(57)【要約】  CTLA4の細胞外領域に兔疫グロブリンの Fc 断片が結合された融合タンパク質をコーディングする治療用遺伝子を調節配列に作動可能に連結させて形成した DNA 作製物の両末端にリンカ-DNAを介してリーダーペプチドを連結させた組換えペプチドベクトル、その製造方法及びその組換えペプチドベクトルの薬剤学的有効量と薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする自家免疫疾患治療用薬剤学的組成物に関するものである。
2007520193.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リーダーペプチド、リンカーDNA及びDNA作製物を含めて、上記のDNA作製物は作動可能に連結する発現調節配列とCTLA4の細胞外領域が免疫グロブリンのFc断片に結合された融合タンパク質を暗号化する治療用遺伝子によって形成され、上記のリーダーペプチドはDNA作製物の両末端にリンカーDNAによって連結されることを特徴とする組換えペプチドベクトル。
【請求項２】
上記のリーダーペプチドは16個のアミノ酸から成ることを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項３】
上記の1番目ないし4番目のアミノ酸が非極性脂肪族の側鎖を有するアミノ酸であることを特徴とする、請求項第２項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項４】
上記の非極性脂肪族の側鎖を有するアミノ酸がGly、Ala、Val、Leu及びIleから成るグループより選ばれることを特徴とする、請求項第３項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項５】
上記の5番目及び6番目のアミノ酸が非イオン性極性側鎖を有するアミノ酸であることを特徴とする、請求項第２項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項６】
上記の非イオン性極性側鎖を有するアミノ酸がAsn、Gln、Ser及びThrから成るグループより選ばれることを特徴とする、請求項第５項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項７】
上記の7番目のアミノ酸がGlyであることを特徴とする、請求項第２項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項９】
上記の8番目ないし12番目のアミノ酸が塩基性側鎖を有するアミノ酸であることを特徴とする、請求項第２項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１０】
上記の塩基性側鎖を有するアミノ酸がLys又はArgであることを特徴とする、請求項第９項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１１】
上記の13番目のアミノ酸がGlyであることを特徴とする、請求項第2項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１２】
上記のリーダーペプチドが配列番号21のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１３】
上記のリンカーDNAが配列番号22の塩基配列と配列番号23の塩基配列が焼きなましされて、形成された塩基配列を有することを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１４】
上記のDNA作製物と一つのリンカーDNAが上記のリンカーDNAの5'-末端燐酸基及び治療用遺伝子の3'-末端の水酸基間のホスホジエステル結合により互いに連結され、上記のリーダーペプチドと他のリンカーDNAがリーダーペプチドのC-末端 Cys 及び上記の他のリンカー-DNAの5'-末端 Cys 間の二硫化物結合によって互いに連結され、上記の二つのリンカーDNAが焼きなましされ、上記のDNA作製物の両末端が上記の二つのリンカー-DNAによりリーダーペプチドに連結されることを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１５】
上記のCTLA4及び上記の免疫グロブリンが哺乳類より由来したことを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１６】
上記の哺乳類が人間又は犬であることを特徴とする、請求項第15項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１７】
上記の発現調節配列がプロモーター、シグナルペプチド配列及びポリアデニル化配列であることを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１８】
上記のプロモーターがサイトメガロウイルスから由来したプロモーターであることを特徴とする、請求項第17項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項１９】
上記のシグナルペプチド配列が人間オンコスタチンMより由来した分泌配列であることを特徴とする、請求項第17項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項２０】
上記のポリアデニル化配列が牛成長ホルモン(BHG)より由来したものであることを特徴とする、請求項第17項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項２１】
上記のDNA作製物が配列番号12又は配列番号20に記載された塩基配列を有することを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項２２】
上記の兔疫グロブリンが IgA 又は IgGであることを特徴とする、請求項第１項に記載の組換えペプチドベクトル。
【請求項２３】
(1) CTLA4の細胞外領域を暗号化する遺伝子と兔疫グロブリンのFc断片を暗号化する遺伝子を連結して、治療用遺伝子を製造する段階;
(2) 上記の治療用遺伝子を発現調節配列と作動可能に連結させてDNA作製物を製造する段階;
(3) リーダーペプチド及びリンカーDNAを合成した後、上記のリーダーペプチド及び上記のリンカーDNAを互いに連結してペプチドベクトルを製造する段階; 及び
(4) 上記の段階(2)で収得したDNA作製物の両末端をリンカーDNAを媒介にしてリーダーペプチドに連結させる段階を含むことを特徴とする、組換えペプチドベクトルの製造方法。
【請求項２４】
上記のDNA作製物と一つのリンカーDNAが上記のリンカーDNAの5'-末端の燐酸基及び治療用遺伝子の3'-末端の水酸基間のホスホジエステル結合によって互いに連結され、上記のリーダーペプチドと他のリンカーDNAがリーダーペプチドのC-末端Cys 及び上記の他のリンカー-DNAの 5'-末端 Cys 間の二硫化物結合により互いに連結され、上記の二つのリンカーDNAが焼きなましされて、上記のDNA作製物の両末端が上記の二つのリンカー-DNAによってリーダーペプチドに連結されることを特徴とする、請求項第23項に記載の組換えペプチドベクトルの製造方法。
【請求項２５】
上記の組換えペプチドベクトルの薬剤学的有効量及び薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする、請求項第１項ないし第22項に記載のいずれかの自家免疫疾患治療用組成物。
【請求項２６】
上記の自家免疫疾患が全身性紅斑性狼瘡であることを特徴とする、請求項第25項に記載の自家免疫疾患治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は自家免疫疾患治療用遺伝子を含む組換えペプチドベクトルに関する。より具体的に、本発明はCTLA4の細胞外領域と兔疫グロブリンのFc断片が結合された融合タンパク質をコーディングする治療用遺伝子を調節配列に作動可能に連結させて形成されたDNA作製物の両末端をリンカー-DNAを媒介にしてリーダーペプチドを連結させた組換えペプチドベクトル(図1)、その製造方法及びその組換えペプチドベクトルの薬剤学的な有効量と薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする自家免疫疾患、特に、全身性紅斑性狼瘡治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
全身性紅斑性狼瘡(又はルプス)は、自家免疫疾患として、多発性関節炎 (nonerosive polyarthritis)、糸球体腎炎(glomerulonephropathy)、溶血性貧血(hemolytic anemia)、血小板減少症(thrombocytopenia)、好中球減少症(neutropenia)、多発性筋炎(polymyositis)、持続性/再発性発熱 (persistent/recurring fever)、皮膚炎(facia/mucocutaneous dermatitis)等の症状を起こす疾病である。
【０００３】
ルプスは患者ごとにその症状が多様で、軽症から重症まで多様な形態で現われるので、症状によって適切に治療しなければならない。一般的に、皮膚の症状又は関節炎等の場合には抗マラリア製剤を用いるが、鎮痛消炎作用が必要な時には少量の副腎皮質ホルモンを用いたりする。腎臓疾患又は甚だしい血小板減少、脳卒中のような重症が現われる際は高容量の副腎皮質ホルモン又は強い免疫抑制剤を用いて治療する。また、最近は上記の従来の一般的治療方法以外に免疫反応が抑制できる天然型(native)又は人為的に作製された遺伝子を用いる遺伝子治療法(gene therapy)による治療方法も試みられている。
【０００４】
このような遺伝子治療のために、今まで治療效果を有した遺伝子を細胞に伝達するために、主にウイルスベクトルが利用されつつある。しかし、今まで様々なウイルスベクトルが開発され、臨床的な実験が進行されたが、ウイルスが有する特性のため、その使用が制限されている。ウイルスは細胞の中に入るために、細胞膜にある特定のリガンドに結合して、それによって細胞内へ入るようになる。従って、ウイルスが結合できるリガンドの種類によって感染され得る細胞が制限されるので、適用できる疾病が限られるしかない。
【０００５】
更に他の重要な理由は、ウイルスが生体に入った時、程度の差はあるものの、全て宿主に免疫反応(急性としては炎症反応、慢性としてはベクトルに対する抗体生成)を起こし、従って、免疫反応に対するウイルスの消失が大きく、ベクトルに対する抗体が生成され、2次接種に制限を有するようになる(再投与時の效果無し)。その他にウイルスの種類によって毒性、治療用遺伝子の大きさ、生体内の持続期間、宿主染色体への統合(integration)等の問題がある。このような理由によってウイルスベクトルが遺伝子治療に応用できるという事実が知られてから20余年が経つまで極めて一部でのみ臨床に適用している実情である。
【０００６】
よって本発明者らは上記の全ての問題を克服した非ウイルス性ペプチドベクトルを開発したことがあり(特許出願番号: 国内: 10-2001-6587、アメリカ: 10/071,476、日本: 2002-032708、中国: 02104729.4、ヨーロッパ: 02002623)、これを具体的な治療用遺伝子の伝達に用いた。一方、自家免疫疾患はT細胞の活性が関与するところ、治療用遺伝子でT細胞の活性を原則的に抑制できる遺伝子を考慮することができる。
【０００７】
T細胞の活性には、一般的に抗原提供細胞(Antigen Presentingg Cell、APC)によって提供される二つの信号が必要である。一番目はAPCのMHCによる抗原が提供されるものであって、T細胞収容体/CD3複合体が認識する信号であり、このような信号によってMHC/抗原複合体を認識する特定のT細胞の活性(activation)が誘導される。二番目は同時刺激シグナル(costimulation signal)とも知られていて、T細胞の分化(proliferation)を誘導する。この信号はAPCのB7によって媒介されて、T細胞はB7を認識する二つのリガンドがある。一番目はCD28と言われ、これはT細胞膜に常に発現されている。CD28がB7と結合すると、IL-2の分泌とT細胞の分化を誘導する。二番目のリガンドはCTLA4と言われ、これはCD28と相同性(homology)を有し、T細胞が活性化された後で発現される。CTLA4はB7に対する結合力がCD28の20倍ほど強力で、これはT細胞の活性を中止させる。従って、CTLA4タンパク質はB7/CD28の信号を遮断する効果的な物質として用いられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
よって、本発明者らはCTLA4を遺伝子治療に用いるために、CTLA4のB7結合部位の細胞外領域(extracellular domain)とこれを二量体形態にしてくれると共に、生体投与後のタンパク質の半減期を増加できる、免疫グロブリンの一部分と結合した治療遺伝子を作製し、本発明者のペプチドベクトルを用いて自家免疫疾患の治療効果を確認して、本発明に至るようになった。
【０００９】
従って、本発明は一観点として、CTLA4の細胞外領域と免疫グロブリンのFc断片が結合された融合タンパク質をコーディングする治療用遺伝子を調節配列に作動可能に連結させて形成されたDNA作製物の両末端にリンカ−DNAを媒介にしてリーダーペプチドが連結された組換えペプチドベクトルを提供する。
【００１０】
他の観点として、(1)CTLA4の細胞外領域をコーディングする遺伝子と免疫グロブリンのFc断片をコーディングする遺伝子を連結して、治療用遺伝子を製造する段階、(2)上記の治療用遺伝子を調節配列と作動可能に連結させて、DNA作製物を製造する段階、(3)リーダーペプチド及びリンカ−DNAを合成した後、この二つを連結してペプチドベクトルを製造する段階及び(4)上記の段階(2)で収得したDNA作製物の両末端にリンカ−DNAを媒介にしてリーダーペプチドを連結させる段階を含む組換えペプチドベクトルの製造方法を提供する。
【００１１】
更に他の観点として、組換えペプチドベクトルの薬剤学的有効量及び薬剤学的に許容される担体を含むことを特徴とする自家免疫疾患治療用組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において治療対象である“自家免疫疾患(autoimmune disease)”とは、体内において自家抗原に対して免疫反応を起こすことによって誘発される疾患を意味する。自家免疫疾患は人体を構成する全ての系統にわたって現われる疾患にして、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、アフタ性口内炎、全身紅斑性狼瘡(ルプス)等のような皮膚疾患、小児糖尿病とも呼ばれる第一型糖尿病、慢性甲状腺炎等、他の内分泌系統の疾患、後天性再生不良性疾患のような造血系統の疾患、肝炎、一次性肝硬変、潰瘍性大腸炎又はクローン病のような消化器系統の疾患、喘息又はシルコシス、石綿肺等のような呼吸器系統の疾患、免疫グロブリンの腎臓疾患、連鎖状球菌感染後の糸球体腎炎等の腎臓疾患等があり、追後、自家免疫疾患として認定されるのも全て本発明の治療対象疾病に含む。
【００１３】
Ｉ．治療用遺伝子及びペプチドベクトル
本発明の明細書に用いられた用語“治療用遺伝子”とは、自家免疫疾患の完治、抑制及び軽減を目的として投与する遺伝子を意味する。具体的に、本発明において治療用遺伝子はCTLA4の細胞外領域が免疫グロブリンのFc断片のヒンジに結合され、形成された融合タンパク質(又はCTLA4-Igと表記する)をコーディングする遺伝子を指す。
【００１４】
本発明の明細書に用いられた用語“細胞外領域(extracellular domain)”とは、燐脂質で構成された細胞膜に位置する膜タンパク質(membrane protein)で疎水性アミノ酸で構成されて、細胞膜を通過する部分(transmembrane domain)を基準に細胞外に露出されている部分を指す。この部分は主に親水性アミノ酸から成されていて、タンパク質の表面に向かう構造(folding)をしていて、水溶液状において可溶性(soluble)を示す。殆どの細胞表面の収容体タンパク質においてリガンドと結合する機能を担当するのは細胞外領域であり、細胞内領域(intracellular domain)は細胞内の信号伝達(signal transduction)機能を担当している。
【００１５】
本発明の明細書に用いられた用語“免疫グロブリン”とは、多様な種類の抗原を特異的に認識するようにB細胞によって生成され、B細胞の抗原収容体の役割を果たすタンパク質分子を指す。この分子はY状に二つの同一な軽鎖と二つの同一な重鎖で構成される。軽鎖と重鎖とも可変及び固定領域を含む。4個の鎖はヒンジ領域という重鎖のフレキシブル領域(flexible region)に位置した二硫化物結合によって共に固定されている。重鎖と軽鎖の両方の可変領域は結合して、2個の同一の抗原−結合部位を形成する。重鎖固定領域によって免疫グロブリンA(IgA)、D(IgD)、E(IgE)、G(IgG)及びM(IgM)の五つの部類に区分される。それぞれの部類はイソタイプといい、独特の構造的特長と相異した生物学的特性を有している。例えば、IgGはFc構造において他のイソタイプと若干異なる。また、IgG及びIgAは多くの次部類がある。例えば、人間IgGのイソタイプ内に4つの次部類IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4があり、それぞれはγ1、γ2、γ3及びγ4重鎖を有する。補体活性化、食細胞-Fc収容体への結合、抗原-依存細胞の毒性のような免疫グロブリン分子の機能は重鎖のFc断片に存在する構造的決定素の所により媒介される。こうした重鎖のFc断片は本発明による組換えペプチドベクトルの構成要素として用いられ、上記の全ての部類又は次部類の免疫グロブリンから由来することができる。
【００１６】
本発明の明細書に用いられた用語“免疫グロブリンFc断片”とは、免疫グロブリンの機能的に区分される複数の断片に分かれて、この中に抗原結合力はないが、容易に結晶体を形成する断片としてヒンジ部位(hinge region)、CH2とCH3のドメインが結合してなされ、抗体で効果物質及び細胞等との結合に関与する部分を示す。従って、本発明に関連して触れるFc断片は一部の文献に記述されたのとは異なるかもしれないが、ヒンジ領域を含み、これは単に本発明を説明するにおいて便利を図るためのものであって、当業者は本願明細書及び図面を参考にして十分理解できるはずであろう。
【００１７】
一方、当業界で周知のとおり、組換えペプチドベクトルが導入される細胞(又は標的細胞)内で治療用遺伝子の発現水準を高めるためには、該治療用遺伝子が上記の標的細胞内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。特に、本発明において特徴的に用いられるペプチドベクトルは別途の調節配列を含んでいないので、治療用遺伝子をペプチドベクトルに導入する前に、調節配列と作動可能に連結した後でこのように形成された“DNA作製物”をペプチドベクトルに含まれるようにするのが望ましい。他の態様として、ペプチドベクトルに先ず調節配列を連結した後、ここに治療用遺伝子を導入することができる。これと関連して本発明の明細書に用いられた用語“DNA作製物”とは本発明による治療用遺伝子と調節配列が作動可能に連結されて形成されたDNA産物を意味する。
【００１８】
本発明の明細書に用いられた用語“調節配列(expression control sequence)”とは、本発明の治療用遺伝子の発現に必須的な又は有益な核酸配列をいう。それぞれの調節配列は融合タンパク質を暗号化する核酸配列に天然的(native)又は外来的(foreign)であり得る。そうした調節配列にはこれに制限されるのではないが、リーダー配列(leader sequence)、ポリアデニル化配列(polyadenylation sequence)、プロペプチド(propeptide)配列、プロモーター、インヘンサー(enhancer)又はアップストリーム(upstream)活性化配列、シグナルペプチド配列(signal peptide sequence)及び終結因子(transcription terminator)等を含む。本発明において調節配列はプロモーター、シグナルペプチド配列及びポリアデニル化配列を含むのが望ましい。その他の調節配列等は本発明による治療用遺伝子の発現量をより増加させるために選択的に含まれる。
【００１９】
本発明の治療用遺伝子を発現させるために、哺乳動物細胞より発現を指示するものの、適切な調節配列の内いずれでも用いられる。このような調節配列の例としてはSV40及びアデノウイルスの初期及び後期のプロモーター(例、アデノウイルスの主要後期プロモーター)、MT-1(メラチオネイン遺伝子)プロモーター、人間サイトメガルウイルス初期遺伝子(CMV)、人間伸張因子1a(human elogation factor 1a、EF-1a)、ショウジョウバエミニマル熱衝撃タンパク質70(Drosophila minimal heat shock protein 70)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、人間ユビキチンC(UbC)プロモーター、人間成長ホルモン転写終結因子、アデノウイルスElb領域ポリアデニル化配列及び牛成長ホルモン(BGH)のポリアデニル化配列等を含む。
【００２０】
本発明の明細書に用いられた用語“シグナルペプチド配列”とは、発現されたタンパク質が細胞膜外に輸送されるように誘導するアミノ酸配列をいう。一般的に細胞膜外に輸送される表面タンパク質又は分泌タンパク質は、細胞膜においてシグナルペプチド(signal peptidase)によって切断されるN-末端配列を有している。本発明においてシグナルペプチド配列は哺乳動物の細胞から分泌を指示するのに適した配列の中でどれでも用いることができる。好ましくは同種又は関連した種の分泌タンパク質から由来したシグナルペプチド配列を用いることができる。それに制限されるものではないものの、hG-CGF、ネズミ(murine)の免疫グロブリンカパ軽鎖又は人間オンコスタチンMのシグナルペプチド配列を用いることができる。
【００２１】
本発明の明細書において用いられた用語“作動可能に連結された(operably linked)”とは、核酸が異なる核酸配列と機能的関係によって配置された状態を意味する。これは適切な分子(例えば、転写活性化タンパク質)が調節配列(等)に結合される時に遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列(等)であり得る。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写を調節したとすれば、その配列に作動可能に連結されたものである。一般的に、“作動可能に連結された”とは、連結されたDNA配列が接触し、また分泌リーダーの場合接触してリーディングフレーム内に存在することを意味する。これら配列の連結は適切な制限酵素部位でライゲーション(連結)によって行われる。そのような部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレチドアダプター(oligonucleotide adaptor)又はリンカ(linker)を用いる。
【００２２】
一方、本発明の明細書に用いられた用語“ベクトル”とは、治療用遺伝子を標的(targeting)細胞内に安定的に運搬できる運搬体をいう。“ペプチドベクトル”は本発明の発明者が既に出願したことがある大韓民国公開特許10-2001-0053621号の“ペプチドベクトル”に開示されたベクトルを含み、これはペプチドとDNAの複合体から成されている。これより形成された“組換えペプチドベクトル”は治療用遺伝子が標的細胞内で発現できるように治療用遺伝子を調節配列に作動可能に連結させて形成されたDNA作製物を含むペプチドベクトルを意味する。
【００２３】
本発明において治療用遺伝子を細胞内に運搬するのに用いられるペプチドベクトルは大きく(1)リーダーペプチド及び(2)リンカ-DNAから成されている。
【００２４】
上記のリーダーペプチドは細胞膜を通過して、細胞内に入る役割をし、具体的にリーダーペプチドは他の分子等との反応性を無くすために、N-末端のアミン基にアセチル基をつけることができ、リンカ-DNAと二硫化物結合で連結されるためにC-末端にCys接合をさせることができる。
【００２５】
本発明においてはリーダーペプチドで16個のアミノ酸で構成されたペプチドベクトルを提供することができる。即ち、本発明による16個のアミノ酸から成されたリーダーペプチドは多様な様態で提供できる。1番目ないし2番目のアミノ酸は細胞膜の燐脂質内に容易に浸透する役割をするものとして、非極性脂肪族(aliphatic)の側鎖を有するアミノ酸(例えば、Gly、Als、Val、Leu、Ile)等の中で選ばれ得る。5番目及び6番目のアミノ酸は上記の4個のアミノ酸が細胞膜に浸透する時に安定的な浸透状態を維持するように支持する役割をするもので、非イオン性極性の側鎖を有するアミノ酸(例えば、Asn、Gln、Ser、Tyr)の中で選ばれ得る。7番目のアミノ酸は前述の6個のアミノ酸と次に位置する9個のアミノ酸等とのスペーサー(spaser)の役割をするものにして、酸性アミノ酸(Asp、Glu)を除いた全てのアミノ酸が位置することができるが、Glyが特に好ましい。8番目ないし12番目のアミノ酸等は細胞膜の内部の陰電荷と作用して、細胞内に流入できる引力を提供する役割をするもので、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、Lys、Arg、His)の中で選ばれ得る。13番目のアミノ酸は細胞膜の間隔上スペーサー(spacer)を置いたので、酸性アミノ酸を除いた全てのアミノ酸が存在してもいいものの、Glyが好ましい。14番目及び15番目のアミノ酸にはどんなアミノ酸でも位置できる。
【００２６】
リーダーペプチドは好ましい態様として次のアミノ酸配列を有することができる。
AC-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-Cys(配列番号21)
【００２７】
配列番号21のアミノ酸配列に該当するリーダーペプチド配列は(1)2番目のLeuがIleに、(2)4番目のIleがLeuに、(3)10番目のLysがArgに、(4)11番目のArgがIleに、又は(5)13番目のGlyがLeu、Ile、Arg、Glnに置換されたアミノ酸配列の全てを含む。
【００２８】
リンカ-DNAはリーダーペプチドと本発明によるDNA作製物を連結してくれる媒介体として役割をするもので、15ないし18個のヌクレオチドで構成することができ、実質的に多様な塩基配列を有することができる。好ましい態様として、次の塩基配列を有することができる。
リンカ-1DNA: 5’-Cys-CTA-ATA-CGA-CTC-ACT-AT-3’(配列番号22)
リンカ-2DNA: 3’-GAT-TAT-GCT-GAG-TGA-T-(P)-5’(配列番号23)
【００２９】
ペプチドベクトルの形成(formation)、即ち、リーダーペプチドとリンカ-DNAの連結はリーダーペプチドのC-末端Cysと上記リンカ-1DNAの5’-末端Cys間の二硫化物結合によって達成される。ここで、リンカ-2DNAとリーダーペプチドは如何なる共有結合で連結されないものの、リンカ-2DNAとリンカ-1DNAが相補的な塩基配列によってアニーリング(annealing)されるので、リーダーペプチドとリンカー-DNA(リンカー1DNA及びリンカー2DNA全て)が連結される。こうした連結状態でリーダーペプチドとリンカー-2DNAの間にはニック(nick)が存在する。
【００３０】
引き継ぎ、組換えペプチドベクトルの形成、好ましくは5'-末端燐酸基が除去された本発明のDNA作製物とペプチドベクトルの連結は、上記のペプチドベクトルのリンカ-2DNAの5'-末端燐酸基(P)とDNA作製物の3'-末端水酸基(-OH)間のホスホジエステル結合(phosphodiester bond)によって達成される。ここで、リンカ-2DNAとリーダーペプチドはある共有結合で連結されないものの、リンカ-2DNAとリンカ-1DNAは相補的な塩基配列によってアニーリング(annealing)されるので、リーダーペプチドとリンカ-DNA(リンカ-DNA及びリンカ-2DNA全て)が連結される。こうした連結状態においてリーダーペプチドとリンカー-2DNAの間にはニック(nick)が存在する。更に、上記のホスホジエステル結合がDNA作製物の両末端全てより形成されるので、究極的にDNA作製物の両末端にリンカー-DNAを媒介にしてリーダーペプチドが連結された組換えペプチドベクトルが完成される。
【００３１】
このように独特に連結された組換えペプチドベクトルは、このペプチドベクトルが細胞の核に導入された時、本発明によるDNA作製物とペプチドベクトルが容易に分離するように手伝う。
【００３２】
II．製造方法
本発明による組換えペプチドベクトルは(1)CTLA4の細胞外領域をコーディングする遺伝子と免疫グロブリンのFc断片をコーディングする遺伝子を連結して、治療用遺伝子を製造する段階、(2)上記の治療用遺伝子を調節配列と作動可能に連結させて、DNA作製物を製造する段階、(3)リーダーペプチド及びリンカー-DNAを合成した後、この二つを連結してペプチドベクトルを製造する段階及び(4)上記の段階(2)において収得したDNA作製物の両末端にリンカー-DNAを媒介にしてリーダーペプチドを連結させる段階を含む組み換えペプチドベクトルの製造方法を提供する。
【００３３】
本発明による製造方法において、段階(1)、(2)及び(3)は互いに個別的に実施することができ、どれを先に実行してもよい。更に、上記で周知したとおり、ペプチドベクトルに先ず調節配列を連結した後でその産物に治療用遺伝子を連結することもできる。
【００３４】
以下では、組換えペプチドベクトルが収得できる方法を段階別に分けて具体的に説明する。
【００３５】
(1) 治療用遺伝子を製造する段階
本発明による治療用遺伝子は一般的に(a)CTLA4の細胞外領域をコーディングする遺伝子及び免疫グロブリンFc断片をコーディングする遺伝子をそれぞれ製造する段階、(b)製造されたCTLA4の細胞外領域をコーディングする遺伝子及び免疫グロブリンFc断片をコーディングする遺伝子に同一の制限酵素認識配列をPCRで挿入する段階、(c)上記の制限酵素認識配列と一致する制限酵素を用いて、上記のCTLA4の細胞外領域をコーディングする遺伝子及び免疫グロブリンFc断片をコーディングする遺伝子の制限酵素認識配列を切断する段階及び(d)両方のDNAの切断された部分をリガーゼ(ligase)で連結することによって、CTLA4の細胞外領域と免疫グロブリンFc断片が融合された形態の治療用遺伝子を製造することができる。
【００３６】
一つの態様として、CTLA4の細胞外領域をコーディングする遺伝子及び免疫グロブリンFc断片をコーディングする遺伝子は治療しようとする種(species)、好ましくは固体(individual)の細胞から分離したmRNAを鋳型に、上記のCTLA4の細胞外領域をコーディングする遺伝子又は免疫グロブリンFc断片をコーディングする遺伝子の両末端をコーディングするオリゴヌクレチドをプライマーとして利用するRT-PCRを行うことにより容易に収得できる。
【００３７】
他の態様として、この遺伝子らは本分野に公知された標準方法によって、例えば、自動DNA合成機(例、バイオサーチ、アプライドバイオシステムス等から購入できるもの)を用いて合成できる。例えば、ホスホロチオエイトオリゴヌクレチドは文献[Stein et al.、Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)]に記述された方法によって合成できる。メチルホスホネートオリゴヌクレチドは調節された有孔ガラス重合体を用いて製造することができる。[Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451(1988)]
【００３８】
(2) 本発明のDNA作製物を製造する段階
本発明においてはこうして製造された治療用遺伝子を調節配列に作動可能に連結させて形成されたDNA作製物をペプチドベクトルに含めるのが望ましい。これらの配列の連結は適切な制限酵素部位でライゲーション(ligation)によって行われる。そうした部位が存在しない場合、通常の方法による合成オリゴヌクレチドアダプター(oligonucleotide adaptor)又はリンカ(linker)を用いる。作動可能に連結するために、上記のDNA断片らは特定の順序(order)と方向(orientation)を考慮して連結するのが好ましい。
【００３９】
DNAは適切なバッファー(buffer)内で特定の制限酵素を用いて切断することができる。一般的に約0.2-1μgのDNA断片は約20μlのバッファー溶液に当該制限酵素約1-2単位(unit)と共に用いられる。適切なバッファー、DNA濃度、培養時間と温度は制限酵素の製造業体によって特定される。一般的に、37℃で約1-2時間程度培養するのが適当なものの、一部の酵素らはより高い温度を要する。培養後に酵素と他の不純物はフェノールとクロロホルムの混合物で上記の消化溶液を抽出することによって除去され、DNAはエタノールで沈澱させ、水溶液層から回収できる。
【００４０】
切断されたDNA断片らは電気泳動(electrophoresis)を用いて、大きさ別に分類されて選択される。DNAはアガロスやポリアクリルアミドマトリックス(matrix)を通じて電気泳動できる。マトリックスの選択は分離されるDNA断片の大きさによって決定される。電気泳動後にDNAは電気溶出(electroelution)によってマトリックスから抽出されたり、低溶融アガロスが用いられたとしたら、アガロスを溶融させてそれからDNAを抽出する。
【００４１】
連結されるべきDNA断片らは同一なモール量で溶液に添加される。このような溶液は通常的にATP、リガーゼ(ligase)バッファー、DNA0.5μg当たり約10単位のT4リガーゼのような連結酵素を含んでいる。DNA断片がベクトルに連結されるためには、ベクトルは適切な制限酵素によって切断され、線形化された後、アルカリ性燐酸加水分解酵素又は牛の内臓の加水分解酵素で処理すれば良い。このような燐酸加水分解酵素処理は連結段階の間にベクトルの自家連結(self-ligation)を防止する。
【００４２】
本発明によるDNA作製物を製造する方法の一態様は、先ず本発明の治療用遺伝子を哺乳動物で効果的に発現を指示するものとして公知された発現ベクトルの調節配列に作動可能に連結されるように挿入し、適切な制限酵素を選別及び利用して、上記の治療用遺伝子及びこれに作動可能に連結された調節配列を含むように切断することによって本発明によるDNA作製物を容易に収得できる。
【００４３】
(3) ペプチドベクトルを製造する段階
本発明によるペプチドベクトルの一構成要素であるリーダーペプチドは生化学分野の熟練家に一般的に広く知られている化学的合成によって容易に製造できる。(Creighton、Proteins: Structures and Molecular Principles、W.H. Freeman and Co.、NY (1983))。代表的な方法として、これらに限定されるものではないものの、液体又は固体状合成、断片凝縮、F-MOC又はT-BOC化学法が含まれる(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins、Williams et al. Eds.、CRC Press、Boca Raton Florida、(1997); A Practical Approach、Atherton ＆ Sheppard、Eds.、IRL Press、Oxford、England、(1989))。
【００４４】
本発明によるリーダーペプチドは保護されたアミノ酸間の凝縮反応(condensation reaction)によって通常の固相方法でC-末端から始まって、第1のアミノ酸、第2のアミノ酸、第3のアミノ酸と一緒に配列によって順次的に進行しながら合成できる。凝縮反応後、保護期及びC-末端アミノ酸が連結された担体を酸分解(acid decomposition)又は加アミン分解反応(aminolysis)のような公知の方法によってとり除くことができる。上記言及されたペプチド合成法は文献に詳しく記述されている(Gross and Meienhofer's、The Peptides、vol 2.、Academic Press (1980))。
【００４５】
本発明によるペプチドの合成のために用いられる固体状の担体は生化学分野で通常使われる担体として代表的にはこれらに限定されるものではないものの、置換されたベンジル形態のポリスチレン樹脂(polystyrene resins of substituted benzyl type)、ヒドロキシメチルフェニルアセチックアミド形態のポリスチレン樹脂、置換されたベンズヒドリルポリスチレン樹脂、ペプチドに結合できる機能基を持つポリアクリルアミド樹脂等が含まれる。
【００４６】
最初保護アミノ酸の保護基らは通常のペプチド合成に用いられる保護基らとして酸分解、還元又は加アミン分解反応のような通常の方法によって容易に除去されるものである。アミノ保護基らの具体例としてはポルミル; トリーフルオロアセチル; ベンジルオキシーカルボニル; (オルソ又はパラー)クロロベンジルオキシーカルボニル及び(オルソ又はパラー)ブロモベンジルオキシーカルボニルのような置換されたベンジルオキシーカルボニル; t-ブトキシカルボニル及び t-アミルロキシカルボニルのような脂肪族オキシーカルボニル等がある。アミノ酸のカルボキシルはエステル基に転換させることによって保護できる。エステル基としては、ベンジルエステル、メトキシベンジルエステルのような置換されたベンジルエステル; シクロヘキシルエステル、シクロヘプチルエステル又は t-ブチルエステルのようなアルキルエステル等がある。グアニジノ基は保護基が必要ではないものの、ニトロ; 又はトシル、メトキシベンゼンスルホニル又はメシチレンスルホニルのようなアリールスルホニルによって保護される。イミダゾールの保護基としてはトシル、ベンジル及びジニトロペリル等がある。トリプトファンのインドール基は保護基がなくても良く、エン麦等で保護基を付けることもできる。
【００４７】
保護基及び担体からペプチドを分離するのは多くの腐食動物(scavenger)下に無水ハイドロフルオロライトによって行われる。腐食動物の例としてはアニソール、(オルソ、メタ-、パラ-)クレゾール、ジメチルスルフィド、Co-クレゾール、エタンエンジオル及びメルカプトピリジン等をあげられ、これらはペプチド合成で通常使われるものらである。
【００４８】
本発明によるリーダーペプチドの更に他の構成要素であるリンカー-DNAは本分野に公知された標準方法によって、例えば自動DNA合成基(例、バイオサーチ、応用生命工学システム等から購入できるもの)を用いて合成することができる。 例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレチドは文献[Stein et al.、Nucl. Acids Res. 16:3209(1988)]に記述された方法によって合成できる。メチルホスホネートオリゴヌクレチドは調節された有孔硝子重合体支持体を用いて製造することができる[Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)]。
【００４９】
こうして製造されたリーダーペプチドとリンカー-DNAは、リーダーペプチドとリンカー-1DNAが二硫化物結合によって連結されて、ここにリンカー-2DNAを添加して、リンカー-1DNAとリンカー-2DNAが塩基対(base pair)によって焼きなましされることによって連結できる。この時、リーダーペプチドとリンカー-DNA間の二硫化物結合は約pH10程度のアルカリ条件で形成することができ、ここにDTT(Dithiotheeitol)のような抗酸化剤を添加するのが好ましい。上記の抗酸化剤はタンパク質らの酸化を防止し、酵素等の活性を保護する役割をするものであり、形成された二硫化物結合を保護し、次にあり得る酵素反応(ligation)時に酵素の活性を持続させることができるからである。続いて、リンカー-1DNAとリンカー-2DNA間の焼きなましはこれらを焼きなましに適した温度である約 50℃で維持することによって達成される。
【００５０】
(4) 本発明のDNA作製物とペプチドベクトルをライゲーションする段階
段階(1)で製造された本発明のDNA作製物及び段階(2)で製造されたペプチドベクトルを連結するのに先立ち、上記のDNA作製物を燐酸加水分解酵素で処理し、5’-末端燐酸基を除去するのが好ましい。これで、DNA作製物はリンカー-1DNAの3’-末端水酸基とは反応できず結合することもできない。燐酸基が除去された上記のDNA作製物とペプチドベクトルを混合し、ここに適したリガーゼを添加すれば、リンカー-2DNAの5’-末端燐酸基とDNA作製物の3’-末端水酸基間のホスホジエステル結合によってDNA作製物とリンカー-DNAが結合するようになる。ここで、DNA作製物の両末端に3’-末端水酸基が位置しているので、窮極的にDNA作製物の両末端にリンカー-DNAを媒介にしてリーダーペプチドが連結されるようになる。
【００５１】
III．薬剤学的組成物
本発明は組換えペプチドベクトルの治療学的有効量及び薬剤学的に許容される担体を含む自家免疫疾患治療用組成物をも含む。
【００５２】
本発明の組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は製剤時に通常的に利用されるものにして、ラクトース、デキストロース、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、珪酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイル等を含むが、これに限定されるのではない。本発明の薬剤学的組成物は上記の成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤等を追加して含める。
【００５３】
本発明の薬剤学的組成物は遺伝子療法で通常的に利用される経路を通じて投与でき、非経口投与が好ましく、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、又は局部投与を用いて投与できる。
【００５４】
本発明の薬剤学的組成物の適切な投与量は製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因らによって多様で、普通熟練した医者は希望する治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。例えば、本発明の薬剤学的組成物は1μg/kg/dayないし100μg/kg/dayの組換えペプチドベクトルを含む。
【００５５】
本発明の組換えペプチドベクトルを含む薬剤学的組成物は本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び/又は賦形剤を用いて製剤化されることにより単位容量形態に製造されるか、又は多容量容器内に入れて製造することができる。この際に剤形はオイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液形態や抽出剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であり得、分散剤又は安定化剤を追加的に含められる。
【００５６】
本発明の組換えペプチドベクトルを含む薬剤学的組成物は室温での安定性を増加させ、高価の低温貯蔵の必要性を減らし、貯蔵寿命(shelf-life)を延ばすために、凍結乾燥することができる。凍結乾燥工程は凍結、一次乾燥及び二次乾燥の連続段階で成される。組成物を凍結させた後の二次乾燥工程は圧力を降下させ、水蒸気の昇華のために加熱する。二次乾燥段階は建築物から吸収された残余水分を蒸発させる。
【００５７】
一態様として、本発明による薬剤学的組成物の凍結乾燥方法は次の手順のとおりである: (1) 凍結乾燥顕微鏡分析法を用いて製剤の崩壊温図(collapse temperature)を決定する(Pikal、M. J. et al. Int. J. Pharm.、1990、vol.62、p.165); (2) バイアルを室温下の凍結-乾燥器の棚に置き、-1℃で約30分間平衡化する; (3) 棚を-55℃に冷却させて、その温度を2時間維持する; (4) 約-32℃の生成物温度又は崩壊温度より5℃低い温度で二次乾燥を実施する; (5) 35℃で二次乾燥を実施する。チャンバ圧力を55ないし120mmHgで調節し、乾燥を完成する; (6) 凍結-乾燥機の真空下でバイアルを栓で塞ぎ、凍結乾燥されたバイアルをクランプ-密封して2℃ないし8℃に保存する。
【００５８】
凍結乾燥された製剤には賦形剤(excipients)及び凍結乾燥保護剤(lyoprotectant)が含まれる。賦形剤としてはこれらに限定されるのではないが、0.9%のNaClと10mMの燐酸ナトリウム(pH7.0)又は10mMの燐酸ナトリウムシトラート(pH 7.0)の緩衝液が含まれる。凍結乾燥保護剤は凍結及び乾燥工程の間に生物学的分子を保護して、最終産物に機械性(mechanical support)を付与する役割をし、これらの例としはPBS(pH7.0)、PBS/4%、12%又は15%のトレハルローズ等があげられる。
【００５９】
以下、実施例はあくまでも本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者において明らかなはずである。
【実施例１】
【００６０】
(1) 犬のCTLA4のコーディング配列の増幅
健康な犬から採取した静脈血10mlに抗凝固剤として1.4mlのCPDA(citrate phosphate dextrose acid)を混合し、フィコ-プラーク勾配遠心分離(Ficoll-Plaque gradient centrifuge)して、末梢血液単核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMCs)を分離した。こうして分離したPBMCsはPBS(Phosphate-buffered saline)で二回洗浄し、エンドトキシンが全くない培地(complete endotoxin free medium)RPMI1640[10%牛胎児血清(fetal calf serum)、50μl/mlのゲンタミシン(gentamicin)、10μl/mlのコンカナバリンA(concanavaline A)を含有]に1x106細胞/mlに合わせて、5%CO2下で37℃で4時間培養した。培養後に遠心分離してPBMCsを収集して、液体窒素に凍結させた。
【００６１】
こうして分離されたPBMCsからトライゾール試薬(Trizol reagent)を用いて全体RNAを分離し、75%のエタノールで洗浄した後、RNA沈殿物(pellet)をDEPC処理水(DEPC treated water)に溶かした。精製された2μgのmRNA及び1μlのオリゴdT(Oligo-dT)30プライマーを混合して70℃で2分間加熱し、氷を入れて冷やし、この混合物に200UのM-Mulv逆転写酵素、5μlの5倍緩衝溶液、1μlのdNTPを入れてDEPC処理水で50μlになるように添加した後、42℃で1時間反応させて1次cDNAを合成した。
【００６２】
上記で得られた1次cDNAを鋳型に、下記のプライマーペアを用いるPCRで758bp大のCTLA4を増幅させた。具体的に、PCRは3μlの1次cDNA、2U Pfu DNA ポリメラーゼ、10μlの10倍反応緩衝溶液、1%のトリトンX-100(Triton X-100)、1mg/mlの牛血清アルブミン(BSA)、3μlのCTLA4のフォーワードプライマー(10uM)、3μlのCTLA4リバースプライマー(10uM)、2μlのdNTP(dNTP、それぞれ10mM)を入れて、3次蒸溜水で100μlになるように添加した後実施した。反応条件は95℃で3分間処理した後、95℃で30秒、52℃で1分間、72℃で1分30秒間ずつ30回反応させ、72℃で10分間更に反応させて、重合酵素連鎖反応産物が完全な平滑末端(blunt end)になるようにした。
CTLA4フォワードプライマー: 5’-AAGACCTGAACACTGCTCCA-3’(配列番号1)
CTLA4リバースプライマー: 5’-TTGAAATTGCCTCAGCTCCT-3’(配列番号2)
【００６３】
(2) 犬の兔疫グロブリン(IgA)Fc断片のコーディング配列の増幅
IgAのFc断片(H-CH2-CH3ドメイン)を増幅するために、前もって修得したPBMCsを5μl/ml LPSで活性化させた後、上記(1)と同一の方法で全体RNAを抽出して、RT-PCRを行った。こうして修得した1次cDNAを鋳型に、下記のプライマーペアを用いるPCRによって726bpのIgA Fc断片を増幅した。
IgA フォワードプライマー: 5’-GATAACAGTCATCCGTGTCA-3’(配列番号3)、
IgA リバースプライマー: 5’-GTAGCAGATGCCGTCCACCT-3’(配列番号 4)。
【実施例２】
【００６４】
CTLA4の細胞外領域及びIgA Fc断片のライゲーション(ligation)
実施例1で増幅したCTLA4の細胞外領域及びIgAの Fc断片のライゲーションのために、CTLA4の細胞外領域が増幅できるようにフォワードプライマー(HindIII 制限酵素認識配列を含む)及びリバース(Eco RI 制限酵素認識配列を含む)プライマーを設定し、同じくIgAのFc断片を増幅するために実施例1の(2)で用いたフォワードプライマー(Eco RI 制限酵素認識配列を含む)及びリバースプライマー(Xba I 制限酵素認識配列を含む)を設定した後、PCRを実施した。
【００６５】
ここで、CTLA4シグナルペプチドが確認されなかったので、細胞外への分泌のために人間オンコスタチンM(oncostatin M)シグナルペプチドを増幅したCTLA4の5’-末端に付けて用いた。これは二つの段階のオーバーラッピング(overlapping)PCRを通じて合成した。一番目のPCRはオンコスタチンMのシグナルペプチドから15個のアミノ酸を含んで、CTLA4のN-末端にある7個のアミノ酸を含むように次のように合成されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて実施した。
【００６６】
SP-CTLA4 フォワードプライマー: 5’-
CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGTCCAAAGGGATGCATGTGGCT-3’(配列番号5)
SP-CTLA4(EcoR I)リバースプライマー:
5’-GAATTCGTCAGAATCTGGGCAAGGTTC-3’(配列番号6)
【００６７】
二番目のPCRは一番目のPCRで増幅したPCR産物を精製した後、オンコスタチンMのN-末端部分にHindIII制限酵素認識配列を含む下記塩基配列を有するフォワードプライマー及び上記のSP-CTLA4(EcoR I)リバースプライマーを用いて実施した。
【００６８】
SP-CTLA4(HindIII)フォワードプライマー:
5’-AAGCTTCACCATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC-3’(配列番号7)
【００６９】
上記のIgAのFc断片の再増幅は次のプライマーを用いた。
【００７０】
IgA(Eco RI) フォワードプライマー:
5’-GAATTCGATAACAGTCATCCGTCTCAT-3’(配列番号8)
IgA(Xba I) リバースプライマー:
5’-TCTAGAGTAGCAGATGCCGTCCAC-3’(配列番号9)
【００７１】
これらのプライマーを用いて、それぞれ472bp(CTLA4の細胞外領域)、741bp(IgA Fc断片)のPCR産物を修得した。この過程でIgAのヒンジにある4個のシステインの中で3個のシステインをセリンに取り換えて鎖(chain)間に1個の二硫化物結合(disulfide bond)が形成されるようにした。増幅したPCR産物はそれぞれpCR2.1ベクトルにクローニングしてpCR2.1-CTLA4及びpCR2.1-IgAを製造して、これをE.coli TOP10に入れて、養成(positive)コロニーを選択して培養した。液体培地培養後、プラスミドを抽出してそれぞれ制限酵素(pCR2.1-CTLA4の場合にはHind III、EcoR I、pCR2.1-IGHACの場合にはEcoR I、Xba I)を処理した後、アガロスゲルで求めるバンドを分離してライゲーションした。ライゲーション産物をまたPCR増幅した後、pCR2.1ベクトルにクローニングした。
【実施例３】
【００７２】
CTLA4-Ig 治療用遺伝子とpcDNA3.1(+)のライゲーション
実施例2で修得したCTLA4-Ig治療用遺伝子とpcDNA 3.1(+)をそれぞれHindIII及びXbaIで処理した後、アガロスゲルで治療用遺伝子とベクトルを分離して精製した後ライゲーションした。この組換えベクトルで更にE.coli TOP10菌株を形質組転換して、選択培養した。
【実施例４】
【００７３】
治療用遺伝子のPCR
最終的に用いる調節配列と作動可能に連結された治療用遺伝子、即ち、DNA作製物を修得するために、pcDNA3.1(+)のCMVプロモーターの先方でフォワードプライマーを設定して、BGHポリAシグナルの後側でリバースプライマーを設定した。
【００７４】
CMV-フォワードプライマー: 5’-GCCAGATATACGCGTTGACAT-3’(配列番号10)
BGH-リバースプライマー: 5’-GCTTAATGCGCCGCTACA-3’(配列番号11)
【００７５】
これらのプライマーを用いてPCRを実施して、2213bpの治療用遺伝子と調節配列が作動可能に連結されたDNA作製物を修得した。このDNA作製物の塩基配列は配列番号12に記載した。
【実施例５】
【００７６】
人間から由来したCTLA4-Ig治療用遺伝子
一方、人間を対象に用いることができるCTLA4-Ig治療用遺伝子を製造するために、人間から由来したCTLA4遺伝子及び兔疫グロブリン遺伝子を用いて、全ての過程は実施例1ないし4に記載されたのと同一の方法で進行した。各段階別に用いたプライマーペアの塩基配列は次のとおりで、ここで生成された治療用遺伝子と調節配列が作動可能に連結されたDNA作製物は配列番号20に記載した。
【００７７】
hCTLA4 フォワードプライマー: 5’-AAGACCTGAACACCGCTCCC-3’(配列番号13)
hCTLA4 リバースプライマー: 5’-GTTAGAATTGCCTCAGCTCTT-3’(配列番号14)
hIgG フォワードプライマー: 5’-GAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC-3’(配列番号15)
hIgG リバースプライマー: 5’-AGCATCCTCGTGCGACCGCG-3’(配列番号16)
hSP-CTLA4 フォワードプライマー:
5’-CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC-3’(配列番号17)
hSP-CTLA4(EcoR I) リバースプライマー: SP-CTLA4(EcoR I) リバースプライマーと同一
hSP-CTLA4(Hind III) フォワードプライマー: SP-CTLA4(Hind III) フォワードプライマーと同一
hIgA(Eco RI) フォワードプライマー:
5’-GAATTCGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATCCCCACCGTCCCCAGCACCTGAACTCCTG-3’(配列番号18)、
hIgA(Xba I) リバースプライマー:
5’-TCTAGAAGCATCCTCGTGCGACCGCGAGAGC-3’(配列番号19)
【実施例６】
【００７８】
ペプチドベクトルの合成
本発明において、治療用遺伝子を細胞内に伝達する役目をするペプチドベクトルはリーダーペプチド及びリンカー-DNAから成っている。
【００７９】
リーダーペプチドは下記のアミノ酸配列を有していて、Fmoc-固相法で合成して、N-末端にアセチル基(Ac)を附着した(ペプトロン(株))。
Ac-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gly-Arg-Arg-Cys(配列番号21)
【００８０】
リンカ配列 :
リンカ-1DNA: 5’-Cys-OO-CTA-ATA-CGA-CTC-ACT-AT-3’(配列番号22)(ここで、-OO- : エステル結合)
リンカ-2 DNA: 3’-GAT TAT GCT GAG TGA-T-5’(配列番号23)
【００８１】
上記のリンカ配列において、リンカ-1DNAの5’-末端にはリーダーペプチドとの結合のためにシステインを接合して、リンカ-2DNAの5’-末端には治療用遺伝子との結合のためにT4polykinaseを用いて燐酸基を付けた(Perkin Elmer)。
【００８２】
リーダーペプチド及びリンカ-1DNAそれぞれ2nmolずつを次のようなバッファー組成(50mMトリス、0.1mMEDTA、10mM DTTを含む、pH 10.5)において、37℃で1時間反応させ、S-S結合で結合させた。以降リンカー-1DNA及び5’-末端が燐酸化したリンカー-2DNAの混成化のために2nmolのリンカー-2DNAを添加した後、60℃で30分間反応させた。引き継ぎ10pmol(20pmol/μl)ずつ分株した後で-20℃以下で保管した。
【実施例７】
【００８３】
DNA作製物とペプチドベクトルのライゲーション
実施例 5においてPCRで増幅したDNA作製物はアガロスゲルの切片でシリカ(silica)を用いて精製した後、ベクトルとT4リガーゼを用いてライゲーションした。ライゲーションした後、アガロスゲルでシフト(shift)したことを確認した後、疾患モデル動物に投与した。図1は本発明で製造されたDNA作製物とペプチドベクトルの模式図を現わしたものである。
【実施例８】
【００８４】
(1) ラットを対象にした治療用遺伝子の伝達有無確認
ペプチドベクトルが治療用遺伝子を多くの組職に伝達することができるか否かを確認するために、ラットに組換えペプチドベクトルを投与して、ラットの多くの組職から治療用遺伝子のRNAを抽出してRT-PCRを行い、結果は図 2aに示した。
【００８５】
図2aは本発明の組換えペプチドベクトルを投与した実験群ラットと投与していない対照群ラットの多くの組職からRNAを抽出してRT-PCRを行い、電気泳動した結果を示したもので(M : 100bp レダ、レイン１及び６: 肝臓、レイン２及び７: 腎臓、レイン３及び８: 脾臓、レイン４及び９:肺臓、レイン５及び 10 : 筋肉、レイン 11 及び 12: 蒸溜水を投与した音声対照群)、組換えペプチドベクトルに導入された治療用遺伝子が肝臓、腎臓、脾臓、肺臓、筋肉等の多くの組職に伝達され、発現されるのを確認することができた。
【００８６】
(2) 犬を対象にした治療用遺伝子の伝達有無確認
犬において治療用遺伝子がまともに発現されるか否かを確認するために、正常の犬には存在しない治療用遺伝子(CTLA4とIgA)の結合部位を増幅させることができるプライマーペアを設定して、犬の末梢血液単核細胞から採取したRNAでRT-PCRを行い、結果は図2bに示した。
【００８７】
図2bは本発明の組換えペプチドベクトルを投与した実験群の犬と投与していない対照群の犬の多くの組職からRNAを抽出して、RT-PCRを行い、電気泳動した結果を示したもので(レイン N: 蒸溜水を投与された音声対照群の犬、レイン C: 組換えペプチドベクトルを投与していない音声対照群の犬、レイン 0、1、3、7、11、15、19、26、30は組換えペプチドベクトルを投与した犬から組換えペプチドベクトルを投与した日からそれぞれ 0、1、3、7、11、15、19、26、30日が経過した後の実験結果、レイン 21 及び 168: 組換えペプチドベクトルを投与した更に他の犬から組換えペプチドベクトルが投与された日からそれぞれ 21、168が経過した後の結果)、治療用遺伝子(CTLA4とIgA)の結合部位に当たる394bpの特異バンドが観察され、投与後、少なくとも168日以上治療用遺伝子が発現するのを確認することができた。
【００８８】
<実験例 1>
尿タンパクとクレアチンの割合測定
ヘパラン硫酸(Heparan Sulfate)で免疫させ、SLEを誘発した犬の尿は午前10時から午後2時の間にカテーテルを用いて収得した。尿タンパクは(Lott JA、et al. Clin. Chem. 1983、vol.29(11)、p.1946)の方法を用いて測定し、尿クレアチンは蒸溜水で1:100に稀釈した後、変形された Jaffe 反応(modified Jaffe reaction)を用いて測定した。尿タンパクとクレアチンの割合が0.6以下ならば正常だと判定し、1以上なら深刻な腎臓糸救体疾患があることと判定することができる(Sodikoff CH. Urine tests. In Sodikoff CH (ed). Laboratory profiles of small animal diseases A guide to laboratory diagnosis. 2nd ed. St. Louis: Mosby, 1995:50)。治療の前、高い尿タンパクとクレアチンの割合を示した犬は、治療後に尿タンパク：クレアチン比が正常数値に戻るにつれて本発明によって製造された遺伝子が腎臓糸球体疾患を緩和させることを確認することができた(表 1)。
【表１】
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【００８９】
<実験例 2>
ペプチドベクトル抗体を測定するためのELISA
本発明に用いられたペプチドベクトルが宿主内で抗体を生成するか否かを確認するために競争的ELISAを行った。
【００９０】
本発明によって製造された遺伝子で治療を実施した後、治療しない対照群の犬及び実験群の犬から 0、3、7、15、30日目に血液を採取し、血清を分離した。ペプチドベクトル(12.5μg/ウェル)をPBSに稀釈した後、4℃で一晩中(overnight)コーティング(coating)した。残っている結合位置を遮断(block)するために、BSAをPBSに溶かして(1% BSA in PBS)、遮断用バッファーとして用いた。犬の血清は1:200に稀釈して用いて、ペプチドベクトルに特異的に結合する抗体はペルオキシダーゼ-共役された兎抗-犬のIgGを二次抗体として用いて、基質としては o-フェニレンジアミン二塩化水素化物(Sigma p9187)を用いて検出した。3M HClを停止溶液(stop solution)に用いて反応を中止させ、492nmの波長で吸光度を測定し、その結果は図3に示した。
【００９１】
図3のグラフは組換えペプチドベクトルが投与された実験群の犬(犬１及び犬２)とそうではない対照群の犬から遺伝子治療後にそれぞれ 0、3、7、15、30日目に組換えペプチドベクトルに対する抗体を測定して比較したものにして、これによると、実験群の犬の血中にペプチドベクトルに対する抗体が生成されなかったことを確認することができた。
【００９２】
<実験例 3>
組織学的検査
犬にヘパランソルフェイト(HS)を投与して全身性紅斑性狼瘡を誘発するようにした後、12週経って皮膚組織を採取した。遺伝子治療を実施した犬の場合には治療してから99日が経った後で皮膚の組職を採取した。採取した皮膚の組職はH&E(Hematoxylin & Eosin)染色と兔疫グロブリンとC3に対する免疫染色をした。重鎖特異的塩素抗-犬IgG、μ鎖特異的塩素抗-犬IgM及び塩素抗-犬 C3(Benthyl laboratories, Montgomery、TX)を一次抗体で1:200に希釈して用い、ペルオキシダーゼ-抗塩素IgG(H+L)を1:200に希釈して二次抗体として用いて検出した。
【００９３】
治療用遺伝子を投与した場合に、肉眼で観察したところによると、脱毛、紅斑、吹き出物、かさぶた等の全身性紅斑性狼瘡と関連した皮膚症状がきれいになくなった(図4a-h)。
【００９４】
同じく遺伝子治療後、99日目に採取した皮膚組職のH&E染色時、真皮の上層部に浸潤されていたリンパ球と形質細胞の数が著しく減少することが確認できた(図5a及びb)。また休止期状態を示して、毛が一本もなかった毛嚢に毛が再び生え、正常な同化段階(anagenic phase)に戻ってきた(図5c及びd)。皮膚免疫組織染色時、紅斑性狼瘡時の特徴的に現われるルプス-特異的なバンドとも呼ばれる、真皮と表皮の接合部に浸潤された兔疫グロブリン(IgM)と補体(C3)の浸潤がなくなった(図5eとf)。
【００９５】
<実験例 4>
HS-免疫させた犬と遺伝子治療した犬における抗核抗体検査
アセトンで固定されたCrandall-Reese Feline Kidney(CRFK)細胞を基質にこの細胞の核に対する自家抗体(抗核抗体)を間接免疫蛍光法を用いて測定した。犬の血清を1：2ないし1：128に稀釈して蛍光測定した。自家抗体に対する結合はイソチオシアンフルオロセイン−共役された塩素抗-犬IgG(1：16希釈)を用いて検出した。蛍光は蛍光顕微鏡(epifluorescence)を用いて観察した。血清はHS免疫させた後、3、7、11、18、25、27週後に採取して、遺伝子治療後に7、32、99日目に採取した。
【００９６】
稀釈倍数が高い血清にも蛍光が検出されたら(陽性を示す)、抗核抗体がより多く存在することを意味する。一般的に正常の犬の場合には1：10まで蛍光を示すことができ、1：16までを低力価陽性(low titered positive)で1：64で蛍光を表せば、高力価陽性(high titered positive)とみなすことができ、下記の表において最小1：128まで陽性を示したのはSLEだと確診するのに十分な数値であり、1：2でのみ陽性を示したのは正常動物の数値と同じことから本発明による組換えペプチドベクトルがSLEを效果的に治療することができた。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００９７】
本発明による組換えペプチドベクトルを利用した遺伝子治療によって抗体生成を最小化すると同時に全ての細胞に治療用遺伝子を取り入れることができるので、特に、自家免疫疾患のような全系統にわたって誘発される疾病を治療するのに用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図1は本発明に伴う組換えペプチドベクトルの模式図を示した図である(CMV: サイトメガロウイルスプロモーター、SP: オンコスタチン M シグナルペプチド配列、V: CTLA4の細胞外領域、H、CH2、CH3: IgAのFc断片、BGH: 牛成長ホルモンポリアデニル化配列、図面の下段のアルファベッドはIgAのヒンジ(H)部位のアミノ酸配列であり、＊はシステインがセリンに置換されたことを表記する)。
【図２】図2の(a)は宿主で治療用遺伝子が発現するかを確認するために、本発明の組換えペプチドベクトルが投与された実験群のラットと投与されていない対照群のラットの諸組織からRNAを抽出して、RT-PCRを行って、電気泳動した結果を表したもので(M: 100bpレダ、レイン1及び6: 肝臓、レイン2及び7: 腎臓、レイン3及び8: 脾臓、レイン4及び9: 肺臓、レイン5及び10: 筋肉、レイン11及び12: 蒸留水が投与された陰性対照群)、図2の(b)は本発明の組換えペプチドベクトルが投与された実験群の犬と投与されていない対照群の犬の血液からRNAを抽出して、RT-PCRを行って、電気泳動した結果を示したものである(レインN: 蒸留水が投与された陰性対照群の犬、レインC: 組換えペプチドベクトルが投与されていない陰性対照群の犬、レイン0、1、3、7、11、15、19、26、30は組換えペプチドベクトルが投与された犬において組換えペプチドベクトルが投与された日からそれぞれ0、1、3、7、11、15、19、26、30日が経過した後の結果、レイン21及び168: 組換えペプチドベクトルが投与された更に他の犬から組換えペプチドベクトルが投与された日からそれぞれ21、168が経過した後の結果)。
【図３】図3は本発明の組換えペプチドベクトルに対する抗体生成有無を確認するために、組換えペプチドベクトルが投与された実験群の犬(個1及び個2)と投与されていない対照群の犬から遺伝子治療後それぞれ0、3、7、15、30日目に組換えペプチドベクトルに対する抗体を測定した結果をグラフで示したものである。
【図４】図4は本発明の組換えペプチドベクトルを用いた遺伝子治療の前後に脱毛の状態を写真を通じて示したものである((a)、(c)、(e)及び(g)は遺伝子治療前であり、(b)、(d)、(f)及び(h)は遺伝子治療後である)。
【図５】図5は本発明の組換えペプチドベクトルを用いた遺伝子治療の前後の皮膚組織状態を確認するためにH＆E染色を行い、その結果を示したものであり、図5の(a)及び(b)はそれぞれ遺伝子治療の前後の上層真皮部位に浸潤したリンパ球と形質細胞の量を、図5の(c)及び(d)はそれぞれ遺伝子治療前後の毛嚢の状態を、図5の(d)及び(e)はそれぞれ遺伝子治療の前後の真皮と表皮の接合部に沈着した免疫グロブリンの量を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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