(57)【要約】  本発明は、ステロイド受容体の遺伝子活性化経路内の異なる段階に作用する少なくとも二種の化合物を投与することを含む、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させるための新規な方法および組成物を含むものである。好ましい方法は、ステロイド受容体の分解を誘導することができる第一の化合物を投与する工程、およびステロイド受容体経路の異なる段階で遺伝子活性化を阻害することができる第二の化合物を投与する工程を含み得る。ステロイド依存性の遺伝子活性化は、少なくとも二種の化合物を組み合わせてまたは一緒に投与すると、より大きく減少もしくは阻害、調節、または制御され得る。
2007526913.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ステロイド受容体を含む生物学的サンプルを提供する工程、
ｂ）前記生物学的サンプルに、前記ステロイド受容体の分解を誘導することができる第一の化合物を投与する工程、および
ｃ）前記生物学的サンプルに、前記ステロイド受容体が遺伝子を活性化することを阻害することができる第二の化合物を投与する工程、
を包含し、
前記第一の化合物および前記第二の化合物が、前記ステロイド受容体の遺伝子活性化経路の異なる段階に作用し、
さらに、前記第一の化合物または前記第二の化合物を単独で投与する場合よりも、ステロイド依存性の遺伝子活性化がより大きく減少し、または阻害されることを特徴とする、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させる方法。
【請求項２】
ステロイド受容体がアンドロゲン受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一の化合物がクルクミンの誘導体または類似体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クルクミンの誘導体がＡＳＣＪ−９、ＡＳＣＪ−１５およびそれらの機能的誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
第二の化合物が、ステロイド受容体へのステロイドの結合を部分的に阻害することができることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第二の化合物が、ビカルタミド、ヒドロキシフルタミドおよびそれらの機能的誘導体からなる群より選択されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第二の化合物が、ステロイド応答エレメントへのステロイド受容体の結合を部分的に阻害することができることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第二の化合物がドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）またはその機能的誘導体であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステロイド応答エレメントがアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二の化合物が、ステロイド受容体の核への移行を部分的に阻害することができることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第二の化合物がシリビニン（ＳＢ）またはその機能的誘導体であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第二の化合物が、ステロイド受容体の転写を部分的に阻害することができることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
第二の化合物がケルセチン（ＱＵ）またはその機能的誘導体であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
第一の化合物および第二の化合物が一緒に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ステロイド受容体の分解を誘導することができる第一の化合物、および前記ステロイド受容体による遺伝子の活性化を阻害することができる第二の化合物を含む組成物であって、前記第二の化合物が前記ステロイド受容体の分解を有意に誘導しないことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
ａ）ステロイド受容体の分解を誘導することができる第一の化合物またはその薬学的に受容可能な塩、
ｂ）前記ステロイド受容体による遺伝子活性化を阻害することができる第二の化合物またはその薬学的に受容可能な塩、および
ｃ）薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバントまたは担体、
を含み、
前記第一の化合物および前記第二の化合物が、組み合わせた場合、治療効果のある量で用いられることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項１７】
第一の化合物がクルクミンの誘導体または類似体である、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
第二の化合物またはその薬学的に受容可能な塩が、ビカルタミド、ヒドロキシフルタミド、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、シリビニン（ＳＢ）、コハク酸ビタミンＥ（ＶＥＳ）、ケルセチン（ＱＵ）、フィナステリド、デュタステライド、またはそれらの機能的誘導体から選択される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
第一の化合物および前記第二の化合物がリポソーム中にカプセル化されている、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ａ）ステロイドによって変調する病状に罹患していると疑われる個体を提供する工程、および
ｂ）前記個体に、請求項１６に記載の薬学的組成物の治療効果のある量を投与する工程、
を包含する、ヒトにおける、ステロイドによって変調する病状を予防または治療する方法。
【請求項２１】
ステロイドによって変調する病状が、座瘡、多毛症、アンドロゲン性脱毛症（男性型禿頭症）、前立腺癌、良性の前立腺肥大症、膀胱癌、肝臓癌、乳癌、子宮頸癌および肺癌からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）創傷部位または炎症部位を有する個体を提供する工程、および
ｂ）請求項１６に記載の薬学的組成物を前記創傷部位または炎症部位に局所的に投与する工程、
を包含する、創傷または炎症を治療する方法。
【請求項２３】
ａ）請求項１６に記載の薬学的組成物を提供する工程、
ｂ）前記薬学的組成物をリポソーム中にカプセル化する工程、および
ｃ）前記カプセル化した薬学的組成物をヒトに投与する工程、
を包含する、ヒトにおけるステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年１月２８日に出願された、「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｂｙ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｔｅｐｓ  ｏｆ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  ＡＲ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」という標題の、米国仮出願番号第６０／５３９７５３号に対して優先権の利益を主張し、これは、その全体が参照として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、全体として、ステロイドに関連する病状の治療のための方法および組成物に関するものである。より具体的には、本発明は、ステロイドによって誘導される遺伝子活性化経路の異なる段階を標的とすることが可能な少なくとも二種の化合物を投与することによる、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するか減少させることが可能な方法および組成物を含む。
【背景技術】
【０００３】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）は、ステロイド受容体スーパーファミリーのメンバーである。ステロイド受容体は、それらの同種のホルモンリガンドに結合すると、転写因子として作用する。ステロイド受容体は、典型的には、リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、ヒンジ領域およびＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。
【０００４】
アンドロゲンは、標的細胞に入り、特異的なアンドロゲン受容体（ＡＲ）に結合することによって、その機能を発揮し、アンドロゲン調節遺伝子を活性化する。男性循環アンドロゲンホルモンであるテストステロンは、酵素５−アルファレダクターゼによって、末梢組織の細胞内で、主要な細胞内アンドロゲンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換される。製薬会社は、テストステロンのＤＨＴへの変換を阻害するか、またはアンドロゲンとＡＲの間の結合を妨害するかのいずれかである薬物を開発してきた。例えば、５−アルファレダクターゼ阻害剤、フィナステリド（プロスカおよびプロペシア）、ならびにアンドロゲン−ＡＲ結合阻害剤であるフルタミドおよびビカルタミド（カソデックス）は、良性の前立腺肥大症、禿頭症、前立腺癌および他のアンドロゲン障害を治療するために使用されてきた非ステロイド性の抗アンドロゲンである。しかし、これらの抗アンドロゲン薬は、治療を受けた人においてインポテンスなどの副作用を引き起こし得る。これは主に、これらのタイプの抗アンドロゲン物質がアンドロゲン活性を非差別的に阻害することに起因する。
【０００５】
アンドロゲンによって誘導されるＡＲ活性化の経路は、複数の段階からなるプロセスであり（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される、ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ（２００３）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８８：４０４３−４０５４を参照されたい）、単にアンドロゲンとＡＲとの結合を含むものではない。ＡＲ活性化の経路は、以下の段階に要約することができる。
【０００６】
１）ＡＲの発現：核にＡＲ遺伝子を有するアンドロゲンの標的（アンドロゲン応答性）細胞が、ＡＲ遺伝子（ＤＮＡ）をＡＲメッセンジャーＲＮＡ（ＡＲ  ｍＲＮＡ）に転写することによってＡＲタンパク質を発現する。ＡＲ  ｍＲＮＡは、ＡＲの合成が起こる細胞質に移動する。合成されたＡＲタンパク質は、ＡＲタンパク質を安定化しそれらのリガンドであるアンドロゲンに対する親和性を維持することを補助するシャペロンタンパク質（ｈｓｐ７０およびｈｓｐ９０のような熱ショックタンパク質）と複合体を形成する。
【０００７】
２）細胞内アンドロゲンの変換：循環していたテストステロンは標的細胞に入り、酵素５−アルファレダクターゼＩおよびＩＩによって、主要な細胞内アンドロゲンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換される。
【０００８】
３）アンドロゲン受容体の活性化、二量体化、および局在化：細胞質アンドロゲン（ＤＨＴ）はＡＲに結合し、次にＡＲはシャペロンタンパク質から解離してアンドロゲン−ＡＲ複合体を形成し、次にこれが核に移行する。結合および移行のプロセスの間、アンドロゲン−ＡＲ複合体はプロテインキナーゼによってリン酸化され、二量体化される。
【０００９】
４）ＡＲコレギュレーターとの相互作用：二量体化したＡＲタンパク質はまた、ＡＲ活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることができる他の調節タンパク質、すなわち、ＡＲコレギュレーターまたはアンドロゲン受容体関連タンパク質（ＡＲＡ）と相互作用することができる。
【００１０】
５）アンドロゲン応答エレメントの結合：核内において、転写因子として機能するアンドロゲン−ＡＲ−ＡＲＡ複合体は、アンドロゲンによって調節される遺伝子のプロモーター領域上のアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）に結合し、アンドロゲン応答性の標的遺伝子を活性化（発現またはリプレッション）させる一般的な転写機構に関与する、他の調節タンパク質を生成させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、少なくとも二種の化合物を投与することを含む、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するか減少させるための新規な方法および組成物を含む。これらの化合物は、真核細胞などの生物学的サンプルまたはヒトなどの生物に投与することができる。第一の化合物はステロイド受容体の分解を誘導することが可能であり、第二の化合物は、ステロイド受容体による遺伝子活性化を阻害することまたは減少させることが可能である。第二の化合物は、ステロイド受容体遺伝子の活性化経路の様々な段階で作用し得る。第二の化合物は、ステロイドとステロイド受容体との間の結合、ステロイド応答エレメントへのステロイド受容体の結合、ステロイド受容体関連タンパク質またはコファクターへのステロイド受容体の結合、ステロイド受容体の核への移行、ステロイド受容体の転写、またはステロイド受容体の翻訳を阻害し得る。ステロイド依存性の遺伝子活性化は、一種の化合物が投与される場合よりも、少なくとも二種の化合物が組み合わされてまたは一緒に投与されるときに、より大きく減少し、または阻害される。
【００１２】
本発明の他の様相において、ステロイド受容体の分解を誘導することが可能な第一の化合物、およびステロイド受容体による遺伝子の活性化を阻害することが可能な第二の化合物を含む組成物が開示される。第一の化合物および第二の化合物は、ステロイド受容体経路内の異なるポイントまたは段階で作用する。
【００１３】
本発明の他の様相において、ステロイド受容体の分解を誘導することが可能な第一の化合物またはその薬学的に受容可能な塩、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害することが可能な第二の化合物またはその薬学的に受容可能な塩、および薬学的に受容可能な希釈剤、アジュバント、またはキャリアを含む、薬学的組成物が開示される。第一の化合物および第二の化合物は、ステロイド受容体経路の異なる段階において作用し、組み合わせた場合、治療効果のある量で用いられる。ステロイド受容体がアンドロゲン受容体である場合、利用可能な化合物の例には、クルクミン誘導体または類似体（例えば、ＡＳＣＪ−９およびＡＳＣＪ−１５であるがこれらに限定されない）、ビカルタミド、ヒドロキシフルタミド、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、シリビニン（ＳＢ）、ケルセチン（ＱＵ）、フィナステリド、デュタステライド、またはこれらの機能的誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
本発明の他の様相において、ヒトにおける、ステロイドによって変調する病状を予防または治療する方法が開示され、この方法は、ステロイドによって変調する病状に罹患していると疑われる個体を提供すること、およびこの個体に、開示された薬学的組成物の少なくとも一種の治療効果のある量を投与することを包含する。この薬学的組成物は、ステロイド依存性の遺伝子活性化を減少させることまたは阻害することが可能な、ステロイド受容体経路の異なる段階において作用する少なくとも二種の化合物を含む。好ましくは、少なくとも二種の化合物は、組み合わせてまたは一緒に投与すると、単独で投与する場合よりも、より高いレベルでステロイド依存性の遺伝子活性化を減少させるか阻害する。本発明が有効であろう病状の例には、座瘡、多毛症、アンドロゲン性脱毛症（男性型禿頭症）、良性の前立腺肥大症、前立腺癌、膀胱癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、および子宮頸癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
本発明の他の様相において、創傷または炎症の治療のための方法および組成物が開示され、この方法は、一種またはそれ以上の開示される組成物、医薬品、または化粧品を、創傷または炎症の治療が必要な個体に局所的に投与する工程を包含し得る。
【００１６】
本発明の他の様相において、開示される組成物または医薬品をヒトに投与する方法が、ステロイド依存性の遺伝子活性化に関連する病状の治療、阻害または減少のために提供される。この方法は、リポソーム中に組成物または医薬品をカプセル化すること、およびカプセル化された組成物または医薬品を目的の個体に投与する工程を包含し得る。
【００１７】
図１は、ＡＳＣＪ−１５と呼ばれるクルクミン誘導化合物を１μＭ投与したときの、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の内因性レベルの減少を実証する、クマシーブルーで染色した、溶解したヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞のウェスタンブロットゲルの画像を示す。テストステロンの生成物であるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）によるホルモン、またはコントロール溶媒を、２ｎＭで２４時間、実施例１に従って培養したＬＮＣａＰ細胞に加えた。アンドロゲン受容体（ＡＲ）の相対濃度もまた、ＤＨＴまたはコントロール溶媒で示したが、これは、アクチンのシグナルでアンドロゲン受容体（ＡＲ）のシグナルを標準化することによって導き出したものである。
【００１８】
図２は、１μＭのクルクミン誘導化合物、特にＡＳＣＪ−１５と呼ばれる化合物の存在下でのアンドロゲン受容体の分解を実証する、クマシーブルーで染色した、溶解したヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞のウェスタンブロットゲルの画像を示す。詳細には、レーン１、４、７および１０はＬＮＣａＰ培養細胞に対応し、レーン２、５、８および１１は１μＭのクルクミン誘導体であるＡＳＣＩ−１５で処理した培養したＬＮＣａＰ細胞に対応し、レーン３、６、９および１２はネガティブコントロールであるビタミンＥで処理した培養したＬＮＣａＰ細胞に対応する。参照したレーンの上に記載された時間は、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドを培養物に加えた後の時間に対応する。β−アクチンをコントロールとして用い、全てのタンパク質が分解されたわけではないことを実証している。
【００１９】
図３は、ヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、クルクミン誘導体であるＡＳＣＪ−１５、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の阻害効果についてのグラフである。アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイは、実施例１に従って、図に示した阻害剤の濃度を用いて行った。単独のＤＨＡおよびＡＳＣＪ−１５はＤＨＴによって誘導されるトランス活性化を抑制することができたのに対して、ＤＨＡとＡＳＣＪ−１５を組み合わせると、ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性の最大の阻害を示した。
【００２０】
図４は、アンドロゲンによって誘導されるヒト前立腺癌細胞の増殖に対する、ＡＳＣＪ−１５およびＤＨＴの阻害効果についてのグラフを示す。ＡＳＣＪ−１５およびＤＨＡは、単独で、コントロール溶媒よりも大きくＬＮＣａＰ細胞の増殖を抑制することが可能であった。しかし、ＬＮＣａＰ細胞の増殖の最大の抑制は、ＡＳＣＪ−１５およびＤＨＡを組み合わせで投与したときに見られた。
【００２１】
図５は、ヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、フルタミドの代謝物であるヒドロキシフルタミド（ＨＦ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。ＨＦおよびＤＨＡは、ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性を抑制することが可能であったが、ＤＨＴによって誘導される活性の最大の抑制は、ＨＦとＤＨＡを組み合わせて使用したときに観察された。
【００２２】
図６は、ヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、ＡＳＣＪ−１５およびシリビニン（ＳＢ）の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。ＡＳＣＪ−１５およびＳＢは、ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性を有意に抑制することが可能であった。一緒に投与したとき、ＡＳＣＪ−１５とＳＢは、ＤＨＴによって誘導される遺伝子活性化に対する抑制のさらなる効果を有した。
【００２３】
図７は、アンドロゲンによって誘導されるＬＮＣａＰ細胞の増殖に対する、ＡＳＣＪ−１５およびＳＢの阻害効果についてのグラフを示す。ＤＨＴによって誘導される細胞増殖の有意な抑制が、ＡＳＤＪ−１５およびＳＢを単独で投与したときに観察された。組み合わせて投与したとき、ＡＳＣＪ−１５とＳＢは、ＤＨＴによって誘導されるＬＮＣａＰ細胞の増殖の抑制に対してさらなる効果を示した。
【００２４】
図８は、ヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、ＡＳＣＪ−１５およびケルセチン（ＱＵ）の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性の有意な抑制が、ＡＳＣＪ−１５およびＱＵを単独で投与したときに観察された。相乗作用的な関係が、ＡＳＣＪ−１５とＱＵを組み合わせて投与したときに観察された。
【００２５】
図９は、野生型のアンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、フルタミドの代謝物であるヒドロキシフルタミド（ＨＦ）、およびＡＳＣＪ１５の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。ＡＳＣＪ１５およびＨＦは、野生型のＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性を有意に抑制することが可能であった。一緒に投与したとき、ＡＳＣＪ１５とＳＢは、ＤＨＴによって誘導される遺伝子活性化の抑制についてさらなる効果を有した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、ステロイド依存性の遺伝子活性化を調節するための方法および組成物を含む。本発明において説明される方法および組成物は、各々がステロイド受容体と関連する効果または活性化を変化させ、阻害し、抑制し、または減少させることが可能な、少なくとも二種の化合物を使用することを含む。ステロイド受容体の遺伝子活性化の経路の異なる段階で作用する二種の化合物を利用することは、ステロイド受容体の効果または活性のさらなる調節または抑制を可能にし得る。この二種の化合物を利用すると、一種の化合物を独立して使用したか単独で投与したときと比較して、抑制、調節または変化を増加させ得る。
【００２７】
Ｉ．阻害剤の組み合わせを使用して、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するか減少させる方法。
【００２８】
本発明は、阻害剤の組み合わせを使用して、ステロイド受容体の効果を変化または減少させる方法を含む。アンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、甲状腺受容体、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、およびオーファンステロイド受容体などのステロイド受容体は、ステロイドとステロイド受容体との間の結合から始まる一連の事象によって遺伝子転写を調節し、その結果、ステロイド受容体とそれに対応するステロイド応答エレメント（ＳＲＥ）との間の相互作用を介して遺伝子を活性化させる。より具体的には、ステロイド受容体遺伝子の調節または活性化の経路は、ステロイド受容体へのステロイドの結合、ステロイド受容体の二量体化（場合によってホモ二量体を形成する）、核へのステロイド受容体の移行、コファクター（ＡＲＡなど）へのステロイド受容体の結合、適切なステロイド応答エレメントへのステロイド受容体の結合、および場合によって他の転写因子の活性化を含んでもよい。ステロイド受容体経路で作用する少なくとも二種の化合物を投与することによって、本発明は、種々の状態に対して可能性のある治療的処置を提供する。好ましくは、少なくとも二種の化合物が、ステロイド受容体経路の異なる段階で作用し、その結果、一緒に投与されたときまたは協同して投与されたときに、化合物は、二つのポイントでステロイド受容体の効果を変化させることが可能である。これによりステロイド依存性の遺伝子調節をより大きく制御または抑制することができ、それゆえに、疾患またはステロイドに関連する状態の治療において、関連する利点を提供することができる。
【００２９】
この方法は、アッセイの目的でインビトロ培養により増殖させた真核細胞などの単離された細胞を含む生物学的サンプルに、または無傷の生きている対象に適用してもよい。適切な対象には、研究上、農業的、または経済的な関心が持たれる哺乳動物が含まれ、これには、齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、およびヒト以外の霊長類が含まれる。対象には、あらゆる年齢、性別、または健康状態のヒトを含むことができる。特に関心が持たれる対象には、少なくとも部分的にステロイドまたはステロイド受容体の活性の影響を受ける疾患状態または病状を有するか、またはそれを発症する危険性があると診断されたヒトが含まれる。例には、アンドロゲンまたはアンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロンまたはプロゲステロン受容体（ＰＲ）、エストロゲンまたはエストロゲン受容体（ＥＲ）などの影響を受ける状態が含まれるが、これらに限定されない。開示される方法または化合物で治療することができる疾患または病状には、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、肺癌および乳癌、およびアンドロゲン受容体活性化経路に関連する他の癌などの癌、球脊髄性筋萎縮症（ケネディ病）などの、しかしそれに限定されない神経障害および神経筋障害、脂腺のアンドロゲンによって誘導されるＡＲ活性化によって引き起こされる座瘡などの皮膚障害、多毛症、および毛髪の損失が毛包や隣接細胞のアンドロゲン受容体によって引き起こされるアンドロゲン性脱毛症すなわち「男性型禿頭症」などの毛髪障害、ならびに創傷または炎症が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
アンドロゲン受容体の二つのアイソフォーム（全長ＡＲ−ＢおよびＮ末端欠失ＡＲ−Ａ）は、多くの胎児および成体のヒト組織において免疫学的に検出可能な形で発現する（ＷｉｌｓｏｎおよびＭｃＰｈａｕｌ（１９９６））。高いＡＲレベルが男女両方の胎児の生殖組織で見られ、また生殖器以外の胎児組織では様々なレベルで見られた。
高いＡＲレベルはまた、成体の生殖組織（前立腺、子宮内膜、卵巣、子宮、卵管、精巣、精嚢、子宮筋層、および射精管）においても見られ、成体の胸部、結腸、肺および副腎組織においては、より低いレベルが見られた。ＡＲ経路は、雄の生殖器官ならびに生殖器以外の器官（筋肉、毛包、および脳を含む）の発生および適切な機能においてとりわけ重要である。これは、前立腺癌、男性不妊、およびケネディ病を含むいくつかの疾患または状態の病理に関与している。
【００３１】
前立腺癌は、米国人男性において、発生率および有病率が最も多い悪性腫瘍である。これは米国で最も頻繁に診断される新生物であり、米国人男性の癌に関する死因で二番目に多い（Ｂｏｒｉｎｇら；１９９２）。毎年１８０，０００人を上回る男性が前立腺癌に冒され、これは女性における乳癌の数とほぼ同じである。１９９９年には米国人の間で３１，９００例の死亡を引き起こし、これは肺癌に次いで二番目である。毎年の前立腺癌の発生の増加は、米国人男性群の加齢と相関している。
【００３２】
前立腺癌細胞の増殖は、アンドロゲンによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）の活性化に依存する。大部分の前立腺癌は、最初に診断されたときにアンドロゲン依存性であり（ＨｅｉｎｌｅｉｎおよびＣｈａｎｇ  ２００４）、従って、抗アンドロゲン剤で治療することができる。転移性前立腺癌のための一つの有効な治療はアンドロゲンを遮断する治療であり、これは、外科的または化学的のいずれかの去勢を行い、抗アンドロゲン治療と組み合わせて、アンドロゲンの生物学的作用を抑制するものである（Ｃｒａｗｆｏｒｄら；１９８９）。しかし、ステロイドの枯渇に対する腫瘍の反応期間中間値はわずか１８〜３６ヶ月であり、癌はほとんどの場合再発し、アンドロゲン非応答性になる。このような場合において、患者は、化学療法などの、より望ましくない治療に直面する。ある場合においては、抗アンドロゲン剤の変更が、再発した前立腺腫瘍の進行を遅延させることがあり（Ｄｕｐｏｎｔら、１９９３；Ｔａｐｌｉｎら、１９９９）、このことは、特定の抗アンドロゲン治療で再発した前立腺腫瘍が別の抗アンドロゲン剤に応答する可能性があることを示す。
【００３３】
球脊髄性筋萎縮症もしくは脊髄延髄筋萎縮症（「ＳＢＮＡ」）、またはケネディ症候群としても知られる（例えば、２００４年４月１５日にアクセスした、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｃｏｍ／ｎｅｕｒｏ／ｔｏｐｉｃ４２１．ｈｔｍでオンラインで利用可能である電子出版物、Ｐａｕｌ  Ｅ．Ｂａｒｋｈａｕｓ（２００３）、「Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、を参照されたい）ケネディ病は、世界中で４０，０００人に１人が罹患すると見積もられている、まれなＸ連鎖劣性遺伝性の神経筋疾患である。ケネディ病は、ＡＲ遺伝子のＮ末端領域において異常に長くポリグルタミンが伸長することからなるアンドロゲン受容体の突然変異によって引き起こされると考えられている。これは進行性であり、現在では不治で治療不可能である。脊髄と延髄の両方の神経細胞が罹患し、全身にわたって、最も顕著には四肢ならびに顔面および咽頭において、筋の衰弱および萎縮を引き起こす。ケネディ病は、発語および嚥下の困難さ、主要な筋肉の痙攣、ならびに他の症候を引き起こす。これは、通常３０歳から５０歳の間の年齢で症候が現れる成人発症の疾患であるが、より早い発症が見られている。この遺伝子を遺伝した男性のみがこの疾患についての完全な表現型を示すのに対して、この遺伝子についてヘテロ接合である女性は一般的に無症候性のキャリアである。ある場合において、ケネディ病についてヘテロ接合性である女性は、無症状性の表現型を示す。平均寿命には一般的に影響はない。
【００３４】
伸長したポリグルタミンリピートを有する突然変異ＡＲを用いて（例えば、プラスミドｐ６ＲＡＲＱ４９またはｐ６ＲＡＲＱ７７で）の細胞の実験的トランスフェクションが、トランス活性化機能の減少に関与し、またある場合には、ミスフォールディングしたＡＲタンパク質の核内封入に関与するということが示されてきた（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２：３１８１−３１８６、これは、その全体が本明細書に参照により援用される）。異常なＡＲの核内蓄積は、ケネディ病のインビボでの病理と一致して、細胞傷害性であり、神経細胞の死を誘発する。
【００３５】
ステロイド受容体の分解の誘導
本発明は、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害する、または減少させる方法を含み、この方法は、ステロイドまたはステロイド受容体の分解を誘導することが可能である化合物を、好ましくはステロイド受容体遺伝子の活性化経路の異なるポイントまたは段階に作用する、ステロイド受容体による遺伝子活性化を阻害するまたは減少させることが可能な第二の化合物と協同して、またはそれと一緒に投与することを包含する。化合物の組み合わせは、組み合わせて使用したときに、相乗的な、相加的な、またはより強い阻害をもたらすことができる。第二の化合物は、ステロイドのより活性した形態への変換を阻害し、ステロイドとステロイド受容体との間の結合を妨害もしくは阻害し、ステロイド受容体と対応する応答エレメントとの間の結合を妨害もしくは阻害し、ステロイド受容体とコファクターもしくはステロイド受容体関連タンパク質（ＡＲＡファミリーから選択されるものなど）との間の相互作用を妨害し、ステロイド受容体の核への移行を減少させ、もしくは妨害し、ステロイド受容体の転写を減少させ、もしくは抑制し、またはステロイド受容体の翻訳を妨害もしくは抑制することができる。
【００３６】
本発明の方法がアンドロゲン依存性の遺伝子活性化の減少または阻害のために利用されるとき、好ましくは投与された化合物の少なくとも一種が、アンドロゲン受容体の分解を誘導することが可能である。アンドロゲン受容体の分解を誘導することが可能である化合物には、例えば、ＡＳＣＪ−９およびＡＳＣＪ−１５であるがこれらに限定されない、種々のクルクミン誘導体および類似体が含まれる。本発明が包含する誘導体および類似体には、ステロイドまたはアンドロゲンの受容体の分解を生じさせることができる、異なった、より少ない、またはより多い構造的特徴を有するクルクミン化合物が含まれる。
【００３７】
ＡＳＣＪ−９、すなわちジメチルクルクミンは、５−ヒドロキシ−１，７−ビス−（３，４−ジメトキシフェニル）−１，４，６−ヘプタトリエン−３−オンであり、以下の構造を有する。
【化１】
2007526913.tif 000003
【００３８】
ＡＳＣＪ−１５は、７−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−４−［３−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−アクリロイル］−５−オキソ−ヘプト−６−エン酸エチルエステルであり、以下の構造を有する。
【化２】
2007526913.tif 000004
【００３９】
図１および図２は、クルクミン誘導体ＡＳＣＪ−１５の投与によるアンドロゲン受容体の分解を示している。化合物ＡＳＣＪ−９およびＡＳＣＪ−１５は同様の分解能力を有する。特定の用途に用いることができるその他のクルクミンの誘導体化合物および類似体化合物は、その全体が参照により本明細書に援用される、米国特許第６７９０９７９号明細書に記載されるものである。
【００４０】
ステロイド受容体の分解の一つ以上のメカニズムが、本発明の方法または化合物によって利用または誘導され得る。好ましくは、化合物の投与によって、他の標的とされないステロイド受容体のレベルまたは活性を実質的に変化させることなく、標的とされたステロイド受容体の特異的分解が生じる。
【００４１】
標的とされるステロイド受容体の分解は、標的とされる組織または細胞型によって異なる程度で誘導することが望ましい。例えば、異なる組織または細胞型の所定のステロイドに対する応答性の程度は様々であるので、一つの組織もしくは細胞型においては適切であるが別の組織もしくは細胞型においてはそうではないステロイド受容体の分解を誘導することが望ましいか、または、組織もしくは細胞型に従って、標的とされたステロイド受容体を異なる「閾値」もしくはレベルまで下げることが望ましい。ある実施態様において、この方法は、所定の組織または細胞型において標的とされたステロイド受容体を分解するために十分な量の化合物を投与し、それにより、ステロイド受容体の効果を所望のレベルまで下げる（例えば、ステロイド受容体がアンドロゲン受容体である場合、所望のアンドロゲン受容体のレベルは、循環アンドロゲンに対して実質的に非応答性であるレベルであってよい）工程を包含することができる。
【００４２】
本発明の方法は、ステロイド受容体の分解を誘導するために、任意の一つ以上の適切なメカニズムを利用してもよい。これらのメカニズムには以下のものが含まれるがこれらに限定されない：ステロイド受容体の核への移行を妨害することもしくはステロイド受容体を細胞の細胞質に維持すること、プロテアーゼ活性を誘導することが可能なステロイド受容体中のモチーフを露出させること、ステロイド受容体を分解することが可能なプロテアーゼの活性を増大させること、ステロイド受容体の安定化を阻害すること、ステロイド受容体の溶解度を減少させること、ステロイド受容体を分解することが可能な経路を活性化すること、ステロイド受容体のユビキチン化を増加させること、適切なキナーゼによるステロイド受容体のリン酸化を増加させること（例えば、アンドロゲン受容体の場合、少なくとも時としてアンドロゲン受容体をリン酸化して受容体のユビキチン化およびその後のプロテオソームによる分解をもたらす、Ａｋｔキナーゼを活性化することによる。例えば、それらの全体が参照により本明細書に援用される、ＨｅｉｎｌｅｉｎおよびＣｈａｎｇ（２００４）ならびにＬｉｎら  （２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２１：４０３７−４０４８を参照されたい。）、アポトーシスを誘導すること、またはステロイド受容体とステロイド受容体を安定化することが可能なＡＲＡなどのコファクターとの間の相互作用を減少させること。
【００４３】
ある態様において、本発明の方法は、ステロイド受容体の核への移行を妨害することによってステロイド受容体の分解を誘導する工程を包含する。例えば、アンドロゲン受容体は、多くの他のステロイド受容体と同様に、細胞質から核に移行し、核内でジンクフィンガーモチーフを用いて遺伝子を調節する。移行を遮断すると、またはアンドロゲン受容体を細胞質内に維持すると、アンドロゲン受容体はタンパク質分解を受けるため、核ＤＮＡまたは調節される遺伝子に影響を与えることが不可能である。
【００４４】
他の実施態様において、本発明の方法および組成物は、プロテアーゼの存在下でタンパク質分解を誘導することができる部位またはモチーフをステロイド受容体内で露出することによって、ステロイド受容体の分解を誘導する。このような露出は、ステロイド受容体内のドメインの立体構造の変化を誘導することによって、例えば、ステロイド受容体に化合物を結合させることによって、またはステロイド受容体のドメインをリン酸化することによって生じさせることができる。アンドロゲン受容体は、ユビキチン依存性のプロテオソーム経路を経由して、また別の方法として、独立したカスパーゼ−３−依存性経路によって、分解可能であると考えられている（ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ（２００３））。ユビキチン依存性のプロテオソーム経路を裏付ける証拠として、ＡＲのヒンジ領域におけるユビキチン化の標的タンパク質であると考えられる、高度に保存されたＰＥＳＴ（プロリン、グルタミン、セリン、およびスレオニンに富んだ）配列の存在、ならびにプロテオソームの阻害がＡＲレベルを上昇させることが挙げられる（Ｌｉｎら、（２００２）ＥＭＢＯ  Ｊ．，２１：４０３７−４０４８）。ＡＲはリンタンパク質であり、Ａｋｔによってリン酸化され得る。Ａｋｔの構成的発現はＡＲのユビキチン化を増強し、アンドロゲンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）の存在下または非存在下でＡＲレベルを顕著に減少させる。Ａｋｔの効果は、プロテオソーム阻害剤ＭＧ１３２によって阻害され得る（Ｌｉｎら（２００２））。さらに、Ａｋｔは、ユビキチンリガーゼ（Ｅ３リガーゼ）であるＭｄｍ２をリン酸化すると考えられている。Ｍｄｍ２はＡｋｔおよびＡＲと複合体を形成し、ＡＲのためのＥ３リガーゼとして働き、ＡＲのユビキチン化およびその後のプロテオソームによる分解を促進する。
【００４５】
カスパーゼ−３−依存性経路（ＬｅｅおよびＣｈａｎｇ（２００３））は、ユビキチン−プロテオソーム経路とは別のものであると考えられている。腫瘍サプレッサーである、ホスファターゼとテンシンのホモログ（ＰＴＥＮ）の発現は、ＬＮＣａＰ細胞の核へのＡＲの移行を妨害し、ＡＲタンパク質分解を促進した。ＰＴＥＮは、ＡＲのＤＮＡ結合ドメインと相互作用することができ、細胞質におけるＡＲの維持およびＡＲの分解をもたらす。
【００４６】
他の実施態様において、本発明の方法は、ステロイド受容体の安定化を妨害しまたは減少させることによって、ステロイド受容体の分解を誘導する工程を包含する。安定化の阻止または減少は、二種以上のステロイド受容体の間の相互作用を阻害することによって、またはステロイド受容体とコファクターとの間の相互作用を阻止しまたは減少させることによって行ってもよい。一つの例において、アンドロゲン受容体は、ホモ二量体を形成するそれ自体の第二のコピーと二量体化すると考えられ、これが受容体の安定性を増加する。二量体化は、受容体のアミノ末端間の相互作用によって生じてもよい。例えば、アミノ末端ドメインまたはその近傍に結合して二量体化を減少させることまたはなくすことが可能な化合物を投与して、二量体化を阻止することで、アンドロゲン受容体の分解を誘導することができ、従って、アンドロゲン受容体の活性化経路を阻害することができる。他の実施態様において、ステロイド受容体とコファクターとの間の相互作用を乱すこともでき、それによって、ステロイド受容体の分解を誘導することができる。例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、アンドロゲン受容体に結合し、これを安定化するコファクターである（ならびに他のタンパク質に対してはシャペロンとして働く）。ＨＳＰは、アンドロゲン受容体のアミノ末端ドメインを結合すると考えられる。例えばＨＳＰとアミノ末端ドメインとの間の結合を特異的に遮断することができる化合物を投与して（ＨＳＰがシャペロンとして働く他のタンパク質へのＨＳＰの結合に影響を与えることなく）コファクターの結合および安定化を特異的に減少させることにより、アンドロゲン受容体の分解を誘導することができ、従って、アンドロゲン受容体により活性化する経路を阻害することができる。これらの非限定的な例において、この化合物は、ステロイド受容体上の任意の位置における相互作用によって、二量体化またはコファクターの結合を乱すことができる。
【００４７】
他の実施態様において、本発明の方法は、ステロイド受容体とコレギュレーターまたはコファクターとの間の結合を妨害または阻害することができる化合物を投与する工程を包含してもよい。アンドロゲン受容体関連（ＡＲＡ）タンパク質などの補助因子は、アンドロゲン受容体などのステロイド受容体に結合し、安定化させることができ、またステロイド受容体による遺伝子活性化の特異性を決定し得る。すなわち、ＡＲＡタンパク質の結合は、ステロイド受容体によって影響される遺伝子の決定を補助し得る。複数のアンドロゲン受容体関連（ＡＲＡ）タンパク質が同定されており、さらなるＡＲＡタンパク質が将来発見されることが想定される。ＡＲＡタンパク質は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のアミノ末端領域またはカルボキシル末端領域の近傍に結合し得る。本発明が標的とすることができるＡＲＡタンパク質の例には、ＡＲＡ２４、ＡＲＡ５４、ＡＲＡ７０、ＡＲＡ２６７−α、ＡＲＡ誘導体、ＡＲＡ類似体などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
他の実施態様において、本発明の方法は、ステロイド受容体のドメインを不安定化することによってステロイド受容体の分解を誘導する。例えば、ある研究は、アンドロゲン受容体のＡＦ−２ドメインが受容体の全体的な構造を安定化し、アミノ末端ドメインがコレギュレーターと相互作用することを可能にすることを示している。例えば、ＡＦ−２ドメインまたはそれ自体がＡＦ−２ドメインと相互作用するドメインと相互作用または結合することによってＡＦ−２を不安定化することができる化合物は、アミノ末端ドメインの安定化を減少させること、コレギュレーターとの相互作用を減少させること、およびアンドロゲン受容体の分解速度を増加させることができる。
【００４９】
他の実施態様において、本発明の方法は、ステロイド受容体を分解することができる経路を活性化することによって、ステロイド受容体の分解を誘導する。例えば、カスパーゼ−３経路がアンドロゲン受容体の分解を誘導することが示されてきた。カスパーゼ−３経路の活性化は、ＰＴＥＮの存在によって、例えばＤＢＤとＰＴＥＮホスファターゼドメインとの間の相互作用によって、生じることができる。従って、カスパーゼ−３経路を誘導することができる化合物は、アンドロゲン受容体の分解を誘導することができる。別の例において、アンドロゲン受容体をリン酸化するＡｋｔキナーゼは、活性化されて、ユビキチン化、およびその後のプロテオソームによるアンドロゲン受容体の分解をもたらすことができる（ＨｅｉｎｌｅｉｎおよびＣｈａｎｇ  ２００４）。
【００５０】
ステロイドのその活性型への変換の妨害
他の実施態様において、本発明は、ステロイドの活性型または別の型への変換を阻害または抑制することができる化合物と組み合わせて、ステロイド受容体の分解を誘導することができる化合物を投与する工程を包含する。例えば、テストステロンは、酵素５−アルファ−レダクターゼによってジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換される。酵素５α−レダクターゼ（５ＡＲ）の活性を阻害または抑制することができる化合物を投与するとＤＨＴの存在が減少し、それゆえにステロイド依存性の遺伝子活性化を抑制し、または減少させる。適切な阻害剤の例には、デュタステライド、フィネステリドなどが含まれる。従って、クルクミンの誘導体または類似体と組み合わせてテストステロンからＤＨＴへの変換を阻害することができる化合物を投与することは、有効な抗アンドロゲン効果を提供し得、種々のアンドロゲン関連障害に対する有効な治療を提供し得る。
【００５１】
ステロイドとステロイド受容体との間の結合の妨害
本発明はまた、ステロイドとステロイド受容体との間の結合を妨害または阻害することでステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害することができるまたは減少させることができる化合物と組み合わせて、またはそれと一緒に、ステロイド受容体を分解することができる化合物を投与する工程を包含する。
【００５２】
二種の化合物が、薬学的組成物または化粧品組成物などの単一の組成物で投与されてもよく、または別々の組成物で投与されてもよい。二種の化合物が、同一の病状の治療に用いられる。
【００５３】
ステロイドとステロイド受容体との間の結合を妨害することができる化合物は、ステロイド、ステロイド受容体、またはその両方に影響を与えることができる。例えば、化合物は、ステロイド受容体のステロイド結合部位に、全体的にまたは部分的に結合することができ、それによってステロイドとステロイド受容体との間の結合を阻止する。別の方法として、この化合物は、ステロイド受容体のステロイド結合部位の外側、または部分的に外側に結合してもよい。この化合物がステロイド受容体へ結合すると、ステロイド受容体の立体構造を変化させることができ、それによって、ステロイドとステロイド受容体が互いに結合する能力を減少させる。ステロイドとステロイド受容体との間の結合を妨害することのできる化合物の例には、ビカルタミド、フルタミドおよびその機能的誘導体または類似体が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００５４】
ステロイドとステロイド受容体との間の結合の妨害は、種々のステロイド関連の障害または病状のために現在使用されている治療法である。例えば、製薬会社によって開発されたフルタミドおよびビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ）は、前立腺癌を治療するために使用されてきた非ステロイド性の抗アンドロゲン剤である。しかし、腫瘍はしばしば再発し、ホルモン不応性になる。本発明は、例えばクルクミンの誘導体または類似体であるがこれらに限定されない、アンドロゲン受容体の分解を誘導することができる化合物と組み合わせて、またはそれと一緒に、一種以上の上記の化合物を投与することを包含する。本発明は、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化をより大きく阻害することができ、フルタミドまたはビカルタミド単独よりも有効な治療を提供することができる。
【００５５】
ステロイド受容体のステロイド応答エレメントへの結合の妨害
本発明はまた、アンドロゲン受容体の分解を誘導することができる化合物、およびステロイド受容体とステロイド応答エレメント（ステロイド受容体応答エレメントまたは対応する応答エレメントとも呼ばれる）との間の結合を減少させること、抑制すること、または妨害することが可能である化合物を投与することを包含する。
【００５６】
ステロイド応答エレメント（ＳＲＥ）は、標的遺伝子のプロモーター領域内に通常位置する内因性ＤＮＡ配列であり、ステロイド受容体のＤＮＡ結合標的である。通常ジンクフィンガーモチーフを有するステロイド受容体が、対応する応答エレメントに結合すると、ステロイド受容体が転写を開始する。本発明の一つ以上の方法および組成物の標的となり得るステロイド応答エレメントの非限定的な例には、アンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）、プロゲステロン応答エレメント（ＰＲＥ）、エストロゲン応答エレメント（ＥＲＥ）、糖質コルチコイド応答エレメント（ＧＲＥ）などが含まれる。
【００５７】
ステロイド受容体と対応する応答エレメントとの間の結合を妨害または阻害することができる本発明の化合物には、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ＤＨＡの機能的誘導体などが含まれるが、これらに限定されない。アンドロゲンを介する遺伝子活性化に対するＤＨＡの効果は以前に研究されている。Ｃｈｕｎｇら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＬＮＣａＰ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：１２０１−１２０６、２００１。本発明は、アンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）へのアンドロゲン受容体の結合を抑制するＤＨＡの能力、およびアンドロゲン受容体の分解を誘導することができる化合物とのその組み合わせについて実証する。実施例１に開示されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化方法を用いたところ、実施例３および図４にさらに開示される結果にあるように、ＤＨＡをクルクミン誘導体であるＡＳＣＪ−１５と組み合わせて使用したときに、インビトロにおける癌細胞の増殖の抑制において相乗効果が見られた。
【００５８】
ステロイド受容体の核への移行の抑制
本発明はまた、少なくとも部分的にステロイド受容体の核への移行を阻害するまたは減少させることができる化合物と組み合わせて、またはそれと一緒に、ステロイド受容体の分解を誘導することができる化合物を用いて、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させることができる方法および組成物を包含する。
【００５９】
ステロイド受容体は、細胞質から核に移行し、ここでステロイド受容体はステロイド応答エレメント（ＳＲＥ）に結合することができる。それゆえに、ステロイド受容体の核への移行を減少させるまたは阻害することができる本発明の化合物および方法は、ステロイド依存性の遺伝子活性化の減少または阻害を可能にする。従って、クルクミンの誘導体または類似体などのステロイド受容体を分解することができる化合物と組み合わせて投与すると、より一層の改善が得られる。
【００６０】
ステロイド受容体の核への移行を少なくとも部分的に減少させるまたは阻害することができる化合物の例は、細胞の細胞質中に存在するとき、ステロイド受容体複合体に作用することができる。化合物は、ステロイド受容体の立体構造の変化を標的とするかまたは誘導することができ、ステロイド受容体の二量体化を阻止することができ、コファクターのステロイド受容体への結合を妨害することができる。本発明に包含される化合物の具体例には、シリビニン（ＳＢ）またはその機能的誘導体が含まれるが、これらに限定されない。シリビニンは、アンドロゲン受容体の核への移行を妨害することが以前に実証されている。Ｚｈｕら、Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＬＮＣａＰ，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：１３９９−１４０３、２００１。実施例５および図６は、シリビニン（ＳＢ）およびクルクミン誘導体であるＡＳＣＪ−１５が、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化の抑制において、相加的に作用することができることを実証している。シリビニン（ＳＢ）およびＡＳＣＪ−１５はまた、前立腺癌細胞の増殖を相加的に抑制することが分かった。このことは、ＳＢおよびＡＳＣＪ−１５が、ステロイドに関連する病状の治療において、有意な治療的有用性を有する可能性があることを示している。
【００６１】
ステロイド受容体の転写または翻訳の減少または抑制
本発明はまた、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させることができる方法および組成物を包含しており、これは、ステロイド受容体の分解を誘導することができる化合物を投与する工程、およびステロイド受容体ｍＲＮＡの転写を減少または抑制することができる化合物を投与する工程を包含する。
【００６２】
分子生物学分野において周知であるように、ＤＮＡまたはｃＤＮＡはｍＲＮＡに転写され、これはタンパク質として翻訳されまたは発現する。従って、ステロイド受容体の発現および適切な提示は、ステロイド受容体の遺伝子配列が対応するｍＲＮＡに適切に転写されることを必要とする。ステロイド受容体遺伝子配列の転写の抑制または減少は、対応するステロイド受容体タンパク質の発現を減少させ、ステロイド依存性の遺伝子活性化の部分的阻害を可能にする。
【００６３】
ステロイド受容体の転写の抑制は、分子生物学分野において公知である種々の抑制技術を利用してもよい。ケルセチン（ＱＵ）は、ＬＮＣａＰ細胞においてアンドロゲン受容体による遺伝子活性化を阻害することが以前に示されている。Ｘｉｎｇら、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＬＮＣａＰ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：４０９−４１４、２００１。本発明に包含される技術には、プロモーター活性を抑制するまたは減少させること、ステロイド受容体の転写を抑制することができる転写因子を活性化または刺激すること、ポリメラーゼ活性を妨害すること、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を利用すること、アンチセンス技術を利用することなどが含まれるが、これらに限定されない。アンドロゲン受容体の転写を抑制することができる化合物の例には、ケルセチン（ＱＵ）、コハク酸ビタミンＥ（ＶＥＳ）およびその機能的誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
さらに、本発明の方法および組成物には、ステロイド受容体の翻訳を減少させるまたは抑制するものが含まれる。開示される化合物および方法は、例えば、ステロイド受容体の発現に関与する制御化合物または制御配列を生じさせること、またはアンチセンス技術の利用といった、しかしこれらに限定されない、ステロイド受容体の翻訳を抑制する任意の公知の方法を利用してもよい。
【００６５】
ＩＩ．ステロイド依存性の遺伝子活性化の阻害または減少が可能な組成物
【００６６】
本発明はまた、それぞれがステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させることができる少なくとも二種の化合物を使用した、ステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させることができる組成物を含む。ある実施態様において、一種の化合物はステロイド受容体の分解を誘導することができ、第二の化合物は、ステロイド受容体経路の異なるポイントまたは段階で作用することによってステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させることができる。ステロイド依存性の遺伝子活性化の抑制または阻害は、単一の化合物を投与する場合と比較して、少なくとも二種の化合物を組み合わせてまたは一緒に投与することによって増大させることができる。第二の化合物は、限定されないが、例えば以下のことによってステロイド受容体経路の一つ以上の段階を阻害し得る：ステロイドと対応するステロイド受容体との間の結合を阻害するまたは減少させること、ステロイド受容体とステロイド応答エレメントとの間の結合を阻害するまたは減少させること、ステロイド受容体とコファクターまたはステロイド受容体関連タンパク質（例えばＡＲＡ）との間の相互作用を妨害すること、ステロイド受容体の核への移行を阻害するまたは減少させること、ステロイド受容体の転写を減少させるまたは阻止すること、ステロイド受容体の翻訳を減少させるまたは阻害することなど。
【００６７】
アンドロゲン依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させるとき、好ましくは、組成物は、アンドロゲン受容体の分解を誘導することができる少なくとも一種の化合物を含み、より好ましくは、化合物は、ＡＳＣＪ−９、ＡＳＣＪ−１５などのクルクミン誘導体である。テストステロンからジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）への変換を阻害することができる化合物の非限定的な例には、デュタステライド、フィナステリドならびに機能的誘導体および類似体などの５−アルファ−レダクターゼ阻害剤が含まれる。アンドロゲンとアンドロゲン受容体との間の結合を阻害することができる化合物の非限定的な例には、ビカルタミド、ヒドロキシフルタミドならびに機能的誘導体および類似体などが含まれるがこれらに限定されない。アンドロゲン受容体とアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）との間の結合を阻害することができる化合物の非限定的な例には、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）ならびに機能的誘導体および類似体などが含まれる。アンドロゲン受容体の核への移行を阻害することができる化合物の非限定的な例には、シリビニン（ＳＢ）ならびに機能的誘導体および類似体などが含まれる。アンドロゲン受容体の転写を阻害することができる化合物の非限定的な例には、コハク酸ビタミンＥ（ＶＥＳ）、ケルセチン（ＱＵ）ならびに機能的誘導体および類似体などが含まれる。
【００６８】
本発明の組成物は、ステロイド依存性の遺伝子活性化と少なくとも部分的に関連する病状を治療することができる薬学的組成物または化粧品組成物を含んでもよい。特に興味が持たれるステロイド受容体には、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、エストロゲン受容体（ＥＲ）、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）、およびオーファンステロイド受容体が含まれ得るが、これらに限定されない。病状には、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、肺癌、および乳癌などの、しかしこれらに限定されない癌、ケネディ病などの神経障害および神経筋障害、座瘡などの皮膚障害、毛髪の損失が毛包や隣接細胞のアンドロゲン受容体に対するアンドロゲンの活性によって引き起こされるアンドロゲン性脱毛症すなわち「男性型禿頭症」、多毛症、ならびに創傷および炎症が含まれるが、これに限定されない。
【００６９】
本発明の組成物は、適切な担体中の二種以上の活性化合物またはその有効な類似体、変化物または誘導体を含んでもよい。もしステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させることが可能であるものならば、あらゆる適切な活性化合物を利用することができる。アンドロゲン関連の病状を対象とするとき、好ましくは少なくとも一種の化合物が、生理学的に受容可能なレベル、例えば実質的に望ましくない副作用または毒性を生じさせないレベルで、アンドロゲン受容体の分解の誘導に有効である。活性化合物は、より一層の安定性、溶解性、または送達特異性などのさらなる利点を提供する一種以上の因子を任意に含むことができる。このような因子は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、核酸、親油性部分、親水性部分、粒子、母剤、またはこれらの組み合わせを含むことができる。例えば、活性化合物は、親水性部分（例えばリン酸基もしくは硫酸基または炭水化物またはキレート分子）に共有結合または非共有結合して、水性緩衝液または体液中での溶解度を改善することができる。別の例において、活性化合物は、早期の分解から活性化合物を保護するペプチドもしくは他の部分に、または、所望の組織もしくは細胞型を特異的に標的として特異的な組織もしくは細胞型への活性化合物の送達を改善する抗体もしくは他の特異的結合物質に、共有結合または非共有結合することができる。別の例において、活性化合物は、安定性を改善し、または送達を改善するために、リポソーム、粒子、母剤、ゲル、ポリマーなどにカプセル化または包埋することができる。
【００７０】
本発明の組成物において有用である適切な担体には、意図される投与形態に従って選択され、かつ従来の薬剤または化粧品の合成に合致する、希釈剤、賦形剤、または担体材料が含まれる。適切な担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、生理学的に適合可能な緩衝液、生理学的に適合可能な塩で緩衝した生理食塩水、油中水型エマルジョンおよび水中油型エマルジョン、アルコール、ジメチルスルホキシド、デキストロース、マンニトール、ラクトース、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩など、およびこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。適切な担体はまた、従来の薬剤合成に合致するような（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版，Ｇｅｎｎａｒｏ（編）およびＧｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００）、適切な薬学的に受容可能な抗酸化剤または還元剤、防腐剤、懸濁剤、可溶化剤、安定剤、キレート剤、錯化剤、粘性調節剤、崩壊剤、結合剤、香料、着色剤、着臭剤、乳白剤、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤、およびこれらの混合物を含むことができる。
【００７１】
単離された細胞、例えば、培養で増殖した細胞およびバイオアッセイで用いる細胞において使用するために、本発明の組成物は、都合の良いように製剤化し、提供することができる。非限定的な例において、組成物は、溶解可能な固体、溶液、懸濁液、リポソーム調製物などとして製剤化し、また、手動または自動化された送達によって（例えば、ピペット、シリンジ、ポンプ、オートインジェクターまたは類似のものなどによって）細胞に供給することができる。
【００７２】
ヒトの対象のような、生きている生物全体における使用のために、本発明の組成物は、意図される投与形態に適した、かつ従来の薬剤合成に合致する（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏ（編）およびＧｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００）任意の処方で製剤化および供給することができる。適切な製剤の例には、錠剤、カプセル、シロップ、エリキシル、軟膏、クリーム、ローション、スプレー、エアロゾル、吸入剤、固形物、散剤、粒子、ゲル、坐剤、濃縮剤、乳濁液、リポソーム、ミクロスフェア、可溶性母剤、滅菌溶液、懸濁液、または注射液などが含まれる。注射液は、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体における溶液または懸濁液に適した濃縮物もしくは固形物、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。
【００７３】
ヒトの対象のような、生きている生物全体における使用のために、そして治療する特定の状態に依存して、本発明の薬学的組成物は、製剤化し、全身的にまたは局所的に投与することができる。製剤化および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（第２０版，Ｇｅｎｎａｒｏ（編）およびＧｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００）中に記載されている。適切な投与経路には、経口、腸内、非経口、経粘膜、経皮、筋肉内、皮下、経皮、直腸内、髄内、髄腔内、静脈内、心室内、心房内、大動脈内、動脈内、または腹腔内の投与が含まれる。本発明の薬学的組成物は、例えば、移植可能な装置、生物分解性の移植物、パッチ、およびポンプであるがこれらに限定されない、医療装置によって対象に投与することができる。このような装置を使用するとき、組成物は、特定の時間にわたって活性化合物の放出を可能にするために、可溶性または不溶性の母剤または媒質（例えば、医療装置上または医療装置中のコーティング、膜、フィルム、含浸母剤、ポリマー、スポンジ、ゲル、または多孔性層）を含むように製剤化してもよい。
【００７４】
ＩＩＩ．ステロイドによって調節される病状を予防または治療する方法
【００７５】
本発明はまた、ステロイドによって調節される状態を治療または予防する方法を含む。開示される方法を用いて治療され得る状態の例には、例えば、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、子宮頸癌、肺癌および乳癌、およびアンドロゲン受容体の活性化経路に関連する他の癌などの癌、ケネディ病などの、しかしそれに限定されない神経筋障害、脂腺のアンドロゲンによって誘導されるＡＲ活性化によって引き起こされる座瘡などの皮膚障害、毛髪の損失が毛包や隣接細胞中のアンドロゲン受容体に作用するアンドロゲンによって引き起こされるアンドロゲン性脱毛症すなわち「男性型禿頭症」、多毛症などの毛髪障害、ならびに創傷または炎症が含まれるが、これらに限定されない
【００７６】
ステロイドによって調節される病状を予防または治療する方法は、ステロイドによって調節される病状に罹患していることが疑われるか、またはそれを発症するリスクがある、ヒトなどの個体を提供する工程、および各々がステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害または抑制することができる少なくとも二種の化合物を場合によっては適切なキャリア中に含む薬剤の治療効果のある量を投与する工程を包含する。この薬剤は、上記に提供された方法または組成物において先に開示された任意のものであってもよい。好ましくは、少なくとも二種の化合物のうち少なくとも二種が、ステロイド受容体の遺伝子活性化経路の異なる段階またはポイントにおいて作用する。ステロイドによって調節される病状がアンドロゲンによって調節される病状であるとき、好ましくは少なくとも一種の化合物がアンドロゲン受容体の分解を誘導することができ、より好ましくは、この化合物は、例えばＡＳＣＪ−９またはＡＳＣＪ−１５であるがこれらに限定されない、クルクミンの誘導体または類似体である。
【００７７】
本発明はまた、創傷部位または炎症領域を有する個体を提供する工程、およびその部位または領域に組成物を局所的に投与する工程を包含する、創傷または炎症を治療する方法を含む。この組成物は、各々がステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害することができる少なくとも二種の化合物を含んでもよい。これらの化合物は、上記に示したように、ステロイド受容体の遺伝子活性化経路の異なるポイントで作用する。
【００７８】
本発明はまた、上記に示した少なくとも一種の組成物を提供する工程、この組成物をリポソーム中にカプセル化する工程、およびこのカプセル化した組成物をヒトに投与する工程を包含する、ヒトにおけるステロイド依存性の遺伝子活性化を阻害するまたは減少させる方法を含む。
【実施例１】
【００７９】
アンドロゲン受容体のトランス活性化アッセイ、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ、およびウェスタンブロット分析を使用しての、ステロイドによって誘導される遺伝子活性化の変化の検出
【００８０】
この実施例は、ステロイド依存性の遺伝子活性化経路の異なる段階において影響を与えることが可能である、少なくとも二種の化合物の組み合わせを投与することの効果の代表的な研究を提供する。この実施例は、野生型アンドロゲン受容体または前立腺癌において見られる突然変異型アンドロゲン受容体の活性に対する、化合物の種々の組み合わせの効果を研究するためのアンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイ、および化合物の組み合わせが前立腺腫瘍細胞の増殖を抑制する能力を試験するためのＭＴＴ細胞増殖アッセイを含む。好ましいアッセイは、ヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ細胞を利用し、これは、アンドロゲン応答性の、臨床的に関連性のある突然変異型アンドロゲン受容体（ＡＲ）を発現するものとして、当業者に認められている。この実施例において、テストステロンの内因性ホルモン代謝物であるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）をＬＮＣａＰ細胞に投与し、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイにおいてアンドロゲン受容体（ＡＲ）の活性を誘導し、ＭＴＴ細胞の増殖アッセイにおいて癌細胞の増殖を刺激する。組み合わせて用いた場合、開示されるアッセイは、種々のステロイド依存性の病状の、利用可能な治療を開発するための指針を提供する。
【００８１】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイ
ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、シリビニン（ＳＢ）、ケルセチン（ＱＵ）およびヒドロキシフルタミド（ＨＦ）と組み合わせた、クルクミン誘導体であるＡＳＣＪ化合物の効果を評価するための第一の手段として、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイを選択した。アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の検出を介して、アンドロゲン受容体（ＡＲ）経路の終点、つまり標的遺伝子の発現を測定する。抗アンドロゲン活性を検出する方法は以前に示されている。Ｏｈｔｓｕら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｄｉａｒｙｌｈｅｐｔａｎｏｉｄｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １１：５０８３−９０，２００３およびＣｕｒｃｕｍｉｎ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｓ  Ａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４５，５０３７−５０４２、２００２。ルシフェラーゼレポーター系は以前に実証されている。Ｓｈｅｒｆ，Ｂ．Ａ．ら  （１９９６）Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ：ａｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃｏ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ  ｆｉｒｅｆｌｙ  Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙｓ．Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  ５７，２。アッセイから導き出されたデータは、ＡＲ活性化経路の遮断、抑制、または阻害における、試験した化合物間の協同作用の大きさを反映する。
【００８２】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイは、プラスミドでトランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞などの細胞群または細胞株を含み、このプラスミドは、プロモーターの中またはその近傍に組み込まれたアンドロゲン応答エレメントと、プロモーターの下流に位置するルシフェラーゼレポーター系とを有する。試験化合物の存在下でのルシフェラーゼの量の検出または測定の変化は、試験化合物による遺伝子発現の調節、抑制または阻害と相関する。
【００８３】
より具体的には、ヒト前立腺癌細胞であるＬＮＣａＰ（ＡＴＣＣ、マナッサス、ＶＡ）を、熱不活化した１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミン（３００ｍｇ／Ｌ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシン）を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。アッセイを行うために、細胞を２４ウェル組織培養プレート中に、１×１０5細胞／ウェルの濃度で置き、５％ＣＯ2のインキュベーターの中で３７℃で培養した。二日後、細胞をＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）、およびプロモーター領域中にアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）を含むＭＭＴＶ−ルシフェラーゼプラスミドからなるＤＮＡ混合物（０．５μｇ／ウェル）、およびＳＶ４０プロモーターの制御下にあるｐＲＬ  Ｒｅｎｉｌｌａプラスミド（５ｎｇ／ウェル）でトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞に、チャコール／デキストラン処理したＦＢＳを含有する培地を与え、実験設計に従って場合によってはジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）とともに、一種の実験化合物または二種の実験化合物の組み合わせで処理した。処理の２０時間後、細胞を溶解し、溶解物中のルシフェラーゼ活性を、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して分析した。
【００８４】
ＭＴＴ細胞増殖アッセイ
ＭＴＴ細胞増殖アッセイを、種々の化合物の組み合わせが癌細胞の増殖を調節、抑制、または阻害する能力を検出するために、本発明において使用する。使用する細胞は、臨床的に関連のあるＬＮＣａＰ細胞である。細胞増殖を、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）を添加して刺激する。従って、ＭＴＴ細胞増殖アッセイは、どの化合物の組み合わせが前立腺細胞の増殖の阻害または抑制に有用であり得るかということに関する指針を提供し得る。
【００８５】
ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ（すべての生きている細胞が有する）による、無色の基質から還元型テトラゾリウムへの変換に依存するＭＴＴアッセイを、ＬＮＣａＰ細胞の増殖を評価するために利用した（Ｓｕら、１９９９）。手短に述べると、１×１０3細胞／ウェルのＬＮＣａＰ細胞を、９６ウェルマイクロテストＩＩＩ組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ、ＮＪ）中に置いた。二日後、培地を、１０％チャコール／デキストランで誘導したＦＢＳを含むＲＰＭＩに交換した。一種以上の試験化合物を、０．１ｎＭのＤＨＴの存在下または非存在下で、指示された濃度で５日間加える。ＭＴＴ溶液（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）を、１／１０体積で、細胞に３７℃で２時間加える。プレートを遠心分離し（１０分間、１０００ｒｐｍ）、次いで、各ウェルから上清を注意深く除去する。１００μｌの溶解緩衝液（５０％ジメチルホルムアミド、５％ドデシル硫酸ナトリウム、０．３５Ｍの酢酸、および５０ｍＭのＨＣｌ）を各ウェルに加えて、各ウェル中のテトラゾリウムを溶解する。各ウェルの酵素活性量に対する、生きている細胞数を測定する（５９５ｎｍの波長における吸光度を、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  ＢｅｎｃｈＭａｒｋマイクロプレートリーダーを使用して読み取る）。ＭＴＴアッセイから導き出されるデータを、実際の細胞計数および形態によっても確認する。
【００８６】
正常細胞および前立腺腫瘍細胞以外の細胞もまた、増殖アッセイに使用した。ヒト内皮細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（ＭＤ）から入手し、ヒト上皮成長因子、ヒドロコルチゾン、ゲンタマイシン、アンフォテリシンＢ、および２％ＦＢＳを補充したＥＧＭ中で維持した。アッセイを開始するために、細胞を、９６ウェル組織培養プレート中に５×１０3細胞／ウェルの密度で播種した。二十四時間後、細胞に、２％チャコール／デキストランで誘導したＦＢＳを補充した同様の培地を与えた。ＴＣＨＭ抽出物を、５日間、種々の濃度（０．１〜１０μｇ／ｍｌ）で細胞に加えた。次いで、ＭＴＴ溶液を加え、先の段落に記載したように細胞増殖活性を測定した。再度、ＭＴＴアッセイから導き出されたデータを、実際の細胞計数および形態を使用して確認した。
【００８７】
ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロッティング法を、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現を測定するために用いた。ウェスタンブロッティング法は、以前に公開されている（Ｓｕら、１９９９）。手短に述べると、細胞を、１０μｇ／ｍｌのベンズアミジン、１０μｇ／ｍｌのトリプシン阻害剤、および１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニルを加えた２×ＳＤＳローディング緩衝液またはＲＩＰＡ溶解緩衝液のいずれかの中で回収した。細胞溶解物からの全タンパク質（４０μｇ／サンプル）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。分離後、タンパク質を、標準的な手順に従って、ゲルからニトロセルロース膜に転写した。この膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）を補充したリン酸緩衝生理食塩水中の１０％脱脂乳とともに一晩インキュベートした。ヒトアンドロゲン受容体（ＡＲ）に特異的な一次抗体（ＢＤ−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、４℃で一晩、または室温で２時間、この膜に加えた。この膜をＰＢＳＴ緩衝液で三回、各回１０分間すすぎ、次いで、室温で１時間、適切な西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体を加えた。再度ＰＢＳＴですすいだ後、膜中のアンドロゲン受容体（ＡＲ）タンパク質のシグナルを、高感度化学発光基質（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して可視化した。サンプル間で確実に等しくロードするために、製造業者の推奨に従って膜を小片化し、β−アクチンに対する特異的抗体（Ｓｉｇｍａ）とともに再インキュベートした。
【実施例２】
【００８８】
クルクミン誘導体の投与によるアンドロゲン受容体の分解の誘導
【００８９】
ＬＮＣａＰ細胞溶解物のウェスタンブロット分析を、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在の減少を明らかにするために用いたが、このとき、ＬＮＣａＰ細胞は、ＡＳＣＪ化合物と呼ばれるクルクミン誘導体の存在下で培養した。アンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在の減少は、ＡＳＣＪ化合物をＬＮＣａＰ細胞中で単独で培養したとき、ＡＳＣＪをアンドロゲンであるＤＨＴとともに共培養したとき、およびＡＳＣＪをタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドとともに共培養したときに見られた。
【００９０】
具体的には、ＬＮＣａＰ細胞は、１０％ＣＤ／ＲＰＭＩ中で培養し、ＤＨＴ（２ｎＭ）の存在下または非存在下で、２４時間、クルクミン誘導体ＡＳＣＪ−１５（１μＭ）またはコントロール溶媒で処理した。各細胞サンプルのアンドロゲン受容体（ＡＲ）タンパク質の発現を、実施例１に示したように、ウェスタンブロットによって分析した。データの再現性を確実にするために、実験を四回行った。一回の実験の代表的なデータを図１に示す。相対的なアンドロゲン受容体（ＡＲ）の濃度を、β−アクチンのシグナルを用いてアンドロゲン受容体（ＡＲ）のシグナルを標準化することによって導き出し、これもまた図１に示した。
【００９１】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）の存在の減少が分解に起因し、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の転写または翻訳の調節に起因するのではないことを実証するために、ＬＮＣａＰ細胞を、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドに曝露した。図２を参照すると、ＬＮＣａＰ細胞を、コントロール溶媒とともに１０％ＣＤ／ＲＰＭＩ中で培養し（レーン１、４、７、１０）、そしてＡＳＣＪ−１５（１μＭ、レーン２、５、８および１１）またはコハク酸ビタミンＥ（ＶＥＳ）（１０μＭ、レーン３、６、９および１２）で２０時間処理した。続いて、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドを、所定の時間の間（２、３および４時間）、すべての培養細胞に加えた（すべてのレーンにおいて１５μｇ／ｍｌ）。各細胞サンプルのアンドロゲン受容体（ＡＲ）の発現を、実施例１に示したように、ウェスタンブロット分析によって分析した。データを、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の濃度について、０時間のコントロールサンプルと比較した。一回の実験の代表的なデータを図２に示す。
【実施例３】
【００９２】
単独で、またはステロイド受容体と対応するステロイド応答エレメント（ＳＲＥ）との間の結合を遮断することが可能な化合物と組み合わせて、ステロイド受容体を分解することが可能な化合物を投与することによる、ステロイドによって誘導される遺伝子活性化の阻害
【００９３】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）を分解することが可能である化合物を、単独で、およびアンドロゲン受容体とアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）との間の結合を遮断または妨害することが可能である化合物と組み合わせて投与した。クルクミン誘導体であるＡＳＣＪは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）の分解を誘導することができる化合物として実施例２に示した。化合物ＡＳＣＪ−１５は、単独で、およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）とアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）との間の結合を遮断または妨害することが可能なオメガ−３脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）と組み合わせて使用した。アンドロゲンが介在する遺伝子活性化に対するＤＨＡの効果は以前に研究されている。Ｃｈｕｎｇら、Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｏｃｏｓａｈｅｘａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｅｉｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｏｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＬＮＣａＰ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：１２０１−１２０６，２００１。本実施例において、アンドロゲン受容体（ＡＲ）経路の異なるポイントにおいて作用する化合物の組み合わせを、実施例１に記載したアンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイとＭＴＴ細胞増殖アッセイの両方で試験した。
【００９４】
ＡＳＣＪ−１５を、実施例１に記載したＬＮＣａＰ細胞を使用するアンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイにおいて、０、０．５および１．０μＭ投与した。次善の量である０．５μＭは、活性が増加するか減少するかに関わらず、ＡＳＣＪ−１５とＤＨＡとの間のあらゆるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性の調節の検出を確実にするために設けた。ＤＨＡは、以前に報告された最小有効量である１５０μＭを投与した。
【００９５】
より詳細には、上記の実施例１に記載したアンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイを、トランスフェクトしたＬＮＣａＰ細胞で用いた。細胞を、ＡＳＣＪ−１５またはＤＨＡの非存在下または存在下で、１ｎＭのＤＨＴとともに２４時間増殖させた。図３は、この実験の結果を示す。ＤＨＴインキュベーションにより上昇したＭＭＴＶ−ルシフェラーゼの発現は、基底レベルの１０倍を超えていた。細胞への１５０μＭのＤＨＡまたは１μＭのＡＳＣＪ−１５を細胞に投与すると、ＤＨＴによって誘導されるレポーター遺伝子の発現をそれぞれ３０％または４５％抑制した。１５０μＭのＤＨＡおよび１μＭのＡＳＣＪ−１５を共に加えると、ＭＭＴＶルシフェラーゼの誘導を８４％低下させた。この効果は、各々の化合物単独により得られたそれぞれの効果の合計よりも大きい。１５０μＭのＤＨＡと共に次善の量（０．５μＭ）のＡＳＣＪ−１５で処理すると、レポーター遺伝子発現の誘導を５５％ダウンレギュレートした。この抑制は、ＤＨＡ処理のみによって生じるもの（３０％）よりも有意に大きい。これらのデータは、ＤＨＡとＡＳＣＪ−１５とを組み合わせることが、ＡＲ活性の抑制において相乗効果を生じ得ることを示唆する。
【００９６】
ＡＳＣＪ−１５およびＤＨＡをまた、ヒト前立腺腫瘍細胞の増殖の制御における効力について、単独でおよび組み合わせて試験した。ＬＮＣａＰ細胞を、実施例１に記載したＭＴＴアッセイで用いた。結果を図４に示す。ＤＨＴはＬＮＣａＰ細胞の増殖を１５０％有意に刺激した。１５０μＭのＤＨＡをＤＨＴ処理細胞に添加すると、増殖を３０％弱めた。１μＭのＡＳＣＪ−１５で細胞を処理すると、増殖の誘導を２２％低下させた。ＡＳＣＪ−１５とＤＨＡとを組み合わせて投与したとき、ＤＨＴにより刺激される増殖は６４％抑制され、これは、ＡＳＣＪ−１５およびＤＨＡによって生じるそれぞれの効果の総和にほぼ等しいか、またはそれよりも大きかった。これらの結果は、前立腺癌の増殖の抑制においてＡＳＣＪ化合物とＤＨＡを組み合わせることによる相乗効果が存在するという、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイのデータに合致する。
【実施例４】
【００９７】
ステロイド受容体とステロイド応答エレメントとの間の結合を減少させることができる化合物と組み合わせて、ステロイドと対応するステロイド受容体との間の結合を減少させることができる化合物を投与することによる、ステロイドによって誘導される遺伝子活性化の阻害
【００９８】
アンドロゲンとアンドロゲン受容体（ＡＲ）との間の結合を減少させることが可能な化合物を、単独で、およびアンドロゲン受容体とアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）との間の結合を遮断または妨害することができる化合物と組み合わせて投与した。フルタミドの代謝物であるヒドロキシフルタミド（ＨＦ）は、アンドロゲンとアンドロゲン受容体との間の結合を遮断すると考えられている。オメガ−３脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、アンドロゲン受容体（ＡＲ）とアンドロゲン応答エレメント（ＡＲＥ）との間の結合を遮断または妨害すると考えられている。これらの二種の化合物を単独で、および組み合わせて、実施例１に記載のアンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイを用いて、ＬＮＣａＰ細胞に投与した。
【００９９】
実施例３におけるように、ＤＨＡは、アンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイにおいて、その最小有効用量１５０μＭで使用した。ＨＦは、０、０．５または１．０μＭで用いた。ＤＨＴは１×１０-9Ｍで用いた。結果を図５に示す。ＤＨＡとＨＦの両方が、単独でおよび組み合わせて、ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン活性を抑制することが可能であった。ＤＨＡとＨＦを組み合わせて使用したときに相乗的な抗アンドロゲン効果が観察され、ＤＨＴによって誘導される活性をより大きく抑制した。
【実施例５】
【０１００】
ステロイド受容体の核への移行を遮断することが可能な化合物と組み合わせて、ステロイド受容体の分解を誘導することが可能な化合物を投与することによる、ステロイドによって誘導される遺伝子活性化の阻害
【０１０１】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）の分解を誘導することが可能な化合物を、単独で、およびアンドロゲン受容体の核への移行を遮断または妨害することが可能な化合物と組み合わせて投与した。ＡＳＣＪ−１５は、実施例２において示したように、アンドロゲン受容体を分解することが可能である。広く摂取されているオオアザミに豊富なポリフェノール性フラボノイドであるシリビニン（ＳＢ）の精製型は、アンドロゲン受容体の核への移行を妨害すると考えられている。各々を、実施例１に記載したアンドロゲン受容体のトランス活性化アッセイおよびＭＴＴ細胞増殖アッセイを使用して、単独でおよび組み合わせて投与した。
【０１０２】
ＡＳＣＪ−１５を、実施例１に記載したアンドロゲン受容体のトランス活性化（ＡＲ）アッセイにおいて、０、０．５または１．０μＭの濃度で投与した。Ｚｈｕらは、５０μＭという低い濃度を使用して、ＳＢが転写活性を阻害できることを以前に実証している。本発明において、ＳＢは、０または２０μＭで用いた。Ｚｈｕら、Ｓｉｌｙｍａｒｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＬＮＣａＰ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：１３９９−１４０３，２００１。図６を参照すると、ＡＳＣＪ−１５およびＳＢは、単独でおよび組み合わせて、ＬＮＣａＰ細胞中の、ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性を抑制することが可能であった。組み合わせて投与したとき、ＡＳＣＪ−１５およびＳＢは、ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体活性の７０％を相加的に抑制した。単独で投与した２０μＭのＳＢおよび１μＭのＡＳＣＪ−１５の抑制効果を合わせた場合にも、ＤＨＴによって誘導される活性の７０％の抑制が算出される。
【０１０３】
ＡＳＣＪ−１５およびＳＢをまた、ヒト前立腺腫瘍細胞の増殖の制御における効力について、単独でおよび組み合わせて試験した。ＬＮＣａＰ細胞を、実施例１に記載したＭＴＴアッセイに用いた。結果を図７に示す。ＡＳＣＪ−１５およびＳＢは、単独でおよび組み合わせて、腫瘍細胞の増殖を抑制することが可能であった。組み合わせて投与したとき、ＡＳＣＪ−１５およびＳＢは、腫瘍細胞の増殖を相加的に抑制した。
【実施例６】
【０１０４】
ステロイド受容体ｍＲＮＡの転写を抑制することが可能な化合物と組み合わせて、ステロイド受容体の分解を誘導することが可能な化合物を投与することによる、ステロイドによって誘導される遺伝子活性化の阻害
【０１０５】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）の分解を誘導することが可能な化合物を、単独で、およびアンドロゲン受容体の転写を抑制することが可能な化合物と組み合わせて投与した。ＡＳＣＪ−１５は、実施例２で示したように、アンドロゲン受容体を分解することが可能である。リンゴ、タマネギ、および緑茶中に見られるフラボノイドであるケルセチン（ＱＵ）の精製型は、アンドロゲン受容体ｍＲＮＡの転写を抑制すると考えられている。Ｘｉｎｇら、Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ＬＮＣａＰ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２２：４０９−４１４、２００１。各々を、実施例１に記載したアンドロゲン受容体のトランス活性化アッセイを用いて、単独でおよび組み合わせて投与した。
【０１０６】
ＡＳＣＪ−１５を、実施例１に記載したアンドロゲン受容体（ＡＲ）のトランス活性化アッセイにおいて、０、０．１２５、０．２５、０．５、または１．０μＭの濃度で投与した。ケルセチン（ＱＵ）を、０、５または７．５μＭ投与した。図８に示したように、ＡＳＣＪ−１５とＱＵの両方が、ＤＨＴによって誘導されるアンドロゲン受容体（ＡＲ）活性を抑制することが可能であった。組み合わせて投与したとき、二種の試験化合物は、ＤＨＴによって誘導される活性を相乗的に抑制した。
【実施例７】
【０１０７】
ステロイドのステロイド受容体への結合を阻害することが可能な化合物と組み合わせて、ステロイド受容体の分解を誘導することが可能な化合物を投与することによる、ステロイドによって誘導される遺伝子活性化の阻害
【０１０８】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）の分解を誘導することが可能な化合物を、単独で、およびアンドロゲンと対応するアンドロゲン受容体（ＡＲ）との間の結合を阻害することが可能な化合物と組み合わせて投与した。ＡＳＣＪ−１５は、実施例２で示したように、アンドロゲン受容体（ＡＲ）を分解することが可能である。フルタミドの代謝物であるヒドロキシフルタミド（ＨＦ）は、アンドロゲンとアンドロゲン受容体（ＡＲ）との間の結合を遮断すると考えられている。ＨＦを、実施例１に記載したアンドロゲン受容体のトランス活性化アッセイにおいて、単独で、およびＡＳＣＪ１５と組み合わせて試験した。各化合物を、ＬＮＣａＰ腫瘍細胞を使用して、野生型アンドロゲン受容体および突然変異型アンドロゲン受容体の活性を抑制する能力について試験した。ＨＦおよびＡＳＣＪ１５は、単独でおよび組み合わせて、野生型アンドロゲン受容体（ＡＲ）の活性を抑制した。組み合わせて投与したときには、図９に示したように、抑制は相加的であった。
【０１０９】
すべての見出しは読者の便宜のためであり、そのように特定されていない限りは、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。参照または引用されるすべての文書は、それらの全体が参照により援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、ＡＳＣＪ−１５によるアンドロゲン受容体（ＡＲ）の内因性レベルの減少を示す、ＬＮＣａＰ細胞のウェスタンブロットゲルの画像を示す。
【図２】図２は、ＡＳＣＪ−１５の存在下でのアンドロゲン受容体の分解を示す、ＬＮＣａＰ細胞のウェスタンブロットゲルの画像を示す。
【図３】図３は、ＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、ＡＳＣＪ−１５およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の阻害効果について示したグラフである。
【図４】図４は、アンドロゲンによって誘導されるヒト前立腺癌細胞の増殖に対する、ＡＳＣＪ−１５およびＤＨＴの阻害効果についてのグラフを示す。
【図５】図５は、ＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、ヒドロキシフルタミド（ＨＦ）、およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。
【図６】図６は、ＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、ＡＳＣＪ−１５およびシリビニン（ＳＢ）の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。
【図７】図７は、アンドロゲンによって誘導されるＬＮＣａＰ細胞の増殖に対する、ＡＳＣＪ−１５およびＳＢの阻害効果についてのグラフを示す。
【図８】図８は、ＬＮＣａＰ細胞における、アンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、ＡＳＣＪ−１５およびケルセチン（ＱＵ）の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。
【図９】図９は、野生型のアンドロゲンによって誘導される遺伝子活性化に対する、フルタミドの代謝物であるヒドロキシフルタミド（ＨＦ）、およびＡＳＣＪ１５の、単独でおよび組み合わせての阻害効果についてのグラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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