(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は本明細書の記載と同義である］で示される化合物に関する。2007538086.tif 000015
2007538086.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2007538086.tif 000014
［式中：
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルコキシル、ニトロ、シアノ、アルキルチオ、ＣＦ３、ＯＣＦ３またはＯＨであり；
Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アリールアルキル、シクロアルキルメチルまたはヘテロシクリルアルキルである；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つはＨ以外の基である］
で示される化合物、あるいはその医薬上許容される塩、水和物または溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ４がＨである、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つが、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルコキシル、ニトロ、シアノ、アルキルチオ、ＣＦ３、ＯＣＦ３またはＯＨである、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アルコキシル、シアノ、ＣＦ３またはＯＨである、請求項１ないし３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１とＲ２とが同一である、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３がＨ、アルキル、アルケニル、アルキルアリールまたはヘテロシクリルメチルである、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ１およびＲ２が、各々、Ｈ、ハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３がアルキル、アリルまたはベンジルである、請求項１ないし７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１およびＲ２が、各々、Ｈであり、Ｒ３がハロゲン、アルキル、アルコキシル、シアノ、ＣＦ３またはＯＨである、請求項１ないし５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１およびＲ２が、各々、Ｈであり、Ｒ３がハロゲン、アルキルまたはアルコキシルである、請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ４がＨである、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ３がメチルまたはメトキシである、請求項９ないし１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
２−［（２−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（３−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（２−メチルフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（４−メチルフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（４−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（２−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］−２−メチルマロノニトリル、または
２−［ジ（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
である、請求項１記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物と、医薬上許容される賦形剤、希釈剤または担体とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
慢性炎症性疾患の治療または阻害を必要とする哺乳動物における慢性炎症性疾患を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１６】
関節リウマチ、脊椎関節症、変形性関節炎、乾癬性関節炎または若年性関節炎の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、関節リウマチ、脊椎関節症、変形性関節炎、乾癬性関節炎、または若年性関節炎を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、または非定型的大腸炎の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、または非定型的大腸炎を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
乾癬の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、乾癬を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
喘息または慢性閉塞性肺疾患の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、喘息または慢性閉塞性肺疾患を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２０】
脳卒中、虚血、または再潅流損傷の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、脳卒中、虚血、または再潅流損傷を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
コレステロール、トリグリセリド、Ｌｐ（ａ）、およびＬＤＬのレベルを低下させ、高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、急性冠状動脈症候群、末梢血管疾患、再狭窄、または血管れん縮の阻害または治療を必要とする哺乳動物における、高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、急性冠状動脈症候群、末梢血管疾患、再狭窄、または血管れん縮を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２２】
アルツハイマー病、認知機能低下、または老人性認知症の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、アルツハイマー病、認知機能低下、または老人性認知症を治療または阻害するする方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
ＩＩ型糖尿病の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、ＩＩ型糖尿病を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２４】
敗血症の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、敗血症を治療または阻害する方法であって、請求項１ないし１３のいずれか一項に記載の化合物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
哺乳動物における、慢性炎症性疾患、関節リウマチ、脊椎関節症、変形性関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、非定型的大腸炎、乾癬、喘息、慢性閉塞性肺疾患、脳卒中、虚血、再潅流損傷、高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、急性冠状動脈症候群、末梢血管疾患、再狭窄、血管れん縮、アルツハイマー病、認知機能低下、老人性認知症、ＩＩ型糖尿病、または敗血症を治療または阻害するため、あるいは、コレステロール、トリグリセリド、Ｌｐ（ａ）、またはＬＤＬのレベルを低下させるための薬物の製造における、請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、出典明示によりその内容を本明細書の一部とする、２００４年５月１９日出願の米国特許仮出願第６０／５７２８５９号に基づく権利を主張する。
【０００２】
本発明は、（ジアリール−メチル）−マロノニトリル化合物と、それらの、エストロゲン受容体リガンドとしての使用とに関する。
【背景技術】
【０００３】
エストロゲン受容体のリガンドが炎症性遺伝子発現を阻害する能力（サイトカイン、ケモカイン、接着性分子、および炎症酵素の低下を引き起こす）は、アテローム性動脈硬化、心筋梗塞（ＭＩ）、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、炎症性腸疾患、および関節炎などの疾患の炎症コンポーネントを治療する手段を提供すると考えられている。これらのタイプの分子を用いた他の潜在的治療適用には、ＩＩ型糖尿病（Ｃｅｆａｌｕ、Ｊ．、Ｗｏｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｇｅｎｄｅｒ−ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄ．、２００１年、１０、２４１、およびＹｕａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、２９３、１６７３）、変形性関節炎（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、Ａｒｔｈｒ．＆Ｒｈｅｕｍ．、２００１年、４４：１２３７、およびＦｅｌｓｏｎら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｒｈｅｕｍ、１９９８年、１０、２６９）、喘息（Ｃｈｉｎ−Ｃｈｉ  Ｌｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、２０００年、７３、５７）、アルツハイマー病（Ｒｏｔｈ，Ａ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、１９９９年、５７、３９９）ならびに多発性硬化症および関節リウマチなどの自己免疫疾患が含まれる。
【０００４】
これらの慢性炎症性の状態に共通している構成要素は、損傷部位への多形核白血球および単球の浸潤であり、これは、それらを動員する原因となるサイトカインおよび接着性分子の発現増加を介して起こると考えられている。サイトカインインターロイキン（ＩＬ−６）の過産生が、慢性炎の状態と関連付けられている（Ｂａｕｅｒ  Ｍ．Ａ．、Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ｆ．、Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、１９９１年、６２、２０３）。ＩＬ−６遺伝子の合成は、転写因子核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）によって誘導される。炎症過程におけるこの段階に干渉すれば、これらの慢性状態で起こる無制御な増殖過程が効果的に調節されると考えられている。
【０００５】
内皮細胞では、ＩＬ−１βで誘発されるＮＦ−ｋＢレポーター活性およびＩＬ−６発現の阻害が、１７β−エストラジオール（Ｅ２）によって、エストロゲン受容体（ＥＲ）に依存した様式で行われる（Ｋｕｒｅｂａｙａｓｈｉ  Ｓ．ら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、６０、１１）。これは、炎症の他の動物モデルで確認されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＥ２の抗炎症性作用と相関していると言われている。アテローム硬化症モデルでは、Ｅ２が内皮細胞の無傷状態および機能を保護すること、ならびに白血球の付着および内膜への蓄積を軽減することが示されている（Ａｄａｍｓ、Ｍ．Ｒ．ら、Ａｒｔｅｒｉｏ、１９９０年、１０５１、Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｔ．Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．、１９９５年、９６、２４８２、Ｎａｔｈａｎ，Ｌ．ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、１９９９年、８５、３７７）。  心筋梗塞（Ｄｅｌｙａｎｉ、Ｊ．Ａ．らＪ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、１９９６年、２８、１００１）および鬱血性心不全の動物モデルで、エストロゲンが血管壁に同様に作用することも明らかにされた。臨床的には、エストロゲン補充療法（ＥＲＴ）によって、ＣＨＦの患者（Ｒｅｉｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏ．、２０００年、３６、５２９）およびＭＩの患者（Ｇｒｏｄｓｔｅｉｎ，Ｆ．ら、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．、２０００年、１３３、９３３、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏ．、２００１年、３８、１、およびＧｒｏｄｓｔｅｉｎ  Ｆ．ら、Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．、２００１年、１３５、１）両方の、死亡する危険性を低下させることが実証されている。ＥＲＴでは、Ｅ２が、βアミロイド１−４２（Ａβ４２）の産生を低下させる作用を有することが、臨床試験によって実証されている（Ｓｃｈｏｎｋｎｅｃｈｔ，Ｐ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．、２００１年、３０７、１２２）。Ａβ４２は、アルツハイマー病における老人性斑の形成に中心的な役割を有するペプチドである。
【０００６】
しかし、１７−β−エストラジオールは、クレアチンキナーゼの発現も強く刺激する。したがって、ＥＲＴでは、使用第１年における心血管イベントの危険性の増大など、好ましくないいくつかの潜在的副作用が示されており（Ｈｕｌｌｅｙ、Ｓ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９９８年、２８０、６０５）、さらに、子宮および乳房組織への増殖性効果も示されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、エストロゲン受容体のリガンドとして作用できる化合物に関する。このタイプの好ましい化合物は、（ジアリール−メチル）−マロノニトリルである。特定の実施形態では、そのような化合物は、式：
【化１】
2007538086.tif 000003
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルコキシル、ニトロ、シアノ、アルキルチオ、ＣＦ３、ＯＣＦ３またはＯＨであり、
Ｒ４は水素、アルキル、アルケニル、アリールアルキル、シクロアルキルメチル、またはヘテロシクリルアルキルである：
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも１つはＨ以外の基である］
で示される化合物、あるいはその医薬上許容される塩、水和物または溶媒和物である。
【０００８】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数のエストロゲン受容体リガンドと、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
【０００９】
さらに他の態様では、本発明は、慢性炎症性疾患の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、慢性炎症性疾患を治療または阻害する方法に関し、この方法は、本発明の化合物を有効な量、前記哺乳動物に投与することを含む。
【００１０】
そのような疾患には、関節リウマチ、脊椎関節症、変形性関節炎、乾癬性関節炎、若年性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、非定型的大腸炎（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、乾癬、喘息、および慢性閉塞性肺疾患が含まれる。
【００１１】
本発明は、脳卒中、虚血、または再潅流損傷の治療または阻害を必要とする哺乳動物における、脳卒中、虚血、または再潅流損傷を治療または阻害する方法にも関し、この方法は、本発明の化合物を有効な量、前記哺乳動物に投与することを含む。他の実施形態では、本発明は、コレステロール、トリグリセリド、Ｌｐ（ａ）、およびＬＤＬのレベルを低下させ、哺乳動物における、高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、急性冠状動脈症候群、末梢血管疾患、再狭窄、または血管れん縮を阻害または治療する方法を対象とする。
【００１２】
さらに他の態様では、本発明の化合物を、哺乳動物におけるアルツハイマー病、認知機能低下、老人性認知症、またはＩＩ型糖尿病を治療または阻害するのに用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の好ましい化合物は、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）で誘発される核因子κＢ（ＮＦ−κＢ）ルシフェラーゼレポーター活性またはインターロイキン−６（ＩＬ−６）発現を、ヒト内皮細胞でＥＲ依存性の様式で遮断するものである。本発明において有用な化合物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでエストロゲンに伴う、子宮および乳房組織への増殖促進作用を全く示さないか、ほとんど示さないことが好ましい。エストロゲンの副作用が存在しないことは、古典的なエストロゲン応答遺伝子であるクレアチンキナーゼ（ＣＫ）の発現がないことによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで確認することができる。。本明細書に記載の化合物は、慢性炎症性疾患の治療および予防に有用であり、古典的なエストロゲンに見られるような、子宮および乳房における細胞増殖の刺激を行わないことが予測されている。
【００１４】
本発明の化合物には、（ジアリール−メチル）−マロノニトリルが含まれる。いくつかの態様において、該化合物は、式：
【化２】
2007538086.tif 000004
［式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルコキシル、ニトロ、シアノ、アルキルチオ、ＣＦ３、ＯＣＦ３またはＯＨであり；
Ｒ４は、水素、アルキル、アルケニル、アリールアルキル、シクロアルキルメチル、またはヘテロシクリルアルキルである；
但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の少なくとも１つはＨ以外の基である］
で示される化合物、あるいはその医薬上許容される塩、水和物または溶媒和物で表される。
【００１５】
特定の化合物では、Ｒ４がＨであることが好ましい。他のものでは、Ｒ４がアルキル、アルケニル、アリールアルキル、シクロアルキルメチル、またはヘテロシクリルアルキルである。
【００１６】
ある実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つが、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルコキシル、ニトロ、シアノ、アルキルチオ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、またはＯＨである。
【００１７】
ある組成物では、Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシル、シアノ、ＣＦ３、またはＯＨであり、これらの組成物の中の特定のものは、Ｒ１およびＲ２が同一である。他の組成物では、Ｒ３が、水素、アルキル、アルケニル、アルキルアリール、またはヘテロシクリルメチルであることが好ましい。特定の実施形態では、Ｒ１およびＲ２が、各々独立して、水素、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシルである。さらに他の実施形態では、Ｒ３がアルキル、アリル、またはベンジルである。
【００１８】
特定の好ましい化合物では、Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨであり、Ｒ３が、ハロゲン、アルキル、アルコキシル、シアノ、ＣＦ３、またはＯＨである。他の化合物は、Ｒ１およびＲ２がそれぞれＨであり、Ｒ３が、ハロゲン、アルキル、またはアルコキシルである。これらの化合物の中の特定のものでは、Ｒ４がＨである。さらに他の化合物では、Ｒ３がメチルまたはメトキシである。
【００１９】
本発明の代表的な化合物には、
２−［（２−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（３−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（２−メチルフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（４−メチルフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（４−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル、
２−［（２−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］−２−メチルマロノニトリル、および
２−［ジ（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
が含まれる。
【００２０】
本発明はまた、本明細書に記載の化合物の立体異性体および医薬上許容される塩のすべてまたはいずれかを対象とする。本発明の化合物が塩基性の部分を含有している場合には、医薬上許容される塩を有機酸または無機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタリンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファスルホン酸、および同様な既知の許容される酸から形成させることができる。本発明の化合物が酸性の部分を含有している場合には、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム、リチウム、またはカリウム）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、１〜６の炭素原子を含有しているアルキルアンモニウム塩または、各アルキル基に１〜６の炭素原子を含有しているジアルキルアンモニウム塩、および各アルキル基に１〜６の炭素原子を含有しているトリアルキルアンモニウム塩などの有機塩基または無機塩基から塩を形成することもできる。
【００２１】
「アルキル」という用語は、別段の記述がない限り、（Ｃ１−Ｃ６）直鎖または（Ｃ３−Ｃ６）分岐鎖の一価飽和炭化水素部分を指す。飽和炭化水素アルキル部分の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル；ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、および同様のものなど、より高次の相同体などの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２２】
「アルケニル」という用語は、別段の記述がない限り、少なくとも１つの二重結合を含有する、（Ｃ２−Ｃ６）直鎖または（Ｃ３−Ｃ６）分岐鎖の一価炭化水素部分を指す。そのような炭化水素アルケニル部分は、一不飽和でも、多価不飽和でもよく、また、Ｅ配置で存在しても、Ｚ配置で存在してもよい。本発明の化合物は、すべての可能なＥ配置およびＺ配置を含むものとする。一不飽和または多価不飽和の炭化水素アルケニル部分の例には、ビニール、２−プロペニル、イソプロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、ブタジエニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、ならびに、より高次の相同体、異性体、および同様のものなどの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
「シクロアルキル」という用語は、別段の記述がない限り、炭素原子が環系の中または外に位置している、３〜１０炭素原子の、一環性、二環性、三環性、縮合環、架橋環、またはスピロ環の一価飽和炭化水素部分を指す。シクロアルキル部分におけるいかなる適当な環位置を、定義された化学構造に共有結合させてもよい。シクロアルキル部分の例には、シクロプロピル、シクロプロピルメチル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、シクロヘキシルエチル、シクロヘプチル、ノルボルニル、アダマンチル、スピロ［４，５］デカニル、ならびに相同体、異性体、および同様のものなどの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
「ハロゲン」という用語は、単独で使用される場合も、他の用語と組み合わせて使用される場合も、本明細書では、別段の記述がない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子と定義する。
【００２５】
「アリール」という用語は、単独で使用される場合も、他の用語と組み合わせて使用される場合も、本明細書では、別段の記述がない限り、最大２０原子までの炭素原子、例えば、６〜２０炭素原子の芳香族炭素環式部分と定義し、これは、単一の環（単環性）でも、あるいは、１分子に縮重しているか、または共有結合によって連結された複数の環（２環式、最多で３環まで）でもよい。アリール部分におけるいかなる適当な環位置を、定義された化学構造に共有結合させてもよい。アリール部分の例には、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ジヒドロナフチル、テトラヒドロナフチル、ビフェニール、アンスリル、フェナントリル、フルオレニル、インダニル、ビフェニレニル、アセナフテニル、アセナフチレニル、および同様のものなどの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「アリールアルキル」という用語は、−Ｒ−Ａｒ基を指し、式中、Ａｒはアリールであり、Ｒはアルキルである。アリールアルキル部分の例には、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、ジフェニルメチル、３−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、フルオレニルメチル、ならびに相同体、異性体、および同様のものなどの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
「複素環式」または「ヘテロシクリル」という用語には、「ヘテロアリール」が含まれ、ヘテロアリールは、別段の記述がない限り、芳香族複素環系を指し、芳香族複素環系は、単一の環（単環性）でも、あるいは、１分子に縮重しているか、または共有結合によって連結された複数の環（２環式、最多で３環まで）でもよい。一部の実施形態では、ヘテロアリール基が４〜２０の炭素原子を有する。これらの環は、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、または硫黄（Ｓ）から選択された１原子から４原子までのヘテロ原子を含有してもよく、所望により、それら窒素原子または硫黄原子が酸化されていても、あるいは窒素原子が四級化されていてもよい。ヘテロアリール部分におけるいかなる適当な環位置を、定義された化学構造に共有結合させてもよい。一部の実施形態では、ヘテロアリール基が、炭素を含有する５員または７員の単環式芳香環であり、独立に窒素、酸素、または硫黄でありうる１から２原子のヘテロ原子を有する。ヘテロアリール部分の例には、フラン、チオフェン、ピロール、Ｎ−メチルピロール、ピラゾール、Ｎ−メチルピラゾール、イミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、１Ｈ−テトラゾール、１−メチルテトラゾール、１，３，４−オキサジアゾール、１Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１−メチル−１，２，４−トリアゾール、１，３，４−トリアゾール、１−メチル−１，３，４トリアゾール、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、ベンゾキサゾール、ベンズイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、チアントレン、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラン、ジベンゾ［ｂ，ｄ］チオフェン、ベンゾイミダゾール、Ｎ−メチルベンゾイミダゾール、インドール、インダゾール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、プリン、プテリジン、９Ｈ−カルバゾール、β−カルボリン、および同様のものなどのヘテロ環が含まれるが、これらに限定されない。
【００２８】
複素環式化学基は、本明細書に既に定義されている通りであるが、これには、所望により飽和または部分飽和の複素環も含まれる。飽和または部分飽和複素環部分の例には、アゼチジニル、１−４−ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ピペラジニル、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ジヒドロベンズイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチエニル、ジヒドロベンゾキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、ジヒドロ−１、４−ジオキサニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、および同様のものなどの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
「ヘテロシクリルアルキル」という用語は、−Ｒ−ヘテロ環を指し、式中、Ｒはアルキルである。
【００３０】
「アルコキシル」という用語は、別段の記述がない限り、酸素原子に共有結合した（Ｃ１−Ｃ６）直鎖または（Ｃ３−Ｃ６）分岐鎖炭化水素を指す。アルコキシル部分の例には、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｓ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、デカノキシ、ならびに相同体、異性体および同様のものなどの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
「アルキルチオ」という用語は、別段の記述がない限り、硫黄原子に共有結合した（Ｃ１−Ｃ６）直鎖または（Ｃ３−Ｃ６）分岐鎖炭化水素を指す。アルキルチオ部分の例には、メチルチオ、エチルチオ、イソプロピルチオ、ｓ−ブチルチオや、ｔ−ブチルチオ、ならびに相同体、異性体、および同様のものなどの化学基が含まれるが、これらに限定されない。
【００３２】
上記の各用語（例えば、アルキル、アリール、ヘテロアリール）には、示した基または部分の非置換型、一置換型、および多置換型が含まれるものとする。各タイプの部分に用いる置換基を以下に示す。
【００３３】
アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アルキレン、アリールアルキルおよびヘテロシクリルアルキルのアルキル部分、ならびにアシル部分に用いる置換基には、−Ｒ’、ＯＲ’、＝Ｏ、ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、ハロゲン−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−  ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ”ＣＯ２Ｒ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、シアノ、およびニトロが含まれ、式中、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ独立に、水素、非置換（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、非置換（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アリールオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アリールチオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヘテロアリールオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、またはヘテロアリールチオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル基、であるか、あるいは所望により、共に環を形成していてもよい（Ｒ’およびＲ”が水素でない場合）。
【００３４】
アリールまたはヘテロシクリル部分は、所望により、置換基で１置換、２置換、または３置換されていてもよい。代表的な置換基には、−Ｒ’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−アルコキシアルキル、アルコキシアルコキシ、シアノ、ハロゲン、ニトロ、トリフロロメチル、トリフルオロメトキシ、−ＮＲ’Ｒ”、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、ヒドロキシアルキル、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−  Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−ＳＯ３Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＣＯ２Ｒ’、およびＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ”ＣＯ２Ｒ’、−ＮＲ’Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＲ’Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＨ、−ＮＨ−Ｃ（ＮＨ２）＝ＮＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、および−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’が含まれ、式中、Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立に、水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ７）シクロアルキル、アリール、アリール（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アリールオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、アリールチオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、ヘテロアリールオキシ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル、またはヘテロアリールチオ（Ｃ１−Ｃ３）アルキル基であるか、あるいは所望により、共に環を形成していてもよい（Ｒ’およびＲ”が水素でない場合）。
【００３５】
本発明の化合物は、不斉原子を含有してもよく、その一部の化合物は、１つまたは複数の不斉原子または不斉中心を含有してもよく、したがって、光学異性体およびジアステレオマーを生じうる。
【００３６】
本発明の化合物に導く１つの合成手法をスキーム１に示す。
【化３】
2007538086.tif 000005
【００３７】
本明細書で使用されている出発物質は、購入可能であるか、当業者に既知の方法で調製される。これらの方法は、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第１〜４巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、英国Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ所在、１９９９年）および  「Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」、第１〜５５巻（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ社、米国ニューヨーク州所在）などの標準的参考文献に見出すことができる。
【００３８】
スキーム１に示した通り、触媒存在下でマロノニトリルを、置換されていてもよい芳香族またはヘテロ芳香族アルデヒドと縮合することによって、中間体（１）を得る。触媒は、アミンおよびカルボン酸（例えば、ギ酸アンモニウムまたはアラニンなどのアミノ酸（Ｇ．Ｊｏｎｅｓ、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、１９６７年、１５、２０４；Ｙ．Ｓｕｍｉｄａ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１９８１年、１３、５２１）、ピリジン中にある、四塩化チタンなどのルイス酸（Ｗ．Ｌｅｈｎｅｒｔ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９７０年、５４、４７２３）または樹脂上に固定されたアミン（Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９９年、４０、７０３１）から得られた塩でよい。最近、イオン性液体も、塩基触媒のクネーフェナーゲル反応用の媒体としての使用が見出されている。縮合産物への、アリールグリニャール試薬またはリチウム／銅試薬（例えば、Ｇｉｌｍａｎタイプ）のＭｉｃｈａｅｌ付加（Ｎ．Ｌａｉｔｉｆ、Ｊ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ、１９７４年、８７５；Ｇｕｐｔｅ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、１９５９年、２４、１３３４）によって、置換されたマロノニトリル（２）を得る。ハロゲン化アルキルまたはスルホン酸塩で、（２）の陰イオンをアルキル化すること（Ａ．Ａ．Ｆａｄｄａ、Ｉｎｄ．Ｊ．Ｃｈｅｍ、１９９０年、２９Ｂ、１７１）によって所望のビスニトリル（３）を得る。
【００３９】
中間体２（式中、Ａｒ１＝ナフチル、Ａｒ＝フェニル）を合成する別法は、スキーム２に示す通り、ジアリールメチルハロゲン化物（またはその等価物）を合成し、それをマロノニトリルの逐次アルキル化に用いるものである。
【化４】
2007538086.tif 000006
【００４０】
スキーム２における中間体ジアリールメチル−Ｘは、スキーム３に示す通りに取得することができる。当業者に既知の方法（例えば、Ｐｈ３Ｐ／ＣＣｌ４、Ｐｈ３Ｐ／ＣＢｒ４、ヨウ化メチルトリフェノキシホスホニウム、ＴｓＣｌ／Ｐｙｒ、ＭｓＣｌ／ＴＥＡ、Ａｃ２Ｏ／Ｐｙｒ）を用いて、アルコール（３）を脱離基に変換する。
【化５】
2007538086.tif 000007
【００４１】
Ｒ４がアリルまたはベンジルである化合物を合成する別法は、スキーム４に示す通り、当業者に既知の方法（例えばクネベナゲル反応）を用いて、２−ベンズヒドリリデン−マロノニトリルを合成し、それに続いて、Ｍｉｚｕｎｏら（Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ、１９８８年、１１０、１２８８）の条件下でアリル（またはベンジル）スタナンを付加するものである。
【化６】
2007538086.tif 000008
【実施例１】
【００４２】
２−［（２−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
（１−ナフタレニルメチレン）−プロパンジニトリル（４０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および無水テトラヒドロフラン１０ｍＬをフラスコに充填した。この撹拌した溶液に、室温で、臭化−２−メトキシフェニルマグネシウム（２．４ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、テトラヒドロフラン中に１Ｍ）を添加した。反応物を１．５時間撹拌し、その後、その反応を１Ｎ塩酸で停止させ、反応物を酢酸エチル中に抽出した。有機物層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。シリカ（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製した後、５５１ｍｇの産物をオフホワイトの泡として単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ）、７．９３（ｍ，２Ｈ）、７．７４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ）、７．６０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ）、７．５３（ｍ，２Ｈ）、７．２７（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８５Ｈｚ）、７．２１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８１，１．７１Ｈｚ）、７．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ）、６．８９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７５Ｈｚ）、６．０２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．２５）、５．９７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４９）、３．８９（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ  ３１１［Ｍ−Ｈ］−；元素分析：Ｃ２１Ｈ１６Ｎ２Ｏの計算値：Ｃ：８０．７５  Ｈ：５．１６  Ｎ：８．９７。実測値：Ｃ：８０．３７  Ｈ：５．０５  Ｎ：８．７０。
【実施例２】
【００４３】
２−ナフタレン−１−イルメチレンマロノニトリル
１−ナフトアルデヒド（２０ｇ、１２８ｍｍｏｌ）、マロノニトリル（１０．１５ｇ、１５３．７ｍｍｏｌ）、ピペリジン（５．４５ｇ、６４ｍｍｏｌ）、エタノール１５０ｍＬのおよびトルエン１００ｍＬを、撹拌子を備えたフラスコ中で混合し、脱水しながら、４時間、環流を行った。その後、反応物を冷却し、酢酸エチル中に抽出した。有機物層を０．１Ｎ塩酸、飽和重炭酸ナトリウム、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。残滓を、酢酸エチル中から再結晶し、融点１６５〜１６７℃の結晶固体として、産物８．８０ｇを得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ９．３６（ｓ，１Ｈ）、８．２５（ｍ，２Ｈ）、８．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ）、８．０６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．６８（ｍ，３Ｈ）
ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ（Ｍ）＋（２０４）
元素分析：Ｃ１４Ｈ８Ｎ２・０．１ｍｏｌ  Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ：８１．６２  Ｈ：４．０１  Ｎ：１３．６０。実測値：Ｃ：８１．７６  Ｈ：３．７６  Ｎ：１３．７５。
【実施例３】
【００４４】
２−［（３−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
実施例２で得た（１−ナフタレニルメチレン）−プロパンジニトリル（４０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および無水テトラヒドロフラン１０ｍＬを、フラスコに充填した。この撹拌した溶液に、室温で、臭化−３−メトキシフェニルマグネシウム（２．４ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、テトラヒドロフラン中に１Ｍ）を添加した。反応物を１．５時間、撹拌し、その後、その反応を１Ｎ塩酸で停止させ、反応物を酢酸エチル中に抽出した。有機物層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。シリカ（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製した後、４０１ｍｇの産物をオフホワイトの泡として単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．２９Ｈｚ）、７．９４（ｍ，２Ｈ）、７．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ）、７．６２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．５４（ｍ，２Ｈ）、７．２５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）、７．０９（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．９５Ｈｚ）、７．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．０８Ｈｚ）、６．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３０Ｈｚ，０．７３Ｈｚ）、６．１１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４９Ｈｚ）、５．８７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４９Ｈｚ）、３．６９（ｓ，３Ｈ）；
ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ，３１２（Ｍ）＋；
元素分析：Ｃ２１Ｈ１６Ｎ２Ｏ・０．３ｍｏｌ  Ｈ２Ｏの計算値  Ｃ：７９．３７  Ｈ：５．２７  Ｎ：８．８２。実測値：Ｃ：７９．３２  Ｈ：５．１４  Ｎ：８．６２。
【実施例４】
【００４５】
２−［（２−メチルフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
実施例２の（１−ナフタレニルメチレン）−プロパンジニトリル（４０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および無水テトラヒドロフラン１０ｍＬを、フラスコに充填した。この撹拌した溶液に、室温で、臭化オルソトリルマグネシウム（１．２ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、テトラヒドロフラン中に２Ｍ）を添加した。反応物を１．５時間、撹拌し、その後、その反応を１Ｎ塩酸で停止させ、反応物を酢酸エチル中に抽出した。有機物層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。シリカ（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製した後、４５５ｍｇの産物をオフホワイトの泡として単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．５４Ｈｚ）、７．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ）、７．９１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ）、７．６０（ｍ，１Ｈ）、７．５４（ｍ，２Ｈ）、７．４６（ｍ，２Ｈ）、７．２４（ｍ，１Ｈ）、７．２０（ｍ，２Ｈ）、６．０４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７６Ｈｚ）、５．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７６Ｈｚ）、２．３０（ｓ，３Ｈ）；
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ  ２９５［Ｍ−Ｈ］−；
元素分析：Ｃ２１Ｈ１６Ｎ２の計算値：Ｃ：８５．１１  Ｈ：５．４４  Ｎ：９．４５。実測値：Ｃ：８４．８１  Ｈ：５．３０  Ｎ：９．４３。
【実施例５】
【００４６】
２−［（４−メチルフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
実施例２の（１−ナフタレニルメチレン）−プロパンジニトリル（４０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および無水テトラヒドロフラン１０ｍＬを、フラスコに充填した。この撹拌した溶液に、室温で、臭化−４−メチルフェニルマグネシウム（２．４ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、テトラヒドロフラン中に１Ｍ）を添加した。反応物を１．５時間、撹拌し、その後、その反応を１Ｎ塩酸で停止させ、反応物を酢酸エチル中に抽出した。有機物層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。シリカ（１５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製した後、１１６ｍｇの産物をオフホワイトの泡として単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．２５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．８１Ｈｚ）、７．９２（ｍ，２Ｈ）、７．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ）、７．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ）、７．５２（ｍ，２Ｈ）、７．３７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．５６Ｈｚ）、７．１３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．８１Ｈｚ）、６．０６（ｄ，Ｊ＝９．７６Ｈｚ，１Ｈ）、５．８５（ｄ，Ｊ＝１０．４９Ｈｚ，１Ｈ）、２．２１（ｓ，３Ｈ）；
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ  ２９５［Ｍ−Ｈ］−；
元素分析：Ｃ２１Ｈ１６Ｎ２・０．１５ｍｏｌ  Ｈ２Ｏの計算値Ｃ：８４．３４  Ｈ：５．４９  Ｎ：９．３７。実測値：Ｃ：８４．０３  Ｈ：５．５４  Ｎ：９．１７。
【実施例６】
【００４７】
２−［（４−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
実施例２の（１−ナフタレニルメチレン）−プロパンジニトリル（４０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および無水テトラヒドロフラン１０ｍＬを、フラスコに充填した。この撹拌した溶液に、室温で、臭化−４−メトキシフェニルマグネシウム（４．８ｍＬ、２．４ｍｍｏｌ、テトラヒドロフラン中に０．５Ｍ）を添加した。反応物を１．５時間、撹拌し、その後、その反応を１Ｎ塩酸で停止させ、反応物を酢酸エチル中に抽出した。有機物層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。シリカ（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製した後、４６５ｍｇの産物をオフホワイトの泡として単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．２５（ｍ，１Ｈ）、７．９３（ｍ，１Ｈ）、７．９０（ｓ，１Ｈ）、７．７９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ）、７．６１（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．８１Ｈｚ）、７．５２（ｍ，２Ｈ）、７．４０（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ）、６．８８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．７９Ｈｚ）、６．０５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４９Ｈｚ）、５．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．４９Ｈｚ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）；
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ  ３３０［Ｍ＋ＮＨ４］＋；
元素分析：Ｃ２１Ｈ１６Ｎ２Ｏ・０．４ｍｏｌ  Ｈ２Ｏの計算値：Ｃ：７８．９３  Ｈ：５．３０  Ｎ：８．７７。実測値：Ｃ：７９．０９  Ｈ：５．１１  Ｎ：８．４７。
【実施例７】
【００４８】
２−（２−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］−２−メチルマロノニトリル
実施例１の２−［（２−メトキシフェニル）（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル（１９６ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１０ｍＬに溶解し、−３５℃まで冷却した。カリウムヘキサメチルジシリルアミド（１．１４ｍＬ、０．７５ｍｍｏｌ、トルエン中０．６６Ｍ）を添加した。冷却浴から取り出し、反応物を室温まで温め、その後、ヨウ化メチル（０．０７８ｍＬ、１２５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０分間撹拌し、その反応を１Ｎ塩酸で停止させ、反応物を酢酸エチル中に抽出した。有機物層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。シリカ（２０％酢酸エチル／ヘキサン）で精製し、メタノール中から再結晶させた後、融点１７５〜１７７℃の結晶固体として、１０４ｍｇの産物を単離した。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．１０（ｍ，１Ｈ）、７．９５（ｍ，３Ｈ）、７．６４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．７５Ｈｚ）、７．５２（ｍ，２Ｈ）、７．３１（ｍ，２Ｈ）、７．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５７Ｈｚ）、６．９１（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５７Ｈｚ，０．９８Ｈｚ）、５．９３（ｓ，１Ｈ）、３．９１（ｓ，３Ｈ）、１．９０（ｓ，３Ｈ）１；
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ  ３２７［Ｍ＋Ｈ］＋；
元素分析：Ｃ２２Ｈ１８Ｎ２Ｏの計算値：Ｃ：８０．９６  Ｈ：５．５６  Ｎ：８．５８  実測値：Ｃ：８０．９１  Ｈ：５．５６  Ｎ：８．５５。
【実施例８】
【００４９】
２−［ジ（１−ナフチル）メチル］マロノニトリル
実施例２の（１−ナフタレニルメチレン）−プロパンジニトリル（４０８ｍｇ、２ｍｍｏｌ）および無水テトラヒドロフラン１０ｍＬを、フラスコに充填した。この撹拌した溶液に、室温で、臭化−１−ナフチルマグネシウム（１２．５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ、テトラヒドロフラン中に０．１Ｍ）を添加した。反応物を２時間撹拌し、その後、その反応を１Ｎ塩酸で停止させ、反応物を酢酸エチル中に抽出した。有機物層を飽和重炭酸ナトリウム水溶液、塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、蒸発乾固させた。残基をエタノール中から再結晶させ、融点１７９〜１８１℃の結晶固体として、２３１ｍｇの産物を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．４１（ｍ，２Ｈ）、７．９６（ｍ，２Ｈ）、７．９１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ）、７．６０（ｄｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，０．９８Ｈｚ）、７．５３（ｍ  ６Ｈ）、６．７６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．５２Ｈｚ）、６．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．２７Ｈｚ）；
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ  ３３１［Ｍ−Ｈ］−；
元素分析：Ｃ２４Ｈ１６Ｎ２の計算値：Ｃ：８６．７２  Ｈ：４．８５  Ｎ：８．４３。実測値：Ｃ：８６．５３  Ｈ：４．７０  Ｎ：８．５１。
【実施例９】
【００５０】
２−（２−フルオロ−ベンジリデン）−マロノニトリル
マロノニトリル（３．３０３ｇ、５０ｍｍｏｌ）、２−フルオロベンズアルデヒド（６．２０５ｇ、５０ｍｍｏｌ）、分子ふるい１ｇ、および樹脂結合ピペリジン５００ｍｇ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９９年、４０、７０３１−３３に記載）を容器に入れ、３００Ｗシングルモードのマイクロ波を、１５秒間、照射した。反応混合物をイソプロピル酢酸中に抽出し、濾過し、蒸発させ、ジクロロメタン中に抽出し、Ｍａｇｎａｓｏｌ（登録商標）パッドに通して濾過し、蒸発させ、エタノール中から再結晶させ、融点１１７〜１１８℃の結晶固体として、標題の物質２．４３５ｇを得た（Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ、１９６７年、４５、１００１−０６）。
１Ｈ  ＮＭＲ  ４００ＭＨｚ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．５８（ｓ，１Ｈ）、８．０４（ｔｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．５７Ｈｚ，１．７１Ｈｚ）、７．７４（ｍ，１Ｈ）、７．４５（ｍ，２Ｈ）；
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ  １７２（Ｍ）−；
元素分析：Ｃ１０Ｈ５ＦＮ２の計算値：Ｃ：６９．７７  Ｈ：２．９３  Ｎ：１６．２７。実測値：Ｃ：６９．６５  Ｈ：２．６７  Ｎ：１６．３３。
【実施例１０】
【００５１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法
細胞
Ｔ−１７５フラスコ中の１００％に集密したＨＡＥＣＴ−１細胞（不死化ヒト大動脈内皮細胞）を、ＨＢＳＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩溶液）８ｍｌで洗浄し、０．２５％ウシ血清アルブミンを含有しているフェノールレッド非含有内皮細胞基本培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社、米国カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ所在、カタログ番号ＣＣ−３１２９）（ＥＢＭ−ＢＳＡ）中で、Ａｄ５−ｗｔ−ｈＥＲαウイルス（ＣＭＶプロモーターからのヒトＥＲαの発現を媒介するアデノウイルス形質移入ベクター）の１：１０希釈液６ｍｌによって４時間感染させた。４時間後に、細胞をＥＢＭ−ＢＳＡで洗浄し、同じ培地中で終夜インキュベートした。終夜のインキュベーションの後、細胞をＥＢＭ−ＢＳＡで洗浄し、ＥＢＭ−ＢＳＡ中で、Ａｄ５−３ｘ（ＮＦｋＢ）Ｌｕｃウイルス（チミジンキナーゼプロモーターの５’側にある３リピートのＭＨＣ  ＮＦκＢ部位からの発現を行うアデノウイルスルシフェラーゼ発現ベクター）の１：１０希釈液６ｍｌによって２時間感染させた。２時間後に、細胞を洗浄し、３４℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、計数し、９５％ＦＢＳ／５％ジメチルスルホキシド中に、密度４×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、クライオバイアル中の１ｍｌまたは５ｍｌアリコートとして凍結させ、−１５０℃で保存した。対照細胞（ＥＲ感染なし）は、上述通り、但しＡｄ５−ｗｔ−ｈＥＲαウイルス感染を行わずに処理した。
【００５２】
ＩＬ−６およびクレアチンキナーゼアッセイ
ＥＲαに感染したＨＡＥＣＴ−１細胞または対照細胞を温かいＥＢＭ−ＢＳＡ中で解凍し、４２×希釈し、９６ウェルプレート中に０．１ｍｌ／ウェルで分注し、３４℃で４ｈインキュベートした。２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を含有しているＥＢＭ−ＢＳＡ中に溶解させた試験化合物を２×保存液として細胞に添加し、プレートをインキュベーター（３４℃）に戻した。１５〜２０ｈ後に、１００μｌアリコートの培地を細胞から分離し、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社のヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキットを用いて、そのＩＬ−６含量をアッセイした。次に、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水３００μｌで洗浄し、細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）５０μｌで溶解させた。ルシフェラーゼは、溶解物１０μｌを使用し、Ｐｒｏｍｅｇａ社ルシフェラーゼアッセイ試薬１００μｌと混合して、Ｗａｌｌａｃ社Ｖｉｃｔｏｒ２ルミノメータ（米国メリーランド州、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ所在）で測定した。クレアチンキナーゼは、細胞溶解液の残りにＣＫアッセイ試薬（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号４７−１０）１００μｌを添加した後のＡ３４０上昇率から測定した。
【００５３】
データ分析
ＩＣ５０およびＥＣ５０を計算するために、化合物濃度のｌｏｇ１０に対する、ＩＬ−６、ルシフェラーゼ、またはＣＫの平均値を、４パラメータロジスティック方程式に適合させた。曲線のＩＣ５０／ＥＣ５０値、「ヒル（Ｈｉｌｌ）勾配」、上限値、および下限値を繰り返して推算した。
【００５４】
マウス
卵巣摘除されたＣ５７ＢＬ／６マウス（１６〜２０ｇ）（Ｔａｃｏｎｉｃ社）を、８匹の群に分離した。５〜７日間の回復期間の後、固形飼料またはアテローム産生性の飼料（脂肪１５．７５％、コレステロール１．２５％、およびナトリウムコール酸０．５％）（Ｐｕｒｉｎａ  ｄｉｅｔ社＃２１５３９）をマウスに与えた。１日に１回、メチルセルロース／ｔｗｅｅｎ溶媒（１マウスあたり０．１ｍｌ）中のＥＥまたは試験化合物を、強制飼養によって５週間投与した。実験期間の終わりに、肝臓を収集し、子宮の湿重量を記録した。
【００５５】
ＲＮＡ分析
肝臓全ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ＢＲＬ社）を用いて、調製した。エストロゲンおよび化合物によるＮＦ−ｋＢ標的遺伝子の調節は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システムを、製造会社のプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）に従って使用して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検証した。これらのデータは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｖ１．７ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて分析し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプライマーセットを用いてＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【００５６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果
表１は、Ａｄ５−ｗｔ−ＥＲ感染にしたＨＡＥＣＴ−１細胞のＮＦ−κＢ、ＩＬ−６、およびクレアチンキナーゼアッセイにおける、Ｅ２およびいくつかの「抗炎症性エストロゲン」活性の概要を示す。表２は、感染していないＨＡＥＣＴ−１細胞のＮＦ−κＢおよびクレアチンキナーゼアッセイにおける、同じ化合物の活性を示す。
【表１】
2007538086.tif 000009
【表２】
2007538086.tif 000010
【００５７】
Ｅ２は、約１ｎＭのＩＣ５０値で、Ａｄ５−ｗｔ−ＥＲに感染したＨＡＥＣＴ−１細胞のＮＦ−κＢ発現およびＩＬ−６発現を阻害し、同様の効力（５．８ｎＭ）で、同じ細胞のクレアチンキナーゼの発現を誘導する（表１）。対照的に、本発明の化合物は、Ａｄ５−ｗｔ−ＥＲに感染したＨＡＥＣＴ−１細胞のＮＦ−κＢ発現およびＩＬ−６発現を阻害し、これらの細胞は、ＣＫ発現の低下または不在を示す（表１）。上述の化合物は、Ａｄ５−ｗｔ−ＥＲウイルスに感染していないＨＡＥＣＴ−１細胞でＩＬ−６がな活性であることに示されているように、ＮＦ−κＢ発現をＥＲ依存的に阻害する（表２）。本発明の化合物が、ＣＫ活性を誘導することなく、ＮＦ−κＢおよびＩＬ−６を阻害できる（表１）ことは、古典的なエストロゲン様活性の非存在下における抗炎症作用と一貫している。
【実施例１１】
【００５８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ活性
エストロゲンが、肝臓における食餌誘発性炎症の発症を調節できるかどうか判定するために、アテローム産生性の飼料によって生じる遺伝子発現変化をモニターした。卵巣摘除されたＣ５７ＢＬ／６マウスに、固形飼料またはアテローム産生性の飼料のいずれかを与え、１日に１回、ＥＥ（０．０１ｍｇ／ｋｇ）または試験化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した（表３）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析によって、アテローム産生性の飼料がＭＨＣ不変鎖（ＭＨＩ）、ＶＣＡＭ−１、ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＮＦ−αのｍＲＮＡを誘導し、ＥＥを用いた処置がこれらの遺伝子の誘導を強く阻害することが確認された。
【００５９】
子宮湿重量増加の誘導は、ＥＥに伴う望ましくない活性であるが、試験化合物での処置は、これを有意に誘導しなかった（表３）。
【表３】
2007538086.tif 000011
【００６０】
ＭＣＦ−７乳癌細胞におけるＥＲＥレポーター試験手順を用いた試験化合物の評価
試験化合物の保存液（通常０．１Ｍ）をＤＭＳＯ中で調製し、その次に、ＤＭＳＯで１０倍から１００倍に希釈して、１ｍＭまたは１０ｍＭの使用液を調製する。ＤＭＳＯ保存液は、４℃（０．１Ｍ）または−２０℃、＜０．１Ｍ）のいずれかで保存する。ＭＣＦ−７細胞を増殖培地［１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリンストレプトマイシン、および２ｍＭ  ｇｌｕｔａＭａｘ−１を含有しているＤ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地］で週に２回継代させる。これらの細胞は、５％  ＣＯ２／９５％加湿空気インキュベーター内の通気フラスコ中、３７℃で維持する。処置を行う１日前に、増殖培地と共に、細胞を２５０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、終夜、３７℃でインキュベートする。
【００６１】
実験培地［１０％（ｖ／ｖ）チャーコール処理済み熱不活性化胎児ウシ血清、１％（ｖ／ｖ）ペニシリンストレプトマイシン、２ｍＭ  ｇｌｕｔａＭａｘ−１、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムを含有している［フェノールレッド非含有Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２培地］中、３７℃で２ｈｒ、５０μｌ／ウェルのアデノウイルス５−ＥＲＥ−ｔｋ−ルシフェラーゼの１：１０希釈液によって細胞を感染させる。その後、実験培地１５０μｌでウェルを１回洗浄する。最後に、１５０μｌ／ウェルの溶媒（０．１％  ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ）、または実験培地中に１０００倍＞希釈された化合物で、８ウェル／処置に複製して、細胞を３７℃で２４ｈｒ処置する。
【００６２】
試験化合物の初期スクリーニングは、１μＭの単回投与で行い、これを、単独で（エストロゲン受容体アゴニストモード）、あるいは、０．１ｎＭ  １７β−エストラジオールと併用して（ＥＣ８０；エストロゲン受容体アンタゴニストモード）試験する。各９６ウェルプレートは、溶媒対照群（０．１％  ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ）およびエストロゲン受容体アゴニスト対照群（０．１または１ｎＭ  １７β−エストラジオール）も含んでいる。活性化合物の用量反応性実験を、１０−１４から１０−５Ｍまでのｌｏｇ増加で、エストロゲン受容体アゴニストモードおよび／またはエストロゲン受容体アンタゴニストモードで行う。これらの用量反応曲線から、ＥＣ５０値およびＩＣ５０値をそれぞれ得る。それぞれの処置群の最終ウェルは、エストロゲン受容体アンタゴニスト対照として３×１０−５ＭのＩＣＩ−１８２７８０  ５μｌ（最終濃度１０−６Ｍ）を含有する。
【００６３】
処置の後、２５μｌ／ウェルの１×細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）で、細胞を１５分間、シェーカー上で溶解させる。細胞溶解液（２０μｌ）を９６ウェルルミノメータプレートに移し、１００μｌ／ウェルのルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ＭｉｃｒｏＬｕｍａｔ  ＬＢ９６Ｐルミノメータ（ＥＧ＆Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社）でルシフェラーゼ活性を測定する。基質を注入する前に、各ウェルについて１秒間のバックグランド測定を行う。基質注入に続いて、１秒間の遅延の後に１０秒間ルシフェラーゼ活性を測定する。データをルミノメータからマッキントッシュパーソナルコンピュータに移して、ＪＭＰソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社）を用いて分析する。このプログラムは、各ウェルのルシフェラーゼ測定からバックグランド値を引き、その後、各処置の平均および標準偏差を計算する。
【００６４】
ルシフェラーゼデータを対数に変換し、ヒューバーのＭ推定を用いて、変換された観察地の中心から外れたものの重みを低下させる。変換され、重み付けされた一元ＡＮＯＶＡ（Ｄｕｎｎｅｔｔ検定）用のデータを分析するのには、ＪＭＰソフトウェアを用いる。化合物処置は、エストロゲン受容体アゴニストモードにおける溶媒対照結果、または、エストロゲン受容体アンタゴニストモードにおける陽性エストロゲン受容体アゴニスト対照結果（０．１ｎＭ  １７β−エストラジオール）と比較する。単回投与の初期実験では、化合物処置の結果が適切な対照と有意に異なる（ｐ＜０．０５）ならば、その結果を１７β−エストラジオール対照に比較したパーセント［すなわち、（（化合物−溶媒対照）／（１７β−エストラジオール対照−溶媒コントロール））×１００］として報告する。ＪＭＰソフトウェアは、非線形用量反応曲線からＥＣ５０および／またはＩＣ５０値を測定するのにも使用する。
【００６５】
子宮肥大活性の測定
試験化合物の子宮肥大活性は、以下の標準的な薬理試験手順に従って測定することができる。
【００６６】
手順１：性的に未熟な（１８日齢）ＳＤラットをＴａｃｏｎｉｃ社から入手し、カゼインベースの飼料（Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ社、５Ｋ９６Ｃ）および水の無制限な摂取を可能とする。１９、２０、および２１日目に、１７α−エチニル−１７β−エストラジオール（０．０６μｇ／ラット／日）、試験化合物または溶媒（５０％ＤＭＳＯ／５０％ダルベッコＰＢＳ）を、ラットに皮下投与する。エストロゲン受容体アンタゴニストの評価を行うために、化合物を１７α−エチニル−１７β−エストラジオール（０．０６μｇの／ラット／日）と共に同時投与する。１群につき６匹のラットを用い、それらは、最終の注射の約２４時間後に、ＣＯ２窒息および気胸によって安楽死させる。子宮を摘出し、付随する脂肪を取り除き、内部のあらゆる体液を絞り出した後に重量測定する。組織試料は、遺伝子発現解析（例えば補体因子３のｍＲＮＡ）用に瞬間凍結させることもできる。
【００６７】
手順２：性的に未熟な（１８日齢）１２９ＳｖＥマウスをＴａｃｏｎｉｃ社から入手し、カゼインベースの飼料（Ｐｕｒｉｎａ  Ｍｉｌｌｓ社、５Ｋ９６Ｃ）および水の無制限な摂取を可能とする。２２、２３、２４、および２５日目に、化合物または溶媒（コーン油）をマウスに皮下投与する。１群につき６匹のマウスを用い、それらは、最終の注射の約６時間後に、ＣＯ２窒息および気胸によって安楽死させる。子宮を摘出し、付随する脂肪を取り除き、内部のあらゆる体液を絞り出した後に重量測定する。
【００６８】
骨粗鬆症および脂質修飾（心臓保護）の評価
雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（卵巣摘除またはニセの対照手術を行ったもの）を、手術の１日後にＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社から入手する（体重２４０〜２７５ｇの範囲）。それらを、１２／１２（明／暗）スケジュールを有する部屋の中のケージに３または４ラット／ケージで収容し、飼料（Ｐｕｒｉｎａ社、５Ｋ９６Ｃラット固形飼料）および水が自由に得られるようにする。全ての試験の処置を、到着の１日後に開始し、指示された投薬を１週間あたり７日間、６週間行う。いかなる処置も受けていない、ニセの対照手術を受けた同年齢のラット群を、各試験に対する、エストロゲンが十分な無傷対照群として用いる。
【００６９】
すべての試験化合物は、５０％ＤＭＳＯ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ社、米国ニュージャージー、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ所在）／１×ダルベッコリン酸食塩水（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社、米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ所在）の溶媒中に、処置容積が０．１ｍＬ／１００ｇ体重となるように、指定された濃度で調製する。１７β−エストラジオールは、コーン油（２０μｇ／ｍＬ）中に溶解させ、０．１ｍＬ／ラットで皮下に送達する。すべての用量は、群の平均体重測定値に応じて３週間間隔で調整し、皮下投与する。
【００７０】
処置開始の５週間後、および試験終了の１週間前に、各ラットの骨密度（ＢＭＤ）の評価を行う。麻酔下のラットにおける近位頸骨の総密度および小柱密度を、ＸＣＴ−９６０Ｍ（ｐＱＣＴ；Ｓｔｒａｔｅｃ  Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ社、独国、Ｐｆｏｒｚｈｅｉｍ所在）を用いて評価する。測定を以下の通りに行う。すなわち、走査を行う１５分間前に、４５ｍｇ／ｋｇケタミン、８．５ｍｇ／ｋｇキシラジン、および１．５ｍｇ／ｋｇアセプロマジンを腹腔内注射することによって、各ラットに麻酔をかける。
【００７１】
直径２５ｍｍのポリカーボネートチューブの中に右後肢を通し、足関節を角度９０°、ひざ関節を１８０°にして、アクリルの枠にテープで固定する。ポリカーボネートチューブは、それをｐＱＣＴの開口部に垂直に維持するスライディンプラットフォームに固定する。大腿骨の遠位末端と脛骨の近位末端とが走査範囲に入るようにプラットフォームを調整する。二次元スカウト像を長さ１０ｍｍ、線分解能０．２ｍｍで取得する。スカウト像がモニターに表示された後に、脛骨の近位末端の位置を定める。この点から３．４ｍｍ遠位の位置からｐＱＣＴスキャンを開始する。ｐＱＣＴスキャンは、厚さ１ｍｍであり、ボクセル（三次元ピクセル）サイズ０．１４０ｍｍを有し、切片全体にわたる１４５の写像からなる。
【００７２】
ｐＱＣＴスキャンが終了した後に、映像がモニターに表示される。脛骨を含み、腓骨を除いた対象領域の輪郭が描かれる。軟組織は、反復アルゴリズムを用いて数学的に除去される。残った骨の密度（総密度）がｍｇ／ｃｍ３で報告される。骨の外側５５％が、同心らせん状に数学的にはぎ取られる。残った骨の密度（小柱の密度）がｍｇ／ｃｍ３で報告される。
【００７３】
ＢＭＤ評価の１週間後に、ラットをＣＯ２窒息および気胸によって安楽死させ、コレステロール定量用に血液を収集する。子宮も摘出し、付随する脂肪を取り除き、内部のあらゆる体液を絞り出した後に重量測定する。総コレステロールは、コレステロール／ＨＰキットを使用したＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｈｉｔａｃｈｉ  ９１１臨床分析器を用いて測定する。統計の比較は、Ｄｕｎｎｅｔ検定を用いた一元配置分散分析を使用して行った。
【００７４】
抗酸化活性の評価
ブタ大動脈を屠殺場から入手し、洗浄し、冷却したＰＢＳに入れて輸送し、大動脈内皮細胞を採取する。細胞を採取するために、大動脈肋間血管を結紮し、大動脈の一方の端をクランプする。血管中に、無菌濾過された新鮮な０．２％コラゲナーゼ（シグマ型Ｉ）を入れ、次に、血管のもう一方の端をクランプして、閉鎖系を形成させる。大動脈を３７℃で１５〜２０分間インキュベートし、その後、コラゲナーゼ溶液を回収し、２０００×ｇで５分間、遠心処理する。チャーコール処理されたＦＢＳ（５％）、ＮｕＳｅｒｕｍ（５％）、Ｌ−グルタミン（４ｍＭ）、ペニシリンストレプトマイシン（１０００Ｕ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）、およびゲンタマイシン（７５μｇ／ｍｌ）で補足されたフェノールレッド非含有ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地からなる内皮細胞培養培地７ｍＬに各ペレットを懸濁し、１００ｍｍペトリ皿に播種し、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートする。２０分間後に、細胞をＰＢＳですすぎ、新たな培地を添加する。これを２４時間に再び繰り返した。約１週間後に細胞が集密状態になる。内皮細胞には、常に、１週間に２回培地を与え、集密状態になったら、トリプシン処理して１：７の割合で播種する。細胞によって媒介される、１２．５μｇ／ｍｌ  ＬＤＬの酸化を、評価されるべき化合物（５μＭ）の存在下に、３７℃で４時間進行させる。結果は、遊離アルデヒド分析用のＴＢＡＲＳ（チオバルビツール酸反応性物質）法によって測定された酸化過程のパーセント阻害で表す［Ｙａｇｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９７６年、１５、２１２−６］。
【００７５】
黄体ホルモン受容体ｍＲＮＡ調節の標準薬理試験手順
この試験手順は、本発明で得られた化合物のエストロゲン様活性、または、抗エストロゲン性活性を評価するのに使用できる［Ｓｈｕｇｈｒｕｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１９９７年、１３８、５４７６−５４８４］。
【００７６】
ラットホットフラッシュ試験手順
試験化合物の、ホットフラッシュへの影響は、標準的な薬理試験手順で評価することができる。それは、モルフィン中毒のラットへの、ナロキソン使用薬物の投与を急激に停止した際に起こる尾部皮膚温度の上昇を緩やかにする、試験化合物の能力を測定するものである［Ｍｅｒｃｈｅｎｔｈａｌｅｒら、Ｍａｔｕｒｉｔａｓ、１９９８年、３０、３０７−１６］。この手順は、基準エストロゲンと共に試験化合物を同時投薬することによって、エストロゲン受容体アンタゴニスト活性を検出するのにも使用できる。
【００７７】
分離されたラット大動脈環の血管運動機能の評価
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２４０〜２６０グラム）を４つの群に分ける。すなわち、
１．正常な非卵巣摘除（無傷）ラット、
２．溶媒で処置された卵巣摘除（ｏｖｅｘ）ラット、
３．１７β−エストラジオール（１ｍｇ／ｋｇ／日）で処置された卵巣摘除ラット、
４．試験化合物（様々な用量）で処置された卵巣摘除ラット
である。
【００７８】
ラットの卵巣摘除は、処置の約３週間前に行う。各ラットには、１％ｔｗｅｅｎ−８０を含む蒸留脱イオン水中に懸濁した１７β−エストラジオール硫酸（１ｍｇ／ｋｇ／日）または試験化合物のいずれかを、胃への強制飼養によって与える。溶媒で処置されるラットには、薬物処置群で用いられる適切な溶媒容積を与える。
【００７９】
ラットは、ＣＯ２吸入および全採血によって安楽死させる。胸部大動脈を迅速に摘出し、以下の組成（ｍＭ）すなわち、ＮａＣｌ（５４．７）、ＫＣｌ（５．０）、ＮａＨＣＯ３（２５．０）、ＭｇＣｌ２  ２Ｈ２Ｏ（２．５）、Ｄ−グルコース（１１．８）、およびＣａＣｌ２（０．２）を有し、最終ｐＨ７．４となるように９５％／５％のＣＯ２−Ｏ２ガスが送られている３７℃の生理溶液中に入れる。外部表面から外膜を除去し、血管を幅２〜３ｍｍの輪に切断する。輪を１０ｍＬの組織浴（ｔｉｓｓｕｅ  ｂａｔｈ）中に懸濁し、輪の一方端の末端が浴槽の底部に付着し、もう一方の端が力変換器に付着するようにする。１グラムの静止張力を輪に加える。輪を１時間平衡化し、シグナルを取得して、分析する。
【００８０】
平衡化した後、輪をフェニレフリンに曝露し、さらにその濃度を増大させ（１０−８から１０−４Ｍに）、張力を記録する。その後、組織浴を新たな緩衝剤で３回すすぐ。洗い流した後に、２００ｍＭ  Ｌ−ＮＡＭＥを組織浴に添加し、３０分間平衡化する。その後、フェニレフリン濃度応答曲線を繰り返す。
【００８１】
心保護活性の評価
アポリポタンパク質Ｅ欠損性のＣ５７／Ｂ１Ｊ（ａｐｏ  Ｅ  ＫＯ）マウスをＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社から入手する。すべての動物操作は、ＩＡＣＵＣガイドラインを厳密に遵守して行う。４〜７週齢の卵巣摘除雌性アポΕノックアウトマウスを、靴箱型ケージに収容し、飼料および水が自由に摂取できるようにした。マウスを、体重によってランダムに複数の動物群（１群あたりｎ＝１２〜１５匹）に分ける。正確投与プロトコル（Ｐｒｅｃｉｓｅ−ｄｏｓｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いて、飼料中に入れた試験化合物またはエストロゲン（１７β−エストラジオール硫酸を１ｍｇ／ｋｇ／日）をマウスに投与する。正確投与プロトコルでは、消費された飼料の量を毎週測定し、それに従って、動物の体重に基づいて、用量を調節する。使用する飼料は、Ｐｕｒｉｎａ社によって調製されたウエスタンスタイル（Ｗｅｓｔｅｒｎ−ｓｔｙｌｅ）飼料（５７Ｕ５）であり、０．５０％コレステロール、２０％ラード、および２５ＩＵ／ＫＧビタミンＥを含有している。このパラダイムを用いてマウスに１２週間投薬／給餌する。対照マウスには、ウエスタンスタイル飼料を給餌し、化合物を与えない。試験期間の終わりに、マウスを安楽死させ、血漿試料を採取する。心臓は、最初に食塩水で、次に中性に緩衝化された１０％ホルマリン溶液でｉｎ  ｓｉｔｕ潅流する。
【００８２】
血漿中脂質およびリポタンパク質を測定するには、総コレステロールおよびトリグリセリドを、それぞれＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社およびＷａｋｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社の市販キットを用いた酵素法を使用して測定し、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｈｉｔａｃｈｉ９１１分析器を用いて分析する。血清リポタンパク質の分離および定量化は、ＦＰＬＣサイズ分別を用いて行った。簡潔には、５０〜１００ｍＬの血清を濾過し直列に連結されたＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムおよびＳｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに注入し、一定流速の１ｍＭナトリウムＥＤＴＡおよび０．１５Ｍ  ＮａＣｌで溶出する。ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、およびＨＤＬを表す各カーブの面積を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｌｌｅｍｕｕｍ（商標）ソフトウェアを用いて積分し、総コレステロール値に、各クロマトグラムピークそれぞれの相対面積パーセントを掛けることによって、各リポタンパク質画分を定量化する。
【００８３】
アテローム性大動脈硬化症の定量化にするために、操作の４８〜７２時間前に、大動脈を慎重に単離し、ホルマリン固定液に入れる。アテローム硬化性病変は、オイルレッドＯ染色を用いて同定する。血管の脱染色を短時間行い、その後、Ｓｏｎｙ社製３ＣＣＤビデオカメラシステムに取り付けたＮｉｋｏｎ社製ＳＭＵ８００顕微鏡を使用し、画像取込みソフトウェアとしてＩＭＡＱ  コンフィギュレーションユーティリティ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社）を併用して映像化する。病変の定量化は、カスタム閾値ユーティリティソフトウェアパッケージ（Ｃｏｌｅｍａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、大動脈弓に沿って左右に向けて行う。このプログラムの閾値関数を用いて、血管、特に腕頭動脈の近位境界から左鎖骨下動脈の遠位境界までの、大動脈弓に囲まれた領域の自動病変評価を行う。アテローム性大動脈硬化症データは、厳密に、この特定の管腔領域内での病変関与のパーセントとして表す。
【００８４】
認識改善の評価
毎日１０分間、５日間連続して、卵巣摘除されたラット（ｎ＝５０）を、８方向放射状迷路に馴化させる。馴化および試行の前は、ラットを渇水状態に置く。各腕部の端に配置された１００μｌアリコートの水が、強化として働く。放射状迷路における、勝者移行課題（ｗｉｎ−ｓｈｉｆｔ  ｔａｓｋ）の獲得は、餌を置いた１つの腕部に、そのラットが進入できるようにすることによって実現させる。飲水後、ラットは、その腕部から退出し、中央区画に再入する。そのとき、中央区画からは、ラットが以前に訪れた腕部または新規な腕部に進入できるようになっている。ラットが新規な腕部への進入を選択したとき、正しい反応として、それが記録される。１日あたり５回の試行を、３日間、各ラットに与える。最終獲得試行の後に、以下の４群の１つにラットを配属させる。すなわち、
１．陰性対照：１０％  ＤＭＳＯ／ゴマ油溶媒を１日１回、６日間注射される群（１ｍＬ／ｋｇ、ＳＣ）、
２．陽性対照：１７β−エストラジオールベンゾエートを２日間注射され、２回目の注射の４日後に試験される群（１ラットあたり１０μｇ（０．１ｍＬ）の１７β−エストラジオールベンゾエート）、
３．エストラジオール：１７β−エストラジオールを毎日、６日間注射される群（２０μｇ／ｋｇ、ＳＣ）、
４．試験化合物：毎日、６日間注射される群（用量は様々）
である。
すべての注射は、最終日の獲得を試験した後に、開始されるであろう。第１、３、および４群の最終注射は、作業記憶の試験をする２時間前に行われるであろう。
【００８５】
作業記憶の試験は、１５、３０、または６０秒の遅延を用いた遅延非見本合わせ（ｄｅｌａｙｅｄ  ｎｏｎ−ｍａｔｃｈｉｎｇ−ｔｏ−ｓａｍｐｌｅ）（ＤＮＭＳ）課題である。この課題は、前述の通り、ラットが中央アリーナに置かれ、１つの腕部への進入が許される獲得課題の変形である。ラットが第１の腕部の半ばまで移動すれば、第２の腕部が開放され、この場合も、ラットはこの腕部を選択する必要がある。この第２の腕部の半ばまでラットが移動したとき、両方のドアは閉じられ、遅延が設けられる。遅延時間が終われば、元の２つのドア両方と、第３の新規なドアとが、同時に開かれる。ラットが第３の新規な腕部の半ばまで移動したときに、正しい反応として、それが記録される。ラットが第１の腕部または第２の腕部のなかばまで移動したとき、誤った反応として、それが記録される。１対象あたり、１日間隔に各５回の試行を３日間、合計１５回の試行を各ラットに与えるであろう。
【００８６】
胸膜炎への影響の評価
ラットで実験的に誘発された胸膜炎の症候を軽減する能力の評価は、Ｃｕｚｚｏｃｒｅａの手順［Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４１：１４５５−６３（２０００年）］に従って実施できる。
【００８７】
グルタミン酸で誘導された細胞毒性に対する防御（神経保護）の評価
本発明の化合物の神経保護活性は、グルタミン酸への曝露を用いた標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理試験手順［Ｚａｕｌｙａｎｏｖら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、１９、７０５−１８；Ｐｒｏｋａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、４４、１１０−４］で評価することができる。
【００８８】
乳腺終蕾試験手順における評価
乳腺管の完全な管伸長および分岐と、それに続く、プロゲステロン影響下での小葉−腺胞終蕾の発生とにはエストロゲンが必要である。この試験手順では、本発明の選択された化合物の向乳腺活性を、以下の標準薬理試験手順に従って評価することができる。２８日齢のＳＤラット（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ社、米国ニューヨーク州、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ所在）を卵巣摘除し、９日間静養させる。ラットは、１２時間の明／暗サイクルの下に収容し、カゼインベースのＰｕｒｉｎａ実験用齧歯類飼料５Ｋ９６（Ｐｕｒｉｎａ社、米国インディアナ州、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ所在）で給餌し、水を自由に摂取させる。その後、ラットに、溶媒（５０％ＤＭＳＯ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ社、米国ニュージャージー州、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ所在）／５０％１×ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社、米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ所在））、１７β−エストラジオール（０．１ｍｇ／ｋｇ）、または試験化合物（２０ｍｇ／ｋｇ）を６日間皮下投与した。最終３日間には、プロゲステロン（３０ｍｇ／ｋｇ）も、ラットに皮下投与する。７日目に、ラットを安楽死させ、乳房の脂肪パッドを摘出する。この脂肪パッドのカゼインキナーゼＩＩ  ｍＲＮＡを、終蕾増殖のマーカーとして分析する。カゼインキナーゼＩＩ  ｍＲＮＡは、リアルタイムのＲＴ  ＰＣＲによって分析する。簡潔には、製造会社の指示に従って、ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社、米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ所在）で単離する。ＤＮＡ−ｆｒｅｅキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて、試料をＤＮＡアーゼＩで処理し、Ｔａｑｍａｎ  Ｇｏｌｄ手順（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用して、カゼインキナーゼＩＩ  ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ  ＰＣＲによって測定する。カゼインキナーゼＩＩに特異的なプライマー対（５’プライマー、ＣＡＣＡＣＧＧＡＴＧＧＣＧＣＡＴＡＣＴ、配列番号１；３’プライマー、ＣＴＣＧＧＧＡＴＧＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧ、配列番号２）と、カスタマイズされたプローブ（ＴＡＭＲＡ−ＣＧＧＣＡＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＣＴ−ＦＡＭ、配列番号３とを用いて、合計５０ｎｇのＲＮＡをトリプリケートで分析する。カゼインキナーゼＩＩ  ｍＲＮＡレベルは、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社販売のプライマーおよびプローブを用いて、各試料反応物中に含有されている１８ＳリボソームＲＮＡに対して正規化する。
【００８９】
炎症性腸疾患用のＨＬＡラット標準薬理試験手順における評価
ＨＬＡラット標準薬理試験手順で、代表的化合物を評価することができる。この試験手順は、ヒトの炎症性腸疾患を模擬するものである。使用された手順と、得られた結果とを以下に簡潔に記述する。雄性ＨＬＡ−Ｂ２７ラットをＴａｃｏｎｉｃ社から入手し、飼料（ＰＭＩ社、ＬａｂＤｉｅｔ  ５００１）および水を無制限に摂取できるようにする。１日１回、少なくとも１週間、溶媒（５０％ＤＭＳＯ／５０％１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）または試験化合物（０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を、ラットに皮下投与する。大便質を毎日観察して、以下のスケールに等級付けする。すなわち、下痢＝３；軟便＝２；正常便＝１である。試験の終わりに、血清を収集し、−７０℃で保存する。大腸切片を組織学分析用に調製し、別の一区域を、ミエロペルオキシダーゼ活性に関して分析する。
【００９０】
組織学分析には、大腸組織を１０％中性緩衝ホルマリンに浸漬する。大腸の各試験体を、評価用に４つの試料に分離する。ホルマリン固定組織を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ真空浸潤プロセッサー（Ｍｉｌｅｓ社、米国コネチカット州、Ｗｅｓｔ  Ｈａｖｅｎ所在）でパラフィン包埋用に処理する。試料を５μｍ切片にし、その後、改変Ｂｏｕｇｈｔｏｎ−Ｓｍｉｔｈスケールを用いて、盲検法による組織学評価用にヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ社）で染色する。スコア付けが完了した後、試料を非盲検化し、データを表にし、複数の平均を比較するＡＮＯＶＡ線形モデリングで分析する。大腸組織の切片をいくつかの疾患指標に関して評価し、相対スコアを与える。
【００９１】
３つの関節炎モデルにおける評価
アジュバント誘発関節炎のＬｅｗｉｓラットアッセイ。６０匹の１２週齢雌性Ｌｅｗｉｓラットを標準設備操作手順に従って飼育する。標準的給餌法に従って、飼料および水の自由な摂取をラットに与える。各ラットは、実験計画群および動物番号を示すケージカードによって同定する。各ラット番号を消えないインクのペンで尾部に印す。試験を行う少なくとも１０〜２１日前に、ラットに麻酔をかけ、標準的な無菌手術技法によって卵巣を摘除する。
【００９２】
関節炎を誘導するために、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ所在）を使用する。完全フロイントアジュバントは、１ｍＬあたり、加熱殺菌し、乾燥させた結核菌１ｍｇ、ミネラルオイル０．８５ｍＬ、およびマンナイドモノオレエート（ロット番号０８４Ｈ８８００）０．１５ｍＬを含有する。
【００９３】
以下は、２つの試験手順の例である。阻害試験手順：０．１ｍＬの完全フロイントアジュバントを、３０匹のラットの尾基部に皮内注射する。ラットをランダムに４群に分ける。各群は６匹のマウスを含む。毎日、ラット群に溶媒（５０％ＤＭＳＯ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ社、米国ニュージャージー州、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ所在）／１×ダルベッコリン酸食塩水（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社、米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ所在））または試験化合物（０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）を与える。１日目にすべてのラットの処置を開始する。
【００９４】
処置試験手順：０．１ｍＬの完全フロイントアジュバントを、３０匹のラットの尾基部に皮内注射する。ラットをランダムに４群に分ける。各群は６匹のマウスを含む。毎日、ラット群に溶媒（５０％ＤＭＳＯ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ社、米国ニュージャージー州、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ所在）／１×ダルベッコリン酸食塩水（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社、米国ニューヨーク州、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ所在））または試験化合物（０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、皮下投与）を与える。アジュバント注射後の８日目に、すべてのラットの処置を開始する。
【００９５】
統計的分析は、Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社のＳｕｐｅｒ  ＡＮＯＶＡ（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社、米国カリフォルニア州Ｂｅｒｋｅｌｅｙ）を用いて行う。対象のパラメータすべてを、群相互に、Ｄｕｎｃａｎの新しい多範囲ｐｏｓｔ  ｈｏｃ検定（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ  ｎｅｗ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒａｎｇｅ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔｉｎｇ）を用いた分散分析で分析した。データは、平均±標準偏差（ＳＤ）で表し、相違は、ｐ＜０．０５である場合に有意とする。
【００９６】
関節炎の重度は、以下の疾患指標、すなわち、後肢紅斑、後肢膨張、関節の圧痛、動き、および姿勢に関して毎日モニターする。０から３までの整数スケールを、紅斑（０＝正常な足、１＝軽度の紅斑、２＝中等度の紅斑、３＝重度の紅斑）および膨張（０＝正常な足、１＝後肢の軽度の膨張、２＝後肢の中等度の膨張、３＝後肢の重度の膨張）のレベルを定量化するのに用いる。１日の最大スコアは１２である。
【００９７】
試験の終わりに、ラットをＣＯ２で安楽死させ、死体解剖で後肢を切り取り、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、足根関節からカルシウムを除去し、パラフィンに包埋した。組織学切片をヘマトキシリン−エオジンまたはサフラニンＯ−ファストグリーンで染色する。
【００９８】
スライドをコード化し、検査師に処置群がわからないようにする。下記に概要を示す通り、足根関節から得た滑膜組織を、滑膜過形成、炎症性細胞浸潤、およびパンヌス形成に基づいて評価する［ＰｏｏｌｅおよびＣｏｏｍｂｓ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ＆  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７、５４、９７−１１３］。
【００９９】
【表４】
2007538086.tif 000012
【０１００】
加えて、以下に示すように、Ｍａｎｋｉｎの組織学採点システムを用いて、関節軟骨および骨を評価する［Ｍａｎｉｋｉｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ＆  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ−Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｏｌｕｍｅ、１９７１年、５３、５２３−３７］
【０１０１】
【表５】
2007538086.tif 000013
【０１０２】
ＨＬＡ−Ｂ２７ラット関節炎モデルにおける評価
ＨＬＡ−Ｂ２７ラット標準薬理試験手順によって、代表的化合物を評価する。この試験手順は、ヒト関節炎を模擬するものである。使用された手順を以下に簡潔に記述する。雄性ＨＬＡ−Ｂ２７ラットをＴａｃｏｎｉｃ社から入手し、飼料（ＰＭＩ社、ＬａｂＤｉｅｔ  ５００１）および水を無制限に摂取できるようにする。１日１回、少なくとも１週間、溶媒（５０％ＤＭＳＯ／５０％１×ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）または試験化合物（０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）を、ラットに皮下投与する。アジュバント誘発関節炎のＬｅｗｉｓラットモデルで、関節スコアおよび組織診断を上述の通り評価する。
【０１０３】
コラーゲン誘発関節炎モデルにおける評価
コラーゲンＩＩ型に対して産生されたモノクローナル抗体、およびリポポリサッカライド（ＬＰＳ）によって関節炎が誘発されている６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスで化合物を評価する。０日目に、４種類の異なった組合せのｍＡｂ、合計４ｍｇ／マウスを、マウスに静脈内投与し、７２時間後（３日目）に、２５μｇのＬＰを静脈内投与した。３日目のＬＰ投与の１時間後から、試験化合物を１日１回、１５日間経口投与する。０、５、７、１０、１４、および１７日目に、各マウスについて、水室（直径１２ｍｍ）を備えた血管内血量計を用いて、両後肢の体積増大を測定する。体積増大のパーセント阻害を計算する。
【０１０４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ発癌モデルにおける評価
様々な悪性腫瘍および過増殖障害を治療および阻害する、本発明の化合物の能力を、標準薬理試験手順によって評価することができる。これらの試験手順は、文献中に容易に見出すことができ、以下の２つの手順を含んでいる。
【０１０５】
乳癌。卵巣切除されたＡｔｈｙｍｉｃ  ｎｕ／ｎｕ（ヌード）マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国マサチューセッツ州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ所在）から入手する。腫瘍細胞注射の１日前に、０．３６〜１．７ｍｇ  １７β−エストラジオールを含有する徐放性植込錠（６０日または９０日放出、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ社、米国フロリダ州、Ｓａｒａｓｏｔａ）またはプラセボをマウスに移植する。植込錠は、１０ゲージの精密套管針を用いて、肩甲内領域で皮下に導入する。その後、マウスの胸部組織に、１×１０７  ＭＣＦ−７細胞または１×１０７  ＢＧ−１細胞を皮下注射する。細胞を等容積の基底膜マトリックス調製物マトリゲルと混合して、腫瘍の確立を促進させる。試験化合物は、腫瘍細胞を移植した１日後（阻害処方計画）または腫瘍が特定のサイズに達した後（治療処方計画）に投与することによって、評価することができる。化合物は、１％ｔｗｅｅｎ−８０を含む食塩水を溶媒として、毎日、腹腔内または経口投与する。腫瘍サイズは、３日または７日ごとに評価する。
【０１０６】
大腸癌。大腸癌を治療または阻害する能力は、Ｓｍｉｒｎｏｆｆの試験手順で評価することができる［Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９９年、１１、２５５−６４］。
【０１０７】
２つのｉｎ  ｖｉｖｏ試験手順における神経保護の評価
スナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ  ｇｅｒｂｉｌ）の一過性広範囲虚血。酸素の欠乏／再潅流に反応した脳損傷の予防または治療への試験化合物の影響は、以下の試験手順を用いて測定することができる。
【０１０８】
雌性スナネズミ（６０〜８０ｇ；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国ニューヨーク州、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ所在）を、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ社動物管理施設（ＡＡＡＬＡＣ公認）で、１２時間の明期および１２時間の暗期の下に、水道水および低エストロゲンカゼイン飼料（Ｐｕｒｉｎａ社；米国インディアナ州、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ所在）の自由な摂取を可能にして飼育した。馴化（３〜５日間）させた後、イソフルラン（Ｏ２との２〜３％混合物）で、スナネズミに麻酔をかけ、卵巣摘除する（０日目）。翌朝（１日目）から開始して、毎日、溶媒（１０％ＥＴＯＨ／コーン油）、１７β−エストラジオール（１ｍｇ／ｋｇ）、または実験化合物（０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）でスナネズミを皮下治療する。６日目に、イソフルランでスナネズミ（ｎ＝４〜５／群）に麻酔をかけ、頸部の正中線切開によって総頸動脈を可視化し、非外傷性微小動脈瘤クリップで、両動脈を同時に５分間閉鎖する。閉鎖の後に、脳の再潅流を可能にするためにクリップを除去し、頸部切開を創傷クリップで閉じる。広範囲虚血の手術を行う前に、すべてのスナネズミを終夜、絶食させる。これは、虚血性損傷の安定性を促進する工程である。１２日目に、スナネズミを致死量のＣＯ２に曝露し、脳をドライアイス上で凍結させて、−８０℃で保存する。
【０１０９】
神経保護の程度は、ニューログラニンｍＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析によって評価する。簡潔には、２０μｍ冠状クリオスタット切片を、ゼラチンコーティングされたスライド上に収集し、乾燥させて、−８０℃で保存する。処理を行うときに、乾燥させたスライドボックスを室温まで温め、スライドを４％パラホルムアルデヒドで事後固定し、無水酢酸で処理し、クロロホルムおよびエタノールで脱脂および脱水する。次に、処理済みの切片を乗せたスライドを、ニューログラニン（３５Ｓ−ＵＴＰ標識ＮＧ−２４１；塩基９９〜３４０）のアンチセンスまたはセンス（対照）リボプローブ２００μｌ（６×１０６ＤＰＭ／スライド）と、５０％ホルムアミドハイブリダイゼーション混合液中でハイブリッド形成させ、カバーグラスをかぶせずに、加湿スライド室内、５５℃で、終夜インキュベートする。翌朝、スライドをラック上に収集し、ＲＮアーゼＡ（２０μｇ／ｍｌ）で処理した２×ＳＳＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム；ｐＨ７．０）／１０ｍＭ  ＤＴＴに浸漬させ、非特異的な標識を除去するために、０．１×ＳＳＣ中、６７℃で、洗浄する（２×３０分）。脱水の後、スライドをＢｉｏＭａｘ（ＢＭＲ−１；Ｋｏｄａｋ社）Ｘ線フィルムに終夜、対峙させる。
【０１１０】
ニューログラニンハイブリダイゼーションシグナルのレベルは、損傷後における、ＣＡ１領域のニューロン減失の程度を定量的に評価するため、そして、１７β−エストラジオールおよび実験化合物の有効性を評価するために用いる。ニューログラニンｍＲＮＡは、ＣＡＩを含めた海馬ニューロンで強く発現されるが、神経膠およびこの脳領域に存在する他の細胞型では発現されていないため、これらの研究に選択される。したがって、存在しているニューログラニンｍＲＮＡ量の測定値は、生存しているニューロンを表すものである。ニューログラニンハイブリダイゼーションシグナルの相対光学濃度測定値は、コンピュータ式画像解析システム（Ｃ−Ｉｍａｇｉｎｇ社、米国ペンシルベニア州、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）を用いてフィルムオートラジオグラムから取得する。１動物あたり６枚の切片（４０μｍ離れている）から得た結果を平均し、統計的に評価する。数値は、平均±ＳＥＭとして報告される。一元配置分散分析を用いて、ニューログラニンｍＲＮＡのレベルの相違を検定し、結果欄における相違がないという記述は、すべてｐ＞０．０５であることを意味する。
【０１１１】
マウスの大脳動脈中央閉塞。神経保護は、Ｄｕｂａｌによって記載された試験手順に従って評価することができる［Ｄｕｂａｌら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、２００１年、９８、１９５２−１９５７、Ｄｕｂａｌら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９９９年、１９、６３８５−６３９３を参照］。
【０１１２】
排卵阻害の標準薬理試験手順
この試験手順は、試験化合物が排卵を阻害できるかどうか、あるいはその時期を改変できるかどうか判定するのに使用される。この試験手順は、排卵された卵母細胞の数を測定するのにも使用できる［Ｌｕｎｄｅｅｎら、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２００１年、７８、１３７−１４３］。
【０１１３】
移植拒絶反応
移植拒絶反応を防止する能力が試験化合物にあるかどうか試験するために、心臓移植（Ｓｔｅｔｓｏｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、１０４：６７６−６８２）または移植性アテローム硬化症（Ｄｅｉｔｒｉｃｈら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、２０００年、２０：３４３−３５２；Ｌｏｕら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９６年、９４、３３５５−３３６１）の動物モデルで化合物を試験することができる。
【０１１４】
再狭窄の予防
この試験手順は、バルーン血管形成術後に起こるものに類似した頸動脈損傷後に、試験化合物が血管平滑筋細胞の増殖を阻害できるかどうか判定するのに使用される。試験化合物は、以前に記載されている動物モデルで試験することができる（Ｋａｒａｓら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ、２００１年、８９、５３４−５３９；Ｃｅｒｅｋら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９９７年、１３１、５９−６６）。
【０１１５】
心筋梗塞の治療
心筋梗塞中に起こる細胞死を、試験化合物が阻害するかどうか判定するために、虚血／再潅流の動物モデルで、試験化合物を試験することができる。化合物は、以前に記載されているモデルで試験することができる（Ｄｅｌｙａｎｉら、Ｊ．Ｍｏｌ．＆Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、１９９６年、２８、１００１−１００８；Ｉｚｕｍｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００１年、１０８、２０３−２１３；Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、１０３、２２９６−２３０２）。
【０１１６】
心筋炎および鬱血性心不全の治療
化合物が効果的な治療であり、心臓機能を改善できるかどうか判定するために、心臓麻痺のモデルで試験化合物を試験することができる。化合物は、以前に記載されている通りに動物で試験することができる（Ｙｏｋｏｓｅｋｉら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ、２００１年、８９、１−９；Ｗａｌｌｅｎら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、２０００年、３６、７７４−７７９；Ｔｏｓｈｉａｋｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００１年、１０４、１０９４−１１０３）。
【０１１７】
糖尿病の治療
肥満および食餌誘発性のインシュリン抵抗性の逆転に試験化合物が効果があるかどうか判定するために、糖尿病のモデルで試験化合物を試験することができる。化合物は、以前に記載されている動物モデルで試験することができる（Ｙｕａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１年、２９３：１６７３−１６７７）。
【０１１８】
喘息の治療
肺炎モデル。０および１４日目にミョウバン中に乳化されたＯＶＡでマウスを感作させる（ｉｐ注射）。２８および２９日目に、ＯＶＡのエアゾール（１％〜５％ＯＶＡ）に、２０分間曝露し、３０日目に、マウスを屠殺し、肺炎分析用にＢＡＬおよび／または肺組織を採取する。
【０１１９】
気道過反応性。このモデルは上述のものに類似しているが、マウスをＯＶＡのエアゾールに連続した３日間、曝露し、最終曝露の４８時間後に、気道過反応性を測定する。必要ならば、この時点でＢＡＬを採取することもできる。
【０１２０】
ＥＲとの関連において、肥満細胞の効果をより直接的に見るため、受動的皮膚アナフィラキシー反応モデルを使用することもできる。このモデルでは、ＩｇＥを耳に注射し、その２４時間後に、ＤＮＰ−ＨＳＡをｉｖ注射する。耳の厚さと、初期相および後期相の反応を測定する。さらに、組織をＫ２中で固定し、切片をエポキシ樹脂に包埋し、漏斗口切片を切り出す。これらの切片で肥満細胞を染色し、肥満細胞脱顆粒の程度を定量化することができる。
【０１２１】
標準薬理試験手順で得られた結果に基づいて、本発明の化合物は、古典的なエストロゲンで見られるように子宮および乳房細胞増殖を刺激することなく、慢性炎症性疾患の治療および予防に有用な、本明細書に記載の選択的な抗炎症性化合物である。
【０１２２】
したがって、本発明の化合物は、骨粗鬆症の治療または阻害、および骨脱ミネラル化の阻害に有用である。これらは、個体の新規な骨組織形成と、古い組織の融食作用との平衡障害から生じうるものであり、骨の純損失に至る。そのような骨の減失は、様々な個体、特に、閉経後の女性、両方の卵巣切除を受けた女性、長期のコルチコステロイド療法を受けているか、受けた人々、性腺発育不全を経験している人々、およびクッシング症候群を患っている人々で起こる。また、歯および口骨を含めた骨交換に対する特別な必要性にも、骨折、骨構造欠損を有する個体、および、骨に関連した手術および／または人工器官の移植を受けた個体で、これらの化合物を用いることによって対処できる。上述したそれらの問題に加えて、これらの化合物は、骨組織に有害効果を有する、変形性関節炎、低カルシウム血症、高カルシウム血症、変形性骨炎、骨軟化症、骨軟化症、複数の骨髄腫、および癌の他の形態の治療および阻害にも使用できる。
【０１２３】
本発明の化合物は、脳内でも活性であり、したがって、アルツハイマー病、認知機能低下、性欲減退、老人性認知症、神経変性障害、うつ病、不安症、不眠症、統合失調症、および不妊症を阻害または治療するのにも有用である。本発明の化合物は、糸球体硬化症、良性前立腺肥大症、子宮平滑筋腫、乳癌、強皮症、線維腫症、子宮内膜症、子宮内膜癌、多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜ポリープ、良性乳房疾患、腺筋症、卵巣癌、黒色腫、前立腺癌、大腸癌、神経膠腫または星状芽細胞腫などのＣＮＳ癌を含めた良性または悪性の異常組織増殖を治療または阻害するのにも有用である。
【０１２４】
本発明の化合物は、心保護的であり、酸化防止物質であり、そして、コレステロール、トリグリセリド、Ｌｐ（ａ）、およびＬＤＬを低下させること、高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患、アテローム性動脈硬化、末梢血管疾患、再狭窄、および血管れん縮を阻害または治療すること、ならびに、免疫介在性血管損傷へと至る、細胞性イベントによる血管壁損傷を阻害することにおいても有用である。
【０１２５】
本発明の化合物は、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎、非定型的大腸炎）、関節炎（関節リウマチ、脊椎関節症、変形性関節炎）、胸膜炎、虚血／再潅流損傷（例えば、脳卒中、移植拒絶反応、心筋梗塞など）喘息、側頭動脈炎、前立腺炎、ぶどう膜炎、乾癬、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、および敗血症を含めた炎症性疾患または自己免疫疾患に関連し障害を治療するのにも有用である。
【０１２６】
本発明の化合物は、白内障、ぶどう膜炎、および黄斑変性症を含めた眼疾患を治療または阻害するのにも、また、加齢、脱毛症、およびざ瘡などの皮膚の状態を治療するのにも有用である。
【０１２７】
本発明の化合物は、ＩＩ型糖尿病などの代謝障害、脂質代謝障害、および食欲障害（例えば、神経性無食欲症および病的飢餓）を治療または阻害するのにも有用である。
【０１２８】
本発明の化合物は、遺伝性出血性毛細血管拡張症、機能性子宮出血などの出血障害を治療または阻害し、出血性ショックに対処するのにも有用である。
【０１２９】
本発明の化合物は、白血病、子宮内膜切除、慢性腎疾患もしくは肝臓疾患、凝血疾患もしくは障害など、無月経であることが有利である疾患状態に有用である。
【０１３０】
これらの結果は、上記の試験化合物が、炎症性遺伝子発現を遮断する能力を有するという点において、抗炎症性の役割を有し、子宮湿重量の誘導が観察されなかったので、その活性が望ましい選択性を有することを示す。
【０１３１】
本明細書に引用されたすべての特許、出版物、および他の参考文献を参照により全体として本明細書に援用する。
【国際調査報告】
2007538086.tif 000016
2007538086.tif 000017
2007538086.tif 000018
2007538086.tif 000019