(57)【要約】【課題】癌細胞に対するより高い免疫反応を引き出すための、向上したＨＬＡ結合及び向上した親和性の両方を有する合成ペプチド類似体を提供する。【解決手段】本発明は、哺乳類の病態生理学的状態を示す細胞（例えば癌細胞など）上でＨＬＡ Ａ０２０１又はＨＬＡ Ａ０３０１分子と特異的に結合する天然ペプチドの類似体を少なくとも含む合成ペプチドを提供する。また、本発明は、ペプチド類似体断片又はそれをエンコードしているＤＮＡを少なくとも含む医薬組成物及び免疫組成物を提供する。また、本発明は、合成ペプチド及び免疫組成物の使用してヘテロクリティック免疫反応を引き起こすことにより、癌を治療する方法を提供する。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成ペプチドであって、
哺乳類の病態生理学的状態を示す細胞上でＨＬＡ Ａ０２０１又はＨＬＡ Ａ０３０１分子と特異的に結合する天然ペプチドの類似体の断片を少なくとも含んでいるアミノ酸配列を有する合成ペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載の合成ペプチドであって、
前記アミノ酸配列は、前記類似体断片の分解産物である、前記類似体断片の前駆体を含んでいることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項３】
請求項２に記載の合成ペプチドであって、
前記前駆体はｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質であり、前記類似体断片は前記ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質の切断点領域をスパンニングすることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載の合成ペプチドであって、
前記前駆体はＷＴ１であり、前記類似体断片は前記ＷＴ１に含まれている天然ペプチド配列を置換することを特徴とする合成ペプチド。
【請求項５】
請求項１に記載の合成ペプチドであって、
当該合成ペプチドと結合する免疫原性担体をさらに有することを特徴とする合成ペプチド。
【請求項６】
請求項５に記載の合成ペプチドであって、
前記免疫原性担体は、タンパク質、ペプチド、又は抗原提示細胞であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項７】
請求項６に記載の合成ペプチドであって、
前記タンパク質又はペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、又はポリアミノ酸であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項８】
請求項６に記載の合成ペプチドであって、
前記抗原提示細胞は、樹枝状細胞であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項９】
請求項１に記載の合成ペプチドであって、
前記類似体断片に含まれるアミノ酸の総数は、前記天然ペプチドに含まれるアミノ酸の総数の約７０〜１３０％であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の合成ペプチドであって、
前記類似体断片は、約８〜１２個のアミノ酸を有することを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１１】
請求項１に記載の合成ペプチドであって、
前記類似体断片は、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質の切断点領域を含んでいる天然ペプチドに由来することを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の合成ペプチドであって、
前記類似体断片は、ｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチド、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチド、又はｐ１９０−ｅ１ａ２天然ペプチドに由来することを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載の合成ペプチドであって、
前記ｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチドに由来する前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、及びＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）から成る群より選択されることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載の合成ペプチドであって、
前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、及びＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）から成る群より選択されることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１５】
請求項１３に記載の合成ペプチドであって、
前記ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチドに由来する前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、及びＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）から成る群より選択されることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載の合成ペプチドであって、
前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載の合成ペプチドであって、
前記類似体断片は、ＷＴ１タンパク質を含んでいる天然ペプチドに由来することを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載の合成ペプチドであって、
前記ＷＴ１天然ペプチドに由来する前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（SEQ ID NO: 18）、ＹＬＧＥＱＱＹＳＶ（SEQ ID NO: 20）、ＹＬＬＰＡＶＰＳＬ（SEQ ID NO: 22）、ＹＬＧＡＴＬＫＧＶ（SEQ ID NO: 24）、ＹＬＮＡＬＬＰＡＶ（SEQ ID NO: 26）、ＧＬＲＲＧＩＱＤＶ（SEQ ID NO:28）、ＫＬＹＦＫＬＳＨＬ（SEQ ID NO: 30）、ＡＬＬＬＲＴＰＹＶ（SEQ ID NO: 32）、ＹＭＴＷＮＱＭＮＬ(SEQ ID NO: 34)、ＮＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、及びＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）から成る群より選択されることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１９】
請求項１に記載の合成ペプチドであって、
前記病態生理学的状態は、白血病、乳癌、リンパ腫、中皮腫、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌から成る群より選択される癌であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載の合成ペプチドであって、
前記白血病は慢性骨髄性白血病であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項２１】
請求項１に記載の合成ペプチドであって、
前記哺乳類は人間であることを特徴とする合成ペプチド。
【請求項２２】
癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導する方法であって、
ヒト免疫細胞を請求項１に記載の合成ペプチドに接触させて、前記免疫細胞を活性化させるステップと、
前記合成ペプチドの前記類似体断片に少なくとも存在する前記活性化された細胞と反応する前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するステップとを含んでおり、
前記増殖性Ｔ細胞が、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する前記癌細胞と交差反応することによって、前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞の癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応が引き起こされることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、癌患者の生体内で接触することを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞はドナーの生体内で接触し、
前記ドナーから前記細胞傷害性Ｔ細胞を取得するステップと、
前記細胞傷害性Ｔ細胞を癌患者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、
前記接触ステップの前に、ドナーから前記活性化したヒト免疫細胞を取得するステップと、
前記誘導ステップの前に、前記活性化された免疫細胞を前記癌患者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項２２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、
前記接触ステップの前に、ドナーからヒト免疫細胞を取得するステップと、
前記接触ステップの後に、生体外で形成及び増殖された前記細胞傷害性Ｔ細胞を前記癌患者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、
前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡを作成するステップと、
前記ＤＮＡを発現させるステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
前記ＤＮＡは、ベクター又は抗原提示細胞に挿入されることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージであることを特徴とする方法。
【請求項３０】
請求項２２に記載の方法であって、
前記癌細胞は、白血病、乳癌、リンパ腫、中皮腫、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌から成る群より選択される癌に由来することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、
前記白血病は慢性骨髄性白血病であることを特徴とする方法。
【請求項３２】
白血病細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすヒト免疫Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するための方法であって、
ヒト免疫細胞を請求項１１に記載の合成ペプチドに接触させて、前記免疫細胞を活性化させるステップと、
前記合成ペプチドの前記類似体断片に少なくとも存在する前記活性化された細胞と反応する前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するステップとを含んでおり、
前記増殖性Ｔ細胞が、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する前記白血病細胞と交差反応することによって、前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞の前記白血病細胞に対するヘテロクリティック免疫反応が引き起こされることを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、癌患者の生体内で接触することを特徴とする方法。
【請求項３４】
請求項３２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞はドナーの生体内で接触し、
前記ドナーから前記細胞傷害性Ｔ細胞を取得するステップと、
前記細胞傷害性Ｔ細胞を癌患者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、
前記接触ステップの前に、ドナーからヒト免疫細胞を取得するステップと、
前記誘導ステップの前に、前記活性化された免疫細胞を前記ドナー又は他の受容者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、
前記接触ステップの前に、ドナーからヒト免疫細胞を取得するステップと、
前記接触ステップの後に、生体外で形成及び増殖された前記細胞傷害性Ｔ細胞を前記ドナー又は他の受容者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項３２に記載の方法であって、
前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮを作成するステップと、
前記ＤＮＡを発現させるステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって、
前記ＤＮＡは、ベクター又は抗原提示細胞に挿入されることを特徴とする方法。
【請求項３９】
請求項２２に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージであることを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項３２に記載の方法であって、
前記類似体断片は、ｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチド、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチド、又はｐ１９０−ｅ１ａ２天然ペプチドに由来することを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、ＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、及びＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項３２に記載の方法であって、
前記白血病細胞は、慢性骨髄性白血病細胞であることを特徴とする方法。
【請求項４３】
癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導する方法であって、
ヒト免疫細胞を請求項１７に記載の合成ペプチドに接触させて、前記免疫細胞を活性化させるステップと、
前記合成ペプチドの前記類似体断片に少なくとも存在する前記活性化された細胞と反応する前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するステップとを含んでおり、
少なくとも前記合成ペプチドの前記類似体断片に存在している前記活性化された細胞に対して反応性を有する前記ヒト免疫Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するステップとを含んでおり、
前記増殖性Ｔ細胞が、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する前記癌細胞と交差反応することによって、前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞の癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応が引き起こされることを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、癌患者の生体内で接触することを特徴とする方法。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞はドナーの生体内で接触し、
前記ドナーから前記細胞傷害性Ｔ細胞を取得するステップと、
前記細胞傷害性Ｔ細胞を癌患者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
請求項４３に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、
前記接触ステップの前に、ドナーからヒト免疫細胞を取得するステップと、
前記誘導ステップの前に、前記活性化された免疫細胞を前記ドナー又は受容者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、
前記接触ステップの前に、ドナーからヒト免疫細胞を取得するステップと、
前記接触ステップの後に、生体外で形成及び増殖された前記細胞傷害性Ｔ細胞を前記癌患者又は他の受容者に注入するステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
請求項４３に記載の方法であって、
前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡを作成するステップと、
前記ＤＮＡを発現させるステップとをさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、
前記ＤＮＡは、ベクター又は抗原提示細胞に挿入されることを特徴とする方法。
【請求項５０】
請求項４３に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージであることを特徴とする方法。
【請求項５１】
請求項４３に記載の方法であって、
前記類似体断片は、ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（SEQ ID NO: 18）、ＹＬＧＥＱＱＹＳＶ（SEQ ID NO: 20）、ＹＬＬＰＡＶＰＳＬ（SEQ ID NO: 22）、ＹＬＧＡＴＬＫＧＶ（SEQ ID NO: 24）、ＹＬＮＡＬＬＰＡＶ（SEQ ID NO: 26）、ＧＬＲＲＧＩＱＤＶ（SEQ ID NO:28）、ＫＬＹＦＫＬＳＨＬ（SEQ ID NO: 30）、ＡＬＬＬＲＴＰＹＶ（SEQ ID NO: 32）、ＹＭＴＷＮＱＭＮＬ(SEQ ID NO: 34)、ＮＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、及びＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする方法。
【請求項５２】
請求項４３に記載の方法であって、
前記癌細胞は、白血病細胞、又は、乳癌、リンパ腫、中皮腫、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌から成る群より選択される細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
請求項５２に記載の方法であって、
前記白血病細胞は、慢性骨髄性白血病細胞であることを特徴とする方法。
【請求項５４】
医薬組成物であって、
治療効果がある量の、請求項１に記載の合成ペプチド又は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡと、
薬学的に許容される担体とを含んでいる医薬組成物。
【請求項５５】
請求項５４に記載の医薬組成物であって、
前記ＤＮＡは、ベクター又は抗原提示細胞に挿入されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項５６】
人間の癌を治療する方法であって、
請求項５４に記載の医薬組成物を前記人間に投与するステップと、
少なくとも前記合成ペプチドの前記類似体断片を認識する細胞傷害性Ｔ細胞によって、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすステップとを含み、
前記細胞傷害性Ｔ細胞が前記癌細胞を認識又は死滅させることによって、癌を治療することを特徴とする方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、
前記癌は、白血病、乳癌、リンパ腫、中皮腫、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項５８】
請求項５７に記載の方法であって、
前記白血病は、慢性骨髄性白血病であることを特徴とする方法。
【請求項５９】
医薬組成物であって、
治療効果がある量の、請求項１１に記載の合成ペプチド又は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡと、
薬学的に許容される担体とを含んでいる医薬組成物。
【請求項６０】
請求項５９に記載の医薬組成物であって、
前記ＤＮＡは、ベクター又は抗原提示細胞に挿入されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項６１】
請求項５９に記載の医薬組成物であって、
前記合成ペプチドを含んでいる類似体断片は、ｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチド、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチド、又はｐ１９０−ｅ１ａ２天然ペプチドに由来することを特徴とする医薬組成物。
【請求項６２】
請求項６１に記載の医薬組成物であって、
前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、及びＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、及びＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）から成る群より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項６３】
人間の白血病を治療する方法であって、
請求項５９に記載の医薬組成物を前記人間に投与するステップと、
少なくとも前記合成ペプチドの前記類似体断片を認識する細胞傷害性Ｔ細胞によって、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する白血病細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすステップとを含み、
前記細胞傷害性Ｔ細胞が前記癌細胞を認識又は死滅させることによって、白血病を治療することを特徴とする方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法であって、
前記白血病は、性骨髄性白血病であることを特徴とする方法。
【請求項６５】
医薬組成物であって、
治療効果がある量の、請求項１７に記載の合成ペプチド又は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡと、
薬学的に許容される担体とを含んでいる医薬組成物。
【請求項６６】
請求項６５に記載の医薬組成物であって、
前記ＤＮＡは、ベクター又は抗原提示細胞に挿入されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項６７】
請求項６５に記載の医薬組成物であって、
前記合成ペプチドの前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（SEQ ID NO: 18）、ＹＬＧＥＱＱＹＳＶ（SEQ ID NO: 20）、ＹＬＬＰＡＶＰＳＬ（SEQ ID NO: 22）、ＹＬＧＡＴＬＫＧＶ（SEQ ID NO: 24）、ＹＬＮＡＬＬＰＡＶ（SEQ ID NO: 26）、ＧＬＲＲＧＩＱＤＶ（SEQ ID NO:28）、ＫＬＹＦＫＬＳＨＬ（SEQ ID NO: 30）、ＡＬＬＬＲＴＰＹＶ（SEQ ID NO: 32）、ＹＭＴＷＮＱＭＮＬ(SEQ ID NO: 34)、ＮＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、及びＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）から成る群より選択されることを特徴とする医薬組成物。
【請求項６８】
人間の癌を治療する方法であって、
請求項６５に記載の医薬組成物を前記人間に投与するステップと、
少なくとも前記合成ペプチドの前記類似体断片を認識する細胞傷害性Ｔ細胞によって、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすステップとを含み、
前記細胞傷害性Ｔ細胞が前記癌細胞を認識又は死滅させることによって、癌を治療することを特徴とする方法。
【請求項６９】
請求項６８に記載の方法であって、
前記癌は、白血病、乳癌、リンパ腫、中皮腫、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項７０】
請求項６９に記載の方法であって、
前記白血病は、慢性骨髄性白血病であることを特徴とする方法。
【請求項７１】
免疫原性組成物であって、
免疫効果がある量の、請求項１に記載の合成ペプチドと、
薬学的に許容される担体、補助剤、希釈剤、又はそれらの組み合わせとを含んでいる免疫原性組成物。
【請求項７２】
請求項７１に記載の免疫原性組成物であって、
前記免疫原性担体は、前記合成ペプチドと結合する、タンパク質、ペプチド、又は抗原提示細胞であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項７３】
請求項７２に記載の免疫原性組成物であって、
前記タンパク質又はペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、又はポリアミノ酸であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項７４】
請求項７２に記載の免疫原性組成物であって、
前記抗原提示細胞は、樹枝状細胞であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項７５】
人間のヘテロクリティック免疫反応を誘導する方法であって、
免疫効果がある量の、請求項７１に記載の免疫原性組成物を前記人間に投与するステップと、
前記免疫原性組成物によって前記ヒト免疫細胞を活性化するステップと、
前記免疫原性組成物を含んでいる前記合成ペプチドの前記類似体断片に少なくとも存在する活性化された細胞に対するヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を引き起こすステップとを含み、
前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞が、前記類似体断片が由来する天然ペプチドに存在する癌含有細胞と交差反応することによって、前記ヘテロクリティック免疫反を引き起こすことを特徴とする方法。
【請求項７６】
請求項７５に記載の方法であって、
活性癌を有する前記人間は、癌が寛解している、又は癌が発病する危険性があることを特徴とする方法。
【請求項７７】
請求項７５に記載の方法であって、
活性癌を有する患者に前記細胞傷害性Ｔ細胞を提供する前記人間は、癌が寛解している、又は癌が発病する危険性があることを特徴とする方法。
【請求項７８】
請求項７５に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージであることを特徴とする方法。
【請求項７９】
前記癌は、白血病、乳癌、リンパ腫、中皮腫、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項８０】
請求項７９に記載の方法であって、
前記白血病は、慢性骨髄性白血病であることを特徴とする方法。
【請求項８１】
免疫原性組成物であって、
免疫効果がある量の、請求項１１に記載の合成ペプチドと、
薬学的に許容される担体、補助剤、希釈剤、又はそれらの組み合わせとを含んでいる免疫原性組成物。
【請求項８２】
請求項８１に記載の免疫原性組成物であって、
前記免疫原性担体は、前記合成ペプチドと結合する、タンパク質、ペプチド、又は抗原提示細胞であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項８３】
請求項８２に記載の免疫原性組成物であって、
前記タンパク質又はペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、又はポリアミノ酸であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項８４】
請求項８２に記載の免疫原性組成物であって、
前記抗原提示細胞は、樹枝状細胞であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項８５】
請求項８１に記載の免疫原性組成物であって、
前記合成ペプチドの前記類似体断片は、ｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチド、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチド、又はｐ１９０−ｅ１ａ２天然ペプチドに由来することを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項８６】
請求項８５に記載の免疫原性組成物であって、
前記類似体断片は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、ＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、及びＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項８７】
人間のヘテロクリティック免疫反応を誘導する方法であって、
免疫効果がある量の、請求項８１に記載の免疫原性組成物を前記人間に投与するステップと、
前記免疫原性組成物によって前記ヒト免疫細胞を活性化するステップと、
前記免疫原性組成物を含んでいる前記合成ペプチドの類似体断片に少なくとも存在する白血病細胞に対するヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を引き起こすステップとを含み、
前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞が、前記類似体断片が由来する天然ペプチドに存在する前記白血病細胞と交差反応することによって、前記ヘテロクリティック免疫反を引き起こすことを特徴とする方法。
【請求項８８】
請求項８７に記載の方法であって、
活性癌を有する前記人間は、癌が寛解している、又は癌が発病する危険性があることを特徴とする方法。
【請求項８９】
請求項８７に記載の方法であって、
活性癌を有する患者に前記細胞傷害性Ｔ細胞を提供する前記人間は、癌が寛解している、又は癌が発病する危険性があることを特徴とする方法。
【請求項９０】
請求項８７に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージであることを特徴とする方法。
【請求項９１】
請求項８７に記載の方法であって、
前記白血病細胞は、慢性骨髄性白血病細胞であることを特徴とする方法。
【請求項９２】
免疫原性組成物であって、
免疫効果がある量の、請求項１７に記載の合成ペプチドと、
薬学的に許容される担体、補助剤、希釈剤、又はそれらの組み合わせとを含んでいる免疫原性組成物。
【請求項９３】
請求項９２に記載の免疫原性組成物であって、
前記免疫原性担体は、前記合成ペプチドと結合する、タンパク質、ペプチド、又は抗原提示細胞であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項９４】
請求項９３に記載の免疫原性組成物であって、
前記タンパク質又はペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、又はポリアミノ酸であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項９５】
請求項９３に記載の免疫原性組成物であって、
前記抗原提示細胞は、樹枝状細胞であることを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項９６】
請求項９２に記載の免疫原性組成物であって、
前記合成ペプチドの前記類似体断片は、ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（SEQ ID NO: 18）、ＹＬＧＥＱＱＹＳＶ（SEQ ID NO: 20）、ＹＬＬＰＡＶＰＳＬ（SEQ ID NO: 22）、ＹＬＧＡＴＬＫＧＶ（SEQ ID NO: 24）、ＹＬＮＡＬＬＰＡＶ（SEQ ID NO: 26）、ＧＬＲＲＧＩＱＤＶ（SEQ ID NO:28）、ＫＬＹＦＫＬＳＨＬ（SEQ ID NO: 30）、ＡＬＬＬＲＴＰＹＶ（SEQ ID NO: 32）、ＹＭＴＷＮＱＭＮＬ(SEQ ID NO: 34)、ＮＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、及びＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）から成る群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫原性組成物。
【請求項９７】
人間のヘテロクリティック免疫反応を誘導する方法であって、
免疫効果がある量の、請求項９２に記載の免疫原性組成物を前記人間に投与するステップと、
前記免疫原性組成物によって前記ヒト免疫細胞を活性化するステップと、
前記免疫原性組成物を含んでいる前記合成ペプチドの前記類似体断片に少なくとも存在する活性化された細胞に対するヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を引き起こすステップとを含み、
前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞が、前記類似体断片が由来する天然ペプチドに存在する癌含有細胞と交差反応することによって、前記ヘテロクリティック免疫反を引き起こすことを特徴とする方法。
【請求項９８】
請求項９７に記載の方法であって、
活性癌を有する前記人間は、癌が寛解している、又は癌が発病する危険性があることを特徴とする方法。
【請求項９９】
請求項９７に記載の方法であって、
活性癌を有する患者に前記細胞傷害性Ｔ細胞を提供する前記人間は、癌が寛解している、又は癌が発病する危険性があることを特徴とする方法。
【請求項１００】
請求項９７に記載の方法であって、
前記ヒト免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージであることを特徴とする方法。
【請求項１０１】
請求項９７に記載の方法であって、
前記癌は、白血病、乳癌、リンパ腫、中皮腫、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌から成る群より選択されることを特徴とする方法。
【請求項１０２】
請求項９７に記載の方法であって、
前記白血病細胞は、慢性骨髄性白血病細胞であることを特徴とする方法。
【請求項１０３】
合成ペプチドであって、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、ＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、及びＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）から成る群より選択される１つ又は複数のアミノ酸配列を有することを特徴とする合成ペプチド。
【請求項１０４】
合成ペプチドであって、ＮＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、及びＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）から成る群より選択される１つ又は複数のアミノ酸配列を有することを特徴とする合成ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的及び白血病治療の分野に関するものである。より詳細には、本発明は合成類似体ペプチドの使用に関するものであり、前記合成類似体の天然ペプチドに対するヒトＴ細胞ヘテロクリティック反応を引き起こすことを目的とする。
【背景技術】
【０００２】
慢性骨髄性白血病（chronic myelogenous leukemia：CML）は多能性幹細胞の疾患であり、フィラデルフィア染色体（Philadelphia chromosome：Ph）が存在することを特徴とする。フィラデルフィア染色体は、ｃ−ａｂｌ腫瘍遺伝子が９番染色体から２２番染色体のｂｃｒ遺伝子内の切断点クラスター領域（breakpoint cluster region：bcr）へ移動するという転座を示し、ｂｃｒ−ａｂｌキメラ遺伝子を作成する。融合遺伝子は、通常は２１０−ｋＤａ又は１９０−ｋＤａタンパク質に変換される、８．５ｋｂのキメラｍＲＮＡをエンコードする。ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質は、慢性骨髄性白血病患者の白血病細胞内にユニークに存在するチロシン−キナーゼであり、形質変換に必要であり十分である。
【０００３】
慢性骨髄性白血病では、ｂｃｒ遺伝子内の切断点は、ｂｃｒエクソン２（ｂ２）と３（ｂ３）との間、又はｂｃｒエクソン３（ｂ３）と４（ｂ４）との間で生じる。また、異常なｂｃｒ−ａｂｌ融合遺伝子と、ｂｃｒ−ａｂｌ ｍＲＮＡとのスプライシングが生じ得る。そのため、慢性骨髄性白血病患者の大部分は、ｐ２１０−ｂ３ａ２又はｐ２１０−ｂ２ａ２を発現する。多くの場合は、ｐ２１０とｐｌ９０の両タンパク質が、低レベルのｐ１９０−ｅ１ａ２ ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質と共に発現する。Ｐｈ１陽性の急性リンパ性白血病（acute lymphocytic leukemia：ALL）では、主要切断点は、ｅ１ａ２部位に生じる。
【０００４】
キメラ融合遺伝子は、潜在的な抗原である。第１に、前記タンパク質は、その接合部が正常タンパク質では発現しないアミノ酸配列を含んでいる慢性骨髄性白血病細胞内にユニークに発現する。第２に、融合したメッセージ上にコドンが等分（split）された結果、新規なアミノ酸であるｂ３ａ２内のリシン、及びｂ３ａ２内の保存されたアミノ酸であるグルタミン酸は、各タンパク質の正確な融合点に存在する。そのため、ｂ３ａ２及びｂ２ａ２切断点領域を含んでいるユニークなアミノ酸配列は、まさに、腫瘍特異性抗原と考えられる。それらのタンパク質が細胞内局在であるにも関わらず、融合タンパク質の生産物の細胞処理によって作成された短ペプチドは、細胞表面のＨＬＡ分子の裂溝内に存在することができる。したがって、前記短ペプチドは、Ｔ細胞によって認識することが可能である。
【０００５】
最近の臨床試験によって、腫瘍特異的なｂｃｒ−ａｂｌ由来多価ワクチンを、慢性期の慢性骨髄性白血病患者に対して安全に投与できることが分かっている。このワクチンは、ｂｃｒ−ａｂｌペプチドに対して特異的なＣＤ４免疫反応を確実に誘導する。前記反応は、インビボでのＤＴＨによって、生体外でのＣＤ４＋Ｔ細胞増殖によって、及び、ＥＬＩＳＰＯＴ分析でのガンマ・インターフェロン分泌によって測定される。しかしながら、高感度ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴ分析により測定すると、ＨＬＡ Ａ０２０１患者ではＣＤ８反応は検出されず、ＨＬＡ Ａ０３０１患者に弱い反応が検出されるだけである。
【０００６】
ウィルムス腫瘍タンパク質１（ＷＴ１）は、正常な個体発生時に、胎児の腎臓、睾丸及び卵巣などに発現するジンク・フィンガー転写因子である。成人の場合は、ＷＴ１発現は、造血幹細胞、筋上皮前駆細胞、腎臓有足細胞、及び、睾丸及び卵巣内のある細胞上で、低いレベルに制限される。最近では、ＷＴ１は、いくつかのタイプの白血病で過剰発現することが実証されている。このことは、ＷＴ１は、免疫療法のための魅力的な標的であることを示唆している。ＷＴ１由来の３つのペプチド九量体が、ＨＬＡ ０２０１及びＨＬＡ ２４０２におけるＷＴ１特異的細胞傷害反応を示すことが知られている。しかしながら、ＷＴ１タンパク質は自己抗原なので、破壊の許容範囲は、潜在的な懸案事項である。
【０００７】
反応の促進に関しては、ＣＤ８反応の強度は、標的ペプチドのクラスＩ ＭＨＣ分子に対する結合親和力、ペプチド−ＨＬＡ複合体の安定性、及び、ペプチド複合体へ結合するためのＴ細胞受容体の親和力に依存する。天然ＣＭＬ細胞の死滅は、天然抗原の適切な処理及び提示を必要とする。そのため、それらの臨床試験における再現可能なＣＤ８反応の欠如は、それらのクラスＩペプチド−ＨＬＡ生化学的相互作用の結果であり、それらの細胞傷害性ＣＤ８細胞に対する弱い免疫原性をもたらす。ＨＬＡポケットと高親和的に結合したヒトＭＨＣと結合するＣＭＬ天然ペプチドは全く報告されていない。このことは、この抗原がＣＭＬ細胞に見られるのにも関わらず、慢性骨髄性白血病患者に見られるタンパク質であるｂｃｒ−ａｂｌペプチドに対する免疫反応が検出されないことを部分的に説明している。
【０００８】
ある抗原性システムでは、ペプチド類似体は、免疫原性反応の不良を回避するのに使用される。類似体ペプチド全体のＭＨＣクラスＩ分子に対する親和性と、ＨＬＡ−Ａ２Ｋｂ遺伝子組み換えマウスのインビボでのペプチド免疫原性との間に高度な相関関係があることが分かっている。ペプチドの安定したＨＬＡ Ａ０２０１複合体を形成する能力と、免疫原性との緊密な相関関係も報告されている。自己ペプチドの類似体、ｇｐ１００１５４−１６２についての、ＨＬＡ Ａ０２０１／Ｋｂ遺伝子組み換えマウスでの向上した免疫原性は、高い親和性と天然ペプチドよりも長期の複合体安定性との両方を示すことが報告されている。
【０００９】
ペプチド類似体をデザインするために、適切な結合モチーフの存在を調べるために多数のタンパク質配列を読み取ることに成功したアルゴリズムが使用される。このアルゴリズムによって、予測される抗原が同定される。同定された抗原は、その後、実験的に確認される。抗原性ペプチドの類似体は、“ＭＨＣアンカー修正リガンド”と呼ばれるＭＨＣアンカー位置を変更することによって、又はＴＣＲ接触部位（一般的には“改変ペプチド・リガンド”と呼ばれる）を修正することによって作成される。インビボ及びインビトロでのＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性を強化するペプチド・エピトープ類似体の同定は、元来は弱い、免疫原性ペプチドの関係するＴ細胞のサブセットを活性化及び増幅させるための能力を向上させると考えられる。この考えは、元々は、ＨＩＶペプチドを使用した、ネズミのＣＤ４＋ Ｔ細胞モデルで説明されていたが（１）、現在では、様々なウイルス及び腫瘍免疫系に拡大されている。
【００１０】
ＭＨＣクラスＩ−結合自己ペプチドの人工変異体がデザインされている（２）。それらの様々なペプチドはホスト免疫系と異質であるので、強力なＣＴＬ反応が引き起こされる。自己ペプチド−ＭＨＣ複合体に対するＴ細胞反応とは違って、様々なペプチドに対するＣＴＬ反応は、細胞分裂又は生存のための信号の不足に起因してクローンを絶滅させることなく、長期間持続することが可能である。そのようなＣＴＬの十分な破片が、腫瘍細胞で発現した非突然変異自己ペプチドと非常に少ない量で交差反応するので、様々なペプチドへの免疫付与は、腫瘍に対するＣＴＬを誘導するためのより効率的な方法であり得る。ＭＨＣクラスＩ−結合ペプチドの採点システムは、免疫付与のための交差反応性自己模倣ペプチドをデザインする便利な方法を提供する。
【００１１】
インビボでの改善された免疫原性と、ＭＨＣアンカー改変リガンドの関連性は、ｇｐ１００由来のメラノーマ関連のＡ０２０１制限ペプチドを使用して悪性黒色腫患者の対照試験を行ったヒト腫瘍性疾患において最初に正式に示された。最近は、ＨＬＡ四量体ベースの検出方法によって、母体となっているメラン−Ａ抗原ペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞を準最適に活性化させる弱いアゴニストであることが分かっている（３）。対照的に、メランＡペプチド類似体は、十分なアゴニストとして作用し、十分なＴ細胞活性化を誘導し、強力な腫瘍抗原特異的ＣＴＬ反応をもたらすことが分かっている（４）。
【００１２】
単純モチーフ（simple motifs）及び統計的な結合マトリックスを、ＭＨＣ−結合ペプチドの大雑把な調査に使用することができる。残念なことに、単純な配列モチーフの存在は、結合とは必ずしも良好に相関しない。そのため、これらの単純なモチーフは、結合には常に必要又は十分ではない。生化学的な結合分析の試験を行ったところ、そのような単純モチーフを有するペプチドの３０％だけが十分に結合する。拡張モチーフ（extended motifs）を使用した場合、結合の予測は、単純モチーフよりも大幅に向上する。拡張モチーフを有するペプチドの約７０％が十分に結合する。
【００１３】
各位置の各アミノ酸が、隣接残基とは無関係にある結合エネルギーに貢献する、及び所定のペプチドの結合は異なる残基によってもたらされる結合の結果であると推測すると、関連したマトリックス値の増加は、対応するペプチドの結合の目安となる。そのような統計的なマトリクスによる予測はより成功的であり、ＭＨＣ結合がある程度の結合の特異性をもたらすことを示唆する。それらの方法に基づいた類似体断片の同定は、プロテイナーゼ３、メラノーマ抗原３、ムチン１、及びテロメラーゼから推定されるＣＴＬエピトープを同定するために、最近になって適用された。
【００１４】
天然ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質の低い免疫原性は、細胞の溶解の乏しさ、又は、自己抗原由来の天然ペプチド（例えばＷＴ１）の使用の耐性の問題によって証明されている。そのため、それらの天然ペプチドのＣＭＬに対する効果的なワクチンとしての使用は避けられてきた。そのため、当該分野では、新生組織形成に必要とされる発癌タンパク質でもある真性腫瘍特異性抗原に対するワクチン接種を用いた治療方法が必要とされている。したがって、より強い免疫反応を引き出すようにデザインされた、改善された合成ペプチド類似体が求められている。
【００１５】
従来技術では、免疫エピトープを認識するだけではなく、オリジナルの天然ペプチドと交差反応する免疫反応を生成できる合成類似体ペプチドは無かった。特に、従来技術では、癌細胞に対するより高い免疫反応を引き出すための、向上したＨＬＡ結合及び向上した親和性の両方を有する合成ペプチド類似体は無かった。本発明は、この当該分野における長年の要求を満たすものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、哺乳類の病態生理学的状態を示す細胞上でＨＬＡ Ａ０２０１又はＨＬＡ Ａ０３０１分子と特異的に結合する天然ペプチドの類似体である断片を少なくとも含んでいるアミノ酸配列を有する合成ペプチドに関するものである。前記合成ペプチドは、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質又はＷＴ１タンパク質の切断点領域を含んでいる天然ペプチドから得られる。
【００１７】
また、本発明は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、及びＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、及びＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）、ＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、及びＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）から成る群より選択されるアミノ酸配列を有する関連合成ペプチドに関するものである。
【００１８】
また、本発明は、治療効果がある量のここに記載された合成ペプチド又は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡと、適切な担体とを含んでいる医薬組成物に関するものである。
【００１９】
また、本発明は、免疫効果がある量のここに記載された合成ペプチドと、薬学的に許容される担体、補助剤、希釈剤、又はそれらの組み合わせとを含んでいる免疫原性組成物に関するものである。
【００２０】
また、本発明は、人間の癌の治療方法に関するものである。ここに記載された医薬組成物は、人間に投与される。ここに記載された合成ペプチドの類似体断片を少なくとも認識する細胞傷害性Ｔ細胞によって、前記類似体断片が由来する天然ペプチドに存在する癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応が引き起こされる。したがって、前記細胞傷害性Ｔ細胞が前記癌細胞を認識する又は死滅させることによって、前記癌を治療できる。また、本発明は、ＷＴ１タンパク質の天然ペプチドに由来する類似体断片を少なくとも含んでいる合成ペプチド、又は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡを有する医薬組成物を使用して行う、人間の白血病の治療方法に関するものである。
【００２１】
また、本発明は、癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導する方法に関するものである。ヒト免疫細胞は、ここに記載された類似体断片を少なくとも含んでいる合成ペプチドと接触する。このことにより、前記合成ペプチドの類似体断片内に存在する活性化された細胞との反応性を有するヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖が誘導される。前記増殖性Ｔ細胞は、前記類似体断片が由来する天然ペプチド内に存在する癌細胞と交差反応して、癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こす。また、本発明は、ヒトの白血病細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導する方法に関するものである。この方法は、前記した癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導する方法と同様である。
【００２２】
本発明は、ヒトにおけるヘテロクリティック反応を誘導する方法に関するものである。ヒト免疫細胞を活性化させるために、ここに記載された免疫原性組成物はヒトに投与される。このことにより、ここに記載された合成ペプチド（免疫原性組成物を有している）の類似体断片に存在する活性化細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖が誘導される。前記細胞傷害性Ｔ細胞は、前記類似体断片が由来する天然ペプチドに存在する癌細胞と交差反応して、前記ヘテロクリティック免疫反応が引き起こされる。また、本発明は、ヒトにおける、白血病細胞に対するヘテロクリティック反応を誘導する方法に関するものである。この方法は、前記した癌細胞に対するヘテロクリティック反応を誘導する方法と同様である。
【００２３】
本発明のさらなる態様、特徴、利点、及び長所は、以下に説明する現時点での発明の好適な実施形態から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明のある実施形態では、哺乳類の病態生理学的状態を示す細胞上でＨＬＡ Ａ０２０１又はＨＬＡ Ａ０３０１分子と特異的に結合する天然ペプチドの類似体である断片を少なくとも含んでいるアミノ酸配列を有する合成ペプチドが提供される。この実施形態では、前記類似体断片に含まれるアミノ酸の数は、前記天然ペプチドに含まれるアミノ酸の数の約７０〜１３０％である。前記類似体断片に含まれるアミノ酸の数は、約８〜１２である。
【００２５】
本発明の全ての態様では、前記病態生理学的状態は癌であり得る。前記癌は、白血病（例えば慢性骨髄性白血病）であり得る。或いは、前記癌は、乳癌、リンパ腫癌、中皮腫癌、肺癌、睾丸癌、又は卵巣癌であり得る。さらに、全ての態様では、前記哺乳類は人間であり得る。
【００２６】
さらに、本実施形態の全ての態様では、前記合成ペプチドは、該合成ペプチドと結合する免疫原性担体を含み得る。前記担体の例としては、タンパク質、ペプチド、又は抗原提示細胞がある。タンパク質又はペプチドの典型的な例は、キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、アルブミン、又はポリアミノ酸である。抗原提示細胞の典型的な例は、樹枝状細胞である。
【００２７】
本実施形態のある態様では、前記アミノ酸は、前記類似体断片の分解産物である、前記類似体断片の前駆体を含んでいる。この態様では、前記前駆体は、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質であり、前記類似体断片は前記融合タンパク質の切断点領域をスパン（span）する。または、前記前駆体はＷＴ１であり、前記類似体断片はＷＴ１の天然ペプチドを置換する。
【００２８】
関連する態様では、前記類似体断片は、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質の切断点領域を含んでいる天然ペプチドに由来する。前記天然ペプチドは、ｐ２１０−３１ａ２天然ペプチドである。または、前記天然ペプチドはｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチドであり、前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、又はＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）である。好ましくは、前記アミノ酸配列は、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、又はＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）である。
【００２９】
または、前記天然ペプチドは、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチドであり、前記類似体断片のアミノ酸配列は、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、又はＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）である。好ましくは、前記アミノ酸配列は、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）である。
【００３０】
本実施形態の他の態様では、前記類似体断片は、ＷＴ１タンパク質を含んでいる天然ペプチドに由来する。前記ＷＴ１由来類似体断片の前記アミノ酸配列は、ＹＭＦＰＮＡＰＹＬ（SEQ ID NO: 18）、ＹＬＧＥＱＱＹＳＶ（SEQ ID NO: 20）、ＹＬＬＰＡＶＰＳＬ（SEQ ID NO: 22）、ＹＬＧＡＴＬＫＧＶ（SEQ ID NO: 24）、ＹＬＮＡＬＬＰＡＶ（SEQ ID NO: 26）、ＧＬＲＲＧＩＱＤＶ（SEQ ID NO:28）、ＫＬＹＦＫＬＳＨＬ（SEQ ID NO: 30）、ＡＬＬＬＲＴＰＹＶ（SEQ ID NO: 32）、ＹＭＴＷＮＱＭＮＬ(SEQ ID NO: 34)、ＮＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、又はＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）である。
【００３１】
本発明の関連する実施形態では、ＹＬＫＡＬＱＲＰＶ（SEQ ID NO: 2）、ＫＱＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 4）、ＫＬＳＳＫＡＬＱＶ（SEQ ID NO: 5）、ＫＬＬＱＲＰＶＡＶ（SEQ ID NO: 7）、ＴＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 9）、ＹＬＦＫＱＳＳＫＶ（SEQ ID NO: 10）、ＬＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 12）、ＬＴＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 13）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＬ（SEQ ID NO: 14）、ＹＬＩＮＫＥＥＡＶ（SEQ ID NO: 15）、又はＹＬＩＮＫＶＥＡＬ（SEQ ID NO: 16）の内の１つ以上のアミノ酸配列を有する合成ペプチドが提供される。または、ＮＭＹＱＲＮＭＴＫ（SEQ ID NO: 36）、ＮＭＨＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 37）、ＮＭＹＱＲＶＭＴＫ（SEQ ID NO: 38）、ＱＭＹＬＧＡＴＬＫ（SEQ ID NO: 40）、ＱＭＮＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 41）、ＱＭＹＬＧＶＴＬＫ（SEQ ID NO: 42）、ＦＭＹＡＹＰＧＣＮＫ（SEQ ID NO: 44）、ＦＭＣＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 45）、ＦＭＹＡＹＰＦＣＮＫ（SEQ ID NO: 46）、ＫＬＹＨＬＱＭＨＳＲ（SEQ ID NO: 48）、ＫＬＳＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 49）、又はＫＬＹＨＬＱＭＨＳＫ（SEQ ID NO: 50）の内の１つ以上のアミノ酸配列を有する合成ペプチドが提供される。
【００３２】
他の関連する実施形態では、治療効果がある量の請求項１に記載の合成ペプチド又は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡと、薬学的に許容される担体とを含んでいる医薬組成物が提供される。本実施形態のある態様では、前記医薬組成物は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡを含んでおり、前記ＤＮＡはベクター又は抗原提示細胞内に挿入される。抗原提示細胞の例としては、樹枝状細胞がある。
【００３３】
本実施形態のある態様では、前記合成ペプチドを含んでいる類似体断片は、ｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチド、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチド、又はｐ１９０−ｅ１ａ２天然ペプチドに由来する。これらの類似体断片のアミノ酸配列は、上記したｐ２１０−ｂ３ａ２及びｐ２１０−ｂ２ａ２由来類似体のアミノ酸配列と同じである。本実施形態の関連する態様では、前記合成ペプチドを含んでいる前記類似体断片は、ＷＴ１タンパク質を含んでいる天然ペプチドに由来する。これらのＷＴ１由来類似体断片のこれらのアミノ酸配列は、上記したＷＴ１由来類似体断片のアミノ酸配列と同じである。
【００３４】
また、本発明の他の実施形態では、免疫効果がある量の、上記した合成ペプチドと、薬学的に許容される担体、補助剤、希釈剤、又はそれらの組み合わせとを含んでいる免疫原性組成物が提供される。前記担体は、前記合成ペプチドと結合する、タンパク質、ペプチド、又は抗原提示細胞であり得る。前記タンパク質又はペプチド担体の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、アルブミン、又はポリアミノ酸がある。前記抗原提示細胞の例としては、樹枝状細胞がある。前記合成ペプチド、及び前記合成ペプチドを含んでいる類似体断片は、上記した通りである。本実施形態のある態様では、前記類似体断片は上記した天然ペプチドから由来し、前記アミノ酸配列は上記した医薬組成物のアミノ酸配列と同じである。
【００３５】
本発明の他の実施形態では、癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するための方法が提供される。この方法は、前記免疫細胞を活性化させるためにヒト免疫細胞を上記した合成ペプチドと接触させるステップと、前記合成ペプチドの前記類似体断片に少なくとも存在する前記活性化された細胞と反応する前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するステップとを含んでおり、前記増殖性Ｔ細胞は、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する前記癌細胞と交差反応して、前記癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすことができる。
【００３６】
この実施形態では、前記方法は、前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡを作成するステップと、前記ＤＮＡを発現させるステップとをさらに含む。前記ＤＮＡは、適切なベクターに挿入される。または、前記ＤＮＡは、抗原提示細胞に挿入される。抗原提示細胞の例としては、樹枝状細胞がある。
【００３７】
この実施形態のある態様では、前記ヒト免疫細胞は癌患者の生体内で接触する。関連する態様では、前記ヒト免疫細胞はドナーの生体内で接触し、前記方法は、前記ドナーから前記細胞傷害性Ｔ細胞を取得するステップと、前記細胞傷害性Ｔ細胞を前記癌患者に注入するステップとを更に含む。
【００３８】
他の態様では、前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、前記方法は、前記ヒト免疫細胞を医薬組成物と接触させる前に、ドナーから前記ヒト免疫細胞を取得するステップと、細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導する前に、前記免疫細胞を癌患者に注入するステップとを更に含む。関連する態様では、前記ヒト免疫細胞は体外で接触し、前記方法は、前記ヒト免疫細胞を接触させる前に、ドナーから前記ヒト免疫細胞を取得するステップを更に含む。この態様では、前記ヒト免疫細胞の接触と、前記細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖との両方は体外で行われる。そして、前記細胞傷害性Ｔ細胞は癌患者に注入される。
【００３９】
この実施形態の全ての態様では、ヒト免疫細胞の典型例は、末梢血単核細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージである。前記合成ペプチド、及び前記合成ペプチドを含む類似体断片は、上記した通りである。この実施形態のいくつかの態様では、前記合成ペプチドを含む類似体断片は、上記したｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチド、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチド、ｐ１９０−ｅ１ａ２天然ペプチド、又はＷＴ１天然ペプチドに由来する。さらに、これらの合成ペプチド又は前記合成ペプチドを含んでいる類似体断片のアミノ酸配列は、上記したｐ２１０−ｂ３ａ２、ｐ２１０−ｂ２ａ２又はＷＴ１に由来する類似体断片の場合と同様である。
【００４０】
関連する態様では、ＷＴ１類似体断片、及びｐ２１０−ｂ３ａ２又はｐ２１０−ｂ２ａ２に由来する類似体断片は、白血病細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こす。白血病細胞の典型例は、慢性骨髄性白血病細胞である。他の関連する態様では、ＷＴ１類似体断片は、乳癌、リンパ腫癌、中皮腫癌、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こす。
【００４１】
本発明の別の実施形態では、人間の癌を治療する方法が提供される。この方法は、ここに記載された医薬組成物を人間に投与するステップと、前記合成ペプチドの前記類似体断片を少なくとも認識する細胞傷害性Ｔ細胞によって、前記類似体断片が由来する前記天然ペプチドに存在する癌細胞に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすステップとを含み、前記細胞傷害性Ｔ細胞が前記癌細胞を認識して死滅させることによって、癌を治療する。
【００４２】
前記合成ペプチド、又は前記合成ペプチドをエンコードしているＤＮＡは、上記した通りである。この実施形態のいくつかの態様では、前記合成ペプチドを含んでいる類似体断片は、上記したｐ２１０−ｂ３ａ２天然ペプチド、ｐ２１０−ｂ２ａ２天然ペプチド、ｐ１９０−ｅ１ａ２天然ペプチド、又はＷＴ１天然ペプチドに由来する。さらに、前記合成ペプチド、又は前記合成ペプチドを含んでいる類似体断片のアミノ酸配列は、上記したｐ２１０−ｂ３ａ２、ｐ２１０−ｂ２ａ２又はＷＴ１に由来する類似体断片の場合と同様である。
【００４３】
ある態様では、少なくとも、前記合成ペプチドを含んでいるＷＴ−１類似体断片及びｐ２１０−ｂ３ａ２又はｐ２１０−ｂ２ａ２由来類似体断片は、白血病を治療する。白血病の典型例は、慢性骨髄性白血病である。他の態様では、少なくとも、前記類似体断片が合成ペプチドを含んでいるＷＴ−１は、乳癌、リンパ腫癌、中皮腫癌、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌を治療する。
【００４４】
関連する実施形態では、人間におけるヘテロクリティック免疫反応を誘導する方法が提供される。この方法は、免疫効果がある量の上記した免疫原性組成物を人間に投与するステップと、前記免疫原性組成物によって前記ヒト免疫細胞を活性化するステップと、前記免疫原性組成物を含んでいる前記合成ペプチドの類似体断片に少なくとも存在する活性化された細胞に対するヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導するステップとを含む。この方法では、前記ヒト細胞傷害性Ｔ細胞が、前記類似体断片が由来する天然ペプチドに存在する癌含有細胞と交差反応することによって、ヘテロクリティック免疫反を引き起こす。
【００４５】
この実施形態のある態様では、前記人間は、活性癌を有する、癌は寛解期にある、又は癌が発病する危険性がある。この実施形態の他の態様では、活性癌の患者にヒト細胞傷害性Ｔ細胞を提供する人間は、癌は寛解期にある又は癌が発病する危険性がある。
【００４６】
この実施形態のいくつかの態様では、前記医薬組成物、前記ヒト免疫細胞、及び前記合成ペプチド又は前記合成ペプチドを含んでいる類似体断片は、上記した通りである。ある態様では、少なくとも、合成ペプチドを含んでいるＷＴＩ由来類似体断片及びｐ２１０−ｂ３ａ２又はｐ２１０−ｂ２ａ２由来類似体断片は、人間の白血病に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こす。白血病の典型例は、慢性骨髄性白血病である。他の態様では、少なくとも、ＷＴ−１由来類似体断片は、人間の乳癌、リンパ腫癌、中皮腫癌、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こす。
【００４７】
また、天然ペプチドの類似体断片を少なくとも含んでいるアミノ酸配列を有する合成免疫原性ペプチドが提供される。この合成免疫原性ペプチドは、天然ペプチドのＨＬＡ Ａ０２０１又はＨＬＡ Ａ０３０１複合体との結合を向上させる。これらの合成ペプチド又は類似体断片は、Ｔ細胞が天然ペプチドと交差反応するのを促進することができる。このことにより、天然ペプチド内に存在する細胞を認識又は死滅させるヘテロクリティック免疫反応を引き起こすことができる。そのような細胞は、これに限定されるものではないが、例えば癌などの病態生理学的状態の特性を示す。少なくとも、合成ペプチドを含んでいる類似体断片は、類似体断片を天然ペプチド自身ではなくＴ細胞に提示することに関与するＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩ分子とより高い親和力で結合する。
【００４８】
合成ペプチド類似体断片は、アンカー又は置換残余での、１つ又は２つのアミノ酸の置換によってデザインされる。また、特にここに記載された天然ペプチドは、アンカー又は置換残余を含む九量体である。類似体は、天然ペプチド内に、約７０〜１３０％のアミノ酸を持つようにデザインされる。本発明では、合成ペプチド類似体は、約８〜１２個のアミノ酸を有している。そのような置換は、生物情報モデル系（bioinformatic model system：BIMAS）によって測定される。前記生物情報モデル系は、結合を予測するのにマトリックスアプローチを使用し、予測されるＨＬＡ分子への結合に基づいてペプチドをランク付ける。ＨＬＡ Ａ０２０１及びＨＬＡ Ａ０３０１と結合するアミノ酸配列及び結合の予測値は、オンラインソフトウエアであるＢＩＭＡＳ及びＳＹＦＰＥＩＴＨＩによって生成される。前記ＢＩＭＡＳは、http://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin/molbio/ken parker comboformから入手できる。また、前記ＳＹＦＰＥＩＴＨＩは、http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/から入手できる。
【００４９】
前記合成ペプチドは、前記合成ペプチドの分解産物である類似体断片の前駆体であり得る。前記前駆体は、ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質であり、前記合成類似体は前記融合タンパク質の切断点領域を補う。または、前記前駆体はＷＴ１タンパク質であり、前記類似体断片はＷＴ１内の天然ペプチド配列を置換する。
【００５０】
さらに、前記合成ペプチドは、慢性骨髄性白血病において新生組織形成に必要な発癌性タンパク質であるｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質の切断点領域の類似体である類似体断片である（又は前記類似体断片を含む）。前記合成ペプチドは、ｐ２１０−ｂ３ａ２、ｐ２１０−ｂ２ａ２、及びｐ１９０−ｅ１ａ２の結合配列に由来する類似体断片である（又は前記類似体断片を含む）。より好ましくは、前記合成ペプチド又は前記類似体断片は、ＨＬＡ Ａ０２０１キー結合位置でペプチドに単一アミノ酸置換又は二重アミノ酸置換が導入されるｐ２１０−ｂ３ａ２及びｐ２１０−ｂ２ａ２に由来する。これらの高親和性ペプチド類似体断片は、特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を天然ペプチドよりもはるかに効率良く生成することができ、白血病細胞に存在する天然配列と交差反応するヒトＣＤ８＋ＣＴＬヘテロクリティック反応を促進することができる。
【００５１】
好ましい合成ペプチド又は類似体断片は、ｐ２１０−ｂ３ａ２類似体 ｐ２１０Ｃ、ｐ２１０Ｄ、ｐ２１０Ｅ、及びｐ２１０Ｆであり、より好ましくは、ｐ２１０Ｃ、及びｐ２１０−ｂ２ａ２類似体ｂ２ａ２ Ａ３、ｂ２ａ２ Ａ４、及びｂ２ａ２ Ａ５であり、最も好ましくは、ｂ２ａ２ Ａ３である。表１は、天然及び合成類似体のアミノ酸配列及び結合予測を示す。ｂ３ａ２における下線を引いたＫ、及び、ｂ２ａ２における下線を引いたＥは、切断点のアミノ酸である。強調された残基は、天然配列からの修飾を示している。
【００５２】
表１：ｂｃｒ−ａｂｌ融合タンパク質のＨＬＡ ０２０１天然ペプチド、及び合成ペプチド類似体
【表１】
2007516966.tif 000002
【００５３】
合成免疫原性ペプチドは、類似体断片であり得る、又はＷＴ１タンパク質由来の類似体断片を含む。ここに記載されたコンピュータ予測分析は、ＨＬＡ Ａ０２０１結合で単一アミノ酸置換が導入され、Ａ０３０１結合位置で単一又は二重アミノ酸置換が導入されるＷＴ１タンパク質のnonamer配列由来の合成ペプチド類似体を予測する。これらの合成ペプチド類似体又は類似体断片は、ＣＤ８＋又はＣＤ３＋Ｔ細胞を天然ペプチドよりもはるかに効率良く生成することができ、これらのＷＴ１天然ペプチドに存在する白血病細胞又は他の細胞の天然配列と交差反応するヒトＣＤ８＋又はＣＤ３＋ＣＴＬヘテロクリティック反応を促進することができる。表２及び表３は、天然ＷＴ１及び合成ＷＴ１ペプチド類似体のアミノ酸配列及び結合予測を示す。強調された残基は、天然配列からの修飾を示している。
【００５４】
表２：ＷＴ１由来のＨＬＡ ０２０１天然ペプチド、及び合成類似体
【表２】
2007516966.tif 000003
【００５５】
表３：ＷＴ１由来のＨＬＡ ０２０１天然ペプチド、及び合成類似体
【表３】
2007516966.tif 000004
【００５６】
また、本発明は、治療効果がある量の合成ペプチド或いは類似体断片、又はそれらをエンコードしている遺伝子の配列或いはＤＮＡと、当該技術分野では周知である薬学的に許容される担体とを含んでいる医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、当該技術分野では周知である様々な方法で投与するために、薬学的担体と共に作成される。例えば、前記医薬組成物は、非経口で、経静脈で、皮下に、経皮的に、粘膜内に、局所的に、経口で、又は吸入によって投与される。
【００５７】
そのため、合成ペプチド又は類似体断片又はその医薬組成物は、患者に免疫性を与えるのに適した免疫原性組成物の作成に使用できると考えられる。前記免疫原性組成物は、当該技術分野では周知である、担体又は免疫反応を高めるのに適した補助剤、或いはそれらの組み合わせを含み得る。前記免疫原性組成物は、ここに記載されているように、当該技術分野では標準的な希釈剤をさらに含み得る。前記免疫原性組成物は、ワクチンを含み得る。
【００５８】
担体は、１つ又は複数のタンパク質又はペプチドを含み得る。担体の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole limpet hemocyanin）、アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、又はポリアミノ酸がよく知られている（ただし、これに限定されるものではない）。また、担体は、ここに記載された合成ペプチドを示す樹枝状細胞などの抗原提示生細胞を含み得る。適切な補助剤としては、フロインド（Freund's）アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ミョウバン、ＱＳ２１、ＢＣＧがある。これらの組成物は、薬学的に許容される希釈剤（水、リン酸緩衝生理食塩水、又は生理食塩水）をさらに含み得る。
【００５９】
さらに、合成ペプチド又はその類似体断片をエンコードしている遺伝子配列は、裸のＤＮＡとして、当該技術分野では周知の適切な方法によって個人に送達される。または、前記遺伝子配列は、弱毒化ウイルスや細菌ベクターなど（ただし、これらに限定されるものではない）の当該技術分野では標準的な適切なベクターに組み込まれる又は挿入される。さらに、前記裸のＤＮＡ、又は前記遺伝子配列又はＤＮＡを含んでいるベクターは、抗原提示細胞（例えば樹枝状細胞など）に形質導入される。前記遺伝子配列、ＤＮＡ、ベクター、又は形質導入された抗原提示細胞は、治療を必要としている患者、又は健康なドナーに導入されとすぐに、遺伝子配列をエンコードしているＤＮＡは合成ペプチドを発現し、細胞傷害性Ｔ細胞反応を引き起こす。ドナーＴ細胞は、その後、それを必要としている患者に注入される。
【００６０】
薬学的又は免疫原性組成物は、例えば癌などの疾患や病気を治療するのに使用される。
前記医薬組成物を含んでいる前記合成ペプチド又は類似体断片の投与は、癌細胞上で発現した天然ペプチドに対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こし、そのことによって効果的な治療結果が得られる。慢性骨髄性白血病では、ｂｃｒ−ａｂｌタンパク質の切断点領域の天然ペプチド、及びＷＴ１タンパク質の天然ペプチドは、白血病細胞上で発現する。ＷＴ１天然ペプチドは、他の白血病細胞上、又は他の固形腫瘍の癌性細胞上で発現する。そのような癌としては、乳癌、リンパ腫癌、中皮腫癌、肺癌、睾丸癌、及び卵巣癌などがある（ただし、これらに限定されるものではない）。
【００６１】
合成ペプチド或いはその合成類似体断片、又はそれをエンコードしている遺伝子配列、又はその医薬組成物或いは免疫原性組成物は、癌細胞（例えば白血病細胞）に対するヘテロクリティック免疫反応を引き起こすことができると考えられる。ヒト免疫細胞を、合成ペプチドである又は合成ペプチドを含んでいる類似体断片と少なくとも接触させると、前記免疫細胞が活性化し、合成ペプチドに存在する細胞を認識する又は細胞と反応するヒト細胞傷害性Ｔ細胞の形成及び増殖を誘導する。ヒト細胞傷害性Ｔ細胞は、類似体断片が由来する天然ペプチドに存在するヒト細胞と交差反応し、ヘテロクリティック反応を引き起こす。
【００６２】
当業者なら、「接触」という用語は、その後の免疫反応を誘導するために、標的免疫細胞を活性化するという意味だと認識する。免疫原は、任意の適切な送達方法によって標的Ｔ細胞に接触させられる。生体内又は生体外では、このことは、適切な培地内で前記免疫原に対して前記標的Ｔ細胞を露出させることにより実現される。インビボの場合は、ここに記載されたように、任意の周知の投与方法が適切である。
【００６３】
したがって、ここに記載された合成ペプチド又はその類似体断片は、生体外又は生体内でＴ細胞を活性化させるのに使用される。インビボでは、合成ペプチド或いはその類似体断片、又はそれをエンドードしているＤＮＡは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するために、患者又は健康ドナーに投与される。ドナーに投与した場合は、それらの細胞傷害性Ｔ細胞はドナーから得られ、それを必要としている個人（癌が活発である、癌が寛解期にある、又は癌が発症する危険性がある個人）に注入される。
【００６４】
生体外の場合は、Ｔ細胞は患者又は健康ドナーから得られ、Ｔ細胞を活性化させるために、抗原提示細胞及び合成ペプチド又は少なくともそれの類似体断片の存在下で培養される。活性化されたＴ細胞は、その後、患者に注入して戻され、天然ペプチドに存在する細胞を認識及び／又は破壊する。または、ヒト免疫細胞は、合成ペプチド又は少なくともその類似体断片と共に培養される。そして、その後すぐに、活性化された免疫細胞は患者に注入されて戻され、活性化された細胞及び天然ペプチドに存在する細胞の両方に対してのＴ細胞の生成を誘導する。免疫細胞の例としては、末梢血単核単球細胞、骨髄細胞、樹枝状細胞、又はマクロファージがある。
【００６５】
さらに、合成ペプチド或いは少なくともその類似体断片、又はその医薬組成物の投与は、被験者内での免疫反応、好ましくはＣＤ８／ＨＬＡ Ａ又はＣＤ３／ＨＬＡ ＡクラスＩ免疫反応（ただし、これらに限定されるものではない）を誘導すると考えられる。合成ペプチド又は少なくともその類似体断片は、ＨＬＡ分子（慢性骨髄性白血病などの白血病）に存在する病態生理的病状又は病気に対して、被験者に免疫性を与える方法に使用できる。また、ＷＴ１合成ペプチド又はその類似体断片は、他の白血病又は癌（胸部、リンパ腫、中皮腫、肺、睾丸又は卵巣癌など）の患者の免疫反応を誘導するために使用できる。ここに記載される、患者に「免疫を与える」又は「免疫付与」は、完全及び部分的な免疫付与を含んでいる。したがって、患者は病気に対して完全に免疫になる、又は病気に対して部分的に免疫になる。患者は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００６６】
患者は、免疫付与前に、活発な又は寛解期にある病気又は疾患を持っている。または、前記病気又は疾患が発病する危険性がある場合は、患者はその発病前に免疫付与される。当業者なら、患者のリスクを決定するために、環境リスク要因や個人リスク要因（家族歴、遺伝子構造、習慣）などのリスク要因を評価することができるであろう。
【００６７】
医薬組成物及び免疫原性組成物は、治療又は免疫効果を得るために、１回又は複数回投与される。当業者なら、１回投与の場合でも複数回投与の場合でも、投与量を容易に決定できるであろう。適切な投与量は、患者の健康状態、病気の進行又は回復状態、投与経路、及び使用される剤形に応じて決定される。
【００６８】
次の実施例は、本発明の様々な実施形態を説明するためのものである。ただし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００６９】
（実施例１：合成ペプチド）
【００７０】
この研究で使用される各ペプチドは、Genemed Synthesis Inc（CA）から購入した。ペプチドは、フルオレニルメトキシカルボニル化学反応、固相合成、及び高速液体クロマトグラフィーによる精製によって合成される。ペプチドの品質は、高速液体クロマトグラフィー分析によって評価される。また、予想される分子量は、マトリックス支援プラズマ脱離質量分析法によって観察される。ペプチドは殺菌され、純度は＞９０％である。ペプチドは、ＤＭＳＯ内に溶解され、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（phosphate-buffered saline：PBS）又は生理食塩水によって５ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈され、−８０℃で保存される。インビトロでの実験では、無関係の対照ペプチド、ＨＬＡ Ａ２４コンセンサスを使用した。
【００７１】
（実施例２：細胞株）
【００７２】
細胞株は、５％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、及び２−メルカプトエタノールが追加されたＲＰＭＩ １６４０培地内で、３７℃、５％のＣ０２を含んでいる加湿空気中で培養される。ＳＫＬＹ−１６は、ＨＬＡ Ａ０２０１を発現するヒトＢ細胞リンパ腫である。また、Ｔ２は、ヒト細胞株であり、ＴＡＰ１及びＴＡＰ２を欠いているために、サイトゾルタンパク質由来のペプチドを提示することができない。
【００７３】
（実施例３：ＨＬＡ Ａ０２０１分子のペプチド結合及び安定性のＴ２評価）
【００７４】
Ｔ２細胞（ＴＡＰ−、ＨＬＡ Ａ０２０１＋）は、２７℃、１×１０Ｅ６細胞／ｍｌで、５μｇ／ｍｌのヒトβ２ｍ（Sigma, St Louis, MO）が加えられた、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地上で一晩培養される。培養は、様々な最終濃度（５０、１０、１、０．１μｇ／ｍｌ）の正の対照であるチロシナーゼペプチド或いはテストペプチドの存在下で、又は存在しない状態（すなわち負の対照）で行われる。５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Sigma）と培養した４時間後、Ｔ２細胞は飽和濃度の抗ＨＬＡ−Ａ２．１（ＢＢ７．２）ｍＡｂによって標識化され（４℃、３０分間）、その後２回洗浄される。そして、前記細胞は、飽和濃度のＦＩＴＣ結合ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ´）２抗マウスＩｇ（Caltag, South San Francisco, CA）によって培養され（４℃、３０分間）、その後２回洗浄される。そして、前記細胞は、ＰＢＳ／１％ パラホルムアルデヒドに固定されFACS Calibur細胞蛍光光度計（Becton Dickinson, Immunocytometry systems, San Jose, CA）を使用して分析される。
【００７５】
各ペプチド濃度で観察された蛍光の平均強度（mean intensity of fluorescence：MIF）は、ペプチドが存在しない場合に観察されたＭＩＦを引き算した後、ペプチド結合を推定するのに使用される。安定性の分析も、同様にして行われる。時間ゼロで最初のペプチド結合の評価を行った後に、細胞は、フリーペプチドを除去するために、ＲＰＭＩ完全培地内で洗浄される。そして、前記細胞は、０．５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの継続的な存在下で、２、４、６、及び８時間培養される。安定したペプチド−ＨＬＡ−Ａ２．１複合体の量は、上記したように、間接的な免疫蛍光分析によって推定される。前記複合体の半減時間は、時間ゼロでの蛍光値の平均強度が５０％減少するのに必要と推定される時間である。
【００７６】
（実施例４：放射免疫競合分析：Competition Radioimmunoassay）
【００７７】
標的Ｔ細胞は、１％のウシ血清アルブミン（Fisher Chemicals, Fairlawn, NJ）を含むＰＢＳ内で２回洗われる。細胞は、氷上で１０７／ｍｌで再懸濁され、ペプチドと結合された天然ペプチドの表面は、３ｍｇ／ｍｌのベータ２ミクログロブリンの存在下でクエン酸塩−リン酸緩衝液を使用して、０℃で２分間裸にされる。ペレットは、３ｍｇ／ｍｌのベータ２ミクログロブリン及び３０ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼの存在下で、ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ内で、５〜１０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁される。そして、２００ｍｌのアリコートは、ＨＬＡ特異的ペプチドと共に、２０℃で１０分間培養される。
【００７８】
１２５Ｉ標識化されたペプチドの結合は、競合する標識化されていないペプチドの有無に関わらず、２０℃で３０分間行われる。結合された１２５Ｉの合計は、ＰＢＳ／２％ ＢＳＡを使用した２回の洗浄、及びＰＢＳを使用した１回の洗浄の後に測定される。相対的親和力は、既知の結合ペプチドと対比しての、試験ペプチドの濃度増加の比較によって測定される。ペプチドは、親和力が＜５００ｎＭのものを使用する。
【００７９】
生細胞表面（ＳＫＬＹ−１６）における、ペプチドのＨＬＡへの結合の特異性分析は、結合が適切なＨＬＡ分子に対してなされ、その特性を制限することを確認するために行われる。これは、過度の標識されていない、同じ又は異なるＨＬＡ分子と結合することが知られているペプチドとの比較、同じ又は異なるＨＬＡ型を発現する標識Ｔ細胞の使用を含んでいる。この分析は、生きている新鮮な又は０．２５％パラホルムアルデヒド固定されたヒト末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell：PBMC）、白血病細胞株、及び特異的ＨＬＡ型のＥＢＶ形質転換Ｔ細胞に対して行われる。特異的細胞上でＭＨＣ分子と結合することが知られているペプチドの相対親和性は、関連するＨＬＡ分子（例えば、チロシナーゼ又はＨＢＶペプチド配列）に対する高い親和性が知られている１２５Ｉ標識化されたペプチドに対しての上記した競合分析（competition assay）によって分析される。
【００８０】
（実施例５：インビトロでの免疫付与、及びヒトＴ細胞の培養）
【００８１】
インフォームド・コンセント（informed consent）を得た後、ＨＬＡ Ａ０２０１ポジティブ健康ドナー及び慢性骨髄性白血病患者由来の末梢血単核細胞を、密度勾配遠心法によって取得する。末梢血樹枝状細胞（dendritic cell：DC）は次のようにして作成する。プラスチック付着法を使用して、末梢血単核細胞全体から、単球に富んだ末梢血単核細胞の破片を単離する。プラスチックに付着したＴ細胞は、１〜５％の自己血漿、１０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒトインターロイキン（Shering-Plough, NJ）、及び１０００Ｕ／ｍＬの組み換えヒト顆粒球マクロファージコロニー形成単位（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor：GM-CSF）（Immunex, Seattle）が追加されたＲＰＭＩ １６４０培地内でさらに培養する。
【００８２】
培養の２日目及び４日目に、前記培地の一部を、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦが追加された新鮮な培養培地と交換する。その後、培養は続けられる。６日目に、前記培地の半分を、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、１０μｇ／ｍｌの組み換えヒト腫瘍壊死因子（tumor necrosis factor：TNF）−アルファ（R & D system）、及び、５００ｎｇ／ｍｌの三量体溶性ＣＤ４０Ｌ（Immunex, Seattle）が追加された培養培地と交換する。９日目に、細胞は採取され、抗原刺激用の単球由来樹枝状細胞として使用される。前記細胞は、その細胞の表面上に、例えばＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡクラスＩ及びＩＩなどの発現樹枝状細胞関連抗原を生成する（データは示さない）。
【００８３】
Ｔリンパ球は、抗ＣＤ１１ｂ、抗ＣＤ５６、ＣＤ１９モノクローナル抗体（Miltenyi, CA）による除去を用いた陰性選択によって、同一のドナーから分離される。合計で１ｘ１０Ｅ６の純粋なＴリンパ球は、１ｘ１０Ｅ６の自己樹枝状細胞と培養される。この培養は、２４ウエルのプレート内で、１０μｇ／ｍｌの濃度の合成ペプチドを有する５％の加熱不活性化したヒト自己血漿及び２μｇ／ｍｌのｂ２ミクログロブリンが追加されたＲＰＭＩ １６４０培地内で、５〜１０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＤＮＡＩＬ−７（Genzyme）及び０．１ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１２の存在下で行われる。
【００８４】
３日間培養した後、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２が加えられる。１０日後、１ｘ１０Ｅ６の細胞は、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２、及び１０μｇ／ｍＬの濃度のペプチドと共に、磁気的に単離された自己ＣＤ１４＋ 単球２ｘ１０Ｅ５を添加することによって、再び刺激される。場合によっては、さらに７日間培養した後に、細胞は同様の方法で、３回目の刺激を受ける。２回目又は３回目の刺激後、ＣＤ８Ｔ細胞は磁気的に単離され、細胞毒性及びガンマＩＦＮ分泌が検査される。
【００８５】
（実施例６：ガンマインターフェロンＥＬＩＳＰＯＴ）
【００８６】
ＨＡ−マルチスクリーンプレート（Millipore, Burlington, MA）は、ＰＢＳ内で１００μｌのマウス抗ヒトＩＦＮガンマ抗体（１０μｇ／ｍｌ；クローン１−Ｄ１Ｋ, Mabtech, Sweden）によって覆われ、４℃で一晩培養した後、非結合抗体を除去するためにＰＢＳで洗われ、ＲＰＭＩ／自己血漿によって３７℃で１時間ブロックされる。９５％以上の純度に精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、１ｘ１０５／ウエルの濃度でプレートされる。Ｔ細胞は、１ｘ１０Ｅ４／ウエルのＴ２細胞によって刺激され、１０μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリン（Sigma, St. Louis）、及び５０μｇ／ｍｌのテストペプチド、陽性対照インフルエンザ基質ペプチド、又は無関係の対照ペプチドによってパルスされる（最終量は１００〜２００μｌ／ウエル）。対照ウエルは、ＣＤ８＋細胞の有無に関わらず、Ｔ２細胞を含んでいる。さらなる対照は、培地又はＣＤ８＋のみに加えて、Ｔ２細胞をパルスするのに使用されたペプチドの濃度に対応して希釈されたＰＢＳ／５％のＤＭＳＯを含んでいる。
【００８７】
３７℃で２０時間培養した後に、プレートはＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎにより広範囲にわたって洗浄され、１００μｌ／ウエルの、ヒトＩＦＮ−ｇに対するビオチン化検出抗体（クローン７−Ｂ６−１、Mabtech, Sweden）が２μｇ／ｍｌで添加される。プレートは、３７℃でさらに２時間培養され、スポットの発達が行われる。スポットの数は、ＫＳ ＥＬＩＳＰＯＴ ４．０ソフトウエア（Carl Zeiss Vision, Germany）を用いたコンピュータ使用ビデオイメージ分析器によって、自動的に測定される。
【００８８】
（実施例７：細胞毒性分析）
【００８９】
特異的ＣＴＬの存在は、標準的な４ｈ−クロム遊離分析によって測定した。４ｘ１０Ｅ６の標的は、Ｎａ２51ＣｒＯ４（NEN Life Science Products, Inc. Boston, MA）の３００μＣｉによって標識化した（３７℃で１時間）。洗浄後、２ｘ１０Ｅ６／ｍｌの細胞を、３μｇ／ｍｌのβミクログロブリンの存在下で、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチドと共に又は無しで、２０℃で２時間培養した。遠心分離による洗浄後、標的Ｔ細胞は、５ｘ１０Ｅ４細胞／ｍｌの完全培地内で再懸濁され、エフェクター細胞と共に、Ｅ／Ｔ（effector／target ratio）が１００：１〜１０：１の範囲で、９６ウエルＵ底プレート（Becton Dickinson (TR), NY）に５ｘ１０Ｅ３細胞／ウエルでプレートされた。プレートは、５％のＣＯ２内で、３７℃で５時間培養された。
【００９０】
上澄みを採取し、ガンマカウンターで放射活性を測定した。特異的溶解の割合は、次の式から決定した。
１００×｛（実験的放出−自然的な放出）／（最大放出−自然放出）｝
最大放出は、２．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００内の標的の溶解から判断した。
【００９１】
（実施例８：ＨＬＡ ０２０１と結合する可能性が高いペプチドの識別及び生成）
【００９２】
９５％のＨＬＡ−Ａ０２対立遺伝子を含むサブタイプである、ＨＬＡ Ａ０２０１と結合する潜在能力を有するペプチドの、ヒトｂ３ａ２及びｂ２ａ２融合タンパク質のアミノ酸配列をスキャンした。ＨＬＡ−Ａ０２０１は、白人集団の約４０％で発現した。天然ｂ３ａ２又はｂ２ａ２融合タンパク質内では、ペプチドの予測される半減時間の１分以上では、高い又は中間の親和性を有するペプチドは同定されなかった。コンセンサスＨＬＡ ０２０１結合モチーフを示さないペプチドが説明されたが、それのＭＨＣに対する親和力は弱い。
【００９３】
この情報に基づいて、及びhttp://bimas.dcrt.nih.gov/cgi-bin!molbio/ken parker comboformから入手可能なBioinformatics & Molecular Analysis Section（National Institutes of Health, Washington, DC）のソフトウエアを使用して行う。このソフトウエアは、ＨＬＡクラスＩ分子からの予測される半減時間分離係数（predicted half-time dissociation coefficient）で、９−ｍｅｒ又は１０−ｍｅｒペプチドをランク付けする（Pinilla, et al. Curr Opin Immunol, 11(2): p. 193-202 (1999)）。類似体ペプチドは、予測される半減時間の１分間以上アンカーアミノに隣接する、アミノ酸配又はさらなるアミノ酸の一方又は両方の変化によってデザインされる。１つ又は２つのアミノ酸置換は、ＨＬＡ Ａ０２０１分子について予測される比較的高い結合スコアを有する配列を生成するための位置１，２，６及び９での好ましい残基（表１）であるＨＬＡ Ａ０２０１で行われる。
【００９４】
ＨＬＡ Ａ０２０１結合するための予測される半減時間は、４つの合成ペプチドでは２４０分以上であり、７つの合成ペプチドでは２４０分未満である。全ての天然ペプチドの半減時間は１時間未満であると予想される。ほとんどの置換は、主要な又は第２のアンカーモチーフ、すなわち位置２にあるロイシン、又は位置９或いは位置６にあるバリンに影響を与える（しかし、場合によっては、位置１でチロシンが置換される）。この置換は、位置２のアンカー残基の結合を安定させることが知られている。
【００９５】
（実施例９：ｂ２ａ２及びｂ３ａ２天然ペプチドの合成ペプチド類似物によるＨＬＡ Ａ０２０１の結合）
【００９６】
ＭＨＣクラスＩ−制限ペプチドの免疫原性は、生細胞表面にあるＭＨＣクラスＩ分子と結合する及び安定させる能力を必要とする。さらに、上記のコンピュータ予測モデルの予測精度は、６０〜８０％にすぎない。ペプチドとＨＬＡ Ａ０２０１分子との間の相互作用強度の直接的な測定は、抗原輸送不完全（ＴＡＰ２−）ＨＬＡ Ａ０２０１ ヒトＴ２細胞を用いる従来の結合及び安定性分析を使用して行われる。Ｔ２細胞欠乏ＴＡＰ機能及びその結果は、シトソル内で生成された抗原ペプチドを有する適切な挿入クラスＩ分子のローディングに不具合がある。体外から加えられた、不耐熱性でＨＬＡ−Ａ２分子が空のペプチドはそれらを安定させ、特異的ｍＡｂ（例えばＢＢ７．２）によって認識されるＨＬＡ Ａ０２０１表面のレベルを増加させる。
【００９７】
高い結合スコアを有するようにデザインされたペプチドの１１の内の７つは、Ｔ２分析（図１Ａ−１Ｂ）によって測定すると、ＨＬＡ Ａ０２０１分子に対して比較的高い結合親和性を示す。結合スコアと結合親和力との間のおおよその相互関係が確立された。したがって、生細胞においてＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドを予測するために、コンピュータで作成された結合スコアの部分的な有用性を示す。こららのペプチドの内のいくつかは、結合親和力は、ＣＴＬを引き起こす最も強力な既知の抗原であるインフルエンザなどのウイルス抗原の結合親和力と同じオーダーであることを実証する。４つの場合で、コンピュータで予測された半減時間と、Ｔ２安定化との間の良好な相互関係は見られなかった。
【００９８】
ｂ３ａ２，ｐ２１０Ｃ由来のペプチドの１つは、予測スコアが良好でなかったペプチドから突然変異したものである。しかしながら、天然配列は、ＨＬＡ Ａ０２０１と弱くではあるが、前述したＣＭＬＡ２ペプチドと同じレベルで結合可能である。ｐ２１０Ｃをデザインするために、位置２にある中性アラニンはロイシンによって置換され、位置９にあるセリンはバリンによって置換される。
【００９９】
ｐ２１０Ｃは、Ｔ２結合分析データ（図１Ａ）と相関関係がある高いＢＩＭＡＳスコアを持っている。ｐ２１０Ｃは、以前にYotondaらによって開示された配列に由来するペプチドである。ＣＭＬＡ２は、弱いバインダーであることがＴ２分析によって分かっている。ｐ２１０Ｆの場合は、位置１及び２にある２つのセリンは、チロシン及びロイシンによって置換される。ＢＩＭＡＳ予測は、７００フォルドの向上を示し、ＨＬＡ Ａ０２０１分子（図１Ａ）への優れた親和性が明らかになっているＴ２細胞と結合する。
【０１００】
ｂ２ａ２由来のペプチドの１つは、ＨＬＡ Ａ０２０１への良好な結合を予測できないペプチドから全て生成される。３つのペプチドｂ２ａ２ Ａ３−Ａ５（表１）は、ＨＬＡ Ａ０２０１分子（図１Ｂ）と良好に結合する。これら３つのペプチドは、位置１及び２においてチロシン−ロイシン配列置換を有しており、位置６及び９においてバリン置換を有している。
【０１０１】
（実施例１０：ＨＬＡ Ａ０２０１由来のｂ２ａ２及びｂ３ａ２合成ペプチド類似体の解離時間の評価）。
【０１０２】
ペプチド抗原の免疫原性は、ＭＨＣ／ペプチド複合体の低い解離速度に依存する。ＨＬＡ Ａ０２０１とｂ３ａ２類似体ペプチドとの間に形成された複合体の安定性は、Ｔ２細胞上で長期にわたって測定された。飽和量のＨＬＡ Ａ０２０１結合ペプチド及びヒトβ２ ミクログロブリンとのＴ２細胞の一晩の培養により、ＨＬＡ Ａ０２０１分子の表面発現は増加する。ペプチドの除去、及びタンパク質の合成を抑制するためのにブレフェルジンＡを添加した後、Ｔ２細胞は３７℃で培養する。そして、細胞表面でのＨＬＡ Ａ０２０１分子の量を、様々な培養後の時間に測定する。
【０１０３】
各ペプチド／ＨＬＡ Ａ０２０１複合体の安定性は、その後、親和性及び半減時間が高いことが知られているチロシナーゼＤペプチド又はＨＩＶ−ｇａｇペプチドに見られる安定性と比較して、正常化する。ペプチドｐ２１０Ａ及びｐ２１０Ｂと共に形成されたＨＬＡ Ａ０２０１複合体は不安定であり、３７℃での培養で、１時間以内に基礎濃度に達する。対照的に、ペプチドｐ２１０Ｃ、ｐ２１０Ｄ、ｐ２１０Ｅ及びｐ２１０Ｆは、６〜８時間は比較的安定的である複合体を形成する。
【０１０４】
（実施例１１：ｂ２ａ２及びｂ３ａ２合成ペプチド類似体に対するＣＤ８免疫反応の誘導）。
【０１０５】
ＭＨＣ分子の親和性はペプチド免疫原性に必要なので、適切なＴ細胞受容体を有する反応性前駆体Ｔ細胞の存在が必要とされている。単球由来ＤＣ、ＣＤ１４＋細胞（ＡＰＣなど）、及び精製されたＴ細胞を有する、最適化されたＴ細胞エクスパンション・システムを使用して、合成ｂ３ａ２及びｂ２ａ２類似体のペプチド特異的ＣＴＬを刺激する能力を試験した。１０の健康的なＨＬＡ Ａ０２０１ドナーと、５人のＣＭＬ患者について試験を行った。
【０１０６】
１０人中５人の患者は、免疫付与に応答して、異なるペプチドをパルス化された標的としてのＴ細胞と接触したときにＩＦＮガンマを分泌するＴ細胞を生成する。ｐ２１０Ｄ及びｐ２１０Ｅは、ある試験されたドナーで免疫反応を生成する。また、ｐ２１０Ｃ及びｐ２１０Ｆは、より一致及び高い免疫反応を生成する（図２Ａ）。応答は、ＣＤ８＋を単離した後のペプチド刺激の２番目又は３番目のときに、又は精製されたＣＤ３＋Ｔで見られる。
【０１０７】
スポット数は、Ｔ２分析で測定したところ、ＨＬＡ ０２０１分子と高い親和性で結合するペプチドよりも常に高い。さらに重要なのは、新規な合成類似体の存在下で作成されたＴ細胞は、天然配列を認識することができる。ｐ２１０Ｃ及びｐ２１０Ｆは、それらの各天然配列を認識するために、Ｔ細胞を刺激することができる（図２Ａ）。ｐ２１０Ｆ由来の天然配列であるＣＭＬ Ａ２は、天然の弱いバインダーであり、慢性骨髄性白血病芽球の表面に自然に発現できるという間接的な証拠がある。異なるドナーを使用したのにも関わらず、ｐ２１０Ａ及びｐ２１０Ｂに対する免疫反応は全く生成されない。結果は、ＭＨＣに対する親和性の減少と一致する。
【０１０８】
慢性期の慢性骨髄性白血病患者ＨＬＡ Ａ０２０１は、Ｔ細胞のｐ２１０Ｃ刺激に反応して、Ｔ細胞のｐ２１０ｃｎ天然ペプチドとの交差反応性を示す。応答は、インビトロでのＴ細胞刺激の２回目のときに見られる（図２Ｂ）。
【０１０９】
ｂ２ａ２由来のペプチドは、ＣＤ３＋ Ｔ細胞のガンマ・インターフェロン分泌によって測定すると、大きな免疫反応を示す。ペプチドｂ２ａ２ Ａ３、Ａ４及びＡ５は、２つの健康的なドナーで免疫反応を生成する（図３Ａ）。ｂ２ａ２ Ａ３に対する反応は、ドナー間でより安定している。ｂ２ａ２ Ａ３の存在下で生成されるＴ細胞は、オリジナルの天然配列を同定することができる。天然ペプチド配列はＨＬＡに対する弱い／中間のバインダーなので、これは特に関連性がある。繰り返すと、慢性期のＣＭＬ患者ＨＬＡ Ａ０２０１は、Ｔ細胞のｂ２ａ２ Ａ３刺激に反応して、ｂ２ａ２ Ａ天然ペプチドによるＴ細胞交差反応性を示す（図３Ｂ）。
【０１１０】
ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴは、機能的な致死と常に関連しているわけではない。そのため、類似体ペプチドからいくつかの刺激を得るＴ細胞株は、ペプチドによってパルス化された標的Ｔ細胞系を使用した、従来のクロム５１分析でテストされる。ｐ２１０Ｃ（図４Ａ）及びｂ２ａ２ Ａ３（図４Ｂ）の存在下で、インビトロで生成されたＴ細胞は、特異的ペプチドによってパルス化されたＴ２細胞系を死滅させることができるが、ペプチドなしでは又は対照ペプチドでは死滅させることができない。この実験は、それぞれｂ３ａ２又はｂ２ａ２転座を示す、慢性骨髄性白血病細胞系又はＣＭＬ芽球に対応したＨＬＡを使用しても行われる。大きな細胞毒性が生成され、天然ペプチドが自然に処理されない及び／又は白血病細胞の表面上に十分に発現しない可能性を高める。
【０１１１】
（実施例１２：ＷＴ１癌タンパク質由来の合成ペプチド類似体による、ＨＬＡ Ａ０２０１及びＡ０３０１の結合）。
【０１１２】
ＴＡＰ １／２ネガティブ細胞株（Ｔ２）を使用した熱安定化分析、及び、Ｒａｊｉ Ａ０３０１細胞を使用した修正プロトコル（modified protocol）は、ＨＬＡ Ａ０２０１又はＡ０３０１分子に対する良好なバインダーであると予測されるいくつかのペプチドが、ＭＨＣクラスＩ Ａ０２０１又はＡ０３０１分子を安定化させることを示す（表２）。ＷＴ１天然ペプチドよりも良好にＨＬＡ Ａ０２０１と結合することが予測される全ての合成類似体ＷＴ１−Ａ１、Ｂｌ、Ｃｌ、及びＤ１は、ＷＴ１−Ａ、−Ｂ、Ｃ、及びＤと比べると同等の又は向上した結合を示す（図５Ａ）。ＷＴ１−Ｄ１は、対照と同様であるＷＴ１−Ｄよりも、ＨＬＡ Ａ０２０１に対する著しく高いレベルの結合を示す。Ａ３ ＷＴ１−Ａ、−Ｂ、Ｃ、及びＤのＨＬＡ Ａ０３０１結合の比較は、それらの３つの類似体の各々は比較的同様の結合を示す（図５Ｂ〜５Ｅ）。
【０１１３】
（実施例１３：ＷＴ１癌タンパク質由来の合成ペプチド類似体に対するＣＤ８又はＣＤ３免疫反応の誘導）。
【０１１４】
細胞は、主に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＴＮＦアルファ、ＰＧＥ２、及びＣＤ４０Ｌの存在下で生成された、自己単球由来、ペプチドによってパルス化された樹枝状細胞によって刺激される。そして、ＩＬ−２及びＩＬ−７の存在下で、ペプチドによってパルス化されたＣＤ１４＋単球で再度刺激される。２〜４時間の刺激後、ＣＤ８＋ ＣＴＬ株は、ＩＦＮアルファ ＥＬＩＳＰＯＴ、又は、パルス化されたＨＬＡ対応白血病細胞株を利用したクロム遊離分析により評価される（図６Ａ〜６Ｂ）。いくつかの類似体ペプチドは、より強い免疫反応、すなわち天然ペプチドよりもＣＤ８Ｔ細胞前駆体の頻度が増加した反応を生成する（図７Ａ〜７Ｄ）。新規な合成ペプチドにより刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＷＴ１天然ペプチド配列と交差反応し、ＨＬＡに対応する慢性骨髄性白血病芽球（図８Ａ〜８Ｂ）を死滅させる。
【０１１５】
前記した文献は、次の通りである。
（１）Kessler et al. J Exp Med, 185 (4): p. 629-40 (1997).
（２）Dyallet al. J Exp Med, 188 (9): p. 1553-61 (1998).
（３）Valmori et al. J Immunol, 165 (1): p. 533-8 (2000).
（４）Valmori et al. J Immunol, 164 (2): p. 1125-31 (2000). 
【０１１６】
上記の刊行物および特許出願の全ては、ここで言及することにより本明細書の一部とする。
【０１１７】
以上、本発明の実施例を示したが、特許請求の範囲で規定された本発明の精神と範囲から逸脱することなく、その形態や細部に種々の変更を加え得ることは勿論である。したがって、本発明の細部の実施にあたっては、当業者は、開示された実施例に様々な改良を加えることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１Ａ】ｂ３ａ２転座により得られるペプチドを使用したＴ２安定性分析を示す。
【図１Ｂ】ｂ２ａ２転座により得られるペプチドを使用したＴ２安定性分析を示す。
【図２Ａ】ｐ２１０Ｃ及びｐ２１０Ｆペプチドを使用した、健康なＨＬＡ Ａ０２０１ドナーのＣＤ８＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図２Ｂ】ｐ２１０Ｃペプチドを使用した、慢性期ＣＭＬ患者ＨＬＡ Ａ０２０１のＣＤ８＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図３Ａ】ｂ２ａ２ Ａ３〜Ａ５ペプチドを使用した、健康なＨＬＡ Ａ０２０１ドナーのＣＤ３＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図３Ｂ】ｂ２ａ２ Ａ３ペプチドを使用した、慢性期の慢性骨髄性白血病患者のＨＬＡ Ａ０２０１のＣＤ８＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図４Ａ】ｐ２１０Ｃ、ｐ２１０Ｆ及びｐ１９０Ｂペプチドを使用した、健康なＨＬＡ Ａ０２０１ドナー由来Ｔ細胞の細胞毒性分析の結果を示す。
【図４Ｂ】ｂ２ａ２ Ａ３ペプチドを使用した、健康なＨＬＡ Ａ０２０１ドナー由来Ｔ細胞の細胞毒性分析の結果を示す。
【図５Ａ】天然及び合成ＷＴ１ペプチドのＨＬＡ Ａ０２０１細胞への結合を示す。
【図５Ｂ】天然及び合成ＷＴ１ペプチドのＨＬＡ Ａ０３０１細胞への結合を示す。
【図５Ｃ】天然及び合成ＷＴ１ペプチドのＨＬＡ Ａ０３０１細胞への結合を示す。
【図５Ｄ】天然及び合成ＷＴ１ペプチドのＨＬＡ Ａ０３０１細胞への結合を示す。
【図５Ｅ】天然及び合成ＷＴ１ペプチドのＨＬＡ Ａ０３０１細胞への結合を示す。
【図６Ａ】天然及び合成ペプチドによりパルス化されたＴ２細胞に対する健康ＨＬＡ Ａ０２０１ドナーのＣＤ３＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図６Ｂ】天然及び合成ペプチドによりパルス化されたＴ２細胞に対する健康ＨＬＡ Ａ０２０１ドナーの細胞毒性の結果を示す。
【図７Ａ】天然及び合成ペプチドを使用した、健康ＨＬＡ Ａ０２０１ドナーのＣＤ８＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図７Ｂ】天然及び合成ペプチドを使用した、健康ＨＬＡ Ａ０２０１ドナーのＣＤ３＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図７Ｃ】天然及び合成ペプチドを使用した、健康ＨＬＡ Ａ０２０１ドナーのＣＤ３＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図７Ｄ】天然及び合成ペプチドを使用した、健康ＨＬＡ Ａ０２０１ドナーのＣＤ３＋ガンマ・インターフェロンＥＬＩＳＰＯＴの結果を示す。
【図８Ａ】天然ペプチド配列に存在する、ＨＬＡに対応したＣＭＬ芽球に対する、ＨＬＡ Ａ０２０１ドナー由来の合成 ＷＴ１ Ａ１ペプチドによって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した、細胞毒性分析の結果を示す。
【図８Ｂ】天然ペプチド配列に存在する、ＨＬＡに対応したＣＭＬ芽球に対する、ＨＬＡ Ａ０２０１ドナー由来の合成 ＷＴ１ Ａ１ペプチドによって刺激されたＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した、細胞毒性分析の結果を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007516966.tif 000027