(57)【要約】  アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー、及び（i）病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は（ii）ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は（iii）抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質を含む複合体は、病原生物又はガンに対する免疫を誘発すること及び／又は治療すること、そして抗原又は免疫原に対する免疫を誘発するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと；
（i）病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は
（ii）ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は
（iii）抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質(agent)
を含む複合体。
【請求項２】
該病原生物が、排他的ではないが主として細胞内生物である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
該病原生物が、マクロファージ起源の細胞及び／又は樹状細胞などの他の抗原提示細胞において存在及び／又は持続する細胞内生物である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
該病原生物が以下の生物から選択される、請求項１に記載の複合体：
ａ）白癬；輪癬；鵞口瘡を含む表在性真菌症；でん風、マラセチア毛包炎、脂漏性皮膚炎、及びスキタリジウム症(Scytalidium Infection)を含むマラセチア感染；外耳道真菌症；及び角膜真菌症を引き起こす生物；
ｂ）Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａを含む侵入性及び慢性真菌感染を引き起こすＣａｎｄｉｄａ種；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ；例えばＡｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ及びＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種によって引き起こされるムコール症；Ｆｕｓａｒｉｕｍ種；Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ種；ブラストミセス症；Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種；Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ種；例えばＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ｖａｒ．  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍによって引き起こされるヒストプラズマ症；例えばＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ｖａｒ．  ｄｕｂｏｉｓｉｉによって引き起こされるアフリカヒストプラズマ症；例えばＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓによって引き起こされるブラストミセス症；例えばＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓによって引き起こされるコクシジオイデス症；例えばＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓによって引き起こされるパラコクシジオイデス症；及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉによって引き起こされる感染；
ｃ）例えば結核菌、異型結核菌、及びライ菌などのマイコバクテリウムファミリーのメンバーによって引き起こされる、例えば結核及びハンセン病等のマイコバクテリア症を引き起こす生物；
ｄ）例えばＳｃｈｉｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍｅｋｏｎｇｉ等の住血吸虫症を引き起こすＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａファミリーのメンバー；
ｅ）例えばセロタイプＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのサルモネラファミリーのメンバー等のチフス及びパラチフス熱を引き起こす生物；
ｆ）例えばＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉなどのトキソプラズマ症を引き起こす生物；
ｇ）例えばＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ又はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅなどのヒトアフリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物；
ｈ）例えばＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉなどのアメリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物；
i）例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅなどのマラリアを引き起こす生物；
ｊ）ＨＩＶ及びＨＴＬＶ感染を引き起こす生物；
ｋ）Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ感染を引き起こす生物。
【請求項５】
該病原生物がリーシュマニア症を引き起こす、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
該物質が、請求項２〜５のいずれか１つに定義される生物を殺す又は崩壊することができる、該病原生物に対する薬理学的活性を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
該薬理学的活性物質がアンフォテリシンＢである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
抗原又は免疫原が、結核、破傷風、炭疽、コレラ、ジフテリア、麻疹、耳下腺炎、風疹、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、帯状疱疹、灰白髄炎、狂犬病、痘瘡、黄熱、水痘、帯状疱疹、単純ヘルペス、インフルエンザ又はリーシュマニア症を引き起こす生物から直接的又は間接的に由来する、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
抗原又は免疫原がインフルエンザ菌タイプＢ，髄膜炎菌、百日咳菌、肺炎連鎖球菌、又はチフス菌から直接的若しくは間接的に由来する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
抗原又は免疫原が請求項２〜６のいずれか１つに定義される生物から直接的又は間接的に由来する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
抗原又は免疫原が自然源から得られる、又は組換えＤＮＡ技術若しくは化学合成、若しくは前記方法のいずれか１つ以上によって作製される、請求項１、請求項９又は請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
ガンに対する薬理学的活性を有する該物質が細胞障害剤である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
薬学的に好適なキャリアと混合して又はそれとともに、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の複合体を含む薬学的製剤。
【請求項１４】
送達システムアジュバントを含む、請求項１３に記載の薬学的製剤。
【請求項１５】
薬剤としての使用のための請求項１〜１４のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１６】
病原生物による感染の治療における使用及び／又は病原生物に対する免疫応答の誘発のための複合体であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む、複合体。
【請求項１７】
病原生物による感染をこのような治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー及び該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１８】
該病原生物に対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
該病原生物が請求項２〜５のいずれか１つに定義される、請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の複合体又は方法。
【請求項２０】
該病原生物に対する薬理学的活性を有する該物質が、請求項６に定義されるものである、請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の複合体又は方法。
【請求項２１】
リーシュマニア症の治療及び／又はその臨床的形態のいずれかであるリーシュマニア症を引き起こす生物に対する免疫応答を誘発するための、請求項１６〜１８のいずれか１つに記載の複合体又は方法。
【請求項２２】
リーシュマニア症を引き起こす生物に対する薬理学的活性を有する物質がアンフォテリシンＢである、請求項２１に記載の複合体又は方法。
【請求項２３】
該免疫応答が病原生物に対する治療用及び／又は予防用ワクチン接種を含む、請求項１６〜２２のいずれかに記載の複合体又は方法。
【請求項２４】
ガンの治療における使用のための複合体であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む、複合体。
【請求項２５】
ガンをその治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２６】
ガンに対する免疫応答を、その必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
該ガンに対する薬理学的活性を有する物質が細胞障害剤である、請求項２４〜２６のいずれか１つに記載の複合体又は方法。
【請求項２８】
該免疫応答が該ガンに対する治療用及び／又は予防用ワクチン接種を含む請求項２４〜２７のいずれか１つに記載の複合体又は方法。
【請求項２９】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマーと抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質を含む、該抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発するための複合体。
【請求項３０】
抗原又は免疫原に対する免疫応答を被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該抗原又は免疫原を含む複合体の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
該抗原又は免疫原がそれに対する防御免疫応答が必要である生物から直接的又は間接的に由来する、請求項１０〜１２のいずれか１つに記載の複合体又は方法。
【請求項３２】
該抗原又は免疫原が請求項８〜１１のいずれか１つに定義される、請求項２９又は３０に記載の複合体又は方法。
【請求項３３】
該免疫応答が該病原生物に対する治療用及び／又は予防用ワクチン接種を含む、請求項２９〜３２のいずれか１つに記載の複合体又は方法。
【請求項３４】
該病原生物による感染の治療及び／又は該病原生物に対する免疫応答を誘発するための、病原生物に対する薬理学的活性を有する物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
【請求項３５】
病原生物による感染をその治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
該病原生物に対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
該免疫応答が、該病原生物に対する治療用及び／又は予防用ワクチン接種を含む、請求項３４に記載のポリマー又は請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該病原生物が請求項２〜５のいずれか１つに定義される、請求項３４〜３７のいずれか１つに記載のポリマー又は方法。
【請求項３９】
該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質が請求項６に定義される、請求項３４〜３８のいずれかに記載のポリマー又は方法。
【請求項４０】
リーシュマニア症の治療及び／又はその臨床形態のいずれかであるリーシュマニア症を引き起こす生物に対する免疫応答を誘発するための、請求項３４〜３７のいずれかに記載のポリマー又は方法。
【請求項４１】
リーシュマニア症を引き起こす該生物に対する薬理学的活性を有する物質がアンフォテリシンＢである、請求項４０に記載のポリマー又は方法。
【請求項４２】
該抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発するための、抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
【請求項４３】
抗原又は免疫原に対する免疫応答をそのような治療の必要な被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該抗原又は免疫原の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
該抗原又は免疫原が請求項３１又は請求項３２に定義される、請求項４２又は４３に記載のポリマー又は方法。
【請求項４５】
該免疫応答が治療用及び／又は予防用ワクチン接種を含む、請求項４２〜４４のいずれか１つに記載のポリマー又は方法。
【請求項４６】
該ガンの治療及び／又は該ガンに対する免疫応答を誘発するための、ガンに対する薬理学的活性を有する物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
【請求項４７】
ガンをその治療の必要な被験体において治療する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４８】
ガンに対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法であって、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該ガンに対する薬理学的活性を有する物質の有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【請求項４９】
該免疫応答が治療用及び／又は予防用ワクチン接種を含む、請求項４６又は請求項４８に記載のポリマー。
【請求項５０】
該ポリマー及び他の物質が一緒に又は別個に投与される、請求項３４〜４９のいずれか１つに記載のポリマー又は方法。
【請求項５１】
該ポリマー及び該薬理学的活性物質が別個に投与される場合、それらが実質的に同時に又は一方が他方の前に投与される、請求項５０に記載のポリマー又は方法。
【請求項５２】
ワクチンの製造における免疫増強アジュバントとしての使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
【請求項５３】
それに対して免疫応答が誘発される抗原又は免疫原を含むワクチンの製造における免疫増強アジュバントとしての使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
【請求項５４】
ワクチン製造のための方法における、免疫増強アジュバントとしてアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーの使用を含む改良。
【請求項５５】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーが、１．７以下の多分散性を有する、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
【請求項５６】
該ポリマーが１．４未満、例えば１．２未満の多分散性を有する、請求項５５に記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
【請求項５７】
血液中に存在する場合に該ポリマーが腎臓を通過する間及び後に実質的に循環血液中に残るような分子量を有する、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
【請求項５８】
該ポリマーが例えば１００．０００以下、例えば１００，００未満、例えば８０，０００以下、例えば７５，０００以下、例えば６５，０００以下、例えば５５，０００以下、例えば４５，０００以下の分子量を有する、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法又はポリマー。
【請求項５９】
該ポリマーが４，０００以上、例えば約５，０００以上、例えば約１０，０００以上、例えば約２０，０００以上、例えば約３０，０００以上、例えば約４０，０００以上の分子量を有する、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６０】
該ポリマーが、８０，０００〜４，０００、７５，０００〜５，０００、６５，０００〜１０，０００、５５，０００〜１０，０００、４５，０００〜１０，０００、５０，０００〜４，０００、４０，０００〜２５，０００又は４５，０００〜１０，０００の範囲内の分子量を有する、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６１】
該ポリマーが、ポリマー前駆体の加水分解を含むプロセスによって作製される、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６２】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマーが、アクリル酸由来のユニット中のアクリレートカルボン酸の水素原子の代わりに加水分解によって切断されて酸を与え得る基を有する対応する前駆体ポリマーの加水分解によって作製される、請求項６１に記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６３】
加水分解によって切断され得る基が、例えば適切な脱離基、例えば電子吸引基、例えばアシレーティング基であり、これは好ましくは一般的にＮ−スクシンイミジル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニル、ジニトロフェニル、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ボルニル、シアノメチル、ピリジル、トリクロロトリアジン、５−クロロキノリノ、及びイミダゾリル基から成る群から選択され、好ましくは、Ｎ−スクシンイミジル又はイミダゾリル基、そして特にＮ−スクシンイミジル基であるカルボキシレート活性化である、請求項６２に記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６４】
加水分解が塩基性薬剤、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩基、例えばナトリウム、カリウム、セシウム、カルシウム、マグネシウム、又はリチウム塩基であり、このような塩基は、例えば、水酸化物、炭酸塩又は炭酸水素塩、例えば水酸化ナトリウムであり得る、請求項６１〜６３のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６５】
該ポリマーがポリ（メタクリル酸）又はその塩である、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６６】
該ポリ（Ｎ−メタクリルオキシスクシンイミド）（ＰＭＯＳｕ）が銅媒介原子移動ラジカル重合法を用いてメタクリルオキシスクシンイミドの均質重合によって作製される、請求項６５に記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６７】
該ポリマーが以下のユニット（Ｉ）：
【化１】
2007518732.tif 000019
（式中、Ｒは水素及びＣ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリール、Ｃ６〜Ｃ１８アリール、カルボン酸、Ｃ２〜Ｃ１８アルコキシカルボニル、Ｃ２〜Ｃ１８アルカミノカルボニルから成る群から選択される又は炭素バックボーン中のヘテロ原子で置換された、又は炭素バックボーンに結合したＣ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ７〜１８アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリール、Ｃ６〜Ｃ１８アリール、カルボン酸、Ｃ２〜Ｃ１８アルコキシカルボニル、Ｃ２〜Ｃ１８アルカミノカルボニルのいずれかであり、Ｒ１は、水素とＣ１〜Ｃ６アルキル基から成る群から選択される）である、またはユニット（Ｉ）を含む；及びその塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩）又はアンモニウム塩）
、或いは該ポリマーが以下のユニット（ＩＩ）：
【化２】
2007518732.tif 000020
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、上記のように定義される；Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニレン、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキレン、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリーレン及びＣ６〜Ｃ１８アリーレンから成る群から選択される；Ｌはブロックを連結する２価のリンカーである；ｍ及びｎは各々１又は１よりも大きい整数である。）
である、又はユニット（ＩＩ）を含む、請求項１〜６４のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６８】
該ポリマーが以下ユニット（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）
【化３】
2007518732.tif 000021
【化４】
2007518732.tif 000022
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、Ｌ、ｍ及びｎは上記に定義され、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して各々Ｒ、Ｒ１及びＲ２と同一の基から選択される；Ｑはポリマーを作製するために使用される条件下で切断されない、又は実質的に切断されない基を表す；ｐは、１又は１よりも大きい整数を表す。所望される場合、Ｑはターゲティング基であり得、即ち該ポリマーを細胞タイプ（例えば、マクロファージ）又は器官（例えば肝臓）に標的化する基であり得る。）
である、又はユニット（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）を含む、請求項１〜６４のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項６９】
該ポリマーが原子媒介原子移動ラジカル重合法、例えば、銅媒介原子移動ラジカル重合法を用いてスクシンイミド前駆体の均質重合によって作製される、請求項１〜６８のいずれか１つに記載の複合体、薬学的製剤、方法、又はポリマー。
【請求項７０】
該ポリマーを形成するために、ポリマー前駆体を加水分解することを含む方法（ここで、該加水分解は前記請求項のいずれか１つに定義される成分（i）、（ii）又は（iii）の存在下で行われる）によって作製される、前記請求項のいずれかに記載の複合体。
【請求項７１】
該加水分解が塩基性薬剤、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩基、例えばナトリウム、カリウム、セシウム、カルシウム、マグネシウム、又はリチウム塩基を用いて行われ、このような塩基は、例えば、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、例えば、水酸化ナトリウムであり得る、請求項７０に記載の複合体。。
【請求項７２】
リーシュマニア症に対する薬理学的活性を有する物質とアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを含む、請求項１に記載の複合体。
【請求項７３】
該薬理学的活性物質がアンフォテリシンＢである、請求項７２に記載の複合体。
【請求項７４】
該ポリマーが請求項５５〜７１のいずれか１つに定義されるものである、請求項７２又は７３に記載の複合体。
【請求項７５】
請求項７２〜７４のいずれか１つに記載の複合体を薬学的に好適なキャリア及び必要に応じて送達システムアジュバントとの混合で含む薬学的製剤。
【請求項７６】
その臨床形態のいずれかでのリーシュマニア症の治療における使用のための、請求項７２〜７４のいずれか１つに記載の複合体又は請求項７５に記載の薬学的製剤。
【請求項７７】
リーシュマニア症をその治療の必要な被験体において治療する方法であって、請求項７２〜７４のいずれか１つに記載の複合体又は請求項７５に記載の薬学的製剤の治療有効量を該被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
イントロダクション
本発明は、アジュバント特性を有する複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
病原生物への曝露に対する防御免疫は、免疫応答の２つの異なるアームの統合によって達成される。それらは、自然応答及び抗原特異的（適応とも呼ばれる）応答である。自然免疫応答は、侵入する病原体からの幅広いキューを検出及び応答することによって、感染の後直ぐ（数分以内）に働く。対照的に、適応免疫応答は、効果的になるために時間を要するが（２週間まで）、それは、病原体の完全な排除及び免疫記憶の生成のために必要である優れた抗原特異性を提供する。自然免疫系による病原体の抗原に独立的な認識は、免疫エフェクター及び制御機構の即座の可動化へ導き、宿主に３つの重要なサバイバルアドバンテージ（survival advantages）を提供する：
（i）免疫応答（自然及び適応性の両方）の迅速な開始、及び抗原認識のために必要な炎症及び共刺激環境（co-stimulatory environment）の生成。
（ii）適応応答の成熟化の間に病原体を抑制するための第１ラインの防御の確立。
（iii）特定の感染因子に対する防御にとって最も効果的である細胞性又は体液性エレメントの免疫応答に向けて適応免疫応答を指揮すること。
【０００３】
従って、ワクチン接種の全般的な目的は抗原特異的免疫の活性化であるが、ワクチンは、第１に且つ効果的に自然免疫応答の病原体検出機構を活性化すること無しに、この目的を最適に成し遂げることはできない。
【０００４】
多くのワクチンは抗原及びアジュバントを含む。それらは、それらが同時に投与される抗原のin vivo免疫原性を高めるそれらの作用能力によって広く定義される。従って、アジュバントは、殆どの好結果なワクチン、特に殺された病原体及び／又は組換え抗原の分離したフラクションを含む病原体のサブユニットに基づくワクチンの重要成分に相当する。しかし、自然免疫機構並びに抗原プロセシング及び提示の詳細の益々の理解の結果、新規且つより高性能なアジュバントが要求される。したがって、従来型と新規なアジュバントは現在、送達システムとして働くものと免疫ポテンシエーターとして働くものに次第に分離されている。送達システムの主な機能は、ワクチン成分を抗原提示細胞に局在化させることである一方、免疫ポテンシエーターはＴｏｌｌ様受容体を含む特定の受容体を介して抗原提示細胞を直接的に活性化する。
【０００５】
感染因子と殆どの認可されたワクチン、特に生きた弱毒化及び死んだ全細胞プロダクトは、総合免疫応答を活性化するために必要な成分の全てを含むことに留意することが重要である。それはこのようなワクチンに使用される病原体が微粒子形態（細胞全体として）に関連抗原の全てを有し、それはまた多くの強い免疫モジュレーター（immune modulator）、即ち病原生物関連分子パターン（pathogen associated molecular pattern）を有するからである。しかし、ワクチン開発における動向は、このような製品から高度に精製された組換えタンパク質として生産されるより安全かつより明確なサブユニットワクチンへと移動する。残念ながら、このような組換え抗原は、それらが本質的な免疫増強活性を欠くため、多くの場合十分に免疫原性でない。従って、サブユニットワクチン開発におけるチャレンジは、自然感染又は全病原体細胞ワクチン手法を模倣するために十分であろう自然免疫応答の活性化のための選択シグナルを再導入することである。サブユニットワクチンの効能を改良するために使用される送達システムと免疫ポテンシエーターは、全細胞ワクチンよりも安全且つより効果的、低コストであるべきである。
【０００６】
“送達システム”及び“アジュバント”という用語は、ワクチンに関して一般的に同義的に使用されるが、明確な区別が多くの場合成され得、各々の役割が明確に定義される。ワクチンのリストに含まれる“アジュバント”は、多くの微粒子送達システム、例えば、エマルジョン、リポソーム、イスコム（iscom）、ウイルス様粒子及びミクロ粒子（これらの原理的作用様式は、免疫応答の誘発を担う主要な抗原提示細胞への抗原の送達（delivery）を促進することである。しかし、それらは弱い免疫モジュレーターであり、従ってそれらの有効性は免疫ポテンシエーターの添加によって顕著に改良される必要がある。他に特定されない限り、“アジュバント”という用語はここにおいて免疫ポテンシエーターを表すために使用される。免疫ポテンシエーターとしての新規かつ改良されたアジュバントの開発に対する主なハードルは、新規ワクチンはそれらが臨床用途のために許容可能であるならば、最小数の有害作用を有しなければならないため、安全性である。結果として、多くのアジュバントが広く前臨床的及び臨床的に評価されてきたが、アルミニウム源（総称的に“アラム（alum）”と呼ばれる）のみが北アメリカにおいてワクチンアジュバントとしての使用のために首尾よく認可された。アラムは、細胞障害性ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を生成することにおいて十分でない。それは、優先的に、Ｔｈ１バイアス免疫応答よりもＴｈ２バイアス免疫を誘発する。
【０００７】
免疫増強アジュバントとしての多くの自然病原体関連分子パターン分子（natural pathogen-associated molecular pattern molecules）の使用のための概念の実証は動物において確立されたが、将来への動向は合成アナログを設計することである。これは主に、十分に確立されかつ標準化された合成免疫ポテンシエーターに付随するより低い製造コスト及びより小さな規制ハードルに起因する。
【０００８】
幾つかの合成ポリアニオン性ポリマーが致死量の髄膜ウイルスでチャレンジされたマウスを保護すること、及びネズミ腹腔マクロファージがin vitroでカルボキシレートコポリマー又はその塩に曝露された時に水疱性口内炎ウイルスを抑制する因子を産生したことが早くも１９６８年に示された（Merigan & Finkelstein. Interferon stimulating and in vivo antiviral effects of various synthetic anionic polymers. Virology 1968; 35: 363-374）。
【０００９】
より最近、アルギナート（海藻から単離されたポリマー）がＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６の放出を誘発することが示された（Otterlei M et al. Induction of cytokine production from human monocytes stimulated with alginate. J. Immunother. 1991; 10: 286-291）。アルギナートの１−４−βマンヌロン酸部分もＣＤ１４／Ｔｏｌｌ様受容体４媒介機構を介して単球からのＴＮＦ−αの放出を誘発した。リグニン誘導体及びフコイダンもマクロファージからのＴＮＦ−α放出をイリシット（illicit）する（Sorimachi K et al. Secretion of TNF-αfrom macrophages following induction with a lignin derivative. Cell Biol. Int 1995; 19: 833-838; Heinzelmann et al. Modulation of LPS-induced monocyte activation by heparin-binding protein and fucoidan. Infect. Immun. 1998; 66: 5842-5847）。硫酸化フカン（sulphated fucan）及びデキストラン硫酸塩もブタオザルに注入された時、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、Ｍ−ＣＳＦ及びＧ−ＣＳＦの循環レベルを顕著に上昇することが示された（Sweeney EA et al. Mobilization of stem/progenitor cells by sulphated polysaccharides does not require selection presence. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000; 6: 6544-6549）。
【００１０】
ケモカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６を含む誘導性炎症性（inducible proinflammatory）のケモアトラクティブサイトカインの異種群である。ＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１βを含むβ−ケモカインは、単球、好酸球、好塩基球、及びリンパ球のための化学誘引物質として働く（Luster AD. Chemokines - chemotactic cytokines that mediate inflammation. New Eng. J. Med. 1998; 338: 436-446）。ケモカインのそれらの各受容体への結合は、イノシトール三リン酸の生成、細胞内カルシウム放出及びプロテインキナーゼＣの活性化を含む細胞活性化のカスケードへと導く。従って、ケモカインは走化性を制御する細胞機構を活性化する。従って、それらは白血球のそれらが蓄積する領域への補充及び局所免疫応答の生成における重要な役割を担う。
【００１１】
しかし、上記のポリマーによる炎症性サイトカインの過剰放出は、それらがヒトに安全に投与されるには毒性が強過ぎることを示した。従って、多くのポリマーが免疫モジュレート特性を有することが示されたが、それらの自然源からの単離、単離の再現性、研究所における合成ポリマーの合成、及びそれらが動物に投与された場合のポリマーの毒性に付随した問題のために、それらはヒトにおける治療用途のためには有効に開発されなかった。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと
（i）病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は
（ii）ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は
（iii）抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質
を含む複合体を提供する。
【００１３】
本発明はまた薬学的に好適なキャリアと混合又はそれとともに本発明の複合体を含む薬学的製剤を提供する。
【００１４】
本発明は、薬剤としての使用のための本発明の複合体を更に提供する。
【００１５】
本発明はまた、病原生物による感染の治療における使用及び／又は病原生物に対する免疫応答を誘発するための複合体を提供し、その複合体は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー及び病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む。
【００１６】
本発明はさらに、病原生物による感染をこのような治療を必要とする被験体において治療する方法を提供し、これはアクリル酸及びその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００１７】
本発明はさらに、病原生物に対する免疫応答をその必要性のある被験体において誘発する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の有効量を被験体に投与することを含む。
【００１８】
本発明はさらに、ガンの治療における使用のための複合体を提供し、その複合体はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーとガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む。
【００１９】
本発明はさらに、このような治療の必要な被験体においてガンを治療する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーとガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００２０】
本発明はさらに、ガンに対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分離症分布のポリマーとガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体の有効量を被験体に投与することを含む。
【００２１】
本発明はさらに、抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発するための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質を含む複合体を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、被験体において抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと抗原又は免疫原を含む複合体の有効量を被験体に投与することを含む。
【００２３】
本発明はさらに、病原生物による感染の治療及び／又は病原生物に対する免疫応答を誘発するための病原生物に対する薬理学的活性を有する物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを提供する。
【００２４】
本発明はさらに、病原生物による感染をそのような治療の必要な被験体において治療する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００２５】
本発明はさらに、病原生物に対する免疫応答をその必要のある被験体において誘発する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の有効量を被験体に投与することを含む。
【００２６】
本発明はさらに、抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発するために、抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを提供する。
【００２７】
本発明はさらに、抗原又は免疫原に対する免疫応答をそのような治療の必要な被験体において誘発する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと抗原又は免疫原の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００２８】
本発明はさらに、ガンの治療及び／又はガンに対する免疫応答を誘発するために、ガンに対する薬理学的活性を有する物質との使用のための、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを提供する。
【００２９】
本発明はさらに、そのような治療の必要な被験体においてガンを治療する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーとガンに対する薬理学的活性を有する物質の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００３０】
本発明はさらに、ガンに対する免疫応答をその必要性のある被験体において誘発する方法を提供し、この方法はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーとガンに対する薬理学的活性を有する物質の有効量を被験体に投与することを含む。
【００３１】
本発明はさらに、ワクチンの製造における免疫増強アジュバントとしての使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを提供する。
【００３２】
本発明はさらに、それに対して免疫が誘発されるべき抗原又は免疫原を含むワクチンの製造における免疫増強アジュバントとしての使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを提供する。
【００３３】
ワクチンの製造のための方法において、本発明はさらに、免疫増強アジュバントとしてのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーの使用を含む改良を提供する。
【００３４】
定義
“アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー”という用語はここにおいて、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマー、例えばここに記載されるポリマーの１つは、例えばメタクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマー、例えばポリメタクリル酸又はその塩、例えばそのナトリウム塩を表す。該ポリマーはアクリル酸（例えば、アクリル酸若しくはメタクリル酸又はその塩）のホモポリマー又はコポリマーのいずれかであり得る。
【００３５】
該ポリマーは、狭い分子量分布、特に１，７以下の、例えば１．６以下の、例えば１．５以下の、例えば１．４以下の、例えば１．２以下の、例えば１．７未満の、例えば１．６未満の、例えば１．５未満の、例えば１．４未満の、例えば１．２未満の多分散性を有する。一般的に、多分散性が低い方がより良い。したがって、１．２未満の多分散性が一般的に好ましい。
【００３６】
ポリマーは一般的に、血液中に存在する場合、糸球体装置を介した濾過をポリマーが殆ど又は全く受けないで、ポリマーが腎臓通過後の循環する血液中に実質的に残留するような分子量を有する。大きな分子の腎臓濾過（糸球体濾過としても知られる）は、とりわけ分子のサイズ及び形状（これは部分的に分子量に依存する）の関数である。一般的に、任意の特定ポリマーについて、それ以下で腎臓濾過が起こり、それよりも上で殆ど又は全く腎臓濾過が起こらない、境界分子量又は狭い範囲の分子量が存在する。任意の特定ポリマーについての境界分子量は、例えば放射標識されたポリマーを使用する標準試験によって測定され得る。
【００３７】
一般的な基準として、該ポリマーは一般的に例えば１００，０００以下、例えば１００，００未満、例えば８０，００以下、例えば７５，０００以下、例えば６５，０００以下、例えば５５，０００以下、例えば４５，０００以下の分子量を有する。該ポリマーは一般的に４，０００以上、例えば５，０００以上、例えば１０，０００以上、例えば２０，０００以上、例えば３０，０００以上、例えば４０，０００以上の分子量を有する。ポリマーは、上記に与えられる高い方の分子量値のいずれかと上記に与えられる低い方の分子量値のいずれかを組み合わせる範囲内の分子量を有し得る。このような範囲の例は、８０，０００〜４，０００、７５，０００〜５，０００、６５，０００〜１０，０００、５５，０００〜１０，０００、及び４５，０００〜１０，０００の範囲を含むがこれらに限定されるのではない。更なる例は、５０，０００〜４，０００、例えば４０，０００〜２５，０００の範囲を含む。４５，０００〜１０，０００の範囲の分子量が好まれ得る。
【００３８】
“ＰＭＡＡ−Ｎａ”という用語はここでポリメタクリル酸、ナトリウム塩を表す。そうでないと示されない限り、それは実施例Ａ１〜Ａ４に記載されるように調製されるポリメタクリル酸、ナトリウム塩を表す。
【００３９】
“複合体”という用語はここで、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーとここに定義されるもう１つの物質間の結合を表し、成分間の結合は、主として例えば任意の１つ以上のイオン、静電、ファンデルワールス力を含む非共有結合である。本発明に従った複合体は、大部分が成分間の非共有結合を含むが、それにもかかわらず幾らかの共有結合が存在し得る。
【００４０】
本発明の詳細な説明
上記に開示されるように、本発明は病原生物による感染の治療における、ガンの治療における及び／又は免疫増強アジュバントとしてのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーの種々の使用に関し、そしてまたアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと（i）病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は（ii）ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は（iii）抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質を含む複合体に関する。
【００４１】
本発明は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーが、主要なヒト組織マクロファージ、即ち抗原提示細胞からベータケモカインＭＩＰ−１α及びＭＩＰ−１β及びインターフェロン−γの放出を、また毒性量の炎症性サイトカインの放出を誘発しないで、誘発したという我々の観察に基づく。該ポリマーは高濃度においてヒト細胞に対して毒性がなかった。試験されたポリマーはここに記載される方法に従って作製された。以下の理論に拘束されるのではないが、我々は上記の観察がアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーがＴｏｌｌ様受容体を含む細胞表面の受容体を刺激することによってＴｈ１免疫増強アジュバントとして働くための、即ち、抗原の免疫刺激特性を増強する物質として働くための可能性を有することを示すと考える。
【００４２】
実際我々は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーが本当にＴｈ１免疫増強アジュバントとして働くことを実証した。抗原、即ちツベルクリン精製タンパク質誘導体ＢＰと、ここに記載されるように作製されたメタクリル酸ナトリウム塩ホモポリマー（ＰＭＡＡ−Ｎａ）を含む複合体は、ツベルクリン抗原自体がしたよりも大きいＴリンパ球増殖を引き起こし、そしてまたツベルクリン抗原単独がしたよりも多くＴリンパ球からのインターフェロン−γ分泌を増加した。
【００４３】
従って、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーは、従来のワクチンにおいて使用される抗原及び／又は免疫原、例えば、それに対して治療及び／又は防御ワクチン投与が望まれる生物から直接的に又は間接的に由来する抗原及び免疫原と結合して免疫増強アジュバントとして使用され得る。このような抗原及び免疫原は、例えば、天然源から得られる抗原及び／又は免疫原、即ち関連性のある生物に直接的に由来する、及びサブユニット抗原及び免疫原、及び組換えＤＮＡ技術及び／又は化学合成によって作製される抗原及び免疫原（抗原及び免疫原は関連性のある生物に間接的に由来する）である。該ポリマーは、適切な抗原及び／又は免疫原と共にワクチン組成物中に配合され得る。キャリア及び賦形剤が存在し得、送達システムアジュバントであり得る。該ポリマー並びに抗原及び／又は免疫原は本発明の複合体の形態で使用され得、又は同時投与され得る（以下参照）。
【００４４】
ワクチン及びこのようなワクチンにおける使用のための抗原及び免疫原の例は、ジフテリア、破傷風、チフス、百日咳、麻疹、風疹、耳下腺炎、ポリオ、Ｈ．インフルエンザ（例えばタイプＢ）、髄膜炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、コレラ、狂犬病、（種々の）脳炎、黄熱及びインフルエンザ、並びにこのようなワクチンにおける使用に使用される及び適した抗原及び免疫原を含むがこれらに限定されるのではない。このような抗原及び免疫原は本発明に従って使用され得る。
【００４５】
しかし、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーは、同時投与される抗原及び免疫原に免疫増強効果を有するだけでなく、それは同時投与される抗原又は免疫原が無くても病原生物、例えば、排他的ではないが主に細胞内生物である病原生物、特にマクロファージ起源の細胞及び／又は樹状細胞を含む他の抗原提示細胞中で大部分において存在し且つ持続する生物に対する防御Ｔｈ１免疫応答を促進する能力も有する。これは該ポリマーと病原生物、（例えば、排他的ではないが主に細胞内生物である病原生物、特にマクロファージ起源の細胞及び／又は樹状細胞を含む他の抗原提示細胞中で存在し且つ持続する病原生物）に対する薬理学的活性を有する物質（ここでは“薬剤”と呼ばれる）、特にこのような生物を殺す、そうでなければ崩壊する物質を投与することによって達成され得る。生物を殺す及び崩壊することは、結果として抗原性物質の放出を生じる。該ポリマーの存在は、この変化したミクロ環境にリクルートされた樹状細胞が放出された抗原を吸収し処理するため、抗原に対する免疫応答を増強する。樹状細胞は次いで、エフェクター細胞障害性Ｔ−リンパ球応答の生成を促進するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を開始する。これらの応答の幾つかは、残存する慢性的に感染した細胞中で持続する任意の生物及びまたこのような細胞の環境中の生物に対して治療的に向けられる。他のエフェクター細胞障害性Ｔ細胞応答は、将来的再感染に対する防御ワクチンベースの応答を提供することができる。従って、薬理学的治療、治療ワクチン投与及び防御ワクチン投与が達成される。
【００４６】
従って、本発明はアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー、病原生物による感染の治療における病原生物に対する薬理学的活性を有する物質との使用のための、及び／又は病原生物に対する免疫応答を誘発するための該ポリマーに関する。本発明はまたそのような治療の必要な被験体において病原生物による感染を治療する方法及び／又は病原生物に対する免疫応答を誘発する方法に関し、これはアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を被験体に投与することを含む。
【００４７】
該ポリマー及び薬理学的活性物質は好ましくは本発明の複合体の形態であり、又は代替的に同時投与され得る（以下参照）。
【００４８】
病原体（これに対して免疫応答が誘発される）は、主として細胞内で複製及び／又は存続するもの、特に組織ベースのマクロファージ及び例えば樹状細胞などの他の抗原提示細胞中で複製及び／又は生存するものである。このような生物並びにこのような生物によって引き起こされる疾患及び障害は、以下を含む：
ａ）白癬；輪癬；鵞口瘡；マラセチア感染（でん風、マラセチア毛包炎、脂漏性皮膚炎、及びスキタリジウム症を含む）；外耳道真菌症；及び角膜真菌症を含む、表在性真菌症を引起す生物。
【００４９】
ｂ）Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ及びＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａを含む侵入性及び慢性真菌感染を引き起こすＣａｎｄｉｄａ種；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｌａｖｕｓ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ；例えばＡｂｓｉｄｉａ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ及びＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ種によって引き起こされるムコール症；Ｆｕｓａｒｉｕｍ種；Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ種；ブラストミセス症；Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種；Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ種；例えばＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ｖａｒ．  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍによって引き起こされるヒストプラズマ症；例えば、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ  ｖａｒ．  ｄｕｂｏｉｓｉｉによって引き起こされるアフリカヒストプラズマ症；例えばＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓによって引き起こされるブラストミセス症；例えばＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓによって引き起こされるコクシジオイデス症；例えばＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓによって引き起こされるパラコクシジオイデス症；及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉによって引き起こされる感染。
【００５０】
ｃ）例えば結核菌、異型結核菌、及びライ菌などのマイコバクテリウムファミリーのメンバーによって引き起こされる、例えば結核及びハンセン病等のマイコバクテリア疾患を引き起こす生物。
【００５１】
ｄ）例えばＳｃｈｉｔｏｓｏｍａ  ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ及びＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍｅｋｏｎｇｉ等の住血吸虫症を引き起こすＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａファミリーのメンバー。
【００５２】
ｅ）例えばセロタイプＡ、Ｂ、Ｃ及びＤのサルモネラファミリーのメンバー等のチフス及びパラチフス熱を引き起こす生物。
【００５３】
ｆ）例えばＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉなどのトキソプラズマ症を引き起こす生物。
【００５４】
ｇ）例えばＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅ又はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅなどのヒトアフリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物。
【００５５】
ｈ）例えばＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉなどのアメリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物。
【００５６】
i）例えばＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅなどのマラリアを引き起こす生物。
【００５７】
ｊ）例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２並びにＨＴＬＶ―Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩなどのＨＩＶ及びＨＴＬＶ感染を引き起こす生物。
【００５８】
ｋ）Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ感染を引き起こす生物。
【００５９】
ｌ）例えば内臓型（例えば、カラアザール）又は皮膚型（例えば、Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ及びＬ．ｍｅｘｉｃａｎａ）のリーシュマニア症を引き起こす生物。
【００６０】
このような疾患及び障害を治療するために使用される薬理学的活性物質（薬剤）は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｎｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  ｂｙ  Ｍａｎｄｅｌｌ  Ｇ．Ｌ、Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ．Ｅ．，  ＆  Ｄｏｌｉｎ  Ｒ．  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ．（２０００）．Ｍａｎｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．  ｂｙ  Ｃｏｏｋ  ＆  Ｚｕｍｌａ．  Ｔｗｅｎｔｙ−ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ．  （２００３）、そして更なる薬剤が開発されている。
【００６１】
病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の例は、クロトリマゾール、フルシトシン、フルコナゾール、グリセオフルビン、イトラコナゾール、ケトコナゾール、ミコナゾール、ピラジナミド、シプロフロキサシン、リファンピシン、チアセタゾン、サイクロセリン、クロファジミン、ダプソーン、ロチオナミド（rothionamide）、メトリフォネート、オキサムニキン、プラジカンテル、コ-トリモキサゾール、ピリメタミン、スルファドキシン、スピラマイシン、メラルソプロール、ニフルティモックス、アモジアキン、クロロキン、メフロキン、プリマキン、プログアニル、キニン、ジドブジン、エファビレンツ、インジナビル、リバビリン、ビダラビン、ラバミソール及びアシクロビルを含むがこれらに限定されない。
【００６２】
生成される生物に対する免疫が効果的な“第２ライン”の防御を提供するため、本発明のこの側面に従った使用に関して、治療は好結果的、（即ち、被験体を治療すること又は完全に生物を除去すること）である必要はない。任意の残留生物は、生成されるエフェクター細胞障害性Ｔ−リンパ球応答によって除去される（なぜなら、それらは残る慢性的感染細胞中に生存する任意の生物に対して治療的に向けられるからである）。必要であるのは、幾らかの生物が殺され、それによって抗原を放出することである。本発明の利点の１つは、たとえ治療が生物を完全に除去しなくても、エフェクター細胞障害性Ｔ−リンパ球応答の誘発が将来的再感染に対する防御ワクチンベース応答を提供することである。従って、薬理学的治療、治療用ワクチン及び防御ワクチンが達成される。
【００６３】
同一の考察がガンに適用する。アクリル酸又はその塩由来の狭い分子量分布のポリマーとガンに対する薬理学的活性を有する物質、特にトランスフォームされた、即ち癌性細胞を殺す又は部分的に殺す、そうでなければ崩壊する細胞障害剤を含む本発明の複合体の使用。細胞を殺すこと又は崩壊は抗原性物質の放出を結果として生じ、その幾らかはマクロファージ及び抗原提示細胞によって非自己抗原として“見られる”。該ポリマーの存在は、この変化したミクロ環境中にリクルートされた樹状細胞が放出された抗原を吸収し且つ処理するため、抗原に対する免疫応答を増強する。樹状細胞は次いでフェクター細胞障害性Ｔ−リンパ球応答の生成を促進するＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を開始する。これらの応答の幾つかは他のガン細胞に対して治療的に向けられ、従ってガンの再発及び任意の残留ミクロ転移の増殖に対する防御ワクチンベースの応答を提供する。これらの応答は多数のマクロファージ及び抗原提示細胞が存在するガンについて最も大きい。これはリンパ腫及び白血病において特にそうである。従って、薬理学的治療、治療ワクチン、及び防御ワクチンが達成される。
【００６４】
ガンに対する薬理学的活性を有する物質は当該技術分野においてよく知られており、そして新たな活性剤が開発されている（例えば、Cancer: Principles and practice of oncology. V.T. DeVita, S Hellman & S.A. Rosenburg, Published by Lippincott Williams & Wilkins, 6tth Edition, 2001を参照）。抗癌剤の例は、アクラルビシン、アクチノマイシンＤ、アムサクリン、アザシチジン、ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ヒドロキシウレア、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシンＣ、ミトザントロン、トレスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン及びクリサンタスペース（crisantaspase）を含むがこれらに限定されない。
【００６５】
上記に示されるように、一般的に該ポリマー、病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又はガンに対する薬理学的活性を有する物質（どちらも“薬剤”と呼ばれる）が本発明の複合体の形態で投与されることが好ましい。このような複合体は薬剤のみよりも抗原提示細胞によってより効果的に吸収され、それはまた、薬剤が生物を殺し抗原が放出されるときにポリマーがその場で直ぐにＴｈ１免疫応答を増強するミクロ環境を生成することができるように、薬剤とポリマーの両方が同時に同一細胞中に存在することを確実にする。しかし、該ポリマー及び薬剤は同一の薬学的製剤又は別個の製剤において同時投与され得る。後者の場合、１つの製剤が他方の前に投与され得るが、一般的に２つの製剤を実質的に同時に投与することが好ましい。
【００６６】
一般的に、該ポリマー並びに抗原及び／又は免疫原を本発明の複合体の形態で投与することも好ましい。しかし、該ポリマー並びに抗原及び／又は免疫原は同一の薬学的製剤又は別個の製剤において同時投与され得る。後者の場合１つの製剤は他方の前に投与され得るが、一般的に２つの製剤は実質的に同時に投与することが好ましい。
【００６７】
本発明の複合体は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと
（i）病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は
（ii）ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は
（iii）抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質
を含む。
【００６８】
病原生物、病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、ガンに対する薬理学的活性を有する物質、並びに抗原及び免疫原は例えば上記のものである。
【００６９】
本発明の複合体、即ちアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーは、該複合体と薬学的に適したキャリアを含む薬学的製剤の形態であり得る。製剤は、成分、特に物質（i）、（ii）及び（iii）の性質に依存して、従来の薬学的製剤又はワクチン或いは両方であり得、又はとしてみなされ得る。免疫応答を誘発する使用が目的とされる場合、送達システムアジュバント、例えばアルムも存在し得る。
【００７０】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーが、該物質を有する複合体の形態において投与される代わりに、上記に定義される物質（i）、（ii）又は（iii）と同時投与される場合、該ポリマー及び物質（i）、（ii）又は（iii）は同一の薬学的製剤中に配合され得、又はそれらは別個の製剤中に配合され得、それぞれの場合において薬学的に適したキャリアと混合される。別個の製剤である場合、１つは他方の前に投与され得るが、２つの製剤を実質的に同時に投与することが好ましくあり得る。
【００７１】
上記に示すように、本発明は病原生物によって引き起こされる疾患及び障害並びにガンの従来の薬学的治療とこのような疾患、障害及びガンに対する免疫応答の誘発の両方を包含する。そのような必要性のある被験体において誘発される免疫応答は好ましくは治療的及び／又は予防免疫応答であることが理解される。治療的免疫応答は、疾患又は障害の治療において援助する。このような応答は短期の応答であり得る。予防免疫応答は、例えば疾患又は障害の再発又は後の感染又は再感染、或いはガンのミクロ転移の移転の増殖及び広がりに対するより長期間の保護を提供する。このような応答は多くの場合治療的且つ予防“ワクチン接種”と呼ばれる。
【００７２】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと病原生物に対する薬理学的活性を有する物質の病原生物によって引き起こされた疾患の治療と同時に免疫応答を誘発することにおける使用はリーシュマニア症のケースで例証された。リーシュマニア症に起因する感染は、例えば内臓型（例えば、カラアザール）又は皮膚型であり得る。内臓リーシュマニア症は散在性原生動物感染である。長年の間、従来の療法は２８日間の静脈又は筋肉注射による毎日一度与えられる５価のアンチモニから成る。しかし、１９９０年からインドにおける大規模のアンチモニ治療の失敗が有効な抗リーシュマニア症剤としてアンフォテリシンＢデオキシコレートＢ（ＡｍＢ）の導入へと導いた。９７％の長期治癒率がアンフォテリシンＢの毎日、又はより典型的には一日おきの静脈投与（０．７５〜１ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で全体で１５〜２０の注入）によって得られた。これらの治療の長期経過は、高い病院の負荷と相当の費用が伴う。結果としてこれは、多くの場合起こる付随した悪影響のため、治療計画の不従順又は放棄へ多くの場合導く。
【００７３】
アンフォテリシンＢの脂質ベース複合体は、組織ベースのマクロファージ中に蓄積する。それらはヒトマクロファージ中で増殖し得る多数の酵母及びカビに対して非常に効果的であることが示された。アンフォテリシンＢの脂質配合物は、内臓リーシュマニア症に対する高い効力を有し、それらは５〜１０日間与えられた場合９０％よりも高い治癒率を結果生じることが示された。Ｓｕｎｄａｒ等は短期コース、即ち１．５ｍｇ／ｋｇ／日の注入で毎日投与されるリポソームアンフォテリシンＢ（ＡｍＢｉｓｏｍｅ；Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた５日間の治療が、患者の９３％を治癒したことを示した。別の追跡試験において、リポソームアンフォテリシンＢの５ｍｇ／ｋｇの一回の全投与注入が患者の９１％を治療した。有害なイベントは殆ど無かった（Sundar, S et al. Treatment of Indian visceral leishmaniasis with single or daily infusion of low dose liposomal amphotericin B: a randomised trial. Brit. Med. J. 2001; 323: 419-422. Sundar, S. et al. Single-dose liposomal amphotericin B in the treatment of visceral leishmaniasis in India: a multicenter study. Clin. Inf. Dis. 2003: 37; 800-804）。従って、単回投与リポソームアンフォテリシンＢ治療はインドにおける内臓リーシュマニア症の治療において安全且つ効果的と考えられ得る。しかし、単回投与でさえ治療は高価であり、現実的な不都合は脂質ベースアンフォテリシンＢ配合物が、特に内臓リーシュマニア症の多くの事例が起こる熱帯の高温において長期間の保存中安定でないことである。
【００７４】
リーシュマニア症における回復及び寄生体クリアランスを促進する免疫応答は、インターフェロンガンマ媒介Ｔｈ−１応答が優位を占める。マクロファージはリーシュマニアを効率的に摂食するが、それらは該生物の摂食によって活性化されない；結果として炎症性ケモカイン、炎症性サイトカイン、及びインターフェロンγは放出されない。マクロファージと対照的に、樹状細胞はリーシュマニア寄生体を吸収し、成熟し、次いで細胞免疫応答の発達を促進する。動物モデルにおいて、感染したマクロファージが活性化され得る場合、寄生体の殺傷が続くことが示された。従って、２つの異なるプロセス、即ち抗原プロセシング及び細胞成熟／活性化が効果的な細胞ワクチン応答のために組み合わせられなければならない。微生物によって実証されるように、抗原性成分及び樹状細胞活性化／成熟成分の両方を保持する物質は、樹状細胞をＴｈ１媒介応答へと進ませ得る。脂質ベースアンフォテリシンＢ配合物は免疫調節性又はアジュバント活性を有しない。
【００７５】
本発明に従ったポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）（ＰＭＡＡ−Ｎａ）とアンフォテリシンＢの複合体が実施例で詳細に説明されるように調製され試験された。複合体は以下の特有の性質を有することが示された。
ａ）それは静脈投与後のアンフォテリシンＢの肝臓、脾臓、リンパ節への効果的な器官送達を可能にする。これらは、動物及びヒトにおいてリーシュマニアによって主に感染される器官である。
ｂ）それは静脈に与えられた場合、アンフォテリシンＢのリーシュマニア感染したマクロファージへの効果的な細胞内送達を可能にする。
ｃ）アンフォテリシンＢ−ポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）複合体は、リーシュマニア無鞭毛体が生残り、増殖し、残存する細胞内細胞小器官中に蓄積し、これはリーシュマニア無鞭毛体の細胞内殺傷を促進する。
ｄ）内臓リーシュマニア症の動物モデルにおけるin vivo試験は、臨床グレードのアンフォテリシンＢ、商業的なリポソームアンフォテリシンＢ製剤ＡｍＢｉｓｏｍｅ及びアンフォテリシンＢ−ポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）製剤の抗リーシュマニア活性は互いに顕著に異ならないことを示した。アンフォテリシンＢ−ポリ（メタクリル酸、ナトリウム）製剤は、内臓リーシュマニア症の動物モデルにおいて商業的リポソームアンフォテリシンＢ製剤ＡｍＢｉｓｏｍｅと同程度効果的であった。
ｅ）ポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）は組織マクロファージ中のアンフォテリシンＢから放出され、それは次いでβ−ケモカイン及びインターフェロン−γの放出を促進する。これは局所Ｔｈ１アジュバント応答を生成する。
ｆ）ケモカイン及びサイトカイン発現の局所誘発は、自然免疫システムの細胞の該サイトへのリクルートメント及び活性化を促進する。これは未成熟樹状細胞及びＣＤ４＋Ｔリンパ球を含む。これらはマクロファージを刺激して更なるＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６を産生させる。
ｇ）自然免疫システムの活性化は、樹状細胞が成熟し、組織からそれらの新たに放出された抗原が提示される局所リンパ節に移動することを誘発する。これは結果としてＣＤ４＋Ｔ細胞応答及びエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘発及び生成を生じる。
ｈ）従って、抗原提示細胞中のリーシュマニアの殺傷及びＴｈ１促進アジュバントの直ぐ近くにおけるリーシュマニア抗原の後のアベイラビリティーは感染したマクロファージを細胞ワクチンへ変換する。
i）抗原提示細胞の近接性、アンフォテリシンＢの殺傷活性によるリーシュマニア抗原の放出、及び適切且つ局所のＴｈ１サイトカイン／ケモカイン環境の同時促進のため、細胞免疫応答は顕著に促進される。
ｊ）同時発生の疾患の治療及び治療エフェクター細胞免疫応答、即ちワクチン接種の生成は、個体が感染した器官に対する長期の防御免疫を生成する。
ｋ）従って、疾患の治療及び治療ワクチン接種は同時且つ外部アジュバント又は外部源のリーシュマニア抗原を投与する必要なく達成される。
ｌ）単回投与治療は、典型的に１５〜２０の投与を必要とするアンフォテリシンＢと異なって効果的である。
ｍ）製剤は、商業的に利用可能であるリポソームアンフォテリシンＢ製剤よりも特に熱帯で見られるより高い周囲温度でより安定である。
ｎ）ヒトにおいて静脈投与された場合によく見られるフリーアンフォテリシンの毒性は、該製剤が使用される場合最小限に下げられる。
ｏ）アンフォテリシンＢ及びＰＭＡＡ−Ｎａ間の複合体を形成することによって、薬剤の化学的誘導体化が回避される。結果として、リーシュマニア種に対するアンフォテリシンＢの効力は、変化又は低下されない。これは、アンフォテリシンＢの糖部分におけるアミノ基に特に関連する（この基がこの薬剤の薬理学的活性を媒介することにおいて重要であるため）。糖部分のアミンは、その反応性のために結合点として以前に使用された（Conover C.D. et al. Utility of poly (ethylene glycol) conjugation to create prodrugs of amphotericin B. Bioconjugate Chem. 2003; 14: 661-666）。
【００７６】
上記のように、本発明は本発明複合体、即ち薬学的に適したキャリアと混合又はそれとともに、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーを含む薬学的製剤を提供する。
【００７７】
本発明の薬学的製剤は、静脈内、動脈内、リンパ循環中、リンパ節中、経口、腹腔内、局所、口内、直腸、皮膚の表面への、皮内、皮下、筋肉内、関節スペースへの、鼻腔内、硝子体内、又は肺、器官への直接的、器官の周り、器官への注射による、又は器官を通る直接的注入の投与に適した形態であり得る。本発明は、このようなルートのいずれかによる本発明に従ったポリマーの複合体の投与を含む。本発明の薬学的製剤は、デポ又は貯蔵製剤、又はエアゾール製剤の形態であり得る。上記及び他のルートの投与のため適切な配合物は当該技術分野において公知である（例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences by E.W. Martinを参照）また、Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42: 2S, 1988を参照。
【００７８】
本発明の、即ちアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーの複合体は、“結合した微粒子（particulate associated）”であり得る。このような微粒子は、当該技術分野に公知のエマルジョン、均質化、及びスプレー乾燥工程によって作製され得る。このような配合物のレビューのために、例えばHanes J, Cleland JL & Langer R, Adanced Drug Delivery Reviews 28 (1997) 97-119を参照。このような本発明の微粒子結合複合体を含む薬学的組成物は、肺又は鼻ルートで粘膜に、摂取によって、又は非粘膜腸管外ルートによって、特に皮下に、又は筋肉内に、投与され得る。
【００７９】
脂質形態の本発明の薬学的製剤において、該ポリマーの濃度は、例えば０．１〜２，５００μｇ／ｍｌ、例えば１〜５００μｇ／ｍｌであり得る。他の配合物は、例えば脂質製剤に基づいて計算される類似量のポリマーを含み得る。
【００８０】
本発明は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー並びにこのようなポリマーと抗原又は免疫原或いは病原生物又はガンに対する薬理学的活性を有する物質を含む複合体に関する。該ポリマーは、アクリル酸由来（例えばアクリル酸若しくはメタクリル酸又はその塩由来）のユニットを含むホモポリマー又はコポリマーであり得る。アクリル酸由来のユニットを含む幾つかのポリマーは公知である。上記のように、該ポリマーは一般的に狭い分子量分布を有するべきである。多分散性は、例えば１．７以下、例えば１．６以下、例えば１．５以下、例えば１．４以下、例えば１．２以下、例えば１．７未満、例えば１．６未満、例えば１．５未満、例えば１．４未満、例えば１．２未満である。一般的に多分散性が低い程よい。従って、１．２未満の多分散性が一般的に好ましい。従って、１．２未満の多分散性が一般的に好ましい。
【００８１】
該ポリマーは一般的に、血液中に存在する場合、糸球体装置を介した濾過をポリマーが殆ど又は全く受けないで、ポリマーが腎臓通過の間及び後の循環する血液中に実質的に残留するような分子量を有する。大きな分子の腎臓濾過（糸球体濾過としても知られる）は、とりわけ分子のサイズ及び形状（これは部分的に分子量に依存する）の関数である。一般的に、任意の特定ポリマーについて、それよりも低いと腎臓濾過が起こり、それよりも上で殆ど又は全く腎臓濾過が起こらない、境界分子量又は狭い範囲の分子量が存在する。任意の特定ポリマーについての境界分子量は、例えば放射標識されたポリマーを使用する標準試験によって測定され得る。
【００８２】
一般的な基準として、該ポリマーは一般的に例えば１００，０００以下、例えば１００，００未満、例えば８０，０００以下、例えば７５，０００以下、例えば６５，０００以下、例えば５５，０００以下、例えば４５，０００以下の分子量を有する。該ポリマーは一般的に４，０００以上、例えば５，０００以上、例えば１０，０００以上、例えば２０，０００以上、例えば３０，０００以上、例えば４０，０００以上の分子量を有する。ポリマーは、上記に与えられる高い方の分子量値のいずれかと上記に与えられる低い方の分子量値のいずれかを組み合わせる範囲内の分子量を有し得る。このような範囲の例は、８０，０００〜４，０００、７５，０００〜５，０００、６５，０００〜１０，０００、５５，０００〜１０，０００、及び４５，０００〜１０，０００の範囲を含むがこれらに限定されるのではない。更なる例は、５０，０００〜４，０００、例えば４０，０００〜２５，０００の範囲を含む。４５，０００〜１０，０００の範囲の分子量が一般的に好まれ得る。
【００８３】
該ポリマー又は複合体は、循環血液中に適切な時間存続するべきことが一般的に望まれる。当業者に知られるように、適切な時間は多くの要因（複合体の場合、該ポリマーにコンプレックスを形成した物質の性質を含む）に依存する。例としては、該ポリマー又は複合体は、数時間循環中に存続し得、例えば２４時間まで、例えば約４〜６時間から約２４時間までである。
【００８４】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマーは、ユニット（Ｉ）；
【００８５】
【化１】
2007518732.tif 000002
【００８６】
（式中、Ｒは水素及びＣ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリール、Ｃ６〜Ｃ１８アリール、カルボン酸、Ｃ２〜Ｃ１８アルコキシカルボニル、Ｃ２〜Ｃ１８アルカミノカルボニル、又は炭素バックボーン中のヘテロ原子で、又は炭素バックボーンに結合したヘテロ原子で置換されたＣ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリール、Ｃ６〜Ｃ１８アリール、カルボン酸、Ｃ２〜Ｃ１８アルコキシカルボニル、Ｃ２〜Ｃ１８アルカミノカルボニルから成る群から選択され、Ｒ１は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基から選択される）；及びその塩、例えばアルカリ金属塩、例えばナトリウム塩又はアンモニウム塩、
を含むポリマーであり得る。
【００８７】
好ましくは、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルカリール、Ｃ１〜Ｃ６アルキルアミド及びＣ１〜Ｃ６アルキルイミドから成る群から選択される。好ましくは、Ｒは水素、又はメチルである。好ましくはＲ１は、Ｒから独立して、水素又はメチルである。特にＲは水素であり、Ｒ１はメチルである。
【００８８】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含むブロックコポリマーの例は、ユニット（ＩＩ）
【００８９】
【化２】
2007518732.tif 000003
【００９０】
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、上記のように定義される；Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニレン、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキレン、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリーレン及びＣ６〜Ｃ１８アリーレンから成る群から選択される；Ｌはブロックを連結する２価のリンカーである；ｍ及びｎは各々１又は１よりも大きい整数である。）
を含むブロックコポリマーを含む。
【００９１】
好ましくは、Ｒは水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アラルキル及びＣ１〜Ｃ６アルカリール、Ｃ２〜Ｃ８アルコキシカルボニル、Ｃ２〜Ｃ８アルカミノカルボニルから成る群から選択される。最も好ましいＲは水素及びメチルから選択される。
【００９２】
好ましいＲ１は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、又はこれらの異性体から成る群から選択される。最も好ましいＲ１は、水素及びメチルから選択される。
【００９３】
好ましいＲ２は、結合から選択される、又は少なくとも１つの炭素原子又は少なくとも１つのヘテロ原子を含む。
【００９４】
Ｒ２が結合でない場合、Ｒ２は、ＣＲ１に２価の基を介して結合し、好ましくはカルボニル、Ｃ１〜Ｃ１８アルキレン基及び／又はＣ６〜Ｃ１８アリーレン基（これらは１つ以上のヘテロ原子で置換され得る）を含む。好ましいＲ２は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ６〜Ｃ１２アリーレン、Ｃ１〜Ｃ１２オキシアルキレン及びカルボニル−Ｃ１〜Ｃ６アルキレンから成る群から選択される基を含む。Ｒ２がアルキレン基を含む場合、それは分岐を有する、直鎖、又は環状、１つ以上のアルキル基で置換され又は置換されないであり得、好ましくは、メチレン、１，２−エチレン、１，３−プロピレン、ヘキシレン又はオクチレンである。Ｒ２がアリーレン基を含む場合、好ましくは、それはベンジレン、トリレン又はキシリレンである。
【００９５】
好ましくは、Ｒ３基（これは同一又は異なり得る）は、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン基、好ましくは１，２-アルキレン、及びＣ６〜Ｃ１２アリーレン基、最も好ましくはメチレン、エチレン、１，２プロピレン及び１，３−プロピレンから成る群から選択される。好ましくは全てのＲ３は、同一であり、最も好ましくは全てが１，２-エチレン又は１，２−プロピレンである。
【００９６】
Ｌは好ましくはＣ１〜Ｃ１８アルキレン又はＣ６〜Ｃ１８アリーレン基（これらは１つ以上のヘテロ原子で置換及び／又は中断され得る）を含む。好ましいＬは、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ６〜Ｃ１２アリーレン、Ｃ１〜Ｃ１２オキシアルキレン及びＣ１〜Ｃ６アシルから成る群から選択される基を含む。Ｌがアルキレン基を含む場合、それは分枝を有する、直鎖、環状、１つ以上のアルキル基で置換され又は置換されないであり得、好ましくはメチレン、１，２−エチレン、１，２−プロピレン、１，３−プロピレン、ｔｅｒｔ‐ブチレン、ｓｅｃ‐ブチレン、ヘキシレン、又はオクチレンである。Ｌがアリーレン基を含む場合、それは好ましくはベンジレン、トリレン又はキシリレンである。最も好ましくは、Ｌは−ＣＯＲａ基（ここでＲａはＣ１〜Ｃ６アルキレン又はＣ６〜Ｃ１２アリーレン、好ましくはメチレン、１，２−エチレン、１，２−プロピレン、１，３−プロピレン、ｔｅｒｔ‐ブチレン、及びｓｅｃ‐ブチレンから成る群から選択される。
【００９７】
ポリマーはユニット（Ｉ）を組み込むホモポリマーであり得、或いは他のポリマー、オリゴマー若しくはモノマーユニットを組み込むコポリマー又はブロックコポリマーであり得、例えば上記のユニット（ＩＩ）を含むブロックコポリマーである。例えば、ホモポリマー又はコポリマー又はブロックコポリマー中に組み込まれた更なるポリマーユニットは、アクリルポリマー、アルキレンポリマー、ウレタンポリマー、アミドポリマー、ポリペプチド、多糖及びエステルポリマーを含み得る。好ましくはポリマーがヘテロポリマーである場合、更なるポリマー成分はポリエチレングリコール、ポリアコニット酸、又はポリエステルを含む。
【００９８】
例えばユニット（Ｉ）又は（ＩＩ）を有するポリマーはまた、例えば前駆体ポリマーの可溶化を可能にする及び／又は本発明に従って使用されるポリマー中の遊離アクリル酸基（従って塩形成基）の数の制御を可能にする更なるユニットを含み得る。例えば、ユニット（Ｉ）を含むポリマーは、構造（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）
【００９９】
【化３】
2007518732.tif 000004
【０１００】
【化４】
2007518732.tif 000005
【０１０１】
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、Ｌ、ｍ及びｎは上記に定義され、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立的に各々Ｒ、Ｒ１及びＲ２と同一の基から選択される；Ｑはポリマーを作製するために使用される条件下で切断されない、又は実質的に切断されない基を表す；ｐは、１又は１よりも大きい整数を表す。所望される場合、Ｑはターゲティング基であり得、即ちポリマーを細胞タイプ（例えば、マクロファージ）又は器官（例えば肝臓）に標的化する基であり得る。）
を有し得る。
【０１０２】
Ｑは、例えばＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルカリール、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ１２アルカノイル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、又はアミン、ヒドロキシル若しくはチオール基で置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ７〜Ｃ１２アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１２アルカリール、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルアミノ、Ｃ１〜Ｃ１２アルカノイルから成る群から選択され得る。好ましくはＱはアミノ基、例えばＣ１〜Ｃ１２ヒドロキシアルキルアミノ基、例えば２−ヒドロキシプロピルアミノ又はヒドロキシエチルアミノ部分を含む。
【０１０３】
基Ｑは水性溶液中のポリマーのための可溶化基であり得る。たとえば、該ポリマーは水溶性ポリアクリルアミドホモ又はコポリマー、好ましくはポリメタクリルアミド又はポリエタクリルアミドホモ又はコポリマーであり得る。更に、基Ｑがポリマーが作製される条件下で基Ｑが切断されない（又は基Ｑの大部分が切断されない）場合、基Ｑの存在は、ポリマー中の遊離アクリル酸基（従って、塩形成基）の数の制御を可能にする。例えば、前駆体ポリマー中の脱離基Ｘ含有ユニットの数に対するＱ含有ユニットの割合は、選択され得る。脱離基Ｘ含有ユニットの数に対するＱ含有ユニットの相対的割合は、ポリマープロダクト中のアクリル酸又は塩基の数を決定する。以下に記載されるように、ポリマーのポリアニオン性質は、その生物学的活性に影響し得る。従って、ポリマーのイオン性質を操作する能力は所望の特性を有するポリマーの作製において有用である。
【０１０４】
本発明に従った使用のためのポリマー（例えば本発明の複合体を形成するため）は、例えばポリメタクリル酸、例えば１．７以下、例えば１．６以下、例えば１．５以下、例えば１．４以下、例えば１．２以下、例えば１．７未満、例えば１．６未満、例えば１．５未満、例えば１．４未満、例えば１．２未満の多分散性を有するポリメタクリル酸であり得る。一般的により低い多分散性がよい。従って、１．２未満の多分散性が一般的に好ましい。該ポリマーの分子量は一般的に上記の定義セクションで説明される通りである。このようなポリメタクリル酸及びその塩、並びにそれらの生産の例はここにおける実施例中に与えられる。このようなポリメタクリル酸及びその塩は、本発明の実施において特に有用であり得る。
【０１０５】
我々は主要な組織マクロファージ、即ちここに記載されるように作製されたポリメタクリル酸ナトリウム塩（ＰＭＡＡ−Ｎａ）によって誘発された抗原提示細胞からのβケモカイン及びインターフェロンγの放出が、同様の狭い分子量分布を有するメタクリル酸ナトリウム塩ホモポリマーの商業的に入手可能なサンプルでは見られなかったことを見出した。組織マクロファージからのケモカイン及びサイトカインの放出における観察された違いは、ここに記載されるように調製されたＰＭＡＡ−Ｎａと商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａ間の構造的相違であるかもしれないことを示唆する。ここに記載されるように調製されたＰＭＡＡ−ＮａのＭｎは商業的サンプルの１つと類似した（即ち、Ｍｎ〜２２ｋｇ／モル）ため、分子量の影響に起因する免疫学的効果ではないようである。ＰＭＡＡ−Ｎａはポリアニオンである。ポリアニオンの生物学的効果は分子量、電荷密度、及びタクチシティ(tacticity)などの構造特性に依存し得ることが示唆される（Ottenbrite, R., et al., Biological activity of poly(carboxylic acid) polymers., in Polymeric Drugs, L. Donaruma and O. Vogl, Editors. 1978, Academic Press: New York. P. 263-304）。上記及び以下の本発明に従って使用されるポリマーの生物学的活性に関する仮説に拘束されるのではないが、我々はその生物学的データは、記載される特有の生物学的性質を有するＰＭＡＡ−Ｎａを結果生じる構造的詳細を与えるのは調製方法であり得ることを示すと考える。
【０１０６】
ここにおける実施例で使用されるポリマーは、水酸化ナトリウムを用いてポリ（Ｎ−メタクリルオキシスクシンイミド）（ＰＭＯＳｕ）の加水分解によって作製されたポリメタクリル酸、ナトリウム塩である。このような方法及び同様の方法（特に前駆体ポリマーの加水分解を必要とする）は、本発明に従った使用のためのその及び他のポリマーの作製に有用であり得る。
【０１０７】
例えば、本発明に従った使用のためのポリマーは、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩基、例えばナトリウム、カリウム、セシウム、カルシウム、マグネシウム、又はリチウム塩基などの塩基性薬剤を用いた前駆体ポリマーの加水分解を含む方法によって作製され得る。このような塩基は、例えば水酸化物、炭酸塩、又は炭酸水素塩、例えば水酸化ナトリウムであり得る。前駆体ポリマーは、ＰＭＯＳｕであり得、それは他の適切な前駆体ポリマー、例えば以下に記載される前駆体ポリマーであり得る。加水分解は適切な溶媒中で実施される。前駆体ポリマーは一般的に疎水性分子であるため、反応は一般的に有機溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＰＵ又はジメチルアセトアミド中で実施される。加水分解は、例えば周囲温度及び圧力及び緩やかな加熱、例えば４０〜６０℃で例えば２〜１６時間などマイルドな条件下で実施され得、又はより強い条件が使用され得る。
【０１０８】
このような方法によって作製されるポリマーはここに説明されるように作製されるＰＭＡＡ−Ｎａによって実証される生物学的特性の幾らか又は全てに類似する生物学的特性を有し得る。
【０１０９】
ここに記載されるＰＭＡＡ−Ｎａの作製における前駆体ポリマーとして使用されるＰＯＭＳｕはＷＯ０１／１８０８０及びここにおける実施例Ａ４に記載されるように、原子移動ラジカル重合法、特に銅媒介方法を用いたメタクリルオキシスクシンイミドの均質重合によって作製された。作製のためのこのような方法は、本発明に従った使用のためのその及び他の前駆体ポリマーの作製のために有用であり得るが、本発明はこのような方法、このような方法によって作製される前駆体ポリマー、このような前駆体ポリマーから作製されるポリマーに限定されるのではない。
【０１１０】
本発明に従った使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマーは、アクリル酸由来のユニットにおけるアクリレートカルボン酸の水素原子の代わりに加水分解によって切断されて酸を与え得る（例えば、マイルドな加水分解による切断）基を有する対応する前駆体ポリマーの加水分解によって作製され得る。加水分解によって切断され得る基は、例えば適切な脱離基、例えば電子吸引基、アシレーティング基であり、これらは好ましくはカルボキシレート活性化であり、一般的にＮ−スクシンイミジル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニル、ジニトロフェニル、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ボルニル、シアノメチル、ピリジル、トリクロロトリアジン、５−クロロキノリノ、及びイミダゾリル基から成る群から選択され、好ましくはＮ−スクシンイミジル又はイミダゾリル基であり、特にＮ−スクシンイミジル基である。
【０１１１】
加水分解は例えば上記に記載の塩基性薬剤、例えば水酸化ナトリウムを用いて実施され得、そして例えば周囲温度、圧力、及び緩やかな加熱（例えば４０〜６０℃）で例えば２〜１６時間のマイルドな条件下で実施され得る。
【０１１２】
上記のユニット（Ｉ）又は（ＩＩ）を含むポリマーは、ＷＯ０１／１８０８０に記載のポリマー（“前駆体ポリマー”）若しくは類似するポリマー又はＷＯ０３／０５９９７３に記載のポリマー、若しくは類似するポリマーから作製され得る。このような前駆体ポリマーは、以下のユニット（Ｉａ）を含むポリマー及びユニット（ＩＩａ）を含むポリマーを含む。
【０１１３】
【化５】
2007518732.tif 000006
【０１１４】
【化６】
2007518732.tif 000007
【０１１５】
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｌ、ｍ及びｎは上記に定義されるとおりであり、Ｘは脱離基、例えばアシレーティング基を表し、これは好ましくはカルボキシレート活性化であり、一般的にＮ−スクシンイミジル、ペンタクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル、パラニトロフェニル、ジニトロフェニル、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−ボルニル、シアノメチル、ピリジル、トリクロロトリアジン、５−クロロキノリノ、及びイミダゾリル基から成る群から選択され、Ｘは好ましくはＮ−スクシンイミジル又はイミダゾリル基を表す。）
基Ｑを含むユニットを含むポリマー、即ちユニット（ＩＩＩ）を含むポリマー又はユニット（ＩＶ）を含むポリマーは対応する前駆体ポリマー（ＩＩＩａ）又は（ＩＶａ）から作製され得る。
【０１１６】
【化７】
2007518732.tif 000008
【０１１７】
【化８】
2007518732.tif 000009
【０１１８】
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６、Ｌ、Ｑ、Ｘ、ｍ、ｎ及びｐは上記に定義される通りである。ｍ、ｎ及びｐは各々５００までの整数を示し得、好ましくはｍ、ｎ及びｐの合計は約５００以下である。
【０１１９】
前駆体ポリマー、特に本発明に従った使用のためのポリマーを加水分解による切断によって与えるために適した脱離基を含む前駆体ポリマーは、任意の適切な方法、特に狭い分子量分布のポリマー特に狭い分子量分布、たとえば１．７以下、例えば１．６以下、例えば１．５以下、例えば１．４以下、例えば１．２以下、例えば１．７未満、例えば１．６未満、例えば１．５未満、例えば１．４未満、例えば１．２未満を有するポリマーの作製を可能にする任意の方法によって作製され得る。一般的により低い多分散性がよりよい。従って、１．２未満の多分散性が一般的に好ましい。該ポリマーは一般的に上記の定義セクションに記載される分子量を有する。
【０１２０】
所望の多分散性を有するポリマー前駆体は原子移動ラジカル重合法、例えば銅媒介原子移動ラジカル重合によって作製され得、又はフリーラジカル重合を含む他の方法が使用され得る。このような方法は、ＷＯ０１／１８０８０及びＷＯ０３／０５９９７３に記載される。例が以下に与えられる。本発明はまた、このような方法に従って得られ得るアクリル酸又はその塩由来のユニットを含むポリマーも提供する。しかし、本発明はこのような方法によって作製されるポリマーに限定されるのではない。アクリル酸原子を含むユニットを含むポリマー（特に上記に記載の多分散性を有する）を作製するのに適した任意の方法が使用され得る。
【０１２１】
重合が原子移動ラジカル重合によって行われる場合、適切なラジカルイニシエーターが利用される。このようなイニシエーターは、アルキルハライド、好ましくはアルキルブロマイドを通常含む。特に、イニシエーターは２−ブロモ−２−メチル−（２−ヒドロキシエチル）プロパノエートである。重合はまた、Ｃｕ（Ｉ）錯体を含む重合メディエーターの存在下で行われる。このような錯体は、通常キレーティングリガンドによってキレート化されるＣｕ（Ｉ）Ｂｒ錯体である。典型的なメディエーターは、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（Ｂｉｐｙ）２、Ｃｕ（Ｉ）（Ｂｉｐｙ）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（ペンタメチルジエチレン）、Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ［メチル］６トリス（２−アミノエチル）アミン］及びＣｕ（Ｉ）Ｂｒ（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−ペンタメチルジエチレントリアミン）である。
【０１２２】
反応は適切な溶媒の存在下で起こる。このような溶媒は一般的に非プロトン性溶媒であり、例えばテトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、及びスルホラン、並びにこれらの混合物である。代替的に水が使用され得る。特に好ましい溶媒は、ジメチルスルホキシド及びジメチルホルムアミド並びにこれらの混合物である。
【０１２３】
本発明の複合体の生物学的特性に関し、我々は本発明の複合体を作製する異なる方法が複合体の特性に影響し得ることを見出した。予め成形されたポリマーと抗原若しくは免疫原又は病原生物若しくはガンに対する薬理学的活性を有する物質間の複合体を形成するよりもむしろ、抗原若しくは免疫原又は病原生物若しくはガンに対する薬理学的活性を有する物質の存在下でポリマーを形成するために、ポリマー前駆体を特にマイルドな条件下で加水分解することによって本発明の複合体を形成することが有利であると思われる。
【０１２４】
抗原若しくは免疫原又は病原生物若しくはガンに対する薬理学的活性を有する物質の存在下でのポリマー前駆体の加水分解は、一般的に抗原、免疫原又は物質が実質的に悪影響を受けないような条件下で実施されるべきであり、例えば加水分解は一般的にマイルドな条件下で実施されるべきである。例えば条件は、抗原、免疫原又は物質が実質的に分解、低下、又はそうでなければ関連する活性の損失が引き起こされないものであるべきである。
【０１２５】
例えば、抗原若しくは免疫原又は病原生物若しくはガンに対する薬理学的活性を有する物質の存在下でのポリマー前駆体の加水分解は、塩基性薬剤、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩基、例えばナトリウム、カリウム、セシウム、カルシウム、マグネシウム又はリチウム塩基を用いて実施され得る。このような塩基は、例えば水酸化物、炭酸塩又は炭酸水素塩、例えば、水酸化ナトリウムであり得る。加水分解は、適切な溶媒、例えば有機溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＤＭＰＵ又はジメチルアセトアミド中で実施される。加水分解は、例えば周囲温度、圧力、及び穏やかな加熱（例えば４０〜６０℃）のマイルドな条件下で実施され得る。反応は例えば２〜１６時間実施され得る。
【０１２６】
例えば上記に記載されるように、抗原若しくは免疫原又は病原生物若しくはガンに対する薬理学的活性を有する物質の存在下でポリマー前駆体を加水分解することによって本発明に従った使用のためのポリマーを作製することによる本発明の複合体を作製する方法は、複合体がこのような方法によって得られ得るため本発明の一部である。
【０１２７】
本発明の複合体において、該ポリマーと病原生物又は抗原又はガンに対する薬理学的活性を有する物質の間の結合は、主に非共有（即ち、イオン又はファンデルワールス結合）であるが、薬理学的活性物質又は抗原の幾つかの分子は該ポリマーに共有結合で結合し得ることが考えられる。共有結合の程度は薬理学的活性物質又は抗原の性質及び該ポリマーの性質に依存し得る。
【０１２８】
上記に記載されるように、“複合体”という用語は該ポリマーと病原生物又は抗原又はガンに対する薬理学的活性を有する物質の間の結合を表すためにここで使用され、主に非共有であるが幾らかの共有結合を含み得る。
【０１２９】
本発明の複合体は、酸性基を有する高分子電解質である。脱プロトン化の程度は、複合体の環境によって変化し得る。本発明の複合体は塩の形態であり得る。塩は例えば１価、２価、３価、４価対イオンを有し得る。１価対イオンは、例えばアルカリ金属イオン、例えばナトリウム若しくはカリウムイオン又はアンモニウムイオンであり得る。２価対イオンは、例えばアルカリ土類金属イオン、例えばカルシウム又はマグネシウムイオンであり得る。他の対イオンは遷移金属のイオン、例えば鉄、スズなどを含む。１タイプ以上の対イオンが存在及び該ポリマーと結合し得る。更に塩形成基の数及び割合は、例えば上記に記載されるような適切なポリマー前駆体などの使用によって制御され得る。該ポリマーは酸性基、従って負の電荷を有するため、該ポリマーを有する複合体を形成する物質又は作用物質は一般的に反対の電荷に起因する静電力を含む非共有的相互作用による直接的複合体の形成を可能にするための正の電荷を保持することができることが理解される。例えば複合体形成に使用される物質又は作用物質は、塩基性、陽イオン性又は両イオン性の性質を有し得、又はこのような性質を有するように適合され得る。代替的に、特に、所望の物質又は作用物質が、例えば基Ｑとの結合を介して複合体を形成することができるように、基Ｑの適切な選択によって該ポリマー組成を変えることが可能である。
【０１３０】
本発明の一実施形態において、本発明の複合体中に又は抗原若しくは免疫原又は病原生物若しくはガンに対する薬理学的活性を有する物質と結合して使用されるポリマーは、１．４未満、好ましくは１．２未満の多分散性を有するポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）又はその塩、例えばナトリウム塩である。該ポリマーの分子量は一般的に上記定義セクションに記載の通りである。ここにおける実施例に記載される又は実質的に記載されるようにポリマーを作製すること、例えば前駆体ポリマー、例えばＮ−スクシンイミド脱離基を有する前駆体ポリマーを水酸化ナトリウムを用いて加水分解することは有利であり得る。抗原若しくは免疫原又は病原生物若しくはガンに対する薬理学的活性を有する物質を有する複合体をポリマーの作製時（in situ）に形成することが有利であり得る。
【０１３１】
本発明は特に、病原生物に対する、例えばリーシュマニアに対する薬理学的活性を有する物質、例えばアンフォテラシンＢを含む本発明の複合体を含む本発明に複合体、及びこのような複合体を含む薬学的製剤、例えば上記に記載の薬学的製剤、及び病原生物によって引き起こされる疾患又は障害の治療及び／又は上記の病原生物に対する免疫応答を誘発することにおけるこのような複合体の種々の使用に関する。複合体のポリマー成分はアクリル酸又はその塩、例えば上記のポリマー、例えば上記のポリメタクリル酸ポリマー又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーである。
【０１３２】
本発明は特に、アンフォテリシンＢ及び上記のポリメタクリル酸ポリマー又はその塩、特にここにおける実施例に記載されるように作製されたＰＭＡＡポリマー又はその塩を含む複合体を提供し、そのような複合体を含む薬学的製剤、例えば上記の薬学的製剤を提供する。本発明はまた、上記のようにリーシュマニア症を治療すること及び／又はリーシュマニア症を引き起こす病原生物に対する免疫応答を誘発すること（リーシュマニア症に対する治療的及び／又は予防ワクチン接種を達成することを含む）におけるこのような複合体の種々の使用を提供する。
【０１３３】
リーシュマニア症を治療及び／又はリーシュマニア症を引き起こす病原生物に対する免疫応答を誘発すること（リーシュマニア症に対する治療用及び／又は予防用ワクチン接種を達成することを含む）のための代替的方法において、本発明のポリマーと病原生物に対する、例えばリーシュマニア症に対する薬理学的活性を有する物質、例えばアンフォテリシンＢは上記に一般的用語で説明されるように、別個の製剤で同時投与され得る。１つの製剤は他方の前に投与され得るが、一般的に２つの製剤を実質的に同時に投与することが好ましい。
【０１３４】
以下の非制限的実施例は本発明を例証する。
【実施例】
【０１３５】
実施例Ａ１：化学合成：メタクリル酸ナトリウム塩ホモポリマーの調製：
ポリ（メタクリル酸、ナトリウム塩）（ＰＭＡＡ−Ｎａ）２は、水酸化ナトリウムを用いてポリ（Ｎ−メタクリルオキシスクシンイミド（ＰＭＯＳｕ）１の加水分解によって調製された（スキーム１）。
【０１３６】
ＰＭＯＳｕ１は、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）手法を用いてメタクリルオキシスクシンイミド３（スキーム２）の重合によって以前に合成された（Brocchini S. J., and Godwin A., “Uniform molecular weight precursors”, 国際公開番号ＷＯ０１／１８０８０Ａ１＆ＥＰ９９３０７１５２．１（２００１年３月１５日））。
【０１３７】
【数１】
2007518732.tif 000010
【０１３８】
実施例Ａ２：ＰＭＯＳｕ１の合成
【０１３９】
【数２】
2007518732.tif 000011
【０１４０】
メタクリルオキシスクシンイミド３の合成。ジクロロメタン（１２ｍｌ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（６．６ｇ、５７ｍｍｏｌ）に、温度を５℃よりも低く維持しながら、トリエチルアミン（５．８ｇ、５７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１２ｍｌ）と同時に塩化メタクリロイルのジクロロメタン（１２ｍｌ）溶液を滴下した。添加の完了後、反応混合液は更に１時間撹拌され、次いで水性炭酸水素ナトリウム（０．１Ｍ）及び水（３回）で洗浄された。有機相は次いで分離され、硫酸マグネシウムで乾燥された。溶媒はプロダクトを白色固体（これはエチルアセテート：ヘキサンから再結晶された）として残すために除去された。質量８ｇ、ｍ．ｐ．＝１０２℃（１Ｈ，５００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：２．００（３Ｈ，ｓ，ＣＨ３）、２．８４（４Ｈ，ｓ（ＣＨ２）２）、６．０９（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ２），６．３４（１Ｈ，ｓ，＝ＣＨ２）。
【０１４１】
均質重合：この反応はスキーム２に示される。モノマー３で５６％の好ましい重量濃度でＤＭＳＯを溶媒として用いる典型的銅媒介重合において、銅（Ｉ）ブロマイド（３１．３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、２−２’−ビピリジン（Ｂｐｙ）（６８．３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）及びモノマー３（２．００ｇ、１０．９ｍｍｏｌ）が、丸底フラスコに添加され、これは次いでセプタムでシールされた。次いでフラスコ中にＤＭＳＯ（１．３ｇ）が注入された。結果生じるブラウン混合物は、溶液が形成されるまで緩やかに加熱され、次いで約５分間アルゴンでパージされた。ＤＭＳＯ（０．２ｇ）中の２−ブロモ−２−メチル−（２−ヒドロキシエチル）プロパネエート４（４６．１ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のアルゴンでパージされた溶液は、次いで混合物中に注入され、フラスコはオイルバス中で１００℃に加熱された。数分後、反応混合物は粘性になり、１０〜１５分後熱から離され、急速に冷却された。ポリマープロダクトは、粗製プロダクト混合物を溶解するために７〜８ｍｌのＤＭＳＯの添加によって分離され、これはＰＭＯＳｕ１を白色固体として沈殿させるために撹拌されたアセトン溶液（１００ｍｌ）にゆっくりと添加された。アセトン溶液は、銅種及びリガンドの溶解に起因して、ポリマー１の沈殿時に緑色になった。原子吸収分析は、ポリマー１中の銅含量をＤＭＦ中の２８．０ｍｇ／ｍｌの濃度における場合に０．１５３ｐｐｍであると示した。ＤＭＳＯ反応溶液からアセトン中へのポリマー１の沈殿は、ポリマープロダクトから銅を除くための銅媒介重合において典型的に使用されてきたアルミナクロマトグラフィーへの実行可能な代替を提供し得る。ポリマー１の分離された収量は、１．７８ｇ（８９％）であった。数平均分子量は２２，７００ｇ／モルであり多分散性指数は１．２０であった。ＰＭＯＳｕ１についての見かけの分子量及び分子量分布はＧｉｂｓｏｎ１３３屈折率検出器に連結したＷａｔｅｒｓ  ＳｔｙｒａｇｅｌＨＲ４及びＨＲ３（７．３×３００ｍｍ）カラム、ポリ（メチルメタクリレート）ＰＭＭＡ校正標準及び０．１％ＬｉＣｌ溶出剤を有するＤＭＦを使用して測定された。
【０１４２】
重合は、異なる分子量を有する狭いＭＷＤ  ＰＭＯＳｕ１を与えるために、異なる割合のモノマー３及びイニシエーター４を用いて実施された。これらの実験は表１に列挙され、メタクリルオキシスクシンイミド３において２〜６ｇの範囲の反応スケールで実施された。これらのＤＭＳＯ中の均質重合条件はおよそ数分でポリマー１を与えた（例えば、表１の実験６は、狭いＭＷＤポリマー１の相当の収量を与えるために２分後に冷やされた）。
【０１４３】
メタクリルオキシスクシンイミド３における溶液の均質性を３３〜９１％の範囲の溶媒重量率に維持するために、８０〜１３０℃の範囲の温度で重合が実施された。好ましい溶媒はＤＭＳＯであったが、ＤＭＦを用いて同様の結果が得られた。極性溶媒（ＤＭＳＯ又はＤＭＦ）に対するモノマー３の重量割合は重合の結果に非常に重要であった。ＤＭＳＯ中で５６％未満の重量割合のモノマー３（例えば５０及び４１％）は、ポリマーのより低い収率を結果生じた（各々、５２及び４０％）。ＤＭＳＯ中の６０％よりも高いモノマー３重量濃度において、重合溶液は固化した。ＤＭＦ中でも同様に、モノマーの重量濃度は重合反応の結果に非常に重要であったが、ＤＭＦにおける最大収量は、ＤＭＳＯにおけるよりも低かった。ポリマー１の５０％収率はモノマー３：ＤＭＦの重量割合６１％において分離された。反応が３３％のモノマー３の重量割合で実施された場合、ポリマーは分離されなかった。より高いモノマー重量濃度において（７５％よりも高い）反応混合物は固化した。
【０１４４】
【表１】
2007518732.tif 000012
【０１４５】
（ａ）初期モノマーと初期イニシエーター濃度の比
（ｂ）ＤＭＳＯを用いた希釈及び急速な冷却によって２．５分後に反応を停止した。
（Ｂ）沈殿重合：ＴＨＦ、酢酸エチル、トルエン及びアセトンなどの溶媒中のモノマー３の銅媒介重合はまた、狭いＭＷＤポリマー１を与えた。ポリマーの分子量に依存して収率は１０〜９５％の範囲であった。より高い分子量のポリマー１（２５，０００ｇ／モルまで）がＴＨＦと炭酸エチレンなどの混合溶媒系中に得られた。１０，０００ｇ／モルよりも高い分子量において収率は時々、重合がＤＭＳＯ又はＤＭＦ中で実施された場合に見られたものよりも低かった。例証的な０．５ｇモノマー１を使用する銅媒介重合は、７０℃で１６時間以上ＴＨＦ中で実施され、表２に列挙される。これらのＴＨＦ反応で使用される銅キレートレジェンドは、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）であった。さらなる沈降反応がイニシエーターとして使用される２−ブロモ−２−メチルプロピオン酸（ＢＭＡ）と共に表３中に列挙される。
【０１４６】
【表２】
2007518732.tif 000013
【０１４７】
【表３】
2007518732.tif 000014
【０１４８】
ａプロダクトは直接的に濾過され洗浄された。
ｂ新たに蒸留されたＴＨＦ
【０１４９】
実施例Ａ３：ＰＭＡＡ−Ｎａ２を与えるためのＰＭＯＳｕ１の加水分解（スキーム１）
ＰＭＯＳｕ１（１．００ｇ、Ｍｎ＝２４，８００ｇ／モル、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２０、ＤＭＦ溶出剤、ＰＭＭＡ標準）はＤＭＦ（５．０ｍｌ）中に溶解され、次いで２Ｍの水性水酸化ナトリウム（６．０ｍｌ）が撹拌下で滴下され、ポリマーの幾らかの沈殿を生じた。反応容器は直ぐに温かくなり、均質な溶液が直ぐに続いた。溶液は次いで２４時間７０℃に加熱され、その後更なる水が添加された（約５０ｍｌ）。希釈された溶液は次いで再生セルロース膜（ＭＷＣＯ２０００、ＳｐｅｃｔｒａＰｏｒ）を用いて水に対して透析された。透析された溶液の凍結乾燥は、白色固体プロダクトＰＭＡＡ−Ｎａ２（０．３ｇ）を生じた。ＧＰＣ（ＰＢＳ溶出剤、ＰＭＡＡ−Ｎａ標準）Ｍｎ＝２２，０００ｇ／モル及びＭｗ／Ｍｎ＝１．２８；ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）１６７５ｃｍ−１、１５４７ｃｍ−１、１１９４ｃｍ−１。
【０１５０】
ＰＭＡＡ−Ｎａ２についての分子量値は、１由来の任意のポリマーについての繰り返しユニットの数を知るための重合度（ＤＰ）を測定するために使用され得る。この実施例においてＰＭＡＡ  Ｎａ２の繰り返しユニットの分子量は１０８であり、このサンプルについてのＤＰは約２０３であった（即ち、２２，０００ｇ／モル÷１０８ｇ／モル）。これは、ＰＭＯＳｕ１についてのＤＰが２０３であることを意味し、ＰＭＯＳｕ１の繰り返しユニットの分子量が１８３ｇ／モルであるため、従って、この実施例におけるＰＭＯＳｕ１の平均分子量の絶対数は、３７，１４９ｇ／モル（即ち、１８３ｇ／モル□２０３）であった。狭いＭＷＤ  ＰＭＯＳｕ１のＤＰについての２０３の値は同様の様式で１由来のポリマーの絶対分子量を測定するために使用され得る。
【０１５１】
実施例Ａ４：ＰＭＯＳｕ１の加水分解
ＰＭＯＳｕ１（２００ｍｇ、Ｍｎ＝３２，２００ｇ／モル、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２４、ＤＭＦ溶出剤、ＰＭＭＡ標準）はＤＭＳＯ（２ｍｌ）中に撹拌下で溶解された。１Ｍ水性水酸化ナトリウム（２．２ｍｌ）を滴下した。典型的に、幾らかの沈殿が生じた。更なる水（２３ｍｌ）が水酸化ナトリウムの添加に続いて直ぐに添加され、混合溶液は室温で１時間撹拌された。結果生じる反応溶液は次いで４４ｍｌに希釈され、Ｖｉｓｋｉｎｇ透析膜（ＭＷＣＯ７０００、Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して１Ｌの水に対して２４時間透析された。透析の間、水は６回代えられた。透析された溶液は０．２μｍフィルターを通して濾過され、次いで０．２ｇのＰＭＡＡ−Ｎａプロダクト２を得るために凍結乾燥された。ＧＰＣ（トリプル検出、ＮａＮＯ３  ０．２Ｍ／１０％  ＣＨ３ＣＮ）Ｍｎ＝３５，７００ｇ／モル及びＭｗ／Ｍｎ＝１．１８）。
【０１５２】
調製されたＰＭＡＡ−Ｎａ２の各沈殿は、１Ｈ核磁気共鳴及びフーリエ変換赤外分光法を用いて特徴付けられ、所望のプロダクトと一致することが見出された。
【０１５３】
実施例Ａ５：ＰＭＡＡ−Ｎａ２を与えるための加水分解が続くＡＩＢＮを用いたフリーラジカル重合によるＰＭＯＳｕ１の合成
アセトン（３０．０ｍｌ）中のメタクリルオキシスクシンイミド３（３ｇ）及びＡＩＢＮ（０．１３５ｇ）のアルゴンでパージされた溶液は、閉じた容器の中で２４時間５０℃に加熱された。形成された白い沈殿物は、濾過によって単離され、ＤＭＳＯ（６．０ｍｌ）中に溶解され、急速に撹拌しているアセトン中で再沈殿された。濾過による単離の後、真空で乾燥し、ＤＭＳＯ（４．８ｍｌ）中の乾燥したＰＭＯＳｕ１の幾らかは、１Ｎ水酸化ナトリウム（５．２ｍｌ）及び水（５６ｍｌ）と混合された。結果生じる溶液は、室温で１時間撹拌され、その後それは新たな水を用いて１０５ｍｌに希釈され、Ｖｉｓｋｉｎｇ透析膜（ＭＷＣＯ  ７０００、Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて５Ｌの水に対して２４時間透析された。５Ｌの水は、６回代えられた。透析された溶液は、０．２μｍのフィルターを通して濾過され、次いで凍結乾燥され、固体プロダクトとしてＰＭＡＡ−Ｎａ２（０．５６ｇ）を与えた；Ｍｗ  ２６、１００  Ｄａ、Ｍｎ  １５，２００ｇ／モル、Ｍｗ／Ｍｎ  １．７（ＳＥＣ  ０．２Ｍ水性ＮａＮＯ３／１０％ＣＨ３ＣＮ、ＰＭＡＡ−Ｎａ標準物）。
【０１５４】
実施例Ａ６：ＰＭＡＡ−Ｎａ２を与えるための、加水分解が続く４，４’−アゾビス（シアノ吉草酸）を用いたフリーラジカル重合による、ＰＭＯＳｕ１の合成
圧力管はメタクリルオキシスクシンイミド３（０．５−１．０ｇ）、４，４’−アゾビス（シアノ吉草酸）（１５−３０重量％）及び溶媒（例えば、アセトン、新たに蒸留されたＴＨＦ又はトルエンと炭酸エチレンを含むこれら溶媒の混合物）でチャージされ及び結果生じる溶液はシールされアルゴンを用いて１５分間パージされた。シールされたフラスコは次いで７０〜１２０℃で０．２５〜２．５時間加熱された。実施例の反応条件については表４を参照。ＰＭＯＳｕ１は、濾過によって白色沈殿物として単離され、真空で乾燥され、ＰＭＭＡ標準物を使用してＤＭＦ中でＧＰＣが測定された。
【０１５５】
【表４】
2007518732.tif 000015
【０１５６】
実施例Ｂ：合成ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６及びブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＭＡＡ−Ｎａ７を与えるためのその加水分解
重合及び加水分解反応はスキーム３に示され、例は以前に記載される（Brocchini S. J and Godwin A. “Block Copolymers.” 国際特許公開番号ＷＯ／０５９９７３及びPedone et al, information rich biomedical polymer library, J. Mat. Chem., 2003, 13, 2825-2837）。
【０１５７】
【数３】
2007518732.tif 000016
【０１５８】
スキーム３．ブロックコポリマーＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６及びＰＥＧ−ＰＭＡＡ−Ｎａ７の合成
【０１５９】
（Ａ）マクロイニシエーター５の調製
ＰＥＧマクロイニシエーター５は、Ｊａｎｋｏｖａ等(Macromolecules (1998), 31, 538-541)の手順によって調製された。１５ｍｌの無水ＣＨ２Ｃｌ２中のトリエチルアミン（１２．５×１０−３モル、１．２６５ｇ、１．７５ｍｌ）は、冷却器、滴下漏斗、ガスインレット及び磁気スターラーを備えた２５０ｍｌの三つ口丸底フラスコに添加された。０℃に冷却した後、１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中の２，２−ブロモイソブチリルブロマイド（１２．５×１０−３モル、２，８４７ｇ、１．５５ｍｌ）が添加され、混合液は窒素でパージされた。次いで５０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２中のモノメトキシキャップされたＰＥＧ（Ｍｎ＝２，０００ｇ／モル）（５×１０−３モル、１０ｇ）が窒素下で１時間滴下された。ＰＥＧは以前にトルエン中で共沸蒸留によって乾燥され、残留トルエンは真空中で除去された。反応混合物の温度は室温まで上げられ、反応は１８時間継続した。溶液は濾過され、溶媒の半分が真空下で蒸発し、プロダクトが冷たいエーテル中で析出した。析出物は無水エタノール中で再結晶化された（冷蔵庫で一晩保存された）。マクロイニシエーター５は濾過され、冷エーテルで洗浄され、真空下で乾燥された。粗製プロダクトは８０ｍｌの水中に４ｇ溶解させることによって精製された。過剰なi−ＢｕＢｒを加水分解するために、溶液のｐＨはｐＨ８に上げられた。次いで溶液はＣＨ２Ｃｌ２（７０ｍｌ）で抽出された。安定なエマルジョンが得られ、完全な相分離のために数時間が必要であった。溶媒は真空中で除去された。プロダクトは熱ＥｔＯＨ中で溶解され、結晶化するために冷蔵庫中に置かれた。次いでそれは濾過されエーテルで洗浄され、真空下で乾燥された。精製されたプロダクト５は白色であった。置換度は、Ｈ  ＭＮＲスペクトルで計算された。この手順はＰＥＧ５０００及びＰＥＧ１００００由来のＰＥＧマクロイニシエーター５を調製するためにも使用された。
【０１６０】
（Ｂ）ブロックＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６の代表的な調製
モノマー３（ＷＯ０１／１８０８０中で合成される）の混合物、炭酸エチレン及びビピリジンはセプタムでシールされたチューブ中に配置され、それは５分間アルゴンでパージされＣｕＢｒが添加された。混合物は溶液（濃い茶色）を形成するために緩やかに加熱され更に３０分間アルゴンでパージされた。次いで炭酸エチレン中の表５において特定されるモノマーと相対的な量のＰＥＧマクロイニシエーター５溶液（エチレンカーボン及び５の両方を液化されるために緩やかに加熱される）は、１０分間アルゴンでパージされ、アルゴンで洗浄されたシリンジでモノマー溶液に添加された。混合溶液はオイルバス中に配置され、撹拌された。反応は空気への曝露、冷却及びＤＭＦでの希釈によって停止された。次いで溶液はアルミナ及びメタノール中で沈殿したポリマーで充填されたカラムを通過させた。ＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６沈殿物は濾過され、エーテルで洗浄され、真空下で乾燥された。ＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６は白色粉末として得られた。表５は、分子量２０００ｇ／モルのＰＥＧ由来のミクロイニシエーター５を用いて実施された重合の重合条件、収率及び分子量特性を示す。
【０１６１】
【表５】
2007518732.tif 000017
【０１６２】
１ＥＣ＝炭酸エチレン
２ゲル浸透クロマトグラフィーはＰＭＭＡ標準物を有するＤＭＦ溶出剤を使用した。
３反応混合物は１時間アルゴンでパージされた。
【０１６３】
（Ｃ）分子量２０００ｇ／モルのポリ（エチレングリコール）由来のＰＥＧ−ＰＭＭＡ−Ｎａ７の合成の詳細な例
銅（Ｉ）ブロマイド（３１．２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、ｂｐｙ（６８．４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）及びＮ−メタクリルオキシスクシンイミド３（３．６７ｇ、２０ｍｍｏｌ）及び炭酸エチレン（２ｇ）は丸底フラスコに添加され、それは次いでセプタムでシールされた。結果生じる茶色混合物は、溶液が形成されるまで緩やかに加熱され、次いで約１５分間アルゴンでパージされた。炭酸エチレン（０．６ｇ）中のＰＥＧ２０００−マクロイニシエーター５（４３０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）のアルゴンでパージされた溶液は、次いで混合物中に注入され、フラスコはオイルバス中で１時間８０℃に加熱された。粘性のある反応混合物は次いで熱から離され、急速に冷却された。結果生じる粗製のポリマープロダクトはＤＭＦ（８ｍｌ）中に溶解され、結果生じる溶液は、撹拌されたメタノール（５００ｍｌ）にゆっくりと添加され白色固体としてＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６（Ｍｎ＝３７，１６０ｇ・モル−１  Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３２  ＳＥＣ（ＤＭＦ  ０．１％  ＬｉＣｌ））を析出した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３８（ｂｒ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．４２（ｂｒ  ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ）、２．７８（ｂｒ、４Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２）、３．５０（ｓ、４Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）。
【０１６４】
ブロックＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６の加水分解が実施された。ＰＥＧ−ＰＭＡＡ−Ｎａ塩へのこの加水分解は２Ｍ  ＮａＯＨ（０．６ｍｌ）を１０ｍｌの丸底フラスコ中のＤＭＦ（０．５ｍｌ）中のブロックコポリマー前駆体（０．１ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液へゆっくりと滴下することによって実施された。反応混合物は１６時間６０℃に加熱され、更なる水（５．０ｍｌ）が添加された。希釈溶液は次いでＶｉｓｋｉｎｇチュービング（ＭＷＣＯ１２，０００〜１４，０００）を用いて透析され、透析物は凍結乾燥され、白色固体プロダクト（ＰＥＧ２０００−ＰＭＡＡ−Ｎａ塩７（９５％収率）Ｍｎ＝３４，１１０ｇ・モル−１、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３４（トリプル検出−ＳＥＣ；ＮａＮＯ３  ０．２Ｍ／１０％ＣＨ３ＣＮ）を与えた。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ０．８５〜０．９６（ｂｒ  ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）１．６０、１．８８（ｂｒ、ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）及び３．５８（ｓ、４Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ＰＥＧ２０００−ブロックに結合したヒンダードエステルが加水分解されなかったことを確証する。
【０１６５】
（Ｄ）分子量５０００ｇ／モルのポリ（エチレングリコール）由来のＰＥＧ−ＰＭＭＡ−Ｎａ７の合成の詳細な例
銅（Ｉ）ブロマイド（１０．４ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）、２，２’−ビピリジン（ｂｐｙ、２２．６ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ）及びＮ−メタクリルオキシスクシンイミド（２．０ｇ、１０．８ｍｍｏｌ）及びＰＥＧ５０００−マクロイニシエーター５（３６２ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）及び炭酸エチレン（２．３６２ｇ）はシュレンクフラスコに添加され、それは次いで隔膜でシールされた。結果生じる茶色混合物は凍結融解法によってガス抜きされた。混合物はオイルバス中で２時間１１０℃に加熱された。粘性にある反応混合物は次いで熱処理から除かれ、急速に冷却された。結果生じる粗製ポリマープロダクトは次いでＤＭＦ（８ｍｌ）中に溶解された。結果生じる溶液は、撹拌されたメタノール／ジエチルエーテル（２：１ｖ／ｖ、３００ｍｌ）にゆっくりと添加され、白色固体（１．８ｇ、７６％）としてＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６を沈殿した（１．８ｇ、７６％）Ｍｎ＝３２，８６０ｇ・モル−１  Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３６（ＳＥＣ（ＤＭＦ０．１％ＬｉＣｌ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１．３８（ｂｒ、３Ｈ、ＣＨ３）、２．２４（ｂｒ  ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｃ）、２．７８（ｂｒ、４Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２）、３．５０（ｓ、４Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）。
【０１６６】
ＰＥＧ−ＰＭＯＳｕ６の加水分解は１０ｍｌの丸底フラスコ中のＤＭＦ（０．５ｍｌ）中のブロックポリマー前駆体６（０．１ｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液に２Ｍ  ＮａＯＨ（０．６ｍｌ）を１滴ずつゆっくりと添加することによって行われた。反応混合物は、６０℃に１６時間加熱され、更なる水（５．０ｍｌ）が添加された。希釈溶液は次いでビスキングチュービング（ＭＷＣＯ  １２，０００−１４，０００）を用いて透析され、透析物は白色固体プロダクトＰＥＧ５０００−ＰＭＡＡ−Ｎａ塩としてＰＥＧ−ＰＭＡＡ−Ｎａ塩７を与えるために凍結乾燥された（７５％収率）；Ｍｎ＝２９，３６０ｇ・モル−１  Ｍｗ／Ｍｎ＝１．２８（トリプル検出−ＳＥＣ；ＮａＮＯ３  ０．２Ｍ／１０％ＣＨ３ＣＮ）。１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ０．８７〜０．９７（ｂｒ  ｓ、３Ｈ、ＣＨ３）１．６３、１．８９（ｂｒ、ｍ、２Ｈ、ＣＨ２）及び３．５８（ｓ、４Ｈ、ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ）はＰＥＧ５０００−ブロックに結合したヒンダードエステルが加水分解されなかったことを確証する。
【０１６７】
実施例Ｃ）アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の調製：
実施例Ｃ１：ポリマー、ＰＭＯＳｕ（４０ｍｇ）はＤＭＳＯ（０．４ｍｌ）中に溶解され、該溶液はアンフォテリシンＢ（“薬剤”）（５０ｍｇ）を含むバイアルに添加された。撹拌下、１Ｍ水性水酸化ナトリウム（０．４４ｍｌ）が結果生じる薬剤混合物に滴下された。典型的に幾らかの沈殿が見られた。更なる水（４．７ｍｌ）は水酸化ナトリウムの添加に直ぐ続いて添加され、結果生じる混合物は室温で１時間撹拌された。反応溶液は次いで８．８ｍｌに希釈され、ビスキング透析膜（ＭＷＣＯ７０００、Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて２４時間水（１Ｌ）に対して透析された。透析中、水は６回代えられた。透析された溶液は０．２μｍフィルターで濾過され、次いで０．９ｇの黄色固体プロダクトを得るために凍結乾燥された。ＦＴ−ＩＲ（ＡＴＲ）１６７６ｃｍ−１、１５６８ｃｍ−１、１４０４ｃｍ−１、１０７０ｃｍ−１、１０２１ｃｍ−１。
【０１６８】
調製物中の薬剤及びポリマーの存在は、１Ｈ  ＮＭＲ及びＦＴ−ＩＲ分光法によって確認された。調製物中のアンフォテリシンＢの重量パーセント（ｗｔ％）は、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．から得たアンフォテリシンＢを用いて作製された校正曲線に対する４１９．５ｎｍにおけるＵＶ分光法を用いて推定された。実施例Ｃ１におけるｗｔ％は４４〜４８％であると推定された。
【０１６９】
それらの生物学的評価の前に、メタクリル酸ナトリウム塩ホモ−ポリマー及びコポリマーの水溶液は活性炭又はポリミキシンＢカラムを用いてエンドトキシンを除去するために処理された。エンドトキシンレベルはリムルス試験（limulus amebocyte lysate (LAL) assay）を用いて測定され、記載される実験に使用された化合物は、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含んだ。これは注射用水についての欧州共同体基準である。
【０１７０】
Ｄ）初代細胞に対するメタクリル酸ナトリウム塩ホモポリマー及びコポリマーの細胞障害性
全ての実験は初代ヒト細胞で実施された。
【０１７１】
実施例Ｄ１：ヒト赤血球：
ヒト赤血球の２％ｖ／ｖ溶液はＲＰＭＩ  １６４０中で調製された。ＰＭＡＡ−Ｎａ（“薬剤”）のストック溶液はＲＰＭＩ  １６４０中で調製された。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の１％溶液は１００％細胞溶解のためのポジティブリファレンスとして使用された。デキストラン及びポリ−Ｌ−リシンは各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。サンプル及び赤血球の等量は９６ウェルマイクロタイター（microtitre）プレート中にアリコートされ、３７℃でインキュベートされた。１時間及び２４時間の後、各サンプルは遠心分離され（２，０００ｇ、１０分）上清は９６ウェルマイクロタイタープレートに添加された。吸光度は分光計を用いて４９０ｎｍで測定された。溶解(lysis)の程度はＴｒｉｔｏｎＸ−１００によって引き起こされた１００％溶解のパーセントとして表された。図１に示されるように、１時間又は２４時間後、２，０００μｇ／ｍｌまでの濃度で、３人のドナー（Ａ，Ｂ，Ｃ）からのヒト赤血球を用いて、ＰＭＡＡ−Ｎａに顕著な毒性は見られなかった。
【０１７２】
実施例Ｄ２：ヒト全血：
ヒト全血の２％ｖ／ｖ溶液はＲＰＭＩ  １６４０中にドナーＤから調製された。ＰＭＡＡ−Ｎａ（“薬剤”）のストック溶液は、ＲＰＭＩ  １６４０中に調製された。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の１％溶液は、１００％細胞溶解のためのポジティブリファレンスとして使用された。デキストラン及びポリ−Ｌ−リシンは、各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。等量のサンプル及び全血は９６ウェルマイクロタイタープレート中にアリコートされ、３７℃でインキュベートされた。１時間、６時間及び２４時間後、各サンプルは遠心分離され（５００ｇ、１０分）そして上清が９６ウェルマイクロタイタープレートに添加された。吸光度は分光計を用いて４９０ｎｍで測定された。溶解の程度は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によって引き起こされる１００％溶解のパーセントとして表された。図２に示されるように、１時間後又は６時間後又は２４時間後に、５００μｇ／ｍｌの濃度までのヒト全血を用いて、ＰＭＡＡ−Ｎａに顕著な毒性は見られなかった。
【０１７３】
実施例Ｄ３
ａ）単球由来マクロファージ
単球は一人のドナーからの新鮮な血液から分離され、ＲＰＩＭ  １６４０、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン（２００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２００μｇ／ｍｌ）及び１０％ヒト血清中で培養され、１×１０６細胞／ｍｌの密度でプレートされた。単球はさらに３日の粘着性によって単球由来マクロファージ（ＭＤＭｓ）に分化させた。ＰＭＡＡ−Ｎａ含有培地が次いで０〜２，０００μｇ／ｍｌの濃度範囲で細胞に添加された。細胞はチアゾリルブルー（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、５ｍｇ／ｍｌ）の添加の前に７１時間インキュベートされた。細胞培養物の生存率は任意の化合物の存在無しで増殖した細胞の生存率のパーセントで表された。デキストラン及びポリ（Ｌ−リシン）は各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。ＰＭＡＡ−Ｎａは、図３ａに示されるようにＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された最高濃度２，０００μｇ／ｍｌにおいてＭＤＭｓに対して毒性でなかった。
【０１７４】
ｂ）腹腔組織マクロファージ
ヒト腹膜細胞はＲＰＭＩ  １６４０培地、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０％混合ドナーのヒト血清、２００  ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン中で培養され、それらの密度は１×１０６細胞／ｍｌに調節された。ＰＭＡＡ−Ｎａ含有培地は次いで０〜２，０００μｇ／ｍｌの濃度範囲で細胞に添加された。細胞はＭＴＴの添加前に７１時間インキュベートされた。細胞の生存率は、任意の化合物の存在無しで増殖した細胞の生存率のパーセントとして表された。デキストラン及びポリ（Ｌ−リシン）は各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。ＰＭＡＡ−Ｎａは、５００μｇ／ｍｌまで腹腔マクロファージに対して毒性でなかった。５００μｇ／ｍ〜２，０００μｇ／ｍｌの間で、図３ｂに示されるように、中程度の量の毒性がＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて見られた。
【０１７５】
Ｅ）抗凝血活性：
実施例Ｅ１：抗凝血活性は、プロトロンビン時間（ＰＴ）、カオリン部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間（ＴＴ）、フィブリノゲン及び抗Ｘａ活性の測定として測定された。化合物はホスフェート緩衝生理食塩水溶液に溶解され、血漿／ベロナールバッファー（１：１）と５０：５０で混合され、試験された。抗Ｘａ活性はヘパリン
／ｍｌ（ＨＥＰ（Ｘａ）（Ｖ／ｍｌ）のユニットとして表された。ＰＭＡＡ−Ｎａは、ＡＰＴＴ及びＴＴを延長したがＰＴに影響しなかった。抗Ｘａアッセイはネガティブであった。従って、これら分子の抗凝血活性は、“ヘパリン様”活性ではなかった（表６を参照）。
【０１７６】
【表６】
2007518732.tif 000018
【０１７７】
連続携行式腹膜透析（ＣＡＰＤ）の患者からの腹膜細胞は各化合物及び３６時間のインキュベーション後に収穫された培養上清と培養された。炎症性ケモカイン及び炎症性サイトカインはＥＩＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定された。
【０１７８】
実施例Ｆ１：
３人のドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）からのヒト腹膜細胞は、ＰＭＡＡ−Ｎａ（５００μｇ／ｍｌ）と培養され、３６時間後に収穫された培養上清はＭＩＰ−１βについて分析された。全ての試薬及びＰＭＡＡ−Ｎａは、リムルス試験（Pyrotell, Associates of Cape Cod, US）を用いて測定されるように、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌ（ＥＵ／ｍｌ）を含んだ。
これは注射用水についての欧州共同体基準値である。図４に示されるように、ＰＭＡＡ−Ｎａの存在下でＭＩＰ−１βの有意な放出があった。
【０１７９】
実施例Ｆ２：
２人のドナー（Ａ及びＢ）からのヒト腹膜細胞はＰＭＡＡ−Ｎａ（５００μｇ／ｍｌ及び２，０００μｇ／ｍｌ）と培養され、３６時間後に収穫された培養上清はＴＮＦ−αについて分析された。全ての試薬及びＰＭＡＡ−Ｎａは、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含んだ。図５に示される様に、両方の濃度においてＰＭＡＡ−Ｎａの存在下でＴＮＦ−αの有意な放出があった。
【０１８０】
実施例Ｆ３：
ヒト腹膜細胞はＰＭＡＡ−Ｎａ（５００μｇ／ｍｌ）と培養され、３６時間後に収穫された培養上清は炎症性ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＩＬ−８、並びに炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６について分析された。全ての試薬及びＰＭＡＡ−Ｎａは、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含んだ。３人までの異なるヒトドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）からの細胞での結果が図６に示される。組織抗原提示細胞からのこれらのケモカイン及びサイトカインの放出は、ヒトにおける薬理学的Ｔｈ１応答を促進するレベルであったが、ヒトにおいて顕著な有害副作用を引き起こすのに十分高くはなかった。
【０１８１】
実施例Ｆ４：
血液由来単球由来マクロファージは、２，０００μｇ／ｍｌまでの濃度のＰＭＡＡ−Ｎａと培養された。全ての試薬及びＰＭＡＡ−Ｎａは、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含んだ。ＭＩＰ−１βの放出は見られなかった。３人の異なるヒトドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）からの細胞での結果が図７に示される。従って、マクロファージ起源の細胞及び組織ボディーベースコンパートメントからの他の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）と比較した血液単球起源の細胞上にＰＭＡＡ−Ｎａの特異な免疫調節効果が存在する。
【０１８２】
Ｇ）商業的に入手可能なＰＭＡＡ−ＮａのＴｈ１アジュバント活性の欠如
実施例Ｇ１：
ヒト腹腔マクロファージは、ＭＷｔ’ｓ範囲（Ｍｎ＝１，３００、２２，１００及び１２９，０００ｇ／モル）且つ狭い分子量分布の商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａ（Polymer Standards Service, Germany）と培養された。全ての試薬及びＰＭＡＡ−Ｎａは＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含んだ。商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａの１つは、我々のＰＭＡＡ−Ｎａ（Ｍｎ＝２２，０００ｇ／モル）の合成調製物と同等のＭＷｔを有した。培養上清は３６時間後に収穫された。ＭＩＰ−１βの放出は無かった。図８は、２人のヒトドナー（Ａ及びＢ）からの個別結果を示す。
【０１８３】
実施例Ｇ２：
ヒト腹腔マクロファージは、ＭＷｔ’ｓの範囲（Ｍｎ＝１，３００、２２，１００及び１２９、０００ｇ／モル）且つ狭い分子量分布の商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａ（Polymer Standards Service, Germany）と培養された。商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａの１つは我々のＰＭＡＡ−Ｎａ（Ｍｎ＝２２，０００ｇ／モル）の合成調製物と同等のＭＷｔを有した。全ての試薬及びＰＭＡＡ−Ｎａは＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを有した。培養上清は３６時間後に収穫された。ＴＮＦ−αの放出は無かった。図９は、２人のヒトドナー（Ａ及びＢ）からの個別結果を示す。
【０１８４】
Ｈ）初代ヒト細胞に対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の細胞障害性
実施例Ｈ１：赤血球
方法は実施例Ｄ１について記載される通りであった。臨床グレードのアンフォテリシンＢ及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（どちらも図において“薬剤”と呼ばれる）間で比較が行われた。試験のための化合物のストック溶液はＭＧＭ中に調製された。ヒト赤血球溶血は、３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）において、１時間（図１０）、６時間（図１１）及び２４時間（図１２）のインキュベーション後に測定された。１時間のインキュベーションの後、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物について毒性は見られなかった。６時間のインキュベーションの後、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性は、臨床グレードのアンフォテリシンＢのものよりも顕著に低かった。インキュベーション時間が２４時間に増加された場合、臨床グレードのアンフォテリシンＢの毒性は１００％に上昇したが、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性には更なる上昇は存在しなかった。
【０１８５】
実施例Ｈ２：赤血球
方法は実施例Ｈ１について記載される通りであった。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（“薬剤”）による赤血球溶血度は、１時間及び２４時間のインキュベーション後に、１，０００μｇ／ｍｌまでの濃度について測定された。結果は図１３に示される。
【０１８６】
実施例Ｈ３：末梢血単核細胞：
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）はＲＰＭＩ培地、１０％混合ドナーヒト血清、２００  ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（１×１０５細胞における）中に懸濁され、３７℃で５％ＣＯ２を有する９６ウェルの組織培養プレート中で培養された。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（“薬剤”）を含有する培地は、１００μｌ／ウェルの終量において０〜７０μｇ／ｍｌの濃度範囲で細胞に添加された。細胞はＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）の添加の前に、１日又は２日又は６日間インキュベートされた。ＭＴＴ溶液は１時間後に除去され、ＭＴＴ結晶を溶解するためにＤＭＳＯ（１００μｌ）が添加された。光学密度はプレートリーダー（Molecular Devices, Wokingham, UK）を用いて５５０ｎｍで測定された。細胞培養物の生存率は、任意の化合物の存在なしで増殖した細胞の生存率のパーセントとして表された。デキストラン及びポリ（Ｌ−リシン）は、各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。化合物は、１日の培養の後、２日の培養の後、６日の培養の後、ＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された最高濃度７０μｇ／ｍｌにおいて末梢血単核細胞に対して毒性が無かった。図１４は、３人までの代表的ヒトドナーからの個別結果を示す。各ドナーからの結果は図１４における線グラフとして示される。
【０１８７】
実施例Ｈ４：単球由来マクロファージ：
単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）細胞は、密度勾配遠心法により１人のドナーからの新鮮な血液から分離され、ＲＰＭＩ  １６４０、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン（２５０ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５０μｇ／ｍｌ）及び１０％ヒト血清を含むマクロファージ増殖培地（ＭＧＭ）において培養された。それらは１×１０６細胞／ｍｌの密度でプレートされ、３日間ＭＤＭに分化された。該化合物（“薬剤”）を含有する培地は次いで１２５μｇ／ｍｌの濃度まで細胞に添加された。細胞はＭＴＴの添加前２日又は３日の間インキュベートされた。細胞生存率は、任意の化合物の存在無しで増殖した細胞の生存率のパーセントとして表された。デキストラン及びポリ（Ｌ−リシン）は、各々ネガティブ及びポジティブコントロールとして使用された。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物は、図１５に示されるように、培養の２日及び３日後のＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された１２５μｇ／ｍｌまでの濃度の全てにおいて臨床グレードのアンフォテリシンＢよりも低毒性であった。
【０１８８】
Ｊ）アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の前鞭毛期リーシュマニアに対する抗リーシュマニア活性の測定
実施例Ｊ１：
前鞭毛期メキシコリーシュマニアがこれら実験に使用された。それらは、１５％ウシ胎児血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及びゲンタマイシン（１ｍｇ／１００ｍｌ）の添加されたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ増殖培地（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）中に維持された。寄生体濃度は２×１０６寄生体／ｍｌに調節された。試験化合物の二倍希釈物は、増殖培地における所望の終濃度の２倍で調製された。等量の薬剤及び寄生体サスペンジョンは次いで９６ウェルプレート中で混合され、２６℃で２４時間インキュベートされた。ここで、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）が添加され、プレートはさらに２４時間２６℃でインキュベートされた。プレートは次いで遠心分離され（２０００ｇ、５分）、上清は廃棄され、ペレットは１００μｌＤＭＳＯ中に再懸濁された。吸光度は分光計を用いて５７０ｎｍで測定された。結果は、コントロールウェル中の前鞭毛期を複製する未処理のＯＤを用いて測定される１００％生存率の前鞭毛期のパーセント生存率として表された。
【０１８９】
前鞭毛期メキシコリーシュマニアについての臨床グレードアンフォテリシンＢの５０％致死量（ＬＤ５０）は、０．１４μｇ／ｍｌであった（図１６、差込み）。前鞭毛期メキシコリーシュマニアについての臨床グレードアンフォテリシンＢの９０％致死量（ＬＤ90）は、１．４９μｇ／ｍｌであった（図１６、差込み）。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いた３つの実験からの結果は図１６に示される。前鞭毛期メキシコリーシュマニアについてのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の５０％致死量（ＬＤ５０）は、０．１０〜０．１９μｇ／ｍｌであった（図１６）。前鞭毛期メキシコリーシュマニアについてのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の９０％致死量（ＬＤ９０）は、１．０２〜１．４９μｇ／ｍｌであった（図１６）。前鞭毛期メキシコリーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の活性は重量毎重量ベースで臨床グレードアンフォテリシンＢのものと同様であった。
【０１９０】
実施例Ｊ２：
前鞭毛期ドノバンリーシュマニアがこれらの実験のために使用された。それらは、ウシ胎児血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及びゲンタマイシン（１ｍｇ／１００ｍｌ）の添加されたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ１９９中に維持された。寄生体濃度は２×１０６寄生体／ｍｌに調節された。試験化合物の２倍希釈物は、増殖培地における所望最終濃度の二倍で調製された。等量の薬剤及び寄生体懸濁液が次いで９６ウェルプレート中で混合され、２６℃で２４時間インキュベートされた。今回、ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）が添加され、プレートは２６℃でさらに２４時間インキュベートされた。該プレートは次いで遠心分離され（２０００ｇ、５分）、上清は廃棄され、ペレットは１００μｌ  ＤＭＳＯ中に再懸濁された。吸光度は分光計を用いて５７０ｎｍで測定された。結果は、コントロールウェル中の前鞭毛期を複製する未処理のＯＤを用いて測定される１００％生存率を有する前鞭毛期のパーセント生存率として表された。
【０１９１】
前鞭毛期ドノバンリーシュマニアについての臨床グレードアンフォテリシンＢの５０％致死量（ＬＤ５０）は０．０８μｇ／ｍｌであった（図１７、差込み）。前鞭毛期ドノバンリーシュマニアについての臨床グレードアンフォテリシンＢの９０％致死量（ＬＤ９０）は１．９１μｇ／ｍｌであった（図１７、差込み）。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いた３つの実験からの結果は図１７に示される。前鞭毛期ドノバンリーシュマニアについてのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の５０％致死量（ＬＤ５０）は、０．１０〜０．１７μｇ／ｍｌであった（図１７）。前鞭毛期ドノバンリーシュマニアについてのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の９０％致死量（ＬＤ９０）は、０．９８〜１．２８μｇ／ｍｌ（図１７）であった。従って、前鞭毛期ドノバンリーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の活性は、重量毎重量ベースで臨床グレードアンフォテリシンＢのものと同様であった。
【０１９２】
Ｋ）無鞭毛期リーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の抗リーシュマニア活性の測定
無鞭毛期メキシコリーシュマニアは、１０％ヒト血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及び２００  ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持されたヒト単球由来のマクロファージを感染するために使用された。細胞は１０６細胞／ｍｌでＬａｂ−Ｔｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅｓ（Ｎｕｎｃ）中にプレートされ、３７℃／５％ＣＯ２において３日間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、等量の新しい培地が添加して戻され、ここにおいて無鞭毛期の濃度は５：１の寄生体：細胞感染比率を与えるように調節されている。細胞は次いで、マクロファージの感染が確立されることを可能とするために、３２℃で２０時間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、試験化合物の二倍希釈物と置換された。細胞は次いで３２℃で７２時間インキュベートされた。ＰＢＳでの洗浄の後、チャンバは分離され、スライドは乾燥させられ、次いでメタノール中に固定された。各スライドは次いでギエムザで染色され、顕微鏡で調べられた。全体で２５０細胞が感染した及び感染していない細胞の数の測定のためにカウントされた。
【０１９３】
感染指数は寄生体／細胞の平均数×感染した細胞のパーセントとして計算された。細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニアの増殖の５０％抑制は、０．１４μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図１９ａ）又は０．４５μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅ（図１９ｂ）と比較して、０．１８〜０．３２μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（図１８）で達成された。細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニアの増殖の９０％抑制は、０．９５μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ又は３．８９μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅと比較して、１．１８〜１．５５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いて達成された。
【０１９４】
図１９及び２０のグラフは、臨床グレードアンフォテリシンＢ及びＡｍｂｉｓｏｍｅ（リポソームアンフォテリシンＢ，Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｒｅａｔ  Ａｂｉｎｇｄｏｎ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）とアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニアに対する相対活性の傾きを比較する。それらはアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物のキリングカーブ（killing curve）は、Ａｍｂｉｓｏｍｅのキリングカーブよりも急であることを実証する。
【０１９５】
実施例Ｋ２：
無鞭毛期ドノバンリーシュマニアは、１０％ヒト血清（５６℃で１時間熱不活性された）、２００  ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＩＭ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持されたヒト単球由来のマクロファージを感染するために使用された。細胞は１０６細胞／ｍｌでＬａｂ−Ｔｅｋ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｓｌｉｄｅｓ（Ｎｕｎｃ）中にプレートされ、３７℃／５％ＣＯ２で３日間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、等量の新たな培地が添加して戻され、ここにおいて無鞭毛期の濃度は５：１の寄生体：細胞感染比率を与えるように調節されている。細胞は次いで、マクロファージの感染が確立されることを可能にするために、３２℃で２０時間インキュベートされた。培地は次いでチャンバスライドから吸引され、試験化合物の二倍希釈物と置換された。細胞は次いで３２℃で７２時間インキュベートされた。ＰＢＳで洗浄したのち、チャンバは分離され、スライドは乾燥させられ、次いでメタノール中で固定された。各スライドは、次いでギエムザで染色され、顕微鏡で調べられた。全体で２５０細胞が感染した及び感染していない細胞の数を測定するためにカウントされた。
【０１９６】
感染指数は寄生体／細胞の平均数×感染した細胞のパーセントとして計算された。細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの増殖の５０％抑制は、０．５４μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図２２a）又は１．９６μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅ（図２２ｂ）と比較して０．３０〜０．７１μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（図２１）で達成された。細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの増殖の９０％抑制は、２．３１μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ又は＞８μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅと比較して、２．１８〜３．１８μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いて達成された。
Ｌ）アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物のインターフェロンγ放出、Ｔｈ１アジュバント活性
【０１９７】
実施例Ｌ１：
マクロファージ及び樹状細胞を含むヒト腹膜細胞は、各化合物と共にマクロファージ増殖培地中で培養された。全ての試薬及び化合物は、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含有した。培養上清は２４時間後に収穫された。インターフェロンγは、ＥＩＡによって測定された。腹腔マクロファージからのＴｈ１促進サイトカイン、インターフェロンγの放出は、図２３に示されるように、コントロールのみ、臨床グレードアンフォテリシンＢ、商業的ＰＭＡＡ−Ｎａ又はＰＭＡＡ−Ｎａの細胞と比較してアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（１００μｇ／ｍｌ）の存在下で有意により高かった。エンドトキシンの無いアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いたインターフェロンγ放出のレベルは、ヒトにおいて薬理学的Ｔｈ１応答を促進するために十分であるが、ヒトにおいて顕著な有害副作用を引き起こす程高くはない。
【０１９８】
実施例Ｌ２：
このセクションに記載される実験の目的は、抗原及びＰＭＡＡ−Ｎａの調製物もＴｈ１ヘルパー応答を刺激するかどうかを確証するためである。
【０１９９】
ツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａは以下のように作製された。実施例Ａ１〜Ａ４に記載されるように調製されたホモポリマー、ＰＭＡＡ−Ｎａ（３０ｍｇ）、は、ツベルクリン精製タンパク質誘導体ＢＰ（１０ｍｌ、１００，０００ユニット／ｍｌ、Ｅｖａｎｓ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）に添加され、結果生じる溶液は室温で１．５時間撹拌された。溶液は次いでビスキング透析膜（ＭＷＣＯ  ７０００、Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いて１リットルの水に対して透析された（水を６回代えながら）。透析された溶液は、０．２μｍフィルターで濾過され、オフホワイトの固体プロダクト（２０ｍｇ）を得るために凍結乾燥された。ＴＦ−ＩＲ（ＡＴＲ）１６４８ｃｍ−１、１５４５ｃｍ−１、１４５０ｃｍ−１、１３９８ｃｍ−１、１２５９ｃｍ−１。
【０２００】
ＰＢＭＣｓは次いでＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅを用いて全血から分離され、１０％ヒト血清、２００μｇ／ｍｌペニシリン及び２００  ＩＵ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０中に再懸濁された。リムルス試験（Pyrotell, Associates of Cape Cod, US）を用いて測定されたように、全ての試薬及び化合物は、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含有した。細胞（１０５細胞／ウェル）及び各化合物は一対(in duplicate)で混合され、３７℃／５％ＣＯ２で４日間インキュベートされた。［３Ｈ］−チミジン（比活性２０〜３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Amersham Biosciences, UK）が１μＣｉ／ウェルで更に１８時間添加された。細胞は次いで収穫され、液体シンチレーションカウンターを用いて増殖が測定された。結果は平均カウント／分（ｃｐｍ）±ｓｅｍとして表された。図２４ａは、それらが１μｇ／ｍｌのツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物と培養された場合、Ｔリンパ球の有意に上昇した増殖が存在したことを示す。それらが１０μｇ／ｍｌのツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（Ｐ＝０．００１）と培養された場合、Ｔリンパ球のより更なる増殖が存在した。
【０２０１】
図２４ｂは、ドナーＢについての結果を示す。１０μｇ／ｍｌのツベルクリン抗原（Ｐ＝０．００２）とよりも１０μｇ／ｍｌのツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物とでは有意な更なるＴリンパ球増殖が存在した。これはツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物が、ツベルクリン抗原そのものよりも有意により多くのＴリンパ球増殖を引き起こすことを示す。
【０２０２】
実施例Ｌ３：インターフェロンγ分泌細胞についてのＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
ヒトＰＢＭＣｓは単離され、１０％ヒト血清、２００μｇ／ｍｌペニシリン及び２００  ＩＵ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ  １６４０中に２×１０５細胞／ウェルに調節された。全ての試薬及び化合物は＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含有した。ＰＢＭＣｓ及び化合物はヒトインターフェロンγモノクローナル抗体（R&D Systems UK）でコートされたＥＬＩＳｐｏｔ  ＰＶＤＦ−バックドマイクロプレート（backed microplate）のウェル中で混合された。刺激されていない細胞がネガティブコントロールとして使用され、組換えヒトインターフェロンγがポジティブコントロールとして使用された。プレートは２４時間３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートされた。次いで、製造者の指示書に従いマイクロプレートを確立し、インターフェロンγについての陽性スポットの数を数えた。各スポットは１つのインターフェロンγ分泌細胞を示した。図２５はツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物が、初代ヒトＴリンパ球からのインターフェロンγの放出を刺激することにおいてツベルクリン抗原のみよりも有意により効果的であったことを示す。Ｔリンパ球からのインターフェロンγ分泌のこの上昇は、５０μｇ／ｍｌのツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物及び１００μｇ／ｍｌのツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物で見られた。
【０２０３】
Ｍ）内臓リーシュマニア症のマウスモデルにおけるドノバンリーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の抗リーシュマニア活性の測定
無鞭毛期ドノバンリーシュマニア種（ＭＨＯＭ／ＥＴ／６７／Ｌ８２）は、重篤に感染したドナーＳｙｒｉａｎ  Ｈａｍｓｔｅｒ−Ｍｅｓｏｃｒｉｔｅｔｕｓ  ａｕｒａｔｕｓの脾臓から集められた。７．５〜１０×１０７の無鞭毛期／ｍｌ含有接種源が調製された。特定病原体フリーであるメスＢＡＬＢ／ｃマウス（２０ｇ）は、０日目に、２００μＬ（１．５〜２×１０７無鞭毛期に等しい）を用いて静脈から感染された。感染の最終点は、１４日目に一つのマウスにおける感染のレベルを調べるための顕微鏡読み、及び感染後２１日目に総寄生体負荷量を測定するためのギエムザ染色された肝臓のインプレッションによって評価された。
【０２０４】
以下の化合物は以下の投薬計画に従って静脈投与された：
ａ）感染後、未処理のコントロール。
ｂ）感染後、１４、１６及び１８日目、０．５ｍｇ／ｋｇのブランクリポソーム。
ｃ）感染後、１４、１６及び１８日目、８ｍｇ／ｋｇのＰＭＡＡ−Ｎａ。
ｄ）感染後、１４、１６及び１８日目、１ｍｇ／ｋｇの臨床グレートアンフォテリシンＢ。
ｅ）感染後、１４、１６及び１８日目、０．５ｍｇ／ｋｇのＡｍＢｉｓｏｍｅ。
ｆ）感染後、１４、１６及び１８日目、０．５ｍｇ／ｋｇのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物。
ｇ）感染後、１４、１６及び１８日目、１ｍｇ／ｋｇのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物。
ｈ）感染後、１４、１６及び１８日目、２ｍｇ／ｋｇのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物。
【０２０５】
各グループに５動物存在した。ＰＭＡＡ−Ｎａの静脈注入及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物のためのキャリア溶液は、５％デキストロースであった。すべての薬剤調製物は０．２μＬシリンジフィルターを用いて濾過された。静脈注入量は注入毎２００μＬであった。
【０２０６】
マウスのグループは毒性の測定として処置の前後に計量され、パーセント重量変化が示された。感染後２１日（これは処置完了後３日であった）に、寄生体負荷量は１０％ギエムザで染色されたメタノール固定された肝臓インプレッションスライドから顕微鏡で測定された。無鞭毛期／５００肝臓細胞の数は顕微鏡でカウントされ、結果は未処理コントロールのパーセントとして表された。
【０２０７】
図２６は、ブランクリポソーム及びＰＭＡＡ−Ｎａが抗リーシュマニア活性を有さないことを示す。コントロールと比較して、無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの臨床グレードアンフォテリシンＢ、Ａｍｂｉｓｏｍｅ、１ｍｇ／ｋｇのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物、２ｍｇ／ｋｇのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物による有意なキリング活性が存在した（Ｐ＜０．０００１）。臨床グレードアンフォテリシンＢ，Ａｍｂｉｓｏｍｅ及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ（２ｍｇ／ｋｇ）の抗リーシュマニア活性は、互いに有意に相違しなかった（Ｐ＜０．０５）。従って、これらの結果はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物が、内臓リーシュマニア症のこの動物モデルにおいてＡｍｂｉｓｏｍｅと同程度に有効であることを示す。
【０２０８】
実施例Ｎ：ＰＭＡＡ−Ｎａ合成
異なる分子量のＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの生成−
ＰＭＡＡ−Ｎａ前駆体（ＰＭＯＳｕ）の合成の間、１９ｋＤ〜３７ｋＤの範囲の分子量を有する幾つかのポリマーを生成するために、重合条件は実施例Ａに記載される様に変更された。分子量及び多分散性指数はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて確立された。
【０２０９】
異なる分子量のＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの初代ヒト細胞（赤血球溶血及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ））についての毒性はＭＴＴアッセイによって確立された。ＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトは、１時間、５時間及び２４時間のインキュベーション後、２ｍｇ／ｍｌの濃度で赤血球溶血を引き起こさなかった（図２７参照）。更に、それらは１日及び２日間のインキュベーションの後、２ｍｇ／ｍｌで末梢血単核細胞に対して毒性でなかった（図２８参照）。これらの結果は、作製されたＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの分子量によって影響されなかった。
【０２１０】
実施例Ｏ：保存時のアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体の安定性：
凍結乾燥されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａは４ヶ月間アルゴン下４℃で保存された。それはまた、５％デキストロース中に１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解され、アルゴン下で７ヶ月間４℃で保存された。この期間の終りに、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体の安定性が、それをヒト赤血球とインキュベートすることによって測定された。以前の実験はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体はアンフォテリシンＢよりも遥かに毒性が低いことを示した。従ってこのアッセイは、数ヶ月間の複合体の保存の後に繰返された。
【０２１１】
実験は以前に記載されるように行われた。新たに調製された臨床グレードアンフォテリシンＢが比較のためのリファレンスとして使用された。インキュベーションは１時間及び６時間行われた。図２９は、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体は保存後に赤血球に対して毒性が無かったことを示す。従って、複合体は、それが凍結乾燥された粉末として４ヶ月間保存された場合、及びまたそれが５％デキストロース中に４℃で７ヶ月間保存された場合、安定である。
【０２１２】
保存後の複合体の抗リーシュマニア活性も上記実施例Ｊ１及びＫ１に記載されるように測定された。図３０は、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａのフリー前鞭毛期リーシュマニア及び細胞内無鞭毛期に対する抗リーシュマニア活性を示す。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａの活性は、４℃で４ヶ月間の粉末での保存によって影響されなかった。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａの活性は５％デキストロース中の４℃で７ヶ月間の保存によって影響されなかった。
【０２１３】
実施例Ｐ：クリプトコッカスネオフォルマンス
National Collection of Pathogenic FungiからのCryptococcus neoformans mucoidal strains var neoformans 3003及びvar gattii 3216が試験された。var neoformansの非ムコイド臨床分離株及びver gattiiの非ムコイド臨床分離株も試験された。該生物は、３２℃で５％ＣＯ２で加湿されたチャンバ中のクロラムフェニコール（Ｏｘｏｉｄ，ＵＫ）を添加したサブロー(Sabouraud)デキストロース寒天プレート上に維持された。
【０２１４】
菌株は、滅菌水に懸濁される前に４８時間サブローデキストロース寒天上で継代培養され、それらの濃度は４×１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌに調節された。サンプルの二倍希釈物は、×２酵母窒素ベース（ＹＮＢ、Ａｎａｃｈｅｍ）中の所望の終濃度の二倍で作製された。等量のサンプル及び酵母懸濁物は、次いで９６ウェルの平底プレートに添加され、３２℃でインキュベートされた。３日のインキュベーションの後、プレートは、酵母をウェルに亘って均一に分散させるために、全体的に振盪され、濁度が分光計を用いて測定された（４９０ｎｍ）。１００％生存率は、コントロールウェルにおける未処理酵母の光学密度を用いて定義された。
【０２１５】
初代ヒトマクロファージの感染のために、クリプトコッカス株は、それらにカプセルを形成させるために、１０％ヒト血清を添加したＹＮＢ中で４８時間５％ＣＯ２の存在下で継代培養された。腹腔ヒトマクロファージ又は単球由来のマクロファージ（〜７５０，０００）は、チャンバスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ，ＵＳＡ）上にプレートされ、２４時間付着された。酵母細胞は、スピンダウンされ、洗浄され、そして１０％ヒト血清及び２％グルコース（後者は酵母の増殖を促進する）を添加したＲＰＭＩ中に再懸濁された。この懸濁物は、マクロファージの１５倍濃度で添加され、感染が５％ＣＯ２で加湿されたチャンバ中で３７℃で〜２１時間進行された。培地は次いで吸引され、マクロファージはＰＢＳで洗浄された。試験サンプルの二倍希釈物は次いで１０％ヒト血清を添加したＲＰＭＩ中に添加され、３日間５％ＣＯ２で加湿されたチャンバ中３７℃でインキュベートされた。培地は吸引され、全ての細胞外cryptococciを除去するためにマクロファージはＰＢＳで徹底的に洗浄された。チャンバは除去され、スライドはメタノール及び熱を用いた固定の前に乾燥させられ、次いでグラム染色された。感染した及び感染していないマクロファージの数及びグラム陽性酵母ＣＦＵの数がカウントされた。結果は感染指数として表され、これはＣＦＵ／感染した細胞のパーセントの平均数として計算された。
【０２１６】
図３１（i）及び（ii）は、Cryptococcus neoformans var neoformansについての結果を示し、図３１（iii）及び（iｖ）は、Cryptococcus neoformans var gattiについての結果を示す。アンフォテリシンＢ（０．９〜１．４μｇ／ｍｌ）及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ（１．６〜２．７μｇ／ｍｌ）についてのＬＤ５０は同様である。図３２（i）及び（ii）は、Cryptococcus neoformans var neoformansについての結果を示し、図３２（iii）及び（iｖ）は、これらの生物がヒト単球由来マクロファージを感染した場合のCryptococcus neoformans var gattiについての結果を示す。実施された８つの実験の全てにおいてアンフォテリシンＢ及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−ＮａについてのＬＤ５０は同様であった。Cryptococcus neoformans var neoformansの場合、アンフォテリシンＢについてのＬＤ５０は０．９〜１．４μｇ／ｍｌであり、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａについてのそれは同様に１．６〜２．７μｇ／ｍｌであった。Cryptococcus neoformas var gattiについて、アンフォテリシンＢのＬＤ５０は０．０６〜１．０μｇ／ｍｌであり、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａのそれは０．１〜０．５μｇ／ｍｌで同様であった。従って、複合体はアンフォテリシンＢのみと同程度にcryptococciに対して活性である。
【０２１７】
実施例Ｑ：Candida sp.
Candida albicans （ＡＴＣＣ  ９００２８）及びCandida glabrata（ＡＴＣＣ  ９００３０）が使用された。それぞれの場合において、菌株は５％ＣＯ２で加湿されたチャンバ中のクロラムフェニコール（Oxoid, UK）を添加したサブローデキストロース寒天プレート上に３２℃で維持された。それは、その濃度が２×１０５ＣＦＵ／ｍｌに調節される前に、４８時間サブローデキストロース寒天上で継代培養された。サンプルの二倍希釈物は、×２酵母窒素ベース（ＹＮＢ、Ａｎａｃｈｅｍ）中の所望終濃度の二倍において作製された。等量のサンプル及び酵母懸濁物が９６ウェル平底プレートに添加され、３２℃でインキュベートされた。１日後、プレートは、酵母の増殖をウェルに亘って均一に分散させるために全体に振盪された。濁度が分光計を用いて測定された（４９０ｎｍ）。１００％生存率は、コントロールウェルにおける未処理酵母の光学密度を用いて確立された。
【０２１８】
図３３（i）は、Candida albicansについての結果を示し、図３３（ii）は、Candida glabrataについての結果を示す。アンフォテリシンＢ（０．９〜１．８μｇ／ｍｌ）及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ（１．６〜２．３μｇ／ｍｌ）についてのＬＤ５０は同様である。従って、複合体はアンフォテリシンＢのみと同程度のCandida sp.に対する活性がある。
【図面の簡単な説明】
【０２１９】
【図１】図１はＲＰＭＩ中のＰＭＡＡ−Ｎａと細胞のインキュベーション後の赤血球の溶血を示す。ヒト赤血球の２％ｖ／ｖ溶液はＰＭＡＡ−Ｎａ（“薬剤”）の溶液とＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃で１時間と２４時間インキュベートされた。１時間後又は２４時間後、２，０００μｇ／ｍｌの濃度までのＰＭＡＡ−Ｎａについて有意な毒性は見られなかった。図は３人のヒトドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）についての結果を示す。図１ａは、ドナーＡについて得た結果を示し、図１ｂはドナーＣについて得た結果を示し、そして図１ｃはドナーＢについての結果である。１時間のインキュベーションの後に得た結果は丸で示され、２４時間のインキュベーション後の結果は菱形で示される。
【図２】図２は、ＲＰＭＩ中でのＰＭＡＡ−Ｎａとのインキュベーション後の全血中の赤血球溶血を示す。ヒト全血（ドナーＤ）の２％ｖ／ｖ溶液はＲＰＭＩ１６４０中でＰＭＡＡ−Ｎａ（“薬剤”）の溶液とインキュベートされた。１時間後（クロスで示される）、６時間後（三角で示される）又は２４時間後（丸で示される）、５００μｇ／ｍｌの濃度までのヒト全血を用いたＰＭＡＡ−Ｎａについて有意な毒性は見られなかった。
【図３】図３は、ヒト単球由来マクロファージ（図３ａ）及び初代ヒト腹腔マクロファージ（図３ｂ）に対してＰＭＡＡ−Ｎａの毒性が無いことを示す。図３ａは、単球由来マクロファージが０〜２，０００μｇ／ｍｌの濃度範囲に亘るＰＭＡＡ−Ｎａを含有する培地でインキュベートされた場合に得られた結果を示す。細胞はチアゾリルブルー（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ  ５ｍｇ／ｍｌ）に添加前に７１時間インキュベートされた。ＰＭＡＡ−Ｎａを用いて得られた結果は黒四角、コントロールとして使用されるポリ（Ｌ−リシン）での結果は丸で示される。ＰＭＡＡ−ＮａはＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された最高濃度２，０００μｇ／ｍｌにおいてＭＤＭｓに対して毒性でなかった。図３ｂは、ヒト腹膜細胞が０〜２，０００μｇ／ｍｌの濃度範囲に亘るＰＭＡＡ−Ｎａで培養された場合に得られた結果を示す。細胞はＭＴＴの添加前に７１時間インキュベートされた。ＰＭＡＡ−Ｎａを用いて得られた結果は黒四角で示され、コントロールとして使用されるポリ（Ｌ−リシン）での結果は丸で示される。５００μｇ／ｍｌまででＰＭＡＡ−Ｎａは腹腔マクロファージに対して毒性でない。５００μｇ／ｍｌ〜２，０００μｇ／ｍｌで、中程度の量の毒性が、ＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて見られた。
【図４】図４は、エンドトキシンフリーＰＭＡＡ−Ｎａによるヒト腹腔マクロファージからのＭＩＰ―１βの放出を示す。３ドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）からのヒト腹膜細胞はエンドトキシン−フリーＰＭＡＡ−Ｎａ（５００μｇ／ｍｌ）と共に培養され、３６時間後に収穫された培養上清はＭＩＰ−1βについて分析された。全ての試薬及びＰＭＡＡ−Ｎａは、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌ（ＥＵ／ｍｌ）を含有した。図４ａは、ドナーＡについて得られた結果を示し、図４ｂは、ドナーＢについてそして図４ｃはドナーＣについてである。ＰＭＡＡ−Ｎａの存在下でＭＩＰ−１βの有意な放出が存在した。
【図５】図５は、エンドトキシンフリーＰＭＡＡ−Ｎａによるヒト腹腔マクロファージからのＴＮＦ−αの放出を示す。２ドナー（Ａ及びＢ、それぞれ図５ａ及び５ｂ）からのヒト腹膜細胞はエンドトキシンフリーＰＭＡＡ−Ｎａ（５００μｇ／ｍｌ及び２，０００μｇ／ｍｌ）と共に培養され、３６時間後に収穫された培養上清はＴＮＦ−αについて分析された。両方の濃度においてＰＭＡＡ−Ｎａの存在下ＴＮＦ−αの有意な放出が存在した。
【図６】図６は、培地コントロール又はＰＭＡＡ−Ｎａとインキュベートされた単一ドナーのヒト腹腔マクロファージからのケモカイン及びサイトカインの放出を示す。ヒト腹膜細胞はＰＭＡＡ−Ｎａ（５００μｇ／ｍｌ）と培養され、３６時間後に収穫された培養上清は炎症性ケモカインＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β及びＩＬ−８、並びに炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１β及びＩＬ−６について分析された。３人の異なるヒトドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）からの細胞を用いた結果が示される。培地コントロールを用いて得た結果は白ブロックで、ＰＭＡＡ−Ｎａを用いたものは黒ブロックで示される。ＭＩＰ−1αの放出は図６ａに、ＴＮＦ−αは図６ｂに、ＭＩＰ−１βは図６ｃにＩＬ−８及び炎症性サイトカインＴＮＦ−α、ＩＬ−１βは図６ｄに、ＩＬ−８は図６ｅに、ＩＬ−６は図６ｆに示される。組織抗原提示細胞からのこれらのケモカイン及びサイトカインの放出は、ヒトにおける薬理学的Ｔｈ１応答を促進するレベルであったが、ヒトにおける顕著な有害副作用を引き起こすほど高くなかった。
【図７】図７は、エンドトキシン−フリーＰＭＡＡ−Ｎａによるヒト単球由来マクロファージからのＭＩＰ−１βの放出を示す。単球由来マクロファージは１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ及び２，０００μｇ／ｍｌの濃度でＰＭＡＡ−Ｎａと培養された。３人の異なるヒトドナーＡ、Ｂ及びＣからの細胞を用いた結果は、各々図７a、７ｂ及び７ｃに示される。ＭＩＰ−１βの放出は見られなかった。従って、組織ボディーベースコンパートメントからの起源のマクロファージの細胞と比較して血液単球起源の細胞に対してＰＭＡＡ−Ｎａの異なる免疫調節効果が存在する。
【図８】図８は、商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａによるのではなく、ＰＭＡＡ−Ｎａによるヒト腹腔マクロファージからのＭＩＰ−１βの放出を示す。ヒト腹腔マクロファージはＭＷｔ’ｓの範囲（Ｍｎ＝１，３００、２２，１００及び１２９，０００ｇ／モル）且つ狭い分子量分布の商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びここで説明されるように作製されたＰＭＡＡ−Ｎａと共に培養された。商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａの１つは実施例Ａ１〜Ａ４に記載されるように調製されたＰＭＡＡ−Ｎａと同等のＭＷｔを有した（Ｍｎ＝２２，０００ｇ／モル）（図中、ＰＭＡＡ−Ｎａ）。各場合において、５００μｇ／ｍｌのＰＭＡＡ−Ｎａが使用された。培養上清は３６時間後に収穫された。ＭＩＰ−１βの放出は無かった。図８a及び８ｂは、各々２人のヒトドナーＡ及びＢからの個別の結果を示す。
【図９】図９は、商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａによるのではなく、ＰＭＡＡ−Ｎａによるヒト腹腔マクロファージからのＴＮＦ−αの放出を示す。ヒト腹腔マクロファージはＭＷｔ’ｓの範囲（Ｍｎ＝１，３００、２２，１００及び１２９，０００ｇ／モル）且つ狭い分子量分布の商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）、及びここに記載されるように作製されたＰＭＡＡ−Ｎａと共に培養された。商業的に入手可能なＰＭＡＡ−Ｎａの１つは我々のＰＭＡＡ−Ｎａの合成調製物と同様のＭＷｔを有した（Ｍｎ＝２２，０００ｇ／モル）（図においてＰＭＡＡ−Ｎａ）。各場合において５００μｇ／ｍｌのＰＭＡＡ−Ｎａが使用された。培養上清は３６時間後に収穫された。ＴＮＦ−αの放出はなかった。図９ａ及び９ｂは各々二人のヒトドナーＡ及びＢからの別個の結果を示す。
【図１０】図１０、１１及び１２はアンフォテリシンＢ又はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体とのインキュベーション後の赤血球溶血を示す。方法は図１について記載した通りであった。臨床グレートアンフォテリシンＢ（アンフォＢ、結果は白四角として示される）と実施例Ｃに記載されるように調製されるアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（アンフォＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ、結果は白丸として示される）の間の比較がなされた。試験のための化合物のストック溶液はＭＧＭ中で調製された。ヒト赤血球溶血は１時間（図１０）、６時間（図１１）及び２４時間（図１２）のインキュベーション後に測定された。各場合において３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）から得た細胞が使用された。各ラインは一人のドナーからの結果を示す。図１０a、１０ｂ及び１０ｃは、各々ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との１時間インキュベーションの結果を示す。図１１a、１１ｂ及び１１ｃは各々ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との６時間インキュベーションの結果を示す。図１２a、１２ｂ及び１２ｃは、各々、ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との２４時間インキュベーションの結果を示す。１時間インキュベーションの後アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物について毒性は見られなかった。６時間インキュベーションの後、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性は、臨床グレードアンフォテリシンＢのものよりも有意に低かった。インキュベーション時間が２４時間の増加した場合、臨床グレードアンフォテリシンＢの毒性は１００％に上昇したが、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性に更なる上昇は無かった。
【図１１】図１０、１１及び１２はアンフォテリシンＢ又はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体とのインキュベーション後の赤血球溶血を示す。方法は図１について記載した通りであった。臨床グレートアンフォテリシンＢ（アンフォＢ、結果は白四角として示される）と実施例Ｃに記載されるように調製されるアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（アンフォＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ、結果は白丸として示される）の間の比較がなされた。試験のための化合物のストック溶液はＭＧＭ中で調製された。ヒト赤血球溶血は１時間（図１０）、６時間（図１１）及び２４時間（図１２）のインキュベーション後に測定された。各場合において３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）から得た細胞が使用された。各ラインは一人のドナーからの結果を示す。図１０a、１０ｂ及び１０ｃは、各々ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との１時間インキュベーションの結果を示す。図１１a、１１ｂ及び１１ｃは各々ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との６時間インキュベーションの結果を示す。図１２a、１２ｂ及び１２ｃは、各々、ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との２４時間インキュベーションの結果を示す。１時間インキュベーションの後アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物について毒性は見られなかった。６時間インキュベーションの後、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性は、臨床グレードアンフォテリシンＢのものよりも有意に低かった。インキュベーション時間が２４時間の増加した場合、臨床グレードアンフォテリシンＢの毒性は１００％に上昇したが、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性に更なる上昇は無かった。
【図１２】図１０、１１及び１２はアンフォテリシンＢ又はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体とのインキュベーション後の赤血球溶血を示す。方法は図１について記載した通りであった。臨床グレートアンフォテリシンＢ（アンフォＢ、結果は白四角として示される）と実施例Ｃに記載されるように調製されるアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（アンフォＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ、結果は白丸として示される）の間の比較がなされた。試験のための化合物のストック溶液はＭＧＭ中で調製された。ヒト赤血球溶血は１時間（図１０）、６時間（図１１）及び２４時間（図１２）のインキュベーション後に測定された。各場合において３人の異なるドナー（Ａ、Ｂ及びＣ）から得た細胞が使用された。各ラインは一人のドナーからの結果を示す。図１０a、１０ｂ及び１０ｃは、各々ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との１時間インキュベーションの結果を示す。図１１a、１１ｂ及び１１ｃは各々ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との６時間インキュベーションの結果を示す。図１２a、１２ｂ及び１２ｃは、各々、ドナーＡ、Ｂ及びＣの細胞との２４時間インキュベーションの結果を示す。１時間インキュベーションの後アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物について毒性は見られなかった。６時間インキュベーションの後、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性は、臨床グレードアンフォテリシンＢのものよりも有意に低かった。インキュベーション時間が２４時間の増加した場合、臨床グレードアンフォテリシンＢの毒性は１００％に上昇したが、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の毒性に更なる上昇は無かった。
【図１３】図１３は、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体とのインキュベーション後の一人のドナーにおける赤血球溶血を示す。方法は図１１について記載される通りであり、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体は実施例Ｃに記載されるように調製された。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（“薬剤”）による赤血球溶血の程度は、１，０００μｇ／ｍｌまでの濃度について、１時間及び２４時間のインキュベーション後に測定された。１時間のインキュベーション後に得られた結果は、白四角として示され、２４時間のインキュベーション後の結果は黒丸である。
【図１４】図１４はＰＢＭＮ細胞を用いた１、２及び６日の培養後にアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａの毒性が無いことを示す。ＲＰＭＩ培地におけるＰＢＭＣｓは０〜７０μｇ／ｍｌの濃度範囲に亘る実施例Ｃにおいて記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（“薬剤”）を含有する培地を用いて培養された。細胞はＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）の添加前に１日又は２日、又は６日間インキュベートされた。化合物は、１日の培養、２日の培養、６日の培養後ＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された７０μｇ／ｍｌの最高濃度におけるＰＢＭＣｓにおいて毒性がなかった。図１４は、３人の代表的ヒトドナーからの個別結果を示す。各ラインは一人のドナーを示す。図１４a、１４ｂ及び１４ｃは、各々１日、２日、及び６日間のインキュベーション後の結果を示す。
【図１５】図１５は、単球由来マクロファージを用いた２日及び３日培養後のアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体の毒性を示す。単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）は、濃度１２５μｇ／ｍｌまでの化合物（“薬剤”）を含有する培地と共に培養された。細胞はＭＴＴの添加前２日又は３日間インキュベートされた。アンフォテリシンＢを用いて得られた結果は白丸で示され、実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いた結果は白四角として示される。図１５ａは、２日の培養後に得られた結果を示し、図１５ｂは２日の培養後の結果である。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物は２日と３日の両方の培養の後ＭＴＴアッセイ及びトリパンブルーアッセイを用いて試験された濃度１２５μｇ／ｍｌまでの全てにおいて臨床グレートアンフォテリシンＢよりも毒性が低かった。
【図１６】図１６は、アンフォテリシン又はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体で処理された前鞭毛期メキシコリーシュマニア(Leishmania mexicana promastigote)の生存率を示す。これらの実験に使用された前鞭毛期メキシコリーシュマニアは、１５％ウシ胎児血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及びゲンタマイシン（１ｍｇ／１００ｍｌ）を添加したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ‘ｓ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ生育培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持された。前鞭毛期メキシコリーシュマニアについての臨床グレートアンフォテリシンの５０％致死量（ＬＤ５０）は、０．１４μｇ／ｍｌであった（図１６ｄ）。前鞭毛期メキシコリーシュマニアについての臨床グレードアンフォテリシンＢの９０％致死量（ＬＤ９０）は、１．４９μｇ／ｍｌ）であった（図１６ｄ）。実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いた３つの実験からの結果は図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃに示される。前鞭毛期メキシコリーシュマニアについてのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａの５０％致死量（ＬＤ５０）は、０．１０〜０．１９μｇ／ｍｌであった（図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃ）。前鞭毛期メキシコリーシュマニアについてのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の９０％致死量（ＬＤ９０）は、１．０２〜１．４９μｇ／ｍｌであった（図１６ａ、１６ｂ及び１６ｃ）。前鞭毛期メキシコリーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の活性は重量毎重量ベースで臨床グレードアンフォテリシンＢのものと同様であった。
【図１７】図１７は、アンフォテリシン又はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体で処理された前鞭毛期ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovani promastigote)の生存率を示す。これら実験に使用された前鞭毛期ドノバンリーシュマニア(Leishmania donovania promastigote)は、１５％ウシ胎児血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及びゲンタマイシン（１ｍｇ／１００ｍｌ）を添加したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ’ｓ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉａ１９９中に維持された。前鞭毛期ドノバンリーシュマニアについての臨床グレートアンフォテリシンＢの５０％致死量（ＬＤ５０）は、０．０８μｇ／ｍｌであった（図１７ｄ）。前鞭毛期ドノバンリーシュマニアのついての臨床グレードアンフォテリシンＢの９０％致死量（ＬＤ９０）は、１．９１μｇ／ｍｌであった（図１７ｄ）。実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いた３つの実験からの結果は図１７ａ、１７ｂ及び１７ｃに示される。前鞭毛期ドノバンリーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の５０％致死量（ＬＤ５０）は、０．１０〜０．１７μｇ／ｍｌであった（図１７ａ、１７ｂ及び１７ｃ）。前鞭毛期ドノバンリーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の９０％致死量（ＬＤ９０）は、０．９８〜１．２８μｇ／ｍｌであった（図１７ａ、１７ｂ及び１７ｃ）。従って、前鞭毛期ドノバンリーシュマニアに対するアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物の活性は、重量毎重量ベースで臨床グレードアンフォテリシンＢのものと同様であった。
【図１８】図１８は、ヒト単球由来マクロファージにおけるアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体による細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニアの増殖の抑制を示す。無鞭毛期メキシコリーシュマニアは、１０％ヒト血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及び２００ ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持されたヒト単球由来マクロファージを感染させるために使用された。感染指数は寄生体／細胞の平均数×感染した細胞のパーセントとして計算された。実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いた４つの実験の結果は、図１８ａ〜１８ｄに示される。臨床グレードアンフォテリシンＢを用いた抑制は図１９ａに示され、ＡｍＢｉｏｓｏｍｅ（Ｇｌｉｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたものは図１９ｂである。細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニア増殖の５０％抑制は、０.ｌ４μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図１９ａ）又は０．４５μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅ（図１９ｂ）と比較して、０．１８〜０，３２μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物で達成された（図１８ａ〜１８ｄ）。細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニア増殖の９０％抑制は、０．９５μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図１９ａ）又は３．８９μｇ／ｍｌのＡｍＢｉｓｏｍｅ（図１９ｂ）と比較して１．１８〜１．５５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いて達成された。
【図１９】図１９は、臨床グレードアンフォテリシンＢ又はＡｍＢｉｏｓｏｍｅ（リポソームアンフォテリシンＢ，Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｒｅａｔ  Ａｂｉｎｇｄｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）を用いた対応する抑制を示す。無鞭毛期メキシコリーシュマニアは、１０％ヒト血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及び２００ ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持されたヒト単球由来マクロファージを感染させるために使用された。感染指数は寄生体／細胞の平均数×感染した細胞のパーセントとして計算された。実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いた４つの実験の結果は、図１８ａ〜１８ｄに示される。臨床グレードアンフォテリシンＢを用いた抑制は図１９ａに示され、ＡｍＢｉｏｓｏｍｅ（Ｇｌｉｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたものは図１９ｂである。細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニア増殖の５０％抑制は、０.ｌ４μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図１９ａ）又は０．４５μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅ（図１９ｂ）と比較して、０．１８〜０，３２μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物で達成された（図１８ａ〜１８ｄ）。細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニア増殖の９０％抑制は、０．９５μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図１９ａ）又は３．８９μｇ／ｍｌのＡｍＢｉｓｏｍｅ（図１９ｂ）と比較して１．１８〜１．５５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いて達成された。
【図２０】図２０は、ＡｍＢｉｏｓｏｍｅと比較したアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体によるヒトマクロファージ中の細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニアの増殖の阻害を示す。図２０に示されるグラフは、実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（白四角として示される；ＩＣ５０＝０．３μｇ／ｍｌ）とＡｍＢｉｓｏｍｅ（リポソームアンフォテリシンＢ，Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｒｅａｔ  Ａｂｉｎｇｄｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）（黒丸として示される；ＩＣ５０＝１．７μｇ／ｍｌ）の細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニアに対する相対活性の傾きを比較する。それは、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物のキリングカーブは、ＡｍＢｉｓｏｍｅについてのキリングカーブよりも急勾配であることを実証する。
【図２１】図２１及び２２は、臨床グレードアンフォテリシンＢ（図２２a）及びＡｍＢｉｏｓｏｍｅ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記の通り）（図２２ｂ）による、ヒト単球由来マクロファージにおけるアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体による細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニア増殖の抑制を示す（４実験、図２１ａ〜２１ｂに示される）。無鞭毛期ドノバンリーシュマニアは、１０％ヒト血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及び２００ ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持されたヒト単球由来マクロファージを感染するために使用された。感染指数は寄生体／細胞の平均数×感染した細胞のパーセントとして計算された。細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの増殖の５０％抑制は、０．５４μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図２２ａ）又は１．９６μｇ／ｍｌのＡｍＢｉｓｏｍｅ（図２２ｂ）と比較して、０．３０〜０．７１μｇ／ｍｌの実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物で達成された（図２１ａ〜２１ｂ）。細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの増殖の９０％抑制は、２．３１μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図２２ａ）又は＞８μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅ（図２２ｂ）と比較して、２．１８〜３．１８μｇ／ｍｌの実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いて達成された（図２１ａ〜２１ｄ）。
【図２２】図２１及び２２は、臨床グレードアンフォテリシンＢ（図２２a）及びＡｍＢｉｏｓｏｍｅ（Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記の通り）（図２２ｂ）による、ヒト単球由来マクロファージにおけるアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体による細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニア増殖の抑制を示す（４実験、図２１ａ〜２１ｂに示される）。無鞭毛期ドノバンリーシュマニアは、１０％ヒト血清（５６℃で１時間熱不活性化された）及び２００ ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に維持されたヒト単球由来マクロファージを感染するために使用された。感染指数は寄生体／細胞の平均数×感染した細胞のパーセントとして計算された。細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの増殖の５０％抑制は、０．５４μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図２２ａ）又は１．９６μｇ／ｍｌのＡｍＢｉｓｏｍｅ（図２２ｂ）と比較して、０．３０〜０．７１μｇ／ｍｌの実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物で達成された（図２１ａ〜２１ｂ）。細胞内無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの増殖の９０％抑制は、２．３１μｇ／ｍｌの臨床グレードアンフォテリシンＢ（図２２ａ）又は＞８μｇ／ｍｌのＡｍｂｉｓｏｍｅ（図２２ｂ）と比較して、２．１８〜３．１８μｇ／ｍｌの実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いて達成された（図２１ａ〜２１ｄ）。
【図２３】図２３は、２４時間の異なる化合物との培養後のヒト腹腔マクロファージからのインターフェロンγの放出を示す。ヒト腹膜細胞は、示される濃度における各化合物とマクロファージ増殖培地中で培養された。使用された化合物は、実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体、臨床グレードアンフォテリシンＢ、商業的ＰＭＡＡ−Ｎａ及び実施例Ａ１〜Ａ４に記載されるように調製されたＰＭＡＡ−Ｎａであった。全ての試薬及び化合物は＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含有した。培養上清は、２４時間後に収穫された。インターフェロンγはＥＩＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によって測定された。腹腔マクロファージからのＴｈ１促進サイトカイン、インターフェロンγの放出はコントロールのみ、臨床グレードアンフォテリシンＢ，商業的ＰＭＡＡ−Ｎａ又はＰＭＡＡ−Ｎａの細胞と比較してアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物（１００μｇ／ｍｌ）の存在下でより有意に高かった。
【図２４】図２４はツベルクリンＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いたインキュベーション後の細胞のＰＭＢＣ増殖を示す。ＰＢＭＣｓは、１０％ヒト血清、２００μｇ／ｍｌペニシリン及び２００ ＩＵ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０中に再懸濁された。ツベルクリンＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（ツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａとも呼ばれる）は実施例Ｌ２に記載されるように調製された。全ての試薬及び化合物は、リムルス試験（Pyrotell, Associates of Cape Cod, US）を用いて測定されるように＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含有した。細胞（１０5細胞／ウェル）及び各化合物（示される濃度のツベルクリンＰＰＤ及びツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ）は一対(in duplicate)で混合され、３７℃／５％ＣＯ２で４日間インキュベートされた。［３Ｈ］−チミジン（比活性２０〜３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Amersham Bioosciences, UK）は、更なる１８時間に１μＣｉ／ウェルで添加された。細胞は次いで収穫され、液体シンチレーションカウンターを用いて増殖が測定された。結果は平均カウント／分（ｃｐｍ）±ｓｅｍとして表された。図２４ａは、ツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物とドナーＡの細胞の６日のインキュベーション後のＰＢＭＣ増殖について得られた結果を示す。図２４ａは、それらが１μｇ／ｍｌのツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物と培養された場合、有意に上昇したＴリンパ球の増殖が存在したことを示す。それらが１０μｇ／ｍｌのツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物と培養された場合、より更なるＴリンパ球の増殖が存在した（Ｐ＝０．００１）。図２４ｂは、ツベルクリンＰＰＤ及びツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物とドナーＢの細胞の５日のインキュベーション後のＰＢＭＣ増殖についての結果を示す。１０μｇ／ｍｌのツベルクリン抗原よりも１０μｇ／ｍｌのツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物を用いて有意により多くＴリンパ球が増殖した（Ｐ＝０．００２）。これは、ツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物がツベルクリン抗原自体よりも有意により多くのＴリンパ球増殖を引き起こすことを示す。
【図２５】図２５は、ドナーＡからの抗原で２４時間刺激されたヒトＰＭＢＣｓによるＩＦＮ−γの産生を示す。ヒトＰＢＭＣｓは、単離され、１０％ヒト血清、２００μｇ／ｍｌペニシリン及び２００ ＩＵ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ １６４０中で２×１０５細胞／ウェルに調節された。全ての試薬及び化合物は、＜０．０６エンドトキシンユニット／ｍｌを含有した。ＰＢＭＣｓ及び化合物（示される濃度の、ツベルクリン及び実施例Ｌ２に記載されるように調製されたツベルクリン−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（ツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａとも呼ばれる））は、ヒトインターフェロンγモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）でコートされたＥＬＩＳｐｏｔＰＶＤＦ−バックドマイクロプレートのウェル中で混合された。刺激されていない細胞は、ネガティブコントロールとして使用され、組換えヒトインターフェロンγはポジティブコントロールとして使用された。プレートは３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートされた。次いで製造者の指示書に従って、マイクロプレートを確立し、インターフェロンγについての陽性スポットの数がカウントされた。図２５はＩＦＮ−γを産生する細胞の数を示す。図２５はツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物が初代ヒトＴリンパ球からのインターフェロンγ放出を刺激することにおいてツベルクリン抗原のみよりも有意により効果的であったことを示す。Ｔリンパ球からのインターフェロンγの分泌におけるこの上昇は、５０μｇ／ｍｌのツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物及び１００μｇ／ｍｌのツベルクリンＰＰＤ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物について見られた。
【図２６】図２６は、臨床グレードアンフォテリシンＢ，ＡｍＢｉｓｏｍｅ又はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ、未処理コントロール及びコントロールとしてのブランクリポソームを用いた静脈処理後のマウスの肝臓マクロファージにおける無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの生存を示す。種々の化合物が図２６に示される濃度で使用された。無鞭毛期／５００肝臓細胞の数が顕微鏡でカウントされ、結果が未処理コントロールのパーセントとして表された。コントロールと比較して、実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体の１ｍｇ／ｋｇの無鞭毛期ドノバンリーシュマニアの有意なキリング活性（Ｐ＜０．０００１）が存在した。これらの結果はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ調製物が内臓リーシュマニアのこの動物モデルにおいて効果的であることを示す。
【図２７】赤血球についての異なる分子量のＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの毒性はＭＴＴアッセイを用いて確立された。図２７ａ〜２７ｃは異なる分子量を有し且つ実施例Ｎに記載されるように作製されたＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトが一人のドナーの赤血球に対して毒性がないことを示す。各場合において、ＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの濃度はμｇ／ｍｌで与えられ、赤血球の溶血はパーセントで与えられる。四角は分子量１９ｋＤａのＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトを用いて得た結果を示し、三角は２８ｋＤａのＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトを用いた結果、そして逆三角は３７ｋＤａのＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトを用いた結果である（ｎ＝３）。図２７aはＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトとの１時間のインキュベーション後の赤血球（ＲＢＣｓ）の溶血を示し、図２７ｂは５時間後のＲＢＣｓの溶血を示し、図２７ｃは２４時間後のＲＢＣｓの溶血を示す。ＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトは１時間、５時間及び２４時間インキュベーションの後２ｍｇ／ｍｌの濃度で赤血球溶血を引き起こさなかった。これらの結果は作製されたＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの分子量によって影響されなかった。
【図２８】異なる分子量のＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの末梢血単核細胞（ＰＭＢＣｓ）に対する毒性がＭＴＴアッセイを用いて確立された。図２８ａ及び２８ｂにおいて、実施例Ｎに記載されるように作製されたＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの濃度は、ＰＭＢＣｓのパーセントに対してプロットされた。四角は分子量１９ｋＤａのＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトを用いて得られた結果を示し、三角は２８ｋＤａのＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトを用いた結果、そして丸は３７ｋＤａのＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトを用いた結果である（ｎ＝３）。図２８ａは、ＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトを用いた１日間のインキュベーション後のＰＭＢＣｓの生存率を示し、図２８ｂは該コンストラクトを用いた２日間のインキュベーション後のＰＭＢＣｓの生存率を示す。使用されたコンストラクトは１日及び２日のインキュベーションの後２ｍｇ／ｍｌにおいて末梢血単核細胞に対して毒性でなかった。結果は作製されたＰＭＡＡ−Ｎａコンストラクトの分子量によって影響されなかった。
【図２９】図２９は、異なる条件下でのアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体の保存の赤血球に対するその毒性についての影響を示す。図２９ａは、実施例Ｃに記載されるように調製され且つ凍結乾燥粉末として４℃で４ヶ月間保存されたＰＭＡＡ−Ｎａ複合体の赤血球（ＲＢＣｓ）に対する毒性がないことを示す。複合体は種々の濃度で１時間ＲＢＣｓとインキュベートされ、ＲＢＣｓの溶血パーセントが測定された。図２９aは、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体が、凍結乾燥粉末として４℃で４ヶ月間の保存の後、赤血球に対して毒性がなかったことを示す。図２９ｂは、実施例Ｃに従って調製され、４℃で７ヶ月間５％デキストロース中に保存されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体が１時間ＲＢＣｓとインキュベートされた場合に得られた結果を示す。溶血はパーセントとして示される。新たに調製された、臨床グレードアンフォテリシンＢが比較のためのリファレンスとして使用された。インキュベーションが１時間及び６時間行われた；１時間のインキュベーションについての結果が示される。図２９ｂは、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体が４℃で７ヶ月間の５％デキストロース中の保存の後、赤血球に対して毒性がないことを示す。
【図３０】図３０は、異なる条件下で保存されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体による前鞭毛期及び無鞭毛期リーシュマニアの抑制を示す。図３０ａは、実施例Ｃに従って調製され、且つ４ヶ月間４℃で凍結乾燥粉末として保存されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体によるＭＤＭｓ中の細胞内無鞭毛期メキシコリーシュマニアの増殖の抑制を示す。感染指数は複合体の濃度に対してプロットされた。ＬＤ５０は０．２１μｇ／ｍｌであった。図３０ｂは、実施例Ｃに従って調製され、且つ７ヶ月間４℃で５％デキストロース中に保存されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体によるＭＤＭｓ中の細胞内無鞭毛期との２日間のインキュベーション後の前鞭毛期メキシコリーシュマニアの生存率を示す。パーセント生存率は、複合体の濃度に対してプロットされた。新たに調製された臨床グレードアンフォテリシンＢが比較のためのリファレンスとして使用された。複合体のＬＤ５０は０．４μｇ／ｍｌであり、アンフォテリシンＢのＬＤ５０は０．３μｇ／ｍｌであった。複合体を用いて得られた結果は黒四角によって示され、アンフォテリシンＢでの結果は白丸である。アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａの活性は、凍結乾燥粉末として４℃で４ヶ月間、４℃で７ヶ月間の５％デキストロース中の保存によって影響されなかった。
【図３１】図３１は、ヒト単球由来マクロファージを感染したＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの種々の株の抑制を示す。抑制は、アンフォテリシンＢ（白丸）を比較のためのリファレンスとして用いて、実施例Ｃに記載されるように調製された種々の濃度のアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体（黒四角）を３日間用いた後測定された。感染した及び感染していないマクロファージの数及びグラム陽性酵母ＣＦＵの数が数えられた。結果はＣＦＵ／感染細胞のパーセントの平均数として計算された感染指数として表された。ＬＤ５０値がまた測定された。図３１ａは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ臨床分離株１の抑制を示し、図３１ｂは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ＮＣＰＦ  ３００３の抑制を示し、図３１ｃは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｇａｔｔｉｉ臨床分離株の抑制を示し、図３１ｄは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｃ  ｖａｒ  ｇａｔｔｉｉ臨床分離株の抑制を示す。アンフォテリシンＢ（０．９〜１．４μｇ／ｍｌ）及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ（１．６〜２．７μｇ／ｍｌ）についてのＬＤ５０は類似する。従って、複合体はアンフォテリシンＢのみと同程度にcryptococciに対して活性である。
【図３２】図３２は、ヒト単球由来マクロファージを感染した種々のＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ株の生存率を示す。生存率は、アンフォテリシンＢ（白丸）を比較のためのリファレンスとして用いて、実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を種々の濃度を３日間使用した後（黒四角）、測定された。図３２aは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ＮＣＰＦ  ３００３についての結果を示し、図３２ｂは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ臨床分離株についての結果を示し、図３２ｃは、Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｇａｔｔｉ  ＮＣＰＦ  ３２１６についての結果を示し、図３２ｄはＣ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｇａｔｔｉ臨床分離株についての結果を示す（それらの生物がヒト単球由来マクロファージを感染したとき）。アンフォテリシンＢ及びアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−ＮａについてのＬＤ５０は、実施された４実験の全てにおいて同様であり、また図３１ａ〜３１ｄに示される４実験と同様でもあった。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓの場合、アンフォテリシンＢについてのＬＤ５０は０．９〜１．４μｇ／ｍｌであり、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａについてのそれは同様に１．６〜２．７μｇ／ｍｌであった。Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｖａｒ  ｇａｔｔｉについて、アンフォテリシンＢについてのＬＤ５０は、０．０６〜１．０μｇ／ｍｌであり、アンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａについてのそれは同様に０．１〜０．５μｇ／ｍｌであった。従って、複合体はアンフォテリシンＢ単独と同程度にcryptococciに対して活性である。
【図３３】図３３ａは、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ  ９００２８の生存率を示し、図３３ｂはＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ  ＡＴＣＣ  ９００３０の生存率を示す（種々の濃度のアンフォテリシンＢ（リファレンス）又はアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体を用いた１日の処理後）。生存率はパーセントとして表される。生存率は分光計（４９０ｎｍ）を用いて測定される濁度によって測定された。１００％生存率はコントロールウェル中の未処理酵母の光学密度を用いて確立された。アンフォテリシンＢ（０．９〜１．８μｇ／ｍｌ）及び実施例Ｃに記載されるように調製されたアンフォテリシンＢ−ＰＭＡＡ−Ｎａ複合体についてのＬＤ５０（１．６〜２．３μｇ／ｍｌ）は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓについて同様であり（図３３ａ）、図３３ｂはＣａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａについての結果を示す。従って、該複合体はアンフォテリシンＢ単独と同程度にＣａｎｄｉｄａ種に対して活性である。
【図１】
2007518732.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007518732.tif 000029
【図８】
2007518732.tif 000030
【図９】
2007518732.tif 000031
【図１０】
2007518732.tif 000032
【図１１】
2007518732.tif 000033
【図１２】
2007518732.tif 000034
【図１３】
2007518732.tif 000035
【図１４】
2007518732.tif 000036
【図１５】
2007518732.tif 000037
【図１６】
2007518732.tif 000038
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2007518732.tif 000050
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2007518732.tif 000053
【図３２】
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【図３３】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年9月6日(2006.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと；
（i）病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は
（ii）ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は
（iii）抗原及び免疫原から選択される１つ以上の作用物質(agent)
を含む複合体。
【請求項２】
該病原生物が、排他的ではないが主として細胞内生物である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
該病原生物が、マクロファージ起源の細胞及び／又は他の抗原提示細胞において存在及び／又は持続する細胞内生物である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
該病原生物が以下の生物から選択される、請求項１に記載の複合体：
ａ）表在性真菌症；白癬；鵞口瘡；マラセチア感染；外耳道真菌症；及び角膜真菌症を引き起こす生物；
ｂ）侵入性及び慢性真菌感染を引き起こすＣａｎｄｉｄａ種；Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ；ムコール症；Ｆｕｓａｒｉｕｍ種；Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ種；ブラストミセス症；Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種；Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ種；ヒストプラズマ症；アフリカヒストプラズマ症，Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｏｓｉｓ；コクシジオイデス症；パラコクシジオイデス症；及びＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｍａｒｎｅｆｆｅｉによって引き起こされる感染；
ｃ）マイコバクテリア症を引き起こす生物；
ｄ）住血吸虫症を引き起こすＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａファミリーのメンバー；
ｅ）チフス及びパラチフス熱を引き起こす生物；
ｆ）トキソプラズマ症を引き起こす生物；
ｇ）ヒトアフリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物；
ｈ）アメリカ・トリパノソーマ症を引き起こす生物；
ｉ）マラリアを引き起こす生物；
ｊ）ＨＩＶ及びＨＴＬＶ感染を引き起こす生物；
ｋ）Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ感染を引き起こす生物。
【請求項５】
該病原生物がリーシュマニア症を引き起こす、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
該薬理学的活性物質がアンフォテリシンＢである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項７】
抗原又は免疫原が、結核、破傷風、炭疽、コレラ、ジフテリア、麻疹、耳下腺炎、風疹、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、インフルエンザ、帯状疱疹、灰白髄炎、狂犬病、痘瘡、黄熱、水痘、帯状疱疹、単純ヘルペス、インフルエンザ又はリーシュマニア症を引き起こす生物から直接的又は間接的に由来する、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
抗原又は免疫原が請求項２〜５のいずれか１つに定義される生物に直接的又は間接的に由来する、請求項１に記載の複合体。
【請求項９】
アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーが、１．７以下の多分散性を有する、前記請求項のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
該ポリマーが１００，０００以下の分子量を有する、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１１】
該ポリマーが４，０００以上の分子量を有する、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１２】
該ポリマーがポリ（メタクリル酸）又はその塩である、前記請求項のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１３】
該ポリマーが以下ユニット（Ｉ）：
【化１】
2007518732.tif 000056
（式中、Ｒは水素及びＣ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリール、Ｃ６〜Ｃ１８アリール、カルボン酸、Ｃ２〜Ｃ１８アルコキシカルボニル、Ｃ２〜Ｃ１８アルカミノカルボニル、又は炭素バックボーン中のヘテロ原子で、又は炭素バックボーンに結合したヘテロ原子で置換されたＣ１〜Ｃ１８アルキル、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニル、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキル、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリール、Ｃ６〜Ｃ１８アリール、カルボン酸、Ｃ２〜Ｃ１８アルコキシカルボニル、Ｃ２〜Ｃ１８アルカミノカルボニルから成る群から選択され、Ｒ１は、水素とＣ１〜Ｃ６アルキル基から成る群から選択される）である、またはユニット（Ｉ）を含む；及びその塩、例えばアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩）又はアンモニウム塩）、或いは該ポリマーが以下のユニット（ＩＩ）：
【化２】
2007518732.tif 000057
（式中、Ｒ、Ｒ１及びＲ２は、上記のように定義される；Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキレン、Ｃ２〜Ｃ１８アルケニレン、Ｃ７〜Ｃ１８アラルキレン、Ｃ７〜Ｃ１８アルカリーレン及びＣ６〜Ｃ１８アリーレンから成る群から選択される；Ｌはブロックを連結する２価のリンカーである；ｍ及びｎは各々１又は１よりも大きい整数である。）
である、又はユニット（ＩＩ）を含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１４】
該ポリマーが以下ユニット（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）
【化３】
2007518732.tif 000058
【化４】
2007518732.tif 000059
（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３、Ｌ、ｍ及びｎは請求項１３に定義される通りであり、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、独立して各々Ｒ、Ｒ１及びＲ２と同一の基から選択される；Ｑはポリマーを作製するために使用される条件下で切断されない、又は実質的に切断されない基を表す；ｐは、１又は１よりも大きい整数を表す。）
である、又はユニット（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）を含む、請求項１〜１１のいずれか１つに記載の複合体。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１つに記載の複合体を薬学的に好適なキャリアと混合で又はそれとともに含む薬学的製剤。
【請求項１６】
送達システムアジュバントを含む、請求項１５に記載の薬学的製剤。
【請求項１７】
薬剤としての使用のための請求項１〜１４のいずれか１つに記載の複合体、又は請求項１５又は１６のいずれかに記載の薬学的製剤。
【請求項１８】
（i）該病原生物による感染の治療及び／又は該病原生物に対する免疫応答を誘発するための、病原生物に対する薬理学的活性を有する物質；（ii）該ガンの治療のためのガンに対する薬理学的活性を有する物質；又は（iii）該抗原又は免疫原に対する免疫応答を誘発するための抗原又は免疫原；との使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
【請求項１９】
病原生物による感染の治療における使用及び／又は病原生物に対する免疫応答を誘発するための請求項１７又は１８に記載の複合体、製剤、又はポリマーであって、その複合体は、アクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと該病原生物に対する薬理学的活性を有する物質を含む。
【請求項２０】
リーシュマニア症の治療及び／又はその臨床的形態のいずれかであるリーシュマニア症を引き起こす生物に対する免疫応答を誘発するための、請求項１７又は１８に記載の複合体、製剤、又はポリマー。
【請求項２１】
ガンの治療における使用又は抗原若しくは免疫原に対する免疫応答を誘発するための、請求項１７又は１８に記載の複合体、製剤、又はポリマー。
【請求項２２】
ワクチン製造における免疫増強アジュバントとしての使用のためのアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマー。
【請求項２３】
該ポリマーが請求項９〜１４のいずれか１つに定義される構造を有する、請求項１８又は２２に記載のポリマー。
【請求項２４】
病原生物による感染を治療すること、病原生物に対する免疫を誘発すること、ガンを治療すること若しくはガンに対する免疫応答を誘発すること、又は抗原若しくは免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、このような治療の必要な患者に、請求項１〜１４のいずれか１つに記載の複合体又は請求項１５又は１６に記載の薬学的製剤の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項２５】
病原生物による感染を治療すること、病原生物に対する免疫応答を誘発すること、ガンを治療すること若しくはガンに対する免疫応答を誘発すること、又は抗原若しくは免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、このような治療の必要な患者に有効量のアクリル酸又はその塩由来のユニットを含む狭い分子量分布のポリマーと（i）病原生物に対する薬理学的活性を有する物質、又は（ii）ガンに対する薬理学的活性を有する物質、又は（iii）抗原又は免疫原から選択される１つ以上の作用物質を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
該ポリマーと他の物質が一緒に又は別個に投与される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
該ポリマーが請求項９〜１４のいずれか１つに定義される構造を有する、請求項２４〜２６のいずれか１つに記載の方法。
【国際調査報告】
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