(57)【要約】  オリゴ糖およびタンパク質のようなバックボーンに連結するオリゴ糖、そのようなオリゴ糖を作る方法、およびそれらを使って、様々な疾患を治療および／または予防する方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコース基がガラクトース基にα１，２結合、α１，３結合、またはα１，４結合して分子および製薬上許容できる担体を含む、薬剤組成物。
【請求項２】
フコースは、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＮＦ−Ｉ基、ＬＮＦ−ＩＩ基、３’ＦＬ基、ＬＮＦ−ＩＩＩ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基、ＬＤＦＴ基または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、中に含まれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
該分子は、グリカン、糖脂質、糖タンパク質、グリコサミノグリカンまたはムチンである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
該分子は、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＮＦ−Ｉ基、ＬＮＦ−ＩＩ基、３’ＦＬ基、ＬＮＦ−ＩＩＩ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基、ＬＤＦＴ基または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも２つの異なる基を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
該分子は、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＮＦ−Ｉ基、ＬＮＦ−ＩＩ基、３’ＦＬ基、ＬＮＦ−ＩＩＩ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基、ＬＤＦＴ基または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも３つの異なる基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
該分子は、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＮＦ−Ｉ基、ＬＮＦ−ＩＩ基、３’ＦＬ基、ＬＮＦ−ＩＩＩ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基、ＬＤＦＴ基または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも５つの基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
該基は、ＳｅｒもしくはＴｈｒにＯ−連結して、またはＡｓｎにＮ−連結してタンパク質に共有結合する、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
該組成物は、哺乳類のミルクを含まない、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
該組成物は、人乳を含まない、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
２’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
３’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；
ラクトジフコテトラオース；
ラクトＮ−テトラオース；
ラクトＮ−ネオテトラオース；
３’−シアリルラクトース；
３’−シアリルラクトサミン；
６’−シアリルラクトース；
６’−シアリルラクトサミン；
シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースｃ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩＩ
ジシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース
ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ；
３’−シアリル−３−フコシルラクトース；
ジシアロモノフコシルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース；
モノフコシルモノシアリルラクト−Ｎ−オクタオース（シアリルＬｅａ）；
シアリルラクト−Ｎ−フコヘキサオースＩＩ；
ジシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
モノフコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース、または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、
から選択される、少なくとも２つの異なる基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む、薬剤組成物。
【請求項１１】
２−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
３−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；
ラクトジフコテトラオース、または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、
から選択される、少なくとも２つの異なる基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む、薬剤組成物。
【請求項１２】
該タンパク質は、少なくとも２つの異なる基のそれぞれの複数コピーを含むように修飾される、請求項１０または１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
該タンパク質は、人乳タンパク質である、請求項１０〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
人乳タンパク質は、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、胆汁塩−刺激リパーゼ、リゾチーム、血清アルブミン、葉酸結合タンパク質、ハプトコリン、リポタンパク質リパーゼ、グリコサミノグリカン、ムチン、ラクトペルオキシダーゼおよびアミラーゼから選択される、請求項１０〜１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
合成組成物である請求項１〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
哺乳類のミルクではない、請求項１〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも一つのビタミンをさらに含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも一つのミネラルをさらに含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
少なくとも一つの食用脂をさらに含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
２’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
３’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；
ラクトジフコテトラオース；
および２’−ＦＬＮａｃ、または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体
から選択される少なくとも２つの異なった基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含み、この際、該タンパク質は、他のオリゴ糖を含むようには修飾されない、薬剤組成物。
【請求項２１】
ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基およびＬＤＦＴ基または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも２つの異なる基を含む、グリカン、糖脂質、糖タンパク質、グリコサミノグリカンまたはムチンを含む、合成栄養組成物。
【請求項２２】
該分子は、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基およびＬＤＦＴ基または、還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも３つの異なる基を含む、請求項２１に記載の合成栄養組成物。
【請求項２３】
該分子は、少なくとも２つの異なる基のそれぞれの複数コピーを含む、請求項２１または２２のいずれかに記載の合成栄養組成物。
【請求項２４】
該分子は、少なくとも２つの異なる基のそれぞれの、少なくとも２個のコピーを含む、請求項２１〜２３のいずれかに記載の合成栄養組成物。
【請求項２５】
該分子は、少なくとも２つの異なる基のそれぞれの、少なくとも５個のコピーを含む、請求項２１〜２４のいずれかに記載の合成栄養組成物。
【請求項２６】
該分子は、少なくとも２つの異なる基のそれぞれの、少なくとも１０個のコピーを含む、請求項２１〜２５のいずれかに記載の合成栄養組成物。
【請求項２７】
該分子は、少なくとも２つの異なる基のそれぞれの、少なくとも２０個のコピーを含む、請求項２１〜２６のいずれかに記載の合成栄養組成物。
【請求項２８】
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ基、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ基、２−フコシルラクトース基、３−フコシルラクトース基、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ基、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ基、およびラクトジフコテトラオース基または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む、合成栄養組成物。
【請求項２９】
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ基、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ基、２−フコシルラクトース基、３−フコシルラクトース基、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ基、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ基、およびラクトジフコテトラオース基または還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも２つの基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む、合成栄養組成物。
【請求項３０】
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
３’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；
ラクトジフコテトラオース；
ラクトＮ−テトラオース；
ラクトＮ−ネオテトラオース；
３’−シアリルラクトース；
３’−シアリルラクトサミン；
６’−シアリルラクトース；
６’−シアリルラクトサミン；
シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースｃ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩＩ
ジシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース
ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ；
３’−シアリル−３−フコシルラクトース；
ジシアロモノフコシルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース；
モノフコシルモノシアリルラクト−Ｎ−オクタオース（シアリル  Ｌｅａ）；
シアリルラクト−Ｎ−フコヘキサオースＩＩ；
ジシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；および
モノフコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースまたは、還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも２つの基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含み、この際、少なくとも該基は、同一または異なるものである合成栄養組成物。
【請求項３１】
該タンパク質は、少なくとも２つの異なる基を含むように修飾される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
食用脂、ビタミン、植物性タンパク質または動物性タンパク質をさらに含む、請求項２１〜２９のいずれかに記載の栄養組成物。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれかに記載の組成物、ただし、前記組成物は、哺乳類のミルクではない、を投与することを含む、感染症を治療するまたは感染症の危険性を減少させる方法。
【請求項３４】
該組成物は、２’ＦＬまたは２’ＦＬＮａｃを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該分子は、２’ＦＬおよび／または２’ＦＬＮＡｃが直接的または間接的に共有結合しているタンパク質を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
該感染症は、Ｖ．コレラまたはＣ．ジェジュニによって引き起こされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
該感染症は、腸感染症である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
該方法は：
（ａ）患者の地理的な位置において、腸疾患を引き起こしうる２つの最も一般的な薬剤を特定すること；
（ｂ）２つの最も一般的な薬剤の第一のグリカンの上皮細胞への結合を阻害する第一のグリカン；および最も一般的な薬剤の第二のグリカンへの上皮細胞への結合を阻害する第二のグリカン、を含む分子を含む組成物；但し、組成物は、母乳ではない、を患者に投与することを含む、患者における腸疾患の危険性を減少させる方法。
【請求項３９】
該方法は：
（ａ）患者の地理的な位置において、腸疾患を引き起こしうる２つの最も一般的な薬剤を特定すること；
（ｂ）ｉ）２つの最も有力な薬剤の第一の分子の上皮細胞への結合を阻害する第一のグリカンを含む第一の分子；
およびｉｉ）最も一般的な薬剤の第二の分子の上皮細胞への結合を阻害することを含む第二の分子グリカンを含む組成物；但し、組成物は、母乳ではない、を患者に投与することを含む、患者における腸疾患の危険性を減少させる方法。
【請求項４０】
ＧＤＰ−マンノース４，６脱水素酵素をエンコードするヌクレオチド配列およびＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを有する酵母細胞。
【請求項４１】
ＧＤＰ−マンノース４，６脱水素酵素は、Ｈ．ピロリＧＤＰ−マンノース４，６脱水素酵素である、請求項４０に記載の酵母細胞。
【請求項４２】
ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素は、Ｈ．ピロリＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素である請求項４０または４１に記載の酵母細胞。
【請求項４３】
該酵母細胞は、ＧＤＰ−フコース／ＧＭＰアンチポーター融合タンパク質をエンコードする核酸分子を有する、請求項４０〜４２のいずれかに記載の酵母細胞。
【請求項４４】
該融合タンパク質は、ゴルジ膜局在配列を含む、請求項４３に記載の酵母細胞。
【請求項４５】
ゴルジ膜局在配列は、Ｖｒｇ４ｐ由来である請求項４３に記載の酵母細胞。
【請求項４６】
少なくとも第１の部分および第２の部分を含むものであって、第１の部分は、ＧＤＰ−フコース／ＧＭＰアンチポーターの活性ドメインを含み、第２の部分は、ゴルジ体局在配列を含む、融合タンパク質をエンコードする単離された核酸分子。
【請求項４７】
該ゴルジ体局在配列は、酵母ゴルジ体局在配列である、請求項４６に記載の単離された核酸分子。
【請求項４８】
請求項４６に記載の単離された核酸分子を有する酵母。
【請求項４９】
フコシル転移酵素またはガラクトシル転移酵素をエンコードする核酸分子をさらに有する、請求項４８に記載の酵母。
【請求項５０】
該フコシル転移酵素は、
ヒトフコシル転移酵素１（ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシル転移酵素、Ｂｏｍｂａｙ表現型が含まれる）（ＦＵＴ１）；
ヒトフコシル転移酵素２（分泌状態が含まれる）（ＦＵＴ２）；
ヒトフコシル転移酵素３（ガラクトシド３（４）−Ｌ−フコシル転移酵素、ルイス血液型が含まれる）（ＦＵＴ３）；
ヒトフコシル転移酵素４（α（１，３）フコシル転移酵素、脊髄に特異的）（ＦＵＴ４）；
ヒトフコシル転移酵素５（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ５）；
ヒトフコシル転移酵素６（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ６）；
ヒトフコシル転移酵素７（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ７）；
ヒトフコシル転移酵素８（α（１，６）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ８）；
ヒトフコシル転移酵素９（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ９）；およびヒトタンパク質ｏ−フコシル転移酵素（ＰＯＦＵＴ１）：から選択される、請求項４９に記載の酵母。
【請求項５１】
ＬＮＴ、ＬＮｎｅｏＴまたは還元性の末端位のＧｌｃがＧｌｃＮＡｃによって置換されたその変異体、から選択される少なくとも２つの異なる基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
人乳の消費は、感染症による発病および死亡に対して、幼児を保護するための薬に知られている最も高い費用対効果の戦略の一つである。人乳は、天然で、且つ、有効な、“栄養補助食品”すなわち、免疫学的利益を伝える、模範となる食品であると考えることができる。感染症に対する保護は、オリゴ糖およびオリゴ糖に関係のある複合糖質を含む、人乳中で発見された様々な相補的メカニズムを通じて起こる。授乳による顕著に向上した免疫学的防御は、下痢性疾患、気道疾患、菌血症、髄膜炎、および壊死性腸炎に対して、説明されてきている。授乳による保護は、下痢性疾患に対して特に有効である。
【０００２】
乳オリゴ糖構造は、ホストリガンドに結合する病原菌を阻害しうるレセプター類似体として、作用していると考えられている（１−３）。人乳中の特定のα１，２結合したフコシル化オリゴ糖は、カンピロバクター（２，４）、カリシウイルス（３−５）および安定毒素（ＳＴ）を伴う大腸菌（１，６，７）を原因とする下痢に対しての保護に関連するようである。
【０００３】
オリゴ糖およびオリゴ糖に関する複合糖質は、人乳オリゴ糖で見られる先天的防御システムの主要な成分である。オリゴ糖は、３〜３２個の様々なサイズの糖であって、ラクトースおよび脂質に続く３番目に一般的な人乳の固形成分を構成するが、それらの役割は、栄養的というよりも、むしろ免疫学的なものである。オリゴ糖は、様々な異なった免疫学的論理機能を有するようである。人乳中のフコシル化オリゴ糖、シアル化オリゴ糖、および、フコシル化ならびにシアル化されていないオリゴ糖を含む、様々なタイプのオリゴ糖は、前生物的な特質、すなわち、腸中の有益な細菌の成長の選択的な刺激を有する。重要なことには、特別な病原菌に対する保護は、フコシル化およびシアル化された人乳オリゴ糖の両者に対して記載されている（５，６，２４，２７，２８）。フコシル化オリゴ糖およびシアル化オリゴ糖の両者は、腸病原菌に対する細胞レセプターについての構造的相同性を有しうり、関連の細胞レセプターへの結合を遮断することにより病原菌の結合を阻害しうる（２４，２９，３０）。特定の病原菌は、腸病原菌性の大腸菌（ＥＰＥＣ）、ロタウイルス、ヘモフィルスインフルエンザおよびその他病原菌を含む、シアル酸およびフコース含有のレセプターに結合すると考えられている（３０−３３）。結合していないオリゴ糖に加えて、不安定毒素およびコレラ毒素、大腸菌の熱安定性毒素（ＥＴＥＣ）、カンピロバクター、志賀毒素、肺炎連鎖球菌、ならびに、ロタウイルス（１６，１７，２４，３４）に対する、人乳中の複合糖質物質による保護は、インビトロ研究および／または動物モデルによって説明されている。４６ｋＤａの糖タンパク質であるラクタドヘリンは、人乳中で様々な濃度で見つかっており、症候性ロタウイルス感染症に対する顕著な保護は、母乳中のラクタドヘリンの増加濃度に関連する（３４）。
【０００４】
オリゴ糖構造物のフコース末端は、分泌遺伝子（ＦＵＴ２）によって、若しくはフコシルトランスフェラーゼＩ遺伝子（ＦＵＴＩ）によって生産されるフコシル転移酵素によって触媒されるα１，２結合、または、ルイス遺伝子（ＦＵＴ３）ファミリーによって生産されるフコシル転移酵素によって触媒される、α１，３若しくはα１，４結合によって結合されてもよい。分泌およびルイス遺伝子の多形性は、ルイス血液型タイプ、人乳中のフコシル化オリゴ糖パターンおよびヒトの上皮細胞表面上のヒスト血液型抗原の発現を決定するものとして知られている（２１，２２，３５）。分泌の際に、α１，２結合のフコシル化オリゴ糖を合成しない非分泌者（すなわち、分泌遺伝子に対して、劣性ホモ）もいる。インド−ヨーロッパおよびアメリカ人の集団において、分泌できない者の患者数は、約２０％であり、一方、先住民の先祖のメキシコ人のようなその他の集団での、分泌できない者の患者数は、一般よりかなり少ない（３６−３８）。場合によっては、発現の不均一性は、個体および集団において、感染症の異なった危険性に関連があると示されている（５，６，２８，３７，３９−４４）。さらに、人乳中の保護オリゴ糖の濃度のバリエーションによって、特定の感染症に対しての保護のレベルが異なった母乳で育った幼児となりうる（２１，２２，３６，３９，４５）。
【０００５】
人乳の最も一般的なオリゴ糖は、４つの、α１，２結合のフコシル化オリゴ糖（ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ［ＬＮＦ−Ｉ］、２−フコシルラクトース［２’−ＦＬ］、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ［ＬＤＦＨ−Ｉ］およびラクトジフコテトラオース［ＬＤＦＴ］）；２位に結合したフコースを持たない３つのフクシルオリゴ糖（ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ［ＬＮＦ−ＩＩ］、３−フコシルラクトース［３−ＦＬ］、およびラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ［ＬＮＦ−ＩＩＩ］）；ならびにこれらの２つの前駆体（ラクト−Ｎ−テトラオース［ＬＮＴ］およびラクト−Ｎ−ネオテトラオース［ＬＮｎｅｏＴ］）を含む。これらの９つのオリゴ糖は、ルイスヒストの血液型抗原の同族体であって、それぞれ、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｌｅｂ、Ｌｅｙ、Ｌｅａ、Ｌｅｘ、タイプ１前駆体、およびタイプ２前駆体である。最も一般的に存在する、人乳中の特定のα１，２位に結合したフコシル化オリゴ糖は、２’−ＦＬ（Ｈ−２エピトープ）である。多くの異なった哺乳類種からのミルクの組成を比較すると、２’−ＦＬはまた、進化生物学においての重要性を示唆している、最も保護されたオリゴ糖構造物である（４６）。しかしながら、２’−ＦＬは、牛乳を含む、いくつかの種のミルクにおいて欠如している。
【発明の開示】
【０００６】
要約
本発明は、フコース基がガラクトース基にα１，２結合、α１，３結合、またはα１，４結合してなる分子および製薬上許容できる担体、を含む薬剤組成物を特徴とする。フコースは、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基またはＬＤＦＴ基中に含まれうる。いくつかの状況において、分子は、グリカン、糖脂質、糖タンパク質、グリコサミノグリカンまたはムチンである。したがって、フコース基は、直接的にまたは間接的にタンパク質に結合しうる。タンパク質またはその他のバックボーン分子は、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基およびＬＤＦＴ基から選択される少なくとも２種（３種または４種）の異なった群を含みうる。タンパク質またはその他のバックボーン分子は、２以上の異なった基の複数コピーを有しうる。本組成物は、哺乳類のミルクは含まない（例えば、それは、人乳を含まない）。
【０００７】
本組成物は、プロバイオティック剤すなわち、有益な微生物、例えば、健康を促進するまたは病気を予防する細菌による腸のコロニー形成を引き起こすまたは促進する消化剤として使用してもよい。
【０００８】
他の実施形態においては、本発明は、発明の特長におけるもう一つの実施形態において、精製されたタンパク質を含む薬剤組成物は、下記から選択される、少なくとも２つ（３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上）の異なる基を含むように修飾された精製タンパク質を特徴とする：
２’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
３’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；
ラクトジフコテトラオース；
ラクトＮ−テトラオース；
ラクトＮ−ネオテトラオース；
３’−シアリルラクトース；
３’−シアリルラクトサミン；
６’−シアリルラクトース；
６’−シアリルラクトサミン；
シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースｃ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩＩ
ジシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース
ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ；
３’−シアリル−３−フコシルラクトース；
ジシアロモノフコシルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース；
モノフコシルモノシアリルラクト−Ｎ−オクタオース（シアリルＬｅａ）；
シアリルラクト−Ｎ−フコヘキサオースＩＩ；
ジシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；および
モノフコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース。
【０００９】
タンパク質は、異なった基のそれぞれの、複数コピー（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、２５またはそれ以上）を含むように修飾されうる。タンパク質自身は、例えば、人乳タンパク質（例えば、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、胆汁塩−刺激リパーゼ、リゾチーム、血清アルブミン、葉酸結合タンパク質、ハプトコリン、リポタンパク質リパーゼ、グリコサミノグリカン、ムチン、ラクトペルオキシダーゼ、または、アミラーゼ）または、その他のタンパク質、例えば、ＢＳＡでありうる。その組成物は、使用をされる際、牛乳または人乳のような哺乳類のミルクと混合されうるが、該組成物は、ほとんど哺乳類のミルクではない合成組成物である。その組成物は、少なくとも一つのビタミン；少なくとも一つのミネラル；少なくとも一つの食用脂；および他の栄養成分を含みうる。
【００１０】
本発明はまた、
２’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
３’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；
ラクトジフコテトラオース；および２’−ＦＬＮａｃ、
から選択される少なくとも２つの異なった基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む薬剤組成物を含み、この際、該タンパク質は、他のオリゴ糖を含むようには修飾されない。
【００１１】
もう一つの実施形態において、本発明は、ＬＮＦ−Ｉ基、及び２’ＦＬ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基及びＬＤＦＴ基から選択される少なくとも２種の異なった基を含む、グリカン、糖脂質、糖タンパク質、グリコサミノグリカンまたは、ムチンを含む、合成栄養組成物を含む。該分子は、ＬＮＦ−Ｉ基、２’ＦＬ基、ＬＤＦＨ−Ｉ基およびＬＤＦＴ基から選択される３種の異なった基、並びに、同じ基の複数コピー（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上）を含みうる。
【００１２】
本発明は、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ基、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ基、２−フコシルラクトース基、３−フコシルラクトース基、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ基、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ基、およびラクトジフコテトラオース基から選択される少なくとも２つ（３、４、５、６、若しくは７またはそれ以上）の基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む合成栄養組成物を含む。
【００１３】
本発明は、
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
３’−フコシルラクトース；
ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；
ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；
ラクトジフコテトラオース；
ラクトＮ−テトラオース；
ラクトＮ−ネオテトラオース；
３’−シアリルラクトース；
３’−シアリルラクトサミン；
６’−シアリルラクトース；
６’−シアリルラクトサミン；
シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースｃ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩ；
モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩＩ
ジシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース
ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ；
ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；
シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ；
３’−シアリル−３−フコシルラクトース；
ジシアロモノフコシルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース；
モノフコシルモノシアリルラクト−Ｎ−オクタオース（シアリル  Ｌｅａ）；
シアリルラクト−Ｎ−フコヘキサオースＩＩ；
ジシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；および
モノフコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース
から選択される、少なくとも（３、４、５、６、または７種）の基を含むように修飾される精製されたタンパク質を含む合成栄養組成物を含む。
【００１４】
他の実施形態において、本発明は、フコース基が、ガラクトース基にα１，２結合してなる分子を含む組成物（但し、哺乳類のミルクでない）を（幼児、子供または大人に）投与することを有する感染症、（例えば、Ｖ．コレラまたはＣ．ジェジュニによる感染症のような、呼吸器官または腸の感染症）を治療するまたは当該感染症の危険性を減少させる方法を特徴とする。したがって、本明細書中に記載されているいずれの薬剤組成物をも、この方法において投与することができる。
【００１５】
本発明はまた、患者における腸疾患の危険性を減少させる方法を特徴とし、該方法は：（ａ）患者の地理的な位置において、腸疾患を引き起こしうる２つ最も一般的な薬剤を特定すること；（ｂ）２つの最も一般的な薬剤の第一のグリカンの上皮細胞への結合を阻害する第一のグリカン；および最も一般的な薬剤の第二のグリカンへの上皮細胞への結合を阻害する第二のグリカン、を含む分子を含む組成物；但し、組成物は、母乳ではない、を患者に投与することを含む。
【００１６】
本発明はまた、患者における腸疾患の危険性を減少させる方法を特徴とし、該方法は：（ａ）患者の地理的な位置において、腸疾患を引き起こしうる２つの最も一般的な薬剤を特定すること；（ｂ）ｉ）２つの最も有力な薬剤の第一の分子の上皮細胞への結合を阻害する第一のグリカンを含む第一の分子；およびｉｉ）最も一般的な薬剤の第二の分子の上皮細胞への結合を阻害するグリカンを含む第二の分子を含む組成物；但し、組成物は、母乳ではない、を患者に投与することを含む。
【００１７】
本発明はまた、ＧＤＰ−マンノース４，６脱水素酵素をエンコードするヌクレオチド配列およびＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素をエンコードするヌクレオチド配列を含む組み換えベクターを有する酵母細胞を含む。該酵母細胞は、さらに、ＧＤＰ−フコース／ＧＭＰアンチポーター融合タンパク質（例えば、ゴルジ膜局在配列（例えば、酵母Ｖｒｇ４ｐ）を含む、融合タンパク質）をエンコードする核酸分子を有してもよい。
【００１８】
第１の部分は、ＧＤＰ−フコース／ＧＭＰアンチポーターの活性ドメインを含み、第２の部分は、ゴルジ体局在配列を含む少なくとも第１の部分および第２の部分を含む融合タンパク質をエンコードする単離された核酸分子は本発明に包含される。ゴルジ体局在配列は、酵母ゴルジ体局在配列でありうる。本発明はまた、該単離された核酸分子および、必要により、フコシル転移酵素またはガラクトシル転移酵素をエンコードする核酸分子を有する酵母を含み、例えば、フコシル転移酵素は、
ヒトフコシル転移酵素１（ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシル転移酵素、Ｂｏｍｂａｙ表現型が含まれる）（ＦＵＴ１）；
ヒトフコシル転移酵素２（分泌状態が含まれる）（ＦＵＴ２）；
ヒトフコシル転移酵素３（ガラクトシド３（４）−Ｌ−フコシル転移酵素、ルイス血液型が含まれる）（ＦＵＴ３）；
ヒトフコシル転移酵素４（α（１，３）フコシル転移酵素、脊髄に特異的）（ＦＵＴ４）；
ヒトフコシル転移酵素５（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ５）；
ヒトフコシル転移酵素６（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ６）；
ヒトフコシル転移酵素７（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ７）；
ヒトフコシル転移酵素８（α（１，６）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ８）；
ヒトフコシル転移酵素９（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ９）；およびヒトタンパク質ｏ−フコシル転移酵素（ＰＯＦＵＴ１）：から選択される。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、ヒトのＧＤＰ−フコース輸送体、または、その機能的な断片に融合する、（酵母ゴルジ体局在配列、例えば、ＶＲＧ４のゴルジ体局在配列、を含む融合タンパク質をエンコードする核酸分子（例えば、組み換えまたは単離された核酸分子、を特徴とする。他の実施形態において、本発明は、ヒトのＧＤＰ−フコース輸送体、もしくは、その機能的な断片に融合する、酵母ゴルジ体局在配列、例えば、ＶＲＧ４のゴルジ体局在配列を含む、からなる、または、本質的に、からなるタンパク質をことを特徴とする。タンパク質は、精製されてもよく、精製されたタンパク質はさらに、異種アミノ酸配列、例えば、アミノ−末端またはカルボキシル−末端配列を含んでもよい。前記タンパク質の精製された断片、例えば、少なくとも約７５、８５、１０４，１０６，１１３，１５０，２００，２５０，３００，３５０，４００，または４５０個のアミノ酸の断片もまた特徴とする。そのタンパク質またはその断片は、修飾されることができ、例えば、（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化、グリセロホスファチジルイノシトールの付加）または、上記いずれかの組合せによって、プロセッシングを受けても、切断されても、修飾されてもよい。
【００２０】
他の態様において、本発明は、ベクター例えば、前記核酸を含むベクターを特徴とする。該ベクターは、１以上の調節エレメント、例えば、酵母において、翻訳に要求される異種プロモーターまたはエレメントをさらに、含んでもよい。該調節エレメントは、融合タンパク質を発現するために、融合タンパク質に機能するように連結することができる。さらにもう一つの態様において、本発明は、前記核酸分子またはベクターを含んだ単離した組み換え細胞、例えば、酵母細胞、を特徴とする。核酸配列は、必要により、ゲノムに組み込まれてもよい。
【００２１】
本明細書中で使用される“精製されたタンパク質”は、天然由来の他のタンパク質、脂質および核酸から単離されたタンパク質をいう。該タンパク質は、精製して調製された乾燥重量の少なくとも１０、２０、５０、７０、８０または９５％から構成されてもよい。
【００２２】
本明細書中で使用される“単離された核酸”は核酸であって、その構造は、天然由来の核酸のいずれにも、または、３つ以上の別々の遺伝子にまたがる、天然に存在するゲノム核酸のいずれの構造とも一致しない。したがって、その言葉は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部であるが、天然に存在する有機体のゲノム中の分子のその部分に隣接する両核酸配列には隣接しないＤＮＡ；（ｂ）結果としての分子は、天然由来のベクターまたはゲノムＤＮＡとは一致しないような形で、原核生物または真核生物のベクターまたはゲノムＤＮＡに組み込まれる核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムの断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生産される断片、または制限断片のような別の分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子すなわち融合タンパク質をエンコードする遺伝子の一部である組み換えヌクレオチド配列を、包含する。
【００２３】
ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーのようなＤＮＡライブラリー中での、異なる（ｉ）ＤＮＡ分子、（ｉｉ）トランスフェクト細胞、または（ｉｉｉ）細胞クローンの混合物中に存在する核酸は、この定義からは、特別に排除される。本発明による単離された核酸分子は、化学的に改変された、および／または修飾されたバックボーンを有する核酸のいずれかと同様に、合成的に生産された分子をさらに含んでもよい。
【００２４】
“核酸分子”との語は元来物理的な核酸分子を意味し、“核酸配列”との語は、核酸分子中のヌクレオチドの配列を意味するが、この２つの言葉は、同じ意味で使われうる。
【００２５】
所定のポリペプチドと関連して本明細書中で使用される“実質的に精製された”との語は、該ポリペプチドは、他の生体高分子を実質的に含まないことを意味する。この実質的に精製されたポリペプチドは、乾燥重量で少なくとも７５％（例えば、少なくとも８０、８５、９５、または９９％）精製されているということである。純度は、適切な標準方法のいずれかの方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、またはＨＰＬＣ分析によって、測ることができる。
【００２６】
“異種プロモーター”は、核酸配列に機能するように結合した際、天然ではその結合していないプロモーターをいう。
図面の説明
本発明の１以上の実施例の細部は、添付図面および下記説明において説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は、説明、図面および特許請求の範囲によって明らかである。
【００２７】
図１は、人乳オリゴ糖構造物に適用するルイス合成経路を概略的に示す。
【００２８】
図２は、特定のオリゴ糖の化学的な合成方法を概略的に示す。
【００２９】
図３は、インビボで特定のオリゴ糖を合成する部分的なアプローチを概略的に示す。
【００３０】
図４は、乳オリゴ糖の合成スキームを示す。
【００３１】
図５は、酵母中でオリゴ糖を生産するに有用なベクターの構築を概略的に示す。
【００３２】
図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃは、乳オリゴ糖の割合（％）としての、（図６Ａ）２’−ＦＬ、（図６Ｂ）ＬＤＦＨ−Ｉ、および（図６Ｃ）トータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖の低い、中間の、または高い相対量を含む母乳をもらった子供の研究におけるＣ．ジェジュニ下痢、カリシウイルス下痢およびすべての原因の中度〜重度の下痢の発症率を示すグラフの一連である。棒状は、それぞれの群における原因−特定の下痢の発症率を示し；縦線は、標準誤差を示す。低い、中間、および高い群は、それぞれ、研究集団の三分位数（ｎ＝３１）のオリゴ糖値を表す。２’−ＦＬに関すると、群による乳オリゴ糖値の割合（％）：低い（＜０．２９）、中間（０．２９−０．３６）、および高い（＞０．３７）。低い群と比較すると、中間および高い群でのカンピロバクター発症率は、両方著しく低かった（Ｐ＜０．０１）。ＬＤＦＨ−Ｉに関すると、群による乳オリゴ糖値の割合：低い（＜０．０７）、中間（０．０７−０．１１）、および高い（＞０．１２）。低い群と比較すると、高い群でのカリシウイルス発症率は、著しく低かった（Ｐ＝０．０２）。トータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖に関し、それぞれの群での乳オリゴ糖値の割合：低い（＜０．７２）、中間（０．７２−０．７７）および高い（＞０．７７）。低い群と比較すると、中間および高い群における中度〜重度の下痢の発症率は、両方著しく低かった（Ｐ＜０．０１）。
【００３３】
図７は、Ｈ−２リガンドおよびＨ−２模倣薬ならびに人乳オリゴ糖によるＦＵＴ１−ＣＨＯ細胞へのカンピロバクター結合の阻害を示す研究結果を表す図である。
【００３４】
図８は、細胞凝集は、ＦＵＴ１（１、２Ｆｕｃ）、ＦＵＴ３（１，３／１，４Ｆｕｃ）、およびＦＵＴ４（１，３Ｆｕｃ）遺伝子を運ぶトランスフェクトＣＨＯ細胞上で侵襲性カンピロバクター株によって誘発することを示す研究結果を表す図である。
【００３５】
図９Ａおよび９Ｂは、細菌の１０４および１０８ＣＦＵによるチャレンジ中にミルクフコシル化オリゴ糖２ｍｇを与えられたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるカンピロバクターコロニー形成の阻害を示す研究結果を示す図のペアである（左）。２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）およびミルクフコシル化オリゴ糖によるカンピロバクターのヒトの腸コロニー形成の阻害の生体外で評価（ＯＳ）。
【００３６】
図１０Ａおよび１０Ｂは、最初泌乳乳腺に対するＨ抗原の発現を命令するＷＡＰプロモーターを伴うＦＵＴ１遺伝子を有する形質転換マウスにおけるカンピロバクターコロニー形成の研究結果を示す図およびチャートである。形質転換マウスから与えられた子マウスは、カンピロバクターのチャレンジから５〜９日後にコロニー形成がなくなった。非形質転換マウスから与えられた対照の子マウスは、カンピロバクター形成を除去することができない。ＣＦＵ＝コロニー形成ユニット。
詳細な説明
特定のオリゴ糖およびオリゴ糖の特定の組合せは、様々な感染体、例えば、腸関連疾患、呼吸器官感染症、膣感染症、尿路感染症、目の感染症または口腔の感染症に関連する感染体による感染症の治療および／または予防に用いられうる。したがって、オリゴ糖の特定の組合せは、コレラ、カンピロバクター下痢、カリシウイルス下痢、カンジダ・アルビカンス感染症、ＨＩＶ感染症、ならびにその他疾患の治療および予防において効果があることが期待されている。オリゴ糖は、一価のもしくは多価の形態、または、その組合せで投与されうる。一価の形態において、遊離オリゴ糖は、単体またはその組合せで投与されうる。多価の形態において、２以上のオリゴ糖は、同じであっても異なってもよいが、ムチン、胆汁塩刺激リパーゼ、またはウシ血清アルブミンのようなバックボーンに付加する。オリゴ糖は、ここで記載されている方法によってインビボで合成されてもいい。加えて、オリゴ糖の多価の形態は、部分的または全体的のいずれかのインビボで、本明細書中で記載されているように調製することができる。どのオリゴ糖またはオリゴ糖の組合せが、所定の個体に対して保護作用があると最も考えられるかを決定する診断法もまた、本明細書中にて記載されている。
【００３７】
オリゴ糖
オリゴ糖は、下記に記載のすべての単体または組合せで使用してよく：フコシル化オリゴ糖（すなわち、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ；ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；２−フコシルラクトース；３−フコシルラクトース；ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ；およびラクトジフコテトラオース）；フコシル化されてない、シアル化オリゴ糖でない（すなわち、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオース）；シアリルオリゴ糖（すなわち、３’−シアリル−３−フコシルラクトース；ジシアロモノフコシルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース；モノフコシルモノシアリルラクト−Ｎ−オクタオース（シアリルＬｅａ）；シアリルラクト−Ｎ−フコヘキサオースＩＩ；ジシアリルラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ；モノフコシルジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース）；およびシアリルフコシル化オリゴ糖（すなわち、３’−シアリルラクトース；３’−シアリルラクトサミン；６’−シアリルラクトース；６’−シアリルラクトサミン；シアリルラクト−Ｎ−ネオテトラオースｃ；モノシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオース；ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩ；モノシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオースＩＩ；ジシアリルラクト−Ｎ−ネオヘキサオース；ジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース；ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩＩ；シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ；ジシアリルラクト−Ｎ−ヘキサオースＩ；およびシアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ）を含む。グルコース（還元性の末端の、Ｇｌｃが、Ｎ−アセチルグルコサミンによって置換される（例えば、２’−フコシル−Ｎ−アセチルグルコサミン（２’−ＦＬＮａｃ）は、２’−ＦＬの変異体であるなど）変異体もまた有用である。これらのオリゴ糖またはこれらの非還元末端部分は、様々な組合せにおいてタンパク質、ムチン、脂質、または炭水化物に結合しうり、一価または多価の複合糖質分子を産出する。多価の複合糖質の場合、２個以上のオリゴ糖は、直接的にまたはリンカーを通じてのいずれかによってバックボーンに結合する。２個以上のオリゴ糖は、同じでも異なってもよく、例えば、１以上の２’−ＦＬおよび１以上の２’−ＦＬＮＡｃは、ヒトの血清アルブミンに結合しうる。
【００３８】
上記オリゴ糖は、人乳中で一般に発見される。図１は、概略的に人乳オリゴ糖構造物に適用されるルイス合成経路を示す。コアタイプ１構造のラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）は、ラクトース（−Ｒ）の終止末端上のＧａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃである。ミルク中の最も豊富なタイプ２構造に対するコアは、ラクトース末端（ｆまたはＬＮＦ−ＩＩＩ）上で、（２’−ＦＬ、３−ＦＬ、およびＬＤＦＴに対して）ラクトース、（ＬＮｎｅｏＴに対して）ラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース、およびＧａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを含む。ルイス構造的部分は、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ中のバックボーン末端を基礎とする；しかしながら、人乳中の最も一般的なタイプ２構造は、ラクトース（Ｇａｌ−Ｇｌｃ）を含み、したがって、−Ｒ１が、−ＯＨであり、−Ｒ２が、−Ｈである、タイプ２ルイス構造のグルコース類似体（ｇａ）として定義される。ＬＮＦ−ＩＩＩのような真のルイス構造は、Ｎ−アセチルのＲ１およびラクトースまたはラクトサミンのＲ２を有する。フコシル転移酵素遺伝子に対する略語は：Ｓｅ（分泌遺伝子、ＦＵＴ２）、Ｌｅ（ルイス遺伝子、ＦＵＴ３）、およびＦＵＴ４，５，６，７，９（３−フコシル転移酵素のルイス遺伝子ファミリー）である。Ｈ−１およびＨ−２抗原から合成される、血液型ＡおよびＢ構造は報告されているが、乳オリゴ糖の主成分ではない。
【００３９】
【表１】
2007525487.tif 000002
【００４０】
【表２】
2007525487.tif 000003
【００４１】
【表３】
2007525487.tif 000004
【００４２】
【表４】
2007525487.tif 000005
【００４３】
タンパク質に連結しているオリゴ糖
下記に、さらに詳細に説明している通り、上記乳オリゴ糖は、タンパク質に共有結合して、（セリンまたはトレオニンに）Ｏ−連結したまたは（アスパラギンに）Ｎ−連結したオリゴ糖を生産しうる。ミルクオリゴ糖が直接的にタンパク質に連結する場合、オリゴ糖の還元性の末端位のＧｌｃが、下記に示すように、ＧｌｃＮＡｃによって置換され、オリゴ糖のＮ−アセチルグルコサミンバージョンが生産されうる。
【００４４】
【表５】
2007525487.tif 000006
【００４５】
【表６】
2007525487.tif 000007
【００４６】
【表７】
2007525487.tif 000008
【００４７】
【表８】
2007525487.tif 000009
【００４８】
内部のＧａｌ残基の複数コピー（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、若しくは５０、またはそれ以上）を有するＬＮＴ、ＬＮｎｅｏＴ、ＬＮＴ−Ｎ、およびＬＮｎｅｏＴ−Ｎの変異体もまた有用である。
【００４９】
感染体
本明細書中に記載の組成物および方法は、オリゴ糖を認識する様々な感染体による感染症の治療および／または予防に使用することができる。本組成物は、カンピロバクター、Ｖ．コレラ、ＥＰＥＣ、ＥＴＥＣ、ＥＨＥＣ、赤痢菌、リステリア、カンジダ・アルビカンス、ＨＩＶ、ノロウイルス、ロタウイルス、ヘリコバクターピロリ、ならびに、呼吸器官路、消化管、膣路、尿路、および目の他の感染体による感染症の治療および／または予防に使用しうる。
カンピロバクター
カンピロバクター株は、世界中で最も一般的なヒトのおよび動物の病原菌である（４７−５４）。下痢は、カンピロバクターに関連する最も一般的な臨床症例であるにもかかわらず、ブロードな臨床スペクトルが、菌血症、局地的感染症、およびギラン・バレー症候群、重度の免疫的合併症を含む感染症において、観察される（４７，４８）。米国において、カンピロバクターの見積もられた発症率は、１年で２００万件の症候性感染症であっておよそ、米国人口の１％にあたる（４９）。イギリス、米国およびスウェーデンにおける人口に基づく研究は、二峰性分布を示し、５歳未満の子供の病気のピーク、青年期および１５歳〜２９歳の大人の第２ピークがある（５０−５４）。最も高い単離率（１００，０００中１５症例）は、１歳である（５１）。発展途上国の流行地において、下痢の子供中の単離率は、８％〜４５％で、症候性の子供の分散率と同様である（５５，５６）。カンピロバクター感染症の年間発症率は、子供−年ごとに、２．１症状と高くなりうる。毎年の食品媒介感染症は、何百万の個体に影響を及ぼすことに対し、新興の懸念事項である。カンピロバクターは、カリシウイルスに次いで、食品媒介感染症の第二の最も一般的な原因である（４９，５０）。単離されたカンピロバクターの多数の抗耐性菌における驚くべき増加は、おそらく動物薬中のおよび動物性食品サプリメントとしてのキノロンの使用による（５７）。
【００５０】
流行地で暮らす子供は、幼少期に極度的に有機体に接することによるカンピロバクター感染に対する効果的な自然免疫を発現する（５５，５６）。人乳中の免疫グロブリンは、呼吸器官および胃腸管の感染症の他の原因と同様に、カンピロバクターに対する重要な保護を与える一方で、人乳中の非免疫グロブリン成分はまた、主要な役割を担うようである（６１−６３）。人乳中の非免疫グロブリン保護因子のうち、オリゴ糖および複合糖質は最も重要であるようである（３０，３５，４５）。感染症に決定的である、カンピロバクターのホスト細胞表面への接触の初期段階は、上皮細胞表面複合糖質の結合を含むようである（２，２８，６４）。これらのリガンドへの構造的相同性を伴う人乳オリゴ糖は、病原菌に結合することによって阻害しうる（２）。したがって、母性遺伝子異質性によるミルク中のこれらのオリゴ糖の可変的な発現は、母乳で育つ幼児の感染症の危険性に影響する（４２，６５，６６）。カンピロバクター感染症の発病機序についての理解の最近の進歩は、完全なゲノムの配列決定に追従している（６７）。カンピロバクターの回腸および盲腸の上皮細胞への付着および侵襲の能力はよく知られている（６８−７３）。運動性および走化性は、腸の下部における細菌の局在化で主な役割を担う（７４−７８）。カンピロバクターの走化性行動の研究は、フコースの存在に陽性応答を示すが、他の糖、さらにはアスパラギン酸塩、システイン、グルタミン酸塩およびセリンのようなアミノ酸に対しては、否である（７６）。Ｌ−フコースは、胆汁およびムチンの両方の重要な構成物質である。これらは、胆嚢および下部腸管に対する有機体の親和性に対して重要な要因でありうる。環境および走化性の刺激物質は、特に、Ｃ．ジェジュニｆｌａＡシグマ２８プロモーターを上方制御する（７７）。デオキシコール酸塩を含む、高いｐＨ、オスモル濃度、および胆汁塩はまた、ｆｌａプロモーターを上方制御し、一方で、高い粘性は、ｆｌａプロモーターの下方制御させる。胆汁およびムチンは、腸で一緒に混合され、ムチン層のＣ．ジェジュニコロニー形成は、インビボにおける発病機序に対して必須条件であることを考慮すると、全体的な応答は、ｆｌａＡ合成およびムチン層への走化性の増加であろう。これらのデータは、胃腸管中のカンピロバクター感染症の発病機序におけるフコースの重要性を説明する（７９）。
【００５１】
初期の研究は、Ｌ−フコースによる腸の上皮細胞へのカンピロバクター付着性の阻害を説明した（８０）。フコシル化された人乳オリゴ糖は、インビトロにおける細胞接着およびインビボにおける腸粘膜のコロニー形成を阻害する（２８）。これらの人乳炭水化物残基の特性は、α１，２−フコシル化オリゴ糖が、主な活性成分であること、および、これらのオリゴ糖、特に、Ｈ−２エピトープを含むこれらは、そのホストレセプターへのカンピロバクター付着性を阻害しうる、ことを示した。α１，２−フコシル部分への結合の特異性は、発現産物がＨ抗原合成の最終段階を触媒する発現産物のヒトのα１，２−フコシル転移酵素に対するヒトの遺伝子をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクトすることで確認した（８１）。親の非トランスフェクトＣＨＯ細胞（Ｈ抗原を発現しない）は、侵襲性カンピロバクターに感染しないのに対し、トランスフェクト細胞は、カンピロバクターによって付着性および侵襲の影響を受けやすい。胃腸管の異なった場所における血液型抗原Ｈ−２の発現差異は、カンピロバクターの下痢の病理学および感染症の局在化の本質的特徴を説明しうる。マウスのホエー酸タンパク質プロモーターに隣接したＦＵＴ１遺伝子をトランスフェクトしたマウスは、ミルク授乳中、特異的にＦＵＴ１を発現する（８２）。これらのトランスフェクトしたマウスは、ミルク中で多量のＨ−２抗原を生産する一方で、野生型のマウスはそれを生産しない。これらトランスフェクトした親に哺乳された子は、カンピロバクターによって腸のコロニー形成に対して保護された。これらのデータは、Ｈ抗原は、腸管へのカンピロバクターの結合に、必須な腸のリガンドであるという概念を支持する。ミルク中で、Ｈ−２エピトープを含む可溶性リガンドは、カンピロバクター感染症から幼児を保護するレセプター類似体として作用でき、これらは、人乳の生来の免疫系の重要な成分になりうる（６３）。
【００５２】
コレラ
コレラへの感染し易さは、ＡＢＨ（Ｏ）組織−血液型抗原に関連があるようである（８３，８４）。ヒトのボランティアによる実験的コレラに対する免疫研究は、血液型Ｏが重要なコレラを発症するボランティアで有意に頻発する（検便体積＞５．０Ｌ）ことを示した。バングラディッシュで行われた大々的疫学的研究は、Ｏ血液型を有すると思われるコレラ患者は、地域社会のコントロールの２倍にもなったことが示された（４４）。この研究はまた、最も重症なタイプの下痢を有する個体は、血液型Ｏ（６８％対３１％；Ｐ＜０．０１）である傾向が最も高かったことが示された。血液型Ｏの人のコレラの重症度が増加したこととして考えられる解釈の一つは、腸の粘膜へのビブリオ属の向上した付着性がこのような個体において起こりうるということである。Ｏ血液型の個体は、重篤なコレラをより発症しやすいため、この血液型の人においてのコレラワクチンの免疫原性および保護効果はまた説明されてきている。弱力化したコレラワクチンを伴うランダムな、二重盲検法、プラセボ対照試験は、非−Ｏ血液型のワクチン接種者より有意に高い幾何平均タイターでＯ血液型の人でより強い免疫反応を示した（８５）；これらの情報は、コレラ菌が、血液型Ｏの人の腸粘膜により強力に付着して、高いビブリオ菌を殺す反応を誘導するという概念を支持している。しかしながら、遺伝的に関連のある保護に対する生物学的基礎および分子的機序は、まだ解明されていない。先の研究は、ヒトのＯ赤血球を伴うＶ．コレラによって生産された球凝集は、Ｌ−フコースによって阻害されうることを説明している（８６）。ヒトの腸の上皮は、ＡＢＨ（Ｏ）およびルイスヒスト血液型抗原の糖脂質および糖タンパク質が豊富である（８７）。Ｈ（Ｏ）抗原は、フコースα１，２ＤＧａｌβ１のバックボーンからなる。したがって、Ｈ抗原は、Ｖ．コレラに対するレセプターとしての作用することが考えられる。我々が、先にカンピロバクターで示したとおり、Ｖ．コレラはまた、インビトロで、ＡＢＨ−ルイスネオ糖タンパク質に結合し、また、ＦＵＴ１−トランスフェクトＣＨＯ細胞の表面に発現するα１，２フコースデターミナントに、選択的に付着する。腸の毒素を生じる大腸菌のコレラ毒素および不安定毒素（ＬＴ）のＢサブユニットは、ＧＭ１ガングリオシドに対し高い親和力をもって結合するだけでなく、ＬＴＢは、Ｎ−アセチルラクトサミン−末端複合糖質と相互作用するという最近の証拠がある（８７、８８）。
【００５３】
他の病原菌
ルイスおよび分泌組織血液型遺伝子型の関連性は、多くの異なった病原菌と関連しているようである。例えば、イケハラ等は、ルイスおよび分泌組織血液型遺伝子型は、ヘリコバクターピロリ感染症の異なる危険性に関連があると報告している（４２）。Ｈｕａｎｇら、分泌者血液型個体は、カリシウイルスの様々な株の感染し易さを増大することを報告している（３）。インフルエンザウイルス結合は、ホストルイス血液型抗原に関して多様性を示している（８９）。さらに、Ｒａｚａら、子供の分泌者は、インフルエンザウイルスＡおよびＢ、ライノウイルス、呼吸器官合胞体ウイルス、ならびにエコー・ウイルスによる呼吸器官感染症の入院の危険性を増加することを報告している（９０）。
【００５４】
ＳＴと結合した大腸菌、および様々なカリシウイルスの株への耐性は、ａ１，２結合したフコシル化オリゴ糖構造による阻害に関連する。人乳フコシルオリゴ糖は、ＳＴのインビボでの下痢の誘発能を阻害する。カリシウイルス研究は、ノーウォーク・ウイルス−様の粒子は、分泌者由来であって非分泌者由来ではない腸−十二指腸の連結部の組織切片に結合し、該結合は、分泌者からのミルクによって遮断されることを示している（９１）。ノーウォーク・ウイルスがチャレンジされたボランティアは、仮に彼らが分泌者である場合に限って症候性に感染した。さらに、Ｌｅｂエピトープおよび他の２位結合のフコシル化オリゴ糖構造物は、カリシウイルスの主な株による結合を阻害するようである。
【００５５】
オリゴ糖およびフコシル化グリカンの合成
組み換え酵母および細菌を用いたオリゴ糖および様々なフコシル化グリカンの合成方法を以下に記載する。
【００５６】
従来、オリゴ糖は、ミルク、例えば、人乳から単離される、または化学的に合成される。人乳から単離したオリゴ糖は、一般的に、非常に高価で感染体に汚染されていることがある。化学的にオリゴ糖を合成する洗練された方法は、利用可能である。オリゴ糖の化学的合成は、所望の構造を形成する配列中に加えられるそれぞれの糖のヒドロキシル基の段階的誘導体化を含む。それぞれの連結に関与するヒドロキシル基は、連結に関らないヒドロキシル基とは異なる保護基で保護される。したがって、複合体構造物の合成は、多くの遮断剤の使用を含む。過去２０年に亘って、適当な遮断剤が開発されて、従来では実現できなかった複合グリカン構造の完全なる化学合成が可能になった。
【００５７】
特に最近、特定の生合成遺伝子のクローニングにより、オリゴ糖の化学酵素的合成を必要とする成分の利用が可能となった。このアプローチにおいて、必須の前駆体または所望の生産物を作るためのこれらに、前駆体を使用するための酵素の形成における重要な段階を触媒する酵素をエンコードする遺伝子は、適切なプラスミドに挿入され、大腸菌のような明確な細菌にトランスフェクトされる。酵素は単離・精製され、固相に付着され、次いで、カラムに充填される。それぞれの反応に対する前駆体をカラムに通すと、生産物は、溶出液から単離される。この技術の例は、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースへの変換、次いで、ラクトース上でＧＤＰ−フコースからフコースへの転移し、２’−ＦＬを形成することを含む（９２）。このアプローチは、容易に、反応のスケールアップを許容し、２’−ＦＬおよび２’−ＦＬＮＡｃの両方のグラム−およびキログラム量を生産する。
【００５８】
組み換え酵母中のオリゴ糖の生産
適切な酵母は、カンジダ属（例えば、カンジダ・アルビカンス）、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、ピチアおよびサッカロミセス（例えば、サッカロミセスセレヴィシエおよびピチアｐａｓｔｏｒｉｓ）に属するものを含む。しかしながら、他の有機体、例えば大腸菌およびバキュロウイルス系は、オリゴ糖のインビボでの生産に対して使用されうる。
【００５９】
下記に記載したベクターおよび人工酵母の生産の際には、様々なプロモーター、発現制御エレメントおよび終止配列が採用されうる。酵母発現系に対して一般的に使用される、および、酵母中における遺伝子の発現を許容する、いずれかのプロモーターが使用されうる。そのようなプロモーターの例は、ＰＧＫ、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＧＡＬｌ、ＧＡＬｌＯ、ＡＤＨ２、ＰＨ０５およびＣＵＰ１を含む。有用なターミネーターは、ＡＤＨ１、ＴＤＨ１、ＴＦＦおよびＴＲＰ５を含む。
【００６０】
酵母に取り込まれた核酸配列は、酵母ゲノムに組み込まれうる、または、ベクター、例えば自己複製を許容する酵母２μの配列を含むベクター上で、運ばれうる。酵母中で発現する多くの自律性ベクターが知られており、ＹＥｐ５ｌ、ｐＹＥＳ２、ＹＥｐ３５１、ＹＥｐ３５２などがある。場合によっては、ベクターは、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＳＵＣ２、またはＬＹＳ２のような選択的なマーカーを含む。
【００６１】
酵母中でタンパク質を発現する、適切なベクター系および発現系は、当業者に周知である。このようなベクター系および発現系は、発行された米国出願２００１００１２６３０；米国特許第６、３１２、９２３号；６、３０６、６２５号；６、３００、０６５号；６、２５８、５６６号；６、１７２、０３９号；６、１６５、７３８号；６、１５９、７０５号；６、１１４、１４７号；６、１００、０４２号；６、０８３、７２３号；６、０２７、９１０号；５、８７６、９５１号；５、７３９、０２９号；５、６０２、０３４号；５、４８２、８３５号；５、３０２、６９７号；およびＲＥ３７、３４３に記載されている。
【００６２】
２’−ＦＬおよび２’−ＦＬＮＡｃのインビトロでの生産
２’−ＦＬおよび２’−ＦＬＮＡｃは、１）ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースを生産する遺伝子操作された酵母（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ）を提供する、２）ＧＤＰ−フコースを含む酵母からフラクションを得る、３）該フラクションを適切なフコシル転移酵素および基質に接触し、例えば、２’−ＦＬまたは２’−ＦＬＮＡｃを生産する、ことによって生産しうる。
【００６３】
ＧＤＰ−フコースを生産する酵母は、１）ＧＤＰ−マンノース４、６脱水素酵素（例えば、Ｈ．ピロリＧＤＰ−マンノース４、６脱水素酵素；Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＤ０５６２５．１ＧＩ：４１５４５４７；配列番号：６または大腸菌ＧＭＤ）、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−マンノースへ転換する酵素、をエンコードする核酸分子および、２）ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−α−Ｄ−マンノース３、５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（例えば、Ｈ．ピロリＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ：ＡＡＬ３３６７８．１ＧＩ：１７０１７４６６；配列番号：７または大腸菌ＧＭＥＲ（ＦＸ））、エピマー化および還元を通じてＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−マンノースからＧＤＰ−Ｌ−フコースに転換する酵素をエンコードする核酸分子を、酵母に形質転換することによって作ることができる。ＧＤＰ−マンノースを生産するための人工酵母のアプローチの一つは、先に記載されている（９３）。ＧＤＰ−フコースは、部分的にまたは完全にＧＤＰ−フコースの合成を許容する条件下において培養した遺伝子操作された酵母から精製しうる。完全に、または、部分的に、精製されたＧＤＰ−フコースは、先に記載されているようにラクトースを必須的に伴う、精製されたＨ．ピロリα１，２−フコシル転移酵素（ＦｕｃＴ２；ＧｅｎＢａｎｋ登録Ｎｏ．ＡＡＣ９９７６４ＧＩ：４０９３１３９；配列番号：８）を使って、２’−ＦＬに転換しうる（９２）。
【００６４】
一実施形態において、ＧＤＰ−フコースは、大腸菌ＧＤＰ−Ｄ−マンノース−４、６脱水素酵素（ｇｍｄ−遺伝子によってエンコードされる）および大腸菌ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノースエピメラーゼ／レダクターゼ（ｗｃａＧ−遺伝子によってエンコードされる）を発現する酵母中で生産されうる。大腸菌遺伝子は、ｐＥＳＣ−ｌｅｕ／ｇｍｄ／ｗｃａＧベクターと称されるベクターを使って酵母に形質転換されうる。該ベクターを作るために、大腸菌ｇｍｄ−遺伝子およびｗｃａＧ−遺伝子、すなわちＧＭＥＲ（ＦＸ）は、それぞれのＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターの下で、ｐＥＳＣ−ｌｅｕ−ベクターに挿入される。ｇｍｄ遺伝子は、ｃ−ｍｙｃ−エピトープのフレームに挿入され、ｗｃａＧ遺伝子は、ＦＬＡＧ−エピトープのフレームに挿入された。ベクターをトランスフェクトしたＳ．セレヴィシエは、いずれの外部のＧＤＰ−マンノースも添加せずとも、ＧＤＰ−フコースのおよそ０．２ｍｇ／Ｌを生産しうる（９３）。上記で説明した通り、２’−ＦＬおよび２’−ＦＬＮＡｃの合成は、大腸菌中で発現するフコシル転移酵素、例えば、ヒトの（ＦＵＴ１およびＦＵＴ２）またはＨ．ピロリ（ＦｕｃＴ２）を使って行われうる。これらのフコシル転移酵素遺伝子は、ｐＧＥＸ４Ｔ−１のような適切なベクターで、大腸菌に挿入され、過剰に発現される。融合タンパク質は、ＧＳＴｒａｐ−カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のアンフィニティクロマトグラフィーによって精製される。精製されたタンパク質は、固相還元的アミド化を通じて、セファロースと共有結合させてもよい。適切なバッファ（例えば、ＰＢＳ）中でＧＤＰ−フコースおよびラクトースは、カラムを通って２’−ＦＬを生産する。ＧＤＰ−フコースおよびＮ−アセチルラクトサミンは、カラムを通って２’−ＦＬＮＡｃを生産する。過剰なＧＤＰ−フコースおよびヌクレオチドフォスフェイトは、イオン交換によって除去される。フコシル化オリゴ糖は、それらをＵｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓアンフィニティカラムに通して、出発物質から分離される。これらの生産物の収率および純度は、結果物のオリゴ糖のＨＰＬＣ分析によって評価する。
【００６５】
転移酵素を発現する、細胞壁を使ったインビボでの２’−ＦＬおよび２’−ＦＬＮＡｃの生産
オリゴ糖合成の改良法を下記に記載する。この方法は、１）ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースへ転換する；２）インビボで２’−ＦＬまたは他の有益なフコシル化された生産物を生産するようなフコシル転移酵素を含むために、遺伝子操作した酵母の使用を必要とする。
【００６６】
酵母中で、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースの転換のために、細胞は、人工的に作られ、適切なＧＤＰ−マンノース４、６脱水素酵素遺伝子を発現するように操作される。例えば、Ｈ．ピロリＧＤＰ−マンノース４、６脱水素酵素（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．ＡＡＤ０５６２５．１ＧＩ：４１５４５４７；配列番号：６）。該酵素は、ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−４−ｋｅｔｏ−６−Ｄ−マンノースへ転換する。該酵母はまた、エピマー化および還元を通じて、ＧＤＰ−４−ケト−６−Ｄ−マンノースからＧＤＰ−Ｌ−フコースへ転換する、適切なＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−α−Ｄ−マンノース３、５−エピメラーゼ−４−レダクターゼ（例えば、Ｈ．ピロリＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ：ＡＡＬ３３６７８．１ＧＩ：１７０１７４６６；配列番号：７）、を発現するように操作する。
【００６７】
該方法において、フコシル転移酵素は、効率良くフコシル化グリカンを生産するために、酵母細胞壁の細胞外で発現する。これは、酵母細胞壁タンパク質、ＰＩＲ、のすべてまたは機能部分が、Ｈ．ピロリＦｕｃＴ２またはヒトのα−１，３、フコシル転移酵素（ＦｕｃＴ；ＦＵＴ６遺伝子によってエンコードされる）のようなフコシル転移酵素のアミノ末端に融合する、融合タンパク質を作ることによって達成される。このようなタンパク質をエンコードする核酸分子の産出は、Ａｂｅら（ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ４：４１７、２００４）およびＡｂｅら、米国の公開された出願２００３００５９８７２に記載されている。
【００６８】
有用なＰＩＲは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅ  ＰＩＲ１（配列番号：１；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標  登録Ｎｏ．Ｑ０３１７８ＧＩ：４１７４９２）を含む。３４１アミノ酸（ａａ）タンパク質において、ａａ１−１８は、シグナル配列であり、ａａ１９−６３は、プロペプチドであり、６１−３４１は、成熟タンパク質であり、ここでａａ８３−１０１、１０２−１２５、１２６−１４４、１４５−１６３、１６４−１８２、１８３−２０１および２０２−２２０は反復領域内である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅ  ＰＩＲ２  （配列番号：２；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＡ０２８８６．１ＧＩ：２１８４５９）；およびＰＩＲ３（配列番号：３；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．Ｓ３７７８８ＧＩ：４８１１０７）。
【００６９】
融合されうるフコシル転移酵素は、ヒトのガラクトシド２−α−Ｌ−フコシル転移酵素２（フコシル転移酵素２；ＦＵＴ２；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．Ｑ１０９８１；ＧＩ：１７３０１２５；配列番号：４）を含む。該３４３ａａタンパク質は、ａａ１５からａａ２８までわたる膜貫通領域を有する。膜貫通領域のアミノ末端側の膜貫通領域および配列は、ＰＩＲ−ＦＵＴ２融合タンパク質において要求されないので、ＰＩＲ−ＦＵＴ２融合タンパク質は、配列番号：４のａａ２９−３４３を含みうるが、配列番号：４のａａ１−２８を含む必要はない。他の有用なフコシル転移酵素は、ヒトのα−（１，３）−フコシル転移酵素（ガラクトシド３−Ｌ−フコシル転移酵素；フコシル転移酵素６；ＦＵＴ６；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．Ｐ５１９９３ＧＩ：１７３０１３６；配列番号：５）を含む。該３５９ａａタンパク質は、ａａ１５からａａ３４までわたる膜貫通領域を有する。膜貫通領域のアミノ末端側の膜貫通領域および配列のアミノ−末端は、ＰＩＲ−ＦＵＴ６融合タンパク質において要求されないので、ＰＩＲ−ＦＵＴ６融合タンパク質は、配列番号：５のａａ３５−３５９を含みうるが、配列番号：５のａａ１−３４を含む必要はない。α−（１，３）−フコシル転移酵素（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＢ９３９８５．１ＧＩ：２２４０２０２；配列番号：６）としてのヘリコバクターピロリのような他の種からのフコシル転移酵素、は使用されうる。
【００７０】
フコシル転移酵素、ガラクトシル転移酵素、グルコシル転移酵素、マンノシル転移酵素、ガラクトサミン転移酵素、シアリル転移酵素およびＮ−アセチルグルコサミン転移酵素を含む、多くのグリコシル転移酵素、は公知で、上記記載の方法を使用しうる。グリコシル転移酵素の配列および活性は、例えば、米国特許第６、２９１、２１９号；６、２７０、９８７号；６、２３８、８９４号；６、２０４、４３１号；６、１４３、８６８号；６、０８７、１４３号；６、０５４、３０９号；６、０２７、９２８号；６、０２５、１７４号；６、０２５、１７３号；５、９５５、２８２号；５、９４５、３２２号；５、９２２、５４０号；５、８９２、０７０号；５、８７６、７１４号；５、８７４、２６１号；５、８７１、９８３号；５、８６１、２９３号；５、８５９、３３４号；５、８５８、７５２号；５、８５６、１５９号；５、５４５、５５３号；およびＲＥ３７、２０６に記載されている。追加の転移酵素は、下記に記載する。
【００７１】
ＧＤＰ−フコース／フコースアンチポーターを使った酵母中のグリカンの生産
酵母中のフコシル化グリカンの製造方法を下記に記載する。この一般的アプローチは、酵母で他のグリカンを生産するために使用してもよい。上記の通り、一般食品原料である酵母は、２種の酵素に対する遺伝子を添加して、ＧＤＰ−フコースを生産する、ＧＤＰ−マンノースの豊富な自然源であり、それは、フコシル化オリゴ糖およびフコシル化グリカンの合成に対する直接的前駆体である。フコシル転移酵素遺伝子の挿入に伴い、フコシル化グリカンは合成されうる。
【００７２】
本発明の方法は、一つのカセット中に、すべての必要な遺伝子のすべてを配置することによって、および、ＧＤＰ−フコース／ＧＭＰに対するアンチポーターを提供することによってＧＤＰ−フコースおよびフコシル化されたグリカンの生産を改善する（１６０）。該アンチポーターは、その合成の場所の場所である細胞質から、フコシル化の場所であるゴルジの内腔（細胞質中において、ＧＤＰ−フコースの合成を誘導する）へ、ＧＤＰ−フコースをシャトルする一方で、ゴルジの内腔（フコシル化を誘導する）から細胞質へＧＭＰをシャトルする、そこではより多くのＧＤＰ−フコースへのリサイクルが行われる（１６１）。
【００７３】
酵母中の２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）の生産
サッカロマイセス・セレヴィシエおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの両方は、フコシル化グリカンを生産するために使用できる。まず、シングルカセットは、ｉｎ  ｓｉｔｕで、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを生産するために必要な、２種の酵素（例えば、Ｈ．ピロリからの：ＧＤＰ−マンノース４、６脱水素酵素、およびＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素、１６２）を取り込むために使われる。適切なカセットは、下記のように生産されうる。まず、プラスミドは、ｐＰＩＣ９Ｋ中のより小さなＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片と、ｐＡＯ８１５からの、より小さなＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ断片を置換することにより構築する。統合的プラスミドｐＰＩＣ９Ｋは、複数コピー遺伝子形質転換体をスクリーニングするために、ＨＩＳ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子）および３’ＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ遺伝子）間の細菌のカナマイシン−耐性遺伝子を含む。ＧＤＰ−Ｄ−マンノース４，６−脱水素酵素（ＧＭＤ）およびＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素（ＧＦＳ）に対するコード配列は、５’−ＥｃｏＲＩ部分を組み込むプライマーを使うＰＣＲによって、プラスミドＤＮＡｐＥＴ１５ｂ−ＧＭＤおよびｐＥＴ１５ｂ−ＧＦＳから増幅させ、プラスミドｐＰＩＣ９Ｋ／ＧＭＤおよびｐＰＩＣ９Ｋ／ＧＦＳそれぞれを生産するために、ｐＰＩＣ９ＫのＥｃｏＲＩ部分へサブクローニングする。ＧＦＳ発現カセットは、Ｂｇｌ  ＩＩ／ＢａｍＨ  Ｉを伴うｐＰＩＣ９Ｋ／ＧＦＳから除去し、ｐＰＩＣ９Ｋ／ＧＭＤのＢａｍ  ＨＩ  部分にサブクローニングしてＧＭＤおよびＧＦＳに対する発現カセットを含む同時発現ベクターを生産する（１６３）。一のプラスミド上に組み込まれた遺伝子は、制限エンドヌクレアーゼＳａｌ  Ｉを用いて消化される同時発現プラスミドのエレクトロポレーションによってＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ染色体に組み込まれる；形質転換体は、カナマイシン培地上で単離される。それぞれの遺伝子は、それ自身のメタノール−誘導性のアルコールオキシダーゼ１プロモーターおよび転写ターミネーターをＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ１１５  ｈｉｓ４の染色体ＤＮＡ上に有する。該タンパク質は、メタノール誘導下で、細胞内に共発現する。該発酵工程は、３つのユニークな期；初期細胞成長のためのグリセロールバッチ期；ＡＯＸ１抑制および高い細胞密度のためのグリセロール供給−バッチ期；ならびにこれらの酵素の発現のための誘導期（１６３）から構成される。糖ヌクレオチドの生産は、キャピラリー電気泳動によってモニタリングされる（１６４，１６５）。
【００７４】
ＧＤＰ−フコースの生産用の組み換えＳ．セレヴィシエは、交配を通じて構築される。最初の個体発現ベクターは、プラスミドｐＧＬＤを使って作られ、それは、グリセルアルデヒド−３−フォスフェイトデヒドロゲナーゼ（ＧＬＤｐ）プロモーターおよびフォスフォグリセロールキナーゼ（ＰＧＫｔ）ターミネーターを含む。ＧＭＤおよびＧＦＳ遺伝子の断片は、プラスミド５４に挿入される。これらのプラスミドは、エレクトロポレーションによってＳ．セレヴィシエＡＴＣＣ６０７２９（Ｍａｔａ；ｈｉｓ、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ｕｒａ３）およびＡＴＣＣ６０７２９（Ｍａｔａ；ｈｉｓ、ｔｒｐ１、ｌｅｕ２、ｕｒａ３）に挿入される。酵母細胞中の２種の交配型、ａ−タイプおよびａ−タイプは、２倍体を作ってもよく、それは、ａ−タイプおよびａ−タイプ由来の遺伝子を有する。ＧＭＤおよびＧＦＳ遺伝子を含む２倍体が形成され、酵素を生産する。
【００７５】
発酵工程は、２つの期からなり、１）初期細胞成長およびこれらの酵素の発現のためのバッチ期２）高い細胞密度およびこれらの酵素の高い発現のための供給−バッチ期。供給−バッチ期において、フィード培地（８０％蔗糖液２００ｍｌ）が５０％空気飽和のＤＯ−ｓｔａｔを使って与えられる。これらの条件下で成長した酵母構築物は、酵素発現、プラスミドの安定性および全収率に対して評価される。糖ヌクレオチドの生産は、キャピラリー電気泳動によってモニタリングされる（１６４，１６５）。
【００７６】
酵母中のＧＤＰ−マンノースの高い生産能は、形質転換体の多量のＧＤＰ−フコースの生産能を提供する。ＧＤＰ−マンノース生産は、酵母中の高マンノース構造の生産を阻害することによりＧＤＰ−フコースへと更にチャンネルしうる（１６６，１６７）。これは、例えば、Ｏｃｈ１ｐ（α１，６マンノシル転移酵素）欠失変異体を使うことによって、または、α１，２マノシダーゼ、ＧｌｃＮａｃ転移酵素、およびＵＤＰ−ＧｌｃＮａｃ輸送体（Ｈａｍｉｌｔｏｎら  ２００３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４）をコーディングする異種遺伝子を含ませることによって達成しうる。
【００７７】
ＧＤＰ−マンノースからＧＤＰ−フコースへの転換は、ＧＤＰ−フコースの穏やかな構築によって阻害されうる（１６８、１６９）。哺乳動物においては、これは、アンチポーター、フコシル化、遊離ＧＤＰの放出、さらにこれによって細胞質に戻す、ＧＤＰ−フコースを細胞質から滑面小胞体／ゴルジ体の内腔へシャトルするゴルジ膜貫通輸送体によって解消される（１６１）。したがって、細胞質中では、ＧＤＰ−フコースは、それが消費されるのと同じ速さで生産しうる。この素晴らしい制御機構は、哺乳動物中で、特に、ヒトの乳房の上皮細胞で広範なフコシル化を許容し、それは、小胞体／ゴルジ膜に亘るＧＤＰ−フコースの動きに関与するアンチポーター遺伝子を挿入することによって取り込まれうる（１６０）。該アンチポーターが有用であるために、それは、ゴルジ膜に挿入されなければならない。サッカロマイセス・セレヴィシエのゴルジにおけるグリコシル化のための主な糖ヌクレオチドであるＧＤＰ−マンノースは、アンチポーターＶＲＧ４遺伝子産物（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．Ｐ４０１０７ＧＩ：７２９６１１；配列番号：９）によって内腔へ輸送される。Ｎ−末端サイトゾルテイルが欠如したＶｒｇ４変異タンパク質は、ゴルジ膜へは局在化しない一方で、非−ゴルジ膜タンパク質へのＶｒｇ４ｐのＮ−末端の融合は、ゴルジへのこれらの輸送を促進する；従ってＮ−末端は、特に、ゴルジへのタンパク質発現を誘導する（１７０）。Ｖｒｇ４ｐ酵母アンチポーター（アミノ酸１−５３または２１−５３または３１−５３）のＮ−末端からヒトのＧＤＰ−フコース輸送体（ＧｅｎＢａｎｋ登録Ｎｏ．ＡＡＫ５０３９７．１ＧＩ：１３９４０５０６；配列番号：１０；ＡＡＫ５１７０５．１ＧＩ：１４００９６６７；配列番号：１１）へ融合することによって、それは、酵母ゴルジ膜中へ配向しうる（１７１）。
【００７８】
適切なフコース輸送体はいずれも、フコースを滑面小胞体の平滑な内腔およびゴルジ体にシャトルするフコース輸送体を作るためにゴルジ体局在配列へ融合されうる。以下のＧＤＰ−フコース輸送体を用いることができる。
１：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．Ｑ９６８Ａ５；ｇｉ｜２０１３８２７９｜
２：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＸＰ＿５０８３８８；ｇｉ｜５５６３５７８９｜
３：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．Ｑ９ＶＨＴ４；ｇｉ｜２０１３８４３７｜
４：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿９９７５９７；ｇｉ｜４６８７７０９８｜
５：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿６６５８３１；ｇｉ｜２２００３８７６｜
６：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＥＡＬ３８３９３；ｇｉ｜５４６５９８３１｜
７：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＥＡＬ３８０６７；ｇｉ｜５４６５９４９３｜
８：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿０６０８５９；ｇｉ｜３７０５９７３１｜
９：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＳ４６７３３；ｇｉ｜４４１５１６００｜
１０：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＸＰ＿４２１１２７；ｇｉ｜５０７４８１４７｜
１１：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿７３２４１２；ｇｉ｜２４６４８１６６｜
１２：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿７２３２６８；ｇｉ｜２４５８２４７６｜
１３：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿４７６８５９；ｇｉ｜２４６３９４５４｜
１４：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５２５０３３；ｇｉ｜１８０７９２６５｜
１５：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５２４１９１；ｇｉ｜１７７３７７０３｜
１６：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５２３５０２；ｇｉ｜１７６４８１１３｜
１７：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿４７７２６４；ｇｉ｜１７１３７３８８｜
１８：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ４０２２３；ｇｉ｜２６３５３１８６｜
１９：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ３８１２７；ｇｉ｜２６３４８９７５｜
２０：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ３４１８１；ｇｉ｜２６３４１０３８｜
２１：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ３２５５４；ｇｉ｜２６３３７７３７｜
２２：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ３０７７０；ｇｉ｜２６３３４１０５｜
２３：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ３０５９５；ｇｉ｜２６３３３７５５｜
２４：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ２８２２６；ｇｉ｜２６３２８９７５｜
２５：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＢＡＣ２７１９９；ｇｉ｜２６３２６９１１｜
２６：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．Ｑ９６Ａ２９；ｇｉ｜２０１３８２８０｜
２７：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿２００５２０；ｇｉ｜１５２４２０３５｜
２８：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５６６４８７；ｇｉ｜１８４００３８１｜
２９：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＯ５０９５４；ｇｉ｜２８８２８２９０｜
３０：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５０２５５０；ｇｉ｜２５１５０８６５｜
３１：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５０５４６７；ｇｉ｜２５１５０１８８｜
３２：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿７４１３６０；ｇｉ｜２５１４８７６５｜
３３：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５０３６０４；ｇｉ｜２５１４６３１７｜
３４：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＰ＿５００３７１；ｇｉ｜１７５３８２４８｜
３５：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＸＰ＿２３０２９２；ｇｉ｜３４８５６５６０｜
３６：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＬ６２４９１；ｇｉ｜１８２５２８１６｜
３７：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＫ５１７０５；ｇｉ｜１４００９６６７｜
３８：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＫ５０３９７；ｇｉ｜１３９４０５０６｜
３９：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＫ５０３９６；ｇｉ｜１３９４０５０４｜
４０：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＫ４９９１０；ｇｉ｜１３９３６７２０｜
４１：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＫ４９９０９；ｇｉ｜１３９３６７１８｜
４２：Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＡＫ４９９０８；ｇｉ｜１３９３６７１６｜
以下などの、多くの適切なゴルジ体局在配列の源がある。
【００７９】
Ｓ．セルビシエＧＤＰ−Ｇａｌポーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録Ｎｏ．ＡＡＴ９２８５５．１ＧＩ：５１０１３１２３）からのゴルジ体局在配列が使用できる。
【００８０】
２’−ＦＬ、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクトジフコテトラオース（ＬＤＦＴ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、またはラクト−Ｎ−ヘキサオースを生産する酵母
多くの有用なオリゴ糖は、還元性の末端位にラクトースを、および、非還元性の末端位に、ラクトースを含む。タイプ１構造のオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミンにａ１，４結合したフコシルを有しうり、一方、タイプ２構造のオリゴ糖は、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはグルコースにα１，３結合したフコシルを有しうる。いずれかのタイプは、ガラクトースにα１，２結合したフコシルを含んでもよい。α１，２結合によるオリゴ糖へフコースの添加は、ＦＵＴ２により生産されたフコシル転移酵素によって触媒される。α１，３またはα１，４結合によるフコースの添加は、該ファミリーのＦＵＴ３または他の遺伝子によって生産されたフコシル転移酵素によって触媒される。これらの酵素によって定義される経路による乳オリゴ糖の合成は、図４に示される。したがって、２つの酵素遺伝子ＧＭＤおよびＧＦＳに加えて、人乳オリゴ糖の合成のための生体触媒としての酵母の開発には、ゴルジで発現するＧＤＰ−フコースアンチポーターに加え、ＦＵＴ２、ＦＵＴ３または両方の共同生産が要求される。ＦＵＴ２およびＦＵＴ３のプラスミド構築ならびに酵母の形質転換（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓおよびＳ．セレヴィシエ中）は、上記に記載したとおり行われる。例えば、ＦＵＴ２（またはＦＵＴ３、または両方）遺伝子のＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓへの挿入は、図５に示した通り、構築されたベクターの形質転換によって達成されうる。組み換え酵母は、ラクトースを与えると、それらは、２’−ＦＬ、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、またはラクトジフコテトラオース（ＬＤＦＴ）を生産しうる。酵母は、ラクト−Ｎ−テトラオースを与えると、それらは、タイプ１ルイスエピトープ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、またはラクト−Ｎ−ヘキサオースを生産しうる。
【００８１】
フコシル転移酵素およびガラクトシル転移酵素
様々な所望のオリゴ糖は、細胞中で適切な転移酵素を発現することによって生産しうる。適切なフコシル転移酵素としては、下記がある。
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＭ＿０００１４８ヒトフコシル転移酵素１（ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシル転移酵素、Ｂｏｍｂａｙ表現型が含まれる）（ＦＵＴ１）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＭ＿０００５１１
ヒトフコシル転移酵素２（分泌状態が含まれる）（ＦＵＴ２）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＭ＿０００１４９
ヒトフコシル転移酵素３（ガラクトシド３（４）−Ｌ−フコシル転移酵素、ルイス血液型が含まれる）（ＦＵＴ３）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＭ＿００２０３３ヒトフコシル転移酵素４（α（１，３）フコシル転移酵素、脊髄の−特定の）（ＦＵＴ４）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＭ＿００２０３４
ヒトフコシル転移酵素５（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ５）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＸＭ＿０１２８００
ヒトフコシル転移酵素６（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ６）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＸＭ＿０５６６５９
ヒトフコシル転移酵素７（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ７）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＭ＿００４４８０
ヒトフコシル転移酵素８（α（１、６）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ８）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＮＭ＿００６５８１
ヒトフコシル転移酵素９（α（１，３）フコシル転移酵素）（ＦＵＴ９）
Ｇｅｎｂａｎｋ（登録商標）登録Ｎｏ．ＡＦ３７５８８４
ヒトタンパク質ｏ−フコシル転移酵素（ＰＯＦＵＴ１）
適切なＧａｌβ１，３転移酵素ガラクトシル転移酵素は：
β１，３ＧａｌＴコア（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＦ１５５５８２）；
β１，３ＧａｌＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＦ１１７２２２）；
β１，３ＧａｌＴ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＦ２８８３９０）；
β１，３ＧａｌＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＦ１３２７３１）；
β１，３ＧａｌＴ４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＢ０２６７３０）；
β１，３ＧａｌＴ５（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＦ１４５７８４）；
β１，３ＧａｌＴ６（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＹ０５０５７０）
を含む。
【００８２】
適切なＧａｌβ１、４転移酵素ガラクトシル転移酵素は：
β１、４ＧａｌＴ１（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）Ｄ２９８０５）；
β１、４ＧａｌＴ２（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＢ０２４４３４）；
β１、４ＧａｌＴ３（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＢ０２４４３５）；
β１、４ＧａｌｔＴ４（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＦ０２２３６７Ｌｃ２  ｓｙｎｔｈａｓｅ）；
β１、４ＧａｌＴ５（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＢ００４５５０）；
β１、４ＧａｌＴ６（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＢ０２４７４２）；
およびβ１、４ＧａｌＴ７（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＢ０２８６００）
を含む。
【００８３】
適切な血液型ＢのＧａｌα１，３転移酵素ガラクトシル転移酵素は、血液型ＢのＧａｌα１，３Ｔ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録Ｎｏ．（登録商標）ＡＦ１３４４１４）である。
【００８４】
一般的に、ヒトのＦＵＴ１およびＦＵＴ２は、α１，２結合を加えることに対し有用であり；ヒトのＦＵＴ３は、α１，４結合を加えることに対し有用であり；ヒトのＦＵＴ５、ＦＵＴ６、ＦＵＴ７、およびＦＵＴ９は、α１，３結合を加えることに対し有用であり；ならびに、ＦＵＴ８は、α１，６結合を加えることに対し有用である。
【００８５】
ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）およびラクト−Ｎ−ネオ−テトラオース（ＬＮｎｅｏＴ）を生産する酵母
人乳オリゴ糖は、一般的なミルクフコシル化オリゴ糖の前駆体である２つのテトラオース、ＬＮＴ（Ｇａｌβ１，３ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）およびＬＮｎｅｏＴ（Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）を含む。ラクト−Ｎ−テトラオースを合成するために、β１，３ＧｌｃＮＡｃ転移酵素は、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ由来のＧｌｃＮＡｃをラクトースに転移し、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩを合成し；次いで、ガラクトースは、ＧｌｃＮＡｃβ１，３Ｇａｌ転移酵素によって、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩに転移する。仮に、その合成のための遺伝子が、野生型酵母に挿入されたら、ＬＮＴが生産されうり；ＦＵＴ２構築物に挿入されたら、ＬＮＦ−Ｉが結果物となり；ＦＵＴ３構築物に挿入されたら、ＬＮＦ−ＩＩが得られ；ＦＵＴ２／ＦＵＴ３構築物に挿入されたら、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース（ＬＤＦＨ−Ｉ）が生産物となりうる。同様に、ＬＮｎｅｏＴは、Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃ転移酵素およびＧｌｃＮＡｃβ１，４Ｇａｌ転移酵素を形質転換されている酵母中で合成されるであろう。これらの酵母は、ラクトースを与えると、ＬＮｎｅｏＴを生産しうる。仮に、これらの遺伝子がＦＵＴ３構築物に挿入されたら、ＬＮＦ−ＩＩＩが生産されうる。これらの形質転換体は、プラスミドを染色体に組み込むことにより生じる。ジェネテシン耐性のレベルは、耐性はプラスミド上のカナマイシンマーカーによって与えられているので、組み込まれたプラスミドの相対的なコピー数を示す。一般的に、高いコピー数の組み込み体は、異種タンパク質生産の高いレベルを得るために好ましい。
【００８６】
化学的合成
別の方法として、化学的合成方法は、様々な方法および本明細書中に示した組成物において有用なオリゴペプチドを調製するために用いられうる。
【００８７】
グリコシルドナーおよびアクセプター、保護基戦略ならびにＬ−フコシル（シス）および−Ｄ−ガラクトピラノシル（トランス）結合の形成のカップリング条件の選択は、現代の合成炭水化物化学の確立された方法によるであろう（１０３−１０５）。一つのアプローチとしては、図２に示され、および、下記に記載される。
【００８８】
α−Ｌ−フコシル残基に対するグリコシルドナー
必須要件は、Ｏ−２における“非参加型”基を伴うドナーである（１０６）。この目的のために、ハロゲン化物イオン触媒条件下、多くのＬ−フコシル誘導体合成において成功的に採用されてきている方法において、２，３，４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノシルブロマイドが採用される（１０７−１１１）。
【００８９】
持続性保護基としてのベンジルエーテル基の使用（１１２、１１３）は、カップリングの後に、目標化合物においてのドナーおよびアクセプター残基の脱保護が触媒水素添加分解によって同時に達成できるという利点を有する。１−チオ、フッ化物、トリクロロアセチミダート、または４−ペンテニルグリコシドのような代替ドナー（１１４）も使われうる。
【００９０】
２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノースアクセプター（ＧｌｃＮＡｃアクセプター）
始めに、該化合物は、ベンジル、４、６−ベンジリデンまたはベンジルグリコシドのアリルエーテル誘導体（図２参照）であるが、この群は、元来ベンジルエーテルが合成の最後においても保持するように操作された。触媒水素添加分解の最終段階は、アクセプターおよびフコシルドナーの両方から誘導された残基の脱保護である。リチウムアルミニウムハイドライド／アルミニウムクロライドを伴うベンジル２−アセトアミド−４、６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド誘導体の還元的開環の位置選択性は、Ｏ−３における置換基の立体的嵩高さに依存する（１１５）。
【００９１】
ｂ−Ｄ−Ｇａラクトピラノシルドナー．第一要件は、Ｏ−２における“参加基”に対してである（１０５）。Ｏ−１における一時的な保護基は、グリコシド化反応で、離脱基としてのハロゲン原子の取り込みを許容する。臭素は、よりよい反応性からみて好ましく（１０５）、取り込みは、実施できる最も穏やかな条件下で行われるべきである。したがって、Ｏ−１置換基は、ジクロロメタン中で臭化水素と反応するｐ−ニトロベンゾイルであろう（１１６）。Ｏ−２において、“参加”基は、１、２−トランス−グリコシド形成に対して必要である。Ｏ−ベンゾイル基は、塩基性条件にそれほど不安定ではなく、移動する傾向が小さく、カップリング反応中、所望しないオルトエステル形成を受ける傾向が少なく、選択的な取り込みがより容易であるという理由から、Ｏ−ベンゾイルは、Ｏ−アセチルより好ましい（１１２）。結合が２’−ＦＬおよび２’−ＦＬＮＡｃに対し所望されるＯ−２位において、一時的な保護基は必要であって、他の結合または基に影響を及ぼすことなく、最初のグリコシド化の後に除去されうり；ベンゾイル基は両方の機能を果たしうる。残りの２つの位置は、持続性基（ベンジル）が占め、合成の最後においてのみ除去される。
【００９２】
特別に保護された“内部の”ガラクトシルドナーおよび保護されたグルコサミンアクセプターのカップリング反応は、酸スカベンジャー（コリジンまたはテトラメチル尿素）、およびモレキュラーシーブの存在下で、すなわちトランスグリコシドカップリングの標準的な条件下でプロモーターとして銀トリフレートを採用しうる（１１７−１１９）。フェルリッヒ条件（１２０）（シアン水銀／臭化第二水銀プロモーター）またはケーニヒス−クノル条件（１２１）（不溶性の触媒としての炭酸銀）は、この段階で置換しうる。いずれの方法を用いても、最初のグリコシド化反応の生産物のクロマトグラフの精製の後、それは、次のフコシル化段階の間にいずれの分子間アセチル転移の危険性をさけるためのペルベンジル化することに有用となりうる。
【００９３】
出発化合物、クロマトグラフィー、脱保護、および構造確認
すべての出発物質は、図２に記載された手順によって、Ｌ−フコース、Ｄ−ガラクトース、および２−アセトアミド−２−デオキシ−Ｄ−グルコース、からアクセスできる。これらの調製およびカップリング反応後は、中間体の精製をモニタリングするためにＴＬＣを行う。カップリング反応の生産物は、シリカゲルカラムおよび分取層クロマトグラフィーによって精製されうる。例えば、２−ブロモエチルグリコシドまたは８−メトキシカルボニルオクチルグリコシドは、必要であればタンパク質複合体形成に置換しうるが、簡単にするために、ＧｌｃＮＡｃアクセプターは、ベンジルグリコシドとして示される。２’−フコシル−Ｎ−アセチルラクトサミンの合成（１１０）は、記載されており、中間体の調製および生産物の特徴づけのための実験的データおよび分光分析データを提供している。最終生産物の純度は、ＴＬＣおよびＨＰＬＣによって決定され、Ｂｉｏ−ｇｅｌＰ−２カラムおよび／またはカチオンおよびアニオン交換樹脂の連結カラムを通すことによる最終精製を、必要によっては行う。重要中間体および最終生産物の構造は、ペルメチル化分析および質量分析によって確認する。
【００９４】
オリゴヌクレオチドの分析
本明細書中に記載のいずれかの方法によって生産されたオリゴ糖は、標準的な方法を使って、分析し、組成および構造を評価できる。例えば、ＧＣ分析は、糖率を分析するために用いてもよい。簡単に言うと、サンプルをメタノール水溶液（５０％）キャピラリチューブ（１ｍｍ  ｉ．ｄ．ｘ３５ｍｍ）に入れる。溶媒は、真空下で遠心分離中に除去する。サンプルをＰ２Ｏ５存在下減圧デシケーター中で乾燥させる。乾燥メタノールＨＣｌ（０．７５ｍｏｌ／Ｌ；２５ｍＬ）およびメチルアセテート（５ｍＬ）をチューブのトップを封じ直す前に加える。該チューブを、８０℃で２時間インキュベートし、周辺温度になるまで冷却してすぐにチューブのトップに切れ目をつけてから割って開ける。該チューブを遠心しながら真空下に放置し、遠心分離でメタノールＨＣｌを除去する。内部標準（メチルヘプタデカン酸塩、５ｍｌメタノールで２ｎｍｏｌ）を加え、溶媒を真空遠心分離で除去する。乾燥ピリジン（５ｍＬ）中の作りたて５０％無水酢酸を加え、チューブを封じ直し、アセチル化を周辺温度で１４時間行う（反応は２時間で完了）。チューブのトップに切れ目をつけてから割って開けてすぐ内容物のアリコート（１ｍＬ）を３０−ｍＤＢ−１カラムを充填したガスクロマトグラフに注入する。ピークは、フレームイオン化によって検出する。ＧＣに注入をした後、温度を１５分間１５０に℃保ち、毎分４℃づつ上昇させ最高温度３００℃にする。ピークエリアは、ＨＰ  インテグレーターで計算する。この方法は、精製した化合物の糖率およびサンプル中の糖の絶対量を決定するための適切な結果を与える。この方法は、約１μｇ（１ｎｍｏｌ）オリゴ糖で一貫してよい結果を生み出す。
【００９５】
生産物は、質量分析により分析することができ、精製を評価し、構造を確認できる。サンプル中の成分数およびこれらの分子量は、マトリクス支援レーザ脱離イオン化質量分析によって決定する。ペルアセチル化されたサンプルのＭＳ／ＭＳは、混合サンプルの個々の成分の組成の情報を得るために用いる。高速原子衝撃質量スペクトルにおけるフラグメンテーションパターンは、精製されたサンプルの構造に対しいくつかの知見を与える。誘導体のＭＳ／ＭＳは、相当な不純物の存在下での主成分を含むサンプルであっても、完全な構造情報を得るために用いられうる。精製された化合物の結合は、部分Ｏ−メチル化ヘキシトールおよびｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｔｏｌアセテート（ＰＭＡＡｓ）のＧＣ／ＭＳ分析によって、見積もられる（１２３）。
【００９６】
多価の糖タンパク質
多くの場合、２以上の異なったオリゴ糖が、同じバックボーン、例えば、タンパク質のバックボーンに共有結合している多価の形態の２以上の異なったオリゴ糖混合物を投与することが望ましい。加えて、多価の形態、すなわち、同じオリゴ糖の複数コピーが、単一のバックボーンに付着している形態の単一のオリゴ糖を投与することが望ましい。適切なバックボーンのいずれも使用でき、例えば、グリカン、糖脂質、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ムチンまたはポリペプチドがある。適切なバックボーンポリペプチドは、多種グリコシル化部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｓｎ、Ｓｅｒおよび／またはＴｈｒ残基）および低いアレルギーの潜在性を有する。いくつかの場合、ヒトに与えることが許容されると考えられるポリペプチドを用いることが望ましい。有用なバックボーンは、κ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、ラクトフェリン、胆汁塩−刺激リパーゼ、リゾチーム、血清アルブミン、葉酸結合タンパク質、ハプトコリン、リポタンパク質リパーゼ、グリコサミノグリカン、ムチン、ラクトペルオキシダーゼ、アミラーゼ、ウシミルクタンパク質および他の一般食品のタンパク質のような人乳タンパク質を含む。
【００９７】
オリゴ糖は、標準方法を使って、タンパク質に付着しうる。例えば、オリゴ糖は、ｐ−アミノフェニルグリコシドに転換し、次いで、標準手順で、ジアゾ化およびＢＳＡまたは他のポリペプチドと複合化する（１２４、１２５）。ｐ−アミノフェニルグリコシドは、ペルアセチルｐ−ニトロフェニルグリコシドを通じ、調製できる（１２６−１２８）。ｐ−アミノフェニルグリコシドは、Ａｄａｍｓ触媒の存在下で、注意深く、Ｏ−デアセチル化（アルカリ加水分解を避けるため）および還元される。比較的不安定なジアゾニウム塩の別の方法として、一般的に安定な結晶性イソチオシアネートが調製され、上述の通り、ＢＳＡまたは他のポリペプチド（例えば、ミルクタンパク質）に結合されうる（１２４）。または、遊離の還元末端を伴うオリゴ糖は、シアノボロハイドライドナトリウムによる還元的アミノ化によって共有結合に転換するリジン残基、または、シッフ塩基を形成するアミノ末端で見られるように、タンパク質上で遊離アミノ基と結合しうる。オリゴ糖のポリペプチドへの付着は、直接的にスペーサーなしで、または様々な鎖長のスペーサーを通じてされうる。スペーサーの異なった化学の多様性が利用可能である。天然の糖タンパク質のコアなＮ結合グリカンのコアは、酵母中で発現するタンパク質上のスペーサーとして働きうる。
【００９８】
天然のグリコシル化部位に付着するコアなＮ結合グリカンを伴う所定のタンパク質を生産するように操作された酵母（Ｈａｍｉｌｔｏｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：１２４４、２００３参照）は、ポリフコシル化ネオ複合糖質の生産のための開始点としてネオ糖タンパク質を作り出すために用いられうる。以下のグリカンのタイプは、スペーサーとして（Ｒは、バックボーン、例えば、タンパク質を示す）および所望のグリカンの還元末端として用いられうるそれらの代表である。
【００９９】
【表９】
2007525487.tif 000010
【０１００】
【表１０】
2007525487.tif 000011
【０１０１】
フコシル化された形態を作るために、ネオ糖タンパク質は、上述の化学的、化学酵素的または、分子生物的アプローチのいずれかによってラクトースのかわりに基質として使用される。これらのタンパク質が、ＧＭＤ、ＧＦＳ、および細胞壁発現ＦＵＴ−２を発現するように操作された酵母中で発現すると、Ｈ−２エピトープの多価の形態を生産しうる。これらの多価のＨ−２分子の生産への代替的アプローチは、コアおよびグリカン構造に必要な、所定の人乳タンパク質およびフコシル転移酵素に対するプラスミド−運搬遺伝子にＧＭＤ、ＧＦＳ、および細胞壁発現ＦＵＴ−２を発現するように操作された酵母にトランスフェクトしてもよい。このような構築物は、Ｕｌｅｘレクチンアフィニティクロマトグラフィーによって単離しうる多価のＨ−２ネオ糖タンパク質を生産しうる。フコシル化された形態を作るために、ネオ糖タンパク質は、上述の化学的、化学酵素的、または分子生物的アプローチのいずれかによってラクトースの代わりの基質として使われる。これらのタンパク質は、ＧＭＤ、ＧＦＳ、および細胞壁発現ＦＵＴ−１またはＦＵＴ−２を発現するように操作された酵母に接触させると、Ｈ−２エピトープの多価の形態を生産しうる；細胞壁上でＦＵＴ３−７若しくはＦＵＴ−９、または、ＦＵＴ−１若しくは２およびＦＵＴ３−９の組合せを発現するものは、他のフコシル化されたエピトープを生産するであろう。これらの多価のＨ−２分子の生産への代替的アプローチは、コアおよびグリカン構造に必要な所定の人乳タンパク質およびフコシル転移酵素に対するプラスミド−運搬遺伝子をＧＭＤ、ＧＦＳ、および細胞壁発現フコシル酵素を発現するように操作された酵母にトランスフェクトしてもよい。このような構築物は、Ｕｌｅｘレクチンアフィニティクロマトグラフィーによって単離しうる多価のＨ−２ネオ糖タンパク質を生産しうる。第三のアプローチは、タンパク質、グリカンコア、糖ヌクレオチドを輸送するアンチポーター、必要とする糖ヌクレオチド合成のための酵素ならびに、それぞれの、フコシル化されたおよび／またはシアリル化構造、またはフコシル化されてない、シアリル化オリフォサッカライドでないものを生産するのに必要なフコシル転移酵素および／またはシアリル転移酵素を生産するために必要なグリコシル転移酵素のための遺伝子を酵母にトランスフェクトしてもよい。
【０１０２】
組成物
バックボーンに結合する、または、しないオリゴ糖は、オリゴ糖（バックボーンと、遊離した、または、に結合した）および製薬上許容できる担体、例えば、様々な湿潤剤または賦形剤と同様に、リン酸緩衝生理食塩溶液、水エタノール混合物、油／水または水／油エマルジョンのような、水およびエマルジョン、を含む薬剤組成物として、投与できる。オリゴ糖薬剤は、患者に投与されたとき拒絶反応、アレルギー反応、さもなければ望ましくない反応を生み出さない物質と組み合わされてもよい。担体または媒介は、溶媒、分散剤、コーティング剤、吸収促進剤、放出制御剤、および１以上の不活性な賦形剤（それは、でんぷん、ポリオール、造粒剤、微結晶性セルロース、希釈剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤およびこれらの物を含む）、等を含んでもよい。仮に所望するなら、開示された組成物の錠剤の投与形態は、標準的な水性または非水性技術によってコーティングされてもよい。
【０１０３】
オリゴ糖薬剤は、例えば、予め決められた量の活性成分を含む錠剤、ペレット、ゲル、ペースト、シロップ、ボーラス、舐剤、スラリー、カプセル、パウダー、顆粒として、水性液体若しくは非−水性液体中の、溶液または懸濁液として；水中油型水溶液エマルジョン若しくは油中型水溶液エマルジョンとして、または、その他の形態で、経口で、投与されてもよい。経口投与組成物は、結合剤、潤滑剤、賦形希釈剤、滑剤、表面活性または分散剤、香料添加剤、および保湿剤を含んでもよい。錠剤のような経口投与製剤は、必要により、コーティングされても、または分割錠であってもよく、および、活性成分の持続放出、遅延放出または制御放出を提供するように配合されてもよい。本発明の薬剤は、肛門坐剤、エアロゾルチューブ、鼻腔−胃チューブ、胃腸管若しくは胃の直接注入によって、または非経口で、投与されうる。
【０１０４】
オリゴ糖薬剤を含む薬剤組成物は、抗ウイルス薬、抗生物質、プロバイオティック、鎮痛剤、および鎮痛剤のような治療薬を含んでよい。
【０１０５】
適切な投与量は、当業者によって決定され、例えば、患者の免疫状態、体重および年齢のような要因に依存する。いくつかの場合、投与量は、ヒトの母乳中に存在する類似オリゴ糖と類似の濃度である。
【０１０６】
オリゴ糖薬剤は、他の組成物へ加えることもできる。例えば、特殊調製粉乳、栄養組成、水分補給用飲料、高齢者または、免疫障害欠陥を持つ個体のための、日常的メンテナンスまたは、サプリメントに加えることができる。
【０１０７】
オリゴ糖薬剤は、食用脂、炭水化物およびタンパク質のような主要栄養素を含む組成物に含ませることができる。食用脂は、例えば、ココナッツオイル、大豆油ならびにモノグリセリド及びジグリセリドを含む。炭水化物は、例えば、グルコース、食用ラクトースおよび加水分解コーンスターチを含む。タンパク価は、例えば、タンパク源は、例えば、大豆タンパク質、乳清、およびスキムミルクでありうる。
【０１０８】
オリゴ糖薬剤を含む、栄養組成物などの組成物はまた、ビタミンおよびミネラル（例えば、カルシウム、リン、カリウム、ナトリウム、クロライド、マグネシウム、マンガン、鉄、炭素、亜鉛、セレン、エレメント、およびビタミンＡ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、およびビタミンＢ複合体）を含みうる。
【０１０９】
オリゴ糖のスクリーニングおよび分析
オリゴ糖は、薬剤自身を使って感染体への結合能を試験することができる。例えば、炎症性下痢の子供由来のプロトタイプの侵襲性Ｃ．ジェジュニ株１６６−ＩＰおよび２８７−ＩＰ；健康な子供由来のＣ．ジェジュニ株５０−ＳＰ；および２つのＶ．コレラ株であるＥｌ  ＴｏｒおよびＣｌａｓｓｉｃは、カンピロバクターおよびＶ．コレラ上のオリゴ糖の影響を研究するために使われうる。
【０１１０】
組織血液型抗原へのカンピロバクターおよびＶ．コレラの結合能を評価するために、細菌結合へのウエスタンブロット法は、ＤＩＧ−標識細菌を用いて行われる（２３，２４）。血液型抗原のネオ糖タンパク質は、レーンごとに６．３×１０−１０Ｍのオリゴ糖の条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用レーンに適用する。膜は、ＴＢＳで洗浄し、ＯＤ６００が０．２のＤＩＧ−標識細菌の懸濁液に浸し、穏やかに攪拌しながら室温で４時間インキュベートする。膜は、その後洗浄し、アルカリホスファターゼ−複合抗−ＤＩＧ抗体で１時間インキュベートし、洗浄し、および、生理食塩水（ｐＨ９．５）基質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中で、Ｘ−フォスフェイト（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト）およびトリス−バッファ含有ニトロブルーテトラゾリウムに染色した。
【０１１１】
α１，２−フコシル転移酵素−トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＦＵＴ１）、α１，３／４−フコシル転移酵素−トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＦＵＴ３）、およびα１，３−フコシル転移酵素−トランスフェクトＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ＦＵＴ４）、ならびに、α１，２ＦＵＴ遺伝子（ＣＨＯ−ＷＴ）が欠失したベクターｐＣＤＭ７をトランスフェクトした親ＣＨＯ細胞は、細菌の結合および細菌／ホスト細胞凝集を、試験をするために使用してよい。ベクターを伴う親ＣＨＯ細胞は、対照として用いる。
【０１１２】
α１，２−フコシル転移酵素（ＦＵＴ１）に対するヒトの遺伝子をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞への細菌の結合は、細菌−細胞結合評価によって評価できる。簡単に言うと、ヒトのＨ−タイプ抗原（α１，２−フコシル残基）の合成に必要なＦＵＴ１フコシル転移酵素を発現するトランスフェクトＣＨＯ細胞は、密集するまで成育させる（２８）。対照は、野生型ＣＨＯ細胞、プラスミドベクターのみを有する親ＣＨＯ細胞、およびマウスＵＤＰＧａｌ：Ｇａｌα１、４ＧｌｃＮＡｃα１，３−転移酵素を発現するクローンである。単層を集め、８−チャンバースライドの各ウェルに播種し、１８時間培養し、洗浄し、９ｘ１０８細菌／ｍＬの懸濁液で培養する。ウェルをリンスし、１時間１０％ホルマリンで固定し、Ｗａｒｔｈｉｎ−Ｓｔａｒｒｙ法によって染色し、蛍光性プラスミドを有する変異株を、油浸下で、光学顕微鏡、または共焦点顕微鏡で調べる。
【０１１３】
丸いカバー・スリップ上で成長させる同一の調製物は、２％グルタルアルデヒドに固定し、一連の段階的に使用する溶媒で脱水し、表面の金処理をした後、電子顕微鏡検査をスキャンすることで調べた。
【０１１４】
α１，２−フコシルリガンドおよびその同族体のようなリガンドは、ＣＨＯ−ＦＵＴ１細胞へのカンピロバクターおよびＶ．コレラ株の結合を阻害する能力について試験する。抗−Ｈ−２モノクローナル抗体（抗−Ｈ−２ＭＡｂｓ）ならびにレクチン  Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ（ＵＥＡ  Ｉ）およびＬｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ（Ｌｏｔｕｓ）を含むＨ−２リガンドに結合する分子に対し、阻害は、１ｘ１０８細菌／ｍＬを含む１００μＬの細菌の懸濁液を加える前に、α１，２−フコシルリガンドのそれぞれと１時間８ウェルチャンバースライドで培養したＣＨＯ−ＦＵＴ１細胞の単層上で測定する。人乳の中性オリゴ糖（Ｎｅｕｔｒａｌ−ＯＳ）、分泌および非−分泌者の親のミルク、ネオ糖タンパク質ＢＳＡ−Ｈ−２（ＩｓｏＳｅｐ  ＡＢ、Ｔｕｌｌｉｎｇｅｎ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ならびに、２’−フコシルラクトース、を含む細胞表面レセプターの同族体を使用する阻害に対しては、１００μＬ細菌の懸濁液を、細胞単層に加える前に、同族体のそれぞれと培養する。両評価において、３７℃での３時間の培養後、ウェルをリンスし、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で溶解し、ウェルごとの細菌のＣＦＵ（コロニー形成ユニット）を決定する。データは、α１，２−フコシルリガンドまたは同族体が加えられていない陽性対照に対する細胞への、細菌結合との、阻害の割合（％）として判断される。
【０１１５】
インビボでのカンピロバクターおよびＶ．コレラコロニー形成上のオリゴヌクレオチドおよびネオ糖タンパク質の効果は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（体重１０−２０ｇ）で決定しうる。３週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＢＩＤ（１日２回）またはＴＩＤ（１日３回）のいずれかを、経口で与え、ネオ糖タンパク質の投与量を２ｍｇ／１００μＬから始め、２００ｍｇ／μＬまで増やす。動物は、最後の投与の後、トレランス、体重、下痢の存在、および異常行動を判断すべく２週間フォローする。
【０１１６】
２つの異なった評価は、ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ  Ｂａｌｂ／ｃの近交系を使ってインビボでのカンピロバクターおよびコレラのコロニー形成の阻害をテストするために用いうる。（１）予防研究。コロニー形成を予防的に阻害するネオ糖タンパク質の能力を研究するために設計された実験において、３週齢の雌のマウスは、ランダムに、２つの実験群ならびに陽性対照および陰性対照群に分配する。２つの実験群は、動物ごとに１０８ＣＦＵをチャレンジする。４つの抗原投与群のうち、２つは、チャレンジの２日前、当日、２時間後、１日２、３回ネオ糖タンパク質またはトリサッカライドのいずれかの処置を受ける。陰性対照群は、動物は始めに病原菌がないことを確認して使う。陽性対照群は、ただ生理食塩水を投与する。それぞれの実験群は、お互い、および生理食塩水対照群と比較する。
【０１１７】
オリゴ糖およびネオ糖タンパク質は、すでに感染した動物のコロニー形成の除去の試験のために使用しうる。また、３週齢のＢａｌｂ／ｃマウスは、始めに１０８ＣＦＵカンピロバクターに感染させ、動物が持続性コロニー形成を示した７日後、該動物は、トレランスおよび安全性研究で確立されている２投与量で１日、２回または３回のネオ糖タンパク質またはトリサッカライドで処置されるであろう。
【０１１８】
カンピロバクター、カリシウイルス、および母乳で育つ幼児におけるすべての原因の下痢に起因する下痢を減少する２位結合フコシル化オリゴ糖
人乳中の２位結合しないフコシル化オリゴ糖に対する、２位結合したフコシル化オリゴ糖の高い率は、母乳で育つ幼児におけるカンピロバクター下痢およびカリシウイルス下痢の発生を減少させたことを説明する研究を以下に示す。３１６の母子ペアのコホートを登録し、メキシコシティの従来から近隣であるＳａｎ  Ｐｅｄｒｏ  Ｍａｒｔｉｒで分娩後２年間モニタリングした。登録は、一般的な出産時体重の幼児を出産することを制限した。この研究は、メキシコおよびシンシナティの施設内倫理委員会で承認された。書面によるインフォームド・コンセントは、参加する親から得た。幼児の病気および授乳歴は、毎週の往診をする訓練を受けた外勤によって集められた。ミルクサンプルは、最初の月は毎週とその後毎月母親から収集した。サンプルは、経験をつんだ研究看護婦によって、Ｅｇｎｅｌｌ電気搾乳器を使って朝に収集され、一方の胸の全内容物を得た。研究の家庭用から実験用へは、サンプルをアイス上で運び、−７０℃で保存した。幼児の糞便サンプルは、週ごとに収集され、下痢が起こるたび毎に追加サンプルを得た。下痢サンプルは、先行刊行物に記載の通り、カンピロバクタージェジュニ、下痢性大腸菌、赤痢菌、サルモネラ菌、アエロモナス菌、およびロタウイルスについて定期的に試験した（１２９、１３６−１３８）。糞便サンプルのカリシウイルス試験は、酵素免疫分析（ＥＩＡ）および逆転写−ＰＣＲによって後に実施され；いずれかの試験でカリシウイルス陽性であるとの判断により陽性の結果であった（１３９−１４１）。研究を通じて、は、２４時間周期以内に３回以上の水様便、または、研究医師によって決定された子供の通常の１日の排便回数を越える２回以上の便による水性の緩んだ腸の動きを下痢症状と定義した。ＲｕｕｓｋａおよびＶｅｓｉｋａｒｉの重篤度評価システムを使って、下痢症状は、仮にスコアが１０以上なら中度〜重度と分類された（１３６、１４２）。疾病重症度の分類は、研究医師が記録したそれぞれの下痢症状の標準史に基づき、乳オリゴ糖分析の独立性に左右されない。仮に、病原菌が、下痢症状の間または７日以内に採集された糞便サンプル中で見つかったら、下痢は、カンピロバクターまたはカリシウイルスに起因するとした。２以上の病原菌に関連のある下痢症状は、病原菌に特異的な分析から排除された。当初のコホート研究が完成すると、母親は、採血に参加することを依頼され、母性血液型を決定した。
【０１１９】
仮に、彼らが少なくとも２週間は、コホート中でフォローされ、母乳で育てられたならば；母親は血液型確認のための血液採取について同意したならば、；および、ミルク分娩後１−５週間の間に採集した２ｍＬ以上を含む少なくとも一つのヴァイアル瓶のミルクを貯蔵して有したなら；母子ペアは、本研究中に含まれる。除外の理由は、少なくとも２週間４０人は、授乳せず、研究として維持されない；９１人の母親は血液採取に同意しなかった；９２人は、貯蔵のミルクサンプルの体積が不十分であったというものであった。トータルで９３の母子ペアは、すべての３つの基準を満たし研究に含まれた。仮に、一つのサンプルより上が母親ごとに利用可能なら、分娩後３０日に最も近い少なくとも２ｍＬの体積のものを採集した。
【０１２０】
ミルクサンプルは、ボストンに移送され、前述の通り分析した（１４３）。乳オリゴ糖は、単離され、ペルベンジル化され、アセトニトリル／水グラジエント逆相ＨＰＬＣ（Ｃ−８）で溶解し、２２９ｎｍで検知された。該クロマトグラフィーシステムは、人乳サンプル８つの主要なピークを検出し、それは最も一般的な人乳オリゴ糖：４つの、２位結合フコシル化オリゴ糖（ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ［ＬＮＦ−Ｉ］、２’−ＦＬ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース［ＬＤＦＨ−Ｉ］およびラクトジフコテトラオース［ＬＤＦＴ］）；２位結合でない（ＬＮＦ−ＩＩおよび３−フコシルラクトース［３−ＦＬ］）２つのフコシル化オリゴ糖；ならびに、これら２つの前駆体（ラクト−Ｎ−テトラオース［ＬＮＴ］およびラクト−Ｎ−ネオテトラオース［ＬＮｎｅｏＴ］）に相当する。これらの８つのオリゴ糖は、それぞれルイスヒスト血液型抗原の同族体で、それぞれ：Ｈ−１、Ｈ−２、Ｌｅｂ、Ｌｅｙ、Ｌｅａ、Ｌｅｘ、ならびにタイプ１および２前駆体である。人乳サンプルのオリゴ糖検知は、貯蔵または凍結融解によって不利に影響しなかった。
【０１２１】
統計分析
授乳中の下痢発症率に絞った一次解析は、授乳の１００のチャイルド−マンス（ｃｈｉｌｄ  ｍｏｎｔｈ）ごとの授乳中に起きる下痢のケースの総数として定義した。授乳のチャイルド−マンスは、出生から授乳の最後まで（または、研究からの最後、いずれか早く起こる方）の授乳に費やした全月の合計として計算した。二次解析は、授乳後のチャイルド−マンスの間のすなわち、授乳の最後から研究からの最後までの下痢発症率測定を実施した。下痢の病気の期間は、発症率を計算するのに使用させる分母には含ませなかった。研究結果は、Ｃ．ジェジュニ、カリシウイルス、下痢のすべての原因、および中度〜重度の下痢のすべての原因に関連する下痢の割合として定義した。主要な独立変数は、ミルク中の濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）および乳オリゴ糖の割合（％）（特定またはトータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖の量を、８つの測定オリゴ糖の合計で割った）に関して特徴付けられた、特定のおよびトータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖であった。乳オリゴ糖測定の割合（％）は、授乳の生理機能、サンプリング、採集、貯蔵、および試験に起因した濃度の変動を修正するために用いた。
【０１２２】
修正は、オリゴ糖測定値中で分析された。乳オリゴ糖測定値および下痢発症率の関連性は、ポワソン連結関数による一般化された線形モデルを使って測定された。このモデルは、フォローアップ時間の可変長を説明するために、一人ごとの１以上の結果の発症率の分析のため、最適として選択された。表１に示される因子による潜在的な相互作用または交絡は、乳オリゴ糖測定値および幼児下痢率に関して分析された。単変量および／または多変数モデルにおける幼児下痢率に関連する有意な（Ｐ＜０．０５）危険性因子は、（２４時間以内に摂食の総数によって割られる授乳の数としての、授乳中の週毎のフォローアップデータから計算される）母乳、幼児の出産順位、母性年齢、および母性ＡＢＯ血液型である、幼児養育率であった。これらの因子は、重回帰モデルに含められたが、それらは、乳オリゴ糖値には関連せず、オリゴ糖測定値および下痢発症率の間の関連性を混同させなかった。したがって、最終の回帰モデルは、下痢発症に関する乳オリゴ糖の割合（％）として表される特定のまたはトータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖のみを含んだ。連続型変数としての乳オリゴ糖分析に加えて、データの投与反応パターンは、群によって計算した幼児下痢率を伴う、乳オリゴ糖値の低、中、および高の三分位数（群あたりｎ＝３１）に分類することによって、母子ペアをさらに調べた。
【０１２３】
研究集団
この研究における９３の母子ペアは、出生および２歳の間の８５７の授乳した幼児−月および７６５の授乳後の幼児−月に対してモニタリングした。これらの９３の母子ペアを、本研究には含まれないが、少なくとも２週間幼児に授乳したコホート中の１８３人の母親と比較した；本研究に含まれる母親は、含まれない母親よりも長い期間授乳し（期間中央値９ｖｓ５月、Ｐ＜０．０１）、中等若しくはそれ以上の教育をより高い確率で修了（Ｐ＜０．０１）したことを除けば、彼らは、授乳中の幼児下痢の発症率ならびにすべての社会人口学的、衛生、および幼児因子（表１）に関し、同程度であった。これらの因子の分析は、それらは乳オリゴ糖レベルと関係があり、交絡とは関係ないということを知得した。したがって、これらの違いは、この研究の内部妥当性に影響を与えないようであった。９３の研究ペアの中で、摂食が人乳であった平均の割合（％）は、授乳期間中の４９％であり；摂食を授乳のみとした者は皆無であった。それら自身の母乳に加えて、本研究の幼児には、異なった量の乳児用ミルク、ジュース、茶、水、固形食および粥が与えられた。２／３の母親は、Ｏ血液型で；ほぼ３／４はルイス陽性分泌者（Ｌｅ  ａ−ｂ＋）および１／４はルイス陰性分泌（Ｌｅ  ａ−ｂ−）であった。２の母親の血清学的分類は、Ｌｅ  ａ＋ｂ−であり、偏性非分泌を示すものとして認識される。しかしながら、これらの２つの母親由来のミルクは、２位結合のフコシル化オリゴ糖を含んでいたので、非分泌者と一貫性がなく、ミルクおよび血液型表現型の間の相違は、血液型を未決定として分類することによって解決した（表１）。
【０１２４】
【表１１】
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【０１２５】
授乳中の下痢結果における月の年齢：期間中央値（範囲）
すべての下痢（２３４症例）：６．９（０．１、２３．４）
中度〜重度の下痢（７７症例）：６．７（０．１、２０．３）
カンピロバクター（３１症例）：９．２（１．６、１５．６）
カリシウイルス（１６症例）：９．１（１．２、１４．４）＊＊
ミルク分析
単一のミルクサンプルは、それぞれの母親ごとに分析し；すべての分析サンプルは、標準的な方法において、分娩後１−５週間（中央値、３週間）採集され、サンプルのばらつきを避けた。この授乳コースに対するこのサンプルの代表性は、１１人のメキシコ人の分泌する母親から時系列データを使って分析した。分娩後３週間目に採集されたミルクサンプルで測定した２位結合のフコシル化オリゴ糖は、３、６、９、および１２月の授乳のそれぞれの母親から採集したミルクでの同じ測定の平均と高い関連性があった（１４４）。
【０１２６】
乳オリゴ糖濃度は、１．０〜３６．１ｍｍｏｌ／Ｌの範囲であった。トータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖濃度は、０．８〜２０．８ｍｍｏｌ／Ｌ（５０〜９２％の乳オリゴ糖）の範囲であった（表２）。最も一般的に普通に存在する特定の２位結合のフコシル化オリゴ糖は、２’−ＦＬ（乳オリゴ糖の３４％）およびＬＮＦ−Ｉ（乳オリゴ糖の２５％）であった。２４人のＬｅ  ａ−ｂ−母親のミルクは、６７人のＬｅ  ａ−ｂ＋の母親（それぞれ、トータルの８０ｖｓ７１％）と比較して、著しく高い（Ｐ＜０．０５）、トータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖の割合であった。ミルク濃度または乳オリゴ糖の割合として分析した２位結合のフコシル化オリゴ糖は、母性社会人口学的要因またはＡＢＯ血液型とは関連性がなかった。ミルク濃度として表される特定のオリゴ糖間の相互関係は、ｒ＝−０．１〜＋０．８の範囲で、乳オリゴ糖の割合として表される特定のオリゴ糖間の相互関係は、−０．５〜＋０．６の範囲であった。
【０１２７】
【表１２】
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【０１２８】
＊  乳オリゴ糖の割合（％）は、本研究で測定された乳オリゴ糖のトータルの量で割ったそれぞれの特定のオリゴ糖量である。
＋  トータルの乳オリゴ糖は、８つのオリゴ糖：４つの２位結合のフコシル化オリゴ糖、２つの非−２位結合のフコシル化オリゴ糖（３−ＦＬおよびＬＮＦＩＩ）およびそれら二つの前駆体を含む。
【０１２９】
下痢との関連性
授乳中、全２３４の下痢症状を特定し（期間中央値、子供ごとに２の下痢症状；範囲、子供ごとに、０−１２の症状）、そのうちの７７（３３％）の下痢症状は、中度〜重度であった。下痢発症率は、授乳中の１００子供−月当たり、２８．８症例であって、中度〜重度の下痢発症率は、授乳中の１００子供−月当たり９．５症例であった。すべての下痢症状中、４０は、Ｃ．ジェジュニ、２５は、カリシウイルス、１０は、腸病原菌の大腸菌、９は、ロタウイルス、５は、赤痢菌、４は、安定な毒素に関連の大腸菌に、関連があった。検出された共感染の下痢症状を除いて、３１の下痢症状は、２２人の子供においてＣ．ジェジュニと関連し、１６の下痢症状は、１３人の子供においてカリシウイルスに関連があった。授乳中のＣ．ジェジュニ下痢率は、逆に、乳オリゴ糖の割合としての２’−ＦＬに関連があり（Ｐ＝０．００７）（表３）、乳オリゴ糖の割合としてのＬＤＦＨ−Ｉ（Ｐ＝０．０４７に）直接的に関連があるが、ＬＤＦＨ−Ｉとの関連性は、回帰モデルにおいて２’−ＦＬの制御後は、継続しなかった。しかしながら、乳オリゴ糖の割合としての２’−ＦＬは、逆に、単変量か多変数モデルかいずれかにおいて、Ｃ．ジェジュニ下痢率との著しい関連性（Ｐ＜０．０５）を保持した。全面的に分析すると、乳オリゴ糖の割合としての低い２’−ＦＬの群は、中間および高い２’ＦＬ群のそれぞれより、授乳中において著しく高い（Ｐ＜０．０１）カンピロバクター下痢率を有した（図６Ａ）。授乳中のカリシウイルスの下痢に対しては、様々な乳オリゴ糖が、保護的な関連性の傾向があるが（表３）、ＬＤＦＨ−Ｉのみは顕著であった（Ｐ＝０．０１２）。乳オリゴ糖の割合としてのＬＤＦＨ−Ｉと、カリシウイルス下痢との逆の関連は、明白な用量依存的関連性を示した（図６Ｂ）。
【０１３０】
【表１３】
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【０１３１】
＊それぞれのモデルは、唯一の独立変数、乳オリゴ糖としての特異的な２位結合のフコシル化オリゴ糖、および独立変数としての病原菌−特定の下痢を含んだ。陰性のβ係数は保護を示す。重大な保護の関連性は、太字である。＋２２の対象は、カンピロバクター下痢の３１症例を有し、１３の対象は、カリシウイルス下痢の１６症例を有した。
【０１３２】
有意な逆相関性（β＝−３．９±１．２（ＳＥ［β］、Ｐ＝０．００１）は、乳オリゴ糖の割合としてのトータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖および授乳中すべての中度〜重度の下痢率の間でポアソン回帰によって見出されたが、すべての下痢には関連性はなかった。連続型変数またはカテゴリ型変数として分析された、ミルク中のトータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖は、中度〜重度の下痢と逆の用量依存的相関性を有した（図６Ｃ）。ミルクの２位結合のフコシル化オリゴ糖および下痢発症の逆相関性は、授乳期間中続いており、授乳中で、年齢において階層化することによって分析した（０−５、６−１２、１３−１８、および１９−２４月）。授乳期間が１ヶ月未満の６つの研究の子供を除外しても、乳オリゴ糖および下痢発症の間で観察された相関性は変わらなかった。
【０１３３】
授乳後期間において、トータルの８９人の子供は、研究は継続され、１８８の下痢症状、６０の中度〜重度の下痢症状、および３６のカンピロバクター下痢症状（カリシウイルス試験は、授乳期間後行われなかった）を経験した。乳オリゴ糖および授乳後の下痢発症の間の関連性は観察されなかった。
【０１３４】
母乳で育つメキシコ人の幼児についての本研究では、我々は、人乳中の特定の２位結合のフコシル化オリゴ糖の低いレベルは、病原菌−特定の幼児下痢、Ｃ．ジェジュニおよびカリシウイルス増加率に著しく関連し、共感染以外では、我々の研究集団において、すべての下痢症状の２０％の割合を占めたことを見出した。乳オリゴ糖の割合としての低い２’−ＦＬレベルは、母乳で育つ幼児中において高いＣ．ジェジュニ下痢率に関連した。同様に、乳オリゴ糖の割合としての低いＬＤＦＨ−Ｉレベルは、より高いカリシウイルス下痢率に用量依存的関連性を有した。我々はまた、乳オリゴ糖の割合としての低いトータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖は、すべての原因の中度〜重度の高い下痢率に用量依存的関連性があることを見出した。分娩後最初の月に測定された乳オリゴ糖および母乳で育つ幼児の下痢の関連性は、授乳を通じて持続するが、最後の授乳の後は持続しない。この観察は、我々の提案した保護メカニズム：病原菌結合を阻害する幼児胃腸管中の乳オリゴ糖の存在と首尾一貫するものであった。我々の研究集団において、すべての母乳は、多少の２位結合のフコシル化オリゴ糖を包含したが、広範囲で発現しており、特定およびトータルの２位結合のオリゴ糖を連続スケールで測定した。母乳で育つ幼児中の乳オリゴ糖および下痢の間の関連性は、乳オリゴ糖の割合に対してのみ見られ、それは、標準的なミルクサンプル採集および実験室方式にも関らず、オリゴ糖の回復におけるばらつきを補正するための分母の重要性を示す。
【０１３５】
本研究で測定された人乳オリゴ糖は、ルイスエピトープ、すなわち、母性ルイスヒスト血液型を制御する同じ遺伝子の生産物である。血液型は、ホスト細胞表面でのオリゴ糖−含有複合糖質の発現を決定する遺伝子的多型性の結果である。組織血液型および細菌およびウイルスの疾患への異なる感染し易さの関連性を先に報告した。Ｇｌａｓｓら、Ｏ血液型個体は、コレラの感染し易さを増大させることを示した（１４５）。Ｐ血液型は、溶血性尿毒症症候群への感染し易さと関連している（１４６）。Ｉｋｅｈａｒａらは、ルイスおよび分泌組織血液型遺伝子型ならびにヘリコバクターピロリへの感染症危険性の関連性を見出した（１４７）。Ｈｕｔｓｏｎその他は、Ｏ血液型個体は、ノーウォーク・ウイルスへの感染し易さを増加させることを報告した（１４８）。インフルエンザウイルス結合性は、ホスト血液型抗原に関して多様であることを示している（１４９）３。さらに、Ｒａｚａらは、分泌する子供は、インフルエンザウイルスＡおよびＢ、ライノウイルス、呼吸器官、合胞体ウイルス、ならびにエコー・ウイルスを原因とする呼吸器官感染症に対する入院危険性を増加させることを報告した（１５０）。
【０１３６】
本研究は、母子一組を調べたという点でユニークである。母乳中での２位結合のフコシル化オリゴ糖の相対量における表現型の多様性は、母乳で育つ幼児へ提供されうる保護を決定する。母親中の体内で乳オリゴ糖を生産するのと同じ遺伝子型が、その幼児における危険性を増加させる細胞表面レセプターを生産することが予期されるので、幼児の感染し易さに対する制御の欠如は、乳オリゴ糖および疾患に対する保護の間の真の関連性が、観察されたもの以上に強くなるよう、我々の結果を偏らせた可能性がある。さらに、我々は、本研究には含まれない特定の主な風土病の病原菌、例えば、ＳＴと結合した大腸菌（１３０、１３４、１３５）はまた、２位結合のフコシル化オリゴ糖によって阻害される一方で、他の病原菌、例えば、ロタウイルスは、分泌およびルイス遺伝子以外の遺伝子の生産物がエンコードしている人乳複合糖質によって阻害される（１２９）ことを見出した。したがって、我々が、記載した関連性は、人乳の先天性免疫反応に対する保護の役割をほんの少しだけ垣間見ることができる。
【０１３７】
本研究に関する明らかになりつつある中身によって、発病の共通機構は、いくつかの細菌およびウイルスの病原菌１７−２０、３３−３５、３７の間で存在しうることが示唆される。我々は、Ｃ．ジェジュニ、細菌、およびカリシウイルスの両方は、２位結合のフコシル化オリゴ糖１７−１９に結合することを見出した。フコシル化オリゴ糖乳汁フラクションは、インビトロでのおよび実験用マウスにおけるコロニー形成で、Ｃ．ジェジュニのヒトの上皮細胞への付着性を阻害し、２’−ＦＬは、Ｃ．ジェジュニが生体外でヒトの腸の粘膜に結合することを阻害する（１３１）。さらに、我々はまた、ヒトのフコシル転移酵素遺伝子をトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞は、Ｃ．ジェジュニと結合し、その結合は２’−ＦＬを含むルイスエピトープによって阻害されることを見出した。我々のカリシウイルスに関する研究は、ノーウォーク・ウイルス−様粒子は、分泌者からの胃−十二指腸接合部の組織切片に結合するが、非分泌者からのものとは結合せず（１３２）、結合は、分泌者からのミルクによって遮断される（１３３）。ノーウォーク・ウイルスをチャレンジしたボランティアは、仮に彼らが分泌者である場合のみ症状として感染する。ＬＤＦＨ−Ｉオリゴ糖（Ｌｅｂオリゴ糖同族体）は、カリシウイルス下痢に対しての保護と関連する我々の発見に一致して、我々の研究データは、Ｌｅｂエピトープおよび他の２位結合のフコシル化オリゴ糖構造物は、一般的なカリシウイルス株によって結合を阻害することを示唆する。
【０１３８】
本研究の潜在的な制限は、考慮すべきである。それぞれの母親から標準的な方法で、集められた単一のミルクサンプルは、授乳中における幼児下痢に関して分析された。しかしながら、我々のデータは、最初の月の２位結合のフコシル化された乳オリゴ糖の発現は、授乳期全体に亘る発現に関し高い相互関係があることを示す。本研究において、我々は、オリゴ糖は、軽度の下痢ではなく、中度〜重度の下痢に対しての保護に関連性があることを見出した。授乳を通じたサンプルサイズおよび多様なサンプル分析が拡大されることに伴い、未来の研究は、乳オリゴ糖が軽度な下痢に対して保護するかを決定することがより可能になるであろう。本研究で母親を含んだことは、極低温貯蔵装置中の十分なミルク体積および採血におけるさらなる参加を要求した。結果として、我々の研究における母親は、通常のコホート中における他の母親より著しく長い授乳および高い教育水準を有したが、これらの要因は、研究下において乳オリゴ糖とは関連しなかった。
【０１３９】
人乳中のオリゴ糖の異種発現は、幼児に特定の抗原に対する様々な程度の保護を提供するということを本発見は示唆し、幼児におけるオリゴ糖エピトープの異種発現が異なる病原体への個々の感染のしやすさの基礎となるという概念と一致する。人乳中で発見された多くのオリゴ糖はユニークであるため、本研究は、授乳の重要性を支持する。要約すれば、本研究から観察される関連性は、人乳オリゴ糖が、下痢に対する臨床的に関連する保護を与えるという初めての臨床証拠を提供し、強力な抗細菌および抗ウイルスの活性を伴う経口剤の基盤を形成するオリゴ糖の潜在性を示唆する。
【０１４０】
２位結合したフコシル化オリゴ糖は、カンピロバクターおよびコレラ細胞への付着性を抑制する。
【０１４１】
ＨＥｐ２細胞中のカンピロバクターの特異的な結合は、Ｈ（Ｏ）血液型エピトープ（Ｆｕｃα１，２Ｇａｌ  １，４ＧｌｃＮＡｃ）を含むフコシル化された炭水化物部分によって阻害される。ニトロ−セルロース膜中で固定されたネオ糖タンパク質としての組織血液型抗原へのカンピロバクターの結合の研究は、モノクローナル抗体の特異的な阻害によって確認するとＨ−２抗原に対して高い親和力を示した。付着性メカニズムに関する研究において、一般的にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とは結合しないＣ．ジェジュニは、該細胞にＨ−２抗原の過剰な発現を引き起こすヒトのα１，２−フコシル転移酵素遺伝子をトランスフェクトした際に、強固に結合した。同様に、Ｖ．コレラは、トランスフェクトされた細胞には付着するが、親細胞には付着しない。この結合は、Ｈ−２リガンド（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  レクチン、ロータス  テトラゴノロブス（ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ）レクチン、およびＨ−２モノクローナル抗体）、Ｈ−２模倣剤、および人乳オリゴ糖によって特異的に阻害された（図７）。侵襲性カンピロバクター２８７−ＩＰは、ＦＵＴ１に結合するが、ＦＵＴ３またはＦＵＴ４−トランスフェクトＣＨＯ細胞には結合しない（図８）。実験モデルにおいて、人乳オリゴ糖は、マウスのインビボおよびヒトの腸の粘膜の生体外でカンピロバクターコロニー形成を阻害した（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０１４２】
カンピロバクター感染症に対する受動的な保護におけるミルクα１，２複合糖質の役割は、授乳中の乳腺、およびそのミルクにおける、最初の組織血液型抗原の発現を誘起するホエープロモーターを伴うヒトのα１，２−フコシル転移酵素遺伝子（ＦＵＴ２）を有する一腹のＢ６−ＳＪＬ遺伝子組み換えの雌のマウス中で評価した。対照として非形質転換の親のマウスが用いられた。乳離れしていないマウスに、Ｃ．ジェジュニの１０４、１０６および１０８ＣＦＵをチャレンジし、母マウスに戻された。腸コロニー形成は、１５日間モニタリングされた。最大９０％の非形質転換の一腹の子は、フォローアップ中コロニーを保持した。形質転換のマウスのコロニー形成は、一時的であり、コロニー形成時間は、直接的に接種材料に関連した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。これらの実験は、強く、カンピロバクター感染症に対する保護におけるミルクのα１，２結合したフコシル化された複合糖質の役割を強く支持し、カンピロバクターに対する主な腸のリガンドは、Ｈ−２組織血液型抗原であることを示唆する。ミルクフコシル化オリゴ糖および特定のフコシル１，２結合した分子は、この結合を阻害する。Ｈ（Ｏ）を発現するｐＷＡＰ  ＦＵＴ１遺伝子組み換え母イヌ由来の乳離れ前の子イヌ中のコレラ感染症の予備実験、乳腺中のＨ（Ｏ）抗原を発現するｐＷＡＰ  ＦＵＴ１が形質転換された母の乳離れ前の子中のコレラ感染症の実験は、カンピロバクターと同様に、非形質転換の対照と比較する際、１０８ＣＦＵの接種材料でコロニー形成において有意な減少および１０１０ＣＦＵの接種材料で死亡における有意な減少を示した。我々のデータは、カンピロバクター感染症に対する保護における１，２−フコシル複合糖質の役割を強く支持し、カンピロバクターに対する主な腸のリガンドは、Ｈ−２組織血液型抗原であることを示唆する。
【０１４３】
参考文献
【０１４４】
【表１４】
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【０１４５】
【表１５】
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【０１４６】
【表１６】
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【０１４７】
【表１７】
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【０１４８】
【表１８】
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【０１４９】
【表１９】
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【０１５０】
【表２０】
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【０１５１】
【表２１】
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【０１５２】
【表２２】
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【０１５３】
【表２３】
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【０１５４】
【表２４】
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【０１５５】
【表２５】
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【０１５６】
【表２６】
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【０１５７】
【表２７】
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【０１５８】
【表２８】
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【０１５９】
【表２９】
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【０１６０】
本発明の多くの実施形態は、詳細に説明されている。しかし、本発明の思想と精神を逸脱することなく、本発明を変更できるというように理解されるであろう。したがって、他の実施形態も下記の請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１Ａ】図１は、人乳オリゴ糖構造物に適用するルイス合成経路を概略的に示す。
【図１Ｂ】図１は、人乳オリゴ糖構造物に適用するルイス合成経路を概略的に示す。
【図２】図２は、特定のオリゴ糖の化学的な合成方法を概略的に示す。
【図３】図３は、インビボで特定のオリゴ糖を合成する部分的なアプローチを概略的に示す。
【図４】図４は、乳オリゴ糖の合成スキームを示す。
【図５】図５は、酵母中でオリゴ糖を生産するに有用なベクターの構築を概略的に示す。
【図６Ａ】図６Ａは、乳オリゴ糖の割合（％）としての、２’−ＦＬの低い、中間の、または高い相対量を含む母乳をもらった子供の研究におけるＣ．ジェジュニ下痢、カリシウイルス下痢およびすべての原因の中度〜重度の下痢の発症率を示すグラフの一連である。棒状は、それぞれの群における原因−特定の下痢の発症率を示し；縦線は、標準誤差を示す。低い、中間、および高い群は、それぞれ、研究集団の三分位数（ｎ＝３１）のオリゴ糖値を表す。２’−ＦＬに関すると、群による乳オリゴ糖値の割合（％）：低い（＜０．２９）、中間（０．２９−０．３６）、および高い（＞０．３７）。低い群と比較すると、中間および高い群でのカンピロバクター発症率は、両方著しく低かった（Ｐ＜０．０１）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、乳オリゴ糖の割合（％）としての、ＬＤＦＨ−Ｉの低い、中間の、または高い相対量を含む母乳をもらった子供の研究におけるＣ．ジェジュニ下痢、カリシウイルス下痢およびすべての原因の中度〜重度の下痢の発症率を示すグラフの一連である。棒状は、それぞれの群における原因−特定の下痢の発症率を示し；縦線は、標準誤差を示す。低い、中間、および高い群は、それぞれ、研究集団の三分位数（ｎ＝３１）のオリゴ糖値を表す。ＬＤＦＨ−Ｉに関すると、群による乳オリゴ糖値の割合：低い（＜０．０７）、中間（０．０７−０．１１）、および高い（＞０．１２）。低い群と比較すると、高い群でのカリシウイルス発症率は、著しく低かった（Ｐ＝０．０２）。
【図６Ｃ】図６Ｃは、乳オリゴ糖の割合（％）としての、トータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖の低い、中間の、または高い相対量を含む母乳をもらった子供の研究におけるＣ．ジェジュニ下痢、カリシウイルス下痢およびすべての原因の中度〜重度の下痢の発症率を示すグラフの一連である。棒状は、それぞれの群における原因−特定の下痢の発症率を示し；縦線は、標準誤差を示す。低い、中間、および高い群は、それぞれ、研究集団の三分位数（ｎ＝３１）のオリゴ糖値を表す。トータルの２位結合のフコシル化オリゴ糖に関し、それぞれの群での乳オリゴ糖値の割合：低い（＜０．７２）、中間（０．７２−０．７７）および高い（＞０．７７）。低い群と比較すると、中間および高い群における中度〜重度の下痢の発症率は、両方著しく低かった（Ｐ＜０．０１）。
【図７】図７は、Ｈ−２リガンドおよびＨ−２模倣薬ならびに人乳オリゴ糖によるＦＵＴ１−ＣＨＯ細胞へのカンピロバクター結合の阻害を示す研究結果を表す図である。
【図８】図８は、細胞凝集は、ＦＵＴ１（１、２Ｆｕｃ）、ＦＵＴ３（１，３／１，４Ｆｕｃ）、およびＦＵＴ４（１，３Ｆｕｃ）遺伝子を運ぶトランスフェクトＣＨＯ細胞上で侵襲性カンピロバクター株によって誘発することを示す研究結果を表す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、細菌の１０４および１０８ＣＦＵによるチャレンジ中にミルクフコシル化オリゴ糖２ｍｇを与えられたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるカンピロバクターコロニー形成の阻害を示す研究結果を示す図のペアである（左）。２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）およびミルクフコシル化オリゴ糖によるカンピロバクターのヒトの腸コロニー形成の阻害の生体外で評価（ＯＳ）。
【図９Ｂ】図９Ｂは、細菌の１０４および１０８ＣＦＵによるチャレンジ中にミルクフコシル化オリゴ糖２ｍｇを与えられたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるカンピロバクターコロニー形成の阻害を示す研究結果を示す図のペアである（左）。２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）およびミルクフコシル化オリゴ糖によるカンピロバクターのヒトの腸コロニー形成の阻害の生体外で評価（ＯＳ）。
【図１０Ａ】図１０Ａは、最初泌乳乳腺に対するＨ抗原の発現を命令するＷＡＰプロモーターを伴うＦＵＴ１遺伝子を有する形質転換マウスにおけるカンピロバクターコロニー形成の研究結果を示す図およびチャートである。形質転換マウスから与えられた子マウスは、カンピロバクターのチャレンジから５〜９日後にコロニー形成がなくなった。非形質転換マウスから与えられた対照の子マウスは、カンピロバクター形成を除去することができない。ＣＦＵ＝コロニー形成ユニット。
【図１０Ｂ】１０Ｂは、最初泌乳乳腺に対するＨ抗原の発現を命令するＷＡＰプロモーターを伴うＦＵＴ１遺伝子を有する形質転換マウスにおけるカンピロバクターコロニー形成の研究結果を示す図およびチャートである。形質転換マウスから与えられた子マウスは、カンピロバクターのチャレンジから５〜９日後にコロニー形成がなくなった。非形質転換マウスから与えられた対照の子マウスは、カンピロバクター形成を除去することができない。ＣＦＵ＝コロニー形成ユニット。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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