(57)【要約】本発明は、治療および／または食品技術に関係する所望の特性を示す植物抽出物および／またはそれより単離された成分に一般に関係する。より具体的には、本発明は、研究試薬分野、とりわけても薬学および／または栄養補助食品の開発、改良され高い価値を持つ食品および飼料製品の製造、穀物からのアルコール製造、ならびに廃棄物処理の分野に広い応用性を有する活性を含む、植物の属：ショウガ属、特にショウガ種（ジンジャーとしても知られる）の根茎からの抽出物およびそこから単離された成分に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質含有食物のための食品添加物としての、少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガ属（Zingiber）の抽出物の使用。
【請求項２】
食物が肉または魚である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
食物が、穀物、マメ、ナッツまたは乳製品を含有する食物である、請求項1記載の使用。
【請求項４】
穀物が、小麦、オートムギ、大麦、ライ麦、モロコシ属、またはトウモロコシである、請求項3記載の使用。
【請求項５】
食物が、ベーカリー製品、朝食用シリアルまたはスナック食品である、請求項4記載の使用。
【請求項６】
抽出物が穀物からのアルコール製造にとって有用である、請求項4または5記載の使用。
【請求項７】
ベーカリー製品が、パン、ケーキ、マフィン、クランペット、イングリッシュマフィン、ピザ生地およびバンを含むリストより選択される、請求項5記載の使用。
【請求項８】
食物が動物用食品である、請求項1〜4いずれか一項記載の使用。
【請求項９】
抽出物がショウガ（Zingiber officinale）由来のものである、請求項1〜8いずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
酵素が根茎から抽出される、請求項1〜9いずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
抽出物がジンジベイン（Zingibain）を含む、請求項9または10記載の使用。
【請求項１２】
食物の栄養価が高められ、かつ／または食物の吸収が高められる、請求項1〜11いずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
食品またはその成分材料を、少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガ属抽出物で処理する工程。
【請求項１４】
食物または成分が、肉、穀物、マメ、ナッツまたは乳製品である、請求項12記載の工程。
【請求項１５】
食物がベーカリー製品である、請求項13記載の工程。
【請求項１６】
成分が小麦である、請求項13記載の工程。
【請求項１７】
少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガ属の抽出物で処理するかまたはそれを含む、食物または食物成分。
【請求項１８】
食物が肉である、請求項17記載の食物。
【請求項１９】
肉が、対応する未処理の肉に比べて、低い脂肪含有量、より軟らかく、かつ／もしくは多汁質な舌ざわりを有し、かつ／またはより高い水分含有量を有する、請求項18記載の食物。
【請求項２０】
水分含有率が約1%〜約5%の量に高められている、請求項19記載の食物。
【請求項２１】
脂肪含有量が、約1%〜約5%の量に下げられている、請求項19記載の食物。
【請求項２３】
食物が穀物含有食物またはスナック食品である、請求項19記載の食品。
【請求項２４】
食物がパスタである、請求項19記載の食物。
【請求項２５】
穀物含有食物がベーカリー製品である、請求項24記載の食物。
【請求項２６】
ベーカリー製品が、パン、ケーキ、マフィン、クランペット、イングリッシュマフィン、ピザ生地およびバンを含む群より選択される、請求項24記載の食品。
【請求項２５】
ベーカリー製品がパンであり、ここでパンが向上した舌ざわり、および／またはクラストを有している、請求項23記載の食物。
【請求項２７】
食物が動物用食品である、請求項17記載の食物。
【請求項２８】
食品が、対応する未処理の食物と比べて、適切な母集団に対し減少したアレルゲン性を有する、請求項22〜27いずれか一項記載の食物。
【請求項２９】
食物または成分が、そのように処理されていない食物または成分に比べて、増大した品質保持期間を有する、請求項17〜28いずれか一項記載の食物。
【請求項３０】
食物が、そのように処理されていない食物に比べて、増大した栄養価かつ／または増大した吸収性を有する、請求項16〜27いずれか一項記載の食物。
【請求項３１】
少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガの抽出物を含む、薬学的および／または健康補助調合物。
【請求項３２】
一種または複数種の賦形剤を含む、請求項31記載の調合物。
【請求項３３】
ジンジベインをインビボで合成することができる細菌および／または酵母を一種または複数種含む、ヒトによる消費に適したプロバイオティック調合物。
【請求項３４】
処置での使用のための少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含む、ショウガ抽出物。
【請求項３５】
少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガ抽出物またはそれを含む組成物の、炎症性疾患の処置のための薬物製造における使用。
【請求項３６】
炎症性疾患が、セリアック病のようなグルテン不耐性、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、および／またはクローン病である、請求項35記載の使用。
【請求項３７】
少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガ属抽出物の治療有効量をヒトに投与する段階を含む、処置方法。
【請求項３８】
炎症性疾患処置のための、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
炎症性疾患がセリアック病のようなグルテン不耐性、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、または病原因子による感染症である、請求項35記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、治療および／または食品技術に関して望ましい特性を示す植物抽出物および／またはそれより単離された成分に一般に関係する。より具体的には、本発明は、研究用試薬、とりわけ薬物および／または栄養補助食品開発、改良された高い価値を持つ食品および飼料製品の製造、穀類からのアルコール製造および廃棄物処理の分野において広い応用性を有する活性を含む、植物のショウガ属（Zingiber）、特にはショウガ種（Zingiber officinale）（ジンジャー（ginger）としても知られる）の根茎からの抽出物およびそれより単離された成分に関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
本明細書の中に著者別に参照している刊行物の詳細な書誌は、明細書の最後にまとめた。
【０００３】
本明細書中の先行技術の参照は、この先行技術がいずれの国においても共通の一般的知識の一部を形作っていることの確認または任意の形の示唆でもなく、そしてそう考えてはならない。
【０００４】
単子葉および双子葉植物の組織からの抽出物は、西洋医学およびシャーマニズムや漢方医学で使用されるような伝統的アプローチの双方を含む医学；建造物の建築；自動車産業ならびにバイオテクノロジーにおいて、有用な極めて多数の化合物および化合物の混合物を提供している。
【０００５】
単子葉および双子葉植物の組織からの特別な抽出物は、例えば食品加工および食品技術の分野において極めて有用である。これら分野では、植物組織から作られた抽出物は、食物を処理して嗜好性を上げるスパイス、着色剤、保存剤、そして食物および化合物に風味を付ける香辛料を含む極めて多様な食品用添加物および処理剤を提供する。
【０００６】
これに加えて、食物調製品の品質を向上するのに有効であり、またはいわゆる「機能性食品」を製造するために、食物とは別に、または食品に追加して用いることができる作用物質を見つけ出すことへの関心が高まりつつある。機能性食品は、健康維持および／または健康の悪化を防止することに関係した識別可能な資質を有している。既存食物の資質のなかで改善が加えられたものとしては、例えば既存食品と同等であるが、「無脂質」、「減塩」または「無アレルゲン」である製品がある。このようなコンセプトは、ヒトが食するための食品だけでなく、多くの動物産業向けの飼料にも同じように当てはまる。さらにまた、植物抽出物は、例えばタンパク質回収段階を必要とする産業応用分野、ならびに廃棄物処理のような分野においても役立っている。
【０００７】
ショウガ植物、ショウガの根茎は、食物調製物のスパイスとして、また様々な疾患状態に対する非特異的な「ハーブ治療」として、時に蜂蜜と組み合わせて用いられている。しかしながらその効果、またはその基礎をなす活性は、筋の通った治療目的にとって十分な程度、信頼できる再現性のある結果をもたらす形では説明または定量化されていない。さらにまた、このような推測を評定しようと計画された研究でも、矛盾のない、再現性のある試験データが得られないという最も重大な問題に悩まされてきた。
【０００８】
関心対象の疾患状態の一つはセリアック病（小児脂肪便症（Coeliac病）およびセリアックスプルー（Celiac Sprue）とも呼ばれる）である。この病気では、コムギを消化する能力が低下し、グルテンが小腸粘膜と呼ばれる小腸下層に有毒な作用を直接に及ぼすことが多々ある。症状としては、下痢、発育不全、短身、象牙質の変色、抑うつ、神経系の未熟変性、発作、関節炎、吸収不全による栄養不良、および腹部膨満が挙げられる。
【０００９】
驚くべきことに、本発明者らは、様々なショウガの根茎抽出物および／またはその成分について、セリアック病の処置での使用を含む多くの有用かつ様々な応用性を明らかにした。本発明によって、ショウガの根茎の各種抽出物および成分の可変性および一貫性を欠くことに伴った困難は克服された。これにより、ショウガの根茎およびその抽出物ならびにその成分の定量化および特徴付けが可能となった。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列番号（SEQ ID NO:）を用いて参照する。配列番号：は配列識別子<400>1（配列番号：1）、<400>2（配列番号：2）等と数値的に対応している。配列識別子は表1にまとめてある。配列一覧表を本明細書の最後に備えた。
【００１１】
本発明は、植物ショウガ科（Zingiberaceae）のメンバーに由来する抽出物、およびその成分を提供する。この科のメンバーとしては、例えばミョウガ（Zingiber mioga）、ショウガ、ジンジベール・カッスムナール（Zingiber cassumunar）およびハナショウガ（Zingiber zerumbet）が挙げられる。本明細書で「ショウガ属抽出物」と言う場合、上記の種の全てからの抽出物を包含する。好ましい種は、ジンジャーとしても知られるショウガである。植物（ショウガ）の根茎から得た抽出物および成分は、動物およびヒトの飼料／食物および健康維持向けの加工補助品および添加物から疾患予防および治療に至るまで、極めて広範囲の関連分野に有益に応用することができる。疾患状態の一つの具体例は、ウイルス、細菌または真核生物（例えば真菌、酵母、下等真核生物）による感染症である。さらに、例えば、細胞および分子生物学での応用を含む生命科学における実験室応用、穀物からのアルコール（例えばエタノール）製造および廃棄物処理といった産業応用等、様々な分野も熟慮し、評価を行い、本発明の抽出物および成分の応用から便益を受けることが見出されている。
【００１２】
本発明はまた、ジンジャー絞り汁や乾燥ジンジャーのようなショウガ属抽出物、およびジンジベイン（Zingibain）のようなショウガ属の成分も提供する。本発明の植物抽出物および成分に特有の応用は、とりわけ食物および飼料の加工；特定食物不耐性原因物質を中和するようなアレルゲン不活性化；血液凝固防止および／または分解；創傷治癒、および癌、アレルギーや不耐性反応を含む炎症性疾患、ならびにウイルス感染の防止まで含む様々な疾患状態の予防および／または治療を包含する。
【００１３】
特に驚くべき態様では、抽出物はセリアック病（小児脂肪便症およびセリアックスプルーとも呼ばれる）およびその他形態のグルテン不耐性の治療および／または予防に有用である。
【００１４】
この有益な活性は、ジンジャー（ショウガ属）の根茎を細断して抽出（「破砕する」）することによって得た一つまたは複数の分画に見出される。得られた破砕体を乾燥させて、活性な粉末形態を生成してもよく、または濾過し、そこから本明細書で「ジンジベイン」と呼ぶ成分を含む「単離物」を生成することができる破砕濾液を産生してもよい。前記のいずれの場合−絞り汁、乾燥粉末、破砕濾液または単離物−においても、本明細書に記載される好ましい活性成分はジンジベインである。ジンジベイン活性は、安定且つ信頼して使用することができ、極めて特異的な様式で特定の目的物を加水分解することができる。より具体的には、ジンジベインは、標的がプロリン残基を有意なパーゼンテージ含むタンパク質分子を含む任意の場合に有効である。プロリン残基は、前に親水性アミノ酸が在るか、または後に続いていることが好ましい。適したアミノ酸としては、例えばグルタミン、アルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられる。本明細書で言うところの「ジンジベイン活性」とは、「ジンジベイン活性群」と読むこともできる。
【００１５】
上記したように、その中に抽出物またはその分子成分を含む好ましい活性化合物は、本明細書では「ジンジベイン」と呼び、そしてそれは広範囲の関連分野で応用される。
【００１６】
本発明のジンジベイン活性が利用される応用分野の一つは、ヒトおよび動物のそれぞれ食物および飼料の調製に関与する産業である。このような食物としては、朝食用シリアル、スナックおよび機能食品が挙げられる。ジンジベインは食材料の品質特性の改良に用いることができる。他の応用分野は、ヒトおよび伴侶動物や家畜を含む動物の健康維持のための手段、ならびにヒトを含む動物の疾患／障害の予防および治療にまで及び、これを包含する。さらなる応用としては、細胞および分子生物学でのツールとしての分子成分の使用、ならびに穀類からのアルコール（例えばエタノール）の製造および廃棄生成物の処理といった産業利用が挙げられる。
【００１７】
特に、好ましい食材料は、ヒトを含む動物のための飼料および／または食物を構成するものである。得られた生成物は、例えば、未処理の同等物に比べてより軟らかく、より味の良い、アレルギー性が低いか、または不耐性反応を起こしにくいことを特徴とする。食品および飼料製品またはその成分は、本発明の抽出物および／または分子成分によって事前処理することによって、それらに付与された、改良された品質特性を有するだろう。
【００１８】
一つの態様では、肉製品の軟らかさ、および特にヒトの消費を目的とする製造肉および調製肉製品の水結合能力を高めることによるジューシーな肉汁およびより高い密度は、本発明の抽出物および／または分子成分を用いた前処理によって増す。こうすることによって、肉のプロリン含有主要タンパク質であるコラーゲンは分解され、柔らかさを増しながらも形を保持することができる。本発明の抽出物および分子成分の更なる応用は、それらが存在することが望ましくない組織でのコラーゲン繊維の分解、例えば標的組織のコラーゲンを取り除くか、または減じることをもくろむ美容処置法へのそれらの使用に関する。
【００１９】
本発明の植物抽出物はさらに、例えば火傷、虫さされ、擦過傷、癌、乾癬およびその他炎症性疾患のような皮膚の疾患状態、およびウイルス、細菌、真菌、酵母もしくは下等真核生物による感染の治療、および幾つかの例では予防のための薬物として、または薬物の製造に有用である。
【００２０】
前記のタイプの皮膚疾患は、その処置に有用な薬物の局所適用を必要とする、表面の傷害と異常を含む。しかしながら本発明は、全身投与向けの薬物として、例えば粉末、液体、シロップ、錠剤およびカプセルに製剤化することもできる薬剤を提供する。従って、その抽出物および／または分子成分はまた、アテローム性動脈硬化、腫瘍、グルテン不耐性などの特にセリアック病のような食物不耐性を含む炎症性疾患、プリオンが原因の疾患、痴呆形成、血液疾患等、病原性生物およびウイルスによる感染症まで広範囲の疾患の治療、および幾つかの例では予防にも応用できる。
【００２１】
関連する態様では、本発明の抽出物および／または分子成分は、上記の全身性および／または皮膚疾患を含む、疾患状態の範囲の予防および／または治療方法に応用できる。
【００２２】
本発明の抽出物および成分は、指向的、特に親水性アミノ酸残基が前にあるか、または後に続き、立体構造的に露出したプロリン残基に近接する標的に向けてタンパク質分解活性を発揮する。それゆえにジンジベインは、このような標的を、確実に加水分解するのに用いることができる。従って上記の応用に加えて、この特性によりジンジベインは、研究開発実験室などの堅実な分析用ツールを必要とする状況において、例えば細胞および分子生物学的アプローチを生物学的な問題の研究に応用するのに特に有用である。このような研究アプローチは、とりわけ組織培養容器からの細胞材料の再現性のある完全な除去；収集のための組織の単細胞への分離；確実な標的特異的タンパク質分解等を必要とするだろう。
【００２３】
さらに、確実な標的特異的タンパク質分解は、ジンジベインの特別な性質の一つであり、この性質は、穀類中のグルテンおよび関連タンパク質を加水分解して加水分解効率を向上させること、デンプンの発酵によりエタノールを製造すること、ならびに植物および／もしくは動物を起源とする不要なタンパク性物質を含む廃棄物を処理し、廃棄物を完全に分離することが望まれるような、産業応用にも求められているものでもある。
【００２４】
ジンジベインの別の有用な性質は、穀類から作られたベーカリー製品および食物内に含まれるグルテンおよびグルテン関連タンパク質に作用することである。ジンジベインをタンパク質および／またはペプチドに作用してそれらを切断することにより、グルテン不耐性なヒトにアレルギー反応を誘発するペプチドを、そのようなヒトでも有害反応なしに消化できるようにすることが提案されている。
【００２５】
本明細書を通して、特に文脈が必要としない限り、語「含む」または、「（単数）含む」もしくは「含んでいる」のようなその変形は、記載の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を包含するものであるが、他の要素もしくは正数、または要素もしくは整数の群を排除するものではないことが理解されるだろう。
【００２６】
（表１）配列識別子一覧
2007522822.tif 000002
【００２７】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、植物ショウガ科のメンバーが抽出可能な分画を含み、この分画またはその成分が様々な応用において有用な性質を示すという観察に一部基づき予測されている。好ましい種は、ショウガであり、これはジンジャーとしても知られている。しかしながら植物ショウガ科の他のメンバーを除外するものではなく、これらも本発明の範囲内に入る。他のショウガ属の例としては、ミョウガ、ジンジベール・カッスムナールおよびハナショウガが挙げられる。以下「ジンジャー植物」と呼ぶ場合、ショウガ以外のショウガ属の種を除外するものではない。
【００２８】
好ましくは、ショウガ属の種はショウガである。
【００２９】
本発明は、ジンジャーの根茎の抽出物および各種成分からの活性成分の利益の上がる量を好都合に調製することを可能にする。これにより、従来不可能であった濃度、および／または最終生成物にジンジャーの風味を付けることなく、活性要素を用いることができる。最後のポイントは、いくつかの状況においては、望ましくないショウガの強烈かつ特有の風味を考えた時に特に意義がある。
【００３０】
さらにまた、それはセリアック患者向けの、穀物、特にグルテン含有食物を初めて可能にし、ここで、食物は、本発明の抽出物を用いた処理を受けなかった同じ食物に比べて、実質的同等またはそれ以上の風味を持つ。本発明以前は、グルテン不耐性、特にセリアック病に対する主たる対策は、単純にグルテン含有食物を食べないことであった。さらにまた、無グルテン食物の選択肢も限定されている。
【００３１】
かくして本発明は、グルテン不耐性なヒト、例えばセリアック病のヒトの食用に適した伝統的なグルテン含有食の調製を可能にする。
【００３２】
本発明はさらに機能食品およびスナック食品を含む領域の動物およびヒト用食物の製造および／または加工を可能にする。
【００３３】
本発明は、ショウガのようなショウガ属からの特定抽出物および成分に関する幅広い、有用な応用を明らかにし、それを説明する。抽出物およびその成分は、とりわけ、親水性アミノ酸残基が前にある、および／または後に続く、立体構造的に露出しているプロリン残基を含むタンパク質分子に極めて特異的に作用できる加水分解活性を備えていることが見いだされている。
【００３４】
「ショウガ（Z. officinale）」または「ショウガ」または「ジンジャー植物（ginger plant）」と書かれている場合、類似の性質を有するショウガ科の別の種または属も含むと解釈するものとする。
【００３５】
「分子成分」は、ショウガなどのショウガ属の根茎の抽出物に含まれ、またれから単離できるものであり、タンパク質を分解する機能を持つ酵素である。これらの酵素は一般的にはタンパク質分解酵素またはプロテアーゼと呼ばれ、またそれらはタンパク質を作り上げているアミノ酸配列内のペプチド結合を加水分解することによって機能する。当業者に周知であるように、プロテアーゼは自然界に普遍的に存在し、また数多く在り、その構造および特に好ましい基質は様々である。それゆえにそれらは、それらの通常の標的に基づいて、類似した種類にグループ分けされるのが一般的である。
【００３６】
プロテアーゼの一つのグループは当技術分野において「システインプロテアーゼ」と呼ばれるものであり、このグループではシステイン残基のチオール基がペプチド結合への攻撃と加水分解に関係する求核基である。タンパク質分解酵素の「システインプロテアーゼ」グループの代表的なメンバーとしては、例えば、パパイン、ブロメリンおよびアナナイン、フィシンならびにアクチニジンが挙げられる。これら分子はパパイヤ（Carica papaya）、パイナップル（Ananas comosus）、イチジクおよびキウイ（Actinidin chinensis）からそれぞれ単離できる。ジンジベインは、「システインプロテアーゼ」として知られる酵素グループに属する。より具体的には、ジンジベインは、プロリン特異的システインプロテアーゼである。従ってジンジベインは、標的がプロリン残基を有意なパーセンテージ含んでいるタンパク質分子を標的とする任意の場合に有効である。
【００３７】
本発明の文脈において、「有意なパーセンテージ」とは、約5%を超えるプロリン量と解するものとし、これはタンパク質中の通常含有量より高く、これにより加水分解が成功するための、露出した部位で親水性アミノ酸残基がプロリンに先行または後続する確率が高くなる。
【００３８】
好ましくは、プロリンのパーセンテージは約60％未満、より好ましくは約50%未満、いっそう好ましくは約40%未満、よりさらに好ましくは約30%未満であり、最も好ましくは約20%未満である。コラーゲンは30%を超えるプロリンまたはヒドロキシプロリンを有するために、最後の句を加える必要がある??）従って、本明細書で「プロリン含有タンパク質」と言う場合は、上記に定義した有意なパーセンテージのプロリン残基を含むタンパク質分子を表すものと理解するものとする。
【００３９】
従って、本発明の一つの局面は、タンパク質断片（ペプチド）を包含するプロリン含有タンパク質を加水分解できる、抽出物またはその分子成分の製造することへの、ショウガ属の種の根茎、好ましくはショウガの根茎の使用を目的とする。
【００４０】
従って本発明の別の局面は、改良された品質特性を示す食材の製造を目的とした、プロリン質含有タンパク質およびその断片を加水分解できる抽出物またはその分子成分の製造においてショウガ属、例えばショウガの根茎の使用を目的とする。
【００４１】
本発明の有用な活性を提供する分子成分は、ショウガなどのショウガ属の根茎を細断または粉砕して得た分画に見いだされる。
【００４２】
細断されたジンジャーの根茎の加工からは多様な調製物が得られる。細断した組織を乾燥させると、調理愛好家に公知である香辛料のジンジャーを作ることができる。または、細断した根茎を抽出して、本発明の所望の活性分子成分を含む溶液である「ジンジャー絞り汁」を作ることができる。
【００４３】
このジンジャー絞り汁を乾燥させて活性粉末をつくることができ、あるいは濾過して、本明細書でジンジャー植物抽出物の分子成分の一つとされているジンジベインを単離することができる破砕濾液を作ることができる。上記いずれの調製物−乾燥粉末、絞り汁またはその濾液もしくは単離物−においても、好ましい活性はジンジベイン抽出物に拠る。本明細書で言う「分子成分」は、ジンジベインの性質を有する成分または抽出物を包含する。
【００４４】
「ジンジベイン」は、本明細書で用いる場合、ジンジャーの根茎から単離でき、少なくとも一つ、または二つ、または三つの近い関係にある、例えばDEAEセルロースクロマトグラフィーによって分離することができる、酵素分画のタンパク質分解活性を含むタンパク質分画を指す。分画の一つは、GP-IIプロテアーゼを含む。「GP-I」と呼ばれる別の分画は、二つの極めて相同性の高いプロテアーゼを含む。三つのタンパク質分解酵素は全て、本明細書に記載の乾燥粉末、絞り汁またはその濾液もしくは単離物に含まれている。したがって、「分子成分」と称する場合、三つの酵素のいずれか一つ、または全てを指す。同様に、本明細書を通して、「ジンジベイン」と言うときは、三種類のプロテアーゼ酵素活性の全てを含む未分離のプロテアーゼ分画か、または該プロテアーゼ活性のいずれか一つまたは複数を表すと理解するものとする。
【００４５】
本発明をある一つの理論または作用様態に制限することを意図せずに、ジンジベインはN末端から読んだとき、アミノ酸配列中のプロリンに続くアミノ酸残基とその後の次のアミノ酸残基との間のペプチド結合を加水分解することによって、そのタンパク質標的を分解すると考えられる。
【００４６】
加水分解を最適に行うには、親水性アミノ酸がプロリン残基に先行および／または後続することが好ましい。好適親水性アミノ酸残基としては、例えばグルタミン、アルギニン、リジン、アスパラギン、グルタミン酸およびアスパラギン酸が挙げられる。
【００４７】
用語「加水分解する」は、タンパク質分解酵素のペプチド結合に対する作用について用いられる場合、作用を受けたペプチド結合が壊されるかまたは破壊されることを意味し、加水分解を受けたタンパク質の配列は、それによって鎖の中のその点で切断または開裂する。攻撃を受けたタンパク質は加水分解によって、結合の加水分解の受ける程度、および実際に起こる加水分解の程度に応じて、二または多くのペプチド片に切断される。それゆえに、加水分解はタンパク質材料を破壊し、それを小さく開裂されたタンパク質の部分またはペプチドに、ならびに／あるいはより極端な形態でそのアミノ酸構成成分に変換および／または分解する。破壊、分解、変換、開裂および／または加水分解されたタンパク質材料は、もはやその本来持つ機能を示さない。
【００４８】
プロリンに隣接するタンパク質を加水分解するというジンジベインの特異性は、タンパク質を小ペプチド片または個々のアミノ酸まで分解するというより、むしろタンパク質の分割をもたらす。しかしながら、ジンジベインの基質が、例えばトリプシンおよび／または肝トリプシンを含む胃内に存在する酵素のような他のタンパク質分解酵素の消化／加水分解の生成物であるペプチドの場合、続いて生成物をジンジベインで加水分解すると個々のアミノ酸および／またはジペプチドもしくはトリペプチドに分解されることがある。
【００４９】
本発明によれば、ショウガの根茎を処理してプロリン特異的システインプロテアーゼ、ジンジベインを含む抽出物を生成することができ、これはプロリン残基に近接する、または「続く」部位の加水分解を介してタンパク質を破壊および／または分解できる。
【００５０】
従って本発明の別の局面では、抽出物の製造におけるショウガのようなショウガ属の根茎の使用を熟考しており、該抽出物は改良された品質特性を示す食材の製造のためのプロリン特異的システインプロテアーゼ、ジンジベインを含む。
【００５１】
関連する態様では、本発明は、改良された品質特性を示す食材の製造におけるショウガのようなショウガ属の根茎抽出物の使用を熟考しており、該抽出物はプロリン特異的システインプロテアーゼ、ジンジベインのような分子成分を含む。
【００５２】
抽出物は食物中、例えばパンのようなベーカリー製品中に、0.01〜10重量％の範囲で加えることができる。好ましくは、それは約0.03〜5%の範囲で加えられる。
【００５３】
本明細書で用いる用語「抽出物」は、ショウガのようなショウガ属の根茎に由来する調製物であって、その中にジンジベインが存在し、また本発明に従って用いることができる任意の調製物にまで及び、これを包含する。それゆえに「抽出物」は、上記のように乾燥した、粉末、ジンジャー粉砕物、粉砕物濾液および単離物ならびにその他任意の好適調合物にまで及ぶ。用語「抽出物」および「ジンジベイン」は、本明細書では互換的に用いられる。
【００５４】
本発明による使用は、その供給源を問わず、例えばそれが、組換え、合成および／またはプロバイオティックにインサイツで調製されたものであるかに関わらず、ジンジバインに実質に同一であるタンパク質の使用も含む。本明細書の文書では実質的に同一とは、アミノ酸レベルにおいて、配列番号1または2と少なくとも95%同一であることを意味する。好ましくは実質的に同一であることは、98%同一であり、より好ましくは99%同一である。
【００５５】
本発明の方法および応用によれば、ジンジャー抽出物は改良された品質特性を示す食材の製造に有利に応用できる。「食材」は、ヒトを含む動物によって栄養源として消費される任意の製品の調製に用いられる、動物および／または植物由来の物質を含み、また包含する。食材は、加工飼料および／または食物の調製に使用される成分まで含み、そうして調製された加工飼料および／または食物も包含する。用語「飼料」は、一般にはヒト以外の動物が消費する製品を指す；これに対して、用語「食物」は一般にヒトによって消費される製品を指す。この意味において、「動物」はネコ、イヌおよびウマのような伴侶動物、ならびにとりわけブタ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、水生動物、およびウシのような産業動物の両方を含む。
【００５６】
一般的な食材としては、例えば穀類やマメのような穀粒、肉ならびに加工肉製品が含まれる。栄養源として消費されるその他の任意の飼料および／または食物も、本発明のこの局面の範囲内である。
【００５７】
従って、本発明は食材内に含まれるプロリンに富むタンパク質の加水分解のために供され、その結果材料の加工、ならびに一又は複数のその品質特性を改良する。
【００５８】
「品質特性」とは、一般的には栄養価や消化値といったより定量的な性質と、味覚値といったより定性的な性質の両方に関係する。定量化可能な、栄養価および／または消化値と関係する性質としては、とりわけ総脂質含有量、脂肪分布の程度、アレルゲン原因成分または食物不耐性エピトープの存在、プリオンの含有および保存期間等が挙げられる。味覚値に関係する定性的な性質としては、とりわけ多汁性、軟らかさ、舌ざわりおよび色が挙げられる。
【００５９】
パンのようなベーカリー製品は、本抽出物を使用すると、舌ざわりが向上し、口当たりが良く、水分含有量が4%まで増加し（望ましいとされる割合）、均一性が向上し、そしてクラストが改善されるだろう。それゆえに一つの局面では、主題発明は、本明細書に記載のジンジャー抽出物を含むベーカリー製品を提供する。
【００６０】
さらなる局面では、本発明は次の段階を含むパン製品などのベーカリー製品を調製するための方法を提供する：
a）少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含む、本発明のショウガ属の抽出物を含む添加物と、ベーカリー製品のその他の成分とを混合し、練り生地または混合物または生地を形作る段階；
b）必要に応じて、練り生地または混合物または生地を寝かせる段階；および
c）必要に応じて練り生地を細分し、練り生地または混合物または生地を成形し、焼いてベーカリー製品を形作る段階。
【００６１】
行程は少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガ属の抽出物を含み、および食物の調製に使用される酵素、例えばキシラナーゼ、アミログルコシダーゼ、リパーゼおよびマルトース生成アミラーゼからなる群より選択される酵素を一つまたは複数含有してもよい添加物を調製する追加段階を包含してもよい。
【００６２】
主題発明は特に、次のものを含むベーカリー製品のための添加物を提供する：
i）少なくとも一種類のシステインプロテアーゼを含むショウガ属の抽出物；
ii）0〜10%のキシラナーゼ；
iii）0〜10%のアミログルコシダーゼ；
iv）0〜10%リパーゼ；および
v）0〜10%の、Novamyl（登録商標）のようなマルトース生成アミラーゼ、
ここで、上記のパーセンテージは添加物の総重量に対する重量比％であり、そしてii）〜v）はいずれも同時に0%にならないものとする。
【００６３】
添加物は、抽出物とその他任意成分とを組み合わせ、次にそれを通常の混合行程にかけて調製される。ひとたび調合された添加物は、例えば練り生地を作る前のパン製品に使用される成分の中に組み入れることができる。添加物の成分は、使用目的に応じて変えることができる。実際の成分および量は、添加物がベーカリー製品の種類に付与しようとする特性に拠って選択される。長い発酵時間から発酵時間のない練り生地について、添加物は酵素のレベルを変えて、練り生地の脹らみの程度を制御する。薄力粉用の添加物は、強力粉用の添加物とは、同じパンの品質を得るにも使用する乳化剤および酵素のタイプおよび／またはレベルが異なる。例えば、バゲットおよび食パンは使用する小麦粉に対し0.5〜1.5重量%、全粒パンは2〜5重量%、マルチシリアルパンは3〜7重量%、そしてパネットーネは2〜4重量%が必要であろう。
【００６４】
本発明の一つの態様では、例えば市販のパン生地3Kgはジンジャー絞り汁を1から120mL含むことができる。
【００６５】
本発明の添加物のさらなる利点は、練り生地、混合物または生地の混合時間を、抽出物を含まない調合物に比べ短縮できることである。
【００６６】
本発明の抽出物および／または分子成分を応用することで改善できるさらなる性質としては、脂肪の分布と含有量；アレルゲン性；食物不耐性、プリオン含有；および飼料転換が挙げられる。
【００６７】
アレルゲン性および食物不耐性は、例えば穀物（とりわけ小麦、オートムギ、大麦、ライ麦、モロコシ属、トウモロコシ）の様な穀粒、マメ（とりわけヒヨコマメ、ダイズ、レンズマメ、ピーナッツ）、プロリンに富むタンパク質のような乳製品中に、消化によりアレルギーまたは不耐性の抗原反応を誘発する特定のタンパク質が存在することと一般には関係している。例を挙げると、穀粒は、内胚乳に局在する、グルテリンとして知られるプロリンの富む貯蔵タンパク質を含んでいる。
【００６８】
例えば小麦は、グルテニンと呼ばれるプロリンに富むグルテリンを含む。グルテリンは内乳胚の中に局在している貯蔵タンパク質である。それらはアスパラギン、グルタミン、アルギニンおよびプロリンに富み、リジン、トリプトファンおよびメチオニンの含有量は低い（Abrol et al., Aust. J. Agric. Res. 22: 197-202, 1971; Derbyshire et al., D. Phytochemistry 15: 3-24; 1976; 上記; Kirkman et al., J. Sci. Food Agric. 33: 115-127; 1982; Larkins, B.A. "Seed storage proteins: characterization and biosynthesis" in "The Biochemistry of Plants" Stumpf, P.K.; Conn, E. E. (eds) Academic Press NY, Vol 6, pp449-489)。小麦のグルテニンは分子量が100万を超える巨大高分子である。ジスルフィド結合が還元されると、分子量80〜160kDaの高分子サブユニットとα-グリアジンに似た低分子量サブユニットの二つの断片が単離される。グリアジンは穀物およびその他牧草の種子に固有の分子群に属する別の内乳貯蔵タンパク質であり、グルテニンと一緒になって、不耐性反応に対して遺伝性素因をもつヒトを含む動物において「グルテン」不耐性および関係する自己免疫疾患を引き起こすことが知られているプロラミンとして知られている。コムギα-グリアジンは5つのドメインを有しており、そのうちの第一のドメインは非反復性のN-末端配列に加えグルタミン、プロリンおよび芳香族アミノ酸に富んだ反復配列を含んでいる。
【００６９】
グルテニンおよびグリアジンについて判明している「グルテン」不耐性に関係するエピトープは全て、そのエピトープ配列の中に、親水性アミノ酸残基に近接してプロリンを少なくとも一つ含んでいる（Vader et al., Gastroenterology 122: 1729-1737; 2002）。ジンジベインのようなショウガ属の抽出物による加水分解は、これらの配列を分解し、同時に未変性タンパク質の「グルテン」不耐性作用を取り除く。小麦粉のような穀粉は、これにより本発明の抽出物を用いた「グルテンセイフ」にすることができる。この応用に関係する穀粉としては、アミロース含有量の低いモチ穀粉が挙げられる。
【００７０】
これらのタンパク質は、本発明の抽出物による加水分解の候補であり、ジンジベインのようなショウガ属の抽出物による攻撃に適したプロリン部位に富んでいる。ジンジベインのようなショウガ属の抽出物によるこれらタンパク質の加水分解は、グルテンに対する既在の敏感性を持つ患者でのアレルギー反応や不耐性反応を防止することが見いだされている。あらゆる種類の酵母練り生地のパン、特に：スクエア、ハイポップ、長時間発酵、ブレッドロール、バゲット、ハンバーガー用のパン、グレインブレッド、フラットブレッドを含むパン、および加工前に発酵を必要としないいわゆるノータイム（no time）生地；ケーキ；マフィンおよびイングリッシュマフィン；クランペット；ピザ生地；焼き菓子およびスポンジならびにその調製に使用する生地、とりわけヒトが消費するか、またはとりわけ動物が消費するために小粒化された動物用の飼料を包含する焼き製品のような製品を加工する間にショウガ抽出物または単離物を加えることによって、問題のヒトまたは動物に存在するか、または予想されるアレルギーまたは不耐性反応を回避できる（実施例4、5および6を参照）。
【００７１】
かくして発明の別の局面では、本発明の該酵素／抽出物を含む食物、例えばパン、ケーキ、パスタ、ピザ生地、ヌードル、朝食用シリアル等のグルテン含有食物、またはそれらを含む組成物を提供する。
【００７２】
このように発明の好ましい局面では、セリアック病のようなグルテン不耐性なヒトにとって誘導であるペプチド断片を生成するグルテン配列部分でグルテンが開裂される、即ちグルテンが分解されて無毒にされたベーカリー製品のようなグルテン含有食物である。
【００７３】
好ましくは、グルテン含有製品はパン製品である。パンは、コムギと水を使って調製したパン酵母によって発酵させた生地を、塩、食用脂、ミルクおよびその他使用可能な食物添加物と共に、またはそれら無しに焼くことで得られるものである。
【００７４】
ジンジベインの持つ、食物内のアレルギー性または不耐性作用を担う公知エピトープを、食物の嗜好性を損なわずに開裂できる能力は、穀粒から作られた食物に限定されるものではない。同様の、アレルギーまたは不耐性反応を起こすことが知られているエピトープは、ミルク、ダイズおよびピーナッツのタンパク質にも存在している。
【００７５】
活性な酵素／抽出物は、例えば好適な形をした粉末、液体のような最終食物に、消費前に加えることができ、この場合酵素はその「活性」型の形で消費されると思われる。
【００７６】
または、酵素／抽出物は、調製中にコムギ粉のような食物の成分材料に加えることもできる。この場合は、酵素／活性抽出物は食物を調理する間／最終調製中に不活性化されることがある。65℃を超える調理温度は酵素を不活性化すると考えられている。
【００７７】
これは、酵素の活性を確実に維持する上で、最終食物製品を特別な条件で保存する必要がない点で有利である。
【００７８】
さらにこれにより、食品製造者は一定の品質を持つ食物が確実に製造できるように管理できるようになり、また最終使用者は分配および／または摂取する酵素の量を管理しなくともよくなる。
【００７９】
さらにまた発明のこの局面には、このような食物について規制認可を得る必要がないという利点もある。
【００８０】
このように酵素／抽出物は、それを含む食物が消費される時、活性型であっても不活性型でもよい。好ましくは、酵素／抽出物は不活性型であろう。
【００８１】
発明のさらなる局面では、ジンジベインのようなショウガ抽出物を、コムギ粉のようなバルク材料に加工中に加えることを提供する。必要な場合には、酵素は材料に加えた後不活性化でき、それはその後通常の方法で取扱い、分配および加工できる。かくして発明は、バルク材料を本発明の酵素／抽出物またはそれらを含有する組成物で処理すること、およびそれらを調製することを含む工程にまで及ぶ。
【００８２】
本主題の抽出物のさらに別の有用な特性は、脂質含有量を、1、2、3、4または5%といった約1重量%〜5重量%を含め、約1重量%〜10重量%にまで下げられる能力である。水分含有量もまた、約1容積／重量%〜5容積／重量%（例えば1、2、3、4または5%）のような、約1容積／重量%〜約10容積／重量%に上昇する。
【００８３】
本発明の主題はまた、このようなバルク製品を、集団のあるパーセンテージにアレルギーおよび／または不耐性反応を起こす性質を減らした食物の調製に使用することにも及ぶ。
【００８４】
バルク商品は、動物に発明の抽出物で処理したものを給餌する場合には、例えば袋詰めまたはバラ材として販売される。
【００８５】
酵素は、約1分から約24時間、約5分から約2時間のような所望する加水分化を行うのに十分な期間、材料／食物に作用させることができる。酵素は、約5〜約30分間の範囲の間作用させることが好ましい。
【００８６】
さらなる局面では、酵素または抽出物は、食事を取る前、同時、または後に摂取する薬学的調合物または健康補助タイプの調合品として投与することができる。
【００８７】
好ましくは、経口調合剤は食物消費前1〜20分、例えば食物消費前5〜10分に投与する。
【００８８】
健康補助調合品は、例えば、午前中のように1日1回または2回取ることができる。
【００８９】
本発明の健康補助品は、それらがタンパク質全体の消化および食物からの栄養吸収を助けることから有益である。発明のこの局面は、住民に十分な影響を提供することが困難な世界中の貧しい国々において特に応用できるだろう。
【００９０】
理論と結びつける意図はないが、ジンジベインのようなジンジャー抽出物は、例えば好適な調合品として経口投与された場合、胃のなかでもその活性を維持でき、有毒なペプチドを加水分解でき、それにより不耐性／アレルギー性／炎症反応を誘発するのを防ぐことができると考えられる。このことは、つきつめれば、このような反応によって体部に加えられる「自己免疫型」損傷を回避することになる。
【００９１】
かくして主題の発明は、該酵素／抽出物を含む、またはこれらからなる組成物、好ましくは薬学的調製物および／または健康補助調製物にまで及ぶ。酵素抽出物は、錠剤、カプセル剤、散剤、飲料物等に製剤化できる。しかしながら酵素は、例えば腸溶コーティングまたはバッファリングによって、胃の酸性条件に対し保護され、耐えられるようにする必要がある。
【００９２】
または酵素は、酵素／成分を合成するように設計／遺伝子工学的に作られた酵母または細菌によって、胃内においてインサイツに作り出させることもできる。
【００９３】
酵母および／または細菌は、活性飲料の形で投与してもよい。かくして発明は、インビボで酵素を調製できるプロバイオティック調合物にまで及ぶ。
【００９４】
本発明のプロバイオティック調合物は、ミルクまたは大豆等に由来する発酵生成物でよい。このような調合物は、ラクトース、グルコース、安定化剤および一もしくは複数の香味料を含むことができる。プロバイオティック調合物に使用できる酵母および細菌は、当業者に公知である。好ましくは、細菌はラクトバチルス カゼイ(Lactobacillus casei)のような乳酸桿菌である。
【００９５】
本明細書で言うところの組成物とは、希釈剤またはキャリアのような一種または複数種の賦形剤の存在を特徴とする。
【００９６】
本発明の主題の植物抽出物は、それゆえにグルテン不耐性といった食物不耐性、特にセリアック病および／または潰瘍性大腸炎および／または炎症性腸疾患の治療のための、およびいくつかの例では予防のための薬物として、または薬物の製造に有用である。
【００９７】
さらにまた、それゆえに本発明の抽出物は、これらの病気の症状である、下痢といった症状の治療にも有用である。ジンジベインの持つタンパク質加水分解に関する特異性と温度活性プロフィールにより、食物の調理のプロセスにおいて、極めて管理された方法により食物の品質を改良することができ、その結果調理重量を高め、調理時間を短縮し、さらにエネルギー消費量を小さくすることができる。
【００９８】
それゆえに、この分野の一つの特異的応用は、プロテインが豊富な天然タンパク質のコラーゲンを含む任意の材料を加工して柔軟にすることに関する。得られた生成物は、未処理の同等物に比べてより柔らかく、あるいは嗜好性がより高いことを特徴とする。このような処理および改良が加えやすい製品は、一般には肉および／または肉派生品である。嗜好性としては、例えば肉製品の多汁性度が挙げられる。肉を柔らかくすることは、動物の飼料または製造工程に、本発明の抽出物および／または成分を応用することで達成できる。あるは、該抽出物を好適な形で、摂取および／または摂取のために調理等で調製する直前に食肉材料に加えてもよい。所望する品質改善を達成する一つの方法は、例えばジンジベインをソース、マリナード、および／またはストック（ブイヨン）に加えることによるものである。
【００９９】
この関係では、用語「肉」および「肉派生」は拡張されて、海産物の新鮮肉：特に、食用材料を含む新鮮肉も包含する。
【０１００】
植物の花粉、特に極めてアレルゲン性である植物の花粉にも、ジンジベインによる攻撃に適したその他のプロリンに富むタンパク質が見出されている。
【０１０１】
最近確認された極めて感染性の高い「プリオン」と呼ばれるタンパク質が、食品および／または飼料製品中に存在することが、欧州、特に英国の肉牛産業において重大且つ深刻な経済的問題になっている。国内に牛海綿状脳症（または「狂牛病」としても知られる）として知られるプリオンを原因とする感染症が蔓延すると、その国の多くの産業が打撃を受け、重大な経済的困難につながることになる。さらには、それが、汚染食物の摂取を介してヒト集団に拡大する可能性についても大いに危惧されている。
【０１０２】
本発明の文脈おいて重要なことは、プリオンの構造に、アミノ酸単位中にプロリンを繰り返し含む反復領域の存在を含めて、コラーゲンと幾つかの共通点があることである。例えばニワトリのプリオンでは、プロリンが3アミノ酸毎にある繰り返し単位（PHNPGY）が9個ある54アミノ酸領域があり、それがコラーゲンにも見出される、張り出した形のポリプロリンII螺旋をそれにより形成している。正常なプリオンタンパク質はプロテアーゼ感受性であるが、感染性の立体構造は多くのタンパク質分解酵素による分解に対し抵抗性である。しかしながらプロリンに富む構造を考えると、プリオンはプロリンに富む天然タンパク質を好選的且つ特異的に破壊するジンジベインによる加水分解の理想的な標的である。かくして、肉およびに肉派生品を前処理することは、肉を「無プリオン化」する、従って安全に消費できるようにする有力な手段である。
【０１０３】
脂肪の含有と肉組織全体の分布、および飼料転換もまた、本発明の抽出物および／または成分を同様に作用させることで、好都合な影響を受けるだろう。
【０１０４】
アレルゲン性を低下させた、不耐性反応のリスクの低い、そして脂肪含有量が小さい、そしてプリオンの含有を下げた、もしくは排除したといった価値のある食材は、このような特性を示さない同等製品に対する、より健康的な代替物を提供するもとの考えられる。それゆえに、このような「改良された品質特性」が求められており、このような特性を一つまたは複数含む食材は、消費者、製造者および健康指導者らにとって一般的に好まれるものである。幾つかの例では、これらの特性を一つまたは複数含む飼料／食物は、「機能性食品」と考えることができる。上記から明らかなように、これらの品質特性は、家畜および伴侶動物が消費する飼料についても、ヒトが摂取するための食物と同様に当てはめられる。
【０１０５】
既述したように、一つの特にプロリンに富む天然タンパク質はコラーゲンである。コラーゲンは、ヒトにおいて最も多く存在するタンパク質であり、全タンパク質の約25%を占めており、その構造は最も原始的な動物からヒトに至る動物界において高く保存されている。コラーゲンは繊維芽細胞に発現している。それは皮膚、腱、血管、骨、眼の角膜および硝子体、ならびに基底膜といった有機的な組織塊を形成している。ある状況では、特定の組織部位のコラーゲン量または存在を取り除くか、または減らすことが望まれるか、または重要になることがある。例としては、血塊中および火傷周囲の死組織中に絡まっているコラーゲン繊維が挙げられる。
【０１０６】
従って、本発明の関連態様は、抽出物またはその分子成分を含む薬物製造への、標的組織中のコラーゲンの除去または減量のための、プロリン含有タンパク質を加水分解できるショウガ根茎の使用を目的としている。
【０１０７】
別の態様では、本発明は、ショウガ根茎抽出物の使用であって、該抽出物がプロリン含有タンパク質を加水分解できる分子成分を、標的組織中のコラーゲンの存在を取り除くか、または減ずるように計画された美容処置法の中で使用することを目的としている。
【０１０８】
「標的組織」とは、その中にコラーゲンが存在し、また美容または健康を目的とする場合には、その中のコラーゲンの分布および量が、多かれ少なかれ好ましく減じるものである任意の組織を包含する。本明細書で意図する標的組織とは、既に上述したもの；すなわち皮膚、腱、血管、骨、眼の角膜および硝子体、ならびに規定膜を包含する。しかしながら、他の組織も、特定の組織部位からのコラーゲンの量または存在の除去および／または減少が望まれる、および／または重要であり、そしてそれがジンジベインによる加水分解によって達成されるのであれば、本発明の意図する範囲内に入れることができる。
【０１０９】
コラーゲンは、特に溶解した形のものは、化粧用および医療用調製物の成分である。ジンジベインには、コラーゲン繊維の構造を微細化し、それをより可溶性にして、その結果として化粧用および医療用調製物としての価値を高める利用法がある。
【０１１０】
発明をある一つの理論または作用様式に限定することなしに、ショウガのようなショウガ属の根茎の抽出物または分子成分は、プロリン残基を有意な割合含んでいるタンパク質を特異的に加水分解すると言われている。特に好ましいプロリンに富む天然タンパク質としては、これらに限定されるものではないが、とりわけコラーゲン、グルテリン、プロラミン、カゼイン、プリオン、フィブリン、フィブリノーゲン、アミロイドベータタンパク質前駆体、および特にレセプターを含む細胞膜タンパク質等が挙げられる。これらの分子は、多くの細胞および生化学的プロセスに関係していることから、健康にとって望ましくない、そして／または有害であろう生化学的プロセスの作用の予防および／または治療に、本明細書でジンジベインと呼ばれるジンジャーの根茎抽出物は広範な応用性を有している。このようなプロセスは、表在性−例えば皮膚に影響する−のものでも、または全身性のものでもよい。
【０１１１】
それゆえに本発明の植物抽出物は、例えば火傷、虫さされ、擦過傷、癌、乾癬、およびその他炎症性疾患のような皮膚の疾患状態の治療、およびある場合には予防のための薬物、または薬物の製造に有用である。
【０１１２】
従って、本発明の別の局面は、ショウガ根茎の抽出物の、本明細書に記載の、被験者の皮膚障害またはその他障害を予防および／または治療するための薬物調製物への使用であって、該抽出物がプロリン含有タンパク質を加水分解できる分子成分を含む使用を目的とする。
【０１１３】
本明細書で「予防」および「治療」とは、その最も広い意味で解釈するものとする。用語「治療」は被験者が完全に回復するまで治療することを必ずしも意味しない。同様に「予防」も、結果として被験者が病的状態にならないことを必ずしも意味しない。従って、予防および治療は、特定の障害または状態の症状の軽減、または特定の障害または状態が発生するリスクを防止するか、もしくは減ずることを含む。用語「予防」は、特定の障害の重症度または発生を軽減することと考えることができる。「治療」もまた、既存の状態の重症度を下げても良い。
【０１１４】
この意味において「被験者」は、ヒトまたは動物の被験者でよい。
【０１１５】
この様式の予防および／または治療が有効であろう前記のタイプの皮膚障害としては、一般的には、その治療に有用な薬物の塗布を必要とする表在性の傷害および／または異常が関係する。このような傷害としては、例えば火傷、虫さされ、日焼けによる皮膚の剥離等がある。しかしながら、本発明はこれらに限定されず、癌、乾癬、およびその他炎症性傷害のようなより重症な疾患まで包含することを理解する。
【０１１６】
従って、本発明のさらに別の局面は、被験者の皮膚疾患および／または異常を治療および／または予防する方法を目的とし、該方法は該疾患および／または異常な皮膚を、ショウガ根茎の抽出物を含み、該抽出物はプロリン含有タンパク質を加水分解できるものである有効量の薬物と、該疾患および／または異常の症状の防止、改善または軽減にとって十分である時間および状態で接触させることを含む。
【０１１７】
これに関係して発明は、全身投与向け薬物として調合できる作用物質を提供する。従って、抽出物および／またはその分子成分はまた、アテローム性動脈硬化症、腫瘍、炎症性大腸炎および潰瘍性腸炎のような炎症性疾患、プリオンを原因とする疾患、痴呆、血液障害、ウイルス感染症、セリアック病のような食物不耐性、クローン病等を含む広範囲の病気の治療、またはいくつかの例では予防にも応用できる。
【０１１８】
従って、本発明のさらなる局面は、プロリン含有タンパク質を加水分解できる抽出物またはその分子成分を含む、被験者の全身性障害の予防および／または治療のための薬物の製造への、ショウガ根茎の使用を意図している。
【０１１９】
ジンジベインの応用が効果的な予防を提供できる可能性のある生命の脅威となる事象は、例えば輸血および／または組織移植および／または汚染した手術用具または血液処理装置を介した感染性プリオンタンパク質の伝播である。上記したように、感染性プリオンタンパク質の立体構造は、多くのタンパク質分解酵素による分解に耐性であるが、そのプリオンに富む構造によってプリオンはジンジベインによる破壊の理想的な標的となっている。発明のこの局面をある一つの理論または作用様態に限定することを望まないが、感染性プリオンは血液および／または移植体レシピエント、または手術を受けた患者に伝播し、そこで正常なプリオン分子を疾患原因構造への構造変化させることで疾患を引き起こすと考えられている。この様式での海綿状脳炎の伝播は、プリオンが極めて発見しにくく、疾患が症状を現すまでに長い年月がかかることから大きな危惧となっている。ジンジベインによる血液／組織の前処理、および手術用具および血液処理用具の除染は、この危険な可能性を排除する。
【０１２０】
かくして一つの態様では、本発明は全身性障害を治療および／または予防する方法を意図するものであり、該方法は、ショウガ根茎の抽出物を含む有効量の薬物を、それを必要とする被験者に、障害の症状を予防、改善または軽減するのに十分な時間と条件で投与する段階を含み、このとき該抽出物はプロリン含有タンパク質を加水分解できる分子成分を含んでいる。
【０１２１】
上記の障害に加えて、本発明の抽出物の応用が効果的であるその他障害としては、他の血液疾患、アテローム性動脈硬化症、食物不耐性およびその結果としての自己免疫疾患、転移性であるか否かにかかわらない癌腫瘍、痴呆、炎症性疾患およびウイルス感染症が挙げられる。このような障害は全て、用語「全身性」に包含されると考える。
【０１２２】
さらに例示すると、本発明の抽出物によるタンパク質分解性の分解に感受性である、特に好ましい、プロリンに富む別の天然タンパク質としては、コラーゲンおよびプリオンに加えて、フィブリンおよびフィブリノーゲンが挙げられる。フィブリンおよびフィブリノーゲンは動物において極めて重要な機能を有しており、同時に血栓、炎症、癌およびアテローム性動脈硬化症といった、いくつかのより一般的な疾患の発生に関係している。例えば、重合し、架橋したフィブリンは血栓症の原因となる血液凝塊を形成する。
【０１２３】
これらのタンパク質−フィブリンおよびフィブリノーゲン−もまた好適親水性アミノ酸残基のすぐ前および／またはすぐ後の重要な位置にプロリン残基を有しており、それゆえにジンジベインのようなジンジャー抽出物を含む、本明細書が意図する調合物による効果的加水分解に対し感受性である。かくして生命を脅かす凝塊を分解することができる。さらには、フィブリノーゲンおよびプロトロンビンのような血液凝固カスケードのその他メンバーを加水分解することによって、ジンジベインは凝血塊の形成を予防することもできる。
【０１２４】
フィブリンおよびフィブリノーゲンはまた炎症とも密接に関係している。本明細書に用いる場合、用語「炎症」は、最も広い意味で解釈し、組織傷害または破壊に対する体の保護反応を示すと解釈するものとする。ここでも発明をある一つの理論または作用様式に限定することを望むことなしに、組織損傷部位に速やかに生成されるトロンビンおよび第XIIIa因子は、その場所で血管内および血管外のフィブリノーゲンを架橋結合したフィブリンに変換すると考えられている。フィブリン網目構造は血液細胞を捕捉して、その部位からの失血を制限する。それはさらに、例えば血小板、顆粒球、単球およびリンパ細胞といった、炎症細胞をその部位に封じ込め、さもなければ血流中に循環しているであろう。これらの細胞のいくつかは、活性化されると、その外面にフィブリンおよび／またはフィブリノーゲンに対し高い親和性を有する細胞接着分子を発現する。それゆえに、炎症部位内では、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンは様々な細胞に接着することができ、それによって細胞を炎症部位に保持すると考えられている。
【０１２５】
それらが炎症で果たす役割の結果、フィブリンおよび／またはフィブリノーゲンは腫瘍増殖促進においても重要である。さらにまた、それらは炎症と関係する別の疾患であるアテローム性動脈硬化症にも関与している。発明の応用をある一つの理論に限定することなく、アテローム性動脈硬化症プラークは細胞外の疎水性脂質、脂質を含むマクロファージ、平滑筋細胞、ならびにフィブリノーゲンおよびその分解産物を含む大動脈内皮細胞層直下に埋込しているタンパク質からなる。プラークのフィブリンおよび／またはフィブリノーゲン含有量とその脂質含有量との間には正の相関性があり、血漿フィブリノーゲンレベルは、アテローム動脈硬化症心疾患の独立リスク因子である。
【０１２６】
従って、本発明の抽出物によるフィブリンおよび／またはフィブリノーゲンの的を絞ったタンパク質分解は、炎症反応の生起および／または程度が不適切、不要および／または望ましくない状況における炎症反応の軽減および／または排除に用いることができる。血液凝固、炎症、アテローム性動脈硬化症および腫瘍増殖を含むフィブリンおよび／またはフィブリノーゲの望ましくない作用は、ショウガのようなショウガ属の根茎抽出物および／または本明細書でジンジベインと呼ぶその成分を用いることによって、予防、改善または軽減できる。
【０１２７】
ウイルス細胞膜タンパク質は、一般的にはプロリンに富んでおり、ジンジベインによる加水分解に適した部位を複数有している。これらタンパク質は宿主細胞への進入およびその他機能にとって必須であり、ジンジベインによるそれらの開裂はウイルス感染を阻止する。
【０１２８】
薬物の活性成分は、具体的な例に応じた「有効量」を投与した時に治療活性を発揮すると予想される。「有効量」とは、少なくとも一部、所望の反応を得る、または治療対象となる特定の状態の発生を遅らせる、または進行を阻止する、または発生または進行を同時に阻止するのに必要な量を意味する。この量は治療対象となる被験者の健康および身体的条件、治療対象となる被験者の分類学的グループ、望まれる予防の程度、摂取する調合物、医学的状態の評価、およびその他関係する要因に応じて変わる。その量は比較的広い範囲になると考えられ、それは通常の試験により決定できる。ヒト被験者を想定した場合、例えば1kg体重あたり、1日約0.1mg〜約4mgの活性成分を投与できるだろう。投与方法は、最適な治療反応を提供するように調整できる。例えば、投与はいくつかに分割して毎日、毎週、毎月、またはその他好適な間隔で行ってもよく、または状態の緊迫度応じて減らすこともできる。
【０１２９】
本発明の応用により、被検者の障害の性質に応じて局所投与または全身投与することによって、本方法と共に使用するための本明細書に開示された抽出物または成分を含む薬物を調合できる。適切に調合された薬物は、次に皮膚の異常または疾患、あるいは上記に述べたような全身性の疾患かに関わらず、疾患の治療および／または予防に利用できる。このような薬物は、複数ある通常の投与形態のいずれか一つとして、また複数ある通常の手段のいずれか一つを用いて投与できる。既に述べたように、「被検者」はヒトを含むが、これに限定されない動物を指す。
【０１３０】
予想される活性成分の好適投与形態としては、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤、クリーム、オイル、ゲル等が挙げられるが、これらは全て次のような追加の成分も含んでよい：ゴム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンのような結合材；第2リン酸カルシウムのような賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；ショ糖、ラクトースまたはサッカリンのような甘味料；ペパーミント、ウインターグリーン油またはチェリーフレーバーのような香味剤。投与単位形態がカプセル剤の場合、それは上記のタイプの材料に加え液体キャリアを含むだろう。その他様々な材料が、コーティングまたは投与単位の物理的形状を変更するその他材料として存在してもよい。例えば錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、砂糖またはその両方でコーティングされてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてのショ糖、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、着色料、およびチェリーもしくはオレンジフレーバーのような香味料を含むことができる。当然、投与単位形態の調製に使用される材料は、薬学的に純粋であり、使用量において実質的に無毒でなければならない。これに加え、活性化合物は、持続放出製剤および調合物に組み入れることができる。
【０１３１】
薬学的に許容されるキャリアおよび／または希釈剤としては、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。このような媒体および作用物質を薬学的に活性な物質に使用することは、当技術分野で周知であり、従来の媒体または作用物質が活性成分に不適合である場合を除いて、治療組成物へのその使用が想定される。組成物には、補助活性成分を組み入れることもできる。
【０１３２】
活性成分は、経口、静脈内（水溶性の場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内または直腸経路といった従来の方法、または埋め込み（例えば、徐放分子を用いて）によって投与することができる。
【０１３３】
経口投与形態にとって好適な活性成分量は、例えば50または100mgのような投与単位当たり10〜250mgのように、単位投与あたり1〜500mgである。
【０１３４】
または、活性成分はクリーム、オイルまたはゲルといった局所投与に合わせて調合できる。活性成分は、ナトリウム、カリウム、マグネシウムまたはカルシウムといったアルカリまたはアルカリ土類塩のような薬学的に許容される無毒な塩の形で投与できる。活性成分は、調製済みの食物および飲料物に補助剤として加えてもよい。
【０１３５】
局所投与にとって好ましい調合物としては、その中で本発明の活性成分が、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤のような局所送達剤と混合されているものが挙げられる。好ましい脂質およびリポソームとしては、中性（例えば：ジオレオイルホスファチジルDOPEエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンDMPC、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（ジミリストイルホスファチジルグリセリンDMPG）および陽イオン性（ジオレオイルテトラメチル-アミノプロピルDOTAPおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンDOTMA）のものが挙げられる。
【０１３６】
局所またはその他の投与については、本発明の抽出物および／また成分は、リポソーム内に封入してもよく、あるいはそれと、特に陽イオンリポソームと複合体を形成してもよい。または、抽出物および／または成分は、脂質、特に陽イオン脂質と複合体を形成してもよい。好ましい脂肪酸およびエステル、薬学的に許容されるその塩、ならびにそれらの使用は、例えば米国特許第6,287,860号に記載のように公知である。
【０１３７】
本発明の抽出物および成分は、特に、プロリン残基を有意なパーセンテージ含む標的に向けてタンパク質分解活性を示す。本明細書ではジンジベインと呼ぶタンパク質分解活性は、このような標的の加水分解に安定且つ信頼して用いることができる。それゆえに、上記の応用に加えて、この特性は、ジンジベインを、研究および開発施設において用いる安定した分析レベルのツール、例えば生物学的な問題の研究に細胞および分子生物学的なアプローチを必要とするような状況において特に有用なものにしている。このような研究アプローチは、とりわけ、組織培養容器からの細胞物質の再現性のある完璧な除去；収集を目的とした組織の単一細胞への解離；または確実な標的特異的なタンパク質分解等を必要とするだろう。
【０１３８】
従って、本発明のさらに別の局面は、組織の解離および／または解離細胞を収集するのための、プロリン含有タンパク質を加水分解できる抽出物またはその分子成分を製造することへのショウガ根茎の使用を意図している。
【０１３９】
関連する態様では、本発明は、特定の標的を特異的に開裂するための、プロリン含有タンパク質を加水分解できる抽出物またはその分子成分を製造することへショウガ根茎の使用を意図している。
【０１４０】
さらにまた、標的特異的にタンパク質を確実に分解することはジンジベインの特性の一つであり、それは穀粒およびその他植物材料からのエタノール製造、ならびに廃棄物の完全な分離が望まれる、植物および／または動物起源の不要なタンパク質材料を含む廃棄物の処理といった産業応用にも求められている特性でもある。
【０１４１】
穀粒中のグルテリンおよびプロラミンは、エタノールを製造するデンプンの加工処理を妨害し、またそれらが不耐性性の反応を誘導することからタンパク質副産物の動物飼料としての価値を低下させる。本発明は、ショウガ根茎を用いて、グルテリンおよびプロラミンを開裂して多糖類のより効率的な加工処理を可能とし、また加水分解された不耐性エピトープを有し、結果として動物飼料としての価値を高めるタンパク質副産物を生成することができる、その抽出物または分子成分を製造する。発明はまた、こうして処理された動物飼料にも及ぶ。
【０１４２】
従って本発明のさらに別の局面は、産業廃棄物を分解処理するための、プロリン含有タンパク質を加水分解できるショウガ根茎の抽出物または分子成分製造へのショウガ根茎の使用を目的とする。
【０１４３】
本発明の方法で分解できる廃棄物の例としては、とりわけ、肉および海産物加工処理ならびにその他食品産業からの廃棄物が挙げられる。
【０１４４】
コムギおよびトウモロコシといった穀物からのエタノール製造の工程およびコスト効率は、グルテリンおよびプロラミンといったタンパク質によって有害な影響を受ける。ジンジベインによるこれらタンパク質の特異的開裂により、デンプンの加水分解および発酵の工程は単純化され、また家畜飼料としての可溶成分添加留器穀物（DGS）副産物の付加価値が付く。
【０１４５】
本発明を、下記の非限定的実施例により詳しく説明する。
【０１４６】
実施例1
ジンジベインタンパク質画分
pH6のリン酸緩衝液を用いてジンジャー根茎からタンパク質画分が抽出可能である（Thompson et al., J. Food Sci. 38: 652-655; 1973; Ichikawa et al., J. Jpn. Soc. Food Nutr. 26: 377-383; 1973; Ohtsuki et al., Biochim. Biophys. Acta 1243: 181-184; 1995;）。この画分は、三つの密接に関連したタンパク質分解酵素を含有し、DEAEセルロースクロマトグラフィーを使用してそれらの酵素を2本のバンド、すなわち二つの酵素を含有するGP-Iと、一つの酵素を含有するGP-IIとに分離できる（上記Ichikawa et al., 1973）。それぞれ分子量約29,000Daを有するこれらの三つの酵素は、アセトンまたはエタノールを用いて抽出物から沈殿でき、分子量14,000および10,000Daを有する二つのタンパク質の混入を何か少量残す。GP-Iの優占構成要素はGP-IIと82%の相同性を有し、プロリン特異性に関する主要アミノ酸は保存されている。
【０１４７】
GP-IIの配列および構造が決定された（上記Choi et al., 1999; Choi and Laursen, Eur. J. Biochem. 267: 1516-1526, 2000）。この酵素はアミノ酸221個を有し、およそ同じ大きさの二つのドメインに折り畳まれた鎖とそれら二つのドメインを分離している溝とを有する。GP-IIのアミノ酸配列を配列番号：1に示す。ドメインIは、13〜112および215〜218番残基を含み、主にα-ヘリックスである。ドメインIIは、3〜12および113〜214番残基を含み、逆平行βシート構造を有する。この全体的な構造は、パパインおよびアクチニジンのような他の植物システインプロテアーゼに非常に類似している。そのタンパク質は、Asn99およびAsn156で二つのN-結合オリゴ糖により8重量%グリコシル化している。三つのジスルフィド結合がGP-IIタンパク質の折り畳みを安定化している。これらの結合は、Cys24とCys65、Cys58とCys98およびCys155とCys206の間の間に局在する。これらの残基は、パパインファミリー全体で厳密に保存されている。極性残基は、分子の底部に濃縮され、活性部位のシステインに向かい合ってそれを取り囲むように約10オングストロームの半径で電気的に中性の面がある。活性部位は、二つのドメインの界面にある深さ5.5オングストローム、長さ9.5オングストロームの溝に存在する。GP-IIの構造の表示を図1に示す。
【０１４８】
GP-IIがQ130-P131-V132-S133で自己開裂してアミノ酸132個およびアミノ酸89個を有する2本のフラグメントを与えることにより、ジンジベインに14,000および10,000Daタンパク質混入物が存在することを説明できる。
【０１４９】
繰り返しの単離により、300U/mgを上回る活性を有する一貫した生成物が与えられる（Dionysius et al., J. Food Sci. 58: 780-784; 1993）。この酵素は、「プロリン特異的システインプロテアーゼ」とも呼ばれている（上記Choi et al., 1999；上記Choi and Laursen, 2000）。この酵素は、システインのチオール基がペプチド結合を攻撃して加水分解するための求核基であるパパイン様システインプロテアーゼファミリーに属する。このファミリーには、例えばパパイヤ（Carica papaya）由来パパイン、パイナップル（Ananas comosus）由来ブロメライン、パイナップル由来アナナイン（ananain）、イチジク由来フィシン、およびキウイフルーツ（Actinidia chinensis）由来アクチニジンなどの酵素がある。
【０１５０】
GP-Iの優占構成要素の配列も決定された。このアミノ酸配列を配列番号：2に示す。
【０１５１】
本明細書で使用する用語「ジンジベイン」は、未分離のプロテアーゼ含有画分ならびに単離および精製されたその下位構成要素を含む。
【０１５２】
実施例2
ジンジベインによるコラーゲンの加水分解
コラーゲンはヒトに最も豊富に存在するタンパク質であり、タンパク質の約25%を占め、その構造は最も原始的な動物からヒトまで動物界で大きく保存されている。コラーゲンは線維芽細胞に発現する。コラーゲンは、皮膚、腱、血管、骨、角膜、眼の硝子体、および基底膜の有機集団を形成する。コラーゲンは重合して三重らせんを形成し、各鎖は1,000個を超えるアミノ酸を有する。大部分の種に主要な形態のコラーゲンは、I型コラーゲンと呼ばれ、2本のα1（I）鎖および1本のα2鎖を有する［α1（I）］2α2である。軟骨コラーゲンは［α1（II）］3の構造を有し、様々な組織、特に胚組織に生じるコラーゲンは［α1（III）］3の構造を有する。コラーゲンにはプロリンおよびヒドロキシプロリンが非常に豊富である。 コラーゲンタンパク質は、ジンジベインによる加水分解に都合のよいアミノ酸の組み合わせをもつ極めて多数の部位を有するが、三次元構造、特に堅固ならせん構造は加水分解が起こり得る部位を限定している。
【０１５３】
アゾコラーゲン（アゾコール）アッセイを使用して、ジンジベインによるコラーゲンの加水分解を研究した。マグネティックスターラーに載せた小型のメスシリンダーの中でアッセイ緩衝液（1mM DTTおよび1mM EDTAを含有する0.1Mリン酸ナトリウム（pH6.0））10mLと洗浄して摩砕したアゾコラーゲン粉末0.1gを室温で混合することによりアゾコラーゲン（Sigma Aldrich）基質懸濁液を調製した。30分後に、試験管の壁に懸濁液を全く残さずに懸濁液1mLを大口径のマイクロピペット（直径2.5mm）でガラス試験管（150mm×13mm）に移した。試験管を、毎分112回の速度で水平移動距離4cmの振盪水浴中で指定の温度で5分間平衡化した。水浴中で一定に振盪しながら酵素試料（50μL）を基質と共に30分間インキュベートした。冷10%v/vトリクロロ酢酸（TCA）1mLで反応を停止させ、反応混合物を微量遠沈管2mLに移した。遠心分離を12,000rpmで5分間行った後で、上清を除き、吸光度を520nmで読み取った。基質1mLを30分間インキュベートして、10%f/v TCA 1mLの後に酵素試料50μLを加えることによりブランク試料を調製した。
【０１５４】
これらの研究により、反応がミカエリス-メンテン速度論に従わなかったことが示された。吸光度は基質濃度と共に実現可能な最大濃度5%まで直線的に増加した。温度の効果は、50℃を超えて速度の増加を示し、60℃では37℃での速度の約4倍の最大速度であり、速度は急に落ち込み、70℃では速度は最大速度の5分の1に減少した。60℃での吸光度の増加は、90分までの時間では直線的であることが分かった。反応速度は、ジンジベイン25〜500μgの範囲で酵素濃度に対して比較的直線的であった。これらの結果を図2に示す。
【０１５５】
ウシ筋コラーゲンの加水分解のSDSゲル電気泳動研究から、ジンジベインが70℃までコラーゲンの破壊に有効であったことが示された。フラグメント化パターンはフィシンおよびパパインのパターン、ならびにヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）コラーゲナーゼのパターンと異なった。そのコラゲナーゼは3.5日かけてコラーゲンの大きなフラグメントを産生したが、ジンジベインはコラーゲンを2,000Da以下のオーダの低分子量のフラグメントに完全に分解した。この研究により、ジンジベインがコラーゲンのらせん区域を攻撃したことが示された。らせん構造がほどけるにつれ、この領域は加水分解にさらに敏感になるであろう。
【０１５６】
よって、ジンジベインによる飼料/食品用の肉の処理は、完全に分解したコラーゲンを速やかに生み、動物が食用する肉の軟化に使用するためにそのような処理を行うことを理想的にする。
【０１５７】
酸可溶性I型コラーゲンの別のSDS電気泳動研究から、三重らせんγ型コラーゲンが、低ジンジベインレベルで攻撃されてγ-バンドのすぐ下であるバンドを形成することが示された。そのバンドは、一本鎖α1およびα2コラーゲンに関するバンドの下にも出現するラインと、二本鎖β形態およびその分解生成物に関するバンドとを伴った。ジンジベインの濃度が増加するにつれ、γ-バンドおよびβ-バンドが速やかに消失し、100,000Daのα形態よりも低分子量のところに分解生成物のはっきりした鮮明なバンドを伴う、薄いα-バンドだけがまだ見えた。より高濃度のジンジベインでは、ジンジベインが原因のバンドおよび低分子量フラグメント生成物のみが見えた。これらの観察は、ジンジベインが分子の両端の単にテロペプチドの位置ではなく、らせん領域を攻撃するという提案も支持している。それは、観察されたフラグメント化パターンを説明するにはこれらの区域が小さすぎるからである。
【０１５８】
肉および水産食品中のコラーゲンのような食品中タンパク質の調理過程中の加水分解の制御によって、極めておいしい食品をより短い調理時間でより少ないエネルギー消費でより効率的に調製するためのプロトコルを開発することが可能になる。肉に最終重量の2%になる総塩量を25%で注入する正規の商業的なプロトコルで調理した塩漬けランプロースを、「外側の扁平な」筋（大腿二頭筋）を使用した例として示す。コンビーフは通常、許容可能な程度の柔軟性を実現するために長時間調理されるが、ジンジャー抽出物を使用することにより、所望の柔軟性は、低温と短い調理時間とで、必要ならば所望の程度の火の通り具合を実現するための高温への急上昇を伴って実現された：牛肉1Kgあたりジンジベイン15mgと共に75℃の水浴中での短い調理時間（時間は肉片のサイズに依存する）による、剪断応力および圧縮がそれぞれ3.5Kgfおよび1.1Kg未満である軟らかい塩漬け肉が産生した；これに比べ、肉250gの片にジンジベインを加えずに60分間まで調理した肉では4.3Kgfおよび1.7Kgであり、6%未満の小さい調理損失を有した。ジンジベインなしで柔らかさを実現するためには、より高い調理損失が付随するかなり長い調理時間が必要である。
【０１５９】
実施例3
ジンジベインによるプリオンタンパク質の加水分解
「プリオン」として知られるタンパク質性感染因子が同定され、過去20年間にわたりキャラクタリゼーションされてきた。これらの感染因子は以下のような海綿状脳症の原因因子であることが知られている：
・  ウシ海綿状脳症（BSE）または狂牛病；
・  スクレイピー、ヒツジおよびヤギの病気；
・  ヒトクロイツフェルト・ヤコブ病、症例の10〜15%は遺伝力を原因とするが、一部の症例は手術感染およびおそらく輸血により不注意に起こされる；
・  ゲルストマン・シュトロイスラー・シャインカー病；および
・  致死性家族性不眠症。
【０１６０】
これらは、独占的でないにしても主にプリオンタンパク質と呼ばれるタンパク質（PrPと称される）からなる。PrPの一形態は病気を起こし（PrPsc）、第二の形態（PrPc、正常形態）は起こさないことが知られている。
【０１６１】
（a）プリオンの構造
その差は、恐らくタンパク質構造のコンホメーション変化により起こるらしい。正常なPrPcは主にαらせんからなり、病的なPrPscは主にβシートからなる。恐らくPrPscの存在が正常なPrPcのコンホメーション変化を起こし、感染性PrPscにするようである。突然変異遺伝子を保有するヒトまたは他の動物にとって、その突然変異はPrPcをαヘリックスからβシートコンホメーションに転換することに感受性にしうる。この変化は、発生に時間がかかり、症状を起こすために脳を十分に損傷するに足る感染性PrPscの蓄積も同様である。
【０１６２】
（b）プロリン普及率およびジンジベイン感受性
くり返すアミノ酸ユニットにプロリンを含有する繰り返し領域の存在を含めて、プリオンの構造はコラーゲンと類似の特性をいくつか共有する。例えばニワトリプリオンでは、9個の繰り返しユニット（PHNPGY）［配列番号：4］を有するアミノ酸54個の領域が存在し、その繰り返しユニットでプロリンは3番目毎のアミノ酸であり、よって、コラーゲンでもみられるように、伸長したポリプロリンIIらせんを形成している（図3参照）。
【０１６３】
正常なPrPはプロテアーゼ感受性である。しかし、感染した脳の中のPrPscはプロテアーゼによる破壊に耐性である。しかし、プリオンの構造を考慮すれば、それらプリオンはジンジベインによる加水分解に対する理想的な標的となる。好ましい標的分子としてプロリンリッチ天然タンパク質を有するジンジベインは、タンパク質分解性開裂を介してPrPscを無害にしうる。ウシプリオンは、下記にみられる配列（配列番号：3としても示す）を有する28,600Daのタンパク質である：
2007522822.tif 000003
【０１６４】
プロリン18個を太字体「P」で表示する。これらのうち16個は「P」に先行または後行する親水性残基を有する。星印、すなわち：*で表示した繰り返しユニット「WGQPHGGG」［配列番号：4］にあるプロリン5個およびPro53はプロリンに隣接するグルタミンを有し；Pro28、Pro41、Pro148、およびPro176はアルギニンを有し；Pro30、Pro113、およびPro116はそれらに隣接するリシンを有し；Pro169はアスパラギンを有し；かつPro46およびPro249はセリンを有する。
【０１６５】
露出してジンジベインに攻撃されるならば、これらプロリンの全ては加水分解に感受性である。さらに、コラーゲンとまさに同様に、プリオンはジンジベインによる多部位加水分解に普遍的な構造をとる。より露出した領域が開裂するにつれ、内部構造が加水分解のために露出するので、適切な条件下ではそのタンパク質を完全に打ち壊すことができる。
【０１６６】
（c）輸血によるプリオン伝染の予防
ジンジベインの適用により予防される一つの起こりうる致命的イベントは、例えば輸血を介した感染性プリオンタンパク質の予想外/検出不能の伝染である。PrPscは受血者に伝染して、PrPc分子と相互作用することにより疾患を引き起こし、βシートが有力な病原性PrPsc構造へのコンホメーション変化をPrPc分子に誘導する。プリオンは検出が非常に困難であろうし、疾患が症状を生じるのに何年もかかることから、輸血を介して海綿状脳症の伝染が起こりうることは大きな懸案事項である。輸血する前に血液をジンジベインで処理すると、この危険な可能性を未然に防ぎうる。同様に、もしもプリオン分子に曝露されたならば、手術用機器および血液処理機器をジンジベインにより汚染除去して疾患の伝染を予防できる。
【０１６７】
（d）無プリオン食品および飼料の調製
ヒト用食品および動物用飼料市場の両方のために調製された肉および肉製品をジンジベインで日常的に処理して、潜在的に致命的なプリオンの分解を起こし、食用の製品を無プリオンにすることによって、安全にすることができる。
【０１６８】
実施例4
ジンジベインによるアレルゲン性および食品不耐性の根絶
多くの商業的に重要な植物タンパク質はプロリンリッチである。オーストラリアの自生樹木からミツバチが集めた花粉さえ、プロリンが特に豊富である。1990/91年の8個の一般花粉源に関する花粉のアミノ酸分析は、以下のパーセント平均値を示している（Stace, "Protein Content and Amino Acid Profiles of Honeybee-Collected Pollens" Bees'N'Trees Consultants, Lismore, NSW, Australia, 1996, 2480）：
2007522822.tif 000004
これらの花粉がアレルゲン性である場合、ジンジベインはタンパク質加水分解によりこれらアレルゲンを除去する。
【０１６９】
実施例5
セリアック病を有する者でのグルテン応答の除去
セリアック病の症状の確立した前歴を有し、厳密な長期「無グルテン」食を摂ってきた者に、濾過したジンジャー絞り汁生産品を原料に含む、小麦粉から作った様々な生産品の毎日の摂取を提供した。それらの生産品には、バターケーキ、「悪魔のように黒いチョコレートトルテ」、フランスパン、卵パスタ（スパゲティ）、市販の朝食用全粒ビスケットおよび市販のパンがあった。市販されていない生産品を以下のように調製した。
【０１７０】
（a）バターケーキ
オーブンを180℃に予熱した。ケーキ型に溶けたマーガリンを刷毛で塗り、底にオーブンペーパーを強いた。電気泡立て器を使用してマーガリン125gおよび粉末白砂糖3/4カップを小型ボウルで、軽くクリーム状になるまで混ぜた。軽く泡立てた卵2個を徐々に加え、加える度によく混ぜた。バニラエッセンス茶さじ1杯を加え、得られた混合物をよく混ぜて一体化した。
【０１７１】
その混合物を大型のボウルに移し、ベーキングパウダー入り小麦粉をふるいにかけたもの2カップと牛乳1/2カップを金属スプーンで交互に混ぜ入れた。得られた混合物をちょうど一体化するまで撹拌して、濾過したジンジャー絞り汁茶さじ1杯を加え、得られた混合物をほとんど滑らかになるまでもう一度撹拌した。
【０１７２】
準備ができた型にその混合物をスプーンで入れ、ケーキを45分間焼き、45分の時点でケーキの中心に入れてから引き出した串はきれいであった。ケーキを10分間型に入れたままにしてから、取り出して金網に置いて冷ました。
【０１７３】
（b）「悪魔のように黒いチョコレートトルテ」
23cmの角ケーキ型の底と側面にマーガリンを塗り、型の底をオーブンペーパで覆った。
【０１７４】
マーガリン（185g）をソースパンに入れて溶かし、火から外した。ダブルエスプレッソコーヒー1カップをかき混ぜながら入れ、みじん切りしたダークチョコレート150gおよび粉末白砂糖1/2カップと合わせ、得られた混合物を滑らかになるまで撹拌した。その混合物を電動ミキサーの大型ボウルに入れた。これに、ベーキングパウダー入り小麦粉1カップ、普通の小麦粉3/4カップ、ココア大さじ2杯をふるいにかけた混合物を3回に分けてかき混ぜながら入れ、卵2個、バニラエッセンス茶さじ1杯および濾過したジンジャー絞り汁であるジンジベイン溶液を茶さじ1杯をかき混ぜながら入れた。
【０１７５】
用意した型に得られた混合物を注ぎ入れ、温度の低いオーブン（150℃）で固くなるまで（1.25時間）焼いた。できたケーキを5分間放置してから、取り出して金網に置いて冷ました。
【０１７６】
ケーキを半分に切り、そのそれぞれを3枚に分けた。ケーキ1枚を盛り皿に乗せ、ラズベリージャムを薄く塗った。次に、ボウルの中で熱く溶けたダークチョコレート200gおよびマーガリン125gを合わせ、ふるった純粉砂糖1/4カップに入れてかき混ぜ、室温に冷まし、フィリングに粘りが出て塗布可能になるまで木製のスプーンで強くかき混ぜることによって、フィリングの薄い層を作った。これにもう一つの層のケーキを乗せ、その層にクレームドカカオ少量をふりかけてからフィリングを薄く塗った。残りのケーキ、リキュールおよびフィリングを用いて重層を繰り返した。層になったケーキを冷蔵庫に数時間入れて固めた。
【０１７７】
残しておいたフィリング（2/3カップ）をケーキに均一に塗り広げた。
【０１７８】
（c）「フランスパン」
以下の原料を指定の順序で加えて、Breville Master Excel BreadおよびDough Makerを（濾過したジンジャー絞り汁であるジンジベイン溶液を加える以外は）「フランス」パン（1個750g）の調理法で使用した：水310ml；濾過したジンジャー絞り汁であるジンジベイン溶液茶さじ1.5杯；エキストラバージンオリーブ油茶さじ2杯；塩茶さじ1.5杯；砂糖茶さじ2杯、普通の無漂白小麦粉（タンパク質12%）3カップ（450g）；パン添加物茶さじ1杯；およびドライイースト茶さじ1.5杯。
【０１７９】
合計3.36時間の以下のプログラムを有する「中」の設定を使用した：第1回こねる；第2回こねる；第1回膨らむ；たたきつける；第2回膨らむ；たたきつける；第3回膨らむ；焼く。パンは容器の上端近くまで膨らんだ。
【０１８０】
（d）卵パスタ（スパゲティ）
卵パスタの練り生地にBreville Master Excel BreadおよびDough Makerを（濾過したジンジャー絞り汁であるジンジベイン溶液を加える以外は）その調理法で使用した。以下の原料を指定の順序で加えてパン型に加えた：軽く泡立てた卵4個（60g）；濾過したジンジャー絞り汁であるジンジベイン溶液茶さじ1.5杯；エキストラバージンオリーブ油茶さじ1杯；塩茶さじ1杯；普通の小麦粉2カップ（300g）；セモリナ粉1カップ（170g）。
【０１８１】
加工時間13分のパスタ生地の設定「8」を使用した。プラスチックシートに「無グルテン」ソバ粉をはたいて使用して練り生地を円筒状に巻いた。生地を切って小分けし、パスタメーカーを通してスパゲティを調製し、そのスパゲティを1時間乾燥させてから包装した。
【０１８２】
1週間目に被験者は毎日午後にバターケーキ1切れを食べた。2週間目に被験者は毎日午後にチョコレートケーキ1切れを食べた。3週間目に被験者は毎日昼食にパン2枚を食べ、3日目の夕食にスパゲティ1皿を食べた。
【０１８３】
食品に対する身体の任意の応答についてその被験者を綿密なの監視をした。有害作用の徴候は全くなかった。小麦粉を用いた生産品を食べた後のその被験者の通常の有害応答の時間が、下痢および鼓腸が始まるまでに約2時間であったことを考慮すると、上記の範囲の小麦粉生産品を摂取後に応答の徴候が全く欠如していたことは、ショウガ絞り汁であるジンジベイン溶液によりグリアジンおよびグルテニンの「グルテン」不耐性エピトープが除去されたという結論を支持する証拠として受け止められた。
【０１８４】
（e）朝食用全粒ビスケット
ジンジャー絞り汁を含む水で、小麦1kgあたり絞り汁1.6mLおよび小麦1kgあたり16mLの比率で「洗った」小麦を調整して、工業的に加工して標準的な全粒ビスケットを作った。被験者にビスケット2枚のセット2個、すなわち絞り汁1.6mLで処理したものと絞り汁16mLで処理したものを提供し、乾燥状態で食べて応答を記録するよう求めた。被験者は処理したビスケットに有害応答を有さず、ビスケットが非常においしいと認めた。
【０１８５】
（f）市販のパン
営業しているパン屋で、漸増する量のジンジャー絞り汁を水に加えて、水1900mLを含有する小麦粉3Kgから一連の焼き分のパンを作った。最低レベルのジンジャー絞り汁（1mL）からジンジャー絞り汁120mLまでを加えると、練り生地を混合して熟成に達する時間が余りかからなくなり（10分間が8分間に減少）、パン職人は、その練り生地が絞り汁を加えない練り生地よりも仕上がりがよく、うまく切れると判定した。蓋つきブリキ型および蓋なしブリキ型で焼いたパンは、より均一な皮を有してより大きく、パンはより白くよりきめが細かい食感であった。処理したパンの方が長い保存期限を有した。パンは全く有害作用を有さずに追加の水120mLを吸着できた。絞り汁240mLでこの品質を維持するためには、水を120mLだけ減らさねばならなかった。
【０１８６】
各焼き分の処理したパン2枚のセットにして包装して凍結し、包装に書かれた番号が大きいもの（9番）（絞り汁240mL）から始めて最も小さい数（2番）（絞り汁1mL）に進みながら1日に2枚を食べる指示と共に配達した。被験者は任意の焼き分に有害不耐性反応を有さなかった。
【０１８７】
被験者はショウガ絞り汁を用いて作った穀物生産品を12か月間食べ続けたが、有害応答を有さなかった。しかし、通常の「グルテン」を含有する食品に対する被験者の有害応答は重症のままである。
【０１８８】
上記のセットの試験を、セリアック病および疱疹状皮膚炎を含めたグルテン不耐性の明確な症状を有する他の7人に繰り返したが、これらの被験者はショウガ絞り汁と共に処理した場合の様々な種類の小麦系食品に有害応答を有さなかった。
【０１８９】
グルテンタンパク質を上記パン試料から65%エタノールで抽出し、SDS-PAGE電気泳動で検討した。標準的なパンに比べて、加工されたパンでのグルテンタンパク質は、ジンジャー抽出液により可溶性が高くなり、等しい抽出および電気泳動に対して各タンパク質のバンドは強度がより大きくなった。高分子量および低分子量グルテニンユニットに関するバンドおよびグリアジンに関するバンドは、低分子量方向に移動した。抽出物のレベルが増加するにつれ、おそらく多数の部位が加水分解されたことが原因でバンドは広がった。これらの結果は、ジンジベインが非常に高分子量のグルテニン集塊構造を短縮して、100,000Da以下のさらに高濃度のグリアジンおよびグルテニンを放出し、検出可能なグリアジンおよびグルテニンの分子量がさらに低い値に移動したことに一致し、これはグルテン不耐性の除去が観察されたことに一致する。
【０１９０】
実施例6
ヒトが食用にするための食品の品質改善
ヒトにより摂取される食品の品質に関して、小麦、トウモロコシおよびオートムギに及ぼすジンジベインの効果を調べてきた。専門家の標準的な「味覚試験」パネルにより報告されたように効果は劇的であった。
【０１９１】
（a）コーヒーバンズ
低脂肪乳と混合した小麦粉を用いて、1焼き分はジンジベインを含み、もう1焼き分は含まないコーヒーバンズを作った。この混合物を約37℃で一晩放置した。2個の練り生地はかなり異なっていた：ジンジベイン処理した練り生地の方が成形しやすいプラスチックに似ていた。マーガリン、砂糖、卵、重曹および卵を混ぜ、200℃で15分間調理した場合、得られたバンズは両方ともおいしい食味であった。しかし、熟練の料理人による盲験味覚試験では、軽く、口に入れたときによい食味で、後口はなめらかであり、かつ「スコーン」の特徴で、もう一方のバンズにみられた「重曹入り小麦粉」の味をわずかも有さないとして、ジンジベイン処理したバンズが選ばれた。
【０１９２】
（b）パン
ジンジベインと共にふるいにかけ、標準的な牛乳パンミックスに含めた小麦粉から作ったパンは、ずっときめが細かく均一な構造を有してジンジベインなしで作ったパンよりはるかに優れているとして味覚パネルにより選択された生産品を生み出した。
【０１９３】
（c）クレープ
1バッチについては原料であるひき割りトウモロコシ粉と共にふるったジンジベインおよび2番目のバッチについてはジンジベインなしでふるった粉を用いて標準的な調理法で“Mellow Yellow”ポレンタからひき割りトウモロコシ粉のクレープを作った。2バッチのバッターを調理前に37℃で1時間放置した。熟練の料理人が（盲験的に）クレープを調製し、一方の生地はクレープパンの上に並はずれてよく留まり、もう一方はクレープパンの上に保つことが常に困難であるという典型的なひき割りトウモロコシ粉のクレープの生地の特徴を示して、これら二つの生地が非常に異なることを調理中に報告した。さらに、2バッチのクレープを「盲験的に」味わうと、その差は非常に顕著であった。一方のバッチは非常に滑らかで均一でザラつきがないと報告されたが、もう一方はザラつきおよびムラのある構造を有してひき割りトウモロコシ粉のクレープに典型的であった。パネルは、堪能したひき割りトウモロコシ粉のクレープを食べたのは最初だと評価した。
【０１９４】
（d）オートムギ粥
沸騰した湯の代わりに、最初に冷たい水道水を加えたことを除き、オートムギを標準的な方法でかゆに調理した。1バッチはジンジベインを含有した。ジンジベインを有さないバッチとは対照的に、ジンジベイン入りのかゆは固い穀粒を有さず、全ての穀粒がゼラチン様になった。
【０１９５】
（e）実施例5のグルテンの危険のない生産品
上記実施例5に示した実験通りに調製したバターケーキ、悪魔のように黒いチョコレートトルテ、フランスパン、卵パスタ（スパゲティ）、市販の朝食用全粒ビスケットおよび市販のパン食品も、被験者達により非常においしいと分類された。
【０１９６】
実施例5fで加えたジンジャー抽出液を用いた市販のパンの試験は、4%までの追加の水で、練り生地の混合時間を10分間（基本処方）から8分間に減らし、ホイロ庫から出したときに20%までの高さの増加およびオーブンから出したときに3.8%までの高さの増加を有し、眼で測定したときに改善された色および食感を有し、パンの身の部分（焼成2日後に測定した）の色が2.2%だけ改善し、ニュートン単位で測定したパンの食感（焼成2日後に測定）は3.15（基本処方）から2.14に減少して、満足なパンを生み出した。
【０１９７】
これらの実施例は、調製中に穀物食品にジンジベインを含有させる結果、よりおいしく好ましい生産品がもたらされることを示す。
【０１９８】
実施例7
動物が食用にするための飼料の品質改善
ペットおよび商業動物用の飼料は、穀物、ダイズ、綿実粕、および動物副産物のような広範囲の供給源からのタンパク質を含む。動物飼料中の酵素は、飼料をよりよく利用する結果として、食料の栄養価を改善して汚染を減少する。全ての動物は、その動物自体に、または消化管のミクロフローラに生成される消化酵素を使用するが、飼料変換効率は100%ではない。いくつかの動物/飼料の組み合わせについて、飼料の25%までが消化されない。
【０１９９】
よって、レクチンおよびトリプシン阻害剤、ならびにアレルゲン性および不耐性エピトープのような抗栄養因子を破壊するために外因性酵素を使用する。それらの因子は多くの飼料原料に存在し、内因性酵素により破壊されない。これらの因子は、さもなければ正常な消化を妨害して動作の不良および自己免疫疾患に関連する食品不耐性反応を引き起こしうる。外因性酵素は、特に抵抗性の細胞壁に囲まれ、よって内因性酵素と接触不可能であるか、または動物が消化できない形態に結合しているかのいずれかである糖質、タンパク質および無機質の利用性も増加する。それらは、内因性酵素により通常は破壊されない原材料中の特異的化学結合も破壊することによって、より多くの栄養物を放出する。
【０２００】
特に若齢動物は、自己の消化系が未熟であることから外因性酵素の恩恵を受ける（"The current feed enzyme market and likely trends" in "Enzymes in Farm Animal Nutrition" Bedford, M.R.; Partridge, G.G. (eds) CABI Publishing Marlborough UK, 2001）。さらに、離乳時に肉の筋肉細胞が蓄積することから、予め消化された富タンパク質飼料を乳離れする動物に提供することが避けられなくなる。このための通常の原材料は、脱脂粉乳、ホエー粉および誘導体、血液および血漿生成物、加工魚肉、「低抗原」ダイズタンパク質、ならびに調理した穀物である。
【０２０１】
ダイズの主要貯蔵タンパク質であるグリシニンおよびβ-コングリシニンは、このマメ科植物を給餌された若齢ブタの腸に対する変化に関係しているとみなされているが（Li et al., J. Animal Sci. 69: 4062; 1992）、タンパク質レベルが高くコストが低いことが原因で、ダイズは依然として飼料に含まれ続けるであろう。これらのタンパク質の抗原性は、ジンジベインで飼料を予備消化することを介して抗原エピトープを開裂することによって除かれる。
【０２０２】
ダイズのトリプシン阻害剤は、給餌の前に破壊されるが、すい臓にプロリンリッチの分泌物を生成させ、同時に腸管内壁の細胞の損失を伴う（Partridge, "Considerations in the Formulation of Piglet Creep and Starter Feed" Technical Bulletin, American Soybean Association, 1997）。ジンジベインを用いた事前インキュベーションは、加水分解によりトリプシン阻害剤の減少も引き起こす。
【０２０３】
ジンジベインの溶液を室温または65℃までの温度でタンパク質源と混合して、飼料タンパク質を予備消化してから、他の原料に加えてペレットにする。後者の工程は時に高温で起こり、そのときジンジベインは不活性化する。または、動物に給餌する直前に乾燥粉末または溶液としてのいずれかの活性状態で乾燥飼料にジンジベインを加える。飼料の効率を改善することに追加して、ジンジベインは動物の健康全般を改善する。
【０２０４】
実施例8
イヌ飼料中のジンジベインの試験
市販の“Super Premium Adult Active”ドッグフードを使用して以下の試験を実施した。
【０２０５】
以下の結果から、そのドッグフードは“Super Premium”ドッグフードであるが、そのドッグフードに加えたジンジベイン粉末のような治癒力も代謝可能なエネルギーも有さなかったことが示される。主にトウモロコシ、鶏肉および乾燥卵生産品由来の粗タンパク質は、30%が保証される。
【０２０６】
合計18平方メートルに屋根を備え、6平方メートルの隔離した夜間犬舎を中に備える24平方メートルの安全な、コンクリートを打った個別の囲いにイヌを収容した。犬に給餌し監視する職員は、いつジンジベインが食餌に導入されるかも、いつジンジベインのレベルが変化したかも知らなかった。
【０２０７】
（a）試験1
この試験の目標は、両側股関節の大きな異常からの関節炎性疼痛を減少すること、ならびに股の問題を考慮して品種、齢および性別に関して適切なレベルに体重を増加することであった。
【０２０８】
試験したイヌは2.5歳のエアデールテリヤの雌であり、通常の飼料1日摂取よりも多く与えられていた（Adult Active 400g；体重20〜30kgの活動するイヌの正常量は260〜360g）にもかかわらず標準体重を約7kg下回っていた（体重18.3kg；標準体重25kg）。股関節の炎症が原因で、このイヌは朝に起きあがること、および通常の活動的な自己であることが徐々に困難になっていた。
【０２０９】
Adult Active乾燥飼料400gを1日目に開始してジンジベイン粉末（32mg）を毎日混合した。33日目から40日目の期間にジンジベイン16mgだけを加えて、低レベルがより少ない効果を有するかどうかを調べた。イヌの健康および動作に及ぼすジンジベインの任意の効果を決定するために、このイヌを定期的に監視した。このイヌの糞を集め、湿重量を毎日計量し、毎週の収集物を別々に風乾して、消化性率の任意の変化を決定した。このイヌの体重を計量し、獣医が0日目およびその後は試験の間に時々このイヌを診察した。
【０２１０】
このイヌは速やかに行動の変化を示し、走ったときに股関節の緩みは明らかであったが、関節炎性疼痛の明らかな徴候を有さなかった。このイヌは、朝に起きあがることを嫌がらずに全身行動がずっと活動的になった。このイヌの体重は図5Aに示すように0日目に18.3kgから87日目に23.3kgまで変化した。33日目から40日目までのジンジベインレベルの減少は体重増加に影響し、隣の犬舎の雌イヌがおよそ57日目に発情したとき、および被験イヌがおよそ78日目に発情したとき、これも体重増加に影響した。このイヌの消化性率（100［飼料重量-乾燥便重量］／飼料重量）は87日間で79%から約82%に増加した。飼料400gからのこのイヌの平均1日体重増加57.5gは、便重量での減少から予想される1日12gを大きく超えた。
【０２１１】
よって、飼料へのジンジベインの補充は、重症の関節異常に起因する関節炎性疼痛を低減することにより動物の全身健康に影響することができる。飼料の代謝可能なエネルギーを大きく増加して、たとえ同じ飼料および（通常よりも高い）同じレベルの飼料が12か月間食べられてきて動物の体重に大きな変化を有さなくても、動物が体重増加するのを可能にすることがさらにできる。
【０２１２】
（b）試験2
本試験では、目標は大きく迅速な体重減少および肛門からの出血を止め、このイヌの健康および体重を回復することであった。獣医の診断は、出血は多発性消化管潰瘍または癌のいずれかに起因し、肝臓に続発性腫瘍の可能性を有し重度の体重減少を引き起こしているというものであった。
【０２１３】
試験したイヌは、通常の体重が約17.5kgであった5歳ケリーブルーテリアである。その体重はその品種、齢および性別についての標準に近い。しかし、このイヌは以前と同様に過去12か月間Adult Active飼料200gを毎日食べ続けたが、突然体重が数週間で減少（約7kg）し、便に血液が認められ、その後重症の肛門出血が観察された。
【０２１４】
ジンジベイン粉末（16mg）をAdult Active乾燥飼料200gに4日目から21日目まで毎日加えた。ジンジベインのレベルを22日目から39日目まで32mgに増やし；40日目から47日目まで16mgに減らして、ジンジベインを再び1日32mgに増やして、ジンジベインレベルに何らかの依存性があるかどうかを調べた。
【０２１５】
0日目から、血液の何らかの徴候についてこのイヌの便を検査し、肛門をティッシュペーパーでぬぐい、血液を捜した。8日目から便を毎日集め、計量し、7日毎に収集物を別々に保管して風乾した。このイヌの全身健康および行動を毎日密接に監視し、このイヌの体重を計量し、獣医が試験の間に時々このイヌを診察した。
【０２１６】
食餌にジンジベインを加えてから（5日目）24時間以内に、出血は止まった。便にもティッシュペーパーにも血液の証拠は観察されず、それ以来出血の証拠はみられなかった。開放部は十分に治癒されて出血を止めたであろうが、原疾患および関連する体重減少は管理にさらに長くかかった。このイヌは毎日食餌全部を食べ続け、エネルギーにあふれて健康の改善を示した。このイヌの体重減少は遅くなり、体重は35日目に最低の9.6kgになり、64日目には増加し始め、隣の囲いの雌イヌが発情した約87日目には一時的に落ち込んだ。120日目までにこのイヌの体重は自己の最低体重から約4kgだけ増加した（図5B参照）。便の乾燥重量は顕著な傾向を示さなかった。
【０２１７】
この例では、ドッグフードへのジンジベインの補充は、重症の血液損失および体重減少を引き起こす消化管疾患の治癒を援助した。
【０２１８】
（c）試験3
本試験の目標は、ジンジベインの補充を加えて通常の飼料の75%を投与することによりイヌの維持エネルギー要求量を提供することであった。被験イヌは7歳ミニチュアシュナウツァーの雌である。このイヌは、体重6.5kg（標準体重は6.0〜6.5Kg）ですばらしい状態であった。このイヌは12か月間1日100gのAdult Active飼料を与えられた。試験期間の間、このイヌにAdult Active乾燥飼料75g（通常の飼料の75%）を給餌した。4日目にジンジベイン粉末を飼料に混合した：ジーナに4日目から32日目まで8mg、33日目から40日目まで4mg、41日目から57日目まで8mg、58日目から0mgを与えた。ジンジベインを加えずに減らした食餌によりこのイヌの状態が影響され始めた64日目に、このイヌを通常の食餌に戻した。
【０２１９】
このイヌを定期的に監視し；上記のように便を計量し、これらの試験の他の動物と同様に、獣医が時々このイヌを診察した。
【０２２０】
ジンジベインを加えずに飼料のレベルを減らした最初の3日間は、このイヌの体重は減少した。しかし、ジンジベインを加えると体重はそれ以上減少せず、体重は実際に増加し始めた。ジンジベインのレベルを半分に減らしたとき、このイヌの体重は再び減少したが、ジンジベインのレベルをもう一度増加すると体重は回復した。飼料からジンジベインを除くと、このイヌは健康状態の悪化および体重減少を示し、それは、全身状態の悪化が原因で63日目に試験を終了することが必要と考えたほどであった（図5C参照）。
【０２２１】
別のイヌについて類似した結果のセットを得た。
【０２２２】
したがって、イヌの体重1kgあたりジンジベイン約1mgを試料に加えるならば、かなり低レベルの飼料を使用してイヌの維持エネルギー要求量を達成できることが明らかである。
【０２２３】
実施例9
ニワトリ飼料中のジンジベインの試験
本実験では、目標は、ジンジベイン溶液で市販のニワトリ飼料を処理する（ニワトリ1kgあたりジンジベイン1mgを1日に食べる平均食品量に入れる）ことが、増加した生体体重と、枝肉重量、胸肉の収量、総タンパク質、脂肪および灰分、ならびに肉のおいしさのような他のいくつかのパラメータとに及ぼす効果を決定することであった。
【０２２４】
新たに孵化したニワトリを試験用に購入した。大部分は最初は黒/灰色で、黄色の点を有するものもあった。黄色のものもあり、黒い点を有するものもあり、さらに茶色のニワトリが1羽いた。それらは色のパターンが十分に異なることから、試験中に同定することが可能であった。同じ一般色のニワトリを箱に入れ、「盲験的選択により」屋内の二つの囲い1m×2.5mに分けた。一方の囲いは対照用であり、もう一方は処置したニワトリ用であり、どちらも十分な水の供給および4個の給餌トレイを有した。1匹だけの茶色のニワトリをジンジベイン処置用の囲いであった「赤の」囲いに入れた。孵化の約2時間後のおよそ午前11：30（1日目）に各ニワトリを計量した。その後、毎日およそ午前7：00および午後5：00にニワトリを計量し、20日目から各囲いで食べ残しの飼料の重量をこれらの時刻に1日2回計量した。各囲いは、ニワトリを確実に暖かく保つために床から適切な距離に設置した60ワット電球を有した。これらのニワトリに毎日24時間4個のトレイから自由に食べさせた（自由給餌）。
【０２２５】
試験に使用した市販の飼料を地域の生産業者から購入した。これらの飼料は、タンパク質含量が14から20%の範囲であった。これらの飼料を水で処理し、試験飼料にジンジベインを加えて1日あたりニワトリ1kgあたりジンジベイン2mgとした。
【０２２６】
ニワトリにコードを付け、それらのニワトリが目標体重範囲に達した後で加工した。凍結枝肉20羽（対照メンドリ5羽、対照オンドリ5羽、試験メンドリ5羽、および試験メンドリ5羽、生体重量および平均生体重量が合致）を胸肉収量、肉質および調理損失について分析した。その後、全てのデータの統計解析を行った。
【０２２７】
独立した担当者が、コードを付けたニワトリから体重が合致した対照および試験枝肉の対を選択し、別々のトレイで（試験1）または穴を開けたオーブンバッグに入れて（試験2）、ファン付きコンベクションオーブンで200℃（試験1）または175℃（試験2）でニワトリを並べてローストした。ニワトリが同程度の焼き具合に調理される前に各下腿肉の外周を測定し、味覚パネルにより肉を分析した。給餌試験全体に関するデータを以下に示す。
【０２２８】
（表２）性別の調整後および同じ初発生体重量に修正後の最終生体重量および枝肉重量に及ぼすジンジベインの効果に関する予測平均
2007522822.tif 000005
*Se：標準誤差；Prob：結果の対が同一である確率
【０２２９】
最終的な生体重量、脱羽後の重量および枝肉重量は、全てジンジベイン補充群（+Zing）で重量増加の傾向を示した。
【０２３０】
（表３）同じ枝肉重量に調整後の胸肉重量、pH、調理損失、肉汁損失、ピーク力および組成に及ぼすジンジベインの効果に関する予測平均
2007522822.tif 000006
*Se：標準誤差；Prob：結果の対が同一である確率
【０２３１】
ジンジベイン処置したニワトリは、同じ枝肉重量で比べた場合、対照よりも16g（6%）多い胸肉重量を有した。ニワトリ胸肉の三つの個別の肉について同じ傾向がみられた。これらの表の最初にある全体のデータセットを使用して、ジンジベイン処置したニワトリが対照よりも重い枝肉を産生する傾向が存在した。次に、これらの平均を使用して、ジンジベイン処置したニワトリおよび対照ニワトリについての胸肉重量を計算した。このとき上に参照した20本の凍結枝肉からのデータから計算した回帰式を使用した。ジンジベイン処置した枝肉重量1630.2gを有するニワトリ胸肉の予測重量は269.8（+/-7.1）であったが、枝肉重量1527.7gを有する対照ニワトリの予測胸肉重量は236.0gであった。これらのデータから、ジンジベイン処置の累積的な利益は、14%のオーダであると推定された。
【０２３２】
調理した胸肉に対するpHまたは剪断力に及ぼすジンジベイン処置の効果は存在せず、これはニワトリ胸肉にコラーゲンが欠如していることを反映していた。調理損失および肉汁損失は、ジンジベイン処置した飼料の方が損失が少ない傾向を示した。化学的脂肪の率を胸肉および枝肉の残り（皮なし）に関して測定し、処置したニワトリの方が脂肪が低い傾向を示した。タンパク質の率は処置されたニワトリの方が高い率の傾向であった。
【０２３３】
（表４）調理した肉の味覚試験
2007522822.tif 000007
nm not measured：測定せず
* 7/7；#4/4
【０２３４】
これらの味覚試験の結果は、上記データの組での傾向と一致し、同じ枝肉重量ではジンジベイン処置したニワトリの方がより低い調理損失（7%）およびより大きい調理後の胸肉（18%）を有し、また、より白い肉および少ない肉内部の脂肪も有した。上記味覚試験の試験官および類似したニワトリの対についての他の組の試験官は、ジンジベイン処置したニワトリの方がおいしく、脂肪が少なく肉汁が多く、より白い肉を示していると全員一致で決定した。
【０２３５】
本明細書における測定にわたり結果に一貫する傾向は、養鶏産業に明らかに関連する。
【０２３６】
実施例10
ウマ飼料へのジンジベインの試験
激しく訓練している人々および他の動物の免疫系は感作された状態になり、その結果、食品に対する不耐性反応がより一般的に重症になる。飼育された興行馬の高率が効率的に飼料を消化せず、腸内での遅い発酵および酸の形成に至る。便pHは排泄物により希釈された腸内酸性度の尺度を提供する。放牧馬は通常は中性の便を有するが、動物飼料を与えられている興行馬については、腸酸性度が増加し、未処置であればこれはそのウマに潰瘍形成および他の損傷を起こしうるし、それらの損傷はそのウマの全身健康および振るまいに影響する。
【０２３７】
この研究では、飼料への補充としてジンジャー絞り汁を使用して、便のような物質のpHを0.02pHまで測定するために設計された特別の電極を用いて、便pHを測定した。各ウマの毎日の便について5個のセットのpH値を記録した。サラブレッド馬数頭および自然の良好な消化速度を有する「温血」馬1頭（Claude）については+/-0.1pHの再現性を通常有した。以下の表にデータを記録する。
【０２３８】
動物の飼料に対して感受性であるウマは、補充なしに約6.4の便pHを有した。補充をその飼料に加えたとき、pHは7.0以上に増加した。ジンジャー抽出物を加えなかったとき、その日のpHは下がり、ジンジャー抽出物をもう一度加えると、pHは速やかに中性pHに増加した。「感受性の高い」ウマが動物飼料に接近せずに草の生えたパドックで休息するならば、便pHは中性になった。ブタゾリジンは腸酸性度を増加することが分かった。
【０２３９】
（表５）毎日のpHの結果
2007522822.tif 000008
G：  ジンジャー抽出液150mL加える
NG：  その日はジンジャー抽出物加えず
P：  草の生えたパドックに入り追加の飼料なし
1.  「温血」馬
2.  この日付の前にジンジャー抽出液を与えてきた
3.  ブタゾリジンを注射
4.  二倍用量のジンジャー抽出液（300mL）
5.  Cooperがワラビを食べるのを観察し、筋肉内注射によりケトプロフェン4.00を与えた。
【０２４０】
ジンジャー抽出物は、動物飼料を与えられている興行馬の腸が潰瘍形成および他の疾患状態に至りうる酸を生成しないことを確実にできると結論した。
【０２４１】
実施例11
ジンジベインによる凝血の分解
フィブリンおよびフィブリノーゲンは、動物に極めて重要な機能を有し、フィブリンはフィブリノーゲンから生成する。しかし、同時にこれらの二つのタンパク質は、例えば血栓症のような、よくみられる病気のいくつかの発生と関連している。
【０２４２】
フィブリノーゲンは分子量340,000Daを有する血漿糖タンパク質である。これは二量体タンパク質であり、それぞれの単量体ユニットはジスルフィド結合した鎖であるAα、Bβおよびγから構成され、二量体性三ノジュール構造を形成している（図4参照）。
【０２４３】
残基Aα50〜78、Bβ85〜114およびγ21〜48からなるE5のαらせんコイルドコイルドメインは、興味深い構造特性を有する。コイルドコイル配列は「ヘプタドリピート」を通常は特徴とし、このリピートでは3個目の次に4個目毎の残基が通常は無極性であり、コアに密に充填されている。しかし、E5ではコイルドコイルドメインに沿った中間の相同位置（Aα65、Bβ100およびγ36）に局在する各鎖のヘプタドリピートからの3残基欠失が1か所存在する。これらの欠失または「とぎれ（stutter）」は、密な充填を防止する。さらに、Bβ鎖のこのとぎれ領域では位置99にプロリンがあり、そこで屈曲が起こり、アルギニンがプロリンの前に来て、ジンジベインによる加水分解を可能にしている。
【０２４４】
E5フラグメントは、フィブリン凝血のトポロジーに関する情報を提供することから、関連している。2個のArg-Gly結合でのトロンビンによるフィブリノーゲンの内因性加水分解は2本のαN鎖からFpAを、かつ2本のβN鎖からFpBを遊離する。これら二つのFpAの遊離は、α鎖の位置19〜21にあるGly-Pro-Arg残基からなるEドメイン上に二つの正に荷電した「ノブ」の形成を招き、それは隣り合うフィブリン単量体のDドメイン上のγ鎖C末端内に予め存在する相補的な「穴」と自然に相互作用する（Hanna et al., V.J.Biochem., 23: 4681-4687; 1984）。FpBの遊離は、プロトフィブリル間の会合に寄与すると考えられるGHRノブを形成する（Laurent and Blomback, Acta Chem. Scand. 12: 1875-1877; 1958; Hantgan et al., "Fibrinogen structure and physiology" in "Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice" Colman, R.W.; Hirsh, J.; Marder, V.J.; Salzman, E.W. (eds) J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1994, pp 277-300; Muller et al., J. Mol. Biol. 174: 369-384; 1984）。いったんフィブリンポリマーが形成されると、それらは、血液凝固第XIIIa因子により触媒される過程であるトランスグルタミン化により共有的に安定化される。
【０２４５】
γ-γ架橋フィブリン分子は、コイルドコイル領域に局在するLys-XおよびArg-X結合の加水分解を介してプラスミンにより分解され、Aα鎖の隆起の中の一つのLys-Met結合が加水分解される（上記Hantgan et al., 1994）。架橋の程度に依存して、これはコイルドコイル領域内から単量体性DおよびEドメイン、二量体性Dドメイン（「D二量体」）、Aα鎖の隆起、Bβ1〜42、Bβ15〜42および低分子量ペプチドを生成する（上記Hantgan et al., 1994）。
【０２４６】
フィブリノーゲンおよびフィブリンはプロリン残基に富み、親水性残基が隣接する。ジスルフィド橋を減らすために2-メルカプトエタノールを加えた精製ヒトフィブリノーゲンのジンジベインによる分解のSDS-PAGE電気泳動研究は、60〜52KDaの領域に3本のバンドを示した個別のα、βおよびγ鎖がそれぞれ完全に分解したことを示した。
【０２４７】
さらに、ジスルフィド橋を破壊するために2-メルカプトエタノールを加えたヒト架橋フィブリンのジンジベインによる加水分解（室温で一晩のインキュベーション）のSDS-PAGE研究は、γ-γ架橋鎖からのバンドが完全に移動したことを示している。加水分解されたフィブリンについてのゲル中の優占バンドは40から50KDaの間である。重合した架橋フィブリンは凝血を形成し、それによって血栓症を引き起こす。これらの結果は、ジンジベインが効率的に凝血を分解できることを実証している。
【０２４８】
さらに、フィブリノーゲンと、可能性があることにはプロトロンビンのような血液凝固カスケードの他の構成員を加水分解することによって、ジンジベインは凝血の形成を防止できる。これは、ジンジベインが表6に示すように新鮮クエン酸血漿についてのプロトロンビン時間アッセイに重大な効果を有する能力により示される。
【０２４９】
（表６）組織トロンボプラスチンを使用したプロトロンビン時間アッセイによる通常クエン酸血凝固時間
2007522822.tif 000009
【０２５０】
これらの結果は、おそらく1ng/mLという低いレベルでジンジベインが血中の凝血のレベルを制限できたことを示す。
【０２５１】
実施例12
ジンジベインは炎症を低減する
フィブリンおよびフィブリノーゲンは炎症と密接に関連し、炎症は組織の傷害または破壊に対する身体の防御応答と広く定義される。組織損傷部位に直ちに発生するトロンビンおよび第XIIIa因子は、その部位で血管内および血管外のフィブリノーゲンを架橋したフィブリン変換する。フィブリンの網は血球を捕捉し、その部位からの血液の損失を限定し、例えば血小板、顆粒球、単球およびリンパ球のような炎症細胞をその部位に留める。それらの細胞はさもなければ循環しているであろう。
【０２５２】
これらの細胞および内皮細胞の一部は外表面に細胞接着分子（CAM）を発現し、CAMは活性化するとフィブリンおよびフィブリノーゲンに顕著な親和性を有する。血小板CAMであるインテグリン（αIIbβ3）は、フィブリンおよびフィブリノーゲンのγC鎖の最終12残基（Peerschke, Semin Hematol. 22: 241-259; 1985）と、おそらくフィブリンおよびフィブリノーゲンのAα鎖内のArg-Gly-Asp配列（Calvete, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 208: 346-360, 1995）とを認識する。好中球、単球およびリンパ球は、同様にインテグリンである少なくとも二つの関連するCAMを発現する。その一つであるαMβ2は、フィブリンおよびフィブリノーゲンのDドメイン内のγ190〜202およびγ377〜395を認識する（Ugarova et al.,J. Biol. Chem. 273: 22519-22527; 1998）；もう一方のαχβ2は、フィブリンのαN鎖でGly-Pro-Arg配列を認識する（Loike et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1044-1048; 1991）。内皮細胞はフィブリンおよびフィブリノーゲンに対する二つの受容体を発現する：フィブリンおよびフィブリノーゲンのAα鎖内のArg-Gly-Aspを認識するインテグリンαvβ3（Hawiger, "Adhesive interactions of blood cells and the vascular wall" in "Hemostasis and Thrombosis: Principles and Clinical Practice" Colman, R.W.; Hirsh, J.; Marder, V. J.; Salzman, E. W. (eds) J.B. Lippincott Company, Philadelphia, 1994, pp 762-796）、および免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの構成員である細胞内接着分子1（ICAM-1）は、γ117〜133を認識する（Languino et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1505-1509; 1995）。
【０２５３】
したがって、炎症部位内でフィブリンおよびフィブリノーゲンは様々な細胞と接着でき、それらの細胞を炎症部位に保つ。本発明によると、ジンジベインによるフィブリンおよびフィブリノーゲンの分解により、炎症に及ぼすフィブリンおよびフィブリノーゲンのこの効果を弱めることができる。
【０２５４】
実施例13
ジンジベインは皮膚癌を除去する
ジンジベインをクリーム基剤に入れてヒト日光性角化症および初期の基底細胞癌に局所適用すると、角化症は瘢痕を残さずに破壊され、初期基底細胞癌から鱗屑性組織は除去される。以下の五つの研究および他の類似の実験は、ジンジベインのクリーム処方物が皮膚癌の強力で簡便な処置を構成しうるという証拠を提供する。
【０２５５】
（a）患者：DG
ジンジベインクリーム処方物は、以下を含む：成分として水、グリセリン10%、セテアリルアルコール10%、ショウガ根抽出物（ジンジベイン）0.3%、鉱物油、ワセリン、セテアレス20。
【０２５６】
病歴および処置に関する全ての観察は、患者のケアにあたる登録看護士によって提供された。7年間で切除により3個の皮膚病変が除去された。腕および手には皮膚病変は認められなかった。6年後の1月／2月に、鼻の（向かって）左側に皮膚病変が最初に観察された。それはバラの茂みによるかき傷から始まった。6か月後の8月に始めた左側の病変の処置を開始して初めて、首筋および鼻の（向かって）右側に別の病変が明らかになった。
【０２５７】
この患者の病歴は以下の通りであった：
3月：病変がさらに拡大、ぬぐい標本の採取、抗生物質の処置後の病変は小さな斑点に消散した。
5月：大きな赤くなった領域となって間欠的な出血エピソードを伴って病変が再び出現した。
6月：6月前半に皮膚科医がチェックし、切除および移植に関して7月後半に再評価すると決定した。
7月：この段階でさらなる成長なし。皮膚科医は患者の年齢を考慮して、さらなる評価および処置について病変を放置した。右手の甲の盛り上がった皮膚領域および左前腕の赤くなった領域が7月後半までに出現した。
【０２５８】
登録看護士によってジンジベインクリームを1日1回鼻の上面、右手の甲および左前腕に適用した。処置を8月に開始した。左前腕の病変は3週間以内に治癒し、皮膚は1か月後に正常な色調および色に達した。およそ10週間後にクリームのチューブが空になったときまでに、右手の甲の病変は治癒して、小さな硬化した領域がまだ存在した。この硬化した領域は2週間以内に消失し、その皮膚は正常の色調および色を帯びた。クリームのチューブが空になったときまでに鼻の（向かって）左側の病変も完全に治癒し、首筋および（向かって）右側の病変だけがまだ盛り上がった小さな領域を有した。
【０２５９】
結論として、これらの皮膚癌をジンジベインを0.3%含有するジンジベインクリームで1日1回処置すると、3か月以内にそれらの病変は治癒した。1日2回の適用が普通は推奨されるが、看護士はこの症例では1日1回の処置しか提供できなかった。それでもなお結果は明らかであった。
【０２６０】
（b）患者：MS
ジンジベインパラフィンクリーム処方物は、成分として以下を含んだ：水、グリセリン9%、軽質流動パラフィン9%、軟質白色パラフィン4.5%、ショウガ根抽出物（ジンジベイン）0.3%、ヒドロキシ安息香酸メチル0.2%、ジクロロベンジルアルコール0.1%。
【０２６１】
この患者の病歴は以下の通りであった。
10月：皮膚科医が顔の側面の日光性角化2個を低温除去した。しかし、処置後に傷は完全には治癒せず、表面のざらつきを示し続けた。
12月：斑点が赤くなり大きさを増し始めた。ジンジベインパラフィンクリームをこれら2個の斑点に1日3回適用した。
2月：処置を開始したとき上の斑点は直径約3.5mmであり、約3mm盛り上がっていた。その隣の下の斑点は直径約4.5mmであり約2mm盛り上がっていた。
上の斑点：1週間後に上の斑点は肉眼で縮んで盛り上がり始め、表面が固くなってから剥がれ落ちた。4週間目までに角化は消失し、治癒した皮膚が残った。
下の斑点：下の斑点は同じ変化をたどり、上の斑点の10日後に消失し、これも治癒した皮膚が残った。
【０２６２】
皮膚科医はその後3月および10月に斑点の領域を診察し、角化症の徴候を見出さなかった。
【０２６３】
（c）患者：FH
患者FHは腕および脚に基底細胞癌の病歴を有した。これらの癌は低温で定期的に除去された。
【０２６４】
ジンジベインパラフィンクリームを数個の初期基底細胞癌に1日2回、4〜6週間適用した。ジンジベイン処方物は以前の症例で挙げたのと同じ成分を含んだ。赤くなった鱗屑性の盛り上がった斑はその期間の間に大きさが減少し、鱗屑性も盛り上がった斑も有さない、皮膚にずっと淡い赤色を有するかまたは全く赤くなっていないかのいずれかであるきれいな皮膚が残った。
【０２６５】
（d）患者：DP
患者DPは基底細胞癌の医学病歴の記録を有し、過去に4回切除を受け、最も最近の鼻での切除は不成功で、広範囲放射線療法が必要であった。過去10年間にかけて、基底細胞癌の前駆体である鱗屑性皮膚斑および「びらん」の除去に6〜12か月毎に液体窒素処置を受ける必要があった。
【０２６６】
ジンジベインパラフィンクリーム（上記のような）を1日2回6週間、鱗屑性皮膚の大規模な斑を有する額の右側の領域に適用した。処置後に鱗屑の徴候はなく、その領域にそれ以来（6か月間）新たな鱗屑性斑は出現していない。
【０２６７】
（e）患者：FNB
患者FNBは非常に顔色がよく、長年にわたり顔の日光性角化を除去するために定期的な低温療法（液体窒素処置）を受けてきた。2003年4月にそばかすの数が非常に多いことから、皮膚科医は低温療法を使用するのは不適切であろうと決定し、5-フルオロウラシルクリーム（Efudix）を使用した化学療法に処置を変え、Efudix療法に普通にみられる副作用である重度の不快感および（一時的な）美観の損ないを軽減するために、合成コルチコステロイドAdvantanを併用した。この処置（18日間）で角化はどんどん炎症で赤くなり、鱗屑性になり、18日間の治療の後でコルチソン処置にかかわらず副作用は重症度を増し続けた。
【０２６８】
ジンジベインの抗炎症性および抗癌性を試験するために、顔の片側にジンジベイン処置を試し、顔のもう片側にコルチソンクリームを使用してジンジベインパラフィンクリームの方がEfudix処置した角化症から病変を速やかに治癒でき、日光性角化症の発現を長期間予防できるかどうか調べることを引き受けてもらうようFNBを招いた。Efudix療法の完了後の2003年4月25日に開始して、顔の左側（頬、鼻、額および頤）にジンジベインクリームを1日3回、顔の右側にコルチソンクリームを適用した。
【０２６９】
0日目：処置を開始する前に左側の頬を写真撮影した。
2日目：2日目までに顔の左側の赤い鱗屑性角化は大きさおよび赤みが減少し、鱗屑の徴候はほとんどなかったが、顔の右側の病変は悪化を続けた。
5日目：この傾向は続き、5日目の結果として患者は右側へのコルチソンクリームの使用を止め、顔の両側にジンジベインクリームを適用した。
9日目：顔の左側は皮膚に数個の淡いピンク色の斑を示したが、盛り上がった角化も鱗屑性角化も、Efudix処置による他の任意の副作用もはっきりとは見られなかった。右側も顕著な改善を示した。
15日目：FNBは角化症が効果的に治癒し、ジンジベイン処置によりEfudix療法の副作用が除去されたことに気づいた。
16および17日目：FNBの顔を診察し、ほとんど全ての角化が治癒し、病変も赤みの徴候も有さない正常な皮膚が残っていることに気づいた。少数の病変について数個の淡いピンク色の斑が残り、顔が全くきれいになるまでFNBがジンジベインクリームを適用し続けることが勧められた（2003年5月19日）。
【０２７０】
FNBは腕および顔の潜在的な日光性角化の徴候に対してジンジベインクリームを使用し続け、完全な成功を収めている。
【０２７１】
実施例14
ジンジベインは細胞の捕集を援助する
細胞膜タンパク質の細胞外ドメインは、細胞へのシグナルのための受容体分子として、または様々な目的の細胞接着分子（CAM）として作用することを含めた一連の機能を有する。これらの分子のいくつかの発現またはこれらの分子の突然変異は、癌のような特定の疾患と関連している。フィブリンは内在性膜タンパク質ではないが、生理化学的吸着または特異的CAMとの結合のいずれかを介して細胞表面に結合する。ジンジベインの適用の一つは、吸着したフィブリンを分解して、培養細胞が容器に接着しないようにして効率的に捕集できるようにすることである。これにはトリプシンが通例使用されるが、それはより一般的なプロテアーゼ活性であることから、細胞表面からフィブリンを取り除く以外に、細胞が機能するのに必要である理想的な細胞膜タンパク質も開裂しうる。
【０２７２】
ジンジベインの非常に大きなプロテアーゼ特異性は、トリプシンの代用として使用されることを可能にする。ジンジベインは細胞表面からフィブリンの効率的な除去を示すが、細胞膜タンパク質が加水分解のために露出した適切なプロリン残基を有さない限り、それらの細胞膜タンパク質に対するリスクは低い。
【０２７３】
他の古典的カドヘリンと同様に、E-カドヘリンは、細胞間接着を仲介する一回貫通型1型細胞表面糖タンパク質である。E-カドヘリンは上皮組織にみられる主なカドヘリンである；集密な上皮細胞単層では、E-カドヘリンはアドヘレンスジャンクションに密集してみられ、かつ細胞が相互に接着している外側面にわたり散在性にみられる。
【０２７４】
上皮細胞（例えばMCF-7、MDCK）を定期的に継代しなければならない標準的な組織培養法に関して、トリプシンおよびEDTAの組み合わせを用いた処置が細胞を分離するために一般的に使用される。この組み合わせは、少なくとも部分的にはE-カドヘリンを開裂することによって細胞間接触を崩壊させることによって作用する。注目すべきことには、トリプシンによるE-カドヘリンの開裂は、トリプシン活性および細胞外カルシウム濃度の両方に感受性である。カドヘリンエクトドメインはカルシウム配位部位を保有し、そのコンホメーションはカルシウム感受性である。
【０２７５】
カルシウムの存在下で、カドヘリンエクトドメインは剛性のロッド様配向をとり、低濃度の結晶トリプシンに耐性である。しかし、細胞外カルシウムをキレートすると、エクトドメインは感受性になる（例えば0.05%w/v結晶トリプシンに）。
【０２７６】
これらの実験について、細胞カドヘリンを保存する条件下で個別の上皮細胞を単離することが望まれた（これはカドヘリンが補給される日常的な細胞継代とは全く独立している）。これは、通常の結晶トリプシンカクテル（0.05%）およびカルシウムを使用すると全く困難でありうる。少なくともその一部の原因は、上皮細胞がカルシウム非依存的デスモソームを形成していることである。細胞はシート状またはクラスター状でのみ単離されることが多く、それらをさらに分離するには（剪断損傷が付随する）激しいすりつぶしが必要である。したがって、代用プロテアーゼとしてジンジベインを試用した。
【０２７７】
2mM CaCl2（pH7.4）を補充したハンクス塩溶液に希釈した一連のジンジベイン濃度（0〜5mg/ml）を試験した。MCF7哺乳動物上皮細胞（内因性E-カドヘリンを発現する高分化乳癌系）を集密まで成長させ、最大10分間ジンジベインに曝露した。目視検査により高濃度（2〜5mg/ml）でインキュベートした細胞は5分以内に分離した。低濃度では良好な分離が10分以内にみられた。遠心分離により細胞を収集し、E-カドヘリンの総発現をウエスタンブロットにより評価した。10分間のインキュベーション後にジンジベイン処理試料のどれにも総カドヘリンレベルの変化が観察されなかった。次に、細胞がカドヘリン被覆支持体上で接着および伸展する能力によりカドヘリンの機能的状態を評価した。これらの研究では、1mg/mlジンジベインに10分間曝露することにより細胞を単離した。これらの単離された細胞の接着および伸展はすばらしく、カドヘリンの機能的反応能が保存されたことが示唆された。
【０２７８】
実施例15
ジンジベインはウイルスを阻害する
インフルエンザウイルスのノイラミニダーゼおよびヘマグルチニンのようなウイルス細胞膜タンパク質はプロリンリッチであり、ジンジベインによる加水分解に対する多数の部位を有する。これらのタンパク質は感染過程に不可欠である。これらの開裂はウイルスの感染および増殖を阻害する。
【０２７９】
蚊媒介性ウイルスであるロス川ウイルス（Ross River Virus/RRV）を10-5および10-6の希釈で用いて、ウイルスに対する薬の阻害活性を試験するための抗ウイルス薬アッセイをジンジベインに関して使用した。ウイルスを0.020mg/mLのジンジベインと混合し、pH7.2で2時間インキュベートさせた。これをVero細胞の集密単層に加えた。ウイルスが生成したプラークを計数した。
【０２８０】
（表７）Vero細胞においてジンジベイン（0.020mg/mL）と共にインキュベートしたロス川ウイルスのプラークアッセイ
2007522822.tif 000010
【０２８１】
より高濃度のジンジベインをこの種のアッセイに使用できなかった。この種のアッセイは、ガラス表面に接着している細胞に依存しており、ジンジベインはVero細胞のような細胞を表面から離して丸めるからである。0.02mg/mLのジンジベインは80%までRRVを阻害した。
【０２８２】
当業者は、本明細書に記載した発明が、具体的に記載したもの以外の変形および変更に影響を受けやすいことを認識しているであろう。本発明はそのような変形および変更の全てを含むものとする。本発明は、本明細書に参照または指示された全ての段階、特性、組成物および化合物も個別にまたは集合的に含み、前記段階または特性の任意の二つ以上の任意のおよび全ての組み合わせも含む。
【０２８３】
参考文献
2007522822.tif 000011
2007522822.tif 000012
2007522822.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】ジンジベインの構造を示した図で、結晶軸単位セル内、二方向に、円筒形で表された螺旋ドメインおよび平坦な方形で表されたβシートドメインを持つ分子が4つあるのが分かる。サッカライド部分の位置も示す。（Choi et al., Biochem. 38:11624-11633, 1999）。
【図２】アゾコラーゲンをコラーゲンとした時の、温度別のジンジベイン加水分解活性を示した図。ジンジベインの活性はy軸上の単位時間当たりに放出されたA520単位として表されている。温度はx軸に示した。
【図３】オーストラリア食肉標準試験（Meat Standard Australia Trials）を示す図。3団体180名のヒトによる試験は、North Queensland産20頭の100% Brahman牛の肉質について、ジンジベインで処理したものと未処理（対照）の同一部位の筋肉を用いて評価した。「Tend」はウシ全体で平均した柔らかさのスコアであり、各人が0〜100のスコアを付ける。「Juice」は多汁性のスコアであり；「Oall」は総合的な嗜好性であり、それぞれ軟らかさと同様の方法で平均化する。MQ4は、MSAが肉の総合的等級付けをおこなうために使用している4つのパラメータに対する重み付けスコアである。
【図４】フィブリノーゲン分子の三節構造を絵で表した図。（Retzinger, 2000参照; http://oz.uc.edu/〜retzings/fibrin ().htm）。フィブリノーゲンはダイマー型の血漿タンパク質で、それぞれのモノマーユニットがジスルフィド結合した鎖Aα、Bβおよびγから構成されている。アミノ末端側のAαの16残基およびBβの14残基はフィブリノペプチドA(FpA)およびB(FpB)とそれぞれ呼ばれている。ダイマーは、11のジスルフィド結合により6つの鎖がまとめられている球状ドメイン（いわゆるジスルフィドまたはEノット）を形成しているアミノ末端鎖を持つ450オングストロームの長さの「ロープ」であり、Bβのカルボキシル末端鎖およびγ端部は球状Dドメイン内にあるが、Aαのカルボキシル末端は中央Eドメインに戻るように伸びている。α-Cドメインを除いて、球状ドメイン間の領域はα-螺旋コイルドコイル構造を形成している。
【図５】図5A〜5Cは、ジンジベインを補給した食餌を与えた時の、動物（イヌ）の体重の経時変化を示す図。（A）体重が0日の18.3kgから87日目に23.3kgに変化した2.5歳の雌のエアデールテリア；（B）5歳の雄のケリーブルーテリア；体重は最低値から120日目までに約4kg増加した；（C）7歳の雌のミニチュアシュナウザーに見られた、飼料へのジンジベイン補給の追加および除去と相関した体重の変動。追加のデータおよび情報については実施例7を参照せよ。
【図１】
2007522822.tif 000014
【図２】
2007522822.tif 000015
【図３】
2007522822.tif 000016
【図４】
2007522822.tif 000017
【図５Ａ】
2007522822.tif 000018
【図５Ｂ】
2007522822.tif 000019
【図５Ｃ】
2007522822.tif 000020
【配列表】
2007522822000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月24日(2006.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における食物不耐性を軽減または取り除くのに有効な量での、食物の処理におけるジンジベイン（Zingibain）の使用。
【請求項２】
前記の量が食物の嗜好性を上げるためにさらに有効である、請求項1記載の使用。
【請求項３】
食物が、穀物、マメ、ナッツまたは乳製品を含有する食物である、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
穀物が、小麦、オートムギ、大麦、ライ麦、モロコシ属、またはトウモロコシである、請求項2または3記載の使用。
【請求項５】
食物が、ベーカリー製品、朝食用シリアル、パスタ、またはスナック食品である、請求項1または2記載の使用。
【請求項６】
ベーカリー製品が、パン、ケーキ、マフィン、クランペット、イングリッシュマフィン、ピザ生地、ビスケット、クッキー、ドーナツ、スコーン、パンケーキ、ホットケーキ、およびバンを含むリストより選択される、請求項5記載の使用。
【請求項７】
製造効率の向上に有効な量での、穀物からのアルコール製造におけるジンジベインの使用。
【請求項８】
食物が動物用食品である、請求項1〜4いずれか一項記載の使用。
【請求項９】
以下の段階を含む、切断されたグルテンによりベーカリー製品を調製するための方法：
a）グルテンの切断に有効な量のジンジベインを含む添加物とベーカリー製品の成分とを混合し、さらなるベーカリー製品の成分と混合し、練り生地または混合物または生地を形作る段階；
b）必要に応じて、練り生地または混合物または生地を寝かせる段階；および
c）必要に応じて練り生地を細分し、練り生地または混合物または生地を成形し、焼いてベーカリー製品を形作る段階。
【請求項１０】
ベーカリー製品が、パン、ケーキ、マフィン、クランペット、イングリッシュマフィン、ピザ生地、朝食用シリアル、ビスケット、クッキー、ドーナツ、スコーン、パンケーキ、ホットケーキ、およびバンを含むリストより選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
請求項9または10のいずれか一項に従って製造したベーカリー製品。
【請求項１２】
ベーカリー製品が、パン、ケーキ、マフィン、クランペット、イングリッシュマフィン、ピザ生地、ビスケット、クッキー、ドーナツ、スコーン、パンケーキ、ホットケーキ、およびバンを含むリストより選択される、請求項10記載のベーカリー製品。
【請求項１３】
約1%〜約5%の量である水分含有率を増加させるのに有効な量のジンジベインで処理するかまたはそれを含む、食物または食物成分。
【請求項１４】
食物が穀物含有食物またはスナック食品である、請求項13記載の食物。
【請求項１５】
食物がパスタである、請求項13記載の食物。
【請求項１６】
穀物含有食物がベーカリー製品である、請求項14記載の食物。
【請求項１７】
ベーカリー製品が、パン、ケーキ、マフィン、クランペット、イングリッシュマフィン、ピザ生地、ビスケット、クッキー、ドーナツ、スコーン、パンケーキ、ホットケーキ、およびバンを含む群より選択される、請求項16記載の食品。
【請求項１８】
ベーカリー製品がパンであり、ここでパンが向上した舌ざわり、および／またはクラストを有している、請求項16記載の食物。
【請求項１９】
被験者における食物不耐性を軽減または取り除くのに有効な量のジンジベインで処理するかまたはそれを含む、食物または食物成分。
【請求項２０】
小麦粉および全穀粒を含む群から選択される、請求項19記載の食物成分。
【請求項２１】
食物が動物用食品である、請求項19記載の食物。
【請求項２２】
食物が、対応する未処理の食物と比べて、適切な母集団に対し減少したアレルゲン性を有する、請求項13〜21いずれか一項記載の食物。
【請求項２３】
食物または成分が、そのように処理されていない食物または成分に比べて、増大した品質保持期間を有する、請求項13〜21いずれか一項記載の食物。
【請求項２４】
食物が、そのように処理されていない食物に比べて、増大した栄養価かつ／または増大した吸収性を有する、請求項13〜21いずれか一項記載の食物。
【請求項２５】
被験者における食物不耐性の処置における、薬物の製造のためのジンジベインの使用。
【請求項２６】
食物不耐性がグルテン不耐性である、請求項25記載の使用。
【請求項２７】
グルテン不耐性がセリアック病である、請求項26記載の使用。
【請求項２８】
ジンジベインの治療有効量をヒトに投与する段階を含む、グルテン不耐性またはセリアック病を処置する方法。
【請求項２９】
セリアック病のようなグルテン不耐性、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、および/またはクローン病からなる群より選択される炎症性疾患の治療のための薬物の製造におけるジンジベインの使用。
【請求項３０】
セリアック病のようなグルテン不耐性、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、または病原因子による感染症からなる群より選択される炎症性疾患の治療のための薬物の製造におけるジンジベインの使用。
【請求項３１】
病原因子がウイルス、細菌、および寄生体を含む群より選択される、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
癌の治療のための薬物の製造におけるジンジベインの使用。
【請求項３３】
プリオンタンパク質の切断に有効な量での、肉および肉派生品の処置におけるジンジベインの使用。
【請求項３４】
フィブリノーゲンの切断に有効な量での、細胞の捕集におけるジンジベインの使用。
【国際調査報告】
2007522822.tif 000021
2007522822.tif 000022
2007522822.tif 000023
2007522822.tif 000024