(57)【要約】骨髄移植のための臍帯血由来造血幹細胞上のセレクチンリガンドのインビトロでのフコシル化の方法が開示される。この方法において、有効量のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（例えば、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ）が、臍帯血由来造血幹細胞を処理して、非機能的ＰＳＧＬ−１または細胞表面上の他のリガンドを、セレクチン（特に、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチン）を結合する機能的形態に変換するためにインビトロで使用される。この処理された細胞は、このような治療の必要がある患者において骨髄を再構成するにあたって、増強された有効性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＳＣを処理する方法であって、該方法は、以下の工程：
一定量のＨＳＣ、少なくとも、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはその発現が減少したＨＳＣの一部を提供する工程；および
該一定量のＨＳＣをインビトロで、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理して、処理されたＨＳＣを形成する工程であって、ここで該処理されたＨＳＣは、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンへの増強された結合を有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、前記表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはその発現が減少したＨＳＣの一部は、減少した骨髄ホーミング能力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該ＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト臍帯血は、未分画量のヒト臍帯血である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該ＨＳＣは、末梢血に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記末梢血は、未分画量の末梢血である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該ＨＳＣは、骨髄に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記骨髄は、未分画量の骨髄である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、前記表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはその発現が減少したＨＳＣの一部は、非フコシル化グリカンまたは非フコシル化Ｏ−グリカンを有するＰＳＧＬ−１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、前記表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはその発現が減少したＨＳＣの一部は、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧＩｃＮＡｃを含み、かつ該ＧｌｃＮＡｃへのα１，３結合のフコースが存在しないかまたは適切なフコシル化を欠く他のグリカンを含む、コア−２Ｏ−グリカンを有するＰＳＧＬ−１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記一定量のＨＳＣを処理する工程において、前記処理されたＨＳＣの少なくとも５０％は、Ｐ−セレクチン結合アッセイにおいて所定の蛍光閾値を超えるＰ−セレクチン結合蛍光を有するか、またはＥ−セレクチン結合アッセイにおいて所定の蛍光閾値を超えるＥ−セレクチン結合蛍光を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記一定量のＨＳＣを処理する工程において、前記α１，３フコシルトランスフェラーゼは、α１，３フコシルトランスフェラーゼＩＶ、α１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ、またはα１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一定量のＨＳＣを処理する工程において、前記フコースドナーは、ＧＤＰ−フコースである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＳＣの組成物であって、以下：
臍帯血に由来し、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはその発現が減少したＣＤ３４＋ＨＳＣであって、ここで該ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも１０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、ＣＤ３４＋ＨＳＣ；および
薬学的に受容可能なキャリア、
を含有する、組成物。
【請求項１５】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも２５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも５０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも７５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも９０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも９５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
血液学的疾患またはＨＳＣの移植を要する他の状態を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、一定量の請求項１４に記載の組成物を、該血液学的疾患またはＨＳＣの移植を要する他の状態を有する被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記血液学的疾患は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄形成異常、慢性骨髄性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、または鎌状赤血球貧血のうちの１つである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
血液製剤であって、以下：
ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−として特徴づけられる細胞を含むヒトＨＳＣの集団であって、ここで該ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣの少なくとも１０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、ヒトＨＳＣの集団、
を含む、血液製剤。
【請求項２３】
前記ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣの少なくとも２５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項２４】
前記ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣの少なくとも５０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項２５】
前記ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣの少なくとも７５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項２６】
前記ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣの少なくとも９０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項２７】
前記ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣの少なくとも９５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項２８】
前記ヒトＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来する、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項２９】
前記ヒトＨＳＣは、末梢血由来である、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項３０】
前記ヒトＨＳＣは、骨髄由来である、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項３１】
薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルをさらに含む、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項３２】
遊離のフコシルトランスフェラーゼまたは支持体に結合したフコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項２２に記載の血液製剤。
【請求項３３】
以下の工程：
一定量のＨＳＣ、少なくとも、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはその発現が減少したＨＳＣの一部を提供する工程；および
該一定量のＨＳＣをインビトロで、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理して、処理されたＨＳＣを生成する工程であって、ここで該処理されたＨＳＣの少なくとも１０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、工程、
を包含する方法により生成される、血液製剤。
【請求項３４】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも２５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項３５】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも５０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項３６】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも７５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項３７】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも９０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項３８】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも９５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項３９】
前記一定量のＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項４０】
前記一定量のＨＳＣは、末梢血に由来する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項４１】
前記一定量のＨＳＣは、骨髄に由来する、請求項３３に記載の血液製剤。
【請求項４２】
ＨＳＣを処理する方法であって、該方法は、以下の工程：
一定量のＨＳＣを提供する工程；および
該一定量のＨＳＣをインビトロで、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理して、処理されたＨＳＣを形成する工程であって、ここで該処理されたＨＳＣは、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンへの増強された結合を有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該一定量のＨＳＣの一部は、減少した骨髄ホーミング能力を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該ＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ヒト臍帯血は、未分画量のヒト臍帯血である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該ＨＳＣは、末梢血に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記末梢血は、未分画量の末梢血である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該ＨＳＣは、骨髄に由来する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記骨髄は、未分画量の骨髄である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該一定量のＨＳＣの一部は、非フコシル化グリカンまたは非フコシル化Ｏ−グリカンを有するＰＳＧＬ−１を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５１】
前記一定量のＨＳＣを提供する工程において、該一定量のＨＳＣの一部は、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧＩｃＮＡｃを含み、かつ該ＧｌｃＮＡｃへのα１，３結合のフコースが存在しないかまたは適切なフコシル化を欠く他のグリカンを含む、コア−２Ｏ−グリカンを有するＰＳＧＬ−１を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記一定量のＨＳＣを処理する工程において、前記処理されたＨＳＣの少なくとも５０％は、Ｐ−セレクチン結合アッセイにおいて所定の蛍光閾値を超えるＰ−セレクチン結合蛍光を有するか、またはＥ−セレクチン結合アッセイにおいて所定の蛍光閾値を超えるＥ−セレクチン結合蛍光を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項５３】
前記一定量のＨＳＣを処理する工程において、前記α１，３フコシルトランスフェラーゼは、α１，３フコシルトランスフェラーゼＩＶ、α１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ、またはα１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記一定量のＨＳＣを処理する工程において、前記フコースドナーは、ＧＤＰ−フコースである、請求項４２に記載の方法。
【請求項５５】
ＨＳＣの組成物であって、以下：
臍帯血に由来するＣＤ３４＋ＨＳＣであって、ここで該ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも１０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、ＣＤ３４＋ＨＳＣ；および
薬学的に受容可能なキャリア、
を含有する、組成物。
【請求項５６】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも２５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも５０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも７５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも９０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ＣＤ３４＋ＨＳＣの少なくとも９５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項６１】
血液学的疾患またはＨＳＣの移植を要する他の状態を有する被験体を処置する方法であって、該方法は、一定量の請求項５５に記載の組成物を、該血液学的疾患またはＨＳＣの移植を要する他の状態を有する被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項６２】
前記血液学的疾患は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄形成異常、慢性骨髄性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、または鎌状赤血球貧血のうちの１つである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
以下の工程：
一定量のＨＳＣを提供する工程；および
該一定量のＨＳＣをインビトロで、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理して、処理されたＨＳＣを生成する工程であって、ここで該処理されたＨＳＣの少なくとも１０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、工程、
を包含する方法により生成される、血液製剤。
【請求項６４】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも２５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項６５】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも５０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項６６】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも７５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項６７】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも９０％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項６８】
前記処理されたＨＳＣの少なくとも９５％は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項６９】
前記一定量のＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項７０】
前記一定量のＨＳＣは、末梢血に由来する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項７１】
前記一定量のＨＳＣは、骨髄に由来する、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項７２】
薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルをさらに含む、請求項６３に記載の血液製剤。
【請求項７３】
遊離フコシルトランスフェラーゼまたは支持体に結合したフコシルトランスフェラーゼをさらに含む、請求項６３に記載の血液製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国特許法１１９条第（ｅ）項の下で、２００３年４月１８日に出願された米国仮出願番号６０／４６３，７７８の利益を主張し、この出願は、本明細書中にその全体が参考として明確に援用される。
【０００２】
（連邦政府によって援助された研究または開発に関する記載）
本発明のいくつかの局面は、国立衛生研究所により与えられた助成金５Ｐ５ＯＨＬ５４５０２の過程でなされた。従って、政府は、本発明のいくつかの局面において一部の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
本発明は概して、造血性幹細胞の治療上の有用性を改善するために、造血性幹細胞（ＨＳＣ）を処理する方法に関し、より詳細には、（これに限定されないが、）臍帯血に由来する造血性幹細胞を処理する方法に関連し、従って、造血性幹細胞が処理される。
【０００４】
炎症の間、Ｐ選択およびＥ選択は、白血球のローリングおよび血管表面への接着に協同して仲介する（ＭｃＥｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．Ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ：ｌｅｃｔｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｉｔｉａｔｅ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００２年１０月；１４：５８１〜８５６）。骨髄移植のプロセスにおいて、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンはまた、骨髄にＨＳＣを静脈内注射する自動誘導を仲介する（Ｆｒｅｎｅｔｔｅ，Ｐ．Ｓ．、Ｓｕｂｂａｒａｏ，Ｓ．、Ｍａｚｏ，Ｉ．Ｂ．、Ｖｏｎ  Ａｎｄｒｉａｎ，Ｕ．Ｈ．、Ｗａｇｎｅｒ，Ｄ．Ｄ．Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｈｅｐａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｈｏｍｉｎｇ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８；９５：１４４２３〜１４４２８）。ほとんどの組織において、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンは、アゴニストの刺激の後、内皮細胞で発現されるが、それらは、骨髄内皮細胞上では構成的に発現される。セレクチンは、リガンドとしての糖タンパク質または糖脂質上のα２，３−シアリル化グリカンおよびα１，３−フコシル化グリカン（例えば、シアリルＬｅｗｉｓＸ（ｓＬｅＸ）を使用する。Ｐ−セレクチンは、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）のＮ末端領域に結合し、ＰＳＧＬ−１は、チロシン表面およびｓＬｅＸでキャップされたＯ−グリカンを含む。Ｅ−セレクチンは、ＰＳＧＬ−１の一つ以上の異なる部位に結合する。Ｅ−セレクチンと相互作用するために、ＰＳＧＬ−１は、チロシンの硫酸化を必要としないが、Ｏ−グリカン上のｓＬｅＸの発現は、結合を増強する。Ｅ−セレクチンはまた、ＨＳＣ上の他のリガンドと相互作用する。ＨＳＣ上のＣＤ４４のイソ型は、インビトロでＥ−セレクチンに結合することが示されている（Ｄｉｍｉｔｒｏｆｆ，Ｃ．Ｊ．、Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．、Ｒａｆｉｉ，Ｓ．Ｆｕｈｌｂｒｉｇｇｅ，Ｒ．Ｃ．、Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ，Ｒ．ＣＤ４４  ｉｓ  ｍａｊｏｒ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１年６月１１日；１５３：１２７７〜１２８６）。ＨＳＣ上のＥ−セレクチンに対する別の潜在的なリガンドは、Ｅ−セレクチンリガンド−１（ＥＳＬ−１）である（Ｗｉｌｄ，Ｍ．Ｋ．、Ｈｕａｎｇ，Ｍ．Ｃ．、Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｈｏｒｓｅｌ，Ｕ．、ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｍｅｒｗｅ，Ｐ．Ａ．、Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ，Ｄ．Ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｋｉｎｅｔｉｃｓ，ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄ−１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００１年８月２４日；２７６：３１６０２〜３１６１２）。これらの糖タンパク質リガンドのそれぞれは、ｓＬｅＸ構造を保有すると考えられる。
【０００５】
一人の個体から収集された造血性幹細胞は、静脈注入の後、別の個体の骨髄に移植され得る。このアプローチは、種々の血液疾患（例えば、白血病）の処置に広く使用されている（Ｔｈｏｍａｓ，Ｅ．Ｄ．Ｈｉｓｔｏｒｙ，ｃｕｒｒｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３８：２３０〜２３７、１９９５）。臨床的に、ヒトＨＳＣは、三つの異なる源：骨髄、流動後の成体末梢血および送達後の臍帯から得られた臍帯血から得られる。５００万より多い無関係の有志の骨髄ドナーが世界中で登録されているが、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が完全にマッチする無関係のドナーを見つけることは、ＨＬＡの多型性に起因して多くの患者にとって問題として残っている。骨髄および成体抹消血と比較して、臍帯血は、特に、細胞の広範かつ迅速な利用可能性、ならびに急性および慢性の対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）の危険度を低減させるので、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡ同一性に対する必要条件があまりストリンジェントではないという点においていくつかの潜在的な利点を有する（Ｒｏｃｈａ，Ｖ．ら、Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｏｕｔｏｃｏｍｅｓ  ｏｆ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ａｎｄ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｂｌｏｏｄ．９７：２９６２〜７１、２００１）。骨髄もしくは成体末梢血由来のＨＳＣではなく、臍帯血ＨＳＣを使用する移植の潜在的な利点としては、以下が挙げられる：（１）大きな潜在的なドナープール；（２）迅速な利用可能性（臍帯血は、予めスクリーニングされ、試験されるので）；（３）収集努力を、代表される人種背景の子供が生まれる病院に集中することによって、より大きな人種の多様性が、バンクに獲得され得ること；（４）ドナーに対する危険性または不快感が減少すること；（５）ウイルスによる汚染が稀であること；および（６）完全ではない組織適合性のレシピエントに対してさえも、対宿主性移植片病（ドナーの細胞が、患者の器官および組織を攻撃する）の危険性が減少すること。従って、ＨＳＣ由来の臍帯血は、近年骨髄移植にますます使用されるようになっている。
【０００６】
移植環境において、ＨＳＣ自動誘導として規定されるプロセスを移植し、そして増殖するための、静脈内に注入されたＨＳＣは、特に骨髄中に噴出する。自動誘導は、インビボおよびインビトロの両方で広く研究され、ＨＳＣと骨髄の内皮との間を相互作用する接着分子に依存すると考えられている。セレクチンは、Ｃａ＋＋依存性（Ｃ型）動物レクチン内のＮ末端炭水化物識別ドメインに関連するＮ末端炭水化物識別ドメインを含む接着分子の一群である。活性化された血小板および内皮細胞で発現されるＰ−セレクチン、および活性化された内皮細胞で発現されるＥ−セレクチンは、白血球およびＨＳＣの複合糖質リガンドに結合する。最も良く特徴付けられた糖タンパク質リガンドは、多数シアル酸付加され、フコシル化されたＯ結合オリゴ糖である、ＰＳＧＬ−１である。ＰＳＧＬ−１は、白血球およびＨＳＣで発現される。ＰＳＧＬ−１欠損マウスを用いた研究は、ＰＳＧＬ−１が白血球のＰセレクチンへの係留およびローリングを仲介し、血流中のＥ−セレクチンへの係留を支持する。ＰＳＧＬ−１はまた、Ｌ−セレクチンに結合し、炎症を起こした内皮細胞表面上をローリングする白血球を増幅する白血球−白血球の相互作用を開始する。ヒトＰＳＧＬ−１において、Ｐ−セレクチンおよびＬ−セレクチン結合部位は、特定の分枝したフコシル化コア−２  Ｏ−グリカンに結合するスレオニンの近くに、３つのチロシン硫酸塩残基を含むペプチド配列を含む（ＭｃＥｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｒ．Ｄ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＰＳＧＬ−１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ  ｉｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１００：Ｓ９７〜１０３．１９９７；Ｒ．Ｐ．ＭｃＥｖｅｒ：Ｓｅｌｅｃｔｉｎｓ：Ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｉｔｉａｔｅ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ｆｌｏｗ．  Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４：５８１〜５８６、２００２）。フコース部分は、合成糖スルホペプチドを用いるインビトロアッセイにより測定した場合、Ｐ−セレクチン結合に不可欠である。フコシル化は、α１，３−フコシルトランスフェラーゼのファミリーによって触媒される。中でもα１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＶ（ＦＴ−ＩＶ）およびα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩＩ（ＦＴ−ＶＩＩ）は、主にヒト白血球において発現される。これらの酵素は、ドナー（例えば、ＧＤＰ−フコース）から、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃ配列中のＧｌｃＮＡｃへのα１，３結合の受容体へのフコース残基の転移を触媒する。ＦＴ−ＩＶおよびＦＴ−ＶＩＩは両方ともｓＬｅｘ構造（ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４［Ｆｕｃα１，３］ＧｌｃＮＡｃβ１−Ｒ）を形成するのに必要であるフコース付加を行なう。ヒトＰＳＧＬ−１のＮ末端アミノ酸配列中の特定のスレオニンに結合したコア−２Ｏグリカン上のｓＬｅＸは、Ｐ−セレクチンに対する結合に重要である。
【０００７】
ＨＳＣは、造血性幹細胞の異なる系統（例えば、赤血球、骨髄性細胞、リンパ球および血小板）へ分化する能力を有する。ヒトＨＳＣは、表面糖タンパク質ＣＤ３４を発現し、これは、ＨＳＣ同定および分離に日常的に使用される。このようなヒトＣＤ３４＋細胞（ＣＤ３４抗原を発現する細胞）は、造血性成熟の種々の程度の前駆体の異種集団を代表する。ヒトＣＤ３４＋細胞上の別の表面タンパク質ＣＤ３８の発現の非存在（「−」）または低い発現（「ｌｏｗ」）は、ＣＤ３４＋細胞の初期の部分集団の代理マーカーになると考えられる。従って、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−部分集団の細胞は、骨髄細胞または成体末梢血由来の全ＣＤ３４＋細胞の約１０〜２０％を含み、多重前駆体および幹細胞活性（移植能を含む）が高度に富化されている。とりわけ、臍帯血ＨＳＣの約３０％は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−である。しかし、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−成体末梢血幹細胞とは違って、臍帯血ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣは、マウス骨髄に戻ることが少ないことが公知であり、このことは、主にヒトＨＳＣのマウスの微小血管内皮上のＰ−セレクチンとの相互作用に依存する（Ｈｉｄａｌｇｏ，Ａ、Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．Ａ．およびＦｒｅｎｅｔｔｅ，Ｐ．Ｓ．）。ヒトＣＤ３４＋細胞の骨髄内皮との相互作用を仲介する機能的なセレクチンリガンドは、出生後に増強される。接着経路は、造血前駆体細胞が骨髄へ戻るのを仲介する（Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１０：５５９〜５６９、２００２）。フローサイトメトリー分析は、この戻りの欠損が、ＨＳＣに由来するこれらのＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−臍帯血上に発現された非機能性のＰＳＧＬ−１から生じることを示唆している。従って、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣのＰ−セレクチンに結合する能力の欠損は、少なくとも一部は、臍帯血ＨＳＣ移植に伴なう血小板移植および骨髄移植の遅れを説明する。移植のための臍帯血ＨＳＣの使用は、主に子供に制限されている（子供は、移植のために必要とする細胞がより少ない）が、これは、へその緒から単離されたＨＳＣの限定された量およびそのＨＳＣの戻る能力の欠損のためである。
【０００８】
ＨＳＣの戻る能力の欠損を矯正する発明は、造血幹細胞の源としての臍帯血の能力を有意に向上し、それによって急性および慢性の移植片対宿主病に対する危険性を低減し、骨髄再構成の成功をもたらす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、一実施形態において、ＨＳＣを処理する方法を企図し、この方法は、一定量のＨＳＣまたはＨＳＣの集団を提供する工程であって、このＨＳＣの内の少なくともある量が、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠如するか、またはその発現が減少している工程、ならびに一定量のＨＳＣまたはＨＳＣの集団をインビトロで、α１，３フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理する工程であって、処理されたＨＳＣが、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンへの結合を増強する工程を包含する。さらに、ＨＳＣは代表的に、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）および／またはＰ−セレクチンもしくはＥ−セレクチンに有効に結合しない他のセレクチンリガンドを含むとして特徴付けられる。より詳細には、ＰＳＧＬ−１またはＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣ上に存在する他のセレクチンリガンドは、フコシル化グリカン、特にＯ−グリカンを欠如するか、またはほとんど有さず、そして、例えば、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを含むコア−２  Ｏ−グリカンを有し、ＧｌｃＮＡｃへのα１，３結合中のフコースを欠如するＰＳＧＬ−１を有する。ＨＳＣは、本明細書中に記載されるフコシル化の前の未処理状態では、骨髄の戻る能力が低減している。本発明の一実施形態において、ＨＳＣは、ヒト臍帯血に由来するが、フコシル化処理後の骨髄へ戻る能力が増強されているとして特徴付けられる限り、骨髄または末梢血に由来し得る。本明細書中に企図される方法において、α１，３フコシルトランスフェラーゼは、例えば、α１，３フコシルトランスフェラーゼＩＶ、α１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ、またはα１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩ、またはこれらの組合せであり得る。フコースドナーは、例えば、ＧＤＰ−フコースであり得る。
【００１０】
本発明はさらに、一実施形態において、ヒトＨＳＣを処理する組成物を企図し、この組成物は、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠如するか、または発現の減少した（ＣＤ３８ｌｏｗ／−）臍帯血由来のＣＤ３４＋ＨＳＣを含む。ここで、このＨＳＣは、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合し得る。ＨＳＣは、保存または患者への投与のための薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤またはビヒクル中に処理され得る。本発明はさらに、処置方法に関し、この方法は、血液疾患、または処置のためにＨＳＣの移植を必要とし、その移植から利益を受ける他の疾患を有する被験体にＨＳＣの有効量を投与する工程を包含する。
【００１１】
上記のように、本明細書中に記載されるフコシル化処理の後、処理されたＣＤ３４＋ＨＳＣ（ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣを含む）は、未処理のＣＤ３４＋ＨＳＣと比較してＰ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに対する結合が増強した。Ｐ−セレクチン（またはＥ−セレクチン）に対する増強された結合は、Ｐ−セレクチン（または、Ｅ−セレクチン、それぞれ）結合アッセイにおいて、（以下に規定する）所定の蛍光閾値より大きい蛍光を有する、処理されたＨＳＣの少なくとも１０％と規定される。別の実施形態において、処理したＨＳＣの少なくとも２５％は、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理したＨＳＣの少なくとも５０％は、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理したＨＳＣの少なくとも７５％は、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理したＨＳＣの少なくとも９０％は、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理したＨＳＣの少なくとも９５％は、所定の蛍光閾値を上回る。
【００１２】
本発明はさらに、一定量のＨＳＣまたはＨＳＣの集団を提供する工程および一定量のＨＳＣをインビトロでα１，３フコシルトランスフェラーゼおよびフコシルドナーで処理する工程を包含する方法によって製造された血液製剤を企図し、そのＨＳＣの少なくとも一部は、ＣＤ３４＋であり、タンパク質ＣＤ３８の発現を欠如するか、または減少している。こここで、処理したＨＳＣの大部分は、本明細書中で記載されるとおりＰ−セレクチン（またはＥ−セレクチン）に対する結合が増強されている。一定量のＨＳＣは、好ましくは、臍帯血に由来するが、骨髄または成人の末梢血から入手され得る。一定量のＨＳＣまたはＨＳｃの集団は、血液または骨髄の一部もしくは分画されていないサンプルを含み得る。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、１つの実施形態において、ＨＳＣを処理する方法を意図し、この方法は、表面結合タンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはＣＤ３８の減少した発現を有するＨＳＣのある量もしくは集団を提供する工程、およびそのＨＳＣの量もしくは集団をインビトロでα１，３フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理する工程を包含し、ここで、そのように処理されるＨＳＣは、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに対する結合が処理していないＨＳＣを超えて高められる。さらに、処理していないＨＳＣは、代表的には、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに十分に結合しないＰＳＧＬ−１または他のセレクチンリガンドを主に含むと特徴付けられる。ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣに生じるＰＳＧＬ−１または他のセレクチンリガンドは、フコシル化グリカン（例えば、Ｏ−グリカン）を欠くかまたはフコシル化グリカンの減少した数を有し、そして例えば、ＰＳＧＬ−１（これは、ＮｅｕＡｃα２，３Ｇａｌβ１，４ＧｌｃＮＡｃを含むコアの２個のＯ−グリカンを有するが、ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３結合においてフコースを欠く）を有し得る。ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣは、フコシル化前のその処理されない状態において、低下した骨髄ホーミング能を有する。ＨＳＣの骨髄ホーミング能を高めるためのさらなるフコシル化を必要とするかもしくはそのようなフコシル化から利益を受けると特徴付けられる限りは、ＨＳＣは、骨髄または末梢血由来であり得るが、好ましくは、ＨＳＣは、ヒト臍帯血（ＣＢ）由来である。本明細書中で意図される方法において、上記α１，３フコシルトランスフェラーゼは、例えば、α１，３フコシルトランスフェラーゼＩＶ、α１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩ、またはα１，３フコシルトランスフェラーゼＶＩＩであり得る。上記フコースドナーは、例えば、ＧＤＰ−フコースであり得る。
【００１４】
本発明は、１つの実施形態において、処理されたヒトＨＳＣの組成物を意図し、その組成物は、表面タンパク質ＣＤ３８（ＣＤ３８ｌｏｗ／−）の発現を欠くかまたはその発現が減少している臍帯血由来のＨＳＣを含み、ここで、処理されたＨＳＣは、ＰＳＧＬ−１または適切にフコシル化された他のセレクチンリガンド（例えば、シアリルＬｅｗｉｓｘを含む）を含み、そしてＰ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）に結合し得る。処理されたＨＳＣは、保管または患者への投与のために、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクル中に置かれ得る。本発明はさらに、処置方法に関し、その方法は、有効量の処理されたＨＳＣを、血液障害または処置のためにＨＳＣを必要とする他の疾患を有する被験体に投与する工程を包含する。
【００１５】
１つの実施形態において、処理されたＨＳＣの組成物は、臍帯血に由来するヒトＨＳＣの集団を含み、その集団のうちの少なくとも一部分は、Ｐ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）に対して増大した結合を有するＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣと特徴付けられる。Ｐ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）に対する増大した結合は、処理されたＨＳＣのうち少なくとも１０％が、Ｐ−セレクチン結合アッセイ（それぞれ、もしくはＥ−セレクチン結合アッセイ）において、所定の蛍光閾値よりも強い蛍光を有すると規定される。別の実施形態において、処理されたＨＳＣのうち少なくとも２５％が、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理されたＨＳＣのうち少なくとも５０％が、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理されたＨＳＣのうち少なくとも７５％が、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理されたＨＳＣのうち少なくとも９０％が、所定の蛍光閾値を上回る。別の実施形態において、処理されたＨＳＣのうち少なくとも９５％が、所定の蛍光閾値を上回る。ヒトＨＳＣの組成物は、好ましくは、保管または患者への投与のために、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクル中に置かれる。
【００１６】
所定の蛍光閾値は、１つの実施形態において、まず、通常の臍帯血（健常な満期胎児に由来する臍帯血）の単核画分から、少なくとも１００個のＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣを含む細胞のサンプルを得ることによって決定される。このＨＳＣのコントロール（ベースライン）サンプルは、本明細書中の他で記載されるＰ−セレクチン結合アッセイ（もしくはＥ−セレクチン結合アッセイ）を使用してか、あるいは当該分野で公知の任意の他のＰ−セレクチン蛍光結合アッセイ（それぞれ、もしくはＥ−セレクチン結合アッセイ）によってアッセイされる。Ｐ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）結合蛍光レベルは、コントロール（ベースライン）サンンプル中のＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣについて測定される。１つの実施形態において、蛍光値は、コントロールサンンプル中のＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣのうちの少なくとも９５％のＰ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）結合蛍光レベルを上回る値が選択される。選択された蛍光値は、処理された（すなわち、フコシル化された）ＨＳＣのＰ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）結合蛍光と比較される所定の蛍光閾値として示される。
【００１７】
本発明はさらに、ＨＳＣのある量もしくは集団を提供する工程であって、そのＨＳＣのうちの少なくとも一部分がＣＤ３４＋でありタンパク質ＣＤ３８の発現を欠くかまたはそのＣＤ３８の減少した発現を有する、工程、ならびにそのＨＳＣの量をインビトロでα１，３フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理する工程を包含する上記方法によって生成される血液産物を意図し、ここで、その処理されたＨＳＣのうちの大部分は、Ｐ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）に結合する。そのＨＳＣの量は、臍帯血由来であり得るが、骨髄または成体の末梢血由来であり得る。
【００１８】
概して、本発明は、方法を意図し、ここで、非機能性ＰＳＧＬ−１もしくは最適以下の機能性ＰＳＧＬ−１あるいは臍帯血ＨＳＣで発現される他のセレクチンリガンドは、インビトロα１，３−フコシル化技術によって改変されて、ホーミング欠損が正され、このことが、骨髄移植における使用を改善する。
【００１９】
上記のように、ＣＤ３４＋臍帯血ＨＳＣは、ＣＤ３８＋（ＣＤ３８に対してポジティブ）またはＣＤ３８ｌｏｗ／−（ＣＤ３８の発現が減少したかもしくは発現しない）と定義され得る。ＣＤ３８ｌｏｗ／−臍帯血ＨＳＣは、上記のような蛍光技術を使用して同定され得る。臍帯血ＨＳＣは、それに結合したフルオロフォアを有するＣＤ３４結合抗体、およびそれに結合した異なるフルオロフォアを有するＣＤ３８結合抗体で処理される。ＣＤ３４＋細胞は、照射の際に抗ＣＤ３４抗体フルオロフォアから蛍光を発するＨＳＣと定義される。ＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣは、ＣＤ３４＋ＨＳＣのうち３０％が、抗ＣＤ３８結合抗体から測定される場合に最も低い蛍光を有するＣＤ３４＋ＨＳＣ、または（本明細書中の他で記載されるような蛍光フローサイトメーターによって測定される場合）５０ユニット以下の抗ＣＤ３８結合抗体蛍光レベルを有するＣＤ３４＋ＨＳＣと定義される。１つの実施形態において、抗ＣＤ３４結合抗体フルオロフォアは、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）であり、一方、抗ＣＤ３８結合抗体フルオロフォアは、フィコエリトリン（ＰＥ）である。
【００２０】
すでに説明されたように、ＣＤ３４＋細胞は、ＰＳＧＬ−１または他のセレクチンリガンド、さらに有意な量の始原ＣＤ３４＋細胞（これは、ＣＤ３８では少ないかまたは存在しない（例えば、始原ＣＤ３４＋細胞は全ＣＤ３４＋臍帯血細胞のうちの約３０％を含む）を発現し、Ｐ−セレクチン（もしくはＥ−セレクチン）に結合しないか、またはごく少量のＰ−セレクチン（それぞれ、もしくはＥ−セレクチン）に結合する。ＰＳＧＬ−１は、ＣＤ３４＋細胞を含むほぼすべての白血球で発現されるホモダイマーのムチンである。機能性（すなわち、Ｐ−セレクチンもしくはＥ−セレクチンに結合し得る）であるために、ＰＳＧＬ−１は、それにｓＬｅｘ基の形成をもたらすいくつかの翻訳後修飾（α１，３−フコシル化を含む）を必要とする。不十分なα１，３−フコシル化は、例えば、未処理のＴ細胞が血管セレクチンと相互作用する能力に障害を生じる。本発明において、臍帯血由来のＨＳＣがＰ−セレクチンもしくはＥ−セレクチンに対して結合不能であることは、ＰＳＧＬ−１または他のセレクチンリガンドの不十分なα１，３−フコシル化に起因することが発見されている。従って、本発明の基となることは、インビトロでのα１，３−フコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦＴ−ＶＩ）（これはまた、ｓＬｅｘ構造の合成を触媒する）によるＣＤ３４＋細胞の処理が、ＰＳＧＬ−１または他のセレクチンリガンドのフコシル化を増大し、それによって、ＨＳＣのホーミング欠損を正すということである。
【００２１】
α１，３結合におけるフコースをＧｌｃＮＡｃに転換し得るフコシルトランスフェラーゼは、当該分野で周知である。いくつかが市販されており、例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから市販されている。さらに、少なくとも５つの異なる型のα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＩＩ−Ｖ）が、ヒトゲノムによってコードされる。これらとしては、以下が挙げられる：ルイス酵素（ＦＴＩＩＩ）（これは、フコースをα（１，３）−Ｇａｌβ４ＧｌｃＮＡｃまたはα（１，４）−ＧＡｌβ３ＧｌｃＮＡｃに転換し得る（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．４：１２８８、１９９０））；ＦＴＩＶ（これは、α（１，３）結合（これは、好ましいシアリル化前駆体ではない）を形成する（Ｇｏｅｌｚら、Ｃｅｌｌ  ６３；１３４９、１９８９；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６；１７４６７、１９９１））；ＦＴＶ（Ｗｅｓｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４１５２、１９９２ａ）およびＦＴＶＩ（Ｗｅｓｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４５７５、１９９２ｂ）（これは、α（１，３）結合を形成し、シアリル化前駆体もしくは非シアリル化前駆体のいずれかをフコシル化し得る）、ならびにＦＴＶＩＩ（Ｓａｓａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４７３０、１９９４；Ｎａｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１６７８９、１９９４）（これは、シアリル化前駆体のみをフコシル化し得る）。
【００２２】
ＦＴＩＩＩは、ＧＤＢ１３５７１７によってコードされる；ＦＴＩＶは、ＧＤＢ１３１５６３によってコードされる；ＦＴＶは、ＧＤＢ１３１６４４によってコードされる；ＦＴＶＩは、ＧＤＢ１３５１８０によってコードされる；そしてＦＴＶＩＩは、ＧＤＢ３７３９８２によってコードされる。６番目のα１，３フコシルトランスフェラーゼ（ＦＴＩＶ）は、ＧＤＢ９９５８１４５（ゲノムデータベース登録ＩＤ番号は、ＧＤＢ（ＴＭ）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｔｒｏｎｔｏ（Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）：Ｔｈｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｆｏｒ  Ｓｉｃｋ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）：Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９０−から入手可能である。インターネット：ＵＰＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ／から入手可能である）によってコードされる。本発明はさらに、例えば、米国特許第６，３９９，３３７号および同第６，４６１，８３５号（これらは、本明細書により明示的にその全体が本明細書中に参考として援用される）に示されるような、当業者が入手可能でありかつ公知の他の非ヒトα１，３フコシルトランスフェラーゼを使用することを意図する。
【００２３】
すでに述べたように、ヒトＨＳＣは、α１，３フコシルトランスフェラーゼによる処理のために、例えば、臍帯血、末梢血、または骨髄の供給源中の他の細胞からの分離によって得られ得る。種々の技術が、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−幹細胞を単独で、またはＣＤ３４＋ＣＤ３８＋ＨＳＣと組み合わせて別個に得るために利用され得る。モノクローナル抗体は、分化の特定の細胞系統および／または段階に関連するマーカー（表面膜タンパク質）を同定するために特に有用である。抗体は、粗製物分離用に固体支持体に付着され得る。利用される分離技術は、回収されるべき画分の生存度の保持を最大限にすべきである。利用される特定の技術は、分離の有効性、細胞毒性の方法論、実行の容易さおよび速度、ならびに洗練された機器および／または技術的技能の必要性に依存する。
【００２４】
分離のための手順としては、抗体コーティングした磁気ビーズを使用する磁気分離、および固体マトリクス（例えば、プレート）に接着した抗体を用いる「パニング」、または他の簡便な技術が挙げられ得る。正確な分離を提供する技術としては、種々の精巧の程度を有する蛍光細胞分析分離装置（例えば、複数の有色チャネル、ローアングル（ｌｏｗ  ａｎｇｌｅ）および鈍角の光散乱検出チャネルおよびインピーダンスチャネル）が挙げられる。
【００２５】
簡便には、抗体は、直接分離を可能にする磁気ビーズ；支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンビオチンと共に除去され得る；蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）と共に使用され得る蛍光色素などのような、マーカーと結合体化され得、特定の細胞型の分離を容易にし得る。残りの細胞の生存に対して過度に有害でない任意の技術が採用され得る。
【００２６】
１つの実施形態において、成熟な細胞マーカーを欠失するＨＳＣが実質的に富化され得、ここで、次いで、この細胞が、ＦＡＣＳまたは高特異性を有する他の形態学により分離され得る。特に簡便な、多色分析がＦＡＣＳと共に使用され得る。細胞は、特定の抗原についての染色レベルに基づいて分離され得る。多色分析において用途を見出し得る蛍光色素としては、例えば、フィコビリンタンパク質（例えば、フィコエリスリン）およびアロヂコシアニン、フルオレセインおよびテキサスレッドが挙げられる。あるいは、ＨＳＣは、例えば、臍帯血、末梢血液または骨髄からの全単核細胞を使用して、未分画の血液サンプルまたは骨髄サンプルから所望のＨＳＣを分離する前に、フコシルトランシフェラーゼを用いて処理され得る。
【００２７】
１つの実施形態において、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−細胞を含むＣＤ３４＋ＨＳＣは、細胞組成物に遊離のフコシルトランスフェラーゼを添加することによって処理され得、ここで、フコシル化されたＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−を含む最終血液産物はまた、細胞を処置するために使用されたフコシルトランスフェラーゼを含む。別の実施形態において、ＨＳＣは、支持体（例えば、磁気ビーズ、または、当業者に公知の任意の他の支持体）に結合されたフコシルトランスフェラーゼを使用して処理され得、この処理プロセスが完了した後に、この細胞組成物から分離され得る。
【００２８】
（方法および結果）
臍帯血サンプルを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｋｌａｈｏｍａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＯＭＲＦ）によって認可されたプロトコールに従って、通常の満期普通分娩から得た。１回の分娩あたり７０〜１００ｍｌの臍帯血を採取した。クエン酸ナトリウムを、抗凝固薬として使用した。臍帯血を採取するための当該分野で公知の、任意の適切な方法（例えば、米国特許第６，４４０，０１０号（その全体が本明細書において参考として明白に援用される）に示される方法）が適切である。血液サンプルの上清内のＣＤ３４＋細胞を、ＣＤ３４単離ミニＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて富化した。臍帯血をまず、当量の０．９％塩化ナトリウム中の６％  デキストラン７０（ＭｃＧａｗ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）と混合した。２〜３時間の沈降の後、上清内の細胞を取り除き、２ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５％  ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含有するＨａｎｋの平衡化塩溶液（ＨＢＳＳ，Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で１度洗浄した。汚染された赤血球を、ＦＡＣＳ溶解溶液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中で溶解した。低密度単核細胞（ＭＮＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（ｄ＝１．０７７ｇ／ｍｌ）にて２５０ｇで遠心分離した後に分離した。ＣＤ３４＋細胞を、製造業者の指示書に従ってＣＤ３４単離ミニＭＡＣＳキットを使用して、ＭＮＣ分画から精製した。単離されたＣＤ３４＋細胞の精製は、フローサイトメトリーによって試験した場合、約９６％であった（図１）。次いで、以下の実験を実施した。
【００２９】
（臍帯血から単離したＣＤ３４＋細胞はＰＳＧＬ−１を発現し、ＣＤ３４＋細胞が異種性であることのフローサイトメトリーによる立証）
この目的のために、三色染色を使用した。ミニＭＡＣＳ選別により富化した細胞を、ヒトＩｇＧを用いてＦｃレセプターをブロッキングした後に、ＦＩＴＣに結合体化した抗ＣＤ３４モノクローナル抗体（ｍＡｂ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ製のクローンＡＣ１３６）、ＰＥに結合体化した抗ＣＤ３８  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびＣｙ５に結合体化した抗ＰＳＧＬ−１モノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にインキュベートした。洗浄した後、細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のフローサイトメトリーにより分析した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔプログラムを使用してデータを回収した。光散乱ゲート化事象を、蛍光強度の対数スケールにプロットした。実質的に全てのＣＤ３４＋細胞がＰＳＧＬ−１を発現し（図２Ａ）、ＣＤ３４＋細胞の約３０％がＣＤ３８の低い発現を有するか、または発現を有さず（図２Ｂ）、これは、始原前駆細胞の下位集団を表す。さらに、Ｐ−セレクチンに結合しないＨＳＣの約２５％は、ＣＤ３４＋およびＣＤ３８ｌｏｗ／−である（図３）。これらの結果は、既存のデータを確証する。
【００３０】
（精製ＣＤ３４＋細胞についてのＰＳＧＬ−１のインビトロα１−３−フコシル化）
ＰＳＧＬ−１またはＣＤ３４＋細胞上の他のセレクチンリガンドに結合するコア２  Ｏ−グリカン上にフコースを導入するために、２〜４×１０６個の細胞を、０．５ｍＬのＨＢＳＳ／１％  ＨＳＡ中の１ｍＭ  グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）−フコース（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、２０ｍＵ／ｍＬ  α１−３−フコシルトランスフェラーゼＶＩ（ＦＴ−ＶＩ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、および１０ｍＭのＭｎＣｌ２を用いて、５％  ＣＯ２を含有する雰囲気下、３７℃にて４０分間処理した。この処理により、最大Ｐ−セレクチン結合により測定されるように、ＣＤ３４＋細胞におけるＰＳＧＬ−１の最適なフコシル化を生じ、さらに、プロピジウムヨージド染色により試験した場合に、ＣＤ３４＋細胞に対して最小の毒性を生じる（図４）。
【００３１】
（ＣＤ３４＋細胞におけるフコシル化エピトープの測定、およびインビトロα１，３−フコシル化が、ＣＤ３４＋細胞にフコシル化されたエピトープを作製することの、フローサイトメトリーによる検証）
シアリルＬｅｗｉｓｘは、フコシル化エピトープである。抗ｓＬｅｘｍＡｂであるＨＥＣＡ  ４５２（ラットＩｇＭ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｇｔｉｏｎ［ＡＴＣＣ］製のハイブリドーマ）と共にインキュベートすることによって、本発明者らは、ＣＤ３４＋細胞においてｓＬｅｘエピトープを試験した。結合したｍＡｂを、ラットＩｇＭ（Ｃａｌｔａｇ）に対してＦＩＴＣ結合体化ヤギＦ（ａｂ）’２フラグメントを用いて検出した。図５Ａにより示されるように、臍帯血から得られたＣＤ３４＋細胞の２６％が、低いフコシル化エピトープを発現するか、または発現しない。これらのデータは、ＣＤ３４＋細胞のサブセットが、適切にフコシル化されていないことを示す。インビトロα１，３−フコシル化が、ＣＤ３４＋細胞においてフコシル化エピトープを作製し得るかどうかを調べるために、本発明者らは、上記の方法を使用して、Ｍｎの存在下で、ＣＤ３４＋細胞をＦＴ−ＶＩおよびＧＤＰ−フコースを用いて処理した後に、ＨＥＣＡ  ４５２で細胞を染色した。本発明者らは、ＨＳＣＡ  ４５２染色により示されるように、インビトロα１，３−フコシル化が、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞におけるｓＬｅｘエピトープを劇的に増加したことを見出した（図５Ｂ）。
【００３２】
（Ｐ−セレクチン結合−結果）
（臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞における可溶性Ｐ−セレクチンの結合特性の検証）
Ｐ−セレクチン結合アッセイについて、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、Ｆｃレセプターをブロッキングした後、抗ＣＤ３４−ＰＥおよびヒト血小板から単離したＰ−セレクチンと共にインキュベートした。Ｐ−セレクチンの結合を、ＦＩＴＣ標識したＳ１２（ヒトＰ−セレクチンに対するブロッキングしていないｍＡｂ）を用いて検出した。細胞のインキュベーションを、４℃にて２０分間実施した。系列滴定後のＰ−セレクチンの飽和量を実験において使用した（図６）。コントロール実験において、細胞のＰ−セレクチンインキュベーションを、Ｇ１（Ｐ−セレクチンに対するブロッキングｍＡｂ）、ＰＬ１（ＰＳＧＬ−１に対するブロッキングｍＡｂ）、またはＣａ２＋依存性のセレクチンリガンド相互作用を排除する１０ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で実施した。フローサイトメトリー分析は、ＣＤ３４＋細胞（主にＣＤ３８ｌｏｗ／−細胞を含む）の約２７％が、Ｐ−セレクチンに結合しなかったことを示し、このことは、以前の刊行されたデータと一致する（図７Ａ）（Ｈｉｄａｌｇｏ，Ａ．，Ｗｅｉｓｓ，Ｌ．Ａ．，およびＦｒｅｎｅｔｔｅ，Ｐ．Ｓ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ａｒｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｏｓｔｎａｔａｌｌｙ．Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｉｎｇ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０：５５９−５６９．２００２）。図７Ｃは、Ｐ−セレクチンが、ＣＤ３４＋細胞上のＰＳＧＬ−１に特異的に結合することを示した。これは、Ｇ１抗体およびＰＬ１抗体、ならびにＥＤＴＡが、結合を無効にしたためである。
【００３３】
（ＣＤ３４＋細胞表面のインビトロα１，３−フコシル化が、Ｐ−セレクチンに対する結合を増加することの、フローサイトメトリーによる実証）
臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、まず、上記のようにＧＤＰ−フコースおよびＦＴ−ＶＩで処理し、次いで、抗ＣＤ３４−ＰＥおよびＰ−セレクチンの両方で染色した。Ｐ−セレクチンの結合を、ＦＩＴＣ標識したｍＡｂ  Ｓ１２で検出した。外来性ＦＴ−ＶＩでの処理が、ヒトＰ−セレクチンに対するＣＤ３４＋細胞の結合を有意に増加した（図７Ｂ）。Ｐ−セレクチンに対する増強された結合は、α１，３−フコシル化の後のＣＤ３４＋細胞における機能的ＰＳＧＬ−１の増加に起因した。なぜならば、この結合は、抗体Ｇ１およびＰＬ１によって、そしてＥＤＴＡによってブロッキングされたからである（図７Ｄ）。インビトロα１，３−フコシル化についての最適な条件を見出すために、種々のインキュベーション時間およびＦＴ−ＶＩ、ＧＤＰ−フコースおよびＭｎの濃度を試験した（データ示さず）。条件（上掲）を、最大のＰ−セレクチン結合によって測定されるように、ＣＤ３４＋細胞におけるＰＳＧＬ−１の最適なフコシル化を生じた全ての実験について選択し（図７Ｂ）、さらに、プロピジウムヨージド染色によって試験されるように、ＣＤ３４＋細胞に対して最小の毒性を生じた（図４）。
【００３４】
（インビトロα１，３−フコシル化が、生理学的せん断流れにおいてＰ−セレクチンに対するＣＤ３４＋細胞の接着を増加することの実証）
臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞を、さらなる処理のために２つの群に分けた。一方の群を、上記のようにＧＤＰ−フコースおよびＦＴ−ＶＩと共にインキュベートし、もう一方の群を、ＧＤＰ−フコースなしのＦＴ−ＶＩで処理した（偽処理コントロール）。２群の細胞のＰ−セレクチン結合能を、以下に記載されるようなインビトロフローチャンバローリングアッセイシステム（ｆｌｏｗ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｒｏｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して比較した。ヒト血小板から単離したＰ−セレクチンを、平行プレートフローチャンバ内に固定した。１２５Ｉ標識した抗Ｐ−セレクチンｍＡｂ  Ｓ１２の結合により測定した場合に、１４５部位／μｍ２のＰ−セレクチン部位濃度を使用した。偽処理、またはＦＴＶＩ処理のＣＤ３４＋細胞（Ｈａｎｋの緩衝化塩溶液および０．５％ヒトアルブミン中１０６個／ｍｌ）を、１ｄｙｎ／ｃｍ２の壁せん断応力の下でＰ−セレクチンについて灌流した。ローリング細胞の蓄積数を、画像分析システムに接続されたビデオ顕微鏡システムを用いて測定した。ＥＤＴＡ、ならびに抗体Ｇ１およびＰＬ１がローリングを無効にし、ヒト血清アルブミンのみでコーティングしたプレート上ではローリングが見られなかったので、ＣＤ３４＋細胞は、ヒトＰ−セレクチン−ＰＳＧＬ−１相互作用により、Ｃａ＋＋依存性の様式でローリングした（図８）。偽処理ＣＤ３４＋細胞と比較して、約３倍多いＦＴ−ＶＩ処理ＣＤ３４＋細胞が、Ｐ−セレクチンについてローリングした。
【００３５】
（Ｅ−セレクチン結合−結果）
（ＣＤ由来のＨＳＣに対する可溶性Ｅ−セレクチンの結合特性）
マウス可溶性Ｅ−セレクチン／ヒトＩｇＭキメラ（Ｅ−セレクチン／ＩｇＭ）を、流体相のＥ−セレクチン結合アッセイのために使用した。ＣＤ４５／ヒトＩｇＭキメラをネガティブコントロールとして使用した。細胞を、Ｆｃレセプターをブロッキングした後に、Ｅ−セレクチン／ＩｇＭと共にインキュベートした。次いで、Ｅ−セレクチンの結合を、ＦＩＴＣ標識したヤギ抗ヒトＩｇＭポリクローナル抗体を用いて検出した。この細胞をまた、ＰＥ標識した抗ＣＤ３４  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。インキュベーションを、４℃にて２０分間実施した。系列滴定の後に、飽和量のＥ−セレクチンを実験に使用した。コントロール実験において、染色を、９Ａ９（Ｅ−セレクチンに対するブロッキングｍＡｂ）、または１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｃａ２＋依存性セレクチンリガンドの相互作用を排除する）の存在下で実施した。フローサイトメトリー分析は、約２５％のＣＤ３４＋ＨＳＣがＥ−セレクチンに結合しなかったことを示した（図９Ａ）。図９Ｃは、ＣＤ３４＋ＨＳＣのＥ−セレクチンとの相互作用が特異的であったことを示し、これは、ｍＡｂ  ９Ａ９およびＥＤＴＡがこの相互作用を無効にしたからである。
【００３６】
（フローサイトメトリーにより測定した場合に、インビトロα１，３−フコシル化が、Ｅ−セレクチンに対するＣＤ３４＋ＨＳＣの結合を増加する）
ＣＢ由来のＣＤ３４＋ＨＳＣを、２つの群に分けた。一方の群（２〜４×１０６個の細胞）を、０．５ｍｌ  ＨＢＳＳ／１％  ＨＡＳ中の１ｍＭ  ＧＤＰ−フコース、２０ｍＵ／ｍｌ  ＦＴＶＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２と共に、５％  ＣＯ２を含有するインキュベーター内で、３７℃にて４０分間インキュベートした。もう一方の群を、ＧＤＰ−フコースなしのＦＴ−ＶＩと共にインキュベートした（偽処理コントロール）。次いで、細胞を、抗ＣＤ３４およびＥ−セレクチン／ＩｇＭの両方で染色した。外来性のα１，３−フコシルトランスフェラーゼ処理の後、ＣＤ３４＋ＨＳＣのＥ−セレクチンに対する結合は、７５％から９５％まで増加した（図９Ａおよび９Ｂ）。Ｅ−セレクチンに対する増加した結合は、ｍＡｂ  ９Ａ９およびＥＤＴＡにより評価したように、特異的であった（図９Ｄ）。図９Ｃおよび９Ｄに見られるＡｂ  ９Ａ９およびＥＤＴＡのブロッキングの後の残りの結合は、ネガティブコントロールであるＣＤ４５／ＩｇＭで染色された細胞が、類似の特性を有した（データ示さず）ので、非特異的であった。
【００３７】
（インビトロα１，３−フコシル化は、生理学的せん断力の下でのＨＳＣのＥ−セレクチンに対する接着を増加させる）
上記のように、ＨＳＣを２つの群に分け、フコシル化した。２つの群の細胞のＥ−セレクチン結合能を、インビトロフローチャンバローリングシステムを使用して比較した。簡単には、可溶性ヒトＥ−セレクチンを、平行プレートフローチャンバ内に固定した。１２５Ｉ標識された抗ヒトＥ−セレクチンｍＡｂ  ＥＳ１の結合により測定した場合、２００部位／μｍ２のＥ−セレクチン部位濃度を使用した。偽処理またはＦＴ−ＶＩ処理したＨＳＣ（ＨＢＳＳおよび０．５％  ＨＳＡ中１０６個／ｍｌ）を、異なるせん断力の下、Ｅ−セレクチンについて灌流した。ローリング細胞の蓄積数およびせん断応力を、画像分析システムに連結されたビデオ顕微鏡システムを用いて測定した。試験したせん断力において、偽処理ＨＳＣと比較して、約２〜３倍多いＦＴ−ＶＩ処理ＨＳＣが、Ｅ−セレクチンについてローリングした（図１０Ａおよび１０Ｂ）。ＦＴ−ＶＩ処理細胞はまた、より低い速度でローリングし、せん断力による剥離により抵抗性であった（図１０Ｃおよび１０Ｄ）。ＨＳＣのＥ−セレクチンとの相互作用は、特異的であった。これは、ｍＡｂ  ＥＳ１がローリングを無効にし、そしてＨＳＡのみでコーティングしたプレートにおいては、ローリング見られなかったからである（図１０Ｂ）。ＰＳＧＬ−１に対するＰ−セレクチンの結合をブロックするＰＬ１は、Ｅ−セレクチンについてのＨＳＣのローリングに影響を与えず（図１０Ｂ）、これは、Ｅ−セレクチンが、ＰＳＧＬ−１についての他の部位、または他の細胞表面リガンドに対する結合によってローリングを媒介することを確認する。
【００３８】
これらの結果は、インビトロα１，３−フコシル化が、流れの下で、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンに対する、生理学的に関連するＣＤ３４＋細胞のローリング接着を増強することを示唆する。
【００３９】
（インビボ実施例）
（フコシル化ＨＳＣは、インビボで、骨髄において増強された移植を示す）
（方法）
インビトロ分析によって、ＧＤＰ−フコースおよびＦＴＶＩで処理したＣＢ  ＨＳＣが、流体相におけるＰ−セレクチンおよびＥ−セレクチンの有意な増加を示し、異なる壁せん断力の下で、フコシル化なしのＣＢ  ＨＳＣと比較して、Ｐ−セレクチンおよびＥ−セレクチンでコーティングした表面上でよりよくローリングしたことが、本明細書において実証された。フコシル化ＣＢ  ＨＳＣはさらに、インビボで、骨髄への改善されたホーミングおよび骨髄における改善された移植を有することが、本明細書において示される。非肥満糖尿病重症複合免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスは、ヒトのＨＳＣのインビボ研究のための異種移植レシピエントとして十分に確立されている。本発明者らは、フコシル化されたかもしくはフコシル化されていないＣＢ  ＨＳＣを移植されたＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、ヒト造血系移植を比較した。
【００４０】
雄性および雌性の病原体を有さない（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（４〜５週齢）を、レシピエントとして使用した。このマウスを、２〜４時間照射し（２３０ｒａｄ）、その後、それぞれ、ＦＴＶＩ処理（フコシル化）または偽処理（ＦＴＶＩ処理したが、ＧＤＰ−フコースなし）したＣＢ  ＨＳＣ（３００μｌ中８×１０６個／マウス）を静脈内注射した。コントロールマウスには、各々ＣＢ  ＨＳＣなしの３００μｌの生理食塩水を与えた。
【００４１】
移植の６週間後、マウスを繁殖させて、屠殺した。両大腿から骨髄細胞を単離し、１０ｍｍメッシュフィルタを通して濾過し、細胞片を除去した。赤血球を溶解した後、各マウスからの骨髄有核細胞を１×１０６個／ｍｌの濃度で、ＨＢＳＳ中に再懸濁した。フローサイトメトリーおよびヒト造血前駆体アッセイ（ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ａｓｓａｙ）の両方により、移植を分析した。フローサイトメトリーについては、骨髄有核細胞を、Ｃｙ５結合体化抗ヒトＣＤ４５  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共にインキュベートした。
【００４２】
ヒト造血前駆体アッセイについては、３５ｍｍ培養皿あたり１×１０５個の骨髄有核細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４４３３培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）中に二連でプレートし、３７℃、５％  ＣＯ２にてインキュベートした。全コロニー、バースト形成単位−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位−顆粒球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、およびコロニー形成単位−顆粒球／巨核球／マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）を、培養の１４日目に計数し、分析した。コロニーのヒト起源を、それぞれ、骨髄細胞についてヒトＣＤ４５に対するｍＡｂで、赤血球についてグリコホリンＡに対するｍＡｂで染色した異なるコロニーから回収した細胞のフローサイトメトリー分析によって確認した。
【００４３】
（結果）
フローサイトメトリーにより分析したように、フコシル化ＣＢ  ＨＳＣを与えた、照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスは、偽処理ＣＢ  ＨＳＣを受けたマウスよりも、骨髄および末梢血におて、２〜３倍多いＣＤ４５陽性のヒト由来の造血細胞を有した（図１１Ａ）。フコシル化細胞を移植したマウスの骨髄におけるヒト造血前駆体の有意に改善された移植は、ＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭの増加により実証されるように、多重系統であった（図１１Ｂ）。注目すべきなのは、ＣＢ  ＨＳＣ由来のコロニーの大きさが、いずれのレシピエント群においても有意に異ならず（データは示さず）、このことは、フコシル化が、ＣＢ前駆体の増殖能を変化しなかったことを示す。従って、このインビボ研究は、ＦＴＶＩ処理したＣＢ  ＨＳＣが、偽処理細胞が有するよりも、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄に帰巣し、骨髄内に移植するより高い能力を有することを実証する。これらの結果は、本発明のＨＳＣが、ヒトにおいて増強された骨髄移植を有することを示す。
【００４４】
（有用性）
本明細書中に記載されるフコシル化ＨＳＣは、種々の方法で使用され得る。例えば、これらの細胞は、ナイーブ（原始的）であるので、これらは、照射された被験体および／または化学療法に供された個体の骨髄を完全に再構築するために使用され得る。
【００４５】
とりわけ、本発明による造血幹細胞の投与により処置され得る症状は、白血病およびリンパ腫（例えば、慢性骨髄性（骨髄形成）白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＪＣＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ急性白血病（ＡＬＬ）、悪性リンパ腫、多発性骨髄種、再生不良性重症貧血（ａｐｌａｓｔｉｃ  ａｎｅｍｉａ  ｇｒａｖｉｓ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）および自己免疫疾患）である。
【００４６】
本発明の処理されたＨＳＣで処置され得る他の疾患は、以下である：Ｇｕｎｔｈｅｒ病、ハンター症候群、ハーラー症候群、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ増殖症候群、および固形組織腫瘍（例えば、乳癌）。
【００４７】
これらの処置において、これらの処置されたＨＳＣの集団が、骨髄が切除両方により破壊された患者に与えられ得る。
【００４８】
本発明の細胞は、例えば、静脈内注射によって、または、当業者に周知の任意の他の適切な方法によって投与され得る。疾患または状態に罹患する宿主を処置するための方法において、ＨＳＣの治療有効量とは、この疾患もしくは状態の症状または効果を減少または排除するのに十分な量である。宿主に投与される治療有効量は、個体を基準に決定され、少なくとも部分的に、個体の大きさ、処置される症状の重篤度、および考えられる結果の考慮に基づく。こうして、治療有効量は、慣用的な実験程度を使用して、このような実務を使用する当業者によって決定され得る。ＨＳＣ移植に関する詳細な情報については、「Ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｉｔｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」［Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｉｓｓｕｅ，５３，２，１９９８］が参考になり得、この文書に与えられる説明は、その全体が、明白に本明細書中に参考として援用される。
【００４９】
投与されるフコシル化幹細胞の投薬量の調製において、種々の薬学的に受容可能なキャリアが利用され得る。キャリア、希釈剤またはビヒクルは、生理学的に受容可能なｐＨを得るための緩衝化剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水）および／または、生理学的に受容可能であり、そして／もしくは使用に安全な他の物質を含み得る。一般に、ヒトにおける静脈内注射用の物質は、当業者に利用可能な、Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎにより確立された規定を満たすべきである。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、１容量：１容量比で、処理されたＨＳＣ組成物と組合せられ得る。このキャリアは、例えば、Ｍ１９９またはＲＰＭＩ  １６４０倍値であり得る。さらに、上記投薬形態の調製において、今日共通して使用される種々の注入物がまた使用され得る。１つの実施形態において、ＨＳＣの移植において従来使用される投与量が使用され得る。この投薬量は、例えば、患者の体重１ｋｇあたり約．０１〜１０×１０８個の処理されたＭＮＣ（処置されたＣＤ３８ｌｏｗ／−ＨＳＣまたは本明細書中のどこかに規定された、他の処置されたＨＳＣを含む）であり得るか、または、適切な場合は、これより多くても少なくてもよい。
【００５０】
本明細書中に記載されるように、本発明は、ＨＳＣを処理する方法を企図し、この方法は、一定量のＨＳＣ（少なくともこのＨＳＣの一部は、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠失しているか、または、この発現が減少している）を提供する工程、およびインビトロにおいて、この量のＨＳＣを、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーで処理して、処理されたＨＳＣを形成する工程を包含し、この処理されたＨＳＣは、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに対して増強された結合を有する。１つの実施形態において、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠失するか、またはこの発現が減少しているＨＳＣの一部は、骨髄帰巣能が減少している。ＨＳＣは、ヒトの臍帯血に由来し得、そして、ヒトの臍帯血の未分画量であり得る。あるいは、ＨＳＣは、末梢血に由来し得、そして、末梢血の未分画量であり得る。あるいは、ＨＳＣは、骨髄に由来し得、そして、骨髄の未分画量であり得る。表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠失するか、またはこの発現が減少しているＨＳＣの一部は、ＰＳＧＬ−１またはフコシル化されていないグリカンもしくはフコシル化されていないＯ−グリカンを有する他の構造を含む。この方法において、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠失するか、またはこの発現が減少しているＨＳＣの一部は、ＮｅｕＡｃα２，３  Ｇａｌ  β１，４  ＧＩｃＮＡｃを含むコア−２  Ｏ−グリカンを有するＰＳＧＬ−１を含み得、これは、ＧｌｃＮＡｃに対するα１，３結合においてフコースを欠くか、または、適切なフコシル化を欠く他のグリカンを含む。１つの実施形態において、少なくとも５０％の処理されたＨＳＣが、Ｐ−セレクチン結合アッセイにおいて所定の蛍光閾値を超えるＰ−セレクチン結合蛍光、またはＥ−セレクチン結合アッセイ（本明細書中のどこかに説明される）において所定の蛍光閾値を超えるＥ−セレクチン結合蛍光を有する。この方法において、α１，３−フコシルトランスフェラーゼは、α１，３−フコシルトランスフェラーゼＩＶ、またはα１，３−フコシルトランスフェラーゼＶＩＩであり得る。さらに、フコースドナーは、ＧＤＰ−フコースであり得る。
【００５１】
本発明はさらに、臍帯血由来のＣＤ３４＋ＨＳＣを含み、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠失するか、またはこの発現が減少しているＨＳＣおよび薬学的に受容可能なキャリアの組成物を企図する。ここで、少なくとも１０％のＣＤ３４＋ＨＳＣが、Ｐ−セレクチン（またはＥ−セレクチン）に結合する。この組成物においては、代替的な実施形態において、少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％または９５％のＣＤ３４＋ＨＳＣがＰ−セレクチン（またはＥ−セレクチン）に結合する。
【００５２】
本発明はまた、造血系疾患、または、ＨＳＣの移植を必要とする他の状態を有する被験体を、本明細書中に記載される処理されたＨＳＣの組成物を、このような造血系疾患、または、ＨＳＣの移植を必要とする他の状態を有する被験体に投与することによって処置することを企図する。この造血系疾患は、例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、脊髄形成異常、慢性骨髄性白血病、若年性慢性骨髄性白血病または鎌状赤血球貧血であり得る。
【００５３】
さらに、本発明は、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−として特徴付けられる細胞を含むヒトＨＳＣの集団を含む血液製剤を企図し、ここで、少なくとも１０％のＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−が、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する。この血液製剤においては、代替的な実施形態において、少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％または９５％（またはこの範囲内の任意の百分率）のＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−が、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する。この血液製剤において、ヒトＨＳＣは、ヒト臍帯血、成人の末梢血、または骨髄に由来し得る。この血液製剤はまた、薬学的に受容可能なキャリアまたはビヒクルを含み得、そしてまた、遊離のフコシルトランスフェラーゼまたは支持体に結合したフコシルトランスフェラーゼを含み得る。
【００５４】
本発明はまた、一定量のＨＳＣ（少なくともこのＨＳＣの一部は、表面タンパク質ＣＤ３８の発現を欠失するか、またはこの発現が減少している）を提供する工程、およびインビトロにて、α１，３−フコシルトランスフェラーゼおよびフコースドナーを用いて一定量のＨＳＣを処理し、処理されたＨＳＣを生成する工程を包含する方法によって製造された血液製剤を企図し、ここで、処理されたＨＳＣの少なくとも１０％が、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する。代替的な実施形態において、この血液製剤の、少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％または９５％（または、この範囲に含まれる任意の百分率）の処理されたＨＳＣが、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合する。血液製剤において、この一定量のＨＳＣは、ヒトの臍帯血、末梢血または骨髄に由来し得る。
【００５５】
本発明は、種々の実施形態と組合せて、その局面がより完全に理解および認識され得るように上に記載されているが、これらの特定の実施形態に本発明が制限されることは意図されない。対照的に、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内に包含され得る、全ての代替物、改変および等価物を網羅することが意図される。従って、先の実施例は、本発明の実施を例示するのに役立ち、示される特定のものが、一例として、かつ、本発明の例示的な議論の目的のためだけのものであり、そして、最も有用であり、手順の説明、ならびに本発明の原理および概念の面を容易に理解すると考えられるものを提供するために提示されることが理解される。
【００５６】
本明細書中に引用される全ての参考文献、特許、および特許出願は、その全体が参考として、本明細書中に援用される。
【００５７】
本明細書中に記載される種々の組成物および生成物の構成および操作において、または、本明細書中に記載される方法の工程、もしくは工程の順序において、本明細書中に記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更がなされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】Ａ：ヒト臍帯血から単離された単核細胞（ＭＮＣ）のＣＤ３４抗体染色。Ｂ：ＣＤ３４濃縮後のＣＤ３４抗体染色。Ｃ：ＣＤ３４＋細胞の同位体コントロールＩｇＧ染色。軸は、フローサイトメトリーにより測定された場合の蛍光強度である。
【図２】Ａ：臍帯血発現ＰＳＧＬ−１から単離されたＣＤ３４＋細胞。Ｂ：ＣＤ３４＋細胞は、約３０％のＣＤ３４＋ＣＤ３８ｌｏｗ／−細胞（始原前駆体（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ））と約６５％のＣＤ３４＋ＣＤ３８＋細胞とからなる。軸は、フローサイトメトリーにより測定された場合の蛍光強度である。
【図３】Ａ：ＣＤ３４＋細胞は、Ｐ−セレクチン結合細胞（Ｒ２）または非Ｐ−セレクチン結合細胞（Ｒ１）としてゲートされている。Ｂ：Ｒ１領域に由来する２４％±５％のＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３８の発現がまったくないか減少している。この結果は、４回の独立のフローサイトメトリー分析の代表であり、非Ｐ−セレクチン結合ＨＳＣの有意な数がＣＤ３４＋およびＣＤ３８ｌｏｗ／−であることを示す。
【図４】ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色により測定されるとおりのインビトロフコシル化後の細胞の生存度。Ａ：非処置細胞。Ｂ：擬処理（ｓｈａｍ−ｔｒｅａｔｅｄ）細胞。Ｃ：ＦＴ−ＶＩ処理細胞。軸は、フローサイトメトリーにより測定された場合の蛍光強度である。
【図５】Ａ：臍帯血から得られたＣＤ３４＋細胞の１５％が、ｓＬｅ特異的モノクローナル抗体ＨＥＣＡ  ４５２で染色されるように、低フコシル化または非フコシル化エピトープを発現する。Ｂ：ＦＴ−ＶＩおよびＧＤＰ−フコースによるインビトロα１，３−フコシル化は、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞におけるｓＬｅｘエピトープを劇的に増加させる。軸は、フローサイトメトリーにより測定された場合の蛍光強度である。
【図６】Ｐ−セクレチンの飽和量を決定するための、フローサイトメトリーによるＣＤ３４＋ＨＳＣ対する可溶性Ｐ−セレクチン結合の滴定。
【図７】臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞に対する飽和濃度の可溶性Ｐ−セレクチンの結合。Ａ：非処理の臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞の約２７％は、Ｐ−セレクチンに結合しないかまたはＰ−セレクチンに対して低レベルの結合を有する。Ｂ：インビトロα１，３−フコシル化は、Ｐ−セレクチン結合についてネガティブまたは低くあるＣＤ３４＋細胞を、Ｐ−セレクチン結合についてポジティブまたは高くある細胞に転換する。ＣおよびＤ：Ｐ−セレクチンは、Ｐ−セレクチン（Ｇ１）およびＰＳＧＬ−１（ＰＬ１）に対してモノクローナル抗体をブロックすることによって確認されるように、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞においてＰＳＧＬ−１に結合する。ＥＤＴＡはまた、結合を阻害し、これは、ＰＳＧＬ−１に対するＰ−セレクチン結合を支持するためのＣａ２＋の要求と一致する。軸は、フローサイトメトリーにより測定された場合の蛍光強度である。
【図８】剪断力下での、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはヒトＰ−セレクチンにおけるＣＤ３４＋細胞の回転。ＧＤＰ−フコースおよびＦＴ−ＶＩによる臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞の処理は、ずれ流動中のＰ−セレクチンにおいて細胞回転を有意に増加する。
【図９】臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞に対する、可飽和濃度の可溶性Ｅ−セレクチンの結合。Ａ：非処理の臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞の約２４％は、Ｅ−セレクチンに結合しないかまたは低レベルの結合を有する。Ｂ：インビトロα１，３−フコシル化は、Ｅ−セレクチン結合についてネガティブかまたは低くあるＣＤ３４＋細胞を、Ｅ−セレクチンについてポジティブかつ高くある細胞に転換する。ＣおよびＤ：Ｅ−セレクチンは、Ｅ−セレクチンに対してモノクローナル抗体をブロックすることにより確認されるように、臍帯血由来のＣＤ３４＋細胞に結合する（９Ａ９）。ＥＤＴＡもまた、結合を阻害する。軸は、フローサイトメトリーにより測定された場合の蛍光強度である。この結果は、３回の独立の測定の代表である。
【図１０】インビトロフコシル化は、剪断力下で、ヒト可溶性Ｅ−セレクチンにおけるＣＤ３４＋細胞回転を有意に増加させる。ＡおよびＢ：ＧＤＰ−フコースおよびＦＴ−ＶＩによるＣＢ  ＣＤ３４＋細胞の処理は、様々な剪断力下で、Ｅ−セレクチンにおいて回転する細胞の数を有意に増加させる。回転は、それらの細胞がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）において回転せず、回転がＥＳ１、ヒトＥ−セレクチンに対するｍＡｂによって特異的にブロックされたがＰＬ１、ｍＡｂ（ＰＳＧＬ−１のＰ−セレクチン結合部位に結合する）によってブッロクされなかったように、Ｅ−セレクチン依存性である。ＣおよびＤ：フコシル化ＣＤ３４＋細胞は、剪断力に対してより耐性であり、非処理ＣＤ３４＋細胞よりもよりゆっくりと回る。このデータは、４回の独立の実験の平均±ＳＤを表す。
【図１１】フコシル化ＣＢ  ＨＳＣは、致死照射したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの骨髄における移植の増強を示す。８×１０６回の擬処理またはＦＴＶＩ処理ＣＢ細胞の移植６週間後のマウスに由来する骨髄（ＢＭ）または末梢血（ＰＢ）が、ヒト由来の造血移植について分析された。（Ａ）ヒト汎白血球マーカーＣＤ４５に対してｍＡｂで染色したＢＭおよびＰＢ細胞のフローサイトメトリー分析は、フコシル化ＣＢ細胞を移植したマウスにおけるヒト由来の細胞の倍加を示した。（Ｂ）フコシル化せずにＣＢ細胞を移植したマウスと比較すると、ヒト造血性前駆体アッセイによって示されるように、フコシル化したＣＢ細胞を移植したマウスに由来するＢＭ細胞は、有意に多くのヒトコロニー形成前駆体（これにはＢＦＵ−Ｅ、ＣＦＵ−ＧＭ、およびＣＦＵ−ＧＥＭＭが挙げられる）を含む。生理食塩水のみを注射したコントロールマウスの骨髄は、コロニーを産生せず、このアッセイの特異性が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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