(57)【要約】  本発明は、中性または陰イオン性多糖類の存在下で、光散乱技術により、核酸やタンパク質などの１種または複数種の特異的結合性分析物を検出する方法を提供し、この方法では、導波体のエバネセント波の侵入度内でのナノ粒子標識複合体の形成によって生じる光散乱の変化が、分析物の存在のシグナルとなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．標的分析物の少なくとも２種の異なるセグメントを認識可能な該標的分析物の特異的結合性相補体が結合した１種のナノ粒子を準備する工程、
ｂ．該特異的結合性相補体を含むと考えられる試料を、該ナノ粒子および多糖類と、該特異的結合性相補体を該標的分析物の２以上の部分と結合させるのに有効な条件下で接触させることにより、光散乱複合体を形成する工程、
ｃ．該光散乱複合体から散乱光を発生させるのに有効な条件下で前記複合体を照明する工程、及び
ｄ．該標的分析物の存在を示す尺度として、前記複合体によって散乱した光を検出する工程を備える少なくとも２つの部分を有する該標的分析物の有無を検出する方法。
【請求項２】
前記照明工程が、前記光散乱複合体の少なくとも一部を導波体のエバネセント波内に配置する工程を備える請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出工程が、前記光散乱複合体からの散乱光の色を観察する工程を備える請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出工程が、前記光散乱複合体からの散乱光の強度を観察する工程を備える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出工程が、前記光散乱複合体からの散乱光の色および強度を観察する工程を備える請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子が金属であり、前記検出工程が表面プラズモンバンドの変化を観察する工程を備える請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記標的分析物および特異的結合性相補体が特異的結合対の相補体である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
特異的結合対の相補体が、核酸、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質類、リポ多糖類、糖タンパク質類、リポタンパク質類、核タンパク質類、オリゴヌクレオチド類、抗体類、イムノグロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン類、非ペプチドホルモン類、インターロイキン類、インターフェロン類、サイトカイン類、腫瘍特異的エピトープを含むペプチド類、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、構成成分または産物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかに対する抗体または代謝物を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸およびオリゴヌクレオチドが、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、真菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡの断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、天然および合成の核酸、ならびにアプタマーを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的分析物が核酸であり、前記特異的結合性相補体がオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的分析物がタンパク質または抗体であり、前記特異的結合性相補体が抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的分析物がタンパク質または抗体であり、前記特異的結合性相補体がポリクローナル抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的分析物がゲノムＤＮＡ試料由来の遺伝子配列であり、前記特異的結合性相補体が、該遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲノムＤＮＡが、哺乳動物または細菌のＤＮＡである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ナノ粒子がコアシェル粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノ粒子によって認識されない前記標的分析物の一部を認識可能な第２の結合性相補体を備える捕捉プローブが結合した導波体を準備する工程を更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的分析物、前記ナノ粒子および前記基質を同時にまたは別々に接触させる工程を更に備える請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記導波体が、ガラス、石英、またはプラスチックを備える請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記多糖類が中性または陰イオン性多糖類である請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記陰イオン性多糖類がデキストラン硫酸である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ａ．各種のナノ粒子上にあるものが標的分析物の異なる部分を認識可能な該標的分析物の特異的結合性相補体が結合した少なくとも２種のナノ粒子を準備する工程、
ｂ．該標的分析物を、特異的結合性相補体が結合した少なくとも２種の金属ナノ粒子および多糖類と、該特異的結合相補体と該標的分析物とが結合可能となるのに十分な条件下で接触させることにより、光散乱複合体を形成する工程と、
ｃ．該光散乱複合体から散乱光を発生させるのに有効な条件下で前記複合体を照明する工程、及び
ｄ．該標的分析物の存在を示す尺度として、前記複合体によって散乱した光を検出する工程を備える少なくとも２つの部分を有する該標的分析物を検出する方法。
【請求項２４】
前記照明工程が、前記光散乱複合体の少なくとも一部を導波体のエバネセント波内に配置する工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出工程が、前記光散乱複合体からの散乱光の色を観察する工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出工程が、前記光散乱複合体からの散乱光の強度を観察する工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出工程が、前記光散乱複合体からの散乱光の色および強度を観察する工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノ粒子が金属であり、前記検出工程が表面プラズモンバンドの変化を観察する工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的分析物と特異的結合性相補体が特異的結合対の相補体である請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
特異的結合対の相補体が、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質類、リポ多糖類、糖タンパク質類、リポタンパク質類、核タンパク質類、オリゴヌクレオチド類、抗体類、イムノグロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン類、非ペプチドホルモン類、インターロイキン類、インターフェロン類、サイトカイン類、腫瘍特異的エピトープを含むペプチド類、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、構成成分または産物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかに対する抗体または代謝物を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
核酸およびオリゴヌクレオチドが、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、真菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡの断片、オリゴヌクレオチド、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、天然および合成の核酸、ならびにアプタマーを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的分析物が核酸であり、前記特異的結合性相補体がオリゴヌクレオチドである請求項２３に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的分析物がゲノムＤＮＡ試料由来の遺伝子配列であり、前記特異的結合性相補体が、該遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的分析物がタンパク質または抗体であり、前記特異的結合性相補体が抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的分析物がタンパク質または抗体であり、前記特異的結合性相補体がポリクローナル抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的分析物がタンパク質または抗体であり、前記特異的結合性相補体がモノクローナル抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的分析物がタンパク質または抗体であり、前記特異的結合性相補体の一つがアプタマーであり、他の前記特異的結合性構成要素が抗体である請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記標的分析物がタンパク質または抗体であり、前記特異的結合性相補体の一つがアプタマーである請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノ粒子がアプタマー被覆金ナノ粒子である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナノ粒子が抗体金ナノ粒子である請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ナノ粒子がＤＮＡ修飾金ナノ粒子である請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記標的分析物がゲノムＤＮＡ由来の遺伝子配列であり、少なくとも４つの部分を含み、前記接触工程が、該遺伝子配列を、オリゴヌクレオチドが結合した少なくとも４種のナノ粒子と接触させ、各種のナノ粒子上の該オリゴヌクレオチドが該遺伝子配列の異なる部分と相補的な配列を有する工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記ゲノムＤＮＡが細菌のＤＮＡである請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記標的分析物を少なくとも２種のナノ粒子と接触させる工程が、前記標的分析物を各種のナノ粒子と順次接触させる工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記標的分析物を少なくとも２種のナノ粒子と接触させる工程が、前記ナノ粒子を前記標的分析物と同時に接触させる工程を備える請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項２３に記載の方法。
【請求項４７】
前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ナノ粒子がコアシェル粒子である請求項２３に記載の方法。
【請求項４９】
前記ナノ粒子によって認識されない前記標的分析物の一部を認識可能な第２の結合性相補体を備える捕捉プローブが結合した導波体を準備する工程を更に備える請求項２３に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的分析物、前記ナノ粒子および前記基質を同時にまたは別々に接触させる工程を更に備える請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記導波体が、ガラス、石英、またはプラスチックを備える請求項２３に記載の方法。
【請求項５２】
前記多糖類が中性または陰イオン性多糖類である請求項２３に記載の方法。
【請求項５３】
前記陰イオン性多糖類がデキストラン硫酸である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
標的核酸配列を少なくとも１種の検出プローブと接触させる工程と、検出可能な変化を観察する工程とを備え、試料が、増幅された核酸分子と比べて生物学的複雑性が高い核酸分子を備える酵素標的またはシグナル増幅を用いない該試料中の該標的核酸配列の同時検出の方法。
【請求項５５】
前記試料が、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、発現ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアまたは他の細胞小器官のＤＮＡ、遊離した細胞のＤＮＡ、ウイルスのＤＮＡまたはウイルスのＲＮＡ、あるいは上記の２以上の混合物を備える請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記標的核酸配列がＤＮＡである請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記検出プローブが、少なくとも一部の前記標的核酸配列と相補的な配列を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドと結合しているナノ粒子である請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子である請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ナノ粒子がコアシェル粒子である請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
少なくとも２種の検出プローブが準備され、それぞれが前記標的核酸配列の異なる部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと結合しているナノ粒子を備える請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
多糖類の存在下で、前記標的核酸を１種または複数種の検出プローブと接触させ、それによって光散乱複合体を形成し、該光散乱複合体から散乱光を発生させるのに有効な条件下で前記複合体を照明し、それから前記標的核酸配列の存在を検出することが可能である請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記光散乱複合体の少なくとも一部が導波体のエバネセント波内に配置される請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記光散乱複合体からの散乱光の色を観察することによって前記標的核酸配列の存在が検出される請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記光散乱複合体からの散乱光の強度を観察することによって前記標的核酸配列の存在が検出される請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記光散乱複合体からの散乱光の色および強度を観察することによって前記標的核酸配列の存在が検出される請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記検出プローブが金属であり、表面プラズモンバンドの変化を観察することによって前記標的核酸配列の存在が検出される請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記標的核酸配列が、遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ウイルスのＲＮＡ、ウイルスのＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、真菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、哺乳動物のｃＤＮＡ、哺乳動物のｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはアプタマーである請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記ゲノムＤＮＡが細菌のＤＮＡである請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記検出プローブがナノ粒子を備える請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
前記ナノ粒子が金属ナノ粒子である請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記金属ナノ粒子が金ナノ粒子である請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ナノ粒子がコアシェル粒子である請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記多糖類が中性または陰イオン性多糖類である請求項６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記陰イオン性多糖類がデキストラン硫酸である請求項７４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特異的な結合相手の相互作用、エバネセント導波体および光散乱に関する。より詳細には、本発明は、中性または陰イオン性多糖類の存在下で、光散乱技術により、１種または複数種の特異的結合性分析物、例えば核酸またはタンパク質を検出する方法に関し、この方法では、導波体のエバネセント波の侵入度内でのナノ粒子標識複合体の形成によって生じる光散乱の変化が分析物の存在を示す。
【背景技術】
【０００２】
本願は、２００３年５月３０日出願の米国仮出願第６０／４７４，５６９号、２００３年８月２９日出願の米国仮出願第第６０／４９９，０３４号、および２００３年１１月４日出願の米国仮出願第第６０／５１７，４５０号の優先権の利益を主張するものであり、これらは本願明細書に援用される。本願に記載の研究は、グラント番号２Ｒ４４ＣＡ８５００８−０２の下で、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から一部援助を受けた。したがって、米国政府は、本明細書で記載されて特許請求されている本発明に対する特定の権利を有し得る。
【０００３】
核酸を基礎とする分析は、遺伝性疾患および感染性疾患の診断にますます重要な手段となってきている１〜３。蛍光標識プローブと組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの標的増幅手順を利用するアッセイは、一般に好まれる検出法として広く受け入れられてきた４、５が、アッセイおよび器具の構造が比較的複雑であるとともに高価であるであるという欠点を有する。これらの制限を回避するために、いくつかの新たな標識法および検出法が開発されている。例えば、蛍光体標識プローブの酵素切断によるシグナル増幅によって、アトモルに近いレベルで複合的な混合物内の特異的ＤＮＡ配列の検出が可能となった６。また、光学的に被覆されたシリコン基質上の酵素の触媒作用によって生じる比色反応も、器具を用いない高感度核酸検出に利用されている７。それにも関わらず、これらの方法は、十分な感度を実現するために、酵素を基礎とする複雑なシグナル増幅手順および／または蛍光読み取り器を依然として必要とする。臨床診断、特にスクリーニング手順に広く適用されるために、十分に高い感度および特異性を得るのに酵素標的またはシグナル増幅を利用しない、より単純な核酸検出が明らかに必要である。さらに、タンパク質などの他の生物分析物（ｂｉｏａｎａｌｙｔｅｓ）の高感度および特異的な検出をもたらす検出戦略は、診断の適用に同様の利点を提供する。
【０００４】
マーキン（Ｍｉｒｋｉｎ）および共同研究者らは、ＤＮＡ修飾金ナノ粒子（ＤＮＡ−ＧＮＰ）の距離依存的な光学特性に基づく、核酸の新しい比色検出法を既に報告した８〜１０。金属ナノ粒子の表面プラズモンバンドの吸収頻度が、粒子間の距離ならびに凝集物サイズに依存することを利用して、ＤＮＡハイブリダイゼーションが媒介するナノ粒子の凝集によって、その表面プラズモンバンドが赤方偏移し、溶液の色が赤から紫または青に視覚的に変化することが示された。この可視的な色の変化は、少ないアリコート（例えば、１μＬ）のハイブリダイゼーション溶液を逆相ＴＬＣプレート上に染みをつけることによって観察され、永久的に記録され得る９。より最近では、この戦略は、適切に官能化された金ナノ粒子を使用するタンパク質１１、炭水化物１２、および金属イオン１３、１４の検出に拡張されている。ＤＮＡ−ＧＮＰプローブは、独特のハイブリダイゼーションの性質、すなわち急激な融解転移および高いＴｍを有することから、この検出法は、単一塩基のミスマッチ、欠失、または挿入の識別を可能にする顕著な配列特異性を達成した１５。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
試料を染みつけて視覚的に読み取るという単純性は、診断への適用に非常に魅力的であるが、検出限界（ＬＯＤ）が標的１０ｆｍｏｌと比較的低い９ことから、その実用性は今日まで限定されてきた。その低感度に寄与する２つの要因は、低濃度のナノ粒子を検出できないこと、および検出可能な色の偏移を起こすのに大きな凝集物を必要とすることである。実験データおよびＤＮＡ結合金ナノ粒子構造の光学的なモデル構築から、表面プラズモンバンド中で測定可能な赤方偏移をもたらすのに多数の（例えば、数百から数千の）直径１５ｎｍの金粒子を必要とすることが示された１０、１６。実験上、これは、大きな凝集物の形成を促進するために、ナノ粒子に対して過剰な物質量の標的を必要とする１０。感度を高める試みは、直径１５ｎｍの粒子より多くの光を吸収する直径５０〜１００ｎｍの金粒子を使用することに集中している。しかし、試験前と試験（凝集）後の色は、染みをつけた後の視覚的な読み取りによって容易には区別できなかった１７。さらに、核酸検出について当技術分野で周知のハイブリダイゼーション条件を用いると、２本鎖であるＰＣＲ単位複製配列などのより複雑な核酸試料との金ナノ粒子プローブ複合体が形成されない。試料の即座の凍結は、短いＰＣＲ単位複製配列（＜１５０塩基対）とのプローブ−標的複合体の形成を促進する。しかし、凍結は、自動化になじまないとともに低温でミスマッチの形成を促進し、したがって、ＧＣ含量が高いＰＣＲ単位複製配列などのより複雑な標的分析物試料、連続した凍結−解凍反応がタンパク質または抗体を損傷する可能性があるタンパク質を基礎とする反応に、あるいは多数の非標的配列が存在するゲノムＤＮＡ試料に適さない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、分析物が媒介する金属ナノ粒子標識プローブ複合体、例えば金ナノ粒子プローブ複合体の形成に基づいて、特異的結合性分析物を検出する方法を提供し、その形成によって散乱光の色および／または強度が変化し、少量の試料を導波体上に配置し、視覚的にまたは光検出器で散乱光を検出することによって散乱光の色および／または強度を測定することができる。核酸検出に適用されたこの検出法の概略図を図１に示す。ナノ粒子プローブ複合体は、特異的な標的分析物と結合した２種以上のプローブを備える。
【０００７】
本発明はまた、酵素標的またはシグナル増幅を用いない、試料中の標的核酸配列の同時検出の方法をも提供する。一態様では、本発明は、試料中の標的核酸配列を少なくとも１種の検出プローブと接触させる工程と、検出可能な変化を観察する工程とを備え、試料は、増幅された核酸分子と比べて生物学的複雑性が高い核酸分子を備える。
【０００８】
本発明の一態様では、プローブ複合体は、特異的な標的、例えばＤＮＡ分子の２以上の領域、例えば反復領域と結合した少なくとも１種のナノ粒子プローブを備える。特定の態様では、ナノ粒子プローブは、該ナノ粒子プローブに結合した１種の特異的結合性構成要素、例えばオリゴヌクレオチドを有することができ、１種の特異的結合性構成要素は、標的、例えばＤＮＡの反復領域と相補的である。他の態様では、ナノ粒子プローブは、該ナノ粒子プローブに結合した２種以上の特異的結合性構成要素を有することができ、２種以上の特異的結合性構成要素は、標的の異なる部分と相補的である。本発明の他の態様では、プローブ複合体は、特異的な標的、例えばＤＮＡ分子の２以上の領域、例えば反復領域と結合した少なくとも２種のナノ粒子プローブを備える。各種のナノ粒子プローブは、特異的な標的、例えばＤＮＡ分子の少なくとも１領域と結合する少なくとも１種の特異的結合性構成要素、例えばオリゴヌクレオチドを有することができる。
【０００９】
散乱を基礎とする本発明の比色検出法は、低い標的濃度でプローブ−標的結合を可能にする中性または陰イオン性多糖類を基礎とする改良されたハイブリダイゼーション法と組み合わさる場合、既に報告された吸収を基礎とするスポット試験よりはるかに高い感度（＞４桁の大きさ）を核酸検出にもたらす。さらに、本発明の方法は、著しく過剰な非凝集粒子の存在下で凝集物の検出を可能にし、低い標的濃度下でもハイブリダイゼーションを行う。また、本願で提供されるエバネセント誘導散乱と組み合わされ、デキストラン硫酸が媒介するプローブ−標的複合体の形成は、総細菌ＤＮＡ中の核酸配列についての、または抗体−抗原相互作用を伴った単純な同時のハイブリダイゼーションおよび比色検出プロトコールを可能にする。
【００１０】
本発明の特定の好ましい実施形態は、特定の好ましい実施形態および特許請求の範囲についての下記のより詳細な説明から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの部分を有する標的分析物の有無を検出する方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、（ａ）標的分析物の２種の異なる部分を認識可能な標的分析物の特異的結合性相補体が結合した１種の金属ナノ粒子を準備する工程と、（ｂ）特異的結合性相補体を含むと考えられる試料を、ナノ粒子、および多糖類、好ましくは中性または陰イオン性多糖と、特異的結合性相補体を標的分析物の２以上の部分と結合させるのに有効な条件下で接触させることにより、光散乱複合体を形成する工程と、（ｃ）光散乱複合体から散乱光を発生させるのに有効な条件下で前記複合体を照明する工程と、（ｄ）標的分析物の存在の指標として、前記複合体によって散乱した光を検出する工程とを備える。
【００１２】
他の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）各種のナノ粒子上の特異的結合性相補体が標的分析物の異なる部分を認識可能な標的分析物の特異的結合性相補体が結合した少なくとも２種の金属ナノ粒子を準備する工程と、（ｂ）標的分析物を、特異的結合性相補体が結合した少なくとも２種の金属ナノ粒子、および多糖類、好ましくは中性または陰イオン性多糖類と、特異的結合相補体および標的分析物の結合が可能となるのに十分な条件下で接触させることにより、光散乱複合体を形成する工程と、（ｃ）光散乱複合体から散乱光を発生させるのに有効な条件下で前記複合体を照明する工程と、（ｄ）標的分析物の存在の指標として、前記複合体によって散乱した光を検出する工程とを備える。
【００１３】
特定の実施形態では、照明工程は、光散乱複合体の少なくとも一部を導波体のエバネセント波内に配置する工程を備える。他の実施形態では、検出工程は、光散乱複合体からの散乱光の色を観察する工程、および／または光散乱複合体からの散乱光の強度を観察する工程を備える。
【００１４】
さらに他の実施形態では、標的分析物および特異的結合性相補体は、特異的結合対の相補体である。特定の実施形態では、特異的結合対には、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、ペプチド核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質類、リポ多糖類、糖タンパク質類、リポタンパク質類、核タンパク質類、オリゴヌクレオチド類、抗体類、イムノグロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン類、非ペプチドホルモン類、インターロイキン類、インターフェロン類、サイトカイン類、腫瘍特異的エピトープを含むペプチド類、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、構成成分または産物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、上記物質のいずれかに対する抗体または代謝物が含まれるがそれらに限定されない。
【００１５】
一実施形態では、核酸およびオリゴヌクレオチドは、遺伝子、ウイルスのＲＮＡおよびＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、真菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡの断片、合成オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、１本鎖および２本鎖の核酸、天然および合成の核酸、またはアプタマーである。
【００１６】
本願において、「標的分析物」とは、検出される任意の分子または化合物である。分析物の非限定的な例には、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、抗原、炭水化物、タンパク質、ペプチド核酸、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬剤、ウイルス、多糖類、脂質類、リポ多糖類、糖タンパク質類、リポタンパク質類、核タンパク質類、オリゴヌクレオチド類、抗体、イムノグロブリン、アルブミン、ヘモグロビン、凝固因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン類、非ペプチドホルモン類、インターロイキン類、インターフェロン類、サイトカイン類、腫瘍特異的エピトープを含むペプチド類、細胞、細胞表面分子、微生物、微生物の断片、部分、構成成分または産物、小有機分子、核酸およびオリゴヌクレオチド、ならびに上記物質のいずれかに対する抗体または代謝物が含まれる。
【００１７】
本発明の特定の実施形態では、標的分析物は核酸であり、特異的結合性相補体はオリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、標的分析物はタンパク質または抗体であり、特異的結合性相補体は抗体である。さらに他の実施形態では、標的分析物はタンパク質または抗体であり、特異的結合性相補体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。
【００１８】
さらに他の実施形態では、標的分析物はゲノムＤＮＡ試料由来の遺伝子配列であり、特異的結合性相補体は、前記遺伝子配列の少なくとも一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、試料中の標的核酸配列の同時検出の方法を提供する。一実施形態では、この方法は、試料中の標的核酸配列を少なくとも１種の検出プローブと接触させる工程と、検出可能な変化を観察する工程とを備え、試料は、増幅された核酸分子と比べて生物学的複雑性が高い核酸分子を備える。したがって、標的核酸配列は、酵素標的またはシグナル増幅を用いることなく検出され得る。本願において、「同時検出」とは、非結合プローブからプローブ分析物複合体を分離することなく検出プローブによって分析物が検出される検出形式を指す。
【００２０】
「酵素標的増幅」の非限定的な例には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、および等温キメラプライマー開始核酸増幅（ＩＣＡＮ（商標））（タカラバイオ社（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ）［日本所在］）が含まれる。
【００２１】
「酵素シグナル増幅」の非限定的な例には、例えば本願に援用されるホールら（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９７巻、８２７２〜８２７７ページに記載の、アトモルに近いレベルで複合的な混合物内の特異的ＤＮＡ配列を検出するための蛍光体標識プローブの酵素触媒作用が含まれる。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明の標的核酸配列は、遺伝子、ウイルスのＲＮＡ、ウイルスのＤＮＡ、細菌のＤＮＡ、真菌のＤＮＡ、哺乳動物のＤＮＡ、哺乳動物のｃＤＮＡ、哺乳動物のｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはアプタマーである。好ましくは、標的核酸配列はＤＮＡである。他の態様では、試料は、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、発現ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアまたは他の細胞小器官のＤＮＡ、遊離した細胞のＤＮＡ、ウイルスのＤＮＡまたはウイルスのＲＮＡ、あるいは上記の２以上の混合物である。
【００２３】
本願において「試料」とは、分析物を構成し、本発明の方法で使用され得る任意の量の物質を指す。例えば、試料は生物試料であり、またはヒト、動物、植物、真菌、酵母、細菌、ウイルス、組織培養物もしくはウイルス培養物、または上記の組合せに由来する生物試料から抽出される。それらは、固形組織（例えば、骨髄、リンパ節、脳、皮膚）、体液（例えば、血清、血液、尿、痰、精液またはリンパ液）、骨格組織、または個々の細胞を含んでもよく、あるいはそれらから抽出されてもよい。また、試料は、精製または部分精製核酸分子、ならびに、例えば本発明の方法をうまく行うのに適した条件を発生させるために使用される緩衝液および／または試薬を含んでもよい。
【００２４】
特定の実施形態では、試料中の核酸分子は、増幅された核酸分子よりも生物学的複雑性が高い。当業者は、例えば、本願に援用されるルーウィン（Ｌｅｗｉｎ）、ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ２、第２版：Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ、１９８０年、ジョンウィリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）［米国ニューヨーク所在］に記載の方法を用いて、標的核酸配列の生物学的複雑性を容易に決定することができる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションの動態は、その反応相手、すなわちハイブリダイズする鎖の濃度に絶対的に依存する。細胞試料から抽出された所与の量のＤＮＡでは、ゲノム、ミトコンドリア（存在する場合）、および染色体外エレメント（存在する場合）の総ＤＮＡの量は、わずか数マイクログラムである。したがって、ハイブリダイズする反応相手の実際の濃度は、その反応相手の大きさ、および抽出ＤＮＡの複雑性に依存することになる。例えば、単一ゲノム当たり１コピー存在する３０塩基の標的配列は、異なる供給源由来の異なる複雑さを有するＤＮＡの試料を比較したとき、異なる濃度で存在する。例えば、ヒト総ＤＮＡ１マイクログラム中の同じ標的配列の濃度は、１マイクログラムの細菌ＤＮＡ試料中の約１／１０００であり、小さなプラスミドＤＮＡ１マイクログラムの試料の約１／１，０００，０００である。
【００２６】
ヒトゲノムの高い複雑性（１×１０９ヌクレオチド）から、ゲノムＤＮＡに重複および類似の配列が存在することにより、異常に高度な特異性が要求される。例えば、２５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを有する核酸配列をヒトゲノム全体から区別するために、４０，０００，０００：１の識別力を有する程度の特異性が要求される。さらに、野生型および変異型の標的が２５ｍｅｒの捕捉配列中で１塩基だけ異なることから、９６％の相同性の２つの標的を区別することが遺伝子型決定の成功に要求される。本発明の方法は、驚くべきことにかつ予期せず、増幅された核酸分子と比べて複雑性が高い標的核酸分子の効率のよい特異的かつ感度の高い同時検出を提供する。
【００２７】
ヒト組織に由来する試料中の標的核酸分子の生物学的複雑性は１，０００，０００，０００程度であるが、植物または動物のゲノムでは最大で１０倍または１／１０となることがある。好ましくは、試料の生物学的複雑性は、約５０，０００〜５，０００，０００，０００である。より好ましくは、生物学的複雑性は、約１，０００，０００〜６，０００，０００である。最も好ましくは、生物学的複雑性は１，０００，０００，０００である。
【００２８】
特定の他の実施形態では、本発明の検出プローブはナノ粒子であり、好ましくは金属ナノ粒子であり、より好ましくは金ナノ粒子であり、標的核酸配列の少なくとも一部と相補的な配列を有する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドと結合している。
【００２９】
他の実施形態では、本発明の同時検出法は、中性または陰イオン性多糖類、好ましくは陰イオン性多糖類、より好ましくはデキストラン硫酸の存在下で、標的核酸を１種または複数種の検出プローブと接触させ、それによって光散乱複合体を形成させる工程を備え、光散乱複合体から散乱光を発生させるのに有効な条件下で前記複合体を照明して標的核酸配列の存在を検出することができる。この実施形態では、検出プローブはナノ粒子であり、好ましくは金属ナノ粒子であり、より好ましくは金ナノ粒子であり、それぞれが、標的核酸配列の異なる部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドと結合している。本願に記載されているように、散乱光を検出して、標的核酸配列の存在を検出することができる。
【００３０】
一実施形態では、本発明の方法は、導波体へと誘導された光の散乱の変化の検出する工程を含み、散乱の変化は、中性または陰イオン性多糖類の存在下での分析物が媒介するナノ粒子プローブ複合体の形成の結果生じ、複合体は、導波体の表面に形成されるかまたは溶液中に形成されるとともに表面上にスポットされ、その結果、試料の少なくとも一部がエバネセント波の侵入度内にある。導波体とは、２次元の内部全反射（ＴＩＲ）エレメントを指し、複数点で内部参照（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）が可能な境界面をもたらし、それによって、表面全て、またはそのほとんど全体にわたって実質的に均質なエバネセント波が発生する。２次元導波体は平面または曲線直線状であり、キュベット型、棒型または皿型が想定される。導波体は、ガラス、石英、プラスチック、例えばポリカーボネート、アクリル、ポリスチレンなどの透明な物質から構成される。好ましくは、導波体は平面導波体、例えばガラススライドである。
【００３１】
本発明の方法でのナノ粒子プローブ複合体の形成は、中性または陰イオン性多糖類の存在下での標的分析物との２以上のナノ粒子標識の特異的結合相互作用（あるいは、単一標的上の複数部位での１ナノ粒子の結合）によって、溶液中で行われる。導波体は、ナノ粒子プローブ複合体の形成による散乱の変化を測定することができるように、溶液と接触される。ナノ粒子プローブ複合体が金属ナノ粒子プローブからなるとき、散乱光の色および強度の形で表面プラズモンバンドの振動数および強度の変化が測定される。本発明の一実施形態では、試料は（例えば、溶液からスポットされた）エバネセント域の侵入度内に配置され、捕捉プローブを必要とすることなく試料からの光散乱が測定され得る。また、試料は、導波体上にスポットされるとともに乾燥される。この手順によって、検出感度を高め、永久的な試験記録をもたらすことができる。
【００３２】
導波体に使用されるガラスまたは他の型の表面は、ハプテンまたはオリゴヌクレオチド配列などの特異的結合性構成要素を含めて、種々の官能基（例えば、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨなど）のいずれでも修飾され得る。この実施形態では、中性または陰イオン性多糖類（例えば、デキストラン硫酸）によって、適切に官能化された１種または複数種の金属ナノ粒子が、同時形式で標的分析物の隣接する領域に結合することができる。一例は、溶液中での相補的な核酸配列（例えば、ＰＣＲ単位複製配列）の隣接する領域との２つのＤＮＡ修飾金属ナノ粒子の結合である。
【００３３】
本願において、ＰＣＲ単位複製配列またはゲノムＤＮＡを用いた実験で、＞２％ｖ／ｖのデキストラン硫酸（平均分子量５００，０００）により、２以上のＤＮＡ修飾金プローブが相補的な標的配列と結合することができ、照明されたガラス導波体上に試料がスポットされる際に比色散乱の検出可能な変化が生じる。２〜５％ｖ／ｖのデキストラン硫酸の使用により、標的分析物の比色散乱における同様の検出可能な変化が示されたが、２％ｖ／ｖ未満のデキストラン硫酸では比色散乱が変化しなかった。２本鎖核酸に加えて、＞２％ｖ／ｖのデキストラン硫酸（平均分子量５００，０００）により、ポリクローナル抗体被覆金プローブがタンパク質を基礎とする標的と結合することができ、照明されたガラス導波体上に試料がスポットされる際に比色散乱の検出可能な変化が生じる。
【００３４】
したがって、本発明の一実施形態では、陰イオン性多糖類である平均分子量５００，０００のデキストラン硫酸などの０．１〜１０％ｖ／ｖの中性または陰イオン性多糖類を使用して、プローブ−標的複合体の形成を促進することができる。好ましくは、陰イオン性多糖類である平均分子量５００，０００のデキストラン硫酸などの２〜５％ｖ／ｖの中性または陰イオン性多糖類が、プローブ−標的の結合に使用される。また、陰イオン性多糖類であるデキストラン硫酸などの１０％を超える中性または陰イオン性多糖類が本発明の方法に使用され得る。
【００３５】
下記に記載する実施例で使用されるデキストラン硫酸の平均分子量の範囲は、〜５００，０００であった。しかし、デキストラン硫酸およびその誘導体は、様々な分子量で製造され得る。上限では、その平均分子量は１００万を超える。下限では、デキストラン硫酸の分子量は１００，０００未満である。本発明の方法での好ましい分子量の範囲は、８０，０００〜６５０，０００である。最も好ましい分子量の範囲は、４００，０００〜６５０，０００であり、平均分子量は５００，０００である。
【００３６】
デキストラン硫酸ナトリウム塩は、デキストランのポリアニオン誘導体である。中性と陰イオン性とのどちらのデキストランポリマーも、ＤＮＡの再生を促進することが既に示されている（ウェットマーら（Ｗｅｔｍｕｒ  ｅｔ．  ａｌ）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、第１４巻（１９７５年）、２５１７ページ）。したがって、中性とポリ陰イオン性とのどちらの多糖類も本発明の方法に使用され、プローブ−標的分析物複合体を形成することができる。さらに、天然のムコ多糖類（例えば、コンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸）も化学組成において類似し、本発明の方法においてプローブ−標的分析物複合体を形成するために使用され得る。加えて、中性、陰イオン性、または陽イオン性、あるいはそれらの混合物である他の天然または合成のポリマーも、本発明の方法に使用され得る。非限定的な例はＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）であり、これもＤＮＡ再生速度を促進することが示されている。
【００３７】
一実施形態では、本発明の方法で、光散乱標識として金属ナノ粒子が使用される。そのような標識は、弾性散乱、すなわち実質的に光エネルギーを吸収することなく散乱する入射光を発生させる。適切であるが非限定的なナノ粒子およびそのようなナノ粒子を調製する方法は、２００３年１月１４日発行の米国特許第６，５０６，５６４号；２００１年３月２８日出願のＵＳＳＮ０９／８２０，２７９号；２００１年１２月７日出願のＵＳＳＮ００８，９７８号；２００２年４月１８日出願のＵＳＳＮ１０／１２５，１９４号；２００１年１２月２８日出願のＵＳＳＮ１０／０３４，４５１号；２００１年３月２８日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号；１２／７／０１出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４６４１８号；および２００２年５月２２日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６３８２号に記載されており、これら全てが本願に援用される。直径＞３０ｎｍの金属ナノ粒子は、照明された導波体上でのプローブ−標的分析物複合体の同時検出に好ましい。直径＞３０ｎｍの金属ナノ粒子は高い効率で光を散乱することが知られており、その散乱強度は個々の粒子の半径の６乗に対応する。さらに、特定の波長の光の吸収および散乱を導く金属ナノ粒子の表面プラズモンバンドの振動数は、粒子の大きさ、化学組成、粒子の形状、および周囲の媒体に依存し、その結果、２以上の金属ナノ粒子の粒子間距離の短縮から、表面プラズモンバンドの振動数および強度の変化が生じる。例えば、特異的結合性構成要素を有する２つの金属ナノ粒子が標的分析物の隣接する領域と結合する際、表面プラズモンバンドの振動数の変化が起こり、溶液の色が変化する。単分散粒子（＜１５％ＣＶ）の合成が可能であり、且つ視覚的に、または照明された導波体上の光学的検出器を用いて散乱光の色および強度の変化をモニターすることができることから、大きさの範囲が直径４０〜８０ｎｍである金属ナノ粒子が最も好ましい。金、銀、銅、および当技術分野で周知の他の金属粒子、あるいは合金またはコアシェル粒子を含む様々な金属ナノ粒子も、報告されている発明で使用され得る。例えば、コアシェル粒子は、金属または非金属（例えば、シリカまたはポリスチレン）の芯を金属の殻で被覆したナノ粒子である。そのようなコアシェル粒子は、例えば、ハラスら（Ｈａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ）、１９９９年、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ第７５巻：２１９７〜９９ページ、およびハラスら（Ｈａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ）、２００１年、Ｊ  ｏｆ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．Ｂ第１０５巻：２７４３ページに記載されており、これは本願に援用される。一実施形態では、表面プラズモンバンドを有する他の型の金属ナノ構造が本発明の方法に使用される。高度に安定であり、且つ様々な生体分子を用いて誘導体化され得ることから、最も好ましい粒子の組成は金である。最も好ましい粒子および大きさ範囲は、直径４０〜８０ｎｍの金粒子である。
【００３８】
デキストラン硫酸を用いてナノ粒子プローブ−標的分析物複合体を形成する際、好ましい検出の実施形態は照明された導波体であり、エバネセント域の侵入度内にある複合体からの散乱光のモニタリングを可能にする。当技術分野で周知であるナノ粒子散乱のモニタリングに伴う高い検出効率に加えて、金属ナノ粒子プローブ−標的分析物複合体の形成は、色の偏移を導くだけでなく、複合体化しなかった金属ナノ粒子プローブと比べられた際に散乱光の強度の実質的な増大をもたらす。
【００３９】
既に報告された系と異なり、これは、過剰なナノ粒子プローブの存在下での標的分析物の同時検出を可能にする。一例はＤＮＡ標的に結合した２つの５０ｎｍ金プローブであり、試料が導波体上で乾燥された後（ある条件下でデキストラン硫酸がいくらかの水分を保持するように、試料が完全に乾燥されなくてもよいことに留意されたい）、過剰な非結合金ナノ粒子が除去されることなく（すなわち、同時反応で）、最大で２０倍過剰な非結合金ナノ粒子プローブの存在下で、導波体上で視覚的に検出可能な色の変化が観察される。その結果、ナノ粒子プローブが過剰でも標的分析物の同時検出が可能となり、デキストラン硫酸と組み合わされて、フェムトモル濃度の標的分析物（例えば、特定のゲノムＤＮＡ配列）を、ピコモル濃度の直径５０ｎｍの金プローブを用いて検出することができる。
【００４０】
さらに、標的分析物に結合する２つより多いプローブを用いることによって、検出可能なプローブ／標的比を実質的に増大させることができる。同時アッセイで４つの５０ｎｍ金プローブをＤＮＡ標的の隣接する領域に結合させることによって、２００倍を超える過剰な金ナノ粒子プローブを本発明の方法で使用することができ、比色散乱の変化は、照明された導波体上で依然として検出可能である。標的に対する過剰なプローブを用いることによって、視覚的に、または光学的検出器を用いて、著しく低い濃度の標的分析物を検出することができる。
【００４１】
本願に記載される実施例は、標的分析物と複合体化された２つのプローブまたは４つのプローブの使用を示。一実施形態では、本発明の方法において、標的分析物と結合するために多数のプローブが使用され、検出感度をさらに高めてプローブ／標的比を大きくすることができる。本発明の他の実施形態では、標的分析物と相補的な配列部分、およびプローブと相補的な第２の配列部分を含む中間オリゴヌクレオチドが標的分析物と結合し、その後ナノ粒子プローブと結合してもよい。標的分析物の異なる部分と結合するが、ナノ粒子と共通する認識配列を有する中間オリゴヌクレオチドを設計することによって、複数の中間オリゴヌクレオチドを有する単一のナノ粒子プローブを使用して２以上のナノ粒子プローブが標的分析物と結合することができる。
【００４２】
当技術分野で周知の非エバネセント散乱を基礎とする検出法は、中性または陰イオン性多糖類の存在下での金属ナノ粒子プローブ複合体の形成について、本発明の方法に適合可能である。光吸収、光透過、光反射、表面増強ラマン散乱などの他の方法、ナノ粒子プローブ複合体を検出するための当技術分野で周知の電気的ならびに他の検出法も使用可能である。
【００４３】
本発明の他の実施形態では、導波体は、少なくとも１つまたは複数の不連続領域を含み、該領域は、１つまたは複数の異なる標的分析物を固定化するために結合した同じまたは異なる特異的結合性構成要素もしくは捕捉プローブを含む。好ましくは、不連続領域は小さなドットまたはスポットの形態である。他の大きさ及び形態が可能であり、本発明の範囲内である。また、導波体は、単一分析物または複数の異なる分析物の異なる部分を標的とする複数の並んだ不連続領域を含んでもよい。
【００４４】
本願で定義するように、「特異的結合性構成要素」とは、同族の結合対のどちらかの構成要素を意味する。本願で定義するように、「同族の結合対」は、一般にイオン引力、水素結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用などの非共有結合的相互作用を介して互いに特異的に結合する任意のリガンド−受容体の組合せである。例示的な同族の対および相互作用は当技術分野で周知であり、これには、例としてであって限定するものではないが、抗体またはＦａｂ断片と、その抗原、ハプテンまたはエピトープとの免疫学的相互作用；タンパク質（例えば、ホルモンまたは酵素）とその受容体（例えば、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチン）との、または炭水化物とレクチンとの生化学的相互作用；金属とキレート剤となどの化学的相互作用；相補的な核酸鎖同士の核酸塩基の対合；核酸または他のペプチド核酸アナログと同族の結合対を形成するＰＮＡがある。核酸には、２’−デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、ならびに安定可能な際にリボ核酸（ＲＮＡ）が含まれることが理解されるであろう。抗体およびオリゴヌクレオチドの特異的結合性構成要素の調製は、当技術分野で周知である。
【００４５】
特定の結合（例えば、表面との相互作用、表面とのイオン相互作用、または表面とのファンデルワールス相互作用を用いずに）を用いることなく、または非共有結合的結合を用いて、導波体上で本発明の分析物−プローブ複合体を直接観察することができる。また、当技術分野で知られている化学結合手段により、特異的結合性構成要素をと導波体とを共有結合させることができる。反応性表面は、様々な化学反応性基を用いて直接誘導体化されることができ、次いで、特定の条件下で、適用された特異的結合性構成要素と安定な共有結合を形成することができる。微小ピペットまたは微小毛細管の手動による使用などの任意の好都合な手段によって、あるいは容積式ポンプ、Ｘ−Ｙ位置決定表、および／またはインクジェット噴霧もしくは印刷システムなどの自動化された方法によって、反応性表面上に捕捉用特異的結合性構成要素を適用することができる。反応性表面上の捕捉用特異的結合性構成要素について任意の適切な密度（単位面積当たりの量）が使用され得る。
【００４６】
反応性表面に捕捉用特異的結合性構成要素を固定化することに加えて、反応性表面は、好ましくは、試験される液体試料中での反応性表面と分析物結合性構成要素との非特異的な相互作用を遮断するように処理される。反応性表面上のタンパク質特異的結合性構成要素（例えば、抗原、抗体またはＰＮＡ）の場合、特異的結合性構成要素の固定化後に遮断物質が適用される。適切な遮断物質には、限定するものではないが、カゼイン、ゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、界面活性剤および長鎖水溶性ポリマーが含まれる。核酸ＳＢＭの場合、遮断物質は、ＳＢＭの固定化の前または後に適用され得る。適切な遮断物質には、上記に記載のもの、ならびに０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）およびデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ）液が含まれる。
【００４７】
第１の特異的結合性構成要素が、必要に応じて、さらなる同族の対の中間体を介して分析物に特異的であり得ることが理解されるべきである。例えば、オリゴヌクレオチドの特異的結合性構成要素はビオチン化され、ビオチン−アビジンの同族の結合対を介して反応性表面に結合される。そのような結合は、例えば欧州特許第０１３９４８９号明細書（オルソ社（Ｏｒｔｈｏ））においてハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）によって記載され、これは本願に援用される。同様に、オリゴヌクレオチドは、例えば、本願に援用される米国特許第４，７５１，１７７号明細書（アムジェン社（Ａｍｇｅｎ））においてスタビンスキー（Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ）により開示されている媒介プローブを介して反応性表面に結合され得る。
【００４８】
本発明では、ナノ粒子は、第２の同族の結合対の第１の特異的結合性構成要素と結合することができる。第２の特異的結合対の構成要素は、「標識用特異的結合性構成要素」と呼ばれ、ナノ粒子と標識用特異的結合性構成要素との複合体は、「標識コンジュゲート」または単に「コンジュゲート」と呼ばれる。直接サンドイッチ法の形式では、標識用特異的結合性構成要素は、分析物上の第２のエピトープに特異的である。これによって、捕捉用特異的結合性構成要素と標識用特異的結合性構成要素との間に分析物を「サンドイッチする」ことができる。間接サンドイッチ法の形式では、標識用特異的結合性構成要素は、分析物と結合した部位またはレポーター基に特異的である。例えば、抗原性の分析物を捕捉した後、ビオチン化抗体を用いて分析物を「サンドイッチする」ことが可能であり、ビオチン特異的標識用特異的結合性構成要素が使用される。この間接サンドイッチ形式は、核酸にも有用である。この場合、捕捉用特異的結合性構成要素は、標的と相補的なオリゴヌクレオチドであり、標的は、特異的結合性レポーター分子（例えば、ビオチンまたはハプテン、通常はＬＣＲやＰＣＲなどの増幅手順により組み込まれる）を含み、標識用特異的結合性構成要素は、レポーター基に特異的であるように選択される。
【００４９】
標識用特異的結合性構成要素は、中間の同族の対を介してそれぞれの相手（その形式に応じて分析物または第１の特異的結合性構成要素）に特異的であることが可能であり、捕捉用特異的結合性構成要素の場合も同様であった。例えば、分析物がハプテンレポーター基を有する増幅産物などのオリゴヌクレオチドである場合、サンドイッチ法の形式は、抗ハプテン抗体と結合したナノ粒子を含んでもよい。したがって、標識用特異的結合性構成要素は、ハプテン−抗ハプテンの同族の結合対を介して分析物に特異的である。
【００５０】
方法の形式に関わらず、標識用特異的結合性構成要素は、ナノ粒子と結合してコンジュゲートを形成することができる。捕捉用特異的結合性構成要素の場合と同様に、標識用特異的結合性構成要素は、ナノ粒子と共有結合することができる。ナノ粒子上への標識用特異的結合性構成要素の物理的な吸着も適切である。そのような場合、結合は、例えば洗浄工程や他の液体の流れからナノ粒子を実質的に欠失することなく、続く反応条件に抵抗するほど十分に強いことだけが必要である。
【００５１】
ナノ粒子と標識用特異的結合性構成要素とを結合するのに適した多数の戦略が存在する。例えば、本願に援用される２００３年１月１４日発行の米国特許第６，５０６，５６４号；２００１年３月２８日出願のＵＳＳＮ０９／８２０，２７９号；２００１年１２月７日出願のＵＳＳＮ００８，９７８号；２００２年４月１８日出願のＵＳＳＮ１０／１２５，１９４号；２００１年１２月２８日出願のＵＳＳＮ１０／０３４，４５１号；２００１年３月２８日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号；１２／７／０１出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／４６４１８号；および２００２年５月２２日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／１６３８２号を参照されたい。
【００５２】
散乱光は、視覚的にまたは光電的手段によって検出され得る。視覚的検出では、観察者は、不連続領域で散乱が起こったか否かを視覚的に決定する。例えば、不連続領域が、周囲の背景、または隣接する領域に位置する非複合体化粒子を含む対照のスポットより明るく見えるときに散乱が観察される。また、観察者は、不連続領域で散乱した光が何色かを決定することもできる。例えば、対象とする不連続領域でのオレンジの散乱色を、周囲の背景と、あるいは隣接する領域に位置する粒子サイズに応じて光を散乱しないまたは弱い緑色光を散乱する非複合体化粒子を含む対照のスポットと比較することが可能である。多数の不連続領域が存在する場合、光電的検出システムが好ましい。光電検出システムには、不連続領域での光の強度および／または振動数によって調節される電気シグナルを使用するどんなシステムも含まれる。
【００５３】
生体分子のまたは分子の検出のための透明基質上の金ナノ粒子複合体の検出について本願で示される照明および画像化の形態が異なる３種の経路が存在する。第１の方法では、白色光で透明基質を平面照明するとエバネセント波がスライド表面上で発生し、基質上の試料から散乱した光をモノクローム光検出器（例えば、ＣＭＯＳまたはＣＣＤ）で収集する。第２の方法では、白色光で透明基質を平面照明するとエバネセント波がスライド表面上で発生し、基質上の試料から散乱した光をカラー光検出器（例えば、ＣＭＯＳまたはＣＣＤ）で収集する。第３の方法では、特定の波長の光で透明基質を平面照明するとエバネセント波がスライド表面上で発生し、基質上の試料から散乱した光をモノクロームまたはカラーの光検出器で収集する。代替の方法では、白色光で透明基質を平面照明するとエバネセント波がスライド表面で発生し、基質上の試料から散乱した光を特定の波長のフィルターに通してモノクローム光検出器上に収集する。さらに、中性または陰イオン性多糖の存在下で形成されるプローブ複合体から散乱した光を、非エバネセント性散乱技術を用いてモニターすることが可能である。
【００５４】
文脈によって特に必要とされない限り、本願で使用される単数の用語は、複数を含むものとし、複数の用語は単数を含むものとする。
本発明は、以下の実施例によりさらに説明される。これらの実施例は、説明のために提供されるものであり、いかなる方法においても本発明を限定することを意図するものではない。これらの実施例では、全ての割合は、固体であれば重量によるものであり、液体であれば体積によるものであり、また、全ての温度は、他に注記がなければ摂氏温度である。
【実施例１】
【００５５】
ナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合プローブの調製
この実施例では、標的となるＡＰＣ、第Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）遺伝子、またはｍｅｃＡ遺伝子の検出に使用するために、典型的なナノ粒子−オリゴヌクレオチド結合検出プローブを調製した。
（ａ）直径１５ｎｍの金ナノ粒子の調製
金コロイド（直径約１５ｎｍ）を、フレンズ（Ｆｒｅｎｓ）、１９７３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｈｙｓ．Ｓｃｉ．、第２４１巻、２０〜２２ページ、およびグレーバー（Ｇｒａｂａｒ）、１９９５年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．第６７巻、７３５ページに記載のように、クエン酸塩を用いたＨＡｕＣｌ４の還元により調製した。簡潔には、全てのガラス器具は、王水（ＨＣｌ３部、ＨＮＯ３１部）で洗浄し、ナノピュアＨ２Ｏですすぎ、次いで、オーブンで乾燥して使用した。ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸ナトリウムは、アルドリッチケミカル社（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。ＨＡｕＣｌ４水溶液（１ｍＭ、５００ｍＬ）は、攪拌しながら還流させた。次いで、３８．８ｍＭクエン酸ナトリウム（５０ｍＬ）を素早く加えた。溶液の色が淡黄色から赤紫色に変わり、還流を１５分間続けた。室温に冷却後、赤色の溶液をミクロンセパレーションインコーポレイティッド社（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）の０．２マイクロメートル（０．２ミクロン）の酢酸アセテートフィルタでろ過した。Ａｕコロイドを、ヒューレットパッカード社（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）８４５２Ａ  ダイオードアレイ分光光度計を用いたＵＶ−可視分光法およびヒタチ（Ｈｉｔａｃｈｉ）８１００透過型電子顕微鏡を用いた透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により特徴付けした。
（ｂ）直径３０、４０、および５０ｎｍの金ナノ粒子
直径３０、４０、および５０ｎｍの金粒子の溶液を、記載された実験のために、テッドペラインコーポレイティッド社（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）から購入した。
（ｃ）ステロイドジスルフィド修飾オリゴヌクレオチド（ＳＤＯ）の合成
ＡＰＣ遺伝子のＤＮＡ配列または第Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）遺伝子のＤＮＡ配列の断片に相補的なオリゴヌクレオチドを、フォスフォアミダイト化学を利用し、シングルカラムモードで、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ合成装置を使用して、１マイクロモルスケールで合成した。エックシュタイン，Ｆ．（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．）（編）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ［ＩＲＬプレス社（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード（Ｏｘｆｏｒｄ）、１９９１年］。全ての合成試薬は、グレンリサーチ社（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）またはアプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から購入した。平均カップリング効率は、９８から９９．８％とさまざまであり、最後のジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基をオリゴヌクレオチドから除去することにより、ステロイドジスルフィドフォスフォアミダイトをカップリングすることが可能であった。
【００５６】
プローブ配列と標的とのハイブリダイゼーションを可能にするために、デオキシアデノシンオリゴヌクレオチド（ｄＡ２０）またはデオキシアデノシンオリゴヌクレオチド−ポリエチレングリコール（ｄＡ１５−ＰＥＧ）を、スペーサーとしてプローブ配列の５'末端に組み込んだ。
【００５７】
５'末端ステロイド環状ジスルフィドオリゴヌクレオチド誘導体［レッチンガーら（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、２０００年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．第１１巻、２８９〜２９１ページおよびＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０（ナノスフィアインコーポレイティッド（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ，Ｉｎｃ．））参照のこと。なお、これらの開示は、そのまま援用される］を生成するために、最後のカップリング反応を、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の自動Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９合成装置で、環状ジチアンが結合したエピアンドロステロンフォスフォアミダイトを用いて行い、試薬は、トルエンの存在下でトランス１，２−ジチアン−４，５−ジオール、エピアンドロステロンおよびｐ−トルエンスルホン酸（ＰＴＳＡ）を用いて調製した。フォスフォアミダイト試薬は、以下のように調製してもよい。エピアンドロステロン（０．５ｇ）、トランス１，２−ジチアン−４，５−ジオール（０．２８ｇ）、およびｐ−トルエンスルホン酸（１５ｍｇ）を含むトルエン（３０ｍＬ）溶液を、水を除去する条件下で７時間還流し（Ｄｅａｎ  Ｓｔａｒｋ装置）、次いで、減圧下でトルエンを除去し、残油を酢酸エチルに溶解した。この溶液を、５％ＮａＨＣＯ３で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮してシロップ状の残油を得て、これをペンタン／エーテル中で一晩放置してステロイド−ジチオケタール化合物を白色固体として得た（４００ｍｇ）。Ｒｆ（ＴＬＣ、シリカプレート、溶離液としてエーテル）０．５。対照として、同一条件で得られたエピアンドロステロンおよび１，２−ジチアン−４，５−ジオールのＲｆ値は、それぞれ０．４および０．３である。続いて、ペンタン／エーテルから再結晶化することにより白色粉末を得た。ｍｐ１１０〜１１２℃。１Ｈ  ＮＭＲδ３．６（１Ｈ，Ｃ３ＯＨ）、３．５４〜３．３９（２Ｈ，ｍ  ジチアン環の２ＯＣＨ）、３．２〜３．０（４Ｈ，ｍ  ２ＣＨ２Ｓ）、２．１〜０．７（２９Ｈ，ｍ  ステロイドのＨ）。質量スペクトル（ＥＳ＋）Ｃ２３Ｈ３６Ｏ３Ｓ２（Ｍ＋Ｈ）の計算値４２５．２１７９、実測値４２５．２１５１。分析（Ｃ２３Ｈ３７Ｏ３Ｓ２）Ｓ：計算値１５．１２、実測値１５．２６。ステロイドジスルフィドケタールフォスフォアミダイト誘導体を調製するために、ステロイド−ジチオケタール（１００ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、ドライアイスアルコール浴で冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８０μＬ）およびβ−シアノエチルクロロジイソプロピルフォスフォアミダイト（８０μＬ）を続けて加え、次いで、この混合物を室温に温め、２時間攪拌し、酢酸エチル（１００ｍＬ）と混合し、５％ＮａＨＣＯ３水溶液および水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して乾燥した。残渣を無水アセトニトリルに溶解し、次いで、真空で乾燥した。収量１００ｍｇ。３１Ｐ  ＮＭＲ  １４６．０２。エピアンドロステロン−ジスルフィドが結合したオリゴヌクレオチドを、最後のＤＭＴを除去することなく、アプライドバイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９遺伝子合成装置で合成した。終了後、エピアンドロステロン��ジスルフィドが結合したオリゴヌクレオチドを、アンモニア水溶液条件下で担体から脱保護し、逆相カラムを用いたＨＰＬＣで精製した。
【００５８】
逆相ＨＰＬＣを、ヒューレットパッカード社（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）のＯＤＳ  ｈｙｐｅｒｓｉｌカラム（４．６×２００ｍｍ、５ｍｍ粒径)を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＤＸ５００システムで、ｐＨ７の０．０３Ｍ  Ｅｔ３ＮＨ＋ＯＡｃ−緩衝液（ＴＥＡＡ）を用い、９５％ＣＨ３ＣＮ／５％ＴＥＡＡの１％／分のグラジエントで行った。流速は１ｍＬ／分で、２６０ｎｍでＵＶ検出した。分取用ＨＰＬＣを用いて、ＤＭＴで保護した修飾オリゴヌクレオチドを精製した。回収および緩衝液の蒸発後、８０％酢酸を用い、室温で３０分間処理することによりＤＭＴをオリゴヌクレオチドから切断した。次いで、溶液を蒸発させてほぼ乾燥させ、水を加え、切断したＤＭＴをオリゴヌクレオチド水溶液から酢酸エチルを用いて抽出した。オリゴヌクレオチドの量を２６０ｎｍの吸収で測定し、最終的な純度を逆相ＨＰＬＣで評価した。
（ｄ）ＳＤＯの直径３０、４０、または５０ｎｍの金粒子への結合
直径３０、４０、または５０ｎｍの金粒子の溶液は、テッドペラインコーポレイティッド社（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）から供給されたままの状態で用いた。金ナノ粒子プローブは、以前に開発された文献の手順１５の改良を用いて、金粒子にステロイドジスルフィド修飾オリゴヌクレオチドを取り付けることにより調製した。簡潔には、金ナノ粒子３ｍＬに付き８ｎｍｏｌのＳＤＯを加え、１５時間、室温でインキュベートした。２４時間後、ドデシル硫酸ナトリウム水溶液（ＳＤＳ、１０重量％）をこの溶液に加えた（最終濃度：０．０１％）。次いで、２Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を、最終濃度が０．１Ｍ  ＮａＣｌになるように加えた。さらに２４時間放置後、ＮａＣｌ濃度を０．２Ｍに上昇させた。次の日、これを繰り返して、プローブ溶液のＮａＣｌ濃度を０．３Ｍにした。さらに２４時間後、ＳＤＯ−金ナノ粒子コンジュゲートを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  １８を用いて遠心することにより（３０ｎｍは、５０００ｒｐｍで２５分間、４０ｎｍは、３０００ｒｐｍで１５分間、５０ｎｍは、３０００ｒｐｍで１５分間）単離した。遠心後、暗赤色のゲル状残渣がエッペンドルフチューブの底に残った。上澄液を除き、コンジュゲートを０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７）（元のコロイドの体積）で洗浄し（２×）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７）に再度分散させた。
【００５９】
ヒトゲノムのＡＰＣ遺伝子の断片に特異的な以下のナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートをこの方法で調製した。
プローブＡＰＣ１−ＷＴ：金−Ｓ'−５'−［ａ２０−ｇｃａｇａａａｔａａａａｇ−３'］ｎ（配列番号１）
プローブＡＰＣ１−ＭＵＴ：金−Ｓ'−５'−［ａ２０−ｇｃａｇａａａａａａａａｇ−３'］ｎ(配列番号２)
プローブＡＰＣ２：金−Ｓ'−５'−［ａ２０−ａａａａｇａｔｔｇｇａａｃｔａ−３'］ｎ(配列番号３)
プローブ第Ｖ因子１−ＷＴ：金−Ｓ'−５'−［ａ２０−ｔａｔｔｃｃｔｃｇｃｃ−３'］ｎ（配列番号４）
プローブ第Ｖ因子１−ＭＵＴ：金−Ｓ'−５'−［ａ２０−ａｔｔｃｃｔｔｇｃｃ−３'］ｎ（配列番号５）
プローブ第Ｖ因子２：金−Ｓ'−５'−［ａ２０−ｃｔｇｃｔｃｔｔａｃａｇａｔｔａｇａａｇ−３'］ｎ（配列番号６）
Ｓ'は、エピアンドロステロンジスルフィド基を介して調製した結合ユニットを示し、ｎは、多くのオリゴヌクレオチドが各金ナノ粒子に結合していることを示す。
【００６０】
【表１】
2007525651.tif 000002
【実施例２】
【００６１】
ＤＮＡ修飾金ナノ粒子プローブを用いた標的二本鎖核を検出するためのハイブリダイゼーション促進剤としてのデキストラン硫酸の使用
金属ナノ粒子（直径３０〜１２０ｎｍ）は、これまでに実証されていないＰＣＲ単位複製配列または同等のゲノムＤＮＡ試料の特異的核酸配列の均一な散乱を基礎とする検出に用いられる可能性がある。金または銀粒子から散乱される光は半径の６乗で増加し、また、散乱光の特異的な色は粒子の組成、大きさ、および形に基づいて発せられる１８，１９。例えば、直径３０〜６０ｎｍの金粒子は、表面プラズモン共鳴周波数に基づく緑に着色した光を散乱し、この粒径範囲の金粒子から散乱される光は、非エバネセント光散乱を観測する検出装置を用いてピコモルからフェムトモルの粒子濃度で検出され得る１８，１９。均一な反応では、もし粒子が近接近するなら、吸収または散乱した光の色は変化する。したがって、金属ナノ粒子の光散乱能を利用して特定の生体分子を検出することは非常に望ましい。
【００６２】
生物分析物（例えば、ＤＮＡ、タンパク質）の均一な検出に使用される条件は金ナノ粒子プローブには直接適用できなかったことから、均一な生体分子の検出アッセイにおける金属ナノ粒子の使用はこれまで制限されてきた。例えば、ＤＮＡで標識した直径１５ｎｍの金粒子プローブを、変性させた二本鎖核酸に結合させるためには、瞬間凍結が必要であることが以前に明らかにされていた。しかし、凍結は自動化に適さず、また、低温ではミスマッチ構造を促進するので、非常に多くの非標的配列が存在するゲノムＤＮＡなどのより複雑な標的分析物試料や、継続的な凍結融解反応がタンパク質または抗体を損傷する可能性のあるタンパク質系反応には適していない。より長いＰＣＲ単位複製配列または特定の配列でさえ、凍結は、ナノ粒子プローブ−標的分析物複合体の形成を阻害するストランド内の塩基対形成を導く可能性がある。
【００６３】
以前の研究で、核酸のハイブリダイゼーション反応は、陰イオン性多糖類であるデキストラン硫酸などの多糖類により促進されることが明らかにされている。第Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）ＰＣＲ単位複製配列（配列番号１０）に相補的な核酸（配列番号４および６）で標識した直径４０ｎｍの金プローブを用いて、デキストラン硫酸を金プローブ−標的分析物複合体の形成の促進剤として試験した。試験には、各プローブ（７０５ｐＭ）５μｌ、ＰＣＲ単位複製配列（配列番号１０）５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２１μｌ、およびｘ％デキストラン硫酸４μＬを加えて、デキストラン硫酸の濃度を変えた。この一連の実験では、ＭＴＨＦＲ１１９ｂｐＰＣＲ単位複製配列（配列番号７）５μｌを陰性対照として用いた。この溶液を室温で１５分間ハイブリダイズさせ、次いで、試料１μｌをポリＬ−リジンスライドガラス上にスポッティングし、カラーＣＭＯＳを用いて濡れたまま撮像した（図２）。予想したように、標準的なハイブリダイゼーション条件下では色の変化は観察されず、金プローブ−標的分析物複合体は形成されなかったことを示した。５％デキストラン硫酸を加えた場合、ＦＶ９９標的溶液から散乱した光は非常に濃い橙色を示し、他方で著しく淡い緑色の光が残存する標的および対照溶液から散乱した。これは、デキストラン硫酸が、均一な反応で金プローブ−標的分析物複合体の形成を可能にすることを示している。
【実施例３】
【００６４】
ＤＮＡで修飾された金ナノ粒子プローブを用いた標的二本鎖核の検出のためのハイブリダイゼーション促進剤としてのデキストラン硫酸の使用
第Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）遺伝子の代わりにｍｅｃＡ遺伝子配列を用い、実施例２で記載したものと同様の実験を行った。ｍｅｃＡ遺伝子ＰＣＲ単位複製配列（２８１ｂｐ、配列番号１４）に結合するよう設計された１組の直径４０ｎｍの金プローブ（配列番号１１および１２）を最初の試験に用いた。〜６ｎＭ  ｍｅｃＡ２８１塩基対ＰＣＲ断片（５μＬ、断片長および濃度の近似値はＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで測定した）を、直径４０ｎｍの金プローブ（１：１の割合、５０ｐＭ全プローブ）６μＬ、およびハイブリダイゼーション緩衝液（緩衝液は、ホルムアミド２０％、デキストラン硫酸１６％、および３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）４μＬと混合した。この溶液を９５℃で３０秒間加熱し、４０℃の水浴で１５分間インキュベートした。１μＬアリコートの各試料をスポッティングし、濡れたまま撮像した。図３に示すように、２％より多いデキストラン硫酸を含む金プローブ試料は、１００倍モル過剰の２８１塩基対ｍｅｃＡ遺伝子ＰＣＲ断片に１５分間ハイブリダイズさせたときに緑から橙色に色の変化を示したが、他方で、１％未満のデキストラン硫酸を含む同じ供試試料では色の変化は観察されなかった。４％デキストラン硫酸を含む標的なしの対照もまた緑色のままで、色の変化がハイブリダイゼーションに特異的であったことを示した。１％未満のデキストラン硫酸を含む標的溶液は、ハイブリダイゼーションの数時間後でさえ緑色のままであり、デキストラン硫酸の濃度が均一なアッセイ形式では重要な要因であることを示した。
【実施例４】
【００６５】
散乱を基礎とする検出と併用した陰イオン性多糖類により媒介される金プローブ（３０、４０、または５０）ハイブリダイゼーションを用いたＰＣＲアンプリコンでの均一なＳＮＰ同定
均一なＳＮＰ同定での有用性を実証するために、アッセイを、ＡＰＣ遺伝子の一塩基変異（ＡＰＣヌクレオチド３９２０のＴをＡに）のために考案した。これは、Ｉ１３０７Ｋ変異といわれる。野生型特異的（ＡＰＣ１−ＷＴ；配列番号１）および変異特異的（ＡＰＣ１−ＭＵＴ；配列番号２）オリゴヌクレオチドプローブを、ＳＮＰに隣接した領域に特異的な第２のオリゴヌクレオチドプローブ（ＡＰＣ２；配列番号３）とともに検出用に設計した。オリゴヌクレオチドプローブを、試験用の３０、４０、および５０ｎｍのＡｕプローブに結合させた。３０ｎｍのＡｕプローブでは、２ｎＭ野生型プローブ（ＡＰＣ−１  ＷＴ）または変異プローブ（ＡＰＣ  １−ＭＵＴ）５μｌ、および２ｎＭ  ＡＰＣ２プローブ５μｌを、野生型（配列番号８）、変異（配列番号９）、または異型接合ＡＰＣ遺伝子ＰＣＲアンプリコン５μｌと混合した。これらの各試料に、２５％デキストラン硫酸２μＬおよび２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２０．５μＬを加えた。試料を９５℃で３０秒間加熱変性し、次いで、１０分間室温でインキュベートした。１μＬアリコートの各サンプルをポリＬ−リジンスライドにスポッティングして撮像した（図４）。３つの異なる照明／検出方法を評価した。最初の検出方法では、試料表面にエバネセント波を生じさせる白色光でスライドガラスの面内を照らし、カラーＣＭＯＳ検出器で画像を記録する（図４Ａ）。第２の検出法では、スライドガラスの面内を白色光で照らし、白黒ＣＭＯＳ検出器でスライドの画像を記録する（図４Ｂ）。第３の検出方法では、スライドグラスの面内を赤色ＬＥＤで照らし、白黒ＣＭＯＳ検出器でスライドの画像を記録する（図４Ｃ）。さらに、これまで試されたことはなかったが、試験しなかった他の方法としては、白色光で照らし、特定の波長のフィルターを用いて金プローブ複合体に特有の特定の波長を選択し、信号識別を高めるものがある。３つの遺伝子型は、全３つの異なる画像検査法を用いて、野生型および変異プローブ反応から散乱した光の強度に基づいて識別可能である。対応する標的／プローブ溶液が濃橙色を示し、かつ、対応しない標的／プローブ溶液が皆無かそれに近い散乱を示す場合には、カラーＣＭＯＳイメージングでは、遺伝子型は散乱光の色に基づいても識別可能である。
【００６６】
この実験を、最初のプローブ濃度が２ｎＭではなく１ｎＭであったことを除いては、同じ組の配列、アッセイ条件、および手順を用いて、直径４０ｎｍの金粒子プローブで繰り返した。この一連の実験の結果を図５に示す。この場合も同様に、３つの遺伝子型は、各画像検査法を用いて、野生型および変異プローブ反応から散乱した光の強度に基づいて識別可能である。カラーＣＭＯＳイメージングでは、遺伝子型は野生型および変異プローブ反応から散乱した光の色（陽性反応では橙色、陰性反応では緑色）に基づいても識別可能である（図５Ａ）。３０ｎｍの金プローブ試料と比較した場合、顕著な差異としては、４０ｎｍの金プローブ試料からの緑色の散乱が増加する（図４Ａおよび図５Ａ）。赤色ＬＥＤ照明は、金プローブ複合体を選択的に照射することによりこのバックグラウンド散乱を最小限に抑える（図５Ｃ）。
【００６７】
この実験を、最初のプローブ濃度が２ｎＭではなく５００ｐＭであったことを除き、同じ組の配列、アッセイ条件、および手順を用いて、直径５０ｎｍの金粒子プローブで繰り返した。この一連の実験の結果を図６に示す。３つの遺伝子型は、各画像検査法を用いて、野生型および変異プローブ反応から散乱した光の強度に基づいて識別可能である。カラーＣＭＯＳイメージングでは、遺伝子型は野生型および変異プローブ反応から散乱した光の色（陽性反応では橙色、陰性反応では緑色）に基づいても識別可能である（図６Ａ）。プローブの大きさの更なる増加により、複合体を形成していない５０ｎｍの金プローブ試料からの緑色散乱のより大きな増加がみられる。このバックグラウンド散乱は、赤色ＬＥＤ照明により最小化される。
【実施例５】
【００６８】
陰イオン性多糖類および散乱型イメージングを用いた場合の検出感度
金ナノ粒子プローブを伴う均一な反応で高感度生物分析物の検出を得る主な試みとしては、低（＜ｎＭ）プローブ濃度で効率的にプローブを結合させる能力がある。均一な反応形式では、標的に結合しないプローブはいずれもバックグラウンド信号の一因となるので、低プローブ濃度が必要とされる。これは、非常にゆっくり拡散する大きな金ナノ粒子（直径＞３０ｎｍ）の主な速度論的問題を示す。さらに、従前の研究では、標的濃度と同等か、もしくはそれよりも低いプローブ濃度を用い、検出可能な色の変化を生じた。結果として、均一な結合およびその後の標的よりもかなり過剰（＞１０：１）のプローブによって生じた色の変化を実証する研究はなかった。
【００６９】
デキストラン硫酸を使用して、金プローブ−標的分析物複合体の形成を促進し、エバネセントが誘導する光散乱検出と組み合わせて、我々は、標的合成ＭｅｃＡ遺伝子を用いてアッセイの感度を滴定実験で試験した（図７）。ｍｅｃＡ遺伝子の隣接領域に結合するように設計したオリゴヌクレオチドプローブを、直径５０ｎｍの金粒子に結合した（配列番号１１および１２）。配列は以下のとおりである。
プローブＭｅｃＡ１：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ａｔｇｇｃａｔｇａｇｔａａｃｇａａｇａａｔａ−３'］ｎ（配列番号１１）
プローブＭｅｃＡ２：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ｔｔｃｃａｇａｔｔａｃａａｃｔｔｃａｃｃａ−３'］ｎ（配列番号１２）
標的ＭｅｃＡ３：５'ｔｇｇ  ｔｇａ  ａｇｔ  ｔｇｔ  ａａｔ  ｃｔｇ  ｇａａ  ｃｔｔ  ｇｔｔ  ｇａｇ  ｃａｇ  ａｇｇ  ｔｔｃ  ｔｔｔ  ｔｔｔ  ａｔｃ  ｔｔｇ  ｇｇｔ  ｔａａ  ｔｔｔ  ａｔｔ  ａｔａ  ｔｔｃ  ｔｔｃ  ｇｔｔ  ａｃｔ  ｃａｔ  ｇｃｃ  ａｔ  ３'（配列番号１３）
様々な濃度の標的（５μＬ）（配列番号１３）を、２０ｐＭの各プローブ３μＬ（配列番号１１および１２）と、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２０．６μＬ、２５％デキストラン硫酸２．６μＬおよびホルムアミド０．８μＬからなるハイブリダイゼーション緩衝液と混合した。標的を含まない溶液を陰性対照として用いた。この溶液を９５℃で３０秒間加熱し、次いで、室温で２時間インキュベートした。１μＬアリコートの溶液をポリＬ−リジンスライド上にピペットで取り、スライド上の試料が乾燥するまでこのスライドをデシケータに置いた。この手順によりスライドガラス上の試料を濃縮し、各試料から散乱する光の量を増大させた。スライドのスライドガラス面内を白色光で照射し、目視によりまたはカラーＣＭＯＳを用いて撮像した（図７）。緑色（陰性対照）から黄色への散乱色の変化が、試験した最も低濃度の標的で（１５μＬ中全コピー３×１０６、３３３フェムトモル濃度）観察された。３×１０８を超える全コピーでは、緑色から橙色への散乱色の変化が観察された。したがって、１μＬのスポットの色の変化の目視による検出でのこれらのアッセイ条件下では、２×１０５以下の標的分子（３３３ｚｍｏｌ）が必要とされた。この感度は、薄層クロマトグラフィプレートから反射された光の視覚分析で達成される以前に報告された１０ｆｍｏｌという検出限界（２μＬの反応で３×１０９コピー／ｐＬ）よりも約４桁高かった９。
【００７０】
この感度のかなりの増加は、３つの主な要因に起因するであろう。第１には、吸収光または反射光と比較して、散乱光の観察が著しく低いナノ粒子濃度の検出を可能にした１８，２１，２２。全プローブ濃度はわずか８ピコモルであったので、１μｌアリコートを逆層プレートにスポッティングした場合には、この実験の試料は目視では検出し得なかった。第２に、どの標的も２つの粒子と複合体を形成したと仮定すれば、色の変化がまだ観察可能である場合には、最低標的濃度で約２４倍過剰の非凝集粒子があった。したがって、標的のハイブリダイゼーションは過剰のプローブにより促進することが可能であり、低濃度の標的が散乱により目視で検出可能なナノ粒子濃度で検出し得る。直径５０ｎｍの粒子では、金の体積が増加するため、直径１５ｎｍの粒子よりも比色分析の大きなシフトを促進すると予想されたが６、この驚くべき結果は、プローブ−標的複合体は、個々のプローブと比較して散乱強度の大きな増加を示すにちがいないことも示した（実施例６、図８も参照のこと）。第３に、デキストラン硫酸の使用がハイブリダイゼーション反応速度を向上させ２３、低（ピコモル）濃度のプローブでさえ、迅速なプローブ−標的ハイブリダイゼーションを可能にした（実施例２も参照のこと）。
【実施例６】
【００７１】
金ナノ粒子プローブ複合体が散乱強度を高める
プローブ／標的複合体の相対的散乱強度は、ダイオードアレイ検出器を用いて観察され得る（図８）。５μｌの標的試料（配列番号１３）を、直径５０ｎｍの金プローブ（配列番号１２および１５）（１：１の割合、２０ｐＭ全プローブ）６μＬ、およびハイブリダイゼーション緩衝液（２０％ホルムアミド、１６％デキストラン硫酸、および３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）４μＬと混合した。ハイブリダイゼーション緩衝液および標的なしの両プローブを含む溶液を、陰性対照として用いた。溶液を９５℃に３０秒間加熱し、次いで、室温で２時間インキュベートした。１μＬアリコートの溶液をスポッティングし、試料が乾燥するまでスライドをデシケータに入れて撮像した。次いで、得られた試料をスポッティングし、ポリＬ−リジンスライド上で乾燥してエバネセント照明器に入れた。スペクトルを、３５０〜１０００ｎｍの範囲に設定されたオーシャンオプティックスインコーポレイティッド社（Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）製のＵＳＢ  ２０００  ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いて収集した（図８）。分光光度計および光源の微妙な差異の原因となるスペクトルの補正因子を設定するために、ろ過されたＬｕｄｏｘ  ＴＭ−５０の溶液に対して全ての試料を標準化した。標的濃度が増加すると、散乱強度は６００〜８００ｎｍの範囲の波長で増加する。全てのプローブ濃度が各実験ごとに同じであったならば、プローブ−標的複合体の形成は、実質的に散乱強度を向上させたということが結論付けられた。結果的に、プローブ−標的複合体は、実施例５に記載したように複合体を形成していないプローブのバックグラウンド中に検出され得る。
【実施例７】
【００７２】
金ナノ粒子プローブ複合体の形成
散乱に基づく色および強度変化が金プローブ複合体の形成に起因して、標的核酸に結合する粒子単独に起因しないことを実証するために対照実験を行った。この実験では、ｍｅｃＡ  ２８１塩基対ＰＣＲ単位複製配列（配列番号１４）を、相補的な直径５０ｎｍの金プローブ配列を１つ含む溶液（ＭｅｃＡ  １  配列番号１１またはＭｅｃＡ  ２  配列番号１２）、または標的に相補的な２つの金プローブを含む同じ溶液（ＭｅｃＡ  １および２をともに、配列番号１１および１２）にハイブリダイズさせた。
標的ＭｅｃＡ  ４（配列番号１４）：
５’ＡＴＣＣＡＣＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＧＴＧＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＡＣＴＴＧＴＡＡＧＣＡＣＡＣＣＴＴＣＡＴＡＴＧＡＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＧＣＡＴＧＡＧＴＡＡＣＧＡＡＧＡＡＴＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＣＣＧＡＡＧＡＴＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＧＧＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＧＡＴＴＧＧＧＴＴＡＡＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＡＴＴＡＧＡＣＧＡＴＡＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＣＧＡＴＧＧＴＡＡＡＧＧＴＴＧＧＣＡＡＡＡＡＧＡＴＡＡＡＴＣＴＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＡＣＡＡＣＧＴ３’
反応条件は、８０ｐＭ全プローブ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４．３３％デキストラン硫酸、５．３３％ホルムアミド、および１３ｎＭのｍｅｃＡ  ２８１ｂｐ  ＰＣＲ産物（配列番号１４）であった。標的なしの両プローブを含む溶液を、負のハイブリダイゼーション対照として用いた。この溶液を３０秒間、９５℃で変性し、室温で２時間ハイブリダイズさせ、続けて１μｌをポリリジンで被覆したスライドガラスに被覆して撮像した（図９）。両プローブを含む溶液により散乱された光は濃橙色であったが、他方で単独のプローブまたは標的を含まない溶液はもっと淡い緑色の散乱を示す。この実験は、両プローブが散乱の変化を見るのに必要とされることを証明している。
【実施例８】
【００７３】
５０ｎｍの金プローブを用いた非増幅ゲノムＤＮＡからのＭｅｃＡ遺伝子検出
ＤＮＡ配列を酵素系の標的または信号増幅手順を用いることなく直接検出することの実現可能性を試験するために、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の臨床試料中のｍｅｃＡ遺伝子の検出に関して実験を行った２４。ｍｅｃＡ遺伝子は、抗生物質であるメチシリンに対する耐性を与える。高ＤＮＡ複合体の存在下で、プローブを標的配列に特異的にハイブリダイズさせなければならないので、高感度に加え、これは高い選択性をも要求する。ｍｅｃＡ遺伝子の隣接領域にハイブリダイズさせる直径５０ｎｍの金プローブ（配列番号１１および１２）を検出に用いた。
プローブＭｅｃＡ  １：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ａｔｇｇｃａｔｇａｇｔａａｃｇａａｇａａｔａ−３'］ｎ（配列番号１１）
プローブＭｅｃＡ  ２：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ｔｔｃｃａｇａｔｔａｃａａｃｔｔｃａｃｃａ−３'］ｎ（配列番号１２）
メチシリン陽性菌（ＭＲＳＡ）およびメチシリン陰性菌（ＭＳＳＡ）の両方のための精製したゲノムＤＮＡ試料をＡＴＣＣ社（各々Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．７００６９９Ｄおよび３５５５６Ｄ）に発注し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓに再懸濁して最終濃度を１μｇ／μＬとした。試料を、３回連続して１０秒間の３ワットのパルスを用いて氷上で超音波分解し、次いで、Ｔｒｉｓ緩衝液で希釈して最終濃度を１００ｎｇ／μＬとした。次いで、１μＬアリコートの各ゲノムＤＮＡ溶液を、１０ｐＭの各プローブ（配列番号１１および１２）を含むプローブ溶液６μＬと混合した。続いて、３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６％（Ｖ／Ｖ）デキストラン硫酸、および１８．７５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液４μＬを試料に加えた。混合物全体を３０秒間、９５℃で加熱し、その後、３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、各試料１μＬをポリＬ−リジンスライド上にスポッティングし、このスライドを白色光でエバネセント照明し、溶液が湿ったままの状態で目視によりまたはカラーＣＭＯＳセンサーを用いて撮像した（図１０）。陰性対照ＭＳＳＡ（ｍｅｃＡ−）ゲノムＤＮＡ試料から散乱した光は緑色に現れたが、他方で、ＭＲＳＡ（ｍｅｃＡ＋）は明黄色から橙色として現れた。これらの結果は、増幅されていないゲノムＤＮＡ中で特定の遺伝子配列を検出するのにこのアッセイを用いることが可能であることを実証した。我々の知る限り、これは、酵素の介在無しにゲノムＤＮＡ配列を検出し得る均一なアッセイの最初の例である。
【実施例９】
【００７４】
５０ｎｍの金プローブを用いた増幅されていないゲノムＤＮＡ試料からのＭｅｃＡ遺伝子の検出
散乱型比色試験は、スライド上で試料を乾燥した後、増幅されていないゲノムＤＮＡ試料から特定の遺伝子配列を検出するのに用いることが可能である。この手順では、粒子間距離を減らすことで検出感度を高めることが可能となる。超音波分解により断片化した精製した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡ試料からｍｅｃＡ遺伝子を検出することにより、この原理を実証した。この実験では、ｍｅｃＡ遺伝子の隣接領域とハイブリダイズさせる２つの５０ｎｍの金プローブ（各々配列番号１１および１２）を検出に用いた。
プローブＭｅｃＡ  １：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ａｔｇｇｃａｔｇａｇｔａａｃｇａａｇａａｔａ−３'］ｎ（配列番号１１）
プローブＭｅｃＡ  ２：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ｔｔｃｃａｇａｔｔａｃａａｃｔｔｃａｃｃａ−３'］ｎ（配列番号１２）
メチシリン耐性菌（ＭＲＳＡ）およびメチシリン感受性菌（ＭＳＳＡ）の両方のための精製した黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡ試料をＡＴＣＣ社（各々Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．７００６９９Ｄおよび３５５５６Ｄ）に発注し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓに再懸濁させて最終濃度を１μｇ／μＬとした。試料を、３回連続して１０秒間の３ワットのパルスを用いて氷上で超音波分解し、次いで、Ｔｒｉｓ緩衝液で希釈して最終濃度を１００ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、または２５ｎｇ／μＬとした。このアッセイでは、１μＬアリコートの各ゲノム試料を１２．５ｐＭの各プローブ（配列番号１１および１２）を含む１．２μＬのプローブ溶液と混合した。続いて、３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６％（Ｖ／Ｖ）デキストラン硫酸、および１８．７５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミドからなるハイブリダイゼーション溶液０．６μｌを試料に加えた。混合物全体を３０秒間、９０℃で加熱し、次いで、３７℃で４０分間インキュベートした。次いで、各試料１μＬを４３℃でポリＬ−リジンスライド上にスポッティングして１０分間乾燥させた。次いで、このスライドを白色光でエバネセント照明し、スポッティングされた各試料から散乱した光の色を目視により、またはカラーＣＭＯＳセンサーを用いて撮像した（図１１）。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）試料は、緑色から橙色への散乱光の変化に基づいて、８ｎｇ／μＬという低濃度でどちらの方法でも検出可能であった。陰性対照試料であるメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）により散乱した光は、これらの検出条件下で、バックグラウンドのゲノムＤＮＡとの非特異的結合を示す色である緑色を表した。この実験は、試料をスポッティングし、スライド上で乾燥後に特定の遺伝子配列が増幅されていないゲノムＤＮＡ試料から検出可能であることを実証している。
【実施例１０】
【００７５】
金ナノ粒子プローブによる均一な検出を用いた増幅されていないゲノムＤＮＡ試料からのＭｅｃＡ遺伝子の検出の再現性および信号の定量
視覚分析に加え、このアッセイにより生じる比色信号はカラーＣＣＤなどのＲＧＢセンサーの赤色チャンネルの信号強度を分析することにより定量され得る。２つのプローブ検出では、１００ｎｇ／μＬのＭＲＳＡ、ＭＳＳＡ、およびＭＲＳＥ（２μＬ）の溶液を、直径４０ｎｍの金プローブ（配列番号１１および１２を１：１の割合で、２５ｐＭ全プローブ）２．４μｌ、およびハイブリダイゼーション緩衝液（３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６％（Ｖ／Ｖ）デキストラン硫酸、および１８．７５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミドからなる）１．６μＬと混合した。混合物全体を１．５分間、９５℃で加熱し、次いで、３７℃で１時間インキュベートした。各試料１μＬを４３℃でスライド上にスポッティングし、１０分間乾燥させた。エバネセントで誘導されたスライドガラスからの散乱をカラーＣＭＯＳセンサーで撮像した。カラーＣＭＯＳセンサーの赤色チャンネルの正味の信号強度を、アキソンインスツルメンツ社（Ａｘｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製のＧｅｎｅｐｉｘソフトウェアを用いて各スポットごと（試験した各ゲノムＤＮＡ試料の３つの複製）に定量した（図１２）。信号の定量もまた、ナノスフィア社（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ）［ノースブルック（Ｎｏｒｔｈｂｒｏｏｋ）、ＩＬ］が設計したＶｅｒｉｇｅｎｅ（商標）ＩＤ検出システムを用いて行い、赤色ＬＥＤ（λｅｘ＝６３０ｎｍの中心波長）でスライドガラスを照射し、白黒の光検出器を用いてスライドガラス全体の画像を取得した（図１２Ｂ）。各スポットからの正味の信号強度を、Ｇｅｎｅｐｉｘソフトウェアを用いて定量した。
【００７６】
メチシリン耐性および感受性ブドウ球菌ゲノムＤＮＡ試料の分析により、目視で観察されるメチシリン耐性試料の比色変化は、メチシリン感受性試料より３〜５倍大きい信号、および陰性対照のメチシリン感受性試料を超える標準偏差＞３である信号を用いた両撮像方法により定量可能であることを実証している（図１２）。さらに、このアッセイにより生じた信号は再現可能である。
【実施例１１】
【００７７】
２個を超える５０ｎｍの金プローブを用いた増幅されていないゲノムＤＮＡ試料からのＭｅｃＡ遺伝子の検出
比色分析のシフトは凝集構造内の粒子数および粒子間の距離に依存することから、我々は、標的１つ当たりの金プローブの数を増加させると、プラズモンバンドの赤色シフトを向上させることにより、より高い感度を提供し得るであろうと推論した。この仮定を検証するために、２つのさらなるｍｅｃＡ遺伝子プローブ（配列番号１５および１６）を、既存のプローブ（配列番号１１および１２）の非常に近くに結合するように設計した（図１３）。直径５０ｎｍの金プローブを、試験用の各配列を用いて調製した。
プローブＭｅｃＡ  １：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ａｔｇｇｃａｔｇａｇｔａａｃｇａａｇａａｔａ−３'］ｎ（配列番号１１）
プローブＭｅｃＡ  ２：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ｔｔｃｃａｇａｔｔａｃａａｃｔｔｃａｃｃａ−３'］ｎ（配列番号１２）
プローブｍｅｃＡ  ３：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ａａａｇａａｃｃｔｃｔｇｃｔｃａａｃａａｇ−３'］ｎ［配列番号１５］
プローブｍｅｃＡ  ４：金−Ｓ'−５'−［ａ１５−ＰＥＧ−ｇｃａｃｔｔｇｔａａｇｃａｃａｃｃｔｔｃａｔ−３'］ｎ［配列番号１６］
培養した細菌の細胞から単離したメシチリン耐性（ｍｅｃＡ＋）および感受性（ｍｅｃＡ−）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｌｚｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）のゲノムＤＮＡ試料をＡＴＣＣ社から購入し（各々Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．７００６９９Ｄおよび３５５５６Ｄ）、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓに再懸濁させて最終濃度を１μｇ／μＬとした。試料を、３回連続して１０秒間の３ワットのパルスを用いて氷上で超音波分解し、次いで、Ｔｒｉｓ緩衝液で希釈して最終濃度を１ｎｇ／μＬまたは２００ｐｇ／μＬとした。このアッセイでは、各ゲノムＤＮＡ試料５μＬを、５ｐＭの各金プローブ（配列番号１１、１２、１５、および１６）を含有する２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液を含むプローブ溶液６μＬと混合した。続いて、３．７５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１６％（Ｖ／Ｖ）デキストラン硫酸、および１８．７５％（Ｖ／Ｖ）ホルムアミドからなるハイブリダイゼーション溶液４μＬを試料に加えた。混合物全体を３０秒間、９５℃で加熱し、次いで、３７℃でインキュベートした。２時間後、各試料１μＬを４３℃でポリＬ−リジンスライド上にスポッティングし、１０分間乾燥させた。次いで、このスライドを白色光でエバネセント照明し、スポッティングされた各試料から散乱した光の色を目視により、またはカラーＣＭＯＳセンサーを用いて撮像した（図１４）。陽性に検出された試料から散乱した光は黄色から橙色に現れるであろうが、陰性試料は緑色に現れる散乱光であろう。
【００７８】
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ｍｅｃＡ＋）試料は、緑色から橙色への散乱色の変化に基づいて、６６ｐｇ／μＬという低濃度で検出可能であった。陰性対照試料であるメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ｍｅｃＡ−）により散乱された光は、試料に存在するバックグラウンドのゲノムＤＮＡ配列への非特異的結合が最小限であることを示す緑色のままであった。標的メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムＤＮＡ６６ｐｇは、スライドガラス上で分析された容量１μＬ中の約２０，０００コピー（３３ｚｍｏｌ）と等価であり、２つのＤＮＡ−ＧＮＰ５０プローブしか用いない同様の分析と比較して大規模な感度の増加を示した。検出可能なプローブ／標的の比の増加（約２３０倍）も同様に重要であり、このことは、４つのプローブ複合体が、２つのプローブ複合体と比較して比色分析のシフトおよび散乱強度の両方を向上させることを示唆していた。
【００７９】
培養した表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）細胞（ＭＲＳＥ：Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．１２２２８ＤおよびＭＳＳＥ：Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．３５９８４ＤはＡＴＣＣ社から入手）から単離した他のメチシリン耐性（ｍｅｃＡ＋）および感受性（ｍｅｃＡ−）ゲノムＤＮＡ試料を、同様のＤＮＡ調製法、アッセイおよび撮像条件を用いて検証した（図１５）。メチシリン耐性表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ｍｅｃＡ＋）試料は緑色から黄色へ散乱色の変化を示したが、他方で、陰性対照試料であるメチシリン感受性表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ｍｅｃＡ−）により散乱された光は緑色のままであった。複数のブドウ球菌の亜種から単離される増幅されていないゲノムＤＮＡ試料中のｍｅｃＡ遺伝子を効率的に検出する能力は、散乱型比色分析検出アッセイの特異性をさらに証明している。
【実施例１２】
【００８０】
抗体で被覆された金プローブの調製
ポリクローナル抗ＩｇＥ抗体は、ケミコンインターナショナルインコーポレイティッド社（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）［テメキュラ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ）、ＣＡ］から購入する。直径４０〜６０ｎｍの金ナノ粒子を、テッドペラインコーポレイティッド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ）［レディング（Ｒｅｄｄｉｎｇ）、ＣＡ］から購入する。抗ＩｇＥ抗体を、金粒子への直接的な結合を介して金ナノ粒子に結合させる（受動的吸着といわれる）。この手順の出典は、ブリティッシュバイオセルインターナショナル社（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）により開発された既存の手順であった。簡潔には、直径４０〜６０ｎｍの金粒子を、炭酸ナトリウム緩衝液を用いてｐＨ９〜１０の間に調整する。３μｇ／ｍＬの抗体を金ナノ粒子に加え、室温で１時間インキュベートする。次に、プローブを直径０．２μｍの酢酸セルロースでろ過し、その後、ＢＳＡを加えて粒子を安定化させる。抗体−金ナノ粒子コンジュゲートを２１００Ｇで２５分間遠心することにより単離する。遠心後に上澄みを除去し、粒子を緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．５）、０．１％ＢＳＡおよび０．０１％アジド）に再分散させる。最終的なナノ粒子濃度を、直径５０ｎｍの金粒子ではε５２０＝１．５×１０Ｍ−１ｃｍ−１、直径６０ｎｍの金粒子ではε５２０＝２．８×１０Ｍ−１ｃｍ−１の推定吸光係数を用いて、５２０ｎｍでＵＶ−可視吸収により測定する。
【００８１】
プローブを０．２Ｍ  ＮａＣｌに入れ、ＢＳＡ工程前に、プローブ凝集物の量を導波路基板上の散乱色を解析することにより測定することに留意すべきである。このことは、調製工程の間にプローブが安定であり、十分な抗体が結合していることを裏付けている。
【実施例１３】
【００８２】
抗ＩｇＥ抗体で被覆された金プローブを用いたＩｇＥの検出
抗原−抗体相互作用を介して形成される金プローブ複合体のエバネセント照明および散乱を基礎とする検出を、抗ＩｇＥポリクローナル抗体で被覆された直径５０および６０ｎｍの金プローブを用いて最初に検証した（図１６）。抗ＩｇＥで被覆された金プローブの標的ＩｇＥへの結合を、デキストラン硫酸有りおよび無しで試験した。試験用に、標的ＩｇＥ（２μｌの２５０ｎｇ／ｍＬ）またはＩｇＧ陰性対照（２μｌの２５０ｎｇ／ｍＬ）、直径５０ｎｍの抗ＩｇＥ金プローブ（３μｌの２５０ｐＭ）、および緩衝液（５μｌの２×ＰＢＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２または２×ＰＢＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４％デキストラン硫酸）を含む試料１０μＬを調製した。インキュベーションの３０分後および４時間後に、各試料１μＬをポリＬ−リジンスライドガラスにスポッティングした。スライドガラスのスライド面内を白色光で照射し、各試料からの散乱光の色を目視で観察し、またはカラーＣＭＯＳ検出器で記録した（図１７）。３０分後、デキストラン硫酸を含む標的試料ＩｇＥから散乱した光は目視で検出可能な黄色であり、他方で、陰性対照ＩｇＧから散乱した光は目視で検出可能な緑色であった。逆に、デキストラン硫酸なしの標的ＩｇＥおよび陰性対照試料ＩｇＧの両方から散乱した光は目視で検出可能な緑色であった。４時間後、デキストラン硫酸を含む標的試料ＩｇＥにより散乱した光は目視で検出可能な橙色であり、他方で、デキストラン硫酸なしの試料から散乱した光は目視で検出可能な緑色であった。これらの実験は、デキストラン硫酸が抗体金プローブ−標的抗体複合体の形成を促進することを証明しており、これにより、エバネセントで誘導される比色分析の散乱による高感度検出をもたらす。
【００８３】
標的ＩｇＥを直径４０ｎｍの抗ＩｇＥ金プローブに滴定し、アッセイ感度を評価した。このアッセイでは、４０ｎｍの抗ＩｇＥ金プローブ（５００ｐＭ）５μＬを、２μＬの標的ＩｇＥ（５、１、０．５、０．２５、または０．１ｎｇ／μＬ）、陰性対照ＩｇＧまたは標的なしの対照としての水、および、６．５％デキストラン硫酸と５ｍＭ  ＭｇＣｌ２と３．５×ＰＢＳとからなるインキュベーション緩衝液３μＬに加える。各試料を室温で１時間インキュベートする。続けて、各試料の小滴１μｌを白色光で照射されたスライドガラスに移し、堆積した各試料から散乱した光を目視により、またはＣＭＯＳカメラで記録する（図１８）。＞０．０５ｎｇ／μＬの標的試料ＩｇＥにより散乱した光の色は橙色であったが、他方で、ＩｇＧおよび標的なしの試料により散乱した光の色は目視により識別可能な緑色であった。標的試料ＩｇＥでの散乱色の赤色シフトは、標的ＩｇＥの結合の結果生じる金プローブ複合体の構造に起因する。これらの光学的変化は、目視により検出されるか、または撮像されて実施例４および１０に記載したように定量されてもよい。
【実施例１４】
【００８４】
エバネセント照明および高解像度光学系を用いた個々の金プローブ複合体に関連する比色変化の撮像
ＤＮＡハイブリダイゼーションを介して形成された１μｌアリコートの直径５０ｍｎの金粒子または金プローブ複合体をスライドガラスにスポッティングし、溶液からの散乱を、スライドガラス面内の白色光照明により生じたエバネセント波を介して溶液の状態を撮像した（図１９）。散乱した光を、カラーＣＣＤカメラの１０〜１００×対物レンズを介して集めた。スライドガラス面内の白色光照明およびカラーＣＣＤカメラの１０〜１００×対物レンズによる収集物から、溶液状態での個々の粒子散乱の高解像度の画像が得られ、これは緑色である（分解能には回折限界があることから、粒子はより大きく見える）。さらに重要なことに、散乱光の色が黄色から赤色となる同時変化により、個々の金プローブ複合体もまた溶液中で検出可能である（図１９）。このことは、個々の金プローブ複合体の形成に関連する比色分析の変化が高解像度の光学系を用いて実行可能であることを実証している。
【００８５】
添付の特許請求の範囲で説明されるように、上述の開示は、本発明のある特定の実施形態に重点を置いたものであり、これらと等価な全ての改良物および代替物が本発明の趣旨および範囲に含まれることを理解すべきである。
【００８６】
参照
1. Kirk, B. W., Feinsod, M., Favis, R., Kliman, R. M. & Barany, F. Single nucleotide polymorphism seeking long term association with complex disease. Nucleic Acids Research 30, 3295-3311 (2002).
2. Whelen, A. C. & Persing, D. H. The role of nucleic acid amplification and detection in the clinical microbiology laboratory. Annual Review of Microbiology 50, 349-373 (1996).
3. Bernard, P. S. & Witter, C. T. Real-time PCR technology for cancer diagnostics. Clinical Chemistry 48, 1178-1185 (2002).
4. Kwok, P. Y. Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms. Annual Review of Genomics and Human Genetics 2, 235-258 (2001).
5. Mackay, I. M., Arden, K. E. & Nitsche, A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research 30, 1292-1305 (2002).
6. Hall, J. G. et al. Sensitive detection of DNA polymorphisms by the serial invasive cleavage reaction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 8272-8277 (2000).
7. Jenison, R., Yang, S., Haeberli, A. & Polisky, B. Interference-based detection of nucleic acid targets on optically coated silicon. Nature Biotechnology 19, 62-65 (2001).
8. Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C. & Storhoff, J. J. A DNA-based method for rationally assembling nanoparticles into macroscopic materials. Nature 382, 607-609 (1996).
9. Elghanian, R., Storhoff, J. J., Mucic, R. C., Letsinger, R. L. & Mirkin, C. A. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science 277, 1078-1081 (1997).
10. Storhoff, J. J. et al. What Controls the Optical Properties of DNA-Linked Gold Nanoparticle Assemblies? Journal of the American Chemical Society 122, 4640-4650 (2000).
11. Thanh, N. T. K. & Rosenzweig, Z. Development of an aggregation-based immunoassay for anti-protein A using gold nanoparticles. Analytical Chemistry 74, 1624-1628 (2002).
12. Otsuka, H., Akiyama, Y., Nagasaki, Y. & Kataoka, K. Quantitative and reversible lectin-induced association of gold nanoparticles modified with alpha-lactosyl-omega-mercapto-poly(ethylene glycol). Journal of the American Chemical Society 123, 8226-8230 (2001).
13. Kim, Y. J., Johnson, R. C. & Hupp, J. T. Gold nanoparticle-based sensing of "spectroscopically silent" heavy metal ions. Nano Letters 1, 165-167 (2001).
14. Liu, J. & Lu, Y. A colorimetric lead biosensor using DNAzyme-directed assembly of gold nanoparticles. Journal of the American Chemical Society 125, 6642-6643 (2003).
15. Storhoff, J. J., Elghanian, R., Mucic, R. C., Mirkin, C. A. & Letsinger, R. L. One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold nanoparticle probes. Journal of the American Chemical Society 120, 1959-1964 (1998).
16. Lazarides, A. A. & Schatz, G. C. DNA-Linked Metal Nanosphere Materials: Structural Basis for the Optical Properties. Journal of Physical Chemistry B 104, 460-467 (2000).
17. Reynolds, R. A., Mirkin, C. A. & Letsinger, R. L. Homogeneous, nanoparticle-based quantitative colorimetric detection of oligonucleotides. Journal of the American Chemical Society 122, 3795-3796 (2000).
18. Yguerabide, J. & Yguerabide, E. E. Light-scattering submicroscopic particles as highly fluorescent analogs and their use as tracer labels in clinical and biological applications-II. Experimental characterization. Analytical Biochemistry 262, 157-176 (1998).
19. Jin, R. C. et al. Photoinduced conversion of silver nanospheres to nanoprisms. Science 294, 1901-1903 (2001).
20. Storhoff, J. J. et al. Diagnostic detection systems based on gold nanoparticle probes. Biosensors and Bioelectronics, submitted for publication (2003).
21. Yguerabide, J. & Yguerabide, E. E. Light-scattering submicroscopic particles as highly fluorescent analogs and their use as tracer labels in clinical and biological applications-I. Theory. Analytical Biochemistry 262, 137-156 (1998).
22. Taton, T. A., Lu, G. & Mirkin, C. A. Two-color labeling of oligonucleotide arrays via size-selective scattering of nanoparticle probes. Journal of the American Chemical Society 123, 5164-5165 (2001).
23. Wetmur, J. G. Acceleration of DNA renaturation rates. Biopolymers 14, 2517-2524 (1975).
24. Chambers, H. F. Methicillin Resistance in Staphylococci: Molecular and Biochemical Basis and Clinical Implications. Clin. Microbiol. Rev. 10, 781-791 (1997).
25. Schultz, S., Smith, D. R., Mock, J. J. & Schultz, D. A. Single-target molecule detection with nonbleaching multicolor optical immunolabels. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 996-1001 (2000).
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】中性または陰イオン性多糖類の存在下におけるエバネセント照明および散乱の検出による金プローブ複合体の検出の図。
【図２】異なる濃度のデキストラン硫酸を用いた散乱を基礎とする検出および４０ｎｍの金粒子プローブ（配列番号４および６）を用いた第Ｖ因子ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）遺伝子配列の検出の図。ＰＣＲ増幅された９９塩基対断片（配列番号１０）を陽性ハイブリダイゼーション対照として用い、ＭＴＨＦＲ１１９塩基対断片（配列番号７）を陰性対照として用いた。検出のためにデキストラン硫酸濃度を０〜５％に変化させた。
【図３】さまざまな濃度のデキストラン硫酸で、直径４０ｎｍの金プローブ（配列番号１１および１２）を用いたｍｅｃＡ遺伝子ＰＣＲ産物（１．３×１０コピー／μＬ）の検出の図。標的なしの対照を比較に用いた。スライドガラスにスポッティングした１μｌの試料のアリコートのカラーＣＭＯＳ画像を示す。
【図４】３０ｎｍの金粒子プローブを用いたＩ１３０７Ｋ遺伝子型。野生型（ｗｔ）、変異（ｍｕｔ）、または異型接合（ｈｅｔ）遺伝子型のＰＣＲ増幅された７８塩基対断片を、野生型（ＷＴ）および変異（ＭＵＴ）ＡＰＣ遺伝子プローブを用いて試験した。（Ａ）白色光照明後にカラーＣＭＯＳで得た画像。Ｏｇ＝橙色。（Ｂ）白色光照明後に白黒ＣＭＯＳで得た画像（ＮＩＳ  ２０００ａ）。（Ｃ）赤色発光ダイオード（ＬＥＤ）で照明後に白黒ＣＭＯＳで得た画像。
【図５】４０ｎｍの金粒子プローブを用いたＩ１３０７Ｋ遺伝子型。野生型（ｗｔ）、変異（ｍｕｔ）、または異型接合（ｈｅｔ）遺伝子型のＰＣＲ増幅された７８塩基対断片を、野生型（ＷＴ）および変異（ＭＵＴ）ＡＰＣ遺伝子プローブを用いて試験した。（Ａ）白色光照明後にカラーＣＭＯＳで得た画像。Ｏｇ＝橙色、Ｇｒ＝緑色。（Ｂ）白色光照明後に白黒ＣＭＯＳで得た画像（ＮＩＳ  ２０００ａ）。（Ｃ）赤色ＬＥＤで照明後に白黒ＣＭＯＳで得た画像。
【図６】５０ｎｍの金粒子プローブを用いたＩ１３０７Ｋ遺伝子型。野生型（ｗｔ）、変異（ｍｕｔ）、または異型接合（ｈｅｔ）遺伝子型のＰＣＲ増幅された７８塩基対断片を、野生型（ＷＴ）および変異（ＭＵＴ）ＡＰＣ遺伝子プローブを用いて試験した。（Ａ）白色光照明後にカラーＣＭＯＳで得た画像。Ｏｇ＝橙色、Ｇｒ＝緑色。（Ｂ）白色光照明後に白黒ＣＭＯＳで得た画像（ＮＩＳ  ２０００ａ）。（Ｃ）赤色ＬＥＤで照明後に白黒ＣＭＯＳで得た画像。
【図７】５０ｎｍの金プローブ（配列番号１１および１２）を用いたｍｅｃＡ遺伝子配列（配列番号１３）の検出の図。１μｌの試料のアリコートを、撮像のためスライド上で乾燥させた。Ｏｇ＝橙色。Ｙｗ＝黄色。Ｇｒ＝緑色。
【図８】ダイオードアレイ検出器を用いた金プローブ−標的複合体の解析の図。１μｌの試料のアリコートをスライドガラス上で乾燥し、エバネセントで誘導された各試料からの散乱をダイオードアレイ検出器を用いて解析した。
【図９】１つの相補的金プローブ（配列番号１１または１２）または２つの相補的金プローブ（配列番号１１および１２）を用いて調べたｍｅｃＡ遺伝子配列（配列番号１３）の図。標的なしの両方のプローブを含む溶液を負のハイブリダイゼーション対照として提供した。Ｏｇ＝橙色。Ｇｒ＝緑色。
【図１０】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の増幅されていないゲノムＤＮＡ試料由来のメチシリン耐性の遺伝子特異的検出（ｍｅｃＡ）の図。メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）を陰性対照として用いた。１μＬの試料のアリコートを、目視およびカラーＣＭＯＳの撮像の両方のために、スライドガラス上にスポッティングした。Ｇｒ＝緑色、Ｙｗ＝黄色。
【図１１】メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）の増幅されていないゲノムＤＮＡ試料由来のメチシリン耐性の遺伝子特異的検出（ｍｅｃＡ）の図。１μＬの試料のアリコートを撮像用にスライドガラス上にスポッティングした。Ｇｒ＝緑色、Ｏｇ＝橙色。
【図１２】光学機器を用いた比色分析。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（ＭＲＳＥ）、およびメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）ゲノムＤＮＡ試料を４０ｎｍの金プローブを用いて試験した図。（ａ）カラーＣＭＯＳ画像（差し込み図）の赤色チャンネル由来の賞味の信号強度を、各試料ごとにプロットする。各試料ごとに３回繰り返し行った。エラーバーは信号強度の標準偏差を表す。記録した画像では、列１（ＭＲＳＡ）の全スポットからの比色分析の散乱は橙色であり、列２（ＭＳＳＡ）は緑色であり、列３（ＭＲＳＥ）は橙色である。（ｂ）スライドガラスを赤色ＬＥＤで励起させ、画像を白黒光検出器で記録する。差し込み図は、この検出設定で記録した画像を示す。
【図１３】標的１つ当たり４つの金プローブを用いた標的分析物の検出の略図。
【図１４】４つの直径５０ｎｍの金プローブを用いたメシチリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の増幅されていないゲノムＤＮＡ試料のメシチリン耐性（ｍｅｃＡ）の高感度遺伝子特異的検出の図。メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＳＳＡ）を陰性対照として供与した。１μＬアリコートを撮像用にスライド上で乾燥させた。Ｇｒ＝緑色、Ｏｇ＝橙色。
【図１５】４つの直径５０ｎｍの金プローブを用いた増幅されていないゲノムＤＮＡ試料のメシチリン耐性（ｍｅｃＡ）の高感度遺伝子特異的検出の図。１μＬアリコートを撮像用にスライド上で乾燥させた。ＭＲＳＡ＝メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）、ＭＳＳＡ＝メチシリン感受性（Ｓｔａｐｈ．ａｕｒｅｕｓ）、ＭＲＳＥ＝メチシリン耐性表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ＭＳＳＥ＝メチシリン感受性表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、Ｇｒ＝緑色、Ｏｇ＝橙色、Ｙｗ＝黄色。
【図１６】抗体で被覆した金粒子の標的タンパク質への結合により生じる散乱色の変化の概略図。例として標的ＩｇＥ抗体を示す。
【図１７】プローブ−標的複合体形成を促進するためにデキストラン硫酸を併用した抗ＩｇＥで被覆した５０ｎｍの金プローブを用いた標的ＩｇＥの検出の図。標的試料ＩｇＥ由来の散乱色を、デキストラン硫酸有りおよび無しの対照試料ＩｇＧと比較した。画像は、白色光を用いたエバネセント照明後にカラーＣＭＯＳ光検出器で記録した。スポッティングした資料からの散乱色もまた裸眼により視覚的に検出可能であることに留意すべきである。観察された散乱色はＯｇ＝橙色、Ｇｒ＝緑色、Ｙｗ＝黄色の文字で表示する。
【図１８】抗ＩｇＥで被覆した４０ｎｍの金プローブを用いたエバネセント照明および標的ＩｇＥの散乱を基礎とする検出の図。連続希釈した標的からの散乱色を、標的なしまたはＩｇＧを含む対照試料と比較した。標的ＩｇＥ濃度を、図の上に示し、標的／プローブの比を図の下に示す。画像は、カラーＣＭＯＳ光検出器で記録した。スポットからの散乱色もまた裸眼により視覚的に検出可能であることに留意すべきである。観察された散乱色はＯｇ＝橙色、Ｇｒ＝緑色、Ｙｗ−Ｇｒ＝黄緑色の文字で表示する。
【図１９】高感度光学系を用いたガラス導波路上にスポッティングされた個々のプローブ複合体からエバネセントで誘導される散乱の検出の図。
【図１】
2007525651.tif 000003
【図２】
2007525651.tif 000004
【図３】
2007525651.tif 000005
【図４】
2007525651.tif 000006
【図５】
2007525651.tif 000007
【図６】
2007525651.tif 000008
【図７】
2007525651.tif 000009
【図８】
2007525651.tif 000010
【図９】
2007525651.tif 000011
【図１０】
2007525651.tif 000012
【図１１】
2007525651.tif 000013
【図１２】
2007525651.tif 000014
【図１３】
2007525651.tif 000015
【図１４】
2007525651.tif 000016
【図１５】
2007525651.tif 000017
【図１６】
2007525651.tif 000018
【図１７】
2007525651.tif 000019
【図１８】
2007525651.tif 000020
【図１９】
2007525651.tif 000021
【国際調査報告】
2007525651.tif 000022
2007525651.tif 000023
2007525651.tif 000024
2007525651.tif 000025
2007525651.tif 000026