(57)【要約】  本発明は、ＬＫＢ１の活性を検定する方法に関し、その方法は、ＬＫＢ１を含む試料を供給するステップと、リン酸化を許容する条件下で前記試料を基質キナーゼと接触させるステップと、前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みをモニターするステップとを含み、前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みがＬＫＢ１活性を示す。好ましくは、その基質キナーゼは、ＡＭＰＫである又はＡＭＰＫに由来する。本発明はまた、特定の異常の治療又は予防におけるＡＭＰＫの使用、並びに特定の異常のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用、並びにＡＭＰＫの活性化及びリン酸化におけるＬＫＢ１の使用にも関する。本発明はまた、ＡＭＰＫＫ及びＡＭＰＫに関する特定の遺伝子変化を有する酵母細胞をも包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＫＢ１の活性を検定する方法であって、
（ｉ）ＬＫＢ１を含む試料を供給するステップと、
（ii）リン酸化を許容する条件下で前記試料を基質キナーゼと接触させるステップと、
（iii）前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みをモニターするステップとを含み、
前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みがＬＫＢ１活性を示す方法。
【請求項２】
基質キナーゼがＡＭＰＫである又はＡＭＰＫに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＭＰＫがヘテロ三量体ＡＭＰＫを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＭＰＫが、マウス又はヒトＡＭＰＫを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ＡＭＰＫの活性を検定することによってＡＭＰＫへのリン酸の取り込みをモニターする、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＳＡＭＳペプチドのリン酸化を介して、ＡＭＰＫの活性を検定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＡＭＰＫのＴ−１７２又はその等価物のリン酸化を検定することによってＡＭＰＫへのリン酸の取り込みをモニターする、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＡＭＰＫ１モル当たりに取り込まれるリン酸の量を定量するステップをさらに含み、リン酸レベルが試料に存在するＬＫＢ１のレベルを示す、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＡＭＰＫの活性化における組換え又は単離ＬＫＢ１の使用。
【請求項１０】
ＡＭＰＫＫとしての組換え又は単離ＬＫＢ１の使用。
【請求項１１】
ＡＭＰＫのリン酸化における組換え又は単離ＬＫＢ１の使用。
【請求項１２】
対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む方法。
【請求項１３】
対象における肥満を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む方法。
【請求項１４】
対象における糖尿病を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む方法。
【請求項１５】
対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む方法。
【請求項１６】
対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む方法。
【請求項１７】
対象における肥満を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む方法。
【請求項１８】
対象における糖尿病を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む方法。
【請求項１９】
対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む方法。
【請求項２０】
対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む方法。
【請求項２１】
対象における肥満を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む方法。
【請求項２２】
対象における糖尿病を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む方法。
【請求項２３】
対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法であって、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む方法。
【請求項２４】
ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用。
【請求項２５】
肥満の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用。
【請求項２６】
糖尿病の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用。
【請求項２７】
肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用。
【請求項２８】
ＡＭＰＫの活性の調節におけるＨＳＰ９０の使用。
【請求項２９】
ＡＭＰＫの活性の調節におけるＣｄｃ３７の使用。
【請求項３０】
ＡＭＰＫの活性の調節におけるＳＴＲＡＤタンパク質の使用。
【請求項３１】
対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法であって、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む方法。
【請求項３２】
対象における肥満を治療する方法であって、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む方法。
【請求項３３】
対象における糖尿病を治療する方法であって、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む方法。
【請求項３４】
対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法であって、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む方法。
【請求項３５】
対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む方法。
【請求項３６】
対象における肥満を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む方法。
【請求項３７】
対象における糖尿病を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む方法。
【請求項３８】
対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法であって、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む方法。
【請求項３９】
ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用。
【請求項４０】
肥満の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用。
【請求項４１】
糖尿病の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用。
【請求項４２】
肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用。
【請求項４３】
ＡＭＰＫを調節する方法であって、ＬＫＢ１を調節するステップを含む方法。
【請求項４４】
ＡＭＰＫをリン酸化する方法であって、ＡＭＰＫを組換え又は単離ＬＫＢ１と接触させるステップを含む方法。
【請求項４５】
系の中でＡＭＰＫのリン酸化を促進する方法であって、前記系の中でＬＫＢ１の活性を促進するステップを含む方法。
【請求項４６】
系の中でＡＭＰＫを活性化する方法であって、前記系の中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む方法。
【請求項４７】
ＡＭＰＫを活性化する方法であって、前記ＡＭＰＫを組換え又は単離ＬＫＢ１と接触させるステップを含む方法。
【請求項４８】
ＡＭＰＫをリン酸化する方法であって、前記ＡＭＰＫを組換え又は単離ＬＫＢ１と接触させるステップを含む方法。
【請求項４９】
ＬＫＢ１の（複数可の）調節因子を同定する方法であって、
（ｉ）ＬＫＢ１の第１と第２の試料を供給するステップと、
（ｉｉ）前記第１の試料をＬＫＢ１の候補調節因子と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）リン酸化を許容する条件下で前記第１と第２の試料を基質と接触させるステップと、
（ｉｖ）前記基質へのリン酸の取り込みをモニターし、前記第１と第２の試料における前記基質へのリン酸の取り込みを比較するステップとを含み、
前記基質へのリン酸の取り込みが前記第１と第２の試料の間で異なる場合、前記候補調節因子が、ＬＫＢ１活性の調節因子として同定される方法。
【請求項５０】
基質が基質キナーゼである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
基質キナーゼが、ＡＭＰＫである又はＡＭＰＫに由来する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
Ｐａｋ１、Ｔｏｓ３及びＥｌｍ１のうち少なくとも２つにおける遺伝子破壊を含む組換え酵母細胞。
【請求項５３】
Ｐａｋ１、Ｔｏｓ３及びＥｌｍ１における遺伝子破壊を含む組換え酵母細胞。
【請求項５４】
Ｓｎｆ１における遺伝子破壊をさらに含む、請求項５２又は５３に記載の組換え酵母細胞。
【請求項５５】
哺乳動物ＡＭＰＫを発現する、請求項５２から５４のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項５６】
哺乳動物ＡＭＰＫが、α、β及びγサブユニットを含む、請求項５５に記載の組換え酵母細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）は、遺伝性の癌の症候群であり、多数の器官系の良性腫瘍も悪性腫瘍も生じやすい傾向を特徴とする。この症候群は、タンパク質キナーゼＬＫＢ１（GenBankアクセッション番号U6333、Hemminki et al. 1998 Nature vol 391 pp185-187を参照）の機能喪失突然変異と関連すると考えられている。
【０００２】
従来技術では、ＬＫＢ１の分子内キナーゼ活性について満足な検定法（assay）は存在しない。
【０００３】
ＬＫＢ１活性についての従来技術の検定法には、Boudeau et al. 2003 Human Mutation:Mutation in Brief 583で示されるものなどの自己リン酸化検定法がある。ＬＫＢ１のＴｈｒ３３６の自己リン酸化が生理的に重要であるにもかかわらず、その意義もせいぜい明らかであるとはいえないが、従来技術ではＬＫＢ１の生理的な基質は知られておらず（例えば、Boudeauの８ページ及びその他を参照）、もちろんＬＫＢ１のどんなキナーゼ基質も知られていない。
【０００４】
さらに、ＬＫＢ１活性について研究する従来技術の試みは、その分子の（複数可の）触媒部分の全体的な欠失体などの機能喪失突然変異体に集中している。従来技術ではＬＫＢ１についてほとんど分かっていないので、そのような洗練されていない実験が、研究の最良の利用可能な経路となっている。ＬＫＢ１と、シグナル伝達／代謝経路の下流の構成成分のつながりが欠如していることによって、進展が妨げられている。
【０００５】
ＬＫＢ１の自己リン酸化がたとえ重要な生物学的事象であっても、この活性を除去し、その負の影響について研究することは、洗練されていない研究手段であり、ＬＫＢ１の意味深く生物学的に重要な基質がないと、下流の構成成分の分析につなげることができない。
【０００６】
従来技術では重要なＬＫＢ１の基質が知られていないので、ＬＫＢ１の活性又は活性化についてのしっかりとした検定法を設計することはできない。制御的ではなく許容的なものに過ぎない可能性がある自己リン酸化事象などのＬＫＢ１自体の役割の意義を詳細に分析することもできない。
【０００７】
ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の研究は、その疾患の根底にある遺伝学的基礎について知られているものに限られる。従来技術では、ＬＫＢ１との関連について論じられている（例えば、Hemminki et al. 1998 Nature vol 391 pp185-187を参照）。しかし、ＬＫＢ１の下流の標的又はエフェクターとの関連は、従来技術では明らかとなっていない。さらに、ＬＫＢ１の下流の標的又はエフェクターも従来技術では明らかとなっていない。したがって、ＰＪＳの治療又は予防においてなどの研究に適した標的が欠如している。
【０００８】
ＡＭＰＫの活性化は、そのリン酸化状態と相関することが知られている（例えば、Neumann et al. 2003 Protein Expression and Purification ‘Mammalian AMP-activated protein kinase:functional, heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in E.coli’を参照）。しかし、このリン酸化の原因となるキナーゼは、同定されていなかった。
【０００９】
従来技術により、ＡＭＰＫの活性化に関する技術をもたらそうとしてきたが、ＡＭＰＫの既知の活性化因子が存在しない中では、これらの技術は、細胞抽出物の部分精製に限られ、次いで、前記の抽出物が、ＡＭＰＫを活性化することができる、ある活性型の未知の上流キナーゼを含むことを期待して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＭＰＫにそれを適用する。これらの実験は、その技術の状態を代表するものであるが、特徴付けが不完全な細胞抽出物に基づいているので、それでもなお大きな労力を要し、必然的に事実上洗練されていない。さらに、これらの実験は動物の屠殺を伴うが、これは最小限に抑えたにしても、それでもなお望ましくはない。
【００１０】
本発明は、従来技術に伴う（複数可の）問題を克服しようとするものである。
【非特許文献１】Hemminki et al. 1998 Nature vol 391 pp185-187
【非特許文献２】Boudeau et al. 2003 Human Mutation:Mutation in Brief 583
【非特許文献３】Neumann et al. 2003 Protein Expression and Purification ‘Mammalian AMP-activated protein kinase:functional, heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in E.coli’
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＬＫＢが下流の（複数可の）キナーゼをリン酸化するという驚くべき知見に基づくものである。さらに、ＬＫＢ１は、ＡＭＰＫと同じ同系の経路中にある。より詳細には、本発明はＬＫＢ１がＡＭＰＫに作用するという驚くべき知見に基づくものである。さらに、本明細書で示すように、ＬＫＢ１は、ＡＭＰＫのリン酸化及び活性化を引き起こす。下記に説明するように、ＬＫＢ１は、ＡＭＰＫを直接リン酸化することによってその作用を発揮することができ、ＬＫＢ１が特異的な細胞キナーゼ基質（例えば、ＡＭＰＫ）を有し、逆に、ＡＭＰＫが、上流キナーゼＬＫＢ１によって標的とされ活性化されることが初めて示される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これらの驚くべき知見から、下記及び添付した特許請求の範囲で詳細に説明する多数の検定法、組成物及び治療法を提供することが可能となった。
【００１３】
したがって、一態様では、本発明は、ＬＫＢ１の活性を検定する方法を提供し、その方法は、ＬＫＢ１を含む試料を供給するステップと、リン酸化を許容する条件下で前記試料を基質キナーゼと接触させるステップと、前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みをモニターするステップとを含み、前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みがＬＫＢ１活性を示す。
【００１４】
ＡＭＰＫがＬＫＢ１の特に良好な基質キナーゼであることを示す。したがって、他の態様では、本発明は、前記の基質キナーゼがＡＭＰＫである又はＡＭＰＫに由来する、上記に記載の方法に関する。
【００１５】
ＡＭＰＫは、ｉｎ  ｖｉｖｏではヘテロ三量体複合体であると考えられている。したがって、ＬＫＢ１を検定するとき、ヘテロ三量体ＡＭＰＫを使用すると有利である。したがって、他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫがヘテロ三量体ＡＭＰＫを含む、上記に記載の方法に関する。好ましくは、ＡＭＰＫは、マウス又はヒトＡＭＰＫを含み、好ましくはヒトＡＭＰＫを含む。
【００１６】
ＡＭＰＫ活性化の検定など任意の適切な方法によって、ＡＭＰＫのリン酸化を検定することができる。他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫの活性を検定することによってＡＭＰＫへのリン酸の取り込みをモニターする、上記に記載の方法に関する。好ましくは、ＳＡＭＳペプチドのリン酸化を介して、ＡＭＰＫの活性を検定する。
【００１７】
ＡＭＰＫのリン酸化状態を直接読み取ることによって、ＡＭＰＫのリン酸化を検定することもできる。放射標識リン酸など任意の適切な方法を用いて、又は特定の試薬を用いてＡＭＰＫのリン酸化状態を直接検定することによって、これを行うことができる。好ましくは、特定の試薬を用いる。したがって、他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫのＴ−１７２又はその等価物のリン酸化を検定することによってＡＭＰＫへのリン酸の取り込みをモニターする、上記に記載の方法に関する。等価物とは、ＡＭＰＫのアイソフォーム又は相同体中の同じ残基を意味し、或いは、ＡＭＰＫでの同じ位置にある異なる残基（例えば、セリン）を含む可能性もある。好ましくは、等価物とは、機能上等価な物、すなわちＡＭＰＫの活性化を示すものを意味する。
【００１８】
ＡＭＰＫへのリン酸の取り込みを定量して、ＬＫＢ１の活性を推定することができると有利である。定量的なキナーゼ検定の技術は、当技術分野で周知である。リン酸画像化（phosphorimaging）によって、又は濃度測定によって、又はＴ−１７２の直接の免疫学的検定に適用される同様の技術によって、リン酸の取り込みを定量することができる。したがって、他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫ１モル当たりに取り込まれるリン酸の量を定量するステップをさらに含み、前記リン酸レベルが前記試料に存在するＬＫＢ１のレベルを示す、上記に記載の方法に関する。
【００１９】
驚くべきことに、ＬＫＢ１を使用してＡＭＰＫをリン酸化且つ活性化できることが、本明細書で開示される。したがって、他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫの活性化における、組換え又は単離ＬＫＢ１の使用に関する。
【００２０】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫＫとしての組換え又は単離ＬＫＢ１の使用に関する。
【００２１】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫのリン酸化における組換え又は単離ＬＫＢ１の使用に関する。
【００２２】
ＡＭＰＫがＬＫＢ１のエフェクターであり、ＬＫＢ１が減少するとＡＭＰＫが減少することが本明細書で示されているので、本発明は、対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法を提供し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む。
【００２３】
他の態様では、本発明は、対象における肥満を治療する方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む。
【００２４】
他の態様では、本発明は、対象における糖尿病を治療する方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む。
【００２５】
他の態様では、本発明は、対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＡＭＰＫを投与するステップを含む。
【００２６】
驚くべきことに、ＡＭＰＫがＬＫＢ１と同じ同系の経路中にあり、ＬＫＢ１の作用によって直接活性化されることが本明細書で開示されている。したがって、本発明は、対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む。
【００２７】
他の態様では、本発明は、対象における肥満を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む。
【００２８】
他の態様では、本発明は、対象における糖尿病を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む。
【００２９】
他の態様では、本発明は、対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫを活性化するステップを含む。
【００３０】
ＬＫＢ１がＡＭＰＫのリン酸化を促進することが本明細書で開示されている。したがって、他の態様では、本発明は、対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む。
【００３１】
他の態様では、本発明は、対象における肥満を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む。
【００３２】
他の態様では、本発明は、対象における糖尿病を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む。
【００３３】
他の態様では、本発明は、対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＡＭＰＫのリン酸化を促進するステップを含む。
【００３４】
他の態様では、本発明は、ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用に関する。
【００３５】
他の態様では、本発明は、肥満の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用に関する。
【００３６】
他の態様では、本発明は、糖尿病の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用に関する。
【００３７】
他の態様では、本発明は、肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＡＭＰＫの使用に関する。
【００３８】
ＬＫＢ１を安定化及び／又は活性化することが知られている特定の分子が存在する。したがって、ＡＭＰＫの活性化及び／又は維持の際にこの（複数可の）分子を使用すると有利である。したがって、本発明は、ＡＭＰＫの調節におけるＬＫＢ１の調節因子の使用に関する。他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫを調節する方法に関し、その方法は、ＬＫＢ１を調節するステップを含む。
【００３９】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫの活性の調節におけるＨＳＰ９０の使用に関する。
【００４０】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫの活性の調節におけるＣｄｃ３７の使用に関する。
【００４１】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫの活性の調節におけるＳＴＲＡＤタンパク質の使用に関する。
【００４２】
他の態様では、本発明は、対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む。
【００４３】
他の態様では、本発明は、対象における肥満を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む。
【００４４】
他の態様では、本発明は、対象における糖尿病を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む。
【００４５】
他の態様では、本発明は、対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む。
【００４６】
他の態様では、本発明は、対象におけるポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む。
【００４７】
他の態様では、本発明は、対象における肥満を治療する方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む。
【００４８】
他の態様では、本発明は、対象における糖尿病を治療する方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む。
【００４９】
他の態様では、本発明は、対象における肥大型心筋症（ＨＣＭ）を治療する方法に関し、その方法は、前記対象に治療上有効な量のＬＫＢ１を投与するステップを含む。
【００５０】
他の態様では、本発明は、ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用に関する。
【００５１】
他の態様では、本発明は、肥満の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用に関する。
【００５２】
他の態様では、本発明は、糖尿病の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用に関する。
【００５３】
他の態様では、本発明は、肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療のための薬剤の製造におけるＬＫＢ１の使用に関する。
【００５４】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫをリン酸化する方法に関し、その方法は、ＡＭＰＫを組換え又は単離ＬＫＢ１と接触させるステップを含む。
【００５５】
他の態様では、本発明は、系の中でＡＭＰＫのリン酸化を促進する方法に関し、その方法は、前記系の中でＬＫＢ１の活性を促進するステップを含む。
【００５６】
他の態様では、本発明は、系の中でＡＭＰＫを活性化する方法に関し、その方法は、前記系の中でＬＫＢ１を活性化するステップを含む。
【００５７】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫを活性化する方法に関し、その方法は、前記ＡＭＰＫを組換え又は単離ＬＫＢ１と接触させるステップを含む。
【００５８】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫをリン酸化する方法に関し、その方法は、前記ＡＭＰＫを組換え又は単離ＬＫＢ１と接触させるステップを含む。
【００５９】
他の態様では、本発明は、ＬＫＢ１の（複数可の）調節因子を同定する方法に関し、その方法は、ＬＫＢ１の第１と第２の試料を供給するステップと、前記第１の試料をＬＫＢ１の候補調節因子と接触させるステップと、リン酸化を許容する条件下で前記第１と第２の試料を基質と接触させるステップと、前記基質へのリン酸の取り込みをモニターするステップと、前記第１と第２の試料における前記基質へのリン酸の取り込みを比較するステップとを含み、基質へのリン酸の取り込みが前記第１と第２の試料の間で異なる場合、その候補調節因子が、ＬＫＢ１活性の調節因子として同定される。好ましくは、基質は基質キナーゼである。好ましくは、基質キナーゼは、ＡＭＰＫである又はＡＭＰＫに由来する。他の態様では、本発明は、この方法によって同定されたＬＫＢ１の調節因子に関する。好ましくは、前記調節因子は活性化因子である。
【００６０】
他の態様では、本発明は、ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫＫの研究のための組換え真核生物に関する。例えば本発明は、有利には、ＡＭＰＫＫを破壊した酵母細胞を提供する。したがって、他の態様では、本発明は、Ｐａｋ１、Ｔｏｓ３及びＥｌｍ１のうち少なくとも２つにおける遺伝子破壊を含む組換え酵母細胞に関する。好ましくは、組換え酵母細胞は、Ｐａｋ１、Ｔｏｓ３及びＥｌｍ１における遺伝子破壊を含む。好ましくは、組換え酵母細胞は、Ｓｎｆ１の遺伝子破壊をさらに含む。好ましくは、組換え酵母細胞は、Ｓｎｆ４の遺伝子破壊をさらに含む。好ましくは、組換え酵母細胞は、ＳＩＰ１、ＳＩＰ２及びＧＡＬ８３の遺伝子破壊をさらに含む。好ましくは、組換え酵母細胞は、哺乳動物ＡＭＰＫを発現することができる。好ましくは、組換え酵母細胞は、哺乳動物ＡＭＰＫを発現する。好ましくは、哺乳動物ＡＭＰＫはマウス又はヒトＡＭＰＫであり、好ましくはヒトＡＭＰＫである。好ましくは、哺乳動物ＡＭＰＫはα、β及びγサブユニットを含む。好ましくは、酵母は、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）である。遺伝子破壊は、任意の適切な技術により行ってもよく、或いは遺伝子交配により、個々の株から同じ細胞に一緒に集めてもよい。
【００６１】
他の態様では、本発明は、これらの株の使用による、例えば、候補ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫＫ又はそのライブラリーでの形質転換、及び機能的ＡＭＰＫ及び／又はＡＭＰＫＫを単離するための炭素源での選択によるＡＭＰＫＫ及び／又はＡＭＰＫの相補性クローン化に関する。他の態様では、本発明は、この形で単離されたＡＭＰＫ及び／又はＡＭＰＫＫに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
本発明者らは、ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）をリン酸化し活性化するタンパク質キナーゼを同定した。これは、ＡＭＰＫの調節、特にＡＭＰＫの活性化を目的とする化合物の治療標的となる。
【００６３】
本発明から、２型糖尿病、ポイツ−ジェガーズ症候群、癌及び肥満の１種又は複数種の治療又は予防における特定の有用性が見出される。さらなる適用例及び詳細を下記に示す。
【００６４】
ＬＫＢ１の下流基質としてのＡＭＰＫの同定から、上流のキナーゼを調節及び／又は活性化し、癌又は本明細書で説明する他の異常の治療において治療的役割を果たす可能性がある化合物をスクリーニングする検定系の提供が可能となる。
【００６５】
ＡＭＰＫカスケードにおける上流のキナーゼの同定により、２型糖尿病及び肥満、並びに本明細書に記載する他の異常の治療を目的とする候補薬剤スクリーニングの標的がもたらされる。
【００６６】
ＬＫＢ１の基質としてのＡＭＰＫの同定から、ＬＫＢ１を活性化する候補薬剤をスクリーニングする検定法がさらにもたらされる。これは、癌の治療並びに代謝異常及び他の異常の治療に適用される。
【００６７】
幅広い態様において、本発明は、ＬＫＢ１の活性を検定する方法に関し、その方法は、ＬＫＢ１の試料を供給するステップと、リン酸化を許容する条件下で前記試料を基質と接触させるステップと、前記基質へのリン酸の取り込みをモニターするステップとを含み、前記基質へのリン酸の取り込みがＬＫＢ１活性を示す。この態様では、基質とは、本明細書で示すもの（実施例の項を参照）など、実証可能な生物学的作用を有するものなどの生物学的意義のある任意の基質を意味する。好ましくは、前記基質は、それ自体キナーゼ（すなわち「基質キナーゼ」）であり、好ましくは、前記基質はＡＭＰＫであり又はそれに由来し、好ましくは、前記基質はＡＭＰＫである。
【００６８】
本明細書において、「基質キナーゼ」という用語は、その通常の意味を有する。具体的には、「キナーゼ」とは、Hunterによって定義されたキナーゼ特異的モチーフ（kinase signature motif）（例えば、Hanks, Quinn and Hunter 1988 Science vol 241 p.42を参照）を有するような、配列比較によって認識可能なキナーゼを意味する。もちろん、「キナーゼ」は、キナーゼ失活変異体又は触媒として不活性な（複数可の）断片を除外したものを意味しないが、Hanksらを参照してキナーゼと通常分類されるタンパク質ファミリーを示すのに使用される。好ましくは、キナーゼは、タンパク質及び／又は糖質及び／又は脂質キナーゼを、好ましくはタンパク質キナーゼを意味する。
【００６９】
本明細書において、「系」とは、その通常の意味を有し、（複数可の）細胞全体などの複雑な（複数可の）生物系を含むことがある。
【００７０】
「由来する」という用語は、当技術分野におけるその通常の意味を有し、物質の一部が、最初の物質のすべて又は一部をその問題の物質に組み込む一連の事象を通じて作り出され又は構築されたとき、その物質がその最初の物質に「由来する」とみなされる。当然ながら、その２つの物質は、例えば突然変異、付加又は欠失或いは類似の改変によって異なる可能性が高いが、その問題の物質がその最初の物質から特徴を受け継いでいる場合、その物質はその最初の物質に由来する。具体的には、（複数可の）ポリヌクレオチドや（複数可の）ポリペプチドなどの生体ポリマーに関連して使用するとき、物質が最初の物質と関連すると認識されるほど十分な配列同一性を有するときにその物質は最初の物質に由来するとみなされる。この場面では、物質が最初の物質に由来する場合、前記物質は、好ましくは少なくとも連続した１０残基を有し、最初の物質と少なくとも２５％の同一性、好ましくは３０％の同一性、好ましくは４０％の同一性、好ましくは５０％の同一性、好ましくは６０％の同一性、好ましくは７０％の同一性、好ましくは８０％の同一性、好ましくは９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性、好ましくは９６％の同一性、好ましくは９７％の同一性、好ましくは９８％の同一性、好ましくは９９％の同一性又はそれをさらに超える同一性を有する。好ましくは、前記物質は、前記同一性を有する、少なくとも連続した１５残基、好ましくは少なくとも２０残基、好ましくは少なくとも３０残基、好ましくは少なくとも５０残基、好ましくは少なくとも１００残基、好ましくは少なくとも２００残基又はそれをさらに超える残基を有する。多量体の物質では、その用語は、その状況から明らかな複合体及び／又は個々の構成要素に適用することができる。一般に、そのサブユニットの１つがその所与の物質に由来すれば、それは十分である。
【００７１】
相同体は、当技術分野で通常理解されている通りである。好ましくは、相同体とは、他の種の生物など他の生物の同等物を指す。
【００７２】
「単離された」という用語は、組換えの及び／又は精製されたものを意味することがある。精製されたとき、その用語は、それが天然に認められる組成物の少なくとも１つの構成要素から分離されたときの物質を指す。
【００７３】
本発明の作用因子／調節因子とは、ＡＭＰＫの活性化及び／又はリン酸化に関与する物質を指す。本発明の例示的な作用因子／調節因子は、ＬＫＢ１である。これは、ＨＳＰ９０及び／又はＣｄｃ３７、或いはその組合せなどの（複数可の）安定化作用因子と併用して使用することができる。他の調節因子は、ＳＴＲＡＤタンパク質であり、ＬＫＢ１を活性化し、したがってＡＭＰＫを活性化することができる。したがって、本発明は、ＡＭＰＫの調節、好ましくはＡＭＰＫの活性化におけるＳＴＲＡＤタンパク質の使用に関する。
【００７４】
ＡＭＰＫ活性の検定
当業者によってＡＭＰＫを検定することができる様々な方法がある。本発明によれば、ＡＭＰＫ活性を検定するための任意の適切な技術を使用することができる。
【００７５】
ＡＭＰＫ活性は、直接的に（例えばＡＭＰＫのキナーゼ活性を検定することによって）決定することもでき、或いは間接的に（例えばＡＭＰＫのスレオニン１７２のリン酸化状態を検定することによって）決定することもできる。好ましくは、ＡＭＰＫ活性は、直接的に測定する。
【００７６】
ＡＭＰＫを検定する大多数の技術は、ＡＭＰＫによってリン酸化されることが可能な基質のリン酸化の測定を利用するものである。この基質は、ポリペプチド（例えば、比較的短い基質ペプチド（例えば５０アミノ酸残基以下））又は長いポリペプチド／タンパク質、或いはその断片又はドメインなど、どんな適切な基質でもよい。
【００７７】
ＡＭＰＫ活性は、ＡＭＰＫによるＡＭＰＫ基質へのリン酸の移行を測定することによって検定することができる。ＡＭＰＫのαサブユニット内の残基１７２（好ましくは野生型スレオニン１７２）のリン酸化状態を決定することによってＡＭＰＫ活性を検定することもできる。この検定の例は、例えば図４ｅに示すように下記で示す。
【００７８】
この方法を用いて、その上流のキナーゼによってＡＭＰＫをリン酸化し、リン酸化スレオニン１７２を特異的に認識する抗体（Cell Signalling Technologiesから市販されている）を用いたウェスタンブロット法によりスレオニン１７２のリン酸化を決定する。
【００７９】
ＡＭＰＫ活性は、好ましくは基質（例えばペプチド又はタンパク質基質）のリン酸化を測定することによって検定する。この手順は、タンパク質キナーゼでは非常に標準的なものである。タンパク質基質（例えばアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ）並びに短いペプチドを用いてＡＭＰＫを検定することができる。
【００８０】
リン酸の移行は、好ましくはリンの（複数可の）放射性同位体を用いてモニターする。例えば、３２−Ｐ標識ＡＴＰを使用することができるが、それはどんな標識リン酸でも、例えば３３−Ｐでもよい。好ましくは、３２−Ｐγ標識ＡＴＰを使用する。
【００８１】
ＡＭＰＫ基質は、好ましくはペプチドである。このペプチドは、ＡＭＰＫによってリン酸化されることが可能などんなペプチド基質でもよい。
【００８２】
好ましくは、ペプチドは、ＡＭＰＫによるリン酸化の共通配列を含み、前記共通配列は、リン酸化可能な残基（セリン又はスレオニン）のＮ末端側５アミノ酸位に疎水性残基を、リン酸化可能な残基のＮ末端側２、３、又は４アミノ酸位に塩基性残基を、リン酸化可能な残基のＣ末端側４アミノ酸位に疎水性残基を含み、以下のように表すことができる：
疎水性−（塩基性，Ｘ，Ｘ）−Ｘ−セリン又はスレオニン−Ｘ−Ｘ−Ｘ−疎水性
上式で、括弧内のアミノ酸の順序は決定的なものではない。
【００８３】
ＡＭＰＫによるリン酸化の共通モチーフのさらなる手引きは、Weekes, J., Ball, K.L., Caudwell, F.B. and Hardie, D.G. FBBS Lett. 334, 335-339 (1993)に認めることができ、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
これらのペプチドは、任意の適切な技術により容易に合成することもでき、或いは営利会社又はサービス研究室（service laboratories）から提供されるものでもよく、或いはその場で必要に応じて単に作製してもよい。
【００８５】
適切なＡＭＰＫ基質の好ましい例は、ＳＡＭＳペプチド（HMRSAMSGLHLVKRR）（Davies, S.P., Carling, D. and Hardie, D.G. Eur. J. Biochem. 186, 123-128 (1989)）である。これは、Upstate Biotechnology Inc.から市販されている。
【００８６】
好ましくは、ＡＭＰＫ活性は、本明細書に記載のように（例えば、図４ｄに示すように）検定する。
【００８７】
ＡＭＰＫは、遺伝学的手段によって検定することもできる。例えば、ｌｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺレポーターの転写が、そのプロモーターと結合したＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐの触媒活性に依存する酵母ＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）の検定法（Kuchin, 2000、参照により本明細書に組み込まれるKuchin, S., Treich, I. & Carlson, M. A regulatory shortcut between the Snfl protein kinase and RNA polymerase II holoenzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7916-7920 (2000)）を使用し又は適合させることができる。この及び他の遺伝学的試験を、実施例の項など、下記でより十分に説明する。
【００８８】
ＡＭＰＫ
本発明の検定におけるＡＭＰＫの使用に関して、当業者に使用可能なタンパク質を作製する多数の代替方法が存在する。
【００８９】
活性化に必要なリン酸化可能な残基を含み、活性に必要なそのアミノ酸残基を含むＡＭＰＫ、又はＡＭＰＫの相同体を、本発明に従った検定法に使用することができる。好ましくは、活性化残基は１７２であり、好ましくはスレオニン１７２である。本明細書に記載の、例えばＳＡＭＳペプチドを用いたＡＭＰＫの（複数可の）検定法で試験することによって、残基が活性に必要かどうかを判定することができる。
【００９０】
ＡＭＰＫは、活性化ループ中のリン酸化によって活性化される。具体的には、ＡＭＰＫは、活性化部位１７２でのリン酸化によって活性化される。天然に存在するＡＭＰＫは通常この部位にスレオニンを有するが、類似のリン酸受容型アミノ酸で、例えばセリンでこの部位を置換できることが理解されるであろう。さらに、当技術分野で知られているように、例えば負に帯電した残基の導入など、この部位でのさらなる突然変異によって、構成的に活性型の変異体を構築することができる。本発明の状況では、ＡＭＰＫは、野生型の哺乳動物の配列を参照することによって判断されるように、活性化ループ中で１７２位にリン酸受容型残基を有するのが好ましく、好ましくは、１７２位はスレオニンである。
【００９１】
これに関して、ＬＫＢ１の任意の活性型製剤、例えば、（複数可の）タグ配列を含む又は含まない適切な系で発現させた組換えＬＫＢ１を使用して、（スレオニン１７２と同等の）活性化部位を保持し、且つ／又はリン酸化後にＡＭＰＫの触媒活性を示すことができたどんな形のＡＭＰＫもリン酸化し活性化することができる。
【００９２】
ＡＭＰＫは、天然には複数のサブユニットから構成されることが理解されるであろう。したがって、本明細書において、「ＡＭＰＫ」という用語は、ＡＭＰＫ活性を有するそのタンパク質又はタンパク質の結合体を指す。現在、ＡＭＰＫを形成する結合体中のサブユニットの考えられる組合せが少なくとも１２種存在する。この数字は、現在αサブユニットが２種、βサブユニットが２種、またγサブユニットが３種存在し、それによって考えられる１２種の異なるヘテロ三量体型のＡＭＰＫが生じることから得られたものである。αサブユニットは、ＬＫＢ１によって標的とされる。
【００９３】
本発明で有用なＡＭＰＫの好ましい供給源は、細菌によって発現された哺乳動物ＡＭＰＫ複合体である。その複合体の発現に使用する好ましい戦略については、Neumann et al. 2003 Protein Expression and Purification ‘Mammalian AMP-activated protein kinase:functional, heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in E.coli’に詳細に記載されている。したがって、好ましい実施形態では、本発明の検定に使用するＡＭＰＫは、Neumannらにしたがって調製する。
【００９４】
NeumannらはGenBankアクセッション番号Ｘ９５５７８、Ｘ９５５７７、及びＵ４０８１９に詳細な記載があるｃＤＮＡによってコードされたマウスＡＭＰＫサブユニットから研究しているが、ヒトＡＭＰＫサブユニットの調製は、Neumannに従い、必要に応じてヒト配列を探知するためにクローン化ステップで使用するＰＣＲプライマーを単に変更し、ＰＣＲステップに適したヒト鋳型核酸を使用することにより、当業者の能力の範囲内で十分に行われる。したがって、他の実施形態では、ＡＭＰＫは、Neumannらに従って調製したヒトＡＭＰＫであることが好ましい。
【００９５】
（複数可の）切断型のＡＭＰＫαサブユニットを、好ましくは触媒サブユニットを含むものを、好ましくはスレオニン１７２を含むものを本発明で使用することも可能である。ＡＭＰＫαを切断することにより、上流のキナーゼによってスレオニン１７２のリン酸化が可能であり、他の２種の制御ＡＭＰＫサブユニット（β及びγ）の不在下で活性のあるタンパク質を作製することが可能である。好ましくは、本発明で使用する切断型ＡＭＰＫαは、Hamilton, S.R., O'Donnell, J.B., Hammet, A., Stapleton, D., Habinowski, S.A., Means, A.R., Kemp, B.E. and Witters, L.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 293, 892-898 (2002)に従って調製する。この物質は、細菌によって発現され、Ｎｉ−ＮＴＡを用いて精製したα１の最初の３１２アミノ酸を含む。次いで、本発明の検定で、この物質を上流キナーゼの基質として使用することができる。
【００９６】
動物組織から精製したＡＭＰＫを使用することも可能である。例えばＡＭＰＫは、Carling, D., Clarke, P.R., Zammit, V.A. and Hardie, D.G. Bur. J. Biochem. 186, 123-128 (1989)に従って、ラット肝から精製することができる。その酵素ＡＭＰＫを含むどんな供給源から精製したＡＭＰＫも本発明の検定で使用できることが、当技術分野の読者によって当然理解されるであろう。例えば、本発明で使用する精製ＡＭＰＫは、Upstate Biotechnology Inc.から市販されている。
【００９７】
さらに、他の種由来のＡＭＰＫの（複数可の）相同体、例えば酵母由来のＳＮＦ１も、本発明に有用であることが理解されるであろう。
【００９８】
好ましい実施形態では、ＡＭＰＫは、Neumannら（Neumann, Woods, Carling, Wallimann and Schlattner Protein Expression and Purification 2003 "Mammalian AMP-activated protein kinase: functional, heterotrimeric complexes by co-expression of subunits in E. coli"）に記載のように、本発明の検定で使用するために調製することができる。
【００９９】
他の好ましい実施形態では、ＡＭＰＫは、本発明での使用に適した切断型のＡＭＰＫの発現について記載するHamiltonら（Hamilton et al. 2002 BBRC vol 293 pp892-898）に従って調製することができる。
【０１００】
ＬＫＢ１
本発明の検定におけるＬＫＢ１の使用に関して、当技術分野の読者に使用可能なＬＫＢ１を作製する多数の代替方法がある。例えば、検定を定性的に使用して、ＬＫＢ１活性が試料に存在するかどうかを決定する場合、天然に前記試料がＬＫＢ１を含むかどうか分からないことがある。
【０１０１】
（例えば、（複数可の）タグ配列を含む又は含まない適切な系で発現させた）ＬＫＢ１の任意の活性型製剤を使用して、（ＡＭＰＫのスレオニン１７２と同等の）活性化部位を保持し、且つ／又はリン酸化後に触媒活性を示すことができたＡＭＰＫなど任意のＡＭＰＫ製剤をリン酸化し活性化することができる（上記のＡＭＰＫの項を参照）。
【０１０２】
具体的には、Sapkotaら（Sapkota et al 2001, JBC vol 276 pp19469-19482）は、本発明での使用に適した、異なるタグの形態のＬＫＢ１の例を提供する。好ましくは、ＬＫＢ１は、大腸菌（E.coli）中で作製し、参照により本明細書に組み込まれるSapkotaらに従って精製する。
【０１０３】
異なる種由来の異なるクローンのＬＫＢ１も適切であることが、当技術分野の読者に理解されるであろう。これらは、ＬＫＢ１の相同体も含むことがある。ヒト又はマウスのＬＫＢ１との、好ましくはヒトＬＫＢ１との最大の配列同一性を示すこれらの相同体が好ましい。
【０１０４】
Sapkotaでは、マウスの配列ＮＣＢＩ  ＡＡ５４２１６３／ＩＭＡＧＥ  ５５０３５５をＬＫＢ１のＰＣＲクローニングでの鋳型として使用する。もちろん、当業者なら、同じ手順に従い、必要に応じてヒト配列に対するプライマー配列を単に適合させ、適切なヒト鋳型核酸を使用することによってヒトＬＫＢ１が得られるように、Sapkota を適合させることが容易であることを理解するであろう。したがって、一実施形態では、ＬＫＢは、好ましくはヒトＬＫＢである。
【０１０５】
活性を保持する切断型のＬＫＢ１を使用することが望ましい可能性がある。ＬＫＢ活性を保持するかどうかは、本発明の検定を用いて容易に決定される。
【０１０６】
下記に記載のように、例えば特定の（複数可の）細胞系統での発現によって、ＬＫＢを活性化することができる。
【０１０７】
活性型でＬＫＢ１を直接発現させることが望ましい可能性があり、次いでこれは本発明の検定に使用することができる。ＬＫＢ１は、当技術分野で知られているように、例えばＨＳＰ９０及び／又はＣｄｃ３７及び／又はＳＴＲＡＤタンパク質を用いて、活性化及び／又は安定化することができる。
【０１０８】
ＬＫＢ１は、ＣＯＳ７、ＨＥＫ２９３、Ｇ３６１黒色種、ＣＣＬ１３肝癌、Ｈ２Ｋ骨格筋、ＨｅＬａ又はＳｆ９細胞で発現するとき、活性であることが知られている。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＬＫＢ及びＡＭＰＫは、同じ種からのもの、又はそれに由来するものである。
【０１１０】
ＬＫＢ１の検定
ＬＫＢ１キナーゼ検定は、キナーゼ検定の標準的な条件を用いて行う。下記の注釈は、検定における終濃度を指す。
【０１１１】
ｐＨは、好ましくはＬＫＢ１キナーゼ検定用に調節する。好ましくは、ｐＨは、６〜９に、好ましくは６．５〜８．５に、好ましくは７．５に調節する。
【０１１２】
緩衝剤は、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ又は他の適切な緩衝剤でもよい。好ましくは、緩衝剤はＨＥＰＥＳである。好ましくは、緩衝剤は５０ｍＭである。
【０１１３】
金属イオンが含まれる。好ましくは２＋金属イオンである。好ましくはマンガン及び／又はマグネシウムイオンである。好ましくはマグネシウムイオンである。好ましくは、金属イオンは金属塩化物として供給する。好ましくは、金属イオンは、１〜１０ｍＭで、好ましくは５ｍＭで存在する。
【０１１４】
場合によっては安定化剤が含まれる。安定化剤は、グリセロール、例えば１０％グリセロールでもよく、或いはトリトン（triton）、例えば１％トリトンやトゥイーン（tween）、例えば０．１％トゥイーンなどの界面活性剤でもよい。
【０１１５】
還元剤が含まれると有利である。還元剤は、ＤＴＴ、グルタチオン、Ｂ−メルカプトエタノール又は他の適切な還元剤でもよい。好ましくは、還元剤は１ｍＭで使用する。好ましくは、還元剤はＤＴＴである。
【０１１６】
場合によってはキレート剤を使用する。好ましくは、キレート剤はＥＤＴＡであり、好ましくは１ｍＭ  ＥＤＴＡである。
【０１１７】
ＡＴＰが含まれる。好ましくは、ＡＴＰは１０μＭ〜１０ｍＭで、好ましくは１０μＭ〜５ｍＭで、好ましくは１００μＭで存在する。ＡＴＰは、必要性及び選択する読み取り方に応じて、例えば３３Ｐ又は３２Ｐで、好ましくは３２Ｐで標識（好ましくはγ標識）してもよく、或いは非標識でもよい。非標識の場合、読み取り方は、好ましくはＡＭＰＫのＰ−Ｔ１７２の免疫学的検出である。
【０１１８】
場合によっては、ＬＫＢ１の（複数可の）活性化因子を含んでよい。これは、ＳＴＲＡＤタンパク質及び／又はＡＭＰを含むことがある。
【０１１９】
所望の場合、ＬＫＢ１に関する他のファクター、例えばＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７他を含んでよい。
【０１２０】
好ましくは、ＬＫＢ１検定の条件は、実施例の項の場合と同様であり、特に好ましくは、１００μＭ  ＡＴＰなどの実施例７で示すその条件である。
【０１２１】
遺伝子破壊
妨害、突然変異や欠失など、当業者に知られている任意の技術によって、遺伝子破壊を実現することができる。好ましくは、遺伝子破壊は、少なくとも一部のコード配列をゲノムから欠失させることによって、好ましくは、コード配列全体をゲノムから欠失させることによって実現する。
【０１２２】
（複数可の）プロモーターエレメントなどの転写エレメントを改変することによって、或いは（複数可の）アンチセンス又は抑制性核酸を過剰発現させて転写ＲＮＡの翻訳を低下させ又は無効にすることによって、或いは当技術分野で知られている他の任意の適切な手段によって破壊を実現することもできる。
【０１２３】
タグ配列
ｍｙｃ、ＨＡ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、フラッグ（flag）や他のタグなどのエピトープタグを付けて、本発明に有用なポリペプチドを調製してもよい。好ましくはフラッグである。
【０１２４】
医療への適用
本発明から、ポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）、肥満、糖尿病、好ましくは２型糖尿病、肥大型心筋症（ＨＣＭ）の治療、予防及び／又は改善、細胞エネルギー恒常性の維持、熱ショックを含むストレス、低酸素及び虚血、細胞ＡＴＰレベルの低下と関係する筋肉疲労及び他の状態、癌、特にＰＪＳ患者に生じる癌、腸ポリポーシス、形質転換に対する抵抗及び細胞増殖の抑制、例えば無秩序な（複数可の）増殖状態の反転／停止、アポトーシス細胞死の誘導及び許容における特定の有用性が見出される。
【０１２５】
Ｓｎｆ１／ＡＭＰＫファミリーのキナーゼは、真核生物における代謝ストレス応答に重要である。哺乳動物では、ＡＭＰＫは、複数のストレスによって活性化され、その多くが細胞のＡＭＰ：ＡＴＰ比の増大を引き起こし、またレプチン及び血糖降下薬メトホルミンによっても活性化される。ＡＭＰＫは、エネルギー恒常性の調整に中心的な役割を有し、脂質代謝、グリコーゲン貯蔵、及びグルコース輸送の主要な制御因子である。ＡＭＰＫは、２型糖尿病及び肥満を含む代謝異常の発症及び治療に関与しており、ＡＭＰＫの突然変異は、ヒトにおいて心臓の異常を引き起こす。
【０１２６】
特に、本発明の治療を、ｐ５３標的薬剤（例えば、Bardeesy et al Nature vol 419 p162を参照）との併用療法に使用して効果を増強することができる。
【０１２７】
上流キナーゼによる酵母Ｓｎｆ１及び哺乳動物ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼの活性化
本発明者らは、Ｓｎｆ１キナーゼカスケードの上流キナーゼとして機能するＴｏｓ３ｐ、Ｐａｋ１ｐ、及びＥｌｍ１ｐの３種のキナーゼを同定した。本発明者らは、これらのキナーゼがｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでＳｎｆ１キナーゼをリン酸化し活性化する遺伝学的及び生物学的証拠を示す（実施例の項を参照）。この３種のキナーゼを欠く変異酵母細胞は、Ｓｎｆ１キナーゼ経路の代表的な機能であるグルコース以外の炭素源の利用能が欠損している。これは、生理的役割／機能を実証した、Ｓｎｆ１／ＡＭＰＫキナーゼカスケードの上流キナーゼの初めての同定である。
【０１２８】
本明細書で検討したＳｎｆの表現型を付与するのに３種すべてに突然変異を起こさなければならないので、この３種のキナーゼは著しい機能の重複をはっきりと示す。しかし、これらは、Ｓｎｆ１の制御に関して何らかの異なった機能を有することが判明する可能性が高いように思われる。その３種の各上流キナーゼは、特定のβサブユニットのアイソフォームを含むＳｎｆ１キナーゼについて何らかの選択性を示す可能性がある。他の可能性は、その３種のキナーゼが、異なる種類の代謝ストレスに、又はグルコース制限などの単一のストレスから生じる異なるシグナルに選択的に応答することである。
【０１２９】
本明細書で説明するように、これらのキナーゼの同定はまた、ＡＭＰＫカスケードの上流キナーゼを同定するための検定及び／又はスクリーニングなど、本発明に従った検定法の設計及び改良が可能となる点において、酵母以外にも意義を有する。
【０１３０】
密接に関連する哺乳動物キナーゼＬＫＢ１（腫瘍抑制キナーゼ）の検討から、ＬＫＢ１がＡＭＰＫの上流キナーゼである証拠が得られた。
【０１３１】
ＬＫＢ１が、活性化ループのスレオニン残基上でＡＭＰＫをｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化し活性化することが、本明細書で実証される。
【０１３２】
したがって、ＬＫＢ１が、細胞中でＡＭＰＫ活性に影響を及ぼす候補薬剤の有益な標的であることが実証される。
【０１３３】
さらに、これらの知見は、増殖及び形質転換並びに代謝の制御におけるＡＭＰＫについて開示される役割、並びにｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＭＰＫの制御におけるＬＫＢ１の生理的役割を支持するものである。
【０１３４】
酵母の上流キナーゼと関連する他の哺乳動物キナーゼが、本発明に従った、ＡＭＰＫカスケードの真正キナーゼの候補でもあることが理解されるであろう。これらの哺乳動物の上流キナーゼは、本発明に従った、特に肥満及び２型糖尿病を含むヒト代謝異常並びに癌の治療についての治療標的となる。
【０１３５】
薬剤組成物
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の（複数可の）作用因子及び／又は（複数可の）調節因子、並びに製剤上許容される担体、希釈剤又は賦形剤（それらの組合せを含む）を含む薬剤組成物をも提供する。
【０１３６】
薬剤組成物は、ヒト医学及び獣医学におけるヒト又は動物での使用のためのものでもよく、通常、１種又は複数種の製剤上許容される任意の希釈剤、担体又は賦形剤を含む。治療上の使用に許容される担体又は希釈剤は、製剤技術分野で周知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。製剤上の担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図された投与経路及び標準的な製剤上の慣習に関して選択することができる。薬剤組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はそれらに加えて、任意の適切な（複数可の）結合剤、（複数可の）潤滑剤、（複数可の）懸濁剤、（複数可の）被覆剤、（複数可の）可溶化剤を含んでもよい。
【０１３７】
保存剤、安定化剤、色素、及び着香剤でさえ、薬剤組成物中に供給することができる。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルがある。抗酸化剤及び懸濁剤を使用することもできる。
【０１３８】
異なる送達系に応じて組成物／製剤の要件が異なってもよい。一例として、本発明の薬剤組成物を製剤して、ミニポンプを用いて、或いは粘膜経路によって、例えば吸入用の経鼻噴霧剤若しくはエアロゾル剤又は経口摂取可能な液剤として、或いは非経口的に投与することができ、非経口的に投与する場合、例えば静脈内、筋内又は皮下経路で送達するために注射可能な形で組成物を製剤する。或いは、いくつかの経路で投与されるように製剤を設計することもできる。
【０１３９】
胃腸粘膜を介して薬剤を粘膜投与する場合、それは、胃腸管を通過する間安定なままであることが可能であるべきであり、例えば、それはタンパク質分解性の分解に抵抗性であり、酸性ｐＨで安定であり、胆汁の界面活性作用に抵抗性であるべきである。
【０１４０】
適当な場合には、吸入により、坐剤又はペッサリーの形で、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤又は散粉剤の形で局所的に、皮膚貼付剤の使用により、デンプンやラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形で経口的に、或いは単独の又は賦形剤と混合したカプセル剤又は腔坐剤で、或いは着香剤又は着色剤を含むエリキシル剤、液剤又は懸濁剤の形で薬剤組成物を投与することもでき、非経口的に、例えば静脈内に、筋内に又は皮下にそれを投与することもできる。非経口投与では、滅菌水性液剤の形で、組成物を最も良好に使用することができ、それは血液と等張な液剤を作製するために他の物質、例えば塩類又は単糖類を含んでよい。口腔内又は舌下投与では、従来通りの方法で製剤することができる錠剤又はトローチ剤の形で組成物を投与することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の作用因子及び／又は成長因子を、シクロデキストリンと組み合わせて使用することもできる。シクロデキストリンは、薬剤分子と包接及び非包接複合体を形成することが知られている。薬剤−シクロデキストリン複合体の形成によって、薬剤分子の溶解度、溶解速度、生体利用度及び／又は安定性を改変することができる。一般に、薬剤−シクロデキストリン複合体は、ほとんどの剤形及び投与経路に有用である。薬剤との直接の複合体化の代替法としては、補助的な添加剤として、例えば担体、希釈剤又は可溶化剤としてシクロデキストリンを使用することができる。α−、β−及びγ−シクロデキストリンは、最も一般的に使用され、適切な例は、ＷＯ−Ａ−９１／１１１７２、ＷＯ−Ａ−９４／０２５１８及びＷＯ−Ａ−９８／５５１４８に記載されている。
【０１４２】
作用因子／調節因子がタンパク質である場合、治療する対象中でｉｎ  ｓｉｔｕで前記タンパク質を調製することができる。これに関して、前記タンパク質が前記ヌクレオチド配列から発現されるように、ウイルスを用いない技術の使用（例えば、リポソームの使用）及び／又はウイルスを用いた技術の使用（例えば、レトロウイルスベクターの使用）によって、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を送達することができる。
【０１４３】
好ましい実施形態では、本発明の薬剤組成物を局所に投与する。
【０１４４】
したがって、好ましくは、薬剤組成物は、局所送達に適した形態である。
【０１４５】
投与
「投与した」という用語は、ウイルスを用いた又は用いない技術による送達を含む。ウイルスを用いた送達の機構には、それだけに限らないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターがある。ウイルスを用いない送達の機構には、脂質媒介性トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性表面両親媒性物質（ＣＦＡ）及びその組合せがある。
【０１４６】
本発明の構成成分は、単独で投与することもできるが、例えば、その構成成分が、意図された投与経路及び標準的な製剤上の慣習に関して選択された適切な製剤上の賦形剤、希釈剤又は担体と混合されているとき、薬剤組成物として一般に投与する。
【０１４７】
例えば、錠剤、カプセル剤、腔坐剤、エリキシル剤、液剤又は懸濁剤の形で（例えば、経口的に又は局所的に）構成成分を投与することができ、それは、即時型、遅延型、改変型、持続型、パルス型又は制御型放出に適用するために着香剤又は着色剤を含むことがある。
【０１４８】
薬剤組成物が錠剤である場合、錠剤は、微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウム及びグリシン、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、ジャガイモ、又はタピオカのデンプン）などの崩壊剤、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロース（croscarmellose）ナトリウム及び特定の複合体ケイ酸塩、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチンやアカシアなどの顆粒結合剤などの賦形剤を含んでもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリン（glyceryl behenate）や滑石などの潤滑剤を含んでもよい。
【０１４９】
ゼラチンカプセル中の充填剤として、同様の型の固体組成物を使用することもできる。これに関して好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量のポリエチレングリコールがある。水性懸濁剤及び／又はエリキシル剤では、薬剤は、種々の甘味剤又は着香剤、着色剤又は色素と、乳化剤及び／又は懸濁剤と、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンやその組合せなどの希釈剤と組み合わせてもよい。
【０１５０】
投与（送達）経路には、それだけに限らないが、１種又は複数種の：経口（例えば、錠剤、カプセル剤、又は経口摂取可能な液剤として）、局所、粘膜（例えば、吸入用の経鼻噴霧剤又はエアロゾル剤として）、鼻から、非経口（例えば、注射可能な形態によって）、胃腸から、髄腔内、腹腔内、筋内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、鞘膜内、脳室内、脳内、皮下、眼（硝子体内又は眼房内（intracameral）を含む）、経皮、直腸から、口腔内、膣から、硬膜外、舌下の経路がある。
【０１５１】
好ましい態様では、薬剤組成物を局所送達する。
【０１５２】
薬剤組成物の構成成分のすべてが、同じ経路で投与することを必要とするわけではないことが理解されるはずである。同様に、組成物が複数の有効成分を含む場合、これらの構成成分は、異なる経路で投与してもよい。
【０１５３】
本発明の構成成分を非経口投与する場合、そのような投与の例には、１種又は複数種の：静脈内、動脈内、腹腔内、クモ膜下腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋内又は皮下への構成成分の投与；及び／或いは注入技術の使用による投与がある。
【０１５４】
非経口投与では、組成物は滅菌水性液剤の形で最も良好に使用され、それは、他の物質、例えば血液と等張な液剤を作製するのに十分な塩又はグルコースを含んでよい。水性液剤は、必要なら適切に（好ましくはｐＨ３〜９に）ｐＨを調整するべきである。滅菌条件下での適切な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製剤技術によって容易に実現される。
【０１５５】
示すように、鼻内へと又は吸入により本発明の（複数可の）構成成分を投与することができ、それは、乾燥粉末吸入器、或いは適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（HFA134A（商標））や１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（HFA227EA（商標））などのヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素又は他の適切な気体を使用する加圧容器、ポンプ、噴霧器又は噴霧吸入器からのエアロゾル噴霧の形で都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、単位投与量は、計量した量を送達する弁を供給することによって決定してもよい。加圧容器、ポンプ、噴霧器又は噴霧吸入器は、例えば、エタノールと噴射剤の混合物を溶媒として使用する有効化合物の液剤又は懸濁剤を含んでよく、その混合物はさらに、潤滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンを含んでよい。吸入器又は注入器で使用するための（例えばゼラチンから作られた）カプセル及びカートリッジを、薬剤の粉末混合物、及びラクトースやデンプンなど適切な粉末基剤を含むように製剤することができる。
【０１５６】
或いは、本発明の（複数可の）構成成分は、坐剤又はペッサリーの形で投与することもでき、ゲル剤、ヒドロゲル剤、ローション剤、液剤、クリーム剤、軟膏剤又は散粉剤の形で局所につけることもできる。本発明の（複数可の）構成成分はまた、皮膚に又は経皮的に、例えば皮膚貼付剤の使用により投与することができる。それらはまた、肺又は直腸からの経路で投与することもできる。それらはまた、眼からの経路で投与することもできる。眼の使用では、化合物は、等張ｐＨ調整滅菌食塩水中で微粉化した懸濁剤として、又は、好ましくは等張ｐＨ調整滅菌食塩水中の液剤として、場合によっては塩化ベンジルアルコニウム（benzylalkonium chloride）などの保存剤と組み合わせて製剤することができる。或いは、これらは、ワセリンなどの軟膏中で製剤することもできる。
【０１５７】
皮膚に局所的に付ける場合、本発明の（複数可の）構成成分は、例えば、以下のうち１種又は複数種との混合物中に懸濁した又は溶解した有効化合物を含む適切な軟膏剤として製剤することができる：鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋及び水。或いはそれは、例えば、以下のうち１種又は複数種の混合物中に懸濁した又は溶解した適切なローション剤又はクリーム剤として製剤することもできる：鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液体パラフィン、ポリソルベート６０、セチルエステル蝋、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水。
【０１５８】
投与レベル
通常、医師は、個々の患者に最も適した実際の投与量を決定する。任意の特定の患者に特異的な投与レベル及び投与の頻度は、様々である可能性があり、使用する特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康状態、性、食事、投与の形態及び時間、排出速度、薬剤の組合せ、特定の疾患の重症度、並びに個々の受けている療法を含めた種々のファクターに依存する。
【０１５９】
必要に応じて、体重１ｋｇ当たり０．０１〜３０ｍｇの投与量で、１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇなどで、より好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜１ｍｇの投与量で薬剤を投与することができる。
【０１６０】
製剤
当技術分野で知られている技術を用いることにより、１種又は複数種の適切な担体、希釈剤又は賦形剤と混合することなどによって、本発明の（複数可の）構成成分を薬剤組成物中に製剤することができる。
【０１６１】
薬剤として有効な塩
本発明の薬剤を、薬剤として許容される塩として投与することができる。通常、薬剤として許容される塩は、必要に応じて所望の酸又は塩基を用いることによって容易に調製することができる。その塩は、溶液から沈殿させ、ろ過によって収集することもでき、或いは溶媒の蒸発によって回収することもできる。
【０１６２】
治療
本明細書において治療を指すものすべてが、１種又は複数種の治癒目的の治療、緩和的治療及び予防的治療を含むことが理解されるはずである。好ましくは、治療という用語は、少なくとも治癒目的の治療及び／又は予防的治療を含む。
【０１６３】
治療は、本明細書で述べた１種又は複数種のその異常、或いはそれに関連する愁訴の治療でもよい。
【０１６４】
療法
本発明の方法によって同定した作用因子／調節因子は、治療薬として、すなわち療法への適用において使用することができる。
【０１６５】
「治療」という用語の場合と同様に、「療法」という用語は、治癒目的の効果、軽減的効果、及び予防的効果を含む。
【０１６６】
療法は、ヒト又は動物に対してのものでよい。
【０１６７】
療法は、本明細書で述べた１種又は複数種のその異常、或いはそれに関連する愁訴の治療を含む可能性がある。
【０１６８】
添付の図面を参照する実施例を通じて、本発明を次に説明する。
【実施例１】
【０１６９】
上流キナーゼによる酵母Ｓｎｆ１及び哺乳動物ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼの活性化
概要
Ｓｎｆ１及びＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ（ＡＭＰＫ）は、代謝ストレスに対する細胞応答において基本的な役割を果たし、すべての真核生物の細胞で保存されていると思われるタンパク質キナーゼカスケードの下流の構成成分である。ヒトでは、ＡＭＰＫは、糖尿病及び肥満を含む代謝異常において役割を果たすことが提唱されている。そのカスケードの（複数可の）上流キナーゼは、徹底した取り組みにもかからず、依然としてはっきりしないままである。本発明者らは、酵母でＳｎｆ１を活性化するＰａｋ１ｐ、Ｔｏｓ３ｐ、及びＥｌｍ１ｐの３種のキナーゼを同定した。その同系の遺伝子を三重欠失させると、変異した表現型が生じ、Ｓｎｆ１の触媒活性が消失する。３種のキナーゼはすべて、活性化ループのスレオニン上で組換えＳｎｆ１ｐをリン酸化する。さらに、Ｔｏｓ３ｐは、組換え哺乳動物ＡＭＰＫをリン酸化し活性化し、このことから、上流キナーゼの機能が保存されていることが示唆される。Ｐａｋ１ｐ、Ｔｏｓ３ｐ、及びＥｌｍ１ｐの触媒ドメインは、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）ファミリーの構成要素と最も密接に関連するが、その明らかな哺乳動物の相同体は存在しない。しかし、以前の研究では、ＡＭＰＫカスケードにおける主要な上流キナーゼ（ＡＭＰＫＫ）はＣａ２＋／カルモジュリン依存性でないことが示唆されている。
【０１７０】
ＣａｍＫＫ関連タンパク質キナーゼのＬＫＢ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＭＰＫをリン酸化し活性化することを本明細書で実証する。ヒトＬＫＢでの突然変異は、遺伝性の癌であるポイツ−ジェガーズ症候群を引き起こす。これらの結果から、同じタンパク質キナーゼカスケードが、代謝並びに増殖及び形質転換の制御に関与することが示唆される。
【０１７１】
Ｓｎｆ１／ＡＭＰＫファミリーのキナーゼは、真核生物における代謝ストレス応答に重要である。哺乳動物では、ＡＭＰＫは、複数のストレスによって活性化され、その多くが細胞のＡＭＰ：ＡＴＰ比の増大を引き起こし、またレプチン及び血糖降下薬メトホルミンによっても活性化される。ＡＭＰＫは、エネルギー恒常性の調整に中心的な役割を有し、脂質代謝、グリコーゲン貯蔵、及びグルコース輸送の主要な制御因子である。ＡＭＰＫは、２型糖尿病及び肥満を含む代謝異常の発症及び治療に関与しており、ＡＭＰＫの突然変異は、ヒトにおいて心臓の異常を引き起こす。
【０１７２】
出芽酵母（S. cerevisiae）では、Ｓｎｆ１キナーゼもストレス応答、特に炭素ストレスへの細胞の適応に必要である。Ｓｎｆ１は、グルコース制限に応答して多数の遺伝子の転写を制御し、代替の炭素源の利用に必要である。Ｓｎｆ１は、減数分裂及び胞子形成、糸状浸潤性増殖（filamentous invasive growth）、並びに加齢にも役割を有する。
【０１７３】
Ｓｎｆ１キナーゼは、触媒サブユニットＳｎｆ１ｐ（ＡＭＰＫのαサブユニット）、Ｓｎｆ４ｐ（ＡＭＰＫのγサブユニット）、３つのβサブユニット（ＳＩＰ１、ＳＩＰ２及びＧＡＬ８３によってコードされる）のうちの１つを含む。Ｓｎｆ４ｐは、Ｓｎｆ１ｐの制御ドメインによる自己抑制を相殺することによって、キナーゼ活性を刺激する。βサブユニットは、キナーゼの細胞下での局在を制御し、下流の標的との相互作用を媒介する。ＡＭＰ：ＡＴＰ比が何らかの役割を有する可能性があるが、グルコースレベルに応答してＳｎｆ１活性を調節するシグナルは、従来技術では明らかにされていない。
【０１７４】
徹底した取り組みにもかからず、Ｓｎｆ１及びＡＭＰＫをリン酸化する上流キナーゼの同定は依然としてはっきりしないままである。酵母では、遺伝学的手法でその同系の遺伝子に突然変異を生じさせることができず、このことから、複数のキナーゼがＳｎｆ１を活性化することが示唆される。
【０１７５】
Ｓｎｆ１はリン酸化によって活性化され、活性化ループのスレオニン残基であるＴ２１０がキナーゼ活性に重要である。
【実施例２】
【０１７６】
Ｔｏｓ３ｐ、Ｅｌｍ１ｐ、及びＰａｋ１ｐはＳｎｆ１を活性化する
酵母タンパク質複合体の質量分析から、Ｔｏｓ３ｐ（ＹＧＬ１７９Ｃ）はＳｎｆ４ｐと同時精製され、Ｐａｋ１ｐ（哺乳動物のｐ２１活性化キナーゼとは無関係）は、Ｓｎｆ１ｐ及びＳｎｆ４ｐと同時精製されることが示唆された。Ｔｏｓ３ｐとＰａｋ１ｐは密接に関連するが、その機能は、Ｐａｋ１がＤＮＡポリメラーゼの突然変異を抑制すること以外は知られていない。
【０１７７】
Ｔｏｓ３ｐ、Ｅｌｍ１ｐ、及びＰａｋ１ｐがＳｎｆ１を活性化することを実証する。
【０１７８】
上流キナーゼ（Ｅｌｍ１ｐ、Ｔｏｓ３ｐ、及びＰａｋ１ｐ）によって酵母ＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）が活性化されることを実証する。
【０１７９】
酵母ＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）の例示的な検定を開示する。
【０１８０】
Ｔｏｓ３ｐがＳｎｆ１ｐと相互作用することを確認するために、Ｔｏｓ３ｐのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合体を酵母中で発現させ、ＬｅｘＡタグ付きＳｎｆ１ｐがグルタチオン−セファロース上で同時精製されることを明らかにした。
【０１８１】
酵母細胞中にｔｏｓ３Δ及びｐａｋ１Δ突然変異を導入し、ｓｎｆ１Δ変異体に特徴的な表現型について試験した。単一及び二重の突然変異体は、ラフィノース又はグリセロール／エタノール上での増殖における欠陥を示さなかった（図１Ｂを参照）。
【０１８２】
次いで、Ｔｏｓ３ｐとＰａｋ１ｐがＳｎｆ１キナーゼと機能的に関連するという他の遺伝学的証拠を探求した。それらがＳｎｆ１を活性化する場合、その過剰発現によって、刺激サブユニットＳｎｆ４ｐの欠如が補償される可能性があると考えた。ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐ又はＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐを過剰発現させると、ＳＵＣ２（インベルターゼ）の遺伝子発現におけるｓｎｆ４Δ変異体の欠陥が部分的に抑制され、ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐによって、ｓｎｆ４Δ変異体におけるラフィンノース上での増殖が回復したが、Ｓｎｆ１の必要性は回避されなかった。
【０１８３】
ｌｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺレポーターの転写が、プロモーターと結合したＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐの触媒活性に依存する検定法も使用した（Kuchin, 2000、これは参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１８４】
ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐ又はＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐを過剰発現させると、グルコース制限に応答してβ−ガラクトシダーゼの合成が刺激され、このことから、ＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐの触媒活性に対する正の効果が暗示される（図１Ａ）。
【０１８５】
その二重変異体における表現型の欠如から、他のキナーゼが重複した機能をもたらすことが示唆された。Ｐａｋ１ｐ及びＴｏｓ３ｐと最も密接に関連するキナーゼはＥｌｍ１ｐであり、これは、細胞の形態が長くなり、偽性菌糸の発達に影響する突然変異によって同定された。Ｅｌｍ１ｐは、芽の成長及び細胞分裂の調節において役割を有する。
【０１８６】
遺伝子破壊によって、ｅｌｍ１Δを上記の変異株中に導入した。ｔｏｓ３Δｅｌｍ１Δ株及びｐａｋ１Δｅｌｍ１Δ株は、ラフィノース及びグリセロール／エタノール上で増殖したが、三重のｔｏｓ３Δｐａｋ１Δｅｌｍ１Δ変異体は増殖しなかった。この結果を確認するために、ｔｏｓ３Δｐａｋ１Δ株とｔｏｓ３Δｅｌｍ１Δ株を交配し、四分子分析を実施した。１３の四分子に由来する１４の三重変異分離個体は、グリセロール／エタノール及びラフィノース上での増殖に欠陥を示した（図１Ｂ）。インベルターゼ活性の検定で、ＳＵＣ２発現が消失することが示された（抑制解除した野生型細胞で９５Ｕ、並びにｓｎｆ１Δ細胞及び三重変異細胞で＜１Ｕ）。三重変異体はまた、グリコーゲン蓄積の欠損、他のｓｎｆ１Δ変異体の表現型を示した。これらの遺伝学的な知見は、Ｔｏｓ３ｐ、Ｐａｋ１ｐ、及びＥｌｍ１ｐによって重複してもたらされる機能がｉｎ  ｖｉｖｏでのＳｎｆ１キナーゼの機能に必要であるという見地を支持するものである。
【実施例３】
【０１８７】
上流キナーゼによるＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）の活性化
これら３種のキナーゼがＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）を活性化するかどうかを決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのキナーゼ検定を使用した。ＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐを発現している野生型細胞及び三重変異細胞から、タンパク質抽出物を調製した。ＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐを抗ＬｅｘＡで免疫沈降し、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でインキュベートした。野生型の抽出物から免疫沈降したとき、ＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐはｉｎ  ｖｉｔｒｏでリン酸化され、触媒として不活性なＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１Ｋ８４Ｒ及びＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１Ｔ２１０Ａ（それぞれ、ＡＴＰ結合部位のリシン及び活性化ループのスレオニンが置換されている）の対照から、Ｓｎｆ１キナーゼ活性が原因であることが確認された。対照的に、三重変異体からＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐを沈降したとき、タンパク質レベルは同等にもかかわらず（図２Ｂ）、リン酸化は検出されなかった（図２Ａ）。
【実施例４】
【０１８８】
ＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）活性の検定
ＳＡＭＳ合成ペプチド基質［Woods, 1994  ＃５０７；Davies, 1989  ＃５２６］のリン酸化によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）の触媒活性についても検定した。キナーゼを活性化する条件下で細胞抽出物からＳｎｆ１を部分精製し［Wilson, 1996  ＃４６３；Woods, 1994  ＃５０７］、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でＳＡＭＳペプチドとともにインキュベートした。ペプチドは、野生型の検定ではリン酸化されたが、ｓｎｆ１Δの抽出物ではリン酸化されなかった。ｔｏｓ３Δｐａｋ１Δｅｌｍ１Δ変異体では活性は検出されなかった（図２Ｃ）；イムノブロット分析によってＳｎｆ１ｐが存在することが確認された（図２Ｄ）。これらの結果から、Ｓｎｆ１が、Ｔｏｓ３ｐ、Ｐａｋ１ｐやＥｌｍ１ｐなどの上流キナーゼの不在下では不活性のままであることが示唆される。
【実施例５】
【０１８９】
上流キナーゼによるＡＭＰＫ（Ｓｎｆ１）の活性化
これら３種のキナーゼがＳｎｆ１ｐを直接リン酸化することを実証するために、基質として、Ｓｎｆ１ＫＤ−Ｋ８４Ｒと名付けた不活性型の単離Ｓｎｆ１触媒ドメインを使用した（図３）。ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐ、ＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐ及びＧＳＴ−Ｅｌｍ１ｐを酵母から精製し、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、細菌で発現させたＳｎｆ１ＫＤ−Ｋ８４Ｒとともにインキュベートした。ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐ及びＧＳＴ−Ｅｌｍ１ｐ及びＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐは、Ｓｎｆ１ＫＤ−Ｋ８４Ｒをリン酸化した。おそらく、最小限の量の全長融合タンパク質しか回収されなかったので、ＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐは基質を弱くリン酸化した。無関係なＧＳＴ−キナーゼであるＹＰＬ１４１Ｃとのインキュベーションから、Ｓｎｆ１ＫＤ−Ｋ８４Ｒが自己リン酸化しないことを確認した。
【０１９０】
Ｔｏｓ３ｐ及びＥｌｍ１ｐが活性化ループのスレオニンをリン酸化することを実証するために、Ｔ２１０を欠如する変異基質のＳｎｆ１ＫＤ−Ｔ２１０Ａを使用した。リン酸化は検出されなかった（図３）。
【実施例６】
【０１９１】
上流キナーゼによるＡＭＰＫ（哺乳動物）の活性化
次に、精製した酵母ＧＳＴ−キナーゼが、哺乳動物ＡＭＰＫをリン酸化及び活性化できることを実証する。細菌中で発現させた組換えＡＭＰＫ（α１β１γ１）（Neumann, 2003）を各キナーゼ及びＭｇＡＴＰとともにインキュベートし、ＳＡＭＳペプチド検定を用いてＡＭＰＫ活性を決定した。
【０１９２】
ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐとともにインキュベートすると、ＡＭＰＫ活性は著明に上昇したが、ＧＳＴ−Ｅｌｍ１ｐ及びＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐでは、少ししか上昇しなかった（図４Ａ）。
【０１９３】
ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐは、触媒として不活性な型のＡＭＰＫのαサブユニットをリン酸化したが、β又はγサブユニットをリン酸化しなかった（図４Ｂ）。イムノブロット分析から、ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐがＴ１７２上でＡＭＰＫをリン酸化することが明らかとなった（図４Ｃ）。これらの知見は、酵母と哺乳動物の間で上流キナーゼが機能的に保存されていることを示唆するものである。
【実施例７】
【０１９４】
上流キナーゼ（哺乳動物）によるＡＭＰＫ（哺乳動物）の活性化
Ｔｏｓ３ｐ、Ｐａｋ１ｐ及びＥｌｍ１ｐは、哺乳動物Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼ（ＣａＭＫＫ）と最も密接に関連するが、それらは、酵母のＣａＭＫの群から分岐している可能性がある。哺乳動物のＣａＭＫＫは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＭＰＫを弱くリン酸化し活性化するが、主要なＡＭＰＫキナーゼ（ＡＭＰＫＫ）は、ＣａＭＫＫと異なるものである。
【０１９５】
本明細書で開示されるように、これらの知見から、ＡＭＰＫＫは、他の（複数可の）ＣａＭＫ関連キナーゼに相当することが確認される。少なくとも１つの主要なＡＭＰＫＫは、ＬＫＢ１（ＳＴＫ１１）腫瘍抑制キナーゼであり、これはポイツ−ジェガーズ症候群において突然変異が認められる。
【０１９６】
ＦＬＡＧタグ付きＬＫＢ１（全長野生型であるＷＴ、又は触媒として不活性な変異体（Ｄ１９４Ａ）；フラッグタグ付きｐＣＤＮＡ３ベクター中のマウスｃＤＮＡ）を、ＣＯＳ７細胞溶解液から、ＦＬＡＧアフィニティーゲル（Sigma）に結合させることによって精製した。細菌で発現させたＡＭＰＫをビーズとともにインキュベートし、ＡＭＰＫ活性を測定した。
【０１９７】
細菌で発現させたＡＭＰＫ（α１β１γ１（Neumann, 2003））を、ＭｇＡＴＰ、及びＦＬＡＧアフィニティーゲルと結合させたＦＬＡＧ−ＬＫＢ１キナーゼとともに、３０℃で３０分間インキュベートした。他の態様では、本発明は振盪インキュベーターに関する。
【０１９８】
具体的には、ＡＭＰＫの緩衝液の条件は、ＦＬＡＧ−ＬＫＢ１ゲルを加えた時点で、終濃度で１００μＭのＡＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０％のグリセロール、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴに調整する。
【０１９９】
遠心して樹脂を除去した後、ＳＡＭＳペプチド検定（Davies, 1989）を用いて、上清中のＡＭＰＫ活性を測定した。
【０２００】
哺乳動物細胞中で発現したＬＫＢ１は、Ｔ１７２をリン酸化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組換えＡＭＰＫを活性化した（図４Ｄ）。
【０２０１】
Ｔ１７２のリン酸化は、イムノブロット法によって決定した（図４Ｅ）。
【０２０２】
したがって、ＬＫＢ１がＡＭＰＫをリン酸化し活性化することが実証される。
【実施例８】
【０２０３】
真核生物細胞におけるＬＫＢ１の発現
ポリメラーゼ連鎖反応に基づく戦略を用いて、ＩＭＡＧＥコンソーシアムから得た全長マウスＬＫＢ１（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡ５４２１５３、ＩＭＡＧＥ番号５５０３５５）をコードする発現配列タグを鋳型として使用した、マウスＬＫＢ１をコードするＮ末端ＦＬＡＧエピトープタグ付きｃＤＮＡ構築物を調製した。５９−プライマー：atgcatactagtgccaccatggactactacaaggacgacgatgacaaggacgtggcggaccccgagccgttgggと３９−プライマー：gacagaactagttcactgctgcttgcaggccgagaを使用して、この構築物を得た。
【０２０４】
ＬＫＢ１（ＫＤ）（ＫＤはキナーゼ失活体）と名付けたＬＫＢ１の触媒として不活性な変異体を調製するために、そのキナーゼドメインのサブドメインＶＩＩ中のＡｓｐ１９４を、Ａｌａへと突然変異させた。
【０２０５】
当然ながら、ＬＫＢ１の哺乳動物相同体などのどんな相同体も、ヒトＬＫＢ１など、マウスの代わりに使用することができる。同様に、フラッグエピトープタグを付けて又は付けずにＬＫＢ１を発現させることもでき、或いは、ｍｙｃ、ＨＡ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼや他のタグなど代替のタグを付けて発現させることもできる。
【０２０６】
哺乳動物細胞におけるＬＫＢ１の発現
哺乳動物細胞におけるＦＬＡＧ−ＬＫＢ１の発現をコードするように、得られたポリメラーゼ連鎖反応断片を、ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片として、ｐＣＤＮＡ３ベクター（Invitrogen）中にサブクローン化した。
【０２０７】
酵母におけるＬＫＢ１の発現
マウスＬＫＢ１（ｍｙｃエピトープタグを含む）を、酵母発現ベクターｐＹＸ２１２（R and D Systems）中にサブクローン化し、酵母で発現させた。
【実施例９】
【０２０８】
ＡＭＰＫのリン酸化及び検定
以前に記載されているように、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen）を用いたクロマトグラフィーによって、細菌で発現させたＡＭＰＫ（α１β１γ１）を精製した（その精製は、参照により本明細書に組み込まれる、Neumann et al., 2003 Protein Expression and Purificationの通りである）。ＡＭＰＫを、上流キナーゼの存在下又は不在下で、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４中の、１００μＭのＡＴＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのＡＭＰ及び１ｍＭのＤＴＴとともに、３０℃で３０分間インキュベートした。短時間遠心した後、ＡＭＰＫを含む上清を移し、ＳＡＭＳペプチド検定（Davies et a.l., 1989）を用いて活性を測定した。Ｔ１７２のリン酸化は、ＡＭＰＫのαサブユニット内のリン酸化スレオニン１７２を特異的に認識する抗体（Cell Signaling Technologies）を用いたウェスタンブロット法によって決定した。
【０２０９】
３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、上流キナーゼの存在下又は不在下で触媒として不活性な型のＡＭＰＫ（αサブユニット内に突然変異Ｄ１５７Ａを有する）をインキュベートすることによって、ＡＭＰＫの３２Ｐ−リン酸標識化を分析した。この実施例では、上流キナーゼはＬＫＢ１である。
【０２１０】
ＬＫＢ１の発現
ＦＬＡＧタグ付き野生型ＬＫＢ１（マウス）、又はＦＬＡＧタグ付きの、触媒として不活性なＬＫＢ１（Ｄ１９４Ａ突然変異を有する）をコードするプラスミドＤＮＡを、リポフェクタミン試薬を用いてＣＯＳ７細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に細胞を収集し、EZview Red M2 FLAGアフィニティーゲル（Sigma）でＬＫＢ１タンパク質を免疫沈降させ、ＡＭＰＫとともにインキュベートする際などに必要に応じて使用した。
【０２１１】
上清中のＡＭＰＫをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、その後オートラジオグラフィーを行った。
【０２１２】
この上記明細書中で言及した刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法及び系の様々な変更形態及び変形形態は、本発明の範囲及び趣旨を逸脱することなく当業者なら明らかであろう。特定の好ましい実施形態と関連させて本発明を説明したが、請求に係る本発明が、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるはずである。実際、生化学、分子生物学／遺伝学及びバイオテクノロジー又は関連分野の技術者には明らかである、本発明を実施する記載された形態の様々な変更形態は、添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１Ａ】過剰発現を示す図である。（Ａ）Ｔｏｓ３ｐ、Ｐａｋ１ｐ、及びＥｌｍ１ｐの過剰発現は、レポーター検定においてＳｎｆ１の機能を刺激する。株ＴＡＴ７（ｕｒａ３：：ｌｅｘＡｏｐ−ｌａｃＺ）の形質転換体は、ＧＳＴを、或いはＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐ、ＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐ又はＧＳＴ−Ｅｌｍ１ｐを、銅誘導性プロモーター（それぞれpRH95、pRH98、pRH94、ライブラリー（Martzen, 1999）及びＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐ（ｐＯＶ８（Vincent, 2001））から精製）から発現した。レポーターからのβ−ガラクトシダーゼの合成は、ＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐの活性に依存していた（Kuchin, 2000）。形質転換体（ｎ＝３）を、選択的な合成完全（ＳＣ）培地＋２％グルコース中で対数期の中間部まで増殖させ、０．５ｍＭのＣｕＳＯ４及び２％グルコース（輪郭のみの棒）又は０．０５％グルコース（黒い棒）を含む培地に移して３時間置き、β−ガラクトシダーゼ活性について検定した（Kuchin, 2000）。各ＧＳＴ−キナーゼとともにＬｅｘＡを発現する対照の形質転換体は、＜０．３Ｕの値を示した。
【図１Ｂ】変異表現型を示す図である。（Ｂ）三重のｔｏｓ３Δｐａｋ１Δｅｌｍ１Δ変異体は、増殖の欠陥を示す。Ｗ３０３、ＭＣＹ５１１７（ＭＡＴα  ｔｏｓ３Δ：：ＫａｎＭＸ４  ｐａｋ１Δ：：ＫａｎＭＸ４  ｕｒａ３）及びＭＣＹ５１２２（ＭＡＴａ  ｔｏｓ３Δ：：ＫａｎＭＸ４  ｅｌｍ１Δ：：ＵＲＡ３  ｕｒａ３）に由来する二重変異体を交配し、四分子分析を行った。分離個体を富栄養培地からＳＣ−Ｕｒａ＋２％グルコース及びＳＣ＋２％グリセロール／３％エタノールに移して複製させた。５つの四分子を示す。ＳＣ＋２％ラフィンノース＋アンチマイシンＡ（１μｇ／ｍｌ）上で同じ増殖パターンが観察された。星印は、三重変異分離個体を示す；ゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析によって遺伝子型を決定した。対照株：野生型（ＷＴ）；ｓｎｆ１Δ変異体；親二重変異体。
【図２】Ｓｎｆ１キナーゼ活性の検定を示す図である。（Ａ、Ｂ）ＬｅｘＡ−Ｓｎｆ１ｐ又はそのＴ２１０Ａ及びＫ８４Ｒ変異誘導体（pRJ55、pRJ217、及びpRJ215（Jiang, 1996））を発現する野生型細胞及び三重変異細胞を、選択的ＳＣ＋２％グルコース中で増殖させた。抽出物（２００μｇ）から抗ＬｅｘＡでタンパク質を免疫沈降させた。免疫沈降物を、（Ａ）γ−３２Ｐ−ＡＴＰを含むキナーゼ緩衝液中でインキュベートし、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで分析し、また（Ｂ）抗ＬｅｘＡを用いたイムノブロット法によって分析した。（Ｃ、Ｄ）富栄養培地中で増殖させた細胞から、二連で抽出物を調製した。ＤＥＡＥセファロース上でのクロマトグラフィーによってＳｎｆ１キナーゼを部分精製し、ピーク分画を貯留し、濃縮した。貯留した分画を、（Ｃ）γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、ＳＡＭＳペプチド（ＨＭＲＳＡＭＳＧＬＨＬＶＫＲＲ）のリン酸化について三連で検定し（Woods, 1994；Davies, 1989）、また（Ｄ）抗Ｓｎｆ１を用いてイムノブロットした。Ｓｎｆ１−Ｋ８４Ｒ変異体の抽出物からも、活性は示されなかった。
【図３】Ｔｏｓ３ｐ及びＥｌｍ１ｐが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴ２１０上でＳｎｆ１ｐをリン酸化することを示す図である。pRH89及びpRH90というpET32c（Novagen）の誘導体から、Ｈｉｓタグ付きのＳｎｆ１ＫＤ−Ｋ８４Ｒ及びＳｎｆ１ＫＤ−Ｔ２１０Ａを細菌で発現させ、TALON樹脂（Clontech）上でのコバルトアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐ（Martzen, 1999）、ＧＳＴ−Ｐａｋ１ｐ（Martzen, 1999）及びＧＳＴ−Ｅｌｍ１ｐ（Zhu, 2000）を発現している酵母細胞から抽出物を調製し、ＧＳＴ−キナーゼをグルタチオンセファロース上で精製した。固定化したＧＳＴ−キナーゼを、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、示したＳｎｆ１ＫＤ変異タンパク質（０．２μｇ）とともに又は基質を入れずに２５℃で２０分間インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってタンパク質を分離した。オートラジオグラムを示す。任意のＧＳＴ−キナーゼであるＹＰＬ１４１Ｃを対照として使用した。矢印、Ｓｎｆ１ＫＤ。星印、自己リン酸化全長ＧＳＴ−キナーゼ。分子サイズマーカー（ｋＤａ）を示す。
【図４】Ｔｏｓ３ｐ及びＬＫＢ１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＭＰＫをリン酸化し活性化することを示す図である。（Ａ）細菌で発現させたＡＭＰＫ（α１β１γ１（Neumann, 2003））を、ＭｇＡＴＰ、及びグルタチオンセファロースと結合したＧＳＴ−キナーゼとともに３０℃で３０分間インキュベートした。遠心して樹脂を除去した後、ＳＡＭＳペプチド検定（Davies, 1989）を用いて上清中のＡＭＰＫ活性を測定した。（Ｂ）αサブユニット中にＤ１５７Ａの突然変異を有する、触媒として不活性な型のＡＭＰＫ（Stein, 2000）（２μｇ）を、γ−３２Ｐ−ＡＴＰの存在下で、グルタチオンセファロースビーズと結合したＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐ又はＧＳＴとともに３０℃で３０分間インキュベートした。遠心によってビーズを除去した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーで上清中のタンパク質を分析した。分子サイズマーカー（ｋＤａ）を示す。（Ｃ）細菌で発現させたＡＭＰＫ（０．１５μｇ）を、ＧＳＴ−Ｔｏｓ３ｐによってリン酸化して、抗リン酸化スレオニン１７２特異的抗体（Cell Signalling Technologies）を用いたイムノブロット法によって分析した。ＡＭＰＫはまた、ＧＳＴ又は部分精製したラット肝ＡＭＰＫＫ（Hawley, 1996）とともにインキュベートした。（Ｄ）ＣＯＳ７細胞溶解液から、ＦＬＡＧアフィニティーゲル（Sigma）と結合させることによって、ＦＬＡＧタグ付きＬＫＢ１（野生型（ＷＴ）、又は触媒として不活性な変異体（Ｄ１９４Ａ））を精製した。細菌で発現させたＡＭＰＫをビーズとともにインキュベートし、（Ａ）と同様にＡＭＰＫ活性を測定した。イムノブロット法によって、Ｔ１７２のリン酸化を決定した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2007520199.tif 000003
【図２】
2007520199.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月23日(2007.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＫＢ１の活性を検定する方法であって、
（ｉ）ＬＫＢ１を含む試料を供給するステップと、
（ｉｉ）リン酸化を許容する条件下で前記試料を基質キナーゼと接触させるステップと、
（ｉｉｉ）前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みをモニターするステップとを含み、
前記基質キナーゼへのリン酸の取り込みがＬＫＢ１活性を示す方法。
【請求項２】
基質キナーゼがＡＭＰＫである又はＡＭＰＫに由来する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＡＭＰＫがヘテロ三量体ＡＭＰＫを含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＡＭＰＫが、マウス又はヒトＡＭＰＫを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ＡＭＰＫの活性を検定することによってＡＭＰＫへのリン酸の取り込みをモニターする、請求項２〜４のいずれか記載の方法。
【請求項６】
ＳＡＭＳペプチドのリン酸化を介して、ＡＭＰＫの活性を検定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＡＭＰＫのＴ−１７２又はその等価物のリン酸化を検定することによってＡＭＰＫへのリン酸の取り込みをモニターする、請求項２〜４のいずれか記載の方法。
【請求項８】
ＡＭＰＫ１モル当たりに取り込まれるリン酸の量を定量するステップをさらに含み、リン酸レベルが試料に存在するＬＫＢ１のレベルを示す、請求項２〜４のいずれか記載の方法。
【請求項９】
組換え又は単離ＬＫＢ１を含むＡＭＰＫの活性化剤。
【請求項１０】
組換え又は単離ＬＫＢ１を含むＡＭＰＫＫ。
【請求項１１】
組換え又は単離ＬＫＢ１を含むＡＭＰＫのリン酸化剤。
【請求項１２】
ＡＭＰＫを含むポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療薬剤。
【請求項１３】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項１２記載のポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療薬剤。
【請求項１４】
ＡＭＰＫを含む肥満の予防又は治療薬剤。
【請求項１５】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項１４記載の肥満の予防又は治療薬剤。
【請求項１６】
ＡＭＰＫを含む糖尿病の予防又は治療薬剤。
【請求項１７】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項１６記載の糖尿病の予防又は治療薬剤。
【請求項１８】
ＡＭＰＫを含む肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療薬剤。
【請求項１９】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項１８記載の肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療薬剤。
【請求項２０】
ＬＫＢ１を含むポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療薬剤。
【請求項２１】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項２０記載のポイツ−ジェガーズ症候群（ＰＪＳ）の予防又は治療薬剤。
【請求項２２】
ＬＫＢ１を含む肥満の予防又は治療薬剤。
【請求項２３】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項２２記載の肥満の予防又は治療薬剤。
【請求項２４】
ＬＫＢ１を含む糖尿病の予防又は治療薬剤。
【請求項２５】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項２４記載の糖尿病の予防又は治療薬剤。
【請求項２６】
ＬＫＢ１を含む肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療薬剤。
【請求項２７】
さらにＨＳＰ９０、Ｃｄｃ３７又はＳＴＲＡＤタンパク質を含む請求項２６記載の肥大型心筋症（ＨＣＭ）の予防又は治療薬剤。
【請求項２８】
ＬＫＢ１の（複数可の）調節因子を同定する方法であって、
（ｉ）ＬＫＢ１の第１と第２の試料を供給するステップと、
（ｉｉ）前記第１の試料をＬＫＢ１の候補調節因子と接触させるステップと、
（ｉｉｉ）リン酸化を許容する条件下で前記第１と第２の試料を基質と接触させるステップと、
（ｉｖ）前記基質へのリン酸の取り込みをモニターし、前記第１と第２の試料における前記基質へのリン酸の取り込みを比較するステップとを含み、
前記基質へのリン酸の取り込みが前記第１と第２の試料の間で異なる場合、前記候補調節因子が、ＬＫＢ１活性の調節因子として同定される方法。
【請求項２９】
基質が基質キナーゼである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
基質キナーゼが、ＡＭＰＫである又はＡＭＰＫに由来する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
Ｐａｋ１、Ｔｏｓ３及びＥｌｍ１のうち少なくとも２つにおける遺伝子破壊を含む組換え酵母細胞。
【国際調査報告】
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