(57)【要約】  核酸レポーターおよびその利用の方法を提供する。核酸レポーターには、細胞膜を介した核酸レポーターの移行を促進するためのタンパク質形質導入ドメインで修飾された分子ビーコンが含まれる。核酸レポーターはまた場合により、特定の細胞、組織、器官、細胞内領域、オルガネラまたは小胞に核酸レポーターを指向するための標的化シグナルで修飾されていてもよい。
2007525967.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質形質導入ドメインに、作動可能に連結した分子ビーコン。
【請求項２】
ステム−および−ループ構造、または直鎖構造を持つ、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項３】
前記タンパク質形質導入ドメインが、分子ビーコンに直接的または間接的に連結されている、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項４】
前記タンパク質形質導入ドメインが、ジスルフィド連結、チオール−マレイミド連結、またはストレプトアビジン−アビジン連結によって直接的または間接的に分子ビーコンに連結されている、請求項３に記載の分子ビーコン。
【請求項５】
前記タンパク質形質導入ドメインがリンカーによって分子ビーコンに連結されている、請求項２に記載の分子ビーコン。
【請求項６】
前記リンカーがＣ1-12アルキル基を含む、請求項５に記載の分子ビーコン。
【請求項７】
前記タンパク質形質導入ドメインが、ジスルフィド連結、チオール−マレイミド連結、またはストレプトアビジン−アビジン連結によってリンカーに連結されている、請求項５に記載の分子ビーコン。
【請求項８】
前記リンカーが分子ビーコンに共有結合している、請求項５に記載の分子ビーコン。
【請求項９】
前記リンカーが分子ビーコンの修飾ヌクレオチドに共有結合している、請求項８に記載の分子ビーコン。
【請求項１０】
前記修飾ヌクレオチドが、標的核酸に相補的ではない分子ビーコンの領域内にある、請求項９に記載の分子ビーコン。
【請求項１１】
前記修飾ヌクレオチドが分子ビーコンのステム内にある、請求項９に記載の分子ビーコン。
【請求項１２】
前記修飾ヌクレオチドが、分子ビーコンの末端から約１〜約６ヌクレオチド内にある、請求項１１に記載の分子ビーコン。
【請求項１３】
前記分子ビーコンが、細胞内条件に暴露された時にタンパク質形質導入ドメインより放出される、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項１４】
前記連結が、酵素によって非特異的に開裂される、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項１５】
さらに標的化配列を含む、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項１６】
前記標的化配列が、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体局在化シグナル、または膜局在化シグナルからなる群から選択される、請求項１５に記載の分子ビーコン。
【請求項１７】
前記タンパク質形質導入ドメインが、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）；ＰＴＤ−５−ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４）；トランスポータンＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号５）；ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号６）；およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号７）を含む、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項１８】
前記タンパク質形質導入ドメインが、タンパク質形質導入ドメインのＣ−末端システイン残基で前記分子ビーコンに連結している、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項１９】
タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコン、および薬理学的に許容可能な賦形剤を含む、薬理学的組成物。
【請求項２０】
標的化シグナルに作動可能に連結した分子ビーコンを含む、核酸レポーター。
【請求項２１】
標的化シグナルが、ＣＧＧＧＰＫＫＫＲＫＶＥＤを含む、請求項２０に記載の核酸レポーター。
【請求項２２】
Ｃ−末端システイン残基を含む、タンパク質形質導入ドメイン。
【請求項２３】
配列番号３０を含む、請求項２２に記載のタンパク質形質導入ドメイン。
【請求項２４】
（ａ）第一末端領域がそれに結合した検出可能な標識を持ち、第二末端領域がそれに結合した消光剤を含む第一および第二末端領域、
（ｂ）標的核酸と相補的な、第一および第二末端領域間の中間領域、および
（ｃ）第一または第二末端領域に作動可能に連結したタンパク質形質導入ドメイン、
を含む組成物であって、検出可能標識の検出可能性が、中間領域が標的核酸に結合すると変化する、組成物。
【請求項２５】
あらかじめ選択された標的認識配列を含む、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコンと、前記あらかじめ選択された標的認識配列を検出するために前記分子ビーコンを用いるための説明書とを含むキット。
【請求項２６】
（ａ）標的核酸を発現していると疑われる細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結し、標的核酸に相補的な領域を含む、分子ビーコンと接触させる工程
（ｂ）分子ビーコンを、励起量の電磁放射線で照射する工程、および
（ｃ）分子ビーコンによって放射された電磁放射線を検出する工程であって、分子ビーコンによって放射された検出可能な量の電磁放射線が細胞が標的核酸を発現することを示す工程、
を含む、標的核酸を発現している細胞を検出する方法。
【請求項２７】
（ａ）複数の細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結している、少なくとも１つの分子ビーコンと接触させる工程であって、前記タンパク質形質導入ドメインは複数の細胞の少なくとも１つの内部への少なくとも１つの分子ビーコンの移行を促進し、分子ビーコンは標的核酸と相補的な領域を含む工程、
（ｂ）複数の細胞を励起量の電磁気エネルギーで照射する工程、
（ｃ）少なくとも前記複数の細胞の少なくとも１つの内部の分子ビーコンから励起量の電磁放射に応答して放射される電磁気エネルギー、を検出する工程、
（ｄ）電磁放射の検出可能な量を放射していない細胞から、検出可能な量の電磁放射を放射している分子ビーコンを含む細胞を分離する工程、
を含む、標的核酸を発現している細胞をより分ける方法。
【請求項２８】
（ａ）ホストに、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコンを投与する工程、
（ｂ）分子ビーコンを励起量の電磁放射線で照射する工程、および
（ｃ）励起量の電磁放射に応答して分子ビーコンによって放射された電磁放射線、を検出する工程、
を含む、ホスト中の標的核酸を検出する方法。
【請求項２９】
（ａ）細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結している分子ビーコンに接触させる工程であって、前記分子ビーコンが標的核酸に特異的である工程、
（ｂ）分子ビーコンを励起量の電磁放射線で照射する工程、および
（ｃ）分子ビーコンからの電磁放射の放射を検出する工程であって、分子ビーコンからの検出可能な放射が細胞内における標的核酸の発現を示す工程、
を含む、生細胞中の標的核酸の発現を検出する方法。
【請求項３０】
（ａ）細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結している分子ビーコンに接触させる工程であって、前記分子ビーコンが標的核酸に特異的である工程、
（ｂ）分子ビーコンを、励起量の電磁放射線で照射する工程、および
（ｃ）分子ビーコンからの電磁放射の放射を検出する工程であって、分子ビーコンからの検出可能な放射が標的核酸の発現を示す工程、
を含む、生細胞中の標的核酸の発現を検出する方法。
【請求項３１】
（ａ）細胞を試験化合物に接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、タンパク質形質導入ドメイン、標的化シグナル、またはその組み合わせに作動可能に連結している核酸レポーターと接触させる工程であって、前記核酸レポーターが、遺伝子の転写物に相補的な領域を含む工程、
（ｃ）励起量の放射線で前記細胞を照射する工程、
（ｄ）細胞からの電磁放射を検出する工程、
（ｅ）対照試料と比較した場合の、試験化合物と接触した細胞の電磁気放射における変化を誘導する試験化合物を選択する工程、
を含む、遺伝子発現のモジュレーターを同定する方法。
【請求項３２】
（ａ）ホスト細胞の試料を、標的核酸の発現を調節すると疑われる試薬と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコンと接触させる工程であって、前記分子ビーコンが標的核酸に相補的な標的認識配列を含む工程、
（ｃ）工程（ｂ）の細胞を励起量の放射線で照射する工程、
（ｄ）励起量の放射に応答して放射された、工程（ｃ）の細胞からの電磁放射を検出する工程、
（ｅ）工程（ｄ）の細胞からの放射を対照試料からの放射と比較する工程であって、工程（ｄ）の細胞の放射の対照試料からの差が、試薬がホスト内の標的核酸の発現を調節することを示す工程、
を含む、ホストにおける試薬の有効性を決定する方法。
【請求項３３】
細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結しており、場合により標的化シグナルに作動可能に連結している分子ビーコンと接触させることを含む、細胞の内部へ分子ビーコンを送達するための方法であって、前記タンパク質形質導入ドメインが細胞の内部への分子ビーコンの移行を促進する、細胞の内部へ分子ビーコンを送達するための方法。
【請求項３４】
前記分子ビーコンがペプチド核酸骨格（ＰＮＡ）を含み、タンパク質形質導入ドメインおよびＰＮＡ分子ビーコンの両者が単一組成物内で一緒に合成可能である、請求項１に記載の分子ビーコン。
【請求項３５】
（ａ）標識された標的タンパク質を含む細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコンと接触させる工程であって、前記分子ビーコンが標的核酸に特異的である工程、
（ｂ）励起量の電磁放射線で分子ビーコンを照射する工程、
（ｃ）励起量の電磁放射線で標識された標的タンパク質を照射する工程、
（ｅ）分子ビーコンからの第一波長の電磁放射線の放射と、標識されたタンパク質からの第二波長の電磁放射線の放射を検出する工程であって、分子ビーコンからの検出可能放射が細胞内における標的核酸の発現を示し、同じ空間的位置での標識されたタンパク質からの検出可能な放射が、標的核酸と標的タンパク質との共局在を示す工程、
を含む、生細胞中の核酸−タンパク質複合体の輸送および局在を検出する方法。
【請求項３６】
前記標識されたタンパク質が融合タンパク質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３７】
前記標識されたタンパク質がグリーンフルオレセンスタンパク質である、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連明細書の相互参照）
本明細書は、２００３年６月２５日に申請された、米国仮出願特許明細書第６０／４８２，６４８号の利益および優先権を主張する。
（連邦後援研究または開発に関する記述）
本明細書にて開示された研究の態様は、部分的にＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．ＢＳＥ−０２２２２１１、Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  Ａｇｅｎｃｙに授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．Ｆ４９６２０−０３−０３２０、およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈに授与されたＧｒａｎｔ  Ｎｏ．Ｒ０１  ＧＭ０６０５６２下に支援されたものである。したがって、米国政府は請求された主題に関して一定の権利を有する。
【０００２】
本開示は一般的に分子ビーコン、例えば、一方の末端に蛍光団を、他方の末端に消光剤を有する二重標識オリゴヌクレオチドプローブ、特に膜を通過するように修飾された分子ビーコンに関する。
【背景技術】
【０００３】
リアルタイムＰＣＲおよびマイクロアレイ解析のような、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子発現を測定するための定量的方法は、分子生物学および薬物開発に革命をもたらしてきた。しかしながら、これらの手法は、一般的に、細胞溶解物からの精製ＤＮＡまたはＲＮＡとともに使用されている。リアルタイムに生細胞および組織内の特異的な内因性ｍＲＮＡの発現を検出し定量できることは、生物学的研究および疾患研究に大きな機会を与え、薬物発見および医学的診断に意義ある衝撃を与えるであろう。しかしながら、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）のような無傷細胞内での遺伝子検出のための現在利用可能な技術は、ＩＳＨ研究が固定細胞の利用およびバックグラウンドシグナルを減少させるための未結合プローブの洗浄に依存しているため、ｉｎ  ｖｉｖｏまたは生細胞中では使用できない（Ｆｅｍｉｎｏ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０，５８５−５９０、Ｌｅｖｓｋｙ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７、８３６−８４０）。生細胞内で遺伝子検出を行うために、プローブは高い特異性で標的を認識し、標的認識を高シグナル対バックグラウンド比で直接的に測定可能なシグナルに変換し、実際と擬陽性事象間の差別化を可能に出来るものでなければならない（Ｍｏｌｅｎａａｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９，Ｅ８９−９）。プローブはまた、高い効率で生細胞内に送達されなければならない。
【０００４】
生細胞遺伝子検出および定量化に関して現在開発されている技術の中で、もっとも見込みがあるものはおそらく、分子ビーコンである。分子ビーコンは、一方の末端で蛍光団を、他方の末端で消光剤を持つ、二重標識アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）プローブである（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，３０３−３０８；Ｔｙａｇｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，４９−５３）。蛍光標識直鎖ＯＤＮプローブとは対照的に、分子ビーコンは相補的標的がない状態でステム−ループ（ヘアピン）構造を形成して、蛍光団の蛍光が消光されるように設計されている。標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションによりヘアピンが開き、消光剤からレポーターが物理的に分離し、これにより励起時に蛍光シグナルを放射することが可能になる。したがって、分子ビーコンは、遊離プローブを洗浄することを必要とせずに、バックグラウンドが低い均質アッセイフォーマットを可能にする。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏにてｍＲＮＡを検出するためには高い効率および速い速度で分子ビーコンを生細胞に送達する必要がある。従来の送達手法は、リポソームまたはデンドリマー類を利用するもののように、ＤＮＡトランスフェクション技術に基づいている。これらの手法は、効率的ではなく（＜８０％）（Ｂａｒｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００２）「低分子干渉ＲＮＡの、初代細胞へのレトロウイルス送達（Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎｔｏ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌｓ．）」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１４９４３−１４９４５）、遅く（送達時間〜４時間）、エンドソーム中で分子ビーコンをトラップし、リポソーム中で分解してバックグラウンドシグナルを有意に増加させるおそれがある（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１２，９０６−９１０）。また、送達時間が長いためにヌクレアーゼによる細胞質分子ビーコンの有意な分解を引き起こし、さらに擬陽性検出を増加させる（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，１０１３−１０１７）。ストレプトリシンＯ（ＳＬＯ）を用いる可逆的膜透過化法はより速く（〜２時間）、エンドサイトーシスに基づいてはいないが（Ｆａｒｉａ，Ｍ．（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９，４０−４４）、ｅｘ−ｖｉｖｏ細胞アッセイでのみ使用可能である。さらに、この可逆的透過化法は、典型的には培地中の血清／他の増殖因子の除去を１０〜１５分間必要とするが、これは細胞内のシグナルカスケードを誘引し、結果として遺伝子発現を変える可能性がある。マイクロインジェクション（Ｓｏｋｏｌ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１１５３８−１１５４３）およびエレクトロポレーション（Ｙｉｎ，Ｄ．，Ｔａｎｇ，Ｊ．Ｇ．（２００１）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９５，１６−２０）のような、その他の送達方法は侵襲的であり、細胞に重度の傷害を引き起こしうる。さらに、マ���クロインジェクションは手間がかかり、少数の細胞の研究の際にのみ実用的である。
【非特許文献１】チャギ  エス  クレイマー  エフ  アール（１９９６）  ナショナルバイオテクノロジー１４巻３０３−３０８項（Ｔｙａｇｉ，Ｓ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，３０３−３０８）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の態様によって、高いシグナル対バックグラウンド比で標的核酸を検出する、リアルタイムイメージングする、および／または定量するための組成物および方法が提供される。１つの態様では、生細胞中の標的核酸を非侵襲的に検出または定量することが可能な組成物が提供される。マイクロインジェクションまたは膜の穿孔のような侵襲的送達技術を避けるために、核酸レポーターを膜を通過するように修飾することが可能であることが発見された。例えば、本開示によって、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結された分子ビーコンを含む（ただしこれに限定されない）、修飾核酸レポーターが提供される。他の態様において、タンパク質形質導入ドメインに連結された核酸レポーターを、例えば核酸局在化シグナルを含む、標的化シグナルに作動可能に連結されるように、さらに修飾することができる。開示された組成物のいくつかの実施形態は、いかなる他の送達試薬を必要とすることなしに、生細胞内に迅速かつ効果的に侵入して特定の膜結合オルガネラに入るか、または特定の細胞内領域へ局在化することが可能である。
【０００６】
ある特定の態様においては、ほぼ１００％の効率、迅速（〜３０分）な送達速度、および細胞質中に局在する能力で、生細胞内に侵入可能な多機能性プローブを提供する、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）ペプチドＴＡＴ−１につながれた分子ビーコンが提供される。さらに、本開示の核酸レポーターは、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果と比較して、生細胞内でのｍＲＮＡ検出に関して、（よりよいシグナル対バックグラウンド比で）よく機能する。この核酸レポーター設計によって、リアルタイムで生細胞および組織中の遺伝子発現を迅速に検出するための、高い特異性と感度を有する強力な方法が提供される。
【０００７】
他の態様では、ストレプトアビジン−ビオチン連結を有する核酸レポーターが提供される。核酸レポーターでは、ステムの消光剤アーム中に、例えば、ビオチン−ｄＴのような修飾ヌクレオチドが含まれる。ビオチン部位は、例えばアルキルリンカーのようなリンカーを介して、修飾ヌクレオチドに連結可能である。４つのビオチン−結合部位を持つ、ストレプトアビジン分子を介して、ビオチン−修飾ＰＴＤはビオチン修飾核酸レポーターに連結する。
【０００８】
他の態様においては、本開示の核酸レポーターはチオール−マレイミド連結を含み、そこでは核酸レポーターがチオール基を加えることによって修飾されて、これがＰＴＤのＣ末端に位置したマレイミド基と反応して直接の、安定な連結を形成できる。
【０００９】
また他の態様においては、開裂可能なジスルフィド橋を有する、ＰＴＤまたは標的化シグナルに連結した核酸レポーターが提供される。ＰＴＤは、チオール−修飾核酸レポーターとジスルフィド橋を形成するシステイン残基をＣ末端に加えることで、修飾可能である。このジスルフィド橋設計のため、細胞質の還元的環境によって、ＰＴＤが核酸レポーターから開裂されうる。
【００１０】
他の態様において、例えばＰＮＡプローブの場合、送達ペプチド配列を核酸レポーターに沿って合成可能であり、この場合は送達ペプチドおよび核酸プローブ配列両方が、単一のペプチドを用いて作製可能である。さらに、送達ペプチドおよび核酸プローブ間の連結を、例えば、還元的なジスルフィド橋を用いて、または連結中に酵素的開裂部位を用いることによって、特異的な開裂を可能にするように仕立てることが可能である。
【００１１】
別の設計態様では、送達物質と核酸レポーターとの間接連結が可能になり、例えば、送達媒体それ自身は、リポソーム／ポリマーのような、デンドリマーに基づくかまたは脂質に基づいてよく、またはそれらの任意の組み合わせであって良く、そこでは核酸プローブは送達媒体の内部にパッケージされ、送達ペプチドはそのような構造物の表面に結びつけられている。結びつけられた送達ペプチド（単一または多型）が、特定の器官、組織、細胞型または細胞内成分へのプローブの効率よい送達を可能にしうる。
【００１２】
他の態様は、既存の方法よりも高い特異性およびシグナル対バックグラウンド比で、生細胞中の標的核酸、例えば核ＲＮＡを検出する組成物および方法を提供する。本手法は、部位指向送達能力、例えば毒素に基づく細胞の可逆性透過化と、例えばＮＬＳペプチドのような標的化シグナルを用いるプローブの核特異的送達能力と、分子ビーコンを用いる標的核ＲＮＡの感度良い検出能力を組み合わせる。他の態様には、細胞の特定の領域、例えば細胞核への、プローブのより迅速でより効率的な送達のための、標的化シグナルと細胞透過化ペプチド（例えばＴａｔ、ｐｏｌｙ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ）の両方を持つ核酸レポーターが含まれる。
【００１３】
また他の態様によって、１つまたはそれ以上のホスト細胞を試薬と接触させること、前記細胞をタンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した、標的核酸に対して特異的である分子ビーコンと接触させること、前記細胞を励起量の放射線で照射すること、励起量の放射線に対する応答の電磁気放射を検出すること、および試薬で処理した細胞中の放射を対照試料からの放射と比較すること、によってホスト内の遺伝子発現における試薬の効果を決定するための方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
１．定義
開示された主題の記述およびクレームにおいて、以下の語句は以下で記された定義に従って使用する。
【００１５】
語句「ポリペプチド」には、タンパク質およびその断片が含まれる。ポリペプチドは、本明細書中ではアミノ酸残基配列として開示される。これらの配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への方向で、左から右に記述される。標準の命名に従って、アミノ酸残基配列を以下に示すような３文字コードまたは単一文字コードで表記する。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｃ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
【００１６】
「変種（ｖａｒｉａｎｔ）」は、参照ポリペプチドおよびポリヌクレオチドからは異なるが本質的な特徴は依然有しているポリペプチドまたはポリヌクレオチドを意味する。ポリペプチドの典型的な変種は、他の、参照ポリペプチドとは、アミノ酸配列が異なっている。一般的に、差違は、参照ポリペプチドと変種の配列が、全体として非常に近く、多くの領域で同一であるように制限される。変種および参照ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の改変（例えば、置換、添加および／または欠損）によって、アミノ酸配列で異なりうる。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝的コードによってコードされたものでもよく、そうでなくてもよい。ポリペプチドの変種は、対立遺伝子変種のように、天然に存在しているものでもよく、または天然に存在することが知られていない変種であっても良い。
【００１７】
改変および変化は、開示中のポリペプチドの構造中で実施され得るが、ポリペプチドとして同様の特性を持つ物質が得られる（例えば保存的アミノ酸置換）。例えば、配列中であるアミノ酸は、さほどの活性の欠損はなしに、他のアミノ酸に置換可能である。ポリペプチドの相互作用能力および性質がポリペプチドの生物学的機能活性を規定するので、ポリペプチド配列中のあるアミノ酸の配列を類似の性質を持つポリペプチドを得るように置換することが可能である。
【００１８】
そのような変化を行う際に、アミノ酸のハイドロパシックインデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮することができる。ポリペプチドに相互作用生物学的機能が与えられる場合の、ハイドロパシックアミノ酸インデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｅｘ）の重要性は、本技術分野で一般的に理解されている。あるアミノ酸が、同様のハイドロパシックインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸で置換されても結果として依然同様の生物学的活性を持つポリペプチドとなりうることが知られている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ハイドロパシックインデックスを割り当てられる。これらの指数は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【００１９】
アミノ酸の相対的ハイドロパシー特性が、得られるポリペプチドの二次構造を決定し、それがひいては酵素、基質、レセプター、抗体、抗原などのような、他の分子とのポリペプチドの相互作用を規定すると考えられている。アミノ酸を、同様のハイドロパシーインデックスを有する他のアミノ酸によって置換して、依然機能的には等価のポリペプチドを得ることが出来ることが、本技術分野で知られている。そのような変化において、そのハイドロパシックインデックスが、±２以内でのアミノ酸の置換が好ましく、特に±１以内の置換が好ましく、また±０．５以内の置換がとりわけ好ましい。
【００２０】
類似アミノ酸の置換はまた、特にそれによって作製された生物学的機能的等価ポリペプチドまたはペプチドを、免疫学的実施形態で使用することを意図する時に、親水性に基づいて実施することも可能である。以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている。アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、プロリン（−０．５±１）、スレオニン（−０．４）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を同様の親水性値を持つ他のものと置換しても、生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なポリペプチドを依然得ることができることが理解される。そのような変化において、その親水性値が±２内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１内の置換が特に好ましく、±０．５内の置換がとりわけ好ましい。
【００２１】
以上で概説したように、アミノ酸置換は一般的に、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどのような、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づく。以上の種々の特徴を考慮に入れた例示の置換が、当業者によく知られており、以下のものが含まれる（本来の残基：例示的置換）：（Ａｌａ：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ）、（Ａｒｇ：Ｌｙｓ）、（Ａｓｎ：Ｇｌｎ、Ｈｉｓ）、（Ａｓｐ：Ｇｌｕ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ）、（Ｇｌｎ：Ａｓｎ）、（Ｇｌｕ：Ａｓｐ）、（Ｇｌｙ：Ａｌａ）、（Ｈｉｓ：Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、（Ｉｌｅ：Ｌｅｕ、Ｖａｌ）、（Ｌｅｕ：Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、（Ｌｙｓ：Ａｒｇ）、（Ｍｅｔ：Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、（Ｓｅｒ：Ｔｈｒ）、（Ｔｈｒ：Ｓｅｒ）、（Ｔｉｐ：Ｔｙｒ）、（Ｔｙｒ：Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、および（Ｖａｌ：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）。したがって、本開示の実施形態は、以上に記載したようなポリペプチドの、機能的または生物学的等価物を意図する。特に、ポリペプチドの実施形態には、対象のポリペプチドに対して、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および９５％の配列同一性を有する変種が含まれうる。
【００２２】
本技術分野で知られている「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、配列を比較することによって決められる、２つ以上のポリペプチド配列間の関係である。本技術分野において、「同一性」はまた、そのような配列の文字列（ｓｔｒｉｎｇ）間の一致によって決定されるポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」および「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、限定はしないが、知られている方法（以下に記述されたものを含む）によって容易に計算可能である：
Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；
Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；および
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、および
Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．，ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。
【００２３】
同一性を決定するための好ましい方法は、テスト配列間で最も大きな一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに整備されている。２つの配列間のパーセント同一性は、Ｎｅｅｄｅｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）アルゴリズム（例えばＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴ）を組み込む解析ソフト（すなわち、ジェネティクス  コンピュータ  グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）を用いることによって決定可能である。デフォールトパラメータを、本発明のポリペプチドについての同一性を決定するために使用する。
【００２４】
一例として、ポリペプチド配列は参照配列と同一で（つまり１００％同一で）あって良く、または％同一性が１００％より小さくなるよう参照配列と比較して特定の整数までのアミノ酸変化を含んでもよい。そのような変化は、少なくとも１つのアミノ酸欠損、置換（保存および非保存置換を含む）、または挿入から選択され、前記変化は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端位置またはカルボキシ末端位置で、またはこれらの末端位置の間のどこであってもよく、参照配列中のアミノ酸中に個々に散らばっていてもよく、または参照配列中に１つまたはそれ以上の連続したグループとして散らばっていてもよい。与えられた％同一性に関するアミノ酸変化の数は、参照ポリペプチド内のアミノ酸の総数に（１００で割った）それぞれのパーセント同一性の％数を掛け、次いで参照ポリペプチド中のアミノ酸の総数から先の積を減じることによって決定される。
【００２５】
本明細書で使用される語句「精製（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」およびそれに類似の語句は、本質的に、天然の環境下で分子または化合物に通常付随する他の成分を含まない（少なくとも６０％フリー、好ましくは７０％フリー、もっとも好ましくは９０％フリー）である形態での、分子または化合物の単離に関する。
【００２６】
本明細書で使用される語句「薬理学的に許容できる担体」には、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、および油／水または水／油エマルジョンのようなエマルジョン類、および種々の湿潤剤のような、任意の標準的薬理学的担体が含まれる。
【００２７】
本明細書で使用される語句「治療する」には、特定の疾病または状態に付随する症状を軽減すること、および／または前記症状を予防することまたは除去させることが含まれる。
【００２８】
「作動可能に連結した」は、その通常の機能を達成するように成分が配置される、並置を意味する。例えば、コード配列に作動可能に連結した調節配列またはプロモーターは、コード配列の発現に影響を与えることが可能であり、蛋白質に作動可能に連結したオルガネラ局在化配列は、連結タンパク質を、特定のオルガネラに局在するように指向しうる。
【００２９】
「局在化シグナルまたは配列またはドメイン」または「標的化シグナルまたは配列またはドメイン」は、互換的に使用され、分子を特定の細胞、組織、オルガネラまたは細胞内領域に指向させるシグナルを意味する。シグナルは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または炭水化物部位であり得、または付着した分子を所望の部位に指向するのに十分な有機または無機化合物でありうる。例示のオルガネラ局在化シグナルには、本技術分野で知られている核局在化シグナル、および表１および２にて提供され、その全てが参照にて本明細書に取り込まれている、Ｅｍａｎｕｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．３００（４）：１００５−１６，２０００  Ｊｕｌ  ２１、およびＣｌｉｎｅ  ａｎｄ  Ｈｅｒｎｙ，Ｉｍｐｏｒｔ  ａｎｄ  Ｒｏｕｔｉｎｇ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．１２：１〜２６，１９９６に記載されたもののような、本技術分野で知られている他のオルガネラ局在化シグナルが含まれる。表１および２で列記された全配列が含まれる必要はなく、これらの配列の修飾（短化（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を含む）は、配列が連結した分子を特定のオルガネラに指向するように動作する限り、本発明の範囲内であることが理解されるであろう。本発明のオルガネラ局在化シグナルは、表１および２中の配列に対して、８０〜１００％の相同性を持ちうる。いくつかの実施形態において、オルガネラ局在化シグナルには、正味電荷、例えば正の電荷、を持つかまたは与えるシグナルが含まれる。正に帯電したシグナルは、ミトコンドリアのような、負に帯電したオルガネラを標的にするために使用されるうる。負に帯電したシグナルは、正に帯電したオルガネラまたは領域を標的化するために使用されうる。
【００３０】
「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤは、脂質二重層、ミセル、細胞膜、オルガネラ膜または小胞膜を横断することを促進する、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物または有機または無機化合物を意味する。他の分子に付着したＰＴＤは、例えば細胞外空間から細胞内空間へ、または細胞質からオルガネラ内へ移動するような、分子が膜を横断することを促進する。例示的ＰＴＤには、限定はしないが、ＨＩＶ  ＴＡＴ  ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）またはＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号２）、１１アルギニン残基、または８〜１５残基、好ましくは９〜１１残基を持つ、正に帯電したポリペプチドまたはポリヌクレオチドが含まれる。
【００３１】
本明細書で使用される語句「外来性ＤＮＡ」または「外来性核酸配列」または「外来性ポリヌクレオチド」は、外部供給源より、細胞またはオルガネラへ導入された核酸配列を意味する。典型的に、導入された外来配列は、組換え配列である。
【００３２】
本明細書で使用される語句「トランスフェクション」は、核酸配列の、生細胞の膜に囲まれた空間の内部への核酸配列の導入（細胞の細胞質、ならびにミトコンドリア、核、またはクロロプラストの内部空間への導入を含む）を意味する。核酸は、種々のタンパク質に付随された裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得、または核酸はベクター内に組み込まれて良い。
【００３３】
本明細書で使用される語句「ベクター」は、細胞内へ核酸配列を導入するために使用した伝達体に関して使用される。ウイルスベクターは、組換え体ＤＮＡ配列が、ホスト細胞または細胞オルガネラ内に導入されることを可能にするように修飾されたウイルスである。
【００３４】
本明細書で使用される語句「オルガネラ」は、クロロプラスト、ミトコンドリアおよび核のような、細胞の膜に結合した構造を意味する。語句「オルガネラ」には、天然および合成オルガネラが含まれる。
【００３５】
本明細書で使用される語句「非核オルガネラ」は、核を除く、細胞内に存在する任意の細胞の膜に結合した構造を意味する。
【００３６】
本明細書で使用される語句「ポリヌクレオチド」は、一般的に、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡ、または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡでありうる、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。したがって、例えば、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ；一本鎖および二本鎖領域の混合であるＤＮＡ；一本鎖および二本鎖ＲＮＡ；一本鎖および二本鎖領域の混合であるＲＮＡ；および一本鎖、より典型的には二本鎖、または一本鎖および二本鎖領域の混合でありうるＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子；を意味する。語句「核酸」、「核酸配列」または「オリゴヌクレオチド」の語はまた、以上で定義されたようなポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
さらに、本明細書で使用されるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡ両方を含む、三本鎖領域を意味する。そのような領域内の鎖は、同一の分子から、または異なる分子から形成されうる。この領域には、１つまたはそれ以上の分子の全体が含まれうるが、より典型的にはいくつかの分子のある領域のみが含まれる。三重螺旋状領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌクレオチドである。
【００３８】
本明細書で使用される語句ポリヌクレオチドには、上述したようなＤＮＡまたはＲＮＡであって１つまたはそれ以上の修飾塩基を含むものが含まれる。したがって、安定性のため、または他の理由のために修飾された骨格を持つＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で意図される「ポリヌクレオチド」である。さらに、２つだけ例を挙げれば、イノシンのような異常塩基、またはトリチル化塩基のような修飾塩基を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書で使用される語句におけるポリヌクレオチドである。
【００３９】
広く種々の修飾が、当業者に知られている多くの有用な目的に役に立つＤＮＡおよびＲＮＡに対して実施されたことが理解されるであろう。本明細書で使用される語句ポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド類のそのような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびに、ウイルスおよび細胞（特に単純および複雑な細胞を含む）のＤＮＡおよびＲＮＡに特徴的な化学的形態、が含まれる。
【００４０】
「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポリヌクレオチド類を意味する。しばしば本語句は一本鎖デオキシリボヌクレオチド類を意味するが、同様に、一本鎖または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡなども意味しうる。
【００４１】
蛍光団は、冷光を発生する化合物または分子である。典型的に、蛍光団は、１つの波長にて、電磁気エネルギーを吸収し、第二波長にて電磁気エネルギーを放射する。代表的な蛍光団には、限定はしないが、１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ、１，８−ＡＮＳ、４−メチルウンベリフェロン、５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオロセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシナフトフルオレセイン、５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）、５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）、５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）、５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）、６−カルボキシローダミン６Ｇ、６−ＣＲ  ６Ｇ、６−ＪＯＥ、７−アミノ−４−メチルクマリン、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン、ＡＢＱ、酸フクシン（Ａｃｉｄ  Ｆｕｃｈｓｉｎ）、ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）、アクリジンオレンジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、アクリジンレッド（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｒｅｄ）、アクリジンイエロー（Ａｃｒｉｄｉｎｅ  Ｙｅｌｌｏｗ）、アクリフラビン（Ａｃｒｉｆｌａｖｉｎ）、アクリフラビンフォイルゲン（Ａｃｒｉｆｌａｖｉｎ  Ｆｅｕｌｇｅｎ）ＳＩＴＳＡ、エクオリン（Ａｅｑｕｏｒｉｎ）（フォトタンパク質）、ＡＦＰｓ−オートフルオレセントタンパク質（ＡｕｔｏＦｌｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）−（クアンタムバイオテクノロジーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））（ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰを参照）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（商標）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（商標）、アリザリンコンプレキソン（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎ）、アリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ）、アロフィコシアニン（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）（ＡＰＣ）、ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ、ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）、ＡＭＣＡ−Ｘ、アミノアクチノマイシンＤ、アミノクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、アニリンブルー（Ａｎｉｌｉｎ  Ｂｌｕｅ）、ステアリン酸アントロシル、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ、ＡＰＴＳ、アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ（Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ４Ｇ）、アストラゾンオレンジＲ（Ａｓｔｏｒａｚｏｎ  Ｏｒａｎｇｅ  Ｒ）、アストラゾンレッド６Ｂ（Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｒｅｄ  ６Ｂ）、アストラゾンイエロー７ＧＬＬ（Ａｓｔｒａｚｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ  ７  ＧＬＬ）、アタブリン（Ａｔａｂｒｉｎｅ）、ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（���標）ＣＢＱＣＡ、ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＦＱ、オーラミン（Ａｕｒａｍｉｎｅ）、オーロフォスフィンＧ（Ａｕｒｏｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  Ｇ）、オーロフォスフィン、ＢＡＯ  ９（ビサミノフェニルオキサジアゾール）、ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）、ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）、硫酸ベルベリン、ベータラクタマーゼ、ＢＦＰブルーシフトＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）、ブルーフルオレセントタンパク質（Ｂｌｕｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＦＰ／ＧＦＰ  ＦＲＥＴ、ビマン（Ｂｉｍａｎｅ）、ビスベンザミド、ビスベンズイミド（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ））、ビス−ＢＴＣ、ブランコフォアＦＦＧ（Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＦＦＧ）、ブランコフォアＳＶ、ＢＯＢＯ（商標）−１、ＢＯＢＯ（商標）−３、Ｂｏｄｉｐｙ４９２／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ４９８／５０３、Ｂｏｄｉｐｙ５００／５１０、Ｂｏｄｉｐｙ５０５／５１５、Ｂｏｄｉｐｙ５３０／５５０、Ｂｏｄｉｐｙ５４２／５６３、Ｂｏｄｉｐｙ５５８／５６８、Ｂｏｄｉｐｙ５６４／５７０、Ｂｏｄｉｐｙ５７６／５８９、Ｂｏｄｉｐｙ５８１／５９１、Ｂｏｄｉｐｙ６３０／６５０−Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ６５０／６６５−Ｘ、Ｂｏｄｉｐｙ６６５／６７６、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆｌ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ  ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆｌ−セラミド、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｒ６ＧＳＥ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘ連結体、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘ、ＳＥ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ  ＡＴＰ、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥ、ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−１、ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−３，ブリリアントスルホフラビンＦＦ（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｓｕｌｐｈｏｆｌａｖｉｎ  ＦＦ）、ＢＴＣ、ＢＴＣ−５Ｎ、カルセイン（Ｃａｌｃｅｉｎ）、カルセインブルー（Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｂｌｕｅ）、カルセインクリムソン（商標）（Ｃａｌｃｅｉｎ  Ｃｒｉｍｓｏｎ（商標））、カルシウムグリーン（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ）、カルシウムグリーン−１  Ｃａ2+Ｄｙｅ、カルシウムグリーン−２Ｃａ2+、カルシウムグリーン−５Ｎ  Ｃａ２＋、カルシウムグリーン−Ｃ１８  Ｃａ2+、カルシウムオレンジ（Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｏｒａｎｇｅ）、カルコフロアホワイト（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）、カスケードブルー（商標）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標））、カスケードイエロー、カテコールアミン（Ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ）、ＣＣＦ２（ジーンブレイザー（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ））、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ−シアンフルオレセントプロテイン（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＣＦＰ／ＹＦＰ  ＦＲＥＴ、クロロフィル（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）、クロモマイシンＡ（Ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ  Ａ）、クロモマイシンＡ、ＣＬ−ＮＥＲＦ、ＣＭＦＤＡ、コエレンテラジン（Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）、コエレンテラジンｃｐ、コエレンテラジンｆ、コエレンテラジンｆｃｐ、コエレンテラジンｈ、コエレンテラジンｈｃｐ、コエレンテラジンｉｐ、コエレンテラジンｎ、コエレンテラジンＯ、クマリン  ファロイジン（Ｃｏｕｍａｒｉｎ  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）、Ｃ−フィコシアニン、ＣＰＭメチルクマリン（Ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）、ＣＴＣ、���ＴＣホルマザン（Ｆｏｒｍａｚａｎ）、Ｃｙ２（商標）、Ｃｙ３．１  ８、Ｃｙ３．５（商標）、Ｃｙ３（商標）、Ｃｙ５．１  ８、Ｃｙ５．５（商標）、Ｃｙ５（商標）、Ｃｙ７（商標）、シアンＧＦＰ、環状ＡＭＰフルオロセンサー（Ｆｌｕｏｒｏｓｅｎｓｏｒ）（ＦｉＣＲｈＲ）、ダビシル（Ｄａｂｃｙｌ）、ダンシル（Ｄａｎｓｙｌ）、ダンシルアミン（Ｄａｎｓｙｌ  Ａｍｉｎｅ）、ダンシルカダベリン（Ｄａｎｓｙｌ  Ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）、ダンシルクロライド（Ｄａｎｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ダンシルＤＨＰＥ、フッ化ダンシル、ＤＡＰＩ、ダポキシル（Ｄａｐｏｘｙｌ）、ダポキシル２、ダポキシル３’ＤＣＦＤＡ、ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート）、ＤＤＡＯ、ＤＨＲ（（ジヒドロローダミン（Ｄｉｈｙｄｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ）１２３）、Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ（非−比）、ＤｉＡ（４−Ｄｉ−１６−ＡＳＰ）、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ）（ＤＣＦＨ）、ＤｉＤ−リポフィリックトレーサー（Ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  Ｔｒａｃｅｒ）、ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））、ＤＩＤＳ、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）、Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））、ジニトロフェノール（Ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）、ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））、ＤｉＲ、ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））、ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）、ＤＮＰ、ドーパミン（Ｄｏｐａｍｉｎｅ）、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ＤＹ−６３０−ＮＨＳ、ＤＹ−６３５−ＮＨＳ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＬＦ  ９７、エオシン（Ｅｏｓｉｎ）、エリスロシン（Ｅｒｙｔｈｒｏｓｉｎ）、エリスロシンＩＴＣ、臭化エチジウム（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ）、エチジウムホモダイマー−１（Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ−１）（ＥｔｈＤ−１）、ユークリシン（Ｅｕｃｈｒｙｓｉｎ）、ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ、塩化（ＩＩＩ）ユーロピニウム（Ｅｕｒｏｐｉｕｍ（ｌｌｌ）ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＥＹＦＰ、ファストブルー（Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｅ）、ＦＤＡ、Ｆｅｕｌｇｅｎ（パラロサニリン（Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ））、ＦＩＦ（ホルムアルデヒド誘導蛍光（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ））、ＦＩＴＣ、フラゾオレンジ（Ｆｌａｚｏ  Ｏｒａｎｇｅ）、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−４、フルオロセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ））、フルオロセインジアセテート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、フルオローエメラルド（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｅｍｅｒａｌｄ）、フルオローゴールド（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ）（ヒドロキシスチルバミジン（Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ））、フルオロールビー（Ｆｌｕｏｒ−Ｒｕｂｙ）、フルオロＸ（ＦｌｕｏｒＸ）、ＦＭ  １−４３（商標）、ＦＭ  ４−４６、Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（商標）（高ｐＨ）、Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（商標）／Ｆｌｕｏ−３、Ｆｕｒａ−２、Ｆｕｒａ−２／ＢＣＥＣＦ、ゲナクリルブリリアントレッドＢ（Ｇｅｎａｃｒｙｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  Ｂ）、ゲナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ、ゲナクリルピンク３��、ゲナクリルイエロー５ＧＦ、ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ（ＣＣＦ２）、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＧＦＰ  ｒｅｄ  ｓｈｉｆｔｅｄ（ｒｓＧＦＰ）、ＧＦＰ野生型（非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ））、ＧＦＰ野生型（ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ））、ＧＦＰｕｖ、Ｇｌｏｘａｌｉｃ  Ａｃｉｄ、Ｇｒａｎｕｌａｒ  ｂｌｕｅ、ヘマトプロフィリン（Ｈａｅｍａｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０、ＨＰＴＳ、ヒドロキシクマリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ）、ヒドロキシスチルバミジン（Ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｉｌｂａｍｉｄｉｎｅ（ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ））、ヒドロキシトリプタミン（Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔａｍｉｎｅ）、Ｉｎｄｏ−１（高カルシウム）、Ｉｎｄｏ−１（低カルシウム）、インドジカルボシアニン（Ｉｎｄｏｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＤｉＤ）、インドトリカルボシアニン（Ｉｎｄｏｔｒｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＤｉＲ）、イントラホワイト（Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ）  Ｃｆ、ＪＣ−１、ＪＯ−ＪＯ−１、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬａｓｅｒＰｒｏ、Ｌａｕｒｏｄａｎ、ＬＤＳ  ７５１（ＤＮＡ）、ＬＤＳ  ７５１（ＲＮＡ）、ＬｅｕｃｏｐｈｏｒＰＡＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＳＦ、Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＷＳ、リッサミンローダミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、リッサミンローダミンＢ、カルセイン／エチジウムホモダイマー（Ｃａｌｃｅｉｎ／Ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）、ＬＯＬＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ、Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ−Ｗｈｉｔｅ、Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ、Ｌｙｓｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｂｌｕｅ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ、Ｍａｇ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍａｇｄａｌａ  Ｒｅｄ（Ｐｈｌｏｘｉｎ  Ｂ）、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−２、Ｍａｇ−Ｆｕｒａ−５、Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１、マグネシウムグリーン（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ）、マグネシウムオレンジ、マラカイトグリーン（Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎ）、
マリーナブルー（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ）、Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  １０  ＧＦＦ、Ｍａｘｉｌｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ  ８  ＧＦＦ、メロシアニン（Ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎ）、メトキシクマリン（Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ）、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ、ＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ、Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ、Ｍｉｔｒａｍｙｃｉｎ、Ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ、Ｍｏｎｏｂｒｏｍｏｂｉｍａｎｅ（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）、Ｍｏｎｏｃｈｌｏｒｏｂｉｍａｎｅ、ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン（Ｍｅｔｈｙｌ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｙｒｏｎｉｎｅ  Ｓｔｉｌｂｅｎｅ））、ＮＢＤ、ＮＢＤ  Ａｍｉｎｅ、ナイルレッド（Ｎｉｌｅ  Ｒｅｄ）、ニトロベンゾキサジドール（Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｘａｄｉｄｏｌｅ）、ノルアドレナリン（Ｎｏｒａｄｒｅｎａｌｉｎｅ）、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ、Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、Ｎｙｌｏｓａｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｌａｖｉｎ  Ｅ８Ｇ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８−Ｘ、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標））、オレゴングリーン４８８（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  ４８８）、オレゴングリーン５００（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  ５００）、オレゴングリーン５１４（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）  ５１４）、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）、パラロサリニン（Ｐａｒａｒｏｓａｎｉｌｉｎｅ（Ｆｅｕｌｇｅｎ））、ＰＢＦＩ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ［Ｒｅｄ  ６１３］、Ｐｈｌｏｘｉｎ  Ｂ（Ｍａｇｄａｌａ  Ｒｅｄ）、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＡＲ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＢＫＬ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  Ｒｅｖ、Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＲＰＡ、Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ  ３Ｒ、ＰｈｏｔｏＲｅｓｉｓｔ、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｂ［ＰＥ］、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ  Ｒ［ＰＥ］、ＰＫＨ２６（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、ＰＫＨ６７、ＰＭＩＡ、ポントクロムブルーブラック（Ｐｏｎｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｂｌｕｅ  Ｂｌａｃｋ）、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、プリムリン（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ）、プロシオンイエロー（Ｐｒｏｃｉｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ）、Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄ（ＰＩ）、ＰｙＭＰＯ、ピレン（Ｐｙｒｅｎｅ）、ピロニン（Ｐｙｒｏｎｉｎｅ）、ピロニンＢ（Ｐｙｒｏｎｉｎｅ  Ｂ）、ピロザルブリリアントフラビン（Ｐｙｒｏｚａｌ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｆｌａｖｉｎ）７ＧＦ、ＱＳＹ  ７、キナクリンマスタード（ＱｕｉｎａｃｒｉｎｅＭｕｓｔａｒｄ）、Ｒｅｄ  ６１３［ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ］、レソルフィン（Ｒｅｓｏｒｕｆｉｎ）、ＲＨ  ４１４、Ｒｈｏｄ−２、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、ローダミン１１０、ローダミン１２３、ローダミン５  ＧＬＤ、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミンＢ  ２００、ローダミンＢ  ｅｘｔｒａ、ローダミンＢＢ、ローダミンＢＧ、ローダミングリーン、ローダミンファリシジン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｐｈａｌｌｉｃｉｄｉｎｅ）、ローダミンファロイジン（Ｒｈｏｄａｍｉｎ���  Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎｅ）、ローダミンレッド、ローダミンＷＴ、ローズベンガル（Ｒｏｓｅ  Ｂｅｎｇａｌ）、Ｒ−フィコシアニン（Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｅ）、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ））、ｒｓＧＦＰ、Ｓ６５Ａ、Ｓ６５Ｃ、Ｓ６５Ｌ、Ｓ６５Ｔ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＧＦＰ、ＳＢＦＩ、セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ２Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ４Ｇ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  Ｂ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｏａｎｇｅ、Ｓｅｖｒｏｎ  Ｙｅｌｌｏｗ  Ｌ、ｓｇＢＦＰ（商標）、ｓｇＢＦＰ（商標）（ｓｕｐｅｒ  ｇ１ｏｗ  ＢＦＰ）、ｓｇＧＦＰ（商標）、ｓｇＧＦＰ（商標）（ｓｕｐｅｒ  ｇｌｏｗ  ＧＦＰ）、ＳＩＴＳ、ＳＩＴＳ（プリムリン（Ｐｒｉｍｕｌｉｎｅ））、ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸（Ｓｔｉｌｂｅｎｅ  ｌｓｏｔｈｉｏｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  Ａｃｉｄ））、ＳＮＡＦＬカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）、ＳＮＡＦＬ−１、ＳＮＡＦＬ−２、ＳＮＡＲＦ  ｃａｌｃｅｉｎ、ＳＮＡＲＦ１、Ｓｏｄｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ、ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｒｅｄ、ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム（６−ｍｅｔｈｏｘｙ−Ｎ−（３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ））、スチルベン（Ｓｔｉｌｂｅｎｅ）、スルホローダミン（Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ）Ｂ  ｃａｎ  Ｃ、スルホローダミンＥｘｔｒａ、ＳＹＴ０  １１、ＳＹＴＯ  １２、ＳＹＴＯ  １３、  ＳＹＴＯ  １４、  ＳＹＴＯ  １５、ＳＹＴＯ  １６、ＳＹＴＯ  １７、ＳＹＴＯ  １８、ＳＹＴＯ  ２０、ＳＹＴＯ  ２１、ＳＹＴＯ  ２２、ＳＹＴＯ  ２３、ＳＹＴＯ  ２４、ＳＹＴＯ  ２５、ＳＹＴＯ  ４０、ＳＹＴＯ  ４１、ＳＹＴＯ  ４２、ＳＹＴＯ  ４３、ＳＹＴＯ  ４４、ＳＹＴＯ  ４５、ＳＹＴＯ  ５９、ＳＹＴＯ  ６０、ＳＹＴＯ  ６１、ＳＹＴＯ  ６２、ＳＹＴＯ  ６３、ＳＹＴＯ  ６４、ＳＹＴＯ  ８０、ＳＹＴＯ  ８１、ＳＹＴＯ  ８２、ＳＹＴＯ  ８３、ＳＹＴＯ  ８４、ＳＹＴＯ  ８５、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、テトラサイクリン（Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、テトラメチルローダミン（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ（商標）連結体、チアジカルボシアニン（Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ）（ＤｉＳＣ３）、チアジンレッドＲ（Ｔｈｉａｚｉｎｅ  Ｒｅｄ  Ｒ）、チアゾールオレンジ（Ｔｈｉａｚｏｌｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、チオフラビン５（Ｔｈｉｏｆｉａｖｉｎ  ５）、チオフラビンＳ（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  Ｓ）、チオフラビンＴＣＮ（Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ  ＴＣＮ）、チオライト（Ｔｈｉｏｌｙｔｅ）、チオゾールオレンジ（Ｔｈｉｏｚｏｌｅ  Ｏｒａｎｇｅ）、Ｔｉｎｏｐｏｌ  ＣＢＳ（ＣａｌｃｏｆｌｕｏｒＷｈｉｔｅ）、ＴＭＲ、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＴｒｉＣｏｌｏｒ（ＰＥ−Ｃｙ５）、ＴＲＩＴＣテトラメチルローダミンイソチ��シアネート（ＴｅｔｒａｍｅｔｈｙｌＲｏｄａｍｉｎｅｌｓｏＴｈｉｏＣｙａｎａｔｅ）、Ｔｒｕｅ  Ｂｌｕｅ、ＴｒｕＲｅｄ、Ｕｌｔｒａｌｉｔｅ、Ｕｒａｎｉｎｅ  Ｂ、Ｕｖｉｔｅｘ  ＳＦＣ、ｗｔ  ＧＦＰ、ＷＷ  ７８１、Ｘ−Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＸＲＩＴＣ、キシレンオレンジ（Ｘｙｌｅｎｅ  ｏｒａｎｇｅ）、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｈ、Ｙ６６Ｗ、Ｙｅｌｌｏｗ  ＧＦＰ、ＹＦＰ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ、チアゾールオレンジ（Ｔｈｉａｚｏｌｅ  Ｏｒａｎｇｅ）（インタキレーティング色素）、（光または他の電磁気エネルギー供給源にて活性化可能な）量子ドットまたはケージド（ｃａｇｅｄ）蛍光団のような半導体ナノ粒子、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【００４２】
語句「核酸レポーター」は、特定の核酸配列を特異的に検出するか、または検出するために使用可能な、化合物、分子、ポリマーを意味する。例示の核酸レポーターには、限定はしないが、例えば、標識アンチセンスポリヌクレオチド類のような、標識ポリヌクレオチド類が含まれる。核酸レポーターは、一本鎖または多重鎖でありうる。例示の核酸レポーターはまた、分子ビーコンを含む。
【００４３】
語句「分子ビーコン」は一般的に、二重標識アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）プローブを意味する。例示的骨格には、限定はしないが、未修飾オリゴデオキシリボヌクレオチド類、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド類、ホスホロチオエート、オリゴデオキシヌクレオチド類、およびメチルホスホネート、ホスホラミデート、メチルチオホスフェート、またはメチルチオホスホトリエステルを含むオリゴデオキシヌクレオチド類が含まれる。例示的標識には、限定はしないが、一方の末端の蛍光団と、もう一方の末端の消光剤が含まれる。消光剤は、他の標識からの検出可能なシグナルを減少させるか、消す、任意の分子または基質でありうる。例示的消光剤には、限定はしないが、金または銀のような、直径が約１００ｎｍより小さい、典型的には、直径約１０ｎｍより小さい金属粒子、または、限定されないがＤＡＢＣＹＬ（４−｛［４−（ジメチルアミノ）フェニル」ジアゼニル｝ベンゾイル、ＢＨＱ−１、およびＢＨＱ−２を含む他の色素が含まれる。消光剤は、それ自身蛍光を持たなくてよい。そのような消光剤は、典型的には暗消光剤と呼ばれる。あるいは、消光剤はそれ自身蛍光性であり得る。
２．修飾分子ビーコン
本開示のいくつかの実施形態の１つによって、ｉｎ  ｖｉｖｏならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏで、標的核酸の存在を非侵襲的に報告可能な、核酸レポーター構築物が提供される。非侵襲的送達とは、例えばニードルのような機械的器具または有意な細胞または組織傷害を引き起こしうるポレーションのような機械的または物理的方法を用いた場合の細胞または組織に対する有意な物理的障害、を与えることのない送達を意味する。本開示の実施形態によって、細胞外空間から細胞内空間への核酸レポーターの転位を促進するためにタンパク質形質導入ドメインによって修飾された核酸レポーターが提供される。核酸レポーターは、核、ミトコンドリア、またはクロロプラストのような、膜結合オルガネラ類の内部を含む、細胞の内部の任意の領域に転位可能である。任意の膜オルガネラが、本開示の範囲内に含まれることが、当業者によって理解されるであろう。さらに、膜を持つ任意の細胞、例えば限定しないがヒト細胞のような動物細胞または植物細胞が、本開示の範囲内であることが理解されうる。
【００４４】
他の実施形態によって、細胞内標的化シグナル、オルガネラ標的化シグナル、細胞標的化シグナル、組織標的化シグナル、または器官標的化シグナルのような、標的化シグナルを含むようにさらに修飾される核酸レポーターが提供される。一般的に、そのような標的化シグナルは、本技術分野で知られている。標的化シグナルには、限定はしないが、アミノ酸または核酸配列、ならびに、核酸レポーターを特定の細胞、組織、器官または細胞の細胞内領域に標的化する脂質または炭水化物が含まれる。そのような標的化は、レセプター：リガンド相互作用を介して、または、核酸レポーターの極性、疎水性、親水性、またはそれらの任意の組み合わせを修飾する標的化シグナルを用いて、達成可能である。したがって、標的化シグナルは、必要に応じて、陽性または陰性電荷を、核酸レポーターに与えうる。例示的標的化シグナルには、限定はしないが、増殖因子、増殖因子レセプター、細胞外エピトープに特異的な抗体またはその断片、炭水化物、脂質、ペプチド、核酸、核酸局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、極性または非極性小分子、補因子およびビタミンが含まれる。
【００４５】
開示された核酸レポーターに、ＰＴＤ、標的化シグナル、またはその組み合わせが含まれうることが、当業者によって理解されるであろう。ＰＴＤ、標的化シグナルまたはその両方は、例えば開裂可能結合を介して、核酸レポーターに放出可能に連結可能であり、よって核酸レポーターが所望部位に到達したときに、その核酸レポーターがＰＴＤまたは標的化シグナルより放出される。１つの態様では、核酸レポーターが細胞質内に入り、標的化シグナルが核酸レポーターに連結したままである場合に、ＰＴＤが開裂される。他の態様では、核酸レポーターが望む局所に到達したときに、標的化シグナルが核酸レポーターより取り除かれる。
２．１  分子ビーコン
本開示の核酸レポーターには、限定はしないが、分子ビーコンのような標識オリゴヌクレオチドが含まれる。分子ビーコンは一般に、例えば分子の各末端での標識のような、一対の標識を持つポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドには、標的核酸に相補的な配列（標的認識配列）が含まれる。相補性の程度は、核酸レポーターと標的核酸間の配列特異的相互作用を可能にするのに十分である。いくつかの実施形態が、標的核酸内の単一塩基差違または単一ヌクレオチドポリモルヒズムを検出可能である。本開示の核酸レポーターは、標的認識配列７〜１４０ヌクレオチドを持ちうるが、標的認識配列は標的核酸との配列特異的結合を許容する任意の長さのものでありうることは理解されるであろう。いくつかの実施形態において、標的認識配列に隣接する配列が、ステムハイブリッド、または長さにして３〜２５の「ステム二本鎖（ｓｔｅｍ  ｄｕｐｌｅｘ）」を形成する。修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド連結を使用して、本開示の核酸レポーターを生み出してよく、以下でより完全に記述されている。そのような修飾は本技術分野で知られており、酵素的分解に対する耐性を増加するための修飾が含まれる。非限定実施形態において、不安定なホスホジエステルまたはホスホエステル結合が、ホスホロチオエートまたはチオエステル結合のような、より安定な結合に置換されて良い。例えば、本開示の核酸レポーターには、例えばペプチド核酸（「ＰＮＡ」）連結が含まれうる。本開示の組成物および標的核酸は、ＤＮＡ、ｒＲＮＡ、核ＲＮＡ、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはこれらの組み合わせでありうる。
２．１．１  修飾ヌクレオチド連結
いくつかの実施形態によって、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含む、複数の核酸またはオリゴヌクレオチドを含む、核酸レポーターが提供される。例示的修飾骨格には、骨格内にリン原子を維持するもの、および骨格内にリン原子を持たないもの、が含まれる。
【００４６】
代表的な修飾オリゴヌクレオチド骨格には、例えば、ホスホロチオエート類、キラルホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、３’−アルキレンホスホネート類、５’−アルキレンホスホネート類およびキラルホスホネート類を含むメチルおよび他のアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデート類を含むホスホルアミデート類、チオノホスホルアミデート類、チオノアルキルホスホナート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、セレノホスフェート類および通常の３’−５’連結を持つボラノホスフェート類、これらの２’−５’連結アナログ、１つまたはそれ以上のヌクレオチド間連結が、３’−３’、５’−５’、または２’−２’連結である逆極性を持つものが含まれ得る。逆極性を持ついくつかのオリゴヌクレオチド類には、最も３’側のヌクレオチド間連結に単一の３’−３’連結、すなわち脱塩基（核酸塩基がないか、またはその代わりにヒドロキシル基を持つ）でありうる単一の逆ヌクレオシド残基が含まれる。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【００４７】
以上のリン含有連結の調製を教示している代表的な米国特許には、限定はしないが、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，１９４，５９９号、第５，５６５，５５５号、第５，５２７，８９９号、第５，７２１，２１８号、第５，６７２，６９７号および第５，６２５，０５０号が含まれる。
【００４８】
いくつかのオリゴヌクレオチド骨格は、そのなかにリン原子を含まず、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル複合ヌクレオシド間連結、または１つまたはそれ以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環状ヌクレオシド間連結によって形成される骨格を持つ。これらには、（部分的に、ヌクレオシドの糖部位中で形成された）モルホリノ連結、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルハメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、を持つもの、およびＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ2成分部分の混合を持つ他のもの、が含まれる。
【００４９】
以上のオリゴヌクレオチドの調製を教示している代表的な米国特許には、限定はしないが、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、第５，７９２，６０８号、第５，６４６，２６９号および第５，６７７，４３９号が含まれる。
【００５０】
さらに別の実施形態において、ヌクレオチドユニットの糖およびヌクレオシド間連結両方、すなわち骨格が、新規の官能基に置き換えられたオリゴヌクレオチド類似体を含む、核酸レポーターが提供される。基礎ユニットは、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのそのようなオリゴマー化合物である、優れたハイブリダイゼーション特性をもつことが示されたオリゴヌクレオチド類似体が、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている。ＰＮＡ化合物中、オリゴヌクレオチドの糖−骨格がアミド含有骨格、特にアミノエチルグリシン骨格、に置き換えられる。核酸塩基は維持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許には、限定はしないが、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号および第５，７１９，２６２号が含まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００に見ることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、ホスホロチオエート骨格を持つオリゴヌクレオチド類、およびヘテロ原子骨格、特に、以上で参照している米国特許第５，４８９，６７７号の、−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＨ2−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られている］、−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−、−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｎ（ＣＨ3）−ＣＨ2−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ2）−ＣＨ2−ＣＨ2−［天然のホスホジエステル骨格は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ2と表される］を持つオリゴヌクレオチド類、および上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格を持つ核酸レポーターが提供される。
【００５２】
他の実施形態において、核酸レポーターには、１つまたはそれ以上の置換糖部位を含む修飾オリゴヌクレオチドが含まれうる。他の修飾オリゴヌクレオチドには、２’位置に以下のうち１つが含まれる：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、（以上においてアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または未置換Ｃ1〜Ｃ10アルキル、またはＣ2〜Ｃ10アルケニルおよびアルキニルでもよい）。特に好ましいのは、Ｏ［（ＣＨ2）nＯ］mＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＮＨ2、Ｏ（ＣＨ2）nＣＨ3、Ｏ（ＣＨ2）nＯＮＨ2、およびＯ（ＣＨ2）nＯＮ［（ＣＨ2）nＣＨ3］2であり、ここで、ｎおよびｍは１〜約１０である。その他のオリゴヌクレオチド類には、２’位置に以下のうち１つが含まれる：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ3、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＳＯＣＨ3、ＳＯ2ＣＨ3、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ開裂基、レポーター基、インターカレーター、核酸レポーターの薬物動態学的特性を改善するための基、および同様の特性を持つ他の置換基。その他の修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ3、また、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，，７８，４８６−５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。さらに好ましい修飾には、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている、Ｏ（ＣＨ2）2ＯＮ（ＣＨ3）2基、および（本技術分野でまた、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）2が含まれる。
【００５３】
その他の修飾には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ3）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）、２’−アリル（２’−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置でありうる。例示的２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾がまた、オリゴヌクレオチドの他の部位、特に、３’末端ヌクレオチド上の糖の３’部位、または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中、および５’末端ヌクレオチドの５’位置上でおこってよい。オリゴヌクレオチド類はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位のような糖の類似体を持ってもよい。そのような修飾糖構造の調製を教示している代表的な米国特許には、限定はしないが、第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、第５，７９２，７４７号および第５，７００，９２０号（以上のうちいくつかは本願と所有者が同じであり、それぞれその全てが参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５４】
さらなる修飾には、２’−ヒドロキシル基が、糖環の３’または４’炭素原子に連結し、それによって二環状糖部位を形成する、ロックト核酸（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：ＬＮＡｓ）が含まれる。連結は、好ましくは、２’酸素原子および４’炭素原子を橋渡しするメチレン（−ＣＨ2−）n基であり、ｎは１または２である。ＬＮＡｓおよびその調製は、米国特許第６，２６８，４９０号、およびＷＯ９９／１４２２６号に記載されている。
【００５５】
オリゴヌクレオチド類にはまた、（本技術分野ではしばしば、単に「塩基（ｂａｓｅ）」として呼ばれる）核酸塩基の修飾または置換も含まれうる。本明細書で使用するところの、「未修飾」または「天然の」核酸塩基には、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンその他のピリミジン塩基のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、システインおよびチミン、５−ウラシル（擬似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルその他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、その他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような、他の合成および天然の核酸塩基が含まれる。さらなる修飾核酸塩基には、フェノキジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキザジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）のような三環状ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリミド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）のようなＧ−クランプが含まれる。修飾核酸塩基にはまた、プリンまたはピリミジン塩基が他のヘテロ環に置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンが含まれうる。さらなる核酸塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ページ８５８−８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．編Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら著，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１年，３０巻，６１３ページに開示されたもの、Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，１５章，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ページ２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９��て開示された物、が含まれる。これらの核酸塩基のいくつかのものが、本開示のオリゴマー化合物の結合親和性を増強させるために特に有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−置換ピリミジン類（５−プロピリニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む）、６−アザピリミジン類、およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン類が含まれる。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃まで、核酸二本鎖安定性を増強することが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．編Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３年，２７６−２７８ページ）好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合に特に好ましい。
【００５６】
以上に記載した修飾核酸塩基のいくつか、ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許には、限定はしないが、以上に記載した米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６４５，９８５号、第５，８３０，６５３号、第５，７６３，５８８号、第６，００５，０９６号および第５，６８１，９４１号（以上のうちいくつかは本願と所有者が共通であり、それぞれその全てが参照により本明細書に取り込まれている）および米国特許第５，７５０，６９２号が含まれる。
２．１．１  蛍光共鳴エネルギー移動
いくつかの実施形態によって、そのレポート能力がその相補的または標的核酸に核酸レポーターが結合しているかどうかに依存して変化するレポーター部位を含む組成物が提供される。例えば、いくつかの核酸レポーターは、標的分子への結合を検出し報告するために、蛍光共鳴エネルギー送達（ＦＲＥＴ）またはＬＲＥＴ（発光共鳴エネルギー送達）による消光を利用するように設計される。ＦＲＥＴは、励起状態での蛍光レポーター色素と、基底状態の消光剤間の、高度に距離依存性の相互作用である。エネルギーは、一つの分子（蛍光団）からもう一方（消光剤）へ、光子の放出なしに移動する。レポート能力のさらなる例には、標的核酸への結合時にシグナルの明らかな増加／減少が存在するするような核酸プローブにつながれたインターキレーティング色素の利用も含まれ得る。さらなる例には、標的核酸への結合時に放出エネルギーの極性状態を変化させるレポーターの利用が含まれる。
【００５７】
以上に記載したように、本開示の核酸レポーターのいくつかの実施形態は、一対の標識を含む。代表的な標識対には、限定はしないが、少なくとも１つのドナー／消光剤対、例えば色素対、または色素と非色素消光剤が含まれる。標識の対には典型的に、蛍光ドナー色素と、ドナー蛍光団に対する消光剤が含まれる。１つの実施形態において、標識は、標的配列に直接はハイブリダイゼーションしない、核酸レポーター中の配列または構造に連結している。
【００５８】
本開示の核酸レポーターには、相補物または標的核酸の存在が標的配列の存在を示すように標識可能な、任意の核酸配列または構造が含まれる。１つの実施形態において、ドナー蛍光が核酸レポーターの標的核酸への配列特異的結合の前に消光するように、そしてドナー蛍光の消光が標的の存在を示すものとして減少するように、核酸レポーター部位がドナー／消光剤色素対で標識される。核酸レポーターは、米国特許第５，９２５，５１７号に記述されたような、ステム−ループ（またはヘアピン）、または米国特許第５，６９１，１４５号に記載されたような、Ｇ−カルテットのような二次構造を持ちうる。二次構造は、ドナーおよび消光剤が二次構造が折りたたまれた時に近くに存在し、ドナー蛍光が消光されるように標識される。標的の存在下で、二次構造は、標的依存反応により展開され、ドナーおよび消光剤の間の距離が増加する。これは消光を減少させ、標的配列の存在を示すものとしての検出可能なドナー蛍光の増加を生み出す。
【００５９】
効率的なＦＲＥＴ消光がおこるために、発光団と消光分子の距離は典型的には約１００Åより短い。いくつかの実施形態において、消光剤の吸収スペクトルは蛍光団の放射スペクトルと重なる。本技術分野で知られている多くのドナー／消光剤色素対が、本発明のいくつかの実施形態にて有用である。これらには、例えば、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、ＦＩＴＣ／Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））、ＦＩＴＣ／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレネブチレート（ＰＹＢ）、ＦＩＴＣ／エオシンイソチオシアネート（ＥＩＴＣ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル１−ピレンスルホネート（ＰＹＳ）／ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ／ローダミンＸ、ＦＩＴＣ／テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）などが含まれる。
【００６０】
エネルギー移動消光機構のために、ドナー／消光剤対は、ドナー蛍光団の放射波長が消光剤の励起波長と重なるように選択可能である。すなわち十分なエネルギー移動、電荷移動または蛍光消光を可能にするために、２つの色素間の十分なスペクトル重なり合いが存在しなければならない。Ｐ−（ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）は隣接蛍光団、例えばフルオレセインまたは５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン（ＥＤＡＮＳ）、からの蛍光を効果的に消光する、非蛍光消光色素である。
【００６１】
本開示の核酸レポーター内で蛍光消光を産生する任意の色素対は、消光がおこる機構にかかわらず、開示した方法での使用のために好適である。末端および内部標識方法もまた本技術分野で知られており、核酸レポーター中のそれぞれの部位でドナーおよび消光色素を連結するためにルーチン的に使われうる。
２．２  タンパク質形質導入ドメイン
本開示の実施形態にはまた、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した核酸レポーターが含まれる。タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）または細胞透過化ペプチド（ＣＰＰ）と呼ばれる、タンパク質のいくつかの小さな領域（９〜１６アミノ酸）は、効率的に生物膜を横断する能力を与える。いかなる理論に束縛されることも意図しないが、いくつかのＰＴＤは、レセプター非依存機構によって細胞膜を通過可能であると信じられている（Ｋａｂｏｕｒｉｄｉｓ，Ｐ．（２００３）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（１１）：４９８−５０３）。ＰＴＤのいくつかが記録されているが、２つのもっとも一般的に使用されるＰＴＤは、ＨＩＶのＴＡＴタンパク質（Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５５（６）：１１８９−９３）、およびそのＰＴＤがペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）として知られているＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ由来Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ転写因子（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１（３０）：１８１８８−９３）に由来する。
【００６２】
Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインは、６８アミノ酸残基長であり、４つのアルファへリックスを含む。ペネトラチンは、Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａの第三へリックスに由来する１６個のアミノ酸配列からなる、このタンパク質の活性ドメインである（Ｆｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１２（１）：４１−８）。ＴＡＴタンパク質は８６個のアミノ酸からなり、ＨＩＶ−１の複製に関与する。ＴＡＴ  ＰＴＤは、取り込みに関して重要であるように思われる、親タンパク質の１１アミノ酸配列ドメイン（残基４７〜５７、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１）からなる（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７）。さらに、塩基性ドメインＴａｔ（４９〜５７）つまりＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号．２）（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９７（２４）：１３００３−８）は、ＰＴＤであると示された。この文献において、ＴＡＴは、細胞内取り込みのために対象タンパク質に融合されるのに好適である。グルタミンからアラニン、すなわちＱからＡへの置換、を含むＴＡＴに対するいくつかの修飾が、哺乳動物細胞において、９０％（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９７（２４）：１３００３−８）から３３倍（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２）：４７４−７）の間の細胞取り込みの増加を示した。修飾タンパク質の最も効果的な取り込みはＴＡＴ−ＰＴＤの変異実験によって明らかにされ、１１アルギニンストレッチが、細胞内送達伝達体として数倍効果的であることが示された。したがって、いくつかの実施形態に、カチオン性または両親媒性であるＰＴＤが含まれる。さらに例示のＰＴＤには、制限はしないが、ポリ−Ａｒｇ−ＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号３）、ＰＴＤ−５−ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（配列番号４）、Ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ  ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ（配列番号５）、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ（配列番号６）、ＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＴＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号７）、およびＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号８）が含まれる。
【００６３】
本開示の核酸レポーターは、レポーター組成物に直接、または間接に連結した、タンパク質形質導入ドメインを持ちうる。１つの実施形態によって、連結化学反応を促進するために、ヌクレオチドのような修飾モノマーを持つ核酸レポーターが提供される。モノマーは、アミン、カルボニル、カルボキシルおよびチオールのような、反応性官能基で修飾されていてもよく、またはヌクレオチドに付着したビオチン基を有していてもよい。そのような修飾モノマーが本技術分野で知られており、市販されており、ｄＴ（リンク  テクノロジーズ（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｓｃｏｔｌａｎｄ，ＵＫ）のような、修飾ヌクレオチド類が含まれる。タンパク質形質導入ドメインは、従来の連結化学反応を用いて、修飾ヌクレオチドに直接に連結可能であり、またはリンカーまたはスペーサー基を用いてアミン修飾ヌクレオチドに間接に連結可能である。リンカー基は、一端で修飾ヌクレオチドに連結可能であり、他端でＰＴＤに連結可能である。
【００６４】
他の実施形態において、タンパク質形質導入ドメインは、ストレプトアビジン−ビオチン連結を用いて、核酸レポーターに作動可能に連結される。核酸レポーターは、標的核酸に対して、（例えばステムの消光剤アームに対して）相補的ではない核酸レポーターの領域中に修飾モノマー、例えばビオチン−ｄＴ、を含む。連結は、炭素リンカーを介しうる。タンパク質形質導入ドメインは、ビオチン部位を含むように修飾可能である。修飾ＰＴＤおよび修飾核酸レポーターは次いで、ストレプトアビジン分子を介して連結可能である。
【００６５】
他の実施形態において、チオール−マレイミド連結が、ＰＴＤを核酸レポーターに連結するために使用される。１つの態様において、核酸レポーターの非相補領域、例えばステム領域、特に消光剤に連結したステム領域は、チオール基を核酸レポーターのモノマーに加えることによって修飾される。チオール基はＰＴＤまたは標的化シグナルのＣ末端に位置するマレイミド基と反応し、連結、特に直接かつ安定な連結を形成する。
【００６６】
他の実施形態には、ＰＴＤまたは標的化シグナルが、チオール修飾核酸レポーターとジスルフィド橋を形成するシステイン残基をＣ末端に加えることによって修飾される、開裂可能ジスルフィド橋が取り入れられる。このジスルフィド橋設計によって、ＰＴＤまたは標的化シグナルが、細胞質の環境を還元的にすることによって、核酸レポーターから開裂可能である。
【００６７】
他の実施形態によって、例えばＰＮＡプローブの場合、核酸レポーターと送達ペプチド配列との組み合わせ合成が可能になり、そこで、送達ペプチドおよび核酸プローブ配列両方が、単一ペプチドを用いて合成可能である。さらに、送達ペプチドおよび核酸プローブ間の連結が、ジスルフィド橋を還元することを用いる、または連結中の酵素的開裂部位を用いる特異的開裂を可能にするように仕立てることが可能である。
【００６８】
他の実施形態によって、核酸レポーターの、送達ペプチドとの間接的連結が可能になり、例えば、送達伝達体それ自身が、リポソーム／ポリマーのようなデンドリマー型または脂質型、または上記の任意の組み合わせであり得、核酸プローブは送達伝達体内部に収納され、送達ペプチドはそのような構造体の表面に付着している。付着した送達ペプチド（単一または多種）によって、プローブの特定の器官、組織、細胞型または細胞内区画への効率的な送達が可能であり得る。
２．３  リンカー
本開示の核酸レポーターは、リンカーまたはスペーサーを介して、タンパク質形質導入ドメインまたは標的化シグナルに連結可能である。リンカーは、原子、アミノ酸、核酸、糖または天然若しくは合成ポリマーモノマーを含む、１つまたはそれ以上のモノマーでありうる。一般的に、リンカーは、本質的に不活性であるかまたは一旦核酸レポーターに結合したならば化学的に反応しない、モノマーからなる。代表的なリンカーには、１〜１２個の炭素、典型的には約６個の炭素のアルキルリンカーが含まれる。リンカーのアルキル基は、例えばアルキルまたはアリール基、ヘテロ環、ハロゲンなどによって置換されていてもよい。リンカーのモノマーの数は変化して良いが、しかし、リンカーは、タンパク質形質導入ドメインまたは標的シグナルがその標的核酸に対する核酸レポーターの結合を立体的に邪魔することを防ぐために十分なモノマーを持つべきである。典型的には、リンカーは従来の連結化学反応を介して、タンパク質形質導入ドメインまたは標的シグナルに連結するよう修飾される。
【００６９】
リンカーは、開裂可能結合、例えば光開裂可能、温度開裂可能、または酵素的に開裂可能な結合、に連結可能であるかまたはそのような開裂可能結合を含みうる。このような結合は本技術分野で知られている。細胞への侵入に際し、開裂可能結合が開裂されうる。結合の開裂によって、ＰＴＤまたは標的化シグナルまたはその両方のが核酸レポーターから分離されうる。
２．４．連結化学反応
分子と他の分子または試薬とを連結するために使用可能な種々の連結化学反応の内、最も一般的なのは、アミン、カルボニル、カルボキシルおよびチオールである。任意の連結化学反応を利用して良いことが、当業者によって理解されるであろう。１つの分子中のアミンの、第二分子中のチオールへの間接的架橋が、ヘテロ連結体を形成するための主たる方法である。核酸レポーター、リンカーまたはタンパク質形質導入ドメインが、あらかじめ１つまたはそれ以上のチオール基を含まない場合、チオール基をチオール化手順を用いて導入可能である。
【００７０】
チオール基（またメルカプタンまたはスルフィジルとも呼ばれる）は、タンパク質のシステイン残基中に存在する。チオールはまた、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）または−メルカプトエタノールのような試薬によってシステインジスルフィドを選択的に還元することによって作製可能である。ＤＴＴまたは−メルカプトエタノールを除去すると、チオールが空気酸化によってジスルフィドへ戻ることがある。ジスルフィド結合の再形成は、チオールを含まない還元試薬トリス−（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いることによって避けることが出来る。ＴＣＥＰは一般的に、細胞膜および疎水性タンパク質コア非透過性であり、そのため水相に面したジスルフィドの選択的還元のための利用が可能である。ｐＨ非感受性および極性が小さいホスフィン誘導体トリス−（２−シアノエチル）ホスフィンが、隠れているジスルフィドとのより大きな活性を与えうる。
【００７１】
いくつかの方法が、分子内へのチオールの導入のために利用可能であり、その中には内在するジスルフィドの還元、ならびにアミン、アルデヒドまたはカルボン酸基のチオール基への変換が含まれる。（例えばタンパク質中のシステインの）ジスルフィド架橋を、ジチオスレイトール、トリス−（２−カルボキシルエチル）ホスフィンまたはトリス−（２−シアノエチル）ホスフィンによってシステイン残基に還元可能である。
【００７２】
アミンを、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートとの反応、続いてＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いた３−（２−ピリジルジチオ）プロピオニル連結体の還元によって、間接的にチオール化可能である。あるいは、スクシンイミジルアセチルチオアセテートとの反応、続いて中性に近いｐＨでの５０ｍＭ  ヒドロキシルアミンまたはヒドラジンを用いたアセチル基の除去によって、アミンを間接的にチオール化可能である。
【００７３】
シスタミンを用いたＥＤＡＣ−仲介反応、続いてＤＴＴまたはＴＣＥＰを用いたジスルフィドの還元によって、チオールをカルボン酸基に組み込むことが可能である。チオールを含まないタンパク質中のトリプトファン残基をメルカプトトリプトファン残基に酸化可能であり、次いでヨードアセタミドまたはマレイミドによって修飾可能である。
【００７４】
チオール反応性官能基は、主にアルキル化剤であり、ヨードアセタミド類、マレイミド類、ハロゲン化ベンジル類およびブロモメチルケトン類が含まれる。ハロゲン化ＮＢＤのようなアリール化剤は、ハロゲン化芳香族化合物の同様の置換によって、チオールまたはアミンと反応する。これらの官能基のうち任意のものとチオールとの反応は、通常、生理的ｐＨ範囲（ｐＨ６．５〜８．０）中、室温または室温以下で迅速に進み、化学的に安定なチオエーテルを産生する。
【００７５】
チオールはまた、イソチオシアネートおよびスクシンイミジルエステルを含む、記述された多くのアミン反応性試薬とも反応する。チオール−イソチオシアネート産物（ジチオカルバメート）は隣接アミンと反応してチオウレアを産生可能であるが、ジチオカルバメートは水とより反応しやすく、共有付加物を形成することなく、反応性試薬を消費する。
【００７６】
ヨードアセタミド類は全てのチオール（ペプチド、タンパク質およびチオール化ポリヌクレオチド中に見られるものを含む）と容易に反応して、チオエーテルを形成する。ヨードアセタミドはメチオニン残基と反応できることがある。これらはまた、ヒスチジンまたはチロシンとも反応するが、一般的に遊離チオールがない場合のみである。ヨードアセタミドはアミンの遊離塩基形態と反応できるが、ｐＨ８以下ではタンパク質のＮ−末端のアミノ基を除くほとんどの脂肪族アミンはプロトン化されており、したがって比較的反応性が低い。さらに、ヨードアセタミド類は、チオール化オリゴヌクレオチドプライマーと、ならびにいくつかの核酸中に存在するチオホスフェートおよびチオウリジン残基と反応するが、通常一般的なヌクレオチドとは反応しない。
【００７７】
ヨードアセタミドは特に溶液中で、光に対して本質的に不安定であり、したがって反応は光を落として実施すべきである。システイン、グルタチオンまたはメルカプトコハク酸の反応混合液への添加が、チオール反応性プローブの反応をクエンチし、透析またはゲル濾過によって容易に除去できる非常に水溶性の高い付加物を形成する。ヨードアセタミドがタンパク質チオールと反応する時に形成されるチオエーテル結合は非常に安定ではあるが、アミノ酸加水分解の間に、バイオ連結体はその蛍光団を失いＳ−カルボキシメチルシステインを産生する。
【００７８】
マレイミドは、チオール選択的修飾、定量および解析のために優れた試薬である。反応は、マレイミドの二重結合へのチオールの付加を伴い、チオエーテルを産生する。マレイミドは明らかに、メチオニン、ヒスチジンまたはチロシンと反応しない。マレイミドのアミンとの反応は通常、マレイミドのチオールとの反応よりも高いｐＨを必要とする。マレイミドの、異性体非反応性マレイン酸の混合物への加水分解は、特にｐＨ８以上で、チオール修飾と有意に競合する。さらに、マレイミド付加物は隣接アミンとの求核反応により、加水分解あるいは開環可能であり、架橋産物を形成する。この後者の反応は、連結の後にｐＨを９より上に上げることによって潜在的に増強可能である。
【００７９】
例えば、ジスルフィド含有リンカーまたはスペーサー（限定はしないが、約１〜約１２炭素原子のアルキルリンカーまたはスペーサーを含む）を、例えばアジド化学反応のような従来の化学反応を用いて、標的核酸塩基またはポリヌクレオチドに光または熱的に連結する。ジスルフィド結合を還元し、遊離チオールを産生する。試薬チオールとチオール反応性リンカー、ハプテン、フルオロクロム、糖、親和性リガンドその他の分子との間で共有結合が形成される。
【００８０】
２つの分子の連結はヘテロ二官能性架橋剤を用いてできる。代表的なヘテロ二官能性架橋剤には、限定はしないが、ｐ−マレイミドフェニルイソシアネート、スクシンイミジルアセチルチオアセテート、スクシンイミジル−トランス−４（マレイミジルメチル）−シクロヘキサン−１カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スクシンイミジルアセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド（ＰＥＡＳ、ＡＥＴ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、スクシンイミジルエステル（ＡＴＦＢ、ＳＥ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、ＳＴＰエステル、ナトリウム塩（ＡＴＦＢ、ＳＴＰエステル）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロベンジルアミン、塩酸、ベンゾフェノン−４−イソチオシアネート、ベンゾフェノン−４−マレイミド、４−ベンゾイル安息香酸、スクシンイミジルエステルが含まれる。ヘテロ二官能性架橋剤は、光学反応性、アミンおよび／またはチオール反応性、またはアルデヒド／ケトン反応性、またはその組み合わせであり得る。
３．標的化シグナル
本開示の核酸レポーターはまた、核酸レポーターを特定の細胞、組織または器官、ならびに特定の細胞内部位またはオルガネラに標的化する、標的化シグナルまたはドメインを含みうる。そのような標的シグナルは、本技術分野で知られている。例えば、核標的化シグナルはｈｔｔｐ：／／ｃｕｂｉｃ．ｂｉｏｃ．ｃｏｌｕｍｂｉａ．ｅｄｕ／ｄｂ／ＮＬＳｄｂ／にあるＮｕｃｌｅａｒＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎＳｉｇｎａｌＤａｔａｂａｓｅ（その全てが参照により本明細書に取り込まれる）で見ることができる。
【００８１】
代表的な核局在化シグナルには、限定はしないが、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号９）のような、ＳＶ４０Ｔ抗原またはその断片が含まれる。ＮＬＳは、約４〜約８アミノ酸の単純なカチオン性配列でありえ、あるいは約１０〜１２アミノ酸の変異耐性リンカー領域によって分離された２つの相互依存性の正の帯電クラスターを有する二部構成でありうる。さらなる代表的なＮＬＳには、限定はしないが、ＧＫＫＲＳＫＶ（配列番号１０）、ＫＳＲＫＲＫＬ（配列番号１１）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤＫ（配列番号１２）、ＲＫＫＲＫＴＥＥＥＳＰＬＫＤＫＡＫＫＳＫ（配列番号１３）、ＫＤＣＶＭＮＫＨＨＲＮＲＣＱＹＣＲＬＱＲ（配列番号１４）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１５）、および  ＫＫＹＥＮＶＶＩＫＲＳＰＲＫＲＧＲＰＲＫ（配列番号１６）が含まれる。
【００８２】
標的化シグナルはまた、本技術分野でも知られているミトコンドリアへ核酸レポーターを標的化することも可能である。代表的ミトコンドリア標的化シグナルには、限定はしないが、ヒトチトクロームオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩのミトコンドリア局在化シグナル、酵母チトクロームＣオキシダーゼサブユニットＩＶ前配列、およびラットオルニチントランスカルバミラーゼのアミノ末端リーダーペプチドが含まれる。
【００８３】
連結核酸レポーターの、クロロプラストまたはミトコンドリア内への移行に必要な特定の配列の同定は、当業者に知られた予測ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｐｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｉ／ｍｅｄｇｅｎ／ｍｉｔｏｆｉｌｔｅｒにあるツールを含む）を用いて決定可能である。
【００８４】
標的化シグナルにはまた、核酸レポーターを多数の葉酸レセプターを含む細胞（限定はしないががん細胞を含む）へ標的化する葉酸のようなビタミンも含まれうる。本開示の核酸レポーターを肝臓に標的化するために、アシアロ糖タンパク質レセプターリガンドもまた本開示の核酸レポーターに連結できる。例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン含有ペプチド、アシアロオロソムコイド、およびガラクトシド含有クラスターリガンドを利用可能である。
【００８５】
標的化配列はまた、特定の局在化シグナルに加えて、特定の区画に対して高い親和性を持つ合成小分子／リガンドでもよく、例えばミトコンドリアを両親媒性合成分子を用いて標的化可能である。
４．デュアルＦＲＥＴ／ＬＲＥＴ核酸レポーター
本開示の別の実施形態によって、（場合によって標的化シグナルに作動可能に連結し）タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した、デュアルＦＲＥＴ核酸レポーターまたは発光共鳴エネルギー送達（ＬＲＥＴ）が提供される。デュアルＦＲＥＴ核酸レポーターには、対で作動する分子ビーコンが含まれる。第一分子ビーコンがドナー色素および消光剤で標識され、第二分子ビーコンがアクセプター色素および消光剤で標識される。その相補物がない場合、色素はそのそれぞれの消光剤によってクエンチされる。第一分子ビーコンのドナー色素と第二分子ビーコンのアクセプター色素間のＦＲＥＴが、両方のビーコンが標的核酸にハイブリダイゼーションした場合にのみおこるように、デュアルＦＲＥＴ対中の各分子ビーコンには標的核酸の隣接領域に相補的な配列が含まれる。一般的に、ビーコンは、ドナー色素とアクセプター色素の距離が約６ｎｍ以下となるように、標的核酸にハイブリダイゼーションしなければならない。その全てが参照により本明細書で取り込まれる、Ｔｓｏｕｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５（３６９７−３７０３）およびＳａｎｔａｇｅｌｏ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｄ．３２（６）ｅ５７を参照のこと。
５．使用方法
本開示の実施形態を、細胞内、特に生細胞、組織または器官中の標的核酸を検出、局在化または定量するための使用可能である。代表的な細胞には、植物および動物細胞が含まれる。標的核酸は、ヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその組み合わせ、ゲノム、ｍＲＮＡ、核ＲＮＡ、酵素的ＲＮＡ、酵素的ＤＮＡ、またはリボゾームＲＮＡの任意のポリマーでありうる。本開示の方法の実施形態によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの特定の内在性ｍＲＮＡ発現のリアルタイム可視化が提供される。
【００８６】
１つの実施形態によって、標的核酸を発現していると疑われる細胞をタンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコンと接触させることを含む、標的核酸を発現している細胞を検出するための方法が提供される。分子ビーコンには、標的核酸に相補的な領域が含まれる。分子ビーコンは、不死化細胞、初代培養細胞、トランスフェクト細胞の細胞培養液に加えるか、生物または組織に投与可能である。好ましい組織は、分子ビーコンの検出を可能にする光学特性を持つ組織であり、またはｉｎ  ｖｉｖｏで励起および電磁気放射の検出のための適切な光学器具類と組み合わされた内視鏡器具の使用を伴ってもよい。好ましい生物には、ヒトおよびゼブラフィッシュが含まれる。組織で使用する場合、近赤外線標識が好ましい。
【００８７】
一たび細胞が核酸レポーターに接触すると、核酸レポーター上のＰＴＤは細胞の膜（限定はしないが脂質二重層、ミセル、小胞および核、ミトコンドリアまたはクロロプラストのようなオルガネラを含む）の移行を促進する。ＰＴＤによって、核酸レセプターは細胞外空間からオルガネラの内部を含む細胞内空間へと移動できる。核酸レポーターを、励起量の電磁放射によって照射可能である。励起量の放射は、核酸レポーターが電磁放射を放射できるようになるのに十分な放射量である。核酸レポーターによって放射される電磁気エネルギーは、核酸レポーターがその相補物に結合したことおよび細胞が標的核酸を発現していること、を示す。
【００８８】
他の実施形態によって、標的核酸を発現している細胞をえり分けるための方法が提供される。標的核酸を発現していると疑われる複数の細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結している少なくとも１つの核酸レポーター（例えば分子ビーコン）と接触させ、そこでタンパク質形質導入ドメインは、複数の細胞のうち少なくとも一つの内部への少なくとも１つの分子ビーコンの移行を促進する。分子ビーコンには、標的核酸に相補的な領域が含まれる。複数の細胞は励起量の電磁気エネルギーで照射され、少なくとも１つの複数の細胞の内部で励起量の電磁放射に対する応答として分子ビーコンによって放射された電磁気エネルギーを検出可能である。次いで、検出可能な量の電磁放射を放射している細胞を、検出可能な量の電磁放射を放射していない細胞より分離可能である。細胞を分離するための方法は本技術分野で知られており、例えば市販されている蛍光活性化細胞ソーターを用いることによる。
【００８９】
他の実施形態によって、ホスト内で、標的核酸を検出するための方法が提供される。本実施形態には、ホストに、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結し場合により標的化シグナルに連結した分子ビーコンを投与することが含まれる。一般的に、分子ビーコンは、薬理学的組成物の形態である。分子ビーコンを励起量の電磁放射で照射し、励起量の電磁放射に対する応答として分子ビーコンによって放射された電磁放射を検出する。検出された電磁放射を、ホスト、細胞、または組織中の、標的化核酸の存在、局在、および量と関係付けることができる。
【００９０】
また他の実施形態によって、細胞を（場合により標的化シグナルに連結した）タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコン（標的核酸に特異的）と接触させること；分子ビーコンを、励起量の電磁放射線で照射すること；および分子ビーコンによって放射された電磁放射線を検出することを含み、分子ビーコンからの検出可能な電磁放射線は細胞内での標的核酸の発現および局在を示唆する、生細胞内の標的核酸の発現を検出するための方法が提供される。
【００９１】
また他の実施形態によって、タンパク質形質導入ドメインならびに必要な場合は（核局在化シグナル（ＮＬＳ）のような）標的化シグナルに作動可能に連結した分子ビーコンを用いる、卵母細胞のような生細胞およびモデル生物中のＲＮＡの輸送を研究するための手法が提供される。これらの研究のために、分子ビーコンを核区画に特異的に伝達し、そこで後に細胞質に輸送されうる標的ＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションしてもよい。本ＲＮＡ輸送リアルタイムイメージングは、ＲＮＡ生物学および発生生物学のよりより理解を得るために使用されうる。さらに、分子ビーコンを、ＮＬＳのような標識シグナルに連結し、ケージド蛍光プローブを用いて修飾してもよい。元々の状態では修飾分子ビーコンはシグナルをさほど放射しない。核区画中での調節された励起を用いてケージド分子が放出され得、核から細胞質へのＲＮＡ分子の輸送を研究するために画像化可能なシグナルを放射する。
【００９２】
他の実施形態によって、ＲＮＡと細胞内オルガネラとの共局在、およびタンパク質と相互作用しているＲＮＡまたはＤＮＡ分子の動力学を研究可能な手法が提供される。この手法のために、（場合により標的化シグナルに連結した）タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコンを、対象の融合タンパク質（ＧＦＰ−タンパク質）または任意の蛍光標識タンパク質（蛍光標識抗体タンパク質）または細胞内オルガネラと連結して使用する。分子ビーコンは対象の核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を標的化し、標的とのハイブリッド時に特定の波長範囲の電磁気放射を行い、一方で融合タンパク質、任意の蛍光標識タンパク質、又はオルガネラは励起に際して、それとは重複しない波長を与える。これにより、生細胞内でのＲＮＡ−タンパク質相互作用およびその動力学を研究可能になる。
【００９３】
また他の実施形態によって、標的核酸、例えば病理学的状況（例えばがんその他の病理状態）に関与すると疑われる核酸の発現に干渉する化合物を同定するための方法が提供される。方法には、一つの生細胞または複数の生細胞を、遺伝子の発現を調整することが疑われる化合物（例えば小有機分子またはアンチセンス薬剤）に接触させること、細胞を遺伝子転写物と相補的な領域を持つ核酸レポーターに接触させること、核酸レポーターまたは細胞を励起量の電磁放射で照射すること、および核酸レポーターからの電磁放射の放射を検出することが含まれ、核酸レポーターからの検出可能な放射は遺伝子の発現または局在を示唆する。細胞は、初代培養、不死化細胞またはトランスフェクト細胞でありうる。典型的には、細胞は対象の遺伝子でトランスフェクトされ、核酸レポーターは対象の遺伝子の転写物に対し特異的である。試験化合物を、対照試料と比較した場合の、遺伝子の発現を減少させるまたは遺伝子の発現を増加させる能力に基づいて選択可能である。対照試料には、試験化合物のない状態で核酸レポーターと接触した細胞が含まれる。遺伝子の発現の減少は、核酸レポーターからの検出可能な放射がほとんどあるいは全く無いことによって示され、一方で遺伝子発現の増加は、試験化合物で処置しない細胞と比較した時の、試験化合物と処置した細胞における核酸レポーターからのより大きい検出可能な放射によって示される。このスクリーニング方法は、（例えばハイスループット検出および画像化を可能にする蛍光活性化細胞ソーター、細胞アレイ、組織アレイ、または他のマイクロ流体器具を用いることで）ハイスループットスクリーニングおよび画像化に適用可能である。コンビナトリアルライブラリーを本方法で使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子発現を調節する化合物を同定可能である。
【００９４】
他の実施形態によって、生細胞中の１つより多い標的核酸を検出する、局在化する、または定量するための方法が提供される（多重化）。この実施形態において、第一および第二核酸レポーターは独立してＰＴＤに作動可能に連結しており、場合により標的化シグナルに連結している。第一および第二核酸レポーターはそれぞれ、異なる標的認識配列を含む。標的認識配列は、同じ遺伝子の異なる形態の転写物または対立遺伝子の転写物に指向可能であり、あるいは異なる遺伝子の転写物に指向可能である。第一および第二核酸レポーターは典型的には、（例えば異なる波長で放射する）異なる検出可能シグナルを与える。
【００９５】
他の実施形態によって、治療剤（例えば、ホストの遺伝子発現を調節する治療剤、または遺伝子発現を調節すると疑われている治療剤）の効果を決定するための方法が提供される。本開示の核酸レポーターを、個体からのｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子発現データ、または個体またはホスト細胞特異的遺伝子発現データを得るために使用可能である。そのようなデータを、ホスト中の特定の遺伝子発現のレベルに基づいて、治療剤が個体において効果的であるかどうかを決定するために使用可能である。１つの実施形態によって、治療剤をホストに投与するステップ、ホストから細胞を得るステップ、細胞を、ＰＴＤに作動可能に連結し、場合により標的シグナルに作動可能に連結した核酸と接触させるステップであって、核酸レポーターが所定の標的核酸に相補的な標的認識配列を含むステップ、励起量の放射で細胞を照射するステップ、および励起量の放射に対する応答としての細胞からの電磁放射を検出するステップ、および細胞からの検出可能な電磁気放射の量を細胞内の標的核酸の量と関係付けるステップ、を含む方法が提供される。治療剤には、ホストの病状、または病状の症状を処置する、緩和する、和らげるためにホストに投与される化合物、分子、薬物またはその組み合わせが含まれる。
【００９６】
あるいは、ホストからの１つ以上の細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、標的の核酸の発現を調節すると疑われる薬剤（例えば治療薬）と接触させることができる。典型的には、細胞を治療試薬が生物学的効果を持つことを可能にする期間、インキュベート可能である。次いで細胞を、タンパク質形質導入ドメインに作動可能に連結した分子ビーコンと接触させることができるが、ここで分子ビーコンは標的核酸と相補的な標的認識配列を含む。核酸レポーターを含む細胞を励起量の放射で照射し、励起量の放射に対する応答として放射される細胞からの電磁放射を検出することができる。治療薬に暴露され分子ビーコンを含む細胞からの放射と、分子ビーコンを含むが治療薬に暴露されなかった細胞の対照試料からの放射と比較することができる。治療薬に暴露され分子ビーコンを含む細胞からの放射と、分子ビーコンを含むが治療薬剤に暴露されなかった細胞の対照試料からの放射との差異は、治療薬がホスト内の標的核酸の発現を調節することを示す。１つより多い標的核酸に特異的な１つより多い核酸レポーターを、ホスト個々に対する特定の薬剤または化合物による遺伝子発現調節のプロファイルを構築するために使用可能であることが当業者に理解されよう。そのようなデータは、１つの個体またはホストに個別化された、治療過程および特定医薬品の使用を決定することを助ける情報を、医療従事者に対して提供することができる。典型的には、薬剤または化合物は、治療的な効果を示すと、すなわち病状または病状の症状を処置または和らげると、信じられている試薬であり得る。
【００９７】
本明細書で提供されたデータは、ペプチドに基づく手法を用いる分子ビーコンの細胞伝達が、従来のトランスフェクション方法と比較してはるかに良い性能をもつことを示している。これは、ペプチド連結分子ビーコンでのみ可能になる、新たな機会を開拓する。例えば、プローブ内在化における迅速な送達速度（〜３０分）および高い効率は、分子ビーコンの高い特異性およびシグナル対バックグラウンド比と組み合わされることにより、ペプチド結合分子ビーコンプローブは、生細胞内でのリアルタイムの遺伝子発現を研究するための独創的かつ新規なシステムとなる。エンドサイトーシス経路を介して送達される（例えばリポソームに基づくトランスフェクション）場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドプローブはエンドサイトーシス小胞内にトラップされ、ヌクレアーゼによってエンドソームおよびリソソーム中で分解される傾向にある（Ｄｏｋｋａ，Ｓ．，Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ，Ｙ．（２０００）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４４，３５−４９）。ペプチドに基づく内在化によればエンドサイトーシス経路を避けることができ、したがってヌクレアーゼ分解による擬陽性シグナルを減少させる。したがって、２’−Ｏ−メチル修飾分子ビーコンの利用のようなプローブのＯＤＮ骨格修飾は必要でなくなりうる。我々の研究で示されたように、迅速なプローブ送達を迅速な光学的画像化と組み合わせることで、細胞内でのｍＲＮＡのライブ検出において高シグナル対バックグラウンドを実現できる。デュアルＦＲＥＴ分子ビーコン手法（Ｔｓｏｕｒｋａｓ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎａｌｙｔｉｃ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：３６９７−３７０３；Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２０６）ｅ５７もまた擬陽性を有意に減少させ、生細胞内でのｍＲＮＡ検出において感度を上昇させるが、同じ標的上の２つのプローブの同時ハイブリダイゼーションを必要とし、通常は３０分より長く時間かかる。一方で、ペプチド連結分子ビーコン手法は、より迅速で（〜３０分）より単純であり、これは薬物分子、毒素および外部刺激に対する応答としての生細胞中のｍＲＮＡ発現レベルの基礎生物学的研究、ＲＮＡｉのノックダウン効果、および疾患検出および診断を含むいくつかの応用により適したものであり得る。レポーターとしてＮＩＲ蛍光団を利用して、ペプチド連結分子ビーコンは、高い感度および空間分解能を持つ、奥行きのない組織の分子画像化のための強力なツールとなる可能性を持つ。
【００９８】
データはペプチドに基づくプローブ送達の高い効率を示したが、細胞膜通過の基となる機構は、概して未知のままである。いくつかの研究では、内在化が既知のエンドサイトーシス工程よりも非常に速い（Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．４：１２５−１３２）という概念と共に、細胞侵入はエンドソーム経路には依存しないと示唆しており（Ｓｉｍｅｏｎｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４）、一方で他の研究は、ＣＰＰ誘導カーゴ（積荷）内在化は古典的なエンドサイトーシスによることを指摘している（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：１４３−１５０、Ｃｏｎｓｏｌｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５１０９−３５１１４）。一つの可能性は、ペプチドと細胞表面間の初期相互作用は静電気力によるが、続く細胞膜透過化はグリコサミノグリカンによって仲介されるというものである（Ｚｉｅｇｌｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：９１８５−９１９４）。しかしながら、多くの問題がまだ未解決なままである。例えば、特定の細胞株に関して、ＴＡＴ−１および他のペプチドがカーゴを細胞核に送達する能力を持ち、このことは細胞質中の指向された動きを示唆している。異なるＣＰＰが、共通の機構に従うか、異なる経路を持つかどうかは未だに明らかではない。ＣＰＰに基づく送達機構の、より多くの生化学的および生理学的研究が、明らかに必要とされている。
【００９９】
細胞内環境中でのレポーター蛍光団の蛍光強度に関する内部制御を作製し、プローブとハイブリダイゼーションしたｍＲＮＡ分子の部分を決定することの必要性など、生細胞中のｍＲＮＡ発現を定量することには多くの課題が存在する。検出感度はまた、蛍光団の特性、蛍光検出方法、利用した光学画像化器具類、およびバックグラウンドシグナルによって影響を受ける。分子ビーコンに基づいた手法が、単一細胞内でたった１０個のｍＲＮＡ分子さえも検出可能であることが示唆された（Ｓｏｋｏｌ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５，１１５３８−１１５４３）。また、多数の細胞での平均ｍＲＮＡ発現は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別装置（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ））を用いて得ることができ、より再現性が高く統計学的により有意な結果を与える。
６．薬理学的組成物
開示の薬理学的組成物および投与形態には、開示物の薬理学的に許容可能な塩、またはその薬理学的に許容可能な多型、溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水物、または非晶質形態が含まれる。本開示の化合物の具体的な塩には、限定はしないが、ナトリウム、リチウム、カリウム塩、およびその水和物が含まれる。
【０１００】
開示の薬理学的組成物およびユニット投与形態はまた典型的に、１つまたはそれ以上の薬理学的に許容可能な賦形剤または希釈剤を含む。限定はしないが、可溶性の増加、および／または増強された流れ、純度または安定性（例えば吸湿性）特性のような、開示の特定の化合物によって提供される利点によって、開示の化合物は患者への薬理学的処方および／または投与において先行技術よりも適したものとなりうる。
【０１０１】
本開示の化合物の薬理学的ユニット投与形態は、患者への、経口、粘膜（例えば経鼻、舌下、膣内、口腔内、直腸内）、非経口（例えば筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、ボーラス注射）、局所または経皮投与に好適である。投与形態の例には、限定はしないが、錠剤、カプレット、硬ゼラチンカプセルおよび軟弾性ゼラチンカプセルのようなカプセル、カシェ剤、トローチ、ロゼンジ、分散体、座薬、軟膏、パップ（湿布）、ペースト、粉末、包帯剤、クリーム、膏薬、溶液、パッチ、エアロゾル（例えば経鼻スプレーまたは吸入剤）、ゲル、および、懸濁液（例えば水性または非水性液体懸濁液、水中油エマルジョン、または油中水液体エマルジョン）、溶液およびエリキシルを含む、患者への経口または経粘膜投与に好適な液体投与形態、患者への非経口投与に好適な液体投与形態、患者への非経口投与に好適な液体投与形態を提供するように再構築可能である、無菌固体（例えば結晶性またはアモルファス固体）が含まれる。
【０１０２】
開示の組成物の投与形態の組成、形態および型は、通常はその用途に依存して変化しうる。例えば、疾患または疾病に関与するが低レベルで発現されている核酸の検出で使用する投与形態は、疾患または疾病中で過剰発現している核酸を検出するために使用する投与形態よりも、より多い量の核酸レポーター（例えば本開示の化合物またはそれらの組み合わせ）を含んでよい。同様に、非経口投与形態は、同一の疾患または疾病を検出するために使用する経口投与形態よりも、より少ない量の核酸レポーターを含んで良い。本開示にの範囲内にある具体的投与形態が互いに相違する、これらおよびその他の点を当業者は容易に理解するであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．（１９９０年）を参照のこと。
【０１０３】
典型的な薬理学的組成物および投与形態は、１つまたはそれ以上の賦形剤を含む。好適な賦形剤は、製薬学または薬理学の当業者によく知られており、好適な賦形剤の非限定的な例は本明細書中で開示されている。特定の賦形剤が、薬理学的組成物または投与形態に組み込まれるのに好適であるかどうかは、本技術分野でよく知られている多数の因子（限定はしないが投与形態を患者に投与する方法を含む）に依存する。例えば、錠剤またはカプセルのような経口投与形態には、非経口投与形態での使用に適していない賦形剤が含まれて良い。特定の賦形剤が好適かどうかはまた、投与形態中の特定の活性成分による。例えば、いくつかの活性成分の分解が、ラクトースのようないくつかの賦形剤によって、または水に暴露したときに、加速されうる。第一級または第二級アミンを含む活性成分は、特にそのような加速分解の影響を受けやすい。
【０１０４】
本開示はさらに、それによって活性成分が分解される速度を減少させる１つまたはそれ以上の化合物を含む、薬理学的組成物および投与形態を含む。そのような化合物は安定化剤と本明細書では称され、限定はしないが、アスコルビン酸のような抗酸化剤、ｐＨ緩衝液または塩緩衝液が含まれる。さらに、本開示の薬理学的組成物または投与形態には、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはカリウムまたは有機酸のような、１つまたはそれ以上の溶解度制御剤が含まれて良い。ある具体的溶解度調節剤は、酒石酸である。
【０１０５】
賦形剤の量および型と同じように、投与形態中の活性成分の量および特定の型が、因子（限定はしないが、例えば患者に投与される経路）に依存して変化しうる。しかしながら、本開示の化合物の典型的な投与形態には、標的核酸を検出するのに十分な量の薬理学的に許容可能な塩、または薬理学的に許容可能な多型、その溶媒和物、水和物、脱水物、共結晶、無水物、または非晶質形態が含まれ、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇの範囲、好ましくは約２５ｍｇ〜約７５０ｍｇの量、より好ましくは５０ｍｇ〜５００ｍｇの量で含まれる。
【０１０６】
さらに、化合物および／または組成物は、脂質またはポリマーに基づくナノ粒子を用いて送達可能である。例えば、ナノ粒子は、非経口的に投与した薬物の薬理学的および治療的特性を改善するように設計可能である（Ａｌｌｅｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｃｕｌｌｉｓ，Ｐ．Ｒ．Ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３０３（５６６５）：１８１８−２２（２００４））。
６．１．非経口投与形態
非経口投与形態は、限定はしないが、皮下、（ボーラス注射を含む）静脈内、筋肉内および動脈内を含む、種々の経路によって患者に投与可能である。非経口投与形態の投与は、汚染物に対する患者の自然防御を回避するので、非経口投与形態は無菌であるか患者への投与前に滅菌可能であることが好ましい。非経口投与形態の例には、限定はしないが、注射可能な溶液、注射のための薬理学的に許容可能な賦形剤中に溶解または懸濁可能な乾燥製品、注射可能な懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。さらに、患者の投与のために制御放出非経口投与形態を調製することもでき、限定はしないが、ＤＵＲＯＳ（登録商標）型投与形態の投与、および急速放出（ｄｏｓｅ−ｄｕｍｐｉｎｇ）が含まれる。
【０１０７】
本開示の非経口投与形態を提供するために使用可能な好適なビヒクルは、当業者によく知られている。例には、限定はしないが、滅菌水、注射用水（Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）ＵＳＰ、食塩水、グルコース溶液、（限定はしないが、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、乳酸化リンガー注射液のような）水性ビヒクル、（限定はしないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロポレングリコールのような）水混和性ビヒクル、および（限定はしないがモロコシ油、木綿油、ピーナッツ油、ごま油、オレイン酸エチル、ミリスチル酸イソプロピルおよび安息香酸ベンジルのような）非水性ビヒクルが含まれる。
【０１０８】
本明細書で、本開示の組成物の薬理学的に許容可能な塩の水溶性を変化または改変する化合物もまた、本開示の非経口投与形態（従来の、および制御放出非経口投与形態を含む）内に組み込むことができる。
６．２．局所、経皮および粘膜投与形態
本開示の局所投与形態には、限定はしないが、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、シャンプー、スプレー、エアロゾル、溶液、エマルジョン、および当業者に知られている他の形態が含まれる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０年）、およびＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ４版，Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９８５年）を参照のこと。スプレー可能ではない局所投与形態のために、局所適用に適合し好ましくは水よりも大きな動的粘性を有する、担体または１つまたはそれ以上の賦形剤を含む、粘性〜半固体または固体形態が典型的に使用される。好適な処方には、限定はしないが、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、塗布薬、軟膏などが含まれ、必要であれば、滅菌されるか、または（例えば浸透圧のような）種々の特性に影響を与えるための補助剤（例えば保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液または塩）と混合される。その他の好適な局所投与形態にはスプレー可能なエアロゾル調製物が含まれ、そこで好ましくは固体または液体不活性担体と組み合わされて、活性成分を、加圧揮発性（例えばフレオンのようなガス噴射剤）との混合物中、またはスクイーズボトル中にパッケージする。加湿剤または湿潤剤も、必要ならば、薬理学的組成物および投与形態に加えることが可能である。そのような追加的成分の例は本技術分野でよく知られている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０年）を参照のこと。
【０１０９】
本開示の組成物の経皮および粘膜投与形態には、限定はしないが、眼用溶液、パッチ、スプレー、エアロゾル、クリーム、ローション、座薬、軟膏、ゲル、溶液、エマルジョン、懸濁液、または当業者に知られている他の形態が含まれる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（１９９０年）、およびＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，４版，Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９８５年）を参照のこと。口腔内の軟骨組織を処置するために好適な投与形態は、うがい薬として、口腔ゲルとして、または頬パッチとして処方可能である。さらなる経皮投与形態には、皮膚に適用し、所望量の活性成分の浸透を可能にする特定の時間塗布することができる、「貯蔵型」または「マトリックス型」パッチが含まれる。
【０１１０】
本開示の活性成分（類）を投与するために使用可能な経皮投与形態と投与方法の例には、限定はしないが、米国特許第４，６２４，６６５号、第４，６５５，７６７号、第４，６８７，４８１号、第４，７９７，２８４号、第４，８１０，４９９号、第４，８３４，９７８号、第４，８７７，６１８号、第４，８８０，６３３号、第４，９１７，８９５号、第４，９２７，６８７号、第４，９５６，１７１号、第５，０３５，８９４号、第５，０９１，１８６号、第５，１６３，８９９号、第５，２３２，７０２号、第５，２３４，６９０号、第５，２７３，７５５号、第５，２７３，７５６号、第５，３０８，６２５号、第５，３５６，６３２号、第５，３５８，７１５号、第５，３７２，５７９号、第５，４２１，８１６号、第５，４６６，４６５号、第５，４９４，６８０号、第５，５０５，９５８号、第５，５５４，３８１号、第５，５６０，９２２号、第５，５８５，１１１号、第５，６５６，２８５号、第５，６６７，７９８号、第５，６９８，２１７号、第５，７４１，５１１号、第５，７４７，７８３号、第５，７７０，２１９号、第５，８１４，５９９号、第５，８１７，３３２号、第５，８３３，６４７号、第５，８７９，３２２号および第５，９０６，８３０号（それぞれ、その全てが参照により本明細書に取り込まれている）に開示されたものが含まれる。
【０１１１】
本開示に含まれる、経皮および粘膜投与形態を提供するために使用可能な好適な賦形剤（例えば担体および希釈液）その他の物質は、薬理学的技術分野の当業者によく知られており、該薬理学的組成物または投与形態が適用される特定の組織または器官に依存する。その事実を考慮した上で、非毒性で薬理学的に許容可能な投与形態を形成するために、典型的な賦形剤には、限定はしないが、水、アセトン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、ミネラル油およびその混合物が含まれる。
【０１１２】
処置すべき特定の組織によっては、本開示の組成物の薬理学的に許容可能な塩での処置の前に、共に、または後に、追加成分を使用して良い。例えば、浸透増強剤を、活性成分を組織へ、または組織を通過して送達することを補助するために使用可能である。好適な浸透増強剤には、限定はしないが、アセトン、エタノール、オレイル、テトラヒドロフリルのような種々のアルコール類、ジメチルスルホキシドのようなアルキルスルホキシド類、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドンのようなピロリドン類、Ｋｏｌｌｉｄｏｎグレード類（ポビドン（Ｐｏｖｉｄｏｎｅ）、ポリビドン（Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ）、尿素、およびＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート８０）およびＳＰＡＮ６０（モノステアリン酸ソルビタン）のような、種々の水溶性または不溶性糖エステル類が含まれる。
【０１１３】
薬理学的組成物または投与形態のｐＨ、または薬理学的組成物または投与形態を投与した組織のｐＨもまた、活性成分（類）の送達を改善するために調節されうる。同様に、溶媒担体の極性、そのイオン強度、または張力を、送達を改善するために調節可能である。送達を改善するよう活性成分（類）の親水性または親油性を有利に変えるために、ステアリン酸のような化合物もまた、薬理学的組成物または投与形態に加えることができる。これに関して、ステアリン酸は、処方の脂質ビヒクルとして、エマルジョン試薬または界面活性剤として、そして送達増強または浸透増強剤として働きうる。本開示の組成物の薬理学的に許容可能な塩の異なる水和物、脱水物、共結晶、溶媒和物、多型、無水物または非晶質形態を、得られる組成物の特性をさらに調節するために使用してもよい。
７．キット
本開示は、本開示の核酸レポーターと、その使用のための、例えば書面の取扱説明書のような指示書を含むキットを含む。典型的には、キットには所定の標的核酸と相補的な領域を持つ核酸レポーターのユニットが含まれる。キットにはさらに、細胞培養またはホストに核酸を投与するための、本技術分野で知られている適切な緩衝液および試薬が含まれる。キットにはまた、１つより多い標的核酸に特異的な、複数の本開示の核酸レポーターも含まれうる。
【０１１４】
実施例
実施例１
ペプチド結合分子ビーコンの設計
ヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）とｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡに標的化されたペプチド連結分子ビーコン、ならびに「ランダム」プローブ配列を持つ分子ビーコンを設計し、合成した。これらの分子ビーコンの具体的設計、および本研究で使用した１１アミノ酸ＴＡＴ−１ペプチドの配列を、表１で示している。ＧＡＰＤＨは、膜融合、微小管バンドリング、核ＲＮＡエクスポート、ＤＮＡ複製および修復を含む、哺乳動物内の種々の範囲の活性を持つ、糖分解タンパク質である（Ｓｉｒｏｖｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９９年）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４３２：１５９−８４）。これらの活性は、ＧＡＰＤＨが、アポトーシス、年齢関連神経変性疾患、前立腺がんおよびウイルス発症に関与することを示唆している。ｓｕｒｖｉｖｉｎ  は、アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーの一メンバーであり、また、細胞分裂を制御する（Ｃｈｉｏｕ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｍｏｎｉｔ．９：ＰＩ２５−２９）。ＧＡＰＤＨビーコンは、ステムを形成するためにハイブリダイゼーションする相補的５−塩基配列が隣接する、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＥｘｏｎ６領域を標的化する１９−塩基プローブドメインからなる。ｓｕｒｖｉｖｉｎビーコンは、同様のステム設計を持つ、１６−塩基標的配列を持つ。「ランダム」ビーコンは、全ヒトゲノム中でいかなるマッチをも持たない１７−塩基プローブ配列を有する、ネガティブコントロールとして設計された。良好な標的接近性を確保するために、同一のｍＲＡＮ分子の異なる区画に相補的な複数の分子ビーコンを、典型的には、ＲＮＡ−結合タンパク質によって占有された標的化配列または二本鎖ＲＮＡが形成される場所を避けるために、設計し、試験する。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
送達ペプチドを分子ビーコンに接着させる際に、図１で例示したように、３つの連結戦略を開発した。第一手法（図１Ａ）では、修飾オリゴヌクレオチドであるビオチン−ｄＴを１２炭素のリンカーを介してステムの消光剤アームに導入することによって、ペプチドをストレプトアビジン−ビオチン橋を介して分子ビーコンに連結した。例示的ペプチド連結分子ビーコンには、ビオチン−修飾分子ビーコン、ストレプトアビジン分子、およびビオチン−修飾ＴＡＴ−１ペプチドが含まれた。各ストレプトアビジン分子が、４つのビオチン結合部位を持つので、ビオチン−修飾分子ビーコンおよび送達ペプチドを、同一のストレプトアビジン分子上に連結可能であった。同一のストレプトアビジンに１つより多い分子ビーコンが連結する可能性を小さくするように、化学量論を制御した。第二設計（図１Ｂ）では、チオール基を炭素リンカーを介して分子ビーコンステムの消光剤アーム上に配置し、次いでこのチオール基がペプチドのＣ末端に加えられたマレイミド基と反応してチオール−マレイミド結合を形成する（図１Ｂ）。ストレプトアビジン−ビオチン橋とチオール−マレイミド連結はどちらも細胞質中で安定である。
【０１１７】
特定の細胞型に関して、ＴＡＴ−１ペプチドを含むＣＰＰは、細胞核内にカーゴを運ぶ傾向にある（Ｓｎｙｄｅｒ，Ｅ．Ｌ．ａｎｄ  Ｄｏｗｄｙ，Ｓ．Ｆ．（２００１年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５２、Ｎｏｒｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４：４４−５０）。このことはポリアデニル化核ＲＮＡ（ＰＡＮ）のような核ＲＮＡ標的を検出する際には有用ではありうるが、ほとんどの応用においては標的ｍＲＮＡは細胞質中にあり、よって分子ビーコンであるべきである。したがって、図１Ｃで示されたように、第三手法としてＴＡＴ−１ペプチドを、チオール−修飾分子ビーコンとジスルフィド橋を形成するシステイン残基をＣ末端に加えることによって、官能化した。この開裂設計は、ひとたび構築物が細胞に入ると細胞質の還元的環境によってジスルフィド結合が開裂し、それによってペプチドがプローブより分離するという原理に基づいた。
【０１１８】
実施例２
ペプチド連結体
図１Ａで示した設計では、ビオチンへの高い親和性と、複数のビオチン結合部位が利用できることから、ストレプトアビジンがリンカー分子として選択された。ステムの消光剤−アーム上の３’末端から３つ目の塩基である修飾ヌクレオチド（ｄＴ）が、１２炭素のリンカーを介してビオチンに連結し、ビオチン−修飾ペプチドは、ビオチンとストレプトアビジン間の結合を介して、ビオチン−修飾分子ビーコンに連結された。ペプチド連結分子ビーコン複合体を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ、１０Ｋ  ＭＷＣＯ（ピアス  バイオテック社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ，）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて、ＰＢＳ（１×）で一晩透析し、緩衝液を交換し、非連結ペプチドを除去した。修飾分子ビーコンを、インテグレイテッド  ＤＮＡ  テクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、およびＭＷＧ  バイオテック社（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）で合成し、修飾ペプチドは、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびシンペップ社（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）で合成した。図１Ｂおよび１Ｃにて示された直接連結手法では、ステムの消光剤アーム上の同一の位置に、６炭素のリンカーを有する修飾ヌクレオチドｄＴ−アミン基がある。
【０１１９】
ペプチドおよび分子ビーコン間に直接の安定な結合を形成するために、ペプチドのＣ末端をマレイミド基で修飾した。ＰＢＳ緩衝液中で、アミン修飾分子ビーコンを２倍モル過剰量のヘテロ二官能性架橋剤ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）））と、２時間反応させ、その後、２０倍モル過剰量のＴＣＥＰ（塩酸３，３’，３’’−ホスフィニジン−トリプロピオン酸（シグマ−アルドリッチ））で還元し、遊離チオール（−ＳＨ）官能基を作製した。次いで、このチオール化ビーコンを、マレイミド−修飾ペプチドと反応させて、ビーコンおよびペプチド間の安定な化学橋を形成した。ペプチド連結分子ビーコン複合体を、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｕｎｉｔ、１０Ｋ  ＭＷＣＯ（ピアス  バイオテック社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて一晩透析して、非連結ペプチドを除去した。
【０１２０】
同様の手法を、システイン修飾ペプチドおよびアミン修飾分子ビーコン間の、開裂可能なジスルフィド橋を形成することにおいて使用した。ビーコン−ビーコン連結体の形成の可能性を減少させるために、ビーコンと比較してより高い（１．５×）濃度のペプチドを使用した。さらに、ペプチドの正電荷が、ペプチドのホモ二量体化の防止を助けた。
【０１２１】
実施例３
ハイブリダイゼーション速度とシングル対バックグラウンド比の溶液アッセイ
ペプチド連結分子ビーコンの、ハイブリダイゼーション速度およびシングル対バックグラウンド比の測定を、ＳＡＦＩＲＥマイクロプレートモノクロメーター読み取り機（ＴＥＣＡＮ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて実施した。速度論研究のために、２００ｎＭペプチド連結分子ビーコンを３７℃で１μＭ相補オリゴヌクレオチド標的と混合し、従来の分子ビーコン、直接連結（安定および開裂可能）ペプチド−分子ビーコン複合体、およびストレプトアビジン連結ペプチド−分子ビーコン複合体について、蛍光強度を時間の関数として記録した。シグナル対バックグラウンド比を決定するために、２００ｎＭの従来のペプチド連結分子ビーコンを、マイクロプレート読み取り機中で２００ｎＭの相補的標的と混合し、平衡時の蛍光強度を記録した。標的のない状態での、各分子ビーコン型（従来、およびペプチド連結）の蛍光シグナルを、バックグラウンドシグナルとして記録した。全ての溶液アッセイは、１×ＰＢＳ緩衝液中で実施した。
【０１２２】
実施例４
ペプチド連結分子ビーコンの細胞送達
初代ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）（Ｃａｍｂｒｅｘ，ＮＪ）および膵臓がん細胞株ＭｉａＰａｃａ−２（ＡＴＣＣ，ＶＡ）を使用した。これらの細胞を、実験前２４時間、ガラスカバースリップ底を持つ８ウェルＮａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ培養プレート中でそれぞれの細胞培養培地中で培養した。送達アッセイを、３７℃で細胞をペプチド連結分子ビーコンを含む培地を用いてインキュベートすることによって実施した。ＧＡＰＤＨに標的化されている分子ビーコンについては、３つの異なる濃度（０．２５μＭ、０．５μＭおよび１．０μＭ）で、ペプチド連結分子ビーコンを、３０、６０および９０分間、ＨＤＦ細胞とともにインキュベートした。ｓｕｒｖｉｖｉｎに標的化されている分子ビーコンについては、０．５μＭのペプチド連結分子ビーコンを、ＨＤＦおよびＭｉａＰａｃａ−２細胞とともに、３０分間インキュベートした。全てのアッセイのために、細胞をＰＢＳで二回洗浄してインキュベーション培地を除去し、蛍光画像化のために新鮮な培地中に入れ、蛍光画像化を共焦点顕微鏡（アキシオヴァート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）ＬＳＭ−１００、Ｚｅｉｓｓ）を用いて実施した。
【０１２３】
実施例５
蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
正常ヒト皮膚繊維芽細胞を、８−ウェルチャンバーカバースライド中で正常の培養培地（ＦＧＭ−２  Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏ．）中、２４時間培養し、次いで、１×ＰＢＳ（ＣａまたはＭｇなし）で洗浄した。スライドを、−２０℃にて、１０分間、１００％メタノール中で固定した。メタノールを除去した後、スライドを風乾させ、−８０℃にて一晩保存した。次いで、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを、まずスライドを１×ＰＢＳ中で５分間洗浄し、２００ｎＭの未修飾ＧＡＰＤＨ−標的化分子ビーコンを含む、１×ＰＢＳ（ＣａまたはＭｇなし）中で、３７℃にて一晩ハイブリダイゼーションすることによって実施した。洗浄によってハイブリダイゼーション溶液を除去し１×ＰＢＳを添加した後、細胞を、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００落射型蛍光顕微鏡を用いて画像化した。
【０１２４】
あるいは、正常ＨＤＦ細胞を、−２０℃で１０分間、１００％メタノール中で固定し、乾燥させ、−８０℃にて１２時間維持した。ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを、野生型Ｋ−ｒａｓおよびＧＡＰＤＨに標的化された蛍光標識直鎖プローブ４００ｎＭで、上記のように実施した。細胞を、洗浄によってハイブリダイゼーション溶液を除去し、１×ＰＢＳを加えた後に、画像化した。
【０１２５】
実施例６
市販トランスフェクション試薬を用いた、分子ビーコンの送達
異なる送達方法の効率および機能性を比較するために、３つの市販のトランスフェクション試薬を使用した：エフェクチン（ＥＦＦＥＣＴＩＮＥ、登録商標）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））、スーパーフェクト（ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ、登録商標）（キアゲン）およびオリゴフェクチミン（ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＩＭＩＮＥ、商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））。トランスフェクションアッセイを、それぞれの供給業者によって推奨された手順にしたがって実施した。初代ＨＤＦ細胞およびＭｉａＰａｃａ−２膵臓がん細胞両方を、０．５、２および３．５時間、従来の（未修飾）分子ビーコンとともにインキュベートした。
【０１２６】
実施例７
ペプチド連結分子ビーコンのハイブリダイゼーション速度
分子ビーコン機能における、ペプチド連結体の効果を決定するために、溶液内ハイブリダイゼーションアッセイを、異なる連結方法を用いてペプチド−連結分子ビーコンの結合速度論について実施した。１つの懸案事項は、正に帯電したＴＡＴ−１ペプチドが、分子ビーコンに連結された時に、負に帯電したヘアピンオリゴヌクレオチドと相互作用し、したがって適切なプローブ−標的結合を妨げるかもしれないことであった。未修飾ＧＡＰＤＨ−標的化分子ビーコンおよびストレプトアビジン−ビオチン連結、安定チオール−マレイミド連結、および開裂可能ジスルフィド橋を持つ、ペプチド連結分子ビーコンについての、プローブ−標的ハイブリダイゼーションの結果としての正規化蛍光強度対時間曲線が、図２Ａに示されている。チオール−マレイミド結合を持つペプチド連結分子ビーコンは、未修飾分子ビーコンとほぼ同じプローブ−標的ハイブリダイゼーション速度論を持ち（それぞれ図２Ａの黒および緑曲線）、このことはチオール−マレイミド結合を用いるペプチドの連結は本質的に、分子ビーコンの機能性に影響を与えないことを示唆している。開裂可能ジスルフィド橋を持つ分子ビーコンもまた、未修飾のものと同様に振る舞う。ストレプトアビジン−ビオチン結合では、図２Ａから分かるように、ペプチド連結分子ビーコンのハイブリダイゼーション速度はわずかに遅いもののシグナルレベルには影響を与えなかった。分子ビーコンと同程度の大きさのストレプトアビジン分子が、標的とヘアピンプローブ間の結合を立体的に阻害し、これがわずかに遅いハイブリダイゼーション速度につながったのかもしれない。ペプチド連結分子ビーコンについてのＳ／Ｂは、未修飾のものよりもわずかに小さいものの、異なる連結方法のシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）に対する効果は比較的小さい（図２Ｂ）。まとめると、図２に示された結果は、ペプチドの分子ビーコンへの連結は、その正常な機能を害することはなかったことを示している。
【０１２７】
実施例８
ペプチド連結分子ビーコンを用いた、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの検出
ペプチド連結分子ビーコンの自己送達およびｍＲＮＡ標的化機能を実証するために、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＨＤＦ）中のハウスキーピング遺伝子ヒトＧＡＰＤＨの検出ｍＲＮＡを検出した。ＴＡＴペプチド連結ＧＡＰＤＨ標的化分子ビーコンとちょうど３０分インキュベーションした時点で、三つの連結スキーム全て（すなわちチオール−マレイミド（図３Ａ）、ジスルフィド橋（図３Ｂ）、およびストレプトアビジン−ビオチン（図３Ｃ））についての、分子ビーコン−標的ｍＲＮＡハイブリダイゼーションの結果としてのＨＤＦ細胞中での明確で局在化した蛍光シグナルが観察された。反対に、ストレプトアビジン−ビオチン共役を有するペプチド連結ランダム配列分子ビーコンは、送達後３０分の時点で本質的にシグナルを与えなかった（図３Ｄ）。
【０１２８】
同様の結果が、ペプチドへのチオール−マレイミドおよびジスルフィド結合を有するランダム配列分子ビーコンを用いて得られた。このことは、ペプチド連結分子ビーコンが、内在化の後で、生細胞中で依然として高度に特異的であることを示している。さらに、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡが、細胞核を取り巻き、細胞形態にしたがう明確な傾向をもって、ＨＤＦ細胞中で興味深いフィラメント様局在パターンを示したしたことがわかった（図３Ａ−Ｃ）。興味深いことに、開裂可能（チオール−システインジスルフィド橋）設計を持つ分子ビーコンは、チオール−マレイミド結合を持つものよりも、よりよい局在化パターンを与えるようであり、後者は、ストレプトアビジン−ビオチン結合を持つ分子ビーコンよりもよく良く機能するように見える。構築物からの送達ペプチドの開裂によって、分子ビーコンは標的ｍＲＮＡ分子によりよく接近することができたのかもしれないが、本現象のさらなる研究が本仮説を評価するために必要である。比較的大きなストレプトアビジン分子を持つ分子ビーコンは、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの二次構造内へ侵入する能力に乏しく、したがってその標的を発見するその能力が低下しているようである。ＧＡＰＤＨペプチド−連結分子ビーコンに暴露されたほとんど全てのＨＤＦ細胞が、強力な蛍光シグナルを示しており、１００％近い送達効率を暗示している（データは示していない）。
【０１２９】
同様の結果が、６０分インキュベーションした時点で得られた（図３Ｅ−Ｈ）。おおよそ同レベルの蛍光が、ペプチドへの異なる連結を持つＧＡＰＤＨ標的化分子ビーコンに関して観察され、一方で、ランダム配列分子ビーコンはさほど多くのシグナルを与えなかった。９０分の時点でさえ、シグナルレベルの増加は本質的になく（データは示していない）、このことは、ほとんどのペプチド連結分子ビーコンが、最初の３０分以内にＨＤＦ細胞に入ることを示唆している。さらに、ＨＤＦ細胞中の蛍光シグナルレベルおよびｍＲＮＡ局在化パターンは、三つの異なる名目分子ビーコン濃度（０．２５μＭ、０．５μＭおよび１．０μＭ）での実験において同様であった。ペプチド連結過程によって、０．２５μＭの名目分子ビーコン濃度で、アッセイにて使用した実際のペプチド連結分子ビーコンの濃度は約１５０〜２００ｎＭであったと見積もられた。
【０１３０】
実施例９
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションとの比較
伝統的な方法と、本方法の結果を相互に関連づけるために、固定ＨＤＦ細胞中での、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ標的化蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを実施した。ＦＩＳＨアッセイで使用したプローブは、ＧＡＰＤＨ−標的化分子ビーコンと同じプローブ配列を持つ、蛍光標識直鎖プローブ（５’−Ｃｙ５−ＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴＡＣＣＡ−３’）（配列番号２１）であった。図４Ａに示されたように、ＨＤＦ細胞中のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡのＦＩＳＨアッセイで得られた蛍光イメージは、図３に示されたものと同様のフィラメント局在パターンを与え、本研究で明らかになったｍＲＮＡ局在が人為的ではないことが確認された。しかしながら、ＦＩＳＨの結果としての蛍光シグナルは、生細胞アッセイでのものほどはっきりしていなかった。ＦＩＳＨの間に、細胞質および核両方にプローブが入ったので、拡散蛍光シグナルが、固定ＨＤＦ細胞核中で現れた（図４Ａ）。このことは、細胞核中で非常に低いシグナルが観察できる図３に示された生細胞イメージとは対照的である。この拡散シグナルは、細胞核内のＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの量の多さならびに比較的均一な分散を反映しているのかもしれない。ネガティブコントロールとして、我々は、蛍光標識直鎖ポリ−Ａプローブ（５’−Ｃｙ５−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−３’）（配列番号．２２）を用いたＦＩＳＨアッセイを実施し、図４Ｂに見られるように得られたバックグラウンドシグナルは非常に低かった。このことはさらに、我々による特定のｍＲＮＡ検出の生細胞および固定細胞研究によって観察された蛍光シグナルが、本当にプローブ／標的ハイブリダイゼーションによるものであることを確かにした。
【０１３１】
実施例１０
ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの検出
分子ビーコンの、遺伝子転写レベルを決定する能力を示すために、生ＨＤＦおよびＭｉａＰａｃａ−２細胞中のｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの発現を観察した。ｓｕｒｖｉｖｉｎ  発現レベルはＨＤＦ細胞で非常に低く、一方で、ＭｉａＰａＣａ−２細胞でそのレベルは比較的高い。ペプチド連結分子ビーコンとのインキュベーションを６０分した時点で、ＭｉａＰａｃａ−２細胞中の蛍光シグナルは、図５Ａで示したように非常に高く、しかしＨＤＦ細胞では、非常に低い蛍光シグナルしか検出できなかった（図５Ｃ）。さらに、ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡは興味深い局在パターンを示し、すなわちＭｉａＰａＣａ−２細胞中のｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ分子は細胞核の１つの側の近くに集中されているように見られた（図５Ｂ）。非常に低い発現レベルではあるが、ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡはＨＤＦ中で同様の様式で局在した（図５Ｃ）。先の研究によって、ｓｕｒｖｉｖｉｎ  の発現レベルおよび局在が、がん進展または予後に関する重要な指標でありうることが示唆された（Ｏｋａｄａ，Ｅ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．１６３：１０９−１１６）。
【０１３２】
実施例１１
従来のトランスフェクション方法との比較
以上で言及したように、リポソームまたはデンドリマーに基づく従来のトランスフェクション法を用いる分子ビーコンの細胞送達は、典型的には３〜４時間のインキュベーションを必要とするが、その間に高レベルのバックグラウンドシグナルが生み出される。内在化の間の分子ビーコンの送達効率および安定性を比較するために、本発明者らは３つの市販されたトランスフェクション試薬、スーパーフェクト（ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（登録商標）（デンドリマーに基づく））、オリゴフェクタミン（ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（リポソームに基づく））、およびエフェクテン（ＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）（リポソームに基づく））を用いた未修飾ＧＡＰＤＨ標的化分子ビーコンの送達研究を実施し、製造業者の取扱説明書に全て従った。スーパーフェクト、オリゴフェクタミン（商標）またはエフェクテン（商標）を用いるＧＡＰＤＨビーコン送達の開始から３０分後にＨＤＦ細胞中の蛍光を観察された時には本質的にシグナルは存在しなかった（データは示していない）。スーパーフェクト（登録商標）でのトランスフェクションの開始から３．５時間後、分子ビーコンがＨＤＦ細胞中で強力なシグナルを与えたことが分かった。しかしながら蛍光イメージは、ペプチド連結分子ビーコンのものとは異なった特徴を有していた。特に、蛍光シグナルがは細胞質および核両方でランダムな「明スポット」に集中しており（図６Ａ）、これは、分子ビーコンがエンドソーム、リポソームおよび核によってトラップされ、分解されたことを示唆している。さらに厄介なことに、ランダム配列分子ビーコンはＨＤＦ細胞中で同様の蛍光シグナルレベルと「明スポット」を示し（図６Ｄ）、これは両方の場合におけるシグナルが、ほとんどが分子ビーコン分解に起因することを示唆している。オリゴフェクタミン（商標）トランスフェクションを用いた場合、３．５時間インキュベーションした時点での結果はさらに悪く、ＨＤＦ細胞中で、ＧＡＰＤＨ標的化およびランダム配列分子ビーコンによって産生されたのと同様のシグナルレベルの高度に集中した明スポットが存在するのみであった（図６Ｂおよび６Ｅ）。分子ビーコン送達のためにエフェクテン（登録商標）を用いることによって、図６ａおよび６ｅで示した対応するイメージと似た蛍光イメージが得られた（図６ｃおよび５ｆはそれぞれＧＡＰＤＨ標的化、ランダム配列分子ビーコンを用いた場合）。明らかに、生細胞遺伝子検出アッセイのために分子ビーコンを送達する際には、これらのトランスフェクション方法を用いることには注意を払わなければならない。
【０１３３】
実施例１２
Ｋ−ｒａｓ標的化分子ビーコン
Ｋ−ｒａｓ標的化および「ランダム」配列分子ビーコン対は、共有−ステム（ｓｈａｒｅｄ  ｓｔｅｍ）設計を採用した（Ｔｓｏｕｒｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。Ｋ−ｒａｓ標的化分子ビーコン、ＧＡＰＤＨ標的化分子ビーコンおよびＣｙ５標識ランダムビーコンは、バイオソースインターナショナル（Ｂｉｏｓｏｕｒｓｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）およびＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）が合成した。Ｃｙ３標識ランダムビーコンおよび全ての合成標的は、インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成された。ＧＡＰＤＨ標的化分子ビーコン（表２を参照のこと）は、ステム配列が、標的配列と独立であるように設計した。図２で示したすべてのビーコン設計中の下線塩基は、分子ビーコンのステムを形成するために加えられた塩基を示している。
【０１３４】
【表２】
2007525967.tif 000004
【０１３５】
実施例１３
分子ビーコンのＳＬＯ送達とオルガネラ標識
Ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡに標的化されている分子ビーコンを、ＳＬＯでの可逆透過化法を用いて生細胞の細胞質内に送達した。詳細なプロトコールは、他に記載されている（Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２（６）：ｅ５７）。簡単に記すと、ＳＬＯをまず、２Ｕ／ｍｌのＳＬＯに対して５ｍＭのＴＣＥＰを３７℃にて３０分間加えることで活性化した。細胞を２４−ウェルプレート中で増殖させ、０．２Ｕ／ｍｌの活性化ＳＬＯ（０．５Ｕ  ＳＬＯ／１０6細胞）および５μｌの各分子ビーコンを含む、血清を含まない培地２００μｌ中で、１０分間インキュベートした。細胞を、０．５ｍｉｌの典型的な増殖培地を加えることによって再封入し、蛍光顕微鏡画像化を実施する前に、３７℃にて一時間インキュベートした。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを標的としている分子ビーコンを、以上で提供したように、ジスルフィド橋を介してＴＡＴペプチドに連結した。ミトコンドリアとＥＲを画像化するために、マイトフルオルグリーン（ＭｉｔｏＦｌｏｕｒ  Ｇｒｅｅｎ（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）））およびＥＲトラッカー（ＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒ（モレキュラープローブス））を、それぞれモレキュラープローブスによって提供されたプロトコールにしたがって利用した。細胞をそれぞれの色素と共に、分子ビーコンの送達に先立ち３０分間インキュベートした。
【０１３６】
実施例１４
デュアルＦＲＥＴ分子ビーコン
デュアルＦＲＥＴ分子ビーコンのために、Ｃｙ３およびＣｙ５をそれぞれドナーおよびアクセプター蛍光団として選択し、ＦＲＥＴシグナル検出のために５４５ｎｍで励起し、６７０ｎｍで放射検出した。マイトフルオルグリーン（ＭｉｔｏＦｌｏｕｒ  Ｇｒｅｅｎ）は、Ｃｙ３−Ｃｙ５  ＦＲＥＴ対との可能性あるスペクトル重複を避け、ミトコンドリアを標識するように選択した。特に、マイトフルオルグリーン（ＭｉｔｏＦｌｏｕｒ  Ｇｒｅｅｎ）の蛍光シグナルを、４５０±２５ｎｍの励起波長下、５１０〜５３０ｎｍの帯域フィルターを用いて検出した。図８で示したように、マイトフルオルグリーン（ＭｉｔｏＦｌｏｕｒ  Ｇｒｅｅｎ）は、本質的に５４５ｎｍで全く励起せず（Ｃｙ３励起）、６７０ｎｍの放射をしない（Ｃｙ５放射検出）ので、分子ビーコンによるＦＲＥＴシグナルを検出するために使用した光学機器は、図７Ａで示したミトコンドリアのイメージに何の影響も持たないはずである。同様に、４８８ｎｍではＣｙ３の励起は非常に限られており、５１０〜５３０ｎｍにＣｙ３の蛍光放射は無い（図８）。したがって、Ｋ−ｒａｓ  ｍＲＮＡのＦＲＥＴ検出と、マイトフルオルグリーン（ＭｉｔｏＦｌｏｕｒ  Ｇｒｅｅｎ）で標識したミトコンドリアの画像化間のクロス−トークはなかった。さらに、マイトフルオルグリーン（ＭｉｔｏＦｌｏｕｒ  Ｇｒｅｅｎ）で標識したミトコンドリアの蛍光シグナルと、同様の細胞中でのＣｙ３標識シグナルビーコンを用いたＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡの蛍光シグナルの検出において、マイトフルオルグリーンが５４５ｎｍ（Ｃｙ３励起）に吸収を持たずＣｙ３が５２０ｎｍでほとんど蛍光放射をしないので（マイトフルオル放射検出）、２つの共焦点蛍光画像化におけるクロス−トークは最小化された。
【０１３７】
ＥＲトラッカー（ＥＲ−Ｔｒａｃｋｅｒ）は、（他のＥＲ染色色素と違い）ＥＲに特異的であり、マイトフルオルグリーンと本質的にスペクトルの重複を有さないので、ＥＲ標識で選択された。ＥＲトラッカーの蛍光放射を、３６０ｎｍの励起下、４６０ｎｍで検出した。このことは、ミトコンドリアとＥＲの蛍光画像化において、クロス−トークがなかったことを裏付けた。
【０１３８】
実施例１６
蛍光顕微鏡画像化
生および固定ＨＤＦ細胞の蛍光画像化を、Ｃｏｏｋｅ  Ｓｅｎｓｉｃａｍ  ＳＶＧＡ冷却ＣＣＤカメラと接続したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １００ＴＶ落射蛍光顕微鏡、またはＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ＬＳＭ−１００共焦点顕微鏡を用いて実施した。２秒間の暴露時間を、すべての画像化アッセイに関して使用した。デュアルＦＲＥＴ分子ビーコンを用いたアッセイに関して、励起および放射検出を、それぞれ５４５ｎｍおよび６６５ｎｍフィルターを用いて実施した。ペプチド連結ＧＡＰＤＨ標的化分子ビーコンを用いるアッセイを、５４３ｎｍでの励起、および５６５〜６２５ｎｍフィルターを用いる放射検出によって実施した。
【０１３９】
実施例１７
標的化分子ビーコン
特定の核ＲＮＡを、ＮＬＳ連結分子ビーコンを用いて、生細胞中で検出し、局在化した。核ＲＮＡは、細胞核中でその機能（タンパク質を産生するために細胞質へ輸送されるｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびリボゾーム複合体のスプライシング、処理、修飾および生合成を含む）を行う非コードＲＮＡ分子である。
【０１４０】
生細胞核内への、分子ビーコンの効果的で区画特異的な送達を達成するために、細胞膜とＮＬＳ（核局在化シグナル）ペプチドの可逆的透過化の組み合わせを使用した。具体的には、核輸入経路を介して核内へ異なるカーゴを送達可能であるＮＬＳペプチドを分子ビーコンに連結し、ペプチド連結分子ビーコンを、Ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ  Ｏ（ＳＬＯ）（Ｃｈｅｕｎｇ，Ｃ．Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１２：９０６−９１０）を用いて、生細胞の細胞質内に送達した。ＮＬＳペプチド連結分子ビーコンはほぼ１００％の効率で、全細胞集団の生細胞の核内に送達され、この手法をマイクロインジェクションと比べて非常に効率が良いものとしている。
【０１４１】
本研究で、生細胞中の核ＲＮＡの特異的検出および可視化を実施するために、もっともよく特性づけられた核ＲＮＡの１つであるＵ３小核小体ＲＮＡ（Ｕ３  ｓｎｏＲＮＡ）を、代表的標的として選択した。Ｕ３  ｓｎｏＲＮＡは、細胞核内で合成され細胞核内に積極的に保持され、コイル体に付随し、リボゾームの生合成の重要な段階であるｒＲＮＡのプロセシングのために核小体へ輸送される、核ＲＮＡの１種である。Ｕ３−ｓｎｏＲＮＡ標的化分子ビーコンを、Ｕ３  ｓｎｏＲＮＡの二次構造に基づいて設計し、ＢＬＡＳＴ検索を用いて標的配列をチェックし、高い特異性を確認した。ネガティブコントロール中で使用するために、「ランダム」配列分子ビーコン（「ランダムビーコン」）を、その特異的標的配列がいかなる哺乳動物遺伝子とも適合しないように設計した。分子ビーコンの設計は表３に示されており、下線部の塩基は分子ビーコンのステムを形成するために加えられた塩基を表す。Ｕ３−ｓｎｏＲＮＡ標的化分子ビーコンおよび「ランダム」配列分子ビーコン両方が、レポーターとしてＣｙ３（シアニン３）を、蛍光消光剤としてＢＨＱ２（ブラックホール消光剤２）を持つ。
【０１４２】
【表３】
2007525967.tif 000005
【０１４３】
ＮＬＳペプチドを分子ビーコンと連結するために、分子ビーコンのステムドメインを修飾して、ｄＴ−（Ｃ６）−ＮＨ2を用いて、機能性アミン基を導入した（表３）。本研究で選択した特定のＮＬＳペプチド配列はＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳのセグメントであって、プラスミドおよびナノ粒子のような異なるカーゴを細胞核へ送達可能であると示されたものである（Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：８０−５、Ｚａｎｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：９１−６、Ｌｕｏ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓａｌｔｚｍａｎ，Ｗ．Ｍ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，３３−７）。
【０１４４】
図１Ｄで模式的に示したように、そのＮ−末端にシステイン（Ｃｙｓ）を持つＮＬＳ配列を、チオールとマレイミド基間の安定な結合を介して、修飾分子ビーコンに連結した。この連結スキームによれば、１つのペプチドのみを分子ビーコンに連結可能である。Ｕ３−ｓｎｏＲＮＡ標的化および「ランダム」配列ペプチド連結分子ビーコンを、活性化ＳＬＯを用いて、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ、ＶＡ）内に導入した。ＮＬＳのプローブへの連結によって、２時間以内での細胞核への分子ビーコンの効果的な送達が可能である。
【０１４５】
図７は、生ＨｅＬａ細胞中のＵ３  ｓｎｏＲＮＡの共焦点蛍光イメージであり、その核中への局在を示している。有意な蛍光シグナルは細胞質では観察されず、これは、ＮＬＳペプチドを用いる分子ビーコンの細胞核への効果的な送達、および核ＲＮＡを標的とする上での分子ビーコンの高い特異性を示している。多数のＮＬＳペプチドを同一のカーゴに連結するほとんどの核導入／輸送研究とは対称的に、分子ビーコン上の単一ＮＬＳペプチドが核へのプローブの送達に十分である。Ｕ３  ｓｎｏＲＮＡの細胞核内への特異的局在を実証するために、より高い倍率のイメージが図７Ｂに提示しており、これは、いくらかのＵ３  ｓｎｏＲＮＡが細胞の核小体内に局在することを示唆しており、Ｕ３  ｓｎｏＲＮＡが、特にリボゾームの生合成のために核小体内でその主要な機能を達成するという示唆と一致する。さらに、核の他の領域へのＵ３  ｓｎｏＲＮＡの局在（図７Ａ）が観察され、これは、Ｕ３  ｓｎｏＲＮＡが、ｓｎＲＮＰ生合成に関与するコイル体に付随するという発見と一致した。
【０１４６】
生細胞検出アッセイにて観察された結果をさらに評価するために、固定細胞中での蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、ヘアピンプローブを用いて実施した（詳細は、支援情報を参照のこと）。図７Ｃで示したように、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの結果は、生細胞中で可視化したＵ３  ｓｎｏＲＮＡの局在パターン（図７Ａ）と同様であり、Ｕ３  ｓｎｏＲＮＡの特異的検出が確認された。ＦＩＳＨ研究でのヘアピンオリゴヌクレオチドプローブの使用により、結果として広範囲な洗浄なしにシグナル対バックグラウンド比が高くなった。予想したように、蛍光標識直鎖オリゴヌクレオチドプローブはヘアピンプローブと比較して、生細胞中でより高いバックグラウンドシグナルを産生した（データは示していない）が、これは主に結合および非結合プローブ間の区別ができないことによる。ネガティブコントロールとして、「ランダム」配列分子ビーコン（表３）をＨｅＬａ細胞の核に送達し、可能性のあるビーコン分解、ヘアピン結合タンパク質および非特異的相互作用による、得られた蛍光シグナルを画像化した。図７Ｄは、「ランダム」ビーコンのバックグラウンドシグナルを示している。明らかに、バックグラウンドシグナルは低くまた何ら局在パターンがなく、Ｕ３  ｓｎｏＲＭＡを検出することにおける高い特異性をさらに実証している。図７で示した全ての蛍光イメージは、５４５ｎｍ励起および５７０ｎｍ発光検出下で、共焦点顕微鏡を用いて得た。
【０１４７】
実施例１８
細胞質および核中のＲＮＡの検出のためのＴａｔ連結分子ビーコン
Ｔａｔ連結分子ビーコンを、４５分以内（上述したＳＬＯおよびＮＬＳペプチドの組み合わせに必要な時間の半分）に、生細胞中のＲＮＡの細胞質内の集団および核内の集団の両方を検出するために使用した。この手法により単一のプローブを用いて細胞質および核のＲＮＡを同時に検出可能であり、またＴａｔペプチドを使用しているためプローブは（つまり標的化シグナルの添加なしで）細胞膜ならびに核膜を通過することができる。この能力を実証するために、Ｕ１  ｓｎＲＮＡを検出した。Ｕ１  ｓｎＲＮＡは核から細胞質に輸送され、そこでその５’キャップが処理され、次いで核に再び輸送される。このＲＮＡ分子は、細胞核内の、ｍＲＮＡスプライシング機構の必須の要素である。ｓｎＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写され、よって得られたＲＮＡはキャップされている。しかしながら、他のｍＲＮＡとは異なってメチル化される。グアニン塩基が、通常Ｎ７位にてメチル化されるが、加えて、位置２にてジメチル化される。したがって、ほとんどのｓｎＲＮＡは、特徴的な２，２，７−トリメチル−グアノシン（ｍ３Ｇ）キャップを持つ。この構造は、スプライセオソームのアセンブリ、および核内へスプライセオソームを戻す輸送のために必須である。
【０１４８】
本アッセイにおいて、分子ビーコンに対してＴａｔペプチドを使用して、Ｕ１  ｓｎＲＮＡの細胞質および核集団両方を検出した。アッセイの結果を図８で示している。ＨＤＦ細胞にて細胞質中でＵ１  ｓｎＲＮＡは主に核周辺領域で観察され、一方で核内では分離したスポット様局在パターンであった。
【０１４９】
Ｕ１  ｓｎＲＮＡの、細胞質および核集団両方を可視化するために、共焦点顕微鏡中、ｚ−スタックスを使用して、イメージを異なる位置で収集した。異なるｚ−位置のスキャンを図８にて示している。この手法を用いて、単一プローブを使用して、それぞれ、核および細胞質中の標的核酸の異なる発現レベルおよび局在パターンを決定可能である。同様の手法をまた、核から細胞質へのＲＮＡの輸送を研究するために使用してよい。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１Ａ−Ｄは送達ペプチドを分子ビーコンに連結するための、３つの例示的実施形態の概略図である。
【図２Ａ】未修飾分子ビーコンに関する、および３つの型のペプチド連結分子ビーコンに関する、時間の関数としての、正規化蛍光強度の線グラフである。
【図２Ｂ】異なる共役方法によって連結した、例示的ペプチド連結分子ビーコンに関する、プローブ−標的ハイブリダイゼーションの、シグナル対バックグラウンド比の棒グラフである。
【図３】図３Ａ−Ｇは例示的分子ビーコンとともにインキュベートした、ＨＤＦ細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図４】図４ＡおよびＢはＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを示しているＨＤＦ細胞の蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション顕微鏡写真である。
【図５】図５ＡおよびＢは、生ＨＤＦおよびＭｉａＰａｃａ−２細胞中の、ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの検出を示している蛍光顕微鏡写真である。
【図６】図６Ａ−Ｆは従来の技術を用いた、分子ビーコンの細胞送達と比較した、ＨＤＦ細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図７】図７Ａ−Ｄは本開示の核酸レポーターの例示的実施形態の核送達を示している、ＨＤＦ細胞の蛍光顕微鏡写真である。
【図８】Ｔａｔ−１ペプチドと連結した、Ｕ１  ｓｎＲＮＡ標的化分子ビーコンを用いた、Ｕ１  ｓｎＲＮＡの核および細胞質局在を示しているＨＤＦ細胞の蛍光顕微鏡写真のパネルである。Ｚ−スタックス（それぞれのｚ位置での共焦点切片）が図中で示されている。Ｕ１  ｓｎＲＮＡが、細胞質の核周辺領域で検出され、核中では、はっきりとしたスポット様分布をもつ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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