(57)【要約】本出願は、リューイ体病（ＬＢＤ）患者およびその遺伝子導入動物モデルにおいてαシヌクレインの新規断片を明らかにするものである。この疾患はαシヌクレインの凝集を特徴とする。この断片は完全長αシヌクレインのＣ末端が切断されたものである。一部の断片は、トリシン緩衝液を用いてＳＤＳゲル電気泳動により測定した分子量が約１２ｋＤａであり、天然型αシヌクレインのＣ末端から少なくとも１０個のアミノ酸が切断されたものであるという特徴を有する。切断部位は、天然型αシヌクレインの残基（１１７）の後および残基（１２６）の前に生じることが好ましい。こうしたαシヌクレインの新規断片の特定には、例えば、創薬、診断、治療、遺伝子導入マウスなどにいくつかの用途がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リューイ体病（ＬＢＤ）を処置するのに有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
該薬剤をαシヌクレインの断片と接触させ、該断片はインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとし
該αシヌクレインの断片の凝集の速度もしくは程度を測定し、該薬剤を用いない対照との比較による凝集の速度もしくは程度の減少によって該薬剤が薬理活性を有することが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１の方法であって、該αシヌクレインの断片が、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する、方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、該αシヌクレインの断片が、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目からなる群から選ばれる、方法。
【請求項４】
請求項１の方法であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする、方法。
【請求項５】
請求項１の方法であって、該αシヌクレインの断片が遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する、方法。
【請求項６】
請求項５の方法であって、該突然変異がＡ５３Ｔ突然変異である、方法。
【請求項７】
請求項１の方法であって、さらに、ＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行って該薬剤が該ＬＢＤの症状を治療もしくは阻止するかどうかを明らかにすることを含む、方法。
【請求項８】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
αシヌクレインを発現し、該αシヌクレインを断片にプロセシングする細胞を薬剤と接触させ、該断片はインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとし
該細胞内の該断片のレベルを該薬剤の非存在下の同じ細胞種内のベースラインレベルとの比較で測定し、該ベースラインに対し断片レベルが減少することにより該薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項９】
請求項８の方法であって、該αシヌクレインの断片が、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する、方法。
【請求項１０】
請求項８の方法であって、該αシヌクレインの断片が、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目からなる群から選ばれる、方法。
【請求項１１】
請求項８の方法であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする、方法。
【請求項１２】
請求項８の方法であって、該αシヌクレインの断片が遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法であって、該突然変異がＡ５３Ｔ突然変異である、方法。
【請求項１４】
請求項８の方法であって、該細胞がヒト細胞である、方法。
【請求項１５】
請求項１４の方法であって、該細胞が神経細胞である、方法。
【請求項１６】
請求項１４の方法であって、該細胞がドーパミン作動性細胞である、方法。
【請求項１７】
請求項１４の方法であって、該細胞がＰＣ１２細胞もしくはＳｙ５Ｙ細胞である、方法。
【請求項１８】
請求項８の方法であって、さらに、ＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行って該薬剤が該ＬＢＤの症状を治療もしくは阻止するかどうかを明らかにすることを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法であって、該リューイ体病がパーキンソン病もしくは瀰漫性リューイ体病（ＤＬＢＤ）である、方法。
【請求項２０】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
αシヌクレインの断片を発現する遺伝子導入動物を接触させ、該断片はインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとし
該薬剤非存在下の同様な遺伝子導入動物の脳内の凝集型の該断片のベースラインレベルとの比較で該遺伝子導入動物の脳内の凝集型の該断片のレベルを測定し、該ベースラインに対する該凝集型断片レベルの減少によって該薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、該αシヌクレインの断片が、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する、方法。
【請求項２２】
請求項２０の方法であって、該αシヌクレインの断片が、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目からなる群から選ばれる、方法。
【請求項２３】
請求項２０の方法であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１１９番目〜１３９番目であるものとする、方法。
【請求項２４】
請求項２０の方法であって、該αシヌクレインの断片が遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する、方法。
【請求項２５】
請求項２０の方法であって、該突然変異がＡ５３Ｔ突然変異である、方法。
【請求項２６】
請求項２０の方法であって、該遺伝子導入動物がマウスである、方法。
【請求項２７】
請求項２０の方法であって、該遺伝子導入動物がショウジョウバエである、方法。
【請求項２８】
請求項２０の方法であって、さらに、ＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行って該薬剤が該ＬＢＤの症状を治療もしくは阻止するかどうかを明らかにすることを含む、方法。
【請求項２９】
請求項２０の方法であって、該ＬＢＤがパーキンソン病もしくはＤＬＢＤである、方法。
【請求項３０】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
αシヌクレインを発現する導入遺伝子を有し、該αシヌクレインを断片にプロセシングする遺伝子導入動物を薬剤と接触させ、該断片はインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとし
該薬剤非存在下のベースラインレベルとの比較で神経細胞内の該断片のレベルを測定し、このベースラインに対する上記断片のレベルの減少によってこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項３１】
請求項３０の方法であって、該αシヌクレインの断片が、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する、方法。
【請求項３２】
請求項３０の方法であって、該αシヌクレインの断片が、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目からなる群から選ばれる、方法。
【請求項３３】
請求項３０の方法であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする、方法。
【請求項３４】
請求項３０の方法であって、該αシヌクレインの断片が遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する、方法。
【請求項３５】
請求項３３の方法であって、該突然変異がＡ５３Ｔ突然変異である、方法。
【請求項３６】
請求項３３の方法であって、該遺伝子導入動物がマウスである、方法。
【請求項３７】
請求項３３の方法であって、該遺伝子導入動物がショウジョウバエである、方法。
【請求項３８】
請求項３３の方法であって、さらに、ＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行って該薬剤が該ＬＢＤの症状を治療もしくは阻止するかどうかを明らかにすることを含む、方法。
【請求項３９】
請求項３８の方法であって、該ＬＢＤがパーキンソン病もしくはＤＬＢＤである、方法。
【請求項４０】
αシヌクレインの断片をコードする核酸セグメントに動作可能なように結合したプロモータを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入動物であって、該断片はインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとし
該遺伝子導入動物に該断片を発現させることにより該動物がＬＢＤの少なくとも１つの特徴を発症しやすくなることを特徴とする
遺伝子導入動物。
【請求項４１】
請求項４０の遺伝子導入動物であって、該αシヌクレインの断片が、１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目からなる群から選ばれる遺伝子導入動物。
【請求項４２】
請求項４０の遺伝子導入動物であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする遺伝子導入動物。
【請求項４３】
請求項４０の遺伝子導入動物であって、該プロモータがＰＤＧＦプロモータである遺伝子導入動物。
【請求項４４】
請求項４０の遺伝子導入動物であって、該少なくとも１つの特徴が運動機能の障害である遺伝子導入動物。
【請求項４５】
請求項４０の遺伝子導入動物であって、該少なくとも１つの特徴が認識機能の障害である遺伝子導入動物。
【請求項４６】
マウスである請求項４０の遺伝子導入動物。
【請求項４７】
ショウジョウバエである請求項４０の遺伝子導入動物。
【請求項４８】
患者においてＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を検出する方法であって
脳脊髄液中のαシヌクレインの断片を検出し、該断片はインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとし
健常者のベースラインレベルよりもレベルが高いことにより、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性が示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項４９】
αシヌクレインの断片に特異的に結合する抗体であって、該断片がインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするが、完全長のシヌクレインには特異的な結合を示さない、抗体。
【請求項５０】
請求項４９の抗体であって、該αシヌクレインの断片が、１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目からなる群から選ばれる、抗体。
【請求項５１】
請求項４９の抗体であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする、抗体。
【請求項５２】
ヒト抗体である請求項４９の抗体。
【請求項５３】
ヒト化抗体である請求項４９の抗体。
【請求項５４】
モノクロナール抗体である請求項４９の抗体。
【請求項５５】
ヒト・アイソタイプＩｇＧ１を有する請求項４９の抗体。
【請求項５６】
ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を診断する方法であって
１１９番目〜１２５番目の残基に遊離Ｃ末端を有するαシヌクレインの断片と特異的に結合するが、完全長のシヌクレインには特異的な結合を示さない抗体を患者に投与し
該患者における該抗体の結合レベルを測定し、健常者のベースラインレベルに対する結合レベルの上昇によって該ＬＢＤの存在もしくは該ＬＢＤに対する罹病性が示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項５７】
ＬＢＤに罹患しているか罹患するリスクのある患者に対してαシヌクレイン断片の有効な療法を施行し、該断片がインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損
ならびにインタクトなαシヌクレインのＣ末端からの少なくとも１０個の連続するアミノ酸の欠損を特徴とし、これにより該ＬＢＤを治療もしくは予防すること
を含むＬＢＤの治療もしくは予防方法。
【請求項５８】
請求項５７の方法であって、該αシヌクレインの断片が、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目からなる群から選ばれる、方法。
【請求項５９】
請求項５７の方法であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする、方法。
【請求項６０】
請求項５７の方法であって、さらに、該断片に対する抗体を含む免疫反応を増強するアジュバントを投与することを含む、方法。
【請求項６１】
請求項５７の方法であって、該断片は融合蛋白質を形成する担体に結合させるものとし、該担体は該断片に対する抗体を含む免疫反応を増強するものとする、方法。
【請求項６２】
ＬＢＤに罹患しているか罹患するリスクのある患者に対して、αシヌクレイン断片に特異的に結合し、該断片はαシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、１番目から１２５番目、および１番目からＸ番目からなる群から選ばれるものとし、ここで、Ｘは、１３０番目〜１３９番目であるものとし、インタクトなαシヌクレインには結合しない抗体の有効な療法を施行し、これにより上記疾患を予防もしくは治療することを含むＬＢＤの治療もしくは予防方法。
【請求項６３】
インタクトなαシヌクレインを切断して断片を生じさせるプロテアーゼをスクリーニングする方法であって、該断片はインタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとし
該プロテアーゼの阻害剤を特定すること
該阻害剤を該プロテアーゼを含む細胞抽出物もしくは組織抽出物と接触させることにより該プロテアーゼを該阻害剤に結合させること、ならびに
該阻害剤から該プロテアーゼを遊離させること
を含む、方法。
【請求項６４】
請求項６３の方法であって、該阻害剤はインタクトなαシヌクレインの１１５番目〜１３０番目の位置の少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含むαシヌクレインのペプチドであるものとする、方法。
【請求項６５】
請求項６４の方法であって、該ペプチドは１１８番目〜１２２番目の位置の少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含むものとする、方法。
【請求項６６】
請求項６５の方法であって、該残基の少なくとも１つが遷移状態アナログである、方法。
【請求項６７】
患者においてリューイ体病の存在もしくはリューイ体病に対する罹病性を検出する方法であって
該患者の脳からの試料においてαシヌクレインの１２５番目の位置がリン酸化もしくはニトロ化されたαシヌクレインのレベルを測定し、健常者集団の平均レベルに対するレベルの上昇によって該患者がリューイ体病を有するかこれに罹患性であることが示されるものとすること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は非仮出願であり、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている２００３年５月１９日提出の米国特許出願第６０／４７１，９２９号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
リューイ体病（ＬＤＢ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびリューイ体の形成である。（ＭｃＫｅｉｔｈら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ（ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＬＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６年）４７：ｐ１１１３−２４）。ＬＤＢとしては、パーキンソン病、瀰漫性リューイ体病（ＤＬＢＤ）、リューイ体型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、およびＰＤとアルツハイマー病（ＡＤ）との併発が挙げられる。リューイ体を有する痴呆（ＤＬＢ）というのは、ＬＢＤについての用語法の相違を調整するために作られた用語である。ＬＢを有する疾患は、依然として、高齢者における運動性疾患および認識力低下に共通する原因となっている。（Ｇａｌａｓｋｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４年）５１：ｐ８８８−９５）。この疾患への罹患率は増加し続けており、深刻な公衆衛生問題を生じているが、今日まで、こうした疾患に対して認可された治療法はない。（Ｔａｎｎｅｒら，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００年）１３：ｐ４２７−３０）。ＬＢＤの原因については意見の分かれるところであり、各種の神経毒および遺伝的感受性要因などのさまざまな要因が役割を果たしていると提唱されている。
【０００３】
ＡＤ、ＰＤおよびＤＬＢＤは高齢者において最も一般的に見出される神経変性疾患である。最近の疫学的研究によれば、アルツハイマー病患者の約３０％がＰＤをも有することから、ＡＤとＰＤとの間には密接な臨床的関係のあることが明らかとなった。従って、ＡＤ患者は、その他の高齢者に比し、ＰＤを併発する可能性がより高い。さらに、痴呆症になるＰＤ患者は、通常、典型的なＡＤをすでに発症している。いずれの神経変性疾患も特定の脳領域および細胞集団に好発し、明確な病理学的特徴を示すが、ＰＤ、ＡＤおよびＤＬＢＤも共通の病理学的特徴を共有している。家族性ＡＤ、ダウン症候群もしくは散発型ＡＤの患者は、扁桃体にＬＢを形成するが、これはＰＤの典型的な神経病理学的特徴である。さらに、各疾患は、神経の変性、神経間シナプス結合および最終的な細胞死、神経伝達物質の枯渇、ならびにその前駆体が正常な中枢神経系の機能に関与する折り畳み構造の蛋白質の異常な蓄積を伴う。ＡＤ、ＰＤおよびＤＬＢＤの間の関連については生化学的研究によって裏付けられている。
【０００４】
近年、ＬＢＤの病因の理解に関して新たな可能性が浮上した。具体的には、いくつかの研究によって、（１）シナプス蛋白質αシヌクレインがＬＢ内に蓄積すること（Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）３８８：ｐ８３９−４０；Ｔａｋｅｄａら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８年）１５２：ｐ３６７−７２；Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７年）２３９：ｐ４５−８）、（２）αシヌクレイン遺伝子の突然変異体が稀な家族型パーキンソン病に伴って単離されること（Ｋｒｕｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．（１９９８年）１８：ｐ１０６−８；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７年）２７６：ｐ２０４５−７）、ならびに（３）遺伝子導入マウス（Ｍａｓｌｉａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ）（２０００年）２８７：ｐ１２６５−９）およびショウジョウバエ（Ｆｅａｎｙら，Ｎａｔｕｒｅ（２０００年）４０４：ｐ３９４−８）におけるその過剰発現によってＰＤのいくつかの病理学的側面が再現されることから、αシヌクレインはＰＤの病因に中心的な役割を果たしていることが分かった。従って、脳内のαシヌクレインの蓄積がヒト、マウス、ハエといった多様な種において同様な形態学的および神経学的変化を伴うという事実から、この分子がＰＤ進行の一因となっていることが示唆される。
【０００５】
ＡＤの典型的な病理学的特徴である神経炎性班は、基本的に、アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）のアミノ酸蛋白分解性産物であるアミロイド・ベータ（Ａβ）蛋白質、およびαシヌクレインのアミノ酸３５個の蛋白分解性断片であるＮＡＣからなる。ＡβおよびＮＡＣはいずれも、それぞれの完全長蛋白質の蛋白分解性断片としてアミロイド班中に初めて確認され、これらの完全長ｃＤＮＡが同定され、クローニングされた。（Ｉｗａｉ  Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０００年）１５０２：ｐ９５−１０９；Ｍａｓｌｉａｈら，ＡＭ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９６年）１４８：ｐ２０１−１０；Ｕｅｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ（１９９３年）９０：ｐ１１２８２−６）。
【０００６】
αシヌクレインは、β−およびγ−シヌクレインならびにシノレチンなどの蛋白質の大きなファミリーの一部である。αシヌクレインは、シナプスと関係がある正常な状態において発現され、神経可塑性、学習および記憶において役割を果たしていると考えられている。αシヌクレインの凝集を増強するヒト（ｈ）αシヌクレインの突然変異が確認されており（Ａｌａ３０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒ）、稀なタイプの常染色体優性型ＰＤと関連付けられている。こうした突然変異がαシヌクレインの凝集傾向を強化するメカニズムについては知られていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（特許請求の範囲に記載されている発明の要旨）
本発明は、リューイ体病（ＬＤＢ）の処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、薬剤と、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするαシヌクレインの断片とを接触させ、およびこのαシヌクレインの断片の凝集の速度もしくは程度を測定し、上記薬剤を用いない対照との比較による凝集割合もしくは程度の減少によってこの薬剤が薬理活性を有することが示されるものとするものである。
【０００８】
この断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。任意選択的に、上記方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＤＢの動物モデルにおいて試験を行う別の工程を含む。
【０００９】
さらに、本発明は、ＬＢＤ（例えば、パーキンソン病もしくはＤＬＢＤ）の処置に有用な薬理活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、αシヌクレインを発現し、このαシヌクレインを断片にプロセシングする細胞を薬剤と接触させることを含む。この断片の特徴は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することである。次いで、上記細胞内の上記断片のレベルを上記薬剤非存在下の同じ細胞種内のベースラインレベルとの比較で測定するが、このベースラインに対し断片レベルが減少することによりこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示される。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片は、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目である。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。上記細胞は、ヒト細胞、神経細胞もしくはドーパミン作動性細胞とすることができる。任意選択的に、この細胞はＰＣ１２細胞もしくはＳｙ５Ｙ細胞である。任意選択的に、この方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＤＢの動物モデルにおいて試験を行う工程を含む。
【００１０】
さらに、本発明は、ＬＢＤ（例えば、パーキンソン病もしくはＤＬＢＤ）の処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレインの断片を発現する遺伝子導入動物を接触させ、および上記薬剤非存在下の同様の遺伝子導入動物の脳内の凝集型の上記断片のベースラインレベルとの比較で上記遺伝子導入動物の脳内の凝集型上記断片のレベルを測定し、このベースラインに対する上記凝集型断片レベルの減少によってこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとするものである。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１１９〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。上記遺伝子導入動物は、任意選択的に、げっ歯類である。また、この遺伝子導入動物は、ショウジョウバエとすることもできる。任意選択的に、この方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＤＢの動物モデルにおいて試験を行うこと含む。
【００１１】
さらに、本発明は、ＬＢＤ（例えば、パーキンソン病もしくはＤＬＢＤ）の処置に有用な薬理活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、薬剤と、αシヌクレインを発現し、αシヌクレインを断片にプロセシングする遺伝子導入動物とを接触させ、この断片は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするものとし、および上記薬剤非存在下のベースラインレベルとの比較で神経細胞内の上記断片のレベルを測定し、このベースラインに対する上記断片のレベルの減少によってこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとするものである。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。上記遺伝子導入動物は、任意選択的に、げっ歯類、マウスもしくはショウジョウバエである。任意選択的に、この方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＤＢの動物モデルにおいて試験を行う工程を含む。
【００１２】
さらに、本発明は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレインの断片をコードする核酸セグメントに動作可能なように結合したプロモータを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入動物であって、この遺伝子導入動物に上記断片を発現させることによりこの動物がＬＢＤの少なくとも１つの特徴を発症しやすくなることを特徴とする遺伝子導入動物を提供する。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目アミノ酸からなる群から選ばれる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。上記プロモータは、任意選択的に、ＰＤＧＦプロモータである。任意選択的に、少なくとも１つの特徴は運動機能の障害である。任意選択的に、上記遺伝子導入動物の少なくとも１つの特徴は、認識機能障害である。上記遺伝子導入動物は、任意選択的に、げっ歯類、マウスもしくはショウジョウバエである。
【００１３】
さらに、本発明は、患者においてＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を検出する方法を提供する。この方法は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とする、脳脊髄液中のαシヌクレインの断片を検出するものである。健常者のベースラインレベルよりもレベルが高いことにより、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性が示されるものとする。
【００１４】
さらに、本発明は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレインの断片と特異的に結合するが、完全長のαシヌクレインには特異的な結合を示さない抗体を提供する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、この断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。上記抗体は、任意選択的に、ヒト型、ヒト化もしくはキメラ抗体である。任意選択的に、この抗体はモノクロナールである。任意選択的に、この抗体はヒト・アイソタイプＩｇＧ１を有する。
【００１５】
さらに、本発明は、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を診断する方法を提供する。この方法は、１１９番目〜１２５番目の残基に遊離Ｃ末端を有するαシヌクレインの断片と特異的に結合するが、完全長のシヌクレインには特異的な結合を示さない抗体を患者に投与し、およびこの患者におけるこの抗体の結合のレベルを測定し、健常者のベースラインレベルに対する結合レベルの上昇によって上記ＬＢの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性が示されるものとするものである。
【００１６】
さらに、本発明は、ＬＢＤに罹患しているか罹患するリスクのある患者に対して、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損すること、およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端から少なくとも１０個の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレイン断片の有効な療法を施行し、これにより上記ＬＢＤを治療もしくは予防することを含むＬＢＤの治療もしくは予防方法を提供する。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目である。任意選択的に、この断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。さらに、この方法は、任意選択的に、この断片に対する抗体を含む免疫反応を増強するアジュバントを投与することを含む。任意選択的に、上記断片は、この断片に対する抗体を含む免疫反応を増強する、融合蛋白質を形成する担体に結合させる。
【００１７】
さらに、本発明は、ＬＢＤを治療もしくは予防する方法を提供する。この方法は、ＬＢＤに罹患しているか罹患するリスクのある患者に対して、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、１番目から１２５番目および１番目からＸ番目からなり、Ｘを１３０〜１３９番目とする群から選ばれるαシヌクレインの断片に特異的に結合するが、インタクトなαシヌクレインには結合しない抗体の有効な療法を施行し、この抗体により上記疾患を予防もしくは治療するものである。
【００１８】
さらに、本発明は、インタクトなαシヌクレインを切断して、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とする断片を生じさせるプロテアーゼをスクリーニングする方法を提供する。この方法は、プロテアーゼの阻害剤を特定し、この阻害剤をこのプロテアーゼを含む細胞抽出物もしくは組織抽出物と接触させることによりこのプロテアーゼをこの阻害剤に結合させ、次いで、この阻害剤からこのプロテアーゼを遊離させるものである。任意選択的に、上記阻害剤は、インタクトなαシヌクレインの１１５番目〜１３０番目の位置の少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含むαシヌクレインのペプチドである。任意選択的に、このペプチドは、１１８番目〜１２２番目の位置のうちの少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含む。任意選択的に、これらの残基の少なくとも１つは遷移状態アナログである。
【００１９】
さらに、本発明は、αシヌクレインの１０９番目から１２０番目までの残基内の抗原決定基に特異的に結合するモノクロナール抗体を提供する。このモノクロナール抗体は、任意選択的に、キメラ型、ヒト化型もしくはヒト型である。
【００２０】
さらに、本発明は、αシヌクレインの１１５番目から１２３番目までの残基内の抗原決定基に特異的に結合するモノクロナール抗体を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、αシヌクレインの４３番目から５１番目および５８番目から６５番目の残基内の非連続的抗原決定基に特異的に結合するモノクロナール抗体を提供する。この抗体は、任意選択的に、キメラ型、ヒト化型もしくはヒト型である。
【００２２】
さらに、本発明は、遊離Ｃ末端を有する独立した完全長のαシヌクレインに特異的に結合し、Ｃ末端が別のポリペプチドに結合しているαシヌクレインを含む融合蛋白質に特異的な結合を示さない末端特異的モノクロナール抗体を提供する。この抗体は、任意選択的に、キメラ型、ヒト化型もしくはヒト型である。
【００２３】
さらに、本発明は、患者においてリューイ体病の存在もしくはリューイ体病に対する罹病性を検出する方法を提供する。この方法は、患者の脳からの試料においてαシヌクレインの１２５番目の位置がリン酸化もしくはニトロ化されたαシヌクレインのレベルを測定し、健常者集団の平均レベルに対するレベルの上昇によって上記患者がリューイ体病を有するかこれに罹患性であることが示されるものとするものである。
【００２４】
（定義）
「薬剤」という用語は、薬理活性を有するか、有する可能性のある化合物を記述するのに用いている。薬剤としては、既知の薬物である化合物、薬理活性が確認されているが、さらに治療上の評価が行われている化合物、および薬理活性についてスクリーニングされることになっているコレクションおよびライブラリを構成する物質である化合物が挙げられる。
【００２５】
「薬理」活性とは、薬剤が疾患の予防もしくは治療に有用であるか、有用である可能性を有することを示すスクリーニング系において、ある薬剤が活性を示すことを意味する。このスクリーニング系はインビトロ系、細胞系、動物系もしくはヒト系とすることができる。薬剤は、疾患の処置における実際的な予防もしくは治療的有用性を立証するにはさらに試験を必要とする可能性があるにしても、薬理活性を有すると評することができる。
【００２６】
ゲル電気泳動を用いた分子量測定との関連で、「約」という用語は、同一条件下でその方法を繰り返した際に実験誤差によると思われる分子量の標準偏差の存在を意味している。αシヌクレインの一部の断片についての１２ｋＤａという分子量測定値は、トリシン緩衝液を用いた測定に適用される。
【００２７】
「特異的に結合する」という語句は、蛋白質その他の生体物質の不均一な集団の存在下に前記蛋白質の存在を決定する結合反応のことを意味する。従って、所定の条件下において、特定のリガンドは特定の蛋白質に選択的に結合するが、試料中に存在する他の蛋白質とは有意な量で結合しない。多くの場合、蛋白質に特異的に結合する抗体のような分子の結合定数は、少なくとも１０６Ｍ−１もしくは１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、より好ましくは約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１以上である。種々のイムノアッセイ方式を用いて特定の蛋白質に対し特異的な免疫反応性を示す抗体を選定することができる。例えば、蛋白質に対し特異的な免疫反応性を示すモノクロナール抗体を選定するのに固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が日常的に用いられている。特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨークを参照されたい。
【００２８】
配列の比較においては、通常、１つの配列を試験配列と比較する対照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験および対照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、部分配列座標を指定し、次に、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、指定したプログラム・パラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムにより、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが算出される。
【００２９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：ｐ４８２（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：ｐ４４３（１９７０年）のホモロジー・アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：ｐ２４４４（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、５７５サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｄｒ．、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、もしくは目視検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌらの上記文献参照）によって行うことができる。
【００３０】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：ｐ４０３−４１０（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた時にある正値の閾値スコアＴにマッチするかこれを満たす検索配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって高相同性スコア（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ）配列対（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは、近傍文字列スコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記文献）と呼ばれる。これらの初期の近傍文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとなる。次いで、これらの文字列ヒットは、累積アラインメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一対の一致残基のスコア値（ｒｅｗａｒｄ）；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティ値；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合、スコアリング・マトリクスを用いて累積スコアを算出する。文字列ヒットの各方向への延長は、以下の場合、即ち、上記累積アラインメント・スコアがその最大到達値から数量Ｘだけ減少した場合、この累積スコアが１つ以上のネガチブ・スコア残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になった場合、もしくはどちらの配列においても末端に到達した場合に停止する。ある核酸もしくはポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを確認するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルト・パラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の蛋白配列を使用）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８９：ｐ１０９１５（１９８９年）参照）。
【００３１】
配列同一性パーセントを算出する他に、ＢＬＡＳＴアルゴニズムは２つの配列間の類似性の統計的な解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９０：ｐ５８７３−５７８７（１９９３年）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴニズムにより得られる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と対照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、この核酸は対照配列と類似していると考えられる。
【００３２】
アミノ酸置換を保存的もしくは非保存的なものとして分類するために、アミノ酸を以下のようにグループ分けする：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅｕ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は同じクラスのアミノ酸間の置換を伴う。非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのアミノ酸を別のクラスのアミノ酸と交換することから成る。
【００３３】
通常、本発明の治療剤は好ましくない夾雑物を実質的に含まない。このことは、薬剤が、妨害蛋白質および夾雑物を実質的に含まないばかりでなく、通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であることを意味する。場合によっては、こうした薬剤の純度は、少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０もしくは約９５％ｗ／ｗである。しかしながら、従来の蛋白質精製法を用いると、少なくとも９９％ｗ／ｗの均一なペプチドを得ることができる。
【００３４】
「抗体」もしくは「免疫グロブリン」という用語は、インタクトな抗体およびその結合性断片を含めて用いている。通常、断片は、それが由来するインタクトな抗体と、個々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含む抗原断片への特異的結合に対して競合する。断片は、組換えＤＮＡ法、もしくはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。また、「抗体」という用語は、他の蛋白質との融合蛋白質へと化学的に結合させ、もしくはこうした融合蛋白質として発現させた１種以上の免疫グロブリン鎖を含む。また、「抗体」という用語は、二重特異性抗体を含む。二重特異性もしくは二官能性抗体は、２種の重／軽鎖対および２種の結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合もしくはＦａｂ’断片間の結合を含む種々の方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：ｐ３１５−３２１（１９９０年）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：：ｐ１５４７−１５５３（１９９２年）を参照されたい。
【００３５】
「アジュバント」という用語は、抗原と共に投与すると、その抗原に対する免疫反応を増強するが、単独で投与してもその抗原に対する免疫反応を生じない化合物のことを意味する。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の賦活ならびにマクロファージの賦活を含むいくつかのメカニズムによって免疫反応を増強することができる。
【００３６】
「患者」という用語は、予防的もしくは治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物の対象を含む。
【００３７】
抗体間の競合は、試験対象の免疫グロブリンが対照抗体のαシヌクレインなどの共通の抗原への特異的結合を阻害するようなアッセイ法を用いて測定される。数多くのタイプの競合的結合アッセイ法が知られており、このようなものとしては、例えば、固相直接もしくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接もしくは間接エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９：ｐ２４２−２５３（１９８３年）参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７：ｐ３６１４−３６１９（１９８６年）参照）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチ・アッセイ（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）参照）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５（１）：ｐ７−１５（１９８８年）参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：ｐ５４６−５５２（１９９０年）；および直接標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：ｐ７７−８２（１９９０年））がある。通常、このようなアッセイ法では、固相面に結合させた精製抗原もしくはこれらの両方を有する細胞、非標識試験免疫グロブリン、および標識対照免疫グロブリンを用いる。競合的阻害は、この試験免疫グロブリンの存在下に固相面もしくは細胞に結合した標識の量を定量することにより測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在させる。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）としては、対照抗体と同じ抗原決定基に結合する抗体、およびこの対照抗体が結合した抗原決定基に、立体障害を生じるのに十分近接した近傍抗原決定基に結合する抗体が挙げられる。通常、競合抗体は、過剰に存在させた場合、対照抗体の共通抗原への特異的結合を少なくとも５０もしくは７５％阻害する。
【００３８】
抗原決定基の座標は近似である（±２アミノ酸）。抗原決定基内の全てのアミノ酸が結合に必ずしも必要な訳ではない。
【００３９】
記載された１つ以上の要素を「含む」組成物もしくは方法には、特に記載されていない他の要素を含めることができる。例えば、αシヌクレイン・ペプチドを含む組成物は、αシヌクレイン・ペプチド単体と、より大きなポリペプチド配列の構成成分としてのαシヌクレイン・ペプチドとの両方を包含する。
【００４０】
特に文脈から明らかでない限り、本発明の実施態様、構成要素、工程もしくは構成は全て、任意の他のものとの組み合わせで用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．概要）
本発明は、部分的に、リューイ体病（ＬＤＢ）患者およびその遺伝子導入動物モデルにおいてαシヌクレインの新規断片を特定することを前提としている。こうした疾患の特徴は、αシヌクレインの凝集である。その断片は完全長のαシヌクレインがＣ末端で切断されたものである。一部の断片は、トリシン緩衝液を用いるＳＤＳゲル電気泳動で測定した分子量が約１２ｋＤａであり、天然型αシヌクレインのＣ末端から少なくとも１０個の連続したアミノ酸が切断されたものであるという特徴を有する。切断部位は、天然型αシヌクレインの１１７番目残基の後および１２６番目残基の前に生じることが好ましい。これらのαシヌクレイン断片の特定には、例えば、創薬、診断、治療、遺伝子導入動物などにおいていくつかの用途がある。
【００４２】
本発明は、ＬＢＤの処置に有用な活性について薬剤をスクリーニングするいくつかの方法を提供する。一部の方法では、本発明の新規断片を生じる切断反応を阻害する薬剤が特定される。他の方法では、この切断反応の産物の凝集を阻害する薬剤が特定される。このような阻害剤はＬＢＤの処置に有用である。また、上記切断反応の阻害剤は、この切断反応に関与するプロテアーゼのアフィニティー精製にも有用である。
【００４３】
また、本発明は、上述のαシヌクレインの断片を発現する遺伝子導入動物モデルおよび細胞を提供する。この遺伝子導入動物モデルおよび細胞には、上記断片の凝集体を含有するリューイ体を含むリューイ体病の特徴を形成する性質がある。この動物モデルおよび細胞は上記のスクリーニング方法に利用することができる。
【００４４】
さらに、本発明は、αシヌクレインの断片に特異的に結合するが、インタクトなαシヌクレイン自体には特異的な結合を示さない末端特異的な抗体を提供する。こうした抗体は、αシヌクレイン凝集体のインビトロ・イメージング用に、および処置の方法にも有用である。また、新規なαシヌクレイン断片は、処置の方法に、必要であれば、アジュバントとの併用で、用いることができる。
【００４５】
（ＩＩ．αシヌクレイン断片）
ヒト型αシヌクレインは以下のアミノ酸配列を有するアミノ酸１４０個のペプチドである：
【００４６】
【化１】
2007525464.tif 000002
（Ｕｅｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３年）９０：ｐ１１２８２−６；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アセッション番号：Ｐ３７８４０）。この蛋白質は、認識される３つのドメイン、即ち、１から６１番目のアミノ酸をカバーするＫＴＫＥ繰返し配列ドメイン（ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）、約６０番目から９５番目のアミノ酸に及ぶＮＡＣ（非アミロイド成分）ドメイン、および約９８番目から１４０番目のアミノ酸に及ぶＣ末端酸性ドメインを有する。
【００４７】
本発明の一部の新規断片は、Ｃ末端から少なくとも１０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸、任意選択的に２０、２２、２３もしくは２５個までのアミノ酸が切断されたものである。これらの断片は、全体もしくはほぼ全体（即ち、上記欠損部以外のαシヌクレインからの少なくとも１００個の連続する残基）を含む。また、一部の断片は、１から４番目、１から６番目、１から１０番目、１から１２番目の欠損など、Ｎ末端から２０個までの比較的短いアミノ酸配列が切断されたものである。一部の断片は１から２３番目、１から３８番目もしくは１から４５番目残基のＮ末端欠損を有する。好ましい断片は、ＳＮ１−１１８、ＳＮ１−１１９、ＳＮＩ−１２０、ＳＮ１−１２１、ＳＮ１−１２２、ＳＮ１−１２３、ＳＮ１−１２４、ＳＮ１−１２５、ＳＮ１−１２６、ＳＮ１−１２７、ＳＮ１−１２８、ＳＮ１−１２９およびＳＮＩ−１３０である。とくに好ましい断片は、ＳＮ１−１１９、ＳＮ１−１２０、ＳＮ１−１２１、ＳＮ１−１２２、ＳＮ１−１２３、ＳＮ１−１２４およびＳＮ１−１２５である。これらのうち特に好ましい断片はＳＮ１−１１９である。切断反応は、１１８番目〜１２６番目のアミノ酸残基間、例えば、１１９番目と１２０番目の残基の間のペプチド結合で行われることが好ましい。本発明の他の断片としては、（ＳＤＳ電気泳動で測定して）約６〜７ｋＤａもしくは５０〜８０個のアミノ酸のαシヌクレインＮ末端断片が挙げられる。本発明の別の断片としては、インタクトなαシヌクレインのＣ末端から１〜１０個のアミノ酸を欠くαシヌクレインのＮ末端断片、即ち、Ｘを１３０〜１３９とした場合のＳＮ１−Ｘが挙げられる。一部の断片は、抗体ＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）および５Ｃ１２（１０９−１２０）への特異的結合、ならびに８Ａ５（遊離Ｃ末端）、ＬＢ５０９（１１５−１２３）およびＥＬＡＤ４７（１１８−１２３）への特異的結合の欠如を特徴とする。一部の断片は、ＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）および５Ｃ１２（１０９−１２０）、ＬＢ５０９（１１５−１２３）およびＥＬＡＤ４７（１１８−１２３）への特異的結合、ならびに８Ａ５（遊離Ｃ末端）への特異的結合の欠損を特徴とする。一部の断片は、ＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）と５Ｃ１２（１０９−１２０）、ＬＢ５０９（１１５−１２３）とＥＬＡＤ４７（１１８−１２３）および８Ａ５（遊離Ｃ末端）への特異的結合、ならびにＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）への特異的結合の欠損を特徴とする。
【００４８】
一部の断片もしくは完全長のαシヌクレインは、αシヌクレインの１２５番目の位置を占めるチロシン残基がリン酸化もしくはニトロ化されたものである。また、１２５番目のアミノ酸セリンを保持している断片、もしくは完全長のαシヌクレインは、この位置でリン酸化されていてもよい。１２５番目の位置のリン酸化もしくはニトロ化または１２９番目の位置のリン酸化に関し、患者において健常者集団の平均に対する増強が検出されることがリューイ体病の指標となる。検出は、１２５番目の位置がリン酸化もしくはニトロ化されたαシヌクレインに特異的な抗体を用いて行うことができる。レベルは、健常者集団の平均プラス１標準偏差より大きい場合、増大していると見なされる。
【００４９】
本発明の断片は、以前に報告されたアルツハイマー病アミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）とは異なる。この断片は、少なくとも２８個のアミノ酸残基（６０番目から８７番目までの残基）および、任意に３５個のアミノ酸残基（６１番目から９５番目までの残基）から成る。Ｉｗａｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：ｐ１０１３９−１０１４５；Ｊｅｎｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０（Ｐｔ１）：ｐ９１−９４（１９９５年）；ジェンバンク・アセッション番号Ｓ５６７４６を参照されたい。
【００５０】
他に断らない限り、αシヌクレインもしくはその断片に言及する場合、前記の天然のヒト型アミノ酸配列もしくはその断片、ならびに対立遺伝子、種および誘発による変異体などのアナログを含む。上記のアナログと天然ヒト型アミノ酸配列とが最大限にアラインメントされている場合、このアナログのアミノ酸にはこのヒト型アミノ酸配列の対応するアミノ酸と同じ番号が付与される。通常、アナログは、多くの場合、保存的置換によって、１箇所、もしくは２箇所、または数箇所の位置で天然ペプチドと異なる。一部の天然の対立遺伝子による変異体は、遺伝性ＬＢＤと遺伝的な関連がある。こうした変異体としては、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔが挙げられる。Ａ５３Ｔ変異は、この突然変異のない健常者のリン酸化の基準に比し、この突然変異を有する者ではαシヌクレインの１２９番目の位置においてリン酸化レベルの上昇を伴う。アナログは、天然ペプチドと少なくとも８０もしくは９０％の配列同一性を示す。また、一部のアナログは、非天然型アミノ酸を、または１箇所、もしくは２箇所、または数箇所の位置のＮもしくはＣ末端アミノ酸が修飾されたものを含む。例えば、天然型のグルタミン酸残基はイソ−アスパラギン酸で置換されることがある。非天然型アミノ酸の例としては、Ｄ，α，α２置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルリジン、イプシロン−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、オメガ−Ｎ−メチルアルギニン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびイソアスパラギン酸が挙げられる。通常、アナログは、天然ヒト型αシヌクレインに対するポリクロナール抗体集団に特異的に結合する。また、本発明は、Ｄ−アミノ酸でαシヌクレインの大部分もしくは全ての位置の対応する天然Ｌ−アミノ酸を置換させることができるＤ−ペプチドを提供する。
【００５１】
αシヌクレイン、その断片およびアナログは、固相ペプチド合成法もしくは組換え発現法によって合成することができ、または自然源から入手することができる。自動ペプチド合成機が、アプライド・バイオシステムズ社、フォスター・シティ、カリフォルニアなどの数多くの製造業者から市販されている。組換え発現法では大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞を用いることができる。組換え発現の方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．プレス、ＮＹ、第２版、１９８９年）に記載されている。
【００５２】
（ＩＩＩ．リューイ体病）
リューイ体病（ＬＤＢ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびリューイ体（ＬＢ）の形成である。（ＭｃＫｅｉｔｈら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ（ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＬＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６年）４７：ｐ１１１３−２４）。リューイ体は神経細胞に見出される球状の蛋白質沈着物である。これが脳内に存在すると、アセチルコリン、ドーパミンなどの化学的メッセンジャーの作用が遮断されて脳の正常な機能が妨げられる。リューイ体病としては、（特発性パーキンソン病（ＰＤ）を含む）パーキンソン病、リューイ体を有する痴呆（ＤＬＢ）としても知られる瀰漫性リューイ体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病とパーキンソン病との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が挙げられる。ＤＬＢＤは、アルツハイマーおよびパーキンソン病の症状を共有する。ＤＬＢＤは、主にリューイ体の存在部位においてパーキンソン病と異なる。ＤＬＢＤではリューイ体は主として皮質に形成される。パーキンソン病ではこれは主として黒質に形成される。他のリューイ体病としては、自律神経失調症、リューイ体性燕下困難、偶発性ＬＤＢ、遺伝性ＬＤＢ（例えば、αシヌクレイン遺伝子ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４の突然変異）ならびに多系統萎縮症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群）が挙げられる。
【００５３】
（ＩＶ．遺伝子導入動物および細胞）
本発明は、上述のＣ末端切断型αシヌクレインをコードしている核酸セグメントを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入動物を提供する。この導入遺伝子はこの遺伝子導入動物の体細胞および生殖系細胞の全体もしくは実質上全体に存在することが好ましい。上記Ｃ末端切断型αシヌクレインをコードしている核酸セグメントは、この切断型αシヌクレインがこの動物の神経細胞内で発現されることを可能にする１つ以上の調節性セグメントに動作可能なように結合させる。ラット神経特異的エノラーゼ・プロモータ、ヒト・β−アクチン遺伝子プロモータ、ヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プロモータ、ラット・ナトリウム・チャンネル遺伝子プロモータ、マウス・ミエリン塩基性蛋白質遺伝子プロモータ、ヒト銅−亜鉛スーパーオキシド・ジスムターゼ遺伝子プロモータ、哺乳動物ＰＯＵ−ドメイン調節遺伝子プロモータなどのプロモータを使用することができる。これらのうち、ＰＤＧＦプロモータが特に適している。任意選択的に、誘導性プロモータを使用する。亜鉛などの重金属をマウスの水もしくは餌に加えることにより調節することができるマウス・メタロチオニン・プロモータが適している。このような遺伝子導入動物は、完全長のαシヌクレインを有する遺伝子導入動物の作製のために（Ｍａｓｌｉａｈら，ＡＭ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９６年）１４８：ｐ２０１−１０およびＦｅａｎｙら，Ｎａｔｕｒｅ（２０００年）４０４：ｐ３９４−８）により報告され、もしくは（突然変異型ＡＰＰを有する遺伝子導入動物の作製に関する）米国特許第５，８１１，６３３号に開示されたのと同じ一般的な方法によって作製することができる。任意選択的に、切断型αシヌクレイン蛋白質を発現する導入遺伝子を有する遺伝子導入動物は、アルツハイマー病モデルなどの他の神経性疾患モデルと交配させることができる。例えば、切断型αシヌクレイン蛋白質を発現する導入遺伝子を有する遺伝子導入動物は、例えば、Ｇａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：ｐ５２３（１９９５年）；ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第５，６１２，４８６号；Ｈｓｉａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：ｐ９９（１９９６年）；Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９４：ｐ１３２８７−１３２９２（１９９７年）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９４：ｐ１３２８７−１３２９２（１９９７年）；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら，Ｎｅｕｒｏｎ  １９：ｐ９３９−９４５（１９９７年）に記載されている導入遺伝子により発現されるＦＡＤ突然変異を含むＡＰＰを有する遺伝子導入動物と交配させることができる。このような交配を実施する方法については、例えば、完全長のαシヌクレインを発現する遺伝子導入マウスとＧａｍｅｓらによるＰＤＡＰＰマウスとの交配を報告しているＭａｓｌｉａｈら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９８：ｐ１２２４５−１２２５０（２００１年）に記載がある。本発明の遺伝子導入動物は、好ましくは、マウス、ラットなどの齧歯動物、もしくはショウジョウバエなどの昆虫である。
【００５４】
動物モデルで切断型αシヌクレインを発現させることにより、リューイ体病の少なくとも１つの特徴を形成する性質を付与された動物が得られる。このような特徴としては、αシヌクレインの細胞内沈着物の量の増加、リューイ体形成の増大、ならびに同種の正常な非遺伝子導入動物と比較した場合の認識および運動機能の障害が挙げられる。このような遺伝子導入動物は、リューイ体病の処置における薬理活性について薬剤をスクリーニングするのに有用である。
【００５５】
また、本発明は、凝集した切断型αシヌクレインを含む封入体を構成する切断型αシヌクレインで形質転換した細胞を提供する。この形質転換細胞は、ＧＴ１−７神経細胞（Ｈｓｕｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：ｐ４０１−４１０（２０００年））、ＰＣ１２細胞、ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞などの神経細胞であることが好ましい。また、ＰＥＡＫ細胞も使用することができる。これらの細胞はヒト細胞であることが好ましい。この切断型発現の発現を確実にする１つ以上の調節性配列に動作可能なように結合させた切断型αシヌクレインをコードしているセグメントを含むベクターをこれらの細胞内に形質導入する。形質導入した細胞を用いることにより、αシヌクレイン封入体を除去する活性について薬剤をスクリーニングすることができる。
【００５６】
（Ｖ．スクリーニング方法）
本発明は、ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤を特定するためのいくつかのスクリーニング方法を提供する。この方法は、インビトロで、または細胞もしくは遺伝子導入動物を用いて実施することができるスクリーニング、および活性の指標としての種々のパラメータを調べるスクリーニングを含む。これらのスクリーニングにおいて活性を有すると判定された薬剤は、ＬＢＤの動物モデルによる二次スクリーニングもしくは臨床試験において再度試験することにより、こうした疾患の行動上その他の症状に対する活性を測定することができる。
【００５７】
（１．インビトロ）
インビトロ・アッセイは、切断型αシヌクレインの凝集に対する薬剤の阻害能を調べるために行う。αシヌクレインのインビトロ凝集を分析するための基本方式については、完全長のαシヌクレインに関するものではあるが、（Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：ｐ１９５０９−１９５１２（１９９９年））に記載がある。本発明の方法では、このアッセイは試験すべき薬剤の存在下に実施する。薬剤存在下のαシヌクレイン凝集の速度もしくは程度を測定して、薬剤を用いない同時的もしくはヒストリカルな対照におけるαシヌクレイン凝集の速度もしくは程度と比較する。対照に対して薬剤存在下の凝集の速度もしくは程度が低下した場合、これによってこの薬剤に切断型αシヌクレインの凝集を阻害する活性があることが明らかになる。この活性は、リューイ体病を治療もしくは予防するのに有用となる可能性がある。
【００５８】
（２．細胞によるアッセイ）
細胞による一部のアッセイは、上述の切断型αシヌクレインをコードしている核酸を用いて、また、任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種を用いて形質導入した細胞で実施する。このような細胞を試験対象の薬剤と接触させ、この切断型αシヌクレインの凝集の程度の速度を測定する。次いで、αシヌクレインの凝集の程度の速度を、薬剤の非存在下に同様に形質導入した対照細胞と比較する。凝集は、免疫組織化学的分析、光学顕微鏡の使用もしくはゲル分析によってモニターすることができる。ゲル分析を用いると、二量体、三量体もしくはそれ以上のオリゴマーの形成、および高レベルのオリゴマー形成によるシヌクレインのゲルへの侵入不能性を検知することができる。対照に対して試験薬剤存在下の凝集の速度もしくは程度が低下した場合、これによって薬剤が切断型αシヌクレインの凝集を阻害する薬理活性を有することが明らかになる。この活性は、リューイ体病を治療もしくは予防するのに有用となる可能性がある。
【００５９】
細胞による他のアッセイは、完全長のαシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種をコードしている核酸を用いて形質導入した細胞で実施する。このような細胞を試験対象の薬剤と接触させ、切断型αシヌクレインおよび／またはリン酸化型もしくはニトロ化型シヌクレインの形成の速度もしくは程度を測定する。こうした型の存在は、αシヌクレインに対する１種以上の抗体を用いるウェスタン・ブロッティングによって検出することができる。末端特異的抗体（即ち、切断型には結合するが、完全長のαシヌクレインには結合しない抗体）はこの分析に特に有用である。また、種々の抗原決定基特異性を有する抗体のコレクションを用いることもできる。例えば、切断型αシヌクレインの存在は、インタクトなαシヌクレインの１１８番目から１２５番目のアミノ酸によってほぼ規定されるアミノ酸セグメントの抗原決定基Ｎ末端を認識する抗体を用いてブロットした時にバンドが認められること、およびこの領域の抗原決定基Ｃ末端を認識する抗体でブロットした時にバンドが認められないことによって明らかにすることができる。薬剤の存在下における切断型αシヌクレインおよび／またはリン酸化型もしくはニトロ化型の形成の速度もしくは程度は、薬剤非存在下の同様な対照細胞と比較する。対照に対して試験薬剤存在下の切断型αシヌクレイン形成の速度もしくは程度が低下した場合、これによって、薬剤がαシヌクレインの切断型へのプロセシングを阻害する薬理活性を有することが明らかになる。この活性は、ＬＢＤを治療もしくは予防するのに有用である。
【００６０】
（３．遺伝子導入動物によるアッセイ）
遺伝子導入動物は、上述の切断型αシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種を発現する導入遺伝子を有する。このような動物を試験対象の薬剤と接触させ、この切断型αシヌクレインの凝集の程度の速度を、同時的もしくはヒストリカルな対照との比較で測定する。この対照は、通常、上記薬剤に接触させなかった同種の同様な遺伝子導入動物である。遺伝子導入動物におけるαシヌクレインの凝集は、実施例で説明したように、ウエスタン・ブロッティングもしくは免疫組織化学によってモニターすることができる。あるいは、もしくはさらに、このような遺伝子導入動物における薬剤の活性は、実施例で説明したように、運動もしくは認識上の特徴などの行動上の特徴から測定することができる。このようなアッセイでは、薬剤の薬理活性は、薬剤に接触させなかった同様な対照遺伝子導入動物と比較した場合の運動もしくは認識上の特徴の改善（即ち、このような特徴の障害の低減）によって示される。
【００６１】
別のアッセイは、完全長型αシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種を発現する導入遺伝子を有する遺伝子導入動物を用いて実施する。このような動物を試験対象の薬剤と接触させ、切断型αシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種についてこれらの出現の速度もしくは程度を検出する。このような型は、（細胞によるアッセイに対して述べたように）適切な抗αシヌクレイン抗体を用いたウエスタン・ブロッティングもしくは免疫組織化学的分析によって検出することができる。切断型αシヌクレインおよび／またはリン酸化もしくはニトロ化型の出現の速度の程度は、薬剤に接触させなかった同様な遺伝子導入動物に相当する同時的もしくはヒストリカルな対照におけるそのような型の出現の速度もしくは程度と比較する。対照に対して試験薬剤に接触させた動物における切断型αシヌクレイン出現の速度もしくは程度が低下した場合、これによって、薬剤が完全長のαシヌクレインの切断型へのプロセシングを阻害する薬理活性を有することが明らかになる。
【００６２】
（４．スクリーニング対象の薬剤）
スクリーニング対象の薬剤としては、αシヌクレインに対する抗体、αシヌクレインのペプチド、ＬＢＤの処置において活性を有することが知られ、もしくは考えられる薬物、天然物、およびコンビナトリアル・ライブラリが挙げられる。好ましいαシヌクレインのペプチドは、αシヌクレインの１１８番目から１２５番目までのアミノ酸を含む３０、２５、２０、１０もしくはそれ以下の個数のアミノ酸から成る比較的短いペプチドである。任意選択的に、Ｃ末端切断型αシヌクレインを生じさせる切断部位のすぐＮ末端側のアミノ酸、例えば、αシヌクレインの１１９番目アミノ酸を、この切断部位を挟む２つのアミノ酸間に加水分解されない結合を形成する遷移状態アナログ・アミノ酸で置換する。アナログの例としては、スタチン、ヒドロキシエチレン、ヒドロキシエタノールアミン、ＡＨＰＰＡ、ＡＣＨＰＡおよびこれらの誘導体などの遷移状態アナログがある。また、天然型αシヌクレインの１つ以上のアミノ酸を他の天然型アミノ酸で置換することもできる。
【００６３】
また、スクリーニング対象の天然物は、国立がんセンター研究所天然物リポジトリ、ベセズダ、ＭＤから入手することもできる。また、ペプチドその他の化合物のランダム・ライブラリを適合性についてスクリーニングすることもできる。コンビナトリアル・ライブラリは、段階的方法で合成することができる多くの種類の化合物について作製することができる。このような化合物としては、ポリペプチド、β−ターン類似物質、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、およびオリゴカルバメートが挙げられる。これらの化合物の大きなコンビナトリアル・ライブラリは、アフィマックス社の国際公開第９５／１２６０８号、アフィマックス社の国際公開第９３／０６１２１号、コロンビア大学の国際公開第９４／０８０５１号、ファーマコペア社の国際公開第９５／３５５０３号およびスクリップス社（Ｓｃｒｉｐｐｓ）の国際公開第９５／３０６４２号（これらのいずれも、あらゆる目的で引用により本明細書に組み込まれている）に開示されている符号化されたライブラリ合成（ＥＳＬ）法によって構築することができる。また、ペプチド・ライブラリは、ファージ・ディスプレイ法によって作製することもできる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎの国際公開第９１／１８９８０号を参照されたい。コンビナトリアル・ライブラリおよび他の化合物は、最初に、これらのαシヌクレインへの結合能を測定することによって適合性をスクリーニングすることができる。
【００６４】
（ＶＩ．毒性アッセイ）
これらのスクリーニング・アッセイに開示されているのと類似の方法を用いて、既存の薬物、食品、環境有害物質および他の化合物がαシヌクレインのプロセシング、リン酸化もしくは凝集の促進を介して毒性作用を発現するかどうかを調べることができる。このようなアッセイは上記スクリーニング・アッセイと同様に行うことができる。毒性作用は、上記スクリーニング・アッセイにおける薬理活性とは逆の結果で示される。
【００６５】
（ＶＩＩ．プロテアーゼの単離）
完全長αシヌクレインの本発明の切断型へのプロセシングは、プロテアーゼを用いて行う。このプロテアーゼは、上述のスクリーニング法によって特定される阻害剤を用いて精製することができる。好ましい阻害剤は、切断部位に対してＮ末端側の残基を遷移状態アナログで置換した１１７番目から１２６番目までの残基を含むαシヌクレインのペプチドである。このような阻害剤をアフィニティー精製試薬として用いることによって脳細胞の抽出物から上記プロテアーゼを精製する。この細胞は、正常者もしくはＬＤＢ病に罹患していた者の死体から入手することができる。プロテアーゼのレベルは後者で高いと考えられる。このプロテアーゼは、αシヌクレイン基質にこれを作用させ、切断産物の形成をモニターすることによってアッセイすることができる。この基質は、例えば、上述の天然のヒト型αシヌクレイン、切断部位の両側から挟む残基を有するその断片、もしくは突然変異が遺伝型ＬＢＤを伴うその突然変異型とすることができる。任意選択的に、こうした基質のＣ末端を固相に、Ｎ末端を標識に固定化することができる。基質が切断されると、この標識が液相に遊離する。この液相は固相から容易に分離されるので、標識の量を蛋白分解活性の指標として測定することができる。
【００６６】
（ＶＩＩ．末端特異的抗体）
本発明は末端特異的抗体を提供する。この抗体は、（Ｃ末端）切断型αシヌクレイン、好ましくはＳＮ１−１１８、ＳＮ１−１１９、１−１２０、１−１２１、１−１２２、１−１２３、１−１２４、１−１２５もしくは１−１２６からなる群から選ばれる型に特異的に結合するが、完全長のαシヌクレインには特異的な結合を示さない。このような抗体は、αシヌクレイン沈着物のインビトロでのイメージングに、および治療剤として（下記参照）、ならびに上述のスクリーニング方法においてαシヌクレインの蛋白分解性切断で生じる切断産物を検出するのに有用である。また、対応するＣ末端側断片、例えば、１１８−１４０、１１９−１４０、１２０−１４０、１２１−１４０、１２２−１４０、１２３−１４０、１２４−１４０、１２５−１４０および１２６−１４０に対する末端特異的抗体を提供する。こうした末端特異的抗体は、これらの断片のＮ末端を認識することによって、完全長のαシヌクレインには特異的な結合を示すことなく、断片に特異的に結合する。
【００６７】
このような抗体は、実験動物をαシヌクレインもしくはその断片で免疫して抗体を生じさせ、得られた抗体をスクリーニングして所望の結合活性を有するものを特定することにより作製することができる。任意選択的に、免疫は、本発明の切断断片のＣ末端を含む２０個未満のアミノ酸からなる比較的短いペプチド（例えば、ＳＮ９９−１１８もしくはＳＮ１１０−１１９）を用いて行うことができる。任意選択的に、こうした短いペプチドは、免疫反応の誘発を促進する担体に結合させる。
【００６８】
任意選択的に、標識もしくは固定化断片への特異的な結合は、非標識の完全長αシヌクレインと競合させる形で行うことができる。任意選択的に、抗体の大きなライブラリは、ファージ・ディスプレイ法を用いて同時にスクリーニングすることができる。
【００６９】
非ヒト、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギもしくはラットのモノクロナール抗体は、（あらゆる目的で引用により本明細書に組み込まれている）Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ、１９８８年）に記載されている方法で作製することができる。実験動物の免疫には、完全フロインドアジュバントと、これに続いて不完全アジュバントを用いることが好ましい。通常、ウサギもしくはモルモットはポリクロナール抗体の作製に用いられる。一般に、モノクロナール抗体の作製にはマウスを用いる。結合は、例えば、ウェスタン・ブロットもしくはＥＬＩＳＡによって評価することができる。抗体の抗原決定基は、この抗体に特異的に結合する最小の断片によって規定される。一方、抗原決定基特異性は、試験および対照抗体がαシヌクレインへの結合に対して競合する競合アッセイによって調べることができる。試験および対照抗体が競合する場合、これらは同じ抗原決定基、もしくは１つの抗体の結合がもう一方の抗体の結合を妨げるのに十分互いに近接した抗原決定基に結合する。
【００７０】
キメラおよびヒト化抗体は、キメラもしくはヒト化抗体の作製の出発原料となるマウスその他の非ヒト抗体と同一もしくは同様の結合特異性および親和性を有する。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖の遺伝子が、異なる種に由来する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、通常遺伝子操作によって構築された抗体である。例えば、マウス・モノクロナール抗体からのこうした遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ４などの定常（Ｃ）セグメントに結合させることができる。ヒト・アイソタイプＩｇＧ１が好ましい。一部の方法として、この抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。また、一部の方法として、ＩｇＭ抗体を用いることもできる。従って、代表的なキメラ抗体は、マウス抗体のＶ、即ち抗原結合ドメインとヒト抗体のＣ、即ちエフェクタ・ドメインとから成るハイブリッド抗体である。
【００７１】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）からの可変領域フレームワーク残基、および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）からの相補性決定領域を有する。ＱｕｅｅｎらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６：ｐ１００２９−１００３３（１９８９年）、国際公開第９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号（これらのいずれも、あらゆる目的のため全文引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。また、定常領域は、存在する場合、実質的にもしくは完全にヒト免疫グロブリン由来のものとする。ヒト可変ドメインは、通常、フレームワーク配列が上記ＣＤＲの由来するマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体から選ばれる。重鎖および軽鎖可変領域フレームワーク残基は、同一もしくは異なるヒト抗体配列に由来するものとすることができる。ヒト抗体の配列は、天然型ヒト抗体の配列もしくは数種のヒト抗体のコンセンサス配列とすることができる。Ｃａｒｔｅｒらの国際公開第９２／２２６５３号を参照されたい。上記ヒト可変領域フレームワーク残基から特定のアミノ酸を選び、ＣＤＲの立体構造および／または抗原への結合に対して及ぼし得る影響に基づいて置換する。このような及ぼし得る影響についての研究は、模型化、特定の位置のアミノ酸の特性の検討、または特定アミノ酸の置換もしくは突然変異の影響についての経験的観察によって行われる。
【００７２】
αシヌクレインに対するヒト抗体は、以下に説明する種々の方法により形成される。特定のマウス抗体と同じ抗原決定基特異性を有する一部のヒト抗体は、競合結合実験もしくは別の方法により選定する。ヒト抗体を得る方法としては、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：ｐ３６１−３６７（１９８３年）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇの米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４，６３４，６６６号（これらはいずれも、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているトリオーマ法、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９３／１２２２号、米国特許第５，８７７，３９７号、米国特許第５，８７４，２９９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，７８９，６５０号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ  １４８：ｐ１５４７−１５５３（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：ｐ８２６（１９９６年）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉの国際公開第９１／１０７４１号（これらはいずれも、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているような、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのセグメントをコードしている導入遺伝子を有する非ヒト遺伝子導入哺乳動物の使用、ならびにファージ・ディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒらの国際公開第９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第９２／０１０４７号、米国特許第５，８７７，２１８号、米国特許第５，８７１，９０７号、米国特許第５，８５８，６５７号、米国特許第５，８３７，２４２号、米国特許第５，７３３，７４３号および米国特許第５，５６５，３３２号（これらはいずれも、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている））が挙げられる。
【００７３】
キメラ、ヒト化もしくはヒト抗体の重鎖および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部分に結合させることができる。定常領域の選択は、一部、抗体依存性補体および／または細胞媒介毒性が所望されるかどうかによって決まる。例えば、アイソトープＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体活性を有するが、アイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は有しない。また、アイソタイプの選択は、脳内への抗体の通過に影響することがある。ヒト・アイソタイプＩｇＧ１が好ましい。軽鎖定常領域はラムダ型もしくはカッパ型とすることができる。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含む四量体として、もしくは別々の重鎖、軽鎖として、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、あるいは重鎖および軽鎖可変ドメインをスペーサを介して結合させた一本鎖抗体として発現させることができる。
【００７４】
また、別の実施態様として、αシヌクレインの１０９番目から１２０番目の残基内もしくは１１５番目から１２３番目の残基内の抗原決定基または４３番目から５１番目の残基および６８番目から６５番目の残基内の不連続な抗原決定基に特異的に結合し、あるいはαシヌクレインのＣ末端に対して末端特異的であるヒト化型、キメラ型およびヒト型などのモノクロナール抗体を提供する。αシヌクレインのＣ末端に対する末端特異的抗体は、遊離蛋白質としてαシヌクレインに特異的に結合することができるが、αシヌクレインのＣ末端が別のペプチドと結合しているような融合蛋白質の構成成分としてのαシヌクレインには特異的に結合できないという性質によって識別することができる。これらの抗体は、治療活性についてスクリーニングすることができ、肯定的な結果が得られれば、治療法に用いることができる。また、こうした抗体は、前述のように、αシヌクレインの断片を検出するのにも用いることができる。
【００７５】
（ＩＸ．診断）
本発明は患者においてＬＢをインビボでイメージングする方法を提供する。このような方法は、ＰＤのリューイ体病もしくはこれに対する罹病性を診断し、またはこれらの診断を確認するのに有用である。例えば、この方法は痴呆の症状を示す患者において用いることができる。この患者がＬＢを有する場合、患者はリューイ体病に罹患していると考えられる。また、この方法は、無症候性の患者においても用いることができる。異常なアミロイド沈着が存在すると、将来症候性疾患に罹患しやすいことが分かる。また、この方法は、以前にリューイ体病と診断された患者において疾患の進行および／または治療に対する反応をモニターするのに有用である。
【００７６】
この方法は、患者の体内でαシヌクレインに結合する上記のような末端特異的抗体を投与し、次いで結合したこの抗体を検出することによって行うことができる。所望であれば、除去反応は、Ｆａｂなどの完全長の定常領域を欠く抗体断片を用いることにより回避することができる。一部の方法では、同一の抗体に治療剤および診断試薬としての両方の機能を持たせることができる。
【００７７】
診断試薬は、患者の体内に静注することにより、または頭蓋内注射により、もしくはドリルで穴をあけた頭蓋骨から直接脳内に投与することができる。試薬の投与量は治療方法の場合と同じ範囲内とする必要がある。通常、この試薬は標識するが、一部の方法では、αシヌクレインに対して親和性を有する主試薬は標識せず、別の標識試薬を用いて主試薬に結合させる。標識の選択は検出方法によって決まる。例えば、蛍光標識は光学的検出に適している。常磁性標識の使用は外科的処置を必要としない断層撮影法による検出に適している。また、放射活性標識はＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴを用いて検出することができる。
【００７８】
診断は、標識された部位の数、大きさおよび／または強度を対応するベースラインレベルと比較することにより行う。このベースラインレベルは健常者集団の平均のレベルとすることができる。また、ベースラインレベルは同一患者で測定した以前のレベルとすることもできる。例えば、処置を始める前の患者においてベースラインレベルを測定し、その後の測定値をこのベースラインレベルと比較することができる。ベースラインに対するレベルの減少は、処置に対する好反応を示唆するものである。
【００７９】
また、末端特異的抗体は、切断型αシヌクレインが脳脊髄液または他の体組織もしくは体液に存在するかどうかを調べるのに有用である。この型が、健常者集団の正常レベルに対し、患者おいて有意に高いレベル（即ち、平均プラス１標準偏差より高いレベル）で存在することは、ＬＢＤに罹患しているか罹患性があることを示すものである。
【００８０】
（Ｘ．処置方法）
本発明は、リューイ体病に罹患しているか、罹患するリスクを有する患者においてこの疾患を予防もしくは治療するいくつかの方法を提供する。治療剤としては、上述の切断型αシヌクレインおよび抗体を誘導するのに有効なその断片、上記のような末端特異的抗体、ならびに上述のような、切断型αシヌクレインの凝集もしくはαシヌクレインの蛋白分解性プロセシングに対する阻害剤が挙げられる。ＬＢＤに罹患しているか、罹患するリスクを有する患者に薬剤を投与する一般的な方法については、あらゆる目的で、記載されている全ての引用文献を含む全文引用により本明細書に組み込まれている同時係属出願の２００２年１１月１日提出の米国特許出願第６０／４２３，０１２号、ならびに２０００年６月１日提出の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１５２３９号および２００３年１０月３１日提出の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３４５２７号に開示されている。
【００８１】
治療の対象となる患者としては、現在ＬＢＤの症状を示している患者ばかりでなく、ＬＢＤに罹患するリスクを有するが、症状は出ていない者も含まれる。従って、本方法は、ＬＢＤについて知られている遺伝的リスクを有する者に予防的に施行することができる。このような者としては、本疾患に罹患したことのある血縁者を有する者、および遺伝もしくは生化学的マーカーの解析によってリスクが明らかにされている者が挙げられる。ＰＤに対するリスクの遺伝マーカーとしては、αシヌクレインもしくはパーキン（Ｐａｒｋｉｎ）、ＵＣＨＬＩ、およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の突然変異；特に、αシヌクレイン遺伝子の３０および５３番目の位置の突然変異が挙げられる。現在パーキンソン病に罹患している者は、静止振戦、筋固縮、運動緩徐および姿勢の不安定を含む臨床症状によって見分けることができる。
【００８２】
一部の方法として、上記患者は、リューイ体を特徴とする疾患以外のどんなアミロイド生成性疾患の臨床症状もしくはリスク要因も有さない者である。一部の方法として、上記患者は、細胞外アミロイド沈着を特徴とするどんな疾患の臨床症状もしくはリスク要因も有さない者である。一部の方法として、上記患者は、Ａβペプチドのアミロイド沈着を特徴とする疾患を有さない者である。一部の方法として、上記患者は、アルツハイマー病の臨床症状およびリスク要因を有さない者である。一部の方法として、上記患者は、アルツハイマー病とリューイ体とを特徴とする疾患を併発している者である。一部の方法として、上記患者は、アルツハイマー病とパーキンソン病とを併発している者である。
【００８３】
無症候性の患者では、任意の年齢（例えば、１０、２０、３０歳）で処置を開始することができる。しかしながら、通常、患者が４０、５０、６０もしくは７０歳に到達するまで処置を開始する必要はない。一般的には、処置は、ある期間にわたって多回投与することを必要とする。処置は、治療剤（例えば、切断型αシヌクレイン・ペプチド）に対する抗体または活性化Ｔ細胞もしくはＢ細胞反応を長い期間をかけてアッセイすることによりモニターすることができる。反応が低下した場合には、追加抗原投与が必要となる。
【００８４】
予防的な適用では、医薬用組成物もしくは薬剤を、ＬＢＤに罹りやすいか、それとも罹るリスクのある患者に対して、そのリスクを除去もしくは低下させ、その重症度を軽減し、あるいはこの疾患の生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の症状、その合併症ならびにこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含むこの疾患の発現を遅らせるのに十分なこの組成物もしくは薬剤の投与量および投与頻度を含む治療法において投与する。治療的な適用では、組成物もしくは薬剤を、そのような疾患が疑われるか、すでに罹患している患者に対して、その合併症およびこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含むこの疾患の（生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の）症状を治すか、少なくとも部分的に抑えるのに十分なこの組成物の投与量および投与頻度を含む治療法において投与する。治療的もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量は、治療的もしくは予防的有効用量と定義される。治療的もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量および投与頻度の組み合わせは、治療的もしくは予防的有効療法と定義される。治療的および予防的有効療法のいずれにおいても、薬剤は、通常、十分な免疫反応が達成されるまで数用量投与する。一般には、免疫反応をモニターし、免疫反応が減弱し始める場合には投薬を繰り返す。
【００８５】
一部の方法では、薬剤の投与によりαシヌクレインの細胞内凝集レベルが低下する。一部の方法では、薬剤の投与によりＣ末端切断型αシヌクレインのレベルが低下する。一部の方法では、薬剤の投与により、パーキンソン病の場合の運動もしくは認識機能のようなＬＢＤの臨床症状が改善する。一部の方法では、薬剤投与後、時々、αシヌクレインの細胞内凝集レベルの低下もしくは疾患の臨床症状の改善をモニターする。
【００８６】
上述の症状の処置に対する本発明の組成物の有効用量は、多くの種々の要因、例えば、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、他の投与薬剤、および処置が予防的なものか治療的なものかによって異なる。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置用量は、安全性および有効性を最適化するために漸増する必要がある。
【００８７】
一部の方法では、この薬剤は、αシヌクレインの切断断片もしくはαシヌクレインに対する抗体を誘導することができるその断片である。このような断片の量は、アジュバントも投与するかどうかによって決まり、アジュバントを用いない場合には用量を上げる必要がある。ヒトへの投与の場合、断片の投与量は、患者１人当たり１から５００μｇまでとし、より普通には、１回の注射当たり５から５００μｇとすることがある。時として、１回の注射当たり１〜２ｍｇの比較的高用量を用いる。一般には、ヒトへの注射１回当たり約１０、２０、５０もしくは１００μｇを用いる。また、断片の質量は、断片全体の質量に対する断片内の免疫原性抗原決定基の質量比によって決まる。通常、断片の１マイクログラムにつき１０−３〜１０−５マイクロモルの免疫原性抗原決定基を用いる。注射のスケジュールは、１日１回から１年に１回、さらには１０年に１回と大きく変えることができる。ある用量の免疫原を投与する所定の日の投与量は、１μｇ／患者より高く、アジュバントも投与する場合には、通常１０μｇ／患者より高いが、アジュバントを用いない場合は、通常１００μｇ／患者より高い。一般的な治療法は、免疫後、６週間間隔などの時間間隔でブースタ注射を行うことから成る。別の治療法は、免疫後、１、２および１２ヶ月後にブースタ注射を行うことから成る。別の治療法は、生涯にわたって２ヶ月毎の注射を必要とする。あるいは、ブースタ注射は、免疫反応のモニタリングによって必要とされる場合、不定期に行うことができる。
【００８８】
また、αシヌクレインの切断断片は、αシヌクレインの切断断片の発現を確実にするための１つ以上の調節性エレメントに動作可能なように結合させたこの断片をコードする核酸の形で投与することもできる。免疫原をコードする核酸の用量は、患者１人当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇもしくは３０〜３００μｇＤＮＡである。感染性ウイルス・ベクターの用量は、投与量当たり１０〜１００ビリオンもしくはそれ以上とする。
【００８９】
一部の方法は末端特異的抗体を用いた受動免疫を含む。このような方法では、投与量は宿主体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇ、より普通には０．０１〜５ｍｇである。例えば、投与量を１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、即ち、７０ｋｇの体重の患者の場合、それぞれ、７０ｍｇもしくは７００ｍｇまたは７０〜７００ｍｇの範囲内とすることができる。例示的な処置療法は、２週間毎に１回もしくは１ヶ月に１回もしくは３〜６ヶ月に１回投与するものである。一部の方法では、種々の結合特異性を有する２種以上のモノクロナール抗体を、各抗体の投与量が示した範囲内に収まるようにして、同時投与する。通常、抗体は複数回にわたって投与する。個々の投薬間の間隔は１週間、１ヶ月もしくは１年とすることができる。また、間隔は、患者におけるαシヌクレインに対する抗体の血中濃度の測定によって必要とされる場合、不定期とすることができる。一部の方法では血漿中抗体濃度が１〜１，０００μｇ／ｍｌとなるように、一部の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように投与量を調節する。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することができるが、この場合、投与頻度を下げる必要がある。投与量および投与頻度は患者体内における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト型抗体は最も長い半減期を示し、これにヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処置が予防的なものか治療的なものかによっても異なることがある。予防的な適用では、比較的低用量を長期間比較的低頻度の間隔で投与する。一部の患者では、その後の生涯にわたって処置を継続する。治療的適用では、疾患の進行が低減するか停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量を投与することが必要な場合がある。その後は、この患者に予防療法を施行することができる。
【００９０】
治療剤は、予防的および／または治療的処置において、非経口的、局所的、経静脈的、経口的、経皮下的、経動脈的、経頭蓋内的、経髄腔内的、経腹腔内的、経鼻腔内的もしくは経筋肉内的手段によって投与することができる。免疫原の最も一般的な投与経路は皮下であるが、他の経路も同様に有効である。次に最も一般的な投与経路は筋肉内注射である。このタイプの注射は、最も一般的には、腕もしくは脚筋において行われている。一部の方法として、薬剤を、沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射（例えば、頭蓋内注射）する。抗体の投与には筋肉内注射もしくは静脈内注射が好ましい。一部の方法として、特定の治療用抗体を頭蓋内に直接注射する。一部の方法として、抗体を徐放組成物もしくはデバイス、例えば、メディパッド（Ｍｅｄｉｐａｄ）（登録商標）デバイスとして投与する。αシヌクレインのプロテアーゼによるプロセシングを阻害することによって作用する小分子は、この小分子が治療もしくは予防効果を示すのに十分脳血液関門を通過する場合には静脈内に、そうでない場合は頭蓋内に直接投与することができる。
【００９１】
本発明の薬剤は、任意選択的に、ＬＢＤの処置において少なくともある程度有効な他の薬剤と組み合わせて投与することができる。また、本発明の薬剤は、脳血液関門に対する本発明の薬剤の通過を促進する他の薬剤と併用して投与することもできる。
【００９２】
免疫原はアジュバントとの組み合わせで投与することがある。種々のアジュバントをαシヌクレインなどのペプチドと組み合わせて用いることにより免疫反応を誘発することができる。好ましいアジュバントは、免疫原に固有の反応を増強するが、この反応の質的な形態に影響する免疫原の立体構造変化を引き起こさない。好ましいアジュバントとしては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ（登録商標））（英国特許第２２２０２１１号（ＲＩＢＩイムノケム・リサーチ社（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、ハミルトン、モンタナ州、現在コリザ社の一部）参照）が挙げられる。スティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（登録商標）ＱＳ−２１は、南アメリカに存在するバラ科キラヤ（学名Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたトリテルペン・グリコシドもしくはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌ＆Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９５年）；米国特許第５，０５７，５４０号（アキラ・バイオファーマシューティカルス社（Ａｑｕｉｌａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、フレーミングハム、ＭＡ）参照）。他のアジュバントには、（スクアレン、ピーナッツ油などの）水中油エマルジョンがあり、任意選択的に、モノホスホリルリピッドＡ（Ｓｔｏｕｔｅら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３６：ｐ８６−９１（１９９７年）、プルロニック・ポリマー、マイコバクテリア死菌などの免疫賦活剤と組み合わせて用いる。別のアジュバントにはＣｐＧ（国際公開第９８／４０１００号）がある。あるいは、αシヌクレインをアジュバントに結合させることができる。しかしながら、このような結合によって、αシヌクレインの立体構造がこれに対する免疫反応の性質に影響を与えるような変化を実質的に生じてはならない。アジュバントは、有効な薬剤を含む治療用組成物の構成任意選択的に成分として投与することができ、あるいは治療剤の投与の前、もしくは投与と同時に、または投与後に別々に投与することができる。
【００９３】
好ましい種類のアジュバントは、水酸化アラム、リン酸アラム、硫酸アラムなどのアルミニウム塩（アラム）である。このようなアジュバントは、ＭＰＬもしくは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどの重合体もしくは単量体アミノ酸のような他の特異的免疫賦活剤と併用するか併用しないで用いることができる。別の種類のアジュバントは水中油エマルジョン製剤である。このようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミドＴＭ）その他の細菌細胞壁成分のような他の特異的免疫賦活剤と併用するか併用しないで用いることができる。水中油エマルジョンとしては、（ａ）モデル１１０Ｙミクロフルイダイザー（ミクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、ニュートン、ＭＡ）などのミクロフルイダイザーを用いて１ミクロン未満の粒子に処方された、（任意選択的に種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）５％スクアレン、０．５％ツウィーン８０および０．５％スパン８５を含むＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）１ミクロン未満のエマルジョンにミクロ流体化するか旋回流を与えてより大きなサイズのエマルジョンとした、１０％スクアレン、０．４％ツウィーン８０、５％プルロニック・ブロック・ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２％ツウィーン８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート、（ＴＤＭ）、細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（デトックス（Ｄｅｔｏｘ）（登録商標））からなる群から選ばれる１種以上の細菌細胞壁成分を含むリビ（Ｒｉｂｉ）（登録商標）アジュバント・システム（ＲＡＳ）（リビ・イムノケム社（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ）、ハミルトン、ＭＴ）が挙げられる。
【００９４】
別の種類の好ましいアジュバントは、スティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（登録商標）（ＱＳ−２１、アキラ社（Ａｑｕｉｌａ）、フレーミングハム、ＭＡ）などのサポニン系アジュバント、もしくはこれらから作製したＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどの粒子である。他のアジュバントとしては、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦならびに完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。別のアジュバントとしては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ１３およびＩＬ−１５）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインが挙げられる。別の種類のアジュバントは、免疫調節剤もしくはアジュバントとしての、糖残基がアミノ酸で置換されているＮ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレアおよびＮ−グリコシルカルバメートを含む糖脂質である（米国特許第４，８５５，２８３号参照）。また、熱ショック蛋白質、例えば、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０もアジュバントとして用いることができる。
【００９５】
アジュバントは、αシヌクレイン断片と一緒に、単一組成物として投与することができ、あるいはαシヌクレイン断片投与の前、もしくはこれと同時に、またはこれの後に投与することができる。αシヌクレイン断片およびアジュバントは、同一バイアルに包装して供給することができ、もしくは別々のバイアルに包装して使用前に混合することができる。通常、αシヌクレイン断片およびアジュバントは、目的とする治療用途を表示するラベルと共に包装する。αシヌクレイン断片およびアジュバントが別々に包装される場合には、この包装に、使用前に混合することについての使用説明書を添付するのが普通である。アジュバントおよび／または担体の選択は、このアジュバントを含む免疫原製剤の安定性、投与経路、投与スケジュールおよび接種対象の種に対するアジュバントの効力によって決まり、ヒトにおいて医薬用として許容可能なアジュバントは、関係する規制機関によってヒトへの投与が承認されているか承認されうるものである。例えば、完全フロインドアジュバントはヒトへの投与に適切ではない。アラム、ＭＰＬおよびＱＳ−２１が好ましい。任意選択的に、２種以上のアジュバントを同時に用いることができる。好ましい組み合わせとしては、アラムとＭＰＬ、ミョウバンとＱＳ−２１、ＭＰＬとＱＳ−２１、ＭＰＬもしくはＲＣ−５２９とＧＭ−ＣＳＦ、およびアラムとＱＳ−２１とＭＰＬが挙げられる。また、任意選択的にアラム、ＱＳ−２１およびＭＰＬならびにこれらの全ての組み合わせのうちのいずれかと併用して、フロイント不完全アジュバントを使用することができる（Ｃｈａｎｇら，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２：ｐ１７３−１８６（１９９８年））。
【００９６】
多くの場合、本発明の薬剤は、有効な治療剤および各種の他の医薬用として許容可能な成分を含む医薬用組成物として投与する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、１９８０年）を参照されたい。好ましい形態は、所望の投与様式および治療用途によって決まる。また、この組成物は、所望の製剤に応じて、動物もしくはヒトへの投与用の医薬用組成物を処方するための一般的な賦形剤と定義される、医薬用として許容可能で毒性のない担体もしくは希釈剤を含むことができる。この希釈剤は、その組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。さらに、この医薬用組成物もしくは製剤は、他の担体、アジュバント、もしくは毒性がなく治療用ではない非免疫原性の安定化剤なども含むことができる。
【００９７】
また、医薬用組成物は、蛋白質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および（ラテックス官能化セファロース（ｌａｔｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標）、アガロース、セルロースなどの）コポリマー、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体、ならびに（油滴、リポソームなどの）脂質凝集物などの大きくてゆっくりと代謝される高分子を含むこともできる。さらに、こうした担体は、免疫賦活剤（即ち、アジュバント）として機能させることができる。
【００９８】
非経口投与の場合、本発明の薬剤は、水、油、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの滅菌液とすることができる医薬用担体を含む生理的に許容可能な希釈剤を用いたこの物質の溶液もしくは懸濁液として、注射可能な用量を投与することができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤を組成物に加えることができる。医薬用組成物の他の成分としては、石油、動物、植物もしくは合成由来の成分、例えば、ピーナッツ油、大豆油および鉱油がある。一般に、プロピレングリコール、ポリエチレン・グリコールなどのグリコール類が、特に注射用溶液には好ましい液体担体である。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。例示的な組成物は、５０ｍＭのＬ−ヒスチジンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌからなり、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整した水性緩衝液に配合したモノクロナール抗体を５ｍｇ／ｍＬ含む。通常、非経口投与用の組成物は、実質的に無菌で、実質的に等張であり、ＦＤＡもしくは同様な機関のＧＭＰ条件下に製造される。
【００９９】
通常、組成物は溶液もしくは懸濁液の形の注射剤として調製するが、注射に先立って液体溶媒に溶解もしくは懸濁するのに適した固形物として調製することもできる。また、この製剤は、上述のアジュバント効果を増強するために、リポソームもしくはポリラクチド、ポリグリコリド、コポリマーなどの微粒子を用いて乳化もしくは封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：ｐ１５２７（１９９０年）およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：ｐ９７−１１９（１９９７年）参照）。本発明の薬剤は、有効成分の持続もしくはパルス放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。
【０１００】
他の投与様式に適した別の製剤としては、経口用、鼻腔内用および呼吸器用（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）製剤、坐剤ならびに経皮投与剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。坐剤の場合、結合剤および担体としては、例えば、ポリアルキレン・グリコールもしくはトリグリセリドが挙げられ、このような坐剤は、本有効成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％含む混合物から作製することができる。経口用製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤もしくは散剤の形をとり、有効成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含む。
【０１０１】
局所に適用すると、経皮的に、もしくは皮内から送達させることができる。本剤をコレラトキシンまたはその無毒化誘導体もしくはサブユニットあるいは他の同様な細菌毒素と同時投与することにより局所投与を容易にすることができる（Ｇｌｅｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：ｐ８５１（１９９８年））。同時投与は、これらの成分を混合物として、または化学的架橋結合もしくは融合蛋白質としての発現により得られる結合分子として用いることにより達成することができる。あるいは、スキン・パス（ｓｋｉｎ  ｐａｔｈ）もしくはトランスフェロソームを用いて経皮的送達を達成することができる（Ｐａｕｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２５：ｐ３５２１−２４（１９９５年）；Ｃｅｖｃら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８：ｐ２０１−１５（１９９８年））。
【実施例】
【０１０２】
（１．遺伝子導入動物における切断型αシヌクレインの検出）
ＰＤＦＧプロモータに動作可能なように結合させたインタクトなαシヌクレインをコードする核酸を有する、６週令、３ヶ月齢および１２ヶ月齢の遺伝子導入マウスを用いて検討した。これらのマウスを安楽死させて、４匹（雄２匹／雌２匹）からの皮質および海馬組織をプールした。この組織をＴＢＳ（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中でホモジナイズした後、１５０，０００×ｇで１５分間遠心した。次いで、得られたペレットを１％トリトンＸにより３０分間４℃で抽出し、これを上記のようにして遠心した。次に、得られたペレットを１％ＳＤＳにより３０分間２５℃で抽出し、これを上記と同様に遠心した。最後に、このペレットを８Ｍ尿素／１％ＳＤＳで抽出した。この方法によって、以下の説明でトリス、トリトン、ＳＤＳおよび尿素抽出物と呼ぶ４種の抽出物が得られた。
【０１０３】
図１Ａおよび図１Ｂは、抗体ＥＬＡＤＷ−４７を用いた、遺伝子導入マウスおよび対応対照からの抽出物のウェスタン・プロットを示す。この抗体は、ＳＮ１１５−１２２内の抗原決定基に結合する（が、何がしかの結合を生じるのに必ずしもその全てのアミノ酸を必要とする訳ではない）ポリクロナール抗体である。この抗体は、ヒト型αシヌクレインを選択的に結合するだけでなく、程度はより少ないがマウス型にも結合する。図１Ａおよび図１Ｂは、対照マウスおよび遺伝子導入マウスにおける１４ｋＤａのαシヌクレインのバンドを示す。このバンドは対照よりも遺伝子導入マウスで強い。各種の抽出物では、トリトン抽出物のバンドが最も強い。この抽出物は、膜結合αシヌクレインおよび恐らくリューイ体様封入体を可溶性にしている。（対照ではなく）遺伝子導入マウスについてのトリスおよび特にトリトン抽出では、トリシン緩衝液中で約１２ｋＤａのバンドが現れる。これは切断型αシヌクレインである。このバンドの分子量は、約１１５〜１２０個のアミノ酸の長さに相当する。
【０１０４】
図２は、図１と同じ抗体を用いて、３ヶ月齢と１２ヶ月齢のマウスで切断型αシヌクレインのレベルを比較したウェスタン・ブロットを示す。この図から、この切断型は３ヶ月齢のマウスでより強く現れることが分かる。この場合も、対照マウスでは切断型は現れない。このように遺伝子導入マウスの発育の初期段階で切断型αシヌクレインがより強く現れることから、切断型αシヌクレインはリューイ体病の発生過程の初期段階で役割を果たしていることが分かる。
【０１０５】
図３Ａおよび図３Ｂは、１２Ｃ１と呼ばれる別の抗体（４３番目から５１番目および５８番目から６５番目のアミノ酸の抗原決定基に結合するモノクロナール抗体ＩｇＧ１  ｋ）を用いたウェスタン・ブロットを示す。この抗体は、４３番目から５１番目および５８番目から６５番目までのアミノ酸を含む抗原決定基においてマウス型およびヒト型αシヌクレインと等しく結合する。図３は、上記遺伝子導入マウスのトリトン抽出物における１２ｋＤａの切断バンドを示す。対照マウスのトリトン抽出物では同じバンドが、ずっとぼんやりと現れる。従って、αシヌクレインの切断型へのプロセシングは正常マウスおよび遺伝子導入マウスのいずれにおいても生じるが、後者の方がより強く生じる。このように遺伝子導入マウスにおいてプロセシングの程度がより強いのは、ヒト型αシヌクレインを直接プロセシングすることによると考えられ、もしくは非遺伝子導入マウスで余り使われていない経路に沿ってマウス型αシヌクレインを追いやるヒト型αシヌクレインの存在による考えられる。
【０１０６】
図４は、図３と同じ抗体を用いた別のウェスタン・ブロットを示す。このゲルでは、分子量約６もしくは７ｋＤａの別の２つのバンドが現れている。７ｋＤａのバンドは対照マウスよりも遺伝子導入マウスにおいて強く現れる。６ｋＤａのバンドは、遺伝子導入マウスにおいてのみ、その上、３ヶ月サンプルにおいてのみ現れる。この６もしくは７ｋＤａのバンドは、長さ約５０〜８０個のアミノ酸のより短いαシヌクレインＮ末端断片を示すものである。
【０１０７】
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、４種の抗体を用いたウェスタン・ブロットおよびこれらの抗体の結合部位の抗原決定基マップを示す。ＥＬＡＤＷ−４４は、ヒト型αシヌクレインにのみ結合する（即ち、マウス型には結合しない）ポリクロナール抗体である。これは９８番目から０１９番目のアミノ酸の抗原決定基に結合する。ＥＬＡＤＷ−４７は、ヒト型に選択的に結合するだけでなく、マウス型にも結合するポリクロナール抗体である。これは１１５番目から１２２番目のアミノ酸の抗原決定基に結合する。ＥＬＡＤＷ−４８は、ヒト型およびマウス型に等しく結合するポリクロナール抗体である。これは１３１番目から１４０番目のアミノ酸の抗原決定基に結合する。８Ａ５は、ヒト型およびマウス型に等しく結合するモノクロナール抗体である。これはαシヌクレインのＣ末端に結合する。図５Ａ〜図５Ｅから、以上の４種の抗体のうち、ＥＬＡＤＷ−４７のみが切断型αシヌクレインを示す１２ｋＤａのバンドを生じたことが分かる。ＥＬＡＤＷ４８がこのバンドを生じなかったという結果は、切断部位のマッピングを行うのに助けになる。ＥＬＡＤＷ−４７は結合し、ＥＬＡＤＷ４８は結合しなかったので、切断部位は、ＥＬＡＤＷ−４７抗原決定基のＮ末端およびＥＬＡＤＷ−４８抗原決定基のＣ末端アミノ酸に隣接している。さらに、ＥＬＡＤＷ−４７抗原決定基の一部のアミノ酸が存在することにより結合が可能となるはずであり、ＥＬＡＤＷ−４８抗原決定基の一部のアミノ酸が存在しないことにより結合が妨げられるはずであるので、切断部位は、さらに、ほぼ１１８番目から１３５番目のアミノ酸の範囲内の領域に限定される。このデータを切断断片のサイズ（約１１５〜１２０アミノ酸）と考え合わせると、考えられる切断部位は、１１８番目〜１２１番目のアミノ酸あたりである。Ｃ末端抗体８Ａ５による結合が見られないことは、この切断部位と整合する。しかしながら、抗体ＥＬＡＤＷ−４４による結合が見られないことについては、さらに解説を要する。切断により生じる切断型ヒト・αシヌクレインが異なる立体構造をＥＬＡＤＷ−４４の結合を妨げるインタクトなαシヌクレインに適合させるのであれば、このように切断が見られないことの説明がつく。一方、正常マウスよりも遺伝子導入マウスでより大きな程度に存在する切断型αシヌクレインは、マウス・αシヌクレイン型である。この場合、遺伝子導入マウスで切断型の量が多いのは、対照マウスの状況と比べて切断型αシヌクレインを生じるプロセシング経路に沿ってより多くのマウス・αシヌクレインを追いやるヒト・αシヌクレインの存在によるものと思われる。
【０１０８】
（２．ＤＬＢＤ患者の脳内の切断型αシヌクレインの検出）
この実施例では、ＬＢ内のαシヌクレイン種をＤＬＢＤ脳の残りの可溶性および粒状蛋白質フラクションと比較する。ＬＢおよび可溶性蛋白質は、単一のＤＬＢＤ患者の皮質から調製する（Ｊｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：ｐ２１５００−２１５０７（２０００年）参照）。組織は、トリス／スクロース（０．３２ｍＭ）／ＥＤＴＡ（５ｍＭ）およびプロテアーゼ阻害剤緩衝液中でホモジナイズした。得られたホモジネートを１０００ｇで遠心した。上清をさらに１５０ｋｇで遠心した。この遠心による上清を用いて蛋白質のトリス可溶性フラクションを調製した。１０００ｇの遠心で得られたペレットは再懸濁し、これを用いてリューイ体フラクションを調製した。リューイ体は、抗シヌクレイン抗体を担持させた磁性ビーズを用いる免疫沈降法によって精製した。次いで、得られた沈降物を７Ｍ尿素２Ｍチオ尿素／４％ＣＨＡＰＳで抽出した。得られた結合型を尿素／チオ尿素／ＣＨＡＰＳで再抽出した。次いで、この工程による抽出物と前回の抽出物とをプールし、２Ｄ  ＰＡＧＥおよびイムノブロットにより分析した。結合型を、さらに９０％ギ酸で抽出した。得られた抽出物は、ギ酸９％にまで希釈して保存した。次いで、この抽出物をＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１０９】
シヌクレイン種は２−Ｄゲルで分離し、ウェスタン・ブロットで検出した。その結果、ＬＢおよび可溶性脳フラクションのいずれにも、リン酸化型および切断型の種を含む複数のαシヌクレイン種が存在した。切断は、αシヌクレインのほぼ１２０番目〜１２５番目のアミノ酸のＣ末端に主に認められた。また、Ｃ末端近くで切断された別の大きな断片も認められた。β−およびγ−シヌクレインは、上記可溶性フラクション中には存在しているにもかかわらず、ＬＢ中には検出されなかった。このＬＢ試料中のαシヌクレインは、別のＣ末端切断部位を有する点、および全体的に切断型αシヌクレイン種が可溶性蛋白フラクションに比し、ＬＢ内に濃縮されている点で、この可溶性フラクション中のものと異なっていた。さらに、分子量が約２５〜３５ｋＤａとより大きい複数のαシヌクレイン種がＬＢ試料にのみ検出された。Ｃ末端切断断片は、実施例１の遺伝子導入マウスで認められたのと同じサイズであり、疾患の原因としての役割が示唆された。
【０１１０】
図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、種々の抗体でプローブし、２−Ｄゲル電気泳動の対象として、ウェスタン・ブロッティングにかけたトリトン抽出物を示す。チャートの左の方にみられるダーク・スポットは完全長のαシヌクレインを示す。最も注目すべき特徴は、８Ａ５のチャートにはみられないＳｙｎ−１のチャートの４つのスポットである。これら４つのスポットは、Ｃ末端アミノ酸の欠如のため８Ａ５抗体を結合することができない切断型αシヌクレインである。これらの切断は、ＳＮ１−１２０〜ＳＮ１−１２５の型にほぼ相当する。完全長αシヌクレインのスポットの下および近傍にはいくつかの別のスポットがみられる。この完全長スポットの下のスポットは、Ｃ末端からの小さな切断（即ち、Ｘを１３０〜１３９とした場合のシヌクレイン１−Ｘ）を示すものと思われる。完全長スポット近傍の右側スポットは（ＥＬＡＤＷ４３を用いたブロットにこのスポットがないため）Ｎ末端からの小さな欠損を示す。
【０１１１】
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、別の抗体を用いたブロットを示す。５Ｃ１２（１０９−１２０）の場合、４つのスポットが認められる。ＥＬＡＤＷ４７（１１８−１２３）の場合、これらのスポットのうちの２つが認められ、ＬＢ５０９（１１５−１２３）の場合、これら全てのスポットがみられなかった。これらのスポットは、分子量においても、ニトロ化、リン酸化などの翻訳後修飾の有無においても互いに異なると思われる。これらの結果から、切断部位はαシヌクレインのほぼ１２０番目から１２５番目のアミノ酸の範囲内に決まる。また、注目すべきは、いくつかのスポットが、修飾されていないシヌクレインのスポットよりもわずか下（分子量がより小さい）もしくは右側（ｐＨがより高い）に出ていることである。これらは、恐らく、主要なスポットに比し、受けた切断の程度が小さい、および／又は翻訳後に受けた修飾が異なるシヌクレインの型を示すものと考えられる。
【０１１２】
図８は、ウェスタン・ブロッティングに用いる抗体が結合する抗原決定基に関係する切断部位の概要を示す。
【０１１３】
図９Ａ、図９Ｂは、トリス可溶性蛋白質とリューイ体からの抽出蛋白質とを２Ｄ電気泳動およびウェスタン・ブロッティングにより比較したものである。左側のトリス・ブロットには、（恐らくアミノ酸１番目から１２０番目〜１番目から１２５番目の範囲にある）切断型αシヌクレインを表すより低分子量の４つのスポットが示されている。これらは、完全長αシヌクレインを表すスポットに比し、強度が比較的低い。リューイ体からの蛋白質のブロットでは、１番目から１２０番目〜１番目から１２５番目の範囲の切断型αシヌクレインを表すより多くのスポットが示されている。しかしながら、これらは、完全長αシヌクレインを表すスポットに比し、強度が高い。また、明らかなことは、２つのスポットが、完全長αシヌクレインより速いが、このブロットの下部に集まっているスポットよりも遅い移動を示すことである。これらのスポットは、Ｘを１３０〜１３９番目のアミノ酸とした場合の１−Ｘの範囲の切断を表すものと考えられる。
【０１１４】
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄは、各種Ｃ末端抗体で再プローブした（ｒｅｐｒｏｂｅｄ）リューイ体からの蛋白質の免疫ブロットを示す。Ｓｙｎ−１（９１−９６）および５Ｃ１２（１０９−１２０）の場合、全てのスポットが現れる。ＥＬＡＤＷ４７の場合、Ｓｙｎ−１および５Ｃ１２ブロットにおいて最も速い速度で最も底部の（ｂａｓｉｃ）位置を移動するスポットは見当たらない。ＬＢ５０９ブロットでは、その他のブロットにおける移動のより速い／より底部のスポットの全てが見当たらないか、ぼんやりとしている。ＥＬＡＤＷ４７およびＬＢ５０９のブロットに特定のスポットが存在しないか、強度が低いことから、これらのスポットは、切断型αシヌクレインを示すものであり、切断がほぼ１２０番目〜１２５番目のアミノ酸で生じることと符合していることが分かる。
【０１１５】
（３．遺伝子導入動物における凝集αシヌクレインの検出）
遺伝子導入動物を安楽死させ、脳を摘出して神経化学的および神経病理学的検討を行う。簡単に言えば、右半分の脳を凍結し、ホモジナイズして凝集および非凝集ヒト・αシヌクレインの免疫反応性をウェスタン・ブロットにより測定する（Ｍａｓｌｉａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）２８７：ｐ１２６５）。左半分の脳は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ビブラトームで連続切片を作製して免疫細胞化学および超微細構造分析を行う。
【０１１６】
脳切片を、ヒト・αシヌクレインに対するウサギ・ポリクロナール抗体（１：５００）で免疫染色する。４℃で一夜インキュベーションした後、切片を、ビオチニル化抗ウサギ二次抗体、次いでアビジンＤ−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（１：２００、ＡＢＣエリート、ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ））とインキュベートする。反応を、０．００１％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶かした０．１％の３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）を用いて視覚化し、次いで、切片をエンテランを用いてスライド上に封入する。免疫反応性のレベルは、クウォンティメット５７０Ｃを用いるオプティカル・デンシトメトリーにより半定量的に評価した。また、この切片を画像解析により調べて、αシヌクレインの免疫反応性封入体の数を測定し、この信頼できるαシヌクレイン凝集の測定値を抗凝集効果の有用な指標として用いる（Ｍａｓｌｉａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）２８７：ｐ１２６５）。
【０１１７】
神経変性のパターンの解析は、シナプトフィジンおよび微小管関連蛋白２（ＭＡＰ２）に対して二重免疫標識し、ＬＳＣＭで視覚化したビブラトーム切片を用い、海馬、前頭皮質、側頭皮質および基底核のシナプスおよび樹状突起の密度を定量分析することによって達成する。神経変性の別の解析は、これまでに報告されている方法（Ｍａｓｌｉａｈら（２０００年））により尾状核被殻および黒質（ＳＮ）のチロシン水酸化酵素（ＴＨ）の免疫反応性を測定することによって達成する。切片はＬＳＣＭによって画像化されることになり、個々の各画像は、線飛程内にピクセル強度を示すＴＨ−免疫反応性終末が含まれるように、相互作用的に閾値によって処理される。スケールはピクセルをμｍ比で求めるように設定する。次いで、この情報を利用してＴＨ−免疫反応性終末によって覆われる神経網の面積％を算出する。また、この同じ切片を用いてＳＮ内のＴＨニューロンの数を計測する。
【０１１８】
（４．ＬＢＤ患者におけるαシヌクレインの分析）
αシヌクレインのどの種が疾患組織内に濃縮され、もしくは疾患組織に特有であるかを明らかにするために、多系統萎縮症（ＭＳＡ）および家族性パーキンソン病突然変異（Ａ５３Ｔ；Ｃｏｎｔｕｒｓｉ家系）の患者からの脳サンプルについて検討した。ＭＳＡおよびＣｏｎｔｕｒｓｉ脳の粒状フラクションを、それぞれ、５０ｍＭトリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１％トリトン（ＭＳＡの場合）もしくは０．１％ＮＰ４０（Ｃｏｎｔｕｒｓｉの場合）からなる溶液中で脳組織をホモジナイズすることによって調製した。年齢をマッチングした対照患者（「正常者」）についても疾患脳と全く同様に処理した。サンプルは、１−Ｄゲルを用い、次いで下記のようにＥＬＩＳＡによって、さらに、２−Ｄゲルを用いて分析した。この分析は粒状フラクションの一部について行い、残りは遠心した。得られた上清についても分析し、ペレットは７Ｍ尿素で抽出した。この抽出による上清は分析した。得られたペレットは、さらに７Ｍ尿素／１％ＳＤＳで抽出し、その上清を分析した。全αシヌクレインを検出し、もしくは１２９番目の位置がリン酸化されたαシヌクレインを特異的に検出する抗体を用いたウェスタン・ブロットの結果を図１１に示した。
【０１１９】
このシヌクレインの分画は、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ脳では対照脳と異なっていた。正常脳のシヌクレインの大部分は、トリス緩衝スクロース液を用いホモジナイズした後、可溶性であったが、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ脳のシヌクレインのほぼ全てで、可溶化するのに尿素およびＳＤＳを必要とし、この患者では大量のリューイ体の存在が示唆された。Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者のシヌクレインは、ｓｅｒ１２９リン酸化の量が対照患者と際立って異なっていた。対照患者ではごく少量のリン酸化α−シヌクレインが検出されたのに対して、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者では、ウェスタン・ブロットを用いた比較によって極めて大量のリン酸化シヌクレインが認められた。従って、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ脳のシヌクレインの不溶性は、シヌクレインのｓｅｒ１２９におけるリン酸化の大きな増大と関連付けられた。また、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者のα−シヌクレインは、Ｃ末端切断の分布が正常脳の場合と異なっていた。Ｃ末端切断型α−シヌクレインは、対照およびＣｏｎｔｕｒｓｉ粒状脳フラクションのいずれにおいても認められたが、検出可能な全ての切断断片は、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者では高度に不溶性（尿素／ＳＤＳ抽出物）であったのに対し、対照患者の脳では可溶性（トリス緩衝スクロース液）であった。Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者のＬＢ濃縮フラクションにおけるＣ末端切断型シヌクレインの濃縮は、ＤＬＢＤ  ＬＢにおいてＣ末端切断型シヌクレインが濃縮されているとの本発明者らの知見と一致している。また、ＭＳＡ脳もリン酸化（ｓｅｒ１２９）α−シヌクレインが濃縮していたことから、ＬＢでもみられたＣ末端切断および多くのリン酸化その他の酸性修飾の存在が明らかとなった。また、ＤＬＢＤ患者の脳では、健常者に比し、高レベルのリン（ｓｅｒ１２９）が認められた。また、別の実験において、Ａ５３Ｔ突然変異を有するαシヌクレインで形質導入したＰＥＡＫ細胞では、野性型ヒト・αシヌクレインで形質導入したＰＥＡＫ細胞に比し、（約３０％高い）高レベルのリン（ｓｅｒ１２９）が認められた。
【０１２０】
（５．遺伝子導入動物における行動上の分析）
マウスの自発運動について、以前に報告された方法（マスリアほか（Ｍａｓｌｉａｈら）（２０００年））により、回転棒（サンディエゴ・インストルメンツ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて２日間検討する。１日目に、５つのトライアルについてマウスを訓練する。即ち、１つ目は１０ｒｐｍ、２つ目は２０ｒｐｍ、３〜５つ目は４０ｒｐｍでのトライアルとする。２日目に、各４０ｒｐｍの７回のトライアルについてマウスを試験する。マウスを円筒上に一匹ずつ置き、回転速度を２４０秒間かけて０から４０ｒｐｍまで増加させる。マウスがその棒上に留まっている時間の長さ（落下潜時）を記録し、これを運動機能の指標として用いた。
【０１２１】
マウスの認識能力について、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ）（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｌｅａｒｎ  Ｍｏｔｉｖａｔ．１２：ｐ２３９−２６０（１９８１年））を用いて試験する。この方法では、水を満たし、水面直下に逃避台を沈めてある円形プールにマウスを入れる。この台に目で見ることのできる印を付けておくことによって、マウスが近位の目に見える手掛かりの方に泳いでいくことによってこの印を見つけることができるようにしてある。あるいは、この台の位置を分からせる型にはまった手掛かりを設けないこの試験のもっと複雑なタイプをマウスに施行する。このタイプでは、マウスは、遠くの目に見える手掛かりとの関連で台の位置を学習する必要がある。マウスが水中に留まっている時間の長さは認識能力に反比例する。
６．細胞株を用いた凝集αシヌクレイン断片の分析
上述のαシヌクレイン、マウス・αシヌクレインの切断断片を発現するｐＣＲ３．１−Ｔ発現ベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド、ＣＡ）を用いてＧＴ１−７神経細胞（Ｈｓｕｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：ｐ４０１−４１０（２０００年））を形質導入し、発現ベクター単独で形質導入した細胞と比較する。ベクター単独で形質導入した細胞は線維芽球様の外観を有するが、αシヌクレインで形質導入した細胞は丸みを帯び、光学顕微鏡および共焦点型走査顕微鏡で見ることのできる細胞表面の封入体を有する。形質導入したＧＴ１−７細胞を用いることによってシヌクレイン封入体を除去する活性について薬剤をスクリーニングすることができる。
【０１２２】
以上の実施例は単に例示的なものであり、本発明を限定するものではない。従って、他の変形形態がありうることは当業者には容易に理解されよう。本発明の範囲は、これにより付与される全ての特許の請求範囲によってカバーされる。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照するのではなく、付与される特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に参照して決定されるべきである。本出願において引用した全ての刊行物、参考文献および特許文献は、個々の刊行物もしくは特許文献がそれぞれ、そのようにして個別に示されている場合と同程度に、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＳＮ１１５〜１２２内の抗原決定基に結合するポリクロナール抗体を用いた、遺伝子導入マウス（Ｂ）および対応対照（Ａ）の皮質および海馬からの各種抽出物のウエスタン・ブロットを示す。
【図２】図２は、図１Ａおよび図１Ｂと同じ抗体を用い、３ヶ月齢および１２ヶ月齢マウスの皮質および海馬のトリトン−Ｘ１００抽出物においてαシヌクレインの切断型の濃度を比較したウエスタン・ブロットを示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、１２Ｃ１と称する別の抗体（４３〜５１番目および５８〜６５番目アミノ酸の抗原決定基に結合するモノクロナール抗体）を用いた、高齢対応対照（Ａ）との比較における３ヶ月齢遺伝子導入マウス（Ｂ）の脳からのトリトン抽出物のウエスタン・ブロットを示す。
【図４】図４は、図３と同じ抗体を用いた、３ヶ月齢および１２ヶ月齢遺伝子導入マウスの脳からのトリトン抽出物による別のウエスタン・ブロットを示す。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、遺伝子導入マウスの脳からの各種抽出物に対する４種の抗体を用いたウエスタン・ブロット（図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ）およびこれらの抗体の結合部位の抗原決定基マップ（図５Ａ）を示す。
【図６】図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、３種の抗体（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）でプローブし、２−Ｄゲル電気泳動の対象とし、ウェスタン・ブロッティングにかけたリューイ体病患者の脳のトリトン抽出物を示す。
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、別の特異性を有する４種の抗体（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ）を用いた、リューイ体病患者脳のトリトン抽出物の別のブロットを示す。
【図８】図８は、ウェスタン・ブロッティングに用いる抗体が結合する抗原決定基に対する切断部位の概要を示す。
【図９】図９Ａ、図９Ｂは、トリス可溶性蛋白質（Ａ）とリューイ体からの抽出蛋白質（Ｂ）とを２Ｄ電気泳動およびウェスタン・ブロッティングにより比較したものである。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄは、各種Ｃ末端抗体で再プローブ（ｒｅｐｒｏｂｅｄ）したリューイ体からの蛋白質の免疫ブロットを示す。
【図１１】図１１は、αシヌクレイン全体を認識する抗体もしくはリン−１２９αシヌクレインに特異的な抗体でプローブした健常者およびＣｏｎｔｕｒｓｉ患者の各種抽出物のウエスタン・ブロットを示す。
【図１】
2007525464.tif 000003
【図２】
2007525464.tif 000004
【図３】
2007525464.tif 000005
【図４】
2007525464.tif 000006
【図５】
2007525464.tif 000007
【図６】
2007525464.tif 000008
【図７】
2007525464.tif 000009
【図８】
2007525464.tif 000010
【図９】
2007525464.tif 000011
【図１０】
2007525464.tif 000012
【図１１】
2007525464.tif 000013
【誤訳訂正書】
【提出日】平成19年7月4日(2007.7.4)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとする、αシヌクレインの断片。
【請求項２】
請求項１の断片であって、該αシヌクレインの断片が遺伝性レヴィー小体病（ＬＢＤ）と関連する突然変異を有する、断片。
【請求項３】
請求項２の断片であって、該突然変異がＡ５３Ｔ突然変異である、断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の断片であって、該αシヌクレインの断片が、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する、断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項の方法であって、該αシヌクレインの断片が、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目である、断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項の方法であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする、断片。
【請求項７】
ＬＢＤを処置するのに有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
該薬剤を、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片と接触させ、該αシヌクレインの断片の凝集の速度もしくは程度を測定し、該薬剤を用いない対照との比較による凝集の速度もしくは程度の減少によって該薬剤が薬理活性を有することが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項８】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
αシヌクレインを発現し、該αシヌクレインを、請求項１〜６のいずれか１項の断片にプロセシングする細胞を薬剤と接触させ、該細胞内の該断片のレベルを該薬剤の非存在下の同じ細胞種内のベースラインレベルとの比較で測定し、該ベースラインに対し断片レベルが減少することにより該薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項９】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片を発現する遺伝子導入動物を接触させ、該薬剤非存在下の同様な非ヒト遺伝子導入動物の脳内の凝集型の該断片のベースラインレベルとの比較で該非ヒト遺伝子導入動物の脳内の凝集型の該断片のレベルを測定し、該ベースラインに対する該凝集型断片レベルの減少によって該薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示され、該非ヒト遺伝子導入動物はマウスもしくはショウジョウバエであるものとすること
を含む、方法。
【請求項１０】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
αシヌクレインを発現する導入遺伝子を有し、該αシヌクレインを、請求項１〜６のいずれか１項の断片にプロセシングする非ヒト遺伝子導入動物を薬剤と接触させ、該薬剤非存在下のベースラインレベルとの比較で神経細胞内の該断片のレベルを測定し、このベースラインに対する上記断片のレベルの減少によってこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片をコードする核酸セグメントに動作可能なように結合したプロモータを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入動物であって、該遺伝子導入動物に該断片を発現させることにより該動物がＬＢＤの少なくとも１つの特徴を発症しやすくなり、該プロモーターは、ＰＤＧＦプロモータであり、該少なくとも１つの特徴が運動機能の障害または認識機能の障害であることを特徴とする
遺伝子導入動物。
【請求項１２】
患者においてＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を検出するのを補助する方法であって
脳脊髄液中の、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片を検出し、健常者のベースラインレベルよりもレベルが高いことにより、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性が示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片に特異的に結合する抗体であって、完全長のシヌクレインには特異的な結合を示さず、該抗体は、ヒト・アイソタイプＩｇＧ１のヒト抗体またはヒト化抗体である、抗体。
【請求項１４】
患者において投与された抗体の結合レベルを測定し、健常者のベースラインレベルよりもレベルが高いことにより、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性が示されるものとすることによって、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を診断することにおいて使用するための請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
レヴィー小体病の治療もしくは予防において使用するための、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片。
【請求項１６】
該断片に対する抗体を含む免疫反応を増強するアジュバントと組み合わせられているか、または該断片に対する抗体を含む免疫応答を増強する、融合蛋白質を形成する担体に結合されている、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片。
【請求項１７】
インタクトなαシヌクレインを切断して、請求項１〜６のいずれか１項の断片を生じさせるプロテアーゼをスクリーニングする方法であって、
該プロテアーゼの阻害剤を特定すること、
該阻害剤を該プロテアーゼを含む細胞抽出物もしくは組織抽出物と接触させることにより該プロテアーゼを該阻害剤に結合させること、ならびに
該阻害剤から該プロテアーゼを遊離させること
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、該阻害剤はインタクトなαシヌクレインの１１５番目〜１３０番目の位置の少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含むαシヌクレインのペプチドであるものとする、方法。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は非仮出願であり、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている２００３年５月１９日提出の米国特許出願第６０／４７１，９２９号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
レヴィー小体病（ＬＢＤ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびレヴィー小体の形成である。（非特許文献１）。ＬＢＤとしては、パーキンソン病、瀰漫性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、レヴィー小体型アルツハイマー病（ＬＢＶ）、およびＰＤとアルツハイマー病（ＡＤ）との併発が挙げられる。レヴィー小体痴呆（ＤＬＢ）というのは、ＬＢＤについての用語法の相違を調整するために作られた用語である。ＬＢを有する疾患は、依然として、高齢者における運動性疾患および認識力低下に共通する原因となっている。（非特許文献２）。この疾患への罹患率は増加し続けており、深刻な公衆衛生問題を生じているが、今日まで、こうした疾患に対して認可された治療法はない。（非特許文献３）。ＬＢＤの原因については意見の分かれるところであり、各種の神経毒および遺伝的感受性要因などのさまざまな要因が役割を果たしていると提唱されている。
【０００３】
ＡＤ、ＰＤおよびＤＬＢＤは高齢者において最も一般的に見出される神経変性疾患である。最近の疫学的研究によれば、アルツハイマー病患者の約３０％がＰＤをも有することから、ＡＤとＰＤとの間には密接な臨床的関係のあることが明らかとなった。従って、ＡＤ患者は、その他の高齢者に比し、ＰＤを併発する可能性がより高い。さらに、痴呆症になるＰＤ患者は、通常、典型的なＡＤをすでに発症している。いずれの神経変性疾患も特定の脳領域および細胞集団に好発し、明確な病理学的特徴を示すが、ＰＤ、ＡＤおよびＤＬＢＤも共通の病理学的特徴を共有している。家族性ＡＤ、ダウン症候群もしくは散発型ＡＤの患者は、扁桃体にＬＢを形成するが、これはＰＤの典型的な神経病理学的特徴である。さらに、各疾患は、神経の変性、神経間シナプス結合および最終的な細胞死、神経伝達物質の枯渇、ならびにその前駆体が正常な中枢神経系の機能に関与する折り畳み構造のタンパク質の異常な蓄積を伴う。ＡＤ、ＰＤおよびＤＬＢＤの間の関連については生化学的研究によって裏付けられている。
【０００４】
近年、ＬＢＤの病因の理解に関して新たな可能性が浮上した。具体的には、いくつかの研究によって、（１）シナプスタンパク質αシヌクレインがＬＢ内に蓄積すること（非特許文献４；非特許文献５）、（２）αシヌクレイン遺伝子の突然変異体が稀な家族型パーキンソン病に伴って単離されること（非特許文献６）、ならびに（３）遺伝子導入マウス（非特許文献７）およびショウジョウバエ（非特許文献８）におけるその過剰発現によってＰＤのいくつかの病理学的側面が再現されることから、αシヌクレインはＰＤの病因に中心的な役割を果たしていることが分かった。従って、脳内のαシヌクレインの蓄積がヒト、マウス、ハエといった多様な種において同様な形態学的および神経学的変化を伴うという事実から、この分子がＰＤ進行の一因となっていることが示唆される。
【０００５】
ＡＤの典型的な病理学的特徴である神経炎性班は、基本的に、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）のアミノ酸蛋白分解性産物であるアミロイド・ベータ（Ａβ）タンパク質、およびαシヌクレインのアミノ酸３５個の蛋白分解性断片であるＮＡＣからなる。ＡβおよびＮＡＣはいずれも、それぞれの完全長タンパク質の蛋白分解性断片としてアミロイド班中に初めて確認され、これらの完全長ｃＤＮＡが同定され、クローニングされた。（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。
【０００６】
αシヌクレインは、β−およびγ−シヌクレインならびにシノレチンなどのタンパク質の大きなファミリーの一部である。αシヌクレインは、シナプスと関係がある正常な状態において発現され、神経可塑性、学習および記憶において役割を果たしていると考えられている。αシヌクレインの凝集を増強するヒト（ｈ）αシヌクレインの突然変異が確認されており（Ａｌａ３０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒ）、稀なタイプの常染色体優性型ＰＤと関連付けられている。こうした突然変異がαシヌクレインの凝集傾向を強化するメカニズムについては知られていない。
【非特許文献１】ＭｃＫｅｉｔｈら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ（ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＬＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６年）４７：ｐ１１１３−２４
【非特許文献２】Ｇａｌａｓｋｏら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｅｍｅｎｔｉａｓ．Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．（１９９４年）５１：ｐ８８８−９５
【非特許文献３】Ｔａｎｎｅｒら，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｋｉｎｅｔｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．（２０００年）１３：ｐ４２７−３０
【非特許文献４】Ｓｐｉｌｌａｎｔｉｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７年）３８８：ｐ８３９−４０；Ｔａｋｅｄａら，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９８年）１５２：ｐ３６７−７２
【非特許文献５】Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．（１９９７年）２３９：ｐ４５−８
【非特許文献６】Ｋｒｕｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎ．（１９９８年）１８：ｐ１０６−８；Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７年）２７６：ｐ２０４５−７
【非特許文献７】Ｍａｓｌｉａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ）（２０００年）２８７：ｐ１２６５−９
【非特許文献８】Ｆｅａｎｙら，Ｎａｔｕｒｅ（２０００年）４０４：ｐ３９４−８
【非特許文献９】Ｉｗａｉ  Ａ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２０００年）１５０２：ｐ９５−１０９
【非特許文献１０】Ｍａｓｌｉａｈら，ＡＭ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９６年）１４８：ｐ２０１−１０
【非特許文献１１】Ｕｅｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  ＳｃｉＵＳＡ（１９９３年）９０：ｐ１１２８２−６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（特許請求の範囲に記載されている発明の要旨）
本発明は、レヴィー小体病（ＬＢＤ）の処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、薬剤と、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするαシヌクレインの断片とを接触させること、およびこのαシヌクレインの断片の凝集の速度もしくは程度を測定することを含み、上記薬剤を用いない対照との比較による凝集速度もしくは程度の減少によって、この薬剤が薬理活性を有することが示される。
【０００８】
この断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。任意選択的に、上記方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行う別の工程を含む。
【０００９】
さらに、本発明は、ＬＢＤ（例えば、パーキンソン病もしくはＤＬＢＤ）の処置に有用な薬理活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、αシヌクレインを発現し、このαシヌクレインを断片にプロセシングする細胞を薬剤と接触させることを含む。この断片の特徴は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することである。次いで、上記細胞内の上記断片のレベルを上記薬剤非存在下の同じ細胞種内のベースラインレベルとの比較で測定し、このベースラインに対し断片レベルが減少することによりこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示される。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片は、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目である。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。上記細胞は、ヒト細胞、神経細胞もしくはドーパミン作動性細胞とすることができる。任意選択的に、この細胞はＰＣ１２細胞もしくはＳｙ５Ｙ細胞である。任意選択的に、この方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行う工程を含む。
【００１０】
さらに、本発明は、ＬＢＤ（例えば、パーキンソン病もしくはＤＬＢＤ）の処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレインの断片を発現するトランスジェニック動物を接触させること、および上記薬剤非存在下の同様のトランスジェニック動物の脳内の凝集型の上記断片のベースラインレベルとの比較で上記トランスジェニック動物の脳内の凝集型上記断片のレベルを測定することを含み、このベースラインに対する上記凝集型断片レベルの減少によってこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示される。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１１９〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。上記トランスジェニック動物は、任意選択的に、げっ歯類である。また、このトランスジェニック動物は、ショウジョウバエとすることもできる。任意選択的に、この方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行うこと含む。
【００１１】
さらに、本発明は、ＬＢＤ（例えば、パーキンソン病もしくはＤＬＢＤ）の処置に有用な薬理活性について薬剤をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、薬剤と、αシヌクレインを発現し、αシヌクレインを断片にプロセシングするトランスジェニック動物とを接触させること（この断片は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とする）、および上記薬剤非存在下のベースラインレベルとの比較で神経細胞内の上記断片のレベルを測定することを含み、このベースラインに対する上記断片のレベルの減少によってこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示される。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、Ａ５３Ｔ突然変異などの遺伝性ＬＢＤと関連する突然変異を有する。上記トランスジェニック動物は、任意選択的に、げっ歯類、マウスもしくはショウジョウバエである。任意選択的に、この方法は、上記薬剤がＬＢＤの症状を治療もしくは抑制するかどうかを調べるためにＬＢＤを有するヒトもしくはＬＢＤの動物モデルにおいて試験を行う工程を含む。
【００１２】
さらに、本発明は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレインの断片をコードする核酸セグメントに作動可能なように結合したプロモータを含む導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物であって、このトランスジェニック動物に上記断片を発現させることによりこの動物がＬＢＤの少なくとも１つの特徴を発症しやすくなることを特徴とするトランスジェニック動物を提供する。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目アミノ酸からなる群から選ばれる。任意選択的に、このαシヌクレインの断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。上記プロモータは、任意選択的に、ＰＤＧＦプロモータである。任意選択的に、少なくとも１つの特徴は運動機能の障害である。任意選択的に、上記トランスジェニック動物の少なくとも１つの特徴は、認識機能障害である。上記トランスジェニック動物は、任意選択的に、げっ歯類、マウスもしくはショウジョウバエである。
【００１３】
さらに、本発明は、患者においてＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する感受性を検出する方法を提供する。この方法は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とする、脳脊髄液中のαシヌクレインの断片を検出することを含む。健常者のベースラインレベルよりもレベルが高いことにより、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する感受性が示される。
【００１４】
さらに、本発明は、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレインの断片と特異的に結合するが、完全長のαシヌクレインには特異的な結合を示さない抗体を提供する。好ましい断片としては、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目が挙げられる。任意選択的に、この断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。上記抗体は、任意選択的に、ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体である。任意選択的に、この抗体はモノクロナールである。任意選択的に、この抗体はヒト・アイソタイプＩｇＧ１を有する。
【００１５】
さらに、本発明は、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する感受性を診断する方法を提供する。この方法は、１１９番目〜１２５番目の残基に遊離Ｃ末端を有するαシヌクレインの断片と特異的に結合するが、完全長のシヌクレインには特異的な結合を示さない抗体を患者に投与すること、およびこの患者におけるこの抗体の結合のレベルを測定することを含み、健常者のベースラインレベルに対する結合レベルの上昇によって上記ＬＢの存在もしくはＬＢＤに対する感受性が示される。
【００１６】
さらに、本発明は、ＬＢＤに罹患しているか罹患する危険性のある患者に対して、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損すること、およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端から少なくとも１０個連続するアミノ酸が欠損することを特徴とするαシヌクレイン断片の有効な療法を施行し、これにより上記ＬＢＤを治療もしくは予防することを含む、ＬＢＤの治療もしくは予防方法を提供する。このαシヌクレインの断片は、任意選択的に、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目である。任意選択的に、この断片は、Ｘを１３０〜１３９番目とした場合、１番目からＸ番目である。さらに、この方法は、任意選択的に、この断片に対する抗体を含む免疫反応を増強するアジュバントを投与することを含む。任意選択的に、上記断片は、この断片に対する抗体を含む免疫反応を増強する、融合タンパク質を形成するキャリアに結合される。
【００１７】
さらに、本発明は、ＬＢＤを治療もしくは予防する方法を提供する。この方法は、ＬＢＤに罹患しているか罹患する危険性のある患者に対して、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、１番目から１２５番目および１番目からＸ番目からなり、Ｘを１３０〜１３９番目とする群から選ばれるαシヌクレインの断片に特異的に結合するが、インタクトなαシヌクレインには結合しない抗体の有効な療法を施行することを含み、それによって、この抗体が上記疾患の予防もしくは治療をもたらす。
【００１８】
さらに、本発明は、インタクトなαシヌクレインを切断して、インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個連続するアミノ酸が存在し、インタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸が欠損することを特徴とする断片を生じさせるプロテアーゼをスクリーニングする方法を提供する。この方法は、プロテアーゼの阻害剤を特定すること、この阻害剤をこのプロテアーゼを含む細胞抽出物もしくは組織抽出物と接触させることによりこのプロテアーゼをこの阻害剤に結合させること、およびこの阻害剤からこのプロテアーゼを遊離させることを含む。任意選択的に、上記阻害剤は、インタクトなαシヌクレインの１１５番目〜１３０番目の位置の少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含むαシヌクレインのペプチドである。任意選択的に、このペプチドは、１１８番目〜１２２番目の位置のうちの少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含む。任意選択的に、これらの残基の少なくとも１つは遷移状態アナログである。
【００１９】
さらに、本発明は、αシヌクレインの１０９番目から１２０番目までの残基内のエピトープに特異的に結合するモノクロナール抗体を提供する。このモノクロナール抗体は、任意選択的に、キメラ型、ヒト化型もしくはヒト型である。
【００２０】
さらに、本発明は、αシヌクレインの１１５番目から１２３番目までの残基内のエピトープに特異的に結合するモノクロナール抗体を提供する。
【００２１】
さらに、本発明は、αシヌクレインの４３番目から５１番目および５８番目から６５番目の残基内の非連続的エピトープに特異的に結合するモノクロナール抗体を提供する。この抗体は、任意選択的に、キメラ型、ヒト化型もしくはヒト型である。
【００２２】
さらに、本発明は、遊離Ｃ末端を有する独立した完全長のαシヌクレインに特異的に結合し、Ｃ末端が別のポリペプチドに結合しているαシヌクレインを含む融合タンパク質に特異的な結合を示さない末端特異的モノクロナール抗体を提供する。この抗体は、任意選択的に、キメラ型、ヒト化型もしくはヒト型である。
【００２３】
さらに、本発明は、患者においてレヴィー小体病の存在もしくはレヴィー小体病に対する感受性を検出する方法を提供する。この方法は、患者の脳からの試料においてαシヌクレインの１２５番目の位置がリン酸化もしくはニトロ化されたαシヌクレインのレベルを測定することを含み、健常者集団の平均レベルに対するレベルの上昇によって上記患者がレヴィー小体病を有するかこれに罹患性であることが示される。
【００２４】
（定義）
「薬剤」という用語は、薬理活性を有するか、薬理活性を有する可能性のある化合物を記述するのに用いている。薬剤としては、既知の薬物である化合物、薬理活性が確認されているが、さらに治療上の評価が行われている化合物、および薬理活性についてスクリーニングされることになっているコレクションおよびライブラリを構成する物質である化合物が挙げられる。
【００２５】
「薬理」活性とは、薬剤が疾患の予防もしくは治療に有用であるか、有用である可能性を有することを示すスクリーニング系において、ある薬剤が活性を示すことを意味する。このスクリーニング系はインビトロ系、細胞系、動物系もしくはヒト系とすることができる。薬剤は、疾患の処置における実際的な予防もしくは治療的有用性を立証するにはさらに試験を必要とする可能性があるにしても、薬理活性を有すると評することができる。
【００２６】
ゲル電気泳動を用いた分子量測定との関連で、「約」という用語は、同一条件下でその方法を繰り返した際に実験誤差によると思われる分子量の標準偏差の存在を意味している。αシヌクレインの一部の断片についての１２ｋＤａという分子量測定値は、トリシン緩衝液を用いた測定に適用される。
【００２７】
「特異的に結合する」という語句は、タンパク質およびその他の生体物質の不均一な集団の存在下で前記タンパク質の存在を決定する結合反応のことを意味する。従って、所定の条件下において、特定のリガンドは特定のタンパク質に選択的に結合するが、試料中に存在する他のタンパク質とは有意な量で結合しない。多くの場合、タンパク質に特異的に結合する抗体のような分子の結合定数は、少なくとも１０６Ｍ−１もしくは１０７Ｍ−１、好ましくは１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、より好ましくは約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１以上である。種々のイムノアッセイ方式を用いて特定のタンパク質に対し特異的な免疫反応性を示す抗体を選定することができる。例えば、タンパク質に対し特異的な免疫反応性を示すモノクロナール抗体を選定するのに固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ法が日常的に用いられている。特異的な免疫反応性を測定するのに用いることができるイムノアッセイ方式および条件の解説については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨークを参照されたい。
【００２８】
配列の比較においては、通常、１つの配列を試験配列と比較する対照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いる際には、試験および対照配列をコンピュータに入力し、必要な場合、部分配列座標を指定し、次に、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータを指定する。次いで、指定したプログラム・パラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムにより、対照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが算出される。
【００２９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，２：ｐ４８２（１９８１年）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：ｐ４４３（１９７０年）のホモロジー・アラインメント・アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８５：ｐ２４４４（１９８８年）の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、５７５サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）Ｄｒ．、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、もしくは目視検査（ｖｉｓｕａｌ  ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌらの上記文献参照）によって行うことができる。
【００３０】
配列同一性パーセントおよび配列類似性を測定するのに適したアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：ｐ４０３−４１０（１９９０年）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公開されている。このアルゴリズムは、先ず、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた時にある正値の閾値スコアＴにマッチするかこれを満たす検索配列中の長さＷの短い文字列を特定することによって高相同性スコア（ｈｉｇｈ  ｓｃｏｒｉｎｇ）配列対（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは、近傍文字列スコア閾値（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記文献）と呼ばれる。これらの初期の近傍文字列ヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとなる。次いで、これらの文字列ヒットは、累積アラインメント・スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一対の一致残基のスコア値（ｒｅｗａｒｄ）；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティ値；常に＜０）を用いて算出する。アミノ酸配列の場合、スコアリング・マトリクスを用いて累積スコアを算出する。文字列ヒットの各方向への延長は、以下の場合、即ち、上記累積アラインメント・スコアがその最大到達値から数量Ｘだけ減少した場合、この累積スコアが１つ以上のネガチブ・スコア残基アラインメントの蓄積によりゼロ以下になった場合、もしくはどちらの配列においても末端に到達した場合に停止する。ある核酸もしくはポリペプチドが本発明の範囲内にあるかどうかを確認するためには、ＢＬＡＳＴプログラムのデフォルト・パラメータが適している。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＮプログラムは、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。ＴＢＬＡＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の蛋白配列を使用）は、デフォルトとして、文字列長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリクスを用いる。（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８９：ｐ１０９１５（１９８９年）参照）。
【００３１】
配列同一性パーセントを算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴニズムは２つの配列間の類似性の統計的な解析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９０：ｐ５８７３−５７８７（１９９３年）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴニズムにより得られる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標となる最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と対照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、この核酸は対照配列と類似していると考えられる。
【００３２】
アミノ酸置換を保存的もしくは非保存的なものとして分類するために、アミノ酸を以下のようにグループ分けする：グループＩ（疎水性側鎖）：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；グループＩＩ（中性親水性側鎖）：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ（酸性側鎖）：ａｓｐ、ｇｌｕ；グループＩＶ（塩基性側鎖）：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；グループＶ（鎖配向に影響する残基）：ｇｌｙ、ｐｒｏ；およびグループＶＩ（芳香族側鎖）：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。保存的置換は同じクラスのアミノ酸間の置換を伴う。非保存的置換は、これらのクラスの中の１つのアミノ酸を別のクラスのアミノ酸と交換することを成す。
【００３３】
通常、本発明の治療剤は好ましくない夾雑物を実質的に含まない。このことは、薬剤が、妨害タンパク質および夾雑物を実質的に含まないばかりでなく、通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）の純度であることを意味する。場合によっては、こうした薬剤の純度は、少なくとも約８０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９０もしくは約９５％ｗ／ｗである。しかしながら、従来のタンパク質精製法を用いると、少なくとも９９％ｗ／ｗの均一なペプチドを得ることができる。
【００３４】
「抗体」もしくは「免疫グロブリン」という用語は、インタクトな抗体およびその結合性断片を含めて用いている。通常、断片は、それが由来するインタクトな抗体と、個々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖを含む抗原断片への特異的結合に対して競合する。断片は、組換えＤＮＡ法、もしくはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって作製することができる。また、「抗体」という用語は、他のタンパク質とともに融合タンパク質に化学的に結合体化しているか、もしくはこうした融合タンパク質として発現される１種以上の免疫グロブリン鎖を含む。また、「抗体」という用語は、二重特異性抗体を含む。二重特異性もしくは二官能性抗体は、２種の重／軽鎖対および２種の結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合もしくはＦａｂ’断片間の結合を含む種々の方法によって作製することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７９：ｐ３１５−３２１（１９９０年）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：：ｐ１５４７−１５５３（１９９２年）を参照されたい。
【００３５】
「アジュバント」という用語は、抗原と共に投与すると、その抗原に対する免疫反応を増強するが、単独で投与してもその抗原に対する免疫反応を生じない化合物のことを意味する。アジュバントは、リンパ球動員、Ｂおよび／またはＴ細胞の賦活ならびにマクロファージの賦活を含むいくつかのメカニズムによって免疫反応を増強し得る。
【００３６】
「患者」という用語は、予防的もしくは治療的処置を受けるヒトおよび他の哺乳動物の対象を含む。
【００３７】
抗体間の競合は、試験対象の免疫グロブリンが対照抗体のαシヌクレインなどの共通の抗原への特異的結合を阻害するようなアッセイ法を用いて測定される。数多くのタイプの競合的結合アッセイ法が知られており、このようなものとしては、例えば、固相直接もしくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接もしくは間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（Ｓｔａｈｌｉら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，９：ｐ２４２−２５３（１９８３年）参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｋｉｒｋｌａｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７：ｐ３６１４−３６１９（１９８６年）参照）；固相直接標識化アッセイ、固相直接標識化サンドイッチ・アッセイ（Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８年）参照）；Ｉ−１２５標識を使用する固相直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｒｅｌら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２５（１）：ｐ７−１５（１９８８年）参照）；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Ｃｈｅｕｎｇら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：ｐ５４６−５５２（１９９０年）；および直接標識化ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３２：ｐ７７−８２（１９９０年））がある。通常、このようなアッセイ法では、固相面に結合させた精製抗原もしくはこれらの両方を有する細胞、非標識試験免疫グロブリン、および標識対照免疫グロブリンを用いる。競合的阻害は、この試験免疫グロブリンの存在下に固相面もしくは細胞に結合した標識の量を定量することにより測定する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在する。競合アッセイによって特定される抗体（競合抗体）としては、対照抗体と同じエピトープに結合する抗体、およびこの対照抗体が結合したエピトープに、立体障害を生じるのに十分近接した近傍エピトープに結合する抗体が挙げられる。通常、競合抗体は、過剰に存在させた場合、対照抗体の共通抗原への特異的結合を少なくとも５０％もしくは７５％阻害する。
【００３８】
エピトープの座標は近似である（±２アミノ酸）。エピトープ内の全てのアミノ酸が結合に必ずしも必要な訳ではない。
【００３９】
記載された１つ以上の要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物もしくは方法には、特に記載されていない他の要素を含めることができる。例えば、αシヌクレイン・ペプチドを含む組成物は、単離されたαシヌクレイン・ペプチドと、より大きなポリペプチド配列の構成成分としてのαシヌクレイン・ペプチドとの両方を包含する。
【００４０】
特に文脈から明らかでない限り、本発明の実施態様、構成要素、工程もしくは構成は全て、任意の他のものとの組み合わせで用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．概要）
本発明は、部分的に、レヴィー小体病（ＬＢＤ）患者およびそのトランスジェニック動物モデルにおいてαシヌクレインの新規断片を特定することを前提としている。こうした疾患の特徴は、αシヌクレインの凝集である。その断片は完全長のαシヌクレインがＣ末端で切断されたものである。一部の断片は、トリシン緩衝液を用いるＳＤＳゲル電気泳動で測定した分子量が約１２ｋＤａであり、天然型αシヌクレインのＣ末端から少なくとも１０個連続したアミノ酸が切断されたものであるという特徴を有する。切断部位は、天然型αシヌクレインの１１７番目残基の後および１２６番目残基の前に生じることが好ましい。これらのαシヌクレイン断片の特定には、例えば、創薬、診断、治療、トランスジェニック動物などにおいていくつかの用途がある。
【００４２】
本発明は、ＬＢＤの処置に有用な活性について薬剤をスクリーニングするための数種の方法を提供する。一部の方法では、本発明の新規断片を生じる切断反応を阻害する薬剤が特定される。他の方法では、この切断反応の産物の凝集を阻害する薬剤が特定される。このような阻害剤はＬＢＤの処置に有用である。また、上記切断反応の阻害剤は、この切断反応に関与するプロテアーゼのアフィニティー精製にも有用である。
【００４３】
また、本発明は、上述のαシヌクレインの断片を発現するトランスジェニック動物モデルおよび細胞を提供する。このトランスジェニック動物モデルおよび細胞には、上記断片の凝集体を含有するレヴィー小体を含むレヴィー小体病の特徴を形成する性質がある。この動物モデルおよび細胞は上記のスクリーニング方法に利用することができる。
【００４４】
さらに、本発明は、αシヌクレインの断片に特異的に結合するが、インタクトなαシヌクレイン自体には特異的な結合を示さない末端特異的な抗体を提供する。こうした抗体は、αシヌクレイン凝集体のインビトロ・イメージング用に、および処置の方法にも有用である。また、新規なαシヌクレイン断片は、処置の方法に、必要であれば、アジュバントとの併用で、用いることができる。
【００４５】
（ＩＩ．αシヌクレイン断片）
ヒトαシヌクレインは以下のアミノ酸配列を有するアミノ酸１４０個のペプチドである：
【００４６】
【化１】
2007525464.tif 000014
（Ｕｅｄａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９３年）９０：ｐ１１２８２−６；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）アセッション番号：Ｐ３７８４０）。このタンパク質は、認識される３つのドメイン、即ち、１から６１番目のアミノ酸をカバーするＫＴＫＥ繰返し配列ドメイン（ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）、約６０番目から９５番目のアミノ酸に及ぶＮＡＣ（非アミロイド成分）ドメイン、および約９８番目から１４０番目のアミノ酸に及ぶＣ末端酸性ドメインを有する。
【００４７】
本発明の一部の新規断片は、Ｃ末端から少なくとも１０個連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも１５個連続したアミノ酸、任意選択的に２０、２２、２３もしくは２５個までのアミノ酸が切断されたものである。これらの断片は、全体もしくはほぼ全体（即ち、上記欠損部以外のαシヌクレインからの少なくとも１００個連続する残基）を含む。また、一部の断片は、１から４番目、１から６番目、１から１０番目、１から１２番目の欠損など、Ｎ末端から２０個までの比較的短いアミノ酸配列が切断されたものである。一部の断片は１から２３番目、１から３８番目もしくは１から４５番目残基のＮ末端欠損を有する。好ましい断片は、ＳＮ１−１１８、ＳＮ１−１１９、ＳＮＩ−１２０、ＳＮ１−１２１、ＳＮ１−１２２、ＳＮ１−１２３、ＳＮ１−１２４、ＳＮ１−１２５、ＳＮ１−１２６、ＳＮ１−１２７、ＳＮ１−１２８、ＳＮ１−１２９およびＳＮＩ−１３０である。特に好ましい断片は、ＳＮ１−１１９、ＳＮ１−１２０、ＳＮ１−１２１、ＳＮ１−１２２、ＳＮ１−１２３、ＳＮ１−１２４およびＳＮ１−１２５である。これらのうち特に好ましい断片はＳＮ１−１１９である。切断反応は、１１８番目〜１２６番目のアミノ酸残基間、例えば、１１９番目と１２０番目の残基の間のペプチド結合で行われることが好ましい。本発明の他の断片としては、（ＳＤＳ電気泳動で測定して）約６〜７ｋＤａもしくは５０〜８０個のアミノ酸のαシヌクレインＮ末端断片が挙げられる。本発明の別の断片としては、インタクトなαシヌクレインのＣ末端から１〜１０個のアミノ酸を欠くαシヌクレインのＮ末端断片、即ち、Ｘを１３０〜１３９とした場合のＳＮ１−Ｘが挙げられる。一部の断片は、抗体ＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）および５Ｃ１２（１０９−１２０）への特異的結合、ならびに８Ａ５（遊離Ｃ末端）、ＬＢ５０９（１１５−１２３）およびＥＬＡＤ４７（１１８−１２３）への特異的結合の欠如を特徴とする。一部の断片は、ＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）および５Ｃ１２（１０９−１２０）、ＬＢ５０９（１１５−１２３）およびＥＬＡＤ４７（１１８−１２３）への特異的結合、ならびに８Ａ５（遊離Ｃ末端）への特異的結合の欠損を特徴とする。一部の断片は、ＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）と５Ｃ１２（１０９−１２０）、ＬＢ５０９（１１５−１２３）とＥＬＡＤ４７（１１８−１２３）および８Ａ５（遊離Ｃ末端）への特異的結合、ならびにＥＬＡＤＷ４３（遊離Ｎ末端）への特異的結合の欠損を特徴とする。
【００４８】
一部の断片もしくは完全長のαシヌクレインは、αシヌクレインの１２５番目の位置を占めるチロシン残基がリン酸化もしくはニトロ化されたものである。また、１２５番目のアミノ酸セリンを保持している断片、もしくは完全長のαシヌクレインは、この位置でリン酸化されていてもよい。１２５番目の位置のリン酸化もしくはニトロ化または１２９番目の位置のリン酸化に関し、患者において健常者集団の平均に対する増強が検出されることがレヴィー小体病の指標となる。検出は、１２５番目の位置がリン酸化もしくはニトロ化されたαシヌクレインに特異的な抗体を用いて行うことができる。レベルは、健常者集団の平均プラス１標準偏差より大きい場合、増大していると見なされる。
【００４９】
本発明の断片は、以前に報告されたアルツハイマー病アミロイドの非Ａβ成分（ＮＡＣ）とは異なる。この断片は、少なくとも２８個のアミノ酸残基（６０番目から８７番目までの残基）および、任意に３５個のアミノ酸残基（６１番目から９５番目までの残基）から成る。Ｉｗａｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：ｐ１０１３９−１０１４５；Ｊｅｎｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１０（Ｐｔ１）：ｐ９１−９４（１９９５年）；ジェンバンク・アセッション番号Ｓ５６７４６を参照されたい。
【００５０】
他に断らない限り、αシヌクレインもしくはその断片に言及する場合、前記の天然のヒト型アミノ酸配列もしくはその断片、ならびに対立遺伝子、種および誘発による変異体などのアナログを含む。上記のアナログと天然ヒト型アミノ酸配列とが最大限にアラインメントされている場合、このアナログのアミノ酸にはこのヒト型アミノ酸配列の対応するアミノ酸と同じ番号が付与される。通常、アナログは、多くの場合、保存的置換によって、１箇所、もしくは２箇所、または数箇所の位置で天然ペプチドと異なる。一部の天然の対立遺伝子による変異体は、遺伝性ＬＢＤと遺伝的な関連がある。こうした変異体としては、Ａ３０ＰおよびＡ５３Ｔが挙げられる。Ａ５３Ｔ変異は、この突然変異のない健常者のリン酸化の基準に比し、この突然変異を有する者ではαシヌクレインの１２９番目の位置においてリン酸化レベルの上昇を伴う。アナログは、天然ペプチドと少なくとも８０もしくは９０％の配列同一性を示す。また、一部のアナログは、非天然型アミノ酸を、または１箇所、もしくは２箇所、または数箇所の位置のＮもしくはＣ末端アミノ酸が修飾されたものを含む。例えば、天然型のグルタミン酸残基はイソ−アスパラギン酸で置換されることがある。非天然型アミノ酸の例としては、Ｄ，α，α２置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、イプシロン−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルリジン、イプシロン−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、オメガ−Ｎ−メチルアルギニン、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、γ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびイソアスパラギン酸が挙げられる。通常、アナログは、天然ヒト型αシヌクレインに対するポリクロナール抗体集団に特異的に結合する。また、本発明は、Ｄ−アミノ酸でαシヌクレインの大部分もしくは全ての位置の対応する天然Ｌ−アミノ酸を置換させることができるＤ−ペプチドを提供する。
【００５１】
αシヌクレイン、その断片およびアナログは、固相ペプチド合成法もしくは組換え発現法によって合成することができ、または自然源から入手することができる。自動ペプチド合成機が、アプライド・バイオシステムズ社（フォスター・シティ、カリフォルニア）などの数多くの製造業者から市販されている。組換え発現法では大腸菌などの細菌、酵母、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞を用いることができる。組換え発現の方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｐ．Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第２版、１９８９年）に記載されている。
【００５２】
（ＩＩＩ．レヴィー小体病）
レヴィー小体病（ＬＢＤ）の特徴は、ドーパミン作動系の変性、運動性変調、認知障害、およびレヴィー小体（ＬＢ）の形成である。（ＭｃＫｅｉｔｈら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｗｙ  ｂｏｄｉｅｓ（ＤＬＢ）：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＬＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（１９９６年）４７：ｐ１１１３−２４）。レヴィー小体は神経細胞に見出される球状のタンパク質沈着物である。これが脳内に存在すると、アセチルコリン、ドーパミンなどの化学的メッセンジャーの作用が遮断されて脳の正常な機能が妨げられる。レヴィー小体病としては、（特発性パーキンソン病（ＰＤ）を含む）パーキンソン病、レヴィー小体を有する痴呆（ＤＬＢ）としても知られる瀰漫性レヴィー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病とパーキンソン病との併発、および多系統萎縮症（ＭＳＡ）が挙げられる。ＤＬＢＤは、アルツハイマーおよびパーキンソン病の症状を共有する。ＤＬＢＤは、主にレヴィー小体の存在部位においてパーキンソン病と異なる。ＤＬＢＤではレヴィー小体は主として皮質に形成される。パーキンソン病ではこれは主として黒質に形成される。他のレヴィー小体病としては、自律神経失調症、レヴィー小体性燕下困難、偶発性ＬＢＤ、遺伝性ＬＢＤ（例えば、αシヌクレイン遺伝子ＰＡＲＫ３およびＰＡＲＫ４の突然変異）ならびに多系統萎縮症（例えば、オリーブ橋小脳萎縮症、線条体黒質変性症およびシャイ・ドレーガー症候群）が挙げられる。
【００５３】
（ＩＶ．トランスジェニック動物および細胞）
本発明は、上述のＣ末端切断型αシヌクレインをコードしている核酸セグメントを含む導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック動物を提供する。この導入遺伝子はこのトランスジェニック動物の体細胞および生殖系細胞の全体もしくは実質上全体に存在することが好ましい。上記Ｃ末端切断型αシヌクレインをコードしている核酸セグメントは、この切断型αシヌクレインがこの動物の神経細胞内で発現されることを可能にする１つ以上の調節性セグメントに作動可能なように結合させる。ラット神経特異的エノラーゼ・プロモータ、ヒト・β−アクチン遺伝子プロモータ、ヒト血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）鎖遺伝子プロモータ、ラット・ナトリウム・チャンネル遺伝子プロモータ、マウス・ミエリン塩基性タンパク質遺伝子プロモータ、ヒト銅−亜鉛スーパーオキシド・ジスムターゼ遺伝子プロモータ、哺乳動物ＰＯＵ−ドメイン調節遺伝子プロモータなどのプロモータを使用することができる。これらのうち、ＰＤＧＦプロモータが特に適している。任意選択的に、誘導性プロモータを使用する。亜鉛などの重金属をマウスの水もしくは餌に加えることにより調節することができるマウス・メタロチオニン・プロモータが適している。このようなトランスジェニック動物は、完全長のαシヌクレインを有するトランスジェニック動物の作製のために（Ｍａｓｌｉａｈら，ＡＭ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ（１９９６年）１４８：ｐ２０１−１０およびＦｅａｎｙら，Ｎａｔｕｒｅ（２０００年）４０４：ｐ３９４−８）により報告され、もしくは（突然変異型ＡＰＰを有するトランスジェニック動物の作製に関する）米国特許第５，８１１，６３３号に開示されたのと同じ一般的な方法によって作製することができる。任意選択的に、切断型αシヌクレインタンパク質を発現する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、アルツハイマー病モデルなどの他の神経性疾患モデルと交配させることができる。例えば、切断型αシヌクレインタンパク質を発現する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物は、例えば、Ｇａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：ｐ５２３（１９９５年）；ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅら、米国特許第５，６１２，４８６号；Ｈｓｉａｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：ｐ９９（１９９６年）；Ｓｔａｕｆｅｎｂｉｅｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９４：ｐ１３２８７−１３２９２（１９９７年）；Ｓｔｕｒｃｈｌｅｒ−Ｐｉｅｒｒａｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９４：ｐ１３２８７−１３２９２（１９９７年）；Ｂｏｒｃｈｅｌｔら，Ｎｅｕｒｏｎ  １９：ｐ９３９−９４５（１９９７年）に記載されている導入遺伝子により発現されるＦＡＤ突然変異を含むＡＰＰを有するトランスジェニック動物と交配させることができる。このような交配を実施する方法については、例えば、完全長のαシヌクレインを発現する遺伝子導入マウスとＧａｍｅｓらによるＰＤＡＰＰマウスとの交配を報告しているＭａｓｌｉａｈら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９８：ｐ１２２４５−１２２５０（２００１年）に記載がある。本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは、マウス、ラットなどの齧歯動物、もしくはショウジョウバエなどの昆虫である。
【００５４】
動物モデルで切断型αシヌクレインを発現させることにより、レヴィー小体病の少なくとも１つの特徴を形成する性質を付与された動物が得られる。このような特徴としては、αシヌクレインの細胞内沈着物の量の増加、レヴィー小体形成の増大、ならびに同種の正常な非トランスジェニック動物と比較した場合の認識および運動機能の障害が挙げられる。このようなトランスジェニック動物は、レヴィー小体病の処置における薬理活性について薬剤をスクリーニングするのに有用である。
【００５５】
また、本発明は、凝集した切断型αシヌクレインを含む封入体を構成する切断型αシヌクレインで形質転換した細胞を提供する。この形質転換細胞は、ＧＴ１−７神経細胞（Ｈｓｕｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：ｐ４０１−４１０（２０００年））、ＰＣ１２細胞、ＳＹ５Ｙ神経芽腫細胞などの神経細胞であることが好ましい。また、ＰＥＡＫ細胞も使用することができる。これらの細胞はヒト細胞であることが好ましい。この切断型発現の発現を確実にする１つ以上の調節性配列に作動可能なように結合させた切断型αシヌクレインをコードしているセグメントを含むベクターをこれらの細胞内に形質導入する。形質導入した細胞を用いることにより、αシヌクレイン封入体を除去する活性について薬剤をスクリーニングすることができる。
【００５６】
（Ｖ．スクリーニング方法）
本発明は、ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤を特定するためのいくつかのスクリーニング方法を提供する。この方法は、インビトロで、または細胞もしくはトランスジェニック動物を用いて実施することができるスクリーニング、および活性の指標としての種々のパラメータを調べるスクリーニングを含む。これらのスクリーニングにおいて活性を有すると判定された薬剤は、ＬＢＤの動物モデルによる二次スクリーニングもしくは臨床試験において再度試験することにより、こうした疾患の行動上その他の症状に対する活性を測定することができる。
【００５７】
（１．インビトロ）
インビトロ・アッセイは、切断型αシヌクレインの凝集に対する薬剤の阻害能を調べるために行う。αシヌクレインのインビトロ凝集を分析するための基本方式については、完全長のαシヌクレインに関するものではあるが、（Ｗｏｏｄ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：ｐ１９５０９−１９５１２（１９９９年））に記載がある。本発明の方法では、このアッセイを試験すべき薬剤の存在下で実施する。薬剤存在下のαシヌクレイン凝集の速度もしくは程度を測定して、薬剤を用いない同時的もしくはヒストリカルな対照におけるαシヌクレイン凝集の速度もしくは程度と比較する。対照に対して薬剤存在下の凝集の速度もしくは程度が低下した場合、これによってこの薬剤に切断型αシヌクレインの凝集を阻害する活性があることが明らかになる。この活性は、レヴィー小体病を治療もしくは予防するのに有用となる可能性がある。
【００５８】
（２．細胞によるアッセイ）
細胞による一部のアッセイは、上述の切断型αシヌクレインをコードしている核酸を用いて、また、任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種を用いて形質導入した細胞で実施する。このような細胞を試験対象の薬剤と接触させ、この切断型αシヌクレインの凝集の程度の速度を測定する。次いで、αシヌクレインの凝集の程度の速度を、薬剤の非存在下に同様に形質導入した対照細胞と比較する。凝集は、免疫組織化学的分析、光学顕微鏡の使用もしくはゲル分析によってモニターすることができる。ゲル分析を用いると、二量体、三量体もしくはそれ以上のオリゴマーの形成、および高レベルのオリゴマー形成によるシヌクレインのゲルへの侵入不能性を検知することができる。対照に対して試験薬剤存在下の凝集の速度もしくは程度が低下した場合、これによって薬剤が切断型αシヌクレインの凝集を阻害する薬理活性を有することが明らかになる。この活性は、レヴィー小体病を治療もしくは予防するのに有用となる可能性がある。
【００５９】
細胞による他のアッセイは、完全長のαシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種をコードしている核酸を用いて形質導入した細胞で実施する。このような細胞を試験対象の薬剤と接触させ、切断型αシヌクレインおよび／またはリン酸化型もしくはニトロ化型シヌクレインの形成の速度もしくは程度を測定する。こうした型の存在は、αシヌクレインに対する１種以上の抗体を用いるウェスタン・ブロッティングによって検出することができる。末端特異的抗体（即ち、切断型には結合するが、完全長のαシヌクレインには結合しない抗体）はこの分析に特に有用である。また、種々のエピトープ特異性を有する抗体のコレクションを用いることもできる。例えば、切断型αシヌクレインの存在は、インタクトなαシヌクレインの１１８番目から１２５番目のアミノ酸によってほぼ規定されるアミノ酸セグメントのエピトープＮ末端を認識する抗体を用いてブロットした時にバンドが認められること、およびこの領域のエピトープＣ末端を認識する抗体でブロットした時にバンドが認められないことによって明らかにすることができる。薬剤の存在下における切断型αシヌクレインおよび／またはリン酸化型もしくはニトロ化型の形成の速度もしくは程度は、薬剤非存在下の同様な対照細胞と比較する。対照に対して試験薬剤存在下の切断型αシヌクレイン形成の速度もしくは程度が低下した場合、これによって、薬剤がαシヌクレインの切断型へのプロセシングを阻害する薬理活性を有することが明らかになる。この活性は、ＬＢＤを治療もしくは予防するのに有用である。
【００６０】
（３．トランスジェニック動物によるアッセイ）
トランスジェニック動物は、上述の切断型αシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種を発現する導入遺伝子を有する。このような動物を試験対象の薬剤と接触させ、この切断型αシヌクレインの凝集の程度の速度を、同時的もしくはヒストリカルな対照との比較で測定する。この対照は、通常、上記薬剤に接触させなかった同種の同様なトランスジェニック動物である。トランスジェニック動物におけるαシヌクレインの凝集は、実施例で説明したように、ウエスタン・ブロッティングもしくは免疫組織化学によってモニターすることができる。あるいは、もしくはさらに、このようなトランスジェニック動物における薬剤の活性は、実施例で説明したように、運動もしくは認識上の特徴などの行動上の特徴から測定することができる。このようなアッセイでは、薬剤の薬理活性は、薬剤に接触させなかった同様な対照トランスジェニック動物と比較した場合の運動もしくは認識上の特徴の改善（即ち、このような特徴の障害の低減）によって示される。
【００６１】
別のアッセイは、完全長型αシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種を発現する導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を用いて実施する。このような動物を試験対象の薬剤と接触させ、切断型αシヌクレイン、および任意選択的にＡｌａ３０ＰｒｏもしくはＡｌａ５３Ｔｈなどの遺伝的変種についてこれらの出現の速度もしくは程度を検出する。このような型は、（細胞によるアッセイに対して述べたように）適切な抗αシヌクレイン抗体を用いたウエスタン・ブロッティングもしくは免疫組織化学的分析によって検出することができる。切断型αシヌクレインおよび／またはリン酸化もしくはニトロ化型の出現の速度の程度は、薬剤に接触させなかった同様なトランスジェニック動物に相当する同時的もしくはヒストリカルな対照におけるそのような型の出現の速度もしくは程度と比較する。対照に対して試験薬剤に接触させた動物における切断型αシヌクレイン出現の速度もしくは程度が低下した場合、これによって、薬剤が完全長のαシヌクレインの切断型へのプロセシングを阻害する薬理活性を有することが明らかになる。
【００６２】
（４．スクリーニング対象の薬剤）
スクリーニング対象の薬剤としては、αシヌクレインに対する抗体、αシヌクレインのペプチド、ＬＢＤの処置において活性を有することが知られ、もしくは考えられる薬物、天然物、およびコンビナトリアル・ライブラリが挙げられる。好ましいαシヌクレインのペプチドは、αシヌクレインの１１８番目から１２５番目までのアミノ酸を含む３０、２５、２０、１０もしくはそれ以下の個数のアミノ酸から成る比較的短いペプチドである。任意選択的に、Ｃ末端切断型αシヌクレインを生じさせる切断部位のすぐＮ末端側のアミノ酸、例えば、αシヌクレインの１１９番目アミノ酸を、この切断部位を挟む２つのアミノ酸間に加水分解されない結合を形成する遷移状態アナログ・アミノ酸で置換する。アナログの例としては、スタチン、ヒドロキシエチレン、ヒドロキシエタノールアミン、ＡＨＰＰＡ、ＡＣＨＰＡおよびこれらの誘導体などの遷移状態アナログがある。また、天然型αシヌクレインの１つ以上のアミノ酸を他の天然型アミノ酸で置換することもできる。
【００６３】
また、スクリーニング対象の天然物は、国立がんセンター研究所天然物リポジトリ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎａｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）（ベセズダ、ＭＤ）から入手することもできる。また、ペプチドその他の化合物のランダム・ライブラリを適合性についてスクリーニングすることもできる。コンビナトリアル・ライブラリは、段階的方法で合成することができる多くの種類の化合物について作製することができる。このような化合物としては、ポリペプチド、β−ターン類似物質、多糖類、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環式化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ−置換グリシン、およびオリゴカルバメートが挙げられる。これらの化合物の大きなコンビナトリアル・ライブラリは、アフィマックス社の国際公開第９５／１２６０８号、アフィマックス社の国際公開第９３／０６１２１号、コロンビア大学の国際公開第９４／０８０５１号、ファーマコペア社の国際公開第９５／３５５０３号およびスクリップス社（Ｓｃｒｉｐｐｓ）の国際公開第９５／３０６４２号（これらのいずれも、本明細書において参考として援用される）に開示されているコード化ライブラリ合成（ＥＳＬ）法によって構築することができる。また、ペプチド・ライブラリは、ファージ・ディスプレイ法によって作製することもできる。例えば、Ｄｅｖｌｉｎの国際公開第９１／１８９８０号を参照されたい。コンビナトリアル・ライブラリおよび他の化合物は、最初に、これらのαシヌクレインへの結合能を測定することによって適合性をスクリーニングすることができる。
【００６４】
（ＶＩ．毒性アッセイ）
これらのスクリーニング・アッセイに開示されているのと類似の方法を用いて、既存の薬物、食品、環境有害物質および他の化合物がαシヌクレインのプロセシング、リン酸化もしくは凝集の促進を介して毒性作用を発現するかどうかを調べることができる。このようなアッセイは上記スクリーニング・アッセイと同様に行うことができる。毒性作用は、上記スクリーニング・アッセイにおける薬理活性とは逆の結果で示される。
【００６５】
（ＶＩＩ．プロテアーゼの単離）
完全長αシヌクレインの本発明の切断型へのプロセシングは、プロテアーゼを用いて行う。このプロテアーゼは、上述のスクリーニング法によって特定される阻害剤を用いて精製することができる。好ましい阻害剤は、切断部位に対してＮ末端側の残基を遷移状態アナログで置換した１１７番目から１２６番目までの残基を含むαシヌクレインのペプチドである。このような阻害剤をアフィニティー精製試薬として用いることによって脳細胞の抽出物から上記プロテアーゼを精製する。この細胞は、正常者の死体もしくはＬＢＤ病に罹患していた者の死体から入手することができる。プロテアーゼのレベルは後者で高いものであり得る。このプロテアーゼは、αシヌクレイン基質にこれを作用させ、切断産物の形成をモニターすることによってアッセイすることができる。この基質は、例えば、上述の天然のヒト型αシヌクレイン、切断部位の両側から挟む残基を有するその断片、もしくは突然変異が遺伝型ＬＢＤと関連するその突然変異型とすることができる。任意選択的に、こうした基質のＣ末端を固相に、Ｎ末端を標識に固定化することができる。基質が切断されると、この標識が液相に遊離する。この液相は固相から容易に分離されるので、標識の量を蛋白分解活性の指標として測定することができる。
【００６６】
（ＶＩＩ．末端特異的抗体）
本発明は末端特異的抗体を提供する。この抗体は、（Ｃ末端）切断型αシヌクレイン、好ましくはＳＮ１−１１８、ＳＮ１−１１９、１−１２０、１−１２１、１−１２２、１−１２３、１−１２４、１−１２５もしくは１−１２６からなる群から選ばれる型に特異的に結合するが、完全長のαシヌクレインには特異的な結合を示さない。このような抗体は、αシヌクレイン沈着物のインビトロでのイメージングに、および治療剤として（下記参照）、ならびに上述のスクリーニング方法においてαシヌクレインの蛋白分解性切断で生じる切断産物を検出するのに有用である。また、対応するＣ末端側断片、例えば、１１８−１４０、１１９−１４０、１２０−１４０、１２１−１４０、１２２−１４０、１２３−１４０、１２４−１４０、１２５−１４０および１２６−１４０に対する末端特異的抗体を提供する。こうした末端特異的抗体は、これらの断片のＮ末端を認識することによって、完全長のαシヌクレインには特異的な結合を示すことなく、上記断片に特異的に結合する。
【００６７】
このような抗体は、実験動物をαシヌクレインもしくはその断片で免疫して抗体を生じさせ、得られた抗体をスクリーニングして所望の結合活性を有するものを特定することにより作製することができる。任意選択的に、免疫は、本発明の切断断片のＣ末端を含む２０個未満のアミノ酸からなる比較的短いペプチド（例えば、ＳＮ９９−１１８もしくはＳＮ１１０−１１９）を用いて行うことができる。任意選択的に、こうした短いペプチドは、免疫反応の誘発を促進するキャリアに結合させる。
【００６８】
任意選択的に、標識断片もしくは固定化断片への特異的な結合は、非標識の完全長αシヌクレインと競合させる形で行うことができる。任意選択的に、抗体の大きなライブラリは、ファージ・ディスプレイ法を用いて同時にスクリーニングすることができる。
【００６９】
非ヒト、例えば、マウス、モルモット、霊長類、ウサギもしくはラットのモノクロナール抗体は、（あらゆる目的で引用により本明細書に組み込まれている）Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（ＣＳＨＰ  ＮＹ、１９８８年）に記載されている方法で作製することができる。実験動物の免疫には、完全フロインドアジュバントと、これに続いて不完全アジュバントを用いることが好ましい。通常、ウサギもしくはモルモットはポリクロナール抗体の作製に用いられる。一般に、モノクロナール抗体の作製にはマウスを用いる。結合は、例えば、ウェスタン・ブロットもしくはＥＬＩＳＡによって評価することができる。抗体のエピトープは、この抗体に特異的に結合する最小の断片によって規定される。あるいは、エピトープ特異性は、試験抗体および対照抗体がαシヌクレインへの結合に対して競合する競合アッセイによって調べることができる。試験抗体および対照抗体が競合する場合、これらは同じエピトープ、もしくは１つの抗体の結合がもう一方の抗体の結合を妨げるのに十分互いに近接したエピトープに結合する。
【００７０】
キメラ抗体およびヒト化抗体は、キメラ抗体もしくはヒト化抗体の作製の出発原料となるマウスその他の非ヒト抗体と同一もしくは同様の結合特異性および結合親和性を有する。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖の遺伝子が、異なる種に由来する免疫グロブリン遺伝子セグメントから、通常遺伝子操作によって構築された抗体である。例えば、マウス・モノクロナール抗体からのこうした遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ４などの定常（Ｃ）セグメントに結合させることができる。ヒト・アイソタイプＩｇＧ１が好ましい。一部の方法として、この抗体のアイソタイプはヒトＩｇＧ１である。また、一部の方法として、ＩｇＭ抗体を用いることもできる。従って、代表的なキメラ抗体は、マウス抗体のＶドメイン即ち抗原結合ドメインとヒト抗体のＣドメイン即ちエフェクタ・ドメインとから成るハイブリッド抗体である。
【００７１】
ヒト化抗体は、実質的にヒト抗体（アクセプター抗体と呼ばれる）からの可変領域フレームワーク残基、および実質的にマウス抗体（ドナー免疫グロブリンと呼ばれる）からの相補性決定領域を有する。ＱｕｅｅｎらのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６：ｐ１００２９−１００３３（１９８９年）、国際公開第９０／０７８６１号、米国特許第５，６９３，７６２号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，５３０，１０１号、およびＷｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号（これらのいずれも、あらゆる目的のため全文引用により本明細書に組み込まれている）を参照されたい。また、定常領域は、存在する場合、実質的にもしくは完全にヒト免疫グロブリン由来のものとする。ヒト可変ドメインは、通常、フレームワーク配列が上記ＣＤＲの由来するマウス可変領域ドメインと高度の配列同一性を示すヒト抗体から選ばれる。重鎖および軽鎖の可変領域フレームワーク残基は、同一もしくは異なるヒト抗体配列に由来するものとすることができる。ヒト抗体の配列は、天然型ヒト抗体の配列もしくは数種のヒト抗体のコンセンサス配列とすることができる。Ｃａｒｔｅｒらの国際公開第９２／２２６５３号を参照されたい。上記ヒト可変領域フレームワーク残基から特定のアミノ酸を選び、ＣＤＲの立体構造および／または抗原への結合に対して及ぼし得る影響に基づいて置換する。このような及ぼし得る影響についての研究は、模型化、特定の位置のアミノ酸の特性の検討、または特定アミノ酸の置換もしくは突然変異の影響についての経験的観察によって行われる。
【００７２】
αシヌクレインに対するヒト抗体は、以下に説明する種々の方法により形成される。特定のマウス抗体と同じエピトープ特異性を有する一部のヒト抗体は、競合結合実験もしくは別の方法により選定する。ヒト抗体を得る方法としては、Ｏｅｓｔｂｅｒｇら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：ｐ３６１−３６７（１９８３年）；Ｏｅｓｔｂｅｒｇの米国特許第４，６３４，６６４号；およびＥｎｇｌｅｍａｎらの米国特許第４，６３４，６６６号（これらはいずれも、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているトリオーマ法、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇらの国際公開第９３／１２２２号、米国特許第５，８７７，３９７号、米国特許第５，８７４，２９９号、米国特許第５，８１４，３１８号、米国特許第５，７８９，６５０号、米国特許第５，７７０，４２９号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，５４５，８０６号、Ｎａｔｕｒｅ  １４８：ｐ１５４７−１５５３（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：ｐ８２６（１９９６年）、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉの国際公開第９１／１０７４１号（これらはいずれも、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている）に記載されているような、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の少なくとも１つのセグメントをコードしている導入遺伝子を有する非ヒト遺伝子導入哺乳動物の使用、ならびにファージ・ディスプレイ法（例えば、Ｄｏｗｅｒらの国際公開第９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開第９２／０１０４７号、米国特許第５，８７７，２１８号、米国特許第５，８７１，９０７号、米国特許第５，８５８，６５７号、米国特許第５，８３７，２４２号、米国特許第５，７３３，７４３号および米国特許第５，５６５，３３２号（これらはいずれも、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている））が挙げられる。
【００７３】
キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部分に結合させることができる。定常領域の選択は、一部、抗体依存性補体および／または細胞媒介毒性が所望されるかどうかによって決まる。例えば、アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は補体活性を有するが、アイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４は有しない。また、アイソタイプの選択は、脳内への抗体の通過に影響することがある。ヒト・アイソタイプＩｇＧ１が好ましい。軽鎖定常領域はラムダ型もしくはカッパ型とすることができる。抗体は、２本の軽鎖および２本の重鎖を含む四量体として、もしくは別々の重鎖、軽鎖として、またはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、あるいは重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインをスペーサを介して結合させた一本鎖抗体として、発現させることができる。
【００７４】
また、別の実施態様として、αシヌクレインの１０９番目から１２０番目の残基内もしくは１１５番目から１２３番目の残基内のエピトープまたは４３番目から５１番目の残基および６８番目から６５番目の残基内の不連続なエピトープに特異的に結合し、あるいはαシヌクレインのＣ末端に対して末端特異的である、ヒト化型、キメラ型およびヒト型などのモノクロナール抗体を提供する。αシヌクレインのＣ末端に対する末端特異的抗体は、遊離タンパク質としてαシヌクレインに特異的に結合することができるが、αシヌクレインのＣ末端が別のペプチドと結合しているような融合タンパク質の構成成分としてのαシヌクレインには特異的に結合できないという性質によって、識別することができる。これらの抗体は、治療活性についてスクリーニングすることができ、肯定的な結果が得られれば、治療法に用いることができる。また、こうした抗体は、前述のように、αシヌクレインの断片を検出するのにも用いることができる。
【００７５】
（ＩＸ．診断剤）
本発明は患者においてＬＢをインビボでイメージングする方法を提供する。このような方法は、ＰＤのレヴィー小体病もしくはこれに対する感受性を診断し、またはこれらの診断を確認するのに有用である。例えば、この方法は痴呆の症状を示す患者において用いることができる。この患者がＬＢを有する場合、患者はレヴィー小体病に罹患していると考えられる。また、この方法は、無症候性の患者においても用いることができる。異常なアミロイド沈着が存在すると、将来症候性疾患に罹患しやすいことが分かる。また、この方法は、以前にレヴィー小体病と診断された患者において疾患の進行および／または治療に対する反応をモニターするのに有用である。
【００７６】
この方法は、患者の体内でαシヌクレインに結合する上記のような末端特異的抗体を投与し、次いで結合した後にこの抗体を検出することによって行うことができる。所望であれば、除去反応は、Ｆａｂなどの、完全長の定常領域を欠く抗体断片を用いることにより回避することができる。一部の方法では、同一の抗体に治療剤および診断試薬としての両方の機能を持たせることができる。
【００７７】
診断試薬は、患者の体内に静注することにより、または頭蓋内注射によってかもしくはドリルで穴をあけた頭蓋骨から直接脳内に投与することができる。試薬の投与量は治療方法の場合と同じ範囲内とする必要がある。通常、この試薬は標識するが、一部の方法では、αシヌクレインに対して親和性を有する一次試薬は標識せず、二次標識試薬を用いて一次試薬に結合させる。標識の選択は検出方法によって決まる。例えば、蛍光標識は光学的検出に適している。常磁性標識の使用は外科的処置を必要としない断層撮影法による検出に適している。また、放射活性標識はＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴを用いて検出することができる。
【００７８】
診断は、標識された部位の数、大きさおよび／または強度を対応するベースラインレベルと比較することにより行う。このベースラインレベルは非罹患集団の平均のレベルとすることができる。また、ベースラインレベルは同一患者で測定した以前のレベルとすることもできる。例えば、処置を始める前の患者においてベースラインレベルを測定し、その後の測定値をこのベースラインレベルと比較することができる。ベースラインに対するレベルの減少は、処置に対する好反応を示唆するものである。
【００７９】
また、末端特異的抗体は、切断型αシヌクレインが脳脊髄液または他の体組織もしくは体液に存在するかどうかを調べるのに有用である。この型が、非罹患個体集団の正常レベルに対し、患者おいて有意に高いレベル（即ち、平均プラス１標準偏差より高いレベル）で存在することは、ＬＢＤに罹患しているか罹患性があることを示すものである。
【００８０】
（Ｘ．処置方法）
本発明は、レヴィー小体病に罹患しているか、罹患する危険性を有する患者においてこの疾患を予防もしくは治療するいくつかの方法を提供する。治療剤としては、上述の切断型αシヌクレインおよび抗体を誘導するのに有効なその断片、上記のような末端特異的抗体、ならびに上述のような、切断型αシヌクレイン断片の凝集もしくはαシヌクレインの蛋白分解性プロセシングに対する阻害剤が挙げられる。ＬＢＤに罹患しているか、罹患する危険性を有する患者に薬剤を投与する一般的な方法については、あらゆる目的で、記載されている全ての引用文献を含む全文引用により本明細書に組み込まれている同時係属出願の２００２年１１月１日提出の米国特許出願第６０／４２３，０１２号、ならびに２０００年６月１日提出の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／１５２３９号および２００３年１０月３１日提出の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３４５２７号に開示されている。
【００８１】
治療の対象となる患者としては、現在ＬＢＤの症状を示している患者ばかりでなく、ＬＢＤに罹患する危険性を有するが、症状は出ていない者も含まれる。従って、本方法は、ＬＢＤについて知られている遺伝的危険性を有する者に予防的に施行することができる。このような者としては、本疾患に罹患したことのある血縁者を有する者、および遺伝マーカーもしくは生化学的マーカーの解析によって危険性が明らかにされている者が挙げられる。ＰＤに対する危険性の遺伝マーカーとしては、αシヌクレイン遺伝子もしくはパーキン（Ｐａｒｋｉｎ）遺伝子、ＵＣＨＬＩ遺伝子、およびＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の突然変異；特に、αシヌクレイン遺伝子の３０番目および５３番目の位置の突然変異が挙げられる。現在パーキンソン病に罹患している者は、安静時振戦、筋固縮、運動緩徐および姿勢の不安定を含む臨床症状によって見分けることができる。
【００８２】
一部の方法として、上記患者は、レヴィー小体を特徴とする疾患以外のどんなアミロイド生成性疾患の臨床症状もしくは危険性要因も有さない者である。一部の方法として、上記患者は、細胞外アミロイド沈着を特徴とするどんな疾患の臨床症状もしくは危険性要因も有さない者である。一部の方法として、上記患者は、Ａβペプチドのアミロイド沈着を特徴とする疾患を有さない者である。一部の方法として、上記患者は、アルツハイマー病の臨床症状および危険性要因を有さない者である。一部の方法として、上記患者は、アルツハイマー病とレヴィー小体とを特徴とする疾患とを併発している者である。一部の方法として、上記患者は、アルツハイマー病とパーキンソン病とを併発している者である。
【００８３】
無症候性の患者では、任意の年齢（例えば、１０歳、２０歳、３０歳）で処置を開始することができる。しかしながら、通常、患者が４０歳、５０歳、６０歳もしくは７０歳に到達するまで処置を開始する必要はない。一般的には、処置は、ある期間にわたって多回投与することを必要とする。処置は、治療剤（例えば、切断型αシヌクレイン・ペプチド）に対する抗体または活性化Ｔ細胞応答もしくは活性化Ｂ細胞反応を長い期間をかけてアッセイすることによりモニターすることができる。反応が低下した場合には、追加抗原投与が必要となる。
【００８４】
予防的な適用では、医薬用組成物もしくは薬剤を、ＬＢＤに罹りやすいか、それとも罹る危険性のある患者に対して、その危険性を除去もしくは低下させ、その重症度を軽減し、あるいは（この疾患の生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の症状、その合併症ならびにこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含む）この疾患の発現を遅らせるのに十分なこの組成物もしくは薬剤の投与量および投与頻度を含む治療法において投与する。治療的な適用では、組成物もしくは薬剤を、そのような疾患が疑われるか、すでに罹患している患者に対して、その合併症およびこの疾患の進行中に発現する中間的な病理学的表現型を含むこの疾患の（生理学的、生化学的、組織学的および／または行動上の）症状を治すか、少なくとも部分的に抑えるのに十分なこの組成物の投与量および投与頻度を含む治療法において投与する。治療的処置もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量は、治療的有効用量もしくは予防的有効用量と定義される。治療的処置もしくは予防的処置を遂行するのに適切な量および投与頻度の組み合わせは、治療的有効療法もしくは予防的有効療法と定義される。治療的有効療法および予防的有効療法のいずれにおいても、薬剤は、通常、十分な免疫反応が達成されるまで数回投与で投与する。一般には、免疫反応をモニターし、免疫反応が減弱し始める場合には投薬を繰り返す。
【００８５】
一部の方法では、薬剤の投与によりαシヌクレインの細胞内凝集レベルが低下する。一部の方法では、薬剤の投与によりＣ末端切断型αシヌクレインのレベルが低下する。一部の方法では、薬剤の投与により、パーキンソン病の場合の運動機能もしくは認識機能のようなＬＢＤの臨床症状が改善する。一部の方法では、薬剤投与後、時々、αシヌクレインの細胞内凝集レベルの低下もしくは疾患の臨床症状の改善をモニターする。
【００８６】
上述の状態の処置に対する本発明の組成物の有効用量は、多くの種々の要因、例えば、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、他の投与薬剤、および処置が予防的なものか治療的なものかによって異なる。通常、患者はヒトであるが、遺伝子導入哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も処置することができる。処置用量は、安全性および有効性を最適化するために用量決定する必要がある。
【００８７】
一部の方法では、この薬剤は、αシヌクレインの切断断片、もしくはαシヌクレインに対する抗体を誘導することができるαシヌクレイン断片である。このような断片の量は、アジュバントも投与するかどうかによって決まり、アジュバントを用いない場合には用量を上げる必要がある。ヒトへの投与の場合、断片の投与量は、患者１人当たり１μｇから５００μｇまでとし、より普通には、１回の注射当たり５μｇから５００μｇとすることがある。時として、１回の注射当たり１ｍｇ〜２ｍｇの比較的高用量を用いる。一般には、ヒトへの注射１回当たり約１０μｇ、約２０μｇ、約５０μｇもしくは約１００μｇを用いる。また、断片の質量は、断片全体の質量に対する断片内の免疫原性エピトープの質量比によって決まる。通常、断片の１マイクログラムにつき１０−３〜１０−５マイクロモルの免疫原性エピトープを用いる。注射のタイミングは、１日１回から１年に１回、さらには１０年に１回と大きく変えることができる。ある用量の免疫原を投与する所定の日の投与量は、１μｇ／患者より多く、アジュバントも投与する場合には、通常１０μｇ／患者より多いが、アジュバントを用いない場合は、通常１００μｇ／患者より多い。一般的な治療法は、免疫後、６週間間隔などの時間間隔でブースタ注射を行うことから成る。別の治療法は、免疫後、１ヶ月、２ヶ月および１２ヶ月後にブースタ注射を行うことから成る。別の治療法は、生涯にわたって２ヶ月毎の注射を必要とする。あるいは、ブースタ注射は、免疫反応のモニタリングによって必要とされる場合、不定期に行うことができる。
【００８８】
また、αシヌクレインの切断断片は、αシヌクレインの切断断片の発現を確実にするための１つ以上の調節性エレメントに動作可能なように結合させたこの断片をコードする核酸の形で投与することもできる。免疫原をコードする核酸の用量は、患者１人当たり約１０ｎｇ〜約１ｇ、約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ、約１μｇ〜約１０ｍｇもしくは約３０μｇ〜約３００μｇのＤＮＡである。感染性ウイルス・ベクターの用量は、１投与量当たり１０ビリオン〜１００ビリオンもしくはそれ以上とする。
【００８９】
一部の方法は末端特異的抗体を用いた受動免疫を含む。このような方法では、投与量は宿主体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜約１００ｍｇ、より普通には約０．０１ｍｇ〜約５ｍｇである。例えば、投与量を１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、即ち、７０ｋｇの体重の患者の場合、それぞれ、７０ｍｇもしくは７００ｍｇまたは７０ｍｇ〜７００ｍｇの範囲内とすることができる。例示的な処置療法は、２週間毎に１回もしくは１ヶ月に１回もしくは３〜６ヶ月に１回投与するものである。一部の方法では、種々の結合特異性を有する２種以上のモノクロナール抗体を、各抗体の投与量が示した範囲内に収まるようにして、同時投与する。通常、抗体は複数回にわたって投与する。個々の投薬間の間隔は１週間、１ヶ月もしくは１年とすることができる。また、間隔は、患者におけるαシヌクレインに対する抗体の血中濃度の測定によって必要とされる場合、不定期とすることができる。一部の方法では血漿中抗体濃度が１〜１，０００μｇ／ｍｌとなるように、一部の方法では２５〜３００μｇ／ｍｌとなるように投与量を調節する。あるいは、抗体は、徐放性製剤として投与することができるが、この場合、投与頻度を下げる必要がある。投与量および投与頻度は患者体内における抗体の半減期によって異なる。一般に、ヒト型抗体は最も長い半減期を示し、これにヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処置が予防的なものか治療的なものかによっても異なることがある。予防的な適用では、比較的低用量を長期間比較的低頻度の間隔で投与する。一部の患者では、その後の生涯にわたって処置を継続する。治療的適用では、疾患の進行が低減するか停止するまで、好ましくは患者が疾患の症状の部分的もしくは完全な寛解を示すまで、比較的短い間隔で比較的高用量を投与することが必要な場合がある。その後は、この患者に予防療法を施行することができる。
【００９０】
治療剤は、予防的処置および／または治療的処置において、非経口的、局所的、経静脈的、経口的、経皮下的、経動脈的、経頭蓋内的、経髄腔内的、経腹腔内的、経鼻腔内的もしくは経筋肉内的な手段によって投与することができる。免疫原の最も一般的な投与経路は皮下であるが、他の経路も同様に有効である。次に最も一般的な投与経路は筋肉内注射である。このタイプの注射は、最も一般的には、腕もしくは脚筋において行われている。一部の方法として、薬剤を、沈着物が蓄積している特定の組織に直接注射（例えば、頭蓋内注射）する。抗体の投与には筋肉内注射もしくは静脈内注射が好ましい。一部の方法として、特定の治療用抗体を頭蓋内に直接注射する。一部の方法として、抗体を徐放組成物もしくは徐放デバイス、例えば、メディパッド（Ｍｅｄｉｐａｄ）（登録商標）デバイスとして投与する。αシヌクレインのプロテアーゼによるプロセシングを阻害することによって作用する小分子は、この小分子が治療効力もしくは予防効果を示すのに十分に血液脳関門を通過する場合には静脈内に、そうでない場合は頭蓋内に直接投与することができる。
【００９１】
本発明の薬剤は、任意選択的に、ＬＢＤの処置において少なくともある程度有効な他の薬剤と組み合わせて投与することができる。また、本発明の薬剤は、血液脳関門に対する本発明の薬剤の通過を促進する他の薬剤と併用して投与することもできる。
【００９２】
免疫原性因子はアジュバントとの組み合わせで投与することがある。種々のアジュバントをαシヌクレインなどのペプチドと組み合わせて用いることにより免疫反応を誘発することができる。好ましいアジュバントは、免疫原に固有の反応を増強するが、この反応の質的な形態に影響するその免疫原の立体構造変化を引き起こさない。好ましいアジュバントとしては、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ（登録商標））（英国特許第２２２０２１１号（ＲＩＢＩイムノケム・リサーチ社（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、ハミルトン、モンタナ州、現在コリクサ（Ｃｏｒｉｘａ）社の一部）参照）が挙げられる。スティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（登録商標）ＱＳ−２１は、南アメリカに存在するバラ科キラヤ（学名Ｑｕｉｌｌａｊａ  Ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたトリテルペン・グリコシドもしくはサポニンである（Ｋｅｎｓｉｌら，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌ＆Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９９５年）；米国特許第５，０５７，５４０号（アキラ・バイオファーマシューティカルス社（Ａｑｕｉｌａ  ＢｉｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、フレーミングハム、ＭＡ）参照）。他のアジュバントには、（スクアレン、ピーナッツ油などの）水中油エマルジョンがあり、任意選択的に、モノホスホリルリピドＡ（Ｓｔｏｕｔｅら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：ｐ８６−９１（１９９７年）、プルロニック・ポリマー、マイコバクテリア死菌などの免疫賦活剤と組み合わせて用いる。別のアジュバントにはＣｐＧ（国際公開第９８／４０１００号）がある。あるいは、αシヌクレインをアジュバントに結合させることができる。しかしながら、このような結合によって、αシヌクレインの立体構造がこれに対する免疫反応の性質に影響を与えるような変化を実質的に生じてはならない。アジュバントは、有効な薬剤を含む治療用組成物の構成成分として投与することができ、あるいは治療剤の投与の前、もしくは投与と同時に、または投与後に別々に投与することができる。
【００９３】
好ましい種類のアジュバントは、水酸化アラム、リン酸アラム、硫酸アラムなどのアルミニウム塩（アラム）である。このようなアジュバントは、ＭＰＬもしくは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリグルタミン酸、ポリリジンなどの重合体アミノ酸もしくは単量体アミノ酸のような他の特定の免疫賦活剤と併用するか併用しないで用いることができる。別の種類のアジュバントは水中油エマルジョン製剤である。このようなアジュバントは、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）テラミドＴＭ）その他の細菌細胞壁成分のような他の特定の免疫賦活剤と併用するか併用しないで用いることができる。水中油エマルジョンとしては、（ａ）モデル１１０Ｙミクロフルイダイザー（ミクロフルイディクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）、ニュートン、ＭＡ）などのミクロフルイダイザーを用いて１ミクロン未満の粒子に処方された、（任意選択的に種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）５％スクアレン、０．５％ツウィーン８０および０．５％スパン８５を含むＭＦ５９（国際公開第９０／１４８３７号）、（ｂ）１ミクロン未満のエマルジョンにミクロ流体化するか旋回流を与えてより大きなサイズの粒子エマルジョンとした、１０％スクアレン、０．４％ツウィーン８０、５％プルロニック・ブロック・ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含むＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレンと、０．２％ツウィーン８０と、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート、（ＴＤＭ）、細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（デトックス（Ｄｅｔｏｘ）（登録商標））からなる群から選ばれる１種以上の細菌細胞壁成分とを含む、リビ（Ｒｉｂｉ）（登録商標）アジュバント・システム（ＲＡＳ）（リビ・イムノケム社（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ）、ハミルトン、ＭＴ）が挙げられる。
【００９４】
別の種類の好ましいアジュバントは、スティミュロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）（登録商標）（ＱＳ−２１、アキラ社（Ａｑｕｉｌａ）、フレーミングハム、ＭＡ）などのサポニン系アジュバント、もしくはこれらから作製したＩＳＣＯＭ（免疫賦活複合体）、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸなどの粒子である。他のアジュバントとしては、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦならびに完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。別のアジュバントとしては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ１３およびＩＬ−１５）、マクロファージ・コロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインが挙げられる。別の種類のアジュバントは、免疫調節剤もしくはアジュバントとしての、糖残基がアミノ酸で置換されているＮ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレアおよびＮ−グリコシルカルバメートを含む、糖脂質アナログである（米国特許第４，８５５，２８３号参照）。また、熱ショックタンパク質、例えば、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０もアジュバントとして用いることができる。
【００９５】
アジュバントは、αシヌクレイン断片と一緒に、単一組成物として投与することができ、あるいはαシヌクレイン断片投与の前、もしくはこれと同時に、またはこれの後に投与することができる。αシヌクレイン断片およびアジュバントは、同一バイアルに包装して供給することができ、もしくは別々のバイアルに包装して使用前に混合することができる。通常、αシヌクレイン断片およびアジュバントは、目的とする治療用途を表示するラベルと共に包装する。αシヌクレイン断片およびアジュバントが別々に包装される場合には、この包装に、使用前に混合することについての使用説明書を添付するのが普通である。アジュバントおよび／またはキャリアの選択は、このアジュバントを含む免疫原製剤の安定性、投与経路、投与スケジュールおよび接種対象の種に対するアジュバントの効力によって決まり、ヒトにおいて医薬用として許容可能なアジュバントは、関係する規制機関によってヒトへの投与が承認されているか承認されうるものである。例えば、完全フロインドアジュバントはヒトへの投与に適切ではない。アラム、ＭＰＬおよびＱＳ−２１が好ましい。任意選択的に、２種以上の別種のアジュバントを同時に用いることができる。好ましい組み合わせとしては、アラムとＭＰＬ、ミョウバンとＱＳ−２１、ＭＰＬとＱＳ−２１、ＭＰＬもしくはＲＣ−５２９とＧＭ−ＣＳＦ、およびアラムとＱＳ−２１とＭＰＬが挙げられる。また、任意選択的にアラム、ＱＳ−２１およびＭＰＬならびにこれらの全ての組み合わせのうちのいずれかと併用して、フロイント不完全アジュバントを使用することができる（Ｃｈａｎｇら，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２：ｐ１７３−１８６（１９９８年））。
【００９６】
多くの場合、本発明の薬剤は、有効な治療剤および各種の他の医薬用として許容可能な成分を含む医薬用組成物として投与する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、１９８０年）を参照されたい。好ましい形態は、所望の投与様式および治療用途によって決まる。また、この組成物は、所望の製剤に応じて、動物もしくはヒトへの投与用の医薬用組成物を処方するための一般的な賦形剤と定義される、医薬用として許容可能で毒性のないキャリアもしくは希釈剤を含むことができる。この希釈剤は、その組み合わせの生物活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例としては、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、およびハンクス液がある。さらに、この医薬用組成物もしくは製剤は、他のキャリア、アジュバント、もしくは毒性がなく治療用ではない非免疫原性の安定化剤なども含むことができる。
【００９７】
また、医薬用組成物は、タンパク質、キトサンなどの多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および（ラテックス官能化セファロース（ｌａｔｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（登録商標）、アガロース、セルロースなどの）コポリマー、アミノ酸重合体、アミノ酸共重合体、ならびに（油滴、リポソームなどの）脂質凝集物などの、大きくてゆっくりと代謝される高分子を含むこともできる。さらに、こうしたキャリアは、免疫賦活剤（即ち、アジュバント）として機能させることができる。
【００９８】
非経口投与の場合、本発明の薬剤は、水、油、生理食塩水、グリセロール、エタノールなどの滅菌液とすることができる医薬用キャリアを含む生理的に許容可能な希釈剤を用いたこの物質の溶液もしくは懸濁液として、注射可能な用量を投与することができる。さらに、湿潤剤、乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝剤などの補助剤を組成物に加えることができる。医薬用組成物の他の成分としては、石油、動物、植物もしくは合成由来の成分、例えば、ピーナッツ油、大豆油および鉱油がある。一般に、プロピレングリコール、ポリエチレン・グリコールなどのグリコール類が、特に注射用溶液には好ましい液体キャリアである。抗体は、有効成分の持続放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。例示的な組成物は、５０ｍＭのＬ−ヒスチジンおよび１５０ｍＭのＮａＣｌからなり、ＨＣｌでｐＨ６．０に調整した水性緩衝液に配合したモノクロナール抗体を５ｍｇ／ｍＬ含む。通常、非経口投与用の組成物は、実質的に無菌で、実質的に等張であり、ＦＤＡもしくは同様な機関のＧＭＰ条件下に製造される。
【００９９】
通常、組成物は溶液もしくは懸濁液の形の注射剤として調製するが、注射に先立って液体賦形剤に溶解もしくは懸濁するのに適した固形物として調製することもできる。また、この製剤は、上述のアジュバント効果を増強するために、リポソームもしくはポリラクチド、ポリグリコリド、コポリマーなどの微粒子を用いて乳化もしくは封入することもできる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：ｐ１５２７（１９９０年）およびＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：ｐ９７−１１９（１９９７年）参照）。本発明の薬剤は、有効成分の持続放出もしくはパルス放出を可能にするように処方することができるデポー注射剤もしくは植込み製剤の形で投与することができる。
【０１００】
他の投与様式に適した別の製剤としては、経口用、鼻腔内用および呼吸器用（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）の製剤、坐剤ならびに経皮投与剤（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）が挙げられる。坐剤の場合、結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルキレン・グリコールもしくはトリグリセリドが挙げられ、このような坐剤は、本有効成分を０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％含む混合物から作製することができる。経口用製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの賦形剤を含む。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤もしくは散剤の形をとり、有効成分を１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％含む。
【０１０１】
局所に適用すると、経皮的に、もしくは皮内から送達させることができる。本剤をコレラトキシンまたはその無毒化誘導体もしくはサブユニットあるいは他の同様な細菌毒素と同時投与することにより局所投与を容易にすることができる（Ｇｌｅｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：ｐ８５１（１９９８年））。同時投与は、これらの成分を混合物として、または化学的架橋結合もしくは融合タンパク質としての発現により得られる結合分子として用いることにより、達成することができる。あるいは、スキン・パス（ｓｋｉｎ  ｐａｔｈ）もしくはトランスフェロソームを用いて経皮的送達を達成することができる（Ｐａｕｌら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）２５：ｐ３５２１−２４（１９９５年）；Ｃｅｖｃら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３６８：ｐ２０１−１５（１９９８年））。
【実施例】
【０１０２】
（１．トランスジェニック動物における切断型αシヌクレインの検出）
ＰＤＦＧプロモータに動作可能なように結合させたインタクトなαシヌクレインをコードする核酸を有する、６週齢、３ヶ月齢および１２ヶ月齢の遺伝子導入マウスを用いて検討した。これらのマウスを安楽死させて、４匹（雄２匹／雌２匹）からの皮質および海馬組織をプールした。この組織をＴＢＳ（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中でホモジナイズした後、１５０，０００×ｇで１５分間遠心した。次いで、得られたペレットを１％トリトンＸ−１００により３０分間４℃で抽出し、これを上記のようにして遠心した。次に、得られたペレットを１％ＳＤＳにより３０分間２５℃で抽出し、これを上記と同様に遠心した。最後に、このペレットを８Ｍ尿素／１％ＳＤＳで抽出した。この方法によって、以下の説明でトリス抽出物、トリトン抽出物、ＳＤＳ抽出物および尿素抽出物と呼ぶ４種の抽出物が得られた。
【０１０３】
図１Ａおよび図１Ｂは、抗体ＥＬＡＤＷ−４７を用いた、遺伝子導入マウスおよび対応対照からの抽出物のウェスタン・プロットを示す。この抗体は、ＳＮ１１５−１２２内のエピトープに結合する（が、何がしかの結合を生じるのに必ずしもその全てのアミノ酸を必要とする訳ではない）ポリクロナール抗体である。この抗体は、ヒト型αシヌクレインを選択的に結合するだけでなく、程度はより少ないがマウス型にも結合する。図１Ａおよび図１Ｂは、対照マウスおよび遺伝子導入マウスにおける１４ｋＤａのαシヌクレインのバンドを示す。このバンドは対照よりも遺伝子導入マウスで強い。各種の抽出物では、トリトン抽出物のバンドが最も強い。この抽出物は、膜結合αシヌクレインおよび恐らくレヴィー小体様封入体を可溶性にしている。（対照ではなく）遺伝子導入マウスについてのトリス抽出および特にトリトン抽出では、トリシン緩衝液中で約１２ｋＤａのバンドが現れる。これは切断型αシヌクレインである。このバンドの分子量は、約１１５個〜約１２０個のアミノ酸の長さに相当する。
【０１０４】
図２は、図１と同じ抗体を用いて、３ヶ月齢と１２ヶ月齢のマウスで切断型αシヌクレインのレベルを比較したウェスタン・ブロットを示す。この図から、この切断型は３ヶ月齢のマウスでより強く現れることが分かる。この場合も、対照マウスでは切断型は現れない。このように遺伝子導入マウスの発育の初期段階で切断型αシヌクレインがより強く現れることから、切断型αシヌクレインはレヴィー小体病の病因の初期段階で役割を果たしていることが分かる。
【０１０５】
図３Ａおよび図３Ｂは、１２Ｃ１と呼ばれる別の抗体（４３番目から５１番目および５８番目から６５番目のアミノ酸のエピトープに結合するモノクロナール抗体ＩｇＧ１  ｋ）を用いたウェスタン・ブロットを示す。この抗体は、４３番目から５１番目および５８番目から６５番目までのアミノ酸を含むエピトープにおいてマウス型およびヒト型のαシヌクレインと等しく結合する。図３は、上記遺伝子導入マウスのトリトン抽出物における１２ｋＤａの切断バンドを示す。対照マウスのトリトン抽出物では同じバンドが、ずっとぼんやりと現れる。従って、αシヌクレインの切断型へのプロセシングは正常マウスおよび遺伝子導入マウスのいずれにおいても生じるが、後者の方がより強く生じる。このように遺伝子導入マウスにおいてプロセシングの程度がより強いのは、ヒト型αシヌクレインを直接プロセシングすることによると考えられ、もしくは非遺伝子導入マウスで余り使われていない経路に沿ってマウス型αシヌクレインを追いやるヒト型αシヌクレインの存在による考えられる。
【０１０６】
図４は、図３と同じ抗体を用いた別のウェスタン・ブロットを示す。このゲルでは、分子量約６ｋＤａもしくは約７ｋＤａの別の２つのバンドが現れている。７ｋＤａのバンドは対照マウスよりも遺伝子導入マウスにおいて強く現れる。６ｋＤａのバンドは、遺伝子導入マウスにおいてのみ、その上、３ヶ月サンプルにおいてのみ現れる。この６ｋＤａもしくは７ｋＤａのバンドは、長さ約５０〜８０個のアミノ酸の、より短いαシヌクレインＮ末端断片を示すものである。
【０１０７】
図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、４種の抗体を用いたウェスタン・ブロットおよびこれらの抗体の結合部位のエピトープマップを示す。ＥＬＡＤＷ−４４は、ヒト型αシヌクレインにのみ結合する（即ち、マウス型には結合しない）ポリクロナール抗体である。これは９８番目から１０９番目のアミノ酸のエピトープに結合する。ＥＬＡＤＷ−４７は、ヒト型に選択的に結合するだけでなく、マウス型にも結合するポリクロナール抗体である。これは１１５番目から１２２番目のアミノ酸のエピトープに結合する。ＥＬＡＤＷ−４８は、ヒト型およびマウス型に等しく結合するポリクロナール抗体である。これは１３１番目から１４０番目のアミノ酸のエピトープに結合する。８Ａ５は、ヒト型およびマウス型に等しく結合するモノクロナール抗体である。これはαシヌクレインのＣ末端に結合する。図５Ａ〜図５Ｅから、以上の４種の抗体のうち、ＥＬＡＤＷ−４７のみが切断型αシヌクレインを示す１２ｋＤａのバンドを生じたことが分かる。ＥＬＡＤＷ４８がこのバンドを生じなかったという結果は、切断部位のマッピングを行うのに助けになる。ＥＬＡＤＷ−４７は結合し、ＥＬＡＤＷ４８は結合しなかったので、切断部位は、ＥＬＡＤＷ−４７エピトープのＮ末端およびＥＬＡＤＷ−４８エピトープのＣ末端アミノ酸に隣接している。さらに、ＥＬＡＤＷ−４７エピトープの一部のアミノ酸が存在することにより結合が可能となるはずであり、ＥＬＡＤＷ−４８エピトープの一部のアミノ酸が存在しないことにより結合が妨げられるはずであるので、切断部位は、さらに、ほぼ１１８番目から１３５番目のアミノ酸の範囲内の領域に限定される。このデータを切断断片のサイズ（約１１５アミノ酸〜約１２０アミノ酸）と考え合わせると、考えられる切断部位は、１１８番目〜１２１番目のアミノ酸あたりである。Ｃ末端抗体８Ａ５による結合が見られないことは、この切断部位と整合する。しかしながら、抗体ＥＬＡＤＷ−４４による結合が見られないことについては、さらに解説を要する。切断により生じる切断型ヒト・αシヌクレインが、異なる立体構造をＥＬＡＤＷ−４４の結合を妨げるインタクトなαシヌクレインに適合させるのであれば、このように切断が見られないことの説明がつく。一方、正常マウスよりも遺伝子導入マウスでより大きな程度に存在する切断型αシヌクレインは、マウス・αシヌクレイン型である。この場合、遺伝子導入マウスで切断型の量が多いのは、対照マウスの状況と比べて切断型αシヌクレインを生じるプロセシング経路に沿ってより多くのマウス・αシヌクレインを追いやるヒト・αシヌクレインの存在によるものと思われる。
【０１０８】
（２．ＤＬＢＤ患者の脳内の切断型αシヌクレインの検出）
この実施例では、ＬＢ内のαシヌクレイン種をＤＬＢＤ脳の残りの可溶性タンパク質フラクションおよび粒状タンパク質フラクションと比較する。ＬＢおよび可溶性タンパク質は、単一のＤＬＢＤ患者の皮質から調製した（Ｊｅｎｓｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：ｐ２１５００−２１５０７（２０００年）参照）。組織は、トリス／スクロース（０．３２ｍＭ）／ＥＤＴＡ（５ｍＭ）およびプロテアーゼ阻害剤緩衝液中でホモジナイズした。得られたホモジネートを１０００ｇで遠心した。上清をさらに１５０ｋｇで遠心した。この遠心による上清を用いてタンパク質のトリス可溶性フラクションを調製した。１０００ｇの遠心で得られたペレットは再懸濁し、これを用いてレヴィー小体フラクションを調製した。レヴィー小体は、抗シヌクレイン抗体を担持させた磁性ビーズを用いる免疫沈降法によって精製した。次いで、得られた沈降物を７Ｍ尿素２Ｍチオ尿素／４％ＣＨＡＰＳで抽出した。得られた結合型を尿素／チオ尿素／ＣＨＡＰＳで再抽出した。次いで、この工程による抽出物と前回の抽出物とをプールし、２Ｄ  ＰＡＧＥおよびイムノブロットにより分析した。結合型を、さらに９０％ギ酸で抽出した。得られた抽出物は、ギ酸９％にまで希釈して保存した。次いで、この抽出物をＳＤＳ  ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１０９】
シヌクレイン種は２−Ｄゲルで分離し、ウェスタン・ブロットで検出した。その結果、ＬＢおよび可溶性脳フラクションのいずれにも、リン酸化型および切断型の種を含む複数のαシヌクレイン種が存在した。切断は、αシヌクレインのほぼ１２０番目〜１２５番目のアミノ酸のＣ末端に主に認められた。また、Ｃ末端近くで切断された別の大きな断片も認められた。β−シヌクレインおよびγ−シヌクレインは、上記可溶性フラクション中には存在しているにもかかわらず、ＬＢ中には検出されなかった。このＬＢ試料中のαシヌクレインは、別のＣ末端切断部位を有する点、および全体的に切断型αシヌクレイン種が可溶性蛋白フラクションに比し、ＬＢ内に濃縮されている点で、この可溶性フラクション中のものと異なっていた。さらに、分子量が約２５ｋＤａ〜約３５ｋＤａである、より大きい複数のαシヌクレイン種がＬＢ試料にのみ検出された。Ｃ末端切断断片は、実施例１の遺伝子導入マウスで認められたのと同じサイズであり、疾患の原因としての役割が示唆された。
【０１１０】
図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、種々の抗体でプローブし、２−Ｄゲル電気泳動の対象として、ウェスタン・ブロッティングにかけた、トリトン抽出物を示す。チャートの左の方にみられるダーク・スポットは完全長のαシヌクレインを示す。最も注目すべき特徴は、８Ａ５のチャートにはみられないＳｙｎ−１のチャートの４つのスポットである。これら４つのスポットは、Ｃ末端アミノ酸の欠如のため８Ａ５抗体を結合することができない切断型αシヌクレインである。これらの切断は、ＳＮ１−１２０〜ＳＮ１−１２５の型にほぼ相当する。完全長αシヌクレインのスポットの下および近傍にはいくつかの別のスポットがみられる。この完全長スポットの下のスポットは、Ｃ末端からの小さな切断（即ち、Ｘを１３０〜１３９とした場合のシヌクレイン１−Ｘ）を示すものと思われる。完全長スポット近傍の右側スポットは（ＥＬＡＤＷ４３を用いたブロットにこのスポットがないため）Ｎ末端からの小さな欠損を示す。
【０１１１】
図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、別の抗体を用いたブロットを示す。５Ｃ１２（１０９−１２０）の場合、４つのスポットが認められる。ＥＬＡＤＷ４７（１１８−１２３）の場合、これらのスポットのうちの２つが認められ、ＬＢ５０９（１１５−１２３）の場合、これら全てのスポットがみられなかった。これらのスポットは、分子量においても、ニトロ化、リン酸化などの翻訳後修飾の有無においても互いに異なると思われる。これらの結果から、切断部位はαシヌクレインのほぼ１２０番目から１２５番目のアミノ酸の範囲内に決まる。また、注目すべきは、いくつかのスポットが、修飾されていないシヌクレインのスポットよりもわずか下（分子量がより小さい）もしくは右側（ｐＨがより高い）に出ていることである。これらは、恐らく、主要なスポットに比し、受けた切断の程度が小さい、および／又は翻訳後に受けた修飾が異なる、シヌクレインの型を示すものと考えられる。
【０１１２】
図８は、ウェスタン・ブロッティングに用いる抗体が結合するエピトープに関係する切断部位の概要を示す。
【０１１３】
図９Ａ、図９Ｂは、トリス可溶性タンパク質とレヴィー小体からの抽出タンパク質とを２Ｄ電気泳動およびウェスタン・ブロッティングにより比較したものである。左側のトリス・ブロットには、（恐らくアミノ酸１番目から１２０番目〜１番目から１２５番目の範囲にある）切断型αシヌクレインを表す、より低分子量の４つのスポットが示されている。これらは、完全長αシヌクレインを表すスポットに比し、強度が比較的低い。レヴィー小体からのタンパク質のブロットでは、１番目から１２０番目〜１番目から１２５番目の範囲の切断型αシヌクレインを表すより多くのスポットが示されている。しかしながら、これらは、完全長αシヌクレインを表すスポットに比し、強度が高い。また、明らかなことは、２つのスポットが、完全長αシヌクレインより速いが、このブロットの下部に集まっているスポットよりも遅い移動を示すことである。これらのスポットは、Ｘを１３０〜１３９番目のアミノ酸とした場合の１−Ｘの範囲の切断を表すものと考えられる。
【０１１４】
図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄは、各種Ｃ末端抗体で再プローブした（ｒｅｐｒｏｂｅｄ）レヴィー小体からのタンパク質の免疫ブロットを示す。Ｓｙｎ−１（９１−９６）および５Ｃ１２（１０９−１２０）の場合、全てのスポットが現れる。ＥＬＡＤＷ４７の場合、Ｓｙｎ−１ブロットおよび５Ｃ１２ブロットにおいて最も速い速度で最も底部の（ｂａｓｉｃ）位置を移動するスポットは見当たらない。ＬＢ５０９ブロットでは、その他のブロットにおける移動のより速い／より底部のスポットの全てが見当たらないか、ぼんやりとしている。ＥＬＡＤＷ４７およびＬＢ５０９のブロットに特定のスポットが存在しないか、強度が低いことから、これらのスポットは、切断型αシヌクレインを示すものであり、切断がほぼ１２０番目〜１２５番目のアミノ酸で生じることと符合していることが分かる。
【０１１５】
（３．トランスジェニック動物における凝集αシヌクレインの検出）
トランスジェニック動物を安楽死させ、脳を摘出して神経化学的および神経病理学的な検討を行う。簡単に言えば、右半分の脳を凍結し、ホモジナイズして凝集ヒト・αシヌクレインおよび非凝集ヒト・αシヌクレインの免疫反応性をウェスタン・ブロットにより測定する（Ｍａｓｌｉａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）２８７：ｐ１２６５）。左半分の脳は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ビブラトームで連続切片を作製して免疫細胞化学および超微細構造分析を行う。
【０１１６】
脳切片を、ヒト・αシヌクレインに対するウサギ・ポリクロナール抗体（１：５００）で免疫染色する。４℃で一夜インキュベーションした後、切片を、ビオチニル化抗ウサギ二次抗体、次いでアビジンＤ−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体（１：２００、ＡＢＣエリート、ベクター社（Ｖｅｃｔｏｒ））とインキュベートする。反応を、０．００１％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶かした０．１％の３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩（ＤＡＢ）を用いて視覚化し、次いで、切片をエンテランを用いてスライド上に封入する。免疫反応性のレベルは、クウォンティメット（Ｑｕａｎｔｉｍｅｔ）５７０Ｃを用いるオプティカル・デンシトメトリーにより半定量的に評価する。また、この切片を画像解析により調べて、αシヌクレインの免疫反応性封入体の数を測定し、この信頼できるαシヌクレイン凝集の測定値を抗凝集効果の有用な指標として用いる（Ｍａｓｌｉａｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００年）２８７：ｐ１２６５）。
【０１１７】
神経変性のパターンの解析は、シナプトフィジンおよび微小管関連蛋白２（ＭＡＰ２）に対して二重免疫標識し、ＬＳＣＭで視覚化したビブラトーム切片を用い、海馬、前頭皮質、側頭皮質および基底核のシナプスおよび樹状突起の密度を分析することによって達成する。神経変性の別の解析は、これまでに報告されている方法（Ｍａｓｌｉａｈら（２０００年））により尾状核被殻（ｃａｕｄｏｐｕｔａｍｅｎ）および黒質（ＳＮ）のチロシン水酸化酵素（ＴＨ）の免疫反応性を測定することによって達成する。切片はＬＳＣＭによって画像化されることになり、個々の各画像は、直線範囲内にピクセル強度を示すＴＨ−免疫反応性末端が含まれるように、相互作用的に閾値によって処理される。スケールはピクセル：μｍ比で求めるように設定する。次いで、この情報を利用してＴＨ−免疫反応性末端によって覆われる神経網の面積％を算出する。また、この同じ切片を用いてＳＮ内のＴＨニューロンの数を計測する。
【０１１８】
（４．ＬＢＤ患者におけるαシヌクレインの分析）
αシヌクレインのどの種が疾患組織内に濃縮され、もしくは疾患組織に特有であるかを明らかにするために、多系統萎縮症（ＭＳＡ）の患者および家族性パーキンソン病突然変異（Ａ５３Ｔ；Ｃｏｎｔｕｒｓｉ家系）の患者からの脳サンプルについて検討した。ＭＳＡおよびＣｏｎｔｕｒｓｉ脳の粒状フラクションを、それぞれ、５０ｍＭトリス、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、および１％トリトン（ＭＳＡの場合）もしくは０．１％ＮＰ４０（Ｃｏｎｔｕｒｓｉの場合）のうちのいずれかからなる溶液中で脳組織をホモジナイズすることによって調製した。年齢をマッチングした対照患者（「正常者」）についても疾患脳と全く同様に処理した。サンプルは、１−Ｄゲルのウェスタンブロットを用い、次いで下記のようにＥＬＩＳＡによって、さらに、２−Ｄゲルを用いて分析した。この分析は粒状フラクションの一部について行い、残りは遠心した。得られた上清（Ｓｕｐ）についても分析し、ペレットは７Ｍ尿素で抽出した。この抽出による上清は分析した。得られたペレットは、さらに７Ｍ尿素／１％ＳＤＳで抽出し、その上清を分析した。全αシヌクレインを検出し、もしくは１２９番目の位置がリン酸化されたαシヌクレインを特異的に検出する抗体を用いたウェスタン・ブロットの結果を図１１に示した。
【０１１９】
このシヌクレインの分画は、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ脳では対照脳と異なっていた。正常脳のシヌクレインの大部分は、トリス緩衝スクロース液を用いホモジナイズした後、可溶性であったが、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ脳のシヌクレインのほぼ全てで、可溶化するのに尿素およびＳＤＳを必要とし、この患者では大量のレヴィー小体の存在が示唆された。Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者のシヌクレインは、ｓｅｒ１２９リン酸化の量が対照患者と際立って異なっていた。対照患者ではごく少量のリン酸化α−シヌクレインが検出されたのに対して、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者では、ウェスタン・ブロットを用いた比較によって極めて大量のリン酸化シヌクレインが認められた。従って、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ脳のシヌクレインの不溶性は、シヌクレインのｓｅｒ１２９におけるリン酸化の大きな増大と関連付けられた。また、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者のα−シヌクレインは、Ｃ末端切断の分布が正常脳の場合と異なっていた。Ｃ末端切断型α−シヌクレインは、対照およびＣｏｎｔｕｒｓｉ粒状脳フラクションのいずれにおいても認められたが、検出可能な全ての切断断片は、Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者では高度に不溶性（尿素／ＳＤＳ抽出物）であったのに対し、対照患者の脳では可溶性（トリス緩衝スクロース液）であった。Ｃｏｎｔｕｒｓｉ患者のＬＢ濃縮フラクションにおけるＣ末端切断型シヌクレインの濃縮は、ＤＬＢＤ  ＬＢにおいてＣ末端切断型シヌクレインが濃縮されているとの本発明者らの知見と一致している。また、ＭＳＡ脳もホスホ（ｓｅｒ１２９）α−シヌクレインが濃縮していたことから、ＬＢでもみられたＣ末端切断および多くのリン酸化その他の酸性修飾の存在が明らかとなった。また、ＤＬＢＤ患者の脳では、非疾患対照に比し、高レベルのホスホ（ｓｅｒ１２９）が認められた。また、別の実験において、Ａ５３Ｔ突然変異を有するαシヌクレインでトランスフェクトしたＰＥＡＫ細胞では、野性型ヒト・αシヌクレインでトランスフェクトしたＰＥＡＫ細胞に比し、（約３０％高い）高レベルのホスホ（ｓｅｒ１２９）が認められた。
【０１２０】
（５．トランスジェニック動物における行動上の分析）
マウスの自発運動について、以前に報告された方法（マスリアほか（Ｍａｓｌｉａｈら）（２０００年））により、回転棒（サンディエゴ・インストルメンツ、サンディエゴ、ＣＡ）を用いて２日間検討する。１日目に、５つのトライアルについてマウスを訓練する。即ち、１つ目は１０ｒｐｍ、２つ目は２０ｒｐｍ、３〜５つ目は４０ｒｐｍでのトライアルとする。２日目に、各４０ｒｐｍの７回のトライアルについてマウスを試験する。マウスを円筒上に一匹ずつ置き、回転速度を２４０秒間かけて０ｒｐｍから４０ｒｐｍまで増加させる。マウスがその棒上に留まっている時間の長さ（落下潜時）を記録し、これを運動機能の指標として用いる。
【０１２１】
マウスの認識能力について、モリス水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ）（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｌｅａｒｎ  Ｍｏｔｉｖａｔ．１２：ｐ２３９−２６０（１９８１年））を用いて試験する。この方法では、水を満たし、水面直下に逃避台を沈めてある円形プールにマウスを入れる。この台に目で見ることのできる印を付けておくことによって、マウスが近位の目に見える手掛かりの方に泳いでいくことによってこの印を見つけることができるようにしてある。あるいは、この台の位置を分からせる型にはまった手掛かりを設けない、この試験のもっと複雑なタイプをマウスに施行する。このタイプでは、マウスは、遠くの目に見える手掛かりとの関連で台の位置を学習する必要がある。マウスが水中に留まっている時間の長さは認識能力に反比例する。
６．細胞株を用いた凝集αシヌクレイン断片の分析
上述のαシヌクレイン、マウス・αシヌクレインの切断断片を発現するｐＣＲ３．１−Ｔ発現ベクター（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールズバッド、ＣＡ）を用いてＧＴ１−７神経細胞（Ｈｓｕｅら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：ｐ４０１−４１０（２０００年））をトランスフェクトし、発現ベクター単独でトランスフェクトした細胞と比較する。ベクター単独でトランスフェクトした細胞は線維芽球様の外観を有するが、αシヌクレインでトランスフェクトした細胞は丸みを帯び、光学顕微鏡および共焦点型走査顕微鏡で見ることのできる細胞表面の封入体を有する。トランスフェクトしたＧＴ１−７細胞を用いることによってシヌクレイン封入体を除去する活性について薬剤をスクリーニングすることができる。
【０１２２】
以上の実施例は単に例示的なものであり、本発明を限定するものではない。従って、他の変形形態がありうることは当業者には容易に理解されよう。本発明の範囲は、これにより付与される全ての特許の特許請求の範囲によってカバーされる。従って、本発明の範囲は、上記の説明を参照するのではなく、特許付与される特許請求の範囲をその均等物の全範囲と共に参照して決定されるべきである。本出願において引用した全ての刊行物、参考文献および特許文献は、個々の刊行物もしくは特許文献がそれぞれ、そのようにして個別に示されている場合と同程度に、あらゆる目的で全文引用により本明細書に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ＳＮ１１５〜１２２内の抗原決定基に結合するポリクロナール抗体を用いた、遺伝子導入マウス（Ｂ）および対応対照（Ａ）の皮質および海馬からの各種抽出物のウエスタン・ブロットを示す。
【図２】図２は、図１Ａおよび図１Ｂと同じ抗体を用い、３ヶ月齢および１２ヶ月齢マウスの皮質および海馬のトリトン−Ｘ１００抽出物においてαシヌクレインの切断型の濃度を比較したウエスタン・ブロットを示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、１２Ｃ１と称する別の抗体（４３〜５１番目および５８〜６５番目アミノ酸の抗原決定基に結合するモノクロナール抗体）を用いた、高齢対応対照（Ａ）との比較における３ヶ月齢遺伝子導入マウス（Ｂ）の脳からのトリトン抽出物のウエスタン・ブロットを示す。
【図４】図４は、図３と同じ抗体を用いた、３ヶ月齢および１２ヶ月齢遺伝子導入マウスの脳からのトリトン抽出物による別のウエスタン・ブロットを示す。
【図５】図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄおよび図５Ｅは、遺伝子導入マウスの脳からの各種抽出物に対する４種の抗体を用いたウエスタン・ブロット（図５Ｂ、図５Ｃ、図５Ｄ、図５Ｅ）およびこれらの抗体の結合部位の抗原決定基マップ（図５Ａ）を示す。
【図６】図６Ａ、図６Ｂおよび図６Ｃは、３種の抗体（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ）でプローブし、２−Ｄゲル電気泳動の対象とし、ウェスタン・ブロッティングにかけたレヴィー小体病患者の脳のトリトン抽出物を示す。
【図７】図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄは、別の特異性を有する４種の抗体（図７Ａ、図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ）を用いた、レヴィー小体病患者脳のトリトン抽出物の別のブロットを示す。
【図８】図８は、ウェスタン・ブロッティングに用いる抗体が結合する抗原決定基に対する切断部位の概要を示す。
【図９】図９Ａ、図９Ｂは、トリス可溶性蛋白質（Ａ）とレヴィー小体からの抽出蛋白質（Ｂ）とを２Ｄ電気泳動およびウェスタン・ブロッティングにより比較したものである。
【図１０】図１０Ａ、図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１０Ｄは、各種Ｃ末端抗体で再プローブ（ｒｅｐｒｏｂｅｄ）したレヴィー小体からの蛋白質の免疫ブロットを示す。
【図１１】図１１は、αシヌクレイン全体を認識する抗体もしくはリン−１２９αシヌクレインに特異的な抗体でプローブした健常者およびＣｏｎｔｕｒｓｉ患者の各種抽出物のウエスタン・ブロットを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月23日(2007.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007525464000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月11日(2007.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インタクトなαシヌクレインの少なくとも１００個の連続するアミノ酸の存在およびインタクトなαシヌクレインのＣ末端の１番目から２３番目の連続するアミノ酸の欠損を特徴とするものとする、αシヌクレインの断片。
【請求項２】
請求項１の断片であって、該αシヌクレインの断片が遺伝性リューイ体病（ＬＢＤ）と関連する突然変異を有する、断片。
【請求項３】
請求項２の断片であって、該突然変異がＡ５３Ｔ突然変異である、断片。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項の断片であって、該αシヌクレインの断片が、インタクトなαシヌクレインの１１８番目〜１２５番目の残基にＣ末端を有する、断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項の方法であって、該αシヌクレインの断片が、αシヌクレインの１番目から１１９番目、１番目から１２０番目、１番目から１２１番目、１番目から１２２番目、１番目から１２３番目、１番目から１２４番目、および１番目から１２５番目である、断片。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項の方法であって、該αシヌクレインの断片が１番目からＸ番目であり、Ｘは１３０番目〜１３９番目であるものとする、断片。
【請求項７】
ＬＢＤを処置するのに有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
該薬剤を、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片と接触させ、該αシヌクレインの断片の凝集の速度もしくは程度を測定し、該薬剤を用いない対照との比較による凝集の速度もしくは程度の減少によって該薬剤が薬理活性を有することが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項８】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
αシヌクレインを発現し、該αシヌクレインを、請求項１〜６のいずれか１項の断片にプロセシングする細胞を薬剤と接触させ、該細胞内の該断片のレベルを該薬剤の非存在下の同じ細胞種内のベースラインレベルとの比較で測定し、該ベースラインに対し断片レベルが減少することにより該薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項９】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片を発現する遺伝子導入動物を接触させ、該薬剤非存在下の同様な非ヒト遺伝子導入動物の脳内の凝集型の該断片のベースラインレベルとの比較で該非ヒト遺伝子導入動物の脳内の凝集型の該断片のレベルを測定し、該ベースラインに対する該凝集型断片レベルの減少によって該薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示され、該非ヒト遺伝子導入動物はマウスもしくはショウジョウバエであるものとすること
を含む、方法。
【請求項１０】
ＬＢＤの処置に有用な薬理活性を有する薬剤をスクリーニングする方法であって
αシヌクレインを発現する導入遺伝子を有し、該αシヌクレインを、請求項１〜６のいずれか１項の断片にプロセシングする非ヒト遺伝子導入動物を薬剤と接触させ、該薬剤非存在下のベースラインレベルとの比較で神経細胞内の該断片のレベルを測定し、このベースラインに対する上記断片のレベルの減少によってこの薬剤にＬＢＤの処置に有用な薬理活性があることが示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片をコードする核酸セグメントに動作可能なように結合したプロモータを含む導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入動物であって、該遺伝子導入動物に該断片を発現させることにより該動物がＬＢＤの少なくとも１つの特徴を発症しやすくなり、該プロモーターは、ＰＤＧＦプロモータであり、該少なくとも１つの特徴が運動機能の障害または認識機能の障害であることを特徴とする
遺伝子導入動物。
【請求項１２】
患者においてＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を検出するのを補助する方法であって
脳脊髄液中の、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片を検出し、健常者のベースラインレベルよりもレベルが高いことにより、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性が示されるものとすること
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片に特異的に結合する抗体であって、完全長のシヌクレインには特異的な結合を示さず、該抗体は、ヒト・アイソタイプＩｇＧ１のヒト抗体またはヒト化抗体である、抗体。
【請求項１４】
患者において投与された抗体の結合レベルを測定し、健常者のベースラインレベルよりもレベルが高いことにより、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性が示されるものとすることによって、ＬＢＤの存在もしくはＬＢＤに対する罹病性を診断することにおいて使用するための請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
リューイ体病の治療もしくは予防において使用するための、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片。
【請求項１６】
該断片に対する抗体を含む免疫反応を増強するアジュバントと組み合わせられているか、または該断片に対する抗体を含む免疫応答を増強する、融合蛋白質を形成する担体に結合されている、請求項１〜６のいずれか１項のαシヌクレインの断片。
【請求項１７】
インタクトなαシヌクレインを切断して、請求項１〜６のいずれか１項の断片を生じさせるプロテアーゼをスクリーニングする方法であって、
該プロテアーゼの阻害剤を特定すること、
該阻害剤を該プロテアーゼを含む細胞抽出物もしくは組織抽出物と接触させることにより該プロテアーゼを該阻害剤に結合させること、ならびに
該阻害剤から該プロテアーゼを遊離させること
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法であって、該阻害剤はインタクトなαシヌクレインの１１５番目〜１３０番目の位置の少なくとも５残基からなる連続したセグメントを含むαシヌクレインのペプチドであるものとする、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】図面
【図１】
2007525464.tif 000015
【図２】
2007525464.tif 000016
【図３】
2007525464.tif 000017
【図４】
2007525464.tif 000018
【図５】
2007525464.tif 000019
2007525464.tif 000020
【図６】
2007525464.tif 000021
【図７】
2007525464.tif 000022
【図８】
2007525464.tif 000023
【図９】
2007525464.tif 000024
【図１０】
2007525464.tif 000025
【図１１】
2007525464.tif 000026
【国際調査報告】
2007525464.tif 000027