(57)【要約】  本発明は、植物の収量、特に種子の収量を増加する方法に関し、ＣＤＫＤをコードする核酸またはその機能的変異体を植物に導入することを含む。また、本発明は、本発明の方法により作出されたトランスジェニック植物を提供し、及び本発明の方法に有用な構築物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ型サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫＤ）をコードする核酸を植物に導入することを含む、対応する野生型植物と比べて植物収量を増加する方法。
【請求項２】
収量の増加が、種子の収量の増加である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
収量の増加が、（ｉ）植物の１以上の部分のバイオマスの増加、（ｉｉ）種子のバイオマスの増加、（ｉｉｉ）（充実した）種子の数の増加、（ｉｖ）種子の大きさの増加、（ｖ）種子の体積の増加、（ｖｉ）収穫指数の増加、及び（ｖｉｉ）千粒重（ＴＫＷ）の増加、から成る群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
核酸が、ＣＤＫＤまたはその機能的変異体をコードし、かつ植物から得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤＫＤをコードする核酸が配列番号１で表され又はその機能的変異体であり、ＣＤＫＤポリペプチドが配列番号２で表され又はその機能的変異体であり、機能的変異体は、
（ｉ）配列番号１の配列で表される核酸の一部、
（ｉｉ）配列番号１の配列で表される核酸にハイブリダイズできる配列、
（ｉｉｉ）配列番号１の配列で表される核酸の選択的スプライス変異体、
（ｉｖ）配列番号１の配列で表される核酸の対立遺伝子変異体、
（ｖ）配列番号２の配列で表されるアミノ酸のホモログ、誘導体及び活性フラグメント、
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ＣＤＫＤをコードする核酸配列が植物で過剰発現される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤＫＤをコードする核酸の発現が構成的プロモーターにより作動される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
増加した収量を有するトランスジェニック植物を作出する方法であって、
（ｉ）ＣＤＫＤをコードする核酸又はその機能的変異体を植物または植物細胞に導入すること、
（ｉｉ）再生及び成熟した植物の成長を促進する条件下で植物細胞を培養すること、
を含む方法。
【請求項９】
収量の増加が、種子の収量の増加である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
植物に、ＣＤＫＤポリペプチド又はその機能的変異体をコードする遺伝子の遺伝子座の遺伝子改変を導入することを含む、植物の収量、特に種子の収量を増加する方法。
【請求項１１】
遺伝子改変が、部位特異的突然変異誘発、相同的組換え、ティリング及びＴ−ＤＮＡ活性化の１つにより生じる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法により得られる植物。
【請求項１３】
（ｉ）ＣＤＫＤをコードする核酸またはその機能的変異体、
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列の発現を作動できる１つ以上の制御配列、及び任意に、
（ｉｉｉ）転写終結配列、
を含む構築物。
【請求項１４】
制御配列が構成的プロモーターである、請求項１３に記載の構築物。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の構築物で形質転換された植物。
【請求項１６】
植物が、ＣＤＫＤまたはその機能的変異体をコードする単離された核酸を含むことを特徴とする、収量の増加したトランスジェニック植物。
【請求項１７】
植物がサトウキビなどの単子葉植物であり、又はイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ミレット、ライムギ、ソルガムまたはオートムギなどの穀類である、請求項１２、１５または１６に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１８】
請求項１２または１５〜１７のいずれか１項に記載の植物の収穫可能な部分。
【請求項１９】
収量の増加、特に種子の収量の増加における、ＣＤＫＤまたはその機能的変異体をコードする単離された核酸の使用。
【請求項２０】
種子の収量が、充実した種子の数の増加、種子重量の増加、収穫指数の増加及びＴＫＷの増加の１つ以上を含む、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＣＤＫＤが配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体、あるいは配列番号２で表されるアミノ酸またはその機能的変異体である、請求項１９または２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に分子生物学の分野に関し、植物の収量を増加する方法に関する。更に具体的には、本発明はＤ型サイクリン依存性キナーゼ（Ｄ−ｔｙｐｅ  Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｋｉｎａｓｅ、ＣＤＫＤ）をコードする核酸を植物に導入することにより、植物の収量、特に種子の収量を増加する方法に関する。また本発明は、本発明による方法で作出された植物に関し、植物は対応する野生型植物と比べて収量が増加する。また本発明は本発明の方法に有用な構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口は増加の一途を辿り、農業に利用できる耕作地の供給が次第に減少しているために、研究は農業の効率を上げる方向に向かっている。従来の農作物の手法及び園芸改良では、望ましい性質を有する植物を特定するために選抜育種技術を利用する。しかしながら、このような選抜育種技術はいくつか欠点があり、すなわちこれらの技術は、典型的に大きな労働力を必要とし、また、しばしば、親植物から伝えられる望ましい特性をいつも生じるとは限らない異種の遺伝的要素を含む植物が生じる。分子生物学の進歩により、人間は動物及び植物の生殖質を改変できるようになった。植物の遺伝子工学は、（典型的にはＤＮＡまたはＲＮＡの形の）遺伝物質の単離及び操作を行い、次に遺伝物質を植物に導入することが必要である。このような技術は、経済的、作物学的、または園芸学的に様々に改良された特徴を有する農作物または植物を作出する力を持っている。具体的な経済的利益を特徴付けるのは収量である。収量は通常、農作物から得られる、経済的価値を測定できるものと定義される。これは量及び／又は質の点から定義されよう。収量は幾つかの因子、例えば器官、植物構造（例えば枝の数）、採種などの数及び大きさなどに直接依存する。根の発達、栄養摂取及びストレス耐性も収量の決定における重要な因子である。農作物の収量は、上記因子の１つを最適化することにより増加することができ、植物の生来の成長メカニズムを改変することにより行うことができる。
【０００３】
植物の生来の成長メカニズムは、「細胞周期」と総称して知られる、非常に秩序のある順番を有する事象にある。細胞周期の進行は、全ての多細胞性生物の成長と発達にとって基本的なことであり、細胞増殖にとって非常に重要である。細胞周期の主な構成要素は酵母、哺乳動物及び植物に高度に保存されている。細胞周期は、一般的に、Ｇ０−Ｇ１−Ｓ−Ｇ２−Ｍの連続した期に分けられる。ＤＮＡ複製又は合成は、一般的に、Ｓ期（「Ｓ」はＤＮＡ合成（ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）である）中に起こり、染色体の有糸分裂分離はＭ期（「Ｍ」は有糸分裂（Ｍｉｔｏｓｉｓ）である）中に起こり、Ｇ１（ＤＮＡ複製前の細胞成長の期間）及びＧ２（ＤＮＡ複製後、分裂のために細胞が準備している期間）のギャップ期が間に存在する。細胞分裂は、細胞質分裂、すなわちＭ期の最終ステップ後に完了する。細胞周期を終え、静止した細胞は、Ｇ０期に入ると言われる。この期にある細胞を刺激してＧ１期の細胞周期に再び入れることができる。Ｇ１、Ｇ２及びＧ０の「Ｇ」は「ギャップ（ｇａｐ）」を表す。細胞周期のプロセスが終了して、各娘細胞は細胞分裂中に親ゲノムの完全なコピーを受け取ることができる。
【０００４】
細胞分裂は、２つの重要な細胞周期の事象、すなわちＤＮＡ合成の開始と有糸分裂の開始により制御される。これらのキーとなる各事象へのそれぞれの移行は、（ＤＮＡ複製及び分裂に関連する）特定のタンパク質複合体で示されるチェックポイントによって制御される。Ｇ１／Ｓの境目でのＤＮＡ合成に必要な遺伝子の発現は、哺乳動物細胞及び植物細胞の転写因子のＥ２Ｆファミリーによって調節される（Ｌａ  Ｔｈａｎｇｕｅ，  １９９４；  Ｍｕｌｌｅｒら，  ２００１；  Ｄｅ  Ｖｅｙｌｄｅｒら，  ２００２）。細胞周期への移行は、シグナルをまとめて細胞周期遺伝子の転写を活性化できるＥ２Ｆ／Ｒｂ複合体により、調節／誘発される。細胞周期の違う期の間の移行及びそれによる細胞周期の進行は、一般的にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）と呼ばれる、異なるヘテロ二量体のセリン／スレオニンプロテインキナーゼの形成と活性化により駆動される。これらのキナーゼの活性に必要な条件は、特定のサイクリンとの物理的結合であり、活性化のタイミングはサイクリンの発現に大きく依存している。サイクリンの結合は、その結合したＣＤＫのＮ末端ローブのコンフォメーション変化を誘発し、複合体の局在化と基質特異性に寄与する。単量体のＣＤＫは、サイクリンと結合すると活性化されて、キナーゼ活性を有する。サイクリンタンパク質のレベルは、細胞周期中に変動し、そのためＣＤＫ活性化のタイミングを決定する際の重要な因子を表す。細胞周期における、サイクリン及びＣＤＫを含むこれらの複合体の周期的な活性化は、細胞周期の移行（チェックポイント）の一時的な調節をメディエートする。ＣＤＫ活性を調節する他の因子として、ＣＤＫ阻害剤（ＣＫＩ、ＩＣＫ、ＫＩＰ、ＣＩＰ、ＩＮＫ）、ＣＤＫ活性化キナーゼ（ＣＡＫ）、ＣＤＫフォスファターゼ（Ｃｄｃ２５）およびＣＤＫサブユニット（ＣＫＳ）が挙げられる（Ｍｉｒｏｎｏｖら、１９９９；  Ｒｅｅｄ  １９９６）。
【０００５】
植物では、Ａ型及びＢ型ＣＤＫとして知られている、ＣＤＫの２つの主なクラスが今まで研究されてきた。Ａ型ＣＤＫは、Ｇ１期からＳ期及びＧ２期からＭ期の両方の移行を調節し、それに対してＢ型ＣＤＫは、Ｇ２期からＭ期のチェックポイントを制御するだけであると考えられる（Ｈｅｍｅｒｌｙら、１９９５；  Ｍａｇｙａｒら、１９９７；  Ｐｏｒｃｅｄｄｕら、２００１）。更に、Ｃ型ＣＤＫ及びＣＤＫ活性化キナーゼ（ＣＡＫ）の存在が報告された（Ｍａｇｙａｒら、１９９７；  Ｕｍｅｄａら、１９９８；  Ｊｏｕｂeｓら、２００１）。Ｖａｎｄｅｐｏｅｌｅら、２００２  は、ホモロジーに基づいたアノテーションの方法で４つのＣＡＫを同定した。これらのＣＡＫは３つのＤ型ＣＡＫ（Ａｒａｔｈ；ＣＤＫＤ；１，Ａｒａｔｈ；ＣＤＫＤ；２及びＡｒａｔｈ；ＣＤＫＤ；３）及び１つのＦ型ＣＡＫ（Ａｒａｔｈ；ＣＤＫＦ；１）であった。
【０００６】
Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ．  １００  （１３）  ８０１９−８０２３，  ２００３）は、タバコの葉の移植片におけるイネのＲ２  ｃＤＮＡ（ＣＡＫをコードする）の過剰発現を記載する。彼らは、培養の最初の７日間のＲ２の一過性の発現によりサイトカイニンの不存在下でカルス形成が誘発されたことを報告した。またＹａｍａｇｕｃｈｉらは、ＣＤＫによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの器官形成の制御を調べた。
【０００７】
Ｆａｂｉａｎ−Ｍａｒｗｅｄｅｌら（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｖｏｌ．  １４，  １９７−２１０，  ２００２）は、イネのＣＡＫ、Ｒ２は、Ｓ期の進行及び懸濁細胞の全体的な成長速度を制御することを報告している。
【０００８】
植物の細胞周期に影響を与え、それにより植物の様々な成長の特徴を改変する能力は、農作物の増収、品種改良、観賞植物の生産、樹芸学（ａｂｏｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）、園芸学、林学、バイオリアクター（医薬、抗体またはワクチンなどの物質を生物工学的に生産するため、または有機性廃棄物を生物変換するため）に使用する藻類の生産及びこのようなその他の分野で、適用されるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＣＤＫＤをコードする核酸を植物に導入することにより、対応する野生型植物と比べて収量が増加した植物が得られることを見出した。従って、本発明の１つの実施形態により、ＣＤＫＤをコードする核酸を植物に導入することを含む、植物の収量を増加する方法を提供する。
【００１０】
本明細書で定義される用語「収量の増加」は、対応する野生型植物とそれぞれ比較して、以下の１つ以上についての増加を意味する：（ｉ）植物の１以上の部分、特に地上の（収穫可能な）部分のバイオマスの増加（重量）、根のバイオマスの増加、又は他の収穫可能な部分のバイオマスの増加；（ｉｉ）種子の収量の増加（種子（種子重量）のバイオマスの増加により生じてもよいし、植物ごと又は個々の種子を基準とする種子重量の増加でもよいし、種子重量の増加が、種子の長さ及び／又は種子の幅及び／又は種子の面積などの種子の寸法が変化したことによるものでもよい）；（ｉｉｉ）（充実した(ｆｉｌｌｅｄ)）種子の数の増加；（ｖｉ）種子の大きさ（ｓｉｚｅ）の増加（種子の組成に影響があってもよい）；（ｖ）種子の体積（ｖｏｌｕｍｅ）の増加（種子の組成に影響があってもよい）；（ｖｉ）収穫指数の増加（全バイオマスにおける、種子などの収穫可能な部分の収量の比率として表される）；及び（ｖｉｉ）千粒重（ＴＫＷ）の増加（数えた充実した種子数及びその全重量から推定される）。千粒重の増加は、種子の大きさの増加及び種子の密度に由来してもよい。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態によれば、収量の増加には、上記（ｉｉ）〜（ｖｉｉ）の１つ以上に定義された種子レベルでの収量の増加が含まれる。
【００１２】
例えばトウモロコシでは、収量の増加は、以下の１つ以上により現すことができる：ヘクタール又はエーカーあたりの植物数の増加、植物あたりの穂（ｅａｒ）の数の増加、列の数の増加、列あたりの穀粒、穀粒重量、千粒重、穂の長さ／直径など。例えばイネでは、収量の増加は、以下の１つ以上により現すことができる：ヘクタール又はエーカーあたりの植物の数、植物当たりの穂首（ｐａｎｉｃｌｅ）の数、穂首あたりの小穂の数、穂首あたりの花の数、種子の充填率の増加、千粒重の増加など。また、収量の増加は構造の改変により起こりうるし、または構造の改変の結果として起こりうる。
【００１３】
好ましい特徴によれば、本発明の方法を行うことにより、対照の又は対応する野生型植物とそれぞれ比較して、少なくとも以下の１つにより現される、収量が増加した植物が得られる：地上に出ている面積の増加、ＴＫＷの増加、充実した種子の数の増加、種子重量の増加、及び収穫指数の増加。
【００１４】
本発明の方法を行うことにより、植物の収量増加に有利に導かれる。
【００１５】
本明細書において使用される用語「植物」は、植物全体、植物の原種及びその後代、及び植物部分を包含し、種子、芽、茎、葉、根（塊茎を含む）、及び植物細胞、組織及び器官を含み、これらのそれぞれは目的の遺伝子を含む。また、用語「植物」は、胚、分裂部位、配偶体、胞子体、花粉及び小胞子を包含し、これらのそれぞれは、目的の遺伝子を含む。本明細書で定義される用語「植物」は、懸濁培養物及びカルス組織を含まない。
【００１６】
本発明の方法はどの植物でも、特に、緑色植物（Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ）スーパーファミリーに属する全ての植物、具体的には以下の植物を含むリストから選択される、飼料または飼い葉用マメ科植物、観賞植物、食用作物、木または低木を含む、単子葉植物及び双子葉植物で行うことができる：アカシア（Ａｃａｃｉａ  ｓｐｐ．）、カエデ（Ａｃｅｒ  ｓｐｐ．）アクティニディア（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、トチノキ（Ａｅｓｃｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、アガチス・アウストラリス（Ａｇａｔｈｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ  ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリカラー（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ  ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、メリケンカルカヤ（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ  ｓｐｐ．）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｓｐｐ．）、アレカ・カテチュ（Ａｒｅｃａ  ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ  ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・シサー（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリジュガ（Ｂａｉｋｉａｅａ  ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ  ｓｐｐ．）、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｓｐｐ．）、ブルグイエラ・ジムノルヒザ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ  ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・アフリカーナ（Ｂｕｒｋｅａ  ａｆｒｉｃａｎａ）、ブテア・フロンドーサ（Ｂｕｔｅａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・ファリノーサ（Ｃａｄａｂａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）、ネムノキ（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ  ｓｐｐ．）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カンナ・インディカ（Ｃａｎｎａ  ｉｎｄｉｃａ）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、桂皮（Ｃａｓｓｉａ  ｓｐｐ．）、セントロエマ・プベスケンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ボケ（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ  ｓｐｐ．）、キンナモムム・カシア（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ）、コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）、コロフォスペルムム・モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｍｏｐａｎｅ）、コロニリア・バリア（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ  ｖａｒｉａ）、コトネアスター・セロティナ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）、クルタエグス（Ｃｒｔａｅｇｕｓ  ｓｐｐ．）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓｐｐ．）、クプレッサス（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｐｐ．）、サイアセア・デアルバータ（Ｃｙａｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、サイドニア・オブロンガ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、キンボポゴン（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ  ｓｐｐ．）、シンシア・ディアルバータ（Ｃｙｎｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、キドニア・オブロンガ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、ダルベルジア・モネタリア（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ  ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・ディバリカータ（Ｄａｖａｌｌｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、デスモディウム（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ディクソニア・スクアローサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ  ｓｑｕａｒｏｓａ）、ディヘテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄｉｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、ディオクレア（Ｄｉｏｃｌｅａ  ｓｐｐ．）、ドリコス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｓｐｐ．）、ドリクニウム・レクタム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ  ｒｅｃｔｕｍ）、エチノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、エラルティア（Ｅｈｒａｒｔｉａ  ｓｐｐ．）、エレウシン・コラカナ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、エラグレスティス（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ  ｓｐｐ．）、エリスリナ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｓｐｐ．）、ユーカリ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｐｐ．）、ユークレア・シンペリー（Ｅｕｃｌｅａ  ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビローサ（Ｅｕｌａｌｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ）、ファゴピルム（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ  ｓｐｐ．）、フェイジョア・セロウィアナ（Ｆｅｉｊｏａ  ｓｅｌｌｏｗｉａｎａ）、イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ｓｐｐ．）、フレミンジア（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ  ｓｐｐ．）、フレイシネチア・バンクシイ（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ  ｂａｎｋｓｉｉ）、ゲラニウム・ツンベルギイ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、ギンゴ・ビロバ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、グリシン・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシディア（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ  ｓｐｐ．）、ゴシピウム・ヒルスツム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ  ｓｐｐ．）、グイボウルティア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ  ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、ヘディサルム（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ  ｓｐｐ．）、ヘマルチア・アルティッシマ（Ｈｅｍａｒｔｈｉａ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントルツス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ）、ホルデウム・ブルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒパーレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ  ｒｕｆａ）、ヒペリクム・エレクツム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｅｒｅｃｔｕｍ）、ヒペルセリア・ディソルタ（Ｈｙｐｅｒｔｈｅｌｉａ  ｄｉｓｓｏｌｕｔａ）、インディゴ・インカルナータ（Ｉｎｄｉｇｏ  ｉｎｃａｒｎａｔａ）、アイリス（Ｉｒｉｓ  ｓｐｐ．）、レプタルレナ・ピロリフォリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ  ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、レスペディザ（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ  ｓｐｐ．）、レチュカ（Ｌｅｔｔｕｃａ  ｓｐｐ．）、レウカエナ・レウコセファラ（Ｌｅｕｃａｅｎａ  ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ロウデチア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネシイ（Ｌｏｔｏｎｕｓ  ｂａｉｎｅｓｉｉ）、ハス（Ｌｏｔｕｓ  ｓｐｐ．）、マクロチローマ・アキシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ  ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ（Ｍａｌｕｓ  ｓｐｐ．）、マニホット・エスクレンタ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、メディカゴ・サティバ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、メタセコイア・グリプトストロボイデス（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ  ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、ムサ・サピエンツム（Ｍｕｓａ  ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、ニコチアヌム（Ｎｉｃｏｔｉａｎｕｍ  ｓｐｐ．）、オノブリョチス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ  ｓｐｐ．）、オルニトプス（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ  ｓｐｐ．）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓｐｐ．）、ペルトフォルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ  ａｆｒ��ｃａｎｕｍ）、ペニセツム（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ  ｓｐｐ．）、ペルセア・グラテッシマ（Ｐｅｒｓｅａ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｓｐｐ．）、ファセオルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フェニックス・カナリエンシス（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、フォルミウム・クッキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ  ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、フォチニア（Ｐｈｏｔｉｎｉａ  ｓｐｐ．）、ピセア・グラウカ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）、ピヌス（Ｐｉｎｕｓ  ｓｐｐ．）ピスム・サティブム（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ  ｔｏｔａｒａ）ポゴナルスリア・フレッキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ  ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナルスリア・セクアルローサ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ  ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ハコヤナギ（Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｓｐｐ．）、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ  ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、シュードツガ・メンジエシイ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ  ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、パイラス・コミュニス（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、クエルクス（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ラフィオレプシス・アンベルラタ（Ｒｈａｐｈｉｏｌｅｐｓｉｓ  ｕｍｂｅｌｌａｔａ）、ロパロスチリス・サピダ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ  ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、リベス・グロッスラリア（Ｒｉｂｅｓ  ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ（Ｒｉｂｅｓ  ｓｐｐ．）、ロビニア・シュードアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ（Ｒｏｓａ  ｓｐｐ．）、キイチゴ（Ｒｕｂｕｓ  ｓｐｐ．）、ヤナギ（Ｓａｌｉｘ  ｓｐｐ．）、スキザクリウム・サングイネウム（Ｓｃｈｙｚａｃｈｙｒｉｕｍ  ｓａｎｇｕｉｎｅｕｍ）、スシアドピティス・ヴァティシラタ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア・セムペルビレンス（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアデンドロン・ギガンテウム（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、ソルガム・バイカラー（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｓｐｐ．）、スポロボルス・フィムブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ  ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ  ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサントス・フミリス（Ｓｔｙｌｏｓａｎｔｈｏｓ  ｈｕｍｉｌｉｓ）、タデハギ（Ｔａｄｅｈａｇｉ  ｓｐｐ．）、タキソディウム・ディスチクム（Ｔａｘｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、テメダ・トリアンドラ（Ｔｈｅｍｅｄａ  ｔｒｉａｎｄｒａ）、トリフォリウム（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ  ｓｐｐ．）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、ツガ・ヘテロフィラ（Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ビシア（Ｖｉｃｉａ  ｓｐｐ．）ビティス・ビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ  ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、ザンテデスキア・アエチオピカ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ  ａｅｔｈｉ��ｐｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アマランス、チョウセンアザミ、アスパラガス、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードの葉（ｃｏｌｌａｒｄ  ｇｒｅｅｎｓ）、亜麻、ケール、レンティル、ナタネ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、ダイズ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、スカッシュ、茶及び藻類など。本発明の特に好ましい実施形態によれば、植物は、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、ナタネ、綿、トマト、ジャガイモまたはタバコなどの農作物植物である。更に好ましくは、植物は、サトウキビなどの単子葉植物である。より好ましくは植物は、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ミレット、ライムギ、ソルガムまたはオートムギなどの穀物である。
【００１７】
用語「Ｄ型ＣＤＫ」または「ＣＤＫＤ」は、本明細書において交換可能に使用され、また、図１に示されるようなＣＤＫの系統樹の作成に使用される場合、Ｄ型ＣＤＫを含むがＡ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型またはＦ型のＣＤＫなどの他のＣＤＫタイプを含まないグループ内か又はその周辺に群をなすアミノ酸配列を指す。本明細書において、ＣＤＫＤをコードする核酸について言及することは、上記に定義したＣＤＫＤアミノ酸をコードする核酸に言及することである。
【００１８】
当業者であれば、デフォルト・パラメータを使うＧＣＧ、ＥＢＩまたはＣＬＵＳＴＡＬパッケージなどの、前記の如き系統樹を作成するための公知技術及びソフトウエアを使って、問題のアミノ酸配列が上述の定義の範囲内にあるかどうかを容易に決定できる。このような系統樹を構築するときに、Ｄ型ＣＤＫグループ内か又はその周辺に群をなす配列は、Ｄ型ＣＤＫの定義の範囲内にあると考えられる。このような配列をコードする核酸は、本発明の方法を行うのに有用である。
【００１９】
一般的に、Ｄ型ＣＤＫは、ＣＤＫをリン酸化し、活性化する能力があり、またＲＮＡポリメラーゼＩＩをリン酸化し、活性化することが示されている。また、Ｄ型ＣＤＫは以下の１つ以上の特徴、好ましくは全ての特徴を示してもよい：（ｉ）ＮＸＴＡＬＲＥモチーフ（Ｘは任意のアミノ酸である）；（ｉｉ）触媒キナーゼドメイン；及び（ｉｉｉ）サイクリンＨと結合する能力。
【００２０】
ＣＤＫＤは容易に他のＣＤＫと区別することができ、それは（現在の知識によれば）モチーフＮＸＴＡＬＲＥがこのタイプのＣＤＫに特有であるからである。対照的に、現在の知識によれば、Ａ型ＣＤＫはＰＳＴＡＩＲＥモチーフ、Ｂ型ＣＤＫはＰ（Ｐ／Ｓ）Ｔ（Ａ／Ｔ）（Ｌ／Ｍ）ＲＥモチーフ、Ｃ型ＣＤＫはＰＩＴＡＩＲＥモチーフを有し、Ｅ型ＣＤＫはＳＰＴＡＲＥモチーフを有し、Ｆ型ＣＤＫはＸＳＡＸＲＥモチーフを有する。
【００２１】
当業者であれば、例えばヒトＣＡＫ２などの精製された基質またはシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のＲＮＡポリメラーゼＩＩカルボキシ末端でのキナーゼ活性についてのアッセイを容易に行うことができる。サイクリンＨに結合するＣＤＫＤの能力は、精製されたＣＤＫＤ及びサイクリンＨから、ＣＤＫＤ−サイクリンＨ複合体を共沈することにより、または２つのハイブリッドアッセイを用いて容易に測定することができる。
【００２２】
シロイヌナズナでは、ＣＤＫＤは３つの異なる遺伝子、即ちＣＤＫＤ；１、ＣＤＫＤ；２及びＣＤＫＤ；３によりコードされ、各遺伝子はモチーフＮＸＴＡＬＲＥ（Ｘは任意のアミノ酸）を含むタンパク質をコードする。
【００２３】
本発明の方法は、上に定義されたＣＤＫＤをコードする核酸を使って有利に行うことができる。ＣＤＫＤをコードする核酸を植物へ導入することにより、植物におけるそのような核酸の発現が調節され（好ましくは発現の増加）、及び／又は活性が調節され（好ましくは増加）、及び／又は植物におけるＣＤＫＤポリペプチドの植物におけるレベルが調節される。ＣＤＫＤの活性はそのポリペプチドのレベルを上げることにより向上させることができる。あるいは、ＣＤＫＤポリペプチドのレベルに変化がない場合またはＣＤＫＤポリペプチドのレベルが減少した場合でさえ、活性を上げることができる。これは、例えば、野生型のポリペプチドよりも活性の高い突然変異体型を作製することによってポリペプチドの固有特性が変化した場合に起こりうる。
【００２４】
ＣＤＫＤをコードする核酸は、好ましくは、植物で過剰発現するための構成的プロモーターと機能的に結合される。構成的プロモーターは、好ましくはＧＯＳ２プロモーターであり、更に好ましくはイネ由来のＧＯＳ２プロモーターである。本発明の適用は、シロイヌナズナ由来のＣＤＫＤの使用に限定されないこと、又は配列番号１で表されるＣＤＫＤに限定されないこと、またＧＯＳ２プロモーターにより作動される場合、ＣＤＫＤをコードする核酸の発現にも本発明の適用は限定されないことを明確にしておく。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、ＣＤＫＤ核酸の発現が強化され又は増加することが認められる。遺伝子発現または遺伝子産物を強化または増加させる方法は、当該技術分野で十分に記載されており、例えば強力なプロモーターにより作動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。
【００２６】
ＣＤＫＤをコードする核酸はどんな源に由来するものでもよい。ＣＤＫＤをコードする核酸／遺伝子は、細菌、酵母または菌類などの微生物源、または植物、藻類または動物（ヒトを含む）源から単離してもよい。この核酸は、その天然の形から改変されて、組成物及び／又は人為的な操作を介したゲノム環境に存在してもよい。核酸は、好ましくは相同な核酸であり、即ち導入される植物種と同じ植物種から得られた核酸でもよいし、異なる植物種から得られた核酸でもよい。核酸は双子葉植物種、好ましくはアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、より好ましくはシロイヌナズナから単離される。より好ましくは、シロイヌナズナから単離されたＣＤＫＤをコードする核酸は、ＣＤＫＤ；１、ＣＤＫＤ；２またはＣＤＫＤ；３である。最も好ましくは、ＣＤＫＤはシロイヌナズナ由来のＣＤＫＤ；１であり、特に、配列番号１で表される核酸配列及び配列番号２で表される対応するアミノ酸配列である。
【００２７】
有利なことに、本発明の実施は、配列番号１で表されるシロイヌナズナ由来のＣＤＫＤ；１の使用に限定されない。また、本発明による方法は、上で定義されたＣＤＫＤの機能的変異体を使用して又はＣＤＫＤをコードする核酸の機能的変異体を使用して行うことができる。好ましい機能的変異体は、配列番号１で表される核酸配列の変異体又は配列番号２で表されるアミノ酸配列の機能的変異体である。
【００２８】
本明細書において定義される用語「機能的変異体」は、上に定義されたＣＤＫＤの定義に該当する変異体である。また、好ましくは、機能的変異体はＣＤＫをリン酸化し、活性化する能力及びＲＮＡポリメラーゼＩＩをリン酸化し、活性化する能力を有する。また、好ましくは、Ｄ型ＣＤＫの機能的変異体は、以下の特徴を１つ以上、好ましくは全てを示す：（ｉ）ＮＸＴＡＬＲＥモチーフ（Ｘは任意のアミノ酸である）；（ｉｉ）触媒キナーゼドメイン；及び（ｉｉｉ）サイクリンＨと結合する能力。また当業者であれば、特定の変異体が機能的であるかどうか（植物の収量を上げることができるかどうかという意味）、機能をテストするために、後述の実施例のセクションで説明する配列を、その変異体と単に置換することにより、容易に決定することができる。
【００２９】
本発明による方法を行うのに有用な核酸及びアミノ酸配列の適切な変異体には、
（ｉ）ＣＤＫＤをコードする核酸の機能的部分、
（ｉｉ）ＣＤＫＤをコードする核酸とハイブリダイズできる配列、
（ｉｉｉ）ＣＤＫＤをコードする核酸の選択的スプライス変異体、
（ｉｖ）ＣＤＫＤをコードする核酸の対立遺伝子変異体、及び
（ｖ）ＣＤＫＤアミノ酸のホモログ、誘導体及び活性フラグメント、
が含まれる。
【００３０】
前述した各変異体は、上に定義した機能的変異体である。
【００３１】
完全長のＣＤＫＤをコードするＤＮＡ配列の使用は、本発明による方法を行うための必要条件ではないことは、当業者に明らかであろう。本発明による方法は、ＣＤＫＤをコードするＤＮＡ／核酸の機能的部分、好ましくは配列番号１で表される核酸配列の機能的部分を使って有利に行うことができる。機能的部分は上で定義された機能的変異体の定義に該当するＣＤＫＤをコードする核酸である。部分は、当該技術分野で周知の技術を使って、配列番号１の核酸配列などのＣＤＫＤをコードする核酸に１つ以上の欠失を作ることにより調製できる。
【００３２】
従って本発明によれば、ＣＤＫＤをコードする核酸の一部を植物に導入することを含む、植物の収量、特に種子の収量を増加する方法が提供される。
【００３３】
別の変異体は、ＣＤＫＤをコードする核酸とハイブリダイズできる配列である。このようなハイブリダイズする配列は、上で定義された機能的変異体の定義に該当する配列である。特に好ましくは、ストリンジェントな条件下でＣＤＫＤをコードする核酸と、特に配列番号１で表されるＣＤＫＤをコードする核酸とハイブリダイズできる配列である。
【００３４】
本明細書で定義される用語「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同の相補的なヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。ハイブリダイゼーションのプロセスは完全に溶液中で起こすことができる、即ち双方の相補的核酸は溶液中に存在する。このようなプロセスが依拠する分子生物学のツールとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；及びそれに基づく全ての方法）、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ランダムプライマー伸長、ヌクレアーゼＳ１マッピング、プライマー伸長、逆転写、ｃＤＮＡ合成、ＲＮＡのディファレンシャル・ディスプレイ、ＤＮＡ配列決定が挙げられる。また、ハイブリダイゼーションのプロセスは、磁性ビーズ、セファロースビーズまたは他のレジンなどのマトリックスに固定化される相補的な核酸の１つを用いて起こすことができる。このようなプロセスが依拠する分子生物学のツールとして、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡの単離が挙げられる。更に、ハイブリダイゼーションのプロセスは、ニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体に固定化された、あるいは例えばフォトリソグラフィーにより、例えば石英質ガラス支持体に固定化された相補的な核酸（後者は核酸アレイ、またはマイクロアレイとして、あるいは核酸チップとして知られる）の１つを用いて起こすことができる。このようなプロセスが依拠する分子生物学のツールは、ＲＮＡ及びＤＮＡゲルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びマイクロアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーションが起こるようにするため、一般的に、核酸分子は、熱的にまたは化学的に変性されて、２重鎖を２つの１本鎖に融解され及び／又はヘアピンまたは他の２次構造が１本鎖の核酸から除去される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、塩濃度、及びハイブリダイゼーションバッファー組成などの条件によって影響される。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で起こる。ストリンジェントな条件として、（１）洗浄を低イオン強度及び高温で行う条件、例えば０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（７％ＳＤＳ、ｐＨ８．０）、６５℃または５５℃、または（２）ハイブリダイゼーションにホルムアミドなどの変性剤を用いる条件、例えば、５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド（０．１％仔牛血清アルブミン）、０．１％フィコール、０．１％ポリビニルポリピロリドン、０．０５Ｍリン酸ナトリウムバッファー（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．５）、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム、４２℃、である。具体例として、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｎｍ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ及び１０％硫酸デキストラン、５５℃での使用、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ、５５℃での洗浄、が挙げられる。当業者であれば、はっきりとした検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るため、適切に、ストリ���ジェンシーな条件を容易に決定し変更することができる。
【００３５】
従って、本発明によれば、好ましくはストリンジェントな条件下で、ＣＤＫＤをコードする核酸とハイブリダイズできる配列を植物に導入することを含む、植物の収量を増加する方法が提供される。
【００３６】
本発明の方法に有用な別の変異体は、ＣＤＫＤをコードする核酸の選択的スプライス変異体である。適切なスプライス変異体は上に定義された機能的変異体の定義に該当する変異体である。本明細書で使用される用語「選択的スプライス変異体」は、選択されたイントロン及び／又はエキソンが切除され、置換されまたは付加された核酸の変異体を包含する。このような変異体は、おそらくタンパク質の生物学的活性が影響を受けていない変異体であり、このような影響を受けないことは、タンパク質の機能的セグメントを選択的に保持することにより達成することができる。このようなスプライス変異体は天然に見出すことができ、または人為的に作れる。このようなスプライス変異体を作製する方法は当該技術分野において周知である。配列番号１のスプライス変異体は、本発明による方法に使用するのに特に好ましい。
【００３７】
従って、本発明はまた、ＣＤＫＤをコードする核酸の選択的スプライス変異体を植物に導入することを含む、植物の収量を増加する方法を提供する。
【００３８】
本発明の方法に有用な別の変異体は、ＣＤＫＤをコードする核酸の対立遺伝子変異体である。適切な対立遺伝子変異体は、上に定義された機能的変異体の定義に該当する変異体である。対立遺伝子変異体は天然に存在し、これらの天然の対立遺伝子の使用は本発明の方法に包含される。対立遺伝子変異体は、小さい挿入／欠失多型（ＩＮＤＥＬ）だけでなく一塩基多型（ＳＮＰ）も包含する。ＩＮＤＥＬのサイズは通常１００ｂｐ以下である。ＳＮＰ及びＩＮＤＥＬは、ほとんどの生物の天然の多型性株において、最大組の配列変異体を形成する。配列番号１の対立遺伝子変異体は、本発明による方法に使用するのに特に好ましい。
【００３９】
従って、本発明はまた、ＣＤＫＤをコードする核酸の対立遺伝子変異体を植物に導入することを含む、植物の収量を増加する方法を提供する。
【００４０】
また更に有利には、本発明による方法は、ＣＤＫＤのホモログ、誘導体又は活性なフラグメントを使って行うことができる。例えば配列番号２で表される、アミノ酸のホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸は、当業者に周知の日常的な技術を使って容易に決定することができる。本発明の方法の使用に適切なこのような核酸は、前述のように容易に決定することができる。
【００４１】
タンパク質の「ホモログ」は、問題の未改変のタンパク質に対して、アミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を有し、該ホモログが由来する未改変のタンパク質と同様の生物学的及び機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。このようなホモログを作製するため、タンパク質のアミノ酸を、類似の性質（例えばα−らせん構造またはβ−シート構造を形成するかまたは壊す、類似の疎水性、親水性、抗原性、性向）を持つ他のアミノ酸と置換することができる。保存的置換の表は当該技術分野で周知である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ  （１９８４）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。
【００４２】
本発明による方法に有用なホモログは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、好適な順に増加して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有する。ＣＤＫＤは互いに約６５％の同一性を示し、他のＣＤＫと４０％以下の同一性を示す。従って、配列番号２によって表されるＣＤＫと少なくとも５０％の同一性を有するホモログは、Ｄ型ＣＤＫ以外の他のＣＤＫを包含しない。
【００４３】
また、用語「ホモログ」には、２つの特別な相同性形態が包含され、それらの形態はオーソロガス配列及びパラロガス配列を含み、それらの配列は遺伝子の先祖の関係を説明するのに使用される進化概念を包含する。用語「パラロガス」は、パラロガス遺伝子に導く種のゲノム内にある遺伝子の重複に関する。用語「オーソロガス」は、先祖の関係に起因する異なる生物の相同な遺伝子に関する。
【００４４】
例えば、単子葉植物種におけるオーソロガスは、いわゆる相互にブラストサーチを行うことにより容易に見つけることができる。これは、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで見ることができる、公開され入手可能なＮＣＢＩデータベースなどの配列データベースに対して、問題の配列（例えば配列番号１または配列番号２）をブラストすることを含む最初のブラストにより行うことができる。もしイネのオーソロガスを探すとすれば、問題の配列を、例えばＮＣＢＩで入手可能なイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）の日本晴の２８，４６９の完全長ｃＤＮＡクローンに対してブラストする。ＢＬＡＳＴｎはヌクレオチドから開始する場合、またはＴＢＬＡＳＴＸはタンパク質から開始する場合に使用でき、スタンダードデフォルト値（エクスペクテーション１０、アラインメント５０）を用いる。ブラスト結果をフィルターにかけてもよい。そして、フィルターにかけた結果またはフィルターにかけていない結果のいずれかの完全長配列を、問題の配列（配列番号１または２）に対してブラストに戻す（すなわち、２回目のブラストを行う）。次に、１回目及び２回目のブラストの結果を比較する。大ファミリーの場合、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、クラスター化の視覚化に役立つ近縁関係結合樹(ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｔｒｅｅ)を作成する。
【００４５】
ホモログはタンパク質の「置換変異体」の形態でもよく、即ち、アミノ酸配列の少なくとも１つの残基が除去されて、その場所に異なる残基が挿入される。アミノ酸置換は典型的に１つの残基の置換であるが、ポリペプチド上にある機能的な制約に応じて群集化していてもよい；挿入は通常、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり、欠失は約１〜２０残基の範囲である。好ましくは、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換を含む。
【００４６】
また、ホモログはタンパク質の「挿入変異体」の形態、即ち、１つ以上のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されていてもよい。挿入は、単一又は複数のアミノ酸の配列内挿入だけでなく、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端融合も含んでもよい。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ−またはカルボキシ−末端融合よりも小さく、約１〜１０残基のオーダーである。アミノ−またはカルボキシ−末端融合タンパク質又はペプチドの例として、酵母ツーハイブリッドシステムに使用される転写活性化因子の結合ドメイン又は活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、プロテインＡ、マルトース−結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、タグ−１００エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン−結合タンパク質）、ＨＡエピトープ、プロテインＣエピトープ及びＶＳＶエピトープが挙げられる。
【００４７】
タンパク質の「欠失変異体」の形態のホモログは、タンパク質から１つ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。
【００４８】
タンパク質のアミノ酸変異体は、当該技術分野で周知のペプチド合成技術、例えば固相ペプチド合成などを使って、または組換えＤＮＡ操作により、容易に作製できる。タンパク質の置換、挿入または欠失変異体を作るためのＤＮＡ配列の操作の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、ＤＮＡの所定の部位に置換突然変異を作る技術は当業者に周知であり、Ｍ１３突然変異誘発法、Ｔ７−Ｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法（ＵＳＢ，  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  ＯＨ）、クイックチェンジ部位特異的突然変異誘発法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）、ＰＣＲ−仲介部位特異的突然変異誘発法または他の部位特異的突然変異プロトコルが挙げられる。
【００４９】
「誘導体」として、例えば配列番号２で表される天然型タンパク質のアミノ酸配列と比較して、天然及び非天然アミノ酸残基の置換、欠失または付加を含む、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素が挙げられる。タンパク質の「誘導体」は、天然型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、天然の、変化された、グリコシル化された、アシル化された、又は非天然の、アミノ酸残基を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質及び酵素を包含する。また、誘導体は、その誘導体に由来するアミノ酸配列と比較して１つ以上の非アミノ酸置換を含んでもよく、例えば、アミノ酸配列と共有結合的に又は非共有結合的に結合したレポーター分子又は他のリガンド、例えば結合してその検出を容易にするレポーター分子、及び天然タンパク質のアミノ酸配列に比較して非天然のアミノ酸残基を含んでもよい。
【００５０】
ＣＤＫＤタンパク質の「活性フラグメント」は、系統樹（例えば図１に示される系統樹）を構築するとＤ型ＣＤＫグループ内またはその周辺に群集化するのに十分なアミノ酸残基を含む。このような系統樹にフラグメントを用いる場合、似たものと似たものを比較すべきであり、つまり他のＣＤＫの対応するフラグメントを、系統樹を作成するのに使用すべきであるという意味である。
【００５１】
ＣＤＫＤホモログの検索及び同定の方法は十分に当業者の範囲内にある。比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野で周知であり、そのような方法として、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡが挙げられる。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３−４５３，  １９７０）のアルゴリズムを使用し、マッチする数を最大にし、ギャップの数を最小にする２つの完全な配列のアラインメントを見つける。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは配列の同一性のパーセントを計算し、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う。ＢＬＡＳＴ分析を行うソフトウエアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公開され入手可能である。本発明の方法に使用するのに適切なホモログ、すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するホモログは、デフォルトパラメーター使用のＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１ソフトウエアを使って完全長ＣＤＫタンパク質配列を取得し、それを整列比較することにより、同定できる。そして距離行列は、ＢＯＸＳＨＡＤＥソフトウエアを使って、再びデフォルトパラメーターを使って、このアラインメントから計算できる。双方のソフトウエアプログラムは公開され入手可能である。
【００５２】
従って、本発明は、配列番号２で表されるＣＤＫＤなどの、ＣＤＫＤのホモログ、誘導体または活性フラグメントをコードする核酸を植物に導入することを含む、植物の収量を増加する方法も提供し、ホモログ、誘導体又は活性フラグメントは、配列番号２で表されるアミノ酸配列に対して、好適な順に増加して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有する。
【００５３】
また本発明は、本発明による方法に有用なヌクレオチド配列の導入及び／又は発現を容易にする遺伝子構築物及びベクターを提供する。
【００５４】
従って、
（ｉ）好ましくは配列番号１で表される、ＣＤＫＤをコードする核酸、またはその機能的変異体（上記に定義される）
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列の発現を作動できる１つ以上の制御配列；及び任意に、
（ｉｉｉ）転写終結配列、
を含む遺伝子構築物が提供される。
【００５５】
本発明による方法に有用な構築物は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。市販された、植物に形質転換するのに適切で、形質転換された細胞で目的の遺伝子を発現させるのに適切なベクターに、遺伝子構築物を挿入することができる。
【００５６】
植物は、目的の配列（すなわち、配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体（上記に定義される））を含むベクターで形質転換される。目的の配列は、１つ以上の制御配列と（少なくともプロモーターと）機能的に結合される。用語「調節要素」、「制御配列」及び「プロモーター」は本明細書においてすべて交換可能に用いられ、連結された配列の発現を行うことが可能な調節核酸配列を指す広い意味で取られるべきである。前述の用語に包含されるのは、古典的な真核生物のゲノム遺伝子由来の転写調節配列（ＣＣＡＡＴボックス配列の有無にかかわらず、正確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスを含む）、及び発生的及び／又は外的刺激に対する応答で、或いは組織特異的な方法で遺伝子の発現を変化させる、更なる調節要素（即ち、上流活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）である。また上記用語に含まれるのは、古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列であり、その場合、−３５ボックス配列及び／又は−１０ボックス転写調節配列を含んでもよい。また、用語「調節要素」は、細胞、組織または器官で核酸分子を発現させ、発現を活性化または増強する合成融合分子または誘導体を包含する。本明細書で使用される用語「機能的に結合された」は、プロモーター配列及び目的の遺伝子の間の機能的な結合をいい、それによりプロモーター配列は目的の遺伝子の転写を開始することができる。
【００５７】
好ましくは、ＣＤＫＤをコードする核酸またはその機能的な変異体は構成的プロモーターと機能的に結合される。本明細書で定義される用語「構成的プロモーター」は、少なくとも１つの組織又は器官において植物のライフサイクルのどのステージでも優先的に発現されるプロモーターをいう。好ましくは、構成的プロモーターは植物の全体にわたって優先的に発現される。好ましくは、構成的プロモーターはイネのＧＯＳ２プロモーターである。
【００５８】
本発明の方法に使用するのに適切な他の構成的プロモーターの例を以下の表Ａに列挙する。
【００５９】
2007525229.tif 000002
また任意に、１つ以上のターミネーター配列を、植物に導入された構築物に使用してもよい。用語「ターミネーター」は、一次転写産物の３’プロセシング及びポリアデニル化、並びに転写の終結を示唆する、転写単位の末端のＤＮＡ配列である制御配列を包含する。更なる調節要素は、翻訳エンハンサーだけでなく転写エンハンサーも含んでもよい。当業者であれば、本発明の実施で使用するのに適切でありうるターミネーター及びエンハンサー配列を認識しているであろう。このような配列は当業者に知られており、または容易に得ることができるであろう。
【００６０】
更に、本発明の遺伝子構築物は、特定の細胞タイプにおいて維持及び／又は複製に必要な、複製配列の開始点を含んでもよい。１つの例は、遺伝子構築物がエピソームの遺伝子要素（例えばプラスミドまたはコスミド分子）として細菌細胞に維持されることが必要とされる場合である。複製の好ましい開始点は、ｆ１−ｏｒｉ及びｃｏｌＥ１であるが、これに限定されない。
【００６１】
遺伝子構築物は、任意に、選択マーカー遺伝子を含んでもよい。本明細書で使用される用語「選択マーカー遺伝子」として、本発明の核酸構築物でトランスフェクトされた、或いは形質転換された細胞の同定及び／又は選択を容易にするように発現される、細胞の表現型を与える遺伝子が挙げられる。適切なマーカーは、抗生物質に対する抵抗性または除草剤抵抗性を与えるマーカーから選択することができる。従って、組換えＤＮＡを含む細胞は、形質転換されていない細胞を殺す抗生物質または除草剤濃度の存在下で生存することができるであろう。選択マーカー遺伝子の例として、除草剤Ｂａｓｔａに対する抵抗性を与えるｂａｒ遺伝子、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を与えるｎｐｔ遺伝子、ハイグロマイシン耐性を与えるｈｐｔ遺伝子が挙げられる。また、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、１９９７）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはルシフェラーゼなどの可視マーカーも選択マーカーとして使用できる。適切な選択マーカー遺伝子の更なる例として、特に、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）、テトラサイクリン耐性遺伝子（Ｔｃｒ）、細菌カナマイシン耐性遺伝子（Ｋａｎｒ）、フォスフィノスリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔII）、ハイグロマイシン耐性遺伝子、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子などが挙げられる。
【００６２】
また本発明は、本発明による方法で得ることができる植物を包含する。従って本発明は、本発明による方法で得ることができる植物を提供し、植物は収量が増加し、ＣＤＫＤタンパク質活性及び／又はレベルが変わり、及び／又は対応する野生型植物と比較してＣＤＫＤタンパク質をコードする核酸の発現が変わる。
【００６３】
また本発明は、ＣＤＫＤをコードする核酸またはその機能的変異体（上に定義される）の植物への導入と発現を含む、収量の増加した形質転換植物を作出する方法を提供する。
【００６４】
より具体的には、本発明は、収量が増加する形質転換植物を作出する方法を提供し、
（ｉ）ＣＤＫＤをコードする核酸またはその機能的変異体（上に定義される）を植物または植物細胞に導入すること、
（ｉｉ）再生及び成熟した植物の成長を促進する条件下で植物細胞を培養すること、
を含む。
【００６５】
核酸は、植物細胞または植物自体に直接導入してもよい（組織、器官または植物の他の部分への導入を含む）。本発明の好ましい特徴によれば、核酸は形質転換により植物に好ましく導入される。
【００６６】
本明細書で言及される用語「形質転換」は、宿主細胞に外来性のポリヌクレオチドの移入を包含し、移入に用いられる方法によらない。次のクローン増殖（器官形成又は胚形成のいずれによってもよい）が可能な植物組織は、本発明の遺伝子構築物で形質転換され、それから完全な植物体を再生できる。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種に用いることができ、その種にもっとも適したクローン増殖システムに応じて、変わるであろう。例えば標的となる組織には、葉片、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、現存の分裂組織（たとえば頂端分裂組織、腋芽分裂組織及び根分裂組織）及び誘発された分裂組織（たとえば子葉分裂組織及び胚軸分裂組織）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞に一時的に又は安定して導入することができ、例えばプラスミドとして、非統合的に維持され得る。あるいは、宿主ゲノムに統合されてもよい。得られた形質転換された植物細胞は、次に、当業者に公知の方法で形質転換植物に再生するのに使用することができる。
【００６７】
植物種の形質転換は、今や完全に日常的な技術である。幾つかの形質転換の方法のいずれも、適切な始祖細胞に目的の遺伝子を導入するのに有利に使用できる。形質転換の方法として、リポソームの使用、エレクトロポレーション、遊離ＤＮＡの取り込みを増やす化学物質、植物への直接のＤＮＡ注入、パーティクルガンボンバードメント、ウイルスまたは花粉を使った形質転換、及びマイクロプロジェクションが挙げられる。方法は、プロトプラストのカルシウム／ポリエチレングリコール方法（Ｋｒｅｎｓ，  Ｆ．Ａ．ら、１８８２，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９６，  ７２−７４；  Ｎｅｇｒｕｔｉｕ  Ｉ．ら、１９８７，６月、  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８，  ３６３−３７３）；プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  Ｒ．Ｄ．ら、１９８５  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ  ３，  １０９９−１１０２）；植物材料へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  Ａ．ら、１９８６，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２０２，  １７９−１８５）；ＤＮＡまたはＲＮＡコートパーティクルボンバードメント（Ｋｌｅｉｎ  Ｔ．Ｍ．ら、  １９８７，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，  ７０）；（非組み込み）ウイルスの感染などから選択してもよい。ＣＤＫＤをコードする核酸を発現する形質転換イネ植物は、好ましくは、例えば以下のいずれかに説明される、イネの形質転換の周知の方法のいずれかを用いて、アグロバクテリウムを介した形質転換を経由して作出される：公開欧州特許出願  ＥＰ  １１９８９８５  Ａ１、Ａｌｄｅｍｉｔａ及びＨｏｄｇｅｓ  （Ｐｌａｎｔａ，  １９９，  ６１２−６１７，  １９９６）；  Ｃｈａｎら、（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２  （３）  ４９１−５０６，  １９９３）、Ｈｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．  ６  （２）  ２７１−２８２，  １９９４）（これらの開示は、あたかも完全に記載されていたかのように本明細書に参照により組み込まれる）。
【００６８】
一般的に形質転換後は、植物細胞または細胞の分類は、目的の遺伝子と同時に移入された、植物で発現可能な遺伝子によりコードされる１つ以上のマーカーの存在について選択され、続いて形質転換された材料は、完全な植物体に再生される。
【００６９】
ＤＮＡの移入及び再生に続いて、推定的に形質転換された植物を、例えばサザン法を使って、目的の遺伝子の存在、コピー数及び／又はゲノム組織について評価することができる。それとは別に又は追加して、新たに導入されたＤＮＡの発現レベルをノザン及び／又はウエスタン分析を使ってモニターすることができ、これらの技術はともに当業者に周知である。
【００７０】
作出された形質転換植物は、クローン増殖または古典的な育種方法などの様々な方法により増殖することができる。例えば、第１世代（またはＴ１）の形質転換植物は自家受粉して、均一の第２世代（またはＴ２）形質転換体を作り、Ｔ２植物は更に古典的な育種技術によって増やすことができる。
【００７１】
作出された形質転換生物は様々な形態を取り得る。例えば形質転換細胞及び非形質転換細胞のキメラ；クローン形質転換体（例えば発現カセットを含むように形質転換された全ての細胞）；形質転換及び非形質転換された組織の移植片（例えば植物において、形質転換されていない接ぎ穂と接ぎ木された台木）であり得る。
【００７２】
本発明は、明らかに、植物細胞または本明細書で説明された方法のいずれかで作出された植物、及び全ての植物部分、その栄養繁殖体まで拡張される。本発明は更に、上述の方法のいずれかで作出された、最初に形質転換又はトランスフェクトされた細胞、組織、器官または全植物体の後代を包含するよう拡張されるが、ただ必要なのは、後代が、本発明の方法により親で作られた特徴と同じ遺伝子型及び／又は表現型の特徴を示すことである。また、本発明は、単離されたＣＤＫＤをコードする核酸を含む宿主細胞を含む。本発明による好ましい宿主細胞は植物細胞である。また本発明は、種子、葉、果実、花、根茎、塊茎、及び鱗茎などの植物の収穫可能な部分に拡張されるが、これらに限定されない。
【００７３】
また本発明はＣＤＫＤをコードする核酸の使用及びＣＤＫＤポリペプチドの使用を包含する。
【００７４】
もちろんこのような使用は、植物の収量の増加、特に種子の収量の増加におけるＣＤＫＤの使用に関する。種子の収量は、以下の１つ以上：充実した種子の数の増加、種子重量の増加、収穫指数の増加及びＴＫＷの増加を含めることができる。ＣＤＫＤは配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体（上で定義される）でもよく、またはＣＤＫＤは配列番号２で表されるアミノ酸またはその機能的変異体（上で定義される）でもよい。
【００７５】
また、ＣＫＤＫをコードする核酸及びＣＤＫＤポリペプチドは、育種計画に使用することも考えられる。ＣＤＫＤは配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体（上に定義される）でもよく、またはＣＤＫＤは配列番号２で表されるアミノ酸またはその機能的変異体（上に定義される）でもよい。例えば、ＣＤＫＤをコードする核酸またはその機能的変異体は、好ましくは１つ以上の関連するファミリーメンバーと一緒に染色体（またはその一部）上に存在してもよい。このような育種計画の例では、ＣＤＫＤタンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸と遺伝子的に結合できるＤＮＡマーカーが同定される。そしてそのＤＮＡマーカーを、育種計画で収量の増加した植物を選択するのに使用することができる。
【００７６】
また、ＣＤＫＤの対立遺伝子変異体は、マーカーを補助に用いる育種などの、従来の育種計画にも使用できる。このような育種計画は、時々、植物の変異誘発処理による植物への対立遺伝子変異の導入を必要とする。１つの適切な変異誘発方法はＥＭＳ突然変異誘発法である。そして、例えばＰＣＲにより対立遺伝子変異体の同定を行う。この後、問題の配列の、植物の収量を増加する優れた対立遺伝子変異体を選択するための選択工程が続く。一般的に選択は、問題の配列の異なる対立遺伝子変異体、例えば配列番号１の異なる対立遺伝子変異体を含む植物の収量をモニタリングすることによって行われる。収量のモニタリングは、温室または農場で行うことができる。更に、任意の工程として、優れた対立遺伝子変異体が同定された植物と別の植物との交配が挙げられる。これは、例えば目的の表現型特性を組み合わせるのに使用できよう。
【００７７】
また、ＣＤＫＤをコードする核酸及びＣＤＫＤポリペプチドは成長調節剤として使用することが考えられる。ＣＤＫＤは配列番号１で表される核酸またはその機能的変異体（上で定義される）でもよく、またはＣＤＫＤは配列番号２で表されるアミノ酸またはその機能的変異体（上で定義される）でもよい。これらのＣＤＫＤは植物の収量の増加に有用であるので、ＣＤＫＤは有用な成長調節剤、例えば除草剤または成長刺激剤などになるだろう。従って、本発明は、成長調節剤として使用するため、ＣＤＫＤを適切な担体、希釈剤または賦形剤と一緒に含む組成物を提供する。
【００７８】
また、本発明による方法は、ＣＤＫＤをコードする核酸を植物に導入することなく行うこともできる。これは、（好ましくはＣＤＫＤをコードする遺伝子の遺伝子座に）遺伝子改変を導入することにより行うことができる。本明細書で定義される遺伝子座は、目的の遺伝子とコード領域の１０ＫＢ上流または下流を含むゲノム領域を意味する。
【００７９】
遺伝子改変は、例えば以下の方法の１つ（あるいは複数）で導入することができる：Ｔ−ＤＮＡ活性化、ティリング（ｔｉｌｌｉｎｇ）法、部位特異的突然変異誘発法、相同的組換え、または上記で論じた植物（細胞）でのＣＤＫＤをコードする核酸の導入と発現。
【００８０】
Ｔ−ＤＮＡアクチベーションタギング（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９２）  １３５０−１３５３）は、プロモーターが標的遺伝子の発現を指令するような配置で、目的の遺伝子または遺伝子のコード領域の１０ＫＢ上流または下流のゲノム領域に、プロモーターを通常含んでいるＴ−ＤＮＡ（翻訳エンハンサーまたはイントロンを含んでもよい）を挿入することを含む。一般的に、天然にあるプロモーターによる標的遺伝子の調節は破壊されて、遺伝子は新しく導入されたプロモーターの制御の支配下に入る。一般的に、プロモーターはＴ−ＤＮＡに組み込まれる。このＴ−ＤＮＡは例えばアグロバクテリウム感染を介して植物ゲノムにランダムに挿入され、挿入されたＴ−ＤＮＡに近い遺伝子の過剰発現を誘導する。作出された形質転換植物は、導入されたプロモーターに近い遺伝子の過剰発現のために、優性の表現型を示す。導入されるプロモーターは、所望の生物、この場合植物で、遺伝子の発現を指令できるプロモーターであればよい。例えば、構成的プロモーター、組織に好適なプロモーター、細胞タイプに好適なプロモーター及び誘導性プロモーターは、Ｔ−ＤＮＡ活性化に使用するのに全て適している。
【００８１】
また、遺伝子改変は、ＴＩＬＬＩＮＧ法（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）の技術を使って、ＣＤＫＤをコードする核酸／遺伝子の遺伝子座に導入することもできる。これは、ＣＤＫＤの生物学的活性を示すことができるＣＤＫＤをコードする核酸を突然変異させた変異体を、生成及び／又は同定し、最終的に単離するのに有用な突然変異誘発技術である。また、ＴＩＬＬＩＮＧ法はこのような突然変異体を有する植物の選択を可能にする。これらの突然変異体は、天然の形の遺伝子により示されるＣＤＫＤ活性よりも高い活性を示すこともある。ＴＩＬＬＩＮＧ法は、高密度の突然変異誘発とハイスループットスクリーニング法を組合わせる。一般的に、ＴＩＬＬＩＮＧ法のステップは以下のとおりである：（ａ）ＥＭＳ突然変異誘発（Ｒｅｄｅｉ及びＫｏｎｃｚ，  １９９２；  Ｆｅｌｄｍａｎｎら、１９９４；  Ｌｉｇｈｔｎｅｒ及びＣａｓｐａｒ，  １９９８）；（ｂ）ＤＮＡ調製及び個体の貯蔵；（ｃ）目的の領域のＰＣＲ増幅；（ｄ）へテロ二本鎖の形成を可能にする変性及びアニーリング；（ｅ）ＤＨＰＬＣ（プールにおけるヘテロ二本鎖の存在はクロマトグラムで過剰なピークとして検出される）、（ｆ）突然変異個体の同定、及び（ｇ）突然変異ＰＣＲ生成物の配列決定。ＴＩＬＬＩＮＧ法は当該技術分野で周知である（ＭｃＣａｌｌｕｍ  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０００  Ａｐｒ；  １８（４）：４５５−７，  ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｅｍｐｌｅ  ２００４  （ＴＩＬＬＩＮＧ−ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｈａｒｖｅｓｔ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００４  Ｆｅｂ；５（２）：１４５−５０．））。
【００８２】
部位特異的突然変異誘発はＣＤＫＤをコードする核酸の変異体を作製するのに使用することができる。部位特異的突然変異を行うのに幾つかの方法が利用でき、最も一般的には、ＰＣＲに基づく方法である（分子生物学の現在のプロトコル、Ｗｉｌｅｙ  Ｅｄｓ．  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．４ｕｌｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）
Ｔ−ＤＮＡ活性化、ＴＩＬＬＩＮＧ法及び部位特異的突然変異法は新規の対立遺伝子及びＣＤＫＤ変異体を作製することができる技術の例である。
【００８３】
相同的組換えは、選択された核酸を、ゲノム内の、確定済みの選択された位置に導入することを可能にする。相同的組換えは、酵母又はニセツリガネゴケなどの下等生物の生物科学で日常的に使用される標準的な技術である。植物で相同的組換えを行う方法は、モデル植物について（Ｏｆｆｒｉｎｇａら、Ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．  １９９０  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １９９０  Ｏｃｔ；  ９（１０）：３０７７−８４）だけでなく、作物、例えばイネについても（Ｔｅｒａｄａ  Ｒ，  Ｕｒａｗａ  Ｈ，  Ｉｎａｇａｋｉ  Ｙ，  Ｔｓｕｇａｎｅ  Ｋ，  Ｉｉｄａ  Ｓ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００２．  Ｉｉｄａ及びＴｅｒａｄａ：  Ａ  ｔａｌｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｓ，  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｔ−ＤＮＡ：  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｂｙ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｉｃｅ．    Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００４  Ａｐｒ；  １５（２）：１３２−８）説明されている。標的となる核酸（ＣＤＫＤをコードする核酸またはその変異体（上で定義される）でもよい）はＣＤＫＤをコードする遺伝子の遺伝子座を標的にする必要はないが、例えば高発現の領域に導入することができる。標的となる核酸は、内在性遺伝子を置換するために使用される改良された対立遺伝子でもよいし、または内因性遺伝子に加えて導入されてもよい。
【００８４】
本発明による方法は、上記で説明したように、収量が増加した植物を作出する。これらの有利な収量の効果は、他の経済的に有利な特質、例えば更なる収量増強の特質、様々なストレスに対する耐性、様々な構造的な特徴を改変する特質、及び／又は生化学的特徴、及び／又は生理学的特徴が組合わされてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８５】
図面の説明：
本発明を添付の図を参照して説明する。
【００８６】
（後述の図面の簡単な説明を参照のこと。）
【実施例】
【００８７】
本発明を以下の実施例を参照して説明するが、説明のみを目的とする。
【００８８】
ＤＮＡ操作：特に明記しない限り、組換えＤＮＡ技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＣＳＨ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９４），Ｖｏｌｕｍｅｓ  １及び２，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される標準的なプロトコルに従って行う。標準的な材料と植物分子の研究方法は、Ｒ．Ｄ．Ｄ．  ＣｒｏｙのＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｓｅ  （１９９３）、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ  （ＵＫ）  及び  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （ＵＫ）出版、に説明されている。
【００８９】
実施例１：遺伝子クローニング
シロイヌナズナＣＤＫＤ１；１を、シロイヌナズナシードリングｃＤＮＡライブラリー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｐａｉｓｌｅｙ，  英国）をテンプレートとして用いてＰＣＲで増幅した。苗から抽出されたＲＮＡを逆転写後、ｃＤＮＡをｐＣＭＶ  Ｓｐｏｒｔ  ６．０にクローニングした。バンクの平均挿入サイズは１．５ｋｂであり、クローンの最初の数は１．５９×１０７ｃｆｕであった。最初の力価は９．６×１０５ｃｆｕ／ｍｌと測定され、最初の増幅後は６×１０１１ｃｆｕ／ｍｌと測定された。プラスミド抽出後、テンプレート２００ｎｇを５０μｌのＰＣＲミックスに使用した。プライマーは、ｐｒｍ２６７６
【化１】
2007525229.tif 000003
【００９０】
（センス；開始コドンは太字、ＡｔｔＢ１部位はイタリック体）及びｐｒｍ３６７７
【化２】
2007525229.tif 000004
【００９１】
（リバース；相補的、停止コドンは太字、ＡｔｔＢ２部位はイタリック体）であり、これらはＧａｔｅｗａｙ組換えのＡｔｔＢ部位を含み、ＰＣＲ増幅に使用した。ＰＣＲはＨｉｆｉ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使って標準的な条件で行った。１２５６ｂｐのＰＣＲフラグメントを増幅して、また標準的な方法を用いて精製した。次に、ＰＣＲＧａｔｅｗａｙ用語によれば「エントリークローン」ｐ２７７７を作るため、フラグメントをｉｎ  ｖｉｖｏでｐＤＯＮＲ２０１プラスミドを用いて組換える間に、Ｇａｔｅｗａｙの手順の最初のステップのＢＰ反応を行なった。プラスミドｐＤＯＮＲ２０１はＧａｔｅｗａｙ（登録商標）技術の一部として、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。
【００９２】
実施例２：ベクターの構築
続いて、エントリークローンｐ２７７７を、ｐ０６４０（イネ形質転換に使用されるディスティネーションベクター）とのＬＲ反応に使用した。このベクターはＴ−ＤＮＡボーダー内に、植物選択マーカーと、スクリーナブルマーカーと、及びエントリークローンにすでにクローニングされた目的の配列を有するＬＲ  ｉｎ  ｖｉｖｏ組換え用のＧａｔｅｗａｙカセットとを含む。構成的発現のためのイネＧＯＳ２プロモーターをＧａｔｅｗａｙカセットの上流に配置した。
【００９３】
ＬＲ組換えステップ後、図２に示した得られた発現ベクター（ＣＤＫＤ１；１：：ＧＯＳ２−アップレグレーション）をアグロバクテリウムに形質転換し、続いてイネ植物に形質転換した。形質転換されたイネ植物は成長が可能で、次に実施例３に説明するパラメーターについて試験した。
【００９４】
実施例３：評価及び結果
約１５〜２０の独立したＴ０イネ形質転換体を作出した。最初の形質転換体を、成長させてＴ１種子を収穫するため、組織培養チャンバーから温室に移した。Ｔ１子孫で導入遺伝子の存在／不存在が３：１に分離した、６つの事象が保持された。これらの各事象について、導入遺伝子（ヘテロ−及びホモ−接合体）を含む約１０本のＴ１苗、及び導入遺伝子を欠く（無接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｔｅ））約１０本のＴ１苗を、可視マーカーの発現をモニタリングすることにより選択した。
【００９５】
統計学的分析：ｔ−テスト及びＦ−テスト
２つのファクターＡＮＯＶＡ（変異体の分析）を、植物表現型特性を全体的に評価するため、統計学的モデルとして使用した。Ｆ−テストを、本発明の遺伝子で形質転換され、全ての事象を有する全ての植物で測定された、全てのパラメーターについて行った。Ｆ−テストは、全ての形質転換事象にわたって遺伝子の効果をチェックするため、及びグローバルな遺伝子効果としても知られる遺伝子の全体的な効果を証明するために行った。真のグローバルな遺伝子効果についての有意性の閾値は、Ｆ−テストについて５％確率レベルにセットした。有意なＦ−テスト値は遺伝子の効果を示し、表現型の違いを起こしている遺伝子の存在または位置のみだけではないことを意味する。
【００９６】
事象内の遺伝子の効果、即ち系統特異的効果について調べるため、ｔ−テストを、形質転換植物及び対応するヌル（ｎｕｌｌ）植物からのデータセットを使って各事象内で行った。「ヌル植物」または「ヌル分離個体」は、トランスジェニック植物と同じ方法で処理したが、導入遺伝子が分離した植物である。ヌル植物はまた、ホモ接合型の陰性形質転換体として説明できる。ｔ−テストでの有意性の閾値は、１０％確率レベルにセットした。５つの形質転換の事象のうちの１つの集団内において、幾つかの事象がｔ−テストの閾値の下または上であり得る。これは、遺伝子はゲノムの一定の位置で効果があるだけで、この位置に依存した効果が起こることは稀ではないという仮説に基づく。この種の遺伝子の効果は、遺伝子の系統効果としても知られる。ｐ−値は、ｔ−値とｔ−分布を比較して、あるいはＦ−値とＦ−分布を比較して得られる。そしてｐ−値は、ヌル仮説（ヌル仮説は「導入遺伝子の効果はない」）が正しいとする可能性を示す。
【００９７】
４．１栄養繁殖測定：
選択したＴ１植物（導入遺伝子を有する約１０本、及び導入遺伝子を有しない約１０本）を温室に移した。各植物に独自のバーコードラベルを貼り、表現型のデータと対応する植物を明確にリンクさせた。選択したＴ１植物を、直径１０ｃｍのポットに入った土で以下の環境設定で育てた：明期＝１１．５時間、日光の強さ＝３０，０００ｌｕｘ以上、日中の温度＝２８℃以上、夜間の温度＝２２℃、相対湿度＝６０−７０℃。形質転換植物及び対応する無接合体をランダムな位置で隣接させて育てた。播種期から成熟期まで、各植物を何度かデジタル画像キャビネットに通して画像化した。各タイムポイントで、デジタル画像（２０４８ｘ１５３６ピクセル、１６００万色）を少なくとも６つの異なるアングルから各植物を撮影した。以下に説明するパラメーターを、イメージ分析ソフトウエアを使って、自動化された方法で全ての植物の全てのデジタル画像から得た。
【００９８】
４．１．１地上の植物面積
植物の地上面積を、バックグラウンドと区別される地上植物部分からピクセルの全数を数えることにより決定した。この値を、同じ時点で異なる角度から撮られた写真を平均化し、検量により平方ｍｍで表した物理的表面値に変換した。実験は、この方法で測定された地上の植物面積は地上の植物部分のバイオマスと相関することを示す。次に、Ｔ１評価で最も良い３つの系統をＴ２ラウンドで評価した。Ｔ２の評価の結果を以下の表１に示す。それに示されるように、系統のうちの１つは、対応する無接合体と比較して、地上面積で統計学的に有意な増加を示す（ｔ−テストからのｐ−値、０．０１０７）。
【表１】
2007525229.tif 000005
【００９９】
各列は１つの事象に対応し、地上面積について、形質転換（ＴＲ）及びヌルの系統（ｎｕｌｌ）を測定し、ユニットで示した。陽性の植物及び陰性の植物間の数値の差（ｄｉｆ）を、これらの植物間の差のパーセンテージ（％ｄｉｆ）と同様に算出した。ｐ−値は、各植物の系統に対するＴ−テストにより生じた確率を表す。最後の列は、全ての事象についての平均数を示す。そこでのｐ−値は、Ｆ−テストから導かれたｐ−値を表す。
【０１００】
４．２−種子関連パラメーターの測定
成熟した最初の穂（ｐａｎｉｃｌｅ）を収穫し、袋に詰め、バーコードを貼付し、それから３７℃のオーブンで３日間乾燥した。次に、穂を脱穀し、全ての種子を集めて数えた。充実した殻を、送風機を使って空の殻と分けた。空の殻を捨て、残った画分を再び数えた。充実した殻を化学天秤で重量測定した。この手順により、以下に説明する種子関連パラメーターのセットが得られた。
【０１０１】
４．２．０充実した種子の数
充実した種子の数を、分離ステップ後に残った充実した殻の数を数えて測定した。再び、Ｔ１評価の最も良い植物のうち３つをＴ２ラウンドに用いた。Ｔ２評価の結果を以下の表２に示す。それに示されるように、系統の２つは、対応する非トランスジェニック植物の充実した種子の数と比較して、トランスジェニック植物の充実した種子の数が有意に増加していたことを示した。また、Ｆ−テストからの有意なｐ−値の０により結論されるように、全体的な遺伝子効果もあった。
【表２】
2007525229.tif 000006
【０１０２】
各列は１つの事象に対応し、その事象について、充実した種子の数を、トランスジェニック系統（ＴＲ）及びヌル系統（ｎｕｌｌ）について測定し、ユニットで示した。陽性の植物及び陰性の植物間の数値の差（ｄｉｆ）を、これらの植物間の差のパーセンテージ（％ｄｉｆ）とともに求めた。ｐ−値は、各植物の系統に対するＴ−テストにより生じた確率を表す。最後の列は、全ての事象についての平均数を示す。そこでのｐ−値は、Ｆ−テストから導かれたｐ−値を表す。
【０１０３】
４．２．１植物あたりの全種子収量
全種子収量を、植物から収穫した全ての充実した殻を重量測定することにより測定した。再び、Ｔ１評価で最も良い植物のうち３つをＴ２ラウンドに用いた。Ｔ２評価の結果を以下の表３に示す。そこに示されるように、系統の２つは、対応する非トランスジェニック植物の種子重量と比べてトランスジェニック植物の種子重量に有意な増加を示した。また、Ｆ−テストからの有意なｐ−値の０により結論されるように、全体的な遺伝子効果もあった。
【表３】
2007525229.tif 000007
【０１０４】
各列は１つの事象に対応し、その事象について、全種子重量を、トランスジェニック系統（ＴＲ）及びヌル系統（ｎｕｌｌ）について測定し、ユニットで示した。陽性の植物及び陰性の植物間の数値の差（ｄｉｆ）を、これらの植物間の差のパーセンテージ（％ｄｉｆ）とともに求めた。ｐ−値は、各植物の系におけるＴ−テストにより生じた確率を表す。最後の列は、全ての事象についての平均数を示す。そこでのｐ−値は、Ｆ−テストから導かれたｐ−値を表す。
【０１０５】
４．２．３植物の収穫指数
本発明の収穫指数は、全種子収量と地上面積（ｍｍ２）との間の比率として定義され、ファクター１０６を乗じる。Ｔ１評価からの最も良い植物のうち３つをＴ２ラウンドに用い、Ｔ２の評価の結果を以下の表４に示す。それに見られるように、１つの系統が、対応する非トランスジェニック植物の収穫指数と比較して、トランスジェニック植物について増加した収穫指数を示し、ｔ−テストからのｐ−値が０であった。また、全体的な遺伝子効果がＦ−テストからのｐ−値の０で明らかであった。
【表４】
2007525229.tif 000008
【０１０６】
各列は１つの事象に対応し、その事象について、収穫指数を、トランスジェニック系統（ＴＲ）及びヌル系統（ｎｕｌｌ）について測定し、ユニットで示した。陽性の植物及び陰性の植物間の数値の差（ｄｉｆ）を、これらの植物間の差のパーセンテージ（％ｄｉｆ）とともに求めた。ｐ−値は、各植物の系統に対するＴ−テストにより生じた確率を表す。最後の列は、全ての事象についての平均数を示す。そこでのｐ−値は、Ｆ−テストから導かれたｐ−値を表す。
【０１０７】
４．２．４千粒重（ＴＫＷ）
このパラメーターは、数えた充実した種子の数、及びその全重量から外挿される。Ｔ１評価の最も良い植物のうちの３つをＴ２ラウンドに用い、Ｔ２の評価の結果を以下の表５に示す。そこに示されるように、１つの系統が、対応する非トランスジェニック植物と比べて、トランスジェニック植物においてＴＫＷの増加を示し、ｔ−テストからのＰ値が０．０４５５であった。
【表５】
2007525229.tif 000009
【０１０８】
各列は１つの事象に対応し、その事象について、ＴＫＷを、トランスジェニック系統（ＴＲ）及びヌル系統（ｎｕｌｌ）について測定し、ユニットで示した。陽性の植物及び陰性の植物間の数値の差（ｄｉｆ）を、これらの植物間の差のパーセンテージ（％ｄｉｆ）とともに求めたｐ−値は、各植物の系に対するＴ−テストにより生じた確率を表す。最後の列は、全ての事象についての平均数を示す。そこでのｐ−値は、Ｆ−テストから導かれたｐ−値を表す。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】様々な植物のＣＤＫを示す系統樹である。完全長ＣＤＫタンパク質の配列を、デフォルトパラメーターを用いて「ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１」ソフトウエアを使って整列比較した。近縁関係結合樹を、デフォルトパラメーターを用いて「ＣｌｕｓｔａｌＸ１．８１」ソフトウエアを使って、このアラインメントから計算した。系統樹を、デフォルトパラメーターを用いて「Ｐｈｙｌｉｐ３．５」パッケージの「ｄｒａｗｇｒａｍ」プログラムを使用して描いた。
【図２】イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）における、ＧＯＳ２プロモーターの制御下のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＤＫＤ；１遺伝子の発現のためのバイナリーベクタを示す。
【図３Ａ】本発明による方法を行うのに有用な配列の例の詳細である。
【図３Ｂ】本発明による方法を行うのに有用な配列の例の詳細である。
【図１】
2007525229.tif 000010
【図２】
2007525229.tif 000011
【図３Ａ】
2007525229.tif 000012
【図３Ｂ】
2007525229.tif 000013
【配列表】
2007525229000001.xml
【国際調査報告】
2007525229.tif 000018
2007525229.tif 000019
2007525229.tif 000020
2007525229.tif 000021
2007525229.tif 000022