(57)【要約】  本発明は、正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがないヒト組織因子に結合能がある抗体を提供する。さらに、本発明の抗体の製造方法および使用方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子に結合能がある単離された抗体であって、前記抗体が正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつＦｃ介在機序を開始しうる前記抗体。
【請求項２】
前記Ｆｃ介在機序が、抗体依存細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）を開始する能力を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記Ｆｃ介在機序が、補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を開始する能力を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、およびＦａｂ発現ライブラリーの抗体産物よりなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が修飾抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が細胞毒性剤に結合している、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記細胞毒性剤が、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびラジオアイソトープよりなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が検出可能剤に結合している、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記検出可能剤が、酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンよりなる群から選択される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含む免疫グロブリン分子。
【請求項１１】
請求項１に記載の抗体のヒト組織因子への結合の阻害能を有する単離された抗抗体。
【請求項１２】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって産生されたモノクローナル抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって産生されたモノクローナル抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項１４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって産生されたモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって産生されたモノクローナル抗体と同じエピトープへの結合を競合するモノクローナル抗体。
【請求項１５】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたＴＦ２６０から入手可能な抗体。
【請求項１６】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６から得られる抗体の結合特性を有する抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１７】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６である、請求項１６に記載のハイブリドーマ。
【請求項１８】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０から得られる抗体の結合特性を有する抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項１９】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０である、請求項１８に記載のハイブリドーマ。
【請求項２０】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって産生されるモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２もしくはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって産生されるモノクローナル抗体と同じエピトープへの結合を競合するモノクローナル抗体。
【請求項２１】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８、もしくはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９から入手可能な抗体。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８から得られる抗体の結合特性を有する抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８である、請求項２２に記載のハイブリドーマ。
【請求項２４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２から得られる抗体の結合特性を有する抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項２５】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２である、請求項２４に記載のハイブリドーマ。
【請求項２６】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９から得られる抗体の結合特性を有する抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項２７】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９である、請求項２６に記載のハイブリドーマ。
【請求項２８】
請求項１に記載の抗体の治療上有効量を含む医薬組成物および薬学的に許容される担体。
【請求項２９】
患者における癌を治療する方法であって、前記方法が請求項２８に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップを含む前記方法。
【請求項３０】
前記癌が固形腫瘍である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記癌が、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌よりなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記医薬組成物が細胞毒性剤に結合した抗体を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
癌を検出する方法であって、前記方法が、請求項８に記載の抗体を試料または対象に提供するステップ、および前記検出可能剤の癌細胞への結合を検出するステップを含む前記方法。
【請求項３４】
前記癌が非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌よりなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
組織因子に結合能があるモノクローナル抗体を生成する方法であって、前記抗体が正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつ前記抗体がＦｃ介在機序を開始することができる前記方法であって、前記方法が、
（ａ）哺乳動物をヒト組織因子の精製細胞外ドメインで免疫するステップと、
（ｂ）前記免疫した哺乳動物のリンパ節から細胞懸濁液を調製するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）の細胞懸濁液からの細胞を骨髄腫細胞と融合させるステップ、および
（ｄ）前記（ｃ）における融合から生成されたハイブリドーマからクローンを同定するステップであって、前記クローンがヒト組織因子に結合能がある抗体を産生し、正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつ前記抗体がＦｃ介在機序を開始することができる前記ステップと
を含む前記方法。
【請求項３６】
配列番号：６、８、１０、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項３７】
配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体。
【請求項３８】
配列番号：６、８、１０、および１２よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３９】
配列番号：１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４０】
（ａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｋ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、および
（ｌ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４１】
（ａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｋ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｌ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｍ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｎ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｏ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｐ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｑ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、および
（ｒ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４２】
配列番号：５、７、９、または１１の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含み、正常血漿対照に比べ組織因子介在血液凝固を阻害することなくヒト組織因子に結合しうるポリペプチドをコードし、かつＦｃ介在機序を開始しうる単離された核酸分子。
【請求項４３】
配列番号：１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドを含み、正常血漿対照に比べ組織因子介在血液凝固を阻害することなくヒト組織因子に結合しうるポリペプチドをコードし、かつＦｃ介在機序を開始しうる単離された核酸分子。
【請求項４４】
請求項４０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４５】
請求項４１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４６】
請求項４４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４７】
請求項４５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むように遺伝子組換えされた宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４１に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むように遺伝子組換えされた宿主細胞。
【請求項５０】
抗体を製造する方法であって、
（ａ）請求項４０に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされた抗体を発現させるステップと、
（ｂ）前記抗体を回収するステップと
を含む前記方法。
【請求項５１】
抗体を製造する方法であって、
（ａ）請求項４１に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされた抗体を発現させるステップと、
（ｂ）前記抗体を回収するステップと
を含む前記方法。
【請求項５２】
（ａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｋ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、および
（ｌ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と
よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することなくヒト組織因子に結合しうるとともに、Ｆｃ介在機序を開始しうる前記ポリペプチド。
【請求項５３】
（ａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｋ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｌ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域と、
（ｍ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｎ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｏ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域と、
（ｐ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
（ｑ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、および
（ｒ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域と、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することなくヒト組織因子に結合しうるとともに、Ｆｃ介在機序を開始しうる前記ポリペプチド。
【請求項５４】
請求項２８に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項５５】
その使用のための印刷された説明書をさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
癌を治療するための前記組成物の使用を説明する印刷物、癌を治療するための前記組成物の使用を説明するあらかじめ録音されたメディアデバイス、またはプランナーをさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５７】
前記印刷物が本、ブックレット、パンフレット、またはリーフレットである、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記あらかじめ録音されたメディアデバイスが、ＤＶＤ、ビデオテープカセット、ＣＤ−ＲＯＭ、オーディオカセット、またはオーディオコンパクトディスクである、請求項５６に記載のキット。
【請求項５９】
治療上有効量の請求項３６に記載の抗体を含む医薬組成物を含むキット。
【請求項６０】
その使用のための印刷された説明書をさらに含む、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
治療上有効量の請求項３７に記載の抗体を含む医薬組成物を含むキット。
【請求項６２】
その使用のための印刷された説明書をさらに含む、請求項６１に記載のキット。  
【請求項６３】
請求項２８に記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に送達する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記医薬組成物を処方することが許されている医師の身元をコンピュータ可読記憶媒体に登録するステップと、
（ｂ）前記患者に前記医薬組成物に付随するリスクに関するカウンセリング情報を提供するステップと、
（ｃ）前記リスクにもかかわらず前記医薬組成物が投与される前記患者のインフォームドコンセントを得るステップと、
（ｄ）前記インフォームドコンセントを得た後に前記患者を前記コンピュータ可読媒体に登録するステップ、および
（ｅ）前記患者の前記医薬組成物へのアクセスを可能にするステップと
を含む前記方法。
【請求項６４】
前記医薬組成物への前記アクセスが処方箋である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項２８に記載の医薬組成物に関して消費者を教育する方法であって、前記方法が前記医薬組成物を販売時点で消費者情報とともに消費者に分配するステップを含む前記方法。
【請求項６６】
前記消費者情報が、英語テキスト、外国語テキスト、視覚映像、チャート、電話録音、ウェブサイト、および生の消費者サービス担当者へのアクセスよりなる群から選択されるフォーマットで示されている、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記消費者情報が、使用説明書、適切な年齢使用、適応症、禁忌、適切な投与、警告、電話番号、またはウェブサイトアドレスである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記医薬組成物に関する消費者の質問に答える立場の関係者へ専門的情報を提供するステップをさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記関係者が医師、医師助手、ナースプラクティショナー、薬剤師、または顧客サービス担当者である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記分配が、薬剤師または医療提供者がいる場所への分配である、請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
請求項２８に記載の医薬組成物を識別し、および薬物と同等物を商品化する方法であって、前記方法が、
（ａ）ヒト組織因子に結合能がある抗体を単離するステップであって、前記抗体が正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつＦｃ介在機序を開始しうる前記ステップと、
（ｂ）（ａ）を反復し、治療上有効であると判明しうる複数の候補抗体を得るステップと、
（ｃ）少なくとも１つのかかる候補抗体について、ヒト以外の動物に投与される場合にその非毒性を証明するステップと、
（ｄ）監視下での臨床試験を行い、前記（ｃ）の候補抗体の非毒性および有効性を証明するステップと、
（ｅ）規制機関の承認を確保し、癌を治療するための前記（ｄ）の候補抗体を分配するステップ、および
（ｆ）活性剤として前記（ｅ）の候補抗体を含む医薬組成物を製造するステップと
を含む前記方法。
【請求項７２】
前記癌が、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌よりなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、正常な組織因子介在血液凝固を阻害することなく組織因子に結合能がある抗体、およびその製造方法、ならびに癌の治療を含むその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
組織因子（ＴＦ）は、第ＶＩＩａ因子とともにインビボで血液凝固を開始する細胞結合成分である。ＴＦは、２１９アミノ酸残基細胞外領域、２３アミノ酸残基膜貫通領域、および２１アミノ酸残基細胞質領域を有する膜貫通糖タンパク質である。ＴＦの細胞外領域は２つのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン、およびクラスＩＩサイトカインとインターフェロン受容体の特徴を示すジスルフィド架橋の分布を有する。ＴＦの細胞質領域は短いが、リン酸化されうる少なくとも１つのセリン残基を含有する。
【０００３】
組織因子は、その天然リガンド−第ＶＩＩａ因子とともに密な複合体（Ｋd〜ｐｍｏｌ）を形成する。複合体においては、ＶＩＩａは組織因子を包み込み（バナー（Banner）,D.W.ら、Nature380、p.41-46（1996年））、かつ組織因子表面との広範囲の領域の接触を形成する。
【０００４】
癌を有する患者は、血栓塞栓性障害の予想発生率よりもはるかに高い発生率を示し、これは一般的にトルソー症候群と呼ばれる。トルソー症候群と一般的に関係した多くの腫瘍型、例えば肺癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌、および胃癌は、ＴＦ陽性に染色する（フー（Hu），T．ら、Oncol.Res.6、p.321-327（1994年）、カランダー（Callander）,N.S.ら、Cancer 70、p.1194-201（1992年））。ＴＦの異常に高い発現は臨床的には、結腸直腸癌（シゲノリ（Shigernori）,C.ら、Thromb.Haemost.80、p.894-898（1998年）、セト（Seto）,S.ら、Cancer 88、p.295-301（2000年））、および非小細胞肺癌（サワダ（Sawada）,M.ら、Br.J.Cancer 79、p.472-477（1999年））を含む多くの腫瘍の不十分な分化と関係があることが示されている。遺伝子発現の分子分析は、ＴＦが乳癌細胞において異なった形で発現されることを示す（キルシュマン（Kirschmann）,D.A.ら、Breast Cancer Res.Treat.55、p.127-136（1999年）、シュビルツケ（Schwirzke）,M.ら、Anticancer Res.19、p.1801-1814（1999年））。
【０００５】
腫瘍組織においては、ＴＦは腫瘍細胞の表面だけではなく腫瘍関連血管内皮細胞でも発現される。ＴＦは胎児血管発達において重要な役割を果たすことが示されている（カルメリート（Carmeliet）,P.ら、Nature 383、p.73-75（1996年））。ＴＦは通常、内皮では発現されない。しかし、乳癌（コントリーノ（Contrino）,J.ら、Nat.Med.2、p.209-215（1996年）、ショウジ（Shoji）,M.ら、Am.J.Pathol.152、p.399-411（1998年））、下垂体腺腫（ニシ（Nishi）,T.ら、Cancer 86、p.1354-1361（1999年））、および肺癌（ショウジ（Shoji），M.ら、Am.J.Pathol.152、p.399-411（1998年）、クーマギ（Koomagi）,R.、およびボルム（Volm）,M.、Int.J Cancer 79、p.19-22（1998年））における腫瘍関連血管内皮細胞はＴＦを発現することが示されている。腫瘍細胞および腫瘍関連血管内皮細胞によるＴＦの発現は、腫瘍分泌ＶＥＧＦおよびＴＮＦによって誘発されることが示されている（ビアハウス（Bierhaus）,A.ら、J.Biol.Chem.270、p.26419-26432（1995年）、ツッカー（Zucker）,S.ら、Int.J.Cancer 75、ｐ．780-786（1998年）、シェン（Shen）,B.Q．ら、J.Biol.Chem.276、p.5281-5286（2001年））。
【０００６】
正常な組織においては、ＴＦは皮膚など密な内皮および組織関門により血液タンパク質から分離された細胞においてのみ発現され、ＴＦは通常、血液タンパク質および抗体に容易にアクセス可能ではない。しかし、腫瘍組織においては、腫瘍関連血管内皮細胞のＴＦは血液タンパク質にさらされる。同時に、腫瘍ＴＦは漏れやすい腫瘍血管系のためアクセス可能でもある。腫瘍細胞は、浸潤過程において最も役割を果たしやすいマトリクスメタロプロテアーゼを分泌し、漏れの原因となりうる。
【０００７】
ＴＦ−ＶＩＩａ相互作用部位に結合する抗体はＴＦ−ＶＩＩａ相互作用を阻害し、したがって血液凝固を阻害または阻止しうる。しかし、大量のその抗体が腫瘍治療に使用されると、患者における有効な出血制御が障害されうる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
本発明は、その抗体が正常血漿対照と比べると組織因子（ＴＦ）介在血液凝固を阻害することがない、ヒト組織因子（ｈＴＦ）に結合能がある単離された抗体に関する。本発明は、その抗体が正常血漿対照と比べるとＴＦ介在血液凝固を阻害することがなく、かつその抗体がＦｃ介在機序を開始しうる、ｈＴＦに結合能がある単離された抗体にも関する。この抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、修飾抗体、その重鎖もしくは軽鎖可変領域、またはＦａｂ発現ライブラリーの抗体産物でありうる。本発明はさらに、かかる抗体を産生するハイブリドーマ、およびかかる抗体をコードする核酸分子に関する。
【０００９】
本発明はさらに、抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含む免疫グロブリン分子に関する。
【００１０】
本発明はさらに、ｈＴＦへの抗体の結合を阻害することが可能な抗抗体に関する。
【００１１】
本発明はさらに、本発明のモノクローナル抗体を生成する方法に関し、この方法は、（ａ）哺乳動物にｈＴＦの精製細胞外ドメインを含むポリペプチドで免疫するステップと、（ｂ）免疫した哺乳動物のリンパ節から細胞懸濁液を調製するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の細胞懸濁液からの細胞を骨髄腫細胞と融合させるステップと、（ｄ）（ｃ）における融合から生成されたハイブリドーマからクローンを同定するステップとを含み、クローンはｈＴＦに結合能がある抗体を産生し、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがなく、かつ場合により抗体がＦｃ介在機序を開始しうる。
【００１２】
本発明はさらに、本発明の抗体の治療上有効量および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００１３】
本発明は、患者における癌を治療する方法にも関し、この方法は本発明の抗体の治療上有効量を患者に投与するステップを含む。抗体は、細胞毒性剤または放射性核種に結合されうる。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はさらに、本発明の抗体、またはその抗体断片とアミノ酸配列において少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。一部の実施形態においては、かかるポリペプチドは本発明の抗体の免疫特異性を有する。本発明は、単離されたポリヌクレオチドを含むベクター、およびベクターを含む宿主細胞にも関する。
【００１５】
本発明はさらに、本発明の抗体の治療上有効量を含む医薬組成物を含むキットに関する。一部の実施形態においては、このキットはさらに、癌を治療するための医薬組成物の使用に関する情報を提供する印刷物、または癌を治療するための医薬組成物の使用に関する情報を提供するあらかじめ録音されたメディアデバイス、またはプランナーを含む。
【００１６】
本発明は、本発明の抗体の治療上有効量を含む医薬組成物をそれを必要とする患者に送達する方法にも関し、この方法は、（ａ）医薬組成物を処方することが許されている医師の身元をコンピュータ可読媒体に登録するステップと、（ｂ）患者に医薬組成物に付随するリスクに関するカウンセリング情報を提供するステップと、（ｃ）付随するリスクにもかかわらず医薬組成物が投与される患者のインフォームドコンセントを得るステップと、（ｄ）インフォームドコンセントを得た後に患者をコンピュータ可読媒体に登録するステップ、および（ｅ）患者の医薬組成物へのアクセスを可能にするステップとを含む。
【００１７】
本発明は、医薬組成物の使用に関して消費者を教育する方法にも関し、この方法は、医薬組成物を販売時点で消費者情報とともに分配するステップを含む。
【００１８】
本発明は、癌を検出する方法にも関し、この方法は、検出可能剤に結合した本発明の抗体を試料または対象に提供するステップ、かつ癌細胞に結合した検出可能剤を検出するステップを含む。
【００１９】
本発明はさらに、本発明の抗体の治療上有効量を含む医薬組成物を識別し、および薬物と同等物を商品化する方法であって、この方法は、（ａ）ヒト組織因子に結合能がある抗体を単離するステップであって、この抗体は正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつＦｃ介在機序を開始しうるステップと、（ｂ）（ａ）を反復し、治療上有効であると判明しうる複数の候補抗体を得るステップと、（ｃ）１つのかかる候補抗体について、ヒト以外の動物に投与される場合にその非毒性を証明するステップと、（ｄ）監視下での臨床試験を行い、１つのかかる候補抗体の非毒性および有効性を証明するステップと、（ｅ）規制機関の承認を確保し、癌を治療するための１つのかかる候補抗体を分配するステップ、および（ｆ）活性剤として候補抗体を含む医薬組成物を製造するステップとを含む方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
好ましい実施形態の詳細な説明
正常な組織においては、ＴＦは皮膚など密な内皮および組織関門により血液タンパク質から分離された細胞においてのみ発現される。ＴＦは通常、抗体を含む血液タンパク質にアクセス可能ではないが、それはＴＨが通常、内皮内血管など血液と直接接触している細胞の表面では発現されないためである。しかし、ＴＦは、ＴＦが血液タンパク質にさらされている腫瘍関連血管内皮細胞を含む多くの型の腫瘍細胞によって発現される。ＴＦは胎児血管発達に関与しており、腫瘍転移と関係がある。したがって、ＴＦは潜在的な腫瘍治療標的であるとみなされている。
【００２１】
抗体
本発明は、ヒトＴＦ（ｈＴＦ）に結合能がある単離された抗体に関し、この抗体は正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがない。本発明は、ｈＴＦに結合能がある単離された抗体にも関し、この抗体は正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがなく、かつこの抗体は１つもしくはそれ以上のＦｃ介在機序を開始しうる。本発明の抗体は正常なＴＦ介在血液凝固を阻害することがないため、正常な血漿凝固は本発明の抗体で治療された患者において影響されない。
【００２２】
本明細書で使用される「単離された」は、その最初の環境（例えば、それが自然発生している場合には自然環境）から除去された物質を指し、したがって、その自然状態から「人間によって」変更される。
【００２３】
基本的な抗体構造単位は、各対が１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する、２つの同一の対のポリペプチド鎖から成る四量体を含むことが知られている。各鎖のアミノ末端部は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシル末端部は、主にＦｃ介在機序に関与する一定の領域を規定する。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類されている。重鎖はミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類されており、かつ抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。一般に、Fundamental Immunology、第７章（ポール（Paul）,W.編、第２版、レイブンプレス（Raven Press）、ニューヨーク（N.Y.）（1989年））を参照。各軽／重鎖対の可変領域は、抗原結合部位を形成する。したがって、無傷のＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する。二官能性または二重特異性抗体以外で、２つの結合部位は同じである。
【００２４】
可変領域はすべて、３つの超可変領域によって一緒に結合された、相補性決定領域すなわちＣＤＲとも呼ばれる比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）という同じ一般構造を示す。各対の重鎖および軽鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域によって調整され、特異的エピトープへの結合を可能にする。Ｎ末端からＣ末端まで、両方の可変領域の軽鎖および重鎖はドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の割当は、カバット（Kabat）、免疫学的関心のタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health、メリーランド州（Md）、ベゼスダ（Bethesda）（1987年および1991年））、コーチア（Chothia）とレスク（Lesk）、J.Mol.Biol.196、p.901-917（1987年）、またはコーチア（Chothia）ら、Nature 342、p.878-883（1989年）の定義に従っている。
【００２５】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、無傷の免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分または断片、すなわち、免疫特異的に抗原に結合する抗原結合部位を含有する分子を指すように意図されている。本発明の抗体は、ｈＴＦへ特異的に結合することができ、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがない。一部の実施形態においては、本発明の抗体はｈＴＦへ特異的に結合することができ、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがなく、かつ抗体が１つもしくはそれ以上のＦｃ介在機序を開始しうる。
【００２６】
本発明の抗体としては、無傷のモノクローナル抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体、修飾抗体、一本鎖抗体、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成される断片、ＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、細胞内で作られた抗体（すなわち、細胞内発現抗体）、および抗原結合抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のすべての型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスでありうる。一部の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ１アイソタイプである。他の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ２アイソタイプである。さらに他の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ４アイソタイプである。免疫グロブリンは、重鎖と軽鎖の両方を有しうる。一連のＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ重鎖は、カッパまたはラムダ形態の軽鎖と対になりうる。
【００２７】
本発明の抗体は、単独もしくは以下の全部または一部と結合して可変領域を含有し得る。すなわち、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＦｃドメイン。本発明の抗体は、鳥および哺乳動物を含む任意の動物由来でありうる。一部の実施形態においては、抗体はヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ロバ抗体、ヒツジ抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、モルモット抗体、ラクダ抗体、ウマ抗体、またはニワトリ抗体である。本明細書で使用される「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つもしくはそれ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子導入動物から単離された抗体を含む。したがって、動物由来の本発明の抗体はヒト組織因子へ結合することができ、かつ正常血漿対照と比べるとＴＦ介在血液凝固を阻害することがないと理解されるべきである。かかる抗体は１つもしくはそれ以上のＦｃ介在機序を開始しうる。
【００２８】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同質の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在しうる可能な自然発生突然変異を除き同一である。通常、異なる決定因子（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定因子に対するものであり、したがってきわめて特異的である。その特異的に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンによって汚染されていないハイブリドーマ培養物によって合成されるため有利である。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同質の抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、かつ特定の方法によって抗体の生成を必要とするとみなされていない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、コーラー（Kohler）とミルスタイン（Milstein）、Nature 256、p.495（1975年）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって製造され、あるいは、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書（カビリー（Cabilly）ら）によって製造されうる。
【００２９】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種由来の抗体における対応する配列と同一または同質であり、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属すると同時に、鎖の残りは別の種由来の抗体における対応する配列と同一または同質であり、または別の抗体クラスまたはサブクラス、およびそれらが所望の生物活性を示す限りかかる抗体の断片に属する重鎖および／または軽鎖の一部を有する抗体を指す（米国特許第４，８１６，５６７号明細書（カビリー（Cabilly）ら）、モリソン（Morrison）ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 81、p.6851-6855（1984年を参照））。
【００３０】
ヒト以外（例えば、マウス）の抗体の「ヒト化」形態は、ヒト以外の免疫グロブリン由来の最小の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、または抗体の他の抗原結合サブ配列）である。大部分、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基がヒト以外の種（ドナー抗体）、例えば、所望の特異性および親和性を有するマウス、ラット、またはウサギのＣＤＲからの残基によって置換されるヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応するヒト以外の残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてもまたは持ち込まれたＣＤＲもしくはフレームワーク配列においても見られない残基を含有し得る。これらの修飾は、さらに抗体性能を高め、かつ最適化するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、可変ドメインの少なくとも１つ、かつ一般的には２つの実質的にすべてを含むが、ここでＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト以外の免疫グロブリンのものに対応し、かつＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてはヒト免疫グロブリン配列にものである。ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、一般的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。詳細については、ジョーンズ（Jones）ら、Nature 321、p.522-525（1986年）、ライヒマン（Reichmann）ら、Nature 332、p.323-329（1988年）、およびプレスタ（Presta）、Curr.Op.Struct.Biol.2、p.593-596（1992年）を参照。
【００３１】
「修飾抗体」という用語は、抗体依存細胞細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）（補体介在細胞死滅としても周知）の介在時に抗体の有効性を強化するために、エフェクター機能に関して修飾されている抗体を指す。例えば、システイン残基はＦｃ領域に導入され、それによってこの領域での鎖間ジスルフィド結合形成を可能にしうる。したがって、生成されるホモ二量体抗体は、内在化能力を改善し、かつ／またはＡＤＣＣおよびＣＤＣを増大させうる。キャロン（Caron）ら、J.Exp.Med.176、p.1191-1195（1992年）、およびショープス（Shopes）,B．、J.Immunol.148、p.2918-2922（1992年）を参照。抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体は、ウォルフ（Wolff）ら、Cancer Research 53、p.2560-2565（1993年）に記載されているように、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製もされうる。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を有し、それによって補体介在溶解およびＡＤＣＣ能力を強化しうるように修飾されうる。スティーブンソン（Stevenson）ら、Anti-Cancer Drug Design 3、p.219-230（1989年）を参照。さらに、抗体を改変し、結果としてＡＤＣＣ活性が強化される糖化パターンを変化させた糖型を生成しうる。米国特許第６，６０２，６８４号明細書を参照。
【００３２】
二重特異性または二官能性抗体は、２つの異なる重／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工的なハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦ（ａｂ’）断片の結合を含むさまざまな方法によって生成されうる。例えば、ソングシビライ（Songsivilai）とラッハマン（Lachmann）、Clin.Exp.Immunol.79、ｐ．315-321（1990年）、コステルニー（Kostelny）ら、J.Immunol.148、p.1547-1553（1992年）を参照。さらに、二重特異性抗体は「二重特異性抗体（diabodies）」（ホリガー（Holliger）ら、PNAS USA 90、p.6444-6448（1993年））、または「ヤヌシンス（Janusins）」（トラウネッカー（Traunecker）ら、EMBO J.10:p.3655-3659（1991年）およびトラウネッカー（Traunecker）ら、Int.J.Cancer Suppl.7、p.51-52（1992年））として形成されうる。
【００３３】
本発明は、本発明の抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含む免疫グロブリン分子にも関する。本発明はさらに、ｈＴＦに対する本発明の抗体の結合を阻害することが可能な単離された抗体に関し、前記抗体は正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがない。
【００３４】
本発明の抗体は、その交差反応性の観点からも記載または特定されうる。一部の実施形態においては、本発明の抗体は、ＴＦポリペプチド（例えば、ヒトＴＦ（配列番号：２））、またはＴＦポリペプチドの断片に少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、または少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドに結合する。一部の実施形態においては、本発明の抗体は、ｈＴＦのマウス、サル、ラット、および／またはウサギ同族体、およびその対応するエピトープと交差反応する。他の実施形態においては、上記の交差反応性は、任意の単一の特異的抗原もしくは免疫原性ポリペプチド、または２、３、４、５、もしくはそれ以上の特異的抗原および／または免疫原性ポリペプチドの組合せに対してである。
【００３５】
技術上周知のように、２つのポリペプチド間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第２のポリペプチドの配列と比較することによって決定されている。本明細書で論じられる場合、特定のポリペプチドが別のポリペプチドと少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるかどうかは、技術上周知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定されうる。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（ウィスコンシン（Wisconsin）配列分析パッケージ、ユニックス用バージョン８、ジェネティクス  コンピュータ  グループ（Genetics Computer Group）、ユニバーシティーリサーチパーク（University Research Park）、５７５サイエンス  ドライブ（Science Drive）、ウィスコンシン州（WI）５３７１１、マディソン（Madison））などであるが、これらに限定されない。ＢＥＳＴＦＩＴでは、スミス（Smith）とウォーターマン（Waterman）のローカルホモロジーアルゴリズム、Advances in Applied Mathematics 2、p.482-489（1981年）を使用し、２つの配列間のホモロジーの最良のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは他の配列調整プログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明による基準配列と９５％同一であるかどうかを判定する場合、パラメータは、もちろん、同一性の割合が基準ポリペプチド配列の完全長にわたって計算され、かつ基準配列におけるアミノ酸の総数の５％までのホモロジーのギャップが許されるように設定されている。
【００３６】
本発明の抗体は、ｈＴＦポリペプチドまたはｈＴＦのポリペプチド断片に免疫特異的に結合しうる。一部の実施形態においては、本発明の抗体はｈＴＦに免疫特異的に結合する。他の実施形態においては、本発明の抗体はｈＴＦの細胞外ドメインに免疫特異的に結合する。本明細書で使用される「ｈＴＦの細胞外ドメイン」は、細胞の外側表面上に局在されているｈＴＦの２１９アミノ酸残基部分を指すよう意図されている（例えば、３２アミノ酸Ｎ末端リーダー配列および９アミノ酸Ｃ末端ＲＧＳ−Ｈｉｓ6タグ配列を有するヒト組織因子の細胞外ドメインのヌクレオチド（配列番号：３）およびアミノ酸（配列番号：４）配列を示す図６を参照）。
【００３７】
一部の実施形態においては、本発明の抗体は優先的にｈＴＦに結合する。他の実施形態においては、本発明の抗体は免疫特異的にｈＴＦに結合し、かつ他の抗原と交差反応することがない。本発明の抗体は、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがない。他の実施形態においては、本発明の抗体は１つもしくはそれ以上のＦｃ介在機序を開始する。
【００３８】
「抗原結合抗体断片」という用語は、本発明の抗体の対応する完全長または天然ポリペプチド配列と比べてポリペプチド配列の一部または部分である分子（例えば、ポリペプチド）を指すよう意図されている。ポリペプチド配列の一部または部分は、フルサイズの本発明の抗体の完全長または天然ポリペプチド配列の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％でありうるが、完全長抗体の少なくともある程度の結合特異性を保持し、かつ正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがなく、場合によりＦｃ介在機序を開始する。
【００３９】
本明細書に記載された抗体分子（例えば、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン）の抗原結合抗体断片（誘導体を含む）としては、ＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、またはＶＬＣＤＲ３を含めて、完全長抗体の少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、もしくは１６０超のアミノ酸の断片（誘導体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。結果として生じる抗体または抗原結合抗体断片は生物活性についてスクリーニングされ、所望の活性（例えば、ｈＴＦに結合する能力）を保持する断片を同定することができる。
【００４０】
非限定的実施例を通じて、抗体は、第２の抗原に対する抗体の解離定数（ＫD）またはオフレート（Ｋoff）より小さいＫDまたはＫoffを有するｈＴＦタンパク質に結合する場合にはｈＴＦに優先的に結合することが考えられうる。他の非限定的実施形態においては、抗体は、第２の抗原に対する抗体のＫDまたはＫoffより少なくとも一桁小さいＫDまたはＫoffを有するｈＴＦタンパク質に結合する場合にはｈＴＦに優先的に結合すると考えられうる。他の非限定的実施形態においては、抗体は、第２の抗原に対する抗体のＫDまたはＫoffより少なくとも二桁小さいＫDまたはＫoffを有するｈＴＦに結合する場合にはｈＴＦに優先的に結合すると考えられうる。
【００４１】
本発明の抗体もそのｈＴＦへの結合親和性に関して記載または特定されうる。一部の実施形態においては、結合親和性は、５×１０-2Ｍ、１０-2Ｍ、５×１０-3Ｍ、１０-3Ｍ、５×１０-4Ｍ、または１０-4Ｍより小さい、またはこれに等しい解離定数すなわちＫDを有するものを含む。他の実施形態においては、親和性は、５×１０-5Ｍ、１０-5Ｍ、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０7Ｍ、５×１０-8Ｍまたは１０-8Ｍよりも小さい、またはこれに等しい解離定数すなわちＫDを有するものを含む。さらに他の実施形態においては、結合親和性は、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×ｌ０-l4Ｍ、１０-14Ｍ、５×ｌ０-l5Ｍ、または１０-15Ｍより小さい、またはこれに等しい解離定数すなわちＫDを有するものを含む。
【００４２】
一部の実施形態においては、本発明の抗体は、５×１０-2秒-1、１０-2秒-1、５×１０-3秒-1、または１０-3秒-1より小さい、またはこれに等しいオフレート（Ｋoff）を有するｈＴＦポリペプチドに結合しうる。他の実施形態においては、本発明の抗体は、５×１０-4秒-1、１０-4秒-1、５×１０-5秒-1、または１０-5秒-1５×１０-6秒-1、１０-6秒-1、５×１０-7秒-1または１０-7秒-1より小さい、またはこれに等しいオフレート（Ｋoff）を有するｈＴＦポリペプチドまたはその断片に結合しうる。
【００４３】
本発明の一部の実施形態においては、ｈＴＦに免疫特異的に結合する抗体は、本発明の細胞株を発現する抗ＴＦ抗体によって発現される重鎖のいずれか１つおよび／または本発明の細胞株を発現する抗ＴＦ抗体によって発現される軽鎖のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有し得る。本発明の他の実施形態においては、ｈＴＦに免疫特異的に結合する抗体は、本発明の細胞株を発現する抗ＴＦ抗体によって発現される重鎖のＶＨドメインのいずれか１つおよび／または本発明の細胞株を発現する抗ＴＦ抗体によって発現される軽鎖のＶＬドメインのいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有し得る。さらに他の実施形態においては、本発明の抗体は、本発明の細胞株を発現する単一の抗ＴＦ抗体によって発現されるＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を含有し得る。他の実施形態においては、本発明の抗体は、本発明の細胞株を発現する２つの異なる抗ＴＦ抗体によって発現されるＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列を含有し得る。ｈＴＦに免疫特異的に結合する本発明の細胞株を発現する抗ＴＦ抗体によって発現されるＶＨおよび／またはＶＬドメインの抗原結合抗体断片を含む、あるいはこれから成る分子も、これらのＶＨおよびＶＬドメイン、分子、および／または断片をコードする核酸分子のように、本発明によって包含される。
【００４４】
本発明は、本明細書に記載されている抗体分子（例えば、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン）の変形（誘導体を含む）を含む、あるいはこれから成るポリペプチドも提供し、このポリペプチドはｈＴＦもしくはその断片または変異体に免疫特異的に結合する。「変異体」という用語は、対応する天然ポリペプチドまたはＤＮＡ配列と比べそのアミノ酸またはヌクレオチド配列において少なくとも１つもしくはそれ以上の差異を有する分子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列）を指す。本発明のアミノ酸配列変異体は、本発明の抗ＴＦ抗体のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。実質的な変異体は、除去された天然配列において少なくとも１つのアミノ酸残基、および同じ位置でその場所において挿入された異なるアミノ酸を有するものである。置換は、分子において１つのみのアミノ酸が置換されているという単一であってもよく、または同じ分子において２つもしくはそれ以上のアミノ酸が置換されているという多重であってもよい。挿入変異体は、アミノ酸のα−カルボキシルまたはα−アミノ官能基のいずれかに結合されている天然アミノ酸配列における特定の位置でアミノ酸に直接隣接して挿入された１つもしくはそれ以上のアミノ酸を有するものである。欠失変異体は、天然アミノ酸配列から除去された１つもしくはそれ以上のアミノ酸を有するものである。通常、欠失変異体は分子の特定の領域において欠失された１つもしくは２つのアミノ酸を有する。例えば、結果としてアミノ酸置換が生じるコード核酸分子の部位指定変異導入またはＰＣＲ介在変異導入によることを含む、当業者に周知の標準技術を使用して本発明の抗体に変異を導入することができる。一部の実施形態においては、変異体（誘導体を含む）は、５０未満のアミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満のアミノ酸置換、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換を他の基準ポリペプチドに対して有する。一部の実施形態においては、変異体ポリペプチドは同じ免疫特異性を有し、または本発明のポリペプチドと同じエピトープに結合する。
【００４５】
同様のアミノ酸を有するポリペプチド、もしくはその断片または変異体が同様の構造および同じ生物活性の多くを有しうることが技術上周知である。したがって、本発明はさらに、単離された一次抗体、またはその抗原結合断片に関し、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二次抗体と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する。すなわち、（ａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６（２００３年５月１５日寄託、ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５１９６）によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０（２００３年５月１５日寄託、ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５１９７）によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８（２００３年１２月３日寄託、ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６７６）によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７（２００３年１２月３日寄託、ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６７５）によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２（２００３年１２月３日寄託、ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６７７）によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９（２００３年１２月３日寄託、ＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６７４）によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｋ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｌ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｍ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｎ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｏ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｐ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｑ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｒ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｓ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｔ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｕ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｖ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｗ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｘ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｙ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｚ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ａａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｂｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｃｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｄｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｅｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｆｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｇｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｈｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｊｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域。一部の実施形態においては、一次抗体、またはその抗原結合断片は、同じ免疫特異性を有し、または二次抗体と同じエピトープに結合する。
【００４６】
本発明は、単離された抗体、またはその抗原結合断片に関し、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。すなわち、（ａ）配列番号：６もしくは８のポリペプチド、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５２もしくはＰＴＡ−５２５３でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ２６０ＶＨ／ＰＵＣ１８またはＴＦ２６０ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｂ）配列番号６もしくは８のポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５２もしくはＰＴＡ−５２５３でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ２６０ＶＨ／ＰＵＣ１８またはＴＦ２６０ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｃ）配列番号６もしくは８のポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５２もしくはＰＴＡ−５２５３でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ２６０ＶＨ／ＰＵＣ１８またはＴＦ２６０ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｄ）配列番号：６もしくは８の変異体であるポリペプチド、（ｅ）配列番号６もしくは８の種同族体であるポリペプチド、（ｆ）配列番号：１０もしくは１２のポリペプチド、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５０もしくはＰＴＡ−５２５１でそれぞれ包含されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８またはＴＦ１９６ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｇ）配列番号：１０もしくは１２のポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５０もしくはＰＴＡ−５２５１でそれぞれ包含されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８またはＴＦ１９６ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｈ）配列番号：１０もしくは１２のポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５０もしくはＰＴＡ−５２５１でそれぞれ包含されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８またはＴＦ１９６ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｉ）配列番号：１０もしくは１２の変異体であるポリペプチド、（ｊ）配列番号：１０もしくは１２の種同族体であるポリペプチド、（ｋ）配列番号：１９もしくは２１のポリペプチド、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９４もしくはＰＴＡ−５６９５でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ２７８ＶＨｓ／ＰＵＣ１８またはＴＦ２７８ＶＬｓ／ＰＵＣ１８）、（ｌ）配列番号：１９もしくは２１のポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９４もしくはＰＴＡ−５６９５でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ２７８ＶＨｓ／ＰＵＣ１８またはＴＦ２７８ＶＬｓ／ＰＵＣ１８）、（ｍ）配列番号：１９もしくは２１のポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９４もしくはＰＴＡ−５６９５でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ２７８ＶＨｓ／ＰＵＣ１８またはＴＦ２７８ＶＬｓ／ＰＵＣ１８）、（ｎ）配列番号：１９もしくは２１の変異体であるポリペプチド、（ｏ）配列番号１９もしくは２１の種同族体であるポリペプチド、（ｐ）配列番号：２３もしくは２５のポリペプチド、（ｑ）配列番号：２３もしくは２５のポリペプチドドメイン、（ｒ）配列番号：２３もしくは２５のポリペプチドエピトープ、（ｓ）配列番号：２３もしくは２５の変異体であるポリペプチド、（ｔ）配列番号：２３もしくは２５の種同族体であるポリペプチド、（ｕ）配列番号：２７のポリペプチド、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９６で提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（ＴＦ３９２ＶＨｓ／ＰＵＣ１８）、（ｖ）配列番号：２７のポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９６で提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（ＴＦ３９２ＶＨｓ／ＰＵＣ１８）、（ｗ）配列番号：２７のポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９６で提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（ＴＦ３９２ＶＨｓ／ＰＵＣ１８）、（ｘ）配列番号：２７の変異体であるポリペプチド、（ｙ）配列番号：２７の種同族体であるポリペプチド、（ｚ）配列番号：２９もしくは３１のポリペプチド、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９２もしくはＰＴＡ−５６９３でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ９ＶＨｓ／ＰＵＣ１８またはＴＦ９ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ａａ）配列番号：２９もしくは３１のポリペプチドドメイン、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９２もしくはＰＴＡ−５６９３でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ９ＶＨｓ／ＰＵＣ１８またはＴＦ９ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｂｂ）配列番号：２９もしくは３１のポリペプチドエピトープ、またはＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９２もしくはＰＴＡ−５６９３でそれぞれ提供されるｃＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド（それぞれ、ＴＦ９ＶＨｓ／ＰＵＣ１８またはＴＦ９ＶＬ／ＰＵＣ１８）、（ｃｃ）配列番号：２９もしくは３１の変異体であるポリペプチド、および（ｄｄ）配列番号：２９もしくは３１の種同族体であるポリペプチド。一部の実施形態においては、抗体、またはその抗原結合断片は同じ免疫特異性を有し、または配列番号：６、８、１０、１２、１９、２１、２３、２５、２７、２９、および３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列によってコードされるポリペプチドと同じエピトープに結合する。
【００４７】
本発明は、本明細書に記載された抗体の１つもしくはそれ以上と同じ生物特性の１つもしくはそれ以上を有する抗体も包含する。「生物特性」によって、抗体のインビトロまたはインビボ活性または特性、例えば、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することなく、ＴＦ（例えば、細胞表面で発現されるｈＴＦ、または膜埋込みｈＴＦ）へ結合する能力などを意味するよう意図されている。場合により、本発明の抗体は、本明細書で特記される抗体の１つと同じエピトープへ結合しうる。かかるエピトープ結合は、技術上周知のアッセイを用いてルーチンに測定されうる。
【００４８】
本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって生成されるモノクローナル抗体の、またはこれによって認識されるエピトープへの結合を競合する、結合特性を有するモノクローナル抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって生成されるモノクローナル抗体の、またはこれによって認識されるエピトープへの結合を競合する、結合特性を有するモノクローナル抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって生成されるモノクローナル抗体の、またはこれによって認識されるエピトープへの結合を競合する、結合特性を有するモノクローナル抗体にも関する。ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって生成されるモノクローナル抗体の、またはこれによって認識されるエピトープへの結合を競合する、結合特性を有するモノクローナル抗体にも関する。ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって生成されるモノクローナル抗体の、またはこれによって認識されるエピトープへの結合を競合する、結合特性を有するモノクローナル抗体にも関する。ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって生成されるモノクローナル抗体の、またはこれによって認識されるエピトープへの結合を競合する、結合特性を有するモノクローナル抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０から得られる抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６から得られる抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８から得られる抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７から得られる抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２から得られる抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９から得られる抗体にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０から生成される抗体と同じ免疫特異性を有し、またはこれと同じエピトープに結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６から生成される抗体と同じ免疫特異性を有し、またはこれと同じエピトープに結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８から生成される抗体と同じ免疫特異性を有し、またはこれと同じエピトープに結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７から生成される抗体と同じ免疫特異性を有し、またはこれと同じエピトープに結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２から生成される抗体と同じ免疫特異性を有し、またはこれと同じエピトープに結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９から生成される抗体と同じ免疫特異性を有し、またはこれと同じエピトープに結合する抗体を生成するハイブリドーマ細胞株にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２にも関する。本発明は、ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９にも関する。本発明は、配列番号：６、８、１０、１２、１９、２１、２３、２５、２７、２９、または３１のアミノ酸配列を含む抗体にも関する。アメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）（ＡＴＣＣ）は、米国、２０１１０−２２０９、バージニア州（ＶＡ）、マナッサス（Manassas）１０８０１ユニバーシティブールバード（University Boulevard）にある。
【００４９】
抗体を生成する方法
本発明の抗体は、抗体の合成のための技術上周知の任意の方法によって、例えば、化学合成によって、または組換え発現技術によって生成されうる。他の実施形態においては、多重部位でのマウスの迅速免疫（ＲＩＭＭＳ）が使用されうる。例えば、キルパトリック（Kilpatrick）,K.E.ら、Hybridoma 16、p.381-389（1997年）を参照。さらに他の実施形態においては、抗体を生成する方法としては、ハイブリドーマ技術、ＥＢＶ形質転換、ゼノマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）（商標）技術（グリーン（Green）ら、Nature Genetics 7、p.13-21（1994年）参照、および本明細書で論じられた他の方法、ならびに以下で論じられる組換えＤＮＡ技術の使用によるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の抗体は技術上周知の適切な任意の方法によって生成されうる。目的とする抗原に対するポリクローナル抗体は技術上周知の種々の手段によって生成されうる。例えば、目的とするポリペプチドは、ウサギ、マウス、ラット等を含むが、これらに限定されない種々の宿主動物に投与され、抗原に特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘発しうる。種々のアジュバントを使用して、宿主種に応じて免疫応答を増大させることができ、これには、フロイント（完全および不完全）アジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質のほか、ＢＣＧ（カルメットゲラン菌）およびコリネバクテリウムパルヴムなどの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。かかるアジュバントも技術上周知である。
【００５１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはその組合せの使用を含む技術上周知の多種多様の技術を用いて調製されうる。例えば、モノクローナル抗体は、技術上周知であり、かつ、例えば、ハーロー（Harlow）ら、抗体：実験室マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual）収載、（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、第２版（1988年））、ハマーリング（Hammerling）ら、モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas）収載、エルゼビア（Elsevier）、ニューヨーク（1981年）、p.563-681に開示されているものを含むハイブリドーマ技術を用いて生成されうる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術により生成される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、真核、原核、またはファージクローンを含む単一クローン由来である抗体を指し、生成される方法を指すものではない。
【００５２】
ハイブリドーマ技術を用いた特異的抗体の生成およびスクリーニング方法はルーチンかつ技術上周知である。非限定的実施例においては、マウスは目的とするポリペプチド、またはかかるペプチドを発現する細胞で免疫されうる。免疫応答が検出され、例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清で検出されると、マウス脾臓が摘出され、かつ脾細胞が単離される。次いで、脾細胞は周知の技術によって適切な骨髄腫細胞、例えば、マウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８．６５３、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８０、バージニア州（ＶＡ）、マナッサス（Manassas）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５８１、バージニア州（VA）、マナッサス（Manassas）、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）、ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−１８、バージニア州（VA）、マナッサス（Manassas））に融合される。ハイブリドーマが選択され、制限希釈によってクローン化される。次いで、ハイブリドーマクローンは、目的とするポリペプチドに結合可能な抗体を分泌する細胞について技術上周知の方法によって分析される。一般に高レベルの抗体を含有する腹水は、陽性ハイブリドーマクローンをマウスに注射することによって生成されうる。
【００５３】
したがって、本発明は、モノクローナル抗体、および本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養するステップを含む方法によって生成される抗体を生成する方法を提供し、ここでハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫された哺乳動物から単離された脾細胞またはリンパ節細胞を骨髄腫細胞と融合し、次いで目的とするポリペプチドに結合することが可能な抗体を分泌するハイブリドーマクローンのための融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングすることによって生成される。
【００５４】
ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法を含む技術上周知のさまざまな方法によって製造されうる。米国特許第４，４４４，８８７号明細書および同第４，７１６，１１１号明細書、およびＰＣＴ公開国際公開第９８／４６６４５号パンフレット、国際公開第９８／５０４３３号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９８／１６６５４号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、および国際公開第９１／１０７４１号パンフレットも参照。さらに、抗体は、例えば、ＣＤＲグラフト法（欧州特許第２３９，４００号明細書、ＰＣＴ公開国際公開第９１／０９９６７号明細書、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、同第５，５３０，１０１号明細書、および同５，５８５，０８９号明細書）、ベニヤリング（veneerinｇ）法または再サーフェシング（resurfacing）法（欧州特許第５９２，１０６号明細書、欧州特許第５１９，５９６号明細書、パドラン（Padlan）、Molecular Immunology 28(4/5)、p.489-498（1991年）、ストゥドニチカ（Studnicka）ら、Ｐrotein Engineering 7(6)、p.805-814（1994年）、ログスカ（Roguska）ら、PNAS 91、p.969-973（1994年））、およびチェーンシャフリング（chain shuffling）法（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）を含む技術上周知のさまざまな技術を用いてヒト化されうる。
【００５５】
ヒト抗体は、機能的内在性免疫グロブリンを発現する能力がないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現できる遺伝子導入マウスを用いて生成されうる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、無作為に、または相同組換え法によってマウス胚幹細胞へ導入されうる。あるいは、ヒト可変領域および定常領域をコードする核酸を、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えてマウス胚幹細胞へ導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換え法によるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別々に、またはこれと同時に非機能的になる。一部の実施形態においては、ＪＨ領域のホモ接合体欠失が内在性抗体産生を阻止する。修飾胚幹細胞は拡大され、胚盤胞へ微量注入され、キメラマウスを生成する。次いで、キメラマウスは、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生成するように育てられる。遺伝子導入マウスは正常なやり方で選択抗原、例えば、目的とするポリペプチドの全部または一部で免疫される。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて免疫された遺伝子導入マウスから得られうる。遺伝子導入マウスによって育まれたヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再構成し、その後にクラススイッチおよび体細胞変異を受ける。したがって、かかる技術を用いることによって、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概観については、ロンベルグ（Lonberg）とフサール（Huszar）、Int.Rev.Immunol.13、p.65-93（1995年）を参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術、およびかかる抗体を生成するためのプロトコールの詳細な考察については、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット、欧州特許第０５９８８７７号明細書、米国特許第５，４１３，９２３号明細書、同５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８８５，７９３号明細書、同第５，９１６，７７１号明細書、同第５，９３９，５９８号明細書、同第６，０７５，１８１号明細書、および同第６，１１４，５９８号明細書を参照。
【００５６】
選択エピトープを認識する完全ヒト抗体は、「誘導選択」と呼ばれる技術を用いて生成されうる。この方法において、選択されたヒト以外のモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を使用して同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（ジェスパース（Jespers）ら、Bio/technology 12、p.899-903（1988年））。
【００５７】
一本鎖Ｆｖｓおよび抗体を生成するために使用されうる技術の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号明細書および同第５，２５８，４９８号明細書、ヒューストン（Huston）ら、Methods in Enzymology 203、p.46-88（1991年）、シュー（Shu）ら、PNAS 90、p.7995-7999（1993年）、およびスケラ（Skerra）ら、Science 240、p.1038-1040（1998年）に記載されたものが挙げられる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を結合することによって形成され、結果として一本鎖ポリペプチドが生じる。大腸菌（E.coli）における機能的Ｆｖ断片のアセンブリのための技術も使用されうる（スケラ（Skerra）ら、Science 242、p.1038-1041（1998年））。
【００５８】
さらに、キメラ抗体を生成するための方法は技術上周知である。例えば、モリソン（Morrison）、Science 229、p.1202（1985年）、オイ（Oi）ら、BioTechniques 4、p.214（1986年）、ジリス（Gillies）ら、J.Immunol.Methods 125、p.191-202（1989年）、ノイベルガー（Neuberger）ら、Nature 312、p.604-608（1984年）、タケダ（Takeda）ら、Nature 314、p.452-454（1985年）、米国特許第５，８０７，７１５号明細書、同第４，８１６，５６７号明細書、および同第４，８１６，３９７号明細書を参照。
【００５９】
本発明の抗体分子が動物によって生成され、化学的に合成され、または組換え技術によって発現されていると、免疫グロブリン分子の精製のための技術上周知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差別的溶解度（differential solubility）によって、またはタンパク質の精製のための他の標準技術によって精製されうる。さらに、本発明の抗体またはその断片は、本明細書に記載された、またはその他技術上周知の異種ポリペプチド配列に融合され、精製を促進しうる。
【００６０】
抗体をコードする核酸分子およびそのポリペプチド
本発明はさらに、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。一部の実施形態においては、単離されたポリヌクレオチド分子は、配列番号５、７、９、または１１のヌクレオチド配列（それぞれ、ＴＦ２６０ＶＨ／ＰＵＣ１８、ＴＦ２６０ＶＬ／ＰＵＣ１８、ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８、またはＴＦ１９６ＶＬ／ＰＵＣ１８で提供、それぞれＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５２、ＰＴＡ−５２５３、ＰＴＡ−５２５０、またはＰＴＡ−５２５１として２００３年６月６日寄託）、または配列番号１８、２０、２６、２８、または３０のヌクレオチド配列（それぞれ、ＴＦ２７８ＶＨｓ／ＰＵＣ１８、ＴＦ２７８ＶＬｓ／ＰＵＣ１８、ＴＦ３９２ＶＨｓ／ＰＵＣ１８、ＴＦ９ＶＨｓ／ＰＵＣ１８またはＴＦ９ＶＬ／ＰＵＣ１８で提供、それぞれＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９４、ＰＴＡ−５６９５、ＰＴＡ−５６９６、ＰＴＡ−５６９２、またはＰＴＡ−５６９３として２００３年１２月９日寄託）、または配列番号２２もしくは２４のヌクレオチド配列、または配列番号６、８、１０、１２（それぞれ、ＴＦ２６０ＶＨ／ＰＵＣ１８、ＴＦ２６０ＶＬ／ＰＵＣ１８、ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８、またはＴＦ１９６ＶＬ／ＰＵＣ１８によってコードされ、それぞれＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５２５２、ＰＴＡ−５２５３、ＰＴＡ−５２５０、またはＰＴＡ−５２５１として２００３年６月６日寄託）、１９、２１、２７、２９、３１（それぞれ、ＴＦ２７８ＶＨｓ−ＰＵＣ１８、ＴＦ２７８ＶＬｓ−ＰＵＣ１８、ＴＦ３９２ＶＨｓ−ＰＵＣ１８、ＴＦ９ＶＨｓ−ＰＵＣ１８、またはＴＦ９ＶＬ−ＰＵＣ１８によってコードされ、それぞれＡＴＣＣ寄託番号：ＰＴＡ−５６９４、ＰＴＡ−５６９５、ＰＴＡ−５６９６、ＰＴＡ−５６９２、またはＰＴＡ−５６９３として２００３年１２月９日寄託）、２３もしくは２５（縮重変異体を含む）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００６１】
本発明はさらに、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む二次抗体のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する一次抗体、またはその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。すなわち、（ａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｋ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｌ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｍ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｎ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｏ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｐ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｑ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｒ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｓ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｔ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｕ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｖ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｗ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｘ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｙ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｚ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ａａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｂｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｃｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｄｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｅｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｆｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｇｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｈｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、および（ｊｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域。一部の実施形態においては、一次抗体、またはその抗原結合断片は、同じ免疫特異性を有し、または二次抗体と同じエピトープに結合する。
【００６２】
本発明はさらに、以下よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドに関する。すなわち、（ａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｋ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｌ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｍ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｎ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｏ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｐ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｑ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｒ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｓ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｔ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｕ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｖ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｗ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｘ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つのＣＤＲ領域、（ｙ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｚ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ａａ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｂｂ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｃｃ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｄｄ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも２つのＣＤＲ領域、（ｅｅ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｆｆ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｇｇ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｈｈ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７７によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｉｉ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域、（ｊｊ）ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも３つのＣＤＲ領域。一部の実施形態においては、単離されたポリヌクレオチドは、本発明の抗体のＶＨドメインまたはＶＬドメインのいずれかと同じ免疫特異性を有するＣＤＲ領域を有する抗体、もしくはその抗原結合断片をさらにコードし、またはこれと同じエピトープに結合するアミノ酸配列をコードする。
【００６３】
本発明はさらに、正常血漿対照と比べ正常なＴＦ介在血液凝固を阻害することなくｈＴＦに結合し、かつ場合によりＦｃ介在機序を開始しうる抗原結合抗体断片をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子に関する。本発明はさらに、ストリンジェントな条件下で配列番号：５、７、９、１１、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズしうるとともに、正常血漿対照と比べ正常なＴＦ介在血液凝固を阻害することなくｈＴＦに結合し、かつ場合によりＦｃ介在機序を開始しうるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチド分子に関する。本発明はさらに、配列番号：５、７、９、１１、１８、２０、２２、２４、２６、２８、または３０のいずれかと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するとともに、正常血漿対照と比べ正常なＴＦ介在血液凝固を阻害することなくｈＴＦに結合し、かつ場合によりＦｃ介在機序を開始しうるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子に関する。
【００６４】
技術上周知のように、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」は、１つのポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列を第２のポリヌクレオチド分子の配列と比較することによって決定される。本明細書で論じられる場合、特定のヌクレオチド配列が別のヌクレオチドと同一であるかどうかは、技術上周知の方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定されうる。例えば、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（ウィスコンシン（Wisconsin）配列分析パッケージ、ユニックス用バージョン８、ジェネティクス  コンピュータ  グループ（Genetics Computer Group）、ユニバーシティーリサーチパーク（University Research Park）、５７５サイエンス  ドライブ（Science Drive）、ウィスコンシン州（WI）５３７１１、マディソン（Madison））などであるが、これらに限定されない。ＢＥＳＴＦＩＴでは、スミス（Smith）とウォーターマン（Waterman）のローカルホモロジーアルゴリズム、Advances in Applied Mathematics 2、p.482-489（1981年）を使用し、２つの配列間のホモロジーの最良のセグメントを見出す。ＢＥＳＴＦＩＴまたは他の配列調整プログラムを用いて、特定の配列が、例えば、本発明による基準配列と９５％同一であるかどうかを判定する場合、パラメータは、もちろん、同一性の割合が基準ポリペプチド配列の完全長にわたって計算され、かつ基準配列における核酸の総数の５％までのホモロジーのギャップが許されるように設定されている。
【００６５】
本明細書で使用される「ストリンジェントな条件」は、第１のポリヌクレオチド分子がハイブリダイズし、６５℃で０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の第２のフィルター結合ポリヌクレオチド分子に結合されたまま、４２℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄することを指す（オースベル（Ausubel）ら（編）、Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ株式会社（Green Publishing Associates,Inc.）およびジョン・ワイリー＆サンズ株式会社（John Wiley&Sons,Inc．）、ニューヨーク（1989年）、p.2.10.3）。
【００６６】
本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクター、およびベクターを含む宿主細胞にも関する。宿主細胞は、例えば、クローニングベクターまたは発現ベクターでありうる本発明のベクターで遺伝子組換え（形質導入、形質転換、またはトランスフェクト）されている。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等の形でありうる。組換え宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、または本発明の遺伝子を増幅するために必要に応じて変更される従来の栄養培養液で培養されうる。培養条件、例えば、温度、ｐＨ等は、発現用に選択された宿主細胞とともに以前に使用されたものでありうるとともに、当業者には自明であろう。
【００６７】
本発明はさらに、（ａ）本発明の単離されたポリヌクレオチドによってコードされた抗体を発現するステップと、（ｂ）抗体を回収するステップとを含む本発明の抗体を製造する方法に関する。
【００６８】
本発明のポリペプチドの断片または部分は、ペプチド合成によって対応する完全長ポリペプチドを生成するために使用されうるため、断片は完全長ポリペプチドを生成するための中間体として使用されうる。本発明のポリヌクレオチドの断片または部分を使用して本発明の完全長ポリヌクレオチドを合成することができる。
【００６９】
本発明のポリヌクレオチド分子は、組換え技術によってポリペプチドを生成するために使用されうる。したがって、例えば、ポリヌクレオチド分子はポリペプチドを発現させるためのさまざまな発現ベクターのいずれか１つに包含されうる。かかるベクターとしては、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡの組合せ由来のベクター、ウイルスＤＮＡ、例えば、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病が挙げられる。しかし、それが複製可能であり、かつ宿主において生存可能である限り他の任意のベクターが使用されうる。
【００７０】
適切なＤＮＡ配列はさまざまな手段によってベクターへ挿入されうる。一般に、ＤＮＡ配列は、技術上周知の手段によってベクターにおける適切な制限エンドヌクレアーゼ部位へ挿入されている。かかる手段およびその他は当業者の範囲内であると考えられる。
【００７１】
発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を方向づける適切な発現制御配列（プロモーター）に作動的に結合されている。かかるプロモーターの代表例としては、ＬＴＲまたはＳＶ４０プロモーター、大腸菌（E.coli）ｌａｃまたはｔｒｐ、ファージラムダＰLプロモーター、および原核もしくは真核細胞またはそのウイルスにおける遺伝子の発現を制御することが知られる他のプロモーターが言及されうる。発現ベクターは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写ターミネーターをも含有すべきである。ベクターは、上記のように、発現を増幅させるための適切な配列をも含みうる。
【００７２】
さらに、発現ベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素など形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質もしくは真核細胞培養のためのネオマイシン耐性、または大腸菌（E.coli）におけるテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性を提供する１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有しうる。
【００７３】
上記の適切なＤＮＡ配列、および適切なプロモーター、または制御配列を含有するベクターを使用して適切な宿主細胞に形質転換させ、宿主細胞がタンパク質を発現することを可能にする。多数の適切なベクターおよびプロモーターは当業者に周知であり、かつ市販されている。以下のベクターは一例として示されている。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（キアゲン（Qiagen））、ｐＢＳ、ｐＤｌ０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（ストラタジーン（Stratagene））；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（ファルマシア（Pharmacia））。真核：ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ、ｐＳＧ（ストラタジーン（Stratagene））ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（ファルマシア（Pharmacia））。しかし複製可能であり、かつ宿主で安定である限り、任意の他のプラスミドまたはベクターは、使用されうる。
【００７４】
プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコール転移酵素）ベクターまたは他のベクターを選択可能なマーカーとともに用いて所望の任意の遺伝子から選択されうる。２つの適切なベクターはＰＫＫ２３３−８およびＰＣＭ７である。特に指名された細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰR、ＰLおよびｔｒｐが挙げられる。真核プロモーターとしては、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクターおよびプロモーターの選択は当業者の十分にレベル内である。プロモーターは、糖分解酵素、例えば、特に３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質等をコードするオペロン由来でありうる。発現される異種構造配列は、翻訳開始および終了配列、かつ、必要に応じて、翻訳タンパク質の分泌を細胞膜周辺腔または細胞外培地へ方向づけることが可能なリーダー配列と適切な段階でアセンブルされる。場合により、異種配列は、所望の特性、例えば、発現組換え生産物の安定化または簡易化精製を与えるＮ末端またはＣ末端識別ペプチドを含む融合タンパク質をコードしうる。
【００７５】
別の実施形態においては、本発明は上記の構築物を含有する宿主細胞に関する。宿主細胞は、哺乳動物細胞など高等真核細胞、または酵母細胞など下等真核細胞であり、または宿主細胞は細菌細胞など原核細胞でありうる。宿主細胞への構築物の導入は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、またはエレクトロポレーションなど任意の適切な技術によって達成されうる。（デービス（Davis），Ｌ．ら、Basic Methods in Molecular Biology、（1986年））。
【００７６】
適切な宿主の代表例としては、大腸菌（E.coli）、ストレプトミセス（Streptomyces）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ショウジョウバエ（Drosophila）およびシロイチモンジョトウ（Spodoptera）Ｓｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、またはボウズ（Bowes）メラノーマなど動物細胞、植物細胞等が言及されうる。適切な宿主の選択は、本明細書の開示から当業者の範囲内にあると考えられる。種々の哺乳動物細胞培養系も組換えタンパク質を発現させるために使用されうる。哺乳動物発現系の例としては、グルッツマン（Gluzman）、Cell 23、p.175（1981年）によって記載されたサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７株、および適合ベクターを発現させることが可能な他の細胞株、例えば、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーター、およびエンハンサーのほか、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列、および５’フランキング非転写配列を含む。ＳＶ４０スプライス由来のＤＮＡ配列、およびポリアデニル化部位を使用して必要な非転写遺伝子要素を提供することができる。
【００７７】
宿主細胞における構築物を従来のやり方で使用し、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生成することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは従来のペプチド合成装置によって合成的に生成されうる。
【００７８】
成熟タンパク質は、適切なプロモーターの制御下に哺乳動物の細胞、酵母、細菌、または他の細胞で発現されうる。セルフリー翻訳系も使用し、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いてかかるタンパク質を生成することができる。原核および真核宿主と使用するための適切なクローニングおよび発現ベクターは、サムブルック（Sambrook）ら、分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning:A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring Harbor）、ニューヨーク（N.Y.）、（１９８９年）によって記載されている。
【００７９】
高等真核細胞によって本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターへ挿入することによって増大されうる。エンハンサーはＤＮＡのｃｉｓ作用要素であり、通常、約１０〜３００ｂｐであり、プロモーター上で作用し、その転写または発現の増幅を増大させる。例としては、複製起点ｂｐ１００〜２７０の後側でのＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側でのポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【００８０】
適切な宿主形質の変換、および宿主形質の適切な細胞密度への増殖の後、選択プロモーターは適切な手段（例えば、温度変化、化学的誘導）によって誘導されうるとともに、細胞は追加の期間、培養される。
【００８１】
所望のタンパク質が細胞内に保持されている場合、細胞は通常、遠心分離によって収穫され、物理的または化学的手段によって破壊され、結果として生じる粗抽出物がさらなる精製のため保持される。タンパク質の発現において使用される微生物細胞は、凍結融解循環、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用、またはその組合せを含めた便利な方法によって破壊される。かかる方法は当業者に周知である。
【００８２】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって組換え細胞培養から回収され、精製されうる。タンパク質再折畳みステップが、必要に応じて、成熟タンパク質の立体配置の仕上げに使用されうる。最後に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップに使用されうる。
【００８３】
本発明のポリペプチドは天然精製産物、または化学合成手段の産物でありうるが、原核または真核宿主から組換え技術によって（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の培養細胞によって）生成されうる。組換え生成法において使用される宿主に応じて、本発明のポリペプチドは糖化され、または非糖化されうる。本発明のポリペプチドは初期メチオニンアミノ酸残基をも含みうる。
【００８４】
抗体複合体
本発明の抗体を使用して、インビトロおよびインビボ両方の診断および治療方法において、ｈＴＦを精製、検出、および／または標的にすることができる。例えば、抗体は、生物試料におけるｈＴＦのレベルを質的および量的に測定するための免疫アッセイにおいて有用でありうる。例えば、ハーロー（Harlow）ら、抗体：実験室マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual）収載、（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、第２版（1988年））を参照。
【００８５】
本発明の抗体は、任意の型の分子の抗体への共有結合によって修飾または結合される抗体の誘導体を含む。例えば、ただし限定する目的ではなく、抗体誘導体は、例えば、糖化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、周知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質への結合等によって修飾されている抗体を含む。多くの化学的修飾のいずれかは、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成等を含むが、これらに限定されない周知の技術によって実施されうる。さらに、誘導体は１つもしくはそれ以上の非典型的アミノ酸を含有しうる。
【００８６】
本発明の抗体は、抗体によって結合されたエピトープを同定するエピトープマッピングに使用されうる。このようにして同定されたエピトープは、同様に、ワクチン候補として、すなわち、個体に免疫し、自然発生形態のｈＴＦに対する抗体を誘発させるために使用されうる。
【００８７】
本発明の抗体は、単独で、または他の組成物と組合わせて使用されうる。抗体は、組換え技術によって、ＮまたはＣ末端で異種ポリペプチドに融合され、もしくはポリペプチドまたは他の組成物に（共有および非共有結合を含めて）化学的に結合されうる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおける標識として、または異種ポリペプチド、薬物、放射性核種、または毒素などエフェクター分子として有用な分子に組換え技術によって融合され、または結合されうる。例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９２／０８４９５号パンフレット、国際公開第９１／１４４３８号パンフレット、国際公開第８９／１２６２４号パンフレット、米国特許第５，３１４，９９５号明細書、および欧州特許第０３９６３８７号明細書を参照。
【００８８】
一部の実施形態においては、本発明の抗体は細胞毒性剤に結合している。「細胞毒性剤」は、細胞に対して毒性あるいはほかの有害な薬剤である。例としては、放射性核種、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびそれらの類似体またはその同族体が挙げられるが、これらに限定されない。細胞毒性剤として有用な放射性核種の例としては、131Ｉ、177Ｌｕ、90Ｙ、および186Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明は、検出可能剤に結合した本発明の抗体をも包含し、ここで検出可能剤は診断または治療目的に使用されうる。抗体は、例えば、臨床試験法の一環として腫瘍の発生または進行を発見しまたは監視し、例えば、所定の治療計画の有効性を判定するために診断的に使用されうる。検出可能剤の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放出断層撮影に用いる陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能物質は、技術上周知の方法を用いて、抗体に直接的、または中間体（例えば、技術上周知のリンカー）を通じて間接的に連結または結合されうる。例えば、本発明による診断薬として使用するための抗体に結合されうる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが挙げられ、適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、およびフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ、かつ適切な放射性物質の例としては、ヨウ素（121Ｉ、123Ｉ、125Ｉ、131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、イオウ（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（111Ｉｎ、112Ｉｎ、113mＩｎ、115mＩｎ）、テクネチウム（99Ｔｃ、99mＴｃ）、タリウム（201Ｔｉ）、ガリウム（68Ｇａ、67Ｇａ）、パラジウム（103Ｐｄ）、モリブデン（99Ｍｏ）、キセノン（133Ｘｅ）、フッ素（18Ｆ）、153Ｓｍ、177Ｌｕ、159Ｇｄ、149Ｐｍ、140Ｌａ、175Ｙｂ、166Ｈｏ、90Ｙ、47Ｓｃ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、142Ｐｒ、105Ｒｈ、および97Ｒｕが挙げられる。
【００９０】
他の実施形態においては、本発明の抗体は治療薬に結合されうる。治療薬としては、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルダカルバジン）、アルキル化薬（例えば、メクロレタミン、チオエパ（thioepa）クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧ダウノマイシン）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）、および放射性核種が挙げられるが、これらに限定されない。治療薬として有用な放射性核種の例としては、131Ｉ、177Ｌｕ、90Ｙ、および186Ｒｅが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
かかる治療部分を抗体に結合させる技術は公知であり、例えば、アルノン（Arnon）ら、「癌治療における薬物の免疫標的のためのモノクローナル抗体（Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy）」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy収載、ライスフィールド（Reisfield）ら編、アランＲ．リス株式会社（Alan R.Liss,Inc.）（1985年）、p.243-256、ヘルストローム（Hellstrom）ら、「薬物送達のための抗体（Antibodies For Drug Delivery）」、Controlled Drug Delivery、第２版収載、ロビンソン（Robinson）ら編、マーセル  デッカー株式会社（Marcel Dekker,Inc）（1987年）、p.623-653、トルプ（Thorpe）、「癌治療における細胞毒性薬の抗体担体：概説（Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review）、Monoclonal Antibodies '84:Biological And Clinical Applications収載、ピンチェラ（Pinchera）ら編、（1985年）、p.475-506、「癌治療における放射性標識抗体の治療用途の分析、結果、および今後の予測（Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy）」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy収載、ボールドウィン（Baldwin）ら編、アカデミックプレス（Academic Press）（1985年）、p.303-316、およびトルプ（Thorpe）ら、「抗体−毒素複合体の調製および細胞毒性（The Preparation And Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates）」、Immunol.Rev.62、p.119-158（1982年）を参照。
【００９２】
本発明は、融合タンパク質を生成するために、目的とするポリペプチドに組換え技術で融合または化学的に結合（共有および非共有結合を含む）された本発明の抗体を包含する。融合は必ずしも直接である必要はないが、リンカー配列を通じて起こりうる。本発明の抗体は、異種タンパク質（例えば、免疫グロブリンＦｃポリペプチドまたはヒト血清アルブミンポリペプチド）のＮまたはＣ末端のいずれかに融合されうる。例えば、抗体は、アルブミン、例えば、組換えヒト血清アルブミンに融合され（例えば、米国特許第５，８７６，９６９号明細書、欧州特許第０４１３６２２号明細書、および米国特許第５，７６６，８８３号明細書を参照）、結果としてキメラポリペプチドが生じうる。他の実施形態においては、抗体は、ヒト血清アルブミンの成熟形態（すなわち、欧州特許第０３２２０９４号明細書の図１および２に示されているヒト血清アルブミンのアミノ酸１−５８５）に融合されうる。他の実施形態においては、抗体は、ヒト血清アルブミンのアミノ酸残基１−ｚを含む、あるいはこれから成るポリペプチド断片と融合されうるが、ここでｚは、米国特許第５，７６６，８８３号明細書に記載されているように３６９〜４１９の整数である。ポリペプチドまたは目的とする他の分子に融合または結合した抗体は、インビトロ免疫アッセイおよび技術上周知の方法を用いる精製方法でも使用されうる。例えば、ハーバー（Harbor）ら、上記、およびＰＣＴ公開国際公開第９３／２１２３２号明細書、欧州特許第４３９，０９５号明細書、ナラムラ（Naramura）ら、Immunol.Lett.39、p.91-99（1994年）、米国特許第５，４７４，９８１号明細書、ジリーズ（Gillies）ら、PNAS89、p.1428-1432（1992年）、およびフェル（Fell）ら、J.Immunol.146、p.2446-2452（1991年）を参照。
【００９３】
抗体は、ペプチドなどマーカー配列に融合され、精製を促進しうる。一部の実施形態においては、マーカーアミノ酸配列は、特に、ｐＱＥベクター（キアゲン株式会社（QIAGEN,Inc.）、９１３１１カリフォルニア州（CA）、チャッツワース（Chatsworth）、９２５９イートンアベニュー（Eton Avenue））で提供されるタグなどヘキサ−ヒスチジンペプチドであり、その多くは市販されている。ゲンツ（Gentz）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86、p.821-824（1989年）に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応する「HA」タグ（ウィルソン（Wilson）ら、Cell 37、p.767（1984年））、および「フラッグ」タグ（カリフォルニア州（ＣＡ）、ストラタジーン（Stratagene））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
本発明の抗体複合体は所定の生物反応を修飾するために使用されうるが、治療薬または薬物部分は典型的な化学治療薬に限定されているとは考えられていない。例えば、薬物部分は所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドでありうる。かかるタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、またはジフテリア毒素などの毒素、タンパク質、例えば、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、アポトーシス剤、例えば、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＡＩＭＩ（国際公開ＷＯ９７／３３８９９号明細書を参照）、ＡＩＭＩＩ（国際公開ＷＯ９７／３４９１１号明細書を参照）、Ｆａｓリガンド（タカハシ（Takahashi）ら、Int.Immunol.6、p.1567-1574（1994年））、ＶＥＧＩ（国際公開ＷＯ９９／２３１０５号明細書を参照）、血栓剤または血管新生阻害剤、例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン、または生物反応修飾因子、例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、または他の成長因子が挙げられうる。
【００９５】
本発明の抗体は、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に有用である固形担体にも付着されうる。かかる固形担体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、およびポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
あるいは、本発明の抗体は二次抗体に結合され、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書に記載されている抗体異種複合体を形成しうる。
【００９７】
抗体結合のアッセイ
本発明の抗体は、技術上周知の適切な方法によって免疫特異的結合について分析されうる。使用されうる免疫アッセイとして、いくつか挙げると、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウェスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル分散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイなどの競合および非競合アッセイ系に用いる技術があるが、これらに限定されない。かかるアッセイは、ルーチンかつ技術上公知である（例えば、オースベル（Ausubel）ら編、Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、ジョン・ワイリー＆サンズ株式会社（John Wiley&Sons,Inc.）、ニューヨーク（1994年）を参照）。例となる免疫アッセイが以下に簡単に記載されている（ただし、限定を目的とするよう意図されていない）。
【００９８】
免疫沈降プロトコールは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジウム酸ナトリウム）が添加されたＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはトリトン（Triton）Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５  Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２で１％トラジロール（Trasylol））など溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解し、目的とする抗体を細胞溶解物に添加し、４℃で一定時間（例えば、１−４時間）インキュベートし、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加し、約１時間もしくはそれ以上、４℃でインキュベートし、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、かつＳＤＳ／サンプル緩衝液中にビーズを再懸濁するステップを含む。目的とする抗体の特定の抗原を免疫沈降する能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価されうる。当業者は、抗体の抗原への結合を増大させ、バックグラウンドを減少させるよう修飾されうるパラメータに関して理解可能であろう（例えば、セファロースビーズによる細胞溶解物のプレクリアリング（pre-clearing））。さらに、免疫沈澱プロトコールに関する説明については、オースベル（Ausubel）ら編、Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、ジョン・ワイリー＆サンズ株式会社（John Wiley&Sons,Inc.）、ニューヨーク（１９９４年）、１０．１６．１を参照。
【００９９】
ウェスタンブロット分析は一般に、タンパク質試料の調製と、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中のタンパク質試料の電気泳動するステップと、タンパク質試料をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロンなど膜へ移動させるステップと、膜をブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは脱脂乳を含むＰＢＳ）中でブロッキングするステップと、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で膜を洗浄するステップと、培養緩衝液で希釈した一次抗体（目的とする抗体）で膜をインキュベートするステップと、洗浄緩衝液で膜を洗浄するステップと、酵素物質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）に結合した（一次抗体、例えば、抗ヒト抗体を認識する）二次抗体または培養緩衝液で希釈した放射性分子（例えば、32Ｐまたは125Ｉ）で膜をインキュベートするステップと、洗浄緩衝液で膜を洗浄するステップと、抗原の存在を検出するステップとを含む。当業者は、検出されるシグナルを増大させ、バックグラウンドノイズを削減させるよう修飾されうるパラメータに関して理解可能であろう。さらに、ウェスタンブロットプロトコールに関する説明については、オースベル（Ausubel）ら編、Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、ジョン・ワイリー＆サンズ株式会社（John Wiley&Sons,Inc.）、ニューヨーク（1994年）、１０．８．１を参照。
【０１００】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６穴マイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし、酵素物質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）など検出可能な化合物に結合した目的とする抗体をウェルに添加し、一定時間インキュベートし、抗原の存在を検出するステップを含む。ＥＬＩＳＡにおいては、目的とする抗体は検出可能な化合物に結合される必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物に結合した（目的とする抗体を認識する）二次抗体をウェルに添加することができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体はウェルにコーティングされうる。この場合、検出可能な化合物に結合した二次抗体は、目的とする抗原のコーティングされたウェルへの添加後に添加されうる。当業者は、検出されるシグナルを増大させるよう修飾されうるパラメータ、および技術上周知のＥＬＩＳＡの他の変異形に関して理解可能であろう。さらに、ＥＬＩＳＡに関する説明については、オースベル（Ausubel）ら編、Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、ジョン・ワイリー＆サンズ株式会社（John Wiley&Sons,Inc.）、ニューヨーク（1994年）、11.2.1を参照。
【０１０１】
抗原への抗体の結合親和性および抗体抗原相互作用のオフレートは、競合結合アッセイによって測定されうる。競合結合アッセイの一例は、増大する量の非標識抗原の存在下に目的とする抗体と標識抗原（例えば、3Ｈまたは125Ｉ）、もしくはその断片、または変異形とのインキュベーション、および標識抗原に結合された抗体の検出を含む放射免疫アッセイである。ｈＴＦを目的とする抗体の親和性および結合オフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから測定されうる。二次抗体との競合も放射免疫アッセイを用いて測定されうる。この場合、ｈＴＦは、増大する量の非標識二次抗体の存在下に標識化合物（例えば、3Ｈまたは125Ｉで標識された化合物）に結合した目的とする抗体でインキュベートされる。２つの抗体間のこの種類の競合アッセイは、２つの抗体が同一の、または異なるエピトープに結合するかどうかを判定するためにも使用されうる。
【０１０２】
血液凝固
血液凝固は、３つの相互作用成分、すなわち、血管、血液凝固因子、および血小板を含む複雑な過程である。血液凝固因子は、不活性前駆体として血液中に存在するタンパク質または糖タンパク質である。出血が起こると、凝固カスケードが開始され、不活性凝固因子は活性プロテアーゼまたは酵素に変換される。
【０１０３】
凝固因子は、共同因子（カルシウム、ＴＦ、およびリン脂質など）の助けを借りて凝固カスケードにおいて順に活性化され、結果としてフィブリン塊の最終的形成が生じる。フィブリンは、血液中で不溶性であり、血小板接着および血液凝固の基礎を提供する粘着性の糸状タンパク質である。
【０１０４】
出血が血管系の損傷外側（皮膚の擦り傷または切り傷）から生じる場合は、外因経路が開始される。損傷が血管内部で生じる場合は、内因経路が活性化される。多くの出血エピソードは両方の経路を活性化する。
【０１０５】
外因凝固経路は、ＴＦが一部の物理的損傷後の血液にさらされると血管外細胞表面上で誘発される。ＴＦは、第ＶＩＩ因子の活性化および不活性化形態の両方に結合しうるタンパク質である。外因経路においては、少量の循環活性化第ＶＩＩ因子（第ＶＩＩａ因子）が、その放出後にＴＦと複合体を形成する。このＴＦ／第ＶＩＩａ因子複合体は、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化形態に変換することによって凝固を開始する。
【０１０６】
この反応は、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、および第Ｘａ因子がＴＦに結合した追加の第ＶＩＩ因子を活性化するフィードバック機序によって増幅される。第Ｘａ因子は、共同因子、第Ｖａ因子、およびリン脂質と複合して、カスケードにおいてプロトロンビン（第ＩＩ因子としても知られる）をトロンビン（第ＩＩａ因子としても知られる）へ活性化し続ける。トロンビンを含む別のフィードバック機序は、第Ｖ、第ＶＩＩＩ、および第ＸＩ因子を活性化するように作用する。第ＶＩＩＩａ因子は血小板表面上で第ＩＸａ因子と複合体を形成し、第Ｘ因子を活性化し、結果としてより局所のトロンビンの生成をもたらす。トロンビンは、フィブリンの最終的な生成に関与する。
【０１０７】
内因経路においては、循環活性化第ＸＩＩ因子が、高分子量のキニノゲンおよびプレカリクレインと複合して、曝露された内皮下膜と接触し、凝固を開始し、かつ第ＸＩ因子を活性化させる。第ＸＩａ因子はカルシウムと複合体を形成し、第ＩＸ因子を活性化する。第ＩＸａ因子は、第ＶＩＩＩａ因子、カルシウム、およびリン脂質と結合し、結果として第Ｘ因子の第Ｘａ因子への活性化、およびその後のトロンビン生成をもたらす。第Ｘ因子の活性化後、外因経路と内因経路は結合する。
【０１０８】
凝血塊形成の最終ステップは、ペプチド結合の切断の結果として血漿可溶性フィブリノゲンの不可溶性フィブリンへの変換である。切断は、プロトロンビンから生成されるタンパク質分解酵素トロンビンの結果として生じる。プロトロンビンのトロンビンへの変換は、カルシウムに加えて、凝固因子と呼ばれる多くのタンパク質を必要とする。フィブリン塊は、血液の形成された要素を取込み、それによって出血部位を封鎖する架橋マトリクスである。形成された要素は、血小板、白血球、および赤血球細胞から成る。
【０１０９】
ＴＦは、第ＶＩＩａ因子とともに、インビボで血液凝固を開始させる細胞固定成分である。ＴＦは、２１９残基の細胞外領域、２３残基の膜貫通領域、および２１残基の細胞質領域を有する膜貫通糖タンパク質である。ＴＦの細胞外領域は２つのフィブロネクチンＩＩＩ様ドメイン、およびクラスＩＩサイトカインとインターフェロン受容体の特徴を示すジスルフィド架橋の分布を有する。ＴＦの細胞質領域は短いが、リン酸化されうる少なくとも１つのセリン残基を含有する。ＴＦは、トロンボプラスチン、第ＩＩＩ因子、およびＣＤ１４２としても知られる。
【０１１０】
ＴＦは、その天然のリガンド、すなわち、第ＶＩＩａ因子と堅い複合体（Ｋd〜ｐｍｏｌ）を形成する。複合体において、ＶＩＩａはＴＦを包み込み（バナー（Banner），D.W.ら、Nature 380、p.41-46（1996年））、ＴＦ表面との広範囲の接触領域を形成する。ＴＦは、第ＶＩＩａ因子（ｆＶＩＩａ）に結合し、アロステリックに活性化し、ＴＦ／ｆＶＩＩａ複合体は第ＩＸおよびＸ因子の活性化によってトロンビン生成に関与し、生理的条件下に血液凝固の主要な開始剤である。ＴＦ−ＶＩＩａ相互作用部位に結合する抗体はＴＦ−ＶＩＩａ相互作用を阻害し、したがって、血液凝固を阻害または遮断しうる。本発明の抗体は、ＴＦ、例えば、ｈＴＦに結合するが、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがない。
【０１１１】
本明細書で使用される「正常血漿対照」という用語は、例えば、ジョージ・キング・バイオメディカル株式会社（George King BioMedical,Inc.）、カンザス州（Kansas）（プール正常血漿（POOLED NORMAL PLASMA））によって提供される血漿など、正常なヒトドナーからプールされた血漿を意味する。
【０１１２】
一部の実施形態においては、ＴＦ介在血液凝固に対する本発明の抗体の効果は血液凝固アッセイを用いて判定されうる。例えば、技術上周知の血液凝固アッセイ、例えば、モリセイ（Morrissey）,J.H.ら、Thrombosis Research 52、p.247-261（1988年）、およびファング（Fang),C.H.ら、Thrombosis and Haemostasis 76、p.361-368（1996年）に記載されているものなどを使用し、血液凝固に対する抗ＴＦ抗体の効果を判定することができる。他の血液凝固アッセイとしては、一段階プロトロンビン時間アッセイ（ミアール（Miale）J.B.、Laboratory Medicine，Hematology，ＣＮモスビー（Mosbey）社、セントルイス（St.Louis）（1977年）が挙げられるが、これに限定されず、二段階凝固アッセイ（バーク（Bach）ら、Biochemistry 15、p.4007-20（1986年））も使用されうる。
【０１１３】
本発明の抗体は「正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがなく」、ここで、以下の実施例の部に記載されているように行われるｈＴＦ凝固アッセイにおいて、抗体で処理した血液サンプルの凝固時間は、正常血漿対照の凝固時間の約１５０％以下、約１４０％以下、約１３０％以下、約１２０％以下、約１１０％以下、または約１００％以下である。
【０１１４】
Ｆｃ介在機序
一部の実施形態においては、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することなくｈＴＦに結合能がある本発明の抗体は、１つもしくはそれ以上のＦｃ介在機序を開始しうる。
【０１１５】
抗体が、パパインまたはペプシンなどのタンパク質分解酵素に曝露されると、いくつかの主要な断片が生成される。抗原結合能を保持する断片は、抗体のＹ構造の２つの「腕」から成り、ジスルフィド結合によって結合された２つのＦａｂ腕を表すＦ（ａｂ）（断片抗原結合）またはＦ（аｂ’）2と呼ばれる。生成される他の主要な断片は、単一の「尾」またはＹの中心軸を構成し、溶液から結晶化するその傾向に対してＦｃ（断片結晶）と呼ばれる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＤのＦｃ断片は、各抗体の２つのカルボキシル末端ドメインの二量体から成る（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤにおけるにおけるＣＨ２およびＣＨ３、およびＩｇＭにおけるＣＨ３およびＣＨ４）。それに反して、ＩｇＥ  Ｆｃ断片は、その３つのカルボキシル末端重鎖ドメイン（Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４）の二量体から成る。
【０１１６】
Ｆｃ断片は抗体の生物「活性部位」を含有するが、これは抗体が他の免疫系分子または細胞と「コミュニケートする」ことを可能にし、したがって、免疫系の防御機能または宿主介在機序を活性化し、かつ調節する。かかるコミュニケーションは、抗体Ｆｃ領域内の活性部位がＦｃ受容体と呼ばれる分子に結合する場合に生じる。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンＦｃ領域内の活性部位に高い親和性と特異性で結合する分子である。Ｆｃ受容体は細胞の外側血漿膜内の膜内在性タンパク質として存在し、または血漿もしくは他の体液中に自由に循環する自由な「可溶性」分子として存在しうる。
【０１１７】
５つの抗体クラスの各々について、そのクラスのＦｃ領域に特異的に結合し、明確な機能を実行するいくつかの型のＦｃ受容体がある。したがって、ＩｇＥ  Ｆｃ受容体は高い親和性でＩｇＥ  Ｆｃ領域または単離されたＩｇＥ  Ｆｃ断片のみに結合する。Ｆｃ領域内の異なる位置を認識し、これに結合する異なる型のクラス特異的Ｆｃ受容体が存在することが知られている。例えば、一部のＩｇＧ  Ｆｃ受容体はＩｇＧの第２の定常ドメイン（ＣＨ２）にのみ結合するが、他の免疫機能を介在するＦｃ受容体は、ＩｇＧの第３の定常のドメイン（ＣＨ３）のみに結合する。他のＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの両方に位置した活性部位に結合し、単一の単離されたドメインに結合することはできない。
【０１１８】
抗体の機能の多くは、そのＦｃ受容体との相互作用により介在される。これらの受容体は、マクロファージ、他の白血球、血小板、および胎盤栄養膜細胞を含むさまざまな細胞で見られる。
【０１１９】
抗体が抗原に結合し、あるいは凝集された後、Ｆｃ領域内の活性部位はＦｃ受容体に結合し、これを活性化することができ、抗体と免疫系の残りの部分との重要な結合を提供する。したがって、Ｆｃ受容体へのＦｃ結合は、それによって抗体機能が介在される「最終共通路」として特徴づけられうる。抗原結合抗体がＦｃ受容体に結合しない場合は、抗体は免疫系の他の部分を活性化することができず、したがって機能的に不活性にされる。
【０１２０】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、Ｆｃ受容体に結合し、複合体は細胞型に応じてさまざまな反応を誘発しうる。マクロファージの場合、反応はファゴサイトーシスおよび抗体依存細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）を含みうる。抗体Ｆｃ領域活性部位の結合によって活性化されると、Ｆｃ受容体はさまざまな重要な免疫殺傷および調節機能を介在する。例えば、一部のＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、抗体がそのＦａｂ腕によって結合した細胞の直接的殺傷を介在する（抗体依存細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ））。他のＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、ＩｇＧによって占有されると、一部の白血球を刺激し、細菌、ウイルス、癌細胞、または他の存在物をファゴサイトーシスとして知られる過程によって、これらを飲み込み、破壊する。Ｂリンパ球として知られる一部の型の白血球のＦｃ受容体は、その抗体分泌血漿細胞への成長および発達を調節する。
【０１２１】
抗体またはその活性ペプチド断片のＦｃ部分が結合する特定の型のＦｃ受容体に応じて、ペプチドは免疫機能を開始または阻害しうる。開始は、Ｆｃ受容体がＦｃ領域の結合の作用によって活性化される型である場合、あるいは、Ｆｃ活性部位ペプチドが受容体を刺激する場合に生じうる。生成される開始の型は、抗体Ｆｃ領域−Ｆｃ受容体結合によって直接的または間接的に介在される機能を含みうるが、これに限定されない。
【０１２２】
免疫系機能を開始させる能力は、上記のものを含めて、細菌、ウイルスまたは真菌などによる感染症、免疫系が先天的または後天的条件のいずれかにより不完全である状態、癌、およびヒトまたは動物の他の多くの病気など疾患の治療において治療上有用であることが知られている。かかる免疫刺激は、ワクチンとして投与される一部の注射または経口投与物質に対する体の保護細胞および抗体反応を促進するのにも有用である。このリストは包括的であることが目的ではなく、免疫刺激が治療有用性を有することが認識された疾患または状態の代表例を単に示しているにすぎない。
【０１２３】
本明細書で使用される「Ｆｃ介在機序」は、Ｆｃ受容体活性化により介在される外来抗原に対する免疫応答の開始を指す。Ｆｃ介在機序としては、抗体依存細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）および補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
一部の実施形態においては、本発明の抗体がＦｃ介在機序を開始させる場合、その機序は抗体依存細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）である。さらに他の実施形態においては、本発明の抗体は補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）を開始しうる。
【０１２５】
抗体依存細胞介在細胞毒性、または抗体依存細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）は、それによってナチュラルキラー細胞、Ｔリンパ球、単球／マクロファージ、および多形核好中球（エフェクター細胞）が外来または感染細胞を破壊するよう誘発される過程である。ＩｇＧ抗体は最初に、ＡＤＣＣを介在する細胞による認識のための細胞を感作する標的細胞上の抗原に結合しなければならない。ＩｇＧ感作標的に曝露されると同時に、ＡＤＣＣを介在する細胞上のＩｇＧ  Ｆｃ受容体は、標的細胞の表面上の曝露Ｆｃ領域に結合する。かかるＦｃ受容体結合は、ＡＤＣＣを介在する細胞を活性化し、標的細胞を直接溶解し、その死をもたらす。ＡＤＣＣとしては、白血球の一部のクラス（多形核好中球、単球、およびマクロファージ）によるファゴサイトーシスの刺激、マクロファージ活性化、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性、ＢおよびＴリンパ球の成長および発達、およびリンフォカイン（殺傷または免疫調節活性を有する分子）のリンパ球による分泌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）（または補体介在細胞毒性、または補体介在細胞溶解）は、それによって外来または感染物質が破壊されうる別の過程である。抗体抗原複合体を形成する外来抗原による抗体相互作用は、結果として抗体のＦｃ領域における構造変化が生じうる。この構造変化は補体因子Ｃ１を活性化させ、それによって、補体開始因子Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４を含む補体活性化カスケードを開始しうる。補体活性化カスケードは、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）を形成するＣ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびＣ９の連続的相互作用で終了する。ＭＡＣは細胞のリン脂質膜を破壊することによって細胞溶解を介在し、細胞膜における大きな孔を形成する。例えば、レフ（Reff），M.E.ら、Blood 83、p.435-445（1994年）を参照。このようにして、ＭＡＣ複合体は、本発明の抗体によって認識される抗原を含有する外来または感染物質の細胞死を刺激することができる。さらに、Ｃ３およびＣ４は、炎症のペプチド介在因子として作用しうるが、これは結果として局所性血管拡張、および好中球、マクロファージ、および他の食細胞の移動をもたらす過程である。これらの食細胞はＦｃ受容体を有し、それによって局所性抗体依存細胞性細胞毒性を増大させうる。
【０１２７】
一部の実施形態においては、本発明の抗体は、中程度から高いＡＤＣＣおよび／または中程度から高いＣＤＣ活性を含むが、これらに限定されない中程度から高いＦｃ介在活性を含む。本発明の抗体は、抗体濃度が１０μｇ／ｍｌであり、標的細胞に対するエフェクター細胞の比が３０であり、標的細胞の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％が溶解される場合に「中程度から高い」ＡＤＣＣ活性を有する。本発明の抗体は、抗体濃度が１０μｇ／ｍｌであり、非希釈ヒト血清またはウサギ血清の存在下、標的細胞の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％が溶解される場合に「中程度から高い」ＣＤＣ活性を有する。
【０１２８】
技術上周知のアッセイのいずれかを使用して本発明の抗体のＦｃ介在機序をモニタリングすることができる。本発明の抗体の１つもしくはそれ以上のＦｃ介在機序を開始させる能力をインビトロまたはインビボでモニタリングすることができる。例えば、抗体のＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性は、オオタ（Ohta）ら、Cancer Immunol.Immunother.36、p.260（1993年）の方法によって測定されうる。他のアッセイとしては、抗体依存細胞介在細胞毒性の51Ｃｒ放出アッセイが挙げられるがこれに限定されず、補体介在溶解も使用されうる。Current Protocols in Immunology、コリガン（Coligan）,A.M.ら（編）、ワイリー＆サンズ株式会社（Wiley&Sons,Inc.）（1991年）、例えば、７．２７部、ワング（Wang）,B.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96、p.1627-1632（1999年）、マンチェス（Manches）,O.ら、Blood 101、p.949-954（2003年）を参照。
【０１２９】
さらに、Ｆｃ介在宿主反応は、反応の抗腫瘍活性がＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣアッセイによって測定されうる従来の免疫アッセイによってインビトロでモニタリングされうる。アッセイ方法は周知であり、実験免疫学便覧（Handbook of Experimental Immunology）、第２巻、ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Blackwell Scientific Publications）、オックスフォード（Oxford）（1986年）に記載されている。さらに、培養癌細胞株に対するヒト化キメラ抗体のＣＤＣ活性およびＡＤＣＣ活性は、免疫学実験入門（Manual of Immunological Experiments）、マツハシ（Matsuhashi）ら、学会出版センター（Gakkai Shuppan Center）、日本、１９８１年）に開示された手順に従って測定されうる。
【０１３０】
Ｆｃ介在機序は、遅延型過過敏反応の進展によって、または皮膚試験反応プロトコール、標準の放射活性放出アッセイを使用することによって、制限希釈アッセイによって、または標準のＥＬＩＳＡアッセイを用いるＩＬ−２の血漿レベルを測定することによって、腫瘍細胞に対する対象のリンパ球の毒性を測定するリンパ球刺激アッセイを含むが、これに限定されない当業者に周知の他のインビボまたはインビトロ手段によってインビボでモニタリングされうる。
【０１３１】
治療用途
本発明は、患者における癌を治療する方法にも関し、この方法は、本発明の抗体の治療上有効量をかかる治療を必要とする患者に投与するステップを含む。一部の実施形態においては、この抗体に基づく治療は、本発明の抗体を動物、より詳しくは哺乳動物、より詳しくはヒト患者に、癌の治療のために投与するステップを含む。
【０１３２】
「治療上有効量」は、状態、障害、または疾患を治療するために対象または患者に投与される場合、過剰なレベルの副作用なしに臨床的に十分である細胞反応を引き起こすに十分である化合物の量である。さらに詳細については、以下の「製剤および治療投与」の部を参照。
【０１３３】
「対象」は、ヒト、家畜（domestic and farm animals）を含む哺乳動物として分類されている動物、動物園の動物、競技用動物、コンパニオンアニマル、例えば家庭のペットのほか、例えば、ウシ、ヒツジ、フェレット、ブタ、ウマ、家禽、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコなどを含むが、これらに限定されない他の飼いならされた動物を指す。一部の実施形態においては、コンパニオンアニマルはイヌおよびネコである。他の実施形態においては、対象はヒトである。
【０１３４】
「患者」は、対象、例えば、状態、障害、または疾患、例えば、癌の治療を必要とするヒトを指す。
【０１３５】
「治療する」および「治療」という用語は、治療的処置および予防的（prophylactic）または予防的（preventative）措置の両方を指し、ここで目的は、望ましくない生理的状態、障害、または疾患を予防し、阻止し、または抑制し（減少させ）、もしくは有利な、または所望の臨床結果を得ることである。本発明の目的のために、有利な、または所望の臨床結果としては、症状の軽減、状態、障害、または疾患の程度の縮小、状態、障害、または疾患の状態の安定化（すなわち悪化させないこと）、状態、障害、または疾患の進行の遅延、または減速、状態、障害、または疾患状態の改善、緩和（一部または全部に関係なく）、または状態、障害、または疾患の増強または改善が挙げられるが、これらに限定されない。治療としては、過剰なレベルの副作用なしに、臨床的に顕著である細胞反応を引き起こすことも挙げられるが、これに限定されない。治療としては、治療を受けていない場合に予想される生存に比べ生存の延長も挙げられるが、これに限定されない。
【０１３６】
本発明の治療化合物としては、本発明の抗体および本発明の抗体をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は、本明細書に記載された疾患、障害、または状態の１つもしくはそれ以上を含むがこれに限定されない癌と関係した障害または状態を治療するために使用されうる。本発明の抗体は、技術上周知の、または本明細書に記載された薬学的に許容される組成物において提供されうる。
【０１３７】
「腫瘍」および「癌」は同義的に、かつ、その文法的変形とともに使用され、ヒト、およびブタ、ネコ、イヌ、および高等霊長類を含むヒト以外の動物種の癌、肉腫、リンパ腫、および白血病を含む細胞型の腫瘍を指す。本発明の方法および組成物は、種々の細胞型の癌、肉腫、およびリンパ腫を含む広範囲の血管系（微小血管新生腫瘍）によって特徴づけられうる固形腫瘍の治療に適切である。本発明の治療によって標的化される固形腫瘍としては、扁平上皮細胞癌および類表皮癌を含む頭部頸部の癌、前立腺癌、硬性癌、乳腺腺癌を含む腺癌、リンパ肉腫、線維肉腫、平滑筋肉腫、軟骨腫、前立腺、肺、乳房、卵巣、胃、膵、喉頭、食道、精巣、肝、耳下腺、胆道、結腸、直腸、頚、子宮、子宮内膜、腎、膀胱、または甲状腺の癌、原発性腫瘍および転移、黒色腫、グリア芽細胞腫、カポジ肉腫、非小細胞肺癌、進行性悪性腫瘍、および血液性腫瘍、例えば、白血病などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明の抗体で治療されうる悪性および転移性の状態としては、悪性疾患、固形腫瘍、および本明細書に記載され、あるいは技術上周知の癌が挙げられるが、これらに限定されない（かかる障害の検討のためには、フィッシュマン（Fishman）ら、Medicine，第２版、Ｊ．Ｂ．リピンコット（Lippincott）社（Co.）、フィラデルフィア（Philadelphia）（1985年）を参照）。したがって、本発明の抗体は、癌に加えて、血管形成を含む他の疾患、障害、および／または状態の治療において有用でありうる。これらの疾患、障害、および／または状態としては、良性腫瘍、例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；アテローム硬化斑；眼内血管形成疾患、例えば、糖尿病網膜症、未熟網膜症、斑状変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、皮膚潮紅、網膜芽細胞腫、眼のブドウ膜炎および翼状片（Pterygia）（異常な血管増殖）；関節リウマチ；乾癬；創傷治癒の遅延；子宮内膜症；脈管形成；肉芽化；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管癒着；心筋血管形成；冠状側副枝；大脳側副枝；動静脈奇形；虚血性四肢血管形成；オスラー−ウェバー（Oslaer-Webber）症候群；斑状新血管形成；毛細血管拡張；血友病関節；血管線維腫；線維性筋性形成異常；創傷肉芽化；クローン病；およびアテローム硬化が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
転移の治療は、動物モデルにおける腫瘍転移を予防する本発明の抗体の能力によって示されうる。例えば、自然転移モデルおよび肺転移腫瘍モデルは技術上周知の転移モデルである。自然転移腫瘍モデルにおいては、動物には原発性腫瘤を形成する腫瘍細胞が皮下注射される。その後、腫瘍細胞の一部は、肺を含む動物の他の部分に自然に移動する。ツィスマン（Zisman）,A.ら、Cancer Research 63、p.4952-59（2003年）、レフ（Lev）,D.C.ら、Clin.Exp.Metas.20、p.515-23（2003年）を参照。肺転移腫瘍モデルにおいては、腫瘍細胞の懸濁液がマウスの尾静脈へ注射され、レシピエント動物の肺における転移の形成が評価される。ティアン（Tian）F.ら、Cancer Reseach 63、p.8284-92（2003年）、オガワ（Ogawa）,K.ら、Int.J.Cancer 91、p.797-802（2001年）を参照。これらの動物においては、転移の治療において有効である抗体が、レシピエント動物へのその投与と同時に、転移の発生を阻止し、または陰性対照が投与されたレシピエント動物で形成された転移の数と比べ形成する転移の数を減少させる。
【０１４０】
本発明の抗体を使用して、新生物を含む高増殖性の疾患、障害、および／または状態を治療し、かつ／または診断することができる。この抗体は直接または間接の相互作用を通じて障害の増殖を抑制することができる。例えば、免疫応答を増大させ、特に高増殖性の障害の抗原の質を増大させ、もしくはＴ細胞を増殖させ、分化させ、または動員することによって、高増殖性疾患、障害、および／または状態は治療され、および／または診断されうる。この免疫応答は、既存の免疫応答を増強させることによって、または新しい免疫応答を開始させることによって増大されうる。
【０１４１】
本発明の抗体によって治療され、および／または診断される高増殖性疾患、障害、および／または状態の例としては、結腸、肺、腹部、骨、乳房、消化系、肝、膵、腹膜、内分泌腺（副腎、甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部頸部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾、胸、および尿生殖器系に位置した新生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
同様に、他の高増殖性疾患、障害、および／または状態は、本発明の抗体によって治療され、および／または診断されうる。かかる高増殖性疾患、障害、および／または状態の例としては、上記の臓器系に位置した新生物に加えて、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性疾患、障害、および／または状態、パラプロテイン血症、紫斑、類肉腫症、セザリー症候群、ヴァルデンストレーム（Waldenstron）マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および、他の高増殖性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
本発明は、本発明の抗体の投与によって新血管形成と関連した疾患、障害、および／または状態の治療を提供する。血管形成の内因性促進剤と阻害剤との自然発生の均衡は、阻害影響が優勢であるものである。ラスチンヤッド（Rastinejad）ら、Cell 56、p.345-355（1989年）。創傷治癒、臓器再生、胚発生、および女性生殖過程など新血管形成が正常な生理条件下に生じるまれな場合には、血管形成は厳密に調節され、空間的および時間的に区切られる。固形腫瘍増殖を特徴づけるものなど病的な血管形成の条件下に、これらの調節管理は不十分となる。調節されない血管形成は病的になり、多くの新生物および非新生物疾患の進行を持続する。多くの重篤な疾患が、固形腫瘍増殖および転移、関節炎、眼疾患、障害、および／または状態の一部の型、および乾癬を含む異常な新血管形成によって支配されている。例えば、モーゼス（Moses）らによる概説、Biotech.9、p.630-634（1991年）、フォルクマン（Folkman）ら、N.Engl.J.Med.、333、p.1757-1763（1995年）、アウアーバッハ（Auerbach）ら、J.Microvasc.Res.29、p.401-411（1985年）、フォルクマン（Folkman）、癌研究の進歩（Advances in Cancer Research）、クライン（Klein）とワインハウス（Weinhous）編、アカデミックプレス（Academic Press）、ニューヨーク(1985年))))、p.175-203、パッツ（Patz）、Am.J.Opthalmol.94、p.715-743（1982年）、およびフォルクマン（Folkman）ら、Science 221、p.719-725（1983年）を参照。多くの病的状態では、新血管形成の過程は疾患状態の一因となる。例えば、固形腫瘍の増殖が血管形成に依存することを示す重要なデータが蓄積されている。フォルクマン（Folkman）とクラーグスブルン（Klagsbrun）、Science 235、p.442-447（1987年）。
【０１４４】
本発明の抗体が治療上使用されうるさらなる手段としては、例えば、補体（ＣＤＣ）によって、またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）によって介在される抗体の直接的細胞毒性、または、例えば免疫複合体としての抗体の間接的細胞毒性が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４５】
本発明の抗体は、他のモノクローナルまたはキメラ抗体と組合わせて、または、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増大させるために役立ち、または上記のようにラジオアイソトープまたは他の細胞毒性剤など細胞毒性物に結合されるリンフォカインまたは造血成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、およびＩＬ−７など）とともに有利に利用されうる。
【０１４６】
本発明の抗体は、単独で、または他の型の治療（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、抗腫瘍薬、および抗レトロウイルス薬）と組合わせて投与されうる。一部の実施形態においては、本発明の抗体は、単独で、または抗レトロウイルス薬と組合わせて投与されうる。
【０１４７】
製剤、治療投与、およびキット
本発明は、化合物、例えば、本発明の抗体、または本発明の医薬組成物の有効量の対象への投与によって治療する方法も提供する。一部の実施形態においては、抗体は実質的に精製される（例えば、実質的にその効果を制限し、または望ましくない副作用を生じる物質を含まない）。この抗体は細胞毒性剤に結合されうる。
【０１４８】
化合物が免疫グロブリンを含むときに使用されうる製剤および投与の方法が本明細書に記載されており、さらに適切な製剤および投与経路は、本明細書の以下に記載されるものの中から選択されうる。
【０１４９】
種々の送達系、例えば、リポソームでのカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現可能である組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス（例えば、ウー（Ｗｕ）とウー（Ｗｕ）、J.Biol.Chem.262、p.4429-4432（1987年））、レトロウイルスまたは他のベクターなどの一部としての核酸の構成等が周知であり、これらを使用して本発明の化合物または医薬組成物を投与することができる。導入の方法としては、皮内、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および経口経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は便利な経路、例えば、注入またはボーラス注入法によって、上皮または粘膜皮膚内膜（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜等）を通じる吸収によって投与されうるとともに、他の生物活性剤といっしょに投与されうる。投与は全身または局所に可能である。さらに、本発明の医薬化合物または組成物を、脳室内および硬膜下腔内注射を含む適切な経路によって中枢神経系に導入することが望ましい場合があり、脳室内注射は、例えば、オマヤレザバーなどレザバーに取付けた脳室内カテーテルによって促進されうる。経肺投与も、例えば、吸入器またはネブライザーの使用、およびエアゾール化剤による調製によって使用されうる。
【０１５０】
一部の実施形態においては、本発明の医薬化合物または組成物を治療を必要とする部位に局所に投与することが望ましく、これは、例えば、ただし限定する目的ではなく、手術中の局所注入、例えば、手術後の創傷包帯と同時に局所適用、注射によって、カテーテルによって、坐剤によって、またはインプラントによって達成されうるが、インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゲル状の材料のものであり、sialastic膜、または繊維など膜を含む。本発明の抗体を含むタンパク質を投与する場合には、タンパク質が吸着することがない材料を使用するように注意しなければならない。
【０１５１】
他の実施形態においては、化合物または組成物はベシクルで、特にリポソームで送達されうる（ランガー（Langer）、Science 249、p.1527-1533（1990年）、トリート（Treat）ら、感染症および癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer）収載、ロペス−べレスタイン（Lopez-Berestein）とフィドラー（Fidler）、編、リス（Liss）、ニューヨーク（1989年）、p.353-365、ロペス−べレスタイン（Lopez-Berestein）、前掲書、p.317-327、一般に前掲書を参照。）
【０１５２】
さらに別の実施形態においては、化合物または組成物は制御放出系で送達されうる。一部の実施形態においては、ポンプを使用することができる（ランガー（Langer）、上掲書、セフトン（Sefton）、CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14、p.201（1987年）、ブッフワルト（Buchwald）ら、Surgery 88、p.507（1980年）、シャウデック（Saudek）ら、N.Engl.J Med.321、p.574（1989年）を参照）。他の実施形態においては、ポリマー材料を使用することができる（制御放出の医療適用（Medical Application of Controlled Release）、ランガー（Langer）とワイズ（Wise）、編、ＣＲＣプレス（CRC Pres.）、フロリダ州、ボーカラトーン（Boca Raton）（1974年）、制御された薬物バイオアベイラビリティ、製剤計画および性能（Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance）、スモーレン（Smolen）とボール（Ball）、編、ワイリー（Wiley）、ニューヨーク（1984年）、ランガー（Langer）とペパス（Peppas）、J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23、p.61（1983年）、ラビー（Lavy）ら、Science 228、p.190（1985年）も参照、デューリング（During）ら、Ann.Neurol.25、p.351（1989年）、ハワード（Howard）ら、J.Neurosurg.71、p.105（1989年）を参照）。さらに他の実施形態においては、制御放出系を治療標的、すなわち脳の近くに配置することができ、したがって、全身量の一部分のみを必要とする（例えば、グッドサン（Goodson）、制御放出の医療適用（Medical Application of Controlled Release）収載、上掲書、第２巻、p.115-138（1984年）を参照）。他の制御放出系は、ランガー（Langer）による概説、Science 249:p.1527-1533（1990年）に開示されている。
【０１５３】
本発明は医薬組成物も提供する。かかる組成物は、治療上有効量の本発明の化合物、および薬学的に許容される担体を含む。一部の実施形態においては、「薬学的に許容される」は、連邦規制機関もしくは州政府によって承認されており、または米国薬局方もしくは動物、より詳しくはヒトにおける使用のために一般に認められている国際的な薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに治療薬が投与される希釈剤、補剤、賦形剤（excipient）、または賦形剤（vehicle）を指す。かかる医薬担体は、水、および石油、動物、植物、または合成由来のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油など滅菌液体でありうる。一部の実施形態においては、水は、医薬組成物が静脈内投与される場合に担体として使用されうる。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も液体担体として、特に注射剤用溶液に使用されうる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキンミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有しうる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、持続放出製剤などの形をとりうる。組成物は、トリグリセリドなど一般的な結合剤および担体とともに坐剤として製剤化されうる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等など標準の担体を含みうる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．マーチン（Martin）によるRemington's Pharmaceutical Sciencesに記載されている。かかる組成物は、患者に対する適切な投与のために形態を提供するために適切な量の担体とともに、好ましくは精製形態で、治療上有効量の化合物を含有する。製剤は投与方法に適しているべきである。
【０１５４】
他の実施形態においては、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物としてルーチンの手順に従って調製される。通常、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性緩衝液での溶液である。必要に応じて、組成物は可溶化剤、およびリグノカインなどの局所麻酔薬も含有し、注射部位での痛みを緩和することができる。一般に、成分は別々に、または、例えば、乾燥凍結粉末、または活性剤の量を示すアンプルもしくは小袋（sachette）など気密容器中の水を含まない濃縮物として単位剤形で混合して供給される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌医薬グレードの水または生理食塩水を含有する注入ビンで調合されうる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合されうるように、注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが供給されうる。
【０１５５】
疾患または障害、例えば、癌の治療において治療上有効となる本発明の化合物の量は、標準の臨床方法によって判定されうる。さらに、場合により、インビトロアッセイを使用し、最適な用量範囲を確認するために役立てることができる。製剤で使用される正確な用量は、投与経路、および疾患または障害の重篤度によっても決まり、医師の判断および各患者の状況に従って決定されるべきである。有効量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から推定されうる。
【０１５６】
抗体については、患者に投与される用量は通常、患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。しかし、放射性標識抗体については、投与される用量は低くなり、例えば、患者の体重の０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇになりうるとともに、毒素免疫複合体については、投与される用量はさらに低くなり、例えば、患者の体重の０．００１ｍｇ／ｋｇになりうる。一部の実施形態においては、患者に投与される用量は患者の体重の０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態においては、患者に投与される用量が患者の体重の０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇである。他の実施形態においては、患者に投与される用量が患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。さらに他の実施形態においては、患者に投与される用量が患者の体重の１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答により他の種由来の抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。したがって、低用量のヒト抗体および低頻度の投与がしばしば可能である。さらに、本発明の抗体の投与の用量および頻度は、例えば、脂質付加などの修飾によって、抗体の（例えば、脳への）摂取および組織透過性を増強させることによって減少されうる。
【０１５７】
本発明は、本発明の医薬組成物を含むキットも提供する。このキットは、本発明の医薬組成物の１つもしくはそれ以上の成分で充填された１つもしくはそれ以上の容器を含みうる。場合により、かかる容器には注意または印刷された説明書が付随している。
【０１５８】
例えば、かかる印刷された説明書は、医薬または生物学的製剤の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって指示された形でありうるが、その注意は、癌などの状態を治療するためにヒトに投与するための製造、使用、または販売の機関による承認を示している。一部の実施形態においては、キットはさらに、例えば、癌を治療するための医薬組成物の使用に関する情報を提供する印刷物、または、例えば、癌を治療するための医薬組成物の使用に関する情報を提供する、あらかじめ録音されたメディアデバイス、またはプランナーを含む。
【０１５９】
「印刷物」は、例えば、本、ブックレット、パンフレット、またはリーフレットの１つでありうる。印刷物には癌の治療のための本発明の医薬組成物の使用が記載されうる。可能なフォーマットとしては、ブレットポイントリスト、よくある質問（ＦＡＱ）のリスト、またはチャートが挙げられるが、これらに限定されない。さらに与えられる情報は、絵、グラフィック、または他の記号を用いる非文章表現で示されうる。
【０１６０】
「あらかじめ録音されたメディアデバイス」は、例えば、ビデオテープカセット、ＤＶＤ（デジタルビデオディスク）、映写スライド、３５ｍｍ映画、または他の視覚メディアデバイスなど視覚メディアデバイスでありうる。あるいは、あらかじめ録音されたメディアデバイスは、ＣＤ−ＲＯＭ（コンパクトディスク読取専用メモリ）、またはフロッピー（登録商標）ディスクなど対話型ソフトウェアアプリケーションでありうる。あるいは、あらかじめ録音されたメディアデバイスは、例えば、レコード、オーディオカセット、またはオーディオコンパクトディスクなどオーディオメディアデバイスでありうる。あらかじめ録音されたメディアデバイスに含まれている情報には、癌の治療のための本発明の医薬組成物の使用が記載されうる。
【０１６１】
「プランナー」は、例えば、週１回、月１回、月複数回、年１回、または年複数回のプランナーでありうる。プランナーは日記として使用し、投与量をモニタリングし、投与される用量のトラックを維持し、または、本発明の医薬組成物が定期的に投与されることが困難でありうる将来のイベントのために準備することができる。あるいは、プランナーは、用量が摂取され、かつ用量が摂取されていない場合にモニタリングの手段を提供するカレンダーでありうる。この種のプランナーは、自分自身に投薬するための通常のスケジュールを有する患者に特に有用となる。さらに、プランナーは、自分自身に投薬することができ、忘れっぽくなりうる高齢者、小児、または他の患者群に有用でありうる。当業者は、本発明で使用するために適切である各種の計画ツールを理解するであろう。
【０１６２】
キットは、キットの他の成分を保存するための容器も含みうる。容器は、例えば、バッグ、ボックス、エンベロープ、または本発明における使用に適切である他の容器でありうる。好ましくは、容器は、本発明の医薬組成物に必要である各成分および／または管理デバイスに適合するように十分に大きい。しかし、場合により、患者のハンドバッグ、ブリーフケース、またはポケットに隠せる小さ目の容器であることが望ましい。
【０１６３】
本発明の医薬組成物を患者に送達する方法
本発明は、本発明の抗体の治療上有効量を含む医薬組成物をそれを必要とする患者に送達する方法にも関し、この方法は、（ａ）医薬組成物を処方することが許されている医師の身元をコンピュータ可読媒体に登録するステップと、（ｂ）患者に医薬組成物に付随するリスクに関するカウンセリング情報を提供するステップと、（ｃ）付随するリスクにもかかわらず医薬組成物が投与される患者のインフォームドコンセントを得るステップと、（ｄ）インフォームドコンセントを得た後に患者をコンピュータ可読媒体に登録するステップ、および（ｅ）患者の医薬組成物へのアクセスを可能にするステップとを含む。
【０１６４】
本発明の薬物送達法は、とりわけ、本発明の医薬組成物を処方する資格のある医師をコンピュータ可読記憶媒体に登録するステップを含む。コンピュータ可読媒体に登録されると、医師は医薬組成物をそれを必要とする患者に処方する資格がありうる。一般的に言えば、コンピュータ可読記憶媒体に登録されるために、医師は、例えば、患者に教育やカウンセリングを提供する種々の局面に応じる必要がありうる。コンピュータ可読記憶媒体における医師の登録は、例えば、郵便、ファクシミリ伝送、またはオンライン伝送で、好ましくは、本発明の医薬組成物に関する教育資料とともに、登録カードまたは書式を医師に提供することによって達成されうる。医師は、そこで要求された情報を提供することによって登録カードまたは書式のすべての項目に記入しうるとともに、登録カードまたは書式は本発明の医薬組成物のメーカーまたは販売業者に、または登録資料の他の正式な受取人に、例えば、郵便、ファクシミリ伝送、またはオンライン伝送で返却されうる。次いで、登録カードまたは書式における医師の情報はコンピュータ可読記憶媒体へ入力される。医師（および以下で論じられる患者）の登録に使用されうる適切なコンピュータ可読記憶媒体は、本出願の開示を把握すれば、当業者には明らかであろう。
【０１６５】
癌患者を含む患者の検査の過程で、医師は患者の状態が本発明の医薬組成物の投与によって改善されうることを判定しうる。本発明の医薬組成物を処方する前に、医師は、例えば、医薬組成物に関連した種々のリスクと利点について患者に助言することができる。患者は医薬組成物に関連した周知の疑わしいリスクのすべての完全な開示が提供されうる。かかるカウンセリングは口頭、および書面の形で提供されうる。一部の実施形態においては、医師は患者に医薬組成物に関する文献資料、例えば、製品情報、教育資料などを患者に提供することができる。
【０１６６】
本発明の医薬組成物に付随するリスクに関するカウンセリングを受けることに加えて、本発明の方法はさらに、患者によって署名されるインフォームドコンセントの書式に患者が記入することを必要とする。インフォームドコンセントの書式の記入完了と同時に、患者はコンピュータ可読記憶媒体に登録されうる。患者が登録されるコンピュータ可読記憶媒体は、医師が登録されるコンピュータ可読記憶媒体と同じであり、またはこれと異なりうる。
【０１６７】
本明細書に記載された方法による医師および患者の１つもしくはそれ以上のコンピュータ可読記憶媒体への登録は、本発明の医薬組成物へのアクセスをモニタリングし、かつ公認する手段を提供する。したがって、コンピュータ可読記憶媒体は、本発明の方法に従うことができない患者へのアクセスを拒否することに役立ちうる。一部の実施形態においては、本発明の医薬組成物へのアクセスは処方箋の形であり、ここで処方する医師はコンピュータ可読記憶媒体に登録されており、医薬組成物の付随リスクに関して患者にカウンセリングを提供し、かつそれを必要とする患者に医薬組成物を処方する前に、患者からインフォームドコンセントを得ている。
【０１６８】
本発明の医薬組成物に関して消費者を教育する方法
本発明は、本発明の医薬組成物の使用について消費者を教育する方法にも関し、この方法は、医薬組成物を販売時点で消費者情報とともに消費者に分配するステップを含む。一部の実施形態においては、分配は薬剤師または医療提供者を有する販売場所で生じる。
【０１６９】
本明細書で使用される「消費者情報」という用語は、英語テキスト、非英語テキスト、視覚映像、チャート、電話録音、ウェブサイト、および生の消費者サービス担当者へのアクセスを含むが、これらに限定されない。本発明の一部の実施形態においては、消費者情報は、本発明の医薬組成物の使用説明書、適切な年齢の使用、適応症、禁忌、または警告を提供する。一部の実施形態においては、この方法はさらに、医薬組成物に関する消費者の質問に答える立場にある関係者へ専門的情報を提供するステップを含む。
【０１７０】
本明細書で使用される「専門的情報」という用語は、医療関係者が医薬組成物に関する顧客の質問に答えることができるように考えられた本発明の医薬組成物に関する情報を含むが、これに限定されない。
【０１７１】
本明細書で使用される「関係者」は、例えば、医師、医師助手、ナースプラクティショナー、薬剤師、および顧客サービス担当者を含む。
【０１７２】
本発明はさらに、本発明の抗体の治療上有効量を含む医薬組成物を識別する方法に関し、この方法は、（ａ）ヒト組織因子に結合能がある抗体を単離するステップであって、この抗体は正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつＦｃ介在機序を開始しうるステップと、（ｂ）（ａ）を反復し、治療上有効であると判明しうる複数の候補抗体を得るステップと、（ｃ）１つのかかる候補抗体について、ヒト以外の動物に投与される場合にその非毒性を証明するステップと、（ｄ）監視下での臨床試験を行い、かかる候補抗体の非毒性および有効性を証明するステップと、（ｅ）規制機関の承認を確保し、癌を治療するためのかかる１つの候補抗体を分配するステップ、および（ｆ）活性剤として候補抗体を含む医薬組成物を製造するステップとを含む。
【０１７３】
本明細書で使用される「抗体の単離」という語句は、本明細書で既述されているように、ヒトＴＦ（ｈＴＦ）に結合能がある抗体の生成および単離に関するアッセイおよびプロトコールの使用を含み、ここで抗体は、インビトロ凝固アッセイによって判定されるように、正常血漿対照と比べＴＦ介在血液凝固を阻害することがない。複数の候補抗体の単離と同時に、この方法はさらに、候補抗体について、ヒト以外の動物に投与される場合にその非毒性を証明するステップを含む。
【０１７４】
医薬の非毒性を証明する方法は技術上周知であり、ヒト以外の動物に本発明の医薬組成物を投与するステップと、標準の医療検査を行い、医薬組成物が投与されるヒト以外の動物に対する医薬組成物の非毒性効果を証明するステップとを含むが、これらに限定されない。本発明の一部の実施形態においては、この方法はさらに、候補抗体のヒト組織因子への結合能を証明するヒト以外の動物でのインビボ実験を含み、ここで候補抗体は正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつヒト以外の動物モデルにおけるＦｃ介在機序を開始しうる。
【０１７５】
本明細書で使用される「臨床試験」は、その安全性を評価し、適切な用量範囲を決定し、かつヒトにおけるその使用の潜在的な副作用を確認する候補抗体の試験を指す。さらに、臨床試験系は、癌の治療における医薬組成物の有効性を確認し、かつヒトへの医薬組成物の安全な投与を最適化するために使用される情報を提供するために行われる試験を含む。臨床試験の成功裏の終了と同時に、この方法はさらに、規制機関、例えば、食品医薬品局の承認を確保し、癌の治療のための候補抗体を分配するステップを含む。
【０１７６】
本明細書に記載された種々の実施形態または選択肢のすべては、ありとあらゆる変形で組合わせられうる。
【０１７７】
以下の実施例はさらに本発明の例示であるが、本発明の範囲を限定するようには考えられていない。
【実施例】
【０１７８】
材料
細胞培養試薬は、インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州（CA）から購入した。チタンワンチューブ（Titan one Tube）ＲＴ−ＰＣＲシステムはロシュ（Roche）（スイス、バーゼル（Basel）、カタログ番号1855476）製であった。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースは、キアゲン（Qiagen）（カリフォルニア州（CA）、カタログ番号３０２１０）から入手し、Ｂｉｏ−ＧｅｌＰ６０はバイオ−ラッド（Bio-Rad）（カリフォルニア州（CA）、カタログ番号150-4161）から入手した。ＨｉＴｒａｐプロテインＧ  ＨＰカラムは、アマシャム（Amershaｍ）（英国、バッキンガムシャー州（Buckinghamshire）、カタログ番号17-0404-01）から購入した。マウス抗ヒトTF mAbはカルビオケム（Calbiochem）（カリフォルニア州（CA）、カタログ番号612161）から得た。プール正常ヒト血漿は、ジョージ・キング・バイオメディカル株式会社（George King Bio-Medical Inc.）（カンザス州（KA）、カタログ番号0010-01）製であった。細胞解離溶液はシグマ（Sigma）（ミズーリ州（MO）、カタログ番号C-5914）製であった。
【０１７９】
ｈＴＦ発現ベクターの構成
ヒト組織因子（ｈＴＦ）遺伝子をＲＴ−ＰＣＲによってヒト乳癌細胞株ＳＫＢＲ３からクローン化した。手短に言えば、総ＲＮＡ  １μｇをトリゾール（Trizol）試薬（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州（ＣＡ）、カタログ番号１５５９６０１８）を用いて、メーカーの指示に従いＳＫＢＲ３細胞から単離した。単離されたＲＮＡを逆転写し、チタンワンチューブ（Titan one Tube）ＲＴ−ＰＣＲシステムを用いて、メーカーの指示に従い、プライマーＴＦ４（５’ＵＴＲ−ACGGAACCCGCTCGATCTCG（配列番号：１３））、およびＴＦ５（３’ＵＴＲ−TGCAGTAGCTCCAACAGTGC（配列番号：１４））で増幅した。最初のＰＣＲ産物をさらに、プライマーＴＦ１（５’−ATC TGC GGA TCC ACC ATG GAG ACC CCT GCC TGG CC−３’（配列番号：１５））およびＴＦ３（５’−ATC TGC CTC GAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG GGA TCC TCT TTC TCT GAA TTC CCC TTT CTC CTG−３’（配列番号：１６））を用いて増幅し、３２  アミノ酸Ｎ末端リーダー配列および９アミノ酸Ｃ末端ＲＧＳ−Ｈｉｓ6タグ配列を有するｈＴＦの細胞外ドメインをコードするｈＴＦ  ＤＮＡ断片を生成する（可溶性ｈＴＦ）。可溶性ｈＴＦは、タンパク質精製のための３’末端でのＨｉｓ−タグを含む発現ベクターへの挿入のための５’ＢａｍＨＩ部位および３’ＸｈｏＩ部位を含んだ。最初のＰＣＲ産物も使用して、プライマーＴＦ１およびＴＦ２（５’−ATC TGC CTC GAG TTA ATG GTG ATG GTG ATG GTG GGA TCC TCT TGA AAC ATT CAG TGG GGA GTT CTC−３’（配列番号：１７））で完全長ｈＴＦ遺伝子を生成した。増幅可溶性ｈＴＦおよび完全長ｈＴＦを配列分析のためにｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州（CA））へクローン化した。ＤＮＡ断片をコードする可溶性ｈＴＦ（配列番号：３）および完全長ｈＴＦ（配列番号：１）もｐＣＥＰ４およびｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（インビトロジェン社（Ｉnvitrogen Corp.）、カリフォルニア州（CA））へクローン化した。
【０１８０】
可溶性ｈＴＦの発現および精製
３×１０5細胞／ウェルのＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションの前日に６穴プレートにプレーティングした。リポフェクタミン（Lipofectamine）プラス試薬（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州（ＣＡ））を用いて３時間３７℃でメーカーの指示に従い可溶性ｈＴＦ／ｐＣＥＰ４プラスミドＤＮＡ  １μｇで細胞をトランフェクションした。安定トランスフェクト細胞をＧ４１８（７５０μｇ／ｍｌ）含有ＤＭＥＭ培地で細胞を培養することによって選択した。次いで、可溶性ｈＴＦタンパク質を１ｍｌサイズのＮｉアガロースカラムを用いて培養培地３００ｍｌから精製し、線形イミダゾールバッファーグラディエント（ＰＢＳバッファー中５ｍＭ〜１００ｍＭイミダゾール）で溶出した。可溶性ｈＴＦを含有する画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析によって同定した。さらに、可溶性ｈＴＦをゲルろ過クロマトグラフィーによって精製し、汚染物を除去した。手短に言えば、遠心フィルター（Centrifugal Filter）（ミリポア（Millipore）、マサチューセッツ州（MA）、カタログ番号ＵＦＶ４ＢＧＣ２５）で約１００μｌに試料を濃縮させ、ＰＢＳ中０．７×５０ｃｍのＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ６０カラム上へロードした。次いで、タンパク質をＰＢＳ中で溶出し、０．５ｍｌ画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。可溶性ｈＴＦバンドをマウス抗ｈＴＦ  ｍＡｂ（カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州（CA）、カタログ番号６１２１６１））を用いて標準ウェスタンブロット法によって検証した。可溶性ｈＴＦを含有する画分をあわせた。
【０１８１】
安定完全長ｈＴＦ発現細胞株の調製
リポフェクタミン（Lipofectamine）プラス試薬を用いてメーカーの指示（インビトロジェン社（Invitrogen Corp.）、カリフォルニア州（CA））に従い完全長ｈＴＦ／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（ｐＴＦ１０３）でＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクションした。７５０μｇ／ｍｌのＧ４１８含有ＤＭＥＭ培地存在下に完全長ｈＴＦを安定に発現するクローンを選択した。選択の１週間後、耐性細胞をプレートからＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ溶液とともに除去し、ＤＭＥＭ／Ｇ４１８培地で３細胞／ｍｌの濃度に希釈した。希釈液の１００μｌアリコートを１つの９６穴プレートの各ウェルへ添加した。単一の細胞クローンを展開し、市販の抗ＴＦ抗体（カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州（ＣＡ）、カタログ番号６１２１６１））を用いてＦＡＣＳによってスクリーニングした。
【０１８２】
マウスにおけるポリクローナル、抗ｈＴＦ  ＩｇＧ反応の免疫および測定
多重部位でのマウスの迅速免疫（RIMMS）のプロトコールは、キルパトリック（Kilpatrick）,K.E.ら、Hybridoma 16、p.381-389（1997年）によって既述されており、これを用いてマウスにおけるｈＴＦに対する抗体を生成した。手短に言えば、８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス３匹の各々に対し、精製可溶性ｈＴＦ（１０μｇ／ｍｌ）の皮下注射を４回、１１日間に、３−５日おきに投与した。各回の免疫のために、マウスを麻酔し、次いで、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の免疫原でうなじの２部位およびふくらはぎと股間の両方に部位当り４０−５０μｌを注射し、ＲＩＢＩアジュバント（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州（ＭＯ）、セントルイス（St.Louis））中で並列部位（下部および中央部ふくらはぎ、大腿部、および腋窩）において部位あたり４０−５０μｌの用量で皮下注射した。初回注射前および最後のブーストの２日後に血液サンプルを取り、免疫原に対する抗体反応についてＥＬＩＳＡで分析した。ＥＬＩＳＡでは、９６穴ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１００μｌ／ウェル、ｐＨ７．４、３７℃、２時間、免疫原（２μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（PBS-T）含有ＰＢＳで１回洗浄し、１５０μｌ／ウェル、３７℃、３０分間、ＰＢＳ中１％ＢＳＡでブロックした。ＰＢＳ−Ｔによる１回の洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ中に希釈した免疫前および免疫血漿を１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。プレートを３７℃、４５分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（サザンバイオテク（Southern Biotech）、アラバマ州、バーミングハム（Birmingham）、カタログ番号１０３１−０５）で結合したヤギ抗マウスＩｇＧの１：５０００希釈液１００μｌを各ウェルに添加した。３７℃、３０分間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＴＭＢ−Ｈ2Ｏ2基質バッファー（ピアス（Pierce）、イリノイ州（ＩＬ）、ロックフォード（Rockford））１００μｌ／ウェルを添加することによって抗体結合を視覚化した。反応を室温下、１０分間続行し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて６５０ｎｍの波長で読んだ。Ｏ．Ｄ．測定価が内部陰性対照（二次抗体のみを有するウェル）のものより２倍高い場合に、抗体力価を血清希釈の逆数と規定した。
【０１８３】
抗体ＴＦ２７８、ＴＦ２７７、ＴＦ３９２、およびＴＦ９を、Ｂａｌｂ／ｃマウス３匹の各々に対し、精製可溶性ｈＴＦ（１０μｇ／ｍｌ）の皮下注射を５回、１１日間に、２−４日おきにしたことを除き、上記と同じ方法を用いて生成した。
【０１８４】
ハイブリドーマの遺伝子
最後のブーストの２日後、その血清が１：１０，０００より大きいＥＬＩＳＡ力価を有する免疫したマウスを二酸化炭素で窒息させることで安楽死させた。両側の膝窩、浅鼡径、腋窩、および鰓リンパ節を単離し、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有する新鮮培地で洗浄した。次いで、単一の細胞懸濁液を５０％Ｅｘｃｅｌｌ−６１０および５０％ＲＰＭＩ−１６４０培地を含む血清を含まない培地中でリンパ節から調製した。リンパ節細胞懸濁液を上記の培地で２回洗浄し、４００ｘｇで１０分間、室温で遠心分離によって回収した。次いで、５０ｍｌのコニカルポリプロピレンチューブにおいて、リンパ節細胞を２．５：１の比で５０％ポリエチレングリコール１５００（ＰＥＧ、ロシュバイオサイエンス（Roche Bioscience）、カリフォルニア州（ＣＡ）、パロアルト（Palo Alto））１ｍｌを添加することによって、マウス骨髄腫細胞（Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８．６５３、ＡＴＣＣ、バージニア州（ＶＡ）、マナッサス（Manassas））と融合した。結果として生じるＰＥＧ細胞調製物を１回洗浄し、次いでＥｘｃｅｌｌ−６１０とＲＰＭＩ−１６４０の５０：５０混合物、１０％ＦＢＳ、１０％オリゲン  クローニング  ファクター（Origen Cloning Factor）（アイゲン（Ｉｇｅｎ）、メリーランド州（ＭＤ）、ロックビル（Rockville））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、および０．０１ｍＭベータ−メルカプトエタノールを含有するハイブリドーマ培地（ＨＭ）中に再懸濁し、平底９６穴プレートへ２×１０5細胞／１００μｌ／ウェルで分配した。７％ＣＯ2で３７℃、１８時間インキュベーション後、２×ＨＡＴ（GIBCO-BRL、ニューヨーク州（ＮＹ）、グランドアイランド（Grand Island））を補充したＨＭ  １００μｌを各ウェルに添加した。培地を９６時間後に１００μＭヒポキサチンおよび１６μＭチミジンを補充したＨＭに変更した。ＨＡＴ選択の７から１０日後、プレートをハイブリドーマ増殖について顕微鏡で検査した。さらに、単一のコロニーからのハイブリドーマを２４穴プレートで個別に展開し、培養上清をＥＬＩＳＡによってｈＴＦに特異的なマウスＩｇＧ抗体についてスクリーニングした（下記参照）。
【０１８５】
ＥＬＩＳＡによる抗ｈＴＦ  ｍＡｂｓの一次スクリーニング
手短に言えば、９６穴ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ、ｐＨ７．４中、３７℃、２時間、２μｇ／ｍｌ可溶性ｈＴＦ  １００μｌ／ウェルでコーティングした。プレートをＰＢＳ−Ｔで１回洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ１５０μｌ／ウェルで３７℃、３０分間ブロックした。ＰＢＳ−Ｔによる１回の洗浄後、ハイブリドーマ上清を１００μｌ／ウェルでプレートに添加した。プレートを３７℃、４５分間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（サザンバイオテクノロジー（Southern Biotechnology）、カタログ番号１０３１−０５）で結合したヤギ抗マウスＩｇＧの１：５０００希釈液１００μｌを各ウェルに添加した。３７℃、３０分間のインキュベーション後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＴＭＢ−Ｈ2Ｏ2基質バッファー１００μｌを各ウェルに添加することによって抗体結合を視覚化した。反応を室温下、１０分間続行し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて６５０ｎｍの波長で読んだ。陽性反応を、内部陰性対照（二次抗体Ａｂのみ）のものより２倍高いＯ．Ｄ．測定値と規定した。すべてのＥＬＩＳＡ陽性クローンをさらにＨＭで展開し、凍結保存した。
【０１８６】
フローサイトメトリーによる抗ｈＴＦ  ｍＡｂｓの二次スクリーニング
完全長ｈＴＦを発現する細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）を０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液で溶離し、２％ＦＢＳおよび０．０５％ＮａＮ3（ＦＡＣＳバッファー）を含有する冷ＰＢＳ中で２回、４００ｘｇで１０分間洗浄し、次いでＵ底９６穴マイクロタイタープレートヘ０．５×１０6細胞／ウェルで分配した。細胞を２００ｘｇで４℃、３分間、遠心分離した。吸引による上清の除去後、細胞をハイブリドーマ上清７０μｌ中に再懸濁した。４℃、４５分間インキュベーション後、細胞を冷ＦＡＣＳバッファー、２２０μｌ／ウェルで、２００ｘｇで３分間、遠心分離によって２回洗浄し、１：２５ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（サザンバイオテクノロジー（Southern Biotechnology））５０μｌ中に再懸濁した。細胞を４℃、３０分間インキュベートし、次いで冷ＦＡＣＳバッファー、２２０μｌ／ウェルで３回洗浄した。最後に、細胞をＦＡＣＳバッファー０．４ｍｌ中に再懸濁し、それらの蛍光強度をフローサイトメーター（FACSscan、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）で測定し、セルクエスト（Cell Quest）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）を用いて分析した。陽性クローンを、ＦＡＣＳプロフィールにおけるパーセント陽性細胞が、細胞がＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧでのみ染色された場合に得られたプロフィールより少なくとも３倍高いクローンとして同定した。
【０１８７】
抗ｈＴＦ  ｍＡｂｓのＢＩＡｃｏｒｅ分析
抗ｈＴＦ  ｍＡｂｓの結合特性をＢＩＡｃｏｒｅＸを用いて評価した。手短に言えば、ＣＭ５  ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサチップを器具へドッキングし、１：１のＮＨＳ／ＥＤＣ  ５５μｌで室温下、活性化した。組換え可溶性ｈＴＦおよびＢＳＡ（０．０５Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．５中１０μｇ／ｍｌ）をそれぞれフローセル１および２の活性化チップ上に固定した。固定は、１０００−２０００ＲＵの共鳴反応が達成されるまで５μｌ／分の流量で行われた。次いで、チップをエタノールアミンＨＣｌ、ｐＨ８．５、５５μｌの注入によりブロックした後、５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１Ｍ  Ｎａｃｌで５回洗浄した。チップへ固定された可溶性ｈＴＦへの抗ｈＴＦ  ｍＡｂｓの結合を測定するために、ＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ、バイアコア（Biacore）ＡＢ、スウェーデン、ウプスラ（Uppsala）、カタログ番号１００１−０８）中の変動濃度で抗ｈＴＦ  ｍＡｂｓ  ３０μｌを５μｌ／分の流量でセンサ表面上に注入した。注入相の完了後、同じ流量で３６０秒間、ＢＩＡｃｏｒｅランニングバッファーで解離をモニタリングした。５０ｍＭ  ＮａＯＨ  １Ｍ  ＮａＣｌ  ３０μｌを用いる注入の間で表面を再生させた。個別のセンサグラムをＢＩＡシミュレーションソフトウェアを用いて分析した。代表的なデータが表３および４に示されている。
【０１８８】
ＴＦ膜抽出物の調製
完全長ｈＴＦを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞（５×１０7）を細胞溶離溶液で回収し、氷冷１×ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を膜抽出緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン）２ｍｌ中に再懸濁し、ティッシュ  テアラー（Tissue Tearor）組織ホミジナイザー（バイオスペック  プロダクツ株式会社（Biospec Products,Inc.）、オクラホマ州（ＯＫ）、バートルズビル（Bartlesville））で３回、各３０秒間、氷上でホモジナイズした。細胞残屑を１５００ｘｇで５分間、遠心分離によって除去した。細胞膜を１２，０００ｘｇで３０分間、４℃、遠心分離によって回収した。ペレットを１×ＰＢＳ中に再懸濁し、等分し、−２０℃で保存した。
【０１８９】
ハイブリドーマＩｇＧの精製
ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳ陽性ハイブリドーマクローンを低ＩｇＧハイブリドーマ培地（４０％ＲＰＭＩ  １６４０、４０％ＥＸ−Ｃｅｌｌハイブリドーマ培地、１０％低ＩｇＧ  ＦＢＳ、１０％オリゲン（ＯＲＩＧＥＮ）クローニングファクター、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム）中で３７℃、７％ＣＯ2の湿気のある環境下に培養した。分泌抗体を含有する培養培地４０ｍｌを１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐプロテインＧ  ＨＰカラム上へロードし、次いでＰＢＳ  １０ｍｌで洗浄した。結合ＩｇＧを０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．７、３ｍｌでカラムから溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で中和した。ＩｇＧ含有画分をプールし、ＰＢＳ中で透析した。
【０１９０】
ｈＴＦ凝固アッセイ
ｈＴＦ抗体の抗凝固活性をモリセイ（Morrissey）,J.H.ら、Thrombosis Research 52、p.247-261（1988年）（２段階プロトロンビン（２ｓｔ−ＰＴ）アッセイとしても知られる）、およびファング（Fang）,C.H.ら、Thrombosis and Haemostasis 76、p.361-368（1996年）によるアッセイを用いて測定した。ｈＴＦ膜抽出物の異なる希釈液をPBSで１００μｌに調節し、３０分間、３７℃水浴中で予熱した。次いで、ヒト血漿５０μｌおよび５０ｍＭ  ＣａＣｌ2  ５０μｌ溶液を混合液に添加し、清潔な使い捨て式プラスチック製キュベットで血液凝固を開始させた。血液凝固を１５秒間隔で４０５ｎｍ（Ａ405）での吸光度を測定することによってモニタリングした。Ａ405測定値の変化が１５秒で０．０１未満に達したところで血液凝固は完了した。結果として１８０秒の血液凝固時間となるｈＴＦ膜希釈を用いてｈＴＦ  ｍＡｂｓの阻害効果を試験した。血液凝固に対するｈＴＦ  ｍＡｂの阻害効果を試験するために、ｈＴＦ膜抽出物を各ｍＡｂ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分間、血液凝固反応の開始前にインキュベートした。
【０１９１】
【表１】
2007525944.tif 000002
【０１９２】
【表２】
2007525944.tif 000003
2007525944.tif 000004
注：結果は、２４穴プレートで増殖した個別のハイブリドーマの培養上清のＦＡＣＳスクリーニングによって得られた。パーセント陽性は、安定にＴＦを発現し、陽性染色したＴＦ３４細胞の集団を示す。
【０１９３】
【表３】
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注：正常血漿対照およびＢ−Ｆａｃｔ対照（正常凝固活性の３０−５０％に希釈されたプールされた正常ヒト血漿（ジョージ・キング・バイオメディカル株式会社（George King Bio-medical,Inc.）、カンザス州（ＫＳ）、カタログ番号００４０−０）は、われわれのアッセイフォーマットで正常ヒト血液および境界ヒト血液サンプルの血液凝固時間を示した。境界対照よりも凝固時間が短いすべての抗体がリストアップされている。凝固時間の長い唯一の阻害抗体（＃８４）が示されている。抗体の大部分は凝固を阻害する。
【０１９４】
【表４】
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注：表４においては、表３に示されているのと同じ正常血漿対照およびＢ−Ｆａｃｔ対照（正常凝固活性の３０−５０％に希釈されたプールされた正常ヒト血漿（ジョージ・キング・バイオメディカル株式会社（George King Bio-medical,Inc.）、カンザス州（ＫＳ）、カタログ番号００４０−０）が使用された。表４にリストアップされたすべての抗体は、境界対照（Ｂ−Ｆａｃｔ対照）よりも短い凝固時間を示した。
【０１９５】
ＡＤＣＣ活性
抗ＴＦ抗体ＴＦ２６０、ＴＦ２７８、およびＴＦ３９２のＡＤＣＣ活性を以下のＡＤＣＣアッセイを使用して測定した。ヒストパーク（Histopaque）−１０７７グラディエント遠心分離法（シグマ社（Sigma Co.）、ミズーリ州（ＭＯ）、セントルイス（St.Louis））を使用して正常ドナーの末梢血からヒト白血球を単離した。次いで、単離された白血球をエフェクター細胞として使用した。Ｕ底９６穴プレートにおいて、腫瘍細胞（５×１０3／ウェル）を、１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０の総量１２０μｌ中で変動濃度の抗ヒトＴＦ  ｍＡｂｓまたは対照抗体の非存在または存在下にエフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）比０：１−４０：１でヒストパーク精製済みヒト白血球と混合した。プレートを３７℃、５％ＣＯ2を含有する湿気のある環境下にインキュベートした。試験抗体なしにエフェクター細胞と混合した標的細胞を陰性対照として使用した。１６−１８時間のインキュベーション後、５０μｌアリコートの培養上清を回収し、平底９６穴プレート中の乳酸脱水素酵素活性について、サイトトックス（Cytotox）９６非放射性細胞毒性アッセイキット（プロメガ社（Promega Co.）、ウィスコンシン州（ＷＩ）、マディソン（Madison））を使用し、メーカーの指示に従って分析した。腫瘍細胞の溶解率を以下のように計算した。％細胞毒性＝実験的放出−エフェクター自然放出−標的自然放出）／（標的最大放出−標的自然放出）×１００。抗ＴＦ抗体ＴＦ２６０、ＴＦ２７８、およびＴＦ３９２のＡＤＣＣ結果は、ドナー６−７人からの３通のサンプルの平均溶解率±Ｓ．Ｄ．で表され、これは図４Ａ−４Ｃで確認されうる。ＡＤＣＣアッセイのために、ＴＦ陽性ＳＷ９００およびＴＦ陰性Ａ５４９肺腫瘍細胞を標的として使用した。無関係のヒトＩｇＧ１を陰性抗体対照として使用した。図４Ａ−４Ｃは、抗ＴＦ抗体ＴＦ２６０、ＴＦ２７８、およびＴＦ３９２が、陰性抗体対照（ｈＩｇＧ）と比べＴＦ陽性細胞でインキュベートすると％細胞毒性を増大させることを明らかに示す。
【０１９６】
すべての文書、例えば、本明細書で引用された科学的刊行物、特許、および特許公報は、各個別の文書が具体的かつ個別にその全体が参照することにより組込まれることが示されたと同程度にその全体が参照することにより本明細書に組込まれる。引用された文書が文書の第１ページのみを示す場合、文書の残りのページを含めて、文書の全体が意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】Ｎｉ−アガロースカラムを用いた可溶性ヒト組織因子（ｈＴＦ）の精製を示す図である。レーン１は分子量マーカーを含む。レーン２は予備精製であり、レーン３−４はフロースルーおよび洗浄試料である。レーン５−９はイミダゾールグラディエントで溶出された画分である。矢印は、可溶性ｈＴＦを示す。レーン８におけるようにタンパク質バンドを含む画分１１−１４をプールし、さらにゲルろ過クロマトグラフィーを用いて精製した。レーン９におけるようにタンパク質バンドを含む画分１５−２６をプールし、免疫に使用した。
【図２】ゲルろ過クロマトグラフィーを用いたｈＴＦの精製を示す図である。レーン１は分子量マーカーを含む。レーン２−１２はゲルろ過カラムから溶出された画分である。レーン６〜１２におけるようにタンパク質バンドを有する画分をプールした。両方のバンド（矢印で示した）は、ウェスタン−ブロット分析で示されているように可溶性ｈＴＦである。
【図３Ａ】選択されたｈＴＦ安定細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す図である。ＦＡＣＳ分析は、市販の抗ＴＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ、カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州（ＣＡ）、カタログ番号６１２１６１）を一次抗体として、かつＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０希釈、サザンバイオテクノロジー（Southern Biotechnology）、アラバマ州（ＡＬ））を二次抗体として用いて行った。抗体染色細胞の蛍光強度をフローサイトメーター（FACScan、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ニュージャージー州（ＮＪ））で測定し、セルクエスト（Cell Quest）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ニュージャージー州（ＮＪ））を用いて分析した。図３Ａ。非トランスフェクトＣＨＯ細胞。図３Ｂ。代表的な安定クローン＃ＴＦ３４。図３Ｃ。代表的な安定クローン＃ＴＦ４８。
【図３Ｂ】選択されたｈＴＦ安定細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す図である。ＦＡＣＳ分析は、市販の抗ＴＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ、カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州（ＣＡ）、カタログ番号６１２１６１）を一次抗体として、かつＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０希釈、サザンバイオテクノロジー（Southern Biotechnology）、アラバマ州（ＡＬ））を二次抗体として用いて行った。抗体染色細胞の蛍光強度をフローサイトメーター（FACScan、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ニュージャージー州（ＮＪ））で測定し、セルクエスト（Cell Quest）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ニュージャージー州（ＮＪ））を用いて分析した。図３Ａ。非トランスフェクトＣＨＯ細胞。図３Ｂ。代表的な安定クローン＃ＴＦ３４。図３Ｃ。代表的な安定クローン＃ＴＦ４８。
【図３Ｃ】選択されたｈＴＦ安定細胞クローンのＦＡＣＳ分析を示す図である。ＦＡＣＳ分析は、市販の抗ＴＦ抗体（１０μｇ／ｍｌ、カルビオケム（Calbiochem）、カリフォルニア州（ＣＡ）、カタログ番号６１２１６１）を一次抗体として、かつＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５０希釈、サザンバイオテクノロジー（Southern Biotechnology）、アラバマ州（ＡＬ））を二次抗体として用いて行った。抗体染色細胞の蛍光強度をフローサイトメーター（FACScan、ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ニュージャージー州（ＮＪ））で測定し、セルクエスト（Cell Quest）ソフトウェア（ベクトンディッキンソン（Becton Dickinson）、ニュージャージー州（ＮＪ））を用いて分析した。図３Ａ。非トランスフェクトＣＨＯ細胞。図３Ｂ。代表的な安定クローン＃ＴＦ３４。図３Ｃ。代表的な安定クローン＃ＴＦ４８。
【図４Ａ】ヒトキメラ抗ＴＦ抗体ＴＦ２６０、ＴＦ２７８、およびＴＦ３９２を用いるＡＤＣＣアッセイ。ＴＦ陽性ＳＷ９００およびＴＦ陰性Ａ５４９肺腫瘍細胞を標的として使用した。無関係のヒトＩｇＧ１を陰性対照抗体として使用した。
【図４Ｂ】ヒトキメラ抗ＴＦ抗体ＴＦ２６０、ＴＦ２７８、およびＴＦ３９２を用いるＡＤＣＣアッセイ。ＴＦ陽性ＳＷ９００およびＴＦ陰性Ａ５４９肺腫瘍細胞を標的として使用した。無関係のヒトＩｇＧ１を陰性対照抗体として使用した。
【図４Ｃ】ヒトキメラ抗ＴＦ抗体ＴＦ２６０、ＴＦ２７８、およびＴＦ３９２を用いるＡＤＣＣアッセイ。ＴＦ陽性ＳＷ９００およびＴＦ陰性Ａ５４９肺腫瘍細胞を標的として使用した。無関係のヒトＩｇＧ１を陰性対照抗体として使用した。
【図５】３２アミノ酸Ｎ末端リーダー配列および９アミノ酸Ｃ末端ＲＧＳ−Ｈｉｓ6タグ配列を有する完全長ヒト組織因子のヌクレオチド（配列番号：１）およびアミノ酸（配列番号：２）配列。
【図６】３２アミノ酸Ｎ末端リーダー配列および９アミノ酸Ｃ末端ＲＧＳ−Ｈｉｓ6タグ配列を有するヒト組織因子の細胞外ドメインのヌクレオチド（配列番号：３）およびアミノ酸（配列番号：４）配列。
【図７Ａ】抗体ＴＦ２６０。図７Ａ。ＴＦ２６０ＶＨ（ＴＦ２６０ＶＨ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：５）およびアミノ酸（配列番号：６）配列。図７Ｂ。ＴＦ２６０ＶＬ（ＴＦ２６０ＶＬ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：７）およびアミノ酸（配列番号：８）配列。
【図７Ｂ】抗体ＴＦ２６０。図７Ａ。ＴＦ２６０ＶＨ（ＴＦ２６０ＶＨ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：５）およびアミノ酸（配列番号：６）配列。図７Ｂ。ＴＦ２６０ＶＬ（ＴＦ２６０ＶＬ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：７）およびアミノ酸（配列番号：８）配列。
【図８Ａ】抗体ＴＦ１９６。図８Ａ。ＴＦ１９６ＶＨ（ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：９）およびアミノ酸（配列番号：１０）配列。図８Ｂ。ＴＦ１９６ＶＬ（ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：１１）およびアミノ酸（配列番号：１２）配列。
【図８Ｂ】抗体ＴＦ１９６。図８Ａ。ＴＦ１９６ＶＨ（ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：９）およびアミノ酸（配列番号：１０）配列。図８Ｂ。ＴＦ１９６ＶＬ（ＴＦ１９６ＶＨ／ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：１１）およびアミノ酸（配列番号：１２）配列。
【図９Ａ】抗体ＴＦ２７８。図９Ａ。ＴＦ２７８ＶＨ（ＴＦ２７８ＶＨｓ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：１８）およびアミノ酸（配列番号：１９）配列。図９Ｂ。ＴＦ２７８ＶＬ（ＴＦ２７８ＶＬｓ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：２０）およびアミノ酸（配列番号：２１）配列。
【図９Ｂ】抗体ＴＦ２７８。図９Ａ。ＴＦ２７８ＶＨ（ＴＦ２７８ＶＨｓ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：１８）およびアミノ酸（配列番号：１９）配列。図９Ｂ。ＴＦ２７８ＶＬ（ＴＦ２７８ＶＬｓ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：２０）およびアミノ酸（配列番号：２１）配列。
【図１０Ａ】抗体ＴＦ２７７。図１０Ａ。ＴＦ２７７ＶＨのヌクレオチド（配列番号：２２）およびアミノ酸（配列番号：２３）配列。図１０Ｂ。ＴＦ２７７ＶＬのヌクレオチド（配列番号：２４）およびアミノ酸（配列番号：２５）配列。
【図１０Ｂ】抗体ＴＦ２７７。図１０Ａ。ＴＦ２７７ＶＨのヌクレオチド（配列番号：２２）およびアミノ酸（配列番号：２３）配列。図１０Ｂ。ＴＦ２７７ＶＬのヌクレオチド（配列番号：２４）およびアミノ酸（配列番号：２５）配列。
【図１１】抗体ＴＦ３９２。ＴＦ３９２ＶＨ（ＴＦ３９２ＶＨｓ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：２６）およびアミノ酸（配列番号：２７）配列。ＴＦ３９２ＶＬのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ＴＦ２６０ＶＬのヌクレオチド（配列番号：７）およびアミノ酸（配列番号：８）配列と同じである。
【図１２Ａ】抗体ＴＦ９。図１２Ａ。ＴＦ９ＶＨ（ＴＦ９ＶＨｓ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：２８）およびアミノ酸（配列番号：２９）配列。図１２Ｂ。ＴＦ９ＶＬ（ＴＦ９ＶＬ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：３０）およびアミノ酸（配列番号：３１）配列。
【図１２Ｂ】抗体ＴＦ９。図１２Ａ。ＴＦ９ＶＨ（ＴＦ９ＶＨｓ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：２８）およびアミノ酸（配列番号：２９）配列。図１２Ｂ。ＴＦ９ＶＬ（ＴＦ９ＶＬ−ＰＵＣ１８）のヌクレオチド（配列番号：３０）およびアミノ酸（配列番号：３１）配列。  注：図７Ａ−１２Ｂにおいて、下線を引いたアミノ酸残基は、抗体ＴＦ２６０、ＴＦ１９６、ＴＦ２７８、ＴＦ２７７、ＴＦ３９２、およびＴＦ９のそれぞれＶＨまたはＶＬ領域のＣＤＲ領域を特定する。  注：５７ヌクレオチド（１９アミノ酸）配列シグナルペプチド：ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CTA TTC CTG ATG GCA GCT   M  A   W   V   W   T   L   L   F   L   M   A   AGCC CAA AGT GCC CAA GCA（配列番号：３２）  A  Q   S   A   Q   A （配列番号: ３３）をＴＦ２６０、ＴＦ１９６、ＴＦ２７８、ＴＦ２７７、ＴＦ３９２のＶＨおよびＶＬ、またはＴＦ９のＶＨを含有するベクターの作成において使用した。６０ヌクレオチド（２０アミノ酸）配列シグナルペプチド：ATG GAA TCA CAG ACT CAG GTC TTC CTC TCC CTG CTG CTC M   E   S   Q   T   Q   V   F   L   S   L   L   LTGG ATA TCT GGT ACC TGT GGG （配列番号:３４） W   I   S   G   T   C   G  （配列番号:３５）をＴＦ９のＶＬを含有するベクターの構成において使用した。
【図１】
2007525944.tif 000007
【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【配列表】
2007525944000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月19日(2007.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子に結合能がある単離された抗体であって、前記抗体が正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつ陰性抗体対照と比べ組織因子陽性細胞の細胞毒性パーセントを増大させる、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体、修飾抗体およびＦａｂ発現ライブラリーの抗体産物よりなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
請求項１および２のいずれかに記載の抗体であって、前記抗体がパクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（tenoposide）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、およびラジオアイソトープよりなる群から好ましく選択される細胞毒性剤に結合しているか、およびまたは前記抗体が酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出断層撮影を用いる陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンよりなる群から好ましく選択される検出可能剤に結合している、前記抗体。
【請求項４】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９から入手可能な請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって産生されたモノクローナル抗体と同じエピトープに結合するか、または前記エピトープへの結合を競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６】
配列番号：６、８、１０、１２、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９から得られる抗体の結合特性を有する抗体の産生能を有するハイブリドーマ。
【請求項８】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５１９７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７６で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７７で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２、またはＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５６７４で寄託されたハイブリドーマ細胞株ＴＦ９である、請求項７に記載のハイブリドーマ。
【請求項９】
（ａ）配列番号：６、８、１０、１２、１９、２１、２３、２５、２７、２９および３１よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）１．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
２．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
３．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
４．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
５．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
６．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
７．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
８．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
９．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域、および
１０．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と
よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体をコードするヌクレオチド配列；または
（ｃ）配列番号：５、７、９、１１、１８、２０、２２、２４、２６、２８または３０の相補体にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであって、正常血漿対照に比べ組織因子介在血液凝固を阻害することなくヒト組織因子に結合しうるとともに、陰性抗体対照と比べ組織因子陽性細胞の細胞毒性パーセントを増大させうるポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド；
を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
請求項９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むように遺伝子組換えされた宿主細胞。
【請求項１３】
１．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
２．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
３．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ１９６によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域、および
４．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２６０によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することなくヒト組織因子に結合しうるとともに、陰性抗体対照と比べ組織因子陽性細胞の細胞毒性パーセントを増大させうる前記ポリペプチド。
【請求項１４】
１．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
２．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
３．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＨドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
４．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ２７８によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
５．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ３９２によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域、および
６．ハイブリドーマ細胞株ＴＦ９によって発現される抗体のＶＬドメインの少なくとも１つ、２つまたは３つのＣＤＲ領域と、
よりなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記ポリペプチドが正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することなくヒト組織因子に結合しうるとともに、陰性抗体対照と比べ組織因子陽性細胞の細胞毒性パーセントを増大させうる前記ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含む免疫グロブリン分子。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体のヒト組織因子への結合の阻害能を有する単離された抗抗体。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体の治療上有効量および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
癌治療用医薬製剤を製造するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項１９】
前記癌が、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌よりなる群から好ましく選択される固形腫瘍である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
癌を検出する方法であって、前記方法が、請求項３に記載の抗体であって、検出可能剤に結合している前記抗体を試料または対象に提供するステップ、および前記検出可能剤の非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌よりなる群から好ましく選択される癌の癌細胞への結合を検出するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
組織因子に結合能があるモノクローナル抗体を生成する方法であって、前記抗体が正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつ前記抗体が陰性抗体対照と比べ組織因子陽性細胞の細胞毒性パーセントを増大させる前記方法であって、前記方法が、
（ａ）哺乳動物をヒト組織因子の精製細胞外ドメインで免疫するステップと、
（ｂ）前記免疫した哺乳動物のリンパ節から細胞懸濁液を調製するステップと、
（ｃ）前記（ｂ）の細胞懸濁液からの細胞を骨髄腫細胞と融合させるステップ、および
（ｄ）前記（ｃ）における融合から生成されたハイブリドーマからクローンを同定するステップであって、前記クローンがヒト組織因子に結合能がある抗体を産生し、正常血漿対照と比べ組織因子介在血液凝固を阻害することがなく、かつ前記抗体が陰性抗体対照と比べ組織因子陽性細胞の細胞毒性パーセントを増大させる前記ステップと
を含む前記方法。
【請求項２２】
抗体を製造する方法であって、
（ａ）請求項９（ｂ）に記載の単離されたポリヌクレオチドによってコードされた抗体を発現させるステップと、
（ｂ）前記抗体を回収するステップと
を含む前記方法。
【請求項２３】
請求項１７に記載の医薬組成物を含むキット。
【請求項２４】
癌を治療するための前記組成物の使用を説明する印刷物、癌を治療するための前記組成物の使用を説明するあらかじめ録音されたメディアデバイス、またはプランナーをさらに含み、ここで、前記印刷物が好ましくは本、ブックレット、パンフレット、またはリーフレットであり、前記あらかじめ録音されたメディアデバイスが、好ましくはＤＶＤ、ビデオテープカセット、ＣＤ−ＲＯＭ、オーディオカセット、またはオーディオコンパクトディスクである、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
癌治療用医薬組成物である、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
癌が固形腫瘍である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
固形腫瘍が、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌、および前立腺癌よりなる群から選択される、請求項２６に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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