(57)【要約】  本発明は既知の受容体の新規機能に関する。詳細には、本発明は、ニューロンシステムおよび辺縁系の操作、ならびに疼痛の診断および治療における、スフィンゴシルホスホリルコリン受容体および/またはそのリガンドの使用に関する。
2007505617.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
GPR12ポリペプチドが機能的に不活性化されている1つまたは複数の細胞を含むGPR12ノックアウト哺乳動物。
【請求項２】
野生型対照との比較における、ロータロッド試験での成績の低下、逆格子での成績の低下、ワイヤー操縦試験での成績の低下、および歩行試験での成績の低下から成る群から選択されるいずれか1つまたは複数の特徴を有する、請求項1に記載のGPR12ノックアウトマウス。
【請求項３】
アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される特徴を有する、請求項2に記載のGPR12ノックアウトマウス。
【請求項４】
1つまたは複数の機能的に不活性なGPR12遺伝子を含む1つまたは複数の哺乳動物細胞を生成する方法であって、
(a) 1つまたは複数の機能的に活性な内在性GPR12遺伝子を含む1つまたは複数の細胞を選択するステップ; 
(b) 1つまたは複数の内在性GPR12遺伝子と相同組換えによって組換えを行うことができる機能的に不活性なGPR12核酸で、ステップ(a)による1つまたは複数の細胞をトランスフェクトするステップ; および、
(c) 1つまたは複数の内在性GPR12遺伝子が、機能的に不活性なGPR12核酸と相同組換えされた1つまたは複数の細胞を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項５】
宿主細胞中で1つまたは複数の内在性GPR12遺伝子を機能的に不活性化するのに適した核酸構築物であって、
(a) 非相同性置換領域; 
(b) 非相同性置換領域の上流に位置する第1の相同性領域; 
(c) 発現された場合に機能的に活性なGPR12をコードしない突然変異GPR12遺伝子; および、
(d) 非相同性置換部分の下流に位置する第2の相同性領域、
を含み、第2の相同性領域が非相同性置換領域の下流に位置し、第2の相同性領域が第2のGPR12遺伝子に対して少なくとも90%の同一性を示すヌクレオチド配列を有する、核酸構築物。
【請求項６】
GPR12ポリペプチド、または1つもしくは複数のその結合タンパク質、あるいはそれらをコードする核酸と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物。
【請求項７】
GPR12ポリペプチドの機能的活性の1つまたは複数のアンタゴニストを同定する方法であって、
(a) 機能的に活性なGPR12ポリペプチドを含む1または複数の哺乳動物を選択するステップ; 
(b) 前記1または複数の哺乳動物を、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数の潜在的アンタゴニストで処置するステップ; 
(c) アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される、GPR12ノックアウトマウスが示す1つまたは複数の特徴を、前記哺乳動物が示すかどうか判定するために、前記1または複数の哺乳動物を試験するステップ; および、
(d) ステップ(c)に記載の1つまたは複数の特徴を示す1つまたは複数のアンタゴニストを選択するステップ、
を含む方法。
【請求項８】
上記ステップ(c)が上記哺乳動物が示すかどうか判定するために、上記1または複数の哺乳動物を試験することを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
GPR12ポリペプチドの機能的活性に対してアゴニストとして作用する1つまたは複数の分子を同定する方法であって、
(a) 機能的に不活性なGPR12ポリペプチドを含む1または複数の哺乳動物を選択するステップ; 
(b) 少なくともGPR12活性の態様に対して潜在的にアゴニストとして作用する1つまたは複数の潜在的GPR12模倣体で、前記1または複数の哺乳動物を処置するステップ; 
(c) ステップ(b)に従って処置された1または複数の哺乳動物が、ステップ(a)に従って選択された哺乳動物と比べて回復している1つまたは複数の特徴を有するかどうか判定するために、それら処置された哺乳動物を試験するステップ; および、
(d) ステップ(a)に従って選択された哺乳動物に対して、野生型哺乳動物の1つまたは複数の特徴を回復させる1つまたは複数のGPR12リガンド模倣体を選択するステップ、
を含む方法。
【請求項１０】
GPR12ポリペプチドの機能的活性に対してアンタゴニストとして作用する1つまたは複数の分子を同定する方法であって、
(a) 機能的に活性なGPR12ポリペプチドを含む1または複数の哺乳動物を選択するステップ; 
(b) 少なくともGPR12活性の態様に対して潜在的にアンタゴニストとして作用する1つまたは複数の潜在的GPR12アンタゴニストで、前記1または複数の哺乳動物を処置するステップ; および、
(c) ステップ(b)に従って処置された1または複数の哺乳動物が、ステップ(a)に従って選択された哺乳動物と比べてモジュレートされている1つまたは複数の特徴を有するかどうか判定するために、それら処置された哺乳動物を試験するステップ、
を含む方法。
【請求項１１】
1つまたは複数の化合物の生物学的効果のアッセイにおける、トランスジェニックGPR12ノックアウト哺乳動物の使用。
【請求項１２】
アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される疾患または状態を診断する方法であって、
(a) 診断される患者からの細胞の試料を選択するステップ; および、
(b) 前記細胞の試料におけるGPR12ポリペプチドの発現レベルおよび/または機能的活性を、健康な個体からの1つまたは複数の対照試料と比較するステップ、
を含む方法。
【請求項１３】
GPR12ポリペプチド、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアゴニスト、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアンタゴニスト、およびGPR12活性の1つまたは複数のモジュレーターから成る群から選択される1つまたは複数をコードする外因性の核酸を、少なくとも一部の細胞の中に含むトランスジェニック動物。
【請求項１４】
アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される患者の状態を治療する方法であって、GPR12ポリペプチド、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアゴニスト、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアンタゴニスト、およびGPR12活性の1つまたは複数のモジュレーターから成る群から選択される1つまたは複数の治療上有効な量でその患者を処置するステップを含む方法。
【請求項１５】
アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される患者の状態を予防または治療するための医薬の調製における、GPR12ポリペプチド、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアゴニスト、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアンタゴニスト、およびGPR12活性の1つまたは複数のモジュレーターから成る群から選択される1つまたは複数の使用。
【請求項１６】
患者におけるニューロン増殖およびシナプス形成を操作する方法であって、GPR12ポリペプチド、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアゴニスト、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアンタゴニスト、およびGPR12活性の1つまたは複数のモジュレーターから成る群から選択される1つまたは複数の治療上有効な量で患者を処置するステップを含む方法。
【請求項１７】
動物におけるニューロン増殖およびシナプス形成を操作するための医薬の調製における、GPR12ポリペプチド、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアゴニスト、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアンタゴニスト、およびGPR12活性の1つまたは複数のモジュレーターから成る群から選択されるものの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知の受容体の新規の機能に関する。詳細には、本発明は、辺縁系の操作における、スフィンゴシルホスホリルコリン受容体および/またはそのリガンドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Annieは、GPR12をコードし、ヒト染色体13q12に位置する。GPR12 cDNAは、長さが1005bpである。それは最初、Songら(Genomics、1995年、28, 347〜349)によって開示された。それは当初、スフィンゴシン1-リン酸の受容体であると考えられた(Uhlenbrock, K.ら、Cellular Signalling、2002年、14: 941〜953)。最近、リガンドが判明し(deorphanised)、スフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)の受容体であることが示された(Ignatovら、2003年、J. Neurosci. 23,(2): 907〜914)。
【０００３】
細胞に対するSPCの作用のいくつかは、S1P-EDG受容体に対する低親和性の結合、およびその活性化によって説明することができる。しかし、SPCによるある種の細胞作用および細胞内作用は、S1Pによって共有されていない。S1Pは、正常な血漿、腹水、および様々な組織で同定されており、脂質媒介因子である。細胞シグナル伝達において、スフィンゴ脂質分解産物が細胞内シグナル伝達分子として、そして細胞外シグナル伝達分子として作用する二通りの役割を果たすことが現在認識されつつある。Gタンパク質共役型受容体がスフィンゴシン1-リン酸およびスフィンゴシルホスホリルコリンに対して高い親和性を有し、また、スフィンゴ脂質が、心拍数の調節、オキシダティブバースト、神経突起の退縮、創傷治癒(分裂促進作用)、または血小板の活性化を含めた多くの機能を有することが示されている。
【０００４】
スフィンゴシン1-リン酸(S1P)は、例えば血小板凝集中に放出される、強力な細胞外リゾリン脂質リン酸媒介因子である。S1Pは、様々な刺激、例えば、成長因子、サイトカイン、GPCRアゴニスト、および抗原などによって誘導される。S1P受容体シグナル伝達経路は、転写因子の活性化、細胞骨格タンパク質、および接着分子の発現などに連結している。したがってS1Pは、有糸分裂誘発、分化、増殖、移動、およびアポトーシスを含めた様々な生物学的反応に影響を与えることができる。さらに、S1Pは、カルシウム動員における役割も果たしている。
【０００５】
Edg1、3、または5は、細胞増殖、血管新生、および細胞移動に関連付けられている(Edg8は、Edg5に最も近く、40%の配列相同性を有する)。Edg4は卵巣癌細胞のマーカーである。
【０００６】
S1Pは乳癌に関連付けられている。S1Pは、エストロゲン非依存性乳癌細胞系であるMDA-MB-231における化学的浸潤能(chemo-invasiveness)を抑制する。白血球移動は、S1Pによる影響を受け、したがって、S1Pは炎症における役割も果たしている可能性がある。肥満細胞におけるS1Pレベルは、それらのアレルギー反応を決定している可能性がある。Edg受容体の変化は、S1Pの細胞内/細胞外濃度の管理において極めて重要な役割を有する可能性があるし、これによって多くの疾患が影響を受ける可能性がある。
【０００７】
Edg受容体は、アルツハイマー病およびパーキンソン病など、調節解除されたアポトーシスに伴う神経学的障害で役割を果たしている可能性がある。PKCの抑制による、瘢痕の局所治療は、別の潜在的適用であり、また、白血病も同様である。
【０００８】
Edg1ヌルマウスを用いて、Liuら(2000年)は、Edg1を介したS1Pシグナル伝達が血管形成に必須であることを実証した。Edg1ヌルマウスは、胚齢12.5日目および14.5日目の間に子宮内死に至る胚出血を示した。突然変異体の胚において、血管発生および血管新生は正常と思われた。しかし、血管成熟は、血管平滑筋細胞/周皮細胞の欠損のために不完全であった。胃腸管および気管支樹の筋肉層は良好に発生したので、この欠損は、平滑筋における全般的な欠損ではなかった。筆者らは、培養された野生型線維芽細胞およびEdge1ヌル線維芽細胞を用いて、S1Pによって誘導される遊走反応をEdg1が媒介し、突然変異体細胞ではこれに欠損があることを示した。突然変異体細胞は、S1P刺激に反応した、Racの活性化も行うことができなかった。
【０００９】
Ishiiら(2001年)は、マウスでEdg3遺伝子の破壊を行ったが、その結果、遺伝子、転写産物およびタンパク質が完全に不在となった。Edg3ヌルマウスは、生存可能かつ繁殖性であり、表現型の明白な異常なしに正常に発生した。野生型マウスの胚性線維芽細胞は、Edg1、Edg5、およびEdg3を発現し、ホスホリパーゼC(PLC; 600810を参照)の活性化、アデニリルシクラーゼの抑制、およびRho (602732を参照)の活性化においてS1Pに対する強い反応を示した。Edg3ヌル線維芽細胞は、PLCの活性化においてかなりの低減を示し、アデニリルシクラーゼの抑制においてわずかな低減を示し、そして、Rhoの活性化には変化を示さなかった。Ishiiら(2001年)は、正常なマウスの発生においてEdg3が有する役割は必須のものではないが、Edg3がS1Pに反応して示す細胞シグナル伝達は非重複性のものであると結論した。
【００１０】
Ishiiら(2002年)は、Edg3およびEdg5の両方におけるヌルマウスを発生させた。Edg5単独の欠損を有するマウスは、生存可能かつ繁殖性であり、正常に発生した。Edg5-Edg3の二重ヌル交雑によって生じた同腹仔の大きさは著しく低減したものであり、これらの子マウスは、幼年期の終わりまで生き残らなかったものが多かったが、生き残った二重ヌルの動物はいかなる明白な表現型も示さなかった。Ishiiら(2002年)は、いずれの受容体サブタイプも胚発生を補助するが、両方の欠失によって顕著な出生時死亡率が生じると結論した。彼らは、S1Pシグナル伝達に対する受容体欠損の影響に関して、マウスの胚性線維芽細胞を検査した。Edg5ヌル線維芽細胞は、S1Pに対する曝露に伴うRho活性化においてかなりの低減を示し、二重ヌル線維芽細胞は、Rho活性化の完全な欠失、ならびにPLC活性化およびカルシウム動員におけるかなりの低減を示し、また、アデニリルシクラーゼ抑制には影響がなかった。彼らは、Edg5およびEdg3が、マウスではそれぞれRhoおよびPLC/Ca(2+)経路に優先的に共役していると結論した。
【００１１】
最近、胚発生中の脳におけるGPR12の発現が示されたが、これはニューロンの分化、成熟、または増殖における役割を示唆するものである。実際、海馬細胞HT22は、SPCに反応して細胞数を増加させ、SPCによって処置された、ラットの皮質初代培養物は、シナプス接触の増大を示す。
【００１２】
マウスでは、ノーザンブロッティングによって、以下の組織、すなわち、脳、特に前脳および後脳、ならびに肝臓でGPR12が検出された。より詳細には、脳のin situによって、海馬、扁桃体、梨状皮質、および嗅覚器(辺縁系)で検出された(Saeki, Y.ら、FEBS letters、1993年、336: 317〜322)。
【００１３】
さらに最近になって、GPR12は、リガンドが判明しスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)の受容体として同定された。GPR12は、胎児マウスおよび成体マウスの脳で優勢に発現されている唯一のSPC受容体である。GPR12 mRNAは、胚発生中には皮質および海馬で非常に強く発現されており、そして、この発現は、成体マウスでもまだ存在しているが、発生中よりは弱く現れる。発生中における発現は、梨状皮質、尾状被殻、背内側核および弓状核、乳頭体、ならびに後脳、脳幹、および脊髄の運動核および知覚神経核にもある。成体マウスでは、GPR12は、皮質(体性感覚皮質および脳梁膨大後皮質)で強く発現され、海馬(CA2領域の錐体細胞層が最も強く標識される)、側坐核、梨状皮質、中隔、嗅球(僧帽細胞層および糸球体細胞層)、扁桃体、および膝状核でも発現される。後脳では、GPR12発現が弱く、小脳(小葉9および10)の一部の細胞のみが発現を示す。
【００１４】
ラットでは、脳および精巣におけるGPR12発現をノーザンが示す。RT-PCRによって、それが脳下垂体、脳、および精巣に存在することが示された。in situハイブリダイゼーションは、脳下垂体の前葉および後葉、梨状皮質、ならびに外側中隔核におけるGPR12発現を明らかにした(Eidne, K. A.ら、FEBS letters、1991年、292. 243〜248)。
【００１５】
しかし、哺乳動物でGPR12が果たしている一般的な役割、とりわけ脳における役割の理解は、従来技術によって達成されていない。国際公開第WO 01/48483号は、GPR12受容体の1つまたは複数のアゴニストまたはアンタゴニストを、食欲制御物質として使用するための試験化合物として使用することを含む、食欲制御物質を提供する方法を記載する。しかし、cDNA配列およびアミノ酸配列の分析は、多くの誤りを示し、それらを明細書から決定することができない。したがって、これらの研究は反復することができない。
【発明の開示】
【００１６】
本発明者らは、GPR12のin vivoの役割を調べるために、GPR12ノックアウトマウスを作製した。本発明者らは、そのようなノックアウトマウスが、それらの移動(歩行運動を含める)能力および学習能力において非突然変異体と異なることを示したが、これは、ニューロン発生、シナプス形成、および神経内分泌性行動モジュレーションを制御するGPR12の役割を示唆する。さらに、そのようなマウスは、それらが痛覚過敏である、すなわち有痛性刺激に対して敏感であるという点において、疼痛に対する感受性の相違を示す。加えて、そのような突然変異体の生理および形態は、ある種の神経学的障害および他の状態、例えば、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛とにおけるGPR12の役割を示唆する。生化学分析は、ノックアウトマウスが、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病を含めた、肝臓疾患および腎臓疾患の徴候を示すことを示す。
【００１７】
GPR12ノックアウトマウスは、疾患のモデルとして、また、治療適用のための、GPR12のアンタゴニストおよびアゴニストを同定するのに有用である。
【００１８】
したがって、第1の態様では、本発明は、GPR12ポリペプチドが機能的に不活性化されている1つまたは複数の細胞を含むGPR12ノックアウト哺乳動物を提供する。
【００１９】
本発明者らは、本発明の上記態様によるGPR12ノックアウトマウスが、逆格子をつかむ能力が他より低いことによって実証される貧弱な運動能力およびバランス能力、ロータロッド(rotarod)上での貧弱な動作、足を大きく広げた異常な歩調、および疼痛に対する感受性の増大から成る群から選択されたものを含めたいくつかの決定的な特徴を示すことを見出した。
【００２０】
ノックアウト哺乳動物の作製は、当業者ならば精通しているであろうものであり、標準的な実験室技法を使用し、本明細書に記載されている通り、相同組換えを用いる。
【００２１】
トランスジェニック哺乳動物は、以下の哺乳動物、すなわち、マウス、ラット、トガリネズミ、スナネズミ、モルモット、サル、ハムスター、ネコ、およびイヌから成る群から選択される哺乳動物のいずれか1種類であることが好ましい。当業者ならば、このリストが網羅的となるように意図されていないことを理解するであろう。この哺乳動物は、マウスが最も有利である。
【００２２】
本明細書において、(相同組換えによってGPR12を)「機能的に不活性化する」という用語は、GPR12ポリペプチドがその本来の環境(すなわちin vivo環境内)で機能しているときに、それが通常行う1つまたは複数の機能が、GPR12が機能的に不活性化されていない対照と比較して、有意に抑制されていることを意味する。「機能的に不活性化する」という用語は、有利には、GPR12がその本来の環境(すなわちin vivo環境内)で機能しているときに、それが通常行う複数の機能が、GPR12が機能的に不活性化されていない対照と比較して、有意に抑制されていることを意味する。本明細書において、「機能的に不活性化されている」という用語は、最も有利には、GPR12がその本来の環境で機能しているときに、それが通常行う全ての機能が、GPR12が機能的に不活性化されていない対照と比較して、有意に抑制されていることを意味する。
【００２３】
同様に、本明細書で定義する、「機能的に不活性化されている」GPR12核酸は、本明細書で定義した機能的に不活性なGPR12をコードする。
【００２４】
上記における、「有意に抑制されている」(GPR12機能)という用語は、(上述の通り、相同組換えによる、哺乳動物細胞における少なくとも1つのGPR12機能の)抑制が、適当な対照と比較して、少なくとも20%抑制されていることを意味する。適当な対照の一例は、同一または類似のin vivo環境にある同一または類似の細胞であって、GPR12が本明細書に記載の相同組換えによって機能的に不活性化されていない、細胞である。(上述の相同組換えによる、哺乳動物細胞における)「有意に抑制されている」(GPR12機能)という用語は、有利には、少なくとも1つのGPR12機能が、適当な対照と比較して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%抑制されていることを意味する。(上述の相同組換えによる、哺乳動物細胞における)「有意に抑制されている」(GPR12機能)という用語は、最も有利には、少なくとも1つのGPR12機能が、適当な対照と比較して100%抑制されていることを意味する。
【００２５】
別の一態様では、本発明は、1つまたは複数の機能的に不活性なGPR12遺伝子を含む1つまたは複数の哺乳動物細胞を生成する方法であって、
(a) 1つまたは複数の機能的に活性な内在性GPR12遺伝子を含む1つまたは複数の細胞を選択するステップ; 
(b) 1つまたは複数の内在性GPR12遺伝子と相同組換えによって、組換えを行うことができる機能的に不活性なGPR12核酸で、ステップ(a)による1つまたは複数の細胞をトランスフェクトするステップ; および、
(c) 1つまたは複数の内在性GPR12遺伝子が、機能的に不活性なGPR12核酸と相同組換えされた1つまたは複数の細胞を選択するステップ、
を含む方法を提供する。
【００２６】
本発明による哺乳動物細胞は、上記に詳述した本発明の方法に従って生成したものが有利である。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、これらの哺乳動物細胞が哺乳動物の体内に含まれる。すなわち、本発明の上記態様による細胞は、好ましくは「ノックアウト」哺乳動物を構成するであろう。本発明によるノックアウト哺乳動物は、マウスが有利である。
【００２７】
機能的に不活性なGPR12でそれら1つまたは複数の細胞をトランスフェクトする方法は、標準的な分子生物学技術を使用することを含み、本明細書に記載されている。同様に、1つまたは複数の内在性GPR12遺伝子が、機能的に不活性なGPR12核酸と相同組換えを受ける、1つまたは複数の細胞を選択する方法は、標準的な実験室技法を用いて実施され、それらは本明細書に記載されている。
【００２８】
別の態様では、本発明は、宿主細胞中で1つまたは複数の内在性GPR12遺伝子を機能的に不活性化するのに適した核酸構築物を提供し、この核酸構築物は、
(a) 非相同性置換領域; 
(b) 非相同性置換領域の上流に位置する第1の相同性領域; 
(c) 発現された場合に機能的に活性なGPR12をコードしない突然変異GPR12遺伝子; および、
(d) 非相同性置換部分の下流に位置する第2の相同性領域、
を含み、この第2の相同性領域は、非相同性置換領域の下流に位置し、この第2の相同性領域は、第2のGPR12遺伝子に対して少なくとも90%の同一性を示すヌクレオチド配列を有する。
【００２９】
本発明者らは、GPR12に関連したいくつかの機能を同定しており、それゆえ、本発明者らは、GPR12ポリペプチド、またはその結合タンパク質の1つもしくは複数、あるいはそれらをコードする核酸が治療上重要であろうと考える。
【００３０】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、GPR12ポリペプチドまたはその1つもしくは複数の結合タンパク質、あるいはそれらをコードする核酸と、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤とを含む組成物を提供する。
【００３１】
本発明の上記態様によれば、この組成物は、1つまたは複数のGPR12ポリペプチド結合タンパク質を含むものが有利である。この1つまたは複数のGPR12結合タンパク質は、GPR12のアンタゴニストまたはアゴニストであることが好ましい。
【００３２】
GPR12結合タンパク質は、天然に存在するものでも、合成のものでもよい。天然に存在する結合タンパク質は、本明細書に定義する抗体などのポリペプチド、または核酸でありうる。合成のGPR12結合タンパク質は、小分子であると有利であり、当業者ならば熟知しているであろう本明細書に記載のスクリーニング法によって選択することができる。
【００３３】
本発明の代替的な一実施形態では、この組成物は、GPR12結合タンパク質をコードする核酸またはGPR12ポリペプチドをコードする核酸を含むことが好ましい。
【００３４】
本発明者らは、驚いたことに、GPR12ノックアウトマウスが、正常な対照マウスと比較して、ニューロン機能が変化していることを見出した。加えて、GPR12ノックアウトマウスは、他の形態学的異常および解剖学的異常も有する。したがって、本発明者らは、GPR12のアゴニストおよび/もしくはアンタゴニスト、またはそれらを含む組成物が、神経学的な状態の治療において、治療上特に有用であろうと考える。そのような神経学的な状態には、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病のうちの1つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
したがって、別の態様では、本発明は、GPR12ポリペプチドの機能的活性に対してアゴニストとして作用する1つまたは複数の分子を同定する方法を提供し、この方法は、
(a) 機能的に不活性なGPR12ポリペプチドを含む1または複数の哺乳動物を選択するステップ; 
(b) 少なくともGPR12活性の態様に対して潜在的にアゴニストとして作用する1つまたは複数の潜在的GPR12模倣体(mimic)で、それら1または複数の哺乳動物を処置するステップ; 
(c) ステップ(b)に従って処置された1または複数の哺乳動物が、ステップ(a)に従って選択された哺乳動物と比べて回復している1つまたは複数の特徴を有するかどうか判定するために、それら処置された哺乳動物を試験するステップ; および、
(d) ステップ(a)に従って選択された哺乳動物に対して、野生型哺乳動物の1つまたは複数の特徴を回復させる1つまたは複数のGPR12リガンド模倣体を選択するステップ、
を含む。
【００３６】
本発明はさらに、GPR12ポリペプチドの機能的活性に対してアンタゴニストとして作用する1つまたは複数の分子を同定する方法を提供し、この方法は、
(a) 機能的に活性なGPR12ポリペプチドを含む1または複数の哺乳動物を選択するステップ; 
(b) 少なくともGPR12活性の態様に対して潜在的にアンタゴニストとして作用する1つまたは複数の潜在的GPR12アンタゴニストで、それら1または複数の哺乳動物を処置するステップ; および、
(c) ステップ(b)に従って処置された1または複数の哺乳動物が、ステップ(a)に従って選択された哺乳動物と比べてモジュレートされている1つまたは複数の特徴を有するかどうか判定するために、それら処置された哺乳動物を試験するステップ、
を含む。
【００３７】
さらに、本発明は、1つまたは複数の化合物の生物学的効果のアッセイにおけるトランスジェニックGPR12ノックアウト哺乳動物の使用も提供する。
【００３８】
本発明の上記態様によれば、「アンタゴニスト」という用語は、GPR12の、1つまたは複数の機能を、適当な対照と比較して、本明細書で定義するように、有意に抑制する分子を指す。
【００３９】
本発明は、GPR12それ自体、そのアゴニスト、およびアンタゴニストを利用し、さらに、GPR12活性のモジュレーターも利用する。当業者ならば、様々な薬剤の作用によって、GPR12の効果が増強または低下されるであろうこと、そして、様々な経路を介して、これが実現されるであろうこと; したがって、アゴニストは、活性化されたGPR12を模倣する場合も、GPR12に結合して、その活性を増強する場合もあること; GPR12活性のアゴニストモジュレーターは、それらと同じことをする場合も、GPR12の内在性アゴニスト、または内在性GPR12それ自体の生産を増強する場合もあることを認識するであろう。アンタゴニストおよびアンタゴニストモジュレーターは、同様に作用しうるが、その結果、GPR12の生物学的効果を減弱させる。
【００４０】
本明細書において、用語「哺乳動物」は、いかなる哺乳動物でもよい。この哺乳動物は、非ヒト哺乳動物であると有利である。この哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスター、スナネズミ、ネコ、イヌ、およびサルから成る群から選択された任意の動物であることが好ましい。当業者ならば、このリストが網羅的となるように意図されていないことを理解するであろう。
【００４１】
本発明のこの態様によれば、(GPR12の潜在的アンタゴニストで哺乳動物を)「処置する」という用語は、その哺乳動物を含む1つまたは複数の細胞を、(GPR12の1つまたは複数の潜在的アンタゴニストと)接触させることを意味する。
【００４２】
本発明の上記態様によれば、異常な神経学的特徴の指標には、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択された任意のものが含まれる。
【００４３】
異常な神経学的機能の試験は、標準的な実験室技法を利用するものであり、当業者ならば熟知しているであろう。
【００４４】
本発明の上記態様のステップ(c)は、GPR12ノックアウトマウスが示した1つまたは複数の特徴を、それらの哺乳動物が示すかどうか判定するために、それら1または複数の哺乳動物を試験することを含む。
【００４５】
本発明の上記態様によれば、ステップ(a)に従って選択された1または複数の哺乳動物は、GPR12ノックアウトマウスが有利である。それらは、本明細書に記載の方法に従って作製されたものが好ましい。
【００４６】
本明細書において、「機能的に不活性な」(GPR12)という用語は、GPR12ポリペプチドがその本来の環境(すなわちin vivo環境内)で機能しているときに、それが通常行う1つまたは複数の機能が、GPR12がその中で機能的に不活性でない対照と比較して、有意に抑制されていることを意味する。有利には、「機能的に不活性な」という用語は、GPR12がその本来の環境(すなわちin vivo環境内)で機能しているときに、それが通常行う複数の機能が、GPR12が機能的に不活性化されていない対照と比較して、有意に抑制されていることを意味する。本明細書において、「機能的に不活性な」という用語は、最も有利には、GPR12がその本来の環境で機能しているときに、それが通常行う全ての機能が、GPR12が機能的に不活性化されていない対照と比較して、有意に抑制されていることを意味する。
【００４７】
同様に、本明細書で定義する、「機能的に不活性な」GPR12核酸は、本明細書で定義した機能的に不活性なGPR12をコードする。
【００４８】
上記における、「有意に抑制されている」(GPR12機能)という用語は、(上述の通り、相同組換えによる、哺乳動物細胞における少なくとも1つのGPR12機能の)抑制が、適当な対照と比較して、少なくとも20%抑制されていることを意味する。適当な対照の一例は、同一または類似のin vivo環境にある同一または類似の細胞であって、GPR12が、本明細書に記載の相同組換えによって機能的に不活性化されていない、細胞である。(上述の相同組換えによる、哺乳動物細胞における)「有意に抑制されている」(GPR12機能)という用語は、有利には、少なくとも1つのGPR12機能が、適当な対照と比較して少なくとも30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%抑制されていることを意味する。(上述の相同組換えによる、哺乳動物細胞における)「有意に抑制されている」(GPR12機能)という用語は、最も有利には、少なくとも1つのGPR12機能が、適当な対照と比較して100%抑制されていることを意味する。
【００４９】
本発明のこの態様によれば、(GPR12の潜在的アンタゴニストで哺乳動物を)「処置する」という用語は、その哺乳動物を含む1つまたは複数の細胞を、(GPR12の1つまたは複数の潜在的アンタゴニストと)接触させることを意味する。
【００５０】
本発明の上記態様によれば、「野生型哺乳動物の1つまたは複数のモジュレートされている特徴」という用語は、本明細書に定義する機能的に不活性なGPR12ポリペプチドを含む哺乳動物と比較して、野生型哺乳動物が示す、1つまたは複数の特徴のモジュレーションを指す。このモジュレーションは、欠失した機能の回復であることが好ましい。
【００５１】
本明細書において、GPR12模倣体は、野生型GPR12の少なくとも1つの活性または機能を複製する。模倣体は、活性化されたGPR12を模倣する場合もあるし、不活性のGPR12を模倣して、それによって、天然の不活性GPR12の非存在下でそれ自体抑制されている機能をさらに抑制する場合もある。
【００５２】
本発明者らは、1つまたは複数の治療効果を生み出すために、GPR12核酸、またはGPR12の1つもしくは複数のアゴニストもしくはアンタゴニストをコードする核酸を哺乳動物に挿入することができると考える。
【００５３】
したがって、別の態様では、本発明は、GPR12ポリペプチド、GPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアゴニスト、およびGPR12ポリペプチドの1つまたは複数のアンタゴニストから成る群から選択される1つまたは複数をコードする外因性の核酸を、少なくともそれの一部の細胞の中に含むトランスジェニック動物を提供する。
【００５４】
このトランスジェニック動物は、マウス、ヒト、ブタ、ヤギ、シカ、サル、およびウシから成る群から選択されたものが有利である。当業者ならば、このリストが網羅的となるように意図されていないことを理解するであろう。
【００５５】
本発明の上記態様によれば、「外因性の核酸」という用語は、その特定の動物から生じたものではない核酸を意味する。しかし、それは同じ動物タイプまたは品種から生じたものでもよい。例えば、トランスジェニックマウスは、細菌由来のGPRアゴニスト核酸を含みうる。
【００５６】
トランスジェニック動物は、それの一部の細胞の中に、GPR12の、1つもしくは複数のアゴニスト、または1つもしくは複数のアンタゴニストをコードする外因性のDNAを含むことが好ましい。
【００５７】
本明細書に記載の通り、非ヒトトランスジェニック動物は、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、およびブタから成る群から選択された任意の1種類または複数でありうる。当業者ならば、このリストが網羅的となるように意図されていないことを理解するであろう。
【００５８】
本発明に従って準備されたGPR12ノックアウトマウスを用いた研究によって、GPR12ポリペプチドが、ニューロン機能に関与し、また、他の状態にも関与していることが示された。そのような神経学的な状態には、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病のうちのいずれか1つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
したがって、別の態様では、本発明は、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される疾患または状態を診断する方法を提供し、この方法は、
(a) 診断される患者からの細胞の試料を選択するステップ; および
(b) それらの細胞の試料におけるGPR12ポリペプチドの発現レベルおよび/または機能的活性を、健康な個体からの1つまたは複数の対照試料と比較するステップ、
を含む。
【００６０】
別の実施形態では、疾患を診断するのに、GPR12またはその天然リガンドの多型を用いることができる。したがって、本発明は、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される疾患または状態を診断する方法を提供し、この方法は、
(a) 診断される患者からの細胞の試料を選択するステップ; および、
(b) 内在性GPR12遺伝子またはGPR12の1つもしくは複数の天然リガンドの1つもしくは複数の多型を検出するために、前記細胞の中の内在性核酸を分析するステップ、
を含む。
【００６１】
本発明の上記態様によれば、試料中で、GPR12の発現レベルおよび/または機能的活性が増大、低減、または他の様態で変化している場合、あるいは、健康な個体から得た1つまたは複数の対照試料と比較して、GPR12核酸、またはGPR12リガンドをコードする核酸が、1つまたは複数の多型を含む場合、それはその試料が採取された個体が、上記の疾患のうちいずれか1つまたは複数を有することを示す。
【００６２】
本発明の上記態様によれば、患者からの細胞の試料は、標準的な実験室技法を用いて選択することができ、当業者ならばそれらを熟知していよう。
【００６３】
上記における、GPR12ポリペプチドの「機能的活性」という用語は、GPR12が、細胞内の自然な環境で正常に行う機能を指す。
【００６４】
さらに別の態様では、本発明は、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される、患者の状態を予防または治療するための医薬の調製における、GPR12の1つまたは複数のアゴニストまたはアンタゴニストの使用を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６５】
一般技法
本発明の実施は、別段の指示がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学における従来の技法を利用するであろう。そして、それらの技法は、当業者の能力の範囲内にある。そのような技法は、文献において説明されている。例えば、J. Sambrook, E. F. Fritsch、およびT. Maniatis、1989年、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、第2版、第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory Press社; Ausubel, F. M.ら(1995年および定期補足;「Current Protocols in Molecular Biology」、第9、13、および16章、John Wiley & Sons社、New York, N.Y.); B. Roe、J. Crabtree、およびA. Kahn、1996年、「DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques」、John Wiley & Sons社; J. M. PolakおよびJames O'D. McGee、1990年、「In Situ Hybridization: Principles and Practice」、Oxford University Press社; M. J. Gait (編集)、1984年、「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」、Irl Press社; D. M. J. LilleyおよびJ. E. Dahlberg、1992年、「Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology」、Academic Press社;「Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I」、Edward Harlow、David Lane、Ed Harlow (1999年、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、ISBN 0-87969-544-7);「Antibodies: A Laboratory Manual」、Ed Harlow (編集)、David Lane (編集)(1988年、Cold Spring Harbor Laboratory Press、社、ISBN 0-87969-314-2)、1855、Lars-Inge Larsson、「Immunocytochemistry: Theory and Practice」、CRC Press inc.社、Baca Raton, Florida、1988年、ISBN 0-8493-6078-1、John D. Pound (編集);「Methods in Molecular Biology」シリーズにおける、「Immunochemical Protocols」、第80巻、Humana Press社、Totowa, New Jersey、1998年、ISBN 0-89603-493-3、「Handbook of Drug Screening」、Ramakrishna Seethala、およびPrabhavathi B. Fernandes編集(2001年、New York, NY, Marcel Dekker、ISBN 0-8247-0562-9);「Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench」、Jane RoskamsおよびLinda Rodgers編集、2002年、Cold Spring Harbor Laboratory社、ISBN 0-87969-630-3; ならびに、「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy」(第17版、Beers, M. H.、およびBerkow, R編集、ISBN: 0911910107、John Wiley & Sons社)を参照のこと。これらの一般的文献のそれぞれを、参照により本明細書に援用する。
【００６６】
GPR12ポリペプチド
本明細書に記載の「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに連結された2つ以上のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質、あるいは修飾ペプチド結合によって互いに連結された2つ以上のアミノ酸を含むもの、すなわちペプチドイソスターのいかなるものも指す。「ポリペプチド」は、短鎖のもの、および長鎖のもの両方を指し、前者は通常、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと呼ばれ、後者は通常、タンパク質と呼ばれる。ポリペプチドは、遺伝子によってコードされている20種のアミノ酸以外のアミノ酸も含有してよい。
【００６７】
「ポリペプチド」には、翻訳後プロセシングなどの天然過程によって修飾されたアミノ酸配列も、当技術分野で周知の化学修飾技法によって修飾されたアミノ酸配列も含まれる。そのような修飾については、基礎的な教科書、およびより詳細な研究書、さらには多数の研究論文に詳細に記載されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシル末端を含めた、ポリペプチドのいかなる箇所でも起こりうる。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同じ程度か、または異なった程度で存在しうることが理解されよう。また、所与のポリペプチドが、多くのタイプの修飾を含有することもある。
【００６８】
ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝している場合があり、そして、ポリペプチドは、環状である場合があり、この場合、それらは分枝していることも、分枝していないこともある。環状ポリペプチド、分枝ポリペプチド、および環状分枝ポリペプチドは、天然の翻訳後過程で生じることも、合成による方法で生成されることもある。修飾には、アセチル化、アシル化、ADPリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合化、ヘム部分の共有結合化、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合化、脂質または脂質誘導体の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化反応、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化(selenoylation)、硫酸化、アルギニン化などの、タンパク質への転移RNA媒介型のアミノ酸付加、およびユビキチン化が含まれる。例えば、「Proteins - Structure and Molecular Properties」、第2版、T. E. Creighton、W. H. Freeman and Company社、New York、1993年、および、Wold, F.、「Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects」、「Posttranslational Covalent Modification of Proteins」における1〜12頁、B. C. Johnson編集、Academic Press社、New York、1983年; Seifterら、「Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors」、Meth Enzymol (1990年)、182: 626〜646、および、Rattanら、「Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging」、Ann NY Acad Sci (1992年)、663:48〜62を参照のこと。
【００６９】
本発明に関する場合、「変異体」、「相同体」、「誘導体」、または「断片」という用語には、ある配列からの、またはある配列への、1つ(または複数)のアミノ酸のいかなる置換(substitution)、変異、修飾、置換除去(replacement)、欠失、または付加も含まれる。文脈によって別段のことが認められない限り、「GPR12」に関する言及には、そのようなGPR12の変異体、相同体、誘導体、および断片への言及が含まれる。
【００７０】
GPR12などの受容体の「受容体活性」または「生物学的活性」について言及する場合、これらの用語は、GPR12受容体の代謝機能または生理学的機能を指すものとし、これらには、同様の活性もしくは改善された活性、または、付随の望ましくない副作用が軽減されているこれらの活性が含まれる。GPR12受容体の抗原性活性および免疫原性活性も含まれる。GPCR活性、およびこれらの活性をアッセイおよび定量化する方法の例は、当技術分野で公知であり、本明細書の他の箇所に詳細に記述する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「欠失」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかの変化であって、その際、それぞれ、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が不在となる変化と定義する。本明細書で使用する場合、「挿入」または「付加」は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の変化であって、天然に存在する物質と比較して、それぞれ、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加をもたらす変化である。本明細書で使用する場合、「置換」は、1つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を、それぞれ、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸で置換除去することによって起こる。
【００７２】
本発明によるGPR12ポリペプチドは、サイレント変化を引き起こし、機能的に同等なアミノ酸配列をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有するものでもよい。慎重なアミノ酸置換は、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似性に基づいて導入することができる。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ; 正に荷電したアミノ酸には、リジンおよびアルギニンが含まれ; そして、同様の親水性度を有する荷電されていない極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。
【００７３】
GPR12ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド
通常、「ポリヌクレオチド」は、いかなるポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオシドも指し、これは、無修飾のRNAもしくはDNA、または修飾されたRNAもしくはDNAでありうる。「ポリヌクレオチド」には、非限定的に、一本鎖DNAおよび二本鎖DNA、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖RNAおよび二本鎖RNA、一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるRNA、ならびに、DNAおよびRNAを含むハイブリッド分子が含まれ、これらのハイブリッド分子は、一本鎖であることもあるが、より典型的な場合、二本鎖であるか、もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であることもある。加えて、「ポリヌクレオチド」は、RNAもしくはDNA、またはRNAおよびDNAの両方を含む三本鎖領域も指す。ポリヌクレオチドという用語には、1つまたは複数の修飾塩基を含有するDNAまたはRNA、および、安定性または他の理由のために修飾されたバックボーンを有するDNAまたはRNAも含まれる。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化された塩基、および、イノシンなどの、通常とは異なる塩基が含まれる。DNAおよびRNAには、様々な修飾がなされており、したがって、「ポリヌクレオチド」は、ウイルスおよび細胞で特徴的な化学形態のDNAおよびRNAだけでなく、通常天然に見出される、化学修飾型、酵素修飾型、または代謝修飾型のポリヌクレオチドも包含する。「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる、比較的短いポリヌクレオチドも包含する。
【００７４】
遺伝暗号の縮重の結果として、多数のヌクレオチド配列が同一のポリペプチドをコードしうることが、当業者には理解されよう。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド配列」という用語は、ヌクレオチド配列、オリゴヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ならびに、それらの変異体、相同体、断片、および誘導体(その部分など)を指す。ヌクレオチド配列は、DNAでも、RNAでも、ゲノム由来でも、化学合成由来でも、組換え体由来でもよく、それは、二本鎖でも、一本鎖でも、センス鎖もしくはアンチセンス鎖のいずれかを表すものでも、それらの組合せを表すものでもよい。ヌクレオチド配列という用語は、組換えDNA技法の使用によって調製されるもの(例えば組換え体DNA)を意味することもある。
【００７６】
「ヌクレオチド配列」という用語は、DNAを意味するのが好ましい。
【００７７】
本発明に関する場合、「変異体」、「相同体」、「誘導体」、または「断片」という用語には、GPR12ヌクレオチド配列の配列からの、またはGPR12ヌクレオチド配列の配列への、1つ(または複数)の核酸のいかなる置換、変異、修飾、置換除去、欠失、または付加も含まれる。文脈によって別段のことが認められない限り、「GPR12」に関する言及、および「GPR12」には、そのようなGPR12の変異体、相同体、誘導体、および断片への言及が含まれる。
【００７８】
GPR12の発現アッセイ
GPR12関連疾患を治療するのに有用な治療法を設計するためには、GPR12(野生型または特定の突然変異体)の発現プロフィールの決定が有用である。したがって、GPR12が発現されている器官、組織、および細胞型(同様に発生ステージ)を決定するために、当技術分野で知られている方法が用いられるであろう。例えば、伝統的ノーザンまたは「電子」ノーザンを行うことができる。逆転写酵素PCR(RT-PCR)も、GPR12遺伝子または突然変異体の発現をアッセイするのに利用できる。GPR12の発現プロフィールを決定するための、さらに感度が高い方法には、当技術分野で公知のRNAseプロテクションアッセイが含まれる。
【００７９】
ノーザン分析は、遺伝子の転写産物の存在を検出するのに用いられる実験室技法であり、特定の細胞型または組織からのRNAがその表面に結合している膜への、標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを含む(Sambrook、同上、第7章、ならびにAusubel, F.M.ら、同上、第4および16章)。BLASTを利用した類似のコンピュータ技法(「電子ノーザン」)は、GenBankデータベース、またはLIFESEQデータベース(Incyte Pharmaceuticals社)などのヌクレオチドデータベース中にある同一もしくは関連の分子を探索するのに用いることができる。このタイプの分析の利点は、それらが、複数の膜をベースにしたハイブリダイゼーションより速いことにある。加えて、コンピュータ検索では、その感度を改変することによって、特定の一致が、正確であると分類されるものか、または相同であると分類されるものか判定することができる。
【００８０】
上述のプローブを含めた本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本明細書の他の箇所でより詳細に説明するように、動物およびヒトの疾患に対する治療および診断を発見するための研究用の試薬および物質として利用することができる。
【００８１】
GPR12ポリペプチドの発現
GPR12ポリペプチドの発現は、GPR12抗体の産生に必要であり、GPR12抗体は、本明細書に記述するように、GPR12のアゴニストまたはアンタゴニストとして機能しうる。
【００８２】
生物学的に活性なGPR12ポリペプチドを発現するためには、GPR12をコードするヌクレオチド配列、またはそれらの相同体、変異体、もしくは誘導体を、適当な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入する。
【００８３】
GPR12をコードする配列と、適当な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントとを含有する発現ベクターの構築は、当業者に周知の方法を用いて行う。これらの方法には、in vitroの組換えDNA技法、合成技法、およびin vivoの遺伝子組換えが含まれる。そのような技法は、Sambrook、J.ら(1989年;「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」、第4、8、および16〜17章、Cold Spring Harbor Press社、Plainview, N.Y.)、および、Ausubel、F. M.ら(1995年および定期補足;「Current Protocols in Molecular Biology」、第9、13、および16章、John Wiley & Sons社、New York、N.Y.)に記載されている。
【００８４】
GPR12をコードする配列を含有および発現する様々な発現ベクター/宿主システムを利用することができる。これらには、組換え体のバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物; 酵母発現ベクターで形質転換された酵母; ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞システム; ウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)またはタバコモザイクウイルス(TMV))、または細菌発現ベクター(例えばTiまたはpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞システム; または、動物細胞システムが含まれるが、これらに限定されない。本発明は、利用される宿主細胞によって限定されない。
【００８５】
「制御エレメント」または「調節配列」は、ベクターの非翻訳領域(すなわち、エンハンサー、プロモーター、ならびに5'および3'の非翻訳領域)であって、それらの領域が宿主細胞タンパク質と相互作用することによって、転写および翻訳が実施される。そのようなエレメントの強度および特異性は様々でありうる。利用するベクターシステムおよび宿主に応じて、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含めた、様々な適当な転写エレメントおよび翻訳エレメントを用いることができる。例えば、細菌システムにクローニングする場合には、BLUESCRIPTファージミド(Stratagene社、La Jolla, Calif.)またはPSPもしくはT1プラスミド(GIBCO/BRL社)のハイブリッドlacZプロモーター、および同様のものなどの誘導性プロモーターを用いることができる。昆虫細胞では、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを用いることができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーターもしくはエンハンサー(例えば、熱ショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子)、または植物ウイルスに由来するもの(例えば、ウイルスのプロモーターまたはリーダー配列)を、ベクターにクローニングすることができる。哺乳動物細胞システムでは、哺乳類遺伝子または哺乳類ウイルスからのプロモーターが好ましい。GPR12ポリペプチドをコードする配列を複数コピー含有する細胞系の作製が必要である場合には、適当な選択マーカーを有する、SV40ベースまたはEBVベースのベクターを用いることができる。
【００８６】
細菌システムでは、意図されているGPR12ポリペプチドの使用に応じて、多数の発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体を誘導するのに大量のGPR12ポリペプチドが必要である場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を指示するベクターを用いることができる。限定されるものではないが、そのようなベクターには、BLUESCRIPT(Stratagene社)、pINベクター(Van Heeke, G.およびS. M. Schuster (1989年)、J. Biol. Chem. 264: 5503〜5509)、および同様のものなどの、多機能性E.coliクローニングベクターおよび発現ベクターが含まれ、BLUESCRIPTでは、GPR12ポリペプチドをコードする配列を、β-ガラクトシダーゼのアミノ末端のMet、およびそれに続く7残基の配列とインフレームになるようにベクター中に連結させて、それによってハイブリッドタンパク質を生成させることができる。pGEXベクター(Promega社、Madison, Wis.)も、外来のポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現するのに使用できる。一般的には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズに吸着させて、それに続いて、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製することができる。そのようなシステムで生成されたタンパク質は、クローニングした目的のポリペプチドをGST部分から自在に放出できるように、へパリン、トロンビン、または第XA因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計することができる。
【００８７】
酵母Saccharomyces cerevisiaeでは、アルファ因子、アルコール酸化酵素、およびPGHなど、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを用いることができる。概説には、Ausubel(同上)、およびGrantら(1987年; Methods Enzymol. 153: 516〜544)を参照のこと。
【００８８】
植物発現ベクターを使用する場合、GPR12ポリペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのうちの任意のものによって駆動させることができる。例えば、CaMVの35Sプロモーターおよび19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを、単独で、あるいはTMVのオメガリーダー配列と組み合わせて用いることができる(Takamatsu, N. (1987年)、EMBO J. 6: 307〜311)。別法として、RUBISCOのスモールサブユニットプロモーターまたは熱ショックプロモーターのなどの植物プロモーターを用いることもできる(Coruzzi, G.ら(1984年)、EMBO J. 3: 1671〜1680; Broglie, R.ら(1984年)、Science 224: 838〜843; および、Winter, J.ら(1991年)、Results Probl. Cell Differ. 17: 85〜105)。これらの構築物は、直接的なDNA形質転換または病原体の媒介によるトランスフェクションによって、これらの植物細胞の中に導入することができる。そのような技法は、一般的に利用可能な多数の総説に記載されている(例えば、McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992)におけるHobbs, S.またはMurry, L. E.、McGraw Hill社、New York, N.Y.; 191〜196頁を参照)。
【００８９】
GPR12ポリペプチドを発現するのに、昆虫システムを用いることもできる。例えば、そのようなシステムの1つでは、外来遺伝子をSpodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫で発現するのに、オートグラファカリフォルニア核多角体ウイルス(AcNPV)をベクターとして用いる。GPR12をコードする配列は、このウイルスにおけるポリヘドリン遺伝子など、必須ではない領域にクローニングして、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。GPR12ポリペプチドの挿入に成功すれば、ポリヘドリン遺伝子を不活性にして、コートタンパク質を欠失した組換え体ウイルスを生成するであろう。この組換え体ウイルスは、その後、例えばS. frugiperda細胞またはTrichoplusia幼虫を感染させるのに用いることができ、それらの中でGPR12ポリペプチドを発現させることができる(Engelhard, E. K.ら(1994年)、Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224〜3227)。
【００９０】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現システムを利用することができる。発現ベクターとしてアデノウィルスを用いる場合、GPR12ポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列からなるアデノウィルス転写/翻訳複合体に連結することができる。このウイルスゲノムの非必須領域であるE1またはE3領域への挿入は、感染した宿主細胞でGPR12ポリペプチドを発現ができる生存ウイルスを得るのに用いることができる(Logan, J.およびT. Shenk (1984年)、Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655〜3659)。加えて、哺乳類宿主細胞での発現を増強するのに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いることもできる。
【００９１】
プラスミド中に含有させて、発現させることのできるものより大きいDNA断片を送達させるために、ヒト人工染色体(HAC)を利用することもできる。治療目的には、約6kbから10MbのHACsを構築して、従来の送達方法(リポソーム 、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル)で送達する。
【００９２】
GPR12ポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を実現するために、特定の開始シグナルを用いることもできる。そのようなシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。GPR12ポリペプチドをコードする配列と、その開始コドンおよび上流配列とを適切な発現ベクターに挿入する場合には、それらに追加して、いかなる転写制御シグナルも、あるいは翻訳制御シグナルも必要ないであろう。しかし、コード配列またはその断片のみを挿入する場合には、ATG開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルを提供するべきである。さらに、開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にするために、正しいリーディングフレームにあるべきである。外因性の翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然のもの、および合成のもの両方の様々な由来のものでよい。発現の効率は、文献に記載されているものなど、使用される特定の細胞システムに適したエンハンサーを包含させることによって増強することができる(Scharf, D.ら(1994年)、Results Probl. Cell Differ. 20: 125〜162)。
【００９３】
加えて、宿主細胞株を、それが挿入配列の発現をモジュレートする能力、または、発現されたタンパク質を望ましい様式でプロセシングする能力によって選択することができる。そのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。「プレプロ」型のタンパク質を切断する翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折りたたみ、および/または機能を促進するのに用いることができる。翻訳後活性のための特定の細胞機構および独特のメカニズムを有する様々な宿主細胞(例えば、CHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38)は、ATCC(American Type Culture Collection、Bethesda, Md.)から入手することができ、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングが確実となるように選択することができる。
【００９４】
組換え体タンパク質の長期的かつ高収率の生産には、安定した発現が好ましい。例えば、GPR12 GPCRを安定的に発現できる細胞系は、ウイルスの複製起点および/または内在性発現エレメントと、選択マーカー遺伝子とを、同一または別個のベクター上に含有するであろう発現ベクターを用いて形質転換することができる。細胞は、ベクターを導入した後、選択培地に切り換える前に、濃縮培地中で約1から2日間成長させることができる。選択マーカーの目的は、選択に耐性を付与することであり、それが存在することによって、導入された配列を良好に発現する細胞の成長と、回収とを可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技法を用いて増殖させることができる。
【００９５】
多数の選択システムのうち任意のものを、形質転換細胞系を回収するに用いることができる。限定されるものではないが、これらには単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子(Wigler, M.ら(1977年)、Cell 11: 223〜32)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(Lowy, I.ら(1980年)、Cell 22: 817〜23)が含まれ、これらはそれぞれ、tk-細胞またはapr-細胞で用いることができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質、もしくは除草剤耐性も、選択の基礎として用いることができる。例えば、dhfrはメトトレキセートに対する耐性を付与し(Wigler, M.ら(1980年)、Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567〜70); nptはアミノグルコシドネオマイシンおよびG-418に対する耐性を付与し(Colbere-Garapin, F.ら(1981年)、J. Mol. Biol. 150: 1〜14); そして、alsまたはpatはそれぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する(Murry、同上)。他の選択可能な遺伝子、例えば、trpBまたはhisDが既に記載されており、trpBは、トリプトファンの代わりに、細胞によるインドールの利用を可能にし、hisDは、ヒスチジンの代わりに、細胞によるヒスチノールの利用を可能にする(Hartman, S. C.およびR. C. Mulligan (1988年)、Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047〜51)。最近では、可視マーカーの使用が好まれるようになっており、そのようなマーカーには、アントシアニン、β-グルクロニダーゼおよびその基質GUS、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンがある。これらのマーカーは、形質変換体を同定するのみでなく、特定のベクターシステムに起因する一過的または安定的なタンパク質発現の量を定量化するのにも使用できる(Rhodes, C. A.ら(1995年)、Methods Mol. Biol. 55: 121〜131)。
【００９６】
マーカー遺伝子発現の存在/不在は、目的の遺伝子も存在することを示唆するが、その遺伝子の存在および発現を確認する必要がある場合もある。例えば、GPR12ポリペプチドをコードする配列を、マーカー遺伝子配列中に挿入する場合、マーカー遺伝子機能の不在によって、GPR12ポリペプチドをコードする配列を含有する形質転換細胞を同定することができる。
【００９７】
別法として、マーカー遺伝子を、GPR12ポリペプチドをコードする配列と直列にして、単一のプロモーターの制御下に配置することもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、直列の遺伝子の発現も示す。
【００９８】
別法として、GPR12ポリペプチドをコードする核酸配列を含有し、かつGPR12を発現する宿主細胞を、当業者に公知の様々な操作法によって同定することもできる。これらの操作法には、核酸配列またはタンパク質配列を検出および/または定量するための、膜、溶液、またはチップベースの技法を含めた、DNA-DNAまたはDNA-RNAハイブリダイゼーション、およびタンパク質のバイオアッセイ技法またはイムノアッセイ技法が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
GPR12ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、GPR12 GPCRをコードするポリヌクレオチドのプローブまたは断片を用いた、DNA-DNAもしくはDNA-RNAハイブリダイゼーション、または増幅によって検出することができる。核酸増幅ベースのアッセイは、GPR12ポリペプチドをコードする配列に基づいたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーを使用して、GPR12をコードするDNAまたはRNAを含有する形質転換体を検出することを含む。
【０１００】
タンパク質に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、GPR12の発現を検出および測定するための様々なプロトコールが当技術分野で知られている。そのような技法の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、および蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が含まれる。GPR12上の2箇所の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用した2部位(two-site)、モノクローナルベースのイムノアッセイが好ましいが、競合結合アッセイを利用することもできる。これらのアッセイおよび他のアッセイは、当技術分野で詳細に記載されており、例えば、Hampton, R.ら(1990年;「Serological Methods, a Laboratory Manual」、 Section IV、APS Press社、St Paul, Minn.)、および、Maddox, D. E.ら(1983年; J. Exp. Med. 158: 1211〜1216)に記載されている。
【０１０１】
様々な標識技法および結合技法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイで用いることができる。GPR12をコードするポリヌクレオチドに関連した配列の検出用に標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識法、または標識されたヌクレオチドを用いたPCR増幅が含まれる。別法として、mRNAプローブを生成するために、GPR12または任意のその断片をコードする配列を、ベクターにクローニングすることもできる。そのようなベクターは、当技術分野で公知であり、市販されており、T7、T3、またはSP6などの適切なRNAポリメラーゼと、標識されたヌクレオチドとを添加することによって、RNAプローブをin vitroで合成するのに用いることができる。これらの操作法は、Pharmacia & Upjohn社(Kalamazoo, Mich.)、 Promega社(Madison, Wis.)、およびU.S. Biochemical Corp.社(Cleveland, Ohio)によって販売されているものなど、市販されている様々なキットを用いて実施できる。適当なレポーター分子、すなわち、検出を容易にするのに用いることのできる標識には、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素生成物質が含まれ、さらに基質、補因子、抑制物質、磁性粒子、および同様のものも含まれる。
【０１０２】
GPR12をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現、および細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養することができる。形質転換細胞によって生成されたタンパク質は、用いられた配列および/またはベクターに応じて、細胞膜中に局在する場合も、分泌される場合も、細胞内に含有される場合もある。当業者ならば理解するであろうが、GPR12をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核細胞または真核細胞の細胞膜を通したGPR12の分泌を指示するシグナル配列を含有するように設計することができる。可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、GPR12をコードする配列を連結するのに、他の構築を用いることもできる。精製を容易にするそのようなドメインには、固定化された金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレート化ペプチド、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、および、FLAGS伸長/親和性精製システム(Immunex Corp.社、Seattle, Wash.)で用いられるドメインが含まれるが、これらに限定されない。精製を容易にするために、精製用ドメインと、GPR12 GPCRをコードする配列との間に、第XA因子またはエンテロキナーゼ(Invitrogen社、San Diego, Calif.)に特異的なものなど、切断可能なリンカー配列を包含させることもできる。そのような発現ベクターの1つは、GPR12と、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する6ヒスチジン残基をコードする核酸とを含有する融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、固定化された金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMIAC; Porath、J.、ら(1992年)、Prot. Exp. Purif. 3: 263〜281に記載)での精製を容易にし、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からGPR12を精製する手段を提供する。融合タンパク質を含有するベクターに関する考察は、Kroll, D. J.ら(1993年; DNA Cell Biol. 12: 441〜453)に提供されている。
【０１０３】
GPR12の断片は、組換え体生成によって生成されるのみでなく、固相法を用いた直接的ペプチド合成によっても生成することができる(Merrifield J. (1963年)、J. Am. Chem. Soc. 85: 2149〜2154)。タンパク質合成は、手動の技法によっても、自動化によっても実施できる。自動化による合成は、例えば Applied Biosystems 431Aペプチドシンセサイザー(Perkin Elmer社)を用いて実現できる。GPR12の様々な断片を別々に合成して、その後、結合させて完全長分子を生成させることができる。
【０１０４】
トランスジェニック動物
(a) ノックアウト
本発明の別の態様では、GPR12ポリペプチドが機能的に不活性化されている1つまたは複数の細胞を含むGPR12ノックアウト哺乳動物を提供する。
【０１０５】
本発明のGPR12ノックアウトは、欠失または置換除去を含めた、GPR12遺伝子の1つまたは複数の機能喪失突然変異を含む、GPR12遺伝子またはこの遺伝子の任意の部分の機能的な破壊の結果として生じうる。これらの突然変異には、単一点突然変異が含まれ、GPR12のコード領域を標的としたものでも、非コード領域を標的としたものでもよい。
【０１０６】
そのようなノックアウト動物は、ブタ、ヒツジ、または齧歯動物などの非ヒト哺乳動物であることが好ましい。ノックアウト動物は、マウスまたはラットであることが最も好ましい。そのようなノックアウト動物は、GPR12のアゴニストおよび/またはアンタゴニストを同定するためのスクリーニング操作に用いることができ、また、in vivoにおける疾患の治療としてのそれらの有効性を試験するのに用いることもできる。
【０１０７】
例えば、GPR12の産生が欠損しているように構築されたノックアウト動物は、GPR12のアゴニストおよび/またはアンタゴニストを同定するためのアッセイで用いることができる。あるアッセイは、潜在的薬物(候補リガンドまたは化合物)を評価して、GPR12受容体の非存在下で生理学的反応を生成するかどうか判定するように設計される。これは、上記に論じた通り、その薬物をノックアウト動物に投与して、その後、その動物で、特定の反応をアッセイすることによって実現することができる。いかなる生理学的パラメーターも、このアッセイで測定できよう。
【０１０８】
GPR12ノックアウト動物から得られた組織は、潜在的薬物(候補リガンドまたは化合物)が、GPR12受容体に結合するかどうかを判定する受容体結合アッセイで用いることができる。そのようなアッセイは、GPR12受容体産生が欠損しているように構築されたノックアウト動物からの第1の受容体調製物と、同定されている任意のGPR12リガンドまたは化合物に結合することが知られている供給源からの第2の受容体調製物とを取得することによって実施できる。一般に、第1の受容体調製物および第2の受容体調製物は、それらが取得された供給源を除けば、あらゆる点で同様のものであろう。例えば、ノックアウト動物(上記のもの、および下記のものなど)から得られた脳組織をアッセイに用いる場合、正常(野生型)動物から得られた、それに相当する脳組織を、第2の受容体調製物の供給源として用いる。各受容体調製物を、GPR12受容体に結合することが知られているリガンドとインキュベートし、その際、単独でのインキュベーション、および候補リガンドまたは化合物の存在下でのインキュベーションの両方を行う。候補リガンドまたは化合物は、好ましくは、いくつかの異なった濃度で検査されるであろう。
【０１０９】
既知リガンドによる結合が、試験化合物によって置換除去される程度を、第1の受容体調製物および第2の受容体調製物の両方で測定する。ノックアウト動物から得られた組織は、アッセイに直接用いても、あるいはこの組織の加工を行って、膜または膜タンパク質を単離してもよく、これらはそれら自体がアッセイに使用される。好ましいノックアウト動物はマウスである。リガンドは、結合アッセイと適合性のあるいかなる手段を用いて標識してよい。これらには、非限定的に、放射性標識、酵素標識、蛍光標識、および化学発光標識が含まれるであろう(上記にさらに詳細に記述した他の標識技術も同様に含まれる)。
【０１１０】
さらに、GPR12受容体のアンタゴニストは、候補化合物などを、機能的なGPR12を発現する野生型動物と、GPR12受容体機能の発現の減少または消失に伴う、任意の表現型の特徴を示すものとして特定されている動物とに投与することによって同定することができる。
【０１１１】
非ヒトノックアウト動物を作製する詳細な方法を、以下に詳細に記述する。ノックアウト哺乳動物を作製するために、動物の生殖細胞系にトランスジェニック遺伝子構築物を導入することができる。例えば、構築物の1または数コピーを、標準的なトランスジェニック技法によって、哺乳動物胚のゲノムに組み入れることができる。
【０１１２】
例示的な実施形態では、非ヒト動物の生殖細胞系に導入遺伝子を導入することによって、本発明の非ヒトノックアウト動物を作製する。様々な発生ステージの標的胚細胞を、導入遺伝子を導入するのに用いることができる。標的胚細胞の発生のステージに応じて、様々な方法が用いられる。本発明を実施するのに使用されるいかなる動物についても、その動物の特定の系列を、全般的健康、胚生産性の高さ、胚における前核可視度の高さ、および自己増殖性適応度の高さによって選択する。加えて、ハプロタイプも重要な因子である。
【０１１３】
胚への導入遺伝子の導入は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはリポフェクションなど、当技術分野で知られている任意の手段によって、実行することができる。例えば、GPR12受容体導入遺伝子は、哺乳動物受精卵の前核の中への構築物のマイクロインジェクションによって、哺乳動物に導入することができ、それによって、発生中の哺乳動物の細胞中における、1または複数コピーの構築物の維持が引き起こされる。受精卵に導入遺伝子構築物を導入した後、卵を、様々な長さの時間in vitoでインキュベートするか、あるいは代理宿主に再移植するか、あるいはそれら両方を行うことができる。成熟するまでのin vitroインキュベーションも、本発明に包含される。一般的な方法の1つは、種に応じて約1〜7日間、胚をin vitoでインキュベートして、その後、代理宿主にそれらを再移植するものである。
【０１１４】
導入遺伝子によって操作された胚の子孫は、組織断片のサザンブロット解析によって、構築物が存在しているかどうか試験することができる。1または複数コピーのクローニングされた外因性構築物が、そのようなノックアウト胚のゲノム中に安定的に組み込まれている場合、添加された構築物を導入遺伝子として保持する恒久的なノックアウト哺乳動物系を確立することが可能である。
【０１１５】
構築物が子孫ゲノム中に取り込まれているかどうか、ノックアウトによって改変された哺乳動物の同腹仔を、出産後にアッセイすることができる。このアッセイは、所望の組換え体タンパク質産物をコードするDNA配列、またはそのセグメントに相当するプローブを、子孫からの染色体物質にハイブリダイズさせることによって実施できる。ゲノム中に少なくとも1コピーの構築物を含有することが判明した子孫哺乳動物を、成熟するまで育てる。
【０１１６】
本発明の目的においては、接合子は、本質的には、完全な生物に発生することができる二倍体細胞の形成である。通常、接合子は、1つまたは複数の配偶子に由来する2つの半数体核の自然融合または人工的融合によって形成された1つの核を含有する卵から成るであろう。したがって、それらの配偶子核は、自然状態で適合性のあるもの、すなわち、分化、および機能性の生物への発生を行うことができる生きた接合子を生ずるものでなければならない。通常は、正倍数体接合子が好ましい。異数体接合子が得られた場合には、その染色体数は、いずれかの配偶子が由来した生物の正倍数体数に比べて、2以上の大きな相違を有するべきではない。
【０１１７】
同様の生物学的要件に加えて、物理的要件も、接合体の核に添加できる外因性遺伝物質、または接合体核の一部を形成する遺伝物質の量(例えば容積)を決定する。遺伝物質が除去されない場合には、添加することができる外因性遺伝物質の量は、物理的な破壊を起こさずに吸収されるであろう量に制限される。通常、挿入される外因性遺伝物質の容積は、約10ピコリットルを超えないであろう。添加の物理的影響は、接合子の生存を物理的に破壊するほどに大きいものであってはならない。DNA配列の数および多様性の生物学的制限は、外因性遺伝物質を含めた、その結果に得られる接合体の遺伝物質が、機能性の生物への接合体の分化および発生の開始および維持を生物学的に行えるものでなくてはならないので、特定の接合体、および外因性遺伝物質の機能によって異なるであろうし、それらは、当業者には容易に明らかであるだろう。
【０１１８】
接合子に添加される導入遺伝子構築物のコピー数は、添加される外因性遺伝物質の総量に依存するものであり、遺伝的形質転換の実現を可能にする量であろう。理論的には、必要なのは1コピーのみであるが、機能的なものが1コピーあることを保障するために、通常、多くのコピー、例えば、1000〜20000コピーの導入遺伝子構築物が用いられる。本発明に関しては、外因性DNA配列の表現型発現を増強するために、挿入される各外因性DNA配列の複数の機能性コピーを有するものが有利であることが多いであろう。
【０１１９】
核遺伝物質への外因性遺伝物質の添加を可能にするいかなる技法も、それが細胞、核膜、または他の既存の細胞構造または遺伝子構造に対して破壊的でない限り、用いることができる。外因性遺伝物質は、マイクロインジェクションによって核遺伝物質に選択的に挿入する。細胞及び細胞構造のマイクロインジェクションは、当技術分野で公知であり、かつ使用されている。
【０１２０】
再移植は、標準方法を用いて実施する。通常は、代理宿主を麻酔にかけ、胚を卵管に挿入する。特定の宿主に移植される胚の数は、種によって異なるが、通常は、その種が自然に生む子孫の数に匹敵するものであろう。
【０１２１】
代理宿主のノックアウト子孫のスクリーニングは、任意の適当な方法によって、導入遺伝子の存在および/または発現に関して行うことができる。スクリーニングは、導入遺伝子の少なくとも一部に相補的なプローブを用いたサザンブロット解析またはノーザンブロット解析によって行われることが多い。導入遺伝子によってコードされているタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロット解析は、導入遺伝子産物の存在に関するスクリーニングの代替または追加の方法として利用することができる。通常は、尾組織からDNAを調製して、導入遺伝子に関するサザン解析またはPCRによって分析する。別法では、導入遺伝子が最も高いレベルで発現されていると考えられる組織または細胞を、サザン解析またはPCRを用いて、導入遺伝子の存在および発現に関して検査するが、いかなる組織または細胞型をこの分析に用いてもよい。
【０１２２】
導入遺伝子の存在を評価する代替または追加の方法には、酵素アッセイおよび/または免疫学的アッセイなどの適当な生化学アッセイ、特定のマーカーおよび酵素活性の組織学的染色、フローサイトメトリー分析、ならびに同様のものが、制限なしに含まれる。血液の分析も、血液中の導入遺伝子産物の存在を検出するのに、そして、様々なタイプの血球および他の血液成分のレベルに対する導入遺伝子の影響を評価するのに有用でありうる。
【０１２３】
非ヒト動物に、導入遺伝子を導入するには、レトロウイルス感染を用いることができる。発生中の非ヒト胚は、胚盤胞期までin vitoで培養できる。この間に、卵割球をレトロウイルス感染の標的とすることができる(Jaenich、R.(1976年)、PNAS 73: 1260〜1264)。透明帯を除去する酵素処理によって、卵割球の効率的な感染が得られる(「Manipulating the Mouse Embryo」、Hogan編集(Cold Spring Harbor Laboratory Press社、Cold Spring Harbor、1986年)。通常、導入遺伝子を導入するのに使用されるウイルスベクターシステムは、導入遺伝子を有する複製欠損性レトロウイルスである(Jahnerら(1985年)、PNAS 82: 6927〜6931; Van der Puttenら(1985年)、PNAS 82: 6148〜6152)。ウイルス産生細胞の単層上で卵割球を培養することによって、簡単かつ効率的にトランスフェクションが得られる(Van der Putten、同上; Stewartら(1987年)、EMBO J. 6: 383〜388)。別法では、さらに後のステージで感染を行うことができる。ウイルスまたはウイルス産生細胞は、卵割腔に注入することができる(Jahnerら(1982年)、Nature 298: 623〜628)。導入遺伝子の取込みはトランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞の部分集団のみで起こるため、初代の大部分は導入遺伝子のモザイクになるであろう。さらに、初代は、ゲノムにおける別々の位置で、導入遺伝子の様々なレトロウイルスの挿入を含有しうるが、これらは通常、子孫では分離しているであろう。加えて、妊娠中の胚の子宮内レトロウイルス感染によって、導入遺伝子を生殖細胞系に導入することも可能である(Jahnerら、(1982年)、同上)。
【０１２４】
導入遺伝子を導入するための、第3のタイプの標的細胞は胚性幹細胞(ES)である。ES細胞は、in vitroで培養された未着床胚から得られ、胚に融合する(Evans.ら(1981年)、Nature 292: 154〜156; Bradley.ら(1984年)、Nature 309: 255-258; Gossler.ら(1986年)、PNAS 83: 9065〜9069; およびRobertsonら(1986年)、Nature 322: 445〜448)。導入遺伝子は、DNAトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介性の形質導入によって、効率的にES細胞に導入することができる。その後は、そのような形質転換されたES細胞は、非ヒト動物から得られた胚盤胞と併せることができる。ES細胞は、その後胚でコロニーを形成し、その結果得られたキメラ動物の生殖細胞系に加わる。概説には、Jaenisch, R. (1988年)、Science 240: 1468〜1474を参照のこと。
【０１２５】
本発明は、宿主細胞のGPR12遺伝子を機能的に破壊するための核酸構築物にも関する。この核酸構築物は、a) 非相同性置換部分と; b) 非相同性置換部分の上流に位置する第1の相同性領域であって、第1のGPR12遺伝子配列に対してかなりの同一性を有するヌクレオチド配列を有する第1の相同性領域と; c) 非相同性置換部分の下流に位置する第2の相同性領域であって、第2のGPR12遺伝子配列に対してかなりの同一性を有するヌクレオチド配列を有する第2の相同性領域(第2のGPR12遺伝子配列は、天然に存在する内在性GPR12遺伝子における第1のGPR12遺伝子配列の下流に位置する)とを含む。加えて、第1および第2の相同性領域は、これらの核酸分子が宿主細胞に導入されたとき、核酸構築物と、宿主細胞の内在性GPR12遺伝子との間で相同組換えが起こるのに十分な長さのものである。好ましい実施形態では、非相同性置換部分は発現レポーターを含み、これには、好ましくはlacZおよび正の選択発現カセットが含まれ、この選択発現カセットには、好ましくは調節エレメントに作用可能に連結したネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。
【０１２６】
GPR12 GPCRの欠失トランスジェニック動物は、以下の通りに作製できる。
【０１２７】
(a) GPR12遺伝子ターゲティングベクターの構築
マウスGPR12ゲノムクローンを、推定上のマウスオープンリーディングフレームcDNA配列(配列番号4)の一部から増幅されたプローブ配列を用いて、HGMP社(Hinxton、英国)から得られたマウスラージインサートPACライブラリーから、標準的な技法を用いて単離する。その後、短いオリゴヌクレオチドプローブと標準的な技法とを用いて、GPR12遺伝子領域における、単離されたマウスGPR12ゲノムクローンの制限地図を作成する。
【０１２８】
相同性アームの設計をターゲッティングベクターにクローニングするのを可能にするため、このマウスゲノム遺伝子座を部分的に配列決定する。欠失されるオープンリーディングフレームの領域のいずれかの端にある2箇所のDNA領域を、PCRによって増幅して、これら断片をターゲッティングベクターにクローニングするが、これら2箇所のDNA領域は通常、大きさが1kbと5kbの間であり、5'および3'の相同性アームと呼ばれる。相同組換え事象が、少なくとも7回膜貫通領域を欠失することによって、GPR12遺伝子を機能的に破壊するように、これらのアームの位置を選択する。調製されるターゲッティングベクターでは、発現促進されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子がGPR12遺伝子と同じ方向に配置されており、このneo遺伝子によって構成された選択カセットの上流にある内在性遺伝子発現レポーター(フレーム非依存性のlacZ遺伝子)によって構成された非相同性配列で、欠失されるGPR12配列が置換除去される。
【０１２９】
(b) 胚性幹細胞のトランスフェクションおよび分析
胚性幹細胞(EvansおよびKaufman、1981年)を、20%ウシ胎仔血清、10%ウシ新生児血清、2mMグルタミン、非必須アミノ酸、100μM 2-メルカプトエタノール、500u/ml白血病抑制因子で補足されたダルベッコ改変イーグル培地中で育てられたネオマイシン耐性の胚性繊維芽細胞支持細胞層上で培養する。培地は毎日交換し、ES細胞は、3日間毎に副培養する。5×106のES細胞を、5μgの線状化されたプラスミドで、エレクトロポレーション(電気容量25μf、400ボルト)によってトランスフェクトする。エレクトロポレーションの後、24時間置き、トランスフェクトした細胞を、200μg/mlネオマイシンを含有する培地中で9日間培養する。クローンを96ウェルプレート中に採取して、複製および増殖させ、その後、内在性GPR12遺伝子とターゲッティング構築物との間での相同組換えがその中で起こっているクローンを同定するために、PCRによってスクリーニングする。通常、1から5%の割合で陽性クローンが同定される。すべて標準的操作法を用いて、レプリカの冷凍と、ターゲッティング事象を確認するための、5'および3'の外部プローブを用いたサザンブロット用に十分に高品質なDNAの調製とを可能にするために、これらのクローンを増殖させる(Russら、2000年、Nature 2000 Mar 2; 404(6773): 95〜9)。
【０１３０】
(c) GPR12欠失マウスの作製
メスおよびオスのC57BL/6マウスを交配させ、妊娠3.5日に、胚盤胞を単離する。選択されたクローンから得た細胞を、胚盤胞1つにつき10〜12細胞注入し、7〜8個の胚盤胞を偽妊娠のF1メスの子宮に移植する。何匹かの高レベル(最大100%)アグーチオスを含むキメラ子マウスの同腹仔が生まれる(アグーチコート色は、ターゲッティングされたクローンの子孫である細胞の分布を示す)。オスキメラをメス、MF1、および129マウスと交配させ、アグーチコート色によって、そしてPCRによるそれぞれのゲノム型決定によって生殖系列への伝達を判定する。
【０１３１】
他の非ヒトトランスジェニック動物
GPR12受容体の過剰発現、またはこの受容体の過小発現(適当な対照と比較して)をもたらす非ヒトトランスジェニック動物も、本発明に従って企図される。
【０１３２】
これらの動物は、受容体機能のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するのに有用であり、また治療にも有用である。
【０１３３】
抗体
本明細書に記載の抗体は、GPR12ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして利用できる。
【０１３４】
本発明の目的では、「抗体」という用語には、反対に指定されない限り、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Fab断片、およびFab発現ライブラリーによって生成される断片が含まれるが、これらに限定されない。そのような断片には、標的物質に対する結合活性を保持している、抗体全体の断片、Fv、F(ab')、およびF(ab')2断片が含まれ、同様に、抗体の抗原結合部位を含む一本鎖抗体(scFv)、融合タンパク質、および他の合成タンパク質が含まれる。抗体およびそれらの断片はヒト化抗体、例えばEP-A-239400に記載のものでよい。さらに、完全にヒトの可変領域(またはそれらの断片)を有する抗体、例えば米国特許第5,545,807号、および第6,075,181号に記載のものを用いてもよい。中和抗体、すなわち、問題のアミノ酸配列の生物学的活性を阻害するものが、診断用および治療用に特に好ましい。
【０１３５】
抗体は、免疫化、またはファージディスプレーライブラリーの使用など、標準的な技法によって産生できる。
【０１３６】
本発明のポリペプチドまたはペプチドは、既知の技法によって抗体を開発するのに用いることができる。そのような抗体は、GPR12タンパク質、または相同体、断片などに特異的に結合できるものでありうる。
【０１３７】
ポリクローナル抗体が望ましい場合、本発明のポリペプチドまたはペプチドを含む免疫原性組成物で、選択された哺乳動物(例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど)を免疫化してよい。免疫学的応答を増強するのに、宿主種に応じて様々なアジュバントを用いることができる。そのようなアジュバントには、フロインド、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、スカシガイヘモシアニン、ジニトロフェノールが含まれるが、これらに限定されない。BCG(ウシ型弱毒結核菌ワクチン(Bacilli Calmette-Guerin))およびCorynebacterium parvumは、問題のアミノ酸配列を精製して、全身性防御反応を刺激するために免疫学的に妥協した(immunologically compromised)個体に投与する場合に利用できる潜在的に有用なヒトアジュバントである。
【０１３８】
免疫化された動物から得られた血清は、公知の操作法に従って採取して、処理を行う。本発明のポリペプチドから取得可能なエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が、他の抗原に対する抗体を含有する場合、免疫親和性クロマトグラフィーによってポリクローナル抗体を精製することができる。ポリクローナル抗血清を産生して、処理する技法は、当技術分野で公知である。そのような抗体を作製できるように、本発明は、動物またはヒトにおいて免疫原として用いるための別のアミノ酸配列をハプテンとして結合した、本発明のアミノ酸配列またはその断片も提供する。
【０１３９】
当業者ならば、本発明のポリペプチドまたはペプチドから取得可能なエピトープに対して産生されるモノクローナル抗体を、容易に産生させることができる。ハイプリドーマによってモノクローナル抗体を作製する一般的方法は周知である。不死性の抗体産生細胞系は、細胞融合によって、また、発癌性DNAを用いたBリンパ球の直接的な形質転換、またはエプスタインーバーウイルスを用いたトランスフェクションなどの他の技法によっても生成することができる。周辺エピトープ(orbit epitope)に対して生成されたモノクローナル抗体のパネルを、様々な特性に関して、すなわちイソタイプおよびエピトープ親和性に関してスクリーニングすることができる。
【０１４０】
モノクローナル抗体は、培養における連続的な細胞系による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製できる。これらには、元々KoehlerおよびMilstein(1975年、Nature 256: 495〜497)によって記載されたハイプリドーマ技法、トリオーマ技法、ヒトB-細胞ハイプリドーマ技法(Kosborら(1983年)、Immunol Today 4: 72; Coteら(1983年)、Proc Natl Acad Sci 80: 2026〜2030)、およびEBVハイプリドーマ技法(Coleら、「Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy」、77〜96頁、Alan R. Liss, Inc.社、1985年)が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４１】
加えて、「キメラ抗体」の産生、すなわち、適切な抗原特異性および生物学的活性を備えた分子を得るために、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングするために、開発された技法を用いることもできる(Morrisonら、(1984年) Proc Natl Acad Sci81: 6851〜6855; Neubergerら、(1984年) Nature312: 604〜608; Takedaら(1985年)、Nature 314: 452〜454)。別法として、一本鎖抗体の産生に関して記載された技法(米国特許第4,946,779号)を、問題の特異的一本鎖抗体を産生するために適合させることもできる。
【０１４２】
本発明のポリペプチドまたはペプチドから取得可能なエピトープに対して産生された抗体は、モノクローナル抗体も、ポリクローナル抗体も両方とも、診断にとりわけ有用であり、中和抗体は受動的免疫療法に有用である。モノクローナル抗体は、詳細には、抗イディオタイプ抗体を産生させるのに用いることができる。抗イディオタイプ抗体は、防御が望まれている物質および/または薬剤の「内部イメージ」を保持する免疫グロブリンである。抗イディオタイプ抗体を産生させる技法は、当技術分野で公知である。これらの抗イディオタイプ抗体も、治療に有用でありうる。
【０１４３】
抗体は、Orlandiら(1989年、Proc Natl Acad Sci 86: 3833〜3837)、およびWinter GおよびMilstein C (1991年; Nature 349: 293〜299)に記載の通りリンパ球集合におけるin vivo産生を誘導することによって、あるいは、特異性の高い結合をする物質を得るための、組換え体免疫グロブリンライブラリーまたはパネルのスクリーニングによって産生させることもできる。
【０１４４】
ポリペプチドまたはペプチドに対する特異的な結合部位を含有する抗体断片を産生させることもできる。例えば、そのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって生成することができるF(ab')2断片と、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元させることによって生成することができるFab断片とが含まれるが、これらに限定されない。別法として、望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ簡単な同定を可能にするために、Fab発現ライブラリーを構築することもできる(Huse WDら、(1989年)、Science256: 1275〜1281)。
【０１４５】
一本鎖抗体を産生するための技法(米国特許第4,946,778号)を、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生するために適合させることもできる。また、ヒト化抗体を発現させるのに、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を含めた他の生物を用いることもできる。
【０１４６】
すなわち、本発明者らは、GPR12抗体またはそれらを含む組成物は、神経学的状態、生殖ホルモンに関連した状態、および他の特定の状態の治療にとりわけ有用でありうると考える。そのような神経学的状態には、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病のうちの任意の1つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
診断アッセイ
別の態様では、本発明は、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病とから成る群から選択される疾患または状態を診断する方法であって、
診断される患者からの細胞の試料を選択するステップ; および、
それらの細胞の試料におけるGPR12ポリペプチドの発現レベルおよび/または機能的活性を、健康な個体からの1つまたは複数の対照試料と比較するステップを含む方法を提供する。
【０１４８】
本発明は、診断における診断試薬としての使用、または遺伝子解析における使用に供する、GPR12ポリヌクレオチド、GPR12ペプチドリガンドをコードするポリヌクレオチド、およびポリペプチド(その相同体、変異体、および誘導体も同様)の使用に関する。そのようなアッセイには、GPR12核酸(相同体、変異体、および誘導体を含める)に相補的な核酸、またはハイブリダイズできる核酸が有用であり、GPR12ポリペプチドおよびGPR12リガンドポリペプチドに対する抗体も有用である。
【０１４９】
機能不全に関連したGPR12遺伝子の突然変異型または他の天然リガンド遺伝子の検出は、GPR12またはその天然リガンドの過小発現、過剰発現、または発現変化から生じる疾患または疾患に対する感受性の診断に追加するか、あるいはそれを規定することのできる診断手段を提供するであろう。GPR12遺伝子(制御配列を含める)の突然変異を有する個体は、様々な技法によってDNAレベルで検出することができる。
【０１５０】
例えば、患者からDNAは単離して、GPR12のDNA多型パターンを決定することができる。同定されたパターンは、GPR12の過剰発現、過小発現、または発現異常に関連した疾患を患っていることが既知の対照患者と比較する。その後、GPR12関連疾患に付随した遺伝的多型パターンを示す患者を同定することができる。GPR12遺伝子の遺伝子解析は、当技術分野で知られている任意の技法で行うことができる。例えば、GPR12対立遺伝子のDNA配列決定によって、RFLPまたはSNP分析などによって個体をスクリーニングすることができる。GPR12の過剰発現、過小発現、または発現異常に関連した疾患に対する遺伝的素因を有する患者を、GPR12遺伝子配列またはその発現を制御する任意の配列のDNA多型の存在を検出することによって同定することができる。
【０１５１】
そのように同定された患者は、GPR12関連疾患の発症を予防するように処置するか、あるいは、疾患のそれ以降の発症または進展を予防するために、GPR12または関連疾患の初期に、より積極的に処置することができる。GPR12関連疾患には、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病が含まれる。
【０１５２】
好ましい実施形態では、GPR12関連疾患は、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病のうちの任意の1つを含む。
【０１５３】
本発明はさらに、GPR12関連疾患に付随する、患者の遺伝的多型パターンを同定するためのキットを開示する。このキットは、DNA試料を採集する手段および遺伝的多型パターンを判定する手段を含み、これらは、次に対照試料と比較して、GPR12関連疾患に対する、患者の感受性を判定する。また、GPR12ポリペプチドおよび/または、そのようなポリペプチド(またはその断片)に対する抗体を含む、GPR12関連疾患を診断するキットも提供する。
【０１５４】
診断用の核酸は、血液、尿、唾液、組織生検試料、または剖検物質など、対象の細胞から得ることができる。好ましい実施形態では、患者の指プリックから得られた血球からDNAを採取し、この血液は、吸い取り紙に収集される。さらに好ましい実施形態では、血液をAmpliCard(商標)(University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF)に収集する。
【０１５５】
DNAは、直接検出に用いても、あるいは分析の前にPCRまたは他の増幅技法を用いて、酵素によって増幅してもよい。目的の遺伝子の特定の多型DNA領域を標的としたオリゴヌクレオチドDNAプライマーは、標的配列のPCR反応増幅が実現されるように調製することができる。RNAまたはcDNAも、同様に鋳型として用いることができる。鋳型DNAから増幅されたDNA配列は、次に、制限酵素を用いて分析して、増幅された配列中にその遺伝的多型が存在するかどうか判定することができ、それによって、患者の遺伝的多型プロフィールを提供する。制限断片の長さは、ゲル分析によって同定することができる。別法として、あるいはこれと組み合わせて、SNP(一塩基多型)分析などの技法を利用することもできる。
【０１５６】
欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比較した、増幅された産物の大きさの変化によって検出することができる。点突然変異は、増幅されたDNAを、標識されたGPR12ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせることによって同定することができる。完全一致した配列は、RNアーゼ消化または融解温度の相違によって、ミスマッチしている二本鎖分子と区別することができる。DNA配列の相違は、変性剤の存在下または非存在下における、ゲル中でのDNA断片の電気泳動度の変化によって、あるいは直接的なDNA配列決定によって検出することもできる。例えば、Myersら、Science(1985年)、230: 1242を参照のこと。特定の位置における配列の変化は、RNアーゼプロテクションおよびS1プロテクションなどのヌクレアーゼ保護アッセイによって、あるいは化学開裂法によって明らかにすることもできる。Cottonら、Proc Natl Acad Sci USA(1985年)、85: 4397〜4401を参照のこと。別の実施形態では、例えば遺伝子変異の効率的なスクリーニングを行うために、GPR12ヌクレオチド配列またはその断片を含むオリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することができる。アレイ技術法は周知であり、一般的な適用性を有し、遺伝子発現、遺伝子連鎖、および遺伝変異性を含めた、分子遺伝学における様々な疑問に取り組むのに用いることができる(例えばM.Cheeら(Science、第274巻、610〜613頁(1996年)を参照)。
【０１５７】
一本鎖配座多型(SSCP法)は、突然変異体の核酸と野生型の核酸との間の電気泳動度の相違を検出するのに用いることができる(Oritaら(1989年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA : 86: 2766; Cotton (1993年)、Mutat. Res 285: 125〜144; およびHayashi (1992年)、Genet. Anal. Tech. Appl. 9: 73〜79も参照)。試料および対照のGPR12核酸一本鎖DNA断片は、変性させ、そして復元させることができる。一本鎖の核酸の2次構造は、配列に応じて異なり、その結果生じる電気泳動度の変化によって、単一塩基の変化でさえ検出が可能となる。DNA断片は、標識しても、標識されたプローブで検出してもよい。アッセイの感受性は、(DNAよりむしろ)RNAを用いることによって増強することができ、RNAの2次構造は、配列の変化に、より敏感である。好ましい実施形態では、問題の方法はヘテロ二本鎖分析を用いて、電気泳動度の変化に基づいて二本鎖のヘテロ二重鎖分子を分離する(Keenら(1991年)、Trends Genet 7: 5)。
【０１５８】
診断アッセイは、記載の方法によるGPR12遺伝子突然変異の検出を通して、細菌感染、真菌感染、原生動物感染、およびウイルス感染などの感染、詳細にはHIV-1もしくはHIV-2によって引き起こされる感染; 疼痛; 癌; 糖尿病、肥満; 食欲不振; 病的飢餓; 喘息; パーキンソン病; 血栓症; 急性心不全; 低血圧; 高血圧症; 勃起機能不全; 尿閉；骨粗鬆症および大理石病などの代謝性骨疾患; 狭心症; 心筋梗塞; 潰瘍; 喘息; アレルギー; 慢性関節リウマチ; 炎症性腸疾患; 過敏性腸管症候群、良性前立腺肥大症; ならびに不安、統合失調症、躁鬱病、せん妄、痴呆、および重度精神発達遅滞を含めた精神病性障害および神経障害、ならびにハンティントン病またはジルドラトゥーレット症候群などの運動障害に対する感受性を診断または判定する方法を提供する。
【０１５９】
特に好ましい実施形態では、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病に対する感受性を診断または判定するのに診断アッセイを用いる。
【０１６０】
GPR12ポリペプチドおよび核酸の存在は、試料中で検出することができる。したがって、上記の感染および疾患は、対象に由来する試料から、GPR12ポリペプチドまたはGPR12 mRNAのレベルの異常な低下または増大を判定することを含む方法によって診断することができる。試料は、GPR12発現の増大、低下、または発現のレベルもしくはパターンの空間的もしくは時間的変化を含めた他の異常に関連した疾患を患っているか、患っている疑いのある生物からの細胞または組織試料を含むものでよい。疾患の診断の方法として、通常、そのような疾患を患っているか、患っている疑いのある生物におけるGPR12発現のレベルまたはパターンを、正常な生物における発現のレベルまたはパターンと比較することができる。
【０１６１】
したがって全般的に、本発明は、試料中におけるGPR12核酸を含む核酸の存在を、前記核酸に特異的な少なくとも1つの核酸プローブと試料を接触させて、この核酸が存在するかどうか前記試料をモニターすることによって検出する方法を含む。例えば、この核酸プローブは、GPR12核酸またはその部分に特異的に結合するものでよく、これら2つの間の結合が検出され、複合体自体の存在も検出されうる。
【０１６２】
さらに、本発明は、GPR12ポリペプチドの存在を、このポリペプチドに結合できる抗体と細胞試料を接触させて、このポリペプチドが存在しているかどうか前記試料をモニターすることによって検出する方法を包含する。これは、抗体とポリペプチドとの間で形成された複合体の存在をモニターするか、あるいはポリペプチドと抗体との間の結合をモニターすることによって実現するのが好都合であろう。2つの実体の間の結合を検出する方法は、当技術分野で公知であり、これには、FRET(蛍光共鳴エネルギー転移)、および表面プラズモン共鳴法などが含まれる。
【０１６３】
発現の減少または増大は、例えば、PCR、RT-PCR、RNアーゼプロテクション、ノーザンブロット、および他のハイブリダイゼーション法など、ポリヌクレオチドを定量化するための、当技術分野で周知の任意の方法を用いてRNAレベルで測定することができる。宿主から得られた試料中にあるGPR12などのタンパク質レベルを測定するのに用いることができるアッセイ技法は、当業者には周知である。そのようなアッセイ法には、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析、およびELISAアッセイが含まれる。
【０１６４】
本発明は、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病の任意の1つを含む疾患、または疾患に対する感受性を診断するキットに関する。
【０１６５】
特に好ましい診断キットは、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病のうちの任意のものである疾患またはこれに対する感受性を検出または診断するのに使用される。
【０１６６】
診断キットは、GPR12ポリヌクレオチドもしくはその断片; 相補的なヌクレオチド配列; GPR12ポリペプチドもしくはその断片、またはGPR12ポリペプチドに対する抗体を含む。
【０１６７】
予防および治療の方法
本発明は、GPR12ポリペプチド活性の過剰に関連した異常な状態、およびその量が不十分であることに関連した異常な状態の両方を治療する方法を提供し、GPR12ポリペプチド、その結合タンパク質、および/またはそれらをコードする核酸が、神経学的状態、生殖ホルモンに関連した状態、および他の特定の状態の治療にとりわけ有用でありうると考える。そのような神経学的な状態には、アルツハイマー病および関連疾患、パーキンソン病、癲癇および癲癇誘発性疾患、めまいおよび動揺病、運動ニューロン疾患、ならびにニューロン機能障害の疾患と、侵害受容器性疼痛および痛覚過敏を含めた疼痛、肝炎、筋肉分解、甲状腺機能低下症、膵炎またはMI、多発性骨髄腫、および糖尿病のうちの1つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
GPR12活性が過剰である場合には、いくつかのアプローチが利用可能である。アプローチの1つは、本明細書で上述した抑制性化合物(アンタゴニスト)を薬学的に許容される担体と共に、GPR12に対するリガンドの結合を遮断することによって、あるいは第2のシグナルを抑制して、それによって異常な状態を軽減することによって活性化を抑制するのに有効な量を対象に投与することを含む。
【０１６９】
別のアプローチでは、内在性GPR12と競合してリガンドに結合することがまだできる、GPR12ポリペプチドの可溶型を投与することができる。そのような競合物質の典型的な実施形態は、GPR12ポリペプチドの断片を含む。
【０１７０】
なお別のアプローチでは、発現遮断技法を用いて、内在性GPR12ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制することができる。公知のそのような技法は、内部に産生されるか、あるいは別々に投与されるアンチセンス配列を使用することを含む。例えば、 「Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression」における、O'Connor, J Neurochem (1991年)、56: 560、CRC Press社、Boca Raton, Fla. (1988年)を参照。別法として、遺伝子と三重ヘリックスを形成するオリゴヌクレオチドを供給することもできる。例えば、Leeら、Nucleic Acids Res (1979年)、6: 3073; Conney., et al、Science  (1988年)、241: 456; Dervanら、Science (1991年)、251: 1360を参照。これらのオリゴマーは、それ自体で投与することもでき、あるいは適切なオリゴマーをin vivoで発現することもできる。
【０１７１】
GPR12およびその活性の過小発現に関した異常な状態の治療にも、いくつかのアプローチが利用可能である。アプローチの1つは、リガンドが結合したGPR12を模倣する化合物、すなわち上述のアゴニストを薬学的に許容される担体と共に、対象に治療上有効な量投与して、それによって異常な状態を軽減することを含む。別法では、対象の適切な細胞によるGPR12の内因性産生に作用するように、遺伝子療法を利用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、上記で論じた通り、複製欠損性レトロウイルスベクターで発現するように構築することができる。レトロウイルス発現構築物は、次に単離して、本発明のポリペプチドをコードするRNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入されたパッケージング細胞に導入することができ、それによって、目的の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を、パッケージング細胞が産生する。in vivoで細胞を操作して、in vivoでポリペプチドの発現を行うために、これらの産生細胞を対象に投与することができる。遺伝子療法の概要に関しては、「Human Molecular Genetics」、T StrachanおよびA P Read、BIOS Scientific Publishers Ltd社 (1996年)における、第20章、「Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches」(およびその中で引用されている参考文献)を参照のこと。
【０１７２】
製剤および投与
可溶型のGPR12ポリペプチド、アゴニストペプチドおよびアンタゴニストペプチドなどのペプチド、または小分子は、適当な薬学的担体と組み合わせて処方することができる。そのような製剤は、治療上有効な量のポリペプチドまたは化合物と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。そのような担体には、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。製剤は、投与方法に適合しているべきであり、十分に当技術分野の技術の範囲内にある。本発明はさらに、前述した本発明の組成物の1つまたは複数の成分で満たした1つまたは複数の容器を含む、医薬品パックおよびキットに関する。
【０１７３】
本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独で用いることも、治療用化合物などの他の化合物と併用することもできる。
【０１７４】
これらの医薬組成物を全身性投与するのに好ましい形態には、注射が含まれ、通常は、静脈内注射による。皮下、筋肉内、または腹腔内など、他の注射経路も用いることができる。全身性投与の代替の方法には、胆汁酸塩もしくはフシジン酸、または他の界面活性剤などの浸透剤(penetrant)を用いた経粘膜投与および経皮投与が含まれる。加えて、腸用製剤またはカプセル剤に適切に製剤した場合には、経口投与も可能であろう。これらの化合物の投与は、軟膏、ペースト、ゲル、および同様のものの形態で局所的および/または局在的に行うこともできる。
【０１７５】
必要な用量範囲は、ペプチドの選択、投与経路、製剤の性質、対象の状態の性質、および担当医の判断による。但し、適当な用量は対象の体重あたり0.1〜100μg/kgの範囲にある。しかし、利用可能な化合物が多様であること、および様々な投与経路の効率が相違していることを考えると、必要な用量は広い範囲にあることが予測される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与より高い用量を必要とすることが予測されよう。これらの用量レベルの変動は、当技術分野で十分に理解されているように、最適化のための実証的な標準的ルーチンを用いて調整することができる。
【０１７６】
上述のように「遺伝子療法」としばしば呼ばれる様式の治療では、治療に使用されるポリペプチドを、対象の体内で内在的に生成することもできる。したがって、例えば、対象から得られた細胞を、例えばレトロウイルスプラスミドベクターの使用によって、ポリペプチドをex vivoでコードするように、DNAまたはRNAなどのポリヌクレオチドを用いて操作しうる。それらの細胞を次に対象の体内に導入する。
【０１７７】
医薬組成物
本発明は、GPR12ポリペプチド、その結合性分子、またはそれらをコードする核酸と、任意選択で、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤(これらの組合せを含める)とを、本発明に従って、治療上有効な量投与することを含む医薬組成物も提供する。
【０１７８】
この医薬組成物は、ヒト医学および獣医学でヒトに使用するものでも、動物に使用するものでもよく、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤のうちの任意の1つまたは複数を含むであろう。治療での使用に許容される担体または希釈剤は、製薬技術分野で周知であり、例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.社(A. R. Gennaro編集、1985年)に記載されている。薬学的担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図されている投与経路と標準的な薬学の慣行とを考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、もしくは希釈剤として、あるいはそれに加えて、任意の適当な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含むことができる。
【０１７９】
保存剤、安定化剤、色素、および風味料さえ、この医薬組成物中に提供することができる。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびp-ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤および懸濁剤も使用できる。
【０１８０】
様々な送達システムに応じて、様々な組成物/製剤要件があるであろう。例として、本発明の医薬組成物は、ミニポンプを用いて送達するように処方することも、あるいは粘膜経路によって、例えば、吸入用の鼻噴霧もしくはエアゾールとして、または摂取可能な溶液として、あるいは組成物が注射可能な形態に処方されて、非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内、または皮下経路によって送達されるように処方することもできる。別法として、製剤は、両方の経路で送達されるように設計することもできる。
【０１８１】
胃腸粘膜を通して薬剤を粘膜送達する場合、その薬剤は、一時的に胃腸管を通る間、安定した状態を維持できるべきであり、例えば、それは、タンパク分解性の分解に耐性を有し、酸性pHで安定であり、かつ胆汁の界面活性剤効果に耐性を有するべきである。
【０１８２】
必要に応じて、医薬組成物は、吸入によって、坐剤もしくは腟坐剤の形態で、ローション、溶液、クリーム、軟膏剤、もしくは丸衣の形態で局所的に、皮膚用パッチ剤の使用によって、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で経口的に、または単独で、もしくは賦形剤との混合物でカプセル剤または腟坐薬の中に入って、または、風味料または着色剤を含有するエリキシール、溶液、もしくは懸濁液の形態で投与することができ、あるいは、非経口的に、例えば、静脈内に、筋肉内に、もしくは皮下にそれらを注入することもできる。非経口投与用には、組成物を無菌水溶液の形態で用いるのが最もよいであろう。この場合、無菌水溶液は、他の物質、例えば血液と等張な溶液を作製するのに十分な塩および単糖を含有することができる。口腔投与用または舌下投与用には、従来の方法で処方できる錠剤またはトローチの形態で、組成物を投与することができる。
【０１８３】
投与
個々の対象に最も適した実際の用量は、通常、医師が決定するであろう。そして、それは特定の患者の年齢、体重、および反応によって異なるであろう。以下の用量は、平均的な場合の例である。当然ながら、個々の場合には、さらに高い用量範囲、またはさらに低い用量範囲が有益となる場合もありうる。
【０１８４】
本発明の医薬組成物は、注射によって直接投与することができる。この組成物は、非経口投与用、粘膜投与用、筋肉内投与用、静脈内投与用、皮下投与用、眼内投与用、あるいは経皮投与用に処方することができる。通常、各タンパク質を、体重あたり0.01から30mg/kgの用量で投与することができ、好ましくは0.1から10mg/kg、より好ましくは体重あたり0.1から1mg/kgで投与する。
【０１８５】
「投与される」という用語は、ウイルス性または非ウイルス性の技法による送達を含む。ウイルス性の送達機構には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルス性の送達機構には、脂質媒介性のトランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性表面両親媒性試薬(CFA)、およびそれらの組合せが含まれる。そのような送達機構のための経路には、粘膜、経鼻、経口、非経口、胃腸、局所、または舌下経路が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８６】
「投与される」という用語には、粘膜経路による、例えば吸入用の鼻噴霧もしくはエアゾールとして、または摂取可能溶液としての送達、送達が、例えば静脈内、筋肉内、または皮下経路の注射可能な形態による非経口経路が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８７】
「同時投与される」という用語は、例えば本発明のポリペプチド、およびアジュバントなどの追加の実体それぞれを投与する部位および時間が、必要な免疫系のモジュレーションを実現するようなものであることを意味する。したがって、ポリペプチドおよびアジュバントは、同じ時間に、そして同じ部位に投与することもできるが、ポリペプチドを、アジュバントとは異なった時間に、そして、異なった部位に投与する方が有利であることもある。ポリペプチドおよびアジュバントは、同じ送達媒体で送達することさえでき、また、ポリペプチドおよび抗原を、結合させて、かつ/または分離させて、かつ/または遺伝学的に結合させて、かつ/または遺伝的に分離させることができる。
【０１８８】
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ヌクレオチド、および任意選択でアジュバントを、宿主対象に別々に投与することも、あるいは単一用量として、もしくは複数用量で同時投与することもできる。
【０１８９】
本発明の医薬組成物は、注射(非経口、皮下、および筋肉内注射を含める)、鼻腔内、粘膜、経口、腟内、尿道、または眼投与など、多くの異なった経路によって投与することができる。
【０１９０】
本発明の医薬組成物は、従来の方法によって非経口的に、例えば、皮下注射または筋肉内注射によって投与することができる。他の方法の投与に適した追加の製剤には、坐剤、および、場合によって、経口製剤が含まれる。坐剤は、伝統的な結合剤および担体、例えばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むものでよく、そのような坐剤は、0.5%から10%の範囲、場合によっては1%から2%の範囲にある活性成分を含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、通常、例えば、製薬のグレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および同様のものなどの通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤、または粉末薬の形態を取り、10%から95%、好ましくは25%から70%の活性成分を含有する。ワクチン組成物が凍結乾燥である場合には、凍結乾燥物質は、投与前に、例えば、懸濁液として再構成することができる。再構成は、緩衝液中で行うのが好ましい。
【０１９１】
これより、本発明を、特定の実施例を参照して説明するが、これらは本発明の制限として考えるべきではない。
【実施例１】
【０１９２】
トランスジェニックGPR12ノックアウトマウス
GPR12遺伝子ターゲッティングベクターの構築
マウスGPR12遺伝子を含有するPACは、コード配列の一部を含む、放射性標識されたPCR断片を用いて同定した。コード配列に隣接するさらなるゲノム配列を、制限部位をアンカーにしたPCR技法を用いて研究室内で取得した。8kbのギャップ付きコンティグを組み立て、ターゲッティングベクターの設計を可能にするのに十分な配列情報が得られた。後の生物情報学的研究によって、このコンティグは14kbに伸長され、欠失していた配列が充填された。このコンティグは、相同性アームの設計を、ターゲッティングベクターにクローニングするのを可能にするのに十分な隣接配列情報を提供した(重要な制限部位を含めた、使用されたターゲッティングベクターの構造を図3に示す)。
【０１９３】
マウスGPR12遺伝子は、単一のコーディングエキソンを有する。ターゲッティングストラテジーは、7tmコーディングドメインの開始の前の、7tmドメインの全体を含むコーディングエキソンの一部を除去するように設計するものである。除去される7tm含有領域に隣接する3.7kbの5'相同性アームと、1.1kbの3'相同性アームとをPCRによって増幅して、断片をターゲッティングベクターにクローニングする。アームを増幅するのに使用された各オリゴヌクレオチドプライマーの5'末端は、ベクターポリリンカーのクローニング部位と適合性を有し、かつ、アーム自体には存在しない切断頻度の低い制限酵素のうち異なる認識部位を含有するように合成する。GPR12の場合には、下記の配列表に記載する通りプライマーを設計し、これらは、5'アームクローニング酵素としてNotI/SpeIを、3'アームクローニング酵素としてAscI/FseIを有する。
【０１９４】
アームプライマー対(5'armF/5'armR)および(3'armF/3'armR)に加えて、GPR12遺伝子座に特異的なプライマーをさらに、以下の目的で設計する。5'および3'のプローブプライマー対(5'prF/5'prR、および3'prF/3'prR)は、各アームの外側にあり、これらを超えた先にある非反復性のゲノムDNAの150〜300bpの2つの短い断片を増幅するためであり、また、単離された推定上の標的クローンにおける、標的遺伝子座のサザン解析を可能にするためでもある。マウス遺伝子型決定プライマー対(hetFおよびhetR)は、ベクター特異的プライマー、この場合Asc403を使用した複合PCRで用いた場合、野生型、ヘテロ接合体、およびホモ接合マウス相互の識別を可能にする。そして、最後に、標的スクリーニングプライマー(3'scr)は、3'アーム領域の末端の下流にアニールし、ベクターの3'末端に特異的なプライマー(neo36)と対にして用いた場合、標的事象に特有の1.5kbアンプリマーを生成する。このアンプリマーは、所望のゲノム変化が起こった細胞に由来する鋳型DNAからのみ得ることができ、無作為に組み込まれたベクターコピーを含有するバックグランドクローンからの、正しくターゲッティングされた細胞の同定を可能にする。ターゲッティングストラテジーで使用されたこれらのプライマーの位置および、GPR12遺伝子座のゲノム構造を配列番号14(図7)に示す。
【表１】
2007505617.tif 000003
【０１９５】
相同性アームの位置は、7回膜貫通領域のすべてを欠失することによってGPR12遺伝子を機能的に破壊するように選択される。調製されるターゲッティングベクターでは、発現促進されるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neo)遺伝子がGPR12遺伝子と同じ方向に配置されており、このneo遺伝子によって構成された選択カセットの上流にある内在性遺伝子発現レポーター(フレーム非依存性のlacZ遺伝子)によって構成された非相同性配列で、欠失されるべきGPR12配列が置換除去される。
【０１９６】
5'および3'の相同性アームがターゲッティングベクターpTK5IBLMNL(図5を参照)にクローニングされると、標準的な分子生物学技法を用いて、大規模の高純度DNA調製物が調製される。20μgの新たに調製されたエンドトキシンフリーDNAを、別の低頻度切断制限酵素であるPmeIで消化する。PmeIは、アンピシリン耐性遺伝子と、細菌の複製起点との間のベクターバックボーン特有の部位に存在する。次に、線状化されたDNAを沈殿させて、100μlのリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁し、エレクトロポレーションの準備ができる。
【０１９７】
エレクトロポレーションの後、24時間置き、トランスフェクトした細胞を、200μg/mlのネオマイシンを含有する培地中で9日間培養する。クローンを96ウェルプレート中に採取して、複製および増殖させ、その後、内在性GPR12遺伝子とターゲッティング構築物との間での相同組換えがその中で起こっているクローンを同定するために、PCR(上述したプライマー3'scrおよびneo36を用いる)によってスクリーニングする。陽性クローンは、1から5%の割合で同定できる。すべて標準的操作法を用いて、レプリカの冷凍と、ターゲッティング事象を確認するための、上述の通りに調製された5'および3'の外部プローブを用いたサザンブロット用に十分に高品質なDNAの調製とを可能にするために、これらのクローンを増殖させる(Russら、2000年、Nature 2000 Mar 2; 404(6773): 95〜99)。診断制限酵素によって消化されたDNAのサザンブロットを、外部プローブでハイブリダイズさせたときに、突然変異体バンドおよび変化していない野生型バンドの存在によって、相同性ターゲッティングされたES細胞クローンが確認される。例えば、5'プローブを用いて、EcoRI消化されたDNAは、5.5kbの野生型バンド、および4.0kbのターゲッティングされたバンドを示すであろう。同様に、3'プローブを用いて、BamHIは、3.9kbの野生型のバンド、および1.5kbのターゲッティングされたバンドを示すであろう。
【０１９８】
ノックアウト前のマウスGPR12ゲノム遺伝子座の構造を、図1に示す。ノックアウト後のマウスGPR12のゲノム遺伝子座の構造を、図2に示す。サザン検定で重要な酵素部位を注釈した。
【０１９９】
GPR12 GPCR欠失マウスの作製
メスおよびオスのC57BL/6マウスを交配させ、妊娠3.5日に、胚盤胞を単離する。選択されたクローンから得た細胞を、胚盤胞1つにつき10〜12細胞注入し、7〜8個の胚盤胞を偽妊娠のF1のメスの子宮に移植する。何匹かの高レベル(最大100%)アグーチオスを含むキメラ子マウスの同腹仔が生まれる(アグーチコート色は、ターゲッティングされたクローンの子孫である細胞の分布を示す)。これらのオスキメラをメスのMF1および129マウスと交配させ、アグーチコート色によって、そしてPCRによるそれぞれのゲノム型決定によって生殖系列への伝達を判定する。
【０２００】
溶解させたテールクリップのPCR遺伝子型決定を、プライマーhetFおよびhetR、ならびに第3の、ベクター特異的プライマー(Asc403)を用いて行う。この複合PCRは、プライマーhetFおよびhetRから、野生型遺伝子座(存在していれば)からの増幅を可能にし、219bpのバンドを与える。ノックアウトマウスではhetFの部位が欠失されているため、この増幅はターゲッティングされた対立遺伝子からは失敗するであろう。しかし、Asc403プライマーは、3'アームのすぐ中の領域にアニールするhetRプライマーと併せて、ターゲッティングされた遺伝子座から441bpのバンドを増幅するであろう。したがって、この複合PCRは、同腹仔の遺伝子型を以下の通りに明らかにする。野生型の試料は219bpの単一のバンドを示すであろう; ヘテロ接合DNA試料は219bpおよび441bpの2つのバンドを生じ、ホモ接合試料は、標的に特異的な441bpバンドのみを示すであろう。
【実施例２】
【０２０１】
B) 結果
I) 遺伝子発現パターン
1) 電子ノーザン
電子ノーザンを用いて、この遺伝子が、以下の臓器、すなわち精巣、小腸、肺、脳、心臓、および脾臓で発現されていることを示した(図4)。
【０２０２】
2) Lac Z染色された構造のリスト
LacZ染色は、脳、詳細には、嗅球、梨状皮質(嗅覚)、線条体(計画および移動経路のモジュレーション、実行機能に関与する他の様々な認識的な過程にも関与する)、視床(聴覚、体性感覚、および視覚的知覚シグナルを受信する)、海馬(学習および記憶固定に重要)、膝状核(側部: 視覚; 内側: 聴覚)、および皮質におけるAnnieの強い発現を明らかにした。
【０２０３】
II) 解剖学的観察
一部のオスは、それらの背に白い毛皮の斑を有していた。いかなる明白な解剖学的な欠損もノックアウト動物では観測されなかった。
【０２０４】
III) 挙動
すべての動物は、午前7時に点灯される12時間光/12時間暗黒の明暗周期の下に、食物および水への自由なアクセスを与えた状態で収容した。概日性への影響を避けるため、試験は決まった時間に行った。
【０２０５】
突然変異体と野生型との間で相違を示した試験
a) ポップマップ
オスノックアウトマウスは、逆格子およびワイヤー操縦で貧弱な把握能力を示した。
【０２０６】
b) ロータロッド
オスノックアウトマウスは、加速中のロータロッド上でうまく振る舞わなかった。メス突然変異体では相違が観測されなかった。
【０２０７】
これは、小脳の学習および運動協調における障害、ならびにパーキンソン病、およびハンティングトン舞踏病などの運動障害を示す。
【０２０８】
c) 足跡/歩行検査
突然変異体のオスは、野生型動物より足を大きく広げた異常歩行を有することが観察された。
【０２０９】
d) テールフリック試験
突然変異体のオスを、テールフリック試験を用いて試験した。これは、当業者に知られている、疼痛に関する実験室検査である。この試験は、ノックアウトマウスの、侵害受容器性疼痛に対する反応の指標として用いた。突然変異体は、痛覚過敏を示す、加熱によって誘発される疼痛により敏感であることが観測された。突然変異体は、彼らの尾を振り動かす際の、潜伏時間がより短いことが観測された(図8)。
【０２１０】
e) ホットプレート試験
ホットプレート試験は、ノックアウトマウスの、侵害受容器性疼痛に対する反応の指標として用いた。ノックアウトマウスは、加熱に誘発されて足をなめる際の潜伏時間がより短いことによって実証されるように、加熱誘発疼痛により敏感であった。この試験は、GPR12ノックアウトマウスのテールフリック試験で上記で観察された痛覚過敏表現型を確認するものである(図9)。
【０２１１】
f) 水迷路試験
水迷路は齧歯動物の空間的な学習能力を評価するのに広く用いられている試験である。学習は、試行を通した、隠されたプラットホームに達する時間の減少として評価する。これらのデータは、空間的な手がかりを用いて、隠されたプラットホームの位置を学ぶ能力が低下していることを示す(図10)。この試験における障害は、アルツハイマー病、老人性痴呆、または一般的な学習および記憶障害などの様々な病態における学習および記憶の問題を示す。
【０２１２】
g) LABORAS
LABORASは、齧歯動物を長期間モニターして、それらの動きを評価できるようにする長期モニターシステムである。
【０２１３】
Annieマウスの終夜のLABORASモニタリングは、野生型マウスと比較して、Annieマウスの登る傾向(時間(図11a)および頻度(図11b)の両方)が低下していることを示す。これらのデータは、運動協調または筋力不足を示すロータロッドのデータを支持する。
【０２１４】
h) 生化学的分析
血液生化学およびホルモン分析を含めた、完全な生化学的分析をAnnieノックアウトマウスから得た試料で実行した。
【０２１５】
オスAnnieノックアウトマウスでは、クレアチンキナーゼ(CK)レベル(図12)が上昇していた。CKは、ATPおよびクレアチンをADPおよびクレアチンリン酸に変換するものであり、細胞損傷の後に、心臓、骨格筋、および脳から放出される。CKの増大は、神経筋疾患、例えば、心臓病、ミトコンドリア障害、炎症ミオパシー、筋無力症、多発性筋炎、マックアードル病、NMJ障害、筋ジストロフィー症、ALS、甲状腺機能低下および甲状腺機能亢進障害、中心コア病、酸性マルターゼ不全、ミオグロビン尿症、横紋筋融解症、MND、およびリウマチ性疾患を示すものである。筋肉の損傷は、行動の研究で見られた運動協調/筋力の低下によっても支持されるであろう。
【０２１６】
生化学分析で見られた他の重要な変化には、
1. グルコース: 3および9カ月のオスおよび3カ月のメスで増大(約20%)。グルコースレベルの増大は、糖尿病、および肝臓疾患などの障害を示す。
【０２１７】
2. クレアチニン(筋代謝の老廃物): 9カ月のオスで増大(約100%)(腎臓病または筋変性で見られるレベルの増大)。
【０２１８】
3. トリグリセリド: 3カ月のメスおよび9カ月のオスで増大(約25%)(肝臓疾患、甲状腺機能低下、膵炎、またはMIを示す)。
【０２１９】
4. 尿酸(肝臓および腎臓に見出され、プリン代謝の最終産物である): 3カ月のオス(約80%)、および9カ月のオス(約15%)で増大(痛風、感染、腎臓病、吸収不全、肝臓損傷または過酸性の腎臓で見られるレベルの増大)。
【０２２０】
5. アルブミン: 9カ月のオスで増大(約25%)(肝臓疾患、多発性骨髄腫で見られるアルブミンの増大)。
【０２２１】
6. アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ: 3および9カ月のオスで増大(約80%)(急性肝細胞損傷または肝炎を示す)。
【０２２２】
総合的な結果は、肝臓または腎臓の機能障害を示唆する。
【０２２３】
各特許出願および特許の手続き中のものを含めた、本明細書で言及した各特許出願および特許、ならびに上記の特許出願および特許のそれぞれで引用または参照された各文献(「特許出願引用文献」)、ならびに、各特許出願および特許、ならびに特許出願引用文献のいずれかで引用または言及したいかなる製品の、製造会社によるいかなる説明書およびカタログも、これにより参照により本明細書に援用する。さらに、本文中で引用されたすべての文献、および本文中で引用された文献中で引用または参照されたすべての文献、および本文中で引用または言及されたいかなる製品の、製造会社によるいかなる説明書およびカタログも、これにより参照により本明細書に援用する。
【０２２４】
本発明の記載した方法およびシステムの種々の変更形態および変形形態は、本発明の範囲および精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。特定の好ましい実施形態に関連して本発明を記述したが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施形態に不当に制限されるべきではないこと、そして、本発明の範囲内において多くの変更および追加を加えることができることを理解されたい。実際に、本発明を実施するために記載した方法の種々の変更形態は、分子生物学あるいは関連分野の当業者には明らかであり、特許請求の範囲内に含まれるものである。さらに、独立形式請求項の特徴を用いて、本発明の範囲から逸脱せずに、従属請求項の特徴の様々な組合せを作ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】図1は、GPR12ノックアウト前のマウスGPR12ゲノム遺伝子座の構造を示す。
【図２】図2は、GPR12ノックアウト後のマウスGPR12ゲノム遺伝子座の構造を示す。
【図３】図3は、重要な制限部位を含めた、GPR12の相同組換えに用いられるターゲッティングベクターの構造を示す。
【図４】図4は、PCRおよび電子ノーザンを用いたGPCR12遺伝子発現パターンを示す。
【図５】図5は、ロータロッド試験における、オスノックアウトマウスの成績を示す。
【図６】図6は、歩行の評価の結果を示す。突然変異体は左の足跡であり、野生型は右の足跡である。
【図７−１】図7-1は、5'プローブFIIから3'プローブR1までのゲノム遺伝子座を示す。
【図７−２】図7-2は、5'プローブFIIから3'プローブR1までのゲノム遺伝子座を示す。
【図７−３】図7-3は、5'プローブFIIから3'プローブR1までのゲノム遺伝子座を示す。
【図８】図8は、テールフリック試験における、オスノックアウトマウスの評価の結果を示す(-/- ノックアウト突然変異体、+/+ 野生型対照)。
【図９】図9は、ホットプレート試験における、オスノックアウトマウスの評価の結果を示す。
【図１０】図10は、水迷路試験の評価の結果を示す(野生型は白抜きの正方形、ノックアウトマウスは黒塗りの丸)。
【図１１】図11aは、マウスが終夜、登る時間のLABORAS評価の結果を示す(野生型はX; ノックアウトは黒塗りの三角形)。図11bは、マウスが終夜、登る頻度のLABORAS評価の結果を示す(野生型はX; ノックアウトは黒塗りの三角形)。
【図１２】図12は、ノックアウトマウスのクレアチンキナーゼレベルの評価の結果を示す(1. 3カ月齢の野生型メス; 2. 3カ月齢のノックアウト(KO)メス; 3. 9カ月齢の野生型メス; 4. 9カ月齢のノックアウト(KO)メス; 5. 3カ月齢の野生型オス; 6. 3カ月齢のノックアウト(KO)オス; 7. 9カ月齢の野生型オス; 8. 9カ月齢のノックアウト(KO)メス)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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