(57)【要約】  本発明は、一種類の細菌発酵液細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡｓ）を直接分離、抽出及び精製する方法を開示しており、その技術分野はバイオテクノロジーの下流の連続的処理の技術分野である。本発明の方法は、物理的方法によって、発酵液に対し、細胞壁を破る前処理を行う段階と、前処理された発酵液のｐＨ値をアルカリ性まで調整する段階と、アニオン界面活性剤を添加して、撹拌しながら反応させる段階と、反応液の中から凝集沈澱物を分離及び抽出する段階と、洗浄し、乾燥させる段階と、を含む。本発明のプロセスが簡単で、コストが低く、抽出収率が高く、かつ、汚染が無く、大規模な工業生産を実現出来るようになるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌発酵液の中から細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを分離及び精製する方法であって、
（１）物理的方法によって、発酵液に対し、細胞壁を破る前処理を行う段階と；
（２）前処理された発酵液のｐＨ値をアルカリ性になるように調整する段階と；
（３）アニオン性界面活性剤を添加して、撹拌しながら反応させる段階と；
（４）反応液の中から凝集沈澱物を分離及び抽出する段階と；
（５）洗浄し、乾燥させる段階と；
を含み、
ｐＨ調整する段階と界面活性剤を添加する段階は互いに交換可能であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記段階（３）で、更に凝集剤を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物理的方法は、超音波破砕、ボールミリング、または高圧処理の中から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記前処理後の発酵液のｐＨを８〜１３に調整することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨ調整に用いるアルカリ性物質は、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３の固体もしくは水溶液、またはアンモニア水であることを特徴とする、請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
前記アニオン性界面活性剤は、アルキレンスルホン酸塩、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテルまたはアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルであり、その添加量は、発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記凝集剤は、ポリアクリル酸ナトリウム、変性澱粉またはポリアミンより選択され、その添加量は、発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記撹拌反応の温度は、１０℃〜７０℃であり、反応時間は、５〜６０分間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記反応液中の沈澱物を分離及び抽出する方法は、遠心分離、圧力濾過または真空吸引濾過より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの後処理に関し、具体的に、バクテリア発酵産物の抽出及び分離に関し、さらに具体的に、細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの直接的抽出及び分離の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（Ｐｏｌｙ−β−Ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ、略称はＰＨＡｓと言う）は、一種類の特定の微生物で特別な成長条件の下に細胞内に蓄えられて来た生物学上のポリエステルであり、ＰＨＡｓの一般式は下記のように示される。
【０００３】
【化１】
2007524345.tif 000002
【０００４】
前記式中、ｎ，ｍは１から４までの整数とし、通常の場合は１とし、即ち３−ヒドロキシアルカノエート（３−ＨＡＳ）であり、Ｒ１，Ｒ２は置換または非置換の飽和または不飽和の直鎖或いは分岐鎖のＣ１〜Ｃ１２のアルキル基であり、Ｘ，Ｙは同時に０とはならず、Ｘ，Ｙの大きさは当該成分の共重合体中の含有量を決めるものである。通常、ＰＨＡｓの重量平均分子量は１００万から４００万Ｄａの間にある。
【０００５】
ＰＨＡｓの物理的性質はポリプロピレンに類似しているが、通常石油化工樹脂（ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｉｎ）が備えない生分解性、生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）、圧電気性（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ）、光学活性等の特性は、工業、農業、医学、衛生、食品、電子等の分野において広い応用の見通しがあるものである。
【０００６】
目下、国際的にはＰＨＡｓの大規模な工業化の生産はまだ実現されていないものであるが、その主な原因は、コストが石油化工樹脂より非常に高価であることによるものである。ＰＨＡｓのコストは、主に原材料のコストと分離・精製のコストを含んでいる。原材料コストの高さは、菌種の生産効率及び採用される発酵プロセスによって決まり、一方、分離・精製のコストは採用されるプロセスによって決まるものである。現在の抽出プロセスは、先ず高速遠心機を使って細胞を発酵液から分離し、更に分離された湿菌体の中のＰＨＡｓを精製する。通常、採用される精製方法は有機溶剤抽出法、化学試薬法、界面活性剤＋酵素法等である。これらの方法は、コストが高いという欠点か、あるいは汚染がひどいという欠点を有しており、工業化生産を実現することが難しいものである。公開番号ＣＮ１３２８１６０Ａの中国特許出願には、短鎖長のポリヒドロキシアルカノエート（Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，ｓｃｌ−ＰＨＡＳ）の細胞を含む発酵液の中から直接的にポリヒドロキシアルカノエートを抽出する、一回（一段階）で抽出、分離する方法を開示しているものである。しかし、当該方法は、大量の次亜塩素酸ナトリウムを使用しなければならないので、操作の環境を劣悪にし、汚染が酷くなり、排水処理のためにコストが上昇し、そして、抽出産物であるＰＨＡｓの分子量に対し、非常に大きな剪断減成（ｓｈｅａｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が発生し、製品の品質に影響を及ぼすものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明の目的は、分離及び精製のコストを効果的に低減し、汚染を減らし、工業化生産に適合するＰＨＡｓの抽出方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一つのバクテリア発酵液の中から細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを直接分離し、精製する方法を提供するものである。本発明の方法は、次の各段階を含む。
（１）物理的方法によって、発酵液に対し、細胞壁を破る前処理を行う段階である。
（２）前処理された発酵液のｐＨ値をアルカリ性になるように調整する段階である。
（３）アニオン性界面活性剤を添加して、撹拌しながら反応させる段階である。
（４）反応液の中から凝集沈澱物を分離及び抽出する段階である。
（５）洗浄し、乾燥させる段階である。
【０００９】
前記（１）から（５）の段階において，ｐＨ調整する段階と界面活性剤を添加する段階は互いに交換可能である。
【００１０】
前記段階（３）では、アニオン界面活性剤のほかに、凝集剤を添加してもよい。
【００１１】
本発明の方法において、細胞壁を破る前処理に使用している物理的方法は、超音波粉砕破砕、ボールミリング、または高圧処理をするものである。
【００１２】
前処理後の発酵液のｐＨは８〜１３に調整することができる。ｐＨ調整に用いるアルカリ性物質は、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３等の固体もしくは水溶液、またはアンモニア水などであってもよいものである。
【００１３】
本発明に用いるアニオン性界面活性剤は、アルキレンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル（ＡＥＯ）、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル等でもよく、その使用量は発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）とすることができる。
【００１４】
本発明の方法のうち、添加される凝集剤としては、ポリアクリル酸ナトリム、変性澱粉、またはポリアミン等がある。凝集剤の使用量は発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）とすることができる。
【００１５】
アニオン界面活性剤と凝集剤を添加した後、撹拌反応の温度は１０℃〜７０℃とし、反応の時間は５〜６０分間とすることができる。
【００１６】
反応液の中から沈澱物を分離・抽出する方法は、遠心分離、圧力濾過または真空吸引濾過等があるものである。
【００１７】
本発明は適用処理の対象が広く、種々のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートのバクテリア及びその変異種並びに遺伝子工学バクテリアなどを含む発酵液の分離・精製に応用出来るものである。適応のバクテリア種属は、主にアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクタ属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メチロトローフ属（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ）とバシラス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）等を含んでいる。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法は、発酵液中の細胞の乾燥重量およびその中のＰＨＡｓの含有量に対する要求は高くないものである。本発明のプロセスは、簡単でコストが低く、抽出収率が高く、且つ、汚染を著しく低減することができるという利点を有している。従って、大規模な工業生産が実現出来るようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
次に、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明する。ただし、これらの実施例は特許請求の範囲に対していかなる制限にもならないものである。本技術分野の当業者が本明細書に開示されている発明に対して行ったいかなる改変及び変更は、本件出願に添附されている特許請求の範囲内に含まれるべきものである。
【００２０】
（実施例１）
アルカリゲネス・エントロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）突然変異種６５−７の発酵液を１０００ｍｌ取り、その中の細胞の乾燥重量が１４２ｇ／ｌ，ＰＨＢＶの含有量が７８．５％であった。ボールミル（５３０ｒｐｍ回転数、０．１ｍｍのスチールボールで）前処理を４０分間行い、３０％の水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１２までに調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを１３ｇ加え、反応温度を３２℃まで調整した。次いで、５分間撹拌しながら反応をさせ、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を水で洗液が中性を呈するまで洗浄し、約７０℃で一定重量まで加熱乾燥させた。得られた製品の純度は９８．２％であり、重量平均分子量は５．２×１０５Ｄａであり、抽出収率は８５．２％であった。真空吸引濾過の廃水は、嫌気性および好気性処理後、そのＣＯＤ、ＢＯＤはそれぞれ８００ｍｇ／ｌと３０ｍｇ／ｌになり、国家の放流規格（ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に達するようになる。
【００２１】
（実施例２）
アルカリゲネス・エントロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）菌発酵液を１００ｍｌ取り、その中の細胞の乾燥重量が１４７ｇ／ｌ、ＰＨＢＶの含有量が７５．２％であった。超音波（仕事率１５００Ｗ）で細胞を破る処理（細胞破壁）をし、３０％のＮａＯＨ溶液でｐＨを８まで調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを０．５ｇ、ポリアクリル酸ナトリウムを５ｇ加え、反応温度を７０℃まで調整した。次いで、３０分間撹拌しながら反応をさせ、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を水で洗浄し、洗液が中性を呈するまで洗浄した後、約７０℃の乾燥器の中において、一定重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が９３．２％で、分子量が４．１×１０５Ｄａ、抽出収率が８０．３％であった。
【００２２】
（実施例３）
アルカリゲネス・エントロファス菌発酵液を５０ｍｌ取り、その中の細胞の乾燥重量が１０２ｇ／ｌ、ＰＨＢ含有量は６０％であった。ボールミル（５６０ｒｐｍ、０．１ｍｍのスチールボール）で細胞破壁の前処理を３０分間行い、ＮＨ３・Ｈ２Ｏ溶液でｐＨを１３までに調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを１０ｇ、変性澱粉を１０ｇ加えて反応温度を１０℃まで調整した。次いで、１０分間撹拌しながら反応を行い、遠心機（分離因数（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）は６００）で分離させ、得られた凝集沈澱物を水で洗浄し、洗浄液が中性を呈するまで洗浄してから、約７０℃の乾燥器の中におき、一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が９８．２％で、分子量が４．４×１０５Ｄａで抽出収率が８７％であった。
【００２３】
（実施例４）
アルカリゲネス・エントロファス突然変異種６５−７の発酵液を５００ｍｌ取り、細胞の乾燥重量は１３５ｇ／ｌ、ＰＨＢ含有量は７５．５％であった。これを特製の容器に置き、６０ＭＰａまで昇圧し、１０分間経過した後、圧力を急速に開放し、液体を収集してから、２回繰り返した。処理された後の発酵液を３０％水酸化ナトリウム溶液によってｐＨを１０までに調整し、ドデシルアルコール・ポリオキシエチレン・エーテル硫酸ナトリウム９ｇを加え、反応温度を３８℃まで調整した。次いで、撹拌しながら反応を８分間行い、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を洗浄液が中性を呈するまで洗浄し、約７０℃で一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が９６．７％で、重量平均分子量が４．２×１０５Ｄａで、抽出収率が８１．５％であった。
【００２４】
（実施例５）
アルカリゲネス・エントロファス菌発酵液を１００Ｌとり、その中の細胞の乾燥重量は１５４ｇ／ｌ、ＰＨＢＶ含有量は８０．５％であった。これを超音波（仕事率が２８００Ｗで連続で処理する）によって４０分間細胞破壁の前処理をし、３０％ＮａＯＨ溶液によって、ｐＨを１１までに調整した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム１０ｋｇと、ポリアクリル酸ナトリウム０．５ｋｇを加え、反応温度を５０℃まで調整し、撹拌しながら反応を６０分間行った。次いで、圧力濾過機によって、圧力濾過を行い、得られた沈澱物を水で洗浄し、ｐＨが中性を呈するまで洗浄した後、約７０℃の乾燥器内に置き、一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は、純度が９７％で、分子量が５．３×１０５Ｄａで、抽出収率が８４％であった。
【００２５】
（実施例６）
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌の発酵液を１００ｍｌとり、その中の細胞の乾燥重量は８６ｇ／ｌであり、ＰＨＢＶ含有量は６１．５％であった。これをボールミル（５６０ｒｐｍ、０．１ｍｍスチールボール）で前処理を５０分間行い、３０％水酸化ナトリウムによってｐＨを１１まで調整した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム３ｇを加え、反応温度を２４℃まで調整し、１０分間撹拌しながら反応を行った。次いで、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を水で洗浄液が中性を呈するまで洗浄し、約７０℃で一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は、純度が９４．２％で、重量平均分子量が３．２×１０５Ｄａであり、抽出収率が７１．２％であった。
【手続補正書】
【提出日】平成17年7月18日(2005.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌発酵液の中から細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを分離及び精製する方法であって、
（１）物理的方法によって、発酵液に対し、細胞壁を破る前処理を行う段階と；
（２）前処理された発酵液のｐＨ値をアルカリ性になるように調整する段階と；
（３）アニオン性界面活性剤を添加して、撹拌しながら反応させる段階と；
（４）反応液の中から凝集沈澱物を分離及び抽出する段階と；
（５）洗浄し、乾燥させる段階と；
を含み、
前記物理的方法は、機械破砕及び超音波破砕を含み、
前記機械破砕は、ボールミリング或いは高圧均質化処理を含み、
ｐＨ調整する段階と界面活性剤を添加する段階は互いに交換可能であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記段階（３）で、更に凝集剤を添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記機械粉砕は、ボールミリングであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記前処理後の発酵液のｐＨを８〜１３に調整することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｐＨ調整に用いるアルカリ性物質は、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３の固体もしくは水溶液、またはアンモニア水であることを特徴とする、請求項１または４に記載の方法。
【請求項６】
前記アニオン性界面活性剤は、アルキレンスルホン酸塩、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテルまたはアルキルフェノールポリオキシエチレンエーテルであり、その添加量は、発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記凝集剤は、ポリアクリル酸ナトリウム、変性澱粉またはポリアミンより選択され、その添加量は、発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記撹拌反応の温度は、１０℃〜７０℃であり、反応時間は、５〜６０分間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記反応液中の凝集沈澱物を分離及び抽出する方法は、遠心分離、圧力濾過または真空吸引濾過より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの後処理に関し、具体的に、バクテリア発酵産物の抽出及び分離に関し、さらに具体的に、細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートの直接的抽出及び分離の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリ−β−ヒドロキシアルカノエート（Ｐｏｌｙ−β−Ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ、略称はＰＨＡｓと言う）は、一種類の特定の微生物で特別な成長条件の下に細胞内に蓄えられて来た生物学上のポリエステルであり、ＰＨＡｓの一般式は下記のように示される。
【０００３】
【化１】
2007524345.tif 000003
【０００４】
前記式中、ｎ，ｍは１から４までの整数とし、通常の場合は１とし、即ち３−ヒドロキシアルカノエート（３−ＨＡＳ）であり、Ｒ１，Ｒ２は置換または非置換の飽和または不飽和の直鎖或いは分岐鎖のＣ１〜Ｃ１２のアルキル基であり、Ｘ，Ｙは同時に０とはならず、Ｘ，Ｙの大きさは当該成分の共重合体中の含有量を決めるものである。通常、ＰＨＡｓの重量平均分子量は１００万から４００万Ｄａの間にある。
【０００５】
ＰＨＡｓの物理的性質はポリプロピレンに類似しているが、通常石油化工樹脂（ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｓｉｎ）が備えない生分解性、生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）、圧電気性（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ）、光学活性等の特性は、工業、農業、医学、衛生、食品、電子等の分野において広い応用の見通しがあるものである。
【０００６】
目下、国際的にはＰＨＡｓの大規模な工業化の生産はまだ実現されていないものであるが、その主な原因は、コストが石油化工樹脂より非常に高価であることによるものである。ＰＨＡｓのコストは、主に原材料のコストと分離・精製のコストを含んでいる。原材料コストの高さは、菌種の生産効率及び採用される発酵プロセスによって決まり、一方、分離・精製のコストは採用されるプロセスによって決まるものである。現在の抽出プロセスは、先ず高速遠心機を使って細胞を発酵液から分離し、更に分離された湿菌体の中のＰＨＡｓを精製する。通常、採用される精製方法は有機溶剤抽出法、化学試薬法、界面活性剤＋酵素法等である。これらの方法は、コストが高いという欠点か、あるいは汚染がひどいという欠点を有しており、工業化生産を実現することが難しいものである。公開番号ＣＮ１３２８１６０Ａの中国特許出願には、短鎖長のポリヒドロキシアルカノエート（Ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ−ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅｓ，ｓｃｌ−ＰＨＡＳ）の細胞を含む発酵液の中から直接的にポリヒドロキシアルカノエートを抽出する、一回（一段階）で抽出、分離する方法を開示しているものである。しかし、当該方法は、大量の次亜塩素酸ナトリウムを使用しなければならないので、操作の環境を劣悪にし、汚染が酷くなり、排水処理のためにコストが上昇し、そして、抽出産物であるＰＨＡｓの分子量に対し、非常に大きな剪断減成（ｓｈｅａｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が発生し、製品の品質に影響を及ぼすものである。
【０００７】
中国特許ＣＮ１１９０６７Ａには、一つのバクテリアの菌体の中から細菌胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを分離し、精製する方法が開示されている。当該方法の抽出の過程の中においては、菌体を発酵液の中から分離させるために必要な、二つの段階を含む。しかし、バクテリアの菌体が非常に小さく（数μｍ）、発酵液は所定の粘度を有するものであるので、分離因数の６０００以上に至る高速遠心機を使用してそれを発酵液の中から分離することが必要である。この方法は、大規模な工業化生産の中では、実現することが困難であり、或いは、投資額を大幅に増やすものであろう。この方法はまた、ＰＨＡｓ類材料の大規模な工業化生産のボトルネックとなる。当該方法は、価格の非常に高い蛋白酵素を用いて、分離させた生産物を更に処理する必要があるので、製品のコストがあがるものであることが予想される。
【０００８】
中国特許ＣＮ１１７１４１０Ａに開示されている抽出方法は、前記特許ＣＮ１１９０６７４Ａと同じで、やはり高速遠心機を使用する必要があると同時に、当該方法はまた、遠心後の分離された物質を凍結乾燥する必要があることを要求することが開示されているが、この二つの段階は、大規模な工業化の中では非常に実施することが困難なものである。年生産高が１０万トンのＰＨＡｓ材料の工場を例として挙げると、一日当たり、高速遠心処理の必要な発酵液が約３０００〜４０００トンで、凍結乾燥の処理量は約６００〜８００トンと言うことになるが、こうした大量の半製品は凍結乾燥が必要であり、このことは、その工業生産のコストが非常に高いということを意味する。得られた産物は、最終的に大量の有機溶剤で洗浄することが必要なので、これにより、操作環境の汚染と製品コストの上昇という結果をもたらすこととなる。
【０００９】
米国特許ＵＳ４９１０１４５Ａが開示している技術は、一種類の酵素と界面活性剤を使用して、ＰＨＡｓ類の材料を分離抽出する方法である。細菌の細胞壁と細胞膜の成分が非常に複雑なものであり、一種類の酵素によって完全に分解することはできないので、多種多様の複合酵素を用いなければならない。しかし、異なった酵素の場合、その酵素にとって一番好適な作用条件、例えばｐＨや、温度などが異なるものであるので、そのために、複合酵素を用いて処理する場合には、プロセスが非常に複雑で、そして、当該方法を採用する場合には先ず発酵液を８０℃以上まで加熱しなければならないので、こうしたことは膨大な量のエネルギーを消費するであろうと同時に、酵素製剤の価格が高いので、当該方法の分離コストが高くなり、かつ、製品の純度は低いものになってしまう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明の目的は、分離及び精製のコストを効果的に低減し、汚染を減らし、工業化生産に適合するＰＨＡｓの抽出方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一つのバクテリア発酵液の中から細胞内のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートを直接分離し、精製する方法を提供するものである。本発明の方法は、次の各段階を含む。
（１）物理的方法によって、発酵液に対し、細胞壁を破る前処理を行う段階である。
（２）前処理された発酵液のｐＨ値をアルカリ性になるように調整する段階である。
（３）アニオン性界面活性剤を添加して、撹拌しながら反応させる段階である。
（４）反応液の中から凝集沈澱物を分離及び抽出する段階である。
（５）洗浄し、乾燥させる段階である。
【００１２】
前記（１）から（５）の段階において，物理的方法は機械破砕及び超音波破砕を含み、ｐＨ調整する段階と界面活性剤を添加する段階は互いに交換可能である。上述の機械粉砕はボールミリング或いは高圧均質化処理を含む。
【００１３】
前記段階（３）では、アニオン界面活性剤のほかに、凝集剤を添加してもよい。
【００１４】
本発明の方法のうち、細胞壁を破る処理に使用している機械粉砕としては、ボールミリングを使用することができる。
【００１５】
前処理後の発酵液のｐＨは８〜１３に調整することができる。ｐＨ調整に用いるアルカリ性物質は、ＮａＯＨ、Ｎａ２ＣＯ３、ＮａＨＣＯ３等の固体もしくは水溶液、またはアンモニア水などであってもよいものである。
【００１６】
本発明に用いるアニオン性界面活性剤は、アルキレンスルホン酸塩（ＡＯＳ）、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル硫酸塩（ＡＥＳ）、脂肪族アルコールポリオキシエチレンエーテル（ＡＥＯ）、アルキルフェノールポリオキシエチレンエーテル等でもよく、その使用量は発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）とすることができる。
【００１７】
本発明の方法のうち、添加される凝集剤としては、ポリアクリル酸ナトリム、変性澱粉、またはポリアミン等がある。凝集剤の使用量は発酵液の量の０．５％〜２０％（Ｗ／Ｖ）とすることができる。
【００１８】
アニオン界面活性剤と凝集剤を添加した後、撹拌反応の温度は１０℃〜７０℃とし、反応の時間は５〜６０分間とすることができる。
【００１９】
反応液の中から凝集沈澱物を分離・抽出する方法は、遠心分離、圧力濾過または真空吸引濾過等があるものである。
【００２０】
本発明は適用処理の対象が広く、種々のポリ−β−ヒドロキシアルカノエートのバクテリア及びその変異種並びに遺伝子工学バクテリアなどを含む発酵液の分離・精製に応用出来るものである。適応のバクテリア種属は、主にアルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アゾトバクタ属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドスピリルム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、メチロトローフ属（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ）とバシラス属（ｂａｃｉｌｌｕｓ）等を含んでいる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の方法は、発酵液中の細胞の乾燥重量およびその中のＰＨＡｓの含有量に対する要求は高くないものである。本発明のプロセスは、簡単でコストが低く、抽出収率が高く、且つ、汚染を著しく低減することができるという利点を有している。従って、大規模な工業生産が実現出来るようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
次に、実施例を用いて本発明についてさらに詳細に説明する。ただし、これらの実施例は特許請求の範囲に対していかなる制限にもならないものである。本技術分野の当業者が本明細書に開示されている発明に対して行ったいかなる改変及び変更は、本件出願に添附されている特許請求の範囲内に含まれるべきものである。
【００２３】
（実施例１）
アルカリゲネス・エントロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）突然変異種６５−７の発酵液を１０００ｍｌ取り、その中の細胞の乾燥重量が１４２ｇ／ｌ，ＰＨＢＶの含有量が７８．５％であった。ボールミル（５３０ｒｐｍ回転数、０．１ｍｍのスチールボールで）前処理を４０分間行い、３０％の水酸化ナトリウム溶液でｐＨを１２までに調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを１３ｇ加え、反応温度を３２℃まで調整した。次いで、５分間撹拌しながら反応をさせ、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた凝集沈澱物を水で洗液が中性を呈するまで洗浄し、約７０℃で一定重量まで加熱乾燥させた。得られた製品の純度は９８．２％であり、重量平均分子量は５．２×１０５Ｄａであり、抽出収率は８５．２％であった。真空吸引濾過の廃水は、嫌気性および好気性処理後、そのＣＯＤ、ＢＯＤはそれぞれ８００ｍｇ／ｌと３０ｍｇ／ｌになり、国家の放流規格（ｄｉｓｃｈａｒｇｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ）に達するようになる。
【００２４】
（実施例２）
アルカリゲネス・エントロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）菌発酵液を１００ｍｌ取り、その中の細胞の乾燥重量が１４７ｇ／ｌ、ＰＨＢＶの含有量が７５．２％であった。超音波（仕事率１５００Ｗ）で細胞を破る処理（細胞破壁）をし、３０％のＮａＯＨ溶液でｐＨを８まで調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを０．５ｇ、ポリアクリル酸ナトリウムを５ｇ加え、反応温度を７０℃まで調整した。次いで、３０分間撹拌しながら反応をさせ、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた凝集沈澱物を水で洗浄し、洗液が中性を呈するまで洗浄した後、約７０℃の乾燥器の中において、一定重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が９３．２％で、分子量が４．１×１０５Ｄａ、抽出収率が８０．３％であった。
【００２５】
（実施例３）
アルカリゲネス・エントロファス菌発酵液を５０ｍｌ取り、その中の細胞の乾燥重量が１０２ｇ／ｌ、ＰＨＢ含有量は６０％であった。ボールミル（５６０ｒｐｍ、０．１ｍｍのスチールボール）で細胞破壁の前処理を３０分間行い、ＮＨ３・Ｈ２Ｏ溶液でｐＨを１３までに調整し、ドデシル硫酸ナトリウムを１０ｇ、変性澱粉を１０ｇ加えて反応温度を１０℃まで調整した。次いで、１０分間撹拌しながら反応を行い、遠心機（分離因数（ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）は６００）で分離させ、得られた凝集沈澱物を水で洗浄し、洗浄液が中性を呈するまで洗浄してから、約７０℃の乾燥器の中におき、一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が９８．２％で、分子量が４．４×１０５Ｄａで抽出収率が８７％であった。
【００２６】
（実施例４）
アルカリゲネス・エントロファス突然変異種６５−７の発酵液を５００ｍｌ取り、細胞の乾燥重量は１３５ｇ／ｌ、ＰＨＢ含有量は７５．５％であった。これを特製の容器に置き、６０ＭＰａまで昇圧し、１０分間経過した後、圧力を急速に開放し、液体を収集してから、２回繰り返した。処理された後の発酵液を３０％水酸化ナトリウム溶液によってｐＨを１０までに調整し、ドデシルアルコール・ポリオキシエチレン・エーテル硫酸ナトリウム９ｇを加え、反応温度を３８℃まで調整した。次いで、撹拌しながら反応を８分間行い、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を洗浄液が中性を呈するまで洗浄し、約７０℃で一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は純度が９６．７％で、重量平均分子量が４．２×１０５Ｄａで、抽出収率が８１．５％であった。
【００２７】
（実施例５）
アルカリゲネス・エントロファス菌発酵液を１００Ｌとり、その中の細胞の乾燥重量は１５４ｇ／ｌ、ＰＨＢＶ含有量は８０．５％であった。これを超音波（仕事率が２８００Ｗで連続で処理する）によって４０分間細胞破壁の前処理をし、３０％ＮａＯＨ溶液によって、ｐＨを１１までに調整した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム１０ｋｇと、ポリアクリル酸ナトリウム０．５ｋｇを加え、反応温度を５０℃まで調整し、撹拌しながら反応を６０分間行った。次いで、圧力濾過機によって、圧力濾過を行い、得られた沈澱物を水で洗浄し、ｐＨが中性を呈するまで洗浄した後、約７０℃の乾燥器内に置き、一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は、純度が９７％で、分子量が５．３×１０５Ｄａで、抽出収率が８４％であった。
【００２８】
（実施例６）
シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌の発酵液を１００ｍｌとり、その中の細胞の乾燥重量は８６ｇ／ｌであり、ＰＨＢＶ含有量は６１．５％であった。これをボールミル（５６０ｒｐｍ、０．１ｍｍスチールボール）で前処理を５０分間行い、３０％水酸化ナトリウムによってｐＨを１１まで調整した。さらに、ドデシル硫酸ナトリウム３ｇを加え、反応温度を２４℃まで調整し、１０分間撹拌しながら反応を行った。次いで、濾紙を用いて真空吸引濾過をし、得られた沈澱物を水で洗浄液が中性を呈するまで洗浄し、約７０℃で一定の重量まで乾燥させた。得られた製品は、純度が９４．２％で、重量平均分子量が３．２×１０５Ｄａであり、抽出収率が７１．２％であった。
【国際調査報告】
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