(57)【要約】本発明は、イオン交換技術を用いてサンプルを濾過および／または精製するための装置および方法に関する。イオン交換材料コアを含む高分子電解質コーティングされた粒子、この粒子を使用するためのデバイス、ＰＣＲ反応生成物および／またはＤＮＡ配列決定反応生成物を分離するために、この粒子を使用するための方法、ならびにこの粒子をコーティングするための組成物が、提供される。上記コアおよびコーティングは、ＰＣＲ反応生成物またはＤＮＡ配列決定反応生成物を分離するように適合されている。
2007522807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子であって、以下：
イオン交換材料を含むコア；および
高分子電解質材料を含むコーティング
を含み、ここで、該コアおよび該コーティングは、ＰＣＲ反応生成物またはＤＮＡ配列決定反応生成物を分離するために適合されている、
粒子。
【請求項２】
前記コアが、プライマー、プライマーダイマー、ｓｓＤＮＡフラグメント、取り込まれていないヌクレオチドおよび塩から選択される、少なくとも１つのＰＣＲ反応生成物に結合する、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
前記粒子が、１００より多くの塩基対を有するｄｓＤＮＡフラグメントを実質的に排除するように適合されている、請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
前記コアが、プライマー、色素標識化プライマー、ヌクレオチド、色素標識化ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、色素標識化ジデオキシヌクレオチドおよび塩から選択される、少なくとも１つのＤＮＡ配列決定反応生成物に結合する、請求項１に記載の粒子。
【請求項５】
前記粒子が、４５より多くのヌクレオチドを有する色素標識化ｓｓＤＮＡフラグメントを実質的に排除するように適合されている、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
前記コーティングが生体高分子を含む、請求項１〜５に記載の粒子。
【請求項７】
前記生体高分子が非サンプルＤＮＡである、請求項６に記載の粒子。
【請求項８】
前記コーティングが合成ポリマーを含む、請求項１〜５に記載の粒子。
【請求項９】
請求項８に記載の粒子であって、前記合成ポリマーがコポリマーを含み、該コポリマーが以下：（メト）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−イソ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチル（メト）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）（メト）アクリルアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、酢酸ビニル（ビニルアルコールの前駆体）、２−ヒドロキシエチル（メト）アクリレート、３−ヒドロキシプロピル（メト）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、ポリ（エチレンオキシド）（メト）アクリレート、Ｎ−（メト）アクリルオキシスクシンイミド、Ｎ−（メト）アクリロイルモルホリン、Ｎ−２，２，２−トリフルオロエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセトアミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル（メト）アクリルアミド、スルホン酸スチレン、スルホン酸スチレンのホモポリマー、スルホン酸スチレンのコポリマー、Ｎ−（メチル）アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミド、（メチル）アクリロイル尿素、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、アクリル酸、メタクリル酸、スルホン酸ビニル、スルホン酸スチレン、４−アセトキシスチレン（４−ヒドロキシスチレンの前駆体）、およびホスホン酸ビニル、ならびにビニルメチルエーテル、から選択される少なくとも１つのモノマーを含む、粒子。
【請求項１０】
前記合成ポリマーが、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−スルホン酸スチレン）、ポリ（塩酸アリルアミン）、およびポリ（アクリル酸）のうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の粒子。
【請求項１１】
前記イオン交換材料が多孔質である、請求項１〜１０のいずれかに記載の粒子。
【請求項１２】
前記イオン交換材料が表面活性化されている、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１３】
前記イオン交換材料が、１００オングストローム〜２０００オングストローム、または５オングストローム〜１０００オングストロームの孔サイズを有する、請求項１１に記載の粒子。
【請求項１４】
前記高分子電解質材料が、１．０メガダルトン〜３．０メガダルトンまたは１０００ダルトン〜６．０メガダルトンのＭｗを有する、請求項１３に記載の粒子。
【請求項１５】
前記イオン交換材料が、１０００オングストロームの孔サイズおよび１．７メガダルトン〜２．４メガダルトンのＭｗを有するか、または１０オングストローム〜５０オングストロームの孔サイズおよび２．４メガダルトン〜４．９メガダルトンのＭｗを有する、請求項１４に記載の粒子。
【請求項１６】
前記合成ポリマーがコポリマーを含み、該コポリマーが、以下：塩酸アリルアミン、（３−アクリルアミドプロピル）トリスメチル塩化アンモニウム、塩酸Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、および加水分解されてアミノ基を１つ生じるＮ−ビニルアミド、から選択される少なくとも１つのモノマーを含む、請求項９に記載の粒子。
【請求項１７】
前記合成ポリマーが、ポリ（Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）である、請求項１６に記載の粒子。
【請求項１８】
前記高分子電解質材料が複数の層を備える、請求項１〜１７のいずれかに記載の粒子。
【請求項１９】
前記複数の層が、交互の層にポリアニオンおよびポリカチオンを含む、請求項１８に記載の粒子。
【請求項２０】
前記コアがマクロ孔質であり、そして前記高分子電解質の複数の層の各々が、該マクロ孔質のコアに浸透し得る分子量を有する、請求項１９に記載の粒子。
【請求項２１】
前記複数の層が磁性の層を備える、請求項１８に記載の粒子。
【請求項２２】
溶液中にある請求項１〜２１のいずれかに記載の粒子であって、該溶液が、カチオンイオン交換材料またはアニオンイオン交換材料を含む、粒子。
【請求項２３】
前記カチオンイオン交換材料または前記アニオンイオン交換材料が、前記粒子と混床を形成する、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２４】
前記カチオンイオン交換材料と前記アニオンイオン交換材料とが、化学量論的に当量で存在する、請求項２３に記載の溶液。
【請求項２５】
非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項２２に記載の溶液。
【請求項２６】
前記非イオン性界面活性剤が、取り込まれていないダイターミネーターの、ＤＮＡ配列決定反応物からの除去を促進するように適合されている、請求項２５に記載の溶液。
【請求項２７】
前記非イオン性界面活性剤が、加熱することなく活性化可能である、請求項２６に記載の溶液。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれかに記載の粒子または溶液を使用するための方法であって、該方法は、以下：
複数の粒子を提供する工程；および
ＰＣＲ反応生成物を接触させて、ｄｓＤＮＡフラグメントを分離する工程、またはＤＮＡ配列決定反応生成物を接触させて、色素標識化ｓｓＤＮＡフラグメントを分離する工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記複数の粒子を単離する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
単離する工程が、前記複数の粒子に力を適用する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記力が、遠心力、重力、磁力、および浮力のうちの少なくとも１つを包含する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の粒子が第一の体積を含み、前記ＰＣＲ反応生成物またはＤＮＡ配列決定反応生成物が第二の体積を含み、そして該第一の体積が該第二の体積以上である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記複数の粒子を固定位置に配置する工程をさらに包含する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記固定位置が、カラムまたはコーティングである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記溶液から、キャピラリー電気泳動のためにサンプルをローディングする工程をさらに包含する、請求項２８〜３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルをローディングする工程が、サンプル注入位置を変更する工程を包含する、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（分野）
本教示は、イオン交換技術を用いてサンプルを濾過および／または精製するための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または配列決定反応から得られた反応生成物の精製は、その後の、下流の処理に関する多くの課題を提示し得る。不純物は、その後の処理工程にアーチファクトを引き起こし得る。アーチファクトを排除するための多くの精製工程は、面倒かつ非効率的であり得る。プライマー、取り込まれていないヌクレオチド、プライマーダイマー、小さなＤＮＡフラグメントを捕獲すること、ならびに一部の場合、ＰＣＲ生成物を脱塩することが所望され得る。プライマー、色素標識化プライマー、ヌクレオチド、色素標識化ヌクレオチド、ジデオキシヌクレオチド、および色素標識化ジデオキシヌクレオチドを捕獲すること、ならびにＤＮＡ配列決定反応生成物を脱塩することが所望され得る。従来の精製技術に関するこれらの問題および他の問題に対処する分離に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（要旨）
種々の実施形態によると、本教示は、イオン交換材料を含むコアおよび高分子電解質材料を含むコーティングを含む粒子を提供する。ここで、上記コアおよびコーティングは、ＰＣＲ反応生成物を分離するように適合されている。種々の実施形態によると、本教示は、ＰＣＲ反応生成物を精製するための方法を提供する。この方法は、複数の粒子を提供する工程（ここで、各粒子は、イオン交換のためのコアおよび高分子電解質のコーティングを含む）、ならびにＰＣＲ反応生成物を接触させて、ｄｓＤＮＡフラグメントを分離する工程を包含する。
【０００４】
種々の実施形態によると、本教示は、イオン交換材料を含むコアおよび高分子電解質材料を含むコーティングを含む粒子を提供する。ここで、上記コアおよびコーティングは、ＤＮＡ配列決定反応生成物を分離するように適合されている。種々の実施形態によると、本教示は、ＤＮＡ配列決定反応生成物を精製するための方法を提供する。この方法は、複数の粒子を提供する工程（ここで、各粒子は、イオン交換のためのコアおよび高分子電解質のコーティングを含む）、ならびにＤＮＡ配列決定反応生成物を接触させて、色素標識化ｓｓＤＮＡフラグメントを分離する工程を包含する。
【０００５】
種々の実施形態によると、本教示は、粒子を形成するための方法を提供する。この方法は、ＰＣＲ反応生成物およびＤＮＡ配列決定反応生成物のうちの少なくとも１つを分離するように適合されたコア材料および高分子電解質材料を選択する工程、イオン交換材料を含むコアを提供する工程、ならびに高分子電解質材料でこのコアをコーティングする工程、を包含する。種々の実施形態によると、本教示は、高分子電解質材料を含む組成物を提供する。ここで、この高分子電解質材料は、イオン交換材料をコーティングすることのため、およびＰＣＲ反応生成物またはＤＮＡ配列決定反応生成物のうちの少なくとも１つの分離を提供することのために適合されている。種々の実施形態によると、本教示は、生物学的分離のためのシステムを提供する。このシステムは、高分子電解質材料を備える。ここで、この高分子電解質材料は、イオン交換材料をコーティングすること、およびＰＣＲ反応生成物またはＤＮＡ配列決定反応生成物のうちの少なくとも１つの分離のためのふるいを提供することのために適合されている。
【０００６】
種々の実施形態のさらなる特徴および利点は、一部は以下の記載に示され、そして一部は、この記載から明らかであるか、あるいは種々の実施形態の実施によって習得され得る。種々の実施形態の目的および他の利点は、本明細書における記載および添付の特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせによって理解され、そして達成される。
【０００７】
図面は、一定の比率に縮尺を合わせて描かれていないことが理解されるべきである。さらに、図面中の対象の間での関係は、一定の比率に縮尺を合わせていなくてもよく、実際、サイズに関して逆の関係を有し得る。図面は、示される各対象の構造に対する理解および明確さをもたらすように意図される。したがって、構造の特定の特徴を示すために、いくつかの特徴が強調され得る。
【０００８】
上記の一般的な説明および下記の詳細な説明の両方は、ただの例示および説明であり、そして本教示の種々の実施形態の説明を提供することを意図していることが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（種々の実施形態の説明）
本明細書において使用される節の表題は、構成目的のみのためであり、そして記載される対象を限定するものとして解釈されるべきではない。本出願において引用される全ての文献（特許、特許出願、論文、書籍、および学術論文が挙げられるが、これらに限定されない）は、任意の目的のために、それらの全体が明確に参考として援用される。
【００１０】
本明細書中で使用される場合、用語「粒子」とは、液体、固体、および／またはガスから作られた、コーティングされ得るイオン交換材料をいう。このコーティングは、粒子の外面全体またはそれらの実質的な部分を被覆し得る。このコーティングは、粒子の内表面の部分を被覆し得る。このコーティングは、不可逆的に、粒子を永久的にコーティングし得るか、または可逆的に、コーティングの溶解により粒子を放出し得る。粒子は、単一材料であっても材料の凝集体であってもよく、この凝集体は、例えば、融合、焼結、プレッシング、圧縮、層分離、沈殿、凝集、および合体によって調製され得るか、または別の方法で一緒に形成され得る。粒子は、規則的または不規則な任意の形状（例えば、球形、楕円形、三角形、円筒形など）を有し得る。
【００１１】
本明細書中で使用される場合、用語「材料」とは、分子レベルまたはバルク状の任意の物質をいい、そして液体および／または固体（例えば、乳濁液または樹脂）であり得る。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、用語「孔サイズ」とは、平均測定値をいい、この孔サイズより大きい粒子は、この粒子の内部に浸透する可能性がより低いが、より小さな粒子は、この粒子の内部に浸透する可能性がより高いという指針を提供する。孔に収容される粒子または孔からそらされる粒子は、正確に所与の「孔サイズ」である必要がないことが、理解されるべきである。つまり、この孔への収容またはこの孔からの排除は、多くの要因に基づく（実際の孔サイズ（コアの各孔は、異なるサイズを有し得る）、立体障害の要因、イオン性引力、分極などが挙げられる）。さらに、いくつかの粒子(例えば、細孔ゲル型のイオン交換材料）は、規定された孔を有さない。この粒子は、サイズ排除限界を規定するゲルマトリックス内の分子間の間隔によって規定される「孔サイズ」を有する。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、用語「イオン交換」とは、イオン交換表面に「結合」または「捕獲」され得る各々の電荷等価物が、適切な溶液中に等価な電荷を放出し得るプロセスをいう。このイオン交換コアからの対イオンの移動は、サンプル溶液中に多くの対イオンを放出し得る。イオン交換コアの選択性は、イオン交換コアの対イオンに対してよりもサンプル溶液から除去されるべきイオンに対してより大きくあり得る。対イオンと同様の親和性のイオンは、イオン交換体に対するこのイオンの相対的な親和性に基づいて平衡分布を確立する。この平衡は、溶液からのイオンの取り込みを、提供してもまたは提供しなくても、いずれでもよい。対イオンは、ほとんど全てのイオン（塩化物、水酸化物、アセテート、ホルメート、臭化物、サルフェート、ニトレート、ホスフェート、または任意の他の有機アニオンもしくは無機アニオンが挙げられる）であり得る。対イオンの選択は、溶液中における除去されるべきイオンの性質によって影響され得る。イオン交換コアに対して、溶液中のイオンと比較して非常に低い親和性を有する対イオンが選択され得、したがって、溶液中のイオンとの交換を提供する。混床中のカチオン交換樹脂を用いた中和は、溶液からのイオンの取り込みを駆動し得る。これは、樹脂に対するカチオンの親和性が対イオンについての親和性よりも低い場合でさえ、そうであり得る。上記でアニオン交換粒子の使用を記載したが、本教示は、カチオン交換粒子についても同様である。カチオン交換粒子に対する対イオンとしては、ヒドロニウム、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、または任意の他の有機カチオンもしくは無機カチオンが挙げられる。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、任意のイオン形態で調製され得る。
【００１４】
用語「混合物」とは、本明細書中で用いられる場合、例えば、充填カラム、混床、均質床、流動床、連続フローの固定カラム、またはバッチ混合物で一緒に用いられる１より多い高分子電解質コーティングされた粒子を指す。混合物としては、高分子電解質コーティングされたカチオン交換粒子、高分子電解質コーティングされたアニオン交換粒子、コーティングされていないカチオン交換粒子、コーティングされていないアニオン交換粒子、不活性物、またはこれらの任意の組み合わせが挙げられ得る。混合物は、分離の分野で公知の任意の物理学的構成、およびイオン交換の分野で公知の任意の化学的混合物を包含し得る。混合物は、任意の割合（化学量論的等価量が挙げられる）であり得る。粒子の混合物は、その溶液の脱塩によってサイズベースの除去を提供し得る。例は、ヒドロニウム形態のカチオン交換粒子を含む混床中の、水酸化物形態の高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子である。粒子の混合物は、その溶液の脱塩なしに小イオンのサイズベースの除去を提供する。例は、高分子電解質コーティングされた塩化物形態もしくは酢酸塩形態（または水酸化物以外の任意の他のアニオン）のイオン交換粒子、およびカチオン交換しない材料である。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子に対して用いられる対イオンの形態の選択は、それらが意図される適用に基づき得る。
【００１５】
用語「コーティング」およびその文法的なバリエーションは、本明細書中で用いられる場合、粒子を覆っている、同じ電荷を有する高分子電解質の単層に満たないもの、単層、または多層、あるいは反対の電荷を有する様々な高分子電解質の多層を指す。例えば、無機緩衝イオンおよびヌクレオチドのようなより小さい分子は、コーティングに浸透（ｐｅｎｅｔｒａｔｅ）もしくは透過（ｐｅｒｍｅａｔｅ）し得、そしてその粒子によって保持され得るかまたはその粒子によってイオン交換され得る。コーティングは、例えば、核酸のようなより大きい分子がそのコーティングを浸透もしくは透過し、粒子に達することを妨げ得る。
【００１６】
用語「ポリマー」、「重合」、「重合する」、「架橋生成物」、「架橋」、「架橋する」および他の同様の用語は、本明細書で用いられる場合、重合生成物と重合方法、および架橋生成物と架橋方法の両方を包含することが意味され、ここで、得られた生成物は、例えば、直鎖状ポリマーとは対照的に、三次元構造を有する。用語「ポリマー」とはまた、オリゴマー、ホモポリマー、およびコポリマーを指す。重合は、熱的に、光化学的に、イオン的に、またはポリマー化学の分野の当業者に公知の任意の他の手段によって開始され得る。種々の実施形態に従って、重合は、縮合（または逐次）重合、開環重合、高エネルギー電子ビームで開始される重合、フリーラジカル重合（原子移動ラジカル付加（ＡＴＲＡ）重合、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合、または任意の他のリビングフリーラジカル重合を含む）であり得る。
【００１７】
接頭語「（メト）アクリル」とは、本明細書で用いられる場合、メタクリルおよびアクリルを指す。例えば、Ｎ−メチル（メト）アクリルアミドとは、Ｎ−メチルメタクリルアミドおよびＮ−メチルアクリルアミドを指し、２−ヒドロキシエチル（メト）アクリレートとは、２−ヒドロキシエチルメタクリレートおよび２−ヒドロキシエチルアクリレートを指す。
【００１８】
用語「ＤＮＡ」とは、本明細書で用いられる場合、任意の核酸（ＲＮＡ、ＰＮＡおよび分子生物学の分野の当業者に理解されるような他のものを含む）を指す。
【００１９】
種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、例えば、生体分子の分離における用途のような多くの用途を有し得る。種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、大分子が粒子のイオン交換活性部位と相互作用する能力を制限することによって、生体分子の分離を提供し得る。高分子電解質コーティングされた粒子に浸透し得る小分子（低分子）は、イオン交換活性部位と相互作用し得、そしてそれらの部位に保持され得る。より大きく高荷電の種は、コア粒子をコーティングするかまたはコア粒子の孔径によって、そのイオン交換コアと相互作用することが制限され得る。このようにより大きく高電荷の種は、イオン交換粒子と結合せずに溶液中にとどまり得る。溶液中にとどまるより大きい種は、分離され得る。より大きい分子は、コーティング上で固定されない。種々の実施形態に従って、小分子は、高分子電解質コーティングされた粒子から溶出され得る。種々の実施形態に従って、大分子としては、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）フラグメントおよび二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）フラグメントが挙げられ得、そして小分子としては、ヌクレオチド、ｓｓＤＮＡの短いフラグメト、ｄｓＤＮＡの短いフラグメト、および小イオン（例えば、塩化物、酢酸塩、および界面活性剤）が挙げられ得る。
【００２０】
種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、イオン交換コアを過剰の高分子電解質に曝露することによって提供され得る。そのコア表面は、高分子電解質コーティングされた状態になり得る。高分子電解質は、生体高分子（天然に存在する生体高分子（例えば、ＤＮＡ）が挙げられる）、または本明細書中に記載されるような合成ポリマーであり得る。
【００２１】
種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、イオン交換コアをそのコアの電荷と反対の電荷を含む高分子電解質に曝露することによって提供され得る。第１の高分子電解質のコーティングの後、そのコーティングされた粒子は、その第１の高分子電解質の電荷と反対の電荷を含む別の高分子電解質に曝露される。このコーティングプロセスは、ポリアニオンおよびポリカチオンの交互の多層を有する高分子電解質コーティングされた粒子を提供するために、繰り返され得る。
【００２２】
種々の実施形態に従って、高分子電解質を含むコーティングは、サイズふるい効果によって、大分子（ｓｓＤＮＡが挙げられる）とコアとの相互作用を減少させ得る。コーティングは、イオン交換コアの外面を覆い、その大分子とその表面との相互作用を減少させ得る。コーティングは、コア粒子の内部への大分子の浸透を減少させるサイズ排除障壁を生じ得る。高分子電解質の化学的特性は、その高分子電解質コーティングされた粒子が示すふるい特性を決定し得る。高分子電解質の特性（例えば、電荷、電荷密度、疎水性、立体規則性（ｔａｃｔｉｌｉｔｙ）、フレキシビリティー、コポリマーおよびターポリマーで使用されるモノマー単位の比、ならびに分子量）はすべて、所望のふるい特徴を提供するために改変され得る。種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングは、所望の物理的特性およびサイズ排除特徴を得るために、後の工程で架橋され得る。
【００２３】
種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、そのイオン交換コアの固有の多孔性を利用することによって、サイズ排除型イオン交換体として機能し得る。イオン交換コアは、広範な孔径（例えば、５オングストローム（細孔）および１０００オングストローム以上（マクロ孔））で得られ得る。イオン交換コアは、そのコアがその適用の要件に基づいて所定のサイズの分子を排除するように、孔径に基づいて選択され得る。種々の実施形態に従って、電解質コーティングは、そのイオン交換コアの孔から排除されるのに十分大きくあり得、それによって、孔の内側のコーティングを実質的に減少させて外側の面をコーティングする。高分子電解質コーティングは、表面のイオン交換部位の相当な量をブロックすることによって、大分子（例えば、ｓｓＤＮＡ）とイオン交換コアの表面との相互作用を減少させ得る。イオン交換コアビーズの孔径は、大分子（例えば、ｓｓＤＮＡ）のコアの孔への浸透、および大分子とコアイオン交換部位との相互作用を減少させるのに十分小さくあり得る。種々の実施形態に従って、表面イオン交換部位は実質的にブロックされ得、そして内部イオン交換部位は接近しにくくなり得、その結果、高分子電解質コーティングされた粒子が著しく少ない大分子（例えば、ｄｓＤＮＡ）を保持し得る。対照的に、より小さいイオン（例えば、塩化物、酢酸塩、リン酸塩、ピロリン酸塩、小さいオリゴヌクレオチド、およびヌクレオチド）は、イオン交換コアの孔に入り、内側のイオン交換部位と相互作用し得る。コーティングは、大分子と同様に、小イオンと表面のイオン交換部位との相互作用を減少させ得る。なぜなら、その表面部位は高分子電解質コーティングに占有されるからである。結果として生じるこのような高分子電解質コーティングされた粒子の（小イオンに対する）イオン交換能力は、裸のイオン交換コアの作業能力から、そのコアの表面の作業能力を減算したものに等しい。粒子の内側の孔は、表面のイオン交換部位が高分子電解質コーティングに占有された後に、高分子電解質コーティングされた粒子の実質的なイオン交換能力を提供する。
【００２４】
種々の実施形態に従って、コーティングは、イオン交換コア上で形成され得、その結果、そのコーティングは等価な単層に満たない厚さから多層の厚さを有する。コーティングの厚さは、イオン交換コアの表面で変わり得るか、またはコーティングの厚さは、イオン交換コアの全表面で均一であり得る。種々の実施形態に従って、コーティングは、少なくとも部分的にイオン交換コアを覆い得る。コーティング材料は、少なくとも部分的に、イオン交換コアの１以上の孔または表面の特徴（例えば、孔、クラック、クレバス、ピット、チャネル、穴、凹部、溝）を満たし得る。例えば、イオン交換コアは、すべての内面および外面で、コーティングを形成するのに適切な高分子電解質でコーティングされ得る。
【００２５】
種々の実施形態に従って、図１は、生体高分子３００からなる高分子電解質層２０でコーティングされた、孔３２を有するイオン交換コア１２を備え得る高分子電解質コーティングされた粒子３０を示す。図２は、合成ポリマー３１０からなる高分子電解質層２０でコーティングされた、孔３２を有するイオン交換コア１２を備え得る高分子電解質コーティングされた粒子３０を示す。小イオン性粒子（示さず）は、アニオン交換コアの場合のように、ふるいにかけられ、そして／または孔３２に入って正電荷で示されるイオン交換部位に結合し得る。高分子電解質コーティングは、イオン交換コアに結合する大きいｓｓＤＮＡフラグメトで示される大分子の量を、実質的に減少させ得る。
【００２６】
種々の実施形態に従って、イオン交換コアは、アニオン性材料またはカチオン性材料であり得る。イオン交換コアは、ポリマー、架橋ポリマーまたは無機材料（例えば、シリカ)であり得る。イオン交換コアは、イオン交換し得る固体コア材料、またはイオン交換樹脂で処理された固体コア材料であり得る。イオン交換コアは表面が活性化され得る。イオン交換コアは、非磁性、常磁性または磁性であり得る。例示的なイオン交換コア材料としては、以下に列挙されるものが挙げられる。
【００２７】
種々の実施形態に従って、コアのためのイオン交換材料としては、アニオン交換樹脂（例えば、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ２５Ｑ、Ａｍｉｎｅｘ  Ａ−２７、ＡＧ  １−Ｘ２、ＡＧ  １−Ｘ４、ＡＧ  １−Ｘ８およびＡＧ  ２−Ｘ８（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＢＧ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂａｌａ  Ｃｙｎｗｙｄ，ＰＡ，ＵＳＡ）、ＰＯＲＯＳ  ＨＱ  ２０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＣＡ０８ＹおよびＣＡ０８Ｓ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｗｈｉｔｅ  Ｐｌａｉｎｓ，ＮＹ，ＵＳＡ）、Ｐｏｗｄｅｘ  ＰＡＯ（Ｇｒａｖｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＤＥ，ＵＳＡ）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ＳＢ（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＩＥ  １−Ｘ８（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）、Ｓｕｐｅｒ  Ｑ−６５０Ｓ（ＴｏｓｏＨａａｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）、ＴＭＡＨＰ−１００（Ｉｏｎｔｏｓｏｒｂ  ＡＶ，Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ)、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＢＡ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）、ならびにＡＮＥＸ−ＱＳ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））が挙げられ得る。種々の実施形態に従って、コア材料としては、ＰＭＭＡ、ＰＳ−ＤＶＢ、シリカ、および／またはセルロースが挙げられ得る。種々の実施形態に従って、イオン交換コアとしては、製造業者によって提供されるアニオン交換樹脂についてのコアと同様に、カチオン交換樹脂が挙げられる（Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）、ＡＧ  ５０ＷＸ８およびＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる）。イオン交換コアとして使用され得る他のカチオン樹脂およびアニオン樹脂は、イオン交換樹脂の分野の当業者に明らかである。
【００２８】
イオン交換コアがイオン交換し得る固体コア材料を包含する種々の実施形態に従って、その固体コア材料は、多孔性シリカ、制御孔ガラス（ＣＰＧ）、内孔を有する多孔性ポリマーミクロスフェア、イオン交換分離の分野の当業者に公知であるような他の多孔性材料、またはそれらの組み合わせであり得る。固体コア材料は、種々の表面特徴（例えば、孔、クラック、クレバス、ピット、チャネル、穴、凹部、または溝が挙げられる）を有し得る。固体コア材料は、酸化ナトリウム、二酸化シリコン、ホウ酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせを含み得る。固体コア材料は、イオン交換し得るように表面が活性化（例えば、カチオン交換またはアニオン交換し得るように改変）され得る。固体コア材料の改変としては、固体コア材料の表面にカチオン性置換基またはアニオン性置換基を形成するための固体コア材料の処理が挙げられ得る。本明細書で用いられる場合、用語「表面」は、外面および／または内面を包含し得る。内面は、例えば、固体コア材料内の空隙または孔の表面であり得る。固体コア材料は、その固体コア材料の表面に１以上の四級化官能基、カルボン酸基、スルホン酸、イオン交換分離の分野の当業者に公知の他のカチオン性官能基またはアニオン性官能基、あるいはこれらの組み合わせを含むように表面が活性化され得る。
【００２９】
種々の実施形態に従って、生体高分子の高分子電解質は、ＤＮＡのような天然に存在する生体高分子であり得る。天然に存在するＤＮＡの例としては、断片化サケ精子ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡの制限消化物、ニシン精子ＤＮＡ、仔ウシ胸腺ＤＮＡおよび他の天然由来のＤＮＡが挙げられる。市販のＤＮＡの例は、せん断サケ精子ＤＮＡ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）である。種々の実施形態に従って、コーティング中で高分子電解質として使用され得る天然に存在する生体高分子ＤＮＡは、その供給源が生物学的反応に供されたサンプルではないことを示すために非サンプルＤＮＡとして区別される。
【００３０】
種々の実施形態に従って、イオン交換コアは、合成ポリマー高分子電解質でコーティングされ得る。種々の実施形態に従って、イオン交換コアは、水溶性のポリアニオンもしくは少なくともわずかに水溶性のポリアニオンでコーティングされ得る。種々の実施形態に従って、アニオン性官能基を含むポリアニオンがコーティングのために使用され得る。アニオン性官能基としては、カルボキシル基、ホウ素基、スルホン酸基、スルフィン基、リン酸基、またはリン基、あるいはそれらの組み合わせが挙げられ得る。無機酸官能基を含むポリアニオンもまた使用され得る。種々の実施形態に従って、水溶性のポリアニオンもしくは少なくともわずかに水溶性のポリアニオンは、酸含有モノマーまたはフェノール含有モノマー（例えば、アクリル酸、メタクリル酸、加水分解されてフェノール基を与え得る４−アセトキシスチレン、４−スチレンスルホン酸、酢酸スチリル、または無水マレイン酸）と、水溶性のコモノマー、少なくともわずかに水溶性のコモノマーもしくは水不溶性のコモノマーとの共重合によって調製され得る。種々の実施形態に従って、合成ポリマーは、ホモポリマー、コポリマー、ターポリマーまたは別のポリマーであり得る。
【００３１】
種々の実施形態に従って、合成ポリマーは、以下のモノマーを含み得る：（メト）アクリルアミド、Ｎ−メチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メチル）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−イソ−プロピル（メト）アクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチル（メト）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−ヒドロキシメチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−（３−ヒドロキシプロピル）（メチ）アクリルアミド、Ｎ−ビニルホルムアミド、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−ビニルアセトアミド、重合後に加水分解されてビニルアルコールを与え得る酢酸ビニル、２−ヒドロキシエチル（メト）アクリレート、３−ヒドロキシプロピル（メト）アクリレート、Ｎ−ビニルピロリドン、ポリ（エチレンオキシド）（メチ）アクリレート、Ｎ−（メト）アクリルオキシスクシンイミド、Ｎ−（メト）アクリロイルモルホリン、Ｎ−２，２，２−トリフルオロエチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−アミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−アセトアミド（メト）アクリルアミド、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル（メト）アクリルアミド、Ｎ−（メチル）アクリロイルトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミド、（メチル）アクリロイル尿素、ビニルオキサゾリドン、ビニルメチルオキサゾリドン、またはそれらの組み合わせ。種々の実施形態に従って、合成ポリマー高分子電解質は、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）またはポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド−ｃｏ−スチレンスルホン酸）であり得る。
【００３２】
種々の実施形態に従って、イオン交換は、水溶性のポリカチオンもしくは少なくともわずかに水溶性のポリカチオンでコーティングされ得る。種々の実施形態に従って、カチオン性官能基を含むポリカチオンがコーティングのために使用され得る。カチオン性官能基としては、プロトン化第一級アミン、プロトン化第二級アミンおよびプロトン化第三級アミンが挙げられ得る。種々の実施形態に従って、水溶性のポリカチオンもしくは少なくともわずかに水溶性のポリカチオンは、正に荷電したモノマーと、水溶性のコモノマー、少なくともわずかに水溶性のコモノマーもしくは水不溶性のコモノマーとの共重合によって調製され得る。ポリカチオンの例としては、アリルアミンヒドロクロリド、（３−アクリルアミドプロピル）トリスメチル塩化アンモニウム、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリド、および加水分解されてアミノ基を与え得るＮ−ビニルアミドが挙げられ得る。種々の実施形態に従って、合成ポリマーは、ポリ（Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）であり得る。
【００３３】
種々の実施形態に従って、図２ａは、モノマーサブユニットを示し、それらに対する合成ポリマーが列挙される。略語としては、アクリル酸（ＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡｍ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、（ポリエチレンオキシド）モノアクリレート（ＰＥＯアクリレート）およびスルホン酸ビニル（ＶＳＡ）が挙げられる。種々の実施形態に従って、合成ポリマーの調製は、５０キロダルトン〜１５．０メガダルトン、または２００キロダルトン〜４．０メガダルトン、または５００キロダルトン〜３．０メガダルトンの範囲の重量平均分子量（Ｍｗ）を提供し得る。種々の実施形態に従って、負もしくは正に荷電したコモノマーのモル百分率は、０．０１パーセント〜１００パーセント、または０．１パーセント〜２０．０パーセント、または１．０パーセント〜１０．０パーセントを提供し得る。
【００３４】
種々の実施形態に従って、他の合成ポリマーとしては、スチレンスルホン酸のホモポリマー、アクリル酸、メタクリル酸、スルホン酸ビニル、スチレンスルホン酸、４−アセトキシスチレン（４−ヒドロキシスチレンの前駆体）およびホスホン酸ビニルのホモポリマーならびにコポリマーが挙げられ得る。種々の実施形態に従って、他の合成ポリマーとしてとしては、アリルアミンヒドロクロリド、（３−アクリルアミドプロピル）トリメチル塩化アンモニウム、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミドヒドロクロリドのホモポリマーおよびコポリマーが挙げられ得る。コモノマーとしては、アクリルアミド、メタクリルアミド、後の工程でビニルアルコールに変換され得る酢酸ビニル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ビニル−Ｎ−メチルアセトアミド、２−ヒドロキシエチルアクリレートおよびビニルメチルエーテルが挙げられ得る。
【００３５】
種々の実施形態に従って、高分子電解質としては、ポリアニオン（例えば、ポリ（スチレンリン酸）、ポリ（リン酸）、マレイン酸、その誘導体などのホモポリマーおよびコポリマー、フマル酸、その誘導体などのホモポリマーおよびコポリマー、ペプチド型合成ポリアニオン（例えば、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（ガラクトロン酸）、ポリ（グルタミン酸））、核酸型合成ポリアニオン（例えば、ポリ（アデニル酸）、ポリ（イノシン酸）、ポリ（ウリジリン酸））、ならびに天然のポリアニオン（例えば、多糖類））が挙げられ得る。
【００３６】
種々の実施形態に従って、イオン交換コアは、多層の高分子電解質でコーティングされ得る。高分子電解質層としては、ポリアニオンとポリカチオンとの交互層が挙げられ得る。このような交互層は、強度耐久性およびコーティングの透過性を調整するための手段を提供し得る。その多層構造の最も外側の高分子電解質が負に荷電しているならば、ＤＮＡフラグメントはその溶液から固定されない。例えば、塩化物およびプライマーのような小アニオンは、多層構造に浸透もしくは透過して、そのコアに結合され得る。
【００３７】
種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、混合物として提供され得る。この混合物は、吸着床またはカラムに取り込まれ得る。種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、バルク形態で提供され得る。十分に形成された高分子電解質コーティングされた粒子のクロマトグラフ床は必ずしも必要ではない。
【００３８】
種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子は、デバイスに提供され得る。デバイスは、１以上の経路を有する微小流体デバイスであり得、ここで、少なくとも１つの経路の少なくとも一部分は、高分子電解質コーティングされた粒子を含む。デバイスは、高分子電解質コーティングされた粒子と流体連絡する入口および出口を有し得る。この粒子は、例えば、カラム中に存在し得る。本明細書中で用いられる場合、カラムは、水平方向または垂直方向、あるいは水平方向と垂直方向との間の任意の位置であり得る。カラムとしては、キャビティ、チャンバ、レザバ、ウェル、反応領域、吸着床、凹部のようなレセプタクル、あるいは高分子電解質コーティングされた粒子および反応生成物を収容するかもしくは保持するのに適切な他のレセプタクルが挙げられ得る。カラムは、複数の高分子電解質コーティングされた粒子を含み得る。デバイスの出口は、レセプタクル（例えば、きれいにされたサンプルウェル、チューブ、ガラスプレート、または精製されたサンプルを収集する別の手段）と流体連絡し得る。種々の実施形態に従って、複数の高分子電解質コーティング粒子は、混合物であり得る。
【００３９】
種々の実施形態に従って、反応生成物を分離するためのデバイスが提供され得る。デバイスは、高分子電解質コーティング粒子の混合物を備え得る。この方法は、粒子をデバイスのカラムに添加する工程を包含し得る。反応生成物は、デバイスの入口に置かれるかまたはデバイスの入口に入れられ得る。反応生成物は、入口から高分子電解質コーティングされた粒子および任意の追加材料を含むカラムを通って移動し得る。サンプルは、サイズ排除分離およびイオン交換の組み合わせに供され得、反応生成物の濾過および／または精製を生じ得る。濾過および／または精製された溶液は、出口を通ってカラムから溶出または除去され得、分析および／またはさらなる処理のためにレセプタクルに指向され得る。反応生成物は、求心力によってカラムを進み得る。種々の実施形態に従って、複数の高分子電解質コーティング粒子は、反応生成物と大量に混合され得る。複数の高分子電解質コーティング粒子は第１の容積を形成し、反応生成物が第２の容積を形成し、ここで、第１の容積は第２の容積以下である。
【００４０】
種々の実施形態に従って、高分子電解質コーティングされた粒子を用いる反応生成物の分離は、適切なイオン交換能力（例えば、反応生成物のうちの少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％のイオン交換）を提供するのに十分な、一定容積の高分子電解質コーティング粒子を用いて達成され得る。分離は、１０分以下、５分以下、または２分以下で生じ得る。分離は、反応生成物と高分子電解質コーティングされた粒子とを、その高分子電解質コーティングされた粒子が反応生成物とイオン交換されるのに十分な一定期間の間接触させる工程、およびその高分子電解質コーティングされた粒子から精製された反応生成物を取り出す工程を包含し得る。
【００４１】
種々の実施形態に従って、粒子から精製された反応生成物を取り出す工程は、高分子電解質コーティングされた粒子から精製された反応生成物を取り出す工程、その精製された反応生成物から粒子を除去する工程、および／または粒子と精製された反応生成物との混合物から精製された反応生成物をサンプリングする工程を包含し得る。粒子と精製された反応生成物との混合物から精製された反応生成物をサンプリングする工程の例としては、キャピラリーを直接チューブに液浸させ、さらなる分析のために機器に注入することによってチューブ中の生成物を分析する工程が挙げられ得る。
【００４２】
種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされた粒子に関する分離としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の分離、ＤＮＡ配列決定反応混合物の分離、およびＲＮＡの精製が挙げられ得る。高分子電解質コーティングされた粒子はまた、例えば、オリゴヌクレオチド、リガーゼ連鎖反応生成物、タンパク質、抗体結合反応生成物、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ生成物、ハイブリダイゼーション生成物および抗体の、精製および／または分離のために使用され得る。高分子電解質コーティングされた粒子はまた、生物学的な生成物または反応混合物の脱塩のために使用され得る。
【００４３】
種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされた粒子の選択性は、以下の基準の少なくとも１つに依存し得る：（１）コーティング中の高分子電解質の分子量、（２）荷電した官能基の化学的性質、およびコーティング中の高分子電解質の電荷密度またはモルパーセント、（３）イオン交換コアの孔のサイズ、（４）コーティングポリマー中のコモノマーの性質、ならびに（５）ポリマー中の種々のコモノマーの割合。各分離は、上記の基準の少なくとも一つに関する種々の所望の特徴を提供し得る。
【００４４】
種々の実施形態によると、ＰＣＲ生成物は、下流の分析を妨害し得る物質を含む。ＰＣＲ生成物は、増幅された標的配列（アンプリコン）、緩衝液の塩、界面活性剤、金属イオン、酵素（例えば、ポリメラーゼ）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー、および溶液中の他の成分を含み得る。種々の実施形態によると、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の標的配列は、分析され得るか、または他のＰＣＲ生成物の少なくともいくつかに対して感受性であり得るその後の酵素反応に使用され得る。例えば、遊離のヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドプライマーは、下流の酵素反応を妨害し得る。種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされた粒子は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマーおよび緩衝液の塩を、ｄｓＤＮＡの標的配列から分離し得る。得られた溶液は、脱塩環境中に精製されたＰＣＲ生成物を含み得、そして下流の反応および分析に使用され得る。
【００４５】
種々の実施形態によると、ＰＣＲ精製は、より大きな二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を、より小さなｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡ（例えば、プライマーダイマー、所望されない副反応生成物（これはｄｓＤＮＡである）、または他の非特異的に増幅されたフラグメント）、遊離ヌクレオチド、ならびに塩から分離することに関し得る。種々の実施形態によると、除去のためのＰＣＲ生成物は、ヌクレオチド、４５ヌクレオチドのｓｓＤＮＡを有するプライマー、６０ｂｐのｄｓＤＮＡを有するプライマーダイマー、および２００ｂｐより小さいｄｓＤＮＡフラグメントを含む。種々の実施形態によると、プライマー、プライマーダイマー、および１００ｂｐより小さいＤＮＡフラグメントは、高分子電解質コーティングされた粒子によって捕獲され得る。種々の実施形態によると、プライマー、プライマーダイマー、および３００ｂｐより小さいＤＮＡフラグメントは、高分子電解質コーティングされた粒子によって捕獲され得る。
【００４６】
種々の実施形態によると、他のＰＣＲ生成物由来のより大きなｄｓＤＮＡの分離は、脱塩を包含し得る。種々の実施形態によると、他のＰＣＲ生成物由来のより大きなｄｓＤＮＡの分離は、脱塩を包含しない。脱塩が下流のプロセス（例えば、より大きなｄｓＤＮＡのＰＣＲ生成物の分離および検出）を妨害する環境が存在する。
【００４７】
種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされた粒子は、ＰＣＲ終了および精製の前のＰＣＲ反応物と同じＰＣＲ条件に供され得る。高分子電解質コーティングされた粒子は、６５℃〜９５℃の温度サイクリングに供され得る。高分子電解質コーティングされた粒子は、ＰＣＲおよびその後の精製を提供するデバイスと抱き合わせにされ得る。
【００４８】
種々の実施形態によると、１００オングストローム〜２０００オングストロームの範囲の孔サイズを有し、１．０メガダルトン〜３．０メガダルトンの範囲のＭｗの高分子電解質でコーティングされたイオン交換コアが、ＰＣＲ精製を提供する。種々の実施形態によると、１０００オングストロームの孔サイズを有し、１．７メガダルトン〜２．６メガダルトンの範囲のＭｗの高分子電解質でコーティングされたイオン交換コアが、ＰＣＲ精製を提供する。
【００４９】
種々の実施形態によると、ＤＮＡ配列決定反応生成物は、下流の分析を妨害し得る物質を含み得る。配列決定反応生成物の精製のための分離の質は、以下の基準の少なくとも１つを分析することによって評価され得る：（１）配列決定データの上に重ね合わされた幅広いピークとして見える、残留色素のアーチファクト（「ブロブ（ｂｌｏｂ）」）、（２）大きなフラグメント間または小さなフラグメント間でのピーク強度のバランス、ならびに（３）配列決定反応生成物の脱塩。
【００５０】
種々の実施形態によると、ＤＮＡ配列決定反応生成物は、色素標識化標的配列（「配列決定ラダー」）、緩衝液の塩、リン酸イオンおよびピロリン酸イオン、金属イオン、酵素（例えば、ポリメラーゼ）、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプライマー、色素標的化オリゴヌクレオチドプライマー、および他の成分（例えば、残った、取り込まれていない色素標識化ジデオキシヌクレオチド（「ダイターミネーター」）を含み得る。種々の実施形態によると、色素標識化標的配列は、電気泳動分析およびＤＮＡ配列決定（「ベースコーリング（ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ）」）に供され得る。色素標識化標的配列は、他の配列決定反応生成物の少なくとも一部に感受性であり、「ベースコーリング」のエラーを引き起こし得る「ブロブ」を生じ得る。種々の実施形態によると、キャピラリーシークエンサーは、界面動電注入（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を使用して、電気泳動分離用の毛細管に配列決定反応生成物を導入し得る。配列決定反応生成物中の塩の存在は、毛細管中へのそれらの導入に影響を及ぼし得る（低い塩濃度は、毛細管への注入を向上させ得る）。
【００５１】
種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされた粒子は、配列決定反応生成物から「ブロブ」を生成する物質を除去し得、そして配列決定反応生成物を脱塩し得る。種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされた粒子によって精製された配列決定反応生成物は、１００μＭ以下の塩濃度または５０μＭ以下の塩濃度を有し得る。高分子電解質コーティングされた粒子によって精製されたサンプル溶液は、界面動電毛細管注入に適切であり得る。これらの目的および他の目的のため、高分子電解質コーティングされた粒子は、例えば、１０ヌクレオチドｓｓＤＮＡ未満のサイズ排除限界を有し得、そしてサンプル溶液から塩のような小さなイオンおよび色素標識化プライマーを除去し得る一方で溶液中にｓｓＤＮＡをそのまま残し得る。高分子電解質コーティングされた粒子を用いた配列決定反応物精製は、ｓｓＤＮＡ（例えば、１０ヌクレオチド〜１５００ヌクレオチド以上のサイズを有する）を、より小さな成分（例えば、色素標識化プライマーおよび塩など）から分離するために使用され得る。
【００５２】
種々の実施形態によると、ＤＮＡ配列決定反応生成物の分離は、プライマー、色素標識化プライマーおよび塩を、色素標識化ｓｓＤＮＡ標的から、４５ヌクレオチドより多くを有する色素標識化ｓｓＤＮＡフラグメントを実質的に順次排除することによって分離する工程を包含し得る。
【００５３】
種々の実施形態によると、配列決定反応サンプルの精製は、色素標識化ジデオキシヌクレオチドと塩とを、このような成分をコーティングに通過させてイオン交換コアと反応させることによって配列決定反応生成物から除去し得、濾過前の量に対して、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の量のｓｓＤＮＡ量を含む精製サンプルを残し得る。
【００５４】
種々の実施形態によると、５オングストローム〜１０００オングストロームの範囲の孔サイズを有し、１０００ダルトン〜６．０メガダルトンの範囲のＭｗの高分子電解質でコーティングされたイオン交換コアが、配列決定反応物の精製を提供する。種々の実施形態によると、１０オングストローム〜５０オングストロームの孔サイズを有し、２．４メガダルトン〜４．９メガダルトンのＭｗの高分子電解質でコーティングされたイオン交換コアが、配列決定反応物の精製を提供する。
【００５５】
種々の実施形態によると、ＤＮＡ配列決定反応生成物を精製するための方法は、複数の高分子電解質コーティングされた粒子を提供する工程、およびＤＮＡ配列決定反応生成物を接触させて、色素標識化ｓｓＤＮＡフラグメントを分離する工程を包含し得る。この方法は、残った色素アーチファクト（例えば、配列決定分析においてブロブを生じ得る色素標識化プライマー）を除去する工程を包含し得る。この方法は、色素標識化ｓｓＤＮＡフラグメントの長さを維持する工程を包含し得る。
【実施例】
【００５６】
（生体高分子によって粒子をコーティングする）
イオン交換樹脂を、１０００μＬの１Ｍ塩溶液、酸溶液もしくは塩基溶液で１００μＬの体積の樹脂を洗浄することによって、イオン交換体に変換した。この混合物を、５分間ボルテックスし、遠心分離機でスピンダウンした。上清を除去し、そして別の、塩溶液、酸溶液もしくは塩基溶液の１０００μＬアリコートを添加した。これを３回繰り返した。次いで、イオン交換コアを洗浄し、ＤＩ水の１０００μＬアリコートを用いて、５回スピンした。
【００５７】
イオン交換コアを、１ｍｇ／ｍＬせん断サケ精子ＤＮＡ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の１００μＬアリコートで繰り返し洗浄することによって、ＤＮＡでコーティングした。１００μＬ体積の樹脂を１００μＬの１ｍｇ／ｍＬせん断サケ精子ＤＮＡで洗浄することによって、コーティングを行った。この混合物を５分間ボルテックスし、そして遠心分離機でスピンダウンした。上清を除去し、そして別の１ｍｇ／ｍＬせん断サケ精子ＤＮＡの１００μＬアリコートを添加した。これを２回繰り返した。次いでＳＥＩＥ粒子を、ＤＩ水の１０００μＬアリコートを用いて３回洗浄し、スピンした。
【００５８】
（合成ポリマーによって粒子をコーティングする）
粒子をコーティングするためのポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）高分子電解質を、過硫酸アンモニウムを開始剤として用い、そしてＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミンを触媒として用いた、２００ｍＬのＤＩ水中、４５℃で１５時間の、０．３２ｇ（４．４４ｍｍｏｌ）のアクリル酸と８．０４ｇ（８１．０７ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドとのフリーラジカル重合によって提供した。得られたポリマーを、透析（５０Ｋ  ＭＷＣＯ）および凍結乾燥によって精製し、７．７０ｇ（９２％収率）のポリマーを提供した；Ｍｗ＝３．４０ＭＤａ、Ｍｎ＝２．６７ＭＤａ。
【００５９】
コーティングの前に、アニオン交換樹脂を最初に、前の実施例と同様の様式で、水酸化アニオン交換コアへと変換した。ＤＩ水の１０００μＬアリコートを、０．２０〜０．２５ｍＬ体積の塩化物形態のアニオン交換コアに添加した。この混合物を２分間ボルテックスし、そして遠心分離機でスピンダウンした。上清を除去し、そしてＤＩ水洗浄を２階繰り返した。２．０Ｍの水酸化アンモニウムの１０００μＬアリコートを、洗浄した樹脂に添加した。この混合物を２分間ボルテックスし、常温で５分間静置し、１分間ボルテックスし、そして遠心分離機でスピンダウンした。上清を除去し、そしてこの水酸化アンモニウム洗浄を２回繰り返した。ＤＩ水の１０００μＬのアリコートをイオン交換粒子のペレットに添加し、１分間ボルテックスし、遠心分離機でスピンダウンし、そして上清を除去した。この最後のＤＩ水洗浄をもう１回繰り返した。樹脂を、スナップキャップ付きポリプロピレン微量遠心管中で５００μＬのＤＩ水に再分散させ、使用前に冷蔵庫で保存した。
【００６０】
１５μＬ〜２０μＬの湿ったアニオン交換樹脂を含む１．５ｍＬ微量遠心管へ、１．０ｍＬのポリマー溶液（脱イオン水中の０．５重量％溶液）を添加した。これを１分間ボルテックスし、常温で５分間静置し、さらに１分間ボルテックスし、遠心分離機でスピンダウンし、そして上清を除去した。このポリマー溶液コーティングをもう１回繰り返した。次いで、このペレットを、１ｍＬのＤＩで洗浄し、そして３回スピンダウンした。最終の洗浄された樹脂を、５００μＬのＤＩ水に再分散させ、使用前に冷蔵庫で保存した。
【００６１】
あるいは、粒子をコーティングするためのポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）高分子電解質を不活性雰囲気（超純粋窒素）下での重合によって提供した。２インチのテフロン（登録商標）攪拌羽、パージ用ガラス製ブリーディング管、および水冷コンデンサを供える５００ｍＬの丸底３頚フラスコに、１５０．０ｍＬのＭｉｌｌｉ−Ｑ水、８．０１６０ｇ（８０．８６ｍｍｏｌ）の再蒸留したＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（Ｄａｊａｃ）、０．３２８５ｇ（４．５６ｍｍｏｌ）の再蒸留したアクリル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、および０．８０４３ｇの１．９９７２重量％の過硫酸アンモニウム水溶液を充填した。この混合物を、２００ｒｐｍの一定速度で攪拌しながら、超純粋窒素を用いて、１５０ｍＬ／分で６０分間パージした。パージ溶液に、８０μＬのＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌからの電気泳動用試薬）を添加した。この混合物を、５０±１℃の湯浴中に下ろし、３．５時間の間、２００ｒｐｍで攪拌した。反応時間の終わりに、５０ｍＬのＤＩ水を添加し、５分間攪拌した。得られた透明な水溶液を、５ＧａｌのＤＩ水中で４日間、２４時間毎に水を２回交換しながら５０Ｋ  ＭＷＣＯ  Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｒｏ膜で透析した。透析された溶液を凍結乾燥し、７．７０ｇ（９２．０％収率）のコポリマーを得た。分子量を、ＧＰＣ／ＭＡＬＬＳによって、２．４ＭＤａ  Ｍｗおよび１．２６ＭＤａ  Ｍｎであると決定した。
【００６２】
（生体高分子を備える高分子電解質コーティングされた粒子によるＤＮＡ配列決定反応物の精製）
ＤＮＡ配列決定反応物精製のため、４００μＬのｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、５０μＬのＭ１３ユニバーサルリバースプライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）、２５μＬのテンプレートアンプリコン（約１００ｎｇ／μＬ）、および５２５μＬのＤＩ水を含むように、サンプルを調製した。この溶液を、２０μＬ／ウェルの体積でサーマルサイクラープレート中のウェルに分取した。この混合物を２５サイクルの加熱に供した。ここで、各サイクルは、９５℃で１０秒間加熱し、５０℃で５秒間加熱し、そして６０℃で１２０秒間加熱する工程を含んだ。
【００６３】
生体高分子を備える高分子電解質コーティングされた粒子を提供するため、各々１００μＬのＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２７、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  １−Ｘ８、およびＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  ２−Ｘ８を、上記のように水酸化高分子電解質コーティングされた粒子として調製した。樹脂を、上記のように１ｍｇ／ｍＬのせん断サケ精子ＤＮＡでコーティングし、ＤＩ水で洗浄した。各々１００μＬのコーティングされたアニオン交換粒子を、１００μＬの  Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧと混合し、上記のように水素形態の高分子電解質コーティングされた粒子として調製し、混合されたイオン交換床を形成した。この混合された床を、上記のように１ｍｇ／ｍＬのせん断サケ精子ＤＮＡで洗浄し、ＤＩ水で洗浄した。２μＬのコーティングされた混床の各々を小さなＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）管（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）に添加した。未コーティングのＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２７およびＣｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧから調製された混床を、コントロールとして調製した。
【００６４】
精製を行うため、１μＬの上記の配列決定反応物を、２μＬのＤＮＡコーティングされた混床イオン交換樹脂を含む各ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）管に添加した。この管を５分間ボルテックスし、その後５μＬのＤＩ水を各管に添加し、ピペットで混合した。この微量遠心管を５０００×ｇでスピンし、５μＬの上清を各管から取り出し、そしてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００シークエンサー上での分析のため９６ウェルプレートにピペットで移した。サンプルを、３６ｃｍのアレイ、ＰＯＰ６（登録商標）ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および標準的配列決定モジュールを使用して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００上で分析した。
【００６５】
図３ａ〜３ｄは、この精製からの結果を示す。図３ａ〜３ｃは、生体高分子電解質コーティングされた粒子が所望の精製を提供したことを示す（図３ａはＤＮＡコーティングされたＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２７を示し、図３ｂはＤＮＡコーティングされたＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  １−Ｘ８を示し、そして図３ｃはＤＮＡコーティングされたＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  ２−Ｘ８を示す。この３つは全てカチオン−アニオン混床中）。例えば、色素ブロブ（残った色素標識化ｄｄＮＴＰ）の実質的な除去および比較的高いシグナル強度は、サンプルの望ましい脱塩を示す。対照的に、図３ｄは、未コーティング混床（Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧと混合されたＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２７）が望ましい精製を提供しなかったことを示す。未コーティングアニオン交換樹脂による精製から予測されるように、ほとんどのＤＮＡフラグメントの消失が観察された。
【００６６】
（生体高分子を備える高分子電解質コーティングされた粒子によるＰＣＲ反応物の精製）
ＰＣＲ反応物の精製を実証するため、ＰＣＲ生成物が蛍光キャピラリーシークエンサー上で分析され得るように、サンプルを蛍光標識されたプライマーを用いて調製した。溶液を、１０２μＬのＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、４μＬのＦＡＭ標識されたフォワードプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）、４μＬのリバースプライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）、２０μＬのヒトｇＤＮＡ、ＣＥＰＨ  １３４７−０２（５０μｇ／μＬ）、および７０μＬの脱イオン水（ＤＩ）を含むように調製した。この溶液を、２０μＬ／ウェルの容量でサーマルサイクラープレートのウェルに分取した。この混合物を９６℃で５分間加熱し、続いて４０サイクル加熱した（ここで、各サイクルは９６℃で３０秒間、次いで６０℃で１２０秒間加熱する工程を含んだ）。
【００６７】
生体高分子でコーティングされた粒子を、前の実施例と同様に提供した。精製を行うため、１μＬの上記溶液を、２μＬのＤＮＡコーティングされた混床イオン交換樹脂を含むＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）管に添加した。この管を５分間ボルテックスし、その後５μＬのＤＩ水をこの管に添加し、ピペットで混合した。この微量遠心管を５０００×ｇでスピンし、５μＬの上清を取り出し、５μＬの脱イオン化ホルムアミドに添加し、そしてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００シークエンサー上での分析のため９６ウェルプレートにピペットで移した。サンプルを、３６ｃｍのアレイ、ＰＯＰ−６（登録商標）キャピラリー電気泳動用ポリマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および標準的フラグメント分析モジュールを使用して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００上で分析した。
【００６８】
図４および図５は、ＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）ソフトウェアを用いて分析した場合の、この精製からの結果を示す。この実験は、５５０ｂｐのＰＣＲ生成物からの色素標識化プライマーの大多数の除去の一方で、二本鎖ＤＮＡアンプリコンを保持していることを観察するために設計された。図４ａは、精製前のＰＣＲ反応溶液を示す。図４ｂは、高分子電解質コーティングされた粒子によって精製され、かつ脱塩されたＰＣＲ反応溶液を示す。図４ａは、プライマーによって生じた４０００〜５０００スキャンからのピーク（３３０と表示される）を示し、一方１５，５００スキャンでのピーク（３２０と表示される）は、５５０ｂｐのアンプリコンによって生じた。ＰＣＲプライマーの存在は、多くの場合、ＰＣＲ生成物のその後の分析またはその後の反応を妨害し得る。ＰＣＲ生成物からのプライマーの除去が所望され得る。図４ｂは、ＰＣＲ生成物が、上記の段落に記載されるように、生体高分子を備える高分子電解質コーティングされた粒子を使用して精製される場合に得られるデータを示す。５５０ｂｐのアンプリコン（３２０と表示される）は、まだ見ることができるが、プライマーは検出可能な量未満に減少している。
【００６９】
図５ａおよび５ｂは、図４ａおよび図４ｂに示されるエレクトロフォトグラム（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｏｇｒａｍ）の一領域の拡大図であり、ＰＣＲプライマー（３３０と表示される）の領域に焦点をあてている。精製工程後、しかしＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００での分析の前に内部標準を注入溶液に加えた。内部標準（２０ｎＭの濃度の合成ＲＯＸ標識オリゴヌクレオチド）を使用して、２つの溶液から相対的な注入効率を測定した。内部標準を、両方のエレクトロフォトグラム（３４０と表示される）において観察した。図５は、２つの溶液からの注入効率が同様であることを示す。ピークの高さを正規化するために内部標準を使用すると、プライマーの減少は１００％であり、一方ＰＣＲ生成物の消失は２２％である。この例は、高分子電解質コーティングされた粒子との接触が、ＰＣＲ溶液からプライマーを実質的に減少させ得る一方で、溶液中に７８％のＰＣＲ生成物を残し得ることを示す。同じ溶液と未コーティングイオン交換ビーズとの接触は、ほとんどのプライマーおよび全てのＰＣＲ生成物の消失をもたらした（示さず）。
【００７０】
（合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子によるＤＮＡ配列決定反応物の精製）
ＤＮＡ配列決定反応物の精製に関して、蛍光キャピラリーシークエンサー上で配列決定反応生成物が分析され得るように、蛍光標識化プライマーを用いてサンプルを調製した。４００μＬのｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）５０μＬのＭ１３ユニバーサルリバースプライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）、２５μＬのテンプレートアンプリコン（約１００ｎｇ／μＬ）、および５２５μＬのＤＩ水を含むように、サンプルを調製した。このマスター溶液を、２０μＬ／ウェルの体積でサーマルサイクラープレート中のウェルに分取した。この混合物を２５サイクルの加熱に供した。ここで、各サイクルは、９５℃で１０秒間加熱し、５０℃で５秒間加熱し、そして６０℃で１２０秒間加熱する工程を含んだ。
【００７１】
合成ポリマーでコーティングされた高分子電解質コーティングされた粒子を提供するため、２０ｕＬのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑイオン交換樹脂を、本明細書において記載されるように水酸化高分子電解質コーティングされた粒子として調製した。この樹脂を、本明細書において記載されるように、ポリ（アクリル酸−ｃｏ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド）でコーティングし（これ以降、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）と称する）、そしてＤＩ水で洗浄した。２０μＬのポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）コーティングされたＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑを２０μＬのＣｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＡＧと混合した（本明細書において記載されるような水素高分子電解質コーティングされた粒子として）。５μＬのイオン交換粒子混合物を小さなＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）管（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）に加えた。
【００７２】
精製を提供するため、１μＬの上記の配列決定反応物を、５μＬのＤＮＡコーティングされた混床イオン交換樹脂を含む各ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）管に添加した。この管を５分間ボルテックスし、その後５μＬのＤＩ水をこの管に添加し、ピペットで混合した。この微量遠心管を５０００×ｇでスピンし、５μＬの上清を取り出し、そしてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００シークエンサー上での分析のため９６ウェルプレートにピペットで移した。サンプルを、３６ｃｍのアレイ、ＰＯＰ−６（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、および標準的配列決定モジュールを使用して、ＡＢＩ  ３１００上で分析した。
【００７３】
図６は、この精製からの結果を示す。図６は、合成ポリマー高分子電解質コーティングされた粒子が所望の精製を提供したことを示す。例えば、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）高分子電解質コーティングされた粒子は、色素ブロブ（残留色素標識化ｄｄＮＴＰ）の実質的な除去、およびサンプルの望ましい脱塩を示す比較的高いシグナル強度を提供した。
【００７４】
他のｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ配列決定反応生成物を、高分子電解質コーティングされた粒子によって精製した。図７ａは、本明細書において記載されるように調製されたポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）でコーティングされたＢｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  １−Ｘ８イオン交換樹脂による、配列決定反応生成物の精製を示す。図７ｂは、本明細書において記載されるように調製されたポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）でコーティングされたＡｍｉｎｅｘ  Ａ−２７イオン交換樹脂による、配列決定反応生成物の精製を示す。高分子電解質コーティングされた粒子は、色素ブロブ（残った色素標識化ｄｄＮＴＰ）の実質的な除去、およびサンプルの望ましい脱塩を示す比較的高いシグナル強度を提供した。他のイオン交換樹脂（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ、Ｉｓｏｌｕｔｅ、Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ３０  ＳＢＧ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ−Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉ−Ｑ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  ２−Ｘ８、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＡＧ  １−Ｘ８、Ａｍｉｎｅｘ  Ａ−２７、Ｐｏｗｄｅｘ−ＰＡＯが挙げられる）を、配列決定反応生成物精製のための種々の合成ポリマー高分子電解質（ポリ（ＡＡ）、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＡＡｍ）、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＰＥＯアクリレート）、ポリ（スルホン酸スチレン）、ポリ（スルホン酸スチレン−ｃｏ−ＤＭＡ）、およびポリ（ＡＡ−ＰＥＯアクリレート−ＶＳＡ）が挙げられる）を用いて試験した。
【００７５】
図８は、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）でコーティングされた高分子電解質コーティングされた粒子によって精製された、配列決定反応生成物の精製を示す。配列決定反応生成物を、種々の分子量（第一列と第二列との両方に関してエレクトロフォトグラムの下から上に増加する）のポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）で精製した。高分子電解質コーティングされた粒子のサイズ弁別（Ｓｉｚｉｎｇ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ）をＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）５００  ＲＯＸ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に基づいたアッセイを使用して評価した。サイズ標準は、３５ｂｐ〜５００ｂｐのサイズの範囲にわたる１６個のｄｓＤＮＡフラグメントから構成される。このアッセイを、５μＬのＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）５００  ＲＯＸ試薬を５μｌの高分子電解質コーティングされた粒子に添加することによって行った。この混合物を５分間攪拌またはボルテックスし、そしてこの液体を高分子電解質コーティングされた粒子から分離した。液体からの高分子電解質コーティングされた粒子の分離を、この混合物を遠心分離し、上清をピペットで取り出すか、またはこの混合物を濾過することによって達成した。次いで、得られた液体を、ＤＮＡシークエンサーを用いて分析した。このようなアッセイの結果を図８に示す。図８の第一列は、１０オングストローム〜１５オングストロームの孔サイズを有するコーティングされた樹脂による分離後の、エレクトロフォトグラムを表す。第二列は、１０００オングストロームの孔サイズのコーティングされた樹脂による分離後の、エレクトロフォトグラムを表す。エレクトロフォトグラムの初めに観察される最も大きなピークは、プライマーピークであり、そして２５ヌクレオチドのフラグメントを表す。図８の第一列におけるエレクトロフォトグラムは、いずれの分子量のコーティングについても、小さなフラグメントの除去を示していない。これらのエレクトロフォトグラムは、未処理コントロールと同様である。図８の第二列のエレクトロフォトグラムは、より低い分子量のコーティングによる分離の後でのより早いピーク（より小さいフラグメント）の排除を示す。これらのデータは、図８の第二列における高分子電解質コーティングされた粒子についてのサイズカットオフが１００ｂｐである一方、図８の第一列における高分子電解質コーティングされた粒子についてのサイズカットオフが３５ｂｐ未満であることを実証する。図８は、配列決定反応生成物の精製に関する高分子電解質コーティングされた粒子による分離についてのサイズカットオフを示す。
【００７６】
図９ａおよび図９ｂは、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）によってコーティングされたＰｏｗｄｅｘ−ＰＡＯイオン交換樹脂を含む、高分子電解質コーティングされた粒子によって精製された、配列決定反応生成物の精製を示す。図９ａは、精製前に得たエレクトロフォトグラムを示し、そして図９ｂは、精製後に得たエレクトロフォトグラムを示す。高分子電解質コーティングされた粒子は、ＬＩＺ（登録商標）色素ｄＴＤＰ（２ＰＰ）およびＬＩＺ（登録商標）色素ｄＴＴＰ（３ＰＰ）を、図９ａに上で表示されるような配列決定反応生成物から除去した。高分子電解質コーティングされた粒子は、配列決定反応生成物から他のアニオンを除去し、そして配列決定反応生成物の界面動電注入を改善した。このことによってシグナル強度において１０倍の増加が得られた。
【００７７】
（合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子によるＰＣＲ反応物の精製）
ＰＣＲ反応生成物の精製を、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子によって提供した。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＨＱイオン交換樹脂を、ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）によってコーティングした。図１０は、種々のモル百分率のアクリル酸および種々の分子量のポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）を示す。分子量とモルパーセンテージとは、一番下のエレクトロフォトグラム（１．１モル％のアクリル酸と９８．９モル％のＤＭＡでコーティングされた樹脂による分離を表す）から一番上のエレクトロフォトグラム（Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）を含まない、１００モル％のアクリル酸またはポリ（ＡＡ）でコーティングされた樹脂による分離を表す）まで、下から上にかけて増加する。１００％のアクリル酸を含む高分子電解質コーティングされた粒子は、プライマー、プライマーダイマーおよびあらゆるＤＮＡフラグメントを除去した。同じ現象が、低いアクリル酸含有量（１．１モル％アクリル酸）を含むポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）で観察された。図１１は、上記の範囲のポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）でコーティングされた、非脱塩Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ５０  ＨＱ（塩化物形態）イオン交換樹脂による、オリゴヌクレオチドプライマー、プライマーダイマーおよびＤＮＡフラグメントの除去を示す。図１１のレーン１には、サイズ標準をローディングし、レーン２には、１マイクロリットルの生（高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離なし）のＰＣＲ生成物を２０マイクロモル濃度のプライマーとともにローディングし、レーン３〜７には、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離後の、１マイクロリットルのＰＣＲ生成物をローディングし、そしてレーン８〜１２には、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離後の、２マイクロリットルのＰＣＲ生成物をローディングした。レーン２は、未分離のＰＣＲ生成物（例えば、プライマー、プライマーダイマーなど）を、主要なバンドの下の拡散したバンドとして示す。レーン３〜１２は、対応するバンドのようなものを有さない。図１２は、上記の範囲のポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）でコーティングされた、非脱塩Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ５０  ＨＱ（塩化物形態）イオン交換樹脂による、プライマーダイマーおよび非特異的に増幅されたｄｓＤＮＡの、ＰＣＲ生成物からのサイズベースの除去を示す。上のエレクトロフォトグラムは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子で分離されていないＰＣＲ生成物を示す。下のエレクトロフォトグラムは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子で分離されたＰＣＲ生成物を示す。この違いは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子による分離の後、１００ｂｐより小さいｄｓＤＮＡフラグメントが、溶液中に残るより大きなフラグメントから分離されたことを示す。
【００７８】
（合成ポリマーおよび界面活性剤を備える高分子電解質コーティングされた粒子によるＤＮＡ配列決定反応物の精製）
サイズベースの精製法を使用する精製の前に、ＤＮＡ配列決定反応物に界面活性剤が添加され得る。例えば、サイズ排除スピンカラムを使用するＤＮＡ配列決定反応物の精製前に、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が添加されて、精製を補助し得る。さらに、ＳＤＳを含むＤＮＡ配列決定反応物は、サイズ排除スピンカラムを使用する精製前に加熱され得る。種々の実施形態において、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子によって精製されたＤＮＡ配列決定反応物において、アニオン性界面活性剤は、非イオン性界面活性剤に置き換えられ得る。このような置き換えは、イオン性界面活性剤とイオン交換粒子との相互作用を防止して、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子のイオン交換能に対する有害な影響を回避し得る。本明細書中で使用される場合、用語「非イオン性」界面活性剤とは、非イオン性界面活性剤、双生イオン性界面活性剤、または溶液の導電性に実質的に寄与しない他の界面活性剤をいう。非イオン性界面活性剤の例としては、Ｂｒｉｊ  ３５およびＢｒｉｊ  ５８（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、オクチル−β−Ｄ−グルコシド、オクチルグルコピラノシド、および（３−［（３−コラミドプロピル（Ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）（「ＣＨＡＰＳ」）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）が挙げられる。種々の実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ＤＮＡ配列決定反応物から取り込まれていないダイターミネーターの除去を促進するために、加熱することなく活性化可能であり得る。
【００７９】
ＤＮＡ配列決定反応物精製のため、配列決定反応生成物が蛍光キャピラリーシークエンサー上で分析され得るように、サンプルを、蛍光標識化ジデオキシヌクレオチドターミネーターを使用して調製した。溶液を、８μＬのＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）ｖ．３．１  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、２０μＬを含むように調製した。配列決定用プライマーは、Ｍ１３ユニバーサルリバースプライマー（３．２ｐｍｏｌ／μＬ）であった。テンプレートは、プラスミドｐＧＥＭ（２００ｎｇ／μＬ）であった。このマスター溶液をＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）９７００サーマルサイクラープレート中のウェルに分取した。この混合物を、２５サイクルの加熱に供した。ここで、各サイクルは、９６℃で１０秒間加熱し、５０℃で５秒間加熱し、そして６０℃で２４０秒間加熱する工程を含んだ。
【００８０】
プールした後、１０μＬのプールした未精製の反応混合物を、精製のため、新しい９６ウェルＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレイの１６ウェルの各々に再分配した。各ウェルは、１０μＬの反応混合物、２０μＬの脱イオン水、１０μＬの界面活性剤、および１０μＬの高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子スラリー（上記のように調製されたＡＧ５０ＷＸ−８との混床中に、ポリ（スルホン酸スチレン）コーティングされたＡＧ１Ｘ−８を含む）を含んだ。高分子電解質コーティングされたイオン交換スラリーは５０％が水であったので、混合物の最終容量は４５μＬであった。これらの実施例において、２つの異なる界面活性剤溶液を使用した：（１）１０μＬの３体積％のＢｒｉｊ  ３５水溶液（全溶液中のＢｒｉｊ  ３５の最終濃度は、０．６７％であった）；および、（２）１０μＬの１０体積％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液（全溶液中のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の最終濃度は、２．２％であった）。これらの界面活性剤の各々についてのコントロールは、この界面活性剤を１０μＬの水で置き換えた。種々の実施形態において、界面活性剤は、０．０１％〜１０％の範囲の濃度で有効であり得る。種々の実施形態において、界面活性剤は、０．１％〜５％の範囲の濃度で有効であり得る。
【００８１】
次いで、ＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレイ中のサンプルを、粘着フィルムで覆い、ボルテキサー（ｖｏｒｔｅｘｅｒ）で３０分間混合した。混合後、サンプルを含むＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレイを３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次いで、このＭｉｃｒｏＡｍｐ（登録商標）トレイを、ＤＮＡ配列決定のため、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒに移した。ＤＮＡ配列決定を、５０ｃｍキャピラリーアレイおよびＰＯＰ−６（登録商標）キャピラリー電気泳動ポリマーを用いて実行した。注入条件は、以下に記載されるようなサンプルおよびビーズを含む管の中の上清から直接的に、１０００Ｖで２２秒であった。図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれＢｒｉｊ  ３５界面活性剤ありおよびなしでのＤＮＡ配列決定物精製を示す。図１５Ａ（Ｂｒｉｊ  ３５界面活性剤なしでの精製）において、色素アーチファクトは、例えばこの配列の１５〜６０ヌクレオチドの範囲において現れた。図１５Ｂ（Ｂｒｉｊ  ３５界面活性剤ありでの精製）において、色素アーチファクトは、同じ範囲に現れなかった。図１６Ａおよび１６Ｂは、それぞれＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤ありおよびなしでのＤＮＡ配列決定物精製を示す。図１６Ａ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤なしでの精製）において、色素アーチファクトは、例えばこの配列の１５〜６０ヌクレオチドの範囲において現れた。図１６Ｂ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤ありでの精製）において、色素アーチファクトは、同じ範囲に現れなかった。どちらの例においても、界面活性剤は、加熱することなく、かつ直接界面動電注入または高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子精製を妨害することなく、色素アーチファクトの除去を容易にし得た。
【００８２】
（複数の合成ポリマー層を備えるコーティング粒子）
ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）高分子電解質を、上記のように調製した。ポリ（塩酸アリルアミン）または「ＰＡＨ」（Ｍｗ  ０．０７ＭＤａ）、およびポリ（アクリル酸）または「ＰＡＡ」（Ｍｗ  ４．００ＭＤａ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、容易に入手可能であった。以下の高分子電解質溶液（０．５重量％）を、適量のポリマーを脱イオン水に添加し、次いで一晩常温で転倒（ｔｕｍｂｌｅ）させることによって調製した：ポリ（ＡＡ−ｃｏ−ＤＭＡ）０．２２８６ｇ／３９．９１５ｇ  Ｈ２Ｏ；ＰＡＨ  ０．２２６８ｇ／４０．０３３ｇ  Ｈ２Ｏ；ＰＡＡ  ０．１１９２ｇ／１９．９９ｇ  Ｈ２Ｏ。
【００８３】
コーティングの前に、アニオン交換樹脂（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ  ５０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を脱イオン水で３回洗浄した。樹脂（３ｍＬ、０．３５ｇの湿った樹脂）と２０ｍＬの脱イオン水とのスラリー溶液を、５０ｍＬの管に添加した。樹脂をコーティングするため、高分子電解質溶液（０．７５０ｍＬ）を添加した。管を１分間ボルテックスし、１７６０ｒｐｍで３分間スピンし、そして上清をデカントした。湿った樹脂を高真空オーブン下で、７０℃で２時間乾燥させた。その後この高分子電解質溶液を用いてこのコーティングプロセスをさらに２回繰り返し、全部で３層の高分子電解質コーティング層を適用した。最後の乾燥工程として、コーティングを一晩乾燥させた。この乾燥したペレットを、４０ｍＬの脱イオン水とボルテックスによって混合し、１６７０ｒｐｍで３分間スピンし、そして上清を除去した。最終的な洗浄された樹脂を、１０ｍＬの脱イオン水に再分散させ、使用前に冷蔵庫で保存した。図１３は、例のうちの１つにおける、樹脂に適用された複数の高分子電解質コーティングを示す。図１４は、より少数の塩基対（ｂｐ）の除去を示すことによって、イオン交換樹脂上における未コーティング樹脂、コーティング樹脂、および複数の高分子電解質コーティングの３つの系列の数回の試行の性能を示す。高分子電解質の３つの系列は、以下の表１に記載されている。ここで、第一層は、樹脂の表面に最も近接し、その後の層は、その上にある。
【００８４】
【表１】
2007522807.tif 000003
（高分子電解質コーティング樹脂の磁化）
ＰＡＡ（Ｍｗ  ４．００ＭＤａ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）およびＦｅ３Ｏ４（ＥＭＧ  １１１１）（Ｆｅｒｒｏｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．）は、容易に入手可能であった。ＰＡＡの溶液（０．７５０ｍＬ）を樹脂（０．２ｇの湿った樹脂）と１０ｍＬの脱イオン水とのスラリー溶液に添加した。この混合物を１分間ボルテックスし、５分間常温でインキュベートし、１７６０ｒｐｍで３分間スピンし、そして上清をデカントした。樹脂を脱イオン水（１０ｍＬ）で一度洗浄した。懸濁液を１７６０ｒｐｍで３分間スピンし、そして水をデカントした。脱イオン水とのＦｅ３Ｏ４の水溶液（０．２０ｍＬ）をこの湿った樹脂に添加した。この懸濁液をボルテックスによって１分間混合し、常温で５分間インキュベートした。この懸濁液を１６７０ｒｐｍで３分間スピンし、水溶液を除去した。この樹脂を３回洗浄し、過剰な未結合Ｆｅ３Ｏ４を除去した。コーティングした樹脂を脱イオン水（１０ｍＬ）に再分散させた。樹脂の磁化を観察した。
【００８５】
（高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子の分離）
上記に提供された反応物および／または実施例の各カテゴリーの範囲内で、多くの特定の用途が存在する。例えば、ＰＣＲ反応物の高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、配列検出用途（終点およびリアルタイムの両方）、ＰＣＲクローニング用途などのための精製を提供し得、そしてＤＮＡ配列決定反応物の高分子電解質コーティングイオン交換粒子は、任意の型の核酸配列決定（例えば、配列決定、フラグメント分析、単一ヌクレオチド多型同定など）のための精製を提供し得る。
【００８６】
核酸を配列決定する前に、精製された上清液から高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子を分離することが所望され得る。配列決定は、例えば、キャピラリー電気泳動によって達成され得る。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子から精製された上清液を単離することは、精製と配列決定との間に、ピペッティング、サンプル移送、遠心分離、磁性体除去および／または熱サイクリングのような工程を追加し得る。精製と配列決定との間で、使用者に対して効率および速度を向上させ、そして費用と処理時間とを低下させるために、このような工程を排除することが所望され得る。
【００８７】
種々の実施形態によると、精製された上清液からの高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子の単離は、粒子を保持する濾過によってか、または粒子を集める遠心分離およびその後の上清液の吸引によって達成され得る。上清液から直接的に、キャピラリー電気泳動のためのサンプルをローディングすることによって、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子を精製された上清液から除去する工程を排除することが所望される。しかし、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、界面動電注入を阻害し、配列決定データに無作為的な混乱を引き起こすことによって、または高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子がサンプル管の底に向けた毛細管によって破壊された場合に、毛細管を詰まらせることによって、ローディングを妨害し得る。
【００８８】
種々の実施形態によると、本教示は、サンプルウェル、サンプル管もしくはサンプルチャンバーの底から毛細管をローディングするための方法を提供する。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、ウェルの側面または頂部へ動かされ得る。図１７Ａ〜図１７Ｃは、ウェル１７０を示し、この中で、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子１７２が上清液１７４から単離されている。この教示は、図１７Ｂに図示するように、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子１７２をウェル１７０の頂部に配置する工程、または図１７Ｃに図示するように、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子１７２をウェル１７０の側面に配置する工程を提供する。
【００８９】
種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、より高密度の溶媒によって浮かせることで、ウェルの頂部に配置され得る。上清液の密度は、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子よりも高密度を有するように増加され得る。上清の密度を増加させ得る溶媒の例としては、エチレングリコール（密度＝１．１１３）、炭酸プロピレン（密度＝１．１８９）、ポリエチレングリコール（密度＝１．１２７を有する蝋状の固体）、グリセロール（密度＝１．２６１）、および種々の濃度のこれらの組み合わせが挙げられる。種々の実施形態において、イオン交換樹脂は、１．０３レベル以上の密度を有し得る。上清液の密度を増加させることにより、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、ウェルの頂部に浮く。次いで、毛細管および電極が、ウェルの、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子の層の下に浸漬され得る。毛細管のローディングは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子を免れ得る。溶媒の添加は、サンプル調製における遠心分離工程を排除し得、そしてアレイピペッターによって自動化され得る。
【００９０】
種々の実施形態によると、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、磁気引力によってウェルの側面に配置され得る。上記のように、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、Ｆｅ３Ｏ４でコーティングされて磁化され得る。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、磁石または電気的に誘導された磁界によって提供されるウェルの側面上またはウェル周辺の磁界によって、ウェルの側面に引きつけられ得る。次いで、毛細管および電極が、同心性の層のないウェルの中央または高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子の層のそばに浸漬され得る。毛細管のローディングは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子を免れ得る。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子の磁化は、サンプル調製における遠心分離工程を排除し得る。
【００９１】
種々の実施形態によると、本教示は、サンプルウェル、サンプル管、またはサンプルチャンバーの頂部から毛細管をローディングする方法を提供する。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子は、ウェルの底へと動かされ得る。図１７Ａは、ウェル１７０を示す。ここでは、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子１７２が上清液１７４から分けられている。この粒子は、上記に考察されたように、遠心または磁化によって底へ動かされ得る。シークエンサー装置は、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子のないウェルのより高い点からサンプルをローディングするように較正され得る。上清ローディングのための毛細管位置の変更は、毛細管の先端から管の底までの間の距離を増加させることによって提供され得る。標準的マイクロタイタートレイに関しては、このような距離は、４．５ｍｍである。これは、９６ウェルトレイの３０μＬに対するウェル体積に対応する。上清の体積は、毛細管が良好な界面動電注入のために上清に浸漬することを確実にするように増加され得る。このことは、脱イオン水の添加によって上清の体積を増加させることによってなされ得る。脱イオン水と上清との混合物は、この混合物を３０分間ボルテックスすることによって提供され得る。
【００９２】
種々の実施形態によると、シークエンサー装置は、トレイもしくはそのトレイが嵌まっているフレームを機械的に変更して、このトレイが装置以内においてより低い位置にあるようにすることによって、ウェルのより高い点からサンプルをローディングするように較正され得る。種々の実施形態によると、シークエンサー装置は、ファームウェア初期ファイルを改変して参照ｚ軸点を変更することによって、ウェルのより高い点からサンプルをローディングするように較正され得る。種々の実施形態によると、シークエンサー装置は、底部のローディング位置から、高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子の上の上清液層中の点まで毛細管を引くようにソフトウェアをプログラムすることによって、ウェルのより高い点からサンプルをローディングするように較正され得る。図１８Ａ〜１８Ｂは、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（登録商標）化学（図１８Ａ）およびｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ化学（図１８Ｂ）を使用し、そしてファームウェア初期ファイルを改変して参照ｚ軸点を変更することによってウェルのより高い点からサンプルをローディングするように較正されたシークエンサー装置を使用した、上清からの核酸配列決定を示す。
【００９３】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的に関して、他に示されない限り、成分の量、材料のパーセンテージもしくは割合、反応条件、および本明細書および特許請求の範囲において使用される他の数値を表現する全ての数は、あらゆる例において、用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、そうではないと示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明によって得られることを求められる所望の特性に依存して変動し得る近似である。最低限でも、そして本特許請求の範囲と等価な理論の適用の限定への試みとしてではなく、各数値パラメーターは、少なくとも、多くの報告された有効数字に照らして、かつ通常の概数化技術を適用することによって、解釈されるべきである。
【００９４】
本発明の広範な範囲を示す多くの数値範囲および数値パラメーターが近似であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は、可能な限り正確に報告されている。しかし、あらゆる数値は、本来、それらのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に得られる特定の誤差を含む。さらに、本明細書において開示される全ての範囲はそこに含まれるありとあらゆる部分的範囲を含むことが、理解されるべきである。例えば、「１〜１０」という範囲は、最低値１と最大値１０との間（それらを含む）の、ありとあらゆる下位範囲を含む。すなわち、ありとあらゆる部分的範囲は、１以上の最低値および１０以下の最大値を有する（例えば、５．５〜１０）。
【００９５】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの」（「ａ」、「ａｎ」）および「その」（「ｔｈｅ」）は、ある対象に対して明確かつ明白に制限されない限り、複数形を含むことが注記される。したがって、例えば、「１つのモノマー（ａ  ｍｏｎｏｍｅｒ）」に対する言及は、２以上のモノマーを含む。さらに、用語「含むこと」（「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」）ならびに他の形態（例えば、「含む」（「ｉｎｃｌｕｄｅ」）および「含まれる」（「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」））の使用は、限定ではない。
【００９６】
本明細書において記載される種々の実施形態に対して、本発明の教示の精神または範囲を逸脱することなく種々の変更および改変がなされ得ることは、当業者にとって明らかである。したがって、本明細書において記載される種々の実施形態は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内で、他の変更および改変を網羅することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１は、高分子電解質コーティングされた粒子の断面図を示す。このコーティングは、生体高分子を含む。
【図２−１】図２は、高分子電解質コーティングされた粒子の断面図を示す。このコーティングは、合成ポリマーである。
【図２−２】図２ａは、高分子電解質コーティングされた粒子のためのコーティング中に含まれ得るいくつかの合成ポリマーを示す。
【図３】図３ａ〜３ｄは、標準的分離技術と比較した、生体高分子を備える高分子電解質コーティングされた粒子による配列決定反応生成物の分離を示す。図３ａ〜３ｃは、種々の実施形態による、高分子電解質コーティングされた粒子による分離を示す。図３ｄは、未コーティングのイオン交換粒子による分離を示す。
【図４】図４ａ〜４ｂは、生体高分子を備える高分子電解質コーティングされた粒子によるＰＣＲ反応生成物の分離を示す。図４ａは、色素標識化アンプリコンと色素標識化プライマーとの混合物を含む、未精製のＰＣＲ反応生成物を示し、そして図４ｂは、高分子電解質コーティングされた粒子によって分離されて色素標識化プライマーを除去された、ＰＣＲ反応生成物示す。
【図５】図５ａ〜５ｂは、それぞれ図４ａ〜４ｂの詳細を示すグラフのセットである。
【図６】図６は、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子による、配列決定反応生成物の分離を示す。
【図７】図７ａ〜７ｂは、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子による、配列決定反応生成物の分離を示す。
【図８】図８は、種々の分子量を有するコーティングポリマーを使用した分離についての、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子による分離についてのサイズカットオフを示す。
【図９−１】図９ａおよび９ｂは、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子による、配列決定反応生成物の分離を示す。
【図９−２】図９ａおよび９ｂは、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子による、配列決定反応生成物の分離を示す。
【図１０】図１０は、合成ポリマーを備える高分子電解質コーティングされた粒子を使用した、より大きなｄｓＤＮＡフラグメントからの、小さなｄｓＤＮＡフラグメントのサイズベースの除去を示す。
【図１１】図１１は、２％アガロースゲルを用いたゲル電気泳動による構成要素の分離の結果を示すことによって、高分子電解質コーティングされた粒子を使用した、ＰＣＲ生成物からのオリゴヌクレオチドプライマーの除去を示す。
【図１２】図１２は、非脱塩高分子電解質コーティングされた粒子を使用した、ＤＮＡサイズ弁別を示す。
【図１３】図１３は、樹脂に塗布された複数の高分子電解質コーティングを示す。
【図１４】図１４は、より少数の塩基対（ｂｐ）の除去を示すことによって、イオン交換樹脂上における未コーティング樹脂、コーティング樹脂、および複数の高分子電解質コーティングの３つの系列の数回の試行の性能を示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、それぞれＢｒｉｊ  ３５界面活性剤ありおよびなしでのＤＮＡ配列決定物精製を示す。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、それぞれＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤ありおよびなしでのＤＮＡ配列決定物精製を示す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｃは、ウェル１７０を示す。高分子電解質コーティングされたイオン交換粒子１７２は、上清液１７４から単離されている。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂは、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ化学（図１８Ａ）およびｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ化学（図１８Ｂ）を使用し、そしてファームウェア初期ファイルを改変して参照ｚ軸点を変更することによってウェルのより高い点からサンプルをローディングするように較正されたシークエンサー装置を使用した、上清からの核酸配列決定を示す。
【図１】
2007522807.tif 000004
【図２−１】
2007522807.tif 000005
【図２−２】
2007522807.tif 000006
【図３ａ】
2007522807.tif 000007
【図３ｂ】
2007522807.tif 000008
【図３ｃ】
2007522807.tif 000009
【図３ｄ】
2007522807.tif 000010
【図４ａ】
2007522807.tif 000011
【図４ｂ】
2007522807.tif 000012
【図５ａ】
2007522807.tif 000013
【図５ｂ】
2007522807.tif 000014
【図６】
2007522807.tif 000015
【図７ａ】
2007522807.tif 000016
【図７ｂ】
2007522807.tif 000017
【図８】
2007522807.tif 000018
【図９−１】
2007522807.tif 000019
【図９−２】
2007522807.tif 000020
【図１０】
2007522807.tif 000021
【図１１】
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【図１２】
2007522807.tif 000023
【図１３】
2007522807.tif 000024
【図１４】
2007522807.tif 000025
【図１５ａ】
2007522807.tif 000026
【図１５ｂ】
2007522807.tif 000027
【図１６ａ】
2007522807.tif 000028
【図１６ｂ】
2007522807.tif 000029
【図１７ａ】
2007522807.tif 000030
【図１７ｂ】
2007522807.tif 000031
【図１７ｃ】
2007522807.tif 000032
【図１８ａ】
2007522807.tif 000033
【図１８ｂ】
2007522807.tif 000034
【国際調査報告】
2007522807.tif 000035
2007522807.tif 000036