(57)【要約】本発明は、ペプチド及び核酸分子、並びに異種タンパク質、プロバイオティック生物、及び機能性食品成分及びプロダクトを製造するためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下；
ペプチドのＮ末端におけるＬｙｓＭドメイン；
該ペプチドのＣ末端におけるａｐｆ様ドメイン；及び
該ＬｙｓＭとａｐｆ様ドメインの間に配置されたグルタミンリッチ領域；
を含むペプチド。
【請求項２】
配列番号１〜６のいずれか１つに示される配列を有するペプチド。
【請求項３】
請求項２記載のペプチドと少なくとも約７５％のアミノ酸配列ホモロジーを有するペプチド。
【請求項４】
異種（heterologous）タンパク質を更に含む、請求項２記載のペプチド。
【請求項５】
該異種タンパク質がリシンである、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
該異種タンパク質がビトロネクチンである、請求項４記載のペプチド。
【請求項７】
該異種タンパク質がe‐カドヘリンである、請求項４記載のペプチド。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１つに記載のペプチドをコードする核酸。
【請求項９】
配列番号７〜２０のいずれか１つに示される配列を有する核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
前記請求項のいずれか１つに記載のペプチド、核酸又はベクターを含有する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド及び核酸分子、並びに異種（heterologous）タンパク質、プロバイオティック生物及び機能性食品成分及びプロダクトを作製するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ等の乳酸菌、並びにＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌は、食品プロダクトの製造及び原料農産物の発酵のために広く使用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これらの細菌は、無害である傾向にあり、且つ腸内環境において生存能力を維持する傾向にあるため、外来タンパク質（即ち、細菌によって自然に産生されないタンパク質）を生産するために、特に有益な健康効果を提供する機能性食品プロダクトの製造、そしてまた新規な生物薬学的プロダクトの製造における使用のために、これらの細菌を使用することに現在関心がある。
【０００４】
乳酸菌のこれらの潜在的な用途に関し、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌の細胞表面上、又は例えばこれら細菌由来の培養上清中で発現し得る分子についての必要性が存在する。さらに、融合タンパク質の形態で外来タンパク質と共に乳酸菌中で発現され得る分子についての必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の説明
本発明は、上記の必要性に取り組むことに努め、従って一側面において、本発明は、ペプチドのＮ末端におけるＬｙｓＭドメイン、ペプチドのＣ末端におけるａｐｆ様ドメイン、そしてＬｙｓＭとａｐｆ様ドメインとの間に配置されるグルタミンリッチ領域を含むペプチドを提供する。
【０００６】
ここに記載されるように、本発明者は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍの細胞表面上で発現される新規な細菌ペプチドを単離し、特徴付けた。該ペプチドは、細胞表面からも分泌され、培養上清中に比較的豊富に存在し、溶液中に分泌された時に比較的安定であることを示唆する。このタンパク質は、“スモール輸出蛋白質（Ｓｍａｌｌ  Ｅｘｐｏｒｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）”即ち“Ｓｅｐ”と命名された。
【０００７】
細胞表面上及び培養上清中のＳｅｐの安定な発現に関し、本発明者は、外来タンパク質の発現を、機能性食品成分、特にＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌から産生される成分の調製における使用に好ましい細菌の細胞表面に標的化するために、Ｓｅｐが特に有用であることを認識した。
【０００８】
“リシンモチーフドメイン”として知られるＬｙｓＭドメインは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のトランスグリコシラーゼ等のプロテオグリカンに結合することができる酵素中で見られた。ＬｓｙＭドメインの例は、Ｅ．ｃｏｌｉの溶菌ムレイントランスグリコシラーゼＤ（lytic murein transglycosylase）（ＭｌｔＤ）において見出されたものである（（Ｂａｔｅｍａｎ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ａ．  Ｂｙｃｒｏｆｔ．  ２０００）Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ＬｙｓＭ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｌｙｔｉｃ  ｍｕｒｅｉｎ  ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ  Ｄ（ＭｌｔＤ）  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９９：  １１１３−１１１９）。
【０００９】
本発明のペプチドのＬｙｓＭドメインは、典型的に約４０〜５０アミノ酸の長さである（それは、より少ない又は多い残基を有し得るが）。典型的に、ＬｙｓＭドメインは、配列番号１に示される配列を有する。
【００１０】
“凝集促進因子ドメイン（aggregation-promoting factor domains）”とも知られるａｐｆ様ドメインは、細菌細胞壁へのタンパク質の付着における役割を担うと理解されている。ａｐｆドメインの例は、Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｎｉ及びＬ．ｇａｓｓｅｒｉのａｐｆ１及びａｐｆ２タンパク質において見られるものを含む（Ｖｅｎｔｕｒａ，Ｍ．，Ｉ．Ｊａｎｋｏｖｉｃ，  Ｄ．Ｃ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｒ．Ｄ．Ｐｒｉｄｍｏｒｅ，ａｎｄ  Ｒ．Ｚｉｎｋ．２００２．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６８：６１７２−６１８１）。
【００１１】
本発明のペプチドのａｐｆドメインは、典型的に、約８０アミノ酸の長さである（それは、より少ない又は多い残基を有し得るが）。典型的に、ａｐｆドメインは、配列番号２に示される配列を有する。
【００１２】
本発明のペプチドのグルタミンリッチ領域は、典型的に、約４４残基を有する配列中に約１３のグルタミン残基を有する。この領域は、典型的に親水性である。典型的に、グルタミンリッチ領域は、配列番号３に示される配列を有する。
【００１３】
本発明のペプチドは、“リーダー配列”としても知られる分泌シグナル配列を更に含み得る。分泌シグナル配列は、ペプチドが細胞表面に付着し得る及び／又は細胞表面から、例えば液体培地中に分泌され得るように、細胞膜を通過するペプチドの分泌における役割を担う。典型的に、分泌シグナル配列は、約３０アミノ酸の長さを有する（それは、より少ない又はより多い残基を有し得るが）。典型的に、分泌シグナル配列は、配列番号４に示される配列を有する。
【００１４】
典型的に、本発明のペプチドは、配列番号５に示される配列を有する。ペプチドが分泌シグナル配列を更に含む場合、ペプチドは、典型的に、配列番号６に示される配列を有する。
【００１５】
本発明者は、分泌シグナル配列、ＬｙｓＭドメイン、グルタミンリッチ領域及びａｐｆドメインの各々が、例えば、異種タンパク質の発現における別個の機能性ユニットとして有用性を有することを認識する。これらの有用性の例は、更に以下に説明される。
【００１６】
例えば、分泌シグナル配列は、異種タンパク質の発現を、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌の細胞表面に標的化するために特に有用である。従って、分泌シグナル配列は、例えば、目的の異種タンパク質、特にこれらの細菌によって天然に発現されないタンパク質を含む機能性食品成分を生産するために特に有用である。
【００１７】
従って、一側面において、本発明は、配列番号６に示される配列を含むペプチドを提供する。
【００１８】
ＬｙｓＭドメインは、プロテオグリカンに結合することが示されたため、ＬｙｓＭドメインは、例えば腸粘膜上皮などの目的の部位において生物活性（bioactive）化合物を濃縮する目的のために、炭水化物を含む生物活性化合物を結合させるために、特に有用であり得ることが認識される。代替的に、ＬｙｓＭドメインは、病原性細菌等の炭水化物を含む生物活性物質を腸粘膜上皮等の目的の部位から除去するために特に有用であり得る。
【００１９】
従って、一側面において、本発明は、配列番号１に示される配列を含むペプチドを提供する。
【００２０】
ａｐｆドメインは、いくつかのＳ−層タンパク質の細菌細胞壁への付着において役割を担うことが理解されるため、ａｐｆドメインは、異種タンパク質を、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌の細胞表面に付着させるために特に有用であり得る。従って、ａｐｆドメインは、例えば、目的のタンパク質を含む機能性食品成分を生産するために有用であり得る。
【００２１】
このように、一側面において、本発明は、配列番号２に示される配列を含むペプチドを提供する。
【００２２】
本発明者は、ペプチドのグルタミンリッチ領域は、特に親水性であることを見出したため、この領域が、融合タンパク質の疎水性ドメインを間隔をあけて離す、従って、各疎水性ドメインの機能性を向上させるためのキメラタンパク質又は融合タンパク質（ここにおいて更に説明される）において非常に有用であり得ることを認識する。従って、本発明者は、グルタミンリッチ領域が、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌による異種タンパク質の発現において特に有用性を有すると考える。
【００２３】
このように、一側面において、本発明は、配列番号３に示される配列を含むペプチドを提供する。
【００２４】
本発明のペプチドは、配列番号１、２、３及び４に示される１つ以上の配列を含み得ることが理解されるであろう。
【００２５】
本発明のペプチドは、典型的に、約１７５アミノ酸残基の長さである（それは、より多くのアミノ酸残基を含み得るが）。ペプチドが分泌シグナル配列に結合する場合、それは典型的に、約２０５アミノ酸残基の長さである。
【００２６】
本発明者は、配列番号５において示される配列と実質的に同一である配列（１以上のアミノ酸残基を除く）を含むペプチドが、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌の表面上又はこれら由来の培養上清中で発現される能力を有することが予測される。これらのペプチドは、ここにおいて更に説明されるプロセスに従って作製され得る。これらペプチドの細胞表面上で発現される又は細胞表面から例えば、培養上清中に分泌される能力は、ここにおいて更に説明されるアッセイによって測定され得る。
【００２７】
上記に関し、本発明は、配列番号１、２、３、４、５及び６の１つに示される配列と相同のアミノ酸配列を有するペプチドを含むことが理解される。これらのペプチドは、“バリアント”と言及される。配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つとのアミノ酸配列ホモロジーに加え、該バリアントは、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌の表面、又はこれら由来の培養上清中で発現される能力（ここで説明されるアッセイによって測定される）に関して特徴付けられる。
【００２８】
アミノ酸配列に関して“ホモロジー”は、最大の同一性を達成するために必要であれば、ギャップを導入して配列を整列した後、配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つのアミノ酸残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。候補配列におけるＮ−又はＣ−末端の伸長又は欠失はホモロジーが低下とはみなされない。配列を整列するためのアルゴリズムの例は、ＣＬＵＳＴＡＬＷである。
【００２９】
典型的に、バリアントは、例えば、配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つと少なくとも約７５％のアミノ酸ホモロジーを有するペプチドである。バリアントは、配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つと、少なくとも８０％、より典型的には８５％よりも高い配列ホモロジー、例えば９０％のアミノ酸ホモロジーを有し得る。しかし、バリアントは配列番号１、２、３、４、５及び６の配列と５０％未満の配列ホモロジー示し得、且つ依然ここに記載されるバリアントの特性を保持する。
【００３０】
ここに記載されるように、本発明のペプチド（バリアントを含む）は、化学合成法又は組換えＤＮＡ技術によって調製され得る。例えば、本発明のペプチドは、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）に記載される、アミノ酸残基の連続的な付加に基づく化学合成法を使用してモノマーから調製され得る。これらのモノマーは、天然残基又は非天然残基（これらの例は、以下に記載される）であり得る。代替的に、本発明のペプチド、特にバリアントは、配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示される配列を含むペプチドを処理することによって化学的又は酵素的に調製され得る。ペプチドが、組換えＤＮＡ技術によって合成される場合、それらは、配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示されるアミノ酸配列、又は配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つとホモロジーを有する配列をコードする核酸分子のランダムな又は予め決定された突然変異（例えば、位置指定ＰＣＲ突然変異誘発）、及びペプチドを得るための宿主細胞における該配列の発現によって調製され得る。これは、バリアントを調製するために特に有用な方法である。代替的な方法は、配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つ、又は配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つと相同な配列をコードする核酸分子の新たな化学合成及びペプチドを得るための宿主細胞における該配列の発現である。
【００３１】
配列番号１、２、３、４、５及び６の配列の１つのバリアントである本発明のペプチドは、典型的に、これらの配列からの１つ以上の保存性アミノ酸の置換において異なる。保存性置換の例は、以下の表１に示される。
【００３２】
【表１】
2007531508.tif 000002
【００３３】
上記の様に、本発明のペプチドは、非天然アミノ酸残基を含み得る。遺伝暗号によってコードされていない一般的に遭遇されるアミノ酸は、以下を含む：
Ｇｌｕ及びＡｓｐについて、２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）；
Ｇｌｕ及びＡｓｐについて、２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ及び他の脂肪族アミノ酸について、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）；
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ及び他の脂肪族アミノ酸について、２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；
Ｇｌｙについて、２−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；
Ｖａｌ及びＬｅｕ及びＩｌｅについてシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；
Ａｒｇ及びＬｙｓについて、ホモアルギニン（Ｈａｒ）；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについて、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；
Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；
Ａｓｎ及びＧｌｎについて、Ｎ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；
Ｌｙｓについて、ヒドロキシルリシン（Ｈｙｌ）；
Ｌｙｓについて、アロヒドロキシルリシン（allohydroxyllysine）（ＡＨｙｌ）；
Ｐｒｏ、Ｓｅｒ及びＴｈｒについて３−（及び４）ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ，４Ｈｙｐ）；
Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＶａｌについてアロイソロイシン（ＡＩｌｅ）；
Ａｌａについて、ｐ−アミジノフェニルアラニン；
Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａについて、Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；
Ｉｌｅについて、Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；
Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸について、ノルバリン；
Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸について、ノルロイシン（Ｎｌｅ）；
Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについて、オルニチン（Ｏｒｎ）；
Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについて、シトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；
Ｐｈｅについて、Ｎ−メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ）フェニルアラニン、トリフロウリルフェニルアラニン（triflourylphenylalanine）。
【００３４】
バリアントを生成するためのアミノ酸置換のための配列番号１、２、３、４、５又は６に示される配列の１つの残基の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１０８１−１０８５によって説明されるアラニンスキャンニング突然変異（alanine scanning mutagenesis）と呼ばれる。ここで、残基又は標的残基の基が同定され（例えば、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＬｙｓ等のチャージした残基）、そしてアミノ酸と周囲環境との相互作用を行わせるために中性又は負にチャージしたアミノ酸によって置換される。置換に対して機能的感受性を示すドメインは、次いで置換部位において又は関して更なる又は他のバリエーションを導入することによってリファインされる（refined）。従って、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位は事前決定されるが、突然変異の性質自体は、事前決定される必要はない。例えば、特定の部位における突然変異の作用を最適化するために、Ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異が、標的コドン又は領域において実施され得、そして発現したペプチドは所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングされ得る。
【００３５】
タンパク質又はペプチドライブラリーのファージディスプレイは、改良された又は変えられた親和性、特異性又は安定性を有するペプチドの選択のための別の方法を提供する（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ，Ｐ（１９９１）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２：６６８−６７３）。Ｍ１３遺伝子ＩＩＩコートタンパク質を有する融合体として一価様式でディスプレイされる高親和性のタンパク質（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｔｒｅｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｓ  １２：１７３−１８３）は、多くの結合選択のラウンドの後、ファージミド粒子中に充填された対応するＤＮＡをクローニングし、シークエンシングすることによって同定され得る。
【００３６】
本発明のペプチドは、遊離酸若しくは塩基として調製され得、又は種々の無機及び有機酸及び塩基の塩に変換され得る。このような塩は本発明の範囲内にある。このような塩の例には、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムなどの金属塩；ジシクロヘキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等の有機塩基との塩；アルギニン又はリシン等のアミノ酸との塩が含まれる。無機及び有機酸との塩も同様に、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸等を使用して調製され得る。無毒且つ生理学的に適合性のある塩は、特に有用である（他のそれ程好ましくない塩は、単離及び精製の過程において有用であり得るが）。
【００３７】
ペプチドは、少なくとも１つの炭水化物分子及び／又は少なくとも１つの脂質分子を含み得る。
【００３８】
ペプチドは、少なくとも１つのアルキル基を含み得る。
【００３９】
本発明のペプチドの特別な用途は、例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌上（これら細菌の表面上）又は、これら由来の培養上清中の異種タンパク質の発現を可能にする融合タンパク質を提供するためのそれらの使用である。
【００４０】
融合タンパク質は、以下に記載される化学的合成法によって作製され得、又はそれらは、例えば、配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示される配列を有するペプチドをコードする核酸分子が異種タンパク質をコードする遺伝子を有するベクター中に配置されるような、組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。ベクターの発現は、異種タンパク質との融合体として産生される本発明のペプチドを結果生じる。
【００４１】
融合タンパク質の３つの広いクラスが考えられる。第一のクラスは、融合タンパク質が配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示される配列を有するペプチド及び異種タンパク質を含み、ここで異種タンパク質は、抗体フラグメント又は他の高親和性分子である。これらの融合タンパク質は、以下の用途を有し得る：微生物の毒素に結合し、不活性化すること；線維構造物(fimbriae)、非線維構造物アドヘシン、又は毒性工程に関与する他の細胞表面分子などの病原菌のコロニー形成決定因子に結合しブロックすること；病原菌の受容体として働く宿主分子に結合しブロックすること；直接的に微生物を殺すこと；化学療法化合物とドッキングする目的でガン細胞に結合すること；例えばＥＬＩＳＡアッセイにおける使用のためのin vitro診断試薬として；in vivo診断試薬（即ち、生体中の診断標的の視覚化）；又は、免疫組織化学試薬。このクラスの異種タンパク質の例は、以下において記載されるものを含む：Ｋｒｕｇｅｒ  Ｃ，  Ｈｕ  Ｙ，  Ｐａｎ  Ｑ，  Ｍａｒｃｏｔｔｅ  Ｈ，  Ｈｕｌｔｂｅｒｇ  Ａ，  Ｄｅｌｗａｒ  Ｄ，  ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ  ＰＪ，  Ｐｏｕｗｅｌｓ  ＰＨ，  Ｌｅｅｒ  ＲＪ，  Ｋｅｌｌｙ  ＣＧ，  ｖａｎ  Ｄｏｌｌｅｎｗｅｅｒｄ  Ｃ，  Ｍａ  ＪＫ，  Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｌ，  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｒｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００２  Ｊｕｌ；  ２０  （７）；  ７０２−６；  Ｏｇｇｉｏｎｉ  ＭＲ，  Ｂｅｎｉｎａｔｉ  Ｃ，  Ｂｏｃｃａｎｅｒａ  Ｍ，  Ｍｅｄａｇｌｉｎｉ  Ｄ，  Ｓｐｉｎｏｓａ  ＭＲ，  Ｍａｇｇｉ  Ｔ，  Ｃｏｎｔｉ  Ｓ，  Ｍａｇｌｉａｎｉ  Ｗ，  Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｉｓ  Ｆ，  Ｔｅｔｉ  Ｇ，  Ｃａｓｓｏｎｅ  Ａ，  Ｐｏｚｚｉ  Ｇ，  Ｐｏｌｅｎｅｌｌｌｉ  Ｌ．  Ｒｏｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ  ｆｏｒ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｓｃＦｖ  ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．  Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００１；  ２０  （２）：  ２７５−８７；  Ｓｏｕｒｉａｕ  Ｃ，  Ｈｕｄｓｏｎ  ＰＪ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  ２００３  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ａｐｒ；  ３  （２）：  ３０５−１８；  Ｒｏｓｓ  ＪＳ，  Ｇｒａｙ  Ｋ，  Ｇｒａｙ  ＧＳ，  Ｗｏｒｌａｎｄ  ＰＪ，  Ｒｏｌｆｅ  Ｍ．  Ａｎｔｉｃｎａｃｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２００３  Ａｐｒ；  １１９  （４）：  ４７２−８５；  Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ＲＪ．  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｔｏｘｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｎａｃｅｒ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．  ２００３  Ｆｅｂ；  ５  （１）：  ４４−５１。
【００４２】
第二のクラスは、融合タンパク質が配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示される配列を有するペプチド及び異種タンパク質を含み、ここで異種タンパク質はファージリシン等のリシン(lysin)である。これらは、特に細胞壁を崩壊させることによって細菌細胞を特異的に殺すために特に有用である。このクラスのリシンの例は、以下において記載されるものを含む：
Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ  ＶＡ．  Ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｃｏｕｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｄｃｉ．  ２００３  Ａｐｒ；  ９８７：  ２０７−１４；  Ｓｃｈｕｃｈ  Ｒ，  Ｎｅｌｓｏｎ  Ｄ，  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ  ＶＡ．Ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｌｙｔｉｃ  ａｇｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｓ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ．  ２００２  Ａｕｇ  ２２；  ４１８  （６９００）：  ８８４−９；  Ｌｏｅｆｆｌｅｒ  ＪＭ，  Ｆｉｓｃｈｅｔｔｉ  ＶＡ．  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｌｅｔｈａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈａｇｅ  ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｎ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  -ｒｅｓｉｓｔａｎｔ    Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｔｒａｉｎｓ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２００３  Ｊａｎ；  ４７  （１）：  ３７５−７；  Ｇａｅｎｇ  Ｓ，  Ｓｈｅｒｅｒ  Ｓ，  Ｎｅｖｅ  Ｈ，  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ  ＭＪ．  ２０００．  Ｇｅｎｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ−ｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｔｉｓ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６６：  ２９５１−８．
第三のクラスは、融合タンパク質は配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示される配列を有するペプチド及び異種タンパク質を含み、ここで異種タンパク質は、感染又は疾患に対する防御免疫応答を導くことができる。このクラスの異種タンパク質の例は、以下において記載されるものを含む：Ｂ．  Ｓｍｉｔｈ  ＤＪ，  Ｋｉｎｇ  ＷＦ，  Ｂａｒｎｅｓ  ＬＡ，  Ｐｅａｃｏｃｋ  Ｚ，  Ｔａｕｂｍａｎ  ＭＡ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ  ｇｌｕｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００３  Ｍａｒ；  ７１  （３）：  １１７９−８４；  Ｏｌｉｖｅ  Ｃ，  Ｃｌａｉｒ  Ｔ，  Ｙａｒｗｏｏｄ  Ｐ，  Ｇｏｏｄ  ＭＦ．  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  ｇｒｏｕｐ  Ａ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ａｎｄ  ｌａｃｋｓ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｕｔｏｅｐｉｔｏｐｅ，  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２００２  Ｊｕｎ  ２１；  ２０  （２１−２２）：  ２８１６−２５；  Ｓｏｕｚａ  Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  ＲＣ，  Ｓｏｕｓａ  ｄｅ  Ｍａｃｅｄｏ  Ｚ，  Ｍｅｄｉｎａ−Ａｃｏｓｔａ  Ｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  Ｂｆｐ  Ａ  ａｎｄ  ＥｓｐＢ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００２  Ｊｕｎ；  ２５  （１）：  １６−２２；  Ｐａｌ  Ｓ，  Ｄａｖｉｓ  ＨＬ，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＥＭ，  ｄｅ  ｌａ  Ｍａｚａ  ＬＭ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｃ  ｍｏｕｓｅ  ｐｎｅｕｍｏｎｉｔｉｓ  ｍａｊｏｒ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＣｐＧ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ａｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｎ  ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００２  Ｓｅｐ；  ７０  （９）：  ４８１２−７。
【００４３】
本発明は、任意の異種タンパク質を有する配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示される配列を有するペプチドの使用（異種タンパク質の機能に関係なく）を考慮する。特に有用であるのは、免疫寛容の誘導、及び免疫系機能の他の修飾、並びに非免疫グロブリン蛋白質を用いた病原体結合の直接的な阻害に関与する異種タンパク質である。特別な例には、配列番号１，２、３、４、５又は６の１つに示される配列と（ｉ）ハウスダストダニからのｄｅｒ ｐ１抗原、又は（ｉｉ）インターロイキン１受容体拮抗剤；又は（ｉｉｉ）シアノビリンＮを有する融合タンパク質；及びワクチンとして使用される異種タンパク質と共にインターロイキン２又はγインターフェロンを含む。
【００４４】
融合タンパク質は、メチオニンにおいて開裂する臭化シアン又はＡｓｎとＧｌｙ残基間を開裂するヒドロキシルアミン等の化学物質を用いて開裂され得る。標準組換えＤＮＡ法を用いて、これらアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対が、所望のペプチドをコードする遺伝子の５’末端の直前に挿入され得る。
【００４５】
代替的に、融合タンパク質のタンパク質分解的な開裂を使用し得る（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ：  Ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  Ｌａｒｇｅｒ−Ｓｃａｌｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，  Ｌａｄｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．  ４２７，  １９９０），  Ｃｈ  １３，  ｐａｇｅｓ  １８１−１９３を参照）。
【００４６】
第Ｘａ因子、トロンビン及びスブチリシン（subtilisin）又はそのミュータントなどのプロテアーゼ並びに多くの他のものは、融合タンパク質を開裂するために首尾よく使用されてきた。典型的に、使用されるプロテアーゼによる開裂を受け易いペプチドリンカーが更なるタンパク質（例えば、タンパク質ＡのＺドメイン）と本発明のペプチドの間に挿入される。組換えＤＮＡ法を用いて、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対が、他のタンパク質をコードする遺伝子フラグメント又は遺伝子間に挿入される。正しいリンカーを含む部分的に精製された融合タンパク質のタンパク質分解的開裂は、次いで天然融合タンパク質又は短縮された又は変性された融合タンパク質において実施され得る。
【００４７】
本発明のペプチドは、融合タンパク質として発現される場合、適切にフォールディングされていない。また開裂部位を含む特別なペプチドリンカーは、プロテアーゼに利用可能であってもなくてもよい。これらの因子は、融合タンパク質が変性されリフォールディングされなければならないかどうかを決定し、そしてそうである場合に、これらの手順が開裂の前又は後に使用されるかを決定する。
【００４８】
変性及びリフォールディングが必要である場合、典型的にペプチドは、グアニジンＨＣｌなどのカオトロープを用いて処理され、次いで、ペプチドがその天然構造にリフォールディングされるように、例えば、適切な割合、ｐＨ及び温度で還元型及び酸化型のジチオスレイトール又はグルタチオンを含む酸化還元バッファーを用いて処理される。
【００４９】
本発明の他の融合タンパク質は、本発明のペプチドが、例えば免疫グロブリン不変領域又は他の免疫グロブリン領域、アルブミン又はフェリチン等の長い半減期を有するタンパク質に融合されるものを含む。
【００５０】
融合タンパク質を作製する方法の例は、ここにおいてさらに説明される。
【００５１】
上記の本発明のペプチドは、化学的合成又は組換えＤＮＡ技術によって作製され得る。これらの方法は、当該技術分野において公知である。化学合成、特に固相合成は、短い（例えば、５０残基未満）のペプチド又は、Ｄ−Ｔｙｒ、オルニチン、アミノアジピン酸などの非天然若しくは非通常のアミノ酸を含むものに好ましい。組換え方法は、より長いペプチドに好ましい。組換え方法が選択される場合、合成遺伝子が新たに構築され得る、又は天然遺伝子が、例えばカセット突然変異誘発によって突然変異され得る。これらの方法は、ここで更に説明される。以下に記載されるのは、本発明のペプチドの化学合成のための例証的な一般方法である。
【００５２】
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５：２１４９（１９６３）によって一般的に説明されるように、固相合成を使用してペプチドは典型的に調製される（当該技術分野において知られる他の同等の化学合成が使用可能であるが）。固相合成は、保護されたαアミノ酸を適切な樹脂に結合させることによってペプチドのＣ−末端から開始される。このような出発材料は、αアミノ保護アミノ酸をエステル結合によってクロロメチル化樹脂又はヒドロキシメチル樹脂に結合させることによって、又はＢＨＡ樹脂又はＭＢＨＡ樹脂へのアミド結合によって調製され得る。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｄ．  （Ｌｏｎｄｏｎ），３８：１５９７−１５９８（１９６６）によって記載される。クロロメチル化樹脂は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，  Ｃａｌｉｆ．及び．Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。このような樹脂の調製は、Ｓｗｅｔｗａｒｔ等（“Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｆｒｅｅｍｅｎ  ＆  Ｃｏ．，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ  １９６９），Ｃｈａｐｔｅｒ  １，ｐｐ．１−６）によって記載される。ＢＨＡ及びＭＢＨＡ樹脂支持体は、商業的に入手可能であり、一般的に、合成される所望のプロペプチドがＣ末端に置換されていないアミドを有する場合にのみ使用される。
【００５３】
ペプチド結合の形成の技術分野においてよく知られる技術を用いてアミノ酸がペプチド鎖に結合される。１つの方法は、カルボキシル基をペプチド断片の遊離Ｎ末端アミノ基との反応により感受性であるようにする誘導体にアミノ酸を変換することを必要とする。例えば、アミノ酸は、保護アミノ酸とエチルクロロホルメート、フェニルクロロホルメート、ｓｅｃ‐ブチルクロロホルメート、イソブチルクロロホルメート、ピバロイルクロリド、又は同様の酸クロリドとの反応によって混合無水物に変換され得る。代替的に、アミノ酸は、２，４，５−トリクロロフェニルエステル、ペンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールから形成されるエステルなどの活性エステルに変換され得る。
【００５４】
他のカップリング方法は、Ｎ，Ｎ１−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はＮ，Ｎ１−ジイソプロピルカルボジイミド等の適切なカップリング剤の使用を必要とする。当業者に明らかな他の適切なカップリング剤は、Ｅ  Ｇｒｏｓｓ  ＆  Ｊ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  Ｉ：Ｍａｊｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｏｎｄ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９７９）。において開示されている。
【００５５】
ペプチド合成に使用される各アミノ酸のαアミノ基は、それらの活性のあるαアミノ官能基が関与する副反応を防ぐために、カップリング反応時に保護されなければならないことが認識されるべきである。特定のアミノ酸は、反応性のある側鎖官能基（例えば、スルフヒドリル、アミノ、カルボキシル及びヒドロキシル）を含み、最初と続くカップリング工程の両方の間においてその部位で化学反応が起こることを防止するために、このような官能基も、適切な保護基によって保護されなければならないことも認識されるべきである。当該技術分野において公知である適切な保護基は、Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ：  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８１）において記載される。
【００５６】
ペプチド合成において使用される特別な側鎖保護基の選択において、以下の一般的ルールが続く。αアミノ保護基は、カップリング反応において使用される条件下でαアミノ官能基を不活性にしなければならず、側鎖保護基を除去せず且つペプチド断片の構造を変化しない条件下でカップリング反応後に容易に除去可能でなければならず、カップリング直前の活性化に際したラセミ化の可能性を除かなければならない。側鎖保護基は、カップリング反応に使用される条件下で側鎖官能基を不活性にしなければならず、αアミノ保護基の除去において使用される条件下で安定でなければならず、ペプチド鎖の構造を変化させない反応条件下での所望のアミノ酸ペプチドの完成に際して容易に除去可能でなければならない。
【００５７】
ペプチド合成のために有用であると知られる保護基は、それらの除去のために使用される薬剤との反応性において変化することが当業者に明らかである。例えば、トリフェニルメチル及び２−（ｐ−ビフェニリル）イソプロピルオキシカルボニルなどの特定の保護基は、非常に不安定（labile）であり、マイルドな酸性条件下で開裂し得る。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ−アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニルなどの他の保護基は、不安定性が低く、それらの除去のために、酢酸中の三フッ化ホウ素、塩酸、トリフルオロ酢酸等の中適度に強い酸を必要とする。ベンジルオキシ−カルボニル（ＣＢＺ又はＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル及びイソプロピルオキシカルボニルなど更に他の保護基は、さらにより不安定性が低いため、それらの除去のために、トリフルオロ酢酸中のボロントリフルオロアセテート（boron trifluoroacetate）、臭化水素、フッ化水素などのより強い酸を必要とする。有用なアミノ酸保護基のクラスの中に、以下が含まれる：
（１）αアミノ酸について（a）フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）ＣＢＺ等の芳香族ウレタン型保護基、及び例えばｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−６−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、２，４−ジクロロベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジルオキシカルボニルなどの置換ＣＢＺ；（ｂ）ＢＯＣ、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、２−（ｐ−ビフェニリル）−イソプロピルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル等の脂肪族ウレタン型保護基；（ｃ）シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル（adamantyloxycarbonyl）、及びシクロヘキシルオキシカルボニル等のシクロアルキルウレタン型保護基；及び（ｄ）アリルオキシカルボニル。好ましいαアミノ保護基は、ＢＯＸ又はＦＭＯＣである。
【００５８】
（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基について、保護は、例えばＢＯＣ、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニルなどの（１）に上記される任意の基により得る。
【００５９】
（３）Ａｒｇのグアニジノ基について、保護は、ミトロ（mitro）、トシル、ＣＢＺ、アダマチルオキシカルボニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル、又は２，３，６−トリメチル−４−メトキシフェニルスルホニル、又はＢＯＣであり得る。
【００６０】
（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒのヒドロキシル基について、保護は、例えば、ｔ−ブチル等のＣ１〜Ｃ４アルキル；ベンジル（ＢＡＬ）；ｐ−メトキシベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−クロロベンジル、ｏ‐クロロベンジル及び２，６−ジクロロベンジル等の置換ＢＺＬにより得る。
【００６１】
（５）Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基について、保護は、例えば、ＢＺＬ、ｔ−ブチル、シクロヘキシル、シクロペンチル等の基を使用するエステル化により得る。
【００６２】
（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素については、トシル部分が適切に使用される。
【００６３】
（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基について、テトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ‐ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４−ブロモベンジル、又は２，６−ジクロロベンジル等の保護基が適切に使用される。好ましい保護基は、２，６−ジクロロベンジルである。
【００６４】
（８）Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖アミノ基については、キサンチル（Ｘａｎ）が好ましく使用される。
【００６５】
（９）Ｍｅｔについては、該アミノ酸は、好ましくは、非保護で残される。
【００６６】
（１０）Ｃｙｓのチオ基については、ｐ−メトキシベンジルが典型的に使用される。
【００６７】
Ｃ末端アミノ酸、例えば、Ｌｙｓは、適切に選択された保護基によってＮ−アミノ位置において保護される（Ｌｙｓの場合は、ＢＯＣ）。ＢＯＣ−Ｌｙｓ−ＯＨは、Ｈｏｒｉｋｉ等（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １６５−１６８  １９７８）において開示される手順に従って、又は約２５℃で２時間、撹拌を用いてイソプロピルカルボジイミドを使用して、ベンジヒドリルアミン（benzyhydrylamine）又はクロロメチル化樹脂に最初に結合され得る。ＢＯＣ‐保護アミノ酸の樹脂支持体への結合に続き、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はＴＦＡのみを使用することでαアミノ保護基が除去される。脱保護は、約０℃〜室温において実施される。ジオキサン中のＨＣｌなどの他の標準開裂試薬及び特定のαアミノ保護基の除去のための条件は、文献に記載される。
【００６８】
αアミノ保護基の除去の後、残るαアミノおよび側鎖保護アミノ酸は、所望の順序で段階的に結合される。合成において各アミノ酸を別個に付加することの代替として、幾つかは、固相合成機への添加の前に互いに結合され得る。適切なカップリング剤の選択は、当該技術のスキルの範囲内にある。カップリング剤として特に適するのは、Ｎ，Ｎ１−ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジイミドである。
【００６９】
各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は、固相リアクター中に過剰に導入され、カップリングが、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）又はＣＨ２Ｃｌ２又はこれらの混合物の媒体中で適切に実施される。不完全なカップリングが起こると、次のアミノ酸のカップリングの前のＮ−アミノ保護基の除去の前に、カップリング手順が繰り返される。合成の各段階におけるカップリング反応の成功は、モニターされ得る。合成をモニターする好ましい方法は、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，３４：５９５（１９７０））に記載されるニンヒドリン反応による。カップリング反応は、例えば、ＢＩＯＳＥＡＲＣＨ９５００ＴＭペプチド合成機等の十分に知られた方法を使用して自動的に実施され得る。
【００７０】
所望のペプチド配列の完成に際して、保護されたペプチドは、樹脂支持体から切断されなければならず、全ての保護基が除去されなければならない。切断反応及び保護基の除去は、同時に又は段階的に、適切に達成される。樹脂支持体が、クロロメチル化ポリスチレン樹脂である場合、ペプチドを樹脂に固定している結合は、Ｃ末端残基の遊離カルボキシル基と樹脂マトリクス上に存在する多くのクロロメチル基の１つとの間に形成されるエステル結合である。固定している結合は、エステル結合を切断し、樹脂マトリクスに浸透することができると知られる試薬によって切断され得ることが理解される。
【００７１】
特に便利な方法は、液体の無水フッ化水素を用いた処理による。この試薬は、ペプチドを樹脂から切断するだけでなく、また全ての保護基を除去する。従って、この試薬の使用は、完全に脱保護されたペプチドを直接的に供給する。クロロメチル化された樹脂が使用される場合、フッ化水素処理は、遊離のペプチド酸の形成を結果として生じる。ベンズヒドリルアミン樹脂が使用される場合、フッ化水素処理は、直接的に遊離のペプチドアミンを結果として生じる。アニソール及びジメチルスルフィドの存在下、０℃で１時間のフッ化水素を用いた反応は、同時に、側鎖保護基を除去し、樹脂からペプチドを放出する。
【００７２】
保護基を除去することなくペプチドを切断することが望まれる場合、保護ペプチド−樹脂は、Ｃ末端カルボキシル基がメチル化された保護ペプチドを生じるためにメタノリシスを受け得る。メチルエステルは、次いで、マイルドなアルカリ条件下で、遊離Ｃ末端カルボキシル基を与えるために、加水分解される。ペプチド鎖上の保護基は、次いで、液体フッ化水素などの強酸を用いた処理によって除去される。メタノリシスのために特に有用な技術は、保護されたペプチド−樹脂が、クラウンエーテルの存在下でメタノールとシアン化カリウムを用いて処理される、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ｐｒｏｃ  Ｆｉｆｔｈ  Ａｍｅｒ  Ｐｅｐｔ  Ｓｙｍｐ，Ｍ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ，  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｎ．Ｙ．，１９７７），ｐ．５１８−５２１）のものである。
【００７３】
クロロメチル化された樹脂が使用される場合に、保護ペプチド型樹脂を切断するもう１つの方法は、アンモノリシス又はヒドラジンを用いた処理による。望まれる場合は、結果生じるＣ末端アミド又はヒドラジドは、遊離Ｃ末端カルボキシル部分に加水分解され得、保護基は、慣用的に除去され得る。
【００７４】
Ｎ末端αアミノ基上に存在する保護基は、保護基が支持体から切断される前又は後に好ましく除去され得ることが理解される。
【００７５】
作製されるペプチドにおいて、四つの非同一の置換基に結合した炭素原子が非対称である場合、化合物は、ジアテレオアイソマー（disastereoisomer）、鏡像異性体、又はそれらの混合物として存在し得る。上記の合成は、ラセミ化合物、鏡像異性体、又はジアステレオアイソマーを出発材料又は中間体として使用し得る。このような合成から結果生じるジアステレオメリックプロダクトは、クロマトグラフィー又は結晶化法によって分離され得る。同様に、鏡像異性体プロダクト混合物は、同一技術又は当該技術分野において公知の他の方法によって分離され得る。不斉炭素原子の各々は（存在する場合）、２つの構造（Ｒ又はＳ）の一つであり得、両方は、本発明の範囲内である。
【００７６】
ペプチドの精製は、典型的に、分取ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）などの従来法、又はゲル浸透、イオン交換、分配クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー
（モノクローナル抗体カラムを含む）又は向流分配等の他の公知のクロマトグラフィー技術を使用して達成される。
【００７７】
上記のように、本発明のペプチドは、種々の無機及び有機の酸及び塩基の塩として調製され得る。多くの方法が、これらの塩の調製のために有用であり、当業者に公知である。例には、遊離酸又は遊離塩基の形態のペプチドと１以上のモル当量の所望される酸又は塩基の溶媒又は溶媒混合中での反応を含み、ここで塩は、不溶性である；又は水のような溶媒中では、その後、溶媒が蒸発、蒸留、凍結乾燥によって除去される。代替的に、遊離酸又は塩基の形態の産物は、所望の塩を形成するためにイオン交換樹脂を通過させられ得、または１つの塩の形態の産物は、同一の一般的方法を使用して他のものに変換され得る。
【００７８】
上記のペプチドの化学合成における使用のために必要とされる出発材料は、文献において公知であり、又は公知の方法及び公知の出発材料を使用して調製され得る。
【００７９】
本発明はまた、本発明に従ったペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００８０】
一側面において、核酸分子は、配列番号１、２、３、４、５又は６の１つに示される配列を有するペプチドをコードする。
【００８１】
典型的に、本発明の核酸分子は、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８、１９又は２０に示される配列の１つ、或いは配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０に示される配列の１つと相補的な配列を含む。
【００８２】
高ストリンジェンシー条件において上記のヌクレオチド配列の１つを有する分子にハイブリダイズし得る核酸分子は、この核酸分子の相補鎖として特に有用であり、バリアントである本発明のペプチドを十分にコードし得る。当該技術分野においてよく知られるように、核酸分子のハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーションのために使用されるバッファーのタイプ及びそのバッファーの温度によって制御され得る。“高ストリンジェンシー条件”とは、バッファーが、約０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含み、且つ温度が約６０℃である条件である。
【００８３】
上記の核酸分子は、ゲノムＤＮＡから、例えば、ＰＣＲ増幅によって、ゲノムライブラリーから、ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡから、ｃＤＮＡライブラリーから、又は合成的に誘導されたヌクレオチドを使用して合成的にＤＮＡ配列を構築することによって得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｄ  ｅｄ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）。
【００８４】
本発明の核酸分子は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸又はこれらの組合せであり得る。
【００８５】
本発明はまた、本発明の核酸分子を含むベクター又はコンストラクトを提供する。
【００８６】
配列番号１９又は２０に示される配列を含むベクターは、これらの配列が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓなどのグラム陽性菌における発現を制御するため、本発明のペプチド及び異種タンパク質を含む融合タンパク質の発現のために特に有用である。
【００８７】
ベクター又はコンストラクトは、典型的に、本発明の核酸分子を、細胞、例えば宿主細胞を形質転換するために使用され得る適切なプラスミド又はベクター中に挿入することによって得られる。一般的に、宿主細胞と適合性のある種由来である複製及び制御配列を含むプラスミドベクターは、それらの宿主と共に使用される。ベクターは、一般的に複製サイト及び形質転換された細胞における表現型の選択を提供することができるタンパク質又はペプチドをコードする配列を有する。
【００８８】
特に好ましいのは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌中への核酸分子の導入を可能にするベクターである。これらベクターの例は、ここにおいて更に説明される。
【００８９】
例えば、融合タンパク質コンストラクトを調製するために有用であり得るベクターは、ｐＢＲ３２２及びその誘導体である。ｐＢＲ３２２は、Ｅ．ｃｏｌｉ種由来のプラスミドである（例えば、Ｍａｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５３：１５４（１９７０）を参照）。  プラスミドｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン抵抗性の遺伝子を含有し、従って、選択のための容易な手段を提供する。他のベクターは、発現において多くの場合重要である異なるプロモーター等の異なる特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ７２０、及びｐＰＬ−ｌａｍｂｄａは、現在利用可能であるｔａｃ、ｔｒｐ又はＰＬプロモーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を有する発現ベクターを表わす。
【００９０】
有用なベクターは、ｐＢ０４７５である。このベクターは、ファージ及びＥ．ｃｏｌｉのための複製起点を含み、このような宿主間でそれがシャトルされることを可能にし、従って、突然変異と発現の両方を促進する（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４３：  １３３０−１３３６  （１９８９）；  Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ５，５８０，７２３）。他の有用なベクターは、ｐＲ１Ｔ５及びｐＲ１Ｔ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）である。これらのベクターは、タンパク質ＡのＺドメインが続く適切なプロモーターを含み、遺伝子がベクター中に挿入され、融合タンパク質として発現されることを可能にする。
【００９１】
他の有用なベクターが、上記のベクターの関連する特性を組み合わせることによって、標準技術を使用して構築され得る。関連性のある特性には、プロモーター、リボソーム結合部位、デコーシン（decorsin）又はオルナチン（ornatin）遺伝子、或いは遺伝子融合（タンパク質ＡのＺドメイン及びデコーシン又はオルナチン及びそのリンカー）、抗生物質抵抗性マーカー、及び適切な複製起点が含まれる。
【００９２】
本発明はまた、上記のベクター又はコンストラクトを含む細胞を提供する。宿主細胞は、典型的に原核生物であり、典型的に、例えばＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ等のグラム陽性菌である。例は、表２に示される。
【００９３】
【表２】
2007531508.tif 000003
【００９４】
原核生物は、本発明のペプチドを産生するために、本発明の核酸分子をクローニング及び発現するために使用され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）は、Ｅ．ｃｏｌｉＢ、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣ番号３１５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ  ｃ６００及びｃ６００ｈｆｌ、Ｅ．ｃｏｌｉＷ３１１０（Ｆ−、ガンマ−（gama-）、原栄養株／ＡＴＣＣ番号２７３２５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ等のバチルス、及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ＿ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ又はＳｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓａｎｓ等の他の腸内細菌、及び種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種と同様に使用され得る。原核生物によって発現される場合、本発明のペプチドは、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンを含み得、そしてグリコシル化されない。融合タンパク質の場合、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンは、融合タンパク質のアミノ末端又は融合タンパク質のシグナル配列上に存在し得る。
【００９５】
本発明はまた、本発明のペプチドを生産するためのプロセスを提供する。該プロセスは、上記の核酸分子或いは上記のベクター又はコンストラクトを含む細胞を、該細胞にペプチドを産生させるために条件下に維持することを含む。
【００９６】
該プロセスは、必要に応じて、タンパク質を回収及び又は精製するステップを含み得る。該ペプチドの精製は、典型的に、分取ＨＰＬＣ（逆相ＨＰＬＣを含む）などの従来的な方法又は、ゲル浸透、イオン交換、分配クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー（モノクローナル抗体カラムを含む）又は向流分配等の他の公知のクロマトグラフィー技術を使用して達成される。
【００９７】
本発明のペプチドの発現は、ここにおいて更に説明される。他の例証的な発現システムは、以下の表３に記載されるものを含む。
【００９８】
【表３】
2007531508.tif 000004
【００９９】
Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍ  Ｍ，  Ｂｅｅｒｔｈｕｙｚｅｎ  ＭＭ，  Ｖａｕｇｈａｎ  ＥＥ，  ｄｅ  Ｖｏｓ  ＷＭ，  Ｋｕｉｐｅｒｓ  ＯＰ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｃｔｅｒｉａ：  ｔｒａｎｓｆｅｒａｂｌｅ  ｎｉｓｉｎ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ，  Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ，  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｃ  ｓｐｐ．  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １９９７  Ｎｏｖ；  ６３  （１１）：  ４５８１−４；  Ｋｒｕｇｅｒ  Ｃ，  Ｈｕ  Ｙ，  Ｐａｎ  Ｑ，  Ｍａｒｃｏｔｔｅ  Ｈ，  Ｈｕｌｔｂｅｒｇ  Ａ，  Ｄｅｌｗａｒ  Ｄ，  ｖａｎ  Ｄａｌｅｎ  ＰＪ，  Ｐｏｕｗｅｌｓ  ＰＨ，  Ｌｅｅｒ  ＲＪ，  Ｋｅｌｌｙ  ＣＧ，  ｖａｎ  Ｄｏｌｌｅｎｗｅｅｒｄ  Ｃ，  Ｍａ  ＪＫ，  Ｈａｍｍａｒｓｔｒｏｍ  Ｌ．  Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２００２  Ｊｕｌ；  ２０  （７）：  ７０２−６；  Ｐｒｅｚ−Ａｒｅｌｌａｎｏ  Ｉ，  Ｐｒｅｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｇ．  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＧＦＰ）  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｌａｃｔｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ．  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２００３  Ｍａｙ  １６；  ２２２（１）：  １２３−７；  Ｓａｖｉｊｏｋｉ  Ｋ，  Ｋａｈａｌａ  Ｍ，  Ｐａｌｖａ  Ａ．  Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ  Ｓ−ｌａｙｅｒ  ｓｉｇｎａｌｓ．  Ｇｅｎｅ．  １９９７  Ｆｅｂ  ２８；  １８６  （２）：  ２５５−６２；  Ｗｅｌｌｓ  ＪＭ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＰＷ，  Ｎｏｒｔｏｎ  ＰＭ，  Ｇａｓｓｏｎ  ＭＪ，  Ｌｅ  Ｐａｇｅ  ＲＷ．  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ：  ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｅｔｈａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｉｏｌ．  １９９３  Ｊｕｎ；  ８  （６）：  １１５５−６２．
本発明は、以下に特定の非制限的実施例を参照して説明される。多くのバリエーション及び／又は修飾が、広く記載される本発明の意図及び範囲を脱することなく本発明に成され得ることを当業者は理解する。以下の実施例は、全ての側面において例証的であり、限定的でないと考えられる。
【実施例】
【０１００】
実施例１  Ｓｅｐの産生
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１は、３７℃で静止のＭＲＳブロス中で増殖され、フラクションが５つのタイムポイント（timepoint）で採取された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、増殖時の上清中に蓄積した多くのタンパク質を明らかにした（図１）。最も小さい目に見えるタンパク質（矢印で示される）は、多くの他のタンパク質のレベルが減少した後期の定常期においても依然として豊富であった。このタンパク質は、スモール輸出タンパク質(small export protein)としてＳｅｐと呼ばれた。その小さなサイズが考慮されると、Ｓｅｐは，Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１の上清中に見られる最も豊富なタンパク質の１つである。Ｓｅｐをさらに特徴付けるために、我々は、ＤＴＩＹＴＶＱＳＧＤＴＬＳＧＩであることが見出されたＮ末端配列を同定した。Ｓｅｐは、３０のアミノ酸のＮ末端分泌シグナルを有する２０５アミノ酸のタンパク質であり、５．３の等電点を有する推定１９ｋＤａの成熟タンパク質を生じる。
【０１０１】
実施例２  Ｓｅｐプロモーターの制御下のＳｅｐ−Ｅカドヘリン融合タンパク質
大腸菌ＪＭ１０９が分子クローニング実験において使用された。アンピシリンが１００又は２００μｇ／ｍｌの濃度でＥ．ｃｏｌｉについて使用され、一方でエリスロマイシンが７５０μｇ／ｍｌの濃度でＥ．ｃｏｌｉについて使用された。プラスミドｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＫＳ）及びｐＧＥＭ３ｚｆが通常のクローニングのために使用された。
【０１０２】
成熟Ｅ−カドヘリンタンパク質のアミノ末端の１〜２１６アミノ酸をコードする領域が、培養された哺乳類のＴ４７Ｄ及びＬＮＣａｐ細胞から調製されたｃＤＮＡ鋳型から、オリゴヌクレオチドＥ−ｃａｄ−ＰｓｔＩ及びＥ−ｃａｄ−ＸｈｏＩを用いてＰＣＲで増幅された。この断片は、コンストラクトＳｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｅｃａｄを生成するために、Ｓｅｐ分泌シグナルをコードするＤＮＡの下流にインフレームでクローニングされた。コドン２１６の後に導入されたストップコドンを含んだクローニングされたＥ−カドヘリンＤＮＡ断片の配列が、ＤＮＡシークエンシングによって確認された。推定のｂｓｐＡ転写ターミネーターは、オリゴヌクレオチドＴｅｒｍ−Ｘｈｏ及びＴｅｒｍ−Ｈｉｎｄを使用して増幅され、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎコーディングＤＮＡの下流にクローニングされた。
【０１０３】
ｐＪＲＳ２３３中にコンストラクトは、ペニシリンを細胞壁弱化剤として１又は１０μｇ／ｍｌの濃度で各々使用してＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１中に以前に記載されるように形質転換された（Ｒｕｓｈ，  Ｃ．Ｍ．，  Ｌ．Ｍ．  Ｈａｆｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｔｉｍｍｓ．  １９９４．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｖａｇｉｎａｌ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｆ  Ｌｃａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｔｒａｃｔ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖａｇｉｎａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４１：  ２７２−２７８；  ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，  Ａ．，  Ｍ．Ｓ．  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｐ．  Ｇｉｆｆａｒｄ  Ｌ．Ｍ．  Ｈａｆｎｅｒ，  ａｎｄ  Ｐ．  Ｔｉｍｍｓ．  ２０００．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｄ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒａｌ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １７３：  ３８３−３８９）。該コンストラクトは、形質転換体を４０℃でエリスロマイシンセレクションの存在下でインキュベートすることによって、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍのｓｅｐプロモーターの下流の染色体中に組み込まれた。
【０１０４】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１は、固体のＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ，  Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）上で嫌気的に、又は静止液体培養チューブ中で増殖された。エリスロマイシンは、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍについて１０μｇ／ｍｌの濃度で使用された。
【０１０５】
細胞抽出物は、後期の対数又は早期の定常期から調製され、一方で上清は、後期の指数増殖期培養物から採取された。細胞を２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で煮沸するか（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｅ．Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．  １９８９．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）又は、超音波破砕（Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｌ．Ｍ．  Ｈａｆｎｅｒ，  Ｔ．  Ｗａｌｓｈ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．  Ｇｉｆｆａｒｄ．  ２００３．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ＬＰＸＴＧ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６９：  ５８５５−５８６３）を含む２つの異なる全細胞タンパク質抽出方法が、以前に記載されるように使用された。細胞の５Ｍ  ＬｉＣｌ抽出物及び上清画分も以前に記載されるように得られた（Ｔｕｒｎｅｒ  ２００３）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディング前に全てのサンプルが５分間煮沸された。タンパク質は、ニトロセルロースに移され、ブロックされ、次いで抗Ｈｉｓ５モノクローナル抗体（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を１０００倍希釈で用いてプローブされた。洗浄に続いて、膜がウサギ抗マウス−ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート（Ｄａｋｏ，  Ｇｌｏｓｔｒｏｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）と共にインキュベートされた。結合した抗体は、ＨＲＰ化学ルミネッセンスキット（Ｒｏｃｈｅ，  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して検出された。抽出物中のＨｉｓ６タンパク質のレベルを推定するために、異なる量のＨｉｓ６ラベルされたタンパク質マーカー（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｇｌｏｓｔｒｏｐ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）が、サンプルの横に含まれた。これらのマーカーは、各バンド中に既知量のＨｉｓ６含有タンパク質を有し、ＴｏｔａｌＬａｂ  ｖ１．１１パッケージ（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ，  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ，  Ｕｎｉｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用してフィルム上でデンシトメトリーを実施することを可能にする。Ｅ−カドヘリンの検出のために、マウスモノクローナル抗ヒトＥ−カドヘリン抗体（クローン ＨＥＣＤ−１；  Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．から）が、７５０分の１の濃度で使用された。
【０１０６】
Ｅ−カドヘリン融合タンパク質は、３０℃で増殖した細胞からのＳＤＳ細胞抽出物及び上清中で検出された（図２）。３０℃におけるこの菌株についてのＥ−カドヘリン融合タンパク質のレベルは、上清においては、リットル培養物毎に〜３０μｇであり、ＳＤＳ細胞抽出物においてはリットル培養物毎に〜３７０μｇであった。Ｅ−カドヘリン融合タンパク質の推定されるサイズは、２５ｋＤａであるが、ウェスタンブロットにおける抗Ｈｉｓ５抗体によって認識されたタンパク質は、〜３８ｋＤａと決定した。このタンパク質が本当にＥ−カドヘリンであることを確認するために、マウスモノクローナル抗ヒトＥカドヘリン抗体がウェスタンブロットにおける一次抗体として使用された。抗Ｅカドヘリン抗体は、抗Ｈｉｓ５抗体を使用して認識されたタンパク質と同一サイズの蛋白質を認識し、親のＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１株の上清中で見出されたタンパク質を認識しなかった。これらの結果は、Ｓｅｐの発現及び分泌シグナルが、ヒトのアミノ末端ＥカドヘリンペプチドをＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ中で分泌させるために使用され得ることを示唆する。Ｅカドヘリンのアミノ末端は病原体Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを引き起こす食品媒介疾患についての主な腸内細胞受容体であるため、このコンストラクトは、腸内のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの接着阻害治療薬として可能性を有し得る。
【０１０７】
実施例３  Ｓｅｐプロモーターの制御下のＳｅｐ−６ｘＨｉｓ融合タンパク質
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９が分子クローニング実験において使用された。アンピシリンは、Ｅ．ｃｏｌｉについて、１００又は２００μｇ／ｍｌの濃度で使用された。プラスミドｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＫＳ）、及びｐＧＥＭ３ｚｆが通常のクローニングのために使用された。
【０１０８】
コンストラクト（Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐ）は、Ｓｅｐの上流ＤＮＡ及び分泌シグナルをコードするｓｅｐ５’領域及び６ヒスチジン（Ｈｉｓ６）エピトープ（Ｎｔｅｒｍ−ＵＳ−Ｘｂａ及びＮｔｅｒｍ−Ｐｓｔ−ＵＳを用いて増幅及びクローニングされた）及び成熟Ｓｅｐタンパク質と推定ｓｅｐ転写ターミネーターをコードするＤＮＡ（ＳｅｐＤＳ−ＰｓｔＸｈｏ及びＳｅｐＤＳ−ＡｐａＳａｌを用いて増幅及びクローニングされた）から成る。該コンストラクト（ＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐ）は、上記のように成熟Ｓｅｐタンパク質と推定ｓｅｐ転写ターミネーターから成るが、以前に記載されるように、代わりにＢｓｐＡ分泌シグナルとＨｉｓ６エピトープをコードするＤＮＡが続く完全長のＢｓｐＡタンパク質をコードする上流ＤＮＡを含む（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記）。Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−ＳｅｐコンストラクトにおけるＳｅｐの成熟Ｎ末端上に付加されたエキストラアミノ酸は、：ＤＴＩＹＴＤＨＨＨＨＨＨＳＡＡＧＳＲであり、ＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクトは、：ＡＳＤＤＶＨＨＨＨＨＨＳＡＡＧＳＲである。
【０１０９】
これらの発現カセットは、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ中で構築され、次いでＸｂａＩ及びＳａｌ１で消化されたｐＪＲＳ２３３中にクローニングされた。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ中のＳｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクトも、ＳａｌＩで消化され、ＸｈｏＩで消化されたｐＧｈ９：ＩＳＳ１中にクローニングされた。
【０１１０】
ｐＪＲＳ２３３中のコンストラクトは、以前に記載されるように、ペニシリンを細胞壁弱化剤として各々１又は１０μｇ／ｍｌの濃度で使用してＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１中に形質転換された（Ｒｕｓｈ，ＭｃＣｒａｃｈｅｎ，上記）。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍにおける発現は、エリスロマイシン選抜の存在下で形質転換体を４０℃でインキュベートすることによって、ｓｅｐ又はｂｓｐＡプロモーター（図３Ａ又は３Ｂ）のどちらかの下流のキメラ遺伝子を組み込むことによって達成された。
【０１１１】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１は、固体のＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）上で嫌気的に、又は静止液体培養チューブ中で、増殖された。エリスロマイシンは、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍについて１０μｇ／ｍｌの濃度で使用された。
【０１１２】
Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ及びＬ．ｌａｃｔｉｓの場合、Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクトは、細胞中に形質転換され、ｐＧｈ９：ＩＳＳ１プラスミド中にクローニングされた（Ｍａｇｕｉｎ，  Ｅ．，  Ｈ．  Ｐｒｅｖｏｓｔ，  Ｓ．Ｄ．  Ｅｈｒｌｉｃｈ，  ａｎｄ  Ａ．  Ｇｒｕｓｓ．  １９９６．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｌａｃｔｏｃｏｃｃｉ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８：  ９３１−９３５）。
【０１１３】
Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ（ＡＴＣＣ  ５３１０３）は、固体のＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）上で嫌気的に、又は静止液体培養チューブ中で増殖された。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３は、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグルコースが添加されたＭ１７培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）中で３０℃で増殖された（ＧＭ１７）。エリスロマイシンは、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓについては１０μｇ／ｍｌそしてＬ．ｌａｃｔｉｓについては５μｇ／ｍｌの濃度で使用された。
【０１１４】
Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓの形質転換は、以前に記載されるように、ペニシリンを細胞壁弱化剤として各々１又は１０μｇ／ｍｌで使用して行われた（Ｒｕｓｈ，ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，２０００，上記）。Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、形質転換体が５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含むＧＭ１７プレート上で直接的に選択される以外は、以前に記載されるように、１％のグリシンを細胞壁弱化剤として使用して形質転換された（Ｈｏｌｏ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｉ．Ｆ．  Ｎｅｓ．  １９８９．  Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｒｅｍｏｒｉｓ  ｇｒｏｗｎ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｉｎｅ  ｉｎ  ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｍｅｄｉａ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ５５：  ３１１９−３１２３）。
Ｌ．ｌａｃｔｉｓ形質転換体は、温度感受性ｐＧｈ９：ＩＳＳ１プラスミド誘導体の複製を可能にするために３０℃で増殖され、一方でＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ形質転換体はプレート上で３０℃で、及び液体中で３０℃又は３７℃で増殖される。
【０１１５】
細胞分画法、タンパク質抽出、及びウェスタンブロット分析は、実施例２において記載されるように実施された。Ｈｉｓ６エピトープの全細胞におけるアクセシビリティーは、以前に記載されるもの同様に行われた（Ｔｕｒｎｅｒ  ２００３  上記）。
【０１１６】
ウェスタンブロットにおけるバンドは、サイズ２８ｋＤａのタンパク質に対応するが（図３Ａ及び３Ｂ）、成熟Ｈｉｓ６−Ｓｅｐ融合タンパク質の予測される分子量は、２１−ｋＤａである。Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐ及びＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクトを含むＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍにおいてＳｅｐ融合タンパク質は、大部分が両方の場合においてリットル培養物毎に〜２ｍｇのレベルで上清中に見られた。Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐ及びＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクトを含むＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍについてのＳＤＳ細胞抽出物におけるＳｅｐ融合タンパク質のレベルは、各々上清において見られるものの〜９％及び〜１３％であった。ソニケート又は５Ｍ  ＬｉＣｌ抽出物中に、Ｓｅｐ融合タンパク質は検出されなかった。ＳＤＳ細胞及び上清抽出物が、隣のレーンに流されると、Ｓｅｐ融合タンパク質のバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で一致して移動した（データは示されない）。これは、細胞に付随したＳｅｐ融合タンパク質が、成熟形態であり、従ってシグナル配列を含まず、細胞膜の外側に局在することを示唆する。
【０１１７】
Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ及びＬ．ｌａｃｔｉｓにおいて、Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクトから発現されたＳｅｐ融合タンパク質のレベルは、各々上清中のリットル培養物毎に〜２００及び〜３００μｇであることが見出された（図３Ｃ及び３Ｄ）。Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ及びＬ．ｌａｃｔｉｓについてのＳＤＳ細胞抽出物におけるＳｅｐ融合タンパク質のレベルは、上清中に見られたものの各々＜１％及び〜１０％であった。興味深い事に、僅かに大きな分子量のＨｉｓ６反応性タンパク質がＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ及びＬ．ｌａｃｔｉｓ両方のソニケート細胞抽出物及びＬ．ｌａｃｔｉｓのＳＤＳ細胞抽出物において観られた。このバンドは、おそらくその分泌シグナルを依然として含有するＳｅｐ融合タンパク質に対応する。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍのように、Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクト含むＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ又はＬ．ｌａｃｔｉｓのどちらの５Ｍ  ＬｉＣｌ抽出物中にも、Ｈｉｓ６−Ｓｅｐは検出されなかった。
【０１１８】
ＳｅｐがＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍの細胞表面上に露出しているかを調べるために、Ｈｉｓ６エピトープについて全細胞の酵素結合イムノソルベント検定法が、以前に記載されるのと同様に実施された（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  上記）。ＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐコンストラクトを含むＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ細胞について得られた細胞のＯＤ６００ｎｍユニット毎のＡ４０５ｎｍシグナル（０．０３０２±０．０００３）は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１細胞について（０．０１６８±０．０００７）よりも顕著に高かった（１．８倍）。この結果は、少なくとも幾つかの細胞結合Ｓｅｐが、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍの細胞エンベロープにおいて露出した形態で局在することを示唆する。
【０１１９】
実施例４  Ｓｅｐの発現及び分泌シグナルを使用したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧにおけるヒトビトロネクチンの発現
ここで使用される発現コンストラクトは、ヒトビトロネクチンが宿主Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｕから培養上清中に輸送されるようなＳｅｐ発現及び分泌シグナルを利用する。成熟ビトロネクチン遺伝子は、ｃＤＮＡから増幅され、制限酵素ＰｓｔＩ及びＸｈｏＩを使用してＳｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｅｃａｄ発現カセット中にクローニングされた。そのｐＧｈ９：：ＩＳＳ１プラスミド中への挿入に続いて、ハイブリッドがＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍＢＲ１１及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ中にトランスフォームされた。３２℃での２日の増殖に続いて、細胞は分画されＨｉｓ６でタグされたビトロネクチンを検出するためにウェスタンブロットを使用して分析された。
【０１２０】
２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で細胞を煮沸することによって調製された細胞抽出物（Ｃ）及び沈殿した上清フラクション（Ｓ）を含むレーンが示される。各レーンにロードされた細胞又は培地の量は、培養物の１ｍｌ（Ｃ）及び９００μｌ（Ｓ）と等しい。
【０１２１】
成熟非グリコシル化Ｈｉｓ６−ビトロネクチンの予測されるサイズは、５４ｋＤａである。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１のクローンについて、上清中に明らかなドミナントタンパク質〜５２ｋＤａが存在し、これはおそらく完全長のビトロネクチンと一致する（図４）。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１クローンの細胞抽出物は、大部分がより小さいおそらく分解された形態のビトロネクチンである多くのバンドを示す。Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧのクローンについて、上清フラクション中に１つのドミナントバンド（〜４７ｋＤａ）が存在し、これは、おそらく少量のＣ末端分解を有するＨｉｓ６−ビトロネクチンに対応する。
【０１２２】
従って、結論として、Ｓｅｐは、一般的に安全と認められる乳酸菌中で商業的に重要である大きなシステインリッチなヒトタンパク質を発現及び分泌することが示された。
【０１２３】
実施例５  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓによる活性Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  バクテリオファージＡ５１１の発現及び分泌
材料及び方法
細菌株、プラスミド及び増殖条件
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１，  Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ  （ＡＴＣＣ  ５３１０３）及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  １４９１７は、嫌気的に固体のＭＲＳ培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕ．Ｋ．）上又は静止液体培養チューブ中で増殖された。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３は、０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のグルコースを添加したＭ１７培地（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｕ．Ｋ．）（ＧＭ１７）中で、且つ適切な場合はエリスロマイシンの存在下で（ＧＭ１７Ｅ）３０℃で増殖された。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９が、分子クローニング実験において使用された。アンピシリンがＥ．ｃｏｌｉについて１００又は２００μｇ／ｍｌの濃度で使用され、一方でエリスロマイシンがＥ．ｃｏｌｉについて５００〜７５０μｇ／ｍｌ、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉについて１０μｇ／ｍｌ、そしてＬ．ｌａｃｔｉｓについて５μｇ／ｍｌの濃度で使用された。発現カセットは、ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１を使用して乳酸菌中に導入された。プラスミドｐＧＥＭ３Ｚｆが通常のクローニングのために使用された。
【０１２４】
ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ及びＬ．ｌａｃｔｉｓの形質転換
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの形質転換は、ペニシリンを細胞壁弱化剤として各々１．２５、１０及び５μｇ／ｍｌの濃度で使用して行われた。Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、形質転換体が５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＧＭ１７プレート上で直接的に選択されたことを除いて、１％グリシンを細胞壁弱化剤として使用して形質転換された。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ形質転換体（ｐＧｈ９：ＩＳＳ１誘導体を含む）は、３０℃で増殖され、一方でｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ形質転換体（ｐＧｈ９：ＩＳＳ１誘導体を含む）は、プレート上及び液体培地中で３２〜３３℃で増殖された。
【０１２５】
ｐｌｙ５１１のＳｅｐ分泌発現カセット中への構築
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓファージＡ５１１のエンドリシンＰｌｙ５１１のアミノ酸１〜３４１をコードするＤＮＡは、クローニングされたｐｌｙ５１１を鋳型として使用して増幅された。このフラグメントは、Ｅカドヘリンコーディング遺伝子断片がｐｌｙ５１１遺伝子で置換されるように、Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｅｃａｄ発現コンストラクトを含むプラスミドｐＧＥＭ−３Ｚｆ中で、Ｓｅｐ分泌シグナルをコードするＤＮＡの下流にインフレームでクローニングされた。新たなプラスミドは、ｐＳｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｐｌｙ５１１と命名された。Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｐｌｙ５１１コンストラクトの機能部分は、オリゴヌクレオチドＳｅｐＵＳ−Ｅｃｏ及びＴｅｒｍ−Ｈｉｎｄ−ｔｒｕｎｃを用いて増幅され、１．９ｋｂフラグメントが次いでＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化された。このフラグメントは、同様に消化されたｐＧｈ９：：ＩＳＳ１（これはＩＳＳ１挿入配列を除去する）にライゲートされ、ライゲーションミックスは、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ中に直接的にトランスフォームされた。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ形質転換体は、可視の濁りを得るように、５μｇ／ｍｌのエリスロマイシン及び十分なオートクレーブされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ４９１細胞を含むＧＭ１７アガー上にプレートされた。２日後、活性Ｐｌｙ５１１を分泌するクローンがコロニーの周りの透明ゾーンの形成によって検出され得る。陽性クローンからのプラスミドは精製され、そしてｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉを形質転換するために使用された。
【０１２６】
細胞分画、タンパク質抽出、及びウェスタンブロット分析
細胞抽出物及び上清は、後期の指数増殖期又は初期の定常期の培養物から調製された。細胞抽出物は、２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で細胞を煮沸することによって調製され、上清は、以前に記載されるように、５％トリクロロ酢酸を使用して濃縮された。タンパク質は、ニトロセルロース中に移され、ブロックされ、次いで４０００分の１の希釈の抗Ｈｉｓ５ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート抗体（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプローブされた。結合した抗体は、Ｌｕｍｉ−ｌｉｇｈｔ化学ルミネセンスキット（Ｒｏｃｈｅ、マンハイム、ドイツ国）を用いて検出された。抽出物中のＨｉｓ６タンパク質のレベルを推測するために、種々の量のＨｉｓ６ラベルされたタンパク質マーカー（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）がサンプルの横に含まれた。これらのマーカーは、各バンド中に既知量のＨｉｓ６含有タンパク質を有し、ＴｏｔａｌＬａｂ  ｖ１．１１パッケージ（Ｐｈｏｒｅｔｉｘ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ、Ｕ．Ｋ．）を使用したフィルム上での密度測定を可能にする。
【０１２７】
再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
タンパク質は、４％の濃縮用ゲル及び１０ｍｌの１２％分離ゲル（オートクレーブされ且つ使用済みＢＨＩブロス中で１００倍に濃縮されたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ４９１を０．５ｍｌ含む）を使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離された。電気泳動に続いて、ゲルは蒸留水で１０分間洗浄され、次いで２３℃で２０時間、再生バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ及び１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を３〜４度チェンジして緩やかに振盪された。ゲルは、次いで蒸留水で簡略にすすがれ、次いで０．０１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＫＯＨ中の０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）メチレンブルーを用いて２時間染色され、次いで蒸留水を数回代えて脱色された。
【０１２８】
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの細胞壁溶解活性のフォトメトリック検出
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ＢＨＩ中で一晩増殖され、細胞は、（ｉ）ＳＭバッファー中で１００倍に濃縮され凍結保存された、又は（ｉｉ）オートクレーブされ使用済みＢＨＩ中で１００倍に濃縮され凍結保存された。分泌されたエンドリシン活性の試験のために、中期から後期の指数増殖期に増殖された乳酸菌からの上清（９００μｌ）は、１００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）の添加によって緩衝化され、キュベット中に置かれた。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓサブストレート細胞が、キュベットに添加されＯＤ６００における任意の変化が２３°で経時的にモニターされた。
【０１２９】
寒天プレート上の乳酸菌コロニーによるｐｌｙ５１１の分泌の検出
１５ｍｌ（最終容量）に対して、０．３ｍｌの１００倍に濃縮されたオートクレーブされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ４９１がＭＲＳ又はＧＭ１７アガーに添加された。エリスロマイシンも前記の濃度で（野生型のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍの増殖のために使用されたアガーを除く）、アガーに添加された。アガーは、０．２Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）（最終濃度）を用いて緩衝化され、最終容量は１５ｍｌに維持された。
【０１３０】
Ｐｌｙ５１１を分泌する乳酸菌によるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの殺菌
乳酸菌及びＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＱＵＴ００８５は、中期から後期の指数増殖期まで増殖され、細胞は遠心分離によって収穫された。乳酸菌は、新しいＢＨＩブロス中で二回、そしてＳＭバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４；ｐＨ７．５）中で一回洗浄され、一方でＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＱＵＴ００８５は、ＢＨＩ中で一回、そしてＳＭバッファー中で一回洗浄された。細胞は、乳酸菌については〜１０１０細胞／ｍｌ、そしてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＱＵＴ００８５については〜１０９細胞／ｍｌで再懸濁された。２００μｌの乳酸菌が８００μｌのＳＭバッファーに添加され、これは次いで１００μｌのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＱＵＴ００８５と混合された。混合物は、３２℃で２．５時間インキュベートされ、次いでＳＭバッファー中で希釈され、生きているＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＱＵＴ００８５を測定するために、Ｏｘｆｏｒｄアガー（Ｏｘｏｉｄ、Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ、Ｕ．Ｋ．）上にプレートされた。
【０１３１】
結果
エンドリシン遺伝子ｐｌｙ５１１のＳｅｐ分泌カセット中へのクローニング
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓバクテリオファージＡ５１１のＰｌｙ５１１エンドリシンをコードするＤＮＡは、ｓｅｐプロモーターとＳｅｐ分泌シグナルをコードするＤＮＡの下流にインフレームでクローニングされた（図５）。発現タンパク質の検出を容易にするために、Ｈｉｓ６エピトープがＳｅｐ分泌シグナルと異種タンパク質の開始の間に配置される（図５）。Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｐｌｙ５１１コンストラクトは、ＰＣＴによって増幅され、消化され、同様に消化されたｐＧｈ９：：ＩＳＳ中にライゲートされた。ライゲーション反応物は、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ中に形質転換され、細胞は、Ｐｌｙ５１１の細胞壁溶解活性を検出するために、エリスロマイシン及びオートクローブされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ４９１細胞を含むＧＭ１７上にプレートされた。コロニーの周りに透明ゾーンを有した幾つかの形質転換体が収穫され、それらのプラスミドは精製された。これらコロニーの１つからのプラスミドは、ｐＳｅｐ５１１ｓｅｃと命名された。
【０１３２】
Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１４９１７及びＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３におけるＰｌｙ５１１の発現及び分泌
プラスミドｐＳｅｐ５１１ｓｅｃは、エレクトロポレーションによって、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ  ＡＴＣＣ１４９１７中に形質転換された。細胞抽出物及び上清フラクションは、ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ及びＬ．ｌａｃｔｉｓ形質転換体から回収され抗Ｈｉｓ５−ＨＲＰコンジュゲートを用いてウェスタンブロッティングで分析された。バンドは、全ての株において見られ、各レーンにおける最大は、〜４０ｋＤａであり、これは、Ｈｉｓ６−Ｐｌｙ５１１の計算された分子量（３８．２ｋＤａ）と近似する（図６Ａ）。全ての株は、上清フラクション及び細胞結合フラクションにおいてＨｉｓ６−Ｐｌｙ５１１を有した。Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓを除く全ての株は、より小さい分子量バンドを有し、タンパク質分解の可能性を示す。ウェスタンブロットによる分析、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは最大量のＨｉｓ６−Ｐｌｙ５１１を産生し、そして完全長Ｈｉｓ６−Ｐｌｙ５１１のレベルは、培養物のリットル毎に〜１０μｇであると推測された。Ｈｉｓ６−Ｐｌｙ５１１が活性を有するかを測定するために、プラスミド無し、ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１又はｐＳｅｐ５１１ｓｅｃのいずれかを含む株からの上清が再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された。オートクレーブされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ４９１細胞は、分離ゲル中に取り込まれ、活性が透明バンドとして同定された（図６Ｂ）。〜４０ｋＤａのバンドがｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含む株からの全ての上清画分において見られたが、野生型又はｐＧｈ：：ＩＳＳ１を含む株では見られなかった。余分な内因性のより大きな分子量の透明バンドがＬ．ｌａｃｔｉｓ（〜４５ｋＤａ）及びＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｓ（〜５２及び〜７２ｋＤａ）の上清フラクションで見られた。
【０１３３】
乳酸菌によって分泌されたＰｌｙ５１１の活性は、０．２Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７）を用いた緩衝化によって促進される。
【０１３４】
ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ及びＬ．ｌａｃｔｉｓによって産生された乳酸がＰｌｙ５１１活性に影響するかを測定するために、我々は、オートクレーブされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ４９１を含むアガー増殖培地を中性付近で０．２Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７）の添加によって緩衝化した。ｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含有するＬ．ｌａｃｔｉｓは、通常の増殖培地上の小さな透明ゾーン及び緩衝化された増殖培地上の大きな透明ゾーンを作った（表５、図７）。通常の増殖培地において、ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１又はｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含有するＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍの両方は、同一の中位サイズの透明ゾーンを作ったが、一方で緩衝化された増殖培地においては、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ｐＳｅｐ５１１ｓｅｃのみが中位の透明ゾーンを作った（表５、図７）。ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１又はｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含有するＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓの両方は、通常の増殖培地上に透明ゾーンを作らなかったが、大きな透明ゾーンが、緩衝化された増殖培地上で増殖したｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含有するＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓによって作られたが、ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１を含有するＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓによっては、作られなかった（表５、図７）。ｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含有するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは、小さなサイズの透明ゾーンを作り、一方で野生型のＰｌａｎｔａｒｕｍは作らなかった。緩衝化された増殖培地上において、ｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含有するＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは、小さな透明ゾーンを作ったが、あまり十分に増殖せず、一方で野生型のＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは、いかなるサイズの透明ゾーンも作らなかったが、十分に増殖した（表５、図７）。
【０１３５】
フォトメトリック活性アッセイ（photometric activity assay）が、Ｐｌｙ５１１を発現するＬ．ｌａｃｔｉｓ株とlactobacilliの上清のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞壁溶解活性の比較のために使用された。上清は、中期から後期の対数増殖期から回収され、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）の添加によって緩衝化され、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞サスペンションと混合され、６００ｎｍでの吸光度における任意の変化が続いた。ｐＳｅｐＰｌｙ５１１ｓｅｃを含有する株の全上清がエンドリシン活性を有することが、このアッセイを用いて見出された。Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍは、最大のエンドリシン活性を有し、一方でＬｌａｃｔｉｓ及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓは中程度のエンドリシン活性を有し、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍは、最も低いが、依然として検出可能なエンドリシン活性を有した（データは示されない）。
【０１３６】
Ｐｌｙ５１１を分泌する乳酸菌によるＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｓの殺菌
洗浄されたＬ．ｌａｃｔｉｓ（〜１０９細胞）は、ＳＭバッファー中の洗浄された生きたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓＱＵＴ００８５（〜１０８細胞）と混合された。２．５時間後、一連の希釈物が、生きたＬｉｓｔｅｒａを数えるためにＯｘｆｏｒｄアガー上に、そして生きたＬ．ｌａｃｔｉｓを数えるためにＧＭ１７Ｅ上にプレートされた。ｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含有するＬ．ｌａｃｔｉｓは、Ｌｉｓｔｅｒａの生存性を１．８８ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍｌ低下させた。
【０１３７】
表４
ａ．下線は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を示す。
ｂ．Ｙ＝Ｃ又はＴ；Ｈ＝Ａ、Ｃ又はＴ；Ｎ＝Ａ、Ｇ，Ｃ又は
【０１３８】
【表４】
2007531508.tif 000005
【０１３９】
表５．
０．２Ｍ  リン酸カリウムバッファーを有する及び有しない寒天プレート上で増殖した乳酸菌のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞壁溶解活性ａ
【０１４０】
【表５】
2007531508.tif 000006
【０１４１】
ａコロニーの周りの透明ゾーンは、以下のように記載される：透明ゾーンなし（−）、小さなちょうど見える透明ゾーン（＋）、中位サイズの透明ゾーン（＋＋）、及び大きな透明ゾーン（＋＋＋）。
【０１４２】
ｂこの株は、緩衝化された増殖培地上であまり十分に増殖しなかったが、通常の増殖培地上で十分に増殖した。
【０１４３】
本明細書において記載された全ての刊行物及び特許出願は、本発明の属する技術分野における当業者の技術レベルを示す。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が特別且つ個別的に、参照によって取り込まれることが意図されるように、同程度ここに参考によって援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】ＭＲＳブロス中で増殖したＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１の培養上清中に見られたタンパク質の分析。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１の増殖は、６００ｎｍにおける光学密度測定によって２４時間に亘ってモニターされた。種々の時点において（円の中の番号で示される）、アリコートが採取され、遠心分離され、そして上清が濾過され、５％ＴＣＡを用いて沈殿された。２２５μｌ等量の培養上清がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０を用いた染色が続いた。矢印は、Ｓｅｐを示す。
【図２】Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ及びＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３におけるＨｉｓ６−Ｓｅｐ融合タンパク質の発現及び細胞内位置。上は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１染色体（Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐ及びＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐ）中に組み込まれた、或いはｐＧｈ９：ＩＳＳ１プラスミド（Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｓｅｐのみ）上のＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ  ＧＧ又はＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＭＧ１３６３に導入されたコンストラクトの配置を示す。下は、抗Ｈｉｓ５抗体を使用した、細胞抽出物及び上清中における融合タンパク質のウェスタンブロット検出を示す。図において、ｓｅｐターミネーター（Ｔｓｅｐ）及びＳｅｐ分泌シグナル（ｓｓＳｅｐ）、ＢｓｐＡ分泌シグナル（ｓｓＢｓｐＡ）及びＨｉｓ６（グレーのボックス）をコードするＤＮＡが示される。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１のsep又はｂｓｐＡ位置のいずれかへのシングルクロスオーバー相同組換え（single crossover homologous recombination）の部位である、ＤＮＡ領域がスポットされ、下がクロスで印される。分子量マーカーのサイズが左側にｋＤａで示される。２×ＳＤＳローディング色素中で煮沸することによって（ＳＤＳ）、超音波破砕によって（ｓｏｎ）、及び５Ｍ  ＬｉＣｌで（ＬｉＣｌ）調製された細胞抽出物、及び沈殿した上清画分（ＳＮ）を含むレーンが示される。各レーンにロードされた細胞又は培地の量は、培養物の５００μｌ（ＳＤＳ）、５０μｌ（ｓｏｎ）、１６０μｌ（ＬｉＣｌ）及び６７５μｌ（ＳＮ）と等しい。
【図３】Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１によるヒトＥ−カドヘリン融合タンパク質の発現及び分泌。上は、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１中に導入されたコンストラクトのアレンジメントを示す（Ｓｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｅｃａｄ及びＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｅｃａｄ）。下は、抗Ｈｉｓ５抗体を使用した（Ａ、Ｂ及びＣ［左側］）、細胞抽出物及び上清中の、及び抗Ｅカドヘリン抗体を使用した（Ｃ［右側］）上清中の融合タンパク質のウェスタンブロット検出を示す。図において、ｂｓｐＡターミネーター（Ｔ  ｂｓｐＡ）、及びＳｅｐ分泌シグナル（ｓｓＳｅｐ）、ＢｓｐＡ分泌シグナル（ｓｓＢｓｐＡ）及びＨｉｓ６（グレーボックス）をコードするＤＮＡが示される。Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＢＲ１１のｓｅｐ又はｂｓｐＡ位置のいずれかへのシングルクロスオーバー相同組換え部位であるＤＮＡ領域がスポットされ、下にクロスで印される。分子量マーカーのサイズが左側にｋＤａで示される。２×ＳＤＳローディング色素中で煮沸することによって（ＳＤＳ）、超音波破砕によって（ｓｏｎ）、及び５Ｍ  ＬｉＣｌを用いて（ＬｉＣｌ）調製された細胞抽出物、並びに沈殿した上清画分（ＳＮ）を含むレーンが示される。各レーンにロードされた細胞又は培地の量は、培養物の５００μｌ（ＳＤＳ）、５０μｌ（ｓｏｎ）、１６０μｌ（ＬｉＣｌ）及び６７５μｌ（ＳＮ）と等しい。パートＣにおけるウェスタンブロットについて、Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｕｔｍ  ＢＲ１１親（ＢＲ１１）又は、ＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｅｃａｄを含むＬ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ（ＢｓｐＡ−６ｘＨｉｓ−Ｅｃａｄ）からの培養上清の１．２ｍｌ等量が各レーンにロードされた。
【図４】Ｓｅｐの発現及び分泌シグナルを使用したヒトビトロネクチンの発現。２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーにおいて細胞を煮沸することによって調製された細胞抽出物（Ｃ）及び沈殿した上清画分（Ｓ）を含むレーンが示される。各レーンにロードされた細胞又は溶媒の量は、培養物１ｍｌ（Ｃ）及び９００μｌ（Ｓ）と等量である。
【図５】乳酸菌におけるＰｌｙ５１１の発現及び分泌のために使用されるｐＳｅｐ５１１ｓｅｃプラスミドの特徴。ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１の温度感受性複製起点（Ｔｓ）の起源が示され、一方でエリスロマイシン抵抗性（ＥｍＲ）マーカー遺伝子の方向も矢印で示される。ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１中にクローニングされたＳｅｐ−６ｘＨｉｓ−Ｐｌｙ５１１発現コンストラクトが示され、矢頭は、ｓｅｐプロモーターを示し、斜線ボックスは、Ｓｅｐ分泌シグナル（ｓｓＳｅｐ）を示し、グレーボックスは、Ｈｉｓ６エピトープコーディングＤＮＡを示し、ロリポップは、ｂｓｐＡオペロンターミネーター（ＴｂｓｐＡ）を示す。図の下は、Ｓｅｐ分泌シグナルとＰｌｙ５１１コーディングＤＮＡ間の接合点のヌクレオチド及び翻訳されたアミノ酸配列である。縦の矢印は、シグナルペプチドの開裂部分を示し、一方で水平の矢印は、Ｐｌｙ５１１の起点を示す。
【図６】Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．及びＬ．ｌａｃｔｉｓによって産生されたＰｌｙ５１１の発現、分泌及び活性の分析。（Ａ）抗Ｈｉｓ５−ＨＲＰコンジュゲートを使用したｐＳｅｐ５１１ｓｅｃを含む乳酸菌の細胞抽出物（Ｃ）及び上清（Ｓ）中のタンパク質のウェスタンブロット解析。各レーンにロードされた細胞抽出物又は培地の量は、各々培養物の５００μｌ及び６７５μｌ等量である。（Ｂ）オートクレーブされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを基質として用いた再生ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した乳酸菌の上清画分の溶菌活性の検出。各株について、（−）レーンは、ｐＧｈ９：：ＩＳＳ１含有（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ，  Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ及びＬ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）又は野生型（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株を示し、一方で（＋）レーンは、ｐＳｅｐ５１１ｓｅｃ含有株を示す。
【図７】オートクレーブされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞を含む緩衝化アガー培地上で増殖した乳酸菌株の細胞壁溶解活性。Ｌ．ｌａｃｔｉｓは、緩衝化されたＧＭ１７Ｅ上で増殖され、一方でプラスミドを含有するＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．株は、エリスロマイシンを有する緩衝化されたＭＲＳ上で増殖され、他方Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ野生型は、エリスロマイシンを有さない緩衝化されたＭＲＳ上で増殖された。
【図８】ＳｅｐＬｙｓＭドメインアミノ酸配列
【図９】ＳｅｐＣ末端（ａｐｆ）ドメインアミノ酸配列
【図１０】Ｓｅｐグルタミンリッチ領域
【図１１】Ｓｅｐ分泌シグナルアミノ酸配列
【図１２】Ｓｅｐアミノ酸配列
【図１３】分泌シグナル配列を含むＳｅｐアミノ酸配列
【図１４】Ｓｅｐ分泌シグナルヌクレオチド配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図１５】Ｓｅｐ  ＬｙｓＭドメインヌクレオチド配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図１６】Ｓｅｐグルタミンリッチ領域ヌクレオチド配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図１７】ＳｅｐＣ末端ヌクレオチド配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図１８】Ｓｅｐヌクレオチド配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図１９】分泌シグナルコーディング配列を含むＳｅｐヌクレオチド配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２０】Ｓｅｐ分泌シグナル逆翻訳配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２１】Ｓｅｐ  ＬｙｓＭドメイン逆翻訳配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２２】Ｓｅｐグルタミンリッチ領域シグナル逆翻訳配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２３】ＳｅｐＣ末端シグナル逆翻訳配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２４】Ｓｅｐ逆翻訳配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２５】分泌シグナルを含むＳｅｐの逆翻訳配列。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２６】可能性のあるｓｅｐプロモーターを含むｓｅｐの直ぐ上流３１０ｂｐのヌクレオチド配列（推定の−３５及び−１０認識６量体は、各々影付き文字及びボールド文字で示される［１つの−３５コンセンサスはまた、−１０コンセンサスであり得る］；推定の−１０コンセンサス６量体の上流のＴＧモチーフは、イタリック体にされた；ｓｅｐリボゾーム結合部位は、下線を引かれた。ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図２７】ｓｅｐ転写ターミネーターを含むｓｅｐの直ぐ下流１５０ｂｐのヌクレオチド配列（配列上の収束する矢印で示される）ＩＵＢ  Ｍｉｘｅｄ  Ｂａｓｅ  Ｃｏｄｅｓ：Ｒ＝ＡＧ  Ｙ＝ＣＴ  Ｍ＝ＡＣ  Ｋ＝ＧＴ  Ｓ＝ＧＣ  Ｗ＝ＡＴ  Ｈ＝ＡＣＴ  Ｂ＝ＧＣＴ  Ｖ＝ＡＧＣ  Ｄ＝ＡＧＴ  Ｎ＝ＡＧＣＴ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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