(57)【要約】  本発明は、そのゲノムが、ｉ）ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、第１の導入遺伝子、ならびにｉｉ）別の前記ロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、少なくとも第２の導入遺伝子を含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関するものであり、ここで、前記ロタウイルスタンパク質は、乳中に別々に分泌され、そこでロタウイルス様粒子（ＶＬＰ）または前記ロタウイルスタンパク質の凝集体に自己集合する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、そのゲノムが、
ｉ）ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、第１の導入遺伝子、ならびに
ｉｉ）ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択される別のロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、少なくとも第２の導入遺伝子
を含み、
ここで、ｃＤＮＡ配列は野生型であるか、または修飾されており、
前記修飾は、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換によるグリコシル化部位の除去、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化およびコドンの最適化、コドンの最適化、早期のポリアデニル化部位の除去、ならびに点突然変異、ならびにこれらの組み合わせから選択され、
前記ロタウイルスタンパク質が、乳中に別々に分泌され、そこでロタウイルス様粒子（ＶＬＰ）または前記ロタウイルスタンパク質の凝集体に自己集合する、哺乳動物。
【請求項２】
第１の導入遺伝子が、ＶＰ２ロタウイルスタンパク質をコードする野生型または修飾されたｃＤＮＡを含み、かつ第２の導入遺伝子が、ＶＰ６ロタウイルスタンパク質をコードする野生型または修飾されたｃＤＮＡを含む、請求項１に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項３】
ＶＰ４およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第３または第４の導入遺伝子をさらに含む、請求項２に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４】
ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードするｃＤＮＡの少なくとも一つが、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換によるグリコシル化部位の除去、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化およびコドンの最適化、コドンの最適化、早期のポリアデニル化部位の除去、ならびに点突然変異から選択される少なくとも一つの修飾を含み、この修飾により、乳腺における前記タンパク質のｍＲＮＡの翻訳が増強する、請求項１〜３のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５】
ＶＰ２をコードするｃＤＮＡがＳＥＱ  ＩＤ Ｎｏ．１〜６から選択される、請求項１または４に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６】
ＶＰ６をコードするｃＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１０〜１６から選択される、請求項１または４に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７】
第１の導入遺伝子が、ＶＰ２をコードする修飾されたｃＤＮＡである、請求項１または４に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８】
第２の導入遺伝子が、ＶＰ４、ＶＰ６またはＶＰ７、好ましくはＶＰ６をコードする、天然のまたは修飾されたｃＤＮＡである、請求項９に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項９】
ＶＰ４をコードするｃＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．７〜９から選択される、請求項１または４に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１０】
ＶＰ７をコードするｃＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１７〜２１から選択される、請求項１または４に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１１】
前記ＶＰ２およびＶＰ６が、少なくとも５０００ＫＤａのＶＬＰまたは凝集体に集合する、請求項１〜８のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１２】
乳が、ＶＰ２とＶＰ６の両方を少なくとも１０μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１００μｇ／ｍｌ含む、請求項１〜８のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１３】
前記乳腺特異的転写制御領域が、乳清タンパク質またはカゼインタンパク質、特に、マウスまたはウサギの長いＷＡＰプロモーターなどのＷＡＰプロモーターから選択される、請求項１〜１２のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１４】
前記乳腺特異的転写制御領域が、ウサギのＷＡＰプロモーターの翻訳開始点から少なくとも３ｋｂ、３ｋｂ〜６．３ｋｂまたは少なくとも６．３ｋｂの領域などの、ウサギの長いＷＡＰプロモーターである、請求項１３に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１５】
導入遺伝子が、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ラットまたはマウスの、ＷＡＰ遺伝子を取り囲むゲノム配列、好ましくは、ＷＡＰ遺伝子の少なくとも１４０Ｋｂ上流および少なくとも１０Ｋｂ下流をさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１６】
導入遺伝子が、ニワトリのβ−グロビン遺伝子クラスターの５’ＨＳ４領域をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１７】
導入遺伝子が、ＳＶ４０初期遺伝子、ＳＶ４０後期遺伝子、β−グロビン遺伝子、ＥＦ１α遺伝子、αｓ１−カゼイン遺伝子、ウサギＷＡＰ遺伝子、ウシおよびヒトの成長ホルモン遺伝子のイントロンなどの、一つまたは複数のイントロンをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１８】
導入遺伝子が、αｓ１−カゼイン遺伝子（単量体または多量体）、ＨＴＬＶ１ゲノムのＬＴＲ、免疫グロブリン遺伝子、ＭＭＴＶゲノムのＬＴＲ、ＷＡＰ遺伝子の上流の末端領域（１４０ｋｂまで）およびβ−グロビン遺伝子のエンハンサーなどの、プロモーター領域および／または転写された領域に位置する一つまたは複数のエンハンサーをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項１９】
導入遺伝子が、ＳＶ４０初期遺伝子および後期遺伝子、β−グロビン遺伝子、ＷＡＰ遺伝子、ならびにウシおよびヒトの成長ホルモンのターミネーターなどの、一つまたは複数の転写ターミネーターをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２０】
ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードする少なくとも二つのｃＤＮＡが、一つの単一の前記導入遺伝子中にある、請求項１〜１９のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２１】
導入遺伝子が、外因性または内因性のペプチドまたはタンパク質またはそのエピトープのコード配列をさらに含む、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物であって、エピトープを有する組換えＶＬＰを乳中に産生する、請求項１〜２０のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２２】
前記エピトープがＨＩＶエピトープ、特にＲＴＰＫＩＱＶ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２２）またはＥＬＤＫＷＡ（ＳＥＱ ＩＤ  Ｎｏ．２３）またはその両方である、請求項２１に記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２３】
前記哺乳動物がヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ラットまたはマウスである、請求項１〜２２のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項２４】
組換えロタウイルスＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜１０および１５〜２２のいずれか一つに記載される導入遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の胚または受精卵に挿入する工程、
（ｂ）前記胚または受精卵を、成体の哺乳動物に成長させる工程、
（ｃ）前記導入遺伝子が乳房組織のゲノム中に存在する、前記ヒト以外の哺乳動物または前記ヒト以外の哺乳動物の雌の子孫において、泌乳を誘導する工程、
（ｄ）前記泌乳するヒト以外の哺乳動物の乳を回収する工程、および
（ｅ）前記回収した乳から前記ＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を単離する工程を包含する方法。
【請求項２５】
組換えロタウイルスＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を産生するための方法であって、
（ａ）請求項１〜２３のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物、または前記ヒト以外の哺乳動物の雌の子孫において、泌乳を誘導する工程、
（ｂ）前記泌乳するヒト以外の哺乳動物の乳を回収する工程、および
（ｃ）前記回収した乳から前記ＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を単離する工程を包含する方法。
【請求項２６】
ＶＬＰのタンパク質部分がＶＰ６の三量体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
乳中に存在するＶＰ２およびＶＰ６が、分解されておらず、切断されておらず、かつグリコシル化されていない、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＶＬＰのタンパク質部分が、精製され、最終的に分離され、そして組換えＶＬＰに再集合するための条件下に置かれる、請求項２５〜２７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項２９】
精製が、乳清を調製することからなる第１の工程を包含する、請求項２５〜２８のいずれか一つに記載の方法。
【請求項３０】
寄生生物、細菌、または、ＨＩＶ、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス、ＲＳＶ、コロナウイルス、口蹄疫ウイルス、ロタウイルス、オーエスキー病ウイルス、マレック病ウイルスを含むウイルスによる感染を治療または予防するためのワクチンなどの免疫学的組成物を製造するための、請求項１〜２４のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック動物または請求項２５〜２９のいずれか一つに記載の方法から得られた、エピトープを有する組換えＶＬＰの使用方法。
【請求項３１】
癌、自己免疫疾患および代謝障害を治療または予防するためのワクチンなどの免疫学的組成物を製造するための、請求項１〜２４のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック動物または請求項２５〜２９のいずれか一つに記載の方法から得られた、エピトープを有する組換えＶＬＰの使用方法。
【請求項３２】
前記免疫学的組成物が、経口もしくは直腸投与、または静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射に適合している、請求項３０または３１に記載の使用方法。
【請求項３３】
注射可能な溶液または坐剤である、直腸投与に適した、請求項１〜２４のいずれか一つに記載のヒト以外のトランスジェニック動物または請求項２５〜２９のいずれか一つに記載の方法から得られた、エピトープを有する組換えＶＬＰを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関するものであり、そのゲノムは、ｉ）ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、第１の導入遺伝子、ならびに、ｉｉ）別の上記ロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、少なくとも第２の導入遺伝子を含み、そして前記ロタウイルスタンパク質は、乳中に別々に分泌され、そこでロタウイルス様粒子（ＶＬＰ）または前記ロタウイルスタンパク質の凝集体に自己集合する。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルスは、伝染性が高いために一般的であると見なされている、広く蔓延しているウイルスである。ロタウイルスは、小児および成人に、健康であろうとなかろうと、等しい効率で感染する。ロタウイルスの感染によって、１日あたり２０００人の小児、および年間あたり８３００００人が死亡しており、これらの大部分は発展途上国におけるものである。感染した人の総数ははるかに多く、一時的ではあるが重要な問題が生じている。
【０００３】
多くの研究が、ロタウイルスのいくつかのタンパク質は、注射によって、または場合によっては経口的に投与した場合に、ワクチンとして使用することができることを実証してきた。弱毒生ワクチンを使用する試みは成功したが、深刻な副作用が同時に生じた。処理した人のうち一部が、腸重積症（腸管の一部の陥入）を患った。従って、このワクチンの使用は中止された。この副作用の制御は困難であると思われ、ワクチンとして組換えロタウイルスタンパク質を用いることがより安全であるように思われる（Ｂｅａｌｅ  ２００２）。
【０００４】
より一般的には、組換えワクチンの使用は、国連によって、発展途上国において健康を改善するための上位１０件の技術のうちの２番目のものと認められている（Ａｃｈａｒｙａら、２００３）。天然または組換えのロタウイルスタンパク質の大部分は少量で生産されており、実験動物を感染から防御するそれらの能力は実証されてきた（Ｂｅｒｔｏｌｏｔｔｉ−Ｃｉａｒｌｅｔら（２００３）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｃｏｒｎｉｌら（２００２）、Ｋｉｍら（２００２）、Ｋｉａｎｇら（１９９９）、Ｃｉａｒｌｅｔら（１９９８）、Ｏ’Ｎｅａｌら（１９９７））。これらのタンパク質が効果的なワクチンとなる可能性は同様ではない。理想的には、ワクチンは、すべての主要なウイルスのサブタイプに対して等価な効率を有するべきである。さらに、組換えワクチンは、注射または経口的経路によって投与するために、低コストで比較的大量に産生されるべきである。
【０００５】
ワクチンとして使用するためのロタウイルスタンパク質の中で、ＶＰ２およびＶＰ６は最良の候補に含まれる。ＶＰ６は、Ａ群ロタウイルスにおいて９０％より高い相同性で高度に保存された構造を有する、キャプシドタンパク質である。それゆえに、これは、すべてのＡ群ロタウイルスに対するワクチンとなる可能性がある。Ａ群ロタウイルスは、主としてヒトに感染するものである。それゆえに、ＶＰ６の使用により、血清型に関係なく、Ａ群のすべてのメンバーに対するワクチン接種ができる可能性がある。
【０００６】
ＶＰ２およびＶＰ６は、経口的に投与されたときであっても、プロテアーゼ耐性のウイルス様粒子（ＶＬＰ）を自発的に形成し、ウイルスに対する免疫学的防御を誘導することができる。これらの実験は、ＶＬＰがロタウイルスの感染に対するワクチン接種を完全に可能にするという考えを証明する。ロタウイルスのＶＬＰの使用を主に制限するものは、それらの供給力である。また、興味深いことには、ＶＰ２またはＶＰ６に融合した外来のペプチドまたはタンパク質は、ＶＬＰに組み込まれ、非常に重要な抗原特性を有する（Ｃｈａｒｐｉｌｉｅｎｎｅら、２００１、および国際公開第０１／６６５６６号パンフレット）。
【０００７】
組換えＶＬＰは、ＶＰ２およびＶＰ６遺伝子を有するバキュロウイルスに感染させたＳｆ９細胞から調製することができる。細胞溶解物から抽出することができるＶＬＰは、新生ＶＬＰと同様の構造的および免疫学的特性を有する。しかし、この系は、組換えタンパク質を産生する能力に限界がある。タンパク質ＶＰ６はトランスジェニックジャガイモ中で調製されており、ウイルスタンパク質を含む塊茎組織は、経口投与した後（ＹｕおよびＬａｎｇｒｉｄｇｅ、２００３）またはアジュバントと注射した後に（Ｍａｔｓｕｍｕｒａら、２００２）、マウスにおいて免疫を誘導することが可能であった。同様に、ジャガイモ中で産生したロタウイルスタンパク質ＶＰ７は、マウスにおいて、高力価の粘膜の中和ＩｇＡを誘導した（Ｗｕら、２００３）。しかし、ジャガイモにおいて産生したロタウイルスタンパク質の量は、すべての場合において非常に少なかった。さらに、組換えタンパク質の精製は、これらの条件において困難であることが予測される。
【０００８】
最近、当分野において、トランスジェニック植物を使用することが提案されてきているが（Ｍａら、２００３）、この系は能力に限界があり、植物のＶＰタンパク質が、ＶＬＰに集合するのに適した形態であろうことは示されていない。加えて、医薬用タンパク質を含むトランスジェニック植物が播種することの問題は解決されていない（Ｍａら、２００３）。
【０００９】
トランスジェニック動物の乳は、大量の医薬用組換えタンパク質を産生するための最も成熟した系である（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２０００）、Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（２００３））。１００を超える組換えタンパク質が、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびウシの乳中で実験的に調製されてきた。乳から抽出された最初の医薬用タンパク質であるヒトアンチトロンビンＩＩＩは、２００４年に市販されると予想されている。このことは、主要な問題である、発現レベル、乳からの精製およびバイオセイフティーが解決されたことを意味する。
【特許文献１】国際公開第０１／６６５６６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者は、当分野における自らの専門知識を用いて様々なベクターを設計し、そして、シグナルペプチドを付加するとロタウイルスタンパク質が乳中で高い割合で産生および分泌され得るということを初めて実証する。本発明者は、幸運にも、タンパク質ＶＰ２およびＶＰ６がカゼインミセルに凝集しないことを観察した。従って、ＶＰタンパク質は、低コストの抽出および精製工程の後に、乳清から回収することができる。
【００１１】
本発明者はまた、組換えＶＰ２およびＶＰ６が、乳中において、さらに精製を可能にする高分子量のＶＬＰまたはＶＰタンパク質の凝集体を自発的に形成することを発見した。本発明者はまた、ＶＰタンパク質をコードするｃＤＮＡを修飾し、産生を驚くべきほどに増強させた。
【００１２】
最後に、本明細書の以下に詳細に記載される本発明に従って産生されるＶＬＰは、ロタウイルス感染に対してマウスを１００％防御することを示しており、このことは、本発明者らが、医薬的要求に見合うＶＬＰの産生速度のみならず、乳中に産生された、免疫防御を付与するのに適切な集合体および立体構造になっているＶＬＰもまた初めて提供するということも意味している。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
それゆえに、第１の態様において、本発明は、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を目的とし、そのゲノムは、
ｉ）ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、第１の導入遺伝子、
ｉｉ）ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択される別のロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡであって分泌シグナル配列を含むｃＤＮＡに機能的に連結した乳腺特異的転写制御領域を含む、少なくとも第２の導入遺伝子、
を含み、
ここで、ｃＤＮＡ配列は野生型であるか、または修飾されており、
前記修飾は、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換によるグリコシル化部位の除去、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化およびコドンの最適化、コドンの最適化、早期のポリアデニル化部位の除去、ならびに点突然変異、ならびにこれらの組み合わせから選択され、
前記ロタウイルスタンパク質は、乳中に別々に分泌され、そこでロタウイルス様粒子（ＶＬＰ）または前記ロタウイルスタンパク質の凝集体に自己集合する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
特定の実施形態において、第１の導入遺伝子は、ＶＰ２ロタウイルスタンパク質をコードする野生型または修飾されたｃＤＮＡを含み、第２の導入遺伝子はＶＰ６ロタウイルスタンパク質をコードする野生型または修飾されたｃＤＮＡを含み、そしてこのゲノムは任意に、ＶＰ４およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードするｃＤＮＡを含む第３または第４の導入遺伝子をさらに含む。ＶＰ２、ＶＰ６、ＶＰ４およびＶＰ７の任意の組み合わせが含まれる。例えば、ＶＰ２−ＶＰ６、ＶＰ２−ＶＰ４、ＶＰ２−ＶＰ７、ＶＰ２−ＶＰ６−ＶＰ４、ＶＰ２−ＶＰ６−ＶＰ７である。
【００１５】
ＶＰ４によって、本発明が、ＶＰ５およびＶＰ８などの、ＶＰ４の天然の切断産物を含むことを理解されたい。
【００１６】
本発明のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物は、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換によるグリコシル化部位の除去、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化、Ａｓｐ→Ｇｌｎの置換とスプライス部位の突然変異とを組み合わせてのグリコシル化およびコドンの最適化、コドンの最適化、早期のポリアデニル化部位の除去、ならびに点突然変異から選択される少なくとも一つの修飾を含む、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７をコードする少なくとも一つのｃＤＮＡを含むことができる。これらの修飾の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２〜６および１１〜１６に示す。
【００１７】
これらの修飾は、乳腺における前記タンパク質のｍＲＮＡの翻訳を増強する。さらに、ＶＰ６におけるグリコシル化部位の除去は、免疫原性を損失するリスクと同様に、それが集合しないリスクも減少させる。配列の修飾のうち、コドンの突然変異ならびに５’および３’ＵＴＲの欠失は、転写、ｍＲＮＡの安定性および翻訳を減少させることが可能なシグナルを除去することができる。
【００１８】
例えば、ＶＰ２をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１〜６から選択され、ＶＰ４をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７〜９から選択され、ＶＰ６をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０〜１６から選択され、そしてＶＰ７をコードするｃＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１７〜２１から選択される。例えば、第１のｃＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６であり、第２のｃＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０である。ＶＰ２に関しては、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６に示したような、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１に１、２、３、５、１０または２０またはそれ以上の修飾を施した、任意の修飾配列が本発明に含まれることを理解されたい。ＶＰ６については、本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１６に示したような、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０に１、２、３、５、１０または２０またはそれ以上の修飾を施した任意の修飾配列に関する。
【００１９】
ＶＰタンパク質のｃＤＮＡ修飾によって得られる利点を、以下にさらに詳述する。
【００２０】
有利には、第１の導入遺伝子は、上記に規定したようなＶＰ２をコードする修飾されたｃＤＮＡである。ここで、第２の導入遺伝子は、ＶＰ４、ＶＰ６またはＶＰ７、好ましくはＶＰ６をコードする天然のまたは修飾されたｃＤＮＡであってよい。
【００２１】
一つの特定の実施形態において、本発明は、上記に規定したようなヒト以外のトランスジェニック哺乳動物に関するものであり、ここで、前記ＶＰ２およびＶＰ６は、少なくとも５０００ＫＤａのＶＬＰまたは凝集体に集合する。従って、別の好ましい実施形態において、本発明は、ヒト以外の雌のトランスジェニック哺乳動物に関するものであり、その乳は、ＶＰ２、ＶＰ６の単量体および多量体（例えばＶＰ６三量体）、ＶＰ２−ＶＰ６を基にした少なくとも５０００ＫＤａのＶＬＰまたはＶＰ２−ＶＰ６凝集体を含む。
【００２２】
前記雌の動物において、乳は、ＶＰ２とＶＰ６の両方を少なくとも１０μｇ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１００μｇ／ｍｌ含み、ロタウイルスに感染させたマウスで１００％の防御を示す。
【００２３】
「ゲノム」という用語は、本明細書では、核または染色体外のＤＮＡを含む、哺乳動物の全ての内因性ＤＮＡを含むものとする。
【００２４】
「導入遺伝子」という表現が、前記のヒト以外の哺乳動物のゲノム中に挿入され、その挿入が時間を経ても安定している外来の配列を含む核酸分子を意味するものであるということは、当業者に理解されるであろう。導入遺伝子は、マイクロインジェクションによって細胞に導入され、相同組換えまたはリコンビナーゼに従った部位特異的組換え（Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）を介してゲノムに組み込まれる。導入遺伝子はまた、組換えウイルスであるベクターの形態とすることができる。従って、「ベクター」または「導入遺伝子」という表現は本明細書で交換可能に用いられる。この分子は、染色体中に組み込まれてもよく、または染色体外で複製するＤＮＡであってもよい。古典的な異種交配、またはインビトロ受精、または導入遺伝子の直接的導入は、ヒト以外のホモ接合体のトランスジェニック哺乳動物の産生を可能にする。本発明の「ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物」は、好ましくは、前記ヒト以外の哺乳動物の生殖系列に、上記に規定した一つまたは複数の「導入遺伝子」を導入することによって産生される。
【００２５】
乳腺特異的転写制御領域は、乳清タンパク質またはカゼインタンパク質をコードする遺伝子から選択することができる。いくつかの乳の遺伝子プロモーターが、乳中で組換えタンパク質を調製するために用いられる（欧州特許第２６４１６６号明細書（乳中に所望のタンパク質を分泌するトランスジェニック動物）および欧州特許第５２７０６３号明細書（トランスジェニック哺乳動物の乳中における目的のタンパク質の産生）を参照のこと）。
【００２６】
より詳細には、乳腺特異的転写制御領域は、ＷＡＰ（ホエイ酸性タンパク質）プロモーター、例えば、マウスまたはウサギの長いＷＡＰプロモーターなどである。
【００２７】
適したＷＡＰプロモーターの例は、ウサギのＷＡＰプロモーターの翻訳開始点から少なくとも３ｋｂ、３ｋｂ〜６．３ｋｂ、または少なくとも６．３ｋｂの領域である。特に有利なウサギの長いＷＡＰプロモーター配列は、参照により本明細書で援用した欧州特許第０５２７０６３号明細書（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅら）の図１および５に記載されている。ウサギＷＡＰ遺伝子の長いプロモーター（６．３ｋｂ）（Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅら、１９９１）を、ＶＰ２およびＶＰ６のｃＤＮＡを発現させるために、以下に記載した実験において使用した。本明細書に記載した導入遺伝子は、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ラットまたはマウスの、ＷＡＰ遺伝子を取り囲むゲノム配列、好ましくは、ＷＡＰ遺伝子の少なくとも１４０Ｋｂ上流および少なくとも１０Ｋｂ下流をさらに含んでもよい。
【００２８】
数年前に行われた実験では、ニワトリのβ−グロビン遺伝子クラスターの５’ＨＳ４領域により、より高い発現レベルで導入遺伝子を発現する動物の割合が劇的に増えることが示された（Ｔａｂｏｉｔ−Ｄａｍｅｒｏｎら（１９９９）、Ｒｉｖａｌ−Ｇｅｒｖｉｅｒら（２００３））。従って、導入遺伝子は、ニワトリのβ−グロビン遺伝子クラスターの５’ＨＳ４領域をさらに含んでもよい。以下の実験において、５’ＨＳ４を、ＶＰ２およびＶＰ６のｃＤＮＡを発現するベクターに加えた。
【００２９】
イントロンもまた、ベクターに加えた。様々なものに由来するいくつかのイントロン、つまりＳＶ４０初期遺伝子、ＳＶ４０後期遺伝子、β−グロビン遺伝子、ＥＦ１α遺伝子、αｓ１−カゼイン遺伝子、ウサギＷＡＰ遺伝子、ウシおよびヒトの成長ホルモン遺伝子のイントロンを試験した。
【００３０】
従って、本発明は、導入遺伝子が、上記に引用したイントロンのような、しかしこれらに限定されない、一つまたは複数のイントロンをさらに含むことを特徴とする、上記のヒト以外の哺乳動物を包含する。
【００３１】
エンハンサー、つまりαｓ１−カゼイン遺伝子（単量体または多量体）、ＨＴＬＶ１ゲノムのＬＴＲ、免疫グロブリン遺伝子、ＭＭＴＶゲノムのＬＴＲ、ＷＡＰ遺伝子の上流の末端領域（１４０ｋｂまで）および下流の末端領域（少なくとも１０Ｋｂ）（Ｒｉｖａｌ−Ｇｅｒｖｉｅｒら（２００２）、Ｒｉｖａｌら、欧州特許出願公開第１２１７０７１号明細書、国際公開第０２／０５２０２３号パンフレット）、β−グロビン遺伝子のエンハンサーもまた、ＷＡＰ遺伝子プロモーターおよびベクターの転写された領域に加えた。従って、本発明は、導入遺伝子が、上記に引用したエンハンサーのような、しかしこれらに限定されない、プロモーター領域および／または転写された領域に位置する一つまたは複数のエンハンサーをさらに含む、上記のヒト以外の哺乳動物を包含する。
【００３２】
いくつかの転写ターミネーター、つまり、ＳＶ４０の初期遺伝子および後期遺伝子、β−グロビン遺伝子、ＷＡＰ遺伝子、ウシおよびヒトの成長ホルモンのターミネーターを使用した。結果として、本発明は、導入遺伝子が、上記に引用したターミネーターのような、しかしこれらに限定されない、一つまたは複数の転写ターミネーターをさらに含む、上記のヒト以外の哺乳動物に関する。
【００３３】
上記のエレメントを含むベクターの共通する構造の例を、図１に示す。
【００３４】
さらに別の実施形態において、本発明は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択されるロタウイルスタンパク質をコードする少なくとも二つのｃＤＮＡが一つの単一の前記導入遺伝子中にある、上記のヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を対象とする。
【００３５】
ｃＤＮＡは、乳房組織中での産生および乳への分泌のために最適化してもよい。その際、ＶＰ２およびＶＰ６のｃＤＮＡ中に存在する潜在性のスプライス部位を不活性化することができ、そして、転写、翻訳を変化させること、またはｍＲＮＡの安定性を減少させることができる可能性があるいくつかの配列を、グリコシル化部位と同様に突然変異させることができる。いくつかのコドンの最適化もまた、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡの発現をさらに増やすために行うことができる。
【００３６】
本発明の趣旨において、導入遺伝子は、外因性または内因性のペプチドまたはタンパク質またはそのエピトープのコード配列をさらに含んでもよい。このことにより、ヒト以外のトランスジェニック哺乳動物が、エピトープを有する組換えＶＬＰを乳中に産生するようになる。例えば、前記エピトープは、ＨＩＶエピトープ、特にＲＴＰＫＩＱＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２０、Ｃｈｅｒｍａｎｎら、欧州特許第０８３５３０９号明細書および米国特許第６１１３９０２号明細書）またはＥＬＤＫＷＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２１，Ｍａｔｏｂａ，Ｎ．，  Ａ．Ｍａｇｅｒｕｓ，  Ｂ．Ｃ．Ｇｅｙｅｒ，  Ｙ．Ｚｈａｎｇ，  Ｍ．Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎ，  Ａ．Ａｌｆｓｅｎ，  Ｃ．Ｊ．Ａｒｎｔｚｅｎ，  Ｍ．Ｂｏｍｓｅｌ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｓ．Ｍｏｒ．  ２００４．  Ａ  ｍｕｃｏｓａｌｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｅｌｉｃｉｔｉｎｇ  ＨＩＶ−１  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ−ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｂｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３５８４−９）、またはその両方である。
【００３７】
「哺乳動物」という表現は、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ウサギ、ラットまたはマウスを含むものとする。
【００３８】
第２の態様において、本発明は、
（ａ）上記に規定した導入遺伝子を、ヒト以外の哺乳動物の胚または受精卵に挿入する工程、
（ｂ）前記胚または受精卵を、成体の哺乳動物に成長させる工程、
（ｃ）前記導入遺伝子が乳房組織のゲノム中に存在する、前記ヒト以外の哺乳動物または前記ヒト以外の哺乳動物の雌の子孫において、泌乳を誘導する工程、
（ｄ）前記泌乳するヒト以外の哺乳動物の乳を回収する工程、および
（ｅ）前記回収した乳から前記ＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を単離する工程、
を包含する、組換えロタウイルスＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を産生するための方法に関するものである。
【００３９】
換言すれば、本発明は、
（ａ）上記に規定したヒト以外のトランスジェニック哺乳動物または前記ヒト以外の哺乳動物の雌の子孫において、泌乳を誘導する工程、
（ｂ）前記泌乳するヒト以外の哺乳動物の乳を回収する工程、および
（ｃ）前記回収した乳から前記ＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を単離する工程、
を包含する、組換えロタウイルスＶＬＰまたはＶＬＰのタンパク質部分を産生するための方法に関するものである。
【００４０】
「ＶＬＰのタンパク質部分」という表現は、ＶＰ２、ＶＰ４、ＶＰ６およびＶＰ７から選択されるタンパク質の単量体、二量体、三量体、またはその他のホモもしくはヘテロの多量体をいう。これはまた、ＶＰ２およびＶＰ６のタンパク質凝集体も包含する。
【００４１】
好ましい実施形態において、乳中に存在するＶＰ２およびＶＰ６は分解されておらず、切断されておらず、かつグリコシル化されていない。
【００４２】
上記の方法において、前記ＶＬＰのタンパク質部分を精製することができ、最終的には分離し、そして組換えＶＬＰに再集合するための条件下に置く。この精製工程は、乳清を調製することからなる第１の工程を包含してもよい。
【００４３】
第３の態様において、本発明は、寄生生物、細菌、または、ＨＩＶ、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス、ＲＳＶ、コロナウイルス、口蹄疫ウイルス、ロタウイルス、オーエスキー病ウイルス、マレック病ウイルスを含むがこれらに限定されないウイルスによる感染を治療または予防するためのワクチンなどの免疫学的組成物を製造するための、上記に規定したヒト以外のトランスジェニック動物または方法から得られた、エピトープを有する組換えＶＬＰを使用することを目的とする。
【００４４】
本発明はまた、癌、自己免疫疾患および代謝障害を治療または予防するためのワクチンなどの免疫学的組成物を製造するための、上記に規定したヒト以外のトランスジェニック動物または方法から得られた、エピトープを有する組換えＶＬＰの使用に関する。
【００４５】
本発明において用いられる医薬組成物は、経口（図１３）、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、経鼻、腸内、または直腸の手段を含むがこれらに限定されない任意の数の経路によって投与されてもよい。
【００４６】
直腸投与の様式もまたマウスにおいて非常に良好な防御を示したので、上記薬剤は直腸投与のためのものであってもよい。従って、本発明は、注射可能な溶液または坐剤である、直腸投与に適した、上記に規定したヒト以外のトランスジェニック動物または上記に規定した方法から得られるエピトープを有する組換えＶＬＰを含む医薬組成物を包含する。
【００４７】
本発明は、以下の実施例および図面においてさらに具体化される。
【００４８】
図面の説明
【００４９】
図１は、乳中でロタウイルスの組換えタンパク質を産生するために用いるベクターの構造である。ベクターの様々なエレメントは本明細書の本文中に示す。
【００５０】
図２は、トランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＶＰ２およびＶＰ６の分泌を示している。（Ａ）ＣＨＯ細胞を、シグナルペプチドと融合させた野生型ＶＰ２またはＶＰ６のｃＤＮＡを含む発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を４８時間増殖させ、次いで培養培地を回収し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ濃縮カラム（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）上で濃縮し、そして抗ロタウイルスポリクローナル抗体（８１４８）を用いたウェスタンブロット分析に供し、続いて化学発光分析（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を行った。ＶＰ２またはＶＰ６を含むプラスミドでトランスフェクトした細胞の培養培地を、それぞれＶＰ２およびＶＰ６と表示する。コントロールは、トランスフェクトしていない細胞である。各タンパク質の位置を矢印で示す。（Ｂ）ウシロタウイルス株ＲＦを用いて行った電気泳動を示している。
【００５１】
図３は、野生型ＶＰ６と突然変異型ＶＰ６との電気泳動の泳動度の比較を示している。（Ａ）実験は、シグナルペプチドと融合した野生型および突然変異型のＶＰ６のｃＤＮＡを含むベクターを用いて、図２の説明で記載したように行った（それぞれＶＰ６およびＶＰ６ｍ）。（Ｂ）野生型ウイルス（ＲＦ）のＶＰ６タンパク質の位置を示しており、矢印によって示されている。
【００５２】
図４は、トランスジェニックマウスの乳中でのＶＰ２およびＶＰ６の存在を示している。非トランスジェニック動物から得た（コントロール乳）、またはトランスジェニック系統１０、２４、２６、２９および４５から得た、いずれかの脱脂乳または乳清の画分を、各レーンに加えて、ウェスタンブロット分析を行った。最初の二つの数字は系統の番号を示す。乳清は、脱脂乳にＣａＣｌ2を加えることによってカゼインを沈殿させた後の上清である。サンプルは、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで希釈し、５分間煮沸し、そして１２％ポリアクリルアミドゲル上にロードしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次いで、タンパク質を、ＰＶＤＦ膜上に転写し、（Ａ）抗ＶＰ２モノクローナル抗体（Ｅ２２）または（Ｂ）抗ロタウイルスポリクローナル抗体（８１４８）でブロットし、そして化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって検出した。マウス１０１４はマウス１０１１よりも少ない導入遺伝子のコピーを有しており、これは、導入遺伝子が分離してゲノムのいくつかの独立した部位に組み込まれたことに起因する。この抗体は、ＶＰ２よりもＶＰ６をはるかに良好に認識する。
【００５３】
図５は、トランスジェニックウサギの乳清中でのＶＰ２およびＶＰ６の存在を示す。トランスジェニックウサギ系統０１、０２、０８、１１、１２、１３の乳清中の（Ａ）ＶＰ２および（Ｂ）ＶＰ６を、（Ａ）抗ＶＰ２モノクローナル抗体（Ｅ２２）または（Ｂ）抗ロタウイルスポリクローナル抗体（８１４８）を用いたウェスタンブロットによって可視化した。
【００５４】
図６は、トランスジェニックＦ０マウスの乳中でのＶＰ６の三量化を示している。非トランスジェニック動物（コントロール）またはトランスジェニックマウス系統２４および２６のいずれかから得た脱脂乳の画分を各レーンにロードした。サンプルは、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーで希釈し５分間煮沸するか、または直接（煮沸なし）のいずれかで、１２％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。次いで、タンパク質をＰＶＤＦ膜上に転写し、抗ロタウイルスポリクローナル抗体でブロットし、そして化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって検出した。マウス１０１４はマウス１０１１よりも少ない導入遺伝子のコピーを有しており、これは、導入遺伝子が分離してゲノムのいくつかの独立した部位に組み込まれたことに起因する。
【００５５】
図７は、トランスジェニック乳を用いた皮下での免疫付与後の、血清中の抗ＶＰ２−ＶＰ６ＩｇＧ抗体を示す。抗ＶＬＰ２／６ＩｇＧ抗体を、二回皮下接種した後のマウスで測定した。血清を、接種の１４日後に採取した。１．５μｇのＶＰ２およびＶＰ６に対応する量の乳をマウスに注射した（Ｔｇ）。コントロールの免疫付与は、コントロール乳（コントロール）、バキュロウイルスによって合成された１μｇの純粋なＶＬＰ２／６（ＶＬＰ）、およびコントロール乳に１μｇのＶＬＰ２／６を加えたもの（コントロール＋ＶＬＰ）を使用して行った。抗体は、ＥＬＩＳＡによって個々のマウスで検出した。データは、１／９００の血清希釈におけるＩｇＧレベルの平均±ＳＥＭである。
【００５６】
図８は、トランスジェニック乳を用いた経口での免疫付与後の、血清中の抗ＶＰ２−ＶＰ６ＩｇＧ抗体および糞便中の抗ＶＰ２−ＶＰ６ＩｇＡ抗体を示す。（Ａ）抗ＶＬＰ２／６ＩｇＧ抗体を、トランスジェニックウサギまたはコントロールのウサギの乳を三回経口投与した後のマウスで測定した。血清を、最後の強制摂取の１４日後に採取した。タンパク質ＶＰ２およびＶＰ６それぞれの約３５μｇに対応する量の乳を、各マウスに投与した。コントロールの免疫付与を、同量の非トランスジェニック動物の乳を用いて行った。抗体を、ＥＬＩＳＡによって個々のマウスにおいて検出した。データは、１／９００の血清希釈におけるＩｇＧレベルに対応する。（Ｂ）同じ動物において測定した糞便サンプルのＩｇＡレベルである（１／５希釈）。
【００５７】
図９は、分泌された野生型ＶＰ６がグリコシル化されていることを示す。乳中に分泌された野生型ＶＰ６は、天然のウイルスタンパク質と比較して、より大きな分子量を有する。この違いは、インビトロでタンパク質を脱グリコシル化するとなくなる。分泌された野生型ＶＰ６を、Ｎ結合型オリゴ糖の切断のためのＰＮＧａｓｅの存在下（＋）または非存在下（−）でインキュベートした。ＶＰ６のグリコシル化型および非グリコシル化型の位置を示す（それぞれＶＰ６ｇｌｙｃおよびＶＰ６）。分子量は、ｋＤａで、ブロットの左側に示す。
【００５８】
図１０は、修飾型のＶＰ６がグリコシル化されていないことを示す。グリコシル化部位が突然変異している修飾したｃＤＮＡから産生されたＶＰ６は、天然のＶＰ６と同一の分子量を示す。それゆえに、修飾した組換えＶＰ６はここではグリコシル化されておらず、グリコシル化がタンパク質の免疫原性を低下させるリスクを減少させる。ｅＦ１アルファ遺伝子のプロモーターに依存するシグナルペプチドと融合した、野生型または修飾したＶＰ６のｃＤＮＡを含むプラスミドを、ＣＨＯ細胞で一過性発現させた。培地を回収し、濃縮し、そしてウェスタンブロット分析に供した。分泌された野生型（ｗｔ）および修飾した（ｍｏｄ）タンパク質を、ＶＰ６に対する抗ロタウイルスポリクローナル抗体を用いて検出した。Ｃはトランスフェクトしていない細胞からのコントロール、ＲＦはロタウイルス株ＲＦを用いて行った電気泳動である。分子量は、ｋＤａで、ブロットの左側に示す。
【００５９】
図１１は、修飾後のＶＰ２の発現の増強を示す。ＶＰ２のｃＤＮＡを修飾し、試験した。本発明者は、これが、野生型ｃＤＮＡと比較してタンパク質の生合成を増強することを発見した。ｅＦ１アルファ遺伝子プロモーターに依存するシグナルペプチドと融合した、野生型または修飾したＶＰ２のｃＤＮＡを含むプラスミドを、ＣＨＯ細胞で一過性発現させた。培地を回収し、濃縮し、そしてウェスタンブロット分析に供した。分泌された野生型（ｗｔ）および修飾した（ｍｏｄ）タンパク質を、抗ＶＰ２モノクローナル抗体Ｅ２２を用いて検出した。Ｃはトランスフェクトしていない細胞からのコントロール、ＲＦはロタウイルス株ＲＦを用いて行った電気泳動である。分子量は、ｋＤａで、ブロットの左側に示す。
【００６０】
図１２は、ウイルス抗原の排泄の割合の減少を示す。本発明に従った乳中で産生されるＶＰ粒子は、１００％の防御を付与することが可能である。マウスを、１０μｇのＶＬＰ２／６／７／４（「ＶＬＰ」）、ＶＰ２およびＶＰ６を含むトランスジェニックウサギの乳から得た３μｇの半精製物質（「Ｔｇ乳」）、またはコントロールとして使用するＲＰＭＩ培地（「ＲＰＭＩ」）のいずれかで、直腸経由で二回免疫付与した。毒性のマウスロタウイルスＥＣｗによるチャレンジの後、感染からの防御のレベルを各々のマウスについて計算し、他所に記載されているように、７日間の糞便中に排泄されるウイルス抗原の減少として表した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ｃｏｒｎｉｌ  Ｉ，  Ｂｅｎｕｒｅａｕ  Ｙ，  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｈ，  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ  ＢＡ，  Ｃｏｈｅｎ  Ｊ  （２００２）  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｉｎｎｅｒ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｒａｎｓｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １６：８１１０−８１１７）。各群におけるマウスの数を示す（ｎ）。
【００６１】
図１３は、トランスジェニックウサギの乳の免疫原性およびチャレンジに対するマウスの防御を示す。５〜８頭のＢａｌｂ／ｃマウス群を、５μｇのコレラ毒素と混合した５００μｌの正常なウサギまたはトランスジェニックウサギの乳（それぞれ、乳およびＴｇ乳）を用いて、４回（各強制摂取の間に１０日間の間隔をあけて）経口的に免疫付与した。血清中のＩｇＧ、ＩｇＡ（Ａ）および（Ｂ）、または糞便中のＩｇＡ（Ｃ）の抗体力価を、ＥＬＩＳＡによって測定した。各群の抗体力価の平均を示し（黒棒）、またＳＥＭを示す（細い線）。＊は、すべての力価が＜１００であることを示し、＃は、乳群とＴｇ乳群との間に有意な差があることを示す（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）。（Ｄ）毒性のマウスロタウイルスの１０３  ＳＤ５０を用いたチャレンジの後の防御レベルを、各々のマウスについて計算した。結果を、コントロール群と比較した、ワクチン群の７日間の糞便中に排泄されたウイルス抗原の割合の減少として表す。水平方向の棒は平均値を表す。＃は、乳群とＴｇ乳群との間に有意な差があることを示す（Ｍａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定）。
【実施例１】
【００６２】
ＶＰ２およびＶＰ６のｃＤＮＡの修飾
【００６３】
ロタウイルスゲノムは、感染した細胞の細胞質中で複製し発現するいくつかのＲＮＡ断片によって形成される。それゆえに、これらの配列はイントロンを有していないが、潜在性のスプライシングシグナルを含む可能性がある。ロタウイルスのＲＮＡは、核から細胞質への移行のためのシグナルを含まない。一方、ウイルスタンパク質は、合成され、細胞質基質中で集合し、小胞体およびゴルジ装置を通過した後のエキソサイトーシスによっては分泌されない。
【００６４】
アミノ酸配列を僅かに変化させるだけの多くのヌクレオチド配列修飾が、二つのｃＤＮＡにおいて行われてきた。様々な哺乳動物のタンパク質（ウシまたはヒトの成長ホルモンファミリー、乳タンパク質等）のシグナルペプチドを天然には分泌されないタンパク質に加えることで、これらのタンパク質の効率的な分泌が可能になる。これらのシグナルペプチドのいくつかを、さらなる最適化を可能にするために比較した。
【００６５】
ＶＰ２およびＶＰ６のｃＤＮＡに存在する潜在性のスプライス部位のいくつかを不活性化した。転写、翻訳を変化させること、またはｍＲＮＡの安定性を減少させることができる可能性があるいくつかの配列を突然変異させた。いくつかのコドンの最適化もまた、哺乳動物細胞におけるｃＤＮＡの発現を増やすために行った。
【００６６】
野生型および最適化したｃＤＮＡの発現を、いくつかのベクター（ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＶＴ９０−２０）、ｐＥＦ０（Ｔａｂｏｉｔ−Ｄａｍｅｒｏｎら、１９９９））を用いてトランスフェクトしたＣＨＯ細胞において比較した。培養培地中のタンパク質ＶＰ２およびＶＰ６の存在を、ウェスタンブロット分析を用いて明らかにした。
【００６７】
図２に示したデータは、ＶＰ２とＶＰ６の両方が、トランスフェクトしたＣＨＯから分泌されたことを示す。これは、ロタウイルスタンパク質が、シグナルペプチドを加えた後の動物細胞から高レベルで分泌され得ることを初めて実証する。これは、ある細胞質基質の区画にタンパク質を方向付けるシグナルがＶＰ２およびＶＰ６にもし存在するならば、それらにシグナルペプチドが加えられるとそれらの効果の重要性が限られたものとなることを示す。野生型のＶＰ６は、ウイルスタンパク質よりもより大きな分子量を有するタンパク質として発現した。このことは、ウイルスタンパク質においては生じないがタンパク質が小胞体およびゴルジ装置を通って移動するときには生じる可能性があるＶＰ６のグリコシル化に起因する可能性がある。そのグリコシル化部位の大部分を欠いている突然変異型ＶＰ６は、ウイルスタンパク質と同じレベルで泳動した（図３）。ＶＰ６における糖質の存在は、ＶＬＰの構造を変化させ、すなわちその免疫学的特性を減少させる可能性がある。
【実施例２】
【００６８】
乳中での特異的分泌のためのベクター
【００６９】
上記の実施例で得られたエレメントを組み合わせて、広範なベクターファミリーを形成し、これを、ウサギ初代乳房細胞と同様に、ＣＨＯ細胞またはマウスＨＣ１１乳房細胞において試験した。トランスジェニック動物における発現レベルを十分に予測するものではなかったが、細胞試験は、最も低い効力を示す組み合わせを除外することを可能にした。最適化した／突然変異したベクターを含む様々なベクターは、野生型ＶＰ２およびＶＰ６のｃＤＮＡと比較して、１０，０００倍の発現の増加を可能にした。最終的には、ベクターの最適化についての本発明者の研究により、乳中に両方のタンパク質を１００μｇ／ｍｌ産生するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物が得られた。
【実施例３】
【００７０】
乳から得たタンパク質ＶＰ２およびＶＰ６の解析
【００７１】
ウェスタンブロット分析は、トランスジェニック動物の系統に従って、乳中のＶＰ２およびＶＰ６の最適な濃度が１００μｇ／ｍｌまたはそれ以上であったことを示した（図４および５、ならびに表１）。
【００７２】
【表１】
2007525991.tif 000002
【００７３】
組換えタンパク質の濃度は、標準としてウイルスタンパク質を使用して、ウェスタンブロットアッセイによって測定した。ＶＰ２ＴｇはＶＰ２がトランスジェニックであることを示しており、ＶＰ６ＴｇはＶＰ６がトランスジェニックであることを示している。
【００７４】
【表２】
2007525991.tif 000003
【００７５】
組換えタンパク質の濃度は、標準としてウイルスタンパク質を使用して、ウェスタンブロットアッセイによって測定した。ＶＰ２ＴｇはＶＰ２がトランスジェニックであることを示しており、ＶＰ６ＴｇはＶＰ６がトランスジェニックであることを示している。
【００７６】
二つのタンパク質は、ウェスタンブロットアッセイにおける完全な変性の後に予測される分子量であった（図４および図５）。このことは、タンパク質が切断、分解、またはグリコシル化されなかったことを示す。興味深いことに、ＶＰ６は、変性が加熱の工程を含まなかったときは三量体の形態であった（図５）。ＶＰ６のこの特性は、新生タンパク質およびＶＰ６のｃＤＮＡを有するバキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞から抽出された組換えタンパク質で見られた。
【００７７】
ウェスタンブロットアッセイにより、乳清（過剰のカルシウムを加えることによるカゼインの特有の沈殿後に得られる）中のＶＰ２およびＶＰ６を同定した（図４および５）。これは、タンパク質ＶＰ２およびＶＰ６がカゼインミセルに凝集しなかったこと、そして、乳清の調製がウイルスタンパク質の精製のための効率的な最初の工程と思われることを示す。
【００７８】
乳清の超遠心分離により、ＶＰ２とＶＰ６の両方をペレット化した。コア様凝集体を形成することが知られているＶＰ２は単独でペレット化したが、ＶＰ６は単独でペレット化せず、ＶＰ２の存在下でのみペレット化した。このことは、組換えＶＰ２およびＶＰ６が、Ｓｆ９−バキュロウイルスなどの他の系におけるのと同様に、乳中で自発的にＶＬＰを形成することを強く示唆する。
【００７９】
ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離がロタウイルス、新生ＶＬＰおよびバキュロウイルス−Ｓｆ９細胞系によって調製された組換えＶＬＰを濃縮できることは知られている。ＣｓＣｌ密度勾配中の浮遊物質を電子顕微鏡で観察したところ、ロタウイルスの形態学的特徴を有するキャプシドを含む。
【００８０】
トランスジェニック動物の乳清を、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２で分画した。ＶＰ２およびＶＰ６を共溶出したところ、ほとんどがボイドボリューム中に存在した。このことは、これらの二つのタンパク質が少なくとも３００，０００ＫＤａの凝集体を共同で形成していることを示す。ボイドボリューム中に見られる物質を、ＣｓＣｌ密度勾配超遠心分離に供した。ＶＰ２およびＶＰ６タンパク質は、勾配中の天然のＶＬＰに対応する密度のところで見られた。
【００８１】
乳中で見られるＶＰ２−ＶＰ６凝集体の厳密な構造は、不完全なキャプシドを形成する可能性がある。実際、ＶＰ２およびＶＰ６は乳中では同様の濃度で存在するのに対して、ウイルス中ではＶＰ６はＶＰ２よりも約６倍豊富である。それでもなお、ＶＬＰは、インビトロでの再集合のために比率を調整して、乳から抽出および精製したＶＰ２／ＶＰ６タンパク質から調製することができる。また、乳中での産生の比率が、ＶＰ２およびＶＰ６を発現する、異なる組み合わせまたは数のベクターを用いて調節され得ることも理解されたい。
【実施例４】
【００８２】
ＶＰ２およびＶＰ４を含む乳を用いたマウスの免疫付与
【００８３】
脱脂したウサギの乳（３０μｌ）を、不完全フロイントアジュバントの存在下で皮下注射によってマウスに投与した。二週間後、処理を繰り返した。代わりに、コレラ毒素（５μｇ）と混合した脱脂乳（５００μｌ）をマウスに経口投与した（強制摂取間で１週間の間隔をあけて３回）。最後の注射または強制摂取の一週間後に、血液および糞便のサンプルを動物から採取し、抗ＶＰ２抗体および抗ＶＰ６抗体の存在を調べた。
【００８４】
大量の抗ＶＰ６ＩｇＧ抗体が、７頭の免疫付与したマウスの血清中に見られた。ＶＰ６に結合している天然の抗体のバックグラウンドのみが、非トランスジェニック動物から得た乳を与えたコントロールマウスの血清で見られた（図７）。非常に多くの量の抗ＶＰ６ＩｇＧ抗体もまた、０２系統のトランスジェニックウサギから得た５００μｌの乳を経口的に与えた５頭のマウスのうち３頭の血清で見られた。この量の乳は、約３５μｇのタンパク質ＶＰ２およびＶＰ６をそれぞれ含んでいた。非トランスジェニックウサギから得た同じ量の乳を与えたコントロールマウスは、ＶＰ６結合タンパク質のバックグラウンドのみを有した（図８Ａ）。
【００８５】
興味深いことに、抗ＶＰ６ＩｇＡは、強制摂取によって免疫付与したマウスの３頭の糞便サンプルにおいて見られた（図８Ｂ）。２頭のマウスでは抗原に対する応答が非常に低かった。このことは、比較的少量のウイルスタンパク質が経口的に投与されたという事実に起因する可能性がある。
【００８６】
これらのデータは、ロタウイルスのタンパク質ＶＰ２およびＶＰ６が、培養細胞において、またインビボで乳中に分泌および共分泌され得ることを初めて報告するものである。分泌されたタンパク質の量は、他の系で得られたそれよりもはるかに多い。これは、新規な低コストで安全なワクチンを産生する可能性を提供する。ここで、いかなるアジュバントも伴わない比較的大量のタンパク質の投与を含む手順は、はるかにより容易に行うことができる可能性がある。
【００８７】
タンパク質ＶＰ２およびＶＰ６は、注射によってまたは経口的に投与するワクチンとして使用することができるＶＬＰを形成する。
【００８８】
本明細書に記載した産生系は、単独でまたはＶＰ２およびＶＰ６と共同で同様にワクチンとして使用される可能性のある、ＶＰ４およびＶＰ７などの他のロタウイルスタンパク質を発現するのに適切である。
【００８９】
ＶＰ２およびＶＰ６への外来のペプチドおよびタンパク質の付加は、ＶＬＰの形成を妨害せず、外来のエピトープに対する抗体の生成を可能にする。本明細書に記載した方法は、ＨＩＶ、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルス、ＲＳＶ、コロナウイルス、口蹄疫ウイルス、オーエスキー病ウイルス、マレック病ウイルスなどの、他のヒトもしくは動物のウイルスから、または病原性細菌および寄生生物から、エピトープを有する組換えＶＬＰを調製することを可能にする。経口経路を介してのこのワクチン接種のアプローチは、病原体を根絶するためにＩｇＡの産生が必要なときに特に重要であるかもしれない。
【００９０】
別の治療的適用は、内因性遺伝子のエピトープのキャリアとして組換えロタウイルスのＶＬＰを用いること、免疫応答を誘導すること、および癌、自己免疫疾患、代謝障害に関与するものといった分子の作用を減少させることである。
【００９１】
参考文献
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Ｙｕ，Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌａｎｇｒｉｄｇｅ，Ｗ．  （２００３）．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｏｔａｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＶＰ６  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｐｏｔａｔｏ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｏｒａｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１２：  １６３−１６９．
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】乳中でロタウイルスの組換えタンパク質を産生するために用いるベクターの構造を示した図。
【図２】トランスフェクトしたＣＨＯ細胞のＶＰ２およびＶＰ６の分泌を示した図。
【図３】野生型ＶＰ６と突然変異型ＶＰ６との電気泳動の泳動度の比較を示した図。
【図４】トランスジェニックマウスの乳中でのＶＰ２およびＶＰ６の存在を示した図。
【図５】トランスジェニックウサギの乳清中でのＶＰ２およびＶＰ６の存在を示した図。
【図６】トランスジェニックＦ０マウスの乳中でのＶＰ６の三量化を示した図。
【図７】トランスジェニック乳を用いた皮下での免疫付与後の、血清中の抗ＶＰ２−ＶＰ６ＩｇＧ抗体を示したグラフ。
【図８】トランスジェニック乳を用いた経口での免疫付与後の、血清中の抗ＶＰ２−ＶＰ６ＩｇＧ抗体および糞便中の抗ＶＰ２−ＶＰ６ＩｇＡ抗体を示したグラフ。
【図９】分泌された野生型ＶＰ６がグリコシル化されていることを示した図。
【図１０】修飾型のＶＰ６がグリコシル化されていないことを示した図。
【図１１】修飾後のＶＰ２の発現の増強を示した図。
【図１２】ウイルス抗原の排泄の割合の減少を示したグラフ。
【図１３】トランスジェニックウサギの乳の免疫原性およびチャレンジに対するマウスの防御を示したグラフ。
【図１】
2007525991.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007525991.tif 000008
【図６】
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【図７】
2007525991.tif 000010
【図８Ａ】
2007525991.tif 000011
【図８Ｂ】
2007525991.tif 000012
【図９】
2007525991.tif 000013
【図１０】
2007525991.tif 000014
【図１１】
2007525991.tif 000015
【図１２】
2007525991.tif 000016
【図１３Ａ】
2007525991.tif 000017
【図１３Ｂ】
2007525991.tif 000018
【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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