(57)【要約】  飼料中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの定量方法を記載する。本方法は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールと異なる質量かつその化合物に類似した極性を有する規定量の内部標準（たとえば、２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロール）を飼料の水性分散液に添加する工程と、水性分散液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで抽出する工程と、ＨＰＬＣにより抽出物をさらに処理する工程と、明細書に記載されているような質量分析の工程と、を含む。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）飼料サンプルを水中に分散して、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールと異なる質量を有しかつ２５−ヒドロキシコレカルシフェロールと類似しているが異なる極性を有する規定量の内部標準化合物を該サンプルに添加する工程と；
ｂ）この水性分散液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで抽出する工程と；
ｃ）このエーテル抽出物をセミ分取ＨＰＬＣにかける工程と；
ｄ）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールおよび該内部標準化合物を含有する画分を捕集する工程と；
ｅ）ｄ）で捕集された画分またはそのアリコートを質量分析と組み合わされたＨＰＬＣにかける工程と；
ｆ）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールのＭＳピーク面積および添加された該内部標準化合物のＭＳピーク面積を決定する工程と；
ｇ）測定された該ＭＳピーク面積を計算処理にかけて２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの量を算出する工程と；
を含む、動物用飼料中の２５−ヒドロキシ−コレカルシフェロールの定量方法。
【請求項２】
前記標準化合物が、２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロール、２５−ヒドロキシ−エルゴカルシフェロール、または１α−ヒドロキシ−コレカルシフェロールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標準化合物が２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記セミ分取ＨＰＬＣが、固定相としてシリカゲルかつ移動相としてイソプロパノール：エチルアセテート：イソオクタン混合物を用いて行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記移動相が、約１：１０：８９の比（体積基準）のイソプロパノール：エチルアセテート：イソオクタンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記固定相が、ハイパーシルＳｉ６０（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｓｉ  ６０）、３μｍである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記分析用ＨＰＬＣが、測定対象の物質が濃縮されるトラッピングカラムと分離に供される固有の分析カラムとを含むクロマトグラフィーシステムで行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記分析用ＨＰＬＣの固定相が、アクアシルＣ１８（Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８）、３μｍなどの変性シリカゲルである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のギ酸を含有する水と０．０５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のギ酸を含有するメタノールとのグラジエントが、移動相として使用される、請求項７または８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、動物用飼料中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（２５−ヒドロキシビタミンＤ３）の定量方法に関する。２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは、家畜やペットなどの動物の健康状態を改善するために、動物用飼料への添加剤として使用され、ヒ・デー（Ｈｙ−Ｄ）ＴＭ（スイス国バーゼルのロシュ・ビタミン・アーゲー（ＲＯＣＨＥ  ＶＩＴＡＭＩＮＳ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））として入手可能である。その生理学的効力および狭い治療濃度域を考えると、化合物の投与量はきわめて重要であるので、飼料中の化合物の量および飼料中のその均一分布を監視するために、信頼性の高い分析手段が必要とされる。血漿中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの種々の定量方法が報告されている。これらは、イムノアッセイに基づくか（ＷＯ９９／６７２１１を参照されたい）、または内部標準として誘導体もしくは同位体を用いるＨＰＬＣ／質量分析に基づく（生物学薬学誌（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）（２００１年）、第２４巻（第７号）、７３８−７４３頁を参照されたい）。しかしながら、これらの公知の方法は、飼料サンプルの分析に利用した場合、十分とは言えない。
【０００２】
以前の方法のいずれを用いても、固体の化学物質および生体物質が多量に存在することが原因で、飼料サンプル中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを分析するのは困難である。これに対して、血漿または血清は、主に水からなる。２つのタイプの方法が利用可能である。ＨＰＬＣおよびＵＶ検出を用いる物理化学的方法ならびにサンプル精製用ＨＰＬＣおよび放射性標識化免疫試薬を用いる免疫化学的方法については、ブルース・ダブリュー・ホリス（Ｂｒｕｃｅ．Ｗ．Ｈｏｌｌｉｓ）、国際石灰化組織誌（Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．）（１９９６年）第５８巻：４−５頁を参照されたい。他の方法は、同様に労力のかかるものであり、定量のために放射性物質を使用する分析工程を含む。この方法は、内部標準としての３Ｈ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの添加、メタノールによる抽出、逆相セップ・パック（ＳＥＰ−ＰＡＫ）カートリッジによるサンプル精製、順相セップ・パック（ＳＥＰ−ＰＡＫ）カートリッジによるさらなる精製、順相ＨＰＬＣによるさらなる精製、および最終的な本質的分析用逆相ＨＰＬＣからなる。全回収率は、３Ｈ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールのシンチレーション計数により決定される。定量化は、２６４ｎｍにおいて外部検量およびＵＶ検出により行われる。最終的な定量化がＵＶにより行われるので、サンプル精製手順は、あまりにも労力がかかりすぎる。そのように抽出物の精製が複雑であるため、放射性標識化２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを用いて回収率の決定を行うことが必要となる。両方法とも操作が面倒であり、性能特性や再現性に不十分な点が多い。
【０００３】
本発明は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを定量するための多工程ではあるが単純明快である新規な手順を提供する。この手順を動物用飼料サンプルに適用した場合、満足すべき結果が得られる。
【０００４】
より特定的には、本発明は、
ａ）飼料サンプルを水中に分散して、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールと異なる質量を有しかつ２５−ヒドロキシコレカルシフェロールと類似しているが異なる極性を有する規定量の内部標準化合物をサンプルに添加する工程と；
ｂ）水性分散液をｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで抽出する工程と；
ｃ）エーテル抽出物をセミ分取ＨＰＬＣにかける工程と；
ｄ）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールおよび内部標準化合物を含有する画分を捕集する工程と；
ｅ）ｄ）で捕集された画分またはそのアリコートを質量分析と組み合わされたＨＰＬＣにかける工程と；
ｆ）２５−ヒドロキシコレカルシフェロールのＭＳピーク面積および添加された内部標準化合物のＭＳピーク面積を決定する工程と；
ｇ）測定されたＭＳピーク面積を計算処理にかけて２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの量を算出する工程と；
を含む、動物用飼料中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの定量方法に関する。
【０００５】
工程ａ）で使用される内部標準化合物は、たとえば、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの誘導体、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの異性体、または同位体標識化２５−ヒドロキシコレカルシフェロールであり、例としては、２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールなどのジュウテリウム標識化同位体（テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．）、第３２巻、第２４号、２８１３−２８１６頁（１９９１年））；または２５−ヒドロキシエルゴカルシフェロールまたは１α−ヒドロキシコレカルシフェロールが挙げられる。好ましい標準化合物は、２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールである。標準化合物は、好適には、飼料サンプルを水中に分散または溶解させる前にメタノール溶液として添加される。サンプルに添加される標準化合物の量は、決定的に重要というわけでない。好適には、標準化合物は、２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを基準にして約０．０５ｍ〜ほぼ等モルの濃度を提供する量で添加される。次に、工程ｂ）において、好ましくは超音波処理を併用して、飼料サンプルの水性分散液または水溶液を約１〜１０倍量のｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルで抽出する。工程ｃ）で用いられるセミ分取ＨＰＬＣは、好適には酸素を排除して、工程ｂ）で得られた抽出物から有機溶媒を蒸発させ、脂肪族Ｃ５〜Ｃ８炭化水素（たとえばイソオクタン）などの無極性溶媒またはそのような溶媒と低級アルカノール（たとえばイソプロパノール）および／もしくはエステル（たとえばエチルアセテート）などの他の極性溶媒との混合物を用いてシリカゲルにかけることにより、達成される。セミ分取ＨＰＬＣに好ましい系は、シリカゲルおよび約１：１０：８９（体積基準）のイソプロパノール：エチルアセテート：イソオクタン混合物である。工程ｅ）で用いられる分析用ＨＰＬＣは、好適には、水または低級アルカノールなどの極性溶媒を用いて変性シリカゲルなどの非極性固定相のカラムで行われる。本明細書中で使用される「変性シリカゲル」という用語は、たとえば、Ｃ１８炭化水素部分でエーテル化されたシリカゲル（たとえば、英国ランコーンのサーモ・ハイパーシル・キーストーン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｒｕｎｃｏｒｎ，ＵＫ）により供給されるアクアシルＣ１８（Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８））などの逆相シリカゲルを意味する。
【０００６】
質量分析測定に基づいて工程ｇ）で求められるサンプル中の２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの量は、以下に示される式により算出される：
【数１】
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ＲＦ＝応答係数；ＲＲＦ＝相対応答係数；ＩＳＤ＝内部標準溶液；ＨＤ＝２５−ヒドロキシコレカルシフェロール；ｃ＝濃度［ｎｇ／ｍｌ］。
【０００７】
相対応答係数（ＲＲＦ）は、メタノール：水（７０：３０）の溶液中に２５−ヒドロキシコレカルシフェロールおよび２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの両方を約５ｎｇ／ｍｌで含んでなる溶液を用いて決定される。
【０００８】
以下の実施例により、本発明についてさらに説明する。
【実施例】
【０００９】
Ａ．抽出：１０ｇの飼料サンプル（２８．６％のダイズ、３％のフィッシュミール、２％のダイズ油、５７．３％のトウモロコシ、２％のトウモロコシデンプン、２  ５のリグノスルホネート、３．１％のコメ、２％のミネラルミックスからなる混合物を含む）をエルレンマイヤーフラスコ中に秤量した。約５００ｎｇの２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（５０ｍｌのメタノール中に２．５ｍｇの２６，２７−ヘキサジュウテロ−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを含んでなる溶液０．０１ｍｌ）および６０ｍｌの水をそれに添加し、スラリーを５０℃の超音波処理浴中で１０分間処理した。次に、４０ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルを添加し、混合物を激しく５分間振盪し、再び５分間超音波処理し、そして遠心分離した。１０ｍｌの有機上澄みを分離し、酸素を排除してエバポレートした。
【００１０】
Ｂ．セミ分取ＨＰＬＣ：残渣を２ｍｌの移動相（イソプロパノール：エチルアセテート：イソオクタン（１：１０：８９））に溶解させ、遠心し、透明上澄みの１００μｌアリコートをハイパーシルＳｉ６０（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｓｉ  ６０）、３μｍ、１２０Å、１５０×４．６ｍｍ（シャンドン（Ｓｈａｎｄｏｎ））のセミ分取ＨＰＬＣカラムに注入した。流量は、１．０ｍｌ／分であった。１４〜１６分の画分を捕集し（開始前に混合標準溶液を注入することにより画分分離をチェックした）、窒素ストリーム中、５０℃でエバポレートした。超音波浴を用いて残渣を０．７ｍｌのメタノールに溶解させた。次に、０．３ｍｌの水を添加し、質量分析計と組み合わされた分析用ＨＰＬＣカラムに溶液を注入した。
【００１１】
Ｃ．分析用ＨＰＬＣ：特定質量検出器と組み合わされたクロマトグラフィーシステムを利用して、分析用ＨＰＬＣを行った。特定質量検出器の前方にあるクロマトグラフィーシステムは、測定対象の物質が濃縮されるトラッピングカラムと分離に供される固有の分析カラムとからなっていた。
【００１２】
装置を図４に模式的に示す。図４中、「ＴＣ」はトラッピングカラムを意味し、「ＡＣ」は分析カラムを意味し、「ＭＳＤ」は特定質量検出器を意味する。「Ａ」および「Ｂ」は、異なる動作モードにおけるクロマトグラフィーシステムの移動相の受け部を記号で表したものである。
【００１３】
トラッピングカラム（ＴＣ）では、固定相は、アクアシルＣ１８（Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８）、３μｍ、２．０×１０ｍｍであった。分析カラム（ＡＣ）では、固定相は、アクアシルＣ１８（Ａｑｕａｓｉｌ  Ｃ１８）、３μｍ、３．０×１５０ｍｍであった。移動相は、水（０．０５％のＨＣＯＯＨを含有する）およびメタノール／水（０．０５％のＨＣＯＯＨを含有する）グラジエントであった。システムの動作パラメーターは、以下のとおりであった：
【００１４】
【表１】
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【００１５】
以下の表１に示されるスキームに従ってクロマトグラフィーを行った：
【００１６】
【表２】
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【００１７】
特定質量検出器（ＭＳＤ）のパラメーターは、以下のとおりであった：
【００１８】
【表３】
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【００１９】
【表４】
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【００２０】
上記の装置および動作モードを用いて、標準溶液、ブランク飼料サンプル（２５−ヒドロキシコレカルシフェロールは存在せず）、および典型的飼料サンプルを分析した。次のように標準溶液を調製した：
【００２１】
１．  ２５−ヒドロキシコレカルシフェロール
２．５ｍｇの２５−ヒドロキシビタミンＤ３を５０ｍｌのメタノールに溶解させた。この溶液の２ｍｌをメタノールで２００ｍｌに希釈して５００ｎｇ／ｍｌを含有する溶液を得た。
【００２２】
２．  ｄ６−２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（内部標準）
２．５ｍｇのｄ６−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールを５０ｍｌのメタノールに溶解させた。この溶液の２ｍｌをメタノールで２００ｍｌに希釈して５００ｎｇ／ｍｌを含有する溶液を得た。
【００２３】
３．  ２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの溶液（１．）およびｄ６−２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの溶液（２．）の各１ｍｌをメタノール：水（７０：３０）で１００ｍｌに希釈して１ｍｌあたり５ｎｇのヒドロキシル化コレカルシフェロールを含有する溶液を得た。
【００２４】
上記のパラグラフＡ．に記載した手順と同様にしてブランク飼料サンプルを分析した。
【００２５】
標準溶液、ブランク飼料サンプル、および典型的飼料サンプルの抽出イオンクロマトグラムを図１〜３に示す。先に与えられた式により２５−ヒドロキシコレカルシフェロールの量を算出した。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明の実施例に係る標準溶液の抽出イオンクロマトグラムである。
【図２】本発明の実施例に係るブランク飼料サンプルの抽出イオンクロマトグラムである。
【図３】本発明の実施例に係る典型的飼料サンプルの抽出イオンクロマトグラムである。
【図４】本発明の実施例に係る分析用ＨＰＬＣの装置の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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