(57)【要約】  【化１】2007516186.tif 000088  本発明は、置換テトラヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［３,４−ｃ］ピリジン、それらを含む組成物、及びそれらの使用に関する。特定には、本発明は、特に腫瘍学において有用な、治療活性を有する新規の置換テトラヒドロ−１Ｈ−ピラゾロ［３,４−ｃ］ピリジンに関する。
2007516186.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）：
【化１】
2007516186.tif 000084
の生成物及びその互変異性体。
式中：
Ｌは結合、ＣＨ2、ＣＯ、ＳＯ2、ＣＯＮＨ、ＣＯＯ、ＮＨＣＯ、ＮＨ、ＮＨＳＯ2、ＳＯ2ＮＨ、ＮＨＣＯＮＨ、ＣＨ2ＮＨ及びＮＨＣＨ2から選択され；
Ｘは結合、ＣＨ2、ＣＯ、ＳＯ2、ＣＯＮＨ及びＣＯＯから選択され；
Ｒ１はＯＨ、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており、Ｘが結合である場合、Ｒ１はハロゲンであってもよく；
Ｒ２はＨであるか又はアルキル、アルキレン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
そしてここで、置換基は独立してＲ３、Ｏ−Ｒ３、ハロゲン、ＮＯ2、ＳＯ2−Ｒ３、ＣＯ−Ｒ３、ＳＯ2ＮＨ−Ｒ３、ＣＯＮＨ−Ｒ３、Ｎ−(Ｒ３)2、ＮＨＣＯ−Ｒ３、ＮＨＳＯ2−Ｒ３、ＮＨＣＯＮＨ−Ｒ３、ＮＨＳＯ2ＮＨ−Ｒ３、ＯＣＯ−Ｒ３、ＣＯＯ−Ｒ３、ＯＳＯ2−Ｒ３、ＳＯ2Ｏ−Ｒ３、ＯＣＯＮＨ−Ｒ３及びＯＳＯ2ＮＨ−Ｒ３から選択され、ここでＲ３は独立してＨ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから選択され、これは場合によりハロゲン、アリール、ヘテロアリール、Ｒ４、ＯＲ４又はＮ(Ｒ４)2で置換されており、ここで各Ｒ４は独立してＨ、Ｃ1−Ｃ4アルキル及びハロゲン化Ｃ1−Ｃ4アルキルから選択される。
【請求項２】
下記式（II）：
【化２】
2007516186.tif 000085
の請求項１に記載の生成物及びその互変異性体。
式中：
Ｘは結合、ＣＨ2、ＣＯ、ＳＯ2、ＣＯＮＨ及びＣＯＯから選択され；
Ｒ１はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
Ｒ２はＨであるか又はアルキル、アルキレン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
そしてここで、置換基は独立してＲ３、Ｏ−Ｒ３、ハロゲン、ＮＯ2、ＳＯ2−Ｒ３、ＣＯ−Ｒ３、ＳＯ2ＮＨ−Ｒ３、ＣＯＮＨ−Ｒ３、Ｎ−(Ｒ３)2、ＮＨＣＯ−Ｒ３、ＮＨＳＯ2−Ｒ３、ＮＨＣＯＮＨ−Ｒ３、ＮＨＳＯ2ＮＨ−Ｒ３、ＯＣＯ−Ｒ３、ＣＯＯ−Ｒ３、ＯＳＯ2−Ｒ３、ＳＯ2Ｏ−Ｒ３、ＯＣＯＮＨ−Ｒ３及びＯＳＯ2ＮＨ−Ｒ３から選択され、ここで各Ｒ３は独立してＨ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから選択され、これは場合によりハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ＯＲ４又はＮ(Ｒ４)2で置換されており、ここで各Ｒ４は独立してＨ及びＣ1−Ｃ4アルキルから選択される。
【請求項３】
下記式（III）：
【化３】
2007516186.tif 000086
の請求項１に記載の生成物及びその互変異性体。
式中：
Ｘは結合、ＣＨ2、ＣＯ、ＳＯ2、ＣＯＮＨ及びＣＯＯから選択され；
Ｒ１はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
Ｒ２はＨであるか又はアルキル、アルキレン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
そしてここで、置換基は独立してＲ３、Ｏ−Ｒ３、ハロゲン、ＮＯ2、ＳＯ2−Ｒ３、ＣＯ−Ｒ３、ＳＯ2ＮＨ−Ｒ３、ＣＯＮＨ−Ｒ３、Ｎ−(Ｒ３)2、ＮＨＣＯ−Ｒ３、ＮＨＳＯ2−Ｒ３、ＮＨＣＯＮＨ−Ｒ３、ＮＨＳＯ2ＮＨ−Ｒ３、ＯＣＯ−Ｒ３、ＣＯＯ−Ｒ３、ＯＳＯ2−Ｒ３、ＳＯ2Ｏ−Ｒ３、ＯＣＯＮＨ−Ｒ３及びＯＳＯ2ＮＨ−Ｒ３から選択され、ここで各Ｒ３は独立してＨ、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから選択され、これは場合によりハロゲン、アリール、ヘテロアリール、ＯＲ４又はＮ(Ｒ４)2で置換されており、そしてここで各Ｒ４は独立してＨ及びＣ1−Ｃ4アルキルから選択される。
【請求項４】
Ｒ１が場合により置換されているヘテロアリールである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項５】
Ｒ１がベンゾイミダゾリル、インドリル、ピロリルから選択され、これは場合によりハロゲン、Ｒ４又はＯ−Ｒ４で置換されている、請求項４に記載の生成物。
【請求項６】
Ｒ１がベンゾイミダゾール−２−イル、インドール−２−イル、ピロール−２−イルから選択され、これは場合によりハロゲン、Ｒ４又はＯ−Ｒ４で置換されている、請求項５に記載の生成物。
【請求項７】
Ｒ２がフェニル、ピリジル、チエニル、Ｃ1−Ｃ4アルキル及びＣ3−Ｃ7シクロアルキルから選択され、これは場合により置換されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項８】
ＸがＣＯ及びＳＯ2から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項９】
Ｒ１がＨである、請求項１に記載の生成物。
【請求項１０】
Ｒ１が置換アリールである、請求項１に記載の生成物。
【請求項１１】
Ｒ１−ＬがＲ１−ＮＨ−ＣＯである、請求項１に記載の生成物。
【請求項１２】
Ｒ１がＨである、請求項１１に記載の生成物。
【請求項１３】
Ｘが結合であり、そしてここでＲ２は置換アリール及び置換ヘテロアリールから選択される、請求項１、１１及び１２のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項１４】
Ｒ２が、
−ＮＨＳＯ2−Ｒ３又はＮＨＣＯＮＨ−Ｒ３で置換されているアリール、及び
−ＮＨＳＯ2−Ｒ３又はＮＨＣＯＮＨ−Ｒ３で置換されているヘテロアリール
から選択される、請求項１３に記載の生成物。
【請求項１５】
アリールがフェニルであり、そしてここでヘテロアリールはピリジル及びピリミジルから選択される、請求項１４に記載の生成物。
【請求項１６】
Ｒ３が置換アリール及び置換ヘテロアリールから選択される、請求項１４に記載の生成物。
【請求項１７】
Ｒ３がハロゲン、Ｒ４、ＯＲ４及びＮ(Ｒ４)2から成る群より選択される置換基で置換されており、ここで各Ｒ４は独立してＨ、Ｃ1−Ｃ4アルキル及びハロゲン化Ｃ1−Ｃ4アルキルから選択される、請求項１６に記載の生成物。
【請求項１８】
【化４】
2007516186.tif 000087
から選択される、請求項１７に記載の生成物。
【請求項１９】
１）ラセミ形態、又は
２）立体異性体が富化された形態、又は
３）鏡像異性体が富化された形態、
であり、また場合により塩にされている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の生成物。
【請求項２０】
医薬として許容し得る添加剤と組み合わせて請求項１〜１９のいずれか１項に記載の生成物を含む医薬組成物。
【請求項２１】
キナーゼ活性を調節する薬剤としての請求項１〜１９のいずれか１項に記載の生成物の使用。
【請求項２２】
キナーゼがＴｉｅ２及びＫＤＲから選択される、請求項２１に記載の生成物の使用。
【請求項２３】
病理学的状態の治療に有用な医薬品を製造するための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の生成物の使用。
【請求項２４】
病理学的状態が癌である、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、特に新規テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン、それらを含む組成物、及びそれらの医薬品としての使用に関する。
より特定的には、本発明は抗癌活性、特にキナーゼ阻害活性、特にTie2阻害活性を示す新規テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ごく僅かのテトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンが知られている。
即ち、WO 02/012442は、場合により置換されているアミノ基で５位において置換されているテトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンを開示している。これらの生成物は、癌及び細胞増殖に関するその他の疾患の治療に有用である。
P. Krogsgaard-Larsenらは、Eur. J. Med. Chemical-Chim. Ther. (1979)、14(2)、157-164頁において、ヒドロキシル基で３位において置換されている２種のテトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンを開示している。
【０００３】
WO 96/12720は、Ｈ、アルキル、アルキレン、シクロアルキル及びメチレンシクロアルキルから選択される置換基で３位において、そして様々な置換基で１位及び６位において置換されているテトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンを特許請求している。これらの生成物は、(ｉ)IV型ホスホジエステラーゼ(PDE-IV)及び(ii)腫瘍壊死因子 (TNF)の阻害剤として記載されており、そして結果として炎症性疾患の治療に有用であると考えられている。本発明の化合物の例は一切開示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
Tie2の効果的な阻害剤を得ることが試みられており、既に成功している(これに関しては、例えばWO 98/02434；WO 98/41525；WO99/10325；WO 99/17770；WO 99/54286；WO 99/21859；WO 99/55335；WO 00/17202；WO 00/17203；WO 00/27822；WO 00/75139；WO 01/37835；WO 01/57008；WO 01/72751；WO 02/060382；WO 02/076396；WO 02/076463；WO 02/076954；WO 02/076984；WO 02/076985；WO02/080926；WO 03/004488を参照)。
しかしながら、これらの文献のいずれにおいても、キナーゼ、特にTie2に対する活性を示す下記4,5,6,7-テトラヒドロ-1H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン誘導体については開示されていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この趣旨で、第１の態様に従う本発明の生成物は、下記式(Ｉ)：
【化１】
2007516186.tif 000003
を満たす生成物及びその互変異性体であり、式中、
Lは結合、CH2、CO、SO2、CONH、COO、NHCO、NH、NHSO2、SO2NH、NHCONH、CH2NH及びNHCH2から選択され；
Xは結合、CH2、CO、SO2、CONH及びCOOから選択され；
R1はOH、H、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール
から選択され、これは場合により置換されており、Xが結合である場合、R1はハロゲンであることもでき；
R2はHであるか、またはアルキル、アルキレン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
置換基は独立してR3、O-R3、ハロゲン、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3及びOSO2NH-R3から選択され、ここで各R3は独立してH、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから選択され、これは場合によりハロゲン、アリール、ヘテロアリール、R4、OR4又はN(R4)2で置換されており、各R4 は独立してH、C1-C4アルキル及びハロゲン化C1-C4アルキルから選択される。
【０００６】
第１の態様に従う本発明の生成物は、より特定的には、下記式(II)：
【化２】
2007516186.tif 000004
の生成物及びその互変異性体から選択され、式中：
Xは結合、CH2、CO、SO2、CONH及びCOOから選択され；
R1はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
R2はHであるか又はアルキル、アルキレン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
置換基は独立してR3、O-R3、ハロゲン、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3及びOSO2NH-R3から選択され、ここで各R3は独立してH、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから選択され、これは場合によりハロゲン、アリール、ヘテロアリール、OR4又はN(R4)2で置換されており、ここで各R4は独立してH及びC1-C4アルキルから選択される。
【０００７】
第１の態様に従う本発明の生成物は、より特定的には、下記式(III)：
【化３】
2007516186.tif 000005
の生成物及びその互変異性体から選択され、式中：
Xは結合、CH2、CO、SO2、CONH及びCOOから選択され；
R1はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
R2はＨであるか又はアルキル、アルキレン、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリールから選択され、これは場合により置換されており；
ここで置換基は独立してR3、O-R3、ハロゲン、NO2、SO2-R3、CO-R3、SO2NH-R3、CONH-R3、N-(R3)2、NHCO-R3、NHSO2-R3、NHCONH-R3、NHSO2NH-R3、OCO-R3、COO-R3、OSO2-R3、SO2O-R3、OCONH-R3及びOSO2NH-R3から選択され、ここで各R3は独立してH、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルから選択され、これは場合によりハロゲン、アリール、ヘテロアリール、OR4又はN(R4)2で置換されており、そしてここで各R4は独立してH及びC1-C4アルキルから選択される。
【０００８】
本発明の生成物は、有利にはその第１の態様の生成物から選択され、式中、R1は場合により置換されているヘテロアリールであり、ここでヘテロアリールは好ましくは、ハロゲン、R4又はO-R4で場合により置換されているベンゾイミダゾリル、インドリル、ピロリルから選択される。
より特定的には、ヘテロアリールは好ましくは、ハロゲン、R4又はO-R4で場合により置換されているベンゾイミダゾール-2-イル、インドール-2-イル、ピロール-2-イルから選択される。
本発明の第１の態様の生成物は有利には、フェニル、ピリジル、チエニル、C1-C4アルキル及びC3-C7シクロアルキルから選択される置換基R2を有し、これは場合により置換されている。
【０００９】
Ｘは有利にはCO及びSO2から選択される。
本発明の第１の態様の生成物は有利には、R1がＨである式(Ｉ)の生成物から選択される。
好ましい生成物は有利には、R1が置換アリールである式(Ｉ)の生成物から選択される。
【００１０】
第１の好ましい実施態様によれば、好ましい生成物は有利には、R1-LがR1-NH-COであり、より好ましくはここでR1がHである式(Ｉ)の生成物から選択される。
【００１１】
特に好ましくは、第２の好ましい実施態様によれば、好ましい生成物は有利には、（ｉ）式(Ｉ)の生成物、又は（ii）好ましくはＸが結合であり、そしてR2が置換アリール及び置換ヘテロアリールから選択される第１の好ましい実施態様の生成物から選択される。
【００１２】
第３の好ましい実施態様によれば、より好ましい生成物は、R2が：
NHSO2-R3又はNHCONH-R3で置換されているアリール、及び
NHSO2-R3又はNHCONH-R3で置換されているヘテロアリール、
から選択される本発明の第２の実施態様の生成物から選択される。
第３の好ましい実施態様の生成物は、有利には：
NHSO2-R3又はNHCONH-R3で置換されているアリール、及び
NHSO2-R3又はNHCONH-R3で置換されているヘテロアリール、
から選択され、ここでアリールはフェニルであり、ヘテロアリールはピリジル及びピリミジルから選択される。
【００１３】
第４の実施態様によれば、第３の好ましい実施態様の生成物は、有利には：
NHSO2-R3又はNHCONH-R3で置換されているアリール、及び
NHSO2-R3又はNHCONH-R3で置換されているヘテロアリール、
から選択され、ここでR3は置換アリール及び置換ヘテロアリールから選択され、R3は有利には、ハロゲン、R4、OR4及びN(R4)2から成る群より選択される置換基で置換されており、ここで各R4は独立してＨ、C1-C4アルキル及びハロゲン化C1-C4アルキルから選択される。
【００１４】
第５の実施態様によれば、第４の好ましい実施態様の生成物は、有利には：
【化４】
2007516186.tif 000006
から選択される。
【００１５】
本発明の第1の態様の生成物は：
１）ラセミ形態、又は
２）立体異性体が富化された形態、又は
３）鏡像異性体が富化された形態、
であってよく、そして場合により塩にされていてもよい。
【００１６】
第２の態様によれば、本発明は、医薬として許容し得る添加剤と組み合わせて上述の生成物を含む医薬組成物に関する。
【００１７】
第３の態様によれば、本発明は、キナーゼ活性を調節する薬剤としての上述の生成物の使用に関する。好ましいキナーゼは、有利にはTie2及びKDRから選択される。Tie2はより好ましい。
第３の態様によれば、本発明は、病理学的状態、特に癌の治療に有用である医薬品を製造するための、上述の生成物の使用に関する。
【００１８】
本発明の生成物は、当業者に周知の方法、特に酸及びアミン間のカップリング技術に関する方法により得ることができる。例えばJ. March, Advanced organic chemistry, (J. Wiley & Sons編), 第4版, 1992を参照されたい。
本発明の生成物は、キナーゼが触媒する反応を阻害する薬剤として有用である。Tie2は、本発明の生成物が阻害剤として特に有効に作用するキナーゼである。これらの生成物はまた、KDRのようなその他のキナーゼの阻害剤としても使用できる。
【００１９】
これらのキナーゼが選択される理由は以下のとおりである：
Ｔｉｅ２
Tie-2(TEK)は、内皮細胞に特異的なチロシンキナーゼ受容体ファミリーの一員である。Tie2はチロシンキナーゼ活性を有する第一の受容体であり、Tie2に対しては、受容体の自己リン酸化及び細胞シグナリングを促進するアゴニスト(アンギオポイエチン(angiopoietin)１又はAng1) [S. Davisら(1996) Cell 87, 1161-1169]、及びアンタゴニスト(アンギオポイエチン２又はAng2) [P.C.Maisonpierreら (1997) Science 277, 55-60]の両方が知られている。アンギオポイエチン１は、新血管形成の最終段階においてVEGFと共同作用することができる[Asahara T. Circ. Res. (1998) 233-240]。Tie2又はAng1発現のノックアウト実験及び遺伝子組み換え操作により、血管形成異常を示す動物が得られた[D.J. Dumontら(1994) Genes Dev. 8, 1897-1909及びC. Suri (1996) Cell 87, 1171-1180]。Ang1がその受容体に結合することによって、Tie2のキナーゼドメインの自己リン酸化が引き起こされ、これは新血管形成にとって、並びに補充(recruitment)及び血管の周皮細胞及び平滑筋との相互作用にとって必須であり；これらの事象は、新たに形成される血管の成熟及び安定化に寄与する [P.C. Maisonpierreら(1997) Science 277、55-60]。Linら(1997), J. Clin. Invest. 100, 8：2072-2078、及びLin P. (1998) PNAS 95, 8829-8834は、胸部腫瘍及び黒色腫異種移植片モデルにおいて、アデノウイルス感染又はTie2(Tek)細胞外ドメイン注入によって腫瘍成長及び血管形成の阻害、並びに肺転移の減少が起きることを示している。
【００２０】
Tie2阻害剤は、新血管形成が不適切に起きている状況(即ち、糖尿病性網膜症、慢性炎症、乾癬、カポジ肉腫、黄斑変性による慢性新血管形成、リウマチ様関節炎、小児心膜血腫及び癌)において使用できる。
【００２１】
ＫＤＲ
KDR(キナーゼ挿入ドメイン受容体(Kinase insert Domain Receptor))は、VEGF-R2(血管内皮成長因子受容体２(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2))としても知られており、内皮細胞においてのみ発現する。この受容体は血管由来成長因子VEGFに結合し、従ってその細胞内キナーゼドメインの活性化を介してトランスダクションシグナルへのメディエイターとして作用する。VEGF-R2のキナーゼ活性を直接阻害することによって、外因性VEGF(血管内皮成長因子(Vascular Endothelial Growth Factor))の存在下で血管形成事象を減少させることができる(Strawnら, Cancer Research, 1996, 第56巻, 3540-3545頁)。このプロセスは、特にVEGF-R2変異体を用いて証明されている(Millauerら, Cancer Research, 1996, 第56巻, 1615-1620頁)。VEGF-R2受容体は、成人において、VEGFの血管形成活性への関与以外はいかなる機能も有しないようである。従って、VEGF-R2のキナーゼ活性の選択的阻害剤はほんの僅かな毒性しか示さないであろう。
【００２２】
近年の研究結果から、動的血管形成プロセスにおけるこの中心的作用に加えて、VEGF発現が化学療法及び放射線療法の腫瘍細胞の生存に寄与することが示唆されており、従ってKDR阻害剤と他の薬剤との相乗作用の可能性が重要視される(Leeら Cancer Research, 2000, 第60巻, 5565-5570頁)。
【００２３】
実験
方法Ａ：ＬＣ／ＭＳによる分析
LC/MS分析は、HP1100デバイスに接続したMicromassモデルLCTデバイスによって行った。多くの生成物を、HPG1315Aダイオードアレー検出器(波長200〜600nm)及びSedex65光散乱検出器を用いて測定した。質量スペクトルを180〜800のレンジで得た。データをMicromass MassLynxソフトウェアを用いて分析した。Hypersil BDS C18、3μm (50 x 4.6mm)カラム上で、流速１mL／分で3.5分かけて、0.05％(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)を含む水に対し、0.05％(v/v)TFAを含むアセトニトリル5〜90％の直線勾配で溶離することによって分離した。カラムの再平衡化のための時間を含め、分析時間は合計７分間で行った。
【００２４】
方法Ｂ：ＬＣ／ＭＳによる精製：
生成物を、Watersモデル600グラジエントポンプ、Watersモデル515再生ポンプ、Waters
Reagent Manager希釈ポンプ、Watersモデル2700自動注入器、２個のRheodyneモデルLabProバルブ、Watersモデル996ダイオードアレー検出器、WatersモデルZMD質量分析器及びGilsonモデル204画分回収器から成るWaters FractionsLynxシステムを使用して、LC／MSにより精製した。このシステムをWaters FractionLynxソフトウェアにより制御した。２個のWaters Symmetryカラム(C18、5μM、19x50mm、カタログ番号186000210)を交互に用いて分離を行い、一方のカラムを0.07％(v/v)トリフルオロ酢酸を含む95／5(v/v)水／アセトニトリル混合物で再生し、その間にもう一方のカラムを分離に使用した。カラムを、流速10mL／分で、0.07％(v/v)トリフルオロ酢酸を含む水に対する0.07％(v/v)トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル5〜95％の直線勾配を用いて溶離した。分離カラムの出口において、溶離液の１／1000をLC Packing Accurateにより分離し、流速0.5mL／分にてメチルアルコールで希釈し、ダイオードアレー検出器に75％を送り、質量分析計に残り25％を送った。溶離液の残り(999/1000)を画分回収器に送り、ここで予想生成物の質量がFractionLynxソフトウェアで検出されない部分の溶離液を廃棄した。予想生成物の分子式をFractionLynxソフトウェアに入力し、これにより、検出された質量シグナルがイオン[M+H]+及び／又は[M+Na]+に一致する場合に生成物の回収を行った。特定の場合には、分析LC/MSの結果に応じて、[M+2H]++に一致する強いイオンが検出された場合、分子質量の計算値の半分(MW/2)に一致する値もFractionLynxソフトウェアに入力した。これらの条件下で、イオン[M+2H]++及び／又は[M+Na+H]++の質量シグナルが検出される場合に回収を行った。
【００２５】
方法Ｃ：ＥＩ分析
Finnigan SSQ 7000スペクトロメータを用いて電子衝撃(70eV)により、質量スペクトルを得た。
【００２６】
方法Ｄ：ＮＭＲ分析
NMRスペクトルを、Bruker Avance 300スペクトロメータ及びBruker Avance DRX 400スペクトロメータで得た。
【００２７】
tert-ブチル 4-(ジアゾエトキシカルボニルメチル)-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート
【化５】
2007516186.tif 000007
【表１】
2007516186.tif 000008
【００２８】
新しく製造したLDA溶液(不活性雰囲気下、−78℃で、ヘキサン中1.6M BuLi 50.19mLを
、乾燥THF 200mL中のジイソプロピルアミン11.29mLの溶液に滴下して加えることにより製造)を、不活性雰囲気下、−78℃で、乾燥THF 300mL中に懸濁されたN-Boc-ピペリジノン10.0ｇ及びエチル ジアゾアセテート5.54mLに滴下して加えた。混合物を−78℃で４時間撹拌し、次いで濃AcOH 14.35mLを用いて−78℃で分解した。得られた混合物を周囲温度で一晩放置し、次いで溶媒を減圧下で蒸発させて最初の体積の１／10にした。これをジイソプロピルエーテル中に希釈し、飽和NaHCO3溶液で４回洗浄した。有機相をMgSO4上で乾燥した。水和した塩を濾過により除去し、乾燥した濾液を減圧下で濃縮して、粘稠黄色油状物質15.12ｇを得た。LC/MS：RT＝2.84；[M+1]+＝304.33. 生成物をそのまま次の工程に使用した。
【００２９】
tert-ブチル 4-(ジアゾエトキシカルボニルメチル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジン-1-カルボキシレート
【化６】
2007516186.tif 000009
【表２】
2007516186.tif 000010
【００３０】
乾燥ピリジン78.0mLをiPr2O 250mL中のtert-ブチル 4-(ジアゾエトキシカルボニルメチル)-4-ヒドロキシピペリジン-1-カルボキシレート15.12ｇの溶液に加えた。混合物を−10℃に冷却し、激しく撹拌しながらPOCl3 8.86mLをゆっくりと加えた。次いで、混合物を撹拌しながら12時間放置して周囲温度に戻した。反応混合物を0.1M NaOH溶液500mLを用いて分解し、次いでEtOAcで３回抽出した。有機相を飽和NaCl溶液で洗浄し、MgSO4上で乾燥した。水和した塩を濾過により除去し、乾燥した濾液を減圧下で濃縮して最初の体積の1/10にした。LC/MS：RT＝4.57；[M+1]+＝296.31. 生成物をそのまま次の工程に使用した。
【００３１】
6-tert-ブチル 3-エチル 2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジル-3,6-ジカルボキシレート
【化７】
2007516186.tif 000011
【表３】
2007516186.tif 000012
【００３２】
前工程で得られたPy/EtOAc中のtert-ブチル 4-(ジアゾエトキシカルボニルメチル)-3,6-ジヒドロ-2H-ピリジル-1-カルボキシレートの溶液を還流下でトルエン150mLに滴下して加えた。共沸 Py/PhMeを、添加速度と同じ速さで蒸留した。溶液を、添加終了後１時間放置して周囲温度に冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させ、得られた粗製生成物(15.05ｇ)を、フラッシュクロマトグラフィー (SiO2、CH2Cl2/MeOH 1％ NH3 7M(MeOH) 40：1 次いで30：1次いで 20：1)によって精製した。溶媒を蒸発させ、黒色固体10.05ｇ(３工程行って71％) を得た：LC/MS：RT＝3.88；[M+1]+＝296.27.
【００３３】
(tert-ブチル 2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジル-6-カルボキシレート)-3-カルボン酸
【化８】
2007516186.tif 000013
【表４】
2007516186.tif 000014
【００３４】
LiOH 1.57ｇ及び水38mLを、MeOH 375mL中の6-tert-ブチル 3-エチル 2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジル-3,6-ジカルボキシレート10.05ｇの溶液に加えた。得られた混合物を一晩還流した。溶液を周囲温度に冷却し、次いで1M HCl溶液50mLでpH＝２に酸性化した。次いで、溶液をEtOAcで４回抽出した。有機相を飽和NaCl溶液で洗浄し、次いでNa2SO4上で乾燥した。得られた塩を濾過により除去し、溶媒を減圧下で蒸発させて、白色固体8.90ｇ(98％)を得た。 LC/MS：RT＝3.21；[M+1]+＝268.23.
【００３５】
生成物ライブラリの製造：
tert-ブチル 3-(アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、ヘテロアリールカルバモイル等)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレート
【化９】
2007516186.tif 000015
【表５】
2007516186.tif 000016
【００３６】
一般的方法：
２当量のアミン(R、Ar又はHet)-NH2を含むDMF溶液中のDCC及びHOBT.H2Oを、１当量のtert-ブチル(2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジル-6-カルボキシレート)-3-カルボン酸のDMF溶液に加え、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。溶媒を減圧下で35℃で一晩留去した。得られた粗製生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(SiO2、CH2Cl2/MeOH 1％ NH3 7M(MeOH) 20：1、次いで10：1、次いで5：1、生成物に従って)により精製した。
【００３７】
使用したアミンR1-NH2のリスト(表１)[注：R1-NH2＝(R、Ar又はHet)-NH2]：
【表６】
2007516186.tif 000017
【００３８】
3-(アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、ヘテロアリールカルバモイル等)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イウム トリフルオロアセテート
【化１０】
2007516186.tif 000018
【００３９】
一般的方法：
16当量のTFAを、1：1 THF／水の溶液中の１当量のtert-ブチル 3-(アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、ヘテロアリールカルバモイル等)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレートに加え、溶液を２時間還流した。溶媒を減圧下で留去し、回収した粘稠油状物を真空下で一晩乾燥した。このようにして得られた生成物を、精製することなく次の工程に使用した。
【００４０】
6-(アルキル、アリール、ヘテロアリール等)カルボニル-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-(アルキル、アリール、ヘチル(hetyl)等)アミド
【化１１】
2007516186.tif 000019
【００４１】
一般的方法：
DMF中の2.5M HOBt・H2O(２当量)の溶液、DMF中の0.833M HBTU(２当量)の溶液、DMF中の2.5M DIPEA(４当量)の溶液、及びDMF中の適当な濃度のR2COOH (２当量)の懸濁液又は溶液を、１当量の3-(アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、ヘテロアリールカルバモイル等)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イウム トリフルオロアセテートのDMF溶液に順に加えた。溶液を周囲温度で一晩撹拌し、次いで100％ AcOH 100μlで酸性化し、濾過し、分取LC/MSにより精製した。
【００４２】
使用した酸Ｒ２ＣＯＯＨのリスト(表２)：
【表８】
2007516186.tif 000020
【００４３】
【表９】
2007516186.tif 000021
【００４４】
結果
以下の生成物を、上述の方法に従って製造した。
【化１２】
2007516186.tif 000022
【００４５】
以下の表３の生成物の表記を単純化するために、スキームＡに示したピラゾロピペリジン環を文字Ｈで表し、Ｈに結合しているアミンR1-NH2を文字Ｂで表し、その文字Ｂの後ろに１〜15の番号(この番号は表１に挙げた生成物に相当する)を記載し、Ｈに結合している
酸R2-COOHを文字Ａで表し、その文字Ａの後ろに１〜70の番号(この番号は表２に挙げた生成物に相当する)を記載した。
【００４６】
従って、A1-H-B1と表される生成物は次の構造：
【化１３】
2007516186.tif 000023
に相当する。
【表９】
2007516186.tif 000024
【００４７】
【表１０】
2007516186.tif 000025
【００４８】
【表１１】
2007516186.tif 000026
【００４９】
【表１２】
2007516186.tif 000027
【００５０】
【表１３】
2007516186.tif 000028
【００５１】
【表１４】
2007516186.tif 000029
【００５２】
【表１５】
2007516186.tif 000030
【００５３】
【表１６】
2007516186.tif 000031
【００５４】
【表１７】
2007516186.tif 000032
【実施例】
【００５５】
実施例１：3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボン酸 2-フェニルエチルアミド
【化１４】
2007516186.tif 000033
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4c]ピリジン-6-カルボン酸 2フェニルエチルアミドは、以下の方法で製造できる：
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン10mgをテトラヒドロフラン0.3mL中に懸濁した。2-フェニルエチルイソシアネート 7.8μlを加え、反応混合物を周囲温度で20時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。
【００５６】
蒸発後の残留物をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボン酸 2-フェニルエチルアミドを含む画分を合一し、SCX相(CUBCX-1HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中の2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。このようにして、3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボン酸 2-フェニルエチルアミド1.2mgを白色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：415.29；保持時間＝3.48分
【００５７】
実施例２：3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6-メタンスルホニル-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン
【化１５】
2007516186.tif 000034
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6-メタンスルホニル-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンは、以下の方法で製造できる：
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン10mgをジクロロメタン0.3mL中に懸濁した。トリエチルアミン15.8μlをメタンスルホニルクロリド4.5μlと共に加えた。反応混合物を周囲温度で20時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。
【００５８】
蒸発後の残留物をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6-メタンスルホニル-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンを含む画分を合一し、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。このようにして、3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6-メタンスルホニル-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン4.2mgを白色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：346.30；保持時間＝3.08分。
1H NMR(300 MHz, (CD3)2SO, δ(ppm))：2.32 (ブロード s：6H)；3.02 (s：3H)；3.03 (mt：2H)；3.52 (ブロード t, J = 5 Hz：2H)；4.45 (ブロード s：2H)；7.24 (ブロード s：1H)；7.42 (ブロード s：1H)；12.45 (未分離ピーク：1H)；13.07 (未分離ピーク：1H).
【００５９】
実施例３：[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノン
【化１６】
2007516186.tif 000035
[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,
4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノンは、以下の方法で製造できる：
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン10mgをDMF 0.3mL中に懸濁した。ニコチン酸6.9mgを加え、次いでHOBT 7.6mg及びジイソプロピルカルボジイミド8.7μlを加えた。反応混合物を周囲温度で20時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。
【００６０】
蒸発後の残留物をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノンを含む画分を合一し、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。このようにして、[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノン5.3mgを白色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：373.31；保持時間＝2.87分
1H NMR(400 MHz, (CD3)2SO, 温度373K, δ(ppm))：2.35 (s：6H)；2.90〜3.10 (mt：2H)；3.76 (未分離ピーク：2H)；4.76 (ブロード s：2H)；7.27 (未分離ピーク：1H)；7.40 (未分離ピーク：1H)；7.51 (dd, J = 8及び5 Hz：1H)；7.90 (ブロード d, J= 8 Hz：1H)；8.70 (mt：2H)；11.80〜12.20 (ブロード 未分離ピーク：1H)；12.50〜13.00 (ブロード 未分離ピーク：1H).
【００６１】
実施例４：6-(3-クロロベンジル)-3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン
【化１７】
2007516186.tif 000036
6-(3-クロロベンジル)-3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンは、以下の方法で製造できる：
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン10mgをメタノール0.3mL中に懸濁した。3-クロロベンズアルデヒド 12.7μlを加え、次いでNaBH3CN 4.7mgを加えた。反応混合物を周囲温度で20時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。
【００６２】
蒸発後の残留物をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、6-(3-クロロベンジル)-3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンを含む画分を合一し、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。このようにして、6-(3-クロロベンジル)-3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン4mgを白色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：392.26；保持時間3.18分。
1H NMR(400 MHz, (CD3)2SO, 温度373K, δ(ppm))：2.35及び2.36 (2 s：6H全体で)；2.83
(t, J = 5.5 Hz：2H)；2.90〜3.00 (mt：2H)；3.62 (ブロード s：2H)；3.78 (s：2H)；7.25〜7.50 (mt：6H)；11.91 (未分離ピーク：1H)；12.30〜12.60 (ブロード 未分離ピーク：1H).
【００６３】
実施例５：[3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノン
【化１８】
2007516186.tif 000037
[3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノンは、以下の方法で製造できる：
3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン ヒドロクロリド15mgをDMF 0.5mL中に懸濁した。ジイソプロピルエチルアミン24.3mgを加え、次いでHOBT 12.7mg、ジイソプロピルカルボジイミド11.9mg及びニコチン酸11.6mgを加えた。反応混合物を周囲温度で20時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。
【００６４】
蒸発後の残留物をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、[3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノンを含む画分を合一し、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。このようにして、[3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-3-ピリジニルメタノン7.7mgを白色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：345.22；保持時間＝1.95分
【００６５】
実施例６：6-(3-クロロベンジル)-3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン
【化１９】
2007516186.tif 000038
6-(3-クロロベンジル)-3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンは、以下の方法で製造できる：
3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン ヒドロクロリド15mgをメタノール0.5mL中に懸濁した。3-クロロベンズアルデヒド26.5mgを加え、次いでNaBH3CN 7.9mgを加えた。反応混合物を周囲温度で20時間撹拌し、次いで減圧下で濃縮した。
【００６６】
蒸発後の残留物をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、6-(3-クロロベンジル)-3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンを含む画分を合一し、SCX相(CUBCX-1HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、メタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。このようにして、6-(3-クロロベンジル)-3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン6.9mgを白色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：364.22；保持時間＝2.19分
【００６７】
実施例７：アミドライブラリの製造
【化２０】
2007516186.tif 000039
アミドライブラリは、以下の方法で製造できる：
19種の酸(表４)を秤量し、19本の試験管のそれぞれに入れた。
【００６８】
【表１８】
2007516186.tif 000040
【００６９】
HOBT 152mg及びジイソプロピルカルボジイミド142mgをDMF 12mL中に可溶化し、得られた溶液を19本の試験管のそれぞれに分配し、１本あたり600μlを入れた。
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩200mgを、N,N-ジイソプロピルエチルアミン290mgの存在下でDMF４mL中に懸濁し、得られた懸濁液を19本の試験管のそれぞれに分配し、１本あたり200μlを入れた。
19種の反応混合物を、周囲温度で20時間オービタルシェーカーで振盪した。
各反応混合物について、試料10μlをとり、DMSO 40μl中に希釈した(Gilson Liquid Handler Quad-Z215)。このようにして得られたDMSO溶液中の各試料をLC/MS(方法A)により分析した。
次いで、19種の反応混合物を蒸発乾固し、蒸発後の残留物をそれぞれDMSO 500μl中に可溶化し、次いで得られた溶液をLC/MS(方法B)により精製した。
【００７０】
LC/MSによる精製後、所望の化合物を含む画分を(場合により合一し)、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。自重を秤量したガラス管に抽出溶液を回収し、蒸発乾固し(Savant AES 2000又はGenevac HT8遠心エバポレーター)、秤量し(Mettler Toledo Automated Workstation LA200)、DMSO中に希釈して10mMとした(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。得られた各溶液をLC/MS(方法A)により分析した。
【００７１】
以下の化合物(表５)を単離し、それらの保持時間及び質量分析(方法A)における分子ピークにより特性決定した。
【表１９】
2007516186.tif 000041
【００７２】
【表２０】
2007516186.tif 000042
【００７３】
実施例８：スルホンアミドライブラリの製造
【化２１】
2007516186.tif 000043
スルホンアミドライブラリは、以下の方法で製造できる：
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩190mgを、トリエチルアミン150μlの存在下でジクロロメタン２mL中に懸濁し、得られた懸濁液を17本の試験管に分配し、１本あたり500μlを入れた。17種のスルホニルクロリド(表６) を秤量し、17本の試験管のそれぞれに加えた。
【００７４】
【表２１】
2007516186.tif 000044
【００７５】
17種の反応混合物を、オービタルシェーカーにより周囲温度で20時間振盪した。
各反応混合物について、試料10μlをとり、DMSO 40μl中に希釈した(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。このようにして得られたDMSO溶液中の各試料をLC/MS(方法A)により分析した。
次いで、17種の反応混合物を蒸発乾固し、蒸発後の残留物を、１滴の5N塩酸水溶液の存在下でそれぞれDMSO 1mL中に可溶化し、得られた溶液をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、所望の化合物を含む画分を(場合により合一し)、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。自重を秤量したガラス管に抽出溶液を回収し、蒸発乾固し(Savant AES 2000又はGenevac HT8遠心エバポレーター)、秤量し(Mettler Toledo Automated Workstation LA200)、DMSO中に希釈して10mMとした(Gilson  Liquid Handler Quad-Z 215)。得られた各溶液をLC/MS(方法A)により分析した。
【００７６】
以下の化合物(表７)を単離し、それらの保持時間及び質量分析(方法A)における分子ピークにより特性決定した。
【表２２】
2007516186.tif 000045
【００７７】
【表２３】
2007516186.tif 000046
【００７８】
実施例９：アミンライブラリの製造
【化２２】
2007516186.tif 000047
アミンライブラリは、以下の方法で製造できる：
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩180mgをメタノール2.7mL中に懸濁し、得られた懸濁液を16本の試
験管に分配し、１本あたり150μlを入れた。
【００７９】
16種のアルデヒド(表８) を秤量し、16本の試験管のそれぞれに加えた。
【表２４】
2007516186.tif 000048
【００８０】
次いで、メタノール 2.7mL中のNaBH3CN 85mgの溶液を16本の試験管に分配し、１本あたり150μl入れた。16種の反応混合物を、オービタルシェーカーにより周囲温度で20時間振盪した。次いで、メタノール100μlを16本のチューブのそれぞれに加えた。
各反応混合物について、試料10μlをとり、DMSO 40μl中に希釈した(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。このようにして得られたDMSO溶液中の各試料をLC/MS(方法A)により分析した。
次いで、16種の反応混合物を蒸発乾固し、蒸発後の残留物をそれぞれDMSO 500μl中に可溶化し、焼結ガラスに通して濾過し、次いで残った溶液をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、所望の化合物を含む画分を(場合により合一し)、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。自重を秤量したガラス管に抽出溶液を回収し、蒸発乾固し(Savant AES 2000又はGenevac HT8遠心エバポレーター)、秤量し(Mettler Toledo Automated Workstation LA200)、DMSO中に希釈して10mMとした(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。得られた各溶液をLC/MS(方法A)により分析した。
【００８１】
以下の化合物(表９)を単離し、それらの保持時間及び質量分析(方法A)における分子ピ
ークにより特性決定した。
【表２５】
2007516186.tif 000049
【００８２】
【表２６】
2007516186.tif 000050
【００８３】
実施例１０：ウレアライブラリの製造
【化２３】
2007516186.tif 000051
ウレアライブラリは、以下の方法で製造できる：
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン ヒドロクロリド120mgを、トリエチルアミン190μlの存在下でテトラヒドロフラン3.6mL中に懸濁し、得られた懸濁液を９本の試験管のそれぞれに分配し、１本あたり300μlを入れた。
【００８４】
９種のイソシアネート(表１０) を秤量し、９本の試験管のそれぞれに加えた。
【表２７】
2007516186.tif 000052
【００８５】
９種の反応混合物を、オービタルシェーカーにより周囲温度で２時間振盪し、次いで蒸発乾固した。
蒸発後の残留物をそれぞれDMSO 1mL中に可溶化し、得られた各溶液について、試料10μlをとり、DMSO 40μl中に希釈した(Gilson Liquid Handler Quad-X 215)。このようにして得られたDMSO溶液中の各試料をLC/MS(方法A)により分析した。
【００８６】
残った溶液をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、所望の化合物を含む画分を(場合により合一し)、蒸発乾固するか(エントリ1、3、6、8及び9)又はSCX相上に装填した(CUBCX1-HL相500mg；エントリ2、4、5及び7)。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。自重を秤量したガラス管に抽出溶液を回収し、蒸発乾固し(Savant AES 2000又はGenevac HT8遠心エバポレーター)、秤量し(Mettler Toledo Automated Workstation LA200)、そしてDMSO中に希釈して10mMとした(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。得られた各溶液をLC/MS(方法A)により分析した。
【００８７】
以下の化合物(表１１)を単離し、それらの保持時間及び質量分析(方法A)における分子ピークにより特性決定した。
【表２８】
2007516186.tif 000053
【００８８】
実施例１１：3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン
【化２４】
2007516186.tif 000054
【００８９】
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンは、以下の方法で製造できる：
水9mL及びトリフルオロ酢酸2.8mLを、THF 9mL中のtert-ブチル3-(2-アミノ-4,5-ジメチルフェニルカルバモイル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレート670mgの溶液に加えた。80℃で２時間撹拌した後、反応溶媒を減圧下で濃縮した。次いで、これを水中に取り上げ、生成した沈殿を焼結ガラスに通して濾過することにより回収し、1N 水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、乾燥した。次いで、得られた水相をジクロロメタンで抽出し、次いで有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残留物と沈殿とを合一し、次いで数滴のDMFを含むメタノール中に可溶化した。次いで、この溶液をMEGA BE-SCX相上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、メタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。
【００９０】
このようにして、3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン46mgをベージュ色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ：ｍ／ｚ＝２６７  Ｍ+.基準ピーク
ｍ／ｚ＝２３８  [Ｍ−ＮＨＣＨ2]+
ｍ／ｚ＝２０９  [Ｍ−Ｃ3Ｈ8Ｎ]+.
1H NMR (300 MHz, (CD3)2SO, δ(ppm))：2.31及び2.32 (2 s：全体で6H)；2.81 (ブロード t, J = 5 Hz：2H)；2.92 (ブロード t, J = 5 Hz：2H)；3.83 (ブロード s：2H)；7.22 (ブロード s：1H)；7.40 (ブロード s：1H)；12.28 (未分離ピーク：1H)；12.73 (未分離ピーク：1H).
【００９１】
実施例１２：3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩
【化２５】
2007516186.tif 000055
【００９２】
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンは、以下の方法で製造できる：
5N塩酸水溶液９mLを、エタノール40mL中のtert-ブチル3-(2-アミノ-4,5-ジメチルフェニルカルバモイル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレート1.7ｇの溶液に加えた。80℃で60時間撹拌後、反応溶媒を周囲温度に戻した。生成した沈殿を焼結ガラスに通して濾過することにより回収し、乾燥した。このようにして、3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩1.04ｇをベージュ色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ：ｍ／ｚ＝２６７  Ｍ+.基準ピーク
ｍ／ｚ＝２３８  [Ｍ−ＣＨ2ＮＨ]+
ｍ／ｚ＝２０９  [Ｍ−Ｃ3Ｈ8Ｎ]+.
ｍ／ｚ＝３６  [ＨＣｌ]+
1H NMR (300 MHz、数滴のCD3COODを加えた(CD3)2SO、δ(ppm))：2.40 (s：6H)；3.23 (ブロード t、J = 5.5 Hz：2H)；3.45 (t、J = 5.5 Hz：2H)；4.45 (s：2H)；7.54 (s：2H).
【００９３】
tert-ブチル 3-(2-アミノ-4,5-ジメチルフェニルカルバモイル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレートは、以下の方法で製造できる：
HBTU 8.5ｇ及びジイソプロピルエチルアミン2.9ｇを、周囲温度で、無水DMF 50mL中の(tert-ブチル2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレート)-3-カルボン酸３ｇの溶液に加えた。周囲温度で20分間撹拌した後、4,5-ジアミノ-o-キシレン3.06ｇを加えた。周囲温度で60時間撹拌後、反応溶媒を、pH 7より大きいpHにおいてNaCl 20ｇを含むNaHCO3水溶液３L中に希釈した。水相を酢酸エチル1Lで３回抽出し、次いで、合一した有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた粗製残留物をジクロロメタン150mL中に取り上げ、焼結ガラスに通して濾過することにより不溶性物質を除去した。次いで、濾液を減圧下で濃縮し、シリカ(20〜45μm Amicon)上のクロマトグラフィーにより、シクロヘキサン中50〜100％酢酸エチルの勾配で精製した。所望の生成物を含む画分を合一し、減圧下で濃縮した。このようにして、tert-ブチル3-(2-アミノフェニルカルバモイル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシ
レート4.37ｇをベージュ色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ：ｍ／ｚ＝３８５  Ｍ+.基準ピーク
ｍ／ｚ＝３２９  [Ｍ−Ｃ4Ｈ8]+.
ｍ／ｚ＝３１２  [Ｍ−Ｃ4Ｈ9Ｏ]+
ｍ／ｚ＝５７  [Ｃ4Ｈ9]+
1H NMR (300 MHz, (CD3)2SO, δ(ppm))：1.46 (s：9H)；2.10及び2.12 (2 s：3H each)；2.77 (mt：2H)；3.58 (t, J = 5.5 Hz：2H)；4.53 (s：2H)；4.57 (未分離ピーク：2H)；6.60 (s：1H)；7.14 (ブロード s：1H)；9.10 (未分離ピーク：1H)；13.08 (未分離ピーク：1H).
【００９４】
実施例13：3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩
【化２６】
2007516186.tif 000056
3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩は、以下の方法で製造できる：
5N塩酸水溶液2.2mLを、エタノール1mL中のtert-ブチル3-(2-アミノフェニルカルバモイル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレート200mgの溶液に加えた。80℃で20時間撹拌した後、反応溶媒を周囲温度に戻した。焼結ガラスに通して濾過することにより不溶性物質を除去し、濾液を減圧下で濃縮した。このようにして、3-(1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩84mgを橙色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：240.26；保持時間＝1.68分
【００９５】
tert-ブチル 3-(2-アミノフェニルカルバモイル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレートは、以下の方法で製造できる：
HBTU 425mg及びジイソプロピルエチルアミン145mgを、周囲温度で、無水DMF 1mL中の(tert-ブチル2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレート)-3-カルボン酸150mgの溶液に加えた。周囲温度で20分間撹拌した後、オルトフェニレンジアミン121mgを加えた。
周囲温度で20時間撹拌後、反応溶媒を水100mL及び酢酸エチル50mL中に希釈した。水相を酢酸エチル50mLで３回抽出し、次いで、合一した有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた粗製残留物を、HPLC (逆相C18 Lichroprep 12μm)により、トリフルオロ酢酸0.07％(v/v)を含む水に対してトリフルオロ酢酸0.07％(v/v)を含むアセトニトリル５〜95％の直線勾配で、流速10mL／分で精製した。所望の生成物を含む画分を合一し、MEGA BE-SCX相上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、メタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。次いで、得られた抽出溶液を減圧下で濃縮した。このようにして、tert-ブチル3-(2-アミノフェニルカルバモイル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-カルボキシレート200mgをベージュ色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
LC/MS(方法A)：検出された分子イオン：358.34；保持時間＝3.19分.
【００９６】
実施例１４：スルホンアミドライブラリの製造
【化２７】
2007516186.tif 000057
スルホンアミドライブラリは、以下の方法で製造できる：
6-[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]ピリジン-3-イルアミン40mgをジクロロメタン２mL中に懸濁し、得られた溶液を４本の試験管に分配し、１本あたり500μlを入れた。
【００９７】
４種のスルホニルクロリド(表１２)を秤量し、４本の試験管のそれぞれに加え、次いでトリエチルアミン15.6μlを加えた。
【表２９】
2007516186.tif 000058
【００９８】
４種の反応混合物を、オービタルシェーカーにより40℃で15時間振盪した。
各反応混合物について、試料5μlをとり、DMSO 100μl中に希釈した(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。このようにして得られたDMSO溶液中の各試料をLC/MS(方法A)により分析した。
次いで、４種の反応混合物を蒸発乾固し、蒸発後の残留物をそれぞれDMSO 500μl中に可溶化し、得られた溶液をLC/MS(方法B)により精製した。LC/MSによる精製後、所望の化合物を含む画分を(場合により合一し)、SCX相(CUBCX1-HL相500mg)上に装填した。次いで、SCX相をメタノールで洗浄し、次いでメタノール中2Mアンモニア溶液で抽出した。自重を秤量したガラス管に抽出溶液を回収し、蒸発乾固し(Savant AES 2000又はGenevac HT8遠心エバポレーター)、秤量し(Mettler Toledo Automated Workstation LA200)、そしてDMSO中に希釈して10mMとした(Gilson Liquid Handler Quad-Z 215)。得られた各溶液をLC/MS(方法A)により分析した。
【００９９】
以下の化合物(表１３)を単離し、それらの保持時間及び質量分光分析(方法A)における分子ピークにより特性決定した。
【表３０】
2007516186.tif 000059
【０１００】
実施例１５：6-[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロ-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]ピリジン-3-イルアミン
【化２８】
2007516186.tif 000060
【０１０１】
6-[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]ピリジン-3-イルアミンは、以下の方法で製造できる：
Pd/CaCO3 10％ 55mgを、エタノール60mL中の3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6-(5-ニトロピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン545mgの溶液に加えた。水素３bar下、35℃で15時間撹拌後、反応溶媒を周囲温度に戻し、セライトに通して濾過し、次いで減圧下で濃縮した。このようにして、6-[3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジン-6-イル]-ピリジン-3-イルアミン300mgを褐色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ  ｍ／ｚ＝３５９  Ｍ+.  基準ピーク
ｍ／ｚ＝２６６  (Ｍ−Ｃ5Ｈ5Ｎ2)+
【０１０２】
実施例１６：3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6-(5-ニトロピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン
【化２９】
2007516186.tif 000061
3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-6-(5-ニトロピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジンは、以下の方法で製造できる：
2-クロロ-5-ニトロピリジン287mg及び炭酸カリウム500mgを、ジメチルホルムアミド5mL中の3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン塩酸塩500mgの溶液に加えた。周囲温度で20時間撹拌後、反応溶媒を水50mL中に加えた。生成した沈殿を焼結ガラスに通して濾過することにより回収し、水15mLで３回洗浄し、次いで減圧下で乾燥した。このようにして、3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾ
イミダゾール-2-イル)-6-(5-ニトロピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン548mgを黄色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ：ｍ／ｚ＝３８９  Ｍ+.  基準ピーク
ｍ／ｚ＝２６６  (Ｍ−Ｃ5Ｈ3Ｎ2Ｏ2)+
【０１０３】
実施例１７：6-｛5-[3-(2-フルオロ-5-トリフルオロメチルフェニル)ウレイド]ピリジン-2-イル｝-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミド
【化３０】
2007516186.tif 000062
6-｛5-[3-(2-フルオロ-5-トリフルオロメチルフェニル)ウレイド]ピリジン-2-イル｝-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミドは、以下の方法で、エチル 6-(5-tert-ブトキシカルボニルアミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレートから製造できる：
エチル 6-(5-tert-ブトキシカルボニルアミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレートのエチルエステルを、アンモニア水溶液を用いてアミド化することによりカルボキサミドに変換して、6-(5-tert-ブトキシカルボニルアミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミドを得た。
ＥＩ：ｍ／ｚ＝３５８
【０１０４】
6-(5-tert-ブトキシカルボニルアミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミドのアミン基を、酸性溶媒(ジクロロメタン中トリフルオロ酢酸)中で脱保護して、6-(5-アミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミドを得た。
ＥＩ：ｍ／ｚ＝２５８
【０１０５】
実施例１に記載された方法に従い、2-フルオロ-5-(トリフルオロメチル)フェニルイソシアネートを用いて、ウレア官能基を6-(5-アミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミド上に導入し、6-｛5-[3-(2-フルオロ-5-トリフルオロメチルフェニル)-ウレイド]ピリジン-2-イル｝-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキサミドを得た。
ＥＩ：ｍ／ｚ＝４６３
【０１０６】
実施例１８：エチル 6-(5-tert-ブトキシカルボニルアミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート
【化３１】
2007516186.tif 000063
【０１０７】
エチル 6-(5-tert-ブトキシカルボニルアミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレートは、以下の方法で製造できる：
Pd/C 10％ 5mg及びジ-tert-ブチルジカルボネート38mgを、メタノール6mL中のエチル 6-(5-ニトロピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート50mgの溶液に加えた。水素3bar下、周囲温度で12時間撹拌後、反応溶媒をセライトに通して濾過し、次いで減圧下で濃縮した。得られた粗製反応生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(SiO2、CH2Cl2/MeOH 勾配75/25〜25/75)により精製した。このようにして、エチル 6-(5-tert-ブトキシカルボニルアミノピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート20mgを白色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ：ｍ／ｚ＝３８７  Ｍ+.
ｍ／ｚ＝３３１  (Ｍ−Ｃ4Ｈ8)+.  基準ピーク
ｍ／ｚ＝２８６  (ｍ／ｚ＝３３１−ＣＯ2Ｈ)+
ｍ／ｚ＝１９４  Ｃ9Ｈ12Ｎ3Ｏ2+
ｍ／ｚ＝５７  Ｃ4Ｈ9+
【０１０８】
実施例１９：エチル 6-(5-ニトロピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート
【化３２】
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エチル 6-(5-ニトロピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレートは、以下の方法で製造できる：
2-クロロ-5-ニトロピリジン522mgを、ピリジン10mL中の3-(5,6-ジメチル-1H-ベンゾイミダゾール-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン トリフルオロアセテート１ｇの溶液に加えた。周囲温度で20時間撹拌後、反応溶媒を減圧下で濃縮した。生成した沈殿を焼結ガラスに通して濾過することにより回収し、水15mLで３回洗浄し、減圧下で乾燥した。得られた粗製反応生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(SiO2、シクロヘキサン／EtOAc 勾配75/25〜25/75)により精製した。このようにして、エチル 6-(5-ニトロ-ピリジン-2-イル)-4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート450mgを黄色粉末の形態で得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ：ｍ／ｚ＝３１７  Ｍ+.  基準ピーク
ｍ／ｚ＝２７１  (Ｍ−ＮＯ2)+.
ｍ／ｚ＝１９４  (Ｍ−Ｃ5Ｈ3Ｎ2Ｏ2)+
ｍ／ｚ＝１４８  (ｍ／ｚ＝１９４−Ｃ2Ｈ6Ｏ)+
【０１０９】
実施例２０：エチル 4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート トリフルオロ酢酸塩
【化３３】
2007516186.tif 000065
エチル 4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート トリフルオロ酢酸塩は、以下の方法で製造できる：
水50mL、次いでトリフルオロ酢酸12mLを、テトラヒドロフラン50mL中の6tert-ブチル-3-エチル 2,4,5,7-テトラヒドロピラゾロ[3,4-c]ピリジル-3,6-ジカルボキシレート３ｇの溶液に加えた。還流下で２時間撹拌後、反応溶媒を周囲温度に戻し、Na2CO3飽和水溶液をpHが塩基性になるまで加えた。得られた水相を酢酸エチルで３回抽出した。合一した有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下で濃縮した。このようにして、エチル 4,5,6,7-テトラヒドロ-2H-ピラゾロ[3,4-c]ピリジン-3-カルボキシレート トリフルオロ酢酸塩1.49gを得、その特性は次のとおりであった：
ＥＩ：ｍ／ｚ＝１９５  Ｍ+.
ｍ／ｚ＝１６６  (Ｍ−ＣＨ3Ｎ)+.  基準ピーク
ｍ／ｚ＝１３８  (Ｍ−Ｃ3Ｈ7Ｎ)+.
ｍ／ｚ＝１２０  (ｍ／ｚ＝１６６−Ｃ2Ｈ6Ｏ)+.
ｍ／ｚ＝９２  (ｍ／ｚ＝１２０−ＣＯ)+.
【０１１０】
Ｔｉｅ２及びＫＤＲキナーゼ活性に対する生成物の阻害効果の測定：
Tie2及びKDRキナーゼ活性に対する生成物の阻害効果を以下に記載した実験プロトコルに従って試験した。
【０１１１】
１．Ｔｉｅ２
細胞内ドメインのアミノ酸776〜1124に対応するヒトTie2のコード配列を、ヒト胎盤モデルから単離したcDNAを用いてPCRにより得た。この配列を、GST融合タンパク質の形態でバキュロウイルス発現ベクターpFastBacGT中に導入した。
分子の阻害効果を、約80％の相同性まで精製したGST-Tie2の存在下でTie2によるPLCのリン酸化アッセイにおいて測定した。基質としてはPLCのSH2-SH3断片を使用し、該PLCはGST融合タンパク質の形態で発現させた。
【０１１２】
Tie2のキナーゼ活性を、10mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM DTT及び10mM グリセロホスフェートを含む20mM MOPSバッファー(pH 7.2)中で測定した。ウェルあたりの反応混合物はGST-Tie2酵素100ngを含むキナーゼバッファー70μlから成り、これを氷上のフラッシュプレート96−ウェルプレート中に入れた。次いで、DMSO中に多くとも10％の濃度で希釈した試験分子10μlを加えた。所定濃度について、それぞれ４連で測定した。GST-PLC 2μg、冷ATP 2μM及び33P[ATP]1μCiを含む溶液20μlを加えて反応を開始した。37℃で１時間インキュベートし、１体積(100μl)の200mM EDTAを加えて反応を停止した。インキュベーションバッファーを除去し、ウェルをPBS 300μlで３回洗浄した。Wallac MicroBeta 1450で放射能を測定した。
Tie2活性の阻害を計算し、化合物の非存在下で測定した対照の活性に対する阻害百分率として表した。
【０１１３】
２．ＫＤＲ
化合物の阻害効果を、シンチレーション技術(96-ウェルプレート、NEN)を使用してインビトロで、KDR酵素による基質のリン酸化アッセイにおいて測定した。
ヒトKDR酵素の細胞質ドメインを、GST融合形態でバキュロウイルス発現ベクターpFastBac中にクローニングした。タンパク質をSF21細胞内で発現させ、約60％の相同性まで精製した。
KDRキナーゼ活性を、10mM MgCl2、100μM Na3VO4及び1mM NaFの存在下で、20mM MOPS、10mM MgCl2、10mM MnCl2、1mM DTT、2.5mM EGTA、10mM b-グリセロホスフェート(pH＝7.2)中で測定した。化合物10μlを、４℃で、KDR酵素100ngを含むキナーゼバッファー70μlに加えた。基質(GST融合タンパク質の形態で発現させたPLCγのSH2-SH3断片)2μg、2μCi γ33P[ATP]及び2μM 冷ATPを含む溶液20μlを加えて、反応を開始した。37℃で１時間インキュベートし、１体積(100μl)の200mM EDTAを加えて反応を停止した。インキュベーションバッファーを除去し、ウェルをPBS 300μlで３回洗浄した。Top Count NXT (Packard) 放射能カウンターを使用して、各ウェルにおいて放射能を測定した。放射性ATP及び基質のみを含む４個のウェル中の放射能を測定して、バックグラウンドノイズを測定した。
【０１１４】
全体活性対照を、化合物以外の全ての試薬(γ33P-[ATP]、KDR及びPLC-γ基質)を含む４個のウェルにおいて測定した。
本発明の化合物によるKDR活性の阻害を、化合物の非存在下で測定した対照活性の阻害百分率として表した。
化合物SU5614 (Calbiochem) (1μM)を、阻害対照として各プレート中に入れた。
【０１１５】
【表３１】
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【０１１６】
【表３２】
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【０１１７】
【表３３】
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【０１１８】
【表３４】
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【０１１９】
【表３５】
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【０１２０】
【表３６】
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【０１２１】
【表３７】
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【０１２２】
【表３８】
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【０１２３】
【表３９】
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【０１２４】
【表４０】
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【０１２５】
【表４１】
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【０１２６】
【表４２】
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【０１２７】
【表４３】
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【０１２８】
【表４４】
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【０１２９】
【表４５】
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【０１３０】
【表４６】
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【０１３１】
【表４７】
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【０１３２】
【表４８】
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【国際調査報告】
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