(57)【要約】  本発明は、ＲＮＡ−仲介干渉（ＲＮＡｉ）の方法によって同定可能である、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、種々のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の、およびそれらの対応する遺伝子産物の、明らかな機能的役割に、そして、そのすべての生物学的に機能的な誘導体を含む、前記遺伝子の機能的オーソログの同定および単離に関する。本発明はさらに、抗−増殖性薬剤の開発または単離における、（前記オーソログを含む）前記遺伝子および遺伝子産物の利用、特に適切なスクリーニング方法におけるそれらの利用、および増殖性および他の疾患の診断および治療のためのそれらの利用に関する。特に、本発明は、増殖性疾患の治療のための、前記遺伝子から由来する、低分子干渉ＲＮＡの利用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能を阻害する医薬品の製造において、ａ）配列ＩＤ番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９にて表される核酸配列、
ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％のａ）による核酸によってコードされているタンパク質と配列同一性を示し、および／またはＢＬＡＳＴ配列解析プログラムを用いたコンピュータ補助検索で、最大で１０−５のｅ値で検出可能である、ポリペプチドをコードしている核酸配列、
ｃ）中程度または高い逼迫性の条件下で、（ａ）または（ｂ）に対応する配列を持つ核酸分子と、ハイブリッド形成可能な核酸分子の配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義したような配列のいずれかのアンチセンス配列、ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の断片、
ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）にて定義したような配列のいずれかに対応する、アンチセンスまたはセンス方向での、２本鎖ＲＮＡまたは１本鎖ＲＮＡ、
からなる配列の群から選択される配列を持つ、核酸分子を含む単離核酸分子の利用。
【請求項２】
該単離核酸分子が、請求項１に記載の配列のいずれかに対応する配列を持つ、低分子干渉ＲＮＡを含む、請求項１に記載の利用。
【請求項３】
該核酸分子が、好適な条件下で、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含む２本鎖ＲＮＡを産出可能であるすくなくとも１つの核酸発現ベクター中に含有され、各ＲＮＡ鎖が、互いに独立して、１９〜３１ヌクレオチドの長さを有する、請求項１に記載の利用。
【請求項４】
該核酸分子が、第１プロモーターの制御下、センスＲＮＡ鎖に対応する核酸を含有する、第１発現カセット、および第２プロモーターの制御下、アンチセンスＲＮＡ鎖に対応する核酸を含有する、第２発現カセットを含む、少なくとも１つの核酸発現ベクターに含有される、請求項１に記載の利用。
【請求項５】
該核酸分子が、１本鎖−ＲＮＡ−分子を導くプロモーターの制御下、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖に対応する核酸を含有する発現カセットを含む少なくとも１つの核酸発現ベクター中に含有され、該１本鎖ＲＮＡ−分子が、バック−折り畳み、ステムループ構造を形成可能である、請求項１に記載の利用。
【請求項６】
各ＲＮＡ鎖が、互いに独立して、２０〜２５の長さ、好ましくは、２０〜２２ヌクレオチドの長さを有する、請求項２〜５のうちいずれか１項に記載の利用。
【請求項７】
各ＲＮＡ鎖が、互いに独立して、２６〜２８の長さ、好ましくは２７ヌクレオチドの長さを有する、請求項２〜５のうちいずれか１項に記載の利用。
【請求項８】
細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能を阻害する医薬品の製造において、ａ）配列ＩＤ番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０にて開示されたような配列、
ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％の（ａ）による任意の配列との配列同一性を示す配列、
ｃ）（ａ）または（ｂ）にて定義したような配列の断片、
からなる配列の群から選択される配列を持つ、ペプチドまたはポリペプチドを含む、単離
ペプチドまたはポリペプチドの利用。
【請求項９】
細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能を阻害する医薬品の製造において、請求項８にて定義したような配列を持つ、少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドに対して指向される抗体の利用。
【請求項１０】
該医薬品が、増殖疾患の治療用である、請求項１〜９のうちいずれか１項に記載の利用。
【請求項１１】
該疾患が、冠動脈再狭窄または新生物疾患であり、後者が好ましくは、リンパ腫、肺がん、大腸がん、卵巣がんおよび乳がんからなる群より選択される、請求項１０に記載の利用。
【請求項１２】
細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能を活性化する医薬品の製造において、
ａ）配列ＩＤ番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９にて表される核酸配列、
ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％のａ）による核酸によってコードされているタンパク質との配列同一性を示し、および／またはＢＬＡＳＴ配列解析プログラムを用いたコンピュータ補助検索で、最大で１０−５のｅ値で検出可能である、ポリペプチドをコードしている核酸配列、
ｃ）中程度または高い逼迫性の条件下で、（ａ）または（ｂ）に対応する配列を持つ核酸分子と、ハイブリッド形成可能な核酸分子の配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義したような任意の配列のアンチセンス配列、
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の断片、
ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）にて定義したような任意の配列に対応する、ＲＮＡ配列、
からなる配列の群から選択される配列を持つ、核酸分子を含む単離核酸分子の利用。
【請求項１３】
細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能を活性化する医薬品の製造において、
（ａ）配列ＩＤ番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０にて開示されたような配列、
（ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％の（ａ）による任意の配列との配列同一性を示す配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）にて定義したような配列の断片、
からなる配列の群から選択される配列を持つ、ペプチドまたはポリペプチドを含む、単離ペプチドまたはポリペプチドの、利用。
【請求項１４】
細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能を活性化する医薬品の製造において、請求項８にて定義したような配列を持つ、少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドに対して指向される抗体の利用。
【請求項１５】
該医薬品が、アポトーシスの増加、増殖遅延または傷治癒の遅れによって特徴づけられる疾患の治療用である、請求項１２〜１４のうちいずれか１項に記載の利用。
【請求項１６】
ａ）請求項１〜７のうちのいずれか１項で定義したような核酸分子または核酸発現ベクター、
ｂ）請求項８にて定義したような配列を含む、ペプチドまたはポリペプチド、
ｃ）（ｂ）による、少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドに対して指向する抗体、
からなる群より選択される単離核酸分子、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体を含む、医薬品。
【請求項１７】
増殖性疾患または細胞分裂の間の異常なスピンドル形成または微小管機能に関連した疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断において、請求項１にて定義したような配列を含む、単離核酸分子の利用、または請求項８にて定義したような配列を含む、少なくとも１つのポリペプチドに特に結合するリガンドの利用。
【請求項１８】
該疾患が、冠動脈再狭窄または新生物疾患であり、後者が好ましくは、リンパ腫、肺がん、大腸がん、卵巣がんおよび乳がんからなる群より選択される、請求項１７に記載の利用。
【請求項１９】
増殖性疾患または細胞分裂の間の異常なスピンドル形成または微小管機能に関連した疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断において、請求項１または２にて定義したような単離核酸分子、および／または請求項８にて定義したような少なくとも１つのポリペプチドに対して指向するリガンドを含む、診断キット。
【請求項２０】
細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する薬物の同定および特性化のためのスクリーニングアッセイにおいて、請求項１〜７のうちいずれか１項に定義されるような単離核酸分子または核酸発現ベクター、または請求項８にて定義されたような配列を含む、少なくとも１つのポリペプチドに対して指向する抗体の利用。
【請求項２１】
細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する相互作用薬物に関するスクリーニングアッセイにおいて、請求項８にて定義されたような配列を持つポリペプチドの利用。
【請求項２２】
ａ）請求項１〜７のうちいずれか１項に定義したような核酸分子または核酸発現ベクターの、宿主細胞または宿主器官への形質導入、
ｂ）阻害または活性化分子に対する少なくとも１つの候補が存在する、または存在しないかいずれかで、段階ａ）の核酸によってコードされるか、または対応する、ポリペプチドまたはＲＮＡの過剰発現を許容する条件下での、段階ａ）にて得た、宿主細胞または宿主器官の培養、
ｃ）該培養細胞または器官における細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の解析、およびそれによる、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害剤または活性化物の同定、
の段階を含む、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する、阻害剤または活性化分子の同定および特性化のためのスクリーニング方法。
【請求項２３】
ａ）宿主細胞内で、請求項１にて定義したような核酸分子配列によってコードされたポリペプチドを、組み換え体的に発現させること、
ｂ）該組み換え体的に発現した段階（ａ）のポリペプチドを、単離し、任意に精製すること、
ｃ）試験基質を任意に標識化すること、および／または該組み換え体的に発現したポリペプチドを標識化すること、
ｄ）該組み換え体的に発現したポリペプチドを、固体相に固定化すること、
ｅ）該固定化ポリペプチドと、少なくとも１つの試験基質を接触させること、
ｆ）任意に一回以上の洗浄段階、
ｇ）固体相にて固定化したポリペプチドに対する、少なくとも１つの試験基質の結合を検出すること、および
ｈ）細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害または活性化のための、機能アッセイを実施すること、
を含む、試験基質のライブラリーから、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する相互作用分子の同定および特性化のためのスクリーニング方法。
【請求項２４】
細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害剤または活性化物が、請求項２２または２３によって同定され、適切な量で合成され、薬理学的組成物中に処方される、薬理学的組成物の調製方法。
【請求項２５】
細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害剤または活性化物が、請求項２２または２３によって提供され、薬理学的組成物内に処方される、薬理学的組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患、特に増殖性疾患の治療における、細胞分裂の間の有糸分裂スピンドル（「スピンドル（ｓｐｉｎｄｌｅ）」）形成または微小管機能を阻害する薬剤の利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
後生動物細胞分裂（有糸分裂）は、娘細胞への細胞物質の正確な伝達を確かにするために、きつく協調され、完全に調節され、綿密にモニタされなければならない、非常に複雑で、高度に調節された細胞工程の組からなる。これらの工程における欠陥は、全ての形態のがんを含む、広い範囲の、増殖性疾患と呼ばれるものを引き起こすと知られている。細胞分裂は、数少ないか、そうでなければすべての形態のがんの原因に共通する細胞工程のみをあらわすので、その特異的な阻害は、治療的な介入の好ましい部位として認識されてきた。
【０００３】
有糸分裂阻害剤薬物は、もっとも有益な種類の化学治療剤の１つとして認識されているが、この種類の新規の薬物候補物を発見するためのスクリーニングの試みが、単一のタンパク質であるチューブリンを標的化する薬剤を同定しうるという、かかるスクリーンの強力な固有の傾向によって不確定なものとされてきた。チューブリンは重合化して、有糸分裂スピンドル機能およびクロマチン分離のために必要である第１細胞骨格要素である微小管を形成する。しかしながらかかる微小管は、分離するしないにかかわらず、ほとんど全ての細胞型によって偏在的に必要であり、したがって、多くの望まない副作用が、抗−チューブリン薬物によって引き起こされる事実を説明する。
【０００４】
おそらく、チューブリンを標的化する非常に成功した抗悪性腫瘍薬のもっとも知られた例は、パクリタキセルと、その市販されている誘導体である、タキソールである。その適用性は、問題のある副作用の範囲によって、適切な投与レジメを決定における困難によって、非常に限定されてきた。タキソール治療は結果として、アナフィラキシーおよび、治療が必要な呼吸困難および高血圧によって特徴づけられる過敏症反応、血管性浮腫、および臨床試験の患者の２〜４％での広汎性じんましんを引き起こす。タキソールは、コルチコステロイドの前治療の後に投与されるが、致命的な反応が起こる。生命を脅かす心不整脈となる重度の伝導性異常が、１パーセント未満の患者で起こり、ペースメーカーの挿入によって治療されなければならない。タキソールは、妊娠女性において、胎児の損傷または胎児死亡を引き起こしうる。さらに、投与は一般的に、頻脈、低血圧、顔面紅潮、皮膚反応および呼吸の短化（穏やかな呼吸困難）を伴う。これらの強力な副作用の理由は、チューブリンが、スピンドル形成において重要な役割を果たすのみでなく、また、たとえば細胞骨格発生および細胞間タンパク質伝達のような他の細胞工程においても、明らかな役割を果たすからである。
【０００５】
結果として、タキソールは、ここ三十年間の新規の抗がん治療で、もっとも成功したものであると多くの者に認められてきたが、いまだに、タキソールの不利な部分を示すことのない抗がん薬物に対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の根本的な問題は、改善された強力な抗がん薬物、特に重度の副作用の少ない薬物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この問題は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する医薬品の製造において、
ａ）配列ＩＤ番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９にて表される核酸配列、
ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％のａ）による核酸によってコードされているタンパク質との配列同一性を示す、および／またはＢＬＡＳＴ配列解析プログラムを用いたコンピュータ補助検索で、最大で１０−５のｅ値で検出可能である、ポリペプチドをコードしている核酸配列、
ｃ）中程度または高い逼迫性の条件下で、（ａ）または（ｂ）に対応する配列を持つ核酸分子と、ハイブリッド形成可能な核酸分子の配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義したような任意の配列のアンチセンス配列、
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の断片、
ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）にて定義したような任意の配列に対応する、アンチセンスまたはセンス方向での、２本鎖ＲＮＡまたは１本鎖ＲＮＡ、
からなる配列の群から選択される配列を持つ、核酸分子を含む単離核酸分子の利用によって解決される。
【０００８】
本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する薬剤を提供するという概念に基づいている。細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能は、有糸分裂の後期の間に起こり、細胞分裂に不可欠な部分である。
【０００９】
本発明の結果として、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に対する標的遺伝子の重要性が同定され、一般的な細胞外形、つまりは一般的な細胞性微小管機能自身を引き離す。
【００１０】
したがって、標的として、タンパク質が、細胞分裂−特異的工程に関与するので、これらの標的タンパク質の阻害が、結果として、有糸分裂の十分な阻害となり、同時に、他の明らかな細胞工程の阻害によって引き起こされる副作用の数を減少させる。
【００１１】
本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に関与する種々のタンパク質および遺伝子に関して、初めて開示する。細胞分裂と微小管はすでに広く研究されてきているが、本発明は、いくつかの種類の標的遺伝子、対応する遺伝子産物、および今までに細胞分裂、特に細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能には関与しないとされてきた他の薬剤を提供する。
【００１２】
この新規に同定された、これらの標的遺伝子およびこれらの対応する遺伝子産物、その相同物、オーソログおよび誘導体の機能は、がんを含む増殖性疾患に対する広範囲の医薬品の開発において、利用可能である。これらの医薬品は、増殖性疾患の治療、特に、細胞分裂、細胞分裂の調節に関連する疾病の場合にて使用可能であり、または細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に依存する。さらに、新規に同定された機能が、診断における使用、および診断試薬の開発を可能にする。
【００１３】
細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に関与する標的遺伝子の同定のために、ラージスケールのＲＮＡｉ技術に基づくスクリーンを、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノム中、１９５１４（９９．７％を意味する）の予想されるオープンリーディングフレームに対して実施した。このラージスケールスクリーンの実行のために、個々のオープンリーディングフレームに対応する２本鎖ＲＮＡを産出し、生体Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ雌雄同体にマイク
ロ−注入し、得られた胚を、経時的ＤＩＣ顕微鏡を用いて、２４時間後に解析した。
【００１４】
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、その発達を通して、ほとんど全体が半透明体を示し、それによって、胚形成のもっとも早期の段階に対してさえも、非常に詳細な細胞学的試料において、比類のない顕微鏡における手段を提供する。その短い生存サイクル（３〜５日間）、その培養の簡便性、およびその低維持コストと共に、この重要な特徴によって、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓが、おそらく間違いなく、すべての後生動物の中でもっとも研究されたものである。また、配列データが、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムの９７％以上で入手可能である（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．「線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのゲノム配列：調査生物学に対するプラットホーム（Ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ：ａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ．）」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０１２−２０１８（１９９８））。したがって、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の新規技術を適用するための、最適な有機物である。本技術は、対象のコード配列の部分に対応する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子を生体虫に導入することによって仲介されるので、遺伝子発現の、標的化、配列−特異的阻害からなる（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．「シノラブディス・エレガンスにおける、２本鎖ＲＮＡによる強力で、特異的な遺伝子干渉（Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｅｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．）」Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６−８１１（１９９８））。現在までに試験された非常の多くの大多数のＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子に関して、明らかに検出可能な、試験した虫のＦ１子孫における（およびいくつかの場合、治療した虫自身における）機能表現型の欠損を伴う、標的化遺伝子の発現の配列−特異的阻害が産出されることが示されてきた。
【００１５】
本発明の文脈において、胚細胞分裂の第１ラウンドを表記するために、非常に証拠力のある顕微鏡アッセイとの組み合わせで、ゲノムＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に基づく、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるスクリーニングアッセイを利用した（Ｓｕｌｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，「線虫シノラブディス・エレガンスの肺細胞系列（Ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｍａｔｏｄｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．）」Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１００，６４−１１９（１９８３）、Ｇｏｎｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，「変異解析による、１つの細胞分裂期  シノラブディス・エレガンス胚における細胞分裂工程の詳細（Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｅｍｂｒｙｏ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｙｓｉｓ．）」Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １４４，９２７−９４６（１９９９））。この技術の組み合わせで、選択した遺伝子、また種々の選択した遺伝子類を、前例のない速度および効率で、機能的に特性化可能である。
【００１６】
ＤＩＣ顕微鏡作製映像を解析して、これらの試料を同定し、それによって細胞分裂が変化したか、または中断したかを同定した。強固で、一定で再現可能な様式で解析を実施するために、各映像を、４７の異なるパラメータに関して解析した。言い換えると、４７の、正常の細胞分裂（すなわち、野生型虫での細胞分裂）の特徴を、全Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓゲノムにわたり、ＲＮＡｉのゲノム−ワイド適用によって産出された、各ＲＮＡｉ表現型に対してスコア化した。
【００１７】
ＤＩＣアッセイの完全な確認および検証、およびアッセイが産出した情報の深さによって、等価の表現型が、非常に関連したタンパク質、同一のファミリーまたは機能的に等価なタンパク質内のタンパク質を表すことが発見されたことが分かった。言い換えると、２つの別々に解析した遺伝子のＲＮＡｉ誘導表現型が同一である場合、２つのタンパク質は
、同一のタンパク質の種類内であるか、または同一の機能を共有するか、少なくとも、両方が、同一の生物学的機構または工程に関与するか、で非常にありうる。したがって、スクリーンをそれらの機能にしたがって、タンパク質をクラス分け、またはグループ分けするために使用することが可能である。結果として、同様のＲＮＡｉ表現型を引き起こす任意の遺伝子が、単一の機構的クラス内で考慮されることに関連し、証明される。
【００１８】
本明細書にしたがった「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、モルホリノ類、およびリン酸チオエート類またはリン酸アミデート類等の、リン酸ジエステル以外の骨格構造を持つ核酸のような、すべての公知の核酸が含まれる。
【００１９】
本発明による「細胞分裂の間の微小管機能（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）」は、微小管構造、分解および再構築、および運動に基づく欠陥を含む、細胞分裂の間の微小管の任意の機能に関する。本発明にしたがった運動に基づく欠陥には、微小管に関連する輸送分子の欠陥に関する、微小管に沿った輸送の任意の欠陥が含まれる。好ましくは、「細胞分裂の間の微小管機能」は、細胞分裂に特異的な微小管機能に関連し、すなわち、非分裂細胞に必須の微小管機能には関連しない。
【００２０】
「細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）」には、細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能の停止または拘束、ならびに遅延または鈍化が含まれる。
【００２１】
本発明の好ましい実施様態において、核酸分子には、配列ＩＤ番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９で表されるような配列の群から選択される配列を持つ、核酸分子が含まれる。好ましくは、核酸分子は、前記配列の群から選択される配列を持つ核酸分子からなる。
【００２２】
語句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は好ましくは、核酸、または対応するＲＮＡｓまたはタンパク質の治療的利用または発現のためのベクターのような、たとえば、診断利用または治療利用において、記述された配列を持つ核酸が機能的に関連する、配列を含む核酸を意味する。好ましくは、配列の上流または下流の任意のさらなる核酸は、２０ｋｂ以下である。より好ましくは、語句「含む」は、ゲノムＢＡＣまたはＹＡＣクローンのような、配列を図らずも含む、大きな構造には関連しない。
【００２３】
詳細には、個々の配列ＩＤ番号は以下の配列を示す。
配列ＩＤ番号１  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ１３Ｆ１０．２のヌクレオチド配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ０８１４４）
配列ＩＤ番号２  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ１３Ｆ１０．２の推定アミノ酸配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ０８１４４）
配列ＩＤ番号３  Ｃ１３Ｆ１０．２のヒトオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２４０６９）
配列ＩＤ番号４  Ｃ１３Ｆ１０．２のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７６９７４）
配列ＩＤ番号５  Ｃ１３Ｆ１０．２のハエホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ００３５４１）
配列ＩＤ番号６  Ｃ１３Ｆ１０．２のハエホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ４９９１１）
配列ＩＤ番号７  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ２５Ａ１．９のヌクレオチド配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ１８５３２）
配列ＩＤ番号８  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ２５Ａ１．９の推定アミノ酸配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ１８５３２）
配列ＩＤ番号９  Ｃ２５Ａ１．９のヒトオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１７９１７）
配列ＩＤ番号１０  Ｃ２５Ａ１．９のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６０３８７）
配列ＩＤ番号１１  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ５４Ｂ３．３のヌクレオチド配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ０３４０５）
配列ＩＤ番号１２  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ５４Ｂ３．３の推定アミノ酸配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ０３４０５）
配列ＩＤ番号１３  Ｆ５４Ｂ３．３のヒトオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１８１８８）
配列ＩＤ番号１４  Ｆ５４Ｂ３．３のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６０６５８）
配列ＩＤ番号１５  Ｆ５４Ｂ３．３のマウスホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿１０９３９９）
配列ＩＤ番号１６  Ｆ５４Ｂ３．３のマウスホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿１０９３９９）
配列ＩＤ番号１７  Ｆ５４Ｂ３．３のラットホモログの（ｍＲＮＡに対応する）ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０５３８６４）
配列ＩＤ番号１８  Ｆ５４Ｂ３．３のラットホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿４４６３１６またはＰ４６４６２）
配列ＩＤ番号１９  Ｆ５４Ｂ３．３のハエオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ００３７１２）
配列ＩＤ番号２０  Ｆ５４Ｂ３．３のハエオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５５２８９）
【００２４】
配列ＩＤ番号２１  Ｆ５４Ｂ３．３の酵母ホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１４８．１、塩基対６１０４７６〜６１２７１９）
配列ＩＤ番号２２  Ｆ５４Ｂ３．３の酵母ホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１５３４９）
配列ＩＤ番号２３  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ０８Ｂ６．２のヌクレオチド配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ２０６５６）
配列ＩＤ番号２４  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＫＦ０８Ｂ６．２の推定アミノ酸配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ２０６５６）
配列ＩＤ番号２５  Ｆ０８Ｂ６．２のヒトオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１６５４１）
配列ＩＤ番号２６  Ｆ０８Ｂ６．２のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５７６２５）
配列ＩＤ番号２７  Ｆ０８Ｂ６．２のラットホモログの（ｍＲＮＡに対応する）ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿１３９１８５）
配列ＩＤ番号２８  Ｆ０８Ｂ６．２のラットホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６３１９２４またはＡＡＡ７３５５３）
配列ＩＤ番号２９  Ｆ０８Ｂ６．２のハエホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ００３６２４）
配列ＩＤ番号３０  Ｆ０８Ｂ６．２のハエホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５２７６１）
配列ＩＤ番号３１  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＣＤ４．４のヌクレオチド配列（Ｗｏｒｍ
ｂａｓｅ登録番号ＣＥ１６９５２）
配列ＩＤ番号３２  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＣＤ４．４の推定アミノ酸配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ１６９５２）
配列ＩＤ番号３３  ＣＤ４．４のヒトオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２４６６７）
配列ＩＤ番号３４  ＣＤ４．４のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７８９４３）
配列ＩＤ番号３５  ＣＤ４．４のヒトオーソログの（ｍＲＮＡに対応する）ヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＬ８３４２６１）
配列ＩＤ番号３６  ＣＤ４．４のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＤ３８９３６）
配列ＩＤ番号３７  ＣＤ４．４のハエホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ００３６０３）
配列ＩＤ番号３８  ＣＤ４．４のハエホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５２０６０）
配列ＩＤ番号３９  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ５４６．１のヌクレオチド配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ２８５２４）
配列ＩＤ番号４０  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ５４６．１の推定アミノ酸配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ２８５２４）
【００２５】
配列ＩＤ番号４１  ＺＫ５４６．１のヒトオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１５８８８）
配列ＩＤ番号４２  ＺＫ５４６．１のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５６９７２）
配列ＩＤ番号４３  ＺＫ５４６．１のラットホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０３１７４５）
配列ＩＤ番号４４  ＺＫ５４６．１のラットホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿１１３９３３）
配列ＩＤ番号４５  ＺＫ５４６．１のマウスホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿１０９４７４）
配列ＩＤ番号４６  ＺＫ５４６．１のマウスホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿１０９４７４）
配列ＩＤ番号４７  ＺＫ５４６．１のハエホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ００３６５５）
配列ＩＤ番号４８  ＺＫ５４６．１のハエホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５３６０５）
配列ＩＤ番号４９  ＺＫ５４６．１の酵母ホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１３６、塩基対３４５６６４〜３５１０３６）
配列ＩＤ番号５０  ＺＫ５４６．１の酵母ホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１０２２５）
配列ＩＤ番号５１  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ５６Ｃ１０．３のヌクレオチド配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ０２５６）
配列ＩＤ番号５２  Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ５６Ｃ１０．３の推定アミノ酸配列（Ｗｏｒｍｂａｓｅ登録番号ＣＥ０２５６）
配列ＩＤ番号５３  Ｃ５６Ｃ１０．３のヒトオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０５９２８２）
配列ＩＤ番号５４  Ｃ５６Ｃ１０．３のヒトオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０５９２８２）
配列ＩＤ番号５５  Ｃ５６Ｃ１０．３のマウスオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２９３６２）
配列ＩＤ番号５６  Ｃ５６Ｃ１０．３のマウスオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０８３６３８）
配列ＩＤ番号５７  Ｃ５６Ｃ１０．３のハエオーソログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＥ００３８３４）
配列ＩＤ番号５８  Ｃ５６Ｃ１０．３のハエオーソログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５８９７７）
配列ＩＤ番号５９  Ｃ５６Ｃ１０．３の酵母ホモログのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１１４４、塩基対１９４４５３〜１９５１７５）
配列ＩＤ番号６０  Ｃ５６Ｃ１０．３の酵母ホモログの推定アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１３１２５）
【００２６】
他の特定しない限り、核酸およびポリペプチド／タンパク質の操作は、分子生物学および免疫学の標準の方法を用いて実施可能である（たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）「分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９５，Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ
Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５を参照のこと）。
【００２７】
本発明は、モデル有機体Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける細胞分裂で、重要な機能を持つとして同定された遺伝子を記述している。モデル有機体における調査を実施するための基礎は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中の遺伝子に対して新規に発見された機能が、ヒトを含む他の種にて保存されうることである。細胞分裂ならびに細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能は、進化の間に非常に保存され、したがって、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける遺伝子機能を発見すること、およびヒトホモログまたはオーソログに対する機能を特徴づける、または指定するために情報を用いることのアプローチが非常に証明されている。
【００２８】
維持における１つの主題は、遺伝子機能が、配列の多大な相違をもって維持されうることである。本発明において、この維持の主題は定義されていない。しかしながら、他の遺伝子が、結果として、本発明において請求されたものと同様の遺伝子産物として同定される遺伝子産物となる機能を持つと発見される場合に、本発明はまた、かかる遺伝子に対して適用を請求する。
【００２９】
しかしながら、進化の間の遺伝子の保存の特に頻繁な主題は、遺伝子配列が保存されうることである。この保存の主題は、特に細胞分裂のような非常に保存された工程に関与する遺伝子に対して、頻繁である。このことは、ＤＮＡヌクレオチド配列または遺伝子のタンパク質コード配列が、異なる種で非常に同様であり、言い換えれば、遺伝子の機能が、異なる種で同一であることを示唆している。
【００３０】
したがって、さらに好ましい実施形態において、核酸分子は、配列ＩＤ番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９によってコードされたタンパク質と、アミノ酸レベルで、１００残基にわたり、少なくとも２５％、好ましくは１００残基にわたり少なくとも３０％、より好ましくは、１００残基にわたり少なくとも５０％、特に、１００残基にわたり少なくとも７０％の配列同一性を示すポリペプチドをコードする配列を持つ。
【００３１】
これらの非常に高い配列類似性は、通常、上記配列のオーソログまたはホモログであるポリペプチドによって示される。ホモログは、同一または他の種からの同一の配列を持つタンパク質である（ホモログの配列類似性は、種形成事象から、または遺伝子複製から由来し、すなわちホモログは、任意の種の関連タンパク質、または他の種における同一のタンパク質である）。ホモログのサブグループは、本質的に、オーソログとして定義される。オーソログは、他の種と比較したものと同様のタンパク質であるが、他の種から由来する（オーソログの配列類似性は、遺伝子複製よりも種形成事象から由来する）。細胞分裂のような保存工程において、ホモログおよびオーソログタンパク質、特にオーソログタンパク質は、同一の生物学的機能を果たす可能性が非常に高いことが、当業者によって知られている。この場合、もっとも関連する生物学的機能は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能への関与、特にそれに対する要求である。
【００３２】
都合良く、本発明の文脈にて同定されたＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子のヒトオーソログは、増殖、細胞生存および有糸分裂に必要であることが示された（実施例１１を参照のこと）。この発見は、ヒトオーソログが、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に必要であり、増殖性疾患の診断および治療の文脈において利用可能である。
【００３３】
当業者は、ホモログおよびオーソログを同定するための異なる方法および原理に熟知している。本発明の文脈において、ホモログおよびオーソログを、実施例１にて記述した手順にしたがって、配列類似性に基づいて同定した。
【００３４】
核酸分子にはまた、最大で１０−５のｅ値、好ましくは最大で１０−１２のｅ値、特に最大で１０−２０のｅ値で、コンピュータ補助データベース検索／アライメントにて検出可能な配列、またはそれらの断片が含まれ得、それによって、データベース配列が、下記のａ）で定義されるような配列と比較される。核酸分子がまた、本発明の原理にしたがって、オーソログと考慮される配列を含みうる（実施例１を参照のこと）。一般的に、配列同一性の程度を、本技術分野で公知のタンパク質配列アライメントを実施可能である、任意のソフトウェアプログラムによって計算可能である。ここで、同一のアミノ酸領域が、その長さが変化可能なギャップによって遮られることも含まれる。
【００３５】
この種類の解析またはアライメントに関して、「ＢＬＡＳＴ配列解析プログラム」が特に好ましい。配列解析のために使用しうる「ＢＬＡＳＴ配列解析プログラム」は、好適に利用可能であり、当業者に公知である。配列アライメントのための公知の解析プログラム、特に「ＢＬＡＳＴ配列解析プログラム」は、比較した配列間の相同性の程度を特性化するために、「ｅ値」と呼ぶものを計算する。一般的に、小さなｅ値は、高い配列類似性を特性化し、一方で、ｅ値が大きければ大きいほど、より小さな配列の類似性を特性化する。  配列変化において必要な類似性の程度は、配列の意図する利用に依存する。配列の機能を改善するため、または方法論の利点を提供するために設計される、変異、挿入および欠損変異に影響を与えることが、当業者によって可能である。
【００３６】
上記の配列  ＩＤによってコードされたタンパク質との以上の配列同一性の程度は、上記配列に対して強く相同的であるようなポリペプチドに対して、特に、ａ）のポリペプチドに対して「オーソログ的である」または「類似的である」ポリペプチド類に特徴的である。
【００３７】
表１は、対応するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子のホモログおよびオーソログとの、アミノ酸レベルでのアライメントに関して計算されたｅ値を示している。それによって、１アミノ酸レベルで１０−５以下のｅ値は、対応するＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子のホモログを特性化する。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子がそれ自身、１０−５以下のｅ値もつ、同定されたホモログの逆数である場合、ホモログは、オーソログとして同定される（実施例１も参照
のこと）。
【００３８】
【表１】
2007505824.tif 000002
【００３９】
表１：Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ１３Ｆ１０．２、Ｃ２５Ａ１．９、Ｆ５４Ｂ３．３、Ｆ０８Ｂ６．２、ＣＤ４．４、ＺＫ５４６．１、Ｃ５６Ｃ１０．３およびそのヒト、マウス、ラット、ハエおよび酵母ホモログおよびオーソログ間の配列類似性
【００４０】
さらに好ましい実施形態によると、核酸分子は、中程度／高逼迫性の条件下、（ａ）ま
たは（ｂ）の核酸配列とハイブリッド形成可能である、ヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
かかるハイブリッド、２本鎖形成および安定性は、ハイブリッドの２本の鎖間の十分な相補性に依存し、ある程度の不適合が許容可能である。したがって、本発明の核酸分子およびプローブには、前記配列変化が、対象の標的ヌクレオチド配列との安定なハイブリッドの形成を許容する、本来の配列に対して、十分な配列類似性を持つ限り、上記の同定された配列の変異（単一および多重両方）、欠損、挿入、およびこれらの組み合わせが含まれる。
【００４２】
このＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、特定のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブに「ハイブリッド形成」するかどうかを決定するために好適な実験条件は、５×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）緩衝液中、１０分間のハイブリッド形成と、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％  ＳＤＳおよび１００ｍｇ／ｍｌの還元超音波処理サケ精子ＤＮＡ（Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）の溶液中でのフィルターの前ハイブリッド形成、それに続く、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のランダムプライム化（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９８３），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２：６−１３）、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識化（特異的活性＞１×１０９ｃｐｍ／μｇ）プローブを含む同様の溶液中での、およそ４５℃にて１２時間のハイブリッド形成に関して試験するために、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むフィルターの予浸が伴う。ついでフィルターを２回、３０分間、２×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ中、少なくとも５５℃（低逼迫性）、少なくとも６０℃（中逼迫性）、好ましくは少なくとも６５℃（中／高逼迫性）、より好ましくは、少なくとも７０℃（高逼迫性）、またはもっとも好ましくは、少なくとも７５℃（非常に高逼迫性）で、２回洗浄する。プローブが選択した条件下でハイブリッド形成する分子を、ｘ線フィルムまたは「リン撮像装置」を用いて検出する。
【００４３】
さらに好ましい実施形態によると、核酸分子はまた、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）にて定義されたような任意の配列のアンチセンス配列を持ちうる。
【００４４】
さらに好ましい実施形態によると、以上で記述したような核酸分子の断片を使用しうる。
【００４５】
本発明にしたがって使用される語句「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、分子および参照する目的に依存して、異なる意味を持ちうる。当業者は、関連する目的に対して、適切な断片をどのように選択するかを知っている。好ましくは、断片は、由来する配列に特異的であるべきである。語句「特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」の意味が、本技術分野で公知である。好ましくは、本文脈における特異的は、配列断片で実施したＢＬＡＳＴ調査において、（断片が由来する）本来の配列が、現在使用している文脈において関連する全ての他の配列よりも、低いｅ値をもって同定されうる（たとえば、調査した試料中に存在する核酸の他のすべての配列）。より好ましくは、本来の配列は、同定された全ての他の配列と比較して、もっとも低いｅ値をもって同定されるべきである。あるいは、「特異的」は、適用した条件下で、断片が、由来する核酸分子にのみ結合することを意味する。特異性の基準は通常、１５ヌクレオチドより長い、好ましくは１９ヌクレオチドより長い断片によって達成される。好ましくは、断片は、高い複雑性の配列領域から選択される。低複雑性領域は、データベース調査、または標準の配列解析プログラムにて利用可能な低複雑性フィルターによって動作可能である。
【００４６】
「生物学的に活性な（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ）」断片または誘導体は、当業者によって合成可能である。これによって、断片または誘導体は、由来する核酸と同様の「生物学的機能（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」を持つべきであ
る。本発明にしたがって、もっとも関連する生物学的機能は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能への関与、阻害、活性化、または要求である。
【００４７】
（ａ）〜（ｅ）下でのように定義された単離核酸分子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏで、特に細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害することによって、細胞分裂および／または細胞増殖に影響を与えるために利用しうる。
【００４８】
前記核酸分子を用いる細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害を、当業者に知られている異なる方法によって達成可能である。たとえば、単離した核酸分子を、対応するタンパク質またはポリペプチドを過剰発現させるために、強力なプロモーターの下流に挿入しうる。タンパク質またはポリペプチドの過剰発現が、内因性タンパク質の生物学的機能の抑制を導きうる。核酸に欠損または他の変異を導入することによって、または好適な断片を用いることによって、ドミナント−ネガティブなペプチドまたはポリペプチドをコードしている配列を産出可能である。かかるドミナント−ネガティブペプチドまたはポリペプチドは、対応する内因性タンパク質の機能を阻害可能である。
【００４９】
特定の核酸を、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害するために、内因性遺伝子の発現（転写および／または翻訳）を阻害するために使用可能である。たとえば、以上で同定したような配列を含むペプチド核酸は、遺伝子と、ＤＮＡ三重構造を形成することによって、対応する内因性遺伝子の発現を抑制可能である。アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのような他の核酸を、内因性遺伝子から転写されたＲＮＡを干渉するために利用可能である。
【００５０】
自動化遺伝子合成の適用によって、天然に存在する遺伝子の配列変化を産出するための機会が提供される。対応するアミノ酸配列の合成変異体をコードしているポリヌクレオチドが、たとえば、１つ以上のアミノ酸置換、欠損または添加となりうるように、産出可能であることは評価できる。また、所望の特徴、たとえば反応性または検出可能基を持つ前記核酸配列を提供する（モルホリノ類を含む）１つ以上の合成ヌクレオチド誘導体を調製可能である。所望の特徴を持つ合成誘導体をまた、対応するポリペプチド内に含めてよい。天然に存在する配列の、少なくとも１部分の生物学的活性または生物学的機能を示している、またはたとえば、ホモログ遺伝子または遺伝子産物の同定のためのプローブとして、利用することが好適である、以上で同定した遺伝子および遺伝子産物のかかる誘導体および断片のすべてが、本発明の目的内に含まれる。また、活性または機能が、天然に存在する配列の生物学的活性または生物学的機能に反対に作用しているような誘導体および断片、たとえば、ドミナント・ネガティブ分子をコードしている誘導体および断片も含まれる。
【００５１】
細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に機能的に関連する種々の遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書で提供されると、遺伝子合成および／または増幅の自動化技術を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの前記核酸分子を同定するために使用しうる。コード配列の長さのために、自動化合成の適用が、長さにして、約３００までのヌクレオチドを、個々に合成し、ついで、最終アセンブリのために、正確な成功率でライゲートする、ステージ化遺伝子構造が要求されうる。個々に合成された遺伝子領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、アセンブリする前に増幅可能である。ＰＣＲ増幅の技術をまた、最終遺伝子／核酸分子の全てまたは部分を直接産出するためにも使用しうる。この場合、プライマーを、一片で、またはついで互いにライゲートしうるいくつかの片でのいずれかで、最終産物のＰＣＲ増幅を開始することが可能であるように合成する。この目的のために、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のための鋳型として使用しうる。ｃＤＮＡ鋳型は、市販されている、または自己構築ｃＤＮＡライブラリーより由来しうる。
【００５２】
さらなる好ましい実施形態にしたがって、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害する医薬品の合成のための、ＲＮＡの形態、特にアンチセンスＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡの形態での、以上で同定した核酸分子またはその断片の利用に関する。また、リボザイムを、以上で同定した配列のために合成可能であり、対応する内因性遺伝子から転写されたＲＮＡを分解するために利用可能である。  
【００５３】
以上で述べたように、２本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、２本鎖でのＲＮＡのいずれかの鎖に非常に相同的である、遺伝子（類）の発現のサイレンシングに影響する。最近の発見によって、元々Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅにて発見された、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるこの効果が、哺乳動物、特にヒト細胞でも観察可能であることが明らかになった。したがって、ＲＮＡ干渉による特定の遺伝子機能の阻害がまた、哺乳動物細胞、特にまたヒト細胞にて実施されうる。
【００５４】
図１で示したように、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ中、ＲＮＡｉによって、（ａ）〜（ｆ）下で定義されたような核酸分子の阻害が、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を改善することによって、細胞分裂を阻害する。
【００５５】
特に好ましいのは、ＲＮＡｉ技術の治療適用、特にヒトまたはヒト細胞での適用におけるこれらのＲＮＡｉ技術の治療適用分子の利用である。
【００５６】
哺乳動物細胞に特に好適なＲＮＡｉ技術によって、「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）として知られる２本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド類の利用がなされる。
【００５７】
したがって、さらに好ましい実施形態によると、本発明は、以上で同定した任意の配列に対応する配列を持つ、低分子干渉ＲＮＡを含む核酸分子の利用に関する。
【００５８】
これらのｓｉＲＮＡ分子を、哺乳動物細胞内、好ましくはヒト細胞内で、特に、増殖性疾患の治療のために、（ａ）〜（ｆ）下で定義されたような核酸配列を含む、本発明の遺伝子の発現の治療的サイレンシングのために利用可能である。
【００５９】
哺乳動物での特定の標的遺伝子の阻害は、標的遺伝子に対して特異的である（以上を参照のこと）配列を持つｓｉＲＮＡ分子の、哺乳動物細胞内への導入によって達成される。ｓｉＲＮＡは、第１および第２ＲＮＡ鎖を含み、両方が互いにハイブリッド形成し、第１ＲＮＡ鎖の配列が、ａ）〜ｆ）にて定義されたような配列の１つの断片であり、第２ＲＮＡ鎖の配列が、第１ＲＮＡ鎖のアンチセンス鎖である。ｓｉＲＮＡ分子は、特徴的な２−または３−ヌクレオチド３’−オーバーハング配列を持ちうる。ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、好ましくは１９〜３１ヌクレオチドの長さを持つ。
【００６０】
ｓｉＲＮＡは、細胞トランスフェクション、特にリポフェクション、エレクトロポレーションまたはマイクロインジェクションの任意の好適で公知の方法によって、哺乳動物細胞内に導入可能である。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、任意の公知のＲＮＡ合成方法によると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにて、合成し、互いにハイブリッド形成可能である。
【００６１】
哺乳動物細胞内、およびヒト細胞内で、疾患−関連遺伝子の遺伝子発現を阻害する可能性によって、薬理学的組成物のための興味深い治療薬剤である、疾患−関連遺伝子の配列を持つ、ｓｉＲＮＡを産出可能であって、ｓｉＲＮＡまたは、ｓｉＲＮＡを産出可能なベクター系を作製する。特に、本発明で定義した配列を持つ、またはかかる遺伝子の１つに相同的であるか、オーソログ的である、ｓｉＲＮＡを、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害のため、および疾患、特に増殖性疾患の治療のための医薬品の製造
のために利用可能である（以下を参照のこと）。同様に、かかるｓｉＲＮＡを産出可能である核酸ベクターを、かかる医薬品の製造のために利用可能である。
【００６２】
他の実施形態において、本発明は、以上で定義したような核酸分子の利用に関し、そこで、この核酸分子は、好適な条件下で、センスＲＮＡ鎖およびアンチセンスＲＮＡ鎖を含む２本鎖ＲＮＡ分子を産出可能である、少なくとも１つの核酸発現ベクター中に含まれ、互いに独立して、各ＲＮＡ鎖は、１９〜３１ヌクレオチドの長さを持つ。
【００６３】
この他の方法（また、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，，ｐｐ．４４６−４４８にて記述された）において、ｓｉＲＮＡ自身の代わりにｓｉＲＮＡを産出可能なベクター系を、遺伝子発現をダウンレギュレートするために、哺乳動物細胞内に導入する。
【００６４】
かかるベクターによって産出されるＲＮＡ鎖の好ましい長さは、一般的にｓｉＲＮＡに対して好ましいものに対応する（以下を参照のこと）。
【００６５】
上記２本鎖ＲＮＡ分子の産出のための「好適な条件（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、本技術分野の状態によると、ハイブリッド形成するときに、２本鎖ＲＮＡ分子を形成する、上記配列および長さを持つ、第１および第２ＲＮＡ鎖の発現を許容する、すべてのｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏである。上記２本鎖ＲＮＡ分子の産出のために、特に好ましい「好適な条件」は、ヒト生細胞または動物細胞中の「ｉｎ  ｖｉｖｏ条件」または培養ヒトまたは動物細胞中の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件」である。
【００６６】
「核酸発現ベクター（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、たとえばプラスミドのような、クロモソーム外構成要素であり得、その複製が、クロモソーム複製に依存しない。あるいは、ベクターは、宿主細胞内、特に哺乳動物宿主細胞内に導入されたときに、宿主細胞ゲノム内に統合され、その統合されたクロモソーム（類）と一緒に複製されるものでありうる。好ましくは、「核酸発現ベクター（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、通常、ヒトにおける遺伝子治療方法で適用される発現ベクター、特にレトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターでありうる。
【００６７】
対象のコーディング配列は、必要であれば、好適な末端またはポリアデニル化配列に動作可能に連結しうる。ＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡの場合、「コーディング配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、対応するＲＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖類をコードしている、または対応する配列を意味する。
【００６８】
さらに、ベクターは、哺乳動物宿主細胞内で、ベクターを複製可能にするＤＮＡ配列を含みうる。かかる配列の例は、特に宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、複製のＳＶ４０起源である。
【００６９】
哺乳動物細胞内での発現に好適である多数のベクターが、本技術分野で公知であり、これらのいくつかが市販されている。好適であり得る、いくつかの市販されている哺乳動物発現ベクターには、制限はしないが、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））、ｐＸＴ１（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ｐｃＤＮＡＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ
３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ  ３７１１０）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ  ３７１４６）が含まれる。すべての本技術分野で公知の好適な遺伝子治療ベクターが好ましい。
【００７０】
本発明の特定の好ましい実施形態において、ベクターはレトロウイルスベクターである。レトロウイルスは、ヒト細胞のような細胞の感染の後に、ＤＮＡに逆転写され、続いて、宿主細胞のゲノム内に統合されるゲノムを持つＲＮＡウイルスである。レトロウイルスは、その宿主細胞に、レセプター仲介エンドサイトーシスによって侵入する。細胞へのエンドサイトーシスの後、レトロウイルスベクターの発現が、サイレンス化されて、単一の細胞のみが感染することが確にされる。ウイルスＤＮＡのゲノム内への統合が、インテグラーゼと呼ばれるウイルスコードタンパク質によって仲介され、ここで、この仲介の場所は定義されていない。レトロウイルスベクターは、また「レトロウイルス形質導入（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｕｃｔｉｏｎ）」として当業者に公知である、レセプター仲介エンドサイトーシスによる宿主細胞へのその移動が、特に効果的であるので、遺伝子治療法におけるその利用のために、特に好ましい。当業者はまた、「パッケージング細胞（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）」と呼ばれるものを用いて、どのようにして、かかるレトロウイルスベクターを宿主細胞内へ導入するかを知っている。
【００７１】
本発明の他の特に好ましい実施形態において、ベクターは、アデノウイルスベクターまたはその誘導体である。アデノウイルスベクターは、複製可能および複製不全ベクター両方を含む。後者には、Ｅ１遺伝子中のベクター欠損が含まれる。
【００７２】
組み換え体ベクターは、哺乳動物、特にヒト細胞の形質導入またはトランスフェクションを可能にする好適な薬理学的キャリアーによって、哺乳動物宿主細胞内に導入する。好ましい形質導入／トランスフェクション技術には、限定はしないが、リポソーム仲介トランスフェクション、ウイルス仲介トランスフェクションおよびリン酸カルシウムトランスフェクションが含まれる。
【００７３】
好ましい実施形態において、本発明は、以上で定義したようなｓｉＲＮＡを産出可能なベクターシステムの利用に関し、そこで、ｓｉＲＮＡに対応する前記核酸は、第１プロモーターの制御下、センスＲＮＡ鎖に対応する核酸を含む第１発現カセット、および第２プロモーターの制御下、アンチセンスＲＮＡ鎖に対応する核酸を含む第２発現カセットを含む、少なくとも１つの核酸発現ベクター中に含まれる。
【００７４】
上記ベクター系中、ベクターは、２つの個々のプロモーターを含み、第１プロモーターは、センス鎖の転写を制御し、第２プロモーターは、アンチセンス鎖の転写を制御する（また、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４４６−４４８にて記述されている）。最後に、ｓｉＲＮＡ２本鎖が、第１および第２ＲＮＡ鎖のハイブリッド形成によって構築される。
【００７５】
語句「発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）」は、本明細書で、特異的な標的ポリペプチドの発現のために、必要であるか、有益である全ての成分を含んで定義される。「発現カセット」には、限定はしないが、（たとえば対象のｓｉＲＮＡまたはポリペプチドをコードしているか、相当している）対象それ自身の核酸配列、および「制御配列（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」が含まれうる。これらの「制御配列」には、限定はしないが、対象の核酸配列に動作可能に連結するプロモーター、リボソーム結合部位、転写開始および終結シグナル、および任意にレプレッサー遺伝子または種々のアクティベーター遺伝子が含まれうる。制御配列は、対象の核酸配列に天然に結合している場合に、「同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」であると呼ばれ、そうでない場合に「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」と呼ばれる。語句「動作可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」は、その意図した目的、すなわち所望のタンパク質の発現、ＲＮＡの場合、所望のＲＮＡの転写、と一致して機能するように、設計されることを示唆する。
【００７６】
上述した「発現カセット」にて使用されるプロモーターは、選択した宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞、好ましくはヒト宿主細胞内で、転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得る。プロモーターは、宿主細胞に対して、同種または異種いずれかで、タンパク質をコードしている遺伝子より由来しうる。
【００７７】
先行技術において公知の一般的な各プロモーターにおけるプロモーターを利用可能であるので、哺乳動物宿主細胞内、特にヒト宿主細胞内での、適切な条件下、対象の遺伝子の発現が可能になる。特に、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）Ｕ６またはヒトＲＮＡｓｅ  Ｐ  ＲＮＡ  Ｈ１を正常にコードしている、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写ユニットから由来するプロモーターを、治療的ｓｉＲＮＡを発現するために、プロモーターとして利用可能である。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターのＩＩＩ型クラスのメンバーである、これらの特に好ましいプロモーターＵ６およびＨ１  ＲＮＡは、第１転写ヌクレオチド（＋１位）を除いて、転写領域の上流にのみ局在する。
【００７８】
好ましい実施形態において、本発明は、以上で同定した核酸配列に関して、ｓｉＲＮＡを産出可能なベクター系の利用に関し、そこで、配列は、１本鎖ＲＮＡ分子を導くプロモーターの制御下、センスＲＮＡ鎖の、およびアンチセンスＲＮＡ鎖の配列を含む発現カセットを含む、少なくとも１つの核酸発現ベクターに含まれ、１本鎖ＲＮＡ分子は、バック折り畳み、ステムループ構造を形成可能である。
【００７９】
本ベクター系（また、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，ｐｐ．４４６−４４８にて記述された）にて、単一ＲＮＡ鎖のみが、単一のプロモーターの制御下で産出され、そこで、ＲＮＡ分子鎖は、最終２本鎖ｓｉＲＮＡ分子のセンスおよびアンチセンス鎖両方を含む。この構造により、ステムループ形成下、相補的センスおよびアンチセンス配列のハイブリッド形成によって、ＲＮＡ鎖のバック折り畳みが導かれる。最後に、この折り畳みバックステムループ構造の細胞内処理によって、ｓｉＲＮＡができる。
【００８０】
本発明による他の好ましい実施形態において、「核酸発現ベクター（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」には、１本鎖のＲＮＡ分子へ導く単一のプロモーターの制御下、センスＲＮＡ鎖の、およびアンチセンスＲＮＡ鎖の配列を含む発現カセットが含まれる。この１本鎖ＲＮＡ分子はそれによって、バック折り畳みステムループ構造を形成可能である。これらの発現した「ヘアピンＲＮＡ分子（ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」が続いて、細胞内処理の後にｓｉＲＮＡとなる。
【００８１】
本発明の好ましい実施形態において、本発明によるｓｉＲＮＡの発現となる、核酸発現ベクターがまず、または遺伝子治療適用に好適で、哺乳動物、特にパッケージング細胞のようなヒト標的細胞に感染可能である、治療的、非毒性ウイルス粒子、ウイルス由来粒子内に導入される。
【００８２】
好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの第１および第２ＲＮＡ鎖は、互いに独立して、１９〜２５ヌクレオチドの、より好ましくは２０〜２５ヌクレオチドの、もっとも好ましくは２０〜２２ヌクレオチドの長さを持ちうる。  
【００８３】
他の好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡの第１および第２ＲＮＡ鎖は、互いに独立して、２６〜３０ヌクレオチド、より好ましくは２６〜２８ヌクレオチド、もっとも好ましくは２７ヌクレオチドの長さを持ちうる。
【００８４】
本発明はまた、以上で定義した配列によってコードされたタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの利用、および／または関与する方法に関する。
【００８５】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する医薬品の製造において、
ａ）配列ＩＤ番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０にて開示される配列、
ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％の（ａ）による任意の配列との配列同一性を示す配列、
ｃ）（ａ）または（ｂ）にて定義したような配列の断片、
からなる配列の群から選択される配列を含む、単離タンパク質またはポリペプチドの利用に関する。
【００８６】
タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、本技術分野にて公知の種々の方法によって細胞内に導入可能である。たとえば、両親媒性分子は、膜透過性であり、細胞に直接侵入可能である。（通常脂溶性分子か、または膜貫通ドメインを含む）膜結合タンパク質またはポリペプチドは、直接細胞膜内に挿入し得、したがってその生物学的機能を達成可能である。導入または細胞内取り込みの他の方法には、マイクロインジェクション、リポフェクション、レセプター仲介エンドサイトーシス、または好適な担体分子、特に担体ペプチドの利用が含まれる。好適な担体ペプチドには、ＨＩＶ−ｔａｔ、アンテナペディア関連ペプチド類（ペネトラチン類）、ガルパラン（トランスポータン）、ポリアルギニン含有ペプチド類またはポリペプチド類、Ｐｅｐ−１、単純ヘルペスウイルスＶＰ−２２タンパク質が含まれるか、またはこれらより由来可能である。他の可能性のある導入方法は、かかるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現可能な核酸ベクターを導入することである。
【００８７】
単離ポリペプチドを産出するための好適な方法が、本技術分野で公知である。例えば、かかる方法には、ポリペプチドをコードしている動作可能に連結した核酸分子を含む発現ベクターを、好適な宿主細胞内に輸送すること、前記宿主細胞を、前記ポリペプチドまたはその断片の発現を許容する条件下で、培養すること、および任意に培養培地中への発現ポリペプチドの分泌、が含まれる。細胞型に依存して、異なる所望する改変、たとえばグリコシル化が達成可能である。  
【００８８】
タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドはまた、たとえば固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  合成）によるように、合成的に産出しうる。
【００８９】
本発明で利用するポリペプチドにはまた、融合ポリペプチドが含まれうる。かかる融合ポリペプチドにおいて、他のポリペプチドを、対象のポリペプチドまたはその断片のＮ−末端またはＣ−末端にて融合しうる。融合ポリペプチドは、他のポリペプチドをコードしている核酸配列（またはその一部）を、本発明の核酸配列（またはその一部）に融合することによって産出される。融合ポリペプチドを産出するための技術は、本技術分野で公知であり、インフレームであり、融合ポリペプチドの発現が、同様のプロモーター（類）およびターミネーターの制御下であるような、コード配列のライゲーションが含まれる。
【００９０】
対象のポリペプチドの発現はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産出合成ｍＲＮＡを用いて実施しうる。合成ｍＲＮＡは、小麦胚芽抽出物および網状赤血球抽出液を限定はしないが含む、種々の細胞を含まない系にて効果的に翻訳可能であり、同様に、カエル卵母細胞、好ましくはアフリカツメガエル卵母細胞を限定はしないが含む、細胞に基づく系にて効果的に翻訳可能である。
【００９１】
前記単離タンパク質またはポリペプチドを用いる細胞分裂の間のスピンドル形成または
微小管機能の阻害を、当業者に知られている異なる方法によって達成可能である。タンパク質またはポリペプチドの過剰発現は、内因性タンパク質生物学的機能の抑制を導きうる。欠損または他の変異の導入によって、または好適な断片の利用によって、ドミナント−ネガティブペプチドまたはポリペプチドをコードしている配列を産出可能である。かかるドミナント−ネガティブペプチドまたはポリペプチドは、対応する内因性タンパク質の機能を阻害可能である。たとえば、断片または変異体を、結合部位のみからなるが、酵素的に不活性である（すなわちその生物学的機能が部分的に欠損している）ように産出可能である。かかるドミナント−ネガティブ分子は、細胞内結合パートナーへ結合し、したがって、内因性分子の活性化を阻害することによって、内因性タンパク質またはポリペプチドの生物学的機能を干渉しうる。
【００９２】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害する医薬品の製造のための、以上で定義したような配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに対して指向する、抗体の利用に関する。
【００９３】
本明細書で使用するところの語句、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ならびに、抗原またはハプテンに結合可能なＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２のようなそれらの断片が含まれる。本発明はまた、所望の抗原特異性を示している非ヒトドナー抗体のアミノ酸配列を、ヒトアクセプター抗体の配列と組み合わせる、「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」ハイブリッド抗体も意図する。
【００９４】
ドナー配列は通常、少なくともドナーの抗原結合アミノ酸残基を含むが、同様にドナー抗体の他の構造的および／または機能的に相関するアミノ酸残基も含みうる。かかるハイブリッドは、本技術分野でよく知られているいくつかの方法によって調製可能である。
【００９５】
具体的には、特にヒト化形態での、前記抗体およびその好適な断片を、がんおよび他の治療的疾患を治療するための方法にて、治療薬剤として利用しうる。
【００９６】
前記抗体の利用にはまた、上記同定核酸分子またはそれらの対応するポリペプチドの治療的阻害も含まれる。特に、この利用は、増殖性疾患を指向しうる。
【００９７】
抗体または断片を、本技術分野で公知の任意の方法によって、体内に導入しうる。抗体、特に断片の、生細胞内での伝達は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に関して記述したように達成しうる。抗原が細胞外または細胞外ドメインである場合、抗体は、細胞内伝達の必要なしに、このドメインに結合することによって、その機能を達成しうる。
【００９８】
抗体を、本目的のための確立されたリンカー技術によって、放射標識、酵素標識、発光標識、蛍光標識などのような、検出可能な標識に共役的に結合可能である。標識化は特に、たとえば、コンピュータ技術、ＰＥＴ（ポジトロン放射トモグラフィー）、またはＳＰＥＣＴ（単一光子放射コンピュータトモグラフィー）によって、診断目的（以下を参照のこと）のため、または体内または新生物腫瘍内の抗体の分布をモニタするために有用である。
【００９９】
他の実施形態において、本発明は、増殖性疾患の治療または治療のための医薬品の製造のために、以上で定義したような、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体の利用に関する。
【０１００】
好ましい実施形態において、疾患は、冠動脈再狭窄または新生物疾患であり、後者は好ましくは、リンパ腫、肺がん、大腸がん、卵巣がんおよび乳がんからなる群より選択される（以上を参照のこと）。
【０１０１】
本発明による「増殖性疾患（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）」は、たとえばがんのような、過剰な細胞分裂または増殖に関連する疾患である。好ましくは、増殖性疾患は、再狭窄、特に冠動脈再狭窄、または新生物疾患であり、後者は好ましくは、リンパ腫、肺がん、大腸がん、卵巣がんおよび乳がんからなる群より選択される。
【０１０２】
再狭窄は、血管形成またはステント移植の部位での組織の増殖による、血管の再狭窄である。ステントは、先にブロックした動脈の開口を維持するための、きわめて小さな金属チューブである。しかしながら、再狭窄は、移植したステントを持つ多くの患者で発達し、したがって、第２の血管形成、ステント移植または冠動脈バイパス手術までを必要とする。
【０１０３】
新生物疾患は、新規に形成される組織または細胞によって引き起こされる疾患である。本発明の文脈において、もっとも関連する新生物疾患は、新生物腫瘍、特に、リンパ腫、肺がん、大腸がん、卵巣がんおよび乳がんからなる群より選択されるものである。
【０１０４】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の活性化する医薬品の製造のための、
ａ）配列ＩＤ番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９にて表される核酸配列、
ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％のａ）による核酸によってコードされているタンパク質との配列同一性を示す、および／またはＢＬＡＳＴ配列解析プログラムを用いた、コンピュータ補助検索で、最大で１０−５のｅ値で検出可能である、ポリペプチドをコードしている核酸配列、
ｃ）中程度または高い逼迫性の条件下で、（ａ）または（ｂ）に対応する配列を持つ核酸分子と、ハイブリッド形成可能な核酸分子の配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義したような任意の配列のアンチセンス配列、
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の断片、
ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）にて定義したような任意の配列に対応する、ＤＮＡ配列、
からなる配列の群から選択される配列を持つ、核酸分子を含む、単離核酸分子の利用に関する。
【０１０５】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を活性化する医薬品の製造において、
ａ）配列ＩＤ番号配列ＩＤ番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０にて開示される配列、
ｂ）１００残基にわたり、少なくとも２５％の（ａ）による任意の配列との配列同一性を示す配列、
ｃ）（ａ）または（ｂ）にて定義したような配列の断片、
からなる配列の群から選択される配列を持つ、ペプチドまたはポリペプチドを含む、単離ペプチドまたはポリペプチドの利用に関する。
【０１０６】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の活性化する医薬品の製造のための、以上で定義したような配列を含む少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドに対して指向する、抗体の利用に関する。  
【０１０７】
したがって、以上で同定した核酸配列、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および抗
体を含む他の利用または方法は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能が異常である、欠損している、または陰性に影響をしている疾患の治療に対して指向している。
【０１０８】
細胞分裂の間で、異常、欠損または陰性に影響しているスピンドル形成または微小管機能を持つ疾患は、アポトーシスの増加および発生疾患、特に増殖遅延または傷治癒の遅れによって特徴づけられうる。
【０１０９】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、疾患が、アポトーシスの増加、増殖遅延または傷治癒の遅延によって特徴づけられる、疾患の治療の利用または方法に関する。
【０１１０】
「細胞分裂間のスピンドル形成または微小管機能の活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｉｎｄｌｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）」には、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管形成の開始および刺激の両方が含まれる。
【０１１１】
利用には、限定はないが、前記標的遺伝子の発現の直接または間接活性化のための、および／または前記標的遺伝子の機能の活性化のための、前記核酸分子およびそれらに対応するポリペプチドの利用が含まれる。特に、利用には、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に関与する内因性遺伝子の機能または活性化の欠如の、置換または補完が含まれうる。
【０１１２】
ＲＮＡまたはポリペプチドの発現は、好適なプロモーター、好ましくは構造性または同種プロモーターを含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの導入によって達成されうる。あるいは、任意の好適な核酸発現ベクターを利用可能である（また以上を参照のこと）。コードされたタンパク質またはポリペプチドは、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能において同様の生物学的機能を持ち、特に、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を活性化する能力を持つ、全長または部分または断片ペプチドでありうる。
【０１１３】
本技術分野で公知のすべての遺伝子治療技術を、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能が陰性に影響を与えている疾患を患っている対象の細胞または組織へ、配列を導入するために使用可能である。以上で同定した配列の導入に対して特に有用なのは、ウイルスベクター、たとえば、レトロウイルスまたはアデノウイルスベクター、リポフェクションおよびエレクトロポレーションである。
【０１１４】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドはまた、任意の公知のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ法によって産出可能であり、細胞内へ直接導入可能である（以上を参照のこと）。
【０１１５】
好適な抗体が、結合する標的タンパク質の生物学的機能を活性化するために利用可能であることが知られている。活性化は、標的タンパク質への結合に際して、立体配座的変化を誘導することによって起こりうる。他の可能性は、抗体が、２つ以上のタンパク質に結合し、これらを、十分に近い物理的な距離まで連結して、標的タンパク質の相互作用を誘導することである。後者の活性化様式は特に、膜結合二量体レセプターに関して知られている。
【０１１６】
使用した核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および抗体に関する特定の実施形態に関して、本発明の他の利用に関して以上で定義したものと同様のものが適用される。
【０１１７】
他の実施形態において、本発明は、
ａ）以上で定義したような核酸分子または核酸発現ベクター、
ｂ）以上で定義したような配列を含むペプチドまたはポリペプチド、
ｃ）（ｂ）にしたがった少なくとも１つのペプチドまたはポリペプチドに対して指向する抗体、
からなる群より選択される、単離核酸分子、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体を含む医薬品に関する。
【０１１８】
好ましくは、この単離核酸分子は、ＲＮＡ分子であり、好ましくは、２本鎖である。特に、単離核酸分子は、本発明によるｓｉＲＮＡ分子である。
【０１１９】
医薬品は、がんのような任意の種類の増殖性疾患の治療のため、好ましくは、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能が、役割を果たす疾患の治療、特に、リンパ腫、肺がん、大腸がん、卵巣がんまたは乳がんの治療方法で利用または適用されうる。
【０１２０】
医薬品はまた、細胞分裂の間、異常または欠損スピンドル形成または微小管機能スピンドル形成または微小管機能に関連する任意の種類の疾患の治療、特に、アポトーシスの増加、発達疾病または異常（特に増殖遅延）および傷治癒の遅延の治療方法で利用または適用しうる。
【０１２１】
医薬品およびそれらの投与に対する以下の考慮がまた、以上で開示した利用に対してと同様に、本発明の医薬品にも適用される。
【０１２２】
医薬品には、好ましくは、好適な薬理学的に許容可能な担体、好ましくは、ウイルスベクターを寄生させ得るウイルス粒子またはウイルス由来粒子、リポソーム、特にカチオン性リポソーム、リン酸カルシウムなどを含むトランスフェクション溶液がさらに含まれる。好ましくは、哺乳動物標的細胞に入る、発現ベクターまたは発現ベクターを含むウイルス粒子の能力を増強可能である担体を利用する。医薬品にはまたさらに、他の担体基質、好ましくはデンプン、ラクトース、脂質、ステアリン酸、アルコール、生理学的ＮａＣｌ溶液またはさらなる添加物、特に安定剤、維持剤、色素および香料が含まれうる。
【０１２３】
医薬品はまた、他の好適な基質を含みうる。たとえば、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含む医薬品がまた、２本鎖ＲＮＡ分子を安定化させる、および／または２本鎖ＲＮＡ分子またはＤＮＡ発現ベクターを、ヒトまたは動物細胞にトランスフェクト、または注入可能にする基質を含みうる。
【０１２４】
投与は、公知の方法によって実施可能であり、そこで、核酸を、所望の細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで導入する。治療適用のために、医薬品は、溶液、特に注射可能溶液、クリーム、軟膏、錠剤、懸濁液、顆粒などの形態でありうる。医薬品は、任意の方法にて、特に、注射によって、経口、経鼻、直腸適用によって投与しうる。医薬品は、特に、非経口で投与でき、これは、消化器官に入らないことを意味し、たとえば、皮下注射によってである。医薬品をまた、注入または注射のための溶液の形態で、静脈内に注射しうる。他の好適な投与形態は、クリーム、軟膏、スプレーおよび他の経皮治療基質の形態で、または鼻スプレー、エアロゾルのような、吸入可能基質の形態で、またはマイクロカプセルまたはインプラントの形態で、皮膚上への直接投与でありうる。
【０１２５】
好ましくは、活性剤または阻害剤を、薬理学的に効果的な量で投与する。本明細書で使用するところの、活性剤または阻害剤の「薬理学的に効果的な量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理した細胞内、またはｉｎ  ｖｉｖｏで治療した対象内のいずれかで、所望の薬理学的結果を達成するために効果的な量である。特に、薬理学的に効果的な量は、いくつかの時点で、増殖性疾患、または細胞分裂の間での、異常または欠損スピンドル形成または微小管機能に
関連した疾患に関連した１つ以上の臨床的に定義した病理学的効果に、陽性に影響を与えるために十分な量である。薬理学的に効果的な量は、選択した特定の活性剤または阻害剤に依存して変化し得、また、治療すべき対象に関連した種々の因子および状態、および疾患の重症度に依存する。たとえば、活性剤または阻害剤が、ｉｎ  ｖｉｖｏで投与されるべき場合、患者の年齢、体重、性別および一般的な健康、ならびに前臨床動物試験にて得た、投与応答曲線および毒性データのような因子が、考慮されるべき因子でありうる。該薬剤（活性化物または阻害剤）に関する薬理学的に効果的な量の決定は、当業者が可能である。好ましくは、活性化物または阻害剤は、０．１〜５０％／薬理学的組成物の重量、より好ましくは１０〜３０％の濃度で存在する。
【０１２６】
本発明による阻害剤、活性化物または薬物はまた、「小分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」である。小分子は、タンパク質、ペプチド抗体または核酸ではなく、５０００Ｄａ未満、好ましくは２０００Ｄａ未満、より好ましくは２０００Ｄａ未満、もっとも好ましくは５００Ｄａ未満の分子量を示す、分子である。かかる小分子は、ライブラリーから開始する、ハイスループット手順／スクリーニングアッセイにて同定しうる。かかる方法は、本技術分野で公知である。好適な小分子はまた、組み合わせ化学として公知の方法によって設計し、またはさらに改変可能である。
【０１２７】
本明細書によって提供され、（ａ）〜（ｆ）にて定義されたような配列の１つを持つ遺伝子／タンパク質を、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する新規の薬剤に関する、ハイ−スループットまたは他のスクリーンにて使用可能である。特に、かかるスクリーンによって同定された、クロマチン分離の阻害剤を、増殖性疾患の治療のため、特に、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能が役割を果たす疾患の治療のための、医薬品として使用しうる。
【０１２８】
他の態様において、本発明は、増殖性疾患、または細胞分裂の間、異常なスピンドル形成または微小管機能に関連する疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のための、以上で定義したような配列を含む、単離核酸分子の利用、または、以上で定義したような配列を含む、少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合するリガンドの利用、に関する。
【０１２９】
好ましい実施形態において、診断は、以上で定義したような増殖性疾患に関する。
他の好ましい実施形態において、診断は、以上で定義したように、細胞分裂の間の、異常、欠損または陰性に影響されたスピンドル形成または微小管機能に関連する疾患に関する。細胞分裂の間の「異常（ａｂｎｏｒｍａｌ）」スピンドル形成または微小管機能の疾患には、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能が欠損するか、陰性に影響される、疾患が含まれる。
【０１３０】
増殖性疾患において、以上で同定した配列に対応する内因性遺伝子の発現が増加されうる。
【０１３１】
細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能が異常、欠損または陰性に影響された疾患において、対応する内因性遺伝子の発現は低くなりうる。さらに、対応する内因性遺伝子が変異され得、対応するタンパク質の活性が低くなるか、または機能しなくなる。
【０１３２】
以上で同定した核酸分子およびプローブの診断利用には、限定はしないが、特に、以上で特性化した核酸配列（特にｃＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む内因性核酸分子に対する定量的ハイブリッド形成による、生物学的プローブ（好ましくは、限定はしないが、組織試料、細胞抽出液、体液など）中の前記標的遺伝子の発現の定量的検出が含まれうる。
【０１３３】
内因性遺伝子およびそれらの対応するタンパク質の発現を、組織試料、体液、および組
織および細胞抽出液中で、ｉｎ  ｖｉｖｏにて解析可能である。発現解析を、ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成、（定量的ＲＴ−ＰＣＲを含む）ＰＣＲ、および、沈殿、受動的凝集、酵素免疫反応（ＥＬＩＳＡ）技術および放射免疫アッセイ技術を限定はしないが含む、種々の血液学的または免疫学的アッセイのような、本技術分野で公知の任意の方法によって実施可能である。
【０１３４】
診断利用にはまた、以上で同定した核酸配列に対応する内因性遺伝子における変異の検出も含まれる。
【０１３５】
好適な核酸プローブは、標準の手順にしたがったＤＮＡ合成の利用によって、または、好ましくは長い配列に関して、選択した鋳型配列および選択したプライマーでのＰＣＲ技術の利用によって合成しうる。このプローブは、放射性または非放射性標識を含む、当業者に公知の、任意の好適な標識で標識化しうる。典型的な放射性標識には、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどが含まれる。放射性同位体で標識したプローブを、ＤＮａｓｅおよびＤＮＡポリメラーゼを用いる、従来のニック翻訳反応によってＤＮＡ鋳型より構築可能である。非放射性標識には、たとえば、ビオチンまたはチロキシンのようなリガンド、または種々の発光または蛍光化合物が含まれる。このプローブはまた、たとえば、一方の末端において同位体標識で、そして他の末端においてビオチン標識で、異なる型の標識で両方の末端で標識化しうる。標識化プローブおよび試料を次に、ハイブリッド形成緩衝溶液中で混合し、アニーリングが起こるまで、適切な温度に維持可能である。かかる核酸プローブをまた、診断目的以外、たとえば、さらなるホモログまたはオーソログの同定のためにも利用しうる。
【０１３６】
前記ポリペプチドに対して特異的に結合する「リガンド（ｌｉｇａｎｄｓ）」が本技術分野で公知である。かかるリガンドには、たとえば細胞内結合パートナー、抗体、分子親和性体のようなタンパク質またはポリペプチド、および小分子が含まれる。特異的に結合するリガンドは、たとえば、酵母２−ハイブリッドスクリーンおよびアフィニティークロマトグラフィーによって、本技術分野で公知の標準スクリーニングアッセイによって同定可能である（以下も参照のこと）。特異的に結合するリガンドは、それが相互作用する分子を阻害すること、または活性化することのような、他の機能を達成する必要がない。
【０１３７】
好ましい実施形態において、リガンドは、以上で定義したような配列を含む、少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する抗体である。
【０１３８】
本発明による「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」は、同定されるべきポリペプチド（標的ポリペプチド）が、試料中に存在する他の任意のポリペプチドよりもより高い親和性で結合することを意味する。少なくとも３倍高い親和性、より好ましくは少なくとも１０倍高い親和性、もっとも好ましくは少なくとも５０倍高い親和性が好ましい。非特異的結合（「交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）」）は、標的ポリペプチドが、たとえば、ウエスタンブロット上でその大きさによって、明確に同定可能である場合に許容されうる。
【０１３９】
好ましくは、特異的に結合するリガンドを、たとえば、蛍光標識、酵素、分子タグ（たとえばＧＳＴ、ｍｙｃ−タグなど）、放射性同位体、または標識化した基質、たとえば、標識化した第２抗体で標識化可能である。ＭＲＩ（磁気共鳴イメージング）に関して、リガンドを、ガドリニウム、超常磁性酸化鉄またはランタニド類によって、キレートしうる。ＰＲＴ（ポジトロン放射トモグラフィー）またはＳＰＥＣＴ（単一光子放出コンピュータトモグラフィー）に関して、一般的に利用される同位体には、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ、１３Ｎ、８６Ｙ、９０Ｙおよび１６Ｃｏが含まれる。
【０１４０】
他の態様において、本発明は、増殖性疾患または異常な細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に関連した疾患のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断のために、以上で定義したような単離核酸分子、および／または以上で定義したような、少なくとも１つのポリペプチドに対して指向するリガンドを含む、診断キットに関する。
【０１４１】
診断キットには、標識化または非標識の、以上で同定した遺伝子または遺伝子産物の、好適な単離核酸またはアミノ酸配列、および／またはそれに対する結合リガンド（たとえば抗体）、および適切であり本技術分野で公知である助剤が含まれる。アッセイは、液体相アッセイならびに（すなわち、支持体上に固定化した１つ以上の試薬での）固体相アッセイでありうる。診断キットにはまた、診断すべき疾患を示唆する他の分子に対して指向するリガンドも含まれうる。
【０１４２】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する薬物の同定および特性化のための、スクリーニングアッセイでの、以上で定義したような、単離核酸分子または核酸発現ベクターの利用、または、以上で同定したような配列を含む少なくとも１つのポリペプチドに対して指向する抗体の利用に関する。
【０１４３】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害または活性化する、相互作用薬物のためのスクリーニングアッセイにおける、以上で定義したような配列を持つ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の利用に関する。かかる相互作用薬物はまた、上述したように、診断のためのリガンドとして使用しうる。
【０１４４】
本発明にしたがった「スクリーニングアッセイ（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｓｓａｙ）」は、基質のライブラリーをスクリーニングすることによって、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する、基質、特に可能性ある薬物を同定可能にするアッセイに関する。本発明にしたがった「スクリーニングアッセイ」はまた、以上で定義した核酸、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体に結合可能な基質に関して、ライブラリーをスクリーンするアッセイにも関する。好適なライブラリーには、たとえば、小分子、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体が含まれうる。
【０１４５】
本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する、または前記核酸、ポリペプチド、ペプチドまたは抗体に結合する基質の同定のためのアッセイ、または特性化のためのアッセイに関する。特に、本発明は、薬物に対するスクリーニングアッセイに関する。かかる薬物は、非特異的化合物のライブラリー、ならびにすでに他の疾患の治療における公知の薬物のライブラリーから同定および特性化しうる。かかる公知の薬物に対して、また、可能性のある副作用および治療的適用用量が公知である。
【０１４６】
好適な薬物には、「相互作用薬物（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ）」、すなわち、以上で同定したポリペプチドまたは核酸に結合する薬物が含まれる。かかる相互作用薬物は、結合する分子を阻害、または活性化しうる。相互作用基質の例は、以上で同定した配列を含むペプチド核酸、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アプトマー、抗体および分子親和性体（キャッチマブス（ＣａｔｃｈＭａｂｓ）、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）である。かかる薬物は、増殖性疾患の治療の、医薬品の製造および方法のための利用を含む、本発明の任意の態様にしたがって利用しうる。かかる相互作用薬物はまた、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に関連する疾患の診断のために、標識化も可能であり、またリガンドとして利用可能である。
【０１４７】
好適なスクリーニングアッセイが、本技術分野で公知である。たとえば、本発明の好ま
しい実施形態において、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する、阻害剤または活性化物の同定および特性化のためのスクリーニング方法には、以下の段階が含まれる。
ａ）以上で定義したような核酸分子または核酸発現ベクターの、宿主細胞または宿主器官への形質導入、
ｂ）阻害または活性化分子に対する少なくとも１つの候補が存在する、または存在しないかいずれかで、段階（ａ）の核酸によってコードされるか、または対応する、ポリペプチドまたはＲＮＡの過剰発現を許容する条件下での、段階ａ）にて得た、宿主細胞または宿主器官の培養、
ｃ）前記培養細胞または器官における細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の解析、およびそれによる、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害剤または活性化の同定。
【０１４８】
本明細書で使用するところの語句「発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）」は、ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ発現ベクターのみに関連するだけでなく、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現しているベクターにも関連する。
【０１４９】
発現ベクターの宿主細胞または宿主器官への伝達は、限定はしないが、リン酸カルシウム形質導入、リポフェクション、マイクロインジェクションを含む、すべての公知の形質導入またはトランスフェクション技術によって実施しうる。宿主細胞／宿主器官は、損傷した細胞分裂の、好ましくは、損傷したクロマチン分離の検出を可能にする、すべての好適な細胞または器官でありうる。特に好ましい宿主器官は、その透明な体によって、スピンドル形成または微小管機能を含む、細胞分裂間の不全の簡単な検出が可能になるので、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓである。脊椎動物細胞、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトの細胞、特にヒト細胞株もまた好ましい宿主細胞である。発現ベクターは、以上で定義したような核酸配列の発現を可能にする、好適である任意の公知のベクターでありうる。好ましい発現ベクターは、以上で定義したような、ＲＮＡ、ペプチドまたはポリペプチドの過剰発現を許容するプロモーターを含む、発現カセットを含む。
【０１５０】
発現ベクターの宿主細胞／宿主器官への伝達の後、宿主細胞または宿主器官の一部分を、少なくとも１つの阻害剤または活性化剤分子の存在下、発現、好ましくは、以上で定義したようなＲＮＡ、ペプチドまたはポリペプチドの過剰発現を可能にする、培養条件下で、培養する。トランスフェクトした宿主細胞の他の部分を、同様の培養条件下、ただし、阻害剤または活性化剤分子のない状態で培養する。
【０１５１】
最後に、適切なインキュベーション時間／培養期間の後、少なくとも１つの阻害剤または活性化剤分子に対する候補の存在下、または存在しない条件で培養した、宿主細胞または宿主器官に関する、増殖状態および／または細胞分裂を検出するか、または好ましくは定量化する。この検出または定量化段階は、特に宿主器官がＣ．ｅｌｅｇａｎｓまたは、経時的蛍光またはＤＩＣ顕微鏡によって解析可能である他のほとんど透明な器官である場合、好ましくは経時的蛍光またはＤＩＣ顕微鏡によって実施する。検出／定量化段階はまた、増殖状態または細胞分裂の程度を検出するのに好適である、本技術分野で公知の他の任意の技術、好ましくは全ての種類の顕微鏡技術によって実施しうる。
【０１５２】
他の好ましい実施形態において、宿主基質のライブラリーからの、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能を阻害する、または活性化する相互作用分子の同定および特性化のためのスクリーニング方法は、以下の段階を含む。
ａ）宿主細胞内で、以上で定義したような核酸分子配列によってコードされたポリペプチドを、組み換え体的に発現させること、
ｂ）前記組み換え体的に発現した段階（ａ）のポリペプチドを、単離し、任意に精製する
こと、
ｃ）試験基質を任意に標識化すること、および／または前記組み換え体的に発現したポリペプチドを標識化すること、
ｄ）前記組み換え体的に発現したポリペプチドを、固体相に固定化すること、
ｅ）前記固定化ポリペプチドと、少なくとも１つの試験基質を接触させること、
ｆ）任意に一回以上の洗浄段階、
ｇ）固体相にて固定化したポリペプチドに対する、少なくとも１つの試験基質の結合を検出すること、および
ｈ）細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害または活性化のための、機能アッセイを実施すること。
【０１５３】
段階ａ）には、好適な発現系からの、特に、細胞を含まない翻訳、細菌発現、または昆虫細胞中のバキュロウイルスに基づく発現からの、以上で同定したポリペプチドまたはその誘導体の組み換え発現が含まれる。
【０１５４】
段階ｂ）には、当業者が知っている適切な生化学的技術で、前記組み換え発現したポリペプチドの単離と、任意にそれに続く精製が含まれる。
【０１５５】
あるいは、これらのスクリーニングアッセイにはまた、融合タンパク質として、または変性タンパク質として、特に、「タグ」−配列を含むタンパク質として、前記ポリペプチドの発現を含む、以上で同定したポリペプチドの誘導体の発現も含まれうる。これらの「タグ」−配列は、前記標的遺伝子のコード配列のＮ−またはＣ−末端いずれかに、「インフレーム」にライゲートしている、短い核酸配列からなる。組み換え体的に発現した遺伝子を標識化するために一般的に使用されているタグは、単にヒスチジンからなる、特に６以上のヒスチジンからなる、ホモポリペプチドをコードしている、ポリ−ヒスチジン−タグ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）およびＧＦＰである。この文脈において、語句「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、単に、配列ＩＤ番号１〜５９の核酸配列を持つポリペプチド、その天然に存在するホモログ、好ましくはオーソログ、より好ましくはヒトオーソログだけを含むのではなく、これらのポリペプチドの誘導体、特にタグ−配列を含む融合タンパク質またはポリペプチドも含む。
【０１５６】
これらのポリペプチド、特に、適切なタグ配列によって標識化されたもの（たとえばＨｉｓタグまたはＧＳＴタグ）を、標準のアフィニティークロマトグラフィープロトコールによって、特に、両方とも市販されている抗Ｈｉｓタグ抗体に、または抗ＧＳＴ抗体に連結したクロマトグラフィー樹脂を用いることによって精製しうる。あるいは、Ｈｉｓタグ化分子を、Ｎｉイオンを用いる、金属キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製しうる。「標識特異的」抗体の利用の代替として、精製にはまた、前記ポリペプチドに対する抗体の利用も含まれうる。以上で記述したような、組み換え発現した標的遺伝子の精製段階（段階２）を含むスクリーニングアッセイは、本発明の本態様の好ましい実施形態である。
【０１５７】
任意に、段階ｃ）にて、相互作用に関して試験した化合物を、放射性同位体の組み込みによって、または発光または蛍光化合物との反応によって、標識化しうる。あるいは、またはさらに、組み換え発現したポリペプチドを標識化しうる。
【０１５８】
段階ｄ）において、組み換え発現したポリペプチドを、固相、特に（限定はしないが）クロマトグラフィー樹脂に固定化する。固相への結合は、共有結合の産出によって好ましく確立される。
【０１５９】
段階ｅ）にて、前記ポリペプチドまたはその複合体（特に薬物ライブラリー）の、可能性のある相互作用パートナーでありうる、候補化学物質を、固定化ポリペプチドとの接触に適用する。
【０１６０】
任意に、段階ｆ）にて、１つ以上の洗浄段階を実施して良い。結果として、固定化ポリペプチドと強力に相互作用する化合物のみが、固体（固定化）相に結合したまま残る。
【０１６１】
段階ｇ）において、ポリペプチドと、特異的結合間の相互作用を、特に、バックグラウンドレベル以上で、固相に結合したままの標識の量をモニタすることによって、検出する。
【０１６２】
かかる相互作用分子を、以上で記述したような診断の目的のために、機能的特性化せずに利用しうる。
【０１６３】
段階ｈ）にて、相互作用分子をさらに、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害または活性化のために解析する。かかる解析または機能アッセイは、本技術分野で公知の任意のアッセイ系にしたがって実施可能である。好適なアッセイには、宿主細胞または宿主器官の、相互作用分子の存在下（試験条件）または存在しない状態（対照条件）での培養、および試験および対照条件下での細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の比較、が含まれる。
【０１６４】
他の態様において、本発明は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能の阻害剤または活性化剤が、以上で記述した任意のスクリーニング方法にしたがって同定され、適切な量で合成され、薬理学的組成物内に処方される、薬理学的組成物の調製方法に関する。
【０１６５】
阻害剤または活性化剤分子を合成するために好適な方法は、本技術分野で公知である。たとえば、ペプチドまたはポリペプチドを、組み換え体発現によって合成可能であり（また以下を参照のこと）、抗体を、ハイブリドーマ細胞株または免疫化動物より得ることが可能である。小分子を、任意の公知の有機合成方法にしたがって合成可能である。
【０１６６】
適切な量は、薬理学的に効果的な量に関連する。
同様に、前記阻害剤または活性化剤は、以上で記述した任意のスクリーニング方法によって提供され、薬理学的組成物内に処方しうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６７】
以下の実施例は、これらに限定することなしに、本発明を例示している。
［実施例１］
他の種での、機能的オーソログを同定するためのプロトコール
オーソログ遺伝子を同定するために、以下の手順を利用した。同定した相同Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質が、１０−５以下のｅ値にて、ＢＬＡＳＴヒットによって（再）同定された場合、同定したホモログをオーソログとして定義した。ＢＬＡＳＴ検索を、デフォルトパラメータおよび低複雑性フィルターオンにて実施した。相同遺伝子の同定のための他のパラメータは、配列同一性の割合であり得る。１００残基にわたり、３０％の配列同一性が、相同遺伝子を定義する。ＢＬＡＳＴが完了した後、多数の配列アライメントを、適切なソフトウェア（たとえば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ）を用いて実施し、隣接連結系統発生ツリーを作製する。当業者は、系統発生ツリーから、ヒトオーソログを同定可能である。特に、単一の種分化事象において分離された、またはツリー上で非常に関連しているヒト配列が、オーソログでありうる。
【０１６８】
［実施例２］
ＲＮＡｉ実験のためのｄｓＲＮＡ分子の作製
第１に、オリゴヌクレオチドプライマー対配列を、標準のＰＣＲ技術を用いて、対照のコード領域の遺伝子の部分を増幅するために選択した。プライマー対は、コード配列の少なくとも５００塩基を含むＰＣＲ産物、または５００残基より小さな遺伝子のための最大コード塩基を含むＰＣＲ産物を産出するために選択した。両方のＤＮＡ鎖から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写反応のための鋳型として、ＰＣＲ産物の続く利用を許容するために、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ」を、フォワードプライマーの５’末端に加え、Ｔ３ポリメラーゼプロモーター配列「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ」を、リバースプライマーの５’末端に加えた。オリゴヌクレオチドプライマーの合成は、商業的供給業者（シグマゲノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）、ＵＫまたはＭＷＧ−バイオテック（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって完了した。
【０１６９】
ＰＣＲ反応を、０．８μＭプライマーと、およそ１．０μｇの野生型（Ｎ２株）ゲノムＤＮＡ鋳型を用いて、Ｔａｑポリメラーゼで、５０μｌの容量中で実施した。ＰＣＲ産物をＥｔＯＨ沈殿し、７０％  ＥｔＯＨで洗浄し、７．０μｌ  ＴＥ中で再懸濁した。１．０μｌのＰＣＲ反応液を、Ｔ３およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、５μｌの転写反応液のために、各２つの新鮮なチューブ内にピペットした。別々のＴ３およびＴ７転写反応を、製造業者の取扱説明書（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔキット）にしたがって実施し、それぞれを、ＲＮａｓｅを含まない水で５０μｌまで希釈し、混合した。
【０１７０】
混合したＲＮＡを、製造業者の取扱説明書（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））にしたがって、ＲＮｅａｓｙキットを用いて精製し、総量１３０μｌのＲＮａｓｅを含まないＨ２Ｏ中に希釈した。５０μｌのこの液体を、１０μｌの６×注射緩衝液（４０ｍＭ  ＫＰＯ４  ｐＨ７．５、６ｍＭクエン酸カリウム、ｐＨ  ７．５、４％  ＰＥＧ６０００）と混合した。ＲＮＡを、６８℃にて１０分間、３７℃にて３０分間加熱することによってアニールした。最終ｄｓＲＮＡの濃度を、０．１〜０．３μｇ／μｌの範囲であると測定した。Ｔ３およびＴ７転写反応、ならびにｄｓＲＮＡ種のＰＣＲの産物を、１％アガロースゲル上に流し、品質制御目的のために試験した。２本鎖化の成功を、非還元ゲルに流した時に、１本鎖ＲＮＡに関する、ゲル移動度のシフトをスコア化することによって査定した。
【０１７１】
［実施例３］
ｄｓＲＮＡの注入および表現型アッセイ
ｄｓＲＮＡを、野生型（Ｎ２株）若生体雌雄同体の両方の生殖腺の合胞体部分に相互に注射し、この動物を２０℃にて２４時間インキュベートした。ついで胚を注射した動物から切り離しを、細胞分裂工程中の可能性のある欠損に関して、すでに記述されたように（Ｇｏｎｃｚｙ  ｅｔ  ａｌ．，「変異解析による、１つの細胞分裂期  シノラブディス・エレガンス胚における細胞運列工程の解剖（Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｎｅ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｅｍｂｒｙｏ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．）」Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４４，９２７−９４６（１９９９））、５秒ごとに１イメージを捕獲し、経時的微分干渉コントラストビデオ顕微鏡によって解析した。各実験に関して、少なくとも３つの異なる注射した虫を、受精後すぐに、４細胞分裂期まで、この様式で撮影した。２つのさらなる注射した虫からの胚を、より短い期間、それぞれ２細胞および４細胞分裂期をカバーして、記録し、これによって、各実験にて、少なくとも５匹の注射した虫に関して記録した。
【０１７２】
いくつかの場合、注射した動物の解剖の間の、構造の統合性の欠如によって証明された
ように、胚が、浸透性変化に対する急性の感受性を示した。この制限を克服するために、注射した動物を解剖せずに、かわりに、０．１％トリカインおよび０．０１％テトラミソールを含むＭ９培地中、１０分間麻酔し、アガロースパッド上、そのままマウントし、子宮内のＦ１胚形成を観察した（Ｋｉｒｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｉｏｌ．１４２，２０３−２１５（１９９０））。体壁を介して見ることによる光学分解能は、解剖した胚を観察することによって実施したものと等しくはなく、これらの場合は、実施される表現型解析は限定された。
【０１７３】
３匹の注射した動物をまた、ｄｓＲＮＡの注射の２４時間後、３つの新鮮なプレートに移し、２０℃にて維持した。２日後、プレートを、Ｆ１幼虫（Ｌ２’ｓ−Ｌ４’ｓ）の存在、ならびにそれらの発育ステージに関して、立体顕微鏡（２０〜４０ｘ  総倍率）で確認した。この２日後、プレートを、Ｆ１生体、ならびにそれらの総体形態、およびＦ２子孫の存在に関して、再び調査した。
【０１７４】
［実施例４］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ１３Ｆ１０．２の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｃ１３Ｆ１０．２遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴ」および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＴＴＣＡＴＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴ」である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【０１７５】
対照虫には、注射をしないか、無関係のｄｓＲＮＡを注射した。無関係なｄｓＲＮＡは、実験的なｄｓＲＮＡと同様のヌクレオチド組成物からなるが、ヌクレオチドは無作為な順番であった。かかる対照虫のＦ１子孫において、最初の２回の胚細胞分裂の細胞事象は、ＤＩＣ顕微鏡によって観察されるように、非常に制限された多様性を示すことが発見された。表現型偏差の可能性に関して試験し、スコア化したすべての工程を、図１３にて列記し、例示する。簡単に記すと、胚の前−後極性をまず、卵へ入った直後、皮質における、雄性前核の部分によって決定する。これは、胚の縦軸にそって、雄性前核まで細胞質の中央部分に通じる卵黄顆粒の明確に協調した流れおよびそれと同時に一連の皮質波、または胚後部へ向かって進む波を伴う。その後すぐに、雄性および雌性前核が、非常にパターン化された移動を受けて、結果として、胚の後部半分内で集合し、その後、胚の縦軸にそったさらなる有糸分裂スピンドルを設定するために、前核対および関連する中心対の集中および回転がおきる。前核エンベロープの同期崩壊後、明らかに二極性有糸分裂スピンドルが、はじめは短いが、ついで延長される。これらの運動は、後部スピンドル極のわずかな後部移動によって起こり、一方前核スピンドル極はほぼ一定のままである。ついでこれによって、後期および終期の間の、スピンドルの非対称性配置となり、それによって、細胞質分裂溝の非対称性配置となり、等しくない大きさの娘細胞が産出される。より小さな後部Ｐ１割球およびより大きな前部ＡＢ割球。ＡＢ核がついで、ＡＢ細胞の中心に直接移動する一方で、その二重中心対の１つが導かれる、前部Ｐ１皮質への再移動の間に、明白な９０°回転が起こる前に、Ｐ１核は典型的には、さらに細胞の後部へ移動する。これは、Ｐ１割球がついで、ＡＢ割球のそれと垂直に、胚の縦軸に沿って分割することを保証する。これらの２つの分割は、Ｐ１が、ＡＢより２〜３分間遅れて、非同期的に起こる。
【０１７６】
ｄｓＲＮＡを注射した虫のＦ１胚において、以下の非常に再現可能な表現型が観察された（図１）。（矢印の先によって示唆された）有糸分裂スピンドルは、伸長の間にドリフトし、曲がり、このことは、微小管−皮質相互作用が弱くなったことを示唆している。表現型は、胚性致死である。
【０１７７】
全ての観察された表現型は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、Ｃ１３Ｆ１０．２遺伝子機能の必要性を示唆している。この機能は、後生動物にわたって、細胞分裂に必須であるので、この遺伝子、およびその任意のホモログおよび誘導体が、抗−増殖性試薬を含む、広範囲の治療の発展における利用のための、優れたツールであることを示している。Ｃ１３Ｆ１０．２遺伝子配列の解析によって、現在まで、これらに帰する機能を持たない、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７６９７４）およびハエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ４９９１１）において、明確なオーソログが明らかになる。特に、オーソログを、細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能に関連づける情報は存在していない。タンパク質レベルでの、非常に高い配列保存に基づいて、これらの遺伝子が、ヒトおよびハエにおいて、細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能において、等価の機能をもつタンパク質を非常にコードする傾向にあると結論づけることができる。
【０１７８】
［実施例５］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ２５Ａ１．９の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｃ２５Ａ１．９遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＣＴＴＡＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＴＴＴＣ」および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＴＡＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴ」である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【０１７９】
ｄｓＲＮＡを注射した虫のＦ１胚において、以下の高度に再現可能な表現型が観察された（図３）。前核がわずかに後方に残り、これによって不完全な前核中心化が導かれる（図３Ａ、Ｂ）。有糸分裂スピンドルは、見ることが難しく、スピンドル位置は、ロッキング相を欠く（図３Ｃ〜Ｅ）。いくつかの場合、これによって、クロマチン分離欠損となりうる（図３Ｆ、矢頭は、ＡＢブラストーマにおけるさらなるカリオメアを示唆している）。表現型は胚致死性である。
【０１８０】
全ての観察された表現型は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、Ｃ２５Ａ１．９遺伝子機能の必要性を示唆している。この機能は、後生動物にわたって、細胞分裂に必須であるので、この遺伝子、およびその任意のホモログおよび誘導体が、抗−増殖性試薬を含む、広範囲の治療の発展における利用のための、優れたツールであることを示している。Ｃ２５Ａ１．９遺伝子配列の解析によって、現在まで、これらに帰する機能を持たない、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０６０３８７）において、明確なオーソログが明らかになる。特に、オーソログを、細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能に関連づける情報は存在していない。タンパク質レベルでの、非常に高い配列保存に基づいて、これらの遺伝子が、ヒトおよびハエにおいて、細胞分裂の間の、スピンドル形成または微小管機能において、等価の機能をもつタンパク質を非常にコードする傾向にあると結論づけることができる。
【０１８１】
［実施例６］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ５４Ｂ３．３の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｆ５４Ｂ３．３遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＣＣＡ」および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴ」である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【０１８２】
ｄｓＲＮＡを注射した虫のＦ１胚において、以下の高度に再現可能な表現型が観察された（図５）。前核は中心に位置せず、短いスピンドルが、背−腹部軸にそって組まれる（図５Ａ）。これによって、異常な開裂部位特性と、３つの部位で溝が出来る（図５Ｂ〜Ｄ、白色矢印）。細胞質分裂に失敗すると、再成核が、互いに近接して並んで位置する（図５Ｆ〜Ｈ、黒色矢印）。さらなるカリオメアが、後部で形成される（図５Ｇ〜Ｈ、白色矢印）。
【０１８３】
全ての観察された表現型は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、Ｆ５４Ｂ３．３遺伝子機能の必要性を示唆している。この機能は、後生動物にわたって、細胞分裂に必須であるので、この遺伝子、およびその任意のホモログおよび誘導体が、抗−増殖性試薬を含む、広範囲の治療の発展における利用のための、優れたツールであることを示している。Ｆ５４Ｂ３．３遺伝子配列の解析によって、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０６０６５８）およびハエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５５２８９）で、明確なオーソログが明らかになる。配列解析に基づいて、ハエタンパク質は、ＡＴＰａｓｅ関連であると記述されてきた。さらに、ホモログが、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿１０９３９９）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ４６４６２またはＮＰ＿４４６３１６）、およびサッカロマイセス  セルビシエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１５３４９）にて同定された。しかしながら、遺伝子を、細胞間のスピンドル形成または微小管機能に連結する情報は存在していない。タンパク質レベルでの、非常に高い配列保存に基づいて、これらの遺伝子、特にオーソログが、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能において、等価の機能をもつタンパク質を非常にコードする傾向にあると結論づけることができる。
【０１８４】
［実施例７］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ０８Ｂ６．２の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｆ０８Ｂ６．２遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧ」および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＴＧ」である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性
前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【０１８５】
ｄｓＲＮＡを注射した虫のＦ１胚において、以下の高度に再現可能な表現型が観察された（図７）。前核中心化および回転は不正確である。有糸分裂スピンドルのロッキング相は、正常よりも協調されていない（図７Ａ〜Ｄ、矢印）。Ｐ１核の回転は痙攣的様である（図７Ｅ〜Ｆ、矢印）。表現型は胚性致死である。
【０１８６】
全ての観察された表現型は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、Ｆ０８Ｂ６．２遺伝子機能の必要性を示唆している。この機能は、後生動物にわたって、細胞分裂に必須であるので、この遺伝子、およびその任意のホモログおよび誘導体が、抗−増殖性試薬を含む、広範囲の治療の発展における利用において優れたツールであることを示している。Ｆ０８Ｂ６．２遺伝子配列の解析によって、グアニンヌクレオチド結合タンパク質として記述されている、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５７６２５）およびハエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５２７６１）で、明確なオーソログが明らかになる。Ｆ０８Ｂ６．２のホモログが、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６３１９２４）で同定された。この遺伝子類を、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に関連づける情報は存在していない。タンパク質レベルでの、非常に高い配列保存に基づいて、これらの遺伝子、特にオーソログが、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能において等価の機能をもつタンパク質を非常にコードする傾向にあると結論づけることができる。
【０１８７】
［実施例８］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＣＤ４．４の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、ＣＤ４．４遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＣＡＡ」および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＧＡＡ」である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【０１８８】
ｄｓＲＮＡを注射した虫のＦ１胚において、以下の高度に再現可能な表現型が観察された（図９）。卵黄顆粒を欠く領域が存在する。小球形構造が、細胞質中で見られる（図９Ａ〜Ｆ、矢印）。この構造は、微小管に結合し、マイナス末端に遊走するようにみられる。表現型は胚性致死である。
【０１８９】
全ての観察された表現型は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、ＣＤ４．４遺伝子機能の必要性を示唆している。この機能は、後生動物にわたって、細胞分裂に必須であるので、この遺伝子、およびその任意のホモログおよび誘導体が、抗−増殖性試薬を含む、広範囲の治療の発展における利用のための、優れたツールであることを示している。ＣＤ４．４遺伝子配列の解析によって、現在まで、これらに帰する機能を持たない、ヒト（２つのヒトオーソログ類、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７８９４３およびＣＡＤ３８９３６）およびハエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿ＡＡＦ５２０６０）で、明確なオーソログが明らかになる。特に、オーソログを、細胞分裂間のスピンドル形成または微小管機能に関連づける情報は存在していない。タンパク質レベルでの、非常に高い配列保存に基づいて、これらの遺伝子、特にオーソログが、それぞれヒトおよびハ
エにおいて、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能において、等価の機能をもつタンパク質を非常にコードする傾向にあると結論づけることができる。
【０１９０】
［実施例９］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ５４６．１の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、ＺＫ５４６．１遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴＧＧＧＴ」および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴＧＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴ」である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、４細胞分裂期まで、〜３０分後、完了している。
【０１９１】
ｄｓＲＮＡを注射した虫のＦ１胚において、以下の高度に再現可能な表現型が観察された（図１１）。中心体が、雄性前核より分離し（図１１Ａ）、雌性前核に向かって遊走する（図１１Ｂ〜Ｃ、矢印）。スピンドルの、雄性クロモソーム物質への統合が失敗すると、結果として、Ｐ１細胞にて、さらなるカリオメアの形成となる（図１１Ｄ〜Ｆ、矢印）。ＡＢスピンドルがまず、クロマチンより分離し、結果として、分離の欠損となる（図１１Ｇ〜Ｈ、矢印）。表現型は胚性致死である。
【０１９２】
全ての観察された表現型は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、ＺＫ５４６．１遺伝子機能の必要性を示唆している。この機能は、後生動物にわたって、細胞分裂に必須であるので、この遺伝子、およびその任意のホモログおよび誘導体が、抗−増殖性試薬を含む、広範囲の治療の発展における利用のための、優れたツールであることを示している。ＺＫ５４６．１遺伝子配列の解析によって、ヒトにおいて明確なオーソログ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０５６９７２）、およびマウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿１０９４７４）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ７４９５０）、ハエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ５３６０５）、およびサッカロマイセス  セルビシエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１０２２５）でホモログが明らかになる。齧歯類ホモログ（Ｈｏｏｋ１）が、精子細胞内での、微小管構造の配置において機能する。しかしながら、遺伝子を、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能に連結する情報は存在しない。タンパク質レベルでの、非常に高い配列保存に基づいて、これらの遺伝子、特にオーソログが、そのそれぞれの種で、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能において、等価の機能をもつタンパク質を非常にコードする傾向にあると結論づけることができる。
【０１９３】
［実施例１０］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ５６Ｃ１０．３の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｃ５６Ｃ１０．３遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧ」および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＧＣＴ」である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理
の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、４細胞分裂期まで、〜３０分後、完了している。
【０１９４】
ｄｓＲＮＡを注射した虫のＦ１胚において、以下の高度に再現可能な表現型が観察された（図１３）。星状微小管に結合しているようにみえるか、または微小管バンドルに似ている、細胞室内で見える構造が存在する。矢印は、星状微小管に沿った無軌道な構造を示唆している。
【０１９５】
全ての観察された表現型は、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能における、Ｃ５６Ｃ１０．３遺伝子機能の必要性を示唆している。この機能は、後生動物にわたって、細胞分裂に必須であるので、この遺伝子、およびその任意のホモログおよび誘導体が、抗−増殖性試薬を含む、広範囲の治療の発展における利用のための、優れたツールであることを示している。Ｃ５６Ｃ１０．３遺伝子配列の解析によって、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ＿０５９２８２．３）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０８３６３８．１）およびハエ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿６１０４６２）にて明確なオーソログ、および酵母（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１３１２５）でホモログが明らかになる。これらのタンパク質の機能は未知である。とくに、遺伝子を、細胞分裂間のスピンドル形成または微小管機能に関連づける情報は存在していない。タンパク質レベルでの、非常に高い配列保存に基づいて、これらの遺伝子、特にオーソログが、そのそれぞれの種で、細胞分裂の間のスピンドル形成または微小管機能において、等価の機能をもつタンパク質を非常にコードする傾向にあると結論づけることができる。
【０１９６】
［実施例１１］
ヒト細胞におけるＲＮＡｉ処理の効果
ｓｉＲＮＡの設計および合成
ヒト細胞における全ての実験において、１９ｂｐの相補配列コアと３’末端での２塩基のオーバーハングからなる、長さにして２１塩基の、短い２本鎖干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）を、Ｃｅｎｉｘによって設計し、アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡによって化学的に合成した。
【０１９７】
以下のｓｉＲＮＡ配列を利用した。
【０１９８】
【表２】
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【０１９９】
トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、リポフェクションに基づくトランスフェクションプロトコールを用いて、１００ｎＭの最終濃度で、ｓｉＲＮＡで処理した。
【０２００】
トランスフェクションの２４時間前に、ＨｅＬａ細胞を、６，０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート中にまいた。
【０２０１】
トランスフェクション当日に、トランスフェクション混合液を以下のように調製した。１０μＭのｓｉＲＮＡストック１μｌを、１６μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．））で希釈し、０．４μｌのＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を、２．４μｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した。複合体形成のために、両方の溶液をゆっくりと混合し、室温で２０分間インキュベートした。培養培地を細胞から取り除き、８０μｌの新鮮な培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン）を加え、続いて、２０μｌのトランスフェクション混合液を加えた。細胞を３７℃にて４時間インキュベートし、３０％ウシ胎児血清を含む５０μｌの新鮮な培地を加え、つづいて、４８〜７２時間インキュベートした。
【０２０２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による、サイレンシングレベルの検出
トランスフェクションの４８時間後、全ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｓｏｒｂキット（インビテックＧｍｂＨ（Ｉｎｖｉｔｅｋ  ＧｍｎＨ）、Ｂｅｒｌｉｎ）を用いて、ＲＮＡｉ処理し
た細胞より抽出し、ｃＤＮＡを、ＡＢＩ  ＴａｑＭａｎ逆転写試薬（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＵＳＡ）で産出した。どちらにおいても、製造業者の取扱説明書に従った。定量的リアルタイムＰＣＲを、以下のプロトコールを用いて実施した。５．５μｌの２×ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  ＰＣＲミックス（アプライド  バイオシステムズ）を、３μｌの試料ｃＤＮＡと、２．５μｌの遺伝子特異的ＰＣＲプライマーの２μＭ溶液と混合し、続いて、ＡＢＩ−７９００−ＨＴリアル−タイムＰＣＲ機械中で、５０℃にて２分間−９５℃にて１０分間−４５サイクル（９５℃  １５秒間−６０℃  １分間）−９５℃で１５秒間−６０℃で１５秒間−９５℃で１５秒間にて、インキュベートした。遺伝子特異的反応に加えて、第２の、参照反応を核ｃＤＮＡ試料に関して、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対するプライマーを用いて実施した。異なる遺伝子特異的試料からの増幅シグナルを、これらのそれぞれの試料に対して、１８Ｓ  ｒＲＮＡにおける参照値を用いて正常化し、対照（アンビオン社からのスクランブルｓｉＲＮＡ）処理細胞からの試料と比較した。
【０２０３】
増殖アッセイ
ＲＮＡｉ処理後の生細胞の数を定量するために、ＡＴＰレベルを、ＡＴＰｌｉｔｅアッセイ（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））を用いて、トランスフェクション７２時間後に測定した。細胞を抽出し、製造業者の取扱説明書にしたがって処理した。ルミネセンス読み取りを、Ｖｉｃｔｏｒ  ２多重標識リーダー（パーキンエルマー）上で実施した。グラフ表示の目的のために、未処理細胞の増殖を１００と設定した。
【０２０４】
アポトーシスアッセイ
ＲＮＡｉ処理細胞におけるプログラムされた細胞死のレベルを、製造業者の取扱説明書にしたがって、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）による、Ｃａｓｐａｓｅ  ３／７特異的蛍光分析アッセイＡｐｏＯｎｅを用いて、トランスフェクション７２時間後に決定した。読み取りを、Ｖｉｃｔｏｒ  ２多重標識リーダー（パーキンエルマー）上で実施した。グラフ表示の目的のために、未処理細胞のアポトーシス率を１００と設定した。
【０２０５】
有糸分裂指数（ＭＩ）
ヒストンＨ３のセリン１０におけるリン酸化が、有糸分裂の顕著な特徴と考えられ、早前期に現れ、終期の間に消える。免疫蛍光顕微鏡を用いて、好適な蛍光標識化第二抗体によって検出した、リン−ヒストンＨ３抗体の結合の増加によって、有糸分裂細胞を明らかにすることが可能である。
【０２０６】
９６ウェル顕微鏡プレート中のＲＮＡｉ処理細胞を、以下のプロトコールを用いて染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、３０分間ＲＴにて、４％パラ−ホルムアルデヒドにて固定し、続いてＰＢＳで３回洗浄した。ついで１０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および２％ＢＳＡの存在下で、３０分間細胞を浸透し、ブロックした。懸濁液を取り除き、抗Ｐｈｏｓｐｈｏ  Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３（マウスモノクローナル抗体クローン６Ｇ３、セル  シグナリング  テクノロジーズ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を、ＲＴにて２時間、１：７５０の希釈にて加え、続いて、ＰＢＳで３回洗浄した。Ｐｈｏｓｐｈ  Ｈｉｓｔｏｎ  Ｈ３標識化核の検出のために、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５６８（モレキュラー  プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））に連結した、ヤギ抗マウス抗体（１：５００）を、すべての核の検出のために、０．５μｇ／ｍｌ  Ｄａｐｉ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール，ジヒドロクロライド）、ＦｌｕｏｒｏＰｕｒｅＴＭグレード、モレキュラー  プローブス）を含む溶液中に加えた。ＲＴにて２時間のインキュベーションの後、細胞を４回洗浄し、イメージを、自動化顕微鏡系（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−１、ユニバーサル  イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．））を用いて、最小６イメージ／ウェルで、撮った。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ−ＨＣＳイメージ処理ソフトウェアを使用して、有糸分裂と総核数を決定した
。有糸分裂指数は、該細胞集団における全ての核にわたる、有糸分裂の区画を象徴する。グラフ表示の目的のために、未処理細胞のＭＩを１００と設定した。
【０２０７】
ＲＮＡｉ処理の効果
図１７で示したように、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ５４６．１のヒトオーソログである、ＮＰ＿０５６９７２．１に対して指向するｓｉＲＮＡを用いるＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉ処理は、結果として、対照処理細胞と比較して、細胞増殖の５０％減少と、有糸分裂指数のわずかな減少となる。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＣＤ４．４のヒトオーソログである、ＣＡＤ３８９３６に対して指向するｓｉＲＮＡを用いるＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉ処理は、結果として、対照処理細胞と比較して、細胞増殖の６０％減少、アポトーシスの有意な誘導、および有糸分裂指数の２．５倍減少となる。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ１３Ｆ１０．２のヒトオーソログである、ＮＰ＿０７６９７４．１に対して指向するｓｉＲＮＡを用いるＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉ処理は、結果として、対照処理細胞と比較して、細胞増殖の４０％減少、アポトーシス率の２倍の増加、および有糸分裂指数の有意な増加となる。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ５４Ｂ３．３のヒトオーソログである、ＮＰ＿０６０６５８．１に対して指向するｓｉＲＮＡを用いるＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉ処理は、結果として、対照処理細胞と比較して、細胞増殖の７０％減少、アポトーシス率の２．５倍増加となる。
【図面の簡単な説明】
【０２０８】
【図１】図１は、Ｃ１３Ｆ１０．２に対して指向したｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）で処理した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ親Ｆ０から、Ｆ１子孫での、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図２】図２は、Ｃ１３Ｆ１０．２と、対応するハエおよびヒトオーソログの、アミノ酸配列アライメントを示している。
【図３】図３は、Ｃ２５Ａ１．９に対して指向したｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）で処理した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ親Ｆ０から、Ｆ１子孫での、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図４】図４は、Ｃ２５Ａ１．９と、その対応するヒトオーソログの、アミノ酸配列アライメントを示している。
【図５】図５は、Ｆ５４Ｂ３．３に対して指向したｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）で処理した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ親Ｆ０から、Ｆ１子孫での、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図６】図６は、Ｆ５４Ｂ３．３と、その対応するハエおよびヒトオーソログ、およびマウスホモログの、アミノ酸配列アライメントを示している。
【図７】図７は、Ｆ０８Ｂ６．２に対して指向したｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）で処理した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ親Ｆ０から、Ｆ１子孫での、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図８】図８は、Ｆ０８Ｂ６．２と、その対応するハエおよびヒトオーソログの、アミノ酸配列アライメントを示している。
【図９】図９は、ＣＤ４．４に対して指向したｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）で処理した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ親Ｆ０から、Ｆ１子孫での、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図１０】図１０は、ＣＤ４．４と、その対応するハエおよびヒトオーソログの、アミノ酸配列アライメントを示している。
【図１１】図１１は、ＺＫ５４６．１に対して指向したｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）で処理した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ親Ｆ０から、Ｆ１子孫での、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図１２】図１２は、ＺＫ５４６．１と、その対応するヒトオーソログおよびそのハエおよびマウスホモログの、アミノ酸配列アライメントを示している。
【図１３】図１３は、Ｃ５６Ｃ１０．３に対して指向したｄｓＲＮＡ（ＲＮＡｉ）で処理した、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ親Ｆ０から、Ｆ１子孫での、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図１４】図１４は、Ｃ５６Ｃ１０．３と、その対応するヒト、マウスおよびハエオーソログの、アミノ酸配列アライメントを示している。
【図１５】図１５は、野生型未処理Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおける、初回の細胞分裂の、経時的記録よりとった、ＤＩＣ顕微鏡イメージを示している。
【図１６】図１４は、ＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉ処理後、残っているｍＲＮＡレベルを示している。それぞれＮＰ＿０５６９７２．１、ＣＡＤ３８９３６、ＮＰ＿０６０３８７．１、ＮＰ＿０７６９７４．１、ＮＰ＿０６０６５８．１、それぞれＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ５４６．１、ＣＤ４．４、Ｃ２５Ａ１．９、Ｃ１３Ｆ１０．２およびＦ５４Ｂ３．３のヒトオーソログに対して指向しているＲＮＡｉでの、ＨｅＬａ細胞の処理が、結果として、ＮＰ＿０５６９７２．１、ＣＡＤ３８９３６およびＮＰ＿０６０６５８．１に関して、対象処理試料と比較して、２０％未満のｍＲＮＡレベルの特異的減少、ＮＰ＿０６０３８７．１およびＮＰ＿０７６９７４．１に関して、５０％未満の減少となる、ことを示している。
【図１７】図１７は、ＨｅＬａ細胞における、細胞増殖、アポトーシス率および有糸分裂における、ＲＮＡｉ治療の効果を示している。グラフ表示のために、未処理細胞の増殖、アポトーシス率およびＭＩを１００に設定した。Ｐｒｏｌｉｆ、増殖、ａｐｏｐｔ、アポトーシス、ＭＩ、有糸分裂指数、％、未処理対照と比較したパーセント、ｓｃｒ．ｃｔｒｌ、スクランブル対照、ｕｎｔｒｔｄ．、未処理。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年7月10日(2006.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
［実施例２］
ＲＮＡｉ実験のためのｄｓＲＮＡ分子の作製
第１に、オリゴヌクレオチドプライマー対配列を、標準のＰＣＲ技術を用いて、対照のコード領域の遺伝子の部分を増幅するために選択した。プライマー対は、コード配列の少なくとも５００塩基を含むＰＣＲ産物、または５００残基より小さな遺伝子のための最大コード塩基を含むＰＣＲ産物を産出するために選択した。両方のＤＮＡ鎖から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写反応のための鋳型として、ＰＣＲ産物の続く利用を許容するために、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター配列「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ」（配列ＩＤ番号６１）を、フォワードプライマーの５’末端に加え、Ｔ３ポリメラーゼプロモーター配列「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧ」（配列ＩＤ番号６２）を、リバースプライマーの５’末端に加えた。オリゴヌクレオチドプライマーの合成は、商業的供給業者（シグマゲノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）、ＵＫまたはＭＷＧ−バイオテック（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって完了した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７４】
［実施例４］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ１３Ｆ１０．２の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｃ１３Ｆ１０．２遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴ」（配列ＩＤ番号６３）および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＴＴＣＡ
ＴＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴ」（配列ＩＤ番号６４）である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
［実施例５］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ２５Ａ１．９の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｃ２５Ａ１．９遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＡＣＴＴＡＡＴＧＣＧＣＣＣＡＴＴＴＴＣ」（配列ＩＤ番号６５）および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＴＴＡＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴ」（配列ＩＤ番号６６）である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８１】
［実施例６］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ５４Ｂ３．３の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｆ５４Ｂ３．３遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＡＧＧＴＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧＡＣＣＡ」（配列ＩＤ番号６７）および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＴＣＧＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＴＧＡＴ」（配列ＩＤ番号６８）である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
［実施例７］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｆ０８Ｂ６．２の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｆ０８Ｂ６．２遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＴＣＡＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＡＡＧ」（配列ＩＤ番号６９）および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＴＧ」（配列ＩＤ番号７０）である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
［実施例８］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＣＤ４．４の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、ＣＤ４．４遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＣＣＧＣＴＣＡＡ」（配列ＩＤ番号７１）および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＧＡＴＣＣＧＡＡ」（配列ＩＤ番号７２）である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、２細胞分裂期まで、１５〜２０分後、完了している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９０】
［実施例９］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子ＺＫ５４６．１の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、ＺＫ５４６．１遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＧＡＴＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴＧＧＧＴ」（配列ＩＤ番号７３）および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＣＡＡＣＴ
ＧＡＧＣＡＡＴＣＣＣＡＴＴＴ」（配列ＩＤ番号７４）である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、４細胞分裂期まで、〜３０分後、完了している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９３】
［実施例１０］
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子Ｃ５６Ｃ１０．３の特性化
ｄｓＤＮＡを設計し、ＲＮＡｉによるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ遺伝子の発現を特異的にサイレンス化するために使用し、これによって、この後生動物における、胚細胞分裂の最初の２回においてその機能的関与を試験した。ｄｓＲＮＡを、ＰＣＲ増幅した、Ｃ５６Ｃ１０．３遺伝子の野生型ゲノムＤＮＡ断片より、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成した。ＰＣＲのために、以下のプライマー対を利用した。それぞれフォワードおよびリバースプライマーとして「ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＴＴＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＧ」（配列ＩＤ番号７５）および「ＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＴＣＧＣＴ」（配列ＩＤ番号７６）である。ｄｓＲＮＡを精製し、生体雌雄同体虫内に注射した。ＲＮＡｉ処理の表現型結果を、経時的微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡を用いて、注射した虫のＦ１子孫にて、２４時間後に記録した。胚の記録は、受精後〜２０分で開始し、一方、雌性前核は、その減数分裂を、４細胞分裂期まで、〜３０分後、完了している。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９８】
【表２】
2007505824.tif 000029
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007505824000001.app
【国際調査報告】
2007505824.tif 000030
2007505824.tif 000031
2007505824.tif 000032
2007505824.tif 000033
2007505824.tif 000034