(57)【要約】  本発明は、経口投与されるβ−グルカンを含む組成物を細胞に接触させることを含む、物質を前記細胞中に導入する方法を提供する。本発明は、上記の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象に物質を導入する方法も提供する。経口送達できる物質には、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学療法剤、生物学的活性のある薬剤、プラスミド、並びに他の小分子及び化合物が含まれるが、それだけに限定されない。最後に、本発明は、ＩｇＭの効果を増強することのできる経口投与されるβ−グルカンを含む組成物、及び前記組成物の様々な使用を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切な量の炭水化物を含む物質の経口摂取用の組成物。
【請求項２】
経口投与されるβ−グルカンの有効量と、１種又は複数の化学療法剤とを含む、１種又は複数の物質を経口送達するための組成物。
【請求項３】
前記炭水化物がグルカンである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記グルカンが、１，３−１，６又は１，３−１，４の混合結合、或いは１，３−１，６及び１，３−１，４の両方の混合結合の混合を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記グルカンが、化学療法剤又は抗癌抗体の効果を増強する、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記グルカンが、草、植物、キノコ、イースト、オオムギ、真菌、コムギ、又は海草に由来する、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記グルカンが高分子量である、請求項３に記載の組成物。
【請求項８】
前記物質が、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はプラスミドである、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記物質が化学療法剤である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１０】
ＩｇＭ抗体の効果を増強することのできる、経口投与される（１→３），（１→６）又は（１→３），（１→４）β−グルカンを有効量で含む組成物。
【請求項１１】
前記抗体が癌の抗体である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗体が腫瘍結合抗体である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体が補体を活性化することができる、請求項１２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年７月１６日出願の米国特許出願第１０／６２１０２７号の一部継続出願であり、その内容の全体を本出願に参照として援用する。
【０００２】
本出願の全体にわたり、様々な参考文献を引用する。これら刊行物の開示は、本発明が関連する技術水準をより完全に記述するために、その全体を本出願に参照として援用する。
【０００３】
本明細書での開示は、経口投与されるβ−グルカンを含む組成物を細胞に接触させることを含む、物質を前記細胞内に導入する方法に関する。本発明の１つの態様は、上記の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象に物質を導入する方法を提供する。経口送達できる物質には、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学療法剤、生物活性物質、及びプラスミドが含まれるが、それだけに限定されない。他の小型分子及び化合物も用いることができる。本発明の別の態様は、ＩｇＭ抗体の効果を増強することのできる経口投与されるβ−グルカンを含む組成物である。
【背景技術】
【０００４】
サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）、又は米国特許第５２５０４３６号に記載されている変異体のイースト菌株などのイーストの細胞壁に由来するグルカンを、上記の組成物に使用することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。β（１−３）及びβ（１−６）結合を有するグルカンは、米国特許第５２３３４９１号及び同第４８１０６４６号に記載されている方法により調製することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。経口投与に適する可溶性又は水性グルカンは、米国特許第４８１０６４６号及び同第５５１９００９号に記載の方法により製造することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。
【０００５】
β−グルカンは、４０年近くの間、マウスにおいて腫瘍治療について試験が行われている１、２。日本では、ＰＳＫ（カワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｖｅｓｉｃｏｌｏｒ）由来）、レンチナン、シゾフィランなど、いくつかの形態のキノコ由来のβ−グルカンが、癌の治療のために臨床的に使用されている。日本における無作為化試験では、ＰＳＫは、原発性腫瘍を摘出するための胃切除３、４、直腸手術５、６、及び食道切除７の後のいくつかの癌の試験において、生存率をそれほど高くはないが有意に上昇させている。乳癌８、９、及び白血病１０では、結果はあまり有望ではなかった。シゾフィランは、手術可能な胃癌１１、手術不可能な胃癌１２、１３、及び子宮頸癌１４の患者の生存率を上昇させている。やはり、群間の生存率には統計学的に有意差があったが、この上昇は大きくなかった。β−グルカンは西洋の腫瘍学者には広くは使われていないが、レイシ（Ｒｅｉｓｈｉ）及びマイタケ１５などのβ−グルカンを含む植物性医薬品は、代替／補足的癌療法として米国の癌患者に広く使われている。β−グルカンの治療効果を探索していたこれらの以前の研究には、試験計画の一部として治療用のモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の同時投与は組み込まれていなかった。ヒトの腫瘍の強力なオプソニンとして働くｉＣ３ｂを沈着させるには抗体が必要であるという証言が増えている。ＭｏＡｂを同時投与しないでβ−グルカンを投与する場合に、β−グルカンの腫瘍細胞毒性作用を発揮させるには天然に存在する抗腫瘍抗体の存在が必要であるが、これは患者間で、また実験用マウス間においてさえも非常に変動することがある。
【０００６】
癌特異性抗体と組合せたときのβ−グルカンの抗腫瘍作用については、以前に記載されている。以前の研究では、オオムギ又はカラスムギ由来の経口投与したβ−グルカンが、異種移植片モデルにおける抗腫瘍モノクローナル抗体の抗腫瘍活性を大いに増強できることが示されている。「治療を増強するグルカン（Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｇｌｕｃａｎ）」、２００２年１月１５日出願、国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ０２／０１２７６号；Ｃｈｅｕｎｇら、「神経芽細胞種の治療において経口の（１−３），（１−４）−β−グルカンが抗ガングリオシドＧＤ２モノクローナル抗体３Ｆ８と相乗作用をする（Ｏｒａｌ  （１−３），（１−４）−ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎ  ｓｙｎｇｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ＧＤ２  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ３Ｆ８  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）」、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００２年、８巻、１２１７〜１２２３頁；Ｃｈｅｕｎｇ  ＮＫら、「経口投与されたβ−グルカンがモノクローナル抗体の抗腫瘍作用を増強する（Ｏｒａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃａｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２００２年、５１巻、５５７〜５６４頁を参照されたい。第Ｉ相の臨床治験は、オオムギのβ−グルカンが転移癌に対する抗体の作用を増強する可能性があるという予想を支持している。以前に述べられたように、（１→３），（１→６）−β−Ｄ−グルカンであるレチナンもラミナリンもオオムギのグルカンほど有効ではなかった１６。更に、（１→３），（１→４）−β−Ｄ−グルカンのなかでも小分子量の製剤及びリケナンも、それほど有効ではなかった。β−グルカンの分子の大きさ及び微細構造が、腫瘍に対する抗体の相乗作用に大きな影響を及ぼすのかもしれない。
【０００７】
欧州及び米国では、特にパン酵母に由来するβ−グルカンが、動物用の飼料添加物として、ヒトの栄養補助食品として１７、傷の治療に１８、また皮膚用クリーム製剤の有効成分として長い間用いられている。β−グルカンの基本的な構造単位は、β（１→３）結合グルコシル単位である。供給源及び分離方法に応じて、β−グルカンは、側鎖に様々な程度の分枝及び結合を有する。側鎖の頻度及びヒンジ構造が、その免疫調節作用を決定する。真菌及びイースト起源のβ−グルカンは、通常水に不溶であるが、酸加水分解により、又はリン酸、硫酸、アミン、カルボキシメチル、などの荷電した基を分子に導入する誘導体化により可溶化することができる１９、２０。
【０００８】
（１→３）−β−Ｄ−グルカン単位が基本骨格を形成し、側鎖が（１→６）−β−Ｄ−グルカンのヒンジに位置する（１→３）−β−Ｄ−グルカン単位により作られる分子構造を有する可溶性グルカンが、パン酵母であるサッカロミセスセレビシエから分離された。高分子量の断片
【化１】
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が得られ、腫瘍モデルにおけるモノクローナル抗体との相乗作用について試験された。可溶性のイーストのβ−グルカンの抗腫瘍作用は、以下に詳しく述べるようにヒトの癌に特異的なモノクローナル抗体と組合せると、可溶性のオオムギのβ−グルカンの抗腫瘍作用に匹敵することが見出された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、経口投与されるβ−グルカンを含む組成物を細胞に接触させることを含む、物質を前記細胞内に導入する方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は、上記の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象に物質を導入する方法である。経口送達できる物質には、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、化学療法剤、生物学的活性のある薬剤、及びプラスミドが含まれるが、それだけに限定されない。他の小型の分子及び化合物も用いることができる。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、ＩｇＭ抗体の効果を増強することのできる、経口投与されるβ−グルカンを含む組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、適切な量の炭水化物を含む物質の経口摂取用の組成物を提供する。一実施形態においては、この炭水化物はグルカンである。
【００１３】
グルカンを経口投与すると、マクロファージ及び単球に取り込まれ、それらによってこの炭化水素は骨髄及び細網内皮系に運ばれ、そこから適切に加工された形態で好中球を含む骨髄細胞上、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ細胞上に放出される。この加工されたグルカンは、これらの好中球及びＮＫ細胞上のＣＲ３に結合し、腫瘍特異性抗体の存在下で、腫瘍細胞毒性の点でこれらを活性化する。
【００１４】
マクロファージ及び単球は消化管からグルカン（可溶性であろうと、ゲルであろうと、粒子であろうと）を取り入れるので、グルカンは遺伝子治療にとって有効な案内役になる可能性がある。ＤＮＡ又はプラスミドはタンパク質とは異なり、比較的熱に安定であり、室温又は体温に冷却されるとゲル化する加温で可溶性のオオムギグルカンに容易に組み込むことができる。マウスにこのＤＮＡ−グルカン複合体を摂取させると、数日以内に末梢血液の単球及びマクロファージ中にレポーター遺伝子を検出することができる。さらに重要なのは、これらのレポーター遺伝子は、このＤＮＡ複合体を摂取した数日後にこれらの細胞中で発現される。これらの発見には、潜在的に生物学的な示唆を含む。グルカン及び同様の炭水化物は、ＤＮＡ又はプラスミドがヒトの体内に入るための有効な案内役になる可能性がある。経口のグルカンは、マクロファージ／単球の遺伝的欠陥を是正し、又は遺伝子ワクチンを投与するための都合のよい媒体になる可能性がある。
【００１５】
このことが、当業者に容易に理解することができると、グルカンのような機能を果たすことのできる他の炭水化物を、同様にして同定し、用いることができるであろう。このような炭水化物に対する１つの容易なスクリーニングは、グルカンを陽性対照として用いて確立することができる。
【００１６】
このグルカンには、β（１−３）及びβ（１−４）の混合結合をもつグルカンが含まれるが、それだけに限定されることはなく、またこのグルカンは高分子量である。このグルカンは、β（１−３）及びβ（１−６）結合も有することができる。
【００１７】
本発明は、上記の組成物を細胞に接触させることを含む、物質を前記細胞内に導入する方法も提供する。前記導入の効率を評価するために、レポーター遺伝子又は他のマーカーを使用することができる。レポーター遺伝子又はマーカーは、分子生物学の分野でよく知られたものである。さらに、本発明は、上記の組成物の有効量を対象に投与することを含む、その対象に物質を導入する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、経口投与されるβ−グルカンの有効量と、１種又は複数の化学療法剤とを含む、１種又は複数の物質を経口送達するための組成物を提供する。
【００１９】
一実施形態においては、このグルカンは、１，３−１，６又は１，３−１，４の混合結合、或いは１，３−１，６及び１，３−１，４の混合結合の混合を含む。他の実施形態においては、このグルカンは、化学療法剤又は抗癌抗体の効果を増強する。
【００２０】
さらなる実施形態においては、このグルカンは、草、植物、キノコ、イースト、オオムギ、真菌、コムギ、又は海草に由来する。このグルカンは高分子量であることがある。このグルカンの分子量は、少なくとも１００００ダルトンであることがある。
【００２１】
さらなる実施形態においては、この物質は、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、又は化学療法剤である。本明細書で用いられる化学療法剤には、動物の体内で疾患と闘う化学物質、又は様々な形態の癌を治療するために用いられる医薬品が含まれる。
【００２２】
本発明は、上記の組成物を細胞に接触させることを含む、物質を前記細胞内に導入する方法を提供する。
【００２３】
経口送達できる物質には、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びプラスミドが含まれるが、それだけに限定されない。他の小分子及び化合物も、使用することができる。
【００２４】
本発明は、上記の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象を治療するための方法を提供する。一実施形態において、この方法はさらにこの物質を含む。
【００２５】
本発明は、上記の組成物及び遺伝的障害を正すことのできる物質の有効量を対象に投与することを含む、前記遺伝的障害のある対象を治療するための方法を提供する。この物質には、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、並びに他の小分子及び化合物が含まれるが、それだけに限定されない。
【００２６】
本発明は、ＩｇＭ抗体の効果を増強することのできる、経口投与される（１→３），（１→６）β−グルカンを有効量で含む組成物を提供する。
【００２７】
本発明は、抗体の効果を増強することのできる、経口投与される（１→３），（１→６）β−グルカンを有効量で含む組成物を提供する。サッカロミセスセレビシエ、又は米国特許第５２５０４３６号に記載されている変異体のイースト菌株などのイーストの細胞壁に由来するグルカンを、上記の組成物に使用することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。β（１−３）及びβ（１−６）結合を有するグルカンは、米国特許第５２３３４９１号及び同第４８１０６４６号に記載されている方法により調製することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。経口投与に適する可溶性又は水性グルカンは、米国特許第４８１０６４６号及び同第５５１９００９号に記載の方法により製造することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。
【００２８】
一実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体、又は癌若しくは腫瘍細胞の抗体であり、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗テネイシン抗体、ＭｏＡｂ  Ｍ１９５、ダクルジマブ（Ｄａｃｌｕｚｉｍａｂ）、抗ＴＡＧ７２抗体、Ｒ２４、ハーセプチン、リツキシマブ、５２８、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｃ２２５、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、及びＭｏＡｂ３Ｆ８が含まれるがそれだけに限定されない。別の実施形態においては、抗体は腫瘍結合抗体である。
【００２９】
さらに、抗体は補体を活性化することができ、且つ／又は抗体依存性で細胞が介在する細胞毒性を活性化することができる。別の実施形態においては、この抗体はＴ細胞又はＢ細胞の機能を調節する。
【００３０】
さらなる実施形態においては、この抗体は、表皮成長因子受容体、ガングリオシド、例えばＧＤ３又はＧＤ２に対するものである。
【００３１】
さらなる実施形態においては、抗体は、神経芽細胞種、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、エプスタインバー関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫、網膜芽細胞腫、小細胞肺癌、脳腫瘍、白血病、扁平上皮癌、前立腺癌、腎細胞癌、移行上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肝臓癌、胃癌、又は他の消化器系の癌を含む癌に有効である。
【００３２】
さらなる実施形態においては、上記の組成物は、製薬上許容される担体中にある。
【００３３】
本発明は、上記の組成物を対象に投与することを含む、対象を治療する方法を提供する。
【００３４】
本発明は、ワクチンの効果を増強することのできる、経口投与される（１→３），（１→６）−β−グルカンを有効量で含む組成物を提供する。一実施形態においては、このワクチンは、癌、又は、細菌、ウイルス、真菌、若しくは寄生虫などの感染性物質に対するものである。
【００３５】
本発明は、自然抗体又は感染性物質の効果を増強することのできる、経口投与される（１→３），（１→６）β−グルカンを有効量で含む組成物を提供する。
【００３６】
本発明は、宿主の免疫を増強することのできる、経口投与される（１→３），（１→６）−β−グルカンを有効量で含む組成物を提供する。
【００３７】
本発明は、組織の拒絶反応を予防する薬剤の作用を増強することのできる、経口投与される（１→３），（１→６）β−グルカンを有効量で含む組成物を提供する。一実施形態においては、この組織は、移植片対宿主疾患における場合と同様に、移植された組織若しくは移植された臓器、又は宿主である。
【００３８】
一実施形態においては、上記の組成物のグルカンは高分子量である。グルカンの分子量は、少なくとも１００００ダルトンである。別の実施形態においては、グルカンは、オオムギ、カラスムギ、キノコ、海草、真菌、イースト、コムギ、又はコケ由来である。さらなる実施形態においては、このグルカンは熱処理に対して安定である。
【００３９】
さらなる実施形態においては、上記の組成物は、３時間煮沸した後も安定である。上記の組成物の有効投与量は、約２５ｍｇ／ｋｇ／日以上、１週間に５日で合計２〜４週間である。
【００４０】
本発明は、以下の実験による説明を参照することによりさらに理解されるが、当業者であれば、特定の詳しい実験は例示的なものにすぎず、添付の特許請求の範囲により定義される本明細書に記載の発明を制限することを意味するものではないことが容易に理解されよう。
【実施例】
【００４１】
（実施例Ｉ）
抗ＧＤ２抗体と組み合わせたオオムギβ−グルカンのステージ４の神経芽細胞腫における第Ｉ相試験
合計２４名の患者に試験を行った。これらの患者は全員小児又は青少年で、再発又は難治性であるステージ４の骨、骨髄、又は遠位のリンパ節に転移した神経芽細胞腫があり、大きな軟組織塊を有するものもある。β−グルカンの耐容性は、用量制限毒性もなく良好である。骨髄疾患（組織学検査、ＭＩＢＧスキャン）、軟組織腫瘍（ＣＴ）、及び生化学的マーカー（尿中のＶＭＡ及びＨＶＡ腫瘍マーカー）に対する抗腫瘍反応が記録された。腫瘍反応の一例を、図１Ａ及び１Ｂに示す。３Ｆ８プラスβ−グルカンによる一治療サイクル後の広範囲にわたる転移の完全に近い解像度を示す１３１Ｉ−メタヨードベンジルグアニジン（ＭＩＢＧ）スキャンである。このような反応は、３Ｆ８単独又は３Ｆ８をサイトカインと組み合わせて治療した、難治性又は再発性であるステージ４の転移ＮＢの患者では非常識的なことである。現在までに得られている３Ｆ８に対する反応率で最もよいものは、３Ｆ８とＧＭＣＳＦとの組合せの第ＩＩ相治験におけるものであり、３３名中７名（２１％）の小児がＭＩＢＧ上の改善を達成した。これとは対照的に、３Ｆ８プラスβ−グルカンで６２％（２１名中１３名）の評価可能な患者がＭＩＢＧ上で改善し、反応率はほぼ３倍となった（χ２検定でｐ＝０．００８）。さらに、骨髄疾患のある１５名の患者のうち、５名が骨髄の完全な寛解を達成し（３０％）、８名が骨髄の疾患安定状態となった。
（図１を参照）
【００４２】
（実施例ＩＩ）
リツキシマブは、補体媒介性で抗体依存性の、細胞が媒介する細胞毒性を活性化し、Ｂ細胞リンパ腫に有効である。β−グルカンは、白血球の間で広く発現される受容体であるＣＲ３のレクチンドメインに結合する天然に存在するグルコースポリマーであり、白血球を刺激して、抗体によって活性化されたｉＣ３ｂに結合させる。オオムギ由来の（１→３），（１→４）−β−Ｄ−グルカン（ＢＧ）を経口投与すると（１日あたり４００μｇ×２９日間）、ＣＤ２０陽性ヒトリンパ腫の治療で静脈投与された治療量以下の投与量のリツキシマブ（週２回２００μｇ×８用量）と強力な相乗作用を示す。ＳＣＩＤマウスに異種移植した、樹立した皮下の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（Ｄａｕｄｉ及びＥＢＶ由来Ｂ−ＮＨＬ）又はホジキン病（Ｈｓ４４５又はＲＰＭＩ６６６６）の増殖は、リツキシマブ又はＢＧ単独で治療したマウスに比べて大幅に抑制された。播種性リンパ腫（Ｄａｕｄｉ及びＨｓ４４５）のマウスの生存率は大幅に上昇した。治療した動物には、体重の減少又は臨床上の毒性は見られなかった。ＢＧプラスリツキシマブに治療上の効果があり毒性がないということは、その臨床上の有用性をさらに調査することを支持している。
【００４３】
（緒言）
キメラの抗ＣＤ２０抗体リツキシマブは、ますます多くの障害で評価されている。再発及び難治性で濾胞性／低グレードの非ホジキンリンパ腫に対する臨床上の効果が最初に実証された後１、他の悪性及び非悪性のＢ細胞障害におけるリツキシマブに対する反応が報告されている２。アポトーシス経路の活性化３、サイトカインの生産４、並びに宿主の補体依存性毒性（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）５の誘発を含む、いくつかの作用機序が提唱されている。Ｂ細胞障害を有する患者の多くはリツキシマブに反応するが、寛解は一過性であることが多い６。２回目にリツキシマブ治療に反応できかった後では、５０％を超えてリンパ腫が再発する７。リツキシマブに対する耐性のメカニズムは未だに明らかではなく、標的抗原の不十分又は喪失８、個々の患者間での薬動力学的変動、ＦｃＲの多型性９、補体活性に対する耐性１０、又はリンパ腫特有の遺伝子の発現１１が含まれる可能性がある。
【００４４】
β−グルカンは、グルコースの複雑なポリマーであり、白血球上のＣＲ３受容体のレクチン部位に対する親和性がある１２。ＣＲ３（ＣＤ１１ｂ）は、結合したβ−グルカンによって刺激を受けて補体活性化抗体により細胞上に沈着したｉＣ３ｂフラグメントと結合する。この受容体は内皮を通じて白血球が漏出するのを媒介し、食作用、脱顆粒、及び腫瘍の細胞毒性を刺激する。多くの真菌は、細胞の表面にβ−グルカン又はβ−グルカン様ＣＲ３結合リガンドを提示している。このため、ｉＣ３ｂの沈着が起こるとＣＤ１１ｂもレクチン部位も塞がれ、食作用及び呼吸性バーストが誘発される１３。対照的に、腫瘍細胞にはそのような分子がなく、ｉＣ３ｂで覆われても通常はＣＲ３を活性化せず白血球を活性化することができない。可溶性形態のβ−グルカンはレクチン部位に結合し、食細胞及びＮＫ細胞を刺激してｉＣ３ｂで覆われた腫瘍の標的を死滅させる１４。
【００４５】
可溶性の、オオムギ由来のβ−グルカンである（１→３），（１→４）−Ｄ−β−グルカン（ＢＧ）は、以前に実験された（１→３），（１→６）−β−グルカンよりも有利であり、特に経口投与で有効であり安全性プロファイルが良好である１５。ヒト神経芽細胞腫異種移植片に対するＢＧと補体結合抗体３Ｆ８とのｉｎ  ｖｉｖｏにおける相乗作用１５、１６が、最近実証された。リンパ腫に対するＢＧとリツキシマブとの相乗作用は、ここで報告される。
【００４６】
（研究デザイン）
細胞系：
ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞系、Ｄａｕｄｉ、並びにホジキン病（ＨＤ）細胞系Ｈｓ４４５及びＲＰＭＩ６６６６を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）より購入した。ヒトＥＢＶ−ＢＬＣＬは、以前に記載の方法１７を用いて樹立した。
【００４７】
マウス：
Ｆｏｘ  Ｃｈａｓｅ  ＩＣＲ  ＳＣＩＤマウス（ニューヨーク州、Ｗｈｉｔｅ  Ｐｌａｉｎｓ、Ｔａｃｏｎｉｃ製）を、機関で承認されたガイドライン及びプロトコールのもとで飼育した。
【００４８】
腫瘍モデル：
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ニュージャージー州、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）０．１ｍｌに懸濁した５×１０６個の細胞をマウス側腹内に注射して皮下腫瘍を樹立した。１週間に２から３回腫瘍の寸法を測定し、２つの最大直径の積として腫瘍の大きさを計算した。最大腫瘍寸法が２０ｍｍを超えた時にマウスを屠殺した。以前に記載されたようにして１８、ＳＣＩＤマウスで播種性腫瘍モデルを樹立した。簡潔に述べると、通常の生理食塩水１００μｌに懸濁したＤａｕｄｉ又はＨｓ４４５細胞５×１０６個を、ＳＣＩＤマウスに静脈注射した。腫瘍は全身に増殖し、腫瘍細胞が脊髄に浸潤するとマウスは麻痺を起こし、後肢麻痺となった。麻痺が始まったとき、又はその体重の１０％が失われたとき、マウスを屠殺した。
【００４９】
治療レジメン：
皮下腫瘍を有するマウスに、腫瘍が樹立した後（直径７〜８ｍｍ）治療を開始した。播種性腫瘍のモデルでは、腫瘍細胞を注入した１０日後に治療を開始した。治療レジメンあたり少なくとも５匹のマウスの群にリツキシマブ、ＢＧ、又はその両方を与え、或いはどちらも与えなかった。リツキシマブ（カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ製）２００μｇを週２回全８投与で静脈注射し、且つＢＧ（ミズーリ州、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、Ｓｉｇｍａ製）４００μｇを２９日間毎日胃管栄養法により経口投与した。動物は毎週体重を測定し、少なくとも１日１回は臨床上の観察を行った。
【００５０】
統計分析：
個々のマウスそれぞれに対し腫瘍の大きさの対数変換値に回帰直線を当てはめることにより、腫瘍の増殖を計算した。調べた観測値について以前に記載されている方法１９を用いて、ｔ検定を用いて群間で直線を比較した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析法を用いて播種性疾患のマウスの生存率を比較し、死亡の割合をＦｉｓｈｅｒの厳密χ２検定により比較した。分析は、ＳＴＡＴＡ７を用いて行った。
【００５１】
結果と考察
皮下の異種移植片モデルのすべてにおいて、リツキシマブ及びＢＧの組合せで治療したマウスの腫瘍増殖に有意の減少が認められた。リツキシマブ単独で治療したマウスでは、腫瘍の増殖は少々減少を示したが、ＢＧ単独治療又は非治療のものでは、腫瘍の増殖は衰えなかった（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）。組合せ療法で治療したもの以外の腫瘍はすべて、２０ｍｍの大きさを超えて増殖し、マウスを屠殺しなければならなかった。組合せ治療を受けたマウスは、治療を中止した後でも腫瘍の抑制は続いた。治療に対しダミー変数を用いた腫瘍増殖速度の多変数線形モデルでは、ＢＧとリツキシマブとの相互作用は陽性で大きく、相乗作用があることを実証している。
【００５２】
播種性の異種移植片では、ＮＨＬ及びＨＤモデルの両方に対し、生存率の点で組合せ群と対照群との間に有意差があった（ログランク検定で、ｐ＜０．００５）（図２）。ＢＧ及びリツキシマブの組合せで治療した播種性のＤａｕｄｉ及びＨｓ４４５腫瘍を有するマウスの、それぞれ５匹／３８匹及び２匹／８匹が、治療中止後１２ヶ月を超えて生存し、疾患が完全に根治したことを示唆していた。対照的に、それぞれの群でリツキシマブ単独を与えたマウスの生存率は０／２９匹及び０／８匹であった（生存率１５％対０％；χ２＝０．０１）。大幅な体重の減少、又は他の臨床上明らかな有害作用はなかった。固定して透過性にした末梢血液の白血球内で免疫蛍光法により細胞内からＢＧを検出することができたという事実から、ＢＧが吸収されていることを推測することができる（データは示さず）。
【００５３】
これらの実験では、ＣＤ２０陽性のリンパ腫のタイプに関係なく、ＢＧとリツキシマブとの相乗作用は高度に有意であった。Ｄａｕｄｉ異種移植片の反応がＨｓ４４５に比べて改善したのは、前者の方がＣＤ２０の発現が高いことによるのかもしれない（相乗平均蛍光のチャンネルは、Ｈｓ４４５で１８４であったのに比べ、Ｄａｕｄｉでは２４１であった）。細胞１個を懸濁した免疫蛍光法の実験又は凍結切片の間接的免疫組織化学的実験により、進行した腫瘍でＣＤ２０の発現を調べたところ、リツキシマブ、ＢＧ単独、又はリツキシマブ＋ＢＧ処理の群間で有意差は認められず（データは示さず）、リツキシマブ＋ＢＧの処理がＣＤ２０の喪失とは関連がないことが示唆された。
【００５４】
他の補体活性モノクローナル抗体とＢＧとの相乗作用１５、１６は、以前に実証された。本データは、この観察をリツキシマブにまで拡張している。ＣＤＣはリツキシマブの細胞毒性にとって重要なメカニズムであると考えられている。げっ歯類の補体は、ヒトの補体調節タンパク質（ｍＣＲＰ）によって効果的に抑制されることはない。したがって、ＣＤＣは、異種移植片モデルにおいて有効な抗腫瘍のメカニズムである可能性がある。しかし実験では、抗体の治療量以下の投与量では、リツキシマブが媒介するＡＤＣＣ及びＣＤＣは、腫瘍細胞を死滅させる作用には十分ではなかった。ＢＧはＡＤＣＣに対し直接作用がないため２０、この相乗作用はｉＣ３ｂが媒介する腫瘍の細胞毒性の結果であることはほぼ間違いない。リンパ腫の細胞は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、及びＣＤ５９を含むｍＣＲＰを発現する１０、２１。しかし、ｉＣ３ｂが媒介する細胞毒性はＣＤ５９の存在による影響を受けず、ＣＤ５９はＭＡＣが媒介する補体の細胞毒性のみに影響を及ぼす２２。さらに、ヒトの乳癌腫瘍では、ｍＣＲＰが存在してもｉＣ３ｂが沈着することが実証されており２３、ＭＡＣに対する阻害作用とは異なりｉＣ３ｂが媒介する腫瘍の細胞毒性に対する作用は絶対ではないことが示唆される。
【００５５】
この相乗作用がヒトで安全に再現することができれば、ｉＣ３ｂが媒介する細胞毒性は、Ｂ細胞の悪性腫瘍を有する患者でリツキシマブの耐性を克服するための有効な戦略になると思われる。Ｔ細胞もＢ細胞もこの相乗作用には必要とされていないため、免疫無防備状態のリンパ腫の患者でもＢＧは有効に働く可能性がある。さらに、自己免疫障害の患者では、この非毒性の経口治療法によりＢ細胞の枯渇が増強される可能性がある。その反面、β−グルカンはＴＮＦ−α及びＩＬ−６などのサイトカインの放出を亢進することがあり２４、リツキシマブの急性毒性もまた、補体の活性化に付随したサイトカインの放出に関係があるため２５、ＢＧとリツキシマブとを組み合わせて用いると毒性が上昇する可能性がある。Ｂ細胞の障害の治療において、及びその他の癌の抗体に基づいた治療において、リツキシマブ治療の補助剤としてＢＧを開発する上でその安全性及び効果を明確にするためには、注意深く計画された第Ｉ相の実験が必要である。
（参考文献１）
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2007531700.tif 000005
2007531700.tif 000006
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【００５６】
（実施例ＩＩＩ）
オオムギのβ−グルカン抽出物がＩｇＭ抗体と相乗作用をする
ヒト血清由来の天然ＩｇＭ抗体をｉ．ｖ．で投与すると、ヒト神経芽細胞腫（ＮＢ）細胞に細胞毒性があり、ヌードラットにおける皮下の固形ヒトＮＢ異種移植片の増殖停止をもたらした（１、２）。ＩｇＭは腫瘍に取り込まれ、大量の血管周囲の補体を活性化し、２４時間後に顆粒球を蓄積させた（３）。転移ＮＢモデルでは、ＩｇＭ抗体は９０％のマウスの腫瘍を排除するのに有効であった（４）。幼児期の間及び（あらゆる年齢の）ＮＢ患者の間にはこの抗ＮＢＩｇＭ抗体が存在せず、これが１２月齢後に優勢になることから、天然ＩｇＭ抗体がＮＢに対する免疫学的制御メカニズムとしての役割を果たす可能性があるという仮説が持ち上がっている（５）。３Ｇ６は、抗ＧＤ２マウスＩｇＭモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）である。ビオチン化３Ｇ６をｉ．ｖ．注射後４８時間以内に、皮下のＮＢ異種増殖片では腫瘍細胞の膜が染色されることが示された。３Ｇ６は、ＩｇＧのＭｏＡｂである３Ｆ８（１４９±４４、ｎ＝７）に比べると蛍光発光の平均は低かったが（５３±１９蛍光発光チャンネル単位、マウスｎ＝７）、３Ｇ６にβ−グルカンを加えたものは皮下のヒトＮＢに対し有効であり（ｐ＜０．０５）、用量反応曲線（図４）は３Ｆ８のものに匹敵していた。これらの結果は、ヒト天然抗ＮＢ  ＩｇＭを使用したときのものと一致していた（１、２）。これらのデータは、β−グルカンはＩｇＧが誘導するワクチンだけでなく、ＩｇＭが誘導するワクチンも増強することができるという考えを支持する。
（参考文献２）
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【００５７】
（実施例ＩＶ）
パン酵母（サッカロミセスセレビシエ）からの（１→３），（１→６）β−グルカンも癌の抗体療法を増強するのに有効である
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ製）１００μｌに懸濁したＬＡＮ−１腫瘍細胞（２×１０６個）を、皮下接種した。腫瘍の寸法をノギスを用いて１週間に２から３回測定し、２つの最長の直行する直径の積として腫瘍の大きさを計算した。腫瘍の直径が０．７から０．８ｃｍに達した時に、４〜５匹のマウスの群での治療実験をすべて開始した。マウスは、抗体（３Ｆ８又は３Ｇ６）治療（１日あたり２００μｇ）をｉ．ｖ．（尾部静脈注射により）で週２回×５用量受け、且つ経口のβ−グルカン（１日あたり４００μｇ）の投与を胃内注射で毎日、全１４〜１８日間受けた（図５及び６を参照）。
【００５８】
サッカロミセスセレビシエ、又は米国特許第５２５０４３６号に記載されている変異体のイースト菌株などのイーストの細胞壁に由来するグルカンを、先に述べた組成物に使用することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。β（１−３）及びβ（１−６）結合を有するグルカンは、米国特許第５２３３４９１号及び同第４８１０６４６号に記載されている方法により調製することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。経口投与に適する可溶性又は水性グルカンは、米国特許第４８１０６４６号及び同第５５１９００９号で記載の方法により製造することができ、上記特許はその開示全体を本明細書に参照として援用する。可溶性β−１，３／１，６グルカン又はＢｉｏｔｅｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｎ（ノルウェー）が製造するＳＢＧなどのβ−グルカンも、使用することができる。
【００５９】
同様の実験で、皮下リンパ腫モデルを実験した。ここでは細胞５×１０６個をＭａｔｒｉｇｅｌ（ニュージャージー州、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）０．１ｍｌに懸濁し、マウスの側腹部に接種した。腫瘍の寸法を１週間に２から３回測定し、２つの最長の直径の積として腫瘍の大きさを計算した。腫瘍の最大寸法が２０ｍｍを超えたときに、マウスを屠殺した。リツキシマブ（カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製）２００μｇを週２回、全８回静脈注射し、グルカン４００μｇを２９日間毎日胃管栄養法により経口投与した。マウスは毎週体重測定し、少なくとも１日１回臨床上の観察を行った。腫瘍の反応率、及び完全な寛解を達成したマウスのパーセント値は、オオムギグルカンとイーストグルカンとの間では双璧であった。この一連の皮下腫瘍モデルにより、高分子量の（＞１００００ダルトン）可溶性のイーストの（１→３），（１→６）β−グルカンは、オオムギの（１→３），（１→４）β−グルカンと同等に強力であることが示された。その上、イーストのグルカンの供給源及び物理的形態は、有意な相違をもたらす可能性がある。
【００６０】
転移リンパ腫モデルの実験も行った。上記のようにＳＣＩＤマウスに播種性腫瘍のモデルを樹立した（１）。簡潔に述べると、Ｄａｕｄｉ細胞５×１０６個を通常の生理食塩水１００μｌに懸濁し、ＳＣＩＤマウスに静脈注射（ｉ．ｖ．）した。腫瘍は全身に増殖し、腫瘍細胞が脊髄に浸潤するとマウスは麻痺を起こし、後肢麻痺となった。麻痺が始まったとき、又は動物の体重の１０％が失われたとき、マウスを屠殺した。腫瘍細胞の注射１０日後に治療を開始した。リツキシマブ（カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製）４０μｇを週２回、全８回静脈注射し、グルカン４００μを２９日間毎日胃管栄養法により経口投与した。マウスは毎週体重測定し、少なくとも１日１回臨床上の観察を行った。（図７を参照）
【００６１】
ここでも、オオムギグルカンもイーストグルカンも、リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）と組み合わせると匹敵する効果を示した。オオムギグルカンもイーストグルカンも、単独で使用したときは生存率に対しいかなる作用もなかった（データは示さず）。
（参考文献３）
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【００６２】
（実施例Ｖ）
経口投与されたβ−グルカンが抗腫瘍モノクローナル抗体とともに腫瘍の寛解を媒介する働きをするメカニズム（１）。
野生型（ＷＴ）Ｃ５７Ｂ１／６マウスに対し、ＣＲ３欠損（ＣＤ１１ｂ−／−）又はＣ３欠損（Ｃ３−／−）のいずれかのＣ５７Ｂ１／６マウスの同系腫瘍（ＧＤ２＋ＲＭＡ−Ｓ）を用いると、ＭｏＡｂ単独では腫瘍の寛解を誘発しなかったが、ｉ．ｖ．の抗ＧＤ２  ＭｏＡｂと経口のオオムギ又はイーストのβ−グルカンとの組合せでは、ＷＴでは大幅な寛解が誘発されたが、ＣＲ３欠損マウスでは誘発されなかった。さらに、ｉ．ｖ．のＭｏＡｂと経口のβ−グルカンとの組合せ療法では、ＷＴマウスでは６０〜１００％で腫瘍なしで生存し、ＣＲ３欠損マウスでは生存率は０〜２０％にすぎなかった。これらの実験により、特に経口のオオムギのβ−グルカンを抗腫瘍ＭｏＡｂとともに投与するときには、抗腫瘍作用を表すには白血球のＣＲ３がほぼ絶対的に必要であることが実証された。ＷＴをＣＲ３欠損マウスと比較した治療のプロトコールにより、同様に、経口のβ−グルカン療法には血清Ｃ３が必要なことが示された。オオムギのβ−グルカン及びイーストのβ−グルカンを蛍光ラベルし（ＢＧ−Ｆ及びＹＧ−Ｆ）胃内注射によりマウスに与えたところ、β−グルカンのトラフィッキングが起こった。ＢＧ−Ｆ又はＹＧ−Ｆを毎日経口投与したところ、３日以内に脾臓及びリンパ節のマクロファージが蛍光ラベルされたβ−グルカンを含むようになった。４日後に骨髄のマクロファージでもＹＧ−Ｆ及びＢＧ−Ｆが観察された。ＷＴ対ＣＲ３欠損マウスのＹＧ−Ｆ及びＢＧ−Ｆの取込みを比較したところ、摂取されたβ−グルカン−Ｆを含むマクロファージのパーセント値にも、細胞あたりのβ−グルカン−Ｆの量にも差は見られなかった。したがって、消化管のマクロファージによるオオムギ及びイーストのβ−グルカンの取込みにはＣＲ３は必要とされず、その代わりにデクチン（Ｄｅｃｔｉｎ）−１によって媒介される可能性がある（２）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び骨髄のマクロファージは、オオムギ及びイーストのβ−グルカンの大分子を、生物学的活性のあるより小型のβ−グルカンの断片に分解することができ、その後この断片を放出する。
【００６３】
マクロファージが放出した可溶性のβ−グルカン−Ｆが本当に骨髄の顆粒球に取り込まれたのか確定するために、１０日間ＹＧ−Ｆ又はＢＧ−Ｆを与えたＷＴ又はＣＲ３欠損マウスにチオグリコレート培地をｉ．ｐ．注射し、骨髄顆粒球の辺縁プールを腹腔内に誘発した。ＷＴの顆粒球だけが、マクロファージから放出されたＹＧ−Ｆ及びＢＧ−Ｆを収拾することができた。これらのデータにより、消化管のマクロファージがβ−グルカンを連続的に摂取し、β−グルカンを骨髄に運び、骨髄で可溶性の分解フラグメントが放出され膜のＣＲ３を介して顆粒球に取り込まれることが示唆される。経口でβ−グルカンを投与されたＷＴ及びＣＲ３欠損マウスから腹腔の顆粒球を分離すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではＷＴの顆粒球だけがｉＣ３ｂで覆われた腫瘍細胞を死滅させることができた。これらの実験が示すのは、骨髄の顆粒球及び組織のマクロファージは、膜のＣＲ３に結合した可溶性のβ−グルカンを消化管マクロファージから獲得し、この結合したβ−グルカンは顆粒球及びマクロファージ両方のＣＲ３を初回抗原刺激して、炎症部位に誘導されるとｉＣ３ｂで覆われた腫瘍細胞を死滅させることができるようにすることである。
（参考文献４）
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【００６４】
（実施例ＶＩ）
可溶性のβ−グルカンをプラスミドのパイプ役として用いることができる。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びタンパク質を経口的に送達する上の大きな障害は、胃内の環境が酸性でタンパク質分解性であること、並びにＧＡＬＴによるタンパク質の取込みが限られていることである。パイエル板内のＭ細胞、及び食細胞は、微粒子を取り込むための優力な媒体であると考えられている。しかし、ナノ粒子も傍細胞メカニズム１、２を介して、及びトランスサイトーシス３によってＧＡＬＴに接近することができる。どちらの場合でも、細胞上の受容体に対する粘膜付着特性又は親和性のある粒子を用いて、観察される粒子の取込みを向上させることができる。ナノ粒子が粘膜付着性であることを作り上げるために、多くのポリマーが使用されている。その中に、アルギン酸、カラギーナン、及びペクチンがある。これらの材料は、ナノ粒子におけるコアポリマーとして用いることが多かったが、これらのポリマーに対する特異的な受容体は同定されておらず、取込みの効率は最適状態には及ばないままである。デクチン−１は、今ではβ−グルカンの万能な受容体として知られており、単球及び食細胞を含む多くのヒトの組織で見出されている。高分子量のβ−グルカンのゲル化特性により、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びタンパク質を包埋することが可能になる。糖類は酸性条件に対する耐性が高いので、酵素、タンパク質、ＲＮＡ、及びＤＮＡは保護されたままで消化管を通過する。デクチン−１受容体のβ−グルカンに対する高い親和性によって、これらの物質は身体の残りの部分への潜在的な媒体として食細胞中に導入される可能性がある。
【００６５】
ｐＥＧＰ−Ｃ１ベクター（図８を参照）をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（カリフォルニア州、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）から購入し、製造元の指示に従って調製した。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１は、哺乳動物の細胞内でのより明るい蛍光及びより高い発現について最適化された野生型ＧＦＰ（１−３）の赤方偏移変異体をコードしている。（励起波長最高＝４８８ｎｍ、発光波長最高＝５０７ｎｍ）。ベクターのバックボーンは、また、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する場合にのみ、哺乳動物の細胞中に複製用のＳＶ４０の起源を含んでいる。このカセットの上流の細菌のプロモータは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではカナマイシン耐性を発現する。ｐＥＧＦＰ−Ｃ１バックボーンは、一重鎖ＤＮＡを産生するための、大腸菌及びｆ１起源における繁殖のための複製のｐＵＣ起源も提供する。
【００６６】
ｐＥＧＦＰ−ｃ１プラスミド５０μｇをβ−グルカン（〜２０００００ダルトン）４００μｇに混合し生理食塩水１００μｌに加えたものを経口胃管栄養法によりマウスに摂取させ、対照のマウスにはプラスミドを単独で与えた。３日間連続で（１、２、及び３日目）経口で摂取させた。尾部静脈より血液５０μｌを採取しＲＢＣを溶血させた後ＦＣＡＳ分析により分析し、全単球数中のＧＦＰを発現する細胞数の％を記録した。グルカン群対非グルカン群（１群あたりのマウスのｎ＝４〜９）の緑色細胞の平均％比率を図９に示す。１４日間の実験を通して、非グルカン群の緑色単球の％は、バックグラウンドレベルで一定であった。一方、経口胃管栄養法の１日目以降に、循環する緑色単球の％は一貫により高く、８日目頃に最高になった。ＧＦＰは通常マウスの単球中には見られないので、緑色細胞が存在したということはＧＦＰタンパク質が発現し、それに続き血液中を循環する単球の中にプラスミドが入ったことに整合する。
【００６７】
より高分子量で（〜３５００００ダルトン）ゲル化特性のより良好なオオムギのβ−グルカンを用いて、この実験を繰り返した。図１０では、同様の動力学が見られ、緑色細胞のパーセントはより高く、それが８日目から１１日目まで続いた（１群あたりマウスのｎ＝４）。
【００６８】
定量的逆転写ＰＣＲ分析を用いてＧＦＰｍＲＮＡの存在を調べた。ｐＥＧＦＰ−ｃ１プラスミド５０μｇを高分子量のβ−グルカン（〜３５００００ダルトン）４００μｇに混合し生理食塩水１００μｌに加えたものを経口胃管栄養法によりマウスに摂取させ、対照のマウスにはプラスミドを単独で与えた。末梢血液５０μｌを用いて全ＲＮＡを抽出し、逆転写し、以前に記載されている方法の修飾を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った４。内部標準としてハウスキーピング遺伝子マウスＧＡＰＤＨを使用する。既知のＧＦＰ及びＧＡＰＤＨ標準を用いて、転写レベルを計算する。ＧＦＰ及びＧＡＰＤＨに対し個々に転写単位を計算し、結果はＧＡＰＤＨに対するＧＦＰの比として計算される。図１１では、平均ＲＮＡレベル（ＧＦＰ／ＧＡＰＤＨ）は、グルカン群対非グルカン群（１群あたりマウスのｎ＝４）の比で表される。ＧＦＰｍＲＮＡは、１０日目まで検出された。
（参考文献５）
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【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】患者における転移の神経芽細胞腫の治療においてオオムギ（１→３），（１→４）−β−Ｄ−グルカンに抗体を加えたもの。多数の化学療法の治療レジメンに対して難治性の転移の神経芽細胞腫を有する患者の治療前及び治療後のＭＩＢＧスキャン。患者に、抗ＧＤ２抗体３Ｆ８の静脈注射（１０ｍｇ／ｍ２／日）を全１０日間、それに加えて同じ期間にわたり経口のオオムギのβ−グルカンを投与した。図１Ａは、患者のベースライン時のＭＩＢＧスキャンを示す。広範囲の骨転移が、大腿、腓骨、骨盤、肋骨、左肩甲骨、右鎖骨、上腕、頭蓋、及び脊柱に見られる。心臓、肝臓、胃、及び大腸の取込みは生理的である。図１Ｂに、同じ患者に３Ｆ８にグルカンを加えたもので１サイクルの治療を行った２ヵ月後のＭＩＢＧスキャンを示す。転移部位は、大幅に改善されている。
【図２】ＳＣＩＤマウスにおける皮下ヒトリンパ腫異種移植片の治療におけるオオムギの（１→３），（１→４）β−Ｄ−グルカンに抗体を加えたもの。樹立された皮下のＤａｕｄｉ（ｎ＝９）（図２Ａ）、Ｈｓ４４５（ｎ＝５）（図２Ｂ）、ＥＢＶ誘導ＬＣＬ（ｎ＝９）（図２Ｃ）、及びＲＰＭＩ６６６６（ｎ＝１０、データは示さず）の異種移植片を有するＳＣＩＤマウスに、リツキシマブ２００μｇを週２回８用量静脈注射したもの（■）、（１→３），（１→４）β−Ｄ−グルカン４００μｇを２９日間毎日胃管栄養法で経口投与したもの（△）、又はリツキシマブと（１→３），（１→４）β−Ｄ−グルカンとの組合せ（ｘ）、或いは非処置（◆）。腫瘍の増殖パーセントをｙ軸に、治療開始後の日数をｘ軸上にプロットした。エラーバーは、ＳＥＭを表しており、リツキシマブ単独及び組合せ群にのみ示されている。異種移植片すべてに対して、組合せ治療だけが腫瘍の増殖の減少に関係していた。リツキシマブに加えてβ−グルカンを摂取した群における１日あたりの腫瘍増殖の減少率は、リツキシマブ単独でＤａｕｄｉに対し２．０％（９５％ＣＩ  １．３〜２．７％；ｐ＜０．０００５）であったのに比べ、異種移植片ＥＢＶ誘導ＬＣＬで０．８％（９５％ＣＩ  ０．４〜１．２％；ｐ＜＝００１）、Ｈｓ４４５で２．２％（９５％Ｃ．Ｉ．１．２〜３．２％；ｐ＝０．０００９）、及びＲＰＭＩ６６６６で１．８％（９５％ＣＩ  １．０〜２．７％；ｐ＜０．０００２；データは示さず）であった。
【図３】ＳＣＩＤマウスにおける播種性ヒトリンパ腫異種移植片の治療におけるオオムギの（１→３），（１→４）−β−Ｄ−グルカンに抗体を加えたもの。Ｄａｕｄｉ細胞（図３Ａ）又はＨｓ４４５細胞５×１０６個を通常の生理食塩水１００μｌに懸濁し、ＳＣＩＤマウスに静脈注射（ＩＶ）した。リツキシマブ２００μｇを週２回８用量静脈注射（破線）、（１→３），（１→４）Ｄ−β−グルカン４００μｇを２９日間毎日胃管栄養法で経口投与（点線）、又はリツキシマブと（１→３），（１→４）Ｄ−β−グルカンとの組合せ（実線）、或いは非処置（太線）で、腫瘍移植１０日後にマウスの治療を開始した。腫瘍は全身に増殖し、腫瘍細胞が脊髄に浸潤するとマウスは麻痺を起こし、後肢麻痺となった。麻痺が始まったとき、又は動物の体重の１０％が失われたとき、マウスを屠殺した。図２Ａ（Ｄａｕｄｉ）、及び２Ｂ（Ｈｓ４４５）に、様々な群に対するＫａｐｌａｎ−Ｍａｉｅｒ法の生存曲線を示す。（１→３），（１→４）−Ｄ−β−グルカンとリツキシマブとの組合せで治療したマウスは、他の治療群すべてと比較して（Ｄａｕｄｉでｐ＜０．０００５、及びＨｓ４４５でｐ＝０．００１）、又はリツキシマブ単独と比較して（Ｄａｕｄｉでｐ＜０．０００５、及びＨｓ４４５でｐ＝０．０１）生存率は有意に上昇した。非治療群、リツキシマブ単独群、ＢＧ群、及びリツキシマブ＋ＢＧ群のマウスの生存率の中間値は、Ｄａｕｄｉ異種移植片でそれぞれ２７、７１、４３、及び１２４日、並びにＨｓ４４５異種移植片でそれぞれ１２、１６、３１、及び２４３日であった。
【図４】ヒト神経芽細胞種の治療におけるオオムギのβ−グルカンの存在下での３Ｇ６（抗ＧＤ２ＩｇＭ抗体）の用量反応曲線を示す図である。ＬＡＮ１神経芽細胞腫細胞を２００万個、無胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下異種移植した。各群５匹のマウスで治療を開始し、腫瘍移植２週間後に、肉眼で見える腫瘍は直径０．７〜０．８ｃｍに達した。３Ｇ６群（黒塗り四角）を、週２回、３Ｇ６  ２００μｇを眼窩後方叢による静脈注射で治療した（Ｍ及びＴｈ）。３Ｇ６＋ＢＧ群は、週２回、ｉ．ｖ．の３Ｇ６  ２００μｇに加えて全１４〜１８日間毎日経口のβ−グルカン（ＢＧ）４００μｇを胃管栄養法により投与して治療した。３Ｇ６は、３つの異なる用量で投与した（白抜き三角は用量あたり８μｇ、白抜き四角は４０μｇ、白抜き丸は２００μｇ）。ＢＧ群（黒塗り丸）は、経口のβ−グルカン４００μｇを単独で投与した。治療１日目から腫瘍の大きさを測定し、最大直径の積を治療０日目の大きさのパーセント値として表した。垂直棒は標準誤差を表し、分かりやすくするために４群のみに描いた。ＢＧ単独及び３Ｇ６単独では、抗腫瘍作用を示さなかったが、ＢＧ＋３Ｇ６  ２００μｇ群は、高度に有意の腫瘍の縮小及び抑制を示し、３Ｇ６に用量依存であった（ｐ＜０．０５）。
【図５】イースト（１→３），（１→６）−β−Ｄ−グルカンの存在下で３Ｇ６（抗ＧＤ２ＩｇＭ抗体）を用いたヒト神経芽細胞腫の治療を示す図である。ＬＡＮ１神経芽細胞腫細胞２００万個を、無胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下異種移植した。各群５匹のマウスで治療を開始し、腫瘍移植２週間後に、肉眼で見える腫瘍は直径０．７〜０．８ｃｍに達した。３Ｇ６群（黒塗り四角）を、３Ｇ６  ２００μｇを眼窩後方叢による静脈注射で全部で週２回合計５用量で治療した（Ｍ及びＴｈ）。粒状のイーストグルカン群（黒塗り三角）は、経口の粒状イーストグルカン４００ｕｇを単独で投与した。３Ｇ６＋全イースト微粒子（白抜きひし形）は、ｉｖの３Ｇ６  ２００μｇを週２回に加えてイースト粒子４００μｇを全１４〜１８日間毎日胃管栄養法により投与して治療した。３Ｇ６＋可溶性イーストグルカン群は、ｉｖの３Ｇ６  ２００μｇを週２回に加えて可溶性イーストグルカン４００μｇを全１４〜１８日間毎日胃管栄養法により投与して治療した。３Ｇ６＋粒状イーストグルカン群は、ｉｖの３Ｇ６  ２００μｇを週２回に加えて粒状イーストグルカン４００μｇを全１４〜１８日間毎日胃管栄養法により投与して治療した。治療１日目から腫瘍の大きさを測定し、最大直径の積を治療０日目の大きさのパーセント値として表した。垂直棒は標準誤差を表し、分かりやすくするために４群のみに描いた。グルカン単独及び３Ｇ６単独では、抗腫瘍作用を示さなかったが、可溶性及び粒状イーストグルカンを３Ｇ６群と組み合わせると、高度に有意な腫瘍の縮小及び抑制が示された（ｐ＜０．０５）。
【図６】オオムギ及びイーストのβ−グルカンの存在下で３Ｆ８（抗ＧＤ２ＩｇＧ抗体）を用いたヒト神経芽細胞種の治療を示す図である。ＬＡＮ１神経芽細胞腫細胞２００万個を、無胸腺Ｂａｌｂ／ｃマウスに皮下異種移植した。各群５匹のマウスで治療を開始し、腫瘍移植２週間後に、肉眼で見える腫瘍は直径０．７〜０．８ｃｍに達した。３Ｆ８群（黒塗りひし形）は、３Ｆ８  ２００μｇを眼窩後方叢による静脈注射で週２回全５用量の治療をした（Ｍ及びＴｈ）。オオムギグルカン群（黒塗り四角）は、オオムギグルカンを単独で４００μｇ投与した。３Ｆ８＋オオムギグルカン群（白抜きひし形）は、ｉｖの３Ｆ８  ２００μｇを週２回に加えてオオムギグルカン４００μｇを全１４〜１８日間毎日胃管栄養法により投与して治療した。３Ｆ８＋可溶性イーストグルカン群（白抜き四角）は、ｉｖの３Ｆ８  ２００μｇを週２回に加えて可溶性イーストグルカン４００μｇを全１４〜１８日間毎日胃管栄養法により投与し治療した。治療１日目から腫瘍の大きさを測定し、最大直径の積を治療０日目の大きさのパーセント値として表した。垂直棒は標準誤差を表している。グルカン単独及び３Ｆ８単独では、抗腫瘍作用を示さなかったが、オオムギ及び可溶性イーストグルカンを３Ｆ８群と組み合わせたると、高度に有意な腫瘍の縮小及び抑制が示された（ｐ＜０．０５）。
【図７】リツキサン、及びオオムギ又はイーストのβ−グルカンを用いたＳＣＩＤマウスにおける播種性ヒトリンパ腫の治療を示す図である。Ｄａｕｄｉ細胞５×１０ｅ６を通常の生理食塩水１００μｌに懸濁し、ＳＣＩＤマウスに静脈注射（ＩＶ）した。腫瘍は全身に増殖し、腫瘍細胞が脊髄に浸潤するとマウスは麻痺を起こし、後肢麻痺となった。麻痺の開始時、又は動物の体重の１０％が失われたとき、マウスを屠殺した。腫瘍細胞の注射後１０日目に治療を開始した。リツキシマブ（カリフォルニア州、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ製）４０μｇを週２回全８投与静脈注射し、グルカン４００μｇを２９日間毎日胃管栄養法により経口投与した。マウスは、毎週体重を測定し、少なくとも１日１回は臨床上の観察を行った。リツキサンプラスオオムギグルカン、又はリツキサンプラスイースト可溶性グルカンを投与されたマウスは、高度に有意の生存率の延長が見られた（ｐ＜０．０５）。
【図８】ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）より購入したｐＥＧＰ−Ｃ１ベクターを示す図である。
【図９】グルカンが単球への遺伝子トランスファーを促進することを示す図である。
【図１０】より高分子量のβ−グルカン及び遺伝子トランスファーを示す図である。
【図１１】循環している単球中にＧＦＰｍＲＮＡが存在することを示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月12日(2007.7.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌又は腫瘍細胞を根絶又は抑制するために哺乳動物に投与される少なくとも１つの抗体の相乗的な治療効果を達成するための、１，３−β結合を含む基本骨格を有する免疫調節又は免疫刺激グルカンを含む、医薬組成物。
【請求項２】
癌又は腫瘍細胞を根絶又は抑制するために哺乳動物に投与される少なくとも１つの抗体の相乗的な治療効果を達成するための、医薬組成物であって、
（ａ）１，３−β結合を含む基本骨格を有し、哺乳動物に経口投与されるグルカンと、
（ｂ）哺乳動物に投与され、癌又は腫瘍細胞に有効な、少なくとも１つの抗体と
を組み合わせることを特徴とする、医薬組成物。
【請求項３】
前記グルカンが、イースト、好ましくはサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces Cerevisiae)に由来する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記グルカンが、以下の構造
【化１】
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を含む、請求項１から３の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体が、モノクローナル抗体、癌に対する抗体、又は腫瘍結合抗体である、請求項１から４の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体が、化学療法剤、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗テネイシン抗体(anti-tenascin antibodies)、ＭｏＡｂ  Ｍ１９５、ダクルジマブ（Ｄａｃｌｕｚｉｍａｂ）、抗ＴＡＧ７２抗体、Ｒ２４、ハーセプチン、リツキシマブ、５２８、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｃ２２５、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、又はＭｏＡｂ３Ｆ８である、請求項１から５の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が、神経芽細胞種、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、エプスタインバー関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫、網膜芽細胞腫、小細胞肺癌、脳腫瘍、白血病、扁平上皮癌、前立腺癌、腎細胞癌、移行上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肝臓癌、胃癌、又は他の消化器系の癌である、請求項１から６の何れか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ワクチンの効果を増強することのできる、（１→３），（１→６）−β−グルカンを含む医薬組成物であって、前記ワクチンが、癌、又は感染性物質、細菌、ウイルス、真菌若しくは寄生虫に対するものである、医薬組成物。
【請求項９】
β−グルカンを含む、ペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はプラスミドを送達するための組成物。
【請求項１０】
癌又は腫瘍細胞を根絶又は抑制するための、キット又は投与装置であって、
（ａ）１，３−β結合を含む基本骨格を有し、哺乳動物に経口投与されるグルカンと、
（ｂ）癌又は腫瘍細胞に有効な少なくとも１つの抗体と
を含む、キット又は投与装置。
【請求項１１】
癌又は腫瘍細胞を根絶又は抑制するために使用される少なくとも１つの抗体の相乗的な治療効果を達成するための製剤又は医薬を製造するための、１，３−β結合を含む基本骨格を有する免疫刺激グルカンの使用。
【請求項１２】
前記抗体が、モノクローナル抗体、癌に対する抗体、又は腫瘍結合抗体である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗体が、化学療法剤、抗ＣＥＡ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗テネイシン抗体(anti-tenascin antibodies)、ＭｏＡｂ  Ｍ１９５、ダクルジマブ（Ｄａｃｌｕｚｉｍａｂ）、抗ＴＡＧ７２抗体、Ｒ２４、ハーセプチン、リツキシマブ、５２８、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、Ｃ２２５、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、又はＭｏＡｂ３Ｆ８である、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記癌が、神経芽細胞種、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、エプスタインバー関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫、網膜芽細胞腫、小細胞肺癌、脳腫瘍、白血病、扁平上皮癌、前立腺癌、腎細胞癌、移行上皮細胞癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、肝臓癌、胃癌、又は他の消化器系の癌である、請求項１１から１３の何れか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
2007531700.tif 000027