(57)【要約】本発明は、ヒトまたは非ヒトの生物学的サンプル中の細胞の増殖状態を評価する方法であって、クロマチン構築因子−１（略してＣＡＦ−１）サブユニットを増殖マーカーとして用いる工程を包含する方法に関する。癌診断または予後、および治療中の腫瘍応答のモニタリングのための適用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは非ヒトの生物学的サンプル中の細胞の増殖状態を評価する方法であって、
ｐ６０およびｐ１５０クロマチン構築因子（略してＣＡＦ−１）サブユニットを増殖マーカーとして検出する工程を包含する方法。
【請求項２】
検出は、タンパク質レベルで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サブユニットのリン酸化された誘導体を検出する工程と包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
全細胞フラクションまたは細胞核中のＣＡＦ−１サブユニットのクロマチン結合フラクションまたはそれらのリン酸化された誘導体を検出する工程を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
検出は、免疫蛍光法、ウエスタン・ブロット、タンパク質チップおよび好ましくは、免疫細胞化学または免疫組織化学によって行われる、請求項２〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
抗ＣＡＦ−１抗体または個々のＣＡＦ−１サブユニットまたはそれらのフラグメントを標的にする抗体を使用する工程を包含し、該抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナ抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＡＦ−１サブユニットの検出は、ＲＮＡレベルで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プライマー対： ｐ６０−フォワード，CGGACACTCCACCAAGTTCT；ｐ６０−リバース，CCAGGCGTCTCTGACTGAAT；ｐ１５０−フォワード， GGAGCAGGACAGTTGGAGTG；ｐ１５０−リバース，GACGAATGGCTGAGTACAGA
を使用する工程を包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
癌の診断または予後、または、治療中の腫瘍応答のモニタリングにおいて、ＣＡＦ−１を使用する工程と包含する、請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
Ｋｉ−６７またはＰＣＮＡまたはＭＣＭとともに、バイオマーカーとしてＣＡＦ−１を使用する工程を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
乳癌、大腸癌、胃癌、腎臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮内膜癌および頚部癌等の固形腫瘍の場合において細胞増殖を評価するための、請求項９または１０に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床診療における新規増殖マーカーおよび癌の予後または診断および治療中の腫瘍応答のモニタリングのためのそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
真核細胞において、核ＤＮＡは、タンパク質と共にクロマチンの形態で密集状態に詰められる。各細胞周期の間に、ＤＮＡは複製され、かつ、クロマチンの構造は再確立されなければならず、これは、ヒストン合成との緊密な調整を必要とする。したがって、これらの事象のいずれかに影響を及ぼす欠陥は、細胞周期の進行に影響を与える可能性がある。ヒストンの沈着は、特に、この関連において興味深い。ヒストンの沈着は、ヒストンの利用性および最近になって大きな関心を得たタンパク質のファミリーをシャペロンが示す中の補助因子の支援の両方に依存するからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
所定の構築因子（assembly factor）がどのように制御されるかおよびそれらが細胞周期の調節のための生理学的な関連ターゲットを示し得るかどうかの見識を得るために、ヒトの健康の関心の中で、本発明者らは、培養された細胞および臨床サンプルの両方における細胞増殖に応じたそれらの発現を検討した。具体的には、目的は、増殖中の細胞と静止状態の細胞との間の相違を分析することである。
【０００４】
本発明者らは、特に、ヒストン・シャペロン、その中でも、３つのサブユニットからなるクロマチン構築因子（Chromatin Assembly Factor）−１（略して、ＣＡＦ−１）に焦点を当て、クロマチン構築因子ＨＩＲＡの発現は一定のままであるのに対して、この特定のヒストン・シャペロンは、周期中の集団と比較して静止状態の細胞において大きくダウンレギュレートされたことを見出した。
【０００５】
本発明者らにより得られた結果からみて、前記の特定のヒストン・シャペロンは、増殖状態の良好な指標であるようである。
【０００６】
したがって、本発明の目的は、細胞群の増殖状態を評価するための新しいマーカーおよび方法を提供することである
本発明の別の目的は、癌の病理学の関連でこのようなマーカーおよび方法の使用を含む。
【０００７】
それ故に、本発明は、ヒトまたは非ヒトの生物学的サンプル中の細胞の増殖状態を評価する方法であって、ＣＡＦ−１サブユニットの増殖マーカーとしての使用を含む方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＣＡＦ−１は、新しく合成されたＤＮＡ上へのヒストンＨ３およびＨ４の沈着を促進するその能力について知られている。ＣＡＦ−１は、ｐ１５０、ｐ６０およびｐ４８サブユニットを含むヘテロトリマー複合体である。ｐ４８サブユニットは、エスコートタンパク質であり、これは、ヒストン代謝に必要とされる複数の追加的な複合体の一部である。
【０００９】
実施例に示されるように、ＣＡＦ−１は、細胞増殖の強力なマーカーであることが分かった。
【００１０】
静止状態からの脱却の際に、ＣＡＦ−１サブユニットは、細胞周期の入った後の早期にＳ期の前に検出される。ＣＡＦ−１の全体的なプールは、クロマチンと緊密に関連するフラクション（活性分子に対応すると考えられている）とは区別される。各プールに対応するＣＡＦ−１タンパク質の量は、細胞の増殖状態と直接的に相関した。この結果は、細胞中の利用可能なＣＡＦ−１の量の調節とクロマチンレベルでのその使用量との間の関連を支持する。さらに、本発明者らは、増殖状態に基づいて比較がなされた場合にＣＡＦ−１の発現がＲＮＡレベルで大きく調節されるらしいことを見出した。
【００１１】
本発明の一実施形態によると、前記検出は、タンパク質レベルで行われる。
【００１２】
本発明の方法は、それ故に、ＣＡＦ−１サブユニット、有利にはＣＡＦ−１ｐ６０を検出する工程を包含する。
【００１３】
本発明の方法はまた、それのリン酸化された誘導体を検出する工程を包含する。
【００１４】
別の実施形態では、本発明の方法は、細胞核中の全細胞フラクションまたはＣＡＦ−１サブユニットのクロマチン結合フラクションまたはそのリン酸化された誘導体を検出する工程を包含する。
【００１５】
有利には、タンパク質レベルでの検出法は、例えば、免疫蛍光法、ウェスタン・ブロット、タンパク質チップ、好ましくは免疫細胞化学または免疫組織化学によって行われる。
【００１６】
前記方法は、有利には、当業者によって知られる通常のプロトコールを用いることによって行われる。
【００１７】
ヒトまたは非ヒトの生物学的サンプル中の細胞の増殖状態を評価する方法は、抗ＣＡＦ−１抗体または個々のＣＡＦ−１サブユニットまたはそのフラグメントを標的にした抗体により行われる。前記抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、ＣＡＦ−１の検出は、ＲＮＡレベルで行われる。プライマー対の例は、ｐ６０−フォワード：CGGACACTCCACCAAGTTCT;ｐ６０−リバース：CCAGGCGTCTCTGACTGAAT、ｐ１５０−フォワード：GGAGCAGGACAGTTGGAGTG;ｐ１５０−リバース：GACGAATGGCTGAGTACAGAを含む。
【００１９】
有利には、ＲＮＡレベルでの検出法は、例えば、定量的または半定量的ＰＣＲ、ノーザンブロットまたはＲＮＡチップによって行われる。
【００２０】
前記方法は、有利には、当業者によって知られる通常のプロトコールを用いることによって行われる。
【００２１】
それ故に、本発明は、ヒトサンプル中の増殖細胞と静止細胞とを区別する手段を提供する。
【００２２】
本発明は、特に、癌の診断、予後、または治療中の腫瘍応答のモニタリングにおける前記方法の使用に関する。
【００２３】
所定タイプの癌において、細胞増殖の評価は、腫瘍の特徴付けさらには生存予測および患者のモニタリングのために必須である。現在、免疫細胞学および組織化学において細胞増殖を評価するための唯一の日常的に用いられるマーカーは、Ｋｉ−６７およびより少ない範囲ではあるがＰＣＮＡである。ＭＣＭタンパク質発現の評価が、最近になって、新規な増殖マーカーとして導入された。
【００２４】
本発明のＣＡＦ−１バイオマーカーは、固形腫瘍（乳癌、大腸癌、胃癌、腎臓癌、甲状癌、前立腺癌、子宮内膜癌および頚部癌等）の場合に細胞増殖を評価するために特に有用である。抗原アンマスキング工程が細胞学的標本上で必要とされないので、ＣＡＦ−１は、例えば、Ｋｉ−６７の検出を超える技術的な利点を提示する。これは、染色処理のスピードアップそして最も重要には染色の変動性の低減を可能にし得る。
【００２５】
本発明の他の特徴および利点は、以下に、各図面を参照しながら与えられることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（材料および方法）
（細胞培養、同調化）
１０％のウシ胎仔血清、１０ｍｇ／ｍＬの抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）および２ｍＭのＬ−グルタミン（Invitrogen，Carlsbad，ＣＡ）により補給された適切な培地中のヒーラ細胞ＭＣＦ７、Ｔ４７ＤおよびＨｓ５７８Ｔ乳房腫瘍細胞、Ｈｓ５７８Ｂｓｔ乳房正常細胞（LGC Promochem，Molsheim，フランス）および１ＢＲ３皮膚主要線維芽細胞（ペトリ皿（Falcon Plastics，Cockeysville，ＭＤ）において生育させられた）。ヒーラおよびＭＣＦ７細胞はＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）、Ｔ４７Ｄ細胞はＲＰＭＩ、Ｈｓ５７８Ｔ細胞は１０ｍｇ／ｍＬのインシュリン（Invitrogen）により補足されたＲＰＭＩ、Ｈｓ５７８Ｂｓｔは３０ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（Epidemal Growrh Factor：ＥＧＦ）（PeproTech，Rocky Hill，ＮＪ）により補足されたＤＭＥＭ、１ＢＲ３細胞はＭＥＭ（Modified Eagle’s Medium）において生育させられた。正常Ｈｓ５７８Ｂｓｔ細胞系は、Ｈｓ５７８Ｔ腫瘍細胞系と同一の患者に由来する。
【００２７】
ヒーラ細胞は、ダブルチミジンブロック：２ｍＭのチミジン（Sigma Aldrich，Lyon，フランス)中の25時間のブロック、３０μＭの２’−デオキシシチジン（Sigma Aldrich）中の１２時間のリリース、２ｍＭのチミジン中の２５時間のブロック、続いて、３０μＭの２’−デオキシシチジン中の３時間、８時間および１４時間のリリースによってＧ１、ＳおよびＧ２に同調させられ、Ｓ、Ｇ２およびＧ１細胞がそれぞれ集められた。ヒーラ有糸分裂細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのノコダゾール（Sigma Aldrich）による１９時間の処理後の有糸分裂のシェイクオフ（shake-off）によって得られた。１ＢＲ３細胞は４日の血清飢餓によって、ＭＣＦ７細胞は１０ｎＭのＩＣＩ  １８２７８０  エストロゲンレセプターアンタゴニスト（Fischer Bioblock Scientific，Ilkirch，フランス）による４８時間の処理によってＧ０にブロックされた。１ＢＲ３細胞は、培養培地中に戻し血清を加えることによって、ＭＣＦ７細胞は１００ｎＭの１７−βエストラジオールＥ２（Sigma Aldrich）による処理によってＧ０からリリースされた。同調培養分析は、ヨウ化プロピジウムインターカレーション（Sigma Aldrich）後にフローサイトメトリーによって行われた。複製中のＳ期細胞の百分率は、ＢｒｄＵ（Sigma Aldrich）取込み後にフローサイトメトリーによって測定された。
【００２８】
（抗体）
用いられた一次抗体は、抗ｐ１５０  ｍＡｂ７６５５および抗ｐ６０  ｍＡｂ８１３３（Abcam，Cambridge，英国）、抗ｐ６０  ｐｏｌｙ、我々の研究所で生産された組み換えタンパク質（Agrobio，Villeny，フランス  からの免疫化）を用いて得られた抗ＡＳＦ１（S.E.Polo，Cancer Research，2004，64：2371-2381）、抗ＨＰ１α  ２Ｇ９（Euromedex，Mundolsheim，フランス）、抗ＨＩＲＡ、抗Ｋｉ−６７  ＭＩＢ１（Dako，Carpinteria，ＣＡ）、抗ＰＣＮＡ  ＰＣ１０（Dako）、抗ＭＣＭ２  ＢＭ２８（BD Pharmingen，San Diego，ＣＡ）、抗ＢｒｄＵ（Harlan SeraLab，Loughborough，英国）、抗ｃｄｃ６  ｓｃ−８３４１（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，ＣＡ）、抗βアクチン  ＡＣ１５（Sigma Aldrich）であった。抗ｐ６０  ｍＡｂ８１３３がｐ６０のリン酸化された形態のみを認識するのに対して、抗ｐ６０  ｐｏｌｙは、リン酸化された形態およびリン酸化されていない形態の両方を認識する。ＦＩＴＣまたはテキサスレッドに結合した二次抗体は、Jackson ImmunoResearch Laboratories，West Grove，ＰＡから購入された。
【００２９】
（免疫蛍光法）
パラホルムアルデヒド固定細胞上の免疫蛍光法は、画像取得のためにＨＢＯ１００水銀ランプ（Osram，ミュンヘン、ドイツ）、CoolSnap FXカメラ（Roper Scientific，Duluth，ＧＡ）およびMetamorph 4.6ソフトウェア（Universal Imaging Co．，Marlow，ＧＢ）を備えた落射蛍光顕微鏡（epifluorescence microscope）（ＤＭＲＨＣモデル；Leica，Deerfield，ＩＬ）を用いて記載されたように行われた。画像は、Adobe Photoshop 5.5ソフトウェア（San Jose，ＣＡ）を用いて処理された。陽性染色された細胞の百分率は、各場合において少なくとも５００の細胞を計数することによって得られた。ＢｒｄＵ免疫検出が記載されたように行われた。
【００３０】
（細胞抽出物，ウェスタン・ブロット）
核、サイトゾル、全体およびＴｒｉｔｏｎ細胞の各抽出物が記載されるように調製され、かつウェスタンブロッティングに付された。シグナルの線形性をチェックするために各サンプル毎に連続的な希釈物が加えられた。タンパク質量は、Bradford分析（核およびサイトゾルの各抽出物について）、ベータアクチンレベルの検出（全抽出物について）またはポンソー（Ponceau）染色（Ｔｒｉｔｏｎ細胞抽出物について）によって推定された。定量化は、Quntity One 4.2.1ソフトウェアを用いて行われた。
【００３１】
（ＲＮＡ抽出物、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット）
全ＲＮＡは、ＲＮＡ  ＮＯＷ（Biogentex，Seabrook，ＴＸ）を用いて製造業者の指示書に従って抽出された。ゲノムＤＮＡによるいかなる汚染も回避するために、ＤＮＡは、３７℃で３０分にわたりＤＮアーゼ１  ＲＮアーゼ  ｆｒｅｅ  ＲＱ１（Promega，Madison，ＷＩ）によって分解された。ＤＮアーゼ１は、次いで、６５℃で１０分にわたり加熱することによって不活化された。
【００３２】
ｐ１５０およびｐ６０のＲＮＡレベルの定量化は、内部対照としてのベータアクチンのＲＮＡレベルに対して行われた。プライマー対（Sigma Genosys，Cambridge，英国）は、Oligo6ソフトウェアを用いてデザインされた：ｐ６０−フォワード，CGGACACTCCACCAAGTTCT；ｐ６０−リバース，CCAGGCGTCTCTGACTGAAT；ｐ１５０−フォワード，GGAGCAGGACAGTTGGAGTG；ｐ１５０−リバース，GACGAATGGCTGAGTACAGA；ベータアクチン−フォワード，ACCCCGTGCTGCTGACCGA； ベータアクチン−リバース，GCACAGCCTGGATAGCAAC。全ＲＮＡ抽出物は、対応するリバースプライマーを用いるOmniscript RT Kit（QIAGEN，Santa Clarita，ＣＡ）を用いて各ＲＴ反応に用いられた（増幅特異性を増加させるために別のリバースプライマー（GGCACAAAGAAACCATCGTC）を必要とするＨｓ５７８Ｂｓｔ細胞系におけるｐ１５０  ＲＴを除く）。定量的増幅は、LightCycler Fast Start DNA Master SYBR Green I Kit（Roche Diagnostics，Basel，スイス）により、製造業者の指示書に従い、４５サイクルの間に、６０℃のハイブリダイゼーション温度で行われた。増幅効率は、ＲＴ産物の連続の１／５希釈物から決定された。全増幅を１００％効果的であるみなして、内部対照のベータアクチンに対して規格化されたｐ１５０またはｐ６０のＲＮＡの相対量は、次のように計算された：２−ΔΔＣＴ，ここで、ΔΔＣＴ＝（ＣＴ  ターゲット−ＣＴ  アクチン）サンプル−（ＣＴ  ターゲット−ＣＴ  アクチン）キャリブレータ、ターゲットは、ｐ１５０またはｐ６０であり、キャリブレータは、非同調ＭＣＦ７細胞として任意に選ばれる。
【００３３】
１５μｇの各ＲＮＡサンプルが、下記改変を伴うノーザンブロット分析に付された。ＲＮＡは、終夜、Hybond N+膜（Amersham Bioscience，Orsay，フランス）に移され、その後に、ＵＶクロスリンクが行われた。膜ハイブリダイゼーションが、６０℃で終夜、ＤＮＡプローブを含むRapid Hyb Buffer（Amersham Biosciences）において行われた。ヒトのベータアクチンｃＤＮＡ対照プローブ（１．８ｋｂ）は、BD Clontech（San Jose，ＣＡ）から購入され、ｐ１５０およびｐ６０のｃＤＮＡプローブ（それぞれ１．２ｋｂ）は、対応する全長ｃＤＮＡ（１０）を含むプラスミドの二重消化および消化産物のアガロースゲルからの精製によって得られた。［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（５０μＣｉ／２５ｎｇのＤＮＡプローブ）を備えたRediprime IIキット（Amersham Biosciences）を用い、製造業者の指示書に従ってランダムプローブラベリングが行われた。検出は、PhosphorImager STORM 860（Molecular Dynamics，Sunnyvale，ＣＡ）を用いて達成された。
【００３４】
（患者および標本）
９８人の患者から得られた１００の胸部腫瘍サンプルがこの研究に含まれた。診断調査の前に、各患者は、インフォームド・コンセントが与えられた。患者の年齢は１８歳から９８歳の範囲であった（平均：５６．８歳）。腫瘍は、事例中、触知不能（Ｔ０）は８％、Ｔ１は１７％、Ｔ２は４９％、Ｔ３および４は２６％であった。６４人の患者は、リンパ節転移陰性であり、３４人は、触知可能な腋窩リンパ節症であった。キュリー研究所（パリ，フランス）において診察を専門とする病理学者によって細針吸引が行われた。触知不能な腫瘍は、超音波誘導技術を用いてサンプリングされた。吸引物は、診断のため２つのスライド上に、かつ、免疫細胞化学研究のため３つの他のスライド（Superfrost +）上に塗抹された。組織学的に、８つの腫瘍は良性であり（線維腺腫：５；膿瘍：２；類結核性肉芽腫：１）、９２が悪性であることが判明した。悪性疾患のうち、１つは、原位置性環状（ducal in situ）であり、７９は浸潤性環状であり、８は浸潤性小葉状（lobular）であり、４は他のタイプの浸潤性の悪性疾患に属していた。癌腫は、I（１３事例）、II（４５事例）およびIII（３１事例）に等級分けされた。１１の事例は、等級分け不能であった。エストロゲンレセプター（ＥＲ）の状態は、９０事例の組織断面についての免疫組織化学によって測定され、６４事例において陽性を示す一方で、２６が陰性を示した。
【００３５】
（ＤＮＡのフローサイトメトリー）
二重識別モジュール（doublet discrimination module）を備えたFACScanフローサイトメータ（Becton Dickinson，San Jose，ＣＡ）を用いて全ＤＮＡのフローサイトメトリー分析が行われた。核ＤＮＡ内容物は、細針吸引（ＦＮＡ）によって得られた細胞懸濁液を用いたフローサイトメトリーによって測定された。臨床サンプルは、点検の後、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａの手順を用いて染色された細胞遠心分離された調合液についての光顕微鏡法によって分析され、少なくとも８０％の材料が腫瘍核からなることが実証された。ヨウ化プロピジウムを用いて染色された少なくとも１０，０００の核からのデータファイルがリスト方式で取得された。０．９〜１．１の範囲のＤＮＡ指数を有する腫瘍は二倍体として分類され、０．９未満または１．１超の単一のＤＮＡ指数を有するものは異数体として分類され、その他は多倍体として分類された。Ｓ期の割合は、ModFit LT 2.0ソフトウェア（Verity Software House，Topsham，Maine）を用いて計算された。腫瘍は、４１事例においてＤＮＡ二倍体、５８事例においてＤＮＡ異倍体／多倍体（１事例において、倍数性が測定され得なかった）。Ｓ期は、０．３〜３１．４％の範囲であった（平均：５．７６％）。Ｓ期の百分率は、４つのグループ（増殖指数）：非常に低い（０〜２％）、低い（２〜４．５％）、中間（４．５〜１０％）および高い（＞１０％）；のキュリー研究所での臨床研究のために共通に用いられる基準にさらに分割された。
【００３６】
（免疫細胞化学、免疫組織化学）
パラホルムアルデヒド固定塗抹またはホルマリン固定パラフィン包理組織断片（４μｍ）上で、適切な抗体であるVectastain Elite ABCペルオキシダーゼ・キット（Vector Laboratories，Peterborough，英国）およびLiquid DAB Substrate Chromogen System（Dako）を用い、製造業者の指示書にしたがってｐ６０、Ｋｉ−６７およびＰＣＮＡの免疫染色が行われた。パラフィン包理組織における全ての抗原検出および塗抹におけるＫｉ−６７検出のために、さらなる抗原回復工程（クエン酸塩緩衝剤  ｐＨ６．１およびマイクロ波加熱）が行われ、その後に、抗体のインキュベーションが行われた。細胞は、ヘマトキシリン（Merck，Darmstadt，ドイツ）により対比染色された。
【００３７】
（統計分析）
免疫細胞化学実験中の陽性染色された細胞の百分率は、２の独立したオブザーバにより各事例において少なくとも１０００の細胞を計数することによって得られた。２つのオブザーバ間の一致は、級内相関係数を算出することによって明らかにされ、これにより、下記の統計分析に平均値を用いることができた。相関は、スピアマン順位検定を用いて評価された。多数のグループ間の平均の比較は、分散が均質な場合には分散の分析によって（バートレット検定にしたがう）、または、クラスカル・ウォリス検定によって測定された。統計的有意性は、ｐ＜０．０５として利用された。全体的な生存率は、腫瘍切除の日から死または最後の調査の日までで算出された。生存率曲線は、カプラン・マイヤー推定量から導き出され、ログランク検定によって比較された。単一変量Ｃｏｘ回帰も行われた。統計的有意性は、ｐ＜０．０５として利用された。統計分析は、SPlus 2000ソフトウェアを用いて行われた。
【００３８】
（臨床標本）
腎臓癌、大腸癌、胃癌、甲状腺癌、前立腺癌、頚部癌、子宮内膜癌および乳癌の事例の保管（archival）ホルマリン固定、パラフィン包理組織および臨床検査材料が、アテネ大学（ギリシャ）の医学部の種々の学科から得られた（臨床病理の詳細は、表１において利用可能である）。４μｍの組織断片が、ＣＡＦ−１  ｐ６０（ｍＡｂ８１３３，Abcam）、Ｋｉ−６７（ＭＩＢＩ，DAKO）およびＭＣＭタンパク質（ＭＣＭ−２：ＭＣＡ１８５９；ＭＣＭ−５：ＭＣＡ１８６０，Serotec）の免疫組織化学的染色に付された。
【００３９】
（結果）
（静止細胞において、構築因子ＣＡＦ−１、ＡＳＦ１およびＨＩＲＡの発現パターンは、ＣＡＦ−１の大きなダウンレギュレーションを示した）
第１に、細胞周期の間のＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０サブユニットの発現は、同調されたヒーラ細胞に由来する全体の細胞抽出物についてのウエスタン・ブロットによって分析された。
【００４０】
結果は、図１与えられる：（Ａ）非同調（ＮＴ）細胞およびＧ１、Ｓ、Ｇ２（ダブル・チミジンブロック）およびＭ（ノコダゾール）に抑えられた同調ヒーラ細胞からの全細胞抽出物中のＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０のウエスタン・ブロット分析。各場合において、１０５個の細胞に相当する溶出液がロード（load）された。βアクチンがコーディングコントロールとして用いられる。対応するＦＡＣＳプロファイルが上側に示される。（Ｂ）ヒーラ細胞およびＭＣＦ７細胞における免疫蛍光法によって示されるＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０サブユニットの発現。ＭＣＦ７細胞は、未処理（ａ）、ＤＭＳＯ処理（ｂ）であるか、４８時間のＩＣＩ  １８２７８０  １０ｎＭ（ＤＭＳＯ中）によりＧ０にブロックされた（Ｇ０）。Ｓ期の割合（％Ｓ）およびＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０染色細胞の百分率（％Ｃ）が下に示される。バーは１０μｍである。（Ｃ）未処理（ａ）、ＤＭＳＯ処理（ｂ）またはＧ０にブロックされたＭＣＦ７細胞からの全細胞抽出物が、半定量ウエスタン・ブロットに用いられ、ＣＡＦ−１サブユニット（ｐ１５０、ｐ６０）およびＣＡＦ−１パートナー（ＡＳＦ−１、ＰＣＮＡ、ＨＰ１）の発現が分析された。簡単のため、複数の分析が類似のβアクチンレベル（内部対照）とともに並列されている。各場合において、１０５個の細胞に相当する溶出液がロードされた。（Ｄ）上側パネル：非同調増殖（ＡＳ）またはＧ０ブロックされた（Ｇ０）ＭＣＦ７細胞からのサイトゾルおよび核の各抽出物においてウエスタン・ブロットによって分析されたＨＩＲＡ、ＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０（抗ｐ６０  ｐｏｌｙ）の発現。１０μｇのタンパク質が各場合においてロードされた。下側パネル：非同調増殖（ＡＳ）またはＧ０ブロック（Ｇ０）ＭＣＦ７細胞において免疫蛍光法によって分析されたＨＩＲＡおよびＣＡＦ−１  ｐ６０（抗ｐ６０  ｐｏｌｙ）の発現。バーは１０μｍである。
【００４１】
前述のように、ｐ６０のリン酸化プロファイルの変動が検出され得た（図１Ａ）。ＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０のサブユニットは、本質的に、細胞周期の全段階において同程度の量で発現されたようであった。
【００４２】
次いで、細胞が細胞周期から抜け出て静止状態に入る場合にＣＡＦ−１発現が維持されるかどうかを決定するための実験が行われた。
【００４３】
非増殖細胞のＣＡＦ−１発現を調査するために、ｐ１５０およびｐ６０の発現レベルが、静止状態（Ｇ０）および非同調増殖細胞における細胞の免疫検出および半定量ウエスタン・ブロットによって比較された。
【００４４】
腫瘍ＭＣＦ７細胞は、ＩＣＩ  １８２７８０によってＧ０に抑止された。Ｇ０抑止は、フローサイトメトリーによって確認された：ＢｒｄＵの取り込みは、３６％から３％に降下した。９３％の細胞は、処理の後Ｇ０／Ｇ１に抑止された。Ｇ０は、低下したｃｄｃ６の発現レベル（ウエスタン・ブロットでの検出限界より下）によってＧ１から区別された。ブロック効果は９３％に推定された。
【００４５】
免疫蛍光法実験は、ＭＣＦ７細胞におけるＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０の核位置および共局在化を示した（図１Ｂ）。これらの細胞の染色も、特徴的なＳ期プロファイルを表した。最も重要には、ｐ１５０およびｐ６０を発現している細胞の数の顕著な減少が、Ｇ０ブロック後に観察された。実際に、数は、８６％から８％に降下した（図１Ｂ）。
【００４６】
Ｇ０細胞において免疫蛍光法によってＣＡＦ−１が検出されなかったのは、エピトープのマスキングまたはタンパク質発現のダウンレギュレーションに起因し得た。
【００４７】
これらの２つの可能性を区別するために、ＣＡＦ−１タンパク質レベルが、ローディングコントロールとしてのβアクチンとともに、半定量ウエスタンブロットによって調べられた。Ｇ０細胞においてＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０の発現は実際にダウンレギュレートされることが分かった（図１Ｃ）。ｐ６０のリン酸化された形態およびリン酸化されていない形態の両方が、Ｇ０において影響（それぞれ１０倍および７倍の減少）される（追加図Ｓ１は、非同調およびＧ０抑止ＭＣＦ７細胞からの全細胞抽出物において、半定量ウエスタンブロットによって分析された、ＭＣＭ２，ＣＡＦ−１  ｐ６０のリン酸化された形態（ｍＡｂ８１３３）、全ＣＡＦ−１  ｐ６０（抗ｐ６０  ｐｏｌｙ）およびＰＣＮＡの発現を、ローディングコントロールとしてのβアクチンとともに与える。静止細胞のダウンレギュレーションのレベルが各場合において与えられる。ロードされた抽出物の相対量は上方に示される）。
【００４８】
静止細胞におけるＣＡＦ−１の大きなダウンレギュレーションを考慮して、その相互作用をしているパートナーのいくつかの調節が研究された。
【００４９】
ＰＣＮＡは、最初に記載されたＣＡＦ−１  ｐ１５０のパートナーである。得られた結果は、ＰＣＮＡもＧ０においてダウンレギュレートされることを示し、これは、増殖マーカーとしてのその使用と相反しないが、ＣＡＦ−１よりはその範囲が小さい（２倍の減少；図１Ｃ、追加図Ｓ１）。これはＰＣＮＡのより長い半減期に起因しているかもしれない。より低いＰＣＮＡレベルが長期静止細胞において検出され得るからである。
【００５０】
複製および修復の間にＣＡＦ−１と相互作用しかつそれに相乗作用を与えるＡＳＦ−１、ヒストンＨ３およびＨ４シャペロンの発現が次に調べられた。ＡＳＦ−１ｂアイソフォームの発現は、Ｇ０において、非同調細胞と比較して実質的に低減させられることが分かった。ＡＳＦ１ａの全レベルはあまり影響されないが、ＡＳＦ１ａは、Ｇ０において高リン酸化される。実際に、リン酸化形態のリン酸化されていない形態に対する比率は、Ｇ０抑止後に１：３から３：１にシフトする（図１Ｃ）。
【００５１】
ＨＰ１α（他のｐ１５０パートナー）の場合、静止細胞と周期細胞との間に有意な差は見出されなかった（図１Ｃ）。
【００５２】
このため、ＣＡＦ−１は、そのパートナーのいくつかと調和して調節されるが、それでも、増殖細胞と静止細胞を区別するための最も強力なマーカーであるようである。Ｇ０におけるＣＡＦ−１のダウンレギュレーションが別のタイプの細胞系である１ＢＲ３一次線維芽細胞において確認された。結果は、追加図Ｓ２において与えられる：（Ａ）血清とともに（非同調）または血清なし（Ｇ０）で４日間生育させられた１ＢＲ３細胞において免疫蛍光法によって分析されたＣＡＦ−１  ｐ１５０（ｍＡｂ７６５５）およびｐ６０（抗ｐ６０  ｐｏｌｙ）サブユニットの発現。ｐ１５０およびｐ６０染色細胞の百分率は下に示される。バーは１０μｍである。（Ｂ）非同調細胞およびＧ０ブロック１ＢＲ３細胞からの全細胞抽出物において半定量ウエスタン・ブロットによって分析されたＣＡＦ−１サブユニットの発現。簡単のため、類似のβアクチンレベル（内部対照）とともに複数の分析が並列されている。各場合において、１０５個の細胞に相当する溶出液がロードされた。
【００５３】
前記結果は、この調節が不死化された形質転換細胞系に特有ではなくて、より一般的な現象を示すことを追加的に示す。これは、ＣＡＦ−１活性とＤＮＡ複製の直接的な結び付きと整合する。静止細胞は複製しないので、それらは、この特定の機能を成し遂げるためにＣＡＦ−１を必要としない。しかしながら、ヒストンの再生は、依然として、長期活動休止細胞に必要とされ、このため、他の因子がヒストンの沈着を確実に行うできである。
【００５４】
この機能のための一つの候補は、クロマチン構築因子ＨＩＲＡである。実際に、ＣＡＦ−１とは対照的に、ＤＮＡ合成とは関係なく、インビトロで、アフリカツメガエルの卵の抽出物と作用することが分かった。それ故、静止細胞においてＨＩＲＡの発現をＣＡＦ−１と比較することは興味深いことであった。驚くべきことに、ＨＩＲＡの発現は、Ｇ０抑止ＭＣＦ７細胞において影響されない（図１Ｄ）。これは、ＨＩＲＡが静止細胞内のクロマチンの安定性を保証することができたことを示唆している。
【００５５】
リン酸化されたｐ６０の量は、周期中および休止中の細胞を区別するための非常に良い候補であるようである。
【００５６】
総合すれば、これらの結果は、静止細胞におけるダウンレギュレーションのための主要なターゲットとしてのクロマチン構築因子ＣＡＦ−１の重要性を強調する。Ｇ０のリン酸化された形態のＣＡＦ−１  ｐ６０のダウンレギュレーションレベルが、前述の増殖マーカー、例えばＰＣＮＡ（２倍減少）およびＭＣＭ２（６倍減少）を含めて分析された他の因子のいずれのレベルよりも大きいことは注目に値する（追加図Ｓ１）。
【００５７】
（全体のおよびクロマチンが結合した各ＣＡＦ−１の量は、細胞増殖と直接的に相関する）
異なる増殖速度（ＢｒｄＵ取込によって推定される）を有する、種々のヒトの乳房細胞系：Ｈｓ５７８Ｂｓｔ正常細胞系（Ｓ期が１３％）、Ｈｓ５７８Ｔ（類似起源の細胞間の比較を提供する）およびＴ４７ＤおよびＭＣＦ７腫瘍細胞系（それぞれ、Ｓ期は２９％、１６％および３７％）におけるＣＡＦ−１サブユニットおよびＣＡＦ−１パートナーの発現を研究するための実験が行われた。
【００５８】
結果は、図２に与えられる：４種のヒト上皮乳房細胞系が研究され：３種が腫瘍ＭＣＦ７（１）、Ｔ４７Ｄ（２）、Ｈｓ５７８Ｔ（３）であり１種が正常Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（４）である。（Ａ）示された細胞系におけるＣＡＦ−１  ｐ１５０（ｍＡｂ７６５５）およびｐ６０（抗ｐ６０  ｐｏｌｙ）の免疫局在化。ＢｒｄＵ取込によって測定された複製細胞の百分率（％Ｓ）およびＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０染色細胞の百分率（％Ｃ）が下に示される。バーは１０μｍである。（Ｂ）示された細胞系からの細胞抽出物が半定量ウエスタン・ブロットに用いられ、ＣＡＦ−１サブユニット（ｐ１５０、ｐ６０）およびＣＡＦ−１パートナー（ＡＳＦ１、ＰＣＮＡ、ＨＰ１）の発現が分析された。全体のおよびクロマチン結合（ｃ結合）の各タンパク質の量は、全体のおよびＴｒｉｔｏｎ処理の各細胞抽出物からそれぞれ決定される（１０５および２５×１０４細胞／ウェル）。ウエスタン・ブロット分析が、類似のβアクチンレベルすなわちポンソー染色（内部対照）と共に並列されている。過剰露出が提供されているのは、正常細胞でのシグナルの検出を可能にするためである。
【００５９】
免疫蛍光法実験（図２Ａ）は、正常細胞系（２１％）に対して腫瘍細胞系（平均で８１％）においてＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０を発現する細胞のより高い百分率を示し、腫瘍細胞系の中でも、よりゆっくりと増殖するＴ４７Ｄ細胞（７２％）に対してＭＣＦ７細胞（８６％）が高い百分率を示した。ウエスタン・ブロット実験は、ＣＡＦ−１サブユニット（ｐ１５０、ｐ６０）並びにＣＡＦ−１パートナー（ＡＳＦ１ａ、ＡＳＦ１ｂ、ＰＣＮＡ、ＨＰ１α）が正常細胞よりも腫瘍細胞においてより多量に発現されることを示した（図２Ｂ）。より高い露出のみが、正常細胞におけるシグナルの検出を可能にした。これらの２つの細胞タイプにおけるＣＡＦ−１発現の相対レベルの推定は、少なくとも６倍の差異を与えた。
【００６０】
総合すると、ＣＡＦ−１およびそのパートナーの発現は細胞増殖と直接的に相関することをこれらのデータは示している。
【００６１】
界面活性剤（detergent）抽出に対する抵抗性を基礎として可溶性フラクションから区別された上記のような核内ＣＡＦ−１クロマチン結合型フラクションは、ＣＡＦ−１活性プールであると考えられる。このプールは、ウエスタン・ブロット分析に示されるように腫瘍細胞において増加させられることが分かった（図２Ｂ）。正常細胞においてシグナルは検出限界未満であったが、我々は、腫瘍細胞系のシグナルを明らかに見ることができた。
【００６２】
前記の結果は、活性ＣＡＦ−１の量は、ＣＡＦ−１の全体量、すなわち、利用可能性に直接的に関連する（それ自体が細胞の増殖状態に関連付けられる）ことを示している。
【００６３】
（ＣＡＦ−１レベルは、Ｓ期に入る前のＧ０解除の際に増加する）
明らかに、Ｇ０においてＣＡＦ−１が減少すれば、細胞が細胞周期に再び入る時にそれを産生する必要性が生じる。そこで、Ｇ０解除後にＣＡＦ−１タンパク質がいつ再発現されるかおよびどのようにこれが細胞周期の進行に関連するのかを決定するための実験が行われた。
【００６４】
結果は、図３に与えられる：（Ａ）ＭＣＦ７細胞において、Ｇ０解除後の示された時間における、非同調（Ａｓ）細胞およびＧ０抑止細胞と比較した免疫蛍光法によって分析されたＣＡＦ−１  ｐ１５０の発現（ｍＡｂ７６５５）およびＢｒｄＵ取込。バーは１０μｍである。（Ｂ）Ｇ０解除後の示された時間になされた、ウエスタン・ブロット（１０５細胞／ウェル）によって分析された示された非同調（Ａｓ）およびＧ０抑止細胞と比較したＭＣＦ７細胞からの全抽出物。βアクチンは、ローディングコントロールとして、サイクリンＡはＳ期マーカーとして用いられる。
【００６５】
ＭＣＦ７細胞は、このように静止期から解除され、細胞周期への進行がモニタリングされた。ＢｒｄＵを取り込む細胞数の増加によって識別されるように、Ｓ期への参入はＧ０解除から１２時間後に起こった（図３Ａ）。Ｓ期への細胞周期進行のさらなるマーカーとして、解除後にサイクリンＡの発現の増加が記録された（図３Ｂ）。Ｇ０解除の間、典型的には早期、中期および末期のＳ期の明瞭なＣＡＦ−１染色プロファイルを収容する細胞が識別され得た。Ｓ期の進行と一致して、早期プロファイルを犠牲にした末期のＳ期プロファイルの蓄積が時間の経過とともに観察された。
【００６６】
免疫蛍光法によって示されるように、ＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０について陽性の染色細胞の数がＧ０解除後に増加した（図３Ａ）。これは、ウエスタン・ブロット分析によって半定量的に確認された（図３Ｂ）。重要なことに、ＢｒｄＵ染色によって識別された全Ｓ期細胞はＣＡＦ−１染色に一貫して陽性であったが、これに反するものは決して観測されなかった（図３Ａ）。同様の結果が、１ＢＲ３の一次線維芽細胞をＧ０から解除する際に得られた。
【００６７】
結果は、追加図Ｓ３に与えられる：（Ａ）１ＢＲ３細胞における、Ｇ０解除後の示された時間において免疫蛍光法によって分析された、非同調（Ａｓ）およびＧ０抑止細胞と比較したＣＡＦ−１  ｐ１５０発現およびＢｒｄＵ取込。ｐ１５０およびＢｒｄＵ（Ｓ期）染色細胞の百分率が下に示される。バーは１０μｍである。（Ｂ）ウエスタン・ブロット（１０５細胞／ウェル）によって分析されたＧ０解除後の示された時間になされた、示されたような非同調（Ａｓ）およびＧ０抑止細胞と比較したＩＢＲ３細胞からの全抽出物。βアクチンはローディングコントロールとして用いられている。
【００６８】
Ｓ期の別のマーカー（すなわち、サイクリンＡ）の免疫検出は、これらの前述の観察を補足した。
【００６９】
ＣＡＦ−１サブユニットは、次いで、Ｓ期に入る前のＧ０解除の際に再発現させられ、これは、ＤＮＡ複製に連結されるクロマチン構築のＳ期中のＣＡＦ−１要求性に一致していた。
【００７０】
（細胞群中のＣＡＦ−１  ＲＮＡの量は、増殖状態と相関する）
細胞増殖と関連があるＣＡＦ−１発現の調節は、ＲＮＡ（転写活性、ＲＮＡの安定性）および／またはタンパク質（翻訳活性、タンパク質の安定性）のレベルにおいて起こり得る。ＲＮＡレベルでのＣＡＦ−１調節を調べるために、ｐ１５０およびｐ６０のＲＮＡレベルが、定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザン・ブロット分析によってβアクチンのＲＮＡレベルと比較して定量化された。結果は、図４に与えられる：乳房細胞系からの全ＲＮＡ抽出物中のβアクチンＲＮＡの相対量（Ａ）およびノーザン・ブロット（Ｂ）。（Ａ）示された細胞系における相対的なｐ６０（白色）およびｐ１５０（黒色）のＲＮＡレベルを示す定量的ＲＴ−ＰＣＴの結果のグラフ表示。ＲＮＡレベルは、βアクチン転写物に対して規格化される。ＢｒｄＵ取込によるＳ期の割合は下に示される。（Ｂ）非同調増殖（Ａｓ）およびＧ０抑止（Ｇ０）ＭＣＦ７細胞におけるｐ６０およびｐ１５０  ＲＮＡのノーザン・ブロット分析。βアクチンＲＮＡの量は、ローディングコントロールとして用いられた。
【００７１】
類似した結果が、両方の実験から得られた。定量的ＲＴ−ＰＣＲからのアンプリコンの長さは、予想された通りであった：ｐ６０プライマーによる７６ｂｐ、ｐ１５０プライマーによる１９８ｂｐおよびβアクチンプライマーによる１１７ｂｐ；増幅効率は、互いに１００％に非常に近く、ｐ６０プライマーについて９７％、ｐ１５０プライマーについて９９％およびβアクチンプライマーについて１００％であった。ｐ６０  ＲＮＡ定量化のために、第６染色体上のｐ６０偽遺伝子から生じた推定の転写産物が結果に影響を及ぼしていないことが確認された（追加図Ｓ４：ＢＬＡＳＴ検索によれば、ｐ６０遺伝子は、ヒトゲノム中に２コピーに存在し：１つは第２１染色体上のものおよび１つは第６染色体上の偽遺伝子であり、複数の点変異を含んでいる。２つのｐ６０  ＲＴ−ＰＣＲ産物の中で、推定の偽遺伝子転写産物からのものは、ＰｓｔＩ制限部位を含んでおり、これは、第２１染色体上のｐ６０遺伝子からのＲＴ−ＰＣＲ産物には存在しておらず、これは、両者の区別を可能にする。ｐ６０に特異的なＲＴ−ＰＣＲ反応が、増殖および静止ＭＣＦ７細胞からの全ＲＮＡについて行われた。陽性対照として、ＰＣＲＳｃｒｉｐｔプラスミド（Stratagene）にＰｓｔＩ制限部位を含むフラグメントが、ＫＳおよびＭ１３プライマー（Sigma Genosys）を用いて増幅させられた。ＰＣＲ産物は、ＰＳｔＩ酵素（Ozyme）によって消化され、消化産物は、８％ポリアクリルアミドゲル上で分析された）。
【００７２】
同様の変化は、ｐ１５０およびｐ６０ＲＮＡの細胞系間の量の両方について見出された（図４Ａ）。Ｔ４７Ｄ細胞系を除けば、概して、これらのＲＮＡは、迅速に増殖するＭＣＦ７と比較して低い増殖速度を有する細胞においてより少なく発現させられた。Ｇ０抑止細胞を非同調増殖ＭＣＦ７細胞と比較した場合にｐ１５０およびｐ６０  ＲＮＡの量に５倍の増加があった（図４Ａ、Ｂ）。
【００７３】
顕著なことに、この相違は、タンパク質レベルにおいて前に観察された相違（７倍増加）にほぼ正確に対応し（追加図Ｓ１）、これは、ＲＮＡレベルでのコントロールがこの特定の細胞タイプにおける増殖状態に連結するＣＡＦ−１発現を説明するのに十分であり得ることを証明する。
【００７４】
この対応は、Ｈｓ５７８Ｔ対Ｈｓ５７８Ｂｓｔ細胞には観察されない。この場合、ＲＮＡレベル（約１．５倍；図４Ａ）と比較してタンパク質レベルにおいてより大きい増加（少なくとも６倍；図２Ｂ）が観察された。興味深いことに、これは、タンパク質レベルでのさらなる調節も、これらの細胞において操作し得ることを示唆し、これは、ｐ１５０およびｐ６０サブユニット中のＰＥＳＴドメインの存在に関連し得る。
【００７５】
（ＣＡＦ−１  ｐ６０：臨床診療における増殖マーカー）
免疫細胞化学は、臨床目的のために日常的に用いられる。この技術は、免疫蛍光法と比較して２つの主要な利点：細胞形態学との相関および再評価のためにスライドを保管する可能性を提供するからである。
【００７６】
ＣＡＦ−１  ｐ６０の免疫細胞化学染色は、最初に、乳房細胞系について行われた。
【００７７】
結果は、図５に与えられる。（Ａ）複製Ｓ期細胞の百分率と比較した、４の上皮乳房細胞系中の３の腫瘍ＭＣＦ７（１）、Ｔ４７Ｄ（２）、Ｈｓ５７８Ｔ（３）および１の正常Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（４）のリン酸化されたｐ６０（ｍＡｂ８１３３）の免疫細胞化学的検出。各細胞系毎に少なくとも１０００の細胞を計数することによって得られたｐ６０染色細胞の百分率が下に示される。倍率は４００倍である。（Ｂ）良性（低発現）および悪性（中程度および高い発現）の胸部病巣からの細針吸引を用いたＫｉ−６７およびリン酸化されたｐ６０（ｍＡｂ８１３３）の免疫細胞化学検出。倍率は４００倍である。（Ｃ）良性（低発現）および悪性（中程度および高い発現）の胸部病巣からのパラフィン包理組織におけるＫｉ−６７およびリン酸化されたｐ６０（ｍＡｂ８１３３）の免疫組織化学検出。倍率は２００倍である。（Ｄ）腫瘍および非腫瘍組織と比較した胸部および大腸からのパラフィン包理組織におけるリン酸化されたｐ６０（ｍＡｂ８１３３）の免疫組織化学的検出。倍率は４００倍である。（Ｅ）正常な皮膚（２００倍）および正常な大腸（４００倍）からのパラフィン包理組織におけるリン酸化されたｐ６０（ｍＡｂ８１３３）の免疫組織化学的検出。正常な皮膚におけるｐ６０発現は、基底細胞および傍基底細胞（＊）の核に制限される。正常な大腸におけるｐ６０発現は、大腸陰窩の３分の１より下に制限される（＊）。
【００７８】
この技術によって得られた陽性染色された細胞の百分率（図５Ａ）は、前述の免疫蛍光法実験（図２Ａ）と一致するが、実際には、一層より明瞭に異なる細胞系間を区別した。ＣＡＦ−１  ｐ６０についての免疫細胞化学検出の特異性は、最初に、ｐ６０に対する異なる抗体（モノクローナル、ポリクローナル）を用いることによって、第二に、組換えｐ６０タンパク質との比較によって確認された。
【００７９】
結果は、追加図Ｓ５に与えられる。（Ａ）２つの相異なるｐ６０モノクローナル抗体（AbcamからのｍＡｂ８１３３、B.Stilmanによって好意的に提供されたｍＡｂ９６）およびウサギの免疫法のための我々の研究所において製造された組換えＨｉｓ−ｐ６０タンパク質（Agrobio，Villeny，フランス）を用いて得られたポリクローナル抗体（ｐ６０  ｐｏｌｙ）を用いた非同調（Ａｓ）およびＧ０抑止ＭＣＦ７細胞についての免疫細胞化学によって検出されたｐ６０の発現。競争実験のために、我々は、ｐ６０ポリクローナル抗体を組換えＧＳＴ−ｐ６０タンパク質とともに予備インキュベートした後に、免疫染色を行い、これにより、核染色が消失した。下に示された陽性染色された核の百分率は、種々の抗体を用いる全実験を通して再現性を示した。倍率は２００倍である。
【００８０】
（Ｂ）悪性（高発現）および良性（低発現）の病巣においてパラフィン包理胸部組織断片を用いて免疫組織化学によって検出されたｐ６０の発現の比較。抗体は示された通りである。倍率は４００倍である。
【００８１】
種々の抗体源を用いた場合に一致した結果が得られた。
【００８２】
細胞学標本の免疫細胞化学染色からの予備的な結果は、少数の事例（１８）においてｐ６０およびＰＣＮＡ発現間に高い相関を示した（ｒ＝０．９５，ｐ＝０．０００１）。しかしながら、増殖マーカーとしてのＰＣＮＡの使用は、固体時間に対する抗原感度に起因する限界を有するので、さらなる実験が、大量のサンプルを用いて、確立された増殖マーカーＫｉ−６７（これは、癌診断および予後のために日常的に広く用いられる）と比較して行われた。ＣＡＦ−１  ｐ６０およびＫｉ−６７の免疫細胞化学染色は、細胞学標本およびパラフィン包理組織について行われ、これは、ＣＡＦ−１  ｐ６０抗体が種々のタイプの臨床材料について十分に用いられ得ることを示した（図５Ｂ、Ｃ）。さらに、ＣＡＦ−１  ｐ６０に対する抗体は、良性の胸部病巣内の増殖細胞を検出することを可能にした（図５Ｂ、Ｃ）。それはまた、非腫瘍および腫瘍組織を明瞭に区別し、腫瘍組織は、強い陽性を示す（図５Ｄ）。正常な組織において、皮膚上皮の基底層および大腸陰窩の下３分の１中に見出される増殖細胞は、我々の抗体により陽性染色された（図５Ｅ）。
【００８３】
前記のデータの観点から、この抗体が増殖細胞をマークするための臨床ツールとして用いられ得るかを調べるためのさらなる実験が行われた。
【００８４】
ｐ６０は、次いで、細胞標本上の陽性染色細胞を計数することによってＫｉ−６７マーカーと比較された。
【００８５】
結果は、図６に与えられる。全ての統計分析は、胸部組織の細針吸引物について免疫染色することから得られたデータについてなされた。（Ａ）Ｓ期フラクション間の相関（スピアマン検定）のグラフ表示、ｐ６０およびＫｉ−６７陽性染色された細胞の百分率。Ｎ：事例数；ｒ：相関因子。（Ｂ）示された予後因子によるｐ６０（上側）およびＫｉ−６７値分布（下側）のボックスプロット表示。灰色のボックスは、２５〜７５％に対応する。ブラケット：範囲；黒点：平均；白線：中央値。ＤＮＡの倍数性：二倍体（１）、異倍体／多倍体（２）：増殖指数：非常に低い（１）、低い（２）、中間（３）、高い（４）。
【００８６】
得られた百分率は、２つの別々のオブザーバ間で調和しており（級内相関係数：Ｋｉ−６７について０．９９８１、ｐ６０について０．９９８３）、そのため、平均の百分率は統計分析のために用いられた。有意な相関因子は、ｐ６０およびＫｉ−６７発現間に達成され（ｒ＝０．９４，ｐ＜１０−４）、これは、ｐ６０発現が細胞増殖の良好な指標であることを示していた（図６Ａ）。相関レベルは、依然として有意であるものの（ｒ＝０．８３（Ｋｉ−６７）、ｒ＝０．８４（ｐ６０）、ｐ＜１０−４）、Ｓ期でより低かった（図６Ａ）。これは、用いられた手順が異なっていた（フローサイトメトリー対免疫細胞化学）、およびＫｉ−６７およびｐ６０が細胞周期（Ｓ期のみではない）マーカーである、という事実に起因しているかもしれない。最後に、ＣＡＦ−１  ｐ６０発現と診療用途の複数の臨床病理学的予後因子との間の相関が調べられた（表１、図６Ｂ）。
【００８７】
【表１】
2007524103.tif 000002
【００８８】
ｐ６０およびＫｉ−６７の値は、胸部腫瘍の細針吸引物についての免疫細胞化学から得られた。ｐ６０およびＫｉ−６７の平均百分率は、各グループ毎に示される。有意なｐ値は、太線で強調されている。増幅指数は、「材料および方法」に記載されたようなＳ期フラクションのレベルにしたがって分類される。Ｎ：事例数。
【００８９】
年齢およびリンパ節の状態との有意な関連が留意されなかったのに対して、以下の明らかな関連が見出された：腫瘍のサイズ（ｐ＝０．００８１）、等級（ｐ＝０．０００４）、エストロゲンレセプターの状態（ｐ＝０．０１９）、増殖指数（ｐ＜０．０００１）およびＤＮＡ倍数性（ｐ＜０．０００１）。
【００９０】
これらの結果は、乳癌に由来する臨床サンプルの範囲で腫瘍におけるＣＡＦ−１検出と増殖状態との間に強い相関を示し、これは、培養細胞により出された結論を補強する。
【００９１】
ＣＡＦ−１は、乳癌の臨床診療における増殖マーカーとして有用であるようである。
【００９２】
（固形腫瘍におけるＣＡＦ−１の診断および予後の価値）
Ｋｉ−６７染色との強い陽性相関に基づいて、ＣＡＦ−１はまた、大腸、胃、腎臓、甲状腺、前立腺および子宮内膜および頚部の各癌における新しい増殖マーカーとして確認された。図７は、陽性染色１６された（positively stained 16）、ＣＡＦ−１  ｐ６０およびＫｉ−６７の百分率間の相関のグラフ表示を与える：ｒ＝相関係数（スピアマン順位検定）；Ｎ＝事例数；全ｐ値は＜１０−４である。
【００９３】
表２に、腫瘍研究の臨床病理学的な詳細が与えられる（Ｔ：腫瘍のサイズ、Ｎ；リンパ節浸潤、Ｍ：転移）。
【００９４】
【表２ａ】
2007524103.tif 000003
【００９５】
【表２ｂ】
2007524103.tif 000004
【００９６】
ＣＡＦ−１およびＭＣＭ染色の比較は、ほとんどの研究において用いられてきたＭＣＭ２およびＭＣＭ５タンパク質に対する抗体を選んで達成された。結果は、表３に与えられる：上側；大腸、胃および甲状腺の各癌における陽性染色された、ＣＡＦ−１  ｐ６０と、ＭＣＭ２、ＭＣＭ５またはＫｉ−６７との百分率間の相関（スピアマン順位検定）。Ｎ＝事例数；全ｐ値は＜１０−４である。下側；胃および大腸の癌におけるＣＡＦ−１  ｐ６０、Ｋｉ−６７およびＭＣＭ値（％）の分布。
【００９７】
【表３】
2007524103.tif 000005
【００９８】
ＣＡＦ−１およびＭＣＭマーカー間の相関は有意であるが、ＣＡＦ−１とＫｉ−６７との間ほどには強くない（表３）。特に、ＭＣＭ染色百分率の分布は、共通して、胃および大腸の癌において観察されるようにＣＡＦ−１と比較してより高い値の方にシフトされる（表３）。このように、ＣＡＦ−１は、潜在的に、ＭＣＭタンパク質より判別性のあるマーカーとして眺められ得る。
【００９９】
さらに、腎臓、頚部、子宮内膜および乳の各癌においてＣＡＦ−１染色と組織学的等級との間に有意な関連が見出された（図８：腎臓癌についてはFuhrman；頚部癌、子宮内膜癌および乳癌については高分化（１）、中分化（２）、低分化（３））。灰色のボックスは、２５〜７５％に対応する。ブラケット：範囲；白色線：中間値）。我々が既に胸部の細胞学的標本上で見出していた、ＣＡＦ−１染色と２つの予後因子、すなわち増殖指数および等級（Polo et al，Cancer Res，64，2371-2381，2004）、との間の強い関連を前提として、臨床結果を予測する際のＣＡＦ−１  ｐ６０の潜在的な価値も調査された。ＣＡＦ−１  ｐ６０染色は、１４％のカットオフ値（中間）を用いて、腎臓癌における生存全体と有意に関連していた（ｐ＝０．０２，図９：患者の２つの集団は、ｐ６０百分率の中間値（すなわち１４％）を基礎として規定される。ｐ値は、ログランク検定を用いて算出される）。１４％未満のｐ６０染色を有する患者において４０％の死（平均の生存５６月；３〜１４４月の範囲）、１４％より大きいｐ６０染色を有する患者において８３％の死（平均生存１２月；２〜１４０月の範囲）があった。１４％で二分されたＣＡＦ−１  ｐ６０値についての単一変量Ｃｏｘ回帰分析は、高いｐ６０染色は、この腫瘍タイプにおける粗悪な結果と強く関連し、３．１３［１．１３−８．６６］の死の危険比を有することを示す（ｐ＝０．０２８）。
【０１００】
前記のデータは、ＣＡＦ−１発現と細胞の増殖状態との間の著しい相関を強調し、静止細胞において顕著に減少している。細胞系モデルにおいてなされたこの観察は、さらに、乳癌、大腸癌、胃癌、腎臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮内膜癌および頚部癌のサンプルを用いた病理学的条件下に確認された。ＣＡＦ−１サブユニットは、これらの腫瘍タイプにおける関連増殖マーカーであるようである。さらに、前記の結果は、増殖状態に連結されるＣＡＦ−１発現が主としてＲＮＡレベルで制御されることを示す。
【０１０１】
これらの結果は、ＣＡＦ−１の機能の現在の知識に照らして考慮されなければならない。主としてインビトロの研究に基づいて、ＣＡＦ−１は、複製および修復の間のＤＮＡ合成に連結されるクロマチン構築に必要とされることが示された。複製はＳ期に特徴的であるのに対して修復は他の期およびＳ期に起こり得る。ＣＡＦ−１発現と細胞増殖との相関は、Ｓ期の機能と整合性があり、ＤＮＡ複製との関連性を補強する。しかしながら、ＣＡＦ−１はまた、Ｓ期外のＧ１およびＧ２において発現され（図１Ａ）、これは、ＤＮＡ修復と関係するＣＡＦ−１の機能を説明し得る。ＤＮＡを複製しないが原則としてＤＮＡ修復を経ることも可能であるべき静止細胞の場合において、この過程におけるＣＡＦ−１の関与が疑われ得る。この関連において、Ｇ０において、（ｉ）低量のＣＡＦ−１がＤＮＡ修復に連結されるクロマチン構築を確実に行うのにまだ十分であり得るか、あるいは（ｉｉ）まだ識別されていない別のクロマチン構築因子がＣＡＦ−１と置き換わり得るかのいずれかを想像し得る。ＣＡＦ−１が新しく合成されたＤＮＡ上でクロマチン構築を促進することを考慮すると、それ故にＤＮＡ複製の間のその主たる要求は、伸長過程と関連付けられるだろう。しかしながら、我々の結果に基づくと、ＣＡＦ−１がＤＮＡ複製の初期ステップにおいても必要とされ得ることを仮定することも魅力的である。実際、我々は、静止状態からの解除後のＣＡＦ−１の再発現が、ＤＮＡ複製の開始に必要とされることが知られたＭＣＭタンパク質と並行して、複製前の早期に起こることを見出した（図３）。
【０１０２】
クロマチン構築に必要とされる他の因子と比較すると、ＣＡＦ−１は、増殖および静止状態間の最も強力なディスクリミネータとして現れる。実際に、ＣＡＦ−１とは逆に、クロマチン構築因子ＨＩＲＡは、両方の状態で同様のレベルで発現され（図１Ｄ）、このため、増殖マーカーとして用いられ得ない。ＡＳＦ１に関しては、ＡＳＦ１ｂのアイソフォームのみが、静止細胞において大きくダウンレギュレートされる。この時に、２つのＡＳＦ１アイソフォーム間の区別は、ウエスタン・ブロットにおいてなされ得、免疫細胞−または組織−化学のさらなる調査を待つ。
【０１０３】
本発明者らはまた、増殖状態に連結されるＣＡＦ−１発現が、ＲＮＡレベルで少なくとも部分的に制御されることを証明し（図２Ｂおよび図４）、これは、ＣＡＦ−１のＲＮＡレベルを調べることにより細胞増殖を評価する可能性を提供する。しかしながら、タンパク質レベルでの評価は、試験される全ての細胞系においてより信頼性があることを強調するべきである。静止対周期細胞におけるＲＮＡレベルのＣＡＦ−１のダウンレギュレーションを示す結果は、細胞周期中のＣＡＦ−１の転写調節について現在の知識を補充する。実際に、ヒト細胞（ヒーラ細胞および一次線維芽細胞）のマイクロアレイ分析は、ＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０のＲＮＡ発現が、Ｇ１／Ｓの境界での増加およびこれに続くＧ２／Ｍにおける減少を伴って細胞周期により調節されることを示した。これらの変化は、一次細胞において明らかである。我々の研究では、ＣＡＦ−１発現において観察される変化は、広範囲の遺伝子の相違に起因し得ない。それらが、同一細胞系からの非同調的増殖とＧ０抑止細胞との間（図１Ｂ、１Ｃ、４）さらには同一の乳房組織に由来するＨｓ５７８ＴおよびＨｓ５７８Ｂｓｔ系の間（図２、４）に観察されたからである。ＣＡＦ−１のＲＮＡ量の細胞周期の変化および細胞周期を抜け出た際のそれらのダウンレギュレーションを考慮すると、Ｒｂ／Ｅ２Ｆを介した可能性のある転写調節について推測するのは魅力的である。実際に、推定のＥ２Ｆバインディングサイトは、インシリコ（in silico）研究によってｐ１５０プロモーターに見出された。これはタンパク質レベルでの追加的な調節を除外しない。迅速に分解させられるタンパク質に共通するアミノ酸配列であり、プロテオソームによる分解のターゲットとなるタンパク質のためのシグナルとして潜在的に作用するＰＥＳＴドメインを、ＣＡＦ−１  ｐ１５０およびｐ６０の両方が含むからである。さらに、ＣＡＦ−１活性は、ＣＡＦ−１タンパク質の量のみによってではなく、翻訳後修飾、例えば、リン酸化／脱リン酸化および以前の研究に記載されたようなＰＣＮＡを介するＤＮＡへの補充によっても調節されるかもしれない。実際に、有糸分裂におけるＣＡＦ−１の高リン酸化がそのクロマチン構築活性を阻害することおよび間期のＣＡＦ−１のリン酸化が、ＤＮＡ修復と連結されるクロマチン構築と関連することが既に示された。いずれにせよ、タンパク質レベルのラベリングは、細胞増殖の信頼性のあるマーカーを提供する。
【０１０４】
細胞系モデルにおける観察は、生理学的関連において、組織サンプルについての研究によってさらに調査された。これらの研究は、タンパク質レベルでＣＡＦ−１  ｐ６０およびいくつかの増殖マーカーとの間に直接的な相関を示した。これは、ＣＡＦ−１の全体の複合体の挙動を反映した可能性が最も高い。実際に、ヒト乳癌におけるトランスクリプトーム分析からの結果は、ＣＡＦ−１  ｐ１５０はＤＮＡ複製に必要とされる遺伝子と同一の「増殖クラスター」に属することを示す。ＰＣＮＡ、Ｋｉ−６７およびＭＣＭタンパク質のような他の増殖マーカーは既に確証されており、首尾良く種々の腫瘍タイプに用いられている。しかしながら、ＰＣＮＡ免疫反応活性は、固定時間によって影響され得、Ｋｉ−６７の使用は、（ｉ）細胞増殖におけるその役割に関する知識の不足、（ｉｉ）その免疫検出のための抗原修正過程の系統的な必要性に起因する限界を有する。逆に、ＣＡＦ−１は、細胞学的標本（cytological preparation）上で直接的に検出され得（追加図Ｓ６：「材料および方法」に記載されたような抗原修正過程有り（＋）またはなし（−）のＭＣＦ７細胞において免疫蛍光法によって分析されたＫｉ−６７およびリン酸化されたｐ６０の発現。バーは１０μｍである）、ＣＡＦ−１活性とＤＮＡ複製との間のＰＣＮＡ媒介型の連結にあるＣＡＦ−１と細胞増殖との間の関連が上手く実証される。ＣＡＦ−１の活性はＤＮＡ修復（ヌクレオチド切除修復）にも直接的に関連付けられ、ＣＡＦ−１は、ＵＶ照射の際にクロマチンに補充されるが、その発現は、ＤＮＡ損傷の際には誘導されない。このため、免疫染色によるＣＡＦ−１の検出は、修復事象に起因する可能性は低く、増殖状態を反映するだけである。さらに、ＰＣＮＡおよびＫｉ−６７が全ての癌タイプにおいて、特に、頚部スミア分析のために有用であるということは判明しなかった。他方、いくつかの論点が、乳癌、大腸癌、胃癌、腎臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮内膜癌および頚部癌に対して立証されたような種々の腫瘍タイプにおける一般的なマーカーとしてのＣＡＦ−１の使用を指摘している。これは、種々の組織タイプに由来する細胞（腎臓に由来する２９３、頚に由来するヒーラ、皮膚および乳房細胞（本研究）に由来する１ＢＲ３）におけるＣＡＦ−１の発現と整合している。興味深いことに、ＣＡＦ−１は、全ての種にわたって保存されており、これは、非ヒトの材料においてこのマーカーを用いることが可能であることを示している（Polo SE，Cancer Research，2004，64：2371-2381）。ＭＣＭタンパク質を標的にする抗体に関して、明らかに、それらは、能動的に増殖している細胞のみを検出するのではなく、増殖能のある細胞も検出し、このため、それらは、増殖ポテンシャルのための高感度なマーカーであるようである。能動的に増殖している細胞のより特異的なマーカーであるＣＡＦ−１の使用によってそれらの使用が補足され得ることが提案される。これらの２種のマーカーの組み合わせた使用は、癌の進行を評価するための強力な診断ツールを提供し得る。さらに、長期の追跡調査研究は、ＣＡＦ−１発現と患者の結果との間の関連性を決定するために非常に興味深い。最後に、上記の全ての増殖マーカーは、ＤＮＡ複製において必要とされるが、さらに、ＣＡＦ−１は、遺伝子発現を含むＤＮＡ代謝の多くの局面のために重大であるクロマチン組織化の制御への直接的な関連を提供する。これは、癌の関連においてクロマチンが関連する事象の重要性のよい例示を示し得る。
【０１０５】
このため、本発明は、癌の診断、予後においておよび治療中の腫瘍応答のモニタリングに役立つ新規の増殖マーカーを提供する。本発明はまた、基礎の癌研究において、特に、腫瘍形成につながる経路にいかにしてＣＡＦ−１発現が組み込まれるかの理解において興味深い展望を開く。
【０１０６】
まとめると、前記のデータは、ＣＡＦ−１が、種々の固形腫瘍（乳癌、大腸癌、胃癌、腎臓癌、甲状腺癌、前立腺癌、子宮内膜癌、頚部癌および乳癌）における癌の診断に興味のある新規増殖マーカーの基準を満たすことを証明し、腎臓癌における生存に関する的確な予測情報を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ＣＡＦ−１およびそのパートナーのＧ０調節。
【図２】ヒトの乳房細胞系のＣＡＦ−１サブユニットおよびそのパートナーの発現。
【図３】ＭＣＦ７細胞におけるＧ０解除の際のＣＡＦ−１サブユニットの発現。
【図４】ＲＮＡレベルでのＣＡＦ−１調節。定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価されたｐ６０およびｐ１５０  ＲＮＡレベル。
【図５】ＣＡＦ−１  ｐ６０の免疫細胞学および組織化学的検出。
【図６】ヒト乳癌の増殖マーカーとしてのＣＡＦ−１  ｐ６０の使用。
【図７】ＣＡＦ−１  ｐ６０とＫｉ−６７陽性染色細胞の百分率間の相関のグラフ表示。
【図８】組織学的等級に従うｐ６０値分布のボックスプロット表示。
【図９】腎臓癌を有する患者のカプラン・マイヤー生存率分析。
【図Ｓ１】静止細胞におけるＣＡＦ−１のダウンレギュレーションレベル。
【図Ｓ２】静止対増殖の１ＢＲ３細胞におけるＣＡＦ−１の発現。
【図Ｓ３】１ＢＲ３細胞におけるＧ０解除の際のＣＡＦ−１の発現。
【図Ｓ４】ｐ６０偽遺伝子の推定転写産物の分析。
【図Ｓ５】ＣＡＦ−１  ｐ６０の免疫細胞化学的検出の特異性。
【図Ｓ６】ＭＣＦ７細胞におけるＫｉ−６７およびＣＡＦ−１免疫検出。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図Ｓ１】
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【図Ｓ２】
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【図Ｓ３】
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【図Ｓ４】
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【図Ｓ５】
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【図Ｓ６】
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【国際調査報告】
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