(57)【要約】  本発明は、親水性のポリマゲルとパターン化された表面とを有する基板へ生体分子をプリントする分子スタンプに関し、ゲルが少なくとも20%の架橋密度を持つことを特徴とする。好ましくは、ポリマ化開始剤とオプションで連鎖移動剤との存在下で、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アミン基、アルキル置換アミン基、カルボン酸基、カルボン酸エステル基、カルボン酸無水物基、カルボキサミド基、イソシアン酸塩基、カルバミン酸塩基、ウレタン基、及び尿素基から選択された少なくとも１つの機能的な基を含む、水溶性のエチレン不飽和の及び／又はエポキシ化されたモノマを少なくとも１つポリマ化するステップと、少なくとも２つのエチレン不飽和基及び／又はエポキシ基を持つ架橋剤でそのポリマを架橋するステップとにより得られるゲルを、そのスタンプが有する。
2007516442.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親水性のポリマゲルとパターン化された表面とを有する基板へ生体分子をプリントする分子スタンプであって、前記ゲルが、少なくとも20%の架橋密度を持つことを特徴とする分子スタンプ。
【請求項２】
前記ゲルが、ポリマ化開始剤とオプションで連鎖移動剤との存在下で、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アミン基、アルキル置換アミン基、カルボン酸塩基、カルボン酸エステル基、カルボン酸無水物基、カルボキサミド基、カルバミン酸塩基、ウレタン基、及び尿素基から選択された少なくとも１つの機能的な基を含む、水溶性のエチレン不飽和の及び／又はエポキシ化されたモノマを少なくとも１つポリマ化し、及び少なくとも２つのエチレン不飽和基及び／又はエポキシ基を持つ架橋剤で前記ポリマを架橋することにより得られる、請求項１に記載の分子スタンプ。
【請求項３】
前記モノマが、ヒドロキシアルキル・アクリレート又はヒドロキシアルキル・メタクリレートであり、前記架橋剤は、ポリエチレングリコール・ジアクリレート又はポリエチレングリコール・ジメタクリレートである、請求項１又は２に記載の分子スタンプ。
【請求項４】
前記スタンプが、自立するものである、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の分子スタンプ。
【請求項５】
前記架橋の密度が、少なくとも40%である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の分子スタンプ。
【請求項６】
前記ポリマが、少なくとも50%の濃度である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の分子スタンプ。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか一項に記載の分子スタンプを準備する方法において、
−ポリマ化開始剤とオプションで連鎖移動剤との存在下で、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アミン基、アルキル置換アミン基、カルボン酸塩基、カルボン酸エステル基、カルボキサミド基、無水基、ウレタン基、及び尿素基から選択された少なくとも１つの機能的な基を含む、水溶性のエチレン不飽和の及び／又はエポキシ化されたモノマを少なくとも１つポリマ化し、
−架橋密度が少なくとも20%で架橋されたポリマに対して、少なくとも２つのエチレン不飽和基及び／又はエポキシ基を持つ架橋剤で前記ポリマを架橋することを有する方法。
【請求項８】
生体分子を基板に、好ましくはゴールド基板にプリントする方法において、
−オプションで、水又は緩衝液を用いて請求項１乃至６のいずれか一項に記載のスタンプを膨らますステップと、
前記スタンプのパターン化された表面に前記生体分子を接触させることにより、前記スタンプの表面に前記生体分子を装着するステップと、
オプションで、水又は緩衝液で前記表面を洗浄し、及び／又は前記スタンプを乾燥するステップと、
前記吸着された生体分子を備える前記スタンプの表面を基板に接触させ、続いて前記スタンプから前記基板へ前記生体分子を移すステップとを有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を基板上にプリントする分子スタンプ、そのスタンプを作成するための方法及び生体分子を基板上にプリントする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断においては、アレイ、またの名をバイオチップと呼ばれるものが利用される。アレイは、比較的小さな領域に非常にたくさんのプローブを含む基板である。現在 1x3 インチxインチのオーダであり、これは、アレイベースのゲノミクス及びプロテオミクスにおいてしばしば使用されるマイクロスコープ・プレートの大きさである。遺伝子プローブは、リソグラフィ技術又はインクジェットプリンティング技術を用いて基板上に配置されることができる。生体サンプルだけでなく、こうした製造技術は高価である。通常は、蛋白質プローブ(蛋白質アレイ)が、スポッティングロボットを用いて配置される。円形スポットが約150μmの標準的な直径で形成されることができる。これまでのところ、最小のスポット直径として約60μmが報告された。DNAアレイの製造に用いるようなリソグラフィ技術は、蛋白質アレイに対して用いられることができない。
【０００３】
診断カートリッジが、検出部とは別に、液体の運搬のためのチャネルを含むことになり、並びに、分離、混合及びフィルタリングのモジュール／部(chamber)をも含むことになりがちになる。こうしたカートリッジは、全体で、現在利用可能なバイオアレイとほぼ同じ大きさにもなる。診断カートリッジは、一層高レベルの統合を必要とするので、検出部は、全体のカートリッジに比べ、かなり小さくなることになる。プローブが配置されるべき領域は、しばしば、通常1x1 cm2未満であり、これは、スライドガラス(microscope slide)より一層小さいものである。
【０００４】
更に、コスト削減のため、検出部の小型化もまた促進される。第１に、カートリッジの検出部は、シリコンで好適に作成されるという理由から、この部分の大きさはできるだけ小さくあるべきである。第２に、バイオプローブは非常に高価な分子であり、使用される量は、できる限り最小化されるべきである。分子診断のための多検体検出プロトコルは、10から1000の生体化合物(DNA/RNA、蛋白質、糖、代謝物、細胞)を１つのカートリッジ上で計測する能力を必要とすることになる。従って、多くの(そして異なる)生体認識プローブを小型の基板上に配置することができる安価な製造法に対する強い要求が存在する。更に、こうした方法は、現在利用可能なピンスポッティングロボットでフラットな基板に唯一配置することが可能な円だけでなく、異なる形状(長方形、正方形)を配置する可能性も含むべきである。最後に、その方法は、バイオプローブの生体機能が損なわれていない状態のままであるように、存在すべきである。例えば、抗体が固定化されるとき、その親和定数(Kd)はできる限り高い状態のままであるべきである。
【０００５】
米国特許5,948,621において、こうした問題を解決するためのある試みがなされた。固体の支持材と、パターン化された表面を形成するためにその支持材に共有結合されるポリマゲルとを有する分子スタンプが、報告された。そのゲルは、支持材に不可逆的に結合されなければならず、そのゲルは、スタンプされるバイオマテリアルを吸着するための気孔を含む。こうしたゲルに用いられる材料は、糖に対してエステル化されたアクリル酸である。そのゲルは、約0.5から10%、好ましくは2から4%、架橋(crosslinked)している。ヒドロゲルの脆性の増加、及び、弾力性と処理に関する安定性との減少が原因で、高い架橋密度は、使用されることができない。更に、実際、2から4%架橋したゲルだけが、一貫して、大きく一様な気孔を与える。毛管ハイドロゲル(capillary hydrogel)を形成するには2%架橋したゲルが良い選択である。調整(preparation)後の斯かるゲルの水分含有量は、通常は85%である。水酸化すると、水分含有量は、4%及び2%架橋のゲルに対してそれぞれ90%及び97.3%にまで上昇する。最終的に、その画像は、エッジ距離に関する約10マイクロメータの空間解像度を持つ。こうした上述のスタンプは、多くの利点を持ち、多くの先行技術における不利な点を克服するけれども、更なる改良の必要性が残されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の目的は、先行技術におけるスタンプの不利な点を持たない分子スタンプを提供することにある。即ち、必ずしも基板に結合されることがない分子スタンプであって、自立スタンプとして使用されることができ、気孔への吸着でない方法でバイオマテリアルの吸着を可能にするスタンプを提供することである。そこでは、堅牢性、弾力性、及び処理に関する安定性を保ちつつ、空間解像度が更に改善される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本目的のため、本発明は、親水性のポリマゲルとパターン化された表面とを有する基板へ生体分子をプリントする分子スタンプに関し、ゲルが少なくとも20%の架橋密度を持つことを特徴とする。
【０００８】
高い架橋密度は、自立するスタンプ、即ち、支持材を必要とせず、かつそのような物として使用されることができるスタンプを得るには重要である。そこで、架橋を少なくとも30%まで、より好ましくは40%まで増加することが好ましい。より好ましくは、スタンプは、少なくとも50%のポリマ濃度を有する。
【０００９】
例えば、米国特許6,444,254にはまた、他の分子スタンプが記載される。そこで述べられる方法は、生体リガンドと蛋白質とがポリマ基板上に直接的にパターン化されることを可能にする反応型マイクロスタンピング技術を参照する。反応成分を備えるポリマ表面が、スタンプと接触される。スタンプの表面には、ポリマ上での第１の反応成分を備える共有結合を形成するための別の反応成分を有するリガンドが吸着される。そのスタンプには、パターン化されない、及びバイオマテリアルを装着することができなければならないというようないずれの制限もほとんど存在しないが、この方法によれば、特別に機能化された基板だけが使用されることができ、その機能化された基板との共有結合を形成するのに機能化された基を含むリガンドだけが使用されることができる。斯かる方法は、限定的な用途のみを持つことは言うまでもない。
【００１０】
また、蛋白質アレイに対するPDMSスタンプを伴うマイクロコンタクト・プリンティング技術の使用が提案される(例えば、Bernard、A、Delamarche、E.、Schmid、H.、Michel、B.、Bosshard、H.R.、Biebuyck、H.による「Langmuir」、14、9、2225-2220、1998及びBernard、A、Renault、J.P.Michel、B.、Bosshard、H.R.、Delamarche、E.による「Advanced Materials」12、14、1067-1070、2000参照)。しかしながら、PDMSは、非常に疎水性の材料であり、再現可能なスタンプをもたらさない表面修正が使用されることを必要とすることが良く知られている。
【００１１】
本発明のゲルスタンプは、水性溶液に基づき生体分子をプリントするのに使用されることができる。こうしたゲルスタンプを用いて、プリント後においても分子が湿潤状態にあるようにすることができる。このことは、これらの生体活動を維持するために非常に重要である。プリンティングは、手動で、又は、例えばウェーブプリンタを用いて装置で行われることができる。
【００１２】
ゲルは、１つ又は複数の反応型の基を備える親水性の分子を用いて合成されることができ、
−ポリマ化開始剤(polymerization initiator)とオプションで連鎖移動剤との存在下で、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アミン基、アルキル置換アミン基、カルボン酸塩基、カルボン酸エステル基、カルボキサミド基、無水基、ウレタン基、及び尿素基から選択された少なくとも１つの機能的な基を含む、水溶性のエチレン不飽和の及び／又はエポキシ化されたモノマを少なくとも１つポリマ化するステップと、
−架橋密度が少なくとも20%で架橋されたポリマに対して、少なくとも２つのエチレン不飽和基及び／又はエポキシ基を持つ架橋剤(crosslinker)でそのポリマを架橋するステップとを有する。
【００１３】
ゲルは、まず水を、そしてオプションで混合物に生体分子を含めることにより生産されることができる。続いて、元の位置でポリマ化することにより、作成済みの表面構造を複製するのにその混合物が使用されることができる。本方法の利点は、生体分子の溶液に浸されるとき、ポリマが更に膨らむことがなく、それにより、複製された構造の寸法を同じに保つ点にある。浸すことは、プリンティングの前の各時点において必要である。
【００１４】
ポリマ化において使用される特に適切なモノマの例は、
アクリルレート(メタクリルレート):
【化１】
2007516442.tif 000003
ビニルエーテル:
【化２】
2007516442.tif 000004
エポキシド:
【化３】
2007516442.tif 000005
である。
【００１５】
強塩基の存在の下で、マイケル付加により、例えば、ジビニルを備えるポリマを与えるジチオール
【化４】
2007516442.tif 000006
【化５】
2007516442.tif 000007
が使われることもできる。ここで、RはH、CH3CH2CH3又はハロゲン、好ましくはClであり、Y = ((CRR’)m)n又は((CRR’)mZ)nであり、Z = O、N、C(O)、C(O)O、C(O)N(H)、N(H)C(O)O、OC(O)Oであり、R、R’はH、CH3、C2-8アルキル、ハロゲンであり、n = 1から25であり、m = 1から8である。
【００１６】
Eは、水素、メチル、ヒドロキシル基、アルコキシル基、アミン、アルキル置換アミン、カルボン酸、及びその塩であり、例えば、COOR’であり、ここで、R’= H、Na、K、Li、NR3’’であり、R’’は、アルキル基、カルボン酸エステル基、カルボン酸無水物、カルボキサミド、イソシアネート基、又は尿素基である。
【００１７】
Y-Eの例は、-(CH2)nOHのようなアルコールと酸とである。Eに関する別の基は、例えばスルホン酸塩でも可能である。例えば、O-SO3R’R’は、以前に与えた意味を持つ。
【００１８】
架橋剤の例は、
【化６】
2007516442.tif 000008
【化７】
2007516442.tif 000009
【化８】
2007516442.tif 000010
【化９】
2007516442.tif 000011
【化１０】
2007516442.tif 000012
【化１１】
2007516442.tif 000013
【化１２】
2007516442.tif 000014
であり、ここで、Rは、以前に与えられた意味を持ち、Y’はYと同じ意味を持つか又はその類似物であるか又はアルキル又はフェニルといった短い無極性基であるとすることができる。Xは、結合手(arm)を例えば炭素原子又はベンゼン環と共に結びつける小さな分子である。連鎖移動剤は、オプションで、追加されることができ、例えばHS-Y-Rである。ここで、YとRとは、以前に与えられた意味を持つ。
【００１９】
ポリマ化反応は、例えば、PBS(リン酸緩衝生理食塩水)、Tris、TE、Hepesバッファなどの水性緩衝溶液において行われる。ポリマ化反応は、例えば、Darocure(登録商標)1173のようなポリマ化開始剤の存在の下に行われる。開始剤は、熱開始剤であり、又は好ましくは、光開始剤とすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は、図面及び実施例によって説明される。
【００２１】
図１Ａは、所望のスタンプを逆さまにした構造を伴うマスタを示す。図１Ｂは、そのマスタにスペーサとカバーガラスとを適用することを示す。図１Ｃにおいて、機能化されたモノマ、架橋剤、架橋エージェント、緩衝液、光開始剤及びオプションで連鎖移動剤及び／又は生体分子を有する液体混合物が適用され、その混合物がポリマを形成するためにUV光に露光される。図１Ｄにおいて、パターン化されたゲルがマスタからはがされ、突起によりパターン化されるスタンプを与える。図１Ｅにおいて、スタンプに蛋白質の緩衝溶液が装着される。装着は、スタンプにバイオマテリアルを接触させる前に行われることもできる。ポリマ化は、ほとんどの場合水性媒体において行われるので、ポリマの形成と同時に膨張が発生する。図１Ｆにおいては、スタンプが、緩衝液で洗浄される及び／又は窒素のストリームの下で乾燥され、生体分子が基板上にスタンプされる。図１Ｇにおいては、上部にある構造を伴う基板が示される。生体分子がゲル構造に対して及び／又はゲル構造内に吸着される。
[実施例]
非常に低い空間解像度(幅が1μmの長方形)を備えるフラットな(ゴールド)基板に生体分子をプリントするのに適した非常に親水性のあるスタンプが作成される。そのスタンプは、水分含有量(膨張、大きさ)が制御されることができるよう、調整されることができる。非常に親水性のあるスタンプは、その生体機能を保ちつつ生体分子をプリントするのに必要である。こうしたスタンプは、多くの他の生体サンプルをプリントするのに使用されることもできる。
【００２２】
材料及び方法
【００２３】
ゴールド基板の準備:
ゴールド基板は、シリコン基板において、Tiの5nmを蒸発させ、続いて、Auの25nmを蒸発させることにより準備される。続いて、基板は、蒸留され、脱イオン化された水、エタノール及びヘプタンを用いて、完全に洗浄される。その基板は、5分間アルゴンプラズマに露光することにより浄化される。
【００２４】
化学物質の準備:
スタンプを作成するための混合物は、40重量パーセントのヒドロキシエチル・アクリレート(MW 116.1、例えばPolysciences)、10重量パーセントのポリエチレングリコール(400)ジアクリレート(例えばKayarad)、50重量パーセントの水及び0.5重量パーセントの光開始剤Darocure(登録商標)1173(例えばMerck)を含み、ポリマが架橋を20%含むゲルを与える。
【００２５】
別の混合物は、次の組成を持つ:72重量パーセントのヒドロキシエチル・アクリレート、18重量パーセントのポリエチレングリコール(400)ジアクリレート、10重量パーセントの水、0.5重量パーセントのDarocure(登録商標)1173である。これは、再び、ポリマが架橋を20%含むゲルを与える。
【００２６】
Sigmaより得られる、標識(labeled)蛋白質、BSA-FITC(アルブミン、フルオレセインイソチオシアネート共役ボビン)の1mg/ml溶液が、PBSバッファの0.01Mにおいてモデルプロテインとして(
2007516442.tif 000015
)使用される。
【００２７】
蛋白質のマイクロコンタクト・プリンティング:
スペーサとカバーガラスとをマスタ上に適用することにより、スタンプが作成される(図１Ａ、Ｂ)。この型は、上述した液体混合物で完全に満たされる(図１Ｃ)。スタンプは、この型におけるポリマ混合物のUV露光の後得られる(例えば１分間に4 mW/cm2、図１Ｄ参照)。続いて、スタンプは、水性緩衝液の蛋白質の溶液の中で所定時間浸される(例えば、20から25℃で１分)(図１Ｅ参照)。浸した後、スタンプは、蒸留され、脱イオン化された水で洗浄され及び／又は窒素のストリームで乾燥される。それから、スタンプは、清潔なゴールド基板と約１分間接触される(図１Ｇ参照)。
【００２８】
プリントされた基板の検出:
蛍光画像が、Photometric Coolsnap(登録商標) HQ CCDカメラを含むDMLM Leica(登録商標)蛍光マイクロスコープ、超高圧水銀ランプ及びLeica(登録商標)フィルタキューブL5を用いて得られる。Image-Pro(登録商標)Plus 4.5ソフトウェアがデータ解析に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】基板上にプロテインを直接パターン化する手続を概略的な表現を与える図である。
【図１Ｂ】基板上にプロテインを直接パターン化する手続を概略的な表現を与える図である。
【図１Ｃ】基板上にプロテインを直接パターン化する手続を概略的な表現を与える図である。
【図１Ｄ】基板上にプロテインを直接パターン化する手続を概略的な表現を与える図である。
【図１Ｅ】基板上にプロテインを直接パターン化する手続を概略的な表現を与える図である。
【図１Ｆ】基板上にプロテインを直接パターン化する手続を概略的な表現を与える図である。
【図１Ｇ】基板上にプロテインを直接パターン化する手続を概略的な表現を与える図である。
【図１Ａ】
2007516442.tif 000016
【図１Ｂ】
2007516442.tif 000017
【図１Ｃ】
2007516442.tif 000018
【図１Ｄ】
2007516442.tif 000019
【図１Ｅ】
2007516442.tif 000020
【図１Ｆ】
2007516442.tif 000021
【図１Ｇ】
2007516442.tif 000022
【国際調査報告】
2007516442.tif 000023
2007516442.tif 000024
2007516442.tif 000025
2007516442.tif 000026