(57)【要約】  分離装置２は、第１直径を備えるチャンバ１６を囲む円筒壁１１をもつ第１管１０から形成され、装置は流体放出用の第１端部１８をもつ。少なくとも２つの固定相の担体が、分離フリット２４を担体の間にもつチャンバ１１に充填される。第１管の１０の内面に固定された少なくとも１つの端部フリット要素２２が、チャンバ１１のセクションに担体を含み、担体から形成されたベッド３０、３２を形成し充填することを可能にする。そのように組み立てられた分離装置２がガードベッドをもつナノカラムを形成するとき、ナノカラムの耐用寿命を延ばすために、ガードベッドを分離装置２から切断することができる。そのように組み立てられた分離装置２が２つの分析セクションと複数のガードベッドとを含むとき、複雑な分析を、耐用寿命が延ばされたカラムで行うことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１直径をもつチャンバを画定する内面と、第２直径を画定する外面と、流体を放出するための第１端部と流体を受けるための第２端部とを備える円筒壁をもつ第１管であって、前記チャンバが第１セクションと少なくとも１つの第２セクションとを含む第１管と、
前記第１セクション内部に含まれる第１担体と、
前記少なくとも１つの第２セクション内部に含まれる第２担体と、
前記チャンバの前記セクションの間で前記担体を分離するために前記第１管の内部に配置される少なくとも１つの分離フリット要素と、
前記第１管の前記内面に固定され、かつ前記第１セクション内の前記第１担体および最終の第２セクション内の前記第２担体からなる群から選択される少なくとも１つの担体を含む少なくとも１つの端部フリット要素とを含む分離装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つの端部フリット要素が、前記第１管の１つの端部と整列する端部をもち、前記１つの端部が、バンド拡張に関連するデッドスペースを最小にするように、前記第１端部および前記第２端部からなる群から選ばれる請求項１に記載の分離装置。
【請求項３】
前記分離フリット要素および前記端部フリット要素から選択される少なくとも１つのフリット要素が、第３直径をもつキャビティを画定する第２内面と、第４直径を画定する第２外面と、第３端部と、第４端部とを備える第２円筒壁をもつ第２管であって、少なくとも１つの担体を留めておくように前記第４直径が前記第１直径と関連しあう請求項１に記載の分離装置。
【請求項４】
前記第４直径が前記第１直径より若干小さい請求項３に記載の分離装置。
【請求項５】
前記第４直径と前記第１直径の間の差が約５μｍと２０μｍの間である請求項４に記載の分離装置。
【請求項６】
前記第４直径と前記第１直径の間の差が約１０μｍである請求項４に記載の分離装置。
【請求項７】
分離フリットとして使用される前記第２管が約０．５ｃｍと３ｃｍの間の長さをもつ請求項３に記載の分離装置。
【請求項８】
分離フリットとして使用される前記第２管が約１ｃｍの長さをもつ請求項３に記載の分離装置。
【請求項９】
前記第３および第４端部から選択される１つの端部が前記第２管の長さに垂直に向けられる請求項３に記載の分離装置。
【請求項１０】
前記第３直径が前記第１直径の約１０％と３０％の間である請求項３に記載の分離装置。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのフリット要素が、流体放出用の前記第１端部内に配置された端部フリット要素であり、前記端部フリット要素が前記分離装置から前記流体を輸送するための移送管を形成する請求項３に記載の分離装置。
【請求項１２】
前記第１直径が約２５μｍと１８０μｍの間である請求項１に記載の分離装置。
【請求項１３】
前記第１管が溶融シリカから形成される請求項１２に記載の分離装置。
【請求項１４】
前記第１直径が７０μｍと１１０μｍの間である請求項１２に記載の分離装置。
【請求項１５】
前記端部フリット要素が、固定相材料と高分子網とを備える粒子の均質混合物を含む固定された固定相として形成される請求項１２に記載の分離装置。
【請求項１６】
前記高分子網が架橋ポリ（ジオルガノシロキサン）であり、かつ前記製品が前記ポリ（ジオルガノシロキサン）内で懸濁される請求項１５に記載の分離装置。
【請求項１７】
前記ポリ（ジオルガノシロキサン）がポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）である請求項１５に記載の分離装置。
【請求項１８】
前記装置を前記分離フリットと、前記第１管の前記第２端部に向けて配置される前記担体との間の境界で切断することができる請求項１２に記載の分離装置。
【請求項１９】
前記分離フリットと、前記第１管の前記第２端部に向けて配置される前記担体との間の前記境界の位置を示す前記第１管の前記外面に少なくとも１つのマーキングをさらに含む請求項１８に記載の分離装置。
【請求項２０】
前記第１担体が第１分析ベッドとして形成され、前記第２担体が第２分析ベッドとして形成される請求項１に記載の分離装置。
【請求項２１】
第３担体を含むための、前記チャンバ内の少なくとも１つの追加の第２セクションと、
前記第２セクション内の前記第２担体と前記追加の第２セクション内の前記第３担体の間に配置される少なくとも１つの追加の分離フリット要素とをさらに含む請求項１に記載の分離装置。
【請求項２２】
前記第１担体が第１分析ベッドとして形成され、前記第２担体が第２分析ベッドとして形成され、前記第３担体がガードベッドとして形成される請求項２１に記載の分離装置。
【請求項２３】
前記第１担体が第１分析ベッドとして形成され、前記第２担体がガードベッドとして形成され、前記第３担体がガードベッドとして形成される請求項２１に記載の分離装置。
【請求項２４】
ガードベッドとして形成される前記第２担体およびガードベッドとして形成される前記第３担体からなる群から選択される前記担体が、イオン交換相、逆相、サイズ排除相および親和相の組から選択される固定相から構成される請求項２３に記載の分離装置。
【請求項２５】
前記第３担体を含む前記少なくとも１つの追加の第２セクションがガードベッドとして形成され、追加の第２セクションの数が１と９の間である請求項２１に記載の分離装置。
【請求項２６】
分析ベッドとして形成される前記第１担体および分析ベッドとして形成される前記第２担体からなる群から選択される前記担体が、イオン交換相、逆相、サイズ排除相および親和相の組から選択される固定相から構成される請求項２１に記載の分離装置。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの分離フリットは、ガラスの微小球の層から構成される請求項１に記載の分離装置。
【請求項２８】
前記ガラスの微小球の層の厚さが、約２５０μｍと５００μｍの間である請求項２７に記載の分離カラム。
【請求項２９】
前記ガラスの微小球の層の厚さが、約２５０μｍである請求項２７に記載の分離カラム。
【請求項３０】
前記ガラスの微小球の直径が、約３．５μｍと５．０μｍの間である請求項２７に記載の分離カラム。
【請求項３１】
前記ガラスの微小球の直径が、約５．０μｍである請求項２７に記載の分離カラム。
【請求項３２】
前記第１担体が分析ベッドとして形成され、前記第２担体がガードベッドとして形成される請求項１に記載の分離装置。
【請求項３３】
チャンバの第１直径を画定する内面と、第２直径を画定する外面と、流体を放出するための第１端部と、流体を受けるための第２端部とを備える円筒壁をもつ第１管内に分離装置を作る方法において、前記チャンバが第１セクションと少なくとも１つの第２セクションとを含む分離装置を作る方法であって、
ａ．前記第１管の端部内に第１端部フリットを固定するステップと、
ｂ．充填分析ベッドを形成する前記第１セクション内の前記第１端部フリットの後部に分析担体を詰め、かつ充填するステップと、
ｃ．前記第１管内の前記充填分析ベッドの後部に分離フリットを配置するステップと、
ｄ．第２充填分析ベッドを形成する前記第２セクション内の前記分離フリットの後部に第２分析担体を詰め、かつ充填するステップとを含む方法。
【請求項３４】
前記第２充填分析ベッドの後部で前記第１管の第２端部フリットを固定するステップをさらに含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１端部フリットが、第３直径をもつキャビティを画定する第２内面と、第４直径を画定する第２外面とを備える第２円筒壁をもつ第２管の長さである請求項３３に記載の分離装置を作る方法。
【請求項３６】
前記第１端部フリットおよび／または前記第２端部フリットが、接着することによって前記第１管に固定される請求項３５に記載の分離装置を作る方法。
【請求項３７】
前記分離フリットが、第３直径をもつキャビティを画定する第２内面と、第４直径を画定する第２外面とを備える第２円筒壁をもつ第２管の長さである請求項３３に記載の分離装置を作る方法。
【請求項３８】
追加４回まで繰り返しステップｃ．およびｄ．を繰り返すことをさらに含む請求項３３に記載の分離装置を作る方法。
【請求項３９】
前記第１端部フリットが、前記第１管の１つの端部に固定相材料と高分子網とを含む粒子の混合物を含む固定された固定相として形成される請求項３３に記載の分離装置を作る方法。
【請求項４０】
前記分離フリットが、ガラスの微小球の層として形成される請求項３３に記載の分離装置を作る方法。
【請求項４１】
サンプルを分析するために分離装置を使用する方法において、前記サンプルが別の成分から分離することができる少なくとも１つの成分を含む方法であって、
ａ．分離装置を提供するステップにおいて、
第１直径をもつチャンバを画定する内面と、第２直径を画定する外面と、流体を放出するための第１端部と流体を受けるための第２端部とを備える円筒壁をもつ第１管であって、前記チャンバが第１セクションと少なくとも１つの第２セクションとを含む第１管と、
前記第１セクション内部に含まれる第１担体と、
ガードカラムと呼ばれる、前記少なくとも１つの第２セクション内部に含まれる第２担体と、
前記チャンバの前記セクションの間で前記担体を分離するために前記第１管の内部に配置される少なくとも１つの分離フリット要素と、
前記第１管の前記内面に固定され、かつ前記第１セクション内の前記第１担体および最終の第２セクション内の前記第２担体からなる群から選択される少なくとも１つの担体を含む少なくとも１つの端部フリット要素とを含む分離装置を提供するステップと、
ｂ．ピークの分離能が劣化するまで各サンプル内の１組の成分を測定するように、前記分離装置を通して一連のサンプルを流すステップと、
ｃ．前記分離フリットの１つの境界で前記第１管を切断することによって、ガードカラムを取り除くステップであって、前記境界が前記第１管の前記第２端部に向けて配置され、短くされた分離装置を作るガードカラムを取り除くステップと、
ｄ．ピークの分離能が劣化するまで各サンプル内の１組の成分を測定するように、前記短くされた分離装置を通して一連のサンプルを流すステップとを含む方法。
【請求項４２】
分離能の劣化はカラムのピーク幅が元の値から２０％増加されたときである請求項４１に記載の分離装置を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年７月１４日出願の米国特許出願第６０／４８７１２３号（整理番号ＷＡＡ−３３２）および２００３年２月１０日出願の米国特許出願第６０／４４６４５７号（整理番号ＷＡＡ−３０９）に加えた開示に関し、またそれを含む。上述の出願の内容は、その全体が参照により本明細書に明白に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に使用されるカラムに関する。本発明は毛細管サイズのＨＰＬＣカラムの耐用寿命を延ばすのに特別な利点がある。
【背景技術】
【０００３】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、化学混合物から１つまたは複数の化合物を分離するために使用されるプロセスである。ＨＰＬＣプロセスは、高圧力の輸送液体の影響下で、固定相充填材料を通して混合物を通過させるステップと、選択的親和力、ふるい分け、吸着または分配によって化合物を分離するステップから構成される。一般に充填剤は、円筒カラムに形成されたチャンバ内部に収納され、一般に所定位置にフリットによってチャンバのいずれかの端部で保持される。物理的または化学的汚染からＨＰＬＣカラムを保護するために、明確な機構として、またはＨＰＬＣカラムに押し付けられたカラムとしてガードカラムを使用することができる。
【０００４】
ガードカラムは、不純物または微粒子がＨＰＬＣカラムに達する前にサンプル混合物または輸送流体内の不純物または微粒子を捕捉し、それによってＨＰＬＣカラムの動作可能寿命を延ばす。ガードカラムを取り除くことができるのが望ましい。交換可能なガードカラムの利点は、ガードカラムより相当に高価であるＨＰＬＣカラムを、それほどしばしば交換する必要がないことである。ＨＰＬＣ装置内のガードカラムの１つの心配は、ガードカラムとＨＰＬＣカラムの間の連結が密封可能で取り外し可能であることを保証することである。使用される高圧力では、簡単な連結および密封機構は十分でなかった。したがって、付属機構がカラムの全体コストを増加させる。
【０００５】
ＨＰＬＣはより微少の量のサンプルで行われるので、カラムのサイズは縮小される。内径７５μｍのナノカラムが一般に小さいサンプル用に使用される。内径７５μｍのナノカラムの使用は、複雑なまたは「汚れた」サンプルを分析することが必要なユーザにはしばしば難しい仕事である。そのようなサンプルを詰めたナノカラムは、１回または２回の注入の後、頻繁に詰まり、さらなる分析のために役にたたなくなる。ナノカラムの小さいサイズのため、ナノカラムと共に使用される任意のガードカラムを、バンド拡張を避けるために、実質的にデッドスペースなしで取り付けなければならないであろう。そのようなガードカラムは入手できなかった。さらに、ナノカラムにガードカラムを取り付けるための任意の結合機構は、たとえ結合機構が非常に小さいことが必要だとしても、高圧力に耐えなければならない。
【０００６】
ＨＰＬＣの他の態様では、２つの別個の分析領域をもつカラムを作るのが利点がある場合がある。これらの領域を、構成および長さに関して正確に形成しなければならならず、また特定の分離を達成するために、中性の材料、一般にはフリットによってそれを分離しなければならない。カラムを形成する円筒の内径が縮小されるので、分離した分析領域を形成する能力が損なわれる。ナノカラム内では、領域を分離することはできなかった。したがって、そのようなマルチユースのナノカラムは、市販されていない。研究の環境では、組み立てられた唯一のマルチユースのカラムは、分析領域の間に確定した境界をもたない。これらのマルチユースのカラムを再現ができないようにする接合点において、２つの担体の混合物である区域がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
複雑なサンプルを分析するのにナノカラムが使用されるときでさえも、現在、ナノカラムの寿命を延ばす必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、第１直径をもつチャンバを画定する内面と、第２直径を画定する外面とを備える円筒壁をもつ第１管を含む分離装置が対象とされる。管の１つの端部は流体を受け、管の他の端部は流体を放出する。チャンバは第１セクションと少なくとも１つの第２セクションをもち、第１セクションは第１担体を含むように構成され、１つまたは複数の第２セクションは第２担体を含むように構成される。第１および第２担体がそれぞれのセクションに含まれるとき、分離フリット要素がセクションの間で担体を分離するために第１管の内部に配置される。少なくとも１つの端部フリット要素が、第１管内に担体の１つを含むために第１管の内面に固定される。
【０００９】
１つの実施形態では、少なくとも１つのフリット要素は、第３直径をもつキャビティを画定する第２内面と、第４直径を画定する第２外面と、第３端部と、第４端部とを備える第２の円筒壁をもつ第２管である。第４直径は第１直径より若干小さく、したがって第２管を第１管に挿入することができる。第２管が第１管に取り付けられたとき、第２管の外面は内面と協働して、面の間を担体が通過するのを防止する。１つの例では、第４直径と第１直径の間の差は約１０μｍである。１つの例では、分離フリットとして使用される第２管は、約１ｃｍの長さをもつ。１つの例では、第３直径は第１直径の約２０％であり、キーストーン効果（ｋｅｙｓｔｏｎｅ  ｅｆｆｅｃｔ）により、担体がキャビティを通過するのを防止する。１つの実施形態では、第２管の端部は第２管の長さに垂直に向けられ、端部フリット要素を第１管の端部と整列することを可能にし、したがってデッドスペースがなくなり、それによってバンド拡張を限定する。
【００１０】
１つの実施形態では、流体を放出するために端部に配置された端部フリット要素は、分離装置から流体を輸送するための移送管として形成される。１つの実施形態では、分離装置は一般に溶融シリカから形成される毛細管として第１管で作られる。分離装置の内径は２５μｍと１８０μｍの間であり、好ましい範囲は７０μｍと１１０μｍの間である。
【００１１】
別の実施形態では、端部フリット要素は固定された固定相として形成され、固定相材料は、高分子網内で懸濁される。高分子網が、架橋ポリ（ジオルガノシロキサン）（ＰＤＭＳ）であるとき、ＰＤＭＳフリットが本来の場所に形成される。１つの実施形態では、少なくとも１つの分離フリットがガラスの微小球の層から構成される。
【００１２】
１つの実施形態では、分離装置は、第１分析ベッドとして形成される第１セクションと、ガードベッドとして形成される第２セクションとから形成される。別の実施形態では、分離装置は、第１分析ベッドとして形成される第１セクションと、第２分析ベッドとして形成される第２セクションとから形成される。この実施形態は、いくつかの例では、チャンバ内に少なくとも追加のセクションをさらに含み、追加のセクションは第３担体を含むように構成される。実施形態は少なくとも第２分離フリット要素を使用し、第２セクション内の担体の間に追加の分離フリット要素が配置される。追加の第２セクションは分離装置の様々な構成を可能にし、第１担体が第１分析ベッドとして形成され、第２担体が第２分析ベッドまたはガードベッドとして形成され、第３担体がガードベッドとして形成される。２つの分析ベッドまで、１０のガードベッドまで分離装置の内部で実現することができる。
【００１３】
これらの分離装置では、分析担体およびガード担体の固定相は、イオン交換相、逆相、サイズ排除相および親和相の組からなる群から選択される。ガードベッドをもつナノカラムの寸法の分離装置は、分離フリットと第１管の受け端部に向けて配置された担体の間の境界で切断されるように構成される。分離装置のいくつかは、そのような切断を容易にするためにその境界の位置を示す第１管の外面上に少なくとも１つのマーキングをもつ。
【００１４】
第１直径をもつチャンバを画定する内面と、第２直径を画定する外面と、流体を放出するための第１端部と、流体を受けるための第２端部とを備える円筒壁をもつ第１管内に２つの分析ベッドをもつ分離装置を作るプロセスは、チャンバ内に第１セクションを形成することによって始まる。このプロセスは、第１管の端部内に第１端部フリットを固定するステップと、充填分析ベッドを形成する第１端部フリットの後方に分析担体を詰め（ｌｏａｄ）、かつ充填する（ｐａｃｋ）ステップと、充填分析ベッドの後方に分離フリットを配置するステップと、第２充填分析ベッドを形成する分離フリットの後方に第２分析担体を詰め、かつ充填するステップとを含む。分離装置を、第２充填分析ベッド後方に第２端部フリットを固定することによって、さらに処理することができる。他の分離装置は、分離フリットを配置し、分析担体を詰め、かつ充填する動作を追加で９回まで繰り返すことによって作られる。分離装置を作る１つの方法では、第１端部フリットは、第２管および分離装置の長さであり、分離フリットは第２管の長さである。分離装置を作る別の方法では、第１端部フリットは固定された固定相として本来の場所に形成され、固定相材料は、第１管の端部内の高分子網（ＰＤＭＳフリット）内で懸濁される。分離装置を作る１つの方法では、分離フリットはガラスの微小球の深さとして形成される。
【００１５】
ガードバンドをもつ分離装置を使用するとき、各サンプルの成分を測定するために、カラムおよび分析装置を通して一連のサンプルが実行される。結果は、知られている時間で成分を示すピークをもつであろう。カラムが破片で詰まるので、業界で知られているように全体のクロマトグラフィーの性能が劣化する。特にピークが広くなり、結果を解釈するのをより困難にする。ガードバンドがカラムから切断されるとき、クロマトグラフィーの性能が回復される。
【００１６】
本発明の特徴および利点は、同じ形体が同じ参照番号で識別される添付の図面に関連して考慮されるとき、以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は図１に示される分離装置が対象とされる。分離装置２は、第１直径１３をもつチャンバ１６を画定する内面１４と、第２直径１５を画定する外面１２と、第１端部１８と、第２端部２０とを備える円筒壁１１をもつ第１管１０を含む。第２端部２０はサンプルを含む流体を受け、第１端部１８は分離された流体を放出する。１つの実施形態では、チャンバ１６は、図１に示されるように第１セクション２６と第２セクション２８とをもつ。第２セクションの数が１０以下であることは本発明の範囲内である。第１セクション２６は、一般に第１分析ベッド３０を形成する第１担体を含むように構成される。第２セクション２８は、第２ベッド３２を形成する第２担体を含むように構成され、第２ベッド３２は第２分析ベッドまたはガードベッドである。第１担体が第１セクション２６内部に含まれ、第２担体が第２セクション２８内部に含まれるとき、分離フリット要素２４が、担体を分離するために、第１セクション２６と第２セクション２８の間で第１管内に配置される。少なくとも１つの端部フリット要素２２が、第１管１０内の担体を含むために第１管１０の内面１４に固定される。
【００１８】
分離装置２が図１に示されるようにガードカラムとして形成されるとき、分析ベッド３０は、端部フリット２２をもつ装置２の第１端部１８の近くに形成され、分析ベッド３０を、正確な長さで形成し充填することを可能にする。分離フリット２４は２つのセクション２６、２８の担体が混合することを防止し、分析ベッドの長さが指定されたようなものであることを保証する。第２セクション２８内の分離フリット２４の後方に形成されたガードベッド３２は、第１管１０の端部まで延び、または材料をチャンバ１６内に固定するために、第２端部フリット２２で上を覆われる。
【００１９】
分離装置２が図２に示されるようにマルチユースカラムとして形成されるとき、第２分析ベッド３８がガードベッド３２に置き換わる。この第２分析ベッド３８は、意図する応用例によって、同じまたは異なる担体から形成される。例えば、応用例がペプチド分析の場合、第１と第２の両方の担体が、マサチューセッツ州、ＭｉｌｆｏｒｄのＷａｔｅｒｓ  Ｃｏ．社からのＣ１８などの活性炭であってもよい。一方、応用例がタンパク質分析の場合、第１担体はイオン交換担体から選び、第２担体は逆相担体から選ばれるであろう。図示されたベッドの長さは、説明目的のためだけである。当分野の技術者は、意図する分離のために必要な固定相の体積を定めることができる。
【００２０】
図２で示される１つの実施形態では、分離装置２の第１管１０は、毛細管から作られる。分離装置２が液体クロマトグラフィーに使用される場合、毛細管３４は好ましくは溶融シリカから作られる。溶融シリカは壊れやすいので、外面は保護のため一般にポリイミド３６の層で覆われる。分離装置２に使用される毛細管の第１直径は、２５μｍと１８０μｍの間であり、好ましい範囲は７０μｍと１１０μｍの間である。毛細管尺度の実施形態では、フリットの端面４０が第１管１０の端部と整列するように、端部フリット要素２２が管１０に嵌合することが望ましい。この整列が、分離装置２が移送管（図示せず）に連結されるとき、デッドスペースを限定し、したがってバンド拡張を最小限に抑える。
【００２１】
図３に示される別の実施形態では、分離装置２がチャンバ１６内に追加のセクション４１をさらに含み、前の第２セクション２８の長さを、新しい第２セクション４３と追加のセクション４１に分割したと考えることができる。追加のセクション４１は第３担体を含むように構成される。この実施形態は、新しい第２セクション４３内の第２担体と追加のセクション４１内の第３担体との間に配置された第２分離フリット要素２４’を使用する。追加のセクション４１は、分離装置２の様々な構成を可能にし、第１担体が第１分析ベッドとして形成され、第２担体が第２分析ベッドまたはガードベッドとして形成されならびに第３担体がガードベッドとして形成される。２個までの分析ベッドおよび１０個までのガードベッド（全部で１１個のベッド）をもつ分離装置２は実用的である。
【００２２】
図３に示されるような複数のガードベッドをもつ毛細管サイズの分離装置は、一般に分離装置を詰まらせる大きな分子を含むサンプルの使用に特に適している。ピークの低減した分離能によって示されるように分離装置２が詰まったとき、分離装置２を分離フリット２４’の流入端２５で切断することによって、最も外側のガードベッド４１が取り除かれる。それから、短くされた分離装置２’は、第２ガードベッド４３が詰まるまで、さらなる分析のために利用できる。短くされた分離装置２’を、第１分離フリット２４の流入端２７で切断することによって、第２ガードベッド４３が取り除かれる。それから、さらに短くされた分離装置２’’は、分析カラムが詰まるまで、さらなる分析のために利用できる。詰まった分析カラムをもつ分離装置は、ガードベッドを含まない分離装置より多くの分析を行った後で捨てられる。
【００２３】
図４に示される毛細管分離装置の１つの実施形態では、少なくとも１つのフリット要素が、第３直径５４を画定する第２内面４９と、第４直径５６を画定する第２外面２８と、第３端部５５と、第４端部５３とを備えるキャビティ４５の周りに第２円筒壁４７をもつ第２管４６として取り付けられる。取り付けられたとき、第４直径５６が少なくとも１つの担体を留めておくように第１直径５０と関連しあう。特に、第４直径５６は、少しだけ第１直径５０より小さく、したがって第２管４６が第１管１０内に摩擦で向けられる。１つの例では、第４直径５６と第１直径５０の差は約１０μｍである。１つの例では、分離フリットとして使用される第２管４６は、約１ｃｍの長さ５８をもつ。第２管４６の端部は、第２管４６の長さ５８の方向に垂直に向けられて、第１管１０の端部と整列する平らな表面をもたらす。第３直径５４は、第２管４６中に形成されたキャビティ４５を通る担体のいかなる移動も限定するために第１直径５０より相当に小さい。１つの例では、第３直径５４は第１直径５０の約２０％である。第２管４６が端部フリット２２を形成するとき、第２管４６は、接着剤で所定位置に固定される。１つの実施形態では、第２管４６中に形成された端部フリット要素２２の１つは、バンド拡張に関連するデッドスペースを残さず第１管１０の対応する端部と整列する端部をもつ。
【００２４】
１つの実施形態では、端部フリット要素２２として作用するより長い第２管４６が放出流体用に第１端部１８中に配置される。第２管４６の長さが、約６ｃｍまたはそれより大きく、約１ｃｍだけが第１端部１８に固定されるとき、この端部フリット要素は流体を分離装置２から輸送するための移送管（図示せず）の働きをする。このタイプの分離装置２は、別の移送管が取り付けられるとき導入されるバンド拡張を最小限に抑える。さらに、移送管を、分離装置２に関連する検出器に直接連結することもできる。
【００２５】
図５に示された分離装置の別の実施形態では、少なくとも１つの端部フリット要素２２’が、固定相材料と架橋ポリ（ジオルガノシロキサン）高分子網とを含む高分子網中に懸濁させた粒子の均質混合物として形成される。具体的な実施では、ポリ（ジオルガノシロキサン）は、ポリ（ジメチルシロキサン）であり、得られるフリットはＰＤＭＳフリットと呼ばれる。
【００２６】
１つの実施形態では、少なくとも１つの分離フリット２４’は、ガラスの微小球６０の層から構成される。ガラスの微小球６０の層は２００μｍと５００μｍの間の厚さである。好ましい厚さは約２５０μｍである。ガラスの微小球６０は、約３．５μｍと５μｍの間の直径をもつ。好ましい直径は約５μｍである。分離フリット２４’は、担体を分離し、分析およびガードベッドを特定の厚さに充填することを可能にする。ガラスのビーズは好ましく、高分子を含むビーズは適切でないが、他の非吸着のビーズを使用できる。
【００２７】
図５は２つのＰＤＭＳ端部フリット２２’と、３つのベッド５９と、ガラスの微小球６０で形成された２つの分離フリット２４’とで形成された分離装置２を説明する。説明された分離装置は、分析ベッドとして形成された放出端部１８の最も近くにベッド５９’と、ガードベッドとして形成された他のベッド５９とをもつ。第１切断点２５は、流入端部２０に向かう分離フリット２４’のすぐ上にあり、第２切断点２７は、流入端部２０に向かう第２分離フリット２４’のすぐ上にある。
【００２８】
これらの様々な分離装置２では、分析担体の固定相は、業界で使用される固定相の任意のものから選択される。特に、固定相は、イオン交換相、逆相、固相抽出相からなる群から選ばれる。ガードベッド３２をもつ分離装置２は、分離フリット２４と、第１管１０の第１端部１８に向かって配置された担体との間の境界２７、４４で切断可能であるように構成される。分離装置２のいくつかは、そのような切断を容易にするために、分離フリット２４と、第１管１０の第２端部２０に向かって配置された担体との間の境界２７の位置を示す第１管１０の外面１２上に少なくとも１つのマーキングをもつ。
【００２９】
図６は、第２管から形成されたフリットを使用して作られた毛細管サイズの分離装置の図である。第１管１０は、装置の外壁６１を形成しさらにその外壁６１の内部にチャンバ６３を形成する。入口管６４がソース（図示せず）に連結され、入口端部フリット６２に押し付けられる。ガード領域６６が入口端部フリット６２と分離フリット６８の間に固定相から作られる。分析領域７０が分離フリット６８と出口端部フリット７２の間に固定相から作られる。参照のためだけだが、説明された分離装置の寸法は約１４ｃｍの長さで、１０ｃｍの分析ベッド、２ｃｍのガード領域、出口およびフリットの長さが約１ｃｍである。
【００３０】
２つの分析ベッドと２つのガードベッドをもつ分離装置を作る方法がプロセスを説明するために以下に詳述される。装置は適切な直径および長さの第１管を選択することによって作られ、円筒壁は、装置内径を画定する円筒壁の内面をもち材料を受けるためのチャンバを囲む。目的とする応用例に特定の固定相の組が、装置に充填するために組み立てられて一連のベッドを形成する。第１管は、下向き端部が出口端部に指定されて、垂直に保持される。第１端部フリットを、フリットが第１管の端部と同一平面になるように、出口端部に固定する。第１固定相分析担体が、第１分析ベッドを形成する端部フリットの後部でチャンバ内に詰められかつ充填される。分離フリットが、続いて装置に詰め込まれる材料からベッドを分離するために、第１分析ベッドの上に配置される。第２分析ベッドを形成するための第２固定相が、分離フリットの後部でチャンバ内に詰められかつ充填される。第２分離フリットが、続いて装置に詰め込まれる材料からベッドを分離するために、第２分析ベッドの上に配置される。第１ガードベッドを形成するための第３固定相が、第２分離フリットの後部でチャンバ内に詰められかつ充填される。第３分離フリットが、続いて装置に詰め込まれる材料からベッドを分離するために、第１ガードベッドの上に配置される。第２ガードベッドを形成するための第４固定相が、第３分離フリットの後部でチャンバ内に詰められかつ充填される。第２端部フリットを、フリットが第１管の端部と同一平面になるように出口端部に固定し、あるいは、それを流体を供給するために入口管を挿入できるように特定の深さだけ、へこませる。
【００３１】
上述の方法は特定の分離装置を作るが、１つだけ分析ベッドをもつ装置、１０個までのガードベッドをもつ装置、様々なベッド内で使用される同じ固定相材料をもつ装置、ならびに第２端部フリットをもたない装置は、すべて本明細書の教示に包含されることを理解することができる。
【００３２】
分離装置２を作る方法のための１つのオプションでは、第１端部フリット２２が第２管４６の長さであり、第２管４６の外径５６が第１管１０の内径５０より若干小さい。第２管４６が、第１管１０の端部１８内に接着剤によって固定される。別のオプションでは、分離フリット２４が第２管４６の長さであり、第２管４６の外径５６が、第１管１０の内径５０より少しだけ小さい。分離フリット２４の管４６が第１管に固定されずに、チャンバ内に形成された２つのベッドの間に置かれている。分離装置２を作る別の方法では、第１端部フリット２２が第１管１０の端部１８内にＰＤＭＳフリットとして本来の位置に（ｉｎ  ｓｉｔｕ）形成される。分離装置２を作る別のオプションでは、分離フリット２４がガラスの微小球の層として形成される。
【００３３】
ガードバンドをもつ分離装置を使用するとき、各サンプルの成分を測定するために、カラムおよび分析装置を通して一連のサンプルが実行される。クロマトグラフィーの結果は、知られている個数の成分を示すピークをもつ。カラムが破片で詰まるので、業界で知られているように全体のクロマトグラフィーの性能が劣化する。特にピークが広くなり、結果を解釈するのがより困難になる。当分野の技術者は、この劣化を認識するであろう。カラムのピーク幅が元の値の約２０％増加するとき、カラムは本質的に使用できなくなった。それからガードバンドはカラムから切断され、クロマトグラフィーの性能が回復される。
【００３４】
当分野の技術者は、単にルーチンの実験を使用するだけで、特定の方法、実施形態、特許請求の範囲および実施例に等価のものを数多く認識し、確認することができるであろう。そのような等価のものは、本発明の範囲内にあり、本明細書に添付された特許請求の範囲によって包含されると考えられた。この出願全体を通して引用されたすべての参照文献、発行された特許および公開された特許出願は、本明細書に参照により組み込まれている。本発明は以下の実施例によってさらに説明される。
【００３５】
（実施例I）
I．装置の組立―第２管フリットを使用
第２管フリットを使用するナノカラムは以下のように準備された。保持フリットとして作用することを意図した（２０μｍ×９０μｍ）（内径×外径）の５ｃｍの長さの２ｃｍのセクションの溶融シリカ毛細管が、カラムのハウジングとしての役割をする（１００μｍ×３６０μｍ）の溶融シリカ毛細管の中に挿入された。より小さい毛細管は、外面の１．５ｃｍをポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）でコーティングしかつ１００μｍ  ＩＤ  毛細管の中に再挿入することによって所定位置に固定された。アセンブリ全体が、ＰＤＭＳを硬化させるために１１０℃のオーブン内に２時間置かれた。硬化の後、（２０μｍ×９０μｍ）の毛細管の余分の３ｃｍがセラミックスコアリング装置を使用して切り取られた。３．５μｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ  ＭＡ）などの分析ベッドが、１０ｃｍの長さにまで１０００ｐｓｉで、続いて４０００ｐｓｉの圧縮ステップで保持フリットに押し付けて充填された。分析ベッドを充填した後で、（２０μｍ×９０μｍ）の毛細管の１ｃｍのセクションが挿入され、（２０μｍ×９０μｍ）の毛細管の１０ｃｍのセクションと共にカラムベッドの上部にまで押された。毛細管の分離フリットが所定の位置につくと、トラッピング／ガードのフェーズの２ｃｍのベッドが２０００ｐｓｉで充填された。（２０μｍ×９０μｍ）の毛細管の第２の１ｃｍのセクションが以前に示されたようにこの短いベッドの頭部に配置される。望ましい数のトラッピング／ガードのベッドが作られると、ＰＤＭＳが周囲で一晩硬化されることを除いて、最終入口フリットが出口保持フリット作成用の前述の手法を用いて取り付けられる。充填ベッド内で任意の残留溶媒が急激な膨張を引き起こし、カラムの破損をもたらすので、最終カラムはＰＤＭＳを硬化するためにオーブン中に配置されなかった。
【００３６】
II．装置の予備評価―第２管フリットを使用
プロトタイプのナノカラム装置は以下のベッドのサイズで組み立てられた。
（１）分析ベッド：１００ｍｍ  ３．５μｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ１８
（２）ガード＃１：１．５ｃｍ  ５．０μｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ１８
（３）ガード＃２：１．５ｃｍ  ５．０μｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ１８
プロトタイプの性能を評価するために、繰り返しカラムに過負荷をかけることが試みられた。この目的のために、５．０ｐｍｏｌμＬのエノラーゼダイジェストの１．０μＬの注入が５０回反復されて、３−４０％Ｂ（Ａ：水中に０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＡＣＮ中に０．１％ＴＦＡ）を含む直線勾配を用いて流量毎分４００ｎＬで３０分行われた。図７は、プロトタイプのナノカラム装置の第１回注入後のクロマトグラフ出力である。区域８０、８２、８４および８６は、比較の目的で強調されている。図８は、プロトタイプのカラムの第４３回注入後のクロマトグラフ出力である。図８は、ペプチドが固定相に吸着し始めカラムがブロックし始めたとき、カラムの性能の劣化を示す。これは、ピーク８０と８０’、８２と８２’、８４と８４’ならびに８６と８６’の間の分離能の減少によって明示された。
【００３７】
第１ガードが取り除かれて、図９Ａ及び９Ｂに示される結果がもたらされる。ここで、カラムの性能が改善されいくつかの分離が取り戻された。ガードカラムが切り離されることによるカラムの長さの変化により、図７と９Ｂの間で保持時間に差があった。しかし、領域８０と８０’’、８２と８２’’、８４と８４’’ならびに８６と８６’’の比較は、詰まったガードカラムを取り除くことによっていかに分離能が回復されるかを示す。
【００３８】
当分野の技術者は、上述の実施形態に基づく本発明のさらなる特徴および利点を理解するであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によって示されたことを除いては、具体的に示され記載されたことによって限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明によるガードカラムを示す図である。
【図２】本発明によるマルチユースのカラムを示す図である。
【図３】本発明によるマルチガードのカラムを示す図である。
【図４】毛細管フリットで作られた本発明によるマルチガードのカラムを示す図である。
【図５】ＰＤＭＳおよびガラスの微小球フリットで作られた本発明によるマルチガードのカラムを示す図である。
【図６】本発明によって作られたガードカラムの図である。
【図７】本発明によるガードカラムを使用したＨＰＬＣシステムの第１回目のランの出力の図である。
【図８】図７のガードカラムをもつＨＰＬＣシステムの第４３回目のランの出力の図である。
【図９Ａ】図７のガードカラムから第１ガードを取り除いた後のＨＰＬＣシステムの出力の図である。
【図９Ｂ】図７のガードカラムから第１ガードを取り除いた後のＨＰＬＣシステムの出力の図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【国際調査報告】
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