(57)【要約】  イントロン融合タンパク質を含む受容体型チロシンキナーゼのイソ型、およびイントロン融合タンパク質を含む受容体型チロシンキナーゼイソ型含有医薬組成物を、本明細書にて提供する。受容体型チロシンキナーゼを含む細胞表面受容体のイソ型の同定方法および製造方法を提供する。受容体型チロシンキナーゼのイントロン融合タンパク質を含む細胞表面受容体イソ型で処置する方法もまた提供する。
2007525187.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９および２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列、ならびにその対立遺伝子変異体と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで：
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものであり；そして、
配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９および２２−２５はそれぞれ、受容体型チロシンキナーゼのイソ型である、
単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７、８、１２、１４、１５、１６、１７、１９、２２、２３および２４のいずれか記載のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、それが同一性を有する配列番号に記載のものと同数のアミノ酸を含むものである、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、哺乳動物に由来するものである、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記哺乳動物が、げっ歯類、霊長類またはヒトである、請求項１から４のいずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子のイントロンによりコードされた少なくとも１個のアミノ酸と操作可能に連結された受容体型チロシンキナーゼの少なくとも１個のドメインを含み、
ここで、受容体型チロシンキナーゼは、ＤＤＲ、ＥＰＨＡ、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥからなる群から選択されるものであるか；または、
前記ポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記受容体型チロシンキナーゼが、ＤＤＲ１、ＥＰＨＡ１またはＥＰＨＡ８から選択されるものである、請求項６記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
キナーゼドメインの少なくとも全部または一部および／または膜貫通ドメインの全部または一部を欠く短縮型受容体型チロシンキナーゼを含み、ここで：
前記ポリペプチドは、非短縮型受容体型チロシンキナーゼと比べて、キナーゼ活性が低下し、かつ／または、膜に局在化せず；
前記ポリペプチドは、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートし；
前記受容体型チロシンキナーゼは、ＤＤＲ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ８、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、およびＴＩＥからなる群から選択されるか、または単離されたポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１または２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し；そして、
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項９】
イントロンによりコードされたアミノ酸配列を含み、ここで：
前記イントロンは、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＦＬＴ１、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥからなる群から選択される受容体型チロシンキナーゼ遺伝子か；または、配列番号１−８および１０−２５のいずれかの前記イントロンによりコードされた配列に由来し；そして、
前記ポリペプチドは、受容体型チロシンキナーゼ細胞質ドメインを欠くものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、さらに膜貫通ドメインを欠くものである、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記単離されたポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするものである、請求項９または請求項１０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
請求項６から１１のいずれか記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ポリペプチドを含み、ここで：
前記ポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列、ならびにその対立遺伝子変異体と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり；
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの配列の全長を比較したものであり；そして、
配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のそれぞれは、受容体型チロシンキナーゼイソ型である、
医薬組成物。
【請求項１４】
受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするために有効な量のポリペプチドを含む、請求項１２または請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ポリペプチドによりモジュレートされる前記受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性が、二量体化、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、キナーゼ活性、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化、受容体型チロシンキナーゼのリン酸転移、シグナル伝達分子のリン酸化、リガンド結合、リガンド結合についての受容体型チロシンキナーゼとの競合、シグナル伝達、シグナル伝達分子との相互作用、膜結合および膜局在化の１種またはそれ以上である、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
モジュレーションが活性の阻害である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
組成物のポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼと複合体を形成する、請求項１２または請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１９】
イントロンおよびエキソンを含み、ここで：
前記イントロンが終止コドンを含み；
前記核酸分子が、エキソンイントロンジャンクションをつなぐオープンリーディングフレームをコードし；そして、
前記オープンリーディングフレームが、前記イントロンの終止コドンで終わる、
請求項１８記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記イントロンが、コードされたポリペプチドの１個またはそれ以上のアミノ酸をコードするものである、請求項１８または請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記終止コドンが、イントロンにおける最初のコドンである、請求項１８または請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項２４】
請求項１２から１７のいずれか記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、疾患または状態を処置する方法。
【請求項２５】
前記疾患または状態が、癌、炎症性疾患、感染症、血管新生関連状態、細胞増殖関連状態、免疫障害および神経変性疾患からなる群から選択されるものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患または状態が、関節リウマチ、多発性硬化症および後部眼内炎、ブドウ膜の障害、眼表面炎症性疾患、血管新生疾患、増殖性硝子体網膜症、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、血管腫、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、アルツハイマー病、狼瘡、血管狭窄、再狭窄、炎症性関節疾患、アテローム性動脈硬化症、尿路閉塞症候群、および喘息からなる群から選択されるものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患または状態が、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、リンパ性悪性疾患、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、扁平上皮肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、上部消化器癌、胃癌、消化器癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎／腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌からなる群から選択されるものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患または状態が、ウイルス感染症または寄生虫感染症である、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記感染症がマラリアである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むものである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物が、血管形成、細胞増殖、細胞移動、または腫瘍細胞増殖もしくは腫瘍細胞転移を阻害するものである、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
細胞表面受容体の活性をモジュレートする候補分子を同定するための創薬方法であって、以下の：
ａ）細胞表面受容体またはその一部をコードする発現された遺伝子配列セットを選択する工程；
ｂ）発現された遺伝子配列セットを集めて、整列した配列セット構築する工程；そして、
ｃ）細胞表面受容体イソ型をコードする整列したセットの少なくとも１個のメンバー配列（ここで前記イソ型が、細胞表面受容体の野生型または優性型と比較して細胞表面受容体の生物学的活性のモジュレートに十分な少なくとも１種のドメインまたはその一部を欠く）を選び、それにより、細胞表面受容体をモジュレートする候補分子を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項３３】
整列したセットと参照遺伝子配列を比較することにより整列したセットのメンバー配列のうち１個またはそれ以上のイントロンおよびエキソンを指定する工程；および、
イソ型をコードする少なくとも１個のメンバー配列（ここで、前記メンバー配列が、エキソンと操作可能に連結したイントロン中にコードされる少なくとも１個のアミノ酸および／または終止コドンを含む）を選択する工程、
をさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記イソ型が、Ｃ末端短縮型細胞表面受容体である、請求項３２または請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記選択されたメンバー配列もまた、参照遺伝子配列の５’コーディングエキソンに相当する５’エキソンを含む、請求項３２から３４のいずれか記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞表面受容体が受容体型チロシンキナーゼである、請求項３２から３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
前記イソ型が、キナーゼドメイン、膜貫通ドメインまたはその組合せからなる群から選択されるドメインまたはその一部を欠くものである、請求項３２から３６のいずれか記載の方法。
【請求項３８】
前記候補分子が、細胞表面受容体と二量体化するものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項３９】
前記候補分子がリガンドと結合し、細胞表面受容体が同じリガンドと結合する、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４０】
前記候補分子が、リガンド結合のために細胞表面受容体と競合するものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
前記候補分子が、細胞表面受容体のリン酸化を阻害するものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４２】
前記候補分子が、細胞表面受容体の生物学的活性を変えるものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４３】
前記改変された生物学的活性が、二量体化、キナーゼ活性、シグナル伝達、リガンド結合、膜結合および膜局在化からなる群から選択されるものである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記候補分子が、受容体の野生型または優性型と比較して、生物学的活性を低下するものである、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記選択されたメンバー配列が、キナーゼドメインをコードするエキソンと操作可能に連結された少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加を含んでなる、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
前記選択されたメンバー配列が、膜貫通ドメインをコードするエキソンに操作可能に連結された少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加を含んでなる、請求項３３記載の方法。
【請求項４７】
請求項３２から４６のいずれか記載の方法により同定されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００３年５月１６日に出願された、米国仮出願番号第６０／４７１，１４１号の、H. Mike Shepard、Gail M. ClintonおよびDavid B. Lackeyらの、発明の名称「INTRON FUSION PROTEINS,AND METHODS OF IDENTIFYING AND USING SAME」に優先権の利益を主張する。認められる場合には、この出願の内容は、ここに参照により全体として組み込まれる。
【０００２】
本出願は、２００４年５月１４日に出願された、米国仮出願番号（代理人整理番号 17118−P2817（17118−008P01））の、Pei Jinの、発明の名称「CELL SURFACE RECEPTOR ISOFORMS,AND METHODS OF IDENTIFYING AND USING SAME」の内容に関連するものである。認められる場合には、この出願の内容は、ここに参照により全体として組み込まれる。
【０００３】
（発明の技術分野）
イントロン融合タンパク質を含む受容体型チロシンキナーゼのイソ型、およびイントロン融合タンパク質を含む受容体型チロシンキナーゼイソ型含有医薬組成物を本明細書にて提供する。受容体型チロシンキナーゼを含む細胞表面受容体のイソ型の同定方法および製造方法を提供する。受容体型チロシンキナーゼのイントロン融合タンパク質を含む細胞表面受容体イソ型で処置する方法もまた提供する。
【０００４】
（背景技術）
細胞シグナル伝達経路は、細胞外シグナル、細胞間シグナルおよび細胞内シグナルを中継するために相互に作用するポリペプチドおよび小分子を含む分子ネットワークを伴う。かかる経路は、その経路の１個のメンバーから次へとシグナルを伝達する、リレーのように相互作用し得る。経路の１個のメンバーのモジュレーションは、シグナル伝達経路を介して中継され得、その結果、他の経路メンバーの活性のモジュレーションを生じ、そして例えばシグナルに対する細胞または生物の表現型および応答に影響を及ぼすなどのようにかかるシグナル伝達の結果をモジュレートする。疾病および疾患は、シグナル伝達経路のモジュレーションにおける誤調節または変化を伴い得る。治療薬剤の目標はかかる誤調節経路を標的とし、シグナル伝達経路におけるより正常な制御を回復することである。
【０００５】
受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多くのシグナル伝達経路に関わるポリペプチドの１つである。ＲＴＫは、細胞分裂、増殖、分化、移動および代謝を含む様々な細胞過程にて役割を果たす。ＲＴＫは、リガンドにより活性化され得る。かかる活性化は、例えば自己分泌性または傍分泌性細胞シグナル経路を誘発することなどにより、例えば、セカンドメッセンジャーの活性化により、シグナル伝達経路における事象を順番に活性にし、その結果、特定の生物学的効果を生じる。ＲＴＫのリガンドは、同系の受容体に特異的に結合する。
【０００６】
ＲＴＫは、乳癌および結腸直腸癌、胃癌、神経膠腫および中胚葉由来の腫瘍などの癌を包含する多くの疾患に関与している。ＲＴＫの誤調節が、いくつかの癌にて指摘されている。例えば、乳癌は、ＥｒｂＢ−２（Ｈｅｒ２とも称される）受容体の上方制御と関連づけられ得る。ＲＴＫはまた、糖尿病性網膜症および黄斑変性症を含む、眼の疾患に関連している。ＲＴＫはまた、生理的血管形成および腫瘍血管形成を含む、血管形成に関わる制御経路に関与する。ＲＴＫはまた、細胞増殖、移動および生存の制御に関与する。
【０００７】
小分子は、ＲＴＫを標的とする治療薬剤として設計され得る。かかる戦略には、多くの制限がある。小分子は、１個の受容体との相互作用に制限され得、故に、多くのファミリーメンバーが、誤調節され得る場合の状態に対して何らの対処もできない。小分子はまた、意図する標的以外の受容体に無差別に作用し得る。さらに、いくつかの小分子は、ＲＴＫに不可逆に結合し、かかるアプローチの利点は、確認されていない。故に、望ましくない細胞増殖および炎症反応を伴う癌および他の疾患を含み、ＲＴＫ活性および／または他の細胞表面タンパク質の活性を伴う疾患の処置のための治療薬剤に関してまだ満たされていない必要性が存在する。従って、本明細書における目的は、かかる治療薬剤、および候補治療薬剤の同定方法または発見方法を提供することである。
【０００８】
（概要）
シグナル伝達経路および他の細胞表面受容体相互作用が関与する疾患および障害を処置するための治療分子を提供する。前記分子を含む組成物、および前記組成物で疾患および状態を処置する方法も提供する。候補治療薬剤を同定する方法も提供する。特に、細胞表面受容体イソ型、ＣＳＲイソ型のファミリー、およびＣＳＲイソ型を作製する方法を、本明細書にて提供する。本明細書にて供される前記細胞表面イソ型およびイソ型のファミリーには、受容体型チロシンキナーゼのイソ型が含まれる。ＣＳＲイソ型を含む医薬組成物、およびＣＳＲイソ型を投与するかまたは発現することにより疾患および状態を処置する方法も提供する。ＣＳＲイソ型のアミノ酸配列およびＣＳＲイソ型をコードするヌクレオチド配列の同定方法および作製方法も、本明細書中に提供する。
【０００９】
細胞表面受容体イソ型である単離されたポリペプチドを、本明細書にて提供する。１つの態様にて、単離されたポリペプチドは、配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９、および２２−２５に記載のアミノ酸配列ならびにその対立遺伝子変異体と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列同一性とは、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものである。配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９および２２−２５はそれぞれ、受容体型チロシンキナーゼイソ型である。かかるポリペプチドには、それが同一性を有する配列番号に記載のものと同数のアミノ酸を含むポリペプチドが含まれる。かかるポリペプチドにはまた、げっ歯類、霊長類またはヒトなどの哺乳動物由来のポリペプチドが含まれる。
【００１０】
本明細書にて提供される単離されたポリペプチドにはまた、受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子のイントロンによりコードされている少なくとも１個のアミノ酸と操作可能に連結された受容体型チロシンキナーゼの少なくとも１個のドメインを有するポリペプチドが含まれる。例えば、受容体型チロシンキナーゼとは、ＤＤＲ１を含むＤＤＲ、ＥＰＨＡ１およびＥＰＨＡ８を含むＥＰＨＡ、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫ、ＴＩＥである。提供される単離されたポリペプチドにはまた、受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子のイントロンによりコードされている少なくとも１個のアミノ酸と操作可能に連結された受容体型チロシンキナーゼの少なくとも１個のドメインを有するポリペプチドであって、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１または２２−２５のアミノ酸配列を含むものが含まれる。
【００１１】
キナーゼドメインの少なくとも全部または一部、および／または、膜貫通ドメインの全部または一部を欠く短縮型受容体型チロシンキナーゼを含む単離されたポリペプチドであって、非短縮型受容体型チロシンキナーゼと比較して、キナーゼ活性が低下し、かつ／または膜に局在化しないポリペプチドもまた提供する。かかるポリペプチドには、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするポリペプチドが含まれる。受容体型チロシンキナーゼの例には、ＤＤＲ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ８、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、およびＴＩＥが含まれる。かかる単離されたポリペプチドには、配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１または２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドが含まれる；ここで、配列同一性とは、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものである。
【００１２】
受容体型チロシンキナーゼの細胞質ドメインを欠く単離されたポリペプチドもまた、本明細書にて提供する。前記単離されたポリペプチドには、イントロンにコードされたアミノ酸配列が含まれ、ここで前記イントロンとは、受容体型チロシンキナーゼ遺伝子由来であるか、または前記イントロンは、配列番号１−８および１０−２５のいずれかのイントロンによりコードされた配列である。前記受容体型チロシンキナーゼ遺伝子は、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＦＬＴ１、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥから選択され得る。かかるポリペプチドには、膜貫通ドメインをさらに欠いたポリペプチドも含まれる。かかるポリペプチドには、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするポリペプチドが含まれる。前記生物学的活性とは、二量体化、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、キナーゼ活性、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化、受容体型チロシンキナーゼのリン酸転移、シグナル伝達分子のリン酸化、リガンド結合、リガンド結合についての受容体型チロシンキナーゼとの競合、シグナル伝達、シグナル伝達分子との相互作用、膜結合および膜局在化であり得る。
【００１３】
本明細書にて提供および記載された単離されたポリペプチドを含む医薬組成物もまた、本明細書にて提供する。本明細書にて提供される医薬組成物には、ポリペプチドが、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列およびその対立遺伝子変異体と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを包含する組成物が含まれ、ここで配列同一性とは、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものであり、配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のそれぞれは、受容体型チロシンキナーゼイソ型である。本明細書にて提供される組成物とは、受容体型チロシンキナーゼの二量体化、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、キナーゼ活性、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化、受容体型チロシンキナーゼのリン酸転移、シグナル伝達分子のリン酸化、リガンド結合、リガンド結合についての受容体型チロシンキナーゼとの競合、シグナル伝達、シグナル伝達分子との相互作用、膜結合および膜局在化の１種またはそれ以上を含む、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性のモジュレートのために有効なポリペプチド量を含む組成物である。かかる組成物には、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性を阻害するものが含まれる。前記組成物には、受容体型チロシンキナーゼと複合体を形成するポリペプチドを含むものも含まれる。本明細書にて供される組成物には、例えば、受容体型チロシンキナーゼの阻害、ホモ二量体化および／またはヘテロ二量体化などをモジュレートする組成物を含む、受容体型チロシンキナーゼの二量体化をモジュレートする組成物、受容体型チロシンキナーゼのリン酸転移または自己リン酸化、および／またはシグナル伝達分子のリン酸化を阻害するかまたは減少する組成物を含む、受容体型チロシンキナーゼのリン酸化を阻害または減少する組成物、リガンド結合について受容体型チロシンキナーゼと競合する組成物、および受容体型チロシンキナーゼリガンド結合を減少するかまたは阻害する組成物、が含まれる。
【００１４】
本明細書中にて供され記載されるポリペプチドをコードする核酸分子を、本明細書中にて提供する。本明細書中にて供される核酸分子には、イントロンおよびエキソンを含むものが含まれ、ここで前記核酸分子は、エキソンイントロンジャンクションをつなぐオープンリーディングフレームをコードし、前記オープンリーディングフレームは、イントロンに含まれる終止コドンで終了する。かかる核酸分子には、コードされるポリペプチドの１個またはそれ以上のアミノ酸をコードするイントロンが含まれる。終止コドンが、イントロンにおける最初のコドンである核酸分子も含まれる。かかる核酸分子は、プロモーターに操作可能に連結され得る。核酸分子を含むベクター、およびベクターおよび／または核酸分子を含む細胞も提供する。
【００１５】
本明細書にて供される医薬組成物のいずれかを含む医薬組成物を投与することにより疾患または状態を処置する方法を、本明細書にて提供する。処置のための疾患または状態には、例えば、癌、炎症疾患、感染症、血管形成が関係する状態、細胞増殖が関係する状態、免疫疾患および神経変性疾患が含まれる。処置のための疾患および状態にはさらに、関節リウマチ、多発性硬化症および後部眼内炎、ブドウ膜の障害（uveitic disorder）、眼表面炎症性疾患、血管新生疾患（neovascular disease）、増殖性硝子体網膜症、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、血管腫、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、アルツハイマー病、狼瘡、血管狭窄、再狭窄、炎症性関節疾患、アテローム性動脈硬化症、尿路閉塞症候群、および喘息が含まれる。前記方法により処置するための癌には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、リンパ性悪性疾患、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、扁平上皮肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、上部消化器癌（gastric cancer）、胃癌（stomach cancer）、消化器癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎／腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌が含まれる。本明細書にて提供される方法には、血管形成、細胞増殖、細胞移動、または腫瘍細胞増殖または腫瘍細胞転移を阻害する医薬組成物で処置する方法が含まれる。また、疾患または状態が、ウイルスまたは寄生虫感染であるときの処置方法も提供され、マラリアの処置方法も含まれる。特に、医薬組成物が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むとき、マラリアの処置のための方法が提供される。
【００１６】
細胞表面受容体の活性をモジュレートする候補分子を同定するための創薬方法を、本明細書中にて提供する。前記方法には、以下：ａ）細胞表面受容体またはその一部をコードする発現された遺伝子配列セットを選択する工程；ｂ）発現された遺伝子配列セットを集め、配列の整列したセットを構築する工程；ｃ）細胞表面受容体イソ型（ここで前記イソ型は、細胞表面受容体の野生型または優性型と比較して細胞表面受容体の生物学的活性をモジュレートするのに十分な、少なくとも１個のドメインまたはその一部を欠く）をコードする整列したセットの少なくとも１個のメンバー配列を選択し；細胞表面受容体をモジュレートする候補分子を同定する工程、が含まれる。前記方法にはまた、整列したセットと参照遺伝子配列の比較により整列したセットのメンバー配列内に１個またはそれ以上のイントロンおよびエキソンを示す工程；およびイソ型をコードする少なくとも１個のメンバー配列を選択する工程、がさらに含まれ、ここで前記メンバー配列には、エキソンと操作可能に連結された、イントロン内にコードされる少なくとも１個のアミノ酸および／または終止コドンが含まれる。前記方法には、参照遺伝子配列の５’コーディングエキソンに相当する５’エキソンを含み、かつ／またはキナーゼドメインをコードするエキソンと操作可能に連結した少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加および／または膜貫通ドメインをコードするエキソンと操作可能に連結された少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加を含む、選択されたメンバー配列を選択する工程が含まれる。
【００１７】
前記方法には、受容体型チロシンキナーゼの活性をモジュレートする候補分子の同定が含まれる。前記方法にはまた、細胞表面受容体のイソ型である候補分子の同定が含まれる。かかるイソ型には、細胞表面受容体のＣ末端短縮型である、キナーゼドメイン、膜貫通ドメインまたはそれらの組合せなどのドメインまたはその一部を欠くイソ型、が含まれる。前記方法には、細胞表面受容体と二量体化する候補分子、細胞表面受容体が同じリガンドに結合するときリガンドに結合する候補分子、およびリガンド結合について細胞表面受容体と競合する候補分子、を同定することが含まれる。前記方法にはまた、細胞表面受容体のリン酸化を阻害する候補分子の同定が含まれる。前記方法には、例えば前記受容体の野生型または優性型と比較して生物学的活性を低下させる候補分子などの、細胞表面受容体の生物学的活性を変える候補分子の同定が含まれる。例えば、生物学的活性には、二量体化、キナーゼ活性、シグナル伝達、リガンド結合、膜結合および膜局在化が含まれる。本明細書中にて供される方法のいずれかにより同定されるポリペプチドも提供する。
【００１８】
（図面の簡単な説明）
図１は、発現配列タグ（ＥＳＴ）およびｅｒｂＢ２のスプライス変異体と共にｅｒｂＢ２遺伝子領域のアライメントを示す。
図２は、発現配列タグ（ＥＳＴ）およびＥｐｈＡ８のスプライス変異体と共にＥｐｈＡ８遺伝子領域のアライメントを示す。
【００１９】
（詳しい説明）
Ａ．定義
他に特に定義しない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および化学用語は、本発明の属する技術分野の通常の技術を有する者により、通常理解されるのと同様の意味を有する。本明細書中にてその全体の開示を通して参照する全ての特許、特許出願、公開された特許出願および刊行物、ＧＥＮＢＡＮＫ配列、ウェブサイトおよび他の公表物は、他に記載がない限り、参照によりその全体を組み込まれる。本明細書中の用語について複数の定義がある場合は、この章のものが優先する。参照が、ＵＲＬまたは他のかかる識別子もしくはアドレスからなる場合、かかる識別子が変更可能であって、かつインターネット上の特定の情報が出現しては消え得るが、同等の情報が公知であり、かつインターネットおよび／または適したデータベースの検索によるなどで容易にアクセス可能であることが、理解される。その参照は、かかる情報の利用可能性および一般的周知性の証拠となる。
【００２０】
本明細書中に用いた、細胞表面受容体は、細胞の表面に発現されるタンパク質であり、一般に、細胞の表面にそれを固定するための、少なくとも１個の膜貫通ドメインまたは他の部分を含む。受容体は、シグナル伝達またはリガンド内在化などの、細胞表面受容体の活性を仲介するかまたはそれに関わるリガンドと結合することができる。細胞表面受容体には、成長因子受容体などの受容体型チロシンキナーゼ、およびイオンチャネルなどのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書中に用いた、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）とは、タンパク質、一般には糖タンパク質を意味し、それは成長因子受容体タンパク質ファミリーのメンバーである。成長因子受容体とは一般に、細胞増殖、細胞分裂、分化、代謝および細胞移動を含む細胞過程に関する。ＲＴＫはまた、細胞増殖、分化および細胞運命決定、ならびに腫瘍増殖に関与することが知られている。ＲＴＫは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを含む、保存されたドメイン構造を有する。一般に、細胞外ドメインは、ポリペプチド成長因子または細胞膜結合分子に結合する。いくつかの場合には、ＲＴＫは、リガンドに結合せず、かつ／またはリガンド結合とは独立して活性である；例えばＨＥＲ２は、リガンド結合なしで活性であり、リガンド結合ＨＥＲ２は確認されていない。一般に、チロシンキナーゼドメインは、受容体の正および負の制御に関与する。いくつかの場合、例えばＥｒｂＢ３には、キナーゼ活性は、受容体のみでは存在しない。
【００２２】
受容体型チロシンキナーゼは、例えばその細胞外ドメイン内の配列モチーフの構造配置などに基づくファミリーにグループ分けされている。例えば、免疫グロブリン、フィブロネクチン、カドヘリン、上皮成長因子およびクリングルリピート（kringle repeat）などの構造モチーフである。構造モチーフによる分類では、それぞれが保存されたチロシンキナーゼドメインを有する、１６個以上のファミリーのＲＴＫが同定されている。ＲＴＫの例としては、エリスロポエチン産生肝細胞（ＥＰＨ）受容体、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）受容体、細胞接着ＲＴＫ（ＣＡＫ）、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、およびインスリン受容体関連（ＩＲＲ）受容体が含まれるが、これらに限定されない。ＲＴＫをコードする遺伝子の例としては、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＴＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ８、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ−１としても公知）、ＦＬＫ１（ＶＥＧＦＲ−２としても公知）、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、およびＴＥＫ（ＴＩＥ−２としても公知）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
ＲＴＫの二量体化は、受容体の触媒性チロシンキナーゼドメインおよびチロシン自己リン酸化を活性化する。キナーゼドメインにおける自己リン酸化は、チロシンキナーゼドメインを活性化された状態に維持する。タンパク質の他の部位の自己リン酸化は、受容体と他の細胞タンパク質との相互作用に影響する。いくつかのＲＴＫに関して、細胞外ドメインへのリガンド結合が、受容体の二量体化を誘導する。いくつかのＲＴＫに関して、受容体は、リガンドの不存在下で二量体化できる。二量体化はまた、受容体の過剰発現によっても増加され得る。
【００２４】
本明細書中に用いた、受容体型チロシンキナーゼのイソ型などの、細胞表面受容体のイソ型（本明細書中にて、ＣＳＲイソ型とも称する）とは、受容体の生物学的活性を変えるか、または受容体の野生型および／または優性型と比較して生物学的活性を低下するのに十分なドメインまたはその一部を欠いた受容体を意味する。一般に、本発明の目的にて、生物学的活性はイソ型で低下され得る。かかる低下は、受容体の野生型および／または優性型と比較して、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍の低下である。一般に、生物学的活性は、１０、２０、５０、１００または１０００倍かもしくはそれ以上で変化する。１つの態様にて、生物学的活性の変化とは、活性の低下である。イソ型に関して、活性の変化とは、受容体の非短縮型と比較して、特定のイソ型である短縮型の間の活性の相違を意味する。生物学的活性の変化には、活性の増大または低下が含まれる。１つの態様にて、生物学的活性の変化とは、生物学的活性の低下である；前記低下は、受容体の野生型および／または優性型と比較して、少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍であり得る。一般に、生物学的活性は、５、１０、２０、５０、１００または１０００倍もしくはそれ以上低下する。
【００２５】
本明細書中、細胞表面受容体の活性のモジュレートとは、ＣＳＲイソ型が、受容体といくつかの方法で相互作用し、細胞表面受容体のリガンド結合または二量体化または他のシグナル伝達関連活性などの活性を変えることを意味する。本明細書中、変化した活性を有するＣＳＲイソ型とは、同系の受容体と比較して、ＣＳＲイソ型の構造または配列が異なることにより活性が変化することを示す。
【００２６】
細胞表面受容体イソ型は、細胞、組織および器官で発現されるイソ型の単離を含む本技術分野で公知のいずれかの方法、および組換え方法、ならびにコンピュータ利用した方法（in silico）および合成方法の使用により、作製され得る。受容体型チロシンキナーゼのイソ型を含む細胞表面受容体のイソ型は、受容体型チロシンキナーゼ遺伝子から転写された選択的にスプライシングされたＲＮＡによりコードされ得る。かかるイソ型には、エキソン欠失、エキソン保持、エキソン伸長、エキソン切断およびイントロン保持により選択的にスプライスされたＲＮＡが含まれる。
【００２７】
本明細書中に用いた、エキソン欠失とは、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡと比較して少なくとも１個のエキソンを欠く核酸分子を生じる、選択的ＲＮＡスプライシング事象を意味する。
【００２８】
本明細書中に用いた、エキソン挿入とは、一般に、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡに存在しない少なくとも１個のエキソンを含む核酸分子を生じる、選択的ＲＮＡスプライシング事象を意味する。
【００２９】
本明細書中に用いた、エキソン伸長とは、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡ中の相当するエキソンよりも長い（エキソン中に含まれるヌクレオチドの数が多い）少なくとも１個のエキソンを含む核酸分子を生じる、選択的ＲＮＡスプライシング事象を意味する。いくつかの場合にて、本明細書中にさらに記載のとおり、ｍＲＮＡは、イントロン融合タンパク質をコードするエキソン伸長により生じる。
【００３０】
本明細書中に用いた、エキソン切断とは、１個またはそれ以上のエキソンが、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡ中の相当するエキソンと比較してより短い（ヌクレオチドの数が少ない）ような、１個またはそれ以上のエキソンの切断を含む核酸分子を生じる、選択的ＲＮＡスプライシング事象を意味する。
【００３１】
本明細書中に用いた、イントロン保持とは、１個またはそれ以上のエキソンと操作可能に連結されたイントロンまたはその一部を含む核酸分子を生じる、選択的ＲＮＡスプライシング事象を意味する。いくつかの場合にて、本明細書中にさらに記載のように、ｍＲＮＡは、イントロン融合タンパク質をコードするイントロン伸長により生じる。
【００３２】
本明細書中に用いた、イントロン融合タンパク質（ＩＦＰ）とは、１個あるいはそれ以上のドメイン、または１個あるいはそれ以上のドメイン一部を欠失するイソ型を意味し、その結果、受容体の生物学的活性の変化を生じる。さらに、ＩＦＰは、エキソンによりコードされたアミノ酸と操作可能に連結された、エキソンによりコードされない１個またはそれ以上のアミノ酸を含み、かつ／またはＣＳＲ遺伝子にコードされる野生型または優性型と比較して短い。ＩＦＰは、可能性のあるスプライス部位を同定し、その後組換え方法によりかかる分子を生じることによりコンピュータ内で同定された、選択的にスプライスされたＲＮＡおよび／またはＲＮＡ分子によりコードされ得る。一般に、ＩＦＰは、ＣＳＲポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡの対応する配列に存在しない、ＩＦＰコーディングＲＮＡにおける１個またはそれ以上の終止コドンの存在により短縮される。アミノ酸および／または終止コドンの付加は、結果としてポリペプチドの野生型または優性型と大きさおよび配列が異なるＩＦＰを生じ得る。
【００３３】
本発明の目的に関して、ＩＦＰには、天然および組合せのイントロン融合タンパク質が含まれる。天然ＩＦＰとは、遺伝子の１個またはそれ以上のエキソンによりコードされるポリペプチドの１個またはそれ以上の部分と操作可能に連結されたイントロンによりコードされる１個またはそれ以上のアミノ酸を含む、選択的にスプライスされたＲＮＡによりコードされるポリペプチドを意味する。選択的にスプライスされたｍＲＮＡは、単離されるものであるか、または遺伝子中のスプライシング供与部位および受容部位を連結することにより合成的に製造され得るものである。天然のＩＦＰには、イントロン配列によりコードされる１個またはそれ以上のアミノ酸および／または１個またはそれ以上の終止コドンが含まれる。組合せＩＦＰとは、ポリペプチドの野生型または優性型と比較して短縮されたポリペプチドを意味する。一般に、短縮とは、生物学的活性が変化されるような、ポリペプチドからの１個またはそれ以上のドメインまたはその一部の除去である。組合せＩＦＰはしばしば、１個またはそれ以上のドメインまたはその一部が、同じ遺伝子配列に由来するかまたは関連する遺伝子ファミリーにおける遺伝子配列に由来する天然ＩＦＰで欠失している点で、天然ＩＦＰとよく似ている。
【００３４】
本明細書中に用いた、ＩＦＰについて天然とは、動物のゲノム内にコードされかつ／または動物にて製造または作製されるか、または遺伝子から合成され得る、任意のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドもしくはそのフラグメント（適当なスプライス受容部位／供与部位の存在による）を意味する。天然ＩＦＰには、対立遺伝子変異体が含まれる。ＩＦＰは、翻訳後修飾され得る。
【００３５】
本明細書中に用いた、エキソンとは、ＲＮＡに転写され、かつスプライシングおよび他のＲＮＡプロセシング後にｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）などのＲＮＡの成熟形態で表されるヌクレオチド配列を意味する。ｍＲＮＡには、操作可能に連結された１個またはそれ以上のエキソンが含まれる。エキソンは、ポリペプチドまたはポリペプチドの一部をコードし得る。エキソンはまた、翻訳されない配列、例えば、翻訳調節配列も含み得る。エキソン配列はしばしば、遺伝子ファミリーメンバー間で保存され、相同性を示す
【００３６】
本明細書中に用いた、イントロンとは、ＲＮＡに転写され、その後通常、ＲＮＡの成熟型、例えばｍＲＮＡを作製するためにスプライシングによりＲＮＡから除去されるるヌクレオチド配列を意味する。一般に、イントロンのヌクレオチド配列は、成熟ＲＮＡには組み込まれておらず、そしてイントロン配列またはその一部もまた通常、ポリペプチドに翻訳されずかつ組み込まれない。スプライス供与体および受容体などのスプライスシグナル配列は、ＲＮＡからイントロンを除去するための細胞のスプライシング機構に用いられる。１個のスプライス変異体におけるイントロンは、他の変異体におけるエキソン（すなわち、スプライスされた転写産物に存在する）であり得ることは特記すべき事項である。故に、ＩＦＰをコードするスプライスされたｍＲＮＡには、エキソンおよびイントロンが含まれ得る。
【００３７】
本明細書中に用いた、スプライシングとは、ｍＲＮＡ中のイントロンが除去され、エキソンが成熟ＲＮＡを作るために操作可能に連結される、ＲＮＡの成熟過程を意味する。選択的スプライシングとは、遺伝子から多数のＲＮＡを作り出す過程を意味する。選択的スプライシング産物には、操作可能に連結した遺伝子の全部ではないエキソン、および／または遺伝子に由来するすべての転写産物に存在しない操作可能に連結した１個またはそれ以上の選択的エキソンが含まれ得る。選択的ＲＮＡスプライシングは、生物、細胞または組織タイプの発達過程で調節され得る。さらに、ホルモンおよびサイトカインなどの他の因子が、転写およびその結果のスプライシングパターンをモジュレートすることができる。これらの因子は、細胞または組織タイプまたは段階でのＲＮＡについて異なるスプライシングパターンを生じ、故にｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡを含む異なるＲＮＡの集団が生じる。選択的スプライシングは、ＲＮＡおよびコードされた分子を生じさせ得る。
【００３８】
本明細書中に用いた、遺伝子配列とも称する、遺伝子とは、少なくとも１個のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、ＲＮＡに転写されるヌクレオチド配列（イントロンおよびエキソン）を意味する。遺伝子には、ＲＮＡの転写およびプロセシングを調節するヌクレオチド配列が含まれる。遺伝子にはまた、プロモーターおよびエンハンサーなどのヌクレオチドの調節配列、および翻訳調節配列が含まれる。
【００３９】
本明細書中に用いた、スプライス部位とは、イントロンの除去および／またはエキソンの連結に関与する遺伝子内の１個またはそれ以上のヌクレオチドを示す。スプライス部位には、スプライス受容部位およびスプライス供与部位が含まれる。
【００４０】
本明細書中に用いた、野生型、例えばポリペプチドの野生型とは、遺伝子によりコードされるポリペプチドを意味する。一般に、野生型とは、変異または機能もしくは構造を変える他の修飾がない遺伝子（またはＲＮＡまたはそれに由来するタンパク質）を意味する；野生型には、種間の対立遺伝子変異体が含まれる。
【００４１】
本明細書中に用いた、優性型、例えば、ポリペプチドの優性型とは、遺伝子から作製される主なポリペプチドであるポリペプチドを意味する。「優性型」は、供給源によって変化する。例えば、異なる細胞または組織タイプが、ポリペプチドの異なる形態を、例えば、選択的スプライシングにより、および／または選択的タンパク質プロセシングにより生じ得る。それぞれの細胞または組織タイプにて、異なるポリペプチド配列を、「優性型」とし得る。
【００４２】
本明細書中に用いた、ドメインとは、構造的および／または機能的に区別可能であるかまたは定義可能なポリペプチドの一部（３個またはそれ以上の、一般に５個または７個またはそれ以上のアミノ酸配列）を意味する。例えば、ドメインは、その配列の関連するファミリーメンバーとの相同性、例えば細胞外ドメインを規定するモチーフの相同性により、同定、定義または分類され得る。他の例にて、ドメインは、例えばキナーゼ活性などの酵素活性など、またはＤＮＡ結合、リガンド結合、および二量体化などの生体分子との相互作用能などの、その機能により分類され得る。ドメイン単独でかまたは他の分子と融合して、例えば、タンパク質分解活性またはリガンド結合などの生物学的活性を果たし得るため、ドメイン単独で、生物学的機能または活性を示し得る。ドメインは、ポリペプチドに由来する直線状のアミノ酸配列または直線状でないアミノ酸配列であり得る。多くのポリペプチドには、複数のドメインが含まれる。例えば、受容体型チロシンキナーゼは一般に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内チロシンキナーゼドメインを含む。
【００４３】
本明細書中に用いた、対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異とは、遺伝子の参照型とは異なる（すなわち、対立遺伝子にコードされる）遺伝子にコードされるポリペプチドを示す。一般に、遺伝子の参照型は、集団または単一のある種の参照メンバーに由来するポリペプチドの野生型および／または優性型をコードする。一般に、種間の変異体を含む対立遺伝子変異体は通常、同種由来の野生型および／または優性型と少なくとも８０％、９０％またはそれ以上のアミノ酸相同性を有し；その相同性の程度は、遺伝子と、比較が種間または種内のどちらであるかに依存する。一般に、種内の対立遺伝子変異体は、ポリペプチドの野生型および／または優性型と９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性を含む、野生型および／または優性型と少なくとも約９５％またはそれ以上の相同性を有する。
【００４４】
本明細書中に用いた、ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸分子におけるヌクレオチド配列の修飾に関連した修飾とは、アミノ酸およびヌクレオチドそれぞれの欠失、挿入、および置換を含む。
【００４５】
本明細書中に用いた、オープンリーディングフレームとは、ポリペプチドまたはその一部をコードするヌクレオチドを意味する。オープンリーディングフレームは、全長のポリペプチドまたはその一部をコードし得る。オープンリーディングフレームは、終止コドンがイントロン内にあり、イントロンの全部または一部が、転写ｍＲＮＡ内にあるとき、１個またはそれ以上のエキソンもしくは１個のエキソンとイントロンを操作可能に連結することにより作製され得る。
【００４６】
本明細書中に用いた、ポリペプチドとは、共有結合した２個またはそれ以上のアミノ酸を示す。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書にて互換可能に用いられる。
【００４７】
本明細書中に用いた、短縮型核酸分子またはタンパク質に関する短縮型とは、タンパク質または核酸分子の野生型または優性型と比較して全長に満たないヌクレオチドまたはアミノ酸配列を示す。
【００４８】
本明細書中に用いた、本明細書中にて供されるイソ型に関する同系の受容体とは、特定のイソ型と同じ遺伝子によりコードされる受容体を示す。一般に、同系の受容体はまた、優性型である。例えば、ヘルスタチン（herstatin）は、Ｈｅｒ−２受容体（ｅｒｂｂ２受容体）の特異的な変異体にコードされる。故に、Ｈｅｒ−２は、ヘルスタチンについて同系の受容体である。
【００４９】
本明細書中に用いた、参照遺伝子とは、遺伝子内のイントロンおよびエキソンをマッピングするために用い得る遺伝子を示す。参照遺伝子は、遺伝子中でイントロンおよびエキソンをマッピングするために、例えば、発現された遺伝子配列と比較され得るゲノムＤＮＡまたはその一部であり得る。参照遺伝子はまた、ポリペプチドの野生型または優性型をコードする遺伝子であり得る。
【００５０】
本明細書中に用いた、タンパク質または遺伝子のファミリーまたは関連ファミリーとは、それぞれ、互いに相同性および／または構造的類似性および／または機能的類似性を有するタンパク質または遺伝子の群を示す。
【００５１】
本明細書中に用いた、未成熟の終止コドンとは、終止コドンが、ポリペプチドの野生型または優性型などの、タンパク質の全長型を生じるかまたは作製するために用いられる終止コドン前の、配列のオープンリーディングフレーム中に生じる終止コドンである。未成熟の終止コドンが生じた場合、結果として、例えば、選択的スプライシングおよび変異が生じ得る。
【００５２】
本明細書中に用いた、発現遺伝子配列とは、遺伝子から転写されるかまたは転写されると予測される任意のヌクレオチド配列を意味する。発現遺伝子配列には、ｃＤＮＡ、ＥＳＴ、および、例えばスプライス部位予測およびスプライスされた配列のコンピュータでの作成に基づく、コンピュータで予測される発現配列が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書中に用いた、発現配列タグ（ＥＳＴ）とは、発現遺伝子配列から作製されるヌクレオチド配列である。ＥＳＴは、ｃＤＮＡを生成するためのｍＲＮＡの集まりを用いることにより作製される。ｃＤＮＡは、ｍＲＮＡに存在するポリＡテイルからプライミングすることにより作製され得る。ｃＤＮＡはまた、ｍＲＮＡの内部でｃＤＮＡ合成をプライミングする、１個またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを用いたランダムプライミングにより作製され得る。生成したｃＤＮＡは配列決定され、その配列は通常、データベースに保存される。ｄｂＥＳＴにおけるＥＳＴデータベースの例は、ncbi.nlm.nih.gov/ dbESTにてオンラインで発見される。各ＥＳＴ配列には、一般に、独自の識別子が割り当てられ、そしてヌクレオチド配列、長さ、発現される組織の型および他の関連するデータなどの情報が識別子に付随される。
【００５４】
本明細書中に用いた、キナーゼとは、分子、特に、マクロ分子および小分子を含む生体分子をリン酸化することができるタンパク質である。例えば、前記分子は、小分子、タンパク質であり得る。リン酸化には、自己リン酸化が含まれる。いくつかのキナーゼは、構成的キナーゼ活性を有する。他のキナーゼは、活性化が必要である。例えば、シグナル伝達に関与する多くのキナーゼは、リン酸化される。リン酸化は、経路における他の生体分子で、そのキナーゼ活性を活性化する。いくつかのキナーゼは、タンパク質構造および／または他の分子との相互作用における変化によりモジュレートされる。例えば、タンパク質の複合化または分子のキナーゼへの結合が、キナーゼ活性を活性化または阻害し得る。
【００５５】
本明細書中に用いた、指定とは、参照または比較の基準としての分子またはその一部の選択を示す。例えば、ドメインは、選択されたドメイン内で修飾されているポリペプチドの構築を目的とした指定ドメインとして選択され得る。他の例にて、イントロンは、選択されたイントロンを含むかまたは除くＲＮＡ翻訳物を同定することを目的とした指定イントロンとして選択され得る。
【００５６】
本明細書中に用いた、モジュレートするおよびモジュレーションとは、タンパク質などの分子の活性を変えることを示す。活性には、シグナル伝達などの生物学的活性が含まれるが、これに限定されない。モジュレーションは、活性の増大（すなわち、上方制御アゴニスト活性）、活性の低下（すなわち、下方制御または阻害）、または活性における他の変化（例えば、周期性、頻度、持続時間、反応速度など）を含み得る。モジュレーションとは、文脈に依存し得、通常、モジュレーションは、指定した状態、例えば、野生型タンパク質、構成的な状態のタンパク質、または指定細胞型もしくは状態で発現されるタンパク質と比較される。
【００５７】
本明細書中に用いた、阻害するまたは阻害とは、生物学的活性における低下を示す。
【００５８】
本明細書中に用いた、組成物とは、任意の混合物を意味する。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水溶液、非水溶液またはそのいずれかの組合せであり得る。
【００５９】
本明細書中に用いた、組合せとは、２個またはそれ以上の物（item）間の任意の結合を意味する。前記組合せは、２個の組成物または２個の集合物などの、２個またはそれ以上の別々の物であり得、２個またはそれ以上の物の単一の混合物などのその混合物、またはその任意の変形であり得る。
【００６０】
本明細書中に用いた、医薬的効果とは、疾患もしくは障害の処置またはその症状の改善を意図した薬物の投与により観察される効果を示す。
【００６１】
本明細書中に用いた、処置とは、状態、障害もしくは疾患の症状、または他の徴候を、改善するかまたは他の有益な変化をもたらす任意の方法を意味する。
【００６２】
本明細書中に用いた、治療的に有効とは、疾患もしくは状態の症状を変化する、通常好転するかもしくは改善するか、または疾患または状態を治療する、対象の処置により生じる効果を意味する。治療的有効量とは、対象への投与後に治療的に有効な結果を生じる、組成物、分子または化合物の量を示す。
【００６３】
本明細書中に用いた、用語「対象」とは、ヒトなどの哺乳動物を含む動物を示す。本明細書中に用いた、患者とは、ヒト対象を示す。
【００６４】
本明細書中に用いた、生物学的活性とは、複合体形成、二量体化、多量体化、リン酸化、脱リン酸化、自己リン酸化、他の分子との複合体形成能、リガンド結合、触媒活性または酵素活性、自己活性化およびポリペプチドの活性化を含む活性化、他の分子の機能の阻害またはモジュレーション、細胞増殖、移動、分化、および成長、分解、膜局在化、膜結合、および腫瘍形成などのシグナル伝達および／または細胞応答の刺激または阻害、を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの機能を示す。生物学的活性を、インビトロ分析、細胞に基づく分析、インビボ分析、動物モデルおよび他の周知の生物学的モデルを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の分析および本技術分野にて公知の標準的な分析により測定することができる。
【００６５】
本明細書中に用いた、複合体形成とは、２個のタンパク質分子などの２個またはそれ以上の分子の相互作用により複合体を形成することを意味する。相互作用は、非共有結合および／または共有結合、ならびに疎水性相互作用および静電的相互作用、ファンデルワールス力および水素結合を含むがこれらに限定されない結合により成され得る。一般的に、タンパク質−タンパク質相互作用は、疎水性相互作用および水素結合を伴う。複合体形成は、温度、ｐＨ、イオン強度および圧力、ならびにタンパク質濃度などの環境条件により影響を受け得る。
【００６６】
本明細書中に用いた、二量体化とは、例えば２個の受容体分子などの、同じ型の２個の分子の相互作用を意味する。二量体化には、２個の同じ分子が相互作用するときのホモ二量体化が含まれる。二量体化には、例えば受容体の２個のサブユニットおよび２個の異なる受容体分子の二量体化などの、２個の異なる分子のヘテロ二量体化も含まれる。通常、二量体化は、それぞれの分子に含まれる二量体化ドメインの相互作用を介して、互いに相互作用する２個の分子を含む。
【００６７】
本明細書中に用いた、コンピュータ内（in silico）とは、コンピュータを用いて行われる探索および実験を意味する。コンピュータを利用した方法には、例えばＢＬＡＳＴ、ＡＣＥＭＢＬＹ、およびＳＩＭ４などを用いた、分子相互作用、配列決定および比較などの、分子モデリング実験、生体分子結合実験、分子構造および／または過程のバーチャル表示が含まれるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書中に用いた、生物学的試料とは、生物起源またはウイルス起源から得られる任意の試料を意味し、それには核酸またはタンパク質または他のマクロ分子を得ることができる対象の任意の細胞型または組織が含まれる。前記生物学的試料は、生物学的起源から直接得られたまたは処理された試料であり得る。例えば、増幅された単離された核酸は、生物学的試料の構成要素である。生物学的試料には、動物および植物由来の、血液、血漿、血清、髄液、滑液、尿および汗などの体液、組織および臓器試料が含まれるが、それらに限定されない。土壌および水試料、ならびに他の環境試料、ウイルス、細菌類、菌類、藻類、原生動物およびその成分もまた含まれる。
【００６９】
本明細書中に用いた、マクロ分子とは、数百から数百万の分子量を有する任意の分子を意味する。マクロ分子には、一般に生命体により合成されるが、合成的にまたは組換え分子生物学的方法を用いて製造できる、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、核酸、および他のかかる分子が含まれる。
【００７０】
本明細書中に用いた、生体分子とは、天然に見られる任意の化合物、またはその誘導体である。生体分子には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴ糖類および単糖類が含まれるが、それらに限定されない。
【００７１】
本明細書中に用いた、用語「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、およびリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびにＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかの類似体または誘導体などの、一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチドを示す。用語「核酸」には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエート型ＤＮＡ、ならびに他のかかる類似体および誘導体またはその組合せなどの、核酸の類似体も含まれる。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）などのポリヌクレオチドを意味し得る。前記用語には、ヌクレオチド類似体、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドから作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのどちらかの等量体、誘導体、変異体および類似体なども含まれる。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。ＲＮＡについて、ウラシル塩基は、ウリジンである。
【００７２】
本明細書中に用いた、用語「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、および例えばヌクレオチド類似体、またはホスホジエステル結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホラミデート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（ペプチド核酸）以外の「骨格」結合を含むＤＮＡまたはＲＮＡ誘導体を含む、少なくとの２個の連結したヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを示す。用語「オリゴヌクレオチド」も、例えば、一般に約５０から１００ヌクレオチド以下の長さであるＰＣＲプライマーなどがオリゴヌクレオチドであると本技術分野では認識されているが、本明細書中にて「ポリヌクレオチド」と本質的に同義で用いられる。
【００７３】
本明細書中に用いた、合成配列および合成遺伝子の文脈における合成とは、組換え方法および／または化学的合成方法により製造される核酸分子を示す。
【００７４】
ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド類似体とは、ポリヌクレオチドの質量分離を可能とする、例えば、質量修飾ヌクレオチド；ポリヌクレオチドの検出を可能とする、蛍光、放射活性、発光または化学発光標識などの検出可能な標識を含むヌクレオチド；または、固体支持体へのポリヌクレオチドの固定化を容易にする、ビオチンまたはチオール基などの反応基を含むヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチドにはまた、例えば、化学的、酵素的または光分解的に選択的に開裂可能な、１個またはそれ以上の骨格結合が含まれ得る。例えば、ポリヌクレオチドには、１個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドとそれに続く１個またはそれ以上のリボヌクレオチド(１個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドがそれに続いていてよい)が含まれ得、このような配列は、例えば塩基性加水分解によりリボヌクレオチド配列で開裂され得る。ポリヌクレオチドはまた、開裂に比較的強い１個またはそれ以上の結合を含み得、例えば、核酸結合により連結されたヌクレオチドと３’末端にホスホジエステル結合または他の適当な結合により連結され、そしてポリメラーゼにより伸長される可能性のある少なくとも１個のヌクレオチドを含む、キメラオリゴヌクレオチドプライマーが含まれ得る。ペプチド核酸配列は、よく知られた方法（例えば、Weilerらの、Nucleic acids Res. 25: 2792−2799（1997）を参照のこと）により製造可能である。
【００７５】
本明細書中に用いた、オリゴヌクレオチドとは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸類似体、およびそれらの組合せを含むポリマーを示す。本明細書の目的に関して、プライマーおよびプローブは、一本鎖オリゴヌクレオチドであるかまたは部分的に一本鎖のオリゴヌクレオチドである。
【００７６】
本明細書中に用いた、プライマーとは、２個またはそれ以上、一般的には３個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み、それから、プライマー伸長産物の合成を開始することができるオリゴヌクレオチドを示す。合成を誘導するための実験条件には、ヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメレースなどの重合化および伸長のための試薬の存在、ならびに適当な緩衝液、温度およびｐＨが含まれる。
【００７７】
本明細書中に用いた、組換えＤＮＡ法を用いた組換え手段による製造法とは、クローン化されたＤＮＡにコードされた発現タンパク質のための分子生物学の周知の方法の使用を意味する。
【００７８】
本明細書中に用いた、核酸分子、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたは抗体などの分子についての「単離された」とは、その天然環境中で見られる状態から人間の手により改変された分子を意味する。例えば、組換え宿主細胞により産生され、および／またはその中に含まれる分子が、「単離された」と見なされる。同様に、天然源または組換え宿主細胞から部分的にもしくは十分に精製されたか、または合成法により製造された分子が、「単離された」と見なされる。意図する適用に依存して、単離された分子は、動物、細胞またはその抽出物中；脱水状態、蒸気、溶液または懸濁液中；または、固体支持体に固定された状態などの任意の形態で存在し得る。
【００７９】
本明細書中に用いた、用語「ベクター」とは、それが連結されている他の核酸を輸送することができる核酸分子を示す。ベクターの１つの型は、エピソーム、すなわち、余分な染色体複製の可能な核酸である。ベクターには、自己複製が可能なもの、および／またはそれらが連結する核酸の発現が可能なものが含まれる。それらが操作可能に連結した遺伝子の発現を指示し得るベクターを、本明細書にて「発現ベクター」と称する。一般に、発現ベクターはしばしば、そのベクター形態では染色体に結合しない環状二本鎖ＤＮＡループである「プラスミド」の形態である。「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に使用されている形態であるため、互換可能に用いられる。同等な機能を果たす他の発現ベクターのかかる他の形態は、当技術分野で公知である。
【００８０】
本明細書中に用いた、「形質転換動物」とは、１個またはそれ以上の動物の細胞が、当業者に周知の形質転換技術などの人間の介入により導入された異種核酸を含む、任意の動物、一般にはヒトでない動物、例えば、哺乳動物、鳥類または両生類などを示す。前記核酸は、例えばマイクロインジェクションによるかまたは組換えウイルスでの感染によるなどの意図的な遺伝子操作により、細胞に直接的または同細胞の前駆体への導入により間接的に導入される。この分子は、染色体内に安定に組込まれ得、すなわち、染色体の一部として複製するか、または染色体外で複製するＤＮＡであり得る。一般的な形質転換動物では、遺伝子導入は、細胞にタンパク質の組換え形態を発現させる。
【００８１】
本明細書中に用いた、レポーター遺伝子構築物とは、転写制御配列と操作可能に連結したレポーターをコードする核酸を含む核酸分子である。レポーター遺伝子の転写は、これらの配列により制御されている。少なくとも１個またはそれ以上のこれらの制御配列の活性は、細胞表面タンパク質、細胞内のシグナル伝達に関与するタンパク質または小分子などの他の分子により、直接的にまたは間接的に調節される。転写制御配列には、プロモーター配列、およびプロモーターの活性をモジュレートするエンハンサー配列などの他の制御部位、またはＲＮＡポリメレースの活性もしくは効率をモジュレートする制御配列、が含まれる。かかる配列は、本明細書中にて、転写制御要素または配列と称される。さらに、前記構築物には、得られるｍＲＮＡの翻訳を変えるヌクレオチドが含まれ得、故にレポーター遺伝子産物の量が変化する。
【００８２】
本明細書中に用いた、「レポーター」または「レポーター部分」とは、細胞により発現されたタンパク質、または生物学的粒子などの、興味のある分子の検出を可能とする任意の部分を示す。通常レポーター部分には、例えば、赤、青および緑の蛍光タンパク質（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ種および他の種由来のＧＦＰを提供する、米国特許番号第６，２３２，１０７号を参照のこと）などの蛍光タンパク質、大腸菌由来のｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスタファーゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）および他のかかる周知の遺伝子が含まれる。細胞における発現について、レポーター部分をコードする核酸は、「レポーター遺伝子」として本明細書中に示され、興味のあるタンパク質との融合タンパク質として発現され得るか、または興味のあるプロモーターの制御下に発現され得る。
【００８３】
本明細書中に用いた、熟語「操作可能に連結された」とは一般に、一本鎖または二本鎖のどちらかの形態である、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸の一部に共有結合されている配列または断片を意味する。前記断片は、必ず隣接しているわけでなく、むしろ、２個またはそれ以上の構成成分が、それらが意図された方法で機能するのを可能とする関係にあるように、並置される。例えば、ＲＮＡの断片（エキソン）は、スプライシングなどにより操作可能に連結され、単一のＲＮＡ分子を形成し得る。他の例にて、ＤＮＡ断片は、操作可能に連結され得、故に、一つの断片上の制御または調節配列が、他の断片の発現または複製または他のかかる制御を制御するか可能とする。故に、レポーターおよび任意の他のポリヌクレオチドと操作可能に連結した調節領域、または調節領域と操作可能に連結したレポーターまたは任意のポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチド／レポーターの発現は、調節領域により影響を受けるかまたは制御される（例えば、増大または減少などのモジュレートまたは変化を受ける）。遺伝子発現に関して、ヌクレオチド配列および制御配列は、転写活性化タンパク質などの適した分子シグナルが調節配列に結合しているとき、遺伝子発現を制御または可能とするような方法で結合している。ＤＮＡなどの異種核酸の、プロモーター、エンハンサー、転写終了部位および翻訳終了部位などのヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列、ならびに他のシグナル配列への操作可能な連結とは、かかるＤＮＡとかかるヌクレオチド配列間のつながりを示す。例えば、異種ＤＮＡのプロモーターへの操作可能な連結は、かかるＤＮＡの転写が、リーディングフレーム内のＤＮＡを特異的に認識し、それと結合し、そして転写するＲＮＡポリメレースにより、プロモーターから開始されるような、ＤＮＡとプロモーター間の物理的関係を意味する。
【００８４】
本明細書中に用いた、イソ型およびＩＦＰなどのポリペプチドの作製に関する語句「核酸から作製される」には、核酸配列のアミノ酸配列への転写による、ポリペプチド分子の文言通りの作製およびポリペプチドのアミノ酸配列の作製が含まれる。
【００８５】
本明細書中に用いた、プロモーター領域とは、それが操作可能に転結するＤＮＡの転写を制御する遺伝子のＤＮＡの一部分を意味する。プロモーター領域には、ＲＮＡポリメレースの認識、結合および転写開始に必要な特定のＤＮＡ配列が含まれる。このプロモーター領域部分は、プロモーターと称される。さらに、プロモーター領域には、ＲＮＡポリメレースのこの認識、結合および転写の開始活性をモジュレートする配列が含まれる。これらの配列は、シス（ｃｉｓ）に作用し得るか、またはトランス（ｔｒａｎｓ）に作用する因子に応答し得る。制御の性質に依存して、プロモーターは構成的であるかまたは調節され得る。
【００８６】
本明細書中に用いた、調節領域とは、操作可能に連結された遺伝子の発現に、正または負に影響するシスに作用するヌクレオチド配列を意味する。調節領域には、遺伝子の誘導性（すなわち、転写の増大に必要な物質または刺激）発現に寄与する、ヌクレオチド配列が含まれる。誘導物質が存在するか、または増加した濃度であるとき、遺伝子発現は、増大され得る。調節領域にはまた、遺伝子発現の抑制に寄与する配列が含まれる（すなわち、転写を減少する物質または刺激）。リプレッサーが存在するか、または増加した濃度であるとき、遺伝子発現は、減少され得る。調節領域は、細胞増殖、細胞成長および細胞死、細胞分化および免疫調節を含むインビボにおける多くの生物学的活性に影響し、モジュレートし、または制御することが知られている。調節領域は通常、遺伝子の転写の増加または減少をもたらす１個またはそれ以上のトランス作用タンパク質に結合する。
【００８７】
遺伝子の調節領域の具体的な例は、プロモーターおよびエンハンサーである。プロモーターは、転写または翻訳開始部位の周囲に位置し、通常翻訳開始部位の５’位に位置する。プロモーターは通常、翻訳開始部位の１Ｋｂ以内に位置するが、例えば、２Ｋｂ、３Ｋｂ、４Ｋｂ、５Ｋｂまたはそれ以上、１０Ｋｂまで（１０Ｋｂを含む）のさらに離れた位置でも良い。エンハンサーは、遺伝子の５’位または３’位に位置するか、またはエキソンあるいはイントロン中に位置するとき、遺伝子発現に影響することが知られている。エンハンサーはまた、遺伝子から遠く離れた場所、例えば、約３Ｋｂ、５Ｋｂ、７Ｋｂ、１０Ｋｂ、１５Ｋｂまたはそれ以上離れた場所でも機能し得る。
【００８８】
調節領域にはまた、プロモーター領域に加えて、翻訳を促進する配列、イントロンのための、ｍＲＮＡのインフレーム翻訳を可能とする遺伝子の正しいリーディングフレームの維持のためのスプライシングシグナル、および終止コドン、リーダー配列および融合パートナー配列、、多重遺伝子もしくはポリシストロンメッセージ構築のための内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）要素、興味のある遺伝子の転写物の適切なポリアデニル化を供するポリアデニル化シグナルおよび終止コドンが含まれ、要すれば、発現ベクターに含まれても良い。
【００８９】
本明細書中に用いた、本明細書に記載の様々なアミノ酸配列に存在する「アミノ酸」は、その公知の、三文字または一文字表記（表１を参照のこと）により同定される。様々なＤＮＡフラグメントに存在するヌクレオチドは、当技術分野で常用される標準的な一文字表記で示される。
【００９０】
本明細書中に用いた、「アミノ酸残基」とは、ポリペプチドの、そのペプチド結合における化学分解（加水分解）により形成されるアミノ酸を示す。本明細書に記載のアミノ酸残基は、一般に「Ｌ」異性体形である。「Ｄ」異性体形の残基は、所望の機能的特性がポリペプチドにより保持される限り、いずれかのＬアミノ酸残基の代わりとなり得る。ＮＨ２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を示す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を示す。J. Biol. Chem.，243:3552−59 (1969)に記載されかつ37 C.F.R. §§. 1.821−1.822で採用された標準的なポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基の略語を 表１に示す：
【００９１】
表１−対応表
【表１】
2007525187.tif 000003
【００９２】
本明細書で式により示されるすべてのアミノ酸残基配列が、アミノ末端からカルボキシル末端への慣習的な方向で左から右への配向を有していることに留意すべきである。さらに、語句「アミノ酸残基」には、対応表に一覧としたアミノ酸、ならびに例えば37 C.F.R. §§ 1.821−1.822（参照により本明細書に組み込まれる）に示されるような修飾されたアミノ酸および異常アミノ酸が含まれると定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは終わりのダッシュ記号が、１個またはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列、またはＮＨ２などのアミノ末端基、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基、と結合するペプチドを示すことに留意すべきである。
【００９３】
ペプチドまたはタンパク質にて、アミノ酸の適当な同類置換が、当業者に周知であって、それは一般に得られる分子の生物学的活性を変化すること無しに行い得る。当業者は、生物学的活性を実質的に変えることのない、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換を理解する（例えば、Watsonらの、Molecular Biology of the Gene、第４版、1987、The Benjamin/Cummings Pub. co.，p.224を参照のこと）。
【００９４】
かかる置換は、以下の表２に記載のとおりに行われ得る：
【００９５】
表２
【表２】
2007525187.tif 000004
【００９６】
他の置換もまた許容され、経験によりまたは他の公知の保存的（または非保存的）置換に従い決定できる。
【００９７】
本明細書中に用いた、２個のタンパク質間または核酸間の「類似性」とは、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の関係性を意味する。類似性とは、そこに含まれる配列および残基の同一性および／または相同性の程度に基づき得る。タンパク質間または核酸間の類似性の程度を評価する方法は、当業者に公知である。例えば、配列相同性を評価する１つの方法にて、２個のアミノ酸またはヌクレオチド配列は、配列間の最大レベルの同一性を生じる方法で整列される。「同一性」とは、アミノ酸またはヌクレオチド配列が変わらない範囲を意味する。アミノ酸配列、およびある程度ヌクレオチド配列のアライメントはまた、アミノ酸（またはヌクレオチド）における保存された相違および／または置換頻度を考慮に入れてよい。保存的相違は、関与する残基の物理化学的特性を保存するものである。アライメントとは、全体（配列の全長にわたり、かつすべての残基を含む比較配列のアライメント）または局所（最も同一の一つの領域または複数の領域のみを含む配列の一部のアライメント）であり得る。
【００９８】
「同一性」自体は、本技術分野で認識される意味を有し、公表された技術を用いて測定され得る（例えば： Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993; Computer Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.MおよびGriffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994; Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987; and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M. and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991を参照のこと）。２個のポリヌクレオチド間またはポリペプチド配列間の同一性を測定する多くの方法があるが、用語「同一性」とは、当業者に公知である（Carillo，H. ＆ Lipton、D.、SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)）。
【００９９】
本明細書中に用いた、別のポリペプチドと比べて、ポリペプチドの全長に沿って比較された配列同一性とは、その全長に沿ってポリペプチドのアミノ酸配列の同一性を評価することを示す。例えば、ポリペプチドＡが１００アミノ酸を有し、ポリペプチドＢがポリペプチドＡのアミノ酸１−９５と一致する９５アミノ酸を有するならば、配列同一性を、ポリペプチドＢの全長を対照としてポリペプチドＡの全長に沿って比較するとき、ポリペプチドＢは９５％の同一性を有する。
【０１００】
本明細書中に用いた、相同（核酸および／またはアミノ酸配列に関する）とは、約２５％以上の配列相同性、典型的には２５％、４０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％または９５％以上の配列相同性を意味する；厳密なパーセンテージは必要であれば明記できる。本発明の目的に関して、用語「相同性」および「同一性」はしばしば、他に特記しない場合、互換的に用いられる。一般に、相同性または同一性の割合を決定するために、配列は最も高い整列一致が得られるように整列される（例えば：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993; Computer Analysis of Sequence Data，Part I， Griffin，A.MおよびGriffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994; Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987; and Sequence Analysis Primer，Gribskov，M. and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照のこと）。配列相同性については、保存されたアミノ酸の数は、標準的なアライメントアルゴリズムプログラムで測定され、各供給元によって確立されたデフォルトギャップペナルティーと併用される。実質的に相同の核酸分子は、興味のある核酸の長さに沿って適度にストリンジェントかまたは高ストリンジェントで通常ハイブリダイズするであろう。また、ハイブリダイジング核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子についても、検討する。
【０１０１】
任意の２個の核酸分子が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の「同一性」または「相同性」であるヌクレオチド配列を有するかどうかを、例えば、Pearsonらの（１９８８） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444に記載のとおりのパラメータを用いた、「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる（他のプログラムには、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux，J.ら、Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul、S.Fら、J Molec Biol 215:403 (1990); Guide to Huge Computers，Martin J. Bishop、ed.，Academic Press，San Diego，1994，およびCarilloら(1988) SIAM J Applied Math 48:1073）が含まれる）。例えば、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）データベースのＢＬＡＳＴ機能を、同一性を決定するために用いることができる。他の商業的または公的に使用可能なプログラムには、ＤＮＡＳｔａｒ「ＭｅｇＡｌｉｇｎ」プログラム（Madison WI）およびウィスコンシン大学のGenetics Computer Group (UWG)の「Ｇａｐ」プログラム（Madison WI）が含まれる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性の割合は、例えば、ＧＡＰコンピュータプログラムを用いた配列情報の比較により決定され得る（例えば、SmithおよびWaterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482）により改訂された、Needlemanら(1970) J. Mol. Biol. 48:443）。簡単には、ＧＡＰプログラムは、類似性を、２個のうちより短い配列におけるシンボルの総数で割った類似である整列されたシンボル（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数として定義する。ＧＡＰプログラムについてのデフォルトパラメータには、以下：（１）単一比較マトリックス（一致について１、不一致について０の値を含む）およびSchwartz and Dayhoff，eds.，ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE，National  Biomedical Research Foundation，pp. 353 358 (1979)に記載のとおりの、Gribskovら(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス；（２）それぞれのｇａｐについて３．０のペナルティー、およびそれぞれのｇａｐにおけるそれぞれのシンボルについてさらに０．１０のペナルティー；および、（３）最後のギャップについてペナルティーなし、が含まれ得る。
【０１０２】
故に、本明細書に用いた、用語「同一性」または「相同性」とは、試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を示す。本明細書中に用いた、用語、少なくとも「９０％同一性」とは、参照核酸またはアミノ酸配列と比べて９０から９９．９９の同一性の割合を示す。９０％またはそれ以上のレベルでの同一性は、例示を目的として仮定して、１００アミノ酸の長さの試験および参照ポリペプチドを比較したとの事実を示す。試験ポリペプチドの１０％（すなわち、１００のうち１０）未満のアミノ酸が参照ポリペプチドのそれと異なる。同様の比較を、試験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。かかる相違は、アミノ酸配列の全長に無作為に分散した点変異として表示され得るか、または例えば１０／１００アミノ酸相違（約９０％の同一性）までの許容される最大の長さまで変わる１個またはそれ以上の位置にクラスター化され得る。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。約８５−９０％を超える相同性または同一性レベルでは、結果は、プログラムおよびｇａｐパラメータセットに左右されるべきではない；そのような高いレベルの同一性を、しばしば、ソフトウェアに頼ることなく、マニュアルアライメントで容易に評価することができる。
【０１０３】
本明細書に用いた、整列配列とは、相同性（類似性および／または同一性）の使用により、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列で対応する位置に合わせることを示す。一般に、５０％またはそれ以上の同一性により関連づけられる２個またはそれ以上の配列が、整列される。整列された配列セットは、対応する位置で整列された２個またはそれ以上の配列を示し、それらには、ＥＳＴなどのＲＮＡから得られた整列配列、およびゲノムＤＮＡ配列と並べられた他のｃＤＮＡが含まれ得る。
【０１０４】
本明細書中に用いた、「プライマー」とは、適当な緩衝液中で、適した温度にて、適した条件下（例えば、４個の異なるヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメレース、ＲＮＡポリメレースまたはリバーストランスクリプターゼなどの重合化物質の存在下）で、テンプレート指示ＤＮＡ合成を開始する点として作用し得る核酸分子を示す。与えられた核酸分子が、「プローブ」および「プライマー」として働き得ることは認識されよう。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リバーストランスクリプターゼ（ＲＴ）−ＰＣＲ、ＲＮＡ  ＰＣＲ、ＬＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、パンハンドルＰＣＲ、キャプチャーＰＣＲ、発現ＰＣＲ、３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ、in situ ＰＣＲ、ライゲーション仲介ＰＣＲおよび他の増幅プロトコルを含む、様々な方法において用いることができる。
【０１０５】
本明細書中に用いた、「プライマー対」とは、（例えば、ＰＣＲにより）増幅される配列の５’末にハイブリダイズする５’（上流）プライマー、および増幅される配列の３’末の相補鎖とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む、プライマーセットを示す。
【０１０６】
本明細書中に用いた、「特異的にハイブリダイズする」とは、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の相補的塩基対合による標的核酸分子へのアニーリングを意味する。当業者は、特定の分子の長さおよび組成などの、特異的なハイブリダイゼーションに影響するインビトロおよびインビボノパラメータに精通している。特にインビトロ・ハイブリダイゼーションに関連したパラメータは、アニーリングおよび洗浄温度、緩衝液組成および塩濃度をさらに含む。例として、非特異的に結合した核酸分子を高ストリンジェントにて除去する洗浄条件は、０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり、中ストリンジェント条件は、０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃である。同等のストリンジェントな条件は、当業者に公知である。当業者は、特定の用途のために適切な標的核酸分子に核酸分子の特異的ハイブリダイゼーションを達成するため、これらのパラメータを容易に合わせることができる。
【０１０７】
本明細書中に用いた、有効量とは、疾患または障害の症状を予防(previsou)、治癒、改善、進行停止または一部進行停止するために必要な治療剤の量である。
【０１０８】
Ｂ．細胞表面受容体（ＣＳＲ）イソ型
細胞表面受容体（ＣＳＲ）イソ型、ＣＳＲ族イソ型およびＣＳＲイソ型を調製する方法を本明細書にて提供する。ＣＳＲイソ型は、挿入および／または欠失がある点で同族の受容体とは異なり、得られたＣＳＲイソ型は、同族の受容体と比較して１個またはそれ以上の活性または機能に関して相違を示す。かかる変化には、キナーゼ活性の除去、および／または膜貫通ドメインの全部または一部の除去などの、生物学的活性における変化が含まれる。本明細書にて供されるＣＳＲイソ型は、細胞表面受容体の活性をモジュレートするために用いられ得る。それらはまた、標的とした細胞または組織への薬物または毒物または核酸などの分子の送達のためのターゲティング物質として用いられ得る。
【０１０９】
ＣＳＲイソ型とは、受容体の生物学的活性を変えるために十分なドメインまたはドメインの一部を欠く受容体を示す。故に、イソ型は、受容体の１つまたはそれ以上の生物学的活性を欠く点で受容体の野生型および／または優性型と異なる。さらに、ＣＳＲイソ型は、受容体の野生型および／または優性型と比較して新しいドメインおよび／または生物学的機能を含み得る。例えば、イントロンによりコードされたアミノ酸は、イソ型に新しいドメインまたはその一部を導入し得る。改変され得る生物学的活性には、二量体化、多量体化および複合体形成などのタンパク質−タンパク質相互作用、リガンドに対する特異性および／または親和性、細胞局在および再局在化、膜固定化、キナーゼ活性などの酵素活性、シグナル伝達経路におけるなどの調節タンパク質、補因子、および他のシグナル分子を含む調節分子への応答が含まれるが、これらに限定されない。一般に、生物学的活性は、受容体の野生型および／または優性型と比較してイソ型で少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、または１０倍改変される。典型的には、生物学的活性は、１０、２０、５０、１００または１０００倍またはそれ以上改変される。例えば、イソ型は生物学的活性が低下していてよい。
【０１１０】
ＣＳＲイソ型はまた、受容体の野生型および／または優性型の活性をモジュレートし得る。例えば、ＣＳＲイソ型は、ＣＳＲイソ型と直接的または間接的に相互作用し、そして受容体の生物学的活性をモジュレートし得る。改変され得る生物学的活性には、二量体化、多量体化および複合体形成などのタンパク質−タンパク質相互作用、リガンドに対する特異性および／または親和性、細胞局在および再局在化、膜固定化、キナーゼ活性などの酵素活性、シグナル伝達経路におけるなどの調節タンパク質、補因子、および他のシグナル分子を含む調節分子への応答が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
ＣＳＲイソ型は、細胞表面受容体に直接的または間接的に相互作用し、細胞表面受容体の生物学的活性をモジュレートするなどの生物学的効果をもたらすかまたは関与し得る。ＣＳＲイソ型はまた、細胞表面受容体とは独立して相互作用し、シグナル伝達経路の開始または阻害などの、生物学的効果をもたらし得る。例えば、ＣＳＲイソ型は、シグナル伝達経路を開始し、細胞増殖を増強または促進することができる。他の例にて、ＣＳＲイソ型は、リガンドとして細胞表面受容体と相互作用し、例えば細胞増殖を遅延または阻害し得るシグナル伝達経路を阻害することにより、生物学的効果をもたらし得る。故に、本明細書にて供されるイソ型は、同系リガンドが受容体活性と相互作用し、変化させるのと同じ方法で、標的受容体と相互作用する点で、細胞表面受容体リガンドとして機能し得る。イソ型は、リガンドとして結合し得るが、必ずしもリガンド結合部位に結合し、受容体の二量体化を阻止する働きをするわけではない。それらは、受容体と相互作用するという意味で、リガンドとして作用する。ＣＳＲイソ型はまた、その受容体のためのリガンドに結合することにより、かつ／または二量体化などの受容体活性を阻害することにより作用し得る。
【０１１２】
例えば、ＣＳＲイソ型は、リガンド結合についてＣＳＲと競合し得る。ＣＳＲイソ型はまた、例えば、ＣＳＲと複合体を形成するとき、優性ネガティブインヒビター（dominant negative inhibitor）として作用し得る。ＣＳＲイソ型は、例えば、ＣＳＲイソ型と複合体形成し、他のＣＳＲと多量体化（例えば、二量体化または三量体化）するためのＣＳＲの能力を改変することにより、優性ネガティブインヒビターとしてかまたはＣＳＲの競合的インヒビターとして作用し得る。ＣＳＲイソ型は、シグナル伝達経路で他のポリペプチドおよび補因子と相互作用するため、ＣＳＲと競合し得る。
【０１１３】
１個またはそれ以上の異なるＣＳＲイソ型を含む医薬組成物を、提供する。医薬組成物を投与することにより、またはイソ型をコードするベクターを投与することなどによりＣＳＲイソ型を送達することにより、疾患または状態を処置する方法もまた、提供する。投与は、インビボまたはエクスビボで行い得る。
【０１１４】
ＣＳＲイソ型およびＣＳＲイソ型をコードする核酸分子の同定方法および製造方法を、本明細書にて提供する。ＣＳＲイソ型の発現方法、単離方法および形成方法もまた提供する。
【０１１５】
ＣＳＲイソ型のクラス
ＣＳＲイソ型は、受容体の生物学的活性を消去または低下するのに十分なドメインまたはドメインの一部を欠くポリペプチドである。ＣＳＲイソ型は、選択的スプライシングによるかまたは組換え方法により作製され得る。ＣＳＲイソ型は、選択的にスプライスされたＲＮＡによりコードされ得る。ＣＳＲイソ型はまた、組換え方法により、ならびにコンピュータ内および合成方法の使用により作製され得る。
【０１１６】
一般に、選択的にスプライスされたＲＮＡから製造されたＣＳＲイソ型は、遺伝子により生じたポリペプチドの優性型ではない。いくつかの例にて、ＣＳＲイソ型は、組織特異的または発生段階特異的なポリペプチドであり得る。ＣＳＲイソ型をコードし得る選択的にスプライシングされたＲＮＡには、エキソン欠損ＲＮＡ、エキソン保持ＲＮＡ、エキソン伸長ＲＮＡ、エキソン切断ＲＮＡ、およびイントロン保持ＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１７】
（ａ）ＣＳＲイソ型の選択的スプライシングおよび製造
ＲＮＡポリメレースによりＲＮＡ産物に転写されるイントロンおよびエキソン部分を含む真核生物の遺伝子は、一般的にプレｍＲＮＡと称される。プレｍＲＮＡは通常、中間産物であり、それは、最終的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を産するためにＲＮＡスプライシングおよびプロセシングを介してさらに処理される。一般に、最終的なｍＲＮＡには、スプライシングによりイントロンが除かれて得られたリボヌクレオチド配列が含まれる。イントロンとエキソンの境界は、スプライスジャンクション；イントロンを除去するためおよびエキソン配列を連結するためのシグナルおよび基質として細胞のスプライシング機構により用いられるヌクレオチド配列、により特徴付けられる。エキソンは、互いに操作可能に連結し、成熟ＲＮＡ分子を形成する。一般に、ｍＲＮＡ中１個またはそれ以上のエキソンが、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む。多くの場合に、オープンリーディングフレームは、２個またはそれ以上のエキソンを操作可能に連結することにより作製され得る；例えば、コーディング配列がエキソンジャンクションをつなぎ、そしてオープンリーディングフレームがそのジャンクションを超えて保持され得る。
【０１１８】
プロセシングおよび成熟中のＲＮＡはまた、選択的スプライシングを受け、単一遺伝子から様々なｍＲＮＡを作製することができる。選択的にスプライスされたｍＲＮＡは、異なる数および／または配列のエキソンを含み得る。例えば、１０個のエキソンを有する遺伝子は、様々な選択的にスプライスされたｍＲＮＡを作製することができる。いくつかのｍＲＮＡは、１０個すべて、いくつかは９、８、７、６、５個などのエキソンを含み得る。さらに、例えば、１０個のエキソンのうち９個を有する産物は、それぞれ異なるエキソンを欠く、さまざまなｍＲＮＡであり得る。選択的にスプライスされたｍＲＮＡは、優性型または野生型をコードするＲＮＡには一般に存在しない、さらなるエキソンを含み得る。エキソンの付加および欠失には、ＲＮＡにおける５’エキソン、３’エキソンおよび内部エキソンのそれぞれの、付加および欠失が含まれる。選択的にスプライスされたＲＮＡにはまた、ＲＮＡとまたはＲＮＡ内に操作可能に連結したイントロンまたはイントロンの一部の付加が含まれる。例えば、野生型または優性型をコードするＲＮＡでスプライシングにより正常に除去されたイントロンは、選択的にスプライスされたＲＮＡに存在し得る。イントロンまたはイントロンの一部は、２個のエキソン間などの、ＲＮＡ内に操作可能に連結され得る。イントロンまたはイントロンの一部は、転写物の３’末などの、ＲＮＡの一端に操作可能に連結され得る。いくつかの例にて、ＲＮＡ内のイントロン配列の存在は、イントロン内のポリアデニル化配列に基づき転写を終了させる。
【０１１９】
選択的ＲＮＡスプライシングのパターンは、細胞型または組織型に依存して変化し得る。選択的ＲＮＡスプライシングはまた、生物、細胞または組織型の発達段階により制御され得る。さらなる他の因子、例えばホルモンまたはサイトカインなどは、転写および得られるスプライシングパターンをモジュレートできる。例えば、ＲＮＡスプライシング酵素およびＲＮＡスプライシングを調節するポリペプチドは、特定の細胞型および組織型、ならびに特定の発達段階で異なる濃度で存在し得る。いくつかの場合にて、特定の酵素または調節ポリペプチドは、特定の細胞もしくは組織型、または特定の発達段階および／またはホルモンおよびサイトカイン発現などの環境により、不存在であり得る。これらの違いが、細胞または組織型または段階におけるＲＮＡの異なるスプライシングパターンを生じ、故に、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡを含む、異なるの量のＲＮＡを生じ得る。かかる複雑性は、例えば、多くのタンパク質産物が、特定の細胞型または発達段階で適切に単一遺伝子から産されるのを可能とする。
【０１２０】
選択的にスプライスされたｍＲＮＡは、様々な異なるポリペプチド、本明細書にてイソ型と称されるものも作製することができる。かかるイソ型には、野生型または優性型と比較して、欠失、付加および短縮型を有するポリペプチドが含まれる。例えば、通常エキソンによりコードされるオープンリーディングフレームの一部を選択的にスプライスされたｍＲＮＡで除去でき、故に結果としてより短いポリペプチドが生じる。イソ型は、Ｎ末端またはＣ末端で除去されるか、または内部で欠失され得るアミノ酸を有する。イソ型は、エキソンの欠失の結果としてドメインまたはドメインの一部を欠失し得る。選択的にスプライスされたｍＲＮＡはまた、さらなる配列を有するポリペプチドを作製し得る。例えば、終止コドンは、エキソンに含まれ得る；このエキソンがｍＲＮＡに含まれないとき、終止コドンは存在せず、オープンリーディングフレームが下流のエキソンに含まれる配列に続く。かかる例にて、付加的オープンリーディングフレーム配列は、ポリペプチドに付加的アミノ酸配列を加え、新しいドメインまたはその一部の付加を含むことができる。
【０１２１】
（ｂ）イントロン融合タンパク質
イソ型の１つのクラスは、イントロン融合タンパク質（ＩＦＰ）である。ＩＦＰは、受容体の生物学的活性を消去または低下するのに十分なドメインまたはドメインの一部を欠くイソ型である。さらに、ＩＦＰには、エキソンにコードされたアミノ酸に操作可能に連結し、および／またはＣＳＲ遺伝子にコードされた野生型または優性型と比較して短縮型である、エキソンによりコードされない１個またはそれ以上のアミノ酸が含まれ得る。一般に、ＩＦＰは、ＣＳＲポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡの対応する配列中に存在しない、ＩＦＰをコードするＲＮＡ中１個またはそれ以上の終止コドンの存在により短縮される。アミノ酸および／または終止コドンの付加は、ポリペプチドの野生型または優性型とサイズおよび配列が異なるＩＦＰを生じ得る。
【０１２２】
ＩＦＰは、１個またはそれ以上の生物学的活性を改変する。例えば、ＩＦＰ中アミノ酸の付加は、ポリペプチドの野生型または優性型と比較して、生物学的活性を付加、拡大および修飾し得る。例えば、イントロンによりコードされたアミノ酸配列のタンパク質への融合は、新しい機能性を有するドメインの付加を生じ得る。イントロンによりコードされるアミノ酸配列のタンパク質への融合はまた、例えば、二量体化の阻害またはキナーゼ活性の阻害などの、生物学的活性を阻害することなどにより、タンパク質に存在する生物学的活性をモジュレートし得る。
【０１２３】
ＩＦＰには、天然または組合せのイントロン融合タンパク質が含まれ得る。天然のＩＦＰは、遺伝子の１個またはそれ以上のエキソンと操作可能に連結された１個またはそれ以上のイントロンまたはその一部を含む選択的にスプライスされたＲＮＡによりコードされている。天然のＩＦＰには、イントロン配列によりコードされる１個またはそれ以上のアミノ酸が含まれ、および／またはＩＦＰは、１個またはそれ以上の終止コドンが１個またはそれ以上のエキソンと操作可能に連結されたイントロン配列によりコードされる結果、短縮され得る。組合せＩＦＰは、ポリペプチドの野生型または優性型と比較して短縮されたポリペプチドである。一般に、短縮では、ポリペプチド由来の１個またはそれ以上のドメインまたはその一部を除去する。組合せＩＦＰはしばしば、同じ遺伝子配列から誘導されるかまたは関連する遺伝子ファミリー中の遺伝子配列から誘導される天然ＩＦＰで欠失される１個またはそれ以上のドメインまたはその一部を除くことにより、天然ＩＦＰに類似する。
【０１２４】
ｉ．天然ＩＦＰ
天然ＩＦＰは、例えばイントロン保持ＲＮＡおよびいくつかのエキソン伸長ＲＮＡなどの、ｍＲＮＡ中に組み込まれたイントロン配列およびエキソン配列を有するｍＲＮＡを含む、選択的にスプライスされたｍＲＮＡのクラスから作製される。組み込まれたイントロン配列には、１個またはそれ以上のイントロンまたはその一部が含まれ得る。かかるｍＲＮＡは、イントロン保持の機構により生じ得る。例えば、プレｍＲＮＡを、スプライシング機構が１個またはそれ以上のイントロンを除去する前に、細胞の核から細胞質へ運び出す。いくつかの場合にて、スプライス部位は、１個またはそれ以上のイントロンのスプライシングを抑制するために、例えば細胞タンパク質により積極的にふさがれ得る。
【０１２５】
１個またはそれ以上のイントロンまたはその一部の保持はまた、本明細書にて天然ＩＦＰと称されるイソ型の生成を導き得る。例えば、イントロン配列は、ＲＮＡスプライシングによりエキソン配列に操作可能に連結されるオープンリーディングフレームを含み得る。イントロンによりコードされる配列は、例えば、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端のどちらか、またはポリペプチド配列の内部に、ポリペプチドにアミノ酸を付加することができる。いくつかの例にて、イントロン配列はまた、１個またはそれ以上の終止コドンを含み得る。１個またはそれ以上のエキソンでオープンリーディングフレームと操作可能に連結される終止コドンをコードするイントロンは、ポリペプチド配列を終了し得る。故に、前記終止コドンの結果として短縮されるイソ型が、製造され得る。いくつかの例にて、ｍＲＮＡ中に保持されたイントロンは、オープンリーディングフレームへの１個またはそれ以上のアミノ酸および終止コドンの付加をもたらし得、よって、イントロンによりコードされる配列で終わるイソ型を産する。
【０１２６】
イントロンによりコードされる１個またはそれ以上のドメインまたはドメインの一部の付加を有するＩＦＰ、および１個またはそれ以上のドメインまたはドメインの一部の欠失を有するＩＦＰを含む、イントロン保持により作製され得る天然ＩＦＰを、本明細書にて提供する。例えば、イントロン配列は、一般的に遺伝子のｍＲＮＡ内にあるエキソン配列の代わりに操作可能に連結され得る。故に、エキソンにコードされるドメインまたはその一部は除去され、イントロンにコードされるアミノ酸が、コードされたポリペプチドに含まれ得る。
【０１２７】
他の例にて、イントロン配列は、ｍＲＮＡに通常存在するエキソンに加えて、操作可能に連結される。１つの例にて、操作可能に連結されたイントロン配列は、ポリペプチドをコードするエキソン配列と一緒にインフレームで終止コドンを導入することができる。他の例にて、操作可能に連結されたイントロン配列は、ポリペプチド中に１個またはそれ以上のアミノ酸を導入することができる。いくつかの態様にて、インフレームの終止コドンはまた、ポリペプチドをコードするエキソン配列と操作可能に連結され、故に、Ｃ末端でイントロンによりコードされるアミノ酸と一緒にポリペプチドをコードするｍＲＮＡを生成する。
【０１２８】
天然ＩＦＰの１つの例にて、イントロン配列によりコードされた１個またはそれ以上のアミノ酸は、ポリペプチドのＣ末端で操作可能に連結される。例えば、ＩＦＰは、ＲＮＡの５’末に１個またはそれ以上のエキソン配列、続いて、ＲＮＡの３’末に保持される１個またはそれ以上のイントロン配列またはイントロン配列の一部を含む、核酸配列から作製される。かかる核酸から作製されたＩＦＰは、Ｎ末端にエキソンによりコードされたアミノ酸、およびＣ末端にイントロン配列によりコードされる１個またはそれ以上のアミノ酸を含む。他の例にて、ＩＦＰは、イントロン配列内にコードされた終止コドンと１個またはそれ以上のエキソン配列を操作可能に連結することにより核酸から作製され、故に、短縮型ポリペプチドをコードする核酸配列が作製される。
【０１２９】
ｉｉ．組合せＩＦＰ
ＩＦＰはまた、ポリペプチドの野生型または優性型と比較して改変されたポリペプチドを産するための組換え方法および／またはコンピュータ内および合成方法により作製され得る。これらのＩＦＰは、組合せＩＦＰとしても知られる。一般に、組合せＩＦＰは、野生型または優性型と比較して、短縮されたポリペプチドである。短縮は、１個またはそれ以上のドメインまたはその一部を除去し得る。
【０１３０】
組合せＩＦＰは、同じ遺伝子配列から誘導されるかまたは関連する遺伝子ファミリー中の遺伝子配列から誘導される天然ＩＦＰで欠失される１個またはそれ以上のドメインまたはその一部の欠失により、しばしば天然ＩＦＰに類似する。例えば、さらに本明細書に記載のとおり、遺伝子ファミリーメンバーの配列を整列すること、ならびにコードされたタンパク質ドメインを同定することにより、イントロンおよびエキソン構造を、核酸配列中に同定することができる。ポリペプチドをコードする組換え核酸分子は、１個またはそれ以上のエキソン、およびイントロンまたはその一部を含むように合成され得る。かかる組換え分子は、エキソンと操作可能に連結された、１個またはそれ以上のアミノ酸および／またはイントロンによりコードされる終止コドンを含み得、ＩＦＰを作製する。組合せＩＦＰを含む組換えポリペプチドも製造され得る。
【０１３１】
（ｃ）イントロンによりコードされたイソ型
もう１つのＣＳＲイソ型は、イントロンによりコードされるイソ型である。イントロンによりコードされたイソ型には、イソ型、例えば天然ＩＦＰなどからのイントロン配列またはその一部が含まれる。イントロンによりコードされたイソ型は、イントロンによりコードされたイソ型と同じ遺伝子から生じるポリペプチドの野生型または優性型と相互作用し得る。イントロンによりコードされたイソ型は、イントロンによりコードされたイソ型と同じ遺伝子から生じるポリペプチドの野生型または優性型と相互作用するシグナル伝達経路における分子と相互作用し得る。イントロンによりコードされたイソ型は、エキソンによりコードされた配列との融合物として発現または製造され得る。イントロンによりコードされたイソ型は、開始メチオニンの付加などにより、非相同配列との融合物として発現または製造され得る。終止コドンは、イントロン配列内部または末端でイントロンによりコードされたイソ型を終結するために、コードされる核酸分子中に設計され得る。
【０１３２】
（ｄ）エキソン修飾により作製されるイソ型
ＣＳＲイソ型は、ＣＳＲポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡの対応するエキソンに対して、エキソンの修飾により作製され得る。エキソン修飾には、エキソン切断、エキソン伸長、エキソン欠失およびエキソン挿入などの、選択的にスプライスされたＲＮＡ型が含まれる。これらの選択的にスプライスされたＲＮＡは、ＣＳＲポリペプチドの野生型または優性型に存在する、付加的アミノ酸を含むこと、および／またはアミノ酸配列を欠くことにより、ＣＳＲポリペプチドの野生型または優性型とは異なるＣＳＲイソ型をコードし得る。
【０１３３】
エキソン挿入型とは、通常、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡに存在しない少なくとも１個のエキソンを含む、選択的にスプライスされたＲＮＡである。挿入されたエキソンは、挿入されたエキソンによりコードされる付加的アミノ酸を、ＲＮＡに存在する他のエキソンに、操作可能に連結し得る。挿入されたエキソンはまた、ＲＮＡによりコードされたポリペプチドが、かかる終止コドンにより終了するように、１個またはそれ以上の終止コドンを含み得る。かかる終止コドンを含むエキソンが、ポリペプチドの野生型または優性型のポリペプチド末端に用いられる終止コドンを含むエキソンの上流に挿入されたとき、短縮型ポリペプチドが製造され得る。
【０１３４】
挿入されたエキソンは、エキソンが挿入されたとき、ＲＮＡがポリペプチドの野生型または優性型のアミノ酸配列と一緒に、挿入されたエキソンによりコードされる付加的アミノ酸を含むイソ型をコードするように、オープンリーディングフレームを維持し得る。挿入されたエキソンは、挿入されたエキソンによりコードされる付加的アミノ酸がイソ型のそれぞれＮ末端、Ｃ末端または内部で連結されるように、ＲＮＡの５’、３’または内部に挿入され得る。挿入されたエキソンはまた、ポリペプチドの野生型または優性型におけるアミノ酸配列の一部のみを含むイソ型が作製されるように、それが挿入されたＲＮＡのリーディングフレームを変え得る。かかるイソ型は、挿入されたエキソンによりコードされるアミノ酸配列をさらに含み、また、挿入されたエキソンに含まれる終止コドンにより終了し得る。
【０１３５】
ＣＳＲイソ型もまた、エキソン欠失事象により製造され得る。エキソン欠失とは、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡと比較して、少なくとも１個のエキソンを欠く核酸分子を製造する、選択的ＲＮＡスプライシングの事象を示す。エキソンの欠失は、アミノ酸をコードする配列を除去し、そしてポリペプチドをコードするＲＮＡのリーディングフレームを変えることなどにより、別のサイズのポリペプチドを製造し得る。エキソン欠失は、コードされたポリペプチドから１個またはそれ以上のアミノ酸を除去し得る；かかるアミノ酸は、ＲＮＡ配列中のエキソンの位置に依存し、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端または内部であり得る。ＲＮＡにおけるエキソンの欠失はまた、ポリペプチドの野生型または優性型に存在しない１個またはそれ以上のアミノ酸を含むイソ型が製造されるように、リーディングフレーム中でシフトも引き起こし得る。リーディングフレームにおけるシフトはまた、ポリペプチドの野生型または優性型のそれとは異なる配列で終わるイソ型を産するリーディングフレームにおける終止コドンを生じ得る。１つの例にて、リーディングフレームのシフトは、ポリペプチドの野生型または優性型と比較して短縮されたイソ型を産する。かかる短縮型のイソ型はまた、ポリペプチドの野生型または優性型に存在しないアミノ酸配列を含み得る。
【０１３６】
ＣＳＲイソ型はまた、ＲＮＡ中のエキソン伸長により産され得る。エキソン伸長とは、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡにおける対応するエキソンよりも長い（エキソンに含まれるヌクレオチドの数が多い）少なくとも１個のエキソンを含む核酸分子を産する、選択的ＲＮＡスプライシング事象である。エキソン伸長に含まれる付加的配列は、付加的アミノ酸をコードし得、および／またはポリペプチドを終える終止コドンを含み得る。インフレームで終止コドンを含むエキソン挿入は、エキソン伸長の配列で終わる短縮型のイソ型を産し得る。エキソン挿入はまた、ＲＮＡのリーディングフレームをシフトし得、その結果、ポリペプチドの野生型または優性型に存在しない１個またはそれ以上のアミノ酸を含むイソ型、および／またはポリペプチドの野生型または優性型のそれとは異なる配列で終わるイソ型が生じる。エキソン伸長は、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡのイントロンに含まれる配列を含み得、よって、イントロン融合タンパク質を産する。
【０１３７】
ＣＳＲイソ型はまた、エキソン切断により産され得る。エキソン切断は、１個またはそれ以上のエキソンが、ポリペプチドの野生型または優性型をコードするＲＮＡにおける対応するエキソンと比較してより短い（ヌクレオチドの数が少ない）ように、１個またはそれ以上のエキソンの切断を含むＲＮＡである。エキソン切断を有するＲＮＡは、ポリペプチドの野生型または優性型と比較して短縮されたポリペプチドを産し得る。エキソン切断はまた、ポリペプチドの野生型または優性型に存在しない１個またはそれ以上のアミノ酸を含むイソ型を産するように、リーディングフレームにおけるシフトを生じ得る。リーディングフレームにおけるシフトはまた、リーディングフレームに終止コドンを生じ、その結果、ポリペプチドの野生型または優性型のそれとは異なる配列で終わるイソ型を産する。
【０１３８】
エキソン修飾を含む選択的にスプライシングされたＲＮＡは、生物学的活性の低下または除去に十分なドメインまたはその一部を欠くＣＳＲイソ型を産し得る。例えば、エキソン修飾されたＲＮＡは、ドメインまたはその一部を欠く短縮型ＣＳＲポリペプチドをコードし得る。エキソン修飾されたＲＮＡはまた、ドメインが、挿入されたアミノ酸により中断され、かつ／またはポリペプチドの野生型または優性型に存在しない１個またはそれ以上のアミノ酸を有するドメインを中断するリーディングフレームにおけるシフトにより中断されたものである、ポリペプチドをコードし得る。
【０１３９】
Ｃ．受容体型チロシンキナーゼイソ型
本明細書にて供されるＣＳＲイソ型には、受容体型チロシンキナーゼＩＦＰを含む、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のイソ型が含まれる。受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、構造的に関連する成長因子受容体の大きなファミリーである。ＲＴＫは、細胞増殖、分化、代謝および細胞移動を含む、細胞過程に関与する。ＲＴＫはまた、細胞増殖、分化および細胞の運命決定に関与することが知られている。前記ファミリーのメンバーには、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、神経成長因子（ＮＧＦ）受容体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）受容体、エフリンの受容体（Ｅｐｈと呼ぶ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）受容体（ＭＥＴと呼ぶ）、ＴＥＫ／Ｔｉｅ−２（アンジオポイエチン１の受容体）、ジスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）および他のＴｙｒｏ３／Ａｘ１などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
ＲＴＫの生物学的活性を除去または低下するのに十分なＲＴＫのドメインまたはドメインの一部を欠くように、ＲＴＫのもう１つのドメインが改変されたＲＴＫイソ型を、本明細書にて供する。もう１つのアミノ酸の欠失および／または付加などにより、ＲＴＫ配列の１個またはそれ以上のアミノ酸を改変されたＲＴＫイソ型もまた、提供する。付加的アミノ酸は、新しいドメインまたはその一部を付加し得る。ＲＴＫイソ型は、二量体化、キナーゼ活性、シグナル伝達、リガンド結合、膜結合および膜局在化を含むが、それらに限定されない生物学的活性に関して改変され得る。ＲＴＫイソ型はまた、ＲＴＫの生物学的活性をモジュレートし得る。
【０１４１】
１．ＲＴＫドメインおよび生物学的活性
ＲＴＫは、細胞外ドメイン、膜貫通（transmembrane）ドメインおよび細部内チロシンキナーゼドメインを含む、保存されたドメイン構造を有する。細胞外ドメインは、ポリペプチド増殖因子または細胞膜結合分子などのリガンドと結合し得る。いくつかのＲＴＫは、同定されたリガンドを有しないオーファン（orphan）受容体に分類されている。いくつかのＲＴＫは、リガンド結合なしで活性な構成的ＲＴＫに分類され、例えばＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）は、活性にリガンドを必要としない。
【０１４２】
一般に、ＲＴＫの二量体化は、受容体の触媒性チロシンキナーゼドメインを活性化し、続いてシグナル伝達を活性にする。ＲＴＫは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であり得る。例えば、ＰＤＧＦは、αおよびβサブユニットから成るヘテロ二量体である。ＶＥＧＦ受容体は、ホモ二量体である。ＥＧＦ受容体は、ヘテロ二量体かまたはホモ二量体のどちらかであり得る。他の例にて、リガンドであるヘレグリン(heregulin）の存在下でｅｒｂＢ３は、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３などのＥｒｂＢファミリー（ＥＧＦＲファミリー）の他のメンバーとヘテロ二量体化している。多くのＲＴＫは、サブユニット間のリン酸転移などにより二量体化するとき、自己リン酸化が可能である。キナーゼドメインにおける自己リン酸化は、チロシンキナーゼドメインを活性化された状態に維持する。タンパク質の他の領域における自己リン酸化は、受容体と他の細胞タンパク質の相互作用に影響し得る。
【０１４３】
ＲＴＫは、シグナル伝達経路に関与する。例えば、ＲＴＫが活性化したとき、他のシグナリング分子をリン酸化し得る。例えば、シグナル伝達経路に関与するＥＧＦＲは、増殖、脱分化、アポトーシス、細胞移動および血管形成を含む過程に関与する。ＥＧＦＲファミリーメンバーは、タンパク質：タンパク質相互作用；シグナリング分子と受容体上のチロシンリン酸化部位との特異的結合に関与するいくつかの相互作用を介してシグナリング分子を集め得る。例えば、Ｇｒｂ２／Ｓｏｓ複合体はＥＧＦＲ上のリン酸化チロシン部位に結合し、次にＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫシグナリングカスケードを活性化し得、それが細胞増殖、移動および分化に影響を与える。他のシグナリング分子の例には、他のＲＴＫ、Ｇ共役受容体、インテグリン、ホスホリパーゼＣ、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼ、転写活性化因子、サイトカインおよび他のキナーゼが含まれる。
【０１４４】
２．受容体型チロシンキナーゼイソ型
ＲＴＫイソ型は、受容体型チロシンキナーゼのドメインまたはドメインの一部を欠く。故に、ＲＴＫイソ型は、１個またはそれ以上の生物学的活性に関して同系ＲＴＫとは異なる。さらに、ＲＴＫイソ型は、例えばＲＴＫと直接的または間接的に相互作用するなどにより、ＲＴＫの生物学的活性をモジュレートし得る。生物学的活性には、二量体化、多量体化および複合体形成などのタンパク質−タンパク質相互作用、リガンドに対する特異性および／または親和性、細胞局在および再局在、膜固定化、キナーゼ活性などの酵素活性、例えばシグナル伝達経路における調節タンパク質、補因子、および他のシグナリング分子を含む調節分子への応答が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
ＲＴＫイソ型構造および活性
１つの態様にて、ＲＴＫイソ型は、キナーゼドメインを修飾される。例えば、ＲＴＫイソ型は、キナーゼドメインまたはその一部の欠失を含む。前記欠失は、ドメイン全体を欠失する必要はなく、１個またはそれ以上のアミノ酸がドメイン内で欠失されていれば良い。前記欠失は、キナーゼドメインのＮ末端、ドメイン内のＣ末端または内部であり得る。他の例にて、ＲＴＫイソ型は、キナーゼドメインにおけるアミノ酸の付加を含む。アミノ酸の付加は、ドメインのＮ末端、キナーゼドメイン内のＣ末端または内部のどこかであり得る。
【０１４６】
態様の１つの局面にて、ＲＴＫイソ型のキナーゼ活性を変化する。例えば、ＲＴＫイソ型のキナーゼ活性を、低下または除去する。１つの例にて、ＲＴＫイソ型のキナーゼ活性の基質特異性を変える。例えば、ＲＴＫイソ型は、自己リン酸化が可能であるが、例えばシグナル伝達経路におけるポリペプチドなどの他のポリペプチドのリン酸化はできない。他の例にて、ＲＴＫイソ型は、他のポリペプチドをリン酸化するが、自己リン酸化は不可能である。ＲＴＫイソ型のキナーゼ活性は、活性を増大され得る。ＲＴＫイソ型のキナーゼ活性は、調節が変わり得る。例えば、キナーゼ活性は、構成的に活性であるかまたは構成的に不活性であり得、例えば、リガンドの付加、受容体の二量体化、タンパク質：タンパク質相互作用を介した複合体化、および／または自己リン酸化により制御されない。
【０１４７】
１つの態様にて、ＲＴＫイソ型は、膜貫通ドメインが修飾される。例えば、ＲＴＫイソ型は、膜貫通ドメインまたはその一部の欠失を含む。前記欠失は、膜貫通ドメインのＮ末端、Ｃ末端またはドメイン内部であり得る。他の例にて、ＲＴＫイソ型は、膜貫通ドメインにおけるアミノ酸の付加を含む。アミノ酸の付加は、ドメインのＮ末端、膜貫通ドメイン内のＣ末端または内部のどこかであり得る。
【０１４８】
態様の１つの局面にて、ＲＴＫイソ型の膜結合および／または局在化を変える。例えば、ＲＴＫイソ型は、ＲＴＫの野生型または優性型が膜に局在化するとき、可溶性タンパク質（例えば、膜に局在化しない）であり得る。例えば、ＲＴＫイソ型は、細胞外に分泌されるかまたは細胞質に局在化されるかまたは細胞器官（オルガネラ）に内在化され得る。ＲＴＫイソ型は、その膜局在を変えることができる。例えば、ＲＴＫイソ型は、細胞器官の膜などの細胞内膜と結合し得るが、細胞質膜とは結合しない。ＲＴＫイソ型は、その膜との結合を減少させることができるため、膜に結合したタンパク質の割合が変化する；例えば、タンパク質のいくつかは、溶解性であり、いくつかは膜結合性である。ＲＴＫイソ型はまた、ＲＴＫの野生型または優性型の配向性と比較して膜または膜内の配向性が変わり得る。例えば、ポリペプチドは多かれ少なかれ、膜内に埋め込まれている。ポリペプチドは多かれ少なかれ、細胞膜のどちらかの側面と結合され得る。例えば、配向性を、ＲＴＫイソ型の多くが、ＲＴＫの野生型または優性型と比較して細胞質または細胞外で発見されるように変えることができる。
【０１４９】
１つの態様にて、ＲＴＫイソ型を、その二量体化活性に関して変える。例えば、ＲＴＫイソ型は、ホモ二量体化（すなわち、ＲＴＫイソ型：ＲＴＫイソ型複合体）するが、ヘテロ二量体化しないか、または同じ遺伝子から誘導されるＲＴＫの野生型または優性型とのヘテロ二量体化が減少する。他の例にて、ＲＴＫイソ型は、それ自体でホモ二量体化しないか、またはホモ二量体化活性は低下するが、同じ遺伝子または違う遺伝子由来のＲＴＫの野生型または優性型とヘテロ二量体化し得る。他の例にて、ＲＴＫイソ型は、他の遺伝子由来のＲＴＫとのヘテロ二量体化が減少するが、同じ遺伝子由来のＲＴＫとヘテロ二量体化する。
【０１５０】
１つの態様にて、ＲＴＫイソ型を、そのシグナル伝達活性に関して変える。例えば、ＲＴＫイソ型を、シグナル伝達経路における他の細胞タンパク質または補因子とのその結合に関して変える。例えば、ＲＴＫイソ型を、それらに限定されないが、他のＲＴＫ、Ｇ共役受容体、インテグリン、ホスホリパーゼＣ、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性キナーゼ、転写活性化因子または制御因子、サイトカインおよび他のキナーゼとの相互作用などの相互作用に関して変える。他の例にて、ＲＴＫイソ型は、ＲＴＫのシグナル伝達を変える。例えば、ＲＴＫイソ型は、ＲＴＫと相互作用し、ＲＴＫによりシグナル伝達を阻害するかまたは刺激することなどにより、シグナル伝達におけるその活性を変化する。
【０１５１】
１つの態様にて、ＲＴＫイソ型を、２個またはそれ以上の生物学的活性に関して変える。例えば、ＲＴＫイソ型を、キナーゼ活性および膜結合に関して変える。もう１つの例にて、ＲＴＫイソ型を、キナーゼ活性および二量体化に関して変える。さらにもう１つの例にて、ＲＴＫイソ型を、キナーゼ活性、二量体化および膜結合に関して変える。例えば、ＲＴＫイソ型を、キナーゼドメインおよび膜貫通ドメインの両方に関して修飾する。他の例にて、アミノ酸の挿入付加は、キナーゼドメインおよび膜貫通ドメインを中断する。もう１つの態様にて、ＲＴＫイソ型を、ドメインジャンクション、またはドメインの直鎖状アミノ酸配列の外側で修飾し、その修飾は、キナーゼドメイン、または膜貫通ドメインなどのドメインの３次元構造などの構造を変える。
【０１５２】
ＲＴＫイソ型によるＲＴＫのモジュレーション
ＲＴＫイソ型は、ＲＴＫとの直接的または間接的な相互作用などにより、ＲＴＫの生物学的活性をモジュレートまたは変化し得る。生物学的活性には、二量体化、多量体化および複合体形成などのタンパク質−タンパク質相互作用、リガンドについての特異性および／または親和性、細胞局在および再局在、膜固定化、キナーゼ活性などの酵素活性、例えばシグナル伝達経路などにおける制御タンパク質、補因子、および他のシグナリング分子を含む制御分子への応答などが含まれるが、それらに限定されない。１つの態様にて、ＲＴＫイソ型とＲＴＫとの相互作用は、ＲＴＫの生物学的活性を阻害する。他の態様にて、ＲＴＫイソ型とＲＴＫとの相互作用は、ＲＴＫの生物学的活性を刺激する。
【０１５３】
例えば、ＲＴＫイソ型は、リガンド結合についてＲＴＫと競合する。ＲＴＫイソ型は、遊離リガンドを除去するための「リガンドスポンジ」として用いられ得、よってＲＴＫの活性を調節するかまたはモジュレートする。もう１つの例にて、ＲＴＫイソ型は、例えば、トランス自己リン酸化を抑制することにより、ＲＴＫとヘテロ二量体化または複合体化したとき、優性ネガティブインヒビターとして作用する。キナーゼ活性を変えるのに十分な、タンパク質キナーゼドメインまたはその一部を欠くＲＴＫイソ型は、トランスドミナントな方法でＲＴＫの活性化を阻害し得る。
【０１５４】
１つの態様にて、ＲＴＫイソ型は、ＲＴＫの二量体化の競合的インヒビターとして働く。例えば、ＲＴＫイソ型は、ＲＴＫと相互作用し、ＲＴＫの、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化を妨げる。受容体の二量体化を阻害するイソ型は、例えば下流のシグナリングとして受容体と複合体を形成すること、および受容体活性化を阻害することなどにより、下流のシグナル伝達経路をモジュレートすることができる。ＲＴＫイソ型はまた、シグナル伝達経路における他のポリペプチドおよび補因子と相互作用するためのＲＴＫと直接的に競合することにより、ＲＴＫの競合的インヒビターとして働く。
【０１５５】
Ｄ．ＣＳＲイソ型の同定方法および作製方法
ＣＳＲイソ型は、本明細書に記載のバイオインフォマティクス法およびアルゴリズムを用いた天然に生じる遺伝子および発現産物（ＲＮＡ）の分析および同定により、例えば天然のＩＦＰを同定および作製することにより、作製され得る。さらに、ＩＦＰなどのＣＳＲイソ型は、バイオインフォマティクス法などの本明細書に記載の方法を用いて天然に生じるアミノ酸配列の組合せを産することにより、例えば組合せＩＦＰを作製することにより、作製され得る。ＣＳＲイソ型はまた、配列アライメントおよびドメインマッピングおよび選択などのバイオインフォマティクス法と組み合わせたクローニング法を用いて作製され得る。
【０１５６】
１．ＩＦＰ配列の同定方法および作製方法
本明細書に記載の天然ＩＦＰを同定する方法を、発現された遺伝子配列と、ゲノムＤＮＡ配列などの遺伝子の配列との比較に用いる。例えば、１個またはそれ以上のＩＦＰを、イントロン保持配列が、エキソン配列と操作可能に連結された１個またはそれ以上のイントロン配列を含むとき、発現された遺伝子配列セット由来のイントロン保持配列を同定することにより作製することができる。ＩＦＰを、エキソンによりコードされる配列と操作可能に連結した１個またはそれ以上のアミノ酸または終止コドンを有するポリペプチドをコードするものを選択することにより、イントロン保持配列から選択することができる。
【０１５７】
イントロン保持配列を、イントロンとエキソンの境界を同定または予測するための、当技術分野で公知のいずれかの方法により同定することができる。例えば、イントロン保持配列を、発現遺伝子配列セットを得ること、および遺伝子配列に対応する発現遺伝子配列の下位集団を選択することにより、同定することができる。配列の下位集団を、互いに比較して発現配列の同一性に基づき配列の整列したセットに集めることができる。下位集団はまた、ゲノム遺伝子配列などの遺伝子配列と整列され得る。遺伝子のゲノムＤＮＡ配列との整列したセットの比較は、整列したセットのイントロンとエキソンの境界の同定を可能とする。言い換えると、発現配列の整列したセットを、全長ポリペプチドをコードする遺伝子配列、またはＲＮＡあるいはコードされたタンパク質の主な形態に基づく予測される遺伝子配列などの遺伝子配列と比較することができる。イントロンとエキソンの境界を、整列したセットの１個またはそれ以上の配列に存在し、遺伝子配列に存在しない配列に基づいて同定することができる。１個またはそれ以上のエキソンと操作可能に連結された、１個またはそれ以上のイントロンまたはその一部を保持する配列を、選択する。
【０１５８】
例えば、前記方法の１つの態様にて、特定の遺伝子についての選択的ＲＮＡスプライシングパターンを、細胞型または組織型に関わらず、その遺伝子についてのすべての発現配列タグ（ＥＳＴ）の配列を得、次に、同じ配列を整列することにより隣接（contig）セット中にこれらの配列タグを集めることにより、決定することができる。それぞれの選択的にスプライスされたプレｍＲＮＡを、ユニーク配列により、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Basic Local Alignment Search Tool）を用いて遺伝子のＤＮＡ配列上にこれらの配列それぞれをマッピングすることにより、表示することができる。この方法にて、それぞれの選択的にスプライスされたｍＲＮＡのイントロン／エキソン境界は、ＥＳＴで同定され、そして遺伝子配列上に正確に定義される。
【０１５９】
ＥＳＴは、現在、非常に多くのかつ多種の細胞および組織型からクローニングおよびシークエンスされているため、これらのＥＳＴ配列には、ＥＳＴがシークエンスされているすべての細胞および組織型について任意の与えられた遺伝子についてのＲＮＡスプライシングパターンを完全にするための近似が含まれる。さらに、ＥＳＴ配列の数およびそれらが誘導される細胞および組織型の種類は、選択的にスプライスされたｍＲＮＡ変異型セットの完全な表示に近づいているため、将来増大すると予期される。故に、本明細書の方法を、多種多様な細胞型および組織型に発現されるタンパク質およびＩＦＰの広い分類からＩＦＰを誘導するために用いることができる。
【０１６０】
１つの態様にて、選択的ＲＮＡスプライシングパターンを、ＮＣＢＩ（The National Center for Biotechnology Information、at hypertext transfer protocol (http)、ウェブ上でのURLは、”ncbi.nlm.nih.gov/IPB/Research/Acembly/index.html”）により公共に利用可能なＡｃｅＶｉｅｗデータベースプログラムにアクセスすることにより得る。このプログラムは、ＥＳＴおよびｍＲＮＡ、ならびに配列アセンブリを明らかにマッピングする。例えば、このプログラムは、全部で２１０，１２２個の選択的転写変異体と共に、公共のデータベースからの２，７６３，４０１個のＥＳＴおよび８３，８７２個のｍＲＮＡ、ならびに８３，８７４個の遺伝子中１８，０００個のＮＣＢＩ参照配列Acembly（選択的スプライシング形態をマップするＡｃｅＶｉｅｗプログラム）クラスターをマップしている。３３，２８６個の遺伝子が、少なくとも１個の有効なｇｔ−ａｇまたはｇｃ−ａｇスプライスされたイントロンを有し、平均４．６個の選択的にスプライスされた変異体を有する。それぞれの遺伝子由来の選択的にスプライスされたｍＲＮＡのグラフ表示を、ＡｃｅＶｉｅｗプログラムにより示す。さらに、それぞれのｍＲＮＡに由来するアミノ酸配列を、タンパク質イソ型が、少なくともいくつかの細胞および組織型に関して自然に発現されるかまたは発現されると予測されると予測するようなこのプログラムから得ることができる。配列を、１個またはそれ以上のエキソンと操作可能に連結された１個またはそれ以上のイントロンまたはその一部を含むように選択する。
【０１６１】
イントロン保持配列から、１個またはそれ以上のエキソンと操作可能に連結された、イントロンまたはその一部から誘導される１個またはそれ以上のアミノ酸または終止コドンを有するポリペプチドをコードするＩＦＰを選択する。ポリペプチド配列を、標準的な分子生物学的方法およびバイオインフォマティクス法により、イントロン保持配列などの核酸配列から作製することができる。かかる方法は、核酸配列内のオープンリーディングフレームを同定し、核酸によりコードされるアミノ酸配列を作製する。いくつかの態様にて、ＩＦＰは、ポリペプチドの１個またはそれ以上のドメインの欠失および／またはドメインまたはその一部の付加を含む。タンパク質ドメインを、当技術分野で公知のいずれかの方法により同定することができる。多くのバイオインフォマティクスプログラムおよび方法が、例えば、アミノ酸配列の同一性および／または構造的予測に基づき、ドメインを予測するためか、またはタンパク質ドメインを同定するために存在する。これらのドメイン予測に基づき、１個またはそれ以上のドメインを含むか、または１個またはそれ以上のドメインが欠失されているＩＦＰを選択することができる。
【０１６２】
１つの態様にて、タンパク質ファミリーデータベース（ＰＦＡＭ）を、タンパク質ドメインまたはその一部を含むそれぞれのタンパク質イソ型の主要なアミノ酸配列の一部を決定することに用いる。Ｐｆａｍは、タンパク質ファミリーおよびドメインの半自動的なデータベースであり、そしてこれらのファミリーの複数のタンパク質アライメントとプロフィール−ＨＭＭを含んでいる。Ｐｆａｍは、いかなるアミノ酸配列のドメイン組成を決定するためにも用いることができる、タンパク質多重配列アライメントおよびプロフィール隠れマルコフモデルを多数収集している。Ｐｆａｍは、英国ではＵＲＬ［sanger.cgb.ki.se/Pfam］、スウェーデンではＵＲＬ［cgb.ki.se/Pfam/］、フランス（ｈｔｔｐ）ではＵＲＬ［pfam.jouy.inra.fr］、そして米国（ｈｔｔｐ）ではＵＲＬ［pfam.wustl.edu］にてウェブ上で利用可能である。ＰｆａｍのＶｅｒｓｉｏｎ６．６には、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  ３９およびＴｒＥＭＢＬ  １４（Bateman、Aら、(2002) Nucleic Acids Research 30(1): 276−28）にて６９％のタンパク質が適合する、３０７１個のファミリーが含まれる。Ｐｆａｍは、ＡｃｅＶｉｅｗにより予測されるタンパク質イソ型のそれぞれに存在するタンパク質モチーフを同定する。
【０１６３】
ＩＦＰを、利用可能であるかまたは作製され得る発現遺伝子配列および比較のための遺伝子遺伝子配列（本明細書に記載のゲノム遺伝子配列または他の配列）である、提供されるどんな遺伝子または遺伝子クラスからも同定および作製することができる。例えば、ＩＦＰを、受容体型チロシンキナーゼ、受容体型セリン／スレオニンキナーゼおよびサイトカイン受容体を含むが、これらに限定されない細胞表面受容体から同定および作製することができる。
【０１６４】
２．ＲＴＫ−ＩＦＰの同定
ＩＦＰの同定に有用な細胞表面受容体タンパク質のクラスの例は、細胞表面受容体の受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）クラスである。ＲＴＫ細胞表面受容体遺伝子を、本明細書中、天然ＩＦＰの同定のためのバイオインフォマティクス法などの方法を行うために用る。イントロン保持配列が、エキソン配列と操作可能に連結した１個またはそれ以上のイントロン配列を含む場合、天然ＩＦＰを、発現遺伝子配列セットからイントロン保持配列を同定することによりＲＴＫ細胞表面受容体遺伝子について同定および作製することができる。ＲＴＫ  ＩＦＰを、ＲＴＫ遺伝子配列をコードするエキソンと操作可能に連結した１個あるいはそれ以上のアミノ酸または終止コドンを有するポリペプチドをコードするものを選択することにより、イントロン保持配列から選択することができる。１つの態様にて、ＲＴＫ遺伝子または予測されるＲＴＫ遺伝子の最初のコーディングエキソンまたは最初のコーディングエキソンの一部を含むＲＴＫ  ＩＦＰが同定される。かかるＲＴＫ  ＩＦＰは、全長または野生型ＲＴＫと同一のドメインまたはドメインの一部を有するＮ末端配列を含む。もう１つの態様にて、指定されたドメインが全長または野生型ＲＴＫに含まれる場合、少なくとも１個の指定されたドメインまたはその一部を欠くＲＴＫ  ＩＦＰが選択される。１つの例にて、指定されたドメインとは、キナーゼドメインである。もう１つの態様にて、指定されたドメインとは、膜貫通ドメインである。
【０１６５】
本明細書に記載の、１つの例示的態様にて、ＲＴＫ  ＩＦＰは、細胞外ドメインを含むが、細胞内タンパク質キナーゼドメインを欠く。もう１つの態様にて、ＲＴＫ  ＩＦＰは、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むが、細胞内タンパク質キナーゼドメインを欠く。膜貫通ドメインは、少なくともヘルスタチンの場合には可欠であるように見えるが、その対応する天然の受容体タンパク質に対するＩＦＰの見かけの結合親和性に、実質的に貢献し得る。ＲＴＫのタンパク質Ｃ末端に位置する細胞内タンパク質キナーゼドメインおよび／または膜貫通ドメインを欠くイソ型を、当技術分野で公知のツールに基づく任意のドメイン局在、構造同定または相同性を用いて、例えば、選択的なタンパク質イソ型配列についてＰｆａｍプログラム／データベースを適用することにより、容易に同定することができる。
【０１６６】
ヘルスタチン
ＲＴＫ−ＩＦＰの例は、ＨＥＲ−２遺伝子（米国特許番号第６，４１４，１３０号および米国で刊行された特許出願番号第２００４００２２７８５号を参照のこと）から製造されるＩＦＰである、ヘルスタチンである。ＨＥＲ−２（ｅｒｂＢ−２）遺伝子は、癌遺伝子に関与し、そして調べたヒト癌腫でその役割を果たす受容体型チロシンキナーゼをコードする。ＨＥＲ−２は、約１８５ｋＤのポリペプチド（Ｐ１８５ＨＥＲ２）をコードする４．５ｋＢの主なｍＲＮＡ転写物を有する。Ｐ１８５ＨＥＲ２は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを含む。
【０１６７】
他のポリペプチド形態がＨＥＲ−２遺伝子から生産され、タンパク質分解プロセシングにより生じるポリペプチドおよび選択的にスプライスされたＲＮＡから生じる形態が含まれる。ヘルスタチン（米国特許番号第６，４１４，１３０号）は、胎児の腎臓および肝臓で見られる、選択的にスプライスされたヒト上皮性成長因子受容体２（ＥＲＢＢ２）の変異体であり、Ｃ末端に７９個のアミノ酸のイントロンにコードされた挿入部分を含む。ヘルスタチンは、イントロンによりコードされたヒト上皮成長因子受容体細胞外ドメインおよびＣ末端ドメインのサブドメインＩおよびＩＩを含む。得られたヘルスタチンタンパク質は、４１９アミノ酸（サブドメインＩおよびＩＩ由来の３４０アミノ酸、＋イントロン８由来の７９アミノ酸）を含む。ヘルスタチンタンパク質は、細胞外ドメインＩＶ、ならびに膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを欠く。ヘルスタチンは、ＥｒｂＢファミリーのチロシンキナーゼ受容体の阻害を示した。
【０１６８】
前記方法の例示的態様にて、ＥＲＢＢ２遺伝子をＩＦＰの同定に用いた。ヘルスタチンが選択的ＲＮＡスプライシング形態としてこの遺伝子から誘導され、そしてこのタンパク質イソ型のアミノ酸配列が選択的ｍＲＮＡ配列から決定されるため、ＥＲＢＢ２を対照実験として用いることができる。天然ＩＦＰを検出するための方法を用いて、ｅｒｂＢ２からのＥＳＴおよびｅｒｂＢ２のゲノム配列を、整列させた。１個またはそれ以上のエキソンと操作可能に連結した少なくとも１個のイントロンまたはその一部を含む、整列配列を選択した。整列配列はさらに、コードされたポリペプチドが、イントロン配列によりコードされる１個またはそれ以上のアミノ酸および／または終止コドンを含む場合に選択される。これらの整列配列から、ｅｒｂＢ２配列のドメインマッピングに基づき（例えば、ドメインマッピングについてＰｆａｍを用いて）、ｅｒｂＢ２チロシンキナーゼドメインの少なくとも一部を欠く、配列のサブセットを選択した。選択された配列は、予測された４１９アミノ酸のヘルスタチンタンパク質イソ型と合致した（Ｄｏｈｅｒｔｙら（１９９９） Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:10869−10874）。
【０１６９】
３．組合せＩＦＰの作製
組合せＩＦＰを、それらがエキソン配列と操作可能に連結されるように、イントロンにコードされた配列と組み合わせることにより作製することができる。組合せＩＦＰには、天然に生じないが、イントロン／エキソン境界、ならびにイントロンおよびエキソン配列の予測を用いて構築され得るＩＦＰポリペプチドが含まれる。組合せＩＦＰにはまた、天然に生じる形態に見られるのと異なる量で、異なる遺伝子由来のタンパク質ドメインを組合せること、および／またはタンパク質ドメインを組み立てることにより構築されるＩＦＰが含まれる。組合せＩＦＰにはまた、ＩＦＰの生物学的活性を改変するため、特定のタンパク質領域における１個またはそれ以上のアミノ酸を変えることにより修飾されたＩＦＰが含まれる。かかる修飾物には、変異した天然および組合せＩＦＰが含まれる。
【０１７０】
組合せＩＦＰを、全長もしくは野生型機能の１個またはそれ以上のドメインまたはその一部を欠くポリペプチド配列を作製することによりイントロン保持の効果を模倣することを含む本明細書に記載の方法により作製することができる。組合せＩＦＰは、全長または野生型タンパク質と比較して、生物学的活性が改変されたポリペプチドイソ型を作製することができる。
【０１７１】
組合せＩＦＰは、１個またはそれ以上のドメインまたはその一部を欠く受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）として作製され得る。組合せＲＴＫ  ＩＦＰには、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含むが、細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く組合せＩＦＰが含まれる。組合せＲＴＫ  ＩＦＰにはまた、細胞外ドメインを含むが、細胞内チロシンキナーゼドメインおよび膜貫通ドメインを欠く組合せＩＦＰが含まれる。
【０１７２】
例示的態様にて、組合せＩＦＰを、ＴＩＥ−２チロシン受容体キナーゼについて作製する。組合せＩＦＰを、本明細書に記載のとおり、任意のドメインの予測ツールを用いて遺伝子のドメインを同定することにより、この遺伝子から作製することができる。例えば、ＰＦＡＭは、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）から市販されている一般的なドメインアセンブリプログラムを用いて、ＴＩＥ−２遺伝子のタンパク質キナーゼドメインを同定するために用いられ得る。タンパク質キナーゼドメイン、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインが、ＴＩＥ−２中で同定される。ポリペプチドは、残基８３９−１１０７、またはその一部を切断することなどにより、細胞内キナーゼドメインまたはその一部を欠失して構成される。例えば、ＴＩＥ−２組合せＩＦＰは、残基１−８３８のみを含む構成である。このポリペプチドは、リガンド結合に必要なすべての細胞外受容体ドメイン、ならびに任意の膜貫通ドメインを含むが、タンパク質キナーゼドメインを欠く。さらなるＴＩＥ−２組合せＩＦＰは、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン内に欠失を含むように構成され得る。例えば、ＴＩＥ  ＩＦＰ  ６３２、ＴＩＥ  ＩＦＰ  ５３３、ＴＩＥ  ＩＦＰ  ４２８、ＴＩＥ  ＩＦＰ  ３４４、ＴＩＥ  ＩＦＰ  ２５５、ＴＩＥ  ＩＦＰ  １９７である。それぞれのポリペプチドは、ＴＩＥ  ＩＦＰ  Ｘと称されるＮ末端アミノ酸１−ｘを含む。かかる組合せＩＦＰを、例えば、ＴＩＥ−２リン酸化の阻害の効果を決定することにより、ＩＦＰ生物学的活性について試験することができる。
【０１７３】
４．ＣＳＲイソ型の同定方法および単離方法
発現遺伝子配列のクローニング、およびゲノムＤＮＡ配列などの遺伝子配列とのアライメントを用いたＣＳＲイソ型の同定方法および単離方法を本明細書にて提供する。例えば、１個またはそれ以上のイソ型を、受容体型チロシンキナーゼなどの候補遺伝子を選択することにより単離することができる。ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡの部位などの発現配列を、単離する。プライマーを、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡの部位を増幅するために設計することができる。１つの例にて、プライマーを、候補遺伝子のオープンリーディングフレームの開始コドンに重なるかまたは隣接するよう設計し、かつプライマーを、オープンリーディングフレームの終止コドンに重なるかまたは隣接するよう設計する。プライマーを、オープンリーディングフレームをコードする核酸分子を増幅するために、ｍＲＮＡと一緒にリバーストランスクリプターゼＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）などのＰＣＲに用いることができる。かかる核酸分子を、イソ型をコードするものを同定するためにシークエンスすることができる。１つの例にて、予測サイズ（例えば、野生型または優性型をコードするために予測されたサイズなど）とは異なるサイズ（例えば、分子量）の核酸分子を、候補イソ型として選択する。そして、さらにイソ型をコードしている分子を選択するために、以下に説明するようにかかる核酸分子について分析することができる。
【０１７４】
コンピュータ分析を、候補イソ型をさらに選択するために得られた核酸配列を用いて行う。例えば、ｃＤＮＡ配列を、選択された候補遺伝子のゲノム配列と整列する。かかるアライメントは、手動でかまたはＳＩＭ４（スプライス変異体の分析のためのコンピュータプログラム）などのバイオインフォマティクスプログラムを用いることにより行うことができる。標準的な供与側−受容側スプライシング部位（例えば、ＧＴ−ＡＧ）を有する配列が選択される。エキソン欠失、エキソン保持、エキソン伸長およびイントロン保持などの選択的にスプライスされた産物を示す分子を選択できる。
【０１７５】
単離された核酸分子の配列分析をまた、野生型または優性型と比較してドメインおよび／または生物学的機能を保持または欠失するイソ型のさらなる選択のために用いることができる。例えば、単離された核酸分子にコードされるイソ型は、タンパク質ドメインの同定のために、本明細書に記載のようなバイオインフォマティクスプログラムを用いて分析し得る。その後、ドメインまたはその一部を保持または欠失するイソ型を選択し得る。
【０１７６】
前記方法の１つの態様にて、膜局在化を欠くかまたは顕著に低下するのに十分な、膜貫通ドメインまたはその一部を欠くイソ型を選択する。例えば、イソ型は、膜貫通ドメインの前で短縮されるかまたは膜貫通ドメイン内で短縮されるものが選択され得る。膜貫通ドメインまたはその一部を欠き、そして欠損ドメインまたはドメインの一部の位置に操作可能に連結した１個またはそれ以上のアミノ酸を有するイソ型を、選択することもできる。かかるイソ型は、エキソン伸長、イントロン保持、エキソン欠失およびエキソン挿入などの選択的スプライシング事象の結果生じ得る。いくつかの場合にて、かかる選択的にスプライスされたＲＮＡは、野生型または優性型をコードするＲＮＡには見られない、ＲＮＡおよび／または操作可能な連結配列のリーディングフレームを改変する。キナーゼドメインまたはその一部を欠くイソ型を、選択することもできる。キナーゼドメインまたはその一部を欠き、そして膜貫通ドメインまたはその一部も欠くイソ型を、選択することができる。前記方法により選択されるイソ型には、ＩＦＰおよびイントロンによりコードされたイソ型が含まれる。
【０１７７】
例えば、候補ＲＴＫイソ型をコードする核酸分子は、キナーゼドメイン、膜貫通ドメイン、細胞外ドメインまたはその一部を欠くイソ型についてさらに選択され得る。ＲＴＫイソ型をコードし、ＲＴＫの野生型または優性型とは異なる生物学的活性を有する核酸分子を、選択することができる。１つの例にて、イソ型が、膜局在化せず、かつ細胞から分泌されるように、膜貫通ドメインを欠くＲＴＫイソ型が選択される。
【０１７８】
５．イソ型の対立遺伝子変異体
天然および組合せＩＦＰを含む、ＣＳＲイソ型配列の対立遺伝子変異体を、異なる種、同種の集団または個体に由来する核酸中に作製することができるかまたは同定することができる。かかる変異体は一般に、組織または細胞源における野生型または優性型と１個またはそれ以上のアミノ酸が異なるが、細胞、組織または生物における対応する遺伝子によりコードされる。その結果、対応するイソ型（または短縮変異体またはＩＦＰ）は、同じ位置の参照タンパク質とは異なる。例えば、イソ型は、遺伝子の異なる対立遺伝子に由来し得る；それぞれの対立遺伝子は、１個またはそれ以上のアミノ酸の相違を有し得る。かかる対立遺伝子は、保存および／または非保存のアミノ酸相違を有し得る。対立遺伝子変異体にはまた、個々の患者またはモデル動物などの異なる対象から生じるかまたは同定されるイソ型が含まれる。アミノ酸変異は、イソ型の生物学的活性のモジュレーションを生じ得る。いくつかの場合にて、アミノ酸相違は、生物学的活性の効果が検出されない「サイレント」となり得る。イソ型の対立遺伝子変異体はまた、突然変異により作製され得る。かかる突然変異は、無作為または特異的であり得る。例えば、イソ型におけるある部分での選択的糖化、糖化の増大または抑制を含むイソ型の糖化における変化に影響を与えるために、アミノ酸配列または可能性のある糖化部位を変える対立遺伝子変異体イソ型を作製することができる。対立遺伝子変異体イソ型は、イソ型と少なくとも９０％の同一性の配列である。一般に、対立遺伝子変異体イソ型は、参照イソ型と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であり、一般に、対立遺伝子変異体は、イソ型と９８％、９９％、９９．５％同一である。
【０１７９】
Ｅ．ＲＴＫイソ型の例
本明細書に記載の方法は、遺伝子の変異体由来のＣＳＲ  ＩＦＰなどのＣＳＲイソ型を同定、発見または作製するために用いられ得る。前記方法を適用することができる１つの遺伝子群の例は、受容体型チロシンキナーゼである。受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は、多数のポリペプチドを構成し、そしてそのコーディング遺伝子は、例えば、ポリペプチド中の配列モチーフの構造的配列などに基づくファミリーにグループ化される。例えば、免疫グロブリン、フィブロネクチン、カドヘリン、上皮成長因子およびクリングルリピートなどの細胞外ドメイン中の構造モチーフは、ＲＴＫのグループ分けに用いられる。かかる構造モチーフによる分類により、保存されたチロシンキナーゼドメインをそれぞれ有する、ＲＴＫの１６個以上のファミリーが同定されている。ＲＴＫの例には、エリスロポエチン産生肝細胞（ＥＰＨ）受容体、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）受容体、細胞接着ＲＴＫ（ＣＡＫ）、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ受容体、肝細胞生長因子（ＨＧＦ）受容体（ＭＥＴと称す）、ＴＥＫ／Ｔｉｅ−２（アンジオポイエチン−１の受容体）、ジスコイジンドメイン受容体（ＤＤＲ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、インスリン受容体関連（ＩＲＲ）受容体、およびＴｙｒｏ３／Ａｘ１などのその他が含まれるが、それらに限定されない。ＲＴＫをコードする遺伝子の例には、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＤＤＲ１、ＤＤＲ２、ＴＫＴ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ８、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１（ＶＥＧＦＲ−１としても公知）、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢおよびＴＥＫ（ＴＩＥ−２としても公知）および上記ならびに記載されていないＲＴＫをコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
ＲＴＫは、シグナル伝達経路、および細胞増殖、脱分化、アポトーシス、細胞移動および血管形成を含む重要な細胞過程の調節に関与する。ＲＴＫの活性化、ひいてはシグナル伝達経路の連続的な活性化は、一般に、リガンド結合および自己リン酸化による受容体の活性化などにより、受容体活性化に依存する。ＲＴＫは、シグナル伝達の誤調節に至る誤調節を生じやすい。あるいは、あるＲＴＫは細胞で発現され、発癌性形質転換などの細胞活性における変化を誘導するかまたはそれに関与する。かかる発現および／または誤調節は、腫瘍性疾患、再狭窄、前部の眼疾患、心血管疾患、肥満および様々な他の疾患などの異常な細胞増殖に関係する疾患が含まれるが、それらに限定されない多くの疾患および状態に関係する。
【０１８１】
本明細書にて供され、本明細書に記載の方法により作製されるＲＴＫイソ型を、特定の細胞型または組織に対して、内生のＲＴＫなどのＲＴＫの生物学的活性をモジュレートするために用いることができる。ＲＴＫの生物学的活性をモジュレートするための能力は、ＲＴＫが関与する細胞経路の直接的な調節と同様にＲＴＫの再調節を可能とする。ＲＴＫの生物学的活性のモジュレートには、例えばＲＴＫとの複合体形成により、ＲＴＫイソ型がＲＴＫと相互作用する直接的なモジュレーション、ＲＴＫのホモ二量体化および／またはヘテロ二量体化のモジュレーション、および／またはＲＴＫのリン酸化の阻害を含むＲＴＫのトランス−リン酸化のモジュレーショが含まれる。ＲＴＫのモジュレーションにはまた、ＲＴＫイソ型が、ＲＴＫの生物学的活性に間接的に影響を与えるための、間接的なモジュレーションが含まれる。間接的なモジュレーションには、ＲＴＫとリガンド結合について競合する「リガンドスポンジ」として作用するイソ型が含まれる。間接的なモジュレーションにはまた、シグナリング経路におけるイソ型とシグナリング分子との相互作用が含まれ、それ故に、かかるシグナリング分子とＲＴＫの相互作用との競合などの活性をモジュレートする。ＲＴＫ活性を標的とし調節することにおける、典型的なＲＴＫイソ型およびかかるＲＴＫイソ型の使用を、以下に説明する。
【０１８２】
１．ＥＧＦＲ
ＥＧＦＲは、上皮細胞および多様な他の細胞型の増殖を刺激する、ＥＧＦ（小さな、５３アミノ酸のタンパク質リガンド）と結合する１７０ｋＤａのタンパク質である。ＥＧＦ受容体は、上皮組織、間葉組織および神経組織に広く発現し、増殖および分化に重要な役割を果たす。ＥＧＦ受容体は、ｅｒｂＢ遺伝子（例えば、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４）およびＨＥＲ遺伝子（例えば、Ｈｅｒ−２）としても公知の関連する遺伝子ファミリーによりコードされる。前記ＥＧＦ受容体ファミリーには、４つのメンバーである、ＥＧＦ受容体（ＨＥＲ−１；ｅｒｂＢ−１）、ヒト上皮成長因子受容体−２（ＨＥＲ−２；ｅｒｂＢ−２）、ＨＥＲ−３（ｅｒｂＢ−３）およびＨＥＲ−４（ｅｒｂＢ−４）が含まれる。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ−１のリガンドは、ＥＧＦであり、一方、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３およびＨＥＲ−４のリガンドはニューレグリン−１（ＮＲＧ−１）である。ＮＲＧ−１は、優先的にＨＥＲ−３またはＨＥＲ−４のどちらかと結合し、その後、結合した受容体サブユニットは、ＨＥＲ−２とヘテロ二量体化する。ＨＥＲ−４はまた、活性受容体を形成するために、ホモ二量体化できる。
【０１８３】
ＥｒｂＢファミリーの誤調節は、多くの異なる型の癌に関係がある。例えば、ＥＧＦＲの過剰発現は、食道癌、胃癌、膀胱癌および結腸癌、神経膠腫および髄膜種、扁平上皮肺癌、および卵巣癌、子宮頸癌および腎臓癌を含むが、これに限定されない多くのヒト腫瘍に関係する。本明細書にて供される方法の使用にて、ＲＴＫイソ型、およびＲＴＫイソ型を含む医薬組成物を、ＥＧＦ受容体の誤調節を標的とし、再調節する治療薬としての使用のために作製することができる。
【０１８４】
例示的態様にて、ＲＴＫイソ型を、ＥＧＦ受容体遺伝子であるｅｒｂＢ２およびｅｒｂＢ３を用いて、ＲＴＫ−ＩＦＰについて本明細書に記載の方法を用いて同定および作製した。前記方法により同定されるイソ型には、配列番号５−１０に記載のＲＴＫ−ＩＦＰが含まれる。
【０１８５】
ａ．ＥｒｂＢ−２
ＥｒｂＢ−２は、ＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーである。高い親和性で結合するリガンドは、ＥｒｂＢ２について同定されていない。その代わり、ＥｒｂＢ−３またはＥｒｂＢ−４は、リガンド（ＮＲＧ−１）が結合したとき、ＥｒｂＢ−２とヘテロ二量体化し、活性な受容体の二量体を形成する。さらに、ＥｒｂＢ２は、リガンドの不存在下で構成的な活性（ホモ二量体化およびキナーゼ活性）を示す。さらに、ＥｒｂＢ−２の過剰発現は、細胞の形質転換を可能にする。ＥｒｂＢ−２の過剰発現は、乳癌、卵巣癌、胃癌および子宮内膜癌を含む多様な癌で同定されている。故に、ＥｒｂＢ−２ホモ二量体を標的とすると、ＥｒｂＢ−２ホモ二量体化を調節することができる。例えば、ｅｒｂＢ−２  ＲＴＫイソ型は、ＥｒｂＢ−２過剰発現を標的とし、下方制御することができる。さらに、ｅｒｂＢ−２  ＲＴＫ−イソ型は、ヘテロ二量体化を介してｅｒｂＢ−３および／またはｅｒｂＢ−４を標的とすることができる。
【０１８６】
ｅｒｂＢ−２イソ型の例には、配列番号５−９に記載のｅｒｂＢ−２  ＩＦＰが含まれる。ＥｒｂＢ−２イソ型を、例えば、ｅｒｂＢ−２および／またはｅｒｂＢ−３の過剰発現により特徴付けられるような、ＥＧＦＲ受容体の過剰発現により特徴付けられる癌の処置などにおいて、ＲＴＫをモジュレートするために用いることができる。例えば、ｅｒｂＢ−２イソ型を、喘息を含む、炎症および過剰増殖の維持にＥＧＦＲファミリーメンバーが関与する自己免疫性疾患の処置に用いることができる。ＥｒｂＢ−２イソ型をまた、メネトリエ病、アルツハイマー病を含む状態でＲＴＫを標的とするため、モジュレーター、例えば、骨吸収のアンタゴニストとして、用いることができる。
【０１８７】
ｂ．ＥｒｂＢ−３
ＥｒｂＢ−３はまた、ニューロンの成長およびシナプス形成の発達、星状細胞分化ならびにミクログリア活性化の調節に関わるＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーである。ＥｒｂＢ−３のリガンドは、ＮＲＧ−１である。ＮＲＧ−１は、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４の両方と結合することができるが、ＥｒｂＢ−３は、ＥｒｂＢ−４よりかなり低い親和性でＮＲＧ−１と結合する。ＥｒｂＢ−３は、ＥＧＦＲファミリーの他のメンバーと比較して、より低いチロシンキナーゼ活性を有する。それは、別のシグナリング分子、例えば、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼを集めることができる。ＥｒｂＢ−３の過剰発現は、乳癌、肺癌および膀胱癌および腺癌などの多くのヒトの癌に関係している。
【０１８８】
ｅｒｂＢ−３イソ型の例には、配列番号１０に記載のｅｒｂＢ−３  ＩＦＰが含まれる。ＥｒｂＢ−３イソ型を、例えば、ｅｒｂＢ−２および／またはｅｒｂＢ−３の過剰発現により特徴付けられる癌などの、ＥＧＦＲ受容体の過剰発現により特徴付けられる癌の処置などにて、ＲＴＫを標的とするために用いることができる。ＥｒｂＢ−３イソ型は、ｅｒｂＢ−３ホモ二量体を標的とし得る。ＥｒｂＢ−３  イソ型は、ｅｒｂＢ−３  イソ型とｅｒｂＢ−２のヘテロ二量体化を介してｅｒｂＢ−２を標的とし得る。ＥｒｂＢ−３イソ型を、ＥＧＦＲ受容体が関与する疾患および状態の処置のために用いることができる。例えば、ｅｒｂＢ−３イソ型を、喘息を含む、炎症および過剰増殖の維持にてＥＧＦＲファミリーメンバーが関与する自己免疫性疾患の処置として用いることができる。ＥｒｂＢ−３イソ型を、メネトリエ病、アルツハイマー病を含む状態にてＲＴＫを標的とするため、モジュレーター、例えば、骨吸収のためのアンタゴニストとしても用いることができる。
【０１８９】
２．ジスコイジンドメイン受容体−ＤＤＲ１
ジスコイジンドメイン受容体（例えば、ＤＤＲ−１）は、細胞接着にて役割を果たすと考えられるＲＴＫのファミリーである。ＤＤＲは、細胞性粘菌（Dictyostelium discoideum）（粘菌）タンパク質であるジスコイジン−１（細胞集合に関与する炭水化物結合タンパク質）に相同である、その細胞外ドメインに独特の構造モチーフを有する。ジスコイジン様ドメインには、約１６０個のアミノ酸が含まれ、それは、他のＲＴＫには見られないが、細胞膜タンパク質（例えば、凝固第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子など）と相互作用することが知られている他の細胞外分子にて見られる。コラーゲン（例えば、Ｉ型からＶＩ型コラーゲン）は、ＤＤＲ−１の自己リン酸化を刺激する。
【０１９０】
ＤＤＲチロシンキナーゼは、ヒトの癌と関係している。例えば、ＤＤＲ１は、コラーゲンと結合し得、マトリックスメタロプロテアーゼ−１のコラーゲンにより誘導される活性化を仲介する。マトリックスメタロプロテアーゼ−１は、腫瘍細胞の転移を可能とする、細胞外マトリックスの分解に関与する。ＤＤＲ−１の過剰発現は、乳癌、卵巣癌および食道癌ならびに小児脳腫瘍などの多様な中枢神経系新生物などの癌に関与している。ＤＤＲ１の活性はまた、炎症応答に関係を有する。
【０１９１】
ＤＤＲイソ型の例は、ＤＤＲ１−ＩＦＰであり、配列番号１に記載されている。ＤＤＲ−１イソ型は、ＤＤＲ−１  ＲＴＫをモジュレートするために用いられ得る。例えば、ＤＤＲ−１イソ型を、ＤＤＲ−１が関与する疾患および状態におけるＤＤＲ−１過剰発現および／または活性化を下方制御するために用いることができる。
【０１９２】
３．Ｅｐｈ受容体
Ｅｐｈ受容体は、ＲＴＫの最も大きな既知のファミリーである。Ｅｐｈ受容体に対するリガンドは、エフリン（Ｅｐｈ受容体結合タンパク質）である。リガンドおよび受容体は両方とも膜結合分子であり、シグナリングは、どちらかのタンパク質を介して起こり得る。Ｅｐｈは、細胞質チロシンキナーゼドメイン、保存されたシステインに富むドメイン、２個のＩＩＩ型フィブロネクチンドメインおよび免疫グロブリン様Ｎ末端ドメインにより特徴付けられる。エフリンは、ＧＰＩ結合タンパク質（Ａ型）または膜貫通タンパク質（Ｂ型）のどちらかであり得る。ＲＴＫのＥｐｈファミリーは、胚パターン形成、神経標的化、血管発生および血管形成を含む多様な細胞過程に関与する。特に血管形成における役割のために、乳癌などのヒトの癌にＥｐｈ受容体が関係する。ＥｐｈＡ受容体の誤調節はまた、病的状態に関与する。例えば、ＥｐｈＡ受容体型チロシンキナーゼの上方制御は、ある種の眼疾患、関節リウマチおよび癌に共通の、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）により誘導される血管形成を刺激する。ＥｐｈＡ受容体アンタゴニストとして作用するイソ型などのＥｐｈＡイソ型は、不適当な血管形成を抑制するかまたは阻害するために用いられ得る。
【０１９３】
ａ．ＥｐｈＡ１
ＥｐｈＡ１は、Ａ型のＥｐｈ受容体である。Ａ型のＥｐｈ受容体は、エフリンＡ型と結合し、それはＧＰＩアンカーを介して細胞膜と結合する。ＥｐｈＡ１は、皮膚、成人の胸腺、腎臓および副腎皮質を含む、分化した上皮細胞に広く発現される。ＥｐｈＡ１の過剰発現は、頭頸部癌を含む、多様なヒトの癌に関与する。ＥｐｈＡ１イソ型を、Ｅｐｈ受容体が関係する疾患および他の状態などを標的とするために用いることができる。ＥｐｈＡ１イソ型の例としては、配列番号３に記載のＥｐｈＡ１  ＩＦＰがある。
【０１９４】
ｂ．ＥｐｈＡ８
ＥｐｈＡ８は、Ａ型のＥｐｈ受容体である。Ａ型のＥｐｈ受容体は、エフリンＡ型と結合し、それはＧＰＩアンカーを介して細胞膜と結合する。ＥｐｈＡ８は、細胞移動および細胞接着、ならびに軸索誘導を含む神経系の発達に関与する。ＥｐｈＡ８イソ型は、Ｅｐｈ受容体が関係する疾患および他の状態などを標的とするために用いられ得る。ＥｐｈＡ８イソ型の例としては、配列番号４に記載のＥｐｈＡ８  ＩＦＰがある。
【０１９５】
４．繊維芽細胞成長因子
繊維芽細胞成長因子受容体ファミリーには、ＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ−２、ＦＧＦＲ−３、ＦＧＦＲ−４およびＦＧＦＲ−５が含まれる。１個またはそれ以上のＦＧＦ受容体と結合することのできる、少なくとも２３個の既知のＦＧＦタンパク質が存在する。ＦＧＦ受容体は、Ｎ末端のＩｇ様ドメイン（細胞外）、Ｃ末端（細胞質）の膜貫通ドメインおよび２個のキナーゼドメインにより構造的に特徴付けられる。ＦＧＦおよびその受容体は、血管形成および創傷治癒を促進し、細胞運動および分化をモジュレートする、細胞増殖の刺激に関与する。ＦＧＦＲは、多様なヒト癌、ならびに眼疾患に関与している。
【０１９６】
ａ．ＦＧＦＲ−２
ＦＧＦＲ−２は、繊維芽細胞成長因子受容体ファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲ−２のリガンドには、ＦＧＦ−１（塩基性ＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（酸性ＦＧＦ）、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−７が含まれるが、それらに限定されない多くのＦＧＦタンパク質が含まれる。ＦＧＦ受容体は、発達中の組織再構築の細胞−細胞情報伝達、ならびに成体組織における細胞恒常性に関与する。ＦＧＦＲ−２の過剰発現、またはＦＧＦＲ−２における変異は、乳癌、膵臓癌、結腸直腸癌、膀胱癌および子宮頸癌を含む、多様なヒト癌を含む過増殖性疾患との関係を有する。配列番号１１に、ＦＧＦ−２イソ型の例を記載する。ＦＧＦ−２ＩＦＰなどのＦＧＦ−２イソ型は、癌を含む、ＦＧＦが上方制御される状態を処置するために用いられ得る。
【０１９７】
ｂ．ＦＧＦＲ−４
ＦＧＦＲ−４は、ＦＧＦ受容体型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。ＦＧＦＲ４調節は、いくつかの癌細胞で改変される。例えば、いくつかの腺癌でＦＧＦＲ４は、正常な繊維芽細胞における発現と比較して下方制御される。ＦＧＦＲ４の選択的形態が、いくつかの腫瘍細胞で発現される。例えば、ｐｔｄ−ＦＧＦＲ−４は、ＦＧＦＲ４細胞外ドメインのタンパク質を欠くが、３番目のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを含む。このイソ型は、下垂体腫瘍で見られ、腫瘍形成性である。ＦＧＦＲ４イソ型は、ＦＧＦＲ４が調節を失敗された疾患および状態を処置するために用いられ得る。例えば、ＦＧＦＲ４−イソ型を、ｐｔｄ−ＦＧＦＲ４などの腫瘍形成性ＦＧＦＲ４イソ型を下方制御するために用いることができる。イソ型の例であるＦＧＦＲ４−ＩＦＰは、配列番号１２に記載されている。
【０１９８】
５．血小板由来成長因子受容体
血小板由来成長因子受容体は、２個のサブユニットであるαおよびβからなるホモまたはヘテロ二量体である。受容体サブユニットは、Ｎ末端の５個のＩｇ様ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＣ末端のスプリットキナーゼドメイン（split kinase domain）から成る。その受容体と同様に、ＰＤＧＦリガンドは、Ａ鎖および／またはＢ鎖のホモ−またはヘテロ二量体である。α−ＰＤＧＦ受容体は、ＰＤＧＦ−ＡまたはＰＤＧＦ−Ｂのどちらかにより活性化され得る。β−ＰＤＧＦ受容体は、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖でのみ活性化され得る。ＰＤＧＦファミリーの２個のさらなるメンバーである、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄもまた単離されている。
【０１９９】
ＰＤＧＦ受容体およびリガンドは、血栓形成、細胞外マトリックス合成、免疫細胞の走化性、アポトーシスおよび胚発生を含む、多様な細胞過程に関与する。ＰＤＧＦ受容体の過剰発現は、胃癌、膵臓癌、肺癌および前立腺癌を含む、多くのヒト悪性腫瘍に関連している。血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）の活性化は、前立腺肥大および前立腺癌、ならびに他の癌タイプに関連する。ＰＤＧＦ−Ｒの活性化はまた、アテローム性動脈硬化症の発生における平滑筋の増殖と関連がある。ＰＤＧＦＲはまた、増殖性硝子体網膜症（網膜の後方での繊維芽細胞の増殖により引き起こされる一般的な医学的問題であり、結果として網膜剥離をもたらす）をモジュレートすることに関する。
【０２００】
ＰＤＧＦＲイソ型の例としては、配列番号２０および２１に記載のＰＤＧＦＲ−ＩＦＰがある。ＰＤＧＦＲイソ型は、例えば、増殖性硝子体網膜症およびアテローム性動脈硬化症を含む平滑筋過増殖性状態などの過増殖性疾患を含む、ＰＤＧＦＲが関与する疾患および状態を標的とすることに用いられ得る。
【０２０１】
６．ＭＥＴ（ＨＧＦ）
ＭＥＴは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の、多機能なサイトカインにより制御される細胞増殖、形態形成および運動性のためのＲＴＫである。ＨＧＦ（主として間葉細胞により産生される傍分泌因子）は、すばやい細胞膜の波打ち現象、微小突起の形成、および増大した細胞運動性を含む、細胞分裂および形態形成における変化を引き起こす。ＭＥＴを介するシグナリングは、腫瘍形成性を増大し得、細胞運動性を誘導し、インビトロにおける侵襲性およびインビボにおける転移を増大する。ＭＥＴシグナリングはまた、腫瘍転移を促進するために重要な、細胞外マトリックス／基底膜の分解を導く、プロテアーゼおよびウロキナーゼの産出を増大することができる。
【０２０２】
ＭＥＴは、肝細胞で高度に発現されるＲＴＫである。ＭＥＴは、２個のジスルフィドで結合されたサブユニット、５０−ｋＤのαサブユニットおよび１４５−ｋＤのβサブユニットから成る。十分に加工されたＭＥＴタンパク質において、αサブユニットは細胞外であり、βサブユニットは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメインを有する。ＭＥＴのリガンドは、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）である。ＦＧＦおよびＭＥＴを介するシグナリングは、細胞増殖、運動性および浸潤を含む、肝細胞および上皮細胞における細胞分裂活性を刺激する。他のＲＴＫのように、これらの特性は、ＭＥＴと発癌性活性を結び付ける。癌における役割に加えて、ＭＥＴはまた、マラリア感染の発生における重要な因子となることが示されている。ＭＥＴの活性化は、肝細胞をマラリア感染に感受性とするために必要であり、故にＭＥＴは、前記疾患の予防のための最初の標的である。
【０２０３】
配列番号１９に、典型的なＭＥＴイソ型、ＭＥＴ−ＩＦＰを記載する。ＭＥＴイソ型は、転移癌の処置または予防、および腫瘍増殖に必要な血管形成などの血管形成の阻害に用いられ得る。ＭＥＴイソ型の治療用途には、肺癌、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）、結腸癌、胃癌、および皮膚悪性黒色腫が含まれる。
【０２０４】
ＭＥＴイソ型はまた、他の抗血管形成薬と組み合わせて、腫瘍細胞侵襲性を予防するために用いられ得る。抗血管形成薬は、ＨＧＦ刺激に対して細胞を感受性にすることにより腫瘍細胞の浸潤を促進することができる腫瘍にて低酸素状態を作り出す。ＭＥＴイソ型は、抗血管形成薬が与えられるときＭＥＴを阻害または下方制御することなどにより、ＭＥＴの生物学的活性を標的としモジュレートすることができ、故に、新しい内皮細胞により腫瘍細胞の侵襲性を腫瘍の浸潤と同じくらい予防または阻害する。
【０２０５】
ＭＥＴイソ型の治療的用途には、マラリアの予防も含まれる。プラスモジウム（マラリアの原因物質）を、哺乳動物感染を起こすために最初に肝細胞に感染させなければならない。感染が最終的に１個の肝細胞に確立される前に、スポロゾイトは、肝細胞の原形質膜を破ることによりいくつかの肝細胞を通って移動する。スポロゾイト移動による肝細胞の損傷は、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）の分泌を誘導し、肝細胞を感染に対して感受性にする。感染は、分泌されたＨＧＦにより、ＨＧＦ受容体であるＭＥＴの活性化に依存する。マラリア寄生虫は、宿主細胞を感染に対して感受性にするシグナルのメディエーターとしてＭＥＴを利用する。ＨＧＦ／ＭＥＴシグナリングは、肝細胞中での寄生虫の初期発生に必要な宿主細胞のアクチン細胞骨格の再構成を誘導する。ＭＥＴイソ型は、ＭＥＴを下方制御するための治療薬として投与され得、故に、マラリア寄生虫によるＭＥＴシグナリングの誘導を阻害または予防し、よってマラリア感染を阻害または予防する。ＭＥＴはまた、ワクチン接種後すぐの期間におけるスポロゾイトによる感染を予防することにより、マラリアに対するワクチンに用いることができる。
【０２０６】
７．ＦＬＴ１（ＶＥＧＦ−１Ｒ）
血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、８個のシステイン残基の保存されたパターンを有する近似の成長因子のファミリーであって、一般的なＶＥＧＦ受容体を共有する。ＶＥＧＦ受容体には、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）およびＶＥＧＦＲ−２（Ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）が含まれる。ＶＥＧＦ受容体のリガンドには、血管内皮細胞成長因子−Ａ（vasculotropin（ＶＡＳ）または血管透過性因子（ＶＰＦ）としても公知）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄおよび胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）が含まれる。ＶＥＧＦタンパク質および受容体は、細胞移動、増殖および管形成を含む血管形成の多くの局面にて重要な役割を果たし、故にこれらのタンパク質は多くのタイプの癌の病因と関連する。Ｆｌｔ−１およびＦｌｋは、ＶＥＧＦＲファミリーメンバーをコードする２個の遺伝子である。
【０２０７】
Ｆｌｔ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１）は、チロシンキナーゼのＶＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーである。Ｆｌｔ−１のリガンドには、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）が含まれる。Ｆｌｔ−１およびそのリガンドは血管形成に重要であるため、これらのタンパク質の誤調節は、固形腫瘍の増殖または転移、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、網膜症および乾癬症などの、異常な血管形成から生じる多様な疾患に重大な影響を与える。Ｆｌｔ−１はまた、川崎病（微小血管系過透過性がある全身性脈管炎）に関係している。
【０２０８】
ＶＥＧＦＲ関連疾患および状態を標的とするための典型的なＲＴＫイソ型には、配列番号１３−１８に記載のＶＥＧＦＲ−ＩＦＰが含まれる。かかるイソ型は、例えば、川崎病、関節リウマチ、糖尿病性網膜症、網膜症および乾癬症などの急性炎症性疾患の処置、ならびに異常な血管形成の再調節に用いられ得る。さらに、ＶＥＧＦＲ−イソ型を、乳癌を含む癌の処置に使用することができる。
【０２０９】
８．ＴＥＫ（ＴＩＥ−２）
Ｔｉｅ−１およびＴｉｅ−２／ＴＥＫは、免疫グロブリンおよび上皮成長因子相同性ドメインを有する内皮性ＲＴＫである。Ｔｉｅ−２／ＴＥＫの既知のリガンドには、アンジオポイエチン（Ａｎｇ）−１およびＡｎｇ−２が含まれる。これらのＲＴＫは、胚の血管系の発生、および成体の内皮細胞中での発現の継続に重要な役割を果たす。Ｔｉｅ−２／ＴＥＫは、ほぼ血管内皮にのみ発現されるＲＴＫである。Ｔｉｅ−２／ＴＥＫの発現は、胚の血管系の発生に重要である。Ｔｉｅ−２／ＴＥＫの過剰発現および／または変異は、病原性の血管形成、その結果としての腫瘍増殖、ならびに骨髄性白血病と関係する。
【０２１０】
Ｔｉｅ／ＴＥＫ−受容体を標的とするための典型的ＲＴＫ−イソ型には、配列番号２２−２５に記載のＴｉｅ／ＴＥＫ−ＩＦＰなどのＲＴＫイソ型が含まれる。かかるＲＴＫイソ型は、癌、眼疾患および関節リウマチなどの疾患における抗血管形成治療を含む、Ｔｉｅ／Ｔｅｋ受容体が関係する疾患および状態の処置に用いられ得る。ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型で処置され得る他の疾患および状態には、関節炎、リウマチ、および乾癬などの炎症性疾患、良性腫瘍および前癌状態、心筋の血管形成、血友病性関節症、強皮症、脈管接着、アテローム斑新生血管形成、毛細血管拡張症、および創傷部肉芽形成が含まれる。Ｔｅｋ受容体イソ型のさらなる標的には、ＴＥＫが過剰発現される疾患、例えば、慢性骨髄性白血病が含まれる。
【０２１１】
Ｆ．ＣＳＲイソ型の核酸およびポリペプチドを作製する方法
ＣＳＲイソ型の核酸分子およびポリペプチドを作製する典型的な方法を、本明細書にて供する。かかる方法には、ＰＣＲなどの核酸分子のインビトロでの合成方法、遺伝子構築物の合成、および単離ならびに／または合成された核酸フラグメントのインビトロでのライゲーションが含まれる。ＣＳＲイソ型核酸分子はまた、細胞から単離されたＲＮＡおよびＤＮＡのＰＣＲを含む、クローニング法、およびハイブリダイゼーションおよび／または発現スクリーニング方法による核酸分子ライブラリのスクリーニングにより単離され得る。
【０２１２】
ＣＳＲイソ型ポリペプチドは、インビトロおよびインビボ合成法を用いてＣＳＲイソ型核酸分子から作製され得る。ＣＳＲイソ型は、その必要量を産するため、ならびに投与および処置に必要なイソ型の形成のために適するどんな生物でも発現され得る。発現宿主には、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞系および形質転換動物を含む哺乳動物細胞などの原核生物および真核生物が含まれる。ＣＳＲイソ型はまた、イソ型が組換え的に作製される細胞および生物、ならびにイソ型が選択的スプライシング事象により作製されたゲノムにコードされるイソ型などの組換え手段なしで合成される細胞および生物を含む、それらが発現される細胞および生物から単離され得る。
【０２１３】
１．合成遺伝子およびポリペプチド
ＣＳＲイソ型核酸分子およびポリペプチドは、合成的遺伝子合成を用いて当業者に公知の方法により合成され得る。かかる方法にて、ＣＳＲイソ型のポリペプチド配列は、イソ型をコードする１個またはそれ以上の核酸分子を作製するために「逆翻訳（back-translated）」する。次いで、逆翻訳された核酸分子は、自動化ＤＮＡ合成技術などにより１個またはそれ以上のＤＮＡフラグメントとして合成される。次いで、前記フラグメントは、イソ型をコードする核酸分子を形成するために操作可能に連結する。核酸分子はまた、ベクターなどのさらなる核酸分子（転写、翻訳、および他のポリペプチドをコードする核酸分子を調節するための調節配列）と結合され得る。イソ型をコードする核酸分子はまた、放射性標識を含むトラッキング、および蛍光部分などの標識と結合され得る。
【０２１４】
逆翻訳の過程では、ＣＳＲイソ型などの興味のある任意のポリペプチドのヌクレオチド遺伝子配列を得るために遺伝コードを用いる。遺伝コードは、６４個のコドンで２０個のアミノ酸および３個の終止コドンを指定するように縮重されている。かかる縮重は核酸の設計および作製に融通性を持たせ、例えば、それぞれの合成されたフラグメント内に、核酸フラグメントの連結および固有の識別子配列の配置を容易にするために制限部位を加えることを可能とする。遺伝コードの縮重はまた、核酸分子の設計が、効率的な翻訳に悪影響を及ぼす可能性のある望まれない制限部位、スプライシング供与部位あるいは受容部位、または他のヌクレオチド配列を含む、望まれないヌクレオチド配列を避けるのを可能にする。さらに、生物は時々、特定のコドンの利用および／または規定されたＧＣヌクレオチド対ＡＴヌクレオチドの比率を示す傾向がある。故に、遺伝コードの縮重は、特定の生物または生物群における発現に合わせた核酸分子の設計を可能にする。さらに、核酸分子は、配列の最適化（または非最適化）に基づく異なるレベルでの発現のために設計され得る。逆翻訳は、ポリペプチドをコードするコドンを選択することにより行われる。かかる過程は、遺伝コードおよびポリペプチド配列の表を用いて手動で行われ得る。別法にて、公共に利用可能なソフトウェアを含むコンピュータプログラムを、逆翻訳核酸配列を作製するために用いることができる。
【０２１５】
例えば、配列番号１９に記載のＩＦＰなどのイソ型には、９３４個のアミノ酸の配列が含まれる。このアミノ酸配列のコーディングＤＮＡ配列（および、いかなる他のアミノ酸配列も全て）を、逆翻訳の処理により決定することができる。生物に選好されない遺伝コードの表を用いることができる。別法にて、発現宿主などの特定の生物に選好されるコドンを組み入れる遺伝コード表が、選択される。配列番号１９にコードされる典型的な核酸配列を、配列番号２６に記載する。
【０２１６】
逆翻訳核酸分子を合成するため、核酸合成のための当技術分野にて利用可能な任意の方法を用いることができる。例えば、ヌクレオチドのＣＳＲイソ型をコードする配列のフラグメントに対応する個々のオリゴヌクレオチドを、標準的な自動化された方法、およびアニーリング反応またはハイブリダイゼーション反応と合わせて行うことにより合成する。かかるオリゴヌクレオチドを合成し、かかるアニーリングの結果、二本鎖相補配列を形成するための重複一本鎖突出末端、一般的に長さが約１００個のヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチドから遺伝子の自己会合を生じる。二本鎖ＤＮＡにおける単一のヌクレオチド「ニック（nick）」を、例えばバクテリオファージＴ４  ＤＮＡライゲースを用いたライゲーションを用いて閉じる。故に、制限エンドヌクレアーゼリンカー配列を、例えば、タンパク質発現に適する多様な組換えＤＮＡベクターの任意の１つに合成遺伝子を挿入するために用いることができる。他の同様の方法にて、一連の重複オリゴヌクレオチドを、化学的オリゴヌクレオチド合成法により製造する。これらのオリゴヌクレオチドのアニーリングの結果、ギャップＤＮＡ構造が生じる。ＤＮＡポリメラーゼＩなどの酵素により触媒されるＤＮＡ合成は、これらのギャップを埋めるために用いられ得、ライゲーションは、二本鎖構造における任意のニックを閉じるために用いられる。ＰＣＲおよび／または他のＤＮＡ増幅技術を、形成された直線状の二本鎖ＤＮＡを増幅するために用いることができる。
【０２１７】
付加的ヌクレオチド配列を、例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質をコードするＤＮＡ配列の増幅のために設計されたベクターなどのベクター内に合成遺伝子をクローニングするための制限酵素部位を含むリンカー配列を含むＣＳＲイソ型をコードする核酸分子と連結することができる。さらに、機能的ＤＮＡ要素を特定する付加的ヌクレオチド配列を、イソ型をコードする核酸分子と操作可能に連結することができる。かかる配列の例には、細胞内タンパク質発現を容易にするために設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を容易にするように設計された分泌配列が含まれるが、これらに限定されない。タンパク質結合領域を特定する配列などの付加的ヌクレオチド配列を、イソ型をコードする核酸分子と連結することもできる。かかる領域には、特定の標的細胞におけるイソ型の取り込みを容易にするか、または別法で合成遺伝子の薬物動態を高める配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
ＣＳＲイソ型はまた、自動化合成ポリペプチド合成を用いて合成され得る。クローニングされ、および／またはコンピュータ内で作製されたポリペプチド配列を、フラグメントに合成することができ、その後化学的に連結することができる。別法にて、イソ型を、単一ポリペプチドとして合成することができる。故に、かかるポリペプチドを、本明細書に記載の分析および処置的投与に用いることができる。
【０２１９】
２．ＣＳＲイソ型のクローニング方法および単離方法
ＣＳＲイソ型を、核酸分子をクローニングおよび単離するために当技術分野にて公知の、任意の利用可能な方法を用いてクローニングおよび単離することができる。かかる方法には、核酸のＰＣＲ増幅、ならびに核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニングおよび活性に基づくスクリーニングを含むライブラリのスクリーニングが含まれる。
【０２２０】
核酸の増幅方法を、イソ型をコードする核酸分子を単離するために用いることができ、それには例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が含まれる。核酸含有物質を、イソ型をコードする核酸分子が単離され得る出発物質として用いることができる。例えば、ＤＮＡおよびｍＲＮＡ調製物、細胞抽出物、組織抽出物、液体試料（例えば、血液、血清、唾液）、健常な対象および／または疾患を患う対象からの試料を、増幅方法にて用いることができる。核酸ライブラリを、出発物質の源として用いることもできる。プライマーを、イソ型を増幅するために設計することができる。例えば、プライマーを、イソ型が作製される発現配列に基づいて設計することができる。プライマーを、イソ型アミノ酸配列の逆翻訳を基に設計することができる。増幅により作製された核酸分子を、シークエンスし、イソ型をコードすることを確認することができる。
【０２２１】
イソ型をコードする核酸分子を、ライブラリスクリーニングを用いて単離することができる。例えば、ｃＤＮＡとして発現ＲＮＡ転写物を表わす核酸ライブラリを、ＣＳＲイソ型またはその一部をコードする核酸分子でハイブリダイズすることによりスクリーニングすることができる。例えば、ＣＳＲ遺伝子由来のイントロン配列またはその一部を、相同配列へのハイブリダイゼーションに基づく分子を含むイントロン保持のスクリーニングに用いることができる。発現ライブラリスクリーニングを、ＣＳＲイソ型をコードする核酸分子を単離するために用いることができる。例えば、発現ライブラリを、特定のイソ型またはイソ型の一部を認識する抗体でスクリーニングすることができる。ＣＳＲイソ型またはイソ型に含まれる領域あるいはペプチドに特異的に結合する抗体を、得ること、および／または製造することができる。イソ型に特異的に結合する抗体を、ＩＦＰなどのイソ型をコードする核酸分子を含む発現ライブラリをスクリーニングするために用いることができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体ならびにそれら由来のフラグメントを含む抗体の製造方法および単離方法は、当技術分野で周知である。組換え抗体および合成抗体の製造方法および単離方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、かかる抗体を、候補ポリペプチドに特異的に結合する抗体の抗原結合部位のヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を用いて、固相ペプチド合成を用いて構築することができるか、または組換え的に製造することができる。抗体を、可変重鎖および可変軽鎖を含むか、またはその抗原結合部分を含む組合せライブラリをスクリーニングすることによっても得ることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および非天然抗体の製造、単離および使用方法は、例えば、KontermannおよびDubel著(2001)「Antibody Engineering」 Springer Verlag；HowardおよびBethell著(2001)「Basic Methods in Antibody Production and Characterization」 CRC Press；ならびに、O’BrienおよびAitkin著(2001)「Antibody Phage Display」Humana Pressに掲載される。かかる抗体を、イソ型ポリペプチドの存在をスクリーニングするため、例えば、細胞、組織または抽出物におけるＣＳＲイソ型の発現を検出するために用いることもできる。
【０２２２】
３．イソ型複合体
ＣＳＲイソ型は、イソ型と他の物質との複合体としても提供され得る。前記複合体を、イソ型が相互作用する受容体、および／またはイソ型の送達のための他の標的化受容体を標的とするために用いることができる。かかる複合体には、標的化物質および／または標的物質へのＣＳＲイソ型の連結が含まれる。複合体は、化学的結合を含む任意の適する方法によるか、または例えば、標的化物質または標的物質をコードするＤＮＡが、リンカー領域を有するかまたは有しないでＲＴＫイソ型をコードするＤＮＡと操作可能に連結された融合タンパク質の発現により、製造され得る。複合体はまた、一般的には、構成要素中に存在するかまたは付加されたシステイン残基間のジスルフィド結合を介するか、またはアミド結合あるいは他の適当な結合を介して、化学的カップリングにより製造され得る。イオン結合または他の結合もまた、考慮される。
【０２２３】
ＣＳＲイソ型複合体化し、処置を、例えば、生理学的に許容される賦形剤中、治療的有効量の複合体を投与することにより行う、医薬組成物を製造することができる。ＣＳＲイソ型複合体はまた、融合タンパク質としてＣＳＲイソ型複合体をコードする核酸を含むベクターを送達することなどにより、インビボ治療方法に用いられ得る。
【０２２４】
複合体には、１個またはそれ以上の標的化物質（少なくとも１個のＣＳＲイソ型が、少なくとも１個の標的化物質と直接結合するか、または１個あるいはそれ以上のリンカー（Ｌ）を介して結合する、（ＣＳＲイソ型）ｎ、（Ｌ）ｑ、および（標的化物質）ｍ）と直接またはリンカーを介してのどちらかで結合した１個またはそれ以上のＣＳＲイソ型が含まれ得る。かかる複合体はまた、処置のための標的細胞タイプなどの、標的と結合するのに十分なＣＳＲイソ型の任意の部分と一緒に調製され得る。ｎおよびｍが１より大きい整数であり、そしてｑがゼロかまたは１より大きい整数である、複合体の成分と任意の数の成分とのいかなる適した結合も、得られた複合体が標的化ＣＳＲまたは標的化細胞タイプと相互作用する限り検討する。
【０２２５】
１つの例にて、ＣＳＲイソ型を、もう一方の分子（標的化物質として本明細書に称される）を標的とするための標的物質として用いる。例えば、ヘルスタチン（配列番号９）を標的ドメインとして用いることができる。他の例にて、イントロンにコードされる部分またはドメインを、標的物質、例えば、ＥＣＤＩＩＩａ（例えば、米国特許番号第６，４１４，１３０号および米国特許公開出願番号第２００４００２２７８５号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）として用いる。
【０２２６】
標的化物質の例には、薬剤、および細胞表面でまたは細胞表面から作用する毒物、および細胞内で作用する毒物などの他の細胞毒性分子が含まれる。かかる部分の例には、ＣＳＲイソ型と結合したとき標的とされ得るような、例えば、イオン化α粒子あるいはβ粒子、またはＸ線あるいはγ線を送達するために崩壊する放射性核種、放射活性原子が含まれる。他の例には、イソ型と結合することにより標的化され得る化学治療薬剤が含まれる。例えば、ゲルダナマイシンは、プロテオソームを標的とする。イソ型−ゲルダナマイシン分子は、細胞内プロテオソームを対象とし得、標的化イソ型を分解し、プロテオソームでゲルダナマイシンを解放する。他の毒性分子には、リシン（ricin）、サポリン（saporin）およびコンシュ（conche）または軟体動物の他のメンバー由来の天然産物などの毒物が含まれる。標的化物質との複合体のもう１つの例には、抗体または抗体フラグメントと、例えば、タンパク質融合物として結合したＣＳＲイソ型がある。例えば、イソ型は、好中球、ナチュラルキラー細胞、およびマクロファージにおけるキラーＴ細胞活性を誘導するための特定の細胞表面マーカーと結合する抗体のＦｃフラグメントと結合され得る。多様な毒物が当業者に周知である。
【０２２７】
複合体には、１個またはそれ以上の標的化物質（少なくとも１個のＣＳＲイソ型が、少なくとも１個の標的化物質と直接結合するか、または１個あるいはそれ以上のリンカー（Ｌ）を介して結合する、（ＣＳＲイソ型）ｎ、（Ｌ）ｑ、および（標的化物質）ｍ）と直接またはリンカーを介してのどちらかで結合した１個またはそれ以上のＣＳＲイソ型が含まれ得る。ｎおよびｍが１より大きい整数であり、そしてｑがゼロかまたは１より大きい任意の整数であるとき、複合体の成分と任意の数の成分とのいかなる適した結合も、得られた複合体が標的化細胞タイプなどの標的と相互作用する限り検討する。
【０２２８】
標的物質には、特定の組織または細胞タイプまたは器官などの標的に対してＣＳＲイソ型を標的とする任意の分子が含まれる。標的物質の例には、細胞表面抗原、細胞表面受容体、細胞表面または細胞膜内のタンパク質、脂質および炭水化物部分、細胞表面で作られる分子、分泌分子および他の細胞外分子が含まれる。標的分子として有用な分子には、有機化合物；無機化合物；金属錯体；受容体；酵素；抗体；タンパク質；核酸；ペプチド核酸；ＤＮＡ；ＲＮＡ；ポリヌクレオチド；オリゴヌクレオチド；オリゴ糖；脂質；リポタンパク質；アミノ酸；ペプチド；ポリペプチド；ペプチド模倣物；炭水化物；補因子；薬物；プロドラッグ；レクチン；糖；糖タンパク質；生体分子；マクロ分子；バイオポリマー；ポリマー；および他のかかる生物学的物質が含まれるが、これらに限定されない。標的物質として有用な典型的な分子には、タンパク性物質および小分子リガンドなどの受容体のためのリガンド、ならびに抗原結合タンパク質などの抗体および結合タンパク質が含まれる。
【０２２９】
あるいは、特定の受容体（または複数の受容体）と特異的に相互作用するＣＳＲイソ型は、標的物質であり、そして毒物、薬物または核酸分子などの標的化物質と結合される。前記核酸分子は、標的化細胞において転写および／または翻訳され得るか、または調節核酸分子であり得る。
【０２３０】
ＣＳＲは、標的とされた物質（または標的物質）と直接またはリンカーを介して結合され得る。リンカーには、ペプチド性および非ペプチド性のリンカーが含まれ、それらは、ＣＳＲイソ型に対する標的化物質または標的物質の隣接による立体障害を除去または軽減し、および／または複合体の他の特性、例えば特異性、毒性、溶解性、血清の安定性および／または細胞内の有用性などを増大または変化する、および／またはＣＳＲイソ型と標的とされた物質または標的物質の間の結合の柔軟性を増大するなどの機能性で選択され得る。リンカーの例および複合体化の方法は、当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ００／０４９２６を参照のこと）。ＣＳＲはまた、被包分子または封入分子の送達を導くリポゾームおよび他のかかる部分を用いて標的化され得る。
【０２３１】
４．発現系
天然および組合せＩＦＰを含むＣＳＲイソ型を、インビボ方法およびインビトロ方法を含む当技術分野で公知の任意の手段で作製することができる。ＣＳＲイソ型は、その必要量を産するため、ならびに投与および処置に必要なＣＳＲイソ型を形成するために適するすべての生物において発現され得る。発現宿主には、大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、ヒト細胞系および遺伝子組換え動物を含む哺乳動物細胞などの、原核生物および真核生物が含まれる。発現宿主は、それらのタンパク質生産レベル、ならびに発現タンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプに相違があってよい。発現宿主の選択は、これらの因子および、調節および安全性の検討、生産コストおよび必要性および精製のための方法などの他の因子に基づいて行われ得る。
【０２３２】
多くの発現ベクターが、ＣＳＲイソ型の発現のために利用可能である。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択に影響されるかもしれない。一般に、発現ベクターには、転写プロモーターが含まれ得、要すればエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルが含まれ得る。安定な形質転換に用いられる発現ベクターは一般に、形質転換細胞の選択および維持を可能にする選択可能マーカーを有する。いくつかの場合にて、複製起点を、多くのベクターのコピーを増幅するために用いることができる。
【０２３３】
ＣＳＲイソ型は、タンパク質融合物としても利用または発現され得る。例えば、イソ型融合物は、イソ型にさらなる機能を付加するために作製され得る。イソ型融合タンパク質の例には、シグナル配列の融合物、局在化のための、例えばｈｉｓ６タグまたはｍｙｃタグなどのタグ、または精製のための、例えばＧＳＴ融合などのタグ、およびタンパク質分泌および／または膜結合を導くための配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０２３４】
ａ．原核生物発現
原核生物、とりわけ大腸菌は、ＣＳＲイソ型などの多量のタンパク質を製造するためのシステムを提供する。大腸菌の形質転換は、当業者に周知の簡便かつ迅速な技術である。大腸菌のための発現ベクターには、誘導プロモーターが含まれ得、かかるプロモーターは、高レベルのタンパク質発現の誘導、および宿主細胞に対していくつかの毒性を示すタンパク質の発現に有用である。誘導プロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ハイブリッドｔａｃプロモーター、Ｔ７およびＳＰ６ＲＮＡプロモーター、および温度調節λＰＬプロモーターが含まれる。
【０２３５】
イソ型は、大腸菌の細胞質環境中にて発現され得る。前記細胞質は還元的環境であり、いくつかの分子に関して、このことは、不溶性の封入体の形成をもたらす結果となる。ジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノールなどの還元剤と、グアニジン−ＨＣｌおよび尿素などの変性剤を、タンパク質を再溶解するために用いることができる。別法としては、酸性環境で、かつシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを供するバクテリアのペリプラズム空間内におけるＣＳＲイソ型の発現であり、可溶性タンパク質の産生を導き得る。一般に、リーダー配列は、発現されるタンパク質と融合されており、それは前記タンパク質をペリプラズムに導く。その後、リーダー配列は、ペリプラズム内でシグナルペプチダーゼにより除去される。ペリプラズムを標的とするリーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のｐｅｌＢリーダーおよびアルカリホスタファーゼ遺伝子から誘導されたリーダーが含まれる。いくつかの場合にて、ペリプラズム発現は、培養培地への発現タンパク質の漏出を許容する。タンパク質の分泌は、培養上清からの迅速かつ簡便な精製を可能とする。分泌されないタンパク質を、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、いくつかの場合に、タンパク質が不溶性になり得、変性剤および還元剤を、可溶化および再ホールディングを容易にするために用いることができる。誘導および増殖の温度はまた、発現レベルおよび溶解性に影響し得、一般に、２５℃と３７℃の間の温度が用いられる。一般に、バクテリアは、糖化されていないタンパク質を産する。故に、タンパク質が、機能のために糖化される必要があるとき、糖類は、宿主細胞から精製された後、インビトロで付加され得る。
【０２３６】
ｂ．酵母
出芽酵母、分裂酵母、アルカン資化酵母（Yarrowia lipolytica）、キラー酵母（Kluyveromyces lactis）およびメタノール資化性酵母（Pichia pastoris）などの酵母は、ＣＳＲイソ型の生産のための有用な発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターでか、または相同的組み換えによる安定な染色体挿入により形質転換され得る。一般に、誘導プロモーターは、調節遺伝子発現に用いられる。かかるプロモーターの例には、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７およびＧＡＬ５ならびにＣＵＰ１などのメタロチオネインプロモーターが含まれる。発現ベクターにはしばしば、形質転換されたＤＮＡの選択および維持のためのＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３およびＵＲＡなどの選択可能マーカーが含まれる。酵母にて発現されるタンパク質は、しばしば可溶性である。Ｂｉｐなどのシャペロニンとタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの共発現は、発現レベルおよび溶解性を改善し得る。さらに、酵母におけるタンパク質発現は、出芽酵母由来の酵母交配型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物と、Ａｇａ２ｐ接合接着受容体またはアルシュラ・アデニニボラン（Arxula adeninivorans）グルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を用いて分泌を誘導することができる。Ｋｅｘ−２プロテアーゼなどのプロテアーゼ切断部位は、分泌経路をはずれるとき、発現されたポリペプチドから融合配列を除去するために構築され得る。酵母はまた、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフで糖化され得る。
【０２３７】
ｃ．昆虫細胞
特にバキュロウイルス発現に用いられる昆虫細胞は、ＣＳＲイソ型などのポリペプチドの発現に有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物に用いられるほとんどの翻訳後修飾が可能である。バキュロウイルスは、安全性を高め、かつ真核生物発現の調節上の懸念を減少する、制限された宿主範囲を有する。典型的な発現ベクターは、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターなどの高レベル発現のためのプロモーターを用いる。通常用いられるバキュロウイルス系には、バキュロウイルス（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）、カイコ核多角病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）およびスポドプテラ・フルギペルタ（Spodoptera frugiperda）由来のＳｆ９などの昆虫細胞系、シューダレティア・ユニプンクタ（Pseudaletia unipuncta）（Ａ７Ｓ）およびダナウス・プレクシップス（Danaus plexippus）（ＤｐＮ１）などのバキュロウイルスが含まれる。高レベルの発現に関して、発現される分子のヌクレオチド配列は、ウイルスのポリヘドリン（polyhedrin）開始コドンのすぐ下流に融合される。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞にて正確に処理され、培養培地への発現タンパク質の分泌に用いられ得る。さらに、シューダレティア・ユニプンクタ（Ａ７Ｓ）およびナウス・プレクシップス（ＤｐＮ１）細胞系は、哺乳動物細胞系と同じ糖化パターンを有するタンパク質を産する。
【０２３８】
昆虫細胞における選択的発現系とは、安定に形質転換された細胞の使用である。シュナイダー２（Ｓ２）およびＫｃ細胞（キイロショウジョウバエ）およびＣ７細胞（ヒトスジシマカ）などの細胞系を、発現のために用いることができる。ショウジョウバエのメタロチオネインプロモーターを、カドミウムまたは銅で誘導される重金属の存在下での高レベルの発現を誘導するために用いることができる。発現ベクターは、一般に、ネオマイシンおよびハイグロマイシンなどの選択可能マーカーの使用により維持される。
【０２３９】
ｄ．哺乳動物細胞
哺乳動物発現系を、ＣＳＲイソ型を発現するために用いることができる。発現構築物は、アデノウイルスなどのウイルス感染によるか、またはリポゾーム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランなどの直接的なＤＮＡ運搬により、ならびにエレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションなどの物理的手段により哺乳動物細胞に移される。哺乳動物細胞の発現ベクターには通常、ｍＲＮＡキャップ部位、ＴＡＴＡボックス、翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）およびポリアデニル化成分が含まれる。かかるベクターにはしばしば、高レベルな発現のための転写プロモーター−エンハンサー、例えばＳＶ４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長い末端反復配列が含まれる。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞型で活性である。組織および細胞型プロモーターおよびエンハンサー領域を、発現のために用いることもできる。プロモーター／エンハンサー領域の例には、エラスターゼＩ、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトタンパク質、α１アンチトリプシン、βグロブリン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖２、およびゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子コントロールなどの遺伝子由来のものが含まれるが、これらに限定されない。選択マーカーを、発現構築物を有する細胞を選択し維持するために用いることができる。選択マーカー遺伝子の例には、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素およびチミジンキナーゼが含まれるが、それらに限定されない。ＴＣＲ−ζおよびＦｃεＲＩ−γなどの細胞表面シグナリング分子との融合は、細胞表面で活性状態のタンパク質の発現を導き得る。
【０２４０】
多くの細胞系を、マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリおよびハムスター細胞を含む哺乳動物発現のために利用することができる。細胞系の例には、ＣＨＯ、Ｂａｌｂ／３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＭＴ２、マウスＮＳ０（非分泌）および他の骨髄腫細胞系、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞系、リンパ球、繊維芽細胞、Ｓｐ２／０、ＣＯＳ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、２９３Ｓ、２Ｂ８、およびＨＫＢ細胞が含まれるが、それらに限定されない。細胞系はまた、血清なしの培地に適応させたものが利用可能であり、それは、細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする。かかる例の１つは、血清なしのＥＢＮＡ−１細胞系（Phamら、(2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332−42）である。
【０２４１】
ｅ．植物
トランスジェニック植物細胞および植物を、ＣＳＲイソ型を発現するために用いることができる。発現構築物は一般に、アグロバクテリウムを介する形質転換と一緒に、マイクロプロジェクタイル法（microprojectile bombardment）およびプロトプラスト中へのＰＥＧを介する輸送法などの直接的ＤＮＡ輸送を用いて植物に運ばれる。発現ベクターには、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結成分および翻訳制御要素が含まれ得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、シロイヌナズナおよびタバコなどの双子葉植物宿主、ならびにコーンおよびコメなどの単子葉植物宿主間で分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、酸化窒素シンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターおよびユビキチンおよびＵＢＱ３プロモーターが含まれる。ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択マーカーは、しばしば、形質転換された細胞の選択および維持を容易にするために用いられる。形質転換された植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）または植物全体の再生物として培養中に維持され得る。トランスジェニック植物細胞にはまた、ＣＳＲイソ型（例えば、Mayfieldら、(2003) PNAS 100:438−442を参照のこと）を製造するため構築された藻類が含まれ得る。植物は、哺乳動物細胞とは異なる糖化パターンを有するため、このことは、これらの宿主で製造されたＣＳＲイソ型の選択に影響を及ぼし得る。
【０２４２】
Ｇ．生物学的活性分析
一般に、ＣＳＲイソ型は、受容体の野生型または優性型と比較して、１個またはそれ以上の生物学的活性に変化を有する。インビトロおよびインビボ分析を、ＣＳＲイソ型の生物学的活性を観察するために用いることができる。インビトロおよびインビボ分析の例を、ＲＴＫイソ型の生物学的活性とＲＴＫの野生型または優性型の生物学的活性を比較するために、本明細書に提供する。多くの分析を、他のＣＳＲおよびＣＳＲイソ型に用いる。さらに、ＣＳＲの生物学的活性のための多くの分析が、当業者に公知である。ＲＴＫイソ型およびＲＴＫの分析には、キナーゼ分析、ホモ二量体およびヘテロ二量体分析、タンパク質：タンパク質相互作用分析、構造分析、細胞シグナリング分析およびインビボ表現型分析が含まれるが、これらに限定されない。分析にはまた、生物学的活性が観察および／または測定され得る疾患モデルを含む動物モデルの使用が含まれる。かかる分析におけるＲＴＫイソ型の用量応答曲線を、生物学的活性のモジュレーションを評価するため、ならびに投与のためのＲＴＫイソ型の治療的有効量を決定するために用いることができる。分析の例を、以下に記載する。
【０２４３】
１．キナーゼ分析
キナーゼ活性を、直接および間接的に検出および／または測定することができる。例えば、リン酸化チロシンに対する抗体を、ＲＴＫ、ＲＴＫイソ型、ＲＴＫ：ＲＴＫイソ型複合体のリン酸化、および他のタンパク質とシグナリング分子のリン酸化を検出するために用いることができる。例えば、ＲＴＫのチロシンキナーゼ活性の活性化を、ＲＴＫに対するリガンドの存在下に測定することができる。リン酸転移を、抗リン酸化チロシン抗体により検出することができる。リン酸転移を、ＲＴＫイソ型の存在下または不存在下で測定および／または検出することができ、それにより、ＲＴＫのリン酸転移をモジュレートするＲＴＫイソ型の能力を測定することができる。簡単に言うと、ＲＴＫイソ型を発現する細胞またはＲＴＫイソ型に暴露された細胞を、リガンドで処理する。細胞を溶解し、タンパク質抽出物（全細胞抽出物または分割された抽出物）を、ポリアクリルアミドゲル上に充填し、電気泳動で分け、ウエスタンブロッティングに用いられるような膜に転写する。抗ＲＴＫ抗体を用いた免疫沈降を、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを行う前に、ＲＴＫタンパク質を分画し分離するためにも用いることができる。前記膜を、全量のＲＴＫタンパク質を検出するための抗ＲＴＫ抗体でプローブするのと同様に、リン酸化を検出するための抗リン酸化チロシン抗体でプローブすることができる。ＲＴＫイソ型を発現していない細胞およびリガンドに暴露されていない細胞などの対照細胞を、比較のために同じ方法で調べることができる。
【０２４４】
チロシンリン酸化を、質量分析などにより直接的に測定することもできる。例えば、リン酸化状態のＲＴＫに対するＲＴＫイソ型の影響を、様々な濃度のＲＴＫイソ型で無傷の細胞を処理し、そしてＲＴＫの活性化の影響を測定することなどにより測定することができる。ＲＴＫを、免疫沈降により単離し、質量分析により分析用のペプチド断片を作製するためにトリプシン処理することができる。ペプチド質量分析は、タンパク質のチロシンリン酸化量を定量的に測定するためのよく確立された方法である；チロシンのリン酸化は、リン酸化チロシンを含むペプチドイオンの質量を増加し、そしてこのペプチドは、質量分析により非リン酸化ペプチドから容易に分けられる。
【０２４５】
例えば、チロシン−１１３９およびチロシン−１２４８は、ＥｒｂＢ−２ＲＴＫにて自己リン酸化されることが知られている。トリプシン処理したペプチドを、実験的に決定することができるか、または例えばＥｘＰＡＳｙ−ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓプログラムを用いることによりポリペプチド配列に基づき予測することができる。チロシン−１１３９およびチロシン−１２４８のリン酸化量を、これらのチロシンを含むペプチドの質量分析データから決定することができる。かかる分析を、ＲＴＫイソ型の自己リン酸化の量、およびＲＴＫのトランスリン酸化に対するＲＴＫイソ型の能力を評価するために用いることができる。
【０２４６】
２．複合体
ＲＴＫとＲＴＫイソ型の二量体化などの複合体を、検出および／または測定することができる。例えば、単離されたポリペプチドを、一緒に混合し、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングすることができる。ＲＴＫおよび／またはＲＴＫイソ型にはまた、全細胞または分画抽出物などの、細胞および細胞抽出物を加えることができ、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを行うことができる。抗体認識ポリペプチドを、単量体、二量体および他の複合体型の存在を検出するために用いることができる。別法として、標識したＲＴＫおよび／または標識したＲＴＫイソ型を、前記分析にて検出することができる。かかる分析を、ＲＴＫイソ型の存在下および不存在下におけるＲＴＫのホモ二量体化または２個もしくはそれ以上のＲＴＫのヘテロ二量体化と比較するために用いることができる。分析を、ＲＴＫイソ型のホモ二量体化および／またはＲＴＫとヘテロ二量体化するためのその能力を評価するためにも行うことができる。例えば、ＥｒｂＢ−２ＲＴＫイソ型を、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４とヘテロ二量体化するためのその能力について評価することができる。さらに、ＥｒｂＢ−２ＲＴＫイソ型を、それ自身とホモ二量体化するためのＥｒｂＢ−２の能力をモジュレートするためのその能力について評価することができる。
【０２４７】
３．リガンド結合
一般に、ＲＴＫは、１個またはそれ以上のリガンドと結合する。リガンド結合は、受容体の活性をモジュレートし、故に、例えば、シグナル伝達経路内のシグナリングをモジュレートする。ＲＴＫイソ型の存在下におけるＲＴＫイソ型のリガンド結合およびＲＴＫのリガンド結合を測定することができる。例えば、放射標識したリガンドなどの標識したリガンドを、ＲＴＫイソ型の存在下および不存在下（対照）にて精製されたかまたは部分的に精製されたＲＴＫに付加することができる。免疫沈降および放射活性の測定を、ＲＴＫイソ型の存在下および不存在下にてＲＴＫに結合したリガンドの量を定量するために用いることができる。ＲＴＫイソ型を、標識したリガンドと一緒にＲＴＫイソ型をインキュベートし、ＲＴＫイソ型に結合する標識したリガンドの量を、例えば、対応するＲＴＫの野生型または優性型に結合する量と比較して測定することなどにより、リガンド結合について判定することもできる。
【０２４８】
４．細胞増殖分析
多くのＲＴＫ、例えばＶＥＧＦＲが、細胞増殖に関与する。細胞増殖におけるＲＴＫイソ型の効果を測定することができる。例えば、リガンドを、ＲＴＫを発現する細胞に添加することができる。ＲＴＫイソ型を、リガンド添加の前、添加と同時または添加後にかかる細胞に加えることができ、細胞増殖における効果を測定することができる。別法にて、ＲＴＫイソ型を、かかる細胞モデルにて、例えばアデノウイルスベクターを用いて発現させることができる。例えば、ＶＥＧＦＲイソ型を、ＶＥＧＦＲを発現する内皮細胞に添加する。イソ型の添加後、ＶＥＧＦリガンドを添加し、細胞を、標準的増殖温度（例えば、３７℃）で数日間インキュベートする。細胞をトリプシン処理し、トリパンブルーで染色し、生存細胞を数える。ＶＥＧＦＲイソ型および／またはリガンドに暴露しない細胞を、比較のために対照として用いる。
【０２４９】
５．細胞疾患モデル分析
疾患あるいは状態からの細胞、または疾患または状態に似た症状にするためにモジュレートし得る細胞を、ＣＳＲイソ型の効果を測定および／または検出するために用いることができる。ＲＴＫイソ型を、添加するかまたは細胞中で発現させ、表現型を、ＲＴＫイソ型に暴露していない細胞またはＲＴＫイソ型を発現していない細胞と比較して測定または検出する。かかる分析を、細胞増殖、転移、炎症、血管形成、病原菌感染および骨吸収における効果を含む効果を測定するために用いることができる。
【０２５０】
例えば、ＭＥＴイソ型の効果を、かかる分析を用いて測定することができる。ＨｅｐＧ２肝臓細胞などの肝臓細胞モデルを、スポロゾイトによる培養においてマラリア感染性を観察するために用いることができる。ＭＥＴイソ型などのＲＴＫイソ型を、細胞に添加し、および／または細胞において発現させることができる。その後、かかる細胞のマラリアスポロゾイト感染を、感染の結果として産されるスポロゾイトのＥＥＦ（赤血球外型）を染色および計測することなどにより測定する（Carrolo ら、(2003) Nat Med  9(11):1363−1369）。ＲＴＫイソ型の影響を、ＲＴＫイソ型に暴露していない細胞またはＲＴＫイソ型を発現していない細胞および／または感染していない細胞と比較することにより、判定することができる。
【０２５１】
ＲＴＫイソ型の影響を、血管形成にて測定することもできる。例えば、インビトロでのヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）などの内皮細胞による細管形成を、血管形成および血管形成の効果を測定するための分析として用いることができる。インビトロでの血管形成分析での様々な量のＲＴＫイソ型の添加は、血管形成のモジュレーターとしてのＲＴＫイソ型の有効性をスクリーニングするために適した方法である。
【０２５２】
骨吸収を、破骨細胞培養物を用いることなどにより、ＲＴＫイソ型の有効性を測定するために細胞培養にて測定することができる。破骨細胞は、生体内で骨を吸収する造血細胞を起源とする高度に分化した細胞であり、インビトロでの骨薄片からの骨の吸収が可能である。破骨細胞の細胞培養のための方法および破骨細胞培養における骨吸収を測定する定量技術は、当技術分野で報告されている。例えば、単核細胞をヒト末梢血から単離し、培養することができる。ＲＴＫイソ型の添加および／または発現を、酒石酸耐性酸ホスファターゼに対して陽性の多核細胞、ならびに骨薄片から遊離されるコラーゲン断片の再吸収領域を測定することなどにより破骨細胞形成への影響を判定することに用いることができる。用量応答曲線を、骨吸収のモジュレートに必要なＲＴＫイソ型の治療的有効量を決定するために用いることができる。
【０２５３】
６．動物モデル
動物モデルを、ＲＴＫイソ型の効果を判定するために用いることができる。例えば、癌細胞増殖、移動および侵襲性に影響するＲＴＫイソ型を測定することができる。１つのかかる分析にて、卵巣癌細胞などの癌細胞を、ＲＴＫイソ型を発現するアデノウイルスを用いて感染させる。インビトロで培養後、細胞をトリプシン処理し、適した緩衝液に懸濁し、マウスに（例えば、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスなどのモデルマウスの脇腹および肩に）注射する。腫瘍増殖を長期間にわたり観察する。ＲＴＫイソ型を発現していない対照細胞を、比較のためにマウスに注射することができる。同様の分析を、例えば、マウス肺癌（ＬＬＣ）細胞およびＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＳＣＩＤマウスなどの他の細胞型および動物モデルで行うことができる。眼疾患におけるＲＴＫイソ型の効果を、角膜マイクロポケット分析（corneal micropocket assay）などの分析法を用いて判定することができる。簡単に言うと、マウスは、分析の２−３日前に注射によりＲＴＫイソ型（または対照）を発現する細胞を受容する。その後、前記マウスを麻酔し、ＶＥＧＦなどのリガンドのペレットを、眼の角膜マイクロポケットに移植する。その後、新血管形成を、例えば、移植後５日目に測定する。その後、対照と比較したときの血管形成におけるＲＴＫイソ型の効果を判定する。例えば、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、およびインスリン依存性糖尿病（Gregersenら、(2004) Tissue Antigens 63(5):383−94）を含む自己免疫性疾患のモデルとして用いられ得る、ＤＲおよびＤＱ主要組織適合性遺伝子複合体ＩＩ分子を発現するアテローム性動脈硬化症マウス、アテローム性動脈硬化症についてのモデルであるアポリポタンパク質−Ｅ欠損マウス（ＡｐｏＥ−／−）、炎症性腸疾患およびクローン病（Scheininら、(2003) Clin. Exp. Immunol. 133(1):38−43）についてのモデルであるＩＬ−１０ノックアウトマウス、ならびに変異体アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現する遺伝子組換えマウスなどのアルツハイマー病モデルおよび家族性常染色体優性と関係するＰＳ１を発現するマウスなどのヒト化遺伝子組換えマウスモデルなどの、遺伝子組換えマウスを含む、当技術分野にて公知のどんな動物モデルも、ＲＴＫイソ型などのＣＳＲイソ型の効果を判定するために用いることができる。動物モデルには、多発性硬化症についてのモデルとして使用されるＥＡＥ誘導動物などの、疾患を誘導されたかまたは疾患を示すための処理をされた動物が含まれる。
【０２５４】
Ｈ．ＣＳＲイソ型およびＣＳＲイソ型組成物の製造、形成および投与
ＲＴＫイソ型およびＲＴＫイソ型組成物を含むＣＳＲイソ型およびＣＳＲイソ型組成物を、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、経鼻、経口、経直腸、局所的、吸入、口腔内（例えば、舌下腺）、および経皮投与または任意の経路を含む当業者に公知の任意の経路により投与するために剤形化することができる。ＣＳＲイソ型は、上皮層または粘膜層（例えば、口腔粘膜、直腸粘膜および腸粘膜など）を介する吸収により、任意の簡便な経路、例えば注入またはボーラス注射により投与され得、他の生物学的活性物質と一緒に、同時に、断続的にまたは同じ組成物中にて投与され得る。投与は、処置の場所に依存して局部的、局所的または全身的であり得る。処置の必要な部分への局所投与は、例えば、外科手術中の局所注入、例えば、外科手術後の創傷被覆材との併用における局所使用、注射、カテーテル手段、坐剤手段、または移植手段により達成され得るが、それらに限られない。投与にはまた、ポンプ手段によるなどの、制御放出剤形および制御放出装置を含む制御放出系が含まれ得る。任意の特定の場合における最も適した経路は、処置される疾患または状態の性質および重傷度、ならびに用いられる特定の組成物の性質に依存するだろう。
【０２５５】
様々な送達系が公知であり、それらに限られないが、リポゾームカプセル化、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現し得る組換え細胞、受容体に仲介されるエンドサイトーシス、およびレトロウイルス送達系などのＣＳＲイソ型をコードする核酸分子の送達などが、ＣＳＲイソ型の投与のために用いられ得る。
【０２５６】
ＣＳＲイソ型を含む医薬組成物を、作製することができる。一般に、薬学的に許容される組成物を、監督官庁の承認を考慮して作製するかまたは動物およびヒトに用いるための一般に認識された薬局方にしたがって作製する。医薬組成物には、投与されるイソ型と一緒に、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルなどの担体が含まれ得る。かかる医薬的担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、およびごま油などの、石油、動物、野菜または合成起源のものを含む水および油などの無菌の液体であって良い。水は、医薬組成物が静脈内に投与されるときの典型的な担体である。食塩水およびブドウ糖溶液およびグリセロール溶液も、液体担体として、具体的には注射用溶液として用いることができる。組成物には、活性成分と一緒に、以下のものが含まれ得る：ラクトース、スクロース、第二リン酸カルシウム、またはカルボキシメチルセルロースなどの希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルクなどの潤滑剤；およびデンプン、アラビアゴムなどの天然ゴム、ゼラチン、グルコース、モラス、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンなどの結合剤、および当業者に公知の他のかかる結合剤。好ましい医薬的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、コムギ、粉乳(chalk)、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールが含まれる。所望であれば、組成物はまた、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸塩ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミン、および他のかかる物質を含んでいてよい。これらの組成物は、溶液、懸濁物、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル、粉末の形態、および持続放出剤形をとり得る。組成物を、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体と一緒に、坐剤として剤形化することができる。経口剤形には、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムの医薬品等級などの標準的な担体、および他のかかる物質が含まれ得る。適した医薬的担体の例は、E. W. Martinによる「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。かかる組成物には、患者に適切に投与するための形態を提供するために、適する量の担体と一緒に、一般に精製された形態で、治療的有効量の化合物が含まれるであろう。
【０２５７】
剤形は、錠剤、カプセル、ピル、粉末、顆粒、滅菌非経腸溶液または懸濁液、および経口溶液または懸濁液、および適した量の化合物またはその薬学的に許容される誘導体を含む油：水エマルジョンなどの、単位投与量剤形でヒトおよび動物に投与するために提供される。薬学的治療的活性化合物およびその誘導体は、一般に、単位投与形態または複数投与形に剤形化され、投与される。本明細書にて用いられる単位投与量形とは、ヒトおよび動物対象に適する物理的に不連続であって、当技術分野で公知のとおり個々にパッケージされた単位を示す。それぞれの単位投与量には、必要な薬学的担体、ビヒクルまたは希釈剤と合して、望ましい治療効果をもたらすのに十分な治療的に活性な化合物の所定の量が含まれる。単位投与量剤形の例には、アンプルおよびシリンジ、ならびに個々にパッケージされた錠剤またはカプセルが含まれる。単位投与量剤形は、分割してまたは複数で投与され得る。複合投与剤形は、分けられた単位投与量剤形で投与されるために単一の容器内にパッケージされた複数個の同じ単位投与量剤形である。複合投与剤形の例には、バイアル、錠剤あるいはカプセルの瓶、またはパイント瓶あるいはガロン瓶が含まれる。故に、複合投与剤形とは、パッケージで分けられていない複数の単位投与量である。
【０２５８】
毒性のない担体から構成される、平衡状態で０．００５％から１００％の範囲で活性成分を含む投与量剤形または組成物を、作製することができる。経口投与に関して、医薬組成物は、結合剤（例えば、アルファトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；分解剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤と一緒に、従来的な方法で製造される形態、例えば、錠剤またはカプセルであり得る。前記錠剤は、当技術分野で周知の方法によりコーティングされ得る。
【０２５９】
医薬調製物はまた、液体形態、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液などであり得るか、または使用前に、水または他の適したビヒクルで再構成するための薬剤製品として存在し得る。かかる液体調製物は、薬学的に許容される添加剤、例えば懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、または分画植物油）；および、保存料（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−安息香酸ヒドロキシまたはソルビン酸）など、と一緒に従来的な方法で製造され得る。
【０２６０】
経直腸投与に適する剤形を、単位投与量坐剤として提供することができる。これらは、活性成分を１個またはそれ以上の常用の固体担体、例えば、カカオバターと混合し、その後得られた混合物を成形することにより製造され得る。
【０２６１】
皮膚または目への局所使用に適する剤形には、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルおよびオイルが含まれる。担体の例には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびその２個またはそれ以上の組合せが含まれる。局所的剤形にはまたは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ（アルキレングリコール）、ポリヒドロキシアルキル、（メタ）アクリレートまたはポリ（メタ）アクリルアミドから選択される増粘剤を重量にして０．０５から１５、２０、２５％含み得る。局所的剤形はしばしば、結膜嚢へ点眼によるかまたは軟膏として用いられる。それは、眼、顔面洞（facial sinus）、および外耳道の洗浄または潤滑のためも用いられ得る。それは、前部眼房および他の場所へ注入されてもよい。液体状態の局所剤形は、そこから活性成分が放出される、ストリップ形状またはコンタクトレンズ形状の親水性三次元ポリマーマトリックスに存在していても良い。
【０２６２】
吸入による投与について、本明細書における使用のための化合物は、適した推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスなどの使用と一緒に、加圧パックまたはネブライザーから発されるエアロゾルスプレーの形状で送達され得る。加圧エアロゾルの場合にて、前記投与量単位は、一定量を送達するためのバルブを通じて決定され得る。吸入または吸入器に用いるための、例えば、ゼラチンのカプセルおよび薬包は、化合物と、例えばラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基剤の粉末混合物を含んで剤形化され得る。
【０２６３】
口腔（舌下腺）投与に適する剤形には、例えば、フレーバー基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの中に活性成分を含むトローチ剤；および、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に前記成分を含むトローチが含まれる。
【０２６４】
ＣＳＲイソ型の医薬組成物は、例えば、ボーラス注入または持続注入などの、注射による非経腸的投与のために剤形化され得る。注射のための剤形は、単位投与量剤形、例えば、アンプルまたは複合投与量容器中に、付加された防腐剤と一緒に存在し得る。前記組成物は、油性または水性ビヒクル中における懸濁物、溶液またはエマルジョンであり得、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの剤形化剤を含み得る。別法にて、活性成分は、使用前には、適したビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水または他の溶媒で再構築するための粉末形状であり得る。
【０２６５】
経皮投与に適する剤形は、長期間、受容者の表皮と密に接触したままにされる個別のパッチとして与えられて良い。かかるパッチは好適には、活性化合物を、例えば、活性化合物に対して０．１Ｍ濃度から０．２Ｍ濃度の任意に緩衝化した水溶液として含む。経皮投与に適する剤形はまた、イオン導入（例えば、Pharmaceutical Research 3(6)、318 (1986)を参照のこと）により送達され得、そして活性化合物の任意に緩衝化した水溶液の形態で局所的に摂取され得る。
【０２６６】
医薬組成物はまた、制御放出手段および／または送達装置により投与され得る（例えば、米国特許番号第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第３，６３０，２００号；第３，８４５，７７０号；第３，８４７，７７０号；第３，９１６，８９９号；第４，００８，７１９号；第４，６８７，６１０号；第４，７６９，０２７号；第５，０５９，５９５号；第５，０７３，５４３号；第５，１２０，５４８号；第５，３５４，５６６号；第５，５９１，７６７号；第５，６３９，４７６号；第５，６７４，５３３号および第５，７３３，５６６号を参照のこと）。
【０２６７】
任意の態様にて、リポゾームおよび／またはナノ粒子はまた、ＣＳＲイソ型投与と共に用いられ得る。リポゾームは、水性溶媒中に分散されたリン脂質から形成され、自然に多重膜コンセントリック二層ビヒクル（多重膜ビヒクル（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは一般に、２５ｎｍから４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波分解により、コアに水溶液を含む、２００から５００Åの範囲の直径を有する小さな単層状のビヒクル（ＳＵＶ）形状を生じる。
【０２６８】
リン脂質は、脂質対水のモル比に依存して、水中に分散されたときリポゾーム以外の多様な構造を形成し得る。低い比にて、リポゾームが形成される。リポゾームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。リポゾームは、イオン性および極性物質に対して低い透過性を示すが、高温では、その透過性を顕著に変える相転移を受ける。相転移は、ゲル状態として公知の、ぎっしり詰まった秩序だった構造から、液体状態として公知の、ゆるく詰まったより秩序だってない構造への変化に関する。これは、特有の相転移温度で起こり、その結果、イオン、糖および薬剤に対する透過性の増大を生じる。
【０２６９】
リポゾームは、異なるメカニズム：マクロファージおよび好中球などの網膜内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水力または静電気力のどちらかによる細胞表面への吸着、または細胞表面成分との特異的相互作用；細胞膜へのリポゾームの脂質二重層の挿入による細胞質細胞膜との融合と同時の細胞質へのリポゾーム成分の放出；および、リポゾーム内容物のすべての結合なしの、細胞膜または細胞内膜へのリボソーム脂質の移動、またはその逆、により細胞と相互作用する。様々なリポゾーム剤形は、２個以上が同時に作用し得るが、メカニズムが有効であるように変えられ得る。ナノカプセルは一般に、安定かつ再生可能な方法で化合物を取り込むことができる。細胞内の過剰量のポリマーによる副作用を避けるため、かかる超微粒子（直径約０．１マイクロメーターのサイズ）を、インビボで分解され得るポリマーを用いて設計することができる。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子を、本明細書にて用いるために検討し、そしてかかる粒子は容易に作製され得る。
【０２７０】
投与方法を、抗原性応答および免疫原性応答によるタンパク質分解および免疫学的干渉などの、分解過程へのＣＳＲイソ型の暴露を減少させるために用いることができる。かかる方法の例には、処置の場所での局所的投与が含まれる。ＣＳＲイソ型はまた、血清の安定性および半減期のモジュレート、ならびに免疫原性の減少のため修飾され得る。かかる修飾は、当技術分野で公知の任意の手段により行われ得、ＣＳＲイソ型への、ＰＥＧ付加、および血清アルブミン、ＩｇＧならびに糖鎖の付加などの分子の付加が含まれ得る（Rajuら、(2001) Biochemistry 40(3):8868−76; van Der Auweraら、(2001) Am J Hematol. 66(4):245−51）。
【０２７１】
治療薬剤のＰＥＧ付加が、タンパク質分解に対する抵抗性（血漿中の半減期を増大し、抗原性および免疫原性を減少する）を増大させることが報告されている。ＰＥＧ付加法の例は、当技術分野で公知である（例えば、Lu and Felix、Int. J. Peptide Protein Res.，43: 127−138，1994; LuおよびFelix，Peptide Res.，6: 142−6、1993; Felixら、Int. J. Peptide Res.，46 : 253−64，1995; Benharら、J. Biol. Chem.，269: 13398−404、1994; Brumeanuら、J Immunol.，154: 3088−95、1995を参照のこと;また、Calicetら、(2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261−77 and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S−8Sも参照のこと）。ＰＥＧ付加はまた、インビボにおける核酸分子の送達にて用いられ得る。例えば、アデノウイルスのＰＥＧ付加は、安定性および遺伝子導入を増大し得る（例えば、Chengら、(2003) Pharm. Res. 20(9): 1444−51を参照のこと）。
【０２７２】
望ましい血中濃度を、血漿濃度により確認されるような、活性物質の連続注入により維持することができる。担当医は、どのように、かついつ治療を終えるか、中断するか、または毒性、もしくは骨髄、肝臓あるいは腎臓機能不全のためにより少ない投与量に調整するかを知っているであろうことは当然である。逆に、担当医はまた、臨床的応答が適量（毒性の副作用を避けながら）でないならば、どのようにかついつ、例えば、経口的、経肺的、非経腸的（筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内（ＩＶ）注射または皮下注射）、吸入（微粉末剤形による）、経皮的、経鼻的、膣内、経直腸による投与、または舌下投与で、より高濃度に処置量を調整するかも知っており、そしてそれぞれの投与経路に適する剤形に剤形化され得る（例えば、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９３／２５２２１およびＷＯ９４／１７７８４；およびヨーロッパ出願番号第６１３，６８３号を参照のこと）。
【０２７３】
ＣＳＲイソ型は、処置した患者で望まない副作用がなく治療的に有益な効果を与えるために十分な量の薬学的に許容される担体に含まれる。治療的有効濃度は、既知のインビトロおよびインビボ系にて化合物を試験すること、例えば本明細書に供する分析により実験的に決定され得る。
【０２７４】
組成物中のＣＳＲイソ型の濃度は、複合体の吸収率、不活性化率および排出率、複合体の物理化学的特性、投与計画、および投与される量、ならびに当業者に公知の他の因子に依存するであろう。
【０２７５】
疾患または状態、例えば癌、自己免疫性疾患、および感染の処置ために投与されるＣＳＲイソ型の量は、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、インビトロ分析および動物モデルを、最適な投与量範囲を特定するのを支持するために用いることができる。経験的に決定され得る正確な投与量は、投与経路および疾患の重症度に依存し得る。投与の適した投与量範囲は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｐｇから１ｍｇの範囲であり、一般に、患者の体重１ｋｇ当たりＣＳＲイソ型が０．０５ｍｇから２００ｍｇである。
【０２７６】
ＣＳＲイソ型は、一度に投与することができるか、または間隔を空けて投与するためにより少量で多数回に分けて投与することができる。ＣＳＲイソ型を、処置時間の経過に伴って、例えば数時間、数日、数週、または数月かけて１個またはそれ以上の投与量で投与することができる。いくつかの場合には、連続投与が有用である。処置の正確な投与量および持続時間が、処置される疾患の機能であり、既知の試験プロトコルを用いて経験的にか、またはインビボもしくはインビトロ試験データからの推定により決定され得ることが、理解される。濃度および投与量値も、軽減される状態の重症度によって変化し得ることにも注意すべきである。どんな特定の対象に関しても、特定の投与計画が、個人の必要性、および組成物の投与を管理または観察する人の専門的判断により時間をかけて合わせられるべきであることがさらに理解されており、そして本明細書に記載の濃度範囲は、例示のみを目的としており、組成物およびそれを含む組合せの範囲または使用を制限することは意図されない。
【０２７７】
Ｉ．ＣＳＲイソ型のインビボ発現
ＣＳＲイソ型は、ＣＳＲイソ型をコードする核酸分子として投与されて良く、エクスビボ技術および直接的なインビボ発現が含まれる。ＣＳＲイソ型の投与方法には、ウイルスベクター投与、エクスビボおよびインビボの核酸投与、および染色体内部への核酸の導入が含まれる。エクスビボ処置に関して、患者の細胞を取り出し、前記核酸をこれらの単離された細胞に導入し、改変された細胞を、直接的かまたは、例えば、患者に移植される多孔質膜に封入することにより、患者に対して投与する（例えば、米国特許番号第４，８９２，５３８号および第５，２８３，１８７号を参照のこと）。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を導入するために適する技術には、リポゾームおよび陽イオン性脂質（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌ）を用いるエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、およびリン酸カルシウム沈殿方法が含まれる。ＤＮＡ送達の方法は、インビボでＣＳＲイソ型の発現に用いられ得る。かかる方法には、エレクトロポレーション、超音波およびカルシウムリン酸送達などを用いた局所的および全身的送達を含む、核酸のリポゾーム送達およびネイキッドＤＮＡ送達が含まれる。他の技術には、マイクロインジェクション、細胞融合、染色体を介する遺伝子転移、マクロ細胞を介する遺伝子転移およびスフェロプラスト融合が含まれる。
【０２７８】
治療の目的のために核酸を導入され得る細胞には、処置される疾患または状態に対して望ましい利用可能な細胞型が包含され、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン生成細胞、繊維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞；様々な幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または造血前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓、および他のその源から入手された幹細胞などが含まれるが、それらに限定されない。腫瘍細胞はまた、インビボでＣＳＲイソ型を発現するための標的細胞であり得る。インビボでのイソ型の発現に用いられる細胞にはまた、患者自身の細胞が含まれる。かかる細胞を患者から取り出し、ＣＳＲイソ型の発現のための核酸を導入し、その後、注射または移植などにより患者に投与することができる。
【０２７９】
ＣＳＲイソ型を、ウイルスにより発現させ、処置の必要な対象に投与することができる。遺伝子治療に適するウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスが含まれる。アデノウイルス発現技術は、当技術分野で公知であり、アデノウイルス生産方法および投与方法もまた、周知である。アデノウイルス血清型は、例えば、American Type Culture Collection（ATCC、Rockville、MD）により市販されている。アデノウイルスは、エクスビボで用いられ得、例えば、細胞を処置の必要な患者から単離し、そしてＣＳＲイソ型を発現するアデノウイルスベクターで遺伝子導入する。適した培養期間後、形質導入された細胞を、局所的および／または全身的に対象に投与する。別法にて、ＣＳＲイソ型を発現するアデノウイルス粒子を、単離し、対象の疾患または状態を予防、処置または改善するための治療的有効量を送達するために、薬学的に許容される担体に剤形化する。一般的には、アデノウイルス粒子は、対象の体重１ｋｇ当たり１個の粒子から１０１４個の粒子、通常対象の体重１ｋｇ当たり１０６または１０８個の粒子から１０１２個の粒子の範囲の投与量で送達される。いくつかの状況にて、例えば、細胞表面膜タンパク質あるいは標的細胞、または標的細胞上の受容体のリガンドに対して特異的な抗体などの、核酸供給源と細胞を標的とする物質を提供するのが望ましい。リポゾームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関係のある細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質を、例えば特定の細胞型に影響を及ぼすカプシドタンパク質またはその断片、細胞周期の内在化を来すタンパク質に対する抗体、および細胞内局在を標的とし、細胞内半減期を増すタンパク質などの、標的化および／または取り込みの促進に用いることができる。
【０２８０】
ＣＳＲイソ型はまた、エクスビボでの非ウイルス性ベクターを用いた遺伝子発現治療に用いられ得る。例えば、細胞を、調節配列に操作可能に連結するかまたはゲノム部位における調節配列に操作可能に連結して位置するかのどちらかで、ＣＳＲイソ型配列をゲノム部位に挿入することなどによりＣＳＲイソ型を発現するように操作することができる。その後、かかる細胞を、処置の必要な患者などの対象に、局所的または全身的に投与することができる。
【０２８１】
ＣＳＲイソ型のインビボ発現を、付加的分子の発現と関連させることができる。例えば、ＣＳＲイソ型の発現を、人工のウイルス中かまたは細胞毒性ウイルスで発現されるなどの細胞毒性産物の発現と関連させることができる。かかるウイルスを、治療効果の標的である特定の細胞型に標的化することができる。発現されたＣＳＲイソ型を、ウイルスの細胞毒性を増強するために用いることができる。
【０２８２】
ＣＳＲイソ型のインビボ発現は、核酸分子をコードするＣＳＲイソ型と細胞特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターなどの特異的調節配列との操作可能な連結を含み得る。ＣＳＲイソ型はまた、標的細胞型および／または組織に特異的に感染および／または複製されるベクターから発現され得る。誘導プロモーターを、ＣＳＲイソ型発現を選択的に調節するために用いることができる。
【０２８３】
Ｊ．ＣＳＲイソ型を用いた処置例および実験例
疾患および状態をＣＳＲイソ型で処置する方法を、本明細書にて提供する。ＲＴＫイソ型などのＣＳＲイソ型を、本明細書に記載のものを含む様々な疾患および状態の処置に用いることができる。処置は、標的化された送達かまたはリポゾームなどの送達ビヒクル中への封入のため、ポリペプチドとしての組成物で提供され得、かつ標的物質と結合され得るポリペプチドの適した経路剤形による投与により有効であり得る。別法にて、ポリペプチドをコードする核酸を、ネイキッド核酸としてかまたはベクター、具体的には遺伝子治療用ベクターにて投与することができる。かかる遺伝子治療は、対象から細胞を取り出し、ベクターまたは核酸を細胞に導入し、その後改変された細胞を再び導入することによりエクスビボで有効であり得る。遺伝子治療はまた、核酸またはベクターの直接的な投与によりインビボで有効であり得る。
【０２８４】
本明細書にて供するＣＳＲイソ型を用いた処置には、眼疾患、アテローム性動脈硬化症、癌および血管損傷を含む血管形成が関係する疾患および状態、アルツハイマー病を含む神経変性疾患、アテローム性動脈硬化症を含む炎症性疾患および状態、癌を含む細胞増殖と関係のある疾患および状態、ならびに平滑筋細胞関連状態、ならびに多様な自己免疫性疾患の処置が含まれるが、これらに限定されない。処置および前臨床試験の例を、ＲＴＫイソ型での処置および治療について記載する。かかる記述は、例示の目的のみで、かつ特定のＲＴＫイソ型に限定されないことを意味する。当業者は、処置される疾患タイプ、疾患の重症度および経過、分子が予防または治療目的で投与されたかどうか、薬歴、患者の病歴および治療への反応、ならびに投与する分子の適当な投与量についての担当医の判断、に基づいて評価することができる。
【０２８５】
１．血管新生関連眼状態
ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＴＩＥ／ＴＥＫ、ＦＧＦ、ＥＧＦＲ、およびＥｐｈＡを含むがこれらに限定されないＲＴＫイソ型を、血管新生を伴う眼疾患を含む血管形成関連眼疾患および状態の処置に用いることができる。眼の血管新生疾患は、網膜または角膜などの、眼の構造中への新しい血管の侵入により特徴付けられる。それは、失明の最も一般的な原因であり、約２０種の眼疾患に関与する。加齢性黄斑変性症にて、関連する視力の問題が、網膜色素上皮の下の繊維性血管性組織の増殖でブルッフ膜中の欠陥を通して脈絡膜毛細血管の不成長により引き起こされる。血管新生による損傷はまた、糖尿病性網膜症、未熟網膜症、角膜移植拒絶、血管新生緑内障および水晶体後線維増殖症に関連している。角膜の新血管形成に関連する他の疾患には、流行角結膜炎、ビタミンＡ欠損症、コンタクトレンズ過剰使用、アトピー性角膜炎、上方輪部角結膜炎、翼状片乾燥性角膜炎、シェーグレン症、酒さ、フェレクテヌロシス（phylectenulosis）、梅毒、マイコバクテリア感染症、脂質変性、化学熱傷、細菌性潰瘍、菌性潰瘍、単純ヘルペス感染、帯状疱疹感染、原虫感染、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン周辺角膜変性、角膜表皮剥離、関節リウマチ、全身性狼瘡、多発動脈炎、外傷、ヴェゲナー肉芽腫症、強膜炎、スティーブンスジョンソン病、類天疱瘡放射状角膜切除術、および角膜移植拒絶が含まれるが、それらに限定されない。網膜／脈絡膜血管新生に関連する疾患には、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、鎌状赤血球性貧血、類肉腫、梅毒、弾性線維性仮性黄色腫、パジェット病、静脈閉塞症、動脈閉塞症、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブドウ膜炎／硝子体炎、マイコバクテリア感染症、ライム病、全身性狼瘡エリテマトーデス、未熟児網膜症、イールズ病、ベーチェット病、網膜炎または脈絡膜炎を引き起こす感染症、推定眼ヒストプラスマ症、ベスト疾患、近視、視窩、シュタルガルト病、扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘ちょう度症候群、トキソプラズマ症、外傷およびレーザー処理後の合併症が含まれるが、それらに限定されない。他の疾患には、ルベオーシス（角度の血管新生）と関連する疾患および増殖性硝子体網膜症の全ての形態を含む繊維性血管組織または繊維組織の異常増殖により引き起こされる疾患が含まれるが、それらに限定されない。
【０２８６】
ＲＴＫイソ型治療は、本明細書に記載のように、動物モデルにて評価され得る眼疾患の処置など、例えば角膜移植における血管形成に有効である。例えば、ＲＴＫなどの血管形成のモジュレーションを、ヌードマウスにおける類表皮Ａ４３１腫瘍およびヌードマウスに移植されたＶＥＧＦまたはＰＩＧＦ導入ラットＣ６神経膠腫などのヌードマウスモデルにて判定することができる。ＣＳＲイソ型を、タンパク質として局所的または全身的に注射することができる。別法にて、ＣＳＲイソ型を発現する細胞を、局所的にかまたは腫瘍と離れた部位に接種することができる。腫瘍を、不十分な血管新生のかつ血色の悪い腫瘍、ネクローシス、増殖の減少および腫瘍細胞アポトーシスの増加を含む腫瘍抑制の表現型を観察するために対照処理およびＣＳＲイソ型処理モデル間で比較することができる。かかる処理の1つにて、Ｆｌｔ−１イソ型を、眼疾患の処置に用い、かかるモデルで評価する。
【０２８７】
ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型で処置され得る眼疾患の例は、糖尿病性網膜症（糖尿病の重大な合併症）、未熟児網膜症（慢性の視力障害をしばしば導き、失明の高い危険を伴うこの壊滅的な眼の状態は、早産児のケア中の重篤な合併症である）、血管新生緑内障、網膜芽細胞腫、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、ブドウ膜炎、黄斑変性症、および角膜移植血管新生を含むがこれらに限定されない、眼の血管新生により特徴付けられる眼疾患である。他の眼性炎症疾患、眼腫瘍、および脈絡膜または虹彩新生血管に関連する疾患もまた、ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型で処置され得る。
【０２８８】
ＰＤＧＦＲイソ型はまた、増殖性硝子体網膜症の処置に使用され得る。例えば、レトロウイルスベクターなどの発現ベクターを、ＰＤＧＦＲイソ型をコードする核酸分子を含むように構築する。ウサギ結膜繊維芽細胞（ＲＣＦ）を、レトロウイルスベクターなどのトランスフェクションによるか、またはプラスミドあるいは染色体に基づくベクターなどの形質転換により、発現ベクターを含むように製造する。ＰＤＧＦＲイソ型の発現を、ＰＤＧＦＲイソ型を認識する抗体の使用、およびペプチドタグ（例えばｍｙｃタグ）および対応する抗体の使用を含む、当技術分野で公知の方法により細胞中で観察することができる。ＲＣＦを、眼の硝子体部分に注入する。例えば、ウサギ動物モデルにて、約１×１０５個のＲＣＦを、ガスvitreomyにより注入する。ＰＤＧＦＲイソ型を発現するレトロウイルス、〜２×１０７ＣＦＵを、同じ日に注入する。増殖性硝子体網膜症での効果を、疾患兆候の減衰などを、例えば、外科手術後２−４週で観察することができる。
【０２８９】
ＥｐｈＡイソ型を、眼疾患などの、誤調節および／または不適切な血管形成を有する疾患または状態の処理に用いることができる。例えば、ＥｐｈＡイソ型を、エフェリンＡ−１誘導血管形成に影響を及ぼすためのマウス角膜モデルなどの動物モデルにて判定することができる。エフェリンＡ−１含有水性ペレットのみ、またはＥｐｈＡイソ型タンパク質を一緒に含む水性ペレットを、マウス角膜に移植する。目視観測を、ＥｐｈＡイソ型阻害または血管形成の減少を観察するために、移植後数日間行う。ＶＥＧＦＲイソ型について記載のような抗血管形成処置および方法を、ＥｐｈＡイソ型に適用することができる。
【０２９０】
２．血管形成関連アテローム性動脈硬化症
ＲＴＫイソ型、例えばＶＥＧＦＲ  Ｆｌｔ−１およびＴＩＥ／ＴＥＫイソ型を、アテローム性動脈硬化症プラークの血管形成などのアテローム性動脈硬化症に関連する血管形成状態の処置のために用いることができる。血管のルーメン中で形成されたプラークは、血管形成刺激活性を有することが示されている。ヒト冠状動脈アテローム性動脈硬化症におけるＶＥＧＦ発現は、ヒト冠状動脈の発達に関与する。
【０２９１】
動物モデルを、アテローム性動脈硬化症の処置におけるＲＴＫイソ型の評価に用いることができる。アポリポタンパク質−Ｅ欠損マウス（ＡｐｏＥ−／−）は、アテローム性動脈硬化症を起こす傾向がある。かかるマウスを、５週齢、１０週齢および２０週齢で始めて例えば５週間の時間的経過をかけて、Ｆｌｔ−１  ＩＦＰタンパク質などのＲＴＫイソ型、例えばＶＥＧＦＲイソ型を注射することにより処置する。大動脈起始部での損傷を、イソ型で処理したマウスにおけるアテローム性動脈硬化部の減少を観察するために、対照のＡｐｏＥ−／−マウスおよびイソ型で処理したＡｐｏＥ−／−マウス間で判定する。
【０２９２】
３．付加的血管形成関連処置
ＶＥＧＦＲイソ型、例えば、Ｆｌｔ１イソ型、およびＥｐｈＡイソ型などのＲＴＫイソ型もまた、関節リウマチ（ＲＡ）に現れる、滑膜細胞の増殖、炎症細胞の浸潤、軟骨破壊およびパンヌス形成などの血管形成および炎症関連状態の処置に用いることができる。マウスにて誘導される多関節性関節炎などの、ＩＩ型コラーゲン誘導関節炎の自己免疫モデルを、ヒトＲＡについてのモデルとして用いることができる。タンパク質の局所的注射によるなどの、ＲＴＫイソ型で処理されたマウスを、足の腫れ、紅斑および硬直を含む関節炎症状の減少について観察することができる。滑膜性血管形成および滑膜性炎症における減少もまた、観察され得る。血管形成は、ＲＡにおけるパンヌスの形成および維持にて役割を果たす。ＲＴＫイソ型を、単独で、ならびに血管形成をモジュレートする他のイソ型および他の処置との組合せで用いることができる。例えば、血管形成阻害剤を、ＲＡの処置のためにＲＴＫイソ型との組合せで用いることができる。血管形成阻害剤の例には、アンギオスタチン、抗血管形成アンチトロビンＩＩＩ、カンスタチン、軟骨由来阻害剤、フィブロネクチン断片、ＩＬ−１２、バスキュロスタチンおよび当技術分野で公知の他のもの（例えば、Paleolog (2002) Arthritis Research Therapy 4 (supp 3) S81−S90を参照のこと）が含まれるが、それらに限定されない。
【０２９３】
ＶＥＧＦＲイソ型で処置され得る他の血管形成関連状態には、血管腫が含まれる。最も多発性の小児の血管形成疾患の１つは、血管腫である。多くの場合、腫瘍は、良性であり、医療行為なしに退行する。より重症の場合、腫瘍は、大きな海綿状および浸潤性形に進行し、臨床的合併症を生じる。血管腫、血管腫性の全身的形成は、高い死亡率を有する。多くの場合の血管腫には、処置され得ないか、または現在使用中である治療薬剤で処置することが難しいものが存在する。
【０２９４】
ＶＥＧＦＲイソ型を、血管形成が、オースラー−ウェーバー−ランデュ病、または遺伝性出血性毛細血管拡張症などにおける損傷を担うとき、かかる疾患および状態の処置に用いることができる。これは、複数の小さな血管腫、血管またはリンパ管の腫瘍により特徴付けられる遺伝病である。血管腫は、皮膚および粘膜で見られ、しばしば鼻出血（鼻血）または消化管出血を伴い、時々肺または肝臓の動静脈瘻を伴う。望ましくない血管透過性により特徴付けられる疾患および障害も、ＶＥＧＦＲイソ型により処置され得る。これらには、脳腫瘍に関連する浮腫、悪性腫瘍、メグス症候群、肺炎症、ネフローゼ症候群、心外膜液および胸水に関連する腹水症が含まれる。
【０２９５】
血管形成はまた、再生および創傷治癒などの正常な生理学的過程に関与する。血管形成は、排卵および、受精後の胞胚の着床にもまた、重要な工程である。ＶＥＧＦＲイソ型による血管形成のモジュレーションは、排卵の防止または胞胚による着床を防止するため、無月経の誘導に用いられ得る。ＶＥＧＦＲイソ型はまた、外科的処置において用いることができる。例えば、創傷治癒で、過剰修復または繊維増殖は、外科的処置の有害な副作用であり得、血管形成により引き起こされるか、または悪化され得る。接着は、外科手術の多発する合併症であり、小腸障害などの問題を引き起こす。
【０２９６】
ＰＤＧＦＲイソ型を、動脈の外科手術などの、動脈損傷後の新生内膜形成の調節に用いることができる。例えば、ＰＤＧＦＲＢイソ型を、新生内膜形成などに関与するＰＤＧＦ−ＢＢ誘導細胞増殖を調節するために用いることができる。ＰＤＧＦＲイソ型を、例えば、バルーン障害ルースター大腿動脈モデルにて、判定することができる。ＰＤＧＦＲイソ型を発現するアデノウイルスベクターを構築し、動脈モデルにてインビボで導入する。新生内膜関連血栓症を、導入した動脈にて、対照と比較して減少を観察することにより判定する。
【０２９７】
血管形成関連疾患および状態の処置に有用なＲＴＫイソ型を、抗血管形成剤である、ＶＥＧＦＲリガンドのモジュレーションを含むＲＴＫ関連経路で他のシグナリング分子と相互作用する分子と一緒に併用治療に用いることもできる。例えば、既知の抗リウマチ薬であるブシラミン（ＢＵＣ）などは、滑膜細胞により産生されるＶＥＧＦの阻害作用のそのメカニズム内に含まれることが分かっている。ＢＵＣの抗リウマチ性効果は、滑膜細胞により産生されるＶＥＧＦの阻害を介する、関節炎滑膜における血管形成および滑膜性増殖の抑制により仲介される。かかる薬剤のＶＥＧＦＲイソ型との組合せ治療は、処置の多数のメカニズムおよび作用部位を可能とし得る。
【０２９８】
４．癌
ＥＧＦＲ、ＴＩＥ／ＴＥＫ、ＶＥＧＦＲ、ＭＥＴおよびＦＧＦＲのイソ型などのＲＴＫイソ型を、癌の処置に用いることができる。ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３イソ型などのＥＧＦＲ  ＲＴＫイソ型、Ｆｌｔ１イソ型などのＶＥＧＦＲイソ型、ＦＧＦＲ４イソ型などのＦＧＦＲイソ型、およびＥｐｈＡ１イソ型を含むが、それらに限定されないＲＴＫイソ型は、癌の処置に用いられ得る。本明細書にて処置される癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれるが、それらに限定されない。かかる癌のさらなる例には、扁平上皮癌（例えば、扁平上皮癌）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および扁平上皮肺癌を含む肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化器癌を含む上部消化管癌または胃癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部癌が含まれる。組合せ治療を、抗ホルモン化合物、心臓保護作用薬剤、および化学治療薬剤および増殖阻害剤などの抗癌剤を含むＥＧＦＲイソ型と一緒に用いることができる。
【０２９９】
ＥＧＦＲイソ型で処置可能な癌は、一般に、ＥＧＦＲ受容体を発現する癌である。かかる癌は、ＥＧＦＲ発現を検出するための当技術分野で公知のいずれかの方法により同定され得る。利用可能なＥｒｂＢ２発現診断／予後分析の例には、HERCEPTEST.RTM.(Dako)が含まれ得る。腫瘍生検標本由来のパラフィン包埋組織切片を、ＩＨＣ分析し、そしてＥｒｂＢ２タンパク質染色強度基準を一致させる。基準スコア以下で一致した腫瘍は、過剰発現ではないＥｒｂＢ２で特徴付けられ得るが、基準スコア以上かまたは等しいそれらの腫瘍は、ＥｒｂＢ２の過剰発現により特徴付けられ得る。処置の一例にて、ｅｒｂＢ２過剰発現腫瘍を、ｅｒｂＢ２イソ型などのＥＧＦＲイソ型で処置するための候補物質として評価する。
【０３００】
ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型を、腫瘍関連血管形成をモジュレートすることなどにより、癌の処置に用いることができる。血管形成は、癌の増殖および拡散の調節に関与する。例えば、血管形成の阻害および新血管形成は、固形腫瘍増殖および進展を阻害する。Ｔｉｅ２などのＴｉｅ／Ｔｅｋ受容体は、正常および癌組織における血管発生に影響を与えることが示されている。ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型は、腫瘍血管形成の阻害剤として用いられ得る。ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型は、細胞中、タンパク質の発現によるなどで製造される。例えば、ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型の分泌型は、細胞中に発現され得、培地から採取可能である。タンパク質は、当技術分野で公知の生化学的手法、およびＴＩＥ／ＴＥＫイソ型またはその一部に対する抗体などの抗体精製の使用または標識したＴＩＥ／ＴＥＫイソ型および対応する抗体の使用により、精製または部分的精製が可能である。血管形成における効果を、ラット角膜のマイクロポケットに外科的に移植される水性ペレット中成らし培地としてかまたはウィンドウチャンバーに投与される精製タンパク質（例えば、１００μｇ／用量）として剤形化されたＴＩＥ／ＴＥＫイソ型でラット角膜を処置することなどにより動物モデルにて観察することができる。例えば、無血管角膜を有するＦ３４４ラットなどのラットモデルを、腫瘍−細胞成らし培地と一緒にか、または血管形成を誘導するために眼のウィンドウチャンバー中に腫瘍の断片を移植することにより用いることができる。角膜を、腫瘍細胞成らし培地により誘導される血管形成の阻害を検出するために組織学的に試験することができる。ＴＩＥ／ＴＥＫイソ型を、初期および転移性の非上皮性悪性腫瘍および上皮性悪性腫瘍を含む、固形腫瘍などの悪性状態および転移状態を処置するためにも用いることができる。
【０３０１】
ＦＧＦＲ４イソ型を、癌、例えば下垂体腫瘍の処置に用いることができる。動物モデルを、ヒト下垂体腫瘍増加の進行を真似るために用いることができる。例えば、ＦＧＦＲのＮ末端短縮型であるｐｔｄ−ＦＧＦＲ４が、長期および大規模な過形成なしの下垂体腺腫形成を含む、下垂体腫瘍形成を繰り返す形質転換マウスに発現させる（Ezzatら、 (2002) J. Clin. Invest. 109:69−78）。ＦＧＦＲ４イソ型を、ｐｔｄ−ＦＧＦＲ４マウスに投与することができ、そして下垂体構造および腫瘍進行の経過を対照マウスと比較する。
【０３０２】
５．アルツハイマー病
ＥＧＦＲイソ型を、アルツハイマー病および関連する状態の処置にも用いることができる。アミロイド前駆体タンパク質変異体を過剰発現する形質転換マウスおよび家族性常染色体優性関連ＰＳ１を発現するマウス、および両方のタンパク質（ＰＳ１  Ｍ１４６Ｌ／ＡＰＰＫ６７０Ｎ：Ｍ６７１Ｌ）を発現するマウスを含む多様なマウスモデルが、ヒトアルツハイマー病のために利用可能である。アルツハイマーモデルを、ＥｒｂＢイソ型の注射などにより処理する。プラーク発生を、染色および抗体反応性分析を用いて、例えば海馬、内嗅皮質、および大脳皮質における神経プラークの観察などにより判定することができる。
【０３０３】
６．平滑筋増殖が関係する疾患および状態
ＥｒｂＢイソ型を含むＥＧＦＲイソ型を、哺乳動物、例えばヒトにおける平滑筋細胞増殖に関与する多様な疾患および状態の処置に利用することができる。例としては、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖に関与し、そして血管狭窄、血管形成または外科的もしくはステント移植の結果の再狭窄、アテローム性動脈硬化症および高血圧症などの内膜過形成を導く心疾患の処置である。かかる状態にて、様々な細胞と放出されるサイトカインの相互作用は、自己分泌、傍分泌またはジャクスタクリンに作用し、結果として、中膜における正常な位置から損傷を受けた脈管内膜にＶＳＭＣの移動を生じる。移動したＶＳＭＣは過度に増殖し、そして血管内膜の肥大を導き、結果として血管の狭窄または閉塞を生じる。損傷部位での血小板凝集および堆積の悪化が問題である。α−トロンビン、多官能セリンプロテアーゼは、血管損傷部位に凝集され、そしてＶＳＭＣ増殖を刺激する。この受容体の活性化に続いて、ＶＳＭＣは、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦを含む、様々な自己分泌性増殖因子を製造し分泌する。ＥＧＦＲは、シグナル伝達カスケードに関与し、それは最終的に、内皮細胞の細胞分裂のため、および内皮細胞における遊走反応の誘導のための様々な因子を分泌するための、線維芽細胞およびＶＳＭＣの移動および増殖、ならびにＶＳＭＣの刺激を生じる。ＥＧＦＲイソ型を用いる処置を、かかるシグナリングおよび応答をモジュレートするために用いることができる。
【０３０４】
ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３イソ型などのＥＧＦＲイソ型を、ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ３などのＥＧＦＲが、下部の尿道に影響を及ぼす閉塞性症候群に反応して生じる膀胱壁肥大などの、膀胱ＳＭＣをモジュレートする場合の状態の処置に用いることができる。ＥＧＦＲイソ型を、膀胱平滑筋細胞の増殖の制御に用いることができ、そして尿路閉塞症候群の予防または処置する結果となる。
【０３０５】
ＥＧＦＲイソ型を、平滑筋細胞増殖に関する病変が基礎疾患である閉塞性気道疾患を処置するために用いることができる。１つの例は、気道炎症および気管支収縮として現れる喘息である。ＥＧＦは、ヒト気道ＳＭＣの増殖を刺激することが示されており、そして閉塞性気道疾患における気道ＳＭＣの病理学的増殖に関与する因子の１個である可能性が高い。ＥＧＦＲイソ型を、ＥＧＦＲによるＥＧＦへの効果および応答をモジュレートするために用いることができる。
【０３０６】
７．併用療法
ＲＴＫイソ型などのＣＳＲイソ型を、疾患および状態を処置するために他の既存の薬剤および治療薬剤と組合せて用いることができる。例えば、本明細書に記載のような多数のＲＴＫイソ型を、血管形成関連状態および疾患の処置、および／または腫瘍増殖の制御に用いることができる。かかる処置を、抗血管形成および／または抗腫瘍性薬剤および／または治療薬剤と共同して行うことができる。チロシンキナーゼ阻害剤およびチロシンキナーゼシグナル伝達をモジュレートし得る分子を含む、組合せ治療に有用な抗血管形成および抗腫瘍性の薬剤および治療剤の例には、４−アミノピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン（例えば、米国特許番号第５，６３９，７５７号を参照のこと）、およびキナゾリン化合物ならびに組成物（例えば、米国特許番号第５，７９２，７７１号）が含まれるが、それらに限定されない、組合せ治療剤にて用いられ得る。組合せ治療に有用な他の化合物には、アンギオスタチック４，９（１１）−ステロイドおよびＣ２１酸化ステロイド、アンギオスタチン、エンドスタチン、バスキュロスタチン（vasculostatin）、カンスタチンおよびマスピン、アンジオポイエチン、細菌性多糖類ＣＭ１０１および抗体ＬＭ６０９（米国特許番号第５，７５３，２３０号）、トロンボスポンジン（ＴＳＰ−１）、血小板第４因子（ＰＦ４）、インターフェロン、メタロプロテアーゼ阻害剤、ＡＧＭ−１４７０／ＴＮＰ−４７０、サリドマイド、およびカルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）を含む薬理作用剤、ヘパリンまたはヘパリン断片の存在するようなコルチゾン、抗浸潤因子、レチノイン酸およびパクリタキセル（米国特許番号第５，７１６，９８１号；参照により本明細書に組み込まれる）、サメ軟骨抽出物、陰イオン性ポリアミドまたはポリウレアオリゴマー、オキシンドール誘導体、エストラジオール誘導体およびチアゾロピリミジン誘導体などのステロイドが含まれる。
【０３０７】
ＥＧＦＲを過剰発現する癌の処置を含む癌の処置には、異なる化学治療剤のカクテルの併用を含む、抗癌剤、化学治療剤および増殖阻害剤との組合せ治療が含まれ得る。化学治療剤の例には、タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセルなど）およびアントラサイクリン系抗生物質が含まれる。かかる化学治療剤の製造法および投与計画は、製造元の取扱説明書によるかまたは当業者により実験的に決定されたとおりのものを用いることができる。かかる化学治療剤の製造および投与計画は、Chemotherapy Service Ed.，M. C. Perry，Williams＆Wilkins，Baltimore，Md.(1992)にも記載されている。
【０３０８】
付加的化合物を、ＲＴＫイソ型との組合せ治療に用いることができる。抗ホルモン化合物を、ＥＧＦＲイソ型などとの組合せ治療に用いることができる。かかる化合物の例には、かかる分子について既知の投与量にて、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストンなどの抗プロゲステロンおよびフルタミドなどの抗エンドロゲン、が含まれる。それは、心臓保護剤（治療と関連し得る心筋機能不全を防ぐかまたは減少させる）または１個あるいはそれ以上のサイトカインの同時投与に有益であり得る。上記治療法に加えて、患者に、癌細胞の外科的除去および／または放射線治療を行うことができる。
【０３０９】
アジュバントおよび他の免疫調節剤を、例えば、腫瘍細胞の免疫応答を増加するためなどの、癌の処置におけるＣＳＲイソ型との組合せに用いることができる。組合せ治療は、処置の有効性を増加し得、いくつかの場合に、前記組合せが、別々な処置の相加効果よりも効果的であるような相乗効果を引き起こす。アジュバントの例には、細菌性ＤＮＡ、弱毒化したマイコバクテリア細胞（ＢＣＧ；Bacillus−Calmette−Guerin）の核酸断片、ＢＣＧゲノム由来の合成オリゴヌクレオチド、およびＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ  ＯＤＮ； Wooldridgeら、(1997) Blood 89:2994−2998）を含む合成オリゴヌクレオチド、レバミゾール、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、ＢＣＧ、不完全なフロイトのアジュバント（ＩＦＡ）、ＱＳ−２１（植物由来免疫賦活剤）、スカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）、およびジニトロフェニル（ＤＮＰ）が含まれるが、それらに限定されない。免疫調節剤の例には、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＩＬ−１  ＲＡ）などのサイトカイン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ、エリスロポイエチン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、インターフェロン、Ｂ７．１（ＣＤ８０としても公知）、Ｂ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６としても公知）、ＴＮＦファミリーメンバー（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＴ−β、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、トレイル）、およびＭＩＦ、インターフェロン、ＩＬ−２およびＩＬ−１２などのサイトカイン；および、メトトレキサートおよびクロラムブシルなどの化学治療剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１０】
８．前臨床研究
モデル動物実験を、候補治療薬剤であるＲＴＫイソ型の前臨床評価に用いることができる。評価し得るパラメータには、有効性および濃度−応答、安全性、薬物動態、種間スケーリングおよび組織分布が含まれるが、それらに限定されない。モデル動物実験には、本明細書に記載のような分析、ならびに当業者に公知の分析が含まれる。動物モデルを、データを得るために用いることができ、故にＲＴＫイソ型での臨床試験および処置の設計のためのヒト投与量を推定することができる。例えば、腫瘍担持マウスにおけるＶＥＧＦＲ阻害剤の有効性および濃度応答を、必要な有効性の範囲にてヒトに用いるためのＶＥＧＦＲに対する抗体などの治療的阻害剤を維持するために有効な臨床投与計画を定義するために、ヒトの処置（Mordentiら、(1999) Toxicol Pathol. Jan−Feb;27(1):14−21）の場合に当てはめることができる。同様のモデルおよび投与実験を、ＶＥＧＦＲイソ型投与量決定および適切なヒト投与への変換、ならびに当業者に公知の他の技術に用いることができる。前臨床安全性試験および臨床前薬物動態を、例えばサル、マウス、ラットおよびウサギで行うことができる。マウス、ラットおよびサルからの薬物動態データを、相対的スケーリングを用いてヒトにおける対応する（counterpart）治療の薬物動態を推定するために用いている。よって、適当な用量情報を、関節リウマチ、眼新血管新生および癌を含むヒトの病状の処置のために決定することができる。抗ＶＥＧＦ抗体のヒト化変形体を、抗癌剤として臨床試験に用いることができ（Brem、(1998) Cancer Res. 58(13):2784−92; Prestaら、(1997) Cancer Res. 57(20):4593−9）、かかる臨床データを、ＶＥＧＦＲイソ型の治療用量を設計するとき、参照源として考慮することもできる。
【０３１１】
以下の実施例は、説明の目的でのみ包含され、本発明の範囲を限定するものではない。
【０３１２】
Ｋ．実施例
実施例１
天然ＩＦＰポリペプチド配列の単離
ＥｒｂＢ−２遺伝子を、天然ＲＴＫ−ＩＦＰを作製するための標的ＲＴＫとして選択する。発現配列を、公共に利用可能なデータベース配列を用いてＥｒｂＢ−２について得る。前記発現配列を、ＥｒｂＢ−２についての配列の整列セットを作製するため、参照としてのＥｒｂＢ−２ゲノム配列をＡｃｅＶｉｅｗおよびＡｃｅｍｂｌｙを用いて整列させる。ＥｒｂＢ−２  ＲＴＫの優性型を、１２５５個のアミノ酸形態（配列番号２７）として同定する。
【０３１３】
ＥｒｂＢ−２配列のドメインを、Ｐｆａｍを用いることにより整列セットと比較してマッピングする。４つのドメインを、以下に示す表３のように、ＥｒｂＢ−２優先型にて同定する：
【０３１４】
【表３】
2007525187.tif 000005
【０３１５】
整列セットには、ＩＦＰを含む、ｅｒｂＢ−２のイソ型をコードする多数の選択的にスプライスされた変異体が含まれる。キナーゼドメインの少なくとも一部を欠くＩＦＰが、選択される。選択されたＩＦＰの１つの例は、配列番号９である。この配列は、アミノ酸１−５２の受容体Ｌドメインおよび１８９−３４３のフリン様ドメインを含む。ｃ末端領域は、ＥｒｂＢ−２の優性型におけるアミノ酸配列のいずれとも一致しない７９個のアミノ酸をコードする（配列番号２７）。
【０３１６】
選択されたＩＦＰのもう１つの例は、配列番号５である。この配列は、アミノ酸１−５２に受容体Ｌドメイン、１８９−３４３にフリン様ドメイン、そして３６６−４９６に第２の受容体Ｌドメインを含む。前記配列は、膜貫通ドメインおよびタンパク質キナーゼドメインを欠く。このＩＦＰは、ＥｒｂＢ−２の優性型（配列番号２７）と共通の最初の６５０Ｎ末端アミノ酸を共有し、ＥｒｂＢ−２の優性型と顕著な配列相同性を有しない、さらに３０イントロンにコードされたアミノ酸を有する。
【０３１７】
選択されたＩＦＰの他の例は、配列番号６である。この配列は、アミノ酸１−５２に受容体Ｌドメイン、１８９−３４３にフリン様ドメイン、そしてアミノ酸３６６−４９６に第２の受容体Ｌドメインを含む。この配列は、膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを欠く。このＩＦＰは、ＥｒｂＢ−２の優性型（配列番号２７）と共通の最初の６３３Ｎ末端アミノ酸を共有し、さらなるイントロンにコードされるアミノ酸を有さずエキソン／イントロン境界の終止コドンで終了する。
【０３１８】
選択されたＩＦＰの他の例は、配列番号７である。この配列は、アミノ酸１−５２に受容体Ｌドメイン、１８９−３４３にフリン様ドメイン、そしてアミノ酸３６６−４９６に第２の受容体Ｌドメインを含む。この配列は、膜貫通ドメインおよびキナーゼドメインを欠く。このＩＦＰは、ＥｒｂＢ−２の優性型（配列番号２７）と共通の最初の５０４Ｎ末端アミノ酸を共有し、配列番号２７と顕著に配列相同性を欠くさらなる７０個のイントロンにコードされたアミノ酸も含む。
【０３１９】
実施例２
組合せＩＦＰの作製
組合せＩＦＰを、ＲＴＫ  ＴＩＥ受容体を用いて構築した。発現ＴＩＥ遺伝子配列を、Ａｃｅｍｂｌｙ（ＮＣＢＩ）を用いて参照ＴＩＥゲノム配列とアライメントする。アライメントした配列を、ＴＩＥ中のイントロン、エキソンおよびイントロン／エキソン境界を同定するために用いる。ＴＩＥ配列のドメインを、Ｐｆａｍプログラムを用いてマッピングする。ＴＩＥの優性型（配列番号２８）についてのＴＩＥドメインを、以下の表４に示す：
【表４】
2007525187.tif 000006
【０３２０】
ＴＩＥ組合せＩＦＰを構築する。配列番号２９を、キナーゼドメインのアミノ酸８３９−１１０７を欠く、アミノ酸１−８３８から構築する。付加的ＴＩＥ  ＩＦＰを、アミノ酸１−７８６、１−６３２、１−５３３、１−４２８、１−３４４、１−２５５および１−１９７（配列番号２５および３０−３５）を含むように構築する。
【０３２１】
逆翻訳を、ＴＩＥ  ７８６  ＩＦＰをコードする核酸分子（配列番号３６）を作製するために用いる。逆翻訳ユーティリティ・プログラム（Swiss Institute of Bioinformatics; available on the World Wide Web at the URL 「us.expasy.org」）。
【０３２２】
実施例３
ＲＴ−ＰＣＲを用いたＩＦＰクローニング
本実施例は、３つのイントロンが組み入れられた４つのエキソンを含む例示遺伝子由来の例示ＩＦＰを用いたＲＴ−ＰＣＲによるＩＦＰクローニングを説明する。例示遺伝子にて、コードされたポリペプチドの野生型または優性型は、４つのエキソンすべてとスプライシングにより除かれる３つのイントロンを含むＲＮＡから発現される。故に、前記例示遺伝子は、構造Ｅ１−Ｉ１−Ｅ２−Ｉ２−Ｅ３−Ｉ３−Ｅ４を有し、ここでＥｎとはエキソンを示し、Ｉｎとは、イントロンを示す。
【０３２３】
ＰＣＲプライマーは、４つのエキソンすべてを含み、イントロン３（Ｉ３）を保持するＲＮＡから発現されるＩＦＰを増幅するために設計される。ＰＣＲプライマーは、Ｅ１中１つのプライマー（Ｐ１）およびＩ３中もう１つのプライマー（Ｐ３）を含むように設計されるため、Ｐ１およびＰ３プライマーを用いたＰＣＲでは、エキソン１配列およびイントロン３配列を含む核酸分子のみが増幅する。プライマーは、Rozen S、Skaletsky Hらの、Primer 3 on the internet for general users and for biologist programmers（Methods Mol Biol 2000; 132:365-386）によるバイオインフォマティクスプログラムを用いて設計される。ＰＣＲプライマーＰ１およびＰ３を用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅は、保持されたイントロン３を含むＲＮＡスプライス変異体のみを増幅し、野生型または優性型をコードするＲＮＡを増幅しない。ゲノムＤＮＡは、多くの場合に効率よく増幅されず、そのより大きなサイズの増幅産物により選択的にスプライスされたＲＮＡの増幅産物から分けられる。
【０３２４】
増幅産物を、ＰＣＲプライマーＰ２およびＰ３を用いた第二のＰＣＲ反応により確認する。プライマーＰ２を、エキソン２配列とハイブリダイズするように設計する。プライマーＰ２およびＰ３を用いたＰＣＲは、野生型または優性型をコードするＲＮＡなどのイントロン３を保持しないＲＮＡと比較して、ＩＦＰをコードするＲＮＡとイントロン３保持ＲＮＡとの大きさの違う増幅産物を作製する。
【０３２５】
ＭＥＴをコードする核酸分子（配列番号１９）を、２８９０ヌクレオチドのＰＣＲ産物を産するために、プライマーＰ１  ５’−ＣＧＣＴＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧＧＴＴ−３’（配列番号４０）およびＰ３  ５’−ＴＧＡＧＣＣＡＡＡＡＣＣＣＡＣＡＣＡＴＡ−３’（配列番号４１）を用いて増幅する。プライマーＰ２  ５’−ＣＣＡＧＡＡＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＡＧＣＡ−３’（配列番号４２）およびＰ３（配列番号４１）を用いた確認では、１３８０ヌクレオチド産物を産する。期待された分子量の両方の産物が別々のＰＣＲ反応から得られるとき、イントロン保持スプライス形態の増幅は成功しており、シークエンシングにより確認される。
【０３２６】
ＦＬＴ１．ｃ  ＢＵＩＬＤ  ３２  ５／２４  プロリン（配列番号１４）をコードする核酸分子を、１２２８ヌクレオチドのＰＣＲ産物を作製するために、プライマーＰ１  ５’−ＧＧＧＧＡＡＧＴＧＧＴＴＧＴＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号４３）およびＰ３  ５’−ＧＡＡＡＣＣＣＡＴＴＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴ−３’（配列番号４４）を用いて増幅する。プライマーＰ２  ５’−ＧＣＴＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＡＡ−３’（配列番号４５）およびＰ３（配列番号４４）を用いた確認では、４７１ヌクレオチド産物を産する。期待された分子量の両方の産物が別々のＰＣＲ反応から得られるとき、イントロン保持スプライス形態の増幅は成功しており、シークエンシングにより確認される。
【０３２７】
ＰＤＧＦＲＡ．ｃＤｅｃ０３（配列番号２１）をコードする核酸分子を、８１７ヌクレオチドのＰＣＲ産物を作製するために、プライマーＰ１  ５’−ＣＴＣＣＡＴＧＴＧＴＧＧＧＡＣＡＴＴＣＡ−３’（配列番号４６）およびＰ３  ５’−ＧＧＧＴＣＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号４７）を用いて増幅する。プライマーＰ２  ５’−ＣＣＣＡＣＡＣＡＧＧＧＴＴＧＴＡＣＡＣＴＴＡ−３’（配列番号４８）およびＰ３（配列番号４７）を用いた確認では、４８３ヌクレオチド産物を産する。期待された分子量の両方の産物が別々のＰＣＲ反応から得られるとき、イントロン保持スプライス形態の増幅は成功しており、シークエンシングにより確認される。
【０３２８】
Ｅｒｂｂ２．ｄＤｅｃ０３（配列番号５）をコードする核酸分子を、２３３１ヌクレオチドのＰＣＲ産物を産生するために、プライマーＰ１  ５’−ＧＴＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＴＧＴ−３’（配列番号４９）およびＰ３  ５’−ＣＣＴＣＣＣＴＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡ−３’（配列番号５０）を用いて増幅する。プライマーＰ２  ５’−ＡＣＡＣＡＧＣＧＧＴＧＴＧＡＧＡＡＧＴＧ−３’（配列番号５１）およびＰ３（配列番号５０）を用いた確認では、１０４７ヌクレオチド産物を産する。期待される分子量の両方の産物が別々のＰＣＲ反応で得られるとき、イントロン保持スプライス形態の増幅は成功しており、シークエンシングにより確認される。
【０３２９】
実施例４
ＲＴＫイソ型のクローニング方法
Ａ．メッセンジャーＲＮＡの製造
健常または疾患組織由来および細胞系由来の主要ヒト組織型を示すｍＲＮＡを、購入し（例えば、Clontech（BD Bi osciences、Clontech、Palo Alto、CA）、Stratagene（La Jolla、CA）、および他の商業的供給者から）、一緒にプールする。このｍＲＮＡプールを、逆転写に基づくＰＣＲ増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）のためのテンプレートとして用いる。
【０３３０】
Ｂ．ｃＤＮＡ合成
ｍＲＮＡを、１０分間、４０％ＤＭＳＯの存在下で７０℃にて変性させ、氷上で反応を止める。最初のｃＤＮＡ鎖を、１０％ＤＭＳＯ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  各ｄＮＴＰ、５ｍｇ  ｍＲＮＡ、および２００ユニットのＳＴＲＡＴＡＳＣＲＩＰＴリバーストランスクリプターゼ（Stratagene、La Jolla、CA）を含む２０μｌ反応液中、２００ｎｇのオリゴ（ｄＴ）１２−１６または２０ｎｇのランダムヘキサマーのどちらかを用いて合成する。３７℃で１時間インキュベーション後、両方の反応からのｃＤＮＡを集め、１０ユニットのＲＮａｓｅＨ（Promega、Madison、WI）で処理する。
【０３３１】
Ｃ．ＰＣＲ増幅
遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを、オリゴ6.6ソフトウェア（Molecular Biology Insights，Inc.，Cascade，CO）を用いて選択する。前記ソフトウェアプライマーは、開始コドンに隣接する。逆のプライマーは、終止コドンに隣接するか、または開始コドンから少なくとも１．５ｋｂ下流の領域から選択される。プライマーを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）により合成する。それぞれのＰＣＲ反応液は、５０μｌの全量中に、１０ｎｇの逆転写ｃＤＮＡ、０．０２５ｕ／μｌ  ＴａｇＰｌｕｓ（Stratagene）、０．００３５ｕ／μｌ  ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）（Stratagene）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（Amersham、Piscataway、NJ）、ならびに０．２μＭのフォワードおよびリバースプライマーを含む。ＰＣＲ条件は、９４．５℃で４５秒、６０℃で５０秒、そして７２℃で５分を３５サイクルである。その反応を、７２℃で１０分間の伸長工程で終了する。ＦＧＦＲ４（配列番号５３）に対するプライマーの例を、配列番号３８および３９に記載する。
【０３３２】
Ｄ．ＰＣＲ産物のクローニングおよびシークエンシング
ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で電気泳動し、そして検出可能なバンドからのＤＮＡを、Ｇｅｌｓｔａｒ（BioWhitaker Molecular Application、Walkersville、MD）で染色する。ＤＮＡバンドを、ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Qiagen、Valencia、CA）で抽出し、ｐＤｒｉｖｅ  ＵＡ−クローニングベクター（Qiagen）にラーゲーションし、そして大腸菌を形質転換する。組み換えプラスミドを、１００μｇ／ｍｌカルベニシリンを含むＬＢアガープレート上で選択する。それぞれのトランスフェクションについて、１９２個のコロニーを無作為に選び、それらのｃＤＮＡ挿入サイズを、Ｍ１３  フォワードおよびリバースベクタープライマーでのＰＣＲにより決定する。その後、蛍光イメージング（Alpha Innotech、San Leandro、CA）により可視化された区別可能な分子量を有するＰＣＲ産からの代表的なクローンを、両方向のベクタープライマー（Ｍ１３フォワードおよびリバース）を用いてシークエンスする。すべてのクローンを、ギャップ領域を越えてシークエンシングを完了するためのカスタムプライマーを用いて完全にシークエンスする。
【０３３３】
Ｅ．配列分析
選択的スプライシングのコンピュータ分析を、ＳＩＭ４（スプライス変異体の分析のためのコンピュータプログラム）を用いて、それぞれのｃＤＮＡ配列をその各ゲノム配列に対してアライメントすることにより行う。標準的な（例えば、ＧＴ−ＡＧ）供与−受容スプライシング部位を有する転写産物のみが、分析を考慮される。推定ＲＴＫイソ型をコードするクローンを、さらに研究する（以下を参照のこと）。
【０３３４】
Ｆ．標的クローニング
公共のＥＳＴデータベースのコンピュータ分析により、イントロン保持または挿入を有する、可能性のあるスプライス変異体を同定することができる。ＥＳＴデータベース分析により同定された可能性のあるスプライス変異体のクローニングを、上記のような推定オープンリーディングフレームに隣接するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより行うことができる。
【０３３５】
実施例５
ＲＴＫイソ型発現分析
Ａ．ｍＲＮＡ発現の分析
クローン化したＲＴＫイソ型の発現を、変異型特異的なプライマー（実施例３に記載のような）を用いて様々な組織においてＲＴ−ＰＣＲ（または定量的ＰＣＲ）により決定する。
【０３３６】
Ｂ．分泌
推定ＲＴＫイソ型を、分泌されたイソ型について評価するために、培養ヒト細胞において分析する。候補ＲＴＫイソ型をコードするスプライス変異体ｃＤＮＡを、それらの検出を容易にするために、タンパク質のＣ末端に融合されたｍｙｃタグを有するｐｃＤＮＡ３ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）などの、哺乳動物発現ベクター中にサブクローニングする。組み換えｃＤＮＡ構築物を、ヒト胚性腎臓２９３細胞に一過性にトランスフェクトする。細胞培養上清を、トランスフェクションの４８時間後に集める。細胞培養培地に分泌されたＲＴＫイソ型の発現を、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出する。
【０３３７】
Ｃ．受容体結合
ＲＴＫイソ型の結合および分泌されたＲＴＫイソ型とそれぞれの膜結合した全長の受容体との結合を、共免疫沈降実験により決定することができる（例えば、Jinらの、J Biol Chem 2004、279:1408 およびJinらの、J Biol Chem 2004、279:14179を参照のこと）。
【図面の簡単な説明】
【０３３８】
【図１】図１は、発現配列タグ（ＥＳＴ）およびｅｒｂＢ２のスプライス変異体と共にｅｒｂＢ２遺伝子領域のアライメントを示す。
【図２】図２は、発現配列タグ（ＥＳＴ）およびＥｐｈＡ８のスプライス変異体と共にＥｐｈＡ８遺伝子領域のアライメントを示す。
【図１】
2007525187.tif 000007
【図２】
2007525187.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月2日(2006.3.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９および２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列、ならびにその対立遺伝子変異体と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで：
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものであり；そして、
配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９および２２−２５はそれぞれ、受容体型チロシンキナーゼのイソ型である、
単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７、８、１２、１４、１５、１６、１７、１９、２２、２３および２４のいずれか記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、それが同一性を有する配列番号に記載のものと同数のアミノ酸を含むものである、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、哺乳動物に由来するものである、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記哺乳動物が、げっ歯類、霊長類またはヒトである、請求項１から４のいずれか記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子のイントロンによりコードされた少なくとも１個のアミノ酸と操作可能に連結された受容体型チロシンキナーゼの少なくとも１個のドメインを含み、
ここで、受容体型チロシンキナーゼは、ＤＤＲ、ＥＰＨＡ、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥから選択されるものであるか；または、
前記ポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５から選択されるアミノ酸配列を含むものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記受容体型チロシンキナーゼが、ＤＤＲ１、ＥＰＨＡ１またはＥＰＨＡ８から選択されるものである、請求項６記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
キナーゼドメインの少なくとも全部または一部および／または膜貫通ドメインの全部または一部を欠く短縮型受容体型チロシンキナーゼを含み、ここで：
前記ポリペプチドは、非短縮型受容体型チロシンキナーゼと比べて、キナーゼ活性が低下し、かつ／または、膜に局在化せず；
前記ポリペプチドは、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートし；
前記受容体型チロシンキナーゼは、ＤＤＲ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ８、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、およびＴＩＥから選択されるか、または単離されたポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１または２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し；そして、
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項９】
イントロンによりコードされたアミノ酸配列を含み、ここで：
前記イントロンは、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＦＬＴ１、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥから選択される受容体型チロシンキナーゼ遺伝子か；または、配列番号１−８および１０−２５のいずれかの前記イントロンによりコードされた配列に由来し；そして、
前記ポリペプチドは、受容体型チロシンキナーゼ細胞質ドメインを欠くものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、さらに膜貫通ドメインを欠くものである、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記単離されたポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするものである、請求項９または請求項１０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
請求項６から１１のいずれか記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ポリペプチドを含み、ここで：
前記ポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列、ならびにその対立遺伝子変異体と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり；
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの配列の全長を比較したものであり；そして、
配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のそれぞれは、受容体型チロシンキナーゼイソ型である、
医薬組成物。
【請求項１４】
受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするために有効な量のポリペプチドを含む、請求項１２または請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ポリペプチドによりモジュレートされる前記受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性が、二量体化、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、キナーゼ活性、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化、受容体型チロシンキナーゼのリン酸転移、シグナル伝達分子のリン酸化、リガンド結合、リガンド結合についての受容体型チロシンキナーゼとの競合、シグナル伝達、シグナル伝達分子との相互作用、膜結合および膜局在化の１種またはそれ以上である、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
モジュレーションが活性の阻害である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
組成物のポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼと複合体を形成する、請求項１２または請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１９】
イントロンおよびエキソンを含み、ここで：
前記イントロンが終止コドンを含み；
前記核酸分子が、エキソンイントロンジャンクションをつなぐオープンリーディングフレームをコードし；そして、
前記オープンリーディングフレームが、前記イントロンの終止コドンで終わる、
請求項１８記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記イントロンが、コードされたポリペプチドの１個またはそれ以上のアミノ酸をコードするものである、請求項１８または請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記終止コドンが、イントロンにおける最初のコドンである、請求項１８または請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項２４】
請求項１２から１７のいずれか記載の医薬組成物を投与することを含んでなる、疾患または状態を処置する方法。
【請求項２５】
前記疾患または状態が、癌、炎症性疾患、感染症、血管新生関連状態、細胞増殖関連状態、免疫障害および神経変性疾患から選択されるものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記疾患または状態が、関節リウマチ、多発性硬化症および後部眼内炎、ブドウ膜の障害、眼表面炎症性疾患、血管新生疾患、増殖性硝子体網膜症、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、血管腫、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、アルツハイマー病、狼瘡、血管狭窄、再狭窄、炎症性関節疾患、アテローム性動脈硬化症、尿路閉塞症候群、および喘息から選択されるものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患または状態が、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、リンパ性悪性疾患、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、扁平上皮肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、上部消化器癌、胃癌、消化器癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎／腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌から選択されるものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記疾患または状態が、ウイルス感染症または寄生虫感染症である、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
前記感染症がマラリアである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むものである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物が、血管形成、細胞増殖、細胞移動、または腫瘍細胞増殖もしくは腫瘍細胞転移を阻害するものである、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】
細胞表面受容体の活性をモジュレートする候補分子を同定するための創薬方法であって、以下の：
ａ）細胞表面受容体またはその一部をコードする発現された遺伝子配列セットを選択する工程；
ｂ）発現された遺伝子配列セットを集めて、整列した配列セット構築する工程；そして、
ｃ）細胞表面受容体イソ型をコードする整列したセットの少なくとも１個のメンバー配列（ここで前記イソ型が、細胞表面受容体の野生型または優性型と比較して細胞表面受容体の生物学的活性のモジュレートに十分な少なくとも１種のドメインまたはその一部を欠く）を選び、それにより、細胞表面受容体をモジュレートする候補分子を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項３３】
整列したセットと参照遺伝子配列を比較することにより整列したセットのメンバー配列のうち１個またはそれ以上のイントロンおよびエキソンを指定する工程；および、
イソ型をコードする少なくとも１個のメンバー配列（ここで、前記メンバー配列が、エキソンと操作可能に連結したイントロン中にコードされる少なくとも１個のアミノ酸および／または終止コドンを含む）を選択する工程、
をさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記イソ型が、Ｃ末端短縮型細胞表面受容体である、請求項３２または請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記選択されたメンバー配列もまた、参照遺伝子配列の５’コーディングエキソンに相当する５’エキソンを含む、請求項３２から３４のいずれか記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞表面受容体が受容体型チロシンキナーゼである、請求項３２から３５のいずれか記載の方法。
【請求項３７】
前記イソ型が、キナーゼドメイン、膜貫通ドメインまたはその組合せから選択されるドメインまたはその一部を欠くものである、請求項３２から３６のいずれか記載の方法。
【請求項３８】
前記候補分子が、細胞表面受容体と二量体化するものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項３９】
前記候補分子がリガンドと結合し、細胞表面受容体が同じリガンドと結合する、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４０】
前記候補分子が、リガンド結合のために細胞表面受容体と競合するものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４１】
前記候補分子が、細胞表面受容体のリン酸化を阻害するものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４２】
前記候補分子が、細胞表面受容体の生物学的活性を変えるものである、請求項３２から３７のいずれか記載の方法。
【請求項４３】
前記改変された生物学的活性が、二量体化、キナーゼ活性、シグナル伝達、リガンド結合、膜結合および膜局在化から選択されるものである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記候補分子が、受容体の野生型または優性型と比較して、生物学的活性を低下するものである、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
前記選択されたメンバー配列が、キナーゼドメインをコードするエキソンと操作可能に連結された少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加を含んでなる、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
前記選択されたメンバー配列が、膜貫通ドメインをコードするエキソンに操作可能に連結された少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加を含んでなる、請求項３３記載の方法。
【請求項４７】
請求項３２から４６のいずれか記載の方法により同定されたポリペプチド。
【請求項４８】
ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＦＬＴ１、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥから選択される受容体のイソ型であるイントロン融合タンパク質である、請求項９または１０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４９】
癌、炎症疾患、感染症、血管形成が関係する状態、細胞増殖が関係する状態、免疫疾患および神経変性疾患から選択される疾患または状態を処置するための薬剤を剤形化するための、請求項１２−１７のいずれか記載の医薬組成物の使用。
【請求項５０】
癌、炎症疾患、感染症、血管形成が関係する状態、細胞増殖が関係する状態、免疫疾患および神経変性疾患から選択される疾患または状態を処置するための医薬組成物の使用。
【請求項５１】
前記疾患または状態が、関節リウマチ、多発性硬化症および後部眼内炎、ブドウ膜の障害、眼表面炎症性疾患、血管新生疾患、増殖性硝子体網膜症、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、血管腫、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、アルツハイマー病、狼瘡、血管狭窄、再狭窄、炎症性関節疾患、アテローム性動脈硬化症、尿路閉塞症候群、および喘息から選択される、請求項４９または５０記載の使用。
【請求項５２】
前記疾患または状態が、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、リンパ性悪性疾患、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、扁平上皮肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、上部消化器癌、胃癌、消化器癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎／腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌から選択されるものである、請求項４９または５０記載の使用。
【請求項５３】
前記疾患または状態が、ウイルス感染症または寄生虫感染症である、請求項４９または５０記載の使用。
【請求項５４】
前記感染症がマラリアである、請求項４９または５０記載の使用。
【請求項５５】
前記医薬組成物が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むものである、請求項４９または５０記載の使用。
【請求項５６】
前記医薬組成物が、血管形成、細胞増殖、細胞移動、または腫瘍細胞増殖もしくは腫瘍細胞転移を阻害するものである、請求項４９または５０記載の使用。
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月6日(2006.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007525187000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月6日(2006.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９および２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列、ならびにその対立遺伝子変異体と、少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで：
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものであり；そして、
配列番号１、３、５−８、１２、１４−１７、１９および２２−２５はそれぞれ、受容体型チロシンキナーゼのイソ型である、
単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７、８、１２、１４、１５、１６、１７、１９、２２、２３および２４のいずれか記載のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、それが同一性を有する配列番号に記載のものと同数のアミノ酸を含むものである、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、哺乳動物に由来するものである、請求項１記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記哺乳動物が、げっ歯類、霊長類またはヒトである、請求項４記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
受容体型チロシンキナーゼをコードする遺伝子のイントロンによりコードされた少なくとも１個のアミノ酸と操作可能に連結された受容体型チロシンキナーゼの少なくとも１個のドメインを含み、
ここで、受容体型チロシンキナーゼは、ＤＤＲ、ＥＰＨＡ、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥから選択されるものであるか；または、
前記ポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５から選択されるアミノ酸配列を含むものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記受容体型チロシンキナーゼが、ＤＤＲ１、ＥＰＨＡ１またはＥＰＨＡ８から選択されるものである、請求項６記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
キナーゼドメインの少なくとも全部または一部および／または膜貫通ドメインの全部または一部を欠く短縮型受容体型チロシンキナーゼを含み、ここで：
前記ポリペプチドは、非短縮型受容体型チロシンキナーゼと比べて、キナーゼ活性が低下し、かつ／または、膜に局在化せず；
前記ポリペプチドは、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートし；
前記受容体型チロシンキナーゼは、ＤＤＲ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ８、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ４、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、およびＴＩＥから選択されるか、または単離されたポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１または２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し；そして、
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの全長配列を比較したものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項９】
イントロンによりコードされたアミノ酸配列を含み、ここで：
前記イントロンは、ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＦＬＴ１、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥから選択される受容体型チロシンキナーゼ遺伝子か；または、配列番号１−８および１０−２５のいずれかの前記イントロンによりコードされた配列に由来し；そして、
前記ポリペプチドは、受容体型チロシンキナーゼ細胞質ドメインを欠くものである、
単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、さらに膜貫通ドメインを欠くものである、請求項９記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記単離されたポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするものである、請求項９または請求項１０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
請求項６から１１のいずれか記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ポリペプチドを含み、ここで：
前記ポリペプチドは、配列番号１、３、４−８、１０、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のいずれか記載のアミノ酸配列、ならびにその対立遺伝子変異体と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものであり；
配列同一性は、各配列番号の全長と単離されたポリペプチドの配列の全長を比較したものであり；そして、
配列番号１、３、４−８、１０、１１、１２、１４−１７、１９、２０、２１および２２−２５のそれぞれは、受容体型チロシンキナーゼイソ型である、
医薬組成物。
【請求項１４】
受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性をモジュレートするために有効な量のポリペプチドを含む、請求項１２または請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
ポリペプチドによりモジュレートされる前記受容体型チロシンキナーゼの生物学的活性が、二量体化、ホモ二量体化、ヘテロ二量体化、キナーゼ活性、受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化、受容体型チロシンキナーゼのリン酸転移、シグナル伝達分子のリン酸化、リガンド結合、リガンド結合についての受容体型チロシンキナーゼとの競合、シグナル伝達、シグナル伝達分子との相互作用、膜結合および膜局在化の１種またはそれ以上である、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
モジュレーションが活性の阻害である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
組成物のポリペプチドが、受容体型チロシンキナーゼと複合体を形成する、請求項１２または請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１９】
イントロンおよびエキソンを含み、ここで：
前記イントロンが終止コドンを含み；
前記核酸分子が、エキソンイントロンジャンクションをつなぐオープンリーディングフレームをコードし；そして、
前記オープンリーディングフレームが、前記イントロンの終止コドンで終わる、
請求項１８記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記イントロンが、コードされたポリペプチドの１個またはそれ以上のアミノ酸をコードするものである、請求項１８または請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記終止コドンが、イントロンにおける最初のコドンである、請求項１８または請求項１９記載の核酸分子。
【請求項２２】
請求項１８から２１のいずれか記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２３】
請求項２２のベクターを含んでなる、細胞。
【請求項２４】
細胞表面受容体の活性をモジュレートする候補分子を同定するための創薬方法であって、以下の：
ａ）細胞表面受容体またはその一部をコードする発現された遺伝子配列セットを選択する工程；
ｂ）発現された遺伝子配列セットを集めて、整列した配列セット構築する工程；そして、
ｃ）細胞表面受容体イソ型をコードする整列したセットの少なくとも１個のメンバー配列（ここで前記イソ型が、細胞表面受容体の野生型または優性型と比較して細胞表面受容体の生物学的活性のモジュレートに十分な少なくとも１種のドメインまたはその一部を欠く）を選び、それにより、細胞表面受容体をモジュレートする候補分子を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項２５】
整列したセットと参照遺伝子配列を比較することにより整列したセットのメンバー配列のうち１個またはそれ以上のイントロンおよびエキソンを指定する工程；および、
イソ型をコードする少なくとも１個のメンバー配列（ここで、前記メンバー配列が、エキソンと操作可能に連結したイントロン中にコードされる少なくとも１個のアミノ酸および／または終止コドンを含む）を選択する工程、
をさらに含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記イソ型が、Ｃ末端短縮型細胞表面受容体である、請求項２４または２５記載の方法。
【請求項２７】
前記選択されたメンバー配列もまた、参照遺伝子配列の５’コーディングエキソンに相当する５’エキソンを含む、請求項２４から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞表面受容体が受容体型チロシンキナーゼである、請求項２４から２７のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
前記イソ型が、キナーゼドメイン、膜貫通ドメインまたはその組合せから選択されるドメインまたはその一部を欠くものである、請求項２４から２８のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
前記候補分子が、細胞表面受容体と二量体化するものである、請求項２４から２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
前記候補分子がリガンドと結合し、細胞表面受容体が同じリガンドと結合する、請求項２４から２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
前記候補分子が、リガンド結合のために細胞表面受容体と競合するものである、請求項２４から２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
前記候補分子が、細胞表面受容体のリン酸化を阻害するものである、請求項２４から２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４】
前記候補分子が、細胞表面受容体の生物学的活性を変えるものである、請求項２４から２９のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
前記改変された生物学的活性が、二量体化、キナーゼ活性、シグナル伝達、リガンド結合、膜結合および膜局在化から選択されるものである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記候補分子が、受容体の野生型または優性型と比較して、生物学的活性を低下するものである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記選択されたメンバー配列が、キナーゼドメインをコードするエキソンと操作可能に連結された少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加を含んでなる、請求項２５記載の方法。
【請求項３８】
前記選択されたメンバー配列が、膜貫通ドメインをコードするエキソンに操作可能に連結された少なくとも１個のアミノ酸または終止コドンの付加を含んでなる、請求項２５記載の方法。
【請求項３９】
請求項２４から３８のいずれか一項記載の方法により同定されたポリペプチド。
【請求項４０】
ＤＤＲ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ３、ＦＬＴ１、ＭＥＴ、ＰＤＧＦＲＡ、ＴＥＫおよびＴＩＥから選択される受容体のイソ型であるイントロン融合タンパク質である、請求項９または１０記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
癌、炎症疾患、感染症、血管形成が関係する状態、細胞増殖が関係する状態、免疫疾患および神経変性疾患から選択される疾患または状態を処置するための薬剤を剤形化するための、請求項１２−１７のいずれか一項記載の医薬組成物の使用。
【請求項４２】
癌、炎症疾患、感染症、血管形成が関係する状態、細胞増殖が関係する状態、免疫疾患および神経変性疾患から選択される疾患または状態を処置するための請求項１２から１７のいずれか一項記載の医薬組成物の使用。
【請求項４３】
前記疾患または状態が、関節リウマチ、多発性硬化症、後部眼内炎、ブドウ膜の障害、眼表面炎症性疾患、血管新生疾患、増殖性硝子体網膜症、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、血管腫、糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、乾癬、アルツハイマー病、狼瘡、血管狭窄、再狭窄、炎症性関節疾患、尿路閉塞症候群、および喘息から選択される、請求項４１または４２記載の使用。
【請求項４４】
前記疾患または状態が、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性悪性疾患、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、扁平上皮肺癌、腹膜癌、肝細胞癌、上部消化器癌、胃癌、消化器癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎／腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、および頭頸部癌から選択されるものである、請求項４１または４２記載の使用。
【請求項４５】
前記疾患または状態が、ウイルス感染症または寄生虫感染症である、請求項４１または４２記載の使用。
【請求項４６】
前記感染症がマラリアである、請求項４５記載の使用。
【請求項４７】
前記医薬組成物が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むものである、請求項４６記載の使用。
【請求項４８】
前記医薬組成物が、血管形成、細胞増殖、細胞移動、腫瘍細胞増殖または腫瘍細胞転移を阻害するものである、請求項４１または４２記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
細胞表面受容体イソ型は、細胞、組織および器官で発現されるイソ型の単離を含む本技術分野で公知のいずれかの方法、および組換え方法、ならびにコンピュータを利用した方法（in silico）および合成方法の使用により、作製され得る。受容体型チロシンキナーゼのイソ型を含む細胞表面受容体のイソ型は、受容体型チロシンキナーゼ遺伝子から転写された選択的にスプライシングされたＲＮＡによりコードされ得る。かかるイソ型には、エキソン欠失、エキソン保持、エキソン伸長、エキソン切断およびイントロン保持により選択的にスプライスされたＲＮＡが含まれる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本明細書中に用いた、イントロンとは、ＲＮＡに転写され、その後通常、ＲＮＡの成熟型、例えばｍＲＮＡを作製するためにスプライシングによりＲＮＡから除去されるヌクレオチド配列を意味する。一般に、イントロンのヌクレオチド配列は、成熟ＲＮＡには組み込まれておらず、そしてイントロン配列またはその一部もまた通常、ポリペプチドに翻訳されずかつ組み込まれない。スプライス供与体および受容体などのスプライスシグナル配列は、ＲＮＡからイントロンを除去するための細胞のスプライシング機構に用いられる。１個のスプライス変異体におけるイントロンは、他の変異体におけるエキソン（すなわち、スプライスされた転写産物に存在する）であり得ることは特記すべき事項である。故に、ＩＦＰをコードするスプライスされたｍＲＮＡには、エキソンおよびイントロンが含まれ得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
本明細書中に用いた、組合せとは、２個またはそれ以上の物（item）間の任意の関連を意味する。前記組合せは、２個の組成物または２個の集合物などの、２個またはそれ以上の別々の物であり得、２個またはそれ以上の物の単一の混合物などのその混合物、またはその任意の変形であり得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
本明細書中に用いた、プライマーとは、２個またはそれ以上、一般的には３個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み、それらからプライマー伸長産物の合成を開始することができるオリゴヌクレオチドを示す。合成を誘導するための実験条件には、ヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメレースなどの重合化および伸長のための試薬の存在、ならびに適当な緩衝液、温度およびｐＨが含まれる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
ＩＦＰを、利用可能であるかまたは作製され得る発現遺伝子配列および比較のための遺伝子配列（本明細書に記載のゲノム遺伝子配列または他の配列）である、提供されるどんな遺伝子または遺伝子クラスからも同定および作製することができる。例えば、ＩＦＰを、受容体型チロシンキナーゼ、受容体型セリン／スレオニンキナーゼおよびサイトカイン受容体を含むが、これらに限定されない細胞表面受容体から同定および作製することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８７】
ｂ．ＥｒｂＢ−３
ＥｒｂＢ−３はまた、ニューロンの生存およびシナプス形成の発達、星状細胞分化ならびにミクログリア活性化の調節に関わるＥＧＦ受容体ファミリーのメンバーである。ＥｒｂＢ−３のリガンドは、ＮＲＧ−１である。ＮＲＧ−１は、ＥｒｂＢ−３およびＥｒｂＢ−４の両方と結合することができるが、ＥｒｂＢ−３は、ＥｒｂＢ−４よりかなり低い親和性でＮＲＧ−１と結合する。ＥｒｂＢ−３は、ＥＧＦＲファミリーの他のメンバーと比較して、より低いチロシンキナーゼ活性を有する。それは、別のシグナリング分子、例えば、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼを集めることができる。ＥｒｂＢ−３の過剰発現は、乳癌、肺癌および膀胱癌および腺癌などの多くのヒトの癌に関係している。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２３】
ＣＳＲイソ型を複合体化し、処置を、例えば、生理学的に許容される賦形剤中、治療的有効量の複合体を投与することにより行う、医薬組成物を製造することができる。ＣＳＲイソ型複合体はまた、融合タンパク質としてＣＳＲイソ型複合体をコードする核酸を含むベクターを送達することなどにより、インビボ治療方法に用いられ得る。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６３】
口腔（舌下）投与に適する剤形には、例えば、フレーバー基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの中に活性成分を含むトローチ剤；および、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤中に前記成分を含むトローチが含まれる。
【国際調査報告】
2007525187.tif 000009
2007525187.tif 000010
2007525187.tif 000011
2007525187.tif 000012
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2007525187.tif 000015
2007525187.tif 000016