(57)【要約】  本発明は、骨石灰化を研究し、骨石灰化を調整する物質を同定するための組成物、化合物、装置、およびそれらの使用方法を開示する。化合物のスクリーニングおよび調査を行うための骨石灰化遺伝子プロファイルおよび識別特性の使用方法も開示する。治療および調査の両方の用途のための、骨石灰化を調節する試薬も提供する。
2007525953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨負荷が与えられた骨細胞の遺伝子発現プロファイルであって、該骨負荷がＷｎｔ経路モジュレーターによって調節されている、遺伝子発現プロファイル。
【請求項２】
ＣＯＸ−２、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、およびｅＮＯＳの遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項３】
表１〜５、１１、または１２の２つ以上の遺伝子を含む、請求項１に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項４】
前記Ｗｎｔ経路モジュレーターがアゴニストである、請求項１に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項５】
前記アゴニストがＧＳＫ−３阻害剤である、請求項４に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項６】
前記アゴニストが、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａ変異体、Ｗｎｔ３Ａミメティック、またはＷｎｔ３Ａアゴニストである、請求項４に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項７】
前記ＧＳＫ−３阻害剤が選択的ＧＳＫ−３阻害剤である、請求項５に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項８】
前記ＧＳＫ−３阻害剤が、塩化リチウムまたは薬学的に許容されるその塩、マレイミド、ムスカリン様アゴニスト、アロイシン（ａｌｏｉｓｉｎｅ）、ヒメニニジシン（ｈｙｍｅｎｉｎｉｄｉｓｉｎｅ）、あるいはイニジルビン（ｉｎｉｄｉｒｕｂｉｎ）である、請求項５に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項９】
前記マレイミドが、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、または３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈピロール−２，５−ジオンである、請求項８に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項１０】
前記遺伝子発現プロファイルが、培養細胞、または動物組織から得た細胞に由来する、請求項４に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項１１】
前記骨細胞が、前骨芽細胞、骨幹細胞、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、または間葉系系幹細胞、あるいはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の遺伝子発現プロファイル。
【請求項１２】
Ｗｎｔ経路調節物質を同定し、それによって骨リモデリングを調節する方法であって、
（Ａ）候補物質に曝露した骨細胞の遺伝子発現プロファイルを得るステップと、
（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記遺伝子発現プロファイルを、請求項１に記載の遺伝子発現プロファイルと比較し、それによって、Ｗｎｔ経路が調節されたかどうかを決定するステップとを含む、方法。
【請求項１３】
動物に機械的負荷が与えられて、前記骨細胞が前記動物から得られるか、または培養骨細胞に機械的負荷が与えられるかである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
機械的応力およびＷｎｔ経路モジュレーターが与えられたＨＢＭ細胞の遺伝子発現プロファイル。
【請求項１５】
骨荷重遺伝子発現プロファイルを作成する方法であって、
（Ａ）骨負荷に曝露していない骨細胞の第１の遺伝子発現プロファイルと、骨負荷に曝露した骨細胞の第２の遺伝子発現プロファイルと、骨負荷およびＷｎｔ経路モジュレーターに曝露した骨細胞の第３の遺伝子発現プロファイルとを得るステップと、
（Ｂ）前記第１、第２、および第３の遺伝子発現プロファイルを比較することによって、Ｗｎｔ経路モジュレーターによって調節される遺伝子の骨荷重遺伝子発現プロファイルを得るステップとを含む、方法。
【請求項１６】
前記骨細胞が、破骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、またはこれらの骨細胞の組み合わせである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｗｎｔ経路モジュレーターがＷｎｔ経路アゴニストである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｗｎｔ経路アゴニストが、ＧＳＫ−３阻害剤、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａミメティック、Ｗｎｔ３Ａアゴニスト、ＬＲＰ５アゴニスト、ＬＲＰ６アゴニスト、βカテニンアゴニスト、またはＤｋｋ１アンタゴニストである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法によって得られた、Ｗｎｔ経路モジュレーターによって制御される遺伝子を含む骨荷重遺伝子発現プロファイル。
【請求項２０】
骨負荷の関連するリモデリングを増強する物質をスクリーニングする方法であって、
（Ａ）前記物質を加えて培養され骨負荷に曝露された骨細胞の遺伝子発現プロファイルを得るステップと、
（Ｂ）ステップ（Ａ）の前記遺伝子発現プロファイルを、請求項１９に記載の骨荷重遺伝子発現プロファイルと比較するステップであって、前記Ｗｎｔ経路モジュレーターが対照Ｗｎｔ経路モジュレーターであるステップとを含む、方法。
【請求項２１】
前記参照Ｗｎｔ経路モジュレーターが、ＧＳＫ−３阻害剤またはＷｎｔ  ３Ａである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
候補物質を使用せずに評価される前記培養骨細胞がＨＢＭ骨細胞である請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記骨細胞が、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨幹細胞、間葉系系幹細胞、またはそれらの組み合わせである請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記骨細胞が骨芽細胞であり、骨芽細胞数および／または増殖に対する前記物質の効果が、［3Ｈ］−チミジンの混入、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の混入、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）アッセイ、またはアポトーシスアッセイによって測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項２０に記載のステップ（Ａ）および（Ｂ）で与えられる前記骨負荷が約５０με〜約５，０００μεの量の機械的負荷である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法によって同定された、低骨量状態を治療するための候補物質。
【請求項２７】
治療有効量の請求項２６に記載の候補物質を投与するステップを含む、骨石灰化疾患または障害の治療方法。
【請求項２８】
前記骨疾患または障害が、骨粗鬆症、骨折、軟骨形成異常、薬物性骨障害、高骨代謝回転、高カルシウム血症、骨化過剰症、変形性関節症、骨髄炎、およびパジェット病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記骨折が、股関節骨折、コーレス骨折、または椎骨粉砕骨折である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記薬物性障害が、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、ヘパリン誘発性骨粗鬆症、水酸化アルミニウム誘発性骨軟化症、抗痙攣薬誘発性骨軟化症、またはグルテチミド誘発性骨軟化症である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記候補物質が、ＧＳＫ−３アンタゴニスト、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａミメティック、Ｗｎｔ３Ａアゴニスト、Ｄｋｋ１アンタゴニスト、ＬＲＰ５アゴニスト、βカテニンアゴニスト、またはＬＲＰ６アゴニストである、請求項２５に記載の候補物質。
【請求項３２】
複数のプローブを含む組成物であって、前記プローブが、請求項１９に記載の骨荷重遺伝子発現プロファイルの核酸にアニールする核酸配列を含む、組成物。
【請求項３３】
前記複数のプローブが固体基体に取り付けられている、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記固体基体が、ビーズ、プレート、またはスライドである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記複数のプローブが、コネキシン４３、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、ＳＦＲＰ１、Ｊｕｎ、およびＦｏｓタンパク質をコードする核酸配列にアニールする核酸配列を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３６】
前記複数のプローブが、表１〜５、１１、または１２の遺伝子または遺伝子転写物の核酸配列にアニールする核酸配列を含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３７】
ＰＤＧＦＲＡ、ＭＥＴ、ＯＳＭＲ、ＩＴＧＢＬ１、ＣＴＧＦ、ＷＮＴ６、ＴＩＭＰ３、ＧＪＡ１、ＧＡＳ６、ＬＯＸ、ＭＹＢＬ１、ＴＨＢＳ１、ＩＴＧＢ５、ＣＴＳＫ、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＢＬＮ１、ＣＣＮＤ１、ＴＩＭＰ２、ＣＯＬ６Ａ３、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＷＩＳＰ２、ＦＺＤ２、ＳＦＲＰ４、ＩＧＦＢＰ６、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＬＳＰ１、ＣＸ３ＣＲ１、ＴＲＦＢＲ２、ＶＣＡＭ１、ＩＬ６、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＳＴＡＴ１、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＩＦＧ２Ｒ、ＩＧＦ２、ＳＰＡＲＣ、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１ｂ、ＴＮＦＳＦ１１、ＡＣＰ５、ＦＡＰ、ＭＣＣ、ＤＥＬＴＥＸ、ＥＰＨＢ２、ＣＮＫ１、ＥＲＢＢ３、ＧＲＯ１、ＭＹＣ、およびＷＮＴ１０Ｂの核酸配列にアニールするプローブをさらに含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項１または１４のいずれかの骨負荷発現プロファイルが得られる物質を投与するステップを含む、細胞中の骨石灰化を調節する方法。
【請求項３９】
前記物質が、Ｗｎｔアゴニスト、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａミメティック、Ｗｎｔ３Ａ変異体、Ｗｎｔ３Ａアゴニスト、Ｄｋｋアンタゴニスト、ＣＯＸ−２アンタゴニスト、ＬＲＰ５アゴニスト、ＬＲＰ６アゴニスト、ＧＳＫ−３アンタゴニスト、またはβカテニンアゴニストである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＧＳＫ−３アンタゴニストが、マレイミド、ムスカリン様アゴニスト、アロイシン、ヒメニニジシン、またはイニジルビンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マレイミドが、第２の骨リモデリング調節物質と組み合わせて投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第２の骨リモデリング調節物質が、副甲状腺ホルモン、エストロゲン、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、グルココルチコイド、カルシウム製剤、またはビスホスホネートである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
骨石灰化および／または骨リモデリングの調節を必要とする被験体の骨石灰化および／または骨リモデリングを調節する方法であって、請求項１９に記載の骨負荷発現プロファイルが得られる化合物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４４】
基体と、該基体に付着させた複数の免疫グロブリンとを含む組成物であって、前記免疫グロブリンが、表１〜５、１１、または１２の２種類以上のタンパク質を認識してこれらと結合する、組成物。
【請求項４５】
前記複数の免疫グロブリンが、表１〜５、１１、または１２の前記２種類以上のタンパク質を認識してこれらと結合する２種類以上の免疫グロブリンを含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記２種類以上のタンパク質が、ｅＮＯＳ、コネキシン４３、ＳＦＲＰ１、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、またはＣＯＸ−２である、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記基体が、マイクロチップ、ビーズ、プレート、スライド、またはチューブである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４８】
骨負荷の調節を研究するための組成物であって、
（Ａ）基体と、
（Ｂ）前記基体に付着された、複数の細胞溶解物とを含み、前記溶解物が、（ｉ）機械的応力を与えていない細胞、（ｉｉ）機械的応力に曝露した細胞、（ｉｉｉ）機械的応力を与えていないＨＢＭ細胞、（ｉｖ）機械的応力に曝露したＨＢＭ細胞、および（ｖ）Ｗｎｔ経路モジュレーターに曝露した前記細胞のいずれかに由来するものである、組成物。
【請求項４９】
前記基体が、マイクロチップ、ビーズ、プレート、スライド、またはチューブである、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
骨リモデリングおよび／または骨石灰化を調節するタンパク質と結合する試薬をスクリーニングする方法であって、
（Ａ）候補試薬を請求項４８に記載の組成物に結合させるのに好適な条件下で、候補試薬を請求項４８に記載の組成物に曝露するステップと、
（Ｂ）前記候補試薬が請求項４８に記載の組成物に結合したかどうかを調べ、請求項４８に記載の組成物のタンパク質が前記候補試薬と結合したかどうかをさらに調べるステップとを含む、方法。
【請求項５１】
化合物または組成物が、骨細胞活性／機能、および／または石灰化に対する骨負荷の効果を増強するかどうかを決定する方法であって、
（Ａ）前記化合物または前記組成物を細胞系に投与するステップと、
（Ｂ）その後、機械的刺激を前記細胞系に与えるステップと、
（Ｃ）前記細胞系から細胞溶解物を得るステップと、
（Ｄ）前記細胞溶解物中のタンパク質を請求項４４に記載の組成物と結合させるのに好適な条件下で、前記細胞溶解物を請求項４４に記載の組成物と接触させるステップと、
（Ｅ）ステップ（Ｄ）で得られたパターンを、機械的負荷刺激のみを与えた細胞の細胞溶解物から得られた発現パターンと比較することによって、前記化合物または前記組成物が、骨細胞活性／機能、および／または石灰化に対する骨負荷の効果を増強するかどうかを決定するステップとを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（記載なし）
【背景技術】
【０００２】
骨ミネラルの減少を伴う骨障害は、米国における高齢者の医療費および健康障害の大きな原因となっている。骨粗鬆症は、医療費がかさむ原因となる主要な症状である。
【０００３】
骨ミネラルの減少は、骨リモデリングのホメオスタシスと正常な血清カルシウム量の維持とのバランスがとれないことによって生じる。血清カルシウムは、腸内カルシウム吸収、腎排泄、および骨格動員の相互作用、あるいはカルシウムの取り込みに依存する。血清カルシウムは、全体カルシウムの１％未満であるが、この血清中濃度は正常な細胞機能を維持するために非常に重要である。
【０００４】
血清カルシウムは、３種類の主要ホルモンを調整し、これらによって調整される。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、カルシウムおよび骨ホメオスタシスの主要調節因子である。ＰＴＨは腎臓に作用して、カルシウム再吸収、ホスフェートの排泄、および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生成を増加させる。ＰＴＨは骨吸収を増加させる。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、骨吸収の強力な刺激物質であり、腸内カルシウム（およびホスフェート）吸収のさらに強力な刺激物質である。１，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、骨石灰化のためにも必要である。血清カルシウムの調整にかかわる第３のホルモンはカリシトニン（ｃａｌｉｃｉｔｏｎｉｎ）である。カルシトニンは、ＰＴＨおよび１，２５−ジヒドロキシビタミンＤよりも弱い程度でカルシウムホメオスタシスを調節する。
【０００５】
血清カルシウムおよび２つの主要な恒常性ホルモンの量を制御するために、多数のフィードバックループが機能する。副甲状腺細胞中および腎細胞中で同定され、細胞外カルシウムを感知する他の組織中でも見いだされているカルシウム感受性受容体、カルシウムホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす。低血清カルシウム量は、ＰＴＨ放出（および合成）の刺激を介して、直接１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ合成を刺激する。血清カルシウムレベルの上昇を防止するため、第２のフィードバックループの組が、ＰＴＨおよび１，２５ジヒドロキシビタミンＤの量を減少させるように作用する。これらのフィードバックループは、個々で消費されるカルシウム量とは無関係に、狭い生理学的範囲内に血清カルシウムを維持する。
【０００６】
カルシウムホメオスタシスおよびカルシウムのホルモンによる制御以外に、骨石灰化も細胞性骨リモデリングの影響を大きく受ける。骨は、細胞外マトリックス（大部分が石灰化されている）、コラーゲン、および細胞からなる。コラーゲン繊維はＩ型であり、骨中の全タンパク質の９０％を構成する。これらのコラーゲン繊維の内部には、ハイドロキシアパタイト［３Ｃａ3（ＰＯ4）2］・（ＯＨ）2の紡錘型または板状の結晶が存在する。これらの紡錘型または板状の結晶は、血清カルシウムおよびホスフェートから誘導されるリン酸カルシウム含有化合物である。ハイドロキシアパタイトは「基質」上にも見いだされている。この基質は、主として糖タンパク質およびプロテオグリカンで構成される。これらの高い陰イオン性の錯体は、高いイオン結合能力を有し、したがって石灰化において重要な役割を果たしていると考えられている。
【０００７】
コラーゲン以外に、骨リモデリングおよび石灰化において重要な役割を果たす数種類の細胞が存在する。骨の中の重要な細胞は破骨細胞および骨芽細胞（これは休止期骨芽細胞および骨細胞も含んでいる）である。破骨細胞は骨の吸収を担う細胞であり、造血幹細胞に由来する。骨芽細胞は局所的な間葉系細胞に由来し、骨形成に直接関与する。骨芽細胞は、パラクリン因子を介して破骨細胞の骨吸収を調節することで間接的に関与している。
【０００８】
骨は絶えず再生され続けており、これが骨リモデリングと呼ばれる。正常成人では、新しい骨は骨芽細胞によって形成される。新しい骨の増殖は、破骨細胞の骨吸収と一致する。骨の代謝回転の大部分は骨表面、特に骨内膜の表面で起こる。リモデリング速度は、個々の骨に対する物理的負荷、滑膜性の連結の近傍、または骨髄中の脂肪組織ではなく造血組織の存在に起因して位置が異なると異なり、さらに骨の種類によっても異なる。海綿骨のリモデリングは皮質骨の３〜１０倍速い。
【０００９】
リモデリングは、骨の代謝回転の基本多細胞単位または骨リモデリング単位（ＢＭＵ）と呼ばれる規則的な順序に従う。このサイクルにおいて、骨吸収は、破骨細胞の動員によって開始し、これらは、休止期骨芽細胞に由来するプロテイナーゼによって露出した基質に対して作用する。吸収小窩（すなわち、ハウシップ窩）が破骨細胞によって形成される。この小窩は、破骨細胞からリソソーム酵素がポケット内部に放出され基質が吸収されることによって得られる。この吸収段階の後に骨形成段階が続き、この段階で骨芽細胞によって小窩に類骨が充填される。次に類骨ハイドロキシアパタイトで石灰化されて新しい骨基質が形成される。このリモデリングサイクルのアンカップリングによって、有害な正味の骨の変化が生じることがあり、これが骨粗鬆症および他の骨石灰化障害において観察される。
【００１０】
骨ミネラルの減少は、骨折が生じるにもかかわらず、それ自体に臨床効果はない。骨粗鬆症または骨石灰化低下障害による骨折の好発部位としては、軽度外傷後の脊椎、手首、股関節、または骨盤の骨折が挙げられる。骨折は、前方高さの減少（すなわち楔状骨折）、中部脊椎の高さの減少（すなわち、タラ形椎）、または前方、中央、および後方の高さの減少（すなわち、圧迫骨折または粉砕骨折）において顕在化することもある。骨量減少を伴う他の疾患としては骨軟化症およびくる病が挙げられる。
【００１１】
骨の形成が増加しても、骨折が生じる場合がある。パジェット病は、骨の局所的部分で破骨細胞が活発になりすぎるために骨の代謝回転が増加する疾患である。リモデリングが増加することで、四肢の変形、骨痛、および骨折の危険性の増加が起こり得る。
【００１２】
現在、骨量減少を防止または抑制する方法としては、運動、女性の場合８００〜１２００ｍｇ／日の毎日の食事性カルシウムの摂取、およびカルシウム代謝に悪影響を与える（例えば、骨芽細胞の骨形成を阻害する）コルチコステロイド類の回避が挙げられる。カルシウム吸収不良が見られる場合には、ビタミンＤの補給が推奨され得る。女性の場合、エストロゲン補充療法も、ＩＬ−１およびＲＡＮＫなどのサイトカインの産生を減少させることによって破骨細胞形成を減少させるので、一般的な治療法である。最後に、ビスホスホネートは、骨量減少を治療するための有効な手段である。これらの化合物は、破骨細胞の機能を阻害することによって作用する。しかし、骨石灰化を向上させる治療は存在せず、既存の治療法は、罹患した集団の骨量減少の阻害においてはあまり有効ではない。大部分の治療法は、骨量減少の進行を遅延させるのみであり、罹患した個人は治療にもかかわらず骨の質量密度が低下し続ける。
【００１３】
血清カルシウムホメオスタシスおよび骨リモデリングホメオスタシスが複雑であること、これらを制御するフィードバック機構、および骨障害を治療するために使用することができる現行の治療方法を考慮すると、骨リモデリング障害を治療するためのさらに別の方法が必要である。骨リモデリングおよび石灰化を調節する物質をスクリーニングする方法も必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、骨リモデリングおよび／または石灰化を調節する新規な試薬の提供に関する。本発明はさらに、骨リモデリングを調節する新しく解明された経路であるＷｎｔ経路に基づいて骨リモデリングおよび／または石灰化を調節する化合物および組成物をスクリーニングすることができる新規リサーチツールを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様は、骨負荷がＷｎｔ経路モジュレーターによって調節されている、骨負荷を受けた骨細胞の遺伝子発現プロファイルに関する。この遺伝子発現プロファイルは、表１〜５または１２のいずれかの任意の２つ以上の遺伝子、あるいは、図１６の経路モデル中に含まれるそれらに由来する遺伝子およびタンパク質を含む。好ましくは、このＷｎｔ経路モジュレーターがＷｎｔ経路のアゴニストである。より好ましくは、このアゴニストは、ＧＳＫ−３阻害剤、あるいはＷｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａミメティック、またはＷｎｔ３Ａアゴニストである。他の好ましいモジュレーターについては本明細書で議論する。好ましいＧＳＫ−３阻害剤としては、塩化リチウムまたは他のリチウム塩、マレイミド、ムスカリン様アゴニスト、アロイシン（ａｌｏｉｓｉｎｅ）、ヒメニニジシン（ｈｙｍｅｎｉｎｉｄｉｓｉｎｅ）、またはイニジルビン（ｉｎｉｄｉｒｕｂｉｎ）が挙げられる。好ましいマレイミドは、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、または３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈピロール−２，５−ジオンである。
【００１６】
本発明の別の態様においては、本発明の遺伝子プロファイルは培養細胞、好ましくは骨細胞に由来する。好ましい骨細胞は、骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、前骨芽細胞、骨幹細胞、または間葉系系幹細胞、あるいはこれらの細胞のあらゆる組み合わせである。
【００１７】
本発明の別の目的は、Ｗｎｔ経路調節物質を同定し、それによって骨リモデリングを調節する方法であって、
（Ａ）候補物質に曝露した骨細胞の遺伝子発現プロファイルを作成するステップと、
（Ｂ）ステップ（Ａ）の遺伝子発現プロファイルを好ましい遺伝子発現プロファイルと比較し、それによって、Ｗｎｔ経路が調節されたかどうかを決定するステップとを含む方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の態様においては、本発明の遺伝子発現プロファイルは、培養細胞、または動物から得られる細胞（インビボ）に由来するものであってよい。これらの細胞は、好ましくは骨細胞または幹細胞であり、例えば骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞、または間葉系細胞である。得られるプロファイルとしては、機械的負荷をかけた細胞または負荷をかけていない細胞から得られるデータが挙げられる。さらに別のプロファイルを、高い骨量の表現型が得られるＬＲＰ５変異を発現する細胞（ＨＢＭ細胞）から得ることができる。
【００１９】
本発明のさらに別の目的は、骨荷重遺伝子発現プロファイルを作成する方法であって、
（Ａ）機械的応力にさらされていない骨細胞集団の遺伝子発現プロファイル、および機械的応力にさらされた骨細胞集団の遺伝子発現プロファイルを得るステップと、
（Ｂ）機械的応力にさらされていない遺伝子発現プロファイルを、機械的応力にさらされた遺伝子発現プロファイルと比較することによって、骨荷重遺伝子発現プロファイルを得るステップとを含む方法を提供することである。この方法は、
（Ｃ）Ｗｎｔ経路モジュレーターおよび機械的応力が与えられた骨細胞集団の遺伝子発現プロファイルを得るステップと、
（Ｄ）ステップ（Ｃ）の遺伝子発現プロファイルを、ステップ（Ａ）および（Ｂ）の遺伝子発現プロファイルと比較することによって、増強された骨荷重遺伝子発現プロファイルを得るステップとをさらに含むことができる。この方法は好ましくは、破骨細胞、骨芽細胞、または他の骨細胞を使用する。
【００２０】
本発明の別の態様においては、上記方法のモジュレーターがＷｎｔ経路アゴニストまたはアンタゴニストである。好ましいアゴニストとしては、Ｄｋｋアンタゴニスト（好ましくはＤｋｋ１アンタゴニスト）、Ｗｎｔ  ３Ａアゴニストまたはミメティック（およびＷｎｔ  ３Ａ）ＧＳＫ−３アンタゴニスト、ＬＲＰ５アゴニスト、ＬＲＰ６アゴニスト、βカテニンアゴニストが挙げられる。
【００２１】
本発明の別の目的は、機械的負荷によって骨リモデリングを強化する物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質の非存在下と候補物質の存在下とで得られた遺伝子発現プロファイルからのデータセットを比較することによって、培養骨細胞の負荷応答に対する候補物質の効果を測定するステップを含む方法を提供することである。好ましくはこのようなスクリーニングツールおよび方法は、基準化合物（コントロール）を含む。ポジティブコントロールとしては、例えばＧＳＫ−３阻害剤、および副甲状腺ホルモンおよびが挙げられる。他の基準サンプルは、本開示より明らかとなるであろう。
【００２２】
上記方法によって同定された物質は、骨粗鬆症、骨折、軟骨形成異常、薬物性骨障害、高骨代謝回転、高カルシウム血症、骨過形成、変形性関節症、骨髄炎、およびパジェット病などの症状および疾患の治療に使用することができる。好ましい骨折としては、限定するものではないが、股関節骨折、コーレス骨折、椎骨粉砕骨折が挙げられる。好ましい薬物性障害としては、限定するものではないが、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、ヘパリン誘発性骨粗鬆症、水酸化アルミニウム誘発性骨軟化症、抗痙攣薬誘発性骨軟化症、またはグルテチミド誘発性骨軟化症が挙げられる。
【００２３】
さらに別の態様においては、本発明は、骨荷重遺伝子発現プロファイルの遺伝子に対応する複数のプローブを含む組成物に関する。これらの複数のプローブは、好ましくは、コネキシン４３、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、ＳＦＲＰ１、Ｊｕｎ、およびＦｏｓ、あるいは表１〜５、１１または１２に記載されるあらゆる遺伝子の核酸配列に結合するプローブを含む。
【００２４】
本発明の別の態様は、上記骨負荷または機械的負荷発現プロファイルの１つが得られる試薬を使用して細胞中の骨石灰化を調節することを意図している。好ましい試薬は、限定するものではないが、例えばマレイミド、ムスカリン様アゴニスト、アロイシン、ヒメニニジシン、またはイニジルビンなどのＧＳＫ−３アンタゴニストである。Ｗｎｔ３Ａ、そのミメティック、またはそれらの機能的変異体、およびＷｎｔ３Ａアゴニストも好ましい。
【００２５】
別の態様において、これらの試薬は、既に承認されている治療法と併用することができる。例えば、Ｗｎｔ経路のアゴニストは、既存の骨石灰化調節物質と併用することができ、例えば、限定するものではないが、副甲状腺ホルモン、エストロゲン、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、選択的エストロゲン受容体モジュレーター、グルココルチコイド、カルシウム製剤、またはビスホスホネートなどと併用することができる。
【００２６】
本発明の別の目的においては、表１〜５、１１、または１２の遺伝子によってコードされる２種類以上のタンパク質と結合して認識する複数の試薬（例えば、免疫グロブリンまたは他のタンパク質結合リガンド）を含む組成物を提供する。これらの試薬によって認識され結合する好ましいタンパク質は、２種類以上のタンパク質であり、ｅＮＯＳ、コネキシン４３、ＳＦＲＰ１、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、およびＣＯＸ−２である。
【００２７】
本発明の別の態様は、骨負荷調節を研究するための組成物であって、（Ａ）基質と、（Ｂ）（ｉ）機械的応力を受けていない細胞、（ｉｉ）機械的応力を受けた細胞、（ｉｉｉ）機械的応力を受けていないＨＢＭ細胞、（ｉｖ）機械的応力を受けたＨＢＭ細胞、（ｖ）Ｗｎｔ経路モジュレーターを有する上記細胞のいずれか、からの２種類以上の溶解物である複数の骨細胞溶解物とを含む組成物を提供する。
【００２８】
次に、これらの組成物は、上記タンパク質と結合する試薬のスクリーニングに使用することができる。
【００２９】
本発明の別の目的は、ある化合物または組成物が、骨細胞活性／機能および／または石灰化に対する骨負荷の影響を強化するかどうかを調べる方法であって、
（Ａ）前記化合物または前記組成物を細胞系に与えるステップと、
（Ｂ）その後、機械的刺激を前記細胞系に与えるステップと、
（Ｃ）前記細胞系から細胞溶解物を取得するステップと、
（Ｄ）好適な条件下で前記細胞溶解物を固体基体（例えば、プレート、スライド、ビーズなど）と接触させて、前記細胞溶解物中のタンパク質を前記固体基体と結合させるステップと、
（Ｅ）ステップ（Ｄ）から得られたパターンを、機械的負荷刺激のみを与えた細胞の細胞溶解物から得た発現パターンと比較することによって前記化合物または前記組成物が、骨細胞活性／機能および／または石灰化に対する骨負荷の影響を強化するかどうかを決定するステップとを含む方法を意図している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書において開示される方法、組成物、およびアッセイは、骨石灰化障害および疾患の治療のための化合物および組成物の同定および分析、ならびにそれらの使用に関する。このような障害および疾患としては、限定するものではないが、骨発育障害、骨折（例えば、脊椎、股関節、手首、または骨盤の骨折、楔状骨折、圧迫骨折、および粉砕骨折）、年齢と関連する骨量減少、軟骨ジストロフィー（例えば、軟骨形成不全症、致死性骨異形成、ＦＧＦＲ−２の変異を伴うジャクソンワイス症候群、およびＦＧＦＲ−１の変異を伴うプファイファー症候群）、薬物性骨障害（例えば、グルココルチコイド誘発性骨量減少）、高骨代謝回転、高カルシウム血症、骨過形成、骨髄炎、骨粗鬆症、大理石骨病、中部脊椎、前方、中部、または後方の高さの減少、パジェット病、あるいは本明細書において議論されるあらゆる他の障害および疾患が挙げられる。
【００３１】
（１．定義および略語）
（１．１  定義）
「被験体」とは、あらゆる動物を意味する。好ましい動物としては、鳥類、魚類、哺乳類、および齧歯類が挙げられる。動物の他の分類としては、家畜動物または農業用動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、およびウズラなどの家禽、ならびにブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、バッファローなど）が挙げられる。好ましい哺乳類としては、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、および霊長類であり、好ましい霊長類はヒトである。
【００３２】
「物質」または「試薬」は、好ましくはＷｎｔ経路またはそのメンバーを調節する化合物または組成物を含むことを意味している。
【００３３】
「基準化合物」は、コントロールとして機能することができ、Ｗｎｔ経路、より好ましくはＷｎｔ経路および骨リモデリングの両方を調節する化合物を含むことを意味している。基準化合物としては、限定するものではないが、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）およびＧＳＫ阻害剤が挙げられる。
【００３４】
「調節する」または「制御する」とは、タンパク質、タンパク質をコードする核酸、経路（例えばＷｎｔ経路）、経路内のタンパク質などの活性のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションによって変化させる能力を意味する。
【００３５】
「骨細胞の調節」は、骨密度および／または骨石灰化の調節を含むことを意味している。骨細胞の調節は、骨石灰化、アルカリホスファターゼの誘導、または骨芽細胞の誘導における変化を評価することによってインビトロで決定することができる。インビボでの骨調節は、インビトロで研究されているものと同じあらゆる方法によって、ならびに、骨のスキャンによる骨の質量密度の変化、あるいはβカテニン、または本明細書において議論される骨調節に関する他のマーカーに関して組織サンプルを染色することによるＷｎｔ経路活性の変化を調べることによって、評価することができる。
【００３６】
用語「力」、「負荷」、「応力」、および「ひずみ」は、本明細書において交換可能に使用され、身体の位置を維持または変化させる、またはそれをひずませる傾向にある力学的なあらゆる作用である力の原理と関係するものであり、この用語は本明細書において負荷と交換可能に使用される。単位面積当たりの大きさとしての力は、「応力」として定義され、これは本明細書においては「機械的応力」とも記載され、どのように力（負荷）が加わるかによって圧縮、引張、または剪断として分類することができる。具体的には、負荷が加わって材料が短くなる場合には圧縮応力が発生し、一方、材料が延伸される場合には引張応力が発生する。剪断応力は、材料の一領域が隣接する領域に対して摺動する場合に発生する。応力の結果は、変形として定義され、相対的な変形または長さの変化の％値を「ひずみ」と呼ぶ。例えば材料が、その元の長さの１０１％まで延伸される場合、これは０．０１または１％のひずみを有する。ひずみは単位を有さないので、これは、０．０１のひずみが１％変形に等しい場合の相対変形として、またはマイクロストレインで記載される場合には１０，０００マイクロストレインが０．０１ひずみまたは１％変形と等しい場合として報告される（Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ，１４：５９５−６０８（１９９３））。
【００３７】
「Ｗｎｔ経路」は、Ｗｎｔタンパク質活性の下流または上流のあらゆるタンパク質を含むことを意味する（図１６参照）。例えば、これは、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、Ｄｋｋ、ＧＳＫ−３、Ｗｎｔ１０Ｂ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ３（例えば、Ｗｎｔ  ３Ａ）、Ｗｎｔ１、または本明細書において議論されるあらゆる他のタンパク質、ならびにこれらのタンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。Ｗｎｔ経路の記述は、骨リモデリングに含まれるＷｎｔの下流の全ての経路、例えば、ＬＲＰ５またはＨＢＭ経路、Ｄｋｋ経路、βカテニン経路、ＭＡＰＫＡＰＫ２経路、ＯＰＧ／ＲＡＮＫ経路などを含むことも意味する。
【００３８】
「ＧＳＫ阻害剤」とは、ＧＳＫ活性を阻害するあらゆる物質を意味する。このようなものとしては、非選択的ＧＳＫ阻害剤、例えばＬｉＣｌまたは他のリチウム塩、ならびに選択的ＧＳＫ阻害剤を挙げることができる。好ましいＧＳＫ阻害剤はＧＳＫ−３阻害剤である。より好ましいＧＳＫ阻害剤はＧＳＫ−３アイソフォーム特異的阻害剤、例えばＧＳＫ−３βまたはＧＳＫ−３αの阻害剤である。さらに別の阻害剤としては、限定するものではないが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいはそれらの免疫原性活性フラグメント、ペプチドアプタマー、ＧＳＫ結合タンパク質、ＧＳＫ核酸に対するアンチセンス分子、ＲＮＡ干渉分子、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイム、およびペプチドが挙げられる。
【００３９】
「Ｄｋｋ１アンタゴニスト」は、限定するものではないが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体、あるいはそれらの免疫原性活性フラグメント、ペプチドアプタマー、ＧＳＫ結合タンパク質、ＧＳＫ核酸に対するアンチセンス分子、ＲＮＡ干渉分子、モルホリノオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、リボザイム、およびＷｎｔ経路においてＤｋｋ１活性を阻害するペプチドを含むことを意味している。
【００４０】
「Ｗｎｔ  ３Ａ  アゴニスト」は、Ｗｎｔ  ３Ａの合成および／または活性をアップレギュレートする試薬を含むことを意味している。「Ｗｎｔ  ３Ａミメティック」とは、好ましくは実施例９に見られるような方式でＷｎｔ３Ａと活性が類似している分子を意味する。「Ｗｎｔ  ３Ａ変異体」は、負荷が与えられた場合にＷｎｔ／βカテニン応答とともに活性化を増大させることができるあらゆる機能性変異体を含む。
【００４１】
「骨障害」および「骨疾患」は、被験体の骨石灰化ホメオスタシスが悪い方向に乱れる障害を含むことを意味している。悪い方向の混乱は、骨石灰化の増加および骨石灰化の減少の形態であってよい。骨障害としては、本明細書において議論されるあらゆる障害が挙げられる。好ましい骨障害としては、骨量の減少、または骨石灰化ホメオスタシスの低下が挙げられる。例えば、好ましい骨の障害および疾患としては、限定するものではないが、骨粗鬆症、骨折、軟骨形成異常、薬物性骨障害、高骨代謝回転、高カルシウム血症、骨過形成、変形性関節症、骨髄炎、およびパジェット病が挙げられる。好ましい骨折としては、限定するものではないが、股関節骨折、コーレス骨折、または椎骨粉砕骨折が挙げられる。好ましい薬物性障害としては、限定するものではないが、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、ヘパリン誘発性骨粗鬆症、水酸化アルミニウム誘発性骨軟化症、抗痙攣薬誘発性骨軟化症、またはグルテチミド誘発性骨軟化症が挙げられる。
【００４２】
「骨細胞」は、組織培養から得られた細胞（「培養細胞）または骨組織から得られた細胞を含むことを意味している。このような細胞としては、限定するものではないが、骨芽細胞、前骨芽細胞、骨幹細胞、破骨細胞、骨細胞、間葉系系幹細胞、またはそれらのあらゆる組み合わせが挙げられる。骨組織は、これらの細胞の組み合わせを含むことを意味し、骨生検から得ることができる。
【００４３】
「骨リモデリング」とは、骨の成長および代謝回転の過程を意味する。「骨リモデリング物質」とは、骨リモデリングを調節する化合物または組成物を意味する。好ましくはこの物質は、骨リモデリングを増強させ、それによって骨石灰化を向上させ骨吸収を抑制する。したがって、このような物質は、「骨石灰化モジュレーター」を含むこともできる。骨リモデリングはインビボおよびインビトロの両方で研究することができる。
【００４４】
「骨石灰化」とは、骨中でハイドロキシアパタイトが形成される過程を意味する。骨石灰化を調節する試薬が本明細書において考慮され、この場合、骨中で形成されるハイドロキシアパタイトの量が調節される。例えば、骨石灰化アゴニストは、ハイドロキシアパタイト形成量をそれを必要とする被験体中で増加させるアゴニストである。骨リモデリングは、インビボおよびインビトロの両方で研究することができる。
【００４５】
「ＬＲＰ５経路」および「ＨＢＭ経路」は、ＬＲＰ５またはＨＢＭミュータント、および骨リモデリングに関連するシグナリングに関与するＬＲＰ５またはＨＢＭミュータントの下流のタンパク質を含むあらゆるタンパク質／遺伝子を意味する。好ましい本発明の物質は、骨量減少が関連する障害の治療に有用なＬＲＰ５経路のアゴニストである。関連するＬＲＰ６経路のアゴニストである物質も考慮される。ＬＲＰ５とＬＲＰ６との類似性が高いので、ＬＲＰ５およびＨＢＭの調節に関する全ての言及は、ＬＲＰ６に関するものも考慮している。
【００４６】
「ＨＢＭ」は、高い骨量、およびＨＢＭ１家系と関連する表現型を含むことを意味している。ヒトＬＲＰ５においては、ＨＢＭ１家系において観察される表現型が得られるＧ１７１Ｖの変異が存在する。しかしこの部位におけるあらゆる変異は、ヒトＬＲＰ５遺伝子、またはあらゆる哺乳類ＬＲＰ５遺伝子、またはＬＲＰ６のβプロペラ中の同等の部位にあると考えられる。
【００４７】
「ＨＢＭ表現型」は、ＨＢＭ１家系で観察されるような表現型が得られるあらゆる変異を含むことを意味している。これらの変異は、ヒトＬＲＰ５の残基１７１、またはＬＲＰ５における他の部位、または動物において発現される場合に高骨量が誘発されるＬＲＰ６における類似の部位にあってよい。
【００４８】
「βカテニン経路」とは、βカテニン、および骨リモデリングと関連するシグナリングに関与するβカテニンの下流のタンパク質を含むあらゆるタンパク質／遺伝子を意味する。本発明の好ましい物質は、βカテニン経路を活性化する物質（すなわちβカテニンアゴニスト）である。
【００４９】
「ＭＡＰＫＡＰＫ２経路」とは、ＭＡＰＫＡＰＫ２、および骨リモデリングと関連するシグナリングに関与するＭＡＰＫＡＰＫ２の下流のタンパク質を含むあらゆるタンパク質／遺伝子を意味する。
【００５０】
「ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ経路」とは、ＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ、ならびに骨リモデリングと関連するシグナリングに関与するＯＰＧおよびＲＡＮＫＬの下流のタンパク質を含むあらゆるタンパク質／遺伝子を意味する。
【００５１】
「Ｄｋｋ経路」は、Ｗｎｔ経路の一部であるＤｋｋ−１およびＬＲＰ５および／またはＬＲＰ６の相互作用に関与するあらゆるタンパク質／遺伝子を含むことを意味している。Ｄｋｋ−１はＬＲＰ５活性を阻害する。したがって骨量減少障害の場合、Ｄｋｋ−１アンタゴニストが好ましい。
【００５２】
「タンパク質」とは、ペプチド結合によって互いに結合したアミノ酸残基のポリマーを意味する。本明細書において使用される場合、この用語は、任意の大きさ、構造、または機能のタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを意味する。しかし典型的には、タンパク質は少なくとも６個のアミノ酸の長さである。好ましくは、タンパク質が短いペプチドである場合、少なくとも約１０アミノ酸残基の長さとなる。また「タンパク質」は、天然、組換え、または合成のタンパク質を含んでいる。この用語を使用して、タンパク質フラグメントを指す場合もある。タンパク質は、１分子であってもよいし、複数分子の複合体であってもよい。タンパク質という用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の人工的化学類似体である、アミノ酸ポリマーにも適用することができる。１つ以上のアミノ酸残基が「非天然の」アミノ酸であり、全ての天然アミノ酸に対応していないアミン酸ポリマーも、用語「タンパク質」の使用に含めることができる。好ましくはタンパク質は、骨リモデリングおよび／または骨石灰化に関する生物活性を有する。
【００５３】
「タンパク質のフラグメント」または「タンパク質フラグメント」は、別のタンパク質の一部であるタンパク質／ポリペプチドを意味する。例えば、タンパク質のフラグメントは、培養細胞から単離された全長タンパク質を消化することで得られたポリペプチドであってよい。タンパク質のフラグメントは典型的には少なくとも６個のアミノ酸を含む。より典型的には、フラグメントは少なくとも１０個のアミノ酸を含む。好ましくは、フラグメントは少なくとも約１６個のアミノ酸を含む。このようなタンパク質フラグメントは好ましくは生物活性を有する。このような生物活性は、好ましくは、骨石灰化の調節につながるＷｎｔ経路の調節である。
【００５４】
「免疫グロブリン」は、抗体、抗体フラグメント、および抗体の一部である組換えタンパク質を含むことを意味している。用語「抗体」の使用は、天然、あるいは全体または一部が合成によって生成された免疫グロブリンを意味している。抗原と特異的に結合する能力を維持するそれらのあらゆる誘導体もこの用語に含まれる。この用語は、免疫グロブリンの結合領域と同じまたは大部分が同じである結合領域を有するあらゆるタンパク質も含んでいる。これらのタンパク質は、自然源から誘導されてもよいし、部分的または完全に合成されてもよい。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。抗体は、あらゆる免疫グロブリンクラス、例えばあらゆるヒトのクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ、ならびにサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）のメンバーであってよい。しかしＩｇＧクラスの誘導体が、本発明において好ましい。
【００５５】
用語「抗体フラグメント」とは、全長よりも短い抗体のあらゆる誘導体を意味する。好ましくは、抗体フラグメントは、全長抗体の特異的結合能力の少なくとも実質的な部分を維持する。抗体フラグメントの例としては、限定するものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）、およびＦｄフラグメントが挙げられる。抗体フラグメントはあらゆる手段によって生成することができる。例えば、抗体フラグメントは、無傷の抗体の断片化によって酵素的または化学的に生成することができるし、あるいは、部分抗体配列をコードする遺伝子からの組換えによって生成することもできる。あるいは、抗体フラグメントは、全体または一部を合成することによって生成することもできる。抗体フラグメントは、場合によっては１本鎖の抗体フラグメントであってよい。あるいは、フラグメントは、例えばジスルフィド結合などによって互いに結合した複数の鎖を含むこともできる。フラグメントは、場合により多分子複合体であってもよい。機能性抗体フラグメントは、典型的には少なくとも約５０個のアミノ酸を含み、より典型的には少なくとも約２００個のアミノ酸を含み、あるいはこれらの値のあらゆる長さとなる。
【００５６】
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓｃＦｖｓ」）は、ポリペプチドリンカーによって互いに共有結合した軽鎖可変領域（ＶL）および重鎖可変領域（ＶH）のみからなる組換え抗体フラグメントである。ＶLまたはＶHのいずれかがＮＨ2末端領域であってよい。このポリペプチドリンカーは、重大な立体障害なしに２つの可変領域を架橋させる限り、種々の長さおよび組成を有することができる。典型的には、このリンカーは、主としてグリシン残基およびセリン残基で構成され、溶解性のためにある程度グルタミン酸残基またはリジン残基が散在している。
【００５７】
「二重特異性抗体」は、二量体のｓｃＦｖｓである。ダイアボディの構成要素は、典型的には、ほとんどのｓｃＦｖｓよりも短いペプチドリンカーを有し、これらは二量体として会合していることが好ましい。
【００５８】
「Ｆｖ」フラグメントは、非共有相互作用によって互いに維持される１つのＶH領域および１つのＶL領域からなる抗体フラグメントである。本明細書において用語「ｄｓＦｖ」は、ＶH−ＶLの組を安定化させるための改変された分子間ジスルフィド結合を有するＦｖを指すために使用される。
【００５９】
「Ｆ（ａｂ’）2」フラグメントは、ｐＨ４．０〜４．５において酵素ペプシンで消化することによって免疫グロブリン（典型的にはＩｇＧ）から得られるものと実質的に同じ抗体フラグメントである。このフラグメントは組換えによって生成することもできる。
【００６０】
「Ｆａｂ」フラグメントは、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント中の２つの重鎖断片を連結する１つ以上のジスルフィド架橋の還元によって得られるものと実質的に同じ抗体フラグメントである。このＦａｂ’フラグメントは組換えによって生成することもできる。
【００６１】
「Ｆａｂ」フラグメントは、免疫グロブリン（典型的にはＩｇＧ）を酵素パパインで消化することによって得られるものと実質的に同じ抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは組換えによって生成することもできる。Ｆａｂフラグメントの重鎖セグメントはＦｄ断片である。
【００６２】
用語「タンパク質捕捉剤」は、タンパク質と結合することができる分子または多分子複合体を意味する。タンパク質捕捉剤は、好ましくは、実質的に特異的な方式でそれらの結合相手と結合する。解離定数（ＫD）が約１０-6未満であるタンパク質捕捉剤が好ましい。抗体または抗体フラグメントは、タンパク質捕捉剤として非常に好適である。抗原も、抗体と結合できるため、タンパク質捕捉剤として機能することができる。タンパク質リガンドと結合する受容体は、可能性のあるタンパク質捕捉剤の別の例である。非共有相互作用を介してそれらの結合相手と相互作用するだけである物質に、タンパク質捕捉剤が限定されるものではないことを理解されたい。場合によってはタンパク質捕捉剤は、結合するタンパク質と共有結合してもよい。例えば、タンパク質捕捉剤は、結合相手と結合した後で光架橋させることができる。
【００６３】
用語「結合相手」とは、特定のタンパク質捕捉剤と、好ましくは実質的に特異的な方法で、結合するタンパク質を意味する。場合によっては、結合相手は、タンパク質捕捉剤であるタンパク質とインビボで通常結合するタンパク質であってよい。しかし、別の実施形態においては、結合相手は、それによってタンパク質捕捉剤が選択される（インビトロまたはインビボの選択）、または産生される（抗体の場合など）タンパク質またはペプチドであってよい。結合相手は、２つ以上のタンパク質捕捉剤によって共有されてもよい。例えば、種々のポリクローナル抗体と結合する結合相手は、多数のエピトープを有することができる。１つのタンパク質捕捉剤が多数の結合相手と結合することもできる（例えば、複数の結合相手が同じエピトープを共有する場合）。
【００６４】
「タンパク質の結合に好適な条件」とは、溶液中でタンパク質とその結合相手との間で結合が起こる条件（塩濃度、ｐＨ、界面活性、タンパク質濃度、温度などに関する）を意味する。好ましくは、これらの条件は、有意量の非特異的タンパク質結合が起こるほど緩い条件ではない。
【００６５】
「アレイ」は、基体上のパターンの配列のことである。このパターンは多くの場合二次元パターンであるが、アレイ基体に材料をより多く適用するため、このパターンが三次元パターンであってもよい。
【００６６】
用語「基体」とは、本発明のアレイの塊状材料、下層の材料、およびコア材料を意味する。この基体は、核酸、抗体、免疫グロブリン、およびその他の化合物が固定される材料である。
【００６７】
用語「微細機械加工」および「微細加工」の両方は、微細構造（サブミリメートルの特徴の寸法を有する構造）の形成に有用な多数の技術を意味する。このような技術としては、限定するものではないが、レーザーアブレーション、電着、物理蒸着および化学蒸着、フォトリソグラフィ、ならびに湿式化学エッチングおよび乾式エッチングが挙げられる。射出成形およびＬＩＧＡ（例えば、Ｘ線リソグラフィ、電着、および成形）などの関連技術も含まれる。これらの技術のほとんどは、半導体、マイクロエレクトロニクス、および、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）において使用するために本来開発されているが、本発明にも十分適用可能である。
【００６８】
用語「被膜」とは、基体表面に自然にまたは合成によって形成または塗布された層を意味する。例えば、シリコンなどの基体を空気に曝露すると、曝露した面が酸化される。シリコンでできた基体の場合、空気に曝露することによって表面上に酸化ケイ素被膜が形成される。別の場合では、被膜は基体からは誘導されず、機械的、物理的、電気的、または化学的な手段によって表面に被膜を配置することができる。この種の被膜の例は、シリコンまたはポリマーの基体に適用される金属被膜、あるいはシリコン基体に適用される窒化ケイ素被膜である。被膜はあらゆる厚さであってよいが、典型的には被膜は、基体の厚さよりも薄い厚さを有する。
【００６９】
「中間層」は、第１の被膜と基体との間にある追加の被膜または層である。場合により複数の中間層を合わせて使用することができる。典型的な中間層の主目的は、第１の被膜と基体との間の接着を促進することである。例えば、シリコンまたはガラスの基体に金被膜を接着するためにチタンまたはクロムの中間層が使用される。しかし、中間層の他の実現可能な機能も予期される。例えば、ある中間層は、アレイの検出システムにおいてある役割を果たすことができる（例えば、非伝導性基体と非伝導性被膜との間の半導体または金属層など）。
【００７０】
「アフィニティータグ」は、有機薄膜の露出した官能基に直接的または間接的にポリペプチドを固定することができる官能性部分を意味する。好ましくは、アフィニティータグは、部位特異的な固定が可能であり、それによってポリペプチドまたは核酸の有機薄膜上への方向性が向上する。場合によっては、アフィニティータグは単純な化学官能基であってよい。他の可能性としては、核酸、アミノ酸、ポリ（アミノ酸）タグ、または全長タンパク質が挙げられる。さらに別の可能性としては炭水化物および核酸が挙げられる。例えば、アフィニティータグは、ポリヌクレオチドであってよく、これが、有機薄膜上の官能基として機能する別のポリヌクレオチド、またはアダプターとして機能する別のポリヌクレオチドとハイブリダイズする。アフィニティータグは合成化学部分であってもよい。各パッチの有機薄膜が脂質二重層または単層を含む場合は、膜アンカーが好適なアフィニティータグとなる。アフィニティータグは、タンパク質と共有結合してもよいし、非共有結合してもよい。例えば、アフィニティータグがポリペプチドと共有結合する場合、化学共役を介して結合することもあるし、融合タンパク質として結合することもある。アフィニティータグは、開裂可能な結合を介してタンパク質と結合することもできる。あるいは、アフィニティータグは、ポリペプチドと直接接触しなくてもよい。その代わりにアフィニティータグが、アダプターによってタンパク質から分離していてもよい。アフィニティータグは、非共有相互作用または共有結合のいずれかを介して、タンパク質を有機薄膜に固定することができる。
【００７１】
本発明の目的では「アダプター」は、アレイのパッチの固定されたタンパク質とアフィニティータグとを連結するあらゆる要素であってよい。アダプターは、かならずしも必要ではないが、アフィニティータグとタンパク質との両方に非共有結合する別個の分子であってもよい。この代わりに、アダプターは、アフィニティータグまたはタンパク質、あるいは両方と共有結合することもできる（例えば、化学共役を介して、または融合タンパク質として）。全長タンパク質などのタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが典型的なアダプターである。他の可能性のあるアダプターとしては炭水化物および核酸が挙げられる。
【００７２】
用語「融合タンパク質」は、２つ以上のポリペプチドで構成され、典型的には本来の状態では連結していないが、ペプチド結合を介してそれぞれのアミノ末端およびカルボキシル末端で連結して、１つの連続したポリペプチドを形成しているタンパク質を意味する。２つ以上のポリペプチド成分は、直接連結する場合もあるし、ペプチドリンカー／スペーサーを介して間接的に連結する場合もあるものと理解されたい。
【００７３】
用語「通常の生理学的条件」とは、生物または細胞の内部で典型的である条件を意味する。一部の器官または生物では極限条件が得られることが認識されているが、生物内および細胞内の環境は通常ｐＨ７付近（すなわちｐＨ６．５〜ｐＨ７．５）で変動し、主要溶媒として水を含有し、０℃を超え５０℃未満の温度で存在する。種々の塩の濃度は、基準として使用される器官、生物、細胞、または細胞区画に依存することが認識されている。通常の生理学的条件は、骨組織および骨細胞の負荷がかけられた状態または負荷がかかっていない状態の両方をさらに含むことができる。
【００７４】
「プロテオミクス」とは、プロテオームまたはプロテオームの一部のいずれかの研究または特徴を意味する。「プロテオーム」は、細胞または細胞集団の細胞内タンパク質、および細胞または細胞集団によって分泌されるタンパク質の全コレクションである。この特性決定は、最も典型的には、その存在の測定、および通常は、細胞によって発現されたタンパク質の量が上げられる。そのタンパク質の機能、構造特性（翻訳後修飾など）、および細胞内の位置も研究される。「機能的プロテオミクス」とは、細胞または細胞集団のタンパク質発現産物の機能的特性、活性レベル、および構造特性の研究を意味する。
【００７５】
（１．２略語）
【表１Ａ】
2007525953.tif 000003
【表１Ｂ】
2007525953.tif 000004
【表１Ｃ】
2007525953.tif 000005
【表１Ｄ】
2007525953.tif 000006
【表１Ｅ】
2007525953.tif 000007
【表１Ｆ】
2007525953.tif 000008
【００７６】
（２．骨負荷遺伝子発現プロファイル）
本発明の新しい一態様は、Ｗｎｔ経路が骨石灰化ホメオスタシスに含まれること、この経路を調節することによって、さらに石灰化を調節することが可能であることを解明することである。インビボおよびインビトロの両方のアッセイを使用して、骨負荷の遺伝子発現プロファイルを解明した。最も典型的には、遺伝子発現プロファイル（すなわち、どの遺伝子がアップレギュレートおよびダウンレギュレートされるかの同定）、さらに特に、Ｗｎｔシグナリング経路の活性化と直接的または間接的に関連する多種多様の遺伝子に対する遺伝子識別特性プロファイル（すなわち、互いに対してアップレギュレートおよびダウンレギュレートした遺伝子転写量）を作成した。
【００７７】
本明細書に開示される遺伝子発現分析（後出の項および実施例を参照されたい）を実施すると、多数の遺伝子、特にＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、コネキシン４３、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、およびＳＦＲＰ１（さらに別の遺伝子は後出の表に示している）などが骨付加および骨付加の増加に応答してアップレギュレートすることを発見した。さらに、βカテニンが、標準的なＷｎｔ経路における必須成分であることが分かった。この経路が活性化されると、βカテニンがリン酸化されなくなる。リン酸化されない形態のβカテニンが、細胞質中に蓄積し、核内に移行する。核内では、βカテニンは、ＴＣＦおよびＬＥＦなどの標的転写因子の阻害物質を軽減することができ、それによって転写が活性化される。
【００７８】
シグナリング経路アゴニスト（すなわち、Ｗｎｔ経路アゴニスト）としては、限定するものではないが、ＧＳＫ阻害剤が挙げられる。さらに別のシグナリング経路阻害剤としては、限定するものではないが、Ｗｎｔ３Ａ、Ｗｎｔ３Ａミメティック、Ｗｎｔ３Ａアゴニスト、ＰＫＣ阻害剤（例えば、ＳＱ２２５３６）、ＰＫＡ阻害剤（例えば、Ｈ８９、カルビオケム）、ＭＥＫ１／２阻害剤（例えば、カルビオケムのＵ０１２６、ＰＤ９８０５９）、Ｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤（例えば、ＳＢ２０３５８０、カルビオケム）、ＪＮＫ阻害剤（カルビオケムのＳＰ−６００１２５）、ＭＡＰＫＡＰＫ２阻害剤（カルビオケムＣａｔ．Ｎｏ．３８５０８８０）、カルシウム動態阻害剤（例えば、ＴＭＢ−８塩酸塩）、Ｇタンパク質共役シグナリング阻害剤（例えば、百日咳毒素）、酸化窒素シンセターゼ阻害剤（例えば、Ｌ−ＮＡＭＥ）、およびＣＯＸ−２阻害剤（例えば、ＮＳ−３９８、インドメタシン）が挙げられる。
【００７９】
したがって、上述のアゴニストおよびアンタゴニストの両方を、（１）Ｗｎｔ経路、（２）骨ホメオスタシスと関連するＷｎｔ経路シグナリング、（３）骨ホメオスタシスに関するＷｎｔ経路の制御、（４）Ｗｎｔ経路シグナリングと連動する他のシグナリング経路の寄与、（５）インビボおよびインビトロの両方での骨負荷応答および遺伝子発現プロファイル、ならびに（６）骨ホメオスタシスおよびそれらの調節を研究するためのリサーチツールとして使用することができる。これらの試薬は、例えば、新規な骨同化遺伝子標的の同定に使用することができ、これらは骨ホメオスタシス調節の必要な被験体の治療にも使用することができる。例えば、Ｗｎｔ経路アゴニストは骨量減少の治療に使用することができ、Ｗｎｔ経路アンタゴニストは、大理石骨病に見られるような骨石灰化の増加を伴う障害の治療に使用することができる。
【００８０】
（２．１遺伝子発現プロファイリング）
遺伝子発現プロファイリングは、遺伝子のＲＮＡへの転写を分析することによって実施される。これを実施するための好ましい方法は、リアルタイムＰＣＲおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）法による方法である。リアルタイムＰＣＲによって、特に刺激直後の時点での、刺激に対する応答における転写プロファイルおよび遺伝子転写識別特性の、迅速で再現性のある決定方法が得られる。したがってこの方法は、骨負荷に対する骨細胞の応答の分析に特に有用である。検出される信号は、反応におけるＰＣＲ産物量に正比例する。各サイクルにおける蛍光発光量を記録することによって、ＰＣＲの対数期中のＰＣＲ反応を関しすることが可能となり、ここで、ＰＣＲ産物の初期の顕著な増加は、ターゲットテンプレートの初期量と相関がある。
【００８１】
したがって、リアルタイムＰＣＲと、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術の使用とによって、全てのプライマーセットで同じ温度サイクルパラメータが使用されるのであれば、同じプレート上の複数の標的の分析も可能となる。したがって、骨応力刺激に対する応答においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートすることが示されている遺伝子などの複数の遺伝子その分析を評価することができる。リアルタイムＰＣＲの使用方法は、本明細書および実施例に開示している。別の方法も当業者に周知となっている。例えば、ＲＡＰＩＤ  ＣＹＣＬＥ  ＲＥＡＬ−ＴＩＭＥ  ＰＣＲ：ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ，Ｓ．Ｍｅｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ２００１）、ならびにＲＡＰＩＤ  ＣＹＣＬＥ  ＲＥＡＬ−  ＴＩＭＥ  ＰＣＲ−ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｗ．Ｄｉｅｔｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  ２００２）を参照されたい。
【００８２】
リアルタイムＰＣＲが、遺伝子発現プロファイリング実施のために好ましい方法であるが、ＲＮＡの分析および定量の別の方法を使用することもできる。ＲＮＡ発現を分析するための別の手段も当分野において周知であり、例えば、ｅＴＡＧ（アクララ・バイオサンエンシズ（ＡＣＬＡＲＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼ分析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、およびウエスタンブロット（タンパク質量の変化を見る）が挙げられる。これらのアッセイを実施する方法は当分野において周知である。例えば、ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥｓ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｈａｒｌｏｗ，ＥｄおよびＬａｎｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）；およびＭａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８２）を参照されたい。
【００８３】
遺伝子発現プロファイリングは、骨荷重のインビトロ分析、および骨組織から得られた細胞の転写のインビボ分析のために、培養して増殖させた細胞に対して実施することができる。インビボおよびインビトロ分析の両方のために骨に刺激を与える方法を、以下に詳細に議論する。簡潔に述べると、遺伝子発現プロファイルおよび識別特性は、未負荷の細胞、負荷を与えた細胞、Ｗｎｔ経路を調節する物質を与えた細胞、安静時および負荷を与えたＨＢＭ細胞、ならびにＨＢＭトランスジェニック（ＴＧ）動物または正常動物のいずれかの事前の分類からの細胞から求めた。各細胞集団から得た遺伝子発現プロファイルを編集することよって、物質のスクリーニングをあらかじめ形成することによる１つの遺伝子プロファイルおよび遺伝子識別特性の組と、実際の骨刺激に対する応答でアップレギュレートおよびダウンレギュレートすることが分かった同じ遺伝子の組である最適化された組の遺伝子発現プロファイルとの両方が得られた。
【００８４】
骨遺伝子発現プロファイルは、以下のパラメータの組について求めた。
（１）負荷のないインビトロ細胞培養、
（２）負荷刺激を与えたインビトロ細胞培養、
（３）Ｗｎｔ経路活性を調節する化合物を与えた後に負荷刺激を与えたインビトロ細胞培養、
（４）負荷を与えたＨＢＭ動物から得た細胞、
（５）動物に負荷を与えＷｎｔ経路を調節する化合物を与えたＨＢＭ  ＴＧ動物から得た細胞、
（６）負荷を与えた非ＴＧ動物から得た細胞、
（７）負荷を与えＷｎｔ経路モジュレーターを与えた非ＴＧ動物から得た細胞、および
（８）負荷を与えていないＴＧ動物または非ＴＧ動物のいずれかから得た細胞。
【００８５】
各組の細胞から得たデータに基づいて、遺伝子発現プロファイル（すなわち、アップレギュレートおよびダウンレギュレートする遺伝子の指標）および遺伝子発現識別特性（すなわち、安静時と比較した、遺伝子発現のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの程度）を得た。このデータから、骨負荷に対する応答で常にアップレギュレートまたはダウンレギュレートする遺伝子を構成する中心となる遺伝子の組を得た。
【００８６】
以下の表は、上記の各パラメータについて得られた遺伝子発現プロファイルの分析である。
【００８７】
【表２】
2007525953.tif 000009
【００８８】
表１における「応力および破骨細胞機能」は、応力に応答する遺伝子、および破骨細胞形成および機能に必要な遺伝子を意味する。表１で使用されている「負荷センサー」は、機械的負荷に応答することが文献により知られている遺伝子を意味する。表１および本明細書全体で使用されている「ＨＢＭ識別特性」は、ＨＢＭ変異を発現する細胞系、またはヒトＨＢＭ１家系の罹患した個人において異なる発現をする遺伝子の組を含むことを意味する。
【００８９】
【表３Ａ】
2007525953.tif 000010
【表３Ｂ】
2007525953.tif 000011
【００９０】
【表４Ａ】
2007525953.tif 000012
【表４Ｂ】
2007525953.tif 000013
【００９１】
上記の遺伝子は、培養したＭＣ３Ｔ３細胞に重力負荷を与えることに対する応答で調節された。
【００９２】
【表５】
2007525953.tif 000014
【００９３】
アップレギュレーションおよびダウンレギュレーションが起こるさらに別の遺伝子については、実施例および本明細書に提供される別の表を参照されたい。
【００９４】
（３．インビボで骨荷重を研究する方法）
（３．１  骨の研究）
ＨＢＭ変異の同化の性質の基礎となる機構を理解するため、ＨＢＭトランスジェニック（ＴＧ）マウスにインビボで機械的荷重を与えて、遺伝子発現の変化を調べ、それらの非トランスジェニック（非ＴＧ）コントロール同腹子と比較した。これは、骨負荷刺激を与えた動物から脛骨または頭蓋冠を得ることによって行ったが、他の好適な骨を使用することもでき、限定するものではないが、例えば尺骨、大腿骨、および椎骨などを使用することができる。負荷刺激を与えた後で、ＨＢＭ  ＴＧおよび非ＴＧの同腹子マウスからＲＮＡを得た。次に、頭蓋冠または脛骨（またはその他の骨）からＲＮＡを抽出し、これらの動物の間（すなわち、安静時および負荷刺激後のＨＢＭ  ＴＧおよび非ＴＧ動物）で比較を行った。
【００９５】
ＨＢＭマウスは、それらの非ＴＧ同腹子コントロールよりもはるかに大きなＷｎｔ経路遺伝子応答を示すことが観察された。この観察から、ＨＢＭ変異によって、骨が機械的荷重に対してより敏感になるとの結論を得た。負荷刺激インビボに対する応答で得られる遺伝子の識別特性の組の１つは、コネキシン４３、オステオネクチン、オステオプロテゲリン、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、プロスタサイクリンシンセターゼ（ＰＴＧＳ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＳＦＲＰ１、およびＳＦＲＰ４のアップレギュレーションを含む。後に詳細に示し、実施例でも示されるように、別の遺伝子でもアップレギュレーションが起こった。
【００９６】
骨負荷刺激を誘発する方法としては、実施例において検討される４点負荷システムが挙げられる。負荷を与えるための別のインビボ方法は当分野で周知であり（例えば、３点負荷システム）、当業者に知られているとおりに使用することができる。
【００９７】
ＨＢＭ  ＴＧマウスにおいて得られた上記の発現プロファイル、または本明細書において議論される別の遺伝子のあらゆる組み合わせを使用して、特定の物質がＷｎｔ経路の活性化を向上させ、およびそれによる骨石灰化を向上させるかどうかを評価するために非ＴＧ動物およびＨＢＭ  ＴＧ動物において物質のスクリーニングを行うことができる。石灰化を向上させる物質を研究するためのいくつかのポジティブコントロールとしては、ＰＴＨ、およびＷｎｔ経路の活性化によって石灰化を向上させるＧＳＫ−３阻害剤の３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１−Ｈ−ピロール−２，５−ジオンが挙げられる。本明細書に記載される他のＧＳＫ−３阻害剤もポジティブコントロールとして使用することができる。
【００９８】
負荷刺激および／またはＷｎｔ経路調節を行った動物から得られる遺伝子発現プロファイルおよび識別特性以外に、負荷および／またはＷｎｔ経路調節による動物の骨の病理学的変化を研究することができる。例えば、頭蓋冠の厚さの変化（または他の骨の厚さの変化）、ならびに、骨負荷刺激単独、または骨リモデリングを調節する１種類以上の化合物との併用に対する応答でアップレギュレートまたはダウンレギュレートするとして本明細書のいずれかの表に記載されるあらゆるＲＮＡのタンパク質発現またはタンパク質が挙げられる。
【００９９】
頭蓋冠骨分析は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で試験物質を動物に投与することによって行うことができる。より好ましくは、この物質は０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日の量で与えられる。例えば動物には、約０．５、１０、および５０ｍｇ／ｋｇ／日で物質を投与することができる。典型的には、動物は、１群当たり６匹のマウス（１つの研究で合計７２匹のマウス）に分けてで実施され、投与後５、１５、および３０日に試験が行われる。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）を、ポジティブコントロールとして使用することができ、ＧＳＫ−３阻害剤として、３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈピロール−２，５−ジオンを使用することができる。これらの試薬の存在下および非存在下での骨負荷刺激の後、頭蓋冠の大きさの差を測定することができる。
【０１００】
骨の病理学的変化を研究するための他の方法は当業者には明らかである。次に、これらの骨の病理学的変化を、インビボおよびインビトロの両方で得られた遺伝子発現および遺伝子識別特性プロファイルと比較して、データをさらに相関させることができる。前述したように、遺伝子発現プロファイルは、本明細書で議論されるあらゆる方法、または当業者には明らかな方法によって得ることができる。
【０１０１】
前述のあらゆる遺伝子について、骨負荷刺激に対する応答において調節される活性を分析することができるが、評価するのに好ましい遺伝子としては、限定するものではないが、ＳＦＲＰ１、ＴＩＭＰ３、ＧＪＡ１、ＣＴＳＫ、Ｃｏｌ１Ａ１、ＣＣＮＤ１、ＴＩＭＰ２、ＧＡＤＤ４５Ａ、ＷＩＳＰ２、ＦＺＤ２、ＳＦＲＰ４、ＩＧＦＢＰ６、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、ＩＬ６、ＩＧＦ２、ＳＰＡＲＣ、ＭＡＰＫＡＰＫ２、ＴＮＦ、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、ｅＮＯＳ、ＧＲＯ１、およびＷｎｔ１０Ｂが挙げられる。骨負荷刺激単独、または骨リモデリングを調節する１種類以上の化合物との併用に対する応答においてアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションが起こるとして本明細書のいずれかの表に記載される遺伝子も参照されたい。
【０１０２】
（４．インビトロで骨荷重を研究する方法）
本発明の一態様は、インビトロでの骨負荷の影響、および骨負荷の利益（すなわち骨石灰化の増加）を増大することができる手段を研究することである。骨負荷の増強の研究は、インビボ（前述の通り）およびインビトロの両方で実施することができる。好ましくは骨負荷の増強は、最初にインビトロの実験を行った後、前述したようにインビボの実験を行う。
【０１０３】
したがって、本発明の一態様は、負荷刺激をシミュレートする条件下に細胞を置くことを含む。インビボで観察される骨負荷応答を模倣するために細胞培養に対してひずみを与えることができる方法が数種類存在する。このような方法としては、限定するものではないが、流体剪断、静水圧縮、一軸延伸、二軸延伸、重力荷重、およびＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）を使用して誘導される負荷、または同等のシステムが挙げられる。
【０１０４】
（４．１  骨負荷刺激）
前述のいずれかの方法によって得られるような骨負荷刺激によって調節される好ましい遺伝子としては、限定するものではないが、ＳＦＲＰ１、コネキシン４３、ＣＣＮＤ１、Ｗｎｔ１０ｂ、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ−２）、およびｅＮＯＳが挙げられる。活性（例えば、ｍＲＮＡ転写およびタンパク質の増加）の増加を監視することができる別の遺伝子が、本明細書における多くの表に記載されている。骨負荷に対する応答において一貫してアップレギュレートすることが示されている少なくとも６個の遺伝子（すなわち、Ｊｕｎ、Ｆｏｓ、ｅＮＯＳ、ＳＦＲＰ１、ＣＯＸ−２、およびコネキシン４３）も、Ｗｎｔ経路を活性化する物質の添加によって増強される。Ｗｎｔ２などの他の遺伝子は、Ｗｎｔ経路を活性化する試薬（例えば、ＧＳＫ−３阻害剤およびＷｎｔ  ３Ａ、ならびにそのアゴニスト、ミメティック、および変異体）を添加しても増強されず、骨負荷にのみ応答する。
【０１０５】
（４．１．１  流体剪断刺激）
骨負荷を誘発する方法の１つは、流体剪断による方法である。流体剪断は、撹拌機構によって連続層流剪断を発生されるコーンプレート型粘度計を要する。あるいは、フローループ装置は、並流培養チャンバー中にこのような剪断を発生させることができる。後者の方法および装置は、フレクセル・インターナショナル・コーポレーション（Ｆｌｅｘｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）製造のストリーマー（Ｓｔｒｅａｍｅｒ）システムに代表される。フローループ装置は、再現性があり一定の刺激を発生することでも知られている。唯一の欠点は、終点が典型的には短時間であり、これらの変化がどのようなものであっても、分化した骨芽細胞の機能に影響を与えることである（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３０（２）：３４７−５１（２００２））。
【０１０６】
（４．１．２  静水圧縮刺激）
骨負荷を誘発する第２の方法は、静水圧縮の使用である。静水圧縮は、連続または断続的な力を発生させる圧縮空気が利用され、特に、細胞が細胞外マトリックスタンパク質／接着タンパク質と相互作用する領域に、力が集中すると考えられている。
【０１０７】
（４．１．３  一軸延伸刺激）
インビトロで骨負荷を誘発する第３の手段は、一軸延伸刺激の使用である。この一軸延伸法は、１方向での延伸力を利用する。この方法は、シリコーンの可撓性層に固定されたポリスチレンフィルムまたは他のフィルムの処理されたストリップ上での組織培養で細胞を増殖させる。さらにシリコーン層は２つの金属棒に取り付けられる。これらの金属棒は、電磁石または他の移動手段を使用して互いに対して操作することができる。この方法では流体剪断はまったく発生しない。流体剪断がないため、この方法はあまり好ましくないが、その理由は、介在する流体は、機械的延伸よりも、骨リモデリングにおいて重要な働きを担う可能性があるからである。したがって、この方法は、再現性があり一定の刺激を発生できるにもかかわらずインビボでの刺激を十分に模倣することができない（Ｂａｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ３０（２）：３４７−５１（２００２））。
【０１０８】
（４．１．４  二軸延伸刺激）
二軸延伸は、実質的には、本明細書において検討されているＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）システムである。この方法では、コラーゲンがコーティングされたシラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）膜が利用され、この膜の上で細胞が増殖される。次に、このプレートが特殊なトレー中に取り付けられ、これが真空ポンプに取り付けられる。真空ポンプは、膜を延伸したり他の変形を生じさせたりすることによって、セルの膜を延伸し緩和させる。さらに、任意の媒体または流体の動きによって、流体剪断がさらに加えられる。
【０１０９】
（４．１．５  重力負荷刺激）
重力荷重は、インビトロで骨負荷を誘発することができる別の方法である。実質的には、細胞上に力が加えられることによって、細胞が平坦になる。さらなる詳細については、例えば、Ｈａｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  ＆  Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１８（１）：５８−６６（２００３）；およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．２２８：１６８−７１（１９９６）を参照されたい。特に、細胞はプレートまたはカバーガラス上で増殖され、続いて増加するＧ力に曝露される。
【０１１０】
（４．１．６  Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）刺激）
Ｗｎｔ経路および骨石灰化の試薬に基づく増強を評価するための好ましい方法の１つは、Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）システムを使用する二軸延伸刺激である。簡潔に述べると、骨細胞（例えば、ＭＣ３Ｔ３細胞）は３，４００μεに曝露される。約５０με〜約５，０００με（およびこれらの間にあるあらゆる値）の負荷を、機械的負荷刺激の場合と同様に使用することができる。この範囲内のあらゆる刺激が、生理学的な骨負荷刺激と類似している。そのため５，０００μεを超える刺激は、病態生理学的な負荷となり、好ましくない。これらの細胞は、二軸延伸を行う前にＷｎｔ経路モジュレーター（例えばＧＳＫ阻害剤）に曝露することもできる。
【０１１１】
負荷単独、ＧＳＫ−３阻害剤と併せて与えることによってアップレギュレートされる遺伝子としては、限定するものではないが、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、コネキシン４３、およびＳＦＲＰ１が挙げられる。Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）の研究からインビトロで得られる発現プロファイルは、インビボ荷重遺伝子発現プロファイル（すなわち、ＨＢＭ  ＴＧマウスの脛骨からの細胞に対して実施したＲＮＡ分析であって、これらのマウスは４点システムを使用して骨負荷が与えられたＲＮＡ分析）と類似している。したがって、本明細書に開示される種々の細胞系を使用するこの機械的負荷アッセイ、または他の機械的負荷手段の使用は、古典的Ｗｎｔ経路を調節、好ましくは活性化し、ＨＢＭ表現型と類似している小分子、ペプチド、免疫グロブリンなどの同定に利用することができる。
【０１１２】
細胞に対して機械的応力刺激を誘発するこれらのインビトロ方法は、骨リモデリングと関連し、骨芽細胞および破骨細胞の増殖および破骨細胞吸収に必要な、細胞増殖およびアポトーシスの研究にも使用することができる。例えば、ＨＢＭ細胞および影響を受けていない骨芽細胞を、バイオフレックス（ｂｉｏｆｌｅｘ）６ウェルプレート中に播種し、細胞が約６０％コンフルエントになるまで１０％のＦＢＳを含有する増殖培地中で２〜３日培養することができる。機械的荷重の２４時間前に、この培地を、約２〜約４％のＦＢＳを含有する１ｍＬの基本培地と交換する。次にこれらの細胞に、約５０〜約５，０００μεの負荷を約１〜約５時間与える。
【０１１３】
負荷を与えた後、さらにある期間、細胞を培養する。続いて、多数の市販のアッセイまたは当分野において周知のアッセイ、例えば、限定するものではないが、［3Ｈ］−チミジンの混入、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の混入、３−（４，５ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−トラゾニウム・アルト（ｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ａｌｔ）（ＭＴＳ）アッセイ、ＴＵＮＥＬアッセイ（すなわち、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端ラベリング）、またはアネキシンＶアッセイなどを使用して、細胞数および増殖を評価することができる。
【０１１４】
別のＷｎｔ経路アゴニストとしては、本明細書において検討される別のＧＳＫ−３阻害化合物、天然のＷｎｔ経路リガンド、合成リガンド、小分子、ならびに周知のアンタゴニストのセレブラス（ｃｅｒｅｂｒｕｓ）、ＳＦＲＰ、およびＷＩＦ（Ｗｎｔ抑制因子）が挙げられ、前述のインビトロ骨負荷方法を使用して、骨負荷増強能力を分析することができる。周知のＷｎｔ経路アクチベーターとしては、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３Ａ、小分子Ｗｎｔミメティック、ＬＲＰ５と相互作用しＷｎｔシグナリングを活性化させるペプチドアプタマーが挙げられる。好ましいペプチドアプタマーとしては以下のものが挙げられる：
【０１１５】
【表６】
2007525953.tif 000015
【０１１６】
別の実施形態においては、骨の鉱物質除去（例えば、大理石骨病）が必要な個体の治療のためにＷｎｔアンタゴニストをスクリーニングしたり使用したりすることができる。Ｗｎｔアンタゴニストとしては、限定するものではないが、Ｄｋｋ１アンタゴニストが挙げられる。
【０１１７】
（４．２  細胞培養）
インビトロ荷重実験を実施することができる細胞としては、限定するものではないが、以下のヒト細胞系が挙げられる：Ｕ２ＯＳ細胞（ＡＴＣＣ）、ＭＧ−６３細胞（ＡＴＣＣ）、ＳＡＯＳ−２細胞（ＡＴＣＣ）、ＨＯＳ−ＴＥ８５細胞（ＡＴＣＣ）、ＨＯＢＯ３ＣＥ６細胞（Ｗｙｅｔｈ）、ＨＯＢＯ１Ｃ１前骨細胞（Ｗｙｅｔｈ）、およびヒト初代骨芽細胞。さらに、あらゆる哺乳類系の細胞を培養することができる。研究に好ましい動物系としては、ラットおよびマウスの骨細胞が挙げられる。例えば、上記方法のいずれかで使用することができるマウス骨細胞としては、限定するものではないが、実施例において議論されるＭＣ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）、および初代骨芽細胞、または上記ヒト細胞系と類似するあらゆる細胞系が挙げられる。インビトロで応力を引き起こすための、開示されているいずれかの方法を使用することができるラット細胞としては、限定するものではないが、ＵＭＲ−１０６細胞（ＡＴＣＣ）、ＲＯＳ１７／２．８細胞、および初代骨芽細胞、または上記ヒト細胞系と類似するあらゆる細胞系が挙げられる。これらの細胞を培養する方法は当業者には周知である。例えば、ＩＡＮ  ＦＲＥＳＨＮＥＹ，（ＣＵＬＴＵＲＥ  ＯＦ  ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬＳ−Ａ  ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＢＡＳＩＣ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥ）（４ｔｈ  ｅｄ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０００を参照されたい。
【０１１８】
本発明の別の態様においては、細胞は、骨から採取することができ、それらは骨芽細胞、破骨細胞、および骨細胞、ならびに前駆細胞および幹細胞を含むことができる。好ましい骨芽細胞ならびにそれらの前駆細胞および幹細胞としては、成熟骨芽細胞、前骨芽細胞（成熟および未成熟）、および間葉系幹細胞（間葉由来幹細胞、ＭＤＳＣとも呼ばれる）が挙げられる。
【０１１９】
本発明の別の態様においては、ＨＢＭおよび影響を受けていない個体から得たヒト細胞系を、本明細書において検討される骨負荷方法とあわせて使用することができる。これらの細胞系は、ＨＢＭおよび非トランスジェニックマウスに対して実施されるインビボ荷重実験から同定される遺伝子導入を研究するために使用することができる。
【０１２０】
（４．３  ＴＣＦルシフェラーゼアッセイ）
ＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイ系も、Ｗｎｔシグナリング活性の監視に使用することができる。ＴＣＦ−ルシフェラーゼアッセイのコンストラクトは、当分野で周知なように調製することができる。例えば、特にＬＲＰ５、ＬＲＰ６、およびＨＢＭなどのＷｎｔ経路タンパク質は、分泌のためのペプチドを標的とするコザック配列およびシグナル配列を使用してｐｃＤＮＡ３．１中で発現させることができる。
【０１２１】
コンストラクトが調製された後で、骨芽細胞およびＨＥＫ２９３細胞などの細胞をウェルプレート中に播種し、コンストラクトＤＮＡ、ＣＭＶβ−ガラクトシダーゼプラスミドＤＮＡ、およびＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターＤＮＡをトランスフェクトする。次にこれらの細胞を溶解させ、β−ガラクトシダーゼ活性およびルシフェラーゼ活性を調べ、Ｗｎｔ経路相互作用タンパク質、または抗体などの他の分子がＷｎｔシグナリングに影響を与えるかどうかを決定する。さらなる詳細は、ＴＣＦ−ルシフェラーゼコンストラクトを使用する方法に関する以下の実施例で示される。
【０１２２】
別の実施形態においては、Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）機械的細胞荷重システム（または、細胞に対して負荷を誘発するあらゆるインビトロ手段）を、ＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターシステム、または他のレポーターシステムと併用して、Ｗｎｔ経路に対する機械的荷重の影響を測定することができる。このような実験は、以下のように実施することができる。これらの実験の場合、ＭＣ３Ｔ３細胞（または本明細書において議論される他の同等の細胞）を前述のように播種し、３日間またはコンフルエントになるまで培養する。次に、培地を、ＢＳＡを含有する無血清培地、またはαＭＥＭを含有する低血清培地（１％ＦＢＳ）のいずれかと交換する。続いて、この低血清培地または無血清培地上の細胞をさらに２４時間インキュベートする。機械的負荷を与える約１時間前に、１つのプレートは、Ｗｎｔ経路モジュレーター（例えば、ＧＳＫ阻害剤、天然Ｗｎｔリガンド、例えば、限定するものではないが、Ｗｎｔ  １およびＷｎｔ  ３Ａ）を投与することで予備処理し、別のプレートは処理しない。Ｗｎｔミメティックリガンド、小分子などのいずれかで予備処理した後、前述したように、細胞に約５時間機械的負荷（例えば、３，４００με）を与える。負荷を与えた直後および負荷を与えてから２４時間後に、前述のようにキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ミニキットを使用して負荷を与えたサンプルおよび負荷を与えていないコントロールサンプルからＲＮＡを抽出する。
【０１２３】
続いて、処理による遺伝子発現の変化を観察するために各時点で、負荷識別特性セット遺伝子に対してリアルタイムＰＣＲ（または当分野において周知であるあらゆる好適なＲＮＡアッセイ）を実施することができる。あるいは、当業者に周知の他の方法、または本明細書で議論の他の方法を使用してＲＮＡを分析することができる。
【０１２４】
（５．アレイ）
骨リモデリングおよびその調節と関連するＷｎｔ経路の遺伝子プロファイルおよび識別特性を利用する方法の１つは、核酸アレイおよびタンパク質アレイを作製する形態である。続いて、これらのアレイをＷｎｔ経路およびおよびその骨リモデリングへの関与のさらなる研究に利用することができる。これらのアレイは、Ｗｎｔ経路を介して骨リモデリングを調節する物質のスクリーニングに利用することもできる。
【０１２５】
（５．１  核酸アレイ）
核酸アレイは、当業者に周知のように作製される。このようなアレイの作製方法および使用方法は、例えば、Ｐ．Ｂａｌｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ：ＦＲＯＭ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ  ＴＯ  ＤＡＴＡ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＡＮＤ  ＭＯＤＥＬＩＮＧ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ２００２）；およびＤＮＡ  ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹＳ：Ａ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｄａｖｉｄ  ＢｏｗｔｅｌｌおよびＪｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００２）に記載されている。
【０１２６】
好ましい核酸アレイは、表１〜５または図１６中のあらゆる遺伝子のＷｎｔシグナリング経路のメンバーに対応する核酸を含有する。例えば、このようなアレイは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれを超える数（あるいはこれらの間の任意の整数値）の骨モデリングと関連する遺伝子を含有する。このような遺伝子としては、いずれかの表、実施例に記載される、あるいは図１６に示される経路の一部の、あらゆる調節された遺伝子が挙げられる。これらの核酸は、骨荷重応答と関連する代表的な核酸である。
【０１２７】
別の実施形態においては、アレイは、Ｗｎｔ経路の骨リモデリング遺伝子、および例えば血清カルシウム調節、破骨細胞アポトーシス、骨芽細胞増殖などと関連する遺伝子を含むように作製することができる。
【０１２８】
【表７Ａ】
2007525953.tif 000016
【表７Ｂ】
2007525953.tif 000017
【表７Ｃ】
2007525953.tif 000018
【０１２９】
好ましくは、核酸アレイは、「ＨＢＭ骨」中での発現が観察される遺伝子に対応する２つ以上の配列を含有する。このようなアレイは、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれを超える数（およびこれらの間の任意の整数値）の、表中、実施例中、または図１６中に記載される骨負荷に対する応答でアップレギュレートまたはダウンレギュレートする配列を含むことができる。同様に、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、またはそれを超える数（およびこれらの間の任意の整数値）の、表５に記載されるタンパク質、または本明細書において検討されるあらゆる経路に関与するあらゆるタンパク質に結合するタンパク質、ペプチド、および／または免疫グロブリンを含む高骨量に特異的なタンパク質／抗体アレイを作製することもできる。
【０１３０】
５．１．２  ＤＮＡマイクロアレイの構成
多くの場合、ハイブリダイゼーションの前に核酸サンプルを増幅することが望ましい。好適な増幅方法としては、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ．Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ．ＡＣＡＤＥＭＩＣ  ＰＲＥＳＳ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，（１９９０））、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，４：５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７（１９８８）；およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８９：１１７（１９９０）を参照されたい）、転写増幅（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９））、およびｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０））が挙げられる。
【０１３１】
好ましい実施形態においては、ハイブリッド形成した核酸は、サンプル核酸に取り付けられた１つ以上の標識を検出することによって検出される。これらの標識は、当分野で周知のあらゆる多数の手段によって組み込むことができる。しかし、好ましくは、サンプル核酸の調製においける増幅ステップ中に同時に標識が組み込まれる。したがって、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、標識された増幅産物が得られる。好ましい実施形態においては、前述のような転写増幅に、標識されたヌクレオチド（例えば、フルオレセイン標識されたＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用することによって、転写された核酸中に標識が組み込まれる。
【０１３２】
あるいは、元の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）または、増幅終了後の増幅産物に直接標識を加えることもできる。核酸に標識を取り付ける手段は当業者に周知であり、そのような手段としては、例えば、核酸を含有する反応混合物にキナーゼを添加し、続いてサンプル核酸を標識（例えば蛍光体）と結合させる核酸リンカーを取り付ける（連結）による、ニックトランスレーションまたは末端標識（例えば、標識したＲＮＡの使用）が挙げられる。
【０１３３】
本発明において使用すると好適である検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、または化学的な手段によって検出可能なあらゆる組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、標識されたストレプトアビジン複合体で染色したビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ）、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、または32Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、およびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用される他の酵素）、および熱量測定標識、例えばコロイド金、あるいは着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のビーズが挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書、第３，８５０，７５２明細書、第３，９３９，３５０明細書、第３，９９６，３４５明細書、第４，２７７，４３７明細書、第４，２７５，１４９明細書、および第４，３６６，２４１明細書が挙げられる。
【０１３４】
他の遺伝子、例えば、ＣＯＸ−２などに由来する参照配列は、全長ゲノムから、個別の染色体、エピソーム、遺伝子、遺伝子の成分、例えばエキソンまたは調節配列、さらには数個のヌクレオチドまでの広範囲で変えることができる。約２、５、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、または１０，０００、２０，０００、または１００，０００の間の数のヌクレオチド（およびこれらの間の任意の整数値）の参照配列が一般的である。場合によっては、配列の特定の領域のみが対象となる。
【０１３５】
本発明の方法は、配列が既知である１つ以上の選択された参照配列（例えば、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、Ｊｕｎ、Ｆｏｘ、コネキシン４３、ＳＦＲＰ、または本明細書において議論されるあらゆる他の遺伝子）に対して相補性であるプローブを含むオリゴヌクレオチドアレイを使用する。典型的には、これらのアレイは、固体表面上の高密度アレイ（「オンチップＤＮＡ」）中に固定され、このようなものは、例えば米国特許第５，１４３，８５４号明細書および国際公開第９０／１５０７０号パンフレット、国際公開第９２／１００９２号パンフレットおよび国際公開第９５／１１９９５号パンフレットに開示されており、これらそれぞれが参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３６】
チップ上のオリゴヌクレオチドプローブアレイの配列および表示を行い、それによって標的核酸に関して得られるハイブリダイゼーションパターンおよび配列の情報を最大限にするために、種々の方法を使用することができる。代表的な表示および配列の方法が、国際公開第９４／１２３０５号パンフレットに記載されており、この記載内容が参照により本明細書に組み入れられる。より詳細に説明する目的で、基本的方法の概要を以下に示す。
【０１３７】
基本的なタイリング方法によって、標的配列を分析するための固定化されたプローブのアレイが得られ、これによって１つ以上の選択された参照配列への高度な配列の同定が行われる。この方法を、４つのプローブセットに分割されたアレイの場合で説明するが、１つのプローブセット（すなわち、前述のように参照配列に対して相補的なプローブセット）から満足できる結果が得られることは明らかである。
【０１３８】
第１のプローブセットは、選択された参照配列と完全に相補的である複数のプローブを含む。通常、完全な相補性は、プローブの全長にわたって存在する。しかし、参照配列との相補性が失われた先導配列または後続配列を側部に有する完全な相補性の１つ以上のセグメントを有するプローブを使用することもできる。相補的なセグメント内で、第１のプローブセット中の各プローブは、参照配列中のヌクレオチドに対応する少なくとも１つの呼び掛け位置（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｐｏｓｉｔｉｏｎ）を有する。すなわち、プローブと参照配列とが２つの間で相補性が最大限となるようアラインメントする場合、呼び掛け位置が参照配列中の対応するヌクレオチドとアラインメントする。１つのプローブが２つ以上の呼び掛け位置を有する場合、そのそれぞれが、参照配列中のそれぞれのヌクレオチドに対応する。第１のプローブセット中の特定のプローブ中の呼び掛け位置および対応するヌクレオチドの区別は、第１のセット中のプローブを調べることによって単純に行えるものではない。明らかなように、呼び掛け位置および対応するヌクレオチドは、第１のプローブセット中のプローブの構造を、別のプローブセットに属する対応するプローブと比較することによって画定される。
【０１３９】
基本的に、プローブは、参照配列と相補的なセグメント中の各位置において呼び掛け位置を有することができる。場合によっては、呼び掛け位置は、相補性のセグメントの末端から離れて配置されると、より正確なデータが得られる。例えば、典型的には長さ「ｘ」の相補性のセグメントを有するプローブは、「ｘ−２」個を超える呼び掛け位置を含まない。プローブは典型的には９〜２１ヌクレオチドであり、通常全てのプローブが相補的であるので、プローブは典型的には１〜１９個の呼び掛け位置を有する。多くの場合プローブは、プローブの中央またはその付近に１つの呼び掛け位置を含む。
【０１４０】
説明の目的で、第１のセットの各プローブの場合、３つの別のプローブセットに属する最大３つの対応するプローブが存在する。したがって、参照配列中の対象の各ヌクレオチドに対応する４つのプローブが存在する。４つの対応するプローブのそれぞれが、対象のヌクレオチドとアラインメントする呼び掛け位置を有する。通常、３つの別のプローブセットに属するプローブは、１つの例外を除けば第１のプローブセットに属する対応するプローブと同一である。この例外とは、４つのプローブセットに属する４つの対応するプローブのそれぞれで同じ位置にある少なくとも１つ（多くの場合１つのみ）の呼び掛け位置が、４つのプローブセット中で異なるヌクレオチドで占有されていることである。例えば、参照配列中のアデニン（Ａ）ヌクレオチドの場合、第１のプローブセットに属する対応するプローブは、チミン（Ｔ）で占められた呼び掛け位置を有し、別の３つのプローブセットに属する対応するプローブは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、またはグアニン（Ｇ）によって占められた呼び掛け位置をそれぞれ有し、各プローブ中で異なるヌクレオチドを有する。当然ながら、第１のプローブセットに属するプローブが、参照配列に対する相補性が失われた後続配列またはフランキング配列を含む場合、これらの配列が他の３つのセットに属する対応するプローブ中に存在する必要はない。同様に、別の３つのセットに属する対応するプローブは、第１のプローブセットに属する対応するプローブ中には存在しない、相補性のセグメントの外側に先導配列または後続配列を含むことができる。場合によっては、別の３つのプローブセットに属するプローブが、第１のプローブセットに属する対応するプローブの相補的な全セグメントの連続配列と同一である（呼び掛け位置を除く）。この場合、この配列は、呼び掛け位置を含み、通常は、相補性のセグメントの末端から一方または両方の末端ヌクレオチドが脱落したことだけが全長プローブと異なる。すなわち、第１のプローブセットに属するプローブが、長さ「ｎ」の相補性のセグメントを有する場合、他のセットに属する対応するプローブは、通常、少なくとも長さが「ｎ−２」であるセグメントの配列を含む。したがって、この配列は、通常少なくとも３、４、７、９、１５、２１、または２５ヌクレオチドの長さであり（および任意のこれらの間の整数値）であり、最も典型的には、９〜２１ヌクレオチドの範囲である。呼び掛け位置において変異させた参照配列の変異体の方が、参照配列よりも検出可能に強くハイブリダイズするプローブが得られるように、この配列は十分に長いか、または十分なハイブリダイゼーション条件となるべきである。
【０１４１】
プローブは、オリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴＤＮＡ）またはオリゴリボヌクレオチド（オリゴＲＮＡ）、あるいは相補的な塩基対形成によって標的核酸配列とハイブリダイズ可能なこれらのポリマーのあらゆる修飾された形態であってよい。相補的な塩基対形成とは、配列特異的な塩基対形成を意味し、これには、例えば、ワトソン−クリック型塩基対形成、およびフーグスティーン型塩基対形成などの他の形態の塩基対形成が含まれる。修飾された形態としては、２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド、および、オリゴデオキシリボヌクレオチドが、リン酸ジエステル結合以外のペプチド結合を介して結合している、いわゆるＰＮＡが挙げられる。プローブは、あらゆる結合によって基板に取り付けることができる（例えば、３’−、５’−、または塩基を介して）。３’の結合がより一般的であるが、この方向は、オリゴヌクレオチドの固相合成に好ましい化学物質に適合することが理由である。
【０１４２】
第１のプローブセット中のプローブ数（および結果として、別のプローブセット中のプローブ数）は、参照配列の長さ、参照配列中の対象となるヌクレオチドの数、および呼び掛け位置の数に依存する。一般に、参照配列中の対象となる各ヌクレオチドは、プローブの４つのセットにおいて同じ呼び掛け位置が必要となる。
【０１４３】
ある参照配列においては、全てのヌクレオチドが対象となる。別の参照配列においては、変異体（例えば、変異または多型）が集中している部分のみが対象となる。別の参照配列においては、特定の変異または多型およびすぐ近傍のヌクレオチドのみが対象となる。通常、第１のプローブセットは、少なくとも１つのヌクレオチド（例えば、点変異を表す）およびすぐ近傍の１つのヌクレオチドとに対応するよう選択された呼び掛け位置を有する。通常、第１のセット中のプローブは、少なくとも３、１０、５０、１００、１０００、２０，０００、１００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００（およびその間の任意の整数値）、またはそれを超える連続ヌクレオチドに対応する呼び掛け位置を有する。プローブは通常、参照配列中のヌクレオチドの少なくとも５％、１０％、３０％、５０％、７５％、９０％、９９％、または場合により１００％（およびその間の任意の整数値）に対応する呼び掛け位置を有する。多くの場合、第１のプローブセット中のプローブは、参照配列全体にわたっており、参照配列に対して互いに重なり合っている。例えば、ある共通の配置において、第１のプローブセット中の各プローブが同じセットの別のプローブと異なるのは、参照配列に対して相補的な３’塩基の脱落、および参照配列に対して相補的な５’塩基の獲得によるものである。
【０１４４】
チップ上のプローブ数を非常に大きくすることができる（例えば、１０5〜１０6個）。しかし、多くの場合、所与の長さのプローブの総数の比較的小さな比率（すなわち、約５０％未満、２５％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満）が、特定のタイリング方法、この場合は骨負荷遺伝子発現プロファイルおよび骨負荷遺伝子を増強させる発現プロファイルを反映するタイリング方法、を実施する場合に選択される。例えば、オクトマー（ｏｃｔｏｍｅｒ）プローブの完全なセットは６５，５３６個のプローブを含み、例えば、本発明のアレイは典型的には３２，７６８個未満のオクトマープローブを有する。１０量体プローブの完全なアレイは１，０４８，５７６個のプローブを含み、例えば、本発明のアレイは典型的には約５００，０００個未満の１０量体プローブを有する。多くの場合アレイは、２５、５０、または１００個のプローブの下限を有し、最大で１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10などのプローブ数を有する。アレイは、プローブを支持体に取り付けるためのリンカーなどの、プローブ以外の他の成分を有することができる。
【０１４５】
所与の長さの全ての可能なプローブの集団のみを使用する利点の一部として、以下のことが挙げられる：（ｉ）ハイブリダイゼーションが起こっても起こらなくても、アレイ中の各位置から得られる情報量が多いこと、（ｉｉ）非特異的ハイブリダイゼーションが最小限となること、（ｉｉｉ）特に、既知の標準物質のハイブリダイゼーションパターンを参照する場合に、直接的にハイブリダイゼーションの差を配列の差と関連づけられること、および（ｉｖ）高解像度フォトリソグラフィを使用して、合成中に各プローブを独立にアドレス指定ができるため、あらゆる配列に合わせてアレイの設計および最適が行えること。例えば、任意のプローブの長さを、他と独立に変えることができる。
【０１４６】
通常、プローブのアレイは、前述のように縦横の列をなして配置されるが、このようなチップ上のプローブの物理的配置は重要ではない。アレイ中の各プローブの空間的位置が既知であれば、プローブからのデータを収集し処理して、チップ上のプローブの物理的配置とは無関係に標的の配列を求めることができる。データを処理する場合、チップ上のプローブの物理的配置がどのようなものであっても、それぞれのプローブから得られるハイブリダイゼーション信号を、後のデータ整理に望ましいあらゆる概念上のアレイにリアサートすることができる。
【０１４７】
ある範囲の長さのプローブを、チップ中に使用することができる。前述したように、プローブは、単に相補的セグメントからなっていてもよいし、あるいは、フランキングセグメント、後続セグメント、および／または介在セグメントが近接する１つ以上の相補的セグメントを有することもできる。後者の場合では、相補的セグメントの全長が、プローブの長さよりも重要となる。機能的な面で言えば、プローブの呼び掛け位置に対応するヌクレオチドにおける一塩基変位を含む参照配列の変異体よりも、参照配列の方に、プローブがより強く検出可能にハイブリダイズするように、第１のプローブセットの相補的セグメントが十分な長さを有するべきである。同様に、参照配列よりも、プローブの呼び掛け位置に対応するヌクレオチドにおける一ヌクレオチド置換を有する参照配列の変異体の方に、プローブがより強く検出可能にハイブリダイズするように、別のプローブセットに属する対応するプローブ中の相補的セグメントが十分な長さを有するべきである。通常、プローブは、少なくとも３ヌクレオチドの長さを有する１つの相補的なセグメントを有し、より一般的には少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または３０、あるいはそれを超える数の塩基が参照配列に対して完全な相補性を示す（場合により、プローブセットに依存する呼び掛け位置は除く）。
【０１４８】
あるチップにおいては、全てのプローブが同じ長さである。別のチップでは、複数のグループのプローブセットが使用され、この場合、１つのグループ内でプローブは同じ大きさであるが、異なるグループ間では大きさが異なる。例えば、あるチップは、全てのプローブが１５量体である前述のような４セットのプローブを含む第１のグループとともに、全てのプローブが２０量体である４セットのプローブを含む第２のグループを有する。当然ながら、さらに別のプローブのグループを加えることができる。したがって、あるチップは、例えば、１５量体、２０量体、２６量体、および３０量体の大きさを有する４グループのプローブを含む。別のチップは、４つのプローブの同じグループ内で異なる大きさのプローブを有する。これらのチップにおいて、第１のセット中のプローブが、互いに独立に長さが異なっていてもよい。他のセット中のプローブは通常、第１のセットに属する同じ列にあるプローブと同じ長さである。しかし、場合によっては、４つのレーン中の同じ列の位置で、異なる長さのプローブを含むことができる。長さの異なるプローブは、反応のｐＨ、温度、およびイオン条件におけるオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション安定性に依存するプローブからのハイブリダイゼーション信号を均一にするために含まれる。
【０１４９】
標的配列と完全に一致するプローブと、標的配列と一塩基が異なるプローブとの間を区別するために、プローブの長さが重要となり得る。このような区別は短いプローブの方が通常は行いやすい。通常はプローブが短いほど、二次構造の形成も起こりにくい。しかし、結合する標的配列の絶対量、したがって信号の絶対量は、プローブが大きいほど大きくなる。これらの競合する問題の間で最適となるプローブ長さは、例えば、標的ＤＮＡ配列の特定の領域のＧＣ含有率、二次構造、合成効率、およびクロスハイブリダイゼーションに依存して変動しうる。標的の一部の領域においては、ハイブリダイゼーション条件に依存して、短いプローブ（例えば１１量体）からは、より長いプローブ（例えば１９量体）からは得られない情報が得られる場合があり、この逆の場合もある。最大の配列情報は、前述のようにチップ上の異なる大きさのプローブのグループをいくつか含むことによって実現することができる。しかし、標的配列の多くの領域では、このような方法では、重複情報が得られ、すなわち、異なるグループのプローブから複数回同じ配列が読み取られる。標的配列の特定の領域における読み取り可能な配列を最大化するように大きさが選択された異なる大きさのプローブの１つのグループから、同等の情報を得ることができる。
【０１５０】
（５．２  タンパク質アレイ）
２つの主要な種類またはタンパク質アレイは、一次相アレイ（すなわち、抗体、抗体フラグメント、免疫グロブリン、またはペプチドが基体に固定される）および逆相アレイ（すなわち、細胞溶解物が基体に固定され、続いて抗体などを使用してスクリーニングが行われる）である。これらのタンパク質アレイは、Ｗｎｔ経路を調節する物質、Ｗｎｔ経路活性を増加させる物質、異なる刺激に対する応答における骨タンパク質発現、異なる刺激に対する応答に骨で発現される別のタンパク質の決定などのための迅速なスクリーニングに使用することができる。
【０１５１】
（５．２．１  一次相アレイ）
好ましい方法の１つは、本明細書のいずれかの表に記載される遺伝子のタンパク質を認識し結合する抗体、抗体フラグメント、免疫グロブリン、あるいは本明細書のいずれかの表に記載される遺伝子のタンパク質を認識し結合するペプチドを１種類以上（好ましくは２種類以上）含む一次相タンパク質アレイである。したがって、一態様においては、対象となるタンパク質／ポリペプチドに対して免疫原性活性を有する抗体、それらの免疫原性フラグメント、または免疫グロブリンポリペプチド、あるいは対象となるタンパク質／ポリペプチドを認識して結合することができる他のペプチド、あるいはそれらの組み合わせを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える数で、好適な基体に付着させたアレイが考慮される。次に、好適な条件下で細胞溶解物を一次相アレイと接触させ、リガンドが結合する抗体が、当分野において周知の方法で検出される。例えば、ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．Ｓｕｐｐｌ．３２：５２６−３２（２００２）を参照されたい。
【０１５２】
一次相アレイ（タンパク質検出マイクロアレイとも呼ばれる）は、固体支持体上に高い空間密度で配置された多数の異なるアフィニティー試薬を含むことができる。各試薬は、血清、細胞培養液、または細胞溶解物などの複合混合物から、その標的とするタンパク質またはポリペプチドを捕捉する。捕捉されたタンパク質は、次に、検出および定量が行われる。一次相アレイは、サンドイッチアレイ（すなわち、捕捉される免疫グロブリンが、固体支持体上に固定化されたペプチドであり、結合したタンパク質が、第２の標識された検出抗体を使用して検出される）、または抗原捕捉アレイ（すなわち、タンパク質が、固定化された抗体によって同様に捕捉されるが、捕捉されたタンパク質は、それらがアレイに適用される前に、タンパク質複合混合物の化学標識を行うことによって、通常は直接検出される）の形態であってよい。検討する場合には、ＭａｃＢｅａｔｈ，（２００２）およびそれに記載される参考文献を参照されたい。
【０１５３】
好ましい実施形態においては、各パッチ上で固定化されたタンパク質が、抗体または抗体フラグメントである。アレイの抗体または抗体フラグメントは、場合によっては、１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、Ｆｄフラグメント、全長抗原特異的ポリクローナル抗体、または全長モノクローナル抗体であってよい。好ましい実施形態においては、アレイのパッチ上に固定化されたタンパク質が、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、またはｓｃＦｖである。
【０１５４】
これらの抗体または抗体フラグメントは、（１）骨負荷に対する応答でアップレギュレートまたはダウンレギュレートするタンパク質、（２）Ｗｎｔ経路タンパク質、（３）Ｗｎｔ経路アゴニストまたはアンタゴニストの添加による応答でアップレギュレートまたはダウンレギュレートするＷｎｔ経路タンパク質、（４）ＨＢＭ  ＴＧ動物またはＨＢＭ細胞系における骨負荷刺激および／またはアゴニスト／アンタゴニスト刺激に対する応答で発現されるタンパク質、あるいは（５）アップレギュレートおよびダウンレギュレートする遺伝子／タンパク質として本明細書における表に記載されるタンパク質のいずれかを認識し結合する。より好ましくは、これらの抗体またはそのフラグメントは、増強したＷｎｔ経路活性に対する応答でアップレギュレートまたはダウンレギュレートするタンパク質を認識する抗体またはそのフラグメントである。ダウンレギュレートしたタンパク質に対する抗体は、好ましくは、ダウンレギュレートしたタンパク質の存在を検出することができるか、または、例えば、ホスホリリレーション（ｐｈｏｓｐｈｏｒｌｙｌａｔｉｏｎ）パターンの差を検出し、それによってタンパク質の活性部位を検出することができる（例えばＧＳＫ−３のリン酸化パターン）かのいずれかである。
【０１５５】
好ましくは、これらの免疫グロブリンアレイは、本明細書に記載される種々の条件下（例えば、負荷の適用、負荷を増強する物質など）でアップレギュレートまたはダウンレギュレートする、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、および１００、またはそれを超える数（これらの間の任意の整数値）のタンパク質を認識する免疫グロブリンを含む。したがって、このようなアレイは、細胞溶解物、細胞培養液、または血清、あるいは細胞分画（例えば、細胞核と細胞質の分画）から検出される各タンパク質を認識する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、またはそれを超える数の免疫グロブリンを含むことができる。本明細書において検討されるような、抗体またはそのフラグメント、免疫グロブリン、あるいはペプチドまたは他の部分を認識するタンパク質は、本明細書において検討の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子発現識別特性で挙げられているあらゆるタンパク質の認識または結合が最適に行われる。これらの抗体は、ポリ−Ｌ−リジンまたは他のリンカー物質を使用してアレイ基体上にスポットすることができる。詳細については、Ｓｒｅｅｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７５８５−９３（２００１）を参照されたい。抗体マイクロアレイは当分野において周知である。例えば、サンドイッチマイクロアレイ方式が使用されているＳｉｌｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４４：２０３６−４３（１９９８））を参照されたい。
【０１５６】
抗体およびペプチドのアレイは、典型的にはインクジェットプリンター技術を使用して作製され、プリンターが、モノクローナル抗体を基体上にスポットすることによって、規定量（例えば２００μＭ）のスポットが形成される。あるいは、抗体アレイは、９６ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートを使用して３×３のパターンに形成して、細胞中のタンパク質の産生を監視することができる。アレイをスポットするための別の方法に関しては、例えば、Ｍｏｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３１：１８６−１９４（２００１）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２９４：５５−６２（２００１）；Ｗｉｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１４５１−７（２００１）；Ｊｅｎｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１８９４−１９００（２００１）；Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１：１５７−１６５（２００２）；およびＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：３５９−６５（２００２）を参照されたい。
【０１５７】
（５．２．２  逆相アレイ）
別の側面においては、逆相アレイ（直接型アレイとも呼ばれる）の使用も考慮され、この場合、骨細胞の溶解物を好適なセル表面に付着させ、続いて、検出可能なタグと結合した免疫グロブリンまたは他の物質を使用してタンパク質の存在の有無をスクリーニングする。骨細胞は、細胞培養由来のものであってもよいしあるいはＨＢＭ、ヒトＬＲＰ５、ヒトＬＲＰ６を発現するトランスジェニックマウス、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６（両方を単独および併用）の遺伝子の同じ動物のノックアウトおよびノックインの複合体、または非ＴＧ同腹仔などのマウスに由来するものであってもよい。他の細胞系は、ＨＢＭタンパク質、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、または他のＷｎｔ経路タンパク質を発現する核酸をトランスフェクトした、一過性にトランスフェクトした細胞系であってよい。逆相溶解物アレイは、スクリーニングすることができる基体上の溶解物の小型化されたドットブロットである。基体１つ当たりのスポット数は、溶解物がスクリーニングされる方法に依存して変動する。さらなる議論については、例えばＳｒｅｅｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：７５８５−９３（２００１）を参照されたい。
【０１５８】
溶解物が基体に固定された後、抗体、ＲＮＡ（そのタンパク質がＲＮＡと結合することが知られている場合）、ＤＮＡ（そのタンパク質がＤＮＡと結合することが知られている場合）、ペプチド（そのタンパク質と相互作用することが知られているもの）、別のタンパク質などの検出可能なリガンドを使用してスクリーニングを行うことができ、これらの各部分には、検出可能な標識を取り付けることができる。
【０１５９】
本発明の別の側面においては、上記種類の細胞から得られた溶解物の組み合わせを、アレイ基体上に配置することができる。例えば、骨負荷刺激および／またはＷｎｔ経路モジュレーターが与えられた動物から得た溶解物を、細胞培養から得られた溶解物と混合することができる。細胞培養溶解物は、機械的負荷を与えた細胞のものでも、与えていない細胞のものでもよい。これは、Ｗｎｔ経路モジュレーターおよび負荷を与えた細胞培養に由来するものであってもよいし、細胞溶解物のあらゆる組み合わせであってもよい。このようなアレイは、負荷に対する応答で発現するタンパク質、および／またはＷｎｔ経路を調節しそれによって骨リモデリングも調節する候補となる化合物を迅速にスクリーニングするために使用することができる。
【０１６０】
（５．２．３  タンパク質アレイのための装置）
いずれの種類のアレイの場合も、放射性同位体、発色団、蛍光体、または化学発光種などの検出可能な標識を、検出部分（例えば、二次検出抗体、ペプチドなど）に取り付けることができる。次に、この検出部分を、マイクロチップとともに好適な条件下でインキュベートして、一次抗体または抗原と結合させることができる。
【０１６１】
過剰のプローブタンパク質を洗い流した後で、チップ表面の標識からの信号を分析する。信号が検出されることは、標識されたタンパク質と、タンパク質ライブラリの１つ以上の特有のメンバーとの相互作用を意味する。次に、プローブタンパク質または他のプローブ部分と結合することができるタンパク質の同定は、チップ上のスポットの位置（一次アレイを使用する場合）から行うことができるし、あるいは、逆相アレイを使用する場合は検出可能な標識および関連する抗体によって行うことができる。タンパク質−タンパク質、タンパク質−リガンド、またはタンパク質−核酸の相互作用を検出するために他の方法を使用することもできる。例えば、タンパク質アレイの形成に使用される固体表面が金層である場合は、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して表面における質量変化を検出することができる。金表面が使用され、オリゴヌクレオチド捕捉プローブ上の反応性部分がチオール基（アミノ基ではなく）である場合は、捕捉プローブを取り付けるために金表面を官能化する必要がない。質量分析（特にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を使用して、タンパク質ライブラリの特有のメンバーと結合する化学種を分析することもできる。
【０１６２】
別の実施形態においては、本発明は、基体上に分離した既知の領域で配置した複数のパッチを含むタンパク質をコートした基体（例えば抗体をコートした基体）も提供し（一次アレイを使用する場合）、この場合、各パッチは、種々の既知の配列で固定化したタンパク質を含み、各パッチは、隣接するパッチから約５０ｎｍ〜約５００μｍ離れている。好ましい実施形態においては、タンパク質がコートされた基体は９個以上のパッチを含む。
【０１６３】
基体上に分離した既知の領域で配置した複数のパッチを含むタンパク質をコートした基体を含み、各パッチは、種々の既知の配列で固定化したタンパク質を含み、各パッチは、隣接するパッチから約５０ｎｍ〜約５００μｍ離れている、バイオセンサー、微小測定装置、および医療機器も考慮される。
【０１６４】
あるいは、異なる抗体を使用してスクリーニングするために、異なるパッチを溶解物の領域に設計することもでき、各パッチは、スクリーニングされる対象の異なる細胞溶解物（例えば、コントロール、インビボサンプル、インビトロサンプル、骨負荷、既知のＷｎｔ経路アゴニストを使用した骨負荷など）のそれぞれの１つであってよい。したがって、１つのパッチが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれを超える数の異なる実験の組の細胞溶解物を有することができ、アレイ基体１つ当たりに複数のパッチを有することができる。
【０１６５】
一実施形態においては、基体上に分離した既知の領域で配置され、各パッチは、種々の既知の配列で固定化したタンパク質を含み、各パッチは、隣接するパッチから約５０ｎｍ〜約５００μｍ離れている、複数のパッチ、好ましくは９個以上のパッチを、タンパク質のアレイが含む。好ましい実施形態においては、これらのパッチは、隣接するパッチから約２００ｎｍ〜約５００μｍ離れている。
【０１６６】
アレイのある変形では、各パッチの直径が、パッチ間の距離に比例する。例えば、各パッチの面積は、約１００ｎｍ2〜約４０，０００μｍ2となることができる。好ましくは各パッチが約１μｍ2〜約１０，０００μｍ2の面積を有する。
【０１６７】
アレイの一実施形態においては、アレイは、全面積約１ｃｍ2以内で９個以上のパッチを含む。好ましい実施形態においては、アレイは、全面積約１ｃｍ2以内で１００個以上のパッチを含む。別の実施形態においては、アレイは、全面積約１ｃｍ2以内で１０3個以上のパッチを含む。
【０１６８】
アレイの一実施形態においては、あるパッチ上に固定化されたタンパク質が、同じアレイの第２のパッチ上に固定化されたタンパク質と異なる。例えば、ＧＳＫ−３のあるリン酸化体に対する抗体が、ＧＳＫ−３の別のリン酸化体に対する抗体の隣にある（一次タンパク質アレイを使用する場合）。
【０１６９】
本発明のアレイの別の実施形態においては、異なるパッチ上のタンパク質が同じものである。これらは、有用なコントロール領域として機能させることができる。
【０１７０】
アレイの基体は、有機または無機、生体物質または非生体物質、あるいはこれらの材料のあらゆる組み合わせであってよい。一実施形態においては、基体は、透明または半透明である。基体のパッチがある方の表面の一部は、好ましくは平坦であり、硬質または半硬質である。
【０１７１】
本発明のアレイの実施形態における基体として使用する場合、多くの種類の材料が好適となる。例えば、本発明のアレイの基体は、ケイ素、シリカ、石英、ガラス、細孔が調節されたガラス、炭素、アルミナ、二酸化チタン、ゲルマニウム、窒化ケイ素、ゼオライト、およびガリウムヒ素からなる群より選択される材料を含むことができる。金、白金、アルミニウム  銅、チタン、およびそれらの合金などの多くの金属も、アレイ基体として選択される。さらに、多くのセラミックスおよびポリマーも基体として使用することができる。基体として使用することができるポリマーとしては、限定するものではないが、ポリスチレン、ポリ（テトラ）フルオルエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルエチレン、ポリエチレンイミン、ポリ（エーテルエーテル）ケトン、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリビニルフェノール、ポリラクチド、ポリメタクリルイミド（ＰＭＩ）、ポリアルケンスルホン（ＰＡＳ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリイミド、コブロックポリマー、およびＥｕｐｅｒｇｉｔ（商標）が挙げられ、フォトレジスト、重合ラングミュア−ブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）膜、およびＬＩＧＡ構造も本発明の基体として機能しうる。本発明のアレイに好ましい基体は、ケイ素、シリカ、ガラス、またはポリマーを含む。
【０１７２】
本発明のアレイの好ましい実施形態においては、パッチが、基体表面上に単一層をさらに含み、パッチのタンパク質がこの単一層上に固定化される。この単一層は、好ましくは自己集合性単一層である。この単一層は、場合によっては、式Ｘ−Ｒ−Ｙの分子を含むことができ、式中、Ｒはスペーサーであり、Ｘは、Ｒを表面に結合させる官能基であり、Ｙは、タンパク質を単一層上にタンパク質を結合させるための官能基である。
【０１７３】
種々の化学部分を、アレイ中の単一層として機能させることができる。しかし、好ましくは、アレイのパッチ上に生体反応性のω官能基を高密度で露出させるために３つの主な種類の単一層形成が使用される：（ｉ）ヒドロキシル化された表面上のアルキルシロキサン単一層（「シラン」）、（ｉｉ）貴金属（好ましくはＡｕ（１１１））上のアルキル−チオール／ジアルキルジスルフィド単一層；および（ｉｉｉ）酸化物なしで不動態化させた基体上のアルキル単一層形成。当業者であれば、主として基体、被膜、およびアフィニティータグの選択に応じて、可能性のある多くの部分をＸ、Ｒ、および／またはＹの代わりに使用できることが分かるであろう。単一層の多くの例が、Ｕｌｍａｎ，ＡＮ  ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＴＯ  ＵＬＴＲＡＴＨＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＦＩＬＭＳ：ＦＲＯＭ  ＬＡＮＧＭＵＩＲ−ＢＬＯＤＧＥＴＴ  ＴＯ  ＳＥＬＦ  ＡＳＳＥＭＢＬＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）に記載されている。
【０１７４】
基体への被膜（存在する場合）の堆積または形成は、生体反応性単一層のパッチを形成する前に行われる。単一層適合性の表面パッチは、場合によっては、フォトリソグラフィ、微小成形（国際公開第９６／２９６２９号パンフレット）、湿式化学エッチング、またはこれらのあらゆる組み合わせを使用して製造することができる。次に生体反応性単一層がパッチ上に形成される。あるいは、生体反応性単一層で官能化された表面パッチのアレイは、マイクロスタンピング（例えば、米国特許第５，５１２，１３１号明細書および第５，７３１，１５２号明細書を参照されたい）またはミクロ接触プリンティング（μＣＰ）（例えば国際公開第９６／２９６２９号パンフレットを参照されたい）によって形成することもできる。続いて、生体分子を固定化することによって二次元タンパク質アレイが得られる。インクジェット式化合物供給装置によって、単一層Ｘ−Ｒ−Ｙ分子またはその成分を、基体または被膜の表面にナノメートルまたはマイクロメートルの規模でパターン形成するための別の方法が得られる（例えば、Ｌｅｍｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．６９：５４３−５５１（１９９７）を参照されたい）。
【０１７５】
パッチ間の拡散境界を、形状パターンとして、または垂直の濡れ挙動を有する表面機能として一体化させることができる。例えば、基体材料の壁またはフォトレジストを使用して、一部のパッチを他の部分のパッチと分離したり、全てのパッチを互いに分離したりすることができる。好ましい実施形態においては、Ｘ−Ｒ−Ｙの単一層が存在しない表面によって、パッチが互いに分離される。あるいは、異なる濡れ性を有する非生体反応性単一層を使用して、パッチを互いに分離することもできる。
【０１７６】
本発明の別の好ましい実施形態においては、アレイの各パッチに固定化されたタンパク質がタンパク質捕捉剤である。
本発明のアレイの別の実施形態においては、異なるパッチ上のタンパク質が同じものである。
【０１７７】
タンパク質アレイの作製方法のさらなる詳細については、例えば、米国特許第６，４７５，８０８号明細書、第６，５３７，７４９号明細書、第６，４９５，３１４号明細書、第６，４０６，９２１号明細書、および第６，４０６，８４０号明細書を参照されたい。（ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．Ｓｉｍｐｓｏｎ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００２）も参照されたい。
【０１７８】
（７．骨密度を調節する物質）
古典的Ｗｎｔ経路を介して骨密度を調節する物質としては、限定するものではないが、小化合物、干渉ＲＮＡ、アンチセンス核酸、ポリペプチド、アプタマー、免疫グロブリン、およびタンパク質ミメティックが挙げられる。これらの化合物は、骨負荷応答およびその増強をさらに分析するための研究用試薬として使用することができるし、被験体の骨密度を調節する手段として使用することもできる。好ましくは、これらの化合物は、Ｗｎｔ経路を活性化し、それによって骨粗鬆症に罹患した個人などの、骨石灰化の増強が必要な被験体の骨石灰化を増強するために使用される。
【０１７９】
（７．１  小化合物）
骨負荷を研究するための遺伝子発現プロファイルを発生するためのコントロールとして小化合物を使用することができる。これらの小化合物は、Ｗｎｔ経路の関与する骨石灰化障害の治療に使用することもできる。これらの小化合物は、βカテニン、ＧＳＫ−３、Ｗｎｔ（例えば、Ｗｎｔ  ３Ａ）、ＬＲＰ５（またはＬＲＰ６）、および骨負荷に対する応答またはＷｎｔ経路で発現されるあらゆるタンパク質の調節に使用することができる。
【０１８０】
（７．１．１  ＧＳＫ−３阻害剤）
グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）は、全ての真核生物に見られる多機能のセリン／スレオニンキナーゼである。ＧＳＫ−３が最初に同定された時には、酵素のグリコーゲンシンターゼをリン酸化し、それによってこの酵素を不活性化することが示された。ＧＳＫ−３の活性は、ＧＳＫ−３がリン酸化される程度によって調節される。リン酸化が減少すると、ＧＳＫ−３活性が増加する。現在、ＧＳＫ−３は、糖尿病、アルツハイマー病、双極性障害、および癌の発生と関係していると見なされている。ＧＳＫ−３は、ミトコンドリア細胞死経路の活性化による低酸素誘導性アポトーシスの重要なメディエーターであることも分かっている（Ｌｏｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（４４）：４１６６７−７３（２００２））。
【０１８１】
ＧＳＫ−３は、ＧＳＫ−３のリン酸化に応答するキナーゼであるホスホイノシチド３−キナーゼによって調節され、それによってこのタンパク質が不活性化される。
【０１８２】
周知のＧＳＫ−３阻害剤としてＬｉＣｌが挙げられる。しかし、ＬｉＣｌは選択的ではなく、ＧＳＫ−３以外の多くのタンパク質を調節するので、あまり好ましくない。選択的ＧＳＫ阻害剤およびアゴニストは、ＧＳＫタンパク質活性を調節し他のタンパク質は調節しないので好ましい。ＧＳＫ−３に対して選択的であり他のＧＳＫタンパク質には選択的ではないＧＳＫ阻害剤またはアゴニストがより好ましい。特定のＧＳＫ−３アイソフォーム（すなわち、ＧＳＫ−３αまたはＧＳＫ−３β）を区別することができる（これらの間で選択的である）ＧＳＫ阻害剤またはアゴニストが最も好ましい。選択的ＧＳＫ−３阻害剤としては、アロイシンＡ、アミロライド（Ｎａ+、Ｈ+交互輸送機構の阻害剤）、およびマレイミド化合物が挙げられる。
【０１８３】
アロイシンＡは、ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ〜Ｅ、ＣＤＫ２５／ｐ２５、および両方のＧＳＫ−３アイソフォームに対して選択性が高い。これはＡＴＰ結合ポケットと相互作用することによって作用し細胞増殖を阻害することが分かっている（Ｍｅｔｔｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４６（２）：２２２−３６（２００３））。
【０１８４】
特に、本発明の化合物は、ＧＳＫ−３の強力な阻害剤であるとして同定されている一連のピラゾロ［３，４−ｂ］ピリド［ａｚ］インを含む。これらのピラゾロ［３，４−ｂ］ピリド［ａｚ］インは次式を有する：
【化１】
2007525953.tif 000019
ピリダジン誘導体のＧＳＫ−３αホモロジーモデルへの自動リガンドドッキングから、ＡＴＰ結合部位と相互作用することが分かった。
【０１８５】
国際公開第００／３８６７５号パンフレット（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）（この記載内容全体が本明細書に組み入れられる）に記載されるようなマレイミド誘導体も本明細書での使用が考慮されている。
【０１８６】
国際公開第００／３８６７５号パンフレットに教示されているように、公開特許および特許出願の、欧州特許第４７０４９０号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、国際公開第９３／１８７６６号パンフレット（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、国際公開第９３／１８７６５号パンフレット（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、欧州特許第３９７０６０号明細書（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ）、国際公開第９８／１１１０５号パンフレット（Ａｓｔｒａ）、国際公開第９８／１１１０３号パンフレット（Ａｓｔｒａ）、国際公開第９８／１１１０２号パンフレット（Ａｓｔｒａ）、国際公開第９８／０４５５２号パンフレット（Ｒｏｃｈｅ）、国際公開第９８／０４５５１号パンフレット（Ｒｏｃｈｅ）、独国特許第４２４３３２１号明細書（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ）、独国特許第４００５９７０号明細書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、独国特許第３９１４７６４号明細書（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ）、国際公開第９６／０４９０６号パンフレット（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、国際公開第９５／０７９１０号パンフレット（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）、独国特許第４２１７９６４号明細書（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ）、米国特許第５８５６５１７号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、米国特許第５８９１９０１号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、および国際公開第９９／４２１００号パンフレット（Ｓａｇａｍｉ）（以降、これらの特許および特許出願を「グループ（ＩＡ）の刊行物」とも記載する）には、ある種のビスインドールマレイミド、インドールアリールマレイミド、およびインドロカルバゾール（以降「グループ（ＩＡ）の化合物」とも記載する）、ならびにそれらの調製方法が開示されている。
【０１８７】
公開特許および特許出願の欧州特許第３２８０２６号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、欧州特許第３８４３４９号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、欧州特許第５４０９５６号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、および独国特許第４００５９６９号明細書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）（以降、これらの特許および特許出願を「グループ（ＩＢ）の刊行物」とも記載する）には、ある種のビスインドールマレイミド、インドールアリールマレイミド、およびインドロカルバゾール（以降「グループ（ＩＢ）の化合物」とも記載する）、ならびにそれらの調製方法が開示されている。
【０１８８】
公開特許出願の欧州特許第５０８７９２号明細書（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）（以降、この特許出願を「グループ（ＩＣ）の刊行物」とも記載する）には、ある種のマレイミド誘導体（以降「グループ（ＩＣ）の化合物」とも記載する）、ならびにそれらの調製方法が開示されている。
【０１８９】
「グループ（ＩＡ）の刊行物」、「グループ（ＩＢ）の刊行物」、および「グループ（ＩＣ）の刊行物」からなる刊行物のグループを以降「グループ（Ｉ）の刊行物」と呼ぶ。
【０１９０】
「グループ（ＩＡ）の化合物」、「グループ（Ｂ）の化合物」、および「グループ（ＩＣ）の化合物」からなる刊行物のグループを以降「グループ（Ｉ）の化合物」と呼ぶ。
【０１９１】
公開特許および特許出願の、国際公開第９５／１７１８２号パンフレット（Ｌｉｌｌｙ）、国際公開第９５／３５２９４号パンフレット（Ｌｉｌｌｙ）、欧州特許第６２４５８６号明細書（Ｒｏｃｈｅ）、欧州特許第６５７４５８号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、欧州特許第７７６８９９号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、欧州特許第８０５１５８号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第５４９１２４２号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第５５４１３４７号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第５５４５６３６号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第５５５２３９６号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第５６２４９４９号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第５７１０１４５号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、米国特許第５７２１２７２号明細書（Ｌｉｌｌｙ）、国際公開第９７／１８８０９号パンフレット（Ｌｉｌｌｙ）、および国際公開第９８／０７６９３号パンフレット（Ｌｉｌｌｙ）（以降、これらの特許および特許出願を「グループ（ＩＩ）の刊行物」とも記載する）には、真性糖尿病およびその合併症と関連する症状の治療に有用であると記載されている選択的プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）β１およびＰＫＣβ２阻害剤であるある種の化合物（以降「グループ（ＩＩ）の化合物」とも記載する）が開示されている。
【０１９２】
Ｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６０（１９９９）４３３−４３６には、ある種のビスインドリルイナレイミド（ｂｉｓｉｎｄｏｌｙｌｉｎａｌｅｉｍｉｄｅ）がＧＳＫ−３阻害剤として開示されている。
【０１９３】
「グループ（Ｉ）の刊行物」および「グループ（ＩＩ）の刊行物」の開示は参照して本明細書に組み入れられる。
【０１９４】
一連のある種のビスインドールマレイミド、インドールアリールマレイミド、およびインドロカルバゾールは、特に強力で選択的なＧＳＫ−３阻害剤である。これらの化合物は、ＧＳＫ−３の阻害の必要性と関連する症状の治療および／または予防に有用であることが示されている。
【０１９５】
したがって、一態様においては、本明細書に使用されるマレイミド誘導体は、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物である。「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される好適な化合物は、欧州特許第４７０４９０号明細書、国際公開第９３／１８７６６号パンフレット、国際公開第９３／１８７６５号パンフレット、欧州特許第３９７０６０号明細書、国際公開第９８／１１１０５号パンフレット、国際公開第９８／１１１０３号パンフレット、国際公開第９８／１１１０２号パンフレット、国際公開第９８／０４５５２号パンフレット、国際公開第９８／０４５５１号パンフレット、独国特許第４２４３３２１号明細書、独国特許第４００５９７０号明細書、独国特許第３９１４７６４号明細書、国際公開第９６／０４９０６号パンフレット、国際公開第９５／０７９１０号パンフレット、独国特許第４２１７９６４号明細書、米国特許第５８５６５１７号明細書、米国特許第５８９１９０１号明細書、国際公開第９９／４２１００号パンフレット、欧州特許第３２８０２６号明細書、欧州特許第３８４３４９号明細書、欧州特許第５４０９５６号明細書、独国特許第４００５９６９号明細書、または欧州特許第５０８７９２号明細書（「グループ（Ｉ）の刊行物」）においてそれぞれ定義されている式（Ｉ）の化合物である。
特に、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物としては、「グループ（Ｉ）の刊行物」において例として特に開示されている化合物から選択される化合物が挙げられる。
「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物の例は、「グループ（ＩＡ）の刊行物」または「グループ（Ｂ）の刊行物」に開示されている化合物から選択される化合物であり、式（Ａ）である：
【化２】
2007525953.tif 000020
（上式中
Ｒは水素であり、
Ｒ2は、水素、５−Ｏｎ−Ｐｒ、５−Ｐｈ、５−ＣＯ2Ｍｅ、または５−ＮＯ2であり、
Ｒ3は、Ｍｅまたは（ＣＨ2）3ＯＨであり、
Ｒ4は、Ｍｅ、ｎ−Ｐｒ、−（ＣＨ2）3Ｘであり、Ｘは、ＣＮ、ＮＨ2、ＣＯ2Ｈ、ＣＯＮＨ2、またはＯＨから選択される）。
【０１９６】
「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物のさらに別の例は、「グループ（ＩＢ）の刊行物」に開示されている化合物から選択される化合物であり、式（Ｂ）である：
【化３】
2007525953.tif 000021
（上式中、
Ｒは水素であり、
Ｒ2は水素であり、
Ｒ3は、Ｍｅまたは基−（ＣＨ2）3Ｙであり、ＹはＮＨ2またはＯＨであり、
Ｒ4は、２−Ｃｌまたは２，４−ジ−Ｃｌである）。
【０１９７】
「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物のさらに別の例は、「グループ（ＩＣ）の刊行物」に開示されている化合物から選択される化合物であり、９，１０，１１，１２−テトラヒドロ−１０−カルボキシ−９，１２，−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン（式（Ｃ））である。
【化４】
2007525953.tif 000022
【０１９８】
「グループ（ＩＩ）の化合物」から選択される好適な化合物は、国際公開第９５／１７１８２号パンフレット、国際公開第９５／３５２９４号パンフレット、欧州特許第６２４５８６号明細書、欧州特許第６５７４５８号明細書、欧州特許第７７６８９９号明細書、欧州特許第８０５１５８号明細書、米国特許第５４９１２４２号明細書、米国特許第５５４１３４７号明細書、米国特許第５５４５６３６号明細書、米国特許第５５５２３９６号明細書、米国特許第５６２４９４９号明細書、米国特許第５７１０１４５号明細書、米国特許第５７２１２７２号明細書、国際公開第９７／１８８０９号パンフレット、または国際公開第９８／０７６９３号パンフレット（「グループ（ＩＩ）の刊行物」）において定義される式（Ｉ）の化合物である。
【０１９９】
特に、「グループ（ＩＩ）の化合物」から選択される化合物としては、「グループ（ＩＩ）の刊行物」において例として特に開示されている化合物から選択される化合物が挙げられる。
【０２００】
式（Ａ）の化合物の例としては、以下のリスト（以降「リストＡ」と呼ぶ）の化合物が挙げられる：
３，４−ビス（１−メチル−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−３−インドリル）−４−（１−プロピル−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−３−インドリル）−４−（１−［３−シアノプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−３−インドリル）−４−（１−［３−アミノプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−３−インドリル）−４−（１−［３−カルバモイルプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−５−プロピルオキシ−３−インドリル）−４−（１−［３−アミノプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−５−フェニル−３−インドリル）−４−（１−［３−ヒドロキシプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−５−フェニル−３−インドリル）−４−（１−［３−アミノプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−５−メトキシカルボニル−３−インドリル）−４−（１−［３−ヒドロキシプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−５−ニトロ−３−インドリル）−４−（１−［３−ヒドロキシプロピル］−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；および
３−（１−［３−ヒドロキシプロピル］−５−ニトロ−３−インドリル）−４−（１−メチル−３−インドリル）ピロール−２，５−ジオン；
またはこれらの薬学的に許容される誘導体。
【０２０１】
式（Ｂ）の化合物の例としては、以下のリスト（以降「リストＢ」と呼ぶ）の化合物が挙げられる：
３−（１−メチル−３−インドリル）−４−（２−クロロフェニル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−メチル−３−インドリル）−４−（２，４−ジクロロフェニル）ピロール−２，５−ジオン；
３−（１−［３−ヒドロキシプロピル）−３−インドリル）−４−（２−クロロフェニル）ピロール−２，５−ジオン；および
３−（１−［３−アミノプロピル−３−インドリル）−４−（２−クロロフェニル）ピロール−２，５−ジオン；
またはこれらの薬学的に許容される誘導体。
【０２０２】
式（Ｃ）の化合物の例は、
１０，１１，１２−テトラヒドロ−１０−カルボキシ−９，１２，−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオン、またはこの薬学的に許容される誘導体である。
【０２０３】
好適には、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物は、「グループ（ＩＡ）の刊行物」または「グループ（ＩＢ）の刊行物」に開示される化合物から選択される化合物であり、前述の定義の式（Ａ）の化合物である。
【０２０４】
好適には、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物は、「グループ（ＩＣ）の刊行物」に開示される化合物から選択される化合物であり、前述の定義の式（Ｃ）の化合物である。
【０２０５】
好都合には、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物は、「リストＡ」から選択される式（Ａ）の化合物である。
【０２０６】
好都合には、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物は、１０，１１，１２−テトラヒドロ−１０−カルボキシ−９，１２，−エポキシ−１Ｈ−ジインドロ［１，２，３−ｆｇ：３’，２’，１’−ｋｌ］ピロロ［３，４−ｉ］ベンゾジアゾシン−１，３（２Ｈ）−ジオンまたはこの薬学的に許容される誘導体である。
【０２０７】
好ましくは、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物は、「グループ（Ｂ）の刊行物」に開示される化合物から選択される化合物であり、前述の定義の式（Ｂ）の化合物である。
【０２０８】
より好ましくは、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物は、「リストＢ」から選択される式（Ｂ）の化合物である。
【０２０９】
最も好ましくは、「グループ（Ｉ）の化合物」から選択される化合物は、３−（１−メチル−３−インドリル）−４−（２，４−ジクロロフェニル）ピロール−２，５−ジオンである。
【０２１０】
「グループ（Ｉ）の化合物」および「グループ（ＩＩ）の化合物」は、少なくとも１つのキラル原子を含有することができ、および／または複数の結合を含有することができ、したがって１つ以上の立体異性体として存在することができる。
【０２１１】
本発明は、個別の異性体として、または複数の混合物、例えばラセミ体として、エナンチオマーおよび幾何異性体などの「グループ（Ｉ）の化合物」および「グループ（ＩＩ）の化合物」の全ての異性体を包含している。
【０２１２】
本発明は、「グループ（Ｉ）の刊行物」および「グループ（ＩＩ）の刊行物」にそれぞれ記載されている「グループ（Ｉ）の化合物」および「グループ（ＩＩ）の化合物」の薬理活性のある誘導体も含んでいる。
【０２１３】
本発明の化合物の好適な薬理活性のある誘導体としては、「グループ（Ｉ）の刊行物」および「グループ（ＩＩ）の刊行物」に記載されている塩および溶媒和物が挙げられる。
【０２１４】
「グループ（Ｉ）の化合物」および「グループ（ＩＩ）の化合物」の好適な薬学的に許容される誘導体としては、薬学的に許容される塩、および薬学的に許容される溶媒和物が挙げられる。
【０２１５】
国際公開第００／２１９２７号パンフレット（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）（この記載内容全体が本明細書に組み入れられる）に記載されるマレイミド誘導体も本明細書での使用が考慮される。
【０２１６】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットには、次式（Ｉ）の化合物：
【化５】
2007525953.tif 000023
またはそれらの薬学的に許容される誘導体が開示されている（上式中、
Ｒは、水素、アルキル、アリール、またはアラルキルであり、
Ｒ1は、水素、アルキル、アラルキル、ヒドロキシアルキル、またはアルコキシアルキルであり、
Ｒ2は、置換または未置換アリール、または置換または未置換ヘテロシクリルであり、
Ｒ3は、水素、置換または未置換のアルキル、シクロアルキル、アルコキシアルキル、置換または未置換のアリール、置換または未置換のヘテロシクリル、またはアラルキルであり、上記アリール部分は置換または未置換である、あるいは
Ｒ1およびＲ3を、これらが結合する窒素と合わせたものが、単環または縮合環の、場合によっては置換した、飽和、飽和または不飽和の複素環式環を形成する。
【０２１７】
好適には、Ｒは水素、Ｃ1〜6アルキル、例えばメチルまたはエチルである、またはＲはフェニルまたはベンジルである。
【０２１８】
好ましくは、Ｒは水素である。
【０２１９】
好適には、Ｒ1は、水素、Ｃ1〜6アルキル、例えばメチル、エチルである、またはＲ1は、ヒドロキシエチルまたはメトキシエチルである。
【０２２０】
好ましくは、Ｒ1は水素である。
【０２２１】
Ｒ2が置換または未置換アリールである場合、アリール基の例としてはフェニルおよびナフチルが挙げられる。
【０２２２】
Ｒ2が置換または未置換ヘテロシクリルである場合、ヘテロシクリル基の例としては、インドリル、ベンゾフラニル、チエニル、およびベンゾチエニルが挙げられる。
【０２２３】
Ｒ2が置換フェニルである場合、好適な置換基としては、ハロ、Ｃ1〜6アルコキシ、ニトロ、パーフルオロＣ1〜6アルキル、ベンゾイル、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、Ｃ1〜6アルキルスルホニル、ヒドロキシ、−Ｏ（ＣＨ2）wＯ−（式中のｗは１〜４である）、フェノキシ、ベンジルオキシ、Ｃ1〜6アルコキシＣ1〜6アルキル、パーフルオロＣ1〜6アルコキシ、Ｃ1〜6アルキルＳ−、パーフルオロＣ1〜6アルキルＳ−、（ジＣ1〜6アルキル）Ｎ−、アミノ、Ｃ1〜6アルキルカルボニルアミノ、置換または未置換ウレイド、フェニルカルボニルアミノ、ベンジルカルボニルアミノ、スチリルカルボニルアミノ、（ジＣ1〜6アルコキシ）（フェニル）Ｃ−、Ｃ1〜6アルキル、およびフェニルから独立に選択される最大３つの基が挙げられる。ウレイドの好適な置換基としては、フルオロフェニル、フェニルＣ1〜6アルキル−、シクロヘキシル、Ｃ1〜6アルケニル、Ｃ1〜6アルキル、およびＣ1〜6アルコキシフェニルが挙げられる。
【０２２４】
Ｒ2が置換インドリルである場合、好適な置換基としてはＣ1〜6アルキルが挙げられる。
【０２２５】
Ｒ2が置換ベンゾチエニルである場合、好適な置換基としてはＣ1〜6アルキルが挙げられる。
【０２２６】
好適には、Ｒ2は置換または未置換フェニルである。
【０２２７】
好都合には、Ｒ2は、置換フェニルであって、４−Ｃｌ、３−Ｃｌ、２−Ｃｌ、２，４−ジ−Ｃ１、３，４−ジ−Ｃ１、３，５−ジ−Ｃｌ、２，６−ジ−Ｃｌ、２−Ｆ−６−Ｃｌ、２−Ｆ、３−Ｆ、４−Ｆ、２，３−ジ−Ｆ、２，５−ジ−Ｆ、２，６−ジ−Ｆ、３，４−ジ−Ｆ、３，５−ジ−Ｆ、２，３，５−トリ−Ｆ、３，４，５−トリ−Ｆ、２−Ｂｒ、３−Ｂｒ、４−Ｂｒ、２−Ｉ、４−Ｉ、３−Ｃｌ−４−ＯＭｅ、３−ＮＯ2−４−Ｃ１、２−ＯＭｅ−５−Ｂｒ、２−ＮＯ2、３−ＮＯ2、４−ＮＯ2、２−ＣＦ3、３−ＣＦ3、４−ＣＦ3、３，５−ジ−ＣＦ3、４−ＰｈＣ（Ｏ）−、４−ＭｅＯ（Ｏ）Ｃ−、４−ＭｅＳＯ2−、４−ＯＨ、２−ＯＭｅ、３−ＯＭｅ、４−ＯＭｅ、２，４−ジ−ＯＭｅ、２，５−ジ−ＯＭｅ、３，４−ジ−ＯＭｅ、３，４−ＯＣＨ2Ｏ−、３，４，５−トリ−ＯＭｅ、３−ＮＯ2−４−ＯＭｅ、４−ＯｎＢｕ、２−ＯＥｔ、２−ＯＰｈ、３−ＯＰｈ、４−ＯＰｈ、２−ＯＣＨ2Ｐｈ、４−ＯＣＨ2Ｐｈ、４−（ＭｅＯＣＨ2）、２−ＯＣＦ3、４−ＯＣＦ3、４−ＳＭｅ、３−ＳＣＦ3、４−ＮＭｅ2、３−ＮＨ2、３−（ＮＨＣ（Ｏ）Ｍｅ）、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ（３−Ｆ−Ｐｈ）］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）2Ｐｈ］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨシクロヘキシル］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）Ｐｈ］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ2Ｐｈ］、３−［ｔｒａｎｓ−ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＰｈ］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ｎＰｒ］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＥｔ］、３−［ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ（３−ＯＭｅ−Ｐｈ）］、４−［Ｃ（ＯＭｅ）2Ｐｈ］、２−Ｍｅ、３−Ｍｅ、４−Ｍｅ、４−ｉＰｒ、２，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｍｅ、４−Ｐｈ、２，３−［（−ＣＨ2＝ＣＨ2−）］、または３，４−［（−ＣＨ2＝ＣＨ2−）］で置換されたフェニルである。
【０２２８】
Ｒ3がアルキルである場合、例としてはメチルおよびエチルが挙げられる。
【０２２９】
Ｒ3がシクロアルキルである場合、例としてはシクロヘキシルが挙げられる。
【０２３０】
Ｒ3がアルコキシアルキルである場合、例としてはメトキシエチルが挙げられる。
【０２３１】
Ｒ3がアラルキルである場合、例としてはベンジルおよびフェニルエチルが挙げられる。
【０２３２】
Ｒ3が置換または未置換アリールである場合、例としてはフルオレニル、フェニル、およびジベンゾフリルが挙げられる。
【０２３３】
Ｒ3が置換または未置換ヘテロシクリルである場合、例としてはチエニル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、ピリジル、およびピリミジニルが挙げられる。
【０２３４】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものが、未置換でも置換されていてもよい縮合複素環式環を形成する場合、例としては、インドリニル、インドリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリノニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンズアゼピニル、イソインドリン−２−イル、および１，３，３−トリメチル−６−アザビシクロ［３，２，１］オクタ−６−イルが挙げられる。
【０２３５】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものが、未置換でも置換されていてもよい１つの複素環式環を形成する場合、例としては、１−フェニル−１，３，８−トリアザスピロ−［４，５］−デカン−４−オン−８−イル、ピペラジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、およびピリジニウム環が挙げられる。
【０２３６】
Ｒ3が置換フェニルである場合、好適な置換基としては、置換または未置換のＣ1〜6アルキル、フェニル、ベンジル、置換または未置換Ｃ1〜6アルキルＳ−、ハロ、ヒドロキシ、置換または未置換Ｃ1〜6アルコキシ、置換または未置換フェノキシ、インドリル、ナフチル、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、ベンジルオキシ、ペンタフルオロフェノキシ、ニトロ、Ｎ−置換または未置換カルバモイル、置換または未置換Ｃ1〜6アルキルカルボニル、ベンゾイル、シアノ、パーフルオロＣ1〜6アルキルＳＯ2−、Ｃ1〜6アルキルＮＨＳＯ2−、オキサゾリル、Ｃ1〜6アルキルカルボニルピペラジニル、置換または未置換フェニルＳ−、Ｃ1〜6アルキルピペラジニル−、シクロヘキシル、アダマンチル、トリチル、置換または未置換Ｃ1〜6アルケニル、パーフルオロＣ1〜6アルキル、パーフルオロＣ1〜6アルコキシ、パーフルオロＣ1〜6アルキルＳ−、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、モルホリノ、（ジＣ1〜6アルキル）アミノ、Ｃ1〜6アルキルＣＯＮＨ−（ジＣ16アルコキシ）フェニル（ＣＨ2）nＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（フェニル）Ｓ−（式中、ｎは１〜６である）、およびＣ1〜6アルキルＣＯＮ（Ｃ1〜6アルキル）−、チアゾリジンジオニルＣ1〜6アルキル、フェニルＣＨ（ＯＨ）−、置換または未置換ピペラジニルＣ1〜6アルコキシ、置換または未置換ベンゾイルアミノ、あるいは−［ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ］−、−［（ＣＨ＝ＣＨ）2］−、−［（ＣＨ2）xＮ（Ｃ1〜6アルキルカルボニル）］−、−（ＣＨ2）x−、−ＳＣＨ＝Ｎ−、−ＳＣ（Ｃ1〜6アルキル）＝Ｎ−、？ＯＣＦ2Ｏ−、？ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−、−ＯＣ（ＮＨＣ1〜6アルキル）＝Ｎ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＣ1〜6アルキルＣ（Ｏ）−、−［ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝Ｎ］−、−［ＣＨ＝Ｃ（Ｃ1〜6アルキルカルボニル）Ｏ］−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）−、−［（ＣＨ2）xＣ（Ｏ）］−、−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｃ1〜6アルキル）Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）xＯ−、（ＣＨ2）xＳＯ2（ＣＨ2）y−、−Ｎ（Ｃ1〜6アルキルカルボニル）（ＣＨ2）x−（式中、ｘおよびｙは独立に１〜４である）、ピリミジン−２−イルオキシ、フェニルアミノ、Ｎ−［ピリミジン−２−イル］−Ｎ−［Ｃ1〜6アルキル］アミノ、Ｃ1〜6アルキルスルホニルアミノ、および１，２，３−チアジアゾリルから独立に選択される最大３つの基が挙げられる。
【０２３７】
Ｃ1〜6アルキルの好適な置換基としては、ヒドロキシ、カルボキシ、未置換のまたはＮ−置換カルバモイル、Ｎ−モルホリニルカルボニル、Ｃ1〜6アルキルアミノカルボニル、フルオロ、シアノ、Ｃ1〜6アルキル、Ｃ1〜6アルコキシカルボニルアミノ、アミノ、Ｃ1〜6アルキルカルボニルアミノ、ベンゾイルアミノ、フェニルアミノカルボニルアミノ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、ホスホノ、モノ−またはビスＣ1〜6アルキルホスホネート、Ｃ1〜6アルキルアミノスルホニル、およびＣ1〜6アルキルカルボニルアミノＣ1〜6アルキルアミノＣＯ−が挙げられる。
【０２３８】
Ｃ1〜6アルキルＳ−の好適な置換基としては、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、Ｃ1〜6アルコキシＣ1〜6アルキルアミノカルボニル、未置換またはＮ−置換カルバモイル、およびフルオロが挙げられる。
【０２３９】
Ｃ1〜6アルコキシの好適な置換基としては、Ｃ1〜6アルコキシ、フェニル、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、未置換またはＮ−置換カルバモイル、およびフェニルが挙げられる。
【０２４０】
カルバモイルの好適な置換基としては、Ｃ1〜6アルキル、およびＣ1〜6アルコキシＣ1〜6アルキルが挙げられる。
【０２４１】
Ｃ1〜6アルキルカルボニルの好適な置換基としては、カルボキシ、およびＣ1〜6アルコキシカルボニルが挙げられる。
【０２４２】
フェニルＳ−の好適な置換基としては、クロロ、ニトロ、カルボキシ、Ｃ1〜6アルキルアミノカルボニル、未置換またはＮ−置換カルバモイル、およびＣ1〜6アルコキシカルボニルが挙げられる。
【０２４３】
Ｃ1〜6アルケニルの好適な置換基としては、（ジＣ1〜6アルキル）アミノカルボニル、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、カルバモイル、およびフェニルが挙げられる。
【０２４４】
ピペラジニルＣ1〜6アルコキシの好適な置換基としてはメチルが挙げられる。
【０２４５】
フェノキシの好適な置換基としてはクロロが挙げられる。
【０２４６】
ベンゾイルアミノの好適な置換基としてはヒドロキシが挙げられる。
【０２４７】
Ｒ3が置換ベンゾフラニルである場合、好適な置換基としてはＣ1〜6アルキルカルボニルが挙げられる。
【０２４８】
Ｒ3が置換チエニルである場合、好適な置換基としてはＣ1〜6アルキルカルボニルが挙げられる。
【０２４９】
Ｒ3がオキサゾリルである場合、好適な置換基としてはＣ1〜6アルキルが挙げられる。
【０２５０】
Ｒ3が置換ベンゾオキサゾリルである場合、好適な置換基としてはハロが挙げられる。
【０２５１】
Ｒ3が置換ピリジルである場合、好適な置換基としては、Ｃ1〜6アルキル、Ｃ1〜6アルコキシ、およびハロから独立に選択される最大３個の置換基が挙げられる。
【０２５２】
好適には、Ｒ3は置換または未置換フェニルである。
【０２５３】
好都合には、Ｒ3は、置換フェニルであって、２−Ｍｅ、２−Ｅｔ２−ｉＰｒ、２−ＣＨ2ＯＨ２−Ｐｈ、２−ＣＨ2Ｐｈ、２−ＳＭｅ、２−Ｆ、２−Ｃｌ、２−ＯＨ、２−ＯＭｅ、２−ＯＰｈ、２−Ｍｅ−５−Ｆ、２−Ｍｅ−３−Ｃｌ、２−Ｍｅ−４−Ｃｌ、２−Ｍｅ−５−Ｃｌ、２−Ｍｅ−３−Ｂｒ、２，３−ジ−Ｍｅ、２，４−ジ−Ｍｅ、２−Ｍｅ−４−ＯＨ、２−Ｍｅ−４−ＯＭｅ、２−Ｍｅ−５−ＣＨ2ＯＨ、２，４，６−トリ−Ｍｅ、２−（２−インドリル）、（１−ナフチル）、２−Ｍｅ−５−ＣＯＯＨ、２−Ｍｅ−５−ＣＯＯＭｅ、２−ＯＨ−５−ＣＯＯＨ、２−［Ｏ（ＣＨ2）2ＯＭｅ］−５−［（ＣＨ2）2−，ＣＯＯＨ］、２−［ＳＣＨ（Ｐｈ）ＣＯＮＨ（ＣＨ2）2（３，４−ジ−ＯＭｅＰｈ）］、３−Ｍｅ、３−Ｅｔ、３−ＣＨ2ＯＨ、３−ＣＨ2ＯＨ−６−Ｍｅ、３−ＣＨ2ＯＨ−４−ＯＭｅ、３−（ＣＨ2ＮＭｅ2）−４−ＯＭｅ、３−［ＣＨ2ＣＯＯＨ］、３−［ＣＨ2ＣＯＯＭｅ］、３−［ＣＨ2ＣＯＮＨ2］、３−［ＣＨ2ＣＯＮＨＭｅ］、３−［ＣＨ2−（チアゾリジン−２，４−ジオン−５−イル）］、３−ＳＭｅ、３−Ｆ、３−Ｃｌ、３−Ｂｒ、３−Ｉ、３−ＣＦ3、３−ＯＨ、３−ＯＭｅ、３−ＯＣＨ2Ｐｈ、３−ＯｉＰｒ、３−ＯＰｈ、３−Ｏ−ペンタフルオロフェニル、３−（ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈ）、３−（ＯＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ）、３−（ＯＣＨ2ＣＯ2Ｅｔ）、３−ＮＯ2、３−ＣＯ2Ｈ、３−ＣＯ2Ｍｅ、３−ＣＯＮＨ2、３−ＣＯＮＨＭｅ、３−ＣＯＮＨＣＨ2ＣＨ2ＯＭｅ、３−ＣＯＭｅ、３−ＣＯＰｈ、３−（ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｈ）、３−（ＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ）、３−ＣＮ、３−ＳＯ2ＣＦ3、３−ＳＯ2ＮＨ−ｎＢｕ、３−（５−オキサゾリル）、３−［４−メチルピペラジン−１−イル］−４−ＯＭｅ、３−［Ｏ−（ピリミジン−２−イル）］、３−ＯＨ−４−ＯＭｅ、３，４−ジ−ＯＭｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ、３，４−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｍｅ、３−［ｔｒａｎｓ−ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＭｅ2］−４−Ｃｌ、３−Ｆ−４−Ｍｅ、３−Ｃｌ−４−Ｍｅ、３−Ｂｒ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｆ、３，４−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｂｒ、３−Ｃｌ−４−Ｂｒ、３−Ｃｌ−４−Ｉ、３−Ｃｌ−４−ＯＨ、３−Ｂｒ−４−ＯＨ、３−Ｆ−４−ＯＭｅ、３−Ｃｌ−４−ＯＭｅ、３−Ｃｌ−４−ＳＭｅ、３−Ｂｒ−４−Ｃｌ、３−Ｂｒ−４−ＯＣＦ3、３−Ｂｒ−５−ＣＦ3、３，５−ジ−Ｃｌ−４−ＯＨ、３，５−ジ−Ｂｒ−４−ＯＨ、３，５−ジ−Ｃｌ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｂｒ−４−Ｍｅ、３−［ＣＨ2ＣＨ（Ｍｅ）ＣＯ2Ｈ］、３−ＣＯ2Ｈ−４−Ｃｌ、３−ＣＯ2Ｍｅ−４−Ｃｌ、３−ＣＯ2Ｈ−４−ＯＨ、３−ＣＯＮＨ2−４−Ｍｅ、３−ＮＯ2−４−ＯＨ、３−ＣＯ2Ｈ−４−ＳＰｈ、３−ＣＯ2Ｈ−４−［Ｓ−（２−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ）］、３−ＣＯ2Ｈ−４−［Ｓ−（２−ＣＯＮＨＭｅ−Ｐｈ）］、３−ＣＯ2Ｅｔ−４−［Ｓ−（２−ＣＯ2Ｅｔ−Ｐｈ）］、３−ＣＯ2Ｈ−４−［Ｓ−（３−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ）］、３−ＣＯ2Ｍｅ−４−［Ｓ−（４−Ｃｌ−Ｐｈ）］、４−［Ｎ（Ｍｅ）（ピリミジン−２−イル）］、４−Ｍｅ、４−ｎＢｕ、４−ｔＢｕ、４−シクロヘキシル、４−アダマンチル、４−ＣＰｈ3、４−ＣＨ2ＣＮ、４−ＣＨ（ＯＨ）Ｍｅ、４−ＣＨ（ＯＭｅ）Ｍｅ、４−ＣＨ2ＯＨ、４−ＣＨ2ＮＨ��（Ｏ）ｔ−Ｂｕ、４−ＣＨ2ＮＨ2、４−ＣＨ2ＮＨＣＯＭｅ、４−ＣＨ2ＮＨＣＯＰｈ、４−ＣＨ2ＮＨＣＯＮＨＰｈ、４−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、４−ＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ、４−［ＣＨ2Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2］、４−［ＣＨ2Ｐ（Ｏ）（ＯＥｔ）2］、４−［ＣＨ2ＳＯ2ＮＨＭｅ］、４−（ＣＨ2）2ＯＨ、４−（ＣＨ2）2ＮＨ2、４−（ＣＨ2）2ＮＨＣＯＰｈ、４−（ＣＨ2）2ＮＨＣ（Ｏ）Ｏｔ−Ｂｕ、４−［（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｈ］、４−［（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｍｅ］、４−［（ＣＨ2）2ＣＨ2ＣＯＮＨ2］、４−［ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）6ＮＨＣＯＭｅ］、４−［（ＣＨ2）3ＣＯ2Ｈ］、４−［（ＣＨ2）3ＣＯ2Ｍｅ］、４−［ＣＨ＝ＣＨ2］、４−（ＣＨ＝ＣＨＣＯ2Ｈ）、４−（ＣＨ＝ＣＨＣＯ2Ｅｔ）、４−（ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＨ2）、４−（ＣＨ＝ＣＨＰｈ）、４−（ＣＨ＝ＣＨ（４−ＯＨＰｈ））、４−［１，２，３−チアジアゾール−４−イル］、４−［ＯＣＨ2−（１−メチル−ピペラジン−４−イル）］、４−［４−メチルピペラジン−ｌ−イル］、４−ＣＦ3、４−ＳＭｅ、４−（ＳＣＨ2ＣＯ2Ｈ）、４−（ＳＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ）、４−［ＳＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）2ＯＭｅ］、４−ＳＣＦ3、４−［Ｓ−（４−ＮＯ2−Ｐｈ）］、４−［Ｓ−（２−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ）］、４−［Ｓ−（３−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ）］、４−ＳＯ2ＮＨ2、４−Ｆ、４−Ｃｌ、４−Ｂｒ、４−Ｉ、４−ＯＨ、４−ＯＭｅ、４−ＯｎＢｕ、４−ＯＰｈ、４−［Ｏ−（４−Ｃｌ−Ｐｈ）］、４−ＯＣＨ2Ｐｈ、４−ＯＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ、４−ＣＯＰｈ、４−ＣＯＭｅ、４−ＣＯＮＨ2、４−ＣＯ2Ｈ、４−ＣＮ、４−ＮＯ2、４−モルホリニル、４−［ＣＨ2ＣＯ−モルホリン−１−イル）］、４−［ＣＨ2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）2ＯＭｅ］、４−［（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）6ＮＨＣ（Ｏ）Ｏｔ−Ｂｕ］、４−［（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）6ＮＨ2］、４−［（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ（ＣＨ2）6ＮＨ−ビオチニル］、４−ＮＭｅ2、４−ＮＨＣＯＭｅ、４−Ｎ（Ｍｅ）ＣＯＭｅ、２，３−ジ−Ｆ、４−［ＮＨＣＯ（Ｐｈ−２−ＯＨ）］、４−（フェニルアミノ）、４−メチルスルホニルアミノ、２，４−ジ−Ｆ、２，５−ジ−Ｆ、２−ＯＭｅ−３−Ｆ、３−ＣＨ2ＯＭｅ、３−ＣＨ（ＯＨ）Ｐｈ、３，４−ジ−Ｆ、３−ＣＯ2Ｈ−４−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、３−ＣＯ2Ｈ−４−［Ｓ−（２−ＣＯ2Ｅｔ）Ｐｈ］、３−ＣＯ2Ｅｔ−４−［Ｓ−（４−ＣＯ2Ｈ）Ｐｈ］、３−ＣＯＮＨＭｅ−４−［Ｓ−（２−ＣＯＮＨＭｅ）−Ｐｈ］、３−［４−（ジクロロアセチル）ピペラジン−１−イル］−４−ＯＭｅ、４−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、４−ＳＰｈ、４−［Ｓ−（４−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ）］、および４−ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈで置換されたフェニルが挙げられる。
【０２５４】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものがインドリニルを形成する場合、好適な置換基としては、Ｃ1〜6アルキル、パーフルオロＣ1〜6アルキル、Ｃ1〜6アルキルＳＯ2ＮＨ−ヒドロキシＣ1〜6アルキル、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、Ｃ1〜6アルコキシ、ハロ、ｔ−ブトキシカルボニルピペラジン−ｌ−イル、４−（Ｃ1〜6アルキル）ピペラジニル、ピペラジニル、アミド、およびニトロが挙げられる。
【０２５５】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものがピペラジニルを形成する場合、好適な置換基としては、アルキルカルボニル、アルキル、またはアリールが挙げられる。
【０２５６】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものがテトラヒドロキノリニルを形成する場合、好適な置換基としてはパーフルオロＣ1〜6アルキルが挙げられる。
【０２５７】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものがピリジニウム環を形成する場合、好適な置換基としてはアミノが挙げられる。
【０２５８】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものがピロリジニルを形成する場合、好適な置換基としてはヒドロキシが挙げられる。
【０２５９】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものがピペリジニルを形成する場合、好適な置換基としては、ベンジル、ヒドロキシＣ1〜6アルキル、Ｃ1〜6アルキル、ヒドロキシ、カルバモイル、およびＣ1〜6アルコキシカルボニルが挙げられる。
【０２６０】
Ｒ1およびＲ3を、これらと結合する窒素原子と合わせたものがオキシインドリルを形成する場合、好適な置換基としてはＣ1〜6アルキルが挙げられる。
【０２６１】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、化合物のサブグループであって、完全に式（Ｉ）の範囲内にあり、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が式（Ｉ）に関して定義される通りである式（ＩＡ）の化合物であり、ただし、式（ＩＡ）が以下の化合物（以降、リストＡと呼ぶ）を含まない化合物のサブグループが存在する：
３−フェニル−４−（４−メチルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−［４−（ジフェニルメチル）−１−ピペラジニル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（４−フェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−メチル−３−フェニル−４−（４−フェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−エチル−３−フェニル−４−（４−クロロフェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−アリル−３−フェニル−４−（４−メチルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−インドール−１−イル−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン；
１−（１−メチル−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）ピリジニウムクロリド；
１−［１−（４−メチル−ペンチル）−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル］ピリジニウムクロリド；
１−（１−ドデシル−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−ピリジニウムクロリド；
３−［２−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル−３−［４−（ジメチルアミノ）−２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール−１−イル］−カルバムイミドチオ酸，プロピルエステル；
３−（ジメチルアミノ）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（フェニルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−［［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（メチルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−ＩＨ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−ＩＨ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−ｌ−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（１−ピペリジニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−アセチル−３−［２，５−ジヒドロ−１−メチル−２，５−ジオキソ−４−［［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール；
３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−ｌ−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［３−［（ジメチルアミノ）メチル］−１Ｈ−インドール−ｌ−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−ｌ−イル）−４−（ｌ−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１Ｈ−インドール−１−カルボン酸，３−（４−アミノ−２，５−ジヒドロ−１−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−１，１−ジメチルエチルエステル；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−［（フェニルメチル）アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
グリシン，Ｎ−［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−，エチルエステル；
３−アミノ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［３−［（３−アミノプロピル）アミノ）プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
［［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［［３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］−３−［［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル］プロピル］−３−［［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−［３−（４−メチル−ｌ−ピペラジニル）プロピル］−４−［［３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３，３’−［イミノビス（３，１−プロパンジイルイミノ）］ビス［４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３，３’−［１，４−ピペラジンジイルビス（３，１−プロパンジイルイミノ）］ビス［４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（５−アミノペンチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［５−［（２−アミノエチル）アミノ］ペンチ］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（２−アミノエチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（６−アミノヘキシル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（７−アミノヘプチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［２−［（２−アミノエチル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
ベンゼンプロパンアミド，α−アミノ−Ｎ−［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］−，（Ｓ）−；
ペンタン酸，４−アミノ−５−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］−５−オキソ−，（Ｓ）−；
ペンタンアミド，２−アミノ−５−［（アミノイミノメチル）アミノ］−Ｎ−［２−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］エチル，（Ｓ）−；
ベンゼンプロパンアミド，α−アミノ−Ｎ−［２−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチ］アミノ］エチル−，（Ｓ）−ブタンアミド，４−（アミノイミノメチル）アミノ−Ｎ−［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］−，（Ｓ）−；
３−フェニル−４−（ジエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（ベンジルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−メチル−３−フェニル−４−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−アリル−３−フェニル−４−（２−ジメチルアミノエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；および，
１，３−ジフェニル−４−ピペリジノ−ピロール−２，５−ジオン。
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、化合物のさらなるサブグループであって、完全に式（Ｉ）の範囲内にあり、Ｒ、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が式（Ｉ）に関して定義される通りである式（ＩＢ）の化合物であり、ただし、式（ＩＢ）が以下の化合物（以降、リストＢと呼ぶ）を含まない化合物のサブグループが存在する：
３−（４−メチルピペラジン−１−イル）−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−エチルピペラジン−１−イル）−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−クロロフェニル）−４−（４−メチル−ピペラジン−ｌ−イル）−ピロール−２，５−ジオン；
３−［４−（ジフェニルメチル）−１−ピペラジニル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（４−メチルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（４−フェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−メチル−３−フェニル−４−（４−フェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−エチル−３−フェニル−４−（４−クロロフェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−アリル−３−フェニル−４−（４−メチルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニルアミノ−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−ピペリジン−１−イル−ピロール−２，５−ジオン；
３−（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−モルホリン−４−イル−ピロール−２，５−ジオン；
３−インドール−１−イル−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン；
１−（１−メチル−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−ピリジニウムクロリド；
１−ｌ−（４−メチル−ペンチル）−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−ピリジニウムクロリド；
１−（１−ドデシル−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−ピリジニウムクロリド；
３−［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−イミダゾール−ｌ−イル）−１−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸，１，１−ジメチルエチルエステル；
３−［２−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル−３−［４−（ジメチルアミノ）−２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール−１−イル］−カルバムイミドチオ酸，プロピルエステル；
３−（ジメチルアミノ）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（フェニルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−［［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（メチルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−ｌ−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−ｌ−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（ｌ−ピペリジニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−アセチル−３−［２，５−ジヒドロ−ｌ−メチル−２，５−ジオキソ−４−［［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール；
３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−ｌ−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−ｌ−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インダゾール−ｌ−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［３−［（ジメチルアミノ）メチル］−１Ｈ−インドール−１−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−１Ｈ−ピロール２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−ｌ−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−ｌ−イル）−４−（ｌ−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（３，５−ジメチル−ｌ−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１Ｈ−インドール−１−カルボン酸，３−（４−アミノ−２，５−ジヒドロ−１−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−，１，１−ジメチルエチルエステル；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−［（フェニルメチル）アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
グリシン，Ｎ−［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−，エチルエステル；
３−アミノ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−（４−メチルフェニル）−３−［（４−メチルフェニル）アミノ］−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［［３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］−３−［［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル］プロピル］−３−［［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル）プロピル］［アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−［３−（４−メチル−ｌ−ピペラジニル）プロピル］−４−［［３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３，３’−［イミノビス（３，１−プロパンジイルイミノ）］ビス［４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３，３’−［１，４−ピペラジンジイルビス（３，１−プロパンジイルイミノ）］ビス［４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（３，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（５−アミノペンチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［５−［（２−アミノエチル）アミノ］ペンチル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（２−アミノエチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（６−アミノヘキシル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（７−アミノヘプチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［２−［（２−アミノエチル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
ベンゼンプロパンアミド，α−アミノ−Ｎ−［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル）アミノ］ペンチル］−，（Ｓ）−；
ペンタン酸，４−アミノ−５−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］−５−オキソ−，（Ｓ）−；
ペンタンアミド，２−アミノ−５−［（アミノイミノメチル）アミノ］−Ｎ−［２−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］エチル］−，（Ｓ）−；
ベンゼンプロパンアミド，α−アミノ−Ｎ−［２−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］エチル］−，（Ｓ）−；
ブタンアミド，４−［（アミノイミノメチル）アミノ］−Ｎ−［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］−，（Ｓ）−；
３−（４−メチルフェニル）−ｌ−フェニル−４−（フェニルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１，３−ビス（４−メチルフェニル）−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−１，４−ジフェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−メチルフェニル）−４−（４−モルホリニル）−ｌ−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−メチルフェニル）−１−フェニル−４−［（フェニルメチル）アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−１−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（３，５−ジメチル−ｌ−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−ニトロフェニル）−ｌ−フェニル−４−フェニルアミノ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−１−メチル−４−ｐ−トリル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（２−ジエチルアミノ−エチルアミノ）−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ブチル−（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−１−メチル−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−（４−クロロ−フェニル）−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−（３−メトキシ−フェニル）−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−クロロ−フェニル）−４−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エチルアミノ］−ピロール−２，５−ジオン；
３−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エチルアミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（ジエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（ベンジルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−メチル−３−フェニル−４−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−アリル−３−フェニル−４−（２−ジメチルアミノエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；および
１，３−ジフェニル−４−ピペリジノ−ピロール−２，５−ジオン。
【０２６２】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、完全に式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＣ）：
【化６】
2007525953.tif 000024
の化合物のサブグループが存在する
（上式中、
ＲおよびＲ1は、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり；
Ｒ10は、水素を表すか、あるいは、アルコキシカルボニル、アルコキシアルキル、パーフルオロアルキル、パーフルオロアルキルＳ−、パーフルオロアルキルＯ−、フェニル（ジ−Ｃ1〜6アルコキシ）Ｃ−、ベンゾイル、Ｃ1〜6アルキルＳＯ2−、−［（ＣＨ＝ＣＨ）2］−、フェニル、ニトロ、−ＯＣＨ2Ｏ−、ベンジルオキシ、フェノキシ、ハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アミノ、モノ−またはジ−アルキルアミノ、あるいはチオアルキルからなるリストから選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表し；
Ｒ11は、水素を表すか、あるいは、置換または未置換Ｃ1〜6アルキル、フェニル、ベンジル、置換または未置換Ｃ1〜6アルキルＳ−、ハロ、ヒドロキシ、置換または未置換Ｃ1〜6アルコキシ、置換または未置換フェノキシ、インドリル、ナフチル、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、ベンジルオキシ、フェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、ニトロ、置換または未置換カルバモイル、置換または未置換Ｃ1〜6アルキルカルボニル、ベンゾイル、シアノ、パーフルオロＣ1〜6アルキルＳＯ2−、Ｃ1〜6アルキルＮＨＳＯ2−、オキサゾリル、置換または未置換フェニルＳ−、Ｃ1〜6アルキルピペラジニル−、Ｃ1〜6アルキルカルボニルピペラジニル−、１，２，３−チアジアゾリル、ピリミジン−２−イルオキシ、Ｎ−［ピリミジン−２−イル］−Ｎ−メチルアミノ、フェニルアミノ、Ｃ1〜6アルキルスルホニルアミノ、Ｎ−モルホリニルカルボニル、シクロヘキシル、アダマンチル、トリチル、置換または未置換Ｃ1〜6アルケニル、パーフルオロＣ1〜6アルキル、パーフルオロＣ1〜6アルコキシ、パーフルオロＣ1〜6アルキルＳ−、アミノスルホニル、モルホリノ、（ジＣ1〜6アルキル）アミノ、Ｃ1〜6アルキルＣＯＮＨ−、（ジＣ1〜6アルコキシ）フェニル（ＣＨ2）nＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（フェニル）Ｓ−（式中、ｎは１〜６である）、およびＣ1〜6アルキルＣＯＮ（Ｃ1〜6アルキル）−、チアゾリジンジオニルＣ1〜6アルキル、フェニルＣＨ（ＯＨ）−、置換または未置換ピペラジニルＣ1〜6アルコキシ、置換または未置換ベンゾイルアミノ；あるいは−（ＣＨ2）x−、−ＳＣＨ＝Ｎ−、−ＳＣ（Ｃ1〜6アルキル）＝Ｎ−、−ＯＣＦ2Ｏ−、−［ＣＨ＝ＣＨＣ（Ｏ）Ｏ］−、−［Ｎ＝ＣＨ−ＣＨＣＨ］−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＮＨ−、−ＯＣ（ＮＨＣ1〜6アルキル）＝Ｎ−、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＭｅＣ（Ｏ）−、Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ（Ｏ）−、（ＣＨ2）xＣ（Ｏ）、−Ｎ＝Ｎ−ＮＨ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｃ1〜6アルキル）Ｏ−、−Ｏ（ＣＨ2）xＯ、（ＣＨ2）xＳＯ2（ＣＨ2）y−、および−Ｎ（Ｃ1〜6アルキルカルボニル）（ＣＨ2）x−（式中、ｘおよびｙは独立に１〜４である）からなるリストから選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表す）。
【０２６３】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、Ｒ、Ｒ1、Ｒ10、およびＲ11が式（ＩＣ）に関して定義されている通りである、式（ＩＣ）の範囲内の式（ＩＣ’）の化合物のサブグループが存在し、ただし式（ＩＣ’）は以下のものを含まない：
３−フェニルアミノ−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−（４−メチルフェニル）−３−［（４−メチルフェニル）アミノ］−４−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−メチルフェニル）−１−フェニル−４−（フェニルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１，３−ビス（４−メチルフェニル）−４−［（４−メチルフェニル）アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；および
３−（４−ニトロフェニル）−１−フェニル−４−フェニルアミノ−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン。
【０２６４】
好適には、Ｒは水素である。
【０２６５】
好適には、Ｒ1は水素である。
【０２６６】
好適には、Ｒ10は、水素を表すか、あるいはハロ、ヒドロキシ、アルキル、アルキルチオ、アルコキシ、アミノ、またはメチレンジオキシからなるリストから選択される１つ以上の置換基、特に１つ以上のハロおよびアルキル基を表す。
【０２６７】
好都合には、Ｒ10は、水素を表すか、あるいは、２−Ｂｒ、２−Ｃｌ、２−Ｆ、２−ＯＭｅ、３−Ｃｌ、３−Ｆ、３−Ｍｅ、３−ＮＨ2、３−ＯＭｅ、４−Ｂｒ、４−Ｃｌ、４−Ｉ、４−Ｍｅ、４−ＯＨ、４−ＯＭｅ、４−ＳＭｅ、２，３−ジ−Ｆ、２，５−ジ−Ｆ、２，６−ジ−Ｆ、３，４−ジ−Ｆ、３，５−ジ−Ｆ、２，３，５−トリ−Ｆ、２，４−ジ−Ｃｌ、２，４−ジ−ＯＭｅ、３，４−（ＯＣＨ2Ｏ）、および３，５−ジ−Ｍｅからなるリストから選択される置換基を表す。
【０２６８】
より好都合には、Ｒ10は、２−Ｂｒ、２−Ｃｌ、２−Ｆ、２−ＯＭｅ、３−Ｃｌ、３−Ｆ、３−Ｍｅ、４−Ｂｒ、４−Ｃｌ、４−Ｉ、２，３−ジ−Ｆ、２，５−ジ−Ｆ、２，６−ジ−Ｆ、３，４−ジ−Ｆ、３，５−ジ−Ｆ、２，３，５−トリ−Ｆ、２，４−ジ−Ｃｌ、および３，５−ジ−Ｍｅからなるリストから選択される置換基を表す。
【０２６９】
好ましくは、Ｒ10は、２−Ｆ、２−ＯＭｅ、３−Ｆ、４−Ｃｌ、および２，３−ジ−Ｆからなるリストから選択される置換基を表す。
【０２７０】
好適には、Ｒ11は、水素を表すか、あるいは、２−Ｆ、２−Ｍｅ、３−Ｂｒ、３−Ｃｌ、３−Ｆ、３−Ｉ、３−ＯＨ、３−ＯＭｅ、３−ＯＰｈ、３−ＳＭｅ、３−ＣＯ2Ｈ、３−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、３−ＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ、３−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、３−ＣＨ2ＣＯＮＨＭｅ、３−ＣＨ2ＯＨ、４−Ｃｌ、４−Ｆ、４−Ｍｅ、４−ＮＨＣＯＭｅ、４−ＮＨＰｈ、４−ＮＨＳＯ2Ｍｅ、４−ＮＭｅ2、４−ＯＭｅ、４−ＣＯＰｈ、４−ＳＭｅ、４−ＣＨ2ＣＮ、４−ＳＯ2ＮＨ2、４−（ＣＨ2）2ＯＨ、４−ＣＨ（ＯＨ）Ｐｈ、４−ＣＨ2ＳＯ2ＮＨＭｅ、４−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、４−（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｈ、４−（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｍｅ、４−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ2、４−（ＣＨ2）3ＣＯ2Ｈ、４−（ＣＨ2）3ＣＯＮＨ2、４−ＣＨ＝ＣＨＣＯ2Ｈ、４−ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＨ2、４−ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈ、４−ＳＣＨ2ＣＯ2Ｈ、４−Ｓ−［２−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ］、４−Ｓ−［３−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ］、４−ＣＨ2（１，３−チアゾリジン−２，４−ジオン−５−イル）、２，３−ジ−Ｆ、２，４−ジ−Ｆ、３，４−ジ−Ｆ、３，５−ジ−Ｆ、３−Ｃｌ−４−Ｂｒ、３−Ｃｌ−４−Ｍｅ、３−Ｂｒ−４−Ｍｅ、３−Ｃｌ−４−ＯＨ、３−Ｃｌ−４−ＯＭｅ、３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ、３，４−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、３，４−ＯＣＦ2Ｏ−、３，５−ジ−Ｂｒ−４−ＯＨ、３，５−ジ−Ｃｌ−４−Ｍｅ、３，５−ジ−Ｃｌ−４−ＯＨ、３−ＣＯ2Ｈ−４−［Ｓ−（２−ＣＯ2Ｈ）−Ｐｈ］、３−ＣＯ2Ｈ−４−［Ｓ−（２−ＣＯＮＨＭｅ）−Ｐｈ］、３−ＣＯ2Ｈ−４−Ｃｌ、３−Ｆ−４−Ｍｅ、３−Ｆ−４−ＯＭｅ、３，４−［（ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ）］−、３，４−［（Ｎ＝Ｎ−ＮＨ）］−、３，４−［（ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ）］−、３，４−［（ＣＨ2）3］−、３，４−［（Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ）］−、３，４−［Ｏ−Ｃ（ＮＨＭｅ）＝Ｎ］−、３，４−［ＯＣＨ2Ｏ］−、３，４−［Ｓ−Ｃ（ＮＨＭｅ）＝Ｎ］−、および３，４−［Ｓ−ＣＨ＝Ｎ］−からなるリストから選択される１つ以上の置換基を表す。
【０２７１】
好都合には、Ｒ11は、水素を表すか、あるいは、２−Ｆ、２−Ｍｅ、３−Ｃｌ、３−Ｆ、３−Ｉ、３−ＯＭｅ、３−ＯＰｈ、３−ＳＭｅ、３−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、３−ＣＨ2ＣＯ2Ｍｅ、３−ＣＨ2ＣＯＮＨ2、３−ＣＨ2ＣＯＮＨＭｅ、３−ＣＨ2ＯＨ、４−Ｃｌ、４−Ｆ、４−Ｍｅ、４−ＮＨＣＯＭｅ、４−ＮＨＰｈ、４−ＮＨＳＯ2Ｍｅ、４−ＮＭｅ2、４−ＯＭｅ、４−ＣＯＰｈ、４−ＳＭｅ、４−ＣＨ2ＣＮ、４−ＳＯ2ＮＨ2、４−（ＣＨ2）2ＯＨ、４−ＣＨ（ＯＨ）Ｐｈ、４−ＣＨ2ＳＯ2ＮＨＭｅ、４−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ、４−（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｈ、４−（ＣＨ2）2ＣＯ2Ｍｅ、４−（ＣＨ2）2ＣＯＮＨ2、４−（ＣＨ2）3ＣＯ2Ｈ、４−（ＣＨ2）3ＣＯＮＨ2、４−ＣＨ＝ＣＨＣＯＮＨ2、４−ＯＣＨ2ＣＯ2Ｈ、４−ＳＣＨ2ＣＯ2Ｈ、４−Ｓ−［２−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ］、４−Ｓ−［３−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ］、４−ＣＨ2（１，３−チアゾリジン−２，４−ジオン−５−イル）、２，３−ジ−Ｆ、２，４−ジ−Ｆ、３，４−ジ−Ｆ、３，５−ジ−Ｆ、３−Ｃｌ−４−Ｂｒ、３−Ｃｌ−４−Ｍｅ、３−Ｂｒ−４−Ｍｅ、３−Ｃｌ−４−ＯＨ、３−Ｃｌ−４−ＯＭｅ、３，５−ジ−Ｍｅ、３，５−ジ−ＯＭｅ、３，４−［ＯＣ（Ｏ）ＮＨ］、３，４−［ＯＣＦ2Ｏ］３，５−ジ−Ｃｌ−４−Ｍｅ、３−ＣＯ2Ｈ−４−［Ｓ−（２−Ｃ（ＮＨＭｅ）−Ｐｈ］、３−Ｆ−４−Ｍｅ、３−Ｆ−４−ＯＭｅ、３，４−［（ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ）］、３，４−［（Ｎ＝Ｎ−ＮＨ）］、３，４−［（ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ）］、３，４−［（ＣＨ2）3］、３，４−［Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ］、３，４−［Ｏ−Ｃ（ＮＨＭｅ）＝Ｎ］、３，４−［ＯＣＨ2Ｏ］、３，４−［Ｓ−Ｃ（ＮＨＭｅ）＝Ｎ］、および３，４−［Ｓ−ＣＨ＝Ｎ］からなるリストから選択される１つ以上の置換基を表す。
【０２７２】
より好都合には、Ｒ11は、３−Ｃｌ、３−Ｂｒ、４−ＯＭｅ、３，５−ジ−Ｆ、４−ＣＨ2ＳＯ2ＮＨＭｅ、４−（ＣＨ2）3ＣＯ2Ｈ、および４−Ｓ−［３−ＣＯ2Ｈ−Ｐｈ］からなるリストから選択される置換基を表す。
【０２７３】
特に挙げられる式（ＩＣ）の化合物は、ＲおよびＲ1がそれぞれ水素を表し、Ｒ10およびＲ11がそれぞれ以下のものを表す化合物である：
【０２７４】
【表８】
2007525953.tif 000025
【０２７５】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、完全に式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＤ）：
【化７】
2007525953.tif 000026
の化合物またはその第４級化塩のサブグループが存在する
（上式中、ＲおよびＲ1は、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり、
Ｒ2'は、フェニル、置換フェニル、またはインドリルであり、
Ｒ3'は、水素、アルキル、シクロアルキル、フェニル、置換フェニル、Ｃ1〜6アルキルフェニル（このフェニル基は場合によっては置換されている）、アルコキシアルキル、置換または未置換ヘテロシクリルである）。
【０２７６】
一態様においては、式（ＩＤ）の化合物を除いた前述の定義の式（Ｉ）の化合物が提供される。
【０２７７】
Ｒ、Ｒ1、Ｒ2'、およびＲ3'が式（ＩＤ）に関して定義されている通りであり、式（ＩＤ）の範囲内にある式（ＩＤ’）の化合物のサブグループが存在し、ただし、式（ＩＤ’）は、以下の化合物（以降、リストＤ’と呼ぶ）を含まない：
３−［２−ベンゾ［ｂ］チエン−２−イル−３−［４−（ジメチルアミノ）−２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール−１−イル］−カルバムイミドチオ酸，プロピルエステル；
３−（ジメチルアミノ）−４−（１−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（フェニルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−［［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（メチルアミノ）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（６−クロロ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（６−アミノ−９Ｈ−プリン−９−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−アセチル−３−［２，５−ジヒドロ−１−メチル−２，５−ジオキソ−４−［［４−（トリフルオロメチル）フェニル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール；
３−アミノ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（５−メトキシ−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１Ｈ−インドール−１−カルボン酸，３−（４−アミノ−２，５−ジヒドロ−１−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−，１，１−ジメチルエチルエステル；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−［（フェニルメチル）アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
グリシン，Ｎ−［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−，エチルエステル；
３−アミノ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル［プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−４−［［３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］−３−［［３−［（３−アミノプロピル）アミノ］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
１−［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル］プロピル］−３−［［３−［４−（３−アミノプロピル）−１−ピペラジニル］プロピル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−ｌ−［３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル］−４−［［３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル］アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３，３’−［イミノビス（３，１−プロパンジイルイミノ）］ビス［４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３，３’−［１，４−ピペラジンジイルビス（３，１−プロパンジイルイミノ）］ビス［４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（３，４−ジメトキシフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（５−アミノペンチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［５−［（２−アミノエチル）アミノ］ペンチル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（２−アミノエチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（６−アミノヘキシル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［（７−アミノヘプチル）アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［［２−［（２−アミノエチル）アミノ］エチル］アミノ］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
ベンゼンプロパンアミド，α−アミノ−Ｎ−［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］−，（Ｓ）−；
ペンタン酸，４−アミノ−５−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］−５−オキソ−，（Ｓ）−；
ペンタンアミド，２−アミノ−５−［（アミノイミノメチル）アミノ］−Ｎ−［２−［［５−［［２，Ｓ−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］エチル］−，（Ｓ）−；
ベンゼンプロパンアミド，α−アミノ−Ｎ−［２−［［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］アミノ］エチル］−，（Ｓ）−；
ブタンアミド，４−［（アミノイミノメチル）アミノ］−Ｎ−［５−［［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］アミノ］ペンチル］−，（Ｓ）−；
３−アミノ−１，４−ジフェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−メチルフェニル）−１−フェニル−４−［（フェニルメチル）アミノ］−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−４−（４−メチルフェニル）−１−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−アミノ−１−メチル−４−ｐ−トリル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（２−ジエチルアミノ−エチルアミノ）−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ブチル−（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−１−メチル−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−（４−クロロ−フェニル）−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジエチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−［ベンジル−（２−ジメチルアミノ−エチル）−アミノ］−４−（３−メトキシ−フェニル）−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−クロロ−フェニル）−４−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エチルアミノ］−ピロール−２，５−ジオン；
３−［２−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−エチルアミノ］−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（ジエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（ベンジルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−メチル−３−フェニル−（２−ジエチルアミノエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン；および
１−アリル−３−フェニル−４−（２−ジメチルアミノエチルアミノ）−ピロール−２，５−ジオン）。
【０２７８】
好適にはＲ2'は、インドリル、フェニル、あるいは、ハロ、ハロアルキル、アルコキシ、ニトロ、アルキル、およびアルコキシからなるリストから選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基で置換されたフェニルである。
【０２７９】
Ｒ2'の例としては、フェニル、インドール−３−イル、２−メトキシフェニル、３−フルオロフェニル、３−ニトロフェニル、４−クロロフェニル、４−ヨードフェニル、４−（トリフルオロメチル）フェニル、および２，３−ジフルオロフェニルが挙げられる。
【０２８０】
好適にはＲ3'は、水素、Ｃ1〜6アルキル、シクロヘキシル、フェニル、フルオレニル、Ｃ1〜2アルキルフェニル、Ｃ1〜6アルコキシＣ1〜2アルキル、あるいは、５または６個の環原子を有し、各環中に最大３個のヘテロ原子を有する置換または未置換の単環または単環または縮合環のヘテロシクリル基、例えばオキサゾリル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、ピリジニル、キノリニル、およびピリミジニルを表す。
【０２８１】
Ｒ3'の例としては、水素、エチル、シクロヘキシル、フェニル、フルオレン−２−イル、ベンジル、フェニル（ＣＨ2）2−、ＭｅＯ（ＣＨ2）2−、４−メチルオキサゾール−２−イル、２−アセチルベンゾフラン−５−イル、ジベンゾフラン−２−イル、ジベンゾフラン−３−イル、２−メチルピリジン−３−イル、２，６−ジメチルピリジン−３−イル、２−クロロピリジン−５−イル、キノリン−３−イル、ピリミジン−２−イルが挙げられる。
【０２８２】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、完全に式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＥ）：
【化８】
2007525953.tif 000027
の化合物のサブグループが存在する
（上式中、Ｒは、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり；
Ｒ10'は、水素を表すか、あるいは、アルコキシ、ハロ、およびニトロからなるリストから選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表し；
Ｐ’−Ｑ’は、（ＣＨ2）aＯ（ＣＨ2）b−、（ＣＨ2）aＳ（ＣＨ2）b−、−（ＣＨ2）c−、−（ＣＨ2）dＣＨ（Ｇ）（ＣＨ2）e−、−（ＣＨ2）aＮ（ＺＺ）（ＣＨ2）b−を表し、ａ、ｂ、ｄ、およびｅは独立に１〜４であり、ｃは１〜６であり、ＺＺは、水素、アルキル、アリール、またはアルキルカルボニルであり、Ｇは、アルキル、アミド、ヒドロキシアルキル、アラルキル、またはヒドロキシである）。
【０２８３】
Ｒ、Ｒ10'、およびＰ’−Ｑ’が式（ＩＥ）に関連して定義される通りである、式（ＩＥ）の範囲内にある式（ＩＥ’）の化合物のサブグループが存在し、ただし、式（ＩＥ’）は以下のものを含まない；
３−フェニル−４−ピペリジン−１−イル−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−メチルピペラジン−１−イル）−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−エチルピペラジン−ｌ−イル）−４−フェニル−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−クロロフェニル）−４−（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−ピロール−２，５−ジオン；
３−（４−メチルフェニル）−４−（４−モルホリニル）−１−フェニル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（４−メチルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
３−フェニル−４−（４−フェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−メチル−３−フェニル−４−（４−フェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−エチル−３−フェニル−４−（４−クロロフェニルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；
１−アリル−３−フェニル−４−（４−メチルピペラジノ）−ピロール−２，５−ジオン；および
１，３−ジフェニル−４−ピペリジノ−ピロール−２，５−ジオン。
【０２８４】
好適には、Ｒ10'は、メトキシ、クロロ、またはニトロである。
【０２８５】
Ｒ10'の例としては、４−メトキシ、４−クロロ、２，４−ジクロロ、および３−ニトロが挙げられる。
【０２８６】
−Ｐ’−Ｑ’−の例としては、−（ＣＨ2）4−、−（ＣＨ2）2Ｏ（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）3ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ2−、−（ＣＨ2）3ＣＨ（ＣＯＮＨ2，）ＣＨ2−、−（ＣＨ2）3ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＨ2−、−（ＣＨ2）2ＣＨ（ＣＨ2Ｐｈ）（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）2ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ2）2−、−（ＣＨ2）5−、および−（ＣＨ2）Ｓ（ＣＨ2）2−が挙げられる。
【０２８７】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＦ）：
【化９】
2007525953.tif 000028
の化合物のサブグループが存在する
（上式中、Ｒは、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり；
Ｒ10"は、パーフルオロアルキル、ハロ、ニトロ、アルコキシ、アリールカルボニル、アルキルからなるリストから選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基であり；
Ｚは、結合またはアルキレン鎖であり；
−Ｘ−Ｙ−は、−ＣＨ＝Ｎ、−（ＣＨ2）t−、−（ＣＨ2）uＣＨ（Ｕ）−、−（Ｕ）ＣＨ（ＣＨ2）u−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−（ＣＨ2）vＣ（アルキル）2−、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（アルキル）2−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−であり、ｔ、ｕ、およびｖは独立に１〜４であり、Ｕは、アルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシアルキル、およびアミドであり；
Ｒ12a'、Ｒ12b'、およびＲ12c'はそれぞれ独立に、水素、ニトロ、アルコキシ、４−エチルピペラジン−１−イル、４−ＢＯＣ−ピペラジン−１−イル、４−メチル−ピペラジン−１−イル、４−メチル−ピペラジン−１−イル、ハロ、アルキル、ピペラジン−１−イル、パーフルオロアルキル、およびアルキルスルホニルアミノである）。好適には、Ｚは、結合またはＣ1〜2アルキレン鎖である。
【０２８８】
Ｚの例としては、結合、メチレン、またはエチレンが挙げられる。
【０２８９】
Ｘ−Ｙ−の例は、−ＣＨ＝Ｎ−、−（ＣＨ2）2−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ（ＣＯ2Ｈ）ＣＨ2−、−ＣＨ（ＣＯ2Ｍｅ）ＣＨ2−、−（ＣＨ2）3−、−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）−、−ＣＨ2ＣＨ（Ｍｅ）−、−ＣＨ2Ｃ（Ｍｅ）2−、−ＣＨ（ＣＯＮＨ2）ＣＨ2−、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｍｅ）2−、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−である。
【０２９０】
Ｒ12a'、Ｒ12b'、およびＲ12c'の例としては、水素、ニトロ、フルオロ、メトキシ、４−エチルピペラジン−１−イル、４−ＢＯＣ−ピペラジン−１−イル、４−メチル−ピペラジン−１−イル、４−メチル−ピペラジン−１−イル、クロロ、ブロモ、トリフルオロメチル、およびメタンスルホニルアミノが挙げられる。
【０２９１】
好ましくは、Ｚは結合である。
【０２９２】
好ましくは、−Ｘ−Ｙ−は、−（ＣＨ2）2−または−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ（Ｍｅ）−、または−ＣＨ2Ｃ（Ｍｅ）2−である。
【０２９３】
好ましくは、Ｒ12b'はフッ素である。
【０２９４】
好ましくは、Ｒ12a'はフッ素である。
【０２９５】
最も好ましくは、Ｒ10"は、２−Ｂｒ、２−Ｃｌ、２−Ｆ、２−ＯＭｅ、３−Ｃｌ、３−Ｆ、３−Ｍｅ、４−Ｂｒ、４−Ｃｌ、４−Ｉ、２，３−ジ−Ｆ、２，５−ジ−Ｆ、２，６−ジ−Ｆ、３，４−ジ−Ｆ、３，５−ジ−Ｆ、２，３，５−トリ−Ｆ、２，４−ジ−Ｃｌ、３，５−ジ−Ｍｅであり；
Ｚは結合であり；
−Ｘ−Ｙ−は、−（ＣＨ2）2−、−ＣＨ（ＣＨ2ＯＨ）ＣＨ2−、−ＣＨ（Ｍｅ）ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ（Ｍｅ）−、または−ＣＨ2Ｃ（Ｍｅ）2−であり；
Ｒ12b'はフッ素であり；
Ｒ12a'はフッ素である。
【０２９６】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、完全に式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＧ）：
【化１０】
2007525953.tif 000029
の化合物のサブグループが存在する
（上式中、ＲおよびＲ1は、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり、
Ａは、Ｎ（アルキル）、酸素、または硫黄である）。
【０２９７】
Ａの例は、Ｎ（メチル）、酸素、および硫黄である。
【０２９８】
好ましくは、Ａは硫黄である。
【０２９９】
Ｒ11"は、水素、ハロ、アルキル、アルキルチオ、−Ｓ−ＣＨ＝Ｎ−、フェノキシ、−（ＣＨ2）w−、ヒドロキシ、カルボキシ、−Ｏ（ＣＨ2）xＯ−、ヒドロキシアルキル、およびアルキルアミノスルホニルアルキルからなる群より選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基であり、上式中、ｗおよびｘは独立に１〜４である。
【０３００】
Ｒ11"の例は、水素、ブロモ、メチル、メチルチオ、クロロ、−Ｓ−ＣＨ＝Ｎ−、フェノキシ、−（ＣＨ2）3−、ヒドロキシ、カルボキシ、−Ｏ（ＣＨ2）Ｏ−、フルオロ、ヒドロキシメチル、およびＭｅＮＨＳＯ2ＣＨ2−である。
【０３０１】
好ましくは、Ｒ11"は、３−Ｂｒ、４−Ｍｅ、４−ＳＭｅ、３−Ｂｒ−４−Ｍｅ、３−Ｃｌ、３，４−［Ｓ−ＣＨ＝Ｎ］−、３−ＯＰｈ、３，４−［（ＣＨ2）3］−、３−ＳＭｅ、水素、３，５−ジＢｒ−４−ＯＨ、３，５−ジＣｌ−４−ＯＨ、３−ＣＯ2Ｈ−４−Ｃｌ、３，４−［−ＯＣＨ2Ｏ］−、３−Ｃｌ−４−ＯＨ、３，５−ジＦ、３−ＣＨ2ＯＨ、３−ＯＨ、または４−ＣＨ2ＳＯ2ＮＨＭｅである。
Ｒ13'は、−（ＣＨ＝ＣＨ）2−および水素からなる群より選択される１つ以上、好適には最大２つの置換基である。
【０３０２】
Ｒ13'の例としては、４，５−［（ＣＨ＝ＣＨ）2］−および水素が挙げられる。
【０３０３】
好ましくは、Ｒ13'は水素である。
【０３０４】
国際公開第００／２１９２７号パンフレット、に開示されているように、完全に式（１）の範囲内にある式（ＩＨ）：
【化１１】
2007525953.tif 000030
の化合物のサブグループが存在する
（上式中、ＲおよびＲ1は、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり、
Ｒ11'"は−［（ＣＨ2）aa］であり、ａａは１〜４であり、
Ｒ14'は水素であり、
Ｒ15'は、アルキル、未置換または置換フェニルアミノ、未置換または置換フェニルアルキルアミノ、シクロヘキシルアミノ、アルケニルアミノ、フェニル、ベンジル、スチリル、またはアルキルアミノである）。
【０３０５】
Ｒ11"'の例としては３，４−［（ＣＨ2）3］が挙げられる。
【０３０６】
好適には、Ｒ15'は、Ｃ1〜6アルキル、（ハロフェニル）アミノ、フェニルアルキルアミノ、シクロヘキシルアミノ、プロペニルアミノ、フェニル、ベンジル、スチリル、プロピル、エチルアミノ、または（メトキシフェニル）アミノである。
【０３０７】
Ｒ15'の例としては、メチル、（３−フルオロフェニル）アミノ、フェニルエチルアミノ、シクロヘキシルアミノ、プロペニルアミノ、フェニル、ベンジル、ｔｒａｎｓ−スチリル、ｎ−プロピル、エチルアミノ、および（３−メトキシフェニル）アミノが挙げられる。
【０３０８】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、完全に式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＪ）：
【化１２】
2007525953.tif 000031
の化合物のサブグループが存在する
（上式中、ＲおよびＲ1は、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり、
Ｒ10'"は、アルコキシまたはハロから独立に選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表し、
Ｒ16'は、水素、カルボキシ、アルコキシカルボニル、またはアルキルアミノカルボニルから独立に選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表し、
Ｒ17'は、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ハロ、アルキルアミノカルボニル、ニトロ、または水素から独立に選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表し、
Ｗは硫黄、酸素、置換または未置換のＮＨである）。
【０３０９】
好適には、Ｗは硫黄または酸素である。好都合には、Ｗは硫黄である。
【０３１０】
好適には、Ｒ10'"はＣ1〜6アルコキシ、クロロ、またはフルオロである。
【０３１１】
Ｒ10'''の例は、メトキシ、４−クロロ、２−クロロ、および２，３−ジフルオロである。
【０３１２】
好都合には、Ｒ10'"は２，３−ジフルオロである。
【０３１３】
好適には、Ｒ16'は、水素、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、またはＣ1〜6アルキルアミノカルボニルである。
【０３１４】
Ｒ16'の例は、カルボキシ、水素、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、およびメチルアミノカルボニルである。
【０３１５】
好都合には、Ｒ16'は水素である。
【０３１６】
好適には、Ｒ17'は、カルボキシ、Ｃ1〜6アルコキシカルボニル、ハロ、Ｃ1〜6アルキルアミノカルボニル、ニトロ、または水素である。
【０３１７】
Ｒ17の例は、２−カルボキシ、３−カルボキシ、４−カルボキシ、４−クロロ、２−メチルアミノカルボニル、４−ニトロ、水素、および２−エトキシカルボニルである。
【０３１８】
好都合には、Ｒ17'は３−カルボキシである。
【０３１９】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、完全に式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＫ）：
【化１３】
2007525953.tif 000032
の化合物のサブグループが存在する
（上式中、ＲおよびＲ1は、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり、
Ｒ11''''は、ハロおよびヒドロキシから独立に選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表し、
Ｒ18'は、水素、アルキル、および−（ＣＨ＝ＣＨ）2−から独立に選択される１つ以上、好適には最大３つの置換基を表し、
Ａは硫黄である）。
【０３２０】
好適には、Ｒ11''''はクロロまたはヒドロキシである。
【０３２１】
Ｒ11''''の例は、３−クロロおよび３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシである。
【０３２２】
好適には、Ｒ18'は、水素、Ｃ1〜6アルキル、または−（ＣＨ＝ＣＨ）2−である。
【０３２３】
Ｒ18'の例としては、水素、メチル、および３−メチル−４，５−［（ＣＨ＝ＣＨ）2］−が挙げられる。
【０３２４】
国際公開第００／２１９２７号パンフレットに開示されているように、完全に式（Ｉ）の範囲内にある式（ＩＬ）：
【化１４】
2007525953.tif 000033
の化合物またはその第４級化塩のサブグループが存在する
（上式中、Ｒは、式（Ｉ）に関して定義されている通りであり、
Ｒ2'''は、未置換または置換ヘテロシクリル、または未置換または置換アリールであり、
Ｒ19'は、未置換または置換ヘテロシクリルである）。
【０３２５】
Ｒ、Ｒ2'''、およびＲ19'が式（ＩＬ）に関連して定義される通りである、式（ＩＬ）の範囲内にある式（ＩＬ’）の化合物のサブグループが存在し、ただし、式（ＩＬ’）は以下の化合物（以降、リストＬと呼ぶ）を含まない：
３−インドール−１−イル−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−ピロール−２，５−ジオン；
１−（１−メチル−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−ピリジニウムクロリド；
１−１−（４−メチル−ペンチル）−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−ピリジニウムクロリド；
１−（１−ドデシル−２，５−ジオキソ−４−フェニルアミノ−２，５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−３−イル）−ピリジニウムクロリド；
３−［２，５−ジヒドロ−４−（１Ｈ−イミダゾール−ｌ−イル）−１−メチル−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−３−イル］−１Ｈ−インドール−１−カルボン酸，１，１−ジメチルエチルエステル；
３−（１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−１−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−４−（１−ピペリジニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［４−（ジフェニルメチル）−１−ピペラジニル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−［３−［（ジメチルアミノ）メチル］−１Ｈ−インドール−１−イル］−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１−メチル−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イル）−４−（１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；
３−（１Ｈ−インドール−１−イル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン；および
３−（３，５−ジメチル−１−フェニル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−４−（４−モルホリニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン。
【０３２６】
好適には、Ｒ2'''は、チエニル、フェニル、または１つ以上のハロゲン基で置換されたフェニルである。
【０３２７】
Ｒ2'''の例としては、フェニル、３−チエニル、２−チエニル、４−クロロフェニル、および２，４−ジクロロフェニルが挙げられる。
【０３２８】
好都合には、Ｒ2'''は、フェニル、３−チエニル、４−クロロフェニル、または２，４−ジクロロフェニルである。
【０３２９】
好適には、Ｒ19'は、インドリニル、ピリジニウムハライド、アザビシクロオクタニル、またはトリアザスピロデカノニルである。
【０３３０】
Ｒ19'の例としては、インドリン−１−イル、３−アミノ−１−ピリジニウムクロリド、２−メチルインドリン−１−イル、１，３，３−トリメチル−６−アザビシクロ［３，２，１］オクタン−６−イル、および１−フェニル−１，３，８−トリアザスピロ−［４，５］−デカン−４−オン−８−イルが挙げられる。
【０３３１】
好都合には、Ｒ19'は、インドリン−１−イル、または２−メチルインドリン−１−イルである。
【０３３２】
式（Ｉ）のある化合物は少なくとも１つのキラル炭素を含有することができ、そのため１つ以上の立体異性体で存在することができる。本発明は、個別の異性体として、またはラセミ体などの異性体混合物としてのいずれかで、式（Ｉ）の化合物の全ての異性体を含んでいる。
【０３３３】
本発明の特に好ましい化合物としては、３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン、および３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンが挙げられる。これらのマレイミドはそれぞれインビトロでＧＳＫ−３αを９ｎＭおよび３１ｎＭのＫiで阻害する（Ｃｏｇｈｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．７（１０）：７９３−８０３（２０００））。どちらの化合物も、ＧＳＫ−３のβアイソフォームを同様の強度で阻害した。
【０３３４】
ＧＳＫ−３の別のマレイミド阻害剤（すなわち、３−アニリノ−４−アリールマレイミド）が、自動アレイ方法を使用して同定されている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１（５）：６３５−９（２００１））。
【０３３５】
プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤であるマレイミド化合物の使用も本発明において考慮されている。このようなマレイミドとしては、ＲＯ−３１−８２２０、ビスインドリルマレイミド、インドロカルボゾール（ｉｎｄｏｌｏｃａｒｂｏｚｏｌｅ）Ｋ−２５２ａ、ペリレンキノン、カルフォスチンＣ、カルフォスチンＣ、Ｇｏ  ６９７６、Ｇｏ  ６９８３、およびイソキノリンスルホンアミドＨ７が挙げられる。これらのマレイミドの活性については、Ｄｅｂａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１（１）：６８−８１（２００１）、およびＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．６１（５）：１１６３−７３（２００２）を参照されたい。ＰＫＣαアイソフォームに対して強い特異性を有するＲＯ−３１−８２２０などのＰＫＣ選択的である物質が好ましいＳｃｈｗａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７６（１２）：１５５４−７（１９９７））。
【０３３６】
ＳＢ−２１６７６３およびＳＢ−４１５２８６はＧＳＫ−３を阻害する２種類のマレイミドである。これらのマレイミドは、ＧＳＫ−３αをインビトロで阻害し、それぞれＫiが９ｎＭおよび３１ｎＭであるＣｏｇｈｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｌ．７（１０）：７９３−８０３（２０００））。どちらの化合物も、ＧＳＫ−３のβアイソフォームを同様の強さで阻害した。
【０３３７】
マレイミドの別のグループは、ビスインドリルマレイミドＩおよびＩＸであり、これらはＧＳＫ−３の強力な阻害剤であることが示されているＨｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６０（３）：４３３−６（１９９９））。ＧＳＫ−３の別のマレイミド阻害剤（すなわち、３−アニリノ−４−アリールマレイミド）が自動アレイ方法を使用して同定されているＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１１（５）：６３５−９（２００１））。
【０３３８】
ＧＳＫ−３を調節することができる別のグループの化合物は、Ａｋｔ−３（タンパク質キナーゼＢまたはＲＡＣ−ＰＫとも呼ばれる）調節化合物である。例えば、Ａｋｔ−３阻害剤のＲＯ  ３１−８２２０、スタウロスポリンＭａｓｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５（１）：３５３−６０（１９９９））、およびトポテカンＮａｋａｓｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：５３０３−０９（２０００））を、ＧＳＫ−３の調節に使用することができる。ＲＯ  ３１−８２２０はＰＫＣ阻害剤であり、スタウロスポリンは広域スペクトルのキナーゼ阻害剤であるが、どちらもＡｋｔ−３活性を抑制する。
【０３３９】
あるグループのプロテインキナーゼＣ阻害剤も有効となり得る。好ましい阻害剤は、ＲＯ  ３１−７５４９、ＲＯ  ３１−８２２０、カルフォスチンＣ、およびイルモホシンなどの選択的阻害剤であるＡｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｇｅｎｔｓ  ＆  Ａｃｔｉｏｎｓ  ３９（１−２）：１３−９（１９９３））。
【０３４０】
さらに別のＧＳＫ−３阻害剤およびモジュレーターは、当業者に周知である以下のアッセイを使用して調べることができる。次にこれらのアッセイを使用して同定された物質を、骨石灰化の増強を評価するための本明細書において開示されるインビボおよびインビトロアッセイを使用してさらに評価することができる。
【０３４１】
ＧＳＫ−３調節化合物の評価のためのアッセイの１つでは、ＧＳＫ−３ペプチドを使用する。このアッセイに使用されるＧＳＫ−３特異的ペプチドは、グリコーゲンシンターゼのリン酸化部位から誘導されたものであり、その配列は、ＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＨＱ（Ｓ）ＥＤＥＥＥである。セリン（Ｓ）はあらかじめリン酸化されている。
【０３４２】
グリコーゲンシンターゼペプチドおよび［γ−33Ｐ］ＡＴＰを調製するために使用されるバッファーは、２５ｍＭのＭＯＰＳ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、０．０１％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、および７．５ｍＭのメルカプトエタノールからなりｐＨ７である。これらの化合物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させて最終濃度を１００ｍＭにする。ＤＭＳＯ中で種々の濃度を調製し、基質（すなわち、ＧＳＫ−３ペプチド）溶液（最終濃度２０μＭまで）を、ウサギまたはヒトのＧＳＫ−３αおよびＧＳＫ−３β（最終濃度０．５Ｕ／ｍＬ酵素）とともに混合する。［γ−33Ｐ］ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を１１回少量ずつＡＴＰ混合物（最終濃度１０μＭ）に加えて反応を開始する。室温で３０分後、１０μＬのＨ3ＰＯ4／０．０１％ツイーン−２０（２．５％）を添加することによって反応を終了させる。ある体積（１０μＬ）のこの混合物をＰ−３０ホスホセルロース紙上にスポットする。この紙を、各洗浄に２分かけてＨ3ＰＯ4（０．５％）で４回洗浄し、風乾して、合成グリコーゲンシンターゼペプチド中に放射性ホスフェートを混入し、これをＰ−３０ホスホセルロース紙と結合させ、シンチレーショカウンターを使用して計数する。
【０３４３】
ＧＳＫ−３阻害性化合物をスクリーニングするための別の方法は、ビオチン化ペプチドをリン酸化するキナーゼの能力に基づいており、このビオチン化ペプチドは、グリコーゲンシンターゼのリン酸化部位から誘導され、その配列は、Ｂｉｏｔ−ＫＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＨＱ（Ｓ）ＥＤＥＥＥであり、式中の「Ｂｉｏｔ」はビオチン部分を意味する。セリン（Ｓ）はあらかじめリン酸化されたセリンであり、インビボにおけるグリコーゲンシンターゼと同様である。リン酸化されたビオチン化ペプチドを次に、ストレプトアビジンをコートしたＳＰＡビーズ（アマシャム・テクノロジー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））上に捕捉させて、これによって、ビーズ中に含まれるシンチラントを介して33Ｐからの信号を増幅させることができる。
【０３４４】
０．０１％のツイーン−２０、７．５ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、および１０μＭの［γ−33Ｐ］−ＡＴＰを含有するｐＨ７の２５ｍＭのＭＯＰＳバッファー中１０ｎＭの最終濃度でこのキナーゼを分析する。室温で６０分間インキュベートした後、ストレプトアビジンをコートしたＳＰＡビーズを含有する５０ｍＭのＥＤＴＡ溶液を添加することによって反応を停止させると、３８４マイクロタイタープレート中のアッセイウェル１つ当たり０．５ｍｇのビーズを最終的に含有する。他のプレートを適宜使用することもできる。
【０３４５】
１００％ＤＭＳＯ中の本発明の化合物の１０ｍＭストック溶液を、スクリーニング方法の第１のステップとして調製する。第２のステップは、用量反応プレートの作製を含み、ここでこれらの化合物がプレート全体で希釈され、キナーゼアッセイにおける最終低濃度および高濃度が０．００８μＭおよび１０μＭとされる。第３のステップは、アッセイプレートの作製を含む。これは、４つの９６用量反応プレートからの化合物を３８４アッセイプレートに移すことによって実施することができる。第４のステップでは、前述のアッセイを実施して、マイクロベータ（ｍｉｃｒｏｂｅｔａ）液体シンチレーションおよびルミネセンスカウンタを使用して得られたプレートの計数を行う。最終ステップは、データ収集および解析であり、ここで各化合物のＩＣ５０値が求められる。
【０３４６】
好ましくは、本発明の最も強力な化合物は、約１〜１０ｎＭの間の範囲のＩＣ５０値を示す。
【０３４７】
さらに別のアッセイにおいては、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ペプチドを使用する。このＰＫＣペプチドは、ウシミエリン塩基性タンパク質（残基４〜１４）のフラグメントであってよい。この配列はＰＫＣの特異的基質である。ミエリン塩基性タンパク質および［γ−33Ｐ］−ＡＴＰの調製に使用したバッファーは、１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、０．９ｍＭのＥＧＴＡ、２００μＭの塩化カルシウム、１０ｍＭの塩化マグネシウム、および最終濃度４０μｇ／ｍＬのＬ−ａ−ホスファチジル−Ｌ−セリン、および１μｇ／ｍＬの１，３ジオレインからなりｐＨ７．５０であった。
【０３４８】
候補化合物またはその他の試薬をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解させて、最終濃度を１００ｍＭにする。ＤＭＳＯ中で種々の濃度にして、前述のように基質（すなわち、ミエリン塩基性タンパク質）溶液（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬまで）を、関連のヒト組換えＰＫＣアイソフォーム（最終濃度８８ｍＵ／ｍＬ）とともに混合する。［γ−33Ｐ］−ＡＴＰ（５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌｅ）を少量ずつＡＴＰの混合物（最終濃度１０μＭ）中に加えて反応を開始する。室温で２０分放置した後、１５μＬの反応物をＰ−３０ホスホセルロース紙上にスポットした。この紙を、各洗浄に２分かけて０．５％Ｈ3ＰＯ4で４回洗浄し、風乾して、ミエリン塩基性タンパク質中に放射性ホスフェートを混入し、これをＰ−３０ホスホセルロース紙と結合させ、マイクロベータシンチレーショカウンターを使用して計数する。これらのアッセイは、骨リモデリングに関与するとして本明細書において検討されるあらゆる他のタンパク質を調製する化合物の同定に使用するために修正することができる。
【０３４９】
（７．１．２  ＰＫＡ阻害剤）
ＧＳＫ−３阻害剤に関して前述したように、ＰＫＡ阻害剤も類似の用途を有する。好ましいＰＫＡ阻害剤としては、限定するものではないが、Ｈ８９（カルビオケム）が挙げられる。別のＰＫＡ阻害剤としては、限定するものではないが、タンパク質キナーゼＡ阻害剤５−２４、阻害剤６−２２アミド、および阻害剤１４−２２アミド（カルビオケム）が挙げられる。
【０３５０】
（７．１．３  ＰＫＣ阻害剤）
ＧＳＫ−３阻害剤に関して前述したように、ＰＫＣ阻害剤も同様の用途を有する。意図されるＰＫＣ阻害剤としては、限定するものではないが、ＰＫＣ阻害剤２０−２８ミリストイル化物、ＥＧＦ−Ｒフラグメント６５１−６５８ミリストイル化物、Ｒｏ  ３１−８４２５、Ｒｏ３２−０４３２などが挙げられる（カルビオケム）。
【０３５１】
（７．１．４  ＭＥＫ１／２阻害剤）
ＧＳＫ−３阻害剤に関して前述したように、ＭＥＫ１／２阻害剤も同様の用途を有する。ＭＥＫ１／２阻害剤としては、限定するものではないが、Ｕ０１２６（カルビオケム）およびＰＤ９８０５９（カルビオケム）が挙げられる。
【０３５２】
（７．１．５  ＭＡＰＫ阻害剤）
ＧＳＫ−３阻害剤に関して前述したように、ＭＡＰＫ阻害剤も同様の用途を有する。意図されるＰ３８  ＭＡＰＫ阻害剤としては、限定するものではないが、ＳＢ２０３５８０（Ｉｓｈｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（４）：２２９８−３０４（２００１）、カルビオケムより入手可能である）、ＳＢ２０２１９０（Ｋａｒａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５０２（２）：２０７−２３（２０００））、ＰＤ１６９３１６（Ｐａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（１５）：１１２８４−２９０（２０００））、ｆｒ−１６７６５３（Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｓｉｏｌ．２８３：Ｌ１０３−１２（２００２））、［ｔｒａｎｓ−１−（４−ヒドロキシシクロヘキシル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−（２−メトキシピリジミジン−４−イル）イミダゾール）（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９（５）：Ｌ８９５−９０２（２０００））、および２−（４−クロロフェニル）−４−）４−フルオロフェニル）−５−ピリジン−４−イル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン（カルビオケム）が挙げられる。
【０３５３】
（７．１．６  ＪＮＫ阻害剤）
ＧＳＫ−３阻害剤に関して前述したように、ｃ−Ｊｕｎアミノキナーゼ（ＪＮＫ）経路阻害剤も同様の用途を有する。使用が意図されるＪＮＫ阻害剤としては、限定するものではないが、ＳＰ−６００１２５（カルビオケム）、Ｋ２５２ａファミリーＣＥＰ−１３４７／ＫＴ−７５１５のインドロカルバゾール（Ｓａｐｏｒｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２３−６２（２００２）；およびＭａｒｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７３（５）：１９０１−１２））、およびＪＮＫと結合するＪＮＫ−相互作用タンパク質−１（ＪＩＰ−１）ペプチド（Ｂａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１３）：１０９８７−９７（２００２））が挙げられる。
【０３５４】
（７．１．７  カルシウム動態阻害剤）
ＧＳＫ−３阻害剤に関して前述したように、カルシウム動態阻害剤も、骨石灰化およびＷｎｔ経路の調製およびそれらの研究において同様の用途を有する。好ましいカルシウム動態阻害剤の１つは、カルビオケム製造の［８−（ジエチルアミノ）オクチル−３，４，５−トリメトキシ安息香酸ＨＣｌ（ＴＭＢ−８）である。
【０３５５】
（７．１．８  ＭＡＰＫＡＰＫ２阻害剤）
マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ活性化タンパク質キナーゼ−２（ＭＡＰＫＡＰＫ２）阻害剤も、ＧＳＫ−３阻害剤に関して前述したものと同じ目的に使用することができる。ＭＡＰＫＡＰＫ２は、前述のようにＭＡＰＫの下流の基質である。したがって、ＭＡＰＫの阻害剤はＭＡＰＫＡＰＫ２も阻害する。ＭＡＰＫＡＰＫ２阻害剤としては、限定するものではないが、Ｈｓｐ２５キナーゼ阻害剤（カルビオケム、カタログ番号３８５８８０）およびＳＢ２０３５８０（Ｉｓｈｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７（４）：２２９８−３０４（２００１））が挙げられる。
【０３５６】
（７．１．９  Ｇタンパク質共役型シグナリング阻害剤）
百日咳毒素（シグマ（Ｓｉｇｍａ））などのＧタンパク質共役型シグナリング阻害剤も、ＧＳＫ−３阻害剤に関して本明細書で前述したようなアッセイに使用することができる。他のＧタンパク質共役型シグナリング阻害剤を使用することもできる。
【０３５７】
（７．１．１０  酸化窒素シンターゼ阻害剤）
酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）阻害剤も、ＧＳＫ−３阻害剤に関して本明細書で前述した使用と類似する方法での使用が意図されている。意図されるＮＯＳ阻害剤としては、限定するものではないが、Ｎ（Ｇ）−ニトロ−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＮＡ）（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ  ５７（１）：１０１−８（２００３））、およびＬ−ＮＡＭＥ（シグマ）が挙げられる。
【０３５８】
（７．１．１１  ＣＯＸ−２阻害剤）
ＣＯＸ−２阻害剤も、ＧＳＫ−３阻害剤に関して本明細書で前述したものと類似の使用が意図される。ＣＯＸ−２阻害剤としては、限定するものではないが、インドメタシン（シグマ）、ＶＩＯＸＸ（ロフェコキシブ、メルク・アンド・カンパニー（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．））、ＣＥＬＥＢＲＥＸ（セレコキシブ、Ｇ．Ｄ．サール・アンド・カンパニー（Ｇ．Ｄ．Ｓｅａｒｌｅ  ＆  Ｃｏ．）、２−アミノスルホニルフェニル−３−フェニル−インドール５ａ（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１１（７）：１１５３−６０（２００３））、およびＳＣ−５６０（Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．５１（１２）：６０３−１０（２００２））が挙げられる。
【０３５９】
（７．２．核酸およびポリペプチド）
Ｗｎｔ経路、あるいは、骨負荷単独または他の物質の併用に対する応答でアップレギュレートまたはダウンレギュレートするとして挙げられているあらゆるタンパク質／遺伝子を調節する（好ましくは活性化する）核酸も本明細書において考慮される。好ましくはこれらの核酸は、骨リモデリングを増強して骨密度を高める。本発明において考慮される核酸としては、遺伝子のセンス鎖またはアンチセンス鎖、あるいは遺伝子の転写物のいずれかに結合するアンチセンス化合物が挙げられる。ＲＮＡ干渉を促進する低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）も意図される核酸に含まれる。アンチセンス分子およびｓｉＲＮＡ分子の好適な標的としては、ＧＳＫおよびカテニン、ＬＲＰ５、ＬＲＰ５、ａｘｉｎ、およびＷｎｔ経路の他のあらゆるメンバーが挙げられる。
【０３６０】
Ｗｎｔ経路を調節するポリペプチドも考慮される。このようなポリペプチドとしては、免疫グロブリン、ペプチドアプタマー、遮断化合物などが挙げられ、これらについて以下に詳細に説明する。
【０３６１】
（７．２．１．ＲＮＡ干渉）
骨石灰化と関連するＷｎｔ経路中のタンパク質は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用して、分析するか、または治療目的で調節することもできる。これは、転写後の遺伝子サイレンシングに関する技術であり、標的遺伝子の活性が対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって特異的に無効化される。ＲＮＡｉは、多くの態様において植物のＰＴＧＳと類似しており、トリパノソーマ、ヒドラ、プラナリア、線虫、およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）などの多くの無脊椎動物で見いだされている。ＲＮＡ干渉は、転移因子の動員および抗ウイルス状態の形成の調節と関連し得る。哺乳類系のＲＮＡ干渉は、国際公開第００／６３３６４号パンフレットに開示されており、この記載内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。基本的に、標的（例えば、ＧＳＫ−３またはβカテニン、あるいは、骨負荷単独または他の物質との併用に対する応答でアップレギュレートおよびダウンレギュレートする遺伝子と記載されている本明細書のいずれかの表の遺伝子のＲＮＡと相同）と相同のｄｓＲＮＡが細胞中に導入されると、遺伝子活性の配列特異的な低下が観察される。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の、このような使用も考慮される。例えば、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：６０４７−６０５２（２００２）；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１６：９４８−５８（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−５３（２００２）；Ｔｕｓｃｈｌ，（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：４４６−８（２００２）；およびこれらに記載されている参考文献を参照されたい。これらの部分は、骨リモデリングのさらなる特性決定のためのリサーチツール、および被験体中の骨リモデリングを調節する試薬として使用することができる。
【０３６２】
ＲＮＡｉ技術を使用して研究するために、Ｗｎｔ経路中の特に対象となる遺伝子の１つはβカテニンである。βカテニンは、古典的Ｗｎｔ経路の重要成分の１つである。この経路が活性化されると、βカテニンがリン酸化されなくなり、そのため細胞質中に蓄積されて、核内に移動する。核内に入ると、βカテニンはＴＣＦおよびＬＥＦなどの標的転写因子の阻害剤を除去し、それによって転写を活性化させる。
【０３６３】
これらの実験は、図１５に示される経路中のあらゆる遺伝子を使用することができ、いずれかの表に記載されるアップレギュレートおよびダウンレギュレートする遺伝子を使用することもできる。例えば、βカテニンＲＮＡｉをＭＣ３Ｔ３細胞（または他の好適な骨細胞系）にトランスフェクトすることができる。次に、前述のようにしてこれらの細胞に負荷を５時間与える。続いて、リアルタイムＰＣＲ（またはＲＮＡを分析するための他の手段）をこれらの遺伝子に対して実施することができる。コネキシン４３、オステオネクチン、ＯＰＧ、ｅＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＰＴＧＳ、ＩＬ−６、サイクリンＤ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＳＦＲＰ１、およびＳＦＲＰ４などの遺伝子、あるいは骨負荷および／またはＷｎｔ経路調節に対する応答で調節されると本明細書に記載されるあらゆる遺伝子について、遺伝子発現が評価される。
【０３６４】
どの負荷応答遺伝子がＬＲＰ５発現に依存するかを特異的に同定するために、ＭＣ３Ｔ３細胞にＬＲＰ５  ＲＮＡｉをトランスフェクトすることができる。βカテニンＲＮＡｉを使用する実験と同様に、ＬＲＰ５  ＲＮＡｉの存在下および非存在下で負荷を与えた細胞の間の遺伝子発現の応答も評価される。ＬＲＰ５発現が阻害されることが確認され、ＬＲＰ５  ＲＮＡｉ処理サンプルとの差異が認められない場合、ＬＲＰ６（ＬＲＰ５に近いファミリーメンバー）がＬＲＰ５機能を補うことも可能である。これに対処し、ＬＲＰ６の寄与が観察されるかどうかを評価するために、ＭＣ３Ｔ３細胞に、ＬＲＰ６  ＲＮＡｉ単独、ならびにＬＲＰ６およびＬＲＰ５の複合のＲＮＡｉをトランスフェクトすることができる。したがって、この場合、ＲＮＡｉは、ＬＲＰ５およびＬＲＰ６の互いの相対的な活性および骨リモデリングをさらに特性決定するために使用される。
【０３６５】
より具体的には、ＲＮＡ干渉実験を以下のように実施することができる。ＭＣ３Ｔ３細胞などの骨細胞を、バイオフレックス６ウェルプレート中で、増殖培地を使用して、８０％コンフルエントになるまで３日間培養する。次に培地を除去して、細胞を２ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ（インビトロジェン）で洗浄する。１０μＬのリポフェクタミン２０００（ウェル当たり）を２５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中にあらかじめ希釈することによって、ＤＮＡ／リポフェクトアミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００混合物を調製する。次に、この混合物を、２５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中の４μｇの二本鎖ＲＮＡｉと混合する。ＯｐｔｉＭＥＭを細胞から除去して、混合したＤＮＡ／リポフェクトアミン混合物（合計５００μＬ）をこの細胞に加え、３７℃で４時間インキュベートする。次に培地を、増殖培地または０．２５％ＢＳＡを含有する無血清培地のいずれかと交換し、２４時間インキュベートする。次に、本明細書において前述したように、細胞に５０〜５，０００με（例えば、３，４００με）の機械的負荷を与える。
【０３６６】
次に、ＲＮＡを回収する。ＲＮＡは、機械的負荷を与えた直後に回収することができ、その後の任意の時点（例えば、負荷の２４時間後）で回収することもできる。次に、リアルタイムＰＣＲなどの本明細書に記載されるいずれかの方法を使用して、このＲＮＡを分析する。
【０３６７】
（７．２．２  アンチセンス化合物）
本発明の別の態様においては、Ｗｎｔ経路調節（好ましくはＷｎｔ経路の活性化およびそれによる骨石灰化）に関係するタンパク質は、診断、研究、および治療の目的のためにアンチセンス化合物を使用して変化させることができる。
【０３６８】
例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの調製は以下のように行うことができる。骨芽細胞様マウス細胞系のＭＣ３Ｔ３においてアンチセンス技術を使用する研究が行われている。これらの細胞は、骨分化配列に沿った発達を引き起こすことができる。初期増殖期間は、分化マーカーの最小限の発現、およびコラーゲン様細胞外マトリックスの初期合成を特徴とする。コラーゲンマトリックス合成には、後の分化マーカーの誘導が必要である。マトリックス合成が開始すると、骨芽細胞マーカー遺伝子が明確な時系列で活性化し、早期にアルカリホスファターゼが誘導され、分化過程の後期に骨シアロタンパク質およびオステオカルシンが現れる。遺伝子発現のこの時系列は、成熟および石灰化過程のモニタリングに有用である。成熟が開始してから数日後に開始するマトリックス石灰化では、細胞層と培養プレートとの界面付近のマトリックスの深部でコラーゲン原繊維の上および内部に無機物が堆積する。培養した骨芽細胞によって形成されたこのコラーゲン原繊維の無機物は、インビボでの線維性骨中に見られるものと類似しており、そのため、試薬の研究によく利用される。
【０３６９】
製造元の明細書（米国特許第５，８４９，９０２号明細書）によると、分化の第１週に、ＭＣ３Ｔ３細胞（または他の好適な骨細胞系）にアンチセンスオリゴヌクレオチドがトランスフェクトされる。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＭＣ３Ｔ３などの骨細胞にトランスフェクトされる。次に、製造元の説明書、または当分野において既知の他の手順によって、細胞からＲＮＡが単離される。ノーザン分析、リアルタイムＰＣＲ、または別のＲＮＡアッセイが行われて、アンチセンスポリヌクレオチドの効果が分析される。さらに、転写プロファイリングを行って、Ｗｎｔシグナリングに関与するタンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンス化合物のＷｎｔ経路への影響を研究することができる。
【０３７０】
（７．３  ポリペプチド）
Ｗｎｔ経路を調節し、好ましくはアップレギュレートする（それによって骨石灰化を増強する）核酸以外に、ポリペプチド、および生物活性を有するそのフラグメント、ならびにアプタマーも考慮される。好適なタンパク質および生物活性を有するフラグメントとしては、ポリペプチドおよびアプタマー（図１６に記載の経路のタンパク質を調節する、例えば、ＧＳＫ−３およびβカテニンが挙げられる。活性調節することができるあらゆる種類の免疫グロブリン（例えば、抗体）（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、λファージ抗体（Ｃａｔ技術）、およびそれらのフラグメント）も考慮される。
【０３７１】
前述のインビトロ荷重実験は、負荷応答遺伝子、およびそのコードするタンパク質（すなわち、骨負荷遺伝子プロファイル）から他の既知の合成Ｗｎｔ経路アゴニスト（例えば、他のＧＳＫ−３阻害剤様化合物）、天然Ｗｎｔ経路リガンド、および合成リガンドへの遺伝子応答を調べるために使用することもできる。
【０３７２】
Ｗｎｔ経路の活性化レベルは、ＭＣ３Ｔ３細胞（または他の好適な骨細胞系）中で、限定するものではないが、Ｗｎｔ  １およびＷｎｔ  ３Ａ、小分子Ｗｎｔミメティック、およびＬＲＰ５と相互作用しＷｎｔシグナリングを活性化させるペプチドアプタマー（例えば、アプタマー２６２）などの既知のＷｎｔ経路アクチベーターを使用して評価することができる。このようなアッセイは、Ｗｎｔアンタゴニストの研究に使用することもできる。
【０３７３】
Ｗｎｔアンタゴニストとしては、限定するものではないが、Ｄｋｋ１および小分子Ｄｋｋ１アンタゴニストが挙げられる。同様に、Ｗｎｔアンタゴニストに対する遺伝子活性および調節は、例えばＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを使用して評価することができる。ＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターは、Ｗｎｔ経路活性に対する機械的荷重自体の影響を調べるために使用することができる。
【０３７４】
例えば、ＭＣ３Ｔ３細胞は、前述のように播種して、コンフルエントになるまで３日間培養することができる。ＢＳＡを含有する無血清培地またはαＭＥＭを含有する低血清培地（１％ＦＢＳ）のいずれかと培地を交換し、続いて２４時間インキュベートする。荷重を与える１時間前、１セットのプレートは、ある用量範囲のＷｎｔアゴニスト（例えば、ＧＳＫ−３阻害剤またはＤｋｋ１アンタゴニスト）で予備処理し、同様のコントロールのセットは予備処理を行わない。Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ  ３Ａ、およびＤｋｋ１に関する実験の場合、これらの特異的ｃＤＮＡコンストラクト（またはコントロールセクター（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｃｅｃｔｏｒ））を一過性にトランスフェクトした２９３細胞からの馴化培地を、これらのタンパク質の供給源として使用することができる。Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ  ３Ａ、およびＤｋｋ１の馴化培地を調製するために、１００ｍｍの培養皿当たり１０μｇのプラスミドＤＮＡを使用し、製造元の説明通りにリポフェクタミン２０００（インビトロジェン）を使用して２９３細胞にトランスフェクトすることができる。２９３細胞のトランスフェクションから４８時間後、馴化培地を回収し（合計１０ｍＬ）、遠心分離して細胞片を除去し、等分して、後のＭＣ３Ｔ３細胞ＦｌｅｘｅｒＣｅｌｌ実験のために−７０℃で凍結させる。したがって、Ｗｎｔミメティックリガンド、小分子、または他のＷｎｔ経路モジュレーターのいずれかを使用してＭＣ３Ｔ３細胞の予備処理を行った後、前述のようにＭＣ３Ｔ３骨細胞に機械的負荷を与える。Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙミニキットまたは他の手段を使用して、負荷直後および負荷を与えた後のある時点で、負荷を与えたサンプルおよび与えていないコントロールサンプルからＲＮＡを回収する。所望の時点で、リアルタイムＰＣＲを負荷識別特性セット遺伝子に対して行い、処理による遺伝子発現の変化を観察する。
【０３７５】
Ｗｎｔ経路の活性の測定を伴う実験の場合、ＴＣＦ−ルシフェラーゼレポーターシステムなどによる一過性トランスフェクションを行うことができる。より具体的には、製造元の説明通りにトランスファスト（ＴｒａｎｓＦａｓｔ）トランスフェクション試薬（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して１ウェル当たり約２．５μｇの１６×−ＴＣＦ（ＴＫ）−ルシフェラーゼおよび０．５μｇのＴＫ−Ｒｅｎｉｌｌａ−ルシフェラーゼを使用して、８０％コンフルエントの骨細胞にトランスフェクトされる。あらかじめ希釈したＤＮＡ（１ｍＬの基本αＭＥＭ中）を、８μＬのトランスファスト試薬と混合し、３０分間インキュベートする。この時点で、細胞から増殖培地を除去し、１ｍＬの基本αＭＥＭを各ウェルに加え、３０分間インキュベートする。３０分間のインキュベーションの後、細胞から培地を吸引し、次にトランスファスト／ＤＮＡ混合物をこれらの細胞に加え、３７℃で１時間インキュベートする。あるグループのサンプルは、０．２５％ＢＳＡを含有する無血清培地を加える（２ｍＬ）。別のグループには、２ｍＬの増殖培地を加える。次に培養物を終夜インキュベートして、培地を除去し、１ｍＬのＢＳＡを含有する無血清αＭＥＭと交換する。これらの細胞に機械的負荷を与え、２４時間、または他の好適な時間の間インキュベートし、次にルシフェラーゼ測定を行う。ルシフェラーゼ活性は、３００〜５００μＬのパッシブ・リシス（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ）バッファー（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を加えて細胞を溶解させた後、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）を使用して測定される。
【０３７６】
（７．４  免疫グロブリン）
別の態様においては、免疫グロブリンが単独で使用されるか、または治療、診断、スクリーニング、併用療法などと併用される。タンパク質アレイの形態で使用される場合、免疫グロブリンまたはその結合フラグメント（例えばＦａｂ）を使用して、骨負荷／応力、骨負荷／応力の増大などに応答するタンパク質のスクリーニングのための好適な基体に結合させることができる。好適な免疫グロブリンは、機械的負荷に応答する、または機械的負荷を増強するとして本明細書で挙げられているタンパク質またはタンパク質フラグメントと結合するあらゆる免疫グロブリンである。モノクローナル抗体などの抗体の製造元としては、アブカム（Ａｂｃａｍ）、ベチル・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、バイオソース・インターナショナル・インコーポレイテッド（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．）、ボストン・バイオロジカルズ・インコーポレイテッド（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、カルビオケム−ノババイオケム・コーポレーション（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．）、ＩＣＮバイオメディカルズ・インコーポレイテッド（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、モビテック（ＭｏＢｉＴｅｃ）、オックスフォード・バイオメディカル・リサーチ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、プロメガ・コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）、リサーチ・ダイアグノーシス・インコーポレイテッド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、ロックランド・イムノケミカルズ・インコーポレイテッド（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、サンタ・クルーズバイテクノロジー（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、シグマ−ＲＢＩ（Ｓｉｇｍａ−ＲＢＩ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ユナイテッド・ステイツ・バイオロジカル（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、アップステート（Ｕｐｓｔａｔｅ）、およびザイムド・ラボラトリーズ・インコーポレイテッド（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ）が挙げられる。他の製造元も抗体を製造していることが知られており、使用することができる。
【０３７７】
（８．併用療法）
必要とする被験体に骨石灰化を最適化するために使用される複数の治療法を併用することも考慮される。これは、本明細書に開示される物質の使用、ホルモン補充療法（ＨＲＴ）、選択的エストロゲン−受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、カルシトニン、ビスホスホネート、ラロキシフェン、カルシトニン、およびビタミンＤ、または以下に記載されるあらゆる試薬など既存の治療法とを併用することを含む。Ｗｎｔ経路および骨プロファイル遺伝子のモジュレーターも、以下のいずれかの物質単独（例えば、ＧＳＫ−３阻害剤およびビスホスホネート）または組み合わせ（例えば、アレンドロネート、ＨＲＴ、およびＧＳＫ−３阻害剤）との使用が考慮される。これらの追加の物質の量は、患者によって変化するが、１種類の物質として薬物が使用される場合に典型的に投与される量よりも少なくなると思われる。
【０３７８】
（８．１  ホルモン補充療法）
ホルモン補充療法（ＨＲＴ）は通常、無傷の子宮を有する閉経後の女性におけるエストロゲンおよびプロゲステロン、ならびに子宮摘出を行った女性におけるエストロゲンのみからなる。典型的なエストロゲンおよびそれらの置換用量としては、経口抱合ウマエストロゲン（０．６２５ｍｇ／日）、経口エチニルエストラジオール（０．２ｍｇ／日）、および経皮エストラジオール（０．０５ｍｇ／日、通常は１週間に１パッチを２回の形態）が挙げられる。経口製剤がより一般的に使用されるが、喫煙者の場合には、経口エストロゲンの肝代謝が増加するため、経皮エストロゲン置換がより効果的となり得る。プロゲステロンは、周期的（メドロキシプロゲステロンとして、１０ｍｇ／日を、毎月１０〜１２日）または連続（２．５ｍｇ／日）で投与することができる。必要な用量は、エストロゲンが不足する女性の場合増加する（例えば、２０ｍｇ／日の酢酸メドロキシプロゲステロンまたは５ｍｇ／日のノルエチンドロン）。補充されるホルモン量は、調節する骨石灰化と関連するタンパク質を調節する試薬と併用する場合には、少なくなる場合がある。使用できる承認薬製剤については、後出の表６を参照されたい。
【０３７９】
ホルモン補充療法、ならびにビタミンＤおよびカルシウムの補給は、骨量減少の男性被験体にも利用される。性機能低下性の男性の場合、テストステロン補給による骨量増加が示されている。したがって、一態様においては、これらの物質と、骨石灰化を調節する本明細書に開示の試薬との組み合わせが、必要とする男性被験体に同時投与される。
【０３８０】
（８．２  選択的エストロゲン受容体モジュレーター）
選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）としては、限定するものではないが、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ（登録商標））、タモキシフェン、トリミフェン（ｔｏｒｉｍｉｆｅｎｅ）、酢酸バゼドキシフェン（１Ｈ−インドール−５−オール、１−［［４−［２−（ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１−イル）エトキシ］フェニル］メチル］−２−（４−ヒドロキシフェニル）３−３−メチル−モノアセテートまたは１−［ｐ−［２−（ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１−イル）エトキシ］ベンジル］−２−（ｐ−ヒクロキシフェニル）−３−メチルインドール−５−オールモノアセテート）、チボロン、および薬学的に許容されるそれらの塩が挙げられる。ラロキシフェン（非ステロイド系ベンゾチフェン（ｂｅｎｚｏｔｈｉｐｈｅｎｅ））は、最も一般的に投与されるＳＥＲＭであり、ＦＤＡで承認されている他の表示を有する他の物質も存在する。ラロキシフェンは典型的には６０ｍｇ／日の用量で投与される。
【０３８１】
（８．３  カルシトニン）
カルシトニンは、再吸収阻害性を有するペプチドである。その生物活性を有する形態は、３２アミノ酸を含み、残基１と７との間にＮ末端ジスルフィド架橋を有する。サケのカルシトニンは、ＦＤＡで認可された形態のカルシトニンであり、骨粗鬆症の予防ではなく治療のためのエストロゲンの代替物として承認されている。サケのカルシトニンは最も強力であり、皮肉なことにヒトカルシトニンは利用可能なカルシトニンの中で最も効力が弱い。
【０３８２】
サケカルシトニンは、２００Ｕ／日で経鼻投与され、１日当たり１回投与される。しかし、パジェット病の場合、サケカルシトニンが、約５０〜約１００ＩＵの容量で、１週間当たり３〜７回ｓ．ｃ．またはｉ．ｍ．で投与される。ヒトカルシトニンは、１日当たり約１００ＩＵ（０．５ｍｇ）で使用することができる。経鼻の用量はより多くなり、例えば約４００ＩＵとなる。骨粗鬆症の場合、サケカルシトニンは、注射では１００ＩＵ、または経鼻投与では２００ＩＵの割合で投与される。カルシトニンの投与に関するさらなる情報は、Ｍ．Ｚａｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，カルシトニンの分子的および臨床的薬理学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ），骨生物学の基礎（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１４２３−４０（第２版，ジョン・Ｐ・ビレジキアン（Ｊｏｈｎ  Ｐ．  Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ）ら編著，２００２）を参照されたい。他の形態のカルシトニンも、多剤併用療法における使用が考慮される。
【０３８３】
（８．４  ビスホスホネート）
ビスホスホネートは、骨リモデリングの強力な阻害剤であるが、理由は不明であるが、これらの物質が骨量減少を防止することが示されている。ビスホスホネートとしては、限定するものではないが、アレンドロネート、クロドロネート、ＥＢ−１０５３、エチドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、ミノドロネート、ネリドロネート（ｎｅｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、オルパドロネート（ｏｌｐａｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネート、およびゾレドロネートが挙げられる。ビスホスホネートは、２つのＣ−Ｐ結合を特徴とする化合物。２つのＣ−Ｐ結合が１つの炭素原子上にある場合（すなわち、Ｐ−Ｃ−Ｐ）、それらはピロホスフェート（すなわち、Ｐ−Ｏ−Ｐ）の類似体である。
【０３８４】
アレンドロネートは、骨粗鬆症の治療のために現在承認されている最も広範に研究されているビスホスホネートである。これは  ビスホスホネートまたはピロホスフェートの誘導体であり、骨格に対する再吸収阻害作用を有する。アレンドロネートは典型的には、骨粗鬆症の予防の場合約５ｍｇ／日、骨粗鬆症の治療の場合１０ｍｇ／日、パジェット病の治療の場合４０ｍｇ／日の量で投与される（以下の表６参照）。アレンドロネートは、一般的にＨＲＴとも同時投与される（Ｂ．Ｄａｗｓｏｎ−Ｈｕｇｈｅｓ，閉経後骨粗鬆症の治療の薬物治療（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ），代謝性骨疾患および無機物代謝障害のプライマーに関する入門書（Ｐｒｉｍｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｂｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｏｆ  ＭｉｎｅｒａｌＭｅｔａｂｏｌｉｓｍ）２８３−２８８（第４版，リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ），１９９９）。ビスホスホネートに関するさらなる情報については、Ｈ．フライシュ（Ｆｌｅｉｓｃｈ）  ｅｔ  ａｌ．，ビスホスホネート：作用機序（Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ），骨生物学の基礎１３６１−８５（第２版，ジョン・Ｐ・ビレジキアンら編著，２００２）および現在使用可能なビスホスホネートおよび用量を示している以下の表６を参照されたい。
【０３８５】
（８．５  ビタミンＤおよびビタミンＤ類似体）
現在、ビタミンＤ活性化の主経路を代表する化合物のみが、薬物として使用するために合成されている。このようなものとしては、２５−ヒドロキシビタミンＤ3または２５−ＯＨ−Ｄ3（カルシジオール）とも呼ばれるビタミンＤ3、および１α，２５−（ＯＨ）2Ｄ3（カルシトリオール）が挙げられる。１つの例外が２４（Ｒ），２５−（ＯＨ）2Ｄ3（セカルシフェロール（Ｓｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ））である。したがって、ビタミンＤの天然のプロドラッグおよび代謝産物を投与することができる。ビタミンＤの投与は年齢に依存する。例えば、ビタミンＤの典型的な経口投与は５０歳までの２００ＩＵ、７０歳までの４００ＩＵ、および７０歳を超える場合の６００〜８００ＩＵである。ビタミンＤおよびその類似体に関するさらなる情報については、Ｇ．ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ），ビタミンＤおよび類似体（Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｄ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ），骨生物学の基礎１４０７−２２（第２版，ジョン・Ｐ・ビレジキアンら編著，２００２）を参照されたい。さらに別のビタミンＤ製剤については、以下の表６を参照されたい。
【０３８６】
（８．６  カルシウム補給）
Ｗｎｔ経路モジュレーターは、上記のいずれかの方法および／またはカルシウムサプリメントと併用することもできる。カルシウム補給は、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、ビオン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、リン酸カルシウム、およびリン酸三カルシウムの形態で行うことができる。一般的な用量としては、限定するものではないが、表６に記載の用量、またはより少ない用量が挙げられる。
【０３８７】
（８．７  他の薬物）
さらに別のある薬物は、骨量減少の防止または骨石灰化の増強に有用となり得ることが示されている。チボロンなどのプロゲスチンを、骨粗鬆症および他の骨量減少障害の治療に使用することができる。さらに別のものは抗エストロゲンのタモキシフェンである。タモキシフェンは、典型的には、乳癌の危険性のある女性に約２０〜約３０ｍｇ／日で投与される。これらの薬物の骨石灰化障害の治療への使用は現在承認されていない。
【０３８８】
オメプラゾール、アミロライド、およびＮ−エチルマレイミドなどの他の試薬も、骨吸収の抑制に有効であることが示されている。アミロライドとＮ−エチルマレイミドとの組み合わせは、これらの試薬がそれぞれ単独で投与されるよりも、これらの試薬が併用される方がより強く抑制された。マツダ（Ｍａｔｓｕｄａ，Ｊ．Ｏｓａｋａ  Ｃｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｔｒ．４１（２）：６５３−６１（１９９２）。
【０３８９】
【表９Ａ】
2007525953.tif 000034
【表９Ｂ】
2007525953.tif 000035
【表９Ｃ】
2007525953.tif 000036
【表９Ｄ】
2007525953.tif 000037
【表９Ｅ】
2007525953.tif 000038
【表９Ｆ】
2007525953.tif 000039
【０３９０】
上記試薬は、Ｗｎｔ経路を調節および好ましくは活性化する（さらにそれによって骨リモデリングを増強する）化合物および組成物とあらゆる組み合わせで併用することができる。Ｗｎｔ経路を調節する化合物の１つが投与される場合、ほとんどの場合、既存の治療化合物は、その既存の治療化合物が単独で投与される場合に推奨されるよりも少ない用量で投与される。
【０３９１】
（９．医薬製剤）
本発明の医薬製剤は、小化合物または免疫グロブリンを単独または併用のいずれかで含む。併用は、小化合物および小化合物、ならびに既存の治療と併用される組成物の両方が意図される。
【０３９２】
（９．１  小化合物製剤）
医薬品として使用される場合、本発明の化合物は通常、医薬組成物の形態で投与される。本発明の医薬製剤としては、本明細書に記載されるように、小化合物の組み合わせ、および小化合物とポリペプチド（例えば、免疫グロブリン）または核酸との組み合わせが挙げられる。
【０３９３】
これらの化合物、および併用療法は、経口、非経口、経皮、局所、直腸、および経鼻などの種々の経路によって投与することができる。これらの化合物および併用療法は、注射および経口の両方の組成物として有効である。このような組成物は、医薬分野において周知の方法によって調製され、少なくとも１種類の有効化合物を含む。
【０３９４】
本発明は、有効成分として、上記の１種類以上の化合物とともに薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物も含む。本発明の組成物を製造する場合、通常、有効成分が、賦形剤と混合される、賦形剤によって希釈される、あるいは、カプセル、サッシェ、紙、または他の容器の形態であってよい担体中に封入される。使用される賦形剤は典型的には、ヒト被験体または他の哺乳類への投与に好適な賦形剤である。賦形剤が希釈剤として機能する場合、それは、有効成分の賦形剤、担体、または媒体として作用する固体、半固体、または液体の材料であってよい。したがって、本発明の組成物は、錠剤、丸剤、粉末、ロゼンジ、サッシェ、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エアロゾル（固体として、または液体媒体中で）、例えば最大１０重量％の有効化合物を含有する軟膏、ソフトおよびハードゼラチンカプセル、坐剤、滅菌注射液、および滅菌包装された粉末の形態であってよい。
【０３９５】
製剤を調製する場合、他の成分と混合する前に、適切な粒径となるように有効化合物を粉砕する必要がある場合がある。有効化合物が実質的に不溶性である場合、通常は２００メッシュ未満の粒径まで粉砕される。有効化合物が実質的に水溶性である場合は、通常、製剤中に実質的に均一に分散するように粉砕することによって粒径が調整され、例えば約４０メッシュに調整される。
【０３９６】
好適な賦形剤の一部の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。本発明の製剤はさらに、滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁化剤；保存剤、例えばメチルベンゾエートおよびプロピルヒドロキシベンゾエート；甘味剤；ならびに着香料を含むことができる。本発明の組成物は、当技術分野において周知の手順を使用して、患者に投与した後で、有効成分の迅速な放出、持続する放出、または遅延する放出が起こるように処方することができる。
【０３９７】
医薬組成物およびその単位剤形中の本発明による化合物である有効成分の量は、特定の用途、特定の化合物の効力、および所望の濃度に依存して、広範囲で変動させたり調整したりすることができる。
【０３９８】
本発明の組成物は、各用量が約５〜約１００ｍｇ、より一般的には約１０〜約３０ｍｇの有効成分を含有する単位剤形中に配合される。用語「単位剤形」とは、ヒト被験体および他の哺乳類の単位用量として好適な物理的に分離した単位を意味し、各単位は、所望の治療効果が得られる用に計算された所定量の有効材料と、好適な医薬品賦形剤とを含有する。好ましくは、前述の本発明の化合物が、医薬組成物の約２０重量％以下、より好ましくは約１５重量％以下で使用され、残部は薬学的に不活性な担体である。
【０３９９】
本発明の有効化合物は、広い用量域で効果的であり、一般に薬学的有効量または治療有効量で投与される。しかし、治療すべき症状、細菌感染の重篤度、選択した投与経路、投与される実際の化合物、個々の患者の年齢、体重、および応答、患者の症状の重篤度などの関連の状況を考慮して、実際に投与される化合物の量が医師によって決定されることを理解されたい。
【０４００】
温血動物の細菌感染の治療または根絶のための治療用途では、治療を行う動物中の有効成分の抗菌に有効な濃度、すなわち量または血中濃度が得られ維持される用量で、本発明の化合物またはそれらの医薬組成物が、経口的、局所的、経皮的、および／または非経口的に投与される。一般に、有効成分の投薬のこのような抗菌または治療の有効量（すなわち有効用量）は、約０．１〜約１００、より好ましくは約１．０〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲である。
【０４０１】
錠剤などの固体組成物を調製する場合、主要有効成分を医薬品賦形剤と混合して、本発明の化合物の均一混合物を含有する固体予備処方組成物を形成する。これらの予備処方組成物が均一であると言及する場合、有効成分が組成物全体に一様に分散していることを意味し、そのため、この組成物は、錠剤、丸剤、およびカプセルなどの同等に有効な単位剤形に容易に再分割することができる。次に、この固体予備処方は、例えば０．１〜約５００ｍｇの本発明の有効成分を含有する上記種類の単位剤形に再分割される。
【０４０２】
本発明の錠剤または丸剤は、コーティングまたは他の配合を行うことで、長期間作用する利点が得られる剤形を得ることができる。例えば、錠剤または丸剤は、内部投薬成分および外部投薬成分を含むことができ、後者は前者を包み込む形態となる。これらの２つの成分は、腸溶性層によって分離することができ、この層は、胃での崩壊に抵抗し、内部成分が無傷のまま十二指腸まで通過するか、放出を遅延させるか機能を果たす。このような腸溶性層または被膜としては、種々の材料を使用することができ、このような材料としては、多数のポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料との混合物が挙げられる。
【０４０３】
経口投与または注射のために本発明の新規組成物を混入することができる液体形態としては、水溶液、好適には風味付けされたシロップ、水性または油性懸濁液、およびトウモロコシ油、綿実油、ゴマ油、ヤシ油、またはラッカセイ油の食用油を使用して香味付けされたエマルジョン、およびエリキシル、ならびに類似の医薬品賦形剤が挙げられる。
【０４０４】
吸入または吹送のための組成物としては、薬学的に許容される水性溶媒または有機溶媒、あるいはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。これらの液体または固体の組成物は、前述の好適な薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。好ましくは、これらの組成物は、口または鼻の呼吸経路または全身作用によって投与される。好ましくは薬学的に許容される溶媒中の組成物を、不活性ガスを使用することによって噴霧することができる。噴霧された溶液は、噴霧装置から直接吸入することができるし、噴霧装置をフェースマスクテント、または間欠的陽圧呼吸装置に取り付けることもできる。溶液、懸濁液、または粉末の組成物は、適切な方法で製剤を送達する装置から、好ましくは経口的または経鼻的に投与することができる。
【０４０５】
以下の処方例は、本発明の代表的な医薬組成物を示している。
【０４０６】
（処方例１）
以下の成分を含有するハードゼラチンカプセルを調製する。
【０４０７】
【表１０】
2007525953.tif 000040
【０４０８】
上記成分を混合し、３４０ｍｇの量でハードゼラチンカプセル中に充填する。
【０４０９】
（処方例２）
以下の成分を使用して錠剤処方を調製する。
【０４１０】
【表１１】
2007525953.tif 000041
【０４１１】
これらの成分を混合し、圧縮して各２４０ｍｇの錠剤を形成する。
【０４１２】
（処方例３）
以下の成分を含有する乾燥粉末吸入製剤を調製する。
【０４１３】
【表１２】
2007525953.tif 000042
【０４１４】
有効成分をラクトースと混合し、その混合物を乾燥粉末吸入装置に投入する。
【０４１５】
（処方例４）
それぞれ３０ｍｇの有効成分を含有する錠剤を以下のように調製する。
【０４１６】
【表１３】
2007525953.tif 000043
【０４１７】
有効成分、デンプン、およびセルロースを２０番メッシュ（Ｎｏ．２０  ｍｅｓｈ）ＵＳシーブ（Ｕ．Ｓ．ｓｉｅｖｅ）に通し、十分に混合する。ポリビニルピロリドンを、得られた粉末と混合し、次にこれを１６メッシュＵＳシーブに通す。形成された顆粒を５０℃〜６０℃で乾燥させ、１６メッシュＵＳシーブに通す。３０番メッシュＵＳシーブにあらかじめ通しておいたカルボキシメチルスターチナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、およびタルクを、次にこの顆粒に加え、混合した後、これを錠剤機上で圧縮して、それぞれ１２０ｍｇの重さの錠剤を得る。
【０４１８】
（処方例５）
４０ｍｇの薬剤をそれぞれ含有するカプセルを以下のように作製する：
【０４１９】
【表１４】
2007525953.tif 000044
【０４２０】
有効成分、デンプン、およびステアリン酸マグネシウムを混合し、２０番メッシュＵＳシーブに通し、１５０ｍｇの量でハードゼラチンカプセル中に充填する。
【０４２１】
（処方例６）
それぞれ２５ｍｇの有効成分を含有する坐剤を以下のように作製する。
【０４２２】
【表１５】
2007525953.tif 000045
【０４２３】
有効成分を６０番メッシュＵＳシーブに通し、必要最小限の熱であらかじめ溶融させた飽和脂肪酸グリセリド中に懸濁させる。次に、この混合物を公称容量２．０ｇの坐剤用型中に注ぎ込み、冷却する。
【０４２４】
（処方例７）
５．０ｍＬの用量当たり５０ｍｇの薬剤をそれぞれ含有する懸濁液を以下のように作製      
【０４２５】
する：
【表１６】
2007525953.tif 000046
【０４２６】
有効成分、スクロース、およびキサンタンガムを混合し、１０番メッシュＵＳシーブに通し、続いて、あらかじめ作製しておいた微結晶性セルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムの水溶液と混合する。安息香酸ナトリウム、香料、および着色料を水の一部で希釈して、撹拌しながら加える。次に十分亜水を加えて必要な体積にする。
【０４２７】
（処方例８）
【表１７】
2007525953.tif 000047
【０４２８】
有効成分、デンプン、およびステアリン酸マグネシウムを混合し、２０番メッシュＵＳシーブに通し、４２５．０ｍｇの量でハードゼラチンカプセル中に充填する。
【０４２９】
（処方例９）
以下のように皮下用製剤を調製することができる。
【０４３０】
【表１８】
2007525953.tif 000048
【０４３１】
（処方例１０）
以下のように局所製剤を調製することができる。
【０４３２】
【表１９】
2007525953.tif 000049
【０４３３】
白色ワセリンを溶融するまで加熱する。流動パラフィンおよび乳化蝋を加え、溶解するまで撹拌する。有効成分を加え、分散するまで撹拌を続ける。次にこの混合物を固体になるまで冷却する。
【０４３４】
（処方例１１）
以下のように静脈内の製剤を調製することができる。
【０４３５】
【表２０】
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【０４３６】
本発明の方法で使用される別の好ましい製剤は、経皮的送達機構（「パッチ」）を使用する。このような経皮パッチは、制御された量で本発明の化合物を連続または不連続に注入するために使用することができる。医薬物質を送達するための経皮パッチの構成および使用は当技術分野において周知である。例えば、米国特許第５，０２３，２５２号明細書（本明細書に組み入れられる）を参照されたい。これらのパッチは、医薬物質の連続的、拍動的、または要求通りの送達を行うように構成することができる。
【０４３７】
本発明に使用するための他の好適な製剤は、レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），メース・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ），ペンシルバニア州フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ），第１７版（１９８５）に見ることができる。
【０４３８】
前述したように、本明細書に記載される化合物は、前述の種々のドラッグデリバリーシステムへの使用に好適である。さらに、投与される化合物のインビボ血清半減期を増加させるために、本発明の化合物を、カプセルに入れたり、リポソームの内腔に導入したり、コロイドとして調製したりすることができ、化合物の血清半減期を増加させる他の従来を使用したりすることができる。リポソームを調製するための種々の方法を利用することができ、例えば、スゾカ（Ｓｚｏｋａ）らの米国特許第４，２３５，８７１号明細書、第４，５０１，７２８号明細書、および第４，８３７，０２８号明細書に記載される方法を利用することができ、これらそれぞれが本明細書に組み入れられる。
【０４３９】
前述したように、患者に投与される化合物は、前述の医薬組成物の形態である。これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌することができるし、滅菌濾過することもできる。結果として得られる水溶液は、そのままの使用するために包装することができるし、凍結乾燥して、凍結乾燥した製剤を投与前に滅菌水性担体と混合することもできる。本発明の化合物製剤のｐＨは、典型的には３〜１１の間であり、より好ましくは５〜９であり、最も好ましくは７〜８である。前述のある種の賦形剤、担体、または安定剤を使用することで、医薬の塩が形成されることも理解されたい。
【０４４０】
一般に、本発明の化合物は、類似の有用性を有する物質の容認されているあらゆる投与形態によって、治療有効量で投与される。このような化合物の毒性および治療効力は、標準的製薬手順によって、細胞培養または実験動物において決定することができ、例えば、ＬＤ50（集団の５０％が致死する量）およびＥＤ50（集団の５０％において治療的に有効となる量）を求めることができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ50／ＥＤ50の比として表現することができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
【０４４１】
細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られるデータは、ヒトに使用するための用量域を求めるために使用することができる。このような化合物の用量は、好ましくは、ＥＤ50を含み毒性がわずかまたは全くない血中濃度の範囲内にある。用量は、使用される剤形および使用される投与経路に依存してこの範囲内で変動させることができる。本発明の方法において使用されるあらゆる化合物は、その治療有効用量を、最初に細胞培養アッセイから評価することができる。細胞培養で求めたＩＣ50（症状を最大半分まで抑制する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を実現するための、動物モデルの用量を求めることができる。このような情報を、ヒトに有用な用量をより正確に求めるために使用することができる。血漿レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０４４２】
（９．２  免疫グロブリン製剤）
本発明の一側面、骨石灰化に関与するタンパク質、例えば本明細書に記載されるいずれかのタンパク質を認識しこれと結合する免疫グロブリンの使用を意図している。好ましくは、免疫グロブリンが、骨石灰化を増強するように骨芽細胞−破骨細胞ホメオスタシスを調節する。ある疾患では、骨石灰化を減少させる化合物および組成物が好ましい。
【０４４３】
好ましい免疫グロブリンは、抗体またはそのフラグメントである。好ましい抗体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体を使用する実施形態も考慮される。好ましいモノクローナル抗体としては、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、および霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（商標）モノクローナル抗体が挙げられる。
【０４４４】
語句「薬学的にまたは薬理学的に許容される」とは、必要に応じて動物またはヒトに投与される場合に、有害反応、アレルギー反応、およびその他の不都合な反応が起こらない分子および組成物を意味する。獣医学的使用も本明細書おいて同様に含まれ、「薬学的に許容される」製剤には、臨床および／または獣医学での使用のための製剤が含まれる。例えば、組成物は骨の破壊および骨折を防止する目的で骨石灰化を増加させるため、家禽などのある種の農業動物に投与することができる。
【０４４５】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、あらゆる全ての溶媒、分散媒体、被膜、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのこのような媒体および物質の使用は当技術分野において周知である。いずれかの従来の媒体または物質が有効成分と不適合性である場合を除けば、その治療組成物における使用が考慮される。ヒトに投与する場合、製剤は、ＦＤＡ生物製剤事務局（ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）の規格によって必要とされる無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の規格を満たすべきである。補助的有効成分を本発明の組成物中に混入することもできる。
【０４４６】
「単位用量」製剤は、特定のタイミングで送達されるよう適合させた投与成分の用量または部分用量（ｓｕｂｄｏｓｅ）を含有する製剤である。例えば、代表的な「単位用量」製剤は、一日量または単位、または一日の部分用量、または１週間の用量または単位、または１週間の部分用量などを含有する製剤である。
【０４４７】
例えば、ヒト化抗体は、骨石灰化疾患を治療するための医薬組成物中の有効成分として使用することができる。この医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、または投与可能な他の形態のために処方されると考えられる。この組成物は、希釈剤、充填剤、崩壊剤、甘味料、滑沢剤、および香料などの医薬製剤中に通常使用される非有効成分を含むことができる。この医薬組成物は、静脈内ボーラスまたは持続点滴のいずれかによる静脈内投与のため、あるいは埋め込みカプセルから放出させるために処方される。静脈内投与のための典型的な製剤は、生理食塩水を希釈剤として使用する。
【０４４８】
骨石灰化を調節する免疫グロブリンのフラグメントの使用も考慮される。好ましいフラグメントは、モノクローナル抗体のフラグメント、または組換え技術によって合成されたフラグメントである。これらの抗体フラグメントの製剤は、当技術分野において周知であると考えられる。
【０４４９】
患者のための免疫グロブリン組成物の用量は、使用される特異抗体、体重、年齢、性別、健康状態、食事、組成物の投与時間および処方、投与経路、ならびに治療されるべき疾患に依存する。典型的な用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１００ｍｇ／ｋｇ／日である。より典型的には、用量は１ｍｇ／ｋｇ／日〜５０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０４５０】
（９．２．１  診断用免疫グロブリン）
本発明の抗体は、診断分析に使用することもできる。本発明の診断分析のための好ましい方式の１つは、細胞表面上に骨石灰化と関与するいずれかのタンパク質を発現するサンプル中の細胞の定量である。特定の表面マーカーを有する細胞の計数方法は当技術分野において周知である。例えば、蛍光細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）を使用することができる。本発明の診断分析のための別の方式は、サンプル中の対象の骨石灰化タンパク質量の定量である。このような当技術分野において周知のアッセイを実施するための多くの方式が存在し、例えば抗原固定化またはサンドイッチ方式の酵素結合免疫吸着アッセイなどが存在する。
【０４５１】
（９．２．２  注射製剤）
骨石灰化と関与するタンパク質を認識しこれと結合する抗体、免疫グロブリン、または免疫複合体は、非経口投与用に処方されることが最も多く、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）の注射、経皮、または他のこのような経路、例えば蠕動投与、および部位への直接点滴注入（すなわち、長骨の部位への投与）のために処方される。このような免疫グロブリンを有効成分として含有する水性組成物の製剤は、本明細書の開示を考慮すれば当業者には周知である。典型的には、このような組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射液として調製することができるし、注射前に液体を加えることによって溶液または懸濁液を調製するために使用すると好適な固体形態を調製することもできるし、製剤は乳化することもできる。
【０４５２】
注射用途に好適な医薬品の形態としては、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ラッカセイ油、または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射液または分散液のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合で、その形態が、無菌であり、注射可能である程度に流動性であるべきである。これは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌類などの微生物の汚染作用に対して維持されるべきである。
【０４５３】
骨石灰化に関与するタンパク質を認識しこれと結合する免疫グロブリンは、中性または塩の形態で滅菌水性組成物中に配合することができる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての溶液は、水中で、好適にはヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と混合されて調製される。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成）、ならびに、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、あるいは酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。
【０４５４】
免疫グロブリンと使用すると好適な担体としては、溶媒、ならびに、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する分散媒体が挙げられる。多くの場合、糖または塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被膜の使用によって、分散液の場合に必要な粒径の維持によって、および／または界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０４５５】
通常の貯蔵および使用の条件下で、全てのこのような製剤は、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有すべきである。微生物の阻止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって行うことができる。注射組成物の持続性吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を組成物中に使用することによって実現することができる。
【０４５６】
滅菌注射液は、適切な溶媒中に必要量の有効物質を必要に応じて前述の種々の他の成分とともに混入し、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌有効成分を、基本分散媒体および前述の必要な他の成分を含有する滅菌賦形剤中に混入することで調製される。
【０４５７】
滅菌注射液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌濾過した溶液から、有効成分と任意の所望の追加成分との粉末を得る真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【０４５８】
（９．２．３  持続放出製剤）
タンパク質を認識してこれと結合することによって骨石灰化を調節する免疫グロブリンの製剤は、前述の注射液などの種々の剤形で容易に投与されるが、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、または他の経口投与用固体、坐剤、ペッサリー、点鼻液またはスプレー、エアロゾル、吸入薬、局所製剤、リポソーム形態などの他の薬学的に許容される形態も考慮される。投与形態は、治療される疾患または障害に合わせられる。
【０４５９】
医薬品の「徐放性」カプセルまたは「持続放出」組成物または製剤を使用することができ、一般に適用される。徐放性製剤は、長期間にわたって一定薬物濃度が得られるように一般に意図されている。徐放性製剤は、典型的には長骨などの疾患部位の近傍に埋め込まれる。
【０４６０】
持続放出製剤の好適な例としては、抗体または免疫複合体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形物品の形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル；ヒドロゲル、例えば、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）またはポリ（ビニルアルコール）；ポリラクチド；Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー；非分解性エチレン−酢酸ビニル；分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばルプロンデポ（Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ）（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドで構成される注射用微小球）；ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０４６１】
エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは１００日を超えて分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短い期間タンパク質を放出する。カプセル化された抗体は体内で長期間維持され、これらは３７℃において水分に曝露すると変性または凝集することができ、それによって生物活性の低下および／または免疫原性の変化が起こり得る。関連する機構に応じて安定化のために合理的な戦略を使用することができる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合の形成を伴う場合、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分量の制御、適切な添加剤の使用、特殊なポリマーマトリックス組成物の開発などによって安定化が実現される。所望の免疫グロブリンを含む組成物は、リポソームまたはナノ粒子の中に配合することもできる。
【実施例】
【０４６２】
（実施例１）
（ＧＳＫ阻害剤を使用するＴＣＦ−Ｌｕｃｉアッセイ）
ある種のＧＳＫ阻害剤が知られている。塩化リチウム（ＬｉＣｌ）の形態で投与されるリチウムは、特異性が低く、高ミリモル用量でＧＳＫ−３のみを阻害することができる（スタンボリック（Ｓｔａｍｂｏｌｉｃ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１６６４−６８（１９９６））。より選択的なＧＳＫ阻害剤の３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンは、ＧＳＫ−３のβアイソフォームに対する特異性がより高い。この化合物、その誘導体、同族体、および類似体は、特に、骨形成分子を同定するためのアッセイを較正するために使用することができる。例えば、ＧＳＫ−３阻害剤は、ＬＲＰ５／６アゴニスト、Ｗｎｔアゴニスト、ＬＲＰ５／６−Ｄｋｋ１アンタゴニスト、および他のクロストーク経路特異的シス／トランス要素含有レポーターを同定するための骨または非骨細胞系ＴＣＦアッセイの較正に使用することができる。これらの化合物は、骨形成遺伝子活性の研究に使用することもでき、骨芽細胞／破骨細胞機能、増殖、分化、およびアポトーシスに対する二次アッセイ；ひずみまたは機械的負荷を使用するまたは使用しない、インビトロまたはインビボでの骨芽細胞遺伝子プロファイリングアッセイ；頭蓋冠モデルを使用したインビボ局所効果アッセイ；エクスビボの頭蓋冠または他の骨に由来する骨代謝回転アッセイ、ヤング率モデル（ｙｏｕｎｇ  ｒａｔｅ  ｍｏｄｅｌ）などを使用する全身作用評価アッセイ、あるいはインビボ非活動／卵巣切除型アッセイも、これらの化合物を使用することができる。
【０４６３】
ＴＣＦレポーターアッセイは、１６コピー（すなわち１６×）のＷｎｔ−βカテニンシグナル応答ＴＣＦ要素、基本ＴＫプロモーター、およびルシフェラーゼ遺伝子を含むＴＣＦレポーターを使用する。ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）−２９３Ａ細胞（ＡＴＣＣ）または他の骨肉腫由来骨細胞系（例えば、Ｕ２ＯＳ）を、ダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン）、または１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％のグルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）（インビトロジェン）、および１％のペニシリン−ストレプトマイシン（インビトロジェン）を補給したＲＰＭＩ（インビトロジェン）中で培養した。ＨＥＫ−２９３Ａ細胞（約４０，０００細胞／ウェル）またはＵ２ＯＳ細胞（２５，０００細胞／ウェル）を播種した。２４時間のインキュベーションの後（すなわち、８０〜９０％コンフルエントになるまで）、培地を、１００μＬの新しい無血清ＯＰＴＩＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）またはＲＰＭＩまたはＤＭＥＭの培地のいずれかと交換した。製造元の説明通りにリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、両方の種類の細胞に、１６×−ＴＣＦ（ＴＫ）−ホタルルシフェラーゼ（０．３μｇ／ウェル）およびＴＫ−Ｒｅｎｉｌｌａ−ルシフェラーゼ（０．０６μｇ／ウェル）をトランスフェクトした。このＤＮＡ混合物および試薬を次に室温で２０分間インキュベートする。１ウェル当たり５０μｌ／ウェルのＤＮＡ−試薬混合物を１００μＬのＯＰＴＩＭに加え、３７℃で４時間インキュベートする。トランスフェクション培地を、それぞれ２９３Ａ細胞またはＵ２ＯＳ細胞で１４０μＬの新しいＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ培地に交換した。ＧＳＫ阻害剤（３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）をそれぞれの培地で希釈して、１ウェル当たり１５０μＬの最終量の１０×ストックを得た。１ウェル当たり１０μＬの１０×ストックを、適宜希釈した賦形剤（すなわちＤＭＳＯ）コントロールとともに加えた。ＣＯ2インキュベーター中３７℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後、この化合物を含有する培地を除去した。トランスフェクトし、ＧＳＫ−３阻害剤で処理した細胞単層に、デュアルＬｕｃｉ（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉ）試薬（プロメガ・コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）、ウィスコンシン州マディソン）の１×溶解バッファー１５０μＬを加えることによって、溶解させた。１０分後、２０μＬの溶解物を９６ウェル白色プレート（パッカード／コスター（Ｐａｃｋａｒｄ／Ｃｏｓｔａｒ））中に移した。細胞溶解物を、１００μＬ／ウェルのＬＡＲＩＩバッファー（デュアルＬｕｃｉ試薬）と混合し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。この後、１００μＬ／ウェルの「ストップ・アンド・グロー」（ｓｔｏｐ  ＆  ｇｌｏ）試薬（デュアルＬｕｃｉ試薬）を加え、内部標準ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを測定した。ＴＣＦ−ホタル−Ｌｕｃｉのｒｅｎｉｌｌａに対する比率を計算し、図１〜２に示した。
【０４６４】
図１Ａおよび１Ｂは、ＴＣＦレポーターコンストラクトがＨＥＫ−２９３ＡおよびＵ２ＯＳ骨細胞の中にトランスフェクトされた場合に、ｉＧＳＫ−３が用量依存的にレポーターを転写活性化することができることを示している。ＴＣＦ−ルシフェラーゼシグナル、すなわちＷｎｔシグナルの誘導は、Ｕ２ＯＳ骨細胞中の方がＨＥＫ−２９３細胞中よりも顕著である。さらに、図１Ｂは、Ｕ２ＯＳ細胞中で、ＴＣＦシグナルの顕著な誘導がｉＧＳＫ−３の濃度１０μＭで観察され、３０μＭでは、２９３Ａ細胞とは異なりほぼ最大に達したことを示している。これより、Ｕ２ＯＳ骨細胞はＨＥＫ−２９３Ａ細胞よりも、Ｗｎｔシグナル調節に対して敏感であることが分かる。
【０４６５】
（実施例２）
（ＧＳＫ−３阻害剤は、Ｕ２ＯＳヒト骨芽細胞中のＴＣＦシグナリングを、Ｄｋｋ１の媒介する阻害から開放する）
この実施例は、ＧＳＫ−３阻害剤（３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）が、Ｕ２ＯＳ細胞中のＴＣＦシグナリングを、Ｄｋｋ１の媒介する阻害から開放するために使用できることを示す。図２に示されるように、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３ＡはＴＣＦシグナルをコントロールの約１０〜１５倍活性化する。Ｄｋｋ１を添加すると、Ｗｎｔの媒介するＴＣＦシグナリングが阻害される。しかし、ＧＳＫ−３阻害剤が阻害を逆転させることができる。さらに、これらのデータは、Ｗｎｔリガンド（例えば、Ｗｎｔ  ３Ａ）の存在下でＤｋｋ１およびＬＲＰ５の相互作用を遮断することができる化合物を同定することが意図された別の細胞によるＴＣＦアッセイを確認し構成するための小分子ツールとしてｉＧＳＫ−３を使用できることを示している。最終読取値では、Ｄｋｋ１が媒介して抑制されるＴＣＦシグナルが活性化されている。Ｄｋｋ１−ＬＲＰ５相互作用を遮断してＴＣＦシグナルを活性化することができる既知の性分死が存在しないと、ｉＧＳＫ−３がＴＣＦシグナルを活性化することが示されている。これは、経路を内部から調節することによって、Ｄｋｋ１によってＬＲＰ５を介して外部に発揮される抑制を開放することができることを示している。図２に示される実験は、Ｕ２ＯＳ（ＡＴＣＣ）骨細胞を使用しており、ＬＲＰ５／６受容体の内因性発現に基づいている。これらの細胞を２５，０００  細胞／ウェルで播種し、２４時間のインキュベーションを行う（すなわち、８０〜９０％コンフルエントまで）。培地を、１００μＬの新しい無血清ＯＰＴＩＭ（ギブコ／ＢＲＬ）またはＲＰＭＩ培地と交換する。製造元の説明通りにリポフェクタミン２０００トランスフェクション試薬（プロメガ、ウィスコンシン州マディソン）を使用して、細胞に、１６×−ＴＣＦ（ＴＫ）−ホタルルシフェラーゼ（０．３μｇ／ウェル）、ＴＫ−Ｒｅｎｉｌｌａ−ルシフェラーゼ（０．０６μｇ／ウェル）、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ  ３ａ（０．００２５μｇ／ウェル）、およびＤｋｋ１（０．１μｇ／ウェル）を共トランスフェクトした。このＤＮＡ混合物および試薬を次に室温で２０分間インキュベートする。１ウェル当たり５０μｌ／ウェルのＤＮＡ−試薬混合物を１００μＬのＯＰＴＩＭに加え、３７℃で４時間インキュベートする。トランスフェクション培地を、１４０μＬの新しいＲＰＭＩ培地に交換した。ＧＳＫ−３阻害剤をＲＰＭＩ培地で希釈して、１ウェル当たり１５０μＬの最終濃度（３０ｕＭ）の１５×ストックを得た。１ウェル当たり１０μＬの１５×ストックを、適宜希釈した賦形剤（すなわちＤＭＳＯ）コントロールとともに加えた。ＡＣＯ2インキュベーター中３７℃で２０〜２４時間のインキュベーションの後、この化合物を含有する培地を除去した。トランスフェクトし、ＧＳＫ−３阻害剤で処理した細胞単層に、デュアルＬｕｃｉ試薬（プロメガ・コーポレーション、ウィスコンシン州マディソン）の１×溶解バッファー１５０μＬを加えることによって、溶解させた。１０分後、２０μＬの溶解物を９６ウェル白色プレート（パッカード／コスター中に移した。細胞溶解物を、１００μＬ／ウェルのＬＡＲＩＩバッファ���（デュアルＬｕｃｉ試薬）と混合し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を測定した。この後、１００μＬ／ウェルの「ストップ・アンド・グロー」試薬（デュアルＬｕｃｉ試薬）を加え、内部標準ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを測定した。ＴＣＦ−ホタル−Ｌｕｃｉのｒｅｎｉｌｌａに対する比率を計算し、図２に示した。
【０４６６】
この結果は、Ｗｎｔ１またはＷｎｔ  ３Ａのいずれかを使用すると、それぞれＴＣＦシグナルが基本レベルの約１０〜１５倍増加することを示している。Ｄｋｋ１をＷｎｔ１またはＷｎｔ  ３Ａとともに共トランスフェクトすると、ＴＣＦ活性がほとんど完全に抑制される。しかし、Ｗｎｔ１／Ｗｎｔ  ３ＡおよびＤｋｋ１をトランスフェクトした細胞にｉＧＳＫ−３を加えると、Ｗｎｔ１ではほとんど完全に抑制から開放され、Ｗｎｔ  ３Ａでは約７５％開放される。この実験はＬＲＰ５／６受容体の内因性発現に基づいているが、このようなアッセイは、トランスフェクトしたＬＲＰ５／６の過剰発現、またはＬＲＰ５／６と分子の特異的相互作用に対処するために特異的ｓｉＲＮＡによる内因性ＬＲＰ５／６の抑制によって変更することができる。
【０４６７】
（実施例３）
（マウス頭蓋冠モデルにおける骨形成に対するグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ−３）阻害剤の影響）
ＧＳＫ−３阻害を介したＷｎｔ経路活性化によって骨形成が誘導されるかどうかをインビボで調べるため、ＧＳＫ−３阻害剤（ｉＧＳＫ−３）（すなわち、３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）のマウス頭蓋冠に対する局所投与を行った。
【０４６８】
４週齢の雄のスイス−ウェブスター（Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒ）マウスの頭蓋冠の右側に、１ｍｇ／ｋｇのｉＧＳＫ−３または賦形剤のみを、７日間および１８日間毎日皮下注射した。ｉＧＳＫ−３の頭蓋冠の骨に対する影響を、組織切片において、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰアーゼ）酵素組織化学的染色、定量的形態計測、および免疫組織化学によるβカテニン発現によって評価した。ＣＯ2麻酔によって屠殺した後、頭蓋冠を無傷で取り外し、軟部組織を丁寧に解剖し、さらなる処理および分析のために骨を７０％エタノール中で２４時間固定した。次に、ラムダ縫合および冠状縫合と平行に頭頂骨の中心部を通って矢状縫合に対して垂直に頭蓋冠を二等分した。頭蓋冠前部をパラフィン切片に使用し、頭蓋冠後部を凍結切片に使用した。厚さ５μｍの代表的で不連続な段階の切片を４〜５枚切り取った。パラフィン切片は、通常通りヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色して頭蓋冠の厚さを測定した。凍結切片は、アルカリホスファターゼ検出に使用した。組織形態計測的測定を容易にするため、矢状縫合の縁から各骨の外側縁における筋肉付着部までの各切片の２ｍｍの標準長さを使用した。全ての測定は、Ｒ＆Ｍバイオメトリック・インコーポレイテッド（Ｒ＆Ｍ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．）バイオクアント・イメージ・アナリシス・システム（Ｂｉｏｑｕａｎｔ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して行った。
【０４６９】
固定後、頭蓋冠前部を、サージパス・デカルシファイアＩＩ（Ｓｕｒｇｉｐａｔｈ  Ｄｅｃａｌｃｉｆｉｅｒ  ＩＩ）（イリノイ州、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＩＬ））中で７〜８時間脱灰した後、等級分けされたアルコール中で脱水する。厚さ４〜５μｍの代表的で不連続な冠状の段階のパラフィン切片を〜５枚切り取った。組織切片中の非リンβカテニンの検出には、合成ペプチドＣＧＧ−ＳＹＬＤＳＧＩＨＳＧＡＴＴＴＡＰＳＬＳＧＫ（配列番号４）を免疫原として使用してアップステート・バイオテクノロジー（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ニューヨーク州レークプラシッド）によって産生されたマウスモノクローナル抗体を使用した。このモノクローナル抗体はβカテニンの非リン酸化体を認識する（カタログ番号０６−７３４、アップステート・バイオテック（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））。アビジン結合ＡＰシステム（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州バーリンゲーム）を使用して抗体のエピトープへの結合を可視化した（１μｇ／ｍＬ）。コントロールは、一次抗体が存在せずにアビジン−ＡＰを使用するサンプルを含んだ。
【０４７０】
７０％エタノールで固定した後のマウス頭頂骨の６μｍ凍結切片において、ベクター・レッド・アルカリホスファターゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ）（ベクター・ラボラトリーズ、カリフォルニア州バーリンゲーム）を使用して組織化学的染色を行って、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰアーゼ）の活性評価した。
【０４７１】
これらの実験（図３〜４）から、ＧＳＫ−３阻害剤を１８日日間注射した右半分の頭蓋冠を、同じ動物の注射していない左半分の頭蓋冠と比較すると頭蓋冠の厚さが統計的に増加することが示された（１１．８％、ｐ＜０．００５）。しかし、ＧＳＫ３阻害剤の頭蓋冠の厚さに対する影響を、賦形剤コントロールのみ（賦形剤は２％のＴｗｅｅｎ８０および０．５％メチルセルロースを含有する５０％のＤＭＳＯ）で処理したマウスと比較すると、頭蓋冠の厚さはわずか６％の非統計的増加であった（図５）。重要なことは、２％のツイーン８０および０．５％のメチルセルロースを含有する１０％ＤＭＳＯを含有する異なる賦形剤にＧＳＫ−３阻害剤を溶解させ、１ｍｇ／ｋｇ／ｄ／ｓ．ｃ．で７日間注射すると、賦形剤コントロール処理の頭蓋冠と比較して、頭蓋冠の厚さが統計的に有意な１０％の増加となった（図６）。
【０４７２】
ＧＳＫ３阻害剤がどのようにして同化作用を誘発するのかの機序を調べるために、アルカリホスファターゼ、骨芽細胞分化、および機能マーカーに対して組織化学的染色を実施した。賦形剤コントロールと比較して、アルカリホスファターゼの顕著な増加が、ＧＳＫ−３阻害剤を７日間局所投与した頭蓋冠中の骨芽細胞において観察された（図７）。ＧＳＫ−３阻害剤を注射した頭蓋冠の免疫組織化学（ＩＨＣ）から、前骨芽細胞および骨芽細胞が裏打ちする骨膜中に強いβカテニン発現が見られた（図７）。これとともに、これらの発見から、ｉＧＳＫの局所注射によるＧＳＫ−３の阻害によって、骨同化作用が得られ留ことが分かり、これは骨芽細胞活性を誘導するβカテニン量の増加屠関連がある。
【０４７３】
（実施例４）
（骨芽細胞中のＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）荷重および遺伝子発現）
Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）アッセイを、骨芽細胞に対して実施することができる：Ｕ２ＯＳ（ＡＴＣＣ）、ＭＧ−６３（ＡＴＣＣ）、ＳＡＯＳ−２（ＡＴＣＣ）、ＨＯＳ−ＴＥ８５（ＡＴＣＣ）、ＨＯＢＯ３ＣＥ６（ワイエス）、ＨＯＢ０１Ｃ１前骨細胞（ワイエス）、およびヒト初代骨芽細胞。このアッセイは、ＭＣ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ）、およびマウス初代骨芽細胞に対して実施することもできる。さらに、ＵＭＲ−１０６（ＡＴＣＣ）、ＲＯＳ１７／２．８、およびラット初代骨芽細胞などのラット細胞系も同様に使用することができる。使用するためのさらに別の哺乳類細胞系は当業者には明らかであろう。
【０４７４】
この実施例では、細胞のインビトロ荷重および遺伝子分析をマウス骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３細胞に対して実施した。本明細書に記載のＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）システムを使用してＭＣ３Ｔ３細胞に対して機械的ひずみ（５時間）を与えると、付加を与えていないコントロールと比較して、負荷直後で、ＣＯＸ−２（２．５倍）、ｅＮＯＳ（２．５倍）、コネキシン４３（３．５倍）、Ｊｕｎ（３．５倍）、サイクリンＤ１（３．５倍）、Ｗｎｔ  １０Ｂ（３倍）、ＳＦＲＰ１（３倍）、ｃ−Ｆｏｓ（３．５倍）、およびＦｒｉｚｚｌｅｄ  ２（３倍）の誘導を示した（図８）。負荷を与えた後ではＷＩＳＰ２遺伝子発現の誘導が最小であった。
【０４７５】
これらの実験では、マウスＭＣ３Ｔ３骨芽細胞を、１０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％のグルタマックス（インビトロジェン）、および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（インビトロジェン）を補給したα最小必須培地（αＭＥＭ）（インビトロジェン）中で培養した。ＭＣ３Ｔ３細胞を８０，０００〜１００，０００細胞／ウェルで、コラーゲンＩ型をコートしたバイオフレックス６ウェルプレート（フレクセル・インターナショナル・コーポレーション、ペンシルバニア州マッキーズポート（ＭｃＫｅｅｓｐｏｒｔ，ＰＡ））中に播種し、続いて３〜４日またはコンフルエントになるまで培養した。荷重を与える２４時間前に、培地を、２ｍＬの新しい増殖培地、またはαＭＥＭ、０．２５％のＢＳＡ（セロロジカルズ・プロテインズ・インコーポレイテッド（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｉｎｃ．），イリノイ州カンカキー）、グルタマックス、および／ストレプトマイシンを前述のように含有する無血清培地と交換した。無血清培地中で予備処理されるサンプルは、細胞を２ｍＬの基本αＭＥＭ培地でそれぞれ２回洗浄した後、ＢＳＡ含有培地を加えた。機械的荷重を与える直前に、培地を除去し（すなわち、増殖培地を含有するサンプルを基本αＭＥＭ培地で２回洗浄した）、１ｍＬのαＭＥＭ／ＢＳＡのみ、または化合物（すなわち、ＧＳＫ−３β阻害剤、３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈピロール−２，５−ジオン）とともに各ウェルに加えた。ＦＸ−３０００Ｆｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）ひずみユニット（フレクセル・インターナショナル・コーポレーション）を使用して細胞に、３，４００με（２Ｈｚ、７２００サイクル／時）相当の機械的変形を５時間与えた。次に、機械的ひずみを与えたサンプルおよびひずみを与えていないコントロールの両方から、荷重を与えた直後または２４時間後に、ＲＮＡを回収した（キアゲン・Ｒｎイージー（Ｑｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ）ミニキットを使用）。フレクサーセルを使用した実施例で示される全データは、荷重を与えた直後に回収したｒｎａ８から得たものである。Ｗｎｔ／βカテニン標的遺伝子発現の調整の大きさの変動はわずかであったが、負荷によって調節される遺伝子は、負荷の２４時間後にＲＮＡを回収した場合と同じであった（データは示していない）。
【０４７６】
次に、前述のマウス遺伝子特異的プライマーおよびプローブを使用して記載の遺伝子のリアルタイムＰＣＲを行った。使用したプライマーおよびプローブは表１３に示している。
【０４７７】
（実施例５）
（Ｗｎｔ経路の予備活性化による骨荷重の増強）
遺伝子発現結果に基づいて、次のステップでは、Ｗｎｔ経路の予備活性化が骨負荷応答を増強するかどうかを調べた。ここで、ＭＣ３Ｔ３  細胞、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤（すなわち、３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈピロール−２，５−ジオン）で処理して、βカテニンの核へのトランスロケーションを増加させ、それによって標準Ｗｎｔ／βカテニン経路を活性化させた。ＧＳＫ−３阻害剤を投与した直後に、細胞に負荷（３，４００με、２Ｈｚ、７２，０００サイクル／時、実施例４で前述したものと同じ）を５時間与えた。ＧＳＫ−３阻害剤（５μＭ）によって、コネキシン４３、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＳＦＲＰ１、ＦＺＤ２、ＷＩＳＰ２、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、ＦＯＳ、およびＪＵＮに対して相乗的な誘導が得られた（図９）。さらに、本発明者らは、負荷の存在下でのこれらのＷｎｔ／βカテニン標的遺伝子の相乗的誘導は、ｉＧＳＫ−３濃度に対して用量依存性であることを示した（図１０および表４参照）。
【０４７８】
このデータに基づくと、Ｗｎｔ経路を活性化する物質を与えることによって、骨負荷刺激に対する応答で得られる遺伝子発現応答を増強できる。このような骨負荷刺激の増強は、類似の増強特性を示す他の物質の同定に有用であり、骨量減少の予防または骨量減少障害の治療に使用することができる物質の同定にも有用である。
【０４７９】
（実施例６）
（インビボの機械的負荷に対する応答における骨のシグナリング経路を媒介するβカテニンの活性化）
骨量の増加と減少の両方は、Ｗｎｔ補助受容体、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）５中の変異と関連がある。ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖトランスジェニックマウスおよびそれらの非トランスジェニック同腹子の脛骨に対して脛骨４点（４−ｐｔ．）曲げシステムを使用して機械的負荷を与えると、骨細胞シグナリング経路のいくつかの重要な成分の遺伝子発現パターンに顕著な変化が見られた（表２）。骨芽細胞活性の増加と関連するβカテニンの媒介する遺伝子転写は、荷重を与えた後で非トランスジェニックマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖトランスジェニックマウスの両方でアップレギュレートしたが、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖトランスジェニック（ＨＢＭトランスジェニックとも呼ばれる）の方がアップレギュレーションが大きかった。ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ変異は、破骨細胞の動員および機能を弱めるＲＡＮＫＬ／ＯＰＧシグナリングを抑制することも確認された。これらの結果から、ＨＢＭ変異（Ｇ１７１Ｖ）は骨の異化作用に負の影響を与え、それによって骨増殖が増加することを示している。
【０４８０】
齧歯類の脛骨に４点まげシステムなどの装置を使用して周期的な機械的負荷を骨に与えると、体重負荷運動の効果が刺激され、骨膜の骨芽細胞の増殖、分化、および活性が増加する（タナー（Ｔａｎｎｅｒ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１６：Ｓ２０３（２００１）；ボパート（Ｂｏｐｐａｒｔ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ２３（５）：４０９−４１５（１９９８）；ラーブ−カレン（Ｒａａｂ−Ｃｕｌｌｅｎ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．５５：４７３−７８（１９９４）；カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８：１９４３−４８（２００２））。４点曲げはいくつかの増殖因子の遺伝子発現を刺激するが、機械的シグナルの生化学的応答から骨モデリング過程の活性化までの変換を市販する正確な分子事象はほとんど分かっていない。
【０４８１】
低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）は、多様な生物学的過程に関与する細胞表面受容体のファミリーの１つである。このファミリーの２つのメンバーであるＬＲＰ５および６は、βカテニンを介するＴＣＦ／ＬＥＦ活性化プロモーターへの信号伝達を促進するＷｎｔ補助受容体であると推定されている。骨量減少は、ＬＲＰ５遺伝子の不活性化変異と関連する。ＬＲＰ５ノックアウトマウスは、骨芽細胞増殖および機能が低く、Ｒｕｎｘ２／ＣＢＦＡ１が正常な発現をするにもかかわらず低骨ミネラル密度となる。一方、骨量増加は、同じ遺伝子の他の変異と関連する。ＬＲＰ５遺伝子中の特定の１つの点変異、グリシン１７１からバリンへの（Ｇ１７１Ｖ）変異によって、高骨量の表現型（すなわち、ＨＢＭ）となり、２つの独立したヒト家系の全てのメンバーが影響を受ける。ヒトＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧ）は、高骨量の表現型を忠実に複製している。したがって、骨芽細胞生物学、増殖、および分化は、ＬＲＰ５／Ｗｎｔ媒介シグナリングと関連していると思われる。
【０４８２】
以下のデータは、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖトランスジェニック（ＴＧ）マウスが、負荷を与えた後に、非ＴＧマウスよりも、骨形成および応力で活性化される応答が大きくなることを示している。さらに、βカテニン媒介遺伝子転写は、荷重後に非トランスジェニック（非ＴＧ）マウスおよびＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧ（ＨＢＭ  ＴＧ）マウスの両方で誘導される。βカテニンシグナリング経路を介したシグナリングによって増強される遺伝子型を有する（負荷がない場合でも）ＨＢＭ  ＴＧマウスは、βカテニン媒介遺伝子転写をさらにアップレギュレートすることによって負荷に応答する。ＬＲＰ５におけるＨＢＭ変異（すなわち、Ｇ１７１Ｖ）は、破骨細胞の増殖および活性に関与する遺伝子をダウンレギュレートさせることも本明細書で示されている。本発明者らは、破骨細胞の増殖および活性と関与する主要遺伝子の発現をダウンレギュレートし、それによって骨吸収を阻害する、ＬＲＰ５におけるＧ１７１Ｖ変異のこれまで不明であった役割についていも議論する。
【０４８３】
マウスの骨のインビボ荷重を伴う実験のための、へテロ接合体ＴＩＣ−ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖマウスが、バビー（Ｂａｂｉｊ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓ．１８（６）：９６０−９７４（２００３）に記載されており、これを使用した。これらの動物は、全体積骨密度において統計的に有意な増加（３０〜５５％）を示す。機械的負荷は、右腓骨に対してマウス４点曲げ装置を使用して与えた（アクター（Ａｋｈｔｅｒ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．６３（５）：４４２−９（１９９８）。この装置は、インビボで正確に外力を与えるために特性決定し較正を行った。同様に；  ペデルセン（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．６５（１）：４１−６（１９９９）；アクター（Ａｋｈｔｅｒ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｎｓｉｔｏｍ．５（２）：２０７−１６（２００２）。この装置はバルサ材で構成された厚さ１ｍｍの手術用チューブで覆われてる４つの丸いパッドを介して力が加えられる。上部パッドは４．５ｍｍ離れており、１２ｍｍ離れた下部パッドの中間部にあり、これによって中央横方向で曲げが生じる。荷重を与えている間、動物はイソフルランで麻酔をかけて、脚を適切な位置に維持した。
【０４８４】
これらの実験においては、左足は負荷を与えないコントロールとして機能し、変異によって大きさの差を示した。４点曲げで５日間、右脛骨に負荷を与えた。カルセインを５日目および１２日目に注射し、１５日目に組織を回収した。雌には６ニュートン（Ｎ）（すなわち、非ＴＧ２，２３１±１１０με；ＨＢＭ  ＴＧ１，５２５±８１με）を与え、雄には７Ｎ（すなわち、非ＴＧ２，７４０±１５７με；ＨＢＭ  ＴＧ１，８４１±１３１με）。ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスおよび非ＴＧマウスの負荷を与えた領域から脛骨断面を得た。蛍光顕微鏡を使用して得られた骨の２つの２つのカルセイン先端の間の距離を計算することによって、無機物付着速度（ＭＡＲ）を計算した。単一標識表面（ＳＬＳ）、二重標識表面（ＤＬＳ）、および骨表面（ＢＳ）の線寸法を求め、式ＤＬＳ＋（１／２ＳＬＳ）／ＢＳ×１００を使用してパーセントＭＳ／ＢＳを計算した。０．０３ｍｍ2の画像ウィンドウを使用し、約１．６７ｍｍ2の領域を覆って、４０倍の倍率で染色されていない１０μｍの切片上で測定を行った。全ての測定は、Ｒ＆Ｍバイオメトリック・インコーポレイテッドのバイオクアント・イメージ・アナリシス・システムを使用して行った。
【０４８５】
初代骨芽細胞を得るために、負荷を与えていない約４週齢のＴＩＣ系１９  ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスおよびそれらの野生型非ＴＧ同腹子から脛骨を分離し、小さなチップに切断し、ＤＭＥＭ中に溶解したコラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）を使用して、震盪水浴中３７℃で３０分間消化した。消化した上澄みを遠心分離によって除去し、コラゲナーゼ消化をさらに２回繰り返した。３回目の消化後に得られたチップを新しい増殖培地（１０％ウシ胎児血清を補給したＤＭＥＭ）に写し、細胞のコンフルエントプレートが得られるまで標準的方法で増殖させた。このプレートをシーディング１と呼んだ。チップを次に再度播種して培養し、さらに２つのシーディングを回収した。
【０４８６】
最初の２つの骨チップシーディングから単離したＲＮＡを使用して、アフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）ＭＧＵ７４Ａｖ２アレイにハイブリダイゼーションするためのｃＲＮＡ（すなわち、相補的ＲＮＡ）を作製した。製造元の使用説明書通りにキアゲンＲＮＡキットを使用して８０％コンフルエントプレート全てのＲＮＡを単離した。標的の相補的ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）製剤およびアフィメトリックスＭＧＵ７４Ａｖ２アレイに対するハイブリダイゼーションは、実質的に記載通りに行った。ヒル（Ｈｉｌｌ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０（５４９２）：８０９−１２（２０００）。
【０４８７】
データは、１組のスパイクインコントロールを使用して規格化し、従来記載の通りに分析した。ヒル（Ｈｉｌｌ），Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２（１２）：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００５５（２００１）。
【０４８８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析のため、製造元の使用説明書通りにアンビオン（ＡＭＢＩＯＮ）ＲＮＡキットを使用して骨から全ＲＮＡを単離した。全ＲＮＡに対してＤＮアーゼＩ処理を行い、以下の標準プロトコル通りにＴａｑＭａｎ（登録商標）反応で分析した：
【０４８９】
【表２１】
2007525953.tif 000051
【０４９０】
（逆転写（ＡＢＩ  ４３２２１７１高容量ｃＤＮＡアーカイブキット（Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ）））
ｃＤＮＡカクテルを以下のように作製する：
【０４９１】
【表２２】
2007525953.tif 000052
【０４９２】
十分混合し、室温で１０分、さらに３７℃で２時間インキュベートする。プレートは−８０℃で１年間まで保管することができる。
【０４９３】
（ＩＩ．ＱＣおよびＰＣＲ）
１ウェル当たりプレート５０ｎｇ／１０μｌのｃＤＮＡ。希釈したｃＤＮＡは−２０℃で１週間保管することができる。５０μＭのプライマーミックスを調製する。ＡＢＩ（１００μＭ）から一部のプローブを使用する。
ｃＤＮＡカクテルを以下のように作製する。
【０４９４】
【表２３】
2007525953.tif 000053
【０４９５】
簡単に述べると、プレートを回転させて、ＡＢＩ  ７０００に入れ、ＡＢＩ使用説明書によりデータを分析する。さらに考慮する点としては以下のことが挙げられる：
１．プライマー希釈液およびＰＣＲカクテルはプレＰＣＲフード（ｐｒｅ−ＰＣＲ  ｈｏｏｄ）で調製すべきであり、好ましくは使用日に調製する。
２．低レベルで発現する遺伝子に調整するためにベースラインが必要となり得る。
３．ポジティブコントロールは、できれば各プレートに加えるべきである。これによって異なるプレートおよび装置から得られるデータを規格化しやすくなる。
【０４９６】
（インビボ荷重実験での使用）
ＤＮアーゼ１消化
アンビオンの試薬
【０４９７】
【表２４】
2007525953.tif 000054
【０４９８】
３７℃で４５分〜１時間インキュベートする。１×フェノールＣＨＣｌ3を加え、完全一致（ｅｘａｃｔ）（スピン１５分＠１４，０００）。
【０４９９】
沈殿：
【表２５】
2007525953.tif 000055
【０５００】
十分混合する。−８０℃で３時間またはドライアイス中で２０分維持する。４℃で１５分間回転させる。７５％のＥＴＯＨで１回洗浄する。ＤＥＰＣ  Ｈ2Ｏ中に再度懸濁させる。定量するために、１：５０で希釈しＯＤを測定する。キアゲンの方法などの他の方法を使用することもできる。アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２５（１）：９８−１０６（１９９８）。全てのプローブ−プライマー対は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から入手した。この研究で使用したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ−プライマー対の一覧は表１３で見ることができる。
【０５０１】
非ＴＧマウスと比較してＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスの骨の大きさの増加が観察された。大腿骨および椎骨のより大きな構造強度特性と直接関係があり、外部負荷１ニュートン（Ｎ）当たりの実際のひずみは、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスの方が非ＴＧマウスよりもはるかに小さい。したがって、非ＴＧ同腹子とは対照的に、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスはひずみとして与えられた実際の負荷の約７０％しか感知していない。
【０５０２】
非トランスジェニックおよびＬＲＰ５  Ｇ１７１トランスジェニックの雄および雌のマウスの骨形成を、４−ｐｔ曲げシステムで荷重を与え後に組織形態計測的方法を使用して評価した。雌マウスには６Ｎの負荷を与えた（ＴＧマウスにおける同等のひずみは２，２３１±１１０μεであり、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスにおいては１，５２５±８１μεである）。雄マウスには７Ｎの負荷を与えた（非ＴＧマウスにおける同等のひずみは２，７４０±１５７μεであり、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスにおいては１８４１±１３１μεである）。負荷を与えていないコントロールと比較すると、荷重を与えると両方の遺伝子型および性別で脛骨において強い骨形応答が見られ、これは骨膜のカルセイン標識表面の増加によって確認した（図１１）。負荷を与えた非ＴＧおよび負荷を与えたＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  トランスジェニックマウスにおけるカルセイン標識の増加に、顕著な差はなかった。しかし、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスで感知されるひずみが非ＴＧマウスよりも約３０％低いことを考慮すると、外部負荷を与える場合、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスにおける骨形成応答の方が大きい。
【０５０３】
機械的負荷および同化による骨増殖の効果に関する従来の研究に基づくと、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  変異は、骨負荷に対する骨細胞の感受性を変化させ、それによって骨形成を増加するか能力についての試験であった。ボパート（Ｂｏｐｐａｒｔ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ２３（５）：４０９−４１５（１９９８）；カレン（Ｃｕｌｌｅｎ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｅｒｃｉｓｅ：ＢａｓｉｃおよびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７−２３７（リッピンコッｔ・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ），ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ），ＭＤ  ２０００）；アクター（Ａｋｈｔｅｒ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｉ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｉｎｔ．６３（５）：４４２−９（１９９８）；およびアクター（Ａｋｈｔｅｒ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｎｓｉｔｏｍ．５（２）：２０７−１６（２００２）を参照されたい。インビトロでの周期的機械的荷重によって、プロスタグランジンＥ（ＰＧＥ）の放出、プロスタグランジンシンターゼ（ＣＯＸ−２）、プロスタサイクリンシンターゼ（ＰＴＧＩＳ）、および内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）遺伝子の発現を誘導し、これらは骨芽細胞機能において重要な役割を果たす。骨負荷に対する応答で転写される遺伝子のさらなる分析は、１７週齢の雄および雌のＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスおよび非ＴＧマウスを使用し、雌マウスに６Ｎおよび雄マウスに７Ｎの負荷をインビボで与えてから４時間後および２４時間後に脛骨から得られるＲＮＡに対してリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））を実施することで行った。３つ全ての遺伝子（すなわち、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、およびＰＴＧＩＳ）の転写が全てのマウスの骨中でアップレギュレートしたｅｄ（Ｐ＜０．０１）（図１２）。しかし、このアップレギュレーションは、ＬＲＰ５  Ｇ  ７１Ｖ  ＴＧマウスの方がその非ＴＧ同腹子よりも約４〜１０倍大きかった。
【０５０４】
オステオネクチン（ＳＰＡＲＣ）、カテプシンＫ（ＣＴＳＫ）、およびメタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ）などのいくつかの骨細胞マーカー遺伝子の転写が、荷重を与えた非ＴＧマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスの両方でアップレギュレートした。これは、表１３のプライマーおよびプローブを使用してＴａｑＭａｎ（登録商標）により測定した。しかし、前述の遺伝子の場合と同様に、ｔＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスにおける応答の方が大きく、これらのマウスにおいて骨形成活性の増加が示された。表７は骨荷重に対する応答でこれらのマウスでアップレギュレートおよびダウンレギュレート遺伝子を示している。
【０５０５】
【表２６Ａ】
2007525953.tif 000056
【表２６Ｂ】
2007525953.tif 000057
【０５０６】
「遺伝子型効果」とは、ＨＢＭ  ＴＧまたは非ＴＧ同腹子のいずれかの骨中の遺伝子活性がどのように応答するかを意味する。骨で見られるタンパク質の発現も分析している（「負荷効果」の項目の列）。
統計的には、観察される遺伝子発現は、表８〜１０に示される以下の結果が得られる。
【０５０７】
【表２７】
2007525953.tif 000058
【０５０８】
【表２８】
2007525953.tif 000059
【０５０９】
【表２９】
2007525953.tif 000060
【０５１０】
上記３つの表に記載される全ての倍数の変化は、＜０．０５のＰ値で関連づけられている。
【０５１１】
遺伝子転写の最も強い誘導は、ＷｎｔアンタゴニストのＳＲＦＰ１で観察された。これは、慢性的に活性化されたβカテニンシグナリングの過剰増殖作用を防止する骨細胞中のホメオスタシス応答を示しているといえる。Ｗｎｔ  １０Ｂ  ＲＮＡも、ＨＢＭマウスの骨中でのアップレギュレーションが観察された。早期の発育におけるＷｎｔ／βカテニンシグナリングの役割は十分に研究されており、主要において実証された役割を有する。例えば、興味深いことに、Ｗｎｔ−補助受容体（すなわち、ＬＲＰ５）における変異によって、罹患した個人または動物が高骨量となるが悪性の表現型は現れない。さらに、βカテニンは発育中に関与すると広く記載されているが、βカテニンシグナリング経路が、正常成人の骨を活性化させ、機械感覚性シグナルに対する応答で骨密度調整に関与することが示されたのは、これが最初である。
【０５１２】
βカテニン標的遺伝子の発現は、負荷を与えていないＨＢＭ  ＴＧマウス（すなわち、Ｇ１７１Ｖ変異を有するマウス）の骨細胞中でアップレギュレートすることが示された。骨形成の差に寄与し得る、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスまたは非ＴＧマウスからの骨細胞の転写プロファイルの遺伝子型特性の差を理解するために、脛骨の骨チップシーディングからのＲＮＡ（前述の材料および方法で説明した通り）を分析した。骨芽細胞活性に作用する多くの遺伝子の転写が観察され、例えば、プロコラーゲンＣ−プロテイナーゼエンハンサータンパク質（ＰＣＯＬＣＥ）、コラーゲン１および３、骨特異的ビグリカン（ＢＧＮ）、オステオグリシン（ＯＧＮ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ９および１４（それぞれＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１４）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ２）、コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、ＥｒｂＢ−２．１のトランスデューサー（ＴＯＢ１）、ならびにルミカン（ＬＵＭ）の転写が観察された。これらの遺伝子は、Ｇ  １７１Ｖ  ＬＲＰ５  ＴＧマウスの骨で誘導され、これらのマウスの骨の骨形成活性の増加が見られた。これらの遺伝子の一部の転写活性を表８〜１０に示している。
【０５１３】
これらの骨特異的遺伝子以外に、多数のＷｎｔ／βカテニンシグナリング関連遺伝子について、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスにおいて異なる転写が観察された。Ｗｎｔシグナリング成分遺伝子（例えば、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＳＦＲＰ１、ＳＦＲＰ２、およびＤＫＫ３）およびβカテニン標的遺伝子（すなわち、メタロチオニエン２（ＭＴ２）、サイクリンＤ１（ＣＣＮＤ１）、およびＷＮＴ１誘導性シグナリング経路タンパク質２（ＷＩＳＰ２））の転写が、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスからの骨で誘導された（表８〜１１）。これらの観察は、Ｗｎｔ  シグナリング経路におけるＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ変異の役割に関して実施した研究によるものである。本発明者らは、数種類のシグナリング成分およびＮＦ−ｋＢおよびＪＮＫ経路の標的遺伝子（すなわち、ＮＦ−ｋＢ１、ＧＲＯ１、ＪＵＮ  Ｂ）の転写がこれらのマウスにおいてダウンレギュレーションすることに気づいた。例えば、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ変異は、数種類の経路のシグナリングを調節することによって骨密度に影響を与えることができるが、最も顕著であるのがβカテニンシグナリング経路である。
【０５１４】
βカテニン媒介シグナリングは、非ＴＧマウスおよびＨＢＭ  ＴＧマウスの両方で、骨に機械的負荷を与えた後で活性化することが示された。Ｗｎｔ／βカテニンシグナリングに依存するＬＲＰ５のアップレギュレーションは、骨芽細胞の増殖および機能の増加と関連している。機械的負荷を与えた後の、βカテニン経路の骨形成活性に対する役割を評価するために、ＨＢＭ  ＴＧマウスおよび非ＴＧマウスの負荷を与えていないおよび負荷を与えた脛骨中の数種類の経路成分および標的遺伝子のＲＮＡ量を、前述のようにＴａｑＭａｎ（登録商標）によって分析した。
【０５１５】
非ＴＧマウスの骨中のＷｎｔ  １０Ｂ、ＳＦＲＰ１、ＣＣＮＤ１、コネキシン４３、およびＷＩＳＰ２のＲＮＡ量は、機械的負荷を与えてから４時間後および２４時間後の両方で顕著にアップレギュレートした（Ｌｏｇ2１〜２の平均増加）（図１３Ａおよび１３Ｂ）。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２の転写は負荷の４時間後に誘導されたが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２のＲＮＡ量は２４時間でベースラインまで戻った。ＳＦＲＰ４遺伝子の転写は、非ＴＧマウスに荷重を与えて４時間後または２４時間後のいずれでも顕著な変化はなかった。これらのデータから、機械的応力によって、非ＴＧ野生型マウスの骨細胞中の数種類のシグナリング成分およびβカテニンシグナリング経路の下流標的遺伝子の転写を誘導することが分かる。
【０５１６】
ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスにおいては、分析した全てのＷｎｔ関連遺伝子およびβカテニン標的遺伝子（ＳＦＲＰ４を含む）の転写でより顕著な増加（すなわち、Ｌｏｇ2１．５〜５．０）が観察された。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２のＲＮＡ量は、負荷の４時間後には非ＴＧマウスおよびＨＢＭ  ＴＧマウスの両方でほぼ同僚で誘導された。しかし、非ＴＧマウスとは異なり、ＨＢＭ  ＴＧマウスでは２４時間でもこの増加が維持された。遺伝子転写におけるこれらの変化は、両方の時点でＰ＜０．０１で統計的に有意であった（図１３Ａおよび１３Ｂ）。これらの観察から、機械的荷重がβカテニン媒介シグナリングを活性化させ、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ変異はＷｎｔ経路において機能獲得変異として作用することが分かる。
【０５１７】
機械的負荷のＯＰＧ／ＲＡＮＫＬ媒介シグナリングに対する影響も、ＨＢＭ  ＴＧマウスおよび非ＴＧマウスの両方で調べた。ＨＢＭ  ＴＧマウスの骨においてＮＦ−ｋＢおよびＪｕｎ／Ｆｏｓ媒介シグナリングと関与する遺伝子のダウンレギュレーションが観察された。この観察は、破骨細胞中のＮＦ−ｋＢおよびＪｕｎ／Ｆｏｓ駆動経路の両方を刺激するＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）などの上流因子の発現の変化と見ることができる（Ｒｏｍａｓら、Ｂｏｎｅ  ３０（２）：３４０−６（２００２））。ＲＡＮＫＬは、ＮＦ−ｋＢの受容体アクチベーター（すなわち、ＲＡＮＫ）のリガンドである。ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用によって破骨細胞分化が進行する。この過程は、おとりのＲＡＮＫＬ受容体であるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）によって効果的に遮断される。骨芽細胞およびストローマ細胞の中のＯＰＧおよびＲＡＮＫＬの量は、インビトロおよびインビボの両方で観察されるように相互に調整されることが多い。この相互の調整をふまえて、非ＴＧマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスの骨中のＲＡＮＫＬおよびＯＰＧのＲＮＡ量を分析した。負荷がない場合には、非ＴＧマウスおよびＧ１７１Ｖ  ＬＲＰ５−ＴＧマウスの間でＲＡＮＫＬおよびＯＰＧ  ＲＮＡの間の量の差は観察されなかった。ＲＡＮＫＬのＲＮＡ量は、いずれの遺伝子型で機械的負荷を与えても影響しなかった。ＯＰＧのＲＮＡ量は、非ＴＧマウスでは顕著な誘導は観察されなかったが（０．９  Ｌｏｇ2倍、Ｐ＜０．０１）、ＨＢＭ  ＴＧマウス中のＯＰＧのＲＮＡ量は顕著に増加した（すなわち、３．５ｌｏｇ2倍、Ｐ＜０．０１）（図１４）。ＨＢＭ  ＴＧマウスにおいてＲＡＮＫＬの同時の増加が起こらずにＯＰＧ量が顕著に増加することかから、破骨細胞の分化および活性がＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ変異によって抑制されていることが分かる。
【０５１８】
（実施例７）
（重力負荷を与えた後のＭＣ３Ｔ３細胞の転写プロファイリング）
１５分間遠心分離することによって、重力負荷（すなわち、１Ｇ、６Ｇ、１２Ｇ、および２５Ｇ）をＭＣ３Ｔ３細胞に与えた。荷重を与えた細胞を回収し、全ＲＮＡを得る処理を行った。このＲＮＡを、アフィメトリックス  ＭＧ  Ｕ７４Ａｖ２アレイにハイブリダイゼーションするための標的を作製するために使用した。
【０５１９】
実験条件下で、ＥＲＫ（ｐ４２／４４  ＭＡＰＫとも呼ばれる）がリン酸化、このリン酸化は２５Ｇで最大となる。Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、およびＣＯＸ−２のＲＮＡ量を全て評価し、３つ全ての遺伝子の最大の誘導がこれも２５Ｇで起こることが分かった。さらに、アップレギュレートした遺伝子の大部分は、Ｗｎｔ／βカテニン経路の成分であった。表１１は、重力負荷に対する応答でアップレギュレートまたはダウンレギュレートのいずれかが起こるとして同定された上位の遺伝子を示している。
【０５２０】
【表３０Ａ】
2007525953.tif 000061
【表３０Ｂ】
2007525953.tif 000062
【０５２１】
負荷によってアップレギュレートおよびダウンレギュレートされる遺伝子のより詳細な概要は以下の表１２を参照されたい。「Ｗｎｔ標的遺伝子」は、Ｗｎｔ／βカテニンシグナリングの活性化に応答して転写が誘導される遺伝子を含むが、これに限定されるものではない（図１６）。「Ｗｎｔシグナリング中間体」とは、活性化されたＷｎｔの細胞シグナリングの下流に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含みが、これに限定されるものではないことを意味する。表１１に使用される「炎症」とは、炎症性応答に関与するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。表１１に使用される「細胞成長および増殖」とは、細胞の成長および増殖に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「増殖因子」とは、細胞増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「マトリックスメタロプロテイナーゼ」とは、マトリックス金属タンパク質の開裂に関与するプロテイナーゼをコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「キナーゼ−応力シグナリング」は、応力応答の下流のシグナリングカスケード（例えばｐ３８ＭＡＰＫ経路）に関与するキナーゼをコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「リポタンパク質受容体」は、リポタンパク質の受容体をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「βカテニン核トランスロケーション」とは、細胞質のβカテニンの核への移行に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される細胞周期調節遺伝子」とは、細胞周期の調整に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「骨芽細胞機能」は、骨芽細胞の機能および活性に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「骨芽細胞分化」とは、骨芽細胞系細胞の成熟骨芽細胞および骨細胞への分化に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「増殖抑制」とは、細胞増殖を抑制するタンパク質をコードする遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。表１１に使用される「ｉＧＳＫによって誘導される」とは、ｉＧＳＫによって転写が誘導されることが確認されている遺伝子を含むことを意味するが、これに限定されるものではない。
【０５２２】
【表３１Ａ】
2007525953.tif 000063
【表３１Ｂ】
2007525953.tif 000064
【表３１Ｃ】
2007525953.tif 000065
【表３１Ｄ】
2007525953.tif 000066
【表３１Ｅ】
2007525953.tif 000067
【表３１Ｆ】
2007525953.tif 000068
【表３１Ｇ】
2007525953.tif 000069
【０５２３】
転写プロファイリングを実施するために使用することができる他のアッセイ（すなわち、骨負荷に対する応答における遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションの評価）は、メトリゲニックス（Ｍｅｔｒｉｇｅｎｉｘ）などが製造した他のオリゴヌクレオチドアレイの使用、ｃＤＮＡアレイ（例えば、インサイト（Ｉｎｃｙｔｅ）、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など）の使用、または本明細書に記載のアレイ、タンパク質および抗体アレイ（例えば、ベクトン・ディキンソン、クロンテック、および他の供給元のアレイ）、従来方法を使用するポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲプロトコル：方法および応用への手引き（ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ）（マイケル・イニス（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｉｎｎｉｓ）ら編著，１９９０）を参照されたい）の使用、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（すなわちＡＢＩのリアルタイムＰＣＲ）、ｅＴＡＧ（アクララ・バイオサイエンシズ（ＡＣＬＡＲＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼ分析、ＲＮアーゼ保護アッセイ、およびウエスタンブロットの使用である。これらのアッセイの実施方法は当技術分野において周知である。例えば、抗体の使用：実験室マニュアル（ＵＳＩＮＧ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ），Ｅｄおよびレーン（Ｌａｎｅ），デビッド（Ｄａｖｉｄ）（コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），１９９９）；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）  ｅｔ  ａｌ．，分子クローニング：実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）（第２版，コールド・スプリング・ハーバー・・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），１９８９）；およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）  ｅｔ  ａｌ．，分子クローニング，実験室マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ），（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ），ニューヨーク（ＮＹ）１９８２）を参照されたい。
【０５２４】
遺伝子の分析に使用したプライマーおよびプローブを表１３に示す。
【０５２５】
【表３２Ａ】
2007525953.tif 000070
【表３２Ｂ】
2007525953.tif 000071
【表３２Ｃ】
2007525953.tif 000072
【０５２６】
（実施例８）
（ＣＯＸ−２阻害剤に誘導されるＷｎｔ経路活性の調節および骨負荷に対する影響）
前述したように、ＣＯＸ−２遺伝子の転写は、インビトロおよびインビボの両方で、機械的骨負荷を与えることによって誘導される。ＣＯＸ−２の発現は、Ｗｎｔ  １によって誘導することができる（ハウ（Ｈｏｗｅ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２３）：２０１０８−１５（２００１））。ＣＯＸ−２のプロモーターがＴＣＦ−４結合部位を有することもさらに知られている（アラキ（Ａｒａｋｉ）  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３（３）：７２８−３４（２００３））。したがって、ＣＯＸ−２活性が、負荷によって誘導されるＷｎｔ／βカテニン標的遺伝子の転写に必要であるかどうかが疑問であった。以下の実験および関連するデータがこの質問の答になる。
【０５２７】
ＭＣ３Ｔ３細胞は、未処理のままとするか、または、前述のようにＦｌｅｘｅｒｃｅｌｌ（登録商標）による荷重を与える１時間前に１、１０、および６０μＭのＣＯＸ−２阻害剤のＮＳ−３９８（［Ｎ−（２−シクロヘキシルオキシ−４−ニトロフェニル）メタンスルホンアミド］）で処理した。
【０５２８】
負荷を与えた直後にＲＮＡを単離し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析を行った。分析した転写物は、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、コネキシン４３、ＳＦＲＰ１、Ｗｎｔ１０Ｂ、サイクリンＤ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２、ＷＩＳＰ２、Ｆｏｓ、およびＪｕｎ（図１５）であった。
【０５２９】
これらの結果から、ＦｚＤ２、ｅＮＯＳ  ＦＯＳ、ＪＵＮ、ＣＯＸ−２、コネキシン４３、サイクリンＤ１、ＳＦＲＰ１、およびＷｎｔ１０Ｂの転写が負荷により誘導されることが示された。最後の４つの遺伝子は、ＣＯＸ−２活性に完全に依存し、その理由は、ＣＯＸ−２阻害剤が存在すれば、これらの遺伝子の転写が負荷によって誘導されないからである。Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２、ｅＮＯＳ、ＦｏｓｍおよびＪｕｎの負荷に誘導された転写は、ＣＯＸ−２活性とは無関係であった（図１５）。ＷＩＳＰ２遺伝子び発現は、ＭＣ３Ｔ３細胞においては負荷によって誘導されなかった。ＣＯＸ−２阻害剤を使用するこれらの実験、およびこれらの実験から導き出すことができる結論は、このおよびその他のシグナリング経路モジュレーターを、荷重の同化作用およびＷｎｔ／βカテニン経路の活性化への寄与に必要となる重要な要素／要因の同定にいかにして使用することができるかの一例となる。
【０５３０】
（実施例９）
（Ｗｎｔ  ３Ａはβカテニン標的遺伝子発現を相乗的に誘導する）
負荷の存在下でＧＳＫ３−β阻害剤を使用したＭＣ３Ｔ３細胞（実施例１参照）の治療およびそのβカテニン標的遺伝子発現に対する影響と関連する上記実験と同様に、以下の荷重実験を実施して、別の化合物が骨負荷を増強できるかどうかを調べた。この実験は、天然のＷｎｔリガンドのＷｎｔ  ３Ａの存在下で実施した。この目的はＬＲＰ５／６／Ｆｒｉｚｚｌｅｄ補助受容体のレベルでＷｎｔ／βカテニン経路の活性化が、ＧＳＫ−３阻害剤（上記実施例）で観察されたように、負荷の存在下で、βカテニン標的遺伝子発現を同様に相乗的に誘導するかどうかを調べることであった。
【０５３１】
ここで、Ｗｎｔ  ３Ａのならし培地を、マウスＷｎｔ  ３ＡをトランスフェクトしたマウスＬ−細胞から得た。前述のように、ＭＣ３Ｔ３細胞を、増殖培地に播種してコンフルエントになるまで３日間培養した。次に、ＭＣ３Ｔ３細胞の培地を、ＢＳＡ含有培地に交換し、これらの細胞を２４時間インキュベートした。ＢＳＡ含有培地を次に除去して、種々の量のＬ−細胞Ｗｎｔ  ３Ａ馴化培地、またはトランスフェクトしていないＬ−細胞から得たコントロール馴化培地を含有する最終体積１ｍＬの新しいＢＳＡ培地と交換した。Ｗｎｔ  ３Ａ馴化培地の量は、最終体積１ｍＬの無血清ＢＳＡ培地中０．５、２．０、５．０、１０．０、２０．０、および１００μＬで変動させた。次に、前出の実施例のように、ＭＣ３Ｔ３細胞に３，４００μεを２Ｈｚ、７２００サイクル／時で５時間与えた。
【０５３２】
これらの細胞を回収し、前述の実施例に記載のように処理を行った。図１７に示される結果から、Ｗｎｔ  ３Ａ単独（すなわち負荷なし）では、サイクリンＤ１、コネキシン４３、ＳＦＲＰ１、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＷＩＳＰ２、ＣＯＸ−２、ＦＯＳ、およびＪＵＮの遺伝子発現に対する影響は見られなかったことが分かる。しかし、負荷が存在すれば、Ｗｎｔ  ３Ａの用量依存的（すなわち、二相性で）および相乗的にサイクリンＤ１、コネキシン４３、ＳＦＲＰ１、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＷＩＳＰ２、ＣＯＸ−２、ＦＯＳ、およびＪＵＮの発現を誘導した。負荷単独に対する誘導の倍率は、１．８倍〜２．６倍の誘導の範囲であった。負荷の増強に最も効果的なＷｎｔ  ３Ａならし培地の量は、約２μＬ〜２０μＬの範囲であり、より好ましくは２〜１０μＬの間であった。Ｗｎｔ  ３Ａを含有しなかったコントロールのＬ−細胞馴化培地は、負荷の存在下でのβカテニン標的遺伝子発現に対する付加的な効果はなかった。
【０５３３】
これらのデータは、天然のＷｎｔリガンドを使用したＷｎｔ／βカテニン経路の活性化によって、骨細胞が機械的荷重に対してより応答しやすくなるという構想をさらに支持している。したがって、Ｗｎｔ  ３Ａおよびそのミメティックを、本明細書に記載のＧＳＫ阻害剤として提案したものと同じ目的で使用することができる。例えば、Ｗｎｔ３Ａ発現の増強、またはＷｎｔ  ３Ａミメティックまたは機能性変異体の使用は、患者の骨量を増加させる目的で骨負荷を増強させるために行うことができる。
【０５３４】
（実施例１０）
（機械的負荷へのインビボ応答に対するＧＳＫ阻害剤全身投与の影響）
ＧＳＫ阻害剤を使用した全身治療によって、Ｗｎｔシグナリングを活性化し、それによって機械的負荷に対する骨応答が模倣されるという仮説を発展させてきた。この応答は、高骨量（「ＨＢＭ」）トランスジェニック動物モデルで観察されるものと類似していると予想され、すなわち骨が、野生型動物よりも骨のひずみが小さい量のＨＢＭ動物における同化負荷作用を経験する（Ｗｎｔシグナリングを活性化する）（図１２、１３ａ、および１３ｂ、実施例６参照）。以下の材料および方法を使用してこの仮説を試験した。
【０５３５】
材料および方法。野生型１７週齢の雌マウスに、１０μｇ／ｍＬ／ｋｇ（低）、５０μｇ／ｍＬ／ｋｇ（高）、または賦形剤（コントロール）をそれぞれ注射した。注射は、１４日間で１日２回、皮下投与した。各コホートで合計２０匹の動物が存在した。使用したＧＳＫ阻害剤は、３−（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアミノ）−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオンであった。
【０５３６】
動物の右脛骨に、６Ｎの負荷を３６サイクル、２Ｈｚで与えた。動物の左脛骨は、負荷を与えないコントロールとした。この手順の後、負荷から４時間後に動物を塗擦した。その時点で組織を処理し、液体窒素中で急速冷凍した。脛骨を各コホートで５匹分の４群に集め、負荷（左）および未負荷（右）と集めた。脛骨（負荷および未負荷）、肝臓、脾臓、腎臓、脳、大腸、および皮膚からｍＲＮＡを精製した。選択した負荷−およびＷｎｔ−応答遺伝子（図１２、１３ａ、および１３ｂ、実施例６に記載）に対する脛骨からの試料に対してＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施することで、転写分析を行った。アフィメトリックス（登録商標）遺伝子チップを使用し、その遺伝子チップの製造元の使用説明書を使用して、より全体的なプロファイリングを実施した。
【０５３７】
全ての動物で全てのプロトコルを実施した。以下の遺伝子の発現を脛骨において監視した：Ｃｏｘ２、ｅＮｏｓ、Ｗｎｔ１０Ｂ、ＳＦＲＰ１、Ｃｘｎ４３、ＣＣＮＤ１、Ｆｚｄ２、およびＷＩＳＰ２。ＧＳＫ阻害剤で処理した動物で、顕著な転写の変化が観察され、ＧＳＫ阻害剤を低用量で投与した動物と高容量で投与した動物の間に用量依存性の傾向が得られた。高用量のＧＳＫｉ治療では、監視した全ての遺伝子で、負荷を与えた脛骨の方が未負荷の脛骨よりも顕著に誘導が起こった。この比較において、Ｃｏｘ２は約２７倍、ｅＮｏｓが５倍、Ｗｎｔ１０Ｂが７倍、ＳＦＲＰ１が２．５倍、Ｃｘ４３が５倍、ＣＣＮＤ１が４倍、Ｆｚｄ２が７倍、ＷＩＳＰ２が３倍で誘導された。負荷の早産かでは、高用量のＧＳＫｉを使用した治療では、賦形剤治療と比較して以下の遺伝子発現が相乗的に誘導された：Ｃｏｘ２、ｅＮｏｓ、Ｗｎｔ１０Ｂ、ＳＦＲＰ１、Ｃｘ４３、ＣＣＮＤ１、およびＦｚｄ２。このデータは、ＨＢＭトランスジェニック（実施例６）およびインビトロフレクサーセル研究（実施例９）からの前述の観察を裏付けており、Ｗｎｔシグナリング経路の活性化によって、機械的負荷に対する正常な骨応答が増強され、骨は同等の負荷でより小さなひずみを経験または知覚することが確認された。
【０５３８】
以上の実施例を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の意図から逸脱せずに種々の変形を汚ｋなうことができ、容易に当業者に知ることとなることを理解されたい。
【０５３９】
本出願は、２００３年６月６日提出の米国仮出願第６０／４７６，１６４号明細書、および２００３年９月１０日提出の米国仮出願第６０／５０１，３９８号明細書と関連しており、これらの記載内容全体が、本明細書に組み入れられる。本明細書で引用される全ての特許および刊行物は、それらの記載内容全体が本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０５４０】
【図１Ａ】ＨＥＫ−２９３Ａ細胞中のＧＳＫ−３  阻害剤によるＴＣＦシグナルの用量依存性活性化を示している。このグラフは、３０μＭ〜６０μＭの間の濃度のｉＧＳＫ−３が、トランスフェクトしたＴＣＦレポーターを活性化し、２９３Ａ細胞中のＷｎｔシグナリングを活性化することを示している。
【図１Ｂ】ＨＥＫ−２９３Ａ細胞およびＵ２ＯＳ骨細胞中のＧＳＫ−３  阻害剤によるＴＣＦシグナルの用量依存性活性化の比較を示している。このデータは、２９３Ａ細胞以外に、ｉＧＳＫ−３阻害剤がＵ２ＯＳ骨細胞中のＴＣＦシグナルを活性化することを示している。Ｕ２ＯＳ細胞は、２９３Ａ細胞よりも、ｉＧＳＫ−３媒介ＴＣＦシグナル活性化に対する応答が大きい。ＴＣＦの誘導は、２９３Ａ細胞よりも低い用量（１０μＭ）で開始し、２９３Ａ細胞とは異なり３０μＭでピークとなっている。
【図２】Ｕ２ＯＳ細胞におけるＴＣＦシグナルのＤｋｋ１媒介阻害から開放するためにＧＳＫ−３阻害剤を使用することができる。図示されるように、Ｗｎｔ１およびＷｎｔ３Ａは、コントロールよりも約１０〜１５倍ＴＣＦシグナルを活性化する。Ｄｋｋ１を追加すると、Ｗｎｔ媒介ＴＣＦシグナルが阻害される。ＧＳＫ−３阻害剤はこの阻害を逆転させることができる。このことは、これおよび他のＧＳＫ−３阻害剤を、Ｄｋｋ１−アンタゴニストレポーターアッセイにおけるコントロールまたは有効物質として使用できることを示している。他のＷｎｔアンタゴニストは、ＧＳＫ−３阻害剤を使用して較正することができる。
【図３】マウス頭蓋冠厚さに対するｉＧＳＫ−３局所投与の影響。ｉＧＳＫ−３を注射による局所投与から１８日後に、処理したマウスの頭頂骨の横断面がＨ＆Ｅによって染色された。右半分の頭蓋冠に対する１ｍｇ／ｋｇ／ｄのｉＧＳＫ−３に夜局所同化作用が明らかである。
【図４】頭蓋冠の非注射側からのパーセント変化によって表したマウス頭蓋冠厚さに対するｉＧＳＫ−３局所効果。ヒトＰＴＨ（ｈＰＴＨ）、ｉＧＳＫ−３、および賦形剤（２％のツイーン８０および０．５％のメチルセルロースを含有する５０％のＤＭＳＯ）で処理したマウスの頭蓋冠骨厚さの定量。２０μｇ／ｋｇ／日におけるヒトＰＴＨ（１−３４）はポジティブコントロールとして機能し、頭蓋冠の厚さが顕著に増加した。同じ動物の非注射の左半分の頭蓋冠と比較するとｉＧＳＫ−３を１８日注射した右半分の頭蓋冠で頭蓋冠厚さの顕著な増加が見られた（１１．８％、ｐ＜０．００５）。
【図５】賦形剤処理した頭蓋冠と比較した、１８日ｉＧＳＫ−３処理の局所効果の頭蓋冠厚さへの影響。ｈＰＴＨ、ｉＧＳＫ−３、および賦形剤（２％のツイーン８０および０．５％のメチルセルロースを含有する５０％のＤＭＳＯ）で処理したマウスの頭蓋冠骨厚さの定量。２０μｇ／ｋｇ／日におけるヒトＰＴＨ（１−３４）はポジティブコントロールとして機能し、頭蓋冠の厚さが顕著に増加した。賦形剤単独と比較した場合、ｉＧＳＫ−３を１８日間注射した右半分の頭蓋冠で頭蓋冠厚さの増加（６％）が観察された。
【図６】賦形剤で処理した頭蓋冠と比較した、７日間ＰＴＨ１−３４およびｉＧＳＫ−３で処理した頭蓋冠の厚さに対する局所効果（上図）。ｈＰＴＨ、ｉＧＳＫ−３、および異なる賦形剤（すなわち、２％のツイーン８０および０．５％のメチルセルロースを癌入する１０％のＤＭＳＯ）で７日間処理したマウス頭蓋冠の骨の厚さを定量すると、賦形剤コントロール処理の頭蓋冠と比較して、統計的に有意な１０％の頭蓋冠厚さの増加が見られた（下図）。
【図７】ｉＧＳＫ−３の、内因性アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰアーゼ）、およびマウス頭蓋冠のβカテニンタンパク質発現に対する影響。ｉＧＳＫ−３の頭蓋冠の骨に対する影響を、免疫組織化学によるＡＬＰアーゼ酵素組織化学的染色およびβカテニン発現によって評価した。ＡＬＰアーゼ活性は、ｉＧＳＫ−３またはＰＴＨ投与のいずれかの後で骨芽細胞において顕著に増強した（上図）。ｉＧＳＫ−３を注射した頭蓋冠の免疫組織化学から、骨膜を裏打ちする骨芽細胞においてβカテニンの強い発現が見られた。対照的に、ＰＴＨでは、βカテニン発現量に対する影響はなかった（下図）。
【図８】負荷を与えた直後のＭＣ３Ｔ３細胞中の、遺伝子の広範なリストの遺伝子応答に対するひずみの影響。サイクリンＤ１、コネキシン４３、ＳＦＲＰ１、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＣＯＸ−２、およびｅＮＯＳは遺伝子発現が誘導され、負荷を与えるとＦｒｉｚｚｌｅｄ  ２、Ｆｏｓ、およびＪｕｎも発現が誘導される。負荷の５時間後でＷＩＳＰ２遺伝子発現の誘導が最小であった。
【図９】ｉＧＳＫ−３、および負荷とｉＧＳＫ−３の併用によるβカテニン経路の活性化に対する負荷単独の影響。このデータは、負荷なしのコントロールと比較すると、負荷単独で各遺伝子（ＷＩＳＰ２を除く）の発現が誘導されることを示している。ＧＳＫ−３阻害剤（５μＭ）単独ではｉＦｒｉｚｚｌｅｄ  ２およびＷＩＳＰ２の発現が誘導されたが、コネキシン４３、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ  １０Ｂ、ＳＦＲＰ１、ＣＯＸ−２、ｅＮＯＳ、Ｆｏｓ、およびＪｕｎに対する影響はなかった。しかし、負荷の存在下、ＭＣ３Ｔ３細胞を５μＭのＧＳＫ−３阻害剤で処理すると各標的遺伝子について相乗的な遺伝子発現の誘導が起こった。
【図１０】負荷の存在下での、Ｗｎｔ標的遺伝子発現に対するｉＧＳＫ−３の用量依存性作用。このデータは、負荷なしのコントロールと比較すると、各遺伝子の発現が負荷単独によって誘導されたことを示している。ＧＳＫ−３阻害剤単独では、記載の遺伝子に対してあらゆる濃度で遺伝子発現に影響は見られなかったデータ示さず）。しかし、負荷の存在下、濃度を増加させて（０．０５〜２０μＭ）ＧＳＫ−３阻害剤を使用してＭＣ３Ｔ３細胞を処理すると、各標的遺伝子で、用量依存性の相乗的な遺伝子発現の誘導が起こった。
【図１１】カルセイン標識に対するインビボ荷重の影響。雌マウスに６Ｎの力の負荷を与え、雄マウスには７Ｎの負荷を与えた。負荷なしのコントロールと比較して、負荷を与えたマウスの非トランスジェニックおよびＨＢＭトランスジェニックの両方、および両方の性で、脛骨中でカルセイン標識表面が増加したことによって顕著な骨形成応答が観察された。
【図１２】非ＴＧマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ  １７１Ｖ  ＴＧマウスの負荷なしおよび負荷ありの脛骨における、ＣＯＸ−２、ＰＴＧＳ、およびｅＮＯＳの発現を示すＴａｑＭａｎ（登録商標）データ。３つ全ての遺伝子で、負荷により誘導されたｍＲＮＡ量の増加は、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスの方が非ＴＧマウスよりも大きかった。
【図１３Ａ】負荷を与えて４時間後の非ＴＧマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ  １７１Ｖ  ＴＧ（ＨＢＭ  ＴＧ）マウスにおける、Ｗｎｔ関連遺伝子およびＷｎｔ標的遺伝子の発現を示すＴａｑＭａｎ（登録商標）データを表している。非ＴＧマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスの両方で、βカテニン標的遺伝子の転写が、負荷に誘導されて増加している。しかし、この誘導は、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧ  マウスの場合の方が遙かに大きい。
【図１３Ｂ】負荷を与えて２４時間後の非ＴＧマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ  １７１Ｖ  ＴＧ（ＨＢＭ  ＴＧ）マウスにおける、Ｗｎｔ関連遺伝子およびＷｎｔ標的遺伝子の発現を示すＴａｑＭａｎ（登録商標）データを表している。
【図１４】負荷を与えて４時間後および２４時間後の、非ＴＧマウスおよびＧ  １７１Ｖ  ＬＲＰ５  ＴＧ（ＨＢＭ  ＴＧ）マウスにおける、ＲＡＮＫＬおよびＯＰＧの発現を示すＴａｑＭａｎ（登録商標）データ。ＲＡＮＫＬの遺伝子転写は、非ＴＧマウスおよびＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスのいずれもあまり誘導されない。ＯＰＧ遺伝子転写は、ＬＲＰ５  Ｇ１７１Ｖ  ＴＧマウスでのみ誘導され、非ＴＧマウスでは誘導されない。
【図１５】負荷が誘導する遺伝子発現に対するＣＯＸ−２発現の阻害の影響。荷重（３，４００μεひずみを５時間）を与える１時間前に、ＣＯＸ−２阻害剤のＮＳ−３９８を種々の濃度（１〜６０μＭ）で細胞に加えた。ＣＯＸ−２阻害剤は、負荷によって誘導されるコネキシン４３、サイクリンＤ１、Ｗｎｔ  １０ｂ、ＳＦＲＰ１、およびＣＯＸ−２遺伝子発現の誘導を遮断したが、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ２、ｅＮＯＳ、Ｆｏｓ、およびＪｕｎに対しては影響がなかった。これらのデータは、負荷刺激を与えることによってＷｎｔ標的遺伝子発現の応答を調節する重要な役割をＣＯＸ−２発現が担っていることを示している。
【図１６】Ｗｎｔ／βカテニン経路の活性化におけるＬＲＰ５の関与を説明するモデルである。
【図１７】天然Ｗｎｔリガンド（Ｗｎｔ  ３Ａ）はβカテニン標的遺伝子発現を相乗的に誘導する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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