(57)【要約】  本発明は、研究、生物学、臨床、治療ならびに予後診断および診断目的に有用な、脱ユビキチン化酵素(ＤＵＢ)のファミリーの新規メンバー、ならびに生物学的に、診断にまたは治療に有用なそのフラグメント、誘導体、および相同体を提供する。さらに、本発明により提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、乳癌、白血病または脳障害の処置および診断に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０
(ｂ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０のフラグメント
(ｃ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０の誘導体
(ｄ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０と実質的に相同な配列
から成る群から選択される、ユビキチン特異的プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号２、配列番号６または配列番号１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列から成る、請求項１に記載の単離ＤＮＡ。
【請求項３】
該フラグメントが、配列番号２、配列番号６または配列番号１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０ヌクレオチドを含み、かつユビキチン特異的機能活性を維持している、請求項１に記載の単離ＤＮＡ。
【請求項４】
配列番号２、配列番号６または配列番号１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同性であり、かつユビキチン特異的機能活性を維持しているヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離ＤＮＡ。
【請求項５】
高ストリンジェンシー条件下で、請求項１−４のいずれかに記載の単離ＤＮＡとハイブリダイズする約３０−５０ヌクレオチドの核酸配列を含む、単離ＤＮＡ。
【請求項６】
(ａ)配列番号１、配列番号５、配列番号９
(ｂ)配列番号１、配列番号５、配列番号９のフラグメント
(ｃ)配列番号１、配列番号５、配列番号９の誘導体
(ｄ)配列番号１、配列番号５、配列番号９と実質的に相同な配列
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ユビキチン特異的プロテアーゼの単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号１、配列番号５または配列番号９から成る群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
該フラグメントが配列番号１、配列番号５または配列番号９から成る群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも５連続アミノ酸を含む、請求項６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号１、配列番号５または配列番号９から成る群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％相同性であり、かつユビキチン特異的機能活性を維持している、請求項６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
該誘導体が、ユビキチン特異的プロテアーゼと機能的に同等である、請求項６に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１−５のいずれかに記載の単離ＤＮＡを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１−５のいずれかに記載の単離ＤＮＡを含む、ベクター。
【請求項１３】
転写制御配列を含む、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１２または１３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
ヒトの乳房組織における請求項６−１０のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチドの量を測定し、ここで、正常乳房組織における該ポリペプチドの量と比較して相対的に上昇した量の該ポリペプチドの存在が、該ヒトが乳癌に罹患していることの診断である、ヒトにおける乳癌を診断する方法。
【請求項１６】
該検出段階が、該乳房組織と、請求項６−１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体を接触させ、該抗体と該乳房組織中のポリペプチドの特異的結合を検出することを含み、ここで、ポリペプチドへの特異的結合の検出が、請求項６−１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの存在を示すものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該アミノ酸配列が、配列番号１、そのフラグメント、誘導体または相同体を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
末梢血細胞、とりわけリンパ系細胞における請求項６−１０のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチドの量を測定することを含み、ここで、正常末梢血細胞における該ポリペプチドの量と比較して相対的に上昇した量の該ポリペプチドの存在が、該ヒトが白血病に罹患していることの診断である、ヒトにおける白血病を診断する方法。
【請求項１９】
該検出段階が、該末梢血細胞、とりわけリンパ系細胞と、請求項６−１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体を接触させ、そして該抗体と該末梢血細胞中のポリペプチドの特異的結合を検出することを含み、ここで、ポリペプチドへの特異的結合の検出が、請求項６−１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの存在を示すものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該アミノ酸配列が、配列番号５、そのフラグメント、誘導体または相同体を含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
扁桃体(amgdala)、脊髄または嗅球組織における請求項６−１０のいずれかに記載のポリペプチドを含むポリペプチドの量を測定することを含み、ここで、正常な扁桃体(amgdala)、脊髄および嗅球組織の量と比較して相対的に上昇した量の該ポリペプチドの存在が、該ヒトが脳障害に罹患していることの診断である、ヒトにおける脳障害を診断する方法。
【請求項２２】
該検出段階が、該扁桃体(amgdala)、脊髄または嗅球組織と、請求項６−１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体を接触させ、そして該抗体と該末梢血細胞中のポリペプチドの特異的結合を検出することを含み、ここで、ポリペプチドへの特異的結合の検出が、請求項６−１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドの存在を示すものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該アミノ酸配列が配列番号９、そのフラグメント、誘導体または相同体を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項６−１０のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項２５】
ＦａｂまたはＦ(ａｂ')２フラグメントである、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２６】
ポリクローナル抗体である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２７】
モノクローナル抗体である、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２８】
請求項２４−２７のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される核酸配列を含む遺伝子の発現を阻害するのに適した阻害性の核酸の有効量を乳癌患者に投与することを含む、乳癌を処置する方法。
【請求項３０】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される核酸配列を含む遺伝子の発現を阻害するのに適した阻害性の核酸の有効量を白血病患者に投与することを含む、白血病を処置する方法。
【請求項３１】
配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される核酸配列を含む遺伝子の発現を阻害するのに適した阻害性の核酸および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項３２】
少なくとも１個の下記成分：
(ａ)配列番号２、配列番号６または配列番号１０に記載のヌクレオチド配列もしくはヌクレオチド配列の一部を含む核酸の検出に適したオリゴヌクレオチド、
(ｂ)配列番号１、配列番号５または配列番号９に記載のアミノ酸配列もしくはアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドの検出に適した抗体、
(ｃ)キットの指示書
を含む、ユビキチン特異的プロテアーゼが関連する疾患のための診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ユビキチン特異的プロテアーゼ(ＵＳＰ)、特に、脱ユビキチン化酵素(ＤＵＢ)の新規メンバーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチン(Ｕｂ)は、すべての真核細胞に見られ、かつ、その配列が原生動物から脊椎動物まで非常によく保存されている７６アミノ酸残基のタンパク質である。それは、細胞タンパク質のＡＴＰ−依存性選択的分解、クロマチン構造の維持、遺伝子発現の制御、ストレス応答およびリボソーム生物発生のような様々な細胞過程において重要な役割を演ずる。小さい真核細胞タンパク質ユビキチンへのコンジュゲーションは、プロテアソームによる分解の標的タンパク質を機能的に修飾できる。タンパク質リン酸化と同様、タンパク質ユビキチン化は動的であり、ユビキチンを付加する酵素(ユビキチン結合酵素)およびユビキチンを除去する酵素を含む。ユビキチン修飾の除去、または脱ユビキチン化は、ユビキチン特異的プロテアーゼ(ＵＳＰ)またはユビキチンＣ−末端ヒドロラーゼ(ＵＣＨ)と呼ばれる酵素により行われ、この経路の制御において重要な機構である。これらの酵素は、ユビキチンを前駆体融合タンパク質の一部として連結させるペプチド結合を開裂して、ユビキチン部分を遊離させるか、または(翻訳後に)ユビキチンをタンパク質に結合している結合を開裂させることのいずれかにより、開裂できる。
【０００３】
脱ユビキチン化酵素は、ユビキチンのＣ−末端グリシンでペプチド結合を認識し、加水分解するシステインプロテアーゼである。脱ユビキチン化酵素(ＤＵＢ)の２種の異なるファミリーがある。第一の群は、約２５Kdの酵素であり、ヒトにおいてＵＣＨＬ１、ＵＣＨＬ３、Ｂａｐ１およびＵＣＨ３７が代表である。これらのタンパク質は、ペプチダーゼの分類のファミリーＣ１２に属する。第二のファミリーは、２種の相同な領域、おそらく触媒機構に関与する保存されたシステインを含む領域(システインボックス)と、二個のヒスチジン残基を含み、その一方がおそらくまた触媒機構に関与する領域(ヒスチジンボックス)を共有する、大タンパク質(８００から２０００残基)から成る。これらのタンパク質は最初に酵母で特徴付けされ、ＭＥＲＯＰＳのファミリーＣ１９に属し、ＵＳＰが代表である。
【０００４】
脱ユビキチン化酵素は細胞内で多くの役割を有し、いくつかのユビキチン(Ｕｂ)が結合した基質の安定化、他のＵｂ−結合した基質の分解および細胞の遊離単量体Ｕｂプールのリサイクルを含む。いくつかの脱ユビキチン化酵素は、Ｕｂを細胞標的タンパク質から除去し、それによりプロテアソーム介在分解を防止する(ＵＢＰ２)。他の脱ユビキチン化酵素は、Ｕｂをプロテアソームにより産生されたＵｂ−ペプチド分解産物から除去し、それによりプロテアソーム介在分解を加速する(Ｄｏａ−４)。
【０００５】
近年の異なるゲノムを探索する努力は、このファミリーの保存された性質を示す配列の数を増やしている。サッカロマイセス・セレヴィシエにおいて、例えば、１７個のＤＵＢ酵素のファミリーが、その完全に配列決定されたゲノムにおいて同定されている。保存された配列モチーフ(システインおよびヒスチジンボックス)を含む、高級真核細胞からの数個の他のタンパク質もまた同定されている。しかしながら、これらの新規配列のほとんどが切断されたメンバーであり、その結果、脱ユビキチン化ファミリーメンバーへの実際の配属は困難である。
【発明の開示】
【０００６】
第一の局面において、本発明は：
(ａ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０
(ｂ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０のフラグメント
(ｃ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０の誘導体
(ｄ)配列番号２、配列番号６、配列番号１０と実質的に相同な配列
から成る群から選択されるユビキチン特異的プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離ＤＮＡを提供する。
【０００７】
本発明の一つの局面において、ＤＮＡは配列番号２、配列番号６または配列番号１０から成る群から選択される。
【０００８】
本発明の別の局面において、フラグメントは、配列番号２、配列番号６または配列番号１０のフラグメントであり、かつユビキチン特異的機能活性を維持している。本フラグメントは、少なくとも５０、所望により少なくとも７５または少なくとも１００連続ヌクレオチドであり得る。
【０００９】
本発明のさらに別の局面において、配列番号２、配列番号６または配列番号１０の誘導体は、アミノ酸配列のアミノ酸残基の欠失、付加または置換が、ユビキチン特異的機能活性を維持している機能的に同等であるアミノ酸配列を産生するとき、提供される。
【００１０】
本発明のさらなる局面において、配列番号２、配列番号６または配列番号１０から成る群から選択されるヌクレオチド配列に実質的に相同であり、かつユビキチン特異的機能活性を維持しているヌクレオチド配列を提供する。実質的に相同な配列と配列番号２、配列番号６または配列番号１０の配列の間の相同性パーセントは、少なくとも８０％、より望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。
【００１１】
本発明のさらに別の局面において、高ストリンジェンシー条件下で配列番号２、配列番号６、配列番号１０のいずれかの単離ＤＮＡまたはそのフラグメント、誘導体もしくは実質的に相同な配列とハイブリダイズする、相補性の核酸配列が提供される。
【００１２】
本発明の第二の局面において：
(ａ)配列番号１、配列番号５、配列番号９
(ｂ)配列番号１、配列番号５、配列番号９のフラグメント
(ｃ)配列番号１、配列番号５、配列番号９の誘導体
(ｄ)配列番号１、配列番号５、配列番号９と実質的に相同な配列
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、ユビキチン特異的プロテアーゼの単離ポリペプチドが提供される。
【００１３】
本発明の一つの好ましい局面は、配列番号１に記載のアミノ酸配列の単離ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドまたはそのフラグメントは、乳癌ではない個体の乳房組織よりもかなり大きな程度で、乳癌に罹患している乳房組織において見られる。本発明のこの局面によって、ヒト起源の新規ポリペプチドならびに前記の生物学的に、診断にまたは治療に有用なフラグメント、誘導体および相同体が提供される。
【００１４】
本発明の他の好ましい局面は、配列番号５に記載のアミノ酸配列の単離ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドまたはそのフラグメントは、白血病ではない個体の末梢血よりもかなり大きな程度で、白血病に罹患している末梢血細胞、とりわけリンパ系細胞において見られる。本発明のこの局面によって、ヒト起源の新規ポリペプチドならびに前記の生物学的に、診断にまたは治療に有用なフラグメント、誘導体および相同体が提供される。
【００１５】
本発明のさらに別の好ましい局面は、配列番号９に記載のアミノ酸配列の単離ポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドまたはそのフラグメントは、脳疾患ではない個体の脳組織よりもかなり大きな程度で、脳疾患に罹患している脳組織、とりわけ扁桃体(amygdale)、脊髄および嗅球組織に見られる。本発明のこの局面によって、ヒト起源の新規ポリペプチドならびに前記の生物学的に、診断にまたは治療に有用なフラグメント、誘導体および相同体が提供される。
【００１６】
本発明の第三の局面は、ヒトでの配列番号１、配列番号５または配列番号９から成る群から選択されるポリペプチド、そのフラグメント、誘導体または実質的に相同な配列の量の測定を必要とし、ここで、正常組織における該ポリペプチドまたはそのフラグメンの量と比較して、上昇した量のポリペプチドまたはそのフラグメントが、該ヒトが疾患に罹患していることの診断である、ヒトを診断する方法を包含する。
【００１７】
一つの好ましい局面において、ヒトの乳房組織における、配列番号１のポリペプチド、そのフラグメント、誘導体または実質的に相同な配列の量を測定することを含み、ここで、正常乳房組織における該ポリペプチドの量と比較して、上昇した量の該ポリペプチドの存在が、該ヒトが乳癌に罹患していることの診断である、ヒトにおける乳癌を診断する方法を提供する。
【００１８】
他の好ましい局面において、ヒトの末梢血細胞、とりわけリンパ系細胞における、配列番号５のポリペプチド、そのフラグメント、誘導体または実質的に相同な配列の量を測定することを含み、ここで、正常末梢血細胞、とりわけリンパ系細胞における該ポリペプチドの量と比較して、上昇した量の該ポリペプチドの存在が、該ヒトが白血病に罹患していることの診断である、ヒトにおける白血病を診断する方法を提供する。
【００１９】
さらに別の好ましい局面において、ヒトの扁桃体(amgdala)、脊髄または嗅球組織における、配列番号５のポリペプチド、そのフラグメント、誘導体または実質的に相同な配列の量を測定することを含み、ここで、扁桃体(amgdala)、脊髄および嗅球組織の量と比較して、上昇した量の該ポリペプチドの存在が、該ヒトが脳障害に罹患していることの診断である、ヒトにおける脳障害を診断する方法を提供する。
【００２０】
本発明の別の局面は、前記ポリペプチド、ポリペプチドフラグメント、誘導体、相同体、前記変異体および誘導体、および相同体のフラグメントを製造する方法を提供する。本発明のこの局面の好ましい態様において、外部由来のユビキチン特異的ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、その中に組み入れられて有する宿主細胞を、宿主内でユビキチン特異的ポリペプチドを発現するのに充分な条件下で培養し、その後、発現されたポリペプチドを回収することを含む、前記ヒトポリペプチドを製造する方法を提供する。
【００２１】
本発明の他の局面によって、産物、組成物、工程、とりわけ、研究、生物学、臨床および治療目的に、前記ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する方法を提供する。
【００２２】
本発明のこの局面の別の好ましい態様において、配列番号１、配列番号５または配列番号９に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。この点の、ある特に好ましい態様において、抗体はヒトユビキチン特異的ポリペプチドまたはヒトユビキチン特異的ポリペプチドの一部に非常に特異的である。さらなる局面において、配列番号１、配列番号５または配列番号９に記載のアミノ酸配列のフラグメントと結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。関連する局面において、このような抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
別の局面において、配列番号１、配列番号５または配列番号９に記載のアミノ酸配列のポリペプチド、そのフラグメントもしくは一部と結合する抗体の有効量を対象に投与することにより、対象における疾患(ここで、疾患は乳房組織、末梢血細胞、または脳組織の各々における配列番号１、配列番号５または配列番号９のポリペプチドの存在の上昇が介在するまたはそれと関連するものである)を処置する方法を提供する。また提供されるのは、配列番号１、配列番号５または配列番号９に記載のアミノ酸配列のポリペプチド、またはそのフラグメントもしくは一部と結合する抗体を、免疫アッセイにおいて使用することを含む、対象におけるポリペプチドの上昇と関連する疾患または状態を診断する方法を提供する。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、培養して増殖したとき、配列番号１、配列番号５または配列番号９に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメント、誘導体もしくは実質的に相同な配列を含むポリペプチドを産生できる、インビトロ、好ましくは哺乳動物、より好ましくは脊椎動物細胞で繁殖できる細胞を提供し、ここで、該細胞は所望によりヒト転写制御配列以外の転写制御ＤＮＡ配列を含み、該転写制御配列が、該アミノ酸配列のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を制御する。
【００２５】
別の局面において、本発明は、本発明の外部由来のユビキチン特異的ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、その中に組み入れられて有する宿主細胞を、宿主細胞内でこのようなポリペプチドを発現するのに充分な条件下で培養し、それにより発現されるポリペプチドの産生をもたらし、その後、発現されたポリペプチドを回収することを含む、ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００２６】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、患者からの体組織サンプルにおける、上記の本発明のユビキチン特異的ポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドもしくはフラグメントの検出に必要な成分を含むアッセイ法およびキットを提供し、このようなキットは、例えば、抗体または、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを含む。好ましい態様において、このようなキットはまたキット成分を使用すべき方法を詳述する指示書も含み得る。
【００２７】
別の局面は、配列番号１、配列番号５または配列番号９のヌクレオチド配列、またはそのフラグメント、誘導体もしくは相同体を含む、医薬組成物に関する。
【００２８】
別の局面において、本発明は、本発明のユビキチン特異的プロテアーゼと結合できるおよび／またはユビキチンの活性を調節できる分子、またはユビキチンの転写もしくは翻訳を調節する核酸配列と結合できる分子を同定する方法に関する。このような方法は、例えば、米国特許５,５４１,０７０；５,５６７,３１７；５,５９３,８５３；５,６７０,３２６；５,６７９,５８２；５,８５６,０８３；５,８５８,６５７；５,８６６,３４１；５,８７６,９４６；５,９８９,８１４；６,０１０,８６１；６,０２０,１４１；６,０３０,７７９；および６,０４３０２４に記載され、その全部を引用して本明細書に包含する。このような方法で同定された分子はまた本発明の範囲内に入る。
【００２９】
さらに別の局面において、本発明は、処置を必要とする対象における、１個またはそれ以上の組織に本発明の核酸を挿入し、該核酸によりコードされる１個またはそれ以上のタンパク質が、該組織内の細胞で発現されるおよび／または分泌される結果に至る、方法に関する。
【００３０】
本発明の他の態様、特性、利点および態様は、下記の記載から当業者に明白となろう。しかしながら、下記のおよび具体的な実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、説明のためのみに提供することは理解されるべきである。本発明の精神および範囲内の種々の変化および修飾が、下記の記載を読むことにより、および本明細書の他の部分を読むことにより、当分野の当業者には容易に明らかとなろう。
【００３１】
表の説明
表１(ａ)：ＵＳＰ＿Ｎ０１：新規スプライス変異体−アミノ酸配列
表１(ａ)は、ユビキチン特異的プロテアーゼの新規スプライス形である、配列番号１を記載する。この新規スプライス形は、下記位置への４個の挿入を特徴とする：Ｐｏｓ１−Ｐｏｓ１１、Ｐｏｓ２６７−Ｐｏｓ３００、Ｐｏｓ３６１−Ｐｏｓ３８４およびＰｏｓ１２４３−Ｐｏｓ１４３７。
【００３２】
表１(ｂ)：ＵＳＰ＿Ｎ０１：新規スプライス変異体−ヌクレオチド配列
表１(ｂ)は、表１(ａ)に対応するヌクレオチド配列である、配列番号２を記載する。
【００３３】
表１(ｃ)：DERWENT参照アミノ酸配列ＡＡＵ８２７０６
表１(ｃ)は、表１(ａ)の新規スプライス形を比較した参照アミノ酸配列である、配列番号３を記載する。
【００３４】
表１(ｄ)：参照ヌクレオチド配列
表１(ｄ)は、表１(ｃ)に対応する参照ヌクレオチド配列である、配列番号４を記載する。
【００３５】
表２(ａ)：ＵＳＰ＿Ｎ０７：新規スプライス変異体−アミノ酸配列
表２(ａ)は、ユビキチン特異的プロテアーゼの新規スプライス形である、配列番号５を記載する。この新規スプライス形は、下記位置への１個の挿入を特徴とする：Ｐｏｓ１４−Ｐｏｓ８１。
【００３６】
表２(ｂ)：ＵＳＰ＿Ｎ０７：新規スプライス変異体−ヌクレオチド配列
表２(ｂ)は、表２(ａ)の対応ヌクレオチド配列である、配列番号６を記載する。
【００３７】
表２(ｃ)：DERWENT参照アミノ酸配列ＡＡＵ８２７１４
表２(ｃ)は、表２(ａ)の新規スプライス形を比較した参照アミノ酸配列である、配列番号７を記載する。
【００３８】
表２(ｄ)：参照ヌクレオチド配列
表２(ｄ)は、表２(ｃ)に対応する参照ヌクレオチド配列である、配列番号８を記載する。
【００３９】
表３(ａ)：ＵＳＰ＿Ｎ１１：新規スプライス変異体−アミノ酸配列
表３(ａ)は、ユビキチン特異的プロテアーゼの新規スプライス形である、配列番号９を記載する。この新規スプライス形、下記位置への１個の挿入を特徴とする：Ｐｏｓ１２−Ｐｏｓ４８。
【００４０】
表３(ｂ)：ＵＳＰ＿Ｎ１１：新規スプライス変異体−ヌクレオチド配列
表３(ｂ)は、表３(ａ)の対応ヌクレオチド配列である、配列番号１０を記載する。
【００４１】
表３(ｃ)：DERWENT参照アミノ酸配列ＡＡＵ８２７１３
表３(ｃ)は、表３(ａ)の新規スプライス形を比較した参照アミノ酸配列である、配列番号１１を記載する。
【００４２】
表３(ｄ)：参照ヌクレオチド配列
表３(ｄ)は、表３(ｃ)に対応する参照ヌクレオチド配列である、配列番号１２を記載する。
【００４３】
発明の詳細な記載
ここに引用するすべての特許出願、特許および参考文献は、その全体を引用して本明細書に包含する。
【００４４】
本発明の実施に際して、分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡにおける多くの慣用技術を使用する。これらの技術は既知であり、そして、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II,  and III, 1997 (F. M. Ausubel ed.)；Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；DNA Cloning:A Practical Approach, Volumes I and II, 1985 (D. N. Glover ed.)；Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M. L. Gait ed.)；Nucleic Acid Hybridization, 1985, (Hames and Higgins)；Transcription and Translation, 1984 (Hames and Higgins eds.)；Animal Cell Culture, 1986 (R. I. Freshney ed.)；Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press)；Perbal, 1984, A Practical Guide to Molecular Cloning；the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J. H. Miller and M. P. Calos eds., Cold Spring Harbor Laboratory)；およびMethods in Enzymology Vol. 154およびVol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively)に記載されている。
【００４５】
本発明は、ＤＵＢまたは脱ユビキチン化酵素として既知のヒトユビキチン特異的プロテアーゼの新規スプライス変異体の同定に関する。本発明の新規スプライス変異体は、表１(ａ)、２(ａ)および３(ａ)に提供され、それらは各々配列番号１、配列番号５および配列番号９のアミノ酸配列に対応する。対応するヌクレオチド配列は表１(ｂ)、２(ｂ)および３(ｂ)に提供され、それらは各々配列番号２、配列番号６および配列番号１０に対応する。これらの配列は、各々DERWENT参照配列ＡＡＵ８２７０６、ＡＡＵ８２７１４およびＡＡＵ８２７１３のスプライス変異体である。
【００４６】
本発明は、表１、２および３に提供される配列と実質的に相同な核酸配列およびアミノ酸配列を包含する。しかしながら、本発明より前に記載されたすべてのアミノ酸配列は除外されることは理解されよう。配列と関連して使用するとき、“実質的に相同”なる用語は、配列が、対応する参照配列と比較したとき、実質的に同じ構造および機能を有することを意味する。参照配列のある位置が同じアミノ酸またはヌクレオチドに占有されいるとき、その分子は、その位置で相同性である(すなわちその位置で同一性を有する)。核酸配列比較において、比較している両方の分子において、ヌクレオチドを構成するコドン３個が遺伝コードの縮重のために同じアミノ酸をコードするとき、その位置はまた相同である。
【００４７】
実質的に相同な配列と参照配列の間の相同性パーセントは、少なくとも８０％、より望ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。
【００４８】
配列比較は、Smith-Waterman配列アラインメントアルゴリズムを使用して行う(例えばWaterman, M.S. Introduction to Computational Biology:Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London:1995. ISBN 0-412-99391-0, またはhttp://www-to.usc.edu/software/seqaln/index.html)。
【００４９】
また本発明の核酸配列に含まれるのは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明の核酸配列とハイブリダイズする配列である。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡで５０℃での洗浄と、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃での洗浄の後、より望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡで５０℃での洗浄と、１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃での洗浄の後、さらにより望ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡで５０℃での洗浄と、０.５×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃での洗浄の後、好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡで５０℃での洗浄と０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで５０℃での洗浄の後、より好ましくは７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ４、１mM  ＥＤＴＡで５０℃での洗浄と０.１×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳで６５℃での洗浄の後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナルが観察されると定義する。
【００５０】
本発明の核酸配列は、オープン・リーディング・フレーム(ＯＲＦ)を包含してよく、また５’非翻訳領域(ＵＴＲ)またはその一部を包含してもよい。本発明はまた任意のプロモーター、エンハンサー、レギュレーター(regulatory)、ターミネーターおよび局在化要素ならびに異種遺伝子と合わせたこれらの要素の使用も含み得る。
【００５１】
上記の相同性配列の定義は、本発明の核酸またはアミノ酸配列の新規スプライス変異体のフラグメントを包含する。
【００５２】
“フラグメント”は、新規スプライス変異体の少なくとも５、１０、１５または所望により少なくとも２５、３５、または４５連続アミノ酸を有する任意のペプチド分子を意味する。核酸配列のフラグメントは、少なくとも５０、所望により少なくとも７５または少なくとも１００連続ヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明が関係するフラグメントは、しかしながら、本発明の前に記載されていたかもしれないフラグメントを包含するとは解釈されない。フラグメントは、タンパク質の１個またはそれ以上の生物学的活性、例えばユビキチンに結合するもしくはペプチド結合を加水分解する能力を維持でき、ならびに、ユビキチンプロテアーゼ抗体の産生のための免疫原として使用できるフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、ドメインまたはモチーフ、例えば、触媒部位、ＵＢＰまたはＵＣＨ記号(signature)、膜結合領域、ならびに、グリコシル化、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化、タンパク質キナーゼＣリン酸化、カゼインキナーゼIIリン酸化、チロシンキナーゼリン酸化、Ｎ−ミリストイル化、およびアミド化のための部位を含み得る。
【００５４】
さらに可能性のあるフラグメントは、システインまたはヒスチジンユビキチン認識部位、ユビキチン結合部位、サブユニットの相互作用に重要な部位、およびプロテアーゼの他の機能を実施するのに重要な部位を含む、触媒部位またはドメインを含む。このようなドメインまたはモチーフは、慣用のコンピューターを利用した相同性研究法の手段により同定できる。フラグメントは、例えば、機能的部位から、一方にまたは両方に、５個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個または１００個までのアミノ酸を含むように伸長してよい。
【００５５】
さらに、フラグメントは、上記の特異的ドメインのサブフラグメントを含むことができ、このサブフラグメントは、それらが由来するドメインの機能を保持する。これらの領域は、コンピューターを利用した相同性分析を含む既知の方法により同定できる。本発明はまた免疫原性特性を有するフラグメントを提供する。これらは、ユビキチンプロテアーゼおよび変異体のエピトープ−担持部分を含む。これらのエピトープ−担持ペプチドは、ユビキチンプロテアーゼポリペプチドまたは領域もしくはフラグメントに特異的に結合する抗体の惹起に有用である。これらのペプチドは、少なくとも１０個、１２個、少なくとも１４個、または少なくとも約１５個〜約３０個の間のアミノ酸を含み得る。抗体の産生に使用できる抗原性ポリペプチドの非限定的例は、高い抗原性指数(antigenicity index)を有する領域を伴う細胞外部位ペプチドを含むが、これに限定されない(ＵＳ６,４５１,９９４の図３参照)。しかしながら、細胞内で製造された抗体(“細胞内抗体”)もまた包含され、これは、細胞内ペプチド領域を認識するであろう。本エピトープ−担持ユビキチンプロテアーゼポリペプチドは、任意の慣用的手段により製造できる(Houghten, R. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135)。同時に存在する多くのペプチド合成は、米国特許４,６３１,２１１に記載されている。
【００５６】
フラグメントは不連続であってよく(他のアミノ酸またはポリペプチドと融合しない)、または大きなポリペプチド内にあってよい。さらに、数個のフラグメントが、一つの大きなポリペプチド内に含まれていてよい。一つの態様において、宿主内の発現のために設計されたフラグメントは、ユビキチンプロテアーゼフラグメントのアミノ末端に融合した異種プレ−およびプロ−ポリペプチド領域と、該フラグメントのカルボキシル末端に融合した付加的領域を有し得る。
【００５７】
フラグメントは、完全長遺伝子を単離するため、および高い配列類似性または類似の生物学的活性を有する他の遺伝子を単離するための、ｃＤＮＡライブラリーのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用し得る。このタイプのプローブは、好ましくは少なくとも約３０塩基対を有し、例えば、約３０から約５０塩基対、約５０から約１００塩基対、約１００から約２００塩基対、または２００塩基対以上を含み得る。本プローブは、完全長転写物に対応するｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンまたは制御領域およびプロモーター領域、エキソンおよびイントロンを含む完全長遺伝子を含むクローンの同定に使用し得る。スクリーニングの例は、オリゴヌクレオチドプローブを合成するための既知ＤＮＡ配列を使用することにより、遺伝子のコード領域を単離することを含む。本発明の遺伝子のものと相補の配列を有する標識オリゴヌクレオチドを、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングするために使用して、ライブラリー中のどのメンバーがハイブリダイズするプローブであるかを決定する。
【００５８】
本発明はまたアミノ酸配列の“誘導体”を含む。“誘導体”は、アミノ酸レベル(例えばある天然に存在するアミノ酸が合成アミノ酸置換基で置換されている)または三次元レベル(例えば分子が該アミノ酸配列とほぼ同じ形および立体配置を有する)のいずれかで該アミノ酸配列と関連する配列である。故に誘導体は、変異体、模倣体、ミモトープ、類似体、単量体形および機能的等価体を含む。
【００５９】
サイレント変化をもたらす本アミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換は、機能的に同等であり、異なって発現される遺伝子産物を産生する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいてなし得る。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含み；極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含み；正荷電(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含み；そして負荷電(酸性)アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００６０】
誘導体は、置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによりコードされるものでないもの、置換基が包含されているもの、成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を延長させる化合物の(例えば、ポリエチレングリコール)ような他の化合物と融合しているもの、または、リーダーもしくは分泌配列または成熟ポリペプチドもしくはプロ−タンパク質配列の精製のための配列のような別のアミノ酸が成熟ポリペプチドと融合しているものを含みうる。
【００６１】
既知の修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解的プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレン酸化(selenoylation)、硫酸化、アルギニン化(arginylation)のようなアミノ酸のタンパク質へのトランスファー−ＲＮＡ介在付加、およびユビキチン化を含むが、これらに限定されない。
【００６２】
このような修飾は当分野の当業者には既知であり、科学文献に非常に詳細に記載されている。いくつかの特に一般的な修飾、グリコシル化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、例えば、最も基本的なテキスト、例えばProteins--Structure and Molecular Properties, 2nd ed., T. E. Creighton, W.H. FreemanおよびCompany, New York (1993)に記載されている。このテーマの多くの詳細なレビューが利用可能であり、例えばWold, F.,  Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York 1-12 (1983);Seifter et al. (1990)Meth. Enzymol. 182:626-646)およびRattan et al. (1992)Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62)による。
【００６３】
また既知のように、ポリペプチドは常に完全な直鎖とはならない。例えば、ポリペプチドはユビキチン化により分枝し得、そしてそれらは、一般的に、天然プロセッシング事象および天然では起こらない人工的な操作によりもたらされる事象を含む翻訳後事象の結果、分枝を伴い、または伴わず環状であり得る。環状、分枝および分枝環状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセッシングによりおよび合成法により合成できる。
【００６４】
修飾はペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含む、ポリペプチドのすべての場所で起こり得る。ポリペプチド内のアミノ基またはカルボキシル基の、または両方の共有結合的修飾による遮断は、天然に存在するおよび合成したポリペプチドで一般的である。例えば、大腸菌で産生されたポリペプチドのアミノ末端残基は、タンパク質分解的プロセッシングの前に、ほとんど必ずＮ−ホルミルメチオニンである。
【００６５】
本修飾は、どのようにタンパク質が製造されるかの関数であり得る。組み換えポリペプチドについては、例えば、修飾は宿主細胞翻訳後修飾能およびポリペプチドアミノ酸配列における修飾シグナルにより決定されるであろう。したがって、グリコシル化が望まれるとき、ポリペプチドはグリコシル化された宿主、一般的に真核細胞細胞において発現されなければならない。昆虫細胞は、しばしば哺乳動物細胞と同じ翻訳後グリコシル化を行い、この理由のため、昆虫細胞発現系はまた、グリコシル化の天然のパターンを有する哺乳動物タンパク質の効率的な発現のために開発されている。同様の考えが他の修飾に当てはまる。同じタイプの修飾が、あるポリペプチドの数カ所で同じ程度または違う程度で存在し得る。また、あるポリペプチドは、１種類を超える修飾を含み得る。
【００６６】
本明細書で使用する“機能的等価体”は、上記のように、異なって発現される遺伝子配列によりコードされる内因性の異なって発現される遺伝子産物と実質的に類似のインビボまたはインビトロ活性を示すことができるタンパク質またはポリペプチドを意味し得る。“機能的等価体”はまた、他の細胞分子または細胞外分子と、内因性に異なって発現される遺伝子産物がするのと実質的に類似の方法で相互作用できるタンパク質またはポリペプチドを意味し得る。例えば、“機能的に同等である”ペプチドは、免疫アッセイにおいて、抗体が内因性タンパク質の対応するペプチドに対して惹起されたものであるとき、内因性タンパク質に対応するペプチド(すなわち、そのアミノ酸配列が“機能的に同等である”ペプチドを完成するように修飾されたペプチド)、または内因性タンパク質それ自体への抗体の結合を減少できる。等モル濃度の機能的に同等であるペプチドは、前記の対応するペプチドの結合を、少なくとも約５％、好ましくは約５％〜１０％の間、より好ましくは約１０％〜２５％の間、さらにより好ましくは約２５％〜５０％の間、および最も好ましくは約４０％〜５０％の間まで低下させる。
【００６７】
例えば、機能的に同等であるペプチドは、完全に機能してよく、または１種またはそれ以上の活性の機能を欠失していてよい。故に、本発明において、変異は、例えば、ユビキチン結合、ユビキチン認識、ユビキチン化基質タンパク質との結合またはタンパク質分解のような相互作用、サブユニット相互作用、特にプロテアソーム内のもの、ＡＴＰによる活性化または結合、発生過程での発現、時間的発現、組織特異的発現、転写制御因子、および特にトランス−作用性転写制御因子のような細胞成分との相互作用、ポリユビキチン中のペプチド結合およびユビキチンまたはポリユビキチンと基質タンパク質の間のペプチド結合のタンパク質分解的開裂、およびユビキチンまたはポリユビキチンとペプチドまたはアミノ酸の間のペプチド結合のタンパク質分解的開裂の機能に影響し得る。
【００６８】
完全に機能する変異体は、典型的に保存的変異のみ、または重要ではない残基もしくは重要ではない領域にのみ変異を含む。機能的変異体はまた、機能を変えないか、または微々たる変異しか起こさない、類似アミノ酸の置換を含み得る。あるいは、このような変異は、機能にある程度正にまたは負に影響し得る。
【００６９】
非機能的変異体は、典型的に１個またはそれ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、挿入、転置もしくは切断を含むか、または重要な残基もしくは重要な領域において置換、挿入、転置または欠失を含む。示す通り、変異体は天然に存在し得るか、または組み換え手段または化学合成により製造し、ユビキチンプロテアーゼポリペプチドの有用で新規な特性を提供し得る。これは、タンパク質凝集を防止することによる、医薬製剤からの免疫原性の予防を含む。有用な変異体はさらに触媒活性の変更を含む。例えば、一つの態様は、結合するが、ペプチド結合の加水分解しない、または加水分解をゆっくりにする、結合部位の変異を含む。さらに有用な変異は、ペプチド結合の加水分解の速度の上昇をもたらす。同じ部位でのさらに有用な変異は、基質に対する親和性を高めるか、低下できる。
【００７０】
有用な変異はまた、通常認識するのと異なるユビキチン化基質タンパク質への親和性を提供する変化を含む。他の有用な変異は、通常認識する基質のタイプの認識に影響する、認識の変更を含む。例えば、一つの変異は、ユビキチン化された完全な基質を認識するが、完全なユビキチン化基質の加水分解によりもたらされたタンパク質分解産物であるユビキチン化アミノ酸もしくはペプチドのような基質残存物はしない。あるいは、本プロテアーゼは、１種またはそれ以上の残存産物が認識されるが、完全なタンパク質基質が認識されないように変異できる。他の変異は、プロテアーゼがユビキチン化タンパク質を救済する能力に影響する。故に、通常タンパク質分解から救済されるタンパク質基質が分解の対象となる。さらに有用な変異は、本明細書に記載のものを含むが、それらに限定されないサイトカインのようなアクティベーターにより誘導されるプロテアーゼの能力を変える。別の有用な変異は、酵素が１種またはそれ以上の直鎖ポリユビキチン、分枝鎖ポリユビキチン、直鎖ポリユビキチン化基質または分枝鎖ポリユビキチン基質を認識しないように、ユビキチン基質の認識に影響する。特異的変異は、例えば、ＨＩＳドメインが切断され、変異が脱ユビキチン化活性の減少または損失に至る、切断である。別の有用な変異は、ＡＴＰによる活性化を防止するものを含む。
【００７１】
別の有用な変異は、１個またはそれ以上のドメインまたは小領域が、別のＵＢＰ由来またはＵＣＨ由来の１個またはそれ以上のドメインまたは小領域と操作可能に融合している融合タンパク質を提供する。特に、ドメインまたは小領域は、通常救済機能を有していない酵素にその機能を提供するか、または、元の酵素で認識されない特異的基質の認識のために挿入できる。他の変異は、ユビキチン認識またはユビキチン化基質タンパク質の認識に影響するものを含む。さらに変異は、特にプロテアソーム中の、特異的サブユニット相互作用に影響し得る。別の変異は、発育、時期または組織特異的発現に影響するであろう。他の変異は、転写制御因子のような細胞成分との相互作用に影響するであろう。機能に必須のアミノ酸は、部位特異的変異誘発またはアラニン−スキャンニング変異誘発のような当分野で既知の方法により同定できる(Cunningham et al. (1985)Science 244:1081-1085)。後者は、１個のアラニン変異を、分子のすべての残基に挿入する。得られた変異体分子を、次いで、インビトロでのペプチド加水分解または、増殖性活性、受容体介在シグナル伝達、および本明細書に記載のものを含むが、これらに限定されない、ユビキチン系の機能である、他の細胞過程のようなインビトロでのユビキチン−依存性活性のような、生物学的活性について試験する。結合または認識に重要な部位をまた結晶化、核磁気共鳴または光親和性標識のような構造解析により決定できる(Smith et al. (1992)J. Mol. Biol. 224:899-904;de Vos et al. (1992)Science 255:306-312)。
【００７２】
脱ユビキチン化酵素活性のアッセイは当分野で既知であり、例えば、Zhu et al. (1997)Journal of Biological Chemistry 272:51-57, Mitch et al. (1999)American Journal of Physiology 276:C1132-C1138, Liu et al. (1999)MolecularおよびCell Biology 19:3029-3038に見ることでき、そして、例えば、Ciechanover et al. (1994)The FASEB Journal 8:182-192, Chiechanover (1994)Biol. Chem. Hoppe-Seyler 375:565-581, Hershko et al. (1998)Annual Review of Biochemistry 67:425-479, Swartz (1999)Annual Review of Medicine 50:57-74, Ciechanover (1998)EMBO Journal 17:7151-7160およびD'Andrea et al. (1998)Critical Reviews in BiochemistryおよびMolecular Biology 33:337-352のような種々のレビューに記載されている通りである。これらのアッセイは、ポリユビキチンまたはユビキチン化基質タンパク質またはタンパク質残存物基質の量の減少を含む基質の消失、遊離ユビキチンモノマーの出現のような中間産物および最終産物の出現、一般的タンパク質ターンオーバー、特異的タンパク質ターンオーバー、ユビキチン結合、ユビキチン化基質タンパク質への結合、サブユニット相互作用、ＡＴＰとの相互作用、トランス−作用性制御因子のような細胞成分との相互作用、特異的タンパク質の安定化などを含むが、これらに限定されない。
【００７３】
本明細書で使用する“宿主細胞”は、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染などの何らかの手段により細胞に挿入されている異種ＤＮＡを含む、原核または真核細胞細胞を意味する。
【００７４】
本明細書で使用する“異種”は、“異なる天然起源”を意味するか、非天然状態を意味する。例えば、宿主細胞が別の生物由来の、特に別の種由来のＤＮＡまたは遺伝子で形質転換されているとき、その遺伝子は、その宿主細胞に対して異種であり、そしてその遺伝子を持つ宿主細胞の子孫に対して異種である。同様に、異種は、同じ天然の元の細胞系に由来し、それに挿入されているが、天然状態では存在しない、例えば、異なるコピー数または異なる制御要素の下にあるヌクレオチド配列も意味する。
【００７５】
“ベクター”は、異種核酸を挿入でき、次いで、それを適当な宿主細胞に挿入できる、核酸分子である。ベクターは、好ましくは１個またはそれ以上の複製起点、および１個またはそれ以上の組み換えＤＮＡを挿入できる部位を有する。ベクターは、しばしば、ベクターを有する細胞をそれを有しないものから容易に選択できる簡便な手段を有し、例えば、それらは薬剤遺伝子をコードする。一般のベクターは、プラスミド、ウイルスゲノム、および(主として酵母および細菌中の)“人工染色体”を含む。
【００７６】
“プラスミド”は、一般的に、当分野の当業者によく知られた標準命名法にしたがって、小文字のｐが前にありおよび／または大文字および／または数字が続く。本明細書に記載の出発プラスミドは、市販されているか、制限なく公的に利用可能であるか、または入手可能なプラスミドから、慣用の公開された方法の適用により構築できる。本発明で使用できる多くのプラスミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは、既知であり、当分野の当業者には容易に利用可能である。さらに、当分野の当業者は、本発明で使用するのに適したプラスミドを、いくつでも構築し得る。このようなプラスミドならびに他のベクターの特性、構築および本発明における使用は、本記載から当業者には容易に明らかとなるであろう。
【００７７】
“単離”なる用語は、その物質がその本来の環境(例えば、それが天然に存在するならば、天然の環境)から移されることを意味する。例えば、天然に存在するポリヌクレオチドまたは生存動物に存在するポリペプチドは単離されていないが、天然の系では共存するいくつかのまたはすべての物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それが天然の系にその後再挿入されてさえ、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部でありおよび／またはこのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であり、そしてさらに、このようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部でないため、また単離されている。
【００７８】
本明細書で使用する“転写制御配列”は、それらが操作可能に連結している核酸配列がコードするタンパク質の転写を誘発、抑制もしくは他の方法で制御する、イニシエーター配列、エンハンサー配列およびプロモーター配列のようなＤＮＡ配列を意味する。“ヒト転写制御配列”は、ヒトゲノムに天然に存在するすべてのこれらの転写制御配列であり、そして“非ヒト転写制御配列”は、ヒトゲノムでは見られないすべての転写制御配列である。
【００７９】
様々な宿主−発現ベクター系が、本発明の遺伝子コード配列の発現に使用できる。このような宿主−発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製される媒体でだけでなく、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトしたとき、インサイチュで本発明の異なって発現される遺伝子タンパク質を示し得る細胞も意味する。これらは、異なって発現される遺伝子タンパク質コード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌(例えば、大腸菌、枯草菌)；異なって発現される遺伝子タンパク質コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えばサッカロマイセス、ピキア)；異なって発現される遺伝子タンパク質コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)で感染させた昆虫細胞系；組み換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ)を感染させたか、異なって発現される遺伝子タンパク質コード配列を含む組み換えプラスミド形質転換ベクター(例えば、Ｔｉプラスミド)で形質転換させた植物細胞系；または哺乳動物細胞(例えば、メタロチオネインプロモーター)のゲノム由来のまたは哺乳動物ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７.５Ｋプロモーター)由来のプロモーターを含む組み換え発現構築物を持つ哺乳動物細胞系(例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３)のような微生物を含むが、これらに限定されない。
【００８０】
細菌系において、多くの発現ベクターを、有利には、発現される異なって発現される遺伝子タンパク質の意図する使用に依存して、選択し得る。例えば、大量のこのようなタンパク質を産生するとき、抗体の産生またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、例えば、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルの発現を指示するベクターが望ましいことがある。このようなベクターは、融合タンパク質を産生するように、異なって発現される遺伝子タンパク質コード配列を、個々にベクターのフレーム内にｌａｃＺコード領域と共にライゲートできる、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791)；ｐＩＮベクター(Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109;Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509)；などを含むが、これらに限定されない。ＰＧＥＸベクターは、また外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合タンパク質として発現させるために使用できる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、融解した細胞から、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着、続く遊離グルタチオンでの溶出により容易に精製できる。ＰＧＥＸベクターはまた、クローン化した標的遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から遊離できるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むように設計する。
【００８１】
プロモーター領域は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(“ｃａｔ”)転写ユニット、制限部位の下流または候補プロモーターフラグメントの挿入位置；すなわち、プロモーターを含み得るフラグメントのような、プロモーター領域を欠くレポーター転写ユニットを含むベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択できる。既知のように、ベクターへのプロモーター含有フラグメントの、ｃａｔ遺伝子の上流の制限部位での挿入は、標準ＣＡＴアッセイで検出できるＣＡＴ活性の産生を危うくする。この目的に適したベクターは既知であり、容易に入手可能である。２種のこのようなベクターはｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７である。故に、本発明のポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターは、既知でありかつ容易に入手可能なプロモーターだけではなく、レポーター遺伝子を使用して、前記の技術により容易に得ることができるプロモーターも含む。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に適した既知の細菌プロモーターは、とりわけ大腸菌ｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモーター、Ｔ３およびＴ７プロモーター、Ｔ５  ｔａｃプロモーター、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモーターである。この点で適した既知の真核細胞プロモーターは、とりわけＣＭＶ前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(“ＲＳＶ”)のもののようなレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、およびマウスメタロチオネイン−Ｉプロモーターのようなメタロチオネインプロモーターである。
【００８３】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス(ＡｃＮＰＶ)は、外来遺伝子の発現のためのベクターとして使用できるいくつかの昆虫系の中の一つである。ウイルスはスポンドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞内で増殖する。異なって発現される遺伝子コード配列を、個々にウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)にコード化し、ＡｃＮＰＶプロモーター(例えばポリヘドリンプロモーター)の制御下に置き得る。異なって発現される遺伝子コード配列の挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖び組み換えウイルス(すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク質性被覆を欠くウイルス)をもたらす。これらの組み換えウイルスを、次いで、挿入遺伝子を発現するスポンドプテラ・フルギペルダ細胞に挿入する。(例えば、Smith et al., 1983, J. Virol. 46:584；Smith、米国特許４,２１５,０５１参照)。
【００８４】
哺乳動物宿主細胞において、多くのウイルスを利用した発現系を使用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の異なって発現される遺伝子コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三者間リーダー配列とライゲートし得る。このキメラ遺伝子を、次いでアデノウイルスゲノムに、インビトロまたはインビボ組み換えにより挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域(例えば、領域Ｅ１またはＥ３)への挿入は、生存でき、かつ感染した宿主において異なって発現される遺伝子タンパク質を発現する組み換えウイルスをもたらす。(例えば、Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659参照)。特異的開始シグナルはまた挿入された異なって発現される遺伝子コード配列の有効な翻訳に必要であるかもしれない。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自体の開始コドンおよび隣接配列を含む完全な異なって発現される遺伝子を、適当な発現ベクターに挿入した場合、付加的翻訳制御シグナルは必要ないかもしれない。しかしながら、異なって発現される遺伝子コード配列の一部のみを挿入した場合、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルを提供しなければならない。さらに、開始コドンは、望むコード配列のリーディングフレームと同調(in phase)し、全挿入物の翻訳を確実にしなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成両方の様々な起源であり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどにより促進し得る。(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544参照)。
【００８５】
宿主細胞中の発現のための適当なベクターおよびプロモーターの選択は、既知の方法であり、発現ベクター構築、ベクターの宿主への挿入および宿主での発現それ自体に必須な技術は、当分野の慣用の技術である。
【００８６】
一般に、組み換え発現ベクターは複製の起点、下流構造配列の転写を指示するための高発現遺伝子からのプロモーター、およびベクターに暴露した後のベクター含有細胞の単離を可能にするための選択可能マーカーを含むであろう。
【００８７】
加えて、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を望む特異的形態で調節およびプロセッシングするように選択し得る。このようなタンパク質産物の修飾(例えば、グリコシル化)およびプロセッシング(例えば、開裂)は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための、特徴的かつ特異的機構を有する。適当な細胞系または宿主系は、発現された外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングを確実とするように選択する。この目的のために、一次転写物の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞機構を有する真核細胞宿主細胞を使用し得る。このような哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
組み換えタンパク質の長期の高収率の産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、異なって発現される遺伝子タンパク質を安定して発現する細胞系を操作し得る。ウイルス複製の起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞を、適当な発現制御要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)で制御されたＤＮＡおよび選択可能マーカーで形質転換できる。外来ＤＮＡの挿入に続き、操作された細胞を、１−２日間富化培地で増殖させ、次いで選択培地に移し得る。組み換えプラスミド中の選択可能マーカーが選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に統合させ、増殖して増殖巣を形成し、次いで、これを細胞系にクローン化し、拡大できる。この方法は、有利には、異なって発現される遺伝子タンパク質を発現する細胞系の操作に使用し得る。このような操作された細胞系は、異なって発現される遺伝子タンパク質の内因性活性に影響する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用である。
【００８９】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼキナーゼ(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026)およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy, et al., 1980, Cell 22:817)遺伝子を含むが、これらに限定されない多くの選択系を、各々ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる。また、代謝拮抗物質耐性も、メトトレキサートに耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子(Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567;O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527)；ミコフェノール酸に耐性を付与するｇｐｔ遺伝子(Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072)；アミノグリコシドＧ−４１８に耐性を付与するｎｅｏ遺伝子(Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1)；およびヒグロマイシンに耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147)の選択の基礎として使用できる。
【００９０】
別の融合タンパク質系が、ヒト細胞系で発現される非変性融合タンパク質の容易な精製を可能にする(Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976)。この系において、目的の遺伝子をワクシニア組み換えプラスミドに、遺伝子のオープンリーディングフレームが６ヒスチジン残基から成るアミノ−末端タグに翻訳可能に融合するようにサブクローン化する。組み換えワクシニアウイルス感染細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトリロ酢酸−アガロースカラムに負荷し、ヒスチジン−標識タンパク質をイミダゾール−含有緩衝液で選択的に溶出する。
【００９１】
下記のようなアッセイ系の要素として使用するとき、異なって発現される遺伝子タンパク質を、異なって発現される遺伝子タンパク質と試験物質の間で形成される複合体の検出を容易にするように、直接または関節的に標識してよい。１２５Ｉのような放射性同位体；基質に暴露したときに検出可能な熱量測定シグナルまたは光を発生する酵素標識系；および蛍光標識を含むが、これらに限定されない様々な適当な標識系のいずれかを使用できる。
【００９２】
組み換えＤＮＡ法を使用して、このようなアッセイ系のための異なって発現される遺伝子タンパク質を産生するとき、標識、固定および／または検出を促進できる融合タンパク質を操作するのが有利であり得る。
【００９３】
間接的標識は、特に異なって発現される遺伝子産物のいずれかに結合するような、標識抗体のようなタンパク質の使用を含む。このような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーから産生されたフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【００９４】
別の局面において、本発明のユビキチン特異的プロテアーゼポリペプチドは、ユビキチンプロテアーゼ機能に関連する生物学的アッセイにおいて有用である。このようなアッセイは、ユビキチン−またはユビキチンプロテアーゼ−関連状態の診断および処置に有用な既知の機能または活性または特性のいずれかを含む。可能性のあるアッセイを本明細書に記載し、一般に基質の消失、最終産物の発現、および一般的または特異的タンパク質ターンオーバーを含む。
【００９５】
ユビキチン特異的プロテアーゼポリペプチドは、細胞ベースの系または無細胞系における、薬剤スクリーニングアッセイに有利である。細胞ベースの系は、生検サンプルとしての、または細胞培養で拡大された、天然の、すなわち、通常ユビキチンプロテアーゼを発現する細胞であり得る。一つの態様において、しかしながら、細胞ベースのアッセイは、ユビキチンプロテアーゼを発現する組み換え宿主細胞を含む。試験化合物がユビキチンプロテアーゼと相互作用する能力の決定は、また、該ポリペプチドへの結合が既知の結合分子(例えば、ユビキチン)の能力と比較した、試験化合物が該ポリペプチドに優性に結合する能力の決定を含む。本ポリペプチドは、ユビキチンプロテアーゼ活性を調節する化合物の同定に使用できる。このような化合物は、例えば、直鎖または分枝鎖のいずれかのポリユビキチン、ユビキチン化タンパク質基質、またはユビキチン化タンパク質基質残存物への親和性を増加または減少できる。このような化合物はまた、例えば、これらの成分への結合を上昇または減少できる。このような化合物はまたユビキチンプロテアーゼについてこれらの成分と競合し、またはユビキチンプロテアーゼと結合したこれらの化合物を置換できる。このような化合物はまた、ＡＴＰのような他の成分、例えば、１９Ｓ複合体における、他のサブユニットおよび転写制御因子との相互作用に影響し得る。したがって、このような化合物が、ユビキチンの手段だけでなく、記載のプロテアーゼと機能的に相互作用する成分のいずれかの手段でも同定できることは理解されよう。これは、本明細書に記載の成分のものを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
ユビキチン特異的プロテアーゼ、誘導体およびフラグメントは、ユビキチンプロテアーゼと結合する候補化合物の能力をアッセイするための、ハイスループットスクリーニングに使用できる。これらの化合物は、さらに機能的ユビキチンプロテアーゼに対してスクリーニングし、ユビキチンプロテアーゼ活性に対する該化合物の効果を決定できる。化合物は、ユビキチンプロテアーゼを所望の程度まで活性化(アゴニスト)または不活性化(アンタゴニスト)すると同定できる。調節法をインビトロで(例えば、薬剤と細胞をインキュベートすることにより)、あるいは、インビボで(例えば、対象に薬剤を投与することにより)行うことができる。
【００９７】
本発明のユビキチン特異的プロテアーゼポリペプチドは、化合物のユビキチンプロテアーゼタンパク質と、通常ユビキチンプロテアーゼタンパク質と相互作用する標的分子との間の相互作用を刺激または阻害する能力のスクリーニングに使用できる。該標的は、ユビキチン、ユビキチン化基質、またはポリユビキチンまたはユビキチンプロテアーゼタンパク質が通常相互作用する経路の他の成分(例えば、ＡＴＰ)であり得る。本アッセイは、ユビキチンプロテアーゼタンパク質と候補化合物を、ユビキチンプロテアーゼタンパク質またはフラグメントが標的分子と相互作用できる条件下で合わせ、ユビキチンプロテアーゼタンパク質と標的の複合体形成を測定するか、またはユビキチンプロテアーゼと標的との相互作用の生化学的結果を測定する段階を含む。プロテアーゼ機能の関連する効果のいずれも測定できる。これは、遊離末端ペプチド基質のような加水分解産物、加水分解された基質からの遊離末端アミノ酸、遊離ユビキチン、加水分解されたポリユビキチンの低分子量種、タンパク質分解からの救済に起因する放出された完全な基質タンパク質、完全な基質からのポリユビキチンの加水分解により形成された遊離ポリユビキチン、および基質タンパク質のタンパク質分解により産生されたアミノ酸およびペプチドのような基質残存物、ならびに経路の生物学終点を含む。
【００９８】
ユビキチンプロテアーゼが標的分子に結合する能力の決定は、また、リアルタイムBimolecular Interaction Analysis(ＢＩＡ)のような技術を使用して達成できる。Sjolander et al. (1991)Anal. Chem. 63:2338-2345およびSzabo et al. (1995)Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705。本明細書で使用する“ＢＩＡ”は、生体分子特異的相互作用を、リアルタイムで、反応体(例えば、BIAcore(登録商標))のいかなる標識もなしで試験するための技術である。表面プラスモン共鳴(ＳＰＲ)の光学現象の変化が、生物学的分子間のリアルタイムの反応指標として使用できる。本発明の試験化合物を、当分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができ、それは下記を含む：生物学的ライブラリー；空間的接近可能平行固相または液相ライブラリー；デコンヴォルーションを必要とする合成ライブラリー法；‘１ビーズ１化合物’ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法。生物学ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されるが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用できる(Lam, K. S. (1997)Anticancer Drug Des. 12:145)。
【００９９】
分子ライブラリーの合成法の例は当分野で、例えばDeWitt et al. (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909;Erb et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422;Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37:2678;Cho et al. (1993)Science 261:1303;Carell et al. (1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059;Carell et al. (1994)Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061;およびin Gallop et al. (1994)J. Med. Chem. 37:1233に見ることができる。化合物のライブラリーは溶液中(例えば、Houghten (1992)Biotechniques 13:412-421)、またはビーズ上(Lam (1991)Nature 354:82-84)、チップ(Fodor (1993)Nature 364:555-556)、細菌(Ladner  米国特許５,２２３,４０９)、胞子(Ladner  米国特許'４０９)、プラスミド(Cull et al. (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)またはファージ上(ScottおよびSmith (1990)Science 249:386-390);(Devlin (1990)Science 249:404-406);(Cwirla et al. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6378-6382);(Felici (1991)J. Mol. Biol. 222:301-310);(Ladner supra)に提示できる。候補化合物は、例えば、１)Ｉｇ−テイルド融合ペプチドおよびメンバーｏｆ  無作為ペプチドライブラリー(例えば、Lam et al. (1991)Nature 354:82-84;Houghten et al. (1991)Nature 354:84-86参照)およびＤ−および／またはＬ−立体配置アミノ酸から成るコンビナトリアルケミストリー由来分子ライブラリーを含む、可溶性ペプチドのようなペプチド；２)ホスホペプチド(例えば、無作為および部分的縮重、有向(directed)ホスホペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyang et al. (1993)Cell 72:767-778参照)；３)抗体(例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および一本鎖抗体ならびに抗体のＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ発現ライブラリーフラグメントおよびエピトープ−結合フラグメント)；および４)小有機および無機分子(例えば、コンビナトリアルおよび天然産物ライブラリーから得た分子)を含む。
【０１００】
一つの候補化合物は、基質結合について競合する可溶性完全長ユビキチン特異的プロテアーゼまたはフラグメントである。他の候補化合物は、ユビキチンプロテアーゼ機能に影響し、かつ基質を競合する変異を含む変異体ユビキチンプロテアーゼまたは適当なフラグメントである。したがって、例えば高親和性で、基質を競合するフラグメント、または基質と結合するがペプチド結合を加水分解しないフラグメントが本発明に包含される。他の候補化合物は、プロテアーゼに結合するが、放出されないかゆっくり放出されるユビキチン化タンパク質またはタンパク質類似体を含む。他の候補化合物は、結合するが、放出されないかゆっくり放出される基質残存物のような、他の天然基質の類似体を含む。さらに候補化合物は、本明細書に記載のものを含むが、これらに限定されないサイトカインのようなアクティベーターを含む。
【０１０１】
本発明は、ユビキチンプロテアーゼ活性を調節(刺激または阻害)する化合物を同定するための別の目標を提供する。本アッセイは、典型的にユビキチンプロテアーゼ活性が示される経路における事象のアッセイを含む。これは、細胞サイクル進行、計画細胞死、増殖因子介在シグナル伝達、または本明細書で脱ユビキチン化によると記載したものを含むが、これらに限定されない何らかの細胞過程のような、脱ユビキチン化によりもたらされる細胞事象を含む。具体的な表現型は、ストレス応答、ＤＮＡ複製、受容体内在化、細胞形質転換または形質転換の逆転、および転写サイレンシングにおける変化を含む。アッセイは、脱ユビキチン化酵素の多くの細胞機能に基づく。これらの酵素は、タンパク質ユビキチン化の制御に、様々な異なるレベルで作用する。
【０１０２】
脱ユビキチン化酵素は、直鎖ポリユビキチン鎖を単量体ユビキチン分子に分解できる。イソペプチダーゼ−Ｔのような脱ユビキチン化酵素は、分枝したマルチユビキチン鎖を単量体ユビキチン分子に分解できる。脱ユビキチン化酵素はユビキチンをユビキチン結合した標的タンパク質から除去できる。ＦＡＦまたはＰＡ７００イソペプチダーゼのような脱ユビキチン化酵素は、ポリユビキチンをユビキチン化標的タンパク質から除去でき、それにより標的を２６Ｓプロテアソームによる分解から救済する。Ｄｏａ−４のような脱ユビキチン化酵素はポリユビキチンをプロテアソーム分解産物から除去できる。これらのすべての結果は、遊離単量体ユビキチンの細胞プールの制御である。したがって、アッセイは、加水分解／脱ユビキチン化により産生された産物のいずれかの検出に基づき得る。さらに、ユビキチンプロテアーゼの作用により上方または下方制御されている遺伝子の発現もアッセイできる。一つの態様において、このような遺伝子の制御領域は、ルシフェラーゼのような容易に検出できるマーカーと操作可能に連結できる。したがって、ユビキチンプロテアーゼが介在する生物学的または生化学的機能を終点アッセイとして使用できる。これらは、本明細書に記載の、本明細書で引用し、その終点アッセイ標的について言及することにより本明細書に包含する引用文献に記載のすべての生化学的または生化学的／生物学事象、および当分野の当業者に既知の他の機能を含む。
【０１０３】
結合するおよび／または活性化する化合物はまた、本明細書に記載のような１個またはそれ以上のドメイン、部位など、またはその一部が他のユビキチンプロテアーゼ由来の異種カウンターパートで置換されているキメラユビキチンプロテアーゼタンパク質の使用によりスクリーニングできる。例えば、天然のユビキチンプロテアーゼと異なる基質特異性および／または親和性で相互作用する認識または結合領域を使用できる。したがって、経路の成分の異なるセットが活性化の終点アッセイとして利用可能である。さらに、発育、時期、または組織特異性を担う部位を、プロテアーゼが特異的発育、時期、または組織特異的発現の条件下で検出できるように、異種部位で置換できる。
【０１０４】
ユビキチンプロテアーゼポリペプチドはまたユビキチンプロテアーゼと相互作用する化合物の発見のために設計された方法での競合結合アッセイにおいて有用である。故に、化合物を、ユビキチンプロテアーゼポリペプチドに、化合物がポリペプチドと結合するか他の方法で相互作用する条件下で曝す。可溶性ユビキチンプロテアーゼポリペプチドをまた混合物に添加する。試験化合物が可溶性ユビキチンプロテアーゼポリペプチドと相互作用したとき、形成された複合体の量を減少させるか、またはユビキチンプロテアーゼ標的からの活性を減少させる。このタイプのアッセイは、ユビキチンプロテアーゼの特異的領域と相互作用する化合物の探索時に特に有用である。故に、標的ユビキチンプロテアーゼ領域と競合する可溶性ポリペプチドを、目的の領域に対応するペプチド配列を含むように設計する。
【０１０５】
別のタイプの競合−結合アッセイは、特異的機能的部位と相互作用する化合物の発見に使用できる。例として、ユビキチンおよび候補化合物をユビキチンプロテアーゼのサンプルに添加できる。ユビキチンと同じ部位でユビキチンプロテアーゼと相互作用する化合物は、ユビキチンプロテアーゼとユビキチンの間で形成される複合体の量を減少させる。したがって、ユビキチンプロテアーゼとユビキチンの間の相互作用を防止する化合物の発見が可能である。
【０１０６】
他の例は、候補化合物をユビキチンプロテアーゼおよびポリユビキチンのサンプルに添加することを含む。ポリユビキチンと競合する化合物は、加水分解の量またはポリユビキチンのユビキチンプロテアーゼへの結合を減少させる。したがって、ユビキチンプロテアーゼと相互作用し、ポリユビキチンと競合する化合物が発見できる。このようなアッセイは、ユビキチン化基質タンパク質、ユビキチン化基質残存物、および転写制御因子のようなプロテアーゼと相互作用する細胞成分のような、ユビキチンプロテアーゼと相互作用する任意の他の成分を含み得る。無細胞薬剤スクリーニングアッセイを行うために、ユビキチンプロテアーゼもしくはフラグメント、またはその標的分子のいずれかを固定化し、一方または両方のタンパク質の非複合体形からの複合体の分離を促進し、ならびにアッセイの自動化に適応させることが望ましい。マトリックス上へのタンパク質の固定化の技術は、薬剤スクリーニングアッセイで使用できる。
【０１０７】
一つの態様において、タンパク質のマトリックスへの結合を可能にするドメインを添加した融合タンパク質を提供できる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ユビキチンプロテアーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)またはグルタチオン被覆マイクロタイタープレート上に吸着させ、次いでそれを細胞融解物(例えば、３５Ｓ−標識)および候補化合物と合わせ、そして、混合物を複合体形成を助ける条件下(例えば、塩およびｐＨについて生理学的条件)でインキュベートできる。インキュベーションに続き、ビーズを洗浄してすべての非結合標識を除去し、マトリックスを固定化して放射標識を直接測定するか、または、複合体を解離させた後の上清において測定する。
【０１０８】
あるいは、複合体をマトリックスから解離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてビーズフラクションで見られたユビキチンプロテアーゼ−結合タンパク質レベルを、標準電気泳動法によりゲルから定量する。例えば、ポリペプチドまたはその標的分子のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して、当分野で既知の方法を使用して、固定化できる。あるいは、タンパク質と反応するが、タンパク質のその標的分子への結合を干渉しない抗体を、プレートのウェルの被覆に使用し、抗体結合によりタンパク質をウェルにトラップできる。ユビキチン、ポリユビキチン、ユビキチン化基質タンパク質、ユビキチン化基質タンパク質残存物またはユビキチン化残存物アミノ酸のようなユビキチンプロテアーゼ−結合標的成分、および候補化合物をユビキチンプロテアーゼ−提示ウェル中でインキュベートし、ウェルにトラップされた複合体の量を定量できる。
【０１０９】
このような複合体を検出する方法は、ＧＳＴ−固定化複合体について上記のものに加えて、ユビキチンプロテアーゼ標的分子と反応性の抗体、またはユビキチンプロテアーゼと反応性であり、かつ標的分子と競合する抗体を使用した複合体の免疫検出；ならびに標的分子に関連する酵素活性の検出に基づく酵素結合アッセイを含む。
【０１１０】
これらの薬剤スクリーニングアッセイで同定されたユビキチンプロテアーゼ活性のモジュレーターを、ユビキチンプロテアーゼ経路が介在する障害を有する対象の処置に、ユビキチンプロテアーゼを発現する細胞を処置することにより使用できる。
【０１１１】
一つの局面において、本発明は配列番号２、配列番号６または配列番号１０に記載の核酸配列を含む遺伝子の発現のモジュレーターである。好ましくは、このようなモジュレーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重螺旋ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ＲＮＡアプタマーまたは二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡのような阻害性の核酸である。配列番号２、配列番号６、配列番号１０に記載の核酸配列を含む遺伝子の発現を阻害する核酸を設計するのは、当業者の知識の範囲内である。特に好ましい態様において、阻害性の核酸はｓｉＲＮＡである。好ましいｓｉＲＮＡ分子は、典型的に１８〜３０ヌクレオチド長の間であるが、より長い長さが標的遺伝子発現の阻害に適している。好ましい態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、１９〜２５ヌクレオチド長の間である。
【０１１２】
本発明によって、乳癌組織において、配列番号１、配列番号５または配列番号９から成るから選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量が上昇していることが判明した。故に、本発明の一つの局面において、配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される核酸配列を含む遺伝子の発現を阻害するのに適した阻害性の核酸の有効量を乳癌患者に投与することを含む、乳癌を処置する方法を提供する。好ましい態様において、阻害性の核酸はｓｉＲＮＡである。他の好ましい態様において、核酸配列は配列番号２である。他の態様において、本発明は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される、好ましくは配列番号２の核酸配列を含む遺伝子の発現の阻害に適した阻害性の核酸、好ましくはｓｉＲＮＡの、乳癌の処置用医薬の製造のための使用を提供する。
【０１１３】
本発明によって、末梢血細胞、特にリンパ系細胞において、配列番号１、配列番号５または配列番号９から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量が上昇していることが判明した。故に、本発明の一つの局面において、配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される核酸配列を含む遺伝子の発現を阻害するのに適した阻害性の核酸の有効量を白血病患者に投与することを含む、白血病を処置する方法を提供する。好ましい態様において、阻害性の核酸はｓｉＲＮＡである。他の好ましい態様において、核酸配列は配列番号６である。他の態様において、本発明は、配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される、好ましくは配列番号６の核酸配列を含む遺伝子の発現の阻害に適した阻害性の核酸、好ましくはｓｉＲＮＡの、白血病の処置用医薬の製造のための使用を提供する。
【０１１４】
本発明の他の局面によって、配列番号２、配列番号６、配列番号１０から成る群から選択される核酸配列を含む遺伝子の発現の阻害に適した阻害性の核酸、特にｓｉＲＮＡと、薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０１１５】
本発明の一つの局面において、ヒトからの組織において本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを測定し、ここで、正常組織における該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して、上昇した量の該ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの存在が、該ヒトがユビキチン特異的プロテアーゼが関与する疾患に罹患していることの診断である、ユビキチン特異的プロテアーゼが関与する疾患を診断する方法を提供する。本発明の診断法で使用する組織に関連する文脈において“正常”なる用語は、診断される疾患に罹患していないヒト由来の組織を意味する。この局面の好ましい態様において、このような診断法はインビトロまたはエキソビボで行う。
【０１１６】
本発明の好ましい局面において、ユビキチン特異的プロテアーゼが関与する疾患を診断する方法はは、組織と、配列番号１、配列番号５または配列番号９のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を接触させ、そして、該抗体と該組織中のポリペプチドの特異的結合を検出する段階を含む、検出段階を含み、ここで、ポリペプチドへの特異的結合の存在の検出が、配列番号１、配列番号５または配列番号９のいずれかのアミノ酸を含むポリペプチドの存在の指標である。
【０１１７】
本発明の一つの態様において、診断する細胞は、乳房細胞であり、関与する疾患は乳房の発育の障害、急性乳腺炎、乳管周囲炎(再発性乳輪下膿瘍、乳汁分泌管の扁平上皮化生)、乳管拡張症、脂肪壊死、肉芽腫性乳腺炎およびシリコン乳房インプラントに関連する病理を含むが、これらに限定されない炎症；線維嚢胞性変化；上皮過形成、硬化性腺症および小管乳頭腫を含むが、これらに限定されない増殖性乳房疾患；繊維腺腫、葉状腫瘍および肉腫のような間質腫瘍、ならびに大管乳頭腫のような上皮腫瘍を含むが、これらに限定されない腫瘍；管癌腫インサイチュ(ページェット病を含む)および小葉癌腫インサイチュを含むインサイチュ(非侵襲性)癌腫、ならびに侵襲性管癌腫、具体的な型のない、侵襲性小葉癌腫、髄様癌腫、膠様(粘液性)癌腫、管状癌腫および侵襲性乳頭癌腫を含むが、これらに限定されない侵襲性(浸潤)癌腫を含む乳房の癌腫、ならびに他の種々の悪性新生物を含む。男性乳房の障害は、女性化乳房および癌腫を含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
本発明の他の態様において、診断する細胞は、末梢血細胞、特にリンパ系細胞である。障害は白血病を含むが、これに限定されない。
【０１１９】
本発明のさらに別の態様において、診断する細胞は脳内のものであり、下記を含むが、これらに限定されない脳の疾患を含む：神経が関与する障害、および星状細胞、乏突起膠細胞、上衣細胞および小膠細胞のような膠細胞が関与する障害；脳浮腫、上昇した脳圧およびヘルニア形成、および水頭症；神経管欠損、前脳異常、後頭蓋窩異常および、脊髄空洞症および水脊髄症のような奇形ならびにに発育疾患；出生児脳傷害；低血圧、低灌流、および低流状態−−全脳虚血および脳局所虚血−−局所的血液供給の閉塞による梗塞、脳内(実質内)出血、くも膜下出血および桑実状動脈瘤破裂を含む脳出血、ならびに、血管奇形、ラクナ梗塞、間隙出血および高血圧性脳症高血圧性脳血管疾患を含む、低酸素、虚血および梗塞に関与するもののような脳血管疾患；急性化膿性(細菌性)髄膜炎および急性無菌性(ウイルス性)髄膜炎を含む急性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下蓄膿および硬膜外膿瘍を含む急性病巣化膿性感染、結核およびミコバクテリア症、神経梅毒および神経ボレリア症(ライム病)を含む慢性細菌性髄膜脳炎、節足動物媒介性(Ａｒｂｏ)ウイルス脳炎を含むウイルス髄膜脳炎、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス(帯状ヘルペス)、サイトメガロウイルス、灰白髄炎、狂犬病、ならびに、ＨＩＶ−１髄膜脳炎(亜急性脳炎)、空胞性脊髄症、ＡＩＤＳ−関連筋疾患、末梢ニューロパシーおよび子供のＡＩＤＳを含むヒト免疫不全ウイルス１、進行性多巣性白質脳症、亜急性硬化性全脳炎、真菌性髄膜脳炎、神経系の他の感染症のような感染；伝染性海綿状脳症(プリオン病)；多発性硬化症、多発性硬化症のバリアント、急性播種性脳脊髄炎および急性壊死性出血性脳脊髄炎、および脱髄を伴う他の疾患を含む、脱髄疾患；
【０１２０】
アルツハイマー病およびピック病を含む大脳皮質に影響する変性疾患、パーキンソン病、特発性パーキンソン病(振戦麻痺)、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、線条体黒質変性症、シャイ・ドレーガー症候群およびオリーブ橋小脳萎縮症を含む多系統萎縮症、ならびにハンチントン病を含む基底核および脳幹の変性疾患のような変性疾患；フリードライヒ失調症および血管拡張性失調症を含む脊髄小脳失調症、筋萎縮性側索硬化症(運動ニューロン疾患)、延髄脊髄萎縮(ケネディ症候群)および脊髄性筋萎縮症を含む運動神経に影響する変性疾患を含む、脊髄小脳変性；クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、副腎白質萎縮症、ペリツェウス・メルツバッハー病およびカナバン病を含む白質萎縮症、Leigh病および他のミトコンドリア脳筋症を含むミトコンドリア脳筋症のような先天性代謝異常；チアミン(ビタミンＢ１)欠乏症およびビタミンＢ１２欠乏症のようなビタミン欠乏症、低血糖、高血糖および肝性脳症を含む代謝障害の神経学的続発症、一酸化炭素、メタノール、エタノール、およびメトトレキサートと照射の併用が誘発した傷害を含む放射を含む中毒性疾患を含む、中毒性および後天性代謝疾患；繊維状(広汎性)星状細胞腫および多形神経膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形性黄色星状細胞腫および脳幹神経膠腫を含む星状細胞腫、乏突起細胞腫を含む神経膠腫、および上衣細胞腫および関連する傍脳室塊病変、神経腫瘍、髄芽腫を含む低分化新生物、原発性脳リンパ腫、胚細胞腫瘍および松果体実質腫瘍を含む他の実質腫瘍、髄膜腫、転移性腫瘍、新生物随伴症候群、シュワン腫、神経線維腫および悪性末梢神経鞘腫瘍(悪性シュワン腫)を含む末梢神経鞘腫瘍、および神経線維腫症１型(ＮＦ１)および神経線維腫症２型(ＮＦ２)を含む神経線維腫症、結節性硬化症およびフォンヒッペル・リンドウ病を含む神経皮膚症候群(母斑症)のような腫瘍。
【０１２１】
本発明は、また、乳癌のような、本明細書に記載のようにユビキチンプロテアーゼが発現される組織が関与する疾患を含むが、これらに限定されいない、ユビキチン特異的プロテアーゼが介在する疾患をまたはその素因を診断するための標的を提供するための、本発明のポリペプチドの使用に関する。したがって、ユビキチンプロテアーゼの、細胞、組織または臓器における存在またはレベルを検出する方法を提供する。本方法は、生物学的サンプルと、ユビキチンプロテアーゼと相互作用できる化合物を、相互作用が検出できるように接触させることを含む。本ポリペプチドはまたこれらの成分が減少していることを特徴とする障害の処置にも有用である。故に、本プロテアーゼの活性の上昇または低下が処置に有益である。本ポリペプチドはまた過剰な基質または減少したレベルの基質により特徴付けられる疾患の診断のための標的の提供にも有用である。したがって、基質が過剰であるとき、プロテアーゼポリペプチドは診断アッセイを提供できる。
【０１２２】
さらに、例えば、活性が減少したプロテアーゼを、減少した基質が障害の原因である状態の診断に使用できる。ユビキチンプロテアーゼを検出するための薬剤の一つは、ユビキチンプロテアーゼと選択的に結合できる抗体である。生物学サンプルは、対象から単離した組織、細胞および体液ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含む。本ユビキチンプロテアーゼはまた変異体ユビキチンプロテアーゼを有する患者の活動性疾患、または疾患への素因を診断するための標的を提供する。故に、ユビキチンプロテアーゼを、生物学サンプルから単離し、そして異常なタンパク質に至る遺伝的変異の存在に関してアッセイできる。これはアミノ酸置換、欠失、挿入、再配置(異常なスプライシング事象の結果)、および不適当な翻訳後修飾を含む。分析法は、変えられた電気泳動移動性、変えられたトリプシンペプチド消化、細胞を利用したまたは無細胞アッセイにおける変えられたユビキチンプロテアーゼ活性、ポリユビキチンへの結合または加水分解の変化、ユビキチンのユビキチン化基質タンパク質への結合または該タンパク質からの加水分解の変化、ペプチドまたはアミノ酸を含むユビキチン化タンパク質残存物への結合のおよびユビキチンの該残存物への加水分解の変化、一般的タンパク質ターンオーバー、特異的タンパク質ターンオーバー、抗体−結合パターン、変えられた等電点、直接アミノ酸配列決定、ならびに、本明細書に記載のアッセイを含む一般的にタンパク質中のまたは特にユビキチンプロテアーゼ中の変異の検出に有用な任意の他の既知のアッセイ技術を含む。ユビキチンプロテアーゼ検出のためのインビトロ法は、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光法を含む。
【０１２３】
あるいは、本タンパク質を、対象においてインビボで、対象に標識抗−ユビキチンプロテアーゼ抗体を挿入することにより検出できる。例えば、抗体は、標準造影法でその存在および位置を確認できる放射活性マーカーで標識できる。特に有用なのは、対象において発現されるユビキチンプロテアーゼの対立変異体を検出する方法、およびサンプル中のユビキチンプロテアーゼのフラグメントを検出する方法である。本ユビキチンプロテアーゼポリペプチドはまた薬理ゲノム学的分析において有用である。薬理ゲノム学は、罹患している個体における変えられた薬物動態および異常な作用のための、薬剤に対する応答の臨床的に有意な遺伝性変異を扱う。例えば、Eichelbaum, M. (1996)Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11):983-985およびLinder, M. W. (1997)Clin. Chem. 43(2):254-266参照。これらの変異の臨床的結果が、代謝における個体の変異のためにある個体における治療剤の重篤な毒性をもたらすか、またはある個体における薬剤の治療の不成功をもたらす。故に、個体の遺伝子型は、治療化合物が体内で作用する方法かまたは体が化合物を代謝する方法を決定し得る。さらに、薬剤代謝酵素の活性が、薬剤作用の強度および期間の両方に影響する。故に、個体の薬理ゲノム学は、個々の遺伝子型に基づいた、有効な化合物およびこのような化合物の予防的または治療的処置に有効な量の選択を可能にする。ある薬剤代謝酵素における遺伝子多型の発見が、なぜある患者が期待される薬剤の効果を得られないか、過剰な薬剤の効果を示すか、または標準的な薬剤投与量で重篤な毒性を経験するかの説明となっている。多型は拡張した新陳代謝の表現型および乏しい新陳代謝の表現型において示し得る。したがって、遺伝子多型は、一つの集団における１個またはそれ以上のユビキチンプロテアーゼ機能が、別の集団と異なっているものである、ユビキチンプロテアーゼの対立タンパク質変異体を導き得る。本ポリペプチドは、故に処置モダリティーに影響しう得る遺伝的素因を確認するための標的を可能にする。故に、ユビキチン−ベースの処置において、多型は、多かれ少なかれ活性である触媒領域を発生し得る。したがって、多型を含む一定の集団内で治療効果を最大にするために用量を修飾する必要があろう。遺伝子型分類の代替として、特異的多型ポリペプチを同定し得る。
【０１２４】
本ユビキチンプロテアーゼポリペプチドはまた臨床試験および他の治療中の治療効果のモニタリングに有用である。故に、遺伝子発現、タンパク質レベルまたはユビキチンプロテアーゼ活性を増加または減少させるために設計された薬剤の治療効果は、ユビキチンプロテアーゼポリペプチドを終点の標的として使用して経時的にモニターできる。本モニタリングは、例えば、下記の通りである：(ｉ)本薬剤の投与前に対象から投与前サンプルを得る；(ii)投与前サンプルにおける該タンパク質の発現または活性を検出する；(iii)対象から１個またはそれ以上の投与後サンプルを得る；(iv)投与後サンプルにおける該タンパク質の発現または活性を検出する；(ｖ)投与前サンプルの該タンパク質の発現または活性レベルと、投与後サンプルまたは複数の投与後サンプルの該タンパク質を比較する；そして(vi)対象への薬剤の投与をそれに応じて増加または減少する。
【０１２５】
本発明の別の局面において、処置のための方法は、本明細書に記載のものを含む基質に対して競合する、可溶性ユビキチン特異的プロテアーゼまたはユビキチン特異的プロテアーゼタンパク質のフラグメントの使用を含むが、これらに限定されない。これらのユビキチンプロテアーゼまたはフラグメントは、効率的に競合するように、標的に対して高い親和性を有し得る。該タンパク質が異常に下方制御されているおよび／または上昇した活性が有利な効果を有するようである状況下では、活性の刺激が望ましい。同様に、該タンパク質が異常に上方制御されているおよび／または低下した活性が有利な効果を有するようである状況下では、活性の阻害が望ましい。このような状況の一つの例において、対象が異常な発育または細胞分化により特徴付けられる障害を有する。他の例において、対象は増殖性疾患(例えば、癌)または異常な造血応答により特徴付けられる障害を有する。他の例において、対象において組織再生が望ましい(例えば、対象が脳または脊髄損傷を受け、そして、制御された方法での神経組織の再生が望ましいとき)。
【０１２６】
本発明の別の局面において、特に、異なって発現される遺伝子エピトープの１個またはそれ以上を特異的に認識できる抗体を産生する方法を提供する。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体(ｍＡｂｓ)、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ(ａｂ')２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ(抗−Ｉｄ)抗体、および上記のいずれかのエピトープ−結合フラグメントを含むが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば、生物学サンプルにおけるフィンガープリント、標的、遺伝子の検出において、または、別法として、異常な標的遺伝子活性を阻害するための方法において、使用できる。
【０１２７】
異なって発現される遺伝子に対する抗体を産生するために、種々の宿主動物を、異なって発現される遺伝子タンパク質またはその一部の注射により免疫できる。このような宿主動物は、いくつかを挙げるとウサギ、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。種々のアジュバントを、宿主種に依存して免疫応答を上昇させるために使用でき、フロインド(完全および不完全)、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような界面活性剤、pluronicポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイル・エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールならびに、ＢＣＧ(ゲラン菌)およびコリネバクテリウム・パルバム(Corynebacterium parvum)のような有用な可能性のあるヒトアジュバントを含む。
【０１２８】
ポリクローナル抗体は、標的遺伝子産物またはそれらの抗原性機能誘導体のような抗原で免疫した動物の血清から得られた抗体分子の異種集団である。ポリクローナル抗体の産生のために、上記のような宿主動物を、また上記のようなアジュバントを補った、異なって発現される遺伝子産物で注射して免疫できる。
【０１２９】
特定の抗原に対する個体の同種集団であるモノクローナル抗体は、継代培養細胞系による抗体分子の再生を提供する任意の技術により得ることができる。これらは、Kohler and Milsteinのハイブリドーマ法(1975, Nature 256:495-497;および米国特許4,376,110)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法(Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72;Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030)、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ法(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)を含む。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらのサブクラスのいずれかを含む、任意の免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマをインビトロまたはインビボで培養できる。高力価のｍＡｂｓのインビボでの産生により、それが現在好ましい製造法である。
【０１３０】
加えて、適当な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子と、適当な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子のスプライシングによる、“キメラ抗体”(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855;Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608;Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)の産生のための方法も開発された。キメラ抗体は、マウスｍＡｂ由来の可変領域または超可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域を有するもののような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
【０１３１】
あるいは、一本鎖抗体の産生に関して記載された方法を(米国特許４,９４６,７７８；Bird, 1988, Science 242:423-426;Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883;およびWard et al., 1989, Nature 334:544-546)、異なって発現される遺伝子−一本鎖抗体の産生に適用できる。一本鎖抗体は、Ｆｖ領域の重および軽鎖フラグメントのアミノ酸架橋を介した結合により形成され、一本鎖ポリペプチドがもたらされる。
【０１３２】
最も好ましくは、“ヒト化抗体”の産生に有用な方法が、本発明のポリペプチド、フラグメント、誘導体および機能的等価体に対する抗体の産生に適用できる。このような方法は米国特許５,９３２、４４８；５,６９３,７６２；５,６９３,７６１；５,５８５,０８９；５,５３０,１０１；５,９１０,７７１；５,５６９,８２５；５,６２５,１２６；５,６３３,４２５；５,７８９,６５０；５,５４５,５８０；５,６６１,０１６；および５,７７０,４２９に記載され、それらの記載を、その全体を引用して本明細書に包含する。
【０１３３】
特異的エピトープを認識する抗体フラグメントを、既知の方法で産生できる。例えば、このようなフラグメントは、下記を含むが、これらに限定されない：抗体分子のペプシン照会により産生できるＦ(ａｂ')２フラグメントおよびＦ(ａｂ')２フラグメントのジスルフィド架橋の還元により産生できるＦａｂフラグメント。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281)、所望の特性のモノクローナルＦａｂフラグメントの同定を早く、容易にできる。
【０１３４】
検出の容易さのために特に好ましいのは、サンドイッチアッセイであり、それに関する多くの変法が存在し、そのすべてを本発明に包含すると意図する。
【０１３５】
例えば、典型的な前向きアッセイにおいて、非標識抗体を固体支持体上に固定化し、試験すべきサンプルをその結合した分子と接触させる。その後、適当なインキュベーション時間、抗体−抗原二重抗体の形成に充分な時間放置する。この時点で、検出可能なシグナルを誘発できるレポーター分子で標識した二次抗体を次いで添加し、インキュベートし、抗体−抗原−標識抗体の三重抗体の形成をさせるのに充分な時間取る。未反応物質をすべて洗い流し、抗原の存在をシグナルの観察により測定するか、既知量の抗原を含むコントロールサンプルとの比較により定量し得る。前向きアッセイの変法は、サンプルおよび抗体を、結合した抗体に同時に添加するものである同時アッセイ、または標識抗体と試験すべきサンプルを最初に合わせ、インキュベートし、非標識表面結合抗体に添加するものである逆向きアッセイを含む。これらの方法は当業者に既知であり、微細な変化の可能性は、容易に明らかとなろう。本明細書で使用する“サンドイッチアッセイ”は、基本的二方向の方法のすべての変法を含む。
【０１３６】
このタイプのアッセイで、最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア−または放射性核種−含有分子である。酵素免疫アッセイの場合、酵素を二次抗体に、通常グルタールアルデヒドまたは過ヨウ素酸の手段によりコンジュゲートする。容易に認識されるように、しかしながら、当業者に既知の多くの広範囲の異なる連結方法が存在する。一般的に使用される酵素は、とりわけホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼを含む。特異的酵素と共に使用すべき基質は、一般的に対応する酵素による加水分解により、検出可能な色の変化をもたらすように選択する。あるいは、フルオレッセインおよびローダミンのような蛍光化合物を、抗体に、その結合能を変えることなく化学的に結合できる。特定波長の光の照射により活性化するとき、蛍光色素−標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子の励起状態を誘発し、続いて特徴的波長の光を放出する。放出は、光学顕微鏡で可視的に検出可能な特徴的な色として見られる。免疫蛍光法およびＥＩＡ法は、両方とも当分野で非常によく確立されており、既存の方法で特に好ましい。しかしながら、放射性同位体、化学発光または生物発光分子のような他のレポーター分子も用い得る。当業者には、要求される使用のためにどのように方法を変化させるか、容易に明らかであろう。
【０１３７】
故に他の局面において、本発明は、下記の成分の少なくとも１個を含む、診断キットに関する：(ａ)配列番号２、配列番号６または配列番号１０に記載のヌクレオチド配列またはそのヌクレオチド配列の一部を含む核酸の検出に適したオリゴヌクレオチド、(ｂ)配列番号１、配列番号５または配列番号９に記載のアミノ酸配列またはそのアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドの検出に適した抗体、(ｃ)キットを使用するための指示書。
【０１３８】
本発明のヌクレオチド配列はまた染色体位置決定のためにも価値がある。本配列は、特に、個々のヒト染色体上の特定の位置を特異的に標的とし、そして、それとハイブリダイズできる。本発明による、染色体への関連配列のマッピングは、これらの配列と遺伝子関連疾患を相関させる第一歩である。配列が厳密な染色体上の位置にマッピングされたら、本配列の染色体上の物理的な位置を、遺伝子マップデータと相関させ得る。このようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryからオンラインで利用可能)に見られる。遺伝子と、同じ染色体領域上にマッピングされている疾患の間の関係を、次いで、リンケージ分析(物理的に隣接する遺伝子の共同相続)を介して同定する。
【０１３９】
罹患している個体と罹患していない個体の間のｃＤＮＡまたはゲノム配列の差異をまた決定できる。変異が、罹患している個体のいくらかまたはすべてで観察されるが、いずれの正常個体でも観察されないとき、その変異はその疾患の原因因子でありそうである。
【０１４０】
本発明のさらなる局面は、上記のいずれかの治療効果のための、医薬組成物の薬学的に許容される担体と組み合わせた投与に関する。このような医薬組成物は、本発明のユビキチン特異的プロテアーゼの抗体、模倣体、アゴニスト、アンタゴニスト、または阻害剤から成り得る。本組成物は、単独で、または、安定化化合物のような少なくとも１個の他の薬剤と組み合わせて投与でき、それは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロースおよび水を含む任意の滅菌、生体適合性医薬担体中で投与し得る。本組成物は、患者に単独で、または、他の薬物、薬剤またはホルモンと組み合わせて投与できる。
【０１４１】
本発明により包含される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、髄内、鞘内(intrathecal)、脳室内(intraventricular)、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下または直腸手段を含むが、これらに限定されない、多くの経路により投与できる。
【０１４２】
活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物の製剤への加工を容易にし、かつ、薬学的に許容できる適当な薬学的に−許容される担体を含み得る。製剤および投与のための技術のさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton, Pa.)の最新版に見ることができる。
【０１４３】
経口投与用医薬組成物は、経口投与に適した用量で、当分野で既知の薬学的に許容される担体を使用して製剤できる。このような担体は、医薬組成物の、患者が摂取するための錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、内服液、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液なへの製剤を可能にする。
【０１４４】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物と固体賦形剤を合わせ、所望により得られた混合物を挽き、そして、必要であれば適当な助剤の添加後、顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠コアを得ることにより得ることができる。適当な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；コーン、小麦、米、ジャガイモまたは他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースのようなセルロース；アラビアガムおよびトラガカントを含むガム；およびゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質のような、炭水化物またはタンパク質増量剤である。所望により、崩壊剤または溶解剤を添加でき、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはアルギン酸ナトリウムのようなその塩である。
【０１４５】
糖衣錠コアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタンも含み得る濃縮糖溶液、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物のような適当なコーティングと組み合わせて使用し得る。着色剤または色素も、錠剤または糖衣錠コーティングに製品の同定または活性化合物の用量、すなわち投与量を特徴付けするために添加してよい。
【０１４６】
経口で使用できる医薬製剤は、ゼラチン製の押し込み式カプセルならびに、ゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングから成る軟、密封カプセルを含み得る。押し込み式カプセルは、ラクトースまたはデンプンのような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑剤および、所望により安定化剤と根号された活性成分を含み得る。軟カプセルにおいて、活性化合物は、安定化剤と共にまたは無しで、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールのような適当な液体に溶解または懸濁しててよい。
【０１４７】
非経腸投与に適当な医薬製剤は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理食塩水(physiologically buffered saline)に製剤できる。水性注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として製剤できる。適当な親油性溶媒または媒体は、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセライドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを含む。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーもまた送達に使用できる。所望により、本懸濁液はまた適当な安定化剤または、高濃縮溶液の製造を可能にするための化合物の溶解性を上昇させる化合物を含み得る。
【０１４８】
局所または鼻腔投与のために、透過すべき特定のバリアーに適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で既知である。
【０１４９】
本発明の医薬組成物は、当分野で既知の方法で、例えば、慣用の混合、溶解、造粒、糖衣付加、研磨、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥過程の手段により、製造できる。
【０１５０】
本医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含むが、これらに限定されない多くの酸と形成できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒に、対応する遊離塩基形よりも、より可溶性である傾向がある。他の場合、好ましい製剤は、下記のいずれかまたはすべてを含み得る凍結乾燥粉末であり得る：１−５０mM  ヒスチジン、０.１％−２％スクロース、および２−７％マンニトール、４.５から５.５の範囲のｐＨ、これを使用前に緩衝剤と合わせる。
【０１５１】
医薬組成物を製造した後、適応状態の処置のためにそれらを適当な容器に入れ、ラベルできる。投与のために、ラベルは量、頻度および投与の方法を含むであろう。
【０１５２】
本発明での使用に適当な医薬組成物は、活性成分が、意図する目的を達成するのに充分な量で包含されている、組成物を含む。有効量の決定は、当分野の当業者の能力の範囲内である。
【０１５３】
任意の化合物について、治療に有効な用量を、最初に、例えば新生物細胞の、細胞培養アッセイで、または、動物藻である、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタのいずれかで概算する。動物モデルはまた適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。このような上方を次いでヒトでの有用な投与量および投与の経路の決定に使用できる。
【０１５４】
治療的有効量は、症状または状態を軽減する、活性成分、そのフラグメント、ユビキチン特異的プロテアーゼの抗体、アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の量を意味する。治療効果および毒性、例えば、ＥＤ５０(集団の５０％に治療に有効な量)およびＬＤ５０(集団の５０％に致死的な量)は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、これは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として示すことができる。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物から得たデータを、ヒト使用のための用量の範囲の計算に使用する。このような組成物に包含される投与量は、好ましくは、毒性がほんのわずかか、毒性なく、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量はこの範囲内で用いる投与形態、患者の感受性および投与経路に依存して変化する。
【０１５５】
正確な投与量は実施者により、処置を必要とする対象に関連する因子に照らして、決定される。投与量および投与は、活性分子の充分なレベルを提供するため、または、所望の効果を維持するために調節する。考慮し得る因子は、疾患状態の重症度、対象の一般的健康状態、対象の年齢、体重および性別、食生活、投与の時間および頻度、薬剤(複数もある)の組み合わせ、応答感受性および治療への耐容性／応答を含む。長時間作用医薬組成物を、３〜４日毎、毎週、または２週間に１回、特定の製剤の半減期および排泄速度に依存して投与できる。
【０１５６】
通常の投与量は、１００,０００マイクログラムから約１ｇまでの総投与量の範囲で、投与経路に依存して変化し得る。特定の投与量および送達法に関する指針が文献に記載され、当分野の実施者には一般に利用可能である。当分野の当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤と異なる製剤をヌクレオチドについて用いるであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置などに特異的であろう。タンパク質の経口投与に適当な医薬製剤は、例えば、米国特許５,００８,１１４；５,５０５,９６２；５,６４１,５１５；５,６８１,８１１；５,７００,４８６；５,７６６,６３３；５,７９２,４５１；５,８５３,７４８；５,９７２,３８７；５,９７６,５６９；および６,０５１,５６１に記載されている。
【０１５７】
下記の実施例および表は本発明を説明するものであり、いかなる方法でもその範囲を限定するものではない。
【０１５８】
表：
表１(ａ)−ＵＳＰ＿Ｎ０１：新規スプライス変異体−アミノ酸配列
座位 USP_N01 3370 aa PRT
受託 BAA25496
GeneSeq AAU82706
起源 ヒト
4個の挿入により特徴付けられるスプライス形:
Pos 1-Pos 11
Pos 267-Pos 300
Pos 361-Pos 384
Pos 1243-Pos 1437
1 MRRKNSYYVW QKIFQIQFPL YTAYKHNTHP TIEDISTQES NILGAFCDMN DVEVPLHLLR
61 YVCLFCGKNG LSLMKDCFEY GTPETLPFLI AHAFITVVSN IRIWLHIPAV MQHIIPFRTY
121 VIRYLCKLSD QELRQSAARN MADLMWSTVK EPLDTTLCFD KESLDLAFKY FMSPTLTMRL
181 AGLSQITNQL HTFNDVCNNE SLVSDTETSI AKELADWLIS NNVVEHIFGP NLHIEIIKQC
241 QVILNFLAAE GRLSTQHIDC IWAAAQRKKS LEEQLHHLGH LQLVLKAVII AIHIKVEVVT
301 EPSVHTEQTL YLASMLIKAL WNNALAAKAQ LSKQSSFASL LNTNIPIGNK KEEEELRRTA
361 LKWMSNLLIE PNMCNNDFQT QKESMQGSSD ETANSGEDGS SGPGSSSGHS DGSSNEVNSS
421 HASQSAGSPG SEVQSEDIAD IEALKEEDED DDHGHNPPKS SCGTDLRNRK LESQAGICLG
481 DSQGTSERNG TSSGTGKDLV FNTESLPSVD NRMRMLDACS HSEDPEHDIS GEMNATHIAQ
541 GSQESCITRT GDFLGETIGN ELFNCRQFIG PQHHHHHHHH HHHHDGHMVD DMLSADDVSC
601 SSSQVSAKSE KNMADFDGEE SGCEEELVQI NSHAELTSHL QQHLPNLASI YHEHLSQGPV
661 VHKHQFNSNA VTDINLDNVC KKGNTLLWDI VQDEDAVNLS EGLINEAEKL LCSLVCWFTD
721 RQIRMRFIEG CLENLGNNRS VVISLRLLPK LFGTFQQFGS SYDTHWITMW AEKELNMMKL
781 FFDNLVYYIQ TVREGRQKHA LYSHSAEVQV RLQFLTCVFS TLGSPDHFRL SLEQVDILWH
841 CLVEDSECYD DALHWFLNQV RSKDQHAMGM ETYKHLFLEK MPQLKPETIS MTGLNLFQHL
901 CNLARLATSA YDGCSNSELC GMDQFWGIAL RAQSGDVSRA AIQYINSYYI NGKTGLEKEQ
961 EFISKCMESL MIASSSLEQE SHSSLMVIER GLLMLKTHLE AFRRRFAYHL RQWQIEGTGI
1021 SSHLKALSDK QSLPLRVVCQ PAGLPDKMTI EMYPSDQVAD LRAEVTHWYE NLQKEQINQQ
1081 AQLQEFGQSN RKGEFPGGLM GPVRMISSGH ELTTDYDEKA LHELGFKDMQ MVFVSLGAPR
1141 RERKGEGVQL PASCLPPPQK DNIPMLLLLQ EPHLTTLFDL LEMLASFKPP SGKVAVDDSE
1201 SLRCEELHLH AENLSRRVWE LLMLLPTCPN MLMAFQNISD EQSNDGFNWK ELLKIKSAHK
1261 LLYALEIIEA LGKPNRRIRR ESTGSYSDLY PDSDDSSEDQ VENSKNSWSC KFVAAGGLQQ
1321 LLEIFNSGIL EPKEQESWTV WQLDCLACLL KLICQFAVDP SDLDLAYHDV FAWSGIAESH
1381 RKRTWPGKSR KAAGDHAKGL HIPRLTEVFL VLVQGTSLIQ RLMSVAYTYD NLAPRVLKAQ
1441 SDHRSRHEVS HYSMWLLVSW AHCCSLVKSS LADSDHLQDW LKKLTLLIPE TAVRHESCSG
1501 LYKLSLSGLD GGDSINRSFL LLAASTLLKF LPDAQALKPI RIDDYEEEPI LKPGCKEYFW
1561 LLCKLVDNIH IKDASQTTLL DLDALARHLA DCIRSREILD HQDGNVEDDG LTGLLRLATS
1621 VVKHKPPFKF SREGQEFLRD IFNLLFLLPS LKDRQQPKCK SHSSRAAAYD LLVEMVKGSV
1681 ENYRLIHNWV MAQHMQSHAP YKWDYWPHED VRAECRFVGL TNLGATCYLA STIQQLYMIP
1741 EARQAVFTAK YSEDMKHKTT LLELQKMFTY LMESECKAYN PRPFCKTYTM DKQPLNTGEQ
1801 KDMTEFFTDL ITKIEEMSPE LKNTVKSLFG GVITNNVVSL DCEHVSQTAE EFYTVRCQVA
1861 DMKNIYESLD EVTIKDTLEG DNMYTCSHCG KKVRAEKRAC FKKLPRILSF NTMRYTFNMV
1921 TMMKEKVNTH FSFPLRLDMT PYTEDFLMGK SERKEGFKEV SDHSKDSESY EYDLIGVTVH
1981 TGTADGGHYY SFIRDIVNPH AYKNNKWYLF NDAEVKPFDS AQLASECFGG EMTTKTYDSV
2041 TDKFMDFSFE KTHSAYMLFY KRMEPEEENG REYKFDVSSE LLEWIWHDNM QFLQDKNIFE
2101 HTYFGFMWQL CSCIPSTLPD PKAVSLMTAK LSTSFVLETF IHSKEKPTML QWIELLTKQF
2161 NNSQAACEWF LDRMADDDWW PMQILIKCPN QIVRQMFQRL CIHVIQRLRP VHAHLYLQPG
2221 MEDGSDDMDT SVEDIGGRSC VTRFVRTLLL IMEHGVKPHS KHLTEYFAFL YEFAKMGEEE
2281 SQFLLSLQAI STMVHFYMGT KGPENPQVEV LSEEEGEEEE EEEDILSLAE EKYRPAALEK
2341 MIALVALLVE QSRSERHLTL SQTDMAALTG GKGFPFLFQH IRDGINIRQT CNLIFSLCRY
2401 NNRLAEHIVS MLFTSIAKLT PEAANPFFKL LTMLMEFAGG PPGMPPFASY ILQRIWEVIE
2461 YNPSQCLDWL AVQTPRNKLA HSWVLQNMEN WVERFLLAHN YPRVRTSAAY LLVSLIPSNS
2521 FRQMFRSTRS LHIPTRDLPL SPDTTVVLHQ VYNVLLGLLS RAKLYVDAAV HGTTKLVPYF
2581 SFMTYCLISK TEKLMFSTYF MDLWNLFQPK LSEPAIATNH NKQALLSFWY NVCADCPENI
2641 RLIVQNPVVT KNIAFNYILA DHDDQDVVLF NRGMLPAYYG ILRLCCEQSP AFTRQLASHQ
2701 NIQWAFKNLT PHASQYPGAV EELFNLMQLF IAQRPDMREE ELEDIKQFKK TTISCYLRCL
2761 DGRSCWTTLI SAFRILLESD EDRLLVVFNR GLILMTESFN TLHMMYHEAT ACHVTGDLVE
2821 LLSIFLSVLK STRPYLQRKD VKQALIQWQE RIEFAHKLLT LLNSYSPPEL RNACIDVLKE
2881 LVLLSPHDFL HTLVPFLQHN HCTYHHSNIP MSLGPYFPCR ENIKLIGGKS NIRPPRPELN
2941 MCLLPTMVET SKGKDDVYDR MLLDYFFSYH QFIHLLCRVA INCEKFTETL VKLSVLVAYE
3001 GLPLHLALFP KLWTELCQTQ SAMSKNCIKL LCEDPVFAEY IKCILMDERT FLNNNIVYTF
3061 MTHFLLKVQS QVFSEANCAN LISTLITNLI SQYQNLQSDF SNRVEISKAS ASLNGDLRAL
3121 ALLLSVHTPK QLNPALIPTL QELLSKCRTC LQQRNSLQEQ EAKERKTKDD EGATPIKRRR
3181 VSSDEEHTVD SCISDMKTET REVLTPTSTS DNETRDSSII DPGTEQDLPS PENSSVKEYR
3241 MEVPSSFSED MSNIRSQHAE EQSNNGRYDD CKEFKDLHCS KDSTLAEEES EFPSTSISAV
3301 LSDLADLRSC DGQALPSQDP EVALSLSCGH SRGLFSHMQQ HDILDTLCRT IESTIHVVTR
3361 ISGKGNQAAS
【０１５９】
表１(ｂ)：−ＵＳＰ＿Ｎ０１：新規スプライス変異体−ヌクレオチド配列
1 atgagaagga aaaactctta ctatgtgtgg caaaaaattt ttcaaattca gtttccctta
61 tatactgctt acaagcataa tactcaccct actattgagg atatatcaac tcaagaaagt
121 aacatattag gggcattctg tgatatgaat gatgtagaag taccattgca tttgcttcgt
181 tatgtatgtt tgttttgtgg gaaaaatggc ctttctctca tgaaggattg ctttgaatat
241 ggaactcctg aaactttgcc atttcttata gcacatgcgt ttattacagt tgtgtctaat
301 attagaatat ggctacatat tcccgctgtc atgcagcaca ttataccttt taggacctat
361 gttattaggt atttatgcaa gctctcggat caggagttac gacagagtgc agctcgtaac
421 atggctgact taatgtggag cacagtcaaa gaaccattgg atacaacatt atgctttgat
481 aaagaaagcc tagatcttgc atttaagtac tttatgtcac ctactttgac tatgaggttg
541 gctggattga gtcagataac aaatcaactc cataccttca atgatgtgtg caataatgaa
601 tcattagtat cggacacaga aacgtccatt gcaaaagaac ttgcagactg gcttattagc
661 aacaatgtgg tggagcatat atttggacca aatttacata ttgagattat caaacagtgc
721 caagtgattt tgaatttttt ggcagcagaa gggcgactga gtactcaaca tattgactgt
781 atttgggctg cagcacagag gaagaagagc ttagaagaac agctccatca ccttggtcac
841 ctgcagctag tcctcaaagc agtgataata gcgatacaca tcaaagtgga ggtagtgaca
901 ttgaaatgga tgagcaactt attaatagaa ccaaacatgt gcaacaacga ctttcagaca
961 cagaaggaat ccatgcaggg aagttctgac gaaactgcca acagtggtga agatggaagc
1021 agtggtcctg gtagcagtag tgggcatagt gatggatcta gcaatgaggt taattctagc
1081 cacgcaagcc agtcagctgg gagccctggc agtgaggtac agtcagaaga cattgcagat
1141 attgaagccc tcaaagagga agatgaagac gatgatcatg gtcataatcc tcccaaaagc
1201 agttgtggta cagatcttcg gaatagaaag ttagagagtc aagcaggcat ttgcctgggg
1261 gactcccaag gcacgtcaga aagaaatggg acaagcagcg gaacaggaaa ggacctggtt
1321 tttaacactg aatcattgcc atcagtagat aatcgaatgc gaatgctgga tgcttgttca
1381 cactctgaag acccagaaca tgatatttca ggggaaatga atgctactca tatagcacaa
1441 gggtctcagg agtcttgtat cacacgaact ggggacttcc ttggggagac tattgggaat
1501 gaattattta attgtcgaca atttattggt ccacagcatc accaccacca ccaccaccat
1561 caccaccacc acgatgggca tatggttgat gatatgctaa gtgcagatga tgtcagttgt
1621 agtagctccc aggttagtgc aaaatcagaa aaaaatatgg ctgattttga tggtgaagaa
1681 tctggatgtg aagaggagct agttcagatt aattcacatg cggaactgac atctcacctc
1741 caacaacatc ttcccaattt agcttccatt taccatgaac atcttagtca aggacctgta
1801 gttcataaac atcaattcaa cagtaatgct gttacagaca ttaatttgga taatgtttgc
1861 aagaaaggaa atactttgtt gtgggatata gtccaagatg aagatgcagt taatctttct
1921 gaaggattaa taaatgaagc agagaaactt ctttgttcgt tagtatgttg gtttacagat
1981 agacaaattc gaatgagatt cattgaaggt tgccttgaaa acttgggaaa caacagatca
2041 gtagtaattt cacttcgtct tcttccaaaa ctatttggta cttttcagca gtttgggagc
2101 agttacgata cacactggat aacaatgtgg gcagaaaaag aactgaacat gatgaagctt
2161 ttctttgata atttggtata ctacattcaa actgtgagag aaggaagaca aaaacatgca
2221 ctgtacagcc atagtgctga agttcaagtt cgtcttcaat tcttgacttg tgtattttca
2281 actctgggat cacctgatca tttcaggtta agtttagagc aagttgacat cttatggcat
2341 tgtttagtag aagattctga atgttatgat gatgcactcc attggttttt aaatcaagtt
2401 cgaagtaaag atcaacatgc tatgggtatg gaaacctaca aacatctttt cctggagaag
2461 atgccccagc taaaacctga aacaattagc atgactggct taaacctgtt tcagcatctc
2521 tgtaacttgg ctcgattggc taccagtgcc tatgatggtt gttcaaattc tgagctgtgt
2581 ggtatggacc aattttgggg cattgcttta agagcacaat ctggtgatgt cagtcgagca
2641 gctatccagt atattaactc ctattatatt aatggtaaaa caggtttgga gaaggagcaa
2701 gaatttatta gtaagtgcat ggagagtctt atgatagctt ctagcagtct tgaacaggaa
2761 tcacactcaa gtctcatggt tatagaaaga ggactcctta tgctgaagac acatctggaa
2821 gcgtttagga gaaggtttgc atatcatctg agacagtggc aaattgaagg cactggtatt
2881 agtagtcatt tgaaagcact gagtgacaaa cagtctctgc cgctaagggt tgtatgccag
2941 ccagctggac ttcctgacaa gatgactatt gaaatgtatc ctagtgacca ggtagcagat
3001 cttagggctg aagtaactca ttggtatgaa aatttacaga aagaacaaat aaatcaacaa
3061 gctcagcttc aggagtttgg tcaaagcaac cgaaaaggag agtttcctgg aggcctcatg
3121 ggacctgtca ggatgatttc atctggacac gagttaacaa cagattatga tgaaaaagca
3181 cttcatgagc ttggttttaa ggatatgcag atggtatttg tatctttggg tgcaccaagg
3241 agagagcgga aaggggaagg tgttcagctg ccagcatctt gcctcccacc ccctcagaag
3301 gacaacattc caatgctttt gcttttacaa gagcctcatt taactactct ttttgattta
3361 ttagagatgc ttgcatcatt taaaccaccc tcaggaaaag tggcagtgga tgatagtgag
3421 agcttacgat gtgaagaact tcatcttcat gcagaaaatc tgtctaggcg ggtctgggag
3481 ctactgatgc ttcttcctac atgtcctaat atgttgatgg cattccagaa tatctcagat
3541 gagcagagta atgatggatt taattggaaa gaacttctca aaattaagag cgcccacaag
3601 ctattgtatg ctctggaaat tattgaagca ctgggaaaac ctaatagaag aataaggagg
3661 gagtctacgg gaagttacag tgatctttat ccagattcag atgattcaag tgaggatcaa
3721 gtggaaaata gtaaaaattc ctggagttgc aagtttgttg ctgctggagg gcttcaacag
3781 ttattagaaa tttttaattc tggaattcta gagcctaaag agcaggaatc atggactgtg
3841 tggcagctag actgtcttgc ttgcttgctg aagttaatat gccagtttgc agtagatcca
3901 tccgatttgg atttagctta tcatgatgtc tttgcctggt ctggtatagc ggaaagccat
3961 aggaaaagaa cctggcctgg caaatcaagg aaggctgctg gtgatcatgc taagggtctt
4021 catataccac gattaacaga ggtatttctt gttcttgtcc aaggaaccag tttgattcag
4081 cgacttatgt ctgttgctta tacgtatgat aatctggctc ctagagtttt aaaagctcag
4141 tctgatcaca ggtctagaca tgaagtttca cattattcaa tgtggctctt ggtgagttgg
4201 gctcattgct gttctttagt gaaatctagc cttgctgata gcgatcattt acaagattgg
4261 ctaaagaaat tgactctcct tattcctgag actgcagttc gtcatgaatc atgcagtggt
4321 ctctataagt tatccctgtc agggctggat ggaggagact caatcaatcg ttcttttctg
4381 ctattggctg cctcaacatt attgaaattt cttcctgatg ctcaagcact caaacctatt
4441 aggatagatg attatgagga agaaccaata ttaaaaccag gatgtaaaga gtatttttgg
4501 ttgttatgca aattagttga caacatacat ataaaggacg ctagtcagac aacgctcctc
4561 gacttagatg ccttggcaag acatttggct gactgtattc gaagtaggga gatccttgat
4621 catcaggatg gtaatgtaga agatgatggg cttacaggac tcctaaggct tgcaacaagt
4681 gttgttaaac acaaaccacc ctttaaattt tcaagggaag gacaggaatt tttgagagat
4741 atcttcaatc tcctgttttt gttgccaagt ctaaaggacc gacaacagcc aaagtgcaaa
4801 tcacattctt caagagctgc cgcttacgat ttgttagtag agatggtaaa ggggtctgtt
4861 gagaactaca ggctaataca caactgggtt atggcacaac acatgcagtc ccatgcacct
4921 tataaatggg attactggcc tcatgaagat gtccgtgctg aatgtagatt tgttggcctt
4981 actaaccttg gagctacttg ttacttagct tctactattc agcaacttta tatgatacct
5041 gaggcaagac aggctgtctt cactgccaag tattcagagg atatgaagca caagaccact
5101 cttctggagc ttcagaaaat gtttacatat ttaatggaga gtgaatgcaa agcatataat
5161 cctagacctt tctgtaaaac atacaccatg gataagcagc ctctgaatac tggggaacag
5221 aaagatatga cagagttttt tactgatcta attaccaaaa tcgaagaaat gtctcccgaa
5281 ctgaaaaata ccgtcaaaag tttatttgga ggtgtaatta caaacaatgt tgtatccttg
5341 gattgtgaac atgttagtca aactgctgaa gagttttata ctgtgaggtg ccaagtggct
5401 gatatgaaga acatttatga atctcttgat gaagttacta taaaagacac tttggaaggt
5461 gataacatgt atacttgttc tcattgtggg aagaaagtac gagctgaaaa aagggcatgt
5521 tttaagaaat tgcctcgcat tttgagtttc aatactatga gatacacatt taatatggtc
5581 acgatgatga aagagaaagt gaatacacac ttttccttcc cattacgttt ggacatgacg
5641 ccctatacag aagattttct tatgggaaag agtgagagga aagaaggttt taaagaagtc
5701 agtgatcatt caaaagactc agagagctat gaatatgact tgataggagt gactgttcac
5761 acaggaacgg cagatggtgg acactattat agctttatca gagatatagt aaatccccat
5821 gcttataaaa acaataaatg gtatcttttt aatgatgctg aggtaaaacc ttttgattct
5881 gctcaacttg catctgaatg ttttggtgga gagatgacga ccaagaccta tgattctgtt
5941 acagataaat ttatggactt ctcttttgaa aagacacaca gtgcatatat gctgttttac
6001 aaacgcatgg aaccagagga agaaaatggc agagaataca aatttgatgt ttcgtcagag
6061 ttactagagt ggatttggca tgataacatg cagtttcttc aagacaaaaa catttttgaa
6121 catacatatt ttggatttat gtggcaattg tgtagttgta ttcccagtac attaccagat
6181 cctaaagctg tgtccttaat gacagcaaag ttaagcactt cctttgtcct agagacattt
6241 attcattcta aagaaaagcc cacgatgctt cagtggattg aactgttgac gaaacagttt
6301 aataatagtc aggcagcttg tgagtggttt ttagatcgta tggctgatga cgactggtgg
6361 ccaatgcaga tactaattaa gtgccctaat caaattgtga gacagatgtt tcagcgtttg
6421 tgtatccatg tgattcagag gctgagacct gtgcatgctc atctctattt gcagccagga
6481 atggaagatg ggtcagatga tatggatacc tcagtagaag atattggtgg tcgttcatgt
6541 gtcactcgct ttgtgagaac cctgttatta attatggaac atggtgtaaa acctcacagt
6601 aaacatctta cagagtattt tgccttcctt tacgaatttg caaaaatggg tgaagaagag
6661 agccaatttt tgctttcatt gcaagctata tctacaatgg tacattttta catgggaaca
6721 aaaggacctg aaaatcctca agttgaagtg ttatcagagg aagaagggga agaagaagag
6781 gaggaagaag atatcctctc tctggcagaa gaaaaataca ggccagctgc ccttgaaaag
6841 atgatagctt tagttgctct tttggttgaa cagtctcgat cagaaaggca tttgacatta
6901 tcacagactg acatggcagc attaacagga ggaaagggat ttcccttctt gtttcaacat
6961 attcgtgatg gcatcaatat aagacaaact tgtaatctga ttttcagcct gtgtcgatac
7021 aataatcgac ttgcagaaca tattgtatct atgcttttca catcaatagc aaagttgact
7081 cctgaggcag ccaatccttt ctttaagttg ttgactatgc taatggagtt tgctggtgga
7141 cctccaggaa tgcctccctt tgcatcttat attctgcaga ggatatggga ggtgattgaa
7201 tacaatcctt ctcagtgtct agattggttg gcagtgcaga caccccgaaa taaactggca
7261 cacagctggg tcttacagaa tatggaaaac tgggtcgagc ggtttctttt ggctcacaat
7321 tatcctagag tgaggacttc tgcagcttat cttctggtgt cccttatacc aagcaattca
7381 ttccgtcaga tgttccggtc aacaaggtct ttgcacatcc caacccgtga ccttccactc
7441 agtccagaca caacagtagt cctacatcag gtctacaacg tgctccttgg tttgctctca
7501 agagccaaac tttatgttga tgctgctgtt catggcacta caaagctagt gccctatttt
7561 agctttatga cttactgttt aatttccaaa actgagaagc tgatgttttc cacatatttc
7621 atggatttgt ggaacctttt ccagcctaaa ctttctgagc cagcaatagc tacaaatcac
7681 aataaacagg ctttgctttc attttggtac aatgtctgtg ctgactgtcc agagaatatc
7741 cgccttattg ttcagaaccc agtggtaacc aagaacattg ccttcaatta catccttgct
7801 gaccatgatg atcaggatgt ggtgcttttt aaccgtggga tgctgccagc gtactatggc
7861 attctgaggc tctgctgtga gcagtctcct gcattcacac gacaactggc ttctcaccag
7921 aacatccagt gggcctttaa gaatcttaca ccacatgcca gccaataccc tggagcagta
7981 gaagaactgt ttaacctgat gcagctgttt atagctcaga ggccagatat gagagaagaa
8041 gaattagaag atattaaaca gttcaagaaa acaaccataa gttgttactt acgttgctta
8101 gatggccgct cctgctggac tactttaata agtgccttca gaatactatt agaatctgat
8161 gaagacagac ttcttgttgt atttaatcga ggattgattc taatgacaga gtctttcaac
8221 actttgcaca tgatgtatca cgaagctaca gcttgccatg tgactggaga tttagtagaa
8281 cttctgtcaa tatttctttc ggttttgaag tctacacgcc cttatcttca gagaaaagat
8341 gtgaaacaag cattaatcca gtggcaggag cgaattgaat ttgcccataa actgttaact
8401 cttcttaatt cctatagtcc tccagaactt agaaatgcct gtatagatgt cctcaaggaa
8461 cttgtacttt tgagtcccca tgattttctt catactctgg ttccctttct acaacacaac
8521 cattgtactt accatcacag taatatacca atgtctcttg gaccttattt cccttgtcga
8581 gaaaatatca agctaatagg agggaaaagc aatattcggc ctccgcgccc tgaactcaat
8641 atgtgcctct tgcccacaat ggtggaaacc agtaagggca aagatgacgt ttatgatcgt
8701 atgctgctag actacttctt ttcttatcat cagttcatcc atctattatg ccgagttgca
8761 atcaactgtg aaaaatttac tgaaacatta gttaagctga gtgtcctagt tgcctatgaa
8821 ggtttgccac ttcatcttgc actgttcccc aaactttgga ctgagctatg ccagactcag
8881 tctgctatgt caaaaaactg catcaagctt ttgtgtgaag atcctgtttt cgcagaatat
8941 attaaatgta tcctaatgga tgaaagaact tttttaaaca acaacattgt ctacacgttc
9001 atgacacatt tccttctaaa ggttcaaagt caagtgtttt ctgaagcaaa ctgtgccaat
9061 ttgatcagca ctcttattac aaacttgata agccagtatc agaacctaca gtctgatttc
9121 tccaaccgag ttgaaatttc caaagcaagt gcttctttaa atggggacct gagggcactc
9181 gctttgctcc tgtcagtaca cactcccaaa cagttaaacc cagctctaat tccaactctg
9241 caagagcttt taagcaaatg caggacttgt ctgcaacaga gaaactcact ccaagagcaa
9301 gaagccaaag aaagaaaaac taaagatgat gaaggagcaa ctcccattaa aaggcggcgt
9361 gttagcagtg atgaggagca cactgtagac agctgcatca gtgacatgaa aacagaaacc
9421 agggaggtcc tgaccccaac gagcacttct gacaatgaga ccagagactc ctcaattatt
9481 gatccaggaa ctgagcaaga tcttccttcc cctgaaaata gttctgttaa agaataccga
9541 atggaagttc catcttcgtt ttcagaagac atgtcaaata tcaggtcaca gcatgcagaa
9601 gaacagtcca acaatggtag atatgacgat tgtaaagaat ttaaagacct ccactgttcc
9661 aaggattcta ccctagctga ggaagaatct gagttccctt ctacttctat ctctgcagtt
9721 ctgtctgact tagctgactt gagaagctgt gatggccaag ctttgccctc ccaggaccct
9781 gaggttgctt tatctctcag ttgtggccat tccagaggac tctttagtca tatgcagcaa
9841 catgacattt tagataccct gtgtaggacc attgaatcta caatccatgt cgtcacaagg
9901 atatctggca aaggaaacca agctgcttct tga
【０１６０】
表１(ｃ)−ＵＳＰ＿Ｎ０１参照配列(Derwent AAU82706)
アミノ酸配列：
1 mcencadlve vlneisdveg gdglqlrkeh tlkiftyins wtqrqclccf keykhleifn
61 qvvcalinlv iaqvqvlrdq lckhcttini dstwqdesnq aeeplnidre cnegsterqk
121 siekksnstr icnlteeess kssdpfslws tdekeklllc vakifqiqfp lytaykhnth
181 ptiedistqe snilgafcdm ndvevplhll ryvclfcgkn glslmkdcfe ygtpetlpfl
241 iahafitvvs niriwlhipa vmqhiipfrt yvirylckls dqelrqsaar nmadlmwstv
301 kepldttlcf dkesldlafk yfmsptltmr laglsqitnq lhtfndvcnn eslvsdtets
361 iakeladwli snnvvehifg pnlhieiikq cqvilnflaa egrlstqhid ciwaaaqlkh
421 csryihdlfp sliknldpvp lrhllnlvsa lepsvhteqt lylasmlika lwnnalaaka
481 qlskqssfas llntnipign kkeeeelrrt apspwspaas pqssdnsdth qsggsdiemd
541 eqlinrtkhv qqrlsdtees mqgssdetan sgedgssgpg sssghsdgss nevnsshasq
601 sagspgsevq sediadieal keededddhg hnppksscgt dlrnrklesq agiclgdsqg
661 tserngtssg tgkdlvfnte slpsvdnrmr mldacshsed pehdisgemn athiaqgsqe
721 scitrtgdfl getignelfn crqfigpqhh hhhhhhhhhh dghmvddmls addvscsssq
781 vsakseknma dfdgeesgce eelvqinsha eltshlqqhl pnlasiyheh lsqgpvvhkh
841 qfnsnavtdi nldnvckkgn tllwdivqde davnlsegli neaekllcsl vcwftdrqir
901 mrfiegclen lgnnrsvvis lrllpklfgt fqqfgssydt hwitmwaeke lnmmklffdn
961 lvyyiqtvre grqkhalysh saevqvrlqf ltcvfstlgs pdhfrlsleq vdilwhclve
1021 dsecyddalh wflnqvrskd qhamgmetyk hlflekmpql kpetismtgl nlfqhlcnla
1081 rlatsaydgc snselcgmdq fwgialraqs gdvsraaiqy insyyingkt glekeqefis
1141 kcmeslmias ssleqeshss lmviergllm lkthleafrr rfayhlrqwq iegtgisshl
1201 kalsdkqslp lrvvcqpagl pdkmtiemyp sdqvadlrae vthwyenlqk eqinqqaqlq
1261 efgqsnrkge fpgglmgpvr missgheltt dydekalhel gfkdmqmvfv slgaprrerk
1321 gegvqlpasc lpppqkdnip mllllqephl ttlfdlleml asfkppsgkv avddseslrc
1381 eelhlhaenl srrvwellml lptcpnmlma fqnisdeqsf kaqsdhrsrh evshysmwll
1441 vswahccslv kssladsdhl qdwlkkltll ipetavrhes csglyklsls gldggdsinr
1501 sflllaastl lkflpdaqal kpiriddyee epilkpgcke yfwllcklvd nihikdasqt
1561 tlldldalar hladcirsre ildhqdgnve ddgltgllrl atsvvkhkpp fkfsregqef
1621 lrdifnllfl lpslkdrqqp kckshssraa aydllvemvk gsvenyrlih nwvmaqhmqs
1681 hapykwdywp hedvraecrf vgltnlgatc ylastiqqly mipearqavf takysedmkh
1741 kttllelqkm ftylmeseck aynprpfckt ytmdkqplnt geqkdmteff tdlitkieem
1801 spelkntvks lfggvitnnv vsldcehvsq taeefytvrc qvadmkniye sldevtikdt
1861 legdnmytcs qcgkkvraek racfkklpri xsfntmrytf nmvtmmkekv nthfsfplrl
1921 dmtpytedfl mgkserkegf kevsdhskds esyeydligv tvhtgtadgg hyysfirdiv
1981 nphayknnkw ylfndaevkp fdsaqlasec fggemttkty dsvtdkfmdf sfekthsaym
2041 lfykrmepee engreykfdv ssellewiwh dnmqflqdkn ifehtyfgfm wqlcscipst
2101 lpdpkavslm taklstsfvl etfihskekp tmlqwiellt kqfnnsqaac ewfldrmadd
2161 dwwpmqilik cpnqivrqmf qrlcihviqr lrpvhahlyl qpgmedgsdd mdtsvedigg
2221 rscvtrfvrt lllimehgvk phskhlteyf aflyefakmg eeesqfllsl qaistmvhfy
2281 mgtkgpenpq vevlseeegg eeeeeedils laeekyrpaa lekmialval lveqsrserh
2341 ltlsqtdmaa ltggkgfpfl fqhirdgini rqtcnlifsl crynnrlaeh ivsmlftsia
2401 kltpeaanpf fklltmlmef aggppgmppf asyilqriwe vieynpsqcl dwlavqtprn
2461 klahswvlqn menwverfll ahnyprvrts aayllvslip snsfrqmfrs trslhiptrd
2521 lplspdttvv lhqvynvllg llsraklyvd aavhgttklv pyfsfmtycl iskteklmfs
2581 tyfmdlwnlf qpklsepaia tnhnkqalls fwynvcadcp enirlivqnp vvtkniafny
2641 iladhddqdv vlfnrgmlpa yygilrlcce qspaftrqla shqniqwafk nltphasqyp
2701 gaveelfnlm qlfiaqrpdm reeeledikq fkkttiscyl rcldgrscwt tlisafrill
2761 esdedrllvv fnrglilmte sfntlhmmyh eatachvtgd lvellsifls vlkstrpylq
2821 rkdvkqaliq wqeriefahk lltllnsysp pelrnacidv lkelvllsph dflhtlvpfl
2881 qhnhctyhhs nipmslgpyf pcreniklig gksnirpprp elnmcllptm vetskgkddv
2941 ydrmlldyff syhqfihllc rvaincekft etlvklsvlv ayeglplhla lfpklwtelc
3001 qtqsamsknc ikllcedpvf aeyikcilmd ertflnnniv ytfmthfllk vqsqvfsean
3061 canlistlit nlisqyqnlq sdfsnrveis kasaslngdl ralalllsvh tpkqlnpali
3121 ptlqellskc rtclqqrnsl qeqeakerkt kddegatpik rrrvssdeeh tvdscisdmk
3181 tetrevltpt stsdnetrds siidpgteqd lpspenssvk eyrmevpssf sedmsnirsq
3241 haeeqsnngr yddckefkdl hcskdstlae eesefpstsi savlsdladl rscdgqalps
3301 qdpevalsls cghsrglfsh mqqhdildtl crtiestihv vtrisgkgnq aas
【０１６１】
表１(ｄ)−ＵＳＰ＿Ｎ０１参照配列(Derwent AAU82706)
ヌクレオチド配列：
atgtgcgaga actgcgcaga cctggtggag gtgttaaatg aaatatcaga tgtagaaggt 60
ggtgatggac tgcagctcag aaaggaacat actctcaaaa tatttactta catcaattcc 120
tggacacaga ggcaatgtct atgctgcttc aaggaatata agcatttgga gatttttaat 180
caagtagtgt gtgcacttat taacttagtg attgcccaag ttcaagtgct ccgggaccag 240
ctttgtaaac attgtactac cattaacata gattccacgt ggcaagatga gagtaatcaa 300
gcagaagaac cactgaatat agatagagag tgtaatgaag gaagtacaga aagacaaaaa 360
tcaatagaaa aaaaatcaaa ctctacaaga atttgtaatc tgactgagga ggaatcttca 420
aagagttctg atccttttag tttatggagt acagatgaga aggaaaaact cttactatgt 480
gtggcaaaaa tttttcaaat tcagtttccc ttatatactg cttacaagca taatactcac 540
cctactattg aggatatatc aactcaagaa agtaacatat taggggcatt ctgtgatatg 600
aatgatgtag aagtaccatt gcatttgctt cgttatgtat gtttgttttg tgggaaaaat 660
ggcctttctc tcatgaagga ttgctttgaa tatggaactc ctgaaacttt gccatttctt 720
atagcacatg cgtttattac agttgtgtct aatattagaa tatggctaca tattcccgct 780
gtcatgcagc acattatacc ttttaggacc tatgttatta ggtatttatg caagctctcg 840
gatcaggagt tacgacagag tgcagctcgt aacatggctg acttaatgtg gagcacagtc 900
aaagaaccat tggatacaac attatgcttt gataaagaaa gcctagatct tgcatttaag 960
tactttatgt cacctacttt gactatgagg ttggctggat tgagtcagat aacaaatcaa 1020
ctccatacct tcaatgatgt gtgcaataat gaatcattag tatcggacac agaaacgtcc 1080
attgcaaaag aacttgcaga ctggcttatt agcaacaatg tggtggagca tatatttgga 1140
ccaaatttac atattgagat tatcaaacag tgccaagtga ttttgaattt tttggcagca 1200
gaagggcgac tgagtactca acatattgac tgtatttggg ctgcagcaca gttgaaacat 1260
tgtagtcggt atatacatga cttatttcct tcactcatca agaatttgga tcccgtacca 1320
cttagacatc tacttaatct ggtctcagct cttgagccaa gtgttcatac tgaacagaca 1380
ctgtacttgg catccatgtt aattaaagca ctgtggaata acgcactagc agctaaggct 1440
cagttatcta aacagagttc ttttgcatct ttattaaata ctaatattcc cattggaaat 1500
aagaaagagg aagaagagct tagaagaaca gctccatcac cttggtcacc tgcagctagt 1560
cctcaaagca gtgataatag cgatacacat caaagtggag gtagtgacat tgaaatggat 1620
gagcaactta ttaatagaac caaacatgtg caacaacgac tttcagacac agaggaatcc 1680
atgcagggaa gttctgacga aactgccaac agtggtgaag atggaagcag tggtcctggt 1740
agcagtagtg ggcatagtga tggatctagc aatgaggtta attctagcca cgcaagccag 1800
tcagctggga gccctggcag tgaggtacag tcagaagaca ttgcagatat tgaagccctc 1860
aaagaggaag atgaagacga tgatcatggt cataatcctc ccaaaagcag ttgtggtaca 1920
gatcttcgga atagaaagtt agagagtcaa gcaggcattt gcctggggga ctcccaaggc 1980
acgtcagaaa gaaatgggac aagcagcgga acaggaaagg acctggtttt taacactgaa 2040
tcattgccat cagtagataa tcgaatgcga atgctggatg cttgttcaca ctctgaagac 2100
ccagaacatg atatttcagg ggaaatgaat gctactcata tagcacaagg gtctcaggag 2160
tcttgtatca cacgaactgg ggacttcctt ggggagacta ttgggaatga attatttaat 2220
tgtcgacaat ttattggtcc acagcatcac caccaccacc accaccatca ccaccaccac 2280
gatgggcata tggttgatga tatgctaagt gcagatgatg tcagttgtag tagctcccag 2340
gttagtgcaa aatcagaaaa aaatatggct gattttgatg gtgaagaatc tggatgtgaa 2400
gaggagctag ttcagattaa ttcacatgcg gaactgacat ctcacctcca acaacatctt 2460
cccaatttag cttccattta ccatgaacat cttagtcaag gacctgtagt tcataaacat 2520
caattcaaca gtaatgctgt tacagacatt aatttggata atgtttgcaa gaaaggaaat 2580
actttgttgt gggatatagt ccaagatgaa gatgcagtta atctttctga aggattaata 2640
aatgaagcag agaaacttct ttgttcgtta gtatgttggt ttacagatag acaaattcga 2700
atgagattca ttgaaggttg ccttgaaaac ttgggaaaca acagatcagt agtaatttca 2760
cttcgtcttc ttccaaaact atttggtact tttcagcagt ttgggagcag ttacgataca 2820
cactggataa caatgtgggc agaaaaagaa ctgaacatga tgaagctttt ctttgataat 2880
ttggtatact acattcaaac tgtgagagaa ggaagacaaa aacatgcact gtacagccat 2940
agtgctgaag ttcaagttcg tcttcaattc ttgacttgtg tattttcaac tctgggatca 3000
cctgatcatt tcaggttaag tttagagcaa gttgacatct tatggcattg tttagtagaa 3060
gattctgaat gttatgatga tgcactccat tggtttttaa atcaagttcg aagtaaagat 3120
caacatgcta tgggtatgga aacctacaaa catcttttcc tggagaagat gccccagcta 3180
aaacctgaaa caattagcat gactggctta aacctgtttt cagcatctct gtaacttggc 3240
tcgattggct accagtgcct atgatggttg ttcaaattct gagctgtgtg gtatggacca 3300
attttggggc attgctttaa gagcacaatc tggtgatgtc agtcgagcag ctatccagta 3360
tattaactcc tattatatta atggtaaaac aggtttggag aaggagcaag aatttattag 3420
taagtgcatg gagagtctta tgatagcttc tagcagtctt gaacaggaat cacactcaag 3480
tctcatggtt atagaaagag gactccttat gctgaagaca catctggaag cgtttaggag 3540
aaggtttgca tatcatctga gacagtggca aattgaaggc actggtatta gtagtcattt 3600
gaaagcactg agtgacaaac agtctctgcc gctaagggtt gtatgccagc cagctggact 3660
tcctgacaag atgactattg aaatgtatcc tagtgaccag gtagcagatc ttagggctga 3720
agtaactcat tggtatgaaa atttacagaa agaacaaata aatcaacaag ctcagcttca 3780
ggagtttggt caaagcaacc gaaaaggaga gtttcctgga ggcctcatgg gacctgtcag 3840
gatgatttca tctggacacg agttaacaac agattatgat gaaaaagcac ttcatgagct 3900
tggttttaag gatatgcaga tggtatttgt atctttgggt gcaccaagga gagagcggaa 3960
aggggaaggt gttcagctgc cagcatcttg cctcccaccc cctcagaagg acaacattcc 4020
aatgcttttg cttttacaag agcctcattt aactactctt tttgatttat tagagatgct 4080
tgcatcattt aaaccaccct caggaaaagt ggcagtggat gatagtgaga gcttacgatg 4140
tgaagaactt catcttcatg cagaaaatct gtctaggcgg gtctgggagc tactgatgct 4200
tcttcctaca tgtcctaata tgttgatggc attccagaat atctcagatg agcagagttt 4260
taaagctcag tctgatcaca ggtctagaca tgaagtttca cattattcaa tgtggctctt 4320
ggtgagttgg gctcattgct gttctttagt gaaatctagc cttgctgata gcgatcattt 4380
acaagattgg ctaaagaaat tgactctcct tattcctgag actgcagttc gtcatgaatc 4440
atgcagtggt ctctataagt tatccctgtc agggctggat ggaggagact caatcaatcg 4500
ttcttttctg ctattggctg cctcaacatt attgaaattt cttcctgatg ctcaagcact 4560
caaacctatt aggatagatg attatgagga agaaccaata ttaaaaccag gatgtaaaga 4620
gtatttttgg ttgttatgca aattagttga caacatacat ataaaggacg ctagtcagac 4680
aacgctcctc gacttagatg ccttggcaag acatttggct gactgtattc gaagtaggga 4740
gatccttgat catcaggatg gtaatgtaga agatgatggg cttacaggac tcctaaggct 4800
tgcaacaagt gttgttaaac acaaaccacc ctttaaattt tcaagggaag gacaggaatt 4860
tttgagagat atcttcaatc tcctgttttt gttgccaagt ctaaaggacc gacaacagcc 4920
aaagtgcaaa tcacattctt caagagctgc cgcttacgat ttgttagtag agatggtaaa 4980
ggggtctgtt gagaactaca ggctaataca caactgggtt atggcacaac acatgcagtc 5040
ccatgcacct tataaatggg attactggcc tcatgaagat gtccgtgctg aatgtagatt 5100
tgttggcctt actaaccttg gagctacttg ttacttagct tctactattc agcaacttta 5160
tatgatacct gaggcaagac aggctgtctt cactgccaag tattcagagg atatgaagca 5220
caagaccact cttctggagc ttcagaaaat gtttacatat ttaatggaga gtgaatgcaa 5280
agcatataat cctagacctt tctgtaaaac atacaccatg gataagcagc ctctgaatac 5340
tggggaacag aaagatatga cagagttttt tactgatcta attaccaaaa tcgaagaaat 5400
gtctcccgaa ctgaaaaata ccgtcaaaag tttatttgga ggtgtaatta caaacaatgt 5460
tgtatccttg gattgtgaac atgttagtca aactgctgaa gagttttata ctgtgaggtg 5520
ccaagtggct gatatgaaga acatttatga atctcttgat gaagttacta taaaagacac 5580
tttggaaggt gataacatgt atacttgttc tcaatgtggg aagaaagtac gagctgaaaa 5640
aagggcatgt tttaagaaat tgcctcgcat tttnagtttc aatactatga gatacacatt 5700
taatatggtc acgatgatga aagagaaagt gaatacacac ttttccttcc cattacgttt 5760
ggacatgacg ccctatacag aagattttct tatgggaaag agtgagagga aagaaggttt 5820
taaagaagtc agtgatcatt caaaagactc agagagctat gaatatgact tgataggagt 5880
gactgttcac acaggaacgg cagatggtgg acactattat agctttatca gagatatagt 5940
aaatccccat gcttataaaa acaataaatg gtatcttttt aatgatgctg aggtaaaacc 6000
ttttgattct gctcaacttg catctgaatg ttttggtgga gagatgacga ccaagaccta 6060
tgattctgtt acagataaat ttatggactt ctcttttgaa aagacacaca gtgcatatat 6120
gctgttttac aaacgcatgg aaccagagga agaaaatggc agagaataca aatttgatgt 6180
ttcgtcagag ttactagagt ggatttggca tgataacatg cagtttcttc aagacaaaaa 6240
catttttgaa catacatatt ttggatttat gtggcaattg tgtagttgta ttcccagtac 6300
attaccagat cctaaagctg tgtccttaat gacagcaaag ttaagcactt cctttgtcct 6360
agagacattt attcattcta aagaaaagcc cacgatgctt cagtggattg aactgttgac 6420
gaaacagttt aataatagtc aggcagcttg tgagtggttt ttagatcgta tggctgatga 6480
cgactggtgg ccaatgcaga tactaattaa gtgccctaat caaattgtga gacagatgtt 6540
tcagcgtttg tgtatccatg tgattcagag gctgagacct gtgcatgctc atctctattt 6600
gcagccagga atggaagatg ggtcagatga tatggatacc tcagtagaag atattggtgg 6660
tcgttcatgt gtcactcgct ttgtgagaac cctgttatta attatggaac atggtgtaaa 6720
acctcacagt aaacatctta cagagtattt tgccttcctt tacgaatttg caaaaatggg 6780
tgaagaagag agccaatttt tgctttcatt gcaagctata tctacaatgg tacattttta 6840
catgggaaca aaaggacctg aaaatcctca agttgaagtg ttatcagagg aagaaggggg 6900
agaagaagag gaggaagaag atatcctctc tctggcagaa gaaaaataca ggccagctgc 6960
ccttgaaaag atgatagctt tagttgctct tttggttgaa cagtctcgat cagaaaggca 7020
tttgacatta tcacagactg acatggcagc attaacagga ggaaagggat ttcccttctt 7080
gtttcaacat attcgtgatg gcatcaatat aagacaaact tgtaatctga ttttcagcct 7140
gtgtcgatac aataatcgac ttgcagaaca tattgtatct atgcttttca catcaatagc 7200
aaagttgact cctgaggcag ccaatccttt ctttaagttg ttgactatgc taatggagtt 7260
tgctggtgga cctccaggaa tgcctccctt tgcatcttat attctgcaga ggatatggga 7320
ggtgattgaa tacaatcctt ctcagtgtct agattggttg gcagtgcaga caccccgaaa 7380
taaactggca cacagctggg tcttacagaa tatggaaaac tgggtcgagc ggtttctttt 7440
ggctcacaat tatcctagag tgaggacttc tgcagcttat cttctggtgt cccttatacc 7500
aagcaattca ttccgtcaga tgttccggtc aacaaggtct ttgcacatcc caacccgtga 7560
ccttccactc agtccagaca caacagtagt cctacatcag gtctacaacg tgctccttgg 7620
tttgctctca agagccaaac tttatgttga tgctgctgtt catggcacta caaagctagt 7680
gccctatttt agctttatga cttactgttt aatttccaaa actgagaagc tgatgttttc 7740
cacatatttc atggatttgt ggaacctttt ccagcctaaa ctttctgagc cagcaatagc 7800
tacaaatcac aataaacagg ctttgctttc attttggtac aatgtctgtg ctgactgtcc 7860
agagaatatc cgccttattg ttcagaaccc agtggtaacc aagaacattg ccttcaatta 7920
catccttgct gaccatgatg atcaggatgt ggtgcttttt aaccgtggga tgctgccagc 7980
gtactatggc attctgaggc tctgctgtga gcagtctcct gcattcacac gacaactggc 8040
ttctcaccag aacatccagt gggcctttaa gaatcttaca ccacatgcca gccaataccc 8100
tggagcagta gaagaactgt ttaacctgat gcagctgttt atagctcaga ggccagatat 8160
gagagaagaa gaattagaag atattaaaca gttcaagaaa acaaccataa gttgttactt 8220
acgttgctta gatggccgct cctgctggac tactttaata agtgccttca gaatactatt 8280
agaatctgat gaagacagac ttcttgttgt atttaatcga ggattgattc taatgacaga 8340
gtctttcaac actttgcaca tgatgtatca cgaagctaca gcttgccatg tgactggaga 8400
tttagtagaa cttctgtcaa tatttctttc ggttttgaag tctacacgcc cttatcttca 8460
gagaaaagat gtgaaacaag cattaatcca gtggcaggag cgaattgaat ttgcccataa 8520
actgttaact cttcttaatt cctatagtcc tccagaactt agaaatgcct gtatagatgt 8580
cctcaaggaa cttgtacttt tgagtcccca tgattttctt catactctgg ttccctttct 8640
acaacacaac cattgtactt accatcacag taatatacca atgtctcttg gaccttattt 8700
cccttgtcga gaaaatatca agctaatagg agggaaaagc aatattcggc ctccgcgccc 8760
tgaactcaat atgtgcctct tgcccacaat ggtggaaacc agtaagggca aagatgacgt 8820
ttatgatcgt atgctgctag actacttctt ttcttatcat cagttcatcc atctattatg 8880
ccgagttgca atcaactgtg aaaaatttac tgaaacatta gttaagctga gtgtcctagt 8940
tgcctatgaa ggtttgccac ttcatcttgc actgttcccc aaactttgga ctgagctatg 9000
ccagactcag tctgctatgt caaaaaactg catcaagctt ttgtgtgaag atcctgtttt 9060
cgcagaatat attaaatgta tcctaatgga tgaaagaact tttttaaaca acaacattgt 9120
ctacacgttc atgacacatt tccttctaaa ggttcaaagt caagtgtttt ctgaagcaaa 9180
ctgtgccaat ttgatcagca ctcttattac aaacttgata agccagtatc agaacctaca 9240
gtctgatttc tccaaccgag ttgaaatttc caaagcaagt gcttctttaa atggggacct 9300
gagggcactc gctttgctcc tgtcagtaca cactcccaaa cagttaaacc cagctctaat 9360
tccaactctg caagagcttt taagcaaatg caggacttgt ctgcaacaga gaaactcact 9420
ccaagagcaa gaagccaaag aaagaaaaac taaagatgat gaaggagcaa ctcccattaa 9480
aaggcggcgt gttagcagtg atgaggagca cactgtagac agctgcatca gtgacatgaa 9540
aacagaaacc agggaggtcc tgaccccaac gagcacttct gacaatgaga ccagagactc 9600
ctcaattatt gatccaggaa ctgagcaaga tcttccttcc cctgaaaata gttctgttaa 9660
agaataccga atggaagttc catcttcgtt ttcagaagac atgtcaaata tcaggtcaca 9720
gcatgcagaa gaacagtcca acaatggtag atatgacgat tgtaaagaat ttaaagacct 9780
ccactgttcc aaggattcta ccctagctga ggaagaatct gagttccctt ctacttctat 9840
ctctgcagtt ctgtctgact tagctgactt gagaagctgt gatggccaag ctttgccctc 9900
ccaggaccct gaggttgctt tatctctcag ttgtggccat tccagaggac tctttagtca 9960
tatgcagcaa catgacattt tagataccct gtgtaggacc attgaatcta caatccatgt 10020
cgtcacaagg atatctggca aaggaaacca agctgcttct tga                   10063
【０１６２】
表２(ａ)ＵＳＰ＿Ｎ０７：新規スプライス変異体−アミノ酸配列
座位 USP_N07 1355 aa PRT
受託 NP_060414
GeneSeq AAU82714
起源 ヒト
1個の挿入により特徴付けられるスプライス形:
Pos 14-Pos 81
1 MVPGEENQLV PKEIENAAEE PRVLCIIQDT TNSKTVNERI TLNLPASTPV RKLFEDVANK
61 VGYINGTFDL VWGNGINTAD MAPLDHTSDK SLLDANFEPG KKNFLHLTDK DGEQPQILLE
121 DSSAGEDSVH DRFIGPLPRE GSVGSTSDYV SQSYSYSSIL NKSETGYVGL VNQAMTCYLN
181 SLLQTLFMTP EFRNALYKWE FEESEEDPVT SIPYQLQRLF VLLQTSKKRA IETTDVTRSF
241 GWDSSEAWQQ HDVQELCRVM FDALEQKWKQ TEQADLINEL YQGKLKDYVR CLECGYEGWR
301 IDTYLDIPLV IRPYGSSQAF ASVEEALHAF IQPEILDGPN QYFCERCKKK CDARKGLRFL
361 HFPYLLTLQL KRFDFDYTTM HRIKLNDRMT FPEELDMSTF IDVEDEKSPQ TESCTDSGAE
421 NEGSCHSDQM SNDFSNDDGV DEGICLETNS GTEKISKSGL EKNSLIYELF SVMVHSGSAA
481 GGHYYACIKS FSDEQWYSFN DQHVSRITQE DIKKTHGGSS GSRGYYSSAF ASSTNAYMLI
541 YRLKDPARNA KFLEVDEYPE HIKNLVQKER ELEEQEKRQR EIERNTCKIK LFCLHPTKQV
601 MMENKLEVHK DKTLKEAVEM AYKMMDLEEV IPLDCCRLVK YDEFHDYLER SYEGEEDTPM
661 GLLLGGVKST YMFDLLLETR KPDQVFQSYK PGEVMVKVHV VDLKAESVAA PITVRAYLNQ
721 TVTEFKQLIS KAIHLPAETM RIVLERCYND LRLLSVSSKT LKAEGFFRSN KVFVESSETL
781 DYQMAFADSH LWKLLDRHAN TIRLFVLLPE QSPVSYSKRT AYQKAGGDSG NVDDDCERVK
841 GPVGSLKSVE AILEESTEKL KSLSLQQQQD GDNGDSSKST ETSDFENIES PLNERDSSAS
901 VDNRELEQHI QTSDPENFQS EERSDSDVNN DRSTSSVDSD ILSSSHSSDT LCNADNAQIP
961 LANGLDSHSI TSSRRTKANE GKKETWDTAE EDSGTDSEYD ESGKSRGEMQ YMYFKAEPYA
1021 ADEGSGEGHK WLMVHVDKRI TLAAFKQHLE PFVGVLSSHF KVFRVYASNQ EFESVRLNET
1081 LSSFSDDNKI TIRLGRALKK GEYRVKVYQL LVNEQEPCKF LLDAVFAKGM TVRQSKEELI
1141 PQLREQCGLE LSIDRFRLRK KTWKNPGTVF LDYHIYEEDI NISSNWEVFL EVLDGVEKMK
1201 SMSQLAVLSR RWKPSEMKLD PFQEVVLESS SVDELREKLS EISGIPLDDI EFAKGRGTFP
1261 CDISVLDIHQ DLDWNPKVST LNVWPLYICD DGAVIFYRDK TEELMELTDE QRNELMKKES
1321 SRLQKTGHRV TYSPRKEKAL KIYLDGAPNK DLTQD
【０１６３】
表２(ｂ)ＵＳＰ＿Ｎ０７：新規スプライス変異体−ヌクレオチド配列
1 atggtgcccg gcgaggagaa ccaactggtc ccgaaagaga tagaaaatgc tgctgaagaa
61 cctagagtct tatgtattat acaagatact actaattcaa agacagtgaa tgaacggatc
121 actttaaatt taccagcatc tactccagtc agaaagctct ttgaagatgt ggccaacaaa
181 gtaggctaca taaatggaac ctttgacttg gtgtggggaa atggaatcaa tactgctgat
241 atggcaccac tggatcatac cagtgacaag tcacttctcg acgctaattt tgagccagga
301 aagaagaact ttctgcattt gacagataaa gatggtgaac aacctcaaat actgctggag
361 gattccagtg ctggggaaga cagtgttcat gacaggttta taggtccgct tccaagagaa
421 ggttctgtgg gttctaccag tgattatgtc agccaaagct actcctactc atctattttg
481 aataaatcag aaactggata tgtgggacta gtaaaccaag caatgacttg ctatttgaat
541 agccttttgc aaacactttt tatgactcct gaatttagga atgcattata taagtgggaa
601 tttgaagaat ctgaagaaga tccagtgaca agtattccat accaacttca aaggcttttt
661 gttttgttac aaaccagcaa aaagagagca attgaaacca cagatgttac aaggagcttt
721 ggatgggata gtagtgaggc ttggcagcag catgatgtac aagaactatg cagagtcatg
781 tttgatgctt tggaacagaa atggaagcaa acagaacagg ctgatcttat aaatgagcta
841 tatcaaggca agctgaagga ctacgtgaga tgtctggaat gtggttatga gggctggcga
901 atcgacacat atcttgatat tccattggtc atccgacctt atgggtccag ccaagcattt
961 gctagtgtgg aagaagcatt gcatgcattt attcagccag agattctgga tggcccaaat
1021 cagtattttt gtgaacgttg taagaagaag tgtgatgcac ggaagggcct tcggtttttg
1081 cattttcctt atctgctgac cttacagctg aaaagattcg attttgatta tacaaccatg
1141 cataggatta aactgaatga tcgaatgaca tttcccgagg aactagatat gagtactttt
1201 attgatgttg aagatgagaa atctcctcag actgaaagtt gcactgacag tggagcagaa
1261 aatgaaggta gttgtcacag tgatcagatg agcaacgatt tctccaatga tgatggtgtt
1321 gatgaaggaa tctgtcttga aaccaatagt ggaactgaaa agatctcaaa atctggactt
1381 gaaaagaatt ccttgatcta tgaacttttc tctgttatgg ttcattctgg gagcgctgct
1441 ggtggtcatt attatgcatg tataaagtca ttcagtgatg agcagtggta cagcttcaat
1501 gatcaacatg tcagcaggat aacacaagag gacattaaga aaacacatgg tggatcttca
1561 ggaagcagag gatattattc tagtgctttc gcaagttcca caaatgcata tatgctgatc
1621 tatagactga aggatccagc cagaaatgca aaatttctag aagtggatga atacccagaa
1681 catattaaaa acttggtgca gaaagagaga gagttggaag aacaagaaaa gagacaacga
1741 gaaattgagc gcaatacatg caagataaaa ttattctgtt tgcatcctac aaaacaagta
1801 atgatggaaa ataaattgga ggttcataag gataagacat taaaggaagc agtagaaatg
1861 gcttataaga tgatggattt agaagaggta atacccctgg attgctgtcg ccttgttaaa
1921 tatgatgagt ttcatgatta tctagaacgg tcatatgaag gagaagaaga tacaccaatg
1981 gggcttctac taggtggcgt caagtcaaca tatatgtttg atctgctgtt ggagacgaga
2041 aagcctgatc aggttttcca atcttataaa cctggagaag tgatggtgaa agttcatgtt
2101 gttgatctaa aggcagaatc tgtagctgct cctataactg ttcgtgctta cttaaatcag
2161 acagttacag aattcaaaca actgatttca aaggccatcc atttacctgc tgaaacaatg
2221 agaatagtgc tggaacgctg ctacaatgat ttgcgtcttc tcagtgtctc cagtaaaacc
2281 ctgaaagctg aaggattttt tagaagtaac aaggtgtttg ttgaaagctc cgagactttg
2341 gattaccaga tggcctttgc agactctcat ttatggaaac tcctggatcg gcatgcaaat
2401 acaatcagat tatttgtttt gctacctgaa caatccccag tatcttattc caaaaggaca
2461 gcataccaga aagctggagg cgattctggt aatgtggatg atgactgtga aagagtcaaa
2521 ggacctgtag gaagcctaaa gtctgtggaa gctattctag aagaaagcac tgaaaaactc
2581 aaaagcttgt cactgcagca acagcaggat ggagataatg gggacagcag caaaagtact
2641 gagacaagtg actttgaaaa catcgaatca cctctcaatg agagggactc ttcagcatca
2701 gtggataata gagaacttga acagcatatt cagacttctg atccagaaaa ttttcagtct
2761 gaagaacgat cagactcaga tgtgaataat gacaggagta caagttcagt ggacagtgat
2821 attcttagct ccagtcatag cagtgatact ttgtgcaatg cagacaatgc tcagatccct
2881 ttggctaatg gacttgactc tcacagtatc acaagtagta gaagaacgaa agcaaatgaa
2941 gggaaaaaag aaacatggga tacagcagaa gaagactctg gaactgatag tgaatatgat
3001 gagagtggca agagtagggg agaaatgcag tacatgtatt tcaaagctga accttatgct
3061 gcagatgaag gttctgggga aggacataaa tggttgatgg tgcatgttga taaaagaatt
3121 actctggcag ctttcaaaca acatttagag ccctttgttg gagttttgtc ctctcacttc
3181 aaggtctttc gagtgtatgc cagcaatcaa gagtttgaga gcgtccggct gaatgagaca
3241 ctttcatcat tttctgatga caataagatt acaattagac tggggagagc acttaaaaaa
3301 ggagaataca gagttaaagt ataccagctt ttggtcaatg aacaagagcc atgcaagttt
3361 ctgctagatg ctgtgtttgc taaaggaatg actgtacggc aatcaaaaga ggaattaatt
3421 cctcagctca gggagcaatg tggtttagag ctcagtattg acaggtttcg tctaaggaaa
3481 aaaacatgga agaatcctgg cactgtcttt ttggattatc atatttatga agaagatatt
3541 aatatttcca gcaactggga ggttttcctt gaagttcttg atggggtaga gaagatgaag
3601 tccatgtcac agcttgcagt tttgtcaaga cggtggaagc cttcagagat gaagttggat
3661 cccttccagg aggttgtatt ggaaagcagt agtgtggacg aattgcgaga gaagcttagt
3721 gaaatcagtg ggattccttt ggatgatatt gaatttgcta agggtagagg aacatttccc
3781 tgtgatattt ctgtccttga tattcatcaa gatttagact ggaatcctaa agtttctacc
3841 ctgaatgtct ggcctcttta tatctgtgat gatggtgcgg tcatatttta tagggataaa
3901 acagaagaat taatggaatt gacagatgag caaagaaatg aactgatgaa aaaagaaagc
3961 agtcgactcc agaagactgg acatcgtgta acatactcac ctcgtaaaga gaaagcacta
4021 aaaatatatc tggatggagc accaaataaa gatctgactc aagactga
【０１６４】
表２(ｃ)−ＵＳＰ＿Ｎ０７参照配列(Derwent AAU82714)
アミノ酸配列：
1 mvpgeenqlv pkeapldhts dkslldanfe pgkknflhlt dkdgeqpqil ledssageds
61 vhdrfigplp regsvgstsd yvsqsysyss ilnksetgyv glvnqamtcy lnsllqtlfm
121 tpefrnalyk wefeeseedp vtsipyqlqr lfvllqtskk raiettdvtr sfgwdsseaw
181 qqhdvqelcr vmfdaleqkw kqteqadlin elyqgklkdy vrclecgyeg wridtyldip
241 lvirpygssq afasveealh afiqpeildg pnqyfcerck kkcdarkglr flhfpylltl
301 qlkrfdfdyt tmhriklndr mtfpeeldms tfidvedeks pqtesctdsg aenegschsd
361 qmsndfsndd gvdegiclet nsgtekisks gleknsliye lfsvmahsgs aagghyyaci
421 ksfsdeqwys fddqhvsrit qedikkthgg ssgsrgyyss afasstnaym liyrlkdpar
481 nakflevgey pehiknlvqk ereleeqekr qreierntck iklfclhptk qvmmenklev
541 hkdktlkeav emaykmmdle evipldccrl vkydefhdyl ersyegeedt pmglllggvk
601 stymfdllle trkpdqvfqs ykpgevmvkv hvvdlkaesv aapitvrayl nqtvtefkql
661 iskaihlpae tmrivlercy ndlrllsvss ktlkaegffr snkvfvesse tldyqmafad
721 shlwklldrh antirlfvll peqspvsysk rtayqkaggd sgnvdddcer vkgpvgslks
781 veaileeste klkslslqqq qdgdngdssk stetsdfeni esplnerdss asvdnreleq
841 hiqtsdpenf qseersdsdv nndrstssvd sdilssshss dtlcnadnaq iplangldsh
901 sitssrrtka negkketwdt aeedsgtdse ydesgksrge mqymyfkaep yaadegsgeg
961 hkwlmvhvdk ritlaafkqh lepfvgvlss hfkvfrvyas nqefesvrln etlssfsddn
1021 kitirlgral kkgeyrvkvy qllvneqepc kflldavfak gmtvrqskee lipqlreqcg
1081 lelsidrfrl rkktwknpgt vfldyhiyee dinissnwev flevldgvek mksmsqlavl
1141 srrwkpsemk ldpfqevvle sssvdelrek lseisgipld diefakgrgt fpcdisvldi
1201 hqdldwnpkv stlnvwplyi cddgavifyr dkteelmelt deqrnelmkk essrlqktgh
1261 rvtysprkek alkiyldgap nkdltqd
【０１６５】
表２(ｄ)−ＵＳＰ＿Ｎ０７参照配列(Derwent AAU82714)
ヌクレオチド配列：
atggtgcccg gcgaggagaa ccaactggtc ccgaaagagg caccactgga tcataccagt 60
gacaagtcac ttctcgacgc taattttgag ccaggaaaga agaactttct gcatttgaca 120
gataaagatg gtgaacaacc tcaaatactg ctggaggatt ccagtgctgg ggaagacagt 180
gttcatgaca ggtttatagg tccgcttcca agagaaggtt ctgtgggttc taccagtgat 240
tatgtcagcc aaagctactc ctactcatct attttgaata aatcagaaac tggatatgtg 300
ggactagtaa accaagcaat gacttgctat ttgaatagcc ttttgcaaac actttttatg 360
actcctgaat ttaggaatgc attatataag tgggaatttg aagaatctga agaagatcca 420
gtgacaagta ttccatacca acttcaaagg ctttttgttt tgttacaaac cagcaaaaag 480
agagcaattg aaaccacaga tgttacaagg agctttggat gggatagtag tgaggcttgg 540
cagcagcatg atgtacaaga actatgcaga gtcatgtttg atgctttgga acagaaatgg 600
aagcaaacag aacaggctga tcttataaat gagctatatc aaggcaagct gaaggactac 660
gtgagatgtc tggaatgtgg ttatgagggc tggcgaatcg acacatatct tgatatccca 720
ttggtcatcc gaccttatgg gtccagccaa gcatttgcta gtgtggaaga agcattgcat 780
gcatttattc agccagagat tctggatggc ccaaatcagt atttttgtga acgttgtaag 840
aagaagtgtg atgcacggaa gggccttcgg tttttgcatt ttccttatct gctgacctta 900
cagctgaaaa gattcgattt tgattataca accatgcata ggattaaact gaatgatcga 960
atgacatttc ccgaggaact agatatgagt acttttattg atgttgaaga tgagaaatct 1020
cctcagactg aaagttgcac tgacagtgga gcagaaaatg aaggtagttg tcacagtgat 1080
cagatgagca acgatttctc caatgatgat ggtgttgatg aaggaatctg tcttgaaacc 1140
aatagtggaa ctgaaaagat ctcaaaatct ggacttgaaa agaattcctt gatctatgaa 1200
cttttctctg ttatggctca ttctgggagc gctgctggtg gtcattatta tgcatgtata 1260
aagtcattca gtgatgagca gtggtacagc ttcgatgatc aacatgtcag caggataaca 1320
caagaggaca ttaagaaaac acatggtgga tcttcaggaa gcagaggata ttattctagt 1380
gctttcgcaa gttccacaaa tgcatatatg ctgatctata gactgaagga tccagccaga 1440
aatgcaaaat ttctagaagt gggtgaatac ccagaacata ttaaaaactt ggtgcagaaa 1500
gagagagagt tggaagaaca agaaaagaga caacgagaaa ttgagcgcaa tacatgcaag 1560
ataaaattat tctgtttgca tcctacaaaa caagtaatga tggaaaataa attggaggtt 1620
cataaggata agacattaaa ggaagcagta gaaatggctt ataagatgat ggatttagaa 1680
gaggtaatac ccctggattg ctgtcgcctt gttaaatatg atgagtttca tgattatcta 1740
gaacggtcat atgaaggaga agaagataca ccaatggggc ttctactagg tggcgtcaag 1800
tcaacatata tgtttgatct gctgttggag acgagaaagc ctgatcaggt tttccaatct 1860
tataaacctg gagaagtgat ggtgaaagtt catgttgttg atctaaaggc agaatctgta 1920
gctgctccta taactgttcg tgcttactta aatcagacag ttacagaatt caaacaactg 1980
atttcaaagg ccatccattt acctgctgaa acaatgagaa tagtgctgga acgctgctac 2040
aatgatttgc gtcttctcag tgtctccagt aaaaccctga aagctgaagg attttttaga 2100
agtaacaagg tgtttgttga aagctccgag actttggatt accagatggc ctttgcagac 2160
tctcatttat ggaaactcct ggatcggcat gcaaatacaa tcagattatt tgttttgcta 2220
cctgaacaat ccccagtatc ttattccaaa aggacagcat accagaaagc tggaggcgat 2280
tctggtaatg tggatgatga ctgtgaaaga gtcaaaggac ctgtaggaag cctaaagtct 2340
gtggaagcta ttctagaaga aagcactgaa aaactcaaaa gcttgtcact gcagcaacag 2400
caggatggag ataatgggga cagcagcaaa agtactgaga caagtgactt tgaaaacatc 2460
gaatcacctc tcaatgagag ggactcttca gcatcagtgg ataatagaga acttgaacag 2520
catattcaga cttctgatcc agaaaatttt cagtctgaag aacgatcaga ctcagatgtg 2580
aataatgaca ggagtacaag ttcagtggac agtgatattc ttagctccag tcatagcagt 2640
gatactttgt gcaatgcaga caatgctcag atccctttgg ctaatggact tgactctcac 2700
agtatcacaa gtagtagaag aacgaaagca aatgaaggga aaaaagaaac atgggataca 2760
gcagaagaag actctggaac tgatagtgaa tatgatgaga gtggcaagag taggggagaa 2820
atgcagtaca tgtatttcaa agctgaacct tatgctgcag atgaaggttc tggggaagga 2880
cataaatggt tgatggtgca tgttgataaa agaattactc tggcagcttt caaacaacat 2940
ttagagccct ttgttggagt tttgtcctct cacttcaagg tctttcgagt gtatgccagc 3000
aatcaagagt ttgagagcgt ccggctgaat gagacacttt catcattttc tgatgacaat 3060
aagattacaa ttagactggg gagagcactt aaaaaaggag aatacagagt taaagtatac 3120
cagcttttgg tcaatgaaca agagccatgc aagtttctgc tagatgctgt gtttgctaaa 3180
ggaatgactg tacggcaatc aaaagaggaa ttaattcctc agctcaggga gcaatgtggt 3240
ttagagctca gtattgacag gtttcgtcta aggaaaaaaa catggaagaa tcctggcact 3300
gtctttttgg attatcatat ttatgaagaa gatattaata tttccagcaa ctgggaggtt 3360
ttccttgaag ttcttgatgg ggtagagaag atgaagtcca tgtcacagct tgcagttttg 3420
tcaagacggt ggaagccttc agagatgaag ttggatccct tccaggaggt tgtattggaa 3480
agcagtagtg tggacgaatt gcgagagaag cttagtgaaa tcagtgggat tcctttggat 3540
gatattgaat ttgctaaggg tagaggaaca tttccctgtg atatttctgt ccttgatatt 3600
catcaggatt tagactggaa tcctaaagtt tctaccctga atgtctggcc tctttatatc 3660
tgtgatgatg gtgcggtcat attttatagg gataaaacag aagaattaat ggaattgaca 3720
gatgagcaaa gaaatgaact gatgaaaaaa gaaagcagtc gactccagaa gactggacat 3780
cgtgtaacat actcacctcg taaagagaaa gcactaaaaa tatatctgga tggagcacca 3840
aataaagatc tgactcaaga ctga 3864
【０１６６】
表３(ａ)−ＵＳＰ＿Ｎ１１：新規スプライス変異体：アミノ酸配列
座位 USP_N11 402 aa PRT
受託 AK022614
GeneSeq AAU82713
起源 ヒト
1個の挿入により特徴付けられるスプライス形:
Pos 12-Pos 48
1 MTVRNIASIC NMEEPPALGS PGWTLLAPPL VRAFGELRLE EGIAVPCRGT NASALEKDIG
61 PEQFPINEHY FGLVNFGNTC YCNSVLQALY FCRPFRENVL AYKAQQKKKE NLLTCLADLF
121 HSIATQKKKV GVIPPKKFIS RLRKENDLFD NYMQQDAHEF LNYLLNTIAD ILQEEKKQEK
181 QNGKLKNGNM NEPAENNKPE LTWVHEIFQG TLTNETRCLN CETVSSKDED FLDLSVDVEQ
241 NTSITHCLRD FSNTETLCSE QKYYCETCCS KQEAQKRMRV KKLPMILALH LKRFKYMEQL
301 HRYTKLSYRV VFPLELRLFN TSSDAVNLDR MYDLVAVVVH CGSGPNRGHY ITIVKSHGFW
361 LLFDDDIVEK IDAQAIEEFY GLTSDISKNS ESGYILFYQS RE
【０１６７】
表３(ｂ)−ＵＳＰ＿Ｎ１１：新規スプライス変異体：ヌクレオチド配列
1 atgactgtcc gaaacatcgc ctccatctgt aatatgggca ccaatgcctc tgctctggaa
61 aaagacattg gtccagagca gtttccaatc aatgaacact atttcggatt ggtcaatttt
121 ggaaacacat gctactgtaa ctccgtgctt caggcattgt acttctgccg tccattccgg
181 gagaatgtgt tggcatacaa ggcccagcaa aagaagaagg aaaacttgct gacgtgcctg
241 gcggaccttt tccacagcat tgccacacag aagaagaagg ttggcgtcat cccaccaaag
301 aagttcattt caaggctgag aaaagagaat gatctctttg ataactacat gcagcaggat
361 gctcatgaat ttttaaatta tttgctaaac actattgcgg acatccttca ggaggagaag
421 aaacaggaaa aacaaaatgg aaaattaaaa aatggcaaca tgaacgaacc tgcggaaaat
481 aataaaccag aactcacctg ggtccatgag atttttcagg gaacgcttac caatgaaact
541 cgatgcttga actgtgaaac tgttagtagc aaagatgaag attttcttga cctttctgtt
601 gatgtggagc agaatacatc cattacccac tgtctaagag acttcagcaa cacagaaaca
661 ctgtgtagtg aacaaaaata ttattgtgaa acatgctgca gcaaacaaga agcccagaaa
721 aggatgaggg taaaaaagct gcccatgatc ttggccctgc acctaaagcg gttcaagtac
781 atggagcagc tgcacagata caccaagctg tcttaccgtg tggtcttccc tctggaactc
841 cggctcttca acacctccag tgatgcagtg aacctggacc gcatgtatga cttggttgcg
901 gtggtcgttc actgtggcag tggtcctaat cgtgggcatt atatcactat tgtgaaaagt
961 cacggcttct ggcttttgtt tgatgatgac attgtagaga aaatagatgc tcaagctatt
1021 gaagaattct atggcctgac gtcagatata tcaaaaaatt cagaatctgg atatatttta
1081 ttctatcagt caagagagta a
【０１６８】
表３(ｃ)−ＵＳＰ＿Ｎ１１参照配列(Derwent AAU82713)
アミノ酸配列：
1 mtvrniasic nmgtnasale kdigpeqfpi nehyfglvnf gntcycnsvl qalyfcrpfr
61 envlaykaqq kkkenlltcl adlfhsiatq kkkvgvippk kfisrlrken dlfdnymqqd
121 aheflnylln tiadilqeek kqekqngklk ngnmnepaen nkpeltwvhe ifqgtltnet
181 rclncetvss kdedfldlsv dveqntsith clrdfsntet lcseqkyyce tccskqeaqk
241 rmrvkklpmv lalhlkrfky meqlrrytkl syrvvfplel rlfntssdav nldrmydlva
301 vvvhcgsgpn rghyitivks hgfwllfddd ivekidaqai eefygltsdi sknsesgyil
361 fyqsre
【０１６９】
表３(ｄ)−ＵＳＰ＿Ｎ１１参照配列(Derwent AAU82713)
ヌクレオチド配列：
atgactgtcc gaaacatcgc ctccatctgt aatatgggca ccaatgcctc tgctctggaa 60
aaagacattg gtccagagca gtttccaatc aatgaacact atttcggatt ggtcaatttt 120
ggaaacacat gctactgtaa ctccgtgctt caggcattgt acttctgccg tccattccgg 180
gagaatgtgt tggcatacaa ggcccagcaa aagaagaagg aaaacttgct gacgtgcctg 240
gcggaccttt tccacagcat tgccacacag aagaagaagg ttggcgtcat cccaccaaag 300
aagttcattt caaggctgag aaaagagaat gatctctttg ataactacat gcagcaggat 360
gctcatgaat ttttaaatta tttgctaaac actattgcgg acatccttca ggaggagaag 420
aaacaggaaa aacaaaatgg aaaattaaaa aatggcaaca tgaacgaacc tgcggaaaat 480
aataaaccag aactcacctg ggtccatgag atttttcagg gaacgcttac caatgaaact 540
cgatgcttga actgtgaaac tgttagtagc aaagatgaag attttcttga cctttctgtt 600
gatgtggagc agaatacatc cattacccac tgtctaagag acttcagcaa cacagaaaca 660
ctgtgtagtg aacaaaaata ttattgtgaa acatgctgca gcaaacaaga agcccagaaa 720
aggatgaggg taaaaaagct gcccatggtc ttggccctgc acctaaagcg gttcaagtac 780
atggagcagc tgcgcagata caccaagctg tcttaccgtg tggtcttccc tctggaactc 840
cggctcttca acacctccag tgatgcagtg aacctggacc gcatgtatga cttggttgcg 900
gtggtcgttc actgtggcag tggtcctaat cgtgggcatt atatcactat tgtgaaaagt 960
cacggcttct ggcttttgtt tgatgatgac attgtagaga aaatagatgc tcaagctatt 1020
gaagaattct atggcctgac gtcagatata tcaaaaaatt cagaatctgg atatatttta 1080
ttctatcagt caagagagta a                                           1101
【実施例】
【０１７０】
特に既知のＣＡ／ファミリーＣ１２／Ｃ１９(脱ユビキチン酵素)のクランのファミリーのメンバーをＭＥＲＯＰＳ(Ｃ１２について合計９ペプチド配列およびＣ１９について７６ペプチド配列)から回収し、PSI-BLASTおよびSmith-Waterman検索に付す。検索データベースは、Celeraおよび公的(ＮＣＢＩ)ヒトゲノム配列の両方から翻訳されたオープンリーディングフレーム配列、Celera予測タンパク質、Celeraヒトゲノムに基づいたCelera genscan予測、および私有のデータベースからの予測配列を含む。加えて、２種のファミリー(Ｃ１２およびＣ１９)メンバーを、Interproscan検索に付し、Interproモチーフを同定する。Ｃ１２ファミリー(ユビキチンカルボキシル−末端ヒドロラーゼ、ファミリー１)由来のすべてのタンパク質はＩＰＲ００１５７８および関連するPrints、PrositeおよびPFAMパターン(ＰＲ００７０７、ＰＳ００１４０およびＰＦ０１０８８)により識別される。同様に、ファミリーＣ１９はＩＰＲ００１３９４モチーフ(ユビキチンチオエステラーゼ)および対応するPrintsおよびPFAM特性(signature)(ＰＳ００９７２、ＰＳ００９７３、ＰＳ５０２３５、ＰＦ００４４３)により同定される。Prosite、PrintsおよびPFAMデータベースのモデルをダウンロードし、適当な検索に使用する。様々な検索の結果を融合させ、冗長を減少させるために３個のフィルターで処理した。一次ヒットを低複雑性についてスクリーニングし、GenBank、SwissProtおよびRefseqの両方からのヒトタンパク質配列を含むタンパク質参照データベースに対して適合させる。参照データベースのタンパク質と、少なくとも５０ＡＡにわたり９５％以上の同一性を共有するヒットを除く。加えて、ヒットの対応するＤＮＡ配列を、RefseqヒトｃＤＮＡ配列を含むＤＮＡ参照データベースと適合させる。参照データベースのＤＮＡ配列と、少なくとも１５０ｎｔにわたり９５％以上の同一性を共有するヒットを除く。そして、最後に、フィルタリング処理を残ったヒット９５％同一性カットオフを使用して互いに対して消していき、非常に相同のヒットから成るクラスターを産生する。ＵＳＰ＿Ｎ０１は、このようなクラスターからの代表的ヒット配列である。
【０１７１】
分析の第二ラウンドは、Ｃ１２／Ｃ１９ファミリーのすべてのヒトのメンバーについての遺伝子発現プロファイリングおよび電子的ノーザンを行う。Ｃ１２／Ｃ１９ファミリーメンバーの公知配列を使用して、組織タイプに関して組織タイプのために対応するUniGeneクラスターと連合する正常化された表現配布を確認する。これらは、ヒト組織地図および腫瘍サンプル上の対応するプローブセットを調べることにより得られる遺伝子チップデータと同等である。
【０１７２】
実施例１：
配列番号１および配列番号２に対応するＵＳＰ＿Ｎ０１の遺伝子発現プロファイルを図１に示す。
実施例２：
配列番号５および配列番号６に対応するＵＳＰ＿Ｎ０７の遺伝子発現プロファイルを図２に示す。
【０１７３】
実施例３：
配列番号９および配列番号１０に対応するＵＳＰ＿Ｎ１１の遺伝子発現プロファイルを図３に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
(原文に記載なし)
【図１】
2007501008.tif 000002
【図２】
2007501008.tif 000003
【図３】
2007501008.tif 000004
【国際調査報告】
2007501008.tif 000005
2007501008.tif 000006
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2007501008.tif 000008
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