(57)【要約】   本発明は、（ｉ）動物の樹状細胞に選択的に結合するが、当該動物において自然発生しない分子部分と、（ｉｉ）抗原とを含む、動物のワクチン接種用化合物を提供する。通常、前記のように選択的に結合する分子部分はＤＣ−ＳＩＧＮに結合する。分子部分はＨＩＶ−１  ｇｐ１２０でよい。本発明の化合物は動物のワクチン接種に使用することができ、ワクチン接種後、当該動物を自然感染動物から識別することが可能である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）動物の樹状細胞に選択的に結合するが、当該動物において自然に存在しない分子部分と、（ｉｉ）抗原とを含む、動物のワクチン接種用化合物。
【請求項２】
前記分子部分が樹状細胞のパターン認識受容体に結合する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記パターン認識受容体がＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
選択的に結合する前記分子部分がタンパク質である、請求項１又は請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
選択的に結合する前記分子部分が、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＬＡＭタンパク質若しくはエボラウイルスの糖タンパク質のいずれか１つ又はこれらの部分である、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＬＡＭタンパク質若しくはエボラウイルスの糖タンパク質のいずれか又はこれらの部分と、（ｉｉ）抗原とを含む、動物のワクチン接種用化合物。
【請求項７】
前記抗原がポリペプチドである、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記抗原が、動物の疾患に関連する分子又はその分子の部分若しくは変異体である、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記抗原が、動物の疾患に関連する２つ以上の分子又はそれらの分子の部分若しくは変異体である、請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記抗原が、病原体若しくは腫瘍の抗原性成分又はその成分の抗原性部分若しくは変異体である、請求項８又は請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記病原体が細菌、ウイルス、真菌、原生動物又は蠕虫のいずれかである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
前記抗原が、ＯＩＥリストＡ疾患に関連する病原体から選択される病原体の抗原性成分又はその成分の部分若しくは変異体である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記分子部分と前記抗原とが共有結合された、請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
選択的に結合する前記分子部分と前記抗原とが各々ポリペプチドを含み、双方が同一のポリペプチド鎖に存在する、請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の化合物をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１５に記載の核酸分子又は請求項１６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸分子を含むワクチン。
【請求項１９】
更にアジュバントを含む、請求項１８に記載のワクチン。
【請求項２０】
医薬品における使用のための請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸分子と、製薬的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸分子を動物に投与するステップを含む、疾患に対して動物を免疫する方法。
【請求項２３】
請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸分子を動物に投与するステップを含む、動物の疾患を治療する方法。
【請求項２４】
前記疾患が病原体に惹起された、請求項２２又は請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記病原体が細菌、ウイルス、真菌、原生動物又は蠕虫のいずれかである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記病原体がＯＩＥリストＡ疾患に関連する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記動物が哺乳動物である、請求項２２又は請求項２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記動物が伴侶動物又は家畜である、請求項２２から請求項２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記動物がウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ又はウサギである、請求項２７又は請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
動物疾患治療用医薬品の製造における、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸の使用。
【請求項３１】
動物の免疫化用ワクチンの製造における、請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸の使用。
【請求項３２】
前記疾患が病原体に惹起される、請求項３０又は請求項３１に記載の使用。
【請求項３３】
前記病原体が細菌、ウイルス、真菌、原生動物又は蠕虫のいずれかである、請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記病原体がＯＩＥリストＡ疾患に関連する、請求項３３に記載の使用。
【請求項３５】
前記動物が哺乳動物である、請求項３０又は請求項３１に記載の使用。
【請求項３６】
前記動物が伴侶動物又は家畜である、請求項３０又は請求項３１に記載の使用。
【請求項３７】
前記動物がウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ又はウサギである、請求項３５又は請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記分子部分と前記抗原とを結合するステップを含む、請求項１又は請求項６に記載の化合物を作成する方法。
【請求項３９】
ポリペプチドを含む、請求項１４に記載の化合物を作成する方法であって、（ｉ）前記ポリペプチドを発現する、請求項１７に記載の宿主細胞を培養することと、（ｉｉ）前記ポリペプチドを単離することとを含む方法。
【請求項４０】
樹状細胞に選択的に結合する分子部分をコードする核酸分子と、抗原をコードする核酸分子とを結合することを含む、請求項１５に記載の核酸を作成する方法。
【請求項４１】
（ｉ）樹状細胞に選択的に結合する分子部分をコードする部分と、（ｉｉ）抗原をコードしているポリヌクレオチドを挿入するための挿入ポイントとを含み、前記ポリヌクレオチドが前記挿入ポイントに挿入されたとき、請求項１４に記載の化合物をコードする核酸分子。
【請求項４２】
前記核酸は樹状細胞のパターン認識受容体に選択的に結合する分子部分をコードする、請求項４１に記載の核酸。
【請求項４３】
前記パターン認識受容体がＤＣ−ＳＩＧＮである、請求項４２に記載の核酸。
【請求項４４】
選択的に結合する前記分子部分が、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＬＡＭタンパク質又はエボラウイルスの糖タンパク質のいずれか１つである、請求項４１又は請求項４２に記載の核酸。
【請求項４５】
動物が請求項１に記載の化合物を投与されているかどうかを判定する方法であって、前記動物が樹状細胞に選択的に結合する前記分子部分に免疫応答を示しているかどうかを判定することを含む方法。
【請求項４６】
前記動物が前記化合物に存在する抗原に免疫応答を示しているかどうかを判定することを更に含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ｉ）請求項１から請求項１４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項１５に記載の核酸分子、及び（ｉｉ）樹状細胞に選択的に結合する、前記化合物に存在する前記分子部分に対する免疫応答を検出する手段及び／又は（ｉｉｉ）前記化合物に存在する前記抗原に対する免疫応答を検出する手段を含むパーツキット。
【請求項４８】
（ｉｉ）部が存在する場合には、前記分子部分に対する抗体に結合する前記分子部分の全体又は一部分を含み、（ｉｉｉ）部が存在する場合には、前記抗原に対する抗体に結合する前記抗原の全体又は一部分を含む、請求項４７に記載のパーツキット。
【請求項４９】
（ｉ）動物疾患の抗原に対する免疫応答を検出する手段と、（ｉｉ）樹状細胞に選択的に結合する分子部分に対する免疫応答を検出する手段とを含むパーツキット。
【請求項５０】
免疫応答を検出する手段がＥＬＩＳＡである、請求項４７から請求項４９のいずれか一項に記載のパーツキット。
【請求項５１】
本明細書に記載したように、ワクチン接種動物を自然感染動物から識別可能とした、動物にワクチン接種する任意の新規の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原送達システムに関する。特に、本発明は、疾患に対して動物にワクチン接種し、ワクチン接種動物と自然感染動物とを識別するために利用可能なシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
動物に本来備わっている先天的な適応免疫系を理解し、選択的に操作することは、家畜及び伴侶動物を疾患から防御するという観点から、また、あらゆる種において重要性が増しているトピックである、抗生物質耐性の増大リスクによる、疾病管理に対する抗生物質治療への依存の低減という点から、極めて好ましいことである。
【０００３】
抗生物質は、農業用・伴侶動物種を広範囲の病原体から防御するために、無差別的に使用されることが多い。この抗生物質を不適切に使用するという風土は、防御免疫に対する病原体関連抗原の効果不足によって生じている。
【０００４】
従って、病原体防御における宿主適応免疫の役割の理解を進展・向上させる必要性が、例えば、動物福祉に対する関心及び残留抗生物質が減少した高品質の食肉への消費者の要求増大によって高まっている。
【０００５】
現在、ワクチン製品に用いて動物種における防御を誘導することを目的に、分子抗原に関する研究が増加している。しかし、そうした製品では動物の疾患防御に関して細胞性免疫系の初回刺激に対する要件を考慮することが稀であるため、多くの場合、これらの製品の有効性は限定されている。
【０００６】
疾病管理の手段としてのワクチン接種の制約の１つは、自然感染動物とワクチン接種動物とを識別することが困難であることである。例えば、これは英国における最近の口蹄疫（ＦＭＤ）の発生に関連して大問題になり、国内ウシ群にワクチン接種すれば、その群からのウシの輸入を許可しない国もあるだろうという理由もあってワクチン接種が行われなかった。屠畜体は、存在する可能性がある如何なるウイルスも死滅させるために、感染しているかのように処置し、長時間吊るされた状態にしておく必要があるため、現在のワクチン接種法では食肉の市場価値も低下させてしまう。ＦＭＤについては、感染のない（クリーンな）群を維持することに重点がおかれているが、感染が問題になるため（例えば、ラット、アナグマ等から）、感染のない群を維持することは殆ど不可能である。自然感染動物とワクチン接種動物とを識別する方法として、ワクチン接種動物には異質となる免疫原を含むマーカーワクチンが、提案されている。
【非特許文献１】Steinman et al (1997) Immunol. Rev. 156, 25-37
【非特許文献２】Werling & Jungi (2003) Vet. Immunol. Immunopathol. 91, 1-12
【非特許文献３】Geijtenbeek et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 11314-11320
【非特許文献４】Geijtenbeek et al (2002) J Leukoc. Biol. 71,921-931
【非特許文献５】Geijtenbeek et al (2000) Cell 100, 575-585
【非特許文献６】Kooyk & Geijtenbeek (2002) Immunol. Rev. 186,47-56
【非特許文献７】Tailleux et al (2003) J Exp. Med. 197, 1-5
【非特許文献８】O’Sullivan et al Anal. Biochem. (1979) 100, 100-108
【非特許文献９】Julian et al (1983) Anal. Biochem. 132, 68
【非特許文献１０】Sambrook, J. and Russell, D. (2001) "Molecular Cloning: a laboratory manual" 3rd ed. Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press
【非特許文献１１】Nestle, F. O. (2002) Clinical & Experimental Dermatology 27 (7), 597-601
【非特許文献１２】Werling, D et al (1999) J Leukoc Biol 66 : 50-58
【非特許文献１３】Haeberle, HA et al (2002) J Infect Dis 186: 1199-1206
【非特許文献１４】Haynes, LM et al (2001) J Virol 75: 10730-10737
【非特許文献１５】Kurt-Jones, EA et al (2000) Nat Immunol 1: 398-401
【非特許文献１６】Werling, D et al (2004) Immunology 111 : 41-52
【非特許文献１７】Werling, D et al (2002) J Leukoc Biol 72: 297-304
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者は、樹状細胞に選択的に結合する分子部分―このように選択的に結合する分子部分は当該動物種において自然発生しない―を動物の疾患に関連するような抗原と併用して樹状細胞を標的にすることにより、抗原送達（ワクチン接種）の新概念を示すだけでなく、ワクチン接種動物と自然感染動物とを識別することも可能にすることを提案する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第一の態様は、（ｉ）動物の樹状細胞に選択的に結合するが、当該動物において自然発生しない分子部分と、（ｉｉ）抗原とを含む、動物のワクチン接種用化合物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明者が「動物の樹状細胞に選択的に結合する分子部分」という場合、樹状細胞に選択的に結合するが、他の種類の抗原提示細胞には実質的に結合しない、任意の好適な分子部分のことをいう。分子部分が上記のように選択的に結合するか否かは、例えば、蛍光標識した結合分子部分を用いて、樹状細胞や他の抗原提示細胞に関連する蛍光を測定することにより、樹状細胞への分子部分の結合を他の抗原提示細胞への結合と比較して測定することによって判定できる。また、分子部分の樹状細胞に対する選択性を判定するため、抗分子部分抗体を用いて分子部分がどの細胞に結合するのかを判定することができる。
【００１０】
樹状細胞は非常に強力な抗原提示細胞であり、生理的アジュバントとして予防的又は治療的免疫を誘発するのに効果的であることが示されている。樹状細胞は末梢粘膜組織に侵入する微生物を捕捉し、次に、二次リンパ器官に移動してここでこの抗原形態の微生物を休止Ｔ細胞に提示し、こうして適応免疫応答を開始する。
【００１１】
樹状細胞に選択的に結合する分子部分は、任意の好適な分子部分でありうる。特に、樹状細胞は、通常はその表面に選択的に発現される受容体を有しており、それを樹状細胞の標的として用いうることが知られている。従って、好都合なことに、分子部分は、それ自体が樹状細胞で選択的に発現される受容体に結合する。通常、樹状細胞で選択的に発現される受容体は、他の抗原提示細胞より１０倍、好ましくは１００倍、より好ましくは１０００倍以上のレベルで樹状細胞に存在する受容体である。
【００１２】
分子部分は樹状細胞のパターン認識受容体に結合することが好ましい。パターン認識受容体は病原体に関連する分子パターンと結合する受容体である。通常、パターン認識受容体はレクチンと結合する受容体である。好適なパターン認識受容体はＤＣ−ＳＩＧＮ，ＤＥＣ−２０５（例えば、Steinman et al (1997) Immunol. Rev. 156, 25-37を参照されたい）及びＴＯＬＬ様受容体（例えば、Werling & Jungi (2003) Vet. Immunol. Immunopathol. 91, 1-12を参照されたい）を含む。分子部分は、樹状細胞の表面に高発現されている、細胞特異的な細胞間接着分子３に接着する非インテグリンＣ型レクチンのＤＣ−ＳＩＧＮに結合することがより好ましい。ＤＣ−ＳＩＧＮはＣＤ２０９と呼称されることもある。
【００１３】
ＤＣ−ＳＩＧＮは、Ｎ末端側細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ネック領域、縦列反復領域及びＣ末端側のＣ型（カルシウム依存性）マンノース結合レクチンドメインを形成するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ヒト及びマウスにおいてＤＣ−ＳＩＧＮは、真皮、直腸、子宮や頚部のような粘膜組織の基底膜並びに扁桃、リンパ節及び脾臓のＴ細胞領域に存在する樹状細胞によって発現される。ヒトではＤＣ−ＳＩＧＮはアミノ酸４０４個を有する。
【００１４】
ＤＣ−ＳＩＧＮはヒト、チンパンジー、ゴリラ、マカク属において見出されており、ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡがクローニングされている。ＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、次のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３９１０８６（アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ））、ＡＹ０７８９１３（ナミチンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ））、ＮＭ＿０２１１５５（ヒト）及びＮＭ＿１３３２３８（ハツカネズミ属（Ｍｕｓ））に見出される。図１はウシＤＣ−ＳＩＧＮ一変異体のｃＤＮＡの部分配列を示す。ウシＤＣ−ＳＩＧＮ変異体１の推定アミノ酸配列を、チンパンジー、マカク属及びヒト由来のＤＣ−ＳＩＧＮｓと並置して図３に示す。図６はウシＤＣ−ＳＩＧＮ第二変異体のｃＤＮＡの部分配列を示す。ウシＤＣ−ＳＩＧＮ変異体２の推定アミノ酸配列を、マウス、ヒト及びウシ変異体１のＤＣ−ＳＩＧＮと並置して図７に示す。
【００１５】
ヒト、マウス及びウシ（変異体２）のＤＣ−ＳＩＧＮのＳＭＡＲＴタンパク質ドメイン分析により、タンパク質が構造的相同性を共有し、各々がＣ型レクチン受容体モチーフを含むことが示された。ヒトＤＣ−ＳＩＧＮにおいて推定Ｃ−レクチンドメインは残基２５６〜３７８であり、マウスでは推定Ｃ−レクチンドメインは残基１０８〜２２９であり、ウシ（変異体２）ＤＣ−ＳＩＧＮでは推定Ｃ−レクチンドメインは残基１２９〜２４８である。
【００１６】
ＤＣ−ＳＩＧＮは、樹状細胞の表面に選択的に発現されると考えられ、その免疫系における役割のため、種の間で保存されていると考えられている。従って、例えば、ヒトとマウスのＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸配列をコードしているｃＤＮＡは、図の説明に記載するコンピュータ・プログラムで評価した際、４４％の配列相同性を有する。
【００１７】
従って、本発明者は、ＤＣ−ＳＩＧＮに関し、ポリペプチド配列をコードしているｃＤＮＡが、図２Ａ〜２Ｄに示すヒト又はマウスのヌクレオチド配列と少なくとも４０％の相同性を有する任意のタンパク質を含める。
【００１８】
加えて、例えば、Geijtenbeek et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 11314-11320に記載されたアッセイにより判定できるように、通常、ＤＣ−ＳＩＧＮ分子はＩＣＡＭ−３や他のＩＣＡＭファミリーのメンバーと結合可能な分子である。
【００１９】
次の論文は、ＤＣ−ＳＩＧＮとＨＩＶ−１又はＩＣＡＭ−３との相互作用を述べており、すべて参照により本明細書に組み込まれる：Geijtenbeek et al (2002) J Leukoc. Biol. 71,921-931；Geijtenbeek et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 11314-11320；Geijtenbeek et al (2000) Cell 100, 575-585；及びKooyk & Geijtenbeek (2002) Immunol. Rev. 186,47-56。
【００２０】
加えて、本発明者は、そのポリペプチドが、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３９１０８６、ＡＹ０７８９１３、ＮＭ＿０２１１５５又はＮＭ＿１３３２３８のいずれか１つにその配列が見出されるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドにコードされている任意のタンパク質を含める。
【００２１】
本発明者が言う「ストリンジェント条件」とは、６×ＳＳＣにて６０℃で少なくとも１時間ハイブリダイズさせ、次に、２×ＳＳＣにて６０℃で３０分間洗浄することである。１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮＡＣｌ／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである。
【００２２】
また、本発明者は、ヒト又はマウスのＤＣ−ＳＩＧＮと免疫学的に交差反応する任意のタンパク質も含める。通常、これは、ヒト又はマウスのＤＣ−ＳＩＧＮに対するポリクローナル抗血清を用いて評価しうる。
【００２３】
樹状細胞に選択的に結合する分子部分はタンパク質であることが好ましい。
【００２４】
通常、当該化合物は動物のワクチン接種に使用される。通常、選択的に結合する分子部分は、外来性の、即ち、当該動物と異質の分子の全体又は部分である。分子部分は、ヒトのような別の動物に由来することが可能であり、当該動物において免疫原性であって抗体応答を惹起する分子部分である。従って、上記のように選択的に結合する分子部分は、樹状細胞に対する抗原を標的にするだけでなく、それ自体がワクチン接種のマーカーとして機能する免疫（抗体）応答も惹起する。加えて、選択的に結合する分子部分は、通例はＴＨ１応答を刺激することによって免疫系を刺激する作用を有することも可能であり、従って、アジュバントとして作用する。
【００２５】
種々の分子部分がＤＣ−ＳＩＧＮに結合することが示されており、この中には結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＬＡＭタンパク質（例えば、Tailleux et al (2003) J Exp. Med. 197, 1-5を参照されたい）、エボラウイルスの糖タンパク質及びＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ−１２０（例えば、Geijtenbeek et al (2002) J. Biol. Chem. 277, 11314-11320を参照されたい）が含まれる。結合分子部分はＤＣ−ＳＩＧＮに高親和性で結合できることが好ましい。樹状細胞への結合を可能にするために、これら分子の一部分のみが必要とされることを理解されよう。このような部分は「樹状細胞に結合する分子部分」という用語に含まれる。しかし、分子の全体又はほぼ全体を結合分子部分として用いることが好ましい。
【００２６】
樹状細胞に選択的に結合する分子部分はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質ｇｐ−１２０であることが特に好ましい。自然発生の感染下では、ＤＣ−ＳＩＧＮは樹状細胞によるＨＩＶの粘膜表面（ＨＩＶ暴露部位）から二次リンパ器官（ＨＩＶ感染部位）への移動を媒介する。この移動には数日かかることがあり、この間、ＨＩＶは変性から保護され、感染能を保持する。その機序の可能性の１つは、ＨＩＶがＤＣ−ＳＩＧＮに結合してエンドサイトーシスを起こし、その後、樹状細胞がリンパ節に達してＴ細胞と相互作用を起こした後に細胞表面に戻るというものである。この内在化仮説は、ＤＣ−ＳＩＧＮの細胞質ドメインにおける２つのエンドサイトーシスモチーフと思われるＬＬ及びＹＸＸＬの存在により支持される。これらモチーフは種々の状況でエンドサイトーシス及び再循環を媒介することが示されている。２９３Ｔ細胞に一過性に発現されたＤＣ−ＳＩＧＮに結合したＨＩＶ−１は、数日間、感染能を保持するが、トリプシン処理感受性を示す。これは、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現した２９３Ｔ細胞がＨＩＶ−１を取り込めないことを示しうる。しかし、ＨＩＶ−１の内在化が、樹状細胞においてＨＩＶ−１が保護される重要な機序である可能性がある。
【００２７】
ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ分子の相同体がマウスにおいてこれらモチーフを含むことが見出されているように、ＬＬ及びＹＸＸＬモチーフは種間で保存されている。
【００２８】
ＨＩＶ−１の初期結合がそのエンベロープタンパク質ｇｐ１２０に媒介され、樹状細胞に発現されたＤＣ−ＳＩＧＮに対してなされ、また、ＨＩＶの取込み、Ｔ細胞への輸送及び伝搬におけるＤＣ−ＳＩＧＮの重要性を考慮すれば、ｇｐ１２０分子に結合した抗原を用いて高親和性にて樹状細胞を直接標的にすることが可能であり、従って、本明細書で記載した新規ワクチン接種法の一例を提供することになる。
【００２９】
従って、ＨＩＶ  ｇｐ１２０タンパク質を用いてＤＣ−ＳＩＧＮを標的にすることにより、（ａ）最も強力な抗原提示細胞を標的にして宿主の先天性免疫応答を刺激し、こうしてワクチン適用数、ワクチン接種毎の必要量を制限するとともに、残留抗生物質又は耐性細菌株の増殖の懸念を払拭することを可能にし、（ｂ）市販の試験装置を用い、ワクチン接種動物では自然発生しないタンパク質のＨＩＶ  ｇｐ１２０分子に対する抗体応答を分析して、ワクチン接種動物と自然感染動物の識別を可能にすると思われる。
【００３０】
本発明は、特に、（ｉ）ＨＩＶ  ｇｐ１２０、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＬＡＭタンパク質若しくはエボラウイルスの糖タンパク質のいずれか又はこれらの部分及び（ｉｉ）抗原を含む、動物のワクチン接種用化合物も含む。
【００３１】
当該部分は樹状細胞に、通常はＤＣ−ＳＩＧＮに結合可能であることが好ましい。通例、当該部分は、１０個超のアミノ酸残基長、より典型的には１５，２０，２５，３０，４０，５０，６０又は７０個超のアミノ酸残基長である。
【００３２】
マイコバクテリアＬＡＭタンパク質はＤＣ−ＳＩＧＮに結合し、本発明の実施に有用でありうるが、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、シカなどの放飼・自然生息動物の一部はマイコバクテリアと接触してそれらに感染している可能性があるということを理解されよう。従って、動物が放飼・自然生息動物（又はマイコバクテリアに感染した可能性がある他の動物）である場合には、樹状細胞に結合する分子部分としてマイコバクテリアＬＡＭタンパク質を使用しないことが好ましい。
【００３３】
当該化合物は、樹状細胞への結合後に前記細胞に取り込まれる化合物であることが好ましい。
【００３４】
本発明者が「抗原」という場合、例えば、抗体産生並びにＣＤ−８媒介性及びＮＫ細胞媒介性応答により、体液媒介性であろうと細胞媒介性であろうと免疫応答を誘発できる任意の分子部分を含むものとする。抗原は個々の分子又は抗原性分子の均質集団若しくは異種集団を指しうる。種々の高分子が抗原として作用することができ、この中にはあらゆるタンパク質（適切な状況で存在する場合）、核タンパク質、リポタンパク質、大部分の多糖類（特に、大きな多糖体）、タンパク質又はポリペプチドや他の担体に付着していれば種々の小分子（通常、ハプテンと呼称される）が含まれる。「抗原」という術語は、複数のエピトープを有する多価性又は僅か１つのエピトープを有する一価性の抗原性分子も含む。
【００３５】
ワクチン生産の分野において、抗原は疾患に関連する分子又はその部分又はその変異体である。特に、動物ワクチンの分野において、抗原はワクチン接種を行う動物の疾患に関連する分子又はその部分である。抗原は、病原体を伴う疾患、特に感染病に関連し、病原体の成分の抗原性又は免疫原性部分であることが特に好ましい。
【００３６】
病原体は次の疾患に関連する病原体を含む：口蹄疫、ブタ水胞症、小反芻獣疫、ランピースキン病、ブルータング病、アフリカウマ疫、古典的ブタコレラ、ニューカッスル病、水胞性口炎、牛疫、ウシ伝染性胸膜肺炎、リフトバレー熱、羊痘・山羊痘、アフリカ豚コレラ及び高病原性トリインフルエンザ。これらは、国境線に関わらず非常に深刻かつ急速な伝播の可能性を有し、社会経済又は公衆衛生上の深刻な影響をもたらし、動物及び畜産物の国際貿易において重大な問題となり、ＯＩＥ（国際獣疫局（Ｏｆｆｉｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓ  Ｅｐｉｚｏｏｔｉｅｓ；ｗｗｗ．ｏｉｅ．ｉｎｔ））のリストＡ疾患である伝染病である。
【００３７】
病原体は次の疾患に関連する病原体も含む：炭疽病、オーエスキー病、エキノコックス症／包虫症、心水病、レプトスピラ症、新大陸スクリューワーム（新大陸ラセンウジバエ（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ  ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ））、旧大陸スクリューワーム（旧大陸ラセンウジバエ（Ｃｈｒｙｓｏｍｙａ  ｂｅｚｚｉａｎａ））、パラ結核、Ｑ熱、旋毛虫症を含む多動物種疾患；ウシアナプラズマ病、ウシバベシア病、ウシブルセラ症、ウシ嚢尾虫症、ウシカンピロバクター症、ウシ海綿状脳症、ウシ結核症、デルマトフィルス症、地方病性ウシ白血病、出血性敗血症、ウシ感染性鼻気管炎／膿疱性伝染性外陰膣炎、悪性カタル熱、タイレリア症、トリコモナス病、トリパノソーマ症（ツェツェバエ媒介）を含むウシ疾患；ヤギ・ヒツジブルセラ症（ヒツジ精巣上体炎（Ｂ．ｏｖｉｓ）を除く）、ヤギ関節炎／脳炎、伝染性アガラクシア、ヤギ伝染性胸膜肺炎、流行性ヒツジ流産（ヒツジクラミジア症）、マエディ・ビスナ、ナイロビヒツジ病、ヒツジ精巣上体炎（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｏｖｉｓ）、ヒツジ肺腺種症、サルモネラ症（Ｓ．ａｂｏｒｔｕｓｏｖｉｓ）、スクレイピーを含むヒツジ・ヤギ疾患；伝染性ウマ子宮炎、交疫、流行性リンパ管炎、ウマ脳脊髄炎（東部・西部）、ウマ伝染性貧血、ウマインフルエンザ、ウマピロプラズマ病、ウマ鼻肺炎、ウマウイルス性動脈炎、ウマ鼻疽、ウマ疥癬、ウマ痘、日本脳炎、スーラ病（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｅｖａｎｓｉ）、ベネズエラウマ脳脊髄炎を含むウマ疾患；ブタ萎縮性鼻炎、ブタエンテロウイルス性脳脊髄炎、ブタブルセラ症、ブタ胞虫症、ブタ繁殖・呼吸障害症候群、伝染性胃腸炎を含むブタ疾患；並びにウサギ粘液腫、ウサギウイルス性出血病及び野ウサギ病を含むウサギ疾患。
【００３８】
これらはＯＩＥのリストＢ疾患の一部であり、諸国内において社会経済及び／又は公衆衛生上の深刻な影響をもたらすと考えられるとともに、動物及び畜産物の国際貿易において深刻な感染症である。
【００３９】
特定の病原体には、口蹄疫ウイルス、ＦｅＬＶ（ネコ白血病ウイルス）、ＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）、ＣＤＶ（イヌジステンパーウイルス）、パルボウイルス、コロナウイルス、ウシ呼吸器多核体ウイルス及びウシウイルス性下痢ウイルスが含まれる。
【００４０】
しかし、更に、例えば、腫瘍抗原が疾患に関連する場合の癌のように、抗原は病原体に必ずしも関連しない疾患に関連している。通常、腫瘍抗原は、癌において異常に過剰発現されるか、又は、癌において異常形態、例えば、突然変異型で発現されるタンパク質である。
【００４１】
プリオン及びその部分は、本発明の実施に使用可能な抗原であり、病原生物に関連するとは考えられていない。プリオンは、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）及びヒツジのスクレイピーのような海綿状脳症に関連している。
【００４２】
本発明の分野にて使用するワクチン抗原は、ウイルス、細菌、真菌及び蠕虫を含む寄生虫のような微生物の抗原性又は免疫原性成分又はこのような成分の部分を含み、これは動物疾患の予防を目的とし、又は、動物疾患を防御する。
【００４３】
好適な抗原には、例えば、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のＥ２タンパク質、ウシ白血病ウイルスのｇｐ５１タンパク質及び呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）のＦ又はＧタンパク質が含まれる。これらタンパク質のアミノ酸配列はウイルスゲノムにコードされている。ウイルスゲノムのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ＮＣ―００１７８１（ヒトＲＳＶ）、ＮＣ―００１９８９（ウシＲＳＶ）、ＡＦ０３３８１８（ウシ白血病ウイルス）、ＡＦ０９１６０５（Ｉ型ＢＶＤＶ）及びＡＦ１４５９６７（ＩＩ型ＢＶＤＶ）である。
【００４４】
他の好適な疾患関連抗原は当業者により選択可能であり、通常、このような多くの抗原については、これらをコードしているアミノ酸配列及びｃＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋにて得ることができる。
【００４５】
通常、抗原は、病原体又は腫瘍抗原のポリペプチド成分のような疾患に関連するポリペプチドの全部又は部分である。ポリペプチドの部分は、抗体応答のような免疫応答を誘発可能なポリペプチドの任意の部分でよい。僅か５個のアミノ酸を有するペプチドが抗体応答を誘発しうることが知られているが、通常、より大きなペプチドが使用される。従って、抗原がポリペプチドである場合、少なくとも５個のアミノ酸、通常は５〜５００、５〜２００、５〜１００、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０のように５〜１０００個のアミノ酸、例えば、５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０個のアミノ酸を有しうる。
【００４６】
本発明の化合物の抗原は、疾患を予防する免疫応答を誘発することが可能であれば、疾患に関連する分子の変異体でありうることを理解されよう。このような変異体は、疾患に関連する天然抗原に比し、１つ以上のアミノ酸置換を有するポリペプチドを含み、置換は５％にもなる。通常、置換は保存的置換であり、この場合、例えば、「変異体」とは、１つ以上の位置にてアミノ酸の保存的又は非保存的な挿入、欠失又は置換がなされたタンパク質を指すが、このような変化によりタンパク質の基本特性、例えば、酵素活性（活性型及び特異活性）、耐熱性、ｐＨ領域の活性（ｐＨ安定性）が有意に変化していないタンパク質を生じる場合のことである。この場合の「有意に」とは、当業者であれば変異体の特性は元のタンパク質の特性に対してやはり異なるかもしれないが、自明でないことはないだろうと述べるであろうということである。
【００４７】
「保存的置換」とは、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；及びＰｈｅ，Ｔｙｒのような組合せのことである。
【００４８】
このような変異体は、タンパク工学及び部位特異的突然変異誘発の標準方法を用いて作製しうる。
【００４９】
樹状細胞に選択的に結合する分子部分と抗原は共有結合されることが好ましい。分子部分及び抗原の各々がポリペプチドである場合、当該２部分は任意の従来のポリペプチド架橋法により結合されうる。例えば、本発明の化合物の当該２部分は、O’Sullivan et al Anal. Biochem. (1979) 100, 100-108に概括的に記載された方法のように、任意の従来のポリペプチド架橋法により結合される。例えば、第一の部分はチオール基を導入され、第二の部分は、当該チオール基と反応可能な二価性試薬、例えば、ヨード酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＩＡ）又はＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような、共役の種間にジスルフィド橋を挿入するヘテロ二価性架橋剤と反応しうる。例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでなされるアミド及びチオエーテル結合は、概して、ｉｎ  ｖｉｖｏでジスルフィド結合より安定している。
【００５０】
更なる有用な架橋剤には、温和な条件下でスルフヒドリル基の脱保護を可能にする、一級アミンのチオール化試薬であるＳ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＡＴＡ）（Julian et al (1983) Anal. Biochem. 132, 68）、スベルイミノ酸ジメチル二塩酸塩及びＮ，Ｎ−ｏ−フェニレンジマレイミドが含まれる。
【００５１】
また、当該化合物は組換えＤＮＡ技術により融合化合物（又は融合ポリペプチド）として生成可能であり、これによりＤＮＡ長は、樹状細胞に選択的に結合する分子部分のポリペプチド部分と、化合物の所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードしている領域に互いに隣接しているか、又は、その領域に分離された抗原とをコードしている、それぞれの領域を含む。
【００５２】
本明細書で用いるように、融合ポリペプチドは、本発明の化合物の抗原であるポリペプチドのＮ−又はＣ−末端に融合した、樹状細胞に結合する分子部分のポリペプチド部分であるポリペプチドを含む融合ポリペプチドである。このような融合ポリペプチドを得る簡便な方法は、ポリヌクレオチド配列のインフレームでの融合を翻訳すること、即ち、混成遺伝子を用いることである。融合ポリペプチドをコードしている混成遺伝子を、宿主細胞を形質転換し、又は、宿主細胞にトランスフェクションするのに用いられる発現ベクターに挿入する。通常、翻訳及び転写制御領域は発現ベクター中に存在する。次に、ＤＮＡは好適な宿主に発現され、本発明の第一の態様による化合物を含むポリペプチドを生成する。
【００５３】
抗原は、動物の疾患に関連する２個以上の分子又はこのような分子の部分若しくは変異体を含みうる。
【００５４】
このように、本発明の化合物は、１種類以上の疾患に対するワクチン接種を行うのに用いうる。従って、化合物は、例えば、１つの病原体由来の抗原（例えば、ＢＶＤＶのＥ２ポリペプチド又はその免疫原性部分）と、第二の病原体由来の抗原（例えば、ＲＳＶのＦタンパク質又はその免疫原）とを、樹状細胞に結合する分子部分として同一ポリペプチド鎖に含みうる。他の変形例は当業者には明らかであろう。
【００５５】
本発明の第二の態様は、本発明の第一の態様の融合化合物をコードしている核酸分子を含む。
【００５６】
好適な核酸分子は、Sambrook, J. and Russell, D. (2001) "Molecular Cloning: a laboratory manual" 3rd ed. Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを含むクローニング・マニュアルに記載されているような慣用的方法を用いて、当業者により容易に合成又は構築しうる。
【００５７】
本発明の第一の態様の化合物の抗原をコードしているＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどのＤＮＡ配列データベースを検索して同定することが可能である。好適な抗原のＤＮＡコード配列の例は上記で触れた。選択した抗原をコードしているＤＮＡ配列が分かれば、これを用いて、例えば、治療する疾患に関連する病原体から抗原をコードしているＤＮＡ又はｃＤＮＡ配列を特異的に分離するのに有用なプライマー及び／又はプローブを設計することが可能である。ＤＮＡ配列が分かれば、プライマー及びプローブは、市販のソフトウェアを用いて設計し、自動化合成により合成することが可能である。一般的に、抗原をコードしているＤＮＡ配列は、選択した病原体のような適切な分離源から生成されるｃＤＮＡ又はＤＮＡ配列のライブラリから分離可能である。ライブラリは、非常に厳密な条件下で、選択した抗原をコードしている既知のＤＮＡ配列に相補的なプローブを用いて、対象とするＤＮＡ配列に対してスクリーニングすることが可能である。プローブにハイブリダイズするＤＮＡ配列はサブクローン可能であり、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドは、ＤＮＡ配列分析及び／又はポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、発現と検出又は同様のアッセイにより確認できる。しかし、通常、抗原をコードしている好適なＤＮＡ配列は、当該技術分野において既知であるように、ＰＣＲ及びコード領域の５’及び３’末端方向の好適なプライマーを用いて合成しうる。
【００５８】
選択した抗原をコードしているＤＮＡ配列が分離されれば、これを、例えば、樹状細胞のＤＣ−ＳＩＧＮに選択的に結合するＨＩＶ  ｇｐ１２０のような、樹状細胞に結合する分子部分をコードしているＤＮＡ配列に機能的に連結できる。抗原をコードしているＤＮＡ配列及び樹状細胞に結合する分子部分は、双方とも転写・翻訳制御領域に機能的に連結した同じリーディングフレームに存在する。転写・翻訳制御領域は、プロモーター、エンハンサー、シス調節因子、ポリアデニル化配列、転写・翻訳開始領域及び転写終止配列を含む。
【００５９】
次に、ＤＮＡは好適な宿主に発現され、本発明の第一の態様による化合物であるポリペプチドを生成する。従って、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードしているＤＮＡは、本明細書に包含される教示に照らして適切に修飾され、既知の技法に従って使用して発現ベクターを構築し、次に、これを使用して本発明のポリペプチドの発現及び生成のために適切な宿主細胞を形質転換しうる。
【００６０】
従って、本発明の化合物を構成するポリペプチドをコードしているＤＮＡは、適切な宿主への導入のために他の広範なＤＮＡ配列に結合しうる。伴侶のＤＮＡは、宿主の性質、ＤＮＡの宿主への導入方法及びエピソームの保持又は組込の要求度に依存する。
【００６１】
一般的に、ＤＮＡはプラスミドのような発現ベクターに、適切な配向及び適正なリーディングフレームにて挿入されて発現される。必要であれば、ＤＮＡは、所望の宿主が認識する適切な転写・翻訳調節制御ヌクレオチド配列に連結しうるが、概してこのような制御は発現ベクターで得られる。次に、標準手法によりベクターを宿主に導入する。一般的に、宿主全てがベクターにより形質転換されるわけではない。従って、形質転換された宿主細胞を選択することが必要になる。１つの選択手法は、抗生物質抵抗性のような形質転換細胞において選択可能な形質をコードするＤＮＡを発現ベクターに組み込むことに関わる。また、このような選択可能な形質の遺伝子を別のベクターに導入し、これを、所望の宿主細胞を同時形質転換するのに用いることができる。
【００６２】
次に、本発明の組換えＤＮＡにより形質転換された宿主細胞を、本明細書に開示した教示に照らし、十分な時間、当業者には周知の適切な条件下で培養してポリペプチドを発現させ、次に、これを回収することができる。
【００６３】
多くの発現系が知られており、この中には細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、糸状菌（例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、植物細胞、動物細胞及び昆虫細胞がある。
【００６４】
ベクターは、他の非原核生物細胞種で発現されるのに使用するとしても、原核生物で増殖するようにＣｏｌＥ１  ｏｒｉのような原核生物のレプリコンを含む。ベクターは、形質転換させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌宿主細胞において遺伝子の発現（転写及び翻訳）を誘導できる、原核生物のプロモーターのような適切なプロモーターも含みうる。通常、ベクターは宿主細胞に安定的に組み込まれ、及び／又は、化合物を高発現させるベクターである。好適なベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ  ３．１（＋／−Ｈｉｓタグ）を含む。
【００６５】
本発明者がいう「プロモーター」とは、ＤＮＡ配列により形成され、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写を生じさせる発現制御因子のことである。通常、典型的宿主に適合するプロモーター配列は、本発明のＤＮＡセグメントの挿入に好都合な制限部位を含むプラスミドベクターにて提供される。
【００６６】
従って、本発明の別の態様は、本発明の第一の態様の化合物をコードしている核酸分子により形質転換された宿主細胞を提供する。
【００６７】
本発明の化合物の発現に特に好ましい宿主細胞は、タンパク質を糖化することが可能なＣＯＳ及びＣＨＯ細胞を含む。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を使用しうるが、その場合、化合物の最終生成物に存在しうるリポ多糖成分それ自体が免疫刺激物質でありうる。これは場合によっては有益であるが、免疫応答測定の障害となりうるような望ましくない場合もありうる。
【００６８】
ＤＮＡポリマーを発現させる条件下での宿主細胞の培養は、従来の方法で行われる。生成物は、宿主細胞又は発現産物の局在（細胞内又は培地若しくは細胞のペリプラズムに分泌）に従って従来の方法により回収されうる。従って、宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌の場合、生成物は、例えば、物質的、化学的又は酵素的に溶解され、タンパク質産物は生じた溶解物から分離しうる。宿主細胞が哺乳動物の場合、一般的に、生成物は栄養培地又は無細胞抽出物から分離しうる。宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母の場合、一般的に、生成物は溶解細胞又は培地から分離され、次に、従来の手法を用いて更に精製されうる。発現系の特異性は、対象ポリペプチドに対する抗体を使用したウェスタンブロット法により評価しうる。
【００６９】
従来のタンパク質分離法は、選択的沈殿吸着クロマトグラフィー及びモノクローナル抗体アフィニティーカラムを含むアフィニティー・クロマトグラフィーを含む。
【００７０】
本発明が「カセット発現」ベクターの提供に容易に適することが理解されようが、これにより、カセット発現ベクターの適切な位置に挿入された選択抗原のコード領域に容易に融合可能な、ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０のような樹状細胞に結合する分子部分のコード配列を含むベクターが生成される。
【００７１】
従って、本発明の更なる態様は、（ｉ）樹状細胞に選択的に結合する分子部分をコードする部分と、（ｉｉ）抗原をコードしているポリヌクレオチドを挿入するための挿入ポイントとを含み、前記ポリヌクレオチドが前記挿入ポイントに挿入されたとき、前記核酸分子が本発明の第一の態様による化合物をコードする核酸分子を提供する。
【００７２】
通常、核酸分子は、抗原コード領域が挿入ポイントに挿入された時点で融合ポリペプチドを発現させるために、適切な転写・翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの形態をとる。当該技術分野で周知のように、「カセット発現」ベクターにおける挿入ポイントは、フレーム内融合物が生成されるように、適切なコード配列（この場合、抗原をコードしている配列）の挿入を容易に可能にする挿入ポイントである。通常、挿入ポイントは核酸内の特有の制限部位である。
【００７３】
通常、ベクターは宿主細胞に安定的に組み込まれ、及び／又は、化合物を高レベルで発現させるベクターである。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から入手可能なｐｃＤＮＡ３．１（＋／−Ｈｉｓタグ）ベクターは基礎とすることができ、都合がよい。
【００７４】
抗原はそのＮ末端又はＣ末端にて結合分子部分に融合されるため、挿入ポイントは結合分子部分のコード配列の５’末端又は３’末端であり、好適な転写・翻訳シグナルは当業者には周知のように適切に配置されうる。
【００７５】
本発明の第一の態様の化合物は、動物疾患に対する免疫化及びその治療において有用である。従って、当該化合物はワクチンにおいて有用である。
【００７６】
本発明の更なる態様は、本発明の第一の態様による化合物を医薬用として提供する。通常、当該化合物はパッケージされ、動物用医薬として提示される。
【００７７】
本発明の更なる態様は、本発明の第一の態様による化合物を含むワクチンを提供し、当該ワクチンは本発明のワクチン製剤においてアジュバント化されていることが好ましい。好適なアジュバントはアラム及びＱｕｉｌＡのように市販されている。
【００７８】
アジュバント組成物は、主にＴｈ１型の免疫応答を誘導することが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ，ＴＮＦα，ＩＬ−２及びＩＬ−１２）は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘導を導く傾向がある。当該化合物はＴｈ１及びＴｈ２応答の双方を生じさせることが好ましい。
【００７９】
本発明の更なる態様は、本発明の第一の態様による化合物及び製薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８０】
担体（１つ又は複数）は、本発明の化合物に適合するとともに、そのレシピエントに有害でないという意味において「許容可能」でなければならない。通常、担体は、無菌で発熱物質を含有しない水又は生理食塩水であろう。しかし、他の許容可能な担体も使用しうる。
【００８１】
通常、本発明の医薬組成物又は製剤は、非経口投与用、より具体的には静脈投与用である。当該組成物及び製剤は次の経路で投与しうる：筋肉内、皮下、皮内、鼻腔内、静脈内、経口及び腹腔内。筋肉内投与が獣医にとって最も実用的な方法であるため、最も好ましい。
【００８２】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静細菌剤及び製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含みうる水性及び非水性滅菌注射用溶液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含みうる水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。
【００８３】
本発明は、本発明の第一の態様による化合物を動物に投与するステップを含む、疾患に対して動物を免疫化する方法を提供する。
【００８４】
投与する化合物は、（ｉ）免疫化する動物（動物に対して異質の適切な結合分子部分を選択できるように）及び（ｉｉ）免疫性を付与する疾患（適切な抗原を選択するように）に基づいて選択されることを理解されよう。
【００８５】
従って、本発明の特に好ましい実施形態は、（ｉ）動物の樹状細胞に選択的に結合するが、前記動物において自然発生しない分子部分及び（ｉｉ）疾患に関連する抗原を含む化合物を動物に投与するステップを含む、前記疾患に対して動物を免疫化する方法である。
【００８６】
当該方法及び組成物は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ及びウサギのような家畜並びにネコ及びイヌのような伴侶動物を含む、好ましくは経済的観点から重要な動物を免疫化し、保護することを目的にしうる。使用する抗原の種類により、これら抗原を用いた動物の免疫化は、結果的に感染の予防、症状の改善、死亡率の減少及び／又は中和抗体の誘導を可能にする。
【００８７】
従って、本発明は、本発明の第一の態様による化合物を動物に投与するステップを含む、動物の疾患を治療する方法も提供する。
【００８８】
特に好ましい実施形態は、（ｉ）動物の樹状細胞に選択的に結合するが、前記動物において自然発生しない分子部分及び（ｉｉ）疾患に関連する抗原を含む化合物を動物に投与するステップを含む、動物の疾患を治療する方法である。
【００８９】
通常、当該化合物は免疫原性組成物として投与される。
【００９０】
本発明の方法に従って免疫性を付与し、又は、治療しうる疾患は、ＢＶＤＶ，ＲＳＶ及びウシ白血病ウイルスを含み、適切な抗原は、例えば、ＢＶＤＶ  Ｅ２タンパク質、ＲＳＶ  Ｆ及びＧタンパク質並びにウシ白血病ウイルスのｇｐ５１から選択しうる。従って、本発明の化合物は予防的又は治療的に使用しうる。
【００９１】
通常、治療する疾患は病原体が原因の疾患である。しかし、腫瘍も治療しうる。
【００９２】
本発明の方法により治療しうる腫瘍はメラノーマ（例えば、Nestle, F. O. (2002) Clinical & Experimental Dermatology 27 (7), 597-601を参照されたい）を含む。通常、有効であるためには１種以上の抗原が必要なことがある。これら抗原は、ワクチン接種用に同一の化合物において結合させるか、又は、別々の化合物に含有させてもよい。通常、抗原は、上記Ｎｅｓｔｌｅ（２００２）に記載されているように、突然変異抗原（例えば、突然変異ｐ１６（ＣＤＫＮ２Ａ））、共通の腫瘍特異抗原（例えば、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３及びＮＹ−ＥＳＯ−１）、分化抗原（例えば、チロシナーゼ、ｇｐ１００及びＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ−１）又は細胞表面ガングリオシド類（例えば、ＧＭ２，ＧＤ２及びＧＤ３）でよい。
【００９３】
「腫瘍」という用語は、肺、肝臓、血液細胞、皮膚、膵臓、胃、結腸、前立腺、子宮、乳房、リンパ節及び膀胱の腫瘍を含む、あらゆる形態の新生物細胞増殖を指すものと理解されるものである。固形腫瘍が特に好適である。
【００９４】
本発明の更なる態様は、本発明の第一の態様による化合物を、動物の疾患を治療する医薬品の製造；又は動物を免疫化するワクチンの製造に使用することを提供する。
【００９５】
特に好ましい実施形態は、（ｉ）動物の樹状細胞に選択的に結合するが、前記動物において自然発生しない分子部分及び（ｉｉ）前記動物の疾患に関連する抗原を含む化合物を、動物の疾患を治療する医薬品の製造に使用すること；並びに（ｉ）動物の樹状細胞に選択的に結合するが、前記動物において自然発生しない分子部分及び（ｉｉ）前記動物の疾患に関連する抗原を含む化合物を、動物を免疫化するワクチンの製造に使用することを含む。
【００９６】
本発明は、特に、（ｉ）ＨＩＶ  ｇｐ１２０、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のＬＡＭタンパク質若しくはエボラウイルスの糖タンパク質のいずれか又はこれらの部分及び（ｉｉ）抗原を含む、動物のワクチン接種用化合物を、抗原に関連する疾患を治療する医薬品の製造又は抗原に関連する疾患に対して動物を免疫化するワクチンの製造に使用することを含む。
【００９７】
ワクチン接種動物は樹状細胞に結合する分子部分に免疫応答を示すであろうが、自然感染動物は免疫応答を示さないであろうという理由で、本発明の方法を用いたワクチン接種動物は、本発明の化合物の抗原が関連する病原体に自然感染した動物から識別可能である。
【００９８】
従って、本発明の更なる態様は、動物が本発明の第一の態様による化合物を投与されているかどうかを判定する方法であって、動物が樹状細胞に選択的に結合する分子部分に免疫応答を示しているかどうかを判定するステップを含む方法を提供する。これは、動物が化合物に存在する抗原に免疫応答を示しているかどうかを判定するのにも有用でありうる。
【００９９】
通常、動物から抗体含有試料を採取し、前記分子部分に対する抗体が存在するかどうかを判定する。前記抗原に対する抗体が存在するかどうかも判定する。通常、試料は血液試料である。通例、血液試料は動物の頚静脈又は尾部静脈から得られる。
【０１００】
本発明は、自然感染動物と本発明の第一の態様による化合物を投与された動物とを識別するのに使用しうるパーツキットも提供する。
【０１０１】
１つのパーツキットは、ｉ）本発明の第一の態様による化合物及び（ｉｉ）樹状細胞に選択的に結合する、化合物に存在する分子部分に対する免疫応答を検出する手段及び／又は（ｉｉｉ）前記化合物に存在する抗原に対する免疫応答を検出する手段を含む。
【０１０２】
更なるパーツキットは、ｉ）動物疾患の抗原に対する免疫応答を検出する手段及び（ｉｉ）樹状細胞に選択的に結合する分子部分に対する免疫応答を検出する手段を含む。
【０１０３】
好ましい実施形態において、結合分子部分はＨＩＶ−１  ｇｐ１２０又はその部分である。
【０１０４】
通常、免疫応答は、動物由来の試料が適切な抗体（即ち、抗原及び／又は結合分子部分に対する）を含有するか否かを判定することで検出される。
【０１０５】
従って、免疫応答（単数又は複数）を検出する手段は、ＥＬＩＳＡを用いて抗体応答を判定することを含む。ｇｐ１２０抗体応答を測定するＥＬＩＳＡは、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ又はＩｍｍｕｎｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃで市販されている。
【０１０６】
本明細書で言及した文献は全て、その全体を参照により本明細書に組み込まれる。本明細書中の過去に公開された文献の一覧又は考察は、文献が最新技術の一部又は一般的な知見であるという認識であると必ずしも解釈すべきではない。
【０１０７】
次の図面の簡単な説明及び実施例を参照し、本発明をより詳細に説明する。
【実施例１】
【０１０８】
〈ｇｐ１２０のウシ細胞ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合能〉
本発明者は、ＨＩＶ  ｇｐ１２０−ＦＩＴＣタンパク質（カタログ番号１０２１−Ｆ及び１００１−Ｆ，Ｉｍｍｕｎｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｗｏｂｕｒｎ，ＵＳＡ）がウシＤＣに結合することをフローサイトメトリーにより示した。ＨＩＶ  ｇｐ１２０−ＦＩＴＣを４℃で１時間インキュベートした場合、誘導した結合レベルは低かったが、３７℃でインキュベートするとレベルが上昇した（図４）。
【０１０９】
更に、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ分子に対して生成されたウサギ抗ヒトポリクローナル抗体（Ｄｒ．Ｔ．Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｃｋ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆａｃｕｌｔｙ，Ｖｒｉｊｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍよりご分与）は、共焦点レーザ走査顕微鏡法によりヒトＤＣ（図５）よりウシＤＣ（図５）を染色する程度が低いことを示した。
【０１１０】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０タンパク質のウシ細胞ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合能を評価すべく、タンパク質をコードしているｃＤＮＡを、Ｈｉｓタグ（即ち、オリゴヒスチジンタグ）含有発現ベクターにクローニングする。対照としてＦＩＴＣ標識オボアルブミン（ＯＶＡ）のような、ＤＣ−ＳＩＧＮに結合しないことが既知の無関連Ｈｉｓ標識タンパク質を用いる。ＤＣによるｇｐ１２０−Ｈｉｓの取込みを追跡すべく、ＤＣ培養物を調製し、４細胞群に振り分ける。第一（試験）及び第二（対照）群をｇｐ１２０−Ｈｉｓ又は無関連Ｈｉｓ標識タンパク質で２時間パルスし、洗浄する。第三（陰性対照）群は増殖培地で処理するのみであるが、第四群（取込対照）は、ＤＣの抗原取込能の機能対照としてＤＣのＦＩＴＣ標識抗原（この場合、ＯＶＡ）の取込能を示すために使用する。次に、全細胞群を用いて、共焦点蛍光顕微鏡法によりＦＩＴＣ標識抗Ｈｉｓ抗体を用いて、タンパク質の細胞局在パターンを観察する。最後に、ＤＣ−ＳＩＧＮを遮断するためにポリクローナル抗体でＤＣをプレインキュベートすることにより、ウシＤＣ−ＳＩＧＮ分子に対してポリクローナル抗体が生成され、ＤＣ−ＳＩＧＮによるｇｐ１２０−Ｈｉｓの取込特異性を示す。ＤＣ−ＳＩＧＮの遮断によりｇｐ１２０−Ｈｉｓの取込みは低下するが、他の分子又は対照の取込みは低下しないであろう。
【０１１１】
加えて、或いは、ｇｐ１２０タンパク質のウシ細胞ＤＣ−ＳＩＧＮへの結合能を評価すべく、タンパク質をコードしているｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ及びＮＩＨ  ＡＩＤＳ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍから得た構築体を用いたディレクショナルクローニング法を用いて、Ｈｉｓタグ含有発現ベクターにクローニングする。生じたプラスミドを用いてＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションし、分子量カットオフ・スピンカラム又はＨｉｓタグ精製カラムを用いて、細胞上清及び／又は細胞溶解物から発現タンパク質を濃縮する。ｇｐ１２０−Ｈｉｓの存在を、抗Ｈｉｓ抗体を用いてウェスタンブロット法により評価する。ウシＤＣによるｇｐ１２０−Ｈｉｓの取込みを追跡すべく、ＤＣ培養物を調製し、３細胞群に振り分ける。第一（試験）及び第二（対照）群を、ｇｐ１２０−Ｈｉｓ又は空プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞由来の上清で２時間パルスし、洗浄する。第三群（取込対照；この場合、ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）を機能対照として用いてＤＣの抗原取込能を立証する（Werling, D et al (1999) J Leukoc Biol 66 : 50-58）。次に、全細胞群を用いて、取り込まれたタンパク質の量を観察するか、又は、フローサイトメトリー及び共焦点蛍光顕微鏡法によりタンパク質の細胞局在を同定する。ＦＩＴＣ標識抗Ｈｉｓ抗体を用いてｇｐ１２０−Ｈｉｓを検出する。加えて、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ分子を安定的にトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞を陽性対照として用いる。
【０１１２】
（結果）
公開されたＤＣ−ＳＩＧＮ配列の現在の類似性に基づき、ｇｐ１２０−Ｈｉｓは結合し、次に、ウシＤＣ−ＳＩＧＮ分子により内在化され、また、この結合／取込みはポリクローナル抗体により遮断されるが、これは使用する対照には影響を与えないと考えられる。
【０１１３】
（考察）
結合したｇｐ１２０−Ｈｉｓと内在化したｇｐ１２０−Ｈｉｓとを識別すべく、細胞が取り込んだｇｐ１２０−Ｈｉｓの量を測定することが可能であり、ＥＤＴＡ−トリプシン溶液で細胞を処理すると、表面に結合したｇｐ１２０−Ｈｉｓを分解するが、内在化したｇｐ１２０−Ｈｉｓは分解しない。その後、モノクローナル抗体をＨｉｓタグ又は直接ｇｐ１２０タンパク質に対して用いて、ウェスタンブロット法により細胞抽出物又はサイトゾル抽出物を分析し、ｇｐ１２０−Ｈｉｓの存在を確認する。ｇｐ１２０−Ｈｉｓの取込みが効果を示すと、ｇｐ１２０はモデル抗原（即ち、ウシ呼吸器多核体ウイルス又はウシウイルス性下痢ウイルスのＥ２タンパク質）とともに発現され、これを更なる検討のために用いる（単純化のため、この生成物をｇｐ１２０−Ａｇと命名する）。
【実施例２】
【０１１４】
〈抗原パルス化ＤＣによるＴｈ１免疫応答の発現亢進〉
最近のデータでは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）又はＤＣ−ＳＩＧＮのようなパターン認識受容体による抗原の取込みにより、Ｔｈ１型免疫応答の発現が亢進し、抗原パルス化ＤＣによりＩＦＮα及びＩＬ−１２が放出されることを重視している。これらサイトカインの放出では細胞性免疫の発現が好ましい。
【０１１５】
ＴＬＲに結合することが既知である１つの抗原は呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）のＦタンパク質であり、この結合によりＩＬ−１２が誘導される（Haeberle, HA et al (2002) J Infect Dis 186: 1199-1206；Haynes, LM et al (2001) J Virol 75: 10730-10737；及びKurt-Jones, EA et al (2000) Nat Immunol 1: 398-401）。ＲＳＶはウシ及びヒトを含む、複数の種の新生子（児）における下気道感染の主原因であるため、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をモデル抗原としてこれら試験において用いる。
【０１１６】
ＨＩＶ  ｇｐ１２０（試験１で生成）、ＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｄｒ．Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｏｍｐｔｏｎよりご分与）又はｇｐ１２０／Ｆタンパク質の融合タンパク質（試験１で生成）を含有するＨｉｓタグ発現ベクターを用いて、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクションする。７２時間後、ニッケル−アガロースを用いて細胞上清及び溶解細胞からＨｉｓタグタンパク質を採取し、抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット法によりその存在を解析する。
【０１１７】
ウシＤＣに対するｇｐ１２０−Ｈｉｓ、Ｆ−タンパク質−Ｈｉｓ又はｇｐ１２０−Ａｇの効果を実証すべく、異なる用量の各精製タンパク質で細胞を２時間インキュベートする。この後、上清を採取し、ＥＬＩＳＡ系を用いてＩＦＮα，ＩＬ−１０及びＩＬ−１２の存在を解析する（Werling, D et al (2004) Immunology 111 : 41-52）。
【０１１８】
（結果）
ｇｐ１２０−Ｈｉｓ又はｇｐ１２０−Ａｇに曝露したＤＣにより放出されるＩＦＮα及びＩＬ−１２の量は、同時間・同量でｇｐ１２０−Ｈｉｓに曝露した末梢血リンパ球又はマクロファージにより生成されるＩＦＮα及びＩＬ−１２の量より多いと考えられる。更に、ｇｐ１２０−Ｈｉｓ単独でＩＬ−１０の生成、Ｆ−タンパク質−Ｈｉｓでは主にＩＬ−１２の生成、ｇｐ１２０−ＡｇではＩＬ−１２の高放出になると考えられる。
【実施例３】
【０１１９】
〈ＤＣによる無感作Ｔ細胞の刺激〉
マクロファージ及びＢ細胞のような他の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に比し、ＤＣは無感作Ｔ細胞を刺激し、更に強度に記憶Ｔ細胞応答を刺激する無類の能力を有する（Werling et al (1999)；Werling, D et al (2002) J Leukoc Biol 72: 297-304）。ｇｐ１２０−Ａｇパルス化ＤＣの刺激能を評価すべく、また、これらが無感作Ｔ細胞及び記憶Ｔ細胞を刺激できるかどうかを評価するために、異なるサブセットのＡＰＣを生成し（Werling et al (2002)）、ｇｐ１２０−Ａｇで様々な時間（０〜６時間）インキュベートする。この後、マイトマイシン−Ｄへの曝露により、ＤＣを不活化し、種々の相関にて同一ドナーの選別したＣＤ４＋Ｔ細胞に添加する。培養５日後、ベータカウンターを用いた液体シンチレーション計数法により、増殖Ｔ細胞のＤＮＡに取り込まれた［３Ｈ］標識チミジンの量を測定することにより、ｇｐ１２０−Ａｇパルス化ＤＣ、マクロファージ及びＢ細胞の刺激能を評価する。
【０１２０】
ＢＲＳＶ免疫化ウシ由来のＡＰＣ及びＴ細胞を用いて同様の試験を行い、こうしてＡＰＣサブセットの記憶Ｔ細胞応答を刺激する特性を評価する（免疫化動物へのアクセスはＤｒ  Ｇｅｒａｌｄｉｎｅ  Ｔａｙｌｏｒ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｃｏｍｐｔｏｎを介して存在）。
【０１２１】
（結果）
Ｔ細胞の高増殖はＤＣの存在下でのみ見出され、マクロファージやＢ細胞では見出されないと考えられる（応答が１０倍低いことを示す）。
【０１２２】
ＢＲＳＶ免疫化動物由来のＴ細胞で混合培養する際、ｇｐ１２０−ＡｇでパルスしたＤＣのみが無感作Ｔ細胞の増殖を刺激し、他のＡＰＣの１０倍の増殖応答を誘導するとも考えられる。
【実施例４】
【０１２３】
〈ＨＩＶ−１結合によるＤＣ−ＳＩＧＮのエンドサイトーシス〉
ヒトの場合のシステムにおいて、ＨＩＶ−１結合の結果としてのＤＣ−ＳＩＧＮのエンドサイトーシスにより、ＤＣ表面のＤＣ−ＳＩＧＮ分子の数が減少する。標準方法によりマウスにおいて特異的モノクローナル抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を生成し、或いは、標準方法によりウサギにおいてポリクローナル抗ＤＣ−ＳＩＧＮ抗体を生成し、これらがｇｐ１２０−Ａｇ又はｇｐ１２０−ＨｉｓのＤＣ−ＳＩＧＮへの結合を阻害するか否かの試験を行う。非阻害抗体及び蛍光標識２次抗マウス抗体を用いて、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を援用し、ＤＣ（陰性対照として、ｇｐ１２０−Ａｇ培地又は空プラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ−７細胞の上清でパルス化）の表面上のＤＣ−ＳＩＧＮ発現を定量する。ｇｐ１２０−Ａｇ又はｇｐ１２０−Ｈｉｓで２時間パルスした後、類似ＤＣ群において測定を反復する（試験群）。
【０１２４】
ＤＣ−ＳＩＧＮの結合及び内在化の可能性を増大させるように、十分な量のｇｐ１２０−Ａｇを使用するようにする。
【０１２５】
（結果）
試験群における表面のＤＣ−ＳＩＧＮの量が対照群のＤＣ−ＳＩＧＮの量と同程度であれば、恐らく有意なＤＣ−ＳＩＧＮのエンドサイトーシスは生じず、ＤＣ−ＳＩＧＮ結合抗原は分解から保護されて処理されないという理論を支持すると考えられる。ｇｐ１２０−Ａｇの結合時に表面のＤＣ−ＳＩＧＮ発現が低下すれば、恐らくＤＣ−ＳＩＧＮはＤＣに取り込まれ、従って、引き続いて細胞内のエンドサイトーシス区画に送達され、これによりタンパク質処理が可能になり、次に、ＭＨＣクラスＩＩ（及びＭＨＣクラスＩ）分子を介してＴ細胞に提示される。こうしてＴ細胞の増殖応答が引き続くことになる。
【０１２６】
免疫応答が発現するためにはエンドサイトーシスが生じることが必要である。
【０１２７】
ＤＣ−ＳＩＧＮの遮断はｇｐ１２０−Ｈｉｓの取込みを低下させるであろうが、他の分子はそうではない。
【０１２８】
有用と思われる対照群には、例えば、短時間のトリプシン処理により表面のＤＣ−ＳＩＧＮを有さないＤＣ及びＤＣ−ＳＩＧＮのエンドサイトーシスを惹起する薬剤が含まれる（陽性対照）。
【実施例５】
【０１２９】
〈動物におけるｇｐ１２０−Ａｇ免疫化の有効性〉
動物におけるｇｐ１２０−Ａｇ免疫化の有効性を実証すべく、種々の量のｇｐ１２０−Ａｇによりウシを免疫化し、Ｆタンパク質のような抗原又はｇｐ１２０に対する抗体応答の発現を、特異的Ａｇに利用可能なＥＬＩＳＡ系を用いて解析する。ｇｐ１２０及びＲＳＶ−Ｆタンパク質に好適なＥＬＩＳＡ系は市販されている。担体溶液単独、精製ｇｐ１２０−Ｈｉｓ、精製Ｆタンパク質−Ｈｉｓ又はｇｐ１２０−Ａｇにより４動物群を免疫する。免疫化前後に週１回の頻度で血液試料を採取し、血清試料中の抗体価を測定する。
【０１３０】
（結果）
ｇｐ１２０−Ａｇにより免疫化した動物は、ｇｐ１２０及びＦタンパク質のような対象とするＡｇの双方に対する抗体を発現すると考えられる。Ａｇ特異的抗体とｇｐ１２０特異的抗体との関連を評価するためには、ｇｐ１２０−Ｈｉｓにより免疫化した動物の抗体価が対照として機能し、こうしてｇｐ１２０−Ａｇの取込み及び提示の効率性を実証するデータが確定する。
【０１３１】
通常、ｇｐ１２０−Ａｇにより免疫化した動物におけるｇｐ１２０に対する抗体価を、動物個体の良好な免疫化の直接的な指標として用いることができ、また、これにより免疫化動物と自然感染動物との識別も可能になる。
【実施例６】
【０１３２】
〈良好に免疫化された動物への抗原曝露〉
動物の免疫化を良好に確定した後、同動物群にＲＳＶ  Ｆタンパク質（又は全ＲＳＶ）のような抗原を曝露し、臨床兆候の発現をモニタリングする。
【０１３３】
（結果）
Ｆタンパク質はＲＳＶの主抗原の１つであるため、免疫化動物は以後の曝露に対して防御反応を示し、臨床徴候を示さないが、ｇｐ１２０−Ｈｉｓ又は担体溶液を投与された動物はそうではないと考えられる。
【実施例７】
【０１３４】
〈ウシＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡ配列の獲得〉
Ｗｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  ７２：２９７−３０４における手順に従ってウシ樹状細胞を分離し、ｍＲＮＡを分離した。Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（カタログ番号Ｋ１８１１−１）を使用し、プライマーＴＡＧＣＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＧを用いてｃＤＮＡを増幅した。変異体１と呼称する増幅ｃＤＮＡを配列決定し、図１にそのヌクレオチド配列を示す。
【０１３５】
マウス及びヒトＤＣ−ＳＩＧＮ分子（それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３７３４０８及びＮＭ＿０２１１５５）が共有する相同性に基づいて縮重プライマーを使用し、更なるウシＤＣ−ＳＩＧＮのｃＤＮＡ部分配列を得て、これを変異体２と呼称する。図６にウシＤＣ−ＳＩＧＮの変異体２のｃＤＮＡ部分配列を示す。
【０１３６】
ウシＤＣ−ＳＩＧＮ変異体のｃＤＮＡ配列は、双方ともＣ型レクチン受容体をコードし、塩基対及び／又はアミノ酸配列において、対応するマウス及びヒトの配列と最大で８９％の相同性を共有する（図７）。
【０１３７】
図７は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ（ＮＭ＿０２１１５５＿ＡＡ）、マウスＤＣ−ＳＩＧＮ（マウスＤＣ−ＳＩＧＮ＿ＡＡ）及びウシＤＣ−ＳＩＧＮの２変異体（ウシＤＣ−ＳＩＧＮ変異体１／２）のアミノ酸配列のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメントを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ウシＤＣ−ＳＩＧＮ変異体をコードしているｃＤＮＡの部分配列を示す配列図である（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１）。文字“ｎ”は任意の４種の天然ヌクレオチドＡ，Ｇ，Ｃ又はＴを意味する。
【図２Ａ】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社のＳＥセントラル配列解析パッケージ（Ａｌｉｇｎ  Ｐｌｕｓ及びＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ）を用いた、チンパンジー、ナミチンパンジー、ヒト、マカク属及びマウス由来のＤＣ−ＳＩＧＮをコードしているｃＤＮＡ配列のアラインメントを示す配列図である（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．２−５）。アラインメント、パラメータ及び設定条件を示す。ダッシュはヌクレオチドが存在しないことを示す。
【図２Ｂ】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社のＳＥセントラル配列解析パッケージ（Ａｌｉｇｎ  Ｐｌｕｓ及びＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ）を用いた、チンパンジー、ナミチンパンジー、ヒト、マカク属及びマウス由来のＤＣ−ＳＩＧＮをコードしているｃＤＮＡ配列のアラインメントを示す配列図である（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．２−５）。アラインメント、パラメータ及び設定条件を示す。ダッシュはヌクレオチドが存在しないことを示す。
【図２Ｃ】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社のＳＥセントラル配列解析パッケージ（Ａｌｉｇｎ  Ｐｌｕｓ及びＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ）を用いた、チンパンジー、ナミチンパンジー、ヒト、マカク属及びマウス由来のＤＣ−ＳＩＧＮをコードしているｃＤＮＡ配列のアラインメントを示す配列図である（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．２−５）。アラインメント、パラメータ及び設定条件を示す。ダッシュはヌクレオチドが存在しないことを示す。
【図２Ｄ】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社のＳＥセントラル配列解析パッケージ（Ａｌｉｇｎ  Ｐｌｕｓ及びＣｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ）を用いた、チンパンジー、ナミチンパンジー、ヒト、マカク属及びマウス由来のＤＣ−ＳＩＧＮをコードしているｃＤＮＡ配列のアラインメントを示す配列図である（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．２−５）。アラインメント、パラメータ及び設定条件を示す。ダッシュはヌクレオチドが存在しないことを示す。
【図３】チンパンジー、ヒト及びマカク属由来のＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ．７−９）に対する、ウシＤＣ−ＳＩＧＮ変異体１の推定部分的アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）のアラインメントを示す配列図である。ダッシュはアミノ酸が存在しないことを示す。ウシＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸配列中のアステリスクは、アミノ酸配置が存在しないことを示す。アラインメントはＳＥセントラル配列解析パッケージを用いて行った。アラインメントパラメータ：基準分子に対するタンパク質のグローバルアラインメント；パラメータ：スコアマトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；基準分子：推定ウシＤＣ−ＳＩＧＮ、１−５７７領域；アラインメントする配列の数：４：推定ウシＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸１９２個；チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮのアミノ酸４０４個；ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ＿ＣＤＳのアミノ酸４０５個；アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）＿ＣＤＳのアミノ酸４０５個であった。
【図４】ＨＩＶ  ｇｐ１２０−ＦＩＴＣのウシＤＣへの結合を示すグラフである。細胞は未処理状態にし、或いは、４℃又は３７℃にてｇｐ１２０−ＦＩＴＣで６０分間インキュベートし、フローサイトメトリーで解析した。
【図５】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ分子に対してポリクローナル抗体が生成された、ヒト単球由来のマクロファージ、ヒト単球由来の樹状細胞及びウシ単球由来の樹状細胞の染色パターンを示す写真である。
【図６】ウシＤＣ−ＳＩＧＮ、変異体２をコードしているｃＤＮＡの部分配列を示す配列図である（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）。
【図７】ヒトＤＣ−ＳＩＧＮ、マウスＤＣ−ＳＩＧＮ及びウシＤＣ−ＳＩＧＮの２変異体のアミノ酸配列のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（１．７）によるアラインメントを示す配列図である。
【図１】
2007501009.tif 000003
【図２Ａ】
2007501009.tif 000004
【図２Ｂ】
2007501009.tif 000005
【図２Ｃ】
2007501009.tif 000006
【図２Ｄ】
2007501009.tif 000007
【図３】
2007501009.tif 000008
【図３】
2007501009.tif 000009
【図４】
2007501009.tif 000010
【図５】
2007501009.tif 000011
【図６】
2007501009.tif 000012
【図７】
2007501009.tif 000013
【配列表】
2007501009000001.app
【国際調査報告】
2007501009.tif 000014
2007501009.tif 000015
2007501009.tif 000016
2007501009.tif 000017