(57)【要約】本発明は、Ｔ細胞免疫応答阻害剤を開示する。本発明で提供するＴ細胞免疫応答阻害剤は、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原を含むか；またはターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の活性ポリペプチドを含むか；または不活性化病原体およびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンを含む。本発明のＴ細胞免疫応答阻害剤は、生物を刺激して、正常特異的抗体免疫応答を生じ、そして特異的細胞免疫応答、特にＴｈ１免疫応答を阻害することも可能であり、したがって自己免疫疾患、臓器移植、アレルギーおよびＴ細胞レベルの調節の治療に有効に適用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原；またはターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の活性ポリペプチド；または不活性化病原体および前記のターゲットとされる病原体の核酸ワクチンを含む、Ｔ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項２】
ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の単一のパッケージまたは混合物を含む、請求項１記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項３】
前記のＴ細胞免疫応答阻害剤のターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の物理的比率が、２：１〜１０：１である、請求項２記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項４】
前記のＴ細胞免疫応答阻害剤のターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の物理的比率が、５：１である、請求項３記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項５】
ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の活性ポリペプチドの単一のパッケージまたは混合物を含む、請求項１記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項６】
前記のＴ細胞免疫応答阻害剤のターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の活性ペプチドの物理的比率が、１：５〜５：１である、請求項５記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項７】
不活性化病原体およびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンの単一のパッケージまたは混合物を含む、請求項１記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項８】
前記Ｔ細胞免疫応答阻害剤における不活性化病原体およびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンの物理的比率が、１：２〜１：１０である、請求項７記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項９】
免疫学的アジュバントもまた含む、請求項１〜８記載のＴ細胞免疫応答阻害剤のいずれか１つ。
【請求項１０】
前記核酸ワクチンが、タンパク質抗原をコードする遺伝子を含有する、真核細胞発現キャリアーである、請求項１〜８記載のＴ細胞免疫応答阻害剤のいずれか１つ。
【請求項１１】
前記真核細胞発現キャリアーにおける、制御タンパク質抗原をコードする遺伝子の発現プロモーターが、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ウイルスプロモーターである、請求項１０記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１２】
前記真核細胞発現キャリアーがプラスミド発現キャリアー、ウイルスまたはバクテリオファージ発現キャリアーであり、そして発現キャリアーがプラスミドＤＮＡおよびウイルスまたはバクテリオファージＤＮＡで形成されるか、あるいは発現キャリアーがプラスミドＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ断片で形成される、請求項１０記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１３】
前記タンパク質抗原をコードする遺伝子のＤＮＡが、人工的に合成されるか、あるいは微生物、真核生物および植物細胞または組織から得られる二本鎖ＤＮＡに由来することも可能である、請求項１０記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１４】
前記タンパク質抗原が、人工的合成によって、または生物学的産生によって得られるタンパク質である、請求項２、請求項３または請求項４記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１５】
前記タンパク質抗原の活性ポリペプチドが、人工的合成によって、または生物学的産生によって得られる、請求項５または請求項６記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１６】
前記生物有機体の産生が、人工的培養条件下での、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはバシロシン（ｂａｃｉｌｌｏｃｉｎ）またはサッカロミセート（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ）あるいは他の真核細胞生物の増進された産生を利用することも可能である、請求項１４記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１７】
前記生物有機体の産生が、人工的培養条件下での、大腸菌またはバシロシンまたはサッカロミセートあるいは他の真核細胞生物の増進された産生を利用することも可能である、請求項１５記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１８】
前記不活性化病原体が、非感染性病原体を得るために、一般的に知られる方法を用いて、ウイルス、病原性細菌、寄生虫およびアレルゲン性物質を分離しそして産生することも可能である、請求項７または請求項８記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【請求項１９】
前記不活性化病原体を、核酸ワクチンと直接混合するか、またはミネラルオイルで乳化した後、不活性化病原体を核酸ワクチンと混合することも可能である、請求項１８記載のＴ細胞免疫応答阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、免疫学の分野における阻害剤を含む。本発明は、具体的には、Ｔ細胞免疫応答阻害剤を含む。
【０００２】
技術背景
生物の免疫系は、始めから終わりまで、複雑な制御プロセスである。免疫制御は、免疫応答プロセス中の、免疫系における多様な細胞間、免疫細胞および免疫分子間、並びに免疫系および他の系の間の相互の機能を指し、これらはすべて、相互に協調し、そして相互に拘束しあうネットワーク構造を形成して、適切な強度の免疫応答を維持し、そしてこうして、生物の内部環境の安定を保証する。外部病原体が侵入した後、免疫系は、病原体の特性によって決定されるように、病原体に抵抗し、そして除去するのに必要な免疫応答を活性化することも可能である。免疫応答は、さらに、体液性免疫応答および細胞性免疫応答に分けられる。体液性免疫応答は、特異的抗体によって生じる応答であり、そして細胞性免疫応答は、主にＴ細胞を活性化する免疫応答である。生物の免疫を改善するには、ワクチン接種が主な方法である。現在、感染性病原体に抵抗するワクチンを産生するのに用いられる多くの方法があり、例えば、とりわけ不活性化生ワクチン、弱毒化生ワクチン、組換えワクチン、サブユニット・ワクチンおよびＤＮＡワクチンがある。理論的レベルでは、これらの基本的機能は同じであり、すなわち、ワクチン接種された体内の細胞は、病原体の抗原特性に補助されて、個体が該病原体に感染しないように、該個体において、免疫の目的を達成する免疫応答を同定し、そしてこれを刺激する。しかし、生物の免疫があまりにも強い場合は、自己免疫疾患などの副作用を生じうる。したがって、抗原が外部から侵入する場合、生物は、免疫応答を平衡化するため、免疫制御機構を総動員して利用することもありうる。免疫応答の抑制は、ヒトにおいて、自己免疫疾患を治療するのに用いられる１つの方法である。
【０００３】
Ｔ細胞免疫抑制は、生物の免疫機能における非常に重要なリンクであり、例えば、自己免疫疾病の発生を制限し、そして免疫応答を下方制御する。Ｔ細胞は、非刺激分子が存在する場合、Ｔ細胞を通じてＡＰＣ細胞を刺激するか、または最近確認された胸腺供給源ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞および新規増殖Ｔ細胞の相互作用を通じて、免疫抑制機能を実行する。大部分の自己免疫疾患において、特異的抗原受容体が存在し、例えば、全身性エリテマトーデス患者の血液の臨床検査中には、ＤＮＡ抵抗性抗体が見られる。これらの抗体および抗原は、組織において、周期的炎症を促進する、免疫複合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を形成する。さらに、関節リウマチ（ＲＡ）患者の関節組織が自己免疫応答Ｔ細胞を含有する場合、該細胞が、特定の未知の抗原との反応を生じることもありうる。この種のＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じて特異的抗原を同定することが可能であるばかりでなく、主要組織適合（ＭＨＣ）分子を同定することも可能である。
【０００４】
したがって、自己免疫応答抗原受容体は、炎症の初期の段階で、臨床的全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよび他の深刻な自己免疫疾患を引き起こすトリガーを同定する。
【０００５】
実験室の研究によって、特定の自己免疫疾患、例えばＮＥＢ／ＮＥＷネズミ・エリテマトーデス、ネズミおよびラット動物モデルにおける、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の実験接種およびアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）において、抗原受容体が確認された。
【０００６】
ネズミ・エリテマトーデスにおいて、抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）除去を使用して、Ｂ細胞自己免疫応答を生じると、療法目的が達成される。いくつかの臨床的症例によって、抗イディオタイプ抗体が、明らかに疾病を遅延させうることが示される；しかし、抗イディオタイプ抗体が疾病を悪化させる症例がある。同様に、脳脊髄炎の治療では、自己免疫疾患応答ＴＣＲに抵抗するため、免疫ＴＣＲ由来ペプチドを用いる。その結果、ある症状に関しては、軽減効果が達成され、そしてある症状は悪化した。
【０００７】
したがって、特定の自己免疫疾患を治療するのに免疫化を用いる場合、患者の免疫応答は、治療の臨床的効果に直接影響を及ぼす。免疫化が抗体応答産生および抗Ｉｄ抗体の形成を引き起こす場合、これらの抗Ｉｄは、おそらく、自己免疫応答において、Ｂ細胞またはＴ細胞を一緒にして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの制御性の溶解反応を誘発し、臨床的症状の軽減を達成することもありうるし；逆に、免疫応答が、体に抗Ｉｄを除去させる場合、免疫反応因子は、次に、自己免疫応答において、Ｂ細胞またはＴ細胞に結合することも可能であり、そしてこれはまた、交差点で、抗原受容体と結合して、免疫細胞がさらに多くの自己免疫応答抗体（Ａｂ）またはＴ細胞を産生するのを刺激し、そして臨床的症状の悪化を引き起こすこともありうる。免疫化によって刺激され、そして活性化された、Ｔ細胞の大部分はまた、多様な種類のヘルパーＴ細胞、例えばＴＨ１またはＴＨ２応答を誘発することも可能であり、そして元来の潜在的に存在する自己免疫疾患症状の悪化を引き起こすことも可能であるし、または症状を軽減に向かわせることも可能である。したがって、自己免疫疾患を効果的に治療するため、免疫方法論のより完全な研究が必要である。
【０００８】
現在、一般的に臨床に使用されている免疫抑制剤には、化学的薬剤および抗体が含まれる。これらのうち、化学的薬剤には、プログラフ（ＦＫ５０６）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン（Ａｚａ）、プレドニゾン（Ｐｒｅｄ）およびメチルプレドニゾロン（ＭＰ）が含まれる。抗体は、抗リンパ芽球グロブリン（ＡＬＧ）および抗ＣＤ４モノクローナル抗体（ＯＫＴ４）である。しかし、前述の免疫抑制剤はすべて、不適切に用いた場合、毒性副作用を有する。一方で、生物の免疫応答を過剰に抑制すると、多くの種類の合併症を引き起こす可能性もあり；他方で、体の自己の毒性副作用が、臓器が機能する際、消耗を引き起こす可能性もある。
【０００９】
発明の開示
本発明の目的は、Ｔ細胞免疫応答を選択的に阻害する阻害剤を提供することである。
本発明において提供するＴ細胞免疫応答阻害剤には、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンのタンパク質抗原発現が含まれるか；またはターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の活性ポリペプチドが含まれるか；または不活性化病原体およびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンが含まれる。
【００１０】
記載するＴ細胞免疫応答阻害剤が、個々にパッケージングされているか、または混合されている、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原を含む場合、記載するＴ細胞免疫応答阻害剤において、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の物理的比率は、２：１〜１０：１であることも可能であり、最適には、５：１である。
【００１１】
記載するＴ細胞免疫応答阻害剤が、個々にパッケージングされているか、または混合されている、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の活性ポリペプチドを含む場合、記載するＴ細胞免疫応答阻害剤において、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原の活性ポリペプチドの物理的比率は、１：５〜５：１である。
【００１２】
記載するＴ細胞免疫応答阻害剤が、個々にパッケージングされているか、または混合されている、不活性化病原体およびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンを含む場合、記載するＴ細胞免疫応答阻害剤において、不活性化病原体およびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンの物理的比率は、１：２〜１：１０である。
【００１３】
記載するＴ細胞免疫応答阻害剤はまた、免疫学的アジュバント、例えばミネラルオイル（注射用白色カンフル油）も含むことも可能である。
記載する核酸ワクチンは、タンパク質抗原をコードする遺伝子を含有する、真核細胞発現キャリアーである。
【００１４】
記載する真核細胞発現キャリアーにおいて、制御および調節タンパク質抗原をコードする遺伝子の発現プロモーターは、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターおよびＳＶ４０ウイルスプロモーターであることも可能である。
【００１５】
記載する真核細胞発現キャリアーはプラスミド発現キャリアー、ウイルスまたはバクテリオファージ発現キャリアー、プラスミドＤＮＡおよびウイルスまたはバクテリオファージＤＮＡで構成される発現キャリアー；プラスミドＤＮＡおよび染色体ＤＮＡ断片で構成される発現キャリアー、並びに遺伝子操作の分野で一般的に用いられる他の発現キャリアーであることも可能である。
【００１６】
記載するタンパク質抗原をコードする遺伝子のＤＮＡは、人工的に合成されるか、あるいは微生物、真核生物および植物細胞または組織から抽出される二本鎖ＤＮＡであることも可能である。
【００１７】
記載するタンパク質抗原のタンパク質は、人工的に合成されるか、または生物学的に産生されるタンパク質である。
記載するタンパク質抗原の活性ポリペプチドは、人工的に合成されるか、または生物学的に産生される。
【００１８】
人工的培養条件下で、増進された大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）またはバシロシン（ｂａｃｉｌｌｏｃｉｎ）またはサッカロミセート（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅ）あるいは他の真核細胞生物を用いて、記載する生物有機体を産生することも可能である。
【００１９】
記載する不活性化病原体は、ウイルス、細菌、寄生虫およびアレルゲン性物質から得られる、非感染性病原体であり、一般的に知られる方法を用いて生物有機体を不活性化した後、該生物有機体から単離され、そして産生される。
【００２０】
記載する不活性化病原体を、核酸ワクチンと直接混合するか、またはミネラルオイル（注射用白色カンフル油）で乳化した後、核酸ワクチンと混合することも可能である。
記載するＴ細胞免疫応答阻害剤を、筋内に、皮内に、皮下に、静脈内に、および粘膜組織を通じて、注射、スプレー、経口投与、点鼻剤、点眼剤、浸透、吸収、物理的手段または化学的手段によって、生物に導入することも可能であるし；あるいは他の物理的混合物またはパッケージを通じて、生物に導入することも可能である。
【００２１】
発明の好ましい態様
明記しない限り、以下の態様において言及する試験法は、すべて、慣用法を指す。明記しない場合、言及するパーセント量は、すべて、質量パーセント量である。
【００２２】
ＤＮＡ配合物
低温にした後、動物組織をすりつぶす方法では、フェノール・クロロホルム溶液中でタンパク質を取り除き、そしてエチルアルコールを用いて二本鎖ＤＮＡを単離する。
【００２３】
別の方法では、ＣＴＡＢ法を用いて、植物組織からＤＮＡを抽出し、フェノール・クロロホルム溶液中でタンパク質を取り除き、そしてエチルアルコール沈殿を経て、二本鎖ＤＮＡを析出させる。
【００２４】
別の方法は、大腸菌からプラスミドＤＮＡを抽出し、フェノール・クロロホルム溶液中でタンパク質を除去し、そしてエチルアルコール沈殿を用いて二本鎖ＤＮＡを単離する。
前述の抽出法および技術に関する詳細に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  第２版，  １９８９）およびＣｈａｏｌｏｎｇ  Ｌｉら監修，  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（浙江大学出版）を参照することも可能である。
【００２５】
タンパク質およびポリペプチド配合物
標準的自動化ポリペプチド合成装置（例えばＡＢＩ  ４３３Ａ等）および装置製造者の使用法を用いて、タンパク質およびポリペプチドを合成することも可能であるし；あるいは、日常的なタンパク質化学法にしたがって、動物組織および細胞、植物組織および細胞または微生物から抽出することも可能である。また、遺伝子操作発現細菌または細胞からこれらを抽出することも可能である。これらのポリペプチド抽出法は一般的に知られており；詳細に関しては、ＤｏｏｎａｎのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ニュージャージー州，  １９９６）を参照されたい。
【００２６】
病原体配合物および不活性化
ウイルス、細菌、マイコプラズマ、寄生虫、およびアレルギー性物質などの生物有機体から、既知の不活性化法および試薬、例えばホルムアルデヒドまたはホルマリン、β−プロピオラクトン、Ｎ−アセチル−ビニル−イミドおよびジビニル−イミドを用いて、病原体を分離し、そして産生する。不活性化後、非感染性病原体を得て、そして分離および精製を行う。次いで、調製を完了する。
【００２７】
（態様１）
ウシ口蹄疫（ＦＭＤＶ）ＶＰ１タンパク質抗原調製
１．ウシ口蹄疫ＶＰ１  ｃＤＮＡクローン
ウシ口蹄疫ウイルスに感染したウシ由来の胃の病理組織およびＲＮＡ抽出試薬キット（上海バイオエンジニアリング社から購入）を用いた。試験キットの説明書にしたがって、スルホカルバミジン一工程法を用いて、総ウイルスＲＮＡを得た。具体的な方法は以下のとおりである：病理組織細胞を破壊し、そして分離し、０．５ｍｌのスルホカルバミジン溶液、０．５ｍｌのフェノール／クロロホルム／イソペンタノール（２５：２４：１）溶液を添加し、４℃および１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を新規１．５マイクロリットル・プラスチック遠心管に移し、イソペンタノールの残量を添加し、−２０℃で３０分間静置し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清液を取り除き、７０％アルコール洗浄を用いて沈殿させ、そして沈殿物を乾燥させたら、３０μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解する。変性アガロースゲル電気泳動試験結果は、ウイルスＲＮＡが得られたことを示す。
【００２８】
以下の反応条件下で、ｃＤＮＡの第一鎖を合成する：２μｇのウシ口蹄疫ウイルスＲＮＡ、５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＤＴＴ、３ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ２、５００μｍｏｌ／ｌ  ｄＮＴＰ、１００μｇの６ランダム・ポリマー・プライマー、５００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素を総体積２０μｌにして、そして３７℃で１時間維持する。ｃＤＮＡ産物の第一鎖をテンプレートとして用い、プライマー１：５’−ＡＡＧ ＡＡＴＴＣＧＧＡＧＧＴＡＣＣＡＣＣＴＣＴＧＣＧＧＧＴＧＡＧ−３’およびプライマー２：５’−ＡＡＴＣＴＡＧＡＣＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＧＣＧＧＧ−３’（プライマー１およびプライマー２に、それぞれ、ＥｃｏＲＩ同定部位およびＸｂａＩ同定部位を導入する）の手引きで、ウシ口蹄疫ウイルスＶＰＩ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増大（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を行う。反応系：５μｌの第一鎖ｃＤＮＡ産物、プライマー１およびプライマー２は１０ｐｍｏｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、最終体積を５０μｌにする。反応条件は：９４℃変性３０秒間、５４℃再生３０秒間、および７２℃伸長１分間、全部で３０周期である。ＰＣＲ増大ＦＭＤＶ  ＶＰ１遺伝子の１％アガロースゲル電気泳動試験結果は、表１に示すとおりである（レーンＭはＤＮＡマーカーであり；レーン１はＰＣＲ産物である）。図中、矢印先端は、ターゲットバンド部位を示し、示したターゲット断片のサイズは６３９ｂｐであり、ＶＰ１遺伝子断片のサイズと一致する。低融点（ｌｏｗ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）ゲルを用いて、増大断片を収集する。
【００２９】
２．発現キャリアーＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１構造およびアッセイ
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ消化法を用いて、ウシ口蹄疫ＶＰ１  ｃＤＮＡ断片を得て、電気泳動を行う。収集後、ＶＰ１遺伝子断片クローンを、プラスミドＳｕｐｅｒＹ（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入したプラスミドｐＧＡＰＺａのＳｐｈＩおよびＨｐａＩ部位に、カナマイシン抵抗性遺伝子｛Ｋａｎｒ｝を付加して、ＳｕｐｅｒＹを得る）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ消化部位の間に挿入し、次いで、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限エンドヌクレアーゼを用いて、組換えキャリアーに対して消化アッセイを行い、消化産物を用いて、１％アガロースゲル電気泳動を行う。試験結果を図２に示し（レーンＭはＤＮＡマーカーであり、レーン１は酵素スプライス産物である）、ここで、小断片のサイズは６３９ｂｐであり、これはＶＰ１遺伝子断片のサイズと一致し、ＶＰ１がＳｕｐｅｒＹのクローン上に既に補正されている（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ）ことが示されたため、前記組換えキャリアーに名称ＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１を割り当て、次いでＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１を大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’コンピテント細胞に転換し（ｃｏｎｖｅｒｔ）、選別して、アッセイの陽性クローンを選択して、そして陽性クローンに対して配列分析（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を行う。結果によって、増大産物のヌクレオチド配列は、ＶＰ１遺伝子と一致して、そしてＳｕｐｅｒＹプラスミドへのクローニングが成功していたことが示される。
【００３０】
３．酵母発現におけるＶＰ１遺伝子およびその発現産物の試験
方法２で構築した組換え発現キャリアーＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１を得て、そして電気ショック法を用いて酵母ＳＭＤ１１６８に転換する。アッセイの陽性クローンを選別し、単一細菌コロニーを選択して、フラスコを攪拌した後、３０℃で４８〜９６時間培養する（同時にこれを酵母ＳＭＤ１１６８と名付け、そして酵母ＳＭＤ１１６８をＳｕｐｅｒＹで転換して対照とする）。上清を変性させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う。クーマシーブリリアントブルーＧ２５０染色を行った後、ゲル画像化系を用いて、写真を作製する。結果を図３に示す（レーン１：酵母ＳＭＤ１１６８上清；レーン２：転換ＳｕｐｅｒＹ酵母ＳＭＤ１１６８発現上清；レーン３：転換ＳｕｐｅｒＹ酵母ＳＭＤ１１６８発現上清；レーンＭ：低分子量タンパク質標準）。レーン３から、分子量６６ｋＤおよび４３ｋＤの２種類のＶＰ１発現産物があることがわかり、ＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１中のＶＰ１遺伝子が、酵母細胞において、発現を達成することが示される。前記組換え発現キャリアーＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１の発現産物を用いて、ウェスタンブロット分析を行う。具体的な方法論は：変性発現タンパク質を得た後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてタンパク質を分離し、次いで、ＮＣフィルムに電気的にトランスファーし、そしてシーリング剤（ｓｅａｌａｎｔ）として５％脱脂粉乳を用いる。次に、抗ウシ口蹄疫ウイルス過免疫血清（新彊獣医学研究所構築部門（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｔａｔｉｏｎ）より購入）および抗ヒツジ・ウシＩｇＧ−ＨＲＰ酵素標識抗体（米国Ｓｉｇｍａ社より購入）を用いる。インキュベーションし、そして次いで、ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２中で発色させる。結果を図４に示す（レーンＭ：低分子量タンパク質標準；レーン１：転換ＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１酵母ＳＭＤ１１６８発現上清；レーン３：酵母ＳＭＤ１１６８上清；レーン４：転換ＳｕｐｅｒＹ酵母ＳＭＤ１１６８発現上清）。レーン１では、６６ｋＤおよび４３ｋＤ付近に特異的発色バンドが現れ、そしてレーン２およびレーン３ではバンドは現れなかったことから、発現タンパク質が、抗ＦＭＤＶ血清応答を伴う特異的応答バンドを生じることが可能であり、そして発現タンパク質産物がＦＭＤＶ免疫原性を所持することが示される。発現上清を脱塩し、そして精製した後、−２０℃で保存した。これを、以下の態様において、ウシ口蹄疫ＶＰ１タンパク質ワクチンとして用いることも可能である。
【００３１】
（態様２）
態様２は、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗体複合物の特性を測定する。
【００３２】
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて、態様１の方法１の消化を行い、口蹄疫ＶＰ１  ｃＤＮＡ断片を得る。ＶＰ１遺伝子を収集し、真核発現プラスミドｐｃＤＮＡ３を用いて、正確にＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩとして、消化を行う。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、ＶＰ１遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３（米国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入）に連結する。大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に転換する。プレート上で選別して、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）抵抗性コロニーを選択し、プラスミドを得て、正しいクローンに関して消化選別アッセイを行い、そしてＶＰ１遺伝子を含有する組換えプラスミドｐｃＤ−ＶＰ１を得る。
【００３３】
ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原が、混合後、明確な様式で変化しないことを証明するため、ｐｃＤ−ＶＰ１の残量および１４６Ｓ抗原（ウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン｛蘭州獣医学研究所より購入｝からミネラルオイルを取り除いて、１４６Ｓ抗原を得る）を取る。混合後、３７℃に置き、そして２４時間インキュベーションし、１％アガロースゲル電気泳動を行い、そして変化を比較する。結果を図５に示し、この図は、ｐｃＤ−ＶＰ１および１４６Ｓ抗原を一緒に混合する前および混合した後で、変化がないことを示す。図中、レーン１およびレーン２は、混合前のｐｃＤ−ＶＰ１レベルであり；レーン３およびレーン４は、混合したｐｃＤ−ＶＰ１および１４６ｓ試料の電気泳動後の詳細を示し；レーン５およびレーン６は、３７℃で２４時間インキュベーションした後の、混合したｐｃＤ−ＶＰ１および１４６ｓ試料の詳細を示し；レーン７およびレーン８は、１０単位のＤＮＡ酵素Ｉ（Ｓｉｇｍａ社）を添加し、そして３７℃で２４時間インキュベーションした後の、混合したｐｃＤ−ＶＰ１および１４６ｓ試料の詳細を示す。レーン９は、ＤＮＡマーカーである。
【００３４】
（態様３）
Ｔ細胞免疫応答阻害剤をマウスにワクチン接種した後に産生される抗体のＥＬＩＳＡ検出
ターゲットとされる病原体に対する核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤、並びに不活性化病原体および前記のターゲットとされる病原体に対する核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、ワクチン接種したマウスの免疫系における免疫レベルに対する影響を検証するため、以下の動物試験を行った。
【００３５】
５４匹の６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを、群あたり６匹の９群に分ける。最初の群には、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン（蘭州獣医学研究所より購入）１００マイクロリットルを筋内注射し；第１４日、同じ投薬量の単回追加免疫を投与する。第二の群には、２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第１４日、同じ投薬量の単回追加免疫を投与する。第三の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１タンパク質０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第１４日、同じ投薬量の単回追加免疫を投与する。第四の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１タンパク質０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；最初のワクチン接種の１４日後、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン１００マイクロリットルを筋内注射する。第五の群には、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン１００マイクロリットルを筋内注射し；最初のワクチン接種の１４日後、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１  ０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを注射する。第六の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１  ０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；最初のワクチン接種の１４日後、２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを単回注射する。第七の群には、２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；最初のワクチン接種の１４日後、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１  ０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを単回注射する。第八の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第１４日、同じ投薬量の単回追加免疫注射を投与する。第九の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンを含有する混合物溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第１４日、同じ投薬量の単回追加免疫を投与し、そして次いで、第１５日、第３５日、第５０日および第７２日に、血清を得て、ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体力価測定を行う。試験方法論は：８μｇ／ｍｌ抗原ポケットを含む９６ウェル酵素標識プレートを用いて、４℃で一晩保存する。３％ウシ血清で、３７℃で１時間シーリングし；ＰＢＳＴ（ＰＢＳに溶解した０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて、各５分間、３回洗浄する。免疫動物（ネズミ）血清の連続希釈以上を添加する。対照として、非免疫ネズミ血清を用い、そして３７℃で２時間インキュベーションする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄した後、各ウェルに、１００μｌの西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシド酵素で標識したヒツジ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス）を添加する。３７℃で１時間インキュベーションした後、取り除く。ＰＢＳＴで各５分間、３回洗浄する。ＰＢＳＴで３回洗浄し、次いで１００μｌ基質ＴＭＢ液を添加する。可視反応は、室温で３０分後に起こる。２Ｍ硫酸で反応を停止する。酵素標識装置を用いて、ＯＤ４８０、６２０光学密度シグナルを測定する。実験ウェルのＯＤ値が、対照ウェルのＯＤ値の２倍に達したら、陽性と見なす。図６の結果は、核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１およびｐｃＤ−ＶＰ１発現タンパク質抗原ＶＰ１で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤、並びにウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンおよびｐｃＤ−ＶＰ１で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤を、マウスにワクチン接種した後、他の群と比較して、特異的抗体レベルに明らかな変化がないことを示す。ターゲットとされる病原体に対する核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤、並びに不活性化病原体および前記のターゲットとされる病原体に対する核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤を動物にワクチン接種した後、刺激される特異的抗体レベルには変化がないという説明ができる。図６において、左から右に、第二のワクチン接種１５日後、３５日後、５０日後および７２日後の、各群に関するＥＬＩＳＡ血清学結果を示す（図６のｘ軸は、免疫群を示す）。
【００３６】
（態様４）
免疫マウスの特異的Ｔ細胞増殖に対する、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の影響
３０匹の６〜８週齢ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを３つの群に分ける。最初の群には、２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。第二の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１  ０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。第三の群には、１００マイクログラムの核酸ｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；最初のワクチン接種の１４日後、同じ投薬量の単回追加免疫を投与し、そして次いで、第二のワクチン接種の１４日後、脾臓Ｔ細胞を得て、Ｔ細胞増殖活性を測定した。具体的な方法論は：消毒条件下で、単細胞懸濁物として脾臓を調製する。溶血溶液を用いて、赤血球を取り除き、次いでＰＢＳ液を用いて３回洗浄し、遠心分離し、そして細胞数を数え、細胞濃度を１ｘ１０６部分／ｍｌに調整し、各細胞懸濁物を４つの部分に分け、そして９６ウェル培養プレートに添加する。１部分に１００μｌ  ＣｏｎＡ（マイトジェン）を添加して最終濃度５μｇ／ｍｌにする。１部分に、対応する特異的抗原（ＶＰ１）を添加して、最終濃度２μｇ／ｍｌの刺激剤として利用する。１部分には刺激剤をまったく添加しない。１部分には、１００μｌ  ＢＳＡを添加して最終濃度２μｇ／ｍｌとして、非関連抗原として利用する。次いで、２４時間後、各ウェルに１００μｌ  ＭＴＴを添加し、最終濃度５ｍｇ／ｍｌとする。次に、４８時間後、１００μｌ  ＳＤＳ−ＤＭＳＯ（５０％ＤＭＳＯ、ｐＨ２．０中、２０％ＳＤＳを溶解する）を各ウェルに添加し、そして完全に溶解する。４時間インキュベーションした後、酵素標識剤を用いて、５７０ｎｍのＯＤ値を読み取り、そして刺激指数ＳＩ（ＳＩ＝実験刺激カウント÷非刺激カウント）を計算する。図７ａの結果は、核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１およびＶＰ１を含有するＴ細胞免疫応答阻害剤で免疫した動物のＴ細胞増殖活性が、明らかに、核酸ワクチン群およびＶＰ１群のものより低いことを示す。核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１およびＶＰ１のＴ細胞免疫応答阻害剤がＴ細胞免疫レベルの特異性を減少しうるという説明ができる。図７ｂにおいて、ＣｏｎＡは陽性対照を示し；ＢＳＡは陰性対照であり；ＶＰ１は第一の群であり；ｐｃＤ−ＶＰ１は第二の群であり；そしてＶＰ１＋ｐｃＤ−ＶＰ１は第三の群である。
【００３７】
（態様５）
態様５は、不活性化病原体ワクチンおよびターゲットとされる病原体に対する核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、免疫されたマウスにおけるＴ細胞特異性増大に対する影響である。
【００３８】
５０匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを５つの群に分ける。第一の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムの１４６Ｓ抗原（蘭州獣医学研究所より購入したウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンから油を取り除く）を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。第二の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン（蘭州獣医学研究所より購入）を含有する混合溶液１００μｌを筋内注射する。第三の群には、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンを含有する１００マイクロリットルを筋内注射する。第四の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。第五の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのブタ繁殖および呼吸障害ウイルス（ＰＲＲＳＶ）不活性化ワクチン（ハルビン獣医学研究所より購入）を含有する混合溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。最初の免疫の１４日後、同じ投薬量の単回追加免疫を投与し；そして第二のワクチン接種の１４日後、脾臓Ｔ細胞を得て、Ｔ細胞増殖活性を測定する。具体的な方法論は：消毒条件下で、単細胞懸濁物として脾臓を調製する。溶血溶液を用いて、赤血球を取り除き、次いでＰＢＳ液を用いて３回洗浄し、遠心分離し、そして細胞数を数え、細胞濃度を１ｘ１０６部分／ｍｌに調整し、各細胞懸濁物を４つの部分に分け、そして９６ウェル培養プレートに添加する。１部分に１００μｌ  ＣｏｎＡ（マイトジェン）を添加して最終濃度５μｇ／ｍｌにする。１部分に、対応する特異的抗原（１４６Ｓ抗原）を添加して、最終濃度２μｇ／ｍｌの刺激剤として利用する。１部分には刺激剤をまったく添加せず、そして１部分には、１００μｌ  ＢＳＡを添加して最終濃度２μｇ／ｍｌとして、非関連抗原として利用する。次いで、２４時間後、各ウェルに１００μｌ  ＭＴＴを添加し、最終濃度５ｍｇ／ｍｌとする。次いで、４８時間後、１００μｌ  ＳＤＳ−ＤＭＳＯ（５０％ＤＭＳＯ、ｐＨ２．０中、２０％ＳＤＳを溶解する）を各ウェルに添加し、そして完全に溶解する。４時間インキュベーションした後、酵素標識剤を用いて、５７０ｎｍのＯＤ値を読み取り、そして刺激指数ＳＩ（ＳＩ＝実験刺激カウント÷非刺激カウント）を計算する。図７ｂは、核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのウシ口蹄疫Ｏ型不活性化ワクチンを含有するＴ細胞免疫応答阻害剤、並びにｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチンおよび１４６Ｓ抗原を含有するＴ細胞免疫応答阻害剤で免疫した動物の結果を示す。Ｔ細胞増殖活性は、明らかに、核酸群またはウシ口蹄疫Ｏ型ワクチン群、並びに核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および不活性化ブタ繁殖および呼吸障害ワクチン群のものより低い。Ｔ細胞増殖活性抑制が抗原特異的であるという説明ができる。図７ｂにおいて、１はＣｏｎＡは陽性対照であり；２はＢＳＡ非特異的抗原群であり；３はｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチンおよび１４６Ｓ抗原ワクチン共有免疫群であり；４はｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチ���およびウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン共有免疫群であり；５はウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンであり；６は核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１免疫群であり；７はｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチンおよび不活性化ブタ繁殖および呼吸障害ワクチン共有免疫群である。
【００３９】
（態様６）
不活性化病原体ワクチンおよび前記病原体をターゲットとする核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、免疫されたマウスにおける、同じ部位での共有免疫または異なる部位に対する単一免疫での、Ｔ細胞特異性増大に対する影響
不活性化病原体ワクチンおよびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、免疫されたマウスにおけるＴ細胞特異性増大に対する影響
６０匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを６つの群に分ける。第一の群には、０．９％ＮａＣｌ水溶液中の１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムの１４６Ｓ抗原（ウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン抗原から油を取り除く）で形成される複合物１００μｌを筋内注射し；第二の群には、０．９％ＮａＣｌ水溶液中の２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン５０マイクロリットルを左足に、そして０．９％ＮａＣｌ水溶液中の１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１  ５０マイクロリットルを右足に、筋内注射し；第三の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第四の群には、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン１００マイクロリットルを筋内注射し；第五の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１  ０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第六の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのブタ繁殖および呼吸障害ウイルス（ＰＲＲＳＶ）不活性化ウイルスワクチン（ハルビン獣医学研究所より購入）を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。最初の免疫の１４日後、同じ投薬量の単回追加免疫を投与し；そして第二の用量の１４日後、脾臓Ｔ細胞を得て、Ｔ細胞増殖活性を測定する。具体的な方法論は態様５のものと同じである。結果を図８に示し、そしてこの結果によって、Ｔ細胞免疫応答阻害剤が油アジュバントを含有してもまたはしなくても、動物が、核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および口蹄疫１４６Ｓ抗原を含有するＴ細胞免疫応答阻害剤で免疫された示される。そのＴ細胞増殖活性は、明らかに、核酸群またはウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン群、並びに核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および不活性化ブタ繁殖および呼吸障害ワクチン群のものより低い。このＴ細胞増殖活性の抑制が抗原特異的であるという説明ができ、そして核酸ｐｃＤ−ＶＰ１および口蹄疫１４６抗原が、同じ部位での共有免疫または異なる部位での単一免疫を有していても、Ｔ細胞活性を抑制可能であることがわかる。図８において、１はＣｏｎＡ陽性対照であり；２はＢＳＡ非特異的抗原群であり；３はｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチンおよび１４６Ｓ抗原共有免疫群であり；４は左足筋内注射１４６Ｓ抗原および右足筋内注射ｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチン群であり；５はｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチンおよびウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン共有免疫群であり；６はウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンであり；７は核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１免疫群であり；８はｐｃＤ−ＶＰ１核酸ワクチンおよび不活性化ブタ繁殖および呼吸障害ワクチン共有免疫群である。
【００４０】
（態様７）
病原性抗原および前記のターゲットとされる病原性抗原に対する核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、免疫されたマウスにおけるＴ細胞特異性増大に対する影響
プロトコルとして、ｐＡＤＲプラスミド中のＨＢＶ遺伝子群の全長（Ｇａｎ  ＲＢ，  Ｃｕ  ＭＪ，  Ｌｉ  ＺＰら  「ｐＡＤＲ−１における、Ｂ型肝炎ウイルス・サブタイプａｄｒのクローニングされたＤＮＡの完全ヌクレオチド配列」  Ｓｃｉ  Ｓｉｎ（Ｂ），  １９８７，  ３０（５）：５０７−５２１）を用い、プライマー１：５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＡＡＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＣＴＣＣ−３’；およびプライマー２：５’−ＧＴＣＣＴＴＧＧＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＧＡＡＣＣＣＣＧＧＡＴＣＣＡ−３’（プライマー１およびプライマー２で、ＢａｍＨＩ同定部位を挿入し、同時にプライマー１では開始部位ＡＴＧを導入し、プライマー２では終結部位ＴＧＡを導入する）の手引きで、ＰＣＲ増大ＨＢＶ  Ｓ２抗原ＤＮＡ断片を得る。反応系は：５μｌ  ｐＡＤＲプラスミド（１０ｎｇ）、プライマー１およびプライマー２は各１０ｐｍｏｌ、５００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、そして最終体積を５０μｌにする。反応条件は：９４℃変性３０秒間、５４℃再生３０秒間、７２℃伸長１分間、全部で３０周期である。ＰＣＲ増大ＤＮＡ断片産物に関しては、消化に制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを用い、ＨＢＶ  Ｓ２抗原ＤＮＡ断片を収集し、同じＢａｍＨＩ消化に真核発現プラスミドｐｃＤＮＡ３を用い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、Ｓ２遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社より購入）に付着させ、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に転換し、プレート上で選別して、アンピシリン（５０ｇ／ｍｌ）抵抗性コロニーを選択し、プラスミドを得て、消化選別アッセイを行ってクローンを補正し、そしてＳ２遺伝子を含む組換えプラスミドｐｃＤ−Ｓ２を得る。
【００４１】
３０匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを３つの群に分ける。第一の群には、組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓ遺伝子の核酸ワクチンｐｃＤ−Ｓ２を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第二の群には、２０マイクログラムの組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質（北京天壇Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒより購入）ワクチンを含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００μｌを筋内注射し；第三の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−Ｓ２および２０マイクログラムの組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質ワクチンを含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。最初の免疫の１４日後、同じ量の単回追加免疫を投与し；そして第二の用量の１４日後、脾臓Ｔ細胞を得て、Ｔ細胞増殖活性を試験する。具体的な方法論は、刺激剤が、組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質であることを除き、態様５のものと同一である。結果を図９に示し、そしてこの結果によって、核酸ワクチンｐｃＤ−Ｓ２および２０マイクログラムの組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質ワクチンのＴ細胞免疫応答阻害剤を使用して動物を免疫すると、核酸群およびタンパク質ワクチン群のものに比較して、明らかに、Ｔ細胞増殖活性に対する影響がより低かったことが示される。図９において、１はＣｏｎＡ陽性対照であり；２は核酸ワクチンｐｃＤ−Ｓ２免疫群であり；３は組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質ワクチン免疫群であり；４は核酸ワクチンｐｃＤ−Ｓ２および組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質ワクチン免疫群であり；５はＢＳＡ非特異的抗原群である。
【００４２】
（態様８）
Ｔ細胞活性の抑制における体積−有効性の関係
７０匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを７つの群に分ける。第一の群には、１００マイクログラムの口蹄疫ＶＰ１遺伝子核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第二の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化ウイルスワクチン（蘭州獣医学研究所より購入、５０％の注射用白色カンフル油を含有する）を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第三の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムの口蹄疫ＶＰ１タンパク質ワクチンを含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第四の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２００マイクログラムの口蹄疫ＶＰ１タンパク質ＲＧＤペプチド（配列は：ＮＨ２−ＬＲＧＤＬＱＶＬＡＱＫＶＡＲＴＬ−ＣＯＯＨである）ワクチンを含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第五の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および５０マイクログラムの口蹄疫ＶＰ１タンパク質ＲＧＤペプチドワクチンを含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第六の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および１２．５マイクログラムの口蹄疫ＶＰ１タンパク質ＲＧＤペプチドを含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し；第七の群には、１００マイクログラムの核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのブタ繁殖および呼吸障害ウイルスＥ２抗原ペプチドワクチン（配列は：ＮＨ２−ＣＴＡＶＳＰＴＴＬＲＴ−ＣＯＯＨ）を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。最初の免疫の１４日後、同じ投薬量の単回追加免疫を投与し；そして第二の免疫化の１４日後、脾臓Ｔ細胞を得て、Ｔ細胞増殖活性を測定する。具体的な方法論は、刺激剤が、ＶＰ１タンパク質またはブタ・インフルエンザＥ２ペプチド（第七の群）であることを除き、態様５のものと同じである。結果を図１０に示し、そしてこの結果によって、核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１および組換えＶＰ１タンパク質ワクチンが、動物において免疫を共有することが示される。そのＴ細胞増殖活性は、明らかに、第二の群の核酸ワクチン単一免疫のものより低く；同時に、核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１およびＶＰ１タンパク質ＲＧＤペプチドワクチンは、異なる濃度でＴ細胞免疫応答阻害剤を形成して、動物を同時免疫することもまた示される。そのＴ細胞増殖活性は、明らかに、核酸ワクチン単一免疫群のものより低く、そして体積−有効性の関係が提示され、すなわち、ＲＧＤペプチド濃度が高ければ、Ｔ細胞増殖活性抑制はより明らかである。図１０において、１はＣｏｎＡ陽性対照であり；２は核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１免疫群であり；３はｐｃＤ−ＶＰ１および口蹄疫不活性化ウイルスワクチン免疫群であり；４はｐｃＤ−ＶＰ１および口蹄疫ＶＰ１タンパク質ワクチン免疫群であり；５はｐｃＤ−ＶＰ１および２００マイクログラムの口蹄疫ＶＰ１タンパク質ＲＧＤペプチドワクチン複合免疫群であり；６はｐｃＤ−ＶＰ１および５０マイクログラムのＲＧＤペプチドワクチン複合免疫群であり；７はｐｃＤ−ＶＰ１および１２．５マイクログラムのＲＧＤペプチドワクチン複合免疫群であり；８はｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのブタ・インフルエンザＥ２抗原ペプチドワクチン複合物であり；９はＢＳＡ非特異的抗原群である。
【００４３】
（態様９）
細胞因子レベルの検出
６０匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを各６匹の１０の群に分ける。第一の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００μｌを２回、筋内注射し、２回の注射の間に１４日間の間隔を置く。第二の群には、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン（蘭州獣医学研究所より購入）１００マイクロリットルを２回、筋内注射し、２回の注射の間に１４日間の間隔を置く。第三の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射し、そして１４日後、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンを含有する第二の注射を投与する。第四の群には、２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン１００マイクロリットルを筋内注射し、そして１４日後、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを投与する。第五の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１および２０マイクログラムのウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチンを含有する混合溶液１００マイクロリットルを２回、筋内注射し、２回の注射の間に１４日間の間隔を置く。第六の群には、２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを２回、筋内注射し、２回の注射の間に１４日間の間隔を置く。第七の群には、２０マイクログラムのＶＰ１タンパク質を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを単回、筋内注射し、そして１４日後、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液の第二の注射を投与する。第八の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−ＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルをまず、筋内注射し、そして１４日後、２０マイクログラムのＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルの第二の筋内注射を投与する。第九の群には、１００マイクログラムのｐｃＤ−Ｖ１および２００マイクログラムのＶＰ１を含有する０．９％ＮａＣｌ溶液１００マイクロリットルを２回、筋内注射し、２回の注射の間に１４日間の間隔を置く。第十の群には、対照として、０．９％ＮａＣｌ水溶液１００マイクロリットルを筋内注射する。
【００４４】
細胞因子ｍＲＮＡレベルの試験を行うための多重競合剤（ｐｏｌｙｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）ＰＣＲの使用は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＨＲＰＴおよび他の遺伝子の部分的配列を含有する、内部標準プロトコルｐＱＲＳを導入するカギである（各遺伝子中の５０〜６０ヌクレオチドの部分を、ｐＱＲＳプラスミドに付加して、野生型に対する遺伝子のモデルＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＨＰＲＴおよび他の遺伝子をより大きくする）。同じ種類のプライマー増大を用いた後、サイズに基づいて、内部標準プロトコルおよび野生型プロトコルの間の相違を決定することも可能である。同時に、競合関係のため、野生型プロトコルおよび内部標準プロトコル間の体積関係を決定することも可能である。具体的な調製法に関しては、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９３，  １６５：３７、「定量的ＰＣＲのための多重競合剤ｃＤＮＡの構築」を参照されたい。したがって、内部標準プロトコルとしてｐＱＲＳを用いることによって、免疫動物において、対応する細胞因子の量を検出することが可能である（Ｊｉｎ  Ｈｕａｌｉら、２００４年の雑誌Ｖａｃｃｉｎｅ、第２２巻２９２５ページ掲載の論文：「ＤＮＡワクチン接種に対する化学的アジュバントの影響」）。
【００４５】
ワクチン接種後、マウスの首から脾臓を取り除き、そして総ＲＮＡ（ＴＲＩＺＯＬ、Ｄｉｎｇｇｕｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社）を得る。逆転写はｃＤＮＡであり、そして１μｇの精製総ＲＮＡを得る、Ｄａｌｉａｎｂａｏ社のＲＮＡ  ＲＴ−ＰＣＲ操作ハンドブックにしたがって、逆転写を行う。２５０μｌの遠心管に入れ、そして次いで、対応する試薬を添加する：４μｌ  ＭｇＣｌ２、２μｌ  １０ｘ緩衝溶液、８．５μｌ  ＤＥＰＣ水、２μｌ  ｄＮＴＰ混合物、０．５μｌ  ＲＮアーゼ阻害剤、０．５μｌ  Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍａｇｅ社）、０．５μｌオリゴ（ｄＴ）１２プライマー；反応条件は４２℃で３０分間、９９℃で５分間および５℃で５分間である。Ｋａｎ遺伝子ファミリー、ヒポキサンチン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を内部供給源発現標準として用いて、多様な群のｃＤＮＡ濃度と一致するように調整し、次いで２μｌのｃＤＮＡを１００ｎｇ  ｐＱＲＳ試験管に添加して、ＰＣＲ増大を行う。ｐＱＲＳ競合のため、以下の４つの細胞因子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子、ＩＬ−４遺伝子およびＩＬ−１０遺伝子の増大量は、ｐＱＲＳ増大量と明らかに相関し、そして電気泳動ゲルの異なる濃度で、異なる反応を有するであろう。反応に必要なプライマーおよびＰＣＲ反応条件を表１に示す。
【００４６】
表１．  ＨＰＲＴ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０プライマー配列およびＰＣＲ反応
【００４７】
【表１】
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【００４８】
図１１に示すＰＣＲ産物の電気泳動試験の結果によって、マウスに、核酸ワクチンｐｃＤ−ＶＰ１およびｐｃＤ−ＶＰ１発現タンパク質抗原ＶＰ１で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤、またはウシ口蹄疫不活性化Ｏ型ワクチン（蘭州獣医学研究所より購入）およびｐｃＤ−ＶＰ１で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤をワクチン接種すると（第三群、第四群、第五群、第七群、第八群および第九群）、動物のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＩＬ−４およびＩＬ−１０が増加し、そしてそのＩＬ−２、ＩＦＮ−γレベルが減少することが示される。ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンに対する発現タンパク質抗原で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤をワクチン接種された動物、並びに不活性化病原体および前記のターゲットとされる病原体の発現タンパク質に対する核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤をワクチン接種されたマウスでは、細胞性インターロイキン、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の初期免疫抑制活性が誘発されるという説明ができ、そして該複合物がＩＬ−４およびＩＬ−１０を通じて、Ｔ細胞活性を完全に抑制することがわかる。図１１では、Ｘ軸は免疫群１〜１０である。
【００４９】
産業上の利用
本発明および現存の技術は、以下の利点を有する：
１．本発明のＴ細胞免疫応答阻害剤は、プログラフ（ＦＫ５０６）、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アザチオプリン（Ａｚａ）、プレドニゾン（Ｐｒｅｄ）、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）などの化学的薬剤、およびＯＫＴ４などの抗体と比較して、より安全であり、そして生物のＴ細胞免疫応答のよりよい選択的抑制を有し、したがって、自己免疫疾患、臓器移植およびＴ細胞レベルを調節する他の領域の治療に有効に適用可能である。
【００５０】
２．本発明のＴ細胞免疫応答阻害剤は、生物を刺激して、正常特異的抗体免疫応答を生じ、そして特異的細胞性免疫応答、特にＴｈ１免疫応答を阻害することも可能である。前記の特異的細胞性免疫応答は、インターロイキン１０レベルの増進およびインターフェロンＩＦＮ−γレベルの抑制によって仲介される。増進されたインターロイキン１０レベルは、有効な制御機能を通じて、生物の免疫系の増強された応答を制御し、そして生物が不要な免疫の損失に苦しまないように維持する、重要な手段である。したがって、本発明のＴ細胞免疫応答阻害剤は、特定の病原体が免疫の損失を誘導するのを特異的に阻害して、そして不適切な非特異的免疫抑制を有効に克服することが可能である。
【００５１】
３．本発明のＴ細胞免疫応答阻害剤は、特別な反応条件を必要としない。一般的な生物学的施設および薬剤施設の装置を用いて製造可能であり、産生法が単純で、そして産生を容易に産業化できる。
【００５２】
４．本発明のＴ細胞免疫応答阻害剤を用いて、以下の自己免疫疾患：全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、慢性リンパ性（橋本）甲状腺炎、中毒性甲状腺腫（グレーブズ病）、結節性多発動脈炎、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、慢性活動性肝炎、慢性潰瘍性大腸炎、慢性萎縮性胃炎を伴う悪性貧血、アレルギー性脳脊髄炎、グッドパスチャー症候群、強皮症、一般的な天疱瘡、類天疱瘡、副腎皮質不全症、肝臓の原発性胆汁性肝硬変、多発性硬化症、急性多発性神経根炎および他の深刻な自己免疫疾患を治療することも可能であり；そして本発明の阻害剤を用いて、臓器移植における、自己免疫拒絶応答を抑制することも可能である。
【００５３】
５．本発明のＴ細胞免疫応答阻害剤を用いて、以下の頻繁に見られるアレルゲン：チリダニ、ノミ、ゴキブリ、動物の毛皮、花粉、カビ、細菌によって引き起こされるアレルギー性反応、ウイルスおよびタバコの煙が誘導する、皮膚および呼吸管損傷、並びにアレルギー性応答または免疫過剰刺激が誘導するアレルギー性免疫障害：接触皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー性鼻炎、喘息、腎炎、甲状腺機能増進症、ウイルス肝炎、免疫過敏症等の発生を治療することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、ＰＣＲ増大ＦＭＤＶ  ＶＰ１遺伝子の１％アガロースゲル電気泳動である。
【図２】図２は、ＳｕｐｅｒＹ／ＶＰ１組換え発現キャリアーに対して行った酵素スプライスアッセイの電気泳動である。
【図３】図３は、ＶＰ１遺伝子発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥスペクトログラフである。
【図４】図４は、ＶＰ１タンパク質発現のウェスタンブロット試験である。
【図５】図５は、混合後のｐｃＤ−ＶＰ１および１４６Ｓ抗原の特性における変化を測定する。
【図６】図６は、Ｔ細胞免疫応答阻害剤をマウスにワクチン接種した後の抗体産生のＥＬＩＳＡ試験結果を示す。
【図７ａ】図７ａは、ターゲットとされる病原体の核酸ワクチンおよび前記核酸ワクチンの発現タンパク質抗原で形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、ワクチン接種されたマウスにおけるＴ細胞特異性増大に対する影響を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、不活性化病原体ワクチンおよびターゲットとされる病原体の核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、ワクチン接種されたマウスにおけるＴ細胞特異性増大に対する影響を示す。
【図８】図８は、不活性化病原体ワクチンおよび前記病原体をターゲットとする核酸ワクチンで形成されるＴ細胞免疫応答阻害剤の、ワクチン接種されたマウスにおける、同じ部位での共有免疫または異なる部位に対する単一免疫での、Ｔ細胞特異性増大に対する影響を示す。
【図９】図９は、ｐｃＤ−Ｓ２および組換えＢ型肝炎表面抗原Ｓタンパク質のＴ細胞免疫応答阻害剤の、ワクチン接種されたマウスにおけるＴ細胞特異性増大に対する影響を示す。
【図１０】図１０は、Ｔ細胞活性の抑制に関する、体積−有効性の関係を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、ワクチン接種されたマウスにおけるインターロイキンレベルに対する、Ｔ細胞免疫応答阻害剤の影響を比較する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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