(57)【要約】  本発明は、幹細胞を選択的に活性化および／またはターゲティングし、次いで、前記細胞を遠隔方法で機械的に操作できるようにする方法であって、幹細胞内の磁化可能粒子の結合により、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞を磁気で操作することを含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を選択的に活性化および／またはターゲティングして、前記細胞を、遠隔方法で機械的に操作することを可能にする、方法。
【請求項２】
前記遠隔方法が、非接触方法であり、ｉｎ  ｖｉｖｏの場合には、体外から特異的に活性化／ターゲティングすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
磁化可能粒子と幹細胞との結合により、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞を磁気で操作することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（ｉ）幹細胞を修復部位にターゲティングすることおよび／または前記細胞をその部位に維持すること；および
（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで調整および／または分化すること；
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの幹細胞のターゲティングを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ヒト幹細胞の操作を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞に磁化可能なナノ粒子を付けることを含み、これを体外磁気操作によってある特定の修復部位に送達または維持できることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
特異的幹細胞膜受容体の遠隔活性化を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
患者体内で、幹細胞をある部位に付着させること、前記細胞を前記部位に留めること、およびｉｎ  ｓｉｔｕで前記細胞を遠隔活性化することを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞の膜貫通イオンチャネルの遠隔活性化のために、幹細胞上の特異的受容体をターゲティングすることを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞型の初期段階分化を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ヒト骨髄幹細胞に存在する様々な幹細胞レセプター型をターゲティングすることを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞受容体型が、機械的活性化されたイオンチャネルたとえばＫ＋チャネル（ＴＲＥＫ）、カルシウムチャネル、インテグリン類および表面膜結合部位、たとえばＲＧＤから選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
（幹細胞分化に不可欠な）Ｒｕｎｘ２およびＯｓｔｅｒｉｘ等の下流転写因子を活性化することが証明されている外的成長因子（たとえばＴＧＦＢおよびＢＭＰ２）の受容体をターゲティングすることを含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が、間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
損傷部位または修復部位におけるヒト間葉幹細胞の移植を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
治療的処置を提供することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記治療的処置が、遺伝子療法および細胞工学から選択されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記部位が、組織修復部位であることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記機能レベルで、前記幹細胞は神経細胞として分化されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
幹細胞結合、幹細胞送達および幹細胞活性化を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
成人一次骨髄ヒト幹細胞および／またはヒト胚性幹細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
バイオリアクターが、マルチ・ウェル２Ｄシステム内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または３Ｄ細胞培養足場（３Ｄ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）に基づくシステム内でｉｎ  ｖｉｖｏで、培養された幹細胞に付着させた磁性粒子に力を加えることを可能にすることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前期間葉幹細胞が、造骨個体群、軟骨形成個体群および脂質生成個体群から選択される個体群を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法とモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体が、ＳＴＲＯ−１であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生分解性ポリマーでできた３Ｄ細胞培養足場を使用する、単層でのＢＭＳｃ培養を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記生分解性ポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＥＡ）およびコラーゲンゲルから選択されることを特徴とする、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｉｎ  ｖｉｖｏプロセスのｅｘ  ｖｉｖｏ操作を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
磁化可能粒子と幹細胞との活性化および／またはターゲティングを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
磁化可能粒子と細胞との結合を含む、幹細胞を磁気で操作する方法であって、磁化可能粒子と細胞との結合により細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗することを特徴とする、方法。
【請求項３２】
分化工程を含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記磁化可能粒子が、前記幹細胞と直接結合されることを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項３４】
磁化可能粒子を抗体または酵素と結合し、この抗体または酵素が次に前記幹細胞と結合されること含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項３５】
幹細胞への粒子の導入または幹細胞への粒子の付着を含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項３６】
粒子が、細胞内または細胞外に結合されることを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
粒子が、細胞内に結合されることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞内結合が、内部結合部位との結合を含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
直接的または間接的な、磁化可能粒子とイオンチャネルとの前記結合を含むことを特徴とする、幹細胞における機械受容イオンチャネルを操作することを含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項４０】
粒子が、前記イオンチャネルのＮ−末端領域と結合されることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
粒子が、前記イオンチャネルのＣＯＯＨ末端領域と結合されることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
幹細胞および／または作動もしくは拮抗するイオンチャネルの遠隔操作を含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
剪断応力、細胞膨張および膜伸長および／または外部物質に応答することが判明している幹細胞の使用を含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項４４】
前記外部物質が、脂肪酸または全身麻酔薬であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
疼痛緩和、麻酔、治療法、細胞工学および修復および／または癌治療の用途に組み込まれることを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項４６】
前記幹細胞が、結合組織または神経組織に分化されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記幹細胞が、骨細胞、ニューロン細胞、心臓細胞またはそれらの組み合せに分化されることを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記イオンチャネルが、機械受容イオンチャネルであることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
前記機械受容イオンチャネルが、細胞に移入されていることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項５０】
膜変形を引き起こし、前記機械受容イオンチャネルまたは電位差依存性およびリガンド依存性イオンチャネルの開放のきっかけを与える、力の使用を含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
前記イオンチャネルが、電位差依存性イオンチャネルであることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記イオンチャネルが、リガンド依存性イオンチャネルであることを特徴とする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記イオンチャネルが、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、塩化物チャネルおよび非選択的カチオンチャネルまたはそれらの組み合せを含む群から選択されることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項５４】
前記イオンチャネルが、カルシウムイオンチャネルまたはカリウムイオンチャネルから選択されることを特徴とする、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記イオンチャネルが、カリウムイオンチャネルであることを特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記カリウムチャネルが、ＴＲＥＫ−１チャネルであることを特徴とする、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
骨細胞におけるＴＲＥＫ−１チャネルの使用を含むことを特徴とする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
体外高勾配希土類磁石を使用したターゲティングを含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項５９】
前記希土類磁石が、ＮｄＦｅＢ磁石であることを特徴とする、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記磁石が、細胞に負荷した磁性粒子に対して並進力を及ぼす高磁場／勾配生成物を生み出し、前記細胞を、式：
【数１】
2007518710.tif 000004
に従って、標的部位に維持することを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項６１】
前記活性化が、磁気調整バイオリアクターを使用して達成される遠隔機械的活性化を含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項６２】
本発明の方法で使用される前記磁化可能粒子が、本質的に磁性であってもよく、あるいは磁場中で反応するものであってもよいことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項６３】
前記磁化可能粒子が、磁性であることを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項６４】
前記磁性材料が、常磁性、超常磁性、強磁性および／または反強磁性であることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記磁化可能な材料が、鉄元素（Ｆｅ）、またはその化合物、およびクロム化合物、またはそれらの組み合せを含む群から選択されることを特徴とする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記鉄化合物が、鉄塩であることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記鉄塩が、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、磁赤鉄鉱（γＦｅ2Ｏ3）およびグレイジャイト（Ｆｅ3Ｓ4）、またはそれらの任意の組み合せを含む群から選択されることを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記クロム化合物が、クロム塩であることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記クロム塩が、酸化クロム（ＣｒＯ2）であることを特徴とする、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記磁性材料が、生体適合性コーティングを有する磁気コアを含む粒子を含むことを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
前記生体適合性磁性ナノ粒子が、シリカ、デキストラン、またはＰＶＡコーティングのいずれかを有するマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）および／または磁赤鉄鉱（Ｆｅ2Ｏ3）コアを含むことを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記粒子が、ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項７３】
前記ナノ粒子が、１ｎｍ〜１０μｍの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記粒子が、５０００ｎｍ以下の平均サイズを有することを特徴とする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記粒子が、１ｎｍ〜５０００ｎｍの平均サイズを有することを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記磁性ナノ粒子が、１０ｎｍから数μｍまでの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記コーティングに官能性を持たせて、膜付着モチーフに架橋させることを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項７８】
粒子内部移行頻度、結合効率、安定性ならびに細胞生存能および機能上の結合をカスタマイズするために、前記磁性ナノ粒子を修飾することを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項７９】
前記修飾が、内部結合部位ならびに外膜上の部位のカスタマイズを含むことを特徴とする、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記粒子が、コアおよび該コアを包むシリカ殻を有することを特徴とする、請求項７１に記載の方法。
【請求項８１】
前記粒子が、（ａ）磁化可能粒子を含むコア、および（ｂ）前記コアを包むシリカ殻、を含むものから選択されることを特徴とする、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記粒子が、孔内に多数の磁心を有する多孔性粒子であることを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項８３】
前記方法が、前記磁化可能粒子上に遠隔磁場を加えることを含むことを特徴とする、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項８４】
前記粒子が、１つ以上の特異的抗体または細胞内の重要な細胞要素を認識するタンパク質結合モチーフに付けられることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項８５】
前記特異的抗体またはタンパク質結合モチーフが、膜貫通細胞外マトリックス分子、接着分子または分散した膜接着タンパク質あるいは細胞外マトリックスタンパク質から選択されることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記膜貫通接着分子が、インテグリン類、カドヘリン類、セレクチン類、および免疫グロブリン類から選択されることを特徴とする、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記特異的抗体またはタンパク質結合モチーフが、分散された膜接着タンパク質から選択されることを特徴とする、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記分散した膜接着タンパク質が、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）であることを特徴とする、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
イオンチャネルが関与する疾患に罹っている患者の治療方法であって、このような患者への磁化可能粒子の投与、および体外の磁場を使用した幹細胞イオンチャネルまたは前記幹細胞の操作を含む、方法。
【請求項９０】
請求項８９に記載の方法を含む、腫瘍細胞を治療または軽減する方法。
【請求項９１】
前記腫瘍細胞が、癌細胞であることを特徴とする、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
標的静磁場でイオンチャネルを開いた状態にしておくことによる細胞の死滅を含むことを特徴とする、請求項９１に記載の患者の治療方法。
【請求項９３】
標的時変磁場でイオンチャネルを周期的に開閉することによる、細胞の死滅を含むことを特徴とする、請求項９１に記載の患者の治療方法。
【請求項９４】
イオンチャネルが正常細胞のホメオスタシスに重要な役割を果たす身体の複数の組織に、疾患が関与する、請求項９１に記載の治療方法。
【請求項９５】
前記細胞が、心筋細胞であることを特徴とする、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
高血圧症の治療を含むことを特徴とする、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
疼痛緩和を含むことを特徴とする、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
麻酔を含むことを特徴とする、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記麻酔が、局部的であることを特徴とする、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
組織修復および／または骨修復を含むことを特徴とする、請求項８９に記載の患者の治療方法。
【請求項１０１】
前記細胞が、靭帯細胞、腱細胞、軟骨細胞および他の間質細胞（たとえば軟骨細胞前駆細胞）から選択されることを特徴とする、請求項１００に記載の治療方法。
【請求項１０２】
皮膚、軟骨、靭帯、腱、筋肉または骨等の、組織の再生あるいは人工組織の生成を含むことを特徴とする、請求項１００に記載の治療方法。
【請求項１０３】
イオンチャネルの前記遠隔活性化を含むことを特徴とする、請求項１００に記載の治療方法。
【請求項１０４】
創傷治癒および／または組織接着を含むことを特徴とする、請求項１００に記載の治療方法。
【請求項１０５】
骨修復および／または骨成長を含むことを特徴とする、請求項１００に記載の治療方法。
【請求項１０６】
歯科用途または獣医学用途を含むことを特徴とする、請求項８９に記載の治療方法。
【請求項１０７】
体外の磁場によるイオンチャネル調節の作用により局所麻酔を確立することを特徴とする、請求項９８に記載の治療方法。
【請求項１０８】
０．１〜１０Ｈｚの周波数の磁場の使用を含むことを特徴とする、請求項８９に記載の治療方法。
【請求項１０９】
一般的に１０〜１４００ｍＴの磁束密度を有するであろう磁場の使用を含むことを特徴とする、請求項８９に記載の方法。
【請求項１１０】
磁化可能粒子と前記細胞との結合によって前記細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗すること、および前記磁化可能粒子を磁気で操作することを含む、幹細胞において治療効果を生じさせる方法。
【請求項１１１】
磁化可能粒子と同時に、別々にまたは逐次的に投与することが可能であり、また幹細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗する、治療的に有効な作用物の投与を含む治療方法。
【請求項１１２】
治療的に有効な作用物を幹細胞にターゲティングする方法であって、磁化可能粒子と前記細胞との結合によって前記細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗すること、前記磁化可能粒子を磁気で操作すること、および、該磁化可能粒子の操作と同時に、別々にまたは逐次的に治療的に有効な作用物を投与することを含む、方法。
【請求項１１３】
磁化可能粒子と細胞との結合を含む、幹細胞を磁気で操作する方法における、磁化可能粒子の使用。
【請求項１１４】
幹細胞を選択的に活性化および／またはターゲティングし、次いで前記細胞を、遠隔方法で機械的に操作できるようにすることを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１５】
前記遠隔方法が、非接触方法であり、またｉｎ  ｖｉｖｏの場合には、体外から特異的に活性化／ターゲティングすることを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１６】
磁化可能粒子と幹細胞との結合により、幹細胞をｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで磁気で操作することを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１７】
（ｉ）幹細胞を修復部位にターゲティングすることおよび／または前記細胞を前記部位に維持すること；および
（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでの調整および／または分化
を含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞をターゲティングすることを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１１９】
ヒト幹細胞の操作を含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１２０】
前記幹細胞に磁化可能なナノ粒子を付けることを含み、これを体外磁気操作によって、ある特定の修復部位に送達または維持することができることを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１２１】
特異的幹細胞膜受容体の遠隔活性化を含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１２２】
幹細胞をある部位に付着させること、前記細胞を前記部位に留めること、および患者の体内でｉｎ  ｓｉｔｕで前記細胞を遠隔活性化することを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１２３】
幹細胞の膜貫通イオンチャネルを遠隔活性化するために、幹細胞上の特異的受容体をターゲティングすることを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１２４】
細胞型の初期段階分化を含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１２５】
ヒト骨髄幹細胞に存在する様々な幹細胞受容体のターゲティングを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１２６】
前記幹細胞受容体型が、機械的活性化されたイオンチャネルたとえばＫ＋チャネル（ＴＲＥＫ）、カルシウムチャネル、インテグリン類および表面膜結合部位、たとえばＲＧＤから選択されることを特徴とする、請求項１２５に記載の使用。
【請求項１２７】
（幹細胞分化に不可欠な）Ｒｕｎｘ２およびＯｓｔｅｒｉｘ等の下流転写因子を活性化することが証明されている外的成長因子（たとえばＴＧＦＢおよびＢＭＰ２）の受容体をターゲティングすることを含むことを特徴とする、請求項１２６に記載の使用。
【請求項１２８】
前記幹細胞が、間葉幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１２９】
損傷または修復の部位におけるヒト間葉幹細胞の移植を含むことを特徴とする、請求項１２８に記載の使用。
【請求項１３０】
治療的処置を提供することを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１３１】
前記治療的処置が、遺伝子療法およびヒト組織工学から選択されることを特徴とする、請求項１３０に記載の使用。
【請求項１３２】
前記部位が、組織修復部位であることを特徴とする、請求項１３１に記載の使用。
【請求項１３３】
前記幹細胞が、機能レベルで、神経細胞に分化されることを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１３４】
幹細胞結合、幹細胞送達および幹細胞活性化を含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１３５】
成人一次骨髄ヒト幹細胞および／またはヒト胚性幹細胞を使用することを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１３６】
前記バイオリアクターが、マルチ・ウェル２Ｄシステム内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または３Ｄ細胞培養足場に基づくシステム内でｉｎ  ｖｉｖｏで、培養された幹細胞に付着させた磁性粒子に力を加えることを可能にすることを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１３７】
前記間葉幹細胞が、造骨、軟骨形成および脂肪生成個体群から選択される個体群を含むことを特徴とする、請求項１３６に記載の使用。
【請求項１３８】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法とモノクローナル抗体を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項１３９】
前記モノクローナル抗体が、ＳＴＲＯ−１であることを特徴とする、請求項１３８に記載の使用。
【請求項１４０】
生分解性ポリマーでできた３Ｄ細胞培養足場を使用する、単層でのＢＭＳｃ培養を含むことを特徴とする、請求項１３６に記載の使用。
【請求項１４１】
前記生分解性ポリマーが、ポリ乳酸（ＰＬＥＡ）およびコラーゲンゲルから選択されることを特徴とする、請求項１４０に記載の使用。
【請求項１４２】
ｉｎ  ｖｉｖｏプロセスのｅｘ  ｖｉｖｏ操作を含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１４３】
磁化可能粒子と幹細胞との活性化および／またはターゲティングを含むことを特徴とする、請求項１１３に記載の使用。
【請求項１４４】
磁化可能粒子と幹細胞との結合により、幹細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗することを含む、治療の製造における磁化可能粒子の使用。
【請求項１４５】
分化工程を含むことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１４６】
前記磁化可能粒子が、前記幹細胞と直接結合されることを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１４７】
磁化可能粒子を抗体または酵素と結合し、この抗体または酵素が次に前記幹細胞と結合されること含むことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１４８】
幹細胞への粒子の導入または幹細胞への粒子の付着を含むことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１４９】
粒子が、細胞内または細胞外に結合されることを特徴とする、請求項１４８に記載の使用。
【請求項１５０】
粒子が、細胞内に結合されることを特徴とする、請求項１４９に記載の使用。
【請求項１５１】
前記細胞内結合が、内部結合部位との結合を含むことを特徴とする、請求項１５０に記載の使用。
【請求項１５２】
直接的または間接的な、磁化可能粒子とイオンチャネルとの前記結合を含むことを特徴とする、幹細胞における機械受容イオンチャネルを操作することを含むことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１５３】
粒子が、前記イオンチャネルのＮ−末端領域と結合されることを特徴とする、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５４】
粒子が、前記イオンチャネルのＣＯＯＨ末端領域と結合されることを特徴とする、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５５】
幹細胞および／または作動もしくは拮抗するイオンチャネルの遠隔操作を含むことを特徴とする、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１５６】
剪断応力、細胞膨張および膜伸長および／または外部物質に応答することが判明している幹細胞の使用を含むことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１５７】
前記外部物質が、脂肪酸または全身麻酔薬であることを特徴とする、請求項１５６に記載の使用。
【請求項１５８】
疼痛緩和、麻酔、治療法、細胞工学および修復および／または癌治療の用途に組み込まれることを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１５９】
前記幹細胞が、結合組織または神経組織に分化されることを特徴とする、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６０】
前記幹細胞が、骨細胞、ニューロン細胞、心臓細胞またはそれらの組み合せに分化されることを特徴とする、請求項１５８に記載の使用。
【請求項１６１】
前記イオンチャネルが、機械受容イオンチャネルであることを特徴とする、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１６２】
前記機械受容イオンチャネルが、細胞に移入されていることを特徴とする、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１６３】
膜変形を引き起こし、前記チャネルまたは電位差依存性およびリガンド依存性イオンチャネルの開放のきっかけを与える、力の使用を含むことを特徴とする、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１６４】
前記イオンチャネルが、電位差依存性イオンチャネルであることを特徴とする、請求項１６３に記載の使用。
【請求項１６５】
前記イオンチャネルが、リガンド依存性イオンチャネルであることを特徴とする、請求項１６３に記載の使用。
【請求項１６６】
前記イオンチャネルが、ナトリウムチャネル、カリウムチャネル、カルシウムチャネル、塩化物チャネルおよび非選択的カチオンチャネルまたはそれらの組み合せを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１５２に記載の使用。
【請求項１６７】
前記イオンチャネルが、カルシウムまたはカリウムイオンチャネルから選択されることを特徴とする、請求項１６６に記載の使用。
【請求項１６８】
前記イオンチャネルが、カリウムイオンチャネルであることを特徴とする、請求項１６６に記載の使用。
【請求項１６９】
前記カリウムチャネルが、ＴＲＥＫ−１チャネルであることを特徴とする、請求項１６８に記載の使用。
【請求項１７０】
骨細胞におけるＴＲＥＫ−１チャネルの使用を含むことを特徴とする、請求項１６９に記載の使用。
【請求項１７１】
体外高勾配希土類磁石を使用したターゲティングを含むことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１７２】
前記希土類磁石が、ＮｄＦｅＢ磁石であることを特徴とする、請求項１７１に記載の使用。
【請求項１７３】
前記磁石は、細胞に負荷した磁性粒子に対して並進力を及ぼす高磁場／勾配生成物を生み出し、前記細胞を、式：
【数２】
2007518710.tif 000005
に従って、標的部位に維持することを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１７４】
前記活性化が、磁気調整バイオリアクターを使用して達成される遠隔機械的活性化を含むことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１７５】
本発明の使用で使用される前記磁化可能粒子が、もともと磁性であってもよく、あるいは、磁場中で反応するものであってもよいことを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１７６】
前記磁化可能粒子が、磁性であることを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１７７】
前記磁性材料が、常磁性、超常磁性、強磁性および／または反強磁性であることを特徴とする、請求項１７６に記載の使用。
【請求項１７８】
前記磁化可能な材料が、鉄元素（Ｆｅ）、またはその化合物、およびクロム化合物、またはそれらの組み合せを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１７５に記載の使用。
【請求項１７９】
前記鉄化合物が、鉄塩であることを特徴とする、請求項１７８に記載の使用。
【請求項１８０】
前記鉄塩が、マグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、磁赤鉄鉱（γＦｅ2Ｏ3）およびグレイジャイト（Ｆｅ3Ｓ4）、またはそれらの任意の組み合せを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１７９に記載の使用。
【請求項１８１】
前記クロム化合物が、クロム塩であることを特徴とする、請求項１７８に記載の使用。
【請求項１８２】
前記クロム塩が、酸化クロム（ＣｒＯ2）であることを特徴とする、請求項１８１に記載の使用。
【請求項１８３】
前記磁性材料が、生体適合性コーティングを有する磁気コアを含む粒子を含むことを特徴とする、請求項１７６に記載の使用。
【請求項１８４】
前記生体適合性磁性ナノ粒子が、シリカ、デキストラン、もしくは、ＰＶＡコーティングのいずれかを有するマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）および／または磁赤鉄鉱（Ｆｅ2Ｏ3）コアを含むことを特徴とする、請求項１８３に記載の使用。
【請求項１８５】
前記粒子が、ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１８６】
前記ナノ粒子が、１ｎｍ〜１０μｍの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項１８５に記載の使用。
【請求項１８７】
前記粒子が、５０００ｎｍ以下の平均サイズを有することを特徴とする、請求項１８７に記載の使用。
【請求項１８８】
前記粒子が、１ｎｍ〜５０００ｎｍの平均サイズを有することを特徴とする、請求項１８７に記載の使用。
【請求項１８９】
前記磁性ナノ粒子が、１０ｎｍから数μｍまでの粒子サイズを有することを特徴とする、請求項１８５に記載の使用。
【請求項１９０】
官能性を持たせて膜付着モチーフに架橋させることを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１９１】
粒子内部移行頻度、結合効率、安定性ならびに細胞生存能および機能上の結合をカスタマイズするために、前記磁性ナノ粒子を修飾することを特徴とする、請求項１１３または１４４に記載の使用。
【請求項１９２】
前記修飾が、内部結合部位ならびに外膜上の部位のカスタマイズを含むことを特徴とする、請求項１９１に記載の使用。
【請求項１９３】
前記粒子が、コアおよび前記コアを包むシリカ殻を有することを特徴とする、請求項１８４に記載の使用。
【請求項１９４】
前記粒子が、（ａ）磁化可能粒子を含むコア、および（ｂ）前記コアを包むシリカ殻、を含むものから選択されることを特徴とする、請求項１９３  に記載の使用。
【請求項１９５】
前記粒子が、孔内に多数の磁心を有する多孔性粒子であることを特徴とする、請求項１８３  に記載の使用。
【請求項１９６】
前記磁化可能粒子上に遠隔磁場を加えることを含むことを特徴とする、請求項１１３  または  １４４に記載の使用。
【請求項１９７】
前記粒子が、１つ以上の特異的抗体または細胞内の重要な細胞要素を認識するタンパク質結合モチーフに付けられることを特徴とする、請求項１４７  に記載の使用。
【請求項１９８】
前記特異的抗体またはタンパク質結合モチーフが、膜貫通細胞外マトリックス分子、接着分子または分散した膜接着タンパク質あるいは細胞外マトリックスタンパク質から選択されることを特徴とする、請求項１９７に記載の使用。
【請求項１９９】
前記膜貫通接着分子が、インテグリン類、カドヘリン類、セレクチン類、および免疫グロブリン類から選択されることを特徴とする、請求項１９８に記載の使用。
【請求項２００】
前記特異的抗体またはタンパク質結合モチーフが、分散された膜接着タンパク質から選択されることを特徴とする、請求項１９９に記載の使用。
【請求項２０１】
前記分散した膜接着タンパク質が、ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）であることを特徴とする、請求項２００に記載の使用。
【請求項２０２】
イオンチャネルが関与する疾患に罹っている患者を治療するための治療法であって、このような患者への磁化可能粒子の投与、および体外の磁場を使用した前記幹細胞イオンチャネルまたは前記幹細胞の操作を含む治療法の製造における、幹細胞との結合における磁化可能粒子の使用。
【請求項２０３】
磁化可能粒子と前記細胞との結合によって前記細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗すること、前記磁化可能粒子を磁気で操作すること、および、該磁化可能粒子の操作と同時に、別々にまたは逐次的に治療的に有効な作用物を投与することを含む、治療的に有効な作用物を細胞にターゲティングするためのシステムの製造における磁化可能粒子の使用。
【請求項２０４】
治療的に有効な作用物、および磁化可能粒子を細胞と結合するための手段を含む、キット。
【請求項２０５】
実質的に、添付の図面を参照しながら説明される通りの方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞を磁気により操作する新規な方法およびそれに関連した治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞に基づいた治療方式での幹細胞の使用は現在、疾患治療および修復医学にとって最も刺激的かつ有望な分野の１つである。明らかに、たとえば胚および成人の幹細胞の増殖および分化を制御できる方法の基礎研究は、極めて重要である。
【０００３】
米国特許第６，５４８，２６４号明細書には、磁性金属コアを含むシリカ被覆ナノ粒子が記載されている。該粒子中に存在する磁気コアは、粒子を、磁場に反応できるようにし、したがって、該粒子は、診断用薬、画像化および記録システムでの使用に適当になる。しかし、従来技術のナノ粒子は、細胞レベルの活性化の方法を明確に定めないという欠点が生じるだろう。
【０００４】
磁気ビーズ・ツイスティング・サイトメトリー（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｔｗｉｓｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は、細胞の機械的性質を明白にし、また、インテグリン類等の膜貫通細胞接着分子を介して、細胞表面を越えて細胞骨格を貫いて、機械的外力を伝達できることを証明するために、使用されてきた。たとえば、Ｗａｎｇ，Ｎ  ａｎｄ  Ｉｎｇｂｅｒｇｅｒ，ＤＥ（１９９５）磁気ツイスティング・サイトメトリーを使用した膜貫通機械的結合および細胞力学の精査（Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｍｅｃｈａｎｉｃｓｕｓｉｎｇ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｔｗｉｓｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７３：３２７−３３５を参照されたい。
【０００５】
生体適合性磁性ナノ粒子合成、特性決定1-3およびヘルスケア分野での斬新な磁気技術の応用において、多くの進歩があった4-6。この研究は主として、制御された定方向の医薬輸送の調査研究を含んでいた。これらの系では、治療薬または遺伝子を磁性キャリヤ粒子（通常は、ポリマー被覆マグネタイト）に付着させ、次いで、これを、空間的に集中させた、高勾配磁場を加えることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的部位に集中させる。いったん該薬剤／担体複合体が標的部位に蓄積すると、該薬剤は放出され、該部位における取り込みが増進される。遺伝子療法のための磁気ターゲティングならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデル系で、磁性マイクロ粒子およびナノ粒子キャリヤーの付着を理論的および実験的に試験し改良するための新しい方法の研究が行われてきた4,6。
【０００６】
多数の研究者によって、トルクを使用して細胞膜に力が加えられる短期実験、あるいはＲＧＤまたはコラーゲン分子等の膜貫通タンパク質に張力が加えられる短期実験が記述されている7,8。これらの実験は、膜の「機械的」刺激を使用して、様々な細胞で短期内部カルシウム・フラックスを誘発する。他の技術を使用した機械的情報伝達が、骨髄間質細胞における造骨系への分化経路の引き金となること11、および特に、膜を越えた低レベル機械的シグナルは、骨芽細胞特異的転写因子、ｃｂｆａｌおよびｃｆｓ12,13の発現およびＤＮＡ結合活性を上方制御できることは公知である。
【０００７】
こうした研究では、多数の様々な標識受容体に力を加えることができる。下流プロセスに影響を与えて、コラーゲンおよび他のマトリックスタンパク質の合成を高める方法が証明されている。造骨系統および軟骨形成系統に沿って分化するように調整された骨髄由来の間葉幹細胞を使用して、我々は、特異的受容体の磁性粒子活性化に応答した下流遺伝子調節を研究してきた。予備データは、ヒト間葉幹細胞におけるカルシウムチャネルの磁性粒子刺激に応答したＲｕｎｘ２の上方制御に続く機械受容マトリックスタンパク質、オステオポンチンの上方制御を示した。加えて、我々は、単層ヒト脱分化軟骨細胞の刺激による、ＳＯＸ  ９の上方制御の証拠を得た。これらの研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、組織工学における構築物製作術の使用を研究するための、長期培養に関する細胞播種足場（ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）の３Ｄ解析に拡大されている。さらに、適用された粒子数および力の、用量−応答分析を含む予備研究は有望であり、マトリックス合成および造骨表現型の発現増進を示す。
【０００８】
骨髄は、とりわけ、線維芽細胞、造細胞、脂肪生成細胞および細網細胞に分化することができる多分化能間質幹細胞または間葉幹細胞を含む。これらの間葉幹細胞、たとえばヒト骨髄間質の線維芽細胞は、ボランティア・ドナーから単離することができ、また多系列（脂肪細胞、軟骨形成、造骨）能を保持することが可能である。前述の細胞の使用および操作における１つの利点は、免疫原性が欠如していることにあり、そのため、とりわけ、軟骨および骨修復でこれらの細胞を使用できる可能性がある。
【０００９】
我々の未発表の同時係属国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００３／００２６２４号（国際公開２００４／０００３６９号パンフレット）は、磁性ナノ粒子手法と機械受容イオンチャネル、特に、ＴＲＥＫ  Ｋ＋チャネルの知識とを組み合せる。該ＴＲＥＫチャネルは、造骨細胞、軟骨形成細胞および骨髄間質細胞に存在することは証明されている。特異的受容体のターゲティングをより詳細に規定して活性化を調節するために、我々はＴＲＥＫ遺伝子のＨＩＳタグ付クローンを使用した。ＨＩＳタグは、該ＴＲＥＫ分子の特定の領域に挿入され、ＨＩＳ抗体またはＮＩ2+結合した磁性粒子の付着を可能にし、次いで、磁場を使用して、これに遠隔で回転力を与えることができる。細胞膜内および細胞膜外の両方にあるイオンチャネルタンパク質の部位が標識されており、このような方法で、我々は該分子の機械受容領域を同定し、また下流プロセスのスイッチを入れるために必要なシグナル周波数を規定することができる。図２は、Ｈｉｓタグ付きＴＲＥＫチャネルに付着した磁性ナノ粒子に磁場を与えた結果として、内部カルシウムレベルが上方制御された骨髄間質細胞を使用した実験の結果を示す。
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合組織細胞の調整は、とりわけ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで２Ｄ単層培養および３Ｄ細胞播種足場（ｃｅｌｌ−ｓｅｅｄｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）に磁場を印加することを可能にする磁力バイオリアクターの開発によって、達成できることは証明されている。
【００１１】
しかし、米国特許第６，５４８，２６４号もＷａｎｇも、解決するために努力する必要があり、臨床使用のために細胞を操作する究極の目的を包含する、２つの根本的な問題を取り巻く課題、すなわち；
（ｉ）いかにして細胞を修復部位にターゲットし、かつその部位に維持するか、また、
（ｉｉ）いかにして細胞たとえば幹細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで調整または分化させるか
を、解決するどころか、取り組むことさえしていない。
【発明の開示】
【００１２】
意外なことに、我々はこの度、磁性ナノ粒子を付けた幹細胞を、体外磁気操作で、ある特定の修復部位に送達できる、またはある特定の修復部位に維持できる方法を発見した。加えて、我々は、本質的に、細胞たとえば幹細胞の局在化を含む、特異的な細胞膜受容体の遠隔活性化を含むように、これらの構想をさらに発展させた。もっと簡単に記述すると、これは、ある部位たとえば修復部位に幹細胞を付着させ、該細胞を該部位に留め、患者の体内でｉｎ  ｓｉｔｕで該細胞を遠隔活性化することを含む。
【００１３】
特に、本発明は、幹細胞の膜貫通イオンチャネルを遠隔活性化するために、細胞上の特異的受容体をターゲティングする問題点に取り組む。重要なことは、磁性ナノ粒子に基づく技術は、ヘルスケアの多くの面で、たとえばＭＲＩのためのコントラスト強調で、臨床的に、使用が増加していることである。
【００１４】
本発明で、我々は、これらの細胞型の分化の初期段階を達成した。さらに、該達成された分化は、局在化されたとき、体内での遠隔ターゲティングおよび／または特異的部位における活性化の両者を可能にする結合方法のモデルの役割を果たす。
【００１５】
したがって、本発明は、ヒト骨髄幹細胞に存在する、機械的活性化されたイオンチャネル、たとえば、Ｋ＋チャネル（ＴＲＥＫ）、カルシウムチャネル、インテグリン類およびＲＧＤ等の表面膜結合部位等の、様々な幹細胞レセプター型のターゲティングを可能にする。重要なことは、このような受容体は、遠隔活性化の可能性を有することである。幹細胞分化に不可欠な、Ｒｕｎｘ２およびＯｓｔｅｒｉｘ等の下流転写因子を活性化することが証明されている外的成長因子（たとえばＴＧＦＢおよびＢＭＰ２）等の、他の公知の受容体のターゲティングもまた達成することができた。
【００１６】
したがって、本発明は、とりわけ、ヒト間葉幹細胞の真の移植の機会、損傷部位または修復部位における幹細胞に対する長期生物学的効果を提供する。さらに、これらの細胞を選択し、増殖させ、分化し、磁性ナノ粒子を使用して該細胞をターゲットできることは、特に有利である。さらに、本発明の利用は、とりわけ、遺伝子療法および組織工学における、治療との関連を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
シリカ、デキストラン、またはＰＶＡコーティングのいずれかを有するマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）および／または磁赤鉄鉱（Ｆｅ2Ｏ3）コアで主として構成される、生体適合性磁性ナノ粒子が、本発明で使用され得る。このような粒子は、当該技術分野で公知の方法に従って合成することが可能である。しかし、当然のことながら、他の磁性ナノ粒子を使用することが可能である。粒子サイズは、〜１０ｎｍから数μｍまで、たとえば１〜１０μｍの範囲であってもよい。様々な表面化学を有する市販の磁性マイクロ粒子およびナノ粒子もまた使用することが可能である。該コーティングに官能性を持たせ、上述のような膜付着モチーフに架橋させることが可能である。とりわけ、粒子内部移行頻度および結合効率をカスタマイズするために、該磁性ナノ粒子を修飾することが可能であり、また細胞生存能および機能に与える、結合の効果が検討されるのと同様、安定性が検討される。修飾はまた、内部結合部位ならびに外膜上の部位のカスタマイズも含んでもよい。ヒト骨芽細胞における磁性ナノ粒子結合および負荷に様々なコーティングを使用することが可能であり14,15、またこれらの技術は、たとえば成人一次骨髄ヒト幹細胞および／またはヒト胚性幹細胞を使用して、さらに、幹細胞結合、幹細胞送達、および幹細胞活性化に最適化することが可能である。
【００１８】
ターゲティング
従来公知の高勾配磁石、たとえば体外希土類（主としてＮｄＦｅＢ）（高勾配磁石）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系内および／またはｉｎ  ｖｉｖｏで、該幹細胞を特異的部位にターゲティングすることが可能である。明らかに、ｉｎ  ｖｉｖｏで該幹細胞をターゲティングすることは、本発明の好ましい態様である。このような磁石は、細胞に負荷した磁性粒子に対して並進力を及ぼす高磁場／勾配生成物を生み出し、該細胞を、式：
【数１】
2007518710.tif 000002
に従って、標的部位に維持する。
【００１９】
活性化
遠隔機械的活性化は、たとえば磁気調整バイオリアクターを使用して、達成することが可能である。このようなバイオリアクターは、それ自体公知であり、マルチウェル２Ｄシステム内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで、または３Ｄ細胞培養足場に基づくシステム内でｉｎ  ｖｉｖｏで、培養された細胞に付着させた磁性粒子に力を加えることが可能である。幹細胞、たとえば間葉幹細胞、およびそれらから発生した個体群、たとえば造骨、軟骨形成および脂肪生成個体群は、たとえば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）法とモノクローナル抗体たとえばＳＴＲＯ−１を使用し、それ自体公知の標準プロトコールを使用して、単離することが可能である14。このようなプロトコールとしては、単層でのＢＭＳｃ培養として知られる、ポリ乳酸（ＰＬＬＡ）またはコラーゲンゲル等の生分解性ポリマーでできている３Ｄ細胞培養足場を使用するものなどがある21。
【００２０】
我々は今や、幹細胞を選択的に活性化および／またはターゲティングし、さらにまた該細胞を、遠隔方法で、機械的に操作できるようにする方法を発見した。
【００２１】
用語「遠隔方法で」は、体外から特異的にｉｎ  ｖｉｖｏ活性化／ターゲティングする場合には、たとえば非接触方法を意味する。
【００２２】
したがって、本発明によれば、我々は、磁化可能粒子と幹細胞との結合を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞を磁気で操作する方法を提供する。
【００２３】
本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏプロセスのｅｘ  ｖｉｖｏ操作を含むことも可能である。さらに、１つの細胞についての言及は、複数の細胞を包含すると解釈されるべきものとすることは、当業者に理解されるであろう。
【００２４】
さらに詳細には、本発明は、前述の磁化可能粒子と幹細胞との活性化および／またはターゲティングを含む、前述の方法を提供する。
【００２５】
本発明のさらなる態様によれば、我々は、磁化可能粒子と細胞との結合を含む幹細胞を磁気で操作する方法であって、磁化可能粒子と細胞との結合により細胞内イオンチャネルに作動または拮抗することを特徴とする方法を提供する。
【００２６】
本発明のまたさらなる態様によれば、我々は、分化工程を含む、前述の方法を提供する。
【００２７】
本発明のこの態様において、該磁化可能粒子を、細胞と直接結合してもよい。あるいは、本方法は、磁化可能粒子と抗体、酵素、等々とを結合し、次に、該細胞と結合することを含んでもよい。
【００２８】
磁化可能粒子と細胞との結合は、このような粒子の細胞への導入、このような粒子の細胞への付着、たとえば、細胞の外側または内側への付着、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。したがって、該磁化可能粒子を、細胞内に、細胞外に、または細胞内と細胞外の組み合わせで、結合することが可能である。しかし、本発明の好ましい態様では、該粒子は、細胞内に結合される。
【００２９】
本発明の方法が細胞内結合を含むとき、この方法は内部結合部位との結合を含む。ほんの一例として、ＴＲＥＫ−１の場合、該粒子を、該イオンチャネルのＮ−末端領域と結合してもよい。あるいは、該粒子を、該イオンチャネルのＣＯＯＨ末端領域と結合してもよい。多数のイオンチャネルおよび結合部位を本発明の方法で利用できることは、当業者に理解されるであろう。したがって、ＴＲＥＫ−１に見られるようなイオンチャネルのＮ−末端領域またはＴＲＥＫ−１に見られるようなイオンチャネルのＣＯＯＨ末端領域に対応する内部結合部位も、それ自体が公知である他の結合部位と同様に使用することが可能である。
【００３０】
したがって、我々はまた、機械受容（mechanosensitive）イオンチャネルを操作する方法であって、磁化可能粒子とイオンチャネルとを、直接または間接的に、結合することを含むことを特徴とする方法も提供する。
【００３１】
本発明の方法は、哺乳動物の細胞または他の細胞型、たとえば細菌細胞、植物細胞  等々の操作を含むことが可能である。しかし、本発明の方法を使用して、本明細書に記載されていない他の細胞型を操作できることは、当業者に理解されるであろう。さらに、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であってもｉｎ  ｖｉｖｏ方法であってもよいが、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法が好ましい。
【００３２】
本発明の方法は、本明細書に記載のような幹細胞の機械的操作に応答して、幹細胞における遺伝子発現の上方制御または下方制御を含むことが可能である。遺伝子の発現パターンまたは発現レベルの操作を通じて、幹細胞を、本明細書に記載のような特定の分化経路に従わせることが可能である。
【００３３】
優先的に、本発明の方法は、細胞の遠隔操作、および／または、作動もしくは拮抗するイオンチャネルの遠隔操作、たとえば、体外からの操作、すなわち遠隔機械的活性化を含む。
【００３４】
本発明の方法は、それ自体公知の様々な細胞に関連して使用することが可能である。しかし、優先的に、本方法は、哺乳動物の幹細胞と共に使用するのに適する。
【００３５】
本発明の方法は、従来知られている、前述の細胞内のイオンチャネルと一緒に使用することが可能である。本方法は、機械受容イオンチャネルでの使用に特に適する。このような機械受容イオンチャネルは、多くの細胞型で確認されており、主にカルシウムイオンチャネルまたはカリウムイオンチャネルとして記述されてきたが、当然のことながら、本発明の方法は、カルシウムイオンチャネルまたはカリウムイオンチャネルに関連した使用に限定されない。ほんの一例として、神経細胞で、分子レベルおよび機能レベルで十分に特性決定されている１つのこのようなチャネルは、２Ｐ  Ｋ＋チャネルファミリーの一部である、染色体遺伝子ＴＲＥＫ−１である。ＴＲＥＫ−１チャネルは、骨細胞で同定されており、また剪断応力、細胞膨張および膜伸長ならびに脂肪酸および全身麻酔薬等の他の外部物質に応答することが判っている。
【００３６】
本発明のある特定の態様は、機械受容イオンチャネルを操作する方法を提供することである。
【００３７】
これらの「機械受容」イオンチャネルは、様々な哺乳動物、たとえばヒト、の細胞および細菌細胞に存在し、また、本発明は、体内および／または細胞培養で、該細胞を選択的に活性化できるようにする。たとえば、Ｓｏｋａｂｅ，Ｍ，Ｆ  Ｓａｃｈｓ，Ａ  Ｊｉｎｇ（１９９１）、パッチ固定された膜の定量的ビデオ顕微鏡法：応力、歪み、キャパシタンス、および伸長チャネル活性化（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｖｉｄｅｏ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｏｆ  ｐａｔｃｈ  ｃｌａｍｐｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：Ｓｔｒｅｓｓ，ｓｔｒａｉｎ，ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｓｔｒｅｔｃｈ  ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．５９：７２２−７２８；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｚ．Ｂ  Ｍａｒｔｉｎａｃ  ａｎｄ  Ｊ  Ｄｏｂｓｏｎ（２０００）、走磁性細菌における小コンダクタンスの機械受容膜貫通イオンチャネルの証拠（Ｅｖｉｄｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍａｇｎｅｔｏｔａｃｔｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）．Ｅｌｅｃｔｒｏ−ａｎｄ  Ｍａｇｎｅｔｏｂｉｏｌ．１９：８１−８９を参照されたい。これらのチャネルは、正常な細胞機能で有益であり、また、たとえば、骨および結合組織の産生、または末梢神経系の活性化で特に重要な役割を果たすため、たとえば体外からそれらを遠隔操作できることは、殊に有利であり、とりわけ、疼痛緩和、たとえば麻酔薬、治療薬、組織工学および修復治療および癌治療で利用できる。
【００３８】
本発明のさらなる態様において、本方法はまた、細胞にチャネルを移入することにより、状況によっては反応しやすいこともあり、状況によっては反応しないこともある、従来の非機械受容細胞および／またはイオンチャネルと共に使用するのに適する。
【００３９】
全てのイオンチャネルは、力に応答して開閉し（すなわち構造的状態を変え）、これが、イオンチャネル活性化を推進する原理である。機械受容イオンチャネルの場合には、該力は、膜変形を生じさせ、チャネルの開放のきっかけとなる。電位差依存性イオンチャネルおよびリガンド依存性イオンチャネルはまた、（電位差依存性チャネルの場合）クーロン力および（リガンド依存性チャネルの場合）結合力によって生じるイオンチャネルに対する機械的応力に応答する点で、「機械応答性」でもある。該磁化可能粒子が、直接または間接的に、該チャネルタンパク質の該機械応答性領域に結合されるのであれば、そういうものとして、全てのイオンチャネルを、本明細書に記載の方法で活性化することができる。
【００４０】
したがって、本発明の一態様では、該イオンチャネルは、電位差依存性イオンチャネルであるか、あるいは、該イオンチャネルは、リガンド依存性イオンチャネルである。
【００４１】
多種多様な粒子を本発明の方法で使用することが可能である。本発明の方法で使用される磁化可能粒子は、本質的に磁性であってもよく、あるいは磁場中で反応するものであってもよい。概して、あらゆる磁性材料を使用することが可能であるが、用語「磁性体」は、たとえば、常磁性、超常磁性、強磁性および／または反強磁性である材料を意味し、その例としては、鉄元素（Ｆｅ）、または化合物、たとえばマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、磁赤鉄鉱（γＦｅ2Ｏ3）、およびグレイジャイト（Ｆｅ3Ｓ4）等の、鉄塩、あるいはクロム化合物、たとえば酸化クロム（ＣｒＯ2）等のクロム塩、またはそれらの任意の組み合せなどが挙げられる。好ましくは、該磁性材料は、生体適合性コーティングを有する磁気コアを含む、粒子、たとえばナノ粒子を含む。したがって、このような好ましい粒子は、ナノ粒子、殊にコア、および、たとえば該コアを包むシリカ殻を有する、ナノ粒子である。しかし、孔内に多数の磁心を有する多孔性粒子もまた。このような粒子の例としては、米国特許第６，５４８，２６４号（参照により本明細書に援用する）に記載のナノ粒子などが挙げられる。したがって、従来技術のナノ粒子は、１μｍ未満の平均サイズを有することが可能であり、上記各ナノ粒子は、（ａ）磁化可能粒子を含むコアおよび（ｂ）該コアを包むシリカ殻を含み、該磁化可能粒子は、前述の磁性材料である。
【００４２】
（該細胞に付着されるための）該マイクロ粒子およびナノ粒子は、一般に、実質的に球形または楕円形である。粒子サイズは、とりわけ、磁化可能材料の性質、用途、等々によって変化する可能性がある。しかし、粒子の例は、平均サイズ、たとえば、５０００ｎｍ以下、たとえば１〜５０００ｎｍ、好ましくは１〜１０００ｎｍ、より好ましくは１〜３００ｎｍ、または２〜１０ｎｍの直径を有することができる、ナノ粒子であってもよい。
【００４３】
該細胞に付着させるための粒子は、被覆されていても被覆されていなくてもよく、また単一ドメインであっても多ドメインであってもよい。適当な粒子の例としては以下のものが挙げられるが、その限りではない：
（ｉ）スフェロテック・インコーポレーテッド（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）から販売されているコーテッド磁性マイクロスフェア（ｄ＝４μｍ）。これらのマイクロスフェアは、ポリマーで被覆された、磁気によって遮断されたコアで構成される。
（ｉｉ）調節可能なサイズ（ｄ＝５０〜３００ｎｍ）を有し、サイズ分布が狭い、単一ドメイン、フェライトドープ処理シリカナノ粒子。
【００４４】
本発明の方法では、該イオンチャネルは、前述の磁化可能粒子を、細胞膜の特定領域  および／またはイオンチャネル自身の特定の「受容体」に付着させることによって活性化することができる。したがって、次に、これらの磁性粒子に作用する磁場によって、該チャネルを活性化するために必要な機械力を遠隔で加えることができる。
【００４５】
詳細には、本発明の方法は、前述の磁化可能粒子に１つ以上の特異的抗体、または細胞内の重要な細胞要素を認識するタンパク質結合モチーフを付けることにより、該粒子を修飾することを含む。これらの中には、インテグリン類、カドヘリン類、セレクチン類、および免疫グロブリン類等の膜貫通接着分子、またはＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）等の分散した膜接着タンパク質が含まれる。たとえば、Ｊ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｆａｂｒｙ，Ｅ．Ｌ．Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎ，ａｎｄ  Ｎ．Ｗａｎｇ（２００１）「インテグリン受容体をねじることが、内皮細胞におけるエンドテリン−１遺伝子発現を増加する」（Ｔｗｉｓｔｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８０：１４７５−８４；Ａ．Ｒ．Ｂａｕｓｃｈ，Ｕ．Ｈｅｌｌｅｒｅｒ，Ｍ．Ｅｓｓｌｅｒ，Ｍ．Ａｅｐｆｅｌｂａｃｈｅｒ，ａｎｄ  Ｅ．Ｓａｃｋｍａｎｎ（２００１）「トロンビンで刺激された内皮細胞におけるインテグリン受容体−アクチン連結の急速な固化」：磁性ビーズ・マイクロレオロジー研究」（Ｒａｐｉｄ  ｓｔｉｆｆｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−  ａｃｔｉｎ  ｌｉｎｋａｇｅｓ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ：  ａ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄ  ｍｉｃｒｏｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｓｔｕｄｙ）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ８０：２６４９−５７；Ｃａｒｔｍｅｌｌ，ＳＨ，Ｊ  Ｄｏｂｓｏｎ，Ｓ  Ｖｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ａ  Ｅｌ  Ｈａｊ（２００２）「間欠的機械的活性化を伴う、骨細胞の長期培養のための磁性粒子技術の開発」（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）．ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ＮａｎｏＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  １：９２−９７を参照されたい。
【００４６】
本発明の方法は、様々な疾患の治療方法を提供するため、殊に有利である。実際、本発明は、１つ以上のイオンチャネルが関与する疾患に適用できる治療方法を提供する。加えて、本発明は、疼痛緩和、たとえば麻酔の役割を含むイオンチャネル活性化の電位制御方法を提供する。
【００４７】
したがって、本発明によれば、我々は、イオンチャネルが関与する疾患に罹っている患者の治療方法であって、このような患者に前述の磁化可能なナノ粒子を投与すること、および磁場を使用してこうした粒子を操作することを含む方法を提供する。
【００４８】
前述の治療方法は、限定されると考えるべきではないが、組織および／または骨の修復に殊に有利である。本治療方法は、疼痛緩和、たとえば局所麻酔の方法を、身体の標的領域に提供することにより、さらなる治療を容易にすることができる。
【００４９】
このような細胞の性質は、当該組織の性質によって異なる可能性がある。たとえば、該細胞は、新しい靭帯を成長させるための靭帯細胞であってもよく、新しい腱を成長させるための腱細胞であってもよい。あるいは、該細胞は、軟骨細胞および／または他の間質の細胞、たとえば軟骨細胞前駆細胞であってもよい。
【００５０】
したがって、本発明の方法は、組織の再生、または人工組織、たとえば皮膚、軟骨、靭帯、腱、筋肉または骨の生成を含むことが可能である。
【００５１】
あるいは、本方法は、創傷治癒および／または組織接着を含むことが可能である。
【００５２】
好ましい実施形態では、本方法は、骨修復および／または骨成長を含むことが可能である。
【００５３】
またさらなる代替実施形態では、本発明の方法は、たとえば、歯科用途および／または獣医学用途を含むことが可能である。
【００５４】
本方法はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞（たとえば腫瘍細胞）を選択的に殺すための機構として使用することも可能である。この場合、磁化可能粒子を標的細胞膜またはイオンチャネルタンパク質に付着させ、該ｉｎ  ｖｉｖｏ標的領域に磁場を加える。細胞膜におけるイオンチャネルの、急速な、周期性の開閉（時変磁場を加えることによる）、および／または開放維持（静磁場を加えることによる）は、細胞にイオン（たとえばＣａ++）をあふれさせ、浸透圧ショック、およびその結果として、細胞死を引き起こす。
【００５５】
したがって、本発明のこの態様はまた、磁化可能粒子と細胞との結合によって細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗することを含む、細胞を破壊するかまたは細胞増殖を阻止する方法も提供する。
【００５６】
本方法は、たとえば、磁化可能粒子と細胞との結合により細胞のイオンチャネルに作動または拮抗することによって、細胞に浸透圧ショックを引き起こす方法を含んでもよい。本方法は、腫瘍細胞、たとえば癌細胞の治療または軽減に殊に有用である。
【００５７】
したがって、本方法は、標的静磁場でイオンチャネルを開いた状態にしておくことによる、細胞の死滅を含んでもよい。あるいは、本方法は、標的時変磁場でイオンチャネルを周期的に開閉することによる、細胞の死滅を含んでもよい。
【００５８】
本発明の方法では、該磁場は、とりわけ、治療すべき疾患の性質によって異なる可能性があるが、たとえば、０．１〜１０Ｈｚの周波数であってもよい。しかし、この範囲外の周波数も使用することができる。該磁場は一般的に、ほぼ１０〜１４００ｍＴ程度の（これに限定されない）磁束密度を有する。
【００５９】
本発明の方法では、ｉｎ  ｖｉｖｏ利用の場合に、該磁場を体外で発生させることが可能であり、永久磁石または電磁石により提供することが可能である。該磁場は、定磁場であっても可変磁場であってもよく、たとえば、該細胞に対して永久磁石を異動させてもよい。電磁石の場合には、場合によって、交流と組み合わせて、電磁石に適切な電流レベルを供給することにより、磁場を発生させることが可能である。
【００６０】
本発明のまたさらなる態様によれば、我々は、細胞で治療効果を生じさせる方法であって、磁化可能粒子と細胞との結合により、該細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗すること、および該磁化可能粒子を磁気で操作することを含む、方法を提供する。
【００６１】
加えて、我々は、磁化可能粒子と同時に、別々に、または逐次的に投与することができ、また、該細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗する、治療的に有効な作用物の投与を含む治療方法を提供する。
【００６２】
我々はまた、治療的に有効な作用物を細胞にターゲティングする方法であって、磁化可能粒子と該細胞との結合によって該細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗すること、該磁化可能粒子を磁気で操作すること、および治療的に有効な作用物を同時に、別々にまたは逐次的に投与することを含む方法も提供する。
【００６３】
本発明のまたさらなる態様によれば、我々はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を磁気で操作する方法における、磁化可能粒子の使用も提供する。
【００６４】
該使用は、ｉｎ  ｖｉｖｏプロセスのｅｘ  ｖｉｖｏ操作を含んでもよい。より詳細には、本発明は、細胞を磁気で操作するためのシステムであって、磁化可能粒子と細胞との結合および該細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗することを含むシステムの製造における磁化可能粒子の使用を提供する。
【００６５】
本発明のこの態様では、該磁化可能粒子を、該細胞と直接結合させてもよい。あるいは、該使用は、磁化可能粒子を、抗体、酵素、等々と結合することを含み、これを次に該細胞と結合してもよい。
【００６６】
本発明の該使用が細胞内結合を含むとき。ほんの一例として、ＴＲＥＫ−１の場合、該粒子を該イオンチャネルのＮ−末端領域と結合してもよい。あるいは、該粒子を、（ｓ）該イオンチャネルのＣＯＯＨ末端領域と結合してもよい。
【００６７】
本発明の該使用は、哺乳動物の細胞、または細菌細胞、植物細胞、等々の他の細胞型の操作を含んでもよい。該使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用であってもｉｎ  ｖｉｖｏ使用であってもよいが、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用が好ましい。
【００６８】
優先的に、本発明の該使用は、細胞および／または作動もしくは拮抗するイオンチャネルの遠隔操作、たとえば体外からの操作、すなわち遠隔機械的活性化を含む。
【００６９】
本発明の該使用は、それ自体公知の、様々な細胞に関連して使用することが可能である。しかし、優先的に、該使用は、哺乳動物の体細胞、たとえば、骨、軟骨、筋肉（骨格筋および心筋）リンパ系細胞、内分泌細胞、泌尿器系細胞、生殖器系に関連した細胞、神経細胞および腫瘍細胞との使用に適する。
【００７０】
本発明の該使用は、前述の、従来公知の細胞内イオンチャネルと一緒に使用することが可能である。該使用は、前述の、機械受容イオンチャネルでの使用に特に適する。
【００７１】
本発明のある特定の態様は、機械受容イオンチャネルを操作するためのシステムの製造における使用を提供することである。
【００７２】
本発明のさらなる態様では、該使用はまた、チャネルを細胞に移入することにより、状況によっては反応しやすいこともあり、状況によっては反応しないこともある、従来の非機械受容細胞および／またはイオンチャネルとの使用に適する可能性もある。
【００７３】
本発明の一態様では、該イオンチャネルは、電位差依存性イオンチャネルであるか、あるいは、該イオンチャネルは、リガンド依存性イオンチャネルである。
【００７４】
多種多様な粒子を、本発明の該使用で使用することが可能である。概して、任意の磁化可能材料を使用することが可能であり、その例としては、鉄元素（Ｆｅ）、または鉄化合物、たとえばマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、磁赤鉄鉱（γＦｅ2Ｏ3）、およびグレイジャイト（Ｆｅ3Ｓ4）等の鉄塩、またはクロム化合物、たとえば酸化クロム（ＣｒＯ2）等のクロム塩、またはそれらの任意の組み合せなどが挙げられる。好ましくは、該磁性材料は、生体適合性コーティングを有する磁気コアを含む粒子を含む。したがって、このような好ましい粒子は、ナノ粒子、殊にコアおよび、たとえば該コアを包むシリカ殻を有するナノ粒子である。しかし、孔内に多数の磁心を有する多孔性粒子もまた。このような粒子の一例は、米国特許第６，５４８，２６４号（参照により本明細書に援用する）に記載のナノ粒子である。
【００７５】
特に本発明の該使用は、該粒子に１つ以上の特異的抗体または細胞内の重要な細胞要素を認識するタンパク質結合モチーフを付けることにより、前述の磁化可能粒子を修飾することを含む。これらの中には、インテグリン類、カドヘリン類、セレクチン類、および免疫グロブリン類等の膜貫通接着分子、またはＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）等の分散した膜接着タンパク質などが含まれる。
【００７６】
本発明の使用は、様々な疾患の治療における使用に適するシステムを提供するため、殊に有利である。実際に、本発明は、１つ以上のイオンチャネルが関与する疾患に適用できる、治療に適する医薬の製造における使用を提供する。加えて、本発明は、疼痛緩和、たとえば麻酔の役割を含むイオンチャネル活性化の電位制御のための使用を提供する。
【００７７】
したがって、本発明によれば、我々は、イオンチャネルが関与する疾患に罹っている患者の治療であって、前述の磁化可能粒子をこのような患者に投与すること、および磁場を使用してこうした粒子を操作することを含む治療に適する医薬の製造における磁化可能粒子の使用を提供する。
【００７８】
前述の使用は、限定されると考えるべきではないが、組織修復および／または骨修復で殊に有利である。該使用は、たとえば局所麻酔の場合、身体の標的領域に疼痛緩和の方法を提供することにより、さらなる治療を容易にすることができる。
【００７９】
このような細胞の性質は、当該組織の性質によって異なる可能性がある。たとえば、該細胞は、新しい靭帯を成長させるための靭帯細胞であってもよく、新しい腱を成長させるための腱細胞であってもよい。あるいは、該細胞は、軟骨細胞および／または軟骨細胞前駆細胞等の他の間質細胞であってもよい。
【００８０】
したがって、該使用は、組織の再生または皮膚、軟骨、靭帯、腱、筋肉または骨等の人工組織の生成を含んでもよい。
【００８１】
あるいは、該使用は、創傷治癒および／または組織接着を含んでもよい。
【００８２】
好ましい実施形態では、該使用は、骨修復および／または骨成長を含んでもよい。
【００８３】
またさらなる代替実施形態では、本発明の使用は、たとえば、歯科用途および／または獣医学用途を含んでもよい。
【００８４】
該使用はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞（たとえば腫瘍細胞）を選択的に殺すための機構として使用することも可能である。
【００８５】
したがって、本発明のこの態様によれば、我々は、磁化可能粒子と細胞との結合によって細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗することを含む、細胞を破壊するかまたは細胞増殖を阻止するためのシステムの製造における磁化可能粒子の使用も提供する。該使用は、たとえば、磁化可能粒子と細胞との結合により細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗することによって、細胞に浸透圧ショックを引き起こす方法における使用を含んでもよい。本発明のこの態様における該使用は、腫瘍細胞、たとえば癌細胞の治療または軽減に殊に有用である。
【００８６】
したがって、該使用は、標的静磁場でイオンチャネルを開いた状態にしておくことによる、細胞の死滅を含んでもよい。あるいは、該使用は、標的時変磁場でイオンチャネルを周期的に開閉することによる、細胞の死滅を含んでもよい。
【００８７】
本発明のまたさらなる態様によれば、我々は、細胞で治療効果を誘導するためのシステムであって、磁化可能粒子と該細胞との結合により、該細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗すること、および該磁化可能粒子を磁気で操作することを含む、システムの製造における磁化可能粒子の使用を提供する。
【００８８】
加えて、我々は、磁化可能粒子と同時に、別々に、または逐次的に投与することができ、また、該細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗する、治療的に有効な作用物を含むシステムの製造における磁化可能粒子の使用を提供する。
【００８９】
我々はまた、磁化可能粒子と該細胞との結合によって、該細胞内でイオンチャネルに作動または拮抗すること、該磁化可能粒子を磁気で操作すること、および治療的に有効な作用物を同時に、別々にまたは逐次的に投与することを含む、治療的に有効な作用物を細胞にターゲティングするためのシステムの製造における磁化可能粒子の使用も提供する。
【００９０】
本発明のまたさらなる態様によれば、我々は、治療的に有効な作用物、および磁化可能粒子を細胞と結合するための手段を含むキットを提供する。
【００９１】
従来公知の治療的に有効な作用物または治療的に有効な作用物の組み合わせを本発明のキットに使用できることは、当業者に理解されるであろう。
【００９２】
したがって、該キットは、治療的に有効な作用物、磁化可能粒子のソース、およびその同時投与、逐次投与または別々の投与に関する説明書が入っている容器を含む。本発明のキットはまた、それ自体公知の他の作用物も含んでもよい。本発明はまた、医薬の製造に前述したキットの使用も含んでもよい。
【００９３】
次に、ほんの一例として、また添付の図面を参照しながら、本発明を説明する。
【実施例１】
【００９４】
ターゲティングモデルシステム
該モデルシステムは、寒天ゲルブロック内のチャネルにフィードするチュービングに接続された蠕動ポンプからなる。磁石は、チャネルおよび磁場との関係で、様々な位置に配置することができ、また標的部位の勾配は、ガウスメーターに連結されている軸ホールプローブを使用して測定される。希土類磁石により生じる磁場は、このプロジェクトに要求されるレッドクリフ・ダイアグノースティック・マグスキャン（Ｒｅｄｃｌｉｆｆｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＭａｇＳｃａｎ）フィールド・マッピング・システムを使用して特性決定される。各実験の実施後、ゲル・チャネルを摘出し、染色技術を使用して細胞捕捉を分析する。磁性粒子捕捉は、凍結乾燥したゲルブロック上で超伝導量子磁束計（Ｓｕｐｅｒｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄｅｖｉｃｅ；スクイッド（ＳＱＵＩＤ））磁気測定を実施することにより定量化する。モデルを使用して、磁場強度および形状、磁性粒子特性、細胞当たりの粒子数、等々の送達およびターゲティング・パラメーターを最適化することが可能である。
【実施例２】
【００９５】
磁気サイトメトリー（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を使用した非特異的膜変形
具体的には、足場は、足場サイズに応じて１０6〜１０9ＢＭＳを播種し、２４時間培養してからバイオリアクター内に設置する。次いで、構築物を、様々な磁気負荷方式、たとえば粒子当たり１〜１００ｐＮの範囲の力で、１Ｈｚの周波数で１時間に付す。これらのパラメーターは調節でき、該システムを様々な細胞型および足場材料に最適化することができる。処理後、活性化後の様々な時点で、細胞を取り出し、ＲＮＡ分析およびタンパク質分析に付すことが可能である。ウエスタンブロッティング、ＦＡＣ分析および定量的ＰＣＲ技術を使用すれば、オステオポンチン、コラーゲン・タイプ１、アルカリホスファターゼおよびオステオカルシン等のマトリックスタンパク質と同時に、ｒｕｎｘ２およびｏｓｔｅｒｉｘ等の、骨芽細胞転写因子用のアッセイを実施することができる。
【実施例３】
【００９６】
これらの磁性マイクロ粒子および磁性ナノ粒子の適用性を実証するための、動物モデルにおける新しい骨形成の証明
マウスＳＣＩＤモデルを使用して、皮下拡散チャンバ内でｉｎ  ｖｉｖｏで維持された細胞による、骨細胞分化および新しい骨形成を促進するために、遠隔で幹細胞を活性化できることが、この技術の動物治験によって裏付けられる。このようにして、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験と比較をすることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでの、特定の組織への細胞のターゲティングもまた勧められる。
【実施例４】
【００９７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成の証明
間葉幹細胞からのヒト由来骨芽前駆細胞を使用することが可能である。Ｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成は、重症易感染性免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスで皮下移植モデルを使用して、また該拡散チャンバモデルで、評価することが可能である。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで、磁性マイクロ粒子および磁性ナノ粒子のターゲティング効果を実証するための、迅速かつ確固不動のモデルであり、骨形成の明らかな証明を提供する。該拡散チャンバアッセイは、宿主細胞とは対照的に、移植細胞による骨形成の明白な証明を提供する。該皮下移植モデルは、依然として骨格組織形成の評価のための業界標準のままであり、我々の一人（ＲＯ）は、骨格組織工学の評価に関する、ＲＯ（３０／１７５９）へのプロジェクト許可を受けて、ｓｃモデルおよびＤＣモデルの使用に関して発表した22。簡単に記載すると、選択されたヒト骨前駆細胞を、ＳＣＩＤマウスの皮下に４週間移植し、一方、拡散チャンバ試験用に、細胞および磁性粒子の複合体を各拡散チャンバに入れ、該チャンバを無胸腺ヌード・マウス（ＭＦＩ−ｎｕ−ｎｕ；４〜６週齢；ハーラン・ＵＫ有限会社（Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ）の腹腔内に１０週間埋め込む。その後、拡散チャンバを取り出し、一晩固定し（９５％エタノール、４℃）、４℃のポリ（ヒドロキシメチルメタクリレート）樹脂中に、脱灰せずに包埋する。新しい骨形成は、凍結した、パラフィンおよびメチルメタクリレートプラスチック切片を含む組織学的技術により評価する。形成された軟骨および骨の評価は、トルイジン・ブルー・ギムザ染色、アルシアン・ブルー／シリウスレッド染色およびサフラニン−Ｏ染色を使用する、組織学的検査による。該モデルは、ＲＯ（３０／１７５９）へのプロジェクト許可を受けてサウサンプトン（Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ）で現在実行されている。
【実施例５】
【００９８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、特異的部位への細胞のターゲティング
この研究は、動脈内注射および静脈内注射による、磁性粒子を載荷した細胞の、特定組織部位への送達に焦点を合わせる。簡単に記載すると、選択され、増殖させた間葉幹細胞に磁性粒子を負荷し、尾静脈により、麻酔したＭＦ１ｎｕ／ｎｕマウスに注入する。体外高勾配ＮｄＦｅＢ磁石を使用して、該細胞を特定の標的部位に局在させる。コントロール・マウスにも注入するが、ターゲティングのために磁石を使用しない。ターゲティング効率は、４、７および１４日後に、ＭＲＩ（磁性ナノ粒子が、臨床ＭＲ画像におけるコントラスト強調剤として使用される）および解剖した、凍結乾燥標的組織のスクイッド（ＳＱＵＩＤ）磁気測定分析を使用して評価する。
【実施例６】
【００９９】
本明細書の技法を使用した予備実験は、ヒト骨由来の間葉幹細胞［キャンブレックス・ポイエティクス（Ｃａｍｂｒｅｘ  ｐｏｉｅｔｉｃｓ）−ｈＭＳＣ］で実施されている。１０％ＦＣＳおよび１％抗生物質、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ）およびβ−グリセロリン酸（１０ｍＭ）（サンプル群Ｅ〜Ｈ）を含むαＭＥＭで５日間培養した細胞。
【０１００】
磁性微粒子（ｄ−４μｍ）が、電位差依存性カルシウムイオンチャネルレセプター抗体のビオチニル化α／δ−１サブユニットで被覆された。４日後、カルシウムチャネルレセプターを介して、粒子を幹細胞に４０分間、付着させた。４０分後、該細胞を１Ｈｚの磁場に暴露し、これが、粒子当たりおよそ３０ピコニュートン（ｐｉｃｏＮｅｗｔｏｎ）の力を加えた（〜２粒子／細胞）。２時間４０分後、該粒子を該細胞から離し、吸引により除去した。培地をサンプルに戻し、次いでこれをさらに２４時間培養した。第５日に、コントロールおよび刺激群からのＲＮＡを採取した。各サンプルに遺伝子マイクロアレイ分析を実施した。ＨＧフォーカス（ＨＧ−Ｆｏｃｕｓ）ヒト・ゲノム・チップ（アフィメトリックスＵＫ有限会社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＵＫ  Ｌｔｄ））を使用して、磁気活性化に応答した（２倍増加／減少として考えた上方制御および下方制御）、８０００遺伝子／サンプルを分析した。
【０１０１】
これらの実験のマイクロアレイデータから、機械的刺激は、神経成長因子および線維芽細胞増殖因子等の、ある種の遺伝子の下方制御を招くことが分かった（表１）。これは、磁性粒子を使用した機械力の適用は、ニューロン経路および線維芽細胞経路から離れた幹細胞分化に導くことを示すものである。機械力適用に応答した、テトラネクチン等の遺伝子の上方制御は、造骨経路に向かう細胞の分化を示す。細胞骨格再構築および細胞接着タンパク質に関与する遺伝子の上方制御は、力適用後の予測される細胞プロセスと関連がある。
【０１０２】
【表１】
2007518710.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１ａ】機械的操作用磁性ビーズを付けるための１２×ヒスチジン挿入の３部位を示す、ＴＲＥＫ−１の構造の略図である。
【図１ｂ】ＲＧＤ被覆カルボキシル強磁性粒子（４μｍ）が膜結合した一次星状細胞を示し（倍率×１０００）を示す。
【図２】該タンパク質に存在するＨｉｓ．タグの構造および位置を示すＴＲＥＫイオンチャネルの概略図である。赤い丸は、３部位のＨｉｓタグの部位、一次ループ、ＣＯＯＨ末端、およびＮＨ末端を示す。
【図３】細胞内カルシウムの下流変化を通じてモニターされるＴｒｅｋ−１の磁気活性化を示す。
【図４】およびフラッシュペリカム（Ｆｌａｓｈｐｅｒｉｃａｍ）を共移入されたＨＥＫ２９３  Ｔ細胞で細胞内カルシウムの一時的上昇を引き起こす、ＴＲＥＫ−１の磁気活性化の表示である。
【国際調査報告】
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2007518710.tif 000007
2007518710.tif 000008
2007518710.tif 000009
2007518710.tif 000010
2007518710.tif 000011