(57)【要約】  本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用システム、或いはその使用方法に関する。本発明は、特に、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物と併用して、被験者の皮膚にマイクロチャネルを作製する装置を含むシステムであって、そのマイクロチャネルを通じてそのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが生物中に送達され得るシステムに関する。本発明のシステム及び方法は、それらのポリヌクレオチドによってコードされている目的タンパク質の発現を実現し、したがって、免疫化及び遺伝子療法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用の方法であって、
（ａ）被験者の皮膚のある領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップと、
（ｂ）有効成分として治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む薬剤組成物を、少なくとも１つのマイクロチャネルが存在する被験者の皮膚の前記領域に適用するステップとを含む方法。
【請求項２】
前記被験者の皮膚の前記領域に複数のマイクロチャネルを作製し、それによって、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその合成類似体のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ポリペプチド、類似体、断片、又はその融合タンパク質をコードする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に連結されており、それにより、被験者の細胞において発現されることができる、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが、インスリン、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、インスリン様成長因子−１、インスリン様成長因子−２、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、コロニー刺激因子、形質転換成長因子、腫瘍壊死因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、骨形成タンパク質、エリスロポエチン、造血増殖因子、黄体形成ホルモン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、凝固因子、抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、プラスミノーゲンアクチベーター、ボンベシン、トロンビン、エンケファリナーゼ、血管内皮成長因子、抗血管新生因子、インターロイキン、ウイルス抗原、非ウイルス抗原、輸送タンパク質、及び抗体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）、及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
薬剤組成物が、脂質、ポリカチオン、及びヌクレアーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
被験者の皮膚の領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップが、
（ａ）複数の電極を含む電極カートリッジ、及び
（ｂ）電極が皮膚の近傍にあるときに、２つ以上の電極の間に電気エネルギーを加えて、通常、電流又は１つ若しくは複数のスパークを生じ、前記電極の真下の領域の角質層のアブレーションを可能にし、それによって少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するように適合された制御ユニットを含む主要ユニットを含む装置によって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
電極カートリッジが、形状及び大きさが均一な複数のマイクロチャネルを作製するように適合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電極の直径が、３０〜１５０ミクロンの範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
電極の直径が、４０〜１００ミクロンの範囲である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
電極の長さが、３０〜５００ミクロンの範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
電極の長さが、５０〜１００ミクロンの範囲である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
電気エネルギーが高周波である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用の方法であって、
（ａ）有効成分として治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む薬剤組成物を、被験者の皮膚のある領域に適用するステップと、
（ｂ）被験者の皮膚の前記領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製し、それによってオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するステップとを含む方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその合成類似体のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、ポリペプチド、類似体、断片、又はその融合タンパク質をコードする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に連結されており、それにより、被験者の細胞において発現されることができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、インスリン、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、インスリン様成長因子−１、インスリン様成長因子−２、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、コロニー刺激因子、形質転換成長因子、腫瘍壊死因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、骨形成タンパク質、エリスロポエチン、造血増殖因子、黄体形成ホルモン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、凝固因子、抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、プラスミノーゲンアクチベーター、ボンベシン、トロンビン、エンケファリナーゼ、血管内皮成長因子、抗血管新生因子、インターロイキン、ウイルス抗原、非ウイルス抗原、輸送タンパク質、及び抗体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）、及びｍｉＲＮＡからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
薬剤組成物が、脂質、ポリカチオン、及びヌクレアーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加物をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
被験者の皮膚の領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップが、
（ａ）複数の電極を含む電極カートリッジ、及び
（ｂ）電極が皮膚の近傍にあるときに、２つ以上の電極の間に電気エネルギーを加えて、通常、電流又は１つ若しくは複数のスパークを生じ、前記電極の真下の領域の角質層のアブレーションを可能にし、それによって少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するように適合された制御ユニットを含む主要ユニットを含む装置によって実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
電極カートリッジが、形状及び大きさが均一な複数のマイクロチャネルを作製するように適合される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
電極の直径が、３０〜１５０ミクロンの範囲である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
電極の直径が、４０〜１００ミクロンの範囲である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
電極の長さが、３０〜５００ミクロンの範囲である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
電極の長さが、５０〜１００ミクロンの範囲である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
電気エネルギーが高周波である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
被験者の皮膚を通してのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するための装置、及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物を含む、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用システムであって、前記装置が、
（ａ）複数の電極を含む電極カートリッジ、及び
（ｂ）電極が皮膚の近傍にあるときに、２つ以上の電極の間に電気エネルギーを加えて、通常、電流又は１つ若しくは複数のスパークを生じ、前記電極の真下の領域の角質層のアブレーションを可能にし、それによって少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するように適合された制御ユニットを含む主要ユニットを含む、システム。
【請求項３１】
電極カートリッジが、形状及び大きさが均一な複数のマイクロチャネルを作製するように適合される、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
電極の直径が、３０〜１５０ミクロンの範囲である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
電極の直径が、４０〜１００ミクロンの範囲である、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
電極の長さが、３０〜５００ミクロンの範囲である、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３５】
電極の長さが、５０〜１００ミクロンの範囲である、請求項３４に記載のシステム。
【請求項３６】
電気エネルギーが高周波である、請求項３０に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物と併用して、被験者の皮膚にマイクロチャネルを作製する装置を含むシステムであって、作製されたマイクロチャネルを通じてそのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが皮膚中に送達されるシステムに関する。本発明のシステム及び方法は、被験者の皮膚における目的タンパク質の発現を実現し、免疫化及び遺伝子療法において有用である。
【背景技術】
【０００２】
患者の細胞中への生物活性のあるポリペプチドの直接導入は、有意な治療効果を有し得る。しかし、この手法にはいくつかの欠点もある。特に、ポリペプチドに対する生物学的応答を起こすのに十分な投与量での、潜在的な毒性のリスクが、主要な問題である。ポリペプチドの臨床的効果は、標的組織中に存在するプロテアーゼによる分解に通常起因する、比較的短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期によっても制限されている。さらに、ある組織中に注入されたポリペプチドは、通常、注入先の組織に対して有意な治療効果をもたらす前に血液循環に入る。
【０００３】
これらの理由から、遺伝子療法は、癌、遺伝病、免疫疾患、心血管疾患、ウイルス感染を含めて様々な疾患又は臨床状態のための、また、臨床移植における、潜在的に最終的な治療として構想されている。
【０００４】
欠陥遺伝子の修復を狙いとする臨床試験が、癌を治療するために現在提案されている。すなわち、肺癌並びに頭部及び頸部の癌において、例えば、ｐ５３の欠陥を修復するための臨床試験は、ｐ５３遺伝子のトランスダクション及び発現並びにアポトーシスの証拠を矛盾なく示した（Ｍｏｏｎ他、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９：５０５５〜５０６７頁）。同様に、アデノシンデアミナーゼ遺伝子で処置した重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）患者は、防御免疫をもたらす有意な免疫再構築を示した（Ｅｎｇｅｌ他、（２００３年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：５０３〜５０７頁）。
【０００５】
さらに、望ましくない遺伝子に対して標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチド又は阻害ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ）を用いてそれらの遺伝子をサイレンシングすることも、様々な疾患の治療に対して多くの希望を与える。例えば、多数の増殖因子の過剰発現は癌の発達と相関関係があることが発見された。このような増殖因子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、癌の増殖を改善するのに有用であることが示されている（Ｈｉｒａｉ他、（２００３年）Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．５：９５１〜９５７頁）。
【０００６】
しかし、遺伝子療法をさらに改善できることは明らかである。有望な手段としては、改良した遺伝子送達システム、免疫原の設計及び抗血管新生遺伝子療法、干渉ＲＮＡの設計、並びに遺伝子療法の補助使用が挙げられる。
【０００７】
Ｚｅｗｅｒｔ他の米国特許第５，７４９，８４７号は、生物中にヌクレオチドを送達するための方法を開示する。この方法は、ヌクレオチドを含有する組成物を生物の表皮に適用するステップと、次いで組成物の少なくとも一部が表皮を通過するように表皮をエレクトロポレーションし、その結果、生物にヌクレオチドを送達するステップとを含む。
【０００８】
Ｈｏｆｍａｎｎの米国特許第６，００９，３４５号は、エレクトロポレーション及びイオン浸透法を組み合わせた、薬物又は遺伝子を経皮送達するための装置及び方法を提供する。エレクトロポレーションが角質層を通過する新しい経路を形成するのに対し、イオン浸透法は、これらの経路を通ってその下に存在する組織中へと薬物又は遺伝子を輸送するのに必要な推進力を与える。
【０００９】
Ｅｐｐｓｔｅｉｎの米国特許第６，５２７，７１６号は、生物中に核酸を送達する方法であって、熱伝導成分の使用によって生体膜をアブレーションし、それによって膜の選択した領域に孔をあけるステップと、その選択された領域に電磁場を適用するステップと、次いで、電磁場が生物中への核酸の流入を活発に誘導する条件下で、その選択した領域を核酸と接触させるステップとを含む方法を開示する。すなわち、米国特許第６，５２７，７１６号による、生体膜のアブレーション及び微小孔の形成は、生体膜と接触して保持される熱成分を使用し、この熱成分は、エネルギーを吸収するとき、生体膜の熱アブレーションを引き起こし、核酸は電磁場により追いやられて生物中へ送達される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ポリヌクレオチドを送達するための推進力の供給を必要としない、ポリヌクレオチドを皮内又は経皮送達するための効率的な装置及び方法の必要性が未達成のまま残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用の有効なシステムに関する。本発明はさらに、皮膚の角質層をアブレーションし、前処理されたその皮膚にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを皮内又は経皮送達するためのシステム及び方法にも関する。これらのシステム及び方法は、それらのポリヌクレオチドによってコードされている目的タンパク質の発現を実現し、したがって、免疫化及び遺伝子療法において有用である。このシステム及び方法は、それらのポリヌクレオチドによってコードされている目的タンパク質の発現を実現し、したがって、免疫化及び遺伝子療法において非常に有用である。
【００１２】
本発明の装置による被験者の皮膚のある領域におけるマイクロチャネルの作製、及びそれに続く、ポリヌクレオチドを含む組成物の処理された皮膚への適用が、そのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの発現を実現することを以下に開示する。ポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達、及びそのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの発現は、ポリヌクレオチドを適用する前だけでなく後にマイクロチャネルが作製される場合にも増強される。或いは、ポリヌクレオチドを含む組成物を被験者の皮膚のある領域に適用し、続いて被験者の皮膚の前記領域にマイクロチャネルを作製することによっても、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの発現は実現される。
【００１３】
さらに、本発明の装置によって作製されるマイクロチャネルの直径が数ミクロン〜数十ミクロンの範囲であることも開示される。この範囲の大きさにより、大型のポリヌクレオチドがマイクロチャネルを通して輸送され、生物中に送達されることが可能となる。被験者の皮膚に作製されるマイクロチャネルの深さは、特に、装置の電極の長さに応じて変わる。すなわち、長さ１００ミクロンの電極によって作製されたマイクロチャネルは角質層を越えてその下にある真皮まで貫通するのに対し、長さ５０ミクロンの電極によって作製されたマイクロチャネルは、もっぱら表皮中に存在する。本発明の装置を用いて皮膚中に作製したマイクロチャネルは、電磁場が全くない状況でポリヌクレオチドの促進された流入を実現するのに十分な大きさである。
【００１４】
角質層中に作製されたマイクロチャネルを通して、ポリヌクレオチドをその下の組織中へ輸送すると、そのポリヌクレオチドにコードされている目的タンパク質が発現されることを以下に開示する。本発明の装置の利点は、親水性マイクロチャネルの形成にあり、この親水性マイクロチャネルが親水性ポリヌクレオチドの輸送を可能にすることが理解されるべきである。したがって、本発明は、ポリヌクレオチドの送達及び発現を促進するためにリポソームの使用を必要としない。本発明によれば、目的タンパク質の発現は、「裸の」ポリヌクレオチド（脂質と複合されていない、又はリポソームに入れて提供されない）を用いて成功裡に実現される。さらに、本発明は、脂質と複合されたポリヌクレオチドを用いても有用である。
【００１５】
一態様によれば、本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用の方法であって、（ａ）被験者の皮膚のある領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップと、（ｂ）有効成分として治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む薬剤組成物を、少なくとも１つのマイクロチャネルが存在するその領域に適用するステップとを含む方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用の方法は、（ａ）被験者の皮膚のある領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップと、（ｂ）有効成分として治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び製薬上許容される担体を含む薬剤組成物を、少なくとも１つのマイクロチャネルが存在するその領域に適用するステップと、（ｃ）被験者の皮膚の前記領域に複数のマイクロチャネルを作製し、それによってオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するステップとを含む。
【００１７】
本発明の原理によれば、被験者に投与されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ＤＮＡのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、及びＲＮＡのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドからなる群から選択される。追加の実施形態によれば、ＤＮＡはゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、及び合成ＤＮＡから選択され、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ及び合成ＲＮＡから選択され、１本鎖又は２本鎖型である。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ポリペプチド、タンパク質、断片、類似体、又はその融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、インスリン、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、インスリン様成長因子−１、インスリン様成長因子−２、血小板由来増殖因子、上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、コロニー刺激因子、形質転換成長因子、腫瘍壊死因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、成長ホルモン、骨形成タンパク質、エリスロポエチン、造血増殖因子、黄体形成ホルモン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド−１、抗血管新生タンパク質、凝固因子、抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、プラスミノーゲンアクチベーター、ボンベシン、トロンビン、エンケファリナーゼ、血管内皮成長因子、インターロイキン、ウイルス抗原、非ウイルス抗原、輸送タンパク質、及び抗体からなる群から選択される、治療用ポリペプチド又は免疫原性ポリペプチドをコードする。
【００１９】
追加の実施形態によれば、被験者に投与されるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは調節配列に作動可能に連結されており、その結果、前記ポリヌクレオチドは、前記被験者の細胞において発現されることができる。
【００２０】
したがって、本発明の方法は、治療用タンパク質の発現が必要とされる補充療法において有利である。本発明の方法は、変異タンパク質又は他の有害なタンパク質の転写及び／又は翻訳が阻止されるアンチセンス療法などのＲＮＡサイレンシングにおいても有利である。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、変異タンパク質又は他の有害なタンパク質の転写及び／又は翻訳を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子干渉オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リピート配列に関連した（ｒｅｐｅａｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、及び当技術分野で公知の他の任意のオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。このアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでよい。或いは、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも２１個のヌクレオチドを含んでもよい。追加の実施形態によれば、このオリゴヌクレオチドは２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態によれば、このｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチドである。このｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも１５個のヌクレオチドを含んでよい。或いは、このｓｉＲＮＡ配列の長さは、少なくとも２１個のヌクレオチドを含んでもよい。ｍｉＲＭＡは１本鎖ＲＮＡであり、ヘアピンループを形成する。他の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、タンパク質の免疫原性を増大又は顕在化させることができる。
【００２２】
追加の実施形態によれば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物は、脂質、ポリカチオン、及びヌクレアーゼ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加物をさらに含む。本発明の原理に従う薬剤組成物は、２種以上のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はその組合せを含んでよい。
【００２３】
本発明の方法はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内及び経皮送達を包含することが理解されるべきである。すなわち、本発明の原理に従って作製したマイクロチャネルに隣接した細胞に局所的にオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを送達することができ、且つ／或いは血液循環にそれらを経皮的に送達することができる。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、被験者の皮膚の領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製することは、以下の特許、すなわち、参照によりその内容の全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４８，２３２号、同第６，５９７，９４６号、同第６，６１１，７０６号、同第６，７１１，４３５号、同第６，７０８，０６０号、及び同第６，６１５，０７９号で開示される装置を用いて角質層のアブレーションを誘導することによって実施される。しかし、本発明のいくつかの好ましい実施形態は、本明細書において上記に言及した装置による皮膚のアブレーションによって実現される皮内又は経皮送達に関するが、被験者の皮膚にマイクロチャネルを作製するために、当技術分野で公知の実質的に任意の方法を使用してよいことが強調される。
【００２５】
追加の実施形態によれば、被験者の皮膚の領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップは、
（ａ）複数の電極を含む電極カートリッジ、及び
（ｂ）電極が皮膚の近傍にあるときに、２つ以上の電極の間に電気エネルギーを加え、前記電極の真下の領域の角質層のアブレーションを可能にし、それによって少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するように適合された制御ユニットを含む主要ユニットを含む、装置によって実施される。
【００２６】
他の実施形態によれば、この装置の制御ユニットは、電流の流れ又はスパーク発生を制御し、それにより、１つ又は複数の形成されたマイクロチャネルの幅、深さ、及び形状を調節できるように、電極に送達される電気エネルギーの大きさ、頻度、及び／又は持続期間を制御するための回路を含む。好ましくは、電気エネルギーは、高周波である。
【００２７】
追加の実施形態によれば、電極アレイを形成する、複数の電極を含む電極カートリッジは、形状及び大きさが均一な複数のマイクロチャネルを作製するように適合される。好ましくは、電極カートリッジは着脱可能である。
【００２８】
いくつかの実施形態によれば、電極の直径は、３０〜１５０ミクロンの範囲である。いくつかの例示的な実施形態によれば、電極アレイ内の電極の直径は、４０〜１００ミクロンの範囲である。他の実施形態によれば、電極の長さは、３０〜５００ミクロンの範囲である。いくつかの実施形態によれば、電極の長さは、４０〜１５０ミクロンの範囲である。ある例示的な実施形態によれば、電極アレイ内の電極の長さは、５０ミクロンである。
【００２９】
別の態様によれば、本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの経皮送達用の方法であって、（ａ）本発明の原理に従って、有効成分として治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物を、被験者の皮膚のある領域に適用するステップと、（ｂ）本発明の原理に従って、被験者の皮膚のその領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製し、それによってオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するステップとを含む方法を提供する。
【００３０】
さらなる態様によれば、本発明は、被験者の皮膚を通してのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するための装置、及びオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物を含む、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達用システムであって、その装置が、
（ａ）複数の電極を含む電極カートリッジ、及び
（ｂ）電極が皮膚の近傍にあるときに、２つ以上の電極の間に電気エネルギーを加え、前記電極の真下の領域の角質層のアブレーションを可能にし、それによって少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するように適合された制御ユニットを含む主要ユニットを含む、システムを提供する。
【００３１】
他の実施形態によれば、この装置の制御ユニットは、電流の流れ又はスパーク発生を制御し、それにより、１つ又は複数の形成されたマイクロチャネルの幅、深さ、及び形状を調節できるように、電極に送達される電気エネルギーの大きさ、頻度、及び／又は持続期間を制御するための回路を含む。好ましくは、電気エネルギーは、高周波である。
【００３２】
追加の実施形態によれば、電極アレイを形成する、複数の電極を含む電極カートリッジは、形状及び大きさが均一な複数のマイクロチャネルを作製するように適合される。好ましくは、電極カートリッジは着脱可能である。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、電極の直径は、３０〜１５０ミクロンの範囲である。いくつかの例示的な実施形態によれば、電極アレイ内の電極の直径は、４０〜１００ミクロンの範囲である。他の実施形態によれば、電極の長さは、３０〜５００ミクロンの範囲である。いくつかの実施形態によれば、電極の長さは、４０〜１５０ミクロンの範囲である。ある例示的な実施形態によれば、電極アレイ内の電極の長さは、５０ミクロンである。
【００３４】
本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の図面、説明、実施例、及び特許請求の範囲との関連においてより良く理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、被験者の皮膚のある領域の角質層内に親水性経路を作製する装置、及び少なくとも１種のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物を含む、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド用の経皮送達システムを提供する。オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは親水性分子であるため、本発明のシステムは、経皮的な遺伝子療法において特に有用である。
【００３６】
ポリヌクレオチドの調製
本明細書では、「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」とは、１本鎖又は２本鎖型の、切り離された断片の形態又はより大きな構築物の構成要素としての、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及びその改変型のポリマーを意味する。本発明で使用するポリヌクレオチドには、本発明に従って実施する療法の目的に対する必要に応じて、ＤＮＡ又はＲＮＡのセンス及びアンチセンスのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドが含まれる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、若しくはそのハイブリッド、又はｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子でよい。したがって、本明細書では、「構築物」、「遺伝子構築物」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子の双方を意味することが意図されている。「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが５０ヌクレオチド以下のポリマーを意味し、「ポリヌクレオチド」という用語は、５０ヌクレオチドより長いポリマーを意味する。簡潔のために、ポリヌクレオチドという用語が本明細書を通じて使用され、オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドの双方を含む。
【００３７】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、天然の状態においてその横に並んでいる配列から切り離されたポリヌクレオチド部分又は断片、例えば、通常はその断片に隣接している配列、例えば、その断片が天然に存在する場であるゲノムにおいてその断片に隣接した配列から切り離されたＤＮＡ断片を意味する。この用語は、通常は核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡに付随する他の成分、又は、通常は細胞中でそれに付随するタンパク質からほぼ精製されたポリヌクレオチドにも適用される。したがって、この用語は、例えば、ベクター、自律複製型のプラスミド若しくはウイルス、又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる組換型ＤＮＡ、或いは、他の配列から独立した別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、又はＰＣＲ若しくは制限酵素消化によって作製されたゲノム若しくはｃＤＮＡ断片として）として存在する組換型ＤＮＡを含む。この用語は、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部分である組換型ＤＮＡも含む。
【００３８】
「コードする」という用語は、定義済みのヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又は定義済みのアミノ酸配列を有する生物学的プロセス中の他のポリマー及び高分子を合成するための鋳型としての機能を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなど、単離されたポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列に固有の特性、並びに、それらに起因する生物学的諸特性を意味する。すなわち、あるポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳によって、細胞中であるタンパク質が産生される場合、そのポリヌクレオチドはそのタンパク質をコードしている。
【００３９】
本発明で使用するためのオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、当技術分野で周知のハイブリダイゼーション法を用いて得ることができる。ＤＮＡ及びＲＮＡ配列は、当技術分野で周知の自動核酸合成装置を用いて合成してもよい。周知のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）の使用が、ポリヌクレオチド混合物を作製するのに特に好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２章及び４章（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年）で記載されているプロトコールなど当技術分野で周知の手段によってゲノム核酸を作製してもよい。当技術分野で周知の手段によって、ｃＤＮＡを合成することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８２年を参照されたい）。
【００４０】
遺伝コードの縮重、及びいわゆる「ゆらぎの法則」によって与えられる、コドンの第３位における従来の塩基対に対する例外の許容を考慮すると、複数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードし得ることが、当業者には理解されよう。さらに、より多くの核酸又はより少ない核酸を含むポリヌクレオチドは、同一又は等価なタンパク質を生じることができる。したがって、本発明は、あるポリペプチド又はタンパク質をコードするすべてのポリヌクレオチドを包含するものとする。
【００４１】
本発明で使用するための好ましいポリヌクレオチドは、治療用又は免疫原性のペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はその断片、類似体、及び融合タンパク質をコードし得る。本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を含む。免疫原性のポリペプチドは、体液性応答及び／又は細胞性応答を引き起こすための抗原の役割を果たすことができる。これらのポリヌクレオチドは、抗体をコードすることもできる。なお、「抗体」という用語は、任意のクラスの完全な免疫グロブリン、キメラ抗体、２つ又は複数の抗原特異性を有するハイブリッド抗体、及びハイブリッド断片を含む断片を包含する。このような断片の複合体及びいわゆる抗原結合タンパク質（単鎖抗体）も、「抗体」の意味の範囲に含まれる。これらのコードされた抗体は、例えば、米国特許第４，６９９，８８０号に記載されているような抗イディオタイプ抗体（他の抗体に結合する抗体）でもよい。
【００４２】
本発明による治療用ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質としては、それだけには限らないが、インスリン；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；インスリン様成長因子−１及びインスリン様成長因子−２；血小板由来増殖因子；上皮成長因子；線維芽細胞増殖因子；神経成長因子；形質転換成長因子；腫瘍壊死因子；カルシトニン；副甲状腺ホルモン；成長ホルモン；骨形成タンパク質；エリスロポエチン；造血増殖因子；黄体形成ホルモン；グルカゴン；グルカゴン様ペプチド−１；ＶＩＩＩＣ因子、ＩＸ因子、組織因子、フォンウィルブランド因子などの凝固因子；タンパク質Ｃなどの抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；ウロキナーゼやヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）を含む組織プラスミノーゲンアクチベーターなどのプラスミノーゲンアクチベーター；ボンベシン；トロンビン；エンケファリナーゼ；コラーゲン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；抗血管新生タンパク質（血小板因子４、ＩＰ−１０など）；ホルモン又は増殖因子の受容体；インテグリン；タンパク質Ａ又はＤ；リウマチ因子；骨（ｂｏｎｅ）由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、又は６（ＮＴ３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）などの神経栄養因子；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、ＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；骨誘導因子；免疫毒素；インターフェロン−α、−β、−γなどのインターフェロン；Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１〜ＩＬ−１０などのインターロイキン（ＩＬ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部分などのウイルス抗原；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；抗体；並びに、その類似体及び断片が天然のポリペプチドの治療活性又は免疫原活性を保持する限りにおいて、その類似体又は断片が挙げられる。
【００４３】
本明細書では、「類似体」という用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が別のアミノ酸によって置換されているペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質を意味する。本明細書において先に挙げた天然のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチドに変異を含むように合成によって作製できることを理解されたい。このようなポリヌクレオチドは、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の類似体を生じ、それらペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質類似体が天然のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の治療活性又は免疫原活性を保持する限りにおいて、これらは本発明に包含される。
【００４４】
本明細書では、「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２種の共有結合したペプチド、ポリペプチド、タンパク質、又はその組合せを含むタンパク質を意味する。融合タンパク質は、例えば、免疫応答を引き出すことができるＧＭ−ＣＳＦなど別のポリペプチドの免疫原性を高めることができるポリペプチドを含んでよい。或いは、又はさらに、融合タンパク質は、受容体に対するリガンド結合の特異性を高めるために、その受容体に特異的な抗体を含んでもよい。或いは、又はさらに、融合タンパク質は、その融合タンパク質の検出を改善し、又は発現を高めるために、タグを含んでもよい。
【００４５】
本発明は、タンパク質の免疫原性を高めることができるＣｐＧヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを包含する。
【００４６】
しかし、目的の治療用及び／又は免疫原性ペプチドをコードする、任意のオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又はその混合物を投与する際に使用するために、本発明の方法を適合し得ることが、当業者には理解されよう。したがって、本発明は、いずれかの特定のポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを用いた用途に限定されない。
【００４７】
本発明のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの生物学的利用能及びハイブリダイゼーションの特性を改善するために、修飾されたヌクレオシド間リン酸骨格を含んでよい。結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、メチルホスホナート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｎｉｌｏｔｈｉｏａｔｅ）、ホスホロアニリダート、ホスホルアミダート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、又はその組合せからなる群から選択される。
【００４８】
追加のヌクレアーゼ結合としては、メチルホスホトリエステルやエチルホスホトリエステルなどのアルキルホスホトリエステル、カルボキシメチルエステルなどのカルボナート、カルバマート、モルホリノカルバマート、３’−チオホルムアセタール、ジアルキル（Ｃ１〜Ｃ６）シリルやジフェニルシリルジフェニルシリルなどのシリル、スルファミン酸エステルなどが挙げられる。これらの結合及びそれらをオリゴヌクレオチド中に導入するための方法は、多くの参考文献で説明されており、例えば、一般に、Ｐｅｙｍａｎ及びＵｌｍａｎｎ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：１５４３〜５８４頁（１９９０年）に総説がある。
【００４９】
オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、遺伝子構築物又は発現ベクターの一部分でもよい。「遺伝子構築物」又は「発現ベクター」という用語は、目的タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含み、被験者の細胞中で発現を指示することができるプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結した開始及び終結シグナルを含む、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を意味する。すなわち、遺伝子構築物又は発現ベクターは、個体の細胞中に存在する場合にそのポリヌクレオチドが発現されるように、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結した必要な調節エレメントを有する。
【００５０】
ＤＮＡ分子の遺伝子発現に必要な調節エレメントには、プロモーター、開始コドン、停止コドン、及びポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、エンハンサーも、しばしば遺伝子発現に必要とされる。ポリヌクレオチドが被験者の細胞中で発現され、それにより、目的タンパク質が作製され得るように、これらのエレメントが、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結していることが必要である。
【００５１】
開始コドン及び停止コドンは、一般に、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物の一部分であるとみなされている。しかし、これらのエレメントが、そのポリヌクレオチドを投与される被験者において機能を果たすことが必要である。
【００５２】
本発明を実施するのに有用なプロモーターの例としては、それだけには限らないが、シミアンウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ）４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（Ｍｏｕｓｅ  Ｍａｍｍａｒｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）、モロニーウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、ＡＬＶ、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）、エプスタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子に由来するプロモーター、及びインボルクリン、ケラチン５、及びケラチン１４などの組織特異的プロモーターが挙げられる。遺伝子構築物を構築する際にプロモーターを使用するための適切なプロトコールは、当技術分野で周知であり（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１章、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年を参照されたい）、本明細書において以下に例示する。
【００５３】
本発明を実施するのに有用なポリアデニル化シグナルの例としては、それだけには限らないが、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【００５４】
ＤＮＡ発現に必要とされる調節エレメントの他に、他のエレメントを遺伝子構築物中に含めてもよい。このような追加エレメントにはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、それだけには限らないが、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、並びにＣＭＶ、ＲＳＶ、及びＥＢＶに由来するものなどのウイルスエンハンサーを含む群から選択してよい。
【００５５】
遺伝子構築物は、染色体外でその構築物を維持し、細胞中でその構築物の多数のコピーを作製するために、哺乳動物の複製起点とともに提供することができる。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）社製のプラスミドｐＣＥＰ４及びｐＲＥＰ４は、組み込まれずに高コピー数のエピソーム複製をもたらす、エプスタインバーウイルスの複製起点及び核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を有する。他のプラスミドも、遺伝子構築物がポリヌクレオチドにコードされる目的タンパク質を発現する限りにおいて、使用してもよい。或いは、当業者に公知の発現ベクターを、本発明を実施するのに使用してもよい。発現ベクターの例としては、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクター（Ｂｅｒｎｓ他、１９９５年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：９５〜１０４頁）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（Ｆｉｎｋ他、１９９６年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２６５〜２８７頁）、パッケージングされたアンプリコン（Ｆｅｄｅｒｏｆｆ他、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１６３６〜１６４０頁）、パピローマウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる。
【００５６】
機能的な遺伝子構築物となるためには、これらの調節エレメントは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結していなければならない。したがって、開始コドン及び終止コドンが、目的タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドとインフレームであることが必要である。
【００５７】
１つ又は複数の目的のポリヌクレオチド配列を、例えば、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子とともに遺伝子構築物中に挿入することにより、その遺伝子構築物はこの時点で標的特異性となる。好ましい標的化は、その遺伝子構築物を標的とする抗体を用いることによって達成される。当業者なら、過度に実験をすることなく、遺伝子構築物中に挿入されて目的のポリヌクレオチドを含むその遺伝子構築物の標的特異的送達を可能にする特定のポリヌクレオチドについて知っており、又は容易に確認できるであろう。
【００５８】
初期の研究は、ポリリジンやＤＥＡＦ−デキストランなどのポリカチオンが、タンパク質並びに１本鎖及び２本鎖ポリヌクレオチドの動物細胞中への取り込みを促進することを示した。例えば、ポリリジンベースのベクターが、遺伝子導入のために大規模に検査された。したがって、本発明は、合成的なＤＮＡ送達システムも包含する。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、被験者の皮膚へのポリヌクレオチドの導入は、「裸の」ポリヌクレオチド配列によってではなく、脂質複合によって達成される。ＤＮＡ送達を促進するのに使用される脂質は当技術分野で周知であり、例えば、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンなどのホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジルコリンから選択される。例示的な実施形態では、この脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパンである。したがって、本発明は、１種又は複数の脂質を含むポリヌクレオチド組成物を包含する。本発明によれば、これらの脂質は、非共有結合的に結合された巨視的構造を有する様々な組成物、例えば、リポソーム、多重層の小胞、単層の小胞、ミセル、及び単一の薄膜を作製するために、いくつかの方法でポリヌクレオチドと混合又は組み合わせてよい。ポリヌクレオチド及び脂質は、様々なモル比で混合することができる。ポリヌクレオチド、脂質、及びポリカチオンの複合体形成のためのプロトコールを本明細書において以下に例示する（実施例７を参照されたい）。しかし、処理された被験者の細胞内でポリヌクレオチドが発現されることができる限りにおいて、当技術分野で公知の他の添加物を本発明の薬剤組成物に加えてもよい。
【００６０】
調節配列に作動可能に連結した目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物の導入は、処理された被験者の細胞内での目的タンパク質の発現を引き起こすことを理解されたい。これは、目的タンパク質をコードする遺伝子を被験者の標的細胞中に導入し、それによって、このタンパク質の欠損に関連する疾患の発達を未然に防ぐのに必要なタンパク質の産生をもたらす補充療法で使用することができる。これは、被験者の標的細胞内で変異遺伝子を発現させ、野生型遺伝子をその標的細胞中に導入し、それによって、その変異タンパク質に関連する疾患の発達を未然に防ぐのに必要な野生型タンパク質の産生をもたらす補充療法でも使用することができる。
【００６１】
本発明の別の具体的な利点は、アンチセンス療法での使用と考えられる。すなわち、ある特定の疾患が特定の変異したＤＮＡ配列の発現に関連している場合、転写又は翻訳レベルでその変異遺伝子の特異的発現を阻害するポリヌクレオチドを使用することができる。この手法は、例えば、アンチセンス核酸でｍＲＮＡをマスキングすることによって又はリボザイムでｍＲＮＡを切断することによって、特定の変異ｍＲＮＡの転写又は翻訳を阻止するために、アンチセンス核酸及び／又はリボザイムを利用する。
【００６２】
したがって、アンチセンス核酸とは、ある特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ，２６２：４０頁、１９９０年）。したがって、細胞中で、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、それにより２本鎖分子を形成する。細胞は２本鎖のｍＲＮＡを翻訳しないと考えられるため、これらのアンチセンス核酸は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。これまで、それだけには限らないが、ｐ５３、ｒａｓ、ｆｏｓ、及びｍｙｃを含めて、いくつかの遺伝子及び癌遺伝子が、アンチセンス核酸による抑制又は下向き調節のために標的とされてきた。
【００６３】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似した方式で他の１本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの改変により、ＲＮＡ分子における変異した癌原遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子の形成に関連する特定のポリヌクレオチドを認識し、それを切断する分子を設計することが可能である。この手法の主要な利点は、リボザイムが配列特異的であるため、特定の変異配列を有する標的ｍＲＮＡのみが不活性化されることである。
【００６４】
ＲＮＡサイレンシングは広く研究されている。２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、より具体的には低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が、内在性遺伝子の高度に選択的で配列特異的な阻害物質であることが判明した。したがって、本発明は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、より具体的には低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を包含する。いくつかの実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ配列は、少なくとも１５個のヌクレオチドを含む。他の実施形態によれば、ｓｉＲＮＡ配列は、少なくとも２１個のヌクレオチドを含む。本発明はさらに、変異タンパク質の転写及び／又は翻訳を阻害する、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リピート配列に関連したＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、及び他の任意の公知のオリゴヌクレオチドも包含する。
【００６５】
薬剤組成物
本発明の薬剤組成物は、治療有効量の少なくとも１種の本発明のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む。
【００６６】
薬剤組成物は、製薬上許容される担体又は希釈剤もさらに含む。「製薬上許容される」という用語は、連邦又は州政府の規制機関によって承認されていること、或いは、動物、特にヒトで使用するために米国薬局方又は他の一般的に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療物質がいっしょに投与される希釈剤、補助剤、又はビヒクルを意味する。担体とは、薬剤組成物に添加された場合に組成物に適度な硬度又は形を与える、ほぼ不活性な物質である。
【００６７】
本明細書では、「製薬上許容される担体」は、水系若しくは非水系の溶液、懸濁液、又は乳濁液でよい。水性担体の例としては、水、生理食塩水及び緩衝媒体、アルコール溶液／水溶液、乳濁液、又は懸濁液が挙げられる。薬剤組成物は、表面への吸着を防止するためのアルブミンなどの添加物、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、安定化剤（例えば、グルコース、ガラクトース、及びスクロースなどの単糖類及び二糖類）、並びに保存剤（例えば、チメロサール、ベンジンアルコール、パラベン、ｍ−クレゾール）を含んでもよい。ポリヌクレオチドの薬剤として許容される塩も、本発明に含まれる。無機塩基から誘導される塩には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛などが含まれる。製薬上許容される非毒性有機塩基から誘導される塩には、第１級アミン、第２級アミン、第３級アミン、塩基性アミノ酸などが含まれる。
【００６８】
薬剤組成物は、親水性ポリマーも含んでよい。親水性ポリマーは、本発明のポリヌクレオチドの半減期を延長し、その結果、それらの生物学的利用能を高めることができる。親水性ポリマーの例としては、それだけには限らないが、セルロース、ヒドロキシセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、多糖類、キチン、キトサン、ジアシル化キチン、アカシアガム、アガロース、カラゲナン、ゼラチン、トラガカントゴム、アルギナート、カラヤガム、ビーガム、ペクチン、ヒアルロン酸、マルトデキストリン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコール酸、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、ポリアクリラート、及びメタクリル酸ポリマーが挙げられる。
【００６９】
薬剤組成物は、本発明のポリヌクレオチドがヌクレアーゼによって分解されるのを防止するために、少なくとも１種のヌクレアーゼ阻害剤、例えばアウリントリカルボン酸（ＡＴＡ）をさらに含んでもよい。
【００７０】
薬剤組成物は、少なくとも１種のタンパク質又はポリペプチドも含んでよい。例えば、大型Ｔ抗原核移行シグナルは、ＤＮＡに結合し、細胞の核中へのその輸送を促進するタンパク質である。したがって、本発明によるポリヌクレオチドとＤＮＡ輸送を促進することが知られているタンパク質との組合せは本発明に包含される。
【００７１】
薬剤組成物は、それだけには限らないが、ポリカチオン及び脂質を含めて、他の成分をさらに含んでもよい。ポリカチオンの例としては、ポリリジン、ＤＥＡＥ−デキストラン、硫酸プロタミンが挙げられる。脂質の例としては、ホスファチジルエタノールアミンやホスファチジルコリンなどのリン脂質が挙げられる。
【００７２】
治療有効量の本発明によるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物の製剤形態は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの安定性の改善を提供すると同時にその生物学的利用能を保持又は改善するように決定される。
【００７３】
薬剤組成物は、水性液剤として調製してもよい。或いは、薬剤組成物は、乾燥製剤又は凍結乾燥製剤として調製してもよい。或いは又はさらに、組成物は、当技術分野において公知の医薬用パッチとして調製してもよい（例えば、その内容が、あたかも本明細書で十分に説明されるかのように参照により組み込まれるＰＣＴ／ＩＬ０３／００９０３及びＰＣＴ／ＩＬ０３１００９０２を参照されたい）。薬剤組成物は、フィルム剤の形態で調製しても、例えば、「カーボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）（商標）９４０」及びトリエタノールアミンをゲル化剤として使用することによってゲル剤の形態で調製してもよく、或いは、薬剤組成物は、本発明のポリヌクレオチドの経皮送達を可能にする他の任意の適切な形態で調製してもよい。
【００７４】
本発明の方法を用いて被験者に投与する各ポリヌクレオチドの投与量は、所望の応答及び使用するポリヌクレオチドに応じて変動すると考えられる。
【００７５】
ポリヌクレオチドの投与量は、治療効果のある発現レベルを実現するように変更してよい。ＤＮＡ又はＲＮＡの存在、及び発現されたタンパク質の量を確認する手段は、当業者には周知である。このような手段のうちのいくつかを本明細書で以下に提供する実施例において例示する。一般に、それらには、当技術分野で周知の技術に従って実施されるイムノアッセイ（酵素結合免疫吸着測定法など）、ＰＣＲ法、及び免疫組織学的解析が含まれる。投与されるポリヌクレオチドの投与量は、これらの検出及び定量手段によって与えられる情報に基づいて、また、臨床分野の熟練した医師には公知のｉｎ  ｖｉｖｏの臨床徴候に基づいて、所望の発現レベルを実現するように調整することができる。
【００７６】
ポリヌクレオチドの経皮送達を促進するための装置
本発明のシステムは、ポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するための装置を含む。本発明の原理によれば、この装置は、親水性薬剤組成物が被験者の皮膚を通って身体中へと効率的に送達される通り道となる少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するために使用される。
【００７７】
本特許出願の文脈で使用される「マイクロチャネル」という用語は、通常、皮膚の表面から角質層の全て又はかなりの部分を通して伸び、分子がそれを通って拡散することができる経路を意味する。
【００７８】
いくつかの実施形態によれば、本発明は、以下の特許、すなわち、その内容があたかも本明細書で十分に説明されるかのように参照により組み込まれる米国特許第６，１４８，２３２号、同第６，５９７，９４６号、同第６，６１１，７０６号、同第６，７１１，４３５号、同第６，７０８，０６０号、及び同第６，６１５，０７９号で開示されている装置を含めて、角質層のアブレーションを引き起こすことによってマイクロチャネルを作製するための技術を含む。しかし、本発明のいくつかの好ましい実施形態は、前述の装置による皮膚のアブレーションによって実現される経皮送達に関するが、被験者の皮膚にマイクロチャネルを作製するための当技術分野で公知の実質的に任意の方法を使用してよいことが強調される。
【００７９】
ある実施形態によれば、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの皮内又は経皮送達を促進するための装置は、（ａ）複数の電極を含む電極カートリッジ、及び（ｂ）電極が皮膚の近傍にあるときに、２つ以上の電極の間に電気エネルギーを加えて、通常、電流又は１つ若しくは複数のスパークを生じ、前記電極の真下の領域の角質層のアブレーションを可能にし、それによって少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するように適合された制御ユニットを含む主要ユニットを含む。
【００８０】
本発明の原理によれば、電極カートリッジは、複数の電極を含み、それによって電極アレイを形成し、このアレイは、電気エネルギーを適用すると、被験者の皮膚内に少なくとも１つのマイクロチャネル、好ましくは複数のマイクロチャネルを作製する。「複数」の電極という用語は、本明細書において２つ以上の電極を意味することを理解されたい。電極カートリッジを搭載した主要ユニットは、本明細書では「ＶｉａＤｅｒｍ（商標）」とも呼ばれる。しかし、一般に、角質層中に作製されたマイクロチャネルの全領域は、電極アレイに覆われる全領域と比較して小さい。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、電極アレイ内の電極の直径は、３０〜１５０ミクロンの範囲である。いくつかの実施形態によれば、直径は、４０〜１００ミクロンの範囲である。いくつかの追加の実施形態によれば、電極アレイ内の電極の長さは、３０〜５００ミクロンの範囲である。他の実施形態によれば、電極の長さは、４０〜１５０ミクロンの範囲である。ある例示的な実施形態では、電極アレイ内の電極の長さは、１００ミクロンである。別の例示的な実施形態では、電極アレイ内の電極の長さは、５０ミクロンである。
【００８２】
他の実施形態によれば、この装置の制御ユニットは、電流の流れ又はスパーク発生を制御し、それにより、１つ又は複数の形成されたマイクロチャネルの幅、深さ、及び形状を調節できるように、電極に送達される電気エネルギーの大きさ、頻度、及び／又は持続期間を制御するための回路を含む。好ましくは、電極に送達される電気エネルギーは、高周波である。
【００８３】
現在好ましい実施形態によれば、複数の電極を含む電極カートリッジは、形状及び大きさが均一な複数のマイクロチャネルを作製する。好ましくは、電極カートリッジは着脱可能である。より好ましくは、電極カートリッジは使用した後に廃棄され、したがって、主要ユニットに簡単に取り付け、その後にその主要ユニットから取り外しできるように設計される。
【００８４】
別の実施形態によれば、本発明の装置を被験者の皮膚上に置いている間にかかる圧力が、電極に送達される電気エネルギーを活性化する。このような作用様式により、電極の活性化が皮膚と密接しているときにのみ起こり、マイクロチャネルの望ましい形成を可能にすることが確実となる。
【００８５】
本発明によれば、マイクロチャネルは、細胞を加熱することによって角質層をアブレーションするために、皮膚に電流を印加することによって形成することもできる。スパーク発生、スパーク発生の停止、又は特定の電流レベルは、所望の深さが達成され、電流印加を終結すべきであることを示唆するフィードバックの一形態として使用してもよい。これらの応用では、電極は、好ましくは、角質層中での所望の深さであるがそれを超える深さではないマイクロチャネルの形成を容易にするのに役立つカートリッジの中で造形され、且つ、／又はカートリッジ中に支持される。或いは、スパークを発生せずに角質層中にマイクロチャネルを形成させるように、電流を設定することもできる。得られるマイクロチャネルの形状及びサイズは均一である。
【００８６】
したがって、本発明によれば、電極は、皮膚と接触して、又は皮膚の近傍、すなわち皮膚から最大約５００ミクロンの距離の範囲に維持してよい。別の実施形態によれば、角質層のアブレーションは、約１０ｋＨｚ〜４０００ｋＨｚ、好ましくは約１０ｋＨｚ〜５００ｋＨｚ、より好ましくは１００ｋＨｚの周波数を有する電流を印加することによって実施される。
【００８７】
カートリッジの汚染の機会を最小化するために、カートリッジの取り付け及び取り外しは、使用者が物理的にカートリッジを触らないようにして実施される。好ましくは、カートリッジは滅菌カートリッジホルダー中に密封されており、このホルダーは使用直前に開封され、その結果、主要ユニットがカートリッジの上面と接触するようになって、カートリッジを主要ユニットに固定する仕組みを作動させる。使用者がカートリッジに触ることを必要としない、カートリッジをゆるめ取り出す容易な手段も提供される。
【００８８】
ポリヌクレオチドの経皮送達用の方法
本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの経皮送達用の方法であって、被験者の皮膚のある領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップと、治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物を、少なくとも１つのマイクロチャネルが存在する被験者の皮膚のその領域に適用するステップとを含む方法を提供する。
【００８９】
本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの経皮送達用の方法であって、（ａ）被験者の皮膚のある領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製するステップと、（ｂ）治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物を、少なくとも１つのマイクロチャネルが存在する被験者の皮膚のその領域に適用するステップと、（ｃ）被験者の皮膚の前記領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製し、それによってポリヌクレオチドの送達を促進するステップとを含む方法もさらに提供する。
【００９０】
本発明は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの経皮送達用の方法であって、（ａ）被験者の皮膚のある領域に治療有効量のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む薬剤組成物を適用するステップと、（ｂ）被験者の皮膚のその領域に少なくとも１つのマイクロチャネルを作製し、それによってポリヌクレオチドの送達を促進するステップとを含む方法もさらに提供する。
【００９１】
本発明の原理によれば、被験者の皮膚のある領域におけるマイクロチャネルの作製及びそれに続くポリヌクレオチド組成物の適用が、それらのマイクロチャネルの周囲又は真下にある細胞又は組織中へのポリペプチドの皮内送達、及びこれらの細胞又は組織における、そのポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの発現を実現することを理解すべきである。さらに、ポリヌクレオチド組成物を適用する前だけでなく後にもマイクロチャネルを作製することが特に有利である。これは、このような条件下でのポリペプチド発現が、ポリヌクレオチド組成物の適用前にのみマイクロチャネルを作製する条件下で実現されるレベルより高いためである。或いは、ポリヌクレオチドを含む組成物を被験者の皮膚のある領域に適用し、続いて皮膚のその領域にマイクロチャネルを作製することも有利である。ポリヌクレオチドを含む組成物の適用は、マイクロチャネルを作製した直後に、又はその後に、例えば、約４〜８時間のラグタイムをおいて行うことができることを理解されたい。さらに、この薬剤組成物は、マイクロチャネルが開いたままである限りにおいて、より長いラグタイムの後でも適用することができる。
【００９２】
「治療有効量」という用語は、局所的に適用されたときに、所期の使用期間を通じて、所望の効果をもたらすのに十分なポリヌクレオチドの量を意味する。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態によれば、ポリヌクレオチドの経皮送達方法は、そのポリヌクレオチドにコードされる目的タンパク質を被験者の細胞内で発現させ、それによって目的タンパク質を産生しなければならない、補充療法に非常に有用である。
【００９４】
本発明の追加の実施形態によれば、ポリヌクレオチドの経皮送達方法は、変異遺伝子が標的細胞内で発現され、その変異遺伝子の発現が疾患を引き起こす場合におけるアンチセンス療法において極めて有用である。すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチドの導入は、変異遺伝子の発現を抑制する。さらに、本発明の方法は、配列特異的なｍＲＮＡ分解を媒介することが知られている、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の経皮送達にも有用である。
【００９５】
したがって、本発明の方法は、ポリヌクレオチドの皮内及び経皮送達を包含する。皮内送達が、特にマイクロチャネルに隣接した部位、より具体的には表皮及び真皮内の部位へのポリヌクレオチドの局所的送達を実現するのに対し、経皮送達は、血液循環へのポリヌクレオチド送達を実現する。
【００９６】
本発明で開示する方法は、例えば、化学療法、放射線療法、及び外科手術など従来の療法との併用療法において使用できることを理解されたい。
【００９７】
以上、本発明を一般的に説明したが、本発明は以下の実施例を参照することによってより容易に理解されよう。実施例は、例示のために提供され、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）
ヒト全層皮膚における高周波のマイクロチャネルの形態
材料及び方法
組織
ヒト胸部の全層皮膚を、地域の倫理委員会の承認及び患者のインフォームドコンセントを得て、乳房切除術又は乳房縮小術を行って得た。余分な脂肪組織はすべて、鈍的切開によって除去した。ＭＥＭ（ＥＡＧＬＥＳ）２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ増殖培地（カタログ番号３２３６０〜０２６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐａｉｓｌｅｙ、イギリス）中に組織を移し、切除後３時間以内に使用した。
【００９９】
ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ
本実験で使用した「ＶｉａＤｅｒｍ（商標）」装置は、米国特許第６，１４８，２３２号及びＳｉｎｔｏｖ，Ｉ他（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ８９：３１１〜３２０頁、２００３年）で開示されているものである。ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）  対照：８．８ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ：１１．４ｇ／ｈｍ２
【０１００】
電子顕微鏡検査
サンプルを、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした２．５％グルタルアルデヒドを用いて室温で１時間固定し、同じ緩衝液中で１０分間（５分×２回）洗浄した。これらのサンプルを、４℃で１時間、０．１Ｍカコジル酸緩衝液に溶かした１％四酸化オスミウムで後固定し、次いで、次のようにエタノール濃度の段階的な系列を用いて脱水した：７０％を４℃で１０分間；１００％を４℃で１０分間；１００％を４℃で１０分間；１００％を４℃で１０分間。次いで、これらのサンプルを臨界点乾燥機（Ｓａｍｄｒｉ７８０、Ｍａｒｙｌａｎｄ、アメリカ）の中に移し、二酸化炭素を用いて１２時間乾燥させた。これらのサンプルを金属製サンプル台上に載せ、Ｅｄｗａｒｄスパッターコーターを用いて純金の薄層で被覆した後、ＰｈｉｌｉｐｓＸＬ−２０走査型電子顕微鏡で検査をした。
【０１０１】
結果
図１は、ＶｉａＤｅｒｍの適用後に胸部全層皮膚に作製されたチャネルの構造形態を示す。これらのチャネルは、３０〜５０μｍの範囲のチャネルの幅を有する、組織中への深い陥入としてはっきりと現れている。
【０１０２】
（実施例２）
加熱分離した表皮膜におけるマイクロチャネルの形態
加熱分離したヒト表皮膜における高周波（ＲＦ）マイクロチャネルの分布パターン及び大きさを測定した。
【０１０３】
材料及び方法
組織
ヒトの全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。
【０１０４】
ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ
ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）  対照：６．２ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２０．６ｇ／ｈｍ２
【０１０５】
皮膚の加熱分離
ＶｉａＤｅｒｍ装置の適用に続いて、皮膚の上層（角質層及び分裂可能な表皮）を以下の技術を用いて取り出した。ガラス製容器に入れた蒸留水を６０℃に温め、皮膚サンプルを加熱分離に適したサイズに切断した。ピンセットを用いて、その組織を予熱しておいた容器に入れ、５５秒後にピンセットでその組織を取り出し、乾燥させた。メスを用いて角質層及び表皮層を通る小さな切り目を入れた。次いで、その組織の真皮をしっかりつかんだ。切り目の部分から、表皮及び角質層膜を真皮層からゆっくりと剥ぎ取った。その膜「皮膚弁」が十分に大きくなった後、膜の残りの部分を、手袋をはめた手で取り除いた。単離された膜を、室温のもと、蒸留水を入れた容器中に入れた。容器中では、膜は広がり水の表面上に浮かび、角質層が上側を向いていた。１枚の金属薄片をその膜の下に入れ、その膜を平らな形態で溶液から取り出した。
【０１０６】
光学顕微鏡検査
表皮膜を顕微鏡スライドガラス上に載せ、明視野照明下でＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ５０顕微鏡を用いて観察した。
【０１０７】
電子顕微鏡検査
乾燥させた加熱分離膜を金属製サンプル台上に載せ、Ｅｄｗａｒｄスパッターコーターを用いて純金の薄層で被覆した後、ＰｈｉｌｉｐｓＸＬ−２０走査型電子顕微鏡で検査をした。
【０１０８】
結果
図２及び図３は、ＲＦマイクロチャネルが、角質層及び分裂可能な表皮を含む加熱分離した表皮膜を完全又は部分的に貫通することを示す。おそらくは分離された膜の厚さのばらつきが原因となって、マイクロチャネルの深さは多様であるが、約５０μｍのマイクロチャネルの直径は再現性があり、且つ全層皮膚で観察されたマイクロチャネルの大きさ（図１）と一致していた。
【０１０９】
（実施例３）
加熱分離した表皮膜中のマイクロチャネルを通しての蛍光性ナノ粒子の拡散
ＶｉａＤｅｒｍで処理した、加熱分離した表皮膜を通しての蛍光性ナノ粒子の拡散を実施した。これらの蛍光性ナノ粒子は、非ウイルス性遺伝子療法ベクターと類似した粒子直径を有する。さらに、拡散特性が、使用するパラメータ設定に依存するかどうか、及び皮膚を新鮮な状態で分析すべきか凍結保存の後に分析すべきかを判定することも目的とした。
【０１１０】
材料及び方法
組織
ヒトの新鮮な全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。さらに、同様に獲得し移した後に−２０℃で６週間凍結させておいた皮膚サンプルを室温で解凍した。
【０１１１】
ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ
サンプル１：（新鮮組織）ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：６．７ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２８．２ｇ／ｈｍ２  サンプル２：（新鮮組織）ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：３；ＴＥＷＬ  対照：６．２ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  １９．２ｇ／ｈｍ２  サンプル３：（凍結組織）ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：６．５ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ９．３ｇ／ｈｍ２
【０１１２】
加熱分離
実施例２で説明したようにして加熱分離した表皮膜を調製した。
【０１１３】
拡散アッセイ
非処理のヒト表皮膜及びＶｉａＤｅｒｍで処理したヒト表皮膜をタイプ１ろ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ＰＬＣ、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、ケント州）上に載せ、静置型のフランツ型ガラス拡散セルのドナー区画とレセプター区画の間に置いた。これらの区画をシリコングリースによってシールし、金属クリップで固定してそれらのチャンバーをしっかりと密閉した。正確に較正された体積及び拡散領域を有する各セルのレセプター相をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｐｏｏｌｅ、イギリス）で満たし、完全な混合を確実にするためにマグネチック回転子を加えた。レセプターのアームにガラス製キャップで蓋をし、サンプルの蒸発を防ぐためにドナーチャンバーをカバーガラスで塞いだ。これらのセルを３７℃の一定温度で維持した湯浴中で、マルチポイントマグネチックスターラー上に置き、連続的に攪拌し、３２℃の皮膚表面温度を実現した。ドナーチャンバーに試験用調製物を添加する前に、これらのセルを少なくとも３０分間平衡化し、表皮膜の完全性を視覚的に検査した。
【０１１４】
蛍光（ＦＩＴＣ）標識したポリスチレンナノスフェア（Ｌ−１２８０；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｐｏｏｌｅ、イギリス）を拡散セルのドナーチャンバーに添加した。セルのうちの３つにおいて、ＶｉａＤｅｒｍの２回適用により表皮膜を前処理しておいた。ろ紙のみを用いて、ポジティブコントロールセルを調製した。未処理の表皮膜を含む拡散セルを用いてネガティブコントロールを調製した。
【０１１５】
蛍光性ナノスフェアの懸濁原液、濃度４．５７１０／μｌの１０μｌ／ｍｌ希釈液の体積５００μｌを表皮膜の表面に添加した。１６時間後、蛍光分光光度計（ＢＭＧ  Ｆｌｕｏｓｔａｒ、Ａｙｌｅｓｂｕｒｙ、イギリス）により、それぞれ４８５ｎｍ及び５２０ｎｍに設定した励起波長及び発光波長を用いて分析するために、９６ウェルプレートにドナー相を移した。蛍光性ナノ粒子懸濁液の標準的希釈液を用いて検量線を作製した（図４）。
【０１１６】
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）
脂質：ポリカチオン：ｐＤＮＡ（ＬＰＤ）複合体又は蛍光性ナノ粒子の懸濁液１５μｌを１００メッシュのニッケルグリッド上に載せた。３分後、余分な溶液をろ紙で吸い取り、新しくろ過し、３０秒間遠心分離した２％酢酸ウラニル水溶液で置き換えた。蒸留水で２回グリッドを洗浄し、乾燥させ、Ｐｈｉｌｉｐｓ２０８透過型電子顕微鏡を用いて画像化した。
【０１１７】
結果
図５は、球形の蛍光性ナノ粒子をＬＰＤ非ウイルス性遺伝子送達ベクターの拡散モデルとして使用することの理論的根拠を例示する。図６は、ＶｉａＤｅｒｍで処理した表皮膜を通過する蛍光性ナノ粒子の拡散を示す。図６で示されるように、未処理の表皮膜サンプル（対照）は、１００ｎｍナノ粒子に対する極めて高いバリヤー機能を示し、１６時間のインキュベーション後、添加されたナノ粒子の９４．３％がドナー相でなお回収可能であった。ＶｉａＤｅｒｍで処理した表皮膜のすべてが、ナノ粒子に対して高く且つ再現性のある透過性を示し、添加されたナノ粒子の２８．５〜３０．４％が、ＲＦマイクロチャネルを介してドナー区画を出ていった。このナノ粒子の拡散増大は、特にポジティブコントロール（ろ紙）と比較した場合に注目に値する。ろ紙のサンプルでは、蛍光性ナノ粒子の４４．８％がドナー区画になお存在しており、下にあるフィルター担体のバリヤー特性を示した。皮膚サンプルの経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）のデータは、興味深いものであった。拡散データは、新鮮な組織と凍結組織の双方の皮膚の外層における同程度のレベルの透過を示しているにもかかわらず、新鮮な組織では、ＶｉａＤｅｒｍで処理した場合にＴＥＷＬが６．７から２８．２ｇ／ｈｍ２に増加した一方で、先に凍結した組織では、同じパラメータ設定において６．５から９．３ｇ／ｈｍ２と増加の程度が小さかった。ＶｉａＤｅｒｍ適用後のこのＴＥＷＬの増加量の減少は、他の凍結サンプルでも観察されたため、すべての後続の実験では新しく得た未凍結の組織を使用することに決めた。
【０１１８】
（実施例４）
マイクロチャネルの表面の（ｅｎ  ｆａｃｅ）可視化
ヒト全層皮膚におけるＲＦマイクロチャネルの拡散パターンを検出した。
【０１１９】
材料及び方法
組織
ヒトの全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。
【０１２０】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
図７Ｂ：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：８．１ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  １８．０ｇ／ｈｍ２  図７Ｃ：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：９．５ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２２．０ｇ／ｈｍ２  図８：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用１回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：６．８ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ７．６ｇ／ｈｍ２
【０１２１】
サンプル調製
３７℃で２４時間、媒体（ＭＥＭ（ＥＡＧＬＥＳ）２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で皮膚をインキュベートした。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、氷上で２時間、０．５％グルタルアルデヒド中で皮膚を固定した。メチレンブルー染色をするために、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚の表面に１．５％メチレンブルー溶液５滴を５分間適用した。続いて、過剰な染色をＰＢＳでゆすぎ、組織表面に７０％エタノールを塗布した。
【０１２２】
実体顕微鏡検査
２．０×アタッチメント及びＳｃｈｏｌｔ  ＫＬ１５００電子光源を装備したＺｅｉｓｓ  Ｓｔｅｍｉ  ２０００Ｃ実体顕微鏡を用いて組織を可視化した。
【０１２３】
光学顕微鏡
Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡及びＳｃｈｏｌｔ  ＫＬ１５００電子光源を用いてメチレンブルーで染色した組織を可視化した。
【０１２４】
結果
図７Ｂ及び図７Ｃは、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚におけるマイクロチャネルの分布を明確に示す。図７で観察されるチャネルの茶色の変色は、チャネル周辺の組織の特性の変化を示唆する。これらのチャネルは、溶液中のメチレンブルーを取り込み保持するチャネルの能力を利用して、可視化することもできる（図８）。
【０１２５】
（実施例５）
切片化した組織の組織構造
次に、ＶｉａＤｅｒｍで処理したヒト皮膚中に作製されたマイクロチャネルの深さ及び構造形態を試験した。
【０１２６】
材料及び方法
組織
ヒトの全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。
【０１２７】
サンプル調製
ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚をＰＢＳで洗浄し、氷上で４時間、０．５％グルタルアルデヒド中で固定した。固定した組織をＣａｒｄｉｃｅ上でＯＣＴ包埋剤（ＲＡ  Ｌａｍｂ社、Ｅａｓｔｂｏｕｒｎｅ、イギリス）中に包埋し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ  Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて切片化した。
【０１２８】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
パラメータ３：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：３；ＴＥＷＬ  対照：４．０ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ３０．３ｇ／ｈｍ２
パラメータ５：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：６．７ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２８．２ｇ／ｈｍ２
パラメータ６：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：１；ＴＥＷＬ  対照：５．５ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２４．８ｇ／ｈｍ２
パラメータ７：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：２；ＴＥＷＬ  対照：５．２ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２８．７ｇ／ｈｍ２
パラメータ１０：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：６．５ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ３２．６ｇ／ｈｍ２
【０１２９】
組織染色
ａ）エオジン：接着剤を塗布した「Ｈｉｓｔｏｂｏｎｄ（登録商標）」顕微鏡スライド（ＲＡ  Ｌａｍｂ社）上に組織切片を採取し、１％エオジン水溶液（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ社、Ｄｏｒｓｅｔ、イギリス）中に５秒浸し、水でゆすぎ、乾燥させた。
ｂ）ヘマトキシリンエオジン染色（Ｈ＆Ｅ）：「Ｈｉｓｔｏｂｏｎｄ（登録商標）」顕微鏡スライド上に組織切片を採取し、ハリスヘマトキシリン溶液（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ社）中に５分浸し、水でゆすぎ、乾燥させた。上述したようにして、エオジンによる後染色を実施した。
ｃ）トルイジン（Ｔｏｌｕｄｉｎｅ）ブルー：「Ｈｉｓｔｏｂｏｎｄ（登録商標）」顕微鏡スライド上に組織切片を採取し、１％トルイジンブルー水溶液（ＴＡＡＢ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、イギリス）中に５分浸し、水でゆすぎ、乾燥させた。
【０１３０】
結果
図９及び図１０は、様々なパラメータ設定でＶｉａＤｅｒｍを適用した後にヒト胸部皮膚中に作製されるＲＦマイクロチャネルの大きさを示す。提示された顕微鏡写真は、観察されたチャネルの全集団の代表である。たいていの場合は、チャネルは、長さが約１００μｍであり、最も幅の広い径は３０〜５０μｍである。これらのチャネルは、ヒト表皮を通過してその下にある真皮まで貫通している。
【０１３１】
（実施例６）
マイクロチャネル中への蛍光性ナノ粒子の共局在化
ＲＦマイクロチャネルが１００ｎｍの蛍光性ナノ粒子の浸透及び保持を可能にするのに十分なサイズであるかどうかを評価するために、ＲＦマイクロチャネの大きさを測定した。
【０１３２】
材料及び方法
組織
ヒトの全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。
【０１３３】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：６．７ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ４６．０ｇ／ｈｍ２
【０１３４】
サンプル調製
ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚を６ウェルの細胞培養プレートに入れ、１．５ｍｌの培地（ＭＥＭ（ＥＡＧＬＥＳ）２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で維持した。蛍光（ＦＩＴＣ）標識されたポリスチレンナノスフェア（Ｌ−１２８０；ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ社、Ｐｏｏｌｅ、イギリス）の濃縮（４．５７１０／μｌ）原液５０μｌを、処理された皮膚の表面にピペットで加え、このサンプルを３７℃で６時間インキュベートした。６時間後に、さらに２ｍｌの培地を加えて皮膚を浸した。さらに１８時間皮膚をインキュベートした。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、氷上で１時間、０．５％グルタルアルデヒド中で皮膚を固定した。固定した組織をＣａｒｄｉｃｅ上でＯＣＴ包埋剤（ＲＡ  Ｌａｍｂ社）中に包埋し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ  Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて切片化した。
【０１３５】
染色／可視化
切片を、実施例５で説明したようにしてＨ＆Ｅで染色して可視化し、或いは、染色せずに青色蛍光下で可視化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡）。
【０１３６】
結果
図１１は、ＲＦマイクロチャネルが、直径１００ｎｍの蛍光性ナノ粒子を取り込み閉じ込めるのに十分な大きさであることを示す。したがって、マイクロチャネルは、非ウイルス性遺伝子療法ベクターなどの高分子及びナノ粒子の送達に適した大きさを有する。インキュベーション期間を通して、チャネルの多くは、表面を再び封じられて、「薬物送達貯蔵所」内部に粒子を囲い込むようである。
【０１３７】
（実施例７）
マイクロチャネル中への蛍光標識したＤＮＡの共局在化
以下の実験の目的は、ＲＦマイクロチャネルの大きさが、蛍光標識したプラスミドＤＮＡの浸透及び保持を可能にするのに十分な大きさであるかどうかを判定すること、並びに、プラスミドＤＮＡと脂質及びポリカチオンとの複合体形成が、蛍光標識したプラスミドＤＮＡの浸透及び保持に影響を及ぼすかどうかを判定することであった。
【０１３８】
材料及び方法
組織
ヒトの全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。
【０１３９】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
ＤＮＡのみ：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：７．５ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  １４．２ｇ／ｈｍ２ＬＰＤ：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：５．３ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２８．３ｇ／ｈｍ２
【０１４０】
サンプル調製
「ＬａｂｅｌＩＴ（登録商標）」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を用いて、ローダミンフルオロフォアでｐＥＧＦＰ−Ｎ１レポータープラスミドを標識することによって、蛍光標識したプラスミドＤＮＡを調製した。ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚を６ウェルの細胞培養プレートに入れ、１．５ｍｌの培地（ＭＥＭ（ＥＡＧＬＥＳ）２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で維持した。５０μｌの標識したｐＤＮＡのみ（２μｇのｐＤＮＡを含有）、又は硫酸プロタミン（１０μｇ、サケ精子由来、グレードＸ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｐｏｏｌｅ、イギリス）及び１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）リポソーム（１５μｇ：Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、Ａｌａｂａｍａ、アメリカ）と予め複合体形成させた、蛍光標識されたｐＤＮＡ（５μｇ）を含むＬＰＤ複合体の懸濁液を、処理された皮膚の表面にピペットで加え、このサンプルを３７℃で１時間インキュベートした。１時間後に、さらに２ｍｌの培地を加えて皮膚を浸した。さらに４７時間、皮膚をインキュベートした。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、氷上で１時間、０．５％グルタルアルデヒド中で皮膚を固定した。固定した組織をＣａｒｄｉｃｅ上でＯＣＴ包埋剤（ＲＡ  Ｌａｍｂ社）中に包埋し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ  Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて切片化した。
【０１４１】
光学／蛍光顕微鏡
切片を、染色せずに明視野下又は青色蛍光下で可視化した（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡）。
【０１４２】
結果
図１２Ａは、皮膚の平らな切片上での蛍光標識されたｐＤＮＡの分布を示す。図１２Ｂは、折り畳まれた皮膚中に存在する蛍光性ｐＤＮＡ粒子を示す（角質層が途切れなく壊れていないことに注目されたい）。図１２Ｃは、ＲＦマイクロチャネルを示す。興味深いことに、図１２Ｄは、図１２Ｃで示した、ＶｉａＤｅｒｍで処理した同じ組織サンプルの真皮の深部に蛍光標識したｐＤＮＡ粒子が存在することを示す。
【０１４３】
図１３は、ポリカチオン及び脂質と複合体形成をしてＬＰＤ遺伝子送達ベクターにすることによって、ローダミン標識したｐＤＮＡに付随する蛍光が減少されないことを示す。これらの画像では、ＬＰＤベクターがＲＦマイクロチャネルの表面（図１３Ｂ及び１３Ｄ）並びに内部（図１３Ｆ）の双方に局在していることがはっきりと見える。
【０１４４】
（実施例８）
加熱分離した表皮膜におけるβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現
次に、脂質：ポリカチオン：ｐＤＮＡ（ＬＰＤ）ベクターをＶｉａＤｅｒｍで予め処理した皮膚に適用すると、加熱分離した表皮膜においてβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子が発現され得るかどうかを判定した。
【０１４５】
材料及び方法
組織
ヒトの全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。
【０１４６】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：６．０ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  １４．６ｇ／ｈｍ２
【０１４７】
サンプル調製：
ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚を６ウェルの細胞培養プレートに入れ、１．５ｍｌの培地（ＭＥＭ（ＥＡＧＬＥＳ）２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で維持した。ヒトサイトメガロウイルス最初期（ＣＭＶ  ＩＥ）プロモーターの制御下でβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現するｐＣＭＶβプラスミドＤＮＡを、ＣｌｏｎＴｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、アメリカ）から入手し、アンピシリン選択ＬＢ寒天プレート上にコロニー形成させた大腸菌の形質転換株ＤＨ５ａを用いて増殖させ、３７℃で一晩培養した。ｐＤＮＡを回収し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｅｇａ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、Ｃｒａｗｌｅｙ、イギリス）を用いて精製した。
【０１４８】
５０μｇのｐＣＭＶβプラスミドＤＮＡ、１００μｇの硫酸プロタミン（サケ精子由来、グレードＸ）、及び１５０μｇのＤＯＴＡＰリポソームを含有する脂質：ポリカチオン：ｐＤＮＡ（ＬＰＤ）ベクターの懸濁液３００μｌを調製した。脂質：プロタミン：ｐＤＮＡの質量（ｗ／ｗ）比が３：２：１となるように、初めにプロタミン（滅菌精製水中１ｍｇ／ｍｌ原液）、次いで押出された（ｅｘｔｒｕｄｅｄ）ＤＯＴＡＰリポソームをｐＤＮＡ（ＴＥ緩衝液中１ｍｇ／ｍｌ原液）に順次添加することにより、ＬＰＤ複合体を調製した。ＬＰＤ懸濁液１００μｌを、ＶｉａＤｅｒｍで処理された皮膚の表面にピペットで加え、このサンプルを３７℃で１８時間インキュベートした。１８時間後に、さらに２ｍｌの培地を加え、浸された皮膚をさらに３０時間インキュベートした。
【０１４９】
Ｘ−ｇａｌ染色
ＰＢＳ中で２回洗浄した後、氷上で１時間、０．５％グルタルアルデヒド中で皮膚を固定し、組織染色用のＬａｃＺ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎ−Ｖｉｖｏｇｅｎ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を用いて、２４時間、β−ガラクトシダーゼ活性に対して染色した。ＰＢＳ中でさらに２回洗浄した後、実施例２で説明したようにして皮膚を加熱分離した。
【０１５０】
光学顕微鏡
加熱分離した表皮膜を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡によって可視化した。
【０１５１】
結果
図１４は、加熱分離させた表皮膜中のマイクロチャネルの外観である。実施例４で以前に観察された茶色の変色が再び見える。チャネルの境界、また、おそらく中心が青色に染色されている。酵素アッセイの条件下では、青色の染色は、レポーター遺伝子の産物、すなわちβ−ガラクトシダーゼと関連している。
【０１５２】
（実施例９）
表面の（ｅｎ  ｆａｃｅ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現
次に、ＶｉａＤｅｒｍ装置の適用後に、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子が全層皮膚へ送達され、そこで発現され得るかどうかを判定した。
【０１５３】
材料及び方法
組織
ヒトの全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得及び調製した。
【０１５４】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用２回；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：５；ＴＥＷＬ  対照：１０．３ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ２６．２ｇ／ｈｍ２
【０１５５】
サンプル調製：
ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚を６ウェルの細胞培養プレートに入れ、１．５ｍｌの培地（ＭＥＭ（ＥＡＧＬＥＳ）２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で維持した。ｐＣＭＶβプラスミドＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚の表面にピペットで加え、このサンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。ＰＢＳ中で２回洗浄した後、Ｄ−Ｓｑｕａｍｅ粘着テープ（ＣｕＤｅｒｍ社、Ｄａｌｌａｓ、テキサス州）を用いて２０回テープストリッピングすることによって、皮膚の角質層を除去した。
【０１５６】
Ｘ−ｇａｌ染色
氷上で１時間、０．５％グルタルアルデヒド中で組織を固定し、ＰＢＳ中で一晩ゆすぎ、組織染色用のＬａｃＺ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ社、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を用いて、４８時間、β−ガラクトシダーゼ発現に対して染色した。
【０１５７】
光学顕微鏡
Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡及びＳｃｈｏｌｔ  ＫＬ１５００電子光源を用いて、テープストリッピングした皮膚の表面を可視化した。
【０１５８】
結果
図１５は、ＲＦマイクロチャネルにおいて発現されたβ−ガラクトシダーゼの存在を示す。ＶｉａＤｅｒｍ装置、及びより多くの染色を組織の適切な領域に広げさせるためのＤＮＡ溶液を適用した後に、皮膚をテープストリッピングした。多数の研究が、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に発現され得る裸ＤＮＡの能力を示していたため（例えば、Ｈｅｎｇｇｅ，Ｕ．Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１０：１６１頁、１９９５年；Ｈｅｎｇｇｅ，Ｕ．Ｒ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９７：２９１１頁、１９９６年；Ｃｈｅｓｎｏｙ，Ｓ．及びＨｕａｎｇ，Ｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５：５７頁、２００２年）、この実験では、単独で、すなわち、非ウイルス性のキャリアシステムを全く用いずにプラスミドを使用した。
【０１５９】
（実施例１０）
切片化した組織の組織構造
長さ１００ミクロンの電極又は長さ５０ミクロンの電極を用いて「ＶｉａＤｅｒｍ（商標）」装置を適用した後にヒト皮膚中に作製されたマイクロチャネルの比較を行った。
【０１６０】
材料及び方法
組織
ヒト胸部の全層皮膚を、実施例１で説明したようにして取得した。
【０１６１】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
パラメータ１：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；長さ１００ミクロンの電極を含む電極アレイ；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：１；ＴＥＷＬ  対照：７．４ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  １０．７ｇ／ｈｍ２  パラメータ６：ＶｉａＤｅｒｍのパラメータ設定値：適用４回；長さ５０ミクロンの電極を含む電極アレイ；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：１；ＴＥＷＬ  対照：５．７ｇ／ｈｍ２；適用後のＴＥＷＬ  ８．７ｇ／ｈｍ２
【０１６２】
サンプル調製
ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚をＰＢＳで洗浄し、氷上で２．５時間、０．５％グルタルアルデヒド中で固定し、ＰＢＳで後洗浄した。固定した組織をＣａｒｄｉｃｅ上でＯＣＴ包埋剤（ＲＡ  Ｌａｍｂ社Ｅａｓｔｂｏｕｒｎｅ、イギリス）中に包埋し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ  Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて切片化した。
【０１６３】
組織染色
エオジン：接着剤を塗布した「Ｈｉｓｔｏｂｏｎｄ（登録商標）」顕微鏡スライド（ＲＡ  Ｌａｍｂ社）上に組織切片を採取し、１％エオジン水溶液（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ社、Ｄｏｒｓｅｔ、イギリス）中に５秒浸し、水でゆすぎ、乾燥させた。
トルイジンブルー：「Ｈｉｓｔｏｂｏｎｄ（登録商標）」顕微鏡スライド上に組織切片を採取し、１％トルイジンブルー水溶液（ＴＡＡＢ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ社、Ｄｏｒｓｅｔ、イギリス）中に５分浸し、水でゆすぎ、乾燥させた。
【０１６４】
結果
提示した顕微鏡写真は、観察されたチャネルの全集団の代表である。たいていの場合は、チャネルは、長さが約５０〜１００μｍであり、最も幅の広い径は３０〜５０μｍであった。
【０１６５】
長さ５０又は１００ミクロンの電極アレイによって作製されたマイクロチャネルの差を図１６に示す。本明細書において上記に開示した実施例１〜９においては、長さ１００ミクロンの電極アレイは、ヒト表皮を通過してその下にある真皮まで貫通しているマイクロチャネルを作製した（図１６Ａ）。一方、長さ５０ミクロンの電極アレイは、しばしば、分裂可能な表皮中にもっぱら存在するマイクロチャネルを作製した（図１６Ｂ）。これらの結果に基づいて、長さ５０ミクロンの電極を有する電極アレイを、表皮における遺伝子発現を評価するさらなる研究用に選択した。
【０１６６】
ＴＥＷＬのデータも、５０ミクロン及び１００ミクロンのアレイによって作製されたチャネルの様々な形態をさらに裏付ける（表１）。
【０１６７】
表１．パラメータ設定６でＶｉａＤｅｒｍを４回適用した後の経表皮水分喪失量（ＴＥＷＬ）の増加
【表１】
2007518792.tif 000002
【０１６８】
（実施例１１）
表面の（ｅｎ  ｆａｃｅ）β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現
この実験の目的は、長さ５０ミクロンの電極を有するＶｉａＤｅｒｍ装置の適用後に、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子がヒト皮膚へ送達され、そこで発現され得るかどうかを判定することであった。
【０１６９】
材料及び方法
組織
ヒト全層皮膚を氷上で、５％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ  ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ増殖培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｐａｉｓｌｅｙ、イギリス）に移した。切開により真皮のかなりの比率を取り出すことによって、分層皮膚を調製した。
【０１７０】
ＶｉａＤｅｒｍパラメータ
ＤＮＡ適用前に２回適用、ＤＮＡ適用後に１回適用；長さ５０ミクロンの電極を有する電極アレイ；電極：１４０；バースト長：７００μ秒；バースト数：１；ＴＥＷＬ  対照：ｇ／ｈｍ２
【０１７１】
サンプル調製
ウェルあたり２．５ｍｌの培地（５％ウシ胎児血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ  ２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）を含む６ウェル細胞培養プレート中の金網に支持されたレンズティッシュ上に置くことによって、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚を気相液相界面で維持した。ｐＣＭＶβプラスミドＤＮＡ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚の表面にピペットで加えて広げ、ＶｉａＤｅｒｍを再度適用した。３７℃で２４時間、このサンプルをインキュベートした。ＰＢＳ／ＭｇＣｌ２中で１回洗浄した後（３０分）、４℃で２時間、２％グルタルアルデヒド／ＭｇＣｌ２中で組織を固定した。続いて、一連のＰＢＳ／ＭｇＣｌ２溶液中で２時間、３時間、及び３０分間組織を洗浄した。
【０１７２】
Ｘ−ｇａｌ染色
Ｘ−Ｇａｌ染色溶液［Ｘ−Ｇａｌ（４０ｍｇ／ｍｌジメチルホルムアミド溶液を５％（ｖ／ｖ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、イギリス）、フェリシアン化カリウム（０．６Ｍ溶液を０．８４％（ｖ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イギリス）、フェロシアン化カリウム（０．６Ｍ溶液を０．８４％（ｖ／ｖ））、塩化マグネシウム（１Ｍ溶液を０．２％（ｖ／ｖ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、イギリス）、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５（０．２Ｍ溶液を５０％（ｖ／ｖ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、イギリス）、脱イオン（Ｄｅｍｏｎｉｚｅｄ）水を加えて１００％とする］を用いて２０時間、β−ガラクトシダーゼ発現について組織を染色した。
【０１７３】
実体顕微鏡検査
２．０×アタッチメント及びＳｃｈｏｌｔ  ＫＬ１５００電子光源を装備したＺｅｉｓｓ  Ｓｔｅｍｉ  ２０００Ｃ実体顕微鏡を用いて組織を可視化した。
【０１７４】
光学顕微鏡
Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡及びＳｃｈｏｌｔ  ＫＬ１５００電子光源を用いて、皮膚の表面を可視化した。
【０１７５】
結果
図１７及び図１８は、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚において発現されたβ−ガラクトシダーゼの存在を明確に示す。これまでの研究が、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的に発現され得る裸ＤＮＡの能力を示していたため（例えば、Ｈｅｎｇｇｅ，Ｕ．Ｒ．他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．１０：１６１頁、１９９５年；Ｈｅｎｇｇｅ，Ｕ．Ｒ．他、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．９７：２９１１頁、１９９６年；Ｃｈｅｓｎｏｙ，Ｓ．他  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ，５：５７頁、２００２年）、この実験では、単独で、すなわち、非ウイルス性のキャリアシステムを全く用いずにプラスミドを使用した。β−ガラクトシダーゼ発現に関して最良の結果は、連続的にＶｉａＤｅｒｍ、ＤＮＡ適用、次いで再度ＶｉａＤｅｒｍで皮膚を処理した場合に得られた。したがって、この装置は、皮膚にマイクロチャネルを作製するだけではなく、ＤＮＡの細胞内取り込みも推進し得る。
【０１７６】
（実施例１２）
切片化組織におけるβ−ガラクトシダーゼ発現
次に、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚におけるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現のパターンを決定した。
【０１７７】
材料及び方法
凍結切片化
図１７及び図１８で示す切片３（Ｓｅｃｔｉｏｎ３）に由来するサンプルをＣａｒｄｉｃｅ上でＯＣＴ包埋剤（ＲＡ  Ｌａｍｂ社、Ｅａｓｔｂｏｕｒｎｅ、イギリス）中に包埋し、Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０Ｓ  Ｃｒｙｏｓｔａｔを用いて切片化した。
【０１７８】
光学顕微鏡
これらの組織切片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０顕微鏡を用いて可視化した。
【０１７９】
結果
図１９は、かなりの程度のレポーター遺伝子発現に関連する、ＲＦマイクロチャネル周辺の分裂可能な表皮細胞における強い染色の存在を明確に示す。染色は、主として表皮に局在している。
【０１８０】
したがって、これらの結果から、５０ミクロンの電極アレイを有するＶｉａＤｅｒｍ装置の適用後にヒト胸部皮膚で作製されるＲＦマイクロチャネルが、プラスミドＤＮＡの皮膚への送達を可能にするのに適した大きさであることが実証される。さらに、ＤＮＡ溶液で予め被覆した皮膚にＶｉａＤｅｒｍを適用した場合、遺伝子の取り込み及び発現が促進されるようである。この強い遺伝子発現は、組織の分裂可能な表皮領域に主として局在している。
【０１８１】
本発明は、本明細書において上記に具体的に示し説明したことによって限定されないことを、当業者は理解されたい。正しくは、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】未処理のヒト皮膚におけるＲＦマイクロチャネルの走査型電子顕微鏡写真である。スケールバー＝５０μｍ。
【図２】加熱分離した表皮膜におけるＲＦマイクロチャネルの光学顕微鏡写真である。Ａ：倍率＝×２００；Ｂ：倍率＝×１００
【図３】加熱分離した表皮膜におけるＲＦマイクロチャネルの走査型電子顕微鏡写真である。Ａ：ＶｉａＤｅｒｍを２回適用した後のチャネルの分布パターンを示す、低倍率での走査型電子顕微鏡写真である。Ｂ〜Ｄ：マイクロチャネルの大きさを示す、高倍率での走査型電子顕微鏡写真である。Ｅ〜Ｆ：偏向電子ビーム（ａｎｇｌｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｂｅａｍ）によりマイクロチャネルの深さを走査電子で可視化した写真である（スケールバー（加えられている場合）＝５０μｍ）。
【図４】蛍光性ナノ粒子のドナー濃度を計算するための検量線のグラフである。Ｒ２＝０．９９０。
【図５】脂質：ポリカチオン：ＤＮＡ（ＬＰＤ）非ウイルス性遺伝子療法用ベクターの拡散モデルとして蛍光性ナノ粒子を使用する妥当性を示す、透過型電子顕微鏡写真である。Ａ：ＬＰＤ３：２：１（ｗ／ｗ）のベクター；Ｂ：蛍光性ナノ粒子。スケールバー＝１００ｎｍ。
【図６】ＶｉａＤｅｒｍで処理した表皮膜を通過しての蛍光性ナノ粒子の拡散を示すグラフである。データは、１６時間後にドナー相に残存している、適用された全ナノ粒子の比率として示される。対照：未処理の表皮膜；１：３３０Ｖ、バースト５回、７００μ秒、１４０電極のパラメータ設定でのＶｉａＤｅｒｍの２回適用で処理した、新鮮な組織に由来する表皮膜；２：３３０Ｖ、バースト３回、７００μ秒、１４０電極のパラメータ設定でのＶｉａＤｅｒｍの２回適用で処理した、新鮮な組織に由来する表皮膜；３：３３０Ｖ、バースト５回、７００μ秒、１４０電極のパラメータ設定でのＶｉａＤｅｒｍの２回適用で処理した、解凍組織に由来する表皮膜；ろ紙：ろ紙のみ。
【図７】ヒト皮膚におけるＲＦマイクロチャネルの分布パターンを示す実体顕微鏡写真である。Ａ：未処理の皮膚；Ｂ及びＣ：ＶｉａＤｅｒｍ処理した皮膚。スケールバー＝５００μｍ。
【図８】ＶｉａＤｅｒｍ処理後、メチレンブルー染色した皮膚の光学顕微鏡写真である。Ａ：倍率＝×４０；Ｂ：倍率＝×１００。
【図９】３３０Ｖ、バースト３回、７００μ秒、１４０電極のパラメータ設定でＶｉａＤｅｒｍで処理したヒトの胸部皮膚の光学顕微鏡写真である。Ａ：エオジン染色、倍率＝×２００；Ｂ：トルイジン（Ｔｏｌｕｄｉｎｅ）ブルー染色、倍率＝×２００；Ｃ：トルイジンブルー染色、倍率＝×１００。スケールバー＝１００μｍ。
【図１０】３３０Ｖ、バースト５回、７００μ秒、１４０電極のパラメータ設定でＶｉａＤｅｒｍで処理したヒトの胸部皮膚の光学顕微鏡写真である。Ａ：ヘマトキシリンエオジン染色、倍率＝×１００；Ｂ：ヘマトキシリンエオジン染色、倍率＝×２００。スケールバー＝１００μｍ。
【図１１】蛍光性ナノ粒子を含有するＲＦマイクロチャネルの光学顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真である。Ａ：光学顕微鏡写真；Ｂ：蛍光顕微鏡写真。倍率＝×１００。スケールバー＝１００μｍ。
【図１２】蛍光標識したプラスミドＤＮＡのみとともに後でインキュベートした、ＶｉａＤｅｒｍ処理した皮膚の蛍光顕微鏡写真である。倍率＝×２００。スケールバー＝１００μｍ。
【図１３】ＬＰＤ遺伝子ベクター複合体中の蛍光標識したプラスミドＤＮＡとともに後でインキュベートした、ＶｉａＤｅｒｍ処理した皮膚の二重標識顕微鏡写真である。Ａ、Ｃ、及びＥは、光学顕微鏡写真である。Ｂ、Ｄ、及びＦは、蛍光顕微鏡写真である。倍率＝×１００。スケールバー＝１００μｍ。
【図１４】β−ガラクトシダーゼ発現に対して染色した、加熱分離した表皮膜の光学顕微鏡写真である。Ａ：倍率＝×１００；Ｂ：倍率＝×２００。
【図１５】β−ガラクトシダーゼ発現に対して染色した、テープストリッピングしたＶｉａＤｅｒｍ処理皮膚の光学顕微鏡写真である。倍率＝×１００。
【図１６】ＶｉａＤｅｒｍ処理したヒト胸部皮膚の光学顕微鏡写真である。Ａ  長さ１００ミクロンの電極、エオジン染色、倍率＝×１００；Ｂ  長さ５０ミクロンの電極、トルイジンブルー染色、倍率＝×２００。スケールバー＝１００μｍ
【図１７】ＶｉａＤｅｒｍ適用、ＤＮＡコーティング、次いで追加のＶｉａＤｅｒｍ適用をした後にβ−ガラクトシダーゼ発現について染色したヒト皮膚の実体顕微鏡写真である。Ａ〜Ｅ：ｐＣＭＶβＤＮＡとともにインキュベートした、ＶｉａＤｅｒｍ（長さ５０ミクロンの電極）で処理した皮膚；Ｆ：ＰＢＳとともにインキュベートした、ＶｉａＤｅｒｍで処理した皮膚。スケールバー＝１ｍｍ。
【図１８】ＶｉａＤｅｒｍ適用、ＤＮＡコーティング、次いで追加のＶｉａＤｅｒｍ適用をした後にβ−ガラクトシダーゼ発現について染色したヒト皮膚の３種の異なるサンプルの光学顕微鏡写真である。Ａ  サンプル１：倍率＝×４０；Ｂ  サンプル１：倍率＝×１００；Ｃ  サンプル２：倍率＝×４０；Ｄ  サンプル２：倍率＝×１００；サンプル３：倍率＝×４０；Ｆ  サンプル３：倍率＝×４０；Ｇ  サンプル３：倍率＝×１００；Ｈ  サンプル３：倍率＝×１００。
【図１９】ＶｉａＤｅｒｍ、ＤＮＡコーティング、次いでＶｉａＤｅｒｍで連続的に処理した皮膚に由来する、β−ガラクトシダーゼ染色した組織切片の光学顕微鏡写真である。Ａ：倍率＝×１００；Ｂ：倍率＝×２００；Ｃ：倍率＝×１００；Ｄ：倍率＝×１００；Ｅ：倍率＝×２００；Ｆ：倍率＝×２００；Ｇ：倍率＝×１００；Ｈ：倍率＝×１００。スケールバー＝１００μｍ。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
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【図１８Ｈ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【国際調査報告】
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