(57)【要約】乾癬及び関連疾患の治療は、ＣＬＡとＥ−セレクチンとの相互作用への干渉によるＴ細胞のローリングの抑制又は遮断、及び内皮細胞とのＬＦＡ−ｌ／ＩＣＡＭ及び／又はＶＬＡ／ＶＣＡＭ相互作用を遮断することにより誘導される内皮細胞結合又は血管外遊出への干渉を含む作用機序をもつ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＬＡとＥ−セレクチンとの相互作用並びにＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ及びＶＬＡ／ＶＡＣＭ相互作用に選択的に干渉する化合物を投与することを含む、ヒト宿主におけるＴ細胞のローリングを選択的に抑制する方法。
【請求項２】
前記化合物が免疫賦活剤である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物は免疫療法剤を含み、前記免疫療法剤は精製されたタンパク質抽出物を含み、前記精製された抽出物は、リーシュマニア属の少なくとも１種の無鞭毛体（amastigote）の分離死細胞由来のノニデットＰ−４０不溶粒子状抗原分画から、ジエチルアミノエチル・セファデックス・クロマトグラフィーにより分離され、前記粒子状抗原分画は８Ｍ尿素及び０．０２５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ｐＨ８．３に可溶化されジエチルアミノエチル・セファデックスにかけられ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、８Ｍ尿素及び０．０２５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むｐＨ８．３の溶液で溶離され、前記精製タンパク質抽出物は、完全還元及びアルキル化後７３、８０及び８２ｋＤａのみかけの分子量を有するポリペプチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
その種がアマゾン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
その種がベネズエラ・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）である請求項３に記載の方法。
【請求項６】
その種がブラジル・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
その種がシャーガス・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｃｈａｇａｓｉ）である請求項３に記載の方法。
【請求項８】
その種がアマゾン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びシャーガス・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｃｈａｇａｓｉ）である請求項３に記載の方法。
【請求項９】
７３ｋＤａのポリペプチドは配列番号１、５及び６で示されるアミノ酸配列を含み、８０ｋＤａのポリペプチドは配列番号１、３及び４で示されるアミノ酸配列を含み、８２ｋＤａのポリペプチドは配列番号１及び２で示されるアミノ酸配列を含む請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
アジュバントをさらに含む請求項３乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アジュバントがアルミナである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が免疫療法剤を含み、前記免疫療法剤は免疫療法剤を含み、前記免疫療法剤は精製タンパク質抽出物を含み、前記精製抽出物は、リーシュマニア属の少なくとも１種の無鞭毛体（amastigotes）の分離死細胞由来のノニデットＰ−４０不溶粒子状抗原分画からジエチルアミノエチル・セファデックス・クロマトグラフィーにより分離され、前記粒子状抗原分画は８Ｍ尿素及び０．０２５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ｐＨ８．３に可溶化されジエチルアミノエチル・セファデックスにかけられ、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、８Ｍ尿素及び０．０２５Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含むｐＨ８．３の溶液で溶出され、前記精製タンパク質抽出物は、完全還元及びアルキル化後７３、８０及び８２ｋＤａのみかけの分子量を有するポリペプチドを含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
その種がアマゾン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
その種がベネズエラ・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
その種がブラジル・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
その種がシャーガス・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｃｈａｇａｓｉ）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
その種がアマゾン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）及びシャーガス・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｃｈａｇａｓｉ）である請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
７３ｋＤａのポリペプチドは配列番号１２、１３及び１４で示されるアミノ酸配列を含み、８０ｋＤａのポリペプチドは配列番号１、３及び１０で示されるアミノ酸配列を含み、８２ｋＤａのポリペプチドは配列番号７、８及び９で示されるアミノ酸配列を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含む請求項１２乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
アジュバントがアルミナである請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２００３年１０月１７日出願の米国特許出願第１０／６８７，８９２号の一部継続出願であり、該出願は２００４年１月６日に米国特許第６，６７３，３５１号として発行された米国特許出願第０９／８０９，００３号の継続出願である。
本発明は、一般的に、乾癬の治療及び寛解のための、免疫療法剤又は治療薬、これらの薬剤を含む組成物、及びこれらの薬剤及び組成物を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾癬は、世界人口の１乃至３パーセントが罹患している、慢性で遺伝性の寛解再発を繰り返す鱗屑性で炎症性の、病因不明の皮膚疾患である。乾癬に数種類のタイプがあり、斑状、膿疱性、滴状及び関節炎性の変種が挙げられる。Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｍｅｈｌｉｓ及びＫｅｎｎｅｔｈ  Ｇｏｒｄｏｎが報告したように、乾癬の免疫学は研究されており、乾癬の症状を誘発するヒト免疫系の機序がＴ細胞リンパ球からなるリンパ性浸潤と密接に関連しているように思われる。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ４９（２００３）、Ｓ４４〜５０頁。Ｔ細胞は乾癬を発症させ持続させる役割を果たす。Ｔ細胞が乾癬を発症させ持続させるために果たす役割は、３領域に分けられる。（１）Ｔ細胞の初期活性化、（２）Ｔ細胞の皮膚への移動、及び（３）サイトカイン分泌による皮膚中におけるＴ細胞のエフェクター機能及び免疫学的カスケードの拡大である。
【０００３】
Ｔ細胞の初期活性化には３段階が必要である。第１段階は結合である。即ちＴ細胞は、瞬間的且つ可逆的に抗原提示細胞（ＡＰＣ）に付着する。この過程は、Ｔ細胞上にある白血球機能関連抗原（ＬＦＡ）−１及びＣＤ２並びにＡＰＣ上にある細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）−１及びＬＦＡ−３を含む、接着に使われる表面分子を介して行われる。次の段階は、シグナル１と呼ばれる抗原特異的な活性化過程である。この段階で、Ｔ細胞の特異的Ｔ細胞受容体が、ＡＰＣにより主要組織適合抗原（ＭＨＣＩ又はＩＩ）上に提示される抗原を認識する。最終段階は非抗原特異的細胞−細胞相互作用で、シグナル２又は副刺激と称せられる。副刺激が起こらなければ、Ｔ細胞は反応せず、アポトーシスを受けるか又はその後不応答性になるアネルギーと呼ばれる過程をとるかのいずれかであろう。
【０００４】
乾癬を発症させるか又は持続させるためには、Ｔ細胞が活性化しなければならず、Ｔ細胞が皮膚内に存在しなければならない。Ｔ細胞が皮膚へ移動する又は「輸送」の過程もまた多段階の過程であって、分泌される因子及びＴ細胞と内皮細胞との間の細胞−細胞相互作用によって制御される。循環血中の活性化Ｔ細胞は、発症する組織、この場合は皮膚であるが、そこへ移動する前に、速度を下げてから内皮細胞に結合しなければならない。この過程における第１段階即ちローリングは、移動Ｔ細胞上の皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）と内皮細胞上のＥセレクチンとなどの細胞−細胞相互作用を介して起こる。ローリングは細胞の速度を落とし、その結果細胞は血管壁に結合することができて動かなくなる。結合するためには複数の必要条件があり、ケモカインと呼ばれる小さな走化性タンパク質を介するＴ細胞上の表面タンパク質の活性化、並びにＬＦＡ−ｌ／ＩＣＡＭ及びＶＬＡ／ＶＡＣＭ相互作用を含むＴ細胞と内皮表面タンパク質との結合が含まれる。ひとたびこの結合段階が起こると、Ｔ細胞は血管外遊出と呼ばれる過程で血管壁を通過して移動することができて、乾癬における局所免疫反応に関与し得る。
【０００５】
乾癬の免疫学的過程における最終段階は、Ｔ細胞による角化細胞変化の誘発及び他の炎症性細胞の分泌である。この段階には、Ｔ細胞、局所マクロファージ、樹状細胞、血管内皮細胞、及び角化細胞さえも含む多くのタイプの細胞が関与し得る。乾癬に強い影響を持ち得るこれらのタイプの細胞間には多くの相互作用の可能性があるが、乾癬斑の局所環境において多くの異なった細胞によって分泌されるサイトカインのカスケードが、乾癬における表現型応答において中心的役割を演じているようである（表１）。重要なことであるが、ＣＤ４（＋）及びＣＤ８（＋）Ｔ細胞の両者ともＴ１タイプのサイトカイン即ちインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及びＩＬ−２を産生する。これらのサイトカインは他の細胞に影響を及ぼして、ケモカイン類、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、及びＩＬ−８を含む過剰のタンパク質を局所的に分泌させる。これらが新しい炎症性細胞の皮膚内への移動を制御して、これらの細胞及び角化細胞の活性を増大させ、結果として乾癬斑を生じさせる。
【特許文献１】米国特許出願第１０／６８７，８９２号
【特許文献２】米国特許第６，６７３，３５１号
【特許文献３】米国特許出願第０９／８０９，００３号
【非特許文献１】Ｓｔｅｐｈａｎｉｅ  Ｍｅｈｌｉｓ及びＫｅｎｎｅｔｈ  Ｇｏｒｄｏｎ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、４９（２００３）、Ｓ４４〜５０頁
【非特許文献２】Ｍａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９８２）、１３５〜１３９頁
【非特許文献３】Ｗｅｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５８（１９８３）、１３００６〜１３５１２頁
【非特許文献４】Ｏ’Ｄａｌｙら、Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐｉｃａ（Ｂａｓｅｌ）、４５（１９８８）、１０９〜１２６頁
【非特許文献５】（Ｏ’Ｄａｌｙら、Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐｉｃａ（Ｂａｓｅｌ）、４３（１９８６）、２２５〜２３６頁）。
【非特許文献６】Ｏ'Ｄａｌｙら、Ａ  Ｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．、４３（１９９０）、４４〜５１頁
【非特許文献７】Ｌｏｗｒｙ、０．ら、Ｊ．ＢｉｏＬ．Ｃｈｅｍ．、１９３（１９５１）、２６５〜２７５頁
【非特許文献８】Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」
【非特許文献９】Ｏ’Ｄａｌｙら、Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐｉｃａ（Ｂａｓｅｌ）、５６（１９９４）、２６５〜２８７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
乾癬及びＴ細胞リンパ球の或る種の膜への浸潤に関連するその他の疾患を治療する方法及び組成物を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
乾癬及び関連疾患の治療は、新規なサイトカインによるＣＬＡとＥ−セレクチンとの相互作用への干渉によるＴ細胞のローリングの抑制又は遮断及び未知のＴ細胞クローンの刺激により誘導された、内皮細胞とのＬＦＡ−ｌ／ＩＣＡＭ相互作用及び／又はＶＬＡ／ＶＣＡＭ相互作用を遮断する新規サイトカインによる内皮細胞結合又は血管外遊出への干渉を含む作用機序をもつ。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は乾癬の治療及び臨床的寛解のための新規な組成物及び方法に関する。好ましい実施形態は、免疫原性ポリペプチド又はそれらをコードする核酸を含む組成物によって代表される。本発明の一実施形態において、本発明のポリペプチドはリーシュマニア原虫から、及び好ましくは死滅させたリーシュマニア無鞭毛型原虫（ａｍａｓｔｉｇｏｔｅ ｐｒｏｔｏｚｏａ）から分離することができる。本発明のポリペプチドはリーシュマニア属の原虫から当業者に知られた標準的なタンパク質分離操作を用いて得ることができる。本発明の免疫原性ポリペプチドを組み込む免疫療法剤及び薬剤組成物もまた本発明により考慮されている。一実施形態において、アマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、シャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｄｏｎａｖａｎｉ）、幼児リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｉｎｆａｎｔｕｍ）、大形リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｍａｊｏｒ）、パナマ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｔｒｏｐｉｃａ）、及びガイアナ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）などのリーシュマニア種の複数の混合物の分離ポリペプチドを含む第１世代多価免疫療法剤が提供される。好ましくは、前記混合物はアマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、及びシャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）を含む。前記混合物はこれらの４種からなることが最も好ましい。これらの微生物は、無鞭毛型ステージで、５％胎児仔牛血清を補充した表１に明細を示した合成培地中通常約３０〜３４℃で培養することが好ましい。その後、成長の定常期中に、無鞭毛体を、細胞を死滅させるために効果的な量のＮ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）又は薬理学的に許容されるその塩を含有する媒質にさらす。次に死んだ細胞を分離し、ノニオン界面活性剤ノニデット（Ｎｏｎｅｄｅｔ）ｐ−４０（ＮＰ４０）で処理して表面抗原を溶解し、それを廃棄する。本発明の免疫原ポリペプチドを含む粒子状抗原は、細胞破壊後の遠心分離によって回収できる。これらのポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次にアルミナを含むＰＢＳ中４℃で５分間超音波をかけて再分散する。
【０００９】
別の実施形態においては、アマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、シャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｄｏｎａｖａｎｉ）、幼児リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｉｎｆａｎｔｕｍ）、大形リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｍａｊｏｒ）、パナマ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｔｒｏｐｉｃａ）、及びガイアナ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択された単一のリーシュマニア種から分離したポリペプチドを含む第１世代１価免疫療法剤を示す。単一のリーシュマニア種はアマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、及びシャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）からなる群から選択することが好ましい。この免疫療法剤調製手順は、その他については、第１世代多価免疫療法剤について上記した手順と同一である。
【００１０】
さらに他の実施形態において、アマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、シャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｄｏｎａｖａｎｉ）、幼児リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｉｎｆａｎｔｕｍ）、大形リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｍａｊｏｒ）、パナマ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｔｒｏｐｉｃａ）、及びガイアナ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）などのリーシュマニア種の複数の混合物の分離ポリペプチドを含む第２世代多価免疫療法剤を示す。好ましくは、前記混合物はアマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、及びシャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）を含む。前記混合物はこれらの４種からなることが最も好ましい。これらの生物は、５％胎児仔牛血清を補充した表１に明細を示した合成培地中通常約３０乃至３４℃で無鞭毛型ステージで培養することが好ましい。その後、成長の定常期中に、無鞭毛体を、細胞を死滅させるために効果的な量のＮ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）又は薬理学的に許容されるその塩を含有する媒質にさらす。次に死んだ細胞を分離し、ノニオン界面活性剤ノニデット（Ｎｏｎｅｄｅｔ）ｐ−４０（ＮＰ４０）で処理して表面抗原を溶解し、それを廃棄する。本発明の免疫原ポリペプチドを含む粒子状抗原は、細胞破壊後の遠心分離によって回収できる。これらのポリペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次に８Ｍ尿素、０．０２５Ｍトリス（トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン）中４℃で５分間超音波をかけて再分散する。次に、ポリペプチドをＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムのクロマトグラフにかけ、８Ｍ尿素、０．０２５Ｍトリスを含有するｐＨ８．３の０．０５〜０．３ＭＮａＣｌで段階的に溶離させる。タンパク質７分画を回収して、各分画のポリペプチドを、アルミナを含有するＰＢＳに再分散することによって、各タンパク質分画を含む接種材料を作製する。
【００１１】
さらに他の実施形態において、アマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、シャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）、ドノバン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｄｏｎａｖａｎｉ）、幼児リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｉｎｆａｎｔｕｍ）、大形リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｍａｊｏｒ）、パナマ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｐａｎａｍｅｎｓｉｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｔｒｏｐｉｃａ）、及びガイアナ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｇｕｙａｎｅｎｓｉｓ）からなる群から選択した単一のリーシュマニア種の分離ポリペプチドを含む第２世代１価免疫療法剤を示す。単一のリーシュマニア種はアマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、及びシャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）からなる群から選択することが好ましい。この免疫療法剤調製手順は、その他については、第２世代多価免疫療法剤について上記した手順と同一である。
【００１２】
別の方法として、本発明のポリペプチドは、知られた手法及び技法に従って合成するか、又は所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の１つ若しくは２つ以上で宿主細胞を形質転換することにより遺伝子組み換えで産生することができる。ポリペプチドは宿主細胞で発現できて、分離して所望の精製度に精製できる。本発明のポリペプチドは、本発明に従って、乾癬治療の第３世代の免疫療法剤として使用できる。
【００１３】
本発明はさらに、適当な宿主細胞を形質転換してそれらの細胞に本発明のポリペプチドを産生させるよう働く核酸配列に関する。前記核酸配列は、恒温動物にそのまま又は薬理学的に許容できる組成物の一部として投与して免疫応答を生じさせ、それにより該動物に乾癬の臨床的寛解を誘導することに役立つ。また、遺伝分析のための標識プローブとして、又は核酸分子量マーカーとして有用である。
【００１４】
分子生物学の当業者は、本明細書での教示を考慮して、本発明のポリペプチドをコードする核酸を得ることができる。例えば、本発明の第１世代の免疫療法剤のポリペプチドは、リーシュマニア属の原生動物から分離され精製されていて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定すると８バンドを含み、各バンドはそれぞれ見かけの分子量２１、３３、４４、５０、５５、５８、６５、及び７７ｋＤａの８種の相異なるポリペプチドを表す。これらのバンドの各々は別々のポリペプチドを表していて、各ポリペプチドは分離して標準的アミノ酸配列決定手順に従って配列を決定できる。各第２世代免疫療法剤のポリペプチドは、８種のポリペプチドの混合物を含む第１世代免疫療法剤を、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）・セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）のクロマトグラフにかけて精製した。乾癬を治療する全ての活性を有する２分画を、標準的手順により、分離し、完全に還元し、アルキル化した。これらの分画をアクリルアミド・ゲル上で電気泳動にかけて構成ポリペプチドに分離し、標準的タンパク質配列決定手順によって各ポリペプチドのアミノ酸配列を得た。これらのポリペプチドの各々をコードするヌクレオチド配列は、これらのアミノ酸配列から遺伝子コードを適用することにより導き出すことができる。
【００１５】
それに加えて、本発明は、本発明の免疫原ポリペプチドをコードする核酸を微生物宿主細胞へ導入することにより、大量の該ポリペプチドを産生することを考慮に入れている。核酸は宿主細胞のゲノム中に直接導入するか、又は先ずベクターに導入して次にベクターを宿主に導入することができる。直接導入の典型的な方法には、組替えファージ又はコスミドによる形質導入、特別の処理をした宿主細菌細胞に裸のファージのクロモソームの取り込みを起こさせ得るトランスフェクション、及びカルシウム沈殿による形質転換が挙げられる。これらの方法は当業者によく知られている。
【００１６】
代表的ベクターには、プラスミド、コスミド、及びファージが挙げられる。リーシュマニア種のゲノム・ライブラリーは通常の手段でつくることができ、興味あるＤＮＡはそこから分離できる。例えば、リーシュマニア原虫のＤＮＡを分離することができて、知られている制限酵素で切り出すことができる。それから、生成したＤＮＡ断片を、適合性宿主に導入するために、適当なクローニングベクター中に挿入できる。意中の宿主によって、ベクターは種々の制御領域及びその他の領域を含んでいてよく、通常は、複製開始点、１つ又は複数のプロモーター領域、及び形質転換細胞選択のためのマーカーを含む。一般的に、ベクターは目的ＤＮＡの発現及び増幅のための制御シグナルを提供するであろう。
【００１７】
種々のマーカーを形質転換細胞の選択のために用いることができ、殺生剤抵抗性、特に、アンピシリン、テトラサイクリン、トリメトプリム、クロラムフェニコール、及びペニシリンなどの抗生物質、コリシンなどの毒物、並びに水銀塩などの重金属に対する抵抗性が挙げられる。或いは、栄養要求性宿主に必須の栄養を供給する相補性を用いることもできる。
【００１８】
本発明のポリペプチドを産生するために、当業者によく知られた技法に従って用いることができる宿主には、原核生物即ち細菌、及び酵母を含む真菌、藻、原生動物、糸状菌等などの真核生物などの単細胞微生物並びに培養中又は植物体中両者の植物細胞が含まれる。形質転換を受けやすい具体的な細菌には、種々の株の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）の細菌、及びサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母その他が含まれる。本明細書で使用する微生物宿主細胞という用語は、これらの原核及び真核生物を全て、植物細胞も培養されているもの及び植物体になっているもの両方を含めて包含する。
【００１９】
ＤＮＡライブラリーの或る断片とハイブリダイズする普遍的プローブを得ることは可能で、興味ある遺伝子即ち本発明の一部として記載したポリペプチドをコードするこれらのヌクレチド配列の同定及び選択（即ち「探り出し」（ｐｒｏｂｉｎｇ  ｏｕｔ））が可能になる。これらの遺伝子の分離は、分子生物学の当業者によく知られた技法を使用して実施できる。分離した遺伝子は、微生物宿主細胞の形質転換に使用する適当なベクターに挿入することができる。それに加えて、これらの遺伝子を標準的な核酸配列決定法にかけて、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のヌクレオチド配列に関する特異的情報を提供できる。
【００２０】
宿主細胞中での発現を向上する遺伝子を合成するときには、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように遺伝子を設計することが望ましいことが、今や当業者によく知られている。本発明の目的にとって、「好ましいコドン使用の頻度」とは、与えられたアミノ酸を特定するヌクレオチドのコドンの使用にあたって特定の宿主細胞により示される選択を指す。遺伝子中の特定のコドンの使用頻度を決定するために、遺伝子中のそのコドンの出現数を、遺伝子中の同じアミノ酸を特定する全てのコドンの出現数の合計で割る。同様に、宿主細胞が示す好みのコドン使用の頻度は、宿主細胞が発現する多数の遺伝子中における好みのコドンの使用頻度を平均することによって計算できる。この解析は宿主細胞により高度に発現される遺伝子に限定することが好ましい。
【００２１】
このように、本発明の一実施形態において、細菌、植物又はその他の細胞を、遺伝子操作によって、例えばリーシュマニア諸種原虫の遺伝子で形質転換して、本発明のポリペプチド又はタンパク質を所望の高い発現レベルで得ることができる。遺伝子の発現を強化するために、高度に発現する遺伝子にとって好ましいコドンを含むように遺伝子のＤＮＡ配列を一部変更して、ヌクレオチド塩基組成中のＡ＋Ｔ含有量を、形質転換した宿主細胞と実質的に同じすることができる。また、前記宿主細胞にとって最適の開始配列を形成し、ＲＮＡの不安定化、不適当なポリアデニル化、分解及び停止を惹起する配列を排除して、２次構造のヘアピン部及びＲＮＡスプライス部位を構成する配列を回避することが好ましい。例えば、合成遺伝子においては、与えられたアミノ酸を特定するために使われるコドンは、そのアミノ酸を特定するために宿主細胞内で高度に発現する遺伝子に使われるコドン使用の分布頻度を考慮して選択することができる。当業者が理解しているように、合成遺伝子で使用するコドン使用分布頻度が発現レベルの決定要因である。
【００２２】
本発明の遺伝子の構築は、当業者に知られた標準的な技法を使用して実施できる。宿主細胞内で強く発現するように設計した構造遺伝子は、化学的に合成したオリゴヌクレオチド２本鎖セグメントから、ＤＮＡベクター中に酵素を用いて構築することができる。さらに、その遺伝子を当業者に知られた方法で宿主細胞に導入して発現させることができる。合成遺伝子の発現で産生したタンパク質が天然タンパク質と機能的に等価であることが好ましい。本発明において、「機能的に等価」とは、機能が同一又は殆ど同一ということを指す。活性又は機能に関して、天然タンパク質に類似又は同一の性質を少なくとも１つ有する合成遺伝子産生物は、天然たんぱく質に機能的に等価とみなされる。
【００２３】
これもまた当業者によく知られていることであるが、本発明のヌクレオチド配列を切り詰めて、もとの全長配列からできる或る断片が、全長配列の所望の特性を保持するようにできる。大きな核酸分子から断片を生じさせるのに適した多種多様の制限酵素が、当業者によく知られている。例えば、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼは、時間制御によるＤＮＡ部分消化の目的で便利に使用できることがよく知られている。例えばＭａｎｉａｔｉｓら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９８２）、１３５〜１３９頁を参照されたい。また、Ｗｅｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１９８３）、１３００６〜１３５１２頁も参照されたい。このようにして、Ｂａｌ３１（通常「ｅｒａｓｅ−ａ−ｂａｓｅ」法と称する）が、本発明の核酸のどちらか一方又は両方の端からヌクレオチドを除去することを可能にし、その結果、広範囲の断片を生成させるが、その断片の多くは本発明の天然ポリペプチド配列と機能的に等価な産生物をコードしている。標識法もよく知られていて、当業者ならば、ハイブリダイズのための標識断片を、それらのプローブとしての有用性を決定する特徴に基づいて選別することは日常的に行っている。例えば、遺伝子同定又は診断手法における特異的且つ選択的プローブとして使用するために核酸を標識することは、日常的に行われることである。リーシュマニア全般のＤＮＡに特異的且つ選択的にハイブリダイズする配列の変形又は断片がプローブとしても機能することを、当業者ならば認めるであろう。本発明の核酸の或るセグメントが、本発明に従って特異的且つ選択的にハイブリダイズする断片又は変形種であるかどうかを決定することは、当業者の通常の技術範囲内であって、過度の実験を必要としない。それ故、これらの核酸の断片又は変形種はリーシュマニア種を同定、診断、又は識別するためのプローブとして有用になり得る。
【００２４】
本発明のポリヌクレオチド又はペプチドは、それぞれの核酸又はアミノ酸の分子量決定若しくは測定における分子量マーカーとして役立ち得るということも認められるであろう。
【００２５】
本発明の第１世代免疫療法剤を得るために、リーシュマニア属の生物を表１に挙げた成分を含む合成培地によって培養できる。好ましい実施形態においては、培地に５％胎児仔牛血清を補充する。本発明による原虫の培養は、通常約３０乃至３４℃で実施される。特に好ましい実施形態においては、前記原虫の培養は、その生活環の無鞭毛型ステージで実施する。
【００２６】
【表１】
2007522221.tif 000002
【００２７】
次に、原虫細胞を含む培地を、該細胞を不活化、及び好ましくは死滅させる目的で処理することができる。これらの細胞を分離して、それらから抗原タンパク質を精製し、薬理学的に許容される担体、例えば緩衝溶液に含有させて第２世代の免疫療法剤を作成することができる。好ましくは、前記細胞を非溶解性の薬剤例えばＴＬＣＫで不活化又は死滅させる。本発明の抗原タンパク質は、許容できる方法を用いて細胞から分離できる粒子状タンパク質である。さらに具体的な実施形態においては、本発明の第２世代の免疫療法剤の作成方法として、（１）適当な培地中で原虫を好ましくは無鞭毛ステージで培養する、（２）前記原虫細胞を処理して該細胞を不活化又は死滅させる、（３）処理した細胞を分離する、（４）分離した細胞から抗原タンパク質を抽出する、及び（５）分離した抗原タンパク質の１つ又は２つ以上を薬理学的に許容される担体例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と配合することにより第２世代免疫療法剤組成物を調製する、の各段階が含まれる。好ましい薬理学的に許容される担体は、溶液中にアルミナが存在するＰＢＳ溶液である。
【００２８】
乾癬の臨床的及び組織病理学的診断のついた患者の乾癬を治療するために、第１世代の多価免疫療法剤を三角筋部の筋肉中に、疾患の重症度に従って、月に１度、１５日に１度、又は１週間に１度、平均で７．６±６．０ヶ月、１回５００μｇずつ投与した。
【００２９】
さらに乾癬を治療するために、第１世代の多価免疫療法剤中に存在するリーシュマニアの各１種を有する１価免疫療法剤を本発明の組成物として使用し、多価免疫療法剤と同様な結果を得た。
【００３０】
さらに乾癬を治療するために、粗第１世代免疫療法剤からクロマトグラフ法によって分離したタンパク質分画に加えて０．１ｍｌアルミナ／ｍｇタンパク質を含有する第２世代免疫療法剤を、三角筋部の筋肉中に、１５日毎に、１回０．５ｍｌ中２００μｇずつ、３乃至４回にわたって投与した。
【００３１】
次に示すものは、本発明を実行する手順を例示することになる実施例である。これらの例は制限的なものと解すべきではない。百分率は全て重量基準であり、溶媒混合率は特に断らない限り容積基準である。
【００３２】
〔実施例１〕
免疫原の調製
リーシュマニア属の微生物を、５％胎児仔牛血清を補充した表１に明細を示した合成培地中通常約３０乃至３４℃、無鞭毛型ステージで培養した（Ｏ’Ｄａｌｙら、Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐｉｃａ（Ｂａｓｅｌ）、４５（１９８８）、１０９〜１２６頁）。第２世代の免疫療法剤のために、成長の定常期中の無鞭毛体を遠心分離（８００×ｇ、４℃で２０分間）によって回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄して、すでに述べたように寄生生物を不活化するためにＴＬＣＫ１５０μｇを含有するイーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中３０乃至３４℃で３日間インキュベートした。（Ｏ’Ｄａｌｙら、Ａｃｔａ  Ｔｒｏｐｉｃａ（Ｂａｓｅｌ）、４３（１９８６）、２２５〜２３６頁）。ＰＢＳで２回洗浄した後（１２、１００×ｇ、４℃で１０分間）、１×１０８寄生生物／ｍｌを０．１２％ノニデットＰ４０（ＮＰ４０、Ｓｉｇｍａ）含有ＭＥＭ中４℃で３０分間インキュベートして、表面抗原を溶解し、それを廃棄した（Ｏ'Ｄａｙら、Ａ  Ｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．、４３（１９９０）、４４〜５１頁）。粒子状抗原を遠心分離によって回収し（１２、１００×ｇ、４℃で１０分間）、ＰＢＳで２回洗浄し、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（型式  ＷＩ  ８５、ヒース・システムス・ウルトラソニック・インコーポレイテッド社（Ｈｅａｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州プレインヴュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）所在）中で、マイクロチップ出力を限界５０Ｗに制御して４℃で５分間超音波処理した。タンパク質含有量は、ローリー法によって定量した（Ｌｏｗｒｙ、０．ら、Ｊ．ＢｉｏＬ．Ｃｈｅｍ．、１９３（１９５１）、２６５〜２７５頁）。最終的１価第１世代免疫療法剤製剤は、アルミナ（水酸化アルミニウム低粘度ゲルＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ、Ｒｅｈｅｉｓ  Ｉｎｃ．、ニュー・ジャージー州所在）を寄生生物タンパク質１ｍｇ当り０．１ｍｌの濃度（ｖ／ｗ）で含むＰＢＳ中に各リーシュマニア種抗原を１ｍｇ／ｍｌ含有した。免疫原調製の各段階で、無菌性を確認した。
【００３３】
本発明のもう１つの実施形態においては、粒子状抗原を遠心分離によって回収し（１２、１００×ｇ、４℃で１０分間）、ＰＢＳで２回洗浄し、８ｍｏｌ／ｌの尿素、０．０２５ｍｏｌ／ｌのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含む溶液に溶解して、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（型式  ＷＩ  ８５、ヒース・システムス・ウルトラソニック・インコーポレイテッド社（Ｈｅａｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州プレインヴュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）所在）中で、マイクロチップ出力を限界５０Ｗに制御して４℃で５分間超音波処理した。タンパク質分画は、ＤＥＡＥクロマトグラフによって分離した。
【００３４】
第２世代の免疫療法剤は、粗第１世代免疫療法剤中に存在するリーシュマニアの１種のみ、例えばブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）又は他のリーシュマニア種を含む本発明の組成物のＤＥＡＥクロマトグラフィーによって分離したタンパク質７分画の各１分画を用いて調製した。タンパク質含有量は、ローリー法によって定量した（Ｌｏｗｒｙ、０．ら、Ｊ．ＢｉｏＬ．Ｃｈｅｍ．、１９３（１９５１）、２６５〜２７５頁）。各タンパク質分画をＰＢＳに溶解し、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（型式  ＷＩ  ８５、ヒース・システムス・ウルトラソニック・インコーポレイテッド社（Ｈｅａｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州プレインヴュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）所在）中で、マイクロチップ出力を限界５０Ｗに制御して４℃で５分間超音波処理した。それに続いて、各分画を０．２０μｍミリポア・フィルター（登録商標）を通して無菌にした。最終免疫原製剤は、アルミナ（水酸化アルミニウム低粘度ゲルＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ、Ｒｅｈｅｉｓ  Ｉｎｃ．、ニュー・ジャージー州所在）をタンパク質分画１ｍｇ当り０．１ｍｌの濃度（ｖ／ｗ）で含むＰＢＳ中に、各リーシュマニア種抗原分画を４００μｇ／ｍｌ含有した。第２世代免疫原調製の各段階においても、無菌性を確認した。
【００３５】
一定分量に分けたものを、５％胎児仔牛血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）を含むＥＳＭ中で、及び１２．５％（ｗ／ｖ）バクト・ペプトン（Ｂａｃｔｏ−Ｐｅｐｔｏｎｅ、Ｄｉｆｃｏ）、１２．５％（ｗ／ｖ）酵母抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、３．７５％（ｗ／ｖ）グルコース、及び３．７５％（ｗ／ｖ）ＢＢＬ寒天（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を含む寒天プレート中でインキュベートした。試料を３７℃で７２時間インキュベートすると、速やかに成長する細菌が検出され、２６℃で３週間では成長の遅い細菌及び真菌が検出された。免疫原の各バッチは、リーシュマニアタンパク質バンドのパターンにおける一致を確保するために、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって管理した。第１及び第２世代の免疫療法剤からの各バッチも、発熱物質の存在をＥ−ＴＯＸＡＴＥ（Ｓｉｇｍａ）で試験した。第１世代の免疫原は４℃で少なくとも４週間安定であった。
【００３６】
〔実施例２〕
免疫原のタンパク質成分
上記実施例１で述べた手順によって得た免疫原から、ＴＬＣＫ処理してＮＰ−４０で抽出した、アマゾン・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、シャーガス・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）からの無鞭毛体抽出物のＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によって、８種のタンパク質バンドが同定され、見かけの分子量は２１、３３、４４、５０、５５、５８、６５、及び７７ｋＤａであった。無処理の全無鞭毛体抽出物では、各リーシュマニア種で、分子量が２９から９６ｋＤａの範囲の２８乃至３０バンドが観察されて、主要なバンドは２９、３４、４３、５８、及び６５ｋＤａで観察された。
【００３７】
第２世代免疫療法剤の免疫原製剤は、ＤＥＡＥクロマトグラフィーと全還元とアルキル化との後で得られたタンパク質分画３及び４を含むが、分子量７３、８０、及び８２ｋＤａの３バンドを有していた。
【００３８】
〔実施例３〕
安全性及び免疫原性
上記実施例１及び２で述べた第２世代免疫療法剤のタンパク質を含む免疫原組成物を、５ｍｍを超える皮内反応（ＩＤＲ）を誘発できる投与量を決定する目的で、ヒト志願者に５０μｇで始めて各月５０μｇずつ投与量を増加させて注射した。この投与量は２００μｇであることがわかった。免疫療法剤の最終投与後１ヶ月及び６ヶ月の両方で、追跡血液検査をこの志願者について実施した。血球数；白血球分画；尿素；クレアチニン；糖；アルカリホスファターゼ；ビリルビン；トランスアミナーゼ；コレステロール；トリグリセリド；Ｃ反応性タンパク質；ＶＤＲＬ、ＨＩＶ、抗核抗体などの血清学的検査；ＬＥ細胞；及び尿と糞便の分析である。全ての値は正常の限度内にあって、副作用は認められなかった。
【００３９】
〔実施例４〕
免疫療法剤組成物の調製
第１世代の１価免疫療法剤として、培養した各リーシュマニア種無鞭毛体を遠心分離（８００×ｇ、４℃で２０分間）によって回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、すでに述べたように寄生生物を不活化するために、ＴＬＣＫ１５０μｇを含有するＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中１×１０８寄生生物／ｍｌにして、３０乃至３４℃で３日間インキュベートした。この段階は、無鞭毛体が成長の定常期にあるときに、ＰＢＳで２回洗浄して（１２、０００×ｇ、４℃で１０分間）実施することが好ましい。
【００４０】
特に好ましい実施形態において、本発明による感染防御１価第１世代免疫原組成物の調製は、次の諸段階を含む：
Ａ）無鞭毛体状態にあるリーシュマニア属の微生物を、表１に挙げた成分を含み、５％胎児仔牛血清を補充した合成培地中で、通常３０乃至３４Ｃで培養する；
Ｂ）成長の定常期中で、無鞭毛体ステージにあるリーシュマニア属の微生物を、前記細胞を死滅させるために効果的な量のＮ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン又は薬理学的に許容されるその塩を含有する媒質にさらす；
Ｃ）前記死滅細胞を分離する；
Ｄ）表面タンパク質をノニオン界面活性剤ノニデットｐ−４０で抽出する；
Ｅ）前記調製物を遠心分離して粒子状抗原を分離する；
Ｆ）ＰＢＳで２回洗浄する；及び
Ｇ）前記死滅細胞からの前記粒子状抗原を、アルミナを含有するリン酸緩衝生理食塩水中に再分散することによって、前記粒子状抗原を含む免疫接種材料を作製する。
【００４１】
第２世代の免疫療法剤組成物として、培養した無鞭毛体を遠心分離（８００×ｇ、４℃で２０分間）によって回収し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して、すでに述べたように寄生生物を不活化するために、ＴＬＣＫ１５０μｇを含有するＥａｇｌｅのＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中１×１０８寄生生物／ｍｌにして、３０乃至３４℃で３日間インキュベートした。この段階は、無鞭毛体が定常期にあるときに、ＰＢＳで２回洗浄して（１２、０００×ｇ、４℃で１０分間）実施することが好ましい。
【００４２】
特に好ましい実施形態において、本発明による感染防御第２世代免疫原組成物の調製は、次の諸段階を含む：
Ａ）無鞭毛体状態にあるリーシュマニア属の微生物を、表１に挙げた成分を含み、５％胎児仔牛血清を補充した合成培地中で、通常３０乃至３４℃で培養する；
Ｂ）成長の定常期中で、無鞭毛体ステージにあるリーシュマニア属の微生物を、前記細胞を死滅させるために効果的な量のＮ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン又は薬理学的に許容されるその塩を含有する媒質にさらす；
Ｃ）前記死滅細胞を分離する；
Ｄ）表面タンパク質をノニオン界面活性剤ノニデットｐ−４０で抽出する；
Ｅ）前記調製物を遠心分離して粒子状抗原を分離する；
Ｆ）ＰＢＳで２回洗浄する；
Ｇ）８ｍｏｌ／ｌの尿素、０．０２５ｍｏｌ／ｌのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）を含む溶液に溶解して、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（型式  ＷＩ  ８５、ヒース・システムス・ウルトラソニック・インコーポレイテッド社（Ｈｅａｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍｓ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州プレインヴュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）所在）中で、マイクロチップ出力を限界５０Ｗに制御して４℃で５分間超音波処理する；
Ｈ）タンパク質分画を、ＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム中、８ｍｏｌ／ｌ尿素、０．０２５ｍｏｌ／ｌトリスを含有するｐＨ８．３の溶液中ＮａＣｌ濃度０．０５〜０．３ｍｏｌ／ｌでＮａＣｌ段階溶離により分離する；及び
Ｉ）前記死滅細胞からの前記粒子状抗原を、アルミナを含有するリン酸緩衝生理食塩水中に再分散することによって、前記粒子状抗原を含む免疫接種材料を作製する。
【００４３】
特に好ましい実施形態において、本発明による乾癬の臨床的寛解のための第２世代免疫原組成物の調製は、次の諸段階を含む：
Ａ）無鞭毛体状態にあるリーシュマニア属の微生物を、表１に挙げた成分を含み、５％胎児仔牛血清を補充した合成培地中で、通常約３４℃で培養する；
Ｂ）成長の定常期中で、無鞭毛体ステージにあるリーシュマニア属の微生物を、前記細胞を死滅させるために効果的な量のＮ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン又は薬理学的に許容されるその塩を含有する媒質にさらす；
Ｃ）前記死滅細胞を分離する；
Ｄ）表面タンパク質をノニオン界面活性剤ノニデットｐ−４０で抽出する；
Ｅ）第１世代免疫療法剤中に存在するリーシュマニアの１種のみ、例えばブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）又は他のリーシュマニア種由来の粒子状抗原のＤＥＡＥセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）クロマトグラフィー；
Ｆ）０．０５乃至０．３ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌで段階溶離を用いて分別した、８ｍｏｌ／ｌ尿素、０．０２５ｍｏｌ／ｌトリスを含むｐＨ８．３の溶液中のタンパク質７分画を分離する；
Ｇ）蒸留水による透析及びタンパク質分画の凍結乾燥；
Ｈ）タンパク質分画のリン酸緩衝生理食塩水への溶解；
Ｉ）各分画のタンパク質含有量を、ローリー法により定量する（Ｌｏｗｒｙ、０．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９３（１９５１）、２６５〜２７５頁）；
Ｊ）各タンパク質分画をＰＢＳに溶解し、Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ（型式ＷＩ  ８５、ヒース・システムス・ウルトラソニック・インコーポレイテッド社（Ｈｅａｔｈ−Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ、Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州プレインヴュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ）所在）中で、５０Ｗの出力制御のマイクロチップ限界で４℃で５分間超音波処理する；
Ｋ）各分画を０．２０μｍミリポア・フィルター（登録商標）を通す；及び
Ｌ）前記タンパク質分画の１又は２以上を、アルミナを含むリン酸緩衝生理食塩水に再分散することにより、前記タンパク質分画の１又は２以上を含む第２世代の免疫接種材料を作製する。
【００４４】
〔実施例５〕
アマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）、ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）、ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、及びシャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）を含む第１世代多価免疫療法剤を用いる乾癬の治療
【００４５】
【表２】
2007522221.tif 000003
【００４６】
患者の大部分（７９．１７％）は年齢２６から６５歳の間で、平均年齢は４２．５６±２６．１１歳、年齢範囲は１から８８歳の間であった。
【００４７】
【表３】
2007522221.tif 000004
【００４８】
３５％が乾癬に罹った両親を持ち、発病時期は１１．６±９．８歳、男性及び女性同様であり、範囲は２から４６歳の間であった。
【００４９】
【表４】
2007522221.tif 000005
【００５０】
９２．６％が斑状乾癬（尋常性乾癬、plaque psoriasis）の臨床形態を有し、分布は斑状乾癬の純型（７９．１％）、又は滴状関連（１０．１％）、又は関節炎関連（３．４％）であった。また、１０．１％が滴状の純型であり、０．３％が掌及び足裏型で、１．８％が紅皮症を有し、３．４％が乾癬関節炎であった。
【００５１】
【表５】
2007522221.tif 000006
【００５２】
患者の９６％が治療に反応して、治療前の初期ＰＡＳＩ値からのＰＡＳＩ値低下が１０％を超え、１０％未満のＰＡＳＩ値低下は４％に過ぎなかった。２８％は病変が１００％寛解し、病気が完全に消失し、男性及び女性において同様であった。初期ＰＡＳＩ値との比較で、全体として７４％が病変の７０から１００％の間の寛解、２１％が１０から６９％の寛解であった。志願者の１７．４％は免疫療法剤を１乃至２回投与後に治療を中止した（下記参照）。
【００５３】
【表６】
2007522221.tif 000007
【００５４】
乾癬の１００％寛解には７．６±６．０回の免疫療法剤投与が必要であった。７０乃至９０％及び４０乃至６９％寛解群における投与回数は若干高目で、それぞれ１１．０±１０．０及び９．０±９．６の回数に達しており、このことは臨床的寛解が主として志願者の免疫応答に依存することを示唆している。免疫療法剤抗原に反応できる患者は、治療の始めからそのように決まっているのである。応答しない患者は、免疫療法剤投与の回数を上げても、応答しないままである。
【００５５】
【表７】
2007522221.tif 000008
【００５６】
病変の完全寛解した患者６４８人のうち、１８８人の志願者（２８．９％）が１５．４±２０．６ヶ月後に病気を再発した。再発時のＰＡＳＩ値は、治療前の初期ＰＡＳＩ値の１／３であった。新しい臨床寛解におけるＰＡＳＩは、再発時におけるＰＡＳＩよりも相当低かった。新寛解は免疫療法剤７．１±６．８回投与で５．８±４．９週後に得られ、期間は、病変の臨床的寛解のための最初の治療サイクルで観察された期間よりも短かった。この再発群中８５．６％の患者で、免疫療法剤を６乃至７回投与して、再び病変が寛解した。
【００５７】
【表８】
2007522221.tif 000009
【００５８】
乾癬患者の半数未満で、接種部位に軽微な副作用が観察され、性別又は年齢による差異はなかった。これらの副作用は全て数日以内に消失した。第１世代の免疫療法剤の投与を２１．４±１３．１回受けた乾癬患者５５名の試料を実験室で分析した結果を、表９に示す。全ての値は正常範囲内であった。
【００５９】
【表９】
2007522221.tif 000010
【００６０】
〔実施例６〕
第１世代１価免疫療法剤の試験
【００６１】
【表１０】
2007522221.tif 000011
【００６２】
免疫療法剤は、第１世代の免疫療法剤からのリーシュマニアの個々の種の使用によっても調製し、それに続いて乾癬病変の臨床的寛解を導く能力を試験した。表１０の結果は、乾癬患者における病変の臨床的寛解を得るために、第１世代の免疫療法剤中の４種のリーシュマニアの混合物を調製する必要がないことを明確に示した。治療後ＰＡＳＩを１００％も低下させるために、１種のリ−シュマニアが、多価免疫療法剤で使用した４種の混合物と同じく有効である。このように全てのリーシュマニア抽出物中には、乾癬関連の炎症を抑制する因子がある。
【００６３】
〔実施例７〕
製剤化及び投与
本発明の化合物は、治療用及び非治療用両方の種々の目的に有用である。本発明の新化合物及びそれらを含有する組成物の治療への応用は、当業者に現在知られている又は今後知られると予期される如何なる適当な方法及び技法によっても成し遂げられると考えることができる。さらに本発明の化合物は、他の有用な化合物及び組成物を調製するための出発原料又は中間体として有用である。
【００６４】
上の適応症にある受容者に投与する投与量は、感染がどのようなものであるかということ、受容者の年齢、体重、及び健康状態を含む、関与する受容者のタイプ、同時に行われている治療があるか、及びある場合にはその性質、治療頻度、及び治療可能比に依存するであろう。
【００６５】
本発明の化合物は、薬剤組成物を調製するための既知の方法によって製剤化できる。製剤化は、当業者によく知られ且つ容易に入手できる多くの資料に詳細に記述されている。例えば、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ著「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」には、本発明に関連して使用できる製剤化の記述がある。通常、本発明の組成物は、該組成物の投与効果を向上する目的で、有効量の生理活性化合物を適当な担体と配合して製剤化されるであろう。
【００６６】
〔実施例８〕
リーシュマニア種由来のタンパク質分画のクロマトグラフによる分離及びヒト末梢血単核細胞を用いる幼若化検定
前に述べたようにして、各無鞭毛型寄生生物をＴＬＣＫで処理し、ＮＰ−４０で抽出した後、第１世代免疫療法剤の第１成分であるシャーガス・リーシュマニア由来の粒子状抽出物（ＰＰ７５）から、７分画を分離した。
【００６７】
これらの分画を、当業者が日常的に使用する方法に従って、ワクチン接種前及び後の乾癬患者の末梢血単核細胞を用いて幼若化検定で試験した。例えば、ＲＰＭＩ−１６４０に溶解した各分画の分取量１００μｌ（３組）を、平底マイクロタイター・プレート（Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ製）中で、当業者の日常的方法により、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥ（Ｓｉｇｍａ製）で分離し、加熱不活性化胎児仔牛血清２０％を含むＲＰＭＩ−１６４０の１００μｌに再分散した２×１０５の末梢血単核細胞と共にプレインキュベートした。コンカナバリンＡをリンパ球刺激のポジティブ・コントロールとして使用した。４８時間後に、０．２μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンを分取量１０μｌで加え、試料をさらに１８時間インキュベートした。細胞は、自動セル・ハーベスター（ＭＡＳＨＩＩ）を使用して、濾紙（Ｒｅｅｖｅ  Ａｎｇｅｌ）上に収集した。乾燥したペーパー・ディスクを２．５ｍｌのＡｑｕａｓｏｌ（ＮＥＮ製）と共にミニ・バイアル中に入れて、パッカードＴｒｉ−Ｃａｒｂシンチレーション・カウンター、モデル３３８５で１分間計測した。実験で得た毎分のカウント（ｃ．ｐ．ｍ．）をコントロールのｃ．ｐ．ｍ．で除して、各試料について刺激指数（Ｓ．Ｉ．）を算出した（分画又はマイトジェンとの培養／培地のみでのコントロール培養）。結果は下の表１１乃至１４に例示した。
【００６８】
【表１１】
2007522221.tif 000012
【００６９】
ワクチン接種前の患者群はＳ．Ｉ．＞１．０であった。これらの値はワクチン接種後顕著に上昇した。両群の統計解析結果は次のようである。
ワクチン接種前            ワクチン接種後
パラメーター
平均値          １．６９７１４３          ２．５７１０７２
＃点          ２８                      ２８
標準偏差          ．５２９８８３４          ．６２５９６４５
標準誤差          ．１００１３８６          ．１１８２９６２
最小値            ．８７                  １．６１
最大値          ３．４                    ４．３６
ｔ−検定（対応あり）：
平均の差＝−．８７３９２８６（ペア差の平均）
平均の差の９５％信頼区間：−１．１５００２９から−０．５９７８２８３まで
両側ｐ値は＜０．０００１である。極めて有意。
【００７０】
シャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）抽出物のどの分画で乾癬患者をワクチン接種した後も、リンパ球が有意に刺激されていることをこれらの結果は示している。その中でも高い刺激は、生きた無鞭毛体と同様に分画３及び４で観察された。
第１世代免疫療法剤の第２成分であるブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）粒子状抽出物（ＰＭＨ２７）から、前に述べたようにして、それぞれの無鞭毛型寄生生物をＴＬＣＫで処理し、ＮＰ−４０で抽出した後、７分画を分離した。
【００７１】
【表１２】
2007522221.tif 000013
【００７２】
表１２において、２群の患者はワクチン接種前には顕性で、具体的には、１群はＳ．Ｉ．＜１．０であり、もう１つの群はＳ．Ｉ．＞１．０であった。ワクチン接種後治癒した患者群は、ワクチン接種前のこれらの群のいずれに比較しても顕著に上昇した値を有していた。統計解析結果は次のようである。
Ｓ．Ｉ．＜１．０の群
ワクチン接種前            ワクチン接種後
パラメーター
平均値          １．１５０７１４          ２．２５７８５７
＃点          ２８                      ２８
標準偏差        １．０６２０５２            ．８８７６５３８
標準誤差          ．２００７０９            ．１６７７５０８
最小値            ．４２                    １．０２
最大値          ４．１９                    ４．１３
ｔ−検定（対応あり）：
平均の差＝−１．１０７１４３（ペア差の平均）
平均の差の９５％信頼区間：−１．５３４３８１から−．６７９９０４３まで
両側ｐ値は＜０．０００１である。極めて有意。
【００７３】
Ｓ．Ｉ．＞１．０の群
ワクチン接種前            ワクチン接種後
パラメーター
平均値          ２．９８６４２９          ２．２５７８５７
＃点          ２８                      ２８
標準偏差        １．５０４４７９            ．８８７６５３８
標準誤差          ．２８４３１９９          ．１６７７５０８
最小値          １．２９                  １．０２
最大値          ６．５９                  ４．１３
ｔ−検定（対応なし）：
平均の差＝−．７２８５７１９（Ｂの平均マイナスＡの平均）
平均の差の９５％信頼区間：−１．３９０４から−６．６７４４１３Ｅ−０２まで
両側ｐ値は＜０．０３１６である。有意。
【００７４】
ブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）の抽出物のどの分画でワクチン接種しても、ワクチン接種前の両群のリンパ球が有意に刺激されることをこれらの結果は示している。その中でも高い刺激は、生きた無鞭毛体と同様に分画３及び４で観察された。
【００７５】
第１世代免疫療法剤の第３成分であるベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）粒子状抽出物（ＰＭＨ１６）から、前に述べたようにして、それぞれの無鞭毛型寄生生物をＴＬＣＫで処理し、ＮＰ−４０で抽出した後、６分画を分離した。
【００７６】
【表１３】
2007522221.tif 000014
【００７７】
表１３において、２群の患者はワクチン接種前には顕性で、具体的には、１群はＳ．Ｉ＜１．０であり、もう１つの群はＳ．Ｉ．＞１．０であった。ワクチン接種後治癒した患者群は、ワクチン接種前のこれらの群のいずれに比較しても顕著に上昇した値を有していた。統計解析結果は次のようである。
【００７８】
Ｓ．Ｉ．＜１．０の群
ワクチン接種前            ワクチン接種後
パラメーター
平均値          １．０８９５８３            ３．２０５
＃点          ２４                          ２４
標準偏差        ．４２５０２６９              １．９３８１８１
標準誤差        ８．６７５８２５Ｅ−０２．      ．３９５６２９６
最小値            ．５５                        ．８１
最大値          １．９５                      ７．４１
ｔ−検定（対応あり）：
平均の差＝−２．１１５４１７（ペア差の平均）
平均の差の９５％信頼区間：−３．００８９４４から−１．２２１８９まで
両側ｐ値は＜０．０００１である。極めて有意。
【００７９】
Ｓ．Ｉ．＞１．０の群
ワクチン接種前            ワクチン接種後
パラメーター
平均値          １．８１４１６７          ３．２０５
＃点          ２４                      ２４
標準偏差        ．８０９２２８６            １．９３８１８１
標準誤差          ．１６５１８３          ．３９５６２９６
最小値            ．８３                    ．８１
最大値          ３．９２                  ７．４１
ｔ−検定（対応なし）：
平均の差＝−．７２８５７１９（Ｂの平均マイナスＡの平均）
平均の差の９５％信頼区間：−１．３９０４から−６．６７４４１３Ｅ−０２まで
両側ｐ値は＜０．０３１６である。有意。
【００８０】
ベネズエラ・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｖｅｎｅｚｕｅｌｅｎｓｉｓ）の抽出物のどの分画でワクチン接種しても、ワクチン接種前の両群のリンパ球が有意に刺激されることをこれらの結果は示している。その中でも高い刺激は、生きた無鞭毛体と同様に分画３及び４で観察された。
【００８１】
第１世代免疫療法剤の第４成分であるアマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）粒子状抽出物（ＰＭＨ８）から、前に述べたようにして、それぞれの無鞭毛型寄生生物をＴＬＣＫで処理し、ＮＰ−４０で抽出した後、７分画を分離した。
【００８２】
【表１４】
2007522221.tif 000015
【００８３】
表１４において、２群の患者はワクチン接種前には顕性で、具体的には、１群はＳ．Ｉ＜１．０であり、もう１つの群はＳ．Ｉ．＞１．０であった。ワクチン接種後治癒した患者群は、ワクチン接種前のこれらの群のいずれに比較しても顕著に上昇した値を有していた。統計解析結果は次のようである。
【００８４】
Ｓ．Ｉ．＜１．０の群
ワクチン接種前            ワクチン接種後
パラメーター
平均値          ．７００７４０８            １．２７１７８６
＃点          ２７                          ２８
標準偏差        ．２０４３７３６              ．５４３０５０９
標準誤差        ．０３９３３１７      ．１０２６２７
最小値            ．４５                        ．４７
最大値          １．３９                      ３．１５
ｔ−検定（対応なし）：
平均の差＝−．５７１０４４９（ペア差の平均）
平均の差の９５％信頼区間：．３４７５１７４から．７９４５７２５まで
両側ｐ値は＜０．０００１である。極めて有意。
【００８５】
Ｓ．Ｉ．＞１．０の群
ワクチン接種前            ワクチン接種後
パラメーター
平均値          １．７２６７８６          １．２７１７８６
＃点          ２８                      ２８
標準偏差        ．９２３４７１９            ．５４３０５０９
標準誤差          ．１７４５１９８          ．１０２６２７
最小値            ．８８                    ．４７
最大値          ４．８８                  ３．１５
ｔ−検定（対応なし）：
平均の差＝−．４５４９９９９（Ｂの平均マイナスＡの平均）
平均の差の９５％信頼区間：−．８６０８９２７から−４．９１０７１２Ｅ−０２まで
両側ｐ値は＜０．０２８７である。有意。
【００８６】
アマゾン・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ａｍａｚｏｎｅｎｓｉｓ）の抽出物のどの分画でワクチン接種しても、ワクチン接種前の両群の患者のリンパ球が有意に刺激されることをこれらの結果は示している。その中でも高い刺激は、生きた無鞭毛体と同様に分画３及び４で観察された。まとめると、幼若化反応実験の各々は、第１世代免疫療法剤に含有される各リーシュマニア種由来の任意のタンパク質分画で、特に分画３及び４でワクチン接種すると、リンパ球に有意の刺激を生ずる結果になることを示している。刺激されたリンパ球は、乾癬患者において炎症反応を抑制するサイトカインを産生して、その結果乾癬病変の臨床的寛解をもたらす。
【００８７】
〔実施例１４〕
乾癬患者における液性免疫
【００８８】
【表１５】
2007522221.tif 000016
【００８９】
乾癬患者の血清を、ワクチン接種前及び後に酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて検査した。その結果を表１５に示す。ワクチン接種前と接種後の試料の間で、第１世代免疫療法剤を６回投与した後病変の臨床的寛解に至るまで、吸光度に差は認められなかった。陽性反応に対する境界点（cut-off point）は０．５単位であった。陽性血清は、活性リーシュマニア症患者の試料に属するものだけであった。このことは、第１世代免疫療法剤は液性免疫即ちＴＨ２応答を誘起していないことを示す。
【００９０】
〔実施例１５〕
乾癬患者における細胞性免疫
【００９１】
【表１６】
2007522221.tif 000017
【００９２】
細胞性免疫に対する皮内反応測定の結果を、表１６に示す。このデータは、第１世代免疫療法剤が、治癒した乾癬患者においてＴＨ１応答を誘起していることを示す。第１世代の免疫療法剤のシャーガス・リーシュマニア（Ｌ．（Ｌ）ｃｈａｇａｓｉ）及びブラジル・リーシュマニア（Ｌ．（Ｖ）ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）抗原成分の分画３が、病変寛解後の皮内反応測定で最も高い生体内免疫原活性を示す。これらの種のいずれからの分画４も、高度の活性を示す。
【００９３】
〔実施例１６〕
分離したタンパク質抗原分画を含有する第２世代免疫療法剤での単純盲検試験
【００９４】
【表１７】
2007522221.tif 000018
【００９５】
第２世代免疫療法剤の分画を用いるワクチン接種のＰＡＳＩ値に対する効果を表１７に示す。分画３及び４が乾癬の臨床的寛解に対して最高の活性を示す。これらの分画のいずれかを含む免疫療法剤の２回投与で、ＰＡＳＩはワクチン接種前の患者におけるその初期値に対して８８％低下する。これらの分画はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの幼若化試験において最高の刺激指数を示し、且つ乾癬治癒患者においてワクチン接種後最高のｉｎ  ｖｉｖｏ皮内反応（ＩＤＲ）直径を示した。
【００９６】
〔実施例１７〕
乾癬病変の臨床的寛解を導くタンパク質分画の同定及びキャラクタリゼーション
アクリルアミド・ゲルからのペプチドはニトロセルロース・ペーパーに移して、フロリダ州ゲインズビル（Ｇａｉｎｓｖｉｌｌｅ）所在のフロリダ大学ＩＣＢＲタンパク質化学コア施設で分析した。ＨＰＬＣはヒューレット・パッカード１０９０ＨＰＬＣを使用して行い、消化はＥｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃで行い、アミノ酸分析はＡＢＩ４９４Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して行った。アミノ酸配列の相同性はＢＬＡＳＴプログラムを使用して調べた。
【００９７】
【表１８】
2007522221.tif 000019
分画３は当業者に知られた完全還元及びアルキル化の後３バンドを含んでいた。ペプチド配列の２つを除く全てがケラチンタイプＩ又はＩＩのヒトのタンパク質に対する相同性を示した。分画４も分画３と同様な結果を示した。この無鞭毛型寄生生物ケラチンが、本発明の免疫療法剤の乾癬患者に対する効果の説明になる。多くの著者が、乾癬は表皮角質細胞のヒトケラチンの疾患であると想定してきた。
【００９８】
〔実施例１８〕
フロー・サイトメーターを用いる末梢血リンパ球の分析
【００９９】
【表１９】
2007522221.tif 000020
【０１００】
第１世代免疫療法剤による治療前、全ての乾癬患者が、健常対照者よりも有意に低い末梢血リンパ球数を示した。例外はＨＬＡ及びＩｇＥマーカーでこれらは高レベルで存在した。
【０１０１】
【表２０】
2007522221.tif 000021
【０１０２】
第１世代免疫療法剤による治療前の乾癬患者について末梢血リンパ球集団を検討した。患者は疾患の重症度に分布があり、ＰＡＳＩ値によって表にまとめた。結果は表２０に示した。乾癬患者でＰＡＳＩ値が上昇すると、健常対照者に比較して、末梢血のＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ８−ＣＤ４＋、ＣＤ３、ＣＤ８＋ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ＣＤ３−、ＣＤ８＋ＨＬＡ−のリンパ球数が減少し、一方ＨＬＡ＋の数は増加した。ＰＡＳＩ１乃至９の群では、４つのリンパ球集団が対照の値よりも低いだけであるが、一方ＰＡＳＩ２１乃至６５の群では７リンパ球集団が健常対照者の値よりも低かった。この事実はリンパ球が末梢血から乾癬内患者の皮膚内の真皮及び表皮に移動して疾患の特徴である慢性炎症を誘発することを示唆している。
【０１０３】
【表２１】
2007522221.tif 000022
ＰＡＳＩ値の異なる患者間でリンパ球集団に有意の差がある。１乃至９と１０乃至２０の群間の比較は、４つのリンパ球集団は乾癬の重症度の大きい群で数が減ることを示す。ＰＡＳＩ１乃至９の群とＰＡＳＩが２０を超える群との比較は、７つのリンパ球集団で重症の乾癬病変のある群のリンパ球数が減ることを示す。ＩｇＡ＋リンパ球は重症度の高い方の群で数が多かった。
【０１０４】
【表２２】
2007522221.tif 000023
【０１０５】
病変が完全寛解した後、全ての末梢血リンパ球集団は健常対照者と同程度の正常値に戻った。ＨＬＡ＋及びＣＤ１９リンパ球集団のみ正常対照よりも高い値であったが、おそらく免疫療法剤治療後のリンパ球刺激のためである。
【０１０６】
乾癬病変は、Ｔリンパ球が膨張した皮膚毛細血管から真皮へ移行するので、皮膚内に誘発される。リンパ球に富む炎症性浸潤は、表皮増殖、表皮肥厚、不全角化、及び鱗屑を誘発する。乾癬における変化を誘発する推進力は、主としてＴ細胞からなるリンパ球浸潤の活性であり、それはまた斑（ｐｌａｑｕｅ）の持続にも必要である。
【０１０７】
乾癬の発症及び持続の過程は、Ｔ細胞の活性化、Ｔ細胞の皮膚への移動、及び皮膚内におけるＴ細胞によるサイトカインの分泌である。Ｔ細胞は皮膚内に存在しなければならないので、乾癬を誘発及び／又は持続するためには活性化されなければならない。
【０１０８】
Ｔ細胞が皮膚にホーミングする過程は、分泌される因子及びＴ細胞と内皮との間の相互作用により制御される。第１段階即ちローリングは、移行するＴ細胞の皮膚リンパ球抗原（ＣＬＡ）と内皮細胞上のＥ−セレクチンとの間の細胞−細胞相互作用を介して行われる。この過程には、ケモカインを介するＴ細胞上表面タンパク質の活性化、及びＴ細胞が血管を通過して移動する血管外遊出と呼ばれる過程を完結させる、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ及びＶＬＡ／ＶＣＡＭ相互作用によるＴ細胞と内皮細胞の結合が含まれる。
【０１０９】
最後に、Ｔ細胞、局所マクロファージ、樹状細胞、血管内皮細胞、及び角化細胞自体さえも、多くの相異なる細胞により分泌されるサイトカインのカスケードによって、乾癬における角化細胞変化を誘起する。
【０１１０】
乾癬だけでなく、他の関連ある疾病も類似の作用機序を有する。例えば、アトピー性皮膚炎が同様の作用機序をもつように思われる。本明細書で開示した同じ手法での化合物投与は、アトピー性皮膚炎をもつ患者の病変を著しく退行させることがわかっている。それに加えて、乾癬関節炎が同様な作用機序を有する。乾癬関節炎は乾癬患者のおよそ１５乃至２０％に起こる。乾癬関節炎は滑膜性関節を冒すが、滑膜性関節は、各々軟骨層で覆われ、関節腔で隔てられ、滑膜及び関節包により囲まれた２つの隣接する骨端で構成されている。関節炎の特徴は、リンパ球の経内皮流入により伝達される滑膜の炎症性反応及びＴ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、樹状細胞、マクロファージ及び肥満細胞など種々の単核細胞の局所的活性化並びに新血管形成である。
【０１１１】
リンパ球浸潤の活性から生ずるどのような疾患を治療するためにも、免疫を抑制したりＴ細胞を除去したりする必要はなくて、表１１、１２、１３及び１４で報告した幼若化反応測定により示されるように、むしろ免疫促進物質を供給することができる。分画３及び４は、乾癬病変の１００％寛解後の患者のヒト末梢血リンパ球において最高の刺激指数を有していた。
【０１１２】
末梢血中のリンパ球集団のフロー・サイトメーターを用いる分析によれば、表２０及び２１に示されるように、表１９に示した健常対照者と比較して、乾癬患者においてＰＡＳＩ値が上がると、いくつかのリンパ球集団では細胞数が減少した。病変の臨床的寛解の後、表２２に示したように末梢血リンパ球は正常値に戻った。
【０１１３】
それ故、乾癬及び関連疾患の治療には、新しいサイトカインによるＣＬＡ−Ｅセレクチン相互作用への干渉によるＴ細胞ローリングの抑制若しくは遮断並びに内皮細胞とのＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ相互作用及び／又はＶＬＡ／ＶＣＡＭ相互作用を遮断する未知のＴ細胞クローンの刺激により誘発される新サイトカインによる内皮細胞結合又は血管外遊出への干渉を含む作用機序がある。実際、本発明で開示した組成物を投与した後、患者に最初に見られる臨床所見は皮膚の赤みの減少であり、それは乾癬に典型的な皮膚毛細血管拡張の減少の結果である。
【０１１４】
乾癬関節炎は乾癬患者のおよそ１５乃至２０％に起こる。関節リウマチ（ＲＡ）は慢性炎症性且つ破壊性の関節疾患で、この疾患には工業化した世界の人口のおよそ０．５乃至１％が罹患していて、深刻な身体障害に至り、及びその結果として生活の質が低下する。ＲＡは免疫及び炎症系が軟骨及び骨の破壊に関連している疾患である。しかしながら、この２つの系の間の関連はわかり難く、ＲＡの根本的な原因は未知である。ＲＡは乾癬に類似していて、多遺伝子性の素地があるが、関与する遺伝子は明確にされていない。ＲＡといくつかのタイプの自己抗体との間には強い関連がある。最も重要な自己抗体はリウマチ因子（ＲＦ）で、それはＩｇＧのＦｃ部分に向けられている。乾癬と同様に、ＲＡは感染性因子によって誘発され得ると推測されてきたが、その証拠は依然として不足している。炎症反応の関節特異的局所化の理由もわかっていない。
【０１１５】
多くの形態の関節炎と同様に、ＲＡは初期には経内皮流入によって伝達される滑膜の炎症反応（滑膜炎）及びＴ細胞、Ｂ細胞、形質細胞、樹状細胞、マクロファージ及び肥満細胞など種々の単核細胞の局所的活性化並びに新血管形成により特徴づけられる。関与する細胞を関節にホーミングするに至らせ、その結果としてＴ細胞の反応を誘発する機序には強い関連がある。
【０１１６】
滑膜性関節は、各々軟骨層で覆われ、関節腔で隔てられ、滑膜及び関節包により囲まれた２つの隣接する骨端で構成されている。滑膜は正常のときは１００μｍ未満である。滑膜に浸潤するＴ細胞は、主として、乾癬患者の皮膚に見出されるＴ細胞と同様のＣＤ４＋記憶細胞である。滑膜は正常では１００μｍ未満の厚さで、軟骨及び骨に面する滑膜表層が、滑膜細胞の薄い層で構成されている。滑膜細胞の１タイプはマクロファージ由来で、もう１つのタイプは線維芽細胞由来である。基底膜はない。表層下の相当の血管分布を有する結合組織層に、単核細胞が（あるとしても）少しだけ見出されることがある。滑膜は、軟骨と骨の少し露出した区域とを除く全関節内構造を覆い、軟骨と骨の接合部付近に付着している。
【０１１７】
リンパ浸潤は拡散することができ、又はリンパ節様の構造を形成することがある。この過程は乾癬皮膚内の炎症過程に類似している。表層滑膜層は連続的に分岐して、２０細胞を超える（即ち＞１００μｍ）厚さで肥厚性になり、その結果滑膜は拡張して絨毛を形成する。それに加えて、骨の破壊がある。この過程は乾癬関節炎でも見られる。結果として、本発明のポリペプチドを用いる治療は、リンパ細胞の血液から皮膚への移動を、及び血液から滑膜への移動をも停止させ、それによりＲＡ及び乾癬関節炎両者における慢性炎症に至る炎症過程を逆行させるように作用する。Ｔ細胞受容体上の又は内皮細胞受容体上の血管過程を抑制する新規なサイトカインを産生するＴ細胞を免疫刺激することによって、本発明のポリペプチドはリンパ細胞の移動を停止することができる。
【０１１８】
上述の具体的な実施形態の説明は単に例示的なものであり、本発明の趣旨及び範囲から逸れることなく種々の改良を為すことが可能であって、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【配列表】
2007522221000001.app
【国際調査報告】
2007522221.tif 000024
2007522221.tif 000025
2007522221.tif 000026