(57)【要約】  核酸などの高分子を多様な細胞種へ有効に送達するのに有用なカチオン性脂質組成物が提供される。また、これらの組成物を用いるための方法も提供される。
2007516233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式を有する脂質：
【化１】
2007516233.tif 000011
［式中、Ｘは、Ｎ（Ｒ４Ｒ５Ｒ６）またはジアルキルホスファチジルであるか、またはＸは
【化２】
2007516233.tif 000012
であり、
ＹおよびＺは、アルコキシ、アルカノイルオキシ、アルキルアミン、アルキルウレタンおよびアルキルグアニジンからなる群から独立に選択され、
Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、スペルミイル、スペルミジルおよびカルボキシスペルミイルからなる群から独立に選択され、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素、アルキル、アルケニル、アリールおよびアルキルアリールからなる群から独立に選択され（ただし、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも１つは長鎖アルキルまたはアルケニルである）、
Ｗは、短鎖アルキルまたはアルキルアミノであり、かつ、
Ｒ７は、負電荷または短鎖アルキルである］。
【請求項２】
下記式を有する脂質：
【化３】
2007516233.tif 000013
［式中、Ｘ１は、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨＯＨ）ｎ、−ＮＨ−、−Ｏ−、ポリエーテル、エステル結合、−Ｓ−、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ポリアミド−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択され、
Ｙ１は、（ＣＨ２）ｎ、ポリエーテル、ＮＨＣＯ、−ＣＯ−およびポリアミドからなる群から選択され、
Ｙ２は、（ＣＨ２）ｎ、−ＮＨ−、−Ｏ−、ポリエーテル、エステル結合、−Ｓ−、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ポリアミド−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択され、
Ｚ１およびＺ２は、水素、第一級アルキルアミン、第二級アルキルアミン、第三級アルキルアミン、第四級アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、アルキルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウムアミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質からなる群から独立に選択され、
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は独立に、存在しないか、または水素、直鎖Ｃ１−Ｃ２０アルキル、分枝アルキル、シクロアルキル(cyclalkyl)、直鎖アルケニル、分枝アルケニル、シクロアルケニル、および所望により置換されていてもよいアリールからなる群から選択され、この任意の置換は、存在する場合、−ＯＨ、ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、エステル、アミド、アルキルアミノ、−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択される少なくとも１つの官能基を含んでなり、
ｎ＝１〜１２である］。
【請求項３】
請求項１または２に記載の脂質と、核酸とを含んでなる、組成物。
【請求項４】
核酸がＤＮＡ分子を含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
ＤＮＡ分子が二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ＤＮＡ分子がプラスミドである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
該プラスミドが、自己相補的であって、かつ二本鎖ＲＮＡの一領域を形成する、ＲＮＡ分子をコードする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
核酸がＲＮＡ分子を含んでなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
ＲＮＡ分子が二本鎖ＲＮＡ分子である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
ＲＮＡ分子がｓｉＲＮＡである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
核酸を細胞へ導入する方法であって、真核細胞を請求項３に記載の組成物と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の脂質を含んでなる、細胞をトランスフェクトするためのキット。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の脂質と、ペプチドまたはタンパク質とを含んでなる、組成物。
【請求項１４】
ペプチドまたはタンパク質を細胞へ導入する方法であって、真核細胞を請求項１３に記載の組成物と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１５】
目的のペプチドまたはタンパク質を細胞へ導入するためのキットであって、請求項１または２に記載の脂質を含んでなる、キット。
【請求項１６】
目的分子を組織へ導入する方法であって、組織を、請求項１または２に記載の脂質とを含んでなる組成物と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項１７】
目的分子が、核酸、ペプチド、またはタンパク質である、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本願は、２００３年５月２２日出願の米国出願番号６０／４７２，４０３の優先権を主張するものであり、その内容は引用することによりそのまま本明細書の一部とされる。
【０００２】
核酸を培養細胞へ送達するためのカチオン性脂質の使用は、Felgnerおよび共同研究者ら(Proc. Nat’l Acad. Sci. 84, 7413 (1987))によってはじめて記載された。次に、Behr (Proc. Nat’l Acad. Sci. 86, 6982 (1989))が、ポリカチオン性脂質もまた有効な送達剤であり得ることを示した。現在、多数のカチオン性脂質試薬が記載されており、これら試薬のいくつか、例えば、リポフェクタミン(LipofectAmine)、リポフェクタミン２０００、Ｆｕｇｅｎｅ、トランスフェクタム(TransfectAm)、リポフェクチン(Lipofectin)およびＤＯＴＡＰなどが市販されている。しかしながら、これらの試薬には総ての細胞系統に普遍的に有効なものはないし、ウイルスに基づく遺伝子送達系ほどに有効なものもない。さらに、これらの試薬の大部分はトランスフェクトする細胞に幾分か有毒である。
【０００３】
よって、現在利用できるものよりも毒性が低く、有効性が高く、多様な細胞種をトランスフェクトするのにより普遍的に適用できるトランスフェクション試薬の開発の大きな必要性が依然として存在する。このような試薬は、ウイルスに基づく送達系に比べて安全性リスクおよび免疫原性が最小であることが理想的である。このような試薬の開発の成功は、バイオテクノロジー全般、そして特に遺伝子療法に大きな影響をもたらすであろう。
【発明の概要】
【０００４】
よって、本発明の１つの目的は、核酸などの高分子(macromolecule)を細胞へ送達するのに有用な新規な組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、核酸などの高分子を細胞へ送達するためにこれらの組成物を使用する方法を提供することである。
【０００５】
これらの目的を達成するに当たって、本発明の第一の態様によれば、下記式を有する脂質が提供される：
【化１】
2007516233.tif 000003
［式中、Ｘは、Ｎ（Ｒ４Ｒ５Ｒ６）またはジアルキルホスファチジルであるか、またはＸは
【化２】
2007516233.tif 000004
であり、
ＹおよびＺは、アルコキシ、アルカノイルオキシ、アルキルアミン、アルキルウレタンおよびアルキルグアニジンからなる群から独立に選択され、
Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、スペルミイル、スペルミジルおよびカルボキシスペルミイルからなる群から独立に選択され、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルであり、
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素、アルキル、アルケニル、アリールおよびアルキルアリールからなる群から独立に選択され（ただし、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６のうち少なくとも１つは長鎖アルキルまたはアルケニルである）、
Ｗは、短鎖アルキルまたはアルキルアミノであり、かつ、
Ｒ７は、負電荷または短鎖アルキルである］。
【０００６】
本発明の第二の態様によれば、下記式を有する脂質が提供される：
【化３】
2007516233.tif 000005
［式中、Ｘ１は、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨＯＨ）ｎ、−ＮＨ−、−Ｏ−、ポリエーテル、エステル結合、−Ｓ−、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ポリアミド−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択され、
Ｙ１は、（ＣＨ２）ｎ、ポリエーテル、−ＣＯ−、ＮＨＣＯおよびポリアミドからなる群から選択され、
Ｙ２は、（ＣＨ２）ｎ、−ＮＨ−、−Ｏ−、ポリエーテル、エステル結合、−Ｓ−、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ポリアミド−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択され、
Ｚ１およびＺ２は、水素、第一級アルキルアミン、第二級アルキルアミン、第三級アルキルアミン、第四級アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、アルキルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウムアミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質〜からなる群から独立に選択され、
Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は独立に、存在しないか、または水素、直鎖Ｃ１−Ｃ２０アルキル、分枝アルキル、シクロアルキル(cyclalkyl)、直鎖アルケニル、分枝アルケニル、シクロアルケニル、および所望により置換されていてもよいアリールからなる群から選択され、この任意の置換は、存在する場合、−ＯＨ、ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、エステル、アミド、アルキルアミノ、−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択される少なくとも１つの官能基を含んでなり、
ｎ＝１〜１２である］。
【０００７】
一つの態様では、前記のような脂質と、１以上のペプチド、タンパク質および／または核酸などの１以上の高分子とを含んでなる組成物が提供される。この核酸はＤＮＡ分子、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子を含んでもよい。ＤＮＡ分子はプラスミドであってもよく、例えば、自己相補的であって、かつ二本鎖ＲＮＡの一領域を形成するＲＮＡ分子をコードしてもよい。
【０００８】
もう１つの態様では、この核酸は、１以上のＲＮＡ分子、例えば、１以上の二本鎖ＲＮＡ分子を含んでもよい。ＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡであってもよい。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、真核細胞または組織を上記のような組成物と接触させることによる、ペプチド、タンパク質、および／または核酸を細胞または組織へ導入する方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の態様によれば、上記のような脂質を含んでなる、細胞をトランスフェクトするためのキットが提供される。
【００１１】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示すものであるが、当業者ならば、この詳細な説明から、本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変が明らかであることから、単に例として示すものである。
【発明の具体的説明】
【００１２】
本発明は、核酸およびペプチドおよびタンパク質を多様な細胞および組織へ導入するのに有効な新規な脂質を提供する。これらの脂質は極めて有効であり、試験した総ての細胞種において低毒性を示す。これらの脂質は下記に示される一般構造ＩおよびIIを有する。
【化４】
2007516233.tif 000006
【化５】
2007516233.tif 000007
【００１３】
式Ｉの化合物はアミノアルコール頭部基を含み、ＸはＮ（Ｒ４Ｒ５Ｒ６）またはジアルキルホスファチジルであり得るか、またはＸは
【化６】
2007516233.tif 000008
であり得る。
【００１４】
ＹおよびＺはアルコキシ、アルカノイルオキシ、アルキルアミン、アルキルウレタンおよびアルキルグアニジンからなる群から独立に選択され得る。Ｒ１およびＲ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、スペルミイル、スペルミジルおよびカルボキシスペルミイルからなる群から独立に選択され得る。Ｒ３はＨまたはＣ１−Ｃ４アルキルである。Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、水素、アルキル、アルケニル、アリール、およびアルキルアリールからなる群から独立に選択され、ただし、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６のうち少なくとも１つは長鎖アルキルまたはアルケニルである。このアルキル、アルケニル、アリール、およびアルキルアリール基は、例えば、６〜３０個の炭素原子、有利には１０〜１８個の炭素原子を含み得るが、当業者ならば、これらの基は６未満または３０を超える炭素原子を含んでもよいことが分かるであろう。Ｗは短鎖（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたはアルキルアミノであってよく、Ｒ７は、負電荷または短鎖（Ｃ１−Ｃ６）アルキルであってよい。一般式Ｉに包含される化合物の代表例としては、例えばＲがオレオイルである場合には、下記に示される化合物１２および１３が挙げられる。
【００１５】
単純炭水化物に共役した炭化水素部分を含む式IIの化合物では、Ｘ１は、（ＣＨ２）ｎ、（ＣＨＯＨ）ｎ、−ＮＨ−、−Ｏ−、ポリエーテル、エステル結合−Ｓ−、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ポリアミド−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択され得る。Ｙ１は、（ＣＨ２）ｎ、ポリエーテル、−ＣＯ−、ＮＨＣＯ、およびポリアミドからなる群から選択され得る。Ｙ２は、（ＣＨ２）ｎ、−ＮＨ−、−Ｏ−、ポリエーテル、エステル結合、−Ｓ−、ＣＯＮＨ、ＮＨＣＯ、ポリアミド、−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択され得る。Ｚ１およびＺ２は、水素、第一級アルキルアミン、第二級アルキルアミン、第三級アルキルアミン、第四級アルキルアミン、アルキルアミノアルコール、アルキルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウムアミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質からなる群から独立に選択され得る。Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、およびＲ１１は、独立に、存在しなくてもよいし、または水素、Ｃ１−Ｃ２０直鎖アルキル、分枝アルキル、シクロアルキル(cyclalkyl)、直鎖アルケニル、分枝アルケニル、シクロアルケニル、および所望により置換されていてもよいアリールからなる群から選択されてもよく、この任意の置換は、存在する場合、ＯＨ、ＮＨ２、−ＣＯＯＨ、エステル、アミド、アルキルアミノ、−ＮＨＣＯＮＨ−、およびＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨからなる群から選択される少なくとも１つの官能基を含んでなり、ｎは１〜１２の整数である。
【００１６】
式ＩおよびIIの分子は、当技術分野で周知の方法により作製することができる。例えば、引用することによりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第５，３３４，７６１号および同第５，２６４，６１８号、ＷＯ００／２７７９５およびBenerjee et al. (J. Med. Chem., 44, 4176 (2001)参照。
【００１７】
本発明において、短鎖アルキル基は一般に、特に定義されない限り、例えばＣ１−Ｃ６アルキルである。長鎖アルキル基は、一般に、特に定義されない限り、Ｃ１０−Ｃ２０アルキル、例えば、Ｃ１０−Ｃ３０アルキルである。特に定義されない限り、適当であればいずれかの定義が用いられる。また、当業者ならば、特に定義されない限り、本明細書において適当であれば、アルキル部分、例えばアルコキシ部分を含有する他の誘導体基も短鎖基および／または長鎖基を含み得ることが分かるであろう。
【００１８】
両クラスの脂質の代表的メンバーの合成に関する特定の方法を以下に示す（スキーム１およびスキーム２）。これらの脂質種の他のメンバーは、これらの方法のバリエーションを用いて、または当業者に周知の他の方法によって合成することができることが分かるであろう。
【００１９】
脂質の製造
陽イオン糖脂質（II）の合成は、スキーム１に示されている方法によって行うことができる。２，無水酒石酸３−イソプロピリジンは、オレオイルアミンなどのアルキルアミンで処理して無水物を開環し、対応するアミドとカルボン酸を生成する。このアミドを酸性メタノールで処理すると、イソプロピリジン基が除去され、酸のエステル化が起こる。このエステルをメチルアミンなどのアルキルアミンで処理して対応するジアミドを得る。このジアミドを水素化リチウムアルミニウムなどの還元剤でジアミンへと還元し、ブロモプロピルフタルイミドなどのアルキル化剤でアルキル化する。このフタルイミド基をヒドラジンで除去し、このアミン基をＨＣｌでプロトン化して目的のカチオン性脂質を得る。このスキームは、一般構造１−［（３−アミノプロピル）−アルキル１アミノ］−４−［（３−アミノプロピル）−アルキル２アミノ］−ブタン−２，３−ジオール（アルキル化剤としてブロモプロピルフタルアミドを用いる場合）または１−［（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−アルキル１アミノ］−４−［（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−アルキル２アミノ］−ブタン−２，３−ジオールの特定の化合物を合成するために有効に用いることができる。アルキル１はメチル、エチル、プロピル、Ｃ１０−Ｃ２０アルキル鎖であることができ、アルキル２はＣ１０−Ｃ２０アルキル鎖であることができる。
【００２０】
あるいは、酒石酸ジメチルなどの所望の二酸（ＨＯ２Ｃ−（ＣＨＯＨ）ｎ−ＣＯ２Ｈ、ｎ＝２〜６）のメチルエステルの、所望のアルキルアミンによるアミド化で出発することにより、陽イオン糖脂質の対称類似体を得ることもできる。このジアミドは水素化リチウムアルミニウムなどの好適な還元剤を用いて還元して、対応するアミンを生成する。これらのアミン基は、ブロモプロピルフタルイミドまたはエポキシプロピルフタルイミドでアルキル化した後、このフタルイミド基を水素化ヒドラジンで除去すると、所望のカチオン性脂質が得られる。この合成経路は一般に、一般式１，４−ビス［（３−アミノ−プロピル）アルキルアミノ(aklylamino)］−ブタン−２，３−ジオール（アルキル化剤としてブロモプロピルフタルイミドを用いた場合）および１，４−ビス［（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）アルキルアミノ(aklylamino)］−ブタン−２，３−ジオール（アルキル化剤としてエポキシプロピルフタルアミドを用いた場合）の総ての化合物に適用できる。このアルキル基はＣ１０−Ｃ２０アルキル鎖を構成し得る。他のアルダル酸(alderic acid)ＨＯ２Ｃ−（ＣＨＯＨ）ｎ−ＣＯ２Ｈ（ｎ＝２〜６）で出発することにより、種々の糖脂質を得ることができる。代表的な化合物はリポソーム単独中に、または補助脂質（ＤＯＰＥまたはコレステロール）を用いて処方し、トランスフェクションに使用することができる。
【００２１】
アミノアルコール頭部基を有する式Ｉの脂質は、スキーム２に示されるようにして合成することができる。ジメチルアミノプロパンジオールを所望のスルホン酸アルキルでアルキル化し、ジアルキルオキシ−ジメチルアミノプロパンを得ることができる。ジアルキルオキシ−ジメチルアミノプロパンをエポキシプロピルフタルイミドでアルキル化してアミン基を第四級化し、そのフタルイミド保護基をヒドラジン水和物で除去すると、水酸化物基のアルキル化に由来する副生成物とともに、主生成物として所望のアミノアルコールが得られる。両生成物ともＨＣｌでプロトン化し、リポソーム単独中に、または補助脂質（ＤコレステロールまたはＯＰＥ）を用いて処方し、トランスフェクションに使用した。
【００２２】
本脂質を用いた細胞トランスフェクション
本明細書に記載の新規な脂質は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはコレステロールなどの補助脂質の存在下または不在下で、１以上の核酸とともに、リポソームまたはリポソーム様ビヒクル中に処方することができる。これらの脂質は、当技術分野で公知の逆相蒸発法によってリポソーム中に処方することができる。あるいは、これらの脂質は、音波処理、顕微溶液化などのリポソーム形成に関する他の周知の方法により処方することもできる。これらのリポソーム処方物はＤＮを培養細胞へトランスフェクトするのに有効である。
【００２３】
これらの脂質は、現在市販されているカチオン性脂質と少なくとも同等の活性があり、ほとんどの場合ではより活性が高い。この核酸は、十分な負電荷を持っていて、脂質と混合した際に脂質凝集塊、リポソーム、またはリポソーム様複合体を形成する限り、いずれの種類の既知核酸であってもよい。核酸は例えばＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、オリゴヌクレオチド、プラスミド、または他の形態の核酸分子であってもよい。この核酸は、限定されるものではないが、アンチセンス分子であってもよく、あるいは、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現を阻害するのに用いられる種類の二本鎖ＲＮＡ分子であってもよい。この核酸は短い干渉二本鎖ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）であってもよい。
【００２４】
また、これらの脂質は、当技術分野で公知の方法を用いて、ペプチドおよびタンパク質などを細胞へ導入するために用いることもできる。ペプチドおよびタンパク質送達のためにカチオン性脂質を用いる方法は従前に記載されている。
【００２５】
さらに、これらの脂質は、核酸、ペプチドおよびタンパク質などをin vivoにおける組織へ送達するために用いてもよい。化合物をin vivoにおける組織へ送達するために脂質を用いる方法は従前に記載されている。
【００２６】
上記の化合物に由来するリポソーム処方物を、下記のように、ＢＨＫ−２１、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＶＥＲＯおよび２９３などの培養細胞の、β−ガラクトシダーゼリポータープラスミドｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌでのトランスフェクション効率に関して評価した。
【００２７】
このように概略を述べたが、本発明は、以下の実施例を参照すればより容易に理解できよう。なお、これらの実施例は例として示すものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００２８】
実施例１
Ｎ−１−ジメチル−Ｎ−１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）−２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジアミン（１３）の合成
３−（ジメチルアミノ）−１，２−プロパンジオール（１０．１９ｇ，８５ミリモル）をテトラヒドロフラン中２．５当量の水素化ナトリウムで、７０℃±５℃にて１８〜２４時間処理した。１８〜２４時間後、３当量のスルホン酸テトラデシルメタン（７５．０ｇ，２５６ミリモル）を反応物に加え、さらに４０〜４８時間還流させた（７０℃±１５℃）。この反応混合物を濃縮乾固し、ジクロロメタンおよび水を用いて抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮して油状物を得た。得られた残渣を順相フラッシュクロマトグラフィーカラムに流し、溶離剤として酢酸エチル／ヘキサンを用いて目的生成物１−ジメチルアミノ−２，３−ジテトラデシルオキシプロパンを精製した。最終生成物をＴＬＣにより分析した。
【００２９】
１−ジメチルアミノ−２，３−ジテトラデシルオキシプロパン（１５．０ｇ，２９．３５ミリモル）を、溶媒としてエタノールを用い、２当量のＮ−（２，３−エポキシプロピル）−フタルイミド（１１．９３ｇ，５８．７ミリモル）および２当量の過塩素酸リチウム（６．２４５ｇ，５８．７ミリモル）で処理した。反応は７５〜８０℃で９６±６時間行った。反応は目的生成物１（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ（２−ヒドロキシ−３−フタルイミド−プロピル）−アンモニウム−２，３−ジテトラデシルオキシプロパンの完全性および形成に関してモニタリングした。反応混合物を濃縮乾固し、ジクロロメタンと水を用いて抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで濃縮した。得られた反応混合物を順相フラッシュクロマトグラフィーカラムに流し、溶離剤としてクロロホルム／メタノールを用いて目的生成物１−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−フタルイミド−プロピル）−アンモニウム−２，３−ジテトラデシルオキシプロパンを、Ｏ−アルキル化副生成物とともに精製した。この混合物（１４．９５ｇ）を、溶媒としてエタノールを用い、７５〜８０℃で１５〜１８時間、ヒドラジン水和物（４．６ｍｌ）と反応させた。この反応物を一晩４℃で置き、沈殿を濾過した。濾液を回転蒸発にかけたところ、２種の化合物の混合物からなるゴム質が得られた。この残渣をテトラヒドロフランに溶解し、１．１当量の塩酸を用いて室温で１時間酸性化した。この反応物を乾燥させ、メタノールで２回、およびジクロロメタンで２回共蒸発させた。この２種の化合物を、溶媒としてメタノール／水を用い、逆相（Ｃ−１８）フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。これらの化合物はＴＬＣおよび質量分析により、Ｎ−１−ジメチル−Ｎ−１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）−２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジアミン（主）およびＮ−１−ジメチル−Ｎ−１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）−２−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルオキシ）−プロパン−１，３−ジアミン（副）と同定された。
【００３０】
実施例２
１−［（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−アルキルアミノ］−４−［（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−アルキルアミノ］−ブタン−２，３−ジオールまたはＮ−１，４−ビス［（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピル）−アルキルアミノ］−ブタン−２，  ３−ジオールの合成
酒石酸ジメチル（８．２ｇ，４６．６ミリモル）を１５０ｍｌのメタノールに溶解し、１−  アルキルアミン（０．１１モル）を加えた。この溶液を一晩（＞２２時間）過熱還流した。この反応混合物を室温まで冷却し、４℃で約１時間維持した。沈殿を濾過し、５０ｍｌの冷メタノール（＜４℃）で２回洗浄し、ジアルキルタルタルアミドを白色の結晶質として得た（＞８０％）。
【００３１】
このジアルキルタルタルアミド（２９．６ミリモル）を５００ｍｌの無水ＴＨＦに懸濁させ、２００ｍｌの１Ｍ水素化リチウムアルミニウムのＴＨＦ溶液を滴下した。添加が終了した後、反応混合物を一晩還流した。混合物を冷却し、５００ｍｌＴＨＦで希釈した。２００ｍｌの１５％ＮａＯＨ溶液をこの混合物に滴下し、一晩攪拌した。ＴＨＦ層をデカントし、残った懸濁液をクロロホルムで、クロロホルム層中の目的生成物の存在をＴＣＬでモニタリングしながら、徹底的に抽出した。有機層を合わせ、化合物１，４−ビス（アルキル−アミノ）−ブタン−２，３−ジオールを半固体（収率４０〜７５％）として得た。この生成物を質量分析により同定した。
【００３２】
１，４−ビス（アルキル−アミノ）−ブタン−２，３−ジオール（２１．８７ミリモル）を、５００ｍｌ中の１０％試薬アルコール中、Ｎ−（２，３−エポキシプロピル）−フタルイミド（１０．９０ｇ，５３．６９ミリモル）および過塩素酸リチウム（５．６３ｇ，５３．６ミリモル）で処理した。この混合物を一晩還流し、ロータリーエバポレーターを用いて反応物量１００ｍｌまで減らした。この反応混合物を冷却し、５００ｍｌのクロロホルムで希釈した。このクロロホルム溶液を３００ｍｌの重炭酸ナトリウム溶液（０．１Ｍ）で２回、および３００ｍｌの濃ＮａＣｌ溶液で１回抽出した。クロロホルムをロータリーエバポレーターで除去し、ビス−フタルイミド付加物をガム質として得た。この化合物を質量分析により同定した。
【００３３】
１００ｍｌの１００％試薬アルコール中、このフタルイミドの溶液に、ヒドラジン水和物（２ｍｌ）を加えた。この反応混合物を一晩還流し、１時間室温まで冷却した。次に、この反応混合物を４℃で一晩冷却し、沈殿を濾別した。この固体を２０ｍｌの冷エタノール（−２０℃）で２回洗浄した。エタノールをロータリーエバポレーターで除去した。固体をクロロホルムに溶解し、濾過し、２００ｍｌの水で抽出した。クロロホルムをロータリーエバポレーターで除去し、定量的収量の目的化合物１，４−ビス［（３−アミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−アルキル−アミノ］−ブタン−２，３−ジオールを得た。この材料を、溶離剤として水性メタノールを用い、逆相（Ｃ−１８）フラッシュクロマトグラフィーで精製し、ＴＬＣおよび質量分析により同定した。このようにして、Ｃ１２〜Ｃ１８まで長さが異なるアルキル基を有する化合物が合成された。
【００３４】
実施例３
カチオン性脂質のリポソームへの処方
一般に、必要量のカチオン性脂質および補助脂質を秤量し、丸底フラスコに移した。脂質を溶解させるのに十分な量のクロロホルムを加えた後、分子生物学級の十分な水を加え、所望の濃度の全脂質／容量（例えば、２ｍｇ／ｍｌ）とした。この溶液をロータリーエバポレーターに入れ、クロロホルムを真空下で除去した。クロロホルムを除去すると、水性媒質中でリポソームが形成される。この溶液は乳光性となり、処方されたカチオン性脂質および補助脂質によってその濁度が異なる。例えば、１０．４ｍｇの１，４−ビス［（３−アミノ−２−ヒドロキシ−プロピル）−テトラデシル−アミノ］−ブタン−２，３−ジオールおよび９．６ｍｇのＤＯＰＥ（１：１モル比）を合わせ、丸底フラスコに入れた。この脂質混合物を２ｍｌのクロロホルムに溶解した。このクロロホルム溶液に１０ｍｌの水を加えた。クロロホルムをロータリーエバポレーターで真空除去し、２ｍｇ／ｍｌ（ＭＴ−Ｒ１）のリポソーム溶液を得た。同様に、Ｎ−１−ジメチル−Ｎ−１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）−２−ヒドロキシプロパン−１，３−ジアミンがＤＯＰＥ（１：１）とともに処方され（ＭＴ−Ｒ２）、Ｎ−１−ジメチル−Ｎ−１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）−２−（３−アミノ−２−ヒドロキシプロピルオキシ）−プロパン−１，３−ジアミンが、ＤＯＰＥを伴うだけでなく、それ自体リポソーム中に処方された（ＭＴ−Ｒ３）。
【００３５】
実施例４
トランスフェクションプロトコール
ＢＨＫ−２１、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＶＥＲＯおよび２９３の、β−ガラクトシダーゼリポータープラスミドｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ−β−ｇａｌでのトランスフェクションを次のようにして行った。
【００３６】
トランスフェクションの前日、細胞を、１０％ウシ胎児血清を含有する１００μＬの培地の入った９６穴プレートに入れたところ、所望の密集度（７０％〜９５％）となった。翌日、脂質とＤＮＡをＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で混合し、ＤＮＡ／脂質複合体を形成した。１００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭに種々の量の脂質（０．１〜１．０μｌ）を加えることで複合体を形成した。ＤＮＡ（５０ｎｇ〜４００ｎｇ）を１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに加えた。次に、ＤＮＡと脂質溶液を混合し、ＤＮＡ脂質複合体を形成した。これらの複合体を少なくとも２０分間インキュベートし、２０μｌの複合体を、１０％血清中の細胞に加えた。細胞をさらに２４時間インキュベートし、プラスミドを発現させた。培地を除去し、細胞を１００〜２００μｌの溶解バッファー中で溶解した。この溶解液（２０μｌ）を、酵素基質ＯＮＰＧを用いてβ−ｇａｌ活性に関してアッセイした。総活性を、バイオラッド・ベックマン・マイクロプレート分光光度計を用いて４０５ｎｍにてＯＤを読み取ることにより測定した。
【００３７】
ｓｉＲＮＡトランスフェクションについては、５０〜６０％密集度となるようにトランスフェクション前日に２４穴プレートに、血清含有培地中、適当数の細胞を播種し、３〜５％のＣＯ２インキュベーター中、３７℃で一晩インキュベートする。トランスフェクトする各ウェルに、０．２〜０．４μｌの脂質を含有する２５μｌの血清フリー培地と、ｓｉＲＮＡを含有する２５μｌの血清フリー培地を調製する。ｓｉＲＮＡの終濃度は１０ｎＭである。これらの脂質溶液とｓｉＲＮＡ溶液を混合し、室温で２０分間インキュベートした。脂質／ｓｉＲＮＡ複合体（５０μｌ）を、血清含有培地中の細胞に加え、これらの細胞をＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートする。トランスフェクション後２４〜７２時間に、遺伝子のサイレンシングをモニタリングすることができる。
代表的な結果を下記の図１〜３に示す。
【００３８】
スキーム１：  カチオン性糖脂質類似体の合成の概略
【化７】
2007516233.tif 000009
スキーム２：アルキルアミノアルコール脂質の合成
【化８】
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【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔβ−ｇａｌ、ならびにＭＴ−Ｒ１、ＭＴ−Ｒ２、ＭＴ−Ｒ３およびリポフェクタミン２０００（Ｌ２Ｋ）を用いたＣＯＳ７細胞のトランスフェクションから得られた結果を示す。
【図２】ＭＴ−Ｒ１と市販のカチオン性脂質を用いたｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔβ−ｇａｌによるＶＥＲＯ細胞のトランスフェクションから得られた結果を示す。
【図３】ｐＭＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔβ−ｇａｌ  ＭＴ−Ｒ２およびリポフェクタミン２０００を用いたＢＨＫ−２１細胞のトランスフェクションから得られた結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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