(57)【要約】本発明は、一群のヒト間葉系幹細胞であって、ヒト血清と、真核性発現系において得られたコラーゲンＩへの結合のための分子ドメインをもつトランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１−ＤＵＣ）とを用いたそれらの増殖により、軟骨−骨形成系列へ分化された細胞と、そのように処理された細胞によって吸収された生物適合性材料とを含んでなる、軟骨および骨修復組成物に関する。本発明の組成物は、修復されるべき領域において、インプラントを用いて使用されることが可能であり、あるいは、懸濁物中の該細胞を、損傷の場所において、またはそれらの広範にわたる分布用には全身循環内へ注入することにより、直接的に使用されることが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清と、真核性発現系において得られたコラーゲンＩへの結合のための分子ドメインをもつトランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１−ＣＢＤ）とを用いた増幅によって軟骨−骨形成系列へ分化された、ヒト間葉系幹細胞の、骨および／または軟骨修復のための医薬品の調製における用途。
【請求項２】
前記医薬品の、全身循環内へのインシトゥの注射によるか、または適当な生体材料に吸着されたインプラントによる投与によって特徴づけられる、請求項１の用途。
【請求項３】
前記投与が、適当な材料に吸着されたインプラントによって行なわれることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の用途。
【請求項４】
前記インプラント用に使用された前記材料が、ヒドロキシアパタイトまたは拡散チャンバーであることを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の用途。
【請求項５】
前記ヒト間葉系幹細胞がグルココルチコイドを用いて誘導されることを特徴とする、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の用途。
【請求項６】
前記グルココルチコイドがデキサメタゾンであることを特徴とする、請求項５に記載の用途。
【請求項７】
前記誘導においてβ−グリセロホスフェートが付加的に使用されたことを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の用途。
【請求項８】
コラーゲンＩへの結合のための分子ドメインをもつトランスフォーミング増殖因子−ベータ１が、真核性発現系において発現されていることを特徴とする、請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の用途。
【請求項９】
使用された前記発現系が昆虫細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の用途。
【請求項１０】
前記昆虫細胞がバキュロウイルスによってトランスフェクトされることを特徴とする、請求項９に記載の用途。
【請求項１１】
ヒト間葉系幹細胞からのインビトロにおける軟骨−骨形成細胞の能力付与の方法であって、
ａ．ヒト血清と、コラーゲンＩへの結合のための分子ドメインをもつトランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１−ＣＢＤ）とを添加された培養液中での、幹細胞の一次培養と、
ｂ．それに続く、ヒト血清およびＴＧＦ−β１−ＣＢＤの追加による増幅と、
ｃ．デキサメタゾンおよびβ−グリセロホスフェートによる軟骨−骨形成誘導と、
を含んでなる方法。
【請求項１２】
コラーゲンＩへの結合のための分子ドメインへ融合されたトランスフォーミング増殖因子−ベータ１が、真核性発現系において発現されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
使用された前記発現系が昆虫細胞であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記昆虫細胞がバキュロウイルスによってトランスフェクトされることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養液がヒトＩ型コラーゲンゲルであることを特徴とする、請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養液の最初の添加が、０．１％と１％の間、好ましくは０．５％量のヒト血清を用いて行なわれることを特徴とする、請求項１１から請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記増幅が１日から２５日の間の範囲にわたる期間を通して起こり、その間に培養液は、５％と２５％の間、好ましくは２０％量のヒト血清が追加されることを特徴とする、請求項１１から請求項１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１から請求項１７のいずれか１項に記載の能力付与法によって取得可能な、軟骨−骨形成能をもつ細胞。
【請求項１９】
ヒトにおける骨および／または軟骨修復のための組成物の調製における、請求項１８に記載の軟骨−骨形成能をもつ細胞の用途。
【請求項２０】
生物適合性の、骨誘導性の材料と、請求項１１から請求項１７のいずれか１項に記載の能力付与法により取得された軟骨−骨形成能をもつ一群の細胞とを含んでなることによって特徴づけられる、骨形成を誘導することが可能な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨格修復に関与する薬剤の製造に取組んでいる生物医学産業において、さらに具体的には、任意の病因のための軟骨および骨の修復プロセス、脊椎固定または関節固定術、骨接合、関節形成用人工関節、骨粗鬆症など、および任意の他の、骨または軟骨組織の修復または再生を必要とするもの、および、分化において細胞の補足的供給が、必要とされる組織修復を達成するための有効な助けを含んでいる場合において、適用可能である。
【背景技術】
【０００２】
組織再生は、損傷の部位に存在したか、または動員されていた多様な細胞の完結を必要とする複雑なプロセスである。修復プロセスにおいて起こる全ての事象は、増殖因子およびサイトカインと、細胞と、細胞外マトリックスを形成している分子との間の多くの相互作用によってガイドされる。
【０００３】
多様な誘導物質シグナルと、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、ＢＭＰ、ＩＧＦ、およびＦＧＦを含めた増殖因子とが、骨において共存している（ベセラ（Becerra）ら著、メディキーナ・クリニカ（Med Clin）、２００１年、第１１６巻、ｐ．２３−２４）。これらの中で、ＢＭＰのみが骨誘導物質である；しかしながら、所与の骨折の修復にはすべてが関与している（レッディ（Reddi）著、ネイチャー・メディスン（Nature Medicine）、１９９８年、第３巻、ｐ．８３７−８３９；グローンベルド（Groeneveld）およびバージャー（Burger）著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Eur J Endocrinol）、２０００年、第１４２巻、ｐ．９−２１）。また骨には、骨折の刺激に対して応答する骨形成性前駆細胞が存在しており、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の移動を誘導するＢＭＰを活性化および産生し、それらが増殖して骨形成細胞へ分化する（ゲイラード（Guerado）ら著、レビスタ・デ・オルトペディア・イ・トラウマトロヒア（Rev Ortop Traumatol.）、２００３年、第４７巻、ｐ．３６２−３７４）。しかしながら、間葉系幹細胞と骨祖先前駆細胞との間の、それらの移動、増殖、および骨形成系列への分化を調節する生化学的シグナルによる複雑な相互関係についての理解は、まだかなりの隔たりを示している。
【０００４】
ＴＧＦ−βは、多くの組織および種において発現される遺伝子ファミリーのためにコードされた、一群の増殖因子である（キングズレイ（Kingsley）著、ジーンズ＆ディベロップメント（Genes Dev）、１９９４年、第８巻、ｐ．１３３−１４６；ボストロム（Bostrom）およびアスニス（Asnis））著、クリニカル・オルトペディックス・アンド・リレイティッド・リサーチ（Clin Orthop Relat R）、１９９８年、第３５５Ｓ号、ｐ．１２４−１３１）骨は、細胞機能を調節する能力をもつＴＧＦ−βの局所的産生が見られた最初の組織の一つであった（セントレラ（Centrella）ら著、ザ・ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ジョイント・サージェリー（J Bone Joint Surg）、１９９１年、第７３−Ａ巻、ｐ．１４１８−１４２８）。血小板はＴＧＦ−βの主要な供給源であるが、骨は最も重要な貯蔵所であって、他の軟組織におけるよりも１００倍多く、そこにはまたＢＭＰの共存もある（ロバーツ（Roberts）ら著、バイオケミストリー（Biochemistry）、１９８３年、第２２巻、ｐ．５６９２−５６９８）。
【０００５】
近年、培養にある骨芽細胞に対してＴＧＦ−βが添加されたとき、時として矛盾する、重要な結果が得られている。それらのマイトジェニック（mythogenic）、または骨分化性の効果、またはその逆は、培養にある細胞の不均一性、他の増殖関係者（actors）の存在、細胞密度、培養条件、または該因子の可能な二相性の効果に帰されてきた（ノダ（Noda）ら著、エンドクリノロジー（Endocrinology）、１９８８年、第１２４巻、ｐ．６１２−６１７；スタイン（Stein）およびライアン（Lian）著、「Cellular and Molecular Biology of Bone（骨の細胞および分子生物学）」、アカデミックプレス、サンディエゴ、１９９３年、ｐ．４７−９５）。最近の研究はまた、ＴＧＦ−βまたはＢＭＰに関して、可能な異なる標的細胞の存在を検討している；前者は、すでに骨形成系列に巻込まれた幹細胞に対して作用するように見えるのに対し、ＢＭＰは未拘束細胞に対して作用することが可能である（バロック（Ballock）ら著、ジャーナル・オブ・オルトペディア・リサーチ（J. Oprthop. Res.）、１９９７年、第１５巻、ｐ．４６３−４６７）。いずれの場合にも、ＴＧＦ−β１の存在下にＭＳＣが自己再生および増殖を行なうことが可能であることは明らかであるように見える（アンドレーズ（Andrades）ら著、Cells. エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Exp Cell Res）、１９９９年、第２５０巻、ｐ．４８５−４９８）。
【０００６】
ＭＳＣ培養物におけるＴＧＦ−β１の何らかの制御について、バイオアベイラビリティを制御するため、およびその存在を確かめるため、一つの実験法が最近開発されており、これによれば、ラット骨髄から細胞集団が単離され、増殖され、コラーゲンＩへの特異的結合のための分子ドメインをもつＴＧＦ−β１の存在下に、コラーゲンゲル中で培養された時、骨形成系列へ誘導された。コラーゲンに対する結合のためのドメインは、それが結合されているゲル中での活性因子の緩徐な放出を可能にし、その半減期を延長させ、かつ標的細胞に対する作用に向けたその可用性を増大させることが提唱されている（アンドレーズ（Andrades）ら著、Cells. Exp Cell Res、１９９９年、第２５０巻、ｐ．４８５−４９８）。
【０００７】
骨再生能力は、加齢とともに減少することが証明されている。骨髄の多数の造血細胞は生涯にわたって生残り続けるが、そのＭＳＣは、骨誘導因子の欠如の悪化からの何らかの困難または、細胞がそれらを産生できないかまたはそれらに応答することができないことを認めることに加えて、実質的に減少している（ヘインズワース（Haynesworth）著、「Musculoskeletal Soft-Tissue Aging: Impact on Mobility （筋骨格軟組織の加齢：運動性に対するインパクト）」、ＡＡＯＳ、ロゼモント、１９９４年、第１節、第７章、ｐ．８０−８６）。それゆえ、骨修復不能をもつ固体からのＭＳＣの選別、インビトロにおけるそれらの増幅、および骨形成系列への能力付与を可能にする手法を開発することが望ましい。
【０００８】
上記のことを確実に実行した後、そのように処理された細胞は、適当な生体材料を用いてそれらをビヒクリングして、患者が骨核修復を必要としている部位へ移植されるべきであり、このようにして、失われたか、またはひどく脅かされた骨修復機能を、効果的に確立することを可能にする一種の自己細胞療法を生じさせる。このことはまた、修復の部位を超えてそれらをちょっとの間制御することが困難であり、かつそれらの多面的な影響が停止されない恐れがあることから、生物活性因子による全身性または局所性の感染という望ましくない影響を、回避させるようにしている。
【０００９】
いずれの場合にも、能力付与された細胞の移植は、２以上の骨断片の硬化が必要とされる場合に、骨形成を促進する微小環境下に行なわれるべきである。この点を考慮すれば、骨折または非硬化病巣（偽関節症）が軟骨−骨形成組織の増殖を伴う血管過多であることによって特徴づけられる場合（結合がないか、または肥厚性の偽関節症）には、骨髄内または外のインプラントによる病巣の、単なる硬質の非動的安定化が硬化を促進するべきである。こうした場合、ヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンの担体上で骨形成系列へ能力付与された細胞の移植は、骨合成の後に、骨形成カルスの発生にとって理想的な微小環境である、安定な血管過多層を見出す。非硬化または萎縮性偽関節症の症例においては、２つの断片間の繊維組織は除去されるべきであり、骨に骨を預け、かつ骨穿孔と血管新生化された組織（一般には筋肉）による裏打ちとにより、血管供給源を探るようにする。双方の断片は、もしも界面に動きがあればそれは破壊され、血管の増殖を妨げ、骨形成の代わりに軟骨形成を誘導する化学的媒介物の発現を刺激することとなるため、骨界面における可動性を妨げる硬質の骨合成によって安定化されるべきである（ルエディ（Ruedi）およびマーフィー（Murphy）著、「AO Principles of fracture management（ＡＯ法骨折管理の原則）」、ゲオルグ・ティーメ・フェアラーク（Georg Thieme Verlag）、スタッガート（Sttugart）、２０００年；ブラウン（Browne）ら著、「Skeletal Trauma, Basic Science, Management,and Reconstruction（骨格損傷、基礎科学、管理、および再構築）」、サンダーズ（Saunders）、フィラデルフィア、２００３年）。
【００１０】
【非特許文献１】ベセラ（Becerra）ら著、メディキーナ・クリニカ（Med Clin）、２００１年、第１１６巻、ｐ．２３−２４
【非特許文献２】レッディ（Reddi）著、ネイチャー・メディスン（Nature Medicine）、１９９８年、第３巻、ｐ．８３７−８３９
【非特許文献３】グローンベルド（Groeneveld）およびバージャー（Burger）著、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・エンドクリノロジー（Eur J Endocrinol）、２０００年、第１４２巻、ｐ．９−２１
【非特許文献４】ゲイラード（Guerado）ら著、レビスタ・デ・オルトペディア・イ・トラウマトロヒア（Rev Ortop Traumatol.）、２００３年、第４７巻、ｐ．３６２−３７４
【非特許文献５】キングズレイ（Kingsley）著、ジーンズ＆ディベロップメント（Genes Dev）、１９９４年、第８巻、ｐ．１３３−１４６
【非特許文献６】ボストロム（Bostrom）およびアスニス（Asnis））著、クリニカル・オルトペディックス・アンド・リレイティッド・リサーチ（Clin Orthop Relat R）、１９９８年、第３５５Ｓ号、ｐ．１２４−１３１
【非特許文献７】セントレラ（Centrella）ら著、ザ・ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ジョイント・サージェリー（J Bone Joint Surg）、１９９１年、第７３−Ａ巻、ｐ．１４１８−１４２８
【非特許文献８】ロバーツ（Roberts）ら著、バイオケミストリー（Biochemistry）、１９８３年、第２２巻、ｐ．５６９２−５６９８
【非特許文献９】ノダ（Noda）ら著、エンドクリノロジー（Endocrinology）、１９８８年、第１２４巻、ｐ．６１２−６１７
【非特許文献１０】スタイン（Stein）およびライアン（Lian）著、「Cellular and Molecular Biology of Bone（骨の細胞および分子生物学）」、アカデミックプレス、サンディエゴ、１９９３年、ｐ．４７−９５
【非特許文献１１】バロック（Ballock）ら著、ジャーナル・オブ・オルトペディア・リサーチ（J. Oprthop. Res.）、１９９７年、第１５巻、ｐ．４６３−４６７
【非特許文献１２】アンドレーズ（Andrades）ら著、Cells. エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Exp Cell Res）、１９９９年、第２５０巻、ｐ．４８５−４９８
【非特許文献１３】アンドレーズ（Andrades）ら著、Cells. Exp Cell Res、１９９９年、第２５０巻、ｐ．４８５−４９８
【非特許文献１４】ヘインズワース（Haynesworth）著、「Musculoskeletal Soft-Tissue Aging: Impact on Mobility （筋骨格軟組織の加齢：運動性に対するインパクト）」、ＡＡＯＳ、ロゼモント、１９９４年、第１節、第７章、ｐ．８０−８６
【非特許文献１５】ルエディ（Ruedi）およびマーフィー（Murphy）著、「AO Principles of fracture management（ＡＯ法骨折管理の原則）」、ゲオルグ・ティーメ・フェアラーク（Georg Thieme Verlag）、スタッガート（Sttugart）、２０００年
【非特許文献１６】ブラウン（Browne）ら著、「Skeletal Trauma, Basic Science, Management,and Reconstruction（骨格損傷、基礎科学、管理、および再構築）」、サンダーズ（Saunders）、フィラデルフィア、２００３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
また骨粗鬆症の患者においては、骨形成の損傷に対して、これらの患者における骨形成と再吸収との間のアンバランスへの介入を含む方法により、骨質量形成の能力を高める方法を開発することも望ましい。インビトロで骨形成系列へ能力付与された細胞をシステマティックに投与することは、この均衡のバランスをとることを可能にするであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、骨修復において、さらに具体的には、軟骨−骨修復プロセス、骨粗鬆症、関節形成用人工関節などにおいて使用されるべき薬剤および組成物であって、骨粗鬆症の個体の全身循環では、小さい非接合性骨折または軟骨性損傷においてインシトゥで注入させることが可能であり、あるいは、何らかの重大な損傷では、軟骨または骨の形成を促進するべく、適当な生体材料（コラーゲン、ヒドロキシアパタイトなど）の中に吸着されてインプラントされることが可能な、薬剤および組成物の調製において明確な適用を有する。さらにそれらは、腰、膝の関節形成用人工関節をコーティングするヒドロキシアパタイト（アパタイト周囲）に吸着されて、宿主におけるこれらの人工関節の生物学的統合を強化し、それらの寿命を延長することが可能である。こうした製品はまた、脊椎固定を促進するための関節固定術においても使用可能であり、自己移植または骨銀行を用いた標準的な方法によって行なわれるこうした方法の効率を改善する。
【００１３】
本発明の第１の観点においては、本発明は、ヒト血清と、真核性発現系において得られたコラーゲンＩへの結合のための分子ドメインをもつトランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１−ＣＢＤ）とを用いた増幅手段によって軟骨−骨形成系列へ分化された、ヒト間葉系幹細胞を投与することにより、骨および／または軟骨形成を、それを必要としているヒトにおいて増大させるための方法を提供する。
【００１４】
本発明の好ましい態様においては、これらの能力付与された細胞の投与は、全身循環内へのインシトゥの注射によるか、または、適当な生体材料に吸着されたインプラントによって行なわれる。好ましい態様は、適当な材料中に吸着された細胞によるインプラントの使用であり、さらになお好ましい態様は、再吸着可能な５０％有孔率をもつヒドロキシアパタイト、コラーゲンゲルからなる拡散チャンバーの使用である。
【００１５】
本発明の好ましい態様においては、ヒトＭＳＣは、軟骨−骨形成系列への誘導において、グルココルチコイドを用いて援助された。デキサメタゾンの使用が好ましい。さらに好ましい態様においては、この誘導はデキサメタゾンおよびβ−グリセロホスフェートの存在下に行なわれる。
【００１６】
本発明のもう一つの好ましい態様においては、コラーゲンＩへの結合のための分子ドメインと結合された、トランスフォーミング因子−β１が、真核性発現系において発現された。好ましい態様は、昆虫細胞を用いた発現であり、さらに好ましいのは、バキュロウイルスによってトランスフェクトされた昆虫細胞の使用である。
【００１７】
本発明の第２の観点においては、インビトロの能力付与法は、ヒトＭＳＣからの軟骨−骨形成細胞を用いて提供され、以下の段階を含んでなる：
・ヒト血清と、コラーゲンＩへの結合のための分子ドメインをもつトランスフォーミング増殖因子−ベータ１（ＴＧＦ−β１−ＣＢＤ）とを添加された培養液中での、幹細胞の一次培養；
・それに続く、ヒト血清およびＴＧＦ−β１−ＣＢＤの追加による増幅；
・デキサメタゾンおよびβ−グリセロホスフェートによる軟骨−骨形成誘導。
【００１８】
ヒトＭＳＣは、患者の、異なる組織および部位から、また、骨髄、臍帯血、末梢血、または凍結されたヒト未分化胚芽細胞から取得可能である。
【００１９】
本発明の能力付与法の好ましい態様においては、コラーゲンＩへの結合のための分子ドメインと融合されたトランスフォーミング増殖因子−β１は、真核性の発現系において発現されている。さらに好ましい態様は、発現のための昆虫細胞の使用である。そして、さらになお好ましい態様は、バキュロウイルスでトランスフェクトされた昆虫細胞の使用である。
【００２０】
もう一つの好ましい態様によれば、一次培養はヒトＩ型コラーゲンゲル中で行なわれる。
【００２１】
もう一つの好ましい態様においては、骨髄ＭＳＣの選択は、０．１と１％の間、好ましくは０．５％量のヒト血清を追加した培養物中で行なわれる。
【００２２】
一つの好ましい態様によれば、増幅は１日から２５日の間の範囲にわたる期間を通して起こり、その間に、培養液には５％と２５％の間、好ましくは２０％量のヒト血清が添加される。
【００２３】
本発明の第３の観点においては、本発明は、ＭＳＣの選択、増幅、および軟骨−骨形成誘導を含んでなる、前述の能力付与法によって取得可能な軟骨−骨形成能をもつ細胞を提供する。
【００２４】
本発明の第４の観点においては、前述の能力付与法によって取得可能な、軟骨−骨形成能をもつ細胞の、ヒトにおける骨および／または軟骨修復用の組成物の調製における使用が提供される。
【００２５】
本発明の第５の観点においては、骨形成を誘導することが可能な組成物は、生物適合性および骨誘導性の材料と、前述の能力付与法により取得可能な軟骨−骨形成能をもつ一群の細胞とを含んでなることが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
図１ａのＭＯ細胞は、ｒｈＴＧＦ−β１−ＣＢＤの存在下に、コラーゲンゲル中で１０日間インビトロで培養された。ごくまれに、単離された細胞が見られる。ＭＯ細胞は、ｒｈＴＧＦ−β１−ＣＢＤの存在下にコラーゲンゲル中で３５日間培養され（図１ｂおよび図１ｃ）、各々デキサメタゾンおよびβ−グリセロホスフェートにより誘導された。より大きい細胞密度、およびそれらからなるいくつかのコロニーが見られる。ｘ６０。
【００２７】
図２ａは、ラット皮下組織におけるインプランテーション期間の後の、４つの拡散チャンバーのラジオグラフを示している。異なる密度は、異なる質および量の新生された組織を示す。図２ｂは、細胞がｒｈＴＧＦ−β１−ＣＢＤ無しの対照条件下で培養された場合の、インプランテーション期間の後のチャンバーの組織切片を示している；内側は、いくぶん繊維状の物質で満たされており、何ら軟骨−骨組織の蓄積は見出されない（星印はチャンバーフィルタ）。シリウスレッド−ヘマトキシリン。ｘ１０。図２ｃは、インビトロで処理された細胞がｒｈＴＧＦ−β１−ＣＢＤの存在下に置かれた場合の、チャンバーの切片の低倍率の様相であり、フィルタ（星印）の近くに、他のものから立上っている、新生された組織のいくつかの凝集物（矢印）を検出している。シリウスレッド−ヘマトキシリン。ｘ１０。図２ｄは、これらの凝集物の一つの細部が、２種類の組織を分化しており、一つは軟骨様の様相のものであまり染色されず（塗りつぶされた丸）、もう一つは強く染色され、骨様の様相のものである（白抜きの丸）。青白い組織の外側には、より染色された繊維が見られ、それらは軟骨膜に似る（矢印）。シリウスレッド−ヘマトキシリン。ｘ４０。図２ｅは、上記のものと平行な切片が、ゴルドナー・トリクロミック染色されて呈示されており、強い青色（白抜きの丸）、最も密な組織（骨様）、および軟骨のように見える蒼白色の何か（塗りつぶされた丸）を示している。この丸の周囲には、いくつかの青みがかった繊維があり、軟骨膜層であるように見える（矢印）。ｘ４０。図２ｆは、もう一つの平行な切片がアルシアンブルーで染色された場合、軟骨様組織は青色に見えるのに対し（塗りつぶされた丸）、骨様のもの、ならびに軟骨膜は無色に見える（空の丸）。ｘ４０。このことは、軟骨−骨新生と一致している。シリウスレッドおよびトリクロミック染色の双方は、コラーゲン、特に、骨組織および軟骨膜に特有のＩ型のものを染色するが、一方アルシアンブルーは、軟骨基質に多いプロテオグリカンの酸および硫酸基を染色する。
【００２８】
図３．−本文に示されたように処理された細胞を用いてヒドロキシアパタイトインプラントが行なわれた場合に形成された組織の切片。材料は、切断および染色に先立ち、脱灰されたことから、空のスペース（星印）はヒドロキシアパタイト梁の壁に相当する。これらの壁の中の空洞は今、髄様と呼ばれることが可能な組織で満たされており（塗りつぶされた丸）、一方これらの梁に付着して、薄い新生された組織シートがある（矢印）。図３ａは、ヒドロキシアパタイトの壁を裏打ちしている組織が、同じ切片を偏光で照らしている図３ｂでの複屈折によって示されるように、いかにコラーゲンに富んでいるか（シリウスレッドによる強い赤色）（矢印）を示している。このコラーゲンは、その陽性の性質によって示されるようにＩ型のものであり（矢印）、これらの組織切片が図３ｃにおいて示されるアンチコラーゲンＩ抗体により処理された場合に現れる。ｘ２０。図３ｄは、より大きい倍率を用いて、新たな組織が内側に、骨芽細胞に似た細胞を含有しており、それらが合成した基質中にトラップされていることを示している（ゴルドナー・トリクロミック）。新たな組織は、赤色（より成熟した組織）または緑色がかった色（未成熟の組織）を示す。ｘ４０。図３ｅは、インプラントされたヒドロキシアパタイトに近接した領域（星印）の切片を示しており、ここではいくつかの宿主組織の梁が、緑色がかった若い骨の新たな付着を示していることが見えており、そのことは、本発明者らがＨＡを置いた場所のみでなく、その周辺においても何らかの骨形成活性を示すものであって（ゴルドナー・トリクロミック）、おそらくＨＡを「拡散する」細胞によって引き起される「何らかの離れた骨誘導」を示している。ｘ２０。対照的に、図３ｆは同じ宿主骨の、ＨＡ断片の場所から遠い領域の切片を示しており、骨梁は新しい組織の取込みを示さないこと、およびそれゆえ、骨誘導はインプラントの領域のさらに遠くには達しなかったことが分かる。ｘ２０。
【実施例】
【００２９】
本発明は、以下の制限しない実施例によって例を挙げて説明される。
【００３０】
実施例１．
−コラーゲンＩ結合ドメインをもつヒト融合組換えタンパク質ＴＧＦ−β１（ｒｈＴＧＦ−β１−ＣＢＤ）のデザインおよび獲得
ＴＧＦ−β１遺伝子用のｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲにより、修正能をもつＤＮＡポリメラーゼを用いて得られた。使用された鋳型は、チョムクジンスキー（Chomczynski）およびサッキ（Sacchi）の方法（１９８７年）により、ヒト骨肉腫細胞ＭＧ６３（ＡＴＣＣでの参照：ＣＲＬ−１４２７）から抽出された全ＲＮＡであった。プライマーは、ソフトウェア（オリゴ（Oligo）ｖ６．６）を利用して、ジェンバンクに公表されたｍＲＮＡ配列からデザインされている。ＰＣＲ産物は、維持プラスミド（ｐＢＳＫ  ＩＩ、ストラタジーン（Stratagene））中で不活発（“in dull”）にクローニングされた。ひとたび遺伝子がクローニングされれば、それらは双方の糸の配列決定（sequentiation）によってチェックされた。これらのプラスミドを鋳型として用いて、それらはｐｆｕ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ、成熟したペプチドをコードしている領域、を用いたＰＣＲによって増幅された。使用されたプライマーは、コラーゲン結合ドメイン（ＣＢＤ）と、昆虫細胞（ｐＡｃＧＰ６７Ｂ、ファーミンジェン（Pharmingen））に特異的な分泌用シグナルペプチドのための配列を含有している、バキュロウイルスにおける発現系のトランスファープラスミドにおいて、指向性にクローニングするのに適した制限部位とを含有している。ＣＢＤのない因子を得るためには、プライマーは制限部位のみを有していた。センス鎖プライマーは、以下の構造を有していた：５′−（ＢａｍＨＩ）−ＣＢＤの配列−ＧＧＡＧＧＡ−（ＮｈｅＩ）−ＴＧＦ−β１の成熟ペプチドの最初の６ヌクレオチド。アンチセンス鎖プライマーは、遺伝子の５′末端のいくつかのヌクレオシドによって形成され、停止コドンを含んでなっていた。さらに、それはＮｏｔ  Ｉ部位を有する。全ての場合に、構造はＰＣＲ産物またはそれを含有しているトランスファープラスミドのシーケンシングによってチェックされた。
【００３１】
ＣＢＤのある、および無しの、因子用のトランスファープラスミドがひとたび入手されれば、昆虫細胞（ｓｆ９）は、トランスファープラスミドと、ポリヘドリン遺伝子に加えシステインプロテアーゼをコードしている他の遺伝子が除去されている、市販のＤＮＡバキュロウイルス（ＢａｃＶｅｃｔｏｒ３０００、ノバジェン（Novagen））とによって製造された混合物でコトランスフェクトされた。本発明者らは、リポソーム介在性のトランスファー法（リポフェクチン、ノバジェン）を、商社の指示に従って使用する。
【００３２】
ＤＮＡが細胞へひとたびトランスファーされれば、それらは細胞の様子ぶりが見られるまで、ＴＮＭ−ＦＨ培養液中で数日間培養された。この時間を通じて、細胞の内側では相同組換えが起こっており、それによりウイルスＤＮＡは、ポリヘドリンプロモーターの下流、ペプチド配列シグナルに加えてＣＢＤのある、または無しの因子のものを含んでなるプラスミドの領域ヘトランスファーされる。このプロセスは、細胞を殺す感染性ウイルスを発生させ、このウイルスは周囲へ放出され、他の細胞に感染する。
【００３３】
組換えウイルスは、培養上清中の組換えウイルス混合物から選択された。このことは、セミコンフルエントな細胞培養物を、トランスフェクション上清の希釈物とともに播種することからなる、プレート試験によって行なわれた。感染時間（１時間）の後、プレートは培養液中に溶解されたアガロースでカバーされ、４日間培養に置かれた。これにより、いくつかの細胞の周囲において感染の拡散が起こり、そのことは溶解プレートを生じさせることで得られた。これらの溶解プレートは、個別に移され、ウイルスを抽出するべく少量の培養液中に置かれた。最初の選別による溶解プレートの数およびサイズに基づき、この方法は先の溶解のプレートからもう一度繰返され、本発明者らはこれにより、クローンニングされた組換えウイルスを有していると確証するつもりである。ひとたびウイルスが増幅されれば、それはＰＣＲにより、因子に特異的なプライマーを用いて、関連する遺伝子を含有していることをチェックするべく分析された。次いで、ｐｆｕ／ｍＬ（プレート形成単位／ｍＬ）の数を確定するため、力価測定されるべき大量のストックを使用することが必要であった。
【００３４】
この点から、各々の組換えウイルスについて、最適な産物を得るべく、適切な感染条件が確立された。このことのため、１２ウエルプレートが既知の細胞数を播種された。それらにおいて、異なる培養時間に加えて、ウイルス数／細胞（ＭＯＩ、感染多重度）の異なるパーセントを播種することとした。０．１、１、または１０のＭＯＩが、４８、７２、および９６時間の培養でのサンプリングにより試験された。培養液の血清に関しては、望ましくないタンパク質に汚染されないように、感染後の最初の２４時間後は、培養は無血清培養液で、または血清パーセントの非常に低いものを用いて続けられた。各実験条件を完了した後、上清は集められ、細胞残余を除去するべく遠心分離された。
【００３５】
ウエルの細胞は凍結融解によって破壊され、ＰＢＳで抽出された。双方の試料は、ＳＤＳ電気泳動（変性条件）により、還元剤なしに分析された。ポリアクリルアミドゲルはクーマシーブルーで染色された（充分に感受性がない場合は、銀による染色を行うことができる）。別の試料はまた、特異的なＴＧＦ−β１抗体を用いたイムノブロッティングによっても分析された。本発明者らは、ペルオキシダーゼで標識された二次抗体を使用し、その存在を化学発光（ＣＳＰＤ、アマシャム（Amersham））によって同定した。この情報を用いて、本発明者らは産生されたモノマー／ダイマーのパーセント、および系の収率を査定した。
【００３６】
有意な量の組換えタンパク質を得るため、約２５０ｍＬの液体培養が、約５００，０００細胞／ｍＬで開始された。約２×１０６細胞／ｍＬの増殖が達成されたとき、それらは最も高いＭＯＩを用いて、かつ最大の収率で、ウイルスを接種された。２４時間において、血清を含む培養液は除去され、細胞は無血清培養液中で、先の試験によって決定された日数にわたり培養された。この時間の後、タンパク質はアオノ（Aono）ら（１９９５年）によって記述されたプロトコールに従って精製された。この方法は、ＳＰ−セファロースカラム（アマシャム−ファルマシア（Amersham-Pharmacia））を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを使用する。培養液はｐＨ８で平衡化され、４Ｍ尿素が添加された。カラムは２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８緩衝液、４Ｍ尿素で平衡化された。カラムを通して培養液を流した後、カラムを緩衝液で洗浄し、タンパク質は、０Ｍから０．７Ｍの間のＮａＣｌの直線勾配により溶出された。種々の分画について、２８０ｎｍにおける吸光度が測定され、タンパク質をもつものは、上述の技術の後に、電気泳動により分析された。陽性の分画は集められ、限外濾過により濃縮され、生物活性アッセイに使用された。この最終分画のタンパク質の濃度は、ブラドフォード（Bradford）により測定された。
【００３７】
実施例２．
−ヒト間葉系幹細胞の取得および調製
ヒト間葉系幹細胞は、説明されたドナーからの腸骨稜の外科的摘出の後に、ヒトの骨髄（ＢＭ）から取得された。髄組織は、抗生物質（１００ｍｇ／ｍＬのペニシリンＧ（シグマ（sigma））、５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン（シグマ）、および０．３ｍｇ／ｍＬのフンギゾン（フロー（Flow）−ＩＣＮ））を用いた完全培養液（□−ＭＥＭ、ギブコ（GIBCO）、ＨＤ、アメリカ合衆国）中で洗浄された。個別化された細胞の懸濁物は、１８，２０および２２ゲージの針を通した連続的な分散の後に得られ、組織残余および細胞凝集物を分離するため、最後に２０マイクロメーターのテフロン（登録商標）無菌フィルタ（セル・ストレーナ（Cell Strainer）、ファルコン（Falcon）、ニュージャージー州、リンカーンパーク（Lincoln Park））を通して濾過された。
【００３８】
実施例３．
−コラーゲンゲル中でのＭＳＣの培養
実施例２によって得られた細胞懸濁物は、１００ｇで５分間遠心分離された。遠心分離物は、非常に低濃度の患者の血清（ＨＳ、０．５％）を用いた培養液中に再懸濁された。
【００３９】
細胞を４８のプレートの培養ウエル中に入れる前に、１００ｍＬのヒトコラーゲンＩ溶液（シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich））が、０．３５ｍｇ／ｍＬの濃度で、ｐＨ７．４において、それらの底に入れられた。ウエル当たり１５０ｍＬの、コラーゲンＩ、１ｍｇ／ｍＬの濃度でＴＧＦ−β１、および２×１０６個の骨髄細胞の混合物が、層の上に入れられた。培養プレートは、３７℃において１５分間培養炉内に置かれ、その時まで液体であったコラーゲンゲルを形成させるようにした。次いで、ウエル当たり１０ｍＬの、これもまた同濃度のＴＧＦ−β１を含有している培養液が入れられた。このようにアレンジされた培養物は、９５％の空気および５％のＣＯ２からなる雰囲気下に、３７℃で、１００％相対湿度下に培養された。３日毎に培養液は交換され、各々の場合に同濃度のＴＧＦ−β１が添加された。
【００４０】
ＴＧＦ−β１の至適濃度は、走化性応答についての先の試験において研究された。各実験条件については、１５０ｍＬのコラーゲン（０．３５ｍｇ／ｍＬ）が、より大きい走化能をもつように先に選択された濃度の因子と混合された。コンフルエントなラットの骨髄培養物は分離され、細胞は、２×１０５細胞／ｍＬの□−ＭＥＭの濃度で、ボイデン（Boyden）チャンバー（ニューロプローブ、メリーランド州、ロックビル）の上部コンパートメントへ入れられた。チャンバーの下部コンパートメントには、異なる濃度の試験因子を入れた培養液を含有させた。５％ＣＯ２中、３７℃における４時間のインキュベートの後、フィルタは除去され、メタノール中で固定された；それらは洗浄され、染色され、スライドへ載置された。走化性（chemotaxis）は、各フィルタにおいて、顕微鏡（ｘ４００）の２０視野中に移動する細胞数をカウントすることによって定量された。
【００４１】
実施例４．
−細胞の能力付与（選択、増幅、および誘導）のための実験法
【００４２】
ＭＯ細胞は、上記の実験条件下に、培養液および、さらにＴＧＦ−β１を３日毎に交換して１０日間維持された。このような１０日間の後、培養液は患者の１０％血清（ＨＳ  １０％）によって満たされた。上記事項は、いわゆる選択期間を完了させ、増幅期を開始させ、上記条件は移植を可能にする細胞量を得るために必要な期間にわたり維持されたが、いずれの場合にも、この期間は２５日を超えるべきではない。この期間の後、培養液は、骨誘導性の化学薬品として作用する、デキサメタゾン（１０−８Ｍ）およびβ−グリセロホスフェートで満たされた。このわずか２日間の期間が、誘導（induction）と呼ばれる。
【００４３】
細胞培養の期間の間、試料は０，１０，１４，１８，２１，２４，２７，３０，３３および３６日に採取され、分析は、細胞数およびアルカリホスファターゼの存在およびカルシウム含量について行なわれた。表１、表２、表３は、得られた値を示している。それらは、ＴＧＦ−β１−ＣＢＤが、対照に対していかに細胞数を増加させるかを示している。同じことが、アルカリホスファターゼの合成について起きている。カルシウム含量もまた培養日数とともに増加するが、対照においてはその値は目立たない。
【００４４】
記述されたプロセスの間の、培養物の顕微鏡検査は、細胞がＴＧＦ−β−１ＤＵＣの存在下にあるとき、細胞がどのようにして培養日数の間に増殖し、なおかつ増幅期間の間にコロニーを形成するかを示している（図１）。細胞が、市販のＴＧＦ−β１（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネソタ州、ミネアポリス）で処理されると、それらは分散するか、またはあまりクラスターを作らない。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
【表２】
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【００４７】
【表３】
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【００４８】
実施例５．
−能力付与された細胞のトランスファー
培養期間の完了の後、コラーゲンゲルはコラゲナーゼにより標的化され、細胞は０．０５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡを用いて、２７℃において分散された。細胞は遠心分離され、洗浄され、無血清培養液中に再懸濁された。適当なカウントの後、それらの一部は、ラット皮下組織内へインプラントされたミリポア（Millipore）拡散チャンバー内に挿入され、その他の部分は、特定の骨損傷内へインプラントされるヒドロキシアパタイト断片中に吸収された（図３）。
【００４９】
実施例６．
−皮下インプランテーション。異所性の骨形成。
記述された方法により能力付与されかつ無血清培養液中に懸濁された、１×１０６個のヒト細胞を入れた拡散チャンバーは、７ヶ月齢の３４４匹の雌のフィッシャーラットの背中に、３．５ｍｇ／１００ｍｇ体重のペントバルビタールナトリウムの皮下注射によってそれらに麻酔を投与した後に皮下にインプラントされた。チャンバーを挿入するべく、背中の正中線に２ｃｍの切開が行なわれた。各々のラットは、ＴＧＦ−β１−ＣＢＤで処理された細胞を入れたいくつかのチャンバー、および、培養期間を通じて未処理の細胞を入れた対照のもの、または市販のＴＧＦ−β１を用いたものを有していた。傷は縫合され、ベタダイン（Betadine）で消毒された。４週間（インプランテーション期間）の後、過量の麻酔薬によりラットは殺され、チャンバーは組織学およびラジオグラフの研究用に除去された。後者は、低線量率Ｘ線を用いて行なわれた。組織学研究用には、チャンバーはブーニン（Bounin）中で、または１０％で緩衝化されたホルマリン中で固定された。固定の後、チャンバーのプラスチックリングは、アセトン中に沈めることによって溶解された。脱水の後、それらはパラフィン中に包埋され、いくつかの平面において、５マイクロメータの厚さで前後方向に切断された。切片は、インプランテーション期間の間にチャンバーの内側に形成された組織を分析する目的で、異なる組織化学的、または異なるコラーゲン型に対する抗体を用いた免疫細胞化学的技術により染色された。
【００５０】
図２は、異なるチャンバーについてのラジオグラフ的および組織学的画像を示しており、それらの中で形成された組織の、軟骨および骨の性質を説明している。繊維状組織がほとんど見られない対照チャンバーに比べて、実験のものは軟骨様の特徴をもつ広い組織表面を、他の、骨基質が、完全に形成された骨組織の前兆であるように見えるものとともに示している。データは、軟骨様組織が骨類−骨へとトランスフォームされるように見えることを示唆しており、それゆえこのことは、実際の軟骨内骨化のプロセスがチャンバーの内側で起きていることを示しているように見える。
【００５１】
実施例７．
−脛骨骨折におけるインプランテーションの実例
直径約０．５ｃｍの、ヒドロキシアパタイト、プロオステオン（Proosteon）５００（インターポア（Interopore））の断片は、それらの上に細胞懸濁液を数マイクロリットル滴下すること、およびそれらの穴のほとんどが細胞で満たされることを保証するべくそれらの位置を変えることにより、細胞懸濁液で包埋（embed）される。そのようにアレンジされた細胞は、無菌状態および０℃をわずかに超える温度に注意して手術室へ移された。患者を麻酔した後、骨折表面が用意され、ヒドロキシアパタイト断片が個別に導入された。この骨折は実際に、非結合性または萎縮性の偽関節症であり、繊維状組織をもつ無血管病巣によって特徴づけられ、血管新生化された軟骨−骨形成組織の増殖がない。それゆえ、インプラントに先立ち、同じ外科的行為において、繊維状組織は骨折端から除去され、双方の表面を硬化性の骨組織中に残し、かつ、近位および遠位の各々に血管供給源を見つけるまで穿孔するようにする。ヒドロキシアパタイトの断片は、骨折病巣に対して周辺の場所に沿って、孔の中に置かれた。全９５までの他のヒドロキシアパタイト断片は、骨折線の中に置かれた。軟骨−骨コンピテント細胞を入れたヒドロキシアパタイトの断片を置いた後、双方の骨断片は、中立化の原理に従って、チタンのねじを用いた加圧により取付けられたチタンプレートによって、硬質の、非動的ベース上に安定化された。
【００５２】
図３は、インプランテーションの６週間後の、生検において行なわれた組織学的切片の画像を示している。それらは、骨組織の特徴をもってヒドロキシアパタイト壁と接している新生された組織と、無機質の梁の間に残された空洞中の骨髄組織の形成とを示している。提供された証拠は、形成された組織が、成熟した骨の特徴をもつことを示している。さらに画像は、骨誘導がインプラントの近くに到達しているが、それほど遠くはないことを示しており、そのことは、移植された細胞がこの骨誘導の原因であって、細胞がインプラントの領域内において自然に拡散した場所に広がっていることから説明されることが可能である。インプラントからさらに遠い領域は、骨誘導の兆候を示さない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】ＭＯ細胞がｒｈＴＧＦ−β１−ＣＢＤの存在下で、コラーゲンゲル中でインビトロで培養された状態を説明する図である。
【図２】ラット皮下組織におけるインプランテーション期間の後の拡散チャンバーのラジオグラフである。
【図３】処理された細胞を用いてヒドロキシアパタイトインプラントが行なわれた場合に形成された組織の切片を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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