(57)【要約】本発明は、クロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度を変える方法；ボツリヌス毒素中毒を予防または治療する方法；代謝疾患、筋肉疾患、神経系疾患および／または疼痛状態を治療する方法；細胞膜上での脂質ラフツの形成を抑制する方法；脂質ラフツと関連する疾患を治療する方法；およびクロストリジウム毒素のインターナリゼーションを変える化合物を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中へのクロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度を変える方法であって、細胞の膜上の脂質ラフツの活性を変え、それによって該細胞中へのクロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度を変える工程を含む方法。
【請求項２】
脂質ラフツがカベオラである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
脂質ラフツが、カベオリン含有脂質ラフツおよび非カベオリン含有脂質ラフツよりなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
カベオリン含有脂質ラフツが、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたカベオリンファミリー成員を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
カベオリンファミリー成員が、ニューロン細胞、アストロサイト、グリア細胞、横紋筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、脂肪細胞、内皮細胞、分泌細胞、Ｉ型肺胞細胞、肺細胞、腎臓細胞、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、およびＢ細胞よりなる群から選ばれた細胞型で発現される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
脂質ラフツの活性が、細胞の膜を活性インヒビターと接触させることにより低下する、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
活性インヒビターが抗体を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗体が、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および機能阻止抗体よりなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
抗体が、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２、レッギー１、レッギー２、ストマチン、ＶＩＰ３６、ＬＡＴ／ＰＡＧ、ＭＡＬ、ＢＥＮＥ、シンタキシン１、シンタキシン４、シナプシン１、アデューシン、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、シナプトブレビンII、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、膜結合クロストリジウム毒素レセプタータンパク質、シナプトタグミンＩ、シナプトタグミンIIおよびＧＰＩ−アンカータンパク質に対する抗体よりなる群から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＱ１ｂおよびＧＴ１ｂに対する抗体よりなる群から選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
脂質ラフツの濃度を変化させることにより活性が変わる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞の膜を脂質ラフツ濃度インヒビターと接触させることにより、脂質ラフツの活性が低減する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
脂質ラフツ濃度インヒビターがコレステロール低減剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
コレステロール低減剤が、スタチン、シクロデキストリン、サポニン、およびフィリピンよりなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
脂質ラフツ濃度インヒビターがスフィンゴ脂質低減剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
スフィンゴ脂質低減剤が合成スフィンゴ脂質アナログである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
スフィンゴ脂質低減剤がスフィンゴ脂質合成のインヒビターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
スフィンゴ脂質合成のインヒビターが、Ｌ−シクロセリン、フモニシンＢ１、およびＤ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノールよりなる群から選ばれる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞の膜を脂質ラフツ活性エンハンサーと接触させることにより、脂質ラフツの活性が増大する、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
活性エンハンサーが抗体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗体が、脂質ラフツの成分と連結する（または同時局在またはクラスタリングを引き起こす）、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
活性エンハンサーが脂質ラフツ濃度エンハンサーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
脂質ラフツ濃度エンハンサーがコレステロール促進剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
コレステロール促進剤が合成コレステロールアナログである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
脂質ラフツ濃度エンハンサーがスフィンゴ脂質促進剤を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
スフィンゴ脂質促進剤が合成スフィンゴ脂質アナログである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
哺乳動物においてボツリヌス中毒を予防または治療する方法であって、脂質ラフツ活性インヒビターを投与し、それによってボツリヌス中毒を予防または治療する工程を含む方法。
【請求項２８】
脂質ラフツ活性インヒビターが抗体を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
抗体が、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および機能阻止抗体よりなる群から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
抗体が、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２、レッギー１、レッギー２、ストマチン、ＶＩＰ３６、ＬＡＴ／ＰＡＧ、ＭＡＬ、ＢＥＮＥ、シンタキシン１、シンタキシン４、シナプシン１、アデューシン、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、シナプトブレビンII、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、膜結合クロストリジウム毒素レセプタータンパク質、シナプトタグミンＩ、シナプトタグミンIIおよびＧＰＩ−アンカータンパク質に対する抗体よりなる群から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
抗体が、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＱ１ｂおよびＧＴ１ｂに対する抗体よりなる群から選ばれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
脂質ラフツ濃度インヒビターがコレステロール低減剤を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
コレステロール低減剤が、スタチン、シクロデキストリン、サポニン、およびフィリピンよりなる群から選ばれる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
脂質ラフツ活性インヒビターがスフィンゴ脂質低減剤を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
スフィンゴ脂質低減剤が合成スフィンゴ脂質アナログである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
スフィンゴ脂質低減剤がスフィンゴ脂質合成のインヒビターである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
スフィンゴ脂質合成のインヒビターが、Ｌ−シクロセリン、フモニシンＢ１、およびＤ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノールよりなる群から選ばれる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物において、代謝疾患、筋肉状態、神経系疾患および／または疼痛状態よりなる群から選ばれる医学的状態を予防または治療する方法であって、脂質ラフツ活性エンハンサーを投与し、ついでクロストリジウム毒素を投与し、それによって該代謝疾患、筋肉状態、神経系疾患、疼痛およびそれらの組み合わせを予防または治療する工程を含む方法。
【請求項３９】
該代謝疾患が、糖尿病、肥満および高血圧よりなる群から選ばれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
該筋肉状態が、筋ジストロフィー、斜視、眼瞼痙攣、痙性斜頸、オロマンジブラージストニー、および痙攣性発声障害よりなる群から選ばれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
神経系疾患が自律神経系疾患である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
自律神経系疾患が、鼻漏、中耳炎、唾液分泌過多、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、胃酸分泌過多、痙攣性大腸炎、および発汗過多よりなる群から選ばれる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
疼痛状態が、偏頭痛、筋痙攣、血管障害、アンギナ、神経痛、線維筋痛症、および炎症に伴う疼痛よりなる群から選ばれる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
活性エンハンサーが抗体を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
抗体が、脂質ラフツの成分と連結する（または同時局在またはクラスタリングを引き起こす）、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
活性エンハンサーが脂質ラフツ濃度エンハンサーを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
脂質ラフツ濃度エンハンサーがコレステロール促進剤を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
コレステロール促進剤が合成コレステロールアナログである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
脂質ラフツ濃度エンハンサーがスフィンゴ脂質促進剤を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
スフィンゴ脂質促進剤が合成スフィンゴ脂質アナログである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
脂質ラフツ活性エンハンサーがカベオラアクチベーターである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
細胞上での脂質ラフツの形成を抑制する方法であって、該細胞をクロストリジウム毒素と接触させ、それによって細胞上での脂質ラフツの形成を抑制する工程を含む方法。
【請求項５３】
脂質ラフツがカベオラである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
脂質ラフツが、カベオリン含有脂質ラフツおよび非カベオリン含有脂質ラフツよりなる群から選ばれる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
クロストリジウム毒素がカベオリンファミリー成員と相互作用する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
カベオリンファミリー成員が、ニューロン細胞、アストロサイト、グリア細胞、横紋筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、脂肪細胞、内皮細胞、分泌細胞、Ｉ型肺胞細胞、肺細胞、腎臓細胞、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、およびＢ細胞よりなる群から選ばれた１またはそれ以上の細胞型で発現される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
カベオリンファミリー成員が、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれる、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
脂質ラフツと関連する疾患を治療する方法であって、クロストリジウム毒素を投与する工程を含む方法。
【請求項５９】
該疾患が、肝臓のインスリン抵抗性、肥満、糖尿病、造血状態、免疫炎症状態、およびアルツハイマー病よりなる群から選ばれる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
細胞中へのクロストリジウム毒素のインターナリゼーションを変える化合物を同定する方法であって、クロストリジウム毒素に感受性の細胞を被験化合物と接触させ、ついで脂質ラフツに対するクロストリジウム毒素の親和性を変える化合物をスクリーニングする工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度を変える方法；ボツリヌス毒素中毒を予防または治療する方法；代謝疾患、筋肉疾患、神経系疾患、および／または疼痛状態を治療する方法；細胞膜で上の脂質ラフツ（lipid rafts）の形成を抑制する方法；脂質ラフツと関連する疾患を治療する方法；およびクロストリジウム毒素のインターナリゼーションを変える化合物を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス毒素は、臨床場面において活動亢進（hyperactive）骨格筋を特徴とする神経筋疾患の治療に用いられている。１９８９年にボツリヌス毒素Ａ型複合体は、米国食品医薬品局より眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣の治療について認可された。その後、ボツリヌス毒素Ａ型はまた、ＦＤＡにより頸部ジストニーの治療および眉間のしわの治療について認可され、ボツリヌス毒素Ｂ型は頸部ジストニーの治療について認可された。非Ａ型ボツリヌス毒素血清型は、ボツリヌス毒素Ａ型に比べて明らかに低い効力および／または短い活性期間を有する。末梢筋肉内ボツリヌス毒素Ａ型の臨床作用は、通常、注射１週間以内に認められる。ボツリヌス毒素Ａ型の１回の筋肉内注射による症状軽減の典型的期間は、有意に一層長い期間の治療活性の報告があるものの、平均して約３ヶ月である。
【０００３】
ボツリヌス毒素Ａ型は、臨床場面において、以下のようにして使用されることが報告されている：
（１）頸部ジストニーの治療のため、筋肉内注射（複数の筋肉）当たり約７５〜１２５単位のBOTOXR；
（２）眉間のしわの治療のため、筋肉内注射当たり約５〜１０単位のBOTOXR（５単位を鼻根筋に筋肉内注射および１０単位を各眉毛皺筋に筋肉内注射）；
（３）恥骨直腸筋の括約筋内注射による便秘の治療のため、約３０〜８０単位のBOTOXR；
（４）上瞼の外側瞼板前部眼輪筋（lateral pre-tarsal orbicularis oculi muscle）および下瞼の外側瞼板前部眼輪筋への注射による眼瞼痙攣の治療のため、筋肉当たり約１〜５単位の筋肉内注射したBOTOXR；
（５）斜視の治療のため、外眼筋に約１〜５単位のBOTOXRを注射する、注射する量は、注射する筋肉のサイズと所望の筋肉麻痺の程度（すなわち、所望のジオプトリ補正の程度）との両者に基づいて変わる；
（６）以下の５つの異なる上肢屈筋へのBOTOXRの筋肉内注射による、脳卒中後の上肢痙攣の治療のため：
（ａ）深指屈筋：７.５Ｕ〜３０Ｕ
（ｂ）浅指屈筋：７.５Ｕ〜３０Ｕ
（ｃ）尺側手根屈筋：１０Ｕ〜４０Ｕ
（ｄ）橈側手根屈筋：１５Ｕ〜６０Ｕ
（ｅ）上腕二頭筋：５０Ｕ〜２００Ｕ
［上記５つの筋肉の各々は、患者が各治療期間（session）に筋肉内注射により９０Ｕ〜３００Ｕの上腕屈筋BOTOXRを投与されるように、同じ治療期間に注射した］
（７）偏頭痛の治療のため、頭蓋骨膜注射した（眉間筋、前頭筋および側頭筋に対称的に注射）２５ＵのBOTOXRの注射は、２５Ｕの注射後３ヶ月にわたる偏頭痛頻度、最大重篤度、関連する嘔吐および急性の薬物療法使用の測定値の低下によって測定されるように、ビヒクルに比べて偏頭痛予防的処置としての有意の利益を示した。
【０００４】
さらに、筋肉内ボツリヌス毒素は、結果は印象的ではなかったと報告されているものの、パーキンソン病患者の振せんの治療に用いられている。Marjama-Jyons, J.ら、Tremor-Predominant Parkinson's Disease, Drugs & Aging 16(4);273-278:2000。
【０００５】
ボツリヌス毒素Ａ型は、１２ヶ月まで（European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150:1999）、およびある種の環境下では２７ヶ月もの長期にわたり効力を有しうることが知られている。The Laryngoscope 109:1344-1346:1999。しかしながら、BOTOXRの筋肉内注射の通常の持続時間は、典型的に約３〜４ヶ月である。
【０００６】
各種臨床状態の治療でのボツリヌス毒素Ａ型の成功は、他のボツリヌス毒素血清型への興味に導いた。ヒトで使用するための２つの市販されたボツリヌスＡ型製剤は、Allergan, Inc.（アーバイン、カリフォルニア）から入手可能なBOTOXR、およびBeaufour Ipsen（ポートダウン、イングランド）から入手可能なDysportRである。ボツリヌス毒素Ｂ型製剤（MyoBlocR）は、サンフランシスコ、カリフォルニアのElan Pharmaceuticalsから入手可能である。
【０００７】
ボツリヌス毒素はまた、末梢位置で薬理作用を有することに加えて中枢神経系でも抑制作用を有する。Weigandら、Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161-165、およびHabermann、Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47-56による研究は、ボツリヌス毒素が逆行輸送（retrograde transport）によって脊髄領域に上昇できることを示した。このように、末梢位置にたとえば筋肉内注射したボツリヌス毒素は、脊髄に逆行輸送される。
【０００８】
ボツリヌス毒素はまた、鼻漏、多汗症その他の自律神経系によって媒体される疾患（米国特許第5,766,605号）、緊張型頭痛（米国特許第6,458,365号）、偏頭痛（米国特許第5,714,468号）、術後痛および内臓痛（米国特許第6,464,986号）、脊椎内毒素投与による疼痛治療（米国特許第6,113,915号）、頭蓋内毒素投与によるパーキンソン病その他の運動障害の要素を有する疾患（米国特許第6,306,403号）、毛髪の生育および毛髪の保持（米国特許第6,299,893号）、乾癬および皮膚炎（米国特許第5,670,484号）、負傷した筋肉（米国特許第6,423,319号）、種々の癌（米国特許第6,139,845号）、膵臓疾患（米国特許第6,143,306号）、上部および下部食道、幽門括約筋および肛門括約筋へのボツリヌス毒素の注射を含む平滑筋疾患（米国特許第5,437,291号）、前立腺疾患（米国特許第6,365,164号）、炎症、関節炎および痛風（米国特許第6,063,768号）、若年性脳性麻痺（米国特許第6,395,277号）、内耳疾患（米国特許第6,265,379号）、甲状腺疾患（米国特許第6,358,513号）、副甲状腺疾患（米国特許第6,328,977号）の治療が提唱されている。さらに、徐放毒素インプラントが知られている（たとえば、米国特許第6,306,423号および同第6,312,708号を参照）。
【０００９】
７つの免疫学的に区別されるボツリヌス神経毒：ボツリヌス神経毒Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧが特徴付けられている。これら血清型は、型特異的な抗体による中和によって区別される。ボツリヌス毒素の異なる血清型は、それが作用する動物種およびそれが惹起する麻痺の重篤度および持続期間で変わる。たとえば、ボツリヌス毒素Ａ型は、ラットで生成される麻痺の割合により測定されるように、ボツリヌス毒素Ｂ型よりも５００倍強力であると決定されている。さらに、ボツリヌス毒素Ｂ型は４８０Ｕ／ｋｇの投与量で霊長類で非毒性であることが決定されているが、これはボツリヌス毒素Ａ型についての霊長類ＬＤ５０の約１２倍である。Moyer E.ら、Botulinum Toxin Type B: Experimental and Clinical Experience, "Therapy With Botulinum Toxin", Jankovic, J.ら編(1994), Marcel Dekker, Inc.の第6章、71-85頁。ボツリヌス毒素は、明らかにコリン作動性運動ニューロンに高親和性で結合し、ニューロンに輸送され、アセチルコリンの放出を抑制する。
【００１０】
血清型にも拘わらず、毒素中毒の分子メカニズムは近似しており、少なくとも３つのステップまたは段階を含むと思われる。プロセスの第一ステップでは、毒素は標的ニューロンのシナプス前膜に重鎖、Ｈ鎖、と細胞表面のレセプターとの特異的な相互作用により結合する；レセプターは、ボツリヌス毒素の各型および破傷風毒素で異なると考えられている。Ｈ鎖のカルボキシル末端セグメントＨｃは、毒素の細胞表面へのターゲティングに重要であると思われる。
【００１１】
第二のステップで、毒素は中毒された細胞の細胞質膜を通過する。毒素はまずレセプター媒体エンドサイトーシスによって飲み込まれ、毒素を含むエンドソームが形成される。ついで、毒素はエンドソームを逃れて細胞の細胞質に入る。このステップは、Ｈ鎖のアミノ末端セグメントＨＮによって媒体されると考えられており、このＨＮが約５.５またはそれより低いｐＨに応答して毒素のコンホメーション変化を駆動する。エンドソームは、エンドソーム内ｐＨを低下させるプロトンポンプを有することが知られている。このコンホメーションシフトは毒素内の疎水性残基を暴露させ、これにより毒素自体がエンドソーム膜に埋め込まれることが可能となる。ついで、毒素（あるいは、最小限、軽鎖）は、エンドソーム膜を通って細胞質に輸送される。
【００１２】
ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最後のステップは、重鎖（Ｈ鎖）と軽鎖（Ｌ鎖）とを連結するジスルフィド結合の還元を含むと思われる。ボツリヌス毒素および破傷風毒素の全体の毒素活性は、ホロ毒素（holotoxin）のＬ鎖に含まれる；Ｌ鎖は、細胞質膜の細胞質表面との神経伝達物質含有ベシクルの認識およびドッキング、および該ベシクルの細胞質膜との融合に必須のタンパク質を選択的に開裂する亜鉛（Ｚｎ＋＋）エンドペプチダーゼである。破傷風神経毒、ボツリヌス毒素Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ型は、シナプトソームの膜タンパク質であるシナプトブレビン（ベシクル結合膜タンパク質（vesicle-associated membrane protein）（ＶＡＭＰ）とも呼ばれる）とも呼ばれる）の分解を引き起こす。シナプスベシクルの細胞質表面に存在するＶＡＭＰの殆どは、これら開裂事象のいずれかの結果として除かれる。ボツリヌス毒素Ａ型およびＥ型は、ＳＮＡＰ−２５を開裂する。ボツリヌス毒素血清型Ｃ１は、もともとシンタキシン（syntaxin）を開裂するものと考えられたが、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５を開裂することがわかった。同じ結合を開裂するボツリヌス毒素Ｂ型（および破傷風毒素）を例外として、各ボツリヌス毒素は、異なる結合を特異的に開裂する。
【００１３】
すべてのボツリヌス毒素血清型は、明らかに神経筋接合部での神経伝達物質アセチルコリンの放出を抑制するが、異なる神経分泌タンパク質に作用することにより、および／またはこれらタンパク質を異なる部位で開裂することにより、そのように抑制するのである。たとえば、ボツリヌス毒素Ａ型およびＥ型はともに２５キロダルトン（ｋＤ）のシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を開裂するが、これらボツリヌス毒素は該タンパク質内の異なるアミノ酸配列を標的とする。ボツリヌス毒素Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ型は、ベシクル関連タンパク質（ＶＡＭＰ、シナプトブレビンとも呼ばれる）に作用するが、各血清型は該タンパク質を異なる部位で開裂する。最後に、ボツリヌス毒素Ｃ１型は、シンタキシンおよびＳＮＡＰ−２５をともに開裂することが示されている。これら作用メカニズムの差違は、種々のボツリヌス毒素血清型の相対的な強度および／または作用持続時間に影響を及ぼす。明らかに、ボツリヌス毒素の基質は様々な異なる細胞型で見出すことができる。たとえば、Biochem., J. 1;339 (pt 1):159-65:1999、およびMov Disord, 10(3):376:1995 (pancreatic islet B cells contains at least SNAP-25 and synaptobrevin)を参照。
【００１４】
ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、既知のボツリヌス毒素血清型の７つのすべてについて約１５０ｋＤである。興味深いことに、ボツリヌス毒素は、関連非毒素タンパク質とともに該１５０ｋＤボツリヌス毒素タンパク質分子を含む複合体としてクロストリジウム細菌により放出される。それゆえ、ボツリヌス毒素Ａ型複合体は、クロストリジウム細菌により９００ｋＤ、５００ｋＤおよび３００ｋＤ形として産生されうる。ボツリヌス毒素Ｂ型およびＣ１型は、明らかに７００ｋＤまたは５００ｋＤ複合体としてのみ産生される。ボツリヌス毒素Ｄ型は、３００ｋＤおよび５００ｋＤの両複合体として産生される。最後に、ボツリヌス毒素Ｅ型およびＦ型は、約３００ｋＤの複合体としてのみ産生される。これら複合体（すなわち、約１５０ｋＤよりも大きな分子量）は、非毒素血球凝集素タンパク質および非毒素かつ非毒性の非血球凝集素タンパク質を含んでいると思われる。これら２つの非毒素タンパク質（これらはボツリヌス毒素分子とともに関連する神経毒複合体を構成する）は、ボツリヌス毒素分子に変性に対する安定性を提供し、摂取されたときに消化性の酸に対する防禦を提供するように作用する。さらに、より大きな（約１５０ｋＤの分子量よりも大きな）ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からのボツリヌス毒素のより遅い拡散速度という結果となりうる。
【００１５】
インビトロの研究は、ボツリヌス毒素が脳幹組織の一次細胞培養からのアセチルコリンおよびノルエピネフリンの両者のカリウムカチオン誘発放出を抑制することを示している。さらに、ボツリヌス毒素は、脊髄ニューロンの一次培養で誘発されたグリシンおよびグルタミン酸の両者の放出を抑制すること、および脳シナプトソーム調製物においてボツリヌス毒素が神経伝達物質のアセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン（Habermann E.ら、Tetanus Toxin and Botulinum A and C Neurotoxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J. Neurochem. 51(2);522-527:1988）、ＣＧＲＰ、サブスタンスＰおよびグルタミン酸（Sanchez-Prieto, J.ら、Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur. J. Biochem. 165;675-681:1897）の各々の放出を抑制することが報告されている。それゆえ、適切な濃度を使用すれば、大抵の神経伝達物質の神経誘発放出はボツリヌス毒素により阻止される。たとえば、Pearce, L.B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine, Toxicon 35(9);1373-1412 at 1393; Bigalke H.ら、Botulinum A Neurotoxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360;318-324:1985; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the release of [3H]Noradrenaline and [3H]GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44;224-226:1988, Bigalke H.ら、Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316;244-251:1981;およびJankovic J.ら、Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc., (1994), 5頁を参照。
【００１６】
ボツリヌス毒素Ａ型は、クロストリジウム・ボツリヌム（Clostridium botulinum）の培養液を発酵槽中で確立および増殖させ、ついで公知の手法に従って発酵混合物を回収および精製することにより得ることができる。すべてのボツリヌス毒素血清型は、最初は不活性な一本鎖タンパク質として合成されるので、これがプロテアーゼにより開裂または切れ目を入れられて神経刺激性となる必要がある。ボツリヌス毒素Ａ型およびＧ型を生成する細菌株は内生のプロテアーゼを保有しており、それゆえ、血清型Ａ型およびＧ型は、大部分その活性形にて細菌培養液から回収することができる。対照的に、ボツリヌス毒素Ｃ１型、Ｄ型およびＥ型は非タンパク質分解株により合成され、それゆえ、培養液から回収されるときには典型的に活性化されていない。血清型Ｂ型およびＦ型はタンパク質分解株および非タンパク質分解株の両者により産生され、それゆえ、活性形および不活性形のいずれでも回収されうる。しかしながら、たとえばボツリヌス毒素Ｂ型血清型を産生するタンパク質分解株でさえ、産生される毒素の一部を開裂するにすぎない。切れ目を入れられていない分子に対する切れ目を入れられた分子の正確な比率は、インキュベーションの長さおよび培養温度に依存する。それゆえ、たとえばボツリヌス毒素Ｂ型毒素の調製物のあるパーセントは不活性である傾向があり、これがおそらくボツリヌス毒素Ａ型と比較したボツリヌス毒素Ｂ型の既知の有意に低い効力を説明している。臨床調製物中の不活性なボツリヌス毒素分子の存在は、調製物の全体としてのタンパク質投与量に寄与するであろうが、このことはその臨床的な有効性に寄与することなく増大した抗原性に関連していた。さらに、ボツリヌス毒素Ｂ型は、筋肉内注射したときに、ボツリヌス毒素Ａ型よりも活性の持続時間が短く、同じ投与量レベルで効能も低いことが知られている。
【００１７】
高品質の結晶性ボツリヌス毒素Ａ型は、≧３×１０７Ｕ／ｍｇ、０.６０未満のＡ２６０／Ａ２７８およびゲル電気泳動でのバンド形成の明確なパターンを特徴とするクロストリジウム・ボツリヌムのHall A株から産生することができる。Shantz, E.J.ら、Properties and use of Botulinum toxin and Other Microbial Neurotoxins in Medicine, Microbiol Rev. 56;80-99:1992に示されるように、公知のShantzプロセスを用いて結晶性のボツリヌス毒素Ａ型を得ることができる。一般に、クロストリジウム・ボツリヌムＡ型を適当な培地で培養することにより、嫌気性発酵からボツリヌス毒素Ａ型複合体を単離および精製することができる。公知のプロセスを用い、非毒素タンパク質から分離後、純粋なボツリヌス毒素、たとえば、約１５０ｋＤの分子量を有し比活性（specific potency）が１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の精製したボツリヌス毒素Ａ型；約１５６ｋＤの分子量を有し比活性が１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の精製したボツリヌス毒素Ｂ型；および約１５５ｋＤの分子量を有し比活性が１〜２×１０７ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の精製したボツリヌス毒素Ｆ型を得ることもできる。
【００１８】
ボツリヌス毒素および／またはボツリヌス毒素複合体は、List Biological Laboratories, Inc.、キャンプベル、カリフォルニア；the Centre for Applied Microbiology and Research、ポートンダウン、英国；和光（大阪、日本）、Metabiologics (マジソン、ウイスコンシン)並びにSigma Chemicals（セントルイス、ミズーリ）から得ることができる。純粋なボツリヌス毒素を用いて医薬組成物を調製することもできる。
【００１９】
酵素が一般的にそうであるように、ボツリヌス毒素（細胞内ペプチダーゼである）の生物学的活性は、少なくとも部分的に三次元コンホメーションに依存する。それゆえ、ボツリヌス毒素Ａ型は、加熱、表面拡張（surface stretching）および表面乾燥（surface drying）する種々の化学物質により解毒される。さらに、公知の培養、発酵および精製により得られた毒素複合体の医薬組成調合物に使用される極く極く低い毒素濃度への希釈は、適当な安定化剤が存在しない限り毒素の迅速な解毒という結果となることが知られている。１ミリリットル当たりミリグラムの量の毒素からナノグラム含む溶液への希釈は、そのような急激な希釈による比毒性の速やかな喪失のために有意の困難さを呈示する。毒素は毒素含有医薬組成物を調合した後何ヶ月または何年も使用できるので、毒素はアルブミンやゼラチンなどの安定化剤を用いて安定化することができる。
【００２０】
市販のボツリヌス毒素含有医薬組成物は、商標BOTOXR（Allergan, Inc.、アーヴィン、カリフォルニア）のもとに販売されている。BOTOXRは、滅菌真空乾燥した形態にパッケージングした精製ボツリヌス毒素Ａ型複合体、アルブミンおよび塩化ナトリウムからなる。ボツリヌス毒素Ａ型は、Ｎ−Ｚアミンおよび酵母エキスを含む培地で増殖させたクロストリジウム・ボツリヌムのHall株の培養液から調製する。ボツリヌス毒素Ａ型は、活性な高分子量毒素タンパク質および関連血球凝集素タンパク質からなる結晶性複合体への一連の酸沈降により培養液から精製する。結晶性の複合体を食塩水とアルブミンを含む溶液に再溶解し、真空乾燥前に滅菌濾過する（０.２ミクロン）。真空乾燥した製品を−５℃またはそれ以下で冷蔵庫に貯蔵する。BOTOXRは、筋肉内注射の前に滅菌非保存食塩水で再構成することができる。BOTOXRの各バイアルは、滅菌真空乾燥した形態にて保存剤なしで約１００単位（Ｕ）のクロストリジウム・ボツリヌム毒素Ａ型精製神経毒複合体、０.５ｍｇのヒト血清アルブミンおよび０.９ｍｇの塩化ナトリウムを含む。
【００２１】
真空乾燥したBOTOXRを再構成するため、保存剤を含まない滅菌生理食塩水（０.９％塩化ナトリウム注射液）を、適当なサイズの注射器に適量の希釈液を吸い上げることにより用いる。BOTOXRは泡立てることによりまたは同様の激しい攪拌により変性するので、希釈液を穏やかにバイアルに注入する。滅菌上の理由から、BOTOXRはバイアルを冷蔵庫から取り出し再構成した後４時間以内に投与するのが好ましい。これら４時間の間、再構成したBOTOXRは冷蔵庫中、約２℃〜約８℃で貯蔵できる。再構成した冷蔵BOTOXRは、その効力を少なくとも約２週間保持していることが報告されている。Neurology, 48:249-53:1997。
【００２２】
ガングリオシドは、高パーセントのニューロン細胞の細胞質膜を含むスフィンゴ糖脂質の一つのクラスである；ガングリオシドは、ＢｏＮＴおよびＴｅＮＴ結合活性を有することが見出された最初の膜成分であった。その後の研究は、ｂ系列のガングリオシド、とりわけＧＴ１ｂおよびＧＤ１ｂがこれらクロストリジウム毒素に対して最も高い親和性を有すると同定した。現在では２レセプターモデルが賛同を得ており、これは細胞質膜中のガングリオシドへの毒素の非特異的親和性媒体結合、並びに各毒素のその特別のタンパク質レセプターへの別のさらに特異的な関与を提唱するものである。ガングリオシドと組み合わせたシナプトタグミン（synaptotagmin）は、ＢｏＮＴ／Ａ、ＢｏＮＴ／Ｂ、およびＢｏＮＴ／Ｅに対するレセプターとして作用することが示されている。クロストリジウム・パーフリジェンス（Clostridium perfringens）毒素もまた、細胞質膜を貫通する７量体チャネルを形成し、毒素の細胞内への輸送を可能にすることが示されている。ＴｅＮＴに対する推定レセプターも記載されているが、関与するタンパク質は分子レベルで特徴付けられていない。
【００２３】
脂質二重層細胞質膜の古典的な「流動モザイク」モデルはよく知られている。さらに最近では、コレステロール、スフィンゴ脂質、およびスフィンゴ糖脂質に富んだマイクロドメインを有する「液体秩序（liquid-ordered）」膜部位が細胞質膜メカニズムの探求の注目となっている。これらマイクロドメインは、脂質ラフツ、界面活性剤不溶性の糖脂質リッチドメイン（ＤＩＧ）、カベオラ様界面活性剤不溶性の膜マイクロドメイン、スフィンゴ糖脂質シグナル伝達ドメイン（ＧＳＤ）、糖脂質に富む膜（ＧＥＭ）、および低比重トリトン不溶性（ＬＤＴＩ）複合体としても知られ、シグナル伝達およびタンパク質のトラフィッキング（protein trafficking）において中心的な役割を果たしていると考えられている。イノシトール１,４,５三リン酸レセプター、プロテインキナーゼＣ、Ｇタンパク質結合レセプター、マルチプルへテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質、非レセプターチロシンキナーゼ、ＡＴＰ依存性カルシウムポンプタンパク質、内皮ニトロキシドシンターゼ（ｅＮＯＳ）、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプターを含む高濃度の幾つかのシグナル伝達分子が脂質ラフツと関連していることが見出されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
上記のように、ボツリヌス毒素は多くの医学的状態の予防および治療において有効な治療剤である。
【００２５】
それゆえ、ボツリヌス中毒の治療のための一層有効な医薬および方法に対する必要性がなお存在する。さらに、医学的状態を治療するためのボツリヌス毒素の一層有効な使用に対する必要性がなお存在する。本発明は、そのような改善を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、クロストリジウム毒素の細胞内へのインターナリゼーションの程度を有効に変化させる方法を提供する。幾つかの態様において、該方法は、細胞の膜上の脂質ラフツまたはカベオラの活性を変化させる工程を含む。
【００２７】
さらに、本発明によれば、脂質ラフツの活性は、抗体や脂質ラフツ濃度インヒビターなどの活性インヒビターに細胞の膜を接触させることにより低減する。
【００２８】
さらに、本発明によれば、脂質ラフツの活性は、活性エンハンサーに細胞の膜を接触させることにより増大する。幾つかの態様において、活性エンハンサーは抗体である。幾つかの態様において、活性エンハンサーは、コレステロール促進剤やスフィンゴ脂質促進剤などの脂質ラフツ濃度エンハンサーを含む。
【００２９】
さらに、本発明によれば、哺乳動物においてボツリヌス中毒を予防または治療する方法が提供される。幾つかの態様において、該方法は、脂質ラフツ活性インヒビターを哺乳動物に投与してボツリヌス中毒を予防または治療する工程を含む。幾つかの態様において、脂質ラフツ活性インヒビターは、抗体またはコレステロール低減剤、スフィンゴ脂質低減剤またはそれらの組み合わせを含む。
【００３０】
さらに、本発明によれば、哺乳動物において代謝疾患、筋肉状態、神経系疾患および／または疼痛状態を予防または治療する方法が提供される。幾つかの態様において、該方法は、脂質ラフツ活性エンハンサーを投与し、ついでクロストリジウム毒素を投与する工程を含む。
【００３１】
さらに、本発明によれば、細胞上での脂質ラフツの形成を抑制する方法が提供される。幾つかの態様において、該方法は、クロストリジウム毒素、たとえばボツリヌス毒素に細胞を接触させて細胞膜上での脂質ラフツの形成を抑制する工程を含む。
【００３２】
さらに、本発明によれば、脂質ラフツと関連する疾患を治療する方法が提供される。該方法は、クロストリジウム毒素を哺乳動物に投与する工程を含む。脂質ラフツと関連する疾患の非制限的例としては、肝臓のインスリン抵抗性、肥満、糖尿病、造血状態、および免疫炎症状態が挙げられる。
【００３３】
さらに、本発明によれば、クロストリジウム毒素の細胞内へのインターナリゼーションを変化させる化合物を同定する方法が提供される。幾つかの態様において、該方法は、クロストリジウム毒素に感受性の細胞を被験化合物と接触させ、ついで脂質ラフツに対するクロストリジウム毒素の親和性を変化させる化合物をスクリーニングする工程を含む。
【００３４】
本明細書に記載するいかなる特徴あるいは特徴の組み合わせも本発明の範囲に包含される、ただし、そのような組み合わせに包含される特徴は、文脈、本明細書、および当業者の知識から明らかなように、相互に矛盾していてはならない。
【００３５】
本発明のさらなる利点および側面は、以下の詳細な記載および特許請求の範囲において明らかである。
【００３６】
「脂質ラフツ」（液体秩序ドメイン、膜マイクロドメイン、および界面活性剤不溶性糖脂質リッチドメインとしても知られる）は、その下にあるサイトゾルリーフレット（cytosolic leaflet）とおそらく相互作用している流動二重層の細胞質外リーフレット（exoplasmic leaflet）中のスフィンゴ脂質およびコレステロールの集合である。これら集合は、膜トラフィッキングおよびシグナル伝達における足場（platforms）として機能する。多くのタンパク質がラフツと特異的に相互作用し、これらは生化学およびマススペクトロメトリーにより同定することができる。脂質ラフツは、小さく、丸く、直径が５０〜１００ｎｍである。幾つかの脂質ラフツは、カベオリンファミリーの成員（たとえば、カベオリンおよび／またはフロッティリン（flottillin）、これらはタンパク質である）を含む。幾つかの態様において、カベオリン含有脂質ラフツは、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２およびそれらの組み合わせよりなる群から選ばれたカベオリンファミリー成員を含んでいてよい。さらに、カベオリンファミリー成員の濃度は、細胞の型により変わる。カベオリンファミリー成員はまた、差別的に発現されることが知られており、幾つかのカベオリンは、ニューロン細胞、アストロサイト、グリア細胞、横紋筋細胞、平滑筋細胞、心臓細胞、脂肪細胞、内皮細胞、分泌細胞、Ｉ型肺胞細胞、肺細胞、腎臓細胞、樹状細胞、マスト細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、およびＢ細胞で特異的に発現される。
【００３７】
「カベオラ」は、幾つかのシグナル伝達機能を行う特殊化された脂質ラフツである。カベオラは、細胞質膜の５０〜１００ｎｍの「フラスコ形状の」陥入である。カベオラは、様々な細胞型において、とりわけ内皮細胞において認められる。多くのタンパク質および脂質がカベオラにおいて富んでいることが知られている。
【００３８】
「脂質ラフツの活性」は、たとえば、脂質ラフツによって調整される細胞活性である。広範囲の活性が脂質ラフツによって調整されていると考えられている。脂質ラフツは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシスの両者により、主として分子の細胞トラフィッキングと関係していることが知られている。脂質ラフツは、ニューロンまたは分泌細胞からの分子のエキソサイトーシスの際のベシクル融合タンパク質のアセンブリーのための領域として働く。さらに、脂質ラフツと相互作用する細胞性および／または外来の分子は、脂質ラフツを輸送シャトルとして使用することができる。脂質ラフツは、シグナル伝達分子の細胞膜中への封入を調整する分子ソーティング装置として機能し、それによりレセプター／リガンド複合体のアセンブリーのための足場または認識点として機能することができる。それゆえ、脂質ラフツは、選択された細胞または細胞下領域内でのシグナル伝達経路の空間−時間的なまとめ役（organizers）として作用する。脂質ラフツはまた、膜におけるコンホメーション変化をも媒体することができ、分子の進入または細胞からの分子の進出が可能となる。さらに、脂質ラフツは、分子の局在、区画化および／または濃縮の部位として作用することができ、病原体または毒素タンパク質の進入点として働く。
【００３９】
「ボツリヌス毒素中毒」なる語は、通常はクロストリジウム・ボツリヌムによって産生される活性なボツリヌス毒素の７つの血清型の１またはそれ以上によって引き起こされる状態を意味する。ボツリヌス毒素中毒の症状としては、典型的に暴露１２〜７２時間内に示される、顕著な球麻痺を伴う急性の対称的、下行性の弛緩性麻痺が挙げられる。ボツリヌス毒素中毒は、もしも適切な処置が施されないと致死的である。
【００４０】
「脂質ラフツまたはカベオラの形成と関連する疾患」とは、脂質ラフツの形成の抑制またはカベオラ形成の抑制／制御が疾患の症状を改善しまたは疾患を治療するような疾患である。
【００４１】
「重鎖」なる語は、ボツリヌス毒素の重鎖を意味する。それは約１００ｋＤａの分子量を有し、本明細書では重鎖またはＨと称する。
【００４２】
「ＨＮ」なる語は、ボツリヌス毒素の重鎖に由来する断片（約５０ｋＤａの分子量を有する）（重鎖のアミノ酸末端セグメントとほぼ等価である）、または完全重鎖中の該断片に対応する部分を意味する。それは、細胞内のエンドソーム膜を経た軽鎖の輸送に関与する天然または野生型ボツリヌス毒素の部分を含むと考えられている。
【００４３】
「ＨＣ」なる語は、ボツリヌス毒素の重鎖に由来する断片（約５０ｋＤａの分子量を有する）（重鎖のカルボキシル末端セグメントとほぼ等価である）、または完全重鎖中の該断片に対応する部分を意味する。
【００４４】
「軽鎖」なる語は、ボツリヌス毒素の軽鎖を意味する。それは約５０ｋＤａの分子量を有し、軽鎖Ｌとして、またはボツリヌス毒素のタンパク質分解ドメイン（アミノ酸配列）として言及される。軽鎖は、軽鎖が標的細胞の細胞質中に存在するときの神経伝達物質（すなわち、アセチルコリン）放出のインヒビターを含むエキソサイトーシスのインヒビターとして有効であると考えられている。
【００４５】
「ターゲティング残基」なる語は、細胞、好ましくは特異的な型の細胞の表面上のレセプターによって認識され結合する分子を意味する。
【００４６】
本明細書において使用する「哺乳動物」なる語は、たとえば、ヒト、ラット、ウサギ、マウスおよびイヌを含む。
【００４７】
「局所投与」なる語は、罹患、疾患または疼痛知覚の部位またはその近傍での非全身経路による直接投与を意味する。
【００４８】
各種態様の説明
本発明は、一部、クロストリジウム毒素の細胞中へのインターナリゼーションの程度が細胞の膜の表面上の脂質ラフツの活性を変えることによって変えられるとの知見に基づいている。この知見は、重要な医学的な意義および用途を有する。たとえば、脂質ラフツの活性を低下させることによってクロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度を低下させることができ、クロストリジウム毒素中毒を有効に治療または予防できる。検討してあるように、クロストリジウム毒素は多くの医学的状態を治療するうえで有効である。それゆえ、幾つかの態様においては、脂質ラフツの活性を増大させ、投与したクロストリジウム毒素のインターナリゼーションを増大させるようにすることが有利である。
【００４９】
本発明はまた、一部、クロストリジウム毒素が細胞上での脂質ラフツの形成を抑制するとの知見に基づいている。この知見は、重要な医学的な意義および用途を有する。たとえば、本発明の知見に基づいて、脂質ラフツ形成と関連する種々の医学的状態を治療するためにクロストリジウム毒素を投与することができる。
【００５０】
本明細書において言及するクロストリジウム毒素を使用する新規な方法はまた、クロストリジウム・ベラッチ（Clostridium beratti）、クロストリジウム・ブチリクム（Clostridium butyricum）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）細菌またはクロストリジウム・ボツリヌムによって産生されるいずれの毒素をも使用できる。幾つかの態様において、クロストリジウム毒素は、ボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ１型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型およびＧ型よりなる群から選ばれた毒素である。幾つかの態様において、クロストリジウム毒素は、ボツリヌス毒素Ａ型である。従って、クロストリジウム・ベラッチ、クロストリジウム・ブチリクム、クロストリジウム・テタニ細菌、クロストリジウム・ボツリヌムによって産生されるいかなる毒素、ボツリヌス毒素Ａ型、Ｂ型、Ｃ１型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型またはＧ型を、クロストリジウム毒素の使用が言及される場合に用いることができる。
【００５１】
Ｉ．クロストリジウム毒素の細胞中へのインターナリゼーションの程度を変える方法：
クロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度は、細胞の膜上の脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性を変えることによって変えることができる。たとえば、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性は、細胞の膜を活性インヒビターと接触させることによって低下させることができる。活性インヒビターの非制限的な例としては、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および機能阻止抗体などの抗体が挙げられる。
【００５２】
抗体は、脂質ラフツの重要な成分に結合して物理的に抑制することにより、該成分の機能を妨害または阻止することにより、活性インヒビターとして働く。この成分は、内在性または膜アンカー（membrane-anchored）タンパク質成分、コレステロール、またはスフィンゴ脂質（ガングリオシドを含む）である。抗体の結合は脂質ラフツの膜との関連において重要成分のコンホメーションを変化させ、該成分の機能の抑制という結果となる。重要な脂質ラフツ成分への抗体の結合は、該成分を物理的に不活化させるか、または該成分がシグナル伝達事象に参画するのを直接妨げる。抗体の結合は、複数成分の凝集を引き起こし、それら成分の脂質ラフツ内での局在および／または濃縮を妨害する。
【００５３】
幾つかの態様において、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性を抑制するのに有効な抗体は、脂質ラフツと関連する成分に対してターゲティングすることができる。脂質ラフツと関連する成分の非制限的例としては、カベオリン１、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２、レッギー１（reggie-1）、レッギー２、ストマチン（stomatin）、ＶＩＰ３６、ＬＡＴ／ＰＡＧ、ＭＡＬ、ＢＥＮＥ、シンタキシン１、シンタキシン４、シナプシン１（synapsin I）、アデューシン（adducin）、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、シナプトブレビンII、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、膜結合クロストリジウム毒素レセプタータンパク質、シナプトタグミンＩ、シナプトタグミンIIまたはＧＰＩ−アンカータンパク質が挙げられる。ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＱ１ｂおよびＧＴ１ｂなどのガングリオシドを認識する抗体も脂質ラフツの活性を低減させるのに用いることができる。
【００５４】
幾つかの態様において、カベオリン（たとえば、カベオリン１、カベオリン２、カベオリン３）に対する抗体を脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性を抑制するのに用いる。幾つかの態様において、カベオリンを細胞内に輸送させるべく、カベオリンに対する抗体をトランスポーターとコンジュゲートする。種々のトランスポーターが当該技術分野において知られている。たとえば、米国特許第6,203,794号は、不活性なクロストリジウム毒素のトランスポーターとしての使用を教示している（米国特許第6,203,794号の開示をその全体により参照のため本明細書に引用する）。幾つかの態様において、米国特許第6,203,794号により教示されているように、カベオリンに対する抗体を不活性なクロストリジウム毒素にコンジュゲートする。本明細書では以下、不活性なクロストリジウム毒素にコンジュゲートしたカベオリンに対する抗体を、抗カベオリンコンジュゲートと称する。
【００５５】
幾つかの態様において、抗カベオリンコンジュゲートは、カベオリンに対する抗体および不活性なボツリヌス毒素を含む。たとえば、抗カベオリンコンジュゲートは、カベオリン１に対する抗体および不活性なボツリヌス毒素Ａ型、またはカベオリン２に対する抗体および不活性なボツリヌス毒素Ａ型、またはカベオリン３に対する抗体および不活性なボツリヌス毒素Ａ型を含んでいてよい。幾つかの態様において、抗カベオリンコンジュゲートは、フロッティリンに対する抗体および不活性なボツリヌス毒素を含む。たとえば、抗カベオリンコンジュゲートは、フロッティリン１に対する抗体および不活性なボツリヌス毒素Ａ型、またはフロッティリン２に対する抗体および不活性なボツリヌス毒素Ａ型を含んでいてよい。
【００５６】
本発明をいかなる理論あるいは操作のメカニズムに限定する意図を有するものではないが、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性はまた脂質ラフツの濃度を変えることによって変えることができると考えられる。脂質ラフツの濃度の変化は脂質ラフツの活性を変える、なぜなら、たとえば、細胞膜内の脂質ラフツの濃度の低減は、脂質ラフツ相互作用分子、たとえば、毒素、病原体、シグナル伝達分子、レセプターに対する細胞外リガンド、カベオリンおよびＳＮＡＰおよびＳＮＡＲＥ融合複合体タンパク質などのドッキング部位または接近点の利用可能性を低減させるからである。ドッキング部位や接近点の利用可能性の低減は、エンドサイトーシスおよび／またはエキソサイトーシスの小胞融合の低減および膜トラフィッキングの破砕に導きうる。一方、細胞膜内の脂質ラフツの濃度の増大は、脂質ラフツ相互作用分子、たとえば、毒素、病原体、シグナル伝達分子、レセプターに対する細胞外リガンド、カベオリンおよびＳＮＡＰおよびＳＮＡＲＥ融合複合体タンパク質などのドッキング部位または接近点の利用可能性を増大させる。ドッキング部位や接近点の利用可能性の増大は、エンドサイトーシスおよび／またはエキソサイトーシスの小胞融合の促進および膜トラフィッキングの促進に導きうる。
【００５７】
幾つかの態様において、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性は、脂質ラフツの濃度の変化を引き起こす脂質ラフツ活性インヒビターに細胞の膜を接触させることにより低下させることができる。それゆえ、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）活性インヒビターは、脂質ラフツ濃度インヒビターを含む。脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）濃度インヒビターの非制限的例としては、コレステロール低減剤またはスフィンゴ脂質低減剤が挙げられる。コレステロール低減剤の非制限的例としては、スタチン（statins）、シクロデキストリン、サポニン、およびフィリピン（filipin）が挙げられる。スフィンゴ脂質低減剤の非制限的例としては、合成スフィンゴ脂質アナログおよびスフィンゴ脂質合成のインヒビター（たとえば、Ｌ−シクロセリン、フモニシンＢ１（fumonisin B1）、およびＤ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール）が挙げられる。
【００５８】
コレステロール低減剤またはスフィンゴ脂質低減剤は、脂質ラフツの形成を妨害することによって、またはその組成および／または活性に影響を及ぼすことによって、脂質ラフツを抑制しまたは脂質ラフツの濃度を低減させる。局所的な脂質環境が脂質ラフツの形成、組成および活性に有意の影響を及ぼすことが知られている。たとえば、細胞質膜のサイトゾルリーフレット上のカベオリンタンパク質はコレステロールと相互作用することが知られている。実際、細胞質膜の脂質ラフツドメイン中へのコレステロールの輸送におけるカベオリンの役割についての証拠が存在する。カベオリンノックアウトマウスは脂質ホメオスタシスが変わっており、脂質ラフツ中へのコレステロールの輸送におけるカベオリンタンパク質の予測された役割が脂質ラフツの組成に有意の影響を及ぼすことが示唆されている。それゆえ、脂質ラフツのコレステロールおよびスフィンゴ脂質成分のレベルを低減させる薬剤は、脂質ラフツの形成、組成および／または活性に影響を及ぼすことが予測される。さらに、脂質ラフツの組成を変化させることは、ある種のニューロンについてのボツリヌス毒素などの脂質ラフツ相互作用分子の特異性の変化という結果となる。
【００５９】
幾つかの態様において、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性は増大させることもできる。たとえば、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の活性は、細胞の膜を脂質ラフツ活性エンハンサーと接触させることにより増加させることができる。脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）活性エンハンサーの非制限的例としては、抗体または脂質ラフツ濃度エンハンサーが挙げられる。本発明をいかなる理論あるいは操作のメカニズムに限定する意図を有するものではないが、抗体は、脂質ラフツの成分を連結することにより（または同時局在またはクラスタリング）脂質ラフツ活性エンハンサーとして作用する。この連結は脂質ラフツ活性の増大という結果となる、なぜなら、脂質ラフツの幾つかの成分、たとえば膜貫通タンパク質、成長因子レセプターその他のシグナル伝達タンパク質は二量体を形成することによって活性化されることが知られているからである。さらに、多量体複合体の活性化は、該複合体のアセンブリー状態によって制御しうることが知られている。それゆえ、脂質ラフツ内の多量体複合体の成分の同時局在またはクラスタリングは多量体複合体の活性を制御することができ、それによって脂質ラフツの活性に影響を及ぼす。さらに、幾つかのタンパク質はまた、リン酸化、アセチル化、パルミトイル化およびユビキチン化などの翻訳後修飾によって制御されることが知られている；相互作用タンパク質と接触させることにより、脂質ラフツの重要なタンパク質成分を翻訳後修飾および活性化させ、それによって脂質ラフツの活性を増大させることができる。
【００６０】
幾つかの態様において、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）濃度エンハンサーは、コレステロール促進剤またはスフィンゴ脂質促進剤であってよい。ガングリオシドおよびＧＰＩ−アンカータンパク質は、脂質ラフツ中にしばしば認められる、それぞれスフィンゴ脂質およびタンパク質成分の非制限的例である。生きた細胞では、ＧＰＩ−アンカータンパク質は脂質ラフツ内にクラスタリングすることが示されており、このクラスタリングは細胞中のコレステロールのレベルに依存していた。生きた細胞へのガングリオシドの外部からの適用は、脂質ラフツの特性に影響を及ぼすことが示されており、ＧＰＩ−アンカータンパク質のクラスタリングを廃棄し、それらを脂質ラフツから置換した（Simonsら、1999 Mol. Biol. Cell 10(10): 3187-3196）。それゆえ、脂質ラフツの一つの成分の濃度を変化させることは、脂質ラフツを構成する他の成分に対して広大な影響を及ぼしうる。本発明の幾つかの態様において、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）濃度エンハンサーは、コレステロール促進剤またはスフィンゴ脂質促進剤であってよい。コレステロール促進剤の非制限的例は、合成コレステロールアナログ、たとえば、３β−クロロコレステン、コレステロールのノンフソジェニック（nonfusogenic）アナログである。スフィンゴ脂質促進剤の例は、合成スフィンゴ脂質アナログ、たとえば、Ｃ６−ＮＢＤ−標識スフィンゴ脂質、Ｃ６−ＮＢＤ−標識グルコシルセラミドおよびＣ６−ＮＢＤ−スフィンゴミエリンである（van IJzendoornおよびHoekstra, 1999 Mol. Biol. Cell 10(10): 34493461）。
【００６１】
コレステロール促進剤およびスフィンゴ脂質促進剤は、それぞれ細胞質膜内の脂質ラフツ中のコレステロールおよびスフィンゴ脂質（ガングリオシドを含む）を置換し、それによって脂質ラフツの組成を変化させることによって脂質ラフツの活性を促進する。そのような脂質ラフツ組成の変化は、脂質ラフツの機能を促進または減少させることができる。もしもアナログが置換したコレステロールまたはスフィンゴ脂質成分と同じ活性を有するなら、該アナログの増大した濃度は脂質ラフツの活性を増大させるように作用するであろう。もしもアナログが置換したコレステロールまたはスフィンゴ脂質成分と比べて活性が減少しておれば、該アナログでの処置は脂質ラフツの活性を低減させるであろう。
【００６２】
幾つかの態様において、クロストリジウム毒素の細胞中へのインターナリゼーションの程度は、細胞の膜上のカベオリンファミリー成員（カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３，フロッティリン１、フロッティリン２など）の濃度を変化させることによって変えることができる。カベオリンの濃度の変化はクロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度を変えることができる、なぜなら、クロストリジウム毒素、たとえばボツリヌス毒素は、カベオリンタンパク質と直接または間接的に相互作用すると考えられており、カベオリン含有脂質ラフツは、ボツリヌス毒素のエンドサイトーシス並びに神経伝達物質の分泌および放出に関与する小胞のエキソサイトーシスを媒体すると考えられているからである。たとえば、クロストリジウム毒素のインターナリゼーションの程度は、細胞膜中のカベオリンタンパク質の濃度を低下させることにより低減することができる。幾つかの態様において、カベオリンタンパク質の濃度を低減させる方法は、細胞の膜を抗体と接触させることである。使用できる抗体の非制限的例としては、ヒト化抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、および機能阻止抗体が挙げられる。
【００６３】
細胞膜中のカベオリンタンパク質の濃度を低下させる抗体は、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２、レッギー１、レッギー２、ストマチン、ＶＩＰ３６、ＬＡＴ／ＰＡＧ、ＭＡＬ、ＢＥＮＥ、シンタキシン１、シンタキシン４、シナプシン１、アデューシン、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、シナプトブレビンII、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、膜結合クロストリジウム毒素レセプタータンパク質、シナプトタグミンＩ、シナプトタグミンIIおよびＧＰＩ−アンカータンパク質に対してターゲティングすることができる。ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＱ１ｂおよびＧＴ１ｂなどのガングリオシドを認識する抗体もカベオリンタンパク質の濃度を低減させるのに用いることができる。
【００６４】
当業者であれば、これら抗体の作製法を知っているであろう。たとえば、当該技術分野で一般に知られた抗体の一つの製造法は、標準分子生物学法を用いて目的の組換えペプチドまたはタンパク質を発現および精製し、ついで、この精製ペプチドまたはタンパク質をウサギやマウスなどの哺乳動物に注射することである。適切な時間および複数の免疫後、ついで注射した動物から免疫血清を得、アフィニティー精製法を用いて特定の目的ペプチドまたはタンパク質について特異性の増大した抗体を免疫血清の複合混合物からさらに精製し単離することができる。抗ガングリオシド抗体もまた、他の非ペプチド分子に対してターゲティングした抗体と同様、生成することができる（Schwererら、1999 Infect. Immun. 67(5):2414-2420参照）。モノクローナル抗体の製造などの他の抗体製造法も当該技術分野でよく知られている。
【００６５】
幾つかの態様において、本発明により同定した抗体は、該抗体を細胞中に輸送すべくトランスポーターとコンジュゲートすることができる。幾つかの態様において、抗体は、Dollyの米国特許第6,203,794号に教示されているように、不活性なクロストリジウム毒素とコンジュゲートして細胞中に輸送可能なコンジュゲートを生成する。たとえば、そのようなコンジュゲートは、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３、フロッティリン１、フロッティリン２、レッギー１、レッギー２、ストマチン、ＶＩＰ３６、ＬＡＴ／ＰＡＧ、ＭＡＬ、ＢＥＮＥ、シンタキシン１、シンタキシン４、シナプシン１、アデューシン、ＶＡＭＰ２、ＶＡＭＰ／シナプトブレビン、シナプトブレビンII、ＳＮＡＲＥタンパク質、ＳＮＡＰ−２５、ＳＮＡＰ−２３、膜結合クロストリジウム毒素レセプタータンパク質、シナプトタグミンＩ、シナプトタグミンII、ＧＰＩ−アンカータンパク質、ＧＭ１、ＧＤ１ａ、ＧＤ１ｂ、ＧＱ１ｂおよび／またはＧＴ１ｂに対する以下の抗体の１またはそれ以上を含んでいてよい。
【００６６】
幾つかの態様において、カベオリンタンパク質の濃度はまた、細胞の膜を上記のコレステロール低減剤またはスフィンゴ脂質低減剤と接触させることによっても低下させることができる。
【００６７】
幾つかの態様において、カベオリンタンパク質の濃度は、細胞の膜を上記の合成コレステロールやスフィンゴ脂質アナログなどのコレステロール促進剤またはスフィンゴ脂質促進剤と接触させることにより増加させることができる。
【００６８】
幾つかの態様において、カベオリンタンパク質の濃度は、カベオリン遺伝子発現を刺激することによって増加させることができる。
【００６９】
II．哺乳動物においてクロストリジウム毒素中毒を予防または治療する方法：
脂質ラフツ活性インヒビターは、クロストリジウム毒素、たとえばボツリヌス毒素の細胞中へのインターナリゼーションの低減を引き起こす。そのようであるから、脂質ラフツ活性インヒビターは、クロストリジウム毒素中毒の治療に有効である。幾つかの態様において、クロストリジウム毒素中毒、たとえばボツリヌス毒素中毒を治療または予防する方法は、そのような治療または予防を必要とする哺乳動物に脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）活性インヒビターを投与する工程を含む。上記のように、脂質ラフツ活性インヒビターの非制限的例としては、抗体、コレステロール低減剤、またはスフィンゴ脂質低減剤が挙げられる。
【００７０】
幾つかの態様において、ＢｏＮＴの中毒作用を予防または治療すべく脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）活性インヒビターを投与する。ＢｏＮＴ中毒には主として３つの主要なタイプがある：食物由来ボツリヌス中毒、幼児ボツリヌス中毒および創傷ボツリヌス中毒。そして不運なことに、第四のタイプのＢｏＮＴ中毒：ＢｏＮＴの意図的放出（deliberate release）がある。食物由来ボツリヌス中毒は、前もって生成した毒素をヒトが摂取したときに起こり、数時間から数日で病気に導く。食物由来ボツリヌス中毒は公衆衛生の緊急事態である、なぜなら汚染された食物が患者以外の他のヒトにも依然として利用できるかもしれないからである。食物由来ボツリヌス中毒では、症状は毒素含有食物を食べてから６時間〜２週間（最も普通には１２〜３６時間）で発症する。ボツリヌス中毒の症状としては、複視、目のかすみ、瞼の垂れ、不明瞭言語、嚥下困難、口の渇き、常に体を下降する筋肉の脱力が挙げられる：まず肩がやられ、ついで上腕、下腕、太腿、ふくらはぎ等。呼吸筋の麻痺は、呼吸の補助（機械換気）を施さなければヒトの呼吸を停止させ死に至らしめることがある。幼児ボツリヌス中毒は、消化管にクロストリジウム・ボツリヌムを保菌する少数の感受性の幼児で毎年起こるものである。創傷ボツリヌス中毒は、創傷が毒素を分泌するクロストリジウム・ボツリヌムに感染したときに起こる。意図的なバイオテロＢｏＮＴ中毒は以下の特徴を有する：顕著な球麻痺を伴う急性の弛緩性麻痺の多数の症例の発生；異常なボツリヌス毒素型（たとえば、水分食物からは獲得されることのないＣ、Ｄ、Ｆ、ＧまたはＥ型）の発生；共通の食餌暴露はないが（たとえば、エアゾル攻撃を示唆する特徴）症例間で共通の地理的因子（たとえば、空港）での発生；および共通する原因なしの複数の同時発生。
【００７１】
現在のところ、活性なＢｏＮＴ血清型Ａ〜Ｅに対して防禦する５価ワクチンおよび活性なＢｏＮＴ血清型Ｆに対して防禦する別の１価ワクチンが調査新規医薬（Investigational New Drugs）として利用できる。しかしながら、トキソイドワクチンには多くの欠点がある。たとえば、アナフィラキシーなどの抗毒素に対する重篤な副作用がレシピエントの２％に生じることが報告されている。
【００７２】
ボツリヌス毒素中毒に対抗する他の方法は研究段階であり、その殆どは抗原を投与して毒素に対する抗体を産生させることを含む。たとえば、Simpsonらは、経口で投与して哺乳動物において抗体の産生を刺激することのできる不活性なＢｏＮＴを報告している。米国特許第6,051,239号（その開示の全体を参照のため本明細書に引用する）を参照。抗体の産生に依存するこれら方法はそれほど実際的ではない、なぜなら毒素で中毒になる前に哺乳動物にワクチン接種する必要があるからである。たとえば、もしもワクチン接種していない哺乳動物をボツリヌス毒素で中毒させると、抗原（たとえば、活性なＢｏＮＴ）に対する抗体産生を刺激するための活性なＢｏＮＴの投与は役に立たない、なぜなら哺乳動物による抗体の産生は活性なＢｏＮＴの有害な作用（約１２〜７２時間で起こる）を防ぐに充分なほど時宜を得たものではないからである。
【００７３】
幾つかの態様において、ボツリヌス毒素中毒を予防または治療すべくカベオリンに対する抗体を投与する。
【００７４】
幾つかの態様において、ボツリヌス毒素中毒を予防または治療すべく上記のカベオリンコンジュゲートを投与する。
【００７５】
通常の知識を有する医療従事者は、最適の臨床結果を達成すべく適当な投与量および投与頻度を決定できる。すなわち、医療の当業者であれば、ボツリヌス毒素中毒を有効に予防または治療するため、適量の脂質ラフツ活性インヒビターを適当な時間に投与することができるであろう。
【００７６】
さらに、通常の知識を有する医療従事者は、最適の臨床結果を達成すべく、脂質ラフツ活性インヒビターの適当な投与量および投与頻度を決定できる。すなわち、医療の当業者であれば、クロストリジウム毒素中毒を有効に予防または治療するため、適量の脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）活性インヒビターを適当な時間に投与することができるであろう。
【００７７】
幾つかの態様において、治療を受ける哺乳動物はさらに、精密な呼吸モニタリングおよび腸内チューブまたは非経口栄養による給餌、集中介護、機械換気、および／または二次感染症の治療を受ける。
【００７８】
III．哺乳動物における代謝疾患、筋肉状態、神経系疾患および／または疼痛状態を予防または治療する方法：
哺乳動物において代謝疾患、筋肉状態、神経系疾患および／または疼痛状態を予防または治療するため、クロストリジウム毒素、たとえばボツリヌス毒素を投与できることが知られている。本発明は、クロストリジウム毒素の投与を脂質ラフツ活性エンハンサーとコンバインして治療用クロストリジウム毒素の作用を促進することにより、この知見を改善するものである。
【００７９】
幾つかの態様において、本発明の方法は、脂質ラフツ活性エンハンサーおよびクロストリジウム毒素を組み合わせて投与する（co-administering）工程を含む。組み合わせ投与は、脂質ラフツ活性エンハンサーとクロストリジウム毒素との同時または連続した（いずれの順序にても）投与を含む。
【００８０】
代謝疾患の非制限的例としては、糖尿病、肥満および高血圧が挙げられる。筋肉状態の非制限的例としては、筋ジストロフィー、斜視、眼瞼痙攣、痙性斜頸、オロマンジブラージストニー（oromandibular dystonia）、および痙攣性発声障害が挙げられる。神経系疾患の非制限的例としては、アルツハイマー病が挙げられる。幾つかの態様において、神経系疾患はまた自律神経系疾患でもありうる。自律神経系疾患の非制限的例は、鼻漏、中耳炎、唾液分泌過多、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、胃酸分泌過多、痙攣性大腸炎、および発汗過多である。疼痛状態の非制限的例としては、偏頭痛、筋痙攣、血管障害、アンギナ、神経痛、線維筋痛症、および炎症に伴う疼痛が挙げられる。
【００８１】
上記のように、脂質ラフツ活性エンハンサーは、脂質ラフツの成分；脂質ラフツ濃度エンハンサー；カベオラアクチベーター、たとえばオカダイ酸（okadaic acid）と連結した（または、その同時局在またはクラスタリングを引き起こす）抗体であってよい。
【００８２】
幾つかの態様において、本発明の方法は、脂質ラフツエンハンサーとボツリヌス毒素、たとえばボツリヌス毒素Ａ型とを組み合わせて投与する工程を含む。幾つかの態様において、使用する脂質ラフツエンハンサーは、同時局在させる抗体であってよい。幾つかの態様において、脂質ラフツエンハンサーは、オカダイ酸などのカベオラアクチベーターであってよい。幾つかの態様において、脂質ラフツと関連する疾患を予防または治療すべく、オカダイ酸およびボツリヌス毒素Ａ型を投与する。
【００８３】
通常の知識を有する医療従事者は、最適の臨床結果を達成すべく適当な投与量および投与頻度を決定できる。すなわち、医療の当業者であれば、哺乳動物において代謝疾患、筋肉状態、神経系疾患および／または疼痛状態を有効に予防または治療するため、適量の脂質ラフツ活性エンハンサーを適当な時間に投与することができるであろう。
【００８４】
通常の知識を有する医療従事者は、最適の臨床結果を達成すべく、脂質ラフツ活性エンハンサーの適当な投与量および投与頻度を決定できる。すなわち、医療の当業者であれば、哺乳動物において代謝疾患、筋肉状態、神経系疾患および／または疼痛状態を有効に予防または治療するため、適量の脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）活性エンハンサーを適当な時間に投与することができるであろう。
【００８５】
ＩＶ．細胞膜上での脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の形成を抑制する方法：
脂質ラフツまたはカベオラの形成は、クロストリジウム毒素により抑制することができる。幾つかの態様において、本発明の方法は、細胞をクロストリジウム毒素と接触させる工程を含む。上記のように、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）は、カベオリン含有脂質ラフツまたは非カベオリン含有脂質ラフツであってよい。本発明をいかなる理論あるいは操作のメカニズムに限定する意図を有するものではないが、クロストリジウム毒素はカベオリンタンパク質、または細胞内の他の脂質ラフツ成分と相互作用すると考えられる。クロストリジウム毒素と相互作用するカベオリンタンパク質としては、カベオリン１アルファ、カベオリン１ベータ、カベオリン２、カベオリン３が挙げられる。おそらく、カベオリンタンパク質はクロストリジウム毒素とクロストリジウム毒素上のカベオリン相互作用モチーフにより相互作用する。
【００８６】
さらに、クロストリジウム毒素（たとえば、ボツリヌス毒素）とカベオリンとの相互作用は、クロストリジウム毒素がクロストリジウム毒素の基質（たとえば、ＳＮＡＰ２５、ＶＡＭＰなど）を酵素的に開裂できるようにクロストリジウム毒素をクロストリジウム毒素の基質の近傍に接近させる。これら基質の開裂は、脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の形成を妨げる。これら基質の開裂はまた、小胞膜融合を妨げ、それによって細胞質膜中の新たな脂質ラフツ（たとえば、カベオラ）の形成を抑制する。
【００８７】
幾つかの態様において、これら基質の開裂は既存の脂質ラフツを崩壊させもする。たとえば、クロストリジウム毒素と脂質ラフツの関連でのカベオラタンパク質との相互作用は、毒素が膜二重層を通過できまたは毒素自体が二重層に孔を形成して細胞質内に入れるように毒素タンパク質および／または脂質ラフツのコンホメーション変化という結果となる。いったん細胞質内に入ったら、ボツリヌス毒素のエンドペプチダーゼ活性はＳＮＡＰ−２５（またはＳＮＡＰ−２３、遍在的に発現されるニューロンＳＮＡＰ−２５のアナログ）およびＶＡＭＰタンパク質などの基質に接近できる。いったん開裂されたら、これらボツリヌス毒素の基質はもはや小胞融合を媒体することはできず、さらなるエキソサイトーシスまたはエンドサイトーシスによる小胞融合事象は破壊される。その結果としてのエキソサイトーシス神経伝達物質含有小胞と細胞質膜との融合の破壊は、最終的に細胞質膜中の新たな脂質ラフツの形成、アセンブリーまたは存在の低減という結果となる。同様に、細胞質内でのＳＮＡＰおよびＳＮＡＲＥ複合体タンパク質の分解は、もしも該膜の細胞質面上のＳＮＡＰおよび／またはＳＮＡＲＥ成分が脂質ラフツ内の独特の成分の局在濃度の維持に必要であるのであれば、既存の脂質ラフツの破壊という結果となる。
【００８８】
幾つかの態様において、カベオリンおよび活性なクロストリジウム毒素を含むカベオリンコンジュゲートは、脂質ラフツの形成を抑制するのに用いることができる。たとえば、細胞上の脂質ラフツの形成を抑制するため、カベオリン１（またはカベオリン２またはカベオリン３）および活性なボツリヌス毒素（たとえば、Ａ型）を含むカベオリンコンジュゲートを投与することができる。幾つかの態様において、脂質ラフツの形成を抑制するため、フロッティリンおよび活性なクロストリジウム毒素を含むカベオリンコンジュゲートを使用することができる。たとえば、細胞上での脂質ラフツの形成を抑制するため、フロッティリン１（またはフロッティリン２）および活性なボツリヌス毒素（たとえば、Ａ型）を含むカベオリンコンジュゲートを使用することができる。
【００８９】
Ｖ．クロストリジウム毒素キメラ：
本発明はまた、脂質ラフツと関連する疾患の治療に使用するのに有効なクロストリジウム毒素キメラをも提供する。幾つかの態様において、該キメラは、ターゲティング残基、カベオリン（またはフロッティリン）、およびクロストリジウム毒素を含む。ターゲティング残基は特定の細胞型のレセプターに結合してよく、それゆえクロストリジウム毒素の細胞内への進入が容易になる。本発明をいかなる理論あるいは操作のメカニズムに限定する意図を有するものではないが、いったんクロストリジウム毒素が細胞内に入ったら、カベオリンは脂質ラフツを形成する細胞アセンブリーに該キメラを連れて行くと考えられる。いったんキメラが脂質ラフツを形成する細胞アセンブリー内に入ったら、キメラはクロストリジウム毒素の基質（たとえば、ＳＮＡＰ２５、ＶＡＭＰなど）に対して酵素的に作用すると考えられる。キメラの酵素作用は、脂質ラフツまたはカベオラの形成の抑制という結果となる。幾つかの態様において、ある種の細胞における脂質ラフツまたはカベオラの形成の抑制は、脂質ラフツまたはカベオラの形成と関連する疾患を治療するうえで有効である。
【００９０】
幾つかの態様において、ターゲティング残基およびカベオリンは、当該技術分野において一般に知られた化学的方法を用いてクロストリジウム毒素に共有結合する。たとえば、実施例１６およびDollyらの米国特許第6,203,794号（その開示を全体として本明細書中に参照のため引用する）を参照。幾つかの態様において、当業者に知られた方法を用い、ターゲティング残基、カベオリンおよびクロストリジウム毒素を融合タンパク質として発現させる。
【００９１】
本発明のキメラは、ターゲティング残基（たとえば、本明細書で検討するターゲティング残基）／ボツリヌス毒素（たとえば、Ａ型）／カベオリン（またはフロッティリン）を有するキメラを含む。
【００９２】
ＶＩ．脂質ラフツまたはカベオラの形成と関連する疾患を治療する方法：
脂質ラフツまたはカベオラの形成と関連する疾患とは、脂質ラフツ形成の抑制またはカベオラ形成の抑制が該疾患の症状を軽減しまたは該疾患を治療することとなる疾患である。脂質ラフツの形成を抑制して疾患を治療するには様々な分子的基盤がある。たとえば、脂質ラフツまたはカベオラの形成は、細胞内小胞の融合において役割を演じている。脂質ラフツ形成の抑制は、小胞融合の抑制という結果となる。小胞融合の抑制は、ある種の分子の放出を低下させ、ここで、そのような分子の放出の低下はある種疾患の治療という結果となる。
【００９３】
たとえば、肝臓のインスリン抵抗性、肥満および糖尿病は、脂質ラフツまたはカベオラ形成と関連する疾患である。脂肪細胞はアジポサイトカイン（adipocytokines）として知られる幾つかのタンパク質を分泌し、このアジポサイトカインはインスリン感受性およびグルコース代謝に大きな影響を及ぼす。これらアジポサイトカインは、増大した脂肪蓄積過多（adiposity）と損なわれたインスリン感受性との間の分子的関連を提供する。脂質由来または消化管由来の循環タンパク質の新規なファミリーは、肝臓のインスリン作用をモデュレートすると思われる。たとえば、レジスチン（resistin）は、脂肪組織によって分泌されるホルモンのレジスチン様分子ファミリーと名付けられ最近定められた小さなシステインリッチ分泌タンパク質のファミリーの成員である。該ファミリーの他の２つの成員であるレジスチン様分子−ＲＥＬＭ（ＦＩＺＺ１としても知られる）およびＲＥＬＭベータ（ＦＩＺＺ２）はレジスチンと約６０％類似であり、肺の間質成分および脂肪組織において、および消化管の上皮細胞において、それぞれ発現される。この循環タンパク質のファミリーは、複雑な臓器間コミュニケーションネットワークにおいて役割を果たしているようであり、このネットワークは中間代謝およびエネルギー平衡をモデュレートしているようである。たとえば、レジスチンかまたはレジスチン様分子ベータ（ＲＥＬＭベータ）のいずれかの注入が、重篤な肝臓のインスリン抵抗性を速やかに誘起したことが報告されている。
【００９４】
それゆえ、肝臓のインスリン抵抗性、肥満および糖尿病は、脂肪細胞または消化管細胞から分泌されるレジスチンを低減することにより治療することができる。一つの態様において、ボツリヌス毒素／カベオリン／脂肪細胞または消化管細胞に向けられたターゲティング残基を含むキメラを投与してレジスチンの放出を低下させることができる。ターゲティング分子は、キメラを特異的に脂肪細胞に向ける。たとえば、本発明によるターゲティング残基としては、細胞レセプターに対するペプチドまたはタンパク質リガンド、小分子および細胞型特異的レセプターまたは脂質ラフツ成分に対する抗体が挙げられる。
【００９５】
ターゲティング残基として使用できるペプチドリガンドの例は、ホスホイノシトールグリカン（ＰＩＧ）およびＰＩＧ−ペプチド（脂肪細胞においてインスリンレセプター非依存性インスリンシグナル伝達カスケードを活性化すると報告されている）、合成トロンビンレセプターペプチドＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＳＦＦＬＲＮＰ）（トロンビンによってタンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプターのアミノ末端をミミックしたもの）、および可溶性のインテグリン結合配列ペプチドＬＤＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（マスト細胞インテグリンをターゲティングする）である。ターゲティング残基として使用できるタンパク質リガンドの例は、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４（効率的なエンドサイトーシスおよび脂肪細胞の細胞表面膜との結合が、カベオリンによって影響されると報告されている）、インターロイキン４（ＩＬ４）およびヒトＩｇＥである。ターゲティング残基として使用できる小分子の例は、ベータ３−選択的アドレナリン作用性レセプターリガンドＢＲＬ３７３４４、およびベンゾイルチオフェンアナログＰＤ８１,７２３（脳および脂質細胞膜にターゲティングするためのアデノシンＡ（１）レセプターアロステリックエンハンサー）である。ターゲティング残基として使用できる抗体の例は、脂肪細胞中のＣＤ３６／脂肪酸トランスロカーゼを認識するモノクローナル抗体ＵＡ００９、およびマスト細胞特異的なモノクローナル抗体ＡＡ４である。
【００９６】
幾つかの態様において、肝臓のインスリン抵抗性、肥満および糖尿病を予防または治療するのに使用できるキメラとしては、たとえば、ＰＩＧ／ボツリヌス毒素／カベオリン；またはモノクローナル抗体ＵＡ００９／ボツリヌス毒素／カベオリン；またはＳＦＦＬＲＮＰ／ボツリヌス毒素／カベオリンを含むキメラが挙げられる。
【００９７】
本発明をいかなる理論あるいは操作のメカニズムに限定する意図を有するものではないが、いったんキメラが脂肪細胞内にインターナリゼーションされると、カベオリンはキメラを小胞融合と関連する脂質ラフツアセンブリー（ここにはボツリヌス毒素基質（たとえば、ＳＮＡＰ）もまた局在している）に向けると考えられる。さらに、ボツリヌス毒素はこれら基質を酵素的に開裂し、それによって小胞融合を抑制し、その結果、レジスチンの放出の低下となると考えられる。幾つかの態様において、該キメラは、チアゾリジンジオン（このものはアジポサイトカイン発現のモデュレーションによりインスリン抵抗性を低下させ、現在、２型糖尿病の治療に臨床的に用いられている）とともに投与する。
【００９８】
脂質ラフツまたはカベオラを抑制してある種の疾患を治療する他の分子的基盤が存在する。たとえば、脂質ラフツまたはカベオラは、ある種のタンパク質を細胞表面に連れて行くうえで役割を果たしている。これら特別のタンパク質の提示は様々な医学的状態という結果となる。脂質ラフツまたはカベオラの抑制は、細胞表面上のこれら特別のタンパク質の低減という結果となるであろう。それゆえ、脂質ラフツまたはカベオラの抑制はまた様々な疾患の治療という結果となるであろう。
【００９９】
たとえば、炎症、感染症および／またはアレルギーは、脂質ラフツまたはカベオラの形成を抑制することにより治療することができる。カベオラは、マスト細胞中への細菌（抗原）の進入に関与している。微絨毛および造血細胞（培養したマウス骨髄由来マスト細胞（ＢＭＭＣ））の細胞内小胞でのカベオラの検出が最近報告されている。１型有線毛（fimbriated）大腸菌のレセプターであるＣＤ４８は、ＢＭＭＣ中のカベオラに特異的に局在していた。ＢＭＭＣ中への細菌進入におけるカベオラの関与は、大腸菌進入を特異的に阻止したカベオラ破砕剤およびカベオラ奪取剤の使用により示され、カベオラのマーカーは細菌の進入部位に活発に補充された。それゆえ、ＢＭＭＣ中の細菌包埋（encapsulating）カベオラチャンバの形成は、食細胞中への微生物進入の別個のメカニズムを表していると考えられる。
【０１００】
カベオラはまた、免疫炎症細胞によるプロスタグランジンの合成にも関与していると思われる。Ｖ群分泌性ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）、ＩＶ群サイトゾルＰＬＡ２およびシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）は、マクロファージやマスト細胞などの細胞によるアラキドン酸（ＡＡ）流動性およびプロスタグランジン（ＰＧ）産生のための重要な酵素である。Ｖ群ＰＬＡ２は分泌酵素であることから、それは外膜と再会合してＡＡを放出しなければならないと推定されてきた。マクロファージのリポ多糖への慢性的な暴露は、核周辺領域に近接したカベオリン２含有顆粒と結合したＶ群ＰＬＡ２という結果となることが示されている。ヘパリンはこの結合を阻止することから、該顆粒は細胞の外側表面に以前に結合していたＶ群ＰＬＡ２のインターナリゼーションによって生成することが示唆される。Ｖ群ＰＬＡ２およびＣＯＸ−２は細胞活性化の際に核周辺領域に局在するので、このプロセスは、ＣＯＸ−２に一層近接した核周辺領域にＶ群ＰＬＡ２を連れて行き、ここで、もし活性なら、有効なプロスタグランジン合成の効力を有すると思われる。
【０１０１】
哺乳動物における造血または免疫炎症状態を予防または治療するため、有効量のボツリヌス毒素を哺乳動物に投与することができる。ボツリヌス毒素は、細胞膜上でのカベオラの形成を抑制するのに有効であると考えられる。抗原のマスト細胞への結合およびプロスタグランジンの合成はマスト細胞上で形成されるカベオラに依存しているので、ボツリヌス毒素によるカベオラ形成の抑制は、有効に、抗原のマスト細胞への結合の低減およびプロスタグランジンの合成の低減という結果になるであろう。従って、炎症、感染症および／またはアレルギー状態はボツリヌス毒素の投与によって予防または治療することができる。
【０１０２】
幾つかの態様において、ボツリヌス毒素は、ターゲティング残基にコンジュゲートして毒素コンジュゲートを形成することにより、マスト細胞に一層特異的に向けることができる。ターゲティング残基は、主としてマスト細胞の表面に認められるレセプターに特異的に結合する。そのようなターゲティング残基の例としては、可溶性のインテグリン結合配列ペプチドＬＤＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（マスト細胞インテグリンをターゲティング）、インターロイキン４（ＩＬ−４）のレセプターおよびヒト高親和性ＩｇＥレセプターＦｃイプシロンＲが挙げられる。
【０１０３】
幾つかの態様において、炎症疾患を治療するのに使用できるキメラとしては、たとえば、ＬＤＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡ／ボツリヌス毒素／カベオリンを含むキメラが挙げられる。
【０１０４】
通常の知識を有する医療従事者は、最適の臨床結果を達成すべく適当な投与量および投与頻度を決定できる。すなわち、医療の当業者であれば、脂質ラフツまたはカベオラ形成と関連する疾患を有効に予防または治療するため、適量のキメラを適当な時間に投与することができるであろう。
【０１０５】
通常の知識を有する医療従事者は、最適の臨床結果を達成すべく、脂質ラフツ活性エンハンサーの適当な投与量および投与頻度を決定できる。すなわち、医療の当業者であれば、脂質ラフツまたはカベオラ形成と関連する疾患を有効に予防または治療するため、適量のキメラを適当な時間に投与することができるであろう。
【０１０６】
ＶII．クロストリジウム毒素のインターナリゼーションを変える化合物を同定する方法：
クロストリジウム毒素のインターナリゼーションを変える化合物をスクリーニングすることができる。幾つかの態様において、この方法は、被験化合物をクロストリジウム毒素をインターナリゼーションできる細胞と接触させる工程を含む。この細胞によるクロストリジウム毒素のインターナリゼーションを、負の対照化合物と接触させた細胞と比較する。もしも細胞によるクロストリジウム毒素のインターナリゼーションが（負の対照と比較して）被験化合物との接触により促進されたら、この被験化合物はインターナリゼーションエンハンサーである。もしもクロストリジウム毒素のインターナリゼーションが被験化合物との接触によって抑制されたら、この被験化合物はインターナリゼーションインヒビターである。
【０１０７】
投与経路および投与量の例が本発明の治療方法について提供されているが、適当な投与経路および投与量は一般にケースバイケースでかかりつけの医師により決定される。そのような決定は、当業者にとってルーチンである（たとえば、Harrison's Principles of Internal Medicine (1998)、Anthony Fauciら編、第14版、McGraw Hill刊を参照）。
【０１０８】
本発明はまた、本明細書に記載の組成物の少なくとも一つ、たとえば、脂質ラフツ活性エンハンサー、脂質ラフツ活性インヒビター、キメラ、およびそれらの組み合わせを含む製剤をも包含する。幾つかの態様において、該製剤は、薬理学的に許容しうる担体、たとえば、滅菌生理食塩水、０.１％ゼラチンを含む滅菌食塩水、または１.０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含む滅菌食塩水中に本明細書に記載の組成物の少なくとも一つを含む。
【０１０９】
本明細書に記載の本発明が一層容易に理解されるように以下に実施例を記載する。これら実施例は説明のためにのみ提供されるものであって、いかなる意味でも本発明を限定すると解釈されてはならないと理解すべきである。これら実施例を通じて、分子クローニング反応、その他の標準ＤＮＡ法は、特に断らない限り市販の試薬を用い、Maniatisら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual、第２版、コールドスプリングハーバープレス(1989)に記載の方法に従って行った。
【０１１０】
実施例：
実施例１：細胞上の脂質ラフツの形成を抑制する方法：アテローム性動脈硬化症を予防または治療するためのボツリヌス毒素の使用
アテローム性動脈硬化症の発現は、内皮下の空間に修飾リポタンパク質の形態での脂質の蓄積を特徴とするプロセスである。この開始段階に引き続き、その後、単球／マクロファージおよび平滑筋細胞を含む他の細胞型の補充および増殖が起こる。カベオリン１はカベオラ膜ドメインの主要な構造タンパク質成分であり、カベオラはアテローム性動脈硬化症の病因に関与している。マウスではＡｐｏＥ−／−バックグラウンド中のカベオリン１の喪失が非ＨＤＬ血漿コレステロールレベルの劇的な増大という結果となることが報告されている。しかしながら、この高コレステロール血症にも拘わらず、カベオリン１遺伝子発現の喪失は明らかに大動脈アテロームの発現に対して防御的であり、アテローム性動脈硬化症の障害領域の約７０％までが低減した。カベオリン１の喪失は、ある種の前アテローム発生（proatherogenic）分子、すなわちＣＤ３６および血管細胞接着分子１の劇的なダウンレギュレーションという結果となった。それゆえ、カベオリン１の喪失はアテローム発生リポタンパク質の有害作用を阻止することができる。
【０１１１】
現時点では、カベオリン１の低減またはカベオラの低減がある種の前アテローム発生分子のダウンレギュレーションという結果となるかは明らかではない。いずれにしても、ボツリヌス毒素の投与はカベオラの形成、それゆえ細胞表面上のカベオリンの濃度を抑制するのに有効である。それゆえ、アテローム性動脈硬化症障害の蓄積を低減するため、治療学的有効量のボツリヌス毒素を内皮細胞に投与することができる。
【０１１２】
実施例２：小胞融合と関連する脂質ラフツの形成を抑制する方法：腫瘍形成を予防するためのキメラの使用
哺乳動物上皮細胞は、脂肪細胞および他の間質細胞が寄与する独特の細胞外環境に包埋されており、生存のためにこの環境に依存している。アジポサイトカインは、悪性の乳管上皮細胞の特徴および表現型挙動に独特の影響を及ぼすと報告されている；脂肪細胞分泌因子は、抗アポトーシス転写プログラムおよび癌原遺伝子安定化の誘発により乳腫瘍形成を促進する。アジポサイトカインは、増大した細胞増殖、侵襲性の能力（invasive potential）、生存、および新脈管形成を含む、腫瘍形成に関与する幾つかの転写プログラムを特異的に誘発する。
【０１１３】
乳管上皮細胞におけるアジポサイトカインレベルの制御は、腫瘍形成の可能性、増殖、侵襲性、不死性、および腫瘍形成性トランスフォーメーションに関連する新脈管形成の可能性の低減に導く。
【０１１４】
アジポサイトカインの分泌を低下させるためにカベオリン／ボツリヌス毒素／脂肪細胞または乳管上皮細胞または他の間質細胞に向けられたターゲティング残基を含むキメラは、癌を治療するのに用いることができる。ターゲティング残基は、該キメラを脂肪細胞、乳管上皮細胞または他の間質細胞に特異的に向ける。たとえば、ターゲティング残基としては、細胞レセプターに対するペプチドまたはタンパク質、小分子および細胞型特異的レセプターまたは脂質ラフツ成分に対する抗体が挙げられる。ターゲティング残基として使用できるペプチドリガンドの例は、ホスホイノシトールグリカン（ＰＩＧ）およびＰＩＧ−ペプチド（脂肪細胞においてインスリンレセプター非依存性インスリンシグナル伝達カスケードを活性化すると報告されている）、合成トロンビンレセプターペプチドＳｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ（ＳＦＦＬＲＮＰ）（トロンビンによってタンパク質分解的に活性化されたトロンビンレセプターのアミノ末端をミミックしたもの）、および可溶性のインテグリン結合配列ペプチドＬＤＧＧＣＲＧＤＭＦＧＣＡ（マスト細胞インテグリンをターゲティングする）である。ターゲティング残基として使用できるタンパク質リガンドの例は、グルコーストランスポーターＧＬＵＴ４（効率的なエンドサイトーシスおよび脂肪細胞の細胞表面膜との結合が、カベオリンによって影響されると報告されている）、インターロイキン４（ＩＬ−４）およびヒトＩｇＥである。ターゲティング残基として使用できる小分子の例は、ベータ３−選択的アドレナリン作用性レセプターリガンドＢＲＬ３７３４４、およびベンゾイルチオフェンアナログＰＤ８１,７２３（脳および脂質細胞膜にターゲティングするためのアデノシンＡ（１）レセプターアロステリックエンハンサー）である。ターゲティング残基として使用できる抗体の例は、脂肪細胞中のＣＤ３６／脂肪酸トランスロカーゼを認識するモノクローナル抗体ＵＡ００９、およびマスト細胞特異的なモノクローナル抗体ＡＡ４である。本発明をいかなる理論あるいは操作のメカニズムに限定する意図を有するものではないが、いったんキメラがこれら細胞、たとえば脂肪細胞内にインターナリゼーションされると、カベオリンはキメラを小胞融合と関連する脂質ラフツアセンブリー（ここにはボツリヌス毒素基質（たとえば、ＳＮＡＰ）もまた局在している）に向けると考えられる。さらに、ボツリヌス毒素はこれら基質を酵素的に開裂し、それによって小胞融合を抑制し、その結果、アジポサイトカインの放出の低下となると考えられる。それゆえ、本発明のキメラは、アジポサイトカインの分泌の低減を媒体し、それによって悪性の乳管上皮細胞の表現型挙動を変え、その腫瘍形成の可能性および転移を低減させ、それによって乳癌の治療手段を提供するものである。
【０１１５】
幾つかの態様において、本発明のキメラは、他の抗癌剤（タキソールやタモキシフェンなど）とともに投与することができる。
【０１１６】
実施例３：脂質ラフツの形成を抑制する方法：アルツハイマー病を治療するための脂質ラフツ形成インヒビター（たとえば、脂質ラフツ活性インヒビターまたはボツリヌス毒素）の使用
アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）は、アルツハイマー病患者の脳内の老人斑に認められる主要なタンパク質成分であるベータ−アミロイド（Ａ−ベータ）ペプチドの前駆体であることが知られている。２つの競合するタンパク質分解経路が、アルツハイマー病の病因において重要な役割を果たしている。第一に、Ａ−ベータペプチドは、ベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼによってＡＰＰから生成する。別の経路では、アルファ−セクレターゼはＡＰＰをＡ−ベータアミノ酸配列内で開裂し、それによってＡ−ベータペプチドの生成を排除する。それゆえ、神経組織においてアルファ−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解を促進すること、またはベータ−セクレターゼおよびガンマ−セクレターゼによるＡＰＰのタンパク質分解を低減することは、アルツハイマー病を阻止するうえで有利である。
【０１１７】
カベオリンタンパク質は、ＡＰＰプロセシングにおいて重要な役割を果たすことが提唱されている（Engelmanら、1998 Am. J. Hum. Genet. 63:1578-87）。全脳からの脂質ラフツがＡＰＰ並びにＡ−ベータペプチドを含むことが知られており（Leeら、1998 Nat. Med. 4:730-34）、カベオラはＡＰＰの富化の部位であり、ＡＰＰが濃縮される直接的な手段を提供すると考えられている。組換えカベオリン１タンパク質の過剰発現がＡＰＰのアルファ−セクレターゼ媒体開裂を促進すること、逆に、このＡＰＰのタンパク質分解がアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてカベオリン１発現を阻止することによって廃棄されることが報告されている（Ikezuら、1998 J. Bio. Chem. 273:10485-95）。それゆえ、脂質ラフツ中のカベオリン１の濃度または活性を上昇させることは、アルファ−セクレターゼ媒体されたＡＰＰの開裂を促進させ、Ａ−ベータペプチドの形成を妨げる。
【０１１８】
脂質ラフツの低減が培養した海馬ニューロンにおけるＡ−ベータペプチド分泌を有効に抑制することもまた報告されている（Simonsら、1998 PNAS 95:6460-64）。それゆえ、幾つかの態様において、アルツハイマー病の候補であるかまたは罹患している患者を、脂質ラフツ活性インヒビターの投与により治療することができる。検討したように、クロストリジウム毒素はまた脂質ラフツの形成を抑制する。それゆえ、幾つかの態様において、アルツハイマー病の候補であるかまたは罹患している患者を、ボツリヌス毒素の投与により治療することができる。
【０１１９】
実施例４：ＢｏＮＴおよび脂質ラフツ活性エンハンサーを用いた筋肉疾患に関連する疼痛の治療のための例示的方法
不運な３６歳の女性は、顎関節疾患の１５年の病歴を有し、咬筋および側頭筋に沿って慢性的な痛みを有していた。評価の１５年前には、彼女は、顎がますます動かなくなることに気付き、疼痛および顎の開閉および顔の各側に沿った圧痛を伴っていた。左側は、もともと右側よりも悪いと考えられる。彼女は、顎の不全脱臼を伴う顎関節（ＴＭＪ）機能不全と診断され、外科的なオルソプラスチー半月除去（orthoplasty meniscusectomy）および顆切除の処置を受けている。
【０１２０】
彼女は上記外科処置後も顎の開閉が困難であり、この理由から数年後に顎の両側で人工顎で置換する外科処置を行っている。この外科処置後、進行性の痙攣および顎の異常が続く。人工顎の緩みを正すため、最初の手術に引き続いてさらなる外科的修正を行う。これら外科的処置後も、顎は相当の疼痛と不動を示し続ける。ＴＭＪは筋肉自体と同様に圧痛を示し続けた。顎関節全体にわたる圧痛点並びに全体の筋肉に増大した緊張が存在する。彼女は、術後筋膜疼痛症候群（post-surgical myofascial pain syndrome）と診断され、７Ｕ／ｋｇのＢｏＮＴ（好ましくはＡ型）および治療学的有効量の脂質ラフツ活性エンハンサーを咬筋および側頭筋に注射されている。
【０１２１】
注射数日後、彼女は痛みが実質的に改善しているのに気付き、顎が一層緩やかになったと感じると報告している。このことは２〜３週間にわたって徐々に改善していき、その間に彼女は顎を開ける能力の増大および痛みの減弱に気付いている。この患者は、痛みが過去４年間のどの時期よりも良いと言明している。改善した状態は、修飾した神経毒の最初の投与から２７ヶ月まで持続している。
【０１２２】
実施例５：ヘルペス後（postherpetic）神経痛の治療における偶然の過剰投与−解毒剤としての脂質ラフツ活性インヒビターの使用
嫌気性のグラム陽性細菌であるクロストリジウム・ボツリヌムは、強力なポリペプチド神経毒であるボツリヌス毒素を産生する。クロストリジウム・ボツリヌムの胞子は土中に見出され、一般家庭向け（home based）缶詰工場の不適切に滅菌され密封された食品容器中で増殖することができ、これがボツリヌス中毒の多くの症例の原因である。ボツリヌス中毒の作用は、典型的にクロストリジウム・ボツリヌムの培養または胞子に感染された食物を食べてから１８〜３６時間で現れる。ボツリヌス毒素は、明らかに消化器の内側を弱毒化することなく通過し、末梢の運動ニューロンを攻撃することができる。ボツリヌス毒素の中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および発話困難から呼吸筋の麻痺および死に至るまで進行しうる。
【０１２３】
ボツリヌス毒素Ａ型は、人類に知られた最も致死性の天然の生物学的因子である。約５０ピコグラムの市販のボツリヌス毒素Ａ型（精製した神経毒複合体）（Allergan, Inc.,アーヴィン、カリフォルニアからBOTOXRの商標名にて100単位バイアルで入手可能）は、マウスにおけるＬＤ５０（すなわち、１単位）である。１単位のBOTOXRは、約５０ピコグラム（約５６アトモル）のボツリヌス毒素Ａ型複合体を含む。興味深いことに、モルベースでは、ボツリヌス毒素Ａ型は、ジフテリアよりも約１８億倍、シアン化ナトリウムよりも約６億倍、コブラ毒素よりも約３０００万倍およびコレラよりも約１２００万倍、致死性が高い。Singh, Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins, B.R. Singhら編、Natural Toxins II、Plenum Press、ニューヨーク(1976)の63-84頁（第4章)（ここで、０.３ｎｇのボツリヌス毒素Ａ型のＬＤ５０が１Ｕに等しいとの言及は、約０.０５ｎｇのBOTOXRが１単位に等しいとの事実のために正されている）。ボツリヌス毒素の１単位（Ｕ）は、体重が各１８〜２０ｇの雌Swiss Websterに腹腔内注射したときのＬＤ５０として定められている。
【０１２４】
ヘルペス後神経痛は、慢性の疼痛問題のなかでも最も難治性のものの一つである。この耐え難い疼痛プロセスを罹患する患者はしばしば年配者であり、衰弱させる疾患を患っており、主要な介入処置には適さない。診断は、ヘルペスの治癒した障害部の出現により、および患者の病歴により、容易になされる。痛みは強烈で、感情的に打ちひしぐものである。ヘルペス後神経痛はどこにでも起こるが、最もしばしば胸郭に起こる。
【０１２５】
例示的シナリオにおいて、７６歳の男性がヘルペス後タイプの痛みを呈している。この痛みは腹部に局在している。この患者を、腹部皮内への約０.０５Ｕ／ｋｇ〜約２Ｕ／ｋｇのBOTOXRのボーラス注射により処置する。処置している医師は、偶然、過剰量のBOTOXRを投与する。誤りを認識して、医師は同じ領域に治療学的有効量の脂質ラフツ活性インヒビターを投与する。ｇ−ｉＢｏＮＴの特定の投与量並びに投与頻度は、処置する医師の技量内の様々な因子に依存する。BOTOXRおよび調整用のｇ−ｉＢｏＮＴの投与から１〜７日以内に患者の痛みは実質的に軽減する。
【０１２６】
実施例６：脂質ラフツ活性インヒビターを用いた解毒
ＢｏＮＴのエアゾル分散は、ボツリヌス中毒の症状という結果となりうる。たとえば、５価（ＡＢＣＤＥ）ボツリヌストキソイドがCenters for Disease Control and Preventionから入手できるが、その使用は、免疫が付与されうるまで抗体がレシピエントで誘起されるのを待つ必要のために予防として実行することはできない。
【０１２７】
それゆえ、解毒または暴露後処置の観点からは、トキソイドは実行できない、なぜならそれは何ヶ月にもわたって免疫を誘発するからである。すぐの免疫は、ウマボツリヌス抗毒素の受動投与により、または特異的なヒト高度免疫グロブリンにより、与えることができる。しかしながら、これら解毒手段はそれほど有効ではない。たとえば、集団の一部は、ウマボツリヌス抗毒素の投与でウマ血清アナフィラキシーを患うことが知られている。
【０１２８】
脂質ラフツ活性インヒビターは、活性なＢｏＮＴで汚染された個体の解毒において重要な役割を演ずることができる。臨床または緊急場面において、脂質ラフツ活性インヒビターの犠牲者への注射は、毒素の細胞への輸送の充分な抑制をもたらし、その作用を最小にすることができるであろう。幾つかの態様において、脂質ラフツ活性インヒビターは、丸剤に製剤化して大きな患者集団に安全、迅速かつ容易なアクセスを可能とすることができる。
【０１２９】
実施例７：キメラ（ボツリヌス中毒／ターゲティング残基／カベオリン）を製造するための例示的方法
基質として作用する大抵の分子またはターゲティング残基などのように分子を結合させる大抵の分子は、立体障害の影響を受けない位置を有している。さらに、結合プロセスはターゲティング残基にキラリティーを導入してはならない。さらに、リンカーおよびターゲティング残基は共有結合で結合されなければならない。Ｂｏｔとターゲティング残基との間の距離は、スペーサー成分の挿入により調節できる。好ましいスペーサーは、リンカー、ターゲティング残基およびＢｏｔに結合することができ、それらをコンジュゲートできる官能基を有する。好ましいスペーサー成分としては以下のものが挙げられる。
【０１３０】
（１）ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは１〜１２）；ペプチドのアミノ末端に挿入して該ペプチドをターゲティング残基上のリンカーと結合させるのに適している。
【０１３１】
（２）ＨＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは＞１０）；ペプチドのアミノ末端に結合してＬ鎖をターゲティング残基上のリンカーと結合させるのに適している。
【０１３２】
（３）（Ｃ５Ｈ６）ｎ（式中、ｎは＞２）；Ｂｏｔをターゲティング残基上のリンカーと結合させるのに適している。ベンゼン環は、ターゲティング残基とＢｏｔとの間に堅固なスペーサーを提供する。もちろん、たとえば以下のＸ残基によって同定されるような適当な官能基がベンゼン環上に存在して薬剤とＢｏｔとを連結してもよいであろう。
【０１３３】
様々なリンカーのタイプを想定できる。たとえば、一つのタイプでは、ターゲティング残基−リンカー−Ｂｏｔ分子は循環系への導入後も完全なままである。
【０１３４】
幾つかの態様において、当該技術分野でよく知られた方法により、システイン残基がＢｏｔ分子の末端に結合される。たとえば、Ｂｏｔタンパク質を発現する遺伝子構築物を変異させて、該タンパク質のＮ末端部分にシステインが存在するように発現させることができる。ついで、よく知られた手段によりマレイミドリンカーをシステイン残基に結合させる。
【０１３５】
幾つかの態様において、リンカーをターゲティング残基に直接結合させる。ターゲティング残基−Ｘ残基は、以下の基を有していてよい；Ｘは、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＣＯＮＨ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ３０（式中、Ｒ３０はアルキル基）であってよいが、これらに限られるものではない。もちろん、適当な基は活性部位にはなく、立体障害をもたらしもしないであろう。以下は、ターゲティング残基−Ｘをリンカー分子に連結させる一つの反応の例である。
【０１３６】
ターゲティング残基−Ｘ
Ｂｒ−ＣＨ２−リンカー  →  ターゲティング残基−Ｘ−ＣＨ２−リンカー
【０１３７】
ターゲティング残基にリンカーが結合したら、以下の反応を用いてターゲティング残基をＢｏｔに連結することができる。この反応では、Ｂｏｔは、接近できるリシン基を有しているのが好ましく、これがターゲティング残基の結合部位として使用される。本明細書で検討したように、リシンなどの余分のアミノ酸をＢｏｔ遺伝子のＮ末端部分に容易に付加してターゲティング残基の結合部位として用いることができる。以下の反応では、ナトリウムシアノボロハイドライド（sodium cyanoborohydride）を用いてリンカーをＢｏｔ分子上のリシン基に結合させる。
【０１３８】
ターゲティング残基−リンカー−ＣＨＯ  ＋  ＮａＣＮＢＨ３  ＋  Ｂｏｔ−Ｌｙｓ  →
ターゲティング残基−リンカー−ＣＨ２−ＮＨ−Ｂｏｔ
【０１３９】
本発明において使用を想定できるターゲティング残基としては、遊離の−ＸＨ基を有し、肝臓および／または腎臓トランスポーターと結合することができるものが挙げられる。
【０１４０】
ターゲティング残基がＢｏｔに結合されたら、同様の方法を用いてターゲティング残基−Ｂｏｔをカベオリンに結合させてターゲティング残基／Ｂｏｔ／カベオリンキメラを生成することができる。Dollyの米国特許第6,203,794号（その開示を全体として参照のため本明細書中に引用する）を参照。
【０１４１】
実施例８：トランスポーターとして不活性なボツリヌス毒素を含むコンジュゲートを製造するための例示的方法
実施例７に例示した方法を用い、コンジュゲート、たとえば、トランスポーターを含むコンジュゲートを製造することができる。幾つかの態様において、実施例７の方法を用い、カベオリンに対する抗体、トランスポーターとして不活性なボツリヌス毒素を含むコンジュゲートを製造することができる。幾つかの態様において、実施例７の方法を用い、カベオリンおよび活性なボツリヌス毒素を含むコンジュゲートを製造することができる。
【０１４２】
本明細書で記載したものに加えて、本発明の様々な改変物が上記の記載から当業者には明らかであろう。そのような改変物もまた、添付の特許請求の範囲に包含されることを意図するものである。本明細書で引用した各文献は、参照のためその全体として本明細書中に引用される。
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月15日(2006.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007516257000001.app
【国際調査報告】
2007516257.tif 000002
2007516257.tif 000003
2007516257.tif 000004
2007516257.tif 000005
2007516257.tif 000006
2007516257.tif 000007