(57)【要約】  本発明は，タンパク質の異常凝集フォームを，このタンパク質の正常非凝集フォームの存在下で，選択的に結合する且つ／又は検出するための改良された方法及び組成物を提供する。
2007531895.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の異常凝集フォームを，タンパク質の正常非凝集フォームの存在下で，選択的に結合する方法であって，選択的結合条件のもと，タンパク質の異常凝集フォーム及び正常非凝集フォームを含むと疑われる脳組織を，タンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質，双性イオン性薬剤，及び識別剤と接触させることを含み，ここで，タンパク質の異常凝集フォームはポリイオン性物質に選択的に結合することを特徴とする方法。
【請求項２】
ポリイオン性物質は，プロテアーゼ耐性である請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリイオン性物質は，多数の陰イオン基を有するポリアニオン性物質，又は，多数の陽イオン基を有するポリカチオン性物質である請求項１記載の方法。
【請求項４】
ポリイオン性物質は，サルフェート基，カルボキシル基，若しくはホスフェート基である多数の陰イオン基，又は，アミノ基，イミン基，若しくは第四級アンモニウム基である多数の陽イオン基を有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
識別剤は，ポリイオン性物質よりも低い陰イオン基密度を有する請求項４記載の方法。
【請求項６】
識別剤は，アニオン性界面活性剤である請求項１記載の方法。
【請求項７】
識別剤は，脂肪酸のアミノ酸アミドである請求項１記載の方法。
【請求項８】
識別剤は，ラウリルサルコシンである請求項１記載の方法。
【請求項９】
ポリイオン性物質に選択的に結合したタンパク質の異常凝集フォームは，固定化された捕捉剤で捕捉される請求項１記載の方法。
【請求項１０】
捕捉剤は，タンパク質の異常凝集フォームに特異的な抗体である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質の異常凝集フォームに選択的に結合したポリイオン性物質は，固定化された捕捉剤で捕捉される請求項１記載の方法。
【請求項１２】
捕捉剤は，レクチン又は抗体である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
選択的結合条件は，約８〜約９のｐＨを含む請求項１記載の方法。
【請求項１４】
選択的結合条件は，約８．２〜約８．６のｐＨを含む請求項１記載の方法。
【請求項１５】
ポリイオン性物質は，選択的に結合可能なタグ部分を含み，捕捉剤は，タグ部分に選択的に結合する請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質の異常凝集フォームは，選択的に結合可能なタグ部分を含み，捕捉剤は，タグ部分に選択的に結合する請求項９記載の方法。
【請求項１７】
ポリイオン性物質は，脳組織と接触させる前に，固体支持体物質に固定化される請求項１記載の方法。
【請求項１８】
固体支持体物質は，その上がポリイオン性物質に被覆されている請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ポリイオン性物質は，選択的に結合可能なタグ部分を含み，タグ部分を介して固体支持体物質に固定化される請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
選択的に結合可能なタグ部分は，ビオチン，フルオレセイン，ジニトロフェノール，ジゴキシレニン，核酸若しくは核酸類似体配列，又は（Ｈｉｓ）６である請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
選択的に結合可能なタグ部分は，ビオチン，フルオレセイン，ジニトロフェノール，ジゴキシレニン，核酸若しくは核酸類似体配列，又は（Ｈｉｓ）６である請求項１５記載の方法。
【請求項２２】
ポリイオン性物質は，前記結合アビディティーを有する表面を提供する固体である請求項１記載の方法。
【請求項２３】
双性イオン性薬剤は，双性イオン性界面活性剤を含む請求項１記載の方法。
【請求項２４】
双性イオン性薬剤は，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチロシル−アンモニオ）プロパンスルホネート，３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート，ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，スルフォベタイン，３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート，ジメチル−２−ヒドロキシエチル−１−プロパンスルホネート，３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート，ジメチルベンジルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ジメチルエチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン，ラウリルジメチルアミンオキシド，及びこれらの組合せから実質的になる群より選ばれる請求項１記載の方法。
【請求項２５】
双性イオン性薬剤は，スルフォベタインを含む請求項１記載の方法。
【請求項２６】
双性イオン性薬剤は，スルホン酸基又はカルボキシル基を含む請求項１記載の方法。
【請求項２７】
脳組織試料におけるタンパク質の異常凝集フォームの存在又は不存在を，タンパク質の正常非凝集フォームの存在下で，決定する方法であって，
選択的結合条件のもと，タンパク質の異常凝集フォーム及び正常非凝集フォームを含むと疑われる脳組織を，タンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質，識別剤，及び双性イオン性薬剤と接触させ，そして，ポリイオン性物質と結合したタンパク質の異常凝集フォームの存在又は不存在を決定することを含む方法。
【請求項２８】
タンパク質の異常凝集フォームの量が決定される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ポリイオン性物質と結合したタンパク質の異常凝集フォームの存在又は不存在の決定は，タンパク質の凝集フォームについてのイムノアッセイを行うことにより，定性的又は定量的に決定される請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
タンパク質の異常凝集フォームはＰｒＰScであり，タンパク質の正常非凝集フォームはＰｒＰcである請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
タンパク質の異常凝集フォームはＰｒＰScであり，タンパク質の正常非凝集フォームはＰｒＰcである請求項１記載の方法。
【請求項３２】
双性イオン性薬剤は，双性イオン性界面活性剤を含む請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
双性イオン性薬剤は，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチロシル−アンモニオ）プロパンスルホネート，３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート，ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，スルフォベタイン，３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート，ジメチル−２−ヒドロキシエチル−１−プロパンスルホネート，３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート，ジメチルベンジルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ジメチルエチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン，ラウリルジメチルアミンオキシド，及びこれらの組合せから実質的になる群より選ばれる請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
双性イオン性薬剤は，スルフォベタインを含む請求項１記載の方法。
【請求項３５】
双性イオン性薬剤は，スルホン酸基又はカルボキシル基を含む請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）は，ヒト及び動物において重篤且つ致死的な神経学的症状を伴う，脳の海綿状変性を引き起こす。ＴＳＥには，ヒツジ及びヤギが罹患するスクレイピー；ウシが罹患するウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）；伝染性ミンク脳症；ネコ海綿状脳症；ミュールジカ，オジロジカ，オグロジカ及びヘラジカを含むシカの慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）；並びにヒトが罹患する，クールー，クロイツフェルトヤコブ病，ゲルストマン−ストラウスラー症候群，致死性家族性不眠症，及び変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）が含まれる。
【０００２】
ＴＳＥを引き起こす因子の成分で唯一同定されているものはＰｒＰScであり，これはＰｒＰcの異常な凝集アイソフォームである。ＰｒＰScを検出する現行の方法では，試料をプロテイナーゼＫでのタンパク分解に供してＰｒＰcを破壊する。次いで，ＰｒＰcの存在下にＰｒＰScに対して特異的でない抗体を使用したイムノアッセイによって，残存しているＰｒＰScの存在を判定する。Ｓｅｒｂａｎら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４０：１１０，１９９０を参照のこと。この方法論によると，タンパク分解工程の間には捕捉又は検出用抗体の使用が退けられる。プロテイナーゼＫを除去又は不活性化した後でなければ，抗体をアッセイに導入することができない。
【０００３】
試料の取り扱いを最低限とし，ＴＳＥを含む試料を迅速に同定して，プロテイナーゼＫによる消化と無関係に，疾患に関わるＰｒｐのコンフォーマと正常のものとを判別することができ，且つ高スループットの適用のために自動化することのできる方法が必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一実施態様によって，タンパク質の異常凝集フォームをそのタンパク質の正常非凝集フォームの存在下に選択的に結合させるための方法が提供される。本方法は，選択的結合条件下に，タンパク質の異常凝集フォーム及び正常非凝集フォームを含むことが疑われる脳組織を，そのタンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質，双性イオン性薬剤，及び識別剤と接触させる工程を含み，タンパク質の異常凝集フォームがポリイオン性物質に選択的に結合する。ポリイオン性物質は，プロテアーゼ耐性であってよい。
【０００５】
ポリイオン性物質は，多数の陰イオン基を有するポリアニオン性物質，又は多数の陽イオン基を有するポリカチオン性物質であってよい。ポリイオン性物質は，サルフェート基，カルボキシル基若しくはホスフェート基である多数の陰イオン基，又はアミノ基，イミン基若しくは第四級アンモニウム基である多数の陽イオン基を有してよい。
【０００６】
識別剤は，ポリイオン性物質よりも低い陰イオン基密度を有してよい。識別剤は，陰イオン性界面活性剤又はラウリルサルコシン等の脂肪酸のアミノ酸アミドであってよい。
【０００７】
ポリイオン性物質に選択的に結合する，タンパク質の異常凝集フォームは，固定化された捕捉剤で捕捉されてよい。捕捉剤は，タンパク質の異常凝集フォームに対して特異的な抗体であってよい。
【０００８】
タンパク質の異常凝集フォームに選択的に結合するポリイオン性物質は，固定化された捕捉剤で捕捉されてよい。捕捉剤は，レクチン又は抗体であってよい。
【０００９】
選択的な結合条件には，約８から約９まで，又は約８．２から約８．６までのｐＨが含まれてよい。
【００１０】
ポリイオン性物質は，選択的に結合可能なタグ部分を含み，捕捉剤はそのタグ部分に選択的に結合してよい。タンパク質の異常凝集フォームは，選択的に結合可能なタグ部分を含み，捕捉剤はそのタグ部分に選択的に結合してよい。この結合可能なタグ部分は，ビオチン，フルオレセイン，ジニトロフェノール，ジゴキシレニン，核酸若しくは核酸類似体配列，又は（Ｈｉｓ）６であってよい。
【００１１】
ポリイオン性物質は，脳組織と接触させる前に，固体支持体物質に固定化されてよい。固体支持体物質の上を，ポリイオン性物質が被覆してよい。ポリイオン性物質は，支持体への直接吸着によって固体支持体に固定化されてよい。ポリイオン性物質は，選択的に結合可能なタグ部分を含んでよく，そのタグ部分を介して固体支持体物質に固定化されてよい。結合可能なタグ部分は，ビオチン，フルオレセイン，ジニトロフェノール，ジゴキシレニン，核酸若しくは核酸類似体配列，又は（Ｈｉｓ）６であってよい。ポリイオン性物質は，結合アビディティーを有する表面を提供する固体であってよい。
【００１２】
双性イオン性薬剤は，双性イオン性界面活性剤を含んでよい。双性イオン性薬剤は，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチロシル−アンモニオ）プロパンスルホネート，３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート，ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，スルフォベタイン，３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート，ジメチル−２−ヒドロキシエチル−１−プロパンスルホネート，３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート，ジメチルベンジルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ジメチルエチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン，ラウリルジメチルアミンオキシド，又はこれらの組合せを含んでよい。双性イオン性薬剤は，スルフォベタインを含んでよい。双性イオン性薬剤は，スルホン酸基又はカルボキシル基を含んでよい。タンパク質の異常凝集フォームは，ＰｒＰScであってよく，タンパク質の正常非凝集フォームはＰｒＰcであってよい。
【００１３】
本発明の別の実施態様によれば，タンパク質の正常非凝集フォームの存在下に，脳組織試料中のタンパク質の異常凝集フォームの有無を判定する方法が提供される。この方法は，選択的結合条件下に，タンパク質の異常凝集フォーム及びそのタンパク質の正常非凝集フォームを含むことが疑われる脳組織を，そのタンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質，識別剤，及び双性イオン性薬剤と接触させ；そして，ポリイオン性物質に結合したタンパク質の異常凝集フォームの有無を決定する工程を含む。
【００１４】
タンパク質の異常凝集フォームの量を定量してよい。ポリイオン性物質に結合したタンパク質の異常凝集フォームの有無の決定は，タンパク質の凝集フォームに対するイムノアッセイを行うことによって定性的又は定量的に決定されてよい。
【００１５】
タンパク質の異常凝集フォームはＰｒＰScであってよく，タンパク質の正常非凝集フォームはＰｒＰcであってよい。
【００１６】
双性イオン性薬剤は，双性イオン性界面活性剤を含んでよい。双性イオン性薬剤は，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチロシル−アンモニオ）プロパンスルホネート，３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート，３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート，ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート，スルフォベタイン，３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート，ジメチル−２−ヒドロキシエチル−１−プロパンスルホネート，３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート，ジメチルベンジルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ジメチルエチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン，ラウリルジメチルアミンオキシド，又はこれらの組合せを含んでよい。双性イオン性薬剤は，スルフォベタインを含んでよい。双性イオン性薬剤は，スルホン酸基又はカルボキシル基を含んでよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
タンパク質の異常凝集フォームの選択的結合は，タンパク質の異常凝集フォーム及びそのタンパク質の正常非凝集フォームの双方を含有する試料を，選択的結合条件下でタンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質と接触させることによって成し遂げうることが，最近発見されている。引用することによりその全体が本明細書で援用されるＷＯ  ０３／０７３１０６Ａ２（Ｌａｎｅら，「プリオンタンパク質の病的フォームの結合（Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」）を参照のこと。結合条件には，ラウリルサルコシン等の識別剤が含まれうる。この方法の利点のうち特筆すべきは，タンパク分解工程が排除されるということである。従って，抗体又は他のタンパク質を選択的結合条件に何時でも添加することができる。ＷＯ  ０３／０７３１０６に記載のポリイオン性物質，選択的結合条件，その他の条件，その他の物質，アッセイ方法，及びその他の方法を，本願に開示の方法において使用することができ，特に，引用することによりそれら全体が援用される。
【００１８】
本発明により，ＷＯ  ０３／０７３１０６に記載の組成物及び方法に対する改良がもたらされる。この改良には，荷電界面活性剤等の荷電薬剤，例えば，双性イオン性薬剤を選択的結合条件に添加することが含まれる。例えば，タンパク質の異常凝集フォーム及びそのタンパク質の正常非凝集フォームを含む脳組織を，選択的結合条件下に，そのタンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質，双性イオン性薬剤，及びラウリルサルコシン等の識別剤と接触させることができる。
【００１９】
選択的結合とは，タンパク質の異常凝集フォームはタンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質に結合し，タンパク質の異常非凝集フォームはそのポリイオン性物質に実質的に結合しないことを意味する。
【００２０】
選択的結合条件によって，ポリイオン性物質が，異常凝集タンパク質フォーム，例えばＰｒＰScに結合するが，そのタンパク質の正常非凝集フォーム，例えばＰｒＰcには実質的に結合しないような条件が提供される。選択的結合条件によって，タンパク質の異常凝集フォームの存在についてのアッセイにおいて有用となるに足るほど，強くて選択的な結合が提供される。選択的結合条件は，当業者によって決定されることができ，例えば，反応条件，特に識別剤，双性イオン性薬剤等の荷電薬剤の存在及び濃度や，ｐＨ，並びに洗浄力等を好適に調整することによって達成できる。好適な選択的結合条件は，例えば，ＷＯ  ０３／０７３１０６及び以下の実施例に記載されている。本発明の一実施態様において，選択的結合条件には約８から約９までのｐＨ，特に約８．２から約８．６までのｐＨが含まれる。
【００２１】
結合アビディティーとは，多くの結合部位を有する分子の多価結合剤（例えば，ポリイオン性物質）との全体的な結合強度を意味し，これは，分子と結合剤（例えば，ポリイオン性物質）の各々個々の結合部位間の結合強度である「親和性」とは異なる。
【００２２】
タンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有する好適なポリイオン性物質は，ＷＯ  ０３／０７３１０６に記載されており，これは引用することによりその全体が本明細書で援用される。ポリイオン性物質は，プロテアーゼ耐性でありうる。ポリイオン性物質は，多数の陰イオン基を有するポリアニオン性物質，又は多数の陽イオン基を有するポリカチオン性物質でありうる。陰イオン基は，例えばサルフェート，カルボキシル，又はホスフェート基でありうる。陽イオン基は，例えばアミノ基，イミン基，又は四級アンモニウム基でありうる。
【００２３】
本発明の一実施態様において，界面活性剤は選択的結合条件の一部をなし，洗浄力によるか，又は識別剤として作用することによるかのいずれかで選択的結合を促進する。
【００２４】
タンパク質の異常凝集及び正常非凝集フォーム
本発明の方法によって，タンパク質の異常凝集フォームを，そのタンパク質の正常非凝集フォームの存在下に，検出するか，又は選択的に結合させることができる。詳細には，本発明の方法によって，タンパク質の異常凝集フォームを，そのタンパク質の正常非凝集フォームの存在下に検出するか，又は選択的に結合させることができ，タンパク質は脳組織に存在するものか，又は脳組織由来のものである。本発明の方法は，選択的結合条件下に，タンパク質の異常凝集フォーム及び正常非凝集フォームを含むことが疑われる脳組織等の試料を，そのタンパク質の異常凝集フォームに対する結合アビディティーを有するポリイオン性物質，双性イオン性薬剤，及びラウリルサルコシン等の識別剤と接触させる工程を含む。
【００２５】
異常凝集フォーム及び正常非凝集フォームを有するタンパク質の一例として，ＰｒＰが挙げられる。伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を引き起こす因子の成分で唯一同定されているものはＰｒＰScであり，これはＰｒＰcの正常非凝集フォームの異常な凝集アイソフォームである。従って，本発明の一実施態様において開示される方法は，ＰｒＰcの存在下，ＰｒＰScを検出するか又は選択的に結合させるのに使用することができる。
【００２６】
タンパク質の異常凝集フォームの一例として，アルツハイマー病においてアミロイド沈着を形成するベータ−ペプチド，アルツハイマー及びパーキンソン患者のレビー小体においてアミロイド様沈着を産生するアルファ−シヌクレインタンパク質，並びに家族性ブリティッシュ痴呆（ＦＢＤ）においてアミロイド沈着を形成するＡＢｒｉペプチド等の，ベータ−シート構造が大半を占める異常タンパク質凝集体が挙げられる。
【００２７】
被検試料は，例えば哺乳動物脳組織でありうる。本発明の一実施態様において，閂（ｏｂｅｘ）が使用される。本発明の方法で，スクレイピー，ＢＳＥ，伝染性ミンク脳症，ネコ海綿状脳症，ＣＷＤ，クールー，クロイツフェルトヤコブ病，ゲルストマン−ストラウスラー症候群，致死性家族性不眠症，及び変異型クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ）を引き起こすＴＳＥを含むことが疑われる試料中のＴＳＥを検出するか又は選択的に結合させることができる。
【００２８】
荷電界面活性剤
荷電界面活性剤又は界面活性剤様薬剤を，タンパク質の異常凝集フォームの感度及び検出を向上させるために，本発明の方法の選択的結合条件に追加することができる。荷電界面活性剤又は界面活性剤様薬剤は，陰イオン性，陽イオン性，若しくは双性イオン性界面活性剤又は界面活性剤様薬剤でありうる。双性イオン性薬剤は，陽性及び陰性電荷の双方を担持する分子である。本発明の方法では，あらゆる双性イオン性薬剤が使用でき，例えば，ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−０８（ｎ−オクチル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート），ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１０（ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート），ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１２（ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート），ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート），ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）が挙げられる。本発明の一態様において，双性イオン性化合物は，双性イオン性界面活性剤である。
【００２９】
他の双性イオン性薬剤は，スルフォベタインであり，例えば，３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート，ジメチル−２−ヒドロキシエチル−１−プロパンスルホネート，３−（１−メチルピペリジニウム）−１−プロパンスルホネート，ジメチルベンジルアンモニウム−１−プロパンスルホネート，ジメチルエチルアンモニウム−１−プロパンスルホネートが含まれる。他の双性イオン性薬剤には，ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン及びラウリルジメチルアミンオキシドが含まれる。実施例２及び３に収載された双性イオン性薬剤も参照されたい。
【００３０】
約０．１％から約１０％の双性イオン性薬剤のような荷電薬剤が，選択的結合原液又は作業プレート希釈液に添加される。これにより，約０．０２，０．０５，０．１，０．５，１．０，１．５，２．０，３．０，４．０，５．０，６．０，７．０，８．０，９．０，１０，１５，又は２０％の双性イオン性薬剤が，選択的結合反応に存在する。
【００３１】
識別剤
識別剤は，前述の通りＰｒＰScのポリイオン性物質への選択的結合を許容し，且つ／又はＰｒＰcがポリイオン性物質に結合するのを阻止する薬剤である。識別剤は，ポリイオン性物質よりも低い陰イオン基密度を有しうる。識別剤は，陰イオン性界面活性剤，脂肪酸のアミノ酸アミド，又はラウリルサルコシンでありうる。識別剤は，選択的結合条件の約０．５，１．０，２．０，３．０，４．０，５．０，又は１０％で含まれうる。
【００３２】
タンパク質の異常凝集フォームの検出
タンパク質の異常凝集フォームが一旦ポリイオン性物質に選択的に結合して，そのタンパク質の正常フォームを任意に除去した後，タンパク質の異常凝集フォームの有無及び／又は量を判定することができる。例えば，ＷＯ  ０３／０７３１０６を参照のこと。選択的に結合したタンパク質の異常フォームを検出するいずれのタイプのアッセイも使用することができる。例えば，酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ），ウエスタンブロット，間接蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡ），ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ），血球凝集（ＨＡ），及び蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）を使用することができる。ＰｒＰに対して特異的な抗体のいずれのものでも，これらのアッセイで使用することができる。かかる抗体のいくつかは，当業者によって知られている。場合によっては，グアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）等の変性剤が使用され，ＰｒＰに対して特異的な抗体をアッセイに添加する前又は添加時にＰｒＰエピトープを曝露する。
【００３３】
ポリイオン性物質は，試料との接触前又は接触後のいずれかに，固体支持体物質に固定化することができる。固体支持体物質からの試料の分離は，次いでアッセイからタンパク質の正常非凝集フォームを除去して，タンパク質の異常凝集フォームのみを残すのに使用することができる。固体支持体物質は当該技術分野でよく知られており，例えば，マイクロタイタープレート，ディップスティック，層流デバイス，マイクロビーズ及び超常磁性マイクロビーズが挙げられる。
【００３４】
ビオチン又はその他のタグを，当該技術分野でよく知られた方法によってポリイオン性物質に接合させることができる。ビオチンは，アビジンで誘導体化された固体支持体物質，又はストレプトアビジン，ニュートラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）又はキャプタビジン（Ｃａｐｔａｖｉｄｉｎ）等のアビジン結合性を備えた物質に，ポリイオン性物質を結合させるために使用することができる，結合可能なタグ部分である。
【００３５】
結合可能なタグ部分としてその他の分子を使用することができ，これにはポリイオン性物質に容易に接合し，且つフルオレセインジニトロフェノールＤＮＰ，ジゴキシゲニン，核酸又は核酸類似体配列，及び（Ｈｉｓ）６等の好適な捕捉剤によって捕捉又は結合できるものが含まれる。タグ部分を介するのでなく，ポリイオン性物質自体に選択的に結合する捕捉剤を使用することができる。例えば，ポリグリコシド類は，好適なレクチンによって，又は好適な抗体によって結合されうる。
【００３６】
捕捉されたタンパク質の異常凝集フォームは，必要であればアッセイの前にポリイオン性物質から溶出させることができる。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がこの目的に好適であり，約０．５〜約１重量％，好ましくは約０．７５重量％を上回る濃度で使用されるのが好ましい。
【００３７】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素又は限定なしでも適切に実施することができる。すなわち，例えば，本明細書における各例において「・・・を含む」，「・・・から本質的になる」及び「・・・からなる」という用語は，他の２つのいずれかと置き換えることができる。使用されてきた用語及び表現は，明細書の非制限の用語として使用され，そのような用語及び表現の使用において，示され及び記載された特徴及びその一部の均等物を除外する意図はなく，請求される本発明の範囲内における種々の変形が可能であることが認識される。すなわち，好ましい実施形態及び任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更及び変種が可能であり，そのような変更及び変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【００３８】
さらに，発明の特徴及び態様がマーカッシュ群又は他の代替群の用語で記載されている場合，当業者は，本発明がマーカッシュ群又は他の群の個々のメンバー又はサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【００３９】
以下は，例示目的でのみ提供され，上の一般用語で記載されている本発明の範囲を制限することを意図するものではない。この開示における全引例は，本願明細書に引用したものとする。
【実施例】
【００４０】
実施例１
脳試料（ヒツジ又はウシ）を，陰性かＴＳＥ陽性かが分かっている動物から収集してホモジナイズし，水中１０〜２０％の溶解液を調製した。ＥＬＩＳＡアッセイプレートにホモジネートを付す前に，試料を作業プレート希釈液で希釈した。作業プレート希釈液は，プレート希釈液成分１及びプレート希釈液成分２で構成されたものである。プレート希釈液成分１は，２５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３，５％ウシ血清アルブミン，５％ラウリルサルコシン及び５％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００を含有している。プレート希釈液成分２（１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅＩ及び２．５ｍｇ／ｍＬトリプシン）と成分１とを十分に混合し，２５μｌの最終作業プレート希釈液を１００μｌの脳ホモジネートと混合してアッセイ用試料を調製した。
【００４１】
ＥＬＩＳＡアッセイは，荷電ポリイオンポリマーを被覆した抗原捕捉プレートを使用して実施した。ＷＯ  ０３／０７３１０６を参照のこと。脳ホモジネートと作業プレート希釈液との混合液１００μｌを各ウェルに付して，攪拌せずに室温にて２時間インキュベートした。２時間後に，溶解液をプレートから吸引して，このプレートを１Ｘ洗浄溶液で６回洗浄した。最後の洗液を吸引し，吸収パッドの上で叩打して，４Ｍグアニジンチオシアネートを含有する１００μｌの調整用緩衝液をウェルに添加した。室温で１０分間インキュベートした後，プレートを吸引して１Ｘ洗浄溶液で３回洗浄した。
【００４２】
結合したＰｒＰScを検出するために，プレートをＨＲＰＯ接合抗ＰｒＰ抗体溶液１００μｌと室温で１時間インキュベートした。検出用抗体溶液を吸引した後，プレートを１Ｘ洗浄溶液で５回洗浄した。その後プレートを吸収パッドの上に対して叩打して乾燥させ，１００μｌのＴＭＢ基質を添加し，そのプレートを１５分間インキュベートして発色させた。次いでＨＣｌ停止溶液でアッセイを終了し，４５０ｎｍ及び６５０ｎｍ（バックグラウンドの補正用）にてマイクロウェルの吸光度を読み取った。
【００４３】
ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）を作業プレート希釈液に添加することでＴＳＥアッセイの性能が向上するか否かを判定するために，５％又は０．５％のいずれかのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）を作業プレート希釈液成分１用の製剤に添加した。正常ヒツジ脳，又は正常ヒツジ脳ホモジネートで１：２５若しくは１：１００のいずれかの比に希釈したスクレイピーヒツジ脳ホモジネートを使用してアッセイを実施した。用いたＥＬＩＳＡアッセイのプロトコルは前述した通りのものである。その結果を図１に示す。図１で，対照とはＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）及びラウリルサルコシンで製剤化した作業プレート希釈液を用いて処理した試料のことであり；０．１％又は１％Ｚｗｉｔｔ３−１４とは作業プレート希釈液に０．５％又は５％のいずれかのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）（それぞれ）をＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）及びラウリルサルコシンと共に添加した製剤を言う。
【００４４】
図１により，作業プレート希釈液へのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の添加は，正常脳試料で観察される信号に影響を与えることはないが，スクレイピー脳試料では，ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）を作業プレート希釈液への補給剤として５％で使用した場合に，観察される信号はおよそ２倍になったことが示される。これらのデータは，作業プレート希釈液中に０．５％を上回る濃度でＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）が存在すると，荷電ポリイオンポリマーを被覆したプレートを使用してヒツジ脳ホモジネートから捕捉されるＰｒＰScに特異的な信号が増強されることを示唆している。
【００４５】
図２は，ＢＳＥに罹患したウシの脳に由来するＰｒＰScの検出を増強する上で，ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）が同様に効果的であること示している。図２に示す実験では，５％又は０．１％のいずれかのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）を作業プレート希釈液成分１用の製剤に添加した。いくつかのＢＳＥ脳ホモジネート（ｎ＝２４）を使用してアッセイを実施したが，用いたアッセイのプロトコルは前述したものである。図２で，ｎｏＺｗｉｔｔとはＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）及びラウリルサルコシンで製剤化した作業プレート希釈液を用いて処理した試料のことであり；０．１％又は５％とは作業プレート希釈液にＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）及びラウリルサルコシンと共に添加したＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の濃度を言う。ヒツジ脳試料では，ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）は，ポリイオンポリマーを被覆したプレートを使用して捕捉される信号を増大させるのにすべてで効果的であることが認められたが，ＢＳＥ試料では４つ（そのＯＤ450-650はアッセイカットオフに近かった）で効果的であった。
【００４６】
図３に要約した実験は，ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＰｒＰScの検出を改良するために必要とされる条件を精査するものである。これらの実験で，プレート希釈液成分１は，以下の組成物：ａ）５％ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）及び５％ラウリルサルコシン，ｂ）５％ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）単独，又はｃ）５％ラウリルサルコシン及び５％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール），と共に２５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ８．３及び５％ウシ血清アルブミンを用いて調製した。本研究では，前述のＥＬＩＳＡにおいてプレート希釈液成分１のこれら製剤を用い，ＢＳＥ脳ホモジネートを試験した。従って，この実験で効果的な作業プレート希釈液がアッセイ感度の向上を示すには，ラウリルサルコシン及び双性イオン性薬剤の双方が必要とされる。
【００４７】
図３のデータは，ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）等の双性イオン性界面活性剤単独を作業プレート希釈液に使用するのは効果的でないことを明らかに示している。他方，ラウリルサルコシンの存在下にＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）をＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）に置き換えると，ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）及びラウリルサルコシンよりも優れたアッセイ感度が得られ，試料の多くにおいてそのＯＤ450-650がこの処理で倍加していた。
【００４８】
作業プレート希釈液へのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の添加がＢＳＥ  ＥＬＩＳＡアッセイの感度にどのような影響を及ぼすかを調べるために，正常ウシ脳ホモジネートでＢＳＥ脳ホモジネートの希釈の一系列を調製して，作業プレート希釈液を用いて試験した。図４において，曲線＃１は，トリス緩衝液，ウシ血清アルブミン，５％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）及び５％ラウリルサルコシンで製剤化した作業プレート希釈液を用いた試料希釈ランを表す。曲線＃２は，ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）を５％ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）に置き換えた作業プレート希釈液での試料希釈ランを表す。このデータは，作業プレート希釈液へのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の置換によってほぼ１ログ（ｌｏｇ）単位の感度の増大が引き起こされることを示している。ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００（アルキルアリールポリエーテルアルコール）希釈液の場合，アッセイカットオフを上回って検出された最後の希釈は１：２８８であり，一方ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）製剤の場合には，カットオフを上回って検出された最後の希釈は１：５７６と１：１１５２との間であった。
【００４９】
実施例２  プレート希釈液における異なる双性イオン性界面活性剤の評価
ＴＳＥ  ＥＩＡプレート希釈液１への双性イオン性界面活性剤の添加を，脳ホモジネート中のＰｒＰscの検出能を増加させる能力について，非イオン性界面活性剤ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００と比較して精査した。
【００５０】
プレート希釈液１塩基溶液は，ＴＲＩＺＭＡ（登録商標）Ｂａｓｅ（ｐＨ８．３），Ｎ−ラウロイルサルコシン界面活性剤，ウシ血清アルブミン溶液，及び脱イオン水を含んでいる。実験で使用した双性イオン性界面活性剤には以下のものが含まれる：
ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−８（Ｚｗｉｔｔ  ３−８）：３−（Ｎ，Ｎ−ジメチロシル−アンモニオ）プロパンスルホネート
ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１０（Ｚｗｉｔｔ  ３−１０）：３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート
ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１２（Ｚｗｉｔｔ  ３−１２）：３−（ドデシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート
ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（Ｚｗｉｔｔ  ３−１４）：３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホネート
ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１６（Ｚｗｉｔｔ  ３−１６）：３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルパルミチルアンモニオ）プロパンスルホネート
ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ：ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン
ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＯＢ：ラウリルジメチルアミンオキシド
ＮＤＳＢ  １９５：ジメチルエチルアンモニウム−１−プロパンスルホネート
ＮＤＳＢ  ２０１：３−（１−ピリジノ）−１−プロパンスルホネート
ＮＤＳＢ  ２２１：３−（１−メチルピペリジウム）−１−プロパンスルホネート
ＮＤＳＢ  ２５６：ジメチルベンジルアンモニウム−１−プロパンスルホネート。
【００５１】
対照は，非イオン性界面活性添加剤，Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，アルキルアリールポリエーテルアルコールである。
【００５２】
ＴＳＥ−ＥＩＡアッセイ：
改良ＢＳＥ  ＥＩＡ試験キットの構成要素
正常ヒツジ脳ホモジネート（２０％ｗ／ｖ）
正常ヒツジ脳ホモジネートに１：１５００で希釈されたスクレイピー脳ホモジネート
正常ヒツジ脳ホモジネートに１：３００で希釈されたスクレイピー脳ホモジネート
正常ヒツジ脳ホモジネートに１：４０で希釈されたスクレイピー脳ホモジネート
【００５３】
１１種の双性イオン性界面活性剤を，０．１％，１．０％，及び１０％の濃度でプレート希釈液塩基溶液１に添加した。対照の非イオン性界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）もプレート希釈液塩基に５％添加したが，その量は予め本界面活性剤に対する至適濃度となる量として定量されたものである。プレート希釈液１の各製剤は，標準プレート希釈液２（２．５ｍｇ／ｍＬトリプシン；１ｍｇ／ｍＬ  Ｄｎａｓｅ１；２５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）（作業プレート希釈液中の終濃度））と混合し，次いで２０％脳ホモジネート試料に添加した（２５μｌ作業プレート希釈液に１００μｌの脳ホモジネート）。試料／希釈液混合液を，ポリイオン捕捉マイクロタイタープレートに添加した。指標として以下の４種の試料，すなわち，正常ヒツジ脳ホモジネート並びに正常ヒツジ脳ホモジネートで１：１５００，１：３００，及び１：４０倍希釈に希釈したヒツジスクレイピー脳ホモジネートを用い，標準ＢＳＥアッセイプロトコルに従ってアッセイを実施した。標準ＢＳＥ  ＥＩＡアッセイプロトコルを使用した。気泡が出ないようにしながら，試料と作業希釈液を混合した。希釈した試料を，対照と共にポリイオン捕捉マイクロプレートに添加する。プレートにカバーをして２〜３時間インキュベートする。プレートを１Ｘ洗浄溶液１（２．２ｇ／Ｌ無水第一リン酸ナトリウム；１１．９ｇ／Ｌ無水第二リン酸ナトリウム；８５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム；１０ｇ／Ｌ  Ｎ−ラウロイルサルコシン；脱イオン水）で６回洗浄する。調整用緩衝液を添加し，プレートにカバーをして１０分間インキュベートする。プレートを１Ｘ洗浄溶液２（２．２ｇ／Ｌ無水第一リン酸ナトリウム；１１．９ｇ／Ｌ無水第二リン酸ナトリウム；８５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム；１０ｍＬ／Ｌ  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０；脱イオン水）で３回洗浄する。接合体（接合体希釈液：１７．５５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム；０．２２ｇ／Ｌ無水第一リン酸ナトリウム；１．１９ｇ／Ｌ無水第二リン酸ナトリウム；０．５ｍＬ／Ｌ  ＩｇｅｐａｌＣＡ−７２０；２ｍＬ／Ｌ  ５００ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．１％ウシ血清アルブミン；３ｍＬ／Ｌ青色染料；脱イオン水。接合体濃縮貯蔵液：１２Ｆ１０：ＨＲＰＯ接合体（最終作業濃度：０．１〜１ｕｇ／ｍＬ）；Ｓｔａｂｉｌｚｙｍｅ接合体安定化剤）をプレートに添加する。プレートにカバーをして１５分間インキュベートする。反応をＨＣｌ溶液で停止する。
【００５４】
プレートは，４５０ｎｍ（参照波長ＡREF＝６２０〜６５０ｎｍ）で読み出す。カットオフは平均ＮＣ＋０．１２０である。解釈のため，もしも試料のＡ450−ＡREFがカットオフ未満であれば，結果は陰性である。もしも試料のＡ450−ＡREFがカットオフ以上であれば，結果はひとまず反応性である（二重に再試験）。もしも二重再試験の平均Ａ450−ＡREFがカットオフ以上であれば，試料は陽性である。
【００５５】
図１〜１１は，すべての場合において，１種以上の濃度でプレート希釈液１成分に双性イオン性界面活性剤を添加することにより，陰性の試料に対する信号を顕著に増加させることなく，３つのスクレイピー試料における陽性の信号が倍加したことを示している。ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴＳ（登録商標）（３−８，３−１２，３−１０，３−１４，及び３−１６，図５〜９）並びにＮＤＳＢ（１９５，２０１，２２１，及び２５６，図１２〜１５）の場合，使用した界面活性剤の濃度に関わらずすべでの場合で，信号はほぼ２倍になっていた。２種のＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）界面活性剤（ＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＯＢ及びＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢ，図１０及び１１）の場合，低い方の界面活性剤濃度（０．１％）で至適な結果が得られた。１％及び１０％のＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）濃度では，陽性のスクレイピー信号は０．１％の濃度に比して低下していた。１０％のＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）界面活性剤濃度でスクレイピー信号は最も低く，対照プレート希釈液１製剤と概ね同等か，又はこれよりわずかに低かった。
【００５６】
表１に，異なるプレート希釈液製剤を用いたスクレイピー及び正常ヒツジ試料の試験に対する実測光学密度値（ＯＤ）を示す。スクレイピー１：３００試料の試験について，対照の界面活性剤ＯＤ値に対する被験界面活性剤のＯＤ値を，本研究で評価した異なる双性イオン性界面活性剤について得られた信号の増加の例として列挙する。若干の例外はあるものの，双性イオン性界面活性剤は陰性の試料の信号を増加させることなく陽性の試料に対する光学密度を２〜２．８倍増加させている。
【００５７】
【表１】
2007531895.tif 000003
【００５８】
ＴＳＥ−ＥＩＡのプレート希釈液１にて評価した１１種の双性イオン性界面活性剤すべてが０．１から１０％の間の濃度で，非イオン性ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００プレート希釈液製剤と比較して，ＰｒＰsc特異信号を少なくとも２倍まで増強していた。このデータは，種々の双性イオン性界面活性剤によるＴＳＥプレート希釈液１製剤での置換が可能であり，これらがポリイオン捕捉物質によるＰｒＰscの選択的結合の増加を引き起こすことを立証するものである。
【００５９】
実施例３
実施例２の方法を，ＢＳＥ試料を用いて繰り返した。この結果を，表２及び図１６〜２６に示す。
【００６０】
【表２】
2007531895.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】作業プレート希釈液へのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の添加によって，ヒツジ脳ＰｒＰＳｃの検出が改良されることを示す図である。
【図２】作業プレート希釈液へのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４（ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）の添加によって，ＢＳＥの検出が改良されることを示す図である。
【図３】ＰｒＰＳｃの検出の増強に必要な作業プレート希釈液界面活性剤組成物を示す図である。
【図４】試料の一希釈系列におけるＥＬＩＳＡ感度を示す図である。
【図５】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−８の効果を示す図である。
【図６】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１２の効果を示す図である。
【図７】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１０の効果を示す図である。
【図８】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４の効果を示す図である。
【図９】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１６の効果を示す図である。
【図１０】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＯＢの効果を示す図である。
【図１１】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢの効果を示す図である。
【図１２】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−１９５の効果を示す図である。
【図１３】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−２０１の効果を示す図である。
【図１４】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−２２１の効果を示す図である。
【図１５】スクレイピーＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−２５６の効果を示す図である。
【図１６】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−８の効果を示す図である。
【図１７】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１２の効果を示す図である。
【図１８】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１０の効果を示す図である。
【図１９】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１４の効果を示す図である。
【図２０】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−１６の効果を示す図である。
【図２１】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＯＢの効果を示す図である。
【図２２】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＥＭＰＩＧＥＮ（登録商標）ＢＢの効果を示す図である。
【図２３】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−１９５の効果を示す図である。
【図２４】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−２０１の効果を示す図である。
【図２５】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−２２１の効果を示す図である。
【図２６】ＢＳＥ  ＥＩＡに対する，プレート希釈液１でのＮＤＳＢ−２５６の効果を示す図である。
【図１】
2007531895.tif 000005
【図２】
2007531895.tif 000006
【図３】
2007531895.tif 000007
【図４】
2007531895.tif 000008
【図５】
2007531895.tif 000009
【図６】
2007531895.tif 000010
【図７】
2007531895.tif 000011
【図８】
2007531895.tif 000012
【図９】
2007531895.tif 000013
【図１０】
2007531895.tif 000014
【図１１】
2007531895.tif 000015
【図１２】
2007531895.tif 000016
【図１３】
2007531895.tif 000017
【図１４】
2007531895.tif 000018
【図１５】
2007531895.tif 000019
【図１６】
2007531895.tif 000020
【図１７】
2007531895.tif 000021
【図１８】
2007531895.tif 000022
【図１９】
2007531895.tif 000023
【図２０】
2007531895.tif 000024
【図２１】
2007531895.tif 000025
【図２２】
2007531895.tif 000026
【図２３】
2007531895.tif 000027
【図２４】
2007531895.tif 000028
【図２５】
2007531895.tif 000029
【図２６】
2007531895.tif 000030
【国際調査報告】
2007531895.tif 000031
2007531895.tif 000032
2007531895.tif 000033
2007531895.tif 000034