(57)【要約】被験体においてＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、有効量のＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントを該被験体に投与することを含む上記方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、有効量のＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントを該被験体に投与することを含む上記方法。
【請求項２】
ＦＺＤ１０に関連する疾患が、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも４３〜５６番、６１〜７２番、１５７〜１７２番、１７４〜１９１番、１８９〜２０２番、２１４〜２２５番、又は１〜２２５番のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
被験体においてＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患又は該疾患を発症する素因を診断又は予後診断する方法であって、
（ａ）該被験体由来のサンプルをＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントと接触させるステップ、
（ｂ）該サンプル中のＦＺＤ１０タンパク質を検出するステップ、及び
（ｃ）対照と比較した場合のＦＺＤ１０タンパク質の相対存在量に基づいて、該被験体が上記疾患に罹患している又は該疾患を発症するリスクがあるか否かを判断するステップ、
を含む上記方法。
【請求項７】
ＦＺＤ１０に関連する疾患が、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも４３〜５６番、６１〜７２番、１５６〜１６９番、１５７〜１７０番、１５７〜１７２番、１６１〜１７３番、１７４〜１９１番、１８９〜２０２番、２１４〜２２５番、又は１〜２２５番のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメント、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項１２】
配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントを含む、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を診断又は予後診断するためのキット。
【請求項１３】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を診断又は予後診断するためのキットの製造における、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントの使用。
【請求項１４】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防するための組成物の製造における、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願についての相互参照
本出願は、２００３年７月１１日出願の米国特許仮出願第６０／４８６，１９５号の優先権を主張し、これを参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
２．発明の背景
２．１  発明の分野
本発明は、被験体におけるＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患（特に滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病）の治療及び／又は予防方法に関する。また本発明は、被験体におけるＦＺＤ１０関連疾患の診断方法に関する。さらに本発明は、ＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントを含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．２  関連分野の説明
最近、ヒト化モノクローナル抗体、例えばＥｒｂＢ２に対するトラスツズマブ（ハーセプチン）（非特許文献１）、及びＣＤ２０に対するリツキシマブ（リツキサン）（非特許文献２）などを用いた分子標的治療が、乳癌及び悪性リンパ腫の数事例において治療結果の改善に寄与している。これらの有望な治療は、腫瘍細胞の表面上に存在する標的化タンパク質に直接結合する、ゲノム研究に基づく抗癌薬の最初の例である。ヒト化抗体は、細胞表面受容体の阻害による増殖シグナル伝達の阻害と、特異的抗体との相互作用及び／又は抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）による標的分子のダウンレギュレーションを介して、抗腫瘍作用を発揮すると考えられている。抗体に基づく抗腫瘍効果の正確な機構はまだ解明されていないが、これらの治療は、特に化学療法剤耐性癌又は放射線耐性癌の治療において有望な方法である。
【０００４】
間葉組織に生じる悪性腫瘍として定義される肉腫のうち、骨肉腫、ユーイング肉腫及び黄紋筋肉腫は一般的に化学療法に対して感受性がある。しかしながら他の肉腫の多く（特に成人の紡錘細胞肉腫）は、化学療法剤耐性及び放射線耐性のために治療することが困難な疾患である（非特許文献３〜６）。滑膜肉腫（ＳＳ）は、そのような腫瘍の典型であり、ＳＳの予後は集学的治療の発達により改善されているが、治療結果をさらに改善するには抗体に基づく治療を含む新規な治療方法を開発する必要がある。
【０００５】
標的の腫瘍に対する抗体に基づく治療の開発については、標的腫瘍の大部分において過剰発現され、かつ正常な器官組織においては発現されないか最小限しか発現されない細胞表面分子を同定することが重要である。しかしながら、腫瘍において特異的に発現されるタンパク質を同定することは困難であり、抗体に基づく治療の確立が望まれている滑膜肉腫や他の腫瘍において特異的に発現されているタンパク質に関する報告はない。
【０００６】
【非特許文献１】Fendly, B. M. et al., Cancer Res. 50: 1550-8., 1990年
【非特許文献２】Maloney, D. G. et al., Blood. 90:2188-95., 1997年
【非特許文献３】Crist, W. M. et al., J Clin Oncol. 19: 3091-102., 2001年
【非特許文献４】Wunder, J. S. et al., J Bone Joint Surg Am. 80: 1020-33., 1998年
【非特許文献５】Ferguson, W. S. and Goorin, A. M., Cancer Invest. 19: 292-315., 2001年
【非特許文献６】Adjuvant chemotherapy for localised resectable soft-tissue sarcoma of adults: meta-analysis of individual data. Sarcoma Meta-analysis Collaboration, Lancet. 350: 1647-54., 1997年
【発明の開示】
【０００７】
３．発明の概要
滑膜肉腫の治療法の開発に関する上記の問題及び要求を検討した結果、本発明者のグループは、２３，０４０種の遺伝子からなるｃＤＮＡマイクロアレイを用いた遺伝子発現パターンのゲノムワイドな分析によって、ＳＳが神経冠細胞を起源とする可能性があることを報告し、またＳＳの生物学的特徴が悪性末梢神経鞘腫瘍に類似していることに着目した（Nagayama, S. et al., Cancer Res. 62:5859-66., 2002）。その結果、本発明者はＳＳにおいて共通してアップレギュレートされている２６種の遺伝子を同定し、その産物が新規な治療薬の開発の好適な分子標的となりうると考えた。これらのアップレギュレートされる遺伝子のうち、本発明者は、以下の基準に沿ってＳＳの分子標的治療の開発に好適な１つの候補遺伝子を選択した。すなわち、（ｉ）脳、心臓、肺、肝臓、腎臓及び骨髄などの重要な器官における発現が比較的低いため、決定的な有害な副作用を回避する；（ｉｉ）遺伝子産物が細胞膜内在性タンパク質であると予測される。これらの基準に基づき、本発明者はＷｎｔの細胞表面受容体の１つであり、７回膜貫通タンパク質のＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーに属するＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に着目した。ＦＺＤ１０の発現は原発性直腸結腸癌（Terasaki, H. et al., Int J Mol Med. 9: 107-12., 2002）及び原発性胃癌（Kirikoshi, H. et al., Int J Oncol. 19: 767-71., 2001）並びにＳＳにおいてアップレギュレートされることが証明されているが、腫瘍形成におけるＦＺＤ１０の正確な生物学的作用は明らかとなっていない。従って、腫瘍増殖におけるＦＺＤ１０の関与の可能性は、ＦＺＤ１０のシグナル伝達の阻害によって解明されうる。
【０００８】
今回、本発明者は、滑膜肉腫（ＳＳ）の抗体に基づく治療の開発のために、ＦＺＤ１０のＮ末端細胞外ドメイン（ＦＺＤ１０−ＥＣＤ）を認識する特異的なポリクローナル抗体（ＴＴ６４１ ｐＡｂ）及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。上述の分子標的の選択に関する基準の通り、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫組織化学分析によって、ＦＺＤ１０が、いくつかの器官組織の上皮を除いて、正常な重要器官においては発現されない又は発現が低いことが明らかとなった。さらに、この特異的な抗体が、ＦＺＤ１０を過剰発現するＳＳ細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の媒介に有効であることが証明された。加えて、ヌードマウスを用いたｉｎ ｖｉｖｏ実験によって、ＴＴ６４１ ｐＡｂの腫瘍内注射によって、おそらく腫瘍細胞のアポトーシスの誘導によって、ＳＳ異種移植片の増殖が軽減したことが示された。
【０００９】
以上の知見に基づいて、本発明者はＦＺＤ１０に対する抗体がＳＳ及び他のＦＺＤ１０過剰発現腫瘍の治療及び診断において治療薬及び予防薬の可能性を有すると結論付けた。
【００１０】
従って、一態様において、本発明は、被験体においてＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防する方法であって、有効量のＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントを該被験体に投与することを含む方法を提供する。「ＦＺＤ１０に関連する疾患（ＦＺＤ１０関連疾患）」とは、ＦＺＤ１０タンパク質の過剰発現に関連する疾患を意味する。そのような疾患としては、限定されるものではないが、滑膜肉腫（ＳＳ）、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。
【００１１】
本発明の方法において使用する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうる。抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチド、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも４３〜５６番、６１〜７２番、１５６〜１６９番、１５７〜１７０番、１５７〜１７２番、１６１〜１７３番、１７４〜１９１番、１８９〜２０２番、２１４〜２２５番、又は１〜２２５番のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されていることが好ましい。
【００１２】
さらに、別の態様において、本発明は、被験体においてＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患又は該疾患を発症する素因を診断又は予後診断する方法であって、
（ａ）該被験体由来のサンプルをＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントと接触させるステップ、
（ｂ）該サンプル中のＦＺＤ１０タンパク質を検出するステップ、及び
（ｃ）対照と比較した場合のＦＺＤ１０タンパク質の相対存在量に基づいて、該被験体が上記疾患に罹患している又は該疾患を発症するリスクがあるか否かを判断するステップ、
を含む方法を提供する。
【００１３】
「ＦＺＤ１０に関連する疾患（ＦＺＤ１０関連疾患）」とは、ＦＺＤ１０タンパク質の過剰発現に関連する疾患を意味する。そのような疾患としては、限定されるものではないが、滑膜肉腫（ＳＳ）、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。本発明の方法において使用する抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうる。抗体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチド、特に配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも４３〜５６番、６１〜７２番、１５６〜１６９番、１５７〜１７０番、１５７〜１７２番、１６１〜１７３番、１７４〜１９１番、１８９〜２０２番、２１４〜２２５番、又は１〜２２５番のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されていることが好ましい。
【００１４】
またさらに、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメント、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物を提供する。
【００１５】
さらにまた、本発明は、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントを含む、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を診断又は予後診断するためのキットを提供する。
【００１６】
本発明はまた、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を診断又は予後診断するためのキットの製造における、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントの使用を提供する。
【００１７】
そしてさらに、本発明は、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防するための組成物の製造における、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントの使用を提供する。
【００１８】
４．図面の簡単な説明
図１Ａは、正常ヒト成人組織（心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、膵臓、骨髄及び胎盤）、ＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）並びにＳＳ外科標本（ＳＳ４８７及びＳＳ５８２）におけるＦＺＤ１０のノーザンブロット分析を示す写真である。
【００１９】
図１Ｂは、結腸癌細胞系（ＬｏＶｏ、ＨＴ２９及びＳＷ４８０）並びにＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１、ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）におけるＦＺＤ１０のノーザンブロット分析を示す写真である。
【００２０】
図２Ａ及び２Ｂは、ＦＺＤ１０のＮ末端細胞外ドメイン（ＦＺＤ１０−ＥＣＤ）を認識した、アフィニティ精製したＦＺＤ１０−ＥＣＤ抗体（ＴＴ６４１ ｐＡｂ）の特異性を示す写真である。
【００２１】
図２Ａは、いくつかの腫瘍細胞系、すなわちＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）、結腸癌細胞系（ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＤＬＤ１、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＳＮＵ−Ｃ４及びＳＮＵ−Ｃ５）、子宮頸部腺癌細胞系（ＨｅＬａ）、並びに繊維肉腫細胞系（ＨＴ１０８０）におけるＦＺＤ１０のウエスタンブロット分析を示す写真である。βアクチン発現をローディング対照として用いた。
【００２２】
図２Ｂは、図２Ａで調べたものと同じ腫瘍細胞系におけるＦＺＤ遺伝子ファミリーの半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す写真である。β２ミクログロブリン遺伝子（β２ＭＧ）の発現を内部対照とした。ＦＺＤファミリーメンバーは、ＦＺＤ１０−ＥＣＤに対するアミノ酸配列の相同性の順に配置した。ＦＺＤ９がＦＺＤ１０−ＥＣＤに対して最も高い相同性を有した。
【００２３】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、免疫細胞化学分析によるＦＺＤ１０タンパク質の細胞内局在化を示す写真である。
【００２４】
図３Ａは、ＦＺＤ１０を安定に過剰発現するＣＯＳ７−ＦＺＤ１０細胞の確立を示すウエスタンブロットを示す写真である。Ｓ５、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ３及びＳ１１はＣＯＳ７−ＦＺＤ１０安定トランスフェクト細胞の代表例であり、細胞外に発現される産物は、ＳＳ細胞系であるＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳにおいて発現される内因性ＦＺＤ１０と同じサイズであった。
【００２５】
図３Ｂは、抗ｍｙｃ抗体及びＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫細胞化学染色を示す写真である。左側のパネルは、テキサスレッド結合抗ｍｙｃにより免疫染色された細胞を示す。中央のパネルは、ＴＴ６４１ ｐＡｂ（Alexa Flour 488）で処理した同じ細胞を示し、両方のシグナルを黄色シグナルとして二色画像において重ねている（右側のパネル）。
【００２６】
図３Ｃは、ＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）における内因性ＦＺＤ１０の検出についての、ＴＴ６４１ ｐＡｂによる免疫細胞化学染色を示す写真である。
【００２７】
図４は、いくつかの腫瘍細胞系におけるＴＴ６４１ ｐＡｂを用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。実線はＴＴ６４１ ｐＡｂにより検出されたＦＺＤ１０（細胞表面抗原）の発現レベルを示し、破線は陰性対照として非免疫ウサギＩｇＧと共にインキュベートした細胞のシグナルを表す。
【００２８】
図５は、重複する合成線状ペプチドを用いたＴＴ６４１ ｐＡｂのエピトープマッピングを示す写真である。１アミノ酸が重複し、ＦＺＤ１０−ＥＣＤの全長アミノ酸に対して作製した一連の１０残基のペプチドを含む膜を、ＴＴ６４１ ｐＡｂと反応させ、その結合を、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて検出した。太字は、ＦＺＤ１０−ＥＣＤの可能性あるコアエピトープを示す。
【００２９】
図６Ａ〜６Ｏは、正常ヒト成人組織、ＳＳ腫瘍組織、原発性結腸癌、及び結腸癌の転移肝臓病変における、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫組織化学分析を示す写真である。これらの図において、Ａ＝胎盤、Ｂ＝脳、Ｃ＝心臓、Ｄ＝肺、Ｅ＝肝臓、Ｆ及びＧ＝異なる個体由来の腎臓、Ｈ及びＩ＝同じ個体由来の胃、Ｊ＝結腸、Ｋ及びＬ＝同じ二相ＳＳ標本のＳＳ腫瘍細胞、Ｍ、Ｎ及びＯ＝原発性結腸癌及び同じ患者の転移肝臓病変である。元の倍率は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＭ＝１００倍、Ｈ及びＮ＝４０倍、Ｌ及びＯ＝２００倍である。
【００３０】
図７Ａは、ＦＺＤ１０過剰発現細胞に対するＴＴ６４１ ｐＡｂが媒介するＡＤＣＣを示すグラフである。細胞傷害性は、細胞溶解時の放出乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の定量測定によりアッセイした。ここで、ターゲット細胞及びエフェクター細胞は、Ｅ：Ｔ比２５：１で７μｇ／ｍｌのＴＴ６４１ ｐＡｂと共に同時インキュベートした。この図において、Ｔ＝ターゲット細胞（ＳＹＯ−１）、Ｅ＝エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）、Ｔｓｐｏｎ＝ターゲット細胞からの自発性ＬＤＨ放出、Ｅｓｐｏｎ＝エフェクター細胞からの自発的ＬＤＨ放出、Ａｂ＝ＴＴ６４１ ｐＡｂ。
【００３１】
図７Ｂは、ＦＺＤ１０過剰発現細胞に対するＴＴ６４１ ｐＡｂが媒介するＡＤＣＣを示すグラフである。いくつかのＥ：Ｔ比におけるＦＺＤ１０過剰発現細胞に対する細胞媒介性細胞傷害は、培地に添加したＴＴ６４１ ｐＡｂの量との正の相関を示す。
【００３２】
図８は、ＴＴ６４１ ｐＡｂがＳＳ異種移植片に対して増殖抑制作用を発揮したことを示すグラフである。腫瘍増殖は、ＴＴ６４１ ｐＡｂで処置した実験群（ｎ＝１６）（黒丸）と非免疫ウサギＩｇＧで処置した対照群（ｎ＝１６）（白丸）において処置開始日に計算した腫瘍体積に対する、所定の日における腫瘍体積の比率として評価した。処置は、連続する５日間（第０〜４日）にわたり継続した。データは、平均＋ＳＤで表す。
【００３３】
図９Ａ〜９Ｌは、ＴＵＮＥＬ分析及びＫｉ−６７についての免疫組織化学染色を示す写真である。処置終了の２日後に、腫瘍を摘出し、１０％ホルムアルデヒドで固定した。ＴＵＮＥＬ分析及びＫｉ−６７についての免疫組織化学染色は、細胞増殖能の信頼性ある指標であるため、これを非免疫ウサギ抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ、Ｈ及びＩ）並びにＴＴ６４１ ｐＡｂ（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｊ、Ｋ及びＬ）で処置した腫瘍からのパラフィン包埋検体の連続切片に対して実施した。この図では、Ａ、Ｄ、Ｇ及びＪ＝ＨＥ染色、Ｂ、Ｅ、Ｈ及びＫ＝Ｋｉ−６７についての免疫染色、Ｃ、Ｆ、Ｉ及びＬ＝ＴＵＮＥＬ分析である。元の倍率は、Ａ〜Ｆ＝４０倍、Ｇ〜Ｌ＝２００倍、Ｌの差込図＝４００倍である。
【００３４】
図１０Ａは、８種の正常マウス組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓又は精巣）におけるＦＺＤ１０のノーザンブロット分析により検出された正常マウス組織中のマウスＦＺＤ１０の発現を示す写真である。βアクチンの発現をローディング対照として用いた。
【００３５】
図１０Ｂ〜１０Ｅは、正常マウスの腎臓（Ｂ）、胎盤（Ｃ）、肺（Ｄ）及び脳（Ｅ）組織における、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫細胞化学染色を示す写真である。
【００３６】
図１１Ａ〜１１Ｅは、ＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１及びＹａＦｕＳＳ；上のパネル）、ならびに結腸癌細胞系（ＳＷ４８０及びＨＴ２９;下のパネル）における、抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂである１Ｆ２（Ａ）、１Ｆ４（Ｂ）、５Ｆ２（Ｃ）、５Ｈ４（Ｄ）及び６Ｃ９（Ｅ）を用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。灰色の線は、各ｍＡｂにより検出された細胞表面抗原ＦＺＤ１０の発現を示し、黒色の線は、陰性対照として非免疫ウサギＩｇＧと共にインキュベートした細胞の蛍光シグナルを示す。
【００３７】
図１２は、重複する合成線状ペプチドを用いて行った、ｍＡｂ １Ｆ２、５Ｆ２、５Ｈ４及び６Ｃ９のエピトープマッピングを示す写真である。
【００３８】
図１３は、ＳＳ異種移植片に対するｍＡｂ ５Ｆ２の増殖抑制作用を示すグラフである。腫瘍増殖は、ｍＡｂ（５Ｆ２）で処置した実験群（５Ｆ２、ｎ＝５）（白丸）と非免疫ウサギＩｇＧで処置した対照群（ｎ＝６）（黒丸）において処置開始日に計算した腫瘍体積に対する、所定の日における腫瘍体積の比率として評価した。処置は、連続する１０日間（第０〜９日、矢印）にわたり継続した。データは、平均＋ＳＤで表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
５．発明の詳細な説明及び好ましい実施形態
本発明は、被験体においてＦｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患（ＦＺＤ１０関連疾患）を治療及び／又は予防する方法、並びに該疾患を診断及び／又は予後診断する方法に関する。これらの方法に有用な組成物もまた本発明の範囲内に包含される。
【００４０】
本発明は、以下に説明するように、ＦＺＤ１０に対する特異的なポリクローナル抗体（ＴＴ６４１ ｐＡｂ）及びＦＺＤ１０に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、ＦＺＤ１０を過剰発現するＳＳ細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の媒介、及びＳＳ異種移植片の増殖の抑制に有効であるという知見に基づいている。また、本発明は、ＦＺＤ１０が滑膜肉腫を含む特定の腫瘍において特異的に発現され、これらの腫瘍がＦＺＤ１０に対する特異的抗体を用いて検出可能であるという知見に基づいている。
【００４１】
５．１  抗体の作製
本発明において使用可能な抗体は、ＦＺＤ１０関連疾患に由来するＦＺＤ１０タンパク質と特異的に反応するものである。本明細書において「抗体」という用語は、抗原であるタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントなど）を意味する。抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいし、さらにはヒト化又はキメラ抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体などであってもよい。本発明において使用するための、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は例えば以下の手法により作製することができる。
【００４２】
５．１．１  免疫原（抗原）
本発明において使用可能な抗体を作製するにあたり、免疫原（抗原）として使用するタンパク質を調製する。免疫原タンパク質としては、ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドを用いる。本発明において免疫原として使用可能なＦＺＤ１０タンパク質のアミノ酸配列及び該タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋにそれぞれアクセッション番号ＢＡＡ８４０９３（配列番号１）及びＡＢ０２７４６４（配列番号２）として公開されている。従って、公開されているアミノ酸配列情報を利用して、当技術分野で公知の手法、例えば固相ペプチド合成法などにより、免疫原として使用するためのＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドを合成することができる。ここで、ＦＺＤ１０タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、ＦＺＤ１０タンパク質のＮ末端細胞外ドメイン（ＦＺＤ１０−ＥＣＤ）に相当する、配列番号１に示されるアミノ酸配列のアミノ酸残基１〜２２５を含むペプチドが挙げられる。また、例えばＦＺＤ１０タンパク質（配列番号１）の４３〜５６番、６１〜７２番、１５６〜１６９番、１５７〜１７０番、１５７〜１７２番、１６１〜１７３番、１７４〜１９１番、１８９〜２０２番、又は２１４〜２２５番のアミノ酸残基、あるいはこれらの部分配列うち少なくとも５残基、好ましくは６〜１０残基を含むペプチドも免疫原として使用することが可能である。本発明においては特に、ＦＺＤ１０タンパク質（配列番号１）の２１４〜２２５番のアミノ酸残基を含むペプチドを免疫原として使用することが好ましい。
【００４３】
また、公知の遺伝子組換え手法を利用して、ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドをコードするｃＤＮＡの配列情報を用いて当該タンパク質又はその部分ペプチドを生産することも可能である。以下、遺伝子組換え手法を用いたタンパク質又はその部分ペプチドの生産に関して説明する。
【００４４】
タンパク質生産用組換えベクターは、上記ｃＤＮＡ配列を適当なベクターに連結することにより得ることができ、形質転換体は、タンパク質生産用組換えベクターを、標的ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドが発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。
【００４５】
ベクターとしては、宿主において自律複製するファージ又はプラスミドを使用する。プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌（Escherichia coli）由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２８、ｐＧＥＸ４Ｔ、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、及び他のプラスミドＤＮＡ）、枯草菌（Bacillus subtilis）由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、及び他のプラスミドＤＮＡ）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０、及び他のプラスミドＤＮＡ）などが挙げられる。ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルスベクター及びワクシニアウイルスベクターなどの動物ウイルスベクターを用いることもできるし、バキュロウイルスベクターなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００４６】
例えば以下の方法により、ベクターにＦＺＤ１０又はその部分ペプチドをコードするＤＮＡ（以下、ＦＺＤ１０ ＤＮＡともいう）を挿入する。この方法では、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する。
【００４７】
その他、哺乳動物細胞において用いられるタンパク質生産用組換えベクターには、プロモーター、ＦＺＤ１０ ＤＮＡのほか、所望によりエンハンサー及び他のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）などが連結されていてもよい。
【００４８】
ＤＮＡ断片とベクター断片とを連結させるには、公知のＤＮＡリガーゼを用いる。そして、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリングさせた後連結させ、タンパク質生産用組換えベクターを作製する。
【００４９】
形質転換に使用する宿主としては、ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、宿主としては、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母（Saccharomyces cerevisiae等）、動物細胞（ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００５０】
一例として、細菌を宿主として用いる場合は、タンパク質生産用組換えベクターが該宿主細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合部位、ＦＺＤ１０ ＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、組換えベクターは、プロモーターを制御する遺伝子を含んでもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＢＲＬなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。
【００５１】
細菌宿主への組換えベクターの導入は、当技術分野で公知の任意の方法により行うことができる。そのような方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５２】
酵母、動物細胞、昆虫細胞などを宿主として用いる場合には、同様に、当技術分野で公知の手法に従って形質転換体を作製し、ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドを宿主（形質転換体）において生産することができる。
【００５３】
本発明において免疫原として使用するＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドは、上記作製した形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体のホモジェネートのいずれをも意味するものである。上記形質転換体を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００５４】
大腸菌、酵母菌又は他の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類及び他の成分を含有し、形質転換体が効率的に増殖できる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
【００５５】
形質転換体の培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２５〜３７℃で３〜６時間行う。培養期間中、ｐＨは中性付近に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は、必要に応じて、組換え発現ベクターに挿入した選択マーカーに応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００５６】
培養後、ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞をホモジナイズすることによりタンパク質又はその部分ペプチドを抽出する。また、ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により培地から菌体又は細胞の破砕物を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中からＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドを単離精製することができる。
【００５７】
ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドが得られたか否かは、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。
【００５８】
次に、得られたＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドをバッファーに溶解して免疫原を調製する。なお、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバントを添加してもよい。アジュバントとしては、市販の完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等が挙げられる。これらのアジュバントは、単独で又は混合して用いることができる。
【００５９】
５．１．２  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を作製する場合は、セクション４．１．１のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。必要に応じて完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等のアジュバントを用いることもできる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜７回の免疫を行う。その後、最終の免疫日から１〜７日後に、酵素免疫測定法（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００６０】
５．１．３  モノクローナル抗体
セクション５．１．１のようにして作製した免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。必要に応じて完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）等のアジュバントを用いることもできる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜３回の免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜７日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等が挙げられる。
【００６１】
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合を行う。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばＰ３Ｘ６３−Ａｇ．８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、ＮＳ−Ｉなどのマウスミエローマ細胞株が挙げられる。
【００６２】
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤（例えばポリエチレングリコール等）の存在のもとで融合反応を行う。また、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて細胞融合させることもできる。
【００６３】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。例えば、細胞懸濁液をウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上にまく。各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して細胞培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、３０日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
【００６４】
次に、増殖してきたハイブリドーマの培養上清を、ＦＺＤ１０タンパク質又はその部分ペプチドに反応する抗体が存在するか否かについてスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等を採用することができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。
【００６５】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００６６】
本発明において使用可能なモノクローナル抗体のグロブリンタイプは、ＦＺＤ１０タンパク質との特異的結合活性を有するものである限り特に限定されるものではなく、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤのいずれでもよいが、ＩｇＧ及びＩｇＭが好ましい。
【００６７】
組換えＦＺＤ１０タンパク質に対して誘起されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンであるマウス−マウスハイブリドーマ５Ｆ２ ＴＫ１０Ｐ２は、２００４年２月１８日付で独立行政法人産業技術総合研究所  ＩＰＯＤ国際特許生物寄託センター（ＡＩＳＴ、３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１−１、つくば中央６）に国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２８が付与されている。本発明においてはこのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を使用することが好ましい。しかしながら、本発明において使用可能な抗体は上記モノクローナル抗体に限定されるものではない。
【００６８】
５．１．４  他の抗体
さらに、「キメラ抗体」の作製について開発されている技術（Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314: 452-454）を使用してもよい。これらの技術では、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子からの遺伝子を適当な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングする。キメラ抗体は、異なる動物種に由来する異なる部分が存在する分子であり、例えばマウスｍＡｂ由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体、例えば「ヒト化抗体」がある。
【００６９】
あるいは、一本鎖抗体の作製について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546）を採用して、ＦＺＤ１０タンパク質又はそのペプチドに対する一本鎖抗体を作製することも可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成される。大腸菌における機能性Ｆｖフラグメントの構築に関する技術もまた用いることが可能である（Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041）。
【００７０】
５．１．５  抗体フラグメント
目的のタンパク質の一部（エピトープ）を特異的に認識する抗体フラグメントは、公知の技法により作製することができる。例えば、そのようなフラグメントとしては、限定されるものではないが、抗体分子のペプシン消化により作製しうるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより作製しうるＦａｂフラグメントが挙げられる。
【００７１】
あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを構築し（Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281）、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速かつ簡便に同定することも可能である。
【００７２】
５．２  治療用途
以下に、本発明の抗体を用いた、ＦＺＤ１０関連疾患を治療及び／又は予防するための方法及び医薬組成物について説明する。治療の成果は、処置した被験体に少なくとも健康に良い効果をもたらすことであり、腫瘍の場合には、限定されるものではないが、腫瘍の寛解、腫瘍の症状の軽減、及び腫瘍の転移速度の制御などをもたらすことである。
【００７３】
具体的には、本発明に係る、被験体におけるＦＺＤ１０関連疾患の治療及び／又は予防方法は、その必要のある被験体に、上述の抗体又はフラグメント（セクション５．１参照）を投与することを含む。
【００７４】
本明細書において「被験体」という用語は、ＦＺＤ１０関連疾患を罹患している被験体、またＦＺＤ１０関連疾患を有することが疑われる被験体を意味する。本発明において被験体は、哺乳動物及び鳥類動物を含む動物でありうる。例えば、哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ及びイヌが挙げられる。
【００７５】
本明細書において「ＦＺＤ１０関連疾患」という用語は、ＦＺＤ１０タンパク質の過剰発現に関連する疾患を意味する。具体的には、ＦＺＤ１０関連疾患としては、限定されるものではないが、滑膜肉腫（ＳＳ）、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）が挙げられる。
【００７６】
５．２．１  医薬組成物
本明細書に記載の抗体は、ＦＺＤ１０関連疾患を治療又は予防するために有効な量で被験体に投与することができる。有効量とは、治療対象の被験体に健康に良い効果をもたらすのに十分な抗体の量を意味する。医薬組成物が本発明の抗体を含む場合に採用しうる製剤及び投与方法を以下に記載する。
【００７７】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、１以上の薬学的に許容される担体又は賦形剤を用いて慣用的に製剤化することができる。
【００７８】
抗体は、注射、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与（すなわち静脈内又は筋肉内投与）用に製剤化しうる。注射用製剤は、保存剤を添加して、例えばアンプル又は複数回投与容器中の単位投与剤形として提供することができる。組成物は、懸濁剤、溶剤、又は油性若しくは水性ビヒクル中の乳剤のような剤形をとることができ、懸濁化剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤用薬剤を含みうる。あるいは、抗体は、好適なビヒクル、例えば発熱物質不含の滅菌水などで使用前に再構成するための凍結乾燥粉剤としてもよい。
５．２．２  用量及び投与経路
本発明の抗体の毒性及び治療効力は、例えばＬＤ５０（集団の５０％が致死となる量）及びＥＤ５０（集団の５０％に対して治療上有効な量）を決定するため、標準的な医薬の手順により、細胞培養物又は実験動物において決定することができる。毒性作用を示す用量と治療効果を示す用量の比は治療インデックスであり、比ＬＤ／ＥＤとして表すことができる。
【００７９】
治療インデックスが高い抗体が好ましい。毒性の副作用を示す抗体を用いる場合には、かかる抗体が罹患組織の部位に標的化するような送達系を設計して、非罹患細胞が受ける可能性のある損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減することに注意すべきである。
【００８０】
細胞培養アッセイ及び動物試験から得られたデータを用いて、ヒトにおける使用のための用量範囲を決定しうる。そのような抗体の投与量は、ほとんど又は全く毒性のないＥＤ５０を含む循環血漿濃度の範囲内であることが好ましい。投与量は、この範囲内で、使用する投与剤形、及び採用する投与経路に応じて異なる。本発明の方法において用いる抗体については、まず細胞培養アッセイから有効量を推定しうる。細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、症状の最大半分の抑制を達成する試験抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように、動物モデルにおいて決定しうる。このような情報は、ヒトにおける有効量をより詳細に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定することができる。
【００８１】
被験体の症状及び年齢、並びに／又は投与経路に応じて、当業者であれば、本発明の医薬組成物の適切な用量を選択することができる。例えば、本発明の医薬組成物は、本発明の抗体を１日に被験体の体重１ｋｇ当たり約３〜約１５μｇ、好ましくは被験者の体重１ｋｇ当たり約１０〜約１５μｇの量を投与できるような量で投与される。投与間隔及び投与期間は、被験体の症状及び年齢、投与経路、並びに医薬組成物に対する応答を考慮して選択しうる。例えば、医薬組成物は、１〜５回、好ましくは５〜１０日にわたり１日１回投与することができる。
【００８２】
医薬組成物は、全身投与又は局所投与することができ、好ましくは、標的送達手段を用いて、有効成分が罹患部位に送達されるようにしてもよい。
【００８３】
５．２．３  併用療法
特定の実施形態において、本発明の方法及び組成物は、化学療法剤、例えば限定されるものではないが、メトトレキセート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセル及びドセタキセルなどの化学療法剤の１つ又はその組み合わせと共に、ＦＺＤ１０関連疾患の治療又は予防に用いる。
【００８４】
放射線療法に関して、治療対象のＦＺＤ１０関連疾患の種類に応じて、任意の放射線療法プロトコールを用いることができる。例えば限定されるものではないが、Ｘ線照射を実施しうる。γ線が放射する放射性同位体、例えばラジウム、コバルト及び他の元素の放射性同位体などを組織に照射してもよい。
【００８５】
別の実施形態において、化学療法又は放射線療法は、本発明の抗体を含む方法及び組成物を用いた後、好ましくは少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月、より好ましくは数ヶ月（例えば最大３ヶ月）にわたり実施しうる。化学療法又は放射線療法は、本発明の方法及び組成物を用いた処置の前、処置と同時、又は処置の後に実施することができ、当技術分野で公知の任意の方法により実施することができる。
【００８６】
５．３  診断及び予後診断用途
また、セクション５．１．２に記載のＦＺＤ１０タンパク質又はそのペプチド断片に対する抗体は、本明細書に記載のように、診断薬及び予後診断薬として用いることができる。そのような診断方法は、ＦＺＤ１０関連疾患の有無、及び該疾患を患うリスクを検出するために用いうる。本発明のＦＺＤ１０関連疾患の診断及び／又は予後診断方法は、サンプル中の疾患に由来するＦＺＤ１０タンパク質を、本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて、免疫学的に検出又は測定することを含む。具体的には、本発明に係る、被験体におけるＦＺＤ１０関連疾患又は該疾患を発症する素因を診断又は予後診断する方法は、
（ａ）該被験体由来のサンプルをＦＺＤ１０タンパク質に対する抗体又はそのフラグメントと接触させるステップ、
（ｂ）該サンプル中のＦＺＤ１０タンパク質を検出するステップ、及び
（ｃ）対照と比較した場合のＦＺＤ１０タンパク質の相対存在量に基づいて、該被験体が上記疾患に罹患している又は該疾患を発症するリスクがあるか否かを判断するステップ、
を含む。
【００８７】
本発明の診断及び／又は予後判定方法は、抗体を用いる測定法、すなわち免疫学的アッセイであれば任意の方法に基づいて実施することができる。本発明の抗体又はそのフラグメントをそのアッセイで使用される抗体として用いてＦＺＤ１０タンパク質を検出することができる。例えば、このＦＺＤ１０タンパク質の検出は、免疫組織化学的染色法、イムノアッセイ（酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ）、蛍光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及びウエスタンブロット法等）などを利用して実施される。
【００８８】
本発明のＦＺＤ１０関連疾患の診断及び／又は予後判定方法において被検対象となるサンプルとしては、ＦＺＤ１０関連疾患に由来するＦＺＤ１０タンパク質が含まれる可能性のある生体サンプルであれば特に限定されるものではない。例えば、そのようなサンプルとしては、血液、血清、血漿、リンパ球培養上清、尿、髄液、唾液、汗、腹水などが挙げられる。特に腫瘍組織、腫瘍生検及び転移組織のようなサンプルにおいて、本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて得られたＦＺＤ１０タンパク質の測定値は、ＦＺＤ１０関連疾患の指標として有用である。
【００８９】
例えば、セクション５．１に記載されるような、本発明の抗体又はそのフラグメントを用いて、ＦＺＤ１０タンパク質を定量的又は定性的に検出しうる。本発明の抗体（又はそのフラグメント）はさらに、例えば免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡のように、ＦＺＤ１０タンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために、組織学的に用いてもよい。ｉｎ ｓｉｔｕ検出は、被験体から組織学的サンプルを切除し（組織のパラフィン包埋切片など）、それに本発明の標識化抗体をアプライすることにより実施しうる。抗体（又はそのフラグメント）は、サンプルに標識化抗体（又はそのフラグメント）を積層することによってアプライすることが好ましい。当業者であれば、本発明を用いて広範囲の多様な組織学的方法（染色手法など）に変更を行って、そのようなｉｎ ｓｉｔｕ検出を実施しうることは容易に理解できるだろう。
【００９０】
ＦＺＤ１０タンパク質についてのイムノアッセイは、典型的には、試験対象の被験体に由来するサンプル（例えば生体液、組織抽出物、新たに採取した細胞、又は細胞培養においてインキュベートしておいた細胞の溶解物など）を、本発明の検出可能に標識した抗体の存在下でインキュベートし、当技術分野で周知のいくつかの手法のいずれかにより結合した抗体を検出することを含む。
【００９１】
サンプルは、固相支持体又は担体（ニトロセルロース、又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定することができる他の固体支持体など）と接触させてもよいし、あるいはその上に固定してもよい。続いて支持体を適当なバッファーで洗浄し、ＦＺＤ１０に対する検出可能に標識した抗体を用いて処理する。次に固相支持体にバッファーを用いた２回目の洗浄を行って、未結合の抗体を除去する。そして固体支持体上の結合した標識の量を、慣用的な手段により検出する。
【００９２】
「固相支持体又は担体」という用語は、抗原又は抗体と結合可能な任意の支持体を意味する。当業者であれば、抗体または抗原と結合させるための多くの好適な担体を認識しているか、又は通常の実験を用いてそれを確認することができる。
【００９３】
所定の抗ＦＺＤ１０抗体の結合活性は、周知の方法に従って測定しうる。当業者であれば、通常の実験を用いることにより、各測定についての有効かつ最適なアッセイ条件を決定することができる。
【００９４】
本発明においては、本発明の抗体（又はそのフラグメント）と、サンプル中のＦＺＤ１０関連疾患の罹患部位に由来するＦＺＤ１０タンパク質との反応を容易に検出するために、本発明の抗体を標識することにより該反応を直接検出するか、又は標識二次抗体を用いることにより間接的に検出する。本発明の方法においては、良好な感度のため、後者の間接的検出（例えばサンドイッチアッセイ、ＥＬＩＳＡの結合アッセイなど）を利用することが好ましい。
【００９５】
本発明で使用するための標識の例としては以下のものが挙げられる。すなわち、酵素イムノアッセイの場合には、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アミラーゼ及びビオチン−アビジン複合体等を用いることができる。蛍光イムノアッセイの場合には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、置換ローダミンイソチオシアネート、ジクロロトリアジンイソチオシアネート等を用いることができる。ラジオイムノアッセイの場合には、トリチウム、ヨウ素１２５及びヨウ素１３１等を用いることができる。また、発光イムノアッセイでは、ＮＡＤＨ−ＦＭＮＨ２−ルシフェラーゼアッセイ、ルミノール−過酸化水素−ＰＯＤ系、アクリジニウムエステル系及びジオキセタン化合物系等を用いることができる。
【００９６】
標識は、慣用の手法により抗体と結合させることができる。例えば、標識は、酵素イムノアッセイの場合にはグルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法又は過ヨウ素酸法等の公知の方法により、ラジオイムノアッセイの場合にはクロラミンＴ法、ボルトンハンター法等の公知の方法により、抗体に結合させることができる。
【００９７】
アッセイの操作法は、公知の方法（Ausubel, F.M.ら編, Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 11 "immunology" John Wiley & Sons, Inc. 1995）により行うことができる。
【００９８】
例えば、本発明の抗体を上記のように標識で直接標識する場合には、サンプルを標識した本発明の抗体と接触させて、ＦＺＤ１０タンパク質−抗体の複合体を形成させる。そして未結合の標識抗体を分離して、結合標識抗体量又は未結合標識抗体量よりサンプル中のＦＺＤ１０タンパク質量を測定することができる。
【００９９】
また例えば、標識二次抗体を用いる場合には、本発明の抗体とサンプルとを反応させ（１次反応）、得られた複合体をさらに標識二次抗体を反応させる（２次反応）。１次反応と２次反応は逆の順序で行ってもよいし、同時に行ってもよいし、又は時間をずらして行ってもよい。１次反応及び２次反応により、ＦＺＤ１０タンパク質−本発明の抗体−標識二次抗体の複合体、又は本発明の抗体−ＦＺＤ１０タンパク質−標識二次抗体の複合体が形成される。そして未結合の標識二次抗体を分離して、結合標識二次抗体量又は未結合標識二次抗体量よりサンプル中のＦＺＤ１０タンパク質量を測定することができる。
【０１００】
以下に、本発明の好ましい実施態様の一例を示す。最初に、本発明の抗体を一次抗体としてサンプル（組織切片など）と接触させる。続いて、公知のブロッキング試薬を用いてこの一次抗体の非特異的結合をブロッキングする。次いで、サンプルをＦＺＤ１０タンパク質と異なる部位で一次抗体（本発明の抗体）と反応する標識二次抗体とを接触させ、該標識からのシグナルを検出する。
【０１０１】
本明細書で用いる「ＦＺＤ１０タンパク質と異なる部位で一次抗体と反応する二次抗体」は、一次抗体とＦＺＤ１０タンパク質との結合部位以外の部位を認識する抗体であれば特に制限はない。二次抗体は、上述したように、ポリクローナル抗体、抗血清、モノクローナル抗体のいずれでもよく、またこれらの抗体のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’等）を用いることもできる。更に、二次抗体として複数種の抗体の混合物を用いてもよい。
【０１０２】
以上のようにして、被験体に由来するサンプル中のＦＺＤ１０タンパク質レベルを測定し、必要であれば正常サンプル又はＦＺＤタンパク質が発現しないことが知られている組織サンプル中のタンパク質量と比較し、該ＦＺＤ１０タンパク質レベルが増大又は低減を示す場合には、そのサンプルを採取した被験体が、ＦＺＤ１０関連疾患を患っているか、又は患うリスクがあると判定する。ＦＺＤ１０タンパク質量は各被験体の状態、性別、年齢及び他の要因によっても変動するため、正常な組織又はサンプル中のＦＺＤ１０タンパク質量と、ＦＺＤ１０タンパク質が発現しない組織におけるＦＺＤ１０タンパク質量とを比較し、それらに差があるかどうかを調べることによって、疾患の有無又はリスクを判定することもできる。また、予後診断を行う場合には、原発性腫瘍を有している被験体のサンプルを採取した時点におけるＦＺＤ１０タンパク質量と比較することも有効である。
【０１０３】
さらに別の態様においては、本発明の抗体を放射性同位体で標識し、この標識抗体を被験体に非経口投与することにより、ＦＺＤ１０関連疾患の原発性腫瘍及びそれに関連する転移性腫瘍の局在を侵襲性なく速やかに知ることができる。このような診断方法は、腫瘍イメージングとして公知であり、当業者であればそのための手法を容易に理解することができる。標識抗体の投与経路は、好ましくは非経口経路、例えば静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身又は局部的に投与することができる。
【０１０４】
５．３．１  キット
また本発明の抗体は、上述したように、ＦＺＤ１０タンパク質と特異的に反応するため、ＦＺＤ１０関連疾患の診断及び／又は予後診断用キットとして用いることができる。
【０１０５】
本発明の診断及び／又は予後診断用キットは、セクション５．１に記載した本発明の抗体を含むものである。従って、本発明の診断及び／又は予後診断用キットを用いて、ＦＺＤ１０関連疾患への罹患が疑われる被験体から採取したサンプル中に含まれるＦＺＤ１０タンパク質を検出することによって、該被験体のＦＺＤ１０関連疾患の罹患を迅速かつ簡便に判定することができる。このような免疫学的反応を利用した疾患の診断及び／又は予後診断用キットは周知であり、当業者であれば、抗体以外の適当な成分を容易に選択することができる。また本発明の診断及び／又は予後診断用キットは、イムノアッセイを行うための手法であればいずれの手法においても利用することができる。
【０１０６】
６．実施例
本発明をさらに以下の非限定的な実施例により説明する。
【実施例１】
【０１０７】
組換えタンパク質及びポリクローナル抗体
ＦＺＤ１０のＮ末端細胞外ドメイン（ＦＺＤ１０−ＥＣＤ；配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２２５番の残基）とＨｉｓタグとを融合させた組換えタンパク質を、ｐＥＴ２８発現系（Novagen, Madison, WI）を用いて大腸菌において産生させた。簡単に説明すると、タンパク質の発現は、２５℃での３時間のインキュベーションによって０．５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、その後Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（QIAGEN, Valencia, CA）を用いて製造業者の説明書にしたがって精製した。この精製された組換えタンパク質でウサギを免疫し（Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan）、その後、カップリング溶液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ８．０）中でＦＺＤ１０−ＥＣＤ組換えタンパク質を結合させたＡｆｆｉ−Ｇｅｌ１５支持体（Bio-Rad, Hercules, CA）を用いて高力価の抗血清を精製した。ゲルに結合した抗体を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）でカラムから溶出し、直後に１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中和した。アフィニティー精製されたポリクローナル抗体（以下、「ＴＴ６４１ ｐＡｂ」と称する）の性質及び特異性は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロッティングにより確認した。
【実施例２】
【０１０８】
ＦＺＤ１０の発現
（１）細胞系及び組織標本の調製
ＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２、ＹａＦｕＳＳ及びＳＹＯ−１）、結腸癌細胞系（ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ、ＤＬＤ１、ＨＴ２９、ＨＣＴ１１６、ＳＮＵ−Ｃ４及びＳＮＵ−Ｃ５）、子宮頸部腺癌細胞系（ＨｅＬａ）、繊維肉腫細胞系（ＨＴ１０８０）、並びにＣＯＳ７を、１０％ウシ胎仔血清及び１％抗生物質／抗真菌剤溶液（Sigma, St Louis, MO）を添加した適当な培地中で単層増殖させ、５％ＣＯ２含有空気中で３７℃にて維持した。腫瘍サンプルは、切除直後に液体窒素中で簡易冷凍し、ＲＮＡの調製まで−８０℃で保存した。また外科標本を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋のために慣用法で処理した。パラフィン塊を５μｍ厚の薄片に連続的に切断し、病理学的評価のためにＨＥ（ヘマトキシリン−エオシン）で染色した。分析する全てのサンプルについて京都大学医学部の倫理委員会による承認を受けた。
【０１０９】
（２）ノーザンブロット分析
上記（１）で調製した細胞系及び凍結外科標本から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて製造業者の説明書にしたがって総ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅＩ（Nippon Gene, Osaka, Japan）による処理の後、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ（Invitrogen）を用いて製造業者の説明書に従ってｍＲＮＡを単離した。各ｍＲＮＡの１μｇアリコートを、心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、骨髄、膵臓及び胎盤から単離されたヒト正常組織ポリＡ（＋）ＲＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）と共に、１％変性アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に転写した。Megaprime DNA labeling system（Amersham Bioscience）の説明書に従ってランダムプライマーα３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識ＦＺＤ１０ ｃＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄は製造業者の推奨に従って行った。ブロットは増感スクリーンを用いて−８０℃にて３日間かけてオートラジオグラフィー観察した。
【０１１０】
ノーザンブロット分析により、ＦＺＤ１０は正常ヒト成人組織の中で胎盤において最も高レベルで発現されることが明らかとなったが（図１Ａ）、これは以前の報告と一致するものである（Koike, J. et al., Biochem Biophys Res Commun. 262: 39-43., 1999）。胎盤における転写産物のレベルと比較して、ＦＺＤ１０遺伝子はＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２、ＹａＦｕＳＳ）及びＳＳ外科標本（ＳＳ４８７、ＳＳ５８２）においてさらに高レベルで発現された。これらの知見は、ＦＺＤ１０の転写がＳＳ腫瘍細胞において上昇していることを示す。
【実施例３】
【０１１１】
ＴＴ６４１ ｐＡｂによるＦＺＤ１０の細胞外ドメインの特異的認識
（１）ウエスタンブロッティング
ＦＺＤ１０のＮ末端細胞外ドメイン（ＦＺＤ１０−ＥＣＤ）を認識するポリクローナル抗体を作製した（実施例１参照）。このアフィニティ精製したＦＺＤ１０−ＥＣＤ抗体（ＴＴ６４１ ｐＡｂ）の特異性を調べるため、ウエスタンブロッティング分析を以下のように実施した：
全細胞タンパク質を完全に可溶化するため、接着細胞をＬａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（BioRad）中に回収し、音波処理で溶解させ、５分間煮沸した。各サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに導入し、ニトロセルロース膜（Amersham Bioscience）にブロットし、０．１μｇ／ｍｌのＴＴ６４１ ｐＡｂと共に４℃にて一晩インキュベートした。抗ウサギＨＲＰ結合免疫グロブリン（Amersham Bioscience）と共に１時間インキュベートした後、高感度化学発光試薬（ＥＣＬ）（Amersham Bioscience）を用いてシグナルを可視化した。タンパク質のローディング対照として、βアクチンをモノクローナル抗βアクチンＡＣ−１５（Sigma）で検出した。
【０１１２】
その結果、ＦＺＤ１０発現細胞系において、ＦＺＤ１０に相当する予想サイズの単一の６８ｋＤａバンドが明りょうに観察された（図２Ａ）。しかしながら、他のＦＺＤ遺伝子ファミリーのタンパク質のサイズはＦＺＤ１０タンパク質のサイズと類似しているため、ＴＴ６４１ ｐＡｂにより認識される単一のバンドがＦＺＤ１０に特異的であるか否かは以下のように半定量ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。
【０１１３】
（２）半定量ＲＴ−ＰＣＲ
各細胞系から調製した総ＲＮＡの３μｇアリコートを、オリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー及びSuperscript II（Invitrogen）を用いて逆転写し、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。半定量ＲＴ−ＰＣＲは、ＦＺＤファミリーの各メンバーに特異的なプライマー、又は内部対照としてβ２ミクログロブリン（β２ＭＧ）特異的プライマーを用いて行った。プライマー配列を表１に示す。
【０１１４】
【表１】
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【０１１５】
結果を図２Ｂに示す。ウエスタンブロッティング（図２Ａ）に見とめられる発現パターンを、種々の細胞系を用いたＦＺＤファミリーの１０種のメンバーの転写産物レベルと比較した（図２Ｂ）。図２Ａ及び２Ｂに示すように、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いたウエスタンブロッティングにより検出された発現パターンは、ＦＺＤファミリーの１０種のメンバーの中で半定量ＲＴ−ＰＣＲにより明らかにされたＦＺＤ１０転写産物の発現パターン、特にＨｅＬａ及びＬｏＶｏ細胞系における発現パターンときわめて類似していた。この知見は、ＴＴ６４１ ｐＡｂがＦＺＤ１０の特定のエピトープを認識するが、ＦＺＤ１０遺伝子ファミリーの他のメンバーを認識しないことを示している。
【実施例４】
【０１１６】
細胞におけるＦＺＤ１０の局在
（１）免疫細胞化学
ＦＺＤ１０タンパク質の細胞内局在を調べるために、免疫細胞化学分析を行った。最初に、ｐＣＡＧＧＳ−ＦＺＤ１０−Ｍｙｃ−Ｈｉｓの発現構築物をＣＯＳ７細胞にトランスフェクトすることにより安定にＦＺＤ１０を過剰発現するＣＯＳ７−ＦＺＤ１０細胞（Ｓ５、Ｓ９、Ｓ１０、Ｓ３及びＳ１１）を樹立した（図３Ａ）。
【０１１７】
最初に、ＦＺＤ１０ ｃＤＮＡの全長コード配列を、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（TOYOBO, Osaka, Japan）を用いてＲＴ−ＰＣＲにより増幅し、これを、ＣＡＧ（サイトメガロウイルス極初期エンハンサー・ニワトリβアクチンハイブリッド）プロモーター（Niwa, H. et al, Gene. 108: 193-9., 1991）及びネオマイシン耐性付与遺伝子を有するｐＣＡＧＧＳ哺乳動物発現ベクターの特有のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。Ｍｙｃ及びＨｉｓエピトープタグを発現ベクターのＣ末端に配置した（ｐＣＡＧＧＳ−ＦＺＤ１０−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ）。以下のフォーワード及びリバースプライマーを用いたＤＮＡ配列決定により構築物を確認した。すなわち、フォーワード5'-GTCCCCTTCTCCATCTCCAG-3'（配列番号２３）；リバース5'-TATTTGTGAGCCAGGGCATT-3'（配列番号２４）である。
【０１１８】
続いて、ＣＯＳ７細胞を６ウエルプレート当たり５×１０４細胞で接種した。２４時間後、６μｌのＦｕＧｅｎｅ６トランスフェクション試薬（Roche, Basel, Switzerland）を用いて、１５分間プレインキュベートした２μｇのｐＣＡＧＧＳ−ＦＺＤ１０−Ｍｙｃ−Ｈｉｓ混合物で細胞をトランスフェクトした。０．４ｍｇ／ｍｌのゲネチシン（Invitrogen）を含む選択培地における３週間の培養期間後、安定なトランスフェクト細胞を樹立した。
【０１１９】
ＦＺＤ１０を発現するＣＯＳ７に由来する安定なトランスフェクト細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、その後室温で１時間かけてブロッキング溶液（３％ＢＳＡ）で被覆した。細胞溶解を最小限にするため、界面活性剤による透過性処理を行わなかった。次に細胞をマウス抗ｃ−ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０、１０００倍希釈）と共に、またブロッキング溶液中のＴＴ６４１ ｐＡｂ（２μｇ／ｍｌ）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。一次抗体をヤギ抗ウサギ二次蛍光抗体（Alexa Flour 488；５００倍希釈、Molecular Probes）及びテキサスレッドと結合させたウマ抗マウス二次抗体（１０００倍希釈、Vector Laboratories, Burlingame, CA）を用いて室温にて１時間かけて染色し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で染色し、ＥＣＬＩＰＳＥ Ｅ ６００顕微鏡（Nikon, Tokyo, Japan）で可視化した。ＦＺＤ１０の内因性発現パターンを検出するため、ＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）もまた同様に２μｇ／ｍｌのＴＴ６４１ ｐＡｂを用いて蛍光免疫染色した。
【０１２０】
ＣＯＳ７−ＦＺＤ１０細胞をテキサスレッド結合抗ｍｙｃ抗体で対比染色したところ、赤色シグナルがＴＴ６４１ ｐＡｂの緑色シグナルと一致した（図３Ｂ）。これは、ＴＴ６４１ ｐＡｂのＦＺＤ１０への特異的結合を支持するものである。さらに、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫細胞化学分析によって、ＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）において観察された内因性発現パターンが、安定なトランスフェクト細胞と同様であることが明らかとなった（図３Ｃ）。推定ＦＺＤ１０タンパク質は７回膜貫通受容体であることが知られているが（Koike, J. et al., Biochem Biophys Res Commun. 262: 39-43., 1999）、ＦＺＤ１０が細胞質において点在して染色された理由は不明である。おそらく、細胞質において比較的低濃度で存在する成熟細胞表面抗原と細胞質における多量のプロセシングされていない抗原が免疫細胞化学において検出された可能性がある。
【０１２１】
（２）フローサイトメトリー分析
免疫細胞化学のセクションで生じた細胞内局在に関する疑問点を解決するため、フローサイトメトリー分析を実施した。
【０１２２】
５×１０６細胞をトリプシン処理により回収し、１．５μｇのＴＴ６４１ ｐＡｂ及び非免疫ウサギＩｇＧ（DAKO, Kyoto, Japan）と共に４℃にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄後、２μｇの蛍光抗ウサギＩｇＧ（Alexa Fluor 488, Molecular Probe）を細胞懸濁液に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した直後に、細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson, San Jose, CA）で分析した。
【０１２３】
３つのＳＳ細胞系、すなわちＹａＦｕＳＳ、ＨＳ−ＳＹ−２及びＳＹＯ−１が、ＴＴ６４１ ｐＡｂにより特異的に標識された（図４）が、ＳＷ４８０、ＨＴ２９又はＬｏＶｏ細胞系において蛍光シグナルは検出されなかった。これらの観察結果は、ノーザンブロットにおいて観察されたＦＺＤ１０の発現レベル（実施例１、図１Ｂ参照）と相関した。以上の結果から、これらの知見は、非変性及び変性条件下の両方において、ＴＴ６４１ ｐＡｂがＦＺＤ１０の細胞表面抗原を特異的に認識するが、他のＦＺＤ１０メンバーのいずれも認識しないことを示している（図２Ａ及び２Ｂ）。
【実施例５】
【０１２４】
ＴＴ６４１ ｐＡｂのエピトープマッピング
ＴＴ６４１ ｐＡｂの特異性を決定するため、最初に以下のようにＳＰＯＴｓシステムを用いてエピトープマッピングを行った。
【０１２５】
１アミノ酸が重複し、ＦＺＤ１０−ＥＣＤ（配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２２５番の残基）の全長配列に対して設計した一連の１０残基の線状ペプチドを合成し、ＳＰＯＴ合成技法（SPOTs; Sigma Genosys）によりセルロース膜に共有結合させた。製造業者の推奨に従って、２１６個のペプチドスポットを有する膜をブロッキングバッファー（Sigma）と共に室温にて８時間プレインキュベートし、ブロッキングバッファー中でＴＴ６４１ ｐＡｂと４℃で一晩かけてハイブリダイズさせた。膜を０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２．７ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄後、ブロッキングバッファー中で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗ウサギ免疫グロブリン（Amersham Bioscience）と共に室温にて２時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで３回洗浄後、３−アミノ−９−エチルカルバゾールを含むシグナル現像溶液（Sigma）を用いて可視化した。
【０１２６】
その結果、ＴＴ６４１ ｐＡｂは、ＦＺＤ１０−ＥＣＤの６種のエピトープを異なる程度で認識した（図５）。これらのうち、ＴＴ６４１ ｐＡｂは、２１４〜２２５番の残基の範囲のエピトープと最大の反応性を示した。この部分は、ＴＴ６４１ ｐＡｂのＦＺＤ１０−ＥＣＤへの特異的結合に重要な配列であると考えられる。
【実施例６】
【０１２７】
ＦＺＤ１０タンパク質の発現パターン
（１）免疫組織化学染色
ＴＴ６４１ ｐＡｂが組織切片中のＦＺＤ１０タンパク質を特異的に認識することができるかどうか調べるため、最初に、正常な成人ヒト組織及びＳＳ外科標本においてＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫組織化学分析を行った。
【０１２８】
パラフィン包埋標本の連続切片をそれぞれシラン化スライドにのせ、キシレン中で脱パラフィン処理し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に漬けて再水和した。次に切片を抗原を露出させるためにマイクロ波処理した。３％過酸化水素を用いて内因性のペルオキシダーゼ活性を抑制した後、一次抗体の非特異的結合をブロッキング試薬（DAKO）でブロックした。次にスライドをＴＴ６４１ ｐＡｂ（５μｇ／ｍｌ）と共に４℃で一晩インキュベートした。その後、ウサギＥＮＶＩＳＩＯＮポリマー試薬（DAKO）を二次抗体として添加して、室温で６０分反応させた。最後に、ペルオキシダーゼ基質である３，３’−ジアミノベンチジン四酢酸塩（DAKO）を用いて免疫反応を可視化した。切片は、ヘマトキシリンで対比染色し、段階的な濃度のアルコール中で再水和し、キシレンで清浄し、カバースライドで覆った。陰性対照は、特異的抗体を非免疫正常ウサギＩｇＧ（DAKO）で置き換えて並行して実験した。ヒト成人正常組織のパラフィン包埋スライドは、DAKO及びBioChain（Hayward, CA）から購入し、上述と同様に免疫染色を行った。
【０１２９】
胎盤におけるＦＺＤ１０の陽性染色（図６Ａ）とは対照的に、正常脳（図６Ｂ）、心臓（図６Ｃ）、肺（図６Ｄ）、又は肝臓（図６Ｅ）の５つの異なる組織切片においては、ノーザンブロットの結果（実施例２、図１Ａ参照）から予想されたように、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫染色によってＦＺＤ１０の発現は検出されなかった。しかしながら、正常腎臓においては、近位及び遠位尿細管、並びに集合尿細管（図６Ｆ）において陽性染色が観察された。しかしその染色強度は個体間において変動していた（図６Ｇ）。正常胃組織においては、胃腺の上部において強力な免疫反応が観察されたが、腺の下部に位置する細胞では免疫染色ははるかに弱かった（図６Ｈ及び６Ｉ）。正常結腸組織においても、上皮細胞は腺窩の下部においてＦＺＤ１０の弱い免疫反応を示したが、柔毛の表面では強力な染色強度が検出された（図６Ｊ）。対照的に、二相性ＳＳ標本のＳＳ腫瘍細胞における細胞質パターンにおいてＦＺＤ１０の強力な発現が観察された（図６Ｋ及び６Ｌ）。染色強度は上皮腫瘍細胞において特に強かったが、非上皮性の紡錘腫瘍細胞もわずかな免疫反応を示した。これらのデータは、ＦＺＤ１０タンパク質の発現レベルが、ＳＳ組織においては発現が増大されているのと比較して、正常な重要臓器においては検出されないか又は低いことを示唆している。さらに、原発及び転移病巣における結腸癌細胞もまた、ＴＴ６４１ ｐＡｂにより特異的に免疫染色されたが、その周囲の間質及び肝臓組織においてシグナルは検出可能ではなかった（図６Ｍ、６Ｎ及び６Ｏ）。
【実施例７】
【０１３０】
ＴＴ６４１ ｐＡｂは、ＦＺＤ１０発現ＳＳ細胞に対するＡＤＣＣを媒介する
ＴＴ６４１ ｐＡｂがＳＳ細胞に対する抗体依存性細胞媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するか否かをさらに調べるために、細胞溶解時のＳＳ細胞からのＬＤＨ放出を測定した。
【０１３１】
細胞傷害性は、細胞溶解時に放出される安定な細胞質酵素である乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射活性細胞傷害アッセイ（Promega, Madison, WI）を用いて定量測定することによりアッセイした。新鮮なエフェクター細胞を調製するため、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Amersham Bioscience）密度勾配遠心により健常ドナーのヘパリン添加末梢血から単離した。製造業者の説明書に従って、９６ウエル丸底プレートにおいて５％ＦＢＳを添加したフェノールレッド非含有ＲＰＭＩ１６４０の１００μｌ中で、エフェクター細胞（Ｅ）及びターゲット細胞（Ｔ）（５×１０３／ウエル）を種々のＥ：Ｔ比で、ＴＴ６４１ ｐＡｂ又は非免疫ウサギＩｇＧと共に、３７℃にて６時間にわたり四連で同時インキュベートした。培養上清（５０μｌ）中の放出ＬＤＨは、テトラゾリウム塩の赤色ホルマザン生成物への変換を生じるため、比色アッセイにより測定した。標準的な９６ウエルプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにおける吸光度データを採集した。バックグラウンドシグナルについてデータを補正した後、式：傷害性（％）＝１００×（実験ＬＤＨ放出−エフェクターの自発性ＬＤＨ放出−ターゲットの自発性ＬＤＨ放出）／（ターゲットの最大ＬＤＨ放出−ターゲットの自発性ＬＤＨ放出）に従って特異的な細胞傷害性の割合（％）を算出した。対照は、ターゲット細胞又はエフェクター細胞のいずれかとＴＴ６４１ ｐＡｂとのインキュベーションを含む。
【０１３２】
図７Ａに示されるように、ターゲット細胞及びエフェクター細胞を、Ｅ：Ｔ比２５：１で７μｇ／ｍｌ（０．７μｇ／ウエル）のＴＴ６４１ ｐＡｂと共に同時にインキュベートした場合、ＴＴ６４１ ｐＡｂ単独を用いた場合のターゲット細胞系（ＳＹＯ−１）（Ｔ＋Ａｂ）において細胞傷害作用は観察されず、ＴＴ６４１ ｐＡｂとヒトエフェクター細胞との細胞傷害性相互作用（Ｅ＋Ａｂ）又はターゲット細胞とヒトエフェクター細胞との細胞傷害性相互作用（Ｔ＋Ｅ）は示されなかった。一方、ターゲット細胞を抗体及びヒトエフェクター細胞と共にインキュベートした場合（Ｔ＋Ｅ＋Ａｂ）には、細胞傷害作用が観察された。ターゲット細胞を種々のＥ：Ｔ比で種々の濃度のＴＴ６４１ ｐＡｂと共にインキュベートした場合でさえ、抗体及びヒトエフェクター細胞の両方を同時に添加した場合のみで細胞傷害性が誘導された。
【０１３３】
図７Ｂに示されるように、１μｇのＴＴ６４１ ｐＡｂにより、Ｅ：Ｔ比２５：１においてＦＺＤ１０過剰発現細胞に対して７８％の細胞媒介性細胞傷害が誘導された。この細胞傷害作用は、Ｅ：Ｔ比及び添加抗体量と正に相関した。ターゲット細胞に対しては、対照抗体によって有意なＡＤＣＣは誘導されなかった。これらの結果は、ＦＺＤ１０に対するＴＴ６４１ ｐＡｂがＡＤＣＣを介したＦＺＤ１０過剰発現腫瘍に対する増殖抑制効果を示す可能性を示唆している。
【実施例８】
【０１３４】
ＳＳ異種移植片に対するＴＴ６４１ ｐＡｂの増殖抑制作用
本実施例においては、マウスにＳＹＯ−１細胞を皮下接種して、ＳＳ異種移植片に対するＴＴ６４１ ｐＡｂの増殖抑制作用を調べた。
【０１３５】
動物の操作は動物施設においてその機関のガイドラインに従って行った。６週齢の無胸腺メスマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ）を用いた。マウスは３匹の群を、１２時間の明／１２時間の暗のスケジュールで温度制御した部屋において、層流フードの下、滅菌ケージに順応させ、収容し、オートクレーブ滅菌した食物と水を自由に摂取させた。
【０１３６】
細胞移植のため、ＳＹＯ−１細胞を単層で増殖させ、トリプシン処理し、血清不含培地に再懸濁させた。最終濃度を５×１０７細胞／ｍｌに調節し、細胞懸濁液を氷上に置いた。注射部位をエタノールで消毒した後、０．１ｍｌ（５×１０６細胞）の懸濁液をヌードマウスの横腹に皮下注射した。ダイアルカリパスを用いて腫瘍を測定し、体積を式：０．５×（最大直径）×（最小直径）２を用いて決定した。一次腫瘍は４０〜７５ｍｍ３のサイズであり、動物は２つの群にランダムに分けた。１つの群（ｎ＝１６）には、１０μｇのＴＴ６４１ ｐＡｂを７５μｌのＰＢＳ中の懸濁液として、連続する５日間（第０〜４日）にわたり腫瘍内注射した。対照として、別の群（ｎ＝１５）には、非免疫ウサギＩｇＧ（DAKO）を投与した。腫瘍の増殖は、処置の最初の日に計算した腫瘍体積に対する所定の日における腫瘍体積に基づく増殖比の計算により評価した。
【０１３７】
図８に示すように、ＳＳ異種移植片の増殖は、非免疫ウサギＩｇＧによる処置と比較して、ＴＴ６４１ ｐＡｂによる処置で低減した。抗体注射の開始から６日後に、ＴＴ６４１ ｐＡｂ処置マウスにおけるＳＳ異種移植片の増殖速度は、陰性対照で観察されたものよりも有意に低減した（ｐ＝１．７１×１０−５、スチューデントのｔ検定）。
ＴＴ６４１処置による増殖低減の理由を解明するため、本発明者はＴＵＮＥＬ分析を実施した。
【０１３８】
マウスを所定の時点で犠牲にし、腫瘍を採取して１０％ホルムアルデヒドで固定した。ｉｎ ｓｉｔｕターミナルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイのため、パラフィン包埋検体の連続切片の１つをApopTag Apoptosis Detection Kit（Intergen）を用いて製造業者の説明書に従って染色した。さらに、細胞増殖能を評価するため、抗Ｋｉ−６７マウスモノクローナル抗体（ＭＩＢ−１, DAKO）を用いた免疫組織化学染色を、上記の免疫組織化学染色のセクションに記載の方法と同様に行った。
【０１３９】
ＴＴ６４１ ｐＡｂで処理した腫瘍組織の検体は、アポトーシス細胞のクラスターを示し（図９Ｆ及び９Ｌ）、これは細胞増殖マーカーであるＫｉ−６７について陰性染色（図９Ｅ及び９Ｋ）だったが、アポトーシス細胞は陰性対照の腫瘍検体においてはわずかであった（図９Ｃ及び９Ｉ）。腫瘍組織におけるアポトーシス細胞の周囲には多くの生存腫瘍細胞が存在し、Ｋｉ−６７染色に陽性であった（図９Ｅ及び９Ｋ）。ＳＳ異種移植片に対するＴＴ６４１ ｐＡｂの増殖抑制作用は、腫瘍の急激な退行には不十分であると考えられた。
【実施例９】
【０１４０】
正常マウス組織におけるマウスＦＺＤ１０の発現
ヒトＦＺＤ１０とマウスＦＺＤ１０とのアミノ酸同一性が約９３％であることが明らかとなったため、ノーザンブロット及び免疫組織化学分析により正常マウス組織を用いてＴＴ６４１ ｐＡｂがマウスＦＺＤ１０タンパク質とも交差反応するか否かを調べた。ノーザンブロット分析では、正常マウスの心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓又は精巣組織（図１０Ａ）においてバンドが検出されないことが明らかとなり、免疫組織化学分析では、マウスの腎臓（図１０Ｂ）及び胎盤（図１０Ｃ）、並びに正常なヒト組織において陽性染色が観察され、正常マウスの肺（図１０Ｄ）においては弱い免疫反応が観察されたが、脳（図１０Ｅ）では観察されなかった。
【実施例１０】
【０１４１】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製
抗ＦＺＤ１０モノクローナル抗体（ｍＡｂ １Ｆ２、１Ｆ４、５Ｆ２、５Ｈ４及び６Ｃ９）を以下のように得た。
【０１４２】
精製されたＦＺＤ１０−ＥＣＤ（配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２２５番の残基）組換えタンパク質（Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan）を用いて、３匹の６週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。１００μｇの抗原（ＦＺＤ１０−ＥＣＤ組換えタンパク質）をフロイントの完全アジュバント中に乳化し、各マウスの足底の両方に注射し、その後３日間隔で３回腹腔内注射した。１５０μｌのフロイントの完全アジュバント中の１００μｇを１回追加免疫接種した２日後に、細胞融合と限界希釈によるクローニングを以下のように行った。選択したマウスからの合計６つのリンパ節をＰ３−Ｕ１ミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマをＨＡＴ（１５％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ／ＨＡＴ／ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄＨ１）培地で選択した。融合から約２週間後、組換えＦＺＤ１０−ＥＣＤを抗原として用いて細胞上清をＥＬＩＳＡアッセイでスクリーニングした。４２個の陽性ハイブリドーマ（ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４５０＞０．１）を限界希釈により２回クローニングし、さらにＳＳ細胞系ＹａＦｕＳＳを用いてフローサイトメトリー分析により選択した。最終的に、５つの単一クローンをモノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして選択した。各クローンの重鎖アイソタイプをＥＬＩＳＡにより同定し、モノクローナル抗体濃度を免疫拡散により決定した。大量のｍＡｂを生成するため、５×１０５個のクローニングしたハイブリドーマ細胞を、ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹水に投与した。投与の１０日〜２週間後、腹水を採取しプールした。
【０１４３】
組換えＦＺＤ１０タンパク質に対して誘起されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンであるマウス−マウスハイブリドーマ５Ｆ２ ＴＫ１０Ｐ２は、独立行政法人産業技術総合研究所（ＡＩＳＴ；３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１−１つくば中央６）のＩＰＯＤ国際特許生物寄託センターに、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６２８として２００４年２月１８日に国際寄託されている。
【実施例１１】
【０１４４】
抗ＦＺＤ１０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性
（１）ＦＺＤ１０タンパク質の特異性
本発明者は最初に、ＦＺＤ１０転写産物の高発現を示したＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１及びＹａＦｕＳＳ）、ほとんど発現が検出されなかった結腸癌細胞系（ＳＷ４８０及びＨＴ２９）を用いたフローサイトメトリー分析により実施例１０で得られたｍＡｂの特異性を調べた。これらのｍＡｂは全て、ＳＹＯ−１又はＹａＦｕＳＳにおける表面抗原としてのＦＺＤ１０タンパク質を特異的に認識することができたが、ＳＷ４８０又はＨＴ２９においては蛍光シグナルが検出されなかった（図１１Ａ（１Ｆ２）、１１Ｂ（１Ｆ４）、１１Ｃ（５Ｆ２）、１１Ｄ（５Ｈ４）、１１Ｅ（６Ｃ９））。これらの結果は、実施例４で記載したＴＴ６４１ ｐＡｂを用いて得られた結果と一致している。これらをまとめて検討すると、これらの結果は、抗ＦＺＤ１０ｍＡｂがまた未変性条件下にてＦＺＤ１０の細胞外ドメインを特異的に認識することを示す。
【０１４５】
（２）エピトープマッピング
各ｍＡｂの特異性をさらに特性決定するため、実施例５と同様にエピトープマッピングを実施した。
【０１４６】
１アミノ酸が重複し、ＦＺＤ１０−ＥＣＤの全長配列に対して設計した一連の１０残基の合成線状ペプチドを、実施例５に記載のように、セルロース膜に共有結合させた（SPOTs; Sigma Genosys, Woodlands, Texas）。２１６個のペプチドスポットを有する膜を抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂ（１Ｆ２、５Ｆ２、５Ｈ４及び６Ｃ９）と４℃で一晩かけてハイブリダイズさせた。ＨＲＰ結合抗ウサギＩｇＧ（Amersham Bioscience, Piscataway, New Jersey）と共にインキュベートした後、スポットを３−アミノ−９−エチルカルバゾールを用いて可視化した。
【０１４７】
その結果、ｍＡｂ １Ｆ２、５Ｆ２、５Ｈ４及び６Ｃ９は、それぞれＦＺＤ１０−ＥＣＤ（配列番号１に示されるアミノ酸配列の１〜２２５番の残基）のアミノ酸残基１５７〜１７０（EPTRGSGLFPPLFR）、１５７〜１７０（EPTRGSGLFPPLFR）、１６１〜１７３（GSGLFPPLFRPQR）、１５６〜１６９（DEPTRGSGLFPPLF）を認識した（図１２）。
【実施例１２】
【０１４８】
５Ｆ２ ｍＡｂによるＳＳ異種移植片の増殖の抑制
本発明者の動物施設において、施設のガイドラインに従って、ｉｎ ｖｉｖｏ実験を行った。０．１ｍｌのＳＹＯ−１細胞懸濁液（５×１０６細胞）を６週齢の無胸腺メスマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌ−ｎｕ）の横腹に皮下注射した。腫瘍の体積は式：０．５×（最大直径）×（最小直径）２を用いて決定した。異種移植片は４０〜７５ｍｍ３のサイズであり、動物は２つの群にランダムに分けた。１つの群（ｎ＝５）には５０μｇのｍＡｂ ５Ｆ２を連続する１０日間にわたり腫瘍内注射した。対照として、別の群（ｎ＝６）には、非免疫ウサギＩｇＧ（DAKO）を投与した。腫瘍の増殖は、処置の最初の日に計算した腫瘍体積に対する所定の日における腫瘍体積の比により評価した。
【０１４９】
ＳＳ異種移植片におけるＴＴ６４１ ｐＡｂの増殖抑制作用を確認するため、抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂである５Ｆ２及び１Ｆ２がＳＳ異種移植片における抗腫瘍作用を示すかどうかを調べた。ＳＳ異種移植片の増殖は、非免疫ウサギＩｇＧを用いた処置と比較して、ｍＡｂ ５Ｆ２を用いた処置によって低減した（図１３）。抗体処置の開始から１０日目（図１３において矢印で示す）に、ｍＡｂ ５Ｆ２で処置したマウスにおけるＳＳ異種移植片の増殖速度は、陰性対照で観察された速度よりも有意に低減した（図１３）。これらの知見は、ｍＡｂ ５Ｆ２がＳＳ細胞の腫瘍増殖を抑制している可能性があることを示している。
【０１５０】
特定の好ましい実施形態を参照して本発明を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神及び範囲内で、当業者によって多数の変形及び改変をなしうることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１Ａは、正常ヒト成人組織（心臓、脳、肺、肝臓、腎臓、膵臓、骨髄及び胎盤）、ＳＳ細胞系（ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）並びにＳＳ外科標本（ＳＳ４８７及びＳＳ５８２）におけるＦＺＤ１０のノーザンブロット分析を示す写真である。図１Ｂは、結腸癌細胞系（ＬｏＶｏ、ＨＴ２９及びＳＷ４８０）並びにＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１、ＨＳ−ＳＹ−２及びＹａＦｕＳＳ）におけるＦＺＤ１０のノーザンブロット分析を示す写真である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ＦＺＤ１０のＮ末端細胞外ドメイン（ＦＺＤ１０−ＥＣＤ）を認識した、アフィニティ精製したＦＺＤ１０−ＥＣＤ抗体（ＴＴ６４１ ｐＡｂ）の特異性を示す写真である。
【図３】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、免疫細胞化学分析によるＦＺＤ１０タンパク質の細胞内局在化を示す写真である。
【図４】図４は、いくつかの腫瘍細胞系におけるＴＴ６４１ ｐＡｂを用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図５】図５は、重複する合成線状ペプチドを用いたＴＴ６４１ ｐＡｂのエピトープマッピングを示す写真である。
【図６】図６Ａ〜６Ｏは、正常ヒト成人組織、ＳＳ腫瘍組織、原発性結腸癌、及び結腸癌の転移肝臓病変における、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫組織化学分析を示す写真である。
【図７】図７Ａは、ＦＺＤ１０過剰発現細胞に対するＴＴ６４１ ｐＡｂが媒介するＡＤＣＣを示すグラフである。図７Ｂは、ＦＺＤ１０過剰発現細胞に対するＴＴ６４１ ｐＡｂが媒介するＡＤＣＣを示すグラフである。
【図８】図８は、ＴＴ６４１ ｐＡｂがＳＳ異種移植片に対して増殖抑制作用を発揮したことを示すグラフである。
【図９】図９Ａ〜９Ｌは、ＴＵＮＥＬ分析及びＫｉ−６７についての免疫組織化学染色を示す写真である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、８種の正常マウス組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓又は精巣）におけるＦＺＤ１０のノーザンブロット分析により検出された正常マウス組織中のマウスＦＺＤ１０の発現を示す写真である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ〜１０Ｅは、正常マウスの腎臓（Ｂ）、胎盤（Ｃ）、肺（Ｄ）及び脳（Ｅ）組織における、ＴＴ６４１ ｐＡｂを用いた免疫細胞化学染色を示す写真である。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１及びＹａＦｕＳＳ；上のパネル）、ならびに結腸癌細胞系（ＳＷ４８０及びＨＴ２９;下のパネル）における、抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂである１Ｆ２（Ａ）、１Ｆ４（Ｂ）、５Ｆ２（Ｃ）、５Ｈ４（Ｄ）及び６Ｃ９（Ｅ）を用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１及びＹａＦｕＳＳ；上のパネル）、ならびに結腸癌細胞系（ＳＷ４８０及びＨＴ２９;下のパネル）における、抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂである１Ｆ２（Ａ）、１Ｆ４（Ｂ）、５Ｆ２（Ｃ）、５Ｈ４（Ｄ）及び６Ｃ９（Ｅ）を用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１及びＹａＦｕＳＳ；上のパネル）、ならびに結腸癌細胞系（ＳＷ４８０及びＨＴ２９;下のパネル）における、抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂである１Ｆ２（Ａ）、１Ｆ４（Ｂ）、５Ｆ２（Ｃ）、５Ｈ４（Ｄ）及び６Ｃ９（Ｅ）を用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１及びＹａＦｕＳＳ；上のパネル）、ならびに結腸癌細胞系（ＳＷ４８０及びＨＴ２９;下のパネル）における、抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂである１Ｆ２（Ａ）、１Ｆ４（Ｂ）、５Ｆ２（Ｃ）、５Ｈ４（Ｄ）及び６Ｃ９（Ｅ）を用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｅは、ＳＳ細胞系（ＳＹＯ−１及びＹａＦｕＳＳ；上のパネル）、ならびに結腸癌細胞系（ＳＷ４８０及びＨＴ２９;下のパネル）における、抗ＦＺＤ１０ ｍＡｂである１Ｆ２（Ａ）、１Ｆ４（Ｂ）、５Ｆ２（Ｃ）、５Ｈ４（Ｄ）及び６Ｃ９（Ｅ）を用いたフローサイトメトリー分析を示すグラフである。
【図１２】図１２は、重複する合成線状ペプチドを用いて行った、ｍＡｂである１Ｆ２、５Ｆ２、５Ｈ４及び６Ｃ９のエピトープマッピングを示す写真である。
【図１３】図１３は、ＳＳ異種移植片に対するｍＡｂ ５Ｆ２の増殖抑制作用を示すグラフである。
【図１】
2007526891.tif 000003
【図２】
2007526891.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007526891.tif 000010
【図９】
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【図１０Ａ】
2007526891.tif 000012
【図１０Ｂ】
2007526891.tif 000013
【図１１Ａ】
2007526891.tif 000014
【図１１Ｂ】
2007526891.tif 000015
【図１１Ｃ】
2007526891.tif 000016
【図１１Ｄ】
2007526891.tif 000017
【図１１Ｅ】
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【図１２】
2007526891.tif 000019
【図１３】
2007526891.tif 000020
【配列表】
2007526891000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月7日(2006.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007526891000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月16日(2007.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）タンパク質に対する抗体又はフラグメント、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防するための医薬組成物。
【請求項２】
ＦＺＤ１０に関連する疾患が、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも４３〜５６番、６１〜７２番、１５６〜１６９番、１５７〜１７０番、１５７〜１７２番、１６１〜１７３番、１７４〜１９１番、１８９〜２０２番、２１４〜２２５番、又は１〜２２５番のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）タンパク質に対する抗体又はフラグメントを含む、Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を診断又は予後診断するためのキット。
【請求項７】
ＦＺＤ１０に関連する疾患が、滑膜肉腫、結腸直腸癌、胃癌、慢性骨髄性白血病、及び急性骨髄性白血病からなる群より選択される、請求項６記載のキット。
【請求項８】
抗体がポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である、請求項６又は７記載のキット。
【請求項９】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項６〜８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１０】
抗体が、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも４３〜５６番、６１〜７２番、１５６〜１６９番、１５７〜１７０番、１５７〜１７２番、１６１〜１７３番、１７４〜１９１番、１８９〜２０２番、２１４〜２２５番、又は１〜２２５番のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起されたものである、請求項６〜９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１１】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を診断又は予後診断するためのキットの製造における、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントの使用。
【請求項１２】
Ｆｒｉｚｚｌｅｄホモログ１０（ＦＺＤ１０）に関連する疾患を治療又は予防するための組成物の製造における、配列番号１に示されるアミノ酸配列の少なくとも５個のアミノ酸残基を含むペプチドに対して誘起された抗体又はフラグメントの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
あるいは、一本鎖抗体の作製について記載されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546）を採用して、ＦＺＤ１０タンパク質又はそのペプチドに対する一本鎖抗体を作製することも可能である。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントとを連結し、一本鎖のポリペプチドを得ることにより形成される。大腸菌における機能性Ｆｖフラグメントの構築に関する技術もまた用いることが可能である（Skerra et al., 1988, Science 240: 1038-1041）。
【国際調査報告】
2007526891.tif 000034
2007526891.tif 000035
2007526891.tif 000036
2007526891.tif 000037