(57)【要約】本発明はアルドラーゼを阻害する新しい化合物に関するものであり、該化合物はその阻害効果によって、医薬品として（治療用の用量で）、とりわけある種のガンの治療に好適に用いることができるものである。本発明による化合物は以下の一般式に対応しており、該式において、アルデヒド基（−ＣＨＯ）およびフェノール基（−ＯＨ）は、第一の芳香族結合体と呼ばれる同一の芳香族結合体の隣接する二つの炭素原子に固定されており、Ｒは、リン酸基またはリン酸基のミミックであり、第二の芳香族結合体と呼ばれる二番目の芳香族結合体の炭素原子に固定されている。【化１】2007516184.tif 000030
2007516184.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルデヒド基、フェノール基およびリン酸基またはミミックを有し、
−芳香核がベンゼン型の二つの芳香族結合体を有すること、および
−以下の一般式に対応すること、
を特徴とする芳香族化合物であり、
【化１】
2007516184.tif 000018
該化学式において、
・アルデヒド基（−ＣＨＯ）とフェノール基（−ＯＨ）が、第一の芳香族結合体である同一の芳香族結合体の隣接する二つの炭素原子に固定されていること、
・第二の芳香族結合体である二番目の芳香族結合体の炭素原子に固定されているＲが、リン酸基であるか、または、
−酵素分解される保護基であって、前記芳香族化合物が細胞および／または寄生生物の膜系を受動的に通過できるようにするのに適しており、また、一度細胞の内部または寄生生物の内部において、リン酸基あるいはリン酸基の安定な類似物を形成させるのに適した、酵素分解される保護基、
−リン酸基の安定な類似物であって、自然な脱リン酸化および／または酵素による脱リン酸化から芳香族化合物を保護するのに適したリン酸基の安定な類似物、
から選ばれるリン酸基のミミックであること、
を特徴とする、芳香族化合物。
【請求項２】
以下の一般式を有し、
【化２】
2007516184.tif 000019
該式においてＲ1がリン酸基またはリン酸基のミミックであることを特徴とする、請求項１に記載の芳香族化合物。
【請求項３】
酵素分解される保護基が、一つまたは複数の細胞内エステラーゼによって脱保護される性質の基であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の芳香族化合物。
【請求項４】
酵素分解される保護基が以下の一般式を有し、
【化３】
2007516184.tif 000020
該式において、Ｒ’が、
【化４】
2007516184.tif 000021
【化５】
2007516184.tif 000022
という基から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の芳香族化合物。
【請求項５】
酵素分解される保護基が以下の一般式を有し、
【化６】
2007516184.tif 000023
該式において、Ｒ’’が、
【化７】
2007516184.tif 000024
【化８】
2007516184.tif 000025
【化９】
2007516184.tif 000026
【化１０】
2007516184.tif 000027
という基から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の芳香族化合物。
【請求項６】
酵素分解される保護基が、一つまたは複数の細胞内レダクターゼによって脱保護される性質の基であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の芳香族化合物。
【請求項７】
酵素分解される保護基が以下の一般式を有し、
【化１１】
2007516184.tif 000028
該式において、Ｒ’’’が、
【化１２】
2007516184.tif 000029
という基から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の芳香族化合物。
【請求項８】
リン酸の安定な類似物が、
−メチレンホスホン酸、
−ジフルオロメチレンホスホン酸、
−モノフルオロメチレンホスホン酸、
という基から選択されることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の芳香族化合物。
【請求項９】
少なくとも一つの芳香族化合物の少なくとも一つの炭素原子の水素原子が、芳香族化合物の全体的な疎水性を向上させるのに適した、疎水性置換基である置換基で置換されていることを特徴とする、請求項１〜請求項８のいずれか一つに記載の芳香族化合物。
【請求項１０】
一つまたは複数の疎水性置換基が、主鎖が最大で三つの炭素原子を含む一つまたは複数のアルキル基であることを特徴とする、請求項９に記載の芳香族化合物。
【請求項１１】
クラスＩのアルドラーゼの活性阻害剤として非治療的な利用をするのための、請求項１〜請求項１０のいずれか一つに記載の芳香族化合物。
【請求項１２】
２５μＭ未満、とりわけ５０ｎＭ未満、典型的にはおよそ２５ｎＭである阻害定数Ｋiを有することを特徴とする、請求項１１に記載の芳香族化合物。
【請求項１３】
不可逆的またはほぼ不可逆的に少なくとも一つのアルドラーゼを阻害することができることを特徴とする、請求項１１に記載の芳香族化合物。
【請求項１４】
人体もしくは動物の体、またはヒトの胚から単離されていない生体細胞の細胞内アルドラーゼを除く、細胞外または細胞内アルドラーゼの阻害方法であり、前記アルドラーゼを、少なくとも有意な効果を生じさせるために十分な量の、請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の少なくとも一つの芳香族化合物に、接触させることを特徴とする阻害方法。
【請求項１５】
細胞の解糖の阻害に適用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ガン細胞の進行を止めるために適用される、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の芳香族化合物を含む医薬品。
【請求項１８】
ガン治療のための医薬品を製造するための、請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の芳香族化合物の利用法。
【請求項１９】
ＧＲＨアプローチに従って実施されるガン治療のための医薬品を製造するための、請求項１８に記載の利用法。
【請求項２０】
請求項１に記載の、二番目の芳香族結合体の炭素原子がリン酸化された１−ヒドロキシ−２−ナフトアルデヒド化合物を合成する方法であり、第一の芳香族結合体の１位の炭素原子および第二の芳香族結合体の炭素原子の一つがヒドロキシル化した、ジヒドロキシル化した２−ナフトアルデヒド化合物をリン酸化する過程が行われ、前記リン酸化が、リン酸基による第二の芳香族結合体のヒドロキシル基の置換に対応するものである、合成方法。
【請求項２１】
リン酸化が、ＣＨ2Ｃｌ2／ＴＨＦの溶液中の亜リン酸トリエチル、ピリジンおよびヨウ素の技術によって開始されることを特徴とする、請求項２０に記載の合成方法。
【請求項２２】
５−ホルミル−６−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸を導くために、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトアルデヒドをリン酸化することを特徴とする、請求項２０または請求項２１に記載の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、解糖を阻害する新しい化合物に関するものであり、該化合物の作用はアルドラーゼの阻害として現れる。本発明はまた、それらの合成方法および諸応用法、とりわけガン治療のための医薬品の製造における応用法にも関するものである。
【背景技術】
【０００２】
解糖は複雑なメカニズムを示すもので、該メカニズムは、異なった十種の酵素のカスケードを生じさせることで、ＡＴＰ（アデノシン−５’−三リン酸）の形で蓄積されたエネルギーの放出を伴うグルコースの嫌気性分解を確実に行うものである。
【０００３】
解糖に関与する十種の酵素の中でも、ホモ四量体酵素であるアルドラーゼ（フルクトース−１，６−ビスリン酸塩アルドラーゼ）は重要な過程、つまり、フルクトース−１，６−ビスリン酸（Ｆｒｕ（１，６）Ｐ2）をジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）とグリセルアルデヒド−３−リン酸（ＧＡＰ）という二つのトリオースリン酸に分解する過程に関与する。アルドラーゼによるＦｒｕ（１，６）Ｐ2の分解は、複数の反応中間体を規定する複数の過程からなる機構に従って起こるもので、該反応中間体は十分に同定されている。
【０００４】
アルドラーゼは解糖経路において不可欠であり、従ってピルビン酸とＡＴＰの合成にとって重要である。
【０００５】
アルドラーゼは二つのクラスに分かれている（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４，Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．Ｆｅｄ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．，２３：１２４８−１２５７）。一方のクラスのアルドラーゼは、とりわけその起源、またその作用様態によって、他方のクラスのアルドラーゼと区別される。クラスＩのアルドラーゼは、動物、高等植物およびある種の寄生生物の中に存在するものであり、活性部位のリジン残基（ｌｙｓ−２２９）と基質との間にプロトン化したイミン（すなわちシッフ塩基）を形成することで、Ｆｒｕ（１，６）Ｐ2を固定する。クラスＩＩのアルドラーゼに関しては、これは原核生物に固有である。該アルドラーゼは、分解前にエノラートの形で基質を固定し、安定させるために、二価の金属イオンが触媒部位のところに存在することを必要とする。
【０００６】
今日知られているクラスＩのアルドラーゼの阻害剤の中では、拮抗阻害剤、とりわけＢｌｏｎｓｋｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２３：７１−７７）に記載されている拮抗阻害剤を挙げることができ、該阻害剤とはつまり、ヒドロキノンのリン酸誘導体（ＨＱＮ−Ｐ2）、レゾルシノールのリン酸誘導体（ＲＳＮ−Ｐ2）およびベンズアルデヒド−４−リン酸（ＨＢＡ−Ｐ）である。ウサギ筋肉のアルドラーゼについてテストしたところ、これらの阻害剤は、それぞれ、およそ１３５μＭ、４０μＭおよび５００μＭの解離定数Ｋi（すなわち阻害定数）を示す。また、阻害定数Ｋiがおよそ３０〜４０μＭのリン酸化合物も知られている（Ｈａｒｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４：１０６８−１０７５）。
【０００７】
また、時間に依存する可逆的阻害剤である２−ヒドロキシベンズアルデヒド−４−リン酸（Ｂｌｏｎｓｋｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２３：７１−７７）も挙げることができ、その全体の阻害定数Ｋi*は３５±５μＭであり、およそ２００μＭの阻害剤の濃度ではアルドラーゼ活性を８０％減少させることができる。
【０００８】
これらの化合物のように、今日知られている他のアルドラーゼ阻害剤（Ｇｅｆｆｌａｕｔ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｇ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６３（３）：３０１−３４０）、および一般的な解糖の阻害剤は、非常に高い濃度で用いられない限り、弱い阻害活性を示すものであり、このことはそれらの適用範囲を著しく限定している。また、たとえば治療上の用量に適合する濃度のような低い濃度でそれらを適用することはほとんど考えられない。
【０００９】
ところが、多くの適用において、また特に医療分野において、解糖の効果的な阻害が求められており、そしてそれは、患者に対するあらゆる有害作用を避けるために十分に低い阻害剤の濃度で行う必要がある。このために、ある種のガンおよびある種の固形腫瘍の治療のためのものとして考えられている、ＧＲＨ（“Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｒｅｓｃｕｅｄ  ｈｙｐｏｘｉａ”）アプローチと呼ばれるアプローチが知られている（Ｍｃ  Ｃａｒｔｙ  Ｍ．Ｆ．，２００１，Ｍｅｄ．Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ，５６：２８６−２８９）。その基盤は特に、二つの報告に基づいている。
【００１０】
一つ目には、酸素濃度が低い組織内（低酸素条件）で発現する固形腫瘍および致死ガンが、エネルギー生産の唯一の経路として解糖を用いる表現型を有していることが示されている。同様に、このタイプの細胞がまた、健康な細胞がグルコースの代わりにグリセロールを用いることを可能にする特殊な酵素である、グリセロールキナーゼの活性を有さないことにも特徴があるということが示されている。
【００１１】
従って、ＧＲＨアプローチは、唯一のエネルギー源として十分な用量のグリセロールを患者に投与することで、該患者のあらゆる細胞における解糖経路を阻害することを提案している。こうして、解糖がＡＴＰ合成の主要な経路であるガン細胞は、グルコースを用いることも、グルコースの代わりのエネルギー源としてグリセロールを用いることもできず、「飢える」ことになる。健康な細胞については、グリセロールキナーゼ活性と、解糖の後半部分（トリオース部分）における他の酵素によって、ピルビン酸の合成のためにグリセロールを用いることができる。従って、健康な組織には適切なエネルギー供給を確保しながら、ガン細胞を飢えさせるのである。
【非特許文献１】Ｒｕｔｈｅｒ他、１９６４年、『Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ／Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』２３、１２４８−１２５７。
【非特許文献２】Ｂｌｏｎｓｋｉ  Ｃ．他、１９９７年、『Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ』３２３、７１−７７。
【非特許文献３】Ｈａｒｔｍａｎ他、１９６５年、『Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』４、１０６８−１０７５。
【非特許文献４】Ｇｅｆｆｌａｕｔ  Ｔ．他、１９９５年、『Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ』、６３（３）、３０１−３４０。
【非特許文献５】Ｍｃ  Ｃａｒｔｙ  Ｍ．Ｆ．、２００１年、『Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ』、５６、２８６−２８９。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかし、これまでに、ＧＲＨアプローチを利用するいかなる抗腫瘍治療も実行することができなかったのであり、それは、解糖に対する十分に効果的な阻害剤がないこと、より詳細には解糖の前半部分（ヘキソース部分）の酵素のに対する阻害剤がないという理由のためである。
【００１３】
また、解糖が多くの寄生生物にとってエネルギー合成の唯一の経路に相当するため、解糖を阻止することは、寄生生物に由来する多くの病変の治療に対して非常に期待のもてるアプローチともなる。
【００１４】
従って現状では、とりわけガンならびにある種の寄生虫症を克服する目的で、あるいは、解糖が主要な、ひいては不可欠なエネルギー合成の経路となっているすべての生物を死滅させるという枠組みにおいて、解糖の効果的な阻害剤を少なくとも一つ利用できるようにするという、現実的な必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、解糖を阻害する能力、特にクラスＩのアルドラーゼの活性を阻害する能力を有する新しい化合物を提案することで、先述した不備を補うことを目指すものである。
【００１６】
より詳細には、本発明は、アルドラーゼ阻害効果によって医薬品として利用することができる化合物、つまり治療上の用量、とりわけガン治療の枠内での用量で効果的に利用することができる化合物を提案することを目指すものである。
【００１７】
本発明はまた、治療のための適用を除く、解糖に対する阻害剤としての、これらの化合物の応用を提案することも目的としている。拡張として、本発明は新しい医薬品、とりわけガン治療および／または寄生虫症の治療のための医薬品を提案することを目標とする。
【００１８】
そして最後に、本発明は、本発明による化合物の合成方法を提案することを目的としており、該合成は、実施が単純であると同時に、大量かつコストの低いものであり、これは換言すれば、産業レベルの製造における経済的制約と両立可能な方法ということである。
【００１９】
明細書全体にわたり、以下の用語を採用するものとする。
−芳香族結合体：芳香核の共役環であり、該環において、自由電子は、ある炭素原子から他の炭素原子へ、それらのいずれにも結合することなく移動することができ（共鳴効果による電子の非局在化）、また、ある結合の炭素原子から他の結合の炭素原子へと移動することができる。従って、本発明において実施されるナフタレン型の芳香核は、単結合（σ結合）と二重結合（π結合）を交互に有しており、強く非局在化したπ電子系を、これらの核を形成する二つの芳香族結合体の間に生じさせる。
−リン酸基のミミック：リン酸基以外の化合物の置換基であり、本発明の範囲におけるタンパク質標的（アルドラーゼ）のところで化合物の生物学的利用能を向上させるのに適している。リン酸基のミミックは、酵素分解される保護基またはリン酸の安定な類似物という、二つのタイプからなると考えられる。
−酵素分解される保護基：リン酸基のミミックであり、電荷をマスキングする方法によって、細胞膜または寄生生物の膜系を通過しての化合物の受動拡散を可能にするのに適しており、そして、細胞あるいは寄生生物の内部において酵素変換（すなわち脱保護）を受けてリン酸基またはリン酸の安定な類似物を生じさせるのに適している。
−リン酸の安定な類似物：リン酸基のミミックであり、リン酸基と比較して、生理学的条件、とりわけｐＨおよび／または酵素環境に対してより良い安定性を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明は芳香族化合物に関するものであり、該芳香族化合物はアルデヒド基、フェノール基、およびリン酸基、または酵素分解される保護基もしくはリン酸基の安定な類似物のようなリン酸基のミミックを含んでいるものであり、以下のことを特徴としている。
【００２１】
−芳香核がベンゼン型の二つの芳香族結合体の縮合によって形成されること。
【００２２】
−そして、該芳香核が以下の一般式に対応していること。
【００２３】
【化１】
2007516184.tif 000003
【００２４】
該一般式において、
−アルデヒド基（−ＣＨＯ）およびフェノール基（−ＯＨ）は、第一の芳香族結合体である同一の芳香族結合体の隣接する二つの炭素原子に固定されており、
−そして、Ｒはリン酸基またはリン酸基のミミックであり、第二の芳香族結合体である、二番目の芳香族結合の炭素原子に固定されている。
【００２５】
クラスＩのアルドラーゼによる実際の阻害の機構が、本発明の化合物のそれぞれに対して特定的に確実に明らかにされているわけではないが、該化合物のいくつかに対する発明者らの研究、並びに、クラスＩの様々なアルドラーゼの活性部位をモデル化する研究によって、前述した定義に対応する化合物がこれらのアルドラーゼを効果的に阻害すると考えることが可能である。
【００２６】
このように、本発明によって、ナフタレン型の芳香核のような平面幾何学的な化学構造に結合したリン酸基、ヒドロキシル基およびアルデヒド基が同時に存在することが、良好な認識およびアルドラーゼの活性部位との非常に高い親和性を生み出すために必要であることを示すことが可能である。
【００２７】
リン酸基は、アルドラーゼによる阻害剤の認識には不可欠である。リン酸基は酵素の認識ポケットの内部に入り、また該リン酸基によって、芳香族化合物が活性部位の内部において良好な配向をとることができる。このとき芳香族化合物は、活性部位の三つのリジン残基（Ｌｙｓ−１０７、Ｌｙｓ−１４６、Ｌｙｓ−２２９）の少なくとも一つから良好な距離にアルデヒド基およびフェノール基を置いて、該リジン残基と、生理学的ｐＨ条件下で、プロトン化したイミン型の安定な結合、すなわちシッフ塩基を形成する。従って、リン酸基を、アルデヒド基およびヒドロキシル基が結合した芳香族結合体ではない芳香族結合体に配置する必要があるということには大きな意味がある。実際、ナフタレン型の芳香核によって、アルドラーゼに対して化合物が良好な親和性を有するのに特に適した、リン酸基からの距離に、ヒドロキシル基およびアルデヒド基を配置することが可能になるのだが、リン酸基とアルデヒド基およびヒドロキシル基との距離を隔てることで、化合物にかかる制約を非常に少なくして、従って少ないエネルギー消費で、アルドラーゼによるリン酸基の認識と、三つのリジン残基の一つによる活性部位での化合物の安定化がもたらされる。
【００２８】
他方では、リン酸基に対するアルデヒド基およびヒドロキシル基のそれぞれの位置は、アルドラーゼの、本発明によって定義された化合物に対して特異的な選択性において、重要な役割を果たすものである。
【００２９】
そして最後に、同一の芳香族結合体の隣接する二つの炭素原子にヒドロキシル基とアルデヒド基があることは基幹的であり、クラスＩのアルドラーゼの活性部位のところでこの特徴的な結合を形成することを決定している。ヒドロキシル基は、中間体のカルビノールアミンの脱水時におそらく酸性触媒の役割を果たし、そして、プロトン化したシッフ塩基の安定化におそらく関わるものであり、そしてほぼ不可逆的で効果的な阻害、ひいては不可逆的な阻害を生じさせる。
【００３０】
また、そして有利には、特定の位置にリン酸基、アルデヒド基およびフェノール基が結合しているナフタレン型の芳香核は、アルドラーゼの活性部位への化合物の接近可能性の制約およびこの部位における立体障害の制約に反することなく、アルドラーゼの基質（Ｆｒｕ（１，６）Ｐ2、ＧＡＰ、ＤＨＡＰ）よりも立体構造的に制約の多い平面幾何学的形状であり、適当な寸法をしている化合物を規定することも可能である。
【００３１】
従って、このような芳香族化合物はクラスＩのアルドラーゼの活性部位を塞ぐことができ、その結果、フルクトース−１，６−ビスリン酸の固定および分解を妨げることができ、結局それにより解糖を阻止することができるようになっている。このような芳香族化合物は、真核細胞および／または寄生生物の細胞のアルドラーゼを効果的に阻害し、従って、真核細胞および／または寄生生物の細胞の解糖を阻止することができる。
【００３２】
しかし、細胞内での阻害および／または寄生生物内での阻害が望まれる際、アルドラーゼの活性部位における本発明による化合物の認識および固定に必要なリン酸基の電離状態では、これらの阻害剤に細胞膜を通過させるための問題が生じ、該問題は、これらの化合物の生物学的利用能の低下として現れ、ひいては全体的に活性が弱まることになる。
【００３３】
リン酸化合物の生物学的利用能を向上させることを可能にする第一のアプローチは、とりわけ酵素分解される保護基を用いてリン酸基を保護することで、一時的にこれらの電荷をマスキングし、そして該電荷による細胞膜の受動的な通過を可能にすることからなる。
【００３４】
また、ｐＨ、とりわけ生体組織、細胞および寄生生物におけるｐＨは、リン酸基の自然な切断の原因となる可能性がある。同様に、多くの酵素、とりわけホスファターゼは、芳香環−リン酸の結合を切断する能力がある。また、生体組織、生体細胞、生きた寄生生物への応用については、これらのリン酸基をミミック、とりわけリン酸の安定な類似物で置換することが好ましい。
【００３５】
好適には、リン酸基のミミックは、
−酵素分解される保護基であり、前記芳香族化合物が細胞および／または寄生生物の膜系を受動的に通過できるようにするのに適しており、また、細胞の内部または寄生生物の内部で一度、リン酸基またはリン酸基の安定な類似物を形成させるのに適した、酵素分解される保護基と、
−リン酸の安定な類似物であり、自然な脱リン酸化、ならびに／または酵素による脱リン酸化、とりわけ細胞および／または寄生生物のホスファターゼによる脱リン酸化から、芳香族化合物を保護するのに適したリン酸の安定な類似物、
から選択される。
【００３６】
本発明による、アルドラーゼを阻害することができる化合物の非限定的例示として、公式の呼称に従って、５−ホルミル−６−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸、６−ホルミル−５−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸、４−ホルミル−５−ヒドロキシ−１−ナフチルリン酸、５−ホルミル−４−ヒドロキシ−１−ナフチルリン酸、４−ホルミル−３−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸、３−ホルミル−４−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸、３−ホルミル−２−ヒドロキシ−１−ナフチルリン酸、２−ホルミル−３−ヒドロキシ−１−ナフチルリン酸として指定することのできる化合物、あるいは、リン酸基を本発明によるリン酸基のミミックで置換することで得られるこれらの化合物の誘導体、を挙げることができる。
【００３７】
好適には、本発明による芳香族化合物は以下の一般式を有している。
【００３８】
【化２】
2007516184.tif 000004
【００３９】
該式において、Ｒ1はリン酸基またはリン酸基のミミックである。
【００４０】
Ｒ1がリン酸基であるとき、一般式（ＩＩ）による芳香族化合物は、公式の呼称に従って、５−ホルミル−６−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸（以下、ＦＨＮ−Ｐで表す）として指定される。また、本発明にしたがった一般式（ＩＩ）による化合物は、５−ホルミル−６−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸またはその誘導体であってよく、該誘導体は、リン酸基を本発明によるミミックで置換することで得ることができる。
【００４１】
ＦＨＮ−ＰとクラスＩのアルドラーゼ、より詳細にはウサギの筋肉のアルドラーゼとの相互作用の研究は、ＵＶ／可視光差分光法によって、またエレクトロスプレー質量分析によって行った。これらの研究は、酵素反応速度の分析と、変異アルドラーゼを用いる実験とによって同時に補完した。
【００４２】
ウサギの筋肉のアルドラーゼについて、本発明によって、本発明による芳香族化合物のアルデヒド基と酵素との間にシッフ塩基が形成されることを明らかにすることができた。本発明によって、また、このシッフ塩基の形成に残基Ｌｙｓ−１０７が関わっていることを示すこともできた。さらに、ＦＨＮ−Ｐによるウサギの筋肉のアルドラーゼの阻害は、時間に依存する可逆的な阻害（「ｓｌｏｗ−ｂｉｎｄｉｎｇ阻害」）として定義されている。このタイプの阻害は、高いレベルの選択性を有すること以外に、酵素に対する阻害剤の固定が遅いことを特徴としており、このことにより、化学的に活性な不可逆的なタイプの阻害剤（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  Ｗａｌｓｃｈ、１９８８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｅｒａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，６１：２０１−３０１）によって実現される阻害と同程度の効果を示すことができる。ＦＨＮ−Ｐによるウサギ筋肉のアルドラーゼの阻害は、およそ２５ｎＭの全体の阻害定数Ｋi*を特徴としている。従って、この化合物は今日では、クラスＩのアルドラーゼに対する最も強力な、時間に依存する可逆的な阻害剤に相当するものとなっている。その上、あらゆる阻害が、阻害剤とリジン残基の間におけるシッフ塩基の形成を伴うため、この阻害は、阻害剤−酵素複合体を水素化ホウ素ナトリウムで処理することによって不可逆的とすることもできる。
【００４３】
２−（４−ホルミル−３−ヒドロキシフェニル）−１−リン酸二水素エチレンのような化合物が、アルドラーゼの阻害においてはＦＨＮ−Ｐの等価物として考えることができることに留意すべきである。実際、この化合物は、非常にＦＨＮ−Ｐに類似した様式で、先に記述したアルドラーゼの阻害に必要な条件に応えるものである。この化合物のリン酸基があることによって、まず、アルドラーゼによる認識が可能になる。この化合物はＦＨＮ−Ｐのように、活性部位の内部に向き、該化合物は、ＦＨＮ−Ｐにおける基の距離とほとんど一致している、アルデヒド基とフェノール基からリン酸基を隔てている距離を踏まえて、一つのリジン残基の近傍にアルデヒド基とフェノール基を置く。
【００４４】
好適には、本発明による酵素分解される保護基は、一つまたは複数の細胞内エステラーゼによって脱保護される性質の基である。
【００４５】
好適には、また本発明によれば、この酵素分解される保護基は以下の一般式を有するものである。
【００４６】
【化３】
2007516184.tif 000005
【００４７】
該化学式において、Ｒ’は以下の基から選択することができる。
【００４８】
【化４】
2007516184.tif 000006
【００４９】
【化５】
2007516184.tif 000007
【００５０】
このように、本発明による芳香族化合物は、オキシメチルエステル型である、酵素分解される保護基を有している。このような酵素分解性される保護基の脱保護の機構は、とりわけＦａｒｑｕｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，７２：３２４−３２５）およびＳｒｉｖａｓｔｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１２：１１８−１２４）によって説明されている。
【００５１】
好適には、またもう一つの変形例によると、本発明による酵素分解される保護基は、細胞内エステラーゼによって脱保護される性質をしており、以下の一般式を有するものである。
【００５２】
【化６】
2007516184.tif 000008
【００５３】
該化学式において、Ｒ’’は以下の基から選択することができる。
【００５４】
【化７】
2007516184.tif 000009
【００５５】
【化８】
2007516184.tif 000010
【００５６】
【化９】
2007516184.tif 000011
【００５７】
【化１０】
2007516184.tif 000012
【００５８】
チオエステル型の酵素分解される保護基が、脱保護するために、オキシメチルエステル型の酵素分解される保護基と同じ酵素を用いるのに対し、反応メカニズムは大きく異なっており、該メカニズムはとりわけＬｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８：３９４１−３９５０）によって説明されている。
【００５９】
電荷の一時的なマスキングに関する変形実施例によると、本発明による酵素分解される保護基は、一つまたは複数の細胞内レダクターゼによって脱保護することができる。
【００６０】
好適には、この変形実施例によると、酵素分解される保護基は以下の一般式に対応している。
【００６１】
【化１１】
2007516184.tif 000013
【００６２】
該化学式において、Ｒ’’’は以下の基から選択することができる。
【００６３】
【化１２】
2007516184.tif 000014
【００６４】
このような酵素分解される保護基の脱保護の機構は、Ｐｕｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，２２：１５５−１７４）によって説明されている。
【００６５】
当然のことだが、本発明による特定の芳香族化合物のリン酸基の電離状態を、酵素分解される保護基によって電荷をマスキングする以外の技術によってなくすこともできる。目標としている応用（細胞から抽出されたアルドラーゼまたは抽出されていないアルドラーゼに対する応用）によると、酵素分解される保護基、特に前述したものの補足あるいは代替として、特定のカプセル化（生薬状）または特定の投与技術（注入法）を用いることが好ましい。
【００６６】
好適には、本発明によるリン酸の安定な類似物は、
−メチレンホスホン酸、
−ジフルオロメチレンホスホン酸、
−モノフルオロメチレンホスホン酸、
という基から選択することができ、これらの基はとりわけ、Ｎｉｅｓｃｈａｌｋ  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９６（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，５２（１）：１６５−１７６）に記載されている。
【００６７】
好適には、また本発明によると、少なくとも一つの芳香族結合体の少なくとも一つの炭素原子上の水素原子を、化合物の全体的な疎水性を向上させるのに適した、疎水性置換基である置換基で置換する。このような基があることによって、本発明による芳香族化合物が、比較的疎水性であるアルドラーゼの活性部位に接近することが容易になる。さらに、本発明による化合物の合成と両立可能な基を選択し、アルドラーゼの活性部位のところにおける立体障害による制約を考慮することが望ましい。
【００６８】
好適には、本発明による各疎水性置換基は、主鎖が最大で三つの炭素原子を含むアルキル基である。
【００６９】
本発明はさらに、本発明による芳香族化合物を、真核生物において、クラスＩのアルドラーゼの活性に対する阻害剤として、また外挿によって、解糖の阻害剤として用いることにも関するものである。好適には、芳香族化合物の使用は非治療的枠組みにおいてなされる。
【００７０】
好適には、また本発明によると、この目的に用いられる芳香族化合物は、２５μＭ未満、とりわけ５０ｎＭ未満、典型的にはおよそ２５ｎＭのアルドラーゼの阻害定数Ｋiを有することができる。
【００７１】
好適には、また本発明によると、この目的に用いられる芳香族化合物は、不可逆的に、あるいはほぼ不可逆的に、少なくとも一つのアルドラーゼを阻害することができる。
【００７２】
本発明は細胞外または細胞内のアルドラーゼの阻害方法も範囲に含んでおり、好適には、人体もしくは動物の体またはヒトの胚から単離されていない生体細胞の細胞内アルドラーゼは除くものであり、該方法において、これらのアルドラーゼを、アルドラーゼ活性に対して少なくとも有意な効果を生じさせるのに十分な量の本発明による少なくとも一つの芳香族化合物と接触させる。
【００７３】
好適には、本発明による方法は、細胞の解糖の阻害に応用される。
【００７４】
好適には、本発明による方法は、ガン細胞の進行を止めるために応用することができる。
【００７５】
本発明はまた、本発明による芳香族化合物を含む医薬品も範囲としている。
【００７６】
ガンとの闘いにおいて、様々な治療アプローチが考えられてきており（化学療法、放射線療法、外科的治療など）、多くの治療法が今日では用いられている。しかし、これまでには、ガンに対して全体的に有効ないかなる治療法も存在していない。一般的に、現状における治療法の選択は、組織のタイプおよび冒された器官、並びに浸潤の度合いと悪性度に応じて行われる。しかし、多くの治療法は、多少とも長期間の間、患者にとって耐え難いものとなっている。そのため、一般的には複数の治療によるアプローチが採用されているために、結果として、一人の患者に代わる代わる処方することができるような、同一のタイプのガンを治療することができる様々な治療法を使用できるようにすることが必要となる。ＧＲＨアプローチを実行できるようにすることには、新たな治療法を生み出し、従ってガンとの戦いに大きな進歩をもたらす可能性がある。本発明による芳香族化合物によって、非常に望ましい形でＧＲＨアプローチを実行することが可能になる。
【００７７】
本発明はまた、ガン治療のための医薬品の製造に、とりわけＧＲＨアプローチに従って実施されるガン治療のための医薬品の製造に、本発明による芳香族化合物を用いることも範囲に含むものである。
【００７８】
本発明はまた、本発明による芳香族化合物の合成方法も範囲としている。
【００７９】
本発明の第一の特徴によると、該方法によって、二番目の芳香族結合体の炭素原子がリン酸化した、１−ヒドロキシ−２−ナフトアルデヒドを合成することが可能である。
【００８０】
好適には、本発明による合成方法は、第一の芳香族結合体の１位の炭素原子および第二の芳香族結合体の炭素原子の一つがヒドロキシル化した、ジヒドロキシル化した２−ナフトアルデヒド化合物をリン酸化する過程を含んでおり、前記リン酸化は、第二の芳香族結合体のヒドロキシル基をリン酸基で置換することに対応している。
【００８１】
好適には、また本発明によると、リン酸化過程は、ＣＨ2Ｃｌ2／ＴＨＦ溶液中の亜リン酸トリエチル、ピリジンおよびヨウ素の技術によって開始される（Ｓｔｏｗｅｌ  Ｊ．Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６：１８２−１８５；Ｌａｄａｍｅ  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ，Ｓｕｌｆｕｒ  ａｎｄ  Ｓｉｌｉｃｏｎ，１７４：３７−４７）。
【００８２】
好適には、また本発明によると、脱保護（Ｐａｇｅ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｉｏｏｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，７：１４０３−１４１２）を行った後に５−ホルミル−６−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸（ＦＨＮ−Ｐ）が得られるように、１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトアルデヒドに対してリン酸化を行う。
【００８３】
本発明はまた、アルドラーゼを阻害する芳香族化合物、アルドラーゼおよび解糖の阻害方法、並びに医薬品にも関するものであり、以上で言及した特徴の、または以下で述べる特徴の全てまたは一部の組み合わせを特徴としている。
【００８４】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の実施例を読むことで明らかになる。図１〜図５はこれらの実施例で得られた結果を示している。
【００８５】
合成方法および物理化学的分析方法
湿気に敏感なすべての反応は、無水条件でアルゴン雰囲気下で行った。
【００８６】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）およびエチルエーテルを、ナトリウム／ベンゾフェノンで蒸留する。ジクロロメタンはＰ2Ｏ5で蒸留する。ピリジンおよびトリエチルアミンはカリで蒸留する。メタノールは少量のナトリウムの存在下で蒸留する。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のための溶媒は、他の精製をせずに用いる。
【００８７】
反応の進行は、適切な溶出システムを用いての、シリカプレートの上（Ｍｅｒｃｋ  ６０−Ｆ２５４）での薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって検証する。生成物を、ＵＶ照射（λ＝２５４ｎｍおよび３６６ｎｍ）によって、または、ヨウ素蒸気、リン酸化物に対するＺｉｎｚａｄｅ（モリブデン酸アンモニウム）のような特定の顕色剤、もしくは、６％および８％のモリブデン酸アンモニウムを含む硫酸水溶液である５％の硫酸セリウム（ＩＶ）を含有するＰａｎｃａｌｄｉ顕色剤を用いることによって、可視化した。
【００８８】
生成物は、適切な溶出システムを用いての、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ−６０、２３０−４００メッシュ）におけるフラッシュクロマトグラフィー、または逆相カラムＣ１８（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ  ｐｏｌｙｇｏｐｒｅｐ  Ｃ１８、１２−２５μｍ、６０Ａ）における分取用高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。
【００８９】
1ＨＮＭＲスペクトル、13Ｃスペクトルおよび31Ｐスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＣ２００分光計あるいはＡＣ２５０分光計で記録した。化学シフト（δ）は、1Ｈ核および13Ｃ核についてはテトラメチルシランに基づいて、そして31Ｐ核についてはリン酸に基づいて、ｐｐｍ単位で表されている。結合定数の値はＨｚで表されている。以下の省略記号を用いた：ｓは一重項、ｓｅは励起一重項、ｄは二重項、ｔは三重項、ｑは四重項、そしてｍは多重項である。
【００９０】
質量スペクトル（ＤＣＩ）を、四重極型Ｎｅｒｍａｇ  Ｒ１０−１０分光計で行った。
【００９１】
元素分析はＥａｇｅｒ２００という機器で実施した。
【実施例１】
【００９２】
実施例１：５−ホルミル−６−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸（ＦＨＮ−Ｐ）の合成：
あらかじめ合成された１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトアルデヒド（０．２１ｇ；１．１ｍｍｏｌ（Ｊｏｎｈｓｏｎ  Ｗ．Ｓ．Ｊ．  ｅｔ  Ｓｈｅｌｂｅｒｇ  Ｗ．Ｅ．，１９４５，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６７：１７４５−１７５３；Ｊｏｎｈｓｏｎ  Ｗ．Ｓ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，１９４４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，６６：２１８−２２２；Ｂｉｌｇｅｒ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２２：３６３−３６５）をＣＨ2Ｃｌ2（３４ｍｌ）に溶解した。０℃に維持した無水ピリジン（０．１ｍｌ；１．２４ｍｍｏｌ）を加えた。次にＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）に溶解しているヨウ素（０．１ｇ；１．２ｍｍｏｌ）と亜リン酸トリエチル（０．２３ｍｌ；１．３２ｍｍｏｌ）の混合物を加えた。全体を１時間にわたって０℃で撹拌しながら維持し、次いで、室温で放置した。水（２０ｍｌ）を加えた。有機相を食塩水（ＮａＣｌの飽和水溶液）で洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を減圧下で取り除いた。フラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2）の後、黄色の油が得られた（０．１１ｇ；３１％）。つまり、１−ヒドロキシ−２−ナフトアルデヒド−６−リン酸ジエチルである。
【００９３】
ブロモトリメチルシラン（０．１５ｍｌ；１．１ｍｍｏｌ）を、撹拌しながら、先に得られた１−ヒドロキシ−２−ナフトアルデヒド−６−リン酸ジエチル溶液（０．０５４ｇ；０．１７ｍｍｏｌ）にゆっくりと加え、窒素雰囲気下で無水ＣＨ2Ｃｌ2（２００μｌ）に溶解した。得られた混合物を、室温において３時間にわたって撹拌した。このときＥｔ2Ｏ／Ｈ2Ｏ（１０：１）を加え、得られた有機相を水で洗浄した。水相のｐＨを、１Ｍの炭酸ナトリウムで７．６に調整した。溶液を凍結乾燥して、ナトリウム塩の形態をした５−ホルミル−６−ヒドロキシ−２−ナフチルリン酸（ＦＨＮ−Ｐ）の白い粉末（０．０５０ｇ；９６％）とした。
【００９４】
1ＨＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ７．１１（ｄ、3ＪH3-H4＝８．５０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ３）；７．３４（ｄ、3ＪH7-H8＝８．００Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ７）；７．４１（ｓｅ、１Ｈ、Ｈ５）；８．２４（ｄ、3ＪH4-H3＝８．５０Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ４）；９．８４（ｄ、3ＪH8-H7＝８．００Ｈｚ、１Ｈ、Ｈ８）；９．９１（ｓ、１Ｈ、ＣＨＯ）。
【００９５】
13ＣＮＭＲ（５０ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ１１４．７３（Ｃ２）；１１６．９３（Ｃ１０）：１１８．３２（ｄ、3ＪC-P＝３．５７Ｈｚ、Ｃ５）；１２０．１３（Ｃ８）；１２３．３６（ｄ、3ＪC-P＝５．００Ｈｚ、Ｃ７）；１２３．４２（Ｃ９）：１２６．７２（Ｃ３）；１２８．３１（Ｃ４）；１４２．３５（Ｃ１）；１５８．４９（ｄ、2ＪC-P＝６．００Ｈｚ、Ｃ６）；１９８．３２（ＣＨＯ）。31Ｐ  ＮＭＲ（８１ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：δ０．５６。
【００９６】
質量分析（ＦＡＢ）：２６７、λmaxH2O（ｐＨ７．６）：３９２ｎｍ（ε５１００Ｍ-1・ｃｍ-1）、２７７ｎｍ（ε４６５０Ｍ-1・ｃｍ-1）。
【実施例２】
【００９７】
実施例２：ＦＨＮ−Ｐによるウサギ筋肉のアルドラーゼ（ＲＭ）の阻害活性
【００９８】
分析方法：
アルドラーゼ活性は、連動した酵素試験系を用いて測定した。つまり、３４０ｎｍでの、２５℃で温度を一定にしたＳＡＦＡＳ分光光度計を用いての、トリオースリン酸イソメラーゼと、ＮＡＤＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、フランス）の酸化に応じたグリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼとの系（ＴＩＭ／ＧＤＨ）である。試験は基質（Ｆｒｕ（１，６）Ｐ2；最終濃度１ｍＭ）を添加することによって開始し、トリエタノールアミン緩衝液（ＴＥＡ緩衝液）（１００ｍＭのＴＥＡ／ＨＣＩ；５０ｍＭのＮａＣｌ；１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．６；０．１５のイオン強度）の中で作成された、１ｍｌの最終的な容積に対して０．４２ｍＭのＮＡＤＨの、二つの酵素系（１０μｇ／ｍｌのＧＤＨと１μｇ／ｍｌのＴＩＭ）を含有するアルドラーゼ溶液を完成させる。組換えアルドラーゼの作成、過剰発現および精製は、Ｍｏｒｒｉｓ  Ａ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９３，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１０９５−１１００）およびＢｅｒｔｈｉａｕｍｅ  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９３（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１０８２６−１０８３５）に従って行った。
【００９９】
基質の分解率は３４０ｎｍでの吸収／分の減少を測定することで判定した。アルドラーゼは、使用前にＴＥＡ緩衝液で４℃で一晩にわたって透析した。タンパク質濃度は、吸光係数としてε280＝０．９１ｍｌ．ｍｇ-1・ｃｍ-1を用いて、分光光度計によって判定した。サブユニットの濃度は、アルドラーゼの四量体の１５９０００の分子量に基づいて判定した。
【０１００】
−反応速度論的方法：
この場合、時間に依存する可逆的な阻害（「Ｓｌｏｗ  ｂｉｎｄｉｎｇ阻害」）は、酵素Ｅと阻害剤Ｉの間での平衡が急速に形成されることに関与し、該平衡の形成の後、図１に示されている反応の概要および反応式に表されているように、最初のＥＩ複合体が形成され、それが、反応速度論的により安定したＥＩ*複合体への遅い可逆的な異性化を受けるが、該反応式において、Ｋi*は全体の阻害定数を示し、Ｋiは急速に形成されるミカエリス複合体ＥＩの解離係数を、そしてＫdはＥＩ*複合体の解離定数を示している。
【０１０１】
−時間に依存する可逆的な阻害の解析：
基質の不在の下では、ＥＩ*複合体の形成を示す、一次反応の見かけの速度定数（ｋapp）は、式（１）（図１）によって定義されている（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  Ｗａｌｓｈ，１９８８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｅｒａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，６１：２０１−３００）。
【０１０２】
ｋappの値は、阻害剤の濃度［Ｉ］が高まるときの飽和速度を反映しており、該値は、それぞれｋ-2とｋ2＋ｋ-2である下限と上限の間で変動するものである。
【０１０３】
平衡しており、［ＥＩ*］＞［ＥＩ］であるとき、式（２）（図１）が用いられるのだが、該式において、［Ｅ］tおよび［Ｉ］tは、それぞれ酵素と阻害剤の初期濃度を表しており、ＫdはＥＩ*複合体の解離定数である（Ｓｅｇａｌ  Ｉ．Ｈ．，１９７５，Ｅｎｚｙｍｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ：Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｉｌｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ）。
【０１０４】
ｋ-2がゼロに近づく極端な状況では、時間に依存する可逆的阻害剤は、活性部位に対する不可逆的阻害剤に類似することがある。この状況では、式（３）がこのタイプの阻害に用いられる（Ｍｅｌｏｃｈｅ  Ｈ．Ｐ．，１９６７，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６：２２７３−２２８０）。酵素活性の半減期（ｔ1/2）は、阻害剤の濃度の逆数の関数として定義され、縦軸をｌｎ（２／ｋ2）で通り横軸を−１／Ｋiで通る直線によってグラフで表される。
【０１０５】
実験手順：
天然アルドラーゼ（５μＭのサブユニット）を、ＴＥＡ緩衝液の中で、ＦＨＮ−Ｐ（０．０５〜１ｍＭ）の存在下でインキュベートした。酵素活性を、１０μｌのアリコートで時間に応じて分析した。
【０１０６】
不活性化速度は擬一次反応速度に従い、反応速度のパラメーターＫiおよびｋ2を、式（３）を用いて求めた。再活性化率を求めるために、アルドラーゼ（ＴＥＡ緩衝液中の２５μＭのサブユニット）を、５００μＭのＦＨＮ−Ｐと、９０％の不活性を得るまでインキュベートした。余剰の阻害剤を、ＰＭ−３０膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、限外濾過によって取り除いた。酵素−阻害剤の複合体を、ヘキシトール−Ｐ2（１０ｍＭ）を含むＴＥＡ緩衝液（最終濃度で１５μＭのサブユニット）の中でインキュベートした。アリコート（１０μｌ）を、アルドラーゼ活性を測定するために、様々な時間に回収した。
【０１０７】
対照はＦＨＮ−Ｐを用いないで手順を行うことからなる。再活性化のプロセスは、一次反応であるものとして分析した。
【０１０８】
−ＵＶ／可視光差分光法による検証
吸収スペクトルを、２５℃で温度を一定にした分光光度計Ｃａｒｙ  １Ｅ  Ｖａｒｉａｎを用いて測定した。同様のＴＥＡ緩衝液を、滴定と活性の分析に用いた。吸収スペクトルは異なった二つの方法によって測定し、該方法はとりわけ、Ｇｅｆｆｌａｕｔ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，１９８６（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４：２０４３−２０５４）およびＢｌｏｎｓｋｉ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，１９９７（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３２３：７１−７７）に記載されている。
【０１０９】
方法Ａでは、２５０ｎｍと５００ｎｍの間の波長、あるいは最大吸収または最小吸収に対応する波長で、吸収スペクトルを時間に応じて記録する。測定は、様々な最終濃度のＦＨＮ−Ｐ（０．１〜１ｍＭ）を、一定濃度のアルドラーゼ（１０μＭのサブユニット）を含むＴＥＡ緩衝液に加えることで開始した。測定した酵素複合体の吸収スペクトルは、緩衝液による吸収、ＦＨＮ−Ｐによる吸収、および酵素による吸収（個別に測定されている）によって補正した。このようにして得られた様々な吸収スペクトルを、アルドラーゼ−阻害剤の複合体の形成を規定する定数の値を求めるために用いた。
【０１１０】
方法Ｂはアミノカプロン酸によってＦＨＮ−Ｐを滴定するために用いた。一定濃度のＦＨＮ−Ｐ（１０μＭ）を含むＴＥＡ緩衝液での各分析ごとに、アミノカプロン酸を加え、様々な最終濃度（０．０１〜０．２Ｍ）を得た。様々な吸収スペクトルは、シッフ塩基の形成に対応しているのだが、様々な時間間隔で記録し、それから、緩衝液による吸収、アミノカプロン酸による吸収、そしてＦＨＮ−Ｐによる吸収（個別に測定されている）によって補正した。
【０１１１】
時間ごとの吸収データを一次反応速度式に（あるいは二つの一次反応速度機構の組み合わせに）適用して、各試験について、一次反応の見かけの速度定数（ｋapp）と最大吸収の変化（ΔＡmax）を得た。ＦＨＮ−Ｐとアミノカプロン酸の間に形成されたシッフ塩基の解離定数（Ｋd）は、式（２）を用いて平衡時に求めた吸収の差に基づいて得た。急速に形成されたＥＩ複合体の解離定数（Ｋi）の値と、ＥＩ*複合体の遅い形成に対応する定数ｋ2の値は、式（１）あるいは式（３）による一次反応速度定数の値の分析に由来するものである。
【０１１２】
変異アルドラーゼ（１０μＭのサブユニット）を用いるＵＶ／可視光差分光法によるすべての試験は、方法Ａを用いて行う。
【０１１３】
−エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＩ／ＭＳ）による検証
エレクトロスプレー質量スペクトルは、四重極型Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｍａｔ  ＴＳＱ  ７００でポジティブモードで得た。アルドラーゼ（ＴＥＡ緩衝液中の５０μＭのサブユニット）を、６０±５％の不活性に達するまで、５０μＭのＦＨＮ−Ｐとインキュベートした。余剰の阻害剤は、酢酸アンモニウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５．５）での限外濾過によって除去した。サンプルを、最終濃度が１ｍMの酢酸アンモニウムと０．５％の酢酸を含むＨ2Ｏ／メタノール（１：１、ｖ／ｖ）中で、約１０ｐｍｏｌ／μｌとなるように調製した。サンプルは、分光計のサンプルセルの内部に４μｌ／分の連続流でロードした。
【０１１４】
結果
−ＦＨＮ−Ｐによる、アルドラーゼの、時間に依存する可逆的な阻害。
【０１１５】
ウサギ筋肉のアルドラーゼをＦＨＮ−Ｐとインキュベートすると、一次反応速度に従って、酵素活性が低下した。
【０１１６】
アルドラーゼの強力な拮抗阻害剤である、基質Ｆｒｕ（１，６）Ｐ2、および基質の類似物であるヘキシトール−Ｐ2は、ＦＨＮ−Ｐによる不活性化から酵素を保護しており（表１）、該保護は、酵素の活性部位のところにおいて生じる阻害に対応している。
【０１１７】
実験条件および行った測定は以下の表１にまとめられており、以下の通りである。すなわち、ウサギ筋肉の天然アルドラーゼ（ＲＭ）（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、ＴＥＡ緩衝液（最終体積１ｍｌ；ｐＨ７．６）中で、一定濃度のＦＨＮ−Ｐ（２５０μＭ）の存在下で、Ｆｒｕ（１，６）Ｐ2またはヘキシトール−Ｐ2（１ｍＭ）がある状態とない状態でインキュベートし、アリコートの酵素活性を８０分のインキュベートの後に分析した。
【０１１８】
比較として、同一の実験条件（表１に記載）において、ＦＨＮ−Ｐのリン酸化されていない類似物（２５０μＭの１，６−ジヒドロキシ−２−ナフトアルデヒドすなわちＤＨＮＡ）は完全に不活性であり、このことは、酵素の活性部位へのＦＨＮ−Ｐの固定におけるリン酸基の機能的関与を強く示唆している。速度パラメーターは、式（３）に従って様々な濃度の阻害剤（０．０１〜１．５ｍＭ）について測定される、一次反応の見かけの速度定数（ｋapp）を導き出すものであり、該パラメータは表２にまとめられている。
【０１１９】
【表１】
2007516184.tif 000015
【０１２０】
【表２】
2007516184.tif 000016
【０１２１】
ＦＨＮ−Ｐが存在せず飽和濃度のヘキシトール−Ｐ2（１０ｍＭ）を含む溶液中において、不活性化した酵素をインキュベートすると、酵素活性は部分的に回復した。酵素活性の回復を反映する、一次反応速度定数の値（ｋ-2＝１．３±７・１０-5ｍｉｎ-1）は、不活性化定数ｋ2の１０-4倍である。
【０１２２】
従って、ＦＨＮ−Ｐは時間に依存する可逆的な阻害剤として振る舞う。表２に示された値によると、全体の解離定数Ｋi*は４０±２０ｎＭと概算することができる。また、酵素活性は、水素化ホウ素ナトリウムによって酵素−阻害剤複合体を処理した後では、回復することができず、このことは、ＦＨＮ−Ｐによる阻害メカニズムが、活性部位のリジン残基とのシッフ塩基の形成を引き起こすことを示唆している。
【０１２３】
−ＦＨＮ−Ｐとアミノカプロン酸の相互作用
ＦＨＮ−Ｐおよびアルドラーゼのリジン残基のε−アミノ基をシッフ塩基の形成に対するモデルと考え、参照としてＦＨＮ−Ｐ（１０μＭ）とアミノカプロン酸（０．１〜１ｍＭ）とを反応させ、続いてＵＶ／可視光差分光法を行った。図３（上方部分）に示されている反応モデルは、４２５ｎｍ（Δε  ３７３０±２００Ｍ-1・ｃｍ-1）と２９１ｎｍ（Δε  １３０８０±７００Ｍ-1・ｃｍ-1）での二つの極大に対応する、ＵＶ／可視光差分光法での吸収の変化を特徴としているが、これはシッフ塩基の形成によるものである。この反応モデルはまた、共有結合複合体の内部におけるＦＨＮ−Ｐの減少により生じる、３６７ｎｍ（Δε  −７４０±５０Ｍ-1・ｃｍ-1）と２６７ｎｍ（Δε  −５６５０±３００Ｍ-1・ｃｍ-1）での二つの極小も特徴としている。３８８ｎｍ、３４３ｎｍおよび２７６ｎｍに等吸収点があるということは、中間物が生じておらず、副反応もないことを示している。平衡での差吸収の変化は、アミノカプロン酸の濃度が高まると飽和し（図２）、これらの各濃度についての反応速度は、擬一次反応機構の反応速度に類似し、二次反応の定数、２５℃で０．１２±０．０１Ｍ-1・ｍｉｎ-1であるｋ2ndに対応している。ＦＨＮ−Ｐ−アミノカプロン酸複合体の解離定数Ｋdの値は、１６±３ｍＭ（図２）である。
【０１２４】
ＦＨＮ−Ｐとウサギ筋肉のアルドラーゼの間の相互作用
ＦＨＮ−Ｐ（最終濃度０．１〜１ｍＭ）を天然アルドラーゼ（１０μＭのサブユニット）を含む溶液に加えると、得られたＵＶ／可視光差スペクトルは、４３１ｎｍと２９３ｎｍでの極大、３７６ｎｍと２６８ｎｍでの極小、そして４０１ｎｍと２７９ｎｍでの等吸収点を有している（図３、下方部分）。反応モデルでのバンドの位置のわずかな差の原因は、モデルの系ごとのＦＨＮ−Ｐのタンパク質環境の差によるものと言える。差吸収スペクトルの発達は、別個の一次反応の二つの機構に合わせて生じる。早い反応速度の相は、吸収の変化がより大きくなり、そして酵素活性の全体的な低下に相関して、阻害剤の濃度が高くなると飽和する。遅い反応速度の相もまた、分析をヘキシトール−Ｐ2の飽和濃度（１０ｍＭ）で行った際に見られた。この遅い反応速度の相は、三十倍小さな定数に対応し、吸収の最終的な変化の四分の一に寄与するものだが、見られた阻害に関連するものではない。これらの飽和濃度では、結合したＦＨＮ−Ｐについてのモル吸光係数は、アルドラーゼの四つの活性部位が塞がっていると仮定して計算した。すなわち、Δε431＝３６００±２００Ｍ-1・ｃｍ-1；Δε376＝−２１４０±１１０Ｍ-1・ｃｍ-1；Δε293＝１２４８０±６５０Ｍ-1・ｃｍ-1およびΔε268＝５０８０±２５０Ｍ-1・ｃｍ-1である。
【０１２５】
最大の阻害についての、ＦＨＮ−Ｐがアルドラーゼに結合する化学量論は、アミノカプロン酸−ＦＨＮ−Ｐ複合体による様々な分子吸光と一致しており、該化学量論により、四量体アルドラーゼ１モルに３．９〜４．２モルのＦＨＮ−Ｐが結合したＥＩ*複合体が予測される。
【０１２６】
ＥＩ*複合体の形成を特徴づける反応速度パラメーターＫiおよびｋ2を、図４に示されたデータに基づいて、式（１）または式（３）によって求め、Ｋi＝１２５±２５μＭ、ｋ2＝０．０６７±０．００４ｍｉｎ-1およびｔ1/2〜６ｍｉｎという値を得る。
【０１２７】
これらの結果に基づいて計算された全体の阻害定数Ｋi*は２５±１５ｎＭである。
【０１２８】
−エレクトロスプレー質量分析によるアルドラーゼ−ＦＨＮ−Ｐ複合体の分析。
アルドラーゼ−ＦＨＮ−Ｐ複合体のエレクトロスプレー質量分析による分析により、アルドラーゼのモノマー（３９２１２Ｄａ）に対応する分子量、シッフ塩基の形態のアルドラーゼのサブユニットとＦＨＮ−Ｐとの間の二元複合体（３９４６０Ｄａ）に対応する分子量、および、アルドラーゼのサブユニットと２分子のＦＨＮ−Ｐとの間における微量の三元複合体（３９７１２Ｄａ）に対応する分子量が得られた（図５）。
【０１２９】
−変異ＲＭアルドラーゼとＦＨＮ−Ｐの間における相互作用
１０７、１４６および２２９リジン残基はアルドラーゼの活性部位のところに位置しており、従って、ＦＨＮ−Ｐとのシッフ塩基の形成を介した不活性化を実現するための候補である。ＦＨＮ−Ｐの存在下での差吸収に関与するリジンを同定するために、Ｋ１０７Ｍ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ）、Ｋ１４６Ｍ（Ｂｌｏｎｓｋｉ  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２３：７１−７７）およびＫ２２９Ｍ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ）と命名されている、これらのリジン残基の一時的な変異体を作成する。Ｋ１０７Ｍ、Ｋ２２９Ｍおよび天然酵素の原子位置の比較は、これらの構造変異体が、野生型酵素に対して同型であることを示している（天然アルドラーゼに対する原子位置の標準偏差（「ＲＭＳ偏差」）は、構造体Ｋ１０７ＭおよびＫ２２９Ｍについて、それぞれ０．４１Åおよび０．４８Åである）。ＵＶ／可視光差分光法（方法Ａ）を、一定濃度のＦＨＮ−Ｐ（３００μＭ）の存在下で、一時的な変異体のそれぞれについて酵素複合体の形成を調べるために用いた。４３１ｎｍで得られたデータの分析が表３に示されている。
【０１３０】
【表３】
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【０１３１】
変異体Ｋ２２９Ｍについて見られた差スペクトルは、野生型アルドラーゼで見られたスペクトルと同一である。反応の進行は、別個の一次反応の二つの機構によって立証することができる。反応速度パラメーターおよび形成されたＥＩ*複合体のレベルは、野生型酵素で得られたパラメーターおよびレベルと同一であり、このことから、Ｌｙｓ−２２９は、シッフ塩基の形成を直接的に担うリジン残基ではない。
【０１３２】
比較として、変異体Ｋ１０７ＭとＦＨＮ−Ｐの差スペクトルは遅い反応速度の相を示しており、該相の定数と最大吸収は、野生型酵素で見られた遅い相の値と同一である。酵素阻害がないことに加えて急速な相がないことは、時間に依存する可逆的な阻害現象にＬｙｓ−１０７が関与することを証明している。
【０１３３】
変異体Ｋ１４６ＭのＦＨＮ−Ｐとの反応は、結果として平衡における吸収の全体的な変化を有しており、該変化は、野生型アルドラーゼで見られるものに匹敵する（表３）。酵素阻害に関連する反応速度の相は、一次反応の機構に対応はしているが、シッフ塩基の非常に遅い形成による、野生型アルドラーゼの場合に見られるものとは異なっている。従って、Ｌｙｓ−１４７をメチオニンで置換すると、形成されるＥＩ*複合体の割合が顕著に減少するのだが、複合体を形成する変異体の能力は変化しない。このように、Ｌｙｓ−１４６はシッフ塩基の形成には必要ではないが、該形成を著しく助長する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】反応の概要および反応式を示した図。
【図２】アミノカプロン酸の濃度と差吸収の関係を示したグラフ。
【図３】ＵＶ／可視光差スペクトルを示したグラフ。
【図４】見かけの速度定数を示したグラフ。
【図５】エレクトロスプレー質量分析の結果を示したグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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