(57)【要約】  本発明は神経幹細胞の増殖を促進させるための方法と組成物を含む。また、神経幹細胞(NSC)でMHC分子の発現を調節するための方法も本発明に含まれる。
2007520233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)単離された骨髄ストローマ細胞(BMSC)、及び(b)神経幹細胞(NSC)増殖培地と前記BMSCによって分泌された因子を含むケミカリー・ディファインド培地を含む組成物。
【請求項２】
前記培地が、外因性白血病抑制因子(LIF)を含まない請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記因子が、増殖因子、栄養因子、及びサイトカインから成る群から選ばれる請求項１の組成物。
【請求項４】
前記因子が、LIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質4(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-1(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3から成る群から選ばれる請求項１の組成物。
【請求項５】
さらに単離されたNSCを含む請求項１の組成物。
【請求項６】
前記NSCが、前記BMSCと物理的に接触している請求項５の組成物。
【請求項７】
前記NSCが、前記BMSCと物理的に接触していない請求項５の組成物。
【請求項８】
前記NSCが、ヒトの中枢神経系由来である請求項５の組成物。
【請求項９】
前記BMSCが、ヒト由来である請求項１の組成物。
【請求項１０】
前記NSCに外因性の遺伝物質が導入されている請求項５の組成物。
【請求項１１】
前記BMSCに外因性の遺伝物質が導入されている請求項１の組成物。
【請求項１２】
神経幹細胞(NSC)増殖培地と単離されたBMSCによって分泌された因子を含むケミカリー・ディファインド培地を含む骨髄間質性細胞調整培地(BMSC-CM)。
【請求項１３】
前記BMSC-CMが、外因性LIFを含まない請求項１２のBMSC-CM。
【請求項１４】
前記因子が、増殖因子、栄養因子、及びサイトカインからなる群から選ばれる請求項１２のBMSC-CM。
【請求項１５】
前記因子が、LIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質4(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-1(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3から成る群から選ばれる請求項１２のBMSC-CM。
【請求項１６】
単離されたNSCにおける主要組織適合性複合体(MHC)分子の発現を調節する方法であって、単離されたBMSC及び単離されたNSCを含む細胞の共培養を含む方法。
【請求項１７】
前記細胞が、外因性LIF非存在下で共培養される請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記NSCが、前記BMSCと物理的に接触している請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記NSCが、前記BMSCと物理的に接触していない請求項１６の方法。
【請求項２０】
前記NSCが、ヒトの中枢神経系由来である請求項１６の方法。
【請求項２１】
前記BMSCが、ヒト由来である請求項１６の方法。
【請求項２２】
前記NSCに外因性の遺伝物質が導入されている請求項１６の方法。
【請求項２３】
前記BMSCに外因性の遺伝物質が導入されている請求項１６の方法。
【請求項２４】
単離されたNSCにおけるMHC分子の発現を調節する方法であって、骨髄間質性細胞調整培地(BMSC-CM)を使用する前記NSCの培養を含み、前記BMSC-CMが、NSC増殖培地と前記BMSCによって分泌された因子を含む方法。
【請求項２５】
前記BMSC-CMが、外因性LIFを含まない請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記BMSC-CMに、BMSCが本質的に存在しない請求項２４の方法。
【請求項２７】
前記因子が、増殖因子、栄養因子、およびサイトカインからなる群から選ばれる請求項２４の方法。
【請求項２８】
前記因子が、LIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質4(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-1(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3から成る群から選ばれる請求項２４の方法。
【請求項２９】
前記NSCが、ヒトの中枢神経系由来である請求項２４の方法。
【請求項３０】
前記NSCに外因性の遺伝物質が導入されている請求項２４の方法。
【請求項３１】
単離されたBMSCと単離されたNSCの細胞の共培養方法により作製された単離NSC。
【請求項３２】
前記NSCのMHCクラスI分子の発現が低下している請求項３１の単離NSC。
【請求項３３】
前記NSCのMHCクラスII分子がベースラインレベルを示す請求項３１の単離NSC。
【請求項３４】
前記NSCが、ヒトの中枢神経系由来である請求項３１の単離NSC。
【請求項３５】
前記NSCに外因性の遺伝物質が導入されている請求項３１の単離NSC。
【請求項３６】
単離NSCをBMSC-CMで培養することにより作製された単離NSCであって、前記BMSC-CMが、NSC増殖培地と単離されたBMSCによって分泌された因子を含むケミカリー・ディファインド培地を含んでいる単離NSC。
【請求項３７】
前記NSCのMHCクラスI分子の発現が低下している請求項３６の単離NSC。
【請求項３８】
前記NSCのMHCクラスII分子がベースラインレベルを示す請求項３６の単離NSC。
【請求項３９】
前記NSCが、ヒトの中枢神経系由来である請求項３６の単離NSC。
【請求項４０】
前記NSCに外因性の遺伝物質が導入されている請求項３６の単離NSC。
【請求項４１】
(a)単離NSC
(b)単離BMSC
(c)前記単離BMSCから分泌された因子を含むNSC増殖培地、及び
(d)前記NSC及び前記BMSCが、相互に物理的に接触した状態になることを防ぐための手段
を含む神経細胞の培養装置。
【請求項４２】
さらに、前記NSC及び前記BMSCが相互に物理的に接触した状態になることを防ぐためのフィルター又は膜を備える請求項４１の装置。
【請求項４３】
前記フィルター又は膜が、前記BMSCから分泌された因子が前記フィルター又は膜を透過することを可能とする細孔を有する請求項４２の装置。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
骨髄は少なくとも2つのタイプの幹細胞、すなわち造血幹細胞、並びに間葉幹細胞、骨髄系幹細胞(MSC)又は骨髄ストローマ細胞(BMSC)と様々に呼ばれる非造血組織の幹細胞を含む。本明細書では、これらの用語は同意語として用いる。MSCは骨髄の少量の吸引で容易に分離され、単一細胞由来のコロニーを容易に形成するので、興味深いものである。単一細胞由来のコロニーは、約10週間で50回もの倍加を経て増殖することができ、そして、骨芽細胞、含脂肪細胞、軟骨細胞(非特許文献１;非特許文献２;非特許文献３;非特許文献４)、筋細胞(非特許文献５)、星状細胞、乏突起神経膠芽細胞（オリゴデンドロサイト）、及びニューロン(非特許文献６;非特許文献７;非特許文献８;非特許文献９)に分化することができる。
【０００２】
更に又、MSCは三胚葉すべての細胞を発生させる(非特許文献７;非特許文献１０;非特許文献１１;非特許文献１２;非特許文献１３)。純粋なMSCの細胞群のみならず、骨髄由来の非分割細胞が肺の上皮細胞を含む上皮細胞タイプを発生させることを、生体内実験の証拠は示しており(非特許文献１４;非特許文献１５)、また、組織損傷によってMSCの移植が促進されることを、最近のいくつかの研究が示した(非特許文献１６;非特許文献１７)。これらの理由により、現在、多くのヒトの病気の細胞治療及び遺伝子治療にMSCが利用できる可能性が検討されている(非特許文献１８;非特許文献１９)。
【０００３】
MSCは多能性幹細胞の代替源となるものである。生理条件下においては、それらは様々な細胞接着分子と共に骨髄の構造を維持し、サイトカインから成る分泌物と共に血液新生を調節する(非特許文献２０)。骨髄から成長したMSCは、その組織培養プラスチックへの選択的付着によって効率的に増殖させることができ(非特許文献６;非特許文献２１)、また遺伝子操作も可能である(非特許文献２２)。
【０００４】
また、MSCは骨(非特許文献２３)、軟骨(非特許文献２４)、脂肪(非特許文献２３)、及び筋肉(非特許文献５)を含む多様な中胚葉組織に分化することができることから、間葉系幹細胞とも呼ばれる。さらに、神経マーカーを発現する神経様細胞へと分化することが報告され（非特許文献９;非特許文献２５;非特許文献２６）、そのことから、MSCは胚葉の拘束性を克服する可能性が示唆されている。
【０００５】
幹細胞は、所定の組織、所定の時間において広範囲な発生能を有し、自己再生する多分化能前駆細胞である(非特許文献２７)。神経系の発生を理解する重要性の理由のみならず、神経変性疾患治療における治療の可能性の理由からも、最近、神経系の幹細胞の研究からの多くの関心が起こっている。
【０００６】
胚性幹細胞、及び他の幹細胞株を単離し、維持するための現行の方法は、支持細胞層としてネズミ胎児線維芽細胞（MEF）を用いることに依存している。胚性幹細胞のクローンの頻度は、培養液中で血清代替品を用いると数倍に増加することが報告されている（非特許文献２８）。クローン胚性幹細胞の未分化状態を維持した増殖には、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の存在が不可欠である。ヒト胚性幹細胞の単離、培養、及び増殖のための現行の方法は、そのネズミ胎児線維芽細胞支持細胞層への依存のために制限されている。また、依然として支持細胞不存在下では、幹細胞が未分化状態で無期限に維持され得るということが実証されていない。
【０００７】
ヒト胎児の脳幹細胞の増殖速度を改良するために、多くの異なるグループによっていくつかの違なる方法および増殖因子(GF)が、過去十年間、用いられてきた。bFGFと上皮増殖因子(EGF)がヒト胎児神経幹細胞(hNSC)の増殖と維持に必要であることが示された。通常、これらヒトNSC培養は遊離の浮遊細胞塊（ニューロスフェア）として増殖させるが、ニューロスフェアはbFGF及びEGFのみでは無期限には増殖できない。白血病抑制因子（LIF）がFGF及びEGF反応性NSCの増殖速度を上げ、寿命を長引かすことが示された(カーペンター他、1999及びライト他、2003)。増殖速度を制御することに加えて、LIFはNSCの主要組織適合性複合体（MHC）分子を含むいくつかの遺伝子をダイナミックに制御している（ライト他、2003)。
【０００８】
ヒト胎児脳幹細胞は、損傷組織再生のための幹細胞移植の魅力的な候補として考えられている。胚、又は胎児ドナー由来の幹細胞は同種異系移植を必要とする。遺伝的に異なる個体間の細胞移植は、宿主による移植片拒絶のリスクを常に伴っている。大半の細胞は、主要組織適合性複合体、MHCクラスI分子の生成物を発現している。さらに、多くの細胞タイプは、炎症性サイトカインに曝されたときに、MHCクラスII分子の発現へ誘導されやすい。同種異系移植片拒絶反応は、主としてCD4とCD8サブクラス両方のT細胞によって媒介される(非特許文献２９)。アロ反応性のCD4T細胞は、アロ抗原に対する細胞溶解性のCD8反応を増悪させるサイトカインを産生する。これらのサブクラスの中で、抗原刺激の後に競合亜集団細胞が発生し、これはそれらが産生するサイトカインによって特徴付けられる。IL-2およびIFN-γを産生するTh1細胞は、主に同種異系移植片拒絶に関与している(非特許文献３０)。IL-4およびIL-10を産生するTh2細胞は、IL-10を介してTh１反応をダウンレギュレートすることができる(非特許文献３１)。実際、望ましくないTh1反応を回避しTh２経路へ向かわせるために多くの労力が費やされている。患者の移植片に対する望ましくないアロ反応性Ｔ細胞の反応は、一般的にはプレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリンAのような免疫抑制剤で治療される。残念ながら、これらの薬剤は一般的に、患者の命のために投与される必要があるが、全身性の免疫抑制を含む多くの危険な副作用を有している。
【０００９】
神経幹細胞は、低いか、ごく僅かなレベルしかMHCクラスI、及び／又はクラスII抗原を発現しない(非特許文献３２)が、通常これらの細胞は、免疫抑制剤を使わなければ同種異系のレシピエントへの移植後に拒絶される。おそらく、IFNファミリーである炎症性サイトカインに曝露された後にMHC分子が細胞膜上でアップレギュレートされ、その後拒絶が開始される。
【非特許文献１】A.J.フライデンシュタイン他、1970 Cell Tissue Kinet. 3: 393-403
【非特許文献２】H.カストロ-マラスピーナ他、1980 Blood 56: 289-301
【非特許文献３】N.N.ベレスフォード他、1992 J. Cell Sci. 102:341-351
【非特許文献４】D.J.プロコップ1997 Science 276: 71-74
【非特許文献５】S.Wakitani他、1995 Muscle Nerve 18: 1417-1426
【非特許文献６】S.A.アジジ他、1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3908-3913
【非特許文献７】G.C.コーペン他、1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 10711-10716
【非特許文献８】M.チョップ他、2000 NeuroreportII, 3001-3005
【非特許文献９】D.ウッドベリー他、2000 Neuroscience Res. 61: 364-370
【非特許文献１０】ライチティー,K.W他、2000 Nature Med. 6: 1282-1286
【非特許文献１１】コットン,D.N他、2001 Development 128: 5181-5188
【非特許文献１２】トーマ,C他、2002 Circulation 105: 93-98
【非特許文献１３】ヤン,Y他、2002 Nature 418:41-49
【非特許文献１４】クラウジー他、2001 Cell 105: 369-377
【非特許文献１５】ピーターセン他、1999 Science 284: 1168-1170
【非特許文献１６】フェラーリ,G他、1998 Science 279: 1528-1530
【非特許文献１７】Okamoto,R他、2002 Nature Med. 8: 1101-1017
【非特許文献１８】ホロウィッツ他、1999 Nat. Med. 5: 309-313
【非特許文献１９】キャプラン他、2000 Clin. Orthoped. 379: 567-570
【非特許文献２０】クラーク,B.R.及びキーティング,A.1995 Ann NY Acad Sci 770: 70- 78
【非特許文献２１】コルター , D. C他、2000 Proc Natl Acad Sci USA 97: 3213-218
【非特許文献２２】シュワーツ、E.J他、1999 Hum Gene Ther 10: 2539-2549
【非特許文献２３】ベレスフォード, J. N他、1992 J Cell Sci 102: 341-351
【非特許文献２４】レノン, D. P他、1995 Exp Cell Res 219: 211-222
【非特許文献２５】サンチェス−ラモス, J他、2000 Exp Neurol 164:247-256
【非特許文献２６】デン,W他、2001 Biochem Biophys Res Commun 282:148-152
【非特許文献２７】モリソン他、1997 Cell 88: 287-298
【非特許文献２８】アミット他、2000 Dev Biol 227:271-278
【非特許文献２９】ローゼンバーグ他、1992 Annu. Rev. Immunol. 10: 333
【非特許文献３０】モスマン他、1989 Annu. Rev. Immunol. 7: 145
【非特許文献３１】フィオレンティーノ他、1989 J. Exp. Med. 170:2081
【非特許文献３２】マクラーレン他、2001 J. Neuroimmunol. 112:35
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、治療のためのNSCの増殖を最大にする培養条件の標準化、及びNSCの多分化能が非常に必要となる。さらに現在では、NSCの移植の成功は、NSCの宿主拒絶を防ぐための、免疫効果細胞により仲介されるNSCに対する望ましくない免疫反応の阻止、及び／又は低減によると考えられている。即ち、遺伝的に異なる個体間でのNSCの移植に付随する望ましくない免疫反応を抑制、又は阻止する方法が、長い間求められている。本発明はこの要求を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、神経幹細胞(NSC)を培養するための組成物と方法を含む。また本発明は、そのような組成物と方法によって生産される細胞を含む。
【００１２】
本発明は、単離された骨髄ストローマ細胞（BMSC）並びに神経幹細胞（NSC）増殖培地及び前記BMSCによって分泌された因子を含むケミカリー・ディファインド培地を含む組成物を包含する。
【００１３】
一態様によれば、該培地は外因性の白血病抑制因子(LIF)を含まない。
【００１４】
別の態様によれば、BMSCによって分泌された因子は、増殖因子、栄養因子、及びサイトカインから成る群から選択される。
【００１５】
さらに別の態様によれば、該因子はLIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体（EGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質４(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-１(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3から成る群より選択される。
【００１６】
また本発明は、神経幹細胞（NSC）増殖培地を含むケミカリー・ディファインド培地において、BMSCをNSCと共培養することを包含する。
【００１７】
一態様によれば、該BMSCが該NSCと物理的に接触している接触依存性の方法でBMSCとNSCは培養される。
【００１８】
別の態様によれば、該BMSCが該NSCと物理的に接触していない接触非依存性の方法でBMSCとNSCは培養される。
【００１９】
更なる態様によれば、NSCはヒトの中枢神経系由来である。
【００２０】
更に別の態様によれば、BMSCはヒト由来である。
【００２１】
もうひとつの態様によれば、外因性の遺伝物質が本発明の細胞に導入されている。
【００２２】
本発明は、神経幹細胞（NSC）増殖培地、及び単離されたBMSCによって分泌された因子を含むケミカリー・ディファインド培地を含む骨髄ストローマ細胞調整培地(BMSC-CM)をも包含する。
【００２３】
一態様によれば、該BMSC-CMは外因性LIFを含まない。
【００２４】
別の態様によれば、該BMSC-CMにBMSCは本質的に存在しない。
【００２５】
更に、本発明の別の態様によれば、該BMSC-CMは増殖因子、栄養因子、及びサイトカインからなる群から選択される因子を含む。
【００２６】
さらに別の態様によれば、BMSC-CMはLIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体（EGF）、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-1ra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質４(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-１(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3から成る群より選択される。
【００２７】
また、本発明は、単離されたNSCにおける主要組織適合性複合体(MHC)分子の発現を調節する方法を包含する。
【００２８】
一態様によれば、単離されたNSCと単離されたBMSCの共培養は、該NSCにおけるMHC分子の発現を調節する。
【００２９】
別の態様によれば、NSCにおけるMHC分子の発現は、BMSC-CMでNSCを培養することによって調節できる。
【００３０】
本発明はBMSCとNSCの共培養から調製された単離NSCを包含する。
【００３１】
本発明の一態様によれば、本発明の方法で作製されるNSCはMHCクラスI分子の発現低下を示す。
【００３２】
別の態様によれば、本発明の方法で作製されるNSCはMHCクラスII分子のベースラインレベルを示す。
【００３３】
また本発明は、単離NSC、単離BMSC、NSC増殖培地、及び該NSCと該BMSCが相互に物理的に接触した状態になることを防ぐための手段を含む神経細胞培養装置をも包含する。
【００３４】
別の態様によれば、該装置はさらにNSCとBMSCが相互に物理的に接触した状態になることを防ぐためのフィルター又は膜を備える。
【００３５】
もうひとつの態様によれば、該フィルター又は膜は前記BMSCから分泌される因子が前記フィルター又は膜を透過することを可能とする細孔を有する。
【００３６】
本発明を説明するために、本発明のある実施例を添付図で表す。しかし、本発明は、図に表された実施例の装置と手段のみに限定されるものではない。
【００３７】
図１は、BMSC培地(DMEM-低グルコース、10%ロット検査済み胎児ウシ血清(FBS))又は、NSC培地(DMEM-F12、N2添加、EGF20ng/ml、bFGFlOng/ml、ヘパリン8μg/ml、ペニシリン-ストレプトマイシン(P/S))でのBMSCの増殖を示すグラフである。
図２Ａ乃至２Ｃは、ニューロスフェア状に増殖するNSCを示す一連の画像である。図２Ｂと２Ｃは外因性の白血病抑制因子（LIF）存在下において増殖したNSCを示す。図２Ａは外因性のLIFの非存在下において増殖するニューロスフェアを示す。
図３Ａ乃至３Ｄは、外因性のLIFの存在下(図３Ｃ及び３Ｄ)、並びに非存在下(図３Ａ及び３Ｂ)におけるBMSCとNSCの共培養を示す一連の画像である。
図４Ａ乃至４Ｈは、BMSCと共培養中のNSCによるネスチン及びグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)発現を示す、分化前の一連の画像である(図４Ａ-４Ｆ)。図４Ｇ及び４Ｈは単独で培養されたBMSCによるネスチンおよびGFAPの非存在を示す。
図５Ａ乃至５Ｄは、BMSC上で増殖したNSCが神経細胞、及び星状膠細胞へ分化する能力を保有することを示す一連の画像である。図５Ａ乃至５Ｄは、分化した共培養物のMAP2-GFAP-DAPI染色を示す。MAP２は細胞骨格タンパク質である。DAPIは核を染色する4',6'-ジアミノ-2-フェニルインドール塩酸塩である。
図６は、分化後にごく僅かなネスチン発現を示している分化した共培養物のネスチン-GFAP染色を示す画像である。
図７は、分化したNSCのMAP2-GFAP染色を示す画像である。
図８Ａ及び８Ｂは、神経マーカーおよび星状膠細胞マーカーのごく僅かな発現を示す分化BMSCのMAP2-GFAP-DAPI染色を示す一連の画像である。
図９Ａ及び９Ｂは、BMSC除去後のNSCの表現型を示す一連のFACS解析グラフである。図９Ａは、2％未満の細胞がCD-105(BMSCマーカー)陽性であることを示す。図９Ｂは、90％を超える細胞がCD133陽性であることを示す。
図１０Ａは、BMSCによるネスチン非存在下発現を示す一連のFACS解析グラフである。図１０Ｂは、BMSC支持細胞を用いた共培養から単離されたNSCによるネスチン発現を示す一連のFACS解析グラフである。
図１１は、BMSC上で増殖するNSCがニューロンおよび星状膠細胞に分化する多能性を保有していることを示す画像である。
図１２は、BMSCの存在下あるいは非存在下におけるトランスウェル（登録商標）中のNSCの増殖を示すグラフである。
図１３Ａは、トランスウェル（商標）中のBMSCの存在下、コーティングしていないプレート上で増殖したNSCを示す画像である。図１３Ｂは、トランスウェル（商標）中のBMSCの非存在下において、コーティングしていないプレート上で増殖したNSCを示す画像である。
図１４Ａは、骨髄ストローマ細胞調整培地(BMSC-CM)を用いて培養されたNSCを示す画像である。図１４Ｂは、骨髄ストローマ細胞調整培地(BMSC-CM)を用いて培養されたNSCを示す画像である。図１４Ｃは、外因性LIFの存在下においてNSC培地で培養されたNSCを示す画像である。図１４Ｄは、外因性LIFの非存在下においてNSC培地で培養されたNSCを示す画像である。
図１５は、NSCの増殖において、外因性LIFを有する又は有さない標準NSC培地と比較したBMSC-CMの効果を示すグラフである。BMSC-CM1は、EGF及びFGFの存在するNSC培地で培養されたBMSCによる培地である。BMSC-CM２はEGF及びFGFの存在しないNSC培地で培養されたBMSCによる培地である
図１６Ａ乃至１６Ｄは、異なる二人のドナーのBMSCを用いた共培養から分離されたNSCの表現型プロファイルを示す一連のFACS解析グラフである（図１６Ａ及び１６Ｂ）。図１６Ｃと図１６Ｄは、各々、BMSCを有さないNSC培地、もしくは外因性LIFを有するNSC培地で培養したNSCの表現型プロファイルを示す一連のグラフである。
図１７Ａ乃至１７Ｄは、外因性LIFの存在下および非存在下のNSC培地で培養したNSCの表現型、並びに増殖因子存在下および非存在下のBMSC-CMで培養したNSCの表現型を示す一連のFACS解析グラフである。図１７Ａ乃至１７Ｄは、各々、CD56、CD133、MHCクラスII分子、及びMHCクラスI分子のプロファイルを示している。
図１８Ａ乃至１８Ｄは、外因性LIFの存在下(図１８Ｂ)、および非存在下(図１８Ａ)においてNSC培地で培養したNSCの表現型、並びに完全NSC培地でBMSCと共培養したNSCの表現型(図１８Ｃ及び１８Ｄ)を示す一連のFACS解析グラフである。図１８は、種々の条件下で培養されたNSCによるMHCクラスIおよびクラスII分子の発現を示している（黒：アイソタイプコントロール；灰色：クラスIまたはクラスII）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
本発明は、神経幹細胞（NSC）の増殖を誘導及び／又は促進すると同時にその多分化能を維持するための組成物および方法を含む。また、本発明は、NSCによるMHC分子の発現を調節するための組成物および方法も包含する。
【００３９】
本発明は、骨髄ストローマ細胞(BMSC)がNSCの増殖を支持するための支持細胞層として働くことができるという発見に関する。そのため、本発明はNSCを培養するための支持細胞層としてBMSCを使い、NSCの増殖を誘導及び／又は促進するためと同様にその多分化能を維持するための組成物および方法を含む。
【００４０】
それに加え、増殖の向上のために外因性のLIFを補充した神経幹細胞培地（NSC培地）において、BMSC支持細胞層非存在下で培養されたNSCによるMHC分子発現と比較すると、BMSC支持細胞層上で共培養したNSCによるMHC分子発現のアップレギュレーション及び／又は発現誘導は低下していることを、本開示は示す。すなわち、本発明は、NSCの培養及び増殖のための支持細胞層としてBMSCを用いたNSCによるMHC分子の発現の減少及び／又は阻止のための組成物と方法を含む。
【００４１】
本明細書で開示したデータは、さらにBMSCは、NSCが多分化能を維持しながら増殖するに有用な、特に増殖因子、栄養因子、及び／又はサイトカインを分泌することを示す。BMSCによって分泌される因子は、ある期間内に培地中でBMSCを培養する方法、及び使用するためにその後、調整培地を回収する方法により得ることができる。従って、本発明はまた、NSCの多分化能を維持しながらの増殖に有用である骨髄ストローマ細胞調整培地(BMSC-CM)を含む。
【００４２】
また本発明は、BMSC-CM中に存在するBMSC分泌因子が、NSCによるMHC分子発現のアップレギュレーション及び／又は発現誘導を低下させるという発見に関する。よって、本発明は、NSC上のMHC分子発現のアップレギュレーションを欠如、及び／又は低下させた状態でBMSC-CMを用いてNSCを増殖させるための組成と方法を含む。
【００４３】
従って、本発明は、治療に有用なNSCを産生するための方法および組成を含む。すなわち、本発明は、中枢神経系の疾患、障害あるいは症状に悩まされている患者を治療するために有用なNSCを生産するための組成と方法を含む。その方法は、NSCを培養および増殖するステップ、並びに患者にNSCを投与するステップを含む。
【００４４】
（定義）
本明細書において、次の用語はこのセクションで使われる意味を有する。
【００４５】
本明細書で使用される冠詞「ひとつの」（“a”and“an”）は、冠詞の文法上の対象が、1又は１を超える（すなわち、少なくとも1の）であることを示す。一例として、「ひとつの（an）要素」は1の要素か1以上の要素を意味する。
【００４６】
用語「約」は通常の知識を有する当業者には当然のことながら、使用される文脈である程度異なる。
【００４７】
本明細書で使用される用語「自己の」は、再導入される個体と同一の由来のあらゆる物質を言うものである。
【００４８】
本明細書で使用される用語「同種異系の」は、同じ種の異なる個体由来のあらゆる物質を言うものである。
【００４９】
本明細書で使用される用語「骨髄ストローマ細胞」、「ストローマ細胞」、「間充織幹細胞」又は「MSC」は同義的に用いられ、また骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞の幹細胞様前駆体として働くことができ、プラスチック皿に付着する能力により骨髄から単離される骨髄中の細胞の小分画を言うものである。骨髄ストローマ細胞は、あらゆる動物由来で有り得る。いくつかの実施例においては、ストローマ細胞は、霊長類、好ましくは人間由来である。
【００５０】
本明細書で使用される「分化した」は、細胞が完全に成熟し、また生物学的特化、並びに/又は、特定の環境、及び/もしくは機能への適合を示す程に成熟化の最終段階に達した細胞を言うものである。通常、分化した細胞は、与えられた細胞の中で、分化関連タンパク質をコードした遺伝子発現によって特徴付けられる。例えば、グリア細胞におけるミエリンタンパク質とミエリン鞘の構造の発現は、最終分化したグリア細胞の典型的な例である。細胞が「分化した」と、ここでその用語が使用されるときは、その細胞は分化の過程の途中である。
【００５１】
本明細書で使用される「分化培地」は、添加物を含む、又は添加物が欠如した細胞増殖培地について言うものであり、その培地では、幹細胞、胚性幹細胞、ES様細胞、ニューロスフェア、NSCもしくは、培地中での培養時には完全な分化はしていない他の同様の前駆細胞が成熟して、分化した細胞の特徴のいくつか又は全てを有する細胞となる。
【００５２】
本明細書で使用される「増殖性」は、例えば、数の増加又は細胞集団が集団倍加する場合などの細胞の増殖能力を言うものである。
【００５３】
「支持細胞層」は、増殖を促進し、そして未分化の多分化能幹細胞を維持するために、増殖因子、サイトカイン、他の細胞由来産生物、及び共培養中での必然的な接触を介した物理的支持体を作る細胞を意味する。
【００５４】
本明細書で使用される「支持細胞」は、第二の組織タイプの細胞と共培養され、第二の組織タイプの細胞が成長できる環境を提供する第一の組織タイプの細胞を表す。
【００５５】
本明細書で使用される用語「増殖培地」は、細胞の増殖を促進する培地を言うものである。一般に、増殖培地は動物血清を含む。場合によっては、増殖培地は動物血清を含まない。
【００５６】
本明細書で使用される用語「NSC培地」は、NSCの培養と増殖のための培地を意味する。通常、NSC培地は、DMEM/F12、N2サプリメント、EGF、bFGF、およびヘパリンを含む。場合によっては、NSC媒体は増殖因子(例えばEGF及びbFGF)を含まない。
【００５７】
本明細書で使用される「骨髄間質性細胞調整培地」(BMSC-CM)は、BMSCの培養により調整された培地を言う。本開示に基づけば、BMSC-CMはBMSCをNSC培地中で培養することにより得られ、その培地は、BMSC分泌増殖因子、栄養因子、及びサイトカインを他の化合物と一緒にNSC培地中に有するといった培養によるBMSCを用いて調整されたものである。BMSC-CMは、NSCの多分化能を維持しつつNSCの増殖を促進するNSC培養に用いることができる。さらにBMSC-CMは、MHC分子発現を調節できるNSC培養に用いることができる。
【００５８】
本明細書で使用される「白血病抑制因子」(LIF)は、多数の生物学的機能を有するインターロイキン-6サイトカインファミリーの22kDaタンパク質メンバーを言うものである。LIFは、白血病細胞中で最終的分化を誘導し、正常細胞および骨髄性白血病細胞中で造血分化を誘導し、肝細胞中で急性期タンパク質の合成を刺激する能力を有することが示された。また、ここでLIFは、NSCの多分化能を維持しながら未分化状態のNSCの増殖を促進することが示された。
【００５９】
「外因性のLIF」は、外部の組織、細胞、または系から誘導または産生された、LIFを言う。
【００６０】
本明細書で使用される用語「潜在的多分化能の」又は「多分化能」は、中枢神経系幹細胞が1つ以上のタイプの細胞に分化する能力を意味する。例えば、中枢神経系の多分化能幹細胞は、これに限定はされないが、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトに分化することができる。
【００６１】
本明細書で使用される「ニューロスフェア」は、とりわけ細胞中でネスチンタンパク質を検出する免疫染色などにより、ネスチン発現が検出可能な神経の幹細胞/前駆細胞を言う。ニューロスフェアは増殖性神経幹細胞の集合体であり、ニューロスフェアの構造はインビトロの培養における神経幹細胞の特徴である。
【００６２】
本明細書で使用される「神経幹細胞」は、未分化の、多分化能の、自己複製する神経細胞を言う。神経幹細胞は、分化可能なクローン原性の多分化能幹細胞であり、適切な条件下で自己複製能力を有し、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトに最終的に分化することができる。故に、幹細胞の後代には複数の分化の経路があるので、神経幹細胞は「多分化能」である。各細胞分裂で1娘細胞もまた平均して幹細胞になるという意味で、神経幹細胞は自己保存ができる。
【００６３】
本明細書で使用される「神経細胞」は、中枢神経系、及び／又は末梢神経系由来のグリア細胞およびニューロンのものと同様の形態、機能および表現型の特徴を示す細胞を言うものである。
【００６４】
本明細書で使用される「ニューロン様の細胞」は、ニューロンと同様の形態を示し、検出可能な程度にニューロン特有のマーカー、例えば、これに限定はされないが、MAP2、神経フィラメント200kDa、神経フィラメント-L、神経フィラメント-M、シナプトフィジン、βチューブリンIII(TUJI)、Tau、NeuN、神経フィラメントタンパク質、及びシナプス・タンパク質などを発現する細胞を言う。
【００６５】
本明細書で使用される「星状細胞様細胞」は、星状細胞と同様の表現型を示し、星状細胞特有のマーカー、例えば、これに限定はされないが、GFAPなどを発現する細胞を言う。
【００６６】
本明細書で使用される「オリゴデンドロサイト様細胞」は、オリゴデンドロサイトと同様の表現型を示し、オリゴデンドロサイト特有のマーカー、例えば、これに限定はされないが、Ｏ-4などを発現する細胞を言う。
【００６７】
本明細書で使用される「細胞周期のプログレッション、又は細胞周期を経由したプログレッション」は、細胞が有糸分裂、及び／または減数分裂の準備をする、及び／または分裂に入るプロセスを言う。細胞周期を経由したプログレッションはG1期、S期、G2期、およびM期を経由する進行を含む。
【００６８】
「増殖（Proliferation）」は、特に細胞についての、同様の形態の複製又は増殖（multiplication）を言う。すなわち、増殖は、多くの細胞の生産であり、特に、細胞の数の単純な計算、また細胞中への3H-チミジンの取り込みの測定などによって、測定することができる。
【００６９】
本明細書で使用される用語「外因性」は、外部の組織、細胞、又は系により導入された、又は産生された材料を言う。
【００７０】
「コードする(Encoding)」は、定義されたヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)、又は定義されたアミノ酸配列のいずれか、及びその結果として生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおいて、他の重合体および高分子の合成のためのテンプレートとして役立つ遺伝子、cDNA、又はmRNAなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を言う。すなわち、細胞又は他の生物学的システムにおいて、mRNAの転写及び翻訳の場合、遺伝子はタンパク質を作る遺伝子に対応するタンパク質をコードする。mRNA配列と同一のヌクレオチド配列であって、通常、配列表に提供されるコード鎖、及び遺伝子又はcDNAの転写のためのテンプレートとして用いられる非コード鎖の両者とも、タンパク質、及び遺伝子又はcDNAの他の生産物をコードすると言うことができる。
【００７１】
特に明記しない限り「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの変性バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードしている全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含む場合もある。
【００７２】
「単離された核酸」は、自然な状態で隣接している配列から分離された核酸セグメントまたはフラグメントであり、通常は、例えばフラグメントに近接する配列から分離されたDNAフラグメントを言い、また、自然に存在するゲノム内のフラグメントに近接する配列を言う。また、この用語は、もともと核酸と一緒に存在する他の構成成分、例えば、細胞内でもともと一緒に存在するRNA、DNAまたはタンパク質などから実質的に精製された核酸にも用いられる。従って、例えばこの用語は、ベクター、自己複製プラスミドもしくはウイルス、または、原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた、又は他の配列とは無関係である分離した分子(cDNA、ゲノムまたはPCRもしくは制限酵素消化により作製されたcDNAフラグメントなど)として存在する組換えDNAなどを含む。また、この用語は、付加ポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【００７３】
本発明の文脈では、一般的に用いられる以下の核酸塩基の略語が使用される。「A」はアデノシンを言い、「C」はシトシンを言い、「G」はグアノシンを言い、「T」はチミジンを言い、そして「U」はウリジンを言う。
【００７４】
「ベクター」は単離された核酸を含み、細胞の内部にその単離された核酸を供給するために使用することができる物質の組成物である。これに限定はされないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン化合物または両親媒性化合物を伴ったポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む技術において多数のベクターが知られている。すなわち、用語「ベクター」は自己複製プラスミド又はウイルスを含む。またこの用語は、例えばポリリシン化合物やリポソームなどのような、細胞への核酸の移動を手助けする非プラスミド及び非ウイルス性化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルス性ベクターの例としては、これには限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターやレトロウイルスのベクターなどが含まれる。
【００７５】
「発現ベクター」は、発現を目的とするあるヌクレオチド配列に作用可能に結合している発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを言う。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用エレメントを含み、発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、又はインビトロでの発現システムにおいて供給され得る。発現ベクターは、コスミド、プラスミド(例えば、裸の、又はリポソームに含まれた)や、組換えポリヌクレオチドを組み込むウイルスなどのような当該技術分野で公知のものすべてを含む。
【００７６】
（発明の説明）
本発明は、NSCの多分化能を維持すると同時に、その増殖を促進する方法を含む。その方法は、当該技術分野において公知の方法を使ってNSCを分離すること、及びNSCの多分化能を維持すると同時に、その増殖を促進するためにNSCをBMSCと共培養することを含む。二つの細胞タイプの培養は、NSCがBMSCと物理的に接触する接触依存法においても、NSCがBMSCと物理的に接触しない接触非依存方法においても可能である。
【００７７】
本発明は、NSCの増殖性（複数回複製するためのNSCの能力）がBMSCと共培養することによって増大される得るという発見に関する。すなわち、本発明の実施例は、BMSCがNSCの増殖のための共培養システムにおける支持細胞として働くことができるという発見に関する。本開示に基づき、BMSCが、NSCのための支持細胞層として働くこと、またNSCの多分化能を維持すると同時に、NSCの培養を支持するための、これに限定はされないが、増殖因子、栄養因子およびサイトカインを含む因子を供給することが可能であると当業者は認識できるであろう。また、BMSC支持細胞層は、NSCが増殖できる単層として働くことができる。
【００７８】
またBMSCとNSCは、NSCの増殖を促進することが当該技術分野において公知である他の増殖因子の存在下で共培養され得ることを、本開示に基づき当業者は認識できる。
【００７９】
本発明では、BMSCとNSCは、NSCの多分化能を維持すると同時にNSCの増殖を促進するために、外因性のLIFの非存在下において共培養され得る。本開示は、NSCが、外因性のLIFの存在下において被覆されたプレート（すなわち、ポリオルニチン/フィブロネクチンで被覆されたプレート）上で単独培養されたNSCの増殖レベルよりも、著しく高いレベルで増殖し、広がることを示す。すなわち、本発明は被覆されたプレート及び／又は外因性LIFの使用の必要なくNSCを培養する方法を提供するものである。
【００８０】
本発明のさらなる実施例は、BMSCとNSCの共培養においてNSCからBMSCを除去または分離する方法を包含する。本発明は、共培養中でBMSCに結合する抗体をインキュベートし、次に、これに限定されないが、磁性分離を含む分離ステップによって、そのような共培養中からBMSCを除去できるという発見に関する。BMSCに結合する抗体のひとつの例は、抗CD13抗体である。磁性分離のプロセスは、これに限定されないがダイナビーズ（登録商標）(Dynal Biotech社、Brown Deer、WI)等の磁性ビーズを使うことによって実現される。ダイナビーズ（登録商標）の使用に加え、MACS分離試薬(商標、Miltenyl Biotec社、Auburn、CA)が共培養からBMSCを除去するために使用できる。分離ステップの結果、精製されたNSC集団を得ることができる。BMSCを除去するため、またはその代わりとしてNSCを積極的に選択するためにFACSもまた使用できる。
【００８１】
本発明のNSC培養/増殖方法においては、NSCは多分化能（神経細胞、星状細胞、オリゴデンドロサイト等のような種々の細胞タイプのひとつに分化できる能力）を保持している。本発明のさらなる実施例において、本発明の方法を用いて増殖したNSCは、従来技術の方法を用いてNSCを増殖または培養するよりも、より広範囲に（すなわち、より大きな比率で）分化する能力を維持している。
【００８２】
本明細書で示すNSC培養/増殖の方法は、ヒト疾患の治療のためにNSCを用いる場合の根本的な問題点を解決する。すなわち、本明細書で開示される以前は、培養において、NSCを単離および増殖することは困難であった（すなわち、十分な数に増殖するようにNSCを誘導することが困難であった）。本明細書の開示は、NSCが治療用途として充分な数で増殖および単離され得ることを示す。
【００８３】
また本発明は、NSCによるMHC分子の発現は、NSCとBMSCを共培養することによって制御できるという発見にも関連する。本明細書で示される開示は、多分化能力を維持しつつNSCの増殖を促進することに加え、NSCとBMSCの共培養はまた、当該技術分野で公知の標準的方法を用いて培養されたNSCによるMHC分子発現に比べて、NSCによるMHC分子発現のアップレギュレート及び／又は誘導を低下させることを示す。すなわち、本発明は、培養においてNSCの増殖を促進するために用いられる標準的方法を上回るさらなる利益を与えるNSC培養方法を提供する。
【００８４】
共培養システムは、被覆プレート上でNSC単独または外因性LIFの存在下の被覆プレート上でNSCを培養したときよりも、著しく良好な効果をもたらすNSC培養方法を提供する。本明細書の別の箇所で検討するように、共培養システムは、被覆プレートまたは外因性LIFの使用を必要としない形で大量のNSCを生産する初めての方法を提供する。さらに、共培養システムは、標準NSC培地を用いてNSCのみを培養する従来技術の方法に比べて、付加的な効果、及び／又は高いレベルでの効果を与える方法を提供する。これらの利益は、これに限定はされないが、NSCの多分化能力を維持し、NSCのMHC分子発現を制御すると同時に、NSCの増殖を促進することを含む。
【００８５】
本発明の別の例では、NSCによるMHC分子発現のアップレギュレーション及び／又は誘導を低下させるために、外因性LIFの非存在下でNSCはBMSCと共培養できる。すなわち、本発明は、外因性LIFを用いる必要なくNSCを培養する方法を提供するものである。本明細書の開示は、共培養システムにおいてBMSCは、これには限定されないが、増殖因子、栄養因子およびサイトカインを含む因子を、共培養されたNSCに供給する支持細胞層として機能できることを示す。BMSCによって供給された因子は、NSCの増殖およびNSCによるMHC分子発現に関して、外因性LIF存在下でNSC培地において被覆プレート上でNSCのみを培養するときの利益以上のレベルで、共培養されたNSCに有益な効果をもたらすと考えられる。
【００８６】
本明細書で開示した方法を用いてMHC分子発現が制御できるという発見は、治療、診断、実験用途などのために有用なNSC集団を生産する方法を提供する。例えば、当該技術分野で公知の方法と比較すると、ここで公開される方法を用いたNSCによるMHC分子の発現の低下は、NSCの免疫原性を低下させる方法を提供するものである。好ましくは、NSCによるMHC分子の発現低下は、レシピエントへのNSCの移植の成功を増加させる方法を提供する。
【００８７】
BMSCとNSCの共培養は、二つの細胞タイプについて接触依存的または非依存的に、NSCによるMHC分子発現を制御する方法を提供する。本発明のひとつの実施例においては、NSCは接触依存的にBMSCと共培養できる。特定の理論により制限されるものではないが、BMSCとNSCの物理的な相互作用がNSCの増殖および拡大のための有益な効果の引き金となる。また二つの細胞タイプ間の物理的相互作用は、NSCによるMHC分子発現の調節に貢献する。好ましくは、二つの細胞タイプについて接触依存的なBMSCとNSCの共培養は、外因性LIFを補充した標準NSC培地を用いて被覆プレート上にBMSC非存在下で培養した別の同等のNSCによるMHC分子発現に比べて、NSCによるMHC分子発現のアップレギュレーション及び／又は誘導を低下させる。
【００８８】
本発明の別の例では、NSCはMHC分子の発現を調節するために接触依存的にBMSCと共培養できる。本発明は、透過性の膜フィルターが二つの細胞タイプを分離し、NSCとBMSCの互いの物理的な接触を妨げるコースター社製トランスウェル（登録商標）中でNSCとBMSCは共培養できるという発見に関する。透過性の膜フィルターは、BMSCによって分泌された因子が膜を通過することを許容し、その結果としてNSCの表現型に寄与すること、例えば、NSCの多分化能を維持し、NSCによるMHC分子の発現を調節すると同時に、NSCの増殖を促進するということになどに利用可能である。
【００８９】
トランスウェル（登録商標）を用いた実験によって実証されるように、本開示は、BMSCが、培地中でBMSC分泌因子をもってその培地を補うという手段によって、二つの細胞タイプ間の直接的な接触なしに共培養システム中でNSCの増殖および拡大をサポートできることを示す。特定の理論に限定されるものではないが、BMSCによって分泌される因子はNSCの表現型に寄与する。すなわち本発明は、BMSCが、直接NSCの増殖する支持細胞層である必要がないというBMSCとNSCの共培養の方法を提供する。本発明は、BMSC分泌因子を受け取る手段としての共培養システム中で、NSCがBMSCからの利益を受けるといった接触非依存的なBMSCとNSCの共培養の方法を提供する。
【００９０】
本開示に基づいて当業者は、NSCとBMSCが互いに物理的に接触するのを妨げる方法が共培養システムのために使用できると認識するであろう。例えば、接触非依存的に共培養された細胞を得るために、トランスウェル（登録商標）以外のどんなシステム／装置をも用いることができる。そのようなシステム／装置は、これに限定されないが、二つの細胞タイプ間の直接的な接触を妨げるが、そのフィルター／膜の因子の通過は許容するという孔径を持つフィルター及び膜を含む。BMSCとNSCを共培養するためにこのようなシステム／装置を用いる利点は、NSCの増殖のための連続的な因子の源を有するシステム中でNSCを培養する方法を可能にすることである。従って、本発明は、単離NSC、単離BMSC、NSC増殖培地および前記単離BMSCによって分泌される因子を含む神経幹細胞培養装置、並びにNSCとBMSCが互いに接触するのを妨げる手段を含む構成を包含する。
【００９１】
培地中にBMSCから分泌される因子を供給することを介し、接触非依存的な共培養システム中でNSCの増殖をBMSCが支持できるという発見に基づいて、BMSCによって調整された培地が、NSCの多分化能を維持すると同時にNSCの増殖を促進し、NSCによるMHC分子の発現を調節するという形で、NSCの増殖を支持できるかどうかが評価された。BMSCによって調整された培地がNSCの増殖を支持することができ、接触依存的に比べ、効率的ではないにしても著しく有益な効果を有することを本開示は実証する。すなわち、本発明は、共培養システムを用いることなしにNSCを培養するために骨髄ストローマ細胞調整培地（BMSC-CM）を使用する方法を提供する。またNSCを培養するためのBMSC-CMの使用は、共培養システムを用いて培養されたNSC集団と同等な性質を持つNSC集団を生産するもうひとつの方法を提供する。
【００９２】
さらに本開示は、BMSC-CMが、NSCを培養するために外因性LIFを添加したNSC培地の使用の代替となり得ることを実証する。本開示はBMSC-CMでNSCを培養した後に生産される細胞数は、外因性のLIFを添加したNSC培地を用いて生産された細胞数に匹敵するものであることを実証する。すなわち、本発明は、外因性のLIFを添加したNSC培地を用いたときと同等以上の速度でNSC細胞増殖を誘導するための有益な因子源としてBMSC-CMを使用する方法を提供する。
【００９３】
また、BMSC-CMは、NSC培地を用いたNSCの培養及び増殖のために、被覆プレート、例えばポリオルニチン/フィブロネクチン被覆プレートを用いることの代替になり得ることも実証された。本明細書の開示は、NSCが非被覆プレート上でBMSC-CMを用いて増殖できることを実証する。被覆プレート上のNSC培地にたとえ外因性のLIFが存在していても、そこで単独で培養されたNSCの増殖と、非被覆プレート上でのBMSC-CMを用いたNSCの増殖は少なくとも同等であり、またはそれを超えることが観察されている。すなわち、本発明は、被覆プレートおよび外因性のLIFを必要とすることなしにBMSC-CMを用いてNSCを培養する方法を含む。
【００９４】
また、BMSC-CMの使用は、共培養システム中でBMSCを用いることなしにNSCに効果を与える形でNSCを培養する方法を提供する。本開示は、BMSC-CMが、NSCの培養を支持し、そしてBMSCとNSCを含む共培養システムを用いたときに見られるのと同等な効果をNSCに与えることを実証する。そのようなものとして、本発明は、NSCの多分化能を維持し、MHC分子の発現を調節すると同時にNSCの増殖を促進するためにBMSC-CMを用いたNSCの培養の方法を含む。
【００９５】
本明細書で実証されるように、BMSCは骨髄ストローマ細胞調整培地（BMSC-CM）を作製するために用いられる。BMSC-CMは、NSC培地でBMSCを培養し、特に増殖因子、栄養因子、及び／又はサイトカインをNSC培地中に分泌させる手法によって、培養中にBMSCによって調整された培地である。BMSC-CMは、BMSCから分泌された増殖因子、栄養因子、及び／又はサイトカイン、並びにこれに限定はされないが、LIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-lra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質4(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-1(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3のいずれかを含むことができる。
【００９６】
BMSC-CMはNSCの多分化能力維持しつつ、NSCを増殖、拡大するために有用である。BMSC-CMの使用は、NSCの増殖及び拡大のために、NSCに対して、特にBMSCから分泌される増殖因子、栄養因子、及び／又はサイトカインをもたらす方法を提供する。BMSC-CMの使用は、非コーティング表面上で、外因性のLIFを添加したNSC培地を用いて培養したときと同等の、またはそれを超えた速度でNSCの増殖を誘導する方法を提供する。すなわち本発明は、大量の治療用NSCを生産するための、BMSC-CMを用いた組成物と方法を提供する。
【００９７】
多分化能を維持しつつ、NSCの増殖を支持するためにBMSC-CMを利用することに加えて、本公開は、BMSC-CM中でNSCを培養することがNSCによるMHC分子の発現を調節する方法を提供するということも実証する。好ましくは、BMSC-CM中でNSCを培養することは、外因性LIF存在下のNSC培地中で培養された他の同等のNSCによるMHC分子の発現に比べ、NSCによるMHC分子の発現を低下させる。すなわち、BMSC-CM中でNSCを培養することは、MHC分子の発現アップレギュレーションを低下、及び／又は抑制する。
【００９８】
NSCによるMHC分子の発現を調節するためのBMSC-CMの使用は、BMSC-CM存在下で増殖したNSCが、MHCクラスII分子の検出のために使用される条件下でMHCクラスII分子を発現せず、また外因性のLIFの入ったNSC培地中で培養された他の同等NSCと比較して、低いMHCクラスI発現レベルを示したという発見に基づく。この所見は、接触依存的または接触非依存的のいずれかにおいてNSCとBMSCを共培養した後に、NSCによるMHC分子の発現が低下するという所見と一致する。いずれにしても、接触依存的または接触非依存的方法で、支持細胞層としてのBMSCあるいはBMSC-CM中でのNSCの培養のいずれかを用いたNSCによるMHC分子発現の低下は、NSCによってMHC分子発現を低下させる方法を提供する。本明細書に開示された方法を用いてのMSC分子の発現が調節できるという発見は、治療用に有用なNSC集団を生産する方法を提供する。また、ここに開示された方法を用いたNSCによるMSC分子の発現低下は、レシピエントへの移植成功確率を増加させる方法をも提供する。
【００９９】
本開示に基づいて、本発明は、NSCによるMHC分子発現を低下させると同時に、NSCを培養、増殖させるためのBMSC-CMの利用を包含する。すなわち、本発明は、NSC増殖のためのBMSC-CMの使用が、外因性LIFの存在下、NSC培地で培養された他の同等のNSCと比較して、NSC上のMHC分子のアップレギュレーションが低下、及び／又は抑制されるという発見に基づいている。そのようなものとして、本発明は、治療用に有用な細胞を生産する方法を含む。
【０１００】
遺伝的に異なった個体間（同種異系）の細胞移植は常に移植拒絶の危険性を伴うということは広く定着している。ほぼすべての細胞は主要適合性抗原であるMHCクラスＩ分子の生産物を発現している。さらに、多くの細胞タイプは、炎症性サイトカインに曝されたときにMHCクラスII分子の発現が誘導される。同種異系移植片の拒絶は、主に、MHCクラスIおよびクラスII分子を認識するCD4およびCD８サブクラスを有するT細胞によって媒介される。移植における主目的は、レシピエントに生じる移植片拒絶免疫反応を誘導することのないドナー移植片の永久的な生着である。そのようなものとして、本発明は、ここに開示されたNSCによるMHC分子発現を低下させるための方法を用いて移植前にNSCを培養することによって、レシピエントに移植されたNSCに対するレシピエント側の細胞による免疫反応を減少及び／又は排除するための方法を包含する。特定の理論に限定されるものではないが、ここに開示された方法を用いたNSCによるMHC分子の発現低下は、NSCの細胞膜上のMHC分子の量を低下させ、その結果として、レシピエント中のNSCの免疫原性を低下させる。
【０１０１】
本発明はまた、例えば、細胞治療または遺伝子治療などにNSCが使われ得るように、外因性の遺伝子を発現するNSCを得るために利用できる。すなわち、本発明は、外因性遺伝子を発現する大量のNSCの生産を可能にする。外因性遺伝子とは例えば内因性遺伝子の外因性バージョンのことである（すなわち、遺伝子の野生型バージョンを、変異を含む欠損型対立遺伝子に置き換えるために使用することができる）。外因性遺伝子は、中枢神経系再生のための栄養因子や癌を対象とした細胞障害性遺伝子を含み得る。該外因性遺伝子は、必ずしもそうではないが、一般的には、ひとつあるいはそれ以上の付加遺伝子と共有結合（すなわち、融合）している。「付加遺伝子」の例示として、内因性の遺伝子と同じ染色体部位に、外因性の遺伝子を取り込ませた細胞を選択する「ポジティブ」選択のために用いられる遺伝子、及び外因性の遺伝子を取り込ませた細胞を選択する「ネガティブ」選択のために用いられる遺伝子、あるいはその両方などが挙げられる。
【０１０２】
本発明の方法によって得られたNSCは、選択型細胞へとNSCを分化させるための当該分野で公知の培養条件の選択によって、神経細胞、星状細胞、オリゴデンドロサイトのような細胞へと分化誘導することが可能である。
【０１０３】
本開示で述べるように、培養、増殖されたNSCは、選択した細胞タイプに分化する前、あるいはその後に、NSCを用いた治療が可能であるとして当該分野で知られる様々な疾患を治療するために利用できる。NSCに挿入された外因性の遺伝子を有する、また有さない治療法を含み得る治療法において、NSCは有用である。そのような疾患の例としては、これに限定はされないが、脳外傷、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄損傷、脳卒中、多発性硬化症、癌、中枢神経系のリソソーム病、頭部外傷が含まれる。
【０１０４】
（NSC及びBMSCの単離）
NSCは、哺乳類、好ましくは人間の中枢神経系から得られる。これらの細胞は、これに限定はされないが、前脳、後脳、脳全体、および脊髄を含むさまざまな組織から得ることができる。本明細書中で別に詳述する方法、又は公知の方法、例えば、参照することによって本明細書中で全文が援用される米国特許5,958,767に開示された方法を用いることでNSCは単離され、培養できる。NSCを単離する他の方法は公知であり、将来開発されるであろう方法も含め、当業者は容易に用いることができる。本発明は、目的の細胞を得るための、これらの、又は他の方法には全く限定されない。
【０１０５】
多くの異なったタイプの組織、例えば、ドナー組織からの個々の細胞の分離によって、結合組織の細胞外マトリックスから、又は市販のNSCの原料からNSCは単離できる。1つの例では、無菌操作により脳の組織が取り出され、トリプシンや、コラゲナーゼなどの酵素処理を含む方法、又はすり潰しや、鈍器(blunt instrument)による処理などの物理的な分離手段を用いる方法など、あらゆる公知の方法を用いることで細胞は分離される。神経の細胞、及び他の多分化能幹細胞の分離は、無菌の組織培養基中で実施できる。分離された細胞は、200〜2000rpm、通常は400〜800rpmの低速で遠心分離され、懸濁培地は吸引され、そして細胞は培地で再懸濁される。
【０１０６】
BMSCの原料、及びそれらの原料からBMSCを得る方法は公知である。実質的に、BMSCは、あらゆる骨髄、例えばヒトのドナーの腸骨稜の吸引によって得られる骨髄などから得ることができる。ドナーから骨髄を得る方法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、本明細書中で全文が援用される米国特許6,653,134及び国際公開WO96/30031に記載されている。ヒト間葉系幹細胞は、ケンブレックス社（ウォーカーズビル,MD）から購入することもできる
【０１０７】
（単離された神経幹細胞の使用）
単離された神経幹細胞は、さまざまな形で使用することができる。病気又は負傷で失われた哺乳類の細胞を再構築する為に、これらの細胞は使用できる。自己の、又は同種異系の神経幹細胞の遺伝子組換えによって、遺伝病は、遺伝的欠損の修正、または病気の予防のための治療ができる。ホルモン、酵素、増殖因子などのような特定の分泌物の欠乏に関連する病気もまた、NSCを使用することで治療できる。中枢神経系障害は、神経変性疾患などの数多くの苦痛(例えば、アルツハイマー病又はパーキンソン病のもの)、深刻な脳損傷(例えば、卒中、頭部外傷、脳性まひ、腫瘍切除、化学治療及び放射線治療法の補助治療)、並びに数多くの中枢神経系機能障害(例えば、うつ病、てんかん、及び精神分裂症)を包含する。これには限定されないが、アルツハイマー病、多発性硬化症(MS)、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、及びパーキンソン病を含む疾病は、全て中枢神経系の特定の位置にある神経細胞の変性に関連しており、その細胞、又は脳の領域は、その本来の機能を果たすことができないことになる。ここに記載されている単離され、また培養されたNSCは、これらの疾病を治療するために、前駆細胞の材料として、また拘束された細胞に対して用いることができる。内因性の幹細胞と中枢神経系の再生を刺激する栄養因子の材料としてNSCを用いることができる。
【０１０８】
本明細書に記載されている培養されたNSCは、液体窒素温度で凍結し長期間保存し、解凍して再び使用することができる。通常、細胞はDMSO10%、NSC90%のNSC媒体に保存される。一度解凍されると、細胞は本明細書中で別に詳述する方法を用いて増殖できる。
【０１０９】
（遺伝子組換え）
NSCの培養に有益な、栄養因子、増殖因子、サイトカイン、神経栄養因子などの分子を生産するために、外因性の遺伝子の材料を細胞に導入させることによって、本発明の細胞の遺伝子を組換えることができる。例えば、EGFのような因子を発現するための遺伝子組換えをされていないBMSCとの比較で、高いレベルで上皮細胞成長因子(EGF)を発現し、分泌するために、BMSCの遺伝子を組換えることができる。特定の理論に限定されないが、EGFを発現し、分泌するために遺伝子を組換えられたBMSCは、そのような因子を発現するための遺伝子組換えをされていない別の同等のBMSCと比較して、増加した濃度で発現、分泌を行う。
【０１１０】
共培養システムにおいて、遺伝子組換えBMSCを使用する利益は、外因性因子の共培養システムへの供給を、遺伝子組換えBMSCに連続的に行えることである。外因性因子は、培養されたBMSCかNSCまたはその両方に利益を与える役割を果たす。また、BMSCに導入された外因性遺伝物質は、遺伝子組換えBMSCからの他の内因性因子分泌に寄与できる。さらに、遺伝子を組換えBMSCは、隣接している細胞からの内因性因子分泌に寄与できる。すなわち本発明は、共培養システムへの外因性因子の絶え間ない供給を提供するために遺伝子組換えBMSCを使用することを包含し、そして、時には、BMSCに導入された外因性遺伝物質は、遺伝子を組換えBMSC、及び/又は隣接している細胞からの内因性因子の分泌に寄与する。いずれにしても、外因性因子、及び/又はBMSCから分泌された内因性因子はNSCの培養と増殖のための有益な要因を与える。
【０１１１】
さらに、EGFの濃度が増加したBMSC-CMを作製するためにも、EGFなどの因子を発現し、分泌するために遺伝子組換えされたBMSCを使用することができる。遺伝子組換えされたBMSCは、外因性因子の濃度増加をBMSC-CMにもたらすことに加え、遺伝子組換えBMSC、及び/又は隣接している細胞からの内因性因子の分泌に寄与することもできる。該因子は、これに限定はされないが、LIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-lra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質4(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-1(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3を含む。
【０１１２】
BMSC-CM作製のために遺伝子組換えBMSCを用いる利益は、遺伝子組換えをされていない別の同等のBMSCから作製されたBMSC-CMと比較すると、例えば、培地中に遺伝子組換えBMSCがEGFを分泌することによって、EGFなどの外因性の因子の濃度を増加させることである。遺伝子組換え細胞から分泌されるEGFの濃度増加により、より多くのEGFがBMSC-CMに存在する。さらに、遺伝子組換えBMSCから分泌されたEGFの濃度増加は、遺伝子組換えBMSC、及び/又は、隣接している細胞からの他の内因性因子の分泌に寄与できる。EGF、及び/又は他の因子が濃度増加しているBMSC-CMは、NSCを培養し、増殖する為に役立てることができる。
【０１１３】
もう一つの側面では、BMSCを遺伝子組換えして、BMSC共培養におけるNSCの増殖に引き続く、ガンシクロビルによる処理またはフローサイトメータでの分離によるNSCの取り出しで用いられるHSV-チミジンキナーゼまたは緑色蛍光タンパク質(GFP)のような遺伝子を発現することができる。
【０１１４】
BMSCの遺伝子を組換えることに加えて、本発明は、遺伝子組換えNSCをも含む。個体中の欠陥細胞を交換するために、遺伝子組換えNSCを使用することができる。また、本発明は、分泌される所望のタンパク質を発現するのに使用できる。換言すれば、NSCは単離され、所望のタンパク質の遺伝子が導入され、そして所望のタンパク質が生成され作用し、また別の点では治療の効果が生じる個体に導入されることができる。本発明のこの側面は、個体に遺伝子組換えNSCを導入する手段で治療用タンパク質が個体に投与される遺伝子治療に関する。遺伝子組換えNSCは、本明細書で開示された方法を用いて培養され、単離され、体内でNSCによってタンパク質が発現、及び分泌されたときにその恩恵を受ける個体の中に導入される。
【０１１５】
本発明によれば、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構造体がNSCへ導入される。すなわち、細胞は、その発現が通常個体の治療効果を有する遺伝子を導入するために改変される。本発明のいくつかの側面によれば、患者、別の患者、又は非ヒト動物由来のNSCは、欠損遺伝子を取り替えるために、及び／又はその発現が個体の治療効果を有する遺伝子を導入するために改変できる。
【０１１６】
遺伝子構造体が細胞の中に導入されるあらゆる場合において、異種遺伝子は、細胞内での遺伝子の発現の達成に必要な制御配列に、作用可能に結合している。このような制御配列として、プロモーターとポリアデニル化シグナルが挙げられる。
【０１１７】
好ましくは、遺伝子構造体は発現ベクターとして供与され、その発現ベクターはベクターが細胞の中に導入されたときに、細胞によってコード配列が発現されるために必須の制御配列に作用可能に結合する異種タンパク用コード配列を含む。上記コード配列は、細胞中でのその配列の発現に必要な制御配列に作用可能に結合している。タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、又はそれらのハイブリッド、もしくはmRNAのようなRNA分子であってもよい。
【０１１８】
遺伝子構造体は、制御エレメントに作用可能に結合する有益なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、細胞質機能分子、機能的エピソーム分子として細胞中に存在し、又は細胞の染色体DNAに結合して存在する。外因性の遺伝子の材料は細胞に導入されて、プラスミドの形で別個の遺伝子の材料として存在する場合もある。もう一つの方法として、染色体に結合できる直鎖状DNAを細胞に導入することもできる。細胞にDNAを導入するときに、DNAの染色体への結合を促進する試薬を加えることができる。また、結合の促進に有用なDNA配列がDNA分子に含まれていてもよい。もう一つの方法として、細胞にRNAを導入してもよい。
【０１１９】
遺伝子発現の制御エレメントは、プロモーター、開始コドン、終止コドン、及びポリアデニル化シグナルを含む。これらのエレメントが本発明の細胞の中で機能するのが好ましい。さらに、ヌクレオチド配列が細胞内で発現し故にタンパク質を生産できるように、これらのエレメントがタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作用可能に結合していることが好ましい。一般に、開始コドンと終止コドンはタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられている。しかしながら、これらのエレメントが細胞内で機能的であることが好ましい。同様に、プロモーターとポリアデニル化シグナルは、本発明の細胞内で機能的でなければならない。本発明の実施に有用なプロモーターの例は、これには限定されないが、サイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、及びレトロウイルスのような多くの細胞内でアクティブなプロモーターである。本発明の実施に有用なプロモーターの別の例は、これには限定されないが、組織特異的プロモーター、すなわち、いくらかの組織では機能するが、他では機能しないプロモーター、そして特異的な又は一般的なエンハンサー配列の有無に関わらず細胞内で標準的に発現している遺伝子のプロモーターを含む。いくつかの実施例では、エンハンサー配列の有無に関わらず細胞内で遺伝子を構成的に発現するプロモーターが使用されている。エンハンサー配列は、適切であるか、または必要である場合にそのような実施例において供される。
【０１２０】
当該技術分野の通常の知識を有する者が容易に利用できる公知の技術を用いて、本発明の細胞はトランスフェクトできる。遺伝子によってコードされたタンパク質を発現する細胞に遺伝子構造体を導入するために用いられる標準的な方法で、外因性の遺伝子は細胞に導入できる。いくつかの実施例において、細胞は、リン酸カルシウム沈降トランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、電気穿孔法、顕微注入法、リポソームを介したトランスファー、化学物質を介したトランスファー、リガンドを介したトランスファー、又は組換え型ウイルスベクタートランスファーによってトランスフェクトされる。
【０１２１】
いくつかの実施例では、組換え型アデノウィルスベクターは、所望の配列と共にDNAを細胞に導入するために用いられる。いくつかの実施例では、組換え型レトロウイルスベクターは、所望の配列と共にDNAを細胞に導入するために用いられる。いくつかの実施例では、標準CaP04、DEAEデキストラン、又は脂質担体を介したトランスフェクション技術が、所望のDNAを分化した細胞に取り込むために用いられる。標準的な抗生物質耐性選択の技術が、トランスフェクト細胞を同定し、選択するために使用できる。いくつかの実施例では、顕微注入法によって直接細胞中ににDNAが導入される。同様に、細胞に外来DNAを導入するために、公知の電気穿孔法、又は粒子衝突技術が使用できる。通常、第二の遺伝子は、同時導入されるか、治療遺伝子にリンクされる。一般的に、第二の遺伝子は、選択可能な(selectable)抗生物質耐性遺伝子である。トランスフェクト細胞は、選択可能な(selectable)遺伝子を取り込まない細胞を殺す抗生物質中で培養することによって選択できる。2つの遺伝子が結合されておらず、同時導入されている多くの場合には、抗生物質処理を耐え抜く細胞は、中に両方の遺伝子を持っており、それらの両方を発現している。
【０１２２】
以下の例は、本発明の都合の好ましい実施例を、より完全に具体的に説明するために示される。これらの例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を決して制限するものではない。
【実施例１】
【０１２３】
（NSCの増殖と拡大のための支持細胞としてのBMSC）
NSCの培養ではそ増殖速度と拡大を促進するためには、増殖因子及び特定の基層を必要とするので、NSCの培養は困難である。増殖因子に関しては、FGF及び／又はEGFを含み、血清を含まない特定(defined)増殖培地への外因性LIFの添加は、NSCの増殖を著しく促進する。本明細書中で別に述べたように、外因性LIFと培養皿のコーティングの組み合わせは、多分化能を維持しつつ、更にNSCの増殖レベルを増大させる。
【０１２４】
骨髄ストローマ細胞(BMSC)は容易に得ることができ、培養で実質的に同一の細胞集団を増殖させることができる。さらに、BMSCはNSCの増殖を促進するであろういくらかの栄養因子を分泌する。従って、本実施例は、BMSCがNSCの増殖のための共培養システムにおいて細胞を支持する役割を果たすことができることを実証する。
【０１２５】
本実施例に示された実験に使用される材料と方法をここに述べる。
【０１２６】
（ヒト胎児の神経幹細胞(NSC)の確立、維持、及び特徴付け)
アドバンスド・バイオサイエンス・リソーシーズ社（Advanced Bioscience Resources Inc.）(アラメダ、カリフォルニア)からヒトの脳(11-14週の胎児)を得た。脳組織は冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で粉砕した。遠心沈殿法により細胞をペレット状にし、10mlのNSC増殖培地(DMEM/F12、8mMグルコース、グルタミン、20mM重炭酸ナトリウム、15mM HEPES、8μg/mlヘパリン、N2サプリメント、lOng/ml bFGF、20ng/mlEGF)で再懸濁した。細胞をポリオルニチンでコーティングされたT-25cmのフラスコの上に播種し、５％C02のインキュベーター中で37℃にて培養した。培養は、培地の50%が新しい培地と一日おきに取替えられられることでフィードされ、14日ごとのトリプシン処理で継代された。液体窒素の気相中で、10%DMSOのNSC培地において細胞を凍結保存した。細胞を解凍し、bFGFとEGFの存在下で最初に約1-2継代培養した後、10ng/ml LIFが補充された完全増殖培地に播種した。
【０１２７】
別のNSC増殖培地は、本明細書で開示された方法に用いることができる。例えば、L-グルタミン、bFGF、EGF、及びB27が補充され、レチノイン酸が除かれたNeurobasal（商標）培地(インビトジェン社、カールスバッド、カリフォルニア)で細胞を培養することができる。別のNSC増殖培地としては、増殖因子が補充されたNeuroCult（登録商標）(ステムセル・テクノロジーズ社、バンクーバーBC、カナダ)である。特定の理論に限定されるものではないが、どんな培地でもNSCの培養に用いることができる。しかしながら、好適な培地は、複数の細胞タイプに分化できる細胞の潜在能力を維持しつつ、細胞が増殖し、拡大することを可能にする。
【０１２８】
特徴付けのために、NSCは、異なった継代で、コーティングされたチャンバースライドグラス上に播種され、4%のパラホルムアルデヒドで固定され、ネスチン及びグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)の染色がされた。bFGF、EGF、及びLIFを除去しながら、Neurobasal（商標）培地、B27サプリメント、及びBDNFを用いてNSCを処理することにより、およそ14日間NSCを分化させた。より特異な系統に細胞を分化するために別の分化条件を用いてもよい。細胞は固定され、微小管結合タンパク質(MAP2;ニューロンのマーカー)及びGFAP(星状細胞のマーカー)が染色された。ニューロンのサブタイプを特定するために、抗γ-アミノ酪酸(GABA)、抗チロシン水酸化酵素(TH)を用いて細胞を染色した。使用された一次抗体は、ヒト特異的ネスチン10倍希釈(R&Dシステムズ社製)、MAP2  500倍希釈(シグマ社製)、GFAP  1000倍希釈(ダコ社製)、Ｏ4  100倍希釈、NG-2  200倍希釈(ケミコン社製)である。これらの実験に使用された二次抗体は、商標Alexa Fluor 488トリ抗マウス500倍希釈(モレキュラプローブス社製)及び商標Alexa Fluor 594トリ抗ウサギ500倍希釈(モレキュラプローブス社製)である。
【０１２９】
NSCは、造血細胞マーカーCD45及びCD14、幹細胞マーカーCD34、CD133及びCD56、並びに免疫原性／刺激性マーカーCD80、CD86、MHCクラスI及びMHCクラスIIを含むいくつかのマーカーの発現について、フローサイトメトリーを用いて分析された。
【０１３０】
また、ネスチン発現細胞の定量分析もまたフローサイトメトリーを用いて測定された。この分析は、抗ネスチン(R&D社製)、及びAlexa-fluor488（商標）と結合したヤギ抗マウスIgを用いて行われた。NSCは、ベクトン-ディッキンソン社製サイトフィックス／サイトパームキット（商標）を使用説明書を少し変更して用いることで、固定、及び透過処理された。
【０１３１】
（ヒト骨髄ストローマ細胞(BMSC)の確立、維持、及び特徴付け)
BMSCは、当該技術分野の公知の方法によって生産された。例えば、ヒト骨髄は、注射針吸引によって採取された。骨髄中で、有核細胞が数えられた。骨髄は、PBSで希釈され、ヘスパン（登録商標）と混合された。ヘスパン／細胞懸濁混合液は、約45分〜1時間、静置された。その間、赤血球(RBC)が沈降したことで、上澄み層中に有核細胞の集まりができた。RBCの除去後、有核細胞は、洗浄され、数えられた。
【０１３２】
有核細胞は、例えばポリスチレン製の組織培養用処理容器で、10%ウシ胎児血清を含むDMEM低グルコース培地中で、培養された。第一の培養は、３日から４日ごとに培地を交換しながら、約12日から17日間続けて観察された。接着性紡錘状細胞が十分な数となったとき、トリプシンを用いて接着性細胞を剥がして培養は継代された。細胞は、別容器に移され、引き続き、継代ごとに一度培地を交換しながら約1週間培養が続けられた。
【０１３３】
細胞はフローサイトメトリーにより特異的マーカーを利用して単一化するためのテストが行われた。CD45陰性、並びに90％以上のCD90及びCD13陽性である継代１又は２(PI又はP2)のBMSCが、共培養実験に用いられた。
【０１３４】
（NSC増殖培地でのBMSCの培養）
BMSCは６穴プレート上に異なった密度で播種され、BMSC培地（低グルコース、ロット検査済み10%ウシ胎児血清含有DMEM）中で一晩接着させた。翌日、一つのプレートの培地をNSC培地(DMEM-F12,N2-サプリメント、EGF、20ng/ml、bFGF、10ng/ml、8llg/mlヘパリン、P/S)に置き換えた。残りのプレートには新しいBMSC培地を入れた。細胞には3日ごとに新しいBMSC、又はNSC培地を与えた。1セットの培養については、7日後にトリプシンで処理し、細胞数を数えた。もう1セットの細胞については12日後に回収し、細胞数を数えた。表１および図１に示されるように、BMSC培地で培養した場合には、BMSCはNSC培地で培養したときよりもはるかに多く増殖した。BMSC培地中で観察されたものに比べて、細胞がNSC培地中で示した初期の細胞数の増加は、低いものであった。しかし、7日後、NSC培地中においてはBMSC細胞数の増加はほとんどなかった。BMSC培地中では細胞は12日間以上増殖を続け、最終的に高い融合性が示された。NSC培地中では、BMSCは融合性細胞の渦巻形を形成しなかったが、可視的細胞死を除いては、形態的に正常であった。BMSC培地では、細胞の対照的な形態が観察された。
【０１３５】
【表１】
2007520233.tif 000003
【０１３６】
これらの結果は、NSC培地中でNSCとBMSCを一緒に培養した際、BMSCがNSCと競争してNSCよりも増殖するということが無いことを示す。
【０１３７】
（BMSCとNSCの共培養：コーティングされたプレート上NSCの生存および増殖と対比したBMSC上NSCの生存および増殖）
ヒトBMSC(hBM-03-016,PI)が、解凍され、洗浄され、数えられ、そして2枚の12穴プレートに、一つの穴につき7500個の細胞が播種された。同時に、別の12穴プレートは、15μg/mlポリオルニチン、次に10μg/mlヒトフィブロネクチンでコーティングされ、一晩置かれた。翌日、培養中のhNSCは回収され、EGFとFGFが含まれるNSC培地に再懸濁された。使用されたNSCは、hHB-007,P7であり、EGF、FGF及びLIFが含まれたNSC培地で培養されたものである。これらの細胞の大部分は、ニューロスフェアとして増殖したものである。これらの細胞をBMSCやコーティングされた穴に播種する際、ニューロスフェアは、できるだけ単細胞になるように分割された。BMSC上またはコーティングされたプレート上に、以下の条件で3組ずつNSCを播種した。
1.  25,000NSC+NSC培地、LIFなし
2.  25,000NSC+NSC培地、+LIF
3.  50,000NSC+NSC培地、LIFなし
4.  50,000NSC+NSC培地、+LIF
【０１３８】
使用済み培地50%が新しい培地と置き換えられることによって、培養物には一日おきに栄養が与えられた。細胞の位相差顕微鏡写真が、その時々に撮影された。培養12-13日後、細胞はトリプシンを用いて回収された。簡潔に言えば、細胞は0.05%のトリプシンと伴に、5分間または全ての細胞が皿から離昇するまで置かれた。その後、トリプシンはダイズトリプシン阻害剤(SBTI)によって中和された。細胞はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄され、その後、トリパンブルー染色液を用いて血球計算板で計測した。大きいBMSCと小さいNSCという2種の異なった大きさの細胞が顕微鏡下に見られた。この2つの集団は、別々に数えられた。最初のカウントは、3つの同型培養のうちの2つを貯蔵することにより、12日目に計測された。
【０１３９】
NSCはBMSC上に播種され、接着して、高濃度領域で単層として伸展した。これら細胞上の培地交換は難しくはなかった。他方では、特に、ニューロスフェアとして外因性LIF存在下にて増殖したNSC（図２）は、あまり接着しないので、培地を交換するときには極端に注意を払わなければならなかった。時々、吸引した培地の遠心分離がニューロスフェアの損失を妨ぐために必要とされた。またNSCは、低密度で播種されたときにはBMSCと共培養しなければ生存しなかった。共培養中に増殖したNSCは、平面で広く広がったBMSCの上で形態的に小円形の卵形の細胞ネットワークを形成した。単離されたコロニーを形成したNSCは、時々、線維芽細胞のBMSCのリングによって取り囲まれた（図３）。培養中は時間と共に、各々のコロニーが増殖するうちに、NSCの数が増えNSCのコロニーは大きくなる。外因性LIFの存在下で、かつ高い播種密度の場合のみ、NSCは単独で生存し、増殖する。しかしながら、共培養の場合は、外因性LIF非存在下であっても、NSCの著しい拡大が起こる。すなわち、BMSCは、支持細胞層の役割を果たし、NSCに栄養のサポートも与えたと思われる。NSCの著しい拡大は共培養中で得られ、それは、コーティング（即ち、ポリオルニチン／フィブロネクチンコーティング）された皿で、外因性LIFを添加して増殖したNSCの拡大に相当した。表２は、培養１２日後に回収されたNSCとBMSCの数を表す。
【０１４０】
【表２】
2007520233.tif 000004
【０１４１】
（BMSC上で培養したNSCの特徴付け：ネスチンの発現）
BMSCとの共培養におけるNSCのネスチン発現を免疫染色で評価するために、カバースリップ上で培養が行われた。カバースリップ(lOmm)は、本明細書中で別に述べたように、ポリオルニチン、その後ヒトフィブロネクチンでコーティングされた２４穴皿の中に配置された。カバースリップの１セットは、BMSCを播種(35,000/カバースリップ)し、細胞を一晩かけて接着させた。次の日、培養(THD-015+LIF,P12)中で増殖させたNSCを回収し、カウントした。BMSC上に、又は、直接コーティングされたカバースリップ上に、２５０００NSC／穴が播種された。BMSCの入った穴のいくつかは、NSC無しで単独で培養された。すべての異なる培養が、NSC培地、又はNSC培地+LIFの何れかで行われた。細胞は、50%の新しい培地を、一日おきに１０日間与えられた。１０日後、いくつかの培養物は固定され、ネスチン染色に備えられた。その他の培養物は２週間分化させた。
【０１４２】
培養物を固定するために、培養物を一度PBSで洗浄した。そして4%パラホルムアルデヒドを加え、１５分間室温で放置し、PBSで３回洗浄した。この時点で固定された培養物は４℃でPBS中に保存され、もしくはすぐに染色された。
【０１４３】
培養後のネスチン染色は、抗ネスチン抗体+抗GFAP抗体で染色することにより完了した。当該培養には、BMSC+NSC、BMSC+NSC+LIF、BMSC単独、BMSC+LIF、NSC単独、及びNSC+LIFが含まれる。二つ組のうちのひとつのサンプルが、コントロールとして用いられた（一次抗体なし）。
【０１４４】
NSC培地中で単独培養されたNSCは、外因性LIFの有無に関わらずネスチンを発現した。NSC培地+LIFで培養された場合は、ネスチンの発現に加えて、NSCは同時にGFAPを発現した。
【０１４５】
すべての共培養は、BMSCの表面に広がっている数多くのネスチン陽性細胞を示した(図4A-4F)。BMSC自体は、ごく淡いバックグラウンド染色を示した（図4G-4H)。ネスチン陽性細胞の形態は、不均一であった。多くのネスチン陽性細胞は、GFAPにも陽性であり、一方、他の細胞は、ネスチン陽性であり、GFAP陰性であった。いくつかのネスチン陽性細胞は、小さく、丸いか又は楕円形で、１又は２の糸状の伸張物があったり、なかったりした。いくつかの、ネスチン-GFAPダブルポジティブの細胞は、大きく、扁平で、星状細胞に似ていた。共培養物が培養される際の外因性LIFの添加の有無では、一見して明らかな相違は見られなかった。
【０１４６】
（共培養物の分化）
NSC培地での１０日間の培養後、共培養は２週間の分化計画に供された。分化計画は、1)DMEM/F12とN2サプリメント、EGFなし又はFGFなし、2)DMEM/F12+B27サプリメント、及び3)DMEM/F12+B27+BDNFのそれぞれについて、２つの供給を包含した。分化培養物は、パラホルムアルデヒドで固定され、その後、以下の抗体の組み合わせで染色された：例えば、ネスチン/GFAP、MAP2/GFAP及びO4/GFAP。全てのケースにおいて、GFAPは赤色蛍光(Alexa594、商標)で検出され、一方、ネスチン、MAP2、又はＯ4は緑色蛍光(Alexa488、商標)で検出された。培養物は、DAPIで対比染色され、青色蛍光で全ての核がラベルされた。
【０１４７】
NSCは、BMSC上でニューロン及び星状細胞に分化する能力を保持したまま増殖する(図5A-5D)。分化培地で増殖した後、いくつかの細胞は、神経細胞マーカーMAP-2を発現する。それは、楕円形の核、及び双極または多極の細胞体を有する小さな細胞である。そのプロセスは広範囲にわたり、複雑なニューロンの網がBMSCの表面、又はGFAPが染色された細胞の表面に形成される。GFAP陽性星状細胞もまた、培養全体を通して存在する。ニューロンと較べると、それらは、大きく、多角形で、そして扁平である。広範囲にわたるニューロンのネットワークが細胞の三次元の網を形成している為に、厳密に測定はできないが、概算すると、星状細胞と同じかそれ以上のニューロンが存在する。用いられた希釈液においては、Ｏ4抗体による染色によって、オリゴデンドロサイトに分化する細胞がないことが明らかにされた。オリゴデンドロサイトを生産するためにはさらに長い分化期間が必要らしい。しかしながら、オリゴデンドロサイト分化のマーカーとして、NG2（オリゴデンドロサイトの前駆体の表面で見られるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン）を使用することで、オリゴデンドロサイト細胞の存在が評価され、NG2陽性の細胞がほとんど無いことが観察された。分化した共培養物のネスチンの染色は、わずかにネスチン陽性の、いくらかのGFAP陽性の星状細胞を明らかにしたが、それらは、分化前に見られた小さな糸状細胞と形態的な相違を示した（図６）。培養の間の外因性LIFの存在、非存在によって、共培養におけるNSCの分化が相違することはなかった。単独で培養されたNSCが、上述のように分化したときに、それらが、ニューロン(MAP2陽性)及び星状細胞(GFAP陽性)になることが観察された(図7)。
【０１４８】
BMSC単独で同様の分化条件に供されたときには、それらは、かすかな、そして拡散したネスチン及びGFAPの染色を示し、外因性LIFを添加し、培養した細胞では、GFAPはいくぶん強めであった。細胞の形態は、BMSCと同様のままであり、星状細胞ではなかった。高いネスチン又はMAP2陽性によってNSC又は神経細胞系でのいくらかの分化が示唆されている培養中の稀有な細胞が見られた（図8）。
【実施例２】
【０１４９】
（BMSC及びNSC共培養からのBMSCの消耗）
BMSC及びNSC共培養からの細胞は、マウス抗ヒトCD13抗体(BMSC陽性およびNSC陰性)を用いて共培養物をインキュベートすることにより、分離することができる。パンマウスIgGに結合している磁性ビーズを用いることで、BMSCをNSCから分離することができる。NSCである非結合型細胞は、蛍光標示式細胞分取器（FACS）により分析されるか、もしくは培養中に戻される。FACS分析では、NSCがマウス抗ヒトCD133を用いて検出されるのと同時に、混入しているBMSCを検出するために異なるBMSCマーカー抗体（マウス抗ヒトCD105)が用いられる。
【０１５０】
BMSCは、６穴皿に、150,000細胞/穴で播種され、そしてBMSC培地中で一晩かけて付着させられる。培養で増殖しているNSC,THD-hWB-015+LIFP17は回収され、そしてニューロスフェアを壊すために再懸濁された。BMSC培地がBMSC培養から取り除かれ、そして回収されたNSCが、EGFとFGFを含む、外因性LIFを有する又は有さないNSC培地中のBMSCの表面に播種された(75,000細胞/穴)。当該共培養は、13日間、BMSC培地中で維持された。一日おきに、又は週末を超えて使用済みの培地の半分を新しい培地に置き換えることによって、細胞は養分補給された。
【０１５１】
13日目に、トリプシン、それに続くダイズトリプシン阻害剤を用いて共培養物は回収された。細胞混合物は、0.1%BSAを含むPBSで再懸濁された。細胞混合物は、抗CD13抗体と共に30分間氷の上でインキュベートされた。そして細胞は、遠心分離により、PBS/0.1%BSAを用いて洗浄された。同時に、ダイナルビーズ（商標）-パンマウスIgGは、磁性粒子濃縮器(Dynal-MPC)上で分離される毎に、PBS/0.1%BSAを用いて3回洗浄された。洗浄された細胞は、傾斜/回転装置(ダイナルサンプルミキサー、商標)上で、４℃のPBS/0.1%BSA中、洗浄された磁性ビーズと共に３０分間インキュベートされた。細胞-ビーズ混合物が入った試験管は、2-3分間MPCの中に置かれた。ビーズと付着した細胞は、試験管の磁石に最も近い側面に付着する。上澄み液は回収され、分離試験管に入れられた。
【０１５２】
上澄み液中の細胞の一部はFACS分析に用いられ、細胞の一部は、ポリオルニチンとフィブロネクチンでコーティングされたチャンバースライドグラス上に播種された。FACS分析は、抗CD105(BMSCを認識する)及び抗CD133(NSCを認識する)を用いて行われた。チャンバースライドグラス上に播種された細胞は、NSC培地の中で1-2日間培養され、固定されてネスチン/GFAP染色で免疫染色された。
【０１５３】
２週間を過ぎると、BMSC層の上にNSCは増殖した。いくつかの大きなコロニーが初期に見られ、それは小さなニューロスフェアから生じたと推察される。１つ又は数個の細胞として生じた他のNSCは、２週間を過ぎると、いくつかのNSCの小さなコロニーへと増殖した。
【０１５４】
BMSCの磁気消失の後、分離されたNSCは、FACSによって分析された。90%を超える細胞がCD133陽性であった(図9B)。2%未満がCD105陽性であった(図9A)。チャンバースライドグラス上に播種された細胞は、皿に付着し、形態的にNSCと類似していた。ネスチンの細胞染色は、NSCの存在の確認に用いられた。培養物中に置かれたBMSC-ビーズ混合物は、形態的にBMSCと似ており、多数の結合した磁性ビーズと共に組織培養フラスコに付着していた。BMSCに結合する抗体を用いた簡単な培養とそれに続く磁石による分離によって、富化したNSC集団が残った結果から、共培養物からBMSCがうまく使い尽くされていることが示される。
【実施例３】
【０１５５】
（共培養のスケールアップおよび支持細胞層として最小限のBMSCを用いたNSC増殖促進）
本実験においては、共培養はT-75組織培養フラスコに拡大された。１つのフラスコにつき、およそ2.5×105又は5.0×105の２つの異なる播種密度で、BMSC(ドナーBM-022,PI及びBM-024,PI)をBMSC培地に播種した。２日後、NSC培地及び5.0×105NSC(THD-015,P14)を用いて洗浄された細胞は、BMSCの表面上の完全NSC培地15ml中に播種された。細胞は、２日か３日ごとに培地の半分を新しいNSC培地で置き換えることで栄養分を補給して、15日間共培養された。15日後、トリプシン処理により細胞は回収された。大きいBMSCと小さいNSCは、血球計上でカウントされた。例えば実施例２などに、本明細書中で別に記載したようにBMSCは使い尽くされた。細胞は、およそ5x10×107/mlとなるように再懸濁され、抗ヒトCD13抗体と共に氷上で15分間インキュベートされた。細胞は、一度洗浄され、そして洗浄されたパンマウスIgGダイナビーズ（商標）と共に30分間インキュベートされた。ビーズ結合細胞は、磁性粒子濃縮器上で分離された。NSCを含む上澄み液はNSC培地で洗浄され、再生したNSCの数がカウントされた。細胞のいくらかはFACSによって分析され、他は分化と免疫細胞化学に供された。
【０１５６】
多数のBMSCよりも、より少数のBMSCの支持細胞層上でのNSC培養の方が、より大きなNSC増殖を引き起こすことを本明細書の開示は実証する。NSC播種密度に対するBMSCの割合を変化させることにより、BMSCが50-60%または高い集密で播種されたときに較べて、BMSCが約30%の低い集密で播種されたときには、NSCのより高い倍増殖が観察されるという発見がされた。例えば、表３に示すように、T-75フラスコ中の播種密度についてBMSCが約2.5×105でNSCが5.0×105のとき、同数のNSCを２倍のBMSC上に播種したときの47倍の増殖と比較すると、82倍ものNSCの増殖が観察された。相対的に、BMSC非存在のコーティングされた皿上で、外因性LIFを添加した標準的NSC培地中でNSCが培養された場合、他の実験で達成されたNSCの最大の増殖はおよそ20-25倍である。BMSC存在下でのNSC増殖に引き続き、抗BMSC抗体及び免疫-磁性ビーズを用いた共培養から83-93%の回収率でBMSCは効率的に使い果たされる（表３）。
【０１５７】
【表３】
2007520233.tif 000005
【０１５８】
NSCが増殖し、単離された共培養では、これに限定はされないが、ネスチンを含む前駆細胞のマーカーの発現が続くことが観察された（図１０）。また単離されたNSCは、ニューロンと星状細胞に分化する潜在能力を維持していた（図11）。当該分野における当業者は、本開示を基に、NSCを増殖させる当該方法をさらにスケールアップし、BMSCの生産のために有効となった製造プロセスに類似したシステムに適応させることが可能であることを認識することができるであろう。
【実施例４】
【０１５９】
（トランスウェル（登録商標）でのBMSCとNSCの共培養（接触非依存的共培養））
BMSCがヒト神経幹細胞(hNSC)の増殖および拡張のための、優れた供給/支持層としての役立つことが可能であることが、本明細書中で実証された。本実施例では、2つの細胞タイプの間の物理的接触が必要であるか、又はNSCの増殖と拡大を支持するための可溶性の栄養因子を提供する接触非依存的方法において、NSCの増殖及び拡大をBMSCが支持することができるかを解決するために実験が計画された。
【０１６０】
指定されたhBM-03-016-Pl及びhBM-012-P2のBMSCは、解凍され、BMSC培地中で洗浄され、そしてトランスウェル（登録商標）に播種された。トランスウェル（登録商標）での実験は、コスター（商標）６穴皿中で行われた。BMSCはトランスウェル（登録商標）内に播種され、同時にNSCは穴の底に播種された。両細胞タイプは、同じNSC培地内で培養された。トランスウェル（登録商標）の使用は、例えばBMSC及びNSCなどの2つの細胞タイプがお互いに物理的接触することなしに、異なる細胞タイプを培養することを可能とする。
【０１６１】
約30,000のBMSCが、トランスウェル（商標）の着脱可能な多孔性フィルターの表面に播種された。オーバーナイトで、細胞をBMSC培地中でトランスウェル（商標）の表面に付着させた後、血清を含まない培地を用いて細胞を洗浄し、完全NSC媒体(DMEM/F12+N2サプリメント+EGF+FGF)を供給した。NSC(指定THD-hWB-015-P13)を解凍し、洗浄し、ポリオルニチン/フィブロネクチンでコーティングされた６穴皿上に約40,000細胞/穴の密度で播種した。そして、BMSCを含むトランスウェル（商標）が、NSCを含む6穴プレート内に設置された。コントロールはNSCを含み、トランスウェル中のBMSCを有さない。十分な培地がトランスウェルと穴の底の両方に添加された。約50%の培地交換が、１日おきに行われた。２週間の培養の後、NSCがそれぞれの穴から回収され、カウントされた。細胞は、フローサイトメトリーを用いて、NSCマーカーの発現により分析された。
【０１６２】
コーティングされた穴でトランスウェル内のBMSCと共に培養されたNSCは、コーティングされた穴でBMSCなしで培養されたNSCよりも、良好に増殖したことを、当該結果は実証した(図12)。BMSCは、2つの細胞タイプ間の直接的接触の無い場合であっても、NSCの増殖と拡大をサポートすることが観察された。特定の理論により制限されるものではないが、BMSCから分泌された因子がNSC培地を補い、その結果、NSCの増殖と拡大を支持する助けをすると考えられる。トランスウェル内のBMSCの存在下で培養されたNSC、もしくはBMSC不存在下で単独で培養されたNSCのFACS分析は、NSCが表現型において同様であることを実証した。例えば、両条件で培養されたNSCは、ほぼ100%CD133陽性であることが観察された。
【０１６３】
6穴皿がポリオルニチン/フィブロネクチンでコーティングされなかったことを除いて、同じ実験が行われた。約50,000のBMSCがトランスウェル内に播種された。NSC(指定THD-hWB-015-P12)が解凍され、そしてファルコン（商標）とコスター（商標）の6穴プレート各々に播種された。トランスウエルで培養されたBMSCは、6穴プレートに播種され、そして培養は2週間維持された。コントロールとして、外因性LIFを含む又は含まないNSC培地中にてNSCが単独培養された。トランスウエル中のBMSCと共に培養されたNSCは、外因性LIF存在下でNSC培地中にて単独培養されたNSCと同様の形で増殖したが、外因性LIF非存在下で単独で増殖したNSCよりも著しく良好に増殖した(図13)。また細胞増殖の量に関して、コスター（商標）の皿が細胞増殖の量に関してファルコン（商標）の皿より良い結果を提供したことが観察された。
【実施例５】
【０１６４】
（BMSC調整培地中でのNSCの増殖）
実施例4に示された実験の結果は、NSCの成長を維持する可溶性因子をBMSCが作り出したことを実証した。BMSCから分泌された因子のNSC増殖における効果をさらに解明するために、培養されたBMSCによる調整培地を用いて、実験の次のセットが行われた。本明細書で開示された実験は、BMSCから分泌された増殖、及び/又は他の因子がNSCの増殖及び拡大を支持し、促進することができたかどうかについて検討した。本実験は、１）培養BMSCによって調整された培地が、培養中のNSCへの増殖促進効果を与える外因性LIFが補われたNSC培地の代替となることが可能か否か、２）培養BMSCによって調整された培地が、ポリオルニチン/フィブロネクチンでコーティングされた皿でNSCを培養したものと同様の有益な効果を培養NSCに与えることが出来るか否か、を検討するために計画された。
【０１６５】
BMSC-CMを生成するために、初めにBMSCはT-80フラスコに播種され、BMSC培地で培養された。培養期間の後に、BMSC培地をNSC培地に取り替えた。その結果、bFGF及びEGFを含む完全NSC培地(BMSC-CM1)、又はEGF及びbFGFを含まないNSC培地(BMSC-CM2)のいずれかで培養されたBMSCからBMSC-CMを得た。BMSCは48時間ごとに新しいNSC培地を与えられた。この段階で培地を取り出し、粒子状物質を取り除くために遠心分離し、そしてNSCに与えるために用いたか、又はサイトカインの試験のために-80℃で凍結した。BMSC-CMの実験のために、新しくBMSCから回収されたか、又は2週間位の間4℃で保存されていたBMSC-CMを約25-50%含むNSC培地をNSCに与えた。また、BMSC-CMはサイトカインアレイズ(商標、レイバイオテック社製)によって、もしくは酵素結合免疫測定法（ELISA）によって、様々なサイトカインの存在を分析された。
【０１６６】
BMSC-CM中でNSCを増殖させることができるか否かを試験するために、NSCをポリオルニチン/フィブロネクチンでコーティングされた皿に播種し、a)BMSC-CM1、b)BMSC-CM2、c)外因性LIFを有する完全NSC培地、又はd)外因性LIFを有さない完全NSC培地、を１日おきに培地50%と交換することで、栄養を与えた。BMSC-CM1とBMSC-CM2の最初の2回の交換については、新しいEGF及びFGFを各BMSC-CMを添加したが、その後、BMSC-CMへのEGFとFGFの添加は行わなかった。
【０１６７】
この結果は、BMSC-CM又は完全NSC培地において、NSCが等しく良好に増殖したことを示す。図14は、異なった条件下で培養されたNSCの典型的なフィールドを表す。BMSC-CM1の存在下では、細胞をニューロスフェアの外側で増殖させるニューロスフェアと共に、大きな付着性のニューロスフェアをNSCが形成したことが観察された。また、BMSC-CM1の存在下で培養されたNSCのいくつかが、単一層を形成したことが観察された。また、NSCがBMSC-CM2中で培養された場合も、NSCから形成されたニューロスフェアが観察された。しかしながら、BMSC-CM1存在下で培養されるNSCと較べると、大きなニューロスフェアは比較的少なく形成され、単一層も比較的少なく現れた。完全NSC培地の存在下では、数個のニューロスフェアが互いに接続してNSCが増殖し、ニューロスフェアから増殖している細胞が示された。いずれの場合も、各々の培養セットにおける細胞は10日後に回収され、NSC増殖における異なった培養条件の効果を比較するために、細胞の数がカウントされた。BMSC-CM1から回収された細胞の数(およそ3.4×106細胞)は、外因性LIFが存在する完全NSC培地のもの(およそ3.3×106)と同様であった。BMSC-CM2で得られた細胞数は、およそ2.85×106であった。
【０１６８】
実験の次のセットでは、コーティングされていない皿上であってもBMSC-CM中でNSCが増殖できるかについて、テストされた。NSCの4グループは以下の通りである：1)BMSC-CM1で培養されたNSC;2)BMSC-CM2培養されたNSC;3)外因性LIFを有する完全NSC培地で培養されたNSC;4)外因性LIFを有さない完全NSC培地で培養されたNSC。細胞は2週間培養され、トリプシン処理により継代され、さらにもう2週間、同様の条件で処理された。最初の2週間ではNSCの最大の増殖は、BMSC-CM1において、続いてBMSC-CM2において、その次にNSC媒体+LIFにおいて観察された(図15、PIで示した棒グラフ)。継代後、BMSC-CM1は、NSC培地+LIFのNSCと同様の増殖をした(図15においてP2で示される)。BMSC-CM2を用いて処理した細胞は、増殖を続け、LIFを有さないNSC培地を用いて処理した細胞よりも良好であった。すなわち、本データは、BMSC-CMはhNSC用増殖因子の優れた材料であり、外因性LIFが補われたNSC培地と、等しいかそれより早い速度でNSCの増殖を誘導できることを示す。加えて、BMSC-CMで培養されたNSCはトリプシン処理により継代することができ、さらに細胞数の増加に向けて増殖することができる。
【０１６９】
（BMSC-CMのサイトカインアレイ分析）
BMSCは完全NSC培地で培養された。培地は48時間後に回収され、そして、サイトカインプロフィール特性は、サイトカインアッセイを用いて決定された。レイバイオヒューマンサイトカイン・アンチボディ・アレイCシリーズ1000(商標、アレイVI及びVIIの組合せ)をレイバイオテック社(ノークロス、ジョージア州)から購入した。メーカーのマニュアルで説明されている通りに、アレイ膜をサンプルで処理した。サイトカインの最終検出は、ECL-プラスシステム(商標、アマシャム社製、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州)を用いて行われた。シグナルはエックス線フィルム(アマシャム社製、ピスキャタウェイ、ニュージャージー州)上で可視化された。
【０１７０】
サイトカイン特性の結果は、同じアレイ上での陰性コントロール以上のシグナルの強度に基づいて、様々なサイトカイン/因子がBMSC-CMに存在することを示した。サイトカイン/因子は、これに限定はされないが、LIF、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮増殖因子受容体(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、FGF-6、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、肝細胞増殖因子(HGF)、IFN-γ、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP-2)、IGFBP-6、IL-lra、IL-6、IL-8、単球走化性タンパク質(MCP-1)、単核性食細胞コロニー刺激因子(M-CSF)、神経栄養因子(NT3)、組織性メタロプロテアーゼ阻害剤(TIMP-1)、TIMP-2、腫瘍壊死因子(TNF-β)、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGF-D、ウロキナーゼ・プラスミノーゲン活性化因子受容体(uPAR)、骨形成タンパク質4(BMP4)、IL1-a、IL-3、レプチン、幹細胞因子(SCF)、ストローマ細胞由来因子-1(SDF-1)、血小板由来増殖因子-BB(PDGFBB)、腫瘍細胞増殖因子ベータ(TGFβ-1)、及びTGFβ-3を含む。
【０１７１】
特定の理論に限定されるものではないが、BMSCによって分泌されたか、もしくは培地によって誘導された因子に加えて、培地中に既に存在するEGFとbFGFを含む因子を含むいくつかの因子を、BMSC-CMは包含している。テストされたアレイに存在している120のサイトカインのアレイの陰性コントロール以上のシグナルの評価に基づいて、因子を本明細書中に例示した。
【０１７２】
バックグラウンド（ベースライン）レベルを超えて検出されたサイトカインのいくつかは、これに限定はされないが、EGF及びbFGFを含む。その他、明瞭に現れたサイトカインは、HGF(肝細胞成長因子)、M-CSF(マクロファージコロニー刺激因子)、並びにTIMP-1及びTIMP-2(各々、組織メタロプロテアーゼ阻害薬1及び2)である。神経栄養因子は、これには限定されないが、BDNF、NT3、GDNF、及びCNTFを含む。IGFBP及びFGF-6が存在した。また、多くのケモカイン、炎症性サイトカイン及び血管新生因子、例えばVEGFなどが生産された。また、ELISAによっても確認されたBMSCがLIFを生産した。ELISAアッセイでは、試験されたBMSCからの各分泌因子の実際の量は、BMSC-CMで測定した値から、コントロール培地ベースラインレベルを差し引くことによって算定された。
【０１７３】
本明細書に示された開示から、BMSCがNSCの増殖を促進する可溶因子を作り出すと結論づけることができる。また、調整されたBMSCが、NSCの増殖と拡大を支えることができるので、NSCのBMSCとの直接の接触は必要ではない。本開示は、接触依存性共培養が最も高いNSCの増殖を引き出しており、そのことがBMSCとの接触またはNSCと共にBMSCによって作り出されるBMSC生産物及び可溶因子との接触によるNSC増殖相乗効果を示唆していることを表している。
【実施例６】
【０１７４】
（BMSC上で、又はBMSC-CM中で培養されたNSCは、MHC分子発現レベルの減少を示すが、標準条件で単独培養されたNSCと同様の表現型特性を維持する。）
実施例3で増殖したNSCについて、様々なBMSC及びNSCマーカーの発現をフローサイトメトリーによって分析した。BMSCと共培養されたNSCが、検出可能なMHCクラスII分子の発現を示さないことを除いては、BMSCと共培養されたNSCは、外因性LIFが補われたNSC培地中で、BMSCなしで培養されたNSCと同様の表現型特性(例えばCD56及びCD133陽性、並びにCD105陰性)を維持している(図16)。外因性LIFがNSC培地に添加された場合は、MHCクラスII分子がNSCで誘導されたことが観察された。対照的に、BMSCと共培養されたNSCは、ベースラインを超えたMHCクラスII分子の発現が観測されず、そのことは移植に有利に働き得る。さらに、共培養から単離されたNSCは、ベースラインを超えてBMSCマーカーCD105を発現せず、共培養からBMSCを効率的に使い尽くしていることを示した。
【０１７５】
同様に、BMSC-CMで培養されたNSCは、ベースライン値のMHCクラスII及び、MHCクラスIの減少を示すことを除いて、標準NSC培地+LIFで培養されたNSCと同様の表現型特性を維持している(図17)。4グループのNSCについて、CD133、MHCクラスII分子、MHCクラスI分子、及びCD56の発現をFACS分析した(図17)。当該結果は、外因性LIFの存在下で培養されたNSCは、MHCクラスII分子を発現したという以前の観察を裏付け、またMHCクラスI分子のメジアン蛍光の増加を示した。しかしながら、BMSC-CMで増殖したNSCは、MHCクラスII分子の発現は見られず、MHCクラスI分子発現のレベルは低かった。CD133の発現もすべてのケースで同じであった。すべての細胞について、発現CD56のテストがされたが、外因性LIF存在下で培養された細胞は、CD56のメジアン蛍光の減少を示した。
【実施例７】
【０１７６】
（BMSC上で増殖したNSCのMHCクラスI及びクラスII発現の制御）
共培養されたNSCによるMHCクラスIとクラス11分子の両発現を評価するために、追加実験が行われた。NSCは胎児脳から単離され、NSC培地(THD-WB-015,P13)中で13の継代に培養された。次に、NSCは12日間、1日おきに培地を交換し、以下の4条件で培養された：
１．コーティングされたT25フラスコ内の完全NSC培地中、単独NSC62,500個。
２．コーティングされたT25フラスコ内の完全NSC培地+LIF中、単独NSC62,500個。
３．250,000個のBMSC(ドナー-012)支持細胞層表面で完全NSC培地中、NSC62,500個。
４．250,000個のBMSC(ドナー-016)支持細胞層表面で完全NSC培地中、NSC。
【０１７７】
12日後、細胞はトリプシン処理によって回収された。細胞は、カウントされ、CD133、CD105、MHCクラスI及びMHCクラスIの発現がフローサイトメトリーにより分析された。共培養の場合、全ての細胞が得られ、光散乱及びCD133発現に基づいて、NSCはゲートされた(gated)。図18は、いろいろな条件の下で培養されたNSCによるMHCクラスI及びクラスII分子の発現を示す(黒=アイソタイプコントロール;グレー=クラスI、又はクラスII)。
【０１７８】
当該結果は、全てのNSCがMHCクラスIを発現することを示す。しかしながら、外因性LIF不存在下で培養したNSCと比較したときの対数メディアン蛍光強度の増加に表されるように、外因性LIFの存在下でNSCが培養された場合は、細胞におけるMHCクラスIの発現は顕著に増大した。LIFを用いて増殖したNSCと比較すると、共培養されたNSCは、顕著に低いレベルでMHCクラスIを発現した（表4）。
【０１７９】
【表４】
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【０１８０】
NSCは、MHCクラスII分子を構成的に発現しなかった。一方、LIFは、細胞の38%でMHCクラスII分子の発現を誘導した。BMSCと共に培養されたNSCは、LIF不存在下で培養されたNSCと同様、ベースラインレベルを超えてはMHCクラスIIを発現しなかった。
【０１８１】
上記結果より、BMSC上でNSCを増殖する利益は、NSCの免疫調節性MHCクラスI、及びII分子の発現を低下、及び／又は抑制し、それらを臨床上の移植にさらに適するようにできることが示される。
【０１８２】
全ての特許、特許出願、及び本明細書で引用された刊行物の開示は、全体として、本明細書で資料として使用される。
【０１８３】
本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本発明の方法と構成において、様々な変更と変化が可能であることは、当業者に明らかである。すなわち、本発明は、添付の特許請求の範囲、及びその等価の範囲に含まれる本発明の変更と変化の範囲に及ぶことを意味する。
【図面の簡単な説明】
【０１８４】
【図１】BMSC培地でのBMSCの増殖を示すグラフである。
【図２】２Ａは外因性のLIFの非存在下において増殖するNSCのニューロスフェアを示す。２Ｂ及び２Ｃは外因性の白血病抑制因子（LIF）存在下においてニューロスフェア状に増殖したNSCを示す。
【図３】３Ａ及び３Ｂは、外因性のLIFの非存在下におけるBMSCとNSCの共培養を示す画像である。３Ｃ及び３Ｄは、外因性のLIFの存在下におけるBMSCとNSCの共培養を示す画像である。
【図４】４Ａ-４Ｆは、BMSCと共培養中のNSCによるネスチン及びグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)発現を示す、分化前の画像である。４Ｇ及び４Ｈは単独で培養されたBMSCによるネスチンおよびGFAPの非存在を示す。
【図５】BMSC上で増殖したNSCが神経細胞、及び星状膠細胞へ分化する能力を保有することを示す画像である。
【図６】分化後にごく僅かなネスチン発現を示している分化した共培養物のネスチン-GFAP染色を示す画像である。
【図７】分化したNSCのMAP2-GFAP染色を示す画像である。
【図８】８Ａ及び８Ｂは、神経マーカーおよび星状膠細胞マーカーのごく僅かな発現を示す分化BMSCのMAP2-GFAP-DAPI染色を示す画像である。
【図９】９Ａは、BMSC除去後のNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、2％未満の細胞がCD-105(BMSCマーカー)陽性であることを示す。９Ｂは、BMSC除去後のNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、90％を超える細胞がCD133陽性であることを示す。
【図１０】１０Ａは、BMSCによるネスチン非存在下発現を示すFACS解析グラフである。１０Ｂは、BMSC支持細胞を用いた共培養から単離されたNSCによるネスチン発現を示すFACS解析グラフである。
【図１１】BMSC上で増殖するNSCがニューロンおよび星状膠細胞に分化する多能性を保有していることを示す画像である。
【図１２】BMSCの存在下あるいは非存在下におけるトランスウェル（登録商標）中のNSCの増殖を示すグラフである。
【図１３】１３Ａは、トランスウェル（商標）中のBMSCの存在下、コーティングしていないプレート上で増殖したNSCを示す画像である。１３Ｂは、トランスウェル（商標）中のBMSCの非存在下において、コーティングしていないプレート上で増殖したNSCを示す画像である。
【図１４】１４Ａは、骨髄ストローマ細胞調整培地(BMSC-CM)を用いて培養されたNSCを示す画像である。１４Ｂは、骨髄ストローマ細胞調整培地(BMSC-CM)を用いて培養されたNSCを示す画像である。１４Ｃは、外因性LIFの存在下においてNSC培地で培養されたNSCを示す画像である。１４Ｄは、外因性LIFの非存在下においてNSC培地で培養されたNSCを示す画像である。
【図１５】NSCの増殖において、外因性LIFを有する又は有さない標準NSC培地と比較したBMSC-CMの効果を示すグラフである。
【図１６】１６Ａは、異なる二人のドナーのBMSCを用いた共培養から分離されたNSCの表現型プロファイルを示すFACS解析グラフである。１６Ｂは、異なる二人のドナーのBMSCを用いた共培養から分離されたNSCの表現型プロファイルを示すFACS解析グラフである。１６Ｃは、BMSCを有さないNSC培地で培養したNSCの表現型プロファイルを示すグラフである。１６Ｄは、外因性LIFを有するNSC培地で培養したNSCの表現型プロファイルを示すグラフである。
【図１７】１７Ａは、外因性LIFの存在下および非存在下のNSC培地で培養したNSCの表現型、並びに増殖因子存在下および非存在下のBMSC-CMで培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、CD56のプロファイルを示す。１７Ｂは、外因性LIFの存在下および非存在下のNSC培地で培養したNSCの表現型、並びに増殖因子存在下および非存在下のBMSC-CMで培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、CD133のプロファイルを示す。１７Ｃは、外因性LIFの存在下および非存在下のNSC培地で培養したNSCの表現型、並びに増殖因子存在下および非存在下のBMSC-CMで培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、MHCクラスII分子のプロファイルを示す。１７Ｄは、外因性LIFの存在下および非存在下のNSC培地で培養したNSCの表現型、並びに増殖因子存在下および非存在下のBMSC-CMで培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、MHCクラスI分子のプロファイルを示す。
【図１８】１８Ａは、外因性LIFの非存在下においてNSC培地で培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、種々の条件下で培養されたNSCによるMHCクラスIおよびクラスII分子の発現を示す。１８Ｂは、外因性LIFの存在下においてNSC培地で培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、種々の条件下で培養されたNSCによるMHCクラスIおよびクラスII分子の発現を示す。１８Ｃは、完全NSC培地でBMSCと共培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、種々の条件下で培養されたNSCによるMHCクラスIおよびクラスII分子の発現を示す。１８Ｄは、完全NSC培地でBMSCと共培養したNSCの表現型を示すFACS解析グラフであり、種々の条件下で培養されたNSCによるMHCクラスIおよびクラスII分子の発現を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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