(57)【要約】  本発明は、ＳＡＲＳコロナウイルスの存在についての単純で特異的かつ高感度の検査を提供する。本検査において有用なプライマーを含むキットもまた提供される。
2007514440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸を検出するための方法であって、
Ａ）核酸増幅産物を生成するために、逆転写酵素およびＳＡＲＳコロナウイルスのＮＳＰ１領域に対して特異的な少なくとも１つのプライマーを用いて前記サンプルの核酸を増幅させるステップと、
Ｂ）前記増幅産物を分析するステップと
を含み、予想された核酸増幅産物の検出が前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項２】
ＳＡＲＳコロナウイルスのＮＳＰ１領域に対して特異的な少なくとも１つのプライマーが、配列番号３、４、６、７、９および１０からなる群から選択される配列から本質的になるプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＳＡＲＳコロナウイルスのＮＳＰ１領域に対して特異的な少なくとも１つのプライマーが、配列番号３、４、６、７、９および１０からなる群から選択される配列からなるプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号３のヌクレオチド配列を有するプライマーおよび配列番号４のヌクレオチド配列を有するプライマーが使用され、前記予想される核酸増幅産物が３５２ヌクレオチド長であるポリヌクレオチドとして検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列番号６のヌクレオチド配列を有するプライマーおよび配列番号７のヌクレオチド配列を有するプライマーが使用され、前記予想される核酸増幅産物が１５７ヌクレオチド長であるポリヌクレオチドとして検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
配列番号９のヌクレオチド配列を有するプライマーおよび配列番号１０のヌクレオチド配列を有するプライマーが使用され、前記予想される核酸増幅産物が７７ヌクレオチド長であるポリヌクレオチドとして検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸増幅産物がクロマトグラフィーによって分析される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸を検出するための方法であって、
Ａ）核酸増幅産物を生成するために、逆転写酵素ならびに配列番号９の配列を有する第１プライマーおよび配列番号１０の配列を有する第２プライマーを用いて、前記サンプルの核酸を増幅させるステップと、
Ｂ）配列番号１１の配列を有するプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって前記核酸増幅産物を検出するステップと
を含み、
特異的にハイブリダイズする増幅核酸フラグメントの検出が、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項１０】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド６６５２からヌクレオチド７００３の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップであって、前記プライマーがヌクレオチド長での特定のプライマー長を有し、特定のヌクレオチド数である分離長によって分離されているステップと、
ｉｉ）増幅産物の長さをヌクレオチドで決定するステップと、
ｉｉｉ）フォーワードプライマー長、リバースプライマー長および分離長の合計であるヌクレオチド長を有する増幅産物の存在が、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド６６５２からヌクレオチド７００３の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップと、
ｉｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド６６５２から７００３の部分の少なくとも１８の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって、前記増幅産物を検出するステップと
を含み、
前記増幅産物に対する前記プローブの特異的ハイブリダイゼーションが、前記サンプル中のＳＡＲＳ核酸の存在を示す方法。
【請求項１４】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド４６０９からヌクレオチド４７６５の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップであって、前記プライマーがヌクレオチドでの特定のプライマー長を有し、特定のヌクレオチド数である分離長によって分離されているステップと、
ｉｉ）増幅産物のヌクレオチド長を決定するステップと
を含み、
ｉｉｉ）フォーワードプライマー長、リバースプライマー長および分離長の合計であるヌクレオチド長を有する増幅産物の存在が、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド４６０９からヌクレオチド４７６５の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップと、
ｉｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド４６０９から４７６５の部分の少なくとも１８の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって増幅産物を検出するステップと
を含み、
前記増幅産物に対する前記プローブの特異的ハイブリダイゼーションが、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項１８】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
配列番号３、４、６、７、９および１０からなる群から選択される核酸増幅反応のための少なくとも１つのプライマーを含む、ＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項２０】
配列番号３を有するプライマーおよび配列番号４の配列を有するプライマー、配列番号６を有するプライマーおよび配列番号７の配列を有するプライマー、ならびに配列番号９を有するプライマーおよび配列番号１０の配列を有するプライマーからなる群から選択される少なくとも１対のプライマーを含む、請求項１９に記載のＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項２１】
ＳＡＲＳコロナウイルスゲノム核酸、またはＮＳＰ１領域を含む少なくともその一部分をさらに含む、請求項１９または２０に記載のＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項２２】
前記ＳＡＲＳコロナウイルスゲノム核酸が配列番号１のヌクレオチド配列、またはそのＲＮＡ同等物を有する、請求項２１に記載のＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項２３】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法における、配列番号３、４、６、７、９、１０および１１からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００３年１２月１７日に提出された米国仮特許出願第６０／５２９，７３７号の優先権を主張する。
【０００２】
配列リスト
本出願は、１２の配列を表示する２０頁に及ぶ添付の配列リストを含む。
【０００３】
発明の分野
本発明は、患者サンプル中でＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための定性的核酸増幅アッセイを提供する。本アッセイは、ＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための優れた感度かつ特異性を提供するように開発されているプライマー対を使用する。
【背景技術】
【０００４】
非定型性肺炎である重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）の発生は、２００２年後期における中華人民共和国広東省に始まったと考えられている。ＳＡＲＳに罹患した個人の致死率は、分析された年齢群によっては１５％という高さになる可能性がある。ＳＡＲＳは、極度に高い致死率が付随する高度に感染性および急性の状態である。この状態は、ＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス）と呼ばれるヒトコロナウイルスによって惹起される。この疾患によって２００２年１１月から２００３年７月までの間に推定ＳＡＲＳ症例８０９８例中７７４例の患者が死亡したため、全世界的に深刻な経済的かつ社会的衝撃を与えた。
【０００５】
多数のウイルス性疾患では、ウイルスの伝播は症状発生の前後や直後である早期症候期中に最大となる。だが残念なことに、ウイルス排出量はＳＡＲＳの初期中には相当に少ない。呼吸器検体や大便中へのウイルス排出量は、臨床疾患の発生から約１０日前後にピークとなる。そこで早期に診断を下すためには、この疾患の初期数日間中に存在する低レベルのウイルスゲノムを検出できる高感度の検査を使用する必要がある。
【０００６】
現在は、多数の国々において多くの標準化されていない高感度検査が開発中である。現在利用できるＳＡＲＳ  ＲＴ−ＰＣＲに基づく診断検査は、複雑で実施するのが困難であるという短所が付随することが多い。典型的なＳＡＲＳ診断検査は、特定レベルの特異性および高感度を達成するためにネステッド（２段階）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。例えば、ＳＡＲＳについての典型的なＰＣＲ検査の説明については、世界保健機関（ＷＨＯ）から入手でき、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる「ＳＡＲＳ−ＣｏＶ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒｓ」，ｂｙ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｊ．Ｂｅｌｌｉｎｉ，Ｐｈ．Ｄ．Ｃｈｉｅｆ，Ｍｅａｓｌｅｓ  Ｖｉｒｕｓ，Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＤＶＲＤ／ＮＣ１Ｄ／ＣＤＣ，ＣＤＣｐｒｉｍｅｒｓ．ｐｄｆを参照されたい。
【０００７】
最初にＳＡＲＳが発生した時点には迅速な検出方法が存在しなかった。高感度かつ特異的である迅速な検出法があれば、疫病の蔓延をより良好に封じ込めることができる感染患者の迅速な診断が可能であった。ＰＣＲに基づくアッセイはＢｅｒｎｈａｒｄ  Ｎｏｃｈｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＢＮＩ）（Ｄｒｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）で開発され、Ａｒｔｕｓ社から市販で入手できる。ＢＮＩによって同定されてＡｒｔｕｓ社によって使用されたプライマーは、ＲＮＡポリメラーゼをコードするＳＡＲＳコロナウイルス非構造タンパク質９由来である。ＷＨＯの勧告によると、これらの検査結果はＳＡＲＳの嫌疑症例を除外するためにはまだ使用すべきではない（ＷＨＯ  Ｕｐｄａｔｅ  ７１）。
【０００８】
ＳＡＲＳ患者は初期段階中に他の人々を感染させることがあるので、確実に検出して迅速に隔離する必要があるが、現在利用できる検査は、必須の少量のＳＡＲＳコロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス）を一般に検出することはできないために患者管理および症例管理において重要な役割を果たさない。
【０００９】
コロナウイルスは、宿主細胞の細胞質内で増殖する大きなエンベロープを含むＲＮＡウイルスの１ファミリーであり、通常はヒトおよび動物において軽症呼吸器疾患を誘発する。
【００１０】
ＳＡＲＳコロナウイルスは、単離かつ配列決定されている。２９，７２７塩基対のプロトタイプ配列は、アクセッション番号ＡＹ２７８７４１でＧＥＮＢＡＮＫで見いだすことができ、これにより参照して組み込まれ、配列番号１として表示されている。例えば、１４種の単離体のゲノム配列を分析しているＰ．Ａ．およびＹ．Ｊ．Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：１７７９−１７８５（２００３）、およびＳＡＲＳと関連している第１単離体の１つを特性付けているＲｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３７７−１３７８（２００３）も参照されたい。
【００１１】
多数の様々な単離体由来のＳＡＲＳウイルスの完全ゲノムの配列決定は、このウイルスが典型的なコロナウイルスゲノム構成を有してはいるが、このウイルスは任意の他の既知のコロナウイルスとは密接な関連がないことを指摘した。
【００１２】
ＳＡＲＳウイルスは、レプリカーゼ１ａおよび１ｂタンパク質ならびに４種の構造タンパク質であるスパイクタンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）およびヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）を含む１４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードする。
【００１３】
Ｒｕａｎら（２００３、前記）は、ＳＡＲＳコロナウイルスのシンガポール症例のゲノム配列と他のコロナウイルスゲノム配列のデータベースとを比較した。この比較から、彼らはＳＡＲＳコロナウイルスのどの領域が他のコロナウイルスと相同であるか、したがってどのコロナウイルス系統間で保存されているのか、そしてどの配列がＳＡＲＳコロナウイルスシンガポール系統ＳＩＮ２５００に特有であるのかを見いだすことができた。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、単純で、高感度かつ特異的な診断検査を提供する。本検査は、これまでに開発されている他の検査と比較して単純でありながら高感度かつ特異的な核酸増幅系を提供する。本明細書に記載したプライマーを使用することにより、本発明は、先行技術の検出方法より高感度かつ特異的になされる。さらに、そのような特異性および感受性は、２段階ＰＣＲの代わりに１段階ＰＣＲ法を用いることによって増強させることができる。
【００１５】
本発明は、推定プロテイナーゼであるＳＡＲＳコロナウイルス非構造タンパク質１（ＮＳＰ１）から設計された特異的プライマー対を利用する。これらのプライマーは、ＳＡＲＳコロナウイルスを検出するための多数の技術と一緒に使用できる。
【００１６】
１つの実施形態では、本発明は単純なゲルをベースとするＲＴ−ＰＣＲ検出キットを提供する。そのようなキットは、本発明による１つ以上のプライマーおよび／またはプローブを含み、例えばキットは配列番号３、４、６、７、９、１０および１１のヌクレオチド配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドからなるプライマーを含有していてよい。本発明によるキットは、任意でポジティブコントロール核酸、例えばＳＡＲＳコロナウイルスゲノム核酸、またはＲＮＡもしくはＤＮＡいずれかのようなＮＳＰ１領域を含むその少なくとも一部分を含んでいてよい。
【００１７】
本発明は、サンプル中でＳＡＲＳコロナウイルス核酸を検出するための方法をさらに提供する。本方法は、一般に核酸増幅産物を生成するために、逆転写酵素およびＳＡＲＳコロナウイルスのＮＳＰ１領域に対して特異的な少なくとも１つのプライマーを用いてサンプルの核酸を増幅させるステップを含むと説明できる。増幅産物は次に、予想される核酸増幅産物を検出することを目指して分析される。予想産物の検出は、サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す。
【００１８】
本発明のプライマーは、Ｒｏｃｈｅ製ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製リアルタイムＰＣＲシステム、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製ＡＢＩ  ７０００型リアルタイムＰＣＲ分析装置などのＰＣＲプラットフォームまたは任意の他の適切な検出プラットフォームを用いてリアルタイムＰＣＲ検出のためのプライマーセットとして使用することもできる。
【００１９】
特異的プライマー対は、ＳＡＲＳコロナウイルス系統間で保存された領域を比較し、一般に全コロナウイルス間で保存された配列領域を避けることによって設計されている。ＮＳＰ１プロテイナーゼをコードするＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの一部分を、この比較によって検出標的として選択した。
【００２０】
図１に例示したように、本発明のプライマーは、約２２００番のヌクレオチドから約９８００番のヌクレオチドのＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの部分においてこの領域、もしくはその一部分を増幅できるような方法でハイブリダイズする。この領域は、推定プロテイナーゼをコードするＮＳＰ１領域として既知である。この領域を増幅させるための推定領域として選択したのは、先行技術アッセイにおいて利用されるＲＮＡポリメラーゼ領域とは相違して、その中で突然変異がＳＡＲＳコロナウイルス間で発生したとは思われない重大な一部分があり、この領域はＳＡＲＳコロナウイルスの全単離体に極めて特異的であるためであった；ＮＣＢＩ（国立バイオテクノロジー情報センター）Ｂｌａｓｔ検索によって試験されている仮説。約２６５０ヌクレオチドから約７８５０ヌクレオチドの領域では、数系統間で突然変異を有さないと思われることが同定されている（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。増幅のために好ましいＮＳＰ１領域の一部分は、ヌクレオチド４６０９以降からヌクレオチド７００３までの部分である。
【００２１】
本発明のプライマーは、少なくとも１６ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、さらにいっそう好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である。プライマーは、プライマーの特異性を保存するために、５０未満、好ましくは３０未満、より好ましくは２５未満のヌクレオチド長である。
【００２２】
そこで、本発明のＳＡＲＳ検出方法は、一般にゲノムのこの部分のＰＣＲ増幅について増幅産物を検出するためにＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのＮＳＰ１領域に対して特異的なプライマーセットを使用することにある。本発明の方法は、例えば、ヌクレオチド６６５２からヌクレオチド７００３のＳＡＲＳゲノムの領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマー、またはヌクレオチド４６０９からヌクレオチド４７６５のＳＡＲＳゲノムの領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを使用してサンプル中に存在する核酸を増幅させるステップによって実施できる、前記プライマーは増幅産物を入手するためにヌクレオチドでの特定のプライマー長を有し、特定のヌクレオチド数である分離長によって分離されている。増幅産物はその後に検出される。増幅産物は、例えば、クロマトグラフィー法、または例えば２もしくは３％アガロース中での電気泳動法によるようなゲル電気泳動法のどちらかによって、ヌクレオチドでの増幅産物の長さを決定するステップによって検出できる。フォーワードプライマー長、リバースプライマー長および分離長の合計であるヌクレオチド長を有する増幅産物の存在は、サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す。
【００２３】
または、産物は、例えばＴａｑｍａｎ（商標）システムでのリアルタイム蛍光検出を用いて、ハイブリダイゼーションプローブを使用して検出できる。ハイブリダイゼーションプローブは、好ましくは選択された増幅プライマーおよびテンプレートとしてのＳＡＲＳコロナウイルスゲノム核酸を用いて入手される増幅産物の一部分のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも１６ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド長、さらにいっそう好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長でなければならない。プローブは、プローブの特異性を保存するために、５０未満、好ましくは３０未満、より好ましくは２５未満のヌクレオチド長でなければならない。
【００２４】
本発明によるプライマーもしくはプローブの必須機能は、ＳＡＲＳコロナウイルス核酸であるＲＮＡもしくはＤＮＡいずれかへは特異的にハイブリダイズするが、他のコロナウイルス核酸もしくは他のウイルスの核酸へはクロスハイブリダイズしないことである。そこで、本発明によるプライマーもしくはプローブは、それがその配列を含む場合はヌクレオチド配列および、本発明による診断学的アッセイを実施するために選択された条件下でＳＡＲＳコロナウイルス核酸へ特異的にハイブリダイズする能力を損傷させない追加のヌクレオチドから「本質的になる」。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
実施例において一般に使用した材料および方法
ＳＡＲＳコロナウイルスの培養
本試験のためには、以前に配列決定された（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３）ＳＡＲＳコロナウイルス単離体（２００３ＶＡ２７７４）が使用される。ウイルスストックは、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、イスラエル）を補給した培地１９９（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社、米国）を用いてＶｅｒｏ  Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ：Ｃ１００８）内で増殖させる。７５％を超える細胞単層が細胞変性効果を示した時点に細胞上清を採取し、１３００×ｇでの遠心分離により透明化し、アリコートを採取し、使用時まで−８０℃で保存する。本調製物のＰＦＵは１×１０7ＰＦＵ／ｍＬであると決定される。
【００２６】
プラークアッセイ
培養中のウイルス力価を決定するために、プラークアッセイを実施する。手短には、１００ｍＬの一連のウイルスストック１０倍希釈液を２４ウェルプレート内のＶｅｒｏ  Ｅ６細胞のコンフルエント単層へ添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートする。
【００２７】
この後、５％のＦＣＳを含む培地１９９中の１ｍＬの１％カルボキシメチルセルロースオーバーレイを添加する。５％ＣＯ2中での３７℃での４日間にわたるインキュベーション後に、１０％ホルマリンを用いて細胞を固定し、２％クリスタルバイオレットを用いて染色する。プラークを視覚的に計数し、ウイルス力価を決定する。
【００２８】
ＲＮＡの抽出
ＳＡＲＳコロナウイルス標準物質：
ストックウイルスの１０倍希釈液を健常者から入手した血清中で調製する。ＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ製ウイルスＲＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧＭｂＨ社、独国）を製品添付文書に記載の取扱説明書にしたがって使用して抽出する。
【００２９】
患者の検体：
ウイルスの単離は、シンガポールからの最初の症例集団に属するＳＡＲＳ症例の気管支肺胞洗浄検体について実施する。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ抽出キット（製品番号５２９０６）を製品添付文書に記載の取扱説明書にしたがって使用して検体から直接抽出する。
【００３０】
その他のウイルス：
ＲＮＡは、ＱＩＡＧＥＮ製ウイルスＲＮＡミニキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧＭｂＨ社、独国）を製品添付文書に記載の取扱説明書にしたがって用いてＡＴＣＣ（米国、バージニア州）から入手したストックバイアルから直接抽出する。
【００３１】
ＭＲＣ−５細胞系：
全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ製ＲＮＡ抽出キット（製品番号７４１０４）を用いて正常ヒト二倍体線維芽細胞系ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１７１）から直接抽出し、分光光度計を使用してＲＮＡを定量する。
【実施例１】
【００３２】
プライマーの設計
プライマーは、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの保存領域に基づいてＳＡＲＳコロナウイルスＵｒｂａｎｉ系統（ＡＹ２７８７４１）の配列を用いて選択する（Ｒｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。プロテイナーゼ遺伝子領域内の１セットのプライマー対（非構造タンパク質１（ＮＳＰ１）領域の位置６６５２〜７００３）が、他のウイルスとの極めて低い交差相同性を示すので最も適合することが見いだされている（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。これらのプライマーは、ゲノム全体を通しての可能性のあるミスマッチを考慮に入れるように、そしてプライマー二量体形成を回避する、または少なくとも最小限に抑えるように設計されている。
【００３３】
プライマーのＮＳＰ１領域（プロテイナーゼ）標的は、一般にＳＡＲＳコロナウイルスの単離体間で明確に保存されている。ＮＳＰ１領域の大多数では、コロナウイルス群にわたって極めて強度の相同性を有するＮＳＰ９（ＲＮＡポリメラーゼ）と比較してＳＡＲＳフラグメントと他のコロナウイルスとの間では一致しない（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【００３４】
さらに、この領域の有意な部分において発生した突然変異は見いだされていない（Ｒｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。これは、この領域を標的とするプライマー（表１）を用いて他のウイルスからのＲＮＡサンプルの増幅を検査するステップによって、そしてＳＡＲＳコロナウイルス配列を除外したＮＳＴＢＩデータベース内のすべての既知の配列のＮＳＴＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索によって確証されたように、ＳＡＲＳコロナウイルス（すべての既知の単離体）に対して極めて特異的でもある。
【００３５】
３セットのプライマー対をＮＳＰ１プロテイナーゼ領域から同定する。ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムに関連付けたこれらの３セットの位置は図１に見ることができる。第１セットは、３５２塩基対長（配列番号２）であるセグメントＩＭＣＢ−１を増幅させる。この配列は、上方プライマー（ＩＭＣＢ−１−Ｕ、配列番号３）および下方プライマー（ＩＭＣＢ−１−Ｌ、配列番号４）に挟まれている。これらのプライマーを使用すると、サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を特異的に検出することができる。
【００３６】
ＩＭＣＢ−１−Ｕ（１９マー）：５’ＡＣＡＴＣＡＡＡＴＴＧＣＧＣＴＡＡＧＡ３’（配列番号３）
ＩＭＣＢ−１−Ｌ（２１マー）：５’ＡＣＡＡＴＴＣＴＣＴＡＡＣＧＣＣＡＴＴＡＣ３’（配列番号４）
【００３７】
セット２は、１５７塩基対長（配列番号５）であるＩＭＣＢ−２と呼ばれるセグメントに関する。この配列は、上方プライマー（ＩＭＣＢ−２−Ｕ、配列番号６）および下方プライマー（ＩＭＣＢ−２−Ｌ、配列番号７）に挟まれている。これらのプライマーを使用すると、ＩＭＣＢ−１プライマーセットと同様の方法で、サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を特異的に検出することができる。ＩＭＣＢ−１およびＩＭＣＢ−２プライマーセットのどちらも、例えば実施例３に記載した１段階ＲＴ−ＰＣＲに記載した試薬および条件を用いて使用できる。
【００３８】
ＩＭＣＢ−２−Ｕ（１９マー）：５’ＧＣＣＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＴ３’（配列番号６）
ＩＭＣＢ−２−Ｌ（２１マー）：５’ＣＡＣＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＧＣＴＧＴＣ３’（配列番号７）
【００３９】
セット３は、７７塩基対長（配列番号８）であるＩＭＣＢ−２の一部分であるＩＭＣＢ−３と呼ばれるセグメントに関する。この配列は、上方プライマー（ＩＭＣＢ−３−Ｕ、配列番号９）および下方プライマー（ＩＭＣＢ−３−Ｌ、配列番号１０）に挟まれている。プローブオリゴヌクレオチド（ＩＭＣＢ−３−プローブ、配列番号１１）はＩＭＣＢ−３の２つのプライマー間に位置する。これらのプライマーおよびプローブは、例えば増幅したフラグメントの蛍光検出を用いるリアルタイムアッセイにおいて、ＳＡＲＳコロナウイルスの存在を検出するために使用される。セット２およびセット３の下方プライマーＩＭＣＢ−２−ＬおよびＩＭＣＢ−３−Ｌはほとんど同一であるが、ＩＭＣＢ−３−Ｌは３’末端で３ヌクレオチド長い。これらのプライマーおよび／またはプローブを使用すると、サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を特異的に検出することができる。
【００４０】
ＩＭＣＢ−３−Ｕ（２６マー）：５’ＧＣＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＣＴＴＴＧＧ３’（配列番号９）
ＩＭＣＢ−３−Ｌ（２４マー）：５’ＣＡＣＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＧＣＴＧＴＣＣＴＧ３’（配列番号１０）
ＩＭＣＢ−３−プローブ（１７マー）：５’ＴＧＧＣＴＣＴＴＡＣＡＧＡＧＡＴＴ３’（配列番号１１）
【実施例２】
【００４１】
ＩＭＣＢ−１プライマー対を用いたＳＡＲＳコロナウイルスの検出
上述した第１プライマー対（ＩＭＣＢ−１）は、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド６６５２からヌクレオチド７００３の部分を増幅させるために設計される。本明細書では「上方プライマー」とも呼ぶフォーワードプライマーは、位置６６５２で始まるＳＡＲＳコロナウイルスゲノムへハイブリダイズして、配列番号３の配列を有する１９マーである。
【００４２】
本明細書では「下方プライマー」とも呼ぶリバースプライマーは、位置６９８３で始まるＳＡＲＳコロナウイルスゲノムへハイブリダイズして、配列番号４の配列を有する２１マーである。
【００４３】
ＲＮＡは、ＳＡＲＳ  ＲＮＡを含有すると考えられるサンプルから、既知の方法によって抽出する。ＲＮＡは、次に逆転写酵素または当分野において既知の任意の他の方法を用いてＤＮＡへ転換させる。サンプル混合液は、ＲＴ−ＰＣＲのために第１鎖ｃＤＮＡ合成キット（スイス国、バーゼル所在のＲｏｃｈｅ社によって製品番号１  ４８３  １８８を付けて販売されている）を用いて典型的な方法でｃＤＮＡへ転換させる。
【００４４】
第１鎖ｃＤＮＡ反応は、２０．０μＬの総反応量を生成するために、以下の試薬を表示された濃度で使用して実施する：
【表１】
2007514440.tif 000003
反応は２５℃で１０分間、そして次に４２℃で６０分間にわたり進行させる。
【００４５】
逆転写酵素は、５分間にわたり９９℃で反応液をインキュベートし、５分間にわたり４℃へ冷却することによって不活化する。
【００４６】
ｃＤＮＡは次に、各サンプルへ１μＬの１μｇ／μＬの一本鎖ＤＮＡを添加し、ＰＣＲのためのサンプルを調製することによって増幅させる。当業者であれば、ＤＮＡを増幅させるために当技術分野において公知の他の増幅方法を実施できることを認識する。
【００４７】
ＰＣＲは、以下の試薬および条件を用いて実施する。反応混合液は次に、以下の試薬および濃度を用いて調製する。
【表２】
2007514440.tif 000004
【００４８】
熱サイクリングは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）製Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ９６を用いて各々列挙したステップ、温度および時間について実施する。
【表３】
2007514440.tif 000005
【００４９】
ＰＣＲ産物を２．０％アガロースゲル上で分析する。検出は、または３５２ヌクレオチドの核酸フラグメントとして同定される正確な増幅領域の存在を確証するためにＡＢＩ社（カリフォルニア州フォスターシティー）製ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システムによって実施することができる。
【００５０】
当業者には、ＩＭＣＢ−１プライマーセットを２段階ＲＴ−ＰＣＴならびに１段階ＲＴ−ＰＣＲにおいて使用できることは明白である。特に、ＩＭＣＢ−１プライマーセットは、例えば実施例３に記載した１段階ＲＴ−ＰＣＲに記載した試薬および条件を用いて使用できる。
【実施例３】
【００５１】
ＩＭＣＢ−２プライマーセットを用いたＳＡＲＳコロナウイルスの検出
上述した第２プライマー対セットは、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド４６０９からヌクレオチド４７６５の部分を増幅させるために設計する。本明細書では「上方プライマー」もしくは「ＩＭＣＢ−２−Ｕ」と呼ぶフォーワードプライマーは、位置４６０９で始まるＳＡＲＳコロナウイルスゲノムへハイブリダイズして、以下の配列を有する１９マーである：
ＩＭＣＢ−２−Ｕ  ５’ＧＣＣＧＴＡＧＴＧＴＣＡＧＴＡＴＣＡＴ３’（配列番号６）
【００５２】
本明細書では「下方プライマー」もしくは「ＩＭＣＢ−２−Ｌ」と呼ぶリバースプライマーは、位置４７６５で始まるＳＡＲＳコロナウイルスゲノムへハイブリダイズして、以下の配列を有する２１マーである。
ＩＭＣＢ−２−Ｌ  ５’ＣＡＣＣＴＡＡＣＴＣＴＧＴＡＣＧＣＴＧＴＣ３’（配列番号７）
【００５３】
アッセイを実施するための方法は以下のとおりである。
【００５４】
５μＬのＲＮＡサンプルは、反応バッファー、最終濃度各４００μＭでＱ−溶液（Ｑｉａｇｅｎ製、製品番号２１０２１０）およびｄＮＴＰミックスならびに最終濃度各０．６μＭでの上方プライマーおよび下方プライマーを含有する４５μＬの事前混合溶液を用いて５０μＬの反応液量へ希釈する。１０単位／反応液でのＲＮａｓｅ阻害剤、酵素ミックス、ＲＮａｓｅ無含有水もまた添加する。
【００５５】
サーマルサイクリングは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ  ４０（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を使用して、以下の５０℃での３０分間の逆転写および９５℃での１５分間の初期変性、次に９５℃での４５秒間にわたる変性、５０℃での８０秒間にわたるアニーリング、７２℃での５０秒間にわたる伸長のステップを用いて実施する。サイクルは４２回繰り返す。全ＲＴ  ＰＣＲは、７２℃で１０分間にわたる最終伸長後に完了する。ＰＣＲ産物は、２．０％アガロース中でのゲル電気泳動法によって分析する。
【００５６】
患者のサンプルおよび事前に決定したＳＡＲＳコロナウイルス標準物質を用いると、本発明の診断検査の検出限界は、ＡＲＴＵＳ  ＲｅａｌＡｒｔ（商標）ＨＰＡ−コロナウイルスＬＣ  ＲＴ  ＰＣＲ試薬（製品番号：５６０１−０３）を用いて測定したときに確証されたように、ウイルスに対して約２００コピー／ｍＬ（１コピー／５μＬの反応液）であることが見いだされている。
【実施例４】
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲ  ＳＡＲＳ診断キットおよびその使用
本実施例によるキットは、典型的には５０または１００反応液を含有するように調製する。本キットは、以下に列挙する品目から構成される；本キットは霜の付かない冷凍庫に−２０℃で保管すべきである。図３Ｃは、ＩＭＣＢ−２プライマーセットを含む本キットを用いて入手した結果を示す。
【００５８】
本明細書に記載した逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）キットは、精選された適切なＲＮＡ抽出法を用いて検体から抽出したサンプル中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳコロナウイルス）ＲＮＡの存在を検出するために使用する。本アッセイにおいて増幅させたＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの領域は、ウイルスゲノムのＮＳＰ−１領域（プロテイナーゼ）内にある。このキットは、５μＬの検査サンプル中で数モルのウイルスＲＮＡを検出できるように最適化されており、全方法を１ステップで実施する。
【００５９】
構成要素
本実施例のキットは以下の４本のチューブからなる：
【表４】
2007514440.tif 000006
【００６０】
プロトコル、１段階ＲＴ−ＰＣＲ
１．サンプルの調製
ＲＮａｓｅ無含有エッペンドルフチューブ（０．５ｍＬまたは０．２ｍＬのサイズ）中へ、１検査／反応につき以下の試薬を添加する：
【表５】
2007514440.tif 000007
【００６１】
２．サーマルサイクリングのプロトコルＡ
このサーマルサイクリングのプロトコルは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）などの３ブロック型ＰＣＲサイクラーのために使用する：
【表６】
2007514440.tif 000008
【００６２】
３．サーマルサイクリングのプロトコルＢ
このサーマルサイクリング条件は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ製のＰｘ２  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒなどの１ブロックタイプのＰＣＲサイクラーのための条件である。
【表７】
2007514440.tif 000009
必要な場合は反応チューブとウェルとの間の熱伝導を最大化するためにサーモサイクラーのウェル内へ鉱油を注入するのが好ましい。
【００６３】
４．ＰＣＲ反応の終結
このステップは任意である。
（１）３０μＬのクロロホルム／チューブを添加する。５秒間、ボルテックスミキサーで混合する。
（２）２分間遠心する。（上層＝水相、下層＝有機相）
サンプルは、上層の水相として保存される。
【００６４】
５．電気泳動法による検出
ＰＣＲ反応の産物は、１レーン当たり５μＬの産物反応混合産物を用いることによってＤＮＡゲル電気泳動法によって分解させる。３％のアガロースゲルは良好な分解を提供する；ゲルは典型的には１００Ｖで３０分間にわたりランする。
【００６５】
予想産物のサイズは、実施例１のＩＭＣＢ−２プライマーセットを使用した場合は１５７ｂｐである。そのようなアッセイの結果は、図３Ｃに示す。この実施例は、２回ランされた５コピー／ｒｘｎ（５μＬ）ＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡを含有するサンプルからの増幅産物を示す。この産物を３％アガロースゲル電気泳動法によって分解した。１つのレーンにつき総反応量の１０％（５μＬ）を装填した。レーン１、ラン１の産物；レーン２、重複ランの産物；レーンＭ、１００ｂｐの格子。
【実施例５】
【００６６】
ＩＭＣＢプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの特異性
実施例１において設計したプライマーセットを使用するとＳＡＲＳコロナウイルスを特異的に検出できることを検証するために、選択したウイルスの増幅についてＩＭＣＢプライマーセット１および２を用いたＲＴ−ＰＣＲによって試験する。ＩＭＣＢ  ＲＴ−ＰＣＲプライマーセット１および２の特異性を検査するために以下のウイルスを表示した力価で試験する：
ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７４０  ２．８×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７５９  ３．５×１０7ＬＤ50／０．０２ｍＬ
トリ感染性気管支炎ウイルスＮＣＢＩ  Ｍ９５１６９  ５．８×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
デング熱ウイルス、ＮＣＢＩ  Ｍ８７５１２  １．１×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
黄熱病ウイルス、ワクチン系統１７Ｄ  ０．５×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
ヒト腸内コロナウイルス、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１４７５  ０．２×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
ウシコロナウイルス、ＡＴＣＣ  ＶＲ−８７４  １．１×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
ウサギコロナウイルス、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２０  ２３．３×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
マウス肝炎ウイルス、ＡＴＣＣ  ＶＲ−７６４  ０．６×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
イヌコロナウイルス、ＡＴＣＣ  ＶＲ−８０９  ３６．８×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
ラットコロナウイルス、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１４１０  １．１×１０6ＰＦＵ／ｍＬ
ネコＣｏＶ  ＲＮＡ、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９８９  １×１０5.5ＣＩＤ50／ｍＬ
【００６７】
表８に示した結果は、ＩＭＣＢプライマー対の特異性を示す。他のコロナウイルスおよびＳＡＲＳコロナウイルス非関連性ウイルスを検出するためにＩＭＣＢプライマー対１およびＩＭＣＢプライマー対２をＡＲＴＵＳ検出方法と一緒に使用する。ＩＭＣＢ−１およびＩＭＣＢ−２プライマー対を用いて、全ウイルスについて陰性結果が観察される。そこで、ＩＭＣＢ対はＳＡＲＳコロナウイルスを検出するために高度に特異的であることが証明される。
【００６８】
【表８】
2007514440.tif 000010
【実施例６】
【００６９】
利用可能なＳＡＲＳコロナウイルス検出キットの感受性についての比較
Ｅｉｋｅｎ社、Ａｒｔｕｓ社およびＲｏｃｈｅ  ＳＡＲＳ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社から入手できる、現在利用可能なＳＡＲＳ検出キットが同一ウイルス標準物質を検出する能力について３種のＩＭＣＢプライマー対を用いて比較する。Ｅｉｋｅｎ製キットは１段階ＲＴランプを用いて試験する（Ｔ．Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：Ｅ６３（２０００））。ＩＭＣＢ−１プライマー対は、実施例２に記載した濃度の試薬を用いて試験する。しかし、試薬物質は実施例３に記載したものであり、ＰＣＲプロトコルは実施例３に記載した１段階ＲＴ−ＰＣＲのプロトコルである。ＩＭＣＢ−２プライマー対は、実施例３に記載した試薬物質および濃度ならびに１段階ＲＴ−ＰＣＲのプロトコルを用いて試験する。ＩＭＣＢ−１およびＩＭＣＢ−２プライマーセットを用いて入手した増幅産物を、臭化エチジウム染色を用いるアガロースゲル電気泳動法によって分析する。ＩＭＣＢ−３プライマー対は、実施例１に記載したＴａｑｍａｎ（商標）プローブを用いるＡＢＩ  ７０００リアルタイムシステムについて最適化された１段階ＲＴ−ＰＣＲキットプロトタイプを使用して試験する。Ａｒｔｕｓ製ＡＢＩキットは、ＲｅａｌＡｒｔ（商標）ＨＰＡコロナウイルス（商標）ＲＴ  ＰＣＲ（Ａｂｂｏｔ社製品番号Ｂ３Ｋ３６０  ＲＥＶ．２００３−１０−Ｒ２）を用いて試験する（１回の反応につき５μＬの代わりに１０μＬのサンプルを使用する）。Ａｒｔｕｓ製ライトサイクラーキットは、ＲｅａｌＡｒｔ（商標）ＨＰＡ−Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ＬＣ  ＲＴ  ＰＣＲ試薬（製品番号：５６０１−０３）を用いて試験する。Ｒｏｃｈｅ製キットは、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（商標）ＳＡＲＳ定量キット（製品番号０３６０４４３８００１）バージョン１を用いて試験する。
【００７０】
表９は、比較試験の結果を示す。使用したウイルスサンプルコピー数は、サンプル量／ラン（ｖｏｌ／ｒｘｎ）の項目の下の第１列において表の上方の５μＬにつき８３コピーから表の下方の５μＬにつき０．１コピーへ減少する。表全体で、Ｐｏｓ（陽性）の後の括弧内の数は、実施された試験総数につき陽性検出が何回発生したかを示す。
【００７１】
表９から、ＩＭＣＢ−２プライマーセットは最高感度の検出を提供する；ＩＭＣＢ−１および−２プライマー対は、５μＬサンプルにつき０．８コピーという少数のウイルス核酸を確実に検出できることが明らかである。
【００７２】
【表９Ａ】
2007514440.tif 000011
【表９Ｂ】
2007514440.tif 000012
【実施例７】
【００７３】
患者サンプルの分析
多数の患者から臨床サンプルを入手し、本発明のアッセイによって実施例３に記載したプライマーセットＩＭＣＢ−２およびアッセイ法を用いて分析する。Ａｒｔｕｓ社が同社製ＰＣＲキットを用いて分析したサンプルについては、実施例４に記載したアッセイ法を使用する。結果は表１０に示す。
【００７４】
表１０の第１列は、サンプル識別番号である。第２列は、患者から採取したサンプルのタイプの説明である。第３および４列は、Ａｒｔｕｓ社検出法の結果を表示する。第５列は、ＩＭＣＢ−２プライマーセットを用いるＲＴ  ＰＣＲを使用した検出の結果である。最後の第６列は、各サンプルに関する備考を記録している。
【００７５】
表１０  患者サンプルの分析
【表１０Ａ】
2007514440.tif 000013
【表１０Ｂ】
2007514440.tif 000014
【表１０Ｃ】
2007514440.tif 000015
【実施例８】
【００７６】
ＳＡＲＳリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）診断キット
本実施例のキットは、典型的には５０または１００の反応液を含有するように調製する。このリアルタイム逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）キットは、生物学的サンプル中の重症急性呼吸器症候群コロナウイルスリボ核酸（ＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡ）の存在を検出するために最適化されている。このキットはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製リアルタイムＰＣＲ、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７５００と一緒に使用するために最適化されているが、本明細書の他の場所で記載した他の適合する検出プラットフォームと一緒に使用することもできる。
【００７７】
本キットにより増幅させたＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの部分は、ＳＡＲＳコロナウイルスＲＮＡのプロテイナーゼ領域内にある。本キットは、各ＲＴ−ＰＣＲ反応液中で少数分子のＲＮＡを検出するために十分に高感度である。
【００７８】
構成要素
本実施例の本キットは以下の４本のチューブからなる：
チューブ１：反応ミックス（例、ＡＢＩ、製品番号４３０９１６９）
チューブ２：酵素ミックス（例、ＡＢＩ、製品番号４３０９１６９）
チューブ３：プローブミックス（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．２）中の３μＭ上方プライマー、３μＭ下方プライマー、２μＭプローブ）
チューブ４：ポジティブコントロール（プライマーが標的とした遺伝子のＲＮＡ転写産物）
【００７９】
プロトコル
１．ＲＴ−ＰＣＲ
以下の反応ミックスは９６ウェル光学プレート内で調製する：
【表１１】
2007514440.tif 000016
汚染を回避するために細心の注意を払わなければならない。
【００８０】
２．サーマルサイクリング条件：
【表１２】
2007514440.tif 000017
【００８１】
ＩＭＣＢ−３プライマーセットおよびプローブがＳＡＲＳコロナウイルスを検出する能力について、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製リアルタイムＰＣＲシステムのＭｘ３０００Ｐを用いて試験する。このシステムは、感染患者由来サンプルについての製造業者の指示にしたがって使用する。サンプルは、５μＬ当たりのウイルスコピー数の総数が７．５から６の範囲内となるように数倍へ希釈する。
【００８２】
結果は表１３に示す。５μＬ当たりのＳＡＲＳコロナウイルスのウイルスコピー数は、全３回のランにおいて７．５から６の範囲内である。行Ａ（Ａ１〜３）は、ウイルス無含有の対照サンプルである。行Ｃ（Ｃ１〜Ｃ１０）は５μＬ当たりウイルスコピー数７．５でのサンプルの検出であり、行Ｅ（Ｅ１〜Ｅ１０）は５μＬ当たりウイルスコピー数７．５でのサンプルの検出であり、そして行Ｇ（Ｇ１〜Ｇ１０）は５μＬ当たりウイルスコピー数７．５でのサンプルの検出である。第４列は、試験したサンプル数当たりに検出された陽性結果の数を表示する。これらの結果は、ＩＭＣＢ−３プライマーセットおよびプローブが、臨床状況において有用であるＳＡＲＳコロナウイルスについての高感度かつ特異的アッセイを提供することを証明する。
【００８３】
表１３：リアルタイムＰＣＲ分析におけるＩＭＣＢ−３プライマーセットの感受性
【表１３Ａ】
2007514440.tif 000018
【表１３Ｂ】
2007514440.tif 000019
【００８４】
当業者は、上述した方法における構成要素の存在もしくは非存在、化学物質の濃度、サイクリング条件および装置は、特定の必要性に適合するため、そして反応条件を最適化するために修飾できることを理解できる。
【００８５】
さらに、当業者は、上述した方法および上記の説明が本発明の精神および範囲内に含まれる修飾を含むことができることを理解する。
【００８６】
参考文献
以下の参考文献を本明細書において言及した。以下の参考文献の各々は、そのような言及によりあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ｄｒｏｓｔｅｎ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：１９６７−１９７６．
Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：Ｅ６３．
Ｒｏｔａ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３９４−１３９９．
Ｒｕａｎ，Ｙ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，２００３．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  １４  ＳＡＲＳ  ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｏｒｉｇｉｎｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｌａｎｃｅｔ．３６１，１７７９−１７８５．
ＷＨＯ  Ｕｐｄａｔｅ  ７１．Ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｔｅｓｔｓ，ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｅｎｔｉｔｙ／ｃｓｒ／ｄｏｎ／２００３＿０６＿０２ａ／ｅｎ
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】ＩＭＣＢプライマーセットによって増幅させたＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの部分を示す。
【図２】ＩＭＣＢ−３プライマーセットによって増幅させたＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの部分を示し、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの配列に沿ってＩＭＣＢ−３プライマーとＩＭＣＢ−３プローブとをアライメントしている。上方鎖配列は配列番号１のヌクレオチド４６０９〜４７６５として示す。下方鎖は配列番号１２として示される。
【図３Ａ−３Ｃ】本発明のプライマーの有効性を証明しているゲルを示す。図３Ａは、装填された１サンプル当たりのウイルスコピー数が２６．１コピーから０．０７コピーまで変動したＩＭＣＢ−２プライマーセットを用いたＳＡＲＳコロナウイルスの検出を示す。レーン１はマーカーであり、レーン２および３は５μＬ当たり２６．１コピーのウイルスを含有し、レーン４および５は５μＬ当たり１２．６コピーのウイルスを含有し、レーン６および７は５μＬ当たり１．９６コピーのウイルスを含有し、レーン８および９は５μＬ当たり２．０コピーのウイルスを含有し、レーン１０および１１は５μＬ当たり０．０７コピーのウイルスを含有し、レーン１２は非関連ウイルスのネガティブコントロールを含有し、そしてレーン１３はまた別のマーカーを含有する。図３Ｂは、ＩＭＣＢ−２プライマーセットを用いてＳＡＲＳコロナウイルスを検出する第２実験を示しており、装填されたサンプル当たりのウイルスコピー数は２６．１コピーから０．０８コピーまで変動した。レーン１はマーカーであり、レーン２および３は５μＬ当たり２６．１コピーのウイルスを含有し、レーン４および５は５μＬ当たり８．２コピーのウイルスを含有し、レーン６および７は５μＬ当たり２．６コピーのウイルスを含有し、レーン８は５μＬ当たり０．８コピーのウイルスを含有し、レーン９は５μＬ当たり０．２５コピーのウイルスを含有し、レーン１０および１１は５μＬ当たり０．０８コピーのウイルスを含有し、レーン１２は非関連ウイルスのネガティブコントロールを含有し、そしてレーン１３はまた別のマーカーを含有する。図３Ｃは、計５μＬ中での１ラン（２回ずつ）当たり５コピーのＳＡＲＳコロナウイルスゲノムＲＮＡを含有するサンプルからの増幅産物を示す。産物は、３％アガロースゲル電気泳動法によって分解する。１つのレーンにつき総反応量の１０％（５μＬ）を装填する。レーン１、増幅産物；レーン２、重複反応の増幅産物；レーンＭ、１００ｂｐの格子。
【図４Ａ−４Ｃ】ＩＭＣＢ−１プライマーセットを用いてＳＡＲＳコロナウイルス核酸を検出するための、本発明を用いて達成される感受性を示す。図４Ａは、１サンプルにつき８．８ｐｆｕ（２２００コピー）（レーン１および２）から１サンプルにつき０．０８ｐｆｕ（２２コピー）（レーン５〜６）を用いて達成された結果を示す。レーン７および８は、ウイルスを含有しない対照を示す。図４Ｂは、１サンプルにつき０．０８ｐｆｕ（２２コピー）から１サンプルにつき０．０００８ｐｆｕ（０．２コピー）を用いた同一アッセイのまた別のランの結果を示した図である。レーン１１および１２は、ウイルスを含有しない対照を示す。図４Ｃは、１サンプルにつき０．０８ｐｆｕ（２２コピー）から１サンプルにつき０．００４ｐｆｕ（１コピー）を用いた第３ランを示す。レーン７および８は、ウイルスを含有しない対照を示す。Ｍは分子長マーカーである。
【図１】
2007514440.tif 000020
【図２】
2007514440.tif 000021
【図３Ａ−３Ｂ】
2007514440.tif 000022
【図３Ｃ】
2007514440.tif 000023
【図４Ａ−４Ｃ】
2007514440.tif 000024
【配列表】
2007514440000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月19日(2007.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸を検出するための方法であって、
Ａ）核酸増幅産物を生成するために、逆転写酵素およびＳＡＲＳコロナウイルスのＮＳＰ１領域に対して特異的な少なくとも１つのプライマーを用いて前記サンプルの核酸を増幅させるステップと、ここで、ＳＡＲＳコロナウイルスのＮＳＰ１領域に対して特異的な少なくとも１つの前記プライマーは、配列番号３、４、６、７、９および１０からなる群から選択される配列から本質的になるプライマーである、
Ｂ）前記増幅産物を分析するステップと
を含み、予想された核酸増幅産物の検出が前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項２】
ＳＡＲＳコロナウイルスのＮＳＰ１領域に対して特異的な少なくとも１つのプライマーが、配列番号３、４、６、７、９および１０からなる群から選択される配列からなるプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号３のヌクレオチド配列を有するプライマーおよび配列番号４のヌクレオチド配列を有するプライマーが使用され、前記予想される核酸増幅産物が３５２ヌクレオチド長であるポリヌクレオチドとして検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
配列番号６のヌクレオチド配列を有するプライマーおよび配列番号７のヌクレオチド配列を有するプライマーが使用され、前記予想される核酸増幅産物が１５７ヌクレオチド長であるポリヌクレオチドとして検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
配列番号９のヌクレオチド配列を有するプライマーおよび配列番号１０のヌクレオチド配列を有するプライマーが使用され、前記予想される核酸増幅産物が７７ヌクレオチド長であるポリヌクレオチドとして検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸増幅産物がクロマトグラフィーによって分析される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸を検出するための方法であって、
Ａ）核酸増幅産物を生成するために、逆転写酵素ならびに配列番号９の配列を有する第１のプライマーおよび配列番号１０の配列を有する第２のプライマーを用いて、前記サンプルの核酸を増幅させるステップと、
Ｂ）配列番号１１の配列を有するプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって前記核酸増幅産物を検出するステップと
を含み、
増幅核酸フラグメントの特異的なハイブリダイゼーションの検出が、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項９】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド６６５２からヌクレオチド７００３の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップであって、前記プライマーがヌクレオチド長での特定のプライマー長を有し、特定のヌクレオチド数である分離長によって分離されているステップと、
ｉｉ）増幅産物の長さをヌクレオチドで決定するステップと、
ｉｉｉ）フォーワードプライマー長、リバースプライマー長および分離長の合計であるヌクレオチド長を有する増幅産物の存在が、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示すステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド６６５２からヌクレオチド７００３の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップと、
ｉｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド６６５２から７００３の部分の少なくとも１８の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって、前記増幅産物を検出するステップと
を含み、
前記増幅産物に対する前記プローブの特異的ハイブリダイゼーションが、前記サンプル中のＳＡＲＳ核酸の存在を示す方法。
【請求項１３】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド４６０９からヌクレオチド４７６５の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップであって、前記プライマーがヌクレオチドでの特定のプライマー長を有し、特定のヌクレオチド数である分離長によって分離されているステップと、
ｉｉ）増幅産物のヌクレオチド長を決定するステップと
を含み、
ｉｉｉ）フォーワードプライマー長、リバースプライマー長および分離長の合計であるヌクレオチド長を有する増幅産物の存在が、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項１５】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法であって、
ｉ）増幅産物を入手するために、ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド４６０９からヌクレオチド４７６５の領域に対して選択的な、フォーワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、前記サンプル中に存在する核酸を増幅させるステップと、
ｉｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムのヌクレオチド４６０９から４７６５の部分の少なくとも１８の連続したヌクレオチドのヌクレオチド配列を有するプローブの特異的ハイブリダイゼーションによって増幅産物を検出するステップと
を含み、
前記増幅産物に対する前記プローブの特異的ハイブリダイゼーションが、前記サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を示す方法。
【請求項１７】
前記核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応によって実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号３、４、６、７、９および１０からなる群から選択される核酸増幅反応のための少なくとも１つのプライマーを含む、ＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項１９】
配列番号３を有するプライマーおよび配列番号４の配列を有するプライマー、配列番号６を有するプライマーおよび配列番号７の配列を有するプライマー、ならびに配列番号９を有するプライマーおよび配列番号１０の配列を有するプライマーからなる群から選択される少なくとも１対のプライマーを含む、請求項１８に記載のＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項２０】
ＳＡＲＳコロナウイルスゲノム核酸、またはＮＳＰ１領域を含むＳＡＲＳコロナウイルスゲノム核酸の少なくとも一部分をさらに含む、請求項１８または１９に記載のＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項２１】
前記ＳＡＲＳコロナウイルスゲノム核酸が配列番号１のヌクレオチド配列、またはそのＲＮＡ同等物を有する、請求項２０に記載のＳＡＲＳコロナウイルス検出キット。
【請求項２２】
サンプル中のＳＡＲＳコロナウイルス核酸の存在を検出するための方法における、配列番号３、４、６、７、９、１０および１１からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの使用。
【国際調査報告】
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2007514440.tif 000047
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