(57)【要約】生物学的に活性な、インターフェロン−ベータ１ｂ−ポリマー結合体組成物を開示する。そのポリマー部分は、分子量が少なくとも約１２ｋＤａであるポリアルキレンオキシドポリマーであることが好ましい。これを作製および使用する方法も開示する。
2007526317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）少なくとも約１２ｋＤａの分子量を有するポリアルキレンオキシドポリマーに結合したインターフェロン；ならびに必要に応じて
ｂ）界面活性剤；
ｃ）賦形剤；および
ｄ）バッファー；
を含み、溶液のｐＨ範囲が約３〜約１１であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記インターフェロンが、インターフェロン−ベータ１ｂであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリエチレングリコールより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記ｐＨ範囲が、約２．５〜約８．５であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記ｐＨ範囲が、約３．０〜約５．０であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項６】
前記ｐＨ範囲が、約３．０〜約４．０であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記バッファーが、グリシン−ＨＣｌ、酢酸、酢酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよびコハク酸ナトリウムより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項８】
前記バッファーが、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよびグリシンＨＣｌから選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項９】
前記バッファーのイオン強度が、約１０ｍＭであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
前記バッファーが、約３ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
前記賦形剤が、非イオン性であり、単糖類、二糖類およびアルジトールより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
前記賦形剤が、グルコース、リボース、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース、フルクトース、キシルロース、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン、グリセロール、ソルビトール、マンニトールおよびキシリトールより成る群から選択されることを特徴とする請求項７記載の組成物。
【請求項１３】
前記賦形剤が、スクロース、トレハロース、マンニトールおよびグリセロール、またはそれらの組み合わせより成る群から選択されることを特徴とする請求項８記載の組成物。
【請求項１４】
前記賦形剤が、マンニトールおよびスクロースまたはそれらの組み合わせより成る群から選択されることを特徴とする請求項９記載の組成物。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、非イオン性であり、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、およびポリエチレングリコールより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリアルキレンオキシドポリマーが、直鎖または分枝であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項１７】
前記直鎖ポリアルキレンオキシドポリマーが、次式で表されるものであることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【化１】
2007526317.tif 000029
（式中、
Ａは、キャッピング基であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分枝アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ３〜１２分枝アルケニル、Ｃ１〜６アルキニル、Ｃ３〜１２分枝アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換されたＣ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシアルキル、フェノキシアルキル、およびＣ１〜６ヘテロアルコキシから選択され、
ｘは、重合度である。）
【請求項１８】
前記キャッピング基が、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、ＮＨ２、ＳＨ、およびＣ１〜６アルキル部分より成る群から選択されることを特徴とする請求項５記載の組成物。
【請求項１９】
前記分枝ポリアルキレンオキシドポリマーが、以下のものより成る群から選択されることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【化２】
2007526317.tif 000030
（式中、
（ａ）は、約１〜約５の整数であり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ８、Ｓ、ＳＯ、またはＳＯ２であり、ここで、Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８分枝アルキル、Ｃ１〜８置換アルキル、アリール、またはアラルキルであり；
（ｘ）は、重合度であり；
（ｎ）は、０または１であり；
（ｐ）は、正の整数、好ましくは約１〜約６であり；
ｍ−ＰＥＧは、ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−であり、
リガンドは、インターフェロン−β１ｂである。）
【請求項２０】
前記インターフェロン−ベータ１ｂが、配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
前記インターフェロン−ベータ１ｂが、以下のものから選択されるポリアルキレンオキシドポリマーに結合していることを特徴とする請求項２０記載の組成物。
【化３】
2007526317.tif 000031
【請求項２２】
前記ポリアルキレンオキシドポリマーの分子量が、約１２ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
前記ポリアルキレンオキシドポリマーの分子量が、約３０ｋＤａであることを特徴とする請求項２１記載の組成物。
【請求項２４】
前記ポリアルキレンオキシドポリマーの分子量が、約４０ｋＤａであることを特徴とする請求項２１記載の組成物。
【請求項２５】
前記ポリアルキレンオキシドポリマーが、ウレタン、第二級アミン、アミドおよびチオエーテルより成る群から選択される連結によって、インターフェロン−ベータ１ｂに結合していることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２６】
前記インターフェロン−ベータ１ｂが、前記インターフェロン−ベータ１ｂのアルファ−アミノ末端基を介して、ポリアルキレンオキシドポリマーに結合していることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２７】
前記インターフェロン−ベータ１ｂが、該インターフェロン−ベータ１ｂのＬｙｓのイプシロンアミノ基を介してポリアルキレンオキシドポリマーに結合していることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２８】
前記インターフェロン結合体が、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項２９】
前記インターフェロン結合体が、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
ａ）０．０５〜３．０ｍｇ／ｍｌの、少なくとも約１２ｋＤａの分子量を有するポリアルキレンオキシドポリマーに結合したインターフェロン−ベータ１ｂ、
ｂ）１％〜５％のマンニトール、および
ｃ）３〜１０ｍＭの酢酸を含み、ｐＨが約３．７であることを特徴とする組成物。
【請求項３１】
ＥＭＣ／ＶｅｒｏまたはＥＭＣ／Ａ５４９抗ウイルスバイオアッセイを使用した場合に、天然のインターフェロン−ベータ１ｂと比較して抗ウイルス活性の少なくとも約６５パーセントが保持されている生物学的に活性なポリマー−インターフェロン結合体組成物であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３２】
ＥＭＣ／ＶｅｒｏまたはＥＭＣ／Ａ５４９抗ウイルスバイオアッセイを使用した場合に、天然のインターフェロン−ベータ１ｂと比較して抗ウイルス活性の少なくとも約２０パーセントが保持されている生物学的に活性なポリマー−インターフェロン結合体組成物であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３３】
請求項１記載の組成物を調製する方法であって、活性化ポリアルキレンオキシドポリマーをインターフェロン−ベータ１ｂに結合させるのに十分な条件下で、少なくとも約３０ｋＤａの分子量を有する活性化ポリアルキレンオキシドポリマーと、インターフェロン−ベータ１ｂを反応させ、得られた結合体を精製し、前記結合体を、必要に応じて賦形剤および界面活性剤を含有する、約３．０〜約８．０のｐＨを有する緩衝溶液中に再懸濁させる工程を含み、前記組成物が、ＥＭＣ／ＶｅｒｏまたはＥＭＣ／Ａ５４９抗ウイルスバイオアッセイを使用した場合に、天然のインターフェロン−ベータ１ｂと比較して抗ウイルス活性の少なくとも約２０％が保持されている生物学的に活性なポリマー−インターフェロン結合体組成物であることを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記条件が、前記活性化ポリアルキレンオキシドポリマーを前記インターフェロン−ベータ１ｂのアミノ末端基に結合させるのに十分なものであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記条件が、前記活性化ポリアルキレンオキシドポリマーを前記インターフェロン−ベータ１ｂのＬｙｓのイプシロンアミノ基に結合させるのに十分なものであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記活性化ポリアルキレンオキシドポリマーの分子量が、約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲であることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
前記活性化ポリアルキレンオキシドポリマーの分子量が、約３０ｋＤａであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
前記活性化ポリアルキレンポリマーの分子量が、約４０ｋＤａであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
前記活性化ポリアルキレンポリマーが、活性化ポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
前記活性化ポリエチレングリコールが、末端反応性のアルデヒド部分を含むことを特徴とする請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記活性化ポリエチレングリコールが、ｍＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ、ｍＰＥＧ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯ、ｍＰＥＧ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯおよびｍＰＥＧ２−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨＯより成る群から選択されることを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記活性化ポリエチレングリコールが、以下のものより成る群から選択されることを特徴とする請求項３９記載の方法。
【化４】
2007526317.tif 000032
（式中、
（ａ）は、約１〜約５の整数であり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ８、Ｓ、ＳＯ、またはＳＯ２であり、ただし、Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８分枝アルキル、Ｃ１〜８置換アルキル、アリール、またはアラルキルであり；
（ｘ）は、重合度であり；
（ｎ）は、０または１であり、
（ｐ）は、正の整数、好ましくは約１〜約６であり、
ｍ−ＰＥＧは、ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）Ｘ−である。）
【請求項４３】
前記活性化ポリエチレングリコールが、以下のものより成る群から選択される末端反応性の部分を含むことを特徴とする請求項３３記載の方法。
【化５】
2007526317.tif 000033
【請求項４４】
請求項１記載の組成物を投与する方法であって、酸性バッファーを中和し、それに続いて、かかる投与を必要とする患者に前記組成物を投与する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項４５】
前記酸性バッファーが、リン酸ナトリウムで中和されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、経口的に、静脈内に、皮下に、あるいは筋肉内に投与されることを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
インターフェロン−ベータに反応性の疾患または異常をもつ哺乳類を治療する方法であって、前記疾患または異常を治療するのに有効な量の請求項１記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項４８】
ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体を調製する方法であって、
（ａ）タンパク質を可溶化させる量の適合性のある界面活性剤の存在下で、適合性のある水溶液に該タンパク質を可溶化させる工程；
（ｂ）前記可溶化されたタンパク質を活性化ポリアルキレンオキシドポリマーと反応させて、ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体および界面活性剤を含む溶液を作成する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）の溶液を、前記ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体から前記界面活性剤を解離させるのに有効なｐＨに調整する工程；
（ｄ）前記解離された界面活性剤を前記ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体から分離して、前記ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体を回収する工程；を含むことを特徴とする方法。
【請求項４９】
前記工程（ｃ）において、約ｐＨ３〜約ｐＨ４の範囲にｐＨを調整することを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記活性化ポリアルキレンオキシドポリマーが、約１２ｋＤａ〜約６０ｋＤａのサイズ範囲のポリエチレングリコールポリマーであることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
前記界面活性剤が、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、およびそれらの組み合わせより成る群から選択されることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
前記界面活性剤が、両性イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記タンパク質が、インターフェロンであることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質が、ＩＦＮ−ベータであることを特徴とする請求項５３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、βインターフェロン−ポリマー結合体に関する。詳細には、本発明は、インターフェロンベータ１ｂと、ＰＥＧなどの実質的に非抗原性のポリマーとのポリマー結合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
非常に様々な疾患または異常を治療するのに使用するための大きな展望をもつ多くのタンパク質またはポリペプチドが知られている。不都合なことに、タンパク質治療薬には、水および体液への不十分な可溶性、投与後の血流からの迅速なクリアランス、ならびに治療された人または動物から免疫反応を誘発する可能性を含めていくつかの欠点がある。これらの欠点に対処するための提唱された解決法の１つは、こうしたタンパク質またはポリペプチドを、循環寿命（circulating life）、水溶性を向上させるために、かつ／または抗原性を低下させるために、実質的に非抗原性のポリマーに結合させることである。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および類似の水溶性ポリマーに、ペプチドまたはポリペプチドを結びつけるという初期概念のうちのいくつかは、特許文献１に開示されており、その開示を、参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
インターフェロン（本明細書ではＩＦＮとも呼ぶ）は、向上された循環寿命、水溶性、および／または低下された抗原性によって利益が得られることとなる、治療的なタンパク質の１クラスである。インターフェロンは、様々なインデューサーへの暴露に応答して大抵の動物細胞により分泌される、比較的低分子のポリペプチドタンパク質である。インターフェロンは、その抗ウイルス性、抗増殖性、および免疫調節性の性質のため、治療薬として大きな関心が持たれている。これは、細胞表面上の特定の膜受容体に結合することによって、その細胞活性を発揮させる。インターフェロンは、細胞膜に一度結合されると、複雑な順序の細胞内事象を開始させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究では、この事象には、ある種の酵素の誘導、細胞増殖の抑制、免疫調節性の活動（マクロファージの食細胞活性の増進および標的細胞に対するリンパ球の特定の細胞毒性の増大など）、ならびにウイルス感染細胞におけるウイルス複製の阻害が含まれることが実証された。このように、インターフェロンタンパク質は、機能的に定義されており、非常に様々な天然、および合成、あるいは組換え型のインターフェロンが知られている。３つの主なタイプのヒトＩＦＮが存在する。これらは、以下の通りである：
白血球ＩＦＮまたはＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、すなわち白血球によってｉｎ  ｖｉｖｏで産生される１型ＩＦＮ。
【０００４】
線維芽細胞ＩＦＮまたはＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）、すなわち線維芽細胞によってｉｎ  ｖｉｖｏで産生される１型ＩＦＮ。
【０００５】
免疫系ＩＦＮまたはＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、すなわち免疫系によってｉｎ  ｖｉｖｏで産生される２型ＩＦＮ。
【０００６】
ＩＦＮ−ベータは、いくつかの疾患または異常の治療に対して、特に多発性硬化症またはＭＳの治療に対して特に関心が持たれている。天然のヒトＩＦＮ−ベータは、１６６アミノ酸の糖タンパク質であり、それをコードする遺伝子は、非特許文献１によって配列決定されている。天然のＩＦＮ−ベータは、それぞれ、アミノ酸位１７、３１、および１４１に位置する３つのシステイン（ｃｙｓ）残基を有する。さらに、ＩＦＮ−ベータの非常に多くの組換え型変種が、知られている。
【０００７】
３つの組換え型ＩＦＮ−ベータ生成物が、ＭＳの治療に対して、ヨーロッパおよび米国で認可されている。これらは、インターフェロンベータ−１ａ（「ＩＦＮ−ベータ−１ａ」）またはＡｖｏｎｅｘ（登録商標）（バイオジェン社（Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、マサチューセッツ州）、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）（アレスセレノ社（Ａｒｅｓ−Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｎｏｒｗｏｏｄ、マサチューセッツ州）として市販される別のＩＦＮ−ベータ−１ａ生成物、およびＳｅｒ１７インターフェロン−ベータ−１ｂ（「ＩＦＮ−ベータ−１ｂｓｅｒ１７」）またはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）（バーレックス社（Ｂｅｒｌｅｘ）、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）である。
【０００８】
ＩＦＮベータ−１ａは、天然のヒト遺伝子配列を使用して、哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞）内で産生され、産生されたタンパク質は、グリコシル化される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる特許文献２、特許文献３、および特許文献４を参照のこと。ＩＦＮベータ−１ｂ  Ｓｅｒ１７は、大腸菌（「Ｅ．ｃｏｌｉ」）内で、アミノ酸位１７での操作されたシステインからセリンへの置換を有する改変されたヒト遺伝子配列を使用して産生され、その結果、タンパク質が非グリコシル化であるので、ＩＦＮ−ベータ１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびＲｅｂｉｆ（登録商標））とは構造的に異なる。例えば、特許文献５および特許文献６（これらの開示を、参照により本明細書に組み込む）を参照のこと。
【０００９】
Ｒｅｂｉｆ（登録商標）とＡｖｏｎｅｘ（登録商標）はどちらも、その添付文書によって、少なくとも２〜３×１０８国際単位（ＩＵ）／ｍｇの、異なる方法による特異的活性を有することが述べられている。Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）の添付文書は、約３×１０７ＩＵ／ｍｇの特異的活性を報告しており、１０倍の効力の差が示されている。これらの活性は、若干異なる方法によって決定されるが、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性の大きさの程度（これは、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）およびＡｖｏｎｅｘ（登録商標）グリコシル化ＩＦＮ−ベータ１ａ生成物については、マイクログラム（６０〜１３０ｍｃｇ／週）で、非グリコシル化Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）ＩＦＮ−ベータ１ｂについては０．２５ミリグラム以上で測定される）の差はまた、推奨される用量にも反映される。
【００１０】
ＩＦＮ−ベータは、各々のその組換え型製剤内で、ウイルス複製を阻害する能力を含めて、免疫系に対する多数の効果を有する。ＩＦＮ−ベータ−１ｂは、メーカー（バーレックス社（Ｂｅｒｌｅｘ）、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）によって、サプレッサーＴ細胞活性を増強する、炎症誘発性サイトカイン産生を低下させる、抗原提示を下方制御させ、中枢神経系へのリンパ球輸送の阻害を阻害させるものと記載されている。他の資料は、ＩＦＮ−ベータが、Ｔリンパ球によるＩＦＮ−ガンマの産生を低下させることを報告している。他の有益な治療効果も、推測される。
【００１１】
しかし、すべてのタンパク質治療薬と同様に、この薬物も、腎臓濾過を含めた非特異的な機構によって、血流から迅速に排除される。さらに、ＩＦＮ−ベータを注射された患者は、抗ＩＦＮ−ベータ中和抗体（「Ｎａｂ」）を提示する。Ｎａｂは、抗原を誘発する通常の生物学的効果を阻害するために働く、結合抗体の亜集団であり、治療用タンパク質によって誘発される場合、治療効率は低下する可能性がある。抗ＩＦＮ−ベータＮａｂ提示のリスクおよび治療に対するその後の影響は、インターフェロン薬物を用いるＭＳの早期治療を妨げる可能性がある−その結果、こうした薬剤の治療的将来性を有意に低下させるであろう。その市販されたインターフェロンベータ薬物は各々、ＭＳの治療中の臨床試験中に、Ｎａｂの提示を伴っている。Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）のある２年間の研究では、治療された患者のうちのほぼ半分は、高用量群と低用量群の両方で、研究のある段階で、Ｎａｂを提示した。
【００１２】
インターフェロン療法のある種のさらなる短所は、物理的な不安定性（すなわち、２〜３例を挙げると、タンパク質凝集、変性、および沈殿）、ならびに化学的な不安定性（すなわち脱アミド、加水分解、ジスルフィド交換、酸化など）である。タンパク質凝集は、本明細書では、単量体からの、二量体、三量体、四量体、または多量体の形成を指す（これらは、本発明の調合用バッファーおよび条件で、沈殿する可能性もしない可能性もある）。Ｒｉｂｉｆ（登録商標）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）およびＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）の製剤は現在、タンパク質のウイルス汚染ならびに凝集に関与する可能性があるＨＳＡの使用を含む。
【００１３】
ＩＦＮ−ベータのポリマー結合体は、知られている。特許文献７および特許文献８（参照により本明細書に組み込む）は、特に、ｍＰＥＧ−Ｎ−グルタル酸スクシンイミジルまたはｍＰＥＧ−Ｎ−コハク酸スクシンイミジルを使用する、アミド結合型ＩＦＮ−ベータ１ｂ結合体を記載している。この特許権所有者は、タンパク質のＰＥＧ化が、比較的高モルの過剰の活性化ポリマーを使用して行われることを開示している。Ｌｙｓ残基へのポリマーの連結が好ましいが、Ｎ末端−ポリマー連結、ならびにＣｙｓ、Ｇｌｕ、およびＡｓｐを使用するものも開示されている。例えば、特許文献８の、第８カラム、３４〜４０行を参照のこと。チオール反応性のＰＥＧ化剤を使用する、Ｃｙｓ−１７でのＩＦＮ−ベータ１ａの部位選択的改変を記載する公開された特許文献９は、特許文献７および特許文献８の結果の欠点を記載している。具体的には、この公開されたＰＣＴ出願の、４頁、５〜１８行は、大きなモル過剰の活性化ＰＥＧを使用する非特異的ＰＥＧ化によって、可溶性が向上した結合体が提供され、「主な問題は、活性および収率のレベルの低下である」ということを述べている。
【００１４】
本発明の譲受人に譲渡された特許文献１０は、様々なＰＥＧ−インターフェロン結合体を調製することを開示している。その第１４カラム、第１行には、様々な形の活性化ＰＥＧとの結合のための適切なインターフェロンとしてのＩＦＮ−ベータが述べられている。モノ−ＰＥＧ化された結合体を含めて特定の種を回収するための、ＰＥＧ化された生成物の分別も開示されている。
【００１５】
特許文献１１（参照により本明細書に組み込む）は、一般にＩＦＮ−ベータを含む、イミドエステルリンカーを有するＰＥＧ結合体を作製する方法を記載している。特許文献１２は、ＰＥＧなどのポリマーに必要に応じて結合される、操作されたＣｙｓまたはＬｙｓ残基を介する連結を含む、ＩＦＮ−ベータ１ｂとは異なるＩＦＮ−ベータ変種またはムテインを記載している。ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ）らは、公開された特許文献１３内で、ＰＥＧ結合体およびその使用を含めて、ＩＦＮ−ベータ１ａポリマー結合体を記載している。しかし、２０ｋＤａのＮ末端ＰＥＧ化ＩＦＮ−ベータ１ａ結合体は、試験動物の血清中に長時間存在するにもかかわらず、ＩＦＮ−ベータ活性のための生物学的マーカーに対する影響を延長しなかった（非特許文献２）。さらに、ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ）の報告により、３０ｋＤａのＮ末端ＰＥＧ化ＩＦＮ−ベータ１ａ結合体は、２０ｋＤａのＮ末端ＰＥＧ化ＩＦＮ−ベータ１ａ結合体活性のわずか６分の１しか保持せず、４０ｋＤａのＮ末端ＰＥＧ化ＩＦＮ−ベータ１ａ結合体は、すべてのインターフェロン活性を失うことが示された。
【００１６】
上で述べたことの他に、様々なタイプのＩＦＮタンパク質が、有意な相同性の違いを示す点に留意する必要がある。例えば、非特許文献３によって記載されている通り、例えば、ＩＦＮ−アルファとＩＦＮ−ベータは、シグナル配列のドメインでは、わずか３％の平均相同性、ＩＦＮポリペプチド配列では、わずか４５％の平均相同性しか示さない。さらに、ＩＦＮ−ベータ間の相同性が、より大きいとしても、２者の間には、治療用の使用、適応症などに関して、ある程度の有意差が存在する。
【００１７】
上記の開示にもかかわらず、当分野では、向上したポリマー結合型ＩＦＮ−ベータ組成物、特にＩＦＮ−ベータ１ｂを含有するものに対する、長期にわたって未解決であった必要性が、未だに残っている。また、ポリマー結合型ＩＦＮ−ベータ１ｂを含有する向上した組成物の必要性も存在し続けている（ここで、このポリマーは、約３０ｋＤａ以上（数平均）の分子量を有し、これは、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）を含まない。
【特許文献１】米国特許第４，１７９，３３７号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７９５，７７９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３７６，５６７号明細書
【特許文献４】米国特許第４，９６６，８４３号明細書
【特許文献５】米国特許第４，５８８，５８５号明細書
【特許文献６】米国特許第４，７３７，４６２号明細書
【特許文献７】米国特許第４，７６６，１０６号明細書
【特許文献８】米国特許第４，９１７，８８８号明細書
【特許文献９】ＰＣＴ特許出願国際公開第９９／５５３７７号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第５，７３８，８４６号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，１０９，１２０号明細書
【特許文献１２】米国特許第６，５３１，１２２号明細書
【特許文献１３】米国特許出願公開第２００３００２１７６５号明細書
【非特許文献１】タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、１９８０年、「Ｇｅｎｅ  １０」：１１〜１５、および、Ｒ．デリンク（Ｒ．Ｄｅｒｙｎｃｋ）ら（上記）
【非特許文献２】ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ）ら、２００１年、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．」２９７（３）：１０５９〜１０６６
【非特許文献３】デリンク（Ｄｅｒｙｎｃｋ）、１９８０年「Ｎａｔｕｒｅ」２８５：５４２〜５４７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本明細書に記述されるポリマー結合型ＩＦＮ−ベータ組成物によって、上記の必要性は、対処され、他の利点も提供される。本発明の一態様では、向上した、生物学的に活性なポリマー−インターフェロン結合体組成物が提供される。この組成物には、少なくとも約１２ｋＤａの分子量を有するポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）ポリマーに結合されたインターフェロン−ベータ１ｂが含まれる。好ましくは、ＰＡＯは、約１２ｋＤａ〜約６０ｋＤａの分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは、ＰＥＧは、約３０ｋＤａ〜約６０ｋＤａの分子量を有する。
【００１９】
本発明の一態様では、ポリマーは、ＩＦＮ−ベータ１ｂのアミノ末端基に連結されるが、本発明の別の好ましい態様では、ポリマーは、ＩＦＮ−ベータ１ｂの、Ｌｙｓのイプシロンアミノ基を介して付着される。付着の部位および選択されるポリマーの分子量に応じて、結合体に関して保持される抗ウイルス活性は、３０ｋＤａポリマー結合体については少なくとも約６５パーセントから、４０ｋＤａポリマー結合体については少なくとも約１５％となるであろう。いずれの場合においても、保持される活性の量は、予測されたよりもかなり大きい。
【００２０】
ある種の任意の実施形態では、２つ以上のポリマーが、各ＩＦＮ−ベータ１ｂ分子に連結される。好ましくは、各ＩＦＮ−ベータ１ｂ分子に連結されるポリマーの数は、１〜約４、好ましくは、１〜約３の範囲である。
【００２１】
本発明の組成物は、物理・化学的安定性を増大するために、ある種のバッファーおよび賦形剤の存在下に、上述のポリマー結合体を組み込む。さらなる改良は、ウイルス汚染およびタンパク質凝集のリスクを低下させるために、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）を含まない調合物を提供することを含むものである。
【００２２】
さらなる改良においては、本発明は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）の存在下で、非抗原性ポリマー（ポリアルキレンオキシドなど）とタンパク質を結合させるための、改良されたプロセスを提供する、以前、こうした反応混合物からのＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）の除去は、非実用的であると証明されていた。しかし、本発明は、酸性条件下で、ポリマー結合型タンパク質（例えばＩＦＮ−ベータ１ｂ）からＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）を分離する経済的な方法を提供する。
【００２３】
本発明の他の態様は、結合体組成物または調合物を作製する方法、ならびにこれを使用する治療の方法を含む。
【００２４】
本発明の結果として、向上したＩＦＮ−ベータ１ｂポリマー結合体組成物が提供される。本発明の結合体の保持される抗ウイルス活性は、特に、大抵の本発明の態様では、そのポリマー部分が少なくとも約３０ｋＤａであるという事実からみると、驚く程高い。同じ分子量タイプのＰＥＧが使用される場合、ＩＦＮ−ベータ１ａ、すなわち、グリコシル化された、より強力な形のＩＦＮ−ベータは、ＩＦＮ−ベータ１ｂと比較すると、実質的に活性が低い、あるいは不活性であるということを報告している従来の技術、ペピンスキー（Ｐｅｐｉｎｓｋｙ）ら、２００１年、「Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍ．  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．」２９７（３）：１０５９〜１０６６頁（上記）を参照のこと。
【００２５】
本発明の関連態様では、可溶性が不十分のタンパク質とのポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体を調製する改良された方法であって、
（ａ）タンパク質を可溶化させる量の、適合性のある界面活性剤の存在下で、適合性のある水溶液に当該のタンパク質を可溶化させる工程と；
（ｂ）当該の可溶化されたタンパク質を、活性化ポリアルキレンオキシドポリマーと反応させて、ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体および界面活性剤を含む溶液を生成する工程と；
（ｃ）工程（ｂ）の反応させた溶液を、ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体から界面活性剤を分離させるのに有効なｐＨに調整する工程と、
（ｄ）分離された界面活性剤を、ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体から分離して、ポリアルキレンオキシド−タンパク質結合体を回収する工程とを含む方法が提供される。
【００２６】
この発明の方法は、任意のタンパク質、好ましくは水溶液への可溶性が不十分のタンパク質に、必要に応じて適用される。好ましくは、タンパク質は、インターフェロン（インターフェロンベータなど）である。
【００２７】
好ましくは、ｐＨは、工程（ｃ）において、約ｐＨ３〜約ｐＨ４までの範囲に調整される。
【００２８】
活性化ポリアルキレンオキシドポリマーは、例えば、約１２ｋＤａ〜約６０ｋＤａの範囲のサイズであるポリエチレングリコールポリマーである。
【００２９】
界面活性剤は、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤、およびそれらの組み合わせから必要に応じて選択される。好ましくは、界面活性剤は、両性イオン性界面活性剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
図面の簡単な説明
図１は、実施例７で述べた比較データを示すグラフである。バーは、以下の通りに表される：
2007526317.tif 000003
図２は、実施例８で述べた比較データを示すグラフである。曲線は、以下の通りに表される：
2007526317.tif 000004
図３は、雄および雌のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における、実施例９に記載した通りの１５μｇ／ｋｇ  ＥＺ−２０４６の注射後の、ＥＬＩＳＡによる平均ＩＦＮ−ベータ血清濃度を示すグラフである。曲線は、以下の記号によって表される。（ここで、「ＩＭ」は筋肉内であり、「ＩＶ」は、静脈内であり、「ＳＣ」は皮下であり、「Ｆ」は雌であり、「Ｍ」は雄である。）
2007526317.tif 000005
図４は、実施例２および３によって記載されている通りに、ＥＬＳＤ検出器を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって測定される、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂの最終生成物の純度を示す。
【００３１】
発明の詳細な説明
したがって、本発明は、以下を含む組成物を提供する：
ａ）分子量が少なくとも約１２ｋＤａ、あるいは少なくとも約２０ｋＤａのポリアルキレンオキシドポリマーに結合されたインターフェロン；ならびに、必要に応じて
ｂ）界面活性剤；
ｃ）賦形剤；および
ｄ）バッファー；を含み、溶液のｐＨ範囲が約３．０〜約１１である。
【００３２】
本明細書における実施形態では、組成物は、約３．０〜約８．０のｐＨを有する。
【００３３】
他の実施形態では、本発明の組成物は、ｐＨが、約３．０〜約５．０であり、約３．０〜約４．０のｐＨが最も好ましい。本明細書で提供される組成物のイオン強度は、安定性に影響を及ぼす、すなわち、凝集を防止することが判明している。低ｐＨのバッファーでは、低イオン強度が好ましいのに対して、高ｐＨのバッファーでは、高イオン強度が好ましい。一実施形態では、ｐＨが約３．０〜約４．０である本発明の組成物のイオン強度は、１０ｍＭより低い。別の実施形態では、ｐＨが約５．５〜約７．５である本発明の組成物のイオン強度は、約１００〜約１５０ｍＭである。
【００３４】
本発明の組成物に使用されるインターフェロンは、好ましくはインターフェロン−ベータ１ｂ、好ましくは、ＩＦＮ−ベータ−１ｂＳｅｒｌ７である。
【００３５】
Ａ．ベータインターフェロン
用語「インターフェロン−ベータ」または「ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）」は、本明細書では、天然の供給源から単離される、および／または当分野で記載される通りの組み換えＤＮＡ技術によって産生される、天然のＩＦＮ−ベータの配列相同性および機能性（生物活性を含めて）を有するＩＦＮ−ベータを指す。用語「インターフェロン−ベータ１ｂ」または「ＩＦＮ−ベータ１ｂ」は、本明細書では、残基Ｓｅｒ１７によって置き換えられる残基Ｃｙｓ１７を有し、翻訳後に除去されるＮ−末端アミノ酸（メチオニン）をもち、非グリコシル化形で発現され、本明細書では配列番号１として表されるＩＦＮ−ベータのムテインを指す。
【００３６】
さらに詳細に示される通り（上記）、ポリマー結合体のベータインターフェロン（ＩＦＮ−ベータ）部分は、適切な真核生物または原核生物の宿主細胞中で発現される、合成の遺伝子を使用する組換え技術などを含めて、様々な供給源から調製または獲得できる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，８１４，４８５号明細書を参照のこと。さらに、ＩＦＮ−ベータは、ヒト、反芻動物、またはウシＩＦＮ−ベータなどの哺乳類の供給源抽出物である可能性がある。ある特に好ましいＩＦＮ−ベータは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７３７，４６２号明細書に記載されている通り、ＩＦＮ−ベータ−１ｂＳｅｒ１７、すなわち、バーレックス社（Ｂｅｒｌｅｘ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）から入手できる、組換えによって作製された生成物である。
【００３７】
本発明の結合体を産生するために用いられるＩＦＮ−ベータタンパク質は、市販品として入手できる（例えば、ＩＦＮ−ベータ１ｂは、バーレックス社（Ｂｅｒｌｅｘ，Ｉｎｃ．）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、カリフォルニア州）から得られる）、あるいは、以下に例示される通りに産生および単離される。天然のヒトのＩＦＮ−ベータが、必要に応じて用いられるが、原核生物宿主中で産生および可溶化のために最適化されたＩＦＮ−ベータ・ムテインを使用することが好ましい。ある好ましい原核生物宿主細胞は、大腸菌である。
【００３８】
天然のヒトまたは動物ＩＦＮ−ベータの多くのムテインが、知られており、本発明の実施に用いられることが意図される。好ましいムテインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５８８，５８５号明細書、同第４，９５９，３１４号明細書、同第４，７３７，４６２号明細書、および同第４，４５０，１０３号明細書によって、より詳細に記述される。手短に言えば、上記の通り、好ましいムテインは、天然のヒトのＩＦＮ−ベータのＣｙｓ１７残基が、セリン、トレオニン、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはメチオニンによって置き換えられたものである。最も好ましいものは、ＩＦＮ−ベータの非グリコシル化Ｓｅｒ１７ムテイン（ここではＩＦＮ−ベータ１ｂとも呼ばれる）である。
【００３９】
原核生物宿主系からＩＦＮ−ベータタンパク質を発現および単離する非常に多くの方法、ならびに、原核生物の宿主細胞による発現に適したベクターが知られている。例えば、以下に提供される実施例に用いられるＩＦＮ−ベータの多くは、次の方法によって産生された。細菌発現のためのコドン最適化後、ＩＦＮ−ベータ（例えばＩＦＮ−ベータ１ｂ）をコードする合成の遺伝子を合成した。
【００４０】
ＩＦＮ−ベータ産生および精製のための他の方法および試薬は、例えば、米国特許第６，１０７，０５７号明細書、同第５，８６６，３６２号明細書、同第５，８１４，４８５号明細書、同第５，５２３，２１５号明細書、同第５，２４８，７６９号明細書、同第４，９６１，９６９号明細書、同第４，８９４，３３４号明細書、同第４，８９４，３３０号明細書、同第４，７４８，２３４号明細書、同第４，６５６，１３２号明細書（すべて参照により本明細書に組み込む）によって、また、ここに述べるにはとても多過ぎる他の参考文献によって記載されている。
【００４１】
ＩＦＮ−ベータタンパク質を発現および単離する方法、ならびに、真核生物の宿主細胞による発現に適したベクター（チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，９６６，８４３号明細書、同第５，３７６，５６７号明細書、および同第５，７９５，７７９号明細書によって詳述されている。
【００４２】
Ｂ．非抗原性ポリマー
本発明の組成物に有用な結合体の高分子部分は、直鎖である可能性があり、以下より成る群から選択されることが好ましい：
【化１】
2007526317.tif 000006
（式中、
Ａは、キャッピング基（ｃａｐｐｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分枝アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ３〜１２分枝アルケニル、Ｃ１〜６アルキニル、Ｃ３〜１２分枝アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換Ｃ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシアルキル、フェノキシアルキル、およびＣ１〜６ヘテロアルコキシから選択され、
ｘは、重合度である）。
【００４３】
変数ｘは、好ましくは、ポリマーの分子量が、本明細書で好ましいものであると開示される範囲内、すなわち約２０〜約６０ｋＤａであるように選択される正整数である。
【００４４】
あるいは、本発明の組成物に有用な結合体の高分子部分は、分枝である可能性もあり、以下より成る群から選択されることが好ましい：
【化２】
2007526317.tif 000007
（式中、
（ａ）は、約１〜約５の整数であり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ８、Ｓ、ＳＯ、またはＳＯ２であり、ここで、Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８分枝アルキル、Ｃ１〜８置換アルキル、アリール、またはアラルキルであり；
（ｎ）は、０または１であり；
（ｐ）は、正の整数、好ましくは約１〜約６であり；
ｍ−ＰＥＧは、ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−である）。
【００４５】
好ましくは、キャッピング基Ａは、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、ＮＨ２、ＳＨおよびＣ１〜６アルキル部分より成る群から選択される。
【００４６】
より好ましくは、インターフェロン−ベータ１ｂは、以下より成る群から選択されるポリアルキレンオキシドポリマーに結合される：
【化３】
2007526317.tif 000008
（式中、
Ａは、キャッピング基であり；
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜６アルキル、Ｃ３〜１２分枝アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、Ｃ１〜６置換アルキル、Ｃ３〜８置換シクロアルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、Ｃ１〜６アルケニル、Ｃ３〜１２分枝アルケニル、Ｃ１〜６アルキニル、Ｃ３〜１２分枝アルキニル、Ｃ１〜６ヘテロアルキル、置換されたＣ１〜６ヘテロアルキル、Ｃ１〜６アルコキシアルキル、フェノキシアルキル、およびＣ１〜６ヘテロアルコキシから選択され、
ｘは、重合度である）。
【００４７】
変数ｘは、好ましくは、ポリマーの分子量が、本明細書で好ましいものであると開示される範囲内、すなわち２０〜６０ｋＤａであるように選択される正整数である。
【００４８】
あるいは、本発明の組成物に有用な結合体の高分子部分は、分枝である可能性もあり、以下より成る群から選択されることが好ましい：
【化４】
2007526317.tif 000009
（式中、
（ａ）は、約１〜約５の整数であり；
Ｚは、Ｏ、ＮＲ８、Ｓ、ＳＯ、またはＳＯ２であり、ここで、Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜８アルキル、Ｃ１〜８分枝アルキル、Ｃ１〜８置換アルキル、アリール、またはアラルキルであり；
（ｎ）は、０または１であり；
（ｐ）は、正の整数、好ましくは約１〜約６であり；
ｍ−ＰＥＧは、ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｘ−である）。
【００４９】
好ましくは、キャッピング基Ａは、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、ＮＨ２、ＳＨおよびＣ１〜６アルキル部分より成る群から選択される。
【００５０】
より好ましくは、インターフェロン−ベータ１ｂは、以下より成る群から選択されるポリアルキレンオキシドポリマーに結合される： 
【化５】
2007526317.tif 000010
（式中、ポリアルキレンオキシドポリマーの分子量は、２０〜４０、好ましくは３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲である）。
【００５１】
ポリ（アルキレンオキシド）などのポリマーにＩＦＮ−ベータを結合させるために、ポリマーのヒドロキシル末端基の１つは、結合を可能にする反応性の官能基に転換される。このプロセスは、しばしば「活性化」と呼ばれ、その生成物は、「活性化」ポリマーまたは「活性化」ポリ（アルキレンオキシド）と呼ばれる。他の実質的に非抗原性のポリマーも、同じように「活性化される」、あるいは官能性をもたせられる。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、最も好ましいＰＡＯである。ＰＥＧおよびその誘導体の一般式、すなわち、
【化６】
2007526317.tif 000011
（式中、（ｘ）は、重合度、またはポリマー鎖における繰返し単位の数（上限約２３００）を表し、ポリマーの分子量に応じて変わる）。（Ａ）が、以下で述べるものなどの活性化された連結基であるのに対し、Ａ’は、（Ａ）と同様のもの、すなわち、他の活性化された連結基、Ｈ、またはキャッピング基（ＣＨ３など）である。こうしたモノ活性化されたＰＥＧ誘導体は一般に、ｍＰＥＧ誘導体と呼ばれる。ｍＰＥＧに加えて、任意のＣ１〜４アルキル基を有する一端で終結するＰＥＧも有用であると一般に理解されるべきである。
【００５２】
他の態様では、ポリマーは、ポリ（プロピレングリコール）またはＰＰＧである。本発明の譲受人に譲渡された米国特許第５，６４３，５７５号明細書、同第５，９１９，４５５号明細書、および同第６，１１３，９０６号明細書に記載されているものなどの分枝ＰＥＧ誘導体、「ｓｔａｒ−ＰＥＧ誘導体」、末端が枝分かれしたあるいは二叉のＰＥＧ誘導体、ならびにＮｅｋｔａｒカタログ「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ２００３」に記載されているものなどの多数の腕をもつＰＥＧ誘導体。前述のものの各々の開示を、参照により本明細書に組み込む。提供されるＰＥＧ誘導体の非限定的なリストには、以下が含まれる：ｍＰＥＧ−Ａ、Ａ−ＰＥＧ−Ａ、および
【化７】
2007526317.tif 000012
【００５３】
適切なＰＥＧ活性化連結基の非限定的なリストを、以下に提供する。活性化された連結基は、上で与えられる式におけるＡに相当する。
【化８】
2007526317.tif 000013
前述のものは、ＰＥＧのアルファおよび／またはオメガ末端に付着することができ、こうした連結基が両方とも用いられる場合、得られる結合体は、ポリマー１ユニットあたり、２に相当する量のＩＦＮ−ベータを有することができることが理解されよう。
【００５４】
当業者であれば理解できるであろう通り、アルデヒド誘導体は、ポリマーのＩＦＮへのＮ末端基付着のために使用される。例えば、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）アルデヒドは、アミンのみと反応し、ナトリウムシアノボロハイドライドが存在する場合には、第一級アミンとの還元的なアミノ化反応を受けて、第二級アミンを形成する。適切なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アルデヒドは、Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ、カリフォルニア州の、ネクター社（Ｎｅｋｔａｒ）から入手できる。本発明の別の態様では、上に示した他の活性化されたリンカーは、Ｌｙｓアミノ基形成カルバミン酸エステル（ウレタン）またはアミド結合へのポリマーの非特異的連結を可能にすることとなる。
【００５５】
本発明のある種の好ましい態様では、Ｌｙｓ付着が所望される場合、活性化されるリンカーは、スクシンイミジルカーボネート基などのオキシカルボニル−オキシ−Ｎ−ジカルボキシイミド基である。他の活性化群には、Ｎ−コハク酸イミド、Ｎ−フタルイミド、Ｎ−グルタルイミド、Ｎ−テトラヒドロフタルイミド、およびＮ−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシドが含まれる。これらのウレタン形成基は、共同所有の（ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ｏｗｎｅｄ）米国特許第５，１２２，６１４号明細書に記載されており、その開示を、本明細書に組み込むものとする。活性化ベンゾトリアゾールカーボネート（ネクター社（Ｎｅｋｔａｒ）から入手できるＢＴＧ−で活性化されたＰＥＧ−）などの、他のウレタンを形成する活性化ポリマーも使用できる。上述のＴ−ＰＥＧに関しては、本発明の譲受人に譲渡された（ｃｏｍｍｏｎｌｙ  ａｓｓｉｇｎｅｄ）米国特許第５，３４９，００１号明細書も参照のこと。
【００５６】
ＩＦＮ−ベータを架橋する、あるいは、アッセイ、研究、または診断目的で、特定の領域におけるポリマー−ＩＦＮ−ベータ結合体を、好都合に検出するまたは局所化させるためのターゲティング剤などの他の部分を付着させるための手段を提供する目的で、ヘテロ二官能性ポリアルキレンオキシドが想定されることも理解されよう。
【００５７】
多くの態様では、適切なポリマーは、多少重量が変動するが、好ましくは少なくとも２０，０００（数平均分子量）である。あるいは、ポリマーは、約２０，０００〜約６０，０００の範囲であり、約３０，０００〜約４０，０００が好ましい。本発明のある種の態様では、二官能性ＰＥＧが使用される場合、分子量は、２０，０００程度である可能性がある。
【００５８】
ＰＥＧなどのＰＡＯのための本明細書に記述するのと同じタイプの活性化が用いられる場合、好ましいＰＡＯベースのポリマーに代わるものとして、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド（ＨＰＭＡ−ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなど）、ポリビニルアルコール、炭水化物ベースのポリマー、前述のもののコポリマーなどの、他の事実上非抗原性の、末端に官能性をもたせられたポリマーを使用できる。当業者であれば、前述のリストが、例示的なものに過ぎないこと、また、本明細書に記載されている質を有するすべてのポリマー材料が想定されることを理解するであろう。本発明の目的では、「事実上非抗原性」および「実質的に非抗原性」は、実質的に非毒性であり、哺乳類において、感知できる免疫反応を誘発しないと当分野で理解される、すべてのポリマー材料を含むと理解されるべきである。
【００５９】
活性化ポリマーを、生物活性を有意に妨げないタンパク質部位での付着を可能にするのに適した条件下で、例えば、結合されたＩＦＮ−ベータが、抗ウイルス活性および他の望ましい生物活性を保持するように、ＩＦＮ−ベータと反応させる。適切な場合、当該のＩＦＮ−ベータに利用できるならば、ヒスチジン基、遊離のカルボン酸基、適切に活性化されたカルボニル基、酸化された炭水化物部分およびメルカプト基も、追加の付着部位として使用できる。
【００６０】
一実施形態では、組成物のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ−１ｂ結合体は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜４．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。他の実施形態では、タンパク質結合体は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜３．０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【００６１】
Ｃ．界面活性剤による、結合反応のためのタンパク質の可溶化
ポリアルキレンオキシドポリマーが、当該のタンパク質との有用な結合反応を受けるためには、タンパク質は、溶液でなければならない。不都合なことに、ポリアルキレンオキシドポリマーと反応させるのに望ましいタンパク質の多くは、結合反応条件に適合する条件下では、水溶液中に維持するのが困難である。これは、ＩＦＮ−ベータ−１ｂを含めた多くの不溶性タンパク質に関する問題である。
【００６２】
タンパク質を可溶化するためのある非破壊的方法は、表面活性剤または界面活性剤を溶液中に含めることである。界面活性剤は、タンパク質と結びつき、沈殿および／または凝集を予防することによって、他の方法では不溶性であるタンパク質を、水溶液に可溶化させることとなる。多くのイオン性、非イオン性、および両性イオン性界面活性剤が、タンパク質可溶化のために、十分に好都合であるが、本発明以前には、反応生成物から、すなわち、産生されたポリマー結合タンパク質から、結びつけられた界面活性剤を事実上分離することは、かなりの障害であった。
【００６３】
本発明は、結合型タンパク質から界面活性剤を分離するための、新規かつ効率的な方法を提供する。手短に言えば、当該のタンパク質は、適合性のある界面活性剤を用いて可溶化され、結合反応にかけられる。結合反応が完了した後、反応溶液のｐＨを、タンパク質から界面活性剤を分離するために、十分に低下させる。低下されたｐＨは、例えば約ｐＨ３〜約ｐＨ４の範囲である。その後、界面活性剤は、例えば、遠心分離および／または濾過によって、結合型タンパク質から物理的に分離される。
【００６４】
好ましくは、分離工程は、ダイアフィルトレーションによるものであり、その結果、界面活性剤が、適合性のある過剰なバッファー中で洗浄することによって除去されるのに対し、複合タンパク質は、ダイアフィルター（ｄｉａｆｉｌｔｅｒ）に保持される。ダイアフィルターは、１０Ｋサイズのものであることが好ましいが、当業者であれば、これは、当該のポリマー結合型タンパク質のサイズに伴って変動する可能性があることを理解するであろう。
【００６５】
比較的に不溶性であるタンパク質を、水溶液に安定化または可溶化させるための好ましい界面活性剤には、イオン性、非イオン性、および両性イオン性の界面活性剤が含まれる。イオン性界面活性剤は、実効電荷をもつ頭部を含有するものである。これらは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）に見られるような炭化水素（アルキル）直鎖、あるいは、デオキシコール酸ベースの界面活性剤（例えば、デオキシコール酸ナトリウム）に見られるような堅いステロイド性構造を含有する。
【００６６】
非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン部分からなる、荷電してない親水性の頭部を含有する。典型的な非イオン性界面活性剤には、ポリオキシエチレンラウリルエーテルなどのポリオキシエチレン誘導体（例えば、ＢＲＩＪ（登録商標））、オクチルドデカノールなどのグルカミド（ｇｌｕｃａｍｉｄｅ）ベースの界面活性剤（ＴＲＩＴＯＮＸ−１００（登録商標））、およびエトキシル化脂肪酸エステル（例えばＴＷＥＥＮ（登録商標））、またはオクチルグルコシドおよびドデシルマルトースなどのグリコシド基が含まれる。
【００６７】
両性イオン性界面活性剤は、実効電荷を含有しない。両性イオン性界面活性剤には、アナトレース社（Ａｎａｔｒａｃｅ）によって、Ａｎｚｅｒｇｅｎｔ（登録商標）として、あるいはカルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によって、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）によって提供されるものが含まれる。好ましい両性イオン性界面活性剤は、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３−Ｘ−シリーズおよびＣＨＡＰＳである。より好ましいものは、以下の実施例２および３により記載されている通りの、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標）３〜１４である。上記のプロセスで用いることが想定されるいくつかのさらなる特定の界面活性剤を、次の表に列挙する。  
【表１】
2007526317.tif 000014
【００６８】
界面活性剤または表面活性剤の最適な濃度は、当該のタンパク質および選択肢である特定の界面活性剤または表面活性剤によって異なるが、水溶液中に当該のタンパク質を安全に保つために必要とされる最も低い濃度であるように決定されることが好ましい。
【００６９】
この界面活性剤除去プロセスは、他の方法では水への溶解性が限られている範囲の有用なタンパク質のポリマー結合体を補助するために有用であると考えられる。こうしたタンパク質には一般に、インターロイキン２（ＩＬ−２）などの、リポタンパク質または膜結合型タンパク質が含まれる。好ましくは、タンパク質は、ＩＦＮ（例えばＩＦＮベータ１ｂ）である。
【００７０】
Ｄ．バッファー、界面活性剤、および賦形剤
本発明の組成物は、グリシン−ＨＣｌ、酢酸、酢酸ナトリウム、アスパラギン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、およびコハク酸ナトリウムより成る群から選択することができるバッファーを含有する。
【００７１】
好ましくは、バッファーは、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、およびグリシンＨＣｌから選択される。さらに、バッファーは、好ましくは、イオン強度が約１０ｍＭであり、約１ｍＭ〜約１０ｍＭの濃度で存在する。好ましくは、バッファーは、約３ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で存在する。
【００７２】
本発明の組成物はまた、非イオン性でありかつ単糖類、二糖類、およびアルジトールより成る群から選択される賦形剤を含有する。
【００７３】
好ましくは、賦形剤は、単糖類（グルコース、リボース、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース、フルクトース、キシルロースなど）、二糖類（スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースなど）、多糖類（ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど）、およびアルジトール（グリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトールなど）より成る群から選択される。
【００７４】
より好ましくは、賦形剤は、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびグリセロール、またはそれらの組み合わせより成る群から選択され、マンニトールおよびスクロース、またはそれらの組み合わせからなる群が、最も好ましい。
【００７５】
本発明の組成物については、マンニトールは、１％〜約６％の濃度で存在することができ、スクロースは、約８％〜約１０％の濃度で存在することができ、トレハロースは、約８％〜約１０％の濃度で存在することができる。好ましくは、この組成物は、約５％マンニトールまたは約９％スクロースまたは９％トレハロースを含有する。
【００７６】
本発明の組成物は、非イオン性でありかつポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、およびポリエチレングリコールより成る群から選択される界面活性剤をさらに含有する。一実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート８０である。一実施形態では、界面活性剤Ｔｗｅｅｎ  ８０は、約０．０１％〜約０．５％の濃度で存在する。好ましくは、本発明の組成物については、Ｔｗｅｅｎ  ８０は、約０．５％の濃度で存在する。
【００７７】
反応条件
モノＰＥＧ化された化合物を作製するのに適した特定の反応条件に関する詳細は、実施例で提供される。しかし、本発明の方法は一般に、インターフェロン−ベータ１ｂに、活性化ポリアルキレンオキシドポリマーを結合させるのに、また、標準のアッセイ測定を用いて天然のインターフェロン−ベータ１ｂと比較した場合に少なくとも一部の抗ウイルス活性を保持するのに十分な条件下で、１ｂインターフェロン−ベータを、分子量が少なくとも約３０ｋＤａである活性化ポリアルキレンオキシドポリマーと反応させることを含む。非変性（ｎｏｎ−ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）界面活性剤（非イオン性界面活性剤や両性イオン性界面活性剤など）が、ＰＥＧ化反応における成分として存在していた。好ましい界面活性剤は、両性イオン性界面活性剤である。より好ましいものは、スルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３〜１４など）である。結合を実施するための反応条件には、さらに、ＩＦＮに対しておよそ等モルから、比較的低モル過剰の活性化ポリマーとの付着反応を行うことが含まれる。この点に関しては、このプロセスは、約１〜１５倍のモル過剰、好ましくは約２〜１２倍のモル過剰、最も好ましくは約３〜１０倍のモル過剰で実施できる。結合反応は、およそ室温、２０〜２５℃で実施できる。結合反応が、かなり短い時間、すなわち０．５〜２時間進行され、その後停止されることも好ましい。アルデヒドで活性化されたポリマーを用いる反応は、約５．２のｐＨで行い、その後、還元剤、ナトリウムシアノボロハイドライドを付加することが最良であることが決定した。実際には、非アルデヒドで活性化されたポリマーは、ポリマー−ＩＦＮ位置異性体の混合物の形成という結果になる。好ましくは、各異性体は、アミノ酸残基を介してインターフェロンに付着される単一のポリマー鎖を含有する。別の実施形態では、Ｌｙｓ誘導型のプロセスの結果として、ＩＦＮに付着されるポリマーの２つ以上の鎖が存在する可能性がある。これらの結合体を含有する溶液はまた、そのままでも有用であるし、分子量に基づいて結合体を分離するために、さらに処理することもできる。
【００７８】
溶液ベースの結合反応の性質のため、Ｌｙｓが付着された組成物は、インターフェロン分子上の異なる部位に付着されたポリマー鎖を含有する種の不均質混合物である。結合体を含有する任意の溶液中には、おそらく、少なくとも約２、好ましくは約６、好ましくは約８個の位置異性体の混合物が存在することになるであろう。
【００７９】
治療の方法
本発明の別の態様は、哺乳類（好ましくはヒト）における、様々な医学的状態に対する治療の方法を提供する。この方法は、本明細書に記述する通りに調製されたＩＦＮ−ベータ−ポリマー結合体を含む有効な量の薬剤組成物を、こうした治療を必要とする哺乳類に投与することを含む。この結合体は、特に、インターフェロン感受性の状態、あるいは、医療分野において知られているような、インターフェロンに基づく治療法にプラスにあるいは好都合に反応するであろう状態を治療するのに有用である。
【００８０】
本発明に従って治療することができる状態は、一般に、ＩＦＮ−ベータを用いる治療に感受性があるものである。例えば、感受性のある状態には、医療分野において知られているようなインターフェロンに基づく治療法にプラスにあるいは好都合に反応するであろう状態が含まれる。ＩＦＮ−ベータを用いて治療できる典型的な条件には、これらに限定されないが、多発性硬化症および他の自己免疫不全、細胞増殖異常、ガン、ウイルス感染、ならびに、インターフェロン−ベータおよび／またはインターフェロン−ベータ１ｂ治療法からの利益が当業者に知られている他のすべての医学的条件が含まれる。本発明の好ましい態様では、ポリマー結合型ＩＦＮ−ベータは、多発性硬化症を治療するのに有効な量で、患者に投与される。
【００８１】
本発明のさらなる態様は、以前は、与えられた投薬量では、マイナスの副作用が治療の利益を上回っていたので、こうした治療に対してそれほど十分に応答しなかった、ポリマー結合型ＩＦＮ−ベータ、好ましくはポリマー結合型ＩＦＮ−ベータ１ｂを用いて治療できる状態の治療を提供する。例えば、ＩＦＮ−ベータは、ＨＩＶ／ＡｌＤｓ感染症に関連する予後不良のカポジ肉腫の治療について試験され（マイル（Ｍｉｌｅｓ）ら、１９９０年「Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．」１１２（８）：５８２〜９頁）、そのデータは、最小限の利益の可能性を示唆していた。本発明の実施は、より高用量で、また、当分野で知られた他の治療薬と組み合わせて、この状態および他の状態の治療を可能にするであろう。
【００８２】
投与の方法
記載されている投薬量の投与は、一日おきであってもよいが、週に１または２回が好ましい。１回分用量は通常、注射または注入によって、少なくとも２４週間かけて投与される。１回分用量の投与は、静脈内、皮下、筋肉内、あるいは、従来の医療用シリンジを介する、かつ／または圧力システムを介する皮下または経皮注射を含めて、他の任意の許容される全身的方法であり得る。主治医の判断に基づき、投与される薬物の量および使用される治療計画は当然、治療対象となる患者の年齢、性別、および医学的履歴、特定の疾患状態のステージまたは重症度、ならびに、局所的な毒性によって、また、全身的な副作用によって明らかにされるようなその治療に対する患者の耐性に応じて変わる。投薬量および頻度は、好虫球数の初期スクリーニング中に決定できる。
【００８３】
上述の状態を治療するために投与されるＩＦＮ−ベータ−ポリマー結合体組成物の量は、高分子結合体のＩＦＮ活性に基づく。それは、正の臨床的応答に有意に影響を及ぼすのに十分である量である。臨床用量は、ある種の患者においては、あるレベルの副作用を引き起こすこととなるが、ヒトを含めた哺乳類のための最大量は、管理不能である（ｕｎｍａｎａｇｅａｂｌｅ）臨床的に重要な副作用を引き起こさない最も高い用量である。本発明の目的では、こうした臨床的に重要な副作用は、重いインフルエンザ様の症状、中枢神経系抑制、重い消化管異常、脱毛症、重い掻痒症または発疹によって、治療法の停止が必要とされるであろうものである。実質的な白血球および／または赤血球および／または肝酵素異常または貧血症様の状態も、用量限界である。
【００８４】
当然、様々なＩＦＮ−ベータ結合体組成物の投薬量は、選択されるＩＦＮ−ベータ部分およびポリマーに応じて多少異なる。しかし、一般に、治療される哺乳類またはヒト患者の状態に基づいて、結合体は、１日にあたり約１００，０００から約１００万〜５０００万ＩＵ／ｍ２の範囲の量で投与される。上に記述した範囲は、例示的なものであり、当業者であれば、臨床経験および治療適応症に基づいて選択される、結合体の最適な投薬を決定するであろう。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は、本発明のさらなる認識を提供するという役割を果たすが、いかなる形であれ、本発明の有効な範囲を限定するつもりはない。
【００８６】
実施例１
組換え型ＩＦＮ−ベータ１ｂの産生
Ａ．ＩＦＮ−ベータ１ｂをコードする最適化された遺伝子
ヒトインターフェロン−ベータ−１ｂの報告された１６５アミノ酸配列（配列番号１）をコードするｃＤＮＡ遺伝子（配列番号２）を合成した。この遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発現のために最適化されたコドンを有し、オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）オリゴヌクレオチドセグメントの標準の化学的合成を使用して合成された。隣接する制限部位（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）を、遺伝子の末端に含ませた。制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いる合成ＤＮＡの消化後、この０．５キロベースの遺伝子を、やはり、これら２つの酵素を用いて消化させておいたプラスミドベクターｐＥＴ−２７ｂ（＋）（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを介して連結させた。この組換え型プラスミドを、メーカーの説明書に従い、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ６００を使用して、電気穿孔法によって、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬＲ（ＤＥ３）に導入させた。形質転換混合物を、カナマイシン（１５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天プレート上に蒔き、プラスミドｐＥＴ−２７ｂ（＋）／ＩＦＮ−ベータ−１ｂ（株ＥＮ８３４中の所定のプラスミドｐＥＮ８３１）を含有するコロニーを選択できるようにした。単離したコロニーを、プレーティングによって、さらに精製し、「Ｎｏｖａｇｅｎ  ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｍａｎｕａｌ  Ｎｉｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載されているものなどの標準の方法によって、ＩＰＴＧ誘導可能な遺伝子発現について分析した。
【００８７】
Ｂ．ＩＦＮ−ベータ１ｂの発現
ＩＦＮ−ベータ−１ｂについて最適化された上記のＥ．ｃｏｌｉコドン遺伝子を、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ発現制御を用いるＢＬＲ／ｐＥＴシステムで発現させた。ＩＦＮ−ベータ−１ｂタンパク質を、約３０％の総細胞タンパク質を含む封入体中で発現させた。可溶化およびブタノール抽出の後、タンパク質を精製し、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３〜１４の存在下で、ＤＥＡＥおよびＳＰ（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））イオン交換クロマトグラフィによって、均質に近づけた。他のすべての標準の回収工程を用いた。ベータセロン（ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）の発現は、ＩＰＴＧ（１．０ｍＭ）の存在下で、３７℃で２〜３時間、増殖する培養株の増殖を誘発することによって達成された。ＩＦＮ−ベータ−１ｂは、封入体に蓄積された。
【００８８】
Ｃ．封入体からのインターフェロン−ベータ−１ｂの精製
封入体からのＩＦＮ−ベータ−１ｂの精製を達成し、以前公開されたプロトコルの修正および合併版に従って、均質に近づけた。簡単に言うと、封入体からのＩＦＮ−ベータ−１ｂを、ＳＤＳに可溶化させ、ブタノール相に抽出し、その後、酸沈殿させた。ブタノール抽出を行うことにより、１つの工程で高倍の精製を達成することで、また、調合物から大多数の遊離のＳＤＳを除去することによって、二倍の利点が与えられた。酸沈殿させたタンパク質を、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）にその後再懸濁させ、アミノ末端脱アミドプロセスを慎重に回避しながら、ｐＨ１２．０〜ｐＨ８．０までの一時的なｐＨショックによって可溶化させた。ＩＦＮ−ベータ−１ｂを、その後、重要な再生工程および２つのイオン交換クロマトグラフィにかけ、最大純度を達成した。
【００８９】
あるいは、ＩＦＮ−ベータ−１ｂタンパク質は、バーレックスラボラトリーズ（Ｂｅｒｌｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から市販品として入手してもよい。
【００９０】
実施例２〜３
ＰＥＧ  ２−４０ｋ−ＩＦＮおよびＰＥＧ−ＵＡ−４０ｋ−ＩＦＮの調製
これらの実施例では、それぞれ、ネクターセラピューティクス社（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州、およびエンゾンファーマスーティカルズ社（Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）から入手した活性化ＰＥＧ２−４０ｋ−ＩＦＮおよびＰＥＧ２−４０ｋ−ベータアラニン−ＮＨＳを、実施例１のＩＦＮ−ベータと共にそれぞれ別々にインキュベートした。敏速に撹拌しながら、ＰＥＧ粉末で活性化させた各アミンを、５０〜１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．８）〜１００ｍＬ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）中の０．３〜０．８ｍｇ／ｍＬ  ＩＦＮ−ベータ（＞９５％純度）に、０．５〜１．０ｇ／分で、別々に加えた。あるいは、ＰＥＧ粉末を、１０分の１体積の、１ｍＭ  ＨＣｌ中のＩＦＮ−ベータ溶液に予備溶解し、ＰＥＧ溶液をＩＦＮ−ベータ溶液に加えた。ＰＥＧ：ＩＦＮの反応モル比は、５〜１０：１であった。２５℃での６０分の反応の後、各反応を、２Ｎ  ＨＡｃでｐＨを６．５に低下させることによって、停止させた。ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析される通り、モノＰＥＧ−ＩＦＮの結合体生成率は４０〜６０％であった。
【００９１】
反応混合物を、Ｈ２Ｏ中の０．０３％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）で、５．８ｍＳ／ｃｍの導電率まで希釈した。陽イオン交換樹脂（例えばＳＰ  ＦＦ樹脂（アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ニュージャージー州）を、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＡＰ−２カラムに、６ｃｍの床高（ＩＤ  ２ｃｍ、ＣＶ  １８．８５ｍｌ）まで詰め込み、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．５、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３〜１４で平衡化させた。反応混合物のサンプルを、５０ｃｍ／時間でカラムに装填し（樹脂１ｍＬあたり約４ｍｇのタンパク質が装填された）、基線までの１〜１．５のカラム体積（ＣＶ）のカラム平衡バッファー、その後、５ＣＶの１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．５）、６０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、高分子量の結合体を除去した。
【００９２】
生成物を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ６．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。溶離液中のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）を、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｌａｂｓｃａｌｅ  ＴＦＦシステムを使用するダイアフィルトレーションによって除去した（２カートリッジの、１０Ｋ再生セルロースメンブレン「ペリコン（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）ＸＬカートリッジ」ＰＬＣＴＫ  １０  ５０  ｃｍ２、カタログ番号  ＰＸＣ０３０Ｃ５０、ロット番号  Ｃ３ＳＮ７５２８９−０２３、ＯＤが６ｍｍ（１／４インチ）、ＩＤが３ｍｍ（１／８インチ）であるＬＦＬ  Ｔｙｇｏｎ管（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ  ０６４２９−１６、サンゴバン社（Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ）により製造）。システムの設定は、  Ｐ＝４ｐｓｉ、ポンプフィードは「１」、撹拌速度は「２」にセットし、測定まで＝１８ｐｓｉ、保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）＝１４ｐｓｉであった。ＨＳ（アプライドバイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＳＰ（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））カラムから溶出された生成物を、１０倍のダイアフィルトレーションバッファー（５ｍＭ  ＨＡｃ、ｐＨ  ３．７）ですぐに希釈し、ダイアフィルトレーションシステムで１０倍に濃縮した。このプロセスで、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）を完全に除去するために、サンプル体積の５０倍のダイアフィルトレーションバッファーを消費した。この調合は、その後、同じシステム上で実施された。純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラフィによって確認した。ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のパラメータは、以下の通りだった。
【００９３】
カラム：Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ５、５μｍ、３００Å、４．６×１５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カリフォルニア州）
カラム温度：４５℃
オートサンプラ用サーモスタット：４℃
移動相Ａ：０．１  ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１０％  １，４−ジオキサン水溶液
移動相Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および１０％  １，４−ジオキサンのメタノール溶液；
流速：１．０ｍｌ／分
生成物の純度が、＞９５％の純粋なモノＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂであったことが確認される、ＲＰ−ＨＰＬＣの結果を図４に示す。
【００９４】
実施例４
ジＰＥＧ−２０ｋ−ＩＦＮ
反応モル比が、約１：２０であること以外は、実施例２および３で用いられた同じＰＥＧ化条件を、上の通りに用いた。ネクターセラピューティクス社（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）から入手したＰＥＧ−２０ｋ−ＳＰＡと６０分反応させた後、ジＰＥＧ−２０ｋ−ＩＦＮを、サイズ排除カラム、それに続いて陽イオン交換カラムで精製した。
【００９５】
実施例５
凝集を検出する方法
サンプルを、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）ＹＭ−３０（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を用いて、以下の表に記載されているバッファーにバッファー交換した。試験を加速するために、サンプルを、３７℃で２４時間、Ｎ２下に置いた。安定性は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ上でモニターした。サンプル粒子の凝集を、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．８緩衝系を使用するサイズ排除クロマトグラフィＨＰＬＣ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＨＲ、アマシャムバイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）によって決定した。分解を検出するために、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いた。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに抗ウイルスおよび抗増殖活性も用いた。
【００９６】
凝集は、本明細書では、調合バッファーおよび試験される条件で、溶液から沈殿する可能性がある、あるいは可能性がない、二量体、三量体、四量体、または多量体を形成する１つまたは複数のタンパク質単量体の物理的な連結と定義される。可溶性の凝集物は、非還元性ＳＤＳゲル上で単量体に転換され、希釈すると単量体に逆戻りすることとなる。
【００９７】
液体調合物
実施例５Ａ
より低いｐＨの調合用バッファーが好ましい。
【００９８】
ｐＨが、３．０〜１１．０の範囲である有機および無機のバッファーを試験した。グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ３．０、酢酸、ｐＨ  ３．７、酢酸ナトリウム、ｐＨ  ４．５、コハク酸ナトリウム、ｐＨ  ４．４、アスパラギン酸ナトリウム、ｐＨ  ５．４、クエン酸ナトリウム、ｐＨ  ３〜６、およびリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．０〜７．４を、賦形剤の影響を試験するために、塩基性のバッファーとして使用した。３ｍＭ  ＨＡｃ、ｐＨ  ３．７の存在下では、結合体は、３７℃で、少なくとも１７日間安定であった。
【表２】
2007526317.tif 000015
【００９９】
上の表にまとめられるように、好ましいバッファーは、酢酸（遊離酸または塩）クエン酸（遊離酸または塩）およびグリシン−ＨＣｌである。クエン酸は、キレート化剤としての二重の役割を有する。好ましいｐＨは、酸性であり、より具体的には、ｐＨ３．０〜４．０の間である。ｐＨ  ３．０〜４．０のバッファーの好ましい濃度は、１０ｍＭ未満である。＞５０ｍＭのクエン酸バッファーは、皮下の注射時の過剰な痛み、および血液中のカルシウムのキレート化に起因する毒性作用という結果になる。
【０１００】
実施例５Ｂ
炭水化物の賦形剤
非イオン性の張性改変剤を、結合体を安定化させるための、また、組成物を体液と等張にするための増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として試験した。教科書に分類される通り、単糖類には、グルコース、リボース、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース、フルクトース、キシルロースなどが含まれ、二糖類は、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロースなどであり、多糖類は、ラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなどを含む。アルジトールは、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、キシリトールなどを含む。
【０１０１】
好ましい非イオン性の作用薬は、スクロース、トレハロース、マンニトール、およびグリセロール、またはそれらの組み合わせである。より好ましい非イオン性の増量剤は、マンニトールおよびスクロース、またはそれらの組み合わせである。
【０１０２】
張性改変剤の好ましい組成は、４〜６％マンニトール、８〜１０％スクロース、または８〜１０％トレハロースであった。より好ましい組成は、５％マンニトール、および９％スクロースまたはトレハロースであった。
【０１０３】
負に荷電する多糖類（０．５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌのヘパリンおよびコンドロイチン硫酸など）は、中性のｐＨで、結合体の凝集を予防するのを助けないことが示された。
【０１０４】
実施例５Ｃ
より低いｐＨでは、より低いイオン強度が好ましいのに対し、より高いｐＨでは、より高いイオン強度が好ましい。
【０１０５】
ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２などの試薬を用いるイオン性強度の増大の影響によって、酸性ｐＨで、結合体が凝集され易くなった。特に、１４０ｍＭの濃度（ｐＨ  ３．７）で、これらの塩は、凝集され易くなった。タンパク質の凝集の予防においては、ｐＨ  ５．５〜７．５では、より低いイオン強度よりも、より高いイオン強度が好ましい。例えば、凝集の予防においては、１００ｍＭリン酸ナトリウムは、ｐＨ  ７．４では、その１０ｍＭ濃度よりも好都合である。
【０１０６】
溶液のイオン強度は、ＣｉＺｉ２の合計の２分の１として表される。ここで、Ｃは、濃度であり、Ｚは、電荷であり、ｉは、イオンを表す。
【０１０７】
低いｐＨのバッファーでは、低いイオン強度が好ましいのに対し、高いｐＨのバッファーでは、高いイオン強度が好ましい。ｐＨ  ３．０〜４．０のバッファーにおいて好ましいイオン強度は、１０ｍＭ未満であり、ｐＨ  ５．５〜７．５のバッファーにおいて好ましいイオン強度は、１００〜１５０ｍＭである。
【０１０８】
実施例５Ｄ
界面活性剤の効果
非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、およびポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、およびポリエチレングリコールなどの、ポリオキシエチレンソルビトールエステルが含まれる。改変されていないタンパク質を可溶化するために、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）などの両性イオン性界面活性剤を使用した。好ましい非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０およびポリエチレングリコールである。シグマ社（Ｓｉｇｍａ）からのポリソルベート２０は、タンパク質凝集を防止したが、カルビオケム社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびＪ．Ｔ．ベーカー（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）からのポリソルベート２０は防止しなかった。
【０１０９】
実施例５Ｅ
低い保管温度
様々なバッファー、ｐＨ、および賦形剤中の、様々な温度でのタンパク質の安定性を調査した。
【０１１０】
タンパク質の安定性は、高い温度で低下する：−２０℃、４℃＞２５℃＞３７℃。３７℃の温度を、安定性研究を加速するために使用した。好ましい温度は、−２０℃および２〜８℃である。
【０１１１】
２〜８℃では、結合体は、少なくとも数週間、高濃度の塩（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ）または高いｐＨ（ｐＨ  ７．４）などの好適でない要素が存在する場合にさえ安定であった。低いｐＨ（３．０〜４．０）かつ低いイオン強度のバッファーでは、−８０℃〜＋２０℃までの１０サイクルの凍結融解によって、約２％の凝集が引き起こされた。（−８０℃〜＋３７℃までの凍結融解の各サイクルでは、約３％の凝集が引き起こされた。）
ｐＨ  ５．０〜６．５のバッファー、例えば、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ  ５．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、または１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ  ６．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌでは、ポリソルベート８０の存在下または非存在下で、−８０℃または−２０℃〜＋２０℃への５サイクルの凍結融解によって、いずれの凝集または抗ウイルス活性の喪失も引き起こされなかった。
【０１１２】
実施例５Ｆ
タンパク質濃度
０．１２５〜４ｍｇ／ｍｌの間のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ−１ｂ濃度を調べた。保管安定性試験期間中、サンプルは、５％マンニトール、３ｍＭ  ＨＡｃ  ｐＨ  ３．７）、３７℃中でインキュベートした。  
結合体の完全性を、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって、モニターした。  
タンパク質濃度を低下させることによって、タンパク質凝集が低下した。  
好ましいタンパク質濃度は、３．０ｍｇ／ｍｌ〜０．０５ｍｇ／ｍｌの間である。  
【表３】
2007526317.tif 000016
【０１１３】
実施例５Ｇ
投与のための溶液ｐＨの中和
酸性の溶液は、皮膚刺激を引き起こす可能性があるので、投与前に、リン酸ナトリウム溶液または粉末を加えることによって、酸性度が中和される可能性があることに注意されたい。例えば、１／１０体積の１０×ＰＢＳまたは同じ成分の粉末が、１％マンニトール、３ｍＭ  ＨＡｃ、ｐＨ  ３．７、０．３０ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ−タンパク質に加えられた場合、ｐＨは、６．５に上昇する。中和後のサンプルは、２５℃で２時間、４℃で２０時間以内に投与されるべきである。以下の表にまとめたように、こうしたｐＨ中和の、試験されたＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂの凝集に対する影響は、最小限であった。  
【表４】
2007526317.tif 000017
【０１１４】
実施例５Ｈ
抗ウイルス活性
様々な温度における、３ｍＭ酢酸、５％マンニトール、０．３ｍｇ／ｍＬの、ＰＥＧ２−４０ｋ−ＩＦＮベータ−１ｂの抗ウイルス活性を、Ａ５４９細胞／ＥＭＣＶウイルスに対して試験した。抗ウイルス活性は、並行アッセイにおける天然のＩＦＮ−ベータ−１ｂ活性の割合として表した。この表のデータは、４℃で保管した場合、結合体が少なくとも８ヵ月間安定であったことを示す。  
【表５】
2007526317.tif 000018
【０１１５】
実施例６
凍結乾燥
実施例６ａ：凍結乾燥バッファーへのマンニトールの添加。
【０１１６】
この実施例は、凍結乾燥バッファーにマンニトールを含めることによって、凝集が減少し、また、還元後の抗ウイルス活性が保持されるようになることを確認する。マンニトールに対するＰＥＧ２−４０ｋ−ＩＦＮベータ−１ｂの比は、０．５〜２．５重量％であった。１％の濃度のマンニトールが、好ましかった。  
【表６】
2007526317.tif 000019
【０１１７】
実施例６ｂ：凍結乾燥バッファーへのポリソルベートの添加＊
以下の表にまとめるように、この実施例は、凍結乾燥バッファーへのポリソルベート８０の添加によって、試験されるＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂの還元後の抗ウイルス活性が保持されるようになることを確認する。  
【表７】
2007526317.tif 000020
【０１１８】
実施例６ｃ：ＰＥＧ−タンパク質凝集に対する還元バッファーの影響
この実施例は、凍結乾燥および還元の後の、試験されるＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂにおける凝集の発生率について、ｐＨ  ７．４（１０ｍＭリン酸ナトリウム）、ｐＨ  ５．０（１０ｍＭ酢酸ナトリウム）、および３．７（３ｍＭ酢酸）の、３つの異なる還元バッファーの有効性を比較する。
【０１１９】
還元バッファーのｐＨが低いほど、凝集の量は少ない。好ましい凍結乾燥バッファーは、０．１〜２ｍｇ／ｍｌの試験されるＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂ、０．１〜５％マンニトール、３ｍＭ  ＨＡｃ（ｐＨ  ３．７）、およびＪ．Ｔ．ベーカー（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）からの０．０２〜０．５％ポリソルベート８０を含有していた。
【０１２０】
凍結乾燥させた粉末を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０〜７．４）、０〜１４０ｍＭ  ＮａＣｌの還元バッファーで還元した。
【０１２１】
あるいは、還元バッファーは、０．１〜２ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ−タンパク質を作製する３ｍＭ  ＨＡｃ（ｐＨ  ３．７）であった。その後、投与する前に、ｐＨを中和するために、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．４を加えた。試験されるＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂの凝集に対する、これらの２つのバッファーの影響を、以下の表にまとめる。  
【表８】
2007526317.tif 000021
【０１２２】
結論
上記のことから、本発明のＩＦＮ−ベータ１ｂポリマー結合体の、溶液中での特性をまとめることができる。
【０１２３】
（−２０℃、−８０℃、または＋４℃の）好ましいバッファーは、グリシン−ＨＣｌ、クエン酸塩、酢酸塩、またはアスパラギン酸塩からなり、ｐＨが、３．０〜５．０の間、濃度が５〜１０ｍＭである。上述のバッファーのバッファーイオン強度は、好ましくは１０ｍＭ未満であった。ｐＨが３〜８の範囲である、グリシン−ＨＣｌ、クエン酸塩、酢酸塩、アスパラギン酸塩、リン酸塩、および炭酸塩バッファーも好ましい。酸性のバッファーは、投与の前にリン酸ナトリウムで中和されることが好ましい。
【０１２４】
好ましい炭水化物賦形剤には、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、およびグリセロール、および／またはそれらの組み合わせが含まれる。バッファーが凍結乾燥バッファーとして用いられる場合、好ましい炭水化物賦形剤には、０．１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度の、マンニトール、スクロース、またはトレハロース、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。賦形剤として用いられる好ましい界面活性剤には、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、および／またはポリエチレングリコールが含まれる。バッファーが凍結乾燥バッファーとして用いられる場合、好ましい界面活性剤賦形剤には、０．００２〜０．５％（ｗ／ｖ）の、ポリソルベート８０またはポリソルベート２０が含まれる。
【０１２５】
好ましい還元バッファーは、酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム（ｐＨ  ５．０〜７．４）、さらに、等張まで加えられるＮａＣｌであった。
【０１２６】
他の好ましい還元バッファーは、グリシン−ＨＣｌ、クエン酸塩、酢酸塩、またはアスパラギン酸塩であり、これらは、３．０〜４．０の範囲のｐＨで調製され、それに続いて酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムで中和されて、投与のための５．０〜７．４の範囲の最終ｐＨにされる。
【０１２７】
実施例７
免疫原性およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの安定性
実験計画
体重１５０〜３００ｇのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ハーラン（Ｈａｒｌａｎ））ラット（１グループ３匹）に、０．１ｍｇ／ｋｇの天然のＩＦＮ−ベータ−１ｂまたはＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ−１ｂ結合体を、３〜６週間、週１回、筋肉内または皮下投与した。血漿サンプルを、前の注射から７日後と、次の注射の直前に収集した。
【０１２８】
アッセイ設計
ＩＦＮ−ベータ−１ｂまたはＰＥＧ−ベータ−１ｂ結合体に対して産生された抗体を、直接ＥＬＩＳＡによって分析した。ここで、捕捉試薬は、ＩＦＮ−ベータ−１ｂであり、検出抗体は、ウサギ抗ラットＩｇＧと結合されたホースラディッシュペルオキシダーゼであった。結果を、以下の表に列挙する。  
【表９】
2007526317.tif 000022
表１も参照。
【０１２９】
結論
前述のことから、本発明のＩＦＮ−ベータ１ｂポリマー結合体が、以下を含めたいくつかの利点を提供すると結論付けられる。  
・ＰＥＧ化は、タンパク質の免疫原性を大いに減少させた。  
・モノＰＥＧ−４０ｋおよびジＰＥＧ−２０ｋを用いるＰＥＧ化の後、ＩＦＮ−ベータ−１ｂの免疫原性（ＩｇＧ価）は、９４〜９８％減少した。  
・第１回投与から第６回投与まで、抗体が有意に増加しなかったという測定により確認される通り、ラット免疫系は、ＰＥＧ−タンパク質に対して、元のままのタンパク質よりも許容性があった。  
・この抗体は、抗ウイルス性のバイオアッセイにより分析される場合、中和抗体であった。  
・ＩＭ投与での第４回投与の後、抗体の産生は増加しなかった。  
・ＰＥＧ化後のＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ化合物は、マウス腎臓および肝臓抽出物中のプロテアーゼに対して、より耐性であることが発見された。ＩＦＮ−ベータ−１ｂの半減期は、ＰＥＧ化の後、腎臓と肝臓の抽出物の両方において、６倍増大した。安定性は、ＥＬＩＳＡにより分析された。  
・ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ化合物は、ＰＥＧ化の後、過酸化水素による酸化に対して、より耐性であることもさらに発見された。
【０１３０】
実施例８
増強された薬物動態学的プロフィール
【表１０】
2007526317.tif 000023
表２も参照。
【０１３１】
薬物動態学的研究の結果は、以下の通りにまとめることができる。  
・ＩＦＮ−ベータ−１ｂのＡＵＣは、ＳＣまたはＩＭ投与によって、９０倍超に増大され、クリアランス速度は、ＰＥＧ−４０ｋを用いるモノＰＥＧ化の後、８０倍超に延長された。  
・マウスおよびラットでは、ＩＭ経路によって投与される場合、ＳＣ経路によって投与されるよりも、ＰＥＧ化されたＩＦＮ−ベータ−１ｂの生体利用率が、より優れていた。  
・ＰＥＧ化されたＩＦＮ−ベータ−１ｂの生体利用率は、天然のＩＦＮ−ベータよりも優れていた。  
【表１１】
2007526317.tif 000024
【０１３２】
実施例９
サルにおける薬物動態学的プロフィール
この実施例は、以下の情報を提供する。  
ＥＺ−２０４６ポリマー結合体を投与した後の、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）におけるＥＺ−２０４６  ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータの血清動態。ＥＺ−２０４６は、単一の分枝４０ｋＤａＰＥＧをもつ組換え型ＩＦＮ−ベータ−１ｂのアミド連結型結合体である；
薬物動態および薬力学に対する様々な投与経路の影響；
ＳＣまたはＩＭ投与後のＥＺ−２０４６生体利用率；
ＥＺ−２０４６投与と薬力学的マーカーネオプテリンとの関係。
【０１３３】
材料および方法
雄および雌のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）に、ＩＦＮ−ベータ等価物（ＩＦＮ−ベータ特異的な活性  ３２ｍＩＵ／ｍｇ）１ｋｇあたり１５μｇまたは４８０，０００ＩＵの用量レベルで、静脈内（「ＩＶ」）、皮下（「ＳＣ」）、または筋肉内（「ＩＭ」）投与によって、ＥＺ−２０４６  ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータを単回投与した。結合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗ウイルス活性は、ＩＦＮ−ベータの天然の活性の３２％〜３４％が保持されることを示唆し、したがって、結合体の、活性によって調節された用量は、約１６０，０００ＩＵ／ｋｇであった。これらの方法は、遊離のＩＦＮ−ベータをＰＥＧ化されたＩＦＮ−ベータと区別することができないので、両方の形の薬物を含めたＩＦＮ−ベータ等価物が、実際に測定される。説明を簡単にするため、この報告では、ＩＦＮ−ベータとＩＦＮ−ベータ等価物を、同じ意味で用いる。薬物動態学的パラメータは、血清のＥＬＩＳＡまたは生物活性分析によって、ＥＺ−２０４６について評価された。
【０１３４】
薬力学的影響を、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＺ−２０４６生物活性のためのマーカーとして血漿ネオプテリンレベルを試験するためのＥＬＩＳＡアッセイを使用して評価した。ネオプテリンは、グアノシン三リン酸から誘導されるプテリジン誘導体であり、免疫系の刺激に応答して、リンパ球および／またはマクロファージによって産生される。これは、霊長類およびヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでのインターフェロン生物活性のための、よく知られた生物マーカーである。
【０１３５】
ＥＺ−２０４６最大血漿濃度（「Ｃｍａｘ」）、血漿末端排除（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）半減期（「ｔ１／２」）、０から無限大の期間までの血清濃度−時間曲線下の面積（「ＡＵＣ０−  」）、および生体利用率を、１コンパートメント（ＳＣ、ＩＭ）または２コンパートメント（ＩＶ）の一次薬物動態学的モデルを使用して測定した。
【０１３６】
ネオプテリンＥ０（血清基線（ｂａｓｅｌｉｎｅ）レベル）、Ｔｌａｇ（投与後のラグタイム）、Ｔｍａｘ（最大濃度に到達する時間）、Ｅｍａｘ（正味効果最大）、Ｋ１０＿ＨＬ（血清コンパートメント半減期を残すネオプテリンの割合）、およびＡＵＣ（時間に対する血清濃度の曲線下の面積）を、単一のコンパートメントの一次取り込み、ラグ、一次排除モデルを使用して測定した。
【０１３７】
サンプル収集
血液サンプルを、注射の１０および３０分、ならびに１、３、６、２４、７２、１２０、１６８、および２４０時間後に、３動物／性別／群から収集した。サンプルを、管に収集し、室温で２０分間凝固させた後、氷上にまっすぐに置いた。血清を分離した後、血清を、５つの管に分配し、収集後２時間以内に、約−７０℃（またはそれ以下）で、分析するまで凍結させた。動物は、基線レベルのために投薬の前に採血した。
【０１３８】
血清の測定
血清ＥＺ−２０４６を測定するために、２つの異なる方法を用いた。方法Ａでは、血清ＥＺ−２０４６の濃度は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。方法Ｂでは、血清ＥＺ−２０４６の生物活性は、脳心筋炎（Ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）（ネズミ）ウイルスに暴露されたＡ５４９細胞を用いる抗ウイルスアッセイによって測定した。
【０１３９】
血清ＩＦＮ−ベータのＥＬＩＳＡ定量測定
血清ＩＦＮ−β濃度を、市販品として入手できるワンステップ・サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイキット、（イムノバイオロジカルラボラトリーズ社（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号  ＭＧ５３２２１）を使用して測定した。このアッセイは、製品に記載されている通りに実施した。
【０１４０】
１．装置
（ａ）ポリプロピレンマイクロタイターチューブ。カタログ番号２９４４２〜６０８、ＶＷＲ、Ｓ．Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州、または同等の供給源；
（ｂ）１００μｌおよび１０００μＬを分配するために、高精度反復分注器（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を用い、１００μＬの体積固定のピペット、および１００μＬの調節可能ピペットも用いた。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）または等価物、ＶＷＲ、Ｓ．Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州  ０７０８０または等価物；
（ｃ）吸い取り紙；
（ｄ）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｖｅｒｓａｍａｘプレートリーダー、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州；
（ｅ）自動プレートシェーカー：ラボラインインストルメント社（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）、イリノイ州、米国；
（ｆ）Ｂｉｏ−Ｔｅｋプレートウォッシャー、ＥＬｘ４０５、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ヴァーモント州。
【０１４１】
２．材料
（ａ）ヒトインターフェロン−ベータＥＬＩＳＡキット：イムノバイオロジカルラボラトリーズ社（Ｉｍｍｕｎｏ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号ＭＧ  ５３２２１  ロット番号  ＧＬ４０５０２、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州。
【０１４２】
３．バッファー／溶液の調製
（ａ）洗浄溶液
（ｉ）５０ｍｌの洗浄溶液濃縮物（ボトル４）を、蒸留水で４５０ｍｌに希釈する。使用する前に室温で使用すること。４℃で保管すること。  
（ａ）希釈用バッファー
（ｉ）すぐに使用できる（ｒｅａｄｙ  ｔｏ  ｕｓｅ）。「ボトル５」。４℃で使用および保管すること。  
（ｂ）酵素標識抗体溶液
（ｉ）ＩＦＮ−ベータ（Ｈｕ）、Ｆａｂ’に対するＨＲＰ標識されたマウスモノクローナル抗体を６ｍｌの希釈バッファーに溶解させたバイアル（番号２）。４℃で使用および保管すること。  
（ａ）基質溶液
（ｉ）使用する前に、１０ｍｌの「基質Ａ」（バイアル６）を、０．５ｍｌの「基質Ｂ」（バイアル７）と合わせた。室温で、すぐに使用される。  
（ａ）停止試薬
・停止溶液（ボトル８）すぐに使用できる。室温で使用される。
【０１４３】
４．較正標準
（ａ）凍結乾燥ＩＦＮ−ベータ（Ｈｕ）標準を、穏やかに振動させながら、１ｍｌの氷冷水を用いて再構成し、バイアルラベル上の記載されている濃度（ＩＵ／ｍｌ）の使用液を得た。氷冷した希釈バッファーで、使用液を希釈し、２００、１００、５０、２０、１０、５、および２．５ＩＵ／ｍｌの標準を作製した。０  ＩＵ／ｍｌについては、希釈バッファーを、標準溶液として使用した。希釈は、穏やかに混合しながら、氷上で行った。
【０１４４】
５．イムノアッセイ手順
（ａ）抗体でコートしたマイクロウェルアッセイプレートを、使用前に室温にした。  
（ｂ）４００μＬの洗浄バッファーを、アッセイプレートの各ウェルにに加えた。吸引によって、バッファーを完全に除去した。  
（ｃ）各ウェルに５０μＬの酵素標識抗体を加えた。  
（ｄ）各ウェルに１００μＬの標準または試験サンプルを加えた（グリッドマップを使用、二重）。  
（ｅ）プレートを密封し、軌道振盪（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｉｎｇ）（３５０〜４５０ｒｐｍ）させながら、室温（２０〜３０℃）で２時間インキュベートした。  
（ｆ）溶液を除去し、プレートを４回洗浄し、洗浄と洗浄の間に、１分間インキュベートした。  
（ｇ）各ウェルに１００μＬ基質溶液を加えた。  
（ｈ）プレートを密封し、振盪させながら、室温で３０分インキュベートした。  
（ｉ）１００μＬの停止溶液を加えた。  
（ｊ）５７０ｎｍを基準にして、４５０ｎｍでプレートを読み取った。  
（ｋ）血清濃度は、４パラメータの曲線適合法を使用して作成される較正曲線から測定した。
【０１４５】
Ｂ．カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）血清におけるＩＦＮ−ベータに対する生物活性アッセイ
１．装置
（ａ）９６ウェルポリスチレン組織培養プレート：カタログ番号２９４４２〜０５４、ＶＷＲ、Ｓ．Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州、０７０８０または同等の供給源；
（ｂ）ポリプロピレンマイクロタイターチューブ、カタログ番号２９４４２〜６０８、ＶＷＲ、Ｓ．Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州、または同等の供給源；
（ｃ）マルチチャネルの２５０μＬおよび１０００μＬの調節可能なピペット。Ｆｉｎｎｐｉｐｅｔｔｅまたは等価物、ＶＷＲ、Ｓ．Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州、０７０８０；
（ｃ）無菌のペーパータオル；
（ｄ）インキュベーター、ＣＯ２、加湿型（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  Ｆｏｒｍａ）、米国；
（ｅ）モレキュラーデバイス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）プレートリーダー  Ｖｅｒｓａｍａｘ型、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州。
【０１４６】
２．材料
（ａ）ＩＦＮ−ベータ較正標準、カタログＩ−４１５１、シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、ロット番号  ０８２Ｋ１６７８１、２〜８℃で保管；
（ｂ）ハム（Ｈａｍ’ｓ）Ｆ１２Ｋ培地、カタログ番号  ３０−２００４、ＡＴＣＣ、ロット番号３０００１４４、２〜８℃で保管；
（ｃ）ＭＥＭ、カタログ番号２０−２００３、ＡＴＣＣ、ロット番号３０００３０２
（ｄ）ウシ胎児血清、カタログ番号ＳＨ３００７１、ハイクローン社（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、Ｌｏｇａｎ、ユタ州；
（ｅ）ペニシリンおよびストレプトマイシン、カタログ番号  １５１４０〜１２２、ギブコ社（Ｇｉｂｃｏ）、米国；
（ｆ）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、カタログ番号  １７−５１６Ｆ、ロット番号  ０１１０４２８１、バイオウィッタッカー社（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、米国；
（ｇ）Ａ５４９細胞、カタログ番号  ＣＣＬ−１８５、ＡＴＣＣ；
（ｈ）脳心筋炎ネズミウイルス（ＥＭＣＶ）、エンゾンファーマスーティカル社（Ｅｎｚｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）ロット番号  Ｖ６、ＥＭＣＶ由来のＶｅｒｏ細胞（ＣＣＬ−８１、ＡＴＣＣ）中で産生される、カタログ番号  ＶＲ−１２９Ｂ、ＡＴＣＣ；
（ｉ）３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の溶液、カタログ番号  Ｇ４１０２、ロット１８２６４６０１、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国；
（ｊ）可溶化／停止溶液、カタログ番号  Ｇ４１０１、ロット番号  １７８８６１、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国。
【０１４７】
３．バイオアッセイ手順
血清ＥＺ−２０４６の生物活性を、その抗ウイルス活性（すなわち、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）感染症で攻撃されたＡ５４９細胞に対してＥＺ−２０４６によって提供される防護の量）を試験することによって測定した。血清サンプルまたはＩＦＮ−β標準を連続希釈したものを、９６穴プレートのウェルに三重に加えた。１０％ウシ胎児血清（ＦＢ）を含有するハム（Ｈａｍ’ｓ）−Ｆ１２Ｋ中のＡ５４９細胞（１０４／ウェル）を、プレートのウェルに加え、５％  ＣＯ２内で、３７℃で終夜インキュベートした。増殖培地を除去し、５０μＬ／ウェル  ＥＭＣＶ（１．１×１０５ＰＦＵ／ｍｌ）を、プレートに加え、５％  ＣＯ２下で、３７℃で２時間インキュベートした。ウイルス種菌を除去し、細胞に、５％  ＦＢＳを含有するハム（Ｈａｍ’ｓ）−Ｆ１２Ｋを与えた。プレートを、５％  ＣＯ２内で、３７℃で４０時間インキュベートした。１５マイクロリットルのＭＴＴ溶液、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、各プレートの各ウェルに加え、プレートを、５％  ＣＯ２と共に、３７℃で４時間インキュベートした。ウェルを、暗中、室温で一晩１００μＬの可溶化／停止溶液（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））で可溶化した。ウェルの光学濃度を、６３０ｎｍを基準にして、５７０ｎｍで測定し、サンプルの血清濃度を、４パラメータ適合を使用して作成される標準の較正曲線から測定した。
【０１４８】
ＩＦＮ−ベータ活性に対する生物マーカーとしての、イムノアッセイによる血清ネオプテリンの測定
血清ネオプテリン濃度を、市販品として入手できる競合ＥＬＩＳＡアッセイキット（イムノバイオロジカルラボラトリーズ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号  ＲＥ５９３２１）を使用して測定した。製品に記載されている通り、以下の通りにアッセイを実施した。
【０１４９】
１．装置
ａ．ポリプロピレンマイクロタイターチューブ。カタログ番号２９４４２〜６０８、ＶＷＲ、Ｓ．Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州、または同等の供給源；
ｂ．１００μｌおよび１０００μＬを分配するために、高精度反復分注器（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｐｉｐｅｔｔｏｒ）を用い、１００μＬの体積固定のピペット、および１００μＬの調節可能ピペットも用いた。エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）または等価物、ＶＷＲ、Ｓ．Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ニュージャージー州  ０７０８０または等価物；
ｃ．吸い取り紙；
ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｖｅｒｓａｍａｘプレートリーダー、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州；
ｅ．自動プレートシェーカー：ラボラインインストルメント社（Ｌａｂ−Ｌｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）、イリノイ州、米国；
ｆ．Ｂｉｏ−Ｔｅｋプレートウォッシャー、ＥＬｘ４０５、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ヴァーモント州。
【０１５０】
２．材料
ネオプテリン（Ｈｕ）  ＥＬＩＳＡキット：イムノバイオロジカルラボラトリーズ（Ｉｍｍｕｎｏ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カタログ番号ＲＥ５９３２１、ロット番号  ＥＮ０１８７、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州。
【０１５１】
３．バッファー／溶液の調製
ａ．洗浄溶液
・５０ｍｌの洗浄溶液濃縮物を、蒸留水で４５０ｍｌに希釈した。使用する前に室温で使用された。４℃で、１ヶ月まで保管される。  
ｂ．アッセイバッファー
・すぐに使用できる。４℃で使用および保管すること。  
ｃ．酵素標識抗体溶液
・５ｍｌのアッセイバッファー（１：２０１）に、２５μＬ抗体濃縮物を加える。室温で使用し、光から防護し、２４時間４℃で保管する。  
ｄ．基質溶液
・使用の前に、９ｍＬの基質バッファーに３００μＬ  ＴＭＢ基質を加える。室温で、すぐに使用する。４８時間まで、４℃で保管する。  
ｅ．停止試薬
・停止溶液は、すぐに使用できる。室温で使用する。
【０１５２】
４．較正標準
ａ．較正標準は、安定剤と共にリン酸塩バッファー中にネオプテリンを含有する使用のために準備する。アッセイバッファーは、ゼロ標準として使用される。  
【表１２】
2007526317.tif 000025
ｂ．品質管理のための対照血清は、使える状態で提供される。
【０１５３】
５．イムノアッセイ手順
ｃ．抗体でコートしたマイクロウェルアッセイプレートを、使用前に室温にした。  
ｄ．１０μＬの、各標準、対照、またはサル血清サンプルを、グリッドマップを使用して、二重にマイクロアッセイプレートのウェルに加えた。  
ｅ．各ウェルに、１００μＬの酵素結合体を加えた。  
ｆ．５０μＬネオプテリン抗血清を加えた。  
ｇ．ブラックホイルを用いてプレートを密閉し、室温（２０〜３０℃）で９０分、軌道振盪（３５０〜４５０ｒｐｍ）させながら、暗中でインキュベートした。  
ｈ．溶液を除去し、プレートを４回洗浄し、洗浄と洗浄の間に１分間インキュベートした。  
ｉ．各ウェルに２００μＬの基質溶液を加えた。  
ｊ．プレートを密封し、振盪させながら、１０分間室温でインキュベートした。  
ｋ．１００μＬの停止溶液を加えた。  
１．６５０ｎｍを基準にして、４５０ｎｍでプレートを読み取った。  
ｍ．血清濃度は、４パラメータの曲線適合法を使用して作成される較正曲線から測定した。
【０１５４】
ソフトウェア
記述統計（平均および標準偏差またはＳＤ）、ならびにコンパートメントおよびノンコンパートメント解析を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ第４．１版（ファーサイト社（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用して実施した。ＥＬＩＳＡおよびバイオアッセイのための血清濃度の算出は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｅｘｃｅｌ  ２００２を使用して実施した。グラフィック表示は、ＳＰＳＳ（登録商標）ＳｉｇｍａＰｌｏｔ  第８．０版を使用して行われた。比較統計は、ＳｉｇｍａＳｔａｔ  第３．０１版を使用して実施された。
【０１５５】
結果
ＥＬＩＳＡによって測定されたＥＺ−２０４６濃度−時間プロフィールを表にしたもの
【表１３】
2007526317.tif 000026
【０１５６】
結論：
・平均ＥＺ−２０４６血清濃度値は、雄と雌で類似であり、類似のＥＺ−２０４６濃度−時間プロフィールという結果になった。  
・皮下投与と筋肉内投与を受けたサルに関するＥＺ−２０４６の薬物動態学的値は、互いに類似であった。  
・静脈内に投与されたサルは、ＳＣおよびＩＭ投与と比較すると、Ｃｍａｘが、６〜８倍高く、末端排除が１．４〜２．５倍遅く、ＡＵＣが、１．４〜１．６倍大きかった。  
・ＳＣおよびＩＭ投与後のＥＺ−２０４６の生体利用率は、約６５％であった。  
・ＥＺ−２０４６は、投与後１６８時間、血清中で測定可能であった。
【０１５７】
Ｂ．生物活性アッセイにより測定されるＥＺ−２０４６濃度−時間プロフィール
ＥＬＩＳＡ分析によって、ＥＺ−２０４６動態のタンパク質濃度プロフィールが提供される。これは、生理活性をもつＥＺ−２０４６の動態を測定するためにも使用された。このデータを、ＥＬＩＳＡ薬物動態学的パラメータ推定値と生物活性アッセイ薬物動態学的パラメータとの間の比で示す。  
【表１４】
2007526317.tif 000027
【０１５８】
結論：
・ＥＺ−２０４６生物活性アッセイは、ＥＺ−２０４６の筋肉内および皮下投与後の、ＥＬＩＳＡによって測定されるＣｍａｘ濃度と比較した場合の、平均ＥＺ−２０４６  Ｃｍａｘ活性の、８．１〜１３．１倍の低下、および静脈内投与後の、２．８倍の低下を示した。
【０１５９】
・すべての投与経路は、末端血清排除半減期（ｔ１／２）において、ＥＬＩＳＡによって測定される血清排除半減期と比較した場合に、２．９〜３．２倍の範囲である、類似の生物活性の減少を示した。  
・ＥＺ−２０４６生物活性ＡＵＣは、同様に、ＥＬＩＳＡ値と比較すると、ＩＶ、ＳＣ、およびＩＭ投与後に１４．７、２０．１、および２６．１の分の１に減少した。  
・皮下および筋肉内投与されたＥＺ−２０４６は、ＩＦＮ−ベータ生物活性アッセイによる生体利用率において、ＥＬＩＳＡ推定値と比較した場合に、類似の１．４〜１．８倍の低下を示した。
【０１６０】
Ｃ．ネオプテリン合成によって測定されるＥＺ−２０４６の薬力学的効果
ＥＺ−２０４６投与の薬理的な効果は、上に述べる方法を用いる血清ネオプテリン応答を試験することによって測定された。  
【表１５】
2007526317.tif 000028
【０１６１】
結論：
・投与経路にかかわりなく、ネオプテリン合成に対する薬力学的パラメータは、類似であった。  
・ネオプテリン合成は、ＥＺ−２０４６を投与した後４〜７時間で起こった（Ｔｌａｇ）。  
・最大の効果までの時間（Ｔｍａｘ）は、２８〜３４時間の範囲であった。  
・ＩＦＮ−ベータ１ｂの最大の効果（Ｅｍａｘ）は、１．４ｎｇ／ｍｌの基線ネオプテリンレベル上の２．０〜３．２ｎｇ／ｍｌの範囲であった。  
・血清ネオプテリン効果は、４３．２〜６０．７時間の範囲である排除半減期と共に減弱した。  
・バックグラウンドレベルよりも上のネオプテリン暴露は、２３６〜３３２時間ｈ  ｎｇ／ｍＬの範囲であった。
【０１６２】
さらなる結論：
・カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）へのＰＥＧ−ＩＦＮ−β結合体ＥＺ−２０４６の投与後、ＩＦＮ−βおよびネオプテリンについての薬物動態学的および薬力学的パラメータは、性別間で類似であった。  
・ＥＺ−２０４６の皮下および筋肉内投与は、類似のＣｍａｘ、末端血清排除半減期（ｔ１／２）、ＡＵＣ、および生体利用率が示された。ＳＣおよびＩＭのＥＺ−２０４６血清排除半減期は、静脈内投与と比較して、約２倍遅かった。  
・おそらく、結合されていない薬物と比較して、ＰＥＧ化されたＩＦＮ−ベータの特異的な活性が低いことによって、ＥＺ−２０４６の生物活性は、ＥＬＩＳＡ値と比較して、投与後にＣｍａｘにおいて３倍の低下が示された。  
・ネオプテリン応答は、ＥＺ−２０４６の投与経路にかかわりなく類似であった。  
・ネオプテリンは、ＥＺ−２０４６投与後に基線よりも上に、二倍にゆっくりと増大し、ネオプテリン応答は、ゆっくりと減弱し、ＥＺ−２０４６投与の１週後にも依然として検出可能であった。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】実施例７で述べた比較データを示すグラフである。
【図２】実施例８で述べた比較データを示すグラフである。
【図３】雄および雌のカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）における、実施例９に記載した通りの１５μｇ／ｋｇ  ＥＺ−２０４６の注射後の、ＥＬＩＳＡによる平均ＩＦＮ−ベータ血清濃度を示すグラフである。（ここで、「ＩＭ」は筋肉内であり、「ＩＶ」は、静脈内であり、「ＳＣ」は皮下であり、「Ｆ」は雌であり、「Ｍ」は雄である。）
【図４】実施例２および３によって記載されている通りに、ＥＬＳＤ検出器を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによって測定される、ＰＥＧ−ＩＦＮ−ベータ１ｂの最終生成物の純度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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