(57)【要約】  オメプラゾールといったプロトンポンプ阻害剤は単独で充実性腫瘍に対し抗腫瘍効果を及ぼすことができ、かつ、前処置として使用された場合、耐性が提示されているこのような腫瘍の薬物感受性を実質的に完全に回復させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌性状態の治療又は予防のための薬剤の製造におけるプロトンポンプ阻害剤の使用。
【請求項２】
前記状態が腫瘍である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記腫瘍が転移性である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記プロトンポンプ阻害剤が２−ピリジルメチルスルフィニルベンズイミダゾールプロトンポンプ阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記プロトンポンプ阻害剤がオメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾール、エソメプラゾール、ラベプラゾール、及びその混合物から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
さらに制酸剤を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記薬剤が、経口投与用であり、患者の胃内におけるＰＰＩの完全金属イオン封鎖を防止するために充分な制酸剤での治療を受けてきた患者の治療用である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記制酸剤が前記プロトンポンプ阻害剤に先立って投与するように処方される、請求項６又は７に記載の使用。
【請求項９】
前記制酸剤が炭酸カルシウムである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記制酸剤がＨ２受容体拮抗薬である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
疾病状態の併用療法又は予防のための薬剤の製造におけるプロトンポンプ阻害剤の使用であって、前記プロトンポンプ阻害剤が、前記状態に対して処方される少なくとも１つの追加の薬物に先行して投与される、使用。
【請求項１２】
前記状態の部位に関連する酸性度を低減させるのに充分なほど、前記プロトンポンプ阻害剤の投与を前記追加の薬物の投与に先行して行う、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記追加の薬物の投与に先行する時間が３０分から３日の間である、請求項１１又は１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記追加の薬物が、ビンカアルカロイド；タキサン；アントラサイクリン；アントラセン；エピポドフィロトキシン；カンプトテシン；重金属オキシアニオン；アクチノマイシンｄ；マイトマイシンｃ；メトトレキセート；トリメトレキセート；アムサクリン；イミチニブ；及びメルファラン；５−フルオロウラシル；及びシスプラチンから選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記疾病状態が前記追加の薬物に対する耐性をもち、前記プロトンポンプ阻害剤は、前記追加の薬物のレベルが臨床的に有効量に満たない時点に投与するためのものである、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記疾病状態が癌性状態である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記状態が腫瘍である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記腫瘍が転移性である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記疾病状態がＡＩＤＳ、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、又はそれらの組合せから選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項２０】
前記状態がＡＩＤＳであり、前記追加の薬物がＨＡＡＲＴ薬である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記プロトンポンプ阻害剤が２−ピリジルメチルスルフィニルベンズイミダゾールプロトンポンプ阻害剤である、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
前記プロトンポンプ阻害剤がオメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾール、エソメプラゾール、ラベプラゾール、及びそれらの混合物から選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
さらに制酸剤を含む、請求項１１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記プロトンポンプ阻害剤がオメプラゾールである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
前記薬剤が前記状態の治療用である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オメプラゾールなどのプロトンポンプ阻害剤の抗新生物療法における使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
既存の抗新生物戦略は、高いｉｎ  ｖｉｖｏ全身毒性と合わせて充実性腫瘍に対する低レベルの効能しか示しておらず、全身毒性の低い新しい抗腫瘍戦略に対するニーズがなおも存在している。
【０００３】
発明者らの最近のデータによると、腫瘍の悪性度及び侵襲性は、２つの主要な機序、すなわち（ｉ）異常な食細胞活性（ルグニ（Ｌｕｇｕｎｉ）ら、２００３年）；及び（ｉｉ）Ｆａｓ媒介型アポトーシス機序を通してリンパ球を死滅させることのできるエキソソームの放出（アンドレロラ（Ａｎｄｒｅｏｌａ）ら、２００２年）と結びつけられるということが示唆されている。強力なリソソームネットワークに属する強く酸性化された小胞の輸送が関与する可能性のある１つの共通の機序がこれら２つを関連づけているということも考えられる。アクチン細胞骨格のリソソーム膜への連結を阻害することで、これらの腫瘍の機能が低下し得る。
【０００４】
細胞成長、細胞運動性、腫瘍形成、転移及び癌細胞中のアポトーシスに関するｐＨｉ（細胞内ｐＨ）の影響が研究されてきた（ペローナ（Ｐｅｒｏｎａ）ら、１９８８年；シュラパック（Ｓｃｈｌａｐｐａｃｋ）ら、１９９１年；ゴットリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ）ら、１９９５年；ヘルムリンガー（Ｈｅｌｍｌｉｎｇｅｒ）ら、１９９７年；マルチネス−ザギラン（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｇｕｉｌａｎ）ら、１９９８年）。
【０００５】
充実性腫瘍の微環境は、酸化性が低く酸性度の高い領域を含んでいる。臨床及び実験研究からの増大する証拠は、転移性進行における酸性腫瘍微環境の根本的な役割を指摘している（スバルスキー（Ｓｕｂａｒｓｋｙ）及びヒル（Ｈｉｌｌ）、２００３年）。低下したｐＯ２酸性度そして栄養不足が遺伝子の発現を改変する。血管形成、組織リモデリング及び生存において役割を果たす遺伝子が、腫瘍細胞の生存に必要であり、転移性進行においてきわめて重要な役割を果たす（スバルスキー及びヒル、２００３年）。
【０００６】
充実性腫瘍の細胞外（間質性）ｐＨは、正常な組織のものよりもはるかに酸性度が高い（イズミ（Ｉｚｕｍｉ）ら、２００３年）。データは制限されているものの、ヒトにおけるｐＨ測定は、腫瘍と正常な組織間の差異を示している（タノック（Ｔａｎｎｏｃｋ）及びロチン（Ｒｏｔｉｎ）、１９８９年）。その上、酸性細胞内細胞小器官も同様に、化学療法薬物に対する耐性に参与し（アルタン（Ａｌｔａｎ）ら、１９９８年；フルヴィッツ（Ｈｕｒｗｉｔｚ）ら、１９９７年；シンドラー（Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ）ら、１９９６年；ラーセン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、２０００年；ラグナン（Ｒａｇｈｕｎａｎｄ）ら、１９９９年；オアール（Ｏｕａｒ）ら、１９９９年）かくして腫瘍細胞に対し累積的かつ全体的な選択的利点を付与する。
【０００７】
腫瘍が表示する酸性度は、腫瘍組織を健康な組織と区別するために潜在的に有用な手段であるものとして提案されてきた。細胞外環境及びリソソーム区画の酸性化が１つの役割を果たし得ると考えられる腫瘍の機能としては次のようなものがある；（ｉ）酸性度を通したリンパ球機能の直接的障害（ラトナー（Ｒａｔｎｅｒ）及びヘプナー（Ｈｅｐｐｎｅｒ）、１９８５年）及び（ｉｉ）化学療法薬物を不活性化し及び／又は金属イオン封鎖（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）する能力をもつ化学的／物理的障壁の発生（アルタンら、１９９８年）。
【０００８】
腫瘍細胞の酸性腫瘍微環境と非常に高性能な腫瘍リソソーム区画が協働して一種の消化器の代理をし、腫瘍細胞が細胞外マトリクスを経て死細胞を食することができるようにする可能性があるということが考えられる（ルギーニ（Ｌｕｇｉｎｉ）ら、２００３年）。かくして、腫瘍微環境酸性化が全体的な選択的利点として姿を現わす可能性がある。
【０００９】
腫瘍細胞内の活性なＨ＋トランスポータの１種である空胞（Ｖａｃｕｏｌａｒ）型Ｈ＋ＡＴＰアーゼ（ＶＨ＋ＡＴＰアーゼ）の増強された発現及び活性は、腫瘍細胞外微環境及び細胞内酸性区画の両方の酸性化において主要な役割を有し得る。
【００１０】
癌細胞の酸性微環境は同様に、多剤耐性とも結びつけられてきた。化学療法剤に対する耐性は、癌患者における治療の失敗の主要な原因であり、生化学及び／又は生理学的機序によってひき起こされる可能性がある。生化学的機序には、原形質膜薬物排出トランスポータであるＰ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）などといった耐性付与タンパク質の過剰発現が含まれる。生理学的耐性には、腫瘍微環境が関与し、細胞内及び／又は細胞外ｐＨの改変によってひき起こされる可能性がある。
【００１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、低いｐＨが弱塩基性化学療法薬物の摂取を低減させ、従ってその細胞毒性を低減させる（ラグナンら、１９９９年）。この現象は、ｉｎ  ｖｉｖｏで弱塩基性薬物に対する「生理学的」耐性に貢献するものであると主張されてきており、動物モデルで得られたデータは、重炭酸塩によって誘発された細胞外アルカリ化が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でヒト腫瘍細胞に対する、ドキソルビシンを含めた一部の化学療法薬の治療的有効性の著しい改善を導くことを示している（ラグナンら、２００３年；マホネー（Ｍａｈｏｎｅｙ）ら、２００３年）。モデルシステム内での研究により、腫瘍ｐＨが治療応答の決定因子であり得ることが実証された。
【００１２】
酸性細胞内細胞小器官も同様に化学療法薬物に対する耐性に参与し得る（アルタンら、１９９８年；フルヴィッツら、１９９７年；シンドラーら、１９９６年；ラーセンら、２０００年；ラグナンら、１９９９年；オアールら、１９９９年）。酸性小胞の回転置換は、特にＰ−糖タンパク質といったような原形質膜結合薬物ポンプを過剰発現しない細胞内で化学耐性における重要な因子であり得る。事実、一部のデータは、化学療法薬物が薬物感受性細胞の細胞質及び核質を通して分配するものの、薬物耐性細胞内では核から排除されるということを示唆している（アルタンら、１９９８年；フルヴィッツら、１９９７年；シンドラーら、１９９６年；ラーセンら、２０００年；ラグナンら、１９９９年；オアールら、１９９９年）。実際、複数の報告書が、リソソーム型の小胞の酸性化の増大が薬物耐性の原因として関係しており、酸性細胞小器官内の薬物の金属イオン封鎖及びその後の分泌経路を通した細胞からの排除が化学療法耐性に寄与するという仮説と一貫している、ということを示唆している。（シンドラーら、１９９６年；フルヴィッツら、１９９７年；クリアリー（Ｃｌｅａｒｙ）ら、１９９７年；アルタンら、１９９８年；ラグナンら、１９９９年；オアールら、１９９９年；ブアー・ディル（Ｂｏｕｒ−Ｄｉｌｌ）ら、２０００年；ラーセンら、２０００年）。さらに、一部の最近の発見事実は、弱塩基性化学療法薬物の酸性ｐＨ依存性蓄積を損なうリソソーム作用剤が、拡張した酸性リソソーム区画を伴うＭＤＲ細胞内でアントラサイクリン耐性を逆転させるかもしれないということを示している（オアールら、２００３年）。
【００１３】
空胞Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ（Ｖ−Ｈ＋−ＡＴＰアーゼ）は数多くの細胞区画内でのｐＨの制御に関与するトランスポータの１種類である。この排出ポンプのファミリは、真核生物において数多くの機能を有し、一部のヒト腫瘍細胞を含めて、数多くの細胞型の中で散漫に発現されている（ベック（Ｂｅｃｋ）、１９８７年；バーナネン（Ｖａａｎａｎｅｎ）ら、１９９０年；マルカード（Ｍａｒｑｕａｒｄｔ）ら、１９９１年；マルティネス・ザギラン（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｇｕｉｌａｎ）、１９９３年；モリヤマ（Ｍｏｒｉｙａｍａ）、１９９６年；ムラカミ（Ｍｕｒａｋａｍｉ）ら、２００１年）。これらのＡＴＰアーゼは、細胞質区画からそれ自体細胞内細胞小器官の内腔又は細胞外空間のいずれかによって表わされ得る膜の反対側までのＡＴＰ依存性プロトン輸送を実施する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
オメプラゾール及びその類似体例えばエソメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾール及びラベプラゾールを含むプロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）は、原形質膜を横断して（細胞外空間まで）又は空胞膜を横断して（酸性小胞の内腔まで）の細胞質からのＨ＋イオンの活発な輸送を担当するポンプを特異的に阻害する。これらの分子は現在消化器官疾患の症候を治療するために使用されている薬物である。
【００１５】
特開２００３−２７７２６２号公報は、消化管内の抗癌剤として使用するためのエステル混合物とランソプラゾールの組合せにおいて、エステルがランソプラゾールの生物利用能を増大させる組合せを開示している。
【００１６】
特開２００１−２８６２８４号公報は、ＰＰＩ活性を有するＶ−ＡＴＰアーゼ及びこれに対する抗体のペプチドサブユニットについて開示している。Ｖ−ＡＴＰアーゼは腫瘍と結びつけられていることから、これらの抗体が抗癌活性を有し得ると推測されている。
【００１７】
国際公開第０２／０８０９１７号パンフレットは、マラリア及び癌を含む状態における誘発された多剤耐性（ＭＤＲ）の治療のためのプロトンポンプ阻害剤の使用を開示している。プロトンポンプ阻害剤と抗癌剤の同時投与が示唆されている。誘発されたＭＤＲは、ＡＢＣタンパク質トランスポータを含めたタンパク質トランスポータといったような特徴的タンパク質発現と結びつけられる。かかる発現と結びつけられていない固有の耐性については扱かわれておらず、これは、癌療法においてはるかに重大な問題である。著者らは、ＰＰＩ及びドキソルビシン又はビンクリスチンといったような薬物での同時治療は見かけ上腫瘍細胞の薬物感受性のわずかな増大を導いたということを報告している。
【００１８】
欧州特許第０５６７６４３号明細書は、一定数の新しい抗潰瘍剤について開示しており、裏づけデータは全くないものの著者らはこれらの作用物質が同様に抗癌活性をも有する可能性があるということを推測している。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
驚くべきことに、発明者らはこの度、プロトンポンプ阻害剤が単独で充実性腫瘍に対し抗腫瘍効果を及ぼすことができること、そしてそれらが、前処置として使用されたとき、耐性が現われている場合にかかる腫瘍に対する薬物感受性を実質的に完全に回復させることができることを見出した。
【００２０】
かくして第１の態様では、本発明は、癌性状態の治療のための薬剤の製造におけるＰＰＩの使用を提供している。
【００２１】
治療すべき癌性又は新生物性状態は腫瘍であることが好ましく、さらに、該腫瘍が転移性のものであるか又は例えば熟練した医師により診断されるようにその腫瘍が転移性である又は将来転移性のものとなる確率が高いことが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
上述の通り、細胞内及び細胞外で酸性状態と結びつけられるのは特に転移性腫瘍であり、驚くべきことにオメプラゾール及びその他のＰＰＩがかかる腫瘍に対し全身的効果を及ぼすことができるということが発見されてきた。
【００２３】
個々の患者を治療するのに最も適したＰＰＩの量及びタイプの両方を決定する上で熟練した医師の一助となり得ることから、ＰＰＩの投与の前後に腫瘍のｐＨを査定できることが有利である。このような監視は同様に、腫瘍のｐＨに対するＰＰＩ治療の直接的効果のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの査定をも提供する。
【００２４】
実際、添付の実施例において、発明者らは、さまざまな組織学の腫瘍から誘導されたヒト細胞系統を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験、及び重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウス内に同じ腫瘍細胞を移植するｉｎ  ｖｉｖｏ実験からの結果（ロズポーネ（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ）ら、２０００年；２００３年；２００４年近刊）を提供しかつ、（ｉ）オメプラゾールが、わずかに酸性の培地内で培養された腫瘍細胞について用量依存的に細胞毒性を有すること、（ｉｉ）緩衝培地で培養された同じ腫瘍細胞について非毒性であること、（ｉｉｉ）オメプラゾール又はその類似体でのヒト−ＳＣＩＤのｉｎ  ｖｉｖｏ治療が腫瘍の成長を著しく減少させることができたこと、そしてオメプラゾールでの前処置が一般に、多剤耐性（ＭＤＲ）を往々にして実質的に完全に逆転させることができたことを示している。
【００２５】
ＰＰＩは、弱塩基であることから酸性区画を蓄積しプロトン化を通して活性化されてプロトンポンプ阻害剤としてのその機能を及ぼすという点で、重要な化学的特長を示す。かくして、これらは通常胃の中で蓄積する。
【００２６】
プロトンポンプ阻害剤（ＰＰＩ）は、胃−食道逆流性疾患、十二指腸及び胃潰瘍を含めた酸関連疾患を患う患者を治療するための選択される薬物の種類として出現した（ラーソン（Ｌａｒｓｓｏｎ）ら、１９８５年；ウォルマーク（Ｗａｌｌｍａｒｋ）ら、１９８５年；パスカス（Ｐｕｓｃａｓ）ら、１９９９年；ホーン（Ｈｏｒｎ）２０００年）。ＰＰＩ（標準的にはオメプラゾール、ランゾプラゾール、パントプラゾール及びラベプラゾール）は、類似のコア構造を共有する置換型２−ピリジルメチルスルフィニルベンズイミダゾールである（ホーン、２０００年）。これらの作用物質は約４のｐＫａ値をもつプロトン化可能な弱塩基であり、従って、４未満のｐＨをもつ酸性空間内で選択的に蓄積する。このような酸環境では、ピリジン及びベンズイミダゾール窒素のプロトン化によって、薬物の活性形態を表わす四環性スルフェンアミドの形成が結果としてもたらされる（ホーン、２０００年）。
【００２７】
かくして、好ましいＰＰＩは２−ピリジルメチルスルフィニルベンズイミダゾールＰＰＩ特にオメプラゾール、ランゾプラゾール、パントプラゾール及びラベプラゾールである。
【００２８】
１つの態様においては、消化管の癌でない癌性状態を治療することが好ましい。もう１つの態様では、特に癌性状態が消化管に関連するものである場合、ランゾプラゾールは使用しないことが好ましい。
【００２９】
腫瘍細胞は、中性の緩衝培地内で生存できるものの、驚くべきことに発明者らは、腫瘍細胞内の空胞タイプのＨ＋−ＡＴＰアーゼの発現及び活性により誘発されるｐＨ変動（より低い細胞外、より低い細胞内空胞ｐＨ及びより高い細胞質ｐＨ）を遮断するためにＰＰＩを使用した場合、これらの腫瘍を制御さらには死滅させることができる、ということを発見した。
【００３０】
特に驚くべきことに、ＰＰＩは、摂取時に胃の中で結合されるか又は金属イオン封鎖されると予想されているにも関わらず、腫瘍に対し全身的効果を及ぼすことができる。それでも、例えば、いかなる酸性の胃内条件も経口投与されたいずれのＰＰＩの有効性も削減する必要がないように、制酸剤と併わせてＰＰＩを投与することが好ましい。かくして、ＰＰＩの摂取をさらに容易にするのに充分な制酸剤を患者に対し投与することが好ましい。かかる用量は、熟練した医師によって容易に決定されるいずれのものであってもよいが、指針としては、例えば酸の逆流を治療するためにメーカーが推奨する量であり得る。
【００３１】
オメプラゾール又はＰＰＩが本書で言及されている場合には、別途明らかである場合を除きいずれの用語も本発明において有用なあらゆるＰＰＩに関する。同様にして、「腫瘍」という語が言及されている場合、これは、他に指示されているか又は別途明らかである場合を除き、該発明が適用されるあらゆる癌性状態そして特に酸性微環境に結びつけられ状態にも同様にあてはまる。
【００３２】
ＰＰＩは、抗腫瘍効果を及ぼすのに有効なあらゆる量で投与可能である。一般にこれは例えば胃潰瘍の治療に使用されるのとほぼ同じ量であり得る。オメプラゾールについての許容可能な用量は一般に２０〜４０ｍｇ／日である。この用量は、その他の類似体について増大し得る。例えばパントプラゾールは標準的に４０〜８０ｍｇ／日で投与され得る。しかしながら、５６０ｍｇ／日又は２４００ｍｇ／日の過剰用量でさえ、多大な副作用も安定した副作用も示さなかった。
【００３３】
使用されるＰＰＩの量は、熟練した医師にとっては明らかであるように、患者とその状態に応じて変動し得、又特に例えば制酸剤での治療を受けていない消化器官状態を患者が有する場合、標準的に上向きに変動し得る。ＰＰＩは適切にはメーカーにより提供される通りの従来の形態で投与され得、かかる形態には特に例えば錠剤、カプセル及びトローチ剤ならびに遅延及び持続放出処方を含めた経口投与に適したあらゆる形態が含まれる。
【００３４】
一般には、胃の中の酸分泌を阻害しかくして腫瘍部位に達し得るＰＰＩの濃度を増強しかつ胃の中に残る濃度を最小限におさえるべく、炭酸カルシウムといったもう１つの制酸剤、又はＨ２−受容体拮抗薬といった制酸性薬物例えばラニチジン又はシメチジンで腫瘍患者を前処置することが好ましい。かくして、制酸剤での治療は、体内の酸性部位だけの数が実質的に低減されるか又は少なくとも最も有意な部位が一時的に中和されるか又は改善されることから、ＰＰＩの送達を増大させるのに有効である。
【００３５】
治療は、胃を回避しこれが及ぼす可能性のある希釈効果を回避するべく、もう１つの経路によるものであってもよい。適切なその他のあらゆる経路が受容可能であり、これには、吸入薬、目薬、ペッサリー、遅延放出錠剤、パッチ、坐薬、カテーテル及びｉ．ｐ．（腹腔内）、ｉ．ｍ．（筋内）又はｉ．ｖ．（静脈内）といった注射が含まれ得る。このような処方はいずれも、所望の通りに作成することができ、標準的には、賦形剤、安定化剤、乳化剤、着香剤、滅菌剤及び抗菌剤といった処方に適したあらゆる成分を含有し得る。
【００３６】
一般に、ＰＰＩ薬物は、腫瘍の治療において同等に有効であると思われる。特に好ましいのは、オメプラゾール、エソメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾール及びラベプラゾールであり、オメプラゾールがより好ましい。あらゆる薬剤が活性成分として１つ以上のＰＰＩを含有することができる。
【００３７】
ＰＰＩは、その他の薬物にとっては手に負えないものとなった又は手に負えないものである腫瘍の治療において驚くほど有効であることがわかった。特に、発明者らは、ＰＰＩで前処置された場合にＭＤＲ表現型を有する腫瘍がその薬物耐性を失なうか又は耐性が有意に低下させられるということを発見した。かかる前処置は、同様に薬物耐性を高めると思われる耐性ある腫瘍の酸性化効果を遮断し、腫瘍をその治療のために選択された薬物の効果に曝露された状態に置くと思われる。この結果は、完全に予想外であった。
【００３８】
特に驚くべきことは、該効果が低く塩基性の薬物に制限されるように思われず、試験対象の全ての薬物において全範囲を通して耐性を高めるように思われ、薬物のタイプの如何に関わらず効能を回復させるという点である。同じく該当すると思われるのは、ＰＰＩでの先行治療を全く伴わない同時治療が全く又はきわめてわずかしか有用な効果をもたないということ、そして腫瘍に感受性を回復させるべく前処置を施す必要があるという点である。
【００３９】
シスプラチンといったようなもう１つの抗癌薬と同時に投与された場合のＰＰＩの効能の欠如の理由は流動的であるが、添付の実施例の中で明確に実証されている。前処置は優れた結果を生み出すが、全く前処置無しでの及び同時のＰＰＩ治療のみでの結果は、ＰＰＩが全く存在しない対照に匹敵する。理論により制限されるわけではないが、シスプラスチンといったような薬物がＰＰＩと反対の効果を有していることそして酸性化ＡＴＰアーゼを活性化しかくしてＰＰＩが効果を示す機会がなかった場合にＰＰＩの効果を中和することが可能であると思われる。同様に、抗癌剤の大部分が弱塩基でありＰＰＩと同様活性化されるためにプロント化が必要であることから、２つの薬物が酸性腫瘍環境内で金属イオン封鎖のために競合していることも又可能である。
【００４０】
かくして、ＰＰＩが第２の又はさらなる抗癌剤と併用される癌の合同療法では、患者は、標準的な癌治療であり得る第２の又はさらなる抗癌剤の投与に先立って、ＰＰＩで前処置されるべきである。ＰＰＩでのこの治療は、経口、全身的又は局所的投与といった任意の適切な手段による１つの治療であっても、一連の治療であっても又、例えば前日など全体にわたる経皮パッチ又はカテーテルなどによる連続的治療であってもよい。時間の長さは、ＰＰＩが作用する機会を有し続けていたこと、そして後続する治療の時点で酸性環境がなおも少なくとも部分的に弱められているかぎりにおいて、その他の抗癌剤が投与された時点でＰＰＩの効果がなお存在していることを条件として、特に重要ではない。
【００４１】
かくしてさらなる態様で、本発明は、癌性状態の合同治療のための薬剤の製造におけるプロトンポンプ阻害剤の使用において、プロトンポンプ阻害剤薬剤が合同療法に先立って投与するためのものである使用を提供している。
【００４２】
このような使用においては、特に、前記状態の部位に結びつけられた酸性度を低減させるべく合同療法より充分先行して投与されることが好ましい。合同療法の投与に先立つ時間は、好ましくは３０分〜３日の間である。好ましくは、ＰＰＩは、合同療法の投与に先立つ１つ以上の機会に投与され、第１回目は少なくとも療法より１日前であり、その後好ましくは合同療法の前２時間〜１２時間の間にもう１回投与される。
【００４３】
約２４時間の前処置期間が適切であり得るが、ＰＰＩの最大限の効果を可能にするために、ＰＰＩが治療より少なくとも１時間前に投与されることが好ましい。腫瘍酸性度に対するＰＰＩの効果は２日間又は３日間といったように少ない日数しか持続しないことがわかっていることから、一旦開始したからといって、治療は必ずしも連続的である必要はない。しかしながら、ＰＰＩ治療は安全なものであることから一般に治療をとにかく連続させることが好まれている。
【００４４】
ＰＰＩはその他の薬物での治療の経過全体にわたり連続して投与され得るが、それを１つの投薬計画の一部として投与することが好ましく、ここで、ＰＰＩでの治療は、その他の薬物に先立つ例えば６時間から２４時間の間与えられ、それに続いてその他の薬物が投与され、該サイクルは、そうでなければその腫瘍が耐性をもつことになる薬物にとって適切である通りに反復される。これが、毎日投与される場合、ＰＰＩは連続的に又は例えば該薬物より６時間前に投与され得る。
【００４５】
ＰＰＩによってそれに対する耐性が克服され得るその他の薬物の例としては、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン及びビンデシン；タキサン、例えばパクリタキセル及びドセタキセル；アントラサイクリン、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン及びイダルビシン；アントラセン、例えばビサントレン及びミトキサントレン；エピポドフィロトキシン、例えばエトポシド及びテニポシド；カンプトテシン、例えばトポテカン及びイリノテカン／ｓｎ３８；重金属オキシアニオン、例えば亜ヒ酸塩及び三価アンチモン；アクチノマイシンｄ；マイトマイシンｃ；メトトレキセート；トリメトレキセート；アムサクリン；イミチニブ（ｉｍｉｔｉｎｉｂ）；及びメルファラン；を含めた、排出ポンプタンパク質にＭＤＲが関連づけされると思われる薬物；及び５−フルオロウラシル（５−ｆｕ）及びシスプラチンを含めたタンパク質媒介型排出ポンプにＭＤＲが関連づけされないと思われる薬物が含まれる。
【００４６】
ＰＰＩは抗癌活性を有するものの、それが合同療法の一部として用いられる場合、一般に重大なものとなり得るもう１つの抗癌剤に対する薬物耐性を減少させることはそれらの能力であるが、いずれの累積的抗癌効果も有益でしかあり得ない、ということが分かっている。
【００４７】
かくして、一変形態様において、本発明は、その状態が耐性をもつ１つの薬物を有効量に満たないレベルで有する患者において１種以上の抗新生物薬に対して耐性をもつ癌性状態を治療するための薬剤の調製におけるＰＰＩの使用を提供している。このような場合、患者は、１つの癌性状態のための１薬物コース中にあり得、ＰＰＩの投与時期は、ＰＰＩがかかる効果を有することができるのに充分なほどにその他の抗癌剤のレベルが降下した時点で、腫瘍の酸性微環境に対し効果を有するように選択される。大部分の抗癌剤の毒性効果を考慮して投与と投与の間で患者が体力を回復できるようにするのが慣用的であり、かくして当業者がタイミングのよい機会を容易に発見し設定できるようになっている。ＰＰＩが２日又は３日後にも所望の効果をもち続けるということも同様に一助となり、かくして患者は抗癌剤の次のコースの前日に適切な量のＰＰＩを容易に摂取することができる。
【００４８】
従って、この文脈中、「有効量に満たない」という用語は、薬物レベルが投与の時点又は充分なＰＰＩが全身的に有効である後続する病期においてＰＰＩのＭＤＲ削減効果を防止するのに充分でないことを表わしている。好ましくは、その状態が耐性をもつ薬物レベルは、その間にＰＰＩが好ましくは投与され作用を及ぼすことのできる少なくとも短期間ごくわずかなレベルにまで降下できるようにされるべきである。
【００４９】
本発明は同様に、例えば、きわめて活性の高い抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）に対し不応性のものとなりうるＡＩＤＳといった状態の治療においても有用である。ここでも又、各療法の疾病状態に対する効果が対立しないよう、以前のＨＡＡＲＴ投与から充分な時間後にＰＰＩが投与されることが好ましい。
【００５０】
かくして、本発明はさらに、特に疾病状態がＡＩＤＳであるそして特定的には耐性がＨＡＡＲＴに対するものである薬物耐性のある疾病状態の治療のための薬剤の製造におけるＰＰＩの使用を提供している。
【００５１】
本発明に従った治療に適したその他の潜在的に薬物耐性ある疾病状態及びその治療には、例えば関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病といったような一部の慢性疾患の抗炎症性治療が含まれる。最も適切なのは、該抗炎症性治療が、耐性を生み出すものとして知られているコルチコステロイドの使用に基づくものである場合であると考えられている。かくしてＰＰＩの効果は同様にコルチコステロイドベースの治療のコンプライアンスを改善し、高投薬量又は長期間の治療投薬計画の結果としてもたらされる薬物関連の副作用を低減させることもできる。
【００５２】
本発明は同様に、癌性状態の長期療法及び治療においてならびにかかる状態の予防においても同様に有用である。例えば、ハイリスクであると思われている女性における乳癌を防止するためと同様、乳癌を克服した個体の再発防止のための継続的治療においても、タモキシフェンが用いられる。特に、タモキシフェンが細胞内ｐＨを上昇させるという証拠がある。
【００５３】
耐性を発生させる危険性は、継続的治療を受ける個体において増大し、従って例えばタモキシフェンといった薬物が投与されていない日にＰＰＩが投与される状態でのＰＰＩの同時投与は、耐性が発生するのを防止するため又は継続的治療を妨害する耐性を止めるために一助となり得る。
【００５４】
タモキシフェンは高レベルの全身的毒性を有するのに対し、ＰＰＩは過剰投薬量での投薬計画においてさえ非毒性であることが立証されている。かくして、本発明に従うと、ＰＰＩはタモキシフェンに対する１代替的薬物として使用されるか又は癌の再発を防止する上でタモキシフェンと組み合わされ得る。
【００５５】
同様にして、予防ベースで治療される遺伝性癌のその他の形態も同様にかかる治療を受けることができる。その一例としては結腸ポリープ症及び、環境的要因が促進しうるその他の状態がある。
【００５６】
従って、本発明はさらに、癌性状態の予防のための薬剤の製造におけるＰＰＩの使用をさらに提供している。かかる予防は追加の薬物と併用されること及び、ＰＰＩ及び薬物の投与は好ましくは少なくとも３０分だけ時間的に分離されていることが好ましい。適切な分離時間は、本発明について本書の他の箇所で記述されている通りである。
【００５７】
必要としている患者に対してプロトンポンプ阻害剤を投与することを含む、該患者の体内癌性状態の治療又は予防のための方法において、該癌性状態がそれと結びつけられた酸性微環境を有し、前記プロトンポンプ阻害剤が前記微環境のｐＨを高めるのに充分な量で投与される方法。
【００５８】
かくして、胃癌の予防は、それが無期限に継続されなくてはならないという点で潰瘍の治療とは異なることになる。さらに、その他の癌性状態のためには、投与されるＰＰＩの投薬計画は、腫瘍の酸性微環境に対する効果が最高３日間又はそれ以上持続することから、胃潰瘍の腫瘍の場合ほど高いものである必要がなく、かくして胃潰瘍の場合に処方されるものと類似のＰＰＩ量が例えば一日おきのみ、さらには単に３日おきにだけ患者により摂取されるだけでよいことになる。
【００５９】
本発明はさらに、疾病状態の治療又は予防のための併用療法において、それを必要としている患者に対して
ａ）  プロトンポンプ阻害剤、及び
ｂ）  前記状態の治療のためのプロトンポンプ阻害剤以外の少なくとも１つの薬物
を投与することを含み、かつ前記疾病状態が前記少なくとも１つの薬物に先立って前記患者に投与される、併用療法をも提供する。
【００６０】
ＰＰＩの投与は好ましくは、ＰＰＩが少なくとも部分的に、該状態に結びつけられるあらゆる酸性微環境を中和することができるようにするため、第２の薬物に充分先行した時点で行なわれる。より好ましくは、第２の薬剤が、進行中の投与計画の一部分として投与される場合、前記第２の薬物は、該状態にとって有効であるとみなされる濃度より低い濃度にあるべきである。かくして、第２の薬物がパッチにより投与されないことが好ましく又はそうされる場合には、薬物レベルが有効レベルより低く下降できるようにパッチを取外すべきである。
【００６１】
かかる投薬計画は、１つの状態の再発を防ぐためならびに該状態を治療するために連続する療法で遵守することができ、又、特にハイリスクの個体において、１つの状態を予防する上で利用することもできる。
【００６２】
確認はされていないものの、腫瘍中のｐＨの改変は、全体的な選択的利点を提示し、腫瘍細胞が存続し免疫応答を遮断し広がることができるようにする可能性があると思われている。プロトンポンプの阻害を通して作用しかくして細胞のｐＨを調節することのできる薬物は、ｐＨ改変に代表される利点を妨害できるように思われる。この利点はＶ−Ｈ＋ＡＴＰアーゼよって付与され、実際発明者らは、オメプラゾールそしてその類似体ランソプラゾール、ラベプラゾール及びパントプラゾールを含むこれらの酵素の特異的阻害薬が、効力の高い抗腫瘍活性を有することを発見した。
【００６３】
ここで本発明について添付の限定的意味のない実施例に関してさらに例示する。
【実施例】
【００６４】
実施例１
オメプラゾールを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
材料と方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
薬物：オメプラゾール（Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）（アストラ・ゼネカ（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）、エソメプラゾール（ｅｓｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ）（アストラ・ゼネカ）、パントプラゾール（ｐａｎｔｏｐｒａｚｏｌｅ）（シグマ・タウ（Ｓｉｇｍａ  Ｔａｕ））、ランソプラゾール（ｌａｎｓｏｐｒａｚｏｌｅ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン）及びラベプラゾール（ｒａｂｅｐｒａｚｏｌｅ）（ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ））ナトリウム塩を、原液としてＰＢＳ１Ｘ中に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁させ、−２０℃で保管した。
【００６５】
腫瘍細胞：原発腫瘍から得たヒト腫瘍細胞（２４の黒色腫細胞系統、２個の結腸腺癌細胞系統及び２個の乳癌細胞系統）を加湿された５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気内で１０％のウシ胎児血清及び抗生物質で富化された緩衝された（重炭酸塩で）又は緩衝されていない（重炭酸塩無し）ＲＰＭＩ１６４０培地内で培養した。腫瘍細胞は、イタリアミラノ市のＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｐｅｒ  ｌａ  ｃｕｒａ  ｄｉｅ  Ｔｕｍｏｒｉにより供給して頂いた。
【００６６】
用量応答曲線：懸濁液中に成長する腫瘍細胞を２４ウェルの細胞培養平板（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））中で１．５×１０５／ｍｌの割合で平板固定した。接着状態で成長する腫瘍細胞を２４ウェルの細胞培養平板中で３×１０４個の細胞／ウェルの割合で平板固定した。各々の薬物を、図中で示されているように、４個の対数希釈物を用いて各細胞型上で細胞毒性についてテストした。各希釈物を各実験において少なくともトリプリケートでテストした。
【００６７】
細胞毒性検定：各々の化学療法薬物での処置の後トリパンブルー排除方法を用いて、細胞毒性を評価した。簡単に言うと、処置の後、懸濁液中で成長している細胞を収集し、遠心分離しＰＢＳ１Ｘ中で再懸濁させた。代替的には、接着状態で成長する細胞を収集し、トリプシン処理の後に接着性の（生きた）細胞及び懸濁状態の（死滅したと仮定されている）細胞の両方をプールした。かくして、細胞を遠心分離（１５００ｒｐｍで１０分間）に付し、ＰＢＳ１Ｘ中で再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコートを０．４％のトリパンブルーで１：１（ｖ／ｖ）に希釈させた。５分後に、細胞を血球計算板（ノイバウエル（Ｎｅｕｂａｕｅｒ））上に装填し、生きた（染色していない）細胞及び死滅した（青色染色した）細胞の両方を光学顕微鏡で計数した。以下の公式を用いて死滅細胞の百分率を計算して細胞の生存度を査定した。
死滅細胞％＝（死滅細胞数／死滅細胞数＋生存細胞数）×１００
【００６８】
生／死  生存度／細胞毒性検定（登録商標）。この検定（モレキュラプローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、米国オレゴン州）は、細胞生存度−細胞内エステラーゼ活性及び原形質膜無欠性の２つの認知されたパラメータを測定する２つのプローブ（カルセインＡＭ及びエチジウムホモダイマー１）での生存細胞及び死滅細胞の同時判定に基づく２色螢光細胞生存度検定を提供する。生存細胞は、事実上非螢光の細胞透過性カルセインＡＭの、細胞中に保持されている強力な螢光性をもつカルセイン（ｅｘ／ｅｍ４９５ｎｍ／５１５ｎｍ）への酵素による転換によって判定される遍在性細胞内エステラーゼ活性の存在によって区別された。換言すると、エチジウムホモダイマー１（ＥｔｈＤ−１）は、損傷を受けた膜の中に入り、核酸に結合した時点で螢光の４０倍増強を受け、かくして、死滅細胞内で明るい赤色螢光を生成する（ｅｘ／ｅｍ４９５ｎｍ／５９５ｎｍ）。ＥｔｈＤ−１は、生存細胞の無傷の原形質膜によって排除される。メーカーの指示事項に従って、死滅細胞及び生存細胞の全く異なる標識を達成しかくして細胞毒性効果の正確な定量化を可能にするため、この研究で用いられた細胞型についての最適な染料濃度を判定した。処置の後、懸濁液中で成長する細胞を収集し、遠心分離し、ＰＢＳ１Ｘ中に再懸濁させた。代替的には、接着状態で成長しつつある細胞を収集し、トリプシン処理後接着性の（生存した）細胞及び懸濁状態の（推定上死滅した）細胞の両方をプールした。かくして細胞を遠心分離に付し（１５００ｒｐｍで１０分間）ＰＢＳ１Ｘ中で再懸濁させた。かくして細胞をそれぞれ０．１μＭ及び１μＭの最終濃度でカルセインＡＭａｎｄＥｔｈＤ−１で処置し、３０分間室温で放置した。このインキュベーション期間の後、細胞を一回ＰＢＳ１Ｘ中で洗浄し、ＰＢＳ１Ｘ中で再度再懸濁させた。４８８アルゴンレーザーが備わったＦＡＣＳｃａｎ血球計算器（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。少なくとも２０，０００の事象を獲得した。データを記録し、セルクエスト(Ｃｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔ)ソフトウェアを用いてマッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）コンピュータで統計解析した。対数的に増幅させた信号を均等目盛上の値へと交換した後、（中央値として表わされた）螢光の計算を実施し、パラメータ・コルモゴルフ・スミルノフ（Ｋ／Ｓ）検定を用いることで統計的意義を計算した。アポトーシスデータの統計解析を、スチューデントｔ検定を用いて実施した。報告された全てのデータは少なくとも４つの別々の実験±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の平均である。０．０１未満のｐ値のみが有意なものとみなされた。結果としての二変量度数分布は、緑色の螢光（５３０ｎｍ）生存細胞集団と赤色螢光（５８５ｎｍ）死滅細胞集団（存在する場合にはつねに）の間の明らかな分離を示していた。
【００６９】
統計解析：対応のない両側比較のためにスチューデントｔ−検定を用いて統計学的比較を実施した。０．０５未満のｐ値が有意であるとみなされた。
【００７０】
結果
オペプラゾールはｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞に対し細胞毒性をもつ。
第１の実験の目的は、オメプラゾール及びその他のＰＰＩでの処置を通したＶＨ＋ＡＴＰアーゼの阻害が腫瘍細胞について細胞毒性を示すことになるか否かを立証することにあった。オメプラゾールの細胞毒性効果は、原発性病巣に由来する２４個のヒト黒色腫、２個のヒト結腸腺癌及び２個のヒト乳癌細胞系統についてテストされた。これらの細胞は全て、重炭酸塩で補足されていないＲＰＭＩ１６４０培地により代表されるわずかに酸性の培地の中で、細胞の周期又は生存度に対するいかなる影響もなく生成することができた。以前のデータが腫瘍の微環境が正常な組織と比べわずかに酸性であることを示したことから、これがテストされた。
【００７１】
腫瘍細胞がオメプラゾールに敏感であることを確認するために、発明者らは、わずかに酸性の培地中で成長させられた細胞により代表される実験的条件を使用し、これに基づいてオメプラゾール用量応答曲線を実施した。対照として、緩衝培地（ｐＨ７．２）内で細胞を培養して同じ実験を実施した。図１では、１つの代表的ヒト黒色腫Ｃ系統についての結果が示されている。緩衝された中性培地又は緩衝されていない酸性培地の中での薬物の５つの対数希釈物で細胞を処置して、オメプラゾールの用量応答曲線を得た（図１）。これらの結果は、（ｉ）オメプラゾール単独では中性ｐＨ培地内でテストされた細胞に対するいかなる見かけの細胞毒性効果も見られなかったが、（ｉｉ）酸性培地内のオメプラゾールの存在は用量依存的に明らかに腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を及ぼすということを示した。その他のＰＰＩを用いてその他の腫瘍細胞系統について実施した実験は、匹敵する結果を提供した（データ示さず）。結果は生存／死滅  生存度／細胞毒性検定により完全に確認された。
【００７２】
実施例２
オメプラゾールでのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
材料と方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ
動物：生後４〜５週間でＣＢ．１７ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤ雌マウス（ハーラン、イタリア）を用い、特定の病原体の無い条件下に保った。ＳＣＩＤマウスはマイクロアイソレータケージ内に収容し、使用する前に全ての食物、水及び寝具は加圧滅菌した。
【００７３】
腫瘍細胞：両方の原発性病巣から得たヒト腫瘍細胞（黒色腫、結腸腺癌）を、加湿された５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気内で１０％のＦＣＳが補足されたＲＰＭＩ１６４０中で培養した。
【００７４】
ＳＣＩＤマウス内へのヒト腫瘍の移植及び成長：各マウスの右脇腹に、１０％のＦＣＳが補足された０．２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０中に懸濁された３×１０６個の細胞を皮下注射（ｓ．ｃ．）した。移植の後、各々の腫瘍のサイズを測径器で測定した。腫瘍の重量は、ゲラン（Ｇｅｒａｎ）ら（１９７２年）に従い、以下の公式を用いて推定した：
腫瘍重量（ｍｇ）＝長さ（ｍｍ）＋幅２（ｍｍ）／２
【００７５】
マウスの処置：ＰＢＳ１Ｘ中の懸濁液として、以前に記述された（ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）及びスミス（Ｓｍｉｔｈ）、２００１年）通りに強制飼養により７５ｍｇ／ｋｇの用量でオメプラゾール（アストラ・ゼネカ（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）、イタリア）及びパントプラゾール（シグマ・タウ（Ｓｉｇｍａ  Ｔａｕ）を投与した。ＰＢＳ１Ｘ中の懸濁液として、以前に記述された（ワトソン及びスミス、２００１年）通り強制飼養により２５ｍｇ／ｋｇの用量でランソプラゾール（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スウェーデン）及びラベプラゾール（ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）を投与した。
【００７６】
その他：別段の規定のある場合を除き、その他のパラメータは以上の実施例１で記されている通りである。
【００７７】
結果
ヒト腫瘍細胞が植え付けされたＳＣＩＤマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで査定された通りのヒト腫瘍成長に対するオメプラゾールの効果。
実施例１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、わずかに酸性の条件下でのヒト腫瘍細胞系統に対するオメプラゾールの直接的な細胞毒性効果を示した。かくして、次にｉｎ  ｖｉｖｏ系において効能がテストされた。
【００７８】
この目的で、発明者らは、オメプラゾール及びその類似体が、ヒト黒色腫細胞での皮下（ｓ．ｃ）注射によって植え付けられたＣＢ１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに代表されるヒト／マウスモデル系に対して及ぼす効果をテストした。このモデルは、局所的又は全身的治療戦略を用いて、ヒト腫瘍に対するさまざまな抗腫瘍療法の効能をｉｎ  ｖｉｖｏでテストするのに有用であることが証明された（ロズポーネら、２０００年、２００３年、２００４年近刊）。ヒト腫瘍細胞が植え付けられたマウスを強制飼養によりオメプラゾールで処置した。処置の効果を異なる時点での腫瘍の成長に関して測定した。結果は、反復的なオメプラゾール処置が腫瘍の成長を著しく低減させることを示していた（図２）。マウスをオメプラゾール類似体で処置して得た結果は、オメプラゾールで示されたものに完全に匹敵するものである（図示せず）。とりわけ、実験を停止させた後のヒト腫瘍の組織学的検査は、オメプラゾールで治療されたマウスからの腫瘍において、腫瘍質量は腫瘍のサイズを大部分占める巨大な壊死部域によって占有されており（図示せず）、このことは細胞毒性効果がｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍サイズ測定によって定量化されるものよりも著しく大きいものであることを示唆しているということを示した。
【００７９】
実施例３
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬物及びＰＰＩ
材料と方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験
薬物：ＰＰＩは上述の実施例１の通りであった。１ｍｇ／ｍｌの原液濃度でＰＢＳ１Ｘ中でシスプラスチン（アベンティス（Ａｖｅｎｔｉｓ）、フランス）を１ｍｇ／ｍｌの原液濃度でＰＢＳ１Ｘ中に再懸濁させ、−２０℃で保管した。両方の原液を使用直前に解凍し、再び凍結させなかった。５０ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液の形で５−フルオロウラシル（テヴァ・ファルマ（Ｔｅｖａ  Ｐｈａｒｍａ）、オランダ）を供給し、供給業者により指示される通り、室温で保管した。硫酸ビンブラスチン（エリ・リリー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、パリ、フランス）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で１：１０００のＥｔＯＨ／蒸留水溶液中に再懸濁させ、かくして４℃で保管した原液を得、再懸濁後３日以内に使用した。
【００８０】
腫瘍細胞：ヒト腫瘍細胞は上述の実施例１にある通りであった。
【００８１】
最高１００ｎｇ／ｍＬまで増大する亜致死濃度の硫酸ビンブラスチン（ＶＢＬ）（エリ・リリー、パリ、フランス）に親薬物感受性ヒトＴ−リンパ芽球腫を露呈することによってＣＣＲＦ−ＣＥＭ（ＣＥＭ）細胞のＭＤＲ変異体（ＣＥＭ−ＶＢＬ１００）を得た。この研究中で使用する全ての細胞を加湿された５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気内で１０％のウシ胎児血清及び抗生物質（塩基性培地、ＢＭ）で富化されたＲＰＭＩ１６４０培地の中で培養した。
【００８２】
ＭＣＦ７のＭＤＲ変異体（ＭＣＦ７／ＤＸ）を、最高２００ｎｇ／ｍＬまでの増大する亜致死濃度のドキソルビシン（ＤＸ）（ファルマシア＆アップジョン、イタリア）に親の薬物感受性ヒトＴリンパ芽球腫細胞系統を露呈することによって得た。
【００８３】
用量応答曲線：懸濁液中に成長する腫瘍細胞を２４ウェルの細胞培養平板（コスター（Ｃｏｓｔａｒ））中で１．５×１０５／ｍｌの割合で平板固定した。接着状態で成長する腫瘍細胞を２４ウェルの細胞培養平板中で３×１０４個の細胞／ウェルの割合で平板固定した。各々の薬物を、図中で示されているように、３〜５個の対数希釈物を用いて各細胞型上で細胞毒性についてテストした。各希釈物を各実験において少なくともトリプリケートでテストした。
【００８４】
その他：別段の規定のないかぎり、その他のパラメータは上述の実施例１に記されている通りである。
【００８５】
結果
シスプラチンに対するヒト腫瘍細胞のオメプラゾールによって増強された感受性
第１の実験の目的は、オメプラゾール及びその他のＰＰＩでの処置を通したＶＨ＋ＡＴＰアーゼの阻害が腫瘍細胞の多剤耐性を逆転させることができるということを確認することにあった。その分子中に２つのアミン基が存在することに起因して弱塩基の化学的特性を有するシスプラチンが、腫瘍細胞の弱塩基性薬物耐性の復帰突然変異体としてのオメプラゾールの活性をテストするために選択された。以前に、シスプラチン耐性腫瘍細胞が空胞化プロトンポンプ遺伝子の発現の増強と合わせてより高い細胞ｐＨ（及びより低い細胞外ｐＨ）を表示するということが示されてきた（ムラカミら、２００２年）。シスプラチンに対する細胞耐性に対するオメプラゾールの効果を、原発性病巣に由来しかつシスプラチンに対するその耐性のために選択された２４個のヒト黒色腫、２個の結腸−ヒト腺癌及び２個の乳癌細胞系統についてテストした。図３では３つの代表的黒色腫細胞系統についての結果が示されている。単独で又はオメプラゾールの存在下での該薬物の３つの対数希釈物で細胞を処置することによってシスプラチンについての用量応答曲線を得た。結果は、（ｉ）オメプラゾール単独ではこれらの条件下でテストされた細胞に対するいかなる細胞毒性効果も見られないこと、そして（ｉｉ）培地内のオメプラゾールの存在がテストされた全てのヒト黒色腫細胞内でシスプラチンに対する感受性を著しく増強させること、を示した。その他の腫瘍細胞系統についてその他のＰＰＩを用いて実施した実験は、匹敵する結果（データ示さず）を提供した。
【００８６】
オメプラゾールにより増強された５−フルオロウラシルに対するヒト腫瘍細胞の感受性
ＰＰＩが、あらゆる攻撃に対し抵抗するように腫瘍細胞が発生させた生理学的障壁に作用し細胞内及び／又は細胞外のｐＨを改変させる可能性を次に調査した。この実験においては、発明者らは、この機序が、弱塩基以外の化学療法薬に対する腫瘍耐性を復帰させる上でも有効であることを確認することを試みた。上述のものと同じ実験設計を適用して、発明者らは、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対する原発腫瘍細胞耐性の復帰に及ぼすオメプラゾールの効能をテストした。この薬物はウラシルの誘導体及び葉酸の類似体であり、弱酸性特性を示す。５ＦＵに対する細胞耐性に対するオメプラゾールの効果を、原発性病巣に由来しかつその５ＦＵ耐性のために選ばれた２４個のヒト黒色腫、２個のヒト結腸腺癌及び２個のヒト乳癌細胞系統について、５−ＦＵに対する細胞耐性に及ぼすオメプラゾールの効果をテストした。図４は、３つの代表的実験の結果を示す。５ＦＵ単独又はオメプラゾール及びその類似体の存在下での５ＦＵの５つの異なる対数希釈物で細胞を処置して用量応答曲線を得た（図示せず）。結果は明らかに、５−フルオロウラシル感受性がオメプラゾールでの細胞の前処置によって回復されることを示していた。その他のＰＰＩならびにその他の腫瘍細胞系統を用いても匹敵する結果が得られた（図示せず）。
【００８７】
ＭＤＲについて選択されたｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト細胞系統に対するオメプラゾールの効果
細胞ｐＨの改変が根本的な生理学的障壁としての多剤耐性の原因となる機序であり得るということを確認するため、発明者らは、薬物排出の原因である唯一のトランスポータとしてＰ−糖タンパク質を発現する、ＭＤＲ表現型のために選択されたｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞内のオメプラゾールの効果をテストした。特に発明者らは、最高１００ｎｇ／ｍｌまでの増大する濃度の硫酸ビンブラスチンを含有する培地内での親ヒトリンパ芽球腫状態４＋Ｔ細胞系統ＣＣＲＦ−ＣＥＭの選択によって得られるＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞に対するオメプラゾールの効果をテストした（図５）。ＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞はＰ−糖タンパク質を発現し、１００ｎｇ／ｍｌのビンブラスチン及びその他の関連する薬物に対する耐性を表示する。図５は、３つの代表的実験の結果を示している。単独で又はオメプラゾール及びその類似体の存在下で硫酸ビンブラスチンの５つの異なる対数希釈物でＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞を処置することによって用量応答曲線が得られた（図示せず）。結果は、オメプラゾールで細胞を前処置することで硫酸ビンブラスチン感受性が回復させられることを明白に示した。その他のＰＰＩを用いること（図示せず）ならびにＭＣＦ７親ヒト乳癌細胞系統の選択により得られたＭＣＦ７−ＤＸ細胞系統について同じ実験を実施すること（図示せず）によって、匹敵する結果が得られた。
【００８８】
実施例４
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物及びＰＰＩ
材料と方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内（ｉ．ｐ．）にシスプラチン（アベンティス、フランス）を投与した（ソン（Ｓｏｎ）及びホアン（Ｈｕａｎｇ）１９９４年）
【００８９】
その他：別段の規定のないかぎり、その他のパラメータは、上述の実施例１及び２に記されている通りである。
【００９０】
ヒト腫瘍細胞を植え込んだＳＣＩＤマウスの体内でｉｎ  ｖｉｖｏで査定される通りの化学療法剤のヒト腫瘍の感受性に対するオメプラゾールの効果。
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、ヒト腫瘍細胞系統における細胞毒性薬物に対する感受性を回復させる上でのオメプラゾール治療の直接的な効果を示した。しかしながら、発明者らはｉｎ  ｖｉｖｏ系での効能をテストすることを必要とした。この目的で、発明者らは、ヒト黒色腫細胞が皮下（ｓ．ｃ．）注射することによって植え込まれたＣＢ．１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスによって代表されるヒト／マウスモデル系についてオメプラゾール及びその類似体の効果をテストした。このモデルは、局所的又は全身的治療戦略のいずれかを用いて、ヒト腫瘍に対するさまざまな抗腫瘍療法の効能をｉｎ  ｖｉｖｏでテストするのに有用であることが証明された（ロゾポーン（Ｌｏｚｏｐｏｎｅ）２０００年、２００２年近刊）。ヒト腫瘍細胞が植え込まれたマウスを、（強制飼養により）オメプラゾールで、及び単一用量のシスプラチンで腹腔内で前処置した。処置の効果を異なる時点での腫瘍の成長に関して測定した。結果（図６）は、オメプラゾールでの前処置がシスプラチンに対する腫瘍の感受性を著しく増大させるのに対し、シスプラチン自体は腫瘍の成長に対し著しい効果を示さないことを示した。マウスをオメプラゾール類似体で前処置することで得られた結果は、オメプラゾールで示されたものに完全に匹敵する（図示せず）。ここでも又、実験を停止した後でのヒト腫瘍の組織学的検査は、オメプラゾール／シスプラチン処置を受けたマウス由来の腫瘍の中で、腫瘍質量が腫瘍サイズを大部分占める巨大な壊死部域により占有され（図示せず）、このことは細胞毒性効果がｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍サイズ測定によって定量化されたものよりも大きいことを示唆している、ということを示した。
【００９１】
治療戦略
シスプラチンといったような抗腫瘍薬での治療は、Ｖ−Ｈ＋−ＡＴＰアーゼの活性を増強させる可能性がある（ムラカミＴら、２００１年）。かくして、ＰＰＩ及びシスプラチンでの同時治療又はシスプラチンでの前処置は、ＰＰＩの復帰突然変異体効果を低減させる可能性がある。従って、発明者らは、ＰＰＩの復帰突然変異体効果の障害の主な原因となると考えられる有効でない組合せ治療を査定する目的で実験を実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、シスプラチン前処置（図示せず）及びオメプラゾール−シスプラチン同時治療の両方がヒト黒色腫細胞の生存率に対する任意の測定可能な効果を導かないということを明確に示した（図７Ａ）。これと一貫して、黒色腫担持ＳＣＩＤマウスのシスプラチン及びオメプラゾールでのｉｎ  ｖｉｖｏ同時治療は、腫瘍成長に対し有意な効果を全く示さなかった（図７Ｂ）。
【００９２】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのオメプラゾールの細胞毒性効果  図は、緩衝された（◆、中性、ｐＨ７．２）又は緩衝されていない（■、わずかに酸性）の培地の中でのオメプラゾールの４つの対数希釈物（ｘ軸；０μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）でヒト黒色腫細胞を治療して得た用量応答曲線を示す。結果は、オメプラゾールが、わずかに酸性の培地内で成長させられた腫瘍細胞についてのみ用量依存的に細胞毒性であることを明確に示した。図は、３つの独立した実験からの中央の結果を示している。誤差バー＝標準偏差。
【図２】：ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト腫瘍成長に対するオメプラゾールの効果。  図は、原発性病巣に由来するヒト黒色腫細胞系統が植え付けられたＣＢ．１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスに対する３つの代表的なｉｎ  ｖｉｖｏ実験の中央の結果を示す。腫瘍細胞が植え込まれたマウスを、強制飼養により矢印で示されているように４回処置する（■）か又は処置しなかった（◆）。腫瘍重量（ｍｇ）が時間の関数として表されている。腫瘍の成長を阻害する上でのオメプラゾールの直接的な効果に留意のこと。誤差バー＝標準偏差。  図３：シスプラチン耐性に対するオメプラゾールの効果  図は、シスプラチン単独の３つの対数希釈物（ｘ軸上に示されている通り）でヒト黒色腫細胞を処置して得られた（ＣＴＲライン）又はオメプラゾールでの２４時間の前処置の後に得られた（ＯＭライン）３つの（Ａ、Ｂ、Ｃ）代表的用量応答曲線を示す。対照（ＤＭＳＯライン）として、細胞をシスプラチンプラスＤＭＳＯで処置した。なおここでＤＭＳＯは、原液の中でオメプラゾールが中で可溶化された媒質である。ＤＭＳＯの最終濃度は、細胞のオメプラゾール処置の結果としてのものと同じ、すなわち０．０００８％であった。結果は、オメプラゾールがシスプラチン治療に対する耐性をもつヒト黒色腫細胞（ＣＴＲライン）上でシスプラチンに対する細胞感受性（ＯＭライン）をほぼ完全に回復することができることを明確に示した。
【図４】：５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）耐性に対するオメプラゾールの効果。  図は、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）単独の５つの対数希釈物（ｘ軸上に示されている通り）でヒト結腸腺癌（Ａ）又は黒色腫（Ｂ、Ｃ）細胞を処置して得られた（ＣＴＲライン）又はオメプラゾールで２４時間の前処置の後に得られた（ＯＭライン）３つの代表的用量応答曲線を示す。対照（ＤＭＳＯライン）として、細胞を５−ＦＵプラスＤＭＳＯで処置した。なおここでＤＭＳＯは、原液の中でオメプラゾールが中で可溶化されている媒質である。ＤＭＳＯの最終濃度は、細胞のオメプラゾール処置の結果としてのものと同じ、すなわち０．０００８％であった。結果は、オメプラゾールがシスプラチン治療に対する耐性をもつヒト腫瘍細胞系統（ＣＴＲライン）上で５−ＦＵに対する細胞感受性（ＯＭライン）をほぼ完全に回復することができることを明確に示した。
【図５】：多剤耐性細胞を発現するＰ−ｇｐに対するオメプラゾールの効果  図は、硫酸ビンブラスチン（ＶＢＬ）単独の５つの対数希釈物（ｘ軸上に示されている通り）でＣＥＭ−ＶＢＬ１００細胞を処置して得られた（ＣＴＲライン）又はオメプラゾールでの２４時間の前処置の後に得られた（ＯＭライン）１つの代表的用量応答曲線を示す。対照（ＤＭＳＯライン）として、細胞をＶＢＬプラスＤＭＳＯで処置した。なおここでＤＭＳＯは、原液の中でオメプラゾールが中で可溶化された媒質である。ＤＭＳＯの最終濃度は、細胞のオメプラゾール処置の結果としてのものと同じ、すなわち０．０００８％であった。結果は、オメプラゾールがシスプラチン治療に対する耐性をもつヒト−腫瘍細胞（ＣＴＲライン）上でＶＢＬに対する細胞感受性（ＯＭライン）をほぼ完全に回復することができることを明確に示した。
【図６】：ヒト／ＳＣＩＤマウスモデルにおける腫瘍成長に対するオメプラゾールのｉｎ  ｖｉｖｏ効果  ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、皮下注射を介して黒色腫細胞系統を植え込んだ。腫瘍の出現時点で、マウスを未処置のまま放置する（ＣＴＲライン）か又はオメプラゾール（一日目に１回の単一の強制飼養、重、下矢印）及びシスプラチン（２日目に腹腔内に１回の単一処置、比較的軽い、上向き矢印）ＯＭ−ＣＰＬライン又はシスプラチン単独（ＣＰＬライン）で処置した。グラフは、時間の一関数としてのｍｇ重量（材料と方法を参照のこと）として表現した。腫瘍成長を表わしている。結果は、単独で投与された場合ほぼ効果がなかった（ＣＰＬライン）シスプラチンに対する腫瘍の感受性をオメプラゾールが著しく増強させる（ＯＭ−ＣＰＬライン）ことを明確に示した。
【図７】：治療戦略  （Ａ）同時に投与されたシスプラチンの３つの対数希釈物（ｏｍ／ｃｐｌ）に対する、又は原発性病巣に由来する代表的ヒト黒色腫細胞系統の（ｏｍ＋ｃｐｌ）オメプラゾール処置の後の用量応答曲線。結果（３つの独立した実験からの平均）は、オメプラゾールでの黒色腫細胞の前処置だけがシスプラチン耐性を復帰させることができるということを示した。グラフは薬物濃度（ｘ軸：０μＭ、０．５μＭ、５μＭ、５０μＭ）の関数として死滅細胞の百分率を示す。誤差バー＝標準偏差。  （Ｂ）図は、原発性病巣に由来するヒト黒色腫細胞系統が植え込まれたＣＢ、１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄマウスについての３つの代表的ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の平均結果を示す。腫瘍細胞が植え込まれたマウスを、シスプラチン単独で（ｃｐｌ）、オメプラゾール前処置の後（ｏｍ＋ｃｐｌライン）、オメプラゾール処置と同時に（ｏｍ／ｃｐｌライン）処置するか又は未処置のまま放置した（ｃｔｒ）。腫瘍の重量（ｍｇ）が時間の関数として表わされている。ＳＣＩＤマウスの体内に植え込まれたヒト黒色腫細胞のシステイン耐性を復帰させる上でのオメプラゾール前処理の直接的効果は注目すべきものであり、一方、シスプラチン／オメプラゾールの同時治療は、いかなる阻害薬物耐性も誘発しなかった。誤差バー＝標準偏差。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年10月23日(2006.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃癌以外の癌性状態の治療又は予防のための経口投与薬剤であって、制酸剤を含む薬剤の製造におけるプロトンポンプ阻害剤の使用。
【請求項２】
前記状態が腫瘍である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記腫瘍が転移性である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記プロトンポンプ阻害剤が２−ピリジルメチルスルフィニルベンズイミダゾールプロトンポンプ阻害剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記プロトンポンプ阻害剤がオメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾール、エソメプラゾール、ラベプラゾール、及びそれらの混合物から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤が、経口投与用であり、患者の胃内におけるＰＰＩの完全な隔離を防止するために充分な制酸剤での治療を受けた患者の治療用である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記制酸剤が前記プロトンポンプ阻害剤に先立って投与されるように処方される、請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
前記制酸剤が炭酸カルシウムである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記制酸剤がＨ２受容体拮抗薬である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
胃の疾病を除く疾病状態の併用療法又は予防のための薬剤の製造におけるプロトンポンプ阻害剤の使用であって、前記プロトンポンプ阻害剤が、前記状態に対して処方される少なくとも１つの別の薬物に先行して投与される、使用。
【請求項１１】
前記状態の部位に関連する酸性度を低減させるのに充分なほど、前記プロトンポンプ阻害剤の投与を前記別の薬物の投与に先行して行う、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記別の薬物の投与に先行する時間が３０分から３日の間である、請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記別の薬物が、ビンカアルカロイド；タキサン；アントラサイクリン；アントラセン；エピポドフィロトキシン；カンプトテシン；重金属オキシアニオン；アクチノマイシンｄ；マイトマイシンｃ；メトトレキセート；トリメトレキセート；アムサクリン；イミチニブ；及びメルファラン；５−フルオロウラシル；及びシスプラチンから選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
前記疾病状態が前記別の薬物に対する耐性をもち、前記プロトンポンプ阻害剤は、前記別の薬物のレベルが臨床的に有効量に満たない時に投与するためのものである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記疾病状態が癌性状態である、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記状態が腫瘍である、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記腫瘍が転移性である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記疾病状態がＡＩＤＳ、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、又はそれらの組合せから選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１９】
前記状態がＡＩＤＳであり、前記別の薬物がＨＡＡＲＴ薬である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記プロトンポンプ阻害剤が２−ピリジルメチルスルフィニルベンズイミダゾールプロトンポンプ阻害剤である、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
前記プロトンポンプ阻害剤がオメプラゾール、ランソプラゾール、パントプラゾール、エソメプラゾール、ラベプラゾール、及びそれらの混合物から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
さらに制酸剤を含む、請求項１０〜２１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２３】
前記プロトンポンプ阻害剤がオメプラゾールである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２４】
前記薬剤が前記状態の治療用である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【国際調査報告】
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