(57)【要約】  L-1（LINE-1）によってコードされる逆転写酵素は、この分子によって誘導又は仲介される癌を治療又は予防するための標的分子として同定されている。患者における上記癌を治療又は予防する方法は、患者の細胞中の逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストを有する組成物の治療上の有効量を投与することを含む。この阻害剤又はアンタゴニストはテロメラーゼ陰性細胞におけるテロメアの延長を阻止する。L1RTを発現する病理学的増殖細胞を検出するための方法及びキットも開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌に罹患した個体を治療する方法であって、該個体の細胞中のL-1（LINE-1）レトロトランスポゾンによってコードされる逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストを含む組成物の治療上の有効量を該個体に投与することを含み、その際、該阻害剤又はアンタゴニストがテロメラーゼ陰性細胞中でテロメアの延長を阻止する、上記方法。
【請求項２】
逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストが、アンチセンス配列、無機化合物、有機化合物、ペプチド又は小分子を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
アンチセンス配列が逆転写酵素をコードする核酸とハイブリダイズ可能である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
逆転写酵素をコードする核酸がそのDNAから転写されたRNAを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
アンチセンス配列がキメラRNA-DNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
有機化合物がヌクレオシド類似体である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
有機化合物が、3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T）、ガンシクロビル若しくはバルガンシクロビル、又はこれらの組合せである、ヌクレオシド類似体である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
組成物を経口的に、非経口的に、皮下に、筋肉内に、血管内に又は局所的に投与する、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトの細胞中のL-1(LINE-1)レトロトランスポゾンにコードされる逆転写酵素によって誘導又は仲介されるテロメアの代替的な延長を示す細胞に起因しているヒトの癌を治療する方法であって、1以上のヌクレオシド類似体又はその製薬上許容される塩を含む組成物の治療上の有効量をこの癌に罹患しているヒトに投与することを含む、上記方法。
【請求項１１】
前記ヌクレオシド類似体が、3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T）、ガンシクロビル及びバルガンシクロビルよりなる群から少なくとも1つ選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫である、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
組成物を経口的に、非経口的に、皮下に、筋肉内に又は血管内に投与する、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
2以上の前記ヌクレオシド類似体を含む組成物を投与する、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヌクレオシド類似体の1つを、1日当たり体重1kgにつき約10mg〜約100mgで投与する、請求項10に記載の方法。
【請求項１６】
テロメラーゼ陰性腫瘍細胞におけるテロメアの延長を干渉する方法であって、該細胞中のL-1（LINE-1）レトロトランスポゾンによってコードされる逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストの有効量を該細胞に投与することを含む、上記方法。
【請求項１７】
逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストがアンチセンス配列、無機化合物、有機化合物、ペプチド又は小分子を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
アンチセンス配列が逆転写酵素をコードする核酸とハイブリダイズ可能である、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
逆転写酵素をコードする核酸がDNA、このDNAから転写されるRNA、又はこのRNAから逆転写されるcDNAを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
アンチセンス配列がキメラRNA-DNAオリゴヌクレオチドを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項２１】
有機化合物がヌクレオシド類似体である、請求項16に記載の方法。
【請求項２２】
有機化合物が、3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T）、ガンシクロビル若しくはバルガンシクロビル、又はこれらの組合せである、ヌクレオシド類似体である、請求項16に記載の方法。
【請求項２３】
癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫である、請求項16に記載の方法。
【請求項２４】
テロメラーゼ陰性細胞の増殖を妨害又は阻害する方法であって、該細胞をヌクレオシド類似体と接触させること、又はL1RT酵素をコードするのに必要な核酸の部分配列に実質的に又は完全に相補的なヒトL1RTアンチセンス配列を発現可能な構築物で該細胞をトランスフェクトすることを含む、上記方法。
【請求項２５】
細胞を0.2μMの濃度でヌクレオシド類似体と接触させる、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
核酸がmRNAである、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
核酸がヒトL1RTオープンリーディングフレームである、請求項24に記載の方法。
【請求項２８】
核酸が配列番号を含むタンパク質をコードする、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ヌクレオシド類似体が3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）である、請求項24に記載の方法。
【請求項３０】
アンチセンス配列がDNAオリゴヌクレオチド、2'-O メチルオリゴヌクレオチド、ペプチド核酸オリゴヌクレオチド又はホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、請求項24に記載の方法。
【請求項３１】
アンチセンスL1RT核酸が配列番号1を含むヌクレオチド配列を有する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
アンチセンス配列が約8〜約50ヌクレオチドの長さである、請求項24に記載の方法。
【請求項３３】
アンチセンス配列が約15〜約25ヌクレオチドの長さである、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
細胞を前記核酸の異なる部分配列と完全に相補的な2以上のアンチセンス配列と接触させる、請求項24に記載の方法。
【請求項３５】
アンチセンス配列がリボザイムの一部である、請求項24に記載の方法。
【請求項３６】
テロメラーゼ陰性細胞が、骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫よりなる群から選択される癌細胞である、請求項24に記載の方法。
【請求項３７】
L1RT転写を実行する能力のある系中のL1RT活性を干渉する方法であって、該系中のL1RT活性を干渉するのに有効な量のヌクレオシド類似体又はアンチセンス化合物を該系に与えることを含み、ここで、該系がin vitro又はin vivo細胞増殖系である、上記方法。
【請求項３８】
ヌクレオシド類似体が、3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T）、ガンシクロビル若しくはバルガンシクロビル、又はこれらの組合せである、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
癌予防を必要とする者における癌の予防方法であって、ここで、この癌はその者の細胞中のL-1（LINE-1）レトロトランスポゾンにコードされる逆転写酵素によって誘導又は仲介されるテロメアの代替的延長を示す細胞に起因しており、1以上のヌクレオシド類似体又はその製薬上許容される塩を含む組成物の治療上の有効量をその者に投与することを含む、上記方法。
【請求項４０】
前記癌が骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌及び黒色腫よりなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
細胞中のL-1（LINE-1）レトロトランスポゾン活性を干渉することが可能な核酸セグメントをコードすることが可能なポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項４２】
核酸セグメントが配列番号1を含む、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
請求項41に記載の組成物を含む単離された宿主細胞。
【請求項４４】
細胞がヒト細胞である、請求項41に記載の単離された細胞。
【請求項４５】
細胞が癌細胞である、請求項41に記載の単離された細胞。
【請求項４６】
テロメラーゼ陰性癌細胞中のテロメアを短縮可能な化合物を選別する方法であって、
試験化合物を該細胞に投与すること、
試験化合物の抗L-1（LINE-1）レトロトランスポゾン活性を評価するか、又は化合物が前記細胞中のL-1レトロトランスポゾンによってコードされる逆転写酵素の発現をダウンレギュレートするか否かを評価すること、及び
逆転写酵素の発現をダウンレギュレートする抗L-1レトロトランスポゾン活性を示す化合物を選別すること、
を含む上記方法。
【請求項４７】
評価ステップが前記細胞におけるテロメアの短縮若しくはG2期停止、又は前記細胞のアポトーシスについて試験することを含む、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がin vitroで培養した細胞又は非ヒト動物モデルのいずれかである、請求項46に記載の方法。
【請求項４９】
動物モデルがマウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ、サル及びテンジクネズミよりなる群から選択される、請求項46に記載の方法。
【請求項５０】
テロメラーゼ陰性である細胞サンプルにおいて癌性細胞の存在を検出する方法であって、
該サンプルをL-1（LINE-1）レトロトランスポゾンによってコードされる逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストと接触させること、及び
該細胞におけるテロメアの短縮若しくはG2期停止を示す細胞、又は該細胞のアポトーシスについて試験すること、
を含む上記方法。
【請求項５１】
哺乳動物の組織中で病理学的に増殖可能な細胞を検出する方法であって、
組織から細胞サンプルを取得すること、
細胞サンプルを、L1RT mRNAの部分配列と実質的に相補的な若しくは完全に相補的な核酸プローブと、又はL1RT逆転写酵素に特異的な抗体と、接触させること、及び
該細胞中のL1RT発現を検出すること、
を含む上記方法。
【請求項５２】
核酸プローブが検出可能な部分を含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
検出可能な部分が放射性同位体、蛍光分子、ビオチン又はジゴキシゲニンである、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
核酸プローブが、5'-CCA GAG ATT CTG GTA TGT GGT GTC TTT GTT-3'(配列番号2)、5'-CTT TCT CTT GTA GGC ATT TAG TGC TAT AAA-3'(配列番号3)、5'-CTC TTG CTT TTC TAG TTC TTT TAA TTG TGA-3'(配列番号4)、5'-CTT CAG TTC TGC TCT GAT TTT AGT TAT TTC-3'(配列番号5)及び5'-TCC TGC TTT CTC TTG TAG GCA-3'(配列番号6)よりなる群から選択される配列を含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５５】
L-1（LINE-1）レトロトランスポゾンを発現する単離された細胞又は組織においてL-1（LINE-1）レトロトランスポゾンのポリメラーゼ活性を阻害するか又はアポトーシスを誘導する方法であって、ポリメラーゼ活性を阻害するために、該細胞又は組織を少なくとも1つのヌクレオシド類似体若しくはアンチセンス配列又はその両方と接触させることを含む、上記方法。
【請求項５６】
前記ヌクレオシド類似体が、3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T）、ガンシクロビル若しくはバルガンシクロビル、又はこれらの組合せである、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
アンチセンス配列が、5'-CCA GAG ATT CTG GTA TGT GGT GTC TTT GTT-3'(配列番号2)、5'-CTT TCT CTT GTA GGC ATT TAG TGC TAT AAA-3'(配列番号3)、5'-CTC TTG CTT TTC TAG TTC TTT TAA TTG TGA-3'(配列番号4)、5'-CTT CAG TTC TGC TCT GAT TTT AGT TAT TTC-3'(配列番号5)及び5'-TCC TGC TTT CTC TTG TAG GCA-3'(配列番号6)よりなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
【請求項５８】
L1RT mRNAの部分配列と実質的に又は完全に相補的な核酸プローブを含む、病理学的増殖細胞を検出するためのキット。
【請求項５９】
核酸プローブが検出可能な部分を含む、請求項58に記載のキット。
【請求項６０】
検出可能な部分が放射性同位体、蛍光分子、ビオチン又はジゴキシゲニンである、請求項59に記載のキット。
【請求項６１】
核酸プローブが、5'-CCA GAG ATT CTG GTA TGT GGT GTC TTT GTT-3'(配列番号2)、5'-CTT TCT CTT GTA GGC ATT TAG TGC TAT AAA-3'(配列番号3)、5'-CTC TTG CTT TTC TAG TTC TTT TAA TTG TGA-3'(配列番号4)、5'-CTT CAG TTC TGC TCT GAT TTT AGT TAT TTC-3'(配列番号5)及び5'-TCC TGC TTT CTC TTG TAG GCA-3'(配列番号6)よりなる群から選択される配列を含む、請求項58に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は米国仮出願第60/440,988号（出願日2003年1月15日）の利益を主張する、先行出願第10/758,329号（出願日2004年1月15日）の一部継続出願であり、出願第10/758,329号及び60/440,988号の本文はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
発明の分野
本発明は癌療法の分野に関する。具体的には、そのモジュレーションによりテロメラーゼ陰性癌細胞におけるテロメアの伸長を調節する標的分子が同定されている。より詳細には、ヒトL1（Line-1）レトロトランスポゾンにコードされる逆転写酵素（L1RT）を干渉する様々な阻害剤化合物の、L1RTに誘導される癌を治療又は予防するための使用に関する。本発明はまた、L1RTに仲介される増殖性疾患を治療するのに有用であり得る薬理活性化合物を同定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
リーディング及びラギングDNA鎖の合成における非対称性は、線状ゲノムの複製に関して「末端の問題」を生じる8。これを克服するために、真核生物の染色体は、TTAGGG反復からなるテロメアという特殊化した末端構造を有する9。テロメラーゼはテロメアを伸長し、それによって細胞倍化中に大部分の癌細胞の染色体安定性を維持するリボヌクレオタンパク質酵素である。細胞倍化中にテロメアの末端からのDNAの漸進的消失は、体細胞の細胞増殖能の制御に関与している10。
【０００４】
正常な培養ヒト細胞は培養下での複製能が制限されている。培養下での正常な細胞は、集団の増殖が中断する離散点に達するまで複製する。これはM1期と称され、少数のテロメアの、細胞老化と呼ばれる増殖の停止に導くサイズへの短縮によって生じる。M1期はp53及びpRBヒト腫瘍抑制遺伝子の機能の阻害によってin vitroで回避することができる。次いで、この細胞はテロメアが決定的に短縮されたものとなるまで増殖することができ、これによりM2又は危機期を生じる。M2期での増殖の停止は細胞増殖率と細胞死率との間のバランスによって生じる。M2期では、大部分のテロメアが極端に短い場合に、終端融合及び染色体切断融合が著しい染色体異常及びアポトーシスを引き起こす。稀な状況下で、細胞はM2を免れ、そのテロメアの長さを安定化することによって不死となることができる。これは酵素テロメラーゼの活性化又はテロメア延長の代替的機構（ALT）を介して生じる。
【０００５】
ヒト生殖細胞系2及び大部分の癌細胞3はテロメラーゼを発現する。テロメラーゼはテロメアを伸長し、それによって細胞倍化中に大部分の癌細胞の染色体安定性を維持するリボヌクレオタンパク質酵素である。実際、テロメラーゼによる短縮テロメアの伸長はヒト癌細胞におけるテロメアの維持の主要な機構である。テロメラーゼの阻害剤はヒトテロメラーゼ陽性細胞11の増殖をテロメア長を減少させることによって制限し、これらの化合物はこれらの癌細胞の増殖能を減退させる。逆転写酵素阻害剤は癌を治療するために既に使用されている。in vitro試験において、逆転写酵素阻害剤で処理された腫瘍細胞は14日後にアポトーシスを起こした。
【０００６】
テロメラーゼによる短縮したテロメアの伸長は、ヒト癌細胞におけるテロメア維持の周知の機構である。しかし、最大30％の異なる型のヒト腫瘍はテロメラーゼを発現しない。ALTの存在は、異なる型のヒト腫瘍、腫瘍誘導型細胞系及びin vitroで不死化したヒト細胞系の最大30％で4,5,12,13、並びに腫瘍及び不死化した細胞系のいくつかのサブセット中の最大50％14で報告された。
【０００７】
現在のところ、テロメラーゼ陽性細胞由来の癌を選択的に治療することを目的とする戦略は、アンチセンス戦略、ドミナントネガティブ突然変異体又は薬剤（Bisoffiら, Eur J Cancer, 1998, 34: 1242-1249; Rothら, Leukemia, 2003, 17: 2410-2417; Dammら, EMBO J., 2001, 20: 6958-6968; 米国特許第6,294,332号、6,194,206号、6,156,763号及び6,046,307号）による、テロメアのTERT機能又は長さのモジュレーションを含む。テロメラーゼ陰性癌細胞の選択的モジュレーション（すなわち、選択的阻害又は促進）はまた、係る細胞におけるテロメアの延長に関与する標的分子が公知である場合に可能であり得る。したがって、テロメラーゼ陰性細胞におけるテロメアの延長に関与する標的分子を同定するニーズ、及びテロメラーゼを発現しないヒト腫瘍型も予防又は治療し得るように、同定された標的分子を選択的に干渉するための作用物質を同定するニーズが存在する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
現在では、L1（LINE-1）レトロトランスポゾン逆転写酵素核酸の産物が特定の癌細胞中のテロメアの延長及びそれによるテロメアの維持と関連することがわかっている。具体的には、L1レトロトランスポゾンによってコードされる逆転写酵素の発現の干渉により、癌細胞中のテロメアの伸長を抑制することが見出された。より具体的には、テロメラーゼ陰性細胞中のL1逆転写酵素の発現の干渉が、テロメアの短縮、細胞周期停止及びアポトーシス又は細胞死等の表現型発現を導くことを見出した。逆転写酵素が、おそらくはテロメアDNA合成及び/又はテロメア末端標的化L1トランスポゾンレトロ転移の「ずれ(slippage)」機構によって、テロメアの維持に関与していると考えられる。
【０００９】
さらにより具体的には、逆転写酵素阻害剤3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）によるテロメラーゼ陰性細胞（ALT細胞）の処置、又はアンチセンス戦略を用いたL1逆転写酵素（L1RT）の抑制により、進行性のテロメア消失、G2期停止、染色体異常及びその結果生じる細胞死を誘導することが見出された。
【００１０】
したがって、本発明の一実施形態では、L1RTの発現及び/又はテロメラーゼ発現の欠如によって特徴付けられる腫瘍の治療方法が提供される。L1RT発現又は活性の干渉は、直接的に細胞死を生じるか又は最終的にアポトーシスを介して細胞を死滅させる化学療法薬の効果を増強するだろう。特に、本発明は細胞数の継続的な増加の可能性を有するL1RT発現細胞の増殖を、L1RTの阻害剤及びアンタゴニストを投与することによって阻害する方法を提供する。例えば、L1RT発現は、アンチセンス配向で発現されるようにプロモーターと機能的に連結したcDNA配列（該cDNAはL1RT配列の全て又は一部を有する）を有するDNA分子を取得すること、及び非制御増殖の可能性を有するL1RT細胞にこのDNA分子をトランスフェクトすることによって抑制又はダウンレギュレートすることができる。阻害剤又はアンタゴニストは、場合により製薬上許容される担体と共に投与される。
【００１１】
本発明の別の実施形態では、癌の予防を必要とする者（例えばヒト）における癌の予防方法が提供される。この癌は、ヒトにおける、その者の細胞中のL-1（LINE-1）レトロトランスポゾンにコードされる逆転写酵素によって誘導又は仲介されるテロメアの代替的延長を示す細胞の存在に起因する。細胞中のテロメアの延長は人体中の係る細胞の継続的増殖の可能性を誘導する。この予防方法は治療上有効量の組成物をその者に投与することを含む。この組成物は逆転写酵素の阻害剤又はアンタゴニストを含む。この阻害剤又はアンタゴニストはテロメラーゼ陰性細胞でテロメアの延長を阻止し、それによってL1RT発現細胞の増殖を阻害する。阻害剤が1以上のヌクレオシド類似体、又は係る類似体の製薬上許容される塩であることが好ましい。液体又は固体食品原料は阻害剤又はアンタゴニストで富化される。食品は、例えばヒトによる消費に適したバター、マーガリン、ビスケット、パン、ケーキ、キャンディ、菓子類、ヨーグルト若しくは他の醗酵乳製品又はシリアルの形態の機能性食品であり得る。あるいは、これは栄養補助食品、栄養素、医薬食品、栄養補給食品、健康食品及び/又はデザイナー食品であり得る。定期的に、ヒトはALT細胞の存在について試験される。阻害剤又はアンタゴニストの使用はALT細胞が検出されなくなった時点で停止し得る。
【００１２】
本発明の別の実施形態では、腫瘍細胞の蓄積速度を減少させる可能性を有する薬剤を選別するために、L1RTを発現する細胞を候補薬剤と共にインキュベートするか又は該薬剤で処理すること、及び該細胞に対して有し得る候補薬剤の1以上の所望の生物学的効果をモニターすることによって、候補薬剤又は化合物をスクリーニングする方法が提供される。候補薬剤が所望の生物学的効果を引き起こす場合、薬剤が選別される。係るスクリーニングにおける特に好適な生物学的効果には、進行性のテロメア消失、G2期停止、染色体異常又は癌細胞死が含まれる。生物学的効果には、様々な腫瘍遺伝子（例えばras等）で形質転換されたテロメラーゼ陰性細胞の増殖の阻害も含まれ得る。
【００１３】
本発明は、L1RTを発現する病理学的増殖細胞を検出するための方法及びキットをさらに提供する。本発明のこれらの及び別の実施形態は下記でより詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、LINE-1（L1）レトロトランスポゾンにコードされる逆転写酵素（L1RT）が特定のヒト癌細胞におけるテロメアの延長に関与することを開示する。具体的に本発明は、L1RTが、特定の腫瘍組織（テロメラーゼ陰性腫瘍及び腫瘍誘導型細胞系を含む）におけるテロメアの延長に関与すること、及び腫瘍細胞の増殖性を制御するための若しくはこれらの細胞のアポトーシスを誘導するための標的として、L1RT酵素又はそれをコードする配列を同定することを開示する。
【００１５】
テロメラーゼ陰性腫瘍及び腫瘍誘導型細胞系は、内因性テロメラーゼを発現しないか若しくは有さず、かつ依然としてテロメアの延長（本明細書でテロメアの代替的な延長（ALT）としても称される）を示すものである。細胞におけるL1RT仲介型のテロメア延長は、テロメラーゼにより仲介されるテロメア延長に対して長くかつ不均一なテロメアの存在によって特徴付けることができる。当業者は、例えばTRFアッセイ（Bryanら, 1997, Nature Medicine, 3: 1271-1274参照）を実施することによって、細胞におけるALTの長くかつ不均一なテロメア特性の存在をどのように決定するかを知るだろう。
【００１６】
L1レトロトランスポゾンのORF2によってコードされるL1逆転写酵素は既に特徴付けられており、その核酸及びタンパク質配列は当該技術分野で公知である（GeneBank GI: 5070620;  Ostertagら, 2000, Determination of L1 retrotransposition kinetics in cultured cells, Nucleic Acids Res. 28, 1418-1423; Kimberlandら, 1999, Full-length human L1 insertions retain the capacity for high frequency retrotransposition in cultured cells, Hum. Mol. Genet. 8 (8), 1557-1560）。本発明で、L1RTがテロメラーゼ陰性細胞において染色体にテロメアDNA反復を添加することが見出された。
【００１７】
したがって、本発明の一態様では、動物において不適切に若しくは病理学的に増殖する細胞又は不死化細胞の存在によって引き起こされる疾患を予防又は治療するための方法が提供される。不適切に若しくは病理学的に増殖する細胞又は不死化細胞は、細胞の正常な調節機構とは独立に存在しかつ複製する。これらの細胞は、細胞要素（すなわちL1RT）の活性の結果として正常な細胞から逸脱するため病的である。もちろん本明細書で使用される不適切に増殖する細胞は良性過剰増殖細胞であり得るが、特に記述がない限りこれらの細胞は、癌細胞（典型的には例えば骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫）等の悪性過剰増殖細胞を指す。
【００１８】
特に、L1RTを発現するものとして特徴付けられるヒト腫瘍を予防又は治療する方法が提供される。本発明による疾患の予防又は治療は、L1RTの阻害剤又はアンタゴニストの利用によって達成される。本発明で使用される阻害剤又はアンタゴニストは、L1RTと直接的に若しくは間接的に相互作用してその発現(又は活性)を阻害するもの、及び/又はテロメアに組み込まれることにより、機能的なL1RTに関らずテロメアの更なる伸長を防止してL1RTを発現する細胞の増殖を阻害するものである。したがって、L1RTの阻害剤又はアンタゴニストは細胞の増殖を阻害するために使用される。例えば、L1RTの阻害剤又はアンタゴニストが患者に投与される際、これらは進行性のテロメア短縮、細胞の細胞周期停止及び/又はL1RTを発現する細胞の大量のアポトーシスを引き起こす。本発明において、「増殖を阻害する」又は「増殖の阻害」は細胞分裂の低減又は防止をも意味し得る。本発明において、L1RTを発現する細胞の増殖の阻害は、約100％未満（0％ではない）であり得る。例えば阻害は、対照細胞（対照細胞はL1RTを発現するが阻害剤又はアンタゴニストで処理されていない）のものと比較して、約10％〜約100％、好ましくは少なくとも約25％、そしてより好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約90％、95％又は正確には100％であり得る。増殖の阻害は当該技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、生体染色と共にインキュベートした後に測定される処理サンプル中の生存細胞数を対照サンプル中の生存細胞数と比較することができる。さらに、増殖阻害は細胞増殖の低減をin vitro又はin vivoで検出することができるアッセイ（トリチウム化水素組込みアッセイ、BdU組込みアッセイ、MTTアッセイ、細胞増殖巣形成能の変化、足場依存性若しくは不死化の減少、腫瘍特異的マーカーの減少、及び/又は動物宿主に注入した際に腫瘍形成又は抑制の不能性（Dorafsharら, 2003, J Surg Res.,114:179-186; Yangら, 2004, Acta Pharmacol Sin., 25:68-75）等）によって測定することができる。
【００１９】
単一の不死化細胞又は少数の係る細胞からの癌性腫瘍の発達には、ヒトでは数ヶ月から数年掛るかもしれない。しかし、本発明を実施することによって、L1RT阻害剤で処理した発癌性ALT細胞の能力は腫瘍に成長する機会を得る前にその増殖可能性を失うため、癌を予防することができる。さらに、癌の臨床症状前に腫瘍の進行を停止するための、リスクのある群へのL1RT阻害剤又はアンタゴニストの定期的な予防的投与は、潜在的に新たな癌症例の割合を有意に減少することができた。
【００２０】
本発明で使用されるL1RTの阻害剤又はアンタゴニストは、無機化合物、有機化合物、アンチセンス配列、L1RT mRNAの規定の標的領域に対応する二本鎖RNA（dsRNA）、L1RTタンパク質のドミナントネガティブ突然変異体、抗体又は小分子であり得る。
【００２１】
本発明の一実施形態では、例えばヌクレオシド類似体等の有機化合物がL1RTの阻害剤又はアンタゴニストとして使用される。したがって、L1RTを標的化するための手法の1つは、癌患者にヌクレオシド類似体を投与することによる。ヌクレオシド類似体は、L1RTによって使用されるテロメラーゼ陰性細胞で染色体末端を伸長するための構築ブロックを模倣することができる。L1RTによって染色体末端に組み込まれるこれらの偽の構築ブロック（すなわち、ヌクレオシド類似体）は、テロメアの機能を干渉し、その結果、テロメアの短縮、細胞周期停止及び細胞死に寄与し得る。
【００２２】
当業者に公知の多くのヌクレオシド類似体が存在する。実際に、ヌクレオシド類似体は既知のクラスの抗レトロウイルス薬であり、多くのヌクレオシド類似体薬剤がHIV感染したヒトの治療について承認されている。これらの薬剤は、HIVの遺伝物質（RNA）からDNA形態への複製を干渉することによって、HIVの増殖を停止する。本発明に使用し得るヌクレオシド類似体の例は、3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）、2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T）、アシクロビル、ガンシクロビルである。これらのヌクレオシド類似体の前駆体（又はプロドラッグ）(例えば、バルガンシクロビル)も使用することができる。
【００２３】
L1RTはテロメラーゼ陰性細胞の癌における鍵となる因子であり、この鍵酵素の活性の非競合阻害剤における本知見は、癌の研究及び治療における潜在的な躍進を表す。ヌクレオシド類似体（例えば、AZT及びガンシクロビル）が広く受け入れられたモデル系（下記に記載）におけるALT癌を明らかに阻止することを証明することにより、本発明が本当に劇的な躍進を表すことを裏付ける。有利な使用が本発明によって可能になるとの示唆はなされないが、AIDS患者へのAZTの事前投与は、AZTを癌患者に容易に投与することができることを意味する。
【００２４】
実際に、ヌクレオシド類似体は、癌療法の手段として、癌細胞のテロメラーゼ活性を正常な細胞に見られるものと近似するレベルまで改変することに使用されてきた。しかし、L1RTを阻害するために必要なヌクレオシド類似体の濃度は、テロメラーゼを阻害するために必要な濃度の数分の１であり得る。例えば、L1RT活性を阻害するために必要なAZTの濃度は、テロメラーゼ活性を阻害するために必要な濃度よりも桁違いに低いもの（例えば、10〜1000分の１）であり得る。かかる低レベルのヌクレオシド類似体に対するL1RTの感度は非常に意外であり、今やこの意外な知見がL1RT特異的な癌の治療のための、有利な療法の手段を提供する。重要なことは、本発明が別の状況では癌患者に使用し得るレベルよりも有意に低い有効量の選択を提供することである。本発明の研究は、AZTが200μM〜800μMというよりむしろ、ナノモルの薬剤レベルで癌に有用であろうことを示す。
【００２５】
さらに、AIDS患者へのヌクレオシド類似体の現在の使用は、HIV療法に非常に低用量のAZTを使用する能力を加味して、L1RTに誘導及び/又は仲介される癌の治療におけるAZTの使用について迅速に規制認可されるべきである。さらに本発明は、L1RTに誘導及び/又は仲介される癌を治療するためのAZTの使用に限定されない。実際、L1RT阻害剤の使用は、L1RTが因子である他の疾患の範囲まで広く適用可能である。これらには例えば、血友病Aを誘導する血液因子VIIIの遺伝子、X連鎖性網膜色素変性2、ジストロフィン遺伝子、X連鎖性拡張型心筋症を生じるDMD遺伝子、及び慢性肉芽腫症を引き起こすX連鎖性遺伝子CYBB、中のL1誘導型突然変異が含まれる（Woods-Samuelsら, 1989, Genomics, 4: 290-296;  Schwahnら, 1998, Nat. Genet., 19: 327-332; Holmesら, 1994, Nat Genet., 7: 143-148; Yoshidaら, 1998, Hum Mol Genet., 7: 1129-1132; Brouhaら, 2002, Am J Hum Genet., 71:327-336）。
【００２６】
ヌクレオシド化合物は、単独又は異なる類似体の組合せのいずれかで、及び任意の投与経路（経口投与を含む）によって投与し得る。AZT及びガンシクロビル若しくはそのプロドラッグであるバルガンシクロビルは好適なヌクレオシド類似体である。AZTは市販されており、AZT製剤は多くの米国特許に記載されている（例えば、米国特許第5,683,990号参照）。ALTを有する細胞は、これらの細胞はテロメアの伸長又は維持に関してL1RTに依存しており、かつテロメアの伸長又は維持にはヌクレオシド及び/又はその類似体の組込みが必要であるため、選択的に標的化されるだろう。抗癌作用を発揮するために、特異的な任意の標的化剤が類似体の送達に所望である範囲で、標的化AZT及び/又は他の類似体の使用が本明細書で意図される。したがって、一部の実施形態では、医薬組成物は活性化合物を有してもよく、この場合、特定の標的細胞又は細胞内の核部分に特異的に送達するための標的化剤（例えばペプチド）とコンジュゲートされているAZT又は他のヌクレオシド類似体を有してもよい。
【００２７】
本発明の別の態様では、本明細書でアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドとしても称されるアンチセンス配列は、L1RTの阻害剤又はアンタゴニストとして使用される。本発明におけるアンチセンス配列は、L1RTをコードする核酸に実質的に又は完全に相補的である。アンチセンス配列の相補性（完全に相補的であっても実質的に相補的であっても）は、これらが標的核酸配列と特異的にハイブリダイズし、L1RT機能、発現又はその他を干渉し、かつその干渉が細胞の増殖を阻害するのに十分であるものである。
【００２８】
L1RTをコードする核酸はDNA、係るDNAから転写されるRNA又は該RNAのcDNAであり得る。様々な哺乳動物（マウス、サル及びヒト等）のL1核酸及びアミノ酸配列が配列決定されている(GenBank登録番号AY053456、AF036235、AF148856及びGI5070620参照)(またL1RT ORF2配列に関してはGenBankタンパク質登録番号AAD39215参照)。本発明に関連して、L1RT mRNAはアンチセンス核酸配列を設計するための好適な核酸である。例えば、L1RTをコードする核酸を標的化する、20以上のヌクレオチドの長さの、一連のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが設計される。一般的に、本発明におけるアンチセンス配列は、L1RTのプロモーター又は他の制御領域並びにコード及び/又は非コード領域と結合するように設計し得る。アンチセンス配列が開始コドンを包含するL1RT核酸配列部分を標的化することが好ましい。最も効果的なアンチセンス配列又は構築物がL1RTのコード領域及び非コード領域に相補的な領域を含むことも意図される。正常な細胞機能が影響を受けるか否かを判定するために、単に構築物をin vitroで試験することによって、所与のアンチセンス構築物の有効性を容易に試験することができる。選択したアンチセンス配列が、ALT細胞におけるテロメア延長を誘導又は仲介するのに不十分なレベルまでL1RT活性又は発現を阻害することが好ましい。
【００２９】
L1RT発現の干渉は任意の機構に起因して起こり得る。例えば、上記アンチセンス配列はセンスL1RT mRNAと結合し、その翻訳を干渉すると考えられている。あるいは、アンチセンス配列は、ヌクレアーゼ又はリボザイム消化の影響を受けやすいL1RT mRNAを与え、L1RT mRNAの転写若しくはプロセシングを干渉し、L1RT遺伝子由来のmRNAの転写を抑制し、又は幾つかの他の機構を介して（例えばリボザイムを介して）作用し得る。当業者に周知のリボザイムは、触媒活性を有するRNA分子である。本発明のリボザイムはL1RT RNAに結合し、酵素的に切断しかつこれを不活化するアンチセンス配列である。有用なリボザイムはL1RT RNAに相補的な5’-及び3’-末端配列を含むことができ、L1RT RNA配列に基づいて当業者が操作することができる。しかし、アンチセンス配列がL1RT発現を干渉する特定の機構は、最終結果が一致する限り重要ではない。
【００３０】
一般的に、特異的なハイブリダイゼーションを確実にするために、アンチセンス配列は標的L1RT mRNA配列と実質的に相補的である。特定の実施形態では、標的核酸配列と完全に若しくは正確に相補的なアンチセンス配列、又は所与のL1RT標的核酸配列の異なる部分配列と完全に相補的な2以上のアンチセンス配列を使用し得る。部分配列は、例えば、ヒトL1レトロトランスポゾンのヌクレオチド1987-2800に対応するアンチセンス配列（GenBank GI: 5070620）等、核酸残基のより長い配列の一部分である核酸残基又はヌクレオチドの配列である。
【表１】
2007524668.tif 000002
【００３１】
2007524668.tif 000003
【００３２】
アンチセンス配列（例えば、DNA、RNA、修飾した類似体等）は、核酸を製造する適切な任意の方法（本明細書に開示される（実施例の節参照）化学合成法及び組換え法又は当業者に公知の方法等）を使用して作製することができる。一実施形態では、例えば本発明のアンチセンスRNA分子はデノボ化学合成によって又はクローニングによって調製し得る。例えば、L1RT mRNAにハイブリダイズするアンチセンスRNAは、発現ベクター（例えばプラスミド）中に、逆配向で配列番号1で示される配列を挿入（結合）すること、これをプロモーターと機能的に連結させること、及びこれを発現させることによって作製することができる。プロモーター、並びに好ましくは終結シグナル及びポリアデニル化シグナルが適切に位置付けられるならば、非コード鎖に対応する挿入配列の鎖が転写されて、本発明のアンチセンス配列として作用するだろう。
【００３３】
一部の実施形態では、アンチセンス配列は、ヌクレオチド付加、置換、欠失若しくは修飾を有する修飾型アンチセンス核酸配列、又は関連の標的配列（すなわちL1RT RNA若しくはその遺伝子/cDNA）への特異的な結合が配列の機能特性として維持される限り他の核酸配列若しくは非核酸部分を含んでもよい。
【００３４】
例えば、修飾型アンチセンス核酸配列は、配列番号2、3、4、5又は6のヌクレオチド配列に対応する完全長にわたって修飾型アンチセンス核酸配列が1以上のヌクレオチド置換、欠失又は挿入を有することを除き、配列番号2、3、4、5又は6に示されるものと同一のヌクレオチドからなる。当該技術分野で公知である同一性又は類似性は、配列を比較することによって決定される2以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。同一性はまた、ポリヌクレオチド配列間の配列同系性の程度をも意味し、これはポリヌクレオチドの5'から3'末端配列の文字列間の一致によって決定される。「同一性」は当該技術分野で公知の方法によって容易に算出することができる。例えばAltschulら, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)を参照されたい。例えば、配列同一性は当該技術分野で公知のアライメントアルゴリズム及びヌクレオチド配列間の差異の割合を算出することによって最適化し得る。効果的なアンチセンス配列は、例えば当業者に公知の技術であるGCG（Genetics Computer Group, Madison Wis.）又はオリゴヌクレオチド若しくはDNAマイクロアレイの組合せアレイを用いることによって決定することができる。
【００３５】
本発明において、直接的な化学合成によって作製することができるL1RTアンチセンスポリヌクレオチド、RNA、DNA又は修飾型核酸も使用し得る。化学合成は一般的には本発明における使用のための、オリゴヌクレオチド又は非標準的なヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド（例えば、プローブ、プライマー及びアンチセンスオリゴヌクレオチド）の製造に好ましい。核酸の直接的な化学合成は、当該技術分野で公知の手順によって実施することができる。当業者は、DNAの化学合成はしばしば約100又は150塩基の配列に制限され得るが、より長い配列が短い配列の連結又はより手の込んだ合成法によって取得し得ることを理解するだろう。本発明のL1RTアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば増加したヌクレアーゼ耐性、より強化された結合、安定性若しくは所望のTm等の、所望の性質を与えるために、非標準的な塩基又は非標準的な骨格構造を用いて作製することができると理解されよう。
【００３６】
ペプチド核酸（PNA）を含む幅広い種類の有用な修飾型オリゴヌクレオチドを作製し得る。ペプチド核酸は骨格が糖というよりむしろ擬似ペプチド（アミド、特にN-エチルアミノグリシン骨格）であるDNAの類似体である（Peter E. Nielsen (編), Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications, 初版, 1999, Horizon Scientific Press参照）。係る骨格によって通常達成されるよりも強力な結合及びより大きな特異性を生じることが報告されている。さらに、PNAの固有の化学的、物理的及び生物学的性質が、強力な生体分子ツール、アンチセンス及び抗遺伝子剤（antigene agents）、分子プローブ及びバイオセンサーを作製するために利用されてきた。PNA化合物の更なる教示は米国特許第5,539,082号; 5,714,331号及び5,719,262号中で見出すことができる。
【００３７】
一部の実施形態では、キメラオリゴヌクレオチド、三重鎖形成性アンチセンス配列、RNA-DNAオリゴヌクレオチド（RDO）、骨格類似体を有するオリゴヌクレオチド（ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）及び当該技術分野で公知のその他を合成し、かつ使用し得る。例えば、L1RTをコードする核酸を標的化する、30ヌクレオチドの長さの一連のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを使用し得る。
【００３８】
例えば、L1RTポリヌクレオチドがL1RT発現の検出又は不適切な過剰増殖と関連する症状の診断及び予後に使用されるべき場合に、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを標識することがしばしば有用である。標識は当業者に周知の多くの手段のいずれかによって組み込まれ得る。適切な標識は、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的又は分光学的手段によって検出可能な任意の組成物である。例えば、有用な標識には32P、35S、蛍光色素、酵素（例えばELISAに一般的に使用される）、ビオチン-ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ハプテン及び抗血清若しくはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質、又は標的と相補的な配列を有する核酸分子が含まれる。標識は結合した検出可能な部分の量を定量するために使用することができる測定可能なシグナル（放射活性等）をしばしば生じる。
【００３９】
本発明の別の態様では、L1RT mRNA中の規定の標的領域に対応する二本鎖RNA（dsRNA）は、L1RTの阻害剤又はアンタゴニストとして使用される。dsRNAは標的細胞中のL1RT発現の低減又は減少を生じるL1RTのRNA標的化遺伝子サイレンシングを誘導する。RNA標的化遺伝子サイレンシングは当業者に周知である（Ahlquist, 2002, Science, 296:1270-1273）。dsRNAは内生的に合成してもよいし又は外因的に適用してもよいが、dsRNAの触媒量のみがサイレンシングの誘導に必要である。L1RT遺伝子の一部分由来のヌクレオチド配列が、部分的な又は完全な二本鎖型であり得る抑制性RNAを作製するために選択される。標的遺伝子の一部分由来のヌクレオチド配列は抑制性RNAを作製するために選択されているので阻害は特異的である。
【００４０】
低分子干渉RNA、ショートヘアピンRNA、発現された長い干渉RNA、発現された短い干渉RNA及び発現されたショートヘアピンRNA等の、RNA標的化遺伝子サイレンシングを誘導するための、当該技術分野で公知の異なる方法が存在する。特定のdsRNA（低分子干渉RNA及びショートヘアピンRNA）がリン酸-糖骨格又はヌクレオシドのいずれかに対する修飾を含むことが好ましい。RNA二本鎖形成は、細胞の内部又は外部のいずれかで開始し得る。RNAは、1細胞当たり少なくとも1コピーの送達を可能にする（二本鎖物質の用量が高いほどより効果的な阻害を産出し得る）量で導入し得る。RNAの二本鎖領域に対応するL1RT mRNAヌクレオチド配列が遺伝子阻害のために標的化される点で阻害は配列特異的である。標的配列に対して挿入、欠失、及び単一点突然変異を有するRNA配列が阻害に効果的であることも見出すことができる。
【００４１】
RNAは細胞に送達してもよいし、又は組織の細胞間領域若しくは生物の脈管系に直接導入してもよい。また患者に経口的に送達してもよい。経口的導入のための方法には、食料として使用される種をRNAを発現するよう操作する工学的アプローチのみならず、dsDNAを患者の食料と直接混合し、その後、影響を及ぼすべき生物に与えることを含む。核酸を導入する物理的方法には、細胞への直接的な注入又はRNA溶液の患者への細胞外注入が含まれる。
【００４２】
別の態様では、L1RTタンパク質のドミナントネガティブ突然変異体又はドミナントネガティブ突然変異体L1RTタンパク質又はその非機能的断片若しくは誘導体をコードする配列を有する核酸は、L1RTの相互作用及び細胞中の他の分子を干渉することによってL1RT機能を阻害するために投与される。L1RTはテロメアの伸長のためにテロメアの一部分と直接相互作用する必要があると考えられる。
【００４３】
したがって、機能は欠落しているがテロメアの一部分と結合する際に効果的であるL1RT突然変異体は、野生型L1RTと競合するドミナントネガティブ突然変異体として使用することができる。優性の非機能的L1RTは、L1RTを不適切に過剰発現する癌細胞中での発現向きに操作することができる。野生型L1RTのタンパク質及び核酸配列が公知であれば、当業者は本発明での使用に適切なL1RTのドミナントネガティブ突然変異体を作製することができる。係るドミナントネガティブ突然変異体は、当該技術分野で既に公知の標準的な送達方法に従って、in vivo又はin vitroで細胞に投与し得る。本発明の好適な態様では、治療的核酸は、癌細胞中で優性の非機能的L1RTタンパク質又はその断片若しくはキメラタンパク質を発現する発現ベクターの一部分である、L1RT核酸を有する。
【００４４】
本発明の別の態様では、L1RTに特異的な抗体又はその結合部分がL1RTの阻害剤又はアンタゴニストとして使用される。具体的には、本発明は、ヒト及び他の動物におけるL1RTに誘導される癌の、L1RTに対する抗体の使用を介した予防及び治療を意図する。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体並びに係る抗体の結合部分（Fabフラグメント及びFvフラグメント）はいずれも本発明の関連で意図される。係る抗体は様々な動物（マウス、ウサギ、サル、チンパンジー、ウシ（例えば未成熟の）及びトリ）中で作製し得る。本発明はまた、ヒト及びヒト化抗体をも意図する。抗体は予防的に又は病理学的細胞増殖の急性期の間に使用することができる。
【００４５】
一実施形態では、本発明は、L1RTタンパク質と結合する抗体が投与され、その結果として抗体がL1RTと反応する方法を意図する。別の実施形態では、抗体は他の試薬（これに限定されるものではないが他の抗体を含む）と組み合わされる。抗体の投与は、経口的に、非経口的に又は他の適当な経路によって実施することができる。
【００４６】
抗体の製造は、当該技術分野で周知の技術によって達成し得る。例えば、哺乳動物のリンパ球はヒトL1RTタンパク質又はポリペプチドによる動物（例えばマウス）のin vivoでの免疫処置によって免疫化される。係る免疫処置は最大数週間の間隔で十分な力価の抗体を得るのに必要なだけ繰り返される。ハイブリドーマを作製及び培養してもよく、そして生じたコロニーは所望のモノクローナル抗体の産生についてスクリーニングされる。係る抗体を産生するコロニーはクローニングされ、大量の抗体を産生させるためにin vivo又はin vitroのいずれかで増殖される。
【００４７】
下記でさらに詳細に議論されるように、様々な阻害剤又はアンタゴニストの有効性は被験者又は患者への投与前に標準的な実験動物モデルで示され得る。本発明の方法を用いて治療されるべき被験者又は患者はヒトであることが好ましく、そして胎児、幼児又は成人であり得る。治療し得る他の哺乳動物は、マウス、ラット、ウサギ、サル及びブタであり得る。
【００４８】
阻害剤又はアンタゴニストは、単独で又は他の化学療法若しくはその他の方法と組合せて使用することができる。例えば、L1RTに誘導される癌の療法はテロメラーゼ又は他の幾つかの因子によって誘導される癌を治療するために、化学療法及び/又は放射線療法と併用し得る。当業者に公知の化学療法剤の例には、これに限定されるものではないが、ブレオマイシン、マイトマイシン、ナイトロジェンマスタード、クロラムブシル、5-フルオロウラシル（5-FU）、フロクスウリジン（5-FUdR）、メトトレキサート（MTX）、コルヒチン及びジエチルスチルベストロール（DES）等の抗癌剤が含まれる。併用療法を実行するために、本発明の阻害剤成分は単に、別の抗癌剤と組合せて、動物又は患者内でその組合せ抗癌作用を生ずるのに効果的な様式で動物に投与されよう。したがって、作用物質は標的細胞の領域にその組合せの存在を生じるのに有効な量でかつ有効な期間で提供されよう。この目的を達成するために、作用物質は単一の組成物、又は異なる投与経路を用いる2つの別個の組成物として、同時に投与し得る。あるいは、2つの治療は、例えば数分から数時間又は数日の間隔で、互いに先行又は追随し得る。例示のために、そして非限定的ではあるが、全身的使用のためのAZTの平均一日用量は、ヒト成人については1日当たり10mg/kg、マウスについては1日当たり20mg/kgであり得る。
【００４９】
用量は治療中の被験者の症状に応じていくらか変動し得る。投与に関与する医師は、個別の患者に適切な用量を決定することができ、これは問題の患者の複数の因子（年齢、症状、ファイル・ヒストリ等）に左右され得る。
【００５０】
したがって、本発明の方法は、L1RTに誘導される細胞の病理学的増殖に関連する症状及び疾患に対する治療用途において使用することができる。本発明の治療用途の利益を受け得る疾患は、細胞過剰増殖によって特徴付けられる全ての疾患を含み、これには例えば固形腫瘍及び白血病、並びに非癌症状が含まれる。本発明の方法は、in vivo環境だけでなくex vivo状況で癌細胞の増殖を阻害するために使用できることをさらに意図する。本発明の方法は、病理学的に増殖するヒト細胞（これに限定されるものではないが、ヒト癌細胞-骨肉腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫を含む）の増殖をex vivoで阻害するのに特に有用である。
【００５１】
本発明は細胞におけるL1RTの発現に起因する不適切な、病理学的な又は異常な増殖細胞を同定するための方法及びキットを提供する。この方法は、患者由来の組織中のL1RTの発現の存在（及び/又はレベル）を判定する（L1RT発現の存在は患者における癌細胞又は病理学的細胞増殖を示す）ことによって、患者における癌細胞又は腫瘍の存在を診断するのに役立つスクリーニング方法として使用することができる。
【００５２】
例えば、癌性腫瘍サンプルは様々な方法（これに限定されるものではないが、核酸を用いたハイブリダイゼーション、ノーザンブロッティング、in situハイブリダイゼーション又はRNAマイクロアレイを含む）によって測定されるL1特異的mRNA発現の検出、又は様々な方法（これに限定されるものではないが、ウエスタンブロッティング、免疫沈降法若しくは免疫組織化学）によって測定されるL1レトロトランスポゾンのORF1及び/又はORF2にコードされるタンパク質の存在、又は逆転写酵素の酵素活性によって診断することができる。
【００５３】
ALTを示す癌細胞はまた、触媒的サブユニットmRNA発現（非限定的にノーザンブロッティング、RNA保護アッセイ、in situハイブリダイゼーション、RT-PCR、リアルタイムRT-PCR又はRNAマイクロアレイを含む様々な方法によって測定される）の不在、又はテロメラーゼ触媒的サブユニット翻訳（非限定的に、ウエスタンブロッティング、免疫沈降法又は免疫組織化学を含む様々な方法によって測定される）の不在を判定することによって診断することもできる。ALTを示す細胞の他の特徴は長く不均一なテロメアの存在である（Bryanら, 1997, Nature Medicine, 3:1271-1274）。したがって、診断方法は、ALTを有する細胞の指標として、長く不均一なテロメアの存在の検出を含み得る。この方法は、これに限定されるものではないが、末端の制限消化及びその変形、テロメア特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーション又はテロメア特異的DNA若しくはPNAプローブを用いたフローサイトメトリーを含む。
【００５４】
好適な実施形態では、L1RTに対する核酸プローブは、急速な増殖を経ている組織（ヒトの骨肉種、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫を含む、原発性癌細胞等）中のL1RT mRNAレベルの存在及び/又は増加を検出することに使用することができる。したがって本発明は、病理学的増殖細胞（癌細胞を含む）を検出及び同定するための、L1RTの部分配列に相補的な核酸プローブの使用方法を提供する。例えば、病理学的増殖細胞の同定方法は、L1RT mRNAに対する核酸プローブを用いて試験細胞中のL1RT mRNAの発現レベルを対照細胞中のL1RT mRNAの発現レベルと比較することを含み得る。L1RT発現のレベルが対照細胞と同様に観察される場合、試験細胞は病理学的増殖細胞として同定される。
【００５５】
本発明の方法に使用される核酸プローブがヒトL1RT核酸配列、好ましくはmRNAに完全に相補的であり、かつ試験細胞がヒト細胞であることが好ましい。ヒトL1RT RNA配列に完全に相補的な核酸プローブの一例は5'-TCC TGC TTT CTC TTG TAG GCA-3'(配列番号6)である。しかし、本発明の方法に使用される核酸プローブはさらに、ヒト、マウス又は他の哺乳動物のL1RT mRNA又はL1RTレトロトランスポゾンRT配列に実質的に相補的であり得る。病理学的増殖細胞（例えば癌細胞）中のL1RT RNAを効果的に検出するプローブの能力に影響しない置換を核酸プローブ中に作製し得ることは当業者に明らかであり、したがってそのような置換は本発明の範囲内である。本発明の方法で使用される核酸プローブは、DNAプローブ、又はペプチド核酸プローブ、ホスホロチオエートプローブ若しくは2'-Oメチルプローブ等の改変型プローブであり得る。核酸プローブの長さは約8又は10〜50ヌクレオチド、好ましくは約15〜25ヌクレオチドの長さであり得る。本発明の方法は、ヒト、哺乳動物又は他の脊椎動物由来の細胞抽出物、培養した細胞、又は組織サンプル中で容易に実行することができる。
【００５６】
本発明の方法は、細胞、細胞培養物、並びに固形腫瘍及び癌（例えば、ヒトの骨肉種、乳癌、卵巣癌、肺癌、副腎皮質癌又は黒色腫）等の、ヒト細胞及び組織におけるL1RTの発現に起因する不適切な、病理学的な又は異常な増殖細胞をin vitroで検出するのに有用である。
【００５７】
本発明はまた、過剰増殖細胞又は癌細胞を検出及び/又は阻害するためのキットも提供する。キットはL1RT mRNAの部分配列と完全に又は実質的に相補的な核酸プローブを具備し得る。細胞と接触させる工程を含む、病理学的増殖細胞の増殖を阻害するためのキットは、細胞との接触時に病理学的増殖に影響することができる作用物質、例えばL1RT核酸の部分配列と実質的に相補的な、好ましくは完全に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み得る。キットは、上述した核酸プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本明細書で議論される検出標識を含むか又は含まない他の適当な作用物質の1つ以上を含む容器の形態であり得る。キットは、サンプルRNA、DNA又はタンパク質の分離及びハイブリダイゼーションに適当な膜を含んでもよく、請求項に記載の方法による使用に適合したアッセイ装置の形態であることが好ましい。キットは本発明の方法を実施するための取扱説明書も含むことができる。キットは、様々なアッセイの実行に有用な検出可能な標識及び/又は物質の存在を検出するのに有用な試薬（陽性対照、陰性対照、内部及び/又は外部対照）をさらに含んでもよい。例示的な試薬及び物質はRNA抽出バッファー、ハイブリダイゼーションバッファー、試験チューブ、ホールピペット等である。
【００５８】
本発明の方法に使用することができるL1RTの阻害剤又はアンタゴニストは、いかなる場合も当該出願中で言及された具体的な化合物に限定されるべきではない。本発明が細胞の過剰増殖に関与する標的を開示する場合、L1RTの他の有用な多くの阻害剤またはアンタゴニストは単純なスクリーニング方法によって同定することができる。活性化合物は天然の又は先行技術の化合物の断片又は一部を含んでもよい。しかし、上記化合物のヒトでの試験前に、スクリーニングアッセイにおいて様々な候補作用物質を試験し、抗腫瘍剤としての潜在性を有するものを判定する必要があるかもしれない。癌に対する薬剤の効果を判定するための多くのアッセイが当該技術分野で公知である。したがって、特定の実施形態では、本発明は、L1RTの発現又は活性をモジュレートする化合物を同定又は選別する方法に関する。L1RTの生物活性を干渉する薬剤は抗腫瘍剤の良い候補である、というのも、これらは細胞数の非制御増殖又は継続的な増加に導く工程の1つに影響するからである。
【００５９】
化合物又は薬剤のスクリーニングは、精製したL1RT酵素、in vitroモデル、細胞培養物、遺伝子改変した細胞若しくは動物、又は異種移植モデル抗腫瘍アッセイを用いて実施し得る。特に興味深いのは、ヒト細胞に対して低い毒性を有する薬剤に関するスクリーニングアッセイである。候補薬剤は非常に多くの薬品クラスを包含するが、典型的にこれらは有機分子、50ダルトンより大きくかつ約2,500ダルトン未満の分子量を有するアンチセンスポリ核酸若しくは小さな有機化合物、プリン及びピリミジンの類似体又はこれらの組合せである。既知の薬理的抗癌剤は更なる化学的修飾（アミド化（amidification）等）に供して、構造的類似体を作製することもできる。スクリーニングアッセイが結合アッセイである場合、1以上の分子を標識と結合させることができ、そして標識は検出可能なシグナルを直接的又は間接的に与えることができる。放射性同位体、蛍光色素、化学発光剤、酵素及び特異的結合分子、粒子（例えば、磁性粒子）等の様々な標識を使用し得る。塩、中性タンパク質（例えば、アルブミン、界面活性剤等）などの様々な他の試薬を、最適なタンパク質-タンパク質結合を促進すること及び/又は非特異的な若しくはバックグラウンド相互作用を低減することに使用することもできる。アッセイの効果を改善する試薬（プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等）も使用し得る。
【００６０】
例えば、化合物又は作用物質をその最も単純な形態で同定するためのスクリーニングアッセイ又は方法は、試験されるべき候補化合物が存在しなければL1RT及び他の細胞成分の相互作用が検出可能な又は測定可能な生物学的効果又は化学的効果（例えばテロメアへのヌクレオチド若しくは類似体の付加又はテロメア長の維持）を誘導する条件下で、試験されるべき候補化合物をL1RTを発現する細胞と共にインキュベートすること、及びその後、試験されるべき化合物の存在下で細胞成分と相互作用して検出可能な若しくは測定可能な生物学的効果又は化学的効果を誘導するL1RTの能力を判定することを含み得る。候補化合物又は試験した化合物がL1RTと他の細胞成分との相互作用をモジュレートする場合、その化合物が選別される。
【００６１】
興味深い他のアッセイは、例えば、L1RTを発現する細胞系、又はL1RT発現を可能にする条件下で細胞系に導入し得るL1RT遺伝子を有する発現構築物であり得る。この細胞系に候補作用物質が添加され、そしてL1RT活性を阻害又はダウンレギュレートする能力が検出される。L1RT活性のレベルは機能の読み出し又は機能アッセイ（L1RT発現レベルの変化、テロメア若しくは他の幾つかの基質への結合若しくは結合の阻害、アポトーシス、増殖の存在若しくは欠如、転移の存在若しくは欠如、細胞分裂の存在若しくは欠如、細胞移動の存在若しくは欠如、軟寒天コロニー形成の存在若しくは欠如、接触阻害の存在若しくは欠如、侵襲性の存在若しくは欠如、及び/又は腫瘍進行若しくは他の悪性表現型の存在若しくは欠如を含む）によって決定し得る。
【００６２】
例えば、細胞における野生型L1RT発現を減少させ、かつこれに付随してこれらの細胞のアポトーシスを誘導する候補化合物の能力を判定する方法は、L1RTを発現する細胞を取得すること、候補物質と該細胞とを混合すること、及びL1RT含量及び/又は該細胞の染色体上のテロメア長を低減する候補物質の能力を判定することによって実施し得る。
【００６３】
L1RT発現を干渉することが可能である候補物質を同定する別の簡単な例は、以下であり得る：細胞のL1RT状態を測定又は判定し得る。その細胞がL1RTを発現する能力を有する場合、添加した候補化合物がない状態での基礎L1RT含量が測定される。次いで、細胞に候補化合物を添加し、候補化合物の存在下で野生型L1RT発現を再度測定し得る。試験又は候補化合物の不在下での細胞のL1RT発現と比較して、L1RT発現を減少させる候補化合物は、野生型L1RT発現阻害能を有する候補化合物を示す。したがって、これは予防的及び治療的癌低減ポテンシャル並びにアポトーシスポテンシャルを有することができる。
【００６４】
本発明はまた、様々な動物モデルの使用も包含する。L1RTを発現する細胞系を開発しかつ単離することにより、様々な実験動物で疾患モデルを作製することができる。これらのモデルは細胞の皮下、同所又は全身投与を使用して様々な疾患状態を擬態し得る。例えば、IIICF/c繊維芽細胞系（ALT）をpSV2neo-EJrasプラスミドDNA（EJ膀胱癌細胞系由来の活性化c-Ha-ras癌遺伝子を含む）でトランスフェクトし、G418で選別し、そしてヌードマウスに皮下注射してALT腫瘍を得ることができる。得られた腫瘍はテロメア反復増幅プロトコール（TRAP）アッセイにおいて検出可能ないかなるテロメラーゼ活性も示さず、そしてサザン分析はALTの徴候を示すTRF長パターンを保持したことを示す（Yeagerら, Cancer Res. 1999, 59(17):4175-9）。最終的に、テロメラーゼノックアウト動物（例えばテロメラーゼKOマウス-/-；Rudolphら, 1999, Cell, 96:701-712）又は動物内でトランス遺伝子として野生型L1RTを発現するトランスジェニック動物は、治療のモデルとして利用し得る。もちろん、動物モデルは作用物質の組合せを同様に試験するのに有用なビヒクルを提供する。化合物の有効性のin vivoでの決定は、異なる様々な基準（これに限定されるものではないが、生存、腫瘍退縮、腫瘍進行の停止又は遅延、腫瘍の排除及び転移の阻害若しくは予防を含む）を含み得る。
【００６５】
試験化合物を用いた動物の治療は、動物への該化合物の適当な形態での投与を含むであろう。投与は臨床又は非臨床目的で利用し得る任意の経路（これに限定されるものではないが、経口経路、経鼻経路、口腔経路、経腸経路、膣内経路又は局所経路を含む）によるだろう。あるいは、投与は気道内注入、気管支注入、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射又は静脈注射によってもよい。特に、血液又はリンパ球供給を介した全身静脈投与、局所投与、及び腫瘍内注射を意図する。
【００６６】
もちろん選別に適当な対照値（例えば、候補化合物の不在下での単離した細胞又はALTを示す動物におけるL1RT発現又は産生のレベル）が含まれてもよい。陽性とみなされる、すなわち癌の治療に有益である可能性が高い試験化合物又は候補化合物は、実質的に増殖阻害効果を有するもの（例えば、好ましくは少なくとも20％、より好ましくは少なくとも50％、そして最も好ましくは少なくとも80％、なお一層好ましくは約90〜100％で細胞の増殖を低減することができる試験作用物質）であろう。
【００６７】
上記化合物は多くの態様で重要であろう。これらは、単独で投与されるか又は癌治療において当業者に公知の化学療法及び放射線療法レジメンと併用して投与されるかに関らず、L1RTに関連する癌の治療用レジメンにおいて重要であろう。あるいは、これらの化合物は単にL1RTを低減することによって癌細胞の大量のアポトーシスを選択的に誘導する際に役立つだろう。
【００６８】
所望の薬理活性を有する化合物は選別され、増殖性疾患等の治療のために生理学的に又は製薬上許容される担体中で宿主に投与され得る。製薬上許容される担体は、組成物を投与するために使用される特定の方法だけでなく、投与される特定の組成物（例えば、核酸、タンパク質、有機化合物、ベクター又は形質導入細胞）によってもある程度決定される。したがって、多種多様な本発明の医薬組成物の適切な製剤が存在する。
【００６９】
本発明の医薬組成物は組換え産物を含み得る。例えば、L1RTを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド又はdsRNAを、標的細胞及び生物のトランスフェクションのための多くの周知のベクターのいずれかに挿入することができる。例えば、核酸はDNAプラスミド、裸の核酸、及びリポソーム等の送達ビヒクルと複合体化した核酸として送達される。ウイルスベクター送達系にはDNAウイルス及びRNAウイルスが含まれる（Porter, 2004, Retroviral vectors for suicide gene therapy, Methods Mol Med., 90:91-106; Wangら, 2004, Prolonged and inducible transgene expression in the liver using gutless adenovirus: A potential therapy for liver cancer, Gastroenterology, 126:278-289）。具体的な実施形態では、アンチセンスL1RT核酸を含むウイルスベクターが使用される。例えば、癌遺伝子療法に関して当該技術分野で公知のレトロウイルスベクター又はアデノウイルスベクターを使用することができる。遺伝子療法に使用されるべきアンチセンスL1RT核酸は、患者への遺伝子の送達を促進する適当なベクター中にクローニングされる。
【００７０】
核酸の非ウイルス送達法は、裸のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの作用物質増強型取り込み（agent-enhanced uptake）、マイクロインジェクション、粒子衝突、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質-核酸コンジュゲートを含み得る。細胞（ex vivo投与）又は標的組織（in vivo投与）への送達が可能である（Narayanan, Antisense therapy of cancer, In Vivo. 1994, 8(5):787-793; Zhangら, Anti-oncogene and tumor suppressor gene therapy--examples from a lung cancer animal model, In Vivo. 1994, 8(5):755-769）。特定の実施形態では、アンチセンスL1RT配列及び他の所望の任意の配列がゲノム中の所望部位で相同的組換えを発起する領域に隣接し、その結果、アンチセンスL1RT核酸の染色体内発現を生じる、核酸分子が使用される。L1 RT ORF（ORF2）の5'末端に隣接する配列の一例は5'-agaccat caagactagg aagaaactgc atcaactaat gagcaaaatc accagctaac atcata-3'（配列番号7）である。
【００７１】
本発明の医薬組成物、阻害剤又は拮抗薬は、様々な手法（経口投与、局所投与、非経口投与、例えば、皮下投与、腹腔内投与、ウイルス感染、経脈管投与等を含む）で投与することができる。導入の様式に応じて、化合物は様々な手法で製剤化し得る。経口投与に適当な製剤は溶液であり得る。非経口投与（例えば、関節内、脳室内、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路による）に適当な製剤には、水性及び非水性の、滅菌等張注射溶液が含まれる。本発明の実施において、組成物は、例えば静脈内注射により、経口的に、局所的に、非経口的に又は腹腔内に投与することができる。経口及び非経口投与は好適な投与方法である。製剤化及び投与の技術は当該技術分野で慣用的であり、更なる詳細は、例えば「Remington's Pharmaceutical Sciences (2000), Gennaro AR(編),第20版, Maack Publishing Company, Easton, PA」で見出し得る。
【００７２】
L1RTをモジュレートするための化合物（例えば、核酸、タンパク質、有機化合物、ベクター及び形質導入細胞）を含む医薬組成物は、対象とする目的を達成するのに十分な量で、該組成物を必要とする患者に投与される。治療上有効量又は薬理学的有効量は当該技術分野で十分に認められた表現であり、対象とする薬理結果を生ずるのに効果的な作用物質の量を指す。例えば、治療上有効量は長期にわたって患者に有益な治療反応をもたらす（すなわち、疾患若しくは病状を治療するか又は患者の治療中の疾患の症状を改善する）のに十分な量である。実際に投与される量は、治療されるべき個体に左右され、そして所望の効果が有意な副作用なく達成されるように最適化された量であることが好ましいだろう。下記でさらに詳細に記載されるように、用量は、治療されるべき患者の体重又は表面積だけでなく、使用される特定の阻害剤又は拮抗剤の有効性及び患者の病状によっても決定し得る。用量の規模も、例えば特定の患者への特定の作用物質、ベクター又は形質導入細胞型の投与に付随する任意の副作用の存在、性質及び程度によって決定されよう。
【００７３】
ALTに仲介される癌の発生を予防し、阻害し又は低減することが可能な作用物質の治療上の有効量は、本明細書に開示される細胞培養アッセイからのデータ及び/又は動物モデルを用いたin vivoアッセイからのデータを用いて容易に決定可能である。この関連で、当該技術分野で公知のL1RTに誘導される癌に関する任意の動物モデルを使用することができる（Hahnら, 1999, Nature Medicine, 5(10):1164-1170; Yeagerら, 1999, Cancer Research, 59(17): 4175-4179）。動物モデルはまた、ヒトにおける投与の適切な用量域及び経路を評価するために使用することもできる。ヒト起源の固形腫瘍を有する実験動物（又は技術的に許容される動物モデル）は、臨床環境への移行前に適当な治療線量を最適化するために頻繁に使用される。上記モデルは効果的な抗癌戦略を予測する際に非常に信頼できることが知られる。例えば、固形腫瘍を有するマウス又は技術的に許容されるマウスモデルが、最低毒性で有益な抗腫瘍効果を生じる治療薬の作用範囲を決定するために、前臨床試験で広範に使用される。少なくともAIDS及びテロメラーゼに仲介される癌の関連で使用されるヌクレオシド類似体に関して、技術的に許容されるモデルで既に立証されている安全性に起因して、本発明の前臨床試験はより一層慣用的な実験であろう。in vivoでの有効性は、腫瘍形成（進行）の阻害、腫瘍退縮又は転移等を測定するアッセイを用いて予測し得る。
【００７４】
モデルとしてU-2 OSヒト骨肉腫細胞系から増殖したヌードマウスの皮下（s.c.）腫瘍（すなわち異種移植片を保有するマウス）を用いたAZTの抗腫瘍効果の例示的なin vivoアッセイが下記に記載される。
【００７５】
in vivoアッセイに必要なヒト癌性細胞は、例えば以下のように調製し得る：テロメラーゼ陰性であるが、ALT陽性であるU-2 OSヒト骨肉腫細胞系をATCC等の公共の供給源から取得する。細胞を10％ウシ胎児血清を補充したMcCoy 5培地中、5％ CO2の加湿環境下、37℃で維持する。予備試験はU-2 OS腫瘍モデルが有意な抗腫瘍活性に癌遺伝子発現を必要としたことを示した。したがって、活性化ras癌遺伝子発現ベクターを、製造者使用説明書に従うLipofectamine 2000TMトランスフェクションによってほぼコンフルエントなU-2 OS細胞に導入する。トランスフェクションの1日前に、U-2 OS細胞を6ウェルプレートに1x105個の細胞の密度で蒔く。プラスミドpBABE-puro-ras-V12（公然入手可能）をScaI酵素による制限消化によって線状化する。細胞をこの線状化構築物でトランスフェクトし、培養下で増殖させる。トランスフェクション後1日目に細胞を希釈してもよい。その後、細胞をピューロマイシン（0.5mg/ml-1）で8日間で選別する。マウスモデルにおいて発癌性であろうヒトALT細胞系の別の例は、pSV2neo-EJrasプラスミド（EJ膀胱癌細胞系由来の活性化c-Ha-ras癌遺伝子を含む）DNAでトランスフェクトされ、G418で選別される、IIICF/c繊維芽細胞系である。
【００７６】
in vivoアッセイのために、免疫不全マウス、例えば約5〜7週齢のスイス系同型ヌード（nu/nu）マウス（又は免疫不全マウス、Balb/c-ByJ-Hfh11nu）を取得し、癌細胞の投与前に病原体非含有状況下で維持する。200μlの血清非含有培地に含まれる約5x105個のU-2 OS/ras-V12細胞を全ての動物に送達する（Metofaneで簡単に麻酔し、腫瘍を形成させるために側面へ皮下（s.c.）注射する）。あるいは、腫瘍原性は約30X106個の未形質転換U-2 OS細胞の皮下注射後に達成することができた（Manaraら, 2000, Reversal of malignant phenotype in human osteosarcoma cells transduced with the alkaline phosphatase gene, Bone 26(3): 215-220）。次いで、マウスを実験群と対照群とに分ける。
【００７７】
一実施形態では、確立した腫瘍のサイズの減少というよりむしろ、s.c.腫瘍増殖の減少又は進行抑制期間が評価される。この実施形態では、0日目から開始して、実験群のマウスは、例えば飲料水中のAZT（Retrovirtm IV, GlaxoSmithKline）を得る。水中のAZTの濃度は2mg/mlであり得る。AZTの新鮮な溶液は3日毎に供給される。対照群のマウスは飲料水のみを得る。腫瘍は2〜3日毎に測定される。腫瘍が1cm3を超えた際にマウスが犠牲にされる。腫瘍の体積は式4/3πr3で算出する（ここで、rは腫瘍の半径である）。対照群の全てのマウスで腫瘍が発達すべきであり、実験群の全てのマウスは無腫瘍を維持する。
【００７８】
別の実施形態では、本発明の試薬及び方法は、既に確立した腫瘍を保有する動物において腫瘍退縮をin vivoで促進するために使用することができる。すなわち、本発明の試薬は既存の腫瘍を有する動物を治療するために使用することができる。この場合、癌性細胞は腫瘍を確立させるためにヌード（nu/nu）マウスの側面に皮下注射される。腫瘍細胞の移植後に腫瘍が確立された時点で、実験群のマウスにはL1RT活性に対して有効なヌクレオシド類似体を含む組成物を投与し、対照群のマウスにはヌクレオチド類似体を含まない同一の組成物（例えば、水又は生理食塩水）を1日に2〜3回与える。腫瘍増殖は2〜3日毎にモニターされる。ヌクレオシド類似体が腫瘍細胞移植後10〜14日目にこれらの腫瘍を保有する動物に投与される場合、遅延した腫瘍増殖が観察される。このような腫瘍細胞増殖の阻害は対照群では観察されない。腫瘍移植後数週間で、ヌクレオシド類似体で処理された動物のみが100％の生存を示す。
【００７９】
例えば、形質転換したIIICF/c繊維芽細胞の注射によって、異種移植腫瘍を免疫不全マウスで皮下形成させることができる。約2x106個の細胞をMetofaneで簡単に麻酔したマウスに皮下注射し得る。細胞が背側側面に沿って注射されることが好ましい。増殖する腫瘍は2〜3日毎に測定し得る。腫瘍増殖は側径器を用いて腫瘍の最長軸及びこれに対して垂直な軸を測定することによって追跡することができる。腫瘍の体積は式4/3πr3を用いて算出し得る（ここで、rは腫瘍の半径である）。腫瘍は処理前に切除し、計量し得る。分子生物学的分析に使用されるべき組織は液体窒素中で即座に凍結し、-80℃で保存し得る。異種移植腫瘍はテロメア反復増幅プロトコール（TRAP）アッセイにおいて検出可能なテロメラーゼ活性を有しないだろう。ALTを示す細胞の徴候を示すTRF長パターンはサザン分析によって検証し得る。
【００８０】
腫瘍の誘導後、実験群のマウスをAZTで処理し得る。マウスにPBS中のAZTの溶液を1日2回、10mg/kgの一日総投与量で腹腔内注射し得る。対照群のマウスにはPBSを注射し得る。あるいは、同じ一日投与量のAZTを飲料水中で与えてもよい。対照群のマウスは活発に増殖する腫瘍を保有し、腫瘍を有する実験群のマウスは存在しないだろう。別セットの対照として、ヌードマウスにおけるテロメラーゼ陽性腫瘍は、免疫不全マウスに形質転換したIIICF/c繊維芽細胞の代わりにWM1175（悪性黒色腫）又はHUT292DM（肺癌）細胞を注射することによって誘導し得る。免疫不全マウスにおけるテロメラーゼ陽性腫瘍は、ALT癌細胞の増殖を阻害するために使用される用量のAZTによって阻害することができないことに注意すべきである。
【００８１】
別の実施形態では、アポトーシスの促進を条件付けるin vivoアッセイも使用し得る。この実施形態では、治療組成物で処理した異種移植片保有マウスをアポトーシス病巣（apoptotic foci）の存在について調査し、未処理の対照異種移植片保有マウスと比較し得る。処理マウスの腫瘍で見られるアポトーシス病巣の程度は、組成物の治療効果の示度を与える。
【００８２】
ALTに仲介されるヒトの癌（早期腫瘍及び血管形成腫瘍の両者）の治療のための作用物質の適切な用量を設計する際に、臨床投与に適当な用量を達成するために、本明細書に記載の動物研究から容易に推定し得る。この換算を行うために、実験動物の単位質量毎に投与される作用物質の質量を計上し、そして実験動物とヒト患者との間の体表面積の差異を計上することが好ましい。上記全ての計算は当業者に周知かつ慣用である。したがって、治療上の有効量の決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８３】
例えば、細胞培養アッセイ及びマウス研究においてAZTの成功用量を得る際に、及び質量及び表面積に基づく標準的な計算を適用する際に、ヒト患者での使用に有効なAZTの用量は、患者当たり1日につき約100mg〜約1000mg、好ましくは患者当たり1日につき約500mg〜約600mgであろう。したがって、この情報を使用すれば、ヒト投与のための低用量の治療薬（例えば、ヌクレオシド類似体である3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（AZT）、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）若しくは2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T）又はガンシクロビル）は、患者当たり1日につき約1、5、10、20、25又は約30mg程度であり得、そしてヒト投与に有用な高用量の治療薬は患者当たり1日につき約250、300、400、450、500、1000、3000又は約6000mg程度であり得る。有効な中間用量は患者当たり約500〜約3000mg程度の範囲であり得る。これらの規定の範囲に関らず、本明細書で提供される所与のパラメーター及び詳細な手引き、活性範囲又は最適範囲の更なる変動が本発明の範囲に包含されることも理解されよう。本発明の治療レジメンの意図は、一般的には有意な抗腫瘍効果を産生することであるが、依然として許容できない毒性と関連したレベル以下の用量が維持される。用量自体の変化に加えて、投与レジメンも治療戦略に最適となるよう調整することができる。現在の好適な治療戦略は、約1〜500mg、好ましくは約10〜100mgのL1RTの阻害剤若しくはアンタゴニスト又はこれを含む治療カクテルを、約40日の期間内で毎日投与することである。投与は、経口的に摂取される単回用量又は分割用量を介して、又は例えば、固形腫瘍の部位への直接的な投与若しくは徐放性製剤で、達成することができる。投与に関与する医師は、この開示に照らして、個々の被験者に適当な用量、投与形態及び投与経路を決定することができるだろう。上記最適化及び調整は当該技術分野で慣用的に実施され、決して過度の実験を反映するものではない。特定の用量自体を投与する際、無菌性、発熱性、精度及びヒト患者に対する一般的な安全性の規制基準に従って製薬上許容される組成物を全身的に与えることが好ましいだろう。身体検査、腫瘍測定及び実験室試験は、もちろん治療前及び治療後最大で1〜数ヶ月の間隔で実施すべきであり、当業者は上記慣用の手順をどのように実施するかを知っているだろう。臨床反応は許容される任意の測度によって規定し得る。例えば、完全寛解は治療後所与の期間内で測定可能な全ての腫瘍の消失によって規定し得る。
【実施例】
【００８４】
以下の実施例は本発明をさらに説明する。下記の実施例は、詳細に記載がある場合を除き、当業者に周知かつ慣用的な標準的な技術を用いて実施される。
【００８５】
実施例１：AZT又はガンシクロビル処置後のテロメラーゼ陰性ALT細胞におけるテロメアの短縮、G2停止及びアポトーシスの誘導
ALT機構によってテロメアを維持することが報告された4、2種類の細胞系（U-2 OS及びSaos-2骨肉腫）中のL1特異的RNAを検出するために、総mRNAをL1レトロトランスポゾン特異的プローブを用いたドットブロッティングによって分析した。報告されたテロメラーゼ陽性細胞系（HEC-1及びHeLa）を比較のために用いた4,21（図１）。いずれのALT細胞系（U-2 OS及びSaos-2骨肉腫）はいずれもこの試験で陽性であった。HEC-1細胞は、既に報告されたように20、完全に陰性であり、HeLa細胞中で微量のL1転写産物のみを有した。
【００８６】
テロメアDNAの滑り（slippage）合成がAZT-TPによって阻害され、その結果、テロメアの短縮が誘導され得るか否かを判定するために、ALT細胞系を治療濃度のAZTで処理した。AZT処理細胞系及び未処理細胞系におけるテロメア長を、テロメア特異的ペプチド核酸（PNA）プローブを用いたフローサイトメトリーによって測定した22,23。細胞周期分布を決定するために、細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色した22。AZT処置の14日後、いずれのALT細胞系もテロメア短縮、大量のアポトーシス及びG2停止を証明した（図2）。ALT細胞についてAZT誘導型テロメア短縮の特異性を確認するために、テロメラーゼについて陽性であることが知られるHeLa細胞系を同一の条件下でAZTで処理した。選択した濃度のAZTは、HeLa細胞におけるテロメア長又は細胞周期分布に何の効果も有しなかった（データは示されない）。
【００８７】
テロメア短縮及びDNA合成速度（動力）の変化を立証するために、U-2 OS細胞を異なる時間でAZT処理し、フローサイトメトリーで同時に分析した。DNA合成速度は5-ブロモデオキシウリジン（BdU）の組込みによって測定した24。結果（図3）は、進行性のテロメア短縮及びDNA合成の減少を示す。細胞周期分布、DNA合成及びテロメア長の変化は急速であり、AZT処理のわずか10日後に検出できたことに注目することが重要である。
【００８８】
同時にPI染色は、処理の後期での、AZT処理した細胞における未処理の細胞よりも高いDNA含量を証明した。この事実の合理的説明は、短いテロメアに誘導される染色体の末端同士の結合である12,26。AZT処理したALT細胞のアポトーシスの誘導は、U-2 OS及びSaos-2がp53＋/＋及びp53-/-癌細胞系の両者を示すことから、p53に独立のようである27。
【００８９】
テロメアDNAの滑り合成がGCV-TPによって阻害され得ること、及びテロメア短縮が誘導され得ることを立証するために、U-2 OS細胞を別に治療濃度のグアニン類似体であるガンシクロビル（GCV）でも処理した。未処理（図4a）及びGCV処理した細胞（図4b）におけるテロメア長を、上記のテロメア特異的PNAプローブを用いたフローサイトメトリーによって測定した。
【００９０】
細胞周期分布を決定するために、細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色した。0.3μg/mlの濃度のGCVによる処理の14日後、U-2 OS細胞はテロメア短縮、大量のアポトーシス（プログラム細胞死）及びG2停止を示した。
【００９１】
ヌクレオシド類似体（AZT及びGCV等）は宿主細胞内で一度その三リン酸形態へ変換されることに注意すべきである。例えば、当該技術分野で周知であるように、GCVは最初にGCV-一リン酸（GCV-MP）にリン酸化される。次いで、GCV-MPは内因性キナーゼによってGCV-二リン酸（GCV-BP）及びGCV-三リン酸（GCV-TP）にさらにリン酸化される。GCV-TPはデオキシリボースの3'OH、及びDNA鎖の伸長に必要な2'及び3'炭素間の結合を欠く。したがって、U-2 OS細胞又は他の宿主細胞中のゲノムへのGCV-TPの組込みはDNAポリメラーゼを阻害し、かつDNA鎖の停止を引き起こし、細胞のアポトーシスに導く。
【００９２】
テロメアの伸長が抑制された腫瘍はその腫瘍形成能を喪失することが報告されており12,26、AZTは既にAIDS治療のための臨床用途である。この開示は、AZTが最大30％の癌症例の治療に使用することができることを規定する。既に臨床実践中の他の幾つかのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、2',3'-ジデオキシイノシン（ddI）又は2',3'-ジデヒドロ-3'-デオキシチミジン（d4T））も使用することができた。
【００９３】
実施例2：L1逆転写酵素のアンチセンス阻害後の、テロメラーゼ陰性ALT細胞におけるテロメア短縮、G2停止及びアポトーシスの誘導
ALTがL1逆転写酵素のみによって指示されることを確認するために、U-2 OS細胞をセンス及びアンチセンス配向でヒトL1 ORF2の一部を含む発現構築物でトランスフェクトした。L1特異的逆転写酵素標的化アンチセンス構築物を以下のように作製した：RT-F（5'-ATG ACA GGA TCA ACT TCA CAC-3'）（配列番号8）、RT-R（5'-TCC TGC TTT CTC TTG TAG GCA-3'）（配列番号6）プライマー及び鋳型としてpBS-L1RP-EGFPプラスミドを用いてPCRを実施した。929bpのPCR産物をpTargetTベクター（Promega）にクローニングした。
【００９４】
インサートをセンス及びアンチセンス配向で含む組換え構築物をPlasmid Midi Kit（Qaigen）で精製し、XmnI（Promega）で消化し、そして「Lipofectamine」（Gibco）を製造者使用説明書に従って使用してU-2 OS細胞にトランスフェクトした。0.5mg/mlのG418（Gibco）を含む培地上での40日間の選別後、細胞を回収し、PNA及びPIで染色し、フローサイトメトリーで分析した22。L1逆転写酵素アンチセンス標的化の略図は図5に示される。
【００９５】
図6に提供されるデータは、アンチセンス構築物を保有する細胞が、予想通り大量のアポトーシス、G2停止及びテロメア短縮を証明したことを示す。対照的に、センス構築物を発現する細胞はテロメア長又は細胞周期に差異を示さなかった。
【００９６】
以下の材料及び手順を上記実施例で用いた：
細胞系：この研究で用いた全ての細胞系はAmerican Type Culture Collection (Rockville, MD)から取得した。細胞起源は骨肉腫（Saos-2及びU-2 OS）、肝臓（HEC-1）及び子宮頸部（HeLa）を含んだ。細胞をATCCの推奨に従って培養した。AZTによる細胞の処理のために、培地を0.2μMの3'-アジド-2',3'-ジデオキシチミジン（Sigma）で補充した28。
【００９７】
ドットブロッティング：総細胞RNAを「RNA-STA 60」溶液（Tel-Test, Inc.）を用いて単離した。30μgの総RNA及び特異的プローブとして「HRP North2South」（Pierce）で標識したpBS-L1RP-EGFPプラスミド29を製造者のプロトコールに従って用いて反応を実施した。
【００９８】
ブロモデオキシウリジンの組込み：BdU組込による細胞染色を、細胞を10mM BrdU(Sigma)と共に2.5時間インキュベートし、BU-33抗BrdUモノクローナル抗体（Sigma）及びFITC標識したAlexa 488ヤギ抗マウスIgG(H＋L)（Fab'）フラグメント（Molecular Probes）で染色し、50μg/ml PI（Sigma）で逆染色（contrastain）し、記載されるように24フローサイトメトリーによって分析して実施した。
【００９９】
フローサイトメトリーによるテロメア長の測定：細胞をテロメア特異的FITCコンジュゲート化(C3TA2)3PNA（Applied Biosystems）プローブで染色し、記載されるように210.06μg/mlのPIで逆染色した。
【０１００】
アンチセンス戦略を用いたL1逆転写酵素の阻害：L1特異的逆転写酵素標的化アンチセンス構築物を作製するために、RT-F（5'-ATG ACA GGA TCA ACT TCA CAC-3'）（配列番号8）、RT-R（5'-TCC TGC TTT CTC TTG TAG GCA-3'）（配列番号6）プライマー及び鋳型としてpBS-L1RP-EGFPプラスミドを用いてPCRを実施した。929bpのPCR産物をpTargetTベクター（Promega）にクローニングした。センス及びアンチセンス配向でインサートを含む組換え構築物をPlasmid Midi Kit(Qaigen)で精製し、XmnI（Promega）で消化し、そして「Lipofectamine」（Gibco）を製造者使用説明書に従って使用してU-2 OS細胞にトランスフェクトした。0.5mg/mlのG418（Gibco）を含む培地上での40日間の選別後、細胞を回収し、PNAとPIで染色し、フローサイトメトリーによって分析した22。
【０１０１】
1〜29で番号付けされた下記の参考文献が上記記載中で（対応する上付き番号で）引用される。したがって当業者は参考文献を上記本文中の適当な上付き番号と一致させるだろう。
【０１０２】
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2007524668.tif 000005
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【０１０３】
明細書中で言及された全ての刊行物、特許及び特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願のそれぞれが参照により組み込まれるべきことが具体的にかつ個別に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み入れる。上記発明は理解の明確化の目的で説明及び例示によってある程度詳細に記載されているが、特定の変更及び改変が添付の特許請求の範囲の範囲内で実施され得ることは自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図1はALT及びテロメラーゼ陽性細胞系由来の細胞総RNAの、テロメア特異的プローブを用いたドットブロットである。1. U-2 OS、2. Saos-2、3. RNAなし、4. HEC-1、5. HeLa。
【図２】図2は、ALT細胞系のAZTによる処理の14日後の、テロメア長の減少、大量のアポトーシス及び細胞周期の変化を示す、フローサイトメトリーデータを図示する。細胞周期のG2期におけるテロメア特異的蛍光（（a）Saos-2、(b)U-2 OS細胞）。(c)Saos-2、(d)U-2 OS細胞における細胞周期分布22。未処理の細胞-灰色、処理-黒。
【図３】図3は、AZTを用いて異なる時間で処理したU-2 OS細胞におけるDNA合成速度、細胞周期分布及びテロメア長の変化を示す、フローサイトメトリーデータを図示する。a, b, c, d：それぞれ未処理並びに10、17及び40日間処理。細胞周期分布24-左。BdU組込み（FITC）染色及びPI24染色-中央。PNA-FITC及びPIによる染色-右。数はそれぞれG1及びG2期において恣意的な単位22（arbitrary unit）で測定したテロメア特異的蛍光を示す。
【図４】図4は、ガンシクロビル処理の14日後の、テロメア長の減少、大量のアポトーシス及び細胞周期の変化を示す、PNA-FITC及びPI染色フローサイトメトリーデータを図示する。(a)未処理U-2 OS細胞、(b)ガンシクロビル処理したU-2 OS細胞。
【図５】図5はL1逆転写酵素のアンチセンス標的化戦略の略図を示す。
【図６】図6は、40日間、L1標的化アンチセンス構築物でトランスフェクトしたU-2 OS細胞における細胞周期分布及びテロメア長の変化を示すフローサイトメトリーデータを図示する。(a)未処理、(b)センス構築物、(c)アンチセンス構築物。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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