(57)【要約】Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病に関連するタンパク質（本明細書において、「ＦＬＪ３２０２８」と称される）が単離される。タンパク質をコードする単離された核酸、このタンパク質の少なくとも一部を認識するモノクローナル抗体の生成、及びＢ−ＣＬＬのための診断マーカー又は治療標的としてのこのタンパク質又はそれに対する抗体の使用もまた開示される。また、本発明の１つの局面において、哺乳動物中で慢性リンパ球性白血病細胞の存在を検出する方法が提供され、この方法は、（ａ）前記哺乳動物から採取される細胞の試験サンプル、及び（ｂ）同じ細胞型の正常サンプルのコントロールサンプルにおけるＦＬＪ３２０２８の発現レベルを比較する工程を含む。
2007525195.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１に示されるアミノ酸配列（配列番号１）を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２】
図１に示されるヌクレオチド酸配列（配列番号２）に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項３】
図１に示されるヌクレオチド配列（配列番号２）の全長コード配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項４】
請求項１の核酸を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
前記細胞が原核細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項７】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞が昆虫細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が大腸菌である、請求項５の宿主細胞。
【請求項１１】
前記細胞が酵母細胞である、請求項５の宿主細胞。
【請求項１２】
ポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で請求項５の宿主細胞を培養する工程と、前記細胞の培養物から前記ポリペプチドを回収する工程を含む、前記ポリペプチドを産生する方法。
【請求項１３】
図１に示されるアミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
非相同のアミノ酸配列に融合する請求項１３に記載のポリペプチドを含むキメラ分子。
【請求項１５】
前記非相同のアミノ酸配列がエピトープ標識配列である、請求項１３のキメラ分子。
【請求項１６】
前記非相同のアミノ酸配列が免疫グロブリンのＦｃ領域である、請求項１３のキメラ分子。
【請求項１７】
請求項１３に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は単鎖抗体である、請求項１７の抗体。
【請求項１９】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１７の抗体。
【請求項２０】
前記抗体がネズミ抗体である、請求項１７の抗体。
【請求項２１】
前記抗体が配列番号１０を含む、請求項１７の抗体。
【請求項２２】
前記抗体が配列番号１２を含む、請求項１７の抗体。
【請求項２３】
前記抗体が配列番号１３〜３３のいずれかを含む、請求項１７の抗体。
【請求項２４】
請求項１７に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
前記単離された核酸が、配列番号９で示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項２４に記載の単離された核酸。
【請求項２６】
前記単離された核酸が、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項２４に記載の単離された核酸。
【請求項２７】
請求項２４の核酸を含むベクター。
【請求項２８】
請求項２７のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２９】
抗体を発現させるのに適切な条件下で請求項２８の宿主細胞を培養する工程と、前記細胞の培養物から前記抗体を回収する工程を含む、前記抗体を産生する方法。
【請求項３０】
細胞と抗ＦＬＪ３２０２８抗体とを接触させる工程を含む、慢性リンパ球性白血病細胞を同定する方法。
【請求項３１】
哺乳動物中で慢性リンパ球性白血病細胞の存在を検出する方法であって、当該方法は、（ａ）前記哺乳動物から採取される細胞の試験サンプル、及び（ｂ）同じ細胞型の正常サンプルのコントロールサンプルにおけるＦＬＪ３２０２８の発現レベルを比較する工程を含み、ここで、前記ＦＬＪ３２０２８発現レベルがコントロールサンプルと比較して前記試験サンプルにおいて高いことが、前記哺乳動物におけるリンパ性白血病細胞の存在の指標である、方法。
【請求項３２】
配列番号２を含むヌクレオチドから誘導されるオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３３】
ＱＤＩＳＮＹ（配列番号３４）、ＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹ（配列番号３５）、ＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号３６）及びＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変軽鎖ＣＤＲ１領域を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３４】
ＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号３８）、ＤＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号３９）、ＧＹＴＦＴＤＹＥＶＨ（配列番号４０）、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＮ（配列番号４１）、ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＳ（配列番号４２）、ＧＦＮＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４３）、ＧＹＴＦＴＮＳＷＩＨ（配列番号４４）、ＧＦＮＩＫＤＴＹＭＮ（配列番号４５）、ＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号４６）、ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４７）及びＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号４８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変重鎖ＣＤＲ１領域を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３５】
ＹＴＳ（配列番号４９）、ＦＭＳ（配列番号５０）、ＷＡＳ（配列番号：５１）及びＫＶＳ（配列番号：５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変軽鎖ＣＤＲ２領域を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３６】
ＧＩＤＰＥＩＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号：５３）、ＧＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＬＫＧ（配列番号５４）、ＧＩＤＰＥＳＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５５）、ＲＩＤＰＡＮＮＮＴＮＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号５６）、ＭＩＤＰＡＮＧＮＴＱＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号５７）、ＳＩＳＳＧＧＴＴＹＹＬＤＳＶＫＧ（配列番号５８）、ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号５９）、ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号６０）、ＹＩＨＰＧＰＧＹＴＥＹＮＱＮＦＫＤ（配列番号６１）、ＧＩＤＰＡＮＤＮＴＥＹＶＰＫＦＱＧ（配列番号６２）、ＧＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６３）、ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号６４）及びＧＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変重鎖ＣＤＲ２領域を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３７】
ＱＱＧＮＴＬＰＦＴＦＧＳＧ（配列番号６６）、ＱＱＬＶＥＹＰＬＴＦＧＡＧ（配列番号６７）、ＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧ（配列番号６８）、ＱＱＹＹＳＹＰＬＴＩＧＡＧ（配列番号６９）及びＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧ（配列番号７０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３８】
ＦＡＹ（配列番号７１）、ＧＶＹ（配列番号７２）、ＧＡＤ（配列番号７３）、ＧＧＹＦＤＹ（配列番号７４）、ＳＥＴＮＹ（配列番号７５）、ＨＥＧＤＷＦＡＹ（配列番号７６）、ＨＥＧＮＷＦＡＹ（配列番号７７）、ＧＧＤＷＧＹ（配列番号７８）、ＧＧＹＦＤＹ（配列番号７９）、ＷＤＹ（配列番号８０）、ＱＧＥＮＲＦＡＹ（配列番号８１）及びＳＬＰ（配列番号８２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変重鎖ＣＤＲ３領域を含む、請求項１７に記載の抗体。
【請求項３９】
配列ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４７）を有する重鎖ＣＤＲ１領域を含む抗体。
【請求項４０】
配列ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号５９）を有する重鎖ＣＤＲ２領域を含む抗体。
【請求項４１】
配列ＱＧＥＮＲＦＡＹ（配列番号８１）を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体。
【請求項４２】
配列ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４７）を有する重鎖ＣＤＲ１領域を含む抗体、配列ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号５９）を有する重鎖ＣＤＲ２領域を含む抗体、及び配列ＱＧＥＮＲＦＡＹ（配列番号８１）を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、それぞれ米国仮出願番号第６０／４７５，１５６号及び第６０／５３０，０９４号（２００３年６月２日及び２００３年１２月１５日に出願）に対する優先権を主張し、その開示全体が、参考として本願明細書中に組み込まれる。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の技術分野）
本発明の開示は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病に関連する単離されたタンパク質（「ＦＬＪ３２０２８」と称される）に関する。タンパク質をコードする単離された核酸、このタンパク質の少なくとも一部分を認識するモノクローナル抗体の生成、及びＢ−ＣＬＬのための診断マーカー又は治療標的としてのこのタンパク質又はそれに対する抗体の使用もまた開示される。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の背景）
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（「Ｂ−ＣＬＬ」）は、白血球の疾患である。それは、西半球のもっとも一般的な白血病の形態である。Ｂ−ＣＬＬの顕著な特徴は、ゆっくり増殖するが、延長された寿命を有する悪性ＣＤ５＋Ｂリンパ球の増殖である。
【０００４】
Ｂ−ＣＬＬは、全ての白血病のほぼ３０％を占める。５０歳以上の個人においてより頻繁に起こるけれども、より若い人々においてますます見られている。Ｂ−ＣＬＬは、Ｂ１様表現型（ＣＤ５＋、ＣＤ１９＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ７９ｂ−ｓＩｇｌｏｗ）を有する成熟Ｂ細胞のクローン展開によって特徴付けられる。これらの細胞は、正常なＢ細胞レセプター（「ＢＣＲ」）シグナリングを欠失しており、非機能性であり、反応不顕性である。Ｂリンパ球は通常、感染とたたかうが、Ｂ−ＣＬＬにおいて、血液、骨髄及びリンパ節中で蓄積するように機能する。通常の骨髄及び血液細胞の産生が損なわれ、患者はしばしば重篤な貧血症及び血小板数の低下を経験する。これは、白血球数の減少に起因して致命的な出血の危険があり、重篤な感染が進行する危険がある。
【０００５】
慢性リンパ球性白血病（「ＣＬＬ」）の患者を予後に基づいて２つのグループに分けることができることが示された。患者のおよそ５０％は、体細胞において変異したＶＨ遺伝子を有する悪性細胞を有する。これらの患者は、一般に、良好な予後を有し（平均２６年の生存期間）、任意の処置を必要としない。他の５０％は、変異していない生殖系列ＶＨ遺伝子を有する悪性細胞を有する。これらの患者は、一般に、予後が不良であり（平均８年の生存期間）、応急処置を必要とする。第２のグループに関連する他の好適でない予後の指標は、高い割合のＣＤ３８＋細胞の存在、変異ｐ５３の存在、活性化Ｂ細胞に類似した遺伝子発現プロフィールである。
【０００６】
最近、モノクローナル抗体療法を用いてリスクの大きいＢ−ＣＬＬ患者を処置することにおけるいくつかの成功があった。１つの薬物であるＡｌｅｍｔｕｚａｍａｂ（Ｃａｍｐａｔｈ又は抗ＣＤ５２）は、化学療法にうまく応答しない患者のために承認され、第２の薬物であるＲｉｔｕｘｉｍａｂ（抗ＣＤ２０）は、臨床実験においていくつかの有効性を示した。しかしなから、さらに高い発現レベル及び／又はさらに高い特異性を有するＢ−ＣＬＬに関連する細胞表面マーカーを開発することは依然として必要なままである。このようなマーカーに対するモノクローナル抗体は、既存の治療用抗体より大きな有効性を有し、より低い副作用を有する場合がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（概要）
ｃＤＮＡクローンは、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病に関連する細胞表面タンパク質（本願明細書中で「ＦＬＪ３２０２８」と示される）であると考えられる新規なポリペプチドをコードすることが同定された。
【０００８】
一実施形態では、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む単離された核酸分子が提供される。
【０００９】
１つの態様では、（ａ）２１〜約１８３のアミノ酸残基の配列を有するＦＬＪ３２０２８ポリペプチド（図１（配列番号１）を含む）をコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有するＤＮＡを含む単離された核酸分子が提供される。
【００１０】
別の態様では、本開示は、約５０残基〜約２８０の核酸の相補体に対してハイブリダイズするＤＮＡを含むＦＬＪ３２０２８ポリペプチド（図１（配列番号２）を含む）をコードする単離された核酸分子に関する。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション下及び洗浄条件下で行うことが好ましい。
【００１１】
さらなる態様では、本開示は、（ａ）ヒトタンパク質ＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有するＤＮＡを含む単離された核酸分子に関する。特に有用な実施形態では、核酸は、ヒトタンパク質ＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。
【００１２】
なおさらなる態様では、本開示は、（ａ）２１〜約１８３のアミノ酸残基の配列（図１（配列番号１）を含む）、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体に対して少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有するＤＮＡを含む単離された核酸分子が提供される。
【００１３】
さらなる態様では、本開示は、試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する場合、少なくとも約５０のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドを有し、（ａ）２１〜約１８３のアミノ酸残基の配列（図１（配列番号１）を含む）を有するＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体を用いてストリンジェントな条件下で試験ＤＮＡ分子をハイブリダイズし、試験ＤＮＡ分子を単離することによって産生される、単離された核酸分子に関する。
【００１４】
特定の態様では、本開示は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、Ｎ−末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを有するか又は有さず、その可溶性の、すなわち、膜貫通ドメインが失われているか又は不活性化された改変体を有するか又は有さず、又は核酸分子をコードするものに対して相補性である、単離された核酸分子を提供する。シグナルペプチドは、図１の配列（配列番号１）中のアミノ酸の約１位置〜アミノ酸の約２０位置から延びるものとして暫定的に同定された。膜貫通ドメインは、ＦＬＪ３２０２８アミノ酸配列（図１、配列番号１）中のアミノ酸の約７５位置〜アミノ酸の約１００位置から延びるものとして暫定的に同定された。
【００１５】
別の態様では、本開示は、（ａ）２１〜約１８３のアミノ酸残基の配列（図１（配列番号１）を含む）と比較した場合に、少なくとも約８０％のポジティブスコア、好ましくは少なくとも約８５％のポジティブスコア、さらに好ましくは少なくとも約９０％のポジティブスコア、最も好ましくは少なくとも約９５％のポジティブスコアを有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補体を含む単離された核酸分子に関する。
【００１６】
別の実施形態は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用を発見し得る配列をコードするＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのフラグメントに関する。このような核酸フラグメントは、約２０〜約８０のヌクレオチド長、好ましくは約２０〜約６０ヌクレオチド長、さらに好ましくは約２０〜約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０〜約４０ヌクレオチド長である。
【００１７】
別の実施形態では、本開示は、上に定義される単離された核酸配列のいずれかによってコードされる単離されたＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを提供する。
【００１８】
特定の態様では、本開示は、単離されたネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを提供し、一実施形態では、２１〜約１８３残基のアミノ酸配列（図１、配列番号１）を含む。
【００１９】
別の態様では、本開示は、２１〜約１８３残基のアミノ酸配列（（図１、配列番号１）を含む）に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離されたＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに関する。
【００２０】
さらなる態様では、（図１、配列番号１）の２１〜約１８３残基のアミノ酸配列と比較した場合に、少なくとも約８０％ポジティブスコア、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブスコア、さらに好ましくは少なくとも約９０％ポジティブスコア、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブスコアを有するアミノ酸配列を含む、単離されたＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに関する。
【００２１】
なお別の態様では、本開示は、（図１、配列番号１）を含む２１〜約１８３残基のアミノ酸の配列、又は抗ＦＬＪ３２０２８抗体のための結合部位を提供するのに十分なそれらのフラグメントを含む、単離されたＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに関する。好ましくは、ＦＬＪ３２０２８フラグメントは、ネイティブＦＬＪ３２０２８フラグメントの定量的な生物学的活性を保持する。
【００２２】
なおさらなる態様では、本開示は、（ｉ）（ａ）試験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９０％配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％配列同一性を有する場合、（図１、配列番号１）の約２１〜約１８３残基のアミノ酸の配列を有するＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補体を用いてストリンジェントな条件下でＤＮＡ分子をハイブリダイズする工程、（ｉｉ）試験ＤＮＡ分子を含む宿主細胞を上記ポリペプチドを発現するのに適した条件下で培養する工程、及び（ｉｉｉ）上記細胞の培養物から上記ポリペプチドを回収する工程によって産生されるポリペプチドを提供する。
【００２３】
なお別の実施形態では、本開示は、ネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施形態では、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗ＦＬＪ３２０２８抗体である。
【００２４】
さらなる実施形態において、本開示は、ネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチドと候補分子とを接触させ、上記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることによる、ネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法に関する。
【００２５】
なおさらなる実施形態では、本開示は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド、又は上に定義されるようなアゴニスト又はアンタゴニストを、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
Ｉ．定義
用語「ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド」及び「ＦＬＪ３２０２８」は、本願明細書で使用される場合、ネイティブ配列ポリペプチド及びポリペプチド改変体（本明細書中にさらに記載される）を包含する本願明細書中に記載されるような特定のポリペプチド配列を指す。本願明細書に記載されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、種々の供給源、例えば、ヒト組織型由来又は別の供給源由来から単離されてもよいか、又は、組み換え方法又は合成方法によって調製されてもよい。
【００２７】
ＦＬＪ３２０２８は、タンパク質について共通に知られている任意のモチーフ内にない、すなわち、任意の他の公知のタンパク質にも似ていないため、仮定的タンパク質と考えられる。既知のヒトＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡ配列の分析は、ＦＬＪ３２０２８がＩａ型膜タンパク質であることを示す。ＦＬＪ３２０２８は、ＦＬＪ３２０２８と公共の遺伝子発現プロフィールデータベースと比較することによって、潜在的なＣＬＬ関連マーカーとして同定された。これらの比較は、ＦＬＪ３２０２８が他のヒト遺伝子に対して類似でないことを示した。しかしながら、ＧｅｎｂａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索は、マウス及びラットの配列の両方における遺伝子との維持性を明らかにする（図２を参照）。
【００２８】
「ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド」は、天然から誘導される対応するＦＬＪ３２０２８ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このようなネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、天然から単離することができるか、又は組換え手段又は合成手段によって製造することができる。用語「ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド」は、特定のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの天然に生じる切断された形態又は分泌された形態、ポリペプチドの天然に生じる改変体形態、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。種々の実施形態では、本願明細書中に開示されるネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長ネイティブ配列ポリペプチドである。
【００２９】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に含まないＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの形態を指す。通常、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドＥＣＤは、このような膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満有し、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有する。ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドについて同定される任意の膜貫通ドメインが、このような疎水性ドメインを同定するために当該技術分野で通常に使用される基準に従って同定されることが理解される。膜貫通ドメインの正確な境界は変動してもよいが、本願明細書中に最初に同定されるようなドメインの末端のいずれかで約５を越えないアミノ酸であり得る。任意に、従って、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの膜貫通ドメインは、本明細書中に同定されるような膜貫通ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれかの側に約５又はそれより少ないアミノ酸を含有してもよく、関連するシグナルペプチドを有しても有さなくてもよいこのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は本発明によって考察される。
【００３０】
本願明細書に開示されるさまざまなＦＬＪ３２０２８の「シグナルペプチド」の近似の位置は、本願明細書及び/又は添付の図面に示される。しかしながら、シグナルペプチドのＣ末端境界は変動してもよいが、本願明細書中に最初に同定されるようなシグナルペプチドのＣ末端境界のいずれかで約５を越えないアミノ酸であり得、シグナルペプチドのＣ末端境界は、このようなアミノ酸配列エレメントを同定するために当該技術分野で通常に使用される基準に従って同定されることが注記される（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：１−６（１９９７）及びｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅら、Ｎｕｄ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８３−４６９０（１９８６））。さらに、場合によっては、分泌されたポリペプチド由来のシグナルペプチドの開裂は均一であるというわけではなく、その結果１つより多い分泌された種類を生じることが認識される。これらの成熟ポリペプチドは、本願明細書中で同定されるようなシグナルペプチドのＣ末端境界の約５を越えないアミノ酸で開裂され、これらの成熟ポリペプチド及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明によって考察される。
【００３１】
「ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド改変体」は、本願明細書中で開示されるような全長ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドをもたないＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有するか又は有さないＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は本願明細書中に開示されるような全長ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列の任意の他のフラグメントと少なくとも約８０％同一性を有する上又は下に定義されるような活性ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを意味する。このようなＦＬＪ３２０２８ポリペプチド改変体は、例えば、全長ネイティブアミノ酸配列のＮ−末端又はＣ−末端で１つ以上のアミノ酸残基が付加され、又は欠失されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを含む。通常、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド改変体は、本願明細書中で開示されるような全長ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドをもたないＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有するか又は有さないＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は本願明細書中に開示されるような全長ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列の任意の他のフラグメントと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性を有し、最も好ましくはさらに好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常、ＦＬＪ３２０２８改変体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、しばしば少なくとも約２０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約４０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約６０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約７０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約８０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約９０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約１５０アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約２００アミノ酸長、さらにしばしば少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３２】
本願明細書において同定されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性割合（％）」は、必要な場合、配列同一性割合を最大化させるために配列を整列させ、配列同一性の一部分として任意の保存的置換とみなすことができないギャップを導入した後に、特定のＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一の候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性割合を決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野の技術内の種々の様式、例えば、公的に利用できるコンピュータ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアで達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたるアラインメントを最大化するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【００３３】
「ＦＬＪ３２０２８改変体ポリヌクレオチド」又は「ＦＥＪ３２０２８改変体核酸配列」は、以下に定義されるような活性ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードし、本願明細書中で開示されるような全長ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドをもたないＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有するか又は有さないＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は本願明細書中に開示されるような全長ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列の任意の他のフラグメントと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有する核酸分子を意味する。通常、ＦＬＪ３２０２８改変体ポリヌクレオチドは、本願明細書中で開示されるような全長ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドをもたないＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列、本願明細書中に開示されるようなシグナルペプチドを有するか又は有さないＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの細胞外ドメイン、又は本願明細書中に開示されるような全長ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列の任意の他のフラグメントと少なくとも約８０％の核酸配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性を有し、最も好ましくはさらに好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有する。改変体はネイティブヌクレオチド配列を包含しない。
【００３４】
通常、ＦＬＪ３２０２８改変体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、しばしば少なくとも約６０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約９０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約１２０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約１５０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約１８０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約２１０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約２４０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約２７０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約３００ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約４５０ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約６００ヌクレオチド長、さらにしばしば少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００３５】
本願明細書において同定されるＦＬＪ３２０２８をコードする核酸配列に対する「核酸配列同一性割合（％）」は、必要な場合、配列同一性割合を最大化させるために配列を整列させた後に、目的のＦＬＪ３２０２８核酸配列中のヌクレオチドと同一の候補配列中のヌクレオチドの割合として定義される。核酸配列同一性割合を決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野の技術内の種々の様式、例えば、公的に利用できるコンピュータ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアで達成することができる。
【００３６】
他の実施形態では、ＦＬＪ３２０２８改変体ポリヌクレオチドは、活性ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードし、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で、本願明細書中に開示されるような全長ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズ可能な核酸分子である。ＦＬＪ３２０２８改変体ポリペプチドは、ＦＬＪ３２０２８改変体ポリヌクレオチドによってコードされるものであってもよい。
【００３７】
用語「ポジティブ」は、上に記載されるように行われる配列比較の文脈で、同一ではないが類似の性質を有する、比較される配列中の残基を含む（例えば、保存的置換の結果として、以下の表１を参照）。本願明細書中の目的のために、ポジティブの％値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス中で決定されるように、（ａ）ネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列から誘導される配列を有する目的のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドアミノ酸配列アミノ酸残基と、目的の比較アミノ酸配列（すなわち、それに対してＦＬＪ３２０２８ポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列）との間ののポジティブスコアの数を（ｂ）目的のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのアミノ酸残基の全数で割ることによって決定される。
【００３８】
「単離される」は、本願明細書中で開示される種々のポリペプチドを記載するために使用される場合、同定され、分離され、及び／又はその天然環境の成分から回収されたポリペプチドを意味する。その天然環境の成分の汚染成分は、ポリペプチドの診断的使用又は治療的使用と典型的に干渉する物質であり、酵素、ホルモン類、及び他のタンパク質の溶質又は非タンパク質の溶質を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを用いてＮ−末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（２）クマシーブルー、好ましくは銀染色を用いた非還元条件又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドは、組換え細胞内に系中でポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００３９】
「単離された」ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードする核酸又は他のポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常関連する少なくとも１つの汚染核酸分子から同定され分離される核酸分子である。単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然に見出される形態又は設定以外である。それゆえに、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子は、天然細胞中に存在するような特定のポリペプチドをコードする核酸分子と区別される。しかし、単離されたポリペプチドをコードする核酸分子としては、通常ポリペプチドを発現する細胞中に含有されるポリペプチドをコードする核酸分子を含み、例えば、核酸分子は、染色体の位置において天然細胞の核酸分子とは異なる。
【００４０】
用語「コントロール配列」は、特に宿主生物において操作可能に結合したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適しているコントロール配列としては、例えば、プロモーター、任意にオペレーター配列、及びリボソーム結合部位が上げられる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００４１】
核酸は、別の核酸配列との機能性関係に配置される場合に、「操作可能に結合する」。例えば、プレシークエンス又は分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現する場合、ポリペプチドについてＤＮＡに操作可能に結合し；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に操作可能に結合し；又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に操作可能に結合する。一般的に「操作可能に結合する」は、分泌リーダーの場合には、結合するＤＮＡ配列は隣接しており、リーディング相において隣接していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接する必要はない。結合は、簡便な制限部位にライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、慣行的な実務に従って使用される。
【００４２】
用語「抗体」は、最も幅広い意味において使用され、特に、例えば、抗ＦＬＪ３２０２８モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、抗ＦＬＪ３２０２８抗体組成物、ポリエピトープ特異性を有する抗ＦＬＪ３２０２８の特異性、単鎖抗ＦＬＪ３２０２８抗体、及び抗ＦＬＪ３２０２８抗体のフラグメント（以下を参照）。用語「モノクローナル抗体」は、本願明細書中で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体、すなわち、集合を含む個々の抗体が、少量で存在し得る可能な天然に生じる変異以外は同一であることを指す。
【００４３】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に確定でき、通常、プローブ長さ、洗浄温度、及び塩濃度に依存して経験的に算出される。一般に、さらに長いプローブは、適切なアニーリングのためにさらに高い温度を必要とする一方、さらに短いプローブは、さらに低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖は、それらの融解温度より下で環境に存在する場合、変性ＤＮＡがリアニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望なホモロジーの程度が高いほど、使用可能な相対温度が高くなる。結果として、さらに高い相対温度が、反応条件をさらにストリンジェントにする傾向があり、一方、さらに低い相対温度は反応条件をそれほどストリンジェントにしない。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照。
【００４４】
「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書で定義されるように、以下の方法によって同定されてもよい：（１）洗浄するために低イオン強度及び高温を使用する、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で；（２）ハイブリダイゼーションの間、変性剤（例えばホルムアミド）を使用する、例えば、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）と７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム、４２℃で；又は（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、音波破砕したサーモン精液ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％硫酸デキストラン、４２℃で、さらに、４２℃で洗浄、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）及び５０％ホルムアミド、５５℃で、その後ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄。
【００４５】
「適度にストリンジェントな条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されるように同定されてもよく、上に記載されるような条件よりもストリンジェントでない洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。適度にストリンジェントな条件の例は、以下：２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌ変性サーモン精液ＤＮＡを含む溶液中での３７℃で一晩インキュベーション、その後約３７〜５０℃で１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄である。プローブ長さ等のような因子を調整するのに必要なように、温度、イオン強度等を調整する方法を当業者は認識する。
【００４６】
用語「エピトープタグ化」は、本願明細書において使用される場合、「タグポリペプチド」に融合したＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、作成可能な抗体に対してエピトープを提供するのに十分な残基を有し、融合されるポリペプチドの活性と干渉しない程度に十分短い。タグポリペプチドは好ましくはまた、かなり固有であり、その結果、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しない。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常、約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは、約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。
【００４７】
本願明細書中で使用される場合、用語「免疫付着因子」は、異種タンパク質（付着因子）の結合特異性と免疫グロブリン不変ドメインのエフェクター機能とを併せ持つ抗体様分子を示す。構造的に、免疫付着因子は、抗原認識以外の所望な結合特異性を有するアミノ酸配列及び抗体の結合部位（すなわち、異種である）、及び免疫グロブリン不変ドメイン配列の融合を含む。免疫付着因子分子の付着因子部分は、典型的には、レセプター又はリガンドの結合部位を少なくとも含む隣接するアミノ酸配列である。免疫付着因子中の免疫グロブリン不変ドメイン配列は、任意の免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得られてもよい。
【００４８】
本願明細書における目的のための「活性な」又は「活性」は、ネイティブ又は天然に生じるＦＬＪ３２０２８の生物学的活性及び／又は免疫学的活性を保持するＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの形態を指し、「生物学的」活性は、ネイティブ又は天然に生じるＦＬＪ３２０２８によって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘発する能力以外のネイティブ又は天然に生じるＦＬＪ３２０２８によって生じる生物学的機能（阻害又は刺激のいずれか）を指し、「免疫学的」活性は、ネイティブ又は天然に生じるＦＬＪ３２０２８によって保有される抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘発する能力を指す。
【００４９】
用語「アンタゴニスト」は、最も幅広い意味において、部分的又は完全にブロックし、阻害し、又は本願明細書中に開示されるネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの生物学的活性を中和する任意の分子を含む。同様の様式で、用語「アゴニスト」は、最も幅広い意味において、本願明細書中に開示されるネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を含む。適切なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は、特にアゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は公害フラグメント、ネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのフラグメント又はアミノ酸配列改変体ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、有機低分子等を含む。ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドと候補アゴニスト又はアンタゴニスト分子とを接触させる工程と、通常ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに関連する１つ以上の生物学的活性における検出可能な変化を測定する工程とを含んでもよい。
【００５０】
「処置」は、治療的な処置及び予防薬又は予防手段の両方を指し、この目的は、標的かされた異常状態又は障害を予防するか又は遅延させる（減らす）ことである。処置が必要なものとしては、上記障害をすでに有するもの、及び障害を有するおそれがあるもの、又は障害が予防されるべきものが挙げられる。
【００５１】
「慢性」投与は、連続した期間のために最初の治療効果（活性）を維持するように、急性の様式に対する連続様式での薬剤の投与を指す。「断続的な」投与は、中断なしでなされる連続的にではなく、むしろ現実に周期的な処置である。
【００５２】
処置のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、ヒト、国内動物及び農場動物、及び動物園、スポーツ用動物又は愛がん動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００５３】
１つ以上のさらなる治療薬剤「と組み合わせた」投与は、同時（共存）投与及び任意の順序での連続的な投与を含む。
【００５４】
「キャリア」は、本願明細書において使用される場合、使用される投薬量及び濃度でそれらにさらされる細胞又は哺乳動物に対して非毒性な薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤又は安定化剤を含む。しばしば、生理的に受容可能なキャリアは、ｐＨ緩衝化水溶液である。生理的に受容可能なキャリアの例としては、バッファー、例えば、リン酸塩、シトラート及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量の（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；単糖、二糖及び他の炭水化物（ブドウ糖、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；糖アルコール、例えば、マンニトール又はソルビトール；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）が挙げられる。
【００５５】
「抗体フラグメント」は、一部のインタクトな抗体を含み、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖフラグメント；二重特異性抗体；直線抗体（Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；単鎖抗体分子；及び抗体フラグメントから形成されるマルチ特異抗体が挙げられる。
【００５６】
抗体ＦＬＪ３２０２８のパパイン消化により、２つの同じ抗原結合フラグメント（「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる）に分かれ、それぞれ、単一の抗原結合部位及び残基の「Ｆｃ」フラグメント（結晶化を容易にする能力を反映した命名）を有する。ペプシン処理により、２つの抗原をあわせた部位を有し、抗原を架橋可能なＦ（ａｂ’）２フラグメントを得る。
【００５７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は、件個に非共有的に関連する、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインからなる。この構造において、それぞれの可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を定義するように相互作用する。集合的に、６つのＣＤＲは、抗体に対する抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特有の３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）は、抗原を認識し結合する能力を有するが、結合部位全体よりも低いアフィニティーを有する。
【００５８】
Ｆａｂフラグメントはさらに、軽鎖の不変ドメイン及び重鎖の第１の不変ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域から１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基を付加することによってＦａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、不変ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’についての本願明細書中での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、元々、それらの間にヒンジシステインを有する一対のＦａｂ’フラグメントとして産生される。抗体フラグメントの他の化学カップリングもまた知られている。
【００５９】
任意の脊椎動物種由来の抗体の「軽鎖」（免疫グロブリン）は、それらの不変ドメインのアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる種類（カッパ及びラムダと呼ばれる）の１つに割り当てられる。
【００６０】
それらの重鎖の不変ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なる種類に割り当てることができる。５つの主な種類の免疫グロブリンが存在する：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、及びこれらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられてもよい。
【００６１】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単鎖ポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの観点から、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照。
【００６２】
用語「二重特異性抗体」は、２つの抗原結合部位を有し、このフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む小さな抗体フラグメントを指す。同じ鎖上の２つのドメインが短すぎて一対になることができないリンカーを用いることによって、このドメインは別の鎖の相補性ドメインと対になり、２つの抗原結合部位を作成する。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、ＦＬＪ３２０２８ｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに完全に記載される。
【００６３】
「単離された」抗体は、その天然環境の成分から同定され、分離され、及び／又は回収されるものである。その天然環境の汚染成分は、抗体のための診断的使用又は治療的使用と干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質の溶質又は非タンパク質の溶質を含んでもよい。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって決定される場合に９５重量％より多い重量％になるまで、最も好ましくは９９重量％より多い重量％になるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを用いてＮ−末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（３）クマシーブルー、好ましくは銀染色を用いた非還元条件又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体は、組換え細胞内に系中でポリペプチドを含む。しかしながら、通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００６４】
用語「ラベル」は、本願明細書において使用される場合、「標識化された」抗体を作成するように抗体に直接的又は間接的に接合する検出可能な化合物又は組成物を指す。ラベルは、単独で検出可能（例えば、放射性同位体ラベル又は蛍光ラベル）であるか、又は酵素ラベルの場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
【００６５】
「固相」とは、本発明の抗体が付着可能な非水性マトリックスを意味する。本願明細書において包含される固相の例としては、ガラス（例えば制御細孔ガラス）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから部分的又は完全に形成されるものが挙げられる。特定の実施形態では、内容に依存して、固相は、アッセイプレートのウェルを含むことができ；他方で、精製カラム（例えば、アフィニティークロマトグラフィーカラム）である。この用語はさらに、例えば、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されるような別個の粒子の不連続固相を含む。
【００６６】
「リポソーム」は、薬物（例えば、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド又はそれに対する抗体）を哺乳動物に送達するのに有用な種々の種類の脂質、ホスホリピド及び／又は界面活性剤で構成される小さなベシクルである。リポソームの成分は、生体膜の脂質配置と同様に、通常は二層形成において配置される。
【００６７】
「低分子」は、約５００ダルトン未満の分子量を有するものとして本願明細書中に定義される。
【００６８】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
本開示は、ＦＬＪ３２０２８として本願において称されるポリペプチドをコードする新しく同定され単離されたヌクレオチドを提供する。特に、さまざまなＦＬＪ３２０２８をコードするｃＤＮＡは、以下の実施例にさらに詳細に開示されるように、同定され、単離される。
【００６９】
以下の実施例に詳細に開示されるように、種々のｃＤＮＡクローンが調製される。これらのクローンの実際のヌクレオチド配列は、当該技術分野の通常の方法を用いて受託クローンを配列決定することによって、当業者によって容易に決定することができる。予測されたアミノ酸配列は、通常の技術を用いてヌクレオチド配列から決定することができる。ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに及び本願明細書中に記載されるコードする核酸について、同定されるときに入手可能な配列情報を用いて最良のリーディングフレームであると考えられる。
【００７０】
全長ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８は、図１及び配列番号１において示される。本願明細書中に記載される全長ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに加えて、ＦＬＪ３２０２８改変体が調製可能であると考察される。ＦＬＪ３２０２８改変体は、ＦＬＪ３２０２８  ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入すること、及び所望のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを合成することによって調製可能である。当業者は、アミノ酸の変化が、ＦＬＪ３２０２８の翻訳後プロセスを改変、例えば、グリコシル化部位の数又は位置を変更するか又は膜固着性を変更し得ることを理解する。
【００７１】
ネイティブ全長配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドにおける改変又は本願明細書中に記載されるＦＬＪ３２０２８の種々のドメインにおける改変は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載される保存的変異及び非保存的変異のための技術及びガイドラインのいずれかを用いてなすことができる。改変は、ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８と比較した場合にＦＬＪ３２０２８のアミノ酸配列における変化を生じるＦＬＪ３２０２８をコードする１つ以上のコドンの置換、削除又は挿入であってもよい。任意に、改変は、ＦＬＪ３２０２８のドメインの１つ以上における少なくとも１つのアミノ酸と任意の他のアミノ酸の置換によってである。所望の活性に影響を与えることなくアミノ酸残基が挿入され、置換され、又は欠失され得ることを決定する際のガイドラインは、ＦＬＪ３２０２８の配列と、既知の同種のタンパク質分子の配列とを比較し、高ホモロジーの領域中になされるアミノ酸変化の数を最小化することによって見出され得る。アミノ酸の置換は、１つのアミノ酸を同様の構造及び／又は化学的性質を有する別のアミノ酸と交換（例えば、ロイシンをセリンと交換、すなわち、保存的なアミノ酸交換）した結果であり得る。挿入又は欠失は、任意に、約１〜５アミノ酸の範囲であり得る。改変は、配列におけるアミノ酸の全体的に行う挿入、欠失又は置換によって、及び全長又は成熟ネイティブ配列によって示される活性について得られる改変体を試験することによって決定されてもよい。
【００７２】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドフラグメントは、本願明細書中で提供される。このようなフラグメントは、Ｎ−末端又はＣ−末端で切断されてもよいか、又は、例えば、全長ネイティブタンパク質と比較した場合、内部残基を欠失していてもよい。特定のフラグメントは、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの所望な生物学的活性に必衰ではないアミノ酸残基を欠失している。
【００７３】
ＦＬＪ３２０２８フラグメントは、多くの従来の技術のいずれかによって調製されてもよい。所望のペプチドフラグメントは、化学的に合成されてもよい。代替的なアプローチは、酵素による消化によって、例えば、特定のアミノ酸残基によって定義される部位でタンパク質を開裂するための既知の酵素を用いてタンパク質を処理することによって、又は適切な制限酵素を用いてＤＮＡを消化し、所望のフラグメントを単離することによってＦＬＪ３２０２８フラグメントを生成することを含む。さらに別の適切な技術は、所望のポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを単離し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することを含む。ＤＮＡフラグメントの所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’プライマー及び３’プライマーで使用される。好ましくは、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドフラグメントは、本願明細書中に開示されるネイティブＦＬＪ３２０２８ポリペプチドと少なくとも１つの共通の生物学的活性及び／又は免疫学的活性を有する。
【００７４】
特定の実施形態では、目的の保存的置換は、好ましい置換の見出しの下で表１に示される。このような置換が生物学的活性における変化を生じる場合、さらに実質的な変化、表１における命名された例示的な置換、又はアミノ酸分類に関して以下にさらに記載されるように、導入され、生成物がスクリーニングされる。
【００７５】
【表１】
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ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの機能又は免疫学的な同一性における実質的な改変は、（ａ）置換領域中のポリペプチド骨格の構造、例えば、シート形状又はらせん形状、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の大きさを維持しつつ、それらの効果において顕著な違いを有する置換を選択することによって達成される。天然に生じる残基は、一般の側鎖の性質に基づいてグループに分けられる：
（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
（２）中性の親水性：システイン、セリン、スレオニン；
（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；
（４）塩基性：アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、リシン、アルギニン；
（５）鎖配向に影響する残基：グリシン、プロリン；及び
（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。
【００７６】
非保存的置換は、これらの種類の１つのメンバーを別の種類のメンバーと交換することを伴う。これらの置換された残基はさらに、保存的置換部位に導入されてもよく、さらに好ましくは、残りの（非保存的）部位に導入されてもよい。
【００７７】
改変は、当該技術分野で既知の方法、例えば、オリゴヌクレオチドにより媒介される（部位指向型）突然変異生成、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異生成を用いてなすことができる。部位指向型突然変異生成（Ｃａｒｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７（１９８７））、カセット突然変異生成（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５））、制限選択突然変異生成（Ｗｅｌｌｓら、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６））又は他の既知の技術は、クローン化ＤＮＡ上で行うことができ、ＦＬＪ３２０２８改変体ＤＮＡを産生する。
【００７８】
スキャンニングアミノ酸分析はさらに、連続配列に沿って１つ以上のアミノ酸を同定するために使用することができる。スキャンニングアミノ酸の中で好ましいのは、比較的小さな中性アミノ酸である。このようなアミノ酸としては、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインが挙げられる。アラニンは、β炭素に側鎖を有さず、改変体の主鎖構造を変更すると思われないため、典型的に、このグループの中で好ましいスキャンニングアミノ酸である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。アラニンはさらに、最も一般的なアミノ酸であるため、典型的に好ましい。さらに、アラニンは、埋め込まれた位置及び露出した位置の両方に頻繁に見出される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１５０：１（１９７６））。アラニン置換により十分な量の改変体が得られない場合、等比体積のアミノ酸を使用することができる。
【００７９】
ＦＬＪ３２０２８の共有結合による修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合による修飾の１つの種類は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの標的化されたアミノ酸残基と、ＦＬＪ３２０２８の選択された側鎖又はＮ−末端又はＣ−末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とを反応させることを含む。二官能薬剤を用いた誘導体化は、例えば、ＦＬＪ３２０２８を抗ＦＬＪ３２０２８抗体を精製するための方法において使用するための水不溶性の支持マトリックス又は表面に架橋するために、及びその逆の反応のために有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、-１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能イミドエステル（ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含む）、二官能マレイミド、たとえば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン、及び薬剤、例えば、メチル−３（（ｐ−アジドフェニル）ジチオ）プロピオイミデートが挙げられる。
【００８０】
他の修飾としては、グルタミニル残基及びアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのアミド分解、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のａ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ−末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【００８１】
本発明の範囲内に含まれるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの共有結合による修飾の別の種類は、ポリペプチドのネイティブグリコシル化パターンを変えることを含む。「ネイティブグリコシル化パターンを変えること」は、本願明細書中の目的のために、ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８中に見出される１つ以上の炭化水素部分を欠失すること（内在するグリコシル化部位を除去することによるか、又は化学及び／又は酵素手段によってグリコシル化を欠失することのいずれかによる）、及び／又はネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味することが意図される。それに加えて、この句は、存在する種々の炭化水素部分の性質及び比率における変化を含む、ネイティブタンパク質のグリコシル化における質的な変化を含む。
【００８２】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに対するグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変えることによって達成されてもよい。変更は、例えば、ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８（Ｏ−結合したグリコシル化部位）に対する１つ以上のセリン又はスレオニン残基による付加、又は置換によってなされてもよい。ＦＬＪ３２０２８アミノ酸配列は、任意に、ＤＮＡレベルでの変化を介して、特にあらかじめ選択された塩基でＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させ、コドンが生成され、所望のアミノ酸に翻訳されることによって変更されてもよい。
【００８３】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド上の炭化水素部分の数を増やす別の手段は、ポリペプチドに対するグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによってである。このような方法は、当該技術分野で記載され、例えば、ＷＯ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載される。
【００８４】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド上に存在する炭化水素部分の除去は、化学的又は酵素的に達成されてもよいか、又はグリコシル化のための標的として役立つアミノ酸残基をコードするコドンの変異置換によって達成されてもよい。化学的脱グリコシル化技術は当該技術分野で既知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）及びＥｄｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載される。ポリペプチド上の炭化水素部分の酵素的開裂は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１３８：３５０（１９８７）によって記載されるような種々のエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成することができる。
【００８５】
ＦＬＪ３２０２８の共有結合による修飾の別の種類は、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載される様式で、種々の非プロトン性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンの１つに対するＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの結合を含む。
【００８６】
ＦＬＪ３２０２８はさらに、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＦＬＪ３２０２８を含むキメラ分子を形成する様式で修飾されてもよい。
【００８７】
一実施形態では、このようなキメラ分子は、ＦＬＪ３２０２８と抗タグ抗体が選択的に結合可能なエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的に、ＦＬＪ３２０２８のアミノ末端又はカルボキシル末端に配置される。ＦＬＪ３２０２８のこのようなエピトープタグ化形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの供給は、ＦＬＪ３２０２８が抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する別の種類のアフィニティーマトリックスを用いてアフィニティー精製によって容易に精製されることを可能にする。種々のタグポリペプチド及びそれらのそれぞれの抗体は、当該技術分野で周知である。例としては、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８：２１５９−２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれらに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６（１９８５）；及びヘルペス単純ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２（６）：５４７−５５３（１９９０））が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、フラッグペプチド（Ｈｏｐｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１２０４−１２１０（１９８８））；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４（１９９２））；α−チュブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６（１９９１））；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７（１９９０））が挙げられる。
【００８８】
代替の実施形態では、キメラ分子は、ＦＬＪ３２０２８と免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合を含んでもよい。キメラ分子の二価の形態（これは「免疫付着因子」とも称される）について、このような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対するものである。Ｉｇ融合は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１つの可変領域の代わりにＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの可溶性形態（膜貫通ドメインが欠失又は不活性化される）の置換を含む。特に好ましい実施形態では、免疫グロブリン融合としては、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合の製造についてはさらに、米国特許第５，４２８，１３０号（１９９５年６月２７日登録）も参照。
【００８９】
ＦＬＪ３２０２８の産生は、ＦＬＪ３２０２８核酸を含有するベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を培養することによって達成することができる。もちろん、その代替法（周知技術である）がＦＬＪ３２０２８を調製するために使用されてもよいことが考察される。例えば、ＦＬＪ３２０２８配列又はそれらの一部分は、固相技術を用いて直接ペプチド合成によって製造されてもよい（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４（１９６３）を参照）。インビトロで、手動技術を用いるか又はオートメーションによってタンパク質合成が行われてもよい。オートメーション化システムは、例えば、製造業者の指示を用いてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて達成されてもよい。ＦＬＪ３２０２８のさまざまな部分は、別個に化学的に合成され、化学的又は酵素的な方法をあわせて用いられ、全長ＦＬＪ３２０２８を産生してもよい。
【００９０】
ＦＬＪ３２０２８をコードするＤＮＡは、ＦＬＪ３２０２８ｍＲＮＡを保有し、検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得られてもよい。従って、ヒトＦＬＪ３２０２８ＤＮＡは、例えば実施例に記載されるように、ヒト組織から調製されるｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることが可能である。ＦＬＪ３２０２８をコードする遺伝子はさらに、ゲノムライブラリから得られてもよいか、又は既知の合成手順（例えば、オートメーション化核酸合成）によって得られてもよい。
【００９１】
ライブラリは、目的の遺伝子又はそれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、ＦＬＪ３２０２８に対する抗体又は少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）を用いてスクリーニングすることができる。選択されたプローブを用いてｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されるような標準的な手順を用いて行われてもよい。ＦＬＪ３２０２８をコードする遺伝子を単離するための代替的手段は、ＰＣＲ方法論を使用することである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５））。
【００９２】
以下の実施例は、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための技術を記載する。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、間違ったポジティブを最小化するのに十分な長さを持ち、及び十分に明確であるべきである。オリゴヌクレオチドは、好ましくは、スクリーニングされるライブラリ中でＤＮＡをハイブリダイゼーションする際に検出可能なように標識される。標識化の方法は当該技術分野で周知であり、３２Ｐ−標識化ＡＴＰのような放射能標識、ビオチン化又は酵素標識の使用が挙げられる。中程度のストリンジェンシー及び高ストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）中に提供される。
【００９３】
このようなライブラリスクリーニング方法で同定される配列を、ＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベース又は他の個人的な配列データベースに受託され、入手可能な他の既知の配列に対して比較し、整列させることができる。分子の定義された領域内又は全長配列にわたる配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかで）は、当該技術分野で公知及び本願明細書中に記載されるような方法を用いて決定することができる。
【００９４】
タンパク質コード配列を有する核酸は、最初に本願明細書中に開示される推定アミノ酸配列を用いて選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングし、必要な場合、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような従来のプライマー伸長手順を用いて、前駆体を検出し、ｃＤＮＡへ逆転写され得ないｍＲＮＡの中間体を加工することによって得られてもよい。
【００９５】
宿主細胞は、ＦＬＪ３２０２８産生について本願明細書中に記載される発現ベクター又はクローニングベクターを用いてトランスフェクト又は形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選択するか、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適切なように改変された従来の栄養培地中で培養される。培養条件、例えば、培地、温度、ｐＨ等は、過度な実験なく当業者によって選択することができる。一般に、細胞培養物の生産性を最大化するための原理、プロトコル、及び実用的な技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，ｅｄ．（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）中に見出すことができる。
【００９６】
原核生物のトランスフェクション及び真核細胞の細胞形質転換の方法は、当業者に公知であり、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソームによって媒介されるもの及びエレクトロポレーションである。使用される宿主細胞に依存して、形質転換は、このような細胞に対して適切な標準的な技術を用いて行われる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、一般的に、原核生物について使用される。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを用いた感染は、Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ，２３：３１５（１９８３）及びＷＯ８９／０５８５９（１９８９年６月２９日公開）によって記載されるように特定の植物細胞の形質転換のために使用される。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞について、Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿方法を使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系トランスフェクションの一般的な態様は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．，１３０：９４６（１９７７）及びＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：３８２９（１９７９）の方法に従って行われる。しかしながら、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞を用いる細菌プロトプラスト融合、又はポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンによる、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法が使用されてもよい。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術について、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５：５２７−５３７（１９９０）及びＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８−３５２（１９８８）を参照。
【００９７】
本明細書中でベクター中でＤＮＡをクローニング又は発現するための適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母又は高等真核細胞が挙げられる。適切な原核生物としては、限定されないが、真正細菌（例えばグラム陰性の又はグラム陽性の有機体）、例えば、腸内細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）が挙げられる。種々のＥ．ｃｏｌｉ株は公的に入手可能であり、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の適切な原核生物の宿主細胞としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ＦＬＪ３２０２８ｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、並びにＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６，７１０に開示されるＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ４１Ｐ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これらの例は、限定よりもむしろ例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物発酵のための一般的な宿主株であるため、１つの特に好ましい例又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は、最少量のタンパク分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に対して内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子突然変異を成し遂げるために改変されてもよく、このような宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株１Ａ２（完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株９Ｅ４（完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）（完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴｋａｎｒを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株３７Ｄ６（完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株４０Ｂ４（非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する株３７Ｄ６である）；及び米国特許第４，９４６，７８３号（１９９０年８月７日登録）に開示される変異ペリプラスムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられる。あるいは、クローニングのインビトロ方法では、例えば、ＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適している。
【００９８】
原核生物に加えて、真核生物微生物、例えば糸状菌又は酵母は、ＦＬＪ３２０２８をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に使用されるさらに低い真核生物宿主微生物である。他のものとしては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０（１９８１）；ＥＰ１３９，３８３（１９８５年５月２日公開））；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５（１９９１））、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ，ＣＢＳ６８３，ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２（１９８３））、Ｋ  ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２８：２６５−２７８（１９８８））；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３（１９７９））；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｎｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ＥＰ３９４，５３８（１９９０年１０月３２日公開））；及び糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（ＷＯ９１／００３５７（１９９１年１月１０日公開））、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９（１９８３）；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１（１９８３）；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４（１９８４））及びＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５４７９（１９８５））が挙げられる。メチロトローフ酵母は本発明において適切であり、限定されないが、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、及びＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる群から選択されるメタノール上で増殖可能な酵母が挙げられる。この種類の酵母の例である特定の種類のリストは、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ，２６９（１９８２）中に見出されてもよい。
【００９９】
グリコシル化ＦＬＪ３２０２８を発現するための適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎細胞の例としては、昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９、及び植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞が挙げられる。より特定の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されるサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞又は懸濁培養物中で増殖するためにサブクローン化した２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；及びマウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、本技術の範囲内であると考えられる。
【０１００】
ＦＬＪ３２０２８をコードする核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクターに挿入されてもよい。種々のベクターは公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウィルス粒子又はバクテリオファージの形態であってもよい。適切な核酸配列は、種々の手順によってベクターに挿入されてもよい。一般に、ＤＮＡは、当該技術で公知の技術を用いて適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般的に、限定されないが、１つ以上のシグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写停止配列が挙げられる。１つ以上のこれらの成分を含有する適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準的なライゲーション技術を使用する。
【０１０１】
ＦＬＪ３２０２８は、直接的だけではなく、成熟タンパク質又はポリペプチドのＮ−末端で特定の開裂部位を有するシグナル配列又は他のポリペプチドであってもよい異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組換え的に産生されてもよい。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよいか、又はベクターに挿入されるＦＬＪ３２０２８をコードするＤＮＡの一部分であってもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ、又は耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であってもよい。酵母分泌について、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓα−因子リーダーを含む、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載される）、又は酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（ＥＰ３６２，１７９、１９９０年４月４日公開）、又はＷＯ９０／１３６４６（１９９０年１１月１５日に公開）に記載されるシグナルであってもよい。哺乳動物細胞発現では、哺乳動物シグナル配列は、タンパク質、例えば、同じ種類又は関連種類の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、及びウイルス分裂リーダーの分泌を指向するために使用されてもよい。昆虫白血球細胞発現が使用される代替の実施形態では、シグナル配列は、バキュロウイルスエンベロープタンパク質ｇｐ６７由来であることができる。
【０１０２】
発現ベクター及びクローニングベクターの両方は、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含有する。このような配列は種々のバクテリア、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起源は、ほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起源は酵母に適しており、種々のウイルス起源（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞においてベクターをクローニングするのに有用である。
【０１０３】
発現ベクター及びクローニングベクターは、典型的には、選択遺伝子（選択可能なマーカーと称される）を含有する。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質および他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、又はテトラサイクリンに対する耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠乏症を補完し、又は（ｃ）複合培地から入手できない重要な栄養分、例えば、ＢａｃｉｌｌｉのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【０１０４】
哺乳動物のための適切な選択可能なマーカーの例は、ＦＬＪ３２０２８をコードする核酸、例えば、ＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼを採取可能な細胞の同定を可能にする。野生型ＤＨＦＲが使用される場合、適切な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０）によって記載されるように調製され、繁殖される、ＤＨＦＲ活性をもたないＣＨＯ細胞株である。酵母において使用するための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ，２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ，７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ，１０：１５７（１９８０））。ｔｒｐ１遺伝子ＦＬＪ３２０２８は、トリプトファン中で増殖する能力を持たない酵母の突然変異株のための選択マーカーを提供する（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８５：１２（１９７７）））。
【０１０５】
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、ｍＲＮＡ合成をするためにＦＬＪ３２０２８をコードする核酸配列に操作可能に結合するプロモーターを含有する。種々の潜在的な宿主細胞によって認識されるプロモーターが周知である。原核生物宿主を用いるために適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：５４４（１９７９））、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，８：４０５７（１９８０）；ＥＰ３６，７７６）、及びハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーター（ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５（１９８３））が挙げられる。細菌系で使用するためのプロモーターはさらに、ＦＬＪ３２０２８をコードするＤＮＡに操作可能に結合するＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ）配列を含有する。
【０１０６】
酵母宿主を用いて使用するための適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：２０７３（１９８０））又は他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．，７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：４９００（１９７８））、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼが挙げられる。
【０１０７】
増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘発可能なプロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセリンアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域である。酵母発現において使用するための適切なベクター及びプロモーターは、ＥＰ７３，６５７においてさらに記載される。
【０１０８】
哺乳動物宿主細胞におけるベクター由来のＦＬＪ３２０２８転写は、例えば、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーターから、及び熱ショックプロモーターから、ウイルス（例えば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス（ＵＫ２，２１１，５０４（１９８９年７月５日公開））、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターによって制御されるが、但し、これらのプロモーターは宿主細胞系と適合性である。
【０１０９】
さらに高い真核生物によるＦＬＪ３２０２をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させてもよい。エンハンサーは、その転写を高めるために-プロモーター上で作用する通常は約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのｃｉｓ−作用エレメントである。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物の遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点（ｂｐ１００〜２７０）の後ろ側のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、ＦＬＪ３２０２８コード配列に対して５’又は３’位でベクターに接合されるが、好ましくは、プロモーターから５’部位に配置される。
【０１１０】
真核生物宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒト又は他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはさらに、転写を停止させるため、及びｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列を含有する。このような配列は、通常は、真核生物又はウィルスＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’、及び時折３’、非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、ＦＬＪ３２０２８をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分中にポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含有する。
【０１１１】
組換え脊椎動物の細胞培養物におけるＦＬＪ３２０２８の合成に適応させるのに適切ななお他の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，２９３：６２０−６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ，２８１：４０４６（１９７９）；ＥＰ１１７，０６０；及びＥＰ１１７，０５８に記載される。
【０１１２】
遺伝子増幅及び／又は発現は、例えば、適切な標識化プローブを用いて、本願明細書中で提供される配列に基づいて、ｍＲＮＡの転写を定量化するために従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Ｔｈｏｍａｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５（１９８０））、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又は系中ハイブリダイゼーションによってサンプル中で直接測定されてもよい。特に有用な実施形態では、リアルタイムＰＣＲは、発現を定量的に測定するために使用され、ここで、蛍光標識されたプライマーは、ＰＣＲを行うために使用され、蛍光は時間ごとに測定される（例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６（１０），ｐａｇｅｓ９９５−１００１（１９９６）；及びＨｅｉｄらＧｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６（１０），ｐａｇｅｓ９８６−９９４（１９９６）を参照）。あるいは、抗体は、特定の二本鎖（ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖ハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む）を認識可能なように使用されてもよい。抗体は、順に標識されてもよく、アッセイは、二本鎖が表面に結合して、その表面上で二本鎖が形成する際にで行われてもよく、二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
【０１１３】
あるいは、遺伝子発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量するために、免疫学的方法、例えば、細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養物及び体液のアッセイによって測定されてもよい。免疫組織化学的染色及び／又はサンプル液のアッセイに有用な抗体は、モノクローナル又はポリクローナルのいずれでもよく、任意の哺乳動物中で産生されてもよい。逆に、抗体は、ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに対して、又は本発明において提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して、又はＦＬＪ３２０２８  ＤＮＡに融合し、特定の抗体エピトープをコードする外因性配列に対して産生されてもよい。
【０１１４】
ＦＬＪ３２０２８の形態は、培地又は宿主細胞溶解液から回収されてもよい。膜結合の場合、適切な洗浄溶液（例えば、トリトン−Ｘ１００）を用いるか又は酵素開裂によって膜から放出することができる。ＦＬＪ３２０２８の発現において使用される細胞は、種々の物理的手段又は化学的手段、例えば、凍結−融解サイクル、音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤によって破壊することができる。
【０１１５】
組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＦＬＪ３２０２８を精製することが望ましい場合がある。以下の手順は、適切な精製手順の例である：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂（例えばＤＥＡＥ）でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、セファデックスＧ−７５を用いるゲルろ過；汚染物質（例えばＩｇＧ）を除去するためのタンパク質Ａセファロースカラム；及びＦＬＪ３２０２８のエピトープ−タグ化形態を結合するための金属キレート化カラム。タンパク質精製の種々の方法が使用されてもよく、このような方法は当該技術分野で公知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に記載される。選択される精製ステップは、例えば、使用される製造プロセスの性質に依存し、特にＦＬＪ３２０２８が製造される。
【０１１６】
ＦＬＪ３２０２８をコードするヌクレオチド配列（又はそれらの相補体）は、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において、ハイブリダイゼーションとしての使用を含む分子生物学の分野で種々の適用を有する。ＦＬＪ３２０２８核酸はさらに、本願明細書中で記載される組換え技術によるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの産生において有用である。
【０１１７】
全長ネイティブＦＬＪ３２０２８遺伝子又はそれらの部分は、全長ＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡを単離するため、又は本願明細書中で開示されるネイティブＦＬＪ３２０２８配列に対して望ましい配列同一性を有する他のｃＤＮＡ（例えば、ＦＬＪ３２０２８の天然に生じる改変体をコードするもの又は他の種由来のＦＬＪ３２０２８）を単離するためにｃＤＮＡライブラリのためのハイブリダイゼーションプローブとして使用されてもよい。任意に、プローブの長さは、約２０〜約５０塩基である。ハイブリダイゼーションプローブは、全長ネイティブヌクレオチド配列の少なくとも部分的に新規な領域から誘導されてもよく、これらの領域は、過度な実験を行うことなく、ネイティブ配列ＦＬＪ３２０２８のプロモーター、エンハンサーエレメント及びイントロンから決定されてもよい。例として、スクリーニング方法は、約４０塩基の選択されたプローブを合成するために既知のＤＮＡ配列を用いてＦＬＪ３２０２８遺伝子のコード領域を単離する工程を含む。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のラベル、例えば、放射性ヌクレオチド（例えば３２Ｐ又は３５Ｓ）又は酵素標識（例えばアビジン／ビオチンカップリングシステムを介してプローブに結合するアルカリホスファターゼ）によって標識されてもよい。本発明のＦＬＪ３２０２８遺伝子に対して配列相補性を有する標識化されたプローブは、ライブラリのメンバーがプローブをハイブリダイズするか否かを決定するためにヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリをスクリーニングするために使用することができる。
【０１１８】
本願明細書において開示される任意のＥＳＴ配列は、本願明細書中で開示される方法を用いて、同様にプローブとして使用されてもよい。
【０１１９】
他の有用なＦＬＪ３２０２８核酸のフラグメントとしては、ＦＬＪ３２０２８ｍＲＮＡ（センス）又はＦＬＪ３２０２８  ＤＮＡ（アンチセンス）配列を標的化するために結合可能な一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明にしたがって、ＦＬＪ３２０２８  ＤＮＡのコード領域のフラグメントを含む。このようなフラグメントは、一般に、少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４〜３０ヌクレオチドを含む。所与のタンパク質をコードするｃＤＮＡに基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Ｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８）及びｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８，１９８８）に記載される。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列に対する結合は、二本鎖の分解が高められ、転写又は翻訳が早期に停止することを含むいくつかの手段の１つによって標的配列の転写又は翻訳をブロックするか、又は他の手段により、二本鎖の形成を生じる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＦＬＪ３２０２８タンパク質の発現をブロックするために使用されてもよい。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドはさらに、改質糖ホスホジエステル骨格（又はＷＯ９１／０６６２９に開示されるような他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、このような糖結合は、内因性ヌクレアーゼに耐性である。このような耐性をもつ糖結合を有するオリゴヌクレオチドは、インビボで安定である（すなわち、酵素分解に耐え得る）が、ヌクレオチド配列を標的化するために結合可能な配列特異性を保持する。
【０１２０】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例としては、例えば、ＷＯ９０／１００４８に記載されるような有機部分に共有結合するオリゴヌクレオチド、及び標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドのアフィニティを増加させる他の部分（例えば、ポリ−（Ｌ−リシン））が挙げられる。なおさらに、挿入剤（例えばエリプチシン）、及びアルキル化剤又は金属錯体は、標的ヌクレオチド配列についてのセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を改変するためにセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合してもよい。
【０１２１】
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４により媒介されるＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション又はを含む任意の遺伝子導入方法によって、又は遺伝子導入ベクター（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）を用いることによって、標的核酸配列を含有する細胞に導入されてもよい。好ましい手順では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含有する細胞は、インビボ又はエキソビボのいずれかで組換えレトロウイルスベクターと接触する。適切なレトロウイルスベクターとしては、限定されないが、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶに由来するレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名された二重コピーベクター（ＷＯ９０／１３６４１を参照）が挙げられる。
【０１２２】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドはさらに、ＷＯ９１／０４７５３において記載されるように、リガンド結合分子との接合体を形成することによって標的ヌクレオチド配列を含有する細胞に導入されてもよい。適切なリガンド結合分子としては、限定されないが、細胞表面レセプター、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが挙げられる。又は、蛍光ミクロスフィア（「ｃｏｖａｓｐｈｅｒｅ」）リガンド：レセプター結合アッセイは、Ｂｒｏｗｎら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（１２），ｐａｇｅｓ３２２２−３２２８（１９９５）又はＰｒｅｓｔｏｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（８），ｐａｇｅｓ１９１１−１９１８（１９９７）に開示されるように使用することができる。好ましくは、リガンド結合分子の接合は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する能力と実質的に干渉しないか、又は細胞内にセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその接合された様式が入ることをブロックしない。
【０１２３】
又は、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８において記載されるように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によって、標的核酸配列を含有する細胞に導入されてもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性のリパーゼによって細胞内で分解する。
【０１２４】
アンチセンス又はセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、一般に、少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、又はそれ以上である。
【０１２５】
プローブはさらに、密接に関連したＦＬＪ３２０２８コード配列を同定するための配列のプールを作成するためにＰＣＲ技術において使用されてもよい。
【０１２６】
ＦＬＪ３２０２８をコードするヌクレオチド配列はさらに、ＦＬＪ３２０２８をコードする遺伝子をマッピングするために、及び遺伝障害を持つ個人の遺伝分析のために、ハイブリダイゼーションプローブを構築するために使用することができる。本発明で提供されるヌクレオチド配列は、既知の技術、例えば、系中ハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリを用いたハイブリダイゼーションスクリーニングを用いて、染色体及び染色体の特定の領域にマッピングされてもよい。
【０１２７】
ＦＬＪ３２０２８についてのコード配列が別のタンパク質に結合するタンパク質をコードする（例、ＦＬＪ３２０２８がレセプターとして機能する）場合、ＦＬＪ３２０２８は、結合相互作用に関与する他のタンパク質又は分子を同定するためのアッセイにおいて使用することができる。このような方法によって、レセプター／リガンド結合相互作用のインヒビターを同定することができる。このような結合相互作用に関与するタンパク質はさらに、ペプチド又は低分子インヒビター又は結合相互作用のアゴニストをスクリーニングするために使用することができる。さらに、レセプターＦＬＪ３２０２８は、相関リガンドを単離するために用いることができる。スクリーニングアッセイは、ネイティブＦＬＪ３２０２８又はＦＬＪ３２０２８についてのレセプターの生物学的活性を模倣するリード化合物を見つけるために設計することができる。このようなスクリーニングアッセイは、低分子薬物候補を同定するのに特に適切な化学ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。考察される低分子としては、合成有機化合物又は無機化合物が挙げられる。このアッセイは、当該技術分野で十分に特性決定されている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々のフォーマットで行うことができる。
【０１２８】
ＦＬＪ３２０２８をコードする核酸又はその改変形態はさらに、治療に有用な試薬の開発及びスクリーニングにおいて有用なトランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を作成するために使用することができる。トランスジェニック動物（例えば、マウス又はラット）は、導入遺伝子を含有する細胞を有する動物であり、導入遺伝子は、動物又は出生前、例えば、胎児段階の動物の原種に導入された。導入遺伝子は、細胞のゲノムに組み込まれるＤＮＡであり、そこからトランスジェニック動物が成長する。一実施形態では、ＦＬＪ３２０２８をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従ってＦＬＪ３２０２８をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、そのゲノム配列が、ＦＬＪ３２０２８をコードするＤＮＡを発現する細胞を含有するトランスジェニック動物を作成するために使用される。トランスジェニック動物、特に、動物（例えばマウス又はラット）を作成するための方法は、当該技術分野において一般的なものであり、例えば、米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号に記載されている。典型的に、特定の細胞は、組織特異的なエンハンサーを用いたＦＬＪ３２０２８導入遺伝子組み込みのために標的化される。動物の胚形成期の生殖細胞系に導入されたＦＬＪ３２０２８をコードする導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物は、ＦＬＪ３２０２８をコードするＤＮＡの発現を増加させる効果を試験するために使用することができる。このような動物は、例えば、保護形態、例えば、その過剰発現に関連する病的状態を与えると考えられる試薬についてのテスター動物として使用することができる。本発明の様相に従って、動物は試薬で処置され、導入遺伝子を有する未処置の動物と比較して、病的状態の発症が抑えられることは、病的状態の潜在的な治療への介入を示す。
【０１２９】
あるいは、ＦＬＪ３２０２８の非ヒトホモログは、ＦＬＪ３２０２８をコードする内因性遺伝子と、動物のＥＳ細胞に導入されたＦＬＪ３２０２８をコードする改変ゲノムＤＮＡとの間の同種組換えの結果として、ＦＬＪ３２０２８をコードする遺伝子がないか、又は改変されたＦＬＪ３２０２８「ノックアウト」動物を構築するために使用することができる。例えば、ＦＬＪ３２０２８をコードするｃＤＮＡは、確立された技術に基づいて、ＦＬＪ３２０２８をコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができる。ＦＬＪ３２０２８をコードするゲノムＤＮＡの一部分は、欠失されるか、又は別の遺伝子（例えば、組み込みをモニタリングするために使用可能な選択可能なマーカーをコードする遺伝子）によって交換することがでる。典型的に、改変されていないフランキングＤＮＡ（５’末端及び３’末端の両方で）の数千塩基は、ベクターに含まれる（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３（１９８７）ｆｏｒ  ａ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓを参照）。ベクターは、（例えば、エレクトロポレーションによって）ＥＳ細胞株に導入され、導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと同種組換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉら、Ｃｅｌｌ，６９：９１５（１９９２）を参照）。次いで、選択された細胞は、動物（例えば、マウス又はラット）の尾胞に注射され、凝集キメラが形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７），ｐｐ．１１３−１５２）。次いで、キメラ胚を適切な擬似妊娠させたメスの親動物に移植し、胚からそれらの細菌の相同組換えＤＮＡを有している「ノックアウト」動物の子孫が作成され、これは標準的な技術によって同定することができ、これを使用して動物のすべての細胞が相同組換えＤＮＡを含有する動物を出生させることができる。ノックアウト動物は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドが存在しないことに起因して、例えば、特定の病的状態に対してたたかう能力、及び病的状態を進行させる能力によって特徴付けられる。
【０１３０】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードする核酸はさらに、遺伝子治療において使用されてもよい。遺伝子治療の適用において、治療に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する目的で、遺伝子は、例えば欠失遺伝子の交換のために細胞に導入される。「遺伝子治療」は、治療に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回投与又は繰り返し投与を含む、永続効果が１回の処置によって達成され、遺伝子治療薬剤の投与によって達成される従来の遺伝子治療の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、インビボで特定の遺伝子の発現をブロックする治療薬剤として使用することができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドが、細胞膜による取り込みが制限されることによって細胞内濃度が低くなるもかかわらず、細胞に入れられ、それらがインヒビターとして作用することはすでに示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：４１４３−４１４６（１９８６））。オリゴヌクレオチドは、例えば、負電荷をもつホスホジエステル基を電荷をもたない基に置換することによって、その取り込みを高めるために改変することができる。
【０１３１】
核酸を生菌に導入するのに利用可能な種々の技術が存在する。この技術は、核酸が培養された細胞にインビボで移されるか否か、又はインビボで意図される宿主に移されるか否かに依存して変動する。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移すために適切な技術としては、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等が挙げられる。現時点で好ましいインビボの遺伝子移動技術としては、ウィルス（典型的にレトロウイルス）ベクターを用いるトランスフェクション及びウイルスコートタンパク質−リポソームで媒介されるトランスフェクションが挙げられる（Ｄｚａｕら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１，２０５−２１０（１９９３））。いくつかの状況では、標的細胞を標的化する薬剤（例えば、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞についてのレセプターのためのリガンド等）を用いて核酸供給源を提供することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、カプシドタンパク質又は特定の細胞種に影響を及ぼすそれらのフラグメント、サイクリングにおいて内在化を受けるタンパク質のための抗体、細胞内局在化を標的化し、細胞内半減期を高めるタンパク質の取り込みを標的化及び／又は容易にするために使用されてもよい。レセプターにより媒介されるエンドサイトーシスは、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２（１９８７）；及びＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７，３４１０−３４１４（１９９０）によって記載される。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコルの総括については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６，８０８−８１３（１９９２）を参照。
【０１３２】
本願明細書において記載されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドはさらに、タンパク質電気泳動の目的のために分子量マーカーとして使用されてもよく、単離された核酸配列は、これらのマーカーを組換え発現するために使用されてもよい。
【０１３３】
本願明細書において記載されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードする核酸分子又はそれらのフラグメントは、染色体同定のために有用である。この観点において、実際の配列データが現在入手可能なものに基づく染色体マーキング試薬は比較的少ないため、新規染色体マーカーを同定する必要性がなお存在する。本発明の各ＦＬＪ３２０２８核酸分子は、染色体マーカーとして使用することができる。
【０１３４】
本発明のＦＬＪ３２０２８ポリペプチド及び核酸分子はさらに、組織分類のために使用されてもよく、本発明のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、１つの組織において別の組織と比較した場合に異なって発現する。ＦＬＪ３２０２８核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウエスタン分析のためのプローブを作成するために使用される。
【０１３５】
本願明細書において記載されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドはさらに、治療薬剤として使用されてもよい。本願明細書のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、薬学的に有用な組成物を調製するために既知の方法に従って処方化することができ、それらのＦＬＪ３２０２８生成物は、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルと混合される。治療用処方物は、任意の生理学的に受容可能なキャリア、腑形剤又は安定化剤を用いて、所望の純度を有する活性成分を混合することによって、凍結乾燥した処方物又は水溶液の形態で保存のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。受容可能なキャリア、腑形剤又は安定化剤は、受容者に対して使用される投薬量及び濃度で非毒性であり、バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリビニルピロリドン）、アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン）；ブドウ糖、マンノース又はデキストリンを含む、単糖、二糖及び他の炭水化物；キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えばマンニトール又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；及び／又は非イオン界面活性剤（例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）又はＰＥＧ）を含む。
【０１３６】
インビボ投与において使用される処方物は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再構築の前又は後に滅菌ろ過膜によってろ過することにより、容易に達成される。
【０１３７】
本発明における治療用組成物は、一般的に、無菌のアクセスポートを有する容器（静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって突き刺すことが可能な例えばストッパーを有するバイアル）に入れられる。
【０１３８】
投与経路は、既知の方法に従い、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路による注射又は注入、局所投与、又は徐放性システムによる。
【０１３９】
本発明の薬学的組成物の投薬量及び望ましい薬物濃度は、想定される特定の使用に依存して変動してもよい。適切な投薬量又は投与経路の決定は、十分に通常の医師の技術の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定のために信頼性が高いガイダンスを提供する。効果的な投薬量の種間スケーリングは、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」  Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉら、Ｅｄｓ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−９６によって示される原理に従って行うことができる。
【０１４０】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が使用される場合、通常の投薬量は、投与経路に依存して、哺乳動物の体重あたり又は１日あたり約１０ｎｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日まで変動させてもよい。特定の投薬量及び送達方法に対するガイダンスは、以下の文献に提供される：例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号を参照。異なる処方物が、１つの臓器又は組織を標的化する投与が、例えば、別の臓器又は組織に対する投与とは異なる様式で送達されることが必要な異なる処置化合物及び異なる傷害のために有効であることが予想される。
【０１４１】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの持続放出投与は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は障害を処置するのに適切な放出特徴を有する処方物において望まれ、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのマイクロカプセル化が考察される。持続放出放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン２、及びＭＮｒｇｐ１２０を用いて首尾よく行われる。Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ，２：７９５−７９９（１９９６）；Ｙａｓｕｄａ，Ｂｉｏｍｅｄ，Ｔｈｅｒ．，２７：１２２１−１２２３（１９９３）；Ｈｏｒａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７５５−７５８（１９９０）；Ｃｌｅｌａｎｄ，「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」，ｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，ｅｄｓ，（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９５），ｐｐ．４３９４６２；ＷＯ９７／０３６９２、ＷＯ９６／４００７２、ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【０１４２】
これらのタンパク質の持続放出処方物は、生体適合性及び広範囲の生分解性に起因して、ポリ乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用いて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸とグリコール酸は、人体内で迅速に消去することができる。さらに、このポリマーの分解性は、その分子量及び組成に依存して数ヶ月〜数年に調整することができる。Ｌｅｗｉｓ，「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ」，ｉｎ：Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０），ｐｐ．１−４１。
【０１４３】
この開示は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを模倣する化合物（アゴニスト）を同定し、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの効果を妨害する化合物（アンタゴニスト）のスクリーニング方法を含む。アンタゴニスト薬物候補のためのスクリーニングアッセイは、本発明によって同定される遺伝子によってコードされるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドと結合又は複合体を形成するか、又は他の細胞タンパク質とコードされるポリペプチドとの相互作用と干渉する化合物を同定するように設計される。このようなスクリーニングアッセイは、低分子薬物候補を同定するのに特に適切な化学ライブラリの高スループットスクリーニングに従うアッセイを含む。
【０１４４】
このアッセイは、当該技術分野で十分に特性決定されている、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々のフォーマットで行うことができる。
【０１４５】
アンタゴニストのためのすべてのアッセイは、薬物候補と本発明において同定される核酸によってコードされるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドとを、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件及び時間で接触させるアッセイとして一般的である。
【０１４６】
結合アッセイにおいて、この相互作用は結合であり、形成される複合体は、単離されるか、又は反応混合物中で検出可能である。特定の実施形態では、本発明において同定される遺伝子によってコードされるＦＬＪ３２０２８ポリペプチド又は薬物候補は、固相（例えば、マイクロタイタープレート）に共有結合又は非共有結合によって固定される。非共有結合は、一般的に、固体表面をＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの溶液でコーティングし、乾燥させることによって達成される。又は、固定された抗体、例えば、固定されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を、固体表面にＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを固定させるために使用することができる。このアッセイは、検出可能なラベルによって標識化されてもよい非固定化成分を固定された成分（例えば、接続した成分を含有するコーティングされた表面）に添加することによって行われる。反応が終了したら、反応していない成分は、例えば洗浄によって除去され、固体表面に結合した複合体が検出される。もともと固定されていない成分が検出可能なラベルをもつ場合、表面に固定されたラベルの検出は、複合体化が起こったことを示す。もともと固定されていない成分が検出可能なラベルをもたない場合、複合体化は、例えば、固定された複合体に特異的に結合する標識化された抗体を用いて検出することができる。
【０１４７】
候補化合物が本発明において同定される遺伝子によってコードされる特定のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドと相互作用するが結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための周知の方法によってアッセイすることができる。このようなアッセイとしては、従来のアプローチ、例えば、架橋、共免疫沈澱、及び勾配カラム又はクロマトグラフィーカラムを用いた共精製が挙げられる。それに加えて、タンパク質−タンパク相互作用は、Ｃｈｅｖｒａｙ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ：Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５７８９−５７９３（１９９１）に開示されるように、（Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ，），３４０：２４５−２４６（１９８９）；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：９５７８−９５８２（１９９１））によって記載される酵母ベースの遺伝系を用いることによってモニタリングすることができる。多くの転写アクティベータ（例えば酵母ＧＡＬ４）は、２つの物理的に離れたモジュラドメインからなり、１つはＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他の１つは転写活性ドメインとして作用する。上述の酵母発現系（一般的に「２ハイブリッド系」と称される）はこの性質を利点とし、２つのハイブリッドタンパク質を使用し、そのうち１つにおいて、標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、別の１つにおいて、候補活性タンパク質が活性ドメインに融合する。ＧＡＬ４活性プロモーターの制御下でのＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子の発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介するＧＡＬ４活性の再構築に依存する。相互作用するポリペプチドを含有するコロニーは、β−ガラクトシダーゼのための色素基質を用いて検出される。２ハイブリッド技術を用いる２つの特異的なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（登録商標））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されている。この系はさらに、特定のタンパク質相互作用に関与するタンパク質ドメインをマッピングするために、及びこれらの相互作用のために不可欠なアミノ酸残基を特定するために拡張することができる。
【０１４８】
本発明で同定されるＦＬＪ３２０２８をコードする遺伝子及び他の細胞内又は細胞外の成分の相互作用と干渉する化合物は、以下のように試験することができる：通常は、反応混合物は、２つの産物の相互作用及び結合を可能にする条件及び時間で、産物遺伝子の産物及び他の細胞内又は細胞外の成分を含有して調整され、反応は、試験化合物の非存在か及び存在下で行われる。それに加えて、ポジティブコントロールとして、プラセボが第３の反応混合物に添加されてもよい。混合物中に存在する試験化合物及び細胞内又は細胞外成分間の結合（複合体形成）は、上述のようにモニタリングされる。コントロール反応中で複合体が形成し、試験化合物を含有する混合物中で形成しないことは、この試験化合物が試験化合物とその反応パートナーとの相互作用と干渉することを示す。
【０１４９】
アンタゴニストをアッセイするために、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、特定の活性についてスクリーニングされる化合物とともに細胞に添加されてもよく、その化合物がＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの存在かで目的の活性を阻害する能力は、その化合物がＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに対するアンタゴニストであることを示す。又は、アンタゴニストは、競争的阻害アッセイのための適切な条件下で、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド及び潜在的なアンタゴニストを膜に結合したＦＬＪ３２０２８ポリペプチドレセプター又は組換えレセプターと混合することによって検出されてもよい。ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、例えば、放射能活性によって標識化することができ、その結果、レセプターに結合したＦＬＪ３２０２８ポリペプチド分子の数を、有効な潜在的なアンタゴニストを決定するために使用することができる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に公知の多くの方法、例えば、リガンドパンニング及びＦＡＣＳソーティングによって同定することができる。Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎ．，１（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ  ５（１９９１）。好ましくは、発現クローニングは、ポリアデニル化ＲＮＡがＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに応答性の細胞から調製され、このＲＮＡから作成されるｃＤＮＡライブラリがプールに分けられ、ＣＯＳ細胞又はＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに応答性ではない他の細胞をトランスフェクトするために使用される場合に使用される。ガラススライド上で成長させたトランスフェクトされた細胞は、標識化されたＦＬＪ３２０２８ポリペプチドにさらされる。ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的なタンパク質キナーゼのための認識部位の包含を含む種々の手段によって標識化することができる。固定及びインキュベーションの後、スライドをオートラジオグラフ分析にかける。ポジティブプールは同定され、サブプールが調製され、相互作用するサブプールを用いて再トランスフェクトされ、再スクリーニングプロセスにかけられ、最後に推定レセプターをコードする１個のクローンを得る。
【０１５０】
レセプター同定のための代替のアプローチとして、標識化されたＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは、レセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物と光親和性に結合させることができる。架橋した物質は、ＰＡＧＥによって解像され、Ｘ線フィルムに露光される。レセプターを含有する標識化された複合体が切り取られ、ペプチドフラグメントに分離され、タンパク質マイクロシークエンシングにかけられる。マイクロシークエンシングから得られたアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するためのｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするための１セットの再生オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用される。
【０１５１】
アンタゴニストについての別のアッセイにおいて、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物は、候補化合物の存在下でＦＬＪ３２０２８ポリペプチドとともにインキュベートされる。化合物が相互作用を高めるか又はブロックする能力が測定される。
【０１５２】
潜在的なアンタゴニストのさらに特定的な例としては、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドと免疫グロブリンとの融合物に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限定されないが、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体、及び抗体フラグメント、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びこのような抗体又はフラグメントのキメラ形態又はヒト化形態、及びヒト抗体及び抗体フラグメントを含む抗体が挙げられる。又は、潜在的なアンタゴニストは、密接に関連するタンパク質、例えば、レセプターを認識するが影響を与えず、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの作用を競争的に阻害する、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの突然変異形態であってもよい。
【０１５３】
別の潜在的なＦＬＪ３２０２８ポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されるアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ構築物であり、ここで、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は、標的化されたｍＲＮＡをハイブリダイズし、タンパク質翻訳を防ぐことによってｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンス技術は、三重らせん形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを介する遺伝子発現を制御するために使用することができ、これらの両方の方法は、ＤＮＡ又はＲＮＡに対するポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明の成熟ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の５’コード部分は、約１０〜４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補性であるように設計され（三重らせんについて、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；Ｄｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）を参照）、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの転写及び産生を妨害する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡにハイブリダイズし、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドへのｍＲＮＡ分子の翻訳をブロックする（アンチセンスについて、Ｏｋａｎｏ，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９８８）。上述のオリゴデオキシヌクレオチドはさらに、細胞に送達可能であり、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボで発現し、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの産生を阻害する。アンチセンスＤＮＡが使用される場合、翻訳開始部位から誘導されるオリゴデオキシリボ核酸、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０〜＋１０位置が好ましい。
【０１５４】
潜在的なアンタゴニストは、活性部位、レセプター結合部位又は増殖因子又はＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの他の関連結合部位と結合し、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドの正常な生物学的活性をブロックする低分子を含む。低分子の例としては、限定されないが、低分子ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶なペプチド、及び合成非ペプチジル有機化合物又は無機化合物が挙げられる。
【０１５５】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的開裂を触媒する酵素ＲＮＡ分子である。リボザイムは、配列特異的なハイブリダイゼーションによって相補的な標的ＲＮＡに作用し、エンドヌクレアーゼ的切断が起こる。潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム開裂部位は、既知の技術によって同定可能である。さらなる詳細のために、Ｒｏｓｓｉ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：４６９−４７１（１９９４）、及びＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
【０１５６】
転写を阻害するために使用される三重らせん形成における核酸分子は、一本鎖であり、デオキシヌクレオチドで構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対則を介して三重らせん形成を促進するように設計され、一般的に二本鎖の一本の鎖上でプリン又はピリミジンの相当数の伸長を必要とする。さらなる詳細のために、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９７／３３５５１（前出）を参照。
【０１５７】
これらの低分子は、上に議論される任意の１つ以上のスクリーニングアッセイによって、及び／又は当業者に周知の任意の他のスクリーニング技術によって同定可能である。
【０１５８】
本願明細書中で開示される分子の使用はさらに、ポジティブ機能的アッセイによるヒットに基づいてもよい。
【０１５９】
（抗ＦＬＪ３２０２８抗体）
本開示はさらに、抗ＦＬＪ３２０２８抗体を提供する。例示的な抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、及びヘテロ接合抗体が挙げられる。
【０１６０】
抗ＦＬＪ３２０２８抗体は、ポリクローナル抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、１つ以上の免疫化剤及び所望な場合、アジュバントの注射によって、哺乳動物中で生じさせることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントは、複数回のの皮下の又は腹膜内注射によって哺乳動物に注射される。免疫化剤は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド又はそれらの融合タンパクを含んでもよい。免疫化剤が、免疫化される哺乳動物において免疫原性であることが知られているタンパク質に接合することが有用である場合がある。別の実施形態では、哺乳動物は、タンパク質を発現するベクターとトランスフェクトする細胞（例えば、例えば２９３ＥＢＮＡ細胞）を用いて免疫化することができる。このような免疫原性タンパク質の例としては、限定されないが、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、及びダイズ−トリプシン阻害因子が挙げられる。使用されてもよいアジュバントの例としては、フロイントの完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（一リン酸脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコレート）が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度な実験をすることなく、当業者によって選択され得る。
【０１６１】
抗ＦＬＪ３２０２８抗体は、あるいは、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、ハイブリードーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載される方法）を使用して調製されてもよい。ハイブリードーマ法において、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物は、典型的には、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生可能な免疫化剤を用いて免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫化されてもよい。
【０１６２】
免疫化剤は、典型的に、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチド又はそれらの融合タンパク質を含む。一般的に、ヒト起源の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、非ヒト哺乳動物起源が望ましい場合には、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えばポリエチレングリコール）を用いて不死化細胞株と融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｃｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）ｐｐ．５９−１０３）。不死化細胞株は、通常は、形質転換された細胞株であり、特にげっ歯動物、ウシ及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常は、ラット又はマウスの骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、融合されていない不死化細胞の増殖又は生存を阻害する好ましくは１つ以上の基質を含有する適切な培地中で培養されてもよい。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、これらの基質はＨＧＰＲＴを欠いた細胞の増殖を妨害する。
【０１６３】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体を産生する細胞による安定な高レベルの抗体発現を補助し、ＨＡＴ培地のような培地に感受性のものである。さらに好ましい不死化細胞株は、マウスミエローマ株であり、これは、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａから得ることができる。ヒトミエノーマ及びマウス−ヒトヘテロミエノーマ細胞株はさらに、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏ８ｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８７）ｐｐ．５１−６３）。
【０１６４】
ハイブリドーマ細胞が培養される培地は、ＦＬＪ３２０２８に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱又はインビトロ結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定される。このような技術及びアッセイは、当該技術分野において公知である。モノクローナル抗体の結合アフィニティーは、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析によって決定される。
【０１６５】
所望なハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され、標準的な方法によって増殖されてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ（前出））。この目的のための適切な培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変されたＥａｇｌｅ培地、及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水としてインビボで増殖させてもよい。
【０１６６】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティークロマトグラフィーによって培地又は腹水液から単離又は精製されてもよい。
【０１６７】
モノクローナル抗体はさらに、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作成されてもよい。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を用いて配列決定することができる（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に配置されてもよく、これらは、宿主細胞（例えば、免疫グロブリンを産生しないサルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞）にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成する。ＤＮＡはさらに、例えば、同種マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖不変ドメインのためのコード配列を置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（前出））、又は非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列の全部又は一部分を免疫グロブリンコード配列に共有結合することによって改変されてもよい。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の不変ドメインと置換することができ、又は、キメラ二価抗体を作成するために本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換することができる。
【０１６８】
抗体は、一価抗体であってもよい。一価抗体を調製するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び改変重鎖の組換え発現を含む。重鎖は、一般的に、重鎖の架橋を防ぐためにＦｃ領域中の任意の点で切断される。あるいは、関連したシステイン残基は、別のアミノ酸残基によって置換され、架橋を防ぐために削除される。
【０１６９】
インビトロでは、一価抗体を調製することも適切である。それらのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを産生するための抗体の消化は、当該技術分野で公知の通常の技術を用いて達成することができる。
【０１７０】
本開示に従う抗ＦＬＪ３２０２８抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含んでもよい。非ヒト抗体（例えば、マウス）のヒト化形態は、非ヒトグロブリンから誘導される最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそれらのフラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合配列）である。ヒト化抗体としては、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が挙げられ、ここで、レシピエントの相補的な決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、非ヒト種（例えば、所望の特性、アフィニティー、及び能力を有するマウス、ラット、又はウサギ）のＣＤＲ（ドナー抗体）由来の残基に交換される。いくつかの場合では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって交換される。ヒト化抗体はさらに、レシピエント抗体中にも見出されず、入ってきたＣＤＲでもフレームワーク配列でもない残基を含んでもよい。概して、ヒト化抗体は、可変ドメインの少なくとも１つ、典型的には２つを実質的にすべて含み、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ配列のすべて又は実質的にすべて及びＦＲ領域のすべて又は実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の配列である。ヒト化抗体は、最適に、免疫グロブリン不変領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含む（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ，２：５９３−５９６（１９９２））。
【０１７１】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒトではない供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と称され、これらは典型的には「インポート」可変ドメインからなる。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者ら（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に本質的に従って、げっ歯動物のＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を対応するヒト抗体の配列と置換することによって行われる。従って、このような「ヒト化」抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４，８１６，５６７号）、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が、非ヒト種由来の対応する配列で置換される。実際に、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基及び可能ないくつかのＦＲ残基がげっ歯動物中の類似の部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。
【０１７２】
ヒト抗体はさらに、ファージディスプレイライブラリを含む、当該技術分野で公知の種々の技術を用いて製造することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術は、ヒトモノクローナル抗体の調製のために利用可能である（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することによって作成することができる。チャレンジの際に、ヒト抗体産生が観察され、これは、遺伝子再構成、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含むすべての面においてヒトにおいて見られるものとよく似ていた。このアプローチは、例えば、米国特許番号第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５、６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号及び以下の化学文献において記載される：Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８  ８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８，８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３  ６５−９３（１９９５）。
【０１７３】
二重特異性抗体は、モノクローナルであり、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗原についての結合特異性を有するヒト抗体又はヒト化抗体である。本場合には、結合特異性の１つはＦＬＪ３２０２８についてのものであり、他の１つは任意の他の抗原についてのものであり、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットである。
【０１７４】
二重特異性抗体を製造する方法は、当該技術分野で公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の共発現に基づき、この２つの重鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖のランダム整列のため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、これらのうち１つのみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィーステップによって達成される。類似の手順は、ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。
【０１７５】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン不変ドメイン配列に融合することができる。融合は好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域のうち少なくとも一部分を含む免疫グロブリン重鎖不変ドメインを有する。融合の少なくとも１つの存在する軽鎖結合に必要な部位を含有する重鎖の第１の不変ドメイン（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ及び所望な場合、免疫グロブリン軽鎖は、別個の発現ベクターに挿入され、適切な宿主生物内で共トランスフェクトされる。二重特異性抗体を作成するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）を参照。
【０１７６】
ＷＯ９６／２７０１１に記載される別のアプローチに従って、抗体分子の対間の界面は、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの割合が最大になるように設計することができる。好ましい界面は、抗体不変ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部分を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つ以上の低分子のアミノ酸側鎖は、さらに大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）と交換される。大きな側鎖と同じ又は類似の大きさの代わりの「空洞」は、大きなアミノ酸側鎖と小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はスレオニン）とを交換することによって、第２の抗体分子の界面で作成される。これは、ホモダイマーのような望ましくない他の最終生成物よりもヘテロダイマーの収率を高めるための機構を提供する。
【０１７７】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）。抗体フラグメントから二重特異性抗体を作成するための技術は、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調整することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１（１９８５）は、インタクトな抗体がタンパク分解的に開裂されＦ（ａｂ’）２フラグメントを作成する手順を記載する。これらのフラグメントは、ビシナルジチオールを安定化し、分子間のジスルフィド形成を防ぐジチオール錯化剤亜ヒ酸ナトリウムの存在下で減少する。作成されるＦａｂ’フラグメントは、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つは、メルカプトエチルアミンを用いた還元によってＦａｂ’−チオールに変換され、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。生成した二重特異性抗体は、酵素の選択的な固定化のための薬剤として使用することができる。
【０１７８】
Ｆａｂ’フラグメントは、直接的にＥ．Ｃｏｌｉから除去され、化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成してもよい。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｙ．Ｍｅｄ．１７５：２１７−２２５（１９９２）は、完全にヒト化した二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．Ｃｏｌｉから別個に分泌され、インビトロでの直接的な化学カップリングが行われ、二重特異性抗体が形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプター及び正常ヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合可能であり、ヒト胸部標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性の引き金となり得る。
【０１７９】
組換え細胞培養物から直接的に二重特異性抗体フラグメントを作成し、単離するための種々の技術がさらに記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて製造されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合によって２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に結合した。抗体ホモダイマーは、ヒンジ領域で還元されモノマーを形成し、再酸化されて抗体へテロダイマーを形成した。この方法はさらに、抗体ホモダイマーの製造のために利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８（１９９３）らによって記載される「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体を作成するための代替の機構を提供した。このフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメインが短すぎて一対になることができないリンカーを用いることによって、軽鎖可変ドメイン（ＶＨ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。従って、１つのフラグメントのＶＨドメイン及びＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＨドメイン及びＶＬドメイン対になり、それにより２つの抗原結合部位が形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを用いることによる二重特異性抗体を作成するための別のストラテジーがさらに報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４）。二価より大きい価数を持つ抗体も考察される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。
【０１８０】
例示的な二重特異性抗体は、本発明の所与のＦＬＪ３２０２８ポリペプチド上で２つの異なるエピトープに結合してもよい。あるいは、抗ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドのアームは、特定のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを発現する細胞に対する細胞防御機構に焦点をあてるために、白血球（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７）又はＩｇＧのためのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＨＩ（ＣＤ１６））のようなトリガー分子と結合するアームと組み合わされてもよい。二重特異性抗体はさらに、細胞毒薬剤を特定のＦＬＪ３２０２８ポリペプチドを発現する細胞に局在化させるために使用されてもよい。このような抗体は、ＦＬＪ３２０２８に結合するアームと、細胞毒薬剤又は放射性核種キレーター（例えば、ＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又はＴＥＴＡ）に結合するアームを有する。目的の別の二重特異性抗体は、ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０１８１】
ヘテロ接合体抗体はさらに、本開示の範囲内にある。ヘテロ接合体抗体は、２つの共有結合した抗体で構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化するために提案され（米国特許第４，６７６，９８０号）、ＨＩＶ感染の処置のために提案された（ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）。合成タンパク質化学における既知の方法（架橋剤が関与する反応を含む）を用いて、この抗体がインビトロで調製されてもよいことが考察される。例えば、免疫毒素複合体は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合の形成によって構築されてもよい。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート及び、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるものが挙げられる。
【０１８２】
例えば、癌の処置における抗体の有効性を高めるために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を改変することが望ましい場合がある。例えば、システイン残基は、Ｆｃ領域に導入されてもよく、それによって、この領域中の鎖間ジスルフィド結合形成が可能になる。このようにして作成されたホモダイマー抗体は、内在化能力が改良され、及び／又は相補体により媒介される細胞死及び抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）が増加する。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照。抗腫瘍活性が強化されたホモダイマー抗体はさらに、Ｗｏｌｆｆら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されるようにヘテロ二官能架橋剤を用いて調製されてもよい。あるいは、抗体は、二重Ｆｃ領域を有するように設計することができ、高められた相補体溶解液及びＡＤＣＣ能力を有する場合がある。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）を参照。
【０１８３】
本開示はさらに、細胞毒薬剤（例えば、化学療法剤、毒素（例えば、細菌、菌類、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、又はそれらのフラグメント、又は放射性同位元素（すなわち、放射性接合体））に接合する抗体を含む免疫複合体に関する。
【０１８４】
このような免疫複合体の生成において有効な化学療法剤は、上に記載されている。使用可能な酵素的に活性な毒素及びそれらのフラグメントとしては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非結合活性フラグメント、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ｅエノマイシン及びトリコテセンが挙げられる。種々の放射性核種は、放射性接合された抗体の製造のために利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ、１８６Ｒｅを含む。
【０１８５】
抗体及び細胞毒薬剤の接合体は、種々の二官能タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス−活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて作成される。例えば、リシンイムノトキシンは、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１０９８（１９８７）に記載されるように調製することができる。炭素----−１４標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレン  トリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に対して放射性ヌクレオチドを接合するための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照。
【０１８６】
別の実施形態では、抗体は、腫瘍の前標的化において使用するために「レセプター」（例えば、ストレプトアビジン）に接合されてもよく、抗体−レセプター接合体が患者に投与され、結合していない接合体が清浄剤を用いて循環から除去され、細胞毒薬剤（例えば、放射性ヌクレオチド）に接合する「リガンド」（例えば、アビジン）が投与される。
【０１８７】
本発明で開示される抗体はさらに、免疫リポソームとして処方化されてもよい。抗体を含有するリポソームは、当該技術で公知の方法、例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されるような方法によって調製される。高められた循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【０１８８】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相エバポレーション法によって生成することができる。リポソームは、規定の細孔径のフィルターを介して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本開示の抗体のＦａｂ’フラグメントは、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようにジスルフィド交換反応を介してリポソームに接合できる。化学療法剤（例えばドキソルビシン）は、任意に、リポソーム内に含有される。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照。
【０１８９】
本発明で同定されるＦＬＪ３２０２８ポリペプチドに特異的に結合する抗体、及び、上に開示されるスクリーニングアッセイによって同定される他の分子は、薬学的組成物の形態で種々の障害の処置のために投与することができる。
【０１９０】
ＦＬＪ３２０２８ポリペプチドは細胞内であり、全抗体はインヒビターとして使用され、内在化する抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームはさらに、抗体、又は抗体フラグメントを細胞に送達するために使用することができる。抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに対して特異的に結合する最も小さな阻害フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的のタンパク質配列に結合する能力を保持するペプチド分子を設計することができる。このようなペプチドは、化学的に合成することができ、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：７８８９−７８９３（１９９３）を参照。本発明の処方物はさらに、処置される特定の指標のために必要な１つより多い活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を与えない相補的な活性を有する化合物を含有してもよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、その機能を強化する薬剤、例えば、細胞毒薬剤、サイトカイン、化学療法剤又は増殖阻害剤を含んでもよい。このような分子は、意図される目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。
【０１９１】
活性成分はさらに、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合法によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）中又はマイクロエマルション中に包含されてもよい。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出）に開示される。
【０１９２】
インビボ投与のために使用される処方物は、無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜によってろ過することにより、容易に達成される。
【０１９３】
持続放出調製物が調製されてもよい。持続放出調製物の好ましい例としては、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは成形された形態、例えば、フィルム又はマイクロカプセルである。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドで構成される注射可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブタン酸が挙げられる。ポリマー（例えば、エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸）が１００日間を超えて分子放出可能であり、一方、ヒドロゲルはタンパク質をより短い時間間隔で放出する。カプセル化抗体が長期間体内にとどまる場合、３７℃で水分にさらされた結果、これらは変性又は凝集し、生物学的活性の消失及び免疫原性の可能な変化が生じる場合がある。合理的なストラテジーが、関与する機構に依存して安定化のために考案可能である。例えば、凝集機構がチオスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥すること、適切な添加剤を用いて水分含量を制御すること、及び特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成され得る。
【０１９４】
本発明の抗ＦＬＪ３２０２８抗体は種々の有用性を有する。例えば、抗ＦＬＪ３２０２８抗体はＦＬＪ３２０２８のための診断アッセイ、例えば、特定の細胞、組織、又は結成におけるその発現を検出することにおいて使用されてもよい。当該技術分野で公知の種々の診断アッセイ技術、例えば、不均一相又は均一相のいずれか中で行われる競争結合アッセイ、直接又は関節サンドイッチアッセイ及び免疫沈澱アッセイが使用されてもよい（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８７）ｐｐ．１４７−１５８）。診断アッセイにおいて使用される抗体は、検出可能な部分で標識化することができる。検出可能な部分は、直接又は関節に、検出可能なシグナルを作成可能であるべきである。例えば、検出可能な部分は放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉ）、蛍光又は化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン）、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はワサビペルオキシダーゼ）であってもよい。抗体を検出可能な部分に接合するために、Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｔｙ，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４０：２１９（１９８１）；及びＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．及びＣｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）によって記載される方法を含む、当該技術分野で公知の任意の方法が使用されてもよい。
【０１９５】
抗ＦＬＪ３２０２８抗体はさらに、組換え細胞培養物又は天然源からのＦＬＪ３２０２８のアフィニティー精製のために有用である。このプロセスでは、ＦＬＪ３２０２８に対する抗体は、当該技術分野で周知の方法を用いて、適切な支持体（例えば、セファデックス樹脂又はろ紙）で固定される。次いで、固定化された抗体は、精製されるＦＬＪ３２０２８を含有するサンプルと接触し、その後、支持体は、固定化された抗体に結合したＦＬＪ３２０２８以外のサンプル中の実質的にすべての物質を除去する適切な溶媒で洗浄される。最後に、支持体は、抗体からＦＬＪ３２０２８を放出する別の適切な溶媒で洗浄される。
【０１９６】
以下の実施例は、例示の目的のみのために与えられ、本発明の範囲をいかなる様式でも限定することを意図するものではない。
【０１９７】
本願明細書の全ての特許及び文献引用された文献は、それらの全部において、本願明細書に引用したものとする。
【０１９８】
以下の実施例で称される市販の試薬は、特に明記しない限り、製造業者の指示に従って用いられた。ＡＴＣＣ受託番号によって以下の実施例及び明細書全体において同定される細胞の供給源は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａである。
【実施例】
【０１９９】
ＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡは、従来の逆転写ＰＣＲを用いて、一次ＣＬＬ細胞から単離されたｍＲＮＡからクローン化された。ｃＤＮＡがＩａ型膜タンパク質をコードすることを示すために、ＯＲＦの推定Ｎ−末端又はＣ−末端のいずれかにエピトープタグを融合させた。ウエスタンブロットは、両方のタンパク質が発現することを示したが、フローサイトメトリーから、Ｎ−末端タグのみがインタクトな細胞中の抗タグ抗体に接近可能であったことがわかった。これらの結果は、このタンパク質のＮ−末端が細胞外であり、Ｃ−末端が細胞質内であることを示す。
【０２００】
ＦＬＪ３２０２８の細胞外ドメインにモノクローナル抗体を作成するために、細胞外ドメインが、Ｆｃ融合タンパク質としてバキュロウイルス系中に作成される。このＦＬＪ３２０２８−Ｆｃ融合タンパク質及び全長ＦＬＪ３２０２８を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞は、マウスを免疫化するために使用される。免疫化マウス由来の脾臓は、Ｆａｂ抗体ファージライブラリを作成するために使用される。ＦＬＪ３２０２８細胞外ドメインに対するモノクローナルＦａｂ抗体は、ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃ融合タンパク質上でパンニングすることによってライブラリから選択される。
【０２０１】
Ｆａｂ抗体は、一次ＣＬＬ細胞及び正常ヒト細胞及び組織の表面上でＦＬＪ３２０２８の発現を分析するために使用される。ＣＬＬ細胞についてのいくらかの特異性を示す抗体は、キメラマウス−ヒト全ＩｇＧ抗体に変換され、インビトロ及びインビボでＣＬＬ細胞を殺す能力についてアッセイされる。
【０２０２】
（実施例１）
ＦＬＪ３２０２８同定
Ｂ−ＣＬＬに特異的な、又はＢ−ＣＬＬに関連するｍＲＮＡを同定するために、ＧｅｎｅＥｘｐｌｏｒｅｒウェブアプリケーションを用いて、白血病リンパ腫分子プロファイリングプロジェクト（ＬＬＭＰＰ，ｈｔｔｐ：／／ｌｌｍｐｐ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からの／リンパチップ（ｌｙｍｐｈｏｃｈｉｐ）ｃＤＮＡマイクロアレイデータを閲覧した。正常リンパ球と比較してＣＬＬ細胞において高レベルで発現したｍＲＮＡを、潜在的な膜貫通タンパク質をコードするＯＲＦの存在下で分析した。ＥｘＰＡＳｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｅｒ（ｈｔｔｐ：／／  ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）上で翻訳後修飾及び位相幾何学予測ツールを使用してＯＲＦを分析した。ＡｌｉｚａｄｅｈらＤｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｕｓｅ  ｌａｒｇｅ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ４０３，５０３−５１１（２０００）を参照。Ｗｅｂ補足  ｈｔｔｐ：／／ｌｌｍｐｐ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｌｙｍｐｈｏｍａ；ＲｏｓｅｎｗａｌｄらＲｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４，１６３９−１６４７（２００１）。Ｗｅｂ補足  ｈｔｔｐ：／／ｌｌｍｐｐ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｌ。
【０２０３】
同定された１つのＣＬＬ関連ｃＤＮＡは、仮定タンパク質ＦＬＪ３２０２８（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＭ＿１１４３８０．２）の遺伝子であった。この遺伝子は、ヒト染色体バンド４ｑ３１．３上に位置し、１８３アミノ酸タンパク質のＯＲＦを含有する。ＰＳＯＲＴ（ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／）、ＳＩＧＮＡＬＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）、及びＴＭＨＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ／）位相幾何学予測ツールを用いたポリペプチド配列の分析は、開裂可能なＮ−末端シグナル配列及び１個の膜貫通領域の存在を示す（図１）。それゆえに、ＦＬＪ３２０２８はＩａ型膜タンパク質である。ＰＲＯＳＩＴＥ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）、ＮｅｔＮＧｌｙｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）、ＮｅｔＯＧｌｙｃ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＯＧｌｙｃ／）、及びＮｅｔＰｈｏｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＰｈｏｓ／）翻訳後修飾ツールを用いたポリペプチド配列の分析は、２個の潜在的なＮ−結合グリコシル化部位、４個の潜在的なＯ−結合グリコシル化部位、及び１２個の潜在的なセリン／スレオニンリン酸化部位を予測した（図１）。潜在的なチロシンリン酸化部位は見出されなかった。
【０２０４】
Ｇｅｎｂａｎｋ  ＤＮＡ及びタンパク質配列データベースのＢＬＡＳＴサーチは、仮定ＦＬＪ３２０２８タンパク質に対して類似性を有する配列を同定するために行った（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）。ヒトゲノム中には類似の配列は見つからなかったが、マウス及びラットにおいてＦＬＪ３２０２８に対して顕著に類似性を有する２個のｃＤＮＡが発見された（図２）。興味深いことに、予想された膜貫通領域のヒトＦＬＪ３２０２８のＣ−末端部分は、仮定げっ歯動物のタンパク質において高度に保存されており、一方、予想シグナルペプチド及び膜貫通領域を含むヒトＦＬＪ３２０２８のＮ−末端部分は、あまり保存されていなかった（図２）。
【０２０５】
（実施例２）
タンパク質単離
ＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって一次ＣＬＬ細胞から単離され、哺乳動物発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローン化された。ＦＬＪ３２０２８タンパク質がＩａ型膜タンパク質であることを示すために、Ｎ−末端が細胞外であり、Ｃ−末端が細胞質内であることが示される。ＦＬＪ３２０２８の膜位相幾何学を決定するために、ヘマグルチニンタンパク質（「ＨＡ」）エピトープタグが、ＯＲＦのＮ−末端又はＣ−末端のいずれかにｃＤＮＡに挿入された（図３及び図４）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。
【０２０６】
２個のエピトープ−タグ化ＦＬＪ３２０２８タンパク質は、２９３−ＥＢＮＡ細胞中に一時的に発現され、ビオチン化抗ＨＡタグ抗体を用いてフローサイトメトリー及びウエスタンブロットにより分析された（図５及び図６）。２９３−ＥＢＮＡ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから）は、ベクターｐＣＥＰ４のＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＧＦＰを発現するｐＥＧＦＰプラスミド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて共トランスフェクトされた。トランスフェクション４８時間後、細胞をＲＩＰＡバッファーに溶解した。溶解物を、非還元条件又は還元条件で４〜１５％勾配のポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルにかけ、ニトロセルロースフィルターに移した。ＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８タンパク質は、アルカリホスファターゼ−接合ラット抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてウエスタンブロットにより検出された（図６）。レーンにラベルをつけるために使用される省略形は、ＥＶ：空のベクターでトランスフェクトされた細胞由来の溶解液、ＣＴ：Ｃ−末端ＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８構築物を用いてトランスフェクトされた細胞由来の溶解液、ＮＴ：Ｎ−末端ＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８構築物を用いてトランスフェクトされた細胞由来の溶解液である。
【０２０７】
ＨＡエピトープ−タグ化ＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡを用いて一時的にトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞のフローサイトメトリー分析。２９３−ＥＢＮＡ細胞は、ベクターｐＣＥＰ４のＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）及びＧＦＰを発現するｐＥＧＦＰプラスミド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて共トランスフェクトされた。トランスフェクション４８時間後、細胞を溶解し、ビオチン化ラット抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）で標識化した。次いで、抗ＨＡ抗体をＰＥ−接合ストレプトアビジンで検出した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで細胞を分析した。ＨＡ−タグ化タンパク質をＦ２チャネルで検出し、ＧＦＰをＦＬ１チャネルで検出した。
【０２０８】
緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）は、トランスフェクトされていない細胞からトランスフェクトされた細胞を区別するためのマーカーとして共に発現した。Ｃ−末端タグ化ＦＬＪ３２０２８を発現するインタクトな細胞がビオチン化抗ＨＡ抗体及びストレプトアビジン−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ「ＢＤ」，１  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ  ＵＳＡ  ０７４１７）で標識化される場合、トランスフェクトされたＧＦＰ＋細胞の８５％がＨＡについてネガティブであった（図５）。このことは、Ｃ−末端ＨＡタグが、インタクトな細胞中の抗体及びＣ−末端の細胞質内の位置に接近可能ではないことを示す。対照的に、Ｎ−末端タグ化ＦＬＪ３２０２８を発現するインタクトな細胞がビオチン化抗ＨＡ抗体及びストレプトアビジン−ＰＥで標識化される場合、トランスフェクトされたＧＦＰ＋細胞が９９％を超えてＨＡについて強力にポジティブであった（図５）。このことは、Ｎ−末端ＨＡタグが、インタクトな細胞中の抗体及びＮ−末端の細胞質内の位置に完全に接近可能であることを示す。両方のタグ化タンパク質が発現されていることを確認するために、トランスフェクトされた細胞から溶解液を調製し、ウエスタンブロットによって分析した（図６）。ビオチン化抗-ＨＡ抗体及びアルカリホスファターゼ接合ストレプトアビジンを用いて両方のタンパク質が検出された。これらの結果は、ＦＬＪ３２０２８がＩａ型膜タンパク質の位相幾何学を有することを示す。
【０２０９】
（実施例３）
抗体産生
ＦＬＪ３２０２８細胞外ドメイン（「ＥＤ」）に対するモノクローナル抗体を作成するために、精製されたＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃ融合タンパク質及び／又は全長ＦＬＪ３２０２８を発現する生きている２９３−ＥＢＮＡ細胞を用いてマウスを免疫化した。オーバーラップ伸長ＰＣＲを用いて、マウスＩｇＧ１のＦｃドメインに対するフレームに融合したＦＬＪ３２０２８のＥＤのアミノ酸２３〜７６を含有する融合遺伝子を構築した。融合遺伝子をバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧＰ６７−Ａ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１）にクローン化した。このベクターは、組換えＦｃ融合タンパク質の感染した細胞培養物の上清への効果的な分泌のためのバキュロウイルスエンベロープタンパク質ｇｐ６７由来のシグナル配列を含有する。この構築物は、ＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃタンパク質を昆虫細胞中で発現し、精製するための組換えバキュロウイルスを産生するために使用された。このタンパク質は、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃフラグメント特異的アフィニティーカラムでのＦＰＬＣによって、バキュロウイルス上清２リットルから精製された。
【０２１０】
表２に記載されるスケジュールに従って、マウス（５６４０〜５６４５）を、ＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃタンパク質で免疫化するか、又はＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃタンパク及び全長ＦＬＪ３２０２８を発現する生きている２９３−ＥＢＮＡ細胞（２９３−ＦＬＪ細胞）を用いて免疫化した。採集のブーストの日に血清を集め、ＦＬＪ３２０２８  ＥＤについての抗体の滴定量を決定するために使用した（図９及び図１０）。血清の滴定量は、ＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃでコーティングされたマイクロタイタープレート上でＥＬＩＳＡによって、及び２９３−ＦＬＪ細胞についてフローサイトメトリーによって決定された。さらに特定的には、マウス５６４４を、表２に記載されるようにＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃ融合タンパク質で免疫化した。
【０２１１】
【表２】
2007525195.tif 000004
最後のブーストの日に、血清を単離し、抗体の滴定量をＥＬＩＳＡ（パネルＡ）及びフローサイトメトリー（パネルＢ）によって決定した。ＥＬＩＳＡプロトコルは以下のようであった：マイクロタイターウェルは、ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃタンパク質（ＦＬＪ−Ｆｃ）、ＣＤ２００−Ｆｃタンパク質、又はＢＳＡ０．１μｇでコーティングされた。ウェルをＢＳＡでブロックした後、免疫化前（ｐｒｅ）又は免疫化後（ｐｏｓｔ）の血清（３０〜３００００倍まで順に希釈）を３７℃で１時間添加した。ＰＢＳＴでウェルを３回洗浄することによって血清を除去した。アルカリホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）及びＰＮＰＰ基質を用いて、結合した抗体を検出した。フローサイトメトリーを以下のように行った：
２９３−ＥＢＮＡ細胞をベクターｐＣＥＰ４中のＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡを用いるか、又は空のベクターを用いて一時的にトランスフェクトした。２日後、細胞を分離し、免疫化後血清で３０、１００、又は３００倍希釈で標識化するか、又は免疫前血清で３０倍希釈で標識化した。結合した抗体をＰＥ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで細胞を分析した。マウス５６４０を、表２に記載されるようにＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃ融合タンパク質及び２９３−ＦＬＪ細胞で免疫化した。最後のブーストの日に、血清を単離し、抗体の滴定量を上に記載されるようにＥＬＩＳＡ（パネルＡ）及びフローサイトメトリー（パネルＢ）によって決定した。
【０２１２】
抗血清が一次ＣＬＬ細胞上に存在する細胞表面抗原を認識するか否かを決定するために、ＣＬＬが存在する６人の患者から単離されたＰＢＭＣをマウス５６４４由来の抗血清又は免疫前血清で染色し、フローサイトメトリーで分析した（図１１）。より特定的に、血液をＣＬＬを有すると診断された患者から集め、抹消血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＨｉｓｔｏ−Ｐａｑｕｅ勾配で単離した。２５倍希釈で、ＰＢＭＣをマウス５６４４由来の免疫前血清又は免疫後血清を用いて染色した。結合した抗体を、ＰＥ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて検出した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで細胞を分析した。この結果は、各患者由来の悪性腫瘍細胞の４３〜７９％が、抗血清によって認識される抗原を発現することを示した。ＣＬＬ細胞が高いレベルのＦＬＪ３２０２８  ｍＲＮＡを発現するため、この抗原は、最も見込みのあるＦＬＪ３２０２８である。
【０２１３】
脾臓をマウスから収集し、ＷＯ０３／０２５２０２Ａ２（この開示はその全体が本願明細書中に完全に組み込まれる）に以前に記載されたように、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａ  Ｆａｂ抗体ファージディスプレイライブラリを構築するために使用した。ライブラリは、最良の抗体滴定量を有する２匹のマウス（５６４４及び５６４０）からのみ構築された。
【０２１４】
マウス５６４４から作成されたライブラリは、ＦＬＪ３２０２８  ＥＤに対する抗体を選択するために、固定化されたＦＬＪ３２０２８（ＥＤ）−Ｆｃ融合タンパク質上でパンニングされた。さらに特定的には、ポリ−Ａ  ＲＮＡは、マウス５６４４の脾臓から単離され、Ｆａｂ抗体ファージディスプレイライブラリを構築するために使用された。このライブラリは、Ｆｃに特異的なファージ抗体を除去するために、固定化されたＣＤ２００−Ｆｃを用いて減算され、固定化ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃタンパク質で２回パンニングされた。３回目の後に９５クローンを取り出し、ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃタンパク質０．１μｇ（Ｒ３  Ｇ１  ＦＬＪ）又はＣＤ２００−Ｆｃタンパク質（Ｒ３  Ｇ１  ＣＤ）でコーティングされたマイクロタイタープレート上でファージＥＬＩＳＡで分析した。結合したファージをアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及びＰＮＰＰ基質で検出した。ＦＬＪ３２０２８細胞外ドメインについて特異的なポジティブクローンは、四角の上にラベル付けされている。クローンによって産生されるＦａ（Ｇ１  Ｆａｂ  Ｒ３）ｂの相対量を決定するために、マイクロタイタープレートをウサギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体でコーティングした。ウェルをＢＳＡでブロックした後、ファージ抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。結合していないファージをＰＢＳＴで３回ウェルを洗浄することによって除去した。結合したファージをアルカリホスファターゼ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及びＰＮＰＰ基質で検出した。
【０２１５】
３回のパンニングの後、ＦＬＪ３２０２８  ＥＤに対する特異的な結合についてＥＬＩＳＡによって、各ライブラリーから９５クローンをスクリーニングした（図１２）。ＩｇＧ１ライブラリから、９５クローンのうちの７つが、ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃタンパク質に結合するが、ネガティブコントロールとして使用したＣＤ２００−Ｆｃタンパク質に結合しなかった（図１２）。ＩｇＧ２ａライブラリから、９５クローンのうち１つが、ＦＬＪ３２０２８−Ｆｃタンパク質に結合するがＣＤ２００−Ｆｃタンパク質に結合しなかった（示されない）。ポジティブクローンのＤＮＡ配列は図１３及び１４に示される。図１５及び１６は、５６４４ライブラリからのＦＬＪ３２０２８に特異的なＦａｂの可変領域アミノ酸配列のアラインメントを示す。図１７は、図１７は、ＦＬＪ３２０２８で一時的にトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞に対する、５６４４のライブラリからのＦＬＪ３２０２８に特有のＦａｂ抗体の結合を示す。周辺質フラクションは、Ｆａｂ抗体を発現するＥ．ｃｏｌｉ培養物（株ＴＯＰ１０Ｆ’）から調製した。周辺質フラクションは、全長ＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡを発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞でインキュベートされた。細胞を洗浄した後、ＰＥ接合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントに特異的な二次抗体を用いて結合したＦａｂを検出した。細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析された。
【０２１６】
マウス５６４０から作成されたライブラリは、同じ様式でパンニングされた。４つのライブラリから選択されたＦＬＪ３２０２８  ＥＤ特異的な抗体を精製した。ＢＩＯＣＯＲＥアッセイによって決定される場合に最も高いアフィニティーを有するこれらの抗体は、マウス−ヒトキメラ全ＩｇＧフォーマットに変換され、哺乳動物細胞中で発現した。細胞ベースのアッセイは、これらのキメラ抗体が一次ＣＬＬ細胞又はＣＬＬ親から誘導される細胞株を殺す能力を試験するために行われた。細胞毒性についてのアッセイ（例えば、ＡＴＰ−Ｌｉｔｅ）、抗体依存性細胞媒介細胞毒性についてのアッセイ（ＡＤＣＣ）、及び相補体により媒介される細胞溶解が行われた。
【０２１７】
マイクロタイターウェル上に直接コーティングされたＦＬＪ３２０２８−Ｆｃで６４０ファージライブラリをパンニングするか、又はヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ抗体で捕捉した。調製物中のＦｃ部分又は汚染タンパク質のいずれかに対する多くのバインダーが単離され、次のセットのためのエピトープをマスキングするために使用された。抗原は、ライブラリファージを添加する前に、これらのＦａｂであらかじめインキュベートされた。
【０２１８】
ＦＬＪ３２０２８特異的な抗体の大きなパネルをＩｇＧ１カッパ及びＩｇＧ２ａカッパライブラリから単離した。ＤＮＡ配列を分析し、重鎖相補性−決定領域３（ＨＣＤＲ３）に従ってグループ分けした。選択されたＦａｂを、ＦＬＪ３２０２８トランスフェクトされた２９３細胞に対する結合についてフローサイトメトリーで試験した。図１８Ａ〜Ｅは、ＦＬＪ３２０２８を発現する細胞に対する結合を示すいくつかのＦａｂについてのフローサイトメトリーの結果を示す。図１９は、フローサイトメトリーによって、ＦＬＪ３２０２８に対する結合を示すクローンの重鎖の推定アミノ酸配列を示す。
【０２１９】
種々の改変が本願明細書中に開示される実施形態に対してなされ得ることが理解される。当業者は、添付の特許請求の範囲内の他の改変を想定する。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１−１】図１は、ＦＬＪ３２０２８遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号２）及び予測されたオープンリーディングフレームを示す。プライマーＦ１及びＲ１は、ＲＴ−ＰＣＲによってプライマリーＣＬＬ細胞からｃＤＮＡをクローン化するために使用された。プライマー中のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位は、哺乳動物の発現ベクターにＰＣＲ産物をクローン化するために使用された。予測されたタンパク質配列（配列番号１）は以下のように示される：シグナルペプチド及び膜内外領域は、白抜きの黒い矢印で示され、電位Ｏ−結合（Ｇ）及びＮ−結合（ＮＧ）グリコシル化部位が示され、電位セリン／スレオニンリン酸化部位（Ｐ）は、白抜きの赤色の四角で示される。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図２】図２は、マウス由来（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７９６２３４（配列番号３）及びネズミ由来（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿２２７３１９（配列番号４）の類似のタンパク質を有するヒトＦＬＪ３２０２８タンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す。アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いて作成された。ヒトタンパク質の予測されたシグナルペプチド及び膜内外領域は、黒線の四角で示される。
【図３−１】図３は、タンパク質（配列番号６）の予測されたＮ−末端に挿入されるＨＡエピトープタグを有するＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号５）及び概念上の翻訳を示す。オーバーラップ伸長ＰＣＲによってｃＤＮＡを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、黒色の矢印で示される。予測されたシグナルペプチド、ＨＡタグ、及び膜内外領域は、白抜きの黒い矢印で示される。
【図３−２】図３−１の続きである。
【図４−１】図４は、タンパク質（配列番号８）の予測されたＣ−末端に挿入されるＨＡエピトープタグを有するＦＬＪ３２０２８  ｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号７）及び概念上の翻訳を示す。ＰＣＲによってｃＤＮＡを構築するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、黒色の矢印で示される。予測されたシグナルペプチド、膜内外領域、及びＨＡタグは、白抜きの黒色の矢印で示される。
【図４−２】図４−１の続きである。
【図５】図５は、ＨＡエピトープタグ化されたＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。２９３−ＥＢＮＡ細胞は、ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を発現するｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中でＨＡ−タグ化されたＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡで共トランスフェクトされた。トランスフェクション４８時間後、細胞を分離し、ビオチン化されたラット抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）で標識化された。次いで、抗ＨＡ抗体は、ＰＥ接合ストレプトアビジンで検出された。細胞は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで分析された。ＨＡ−タグ化タンパク質は、ＦＬ２チャネル中で検出され、ＧＦＰは、ＦＬ１チャネル中で検出された。
【図６】図６は、ＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡでトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞の抗ＨＡウエスタンブロット分析の結果を示す。２９３−ＥＢＮＡ細胞は、ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を発現するｐＥＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中でＨＡ−タグ化されたＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡで共トランスフェクトされた。トランスフェクション４８時間後、細胞をＲＩＰＡバッファーで溶解した。溶解液は、非還元条件又は還元条件下で４〜１５％勾配でポリアクリルアミド−ＳＤＳゲルにかけられ、ニトロセルロースフィルターに移された。ＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８タンパク質は、アルカリホスファターゼ接合ラット抗ＨＡ抗体（Ｒｏｃｈｅ）及びＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いるウエスタンブロットによって検出された。レーンにラベルをつけるために使用される省略形は、ＥＶ：空のベクターでトランスフェクトされた細胞由来の溶解液、ＣＴ：Ｃ−末端ＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８構築物を用いてトランスフェクトされた細胞由来の溶解液、ＮＴ：Ｎ−末端ＨＡ−タグ化ＦＬＪ３２０２８構築物を用いてトランスフェクトされた細胞由来の溶解液である。
【図７】図７は、ＦＬＪ３２０２８をコードする核酸配列（配列番号２）を示す。
【図８】図８は、ＦＬＪ３２０２８のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
【図９Ａ】図９は、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによるマウス５６４４由来の血清の滴定の結果を示す。
【図９Ｂ】図９は、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによるマウス５６４４由来の血清の滴定の結果を示す。
【図１０Ａ】図１０は、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによるマウス５６４０由来の血清の滴定の結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーによるマウス５６４０由来の血清の滴定の結果を示す。
【図１１】図１１は、ＦＬＪ３００２８細胞外ドメインに対して上がる抗血清がプライマリーＣＬＬ細胞上で細胞表面抗原を認識することを確立するフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１２】図１２は、マウスＦａｂバクテリオファージディスプレイライブラリからＦＬＪ３２０２８に特異的な抗体を単離するためのパンニングの結果を示す。
【図１３−１】図１３は、ＦＬＪ３２０２８に特異的な抗体のアミノ酸配列及びそれらをコードする核酸配列を示す。
【図１３−２】図１３−１の続きである。
【図１４−１】図１４は、ＦＬＪ３２０２８に特異的な抗体のアミノ酸配列及びそれらをコードする核酸配列を示す。
【図１４−２】図１４−１の続きである。
【図１５】図１５は、５６４４のライブラリからのＦＬＪ３２０２８に特有のＦａｂの可変領域アミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１６】図１６は、５６４４のライブラリからのＦＬＪ３２０２８に特有のＦａｂの可変領域アミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１７】図１７は、ＦＬＪ３２０２８で一時的にトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞に対する、５６４４のライブラリからのＦＬＪ３２０２８に特有のＦａｂ抗体の結合を示す。周辺質フラクションは、Ｆａｂ抗体を発現するＥ．Ｃｏｌｉ培養組織（株ＴＯＰ１０Ｆ’）から調製された。周辺質フラクションは、全長ＦＬＪ３２０２８ｃＤＮＡを発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞でインキュベートされた。細胞を洗浄した後、ＰＥ接合ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントに特異的な二次抗体を用いて結合したＦａｂを検出した。細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて分析された。
【図１８Ａ】図１８Ａ〜Ｅは、ＦＬＪ３２０２８を発現する細胞に対する結合を示す５６４０ファージライブラリからのいくつかのＦａｂについてのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａ〜Ｅは、ＦＬＪ３２０２８を発現する細胞に対する結合を示す５６４０ファージライブラリからのいくつかのＦａｂについてのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ａ〜Ｅは、ＦＬＪ３２０２８を発現する細胞に対する結合を示す５６４０ファージライブラリからのいくつかのＦａｂについてのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１８Ｄ】図１８Ａ〜Ｅは、ＦＬＪ３２０２８を発現する細胞に対する結合を示す５６４０ファージライブラリからのいくつかのＦａｂについてのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１８Ｅ】図１８Ａ〜Ｅは、ＦＬＪ３２０２８を発現する細胞に対する結合を示す５６４０ファージライブラリからのいくつかのＦａｂについてのフローサイトメトリーの結果を示す。
【図１９−１】図１９は、フローサイトメトリーによって、ＦＬＪ３２０２８に対する結合を示す５６４０ファージライブラリからのクローンの重鎖の推定アミノ酸配列を示す。
【図１９−２】図１９−１の続きである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
2007525195.tif 000029
【図１８Ｂ】
2007525195.tif 000030
【図１８Ｃ】
2007525195.tif 000031
【図１８Ｄ】
2007525195.tif 000032
【図１８Ｅ】
2007525195.tif 000033
【図１９−１】
2007525195.tif 000034
【図１９−２】
2007525195.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月9日(2007.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体又は単鎖抗体である、請求項１の抗体。
【請求項３】
前記抗体がヒト抗体である、請求項１の抗体。
【請求項４】
前記抗体がネズミ抗体である、請求項１の抗体。
【請求項５】
前記抗体が配列番号１０を含む、請求項１の抗体。
【請求項６】
前記抗体が配列番号１２を含む、請求項１の抗体。
【請求項７】
前記抗体が配列番号１３〜３３のいずれかを含む、請求項１の抗体。
【請求項８】
請求項１に記載の抗体をコードする単離された核酸。
【請求項９】
前記単離された核酸が、配列番号９で示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
前記単離された核酸が、配列番号１０で示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
請求項８の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１１のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
抗体を発現させるのに適切な条件下で請求項１２の宿主細胞を培養する工程と、前記細胞の培養物から前記抗体を回収する工程を含む、前記抗体を産生する方法。
【請求項１４】
細胞と抗ＦＬＪ３２０２８抗体とを接触させる工程を含む、慢性リンパ球性白血病細胞を同定する方法。
【請求項１５】
哺乳動物中で慢性リンパ球性白血病細胞の存在を検出する方法であって、当該方法は、（ａ）前記哺乳動物から採取される細胞の試験サンプル、及び（ｂ）同じ細胞型の正常サンプルのコントロールサンプルにおけるＦＬＪ３２０２８の発現レベルを比較する工程を含み、ここで、前記ＦＬＪ３２０２８発現レベルがコントロールサンプルと比較して前記試験サンプルにおいて高いことが、前記哺乳動物における慢性リンパ性白血病細胞の存在の指標である、方法。
【請求項１６】
ＱＤＩＳＮＹ（配列番号３４）、ＫＳＬＬＹＫＤＧＫＴＹ（配列番号３５）、ＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹ（配列番号３６）及びＱＳＩＶＨＳＮＧＮＴＹ（配列番号３７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変軽鎖ＣＤＲ１領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
ＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号３８）、ＤＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号３９）、ＧＹＴＦＴＤＹＥＶＨ（配列番号４０）、ＧＦＮＩＫＤＴＹＩＮ（配列番号４１）、ＧＦＴＦＳＤＹＡＭＳ（配列番号４２）、ＧＦＮＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４３）、ＧＹＴＦＴＮＳＷＩＨ（配列番号４４）、ＧＦＮＩＫＤＴＹＭＮ（配列番号４５）、ＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号４６）、ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４７）及びＧＹＴＦＴＤＹＥＭＨ（配列番号４８）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変重鎖ＣＤＲ１領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
ＹＴＳ（配列番号４９）、ＦＭＳ（配列番号５０）、ＷＡＳ（配列番号：５１）及びＫＶＳ（配列番号：５２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変軽鎖ＣＤＲ２領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
ＧＩＤＰＥＩＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号：５３）、ＧＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＬＫＧ（配列番号５４）、ＧＩＤＰＥＳＧＧＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号５５）、ＲＩＤＰＡＮＮＮＴＮＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号５６）、ＭＩＤＰＡＮＧＮＴＱＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号５７）、ＳＩＳＳＧＧＴＴＹＹＬＤＳＶＫＧ（配列番号５８）、ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号５９）、ＲＩＲＳＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号６０）、ＹＩＨＰＧＰＧＹＴＥＹＮＱＮＦＫＤ（配列番号６１）、ＧＩＤＰＡＮＤＮＴＥＹＶＰＫＦＱＧ（配列番号６２）、ＧＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６３）、ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号６４）及びＧＩＤＰＥＴＧＧＴＶＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号６５）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変重鎖ＣＤＲ２領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
ＱＱＧＮＴＬＰＦＴＦＧＳＧ（配列番号６６）、ＱＱＬＶＥＹＰＬＴＦＧＡＧ（配列番号６７）、ＱＱＹＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧ（配列番号６８）、ＱＱＹＹＳＹＰＬＴＩＧＡＧ（配列番号６９）及びＦＱＧＳＨＶＰＬＴＦＧＡＧ（配列番号７０）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変軽鎖ＣＤＲ３領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
ＦＡＹ（配列番号７１）、ＧＶＹ（配列番号７２）、ＧＡＤ（配列番号７３）、ＧＧＹＦＤＹ（配列番号７４）、ＳＥＴＮＹ（配列番号７５）、ＨＥＧＤＷＦＡＹ（配列番号７６）、ＨＥＧＮＷＦＡＹ（配列番号７７）、ＧＧＤＷＧＹ（配列番号７８）、ＧＧＹＦＤＹ（配列番号７９）、ＷＤＹ（配列番号８０）、ＱＧＥＮＲＦＡＹ（配列番号８１）及びＳＬＰ（配列番号８２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、可変重鎖ＣＤＲ３領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
配列ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４７）を有する重鎖ＣＤＲ１領域を含む抗体。
【請求項２３】
配列ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号５９）を有する重鎖ＣＤＲ２領域を含む抗体。
【請求項２４】
配列ＱＧＥＮＲＦＡＹ（配列番号８１）を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体。
【請求項２５】
配列ＧＦＴＦＮＴＹＡＭＮ（配列番号４７）を有する重鎖ＣＤＲ１領域、配列ＲＩＲＴＫＳＮＮＹＡＴＹＹＡＤＳＶＫＤ（配列番号５９）を有する重鎖ＣＤＲ２領域、及び配列ＱＧＥＮＲＦＡＹ（配列番号８１）を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む抗体。