(57)【要約】本発明は、ポリエンポリケチドの新分類、その薬学的に許容される塩及び誘導体並びにその化合物を得るための方法に関する。これらの化合物を得る１つの方法は、ストレプトミセス・アイズネンシスの新規株の培養によるものであり、別の方法は、形質転換宿主細胞において、生合成経路の遺伝子の発現を伴う。本発明はさらに、これらの化合物を生成するのに用いられるストレプトミセス・アイズネンシスの新規株と、これらの化合物及びそれらの薬学的に許容される塩及び誘導体の薬剤としての使用、特に真菌細胞増殖及び癌細胞増殖の阻害薬としての使用とに関する。本発明はまた、これらの新規ポリケチド又はそれらの薬学的に許容される塩若しくは誘導体を含む医薬組成物に関する。最後に本発明は、これらの新規ポリケチドの生合成に関係する新規ポリヌクレオチド配列及びそれらのコードされたタンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
2007525148.tif 000152
式Ｉ
式中、Ａは−ＮＲ１Ｒ２、―Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２、
【化２】
2007525148.tif 000153
及び    
【化３】
2007525148.tif 000154
からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びアミノ酸からなる群から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリール基は、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はアリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールは、さらにハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から独立して選択される１又は２以上の基で置換されてもよい；
Ｂは、エテン−１，２−ジイル又は
【化４】
2007525148.tif 000155
から選択され、
式中Ｒ１０は、オキソ又はＯＲ１１であり、Ｒ１１は、Ｈ又はヘテロシクロアルキルであり、該ヘテロシクロアルキルは、ＯＸ、Ｃ１−３アルキル及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよく、ＸがＨであるか、又は、ＯＸである隣接する置換基が少なくとも２個ある場合に、Ｘは該２つの隣接する酸素基が式：
【化５】
2007525148.tif 000156
のアセタール５員環を形成する結合であってもよく、
式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル及びＣ２−７アルケニルからなる群より選択され；
Ｄは、
【化６】
2007525148.tif 000157
−ＮＲ１２ａＲ１２ａ及びＯＲ１２  から選択され、Ｒ１２は、Ｈ、１〜２個のフェニル基で置換されてもよいＣ１−６アルキルから選択され、該フェニル基は、Ｃ１−６アルキル又はハロで置換されていてもよい；
Ｒ１２ａ及びＲ１２ａは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びアミノ酸から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリールは、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はアリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールはさらに、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から独立して選択される１又は２以上の基で置換されていてもよい。
Ｗ１は、
【化７】
2007525148.tif 000158
であり、
Ｗ２は、
【化８】
2007525148.tif 000159
であり、
Ｗ３は、
【化９】
2007525148.tif 000160
であり、
Ｗ５は、
【化１０】
2007525148.tif 000161
であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３はそれぞれ独立してＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７並びにＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３の隣接する２つが結合である場合に、該２つの隣接する酸素原子と、それらに付着する炭素原子とが式：
【化１１】
2007525148.tif 000162
のアセタール６員環を形成する結合から選択され、
式中、Ｒ５、Ｒ6及びＲ7はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−７アルケニルから選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｙ１３及びＹ１５は、それぞれ独立してエテン−１,２−ジイル、エタン−１,２−ジイル及び
【化１２】
2007525148.tif 000163
から選択され、式中、該エテン−１,２−ジイル基及びエタン−１,２−ジイル基は、メチル基で置換されていてもよい。
ＺはＯＨ、ＮＨＲ８及び
【化１３】
2007525148.tif 000164
から選択され、点線が結合を示す場合には、Ｚはオキソ又はＮＲ９であり、
Ｒ８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルから選択され、
Ｒ９は、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルキルである。
【請求項２】
Ｚがオキソであることを特徴とする、請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｄが、
【化１４】
2007525148.tif 000165
であることを特徴とする、請求項１又は２記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｂが、
【化１５】
2007525148.tif 000166
であることを特徴とする、請求項１、２又は３記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
Ａが-ＮＲ１Ｒ２であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
Ａが
【化１６】
2007525148.tif 000167
であることを特徴とする、請求項４記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
Ｄが、
【化１７】
2007525148.tif 000168
であることを特徴とする請求項１、２、４、５又は６のいずれか記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
【化１８】
2007525148.tif 000169
化合物２（ａ）
で表される化合物。
【請求項９】
式IIで表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化１９】
2007525148.tif 000170
式II
式中、Ａ１が−ＮＨ２、−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ１３、アミノ酸又は−ＮＨ−Ｒ１４であり、Ｒ１３は水素又はフェニルであり、Ｒ１４は、イソプロピル、１−（４-ニトロフェニル）メチル、シクロヘキシルからなる群から選択され、該アミノ酸はその窒素原子により付着し；
【化２０】
2007525148.tif 000171
式中、Ｒ１５はメチル、イソプロピル、フェニル、４−ニトロフェニル、１−アミノエチル、１-アミノ−１−（４-ヒドロキシフェニル）メチル、１−アミノ−２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−ピロリジニル及び１−アミノ−２−ヒドロキシエチルからなる群から選択され、
Ｙ２０はエテン−１，２−ジイル及び
【化２１】
2007525148.tif 000172
からなる群から選択され；
Ｚ１は
【化２２】
2007525148.tif 000173
からなる群から選択され；
Ｒ２０は水素及び
【化２３】
2007525148.tif 000174
からなる群から選択され；
Ｙ３０はエテン−1,２−ジイル又はエタン−１,２−ジイルであり；
Ｄ１はヒドロキシ、メトキシ又は
【化２４】
2007525148.tif 000175
である。
【請求項１０】
以下からなる群から選択される化合物：
【化２５】
2007525148.tif 000176
化合物２（ｂ）
【化２６】
2007525148.tif 000177
化合物２（ｃ）
【化２７】
2007525148.tif 000178
化合物２（ｄ）
【化２８】
2007525148.tif 000179
化合物２（ｅ）
【化２９】
2007525148.tif 000180
化合物２（ｆ）
【化３０】
2007525148.tif 000181
化合物２（ｇ）
【化３１】
2007525148.tif 000182
化合物２（ｈ）
【化３２】
2007525148.tif 000183
化合物２（ｉ）
【化３３】
2007525148.tif 000184
化合物２（ｊ）
【化３４】
2007525148.tif 000185
化合物２（ｋ）
【化３５】
2007525148.tif 000186
化合物２（ｌ）
【化３６】
2007525148.tif 000187
化合物２（ｍ）
【化３７】
2007525148.tif 000188
化合物２（ｎ）
【化３８】
2007525148.tif 000189
化合物２（ｏ）
【化３９】
2007525148.tif 000190
化合物２（ｐ）
【化４０】
2007525148.tif 000191
化合物２（ｑ）
【化４１】
2007525148.tif 000192
化合物２（ｒ）
【化４２】
2007525148.tif 000193
化合物２（ｓ）
【化４３】
2007525148.tif 000194
化合物２（ｔ）
【化４４】
2007525148.tif 000195
化合物２（ｕ）
【化４５】
2007525148.tif 000196
化合物２（ｖ）
【化４６】
2007525148.tif 000197
化合物２（ｗ）
【化４７】
2007525148.tif 000198
化合物２（ｘ）
【化４８】
2007525148.tif 000199
化合物２（ｙ）
【化４９】
2007525148.tif 000200
化合物２（ｚ）
【化５０】
2007525148.tif 000201
化合物２（ａａ）
【化５１】
2007525148.tif 000202
化合物２（ａｂ）
【請求項１１】
ストレプトミセス・アイズネンシス株に由来する細胞を培養するステップ、該培養された細胞を請求項８の化合物の生成に必要な時間、成長培地内で好気的にインキュベートするステップと、該培地を溶媒で抽出し、粗抽出物から請求項８の化合物を精製するステップとを含む、請求項８記載の化合物の生成方法。
【請求項１２】
前記ストレプトミセス・アイズネンシス株が、ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７又はその変異体であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記変異体が、［Ｃ０３］０２３株（寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ０７０８０３−１）又は［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株（寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ２３１２０３−０２）であることを特徴とする、請求項１２記載の方法。  
【請求項１４】
寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ０７０８０３−１によって特定されるストレプトミセス・アイズネンシスの株。
【請求項１５】
寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ２３１２０３−０２によって特定されるストレプトミセス・アイズネンシスの株。
【請求項１６】
治療上有効な量の請求項１〜１０のいずれか記載の化合物及びその薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１７】
治療上有効な量の請求項８記載の化合物及びその薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１８】
治療上有効な量の請求項９記載の化合物及びその薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１９】
哺乳類の真菌症の治療方法で、該感染を罹患している該哺乳類に請求項１〜１０のいずれか記載の化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法。
【請求項２０】
前記真菌感染がカンジダ・アルビカンスに起因することを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
真菌感染がカンジダ種に起因し、該カンジダ種が、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・クルセイ及びカンジダ・トロピカリスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１９の方法。
【請求項２２】
前記真菌感染が、アスペルギルス種に起因し、該アスペルギルス種が、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス及びアスペルギルス・フラーブスから選択されることを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
該真菌感染症が、フサリウム種、セドスポリウム種、クリプトコッカス種、ケカビ種、ヒストプラスマ種、トリコスポロン種、ブラストミセス種又はサッカロマイシス・セレヴィシエに起因することを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２４】
被検体における真菌感染症の治療方法で、該感染を罹患している被検体に、請求項１〜１０のいずれか記載の化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法。
【請求項２５】
前記真菌感染症が、カンジダ・アルビカンス、カンジダ種、アスペルギルス種、フサリウム種、セドスポリウム種、クリプトコッカス種、ケカビ種、ヒストプラスマ種、トリコスポロン種、ブラストミセス種及びサッカロマイシス・セレヴィシエからなる群から選択される真菌に起因することを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記カンジダ種が、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・クルセイ及びカンジダ・トロピカリスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記のアスペルギルス属が、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス及びアスペルギルス・フラーブスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
被検体における癌治療方法で、該癌を罹患している被検体に、請求項１〜１０いずれか記載の化合物の治療上有効な量を投与することを含む方法。
【請求項２９】
前記癌が、白血病、非小細胞肺細胞癌、大腸癌、中枢神経癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選択されることを特徴とする、請求項２８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエンポリケチドの新たな分類、それらの薬学的に許容される塩及び誘導体、及びそれらの生成方法に関連している。これらの新規のポリケチドを得る方法の一つに、ストレプトミセス・アイズネンシス（Streptomyces aizunensis）の新規株の培養によるものがある；別の方法は、形質転換した宿主細胞における、本発明の生合成の遺伝子クラスターの発現にかかわるものである。化合物は、一定のバクテリアの既知の株によっても生成される。本発明は、これらの化合物を生成するストレプトミセス・アイズネンシスの新規株及びこれらの化合物の生合成を導く遺伝子クラスターを包含している。本発明は、これらの新規ポリケチドの使用及びそれらの薬学的に許容される塩及び医薬品としての誘導体、特に真菌並びに細菌性細胞の増殖の阻害剤、癌細胞増殖の阻害剤として、並びに血清コレステロール及び他のステロイドを低下させるために使用されている。本発明は、これらの新規ポリケチド、又は薬学的に許容される塩若しくはその誘導体を含む、薬学的に許容される組成物を包含している。
【背景技術】
【０００２】
放線菌は、土壌中に豊富に存在する細菌の一つの科（family）を構成しており、治療上有用な多くの抗生物質、抗真菌薬、抗癌剤及びコレステロールを低下させる薬剤がこれらの細菌により二次代謝産物として生成された結果として、多大な商業及び科学的な利益をもたらしてきた。多くの放線菌、特にストレプトミセス属は、著しく多様な生物活性代謝物を生成する能力を有するため、広く研究されてきた。新しい天然産物の徹底的な探求は、新種の細菌の同定及び改良株の創出につながった。
【０００３】
ポリエンポリケチドは、多大な商業用利益を生んだ放線菌によって生産された、一群の天然産物である。例えば、Sakuda et al., 1996 J. of Chem. Soc.、 Perkin trans. 1, 2315-19及びSakuda et al., Tetrahedron Letters, Vol 35, No. 16, 2777-2789 (1995) は、ステレプトマイシス種によって生成される線状のポリエン、リニアマイシンＡ（linearmycin A）を開示している。Sakuda et al.は、リニアマイシンＡが抗真菌活性及び抗細菌活性の両方を示したと報告している。Pawlak et al. J of Antibiotics, Vol. XXXIII No. 9, 989-997は、アクチノマイセス・ジアスタトクロモゲネス（Actinomyces diastatochromogenes）によって生成されたポリエンマクロライドリエノマイシン（polyene macrolide lienomycin）を開示している。Pawlak et al. は、リエノマイシンが抗真菌活性、抗細菌活性、抗腫瘍性活性を示したと報告している。ポリエンマクロライドの抗真菌活性は、高コレステロール血症の作用と相関している（C. P. Schaffner, Polyene Microlides in Clinical Practice, in Macrolide Antibiotics: Chemistry, biology and practice, S. Omura, ed. Academic Press (1984), p491; C. P. Schaffner and H. W. Gordon, Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A. 61, 36 (1968)）。
【０００４】
ポリケチドは、一連の縮合反応及びその後の修飾を通して形成された、二炭素単位からなる炭素鎖基幹を有している。Ｉ型ポリケチドは、炭素鎖の伸長及び修飾の各サイクルのために別々の触媒活性部位を持つモジュラーポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）酵素によって、事実上、合成されている。ＰＫＳタンパク質が、マルチモジュラーな性質を有するため、ポリケチド生合成の特異性及び機序については、よく知られている。
【０００５】
多くの生物活性化合物が同定されたのにもかかわらず、増強された性質を持つ新規の天然化合物を得る必要性は依然として残っている。このような化合物を得る現在の方法は、コストも時間もかかる、自然分離株のスクリーニング及び既存の化合物の化学修飾を含むものでる。現在のスクリーニング方法は、化合物の一般的な生物学的性質に基づいており、分子構造の予備知識を要する。既知の活性化合物を化学修飾する方法は存在するが、得られる化合物の種類に関して実質的な限界がある。
【０００６】
従って、費用効果がよい方法で、かつ、高収率で、薬学的な活性を持つ化合物を得る必要性はかなり高い。本発明は、強力な新治療化合物を生産することの出来るストレプトミセス・アイズネンシスの改良株だけでなく、化学合成よりもむしろデノボ生合成によって新規化合物を生成するための試薬（例えば、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含むベクター及びベクターを含む宿主細胞）及び方法によって、これらの問題を解決する。
【非特許文献１】Sakuda et al, 1996 J. of Chem. Soc., Perkin trans. 1, 2315-19
【非特許文献２】Sakuda et al., Tetrahedron Letters, Vol 35, No. 16, 2777-2789 (1995)
【非特許文献３】Pawlak et al. J of Antibiotics、 Vol. XXXIII No. 9, 989-997
【非特許文献４】C. P. Schaffner, Polyene Microlides in Clinical Practice, in Macrolide Antibiotics: Chemistry, biology and practice, S. Omura, ed. Academic Press (1984), p491
【非特許文献５】C. P. Schaffner and H. W. Gordon, Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A. 61, 36 (1968)）
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、式Ｉの化合物、
【０００８】
【化１】
2007525148.tif 000002
式Ｉ
及びその薬学的に許容される塩を含むものである。
式中、Ａは−ＮＲ１Ｒ２、−Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２、
【０００９】
【化２】
2007525148.tif 000003
及び                              
【化３】
2007525148.tif 000004
からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びアミノ酸からなる群から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリールは、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はアリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールは、さらにハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から独立して選択される１又は２以上の基で置換されていてもよい。
Ｂは、エテン−１，２−ジイル又は
【００１０】
【化４】
2007525148.tif 000005
から選択され、
式中、Ｒ１０はオキソ又はＯＲ１１であり、
Ｒ１１は、Ｈ又はヘテロシクロアルキルであり、該ヘテロシクロアルキルは、ＯＸ、Ｃ１−３アルキル及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよく、ＸがＨであるか、又は、ＯＸである隣接する置換基が少なくとも２個ある場合には、Ｘは、該隣接する酸素基が式
【００１１】
【化５】
2007525148.tif 000006
のアセタール５員環を形成するような結合であってもよい。
式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル及びＣ２−７アルケニルからなる群より選択され、
Ｄは、
【００１２】
【化６】
2007525148.tif 000007
−ＮＲ１２ａＲ１２ａ及びＯＲ１２  から選択され、
Ｒ１２は、Ｈ、１〜２のフェニル基で置換されてもよいＣ１−６アルキルから選択され、該フェニル基は、Ｃ１−６アルキル又はハロで置換されていてもよい。
Ｒ１２ａ及びＲ１２ａは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６  シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びアミノ酸から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリールは、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はアリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールはさらに、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から独立して選択される１又は２以上の基で置換されていてもよい。
Ｗ１は、
【００１３】
【化７】
2007525148.tif 000008
であり、
Ｗ２は、
【００１４】
【化８】
2007525148.tif 000009
であり、
Ｗ３は、
【００１５】
【化９】
2007525148.tif 000010
であり、
Ｗ５は、
【００１６】
【化１０】
2007525148.tif 000011
であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３が結合である場合には、二つの該隣接酸素原子及びそれらに付着する炭素原子が一緒に、式
【００１７】
【化１１】
2007525148.tif 000012
のアセタール６員環を形成するように、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立してＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７及び結合から選択され、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−７アルケニルから選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｙ１３及びＹ１５は、それぞれ独立してエテン−１，２−ジイル、エタン−１，２−ジイル及び
【００１８】
【化１２】
2007525148.tif 000013
から選択され、式中、該エテン−１，２−ジイル基及びエタン−１，２−ジイル基は、メチル基で置換されていてもよい。
ＺはＯＨ、ＮＨＲ８及び
【００１９】
【化１３】
2007525148.tif 000014
から選択され、点線が結合のときには、Ｚはオキソ又はＮＲ９であり、
Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルから選択され、
Ｒ９は、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルキルである。
【００２０】
本発明は線状のグリコシル化ポリケチドであり、アミドヒドロキシシクロペンテノン（amidohydroxycyclopentenone）成分を有する化合物２（ａ）、及び薬学的に許容されるその塩をも対象にしている。
【００２１】
【化１４】
2007525148.tif 000015
化合物２（ａ）
【００２２】
化合物２（ａ）の系統名は、以下のように決定された。
５６−アミノ−１５，１７，３３，３５，３７，４１，４３，４５，４７，５１，５３−ウンデカヒドロキシ−１４，１６，３０−トリメチル−３１−オキソ−２９−（３，４，５−トリヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イロルオキシ）−ヘキサペンタコンタ−２，４，６，８，１２，１８，２０，２２，２４，２６，３８，４８−ドデカン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−シクロペント−１−エニル）−アミド。
【００２３】
本発明は、治療上有効な量の式Ｉの化合物又は薬学的に許容されるその塩、及び薬学的に許容される担体を含む、式Ｉの化合物の薬学的組成物を包含している。特に、本発明は、治療上有効な量の化合物２（ａ）又は薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含む、化合物２（ａ）の薬学的組成物を対象にしている。
【００２４】
本発明は、化合物２（ａ）及びここで定義されている式Ｉ及び式IIを含む関連化合物を生成する方法をも対象にしている。そのような方法は、ストレプトミセス・アイズネンシス株に由来する細胞を培養するステップ、該培養細胞を所望の化合物の生成に必要とされる期間と同様の時間、成長培地において、好気的にインキュベートするステップ、該培地をメタノールやエタノールなどの溶媒で抽出し、粗抽出物から化合物を精製するステップを含む。本発明の方法に使用されるストレプトミセス・アイズネンシス株はＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７又はその変異体であってもよい。本発明の方法において有用な好ましいストレプトミセス・アイズネンシスの株は、［Ｃ０３］０２３（寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ０７０８０３−１）として同定された変異株である。本発明の方法において有用なストレプトミセス・アイズネンシスの最も好ましい株は、［Ｃ０３Ｕ０３］０２３（寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ２３１２０３−０２）として同定された変異株である。本発明は、寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ０７０８０３−１及びＩＤＡＣ２３１２０３−０２として同定されたストレプトミセス・アイズネンシス株をも包含している。
【００２５】
本発明は、式Ｉの化合物、式IIの化合物若しくは化合物２（ａ）、又は薬学的に許容される塩に真菌細胞を接触させて、真菌細胞増殖を阻害する方法を包含している。さらに、本発明は、哺乳類における真菌感染の治療方法であって、該感染を患う哺乳類に、治療上有効な量の式Ｉの化合物、式IIの化合物若しくは化合物２（ａ）、又は薬学的に許容される塩を投与することを含む方法を包含している。本発明の方法は、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）によって起こる哺乳類の真菌感染の治療又は真菌細胞の増殖の阻害に特に有用である。本発明は、被験者における他の種類の真菌感染を治療又は阻害する方法を包含し、前記の真菌感染は、カンジダ・グラブラータ（C. glabrata）、カンジダ・ルシタニエ（C. lusitaniae）、カンジダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）、カンジダ・クルセイ（C. krusei）、カンジダ・トロピカリス（C. tropicalis）、サッカロマイシス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）などのカンジダ種；アスペルギルス・フミガーツス（A. fumigatus）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・テレウス（A. terreus）、アスペルギルス・フラーブス（A. flavus）などのアスペルギルス種；フザリウム種（spp.）；セドスポリウム種；クリプトコックス種；ケカビ亜種；ヒストプラスマ種；毛芽胞菌種；及びブラストミセス（Blaspomyces）種 などによって起こる感染を含んでいる。そのような方法では、該真菌感染を患う被験者に治療上有効な量の式Ｉ、式II若しくは化合物２（ａ）、又は薬学的に許容されるその塩を投与する。
【００２６】
本発明は、式Ｉ、式IIの化合物、化合物２（ａ）、又は薬学的に許容されるその塩を癌細胞に接触させることを含む癌細胞の増殖を阻害する方法をも提供する。本発明は、被験者における癌の治療方法であって、前記癌を患う前記被験者に、治療上有効な量の式Ｉ、式IIの化合物若しくは化合物２（ａ）、又は薬学的に許容されるその塩を投与する方法を更に包含している。本発明の方法によって治療又は阻害される癌の例として、白血病、非小細胞肺癌、大腸癌、中枢神経系癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌が挙げられる。
【００２７】
本発明は、その生合成遺伝子座が式２（ａ）の化合物の生成に関与しているストレプトミセス・アイズネンシス（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７）由来の生合成遺伝子座をも提供している。ストレプトミセス・アイズネンシスが化合物２（ａ）を生成すると報告されたことはなかった。この度本発明者らは、ストレプトミセス・アイズネンシスのゲノムにおいて、化合物２（ａ）の生合成に関与する遺伝子クラスターを発見した。従って、本発明は、式Ｉの化合物及び化合物２（ａ）の生成及び工学技術に有用なポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供している。本発明は、式Ｉの化合物及び化合物２（ａ）の化学修飾をも提供している。
【００２８】
一態様においては、本発明は、式Ｉのポリケチドを生成するための生合成遺伝子座に関しており、一実施形態においては、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のポリケチドシンターゼによって形成されたポリケチドシンターゼシステムのドメインを少なくとも一つコードする核酸を含む式Ｉのポリケチドを生成するための単離、精製又は濃縮した核酸を提供している。
【００２９】
別の実施形態においては、前記核酸は、配列番号２１のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号２２；ｂ）配列番号２２の残基１６９〜３５４の核酸；配列番号２２の残基４２１〜１６９８の核酸；配列番号２２の残基１７８９〜３０９３の核酸；配列番号２２の残基３９１０〜４５５１の核酸；配列番号２２の残基４８０７〜４９９２の核酸；配列番号２２の残基５０６８〜６３５４の核酸；配列番号２２の残基６４０３〜７６８６の核酸；配列番号２２の残基８４９７〜９１３５の核酸；配列番号２２の残基９３８８〜９５７３の核酸；配列番号２２の残基９６４３〜１０９２０の核酸；配列番号２２の残基１０９７８〜１２２６７の核酸；配列番号２２の残基１２３０４〜１２６２４の核酸；配列番号２２の残基１３８３４〜１４４８７の核酸；配列番号２２の残基１４７３１〜１４９１６の核酸；配列番号２２の残基１５０１９〜１６３１４の核酸；配列番号２２の残基１６３７８〜１７６４９の核酸；配列番号２２の残基１８４３９〜１９０８０の核酸；配列番号２２の残基１９３３０〜１９５１５の核酸；配列番号２２の残基１９５８５〜２０８６２の核酸；配列番号２２の残基２０９３５〜２２２０６の核酸；配列番号２２の残基２３１０７〜２３７５４の核酸；配列番号２２の残基２４００４−２４１８９の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３０】
別の実施形態においては、前記核酸は、配列番号２３のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号２４；ｂ）配列番号２４の残基１０９〜１３８６の核酸；配列番号２４の残基１４７７〜２７５７の核酸；配列番号２４の残基２７９４〜３１１４の核酸；配列番号２４の残基４２３１〜４８８１の核酸；配列番号２４の残基５１１６〜５３０１の核酸；配列番号２４の残基５３８０〜６６４５の核酸；配列番号２４の残基６６９４〜７９７７の核酸；配列番号２４の残基８８７８−９５１９の核酸；配列番号２４の残基９７７２〜９９５７の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３１】
別の実施形態においては、前記核酸は、配列番号２５のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号２６；ｂ）配列番号２６の残基１０６〜１３８３の核酸；配列番号２６の残基１４４７〜２７２１の核酸；配列番号２６の残基２７５５〜３０８１の核酸；配列番号２６の残基４３１５〜４９６５の核酸；配列番号２６の残基５２０６〜５３９１の核酸；配列番号２６の残基５４９１〜６７６８の核酸；配列番号２６の残基６８４１〜８１４２の核酸；配列番号２６の残基８９４１〜９５８２の核酸；配列番号２６の残基９８３２〜１００１７の核酸；配列番号２６の残基１００８１〜１１３５８の核酸；配列番号２６の残基１１４０７〜１２６７５の核酸；配列番号２６の残基１３４８０〜１４１１８の核酸；配列番号２６の残基１４３８３〜１４５６８の核酸；配列番号２６の残基１４６３８〜１５９１２の核酸；配列番号２６の残基１５９６７〜１７２４４の核酸；配列番号２６の残基１７２７８〜１７５９８の核酸；配列番号２６の残基１８８８０〜１９５３０の核酸；配列番号２６の残基１９７９５〜１９９８０の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３２】
別の実施形態においては、核酸は、配列番号２７のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号２８；ｂ）配列番号２８の残基１０３〜１３８０の核酸；配列番号２８の残基１４５０〜２７６０の核酸；配列番号２８の残基３５８３〜４２１８の核酸；配列番号２８の残基４４６８〜４６５３の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３３】
別の実施形態においては、核酸は、配列番号２９のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号３０；ｂ）配列番号３０の残基１０３〜１３８０の核酸；配列番号３０の残基１４５９〜２７５４の核酸；配列番号３０の残基３６５５〜４２９３の核酸；配列番号３０の残基４５４０〜４７２５の核酸；配列番号３０の残基４８０４〜６０８１の核酸；配列番号３０の残基６１３６〜７４１９の核酸；配列番号３０の残基７４５６〜７７７６の核酸；配列番号３０の残基８９３８〜９５８８の核酸；配列番号３０の残基９８３２〜１００１７の核酸；配列番号３０の残基１００８７〜１１３６４の核酸；配列番号３０の残基１１４２８〜１２７１１の核酸；配列番号３０の残基１２７４５〜−１３０６５の核酸；配列番号３０の残基１４２７８〜１４９２８の核酸；配列番号３０の残基１５１８７〜１５３７２の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３４】
別の実施形態においては、核酸は、配列番号３１のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号３２；ｂ）配列番号３２の残基１０３〜１３８０の核酸；配列番号３２の残基１４３８〜２７４２の核酸；配列番号３２の残基２７７６〜３０９６の核酸；配列番号３２の残基４２６７〜４９１７の核酸；配列番号３２の残基５２０９〜５３９４の核酸；配列番号３２の残基５４６４〜６７４１の核酸；配列番号３２の残基６７８７〜８０７０の核酸；配列番号３２の残基８１０７〜８４２７の核酸；配列番号３２の残基９５６２〜１０２１２の核酸；配列番号３２の残基１０４４７〜１０６３２の核酸；配列番号３２の残基１０７０２〜１１９７９の核酸；配列番号３２の残基１２０４９〜１３３２６の核酸；配列番号３２の残基１３３６６〜１３６８６の核酸；配列番号３２の残基１４９３２〜１５５８２の核酸；配列番号３２の残基１５８５３〜１６０３８の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３５】
別の実施形態においては、核酸は、配列番号３３のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号３４；ｂ）配列番号３４の残基１０３〜１３８０の核酸；配列番号３４の残基１４４１〜２７５１の核酸；配列番号３４の残基３６１３〜４２４８の核酸；配列番号３４の残基４４９８〜４６８３の核酸；配列番号３４の残基４７５３〜６０３０の核酸；配列番号３４の残基６１９９〜７５１５の核酸；配列番号３４の残基８３５６〜８９９４；配列番号３４の残基９２４７〜９４３２の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３６】
別の実施形態においては、核酸は、配列番号３５のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号３６；ｂ）配列番号３６の残基１１８〜１３９５の核酸；配列番号３６の残基１５０７〜２８２３の核酸；配列番号３６の残基２８６０〜３１８０の核酸；配列番号３６の残基４３６６〜５０１６の核酸；配列番号３６の残基５２５１〜５４３６の核酸；配列番号３６の残基５５０３〜６７８０の核酸；配列番号３６の残基６８４１〜８１５４の核酸；配列番号３６の残基８１９１〜８５１１の核酸；配列番号３６の残基９５６２〜１０６３８の核酸；配列番号３６の残基１０６５１〜１１３０１の核酸；配列番号３６の残基１１５３６〜１１７２１の核酸；配列番号３６の残基１１７９４〜１３０７１の核酸；配列番号３６の残基１３１１７〜１４４０９の核酸；配列番号３６の残基１４４４３〜１４７６３の核酸；配列番号３６の残基１５８９８〜１６５４８の核酸；配列番号３６の残基１６７８９〜１６９７４の核酸；配列番号３６の残基１７０５６〜１８３３３の核酸；配列番号３６の残基１８３９１〜１９６７１の核酸；配列番号３６の残基１９７１４〜２００３４の核酸；配列番号３６の残基２１１８４〜２１８３４の核酸；配列番号３６の残基２２０８７〜２２２７２の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３７】
別の実施形態においては、核酸は、配列番号３７のポリケチドシンターゼの１又は２以上のドメインをコードし、以下からなる群から選択される核酸を含む：ａ）配列番号３８；ｂ）配列番号３８の残基１００〜１３７７の核酸；配列番号３８の残基１５０４〜２７７８の核酸；配列番号３８の残基２８１２〜３１３２の核酸；配列番号３８の残基４２５８〜４９０８の核酸；配列番号３８の残基５１４３〜５３２８の核酸；配列番号３８の残基５３９５〜６６７２の核酸；配列番号３８の残基６７３９〜８０１９の核酸；配列番号３８の残基８０５６〜８３７６の核酸；配列番号３８の残基９６０７〜１０２５７の核酸；配列番号３８の残基１０５３７〜１０７２２の核酸；配列番号３８の残基１０９４５〜１１６１６の核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも８０％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３８】
本発明は、ポリケチドシンターゼシステムのドメインをコードする核酸以外の式Ｉのポリケチドの生合成にかかわる核酸をも提供している。本実施形態においては、以下からなる群から選択される核酸で、単離、精製、濃縮される核酸を提供している：ａ）配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の核酸；ｂ）配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、７１、７３、７５、７７のポリペプチドをコードする核酸；ｃ）（ａ）又は（ｂ）の核酸に対して少なくとも７５％の同一性を有する核酸；及びｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸。
【００３９】
本発明は、ストリンジェントな条件で、上記の核酸のいずれかにハイブリダイズ可能で、かつ式Ｉの化合物の合成を誘導するために特異的にハイブリダイズする核酸に置換可能な核酸をさらに提供している。本発明は、上記核酸の、少なくとも２個、好ましくは３個、より好ましくは５個、さらに好ましくは７個以上の配列を含む、単離、精製又は濃縮された核酸をさらに提供している。
【００４０】
本発明は、上記の核酸のいずれかを含む発現ベクターをさらに提供している。本発明は、前記発現ベクターで形質転換した宿主細胞をさらに提供している。
【００４１】
さらなる態様においては、本発明は、式Ｉのポリケチドの生成のための遺伝子クラスターを提供している。一つの実施形態においては、遺伝子クラスターは、上記の核酸を少なくとも１０、好ましくは１２、より好ましくは１５、さらに好ましくは２０以上含む場合がある。さらなる実施形態においては、遺伝子クラスターは、ＩＤＡＣアクセッション番号２５０２０３−０１、２５０２０３−０２、２５０２０３−０３、２５０２０３−０４及び２５０２０３−０５として寄託されたコスミドから選択されたコスミドの核酸を含む場合がある。さらなる実施形態においては、産物を発現するために寄託されたコスミドは、原核宿主に挿入される。前記宿主は、大腸菌、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）、ストレプトミセス・グリセオフスクス（Streptomyces griseofuscus）、ストレプトミセス・アンボファシエンス（Streptomyces ambofaciens）、他種の放線菌類、又はバチルス属、コリネバクテリウム属若しくはテルモアクチノマイシス属の細菌であってもよい。さらなる実施形態においては、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、寄託されたコスミドの核酸にハイブリダイズし、ポリエンポリケチドの生合成にかかわる少なくとも一つのタンパク質をコードする核酸を提供している。さらなる実施形態においては、本発明は、化合物２（ａ）の形成のための生合成経路をコードするストレプトミセス・アイズネンシスから単離され、寄託されたコスミドによって形成された遺伝子クラスターを提供している。
【００４２】
別の態様においては、本発明は、式Ｉのポリケチドの産生のための、単離したポリペプチドに関しており、一つの実施形態においては、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のポリケチドシンターゼドメインのアミノ酸配列をしている。前記ドメインは、β−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）ドメイン、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）ドメイン、ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン、エノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン、チオエステラーゼ（ＴＥ）ドメイン及びデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインであってもよい。一つの実施形態においては、前記ドメインはＫＳドメインであり、前記アミノ酸は、以下のアミノ酸残基からなる群から選択される配列を含む：配列番号２１の残基１４１〜５６６、配列番号２１の残基１６９０〜２１１８、配列番号２１の残基３２１５〜３６４０、配列番号２１の残基５００７〜５４３８、配列番号２１の残基６５２９〜６９５４、配列番号２３の残基３７〜４６２、配列番号２３の残基１７９４〜２２１５、配列番号２５の残基３６〜４６１、配列番号２５の残基１８３１〜２２５６、配列番号２５の残基３３６１〜３７８６、配列番号２５の残基４８８０〜５３０４、配列番号２７の残基３５〜４６０、配列番号２９の残基３５〜４６０、配列番号２９の残基１６０２〜２０２７、配列番号２９の残基３３６３〜３７８８、配列番号３１の残基３５〜４６０、配列番号３１の残基１８２２〜２２４７、配列番号３１の残基３５６８〜３９９３、配列番号３３の残基３５〜４６０、配列番号３３の残基１５８５〜２０１０、配列番号３５の残基４０〜４６５、配列番号３５の残基１８３５〜２２６０、配列番号３５の残基３９３２〜４３５７、配列番号３５の残基５６８６〜６１１１、配列番号３７の残基３４〜４５９、配列番号３７の残基１７９９〜２２２４；及び上記いずれかのアミノ酸残基に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４３】
別の実施形態においては、ドメインはＡＣＰドメインであり、前記アミノ酸は以下のアミノ酸からなる群から選択される配列を含む：配列番号２１の残基５７〜１１８、配列番号２１の残基１６０３〜１６６４、配列番号２１の残基３１３０〜３１９１、配列番号２１の残基４９１１〜４９７２、配列番号２１の残基６４４４〜６５０５、配列番号２１の残基８００２〜８０６３、配列番号２３の残基１７０６〜１７６７、配列番号２３の残基３２５８〜３３１９、配列番号２５の残基１７３６〜１７９７、配列番号２５の残基３２７８〜３３３９、配列番号２５の残基４７９５〜４８５６、配列番号２５の残基６５９９〜６６６０、配列番号２７の残基１４９０〜１５５１、配列番号２９の残基１５１４〜１５７５、配列番号２９の残基３２７８〜３３３９、配列番号２９の残基５０６０〜５１２４、配列番号３１の残基１７３７〜１７９８、配列番号３１の残基３４８３〜３５４４、配列番号３１の残基５２８５〜５３４６、配列番号３３の残基１５００〜１５６１、配列番号３３の残基３０８３〜３１４４、配列番号３５の残基１７５１〜１８１２、配列番号３５の残基３８４６〜３９０７、配列番号３５の残基５５９７〜５６５８、配列番号３５の残基７３６３〜７４２４、配列番号３７の残基１７１５〜１７７６、配列番号３７の残基３５１３〜３５７４、及び上記いずれかのアミノ酸残基に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４４】
別の実施形態においては、ドメインはＡＴドメインであり、前記アミノ酸は以下のアミノ酸からなる群から選択される配列を含む：配列番号２１の残基５９７〜１０１３、配列番号２１の残基２１３５〜２５６２、配列番号２１の残基３６６０〜４０８９、配列番号２１の残基５４６０〜５８８３、配列番号２１の残基６９７９〜７４０２、配列番号２３の残基４９３〜９１９、配列番号２３の残基２２３２〜２６５９、配列番号２５の残基４８３〜９０７、配列番号２５の残基２２８１〜２７１４、配列番号２５の残基３８０３〜４２２５、配列番号２５の残基５３２３〜５７４８、配列番号２７の残基４８４〜９２０、配列番号２９の残基４８７〜９１８、配列番号２９の残基２０４６〜２４７３、配列番号２９の残基３８１０〜４２３７、配列番号３１の残基４８０〜９１４、配列番号３１の残基２２６３〜２６９０、配列番号３１の残基４０１７〜４４４２、配列番号３３の残基４８１〜９１７、配列番号３３の残基２０６７〜２５０５、配列番号３５の残基５０３〜９４１、配列番号３５の残基２２８１〜２７１８、配列番号３５の残基４３７３〜４８０３、配列番号３５の残基６１３１〜６５５７、配列番号３７の残基５０２〜９２６、配列番号３７の残基２２４７〜２６７３；及び上記いずれかのアミノ酸残基に対して７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４５】
別の実施形態においては、ドメインはＫＲドメインであり、前記アミノ酸は以下のアミノ酸からなる群から選択される配列を含む：配列番号２１の残基１３０４〜１５１７、配列番号２１の残基２８３３〜３０４５、配列番号２１の残基４６１２〜４８２９、配列番号２１の残基６１４７〜６３６０、配列番号２１の残基７７０３〜７９１８、配列番号２３の残基１４１１〜１６２７、配列番号２３の残基２９６０〜３１７３、配列番号２５の残基１４３９〜１６５５、配列番号２５の残基２９８１〜３１９４、配列番号２５の残基４４９４〜４７０６、配列番号２５の残基６２９４〜６５１０、配列番号２７の残基１１９５〜１４０６、配列番号２９の残基１２１９〜１４３１、配列番号２９の残基２９８０〜３１９６、配列番号２９の残基４７６０〜４９７６、配列番号３１の残基１４２３〜１６３９、配列番号３１の残基３１８８〜３４０４、配列番号３１の残基４９７８〜５１９４、配列番号３３の残基１２０５〜１４１６、配列番号３３の残基２７８６〜２９９８、配列番号３５の残基１４５６〜１６７２、配列番号３５の残基３５５１〜３７６７、配列番号３５の残基５３００〜５５１６、配列番号３５の残基７０６２〜７２８８、配列番号３７の残基１４２０〜１６３６、配列番号３７の残基３２０３〜３４１９；及び上記いずれかのアミノ酸残基に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４６】
別の実施形態においては、ドメインはＤＨドメインであり、前記アミノ酸は以下のアミノ酸からなる群から選択される配列を含む：配列番号２１の残基４１０２〜４２０８、配列番号２３の残基９３２〜１０３８、配列番号２５の残基９１９〜１０２７、配列番号２５の残基５７６１〜５８６６、配列番号２９の残基２４８６〜２５９２、配列番号２９の残基４２４９〜４３５５、配列番号３１の残基９２６〜１０３２、配列番号３１の残基２７０３〜２８０９、配列番号３１の残基４４５６〜４５６２、配列番号３５の残基９５４〜１０６０、配列番号３５の残基２７３１〜２８３７、配列番号３５の残基４８１５〜４９２１、配列番号３５の残基６５７２〜６６７８、配列番号３７の残基９３８〜１０４４、配列番号３７の残基２６８６〜２７９２；及び上記いずれかのアミノ酸残基に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４７】
別の実施形態においては、ドメインはＥＲドメインであり、前記アミノ酸は以下のアミノ酸からなる群から選択される配列を含む：配列番号３５の残基３１８８〜３５４６、及び配列番号３５の残基３１８８〜３５４６に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４８】
別の実施形態においては、ドメインはＴＥドメインであり、前記アミノ酸は以下のアミノ酸からなる群から選択される配列を含む：配列番号３７の残基３６４９〜３８７２、及び配列番号３７の残基３６４９〜３８７２に対して少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【００４９】
別の実施形態においては、本発明は、本発明のポリケチドシンターゼシステムのドメインをコードするポリペプチド以外の式Ｉのポリケチドの生合成にかかわるポリペプチドを提供する。本実施形態においては、本発明は、以下からなる群から選択される、式Ｉのポリケチドを生成するための、単離したポリペプチドを提供している：ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７；並びにｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５及び７７に対して少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド。
【００５０】
別の態様においては、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、及び７７からなる群から選択された配列を有するポリペプチドを生成する方法であり、以下のステップを含む方法を提供する：（ａ）前記ポリペプチドをコードし、機能可能な状態でプロモーターに結合している核酸を、細菌宿主細胞に挿入するステップ、及び（ｂ）ポリペプチドの発現を導くような条件で形質転換宿主細胞を培養するステップ。
【００５１】
別の態様においては、本発明は、上記核酸の寄託されたコスミドを用いて本発明のポリケチドの産生量を増加する方法に関しており、前記方法には、コスミド又は核酸で原核宿主を形質転換するステップと、形質転換した原核宿主を、結果的にポリケチドが発現するような条件下で培養するステップが含まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
本発明は、式Ｉの化合物及び薬学的に許容されるその塩を包含している。
【００５３】
【化１５】
2007525148.tif 000016
式中、Ａは−ＮＲ１Ｒ２、−Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２、
【００５４】
【化１６】
2007525148.tif 000017
及び        
【化１７】
2007525148.tif 000018
からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、H、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びアミノ酸からなる群から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリールは、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はアリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールは、さらにハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から独立して選択される１又は２以上の基で置換されていてもよい。
Ｂは、エテン−１，２−ジイル又は
【００５５】
【化１８】
2007525148.tif 000019
から選択され、
式中、Ｒ１０は、オキソ又はＯＲ１１であり、
Ｒ１１は、Ｈ又はヘテロシクロアルキルであり、該ヘテロシクロアルキルは、ＯＸ、Ｃ１−３アルキル及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよく、ＸがＨであるか、又は、ＯＸである隣接する置換基が少なくとも２個ある場合には、Ｘは該隣接する酸素基が式
【００５６】
【化１９】
2007525148.tif 000020
のアセタール５員環を形成するような結合であってもよい。
式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル及びＣ２−７アルケニルからなる群より選択され、
Ｄは、
【００５７】
【化２０】
2007525148.tif 000021
−ＮＲ１２ａＲ１２ａ及びＯＲ１２  から選択され、
Ｒ１２は、Ｈ、１〜２のフェニル基で置換されてもよいＣ１−６アルキルから選択され、該フェニル基は、Ｃ１−６アルキル又はハロで置換されていてもよい。
Ｒ１２ａ及びＲ１２ａは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６  シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びアミノ酸から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリールは、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はアリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールはさらに、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から選択される１又は２以上の基で独立して置換されていてもよい。
Ｗ１は、
【００５８】
【化２１】
2007525148.tif 000022
であり、
Ｗ２は、
【００５９】
【化２２】
2007525148.tif 000023
であり、
Ｗ３は、
【００６０】
【化２３】
2007525148.tif 000024
であり、
Ｗ５は、
【００６１】
【化２４】
2007525148.tif 000025
であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３が結合である場合には、２つの該隣接酸素原子及びそれらに付着する炭素原子は一緒に、式
【００６２】
【化２５】
2007525148.tif 000026
のアセタール６員環を形成するように、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３は、それぞれ独立してＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７及び結合から選択され、
Ｒ５、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−７アルケニルから選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ８、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｙ１３及びＹ１５は、それぞれ独立してエテン−１，２−ジイル、エタン−１，２−ジイル及び
【００６３】
【化２６】
2007525148.tif 000027
から選択され、式中、該エテン−１，２−ジイル及びエタン−１，２−ジイル基は、メチル基で置換されていてもよい。
ＺはＯＨ、ＮＨＲ８及び
【００６４】
【化２７】
2007525148.tif 000028
から選択され、破線が結合のときには、Ｚはオキソ又はＮＲ９であり、
Ｒ８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルから選択され、
Ｒ９は、アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルキルである。
【００６５】
第一の実施形態においては、本発明は、式Ｉの化合物を提供し、式中、Ｚはオキソである。他の全ての基は、先に定義した通りであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００６６】
この第一の実施形態内においては、Ｚはオキソであり、Ａは−ＮＲ１Ｒ２であり；及び他の全ての基は先に定義した通りであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００６７】
さらに、この実施形態内においては、Ｚはオキソであり、Ａは−ＮＲ１Ｒ２であり、Ｄは、
【００６８】
【化２８】
2007525148.tif 000029
であり、及び他の全ての基は、先に定義された通りであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００６９】
この第一の実施形態内においては、本発明は、式Ｉの化合物を提供し、式中、Ｚがオキソであり、Ａが
【００７０】
【化２９】
2007525148.tif 000030
であり、及び他の全ての基は、先に定義された通りであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００７１】
さらに、この実施形態内においては、Ｚはオキソであり、Aは
【００７２】
【化３０】
2007525148.tif 000031
であり、及びＤは
【００７３】
【化３１】
2007525148.tif 000032
であり、他の全ての基は、先に定義されたとおりであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００７４】
第二の実施形態においては、本発明は、式Ｉの化合物を提供し、以下のことを特徴とする。Ｂは、
【００７５】
【化３２】
2007525148.tif 000033
であり、Ｒ１０はオキソ又はＯＲ１１であり、及び他の全ての基は、先に定義されたとおりであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００７６】
この第二の実施形態内においては、Ｒ１０はＯＲ１１であり、式中、Ｒ１１は、ヘテロシクロアルキルであり、該ヘテロシクロアルキルは、ＯＸ、Ｃ１−３アルキル及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよく、ＸがＨであるか、ＯＸである隣接する置換基が少なくとも２個ある場合には、Ｘは、該隣接する酸素基が式
【００７７】
【化３３】
2007525148.tif 000034
のアセタール５員環を形成するような結合であってもよい。
【００７８】
この実施形態内においては、Ｒ１１はヘテロシクロアルキルであり、該ヘテロシクロアルキルは、ＯＸ、Ｃ１−３アルキル及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよく、ＸがＨであるか、ＯＸである隣接する置換基が少なくとも２個ある場合には、Ｘは、該隣接する酸素基が式
【００７９】
【化３４】
2007525148.tif 000035
のアセタール５員環を形成するような結合であってよい。及びＡは−ＮＲ１Ｒ２であり、及び全ての他の基は先に定義された通りであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００８０】
さらに、この実施形態内においては、本発明は式Ｉの化合物を提供し、式中、Ｒ１１はヘテロシクロアルキルであり、該ヘテロシクロアルキルは、ＯＸ、Ｃ１−３アルキル及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよく、ＸがＨであるか、ＯＸである隣接する置換基が少なくとも２個ある場合には、Ｘは、該隣接する酸素基が式
【００８１】
【化３５】
2007525148.tif 000036
のアセタール５員環を形成するような結合であってもよい。Ａは−ＮＲ１Ｒ２であり、Ｚはオキソであり、及び全ての他の基は先に定義された通りであるか、又はその薬学的に許容される塩である。
【００８２】
本発明の好ましい化合物は、式IIの化合物を含んでいる。
【００８３】
【化３６】
2007525148.tif 000037
式II
式中、Ａ１は−ＮＨ２、−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ１３、アミノ酸又は−ＮＨ−Ｒ１４であり、Ｒ１３は水素又はフェニルであり、Ｒ１４は、イソプロピル、１−（４−ニトロフェニル）メチル、シクロヘキシルからなる群から選択され、該アミノ酸はその窒素原子を経由して付着しており、
【００８４】
【化３７】
2007525148.tif 000038
式中、Ｒ１５はメチル、イソプロピル、フェニル、４−ニトロフェニル、１−アミノエチル、１−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）メチル、１−アミノ−２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−ピロリジニル及び１−アミノ−２−ヒドロキシエチルからなる群から選択され、
Ｙ２０はエテン−１，２−ジイル及び
【００８５】
【化３８】
2007525148.tif 000039
からなる群から選択され、
Ｚ１は
【００８６】
【化３９】
2007525148.tif 000040
からなる群から選択され、
Ｒ２０は水素及び
【００８７】
【化４０】
2007525148.tif 000041
からなる群から選択され、
Ｙ３０はエテン−１，２−ジイル又はエタン−１，２−ジイルであり、
Ｄ１はヒドロキシ、メトキシ又は
【００８８】
【化４１】
2007525148.tif 000042
及び、その薬学的に許容される塩である。
【００８９】
本発明は、式IIの化合物の薬学組成物を含み、前記組成物は、治療上有効な量の式IIの化合物又はその薬学的に許容される塩、及び薬学的に許容される担体を含んでいる。
【００９０】
本発明の特に好ましい化合物は、式IIの化合物を含んでいる。
【００９１】
【化４２】
2007525148.tif 000043
式II
【００９２】
Ａ１は、アミノ（−ＮＨ２）であり、Ｙ２０、Ｚ１、Ｒ２０、Ｙ３０及びＤ１は、下の表Ａに定義されているとおりである。
【表Ａ】
2007525148.tif 000044
Ａ１がＮＨ２であることを特徴とする式IIの化合物
本発明の付加された好ましい化合物は、式IIの化合物を含んでいる。
【００９３】
【化４３】
2007525148.tif 000045
式II
下の表Ｂ及びＣに記載されている様にＹ２０は、エテン−１，２−ジイルであり、
Ｚ１は、
【００９４】
【化４４】
2007525148.tif 000046
Ｒ２０は、
【００９５】
【化４５】
2007525148.tif 000047
Ｙ３０は、エテン−１，２−ジイルであり、及び
Ｄ１は、
【００９６】
【化４６】
2007525148.tif 000048
及び
Ａ１は、−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ１３（表Ｂ）；−NH−Ｒ１４（表Ｃ）である。
【００９７】
Ａ１が−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ１３  であり、Ｙ２０、Ｚ１、Ｒ２０、Ｙ３０及びＤ１が上記のように定義されていることを特徴とする式IIの化合物    
【表Ｂ】
2007525148.tif 000049
【００９８】
Ａ１が−NH−Ｒ１４であり、Ｙ２０、Ｚ１、Ｒ２０、Ｙ３０及びＤ１が上記のように定義されていることを特徴とする式IIの化合物
【表Ｃ】
2007525148.tif 000050
ＮＡ＝適用外（not applicable）    
表Ａ、Ｂ及びＣの化合物は、下記に示されている。
【００９９】
【化４７】
2007525148.tif 000051
化合物２（ａ）
【０１００】
【化４８】
2007525148.tif 000052
化合物２（ｂ）
【０１０１】
【化４９】
2007525148.tif 000053
化合物２（ｃ）
【０１０２】
【化５０】
2007525148.tif 000054
化合物２（ｄ）
【０１０３】
【化５１】
2007525148.tif 000055
化合物２（ｅ）
【０１０４】
【化５２】
2007525148.tif 000056
化合物２（ｆ）
【０１０５】
【化５３】
2007525148.tif 000057
化合物２（ｇ）
【０１０６】
【化５４】
2007525148.tif 000058
化合物２（ｈ）
【０１０７】
【化５５】
2007525148.tif 000059
化合物２（ｉ）
【０１０８】
【化５６】
2007525148.tif 000060
化合物２（ｊ）
【０１０９】
【化５７】
2007525148.tif 000061
化合物２（ｋ）
【０１１０】
【化５８】
2007525148.tif 000062
化合物２（ｌ）
【０１１１】
【化５９】
2007525148.tif 000063
化合物２（ｍ）
【０１１２】
【化６０】
2007525148.tif 000064
化合物２（ｎ）
【０１１３】
【化６１】
2007525148.tif 000065
化合物２（ｏ）
【０１１４】
【化６２】
2007525148.tif 000066
化合物２（ｐ）
【０１１５】
【化６３】
2007525148.tif 000067
化合物２（ｑ）
【０１１６】
【化６４】
2007525148.tif 000068
化合物２（ｒ）
【０１１７】
【化６５】
2007525148.tif 000069
化合物２（ｓ）
【０１１８】
【化６６】
2007525148.tif 000070
化合物２（ｔ）
【０１１９】
【化６７】
2007525148.tif 000071
化合物２（ｕ）
【０１２０】
【化６８】
2007525148.tif 000072
化合物２（ｖ）
【０１２１】
【化６９】
2007525148.tif 000073
化合物２（ｗ）
【０１２２】
【化７０】
2007525148.tif 000074
化合物２（ｘ）
【０１２３】
【化７１】
2007525148.tif 000075
化合物２（ｙ）
【０１２４】
【化７２】
2007525148.tif 000076
化合物２（ｚ）
【０１２５】
【化７３】
2007525148.tif 000077
化合物２（ａａ）
【０１２６】
【化７４】
2007525148.tif 000078
化合物２（ａｂ）
【０１２７】
下記の二価部分は、下に示されているように、命名法に基づいて、ここに言及されている。
【０１２８】
【化７５】
2007525148.tif 000079
１−オキソ−メチレン−１，１−ジイル
【０１２９】
【化７６】
2007525148.tif 000080
１−ヒドロキシメチレン−１，１−ジイル
【０１３０】
【化７７】
2007525148.tif 000081
１，３−ジオキサシクロペンタン−２，２−ジイル
【０１３１】
【化７８】
2007525148.tif 000082
（２−プロピルアミノ）メチレン−１，１−ジイル
【０１３２】
【化７９】
2007525148.tif 000083
１−ベンジルイミノメチレン−１，１−ジイル
【０１３３】
【化８０】
2007525148.tif 000084
オキシラン−２，３−ジイル。  
【０１３４】
下記の一価成分は、示されている学名によって、ここに言及されている。
【０１３５】
【化８１】
2007525148.tif 000085
(２−ヒドロキシ−５−オキソ−シクロペンタ−１−エニル)−アミノ              
【０１３６】
【化８２】
2007525148.tif 000086
３，４，５−トリヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロピラン−２−イル
【０１３７】
「ポリケチド」又は「ポリエンポリケチド」という表現は、式Ｉ又はIIによって定義されているポリケチド化合物の一分類について述べたものである。好ましい本発明のポリケチドは化合物２ａであり、５６−アミノ−１５，１７，３３，３５，３７，４１，４３，４５，４７，５１，５３−ウンデカヒドロキシ−１４，１６，３０−トリメチル−３１−オキソ−２９−（３，４，５−トリヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘキサペンタコンタ−２，４，６，８，１２，１８，２０，２２，２４，２６，３８，４８−ドデカン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−シクロペント−１−エニル）−アミドという系統名を有する。前記の表現は、さらに化学合成における媒介物として用いられるこの分類の化合物を含む。
【０１３８】
「式Ｉの化合物の産生株」及び「式Ｉの化合物を生成する生物」という表現は、式Ｉの化合物を生成するのに必要な遺伝子情報を保有する微生物について述べたものであり、その生物が式Ｉの化合物を生成することが知られているかどうかは無関係である。「式IIの化合物の産生株」及び「式IIの化合物を生成する生物」という表現は、式IIの化合物を生成するのに必要な遺伝子情報を保有する微生物について述べたものであり、生物体が式IIの化合物を生成することが知られているかどうかは無関係である。「化合物２（ａ）の産生株」及び「化合物２（ａ）を生成する生物」という表現は、化合物２（ａ）を生成するのに必要な遺伝子情報を保有する微生物について述べたものであり、生物体が化合物２（ａ）を生成することが知られているかどうかは無関係である。「ポリケチド産生株」という表現は、式Ｉ又はIIのポリケチドを生成するのに必要な遺伝子情報を保有する微生物に言及している。前記の表現は、式Ｉ又はIIの化合物又は化合物２（ａ）を生成するための遺伝子情報を、その微生物本来の自然な環境で保有している微生物、及び前記遺伝子情報を組換え技術によって導入された微生物の両方に平等に適用される。詳細に述べると、ここで検討されている具体的な微生物としては、以下のものが挙げられる：ミクロモノスポラ科、そのなかでも、ミクロモノスポラ属、アクチノプラーネス属、及びダクチロスポランギウム（Dactylosporangium）属が好ましい；ストレプトミセス科、そのなかでも、ストレプトミセス属及びキタサトスポラ（Kitasatospora）属が好ましい；シュードノカルディアセ（Pseudonocardiaceae）科、そのなかでも、アミコラトプシス（Amycolatopsis）属及びサッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）属が好ましい；及びアクチノシンエマタシエ（Actinosynnemataceae）科、そのなかでも、サッカロスリックス（Saccharothrix）属及びアクチノシンネマ（Actinosynnema）属が好ましい；しかしながら、前記の表現は、式Ｉ又はIIの化合物又は化合物２（ａ）を生成するのに必要な遺伝子情報を有する全ての微生物を包含している。好ましい式Ｉ又は２の化合物又は化合物２（ａ）の産生株としては、ストレプトミセス・アイズネンシス（ＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７）及び株［Ｃ０３］０２３（ＩＤＡＣアクセッション番号.０７０８０３−０１）及び株［Ｃ０３Ｕ０３］０２３（ＩＤＡＣアクセッション番号.２３１２０３−０２）をはじめとするストレプトミセス・アイズネンシスのあらゆる変異体又は改良株が挙げられる。  
【０１３９】
「単離された」という表現は、物質が、その本来の環境、例えばそれが天然物である場合にはその自然環境から除去されていることを意味する。例えば、生体中に存在する天然のポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、その同じポリヌクレオチド又はポリペプチドが、自然界のシステムで共存している物質の一部又はすべてから分離された場合には、それらは単離されたことになる。そのようなポリヌクレオチドがベクターの一部とすること、及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドを組成物の一部とすることも可能であり、その場合も、そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、やはり単離されたことになる。なぜなら、そうしたベクター又は組成物は、そのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドの自然環境の一部ではないためである。
【０１４０】
「精製された」という表現は、１００％の純度を必要とするものではなく、どちらかといえば、相対的な定義を意味している。従来、ライブラリーから得られた各々の核酸は、電気泳動上で同質となるまで精製されている。本発明の精製された核酸は、生物のゲノムＤＮＡの残存物から少なくとも１０４から１０６倍に精製されたものである。しかしながら、「精製された」という表現は、ゲノムＤＮＡの残存物、又は、ライブラリー若しくは他の環境に存在する他の配列から、少なくとも１０１倍、好ましくは１０２倍又は１０３倍、さらに好ましくは１０４倍又は１０５倍に精製された核酸も含むものである。
【０１４１】
「組換え」とは、核酸が細胞中で、自然環境では共存しない「バックボーン」核酸と共存していることを意味する。「組換え」とは、核酸が、自然環境では隣接しない「バックボーン」核酸に隣接していることを意味するとも定義される。「濃縮された」核酸とは、核酸バックボーン分子群中に数にして５％以上の核酸挿入物が存在することを示している。「バックボーン」分子には、発現ベクター、自己複製核酸、ウィルス、組込型核酸などの核酸、及び目的の核酸の維持又は操作に使用する他のベクター又は核酸などがある。前記濃縮核酸は、組換えバックボーン分子群中に存在する核酸挿入物の総数の１５％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが最も好ましい。
【０１４２】
「組換え」ポリペプチド又はタンパク質とは、組換えＤＮＡ技術によって作製された、すなわち、目的のポリペプチド又はタンパク質をコードする外来ＤＮＡコンストラクトによって形質転換された細胞から作製されたポリペプチド又はタンパク質を示す。「合成」ポリペプチド又はタンパク質とは、化学合成によって調製されたポリペプチド又はタンパク質のことである。
【０１４３】
「遺伝子」という表現は、ポリペプチド鎖の生成に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コード領域前後の領域（リーダー及びトレーラー）及び、該当する場合には、個々のコードセグメント（エクソン）間の介在領域（イントロン）を含んでいる。
【０１４４】
「遺伝子座」、「遺伝子クラスター」及び「生合成遺伝子座」という表現は、式２ａのポリケチドの生合成に関与する一群の遺伝子又はその変異体について言及している。遺伝子座、遺伝子クラスター、又は生合成遺伝子座の遺伝子修飾は、当業者に知られているあらゆる遺伝子組換え技術について言及しており、式２ａの化合物の変異体を生成するために適応できる核酸の変異誘発性、不活性、又は置換を含む。遺伝子部位、遺伝子クラスター、又は生合成部位の遺伝子修飾は、当該技術分野で知られているあらゆる遺伝子組換え技術について言及しており、式Ｉの化合物の変異体を作出するために適用できる核酸の突然変異誘発、不活化、又は置換を含むものである。
【０１４５】
ＤＮＡ若しくはヌクレオチド「コード配列」、又は特定のポリペプチド若しくはタンパク質を「コードする配列」とは、適切な制御配列の管理下に置かれた際に、ポリペプチド又はタンパク質に転写及び翻訳されるＤＮＡ配列である。
【０１４６】
「オリゴヌクレオチド」とは、遺伝子、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はその他目的の核酸をコードするゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、又はｍＲＮＡ分子にハイブリダイズ可能なヌクレオチドを、通常は少なくとも１０個、好ましくは１５個、より好ましくは２０個以上で、好ましくは１００個以下有している核酸について言及している。
【０１４７】
プロモーター配列は、プロモーターにおいて転写を開始するＲＮＡポリメラーゼによって認識されるコード配列に「操作可能に結合され」、コード配列をｍＲＮＡへ転写する。
【０１４８】
ＤＮＡの「消化」とは、ＤＮＡにおいて、一定の配列のみを作用させる制限酵素を伴うＤＮＡの酵素による切断のことをいう。ここに用いられている様々な制限酵素は市販されており、それらの反応状況、補因子、及び他の要件を、当業者に公知であるのように用いた。分析用には、通常、２０μｌの緩衝溶液において、ユニットの酵素と共に１μｇのプラスミド又はＤＮＡフラグメントを用いる。プラスミドを構成するためにＤＮＡフラグメントを単離する目的では、通常、より多い容量の２０〜２５０ユニットの酵素で５〜５０μｇのＤＮＡを消化する。特定の酵素の適切な緩衝液及び基質の量は、製造業者によって指定されている。通常は、３７℃で、１時間の培養時間を用いるが、供給業者の指示によって変わることもある。消化後に、望ましいフラグメントを単離するためにゲル電気泳動を実施してもよい。
【０１４９】
本明細書に用いられ、当業者に公知であるように、「同一性」という表現は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係のことである。同一性とは、そのような配列の文字列間の一致によって決定されるポリヌクレオチド配列の配列関連性のレベルを意味している。同一性は容易に測定することができる。（例えば、Computation Molecular Biology, Lesk, A.M., eds., Oxford University Press, New York (1998), and Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., eds., Academic Press, New York (1993) 参照。両文献とも、参照することによって本明細書に組み込まれる）。２つのポリヌクレオチド配列間を測定する方法は多く存在するが、かかる用語は当業者には公知である。（例えば、Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); 及びSequence Analysis Primer, Gribskov., M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991) 参照）。配列間における同一性を決定するために一般的に用いられる方法には、例えばCarillo H. 及び Lipman, D., SIAM J. Applied Math. (1988) 48: 1073において開示されているものが含まれる。本明細書に用いられている「ほぼ同一」とは、対象となるポリヌクレオチドの配列間に、高レベルの相同性（好ましくは、１００％配列同一性）が存在することを意味する。しかしながら、９０％又は９５％より高い配列同一性を有するポリヌクレオチドを、本発明に用いるので、遺伝子変異体、株多型性、又は進化的分岐のために予想される多様な配列が含まれる。
【０１５０】
化合物２（ａ）の生成のための生合成部位は、ＤＮＡの約１７６,０００の塩基対に及び、３８のタンパク質をコードする。１０キロベース以上のＤＮＡ配列を部位の各側で分析し、これらの領域が、一次代謝性遺伝子を含むことが分かった。化合物２（ａ）の生合成部位のタンパク質を示す３８オープンリーディングフレームの順序及び相対位置を図１に示す。図１に関し、化合物２（ａ）の生合成に関連する遺伝子は、隣接する２つのヌクレオチド配列（配列番号１及び１８）に含まれている。隣接するヌクレオチド配列は、化合物２（ａ）生合成部位に見られるように、コンティグ１（配列番号１）のＤＮＡの１１７４０塩基対の３’末端は、コンティグ２（配列番号１８）のＤＮＡ１６４,０５１塩基対の５’末端に隣接していることが分かった。
【０１５１】
化合物２（ａ）の部位に関するヌクレオチド配列及びポリペプチド配列は、本出願と共に提出され、本出願の一部をなしている配列表に示されている。配列番号１は、８つのオープンリーディングフレーム、すなわち、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、及び１７に記載されたＯＲＦ１からＯＲＦ８をそれぞれ構成するコンティグ１の１１７４０の隣接する塩基対である。ＯＲＦ１の遺伝子産物（配列番号２）は、コンティグ１の残基４１８〜２５７７（センス鎖）に由来する配列番号３の核酸配列から推定された７１９アミノ酸である。ＯＲＦ２の遺伝子産物（配列番号４）は、コンティグ１（配列番号１）の残基３００６〜３７６７（センス鎖）に由来する配列番号５の核酸配列から推定された２５３アミノ酸である。ＯＲＦ３の遺伝子産物（配列番号６）は、コンティグ１（配列番号１）の残基４０１６〜６８８６（センス鎖）に由来する配列番号７の核酸配列から推定された９５６アミノ酸である。ＯＲＦ４の遺伝子産物（配列番号８）は、コンティグ１（配列番号１）の残基７５８１〜６９７６（アンチセンス鎖）に由来する配列番号９の核酸配列から推定された２０１アミノ酸である。ＯＲＦ５の遺伝子産物（配列番号１０）は、コンティグ１（配列番号１）の残基８８４８〜７５９８（アンチセンス鎖）に由来する配列番号１１の核酸配列から推定された４１６アミノ酸である。ＯＲＦ６の遺伝子産物（配列番号１２）は、コンティグ１（配列番号１）の残基９０５３〜９６１３（センス鎖）に由来する配列番号１３の核酸配列から推定された１８６アミノ酸である。ＯＲＦ７の遺伝子産物（配列番号１４）は、コンティグ１（配列番号１）の残基９６８２〜１０１７３（センス鎖）に由来する配列番号１５の核酸配列から推定された１６３アミノ酸である。ＯＲＦ８の遺伝子産物（配列番号１６）は、コンティグ１（配列番号１）の残基１０１７０〜１１７１４（センス鎖）に由来する配列番号１７の核酸配列から推定された５１４アミノ酸である。
【０１５２】
配列番号１８は、３０のＯＲＦによって構成されるコンティグ２の１６４,０５１の隣接する塩基対、すなわち、それぞれ、配列番号２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６及び７８に例挙されているＯＲＦ９からＯＲＦ３８である。ＯＲＦ９の遺伝子産物（配列番号１９）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１１０９〜６（アンチセンス鎖）に由来する配列番号２０の核酸配列から推定された３６７アミノ酸である。ＯＲＦ１０の遺伝子産物（配列番号２１）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１３７５〜２５８１８（センス鎖）に由来する配列番号２２の核酸配列から推定された８１４７アミノ酸である。ＯＲＦ１１の遺伝子産物（配列番号２３）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基２５９０２〜３６１８８（センス鎖）に由来する配列番号２４の核酸配列から推定された３４２８アミノ酸である。ＯＲＦ１２の遺伝子産物（配列番号２５）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基３６２１３〜５６４６８（センス鎖）に由来する配列番号２６の核酸配列から推定された６７５１アミノ酸である。ＯＲＦ１３の遺伝子産物（配列番号２７）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基５６６００〜６１５７３（センス鎖）に由来する配列番号２８の核酸配列から推定された１６５７アミノ酸である。ＯＲＦ１４の遺伝子産物（配列番号２９）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基６１８５２〜７７４７５（センス鎖）に由来する配列番号３０の核酸配列から推定された５２０７アミノ酸である。ＯＲＦ１５の遺伝子産物（配列番号３１）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基７７６０６〜９３９０４（センス鎖）に由来する配列番号３２の核酸配列から推定された５４３２アミノ酸である。ＯＲＦ１６の遺伝子産物（配列番号３３）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基９４０５７〜１０３７４０（センス鎖）に由来する配列番号３４の核酸配列から推定された３２２７アミノ酸である。ＯＲＦ１７の遺伝子産物（配列番号３５）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１０３７８９〜１２６３２１（センス鎖）に由来する配列番号３６の核酸配列から推定された７５１０アミノ酸である。ＯＲＦ１８の遺伝子産物（配列番号３７）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１２６３８９〜１３８００７（センス鎖）に由来する配列番号３８の核酸配列から推定された３８７２アミノ酸である。ＯＲＦ１９の遺伝子産物（配列番号３９）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１３９０７９〜１３８０６３（アンチセンス鎖）に由来する配列番号４０の核酸配列から推定された３３８アミノ酸である。ＯＲＦ２０の遺伝子産物（配列番号４１）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４０１１７〜１３９２６６（アンチセンス鎖）に由来する配列番号４２の核酸配列から推定された２８３アミノ酸である。ＯＲＦ２１の遺伝子産物（配列番号４３）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４１１０３〜１４０１１４（アンチセンス鎖）に由来する配列番号４４の核酸配列から推定された３２９アミノ酸である。ＯＲＦ２２の遺伝子産��（配列番号４５）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４１４８３〜１４２４３６（センス鎖）に由来する配列番号４６の核酸配列から推定された３１７アミノ酸である。ＯＲＦ２３の遺伝子産物（配列番号４７）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４２４４０〜１４３０５４（センス鎖）に由来する配列番号４８の核酸配列から推定された２０４アミノ酸である。ＯＲＦ２４の遺伝子産物（配列番号４９）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４３１３３〜１４４１１９（センス鎖）に由来する配列番号５０の核酸配列から推定された３２８アミノ酸である。ＯＲＦ２５の遺伝子産物（配列番号５１）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４４１１６〜１４５１０２（センス鎖）に由来する配列番号５２核酸配列から推定された３２８アミノ酸である。ＯＲＦ２６の遺伝子産物（配列番号５３）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４５０９９〜１４５７４３（センス鎖）に由来する配列番号５４の核酸配列から推定された２１４アミノ酸である。ＯＲＦ２７の遺伝子産物（配列番号５５）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４５８１８〜１４７２３０（センス鎖）に由来する配列番号５６の核酸配列から推定された４７０アミノ酸である。ＯＲＦ２８の遺伝子産物（配列番号５７）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４８９６７〜１４７３０６（アンチセンス鎖）に由来する配列番号５８の核酸配列から推定された５５３アミノ酸である。ＯＲＦ２９の遺伝子産物（配列番号５９）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１４９８７１〜１４９１７６（アンチセンス鎖）に由来する配列番号６０の核酸配列から推定された２３１アミノ酸である。ＯＲＦ３０の遺伝子産物（配列番号６１）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１５０７８８〜１４９８６８（アンチセンス鎖）に由来する配列番号６２の核酸配列から推定された３０６アミノ酸である。ＯＲＦ３１の遺伝子産物（配列番号６３）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１５３７６５〜１５０７６９（アンチセンス鎖）に由来する配列番号６４の核酸配列から推定された９９８アミノ酸である。ＯＲＦ３２の遺伝子産物（配列番号６５）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１５４４８５〜１５６０４１（センス鎖）に由来する配列番号６６の核酸配列から推定された５１８アミノ酸である。ＯＲＦ３３の遺伝子産物（配列番号６７）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１５６０７５〜１５７０６４（センス鎖）に由来する配列番号６８の核酸配列から推定された３２９アミノ酸である。ＯＲＦ３４の遺伝子産物（配列番号６９）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１５７３０８〜１５８８７３（センス鎖）に由来する配列番号７０の核酸配列から推定された５２１アミノ酸である。ＯＲＦ３５の遺伝子産物（配列番号７１）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１５８９７０〜１６０２０２（センス鎖）に由来する配列番号７２の核酸配列から推定された４１０アミノ酸である。ＯＲＦ３６の遺伝子産物（配列番号７３）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１６０１９９〜１６１７１９（センス鎖）に由来する配列番号７４の核酸配列から推定された５０６アミノ酸である��ＯＲＦ３７の遺伝子産物（配列番号７５）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１６１９２４〜１６２５７７（センス鎖）に由来する配列番号７６の核酸配列から推定された２１７アミノ酸である。ＯＲＦ３８の遺伝子産物（配列番号７７）は、コンティグ２（配列番号１８）の残基１６２７２３〜１６４０５１（センス鎖）に由来する配列番号７８の核酸配列から推定された４４２アミノ酸である。
【０１５３】
本明細書に列挙されたいくつかのオープンリーディングフレームは、標準開始コドンＡＴＧ、すなわちＯＲＦ３、５、６、９、１１、１３、２１、２２、２３、２４、２７、３４、３６及び３７（配列番号７、１１、１３、２０、２４、２８、４４、４６、４８、５０、５６、７０、７４及び７６）ではなく、非標準開始コドン（例えば、ＧＴＧ−バリン又はＣＴＧ−ロイシン）で開始する。アミノ末端位置の適切なＭ、Ｖ又はＬで全てのＯＲＦを列挙し、ＯＲＦの最初のコドンの特異性を示す。しかしながら、どんな場合にも、生合成されたタンパク質は、アミノ末端位置でメチオニン残基、より具体的には、ホルミルメチオニン残基を含み、コード遺伝子が非標準開始コドンを特定する場合であっても、細菌におけるタンパク質合成はメチオニン（ホルミルメチオニン）で開始するという公知の原則に則っていることが予測される（例えば、Stryer, Biochemistry 3rd edition, 1998, W. H. Freeman and Co., New York, pp. 752-754）。
【０１５４】
共に部位全体にまたがる５つのＤＨ１０Ｂ大腸菌沈着物は、それぞれストレプトミセス・アイズネンシス（ＮＲＲＬＢ−１１２７７）の化合物２（ａ）の部分的な生合成部位のコスミドクローンを含み、２００３年２月２５日にInternational Depository Authority of Canada, Bureau of Microbiology, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2に寄託され、寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ２５０２０３−０１、ＩＤＡＣ２５０２０３−０２、ＩＤＡＣ２５０２０３−０３、ＩＤＡＣ２５０２０３−０４及びＩＤＡＣ２５０２０３−０５がそれぞれ譲渡された。本明細書に示した配列のあらゆる記載と矛盾する場合には、寄託された株に含まれるポリヌクレオチドの配列及びそれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が調整する。
【０１５５】
化合物２（ａ）を生成する［Ｃ０３］０２３株と称され、式Ｉ及び式IIの化合物を生成するために用いられるストレプトミセス・アイズネンシス（ＮＲＲＬＢ−１１２７７）の自然変異体は、２００３年８月７日に、International Depository Authority of Canada, Bureau of Microbiology, Health Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2に寄託され、寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ０７０８０３−１を譲渡された。  
【０１５６】
化合物２（ａ）を生成する［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株と称され、式Ｉ及び式IIの化合物を生成するために用いられるストレプトミセス・アイズネンシス（ＮＲＲＬＢ−１１２７７）の自然変異体を、２００３年１２月２３日に、International Depository Authority of Canada, Bureau of Microbiology, Helath Canada, 1015 Arlington Street， Winnipeg, Manitoba, Canada R3E 3R2に寄託し、寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ２３１２０３−０２が譲渡された。
【０１５７】
コスミド及び［Ｃ０３］０２３株及び［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株（寄託された株）の寄託を、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項の下に実施した。寄託された株は、特許の発行の際に、制限や条件を伴わずに、必ず公開されるであろう。寄託された株は、単に当業者に便利であるために提供されるものであり、寄託が実施可能性のために必要であることを承認するものではない。寄託された株及びそれに由来する化合物を製造し、使用し、販売するためには認可が必要であり、本明細書は、そのような許可を付与するものではない。
【０１５８】
化合物２（ａ）（化合物２（ａ）ＯＲＦ）の生合成部位のタンパク質を示す３８のオープンリーディングフレームの順序及び相対位置は、図１に概略的に図示されている。図１の一番上の線は、塩基対の尺度を示している。グレーの線は、化合物２（ａ）部位にまたがる２つのＤＮＡコンティグを表している。白の矢印は、化合物２（ａ）生合成部位の３８のオープンリーディングフレームを表している。黒の矢印は、化合物２（ａ）部位の全体にまたがる５つの寄託されたコスミドクローンを示している。
【０１５９】
本発明のある態様は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の配列の１つを含む単離、精製、濃縮された核酸、その相補配列、又は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の配列の１つの少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００又はそれ以上のその連続する塩基若しくはその相補配列を含むフラグメントである。単離、精製、又は濃縮された核酸には、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含むＤＮＡが含まれる。単鎖がコード鎖（センス）又は非コード鎖（アンチセンス）である場合は、ＤＮＡは二重鎖又は単鎖である。或いは、単離、精製又は濃縮された核酸がＲＮＡを含む場合もある。
【０１６０】
下記に詳述されるように、単離、精製又は濃縮された、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の１つの核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つ、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つの少なくとも５０、７５、１００、２００、３００、５００又はそれ以上の連続するアミノ酸を含むフラグメントを調製するために用いられる。
【０１６１】
したがって、本発明の別の態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つをコードする単離、精製又は濃縮された核酸、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つの少なくとも５０、７５、１００、２００、３００以上の連続するアミノ酸を含むフラグメントである。これらの核酸のコード配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の核酸の１つのコード配列の１つ、又はそのフラグメントに同一であってもよく、遺伝子コードの冗長性又は縮重の結果、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つをコードする異なるコード配列、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つの少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００の連続するアミノ酸を含む異なるフラグメントであってもよい。遺伝子コードは、当業者に公知であり、例えば、Stryer, Biochemistry, 3rd edition, W. H. Freeman & Co., New Yorkから取得することが出来る。
【０１６２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つをコードする単離、精製又は濃縮された核酸は、（１）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の１つのコード配列のみ、（２）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８のコード配列、及びリーダー配列やプロタンパク質などの追加のコード配列、及び（３）配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８のコード配列、及びコード配列の５’及び／又は３’の非コード配列などの非コード配列、を含むがこれらに限ったものではない。したがって、本明細書に用いられているように、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」なる用語は、ポリペプチドのコード配列のみを有するポリヌクレオチドだけでなく、追加のコード配列及び／又は非コード配列を有するポリヌクレオチドを包含している。
【０１６３】
本発明は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８に基づくポリペプチドであって、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８のポリヌクレオチドがコードするアミノ酸配列を変更しない変化等の「無変化の」ポリヌクレオチドの変化を有するポリヌクレオチドに関連している。本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドのアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断の原因となるヌクレオチドの変化を有するポリヌクレオチドにも関連している。これらのヌクレオチドの変化は、部位特異的突然変異誘発、ランダムな化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIIIの欠失及び他の組換えＤＮＡ技術などの技術を用いて導入される。
【０１６４】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の単離、精製又は濃縮された核酸、その相補配列、又は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の配列の１つの連続する塩基を少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、若しくは５００有するフラグメント又はその相補配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡを同定し単離するプローブとして用いられる。これらの手順においては、ゲノムＤＮＡライブラリーは、サンプルの微生物又はポリケチドを生成する能力のある微生物を含むサンプルから構成される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つをコードするコード配列或いはコード配列のフラグメント、又はそのフラグメントを有するプローブに、その相補配列に特異的にハイブリダイズすることができる条件下でゲノムＤＮＡライブラリーを接触させる。好ましい実施態様においては、プローブは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６又は７８の核酸に基づいて設計された、長さ約１０から約３０のオリゴヌクレオチドである。次に、プローブにハイブリダイズするゲノムのＤＮＡクローンを、検出し単離する。ＤＮＡクローンの調製及び同定する手順は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997 及び Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989において開示されている。別の態様においては、プローブは、制限フラグメント、又は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８に由来するＰＣＲ増幅された核酸である。
【０１６５】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の単離、精製又は濃縮された核酸、その相補配列、又は配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の配列の１つの少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００のその連続する塩基を有するフラグメント、若しくはその相補配列を、関連する核酸を同定し単離するためのプローブとして用いる。ある態様においては、関連する核酸は、潜在的なポリケチド産生株のゲノムのＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）である。これらの手順においては、関連した配列にプローブが特異的にハイブリダイズできる条件下で、潜在的なポリケチド産生株の核酸を含む核酸のサンプルをプローブと接触させる。核酸サンプルは、潜在的なポリケチド産生株のゲノムのＤＮＡ（又はｃＤＮＡ）ライブラリーである。核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションは、上述の方法のいずれかを用いて検出される。
【０１６６】
ハイブリダイゼーションは、低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーの条件下で実施される。核酸のハイブリダイゼーションの例として、固定化変性核酸を含むポリマー膜を、先ず、０．９ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７.０、５.０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０.５％ＳＤＳ、１０×デンハート（Denhardt）試薬、及び０．５ｍｇ／ｍｌポリリボアデニル（polyriboadenylic）酸からなる溶液中、３０分間、４５℃で、プリハイブリダイズする。次に、約２×１０７ｃｐｍ（特異活性４〜９×１０８ｃｐｍ／ｕｇ）の３２Ｐ末端標識オリゴヌクレオチドプローブを、溶液に添加する。培養の１２〜１６時間後、膜は０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＥＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸塩、ｐＨ７．８、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）で、３０分間室温で洗浄し、続いて、新鮮な１×ＳＥＴを融解温度（Ｔｍ）−１０℃で、Ｔｍが融解温度であるオリゴヌクレオチドプローブについて３０分間洗浄する。次に、ハイブリダイゼーションシグナルを検出するために、膜をオートラジオグラフのフィルムに露光する。
【０１６７】
検出可能なプローブにハイブリダイズするゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡなどの核酸を同定するために用いられるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることによって、プローブに対して異なるレベルの相同性を有する核酸を、同定し単離することができる。プローブの融解温度より低温の様々な温度でハイブリダイゼーションを実施するこによって、ストリンジェンシーが変化する。プローブの融解温度は、以下の式を用いて計算することができる。
【０１６８】
長さ１４から７０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドプローブに関して、融解温度（Ｔｍ）（摂氏）は、式：Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（フラクションＧ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）を用いて計算することができる。ここで、Ｎはオリゴヌクレオチドの長さである。
【０１６９】
ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含む溶液で実施される場合は、融解温度は、等式：融解温度＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ  ［Ｎａ＋］）＋０．４１（フラクションＧ＋Ｃ）−（０．６３％ホルムアミド）−６００／Ｎ）を用いて計算することができる。ここでＮはプローブの長さである。
【０１７０】
プレハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性し断片化したサケの精子ＤＮＡ又は６×ＳＳＣ、５×デンハート試薬、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの変性し断片化したサケの精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミドで実施される。ＳＳＣの組成物及びデンハートの溶液は上記Sambrook et al.に列挙されている。
【０１７１】
ハイブリダイゼーションは、上記に列挙されているハイブリダイゼーション溶液に対して検出可能なプローブを付加することによって実施される。プローブが二重鎖ＤＮＡを構成する箇所は、高温で培養し、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前に素早く冷却することによって変性される。二次構造の形成又はオリゴマ形成を排除又は減少させるたに、単鎖プローブについても、同じように変性させるのが望ましい。相補的又は相同的な配列を含むｃＤＮＡ又はゲノムのＤＮＡをプローブがハイブリダイズできるように、十分な期間、フィルターをハイブリダイゼーション溶液と接触させる。長さが２００より長いヌクレオチドを有するプローブに関しては、融解温度より、１５〜２５℃低温でハイブリダイゼーションを実施する。オリゴヌクレオチドプローブなどの、より短いプローブについては、融解温度より５〜１０℃低い温度でハイブリダイゼーションを実施する。好ましくは、より短いプローブではハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣで実施される。好ましくは、より長いプローブ用の溶液を含む５０％のホルムアミドにおいてハイブリダイゼーションを実施する。前記のハイブリダイゼーションは全て、高ストリンジェンシー条件下で実施されるハイブリダイゼーションの例として考えられる。
【０１７２】
ハイブリダイゼーションに続いて、少なくとも１５分間、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、望ましいストリンジェンシーで室温又はそれより高い温度で、フィルターを洗浄する。次に、３０分間から１時間、室温で（再度）０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターを洗浄する。プローブにハイブリダイズした核酸を、従来のオートラジオグラフィー及び非放射性の検出方法で同定する。
【０１７３】
プローブ配列に対する相同性レベルが減少した核酸を同定するために、上記の手順を改良してもよい。例えば、検出可能なプローブに対する相同性が減少する核酸を得るために、よりストリンジェンシーの低い条件を用いる。例えば、約１ＭのＮａ＋濃度を有するハイブリダイゼーション緩衝液において、ハイブリダイゼーションの温度を６８℃から４２℃まで５℃ずつ低下させる。ハイブリダイゼーションに続いて、ハイブリダイゼーション温度で、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでフィルターを洗浄する。これらの条件は、５０℃より高温の「中程度のストリンジェンシー」及び５０℃より低温の「低ストリンジェンシー」条件と考えられる。「中程度のストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション条件の具体例は、上記のハイブリダイゼーションが５５℃で実施される場合である。「低ストリンジェンシー」のハイブリダイゼーション条件の具体例は、上記のハイブリダイズが４５℃で実施される場合である。
【０１７４】
あるいは、４２℃の温度でホルミアミドを含む６×ＳＳＣのような緩衝液においてハイブリダイゼーションを実施する。この場合、プローブに対する相同性のレベルが減少したクローンを同定するために、ハイブリダイゼーション緩衝液におけるホルミアミドの濃度を、５０％から０％まで５％ずつ減少させる。ハイブリダイゼーションに続いて、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで、５０℃で、フィルターを洗浄する。これらの条件は、２５％以上のホルムアミドである「中程度のストリンジェンシー」条件、及び２５％以下のホルムアミドである「低ストリンジェンシー」条件であると考えられる。「中程度のストリンジェンシー」のハイブリダイゼーション条件の具体例は、上記のハイブリダイゼーションが３０％ホルムアミドで実施される場合である。「低ストリンジェンシー」のハイブリダイズ条件の具体例は、上記のハイブリダイゼーションが、１０％ホルムアミドで実施される場合である。プローブにハイブリダイゼーションした核酸を、従来のオートラジオグラフィー及び非放射性の検出方法によって同定する。
【０１７５】
先の方法は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の配列からなる群から選択される核酸配列に、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、又は少なくとも７０％の配列同一性を有する核酸、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、又は５００のその連続する塩基によって構成されるフラグメント、及びその相補配列を単離するために用いられる。単離された核酸は、本明細書に記載されているコード配列の、自然発生する１つの対立遺伝子の変異体であるコード配列を有する。これらの対立遺伝子の変異体は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の核酸、又はその相補配列と比較して、１又は２以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有する。
【０１７６】
さらに、上記の手順を使用して、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７の１つの配列を有するポリペプチドに、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、又は少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードする核酸、又はデフォルトパラメーターを用いたＢＬＡＳＴＰ版２．２．２アルゴリズムを使用して測定される、少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００の連続するアミノ酸によって構成されるそのフラグメントを単離する。
【０１７７】
本発明の別の態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７の１つの配列を含む単離或いは精製されたポリペプチド、又は少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００、３００の連続するそのアミノ酸を含むフラグメントである。本明細書に記載されているように、これらのポリペプチドは、適切な宿主でコードされたポリペプチドを発現させることができる配列にコード配列が操作可能に結合するように、ポリペプチドをコードする核酸をベクターに挿入することによって得られる。例えば、発現ベクターは、プロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含んでいる。ベクターはまた、発現レベル、複製起点及び選択的マーカーを調節するための適切な配列を含んでいる。
【０１７８】
細菌内のポリペプチド又はフラグメントを発現するのに適したプロモーターには、大腸菌のｌａｃプロモーター又はｔｒｐプロモーター、ｌａｃｌプロモーター、ｌａｃＺプロモーター、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲプロモーター、ラムダＰＬプロモーター、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）などの解糖酵素をコードするオペロンのプロモーター、及び酸性ホスフォターゼプロモーターが含まれる。真菌のプロモーターには、α因子プロモーターが含まれる。真核生物のプロモーターには、ＣＭＶ即時性初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、熱ショックプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、レトロウィルスのＬＴＲ及びマウスのメタロチオネイン−Ｉプロモーターが含まれる。原核細胞若しくは真核細胞又はそれらのウィルスにおいて、遺伝子発現を制御することが知られている他のプロモーターも用いられる。
【０１７９】
哺乳類発現ベクターはまた、複製の起源、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位及び受容部位、転写末端配列及び５’フランキング非転写配列を含む。ある態様においては、ＳＶ４０スプライス及びポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を用いて、必要とされる非転写遺伝子要素を提供する。
【０１８０】
真核細胞においてポリペプチド又はフラグメントを発現するベクターは、発現レベルを向上させるための転写促進因子を含んでいてもよい。転写促進因子は、ＤＮＡのシス作用性の要素であり、通常は、転写を増加させるプロモーターに作用する約１０から約３００ｂｐの長さである。例には、転写起源ｂｐ１００から２７０までの後期部位に対するＳＶ４０転写促進因子、サイトメガウィルス初期プロモーター転写促進因子、起源転写の後期部位に対するポリオーマ転写促進因子、及びアデノウィルス転写促進因子が含まれる。
【０１８１】
さらに、好ましくは、発現ベクターが、ベクターを有する宿主細胞の選択を可能にする１又は２以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。使用される選択可能なマーカーの例には、ヒドロ葉酸還元酵素をコードする遺伝子、真核生物細胞培養物に対するネオマイシン耐性を与える遺伝子、又は大腸菌及び酵母遺伝子ＴＲＰ１にトラサイクリン若しくはアンピシリン耐性を与える遺伝子が含まれる。
【０１８２】
ある態様においては、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つをコードする核酸、又は少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００又は３００の連続するアミノ酸を含むそのフラグメントは、翻訳ポリペプチド又はそのフラグメントの分泌を誘導することのできるリーダー配列によって、適切な段階で構築される。状況に応じて、核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つ、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含むフラグメントが、安定性が増加した又は精製若しくは検出が単純化した等の望ましい性質を伝達する、Ｎ末端同定ペプチドなどの異種性ペプチド又はポリペプチドに融合するような融合ポリペプチドをコードすることができる。
【０１８３】
適切なＤＮＡ配列は、様々な手順によってベクターに挿入される。一般的に、              
適切な制限エンドヌクレアーゼを有するベクターと挿入断片の消化に続き、ＤＮＡ配列をベクターの望ましい位置に結合する。或いは、適切な制限酵素部位は、ＰＣＲによってＤＮＡ配列に組み込むことができる。様々なクローニング技術が、Ausbel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 503 Sons, Inc. 1997及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989に開示されている。これらの手順及び他の手順は、当業者の技術の範囲内と考えらる。
【０１８４】
ベクターは、例えば、プラスミド、ウィルス粒子、又はファージの形態である。
他のベクターには、染色体、非染色体、及び合成ＤＮＡ配列、ウィルス、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベクター、ワクチン、アデノウィルス、家禽ジフテリアウイルス及び仮性狂犬病などのウィルス性ＤＮＡが含まれる。原核宿主及び真核宿主に用いられる様々なクローニング及び発現ベクターは、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., (1989) に記載されている。
【０１８５】
用いられる特定の細菌ベクターには、公知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）、ｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden）、ｐＧＥＭ１ (Promega Biotec, Madison, WI, USA)、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Qiagen）、ｐＤ１０、ｐｈｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＴＭＩＩＫＳ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ(Stratagene)、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５(Pharmacia)、ｐＫＫ２３２−８及びｐＣＭ７の、遺伝子要素を有する市販のプラスミドが含まれる。特定の真核生物ベクターには、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ(Stratagene)、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬ(Pharmacia)が含まれる。しかしながら、宿主細胞において複製可能且つ安定してさえいれば、他のあらゆるベクターも用いることができる。
【０１８６】
宿主細胞は、当業者に公知であればどのような宿主細胞でもよく、原核細胞又は真核細胞が含まれる。適切な宿主の代表例としては、大腸菌、ストレプトミセス・リビダンス、ストレプトミセス・グリセオフスクス、ストレプトミセス・アンボファシエンス、バチルス菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及びシュードモナ（Pseudomonas）属、ストレプトミセス属、バチルス属及びブドウ球菌の様々な種等の細菌細胞、イースト菌等の真菌細胞、ショウジョウバエＳ２（Drosophila S2）及びスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）等の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓメラノーマ、及びアデノウィルス等の動物細胞が挙げられる。適切な宿主を選択することは、当業者の能力の範囲である。
【０１８７】
エレクトロポレーション、形質転換、形質移入、形質導入、ウィルス感染、遺伝子銃、又はチタンを媒介とした遺伝子導入を含む様々な技術を用いて、ベクターを宿主細胞に導入する。適切であれば、プロモーターを活性化させる、形質転換体を選択する、又は本発明の遺伝子を増幅するのに適するように改良された従来の栄養培地で、操作された宿主細胞を培養することができる。適切な宿主株の形質転換、及び宿主株が適当な細胞密度になった後、適当な手段（例えば、温度調節又は化学作用による誘発）によって選択したプロモーターを誘発し、所望のポリペプチド又はそのフラグメントを生成できるように、かかる細胞を更なる期間培養する。
【０１８８】
遠心分離によって細胞を収集し、物理的又は化学手段で破壊し、その結果生じた未精製抽出物を、更に精製するために保持する。タンパク質発現のために使用される微生物細胞を、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用等の、あらゆる便利な方法で破壊することができる。これらの方法は、当業者に公知である。硫安塩析又はエタノール沈澱、酸抽出、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含む方法によって、発現ポリペプチド又はそのフラグメントを組換え細胞培養物から回復させ精製することができる。必要であれば、ポリペプチドの配置を完成させるために、タンパク質リフォールディングステップを用いることができる。望ましい場合は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、精製の最終ステップで使用する。
【０１８９】
様々な哺乳類細胞培養システムを使用して、組換えタンパク質を発現することもできる。哺乳類の発現システムの例には、サル腎臓線維芽細胞のＣＯＳ−７株（Gluzman Cell，23:175 (1981) によって記載）、及びＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ヒーラー及びＢＨＫ細胞株等の互換ベクター(compatible vector)のタンパク質を発現する能力を有する他の細胞株が含まれる。宿主細胞における作成物を、組換え配列がコードする遺伝子産物を生成するための従来の方法で用いる。本発明のポリペプチドは、開始メチオニンのアミノ酸残基も含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【０１９０】
また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチド、又は少なくとも５０、７５、１００、２００又は３００の連続するアミノ酸を含むフラグメントは、従来のポリペプチドシンセサイザーによる合成で生成される。別の態様においては、ポリヌクレオチドのフラグメント又は部分を使用して、ペプチド合成によって、対応する全長のポリペプチドを生成する。したがって、かかるフラグメントは、全長のポリペプチドを生成するための中間体として使用される。
【０１９１】
細胞を含まない翻訳システムを使用し、ポリペプチド又はそのフラグメントをコードする核酸に操作可能に結合するプロモーターを含むＤＮＡ作成物から転写されたｍＲＮＡを用いて、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つ、又は、少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００又は３００の連続するアミノ酸を含むフラグメントを生成することができる。ある態様においては、インビトロで転写反応を行う前に、ＤＮＡ作成物を直線化する。所望のポリペプチド又はそのフラグメントを生成するために、ウサギ網状赤血球抽出物等の細胞を含まない適当な翻訳抽出物(translation extract)と共に、転写したｍＲＮＡを培養する。
【０１９２】
本発明は、また、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの変異体、又は少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００又は３００の連続するアミノ酸を含むフラグメントに関する。「変異体」なる用語には、これらのポリペプチドの派生物又は類似体が含まれる。特に、変異体は、あらゆる組合せで存在する１又は２以上の置換、付加、欠失、融合、及び切断によって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドのアミノ酸配列が異なる。
【０１９３】
前記の変異体は、自然発生的に又はインビトロで作成される。特に、前記の変異体は、部位特異的突然変異誘発、ランダムな化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIII欠失方法及び標準的なクローニング技術などの遺伝子工学技術を用いて作成される。あるいは、前記の変異体、フラグメント、類似体又は派生物は、化学的合成又は改良方法を用いて作成される。
【０１９４】
変異体を作成するための他の方法も当業者には公知である。これらには、天然の単離物から得られた拡酸配列を改良して、産業上又は実験的な利用においてそれらの価値を高めるような特徴を有するポリペプチドをコードする核酸を産生する手続きが含まる。これらの手順において、自然単離物から得られた配列に関して１又は２以上のヌクレオチド差を有する多くの変異配列を、生成し、特徴付ける。好ましくは、これらのヌクレオチド差によって、自然単離物の核酸がコードするポリペプチドに関して、アミノ酸が変化する。
【０１９５】
例えば、変異体は変異性ＰＣＲを用いて作成される。変異性ＰＣＲでは、高率の点変異がＰＣＲ産物の全長に沿って得られるように、ＤＮＡポリメラーゼのフィデリティーが低い条件で、ＤＮＡの増幅が行われる。変異性ＰＣＲは、Leung, D. W., et al., Technique, 1:11-15 (1989) 及びCaldwell, R. C. & Joyce G. F., PCR Methods Applic., 2:28-33 (1992) に記載されている。変異体は、あらゆる目的のクローン化したＤＮＡセグメントにおいて、部位特異的突然変異を産生するために、部位特異的突然変異誘発を用いて作成される。オリゴヌクレオチドの突然変異誘発については、Reidhaar-Olson, J. F. & Sauer, R. T., et al., Science, 241:53-57 (1998) に記載されている。変異体はまた、米国特許第６，３６１，９７４号及び第６，３７２，４９７に記載されているような直接的な進化方法（directed evolution strategies）を用いて作成される。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５及び７７のポリペプチドの変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５又は７７のポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸残基が、保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換される変異体である。これらの置換アミノ酸残基は、遺伝子コードによってコードされてもよく、されなくてもよい。
【０１９６】
保存的な置換は、ポリペプチドの所定のアミノ酸を、類似の特徴を有する別のアミノ酸によって置換するものである。保存的な置換として典型的に見られるのは、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン等の脂肪族アミノ酸と別の脂肪族アミノ酸との置換、セリンとトレオニンとの置換、又はその逆、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸残基と別の酸残基との置換、アスパラギン酸又はグルタミン酸などのアミド基を有する残基とアミド基を有する別の残基との置換、リジン、アルギニン等の塩基性残基と別の塩基性残基との置換、及びフェニルアラニン又はチロシン等の芳香族残基と別の芳香族残基との置換である。
【０１９７】
他の変異体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１又は２以上のアミノ酸残基が、置換基を含む変異体である。さらに、他の変異体は、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）等の別の化合物とポリペプチドとが結合した変異体である。更なる変異体は、リーダー配列、分泌配列、プロタンパク質配列又はポリペプチドの精製、濃縮又は安定化を促進する配列な等のポリペプチドに、更なるアミノ酸が融合した変異体である。
【０１９８】
ある態様においては、フラグメント、派生物及び類似体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドと同じ生物学的機能又は作用を保持する。他の態様においては、フラグメント、派生物又は類似体は、フラグメント、派生物、若しくは類似体から酵素で全体或いは部分的に切断可能なポリペプチドの精製、濃縮、検出、安定化又は分泌を促進する異種の融合配列を含んでいる。
【０１９９】
本発明の別の態様は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５及び７７のポリペプチドの１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は９５％以上の同一性を有するポリペプチド若しくははフラグメント、又は少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００又は３００の連続するそのアミノ酸を含むフラグメントである。アミノ酸の「同一性」が、上述の保存的な置換を含むことは理解されるであろう。
【０２００】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つと相同性を有するポリペプチド若しくはフラグメント、又は少なくとも５０、７５、１００、１５０、２００又は３００のその連続するアミノ酸を含むフラグメントを、上述の技術を用いて、それらをコードする核酸を単離することによって得る。
【０２０１】
あるいは、相同的なポリペプチド又はフラグメントは、生物学的濃縮又は精製手順をによって得られる。潜在的に相同的なポリペプチド又はフラグメントの配列は、タンパク分解の消化、ゲル電気泳動及び／又はマイクロシーケンシングによって決定される。予想される相同的なポリペプチド又はフラグメントの配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つ、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含むフラグメントと比較することができる。
【０２０２】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチド、又は少なくとも４０、５０、７５、１００、１５０、２００又は３００の連続するそのアミノ酸を含むフラグメント、派生物又は類似体を、様々な用途に用いる。例えば、ポリペプチド又はフラグメント、派生物若しくは類似体を使用して、明細書の他の箇所に記載されるように、生化学的反応を触媒する。
【０２０３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチド、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０のその連続するアミノ酸を含むフラグメント、派生物若しくは類似体を使用して、ポリペプチド又はフラグメント、派生物若しくは類似体に特異的に結合する抗体を産生する。配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７から産生された抗体を使用して、生物学的サンプルが、ストレプトミセス・アイズネンシス又は関連する微生物を含むかどうかを判断する。
【０２０４】
これらの手順では、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドの１つ、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含むフラグメントに特異的に結合することができる抗体と、生物学的サンプルとを接触させる。抗体に結合する生体サンプルの能力は、そこで決定される。例えば、蛍光剤、酵素ラベル又は放射性同位元素等の検出可能なラベルで抗体を標識化することによって結合を判断する。あるいは、サンプルに対する抗体の結合を、これらの検出可能なラベルを有する二次抗体を用いて検出する。サンプルにおける、ポリケチド産生株の存在、ストレプトミセス・アイズネンシスの存在、又は配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７に関連したポリペプチドの存在を検出するのに用いられる様々なプロトコルアッセイは、当業者には公知である。特定のアッセイには酸素免疫測定法アッセイ、サンドイッチアッセイ、放射性免疫測定法、及びウェスタンブロット法が含まれる。あるいは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７から生成された抗体を使用して、生体サンプルが、ポリケチドの生合成にかかわる関連ポリペプチドを含むかどうかを決定する。
【０２０５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０のその連続するアミノ酸を含むフラグメントは、動物へのポリペプチドの直接注入、又は動物、好ましくは非ヒト動物へのポリペプチド投与によって得られる。このようにして得られた抗体は、ポリペプチド自体を結合する。このように、ポリペプチドのフラグメントのみをコードする配列を使用しても、未変性のポリペプチド全体に結合する抗体を産生することができる。次に、これらの抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離することができる。
【０２０６】
モノクロナール抗体の調製に関しては、連続継代性細胞培養株によって生成される抗体を提供するあらゆる技術が用いられる。例には、ハイブリドーマ法（Kholer and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497）、トリオーマ法、ヒトＢ細ハイブリドーマ法（Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole, et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,  Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が含まれる。
【０２０７】
単鎖抗体の生成について記載した技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチド、又は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０の連続するアミノ酸を含むフラグメントに対する単鎖抗体を生成するために使用する。また、トランスジェニックマウスを使用して、これらのポリペプチド又はフラグメントに対するヒト化抗体を発現させる。
【０２０８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチド、又は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００又は１５０その連続するアミノ酸を含むフラグメントに対して産生された抗体を、生物体を含むサンプル又は細胞を含まない抽出物から、類似のポリペプチドをスクリーニングする際に用いる。これらの技術において、サンプル由来のポリペプチドを抗体と接触させ、抗体に特異的に結合するポリペプチドを検出する。上述の手順のいずれを使用して、抗体結合を検出してもよい。これらのスクリーニングアッセイの１つは、“Methods for measuring Cellulase Activities,” Methods in Enzymology, Vol 160, pp. 87-116に記載されている。
【０２０９】
化合物２（ａ）部位における遺伝子の機能を同定するために、デフォルトパラメーターを用いたＢＬＡＳＴＰ版２．２．１アルゴリズムを使用して、米国国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の非冗長タンパク質のデータベース及び微生物遺伝子、経路及び天然産物のＤＥＣＩＰＨＥＲaデータベース（Ecopia BioSciences Inc. St-Laurent, QC, Canada）における配列と、ＯＲＦ１〜３８とを比較した。
【０２１０】
このブラスト解析のＧｅｎＢａｎｋでヒットした上位のもののアクセッション番号を、対応するＥ値と共に表１に示す。Ｅ値は、確認されたアラインメントスコアと少なくとも等しいアラインメントスコアを有するアラインメント確率（chance alignments）の予測数に関する。Ｅ値が０．００である場合は、完全な相同体を示している。Ｅ値は、Altschul et al. J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990) に記載さるように計算されている。相同体であるという推定を正当化するために十分な類似性を２つの配列が示すかどうかを決定する際に、かかるＥ値は有用である。
【０２１１】
【表１】
2007525148.tif 000087
2007525148.tif 000088
2007525148.tif 000089
2007525148.tif 000090
2007525148.tif 000091
2007525148.tif 000092
2007525148.tif 000093
2007525148.tif 000094
2007525148.tif 000095
【０２１２】
化合物２（ａ）部位におけるＯＲＦ１〜３８の各々の遺伝子産物に、表１で定めた、既知のタンパク質の構造に類似の配列に基づくタンパク質ファミリーを割り当てる。推定上の機能は、各タンパク質ファミリーの構成要素の既知の機能に基づく化合物２（ａ）部位、生合成部位のそれぞれの遺伝子産物によるものであると考えられる。各タンパク質ファミリーは、明細書及び図面を通して用いられている４文字の記号で表されている。例えば、ＯＲＦ２１（配列番号４３）の遺伝子産物を含むタンパク質ファミリーＡＢＣＤの構成要素は、膜透過トランスポーターである。ＯＲＦ３３（配列番号６７）の遺伝子産物を含むタンパク質ファミリーＡＤＨＹの構成要素は、アミジノヒドラーゼである。ＯＲＦ３４（配列番号６９）の遺伝子産物を含むタンパク質ファミリーＡＤＳＮの構成要素は、アデニル化／縮合酵素である。ＯＲＦ１９及び３５（配列番号３９及び７１）を含むタンパク質ファミリーＡＹＴＦ及びＡＹＴＰの構成要素は、アシルトランスフェラーゼである。タンパク質ファミリーＣＡＬＢの構成要素は、ＯＲＦ２７及び３６（配列番号５５及び７３）を含むアシルＣｏＡリガーゼである。ＯＲＦ３２（配列番号６５）を含むタンパク質ファミリーＣＴＦＣの構成要素は、カルボキシルトランスフェラーゼ／デカルボキラーゼである。ＯＲＦ２５及び２２（配列番号５１及び４５）を含むタンパク質ファミリーＤＥＰＡ及びＤＥＰＬの構成要素は、デヒドラターゼ／エピメラーゼである。ＯＲＦ２３（配列番号４７）を含むタンパク質ファミリーＥＰＩＭの構成要素は、エピメラーゼである。ＯＲＦ９（配列番号１９）を含むタンパク質ファミリーＧＴＦＡの構成要素は、グリコシルトランスフェラーゼである。ＯＲＦ２０（配列番号４１）を含むタンパク質ファミリーＭＥＡＹの構成要素は、膜タンパク質である。ＯＲＦ２４（配列番号４９）を含むタンパク質ファミリーＮＵＴＡの構成要素は、ヌクレオチジルトランスフェラーゼである。ＯＲＦ１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７及び１８（配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７）を含むタンパク質ファミリーＰＫＳＨの構成要素は、Ｉ型のタンパク質であるポリケチドシンターゼである。ＯＲＦ２９（配列番号５９）を含むタンパク質ファミリーＰＰＴＦの構成要素は、フォスフォパンテエチニル（phosphopantetheinyl）トランスフェラーゼである。ＯＲＦ３及び３１（配列番号６及び６３）を含むタンパク質ファミリーＲＥＧＤの構成要素は、転写レギュレーターである。ＯＲＦ４（配列番号８）を含むタンパク質ファミリーＲＲＥＢの構成要素は、応答レギュレーターである。ＯＲＦ５（配列番号１０）を含むタンパク質ファミリーＳＰＫＫの構成要素は、感受性プロテインキナーゼである。ＯＲＦ２及び２６（配列番号４及び５３）を含むタンパク質ファミリーＴＥＳＡの構成要素は、チオエステラーゼである。ＯＲＦ２８（配列番号５７）を含むタンパク質ファミリーＴＭＯＡの構成要素は、モノオキシゲナーゼである。各タンパク質ファミリーの機能に関するより詳細な説明は、表２に示されている。各タンパク質ファミリーの構造と機能の相関関係は、表２に示されている。
【０２１３】
【表２】
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【０２１４】
化合物２（ａ）の生合成は、図１に示されているＯＲＦ１０〜１８（配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７）のマルチモジュラーＩ型ポリケチドシンターゼシステム（ＰＫＳ）に関連する。Ｉ型ＰＫＳは、連続的に（sequential manner）アシルチオエステルを縮合する大きなモジューラータンパク質である。ＰＫＳシステムは、１又は２以上の多機能ポリペプチドからなり、各々がモジュールで構成される。Ｉ型のＰＫＳモジュールはそれぞれ、β−ケトアシルタンパク質シンターゼ（ＫＳ）、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）及びアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）の３つのドメインを有する。ケトレダクターゼ（ＫＲ）、デヒドラターゼ（ＤＨ）及びエノイルレダクターゼ（ＥＲ）などの付加的な酵素活性を与えるドメインも、ＰＫＳモジュールに見られる。これらの付加的なドメインによって、延長するポリケチド鎖のβ−ケト基が様々なレベルで減少する。各モジュールは、β−ケトアシル単位の１回の縮合及び減少の原因となる。モジュールの数とポリケチド鎖の長さの間だけでなく、モジュールのドメイン組成物とポリケチド産物の減少レベルと間にも、直接的な相関関係がある。最終的なポリケチド産物は、ＰＫＳシステムの最終的なモジュールに見られるチオエステラーゼドメインの作用によって、ＰＫＳタンパク質から遊離される。ほとんどのＩ型のＰＫＳ酵素の遺伝子構成は、ポリケチド鎖を生じる生化学反応の順序と、同一線形に並んでいる。当業者であれば、これらの特徴によって、所定の生合成経路に見られるＰＫＳモジュールの構築に基づいて、ポリケチド核構造の予測が可能であることを直ちに理解するであろう。[Hopwood, Chem. Rev., 97: 24, 65-24, 97 (1997) ]。
【０２１５】
化合物２（ａ）部位のＰＫＳシステムは、ＯＲＦ１０〜１８（配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７）から構成され、表３に示されているように、合計２７のモジュールを有する。第一のモジュールは、ＡＣＰドメインのみを含み、付加モジュール（モジュール０）に対応する。一方、残りの２６のモジュールは、ＫＲ、ＤＨ及びＥＲドメインとの様々な組合せにおいて、ＫＳ、ＡＴ及びＡＣＰのドメインを含む。ＯＲＦ１８／モジュール２６に存在するチオエステラーゼドメインは、このモジュールがポリケチド鎖の生合成における最終的なモジュールであることを示している。モジュール６と１１におけるデヒドラターゼドメイン及びモジュール１２におけるケトレダクターゼドメインは、触媒作用に重要な高度に保存された領域に非保存アミノ酸残基が存在するので、不活性である。
【０２１６】
化合物２（ａ）部位ＰＫＳドメイン配位
【表３】
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【０２１７】
化合物２（a）の部位ＰＫＳシステム（図２）に存在するＫＳドメインの複合アミノ酸配列が、ドメインの全体的な類似性、並びにアミノ酸残基の保存及び活性に重要なドメイン領域の保存を示していることから、当業者であれば、全てのＫＳドメインが機能的であることを理解するであろう。同様に、ＡＴドメイン（図３）、ＥＲドメイン（図５）、ＡＣＰドメイン（図７）及びＴＥドメイン（図８）の複合アミノ酸配列は、関連するドメインの全体的な類似性や、タンパク質領域の高度な保存及び触媒活性に重要なアミノ酸残基の保存を示している。化合物２（ａ）の部位ＰＫＳに一度だけ発生するドメイン、すなわち、ＯＲＦ１７(配列番号３５)におけるエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメイン及びＯＲＦ１８（配列番号３７）におけるチオエステラーゼ（ＴＥ）ドメインを、ニスタチンのＩ型ポリケチドのシステムの原型ドメインと比較する（図５及び８）（上記Brauteset et al.参照）。
【０２１８】
化合物２（a）の部位ＰＫＳに見られるＤＨドメインの比較は、触媒活性に重要なアミノ酸残基の高度な保存を示している（図４）。しかしながら、２つのＤＨドメインは、高度な配列保存領域に非保存アミノ酸置換を含むので、不活性である。図４にハイライトで表示されているように、ＯＲＦ１１（配列番号２３）におけるモジュール６のＤＨドメイン及びＯＲＦ１２（配列番号２５）におけるモジュール１１のＤＨドメインは、非荷電脂肪族アミノ酸の荷電アミノ酸アルギニン及びグルタミン酸の置換をそれぞれ含んでいる。
【０２１９】
化合物２（ａ）の部位ＰＫＳシステムに見られるＫＲドメインの比較も、ＯＲＦ１３（配列番号２７）に見られるモジュール１２のＫＲドメインを除いて、触媒に重要な活性部位及びアミノ酸残基の保存を示している。図６は、高度に保存されたチロシン（Ｙ）アミノ酸残基のグルタミン（Q）の置換のモジュールの存在を示している。この非保存アミノ酸置換によって、ＯＲＦ１３（配列番号２７）（ＯＲＦ１３、ｐＫＲ０１）において、モジュール１２のＫＲドメインの酵素活性が不活性となる。
【０２２０】
化合物２（a）の部位ＰＫＳのＡＴドメインの系統的分析を実施し、延長するポリケチド鎖に組み込まれているβ−ケトアシルユニットの性質を評価した。化合物２（ａ）の部位ＰＫＳのＡＴのドメインを、２つのドメイン、ＡＡＦ７１７７９ｍｏｄ０３及びＡＡＦ７１７６６ｍｏｄ１１と比較した。これらは、ニスタチンＰＫＳシステムに由来し[Brautaset、上記]、マロニル−ＣｏＡ及びメチルマロニルＣｏＡの取り込みをそれぞれ特定している。図９は、化合物２（a）の部位ＰＫＳにおけるＯＲＦ１３（配列番号２７）のモジュール１２及びＯＲＦ１６（配列番号３３）のモジュール１９と２０は、ポリケチド鎖にメチルマロニルを取り込み、残りのＡＴドメインは全て、マロネート増量剤(malonate extender)β−ケトアシルユニットを組み込むことを示し、様々なＡＴドメインの系統的な関連性を表している。
【０２２１】
化合物２（ａ）の部位ＰＫＳシステムのドメイン分析は、ポリケチド核構造の合成を明らかに示している。あらゆる特定の作用機序又は生合成の図式に限定する意図はないが、化合物２（ａ）の部位ＰＫＳのモジュールの性質及び構造によって、化合物２（ａ）の合成を説明することができる。図１０は、化合物２（ａ）の推定されたドメイン構造とポリケチド核との相互関係に基づき、ポリケチドシンターゼシステムによって触媒された一連の反応を模式的にハイライトで表している。それらによって達成されるＩ型のＰＫＳドメイン及び反応は、当業者に公知であり、文献に詳しく説明されている。例えば、Hopwood、上記参照。
【０２２２】
γ−アミノブチリル−ＣｏＡスターターユニットを生成するための生合成の経路も、示されている。ＯＲＦ２８（配列番号５７）の遺伝子産物は、タンパク質ファミリーＴＭＯＡの構成要素であり、４−グアニジノブタンアミド（4-guanidinobutanamide）を構成するアルギニンの脱炭素による酸化（decarboxylative oxidation）を触媒する。ＯＲＦ３３（配列番号６７）の遺伝子産物はタンパク質ファミリーＡＤＨＹの構成要素であり、どちらもタンパク質ファミリーＣＡＬＢの構成要素であるＯＲＦ２７又は３６（それぞれ配列番号５５及び７３）によって更に活性化されるγ−アミノブタンアミドを構成するアミジノ基の加水分解を触媒し、γ−アミノブチリル−ＣｏＡを産生する(図１０ａ)。図１０ｂに示されているように、タンパク質ファミリーＡＹＴＦの構成要素であるＯＲＦ１９（配列番号３９）の遺伝子産物は、この特別な増量剤のユニットを、タンパク質ファミリーＰＫＳＨの構成要素であるＯＲＦ１０（配列番号２１）の負荷モジュール（モジュール０）のＡＣＰドメインに負荷する。特定のドメインによって、マロニル−ＣｏＡ及びメチルマロニル−ＣｏＡ増量剤ユニットの連続的な縮合によって、ポリケチド鎖は延長し続けるが、これらの増量剤ユニットは特異的なドメインによって様々なレベルにまで更に低下(reduce)する。ＯＲＦ１１（配列番号２３）のモジュール６及びＯＲＦ１２（配列番号２５）のモジュール１１のデヒドラターゼドメイン、及びＯＲＦ１３（配列番号２７）のモジュール１２におけるケトレダクターゼドメインは不活性であり、結果的に各々の還元反応を触媒しない。図１０ｂに示されているように、成熟したポリケチド鎖は、タンパク質ファミリーＰＫＳＨの構成要素であるＯＲＦ１８(配列番号３７)に見られるチオエステラーゼのドメインの活性によって遊離する。化合物２（ａ）部位のＰＫＳドメインの構造から予測されるポリケチド核構造は、化合物２（ａ）のポリケチドの部分と完全に一致している。
【０２２３】
化合物２（ａ）の部位は、化合物２（ａ）の部位の化学的構造に見られる他の２つの成分の合成に関係する遺伝子を含む。図１１ａは、化合物２（ａ）の部位に見られるアミノヒドロキシ−シクロペンテノン成分を生成するための生合成経路を示している。タンパク質ファミリーＡＹＴＰの構成要素であるＯＲＦ３５（配列番号７１）の遺伝子産物は、５−アミノルブリン酸を形成するサクシニル−ＣｏＡを用いてグリシンを縮合する。かかる中間体は、タンパク質ファミリーＣＡＬＢの両構成要素であるＯＲＦ２７又は３６（それぞれ配列番号５５及び７３）の遺伝子産物の作用を通して更に活性化し、５−アミルブリン酸−ＣｏＡを形成するが、５−アミルブリン酸−ＣｏＡは自然に環化して、アミノヒドロキシシクロペンテノンを生成する。続いて、かかる成分を、図１０ｃに示されているタンパク質ファミリーＡＤＳＮの構成要素であるＯＲＦ３４（配列番号６９）の遺伝子産物の作用によって、ポリケチド鎖の活性化したカルボキシ末端で縮合する。
【０２２４】
図１１ｂは、化合物２（ａ）のデオキシ糖成分の生合成経路を示している。タンパク質ファミリーＮＵＴＡの構成要素であるＯＲＦ２４（配列番号４９）の遺伝子産物は、ｄＮＤＰ−Ｄ−グルコースを形成するＤ−グルコースを活性化する。ｄＮＤＰ−Ｄ−グルコースをその後、ｄＮＤＰ−４−ケト−４，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコースを形成するタンパク質ファミリーＤＥＰＡの構成要素であるＯＲＦ２５（配列番号５１）の遺伝子産物の作用によって脱水する。タンパク質ファミリーＤＥＰＬの構成要素であるＯＲＦ２２（配列番号４５）の遺伝子産物は、ｄＮＤＰ−Ｌ−ラムノースを生成するタンパク質ファミリーＥＰＩＭの構成要素であるＯＲＦ２３（配列番号４７）の遺伝子産物によって後にエピマー化するｄＮＤＰ−Ｄ−フコースを形成する本中間体を更に還元する。
【０２２５】
図１０ｃに図示されるように、グリコシルトランスフェラーゼ、すなわちタンパク質ファミリーＧＴＦＡの構成要素であるＯＲＦ９（配列番号１９）の遺伝子産物の作用によって、最終的なデオキシ糖成分をポリケチド核構造のヒドロキシル基に転移する。図１０ｃは、タンパク質ファミリーＣＡＬＢの構成要素であるＯＲＦ３４（配列番号６９）の遺伝子産物及びタンパク質ファミリーＧＴＦＡの構成要素であるＯＲＦ９（配列番号１９）の遺伝子産物によって触媒される反応のタイミングに関する図式を提示している。しかしながら、本発明は、図１０ｃに示されるような、実際のタイミング及び反応の順序にあるのではないことは、容易に理解されるであろう。
【０２２６】
化合物２（ａ）の部位を形成する更なるタンパク質は、ＯＲＦ２（配列番号４）の遺伝子産物及びタンパク質ファミリーＴＥＳＡの構成要素を含み、ポリケチドプライミングの校正機能を有することが予測される。タンパク質ファミリーＲＥＧＤ、ＲＲＥＢ、ＳＰＫＫ及びＲＥＧＤの構成要素である、ＯＲＦ３、４、５及び３１の各遺伝子産物（配列番号６、８、１０及び６３）は、化合物２（ａ）の合成を制御することが予測される。タンパク質ファミリーＵＮＥＷ及びＡＢＣＤの構成要素であるＯＲＦ６及び２１の各遺伝子産物（配列番号１２及び４３）は、膜透過輸送に関連している。タンパク質ファミリーＰＰＴＦの構成要素であるＯＲＦ２９（配列番号５９）の遺伝子産物は、フォスフォパンテエチニル化（phosphopantetheinylation）によってＡＣＰドメインを活性化する。
【０２２７】
化合物２（ａ）の部位の遺伝子を組み換えることによって、式Ｉ及び式IIの化合物並びに化合物２（ａ）の構造を改変することができる。ＰＫＳ生合成の部位の遺伝子組換えは、当業界では公知である。特許公報ＷＯ０１／３４８１６は、ラパマイシン合成に関する部位における、遺伝子の遺伝子組換えに由来するマクロライドポリケチドラパマイシンの構造的変異体のライブラリーの構築を教示している。教示されている遺伝子組換えには、遺伝子の不活性化、遺伝子挿入及び遺伝子置換が含まれる。ラパマイシン部位内の異なる位置でこれらの改変を単独で、又は組み合わせて行うとポリケチドスターターユニット、鎖長、及び立体特異性が、ラパマイシンにおいて変わる。同様に、McDaniel et al. [Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 18646-51] は、遺伝子不活性化、マイクロライド鎖長及びエリスロマイシン生合成遺伝子のヒドロキシル立体特異性改変を含む遺伝子改変の組合せを用いて、マイクロライド系抗生物質エリスロマイシンの５０より多くの派生物のライブラリーを産生した。
【０２２８】
化合物２ａの生合成をコードする核酸配列の解明によって、生物学的ツールが提供されるが、このツールを用いることによって、当業者は化合物２ａの変異体を産生するための生合成の経路の遺伝子的改変を行うことができる。特に、モジュール数やカルボン酸に対する特異性を変更することによって、また、還元活性を有するドメインを不活性化又は挿入することによって、Ｉ型のＰＫＳシステムを操作する (Katz, Chem. Rev. v. 97, 2557-2575, 1997) 。したがって、ドメインを改変、付加又は欠失させることによって、又は他のＩ型のＰＫＳ酵素から得たドメインに置換することによって、化合物２（ａ）のポリケチドシンターゼシステムを操作する。式Ｉの化合物は、化合物２ａの生成のためのポリケチドシンターゼシステムに基づいて作成された改変ＰＫＳシステムを用いて生成される。好ましい改変ＰＫＳシステムは、ＫＳ、ＡＴ、ＫＲ、ＤＨ又はＥＲドメインが不活性化又は欠失されたシステムである。
【０２２９】
ある態様において、本発明は、改変されたポリケチドシンターゼシステムから得られた式Ｉ又はIIのポリケチドの調製に関し、前記の改変には、本発明の１又は２以上のドメインの欠失、変異誘発体、不活性化、又は置換が含まれる。改変されたポリケチドシンターゼシステムによって、大きさ、飽和レベル、及び酸化レベルが式２ａの化合物とは異なる式Ｉの化合物が生成される。別の態様においては、本発明は、化合物２（ａ）の部位のポリケチドシンターゼシステムの遺伝子組換えによって生成された式Ｉ又はIIの化合物に関する。
【０２３０】
本発明の化合物を、薬学的に許容される担体と組合せて、式Ｉの化合物を含む薬学的組成物に処方してもよい。
【０２３１】
本発明の化合物は、細菌感染、真菌感染及び癌の治療に有用である。
【０２３２】
本明細書において用いられる分子用語は、他に明記されない限り、一般的な意味を有する。
【０２３３】
アルキルなる用語は、直線の又は分枝の炭化水素基に関する。アルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキシメチル等が含まれるが、これらに限定されない。アルキル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボオキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘトロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルフォニル、オキソ、グアニジノ及びホルミルから選択される１又は２以上の置換基によって任意に置換されてもよい。
【０２３４】
アルケニルなる用語は、少なくとも１つの炭素炭素二重結合を含む直線の、分枝の、又は環状炭化水素基に関する。アルケニル基の例には、ビニル、１−プロペン−２−イル、１−ブテン−４−イル、２−ブテン−４−イル、１−ペンテン−５−イル等が含まれるが、これらに限定されない。アルケニル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルフォニル、ホルミル、オキソ及びグアニジノから選択される１又は２以上の置換基によって任意に置換されてもよい。不飽和炭化水素鎖の二重結合部位は、シス型立体配置又はトランス配列のいずれであってもよい。
【０２３５】
シクロアルキル又はシクロアルキル環なる用語は、３から１５の員環を有する炭素単環又は縮合炭素環における飽和又は部分的に不飽和の炭素環に関する。シクロアルキル基の例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが含まれるが、これらに限定されない。シクロアルキル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スフィニル、スルフォニル及びホルミルから選択される１又は２以上の置換基によって任意に置換されてもよい。
【０２３６】
ヘテロシクロアルキル、複素環、アルキル複素環なる用語は、３〜１５の員環を有する単独又は融合の複素環システムにおけるＯ、Ｎ、ＮＨ、ＮＲＸ、ＰＯ２、Ｓ、ＳＯ又はＳＯ２から選択される１〜４のヘテロ原子又はヘテロ基を含む飽和又は部分的不飽和環に関する。ヘテロシクロアルキル基の例は、モルホリニル、ピペリジニル及びピロリジニルを含むが、これに限定されない。ヘテロシクロアルキル基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、オキソ、チオカルボニル、イミノ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルフォニル及びホルミルから選択される１又は２以上の置換基で置換されてもよい。
【０２３７】
アミノ酸なる用語は、天然アミノ酸、合成アミノ酸又は天然アミノ酸の合成派生物に関する。天然アミノ酸は例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンを含むが、これに限定されない。
【０２３８】
ハロなる用語は、臭素、塩素、フッ素又はヨード原子として定義される。
【０２３９】
アリール又はアリール環なる用語は、５〜１５の員環を有する単独又は融合の環系から成る芳香族基に関する。アリール基の例は、フェニル、ナフチル、ビフェニル、テルフェニルを含むが、これに限定されない。アリール基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、アジド、アルキチオ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルフォニル及びホルミルから選択される１又は２以上の置換基で置換されてもよい。
【０２４０】
ヘテロアリール又はヘテロアリール環なる用語は、５〜１５の員環を有し、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＳＯ及びＳＯ２等のヘテロ原子を少なくとも一つ含む単独又は融合環系から成る芳香属基に関する。ヘテロアリール基の例は、ピリジニル、チアゾリル、チアジアゾリル（thiadiazoyl）、イソキノリニル、ピラゾリル、オキサゾリル、オキサジアゾイル（oxadiazoyl）、トリアゾリル及びピロリル基を含むが、これに限定されない。ヘテロアリール基は、アシル、アミノ、アシルアミノ、アシルオキシ、カルボアルコキシ、カルボキシ、カルボキシアミド、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、チオ、チオカルボニル、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、スルフィニル、スルフォニル及びホルミルから選択されるた１又は２以上の置換基で置換されてもよい。
【０２４１】
本明細書中に記載される、「治療」なる表現は、障害、すなわち疾病又は状態、疾患の症状は疾患の傾向がある患者に、疾患、疾患の症状又は疾患の傾向を治療、治癒、緩和、軽減、変化、改善、好転、影響する目的で、治療薬を投与又は塗布すること、又は患者から単離した組織又は細胞株に治療薬を投与又は塗布すること、に関する。
【０２４２】
本明細書中に使用される、「薬学的な組成物」とは、ファルネシルジベンゾジアゼピノン（farnesyl dibenzodiazepinone）及び薬学的に許容される担体の薬学的な有効量を含む。本明細書中に使用される、「薬学的な有効量」、「治療的な有効量」、又は単に「有効量」とは、目的とする薬理学的、治療的又は予防的結果を産出するために有効なファルネシルジベンゾジアゼピノンの量に関する。例えば、もし、ある一定の医療処置が、疾病又は疾患に関連した測定可能なパラメーターが少なくとも２５％の減少した時に、有効であるとみなされるのならば、かかる疾病又は疾患の治療の治療的なに有効量とは、そのパラメーターが少なくとも２５％減少する効果を及ぼすために必要な量のことである。
【０２４３】
「薬学的に許容される担体」なる用語は、治療薬の投与のための担体に関する。前記の担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール及びそれらの組合せを含むが、これに限定されない。かかる用語は、特に細胞培養培地を除外している。経口投与薬に関しては、薬学的に許容される担体とは、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、着味剤、着色剤、及び防腐剤などの薬学的に許容される賦形剤を含むが、これに限定されない。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム及び炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム及びリン酸カルシウム及び乳糖を含まれるが、コーンスターチとアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤は、スターチ及びゼラチンを含むことができるが、潤滑剤は、存在する場合は、一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクである。必要に応じて、錠剤は、消化管における吸収を遅らせるために、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリル等の物質によってコーティングされてもよい。
【０２４４】
薬学的に許容される塩は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。塩の性質は、薬学的に許容されれば、臨界的でない。酸付加塩の例としては、塩酸、臭化水素、よう化水素、窒素、炭酸、硫酸、リン酸、ギ酸、酢酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸、グルタミン酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、マレイン酸、エンボン酸（パモン酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、パントテン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸、メシリック（mesylic）、シクロエキシアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β−ヒドロキシ酪酸、マロン酸、ガランタンティック（galactantic）、ガラクツロン等が含まれるが、これに限定されない。適切な薬学的に許容される本発明の化合物の塩基付加塩は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛からできる金属塩、Ｎ’−ジメチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノール、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、リシン、プロカイン等を含むが、これに限定されない。薬学的に許容される塩のさらなる例は、Journal of Pharmaceutical Sciences, 1977, 66:2に記載されている。これらの全ての塩は、従来の方法で式Ｉの対応する化合物から適切な酸又は塩基を処理して調製することができる。
【０２４５】
本発明の化合物は、１又は２以上の非対称性の炭素原子を有することができ、ラセミ又は非ラセミ化合物を形成しながら、光学異性体として存在することができる。本発明の化合物は、単独の異性体又は立体化学的な異性体の形態として有用である。ジアステオ異性体、すなわち、重ねあわせることが出来ない立体化学異性体は、クロマトグラフィー、蒸留、結晶化及び昇華等の従来の方法で分離することができる。光学異性体は、従来の過程に従って、ラセミ混合物の分割によって得ることができる。
【０２４６】
本発明は、単離された化合物を包含する。単離された化合物は、本発明の化合物が、当業者に既知の従来の生物学分析で検査した際に、抗菌、抗真菌又は抗癌作用を含む生化学的活性を実証できる程度（すなわち統計学的に有意である）有するという条件で、ある混合物内の本発明の化合物が少なくとも１０％、２０％、５０％及び８０％含まれる化合物に関する。
【０２４７】
本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩は、特に細菌感染及び真菌感染症などの疾患の治療的又は予防的処置のための経口、静脈内、筋肉内、皮下投与、局所投与又は非経口投与するための形態で製剤化することができる。経口又は非経口の投与には、本発明の化合物は、従来の薬学的な担体及び賦形剤と混合し、錠剤、カプセル、エルキシル剤、懸濁液、シロップ、ウェハー等の形態で用いることができる。本発明の化合物を含む組成物は、活性化合物を約０．１〜約９９．９重量％、約５〜約９５重量％、約１０〜約８０重量％、又は約１５〜約６０重量％含む。
【０２４８】
本明細書中に開示される薬学的な調製物は、標準の手順に従って調製され、細菌感染及び真菌感染を軽減、予防、又は除去するために選択される投与量を投与する（ヒトの治療のための様々な抗菌剤を投与する方法の一般的な記載に関しては、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA及びGoodman and Gilman’s the Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY参照。  その内容は参照のために組み込まれている）。本発明の組成物は、放出性デリバリーシステム（例えば、カプセル）又は、持続性デリバリーシステム（例えば、生化学的侵食性基質 (bioerodable matrices)）を用いてデリバリーすることが出来る。本発明の組成物（好ましくは式Ｉ）の投与に適切なドラッグデリバリーの放出遅延性デリバリーシステムの例は、米国特許番号４，４５２，７７５（Kent）５，２３９，６６０（Leonard）３，８５４，４８０（Zaffaroni）に記載されている。
【０２４９】
本発明の薬学的に許容される組成物は、本明細書中でまとめて「担体」の物質と言及される、１つ又は２以上の非毒性の薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤及び／又はアジュバンド及び／又は賦形剤と、必要に応じて、他の活性成分と共に、１又は２以上の本発明の化合物を含む。組成物は、コーンスターチ、ゼラチン、乳糖、ショ糖、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、第二リン酸カルシウム、塩化ナトリウム及びアルギン酸等の一般的な担体及び賦形剤を含む。組成物はクロサルメロース・ナトリウム（crosarmellose sodium）、微結晶性セルロース、グリコール酸ナトリウムスターチ及びアルギン酸を含むことができる。
【０２５０】
使用可能な潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム又は他のステアリン酸金属、ステアリン酸、シリコン液、タルク、ワックス、油分及びコロイド状のシリカを含む。
【０２５１】
ペパーミント、ウィンターグリーンの油、チェリー味の着味剤を用いることができる。剤型の外観をより美的にするため、又は本発明の化合物を含む製品を識別しやすくするために、着色剤を添加することが望ましい。
【０２５２】
経口投与には、薬学的な組成物は、例えば、錠剤、カプセル、懸濁液又は液体の形態である。経口での使用には、錠剤やカプセル等のなどの固形製剤が特に有用である。持続性製剤又は経腸的にコーティングされた製剤も考案することができる。錠剤の結合剤としては、アカシア、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリビニエルピロリドン、プロビドン（providone）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖、スターチ及びエチルセルロースを含むことができる。小児及び老人への投与では、懸濁液、シロップ、及びチュアブルな錠剤が特に適切である。薬学的な組成物は、活性成分の治療的な有効量を含む投与ユニットの形態で作られるのが好ましい。かかる投与ユニットの例は、錠剤及びカプセルである。治療上の目的で、活性成分に加えて、錠剤やカプセルは、例えばアカシアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ソルビトール又はトラガカント等の結合剤；リン酸カルシウム、グリシン、乳糖、コーンスターチ、ソルビトール又はショ糖等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、シリカ又はタルクなどの潤滑剤；ポテトスターチ等の崩壊剤；着味剤や着色剤又は許容できる湿潤剤、等従来の担体を含むことができる。経口液体調整物は、通常、水溶液又は油液の形態であり、懸濁液、乳濁液、シロップやエリキシル剤は懸濁剤、乳化剤、非水溶剤、防腐剤、着色剤及び着味剤等の従来の添加物を含むことができる。液体製剤の添加物の例としては、アカシア、アーモンド油、エチルアルコール、ヤシ油、ゼラチン、グルコースシロップ、グリセリン、水素化食用油脂、レシチン、メチルセルロース、メチル又はプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸、プロピリングリコール、ソルビトール、又はソルビン酸を含むことができる。
【０２５３】
静脈内（ＩＶ）に使用する際には、本発明の化合物は、注入投与に一般的に用いられる静脈内輸液に、溶解又は懸濁することが出来る。静脈内輸液には、生理食塩水又はリンガー溶液が含まれるが、これに限定されない。
【０２５４】
非経口投与の製剤は、水溶性又は非水溶性の無菌性等張注射溶液又は懸濁液の形態であってもよい。これらの溶液又は懸濁液は、経口投与用の製剤に使用されると記載された担体を１又は２以上有する無菌性粉末又は顆粒から調製することができる。かかる化合物は、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム及び／又は様々な緩衝液に溶解してもよい。
【０２５５】
筋肉内投与の製剤は、本発明の化合物の無菌性製剤又はかかる化合物を形成する適切な可溶化塩は、注射水（ＷＦＩ）、生理食塩水、又は５％のグルコース等の薬学的な希釈剤に溶解及び投与してもよい。かかる化合物の適切な不溶性の形態は、例えばオレイン酸エチル等の長鎖脂肪酸のエステルといった水溶性基剤又は薬学的に許容できる油性基剤内に懸濁液として調製及び投与してもよい。
【０２５６】
局所使用に関しては、本発明の化合物は、皮膚、鼻や喉の粘液膜に塗布する適切な形態で調製することができ、クリーム、軟膏、液体スプレーや吸入剤、トローチ剤又は喉への塗布剤の形態を取ることが出来る。かかる局所用の製剤は、活性成分の表面浸透を容易にするために、ジメチルスホキサイド等の化学化合物をさらに含むことが出来る。
【０２５７】
眼や耳への投与に関しては、本発明の化合物は、軟膏、クリーム、ローション、塗布剤又は散剤等の、疎水性又は親水基質として製剤化した液体又は半液体の形態をとることが出来る。
【０２５８】
直腸投与には、本発明の化合物は、ココアバター、ワックス又は他のグリセリド等の従来の担体と混合した座薬の形態で投与することが出来る。
【０２５９】
また、本発明の化合物は、デリバリーの際に、適切な薬学的に許容できる担体で再構築するために粉末形態であってもよい。別の態様において、かかる化合物の投与ユニットは、無菌の密閉されたアンプル内の適切な希釈剤における化合物の溶液またはその塩であってもよい。
【０２６０】
投与ユニットあたりの本発明の化合物の量は、対象レシピエント、投与の経路又は頻度によって変化する、本発明の活性化合物の少なくとも一つの治療上有効な量を含む。対象レシピエントは、植物、細胞培養、又はヒツジ等の動物やヒトを含む哺乳類などの動物に関する。
【０２６１】
本発明の本態様によると、本明細書中に開示されている新規組成物は、薬学的に許容できる担体内に配置され、既知のドラッグデリバリーの方法に従って対象レシピエント（ヒトの対象を含む）にデリバリーされる。一般的に、本発明の組成物をインビボでデリバリーする本発明の方法は、当該技術で認められているプロトコルにおける薬剤で本発明の化合物を置換する、実質上の改変だけを行って、薬剤をデリバリーするための当該技術で認められているプロトコルを用いる。
【０２６２】
同様に、クレーム記載の組成物を培養中の細胞を処理するために使用する方法、例えば、細胞培養の細菌又は真菌混入を排除又は減少させる方法は、当該技術で認められているプロトコルにおける薬剤で本発明の化合物を置換する、実質上の改変だけを行って、抗細菌剤や抗真菌剤で細胞培養を処理するための当該技術で認められているプロトコルを用いる。
【０２６３】
本発明の化合物は、細菌感染、真菌感染又は前癌性若しくは癌症状態の治療方法を提供している。本明細書中に記載される、投与ユニットという用語は、目的とする治療反応を誘因する本発明の化合物の治療上有効な量に関する。本明細書中に記載される治療上有効な量なる表現は、発症を予防し、症状を緩和し、細菌感染、真菌感染又は前癌性若しくは癌症状の進行を止める本発明の化合物の量を意味している。治療という表現は、対象に、細菌、真菌感染又は前癌性若しくは癌症状の発症を予防するか、細菌、真菌感染又は前癌性若しくは癌症状を制御又は排除するために、少なくとも１つの本発明の化合物の治療上有効な量を投与することと定義している。目的とする治療反応という表現は、対象レシピエントにおいて、細菌、真菌感染又は前癌性若しくは癌症状を改善、進行を抑制、又は予防するように、対象レシピエントを本発明の化合物で処置することを意味している。
【０２６４】
本発明の化合物は、１日１回、又は１日に数回、投与されてもよい。治療方法は、数日間又は２から４週間の長期間の投与が必要となる場合がある。１回の投与量、又は投与の合計量は、感染の性質や程度、対象レシピエントの年齢や健康、対象レシピエントの化合物に対する耐性、及び細菌や真菌感染の種類、又は癌の種類といった要因によって変化する。
【０２６５】
本発明の化合物は、患者又は動物の食事又は餌に投与してもよい。動物への食餌は、通常の食糧に化合物を添加しても、前もって混ぜたものでもよい。
【０２６６】
本発明の化合物は、治療を必要としている対象レシピエントを治療するために、臨床的に認められている抗菌、抗真菌又は抗癌剤と一緒に又は別々に組み合わせて摂取してもよい。
【０２６７】
式Ｉの化合物は、表４に記載されている成長培地内でアクチノミセス種（Actinomyetes species）を、２４℃〜３４℃の温度で、培養培地を通気するために３〜４０日間振盪して培養することによって、生合成的に得ることができる。式Ｉの化合物は、遠心分離、クロマトグラフィー、吸着、ろ過、抽出又は他の分離方法を含む当業者に知られている方法によって、細菌培養から抽出され単離される。
【０２６８】
式Ｉの化合物は、様々な微生物から生合成することができる。本発明の化合物を合成する微生物は、Actinomycetalesの目（order）、すなわちアクチノミセテスの細菌を含むが、これに限定されない。アクチノミセテスの属としては、ノカルジア（Nocardia）、ゲオデルマトフィルス（Geodermatophilus）、アクチノプラーネス（Atinoplanes）、マイクロモノスポラ（Micromonospor）、  ノカルジオイド（Nocardiodes）、サッカロスリス（Saccharothrix）、アミコラトプシス（Amycolatopsis）、クツネリア（Kutzneria）、サッカロモノスポラ（Saccharomonospora）、サッカロポリスポラ（Saccharopolyspora）、キタサトスポラ（Kitasatospora）、ストレプトミセス（Sterptomyces）、マイクロビスポラ（Microbispora）、ストレプトスポランギム（Streptosporangium）、アクチノマヅラ（Actinomadura）を含むが、これに限定されない。アクチノミセテスの分類法は複雑であり、本発明の化合物を合成することができる属に関して、以下の文献が参考のために組み込まれている：Goodfellow (1989) Suprageneric classification of actinomycetes, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, Williams and Wilkins, Baltimore, pp 2322-2339；Embley and Stackebrandt, (1994) 及びThe molecular phylogeny and systematics of the actinomycetes, Annu. Rev. Microbiol. 48, 257-289 (1994)。
【０２６９】
式Ｉの化合物を生合成的に生成する微生物は、同化有機炭素、窒素及び任意の無機塩並びに他の既知の成長因子を有するアクチノミセテス用の栄養性原料を含むｐＨ約６〜約９の培養培地で培養される。成長培地は表４に例示されているが、これに限定されない。
【０２７０】
式Ｉの化合物を生成するための成長培地の例
【表４】
2007525148.tif 000103
2007525148.tif 000104
指定しない限り、全ての原料は、ｇｍ／Ｌで表す。
*3  微量元素溶液は、以下を含む：１リットル当たり、ＺｎＣｌ２４０  ｍｇ；Ｆｅ  Ｃｌ３  ６Ｈ２Ｏ（２００ｍｇ）；ＣｕＣｌ２２Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）；ＭｎＣｌ２、４Ｈ２Ｏ；Ｎａ２Ｂ４Ｏ７．１０Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４．４Ｈ２Ｏ（１０ｍｇ）。  
*4  成分を８００ｍｌの水に溶解し、オートクレーブし、後に以下を添加する：
１０ｍｌのＫＨ２ＰＯ４（０．５％溶液）；８０ｍｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（３．６８％溶液）；１５ｍｌのＬ−プロリン（２０％溶液）；１００ｍｌＴＥＳ緩衝液（５．７３％溶液、ｐＨ７．２）；５ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ溶液）及び２ｍｌの微量元素溶液。
*5  ｐＨは、ＣａＣｏ３を含む培地にＣａＣｏ３を添加する前に、前記の通り調整する。
【０２７１】
式Ｉの化合物を生合成的に生成する微生物を播種する培養培地は、例えば、回転式振盪機又は温水槽を振盪して、播種した培養培地を攪拌してインキュベートすることによって通気することができる。さらに、インキュベーション中に播種した培養培地に、空気、酸素又は適切なガス混合物を注入して、通気を行うこともできる。
【０２７２】
式Ｉの化合物の培養及び生成後に、化合物は、例えば遠心分離、クロマトグラフィー、吸着等当業者に既知の技術及び／又は、本明細書中に開示されている技術で、培養した培養培地から抽出、単離することができる。例えば、ｎ−ブタノール、ｎ−ブチル酢酸及び４−メチル−２−ペンタノン等の適切な有機溶媒と混合してもよく、かかる有機層は、溶媒除去後の遠心分離、乾燥に至るまでの蒸発、真空状態での乾燥等によって分離することができる。その結果生じた残基は、例えば、水、エタノール、酢酸エチル、メタノール又はそれらの混合物によって再構築し、ヘキサン、四塩化炭素、塩化メチレン又はそれらの混合物等の適切な有機溶媒によって再抽出することができる。溶媒を除去した後に、式Ｉの化合物は、クロマトグラフィー等の標準的技術で、さらに精製することができる。
【０２７３】
微生物で生合成される式Ｉの化合物は、式Ｉの化合物の派生物又は構造類似体である化合物を形成するために、無作為及び／又は定方向の化学的修飾を行ってもよい。類似の機能活性を有する式Ｉの化合物の派生物又は構造類似体は、本発明の範囲内にある。式Ｉの化合物は、本明細書中に記載される、及び当業者に既知の方法を用いて修飾してもよい。
【０２７４】
特に指定されていない限り、分子量、反応条件、ＩＣ５等、明細書及びクレームに用いられている、構成要素の量や性質を表す全ての数は、「約」(about)という用語によって、全ての場合において変更されてもよいと理解されたい。したがって、反対の指示がない限り、本明細書及びクレームに記載される数値のパラメーターは、近似値である。最低限、又はクレームの範囲の均等論で明細書を限定せずに、各々の数値のパラメーターは、少なくとも、有効桁数を鑑みて通常の端数整理の技術を適用して分析される。本発明の広い範囲として記載され数値域及びパラメーターは近似値であるが、実施例、表及び図に記載される数値は可能な限り正確に報告されている。全ての数値は、実験、検査測定、統計分析等で生じる誤差を含む場合がある。
【０２７５】
式Ｉ、式IIの化合物及び化合物２（ａ）は、本明細書中に記載され、当該技術で既知の方法を用いて、化学的に修飾してもよい。
【０２７６】
本発明の化合物は、バイオ発酵（biofermentation）及び周知の化学図式によって生成される。本明細書中に記載される図式は、例示であり、本明細書中に記載される構造を提供する当業者に既知の化学合成プロセスを用いることができ、したがって、本発明に包含される。
【０２７７】
図式１  アシル化反応
ＥＤＣ＝１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド
保護基は、Ｎ−ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、Ｎ−ブトキシカルボニル
（ＢＯＣ）、Ｎ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）を含む。
ＲＸは、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、アリール又はヘテロアリールを表す。ＡＡは、自然発生アミノ酸を表す。
2007525148.tif 000105
【０２７８】
図式２  末端窒素のアミノ化／還元的アミノ化
2007525148.tif 000106
Ｒ１は、前に定義したとおりである。
【０２７９】
図式３  オレフィン反応
2007525148.tif 000107
【０２８０】
図式４  ケトン反応
Ｒ1及びＲ8は、先に定義したとおりである。
2007525148.tif 000108
【０２８１】
図式５  Ｏ反応
Ｒ１、Ｒ５及びＲ６は、先に定義したとおりである。
2007525148.tif 000109
【０２８２】
図式６  加水分解／エステル化
2007525148.tif 000110
【０２８３】
図式１は、化合物２（ａ）から、化合物２（ｍ）、２（ｎ）、２（ｏ）、２（ｐ）、  ２（ｑ）、２（ｒ）、２（ｓ）、２（ｔ）、２（ｕ）、２（ｖ）、２（ｗ）、２（ｘ）、  ２（ｙ）、２（ｚ）、２（ａａ）及び２（ａｂ）を得るために用いられる。
【０２８４】
図式３は、化合物２（ａ）から、化合物２（ｂ）を得るために用いられる。
【０２８５】
図式４は、化合物２（ａ）から、化合物２（ｃ）、２（ｄ）、２（ｅ）及び２（ｆ）
を得るために用いられる。
【０２８６】
図式６は、化合物２（ａ）から、化合物（ｇ）、２（ｈ）、２（ｉ）及び２（ｊ）
を得るために用いられる。
【０２８７】
本発明の特徴については、以下の実施例を参照してさらに詳述されるが、その範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０２８８】
発酵による化合物２（ａ）の生成
［実施例１（Ａ）］
［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株の生成
［Ｃ０３］０２３株
ストレプトミセス・アイズネンシスＮＲＲＬＢ−１１２７７を、３つのトマトペーストオートミール寒天（ＡＴＣＣ培地１３６０）プレートに２８℃で胞子形成のために播種した。プレートを、５〜７日間の期間インキュベートし、その後、胞子を、各々のプレートから５ｍｌの滅菌蒸留水内に回収し、５０００ｒｐｍ（１０分）の遠心分離で沈降し、２０ｍｌの滅菌水に分散した。同様の条件下で２回目の遠心分離後に、ぺレットを１０ｍｌの滅菌水に再懸濁した。本来の胞子懸濁液の一連の１０倍希釈液を調製し、０．５ｍｌずつの分割量が、胞子形成が起きるするまで（５日〜７日間）トマトペーストオートミール寒天上にプレートした。よく単離されたコロニーを単独で有するプレートに由来する個々のクローンは（胞子懸濁液の１０−８〜１０−１０の希釈液から生成）を選択し、保存する胞子を生成するためにトマトペーストオートミール寒天の一つのプレートに移動した。各クローンを、化合物２（ａ）の生成用に、２５×１５０ｍｍのグラス内で育成した。合計３８５個のクローンの、化合物２（ａ）生成レベルのを検査した。クローン［０３］０２３は、野生型株と比べて３倍生成した。このクローンを選択、保存し、突然変異誘発に使用した。
【０２８９】
［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株
［Ｃ０３］０２３の水性胞子懸濁液は、異なるエネルギーレベル（１表面積あたりのｍジュールで表す）で、紫外線照射（２５４ｎｍ）によって、突然変異を起こした。０．４ｍＪ／１ｃｍ２で得られたクローン［Ｃ０３Ｕ０３］０２３は、親クローン［Ｃ０３］０２３よりも３倍より少し多い生成を示した。新規クローンによる化合物２（ａ）の生成は、振盪フラスコ（５００ｍｌの培地ＱＢ又は２Ｌ−調節（baffled）フラスコのＶＡ）と培地ＶＡを有する１００−L発酵槽との両方で、常に再現可能である。
【０２９０】
［実施例１（Ｂ）］
［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株の凍結乾燥したサンプルの活性化
［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株は、凍結乾燥したぺレットとして提供された。凍結乾燥したサンプルを無菌状態で開け、細胞懸濁液を作るために０．３〜０．５ｍｌのＩＴＳＢ培地をサンプルに添加した。液体培養を形成するために、細胞懸濁液を１２５ｍｌのフラスコ内のＩＴＳＢ培地（下記に記載）２５ｍｌに移動した。液体培養は、目に見える増殖が起きるまで、３日〜５日間２８℃でインキュベートした。培養の純度は、ＩＳＰ２寒天プレート上でループをストリークして検査した。
【０２９１】
［実施例１（Ｃ）］
［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株のグリセロールストックの調製及び保存
［Ｃ０３Ｕ０３］０２３株を、いくつかのトマトペーストオートミール寒天プレート上で、２８℃で７日〜１０日間育成した。表面の増殖を、各プレートから、無菌蒸留水に回収し、５０００ｒｐｍ（１０分間）の遠心分離で沈降し、１０ｍｌの滅菌水に分散した。同様の条件下で２回目の遠心分離後に、ぺレットを２ｍｌの無菌のグリコール２５％に再懸濁し、０．５ｍｌずつの分割量をねじ口ガラス瓶に−８０℃で保存した。グリセロール貯蔵物に加えて、回収した細胞塊を１５％の無菌の脱脂粉乳に再懸濁し、０．５ｍｌずつの分割量をガラス製アンプルに分配し、標準的な方法に従って凍結乾燥した。
【０２９２】
［実施例１（Ｄ）］
種培養の調製
実施例１（Ｃ）に記載されたように調製された凍結菌糸を含むバイアルを冷凍庫から取り出し、ドライアイス上で保存した。無菌状態で、ループフルの凍結培養を取り、トマトペーストオートミール寒天プレートの表面上でストリークし、増殖型菌体が現れるまで（５日〜７日間）２８℃でインキュベートした。種培養を開始するために、トマトペーストオートミール寒天プレートから得た表面の増殖は、３００μｌのＩＴＳＢ培地を含む１．５ｍｌのエッペンドルフ型チューブに移動した。寒天フラグメントを有する菌糸を均質化し、１ｍｌのＩＴＳＢ培地を懸濁液に添加した。内容物は２５ｍｌの無菌培地を含む２個の１２５ｍｌフラスコに播種するために用いた。フラスコは２５０ｒｐｍの回転式振盪機で、６５〜７０時間、２８℃でインキュベートした。この種培養は、生成培地ＱＢ又はＶＡを播種するために用いた。
【０２９３】
［実施例１（Ｅ）］
発酵による化合物２（ａ）の生成
上記実施例１（Ｄ）に記載されたように調製した種培養のサンプルは、汚染の有無を顕微鏡で確認した。種培養のサンプルは、次に、１つのＩＳＰ２プレート（コントロールプレート）にストリークし、２８℃でインキュベートした。無菌状態の種培養から、１０ｍｌを取り、５００ｍｌの無培地ＱＢ又はＶＡを含む各２リットルの調節フラスコをインキュベートするために用いた。発酵したバッチを７日間、２８℃で振盪（２５０ｒｐｍ）しながら、好気的にインキュベートした。３日〜５日間のインキュベーション後に、コントロールプレートの培養純度を検査した。
【０２９４】
実施例１Ａ〜１Ｅに用いた成長培地の組成物を以下に示す。生成培地ＱＢ又はＶＡのどちらも、化合物２（ａ）の生成に用いられることができる。しかしながら、生成培地ＶＡは、大規模に発酵を行う場合好ましい。
【０２９５】
種培養ＩＴＳＢ
トリプチカーゼ大豆培養液  （Difco）                    ３０ｇ
酵母抽出物（Sigma）                                    ３ｇ
ＭｇＳＯ４（Sigma）                                    ２ｇ
グルコース（Sigma）                                    ５ｇ
麦芽糖（Sigma）                                        ４ｇ
蒸留水                                                  １Ｌ
【０２９６】
生成培地ＶＡ
グルコース                                              ５０ｇ
大豆紛                                                  ３０ｇ
ＣａＣＯ３                                                ６ｇ
ＮａＣｌ                                                  ５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                          ３ｇ
蒸留水                                                    １Ｌ
【０２９７】
生成培地ＱＢ
可溶性澱粉  （Sigma）                                  １０ｇ
グルコース  （Sigma）                                  １２ｇ
Pharmamedia  (Traders protein)                         １０ｇ
コーンスティープリカー (Sigma)                            ５ｇ
Profloオイル (Traders Protein)                            ４ｍＬ
蒸留水                                                     １Ｌ
* ｐＨを７．２に合わせ、Profloオイルを添加する
【０２９８】
トマトペーストオートミール寒天
オートミール離乳食（Ｈeinz）                            ２０ｇ
トマトペースト                                          ２０ｇ
寒天                                                    １５ｇ
水道水                                                    １Ｌ
ｐＨ７．０
【０２９９】
化合物２（ａ）の生成は、上記の表４に記載の組成物を有する生成培地において、望ましい順に行うことができる。
【実施例２】
【０３００】
化合物２（ａ）の単離
実施例１Ｅの調製フラスコの発酵ブロスからの化合物２（a）の回収の３０分前に、再生、洗浄し、ウエットパックされた、最初の発酵ビール容量の１２％に等しい量のDiaion ＨＰ−２０aを、実施例１Ｅの発酵ブロス全体に添加し、３０分間緩やかに攪拌した。回収時に、２×５００ｍｌのフラスコからの発酵ブロスを遠心分離し、上澄みを樹脂及び菌糸ペレットからデカントした。ペレットを、水中１５％ＭｅＯＨに再懸濁し（本来の発酵ビールの半量）、緩やかに攪拌し、再度遠心分離し、上澄みを残基からデカントした。残基は、同様に、別の水中１５％ＭｅＯＨで二回目の洗浄を行い、最後にメタノール：水（７：３ｖ／ｖ）（本来の発酵ビールの半量）で１回洗浄し、よく洗浄された残基を得た。よく洗浄した菌糸：樹脂残基は、１００％エタノールで３回抽出し、各抽出物は、本来の発酵ビールの２０％であった。３つの抽出物を合わせ、真空下で、回転式蒸発器で乾燥するまで濃縮した。
【０３０１】
３つの抽出物（２×５００ｍｌフラスコの物質）を合わせ、紙上でろ過し、真空下で濃縮し、有機溶媒を除去した。その結果生じた粗化合物２（ａ）の半固体残基（水溶液）は、それぞれの化合物の９０％以上であり、２５％の純度であった。水溶液を一晩凍結乾燥し、４６０ｍｇのこげ茶色の個体を得た。個体を１０ｍｌのエタノールで攪拌し、２分間遠心分離し、不溶性物質を除去した。
粗化合物２（ａ）の半個体残基を、以下の勾配表（表５）を使用して、５ｍＭの水性重炭酸アンモニウムからアセトニトリルで、Waters Xterra a preparative MS C-18カラムを用いて、直径１９ｍｍ×長さ１５０ｍｍの寸法の１０μｍパッキングと共に精製した。
【０３０２】
【表５】
2007525148.tif 000111
【０３０３】
溶出物を３９０ｎｍでモニタリングし、１回の運転は、０．５ｍｌのメタノール内の２３ｍｇの粗残基で行われ、３．４分に溶出するピークの保守的な切断（conservative cut）を行い、化合物２（ａ）を生成した。１９回運転し、約９５％の純度の生成物３３ｍｇを産出した。
【実施例３】
【０３０４】
化合物２（ａ）の構造決定
化合物２（ａ）の構造は、質量、紫外線、ＮＭＲ分光法を含む遺伝子情報及び分光学的データを組み合わせて決定した。質量は、エレクトロスプレー質量分析によって、１２９７（図１３）であることが決定し、ＵＶlｍａｘは、３１９，３３３，３５０であることがわかった（図１４）。ＮＭＲデータは、ＭｅOH−ｄ４に溶解した化合物２（ａ）と共に５００ＭＨｚで回収し、プロトン(図１５ａ)、炭素―１３（図１５ｂ）、多次元的パルスシークエンスｇＤＱＣＯＳＹ、ｇHＳＱＣ、ｇＨＭＢＣ及びＴＯＣＳＹ（それぞれ、図１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅ及び１５Ｆ）が含まれていた。
【０３０５】
ストレプトミセス・アイズネンシスＮＲＲＬＢ−１１２７７は、５〜７日間オートミール寒天プレート上で生育した。表面増殖を回収し、水で洗浄し、ＤＮＡは以下の標準的手順（T. Kiesser et al. Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwick, UK, 2000）に従って抽出した。ゲノムライブラリーを、コスミド及びプラスミドベクター内で生成し、ゲノムはE. Zazopoulos et al., Nature Biotechnology 21:187-190 (2003) に記載されている二次代謝産物の生合成に関連した遺伝子配列タグ（ＧＳＴ）の有無を調べるためにスキャンした。ＧＳＴは、化合物２（ａ）遺伝子座を含むコスミドを単離するために用いた。化合物２（ａ）遺伝子座内のＰＫＳシステムは、２７のモジュールを含む９のＰＫＳ遺伝子を含むことがわかった。（かかるＰＫＳシステムの分析は、本明細書中に完全に記載されている。例えば、表IIIとそのテキストを参照のこと）。ＰＫＳと関連遺伝子の分析により、以下の式Ｉの構造を予測した。
【０３０６】
【化８３】
2007525148.tif 000112
【０３０７】
糖部分のグリコシド結合の位置は、遺伝子分析によって決定することができなｋった。しかし、アミノヒドロキシシクロペンテノン（aminohydroxycyclopentenone）ユニットの位置は、他のアクチノミセス代謝物の配置との類似性によって決定した（Colabomycin A from Streptpomyces griseoflavus Tue 2880, J. Antibot. 1988, 41, 1178-85, 1186-1195 or Enopeptin-A from Streptomyces griseus, Osada et al., J. Antibot. 44, 1463-6, 1991）。
【０３０８】
これらの遺伝子を発現し、この生合成経路の最終産物を得るために、Ｓ．アイズネンシスＮＲＲＬＢ−１１２７７を複数の異なる二次代謝物の生成のための培地で振盪フラスコ中で生育した。回収時に、ブロスは、細胞溶解を誘発するために等量のメタノールで希釈し、希釈した澄んだブロスを１０倍に濃縮した。各培地の濃縮物の分割量（５０mＬ）は、１ｍＬ／分の流速で、Waters Xterra C-18 ＨＰＬＣ カラム (１９×１５０ｍｍ)でクロマトグラフを行い、ダイオードアレー検出器（ＤＡＤ）ＵＶと、陽イオン及び陰イオン質量分析によってモニタリングした。画分（８００μＬ）を回収し、指示株のパネルに対する抗菌活性を検査した。複数の異なる培地の抽出物から、３９〜４５領域のＨＰＬＣ画分はカンジダ・アルカンスに対して強い活性を示し、ＵＶ吸収lmax３１９、３３３及び３５１ｎｍ、ｍ／ｚ１２９８（陽イオンモード）及び１２９６（陰イオンモード）で強いＭＳピークを示した。これらの化学特性は、式１の代謝物と完全に一致した。
【０３０９】
高収率の培地を選択し、生物を２リットルで再度生育した。化合物１（ａ）を、菌糸ペレットとから、メタノールとアセトンとで抽出し、Ｄｉａｏｎ  ＨＰ−２０a残基からは、残基をメタノール：水＝３：２で洗浄した後にメタノールで抽出した。粗抽出物をWaters Xterra C-18カラム（１９×１５０ｍｍ）上で、水性（５ｍＭ重炭酸アンモニウム）／アセトニトリル勾配を使用してＨＰＬＣで精製した。
【０３１０】
化合物２（ａ）、ＭＷ１２９７Ｄａ（Ｃ７０Ｈ１０８Ｎ２Ｏ２０は１２９６．７５を要する）lmax３１９、３３４及び３５１ｎｍの黄色の固体は、ＣＭＲ、１Ｈ−ＮＭＲ、ｇＤＱＣＯＳＹ、ｇＨＳＱＣ、ｇＨＭＢＣ、ＴＯＣＳＹ、ｇＨＳＱＣＴＯＸＹ及びいくつかの１ＤＴＯＣＳＹ実験を含む一連の１Ｄ及び２ＤＮＭＲ測定の対象となった。図１５Ａ〜１５Ｅ参照。これらのスペクトラを分析したところ、図１７の化合物２（ａ）が示す割当となった。シグナルの相当量の重複により、特定のプロトン及び炭素に対する全てのシグナルの曖昧な割合を非実用的なものとしたが、曖昧に生成しうるものは、ゲノムから予測された構造を確認した。
【０３１１】
４．０１ｐｐｍでよく単離したプロトン共鳴と、１０２．６ｐｐｍのアノマー炭素との間のｇＨＭＢＣスペクトラムの主要なクロスピークは、示すように糖を配置し、かかるプロトンが、完全に割当てた炭素とプロトンシグナルを有する主要な鎖の１４炭素セクションに入るようにした。高い信号対雑音比を有するよく分離した炭素スペクトラムにより、割当てられていないメチレン炭素が、４２．０、４５．３、４５．４及び４６．６ｐｐｍであることを示した。ｈＨＳＱＣの分析は、それらが、それぞれ２．２４、１．６２、１．５０及び１．５５ｐｐｍであったことを示した。同様に、６６．２、６６．２（分離）及び６７．２、６９．０ｐｐｍで割当てられていないかルビノールは、それぞれ４．０６、４．０８、４．２２及び３．８９ｐｐｍでプロトンに結合した。割当てられていないオレフィン炭素は、１２９．１、１３１．０、１３１．９、１３３．３、１３３．７、１３４．３、１３４．８、１３６．５、及び１３８．０ｐｐｍで、それぞれ５．７２、５．７２、６．２８、６．２５、６．２８、６．２５、６．１９、５．５３及び５．８６に結合した。アミノヒドロキシシクロペンテノンシグナルは、直線的でなく、この部分の互変異性平衡に反映した。アップフィールドのメチレンシグナルとダウンフィールドのカルボニルシグナルは、他の互変異体の強度の約１０％しか有さなかった。この部分のＣ−１のシグナルは検出されなかったが、以前に同一の構造ユニットの互変異性に割当てられたものである。Ｈe,Ｈ.; Sｈen, B.; Korshella, J.; Siegel, M. M.; Carter, G. T. J. Antibiot. 2000，53，191-195参照。
【実施例４】
【０３１２】
化合物２（ａ）の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の決定
真菌及び細菌のＭＩＣ測定は、米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）Ｍ２７−Ａ（Vol. 17 番号. 9, 1997）、 Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard guidelines: M23-A: Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi; Approved Standard, vol. 22, No. 16 から適用したブロス微量希釈アッセイで行った。
【０３１３】
材料
・  被検真菌株及び細菌株を一晩培養したブロス
・  ＤＭＳＯ内３．２ｍｇ／ｍｌの化合物２（ａ）のストック溶液
・  標準９６ウェル丸底プレート、無菌
・  陽イオン調整したミューラー・ヒントンブロス又はブレインハートインフュージョンブロス（抗菌検査用）
・  モルフォリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）緩衝ＲＰＭＩ−１６４０培地（抗菌検査用）
・  無菌等張食塩水（０．８５％）
・  マックファーランド０．５硫酸バリウム；濁度基準１００×３．２ｍｇ／ｍｌ
【０３１４】
被検化合物の調製
被検物質を、ＤＭＳＰ内で１００×ストック溶液として調製し、濃度の範囲は、３．２ｍｇ／ｍｌ〜０．０６２５ｍｇ／ｍｌであった（２倍希釈１０ポイント以上）。最初の希釈液（３．２ｍｇ／ｍｌ）は、各被検物質をＤＭＳＯ１５６．２５μｌに再懸濁して調製した。ストックを順次2倍量で希釈し、所望の濃度を得た。
【０３１５】
接種菌液の調製
菌株には、接種菌液を以下のように調製した。酵母培地ブロス内で一晩培養した後、細胞濃度が０．８５％の食塩水で０．５マックファーランドに調整した。このプロセスにより、約５×１０６細胞／ｍｌのストック懸濁液が産出された。ボルテックスを経て、作業する懸濁液を、ＲＰＭＩ１６４０でストックを１：５０に希釈し、さらにＲＰＭＩ１６４０で１：２０に希釈し、２×検査接種菌液（約５×１０６細胞／ｍｌ）を得た。糸状の真菌には、接種菌液を、以下のように調製した。４℃で保存した胞子懸濁液から、０．０９から０．１１である最終吸光濃度６００を得るために、０．８５％の食塩水内で適切に希釈し、最終的に０．０９〜０．１１の光学濃度６００を得た。作業懸濁液は、胞子懸濁液をＲＰＭＩに５０回希釈して調製し、２×被検接種菌液（約１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）を得た。
【０３１６】
ＭＩＣ測定
１００×被検物質溶液を、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＨ又はＢＨＩ培地において５０回希釈し、１カラムあたり１濃度で、合計１０のカラムで９６ウェルプレートに分配した。１１番目のカラムは、細胞とＲＰＭＩ１６４０、１％ＤＭＳＯを有し、１２番目のカラムは１００μｌのＲＰＭＩ１６４０だけを有した。
【０３１７】
各指定菌株の最終細胞希釈（酵母、糸状真菌又は細菌）を、５０μｌの希釈薬剤又は培地のみを有するマイクロプレートのそれぞれのウェルに添加した。アッセイプレートは、３５℃で７２時間インキュベートした。カンジダ種及び亜スペルギルス種のＭＩＣリーディングは、２４時間と７２時間に測定し、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）は４８時間と７２時間で測定した。各指定株のＭＩＣは、増殖がまったくみられない被検化合物の最低濃度とた。
【０３１８】
各種酵母株、真菌株の化合物２（ａ）のＭＩＣ（mｇ／ｍｌ）
【表６】
2007525148.tif 000113
*４８時間リーディング；*＊７２時間リーディング
【実施例５】
【０３１９】
アスペルギルス種に対する化合物２（ａ）のインビトロ活性
アスペルギルス種（アスペルギルス・フミガーツス及びアスペルギルス・フラーブス）に対する化合物２（ａ）の抗真菌活性を測定するために、ディスク拡散アッセイが、Wong GK, Griffth S, Kojima I and Demain AL. Antifungal activities of rapamycin and its derivatives, prolylrapamycin, 32-desmethylrapamycin, and 32-desmethoxyrapamycin. J. Antibiotics, 51 (5):487-491, 1998に記載のように、最小有効濃度（ＭＥＣ）を測定するために用いた。かかるアッセイは、アスペルギルス種のような糸状真菌に対する抗真菌活性を解明するために一般的に用いられている（Arikan S, Yurdakul P, Hascelik G. Comparison of two methods and three end points in determination of in vitro activity of micafungin against Aspergillus spp. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 47 (8) : 2640-2643,2003）。
【０３２０】
接種菌液の調製
ＹＭ寒天（細胞培養フラスコ）に散布後、アスペルギルス株（アスペルギルス・フラーブス-ＡＴＣＣ２０４３０４及びアスペルギルス・フミガーツスＬＳＰＱ-２０４３０５）を４〜５日間３５℃で放置し胞子形成した。１０〜２０ｍｌの食塩水（０．８５％ＮａＣｌ）を添加後、使い捨て植菌ループで分生子柄の表面を緩やかにこすって回収した。アスペルギルス胞子懸濁液は、４℃で保存し、ディスクアッセイの接種菌液として用いた。
【０３２１】
ディスクの調製
メタノール内のストック溶液（５ｍｇ／ｍｌ）及びメタノールのストック溶液の一連の希釈液により調製した希釈液内のストック溶液（０．２５、０．５、１．０、２．５、５．０、７．５、１０．０及び５０．０mｇ／ｍｌ）は、被検物質及びコントロール化合物用に調製した。イトラコナゾール及びカスポファンギンをポジティブコントロールとして使用し、フルコナゾール又はＤＭＳＯ単独でネガティブコントロールとして使用した。薬剤を含むディスクは、正しい薬剤溶液（又はコントロールとしてメタノール）１０μｌを滴下して調製し、その後空気乾燥した。
【０３２２】
寒天プレートの調製
アスペルギルス胞子懸濁液は、食塩水内で５３０ｎｍで透過率約８１％に調整した。調整した接種菌液２００mｌを、０．８％の融合ＹＭ寒天（５０℃まで冷却）と混合し、満遍なく混合し、１５０ｍｍペトリ皿に注いだ。寒天の設置後、調製したフィルターはプレートの上に置き、３５℃でインキュベートした。真菌増殖の抑制領域（ＺＯＩ）は、インキュベーションの２４時間後に測定した。
【０３２３】
結果
表７のデータは、真菌増殖の抑制を誘導する最小有効濃度（ＭＥＣ）と、化合物２（ａ）及びコントロールのかかる濃度における対応するＺＯＩを示す。その結果は、化合物２（ａ）は、アスペルギルス・フミガーツス及びアスベルギルス・フラーブスに対して活性化することを示した。イトラコナゾール及びカスポファギンでは同様の効果を得たが、フルコナゾールは不活性であった。
【０３２４】
【表７】
2007525148.tif 000114
ＭＥＣ：最小有効濃度
ＺＯＩ：各ＭＥＣに産出した真菌増殖の抑制領域
【実施例６】
【０３２５】
播種性カンジダ症のマウスモデルにおける化合物２（ａ）の抗真菌活性の評価
化合物２（ａ）は、推測純度９５＋％の乾燥粉末として提供された。ファンギゾン（比較対象として用いるアンホテリシンＢデオキシコール酸）も、推測純度が２（ａ）の乾燥粉末として提供された。化合物２（ａ）及びファンギゾンは、投与する日まで、−８０℃で乾燥粉末として保存した。
【０３２６】
体重が２２〜２４ｇまでの雌のマウス（ハツカネズミ属、ＣＤ−１株、Charles River）を研究に用いた。動物は、処置前に３日間観察した。全ての動物実験は、病院の倫理委員会の動物実験の倫理方針に沿って、聖ジュスティヌ病院（モントリオール、ケベック）にて行われた。研究中に、死亡した動物又は明らかに病気の動物は直ちに取り除き、病気のマウスは、ケージから出した後安楽死させた。
【０３２７】
動物は、温度（２３±２℃）、湿度（４５±５％）、光周期性（１２時間の光／１２時間の闇）及び換気を管理した条件の室内で維持した。動物は、食料及び水を与えられるようなポリカーポネートのケージに入れた（１ケージあたり４匹）。無菌の経木を、動物の寝床に使用し、寝床は一日おきに取り替えた。食料（Harlam Tecklab, Canada）とオートクレーブした水道水が自由にに提供され、食料は、ケージの上の金属製の蓋内に置いた。水のボトルにはゴム栓と吸うチューブがつけられ、一週間に一度洗浄、殺菌し取り替えられた。
【０３２８】
マウスの6つのグループ（１グループあたり１０マウス）は、文献（Dubois, N., et al., Microbiology 1998, 1442,299-2310参照）記載のとおり、カンジダ・アルビカンＳＣ５３１４を３×１０６ＣＣＦＵで、経静脈から感染した。感染の２４時間後に、マウスの各グループは、化合物２（ａ）（１又は３ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．）、コンパレーターとしてのファンギゾン（０．２５、０．５又は１ｍｇ／ｋｇｉ．ｐ．）又は、５％のデキストローズと３％のＤＭＳＯ含有無菌水で処置した。各動物は被検溶液１００mｌで処置した。
【０３２９】
治療計画を、１日１回、合計４日間繰り返した。２１日間に渡ってマウスの罹患の徴候を１日２回観察した。瀕死の動物は非生存としてスコアリングし、二酸化炭素を吸入させ安楽死させた。カプラン−マイヤー法の推定量（product limit estimate）で生存データを分析し、生存時間関数をプロットした。
【０３３０】
化合物２（ａ）及びファンギゾンの接種後の経時生存率
【表８】
2007525148.tif 000115
【０３３１】
表８に示すように、化合物２（ａ）は、ファンギゾン０．２５ｍｇ／ｋｇを投与したときと同様の抗真菌活性をインビボで示し、感染マウスの平均生存期間を４倍にした。
【０３３２】
データ（生存率対摂取後の日数の割合）をプロットした。結果を表すグラフを図１６に示す。
【実施例７】
【０３３３】
化合物２（ａ）のインビトロの抗腫瘍活性
化合物２（ａ）のインビトロによる制癌性の研究は、細胞増殖の５０％抑制濃度（ＩＣ５０）を決定するために、癌細胞株のパネルに対して米国立癌研究所（米国保険研究所、Bethesda, Maryland, USA）が行った。この独特なスクリーニング作業は、白血病、メラノーマ及び肺癌、大腸癌、脳腫瘍、卵巣癌、乳癌、前立腺癌及び腎臓癌を代表する６０の異なるヒト腫瘍細胞株を用いた。化合物２（ａ）は、推定純度９０＋％の凍結乾燥した粉末として提供された。化合物は使用する日まで―２０℃で保存した。
【０３３４】
癌スクリーニングパネル（cancer-screening panel）のヒト腫瘍細胞株は、５％のウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で育成した。典型的なスクリーニング実験として、細胞を１００μｌずつ、各細胞株が倍増する時間によって、５０００〜４０，０００細胞／ウェルの各プレート密度で、９６ウェルマイクロタイタオープレートに播種した（表８）。細胞を播種した後、実験薬剤を添加する２４時間前に、マイクロタイタープレートを３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気、１００％相対湿度でインキュベートした。
【０３３５】
２４時間後、各細胞株の２つのプレートをＴＣＡでインサイチュで固定し、薬剤添加時（Ｔｚ）の各細胞株の細胞群を決定した。化合物２（ａ）はジメチルスルホン酸で、所望の最終最大濃度の４００倍で可溶化し、使用するまで凍結保存した。薬剤添加時に、凍結した濃縮物の分割量を解凍し、５０μｌ／ｍｌゲンタマイシンを含む完全な培地で、所望の最終最大濃度の２倍に希釈した。合計５つの薬物濃度と、コントロールを得るために、さらに４つの段階希釈を調製した。異なる薬剤の希釈液の１００μｌの分割量を、１００μｌの培地を既に含む適切なマイクロタイターに添加し、所望の最終薬剤濃度（２．５×１０−５Ｍ〜２．５×１０−９Ｍ）を得た。
【０３３６】
薬物を添加した後、プレートをさらに３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気、１００％相対湿度で４８時間インキュベートした。接着細胞については、冷たいＴＣＡを添加してアッセイを終了した。インサイチュで冷たい５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（最終濃度、１０％ＴＣＡ）を緩やかに添加し、４℃で６０分間インキュベーションして細胞を固定した。上清を除去し、プレートを水道水で５回洗浄し、風乾した。スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）溶液（１００μｌ）を０．４％（ｗ／ｖ）、１％酢酸を各ウェルに添加し、各プレートを室温で１０分間インキュベートした。染色後、結合していない染料を１％酢酸５回洗浄して除去し、プレートを風乾燥した。結合した染料を順次１０ｍＭトリズマ塩基で可溶化し、吸光度を、５１５nmの波長で自動プレートリーダーで読み取った。懸濁細胞については、配置した細胞を５０μｌの８０％ＴＣＡ（最終濃度、１６％ＴＣＡ）を緩やかに添加してウェルの底に固定してアッセイを終了した以外は、手順は同じであった。
【０３３７】
化合物の２（ａ）の増殖阻害力は、従来のＩＣ５０値ではなく、ＧＩ５０値を使用してＮＣＩで測定した。ＧＩ５０値は、０時間時における細胞計数の修正を強調し、７つの吸光度測定値［０時間（Ｔｚ）、コントロール増殖（Ｃ）、及び５つの濃度レベルにおける薬物存在下の試験増殖（Ｔｉ）］を使用した。ＧＩ５０は、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）×１００＝−５０］として計算し、これは、薬剤インキュベーション中のコントロール細胞におけるタンパク質の純増（ＳｒＢ染色によって測定）である。
【０３３８】
ＮＣＩ開発治療プログラム  化合物２（ａ）のインビトロ検査結果
【表９】
2007525148.tif 000116
2007525148.tif 000117
【０３３９】
この結果は、化合物２（ａ）がＮＣＩスクリーニングパネルで分析した全てのヒト腫瘍細胞株に対し、有効であることを示し、いくつかのヒトの癌に対し、幅広い抗癌活性を有することを示唆した。実際、全ての細胞株で計算したＧＩ５０は、抗癌剤の薬学的活性としては有意なレベルである１０×１０−６Ｍ以下であった。いくつかの例では、ナノモル又はピコモルレベルに達した（ＳＮ１２Ｃ／腎臓癌；HＯＰ９２／非小細胞肺癌種；ＨＣＣ２９９８大腸癌種）。
【実施例８】
【０３４０】
ポリケチドシンターゼシステムにおける不活性ドメインの活性化
【０３４１】
【化８４】
2007525148.tif 000118
ストレプトミセス・アイズネンシス株ＮＲＲＬ Ｂ−１１２７７から発生した化合物２（ａ）をコード遺伝子群は、ＯＲＦ１３モジュール１２においてコードされたケトレダクターゼ（ＫＲ）を再活性するのに遺伝子的に修飾されている。この修飾は、化合物２（ａ）の糖分子、ヒドロキシル基に隣接している中央カルボニル基の転換に帰する（図１２ａに示されている）。
【０３４２】
化合物２（ａ）遺伝子座においては、ＯＲＦ１３内に存在するＫＲドメイン、モジュール１２は不活性である。実施例７の化合物をもたらすために、ＫＲドメインは再活性化されるか、活性ＫＲドメインと交換される。ＫＲドメインの再活性化は、機能性ＫＲドメインに必要な重要な活性部位残基の完全性の診断を要する。活性部位残基は、ＫＲ酵素の補酵素活性化に必要とされるものと触媒作用に必要とされるものとに分けることができる。ケトレダクターゼ活性のための特定の残基を同定する実験（Ried et. al. Biochemistry, 2003, 42:72‐79; Udo et. al., Biochemistry, 1997, 36:34‐40）は、機能性ＫＲ補酵素結合部位残基は、グリシン（Ｇ）、グリシン（Ｇ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）を含み、機能性ＫＲ活性部位残基は、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、及びアスパラギン（Ｎ）を含むことを明らかにしている。これらの残基は、図６ａ及び６ｂに強調表示されている。化合物２（ａ）遺伝子座におけるＫＲドメイン配列は、補酵素活性部位残基が、この部位が確かに活性していることを示すグリシン（Ｇ）、グリシン（Ｇ）、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）であることを示している。しかしながら、触媒活性を担うＫＲ部位で見られるアミノ酸残基は、触媒作用部位がおそらく不活性であることを示す、セリン（Ｓ）、グルタミン（Ｑ）及びアスパラギン（Ｎ）である。この知見は、化合物２（ａ）は、その特定の位置において、カルボニル基を含むという事実によって確認される（図１０、モジュール１２）。グルタミンをコードするコドンを、チロシンをコードするコドンへと修飾すると、ＰＫＳモノマーの機能性ケト還元に必要な活性部位残基がもたらされる。これは、図１２ａに示されているように、適当な宿主細胞を修飾して実施例７の化合物２（ａ）変異体を生成するために用いられる、化合物２（ａ）の遺伝子座の改変核酸配列を生む結果となる。
【０３４３】
グルタミンのチロシンへの修飾は、不適合二重鎖の融解温度未満の温度で、天然ヌクレオチド配列にハイブリダイズする不適合のプライマーを用いて導入される場合がある。前記プライマーは、プライマーの長さ及び塩基組成を狭い範囲内に保ち、Zoller and Smith’ Methods in Enzymol. (1983) 100:468 に記載されているように、変異塩基が中央に位置するように保つことによって固有に保たれる。プライマーの伸張は、ＤＮＡポリメラーゼを用いることで実現される。産物は、クローン化され、プライマーの伸張した鎖（primer extended strand）の分離によって得られる、変異ＤＮＡを有する陽性クローンが選択される。選択は、ハイブリッド形成のプローブとして、変異プライマーを用いて行う（Dalbie‐McFarland et al Proc. Natl. Acad Sci. USA (1982) 79:6409）。
【０３４４】
実施例７の化合物を生成する別の方法は、化合物２（ａ）（ＯＲＦ１３モジュール１２）の遺伝子座からの不活性ケトレダクターゼドメインを、同一又は異なる遺伝子座からの活性ケトレダクターゼドメインと交換することを伴う。交換に適した同一遺伝子座内のドメインの例として、メチルマロネート伸張ユニット（methyl malonate extender unit）の組み入れをコードするモジュール内に発生する活性ケトレダクターゼ、すなわち、ＯＲＦ１６のモジュール１９又は２０が挙げられる。ＰＫＳ遺伝子座間のアシルトランスフェラーゼドメインの交換は、Oliynyk et al. Chem Biol, 1996, 3 (10) : 833-9によって実証されており、６−デオキシエリスロノライド（6-deoxyerythronolide）（ＤＥＢＳ）のモジュール１の中のアシルトランスフェラーゼドメインをコードする遺伝子が、ラパマイシンモジュール２のアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と交換され、２つのアシルトランスフェラーゼが異なるアシル特異性を有するので、新規のトリケチドの合成を生む結果となっている。Hans et. al. J. Am Chem Soc, 2003, 125 (18): 5366-74においては、アシルトランスフェラーゼドメインの交換の結果としての、産物形成の動力学的側面が教示されている。
【０３４５】
ドメインの交換は、Kao et. al. Science, 1994, 265:509-512によって開発された技術を用いて実現される。この遺伝子学的方法では、大腸菌における二重組換え現象を用い、温度に対して感受性のあるドナープラスミドと受容体のシャトルベクターとを、インビボで組換えることができるように、ｐＭＡＫ７０５の誘導体を活用する。交換されるドメインの両側の領域のＡｍｐＲＴｃＲ受容体サブクローン、ｐＣＫ５が作られ、これは両側の隣接配列を１ｋｂ有している。エンドヌクレアーゼの制限部位は、このドメインの境界において、Ｐｓｔｌが左側の３’末端に、Ｘｂａｌが右側の５’末端に導入される。交換されるドメインのサブクローンｐＣＫ６ＣｍＲが生成され、エンドヌクレアーゼ制限部位は、このドメインの境界に導入される。制限部位Ｐｓｔｌは、ＫＲドメインの５’境界に導入され、Ｘｂａｌ部位は、このドメインの３’境界に導入される。制限部位は、ＰＣＲの突然変異誘発によってサブクローンに導入される。ドメインを含む断片は切除され、温度に対して感受性のあるＣｍＲドナープラスミド、ｐＣＫ６に結合される。この受容体プラスミドは、上記のKao et al.によって概説されている選択方法を用い、宿主株の中のプラスミドをインビボで組換えることによって生成される。選択後、目的ドメインが元のドメインと入れ替わり、組換え株が生成される。
【実施例９】
【０３４６】
ポリケチドシンターゼシステム内の機能性ドメインの不活性化
【化８５】
2007525148.tif 000119
【０３４７】
ストレプトミセス・アイズネンシス株に由来する化合物２（ａ）をコードする遺伝子座は、ＯＲＦ１７のモジュール２２におけるエノイルレダクターゼ(ＥＲ)のドメインを不活性化するために、遺伝子的に修飾される。このドメインを不活性化すると、化合物２（ａ）のモジュール２１及び２２によって組み込まれている、アシル単位間の二重結合から単結合への変換を(図１２ｅに示されているように)無効にする。
【０３４８】
実施例８の化合物の生成は、Oh and Chater, 1997, Journal of Bacteriology 179:122-127によって開発された二重交差技術（double crossover techniques）の、挿入による不活性化を経て実現される。ストレプトミセス属におけるポリケチド生合成に関与する、挿入による遺伝子の不活性の例は、当技術分野において周知である。Arrwosmith et. al., 1992, Mol Gen Genet 234: 254-264は、ストレプトミセス・シナモネンシス（Streptomyces cinnamonensis）によるモネンシンの生成における二次代謝関連遺伝子のカセットの役割を同定するため、これらの技術を用いた。Paradkar, et. al., 2001, Appl Environ Microbiol 67:2292-7は、ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）におけるセファマイシンＣの生成を阻害するため、リシンアミノトランスフェラーゼがセファマイシン経路における第一段階を破壊するようにコードするlat遺伝子を不活性化した。同様に、これらの著者は、反足細胞のクラバム合成（antipodal clavam synthesis）の最終段階に関わるｃｖｍ１遺伝子を不活性化した。ポリケチド系におけるドメインの不活性化の方法には、挿入による遺伝子不活化による標的破壊とともに、実施例７に記載のドメイン交換が挙げられる。このため、複製プラスミド媒介性相同的組換えは、ストレプトミセス・アイズネンシスに適用される。相同的組換えのためのプラスミドは、修飾される遺伝子の左側及び右側領域の間のカナマイシン耐性マーカーをクローン化することによって構成される。このような構成体は、破壊プラスミドを生成するチオストレプトン耐性によって特徴づけられる伝達プラスミドにクローン化される。このプラスミドは、ＰＥＧ媒介性プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション又はファージによる自然感染のいずれかによって、ストレプトミセス・アイズネンシスに導入される（Keiser et al (2000) Practical Streptomyces genetics, John Innes Foundation, Norwich）。各々の形質転換体又は接合組換え体（transconjugants）からの胞子は、組換えを誘発するために中性プレート上で培養される。組換えの機会を増すために、このサイクルを３回繰り返す。次に、目的となる遺伝子組換え体をもたらす交差（crossovers）を、単一交差にはカナマイシン及びチオストレプトンを、二重交差にはカナマイシンを用いて選択、選別する。二重交差の不活性を確認するために、レプリカ平板法及びサザンハイブリッド形成法が用いられる（上記Keiser et al (2000)）。
【実施例１０】
【０３４９】
グリコシルトランスフェラーゼ活性の不活性化
【化８６】
2007525148.tif 000120
【０３５０】
化合物２（ａ）遺伝子座のＯＲＦ９をコードするグリコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧＴＦＡ）の不活性化は（図１２ｂに示されている通り）、この実施例の化合物を提供している。ＧＦＴＡを不活性化すると、糖成分の化合物２（ａ）の主鎖への移動を分断する。糖成分が欠如する結果、グリコシル化されていない型の化合物２（ａ）がもたらされる。ストレプトミセス属のポリケチド生合成において、挿入によってＧＴＦＡ遺伝子を不活化することは、周知の技術である。Blanco et. al., 2000, Mol Gen Genet 262: 991-1000は、これらの遺伝子の不活性化に際して、グリコシル化されていないミトラマイシンが生成されたことにより、ミトラマイシン生合成遺伝子クラスターのうち、２つの遺伝子をグリコシルトランスフェラーゼとして同定した。Chen et.al., Gene, 2001, 263:255-64は、ピクロマイシン、ナルボマイシン、メチマイシン及びネオメチマイシンをコードする、生合成経路においてグリコシル化を担う遺伝子を研究し、同様の観察を行っている。
【０３５１】
グリコシルトランスフェラーゼ活性を標的にした不活性化は、実施例８に記載されているように、挿入によって遺伝子破壊する方法を用いて実現される。
【実施例１１】
【０３５２】
アミノヒドロキシシクロペンテノンのユニットの除外
【化８７】
2007525148.tif 000121
【０３５３】
化合物２（ａ）遺伝子座の、以下の３つのいずれかのＯＲＦを不活性化することにより、末端アミノヒドロキシシクロペンテノンの単位を除外することができる。第一に、ＯＲＦ３５を破壊すると、サクシニル−補酵素Ａ及びグリシンが縮合して５−アミノレブリン酸を形成することができないようする、（図１２ｃに示されているような）アシルトランスフェラーゼ（ＡＹＴＰ）活性の不活性化をもたらす。第二に、ＯＲＦ３６を破壊すると、アシル補酵素Ａリガーゼ（ＣＡＬＢ）が不活性化され、５−アミノレブリン酸が、環化してアミノヒドロキシシクロペンテノンを形成する５−アミノレブリン酸補酵素Ａに転換するのを阻止する。第三に、ＯＲＦ３４（ＡＤＳＮ）を破壊すると、アミノヒドロキシシクロペンテノンの単位が、ポリケチド鎖へと移動するのを阻止する。したがって、実施例１０の化合物は、少なくともＯＲＦ３４、３５及び３６のうち１つを遺伝子的に修飾することにより、提供される。３つの遺伝子全てを、挿入によって不活性化するために用いる方法は、実施例９に記載されている。
【実施例１２】
【０３５４】
末端アミノ基のグアニジノ基による置換
【化８８】
2007525148.tif 000122
【０３５５】
末端アミンのグアニジノ基による置換は、実施例９に記載されている方法を用いて、挿入によってＯＲＦ３３（ＡＤＨＹ）を不活性化することで達成される。ＯＲＦ３３ＡＤＨＹを不活性化すると、（図１２ｄに示されているように）、ガンマアミノブタンアミドの合成を破壊し、４−グアニジノブタンアミドの蓄積に至る。集積した４−グアニジノブタンアミドは、ＯＲＦ２７ＣＡＬＢによって４−グアニジノブチリル−補酵素Ａに変換され、次にＯＲＦ１９（ＡＹＴＦ）の作用を通して、ポリケチド合成酵素に（図１０ｂにおいてＯＲＦ１０、モジュール０に示されているように）付着する。
【実施例１３】
【０３５６】
化合物２（ａ）のエポキシ化による化合物２（ｂ）の合成
【化８９】
2007525148.tif 000123
【０３５７】
テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に化合物２（ａ）を溶解した混合物に、１当量のｍ−クロロ過安息香酸を添加する。反応物を氷浴で冷却し、０℃で１〜２時間攪拌する。次に、反応混合物を乾燥するまで蒸発させ、メタノール中に再溶解し、セファデックスＬＨ−２０カラム上で液体クロマトグラフィーにかけ、化合物２（ｂ）を単離する。
【０３５８】
少量の塩酸水溶液（１．０Ｎ）で化合物２（ｂ）を処理することにより化合物２（ｂ）のエポキシド基を、加水分解させ、これにより式：
【０３５９】
【化９０】
2007525148.tif 000124
に相当するジオールを形成する。
【実施例１４】
【０３６０】
３１オキソ基の還元による化合物２（ｃ）の合成
【化９１】
2007525148.tif 000125
アセトニトリルに化合物２（ａ）を溶解した溶液を、１．５当量のＮａＣＮＢＨ３で処理する。反応物を、室温で１時間攪拌する。次に、反応混合物を濃縮して乾燥させ、メタノールに溶解する。混合物をろ過し、ろ過液をセファデックスＬＨ−２０のカラム上で液体クロマトグラフィーにかけ、化合物２（ｃ）を単離する。または、水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ４）を用いても、３１位のオキソ基を還元することができる。
【実施例１５】
【０３６１】
３１位のアセタール環の付加による化合物２（ｄ）の合成
【化９２】
2007525148.tif 000126
【０３６２】
テトラヒドロフランに化合物２（ａ）を溶解した溶液を、微量のトルエンスルホン酸の存在下で、３当量の２，２−ジメチル−１, ３−ジオキサシクロペンタンで処理する。反応物を室温で一晩攪拌し、乾燥するまで蒸発させ、乾燥ＴＨＦ中に取り込み、次にセファデックスＬＨ−２０のカラム上で、液体クロマトグラフィーにかけて精製する。２，２−ジメチル−１, ３−ジオキサシクロペンタンは、微量のトルエンスルホン酸の存在下で、水を除去するために分子ふるいにかけながら、アセトンとエチレングリコールを反応させて合成される。
【０３６３】
または、微量のトルエンスルホン酸の存在下で、化合物２（ａ）を過剰量のエチレングリコールと反応させることでも、３１位のアセタール環を付加することができる。反応は、水を除去するために、分子ふるいにかけながら行う。
【実施例１６】
【０３６４】
化合物２（ｅ）の合成
【化９３】
2007525148.tif 000127
【０３６５】
ベンゼン又はトルエンに化合物２（ａ）を溶解した溶液に、１０当量のベンジルアミンを添加する。反応物を、室温で一晩撹拌する。反応は、水を除去するために、分子ふるいを使用しながら行う。または、ディーンスターク・トラップを用いて、ベンゼン又はトルエンとの共沸混合物として、還流によって水を除去することもできる。反応混合物を、真空下で濃縮し、残留試薬は、一晩室温で高真空下に置いて除去する。
【０３６６】
化合物２（ｅ）とＮａＣＮＢＨ３又はＬｉＢＨ４（１．５当量）をアセトニトリル中で反応させることにより、化合物２（ｅ）の炭素−窒素の二重結合が、アミンに還元され、次の構造の化合物を形成する：
【０３６７】
【化９４】
2007525148.tif 000128
【実施例１７】
【０３６８】
化合物２（ｆ）の合成
【化９５】
2007525148.tif 000129
【０３６９】
アセトニトリルに１当量の化合物２（ａ）を溶解した溶液に、１０当量のイソブチルアミノを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。ベンゼン（１／１０の容量）を添加し、混合物を回転式蒸発装置にて真空下で、乾燥するまで濃縮する。
【０３７０】
次に、シッフ塩基をＮａＣＮＢＨ３又はＬｉＢＨ３（１．５当量）のアセトニトリル溶液で処理し、イミンの炭素−窒素二重結合をアミンに還元し、化合物２（ｆ）を形成する。
【実施例１８】
【０３７１】
化合物２（ｇ）の合成
【化９６】
2007525148.tif 000130
【０３７２】
化合物２（ｇ）は、実施例９に記載されているように、生合成的に合成される。または、化合物２（ｇ）は、化合物２（ａ）の加水分解によっても調製することができる。これは、メーヤワイン（Meerwein）試薬（トリエチルオキソニムテトラフルオロホウ酸）で、ジエチルエーテル／ＴＨＦを含む化合物２（ａ）を、室温で２時間処理し、次に−２０℃まで冷却し、酢酸水溶液を含むＴＨＦに滴下することで実施できる。反応混合物を２０分間攪拌し、その間に温度を室温まで上げることができる。次に混合物を水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリエスチレン樹脂を添加する。この混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を、水でよく洗浄し、産物を１００％のエタノールで溶出する。溶出物を、真空下で濃縮すると、化合物２（ｇ）が得られる。
【実施例１９】
【０３７３】
化合物２（ｈ）の合成
【化９７】
2007525148.tif 000131
【０３７４】
メタノールに０．１当量の化合物２（ｇ）を溶解した溶液に、ジエチルエーテルに０．５当量のジアゾメタンを溶解した溶液を添加する。反応混合物を、一晩室温に放置し、真空下で溶媒を除去すると、化合物２（ｈ）が得られる。
【実施例２０】
【０３７５】
化合物２（ｉ）の合成
【化９８】
2007525148.tif 000132
【０３７６】
メタノールに化合物２（ａ）を溶解した溶液を、等量の０．１ＮのＨＣｌで処理し、反応混合物を、室温で一晩攪拌する。次に混合物を、水（２容積）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。この混合物を、３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を、１００％のエタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｉ）が得られる。
【実施例２１】
【０３７７】
化合物２（ｊ）の合成
【化９９】
2007525148.tif 000133
【０３７８】
化合物２（ｊ）は、化合物２（ｇ）を加水分解して調製する。この加水分解は、前記の実施例１９に記載の、化合物２（ａ）が化合物２（ｉ）に加水分解されるのと同様の方法で行うことができる。
【実施例２２】
【０３７９】
化合物２（ｋ）の合成
【化１００】
2007525148.tif 000134
【０３８０】
化合物２（ｋ）は、実施例８に記載のように、エノイルレダクターゼを不活性化することによって生合成的に調製される。
【実施例２３】
【０３８１】
化合物２（ｌ）の合成
【化１０１】
2007525148.tif 000135
【０３８２】
アセトニトリルに化合物２（ｋ）を溶解した溶液を、１．５当量のＮａＣＮＢＨ３で処理する。反応物を、室温で１時間攪拌する。反応混合物を、乾燥するまで濃縮し、メタノールに溶解する。この混合物をろ過し、ろ過液を、セファデックスＬＨ−２０のカラム上で液体クロマトグラフィーにかけ、化合物２（ｌ）を単離する。または、水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ４）を用いても、３１位のオキソ基を還元することができる。
【実施例２４】
【０３８３】
化合物２（ｍ）の合成
【化１０２】
2007525148.tif 000136
【０３８４】
アセトニトリルに１０当量の化合物２（ａ）を溶解した溶液を、１当量のアセトアルデビトで処理する。反応物を、室温で２時間攪拌する。ベンゼン（１／１０容量）を添加し、混合物を、回転式蒸発装置にて真空下で乾燥し濃縮すると、化合物２（ｍ）が得られる。
【０３８５】
化合物２（ｍ）は、ＮａＣＮＢＨ３又はＬｉＢＨ４（１．５当量）のアセトニトリル溶液で処理することができ、イミン炭素−窒素二重結合をアミンに還元する。
【実施例２５】
【０３８６】
化合物２（ｎ）の合成
【化１０３】
2007525148.tif 000137
【０３８７】
アセトニトリルに１０当量の化合物２（ａ）を溶解した溶液を、１当量のベンズアルデビトで処理する。反応物を、室温で２時間攪拌する。ベンゼン（１／１０容量）を添加し、混合物を、回転式蒸発装置にて真空下で乾燥し濃縮すると、化合物２（ｎ）が得られる。
【０３８８】
化合物２（ｎ）は、ＮａＣＮＢＨ３又はＬｉＢＨ４（１．５当量）のアセトニトリル溶液で処理することができ、イミン炭素−窒素二重結合をアミンに還元する。
【実施例２６】
【０３８９】
化合物２（ｏ）の合成
【化１０４】
2007525148.tif 000138
【０３９０】
テトラヒドフランに化合物２（ａ）を溶解した溶液を、１当量のシアナミドで処理する。反応混合物を、室温で一晩攪拌する。反応混合物から溶媒を真空下で除去すると、化合物２（о）が得られる。
【実施例２７】
【０３９１】
化合物２（ｐ）の合成
【化１０５】
2007525148.tif 000139
【０３９２】
アセトニトリルに１０当量の化合物２（ａ）を溶解した溶液に、１当量のアセトンを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。ベンゼン（１／１０の容量）を添加し、混合物を回転式蒸発装置にて真空下で、乾燥するまで濃縮する。
【０３９３】
得られたシッフ塩基イミンをＮａＣＮＢＨ３又はＬｉＢＨ４（１．５当量）のアセトニトリル溶液で処理し、イミンの炭素−窒素二重結合をアミンに還元し、化合物２（ｐ）を形成する。
【実施例２８】
【０３９４】
化合物２（ｑ）の合成
【化１０６】
2007525148.tif 000140
【０３９５】
アセトニトリルに１０当量の化合物２（ａ）を溶解した溶液に、1当量の４−ニトロベンズアルデヒドを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。ベンゼン（１／１０の容量）を添加し、混合物を回転式蒸発装置にて真空下で、乾燥するまで濃縮する。
【０３９６】
得られたシッフ塩基イミンを、次に、ＮａＣＮＢＨ３又はＬｉＢＨ４（１．５当量）のアセトニトリル溶液で処理し、イミンの炭素−窒素二重結合をアミンに還元し、化合物２（ｑ）を形成する。
【実施例２９】
【０３９７】
化合物２（ｒ）の合成
【化１０７】
2007525148.tif 000141
【０３９８】
アセトニトリルに１０当量の化合物２（ａ）を溶解した溶液に、１当量のシクロヘキシルホルムアルデビドを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。ベンゼン（１／１０の容量）を添加し、混合物を回転式蒸発装置にて真空下で、乾燥するまで濃縮する。
【０３９９】
得られたシッフ塩基イミンを、次に、ＮａＣＮＢＨ３又はＬｉＢＨ４（１．５当量）のアセトニトリル溶液で処理し、イミンの炭素−窒素二重結合をアミンに還元し、化合物２（ｒ）を形成する。
【実施例３０】
【０４００】
化合物２（ｓ）の合成
【化１０８】
2007525148.tif 000142
【０４０１】
テトラヒドロフランに化合物２（ａ）を溶解した溶液に、１当量の無水酢酸及び２当量のトリエチルアミンを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｓ）が得られる。
【実施例３１】
【０４０２】
化合物２（ｔ）の合成
【化１０９】
2007525148.tif 000143
【０４０３】
化合物２（ａ）の溶液に、１当量のイソブチル無水物及び２当量のトリエチルアミンを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を、３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｔ）が得られる。
【実施例３２】
【０４０４】
化合物２（ｕ）の合成
【化１１０】
2007525148.tif 000144
【０４０５】
化合物２（ａ）の溶液に、１当量の安息香酸無水物及び２当量のトリエチルアミンを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｕ）が得られる。
【実施例３３】
【０４０６】
化合物２（ｖ）の合成
【化１１１】
2007525148.tif 000145
【０４０７】
化合物２（ａ）の溶液に、１当量のｐ−ニトロ安息香酸無水物及び２当量のトリエチルアミノを添加する。反応物を、室温で２時間攪拌する。次に、混合物を、水（２倍容量）で洗浄し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を、３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｖ）が得られる。
【実施例３４】
【０４０８】
化合物２（ｗ）の合成
【化１１２】
2007525148.tif 000146
【０４０９】
化合物２（ａ）の溶液を、１当量のＮ保護アラニン活性エステルと反応させる。アラニンのアミノ基を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルジカルボジイミド）又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）とアラニンとを反応させることによって保護し、カルボキシル酸基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステルに転換する。Ｎ保護活性エステルを、テトラヒドロフランなどの不活性溶媒に溶解した化合物２（ａ）に添加する。混合物を還流下で１時間加熱する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｗ）が得られる。
【実施例３５】
【０４１０】
化合物２（ｘ）の合成
【化１１３】
2007525148.tif 000147
【０４１１】
化合物２（ａ）の溶液を、１当量のＮ保護パラヒドロキシフェニルグリシン活性エステルと反応させる。パラヒドロキシフェニルグリシンのアミノ基を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルジカルボジイミド）又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドとアラニンとを反応させることによって保護し、カルボキシル酸基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステルに転換する。Ｎ保護活性エステルを、テトラヒドロフランなどの不活性溶媒に溶解した化合物２（ａ）に添加する。混合物を還流下で１時間加熱する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｘ）が得られる。
【実施例３６】
【０４１２】
化合物２（ｙ）の合成
【化１１４】
2007525148.tif 000148
【０４１３】
化合物２（ａ）の溶液を、１当量のＮ保護チロシン活性エステルと反応させる。チロシンのアミノ基を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルジカルボジイミド）又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドとアラニンとを反応させることによって保護し、カルボキシル酸基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステルに転換する。Ｎ保護活性エステルを、テトラヒドロフランなどの不活性溶媒に溶解した化合物２（ａ）に添加する。混合物を還流下で１時間加熱する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｙ）が得られる。
【実施例３７】
【０４１４】
化合物２（ｚ）の合成
【化１１５】
2007525148.tif 000149
【０４１５】
化合物２（ａ）の溶液を、１当量のＮ保護バリン活性エステルと反応させる。バリンのアミノ基を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルジカルボジイミド）又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドとアラニンとを反応させることによって保護し、カルボキシル酸基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステルに転換する。Ｎ保護活性エステルを、テトラヒドロフランなどの不活性溶媒に溶解した化合物２（ａ）に添加する。混合物を還流下で１時間加熱する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ｚ）が得られる。
【実施例３８】
【０４１６】
化合物２（ａａ）の合成
【化１１６】
2007525148.tif 000150
【０４１７】
化合物２（ａ）の溶液を、１当量のＮ保護プロリン活性エステルと反応させる。プロリンのアミノ基を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルジカルボジイミド）又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドとアラニンとを反応させることによって保護し、カルボキシル酸基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステルに転換する。Ｎ保護活性エステルを、テトラヒドロフランなどの不活性溶媒に溶解した化合物２（ａ）に添加する。混合物を還流下で１時間加熱する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ａａ）が得られる。
【実施例３９】
【０４１８】
化合物２（ａｂ）の合成
【化１１７】
2007525148.tif 000151
【０４１９】
化合物２（ａ）の溶液を、１当量のＮ保護セリン活性エステルと反応させる。セリンのアミノ基を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルジカルボジイミド）又はＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドとアラニンとを反応させることによって保護し、カルボキシル酸基を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性エステルに転換する。Ｎ保護活性エステルを、テトラヒドロフランなどの不活性溶媒に溶解した化合物２（ａ）に添加する。混合物を還流下で１時間加熱する。次に混合物を、水（２倍容量）で希釈し、ＨＰ−２０ポリスチレン樹脂を添加する。混合物を３０分間攪拌し、ろ過し、樹脂を水でよく洗浄し、産物を１００％エタノールで溶出する。この溶出物を真空下で濃縮すると、化合物２（ａｂ）が得られる。
【実施例４０】
【０４２０】
心臓血管疾患治療のための化合物２（ａ）
【０４２１】
ポリエン化合物は、一般的に消化管からは吸収されず、経口投与後に消化管内でコレステロールと結合し、低コレステロール血症の特性を示す。ポリエン化合物による低コレステロール血症の特性は、犬の研究においてはじめて明らかになった（Schaffner, C. P. and Gordon H. W. The Hypocholesterolemic activity of orally administered polyene macrolides. P. N. A. S. 61: 36-41, 1968.）。トリを用いた別の研究では、飼料中の少量のポリエン化合物は、腸肝コレステロール循環の阻害を誘導し、糞便中の脂質排出を増加し、及びアテローム発生を減少させた（Fisher, H., Griminger P. and Siller W. Effect of candicidin on plasma cholesterol and avian atherosclerosis. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 145: 836-839, 1974）。経口投与されたポリエン化合物がコレステロール脂質の代謝に及ぼす有益な効果は、ヒト、ラット、イヌ及びトリなどの複数の種において示されているように、種依存的ではない（Pagliano FM, Correction of hyperdyslipidemia using polyene-structure substances. Controlled clinical trail. Arch Sci Med (Torino). 136: 303-308, 1979; Barbaro A. and Casella G. Action of a polyene macrolide on hyperdislipidaemic disorders. Archivio per Scienze Mediche 137: 211-216, 1980; Singhal, A. K., Mosbach, E. H. and Schaffner, C. P. Effect of candicidin on cholesterol and bile acid metabolism in the rat. Lipids, 16: 423-426, 1981.）。
【０４２２】
高コレステロール症、異常脂質血症、及びアテローム性動脈硬化症などの心臓血管疾患の治療に用いる化合物２（ａ）の治療可能性を、ウサギに経口投与した化合物２（ａ）の効果を測定することにより示した。ニュージーランドウサギを、光及び温度が制御された条件下で飼育し、通常のウサギ用飼料（コントロール）、及び高コレステロール症を誘発させるためにコレステロールを０．５〜１％含む飼料を、異なる二種類の飼料として数週間与えた。１ヶ月にわたって、毎日、ウサギに、化合物２（ａ）（３，１０，３０ｍｇ／体重ｋｇ）又は賦形剤を、強制飼養により投与した。飼料摂取量及びウサギの体重を、実験期間中、毎日測定した。コレステロール、リポタンパク質及びトリグリセリドを測定するための血液サンプルを、実験期間中には４日毎に採取したのと同様に、実験の開始時と終了時においても、耳動脈に挿入したカテーテルから採取した。血清コレステロール、リポタンパク質及びトリグリセリドを、製造者（Sigma Chemical Co）に指定されたとおりに、及びStraprans I, Pan X-M, Rapp JH, Feingold KRに記載されているとおりに市販のキットを使用して、酵素アッセイにより測定した。飼料中の酸化コレステロールにより、コレステロール飼料摂取ラビットにおいて、アテローム性大動脈硬化の発症が促進される。Arteriosclerois, Thrombosis and Vascular Biology, 18: 977-983, 1998。実験の終了時、最後の血液サンプルを採取後に、動物に麻酔を施して、下行大動脈を露出し、切除し、ホルマリンに固定して組織学的検索のために加工する。すなわち、パラフィン縦断面又は横断面（５ミクロン）を、スーダンブラック（脂質染色）で染色して、マッソントリクロムで対比染色する。脈管内膜、中膜、及び外膜領域の形態的定量を、画像解析により実施した。大動脈の脂質沈着を、脂肪染色で視覚化した損傷で覆われた大動脈の割合を求めることで判定する。コレステロールの動脈中濃度を、Thiery J, Nebendahl K, Rapp K, Kluge R, Teupser D and Seidel D. Low atherosclerotic response of a strain of rabbits to diet-induced hypercholesterolemia. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, 15: 1181-1188, 1995で説明されているように、脂質の抽出後に測定する。
【図面の簡単な説明】
【０４２３】
【図１】ストレプトミセス・アイズネンシスについて、化合物２（ａ）の生合成遺伝子座を示す図である。また、２５０２０３−０１、２５０２０３−０２、２５０２０３−０３、２５０２０３−０４及び２５０２０３−０５のアクセッション番号でＩＤＡＣに寄託されているコスミドの位置が示されており、これらは化合物２（ａ）の遺伝子座の長さに及んでいる。
【図２ａ】化合物２（ａ）を合成するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に存在する、２６ＫＳドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＫＳドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、Kakavas et al., J. Bacteriol. 179, 7515-7522 (1997)  による記載に従って選択された。
【図２ｂ】化合物２（ａ）を合成するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に存在する、２６ＫＳドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＫＳドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、Kakavas et al., J. Bacteriol. 179, 7515-7522 (1997)  による記載に従って選択された。
【図２ｃ】化合物２（ａ）を合成するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に存在する、２６ＫＳドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＫＳドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、Kakavas et al., J. Bacteriol. 179, 7515-7522 (1997)  による記載に従って選択された。
【図２ｄ】化合物２（ａ）を合成するポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）に存在する、２６ＫＳドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＫＳドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、Kakavas et al., J. Bacteriol. 179, 7515-7522 (1997)  による記載に従って選択された。
【図３ａ】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２６ＡＴドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＡＴドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al.による記載に従って選択された。
【図３ｂ】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２６ＡＴドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＡＴドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al. による記載に従って選択された。
【図３ｃ】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２６ＡＴドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＡＴドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al. による記載に従って選択された。
【図３ｄ】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２６ＡＴドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＡＴドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al. による記載に従って選択された。
【図４】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する１５ＤＨドメイン（ＯＲＦ１０、１１、１２、１４、１５、１７及び１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＤＨドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al.による記載に従って選択された。不活性ＤＨドメインが、強調表示されている。
【図５】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在するＥＲドメイン（ＯＲＦ１７）と、ニスタチン生合成遺伝子座におけるモジュール５〜１５までのＥＲドメインとをBrautaset et al., Chem. Biol., 7, 395-403 (2000) による記載に従って比較するアミノ酸配列。このＥＲドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al.による記載に従って選択された。
【図６ａ】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２６ＫＲドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＫＲドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al.及びFisher et al. Structure Fold Des. 8, 339-347 (2000) による記載に従って選択された。ＯＲＦ１３のモジュール１２に見られる不活性ＫＲドメインが、強調表示されている。
【図６ｂ】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２６ＫＲドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＫＲドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al.及びFisher et al. Structure Fold Des. 8, 339-347 (2000) による記載に従って選択された。ＯＲＦ１３のモジュール１２に見られる不活性ＫＲドメインが、強調表示されている。
【図７】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２７ＡＣＰドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）を比較する複合アミノ酸配列。このＡＣＰドメインの境界及び重要なセリン残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al.による記載に従って選択された。
【図８】化合物２（ａ）のＰＫＳに存在するＴＥドメイン（ＯＲＦ１８）と、ニスタチン生合成遺伝子座におけるモジュール７のＴＥドメインとを、上記Brautaset et al.による記載に従って比較するアミノ酸配列。このＥＲドメインの境界及び重要な残基（黒で強調表示されている）は、上記Kakavas et al.による記載に従って選択された。各々の配列クラスター（図２〜８）において、配列の下の線は、強く保存されている位置を示すために用いられている。さらに、３つの文字、即ち、＊（アスタリスク）、：（コロン）及び．（ピリオド）が用いられ、「＊」が、単独の完全に保存されている残基を有する位置を示し、「：」が以下のＳＴＡ、ＮＥＱＫ、ＮＨＱＫ、ＮＤＥＱ、ＱＨＲＫ、ＭＩＬＶ、ＭＩＬＦ、ＨＹ及びＦＹＷの強い基のうちの１つが完全に保存されていることを示し、「.」が、 以下のＣＳＡ、ＡＴＶ、ＳＡＧ、ＳＴＮＫ、ＳＴＰＡ、ＳＧＮＤ、ＳＮＤＥＱＫ、ＮＤＥＱＨＫ、ＮＥＱＨＲＫ、ＦＶＬＩＭ及びＨＦＹのより弱い基のうちの１つが完全に保存されていることを示している。
【図９】ニスタチンＰＫＳシステムのモジュール３及び１１に各々に存在するマロニル特異的及びメチルマロニル特異的ＡＴドメインを伴った、化合物２（ａ）のＰＫＳに存在する２６ＡＴドメイン（ＯＲＦ１０〜１８）の、上記Brautaset et al.による記載に従った系統分析。
【図１０】化合物２（ａ）のポリケチドのコア構造の生合成経路。
【図１１】化合物２（ａ）のアミノヒドロキシシクロペンテノン（ａ）及びデオキシ糖（ｂ）成分の生合成経路。
【図１２ａ−ｂ】化合物２（ａ）を機能的に修飾する変異体を提供するため、化合物２（ａ）の遺伝子座を遺伝的に修飾する方法の概要。
【図１２ｃ−ｄ】化合物２（ａ）を機能的に修飾する変異体を提供するため、化合物２（ａ）の遺伝子座を遺伝的に修飾する方法の概要。
【図１２ｅ−ｆ】化合物２（ａ）を機能的に修飾する変異体を提供するため、化合物２（ａ）の遺伝子座を遺伝的に修飾する方法の概要。
【図１３】エレクトロスプレー質量分析法によって得られた化合物２（ａ）の合成データを示している。
【図１４】ＵＶlmax-  によって得られた化合物２（ａ）の合成データを示している。
【図１５ａ】化合物２（ａ）を、陽子を含むｄ３−ＭｅＯＨ溶液に溶解し、５００ＭＨｚでＮＭＲ分析して得られた合成データを示している。
【図１５ｂ】化合物２（ａ）を、炭素を含むｄ３−ＭｅＯＨ溶液に溶解し、５００ＭＨｚでＮＭＲ分析して得られた合成データを示している。
【図１５ｃ】ｇＤＱＣＯＳＹの多次元パルスシーケンス実験から得られた、化合物２（ａ）の合成データを示している。
【図１５ｄ】ｇＨＳＱＣの多次元パルスシーケンス実験から得られた、化合物２（ａ）の合成データを示している。
【図１５ｅ】ｇＨＭＢＣの多次元パルスシーケンス実験から得られた、化合物２（ａ）の合成データを示している。
【図１５ｆ】ＴＯＣＳＹの多次元パルスシーケンス実験から得られた、化合物２（ａ）の合成データを示している。
【図１６】実施例５に記載のモデルマウスにおいて、カンジダ・アルビカンスに対する化合物２（ａ）の抗真菌活性を評価する研究から得られたデータの図。図１６は、化合物２（ａ）（３ｍｇ／ｋｇ）、化合物２（ａ）（１ｍｇ／ｋｇ）、ファンギゾン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）及びファンギゾン（０．５０ｍｇ／ｋｇ）の、植菌後の生存率対日数を示している。
【図１７ａ−ｂ】実施例３で論じられている、化合物２（ａ）の陽子−ＮＭＲ（図１７ａ）、１３Ｃ−ＮＭＲ（図１７ｂ）のスペクトルの割り当て。
【図１】
2007525148.tif 000203
2007525148.tif 000204
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【図４】
2007525148.tif 000212
【図５】
2007525148.tif 000213
2007525148.tif 000214
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【図７】
2007525148.tif 000216
【図８】
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【図９】
2007525148.tif 000218
【図１０】
2007525148.tif 000219
【図１１】
2007525148.tif 000220
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【図１３】
2007525148.tif 000224
【図１４】
2007525148.tif 000225
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2007525148.tif 000227
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【図１６】
2007525148.tif 000232
2007525148.tif 000233
【配列表】
2007525148000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成16年3月10日(2004.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉで表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化１】
2007525148.tif 000605
式Ｉ
式中、Ａは−ＮＲ１Ｒ２、−Ｎ＝ＣＲ１Ｒ２、
【化２】
2007525148.tif 000606
及び
【化３】
2007525148.tif 000607
; 
からなる群から選択され、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、Ｃ6−10アリール、Ｃ5−10ヘテロアリール及びＬ又はＤ自然発生的Ｃ結合型アミノ酸からなる群から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリール基は、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はＣ6−10アリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールは、さらにハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から独立して選択される１又は２以上の基で置換されてもよい；
Ｂは、エテン−１，２−ジイル又は
【化４】
2007525148.tif 000608
から選択され、
式中Ｒ１０は、オキソ又はＯＲ１１であり、Ｒ１１は、Ｈ又はＣ２−６ヘテロシクロアルキルであり、該ヘテロシクロアルキルは、ＯＸ、Ｃ１−３アルキル及び−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ１から選択される１〜４個の置換基で置換されていてもよく、ＸがＨであるか、又は、ＯＸである隣接する置換基が少なくとも二個ある場合に、Ｘは該２つの隣接する酸素基が
【化５】
2007525148.tif 000609
のアセタール５員環を形成する結合であってもよく、
式中、Ｒ５及びＲ６は、それぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル及びＣ２−７アルケニルからなる群より選択され、
Ｄは、
【化６】
2007525148.tif 000610
−ＮＲ１２ａＲ１２ａ及びＯＲ１２から選択され、Ｒ１２は、Ｈ、１〜２個のフェニル基で置換されてもよいキＣ１−６アルキルから選択され、該フェニル基は、Ｃ１−６アルキル又はハロで置換されていてもよい；
Ｒ１２ａ及びＲ１２ａは、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケ
ニル、Ｃ３−６シクロアルキル、Ｃ２−６ヘテロシクロアルキル、Ｃ6−10アリール、Ｃ5−10ヘテロアリール及びＬ又はＤ自然発生的Ｃ結合型アミノ酸から選択され、該アルキル、アルケニル、アリール及びヘテロアリールは、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２又はＣ6−10アリールから選択される基で置換されていてもよく、該アリールはさらに、ハロゲン、ＯＨ、ＮＯ２又はＮＨ２から独立されて選択される１又は２以上の基で置換されていてもよい。
Ｗ１は、
【化７】
2007525148.tif 000611
であり、
Ｗ２は、
【化８】
2007525148.tif 000612
であり、
Ｗ３は、
【化９】
2007525148.tif 000613
であり、
Ｗ５は、
【化１０】
2007525148.tif 000614
であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３はそれぞれ独立してＨ、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ７並びにＸ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２及びＸ１３が結合である場合に、該２つの隣接する酸素原子と、それらに付着する炭素原子とが式：
【化１１】
2007525148.tif 000615
のアセタール６員環を形成する結合から選択され、
式中、Ｒ５、Ｒ6及びＲ6はそれぞれ独立してＨ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−７アルケニルから選択され、
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、Ｙ４、Ｙ５、Ｙ６、Ｙ７、Ｙ９、Ｙ１０、Ｙ１１、Ｙ１２、Ｙ１３及びＹ１５は、それぞれ独立してエテン−１,２−ジイル、エタン−１,２−ジイル及び
【化１２】
2007525148.tif 000616
から選択され、該エテン−１,２−ジイル基及びエタン−１,２−ジイル基は、メチル基で置換されていてもよい。
Ｚは、ＯＨ、ＮＨＲ８及び
【化１３】
2007525148.tif 000617
から選択され、点線が結合を示す場合には、Ｚはオキソ又はＮＲ９であり、
Ｒ８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニルから選択され、
Ｒ９は、Ｃ6−10アリールで置換されていてもよいＣ１−６アルキルである。
【請求項２】
Ｚがオキソであることを特徴とする請求項１記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項３】
Ｄが、
【化１４】
2007525148.tif 000618
であることを特徴とする請求項１又は２記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
Ｂが、
【化１５】
2007525148.tif 000619
であることを特徴とする請求項１、２又は３記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項５】
Ａが-ＮＲ１Ｒ２であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項６】
Ａが
【化１６】
2007525148.tif 000620
であることを特徴とする請求項４記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項７】
Ｄが、
【化１７】
2007525148.tif 000621
であることを特徴とする請求項１、２、４、５又は６記載の化合物又はその薬学的に許容される塩。
【請求項８】
【化１８】
2007525148.tif 000622
化合物２（ａ）
で表される化合物。
【請求項９】
式IIで表される化合物又はその薬学的に許容される塩。
【化１９】
2007525148.tif 000623
式II
式中、Ａ１が−ＮＨ２、−Ｎ＝ＣＨ−Ｒ１３、Ｌ又はＤ自然発生的Ｃ結合アミノ酸又は−ＮＨ−Ｒ１４であり、Ｒ１３は水素又はフェニルであり、Ｒ１４は、イソプロピル、１−（４−ニトロフェニル）メチル、シクロヘキシル、
【化２０】
2007525148.tif 000624
からなる群から選択され、
式中、Ｒ１５はメチル、イソプロピル、フェニル、４−ニトロフェニル、１−アミノエチル、１−アミノ−１−（４−ヒドロキシフェニル）メチル、１−アミノ−２−（４−ヒドロキシフェニル）エチル、１−アミノ−２−メチルプロピル、２−ピロリジニル及び１−アミノ−２−ヒドロキシエチルからなる群から選択され、
Ｙ２０はエテン−１，２−ジイル及び
【化２１】
2007525148.tif 000625
からなる群から選択され、
Ｚ１は
【化２２】
2007525148.tif 000626
からなる群から選択され、
Ｒ２０は水素及び
【化２３】
2007525148.tif 000627
からなる群から選択され、
Ｙ３０はエテン−1,２−ジイル又はエタン−１,２−ジイルであり、
Ｄ１はヒドロキシ、メトキシ又は
【化２４】
2007525148.tif 000628
である。
【請求項１０】
以下からなる群から選択される化合物。
【化２５】
2007525148.tif 000629
化合物２（ｂ）
【化２６】
2007525148.tif 000630
化合物２（ｃ）
【化２７】
2007525148.tif 000631
化合物２（ｄ）
【化２８】
2007525148.tif 000632
化合物２（ｅ）
【化２９】
2007525148.tif 000633
化合物２（ｆ）
【化３０】
2007525148.tif 000634
化合物２（ｇ）
【化３１】
2007525148.tif 000635
化合物２（ｈ）
【化３２】
2007525148.tif 000636
化合物２（ｉ）
【化３３】
2007525148.tif 000637
化合物２（j）
【化３４】
2007525148.tif 000638
化合物２（ｋ）
【化３５】
2007525148.tif 000639
化合物２（ｌ）
【化３６】
2007525148.tif 000640
化合物２（ｍ）
【化３７】
2007525148.tif 000641
化合物２（ｎ）
【化３８】
2007525148.tif 000642
化合物２（ｏ）
【化３９】
2007525148.tif 000643
化合物２（p）
【化４０】
2007525148.tif 000644
化合物２（q）
【化４１】
2007525148.tif 000645
化合物２（ｒ）
【化４２】
2007525148.tif 000646
化合物２（ｓ）
【化４３】
2007525148.tif 000647
化合物２（ｔ）
【化４４】
2007525148.tif 000648
化合物２（ｕ）
【化４５】
2007525148.tif 000649
化合物２（ｖ）
【化４６】
2007525148.tif 000650
化合物２（ｗ）
【化４７】
2007525148.tif 000651
化合物２（ｘ）
【化４８】
2007525148.tif 000652
化合物２（ｙ）
【化４９】
2007525148.tif 000653
化合物２（ｚ）
【化５０】
2007525148.tif 000654
化合物２（ａａ）
【化５１】
2007525148.tif 000655
化合物２（ａｂ）
【請求項１１】
ストレプトミセス株に由来する細胞を培養するステップと、該培養された細胞を請求項８の化合物の生成に必要な時間、成長培地で好気的にインキュベートするステップと、該培地を溶媒で抽出し、粗抽出物から請求項８の化合物を精製するステップとを含む、請求項８記載の化合物の生成方法。
【請求項１２】
前記ストレプトミセス株が、ストレプトミセス・アイズネンシスＮＲＲＬ  Ｂ−１１２７７であることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ストレプトミセス株が変異株［Ｃ０３］０２３（寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ０７０８０３−１）及び［Ｃ０３Ｕ０３］０２３（寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ２３１２０３−０２）から選択されるストレプトミセス・アイズネンシスの変異株であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ０７０８０３−１によって特定されるストレプトミセス・アイズネンシスの株。
【請求項１５】
寄託アクセッション番号ＩＤＡＣ２３１２０３−０２によって特定されるストレプトミセス・アイズネンシスの株。
【請求項１６】
治療上有効な量の請求項１〜１０のいずれか記載の化合物及びその薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１７】
治療上有効な量の請求項８記載の化合物及びその薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１８】
治療上有効な量の請求項９記載の化合物及びその薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか記載の化合物の薬剤としての使用。
【請求項２０】
真菌感染の治療のための薬剤の製造における請求項１〜１０のいずれか記載の化合物の使用。
【請求項２１】
前記真菌感染がカンジダ・アルビカンスに起因することを特徴とする請求項１９又は２０記載の使用。
【請求項２２】
前記真菌感染がカンジダ種に起因し、該カンジダ種は、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・ルシタニエ、カンジダ・パラプシロシス、カンジダ・クルセイ及びカンジダ・トロピカリスからなる群から選択されることを特徴とする請求項１９又は２０の使用。
【請求項２３】
前記真菌感染が、アスペルギルス種に起因し、該アスペルギルス種は、アスペルギルス・フミガーツス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・テレウス及びアスペルギルス・フラーブスからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１９又は２０の使用。
【請求項２４】
前記真菌感染が、フサリウム種、セドスポリウム種、クリプトコッカス種、ケカビ種、ヒストプラスマ種、トリコスポロン種、ブラストミセス種又はサッカロマイシス・セレヴィシエに起因することを特徴とする、請求項１９又は２０の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１０のいずれか記載の化合物の抗癌剤としての使用。
【請求項２６】
前記癌が、白血病、非小細胞肺細胞癌、大腸癌、中枢神経癌、メラノーマ、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌及び乳癌からなる群から選択されることを特徴とする請求項２５の使用。
【請求項２７】
配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７のポリケチドシンターゼによって形成されたポリケチドシンターゼシステムのドメインを少なくとも１つコードする核酸を含む式Ｉのポリケチドを生成するための単離、精製又は濃縮された核酸。
【請求項２８】
配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６及び３８からなる群から選択される請求項３０記載の核酸。
【請求項２９】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号２２
ｂ．配列番号２２の核酸残基１６９〜３５４、配列番号２２の核酸残基４２１〜１６９８、配列番号２２の核酸残基１７８９〜３０９３、配列番号２２の核酸残基３９１０〜４５５１、配列番号２２の核酸残基４８０７〜４９９２、配列番号２２の核酸残基５０６８〜６３５４、配列番号２２の核酸残基６４０３〜７６８６、配列番号２２の核酸残基８４９７〜９１３５、配列番号２２の核酸残基９３８８〜９５７３、配列番号２２の核酸残基９６４３〜１０９２０、配列番号２２の核酸残基１０９７８〜１２２６７、配列番号２２の核酸残基１２３０４〜１２６２４、配列番号２２の核酸残基１３８３４〜１４４８７、配列番号２２の核酸残基１４７３１〜１４９１６、配列番号２２の核酸残基１５０１９〜１６３１４、配列番号２２の核酸残基１６３７８〜１７６４９、配列番号２２の核酸残基１８４３９〜１９０８０、配列番号２２の残基１９３３０〜１９５１５、配列番号２２の核酸残基１９５８５〜２０８６２、配列番号２２の核酸残基２０９３５〜２２２０６、配列番号２２の核酸残基２３１０７〜２３７５４、配列番号２２の核酸残基２４００４〜２４１８９
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３０】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製、濃縮された核酸
ａ．配列番号２４
ｂ．配列番号２４の核酸残基１０９〜１３８６、配列番号２４の核酸残基１４７７〜２７５７、配列番号２４の核酸残基２７９４〜３１１４、配列番号２４の核酸残基４２３１〜４８８１、配列番号２４の核酸残基５１１６〜５３０１、配列番号２４の核酸残基５３８０〜６６４５、配列番号２４の核酸残基６６９４〜７９７７、配列番号２４の核酸残基８８７８〜９５１９、配列番号２４の核酸残基９７７２〜９９５７
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３１】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号２６
ｂ．配列番号２６の核酸残基１０６〜１３８３、配列番号２６の核酸残基１４４７〜２７２１、配列番号２６の核酸残基２７５５〜３０８１、配列番号２６の核酸残基４３１５〜４９６５、配列番号２６の核酸残基５２０６〜５３９１、配列番号２６の核酸残基５４９１〜６７６８、配列番号２６の核酸残基６８４１〜８１４２、配列番号２６の核酸残基８９４１〜９５８２、配列番号２６の核酸残基９８３２〜１００１７、配列番号２６の核酸残基１００８１〜１１３５８、配列番号２６の核酸残基１１４０７〜１２６７５、配列番号２６の核酸残基１３４８０〜１４１１８、配列番号２６の核酸残基１４３８３〜１４５６８、配列番号２６の核酸残基１４６３８〜１５９１２、配列番号２６の核酸残基１５９６７〜１７２４４、配列番号２６の核酸残基１７２７８〜１７５９８、配列番号２６の残基１８８８０〜１９５３０、配列番号２６の核酸残基１９７９５〜１９９８０
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３２】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号２８
ｂ．配列番号２８の核酸残基１０３〜１３８０、配列番号２８の核酸残基１４５０〜２７６０、配列番号２８の核酸残基３５８３〜４２１８、配列番号２８の核酸残基４４６８〜４６５３
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３３】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号３０、
ｂ．配列番号３０の核酸残基１０３〜１３８０、配列番号３０の核酸残基１４５９〜２７５４、配列番号３０の核酸残基３６５５〜４２９３、配列番号３０の核酸残基４５４０〜４７２５、配列番号３０の残基４８０４〜６０８１、配列番号３０の核酸残基６１３６〜７４１９、配列番号３０の核酸残基７４５６〜７７７６、配列番号３０の核酸残基８９３８〜９５８８、配列番号３０の核酸残基９８３２〜１００１７、配列番号３０の核酸残基１００８７〜１１３６４、配列番号３０の核酸残基１１４２８〜１２７１１、配列番号３０の核酸残基１２７４５〜１３０６５、配列番号３０の核酸残基１４２７８〜１４９２８、配列番号３０の核酸残基１５１８７〜１５３７２、
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３４】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号３２
ｂ．配列番号３２の核酸残基１０３〜１３８０、配列番号３２の核酸残基１４３８〜２７４２、配列番号３２の残基２７７６〜３０９６、配列番号３２の核酸残基４２６７〜４９１７、配列番号３２の核酸残基５２０９〜５３９４、配列番号３２の核酸残基５４６４〜６７４１、配列番号３２の核酸残基６７８７〜８０７０、配列番号３２の核酸残基８１０７〜８４２７、配列番号３２の核酸残基９５６２〜１０２１２、配列番号３２の核酸残基１０４４７〜１０６３２、配列番号３２の核酸残基１０７０２〜１１９７９、配列番号３２の核酸残基１２０４９〜１３３２６、配列番号３２の核酸残基１３３６６〜１３６８６、配列番号３２の核酸残基１４９３２〜１５５８２、配列番号３２の核酸残基１５８５３〜１６０３８
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３５】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号３４
ｂ．配列番号３４の核酸残基１０３〜１３８０、配列番号３４の核酸残基１４４１〜２７５１、配列番号３４の核酸残基３６１３〜４２４８、配列番号３４の核酸残基４４９８〜４６８３、配列番号３４の核酸残基４７５３〜６０３０、配列番号３４の核酸残基６１９９〜７５１５、配列番号３４の核酸残基８３５６〜８９９４、配列番号３４の核酸残基９２４７〜９４３２
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３６】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドの生成のための単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号３６
ｂ．配列番号３６の核酸残基１１８〜１３９５、配列番号３６の核酸残基１５０７〜２８２３、配列番号３６の核酸残基２８６０〜３１８０、配列番号３６の核酸残基４３６６〜５０１６、配列番号３６の核酸残基５２５１〜５４３６、配列番号３６の核酸残基５５０３〜６７８０、配列番号３６の核酸残基６８４１〜８１５４、配列番号３６の核酸残基８１９１〜８５１１、配列番号３６の核酸残基９５６２〜１０６３８、配列番号３６の核酸残基１０６５１〜１１３０１、配列番号３６の核酸残基１１５３６〜１１７２１、配列番号３６の残基１１７９４〜１３０７１、配列番号３６の核酸残基１３１１７〜１４４０９、配列番号３６の核酸残基１４４４３〜１４７６３、配列番号３６の核酸残基１５８９８〜１６５４８、配列番号３６の核酸残基１６７８９〜１６９７４、配列番号３６の核酸残基１７０５６〜１８３３３、配列番号３６の核酸残基１８３９１〜１９６７１、配列番号３６の核酸残基１９７１４〜２００３４、配列番号３６の核酸残基２１１８４〜２１８３４、配列番号３６の核酸残基２２０８７〜２２２７２の核酸
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３７】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸を含む、式Ｉのポリケチドを生成する単離、精製、濃縮される核酸。
ａ．配列番号３８
ｂ．配列番号３８の核酸残基１００〜１３７７、配列番号３８の核酸残基１５０４〜２７７８、配列番号３８の核酸残基２８１２〜３１３２、配列番号３８の核酸残基４２５８〜４９０８、配列番号３８の核酸残基５１４３〜５３２８、配列番号３８の核酸残基５３９５〜６６７２、配列番号３８の核酸残基６７３９〜８０１９、配列番号３８の核酸残基８０５６〜８３７６、配列番号３８の核酸残基９６０７〜１０２５７、配列番号３８の核酸残基１０５３７〜１０７２２、配列番号３８の核酸残基１０９４５〜１１６１６
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも８０％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３８】
ａ〜ｄのいずれかから選択される核酸で、ポリエンポリケチドを生成する単離、精製又は濃縮された核酸。
ａ．配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８の核酸
ｂ．配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のポリペプチドをコードする核酸
ｃ．（ａ）又は（ｂ）の核酸と少なくとも７５％の同一性を有する核酸
ｄ．（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の核酸に相補的な核酸
【請求項３９】
請求項４１、３２ｂ）、３３ｂ）、３４ｂ）、３５ｂ）、３６ｂ）、３７ｂ）、３８  ｂ）、３９ｂ）及び４０ｂ）のいずれか記載の核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能で、かつ式Ｉの化合物の合成を誘導するために、特異的にハイブリダイズする核酸に置換可能な単離、精製又は濃縮された核酸。
【請求項４０】
請求項３２〜４１のいずれか記載の核酸の少なくとも２つの配列を含む単離、精製又は濃縮された核酸。
【請求項４１】
請求項３２〜４１のいずれか記載の核酸の少なくとも５つの配列を含む単離、精製又は濃縮された核酸。
【請求項４２】
請求項３０〜４３のいずれか記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４５の発現ベクターで転換した宿主細胞。
【請求項４４】
ＩＤＡＣアクセッション番号２５０２０３−０１で寄託されたコスミド。
【請求項４５】
ＩＤＡＣアクセッション番号２５０２０３−０２で寄託されたコスミド。
【請求項４６】
ＩＤＡＣアクセッション番号２５０２０３−０３で寄託されたコスミド。
【請求項４７】
ＩＤＡＣアクセッション番号２５０２０３−０４で寄託されたコスミド。
【請求項４８】
ＩＤＡＣアクセッション番号２５０２０３−０５で寄託されたコスミド。
【請求項４９】
コスミドを、産物を発現するために原核宿主に挿入することを特徴とする請求項４７〜５１いずれか記載のコスミド。
【請求項５０】
宿主が、大腸菌、ストレプトミセス・リビダン、ストレプトミセス・グリセオフスクス、ストレプトミセス・アンボファシエンス、アクチノマイセス、バチルス種、コリネバクテリア種又はテルモアクチマイセスであることを特徴とする請求項５２記載のコスミド。
【請求項５１】
ポリケチドシンターゼのドメインを含む式Ｉのポリケチドを産生する単離されたポリペプチドで、該ポリケチドシンターゼが、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５又は３７のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項５２】
前記ドメインが、β−ケトアシルシンターゼ（ＫＳ）ドメイン、アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）ドメイン、アシルトランスフェラーゼ(ＡＴ)ドメイン、ケトレダクターゼ（ＫＲ）ドメイン、エノイルレダクターゼ(ＥＲ)ドメイン、チオエステラーゼ（ＴＥ）ドメイン及びデヒドラターゼ（ＤＨ）ドメインからなる群から選択されることを特徴とする請求項５４記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ＫＳドメインが、以下の群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項５５記載の単離されたポリペプチド配列。
ａ．配列番号２１のアミノ酸残基１４１〜５６６、
ｂ．配列番号２１のアミノ酸残基１６９０〜２１１８、
ｃ．配列番号２１のアミノ酸残基３２１５〜３６４０、
ｄ．配列番号２１のアミノ酸残基５００７〜５４３８、
ｅ．配列番号２１のアミノ酸残基６５２９〜６９５４、
ｆ．配列番号２３のアミノ酸残基３７〜４６２、
ｇ．配列番号２２のアミノ酸残基１７９４〜２２１５、
ｈ．配列番号２５のアミノ酸残基３６〜４６１、
ｉ．配列番号２５のアミノ酸残基１８３１〜２２５６、
ｊ．配列番号２５のアミノ酸残基３３６１〜３７８６、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸残基４８８０〜５３０４、
ｌ．配列番号２７のアミノ酸残基３５〜４６０、
ｍ．配列番号２９のアミノ酸残基３５〜４６０、
ｎ．配列番号２９のアミノ酸残基１６０２〜２０２７、
ｏ．配列番号２９のアミノ酸残基３３６３〜３７８８、
ｐ．配列番号３１のアミノ酸残基３５〜４６０、
ｑ．配列番号３１のアミノ酸残基１８２２〜２２４７、
ｒ．配列番号３１のアミノ酸残基３５６８〜３９９３、
ｓ．配列番号３３のアミノ酸残基３５〜４６０、
ｔ．配列番号３３のアミノ酸残基１５８５〜２０１０、
ｕ．配列番号３５のアミノ酸残基４０〜４６５、
ｖ．配列番号３５のアミノ酸残基１８３５〜２２６０、
ｗ．配列番号３５のアミノ酸残基３９３２〜４３５７、
ｘ．配列番号３５のアミノ酸残基５６８６〜６１１１、
ｙ．配列番号３７のアミノ酸残基３４〜４５９
ｚ．配列番号３７のアミノ酸残基１７９９〜２２２４、及び
ａａ．ａ）からｚ）のいずれかのアミノ酸残基と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項５４】
ＡＣＰドメインが、以下の群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項５５記載の単離されたポリペプチド配列。
ａ．配列番号２１のアミノ酸残基５７〜１１８、
ｂ．配列番号２１のアミノ酸残基１６０３〜１６６４、
ｃ．配列番号２１のアミノ酸残基３１３０〜３１９１、
ｄ．配列番号２１のアミノ酸残基４９１１〜４９７２、
ｅ．配列番号２１のアミノ酸残基６４４４〜６５０５、
ｆ．配列番号２１のアミノ酸残基８００２〜８０６３、
ｇ．配列番号２３のアミノ酸残基１７０６〜１７６７、
ｈ．配列番号２３のアミノ酸残基３２５８〜３３１９、
ｉ．配列番号２５のアミノ酸残基１７３６〜１７９７、
ｊ．配列番号２５のアミノ酸残基３２７８〜３３３９、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸残基４７９５〜４８５６、
ｌ．配列番号２５のアミノ酸残基６５９９〜６６６０、
ｍ．配列番号２７のアミノ酸残基１４９０〜１５５１、
ｎ．配列番号２９のアミノ酸残基１５１４〜１５７５、
ｏ．配列番号２９のアミノ酸残基３２７８〜３３３９、
ｐ．配列番号２９のアミノ酸残基５０６０〜５１２４、
ｑ．配列番号３１のアミノ酸残基１７３７〜１７９８、
ｒ．配列番号３１のアミノ酸残基３４８３〜３５４４、
ｓ．配列番号３１のアミノ酸残基５２８５〜５３４６、
ｔ．配列番号３３のアミノ酸残基１５００〜１５６１、
ｕ．配列番号３５のアミノ酸残基３０８３〜３１４４、
ｖ．配列番号３５のアミノ酸残基１７５１〜１８１２、
ｗ．配列番号３５のアミノ酸残基３８４６〜３９０７、
ｘ．配列番号３５のアミノ酸残基５５９７〜５６５８、
ｙ．配列番号３５のアミノ酸残基７３６３〜７４２４、
ｚ．配列番号３７のアミノ酸残基１７１５〜１７７６、
ａａ．配列番号３７のアミノ酸残基３５１３〜３５７４、
ｂｂ．ａ）からａａ）のいずれかのアミノ酸残基と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項５５】
ＡＴドメインが、以下の群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項５５記載の単離されたポリペプチド配列。
ａ．配列番号２１のアミノ酸残基５９７〜１０１３、
ｂ．配列番号２１のアミノ酸残基２１３５〜２５６２、
ｃ．配列番号２１のアミノ酸残基３６６０〜４０８９、
ｄ．配列番号２１のアミノ酸残基５４６０〜５８８３、
ｅ．配列番号２１のアミノ酸残基６９７９〜７４０２、
ｆ．配列番号２３のアミノ酸残基４９３〜９１９、
ｇ．配列番号２３のアミノ酸残基２２３２〜２６５９、
ｈ．配列番号２５のアミノ酸残基４８３〜９０７、
ｉ．配列番号２５のアミノ酸残基２２８１〜２７１４、
ｊ．配列番号２５のアミノ酸残基３８０３〜４２２５、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸残基５３２３〜５７４８、
ｌ．配列番号２７のアミノ酸残基４８４〜９２０、
ｍ．配列番号２９のアミノ酸残基４８７〜９１８、
ｎ．配列番号２９のアミノ酸残基２０４６〜２４７３、
ｏ．配列番号２９のアミノ酸残基３８１０〜４２３７、
ｐ．配列番号３１のアミノ酸残基４８０〜９１４、
ｑ．配列番号３１のアミノ酸残基２２６３〜２６９０、
ｒ．配列番号３１のアミノ酸残基４０１７〜４４４２、
ｓ．配列番号３３のアミノ酸残基４８１〜９１７、
ｔ．配列番号３３のアミノ酸残基２０６７〜２５０５、
ｕ．配列番号３５のアミノ酸残基５０３〜９４１、
ｖ．配列番号３５のアミノ酸残基２２８１〜２７１８、
ｗ．配列番号３５のアミノ酸残基４３７３〜４８０３、
ｘ．配列番号３５のアミノ酸残基６１３１〜６５５７、
ｙ．配列番号３７のアミノ酸残基５０２〜９２６、
ｚ．配列番号３７のアミノ酸残基２２４７〜２６７３、及び
ａａ．ａ）からｚ）いずれかのアミノ酸残基と７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項５６】
ＫＲドメインが、以下の群から選択される配列を含むことを特徴
とする請求項５５記載の単離されたポリペプチド配列。
ａ．配列番号２１のアミノ酸残基１３０４〜１５１７、
ｂ．配列番号２１のアミノ酸残基２８３３〜３０４５、
ｃ．配列番号２１のアミノ酸残基４６１２〜４８２９、
ｄ．配列番号２１のアミノ酸残基６１４７〜６３６０、
ｅ．配列番号２１のアミノ酸残基７７０３〜７９１８、
ｆ．配列番号２３のアミノ酸残基１４１１〜１６２７、
ｇ．配列番号２３のアミノ酸残基２９６０〜３１７３、
ｈ．配列番号２５のアミノ酸残基１４３９〜１６５５、
ｉ．配列番号２５のアミノ酸残基２９８１〜３１９４、
ｊ．配列番号２５のアミノ酸残基４４９４〜４７０６、
ｋ．配列番号２５のアミノ酸残基６２９４〜６５１０、
ｌ．配列番号２７のアミノ酸残基１１９５〜１４０６、
ｍ．配列番号２９のアミノ酸残基１２１９〜１４３１、
ｎ．配列番号２９のアミノ酸残基２９８０〜３１９６、
ｏ．配列番号２９のアミノ酸残基４７６０〜４９７６、
ｐ．配列番号３１のアミノ酸残基１４２３〜１６３９、
ｑ．配列番号３１のアミノ酸残基３１８８〜３４０４、
ｒ．配列番号３１のアミノ酸残基４９７８〜５１９４、
ｓ．配列番号３３のアミノ酸残基１２０５〜１４１６、
ｔ．配列番号３３のアミノ酸残基２７８６〜２９９８、
ｕ．配列番号３５のアミノ酸残基１４５６〜１６７２、
ｖ．配列番号３５のアミノ酸残基３５５１〜３７６７、
ｗ．配列番号３５のアミノ酸残基５３００〜５５１６、
ｘ．配列番号３５のアミノ酸残基７０６２〜７２８８、
ｙ．配列番号３７のアミノ酸残基１４２０〜１６３６、
ｚ．配列番号３７のアミノ酸残基３２０３〜３４１９、及び
ａａ．ａ）からｚ）いずれかのアミノ酸残基と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項５７】
ＤＨドメインが、以下の群から選択される配列を含むことを特徴とする請求項５５記載の単離されたポリペプチド配列。
ａ．配列番号２１のアミノ酸残基４１０２〜４２０８、
ｂ．配列番号２３のアミノ酸残基９３２〜１０３８、
ｃ．配列番号２５のアミノ酸残基９１９〜１０２７、
ｄ．配列番号２５のアミノ酸残基５７６１〜５８６６、
ｅ．配列番号２９のアミノ酸残基２４８６〜２５９２、
ｆ．配列番号３１のアミノ酸残基９２６〜１０３２、
ｇ．配列番号３１のアミノ酸残基２７０３〜２８０９、
ｈ．配列番号３１のアミノ酸残基４４５６〜４５６２、
ｉ．配列番号３５のアミノ酸残基９５４〜１０６０、
ｊ．配列番号３５のアミノ酸残基２７３１〜２８３７、
ｋ．配列番号３５のアミノ酸残基４８１５〜４９２１、
ｌ．配列番号３５のアミノ酸残基６５７２〜６６７８、
ｍ．配列番号３７のアミノ酸残基９３８〜１０４４、
ｎ．配列番号３７のアミノ酸残基２６８６〜２７９２、及び
ｏ．ａ）からｎ）のいずれかのアミノ酸残基と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列。
【請求項５８】
前記ＥＲドメインが、配列番号３５のアミノ酸残基３１８８〜３５４６を有する配列を含み、該アミノ酸と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５５記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項５９】
前記ＴＥドメインが、配列番号３７のアミノ酸残基３６４９〜３８７２の配列を含み、該アミノ酸と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項５５記載の単離されたポリペプチド配列。
【請求項６０】
以下からなる群から選択される、式Ｉのポリケチドを生成する単離したポリペプチド。
ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のいずれかのポリペプチド。  
ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチド。
【請求項６１】
請求項５５〜６３記載のアミノ酸配列を少なくとも２つコードする核酸。
【請求項６２】
請求項５５〜６３記載のアミノ酸配列を少なくとも３つコードする核酸。
【請求項６３】
請求項５５〜６３記載のアミノ酸配列を少なくとも５つコードする核酸。
【請求項６４】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７からなる群から選択された配列を有するポリペプチドを生成する方法で、以下のステップを含む方法：
（ａ）プロモーターに操作可能な状態で結合するポリペプチドをコードする核酸を細菌宿主細胞に導入するステップ、及び（ｂ）ポリペプチドの発現を導くような条件で形質転換宿主細胞を培養するステップ。
【国際調査報告】
2007525148.tif 000656
2007525148.tif 000657