(57)【要約】ｅＩＦ４Ｅの発現を調整するためのオリゴマー化合物、組成物、および方法が提供される。アンチセンス化合物は、一本鎖または二本鎖であってもよく、ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸にターゲットされてもよい。ｅＩＦ４Ｅ発現を調整するために、およびｅＩＦ４Ｅの発現と関連した疾患および症状を診断並びに処置するために、これらの化合物を使用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩であって：
８〜８０核酸塩基の長さであり；
８〜８０核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有し；
ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子にターゲットされ；および、
これは、ｅＩＦ４Ｅの発現を調整し、
前記オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、核酸塩基配列５’−ＡＧＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＡＧＡＴＣＧＡＴ−３’または５’−ＡＧＵＣＧＣＣＡＵＣＵＵＡＧＡＵＣＧＡＵ−３’を含まないことを条件とし、および、
前記調整がｅＩＦ４Ｅの発現阻害であるときは、前記阻害の程度は、少なくとも約５０％であるオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２】
１９〜２３核酸塩基の長さであり、かつ前記アンチセンス部分が１９〜２３核酸塩基の長さである、請求項１記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドを含む、請求項１もしくは２記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項４】
キメラ・オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項５】
一本鎖である、請求項１〜４のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項６】
完全に、または部分的に二本鎖である、請求項１〜４のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項７】
前記ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の５’非翻訳領域、開始領域、コード領域、停止領域、もしくは３’非翻訳領域と特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸分子を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項８】
少なくとも１つの化学的に修飾されたヌクレオシド間結合、糖残基、もしくは核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項９】
前記化学的に修飾されたヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアート結合であるオリゴヌクレオチドを含む、請求項８記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１０】
前記化学的に修飾された糖残基が、２’−Ｏ−メトキシメチル置換基を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項８記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１１】
前記化学的に修飾された糖残基が、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、または４’−チオ置換基を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項８記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１２】
前記化学的に修飾された核酸塩基が、シトシンであるオリゴヌクレオチドを含み、前記シトシンが、５−位置でメチル置換基を有する、請求項８記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１３】
一本鎖２０核酸塩基オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜５もしくは７〜１２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩であって、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合であり、５’末端から３’末端に読んでヌクレオチド１〜５および１６〜２０は、２’−Ｏ−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド６〜１５は、２’−デオキシヌクレオチドであり、すべてのシトシン残基は、５−メチル−シトシンである、オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１４】
少なくとも１つのペプチド核酸部分を含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１５】
少なくとも１つのロックされた核酸部分を含む、請求項１〜１２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項１６】
前記化合物の少なくとも１つの末端が平滑である、ｓｉＲＮＡ化合物である請求項１〜１２のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物の少なくとも１つの鎖が、１つまたは複数のオーバーハンギング・ヌクレオシドを含む、ｓｉＲＮＡ化合物である請求項１〜１２のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１８】
オーバーハンギング・ヌクレオシドの数が１〜６である、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
オーバーハンギング・ヌクレオシドまたはヌクレオシドが、デオキシチミジン（ｄＴ）ヌクレオシドである、請求項１７記載の化合物。
【請求項２０】
ナトリウム塩の形態である、請求項１〜１９のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２１】
前記ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子と少なくとも約９５％の相補性を有する、請求項１〜２０のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
こと。
【請求項２２】
配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５１、５２、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１２、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、もしくは１２２の少なくとも８つの核酸塩基部分を含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２３】
配列番号：２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５１、５２、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１０、１１１、１１２、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、および１２２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２４】
すべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオアート結合である、請求項２２もしくは２３記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２５】
５’末端から３’末端に読んでヌクレオチド１〜５および１６〜２０は、２’−Ｏ−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド６〜１５は、２’−デオキシヌクレオチドである、請求項２２もしくは２３記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２６】
すべてのシトシン残基が５−メチルシトシン残基である、請求項２２もしくは２３記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２７】
配列番号：４０もしくは配列番号：９７を含む、請求項２３記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２８】
請求項２２〜２７のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩であって、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合であり、５’末端から３’末端に読んでヌクレオチド１〜５および１６〜２０は、２’−Ｏ−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド６〜１５は、２’−デオキシヌクレオチドであり、すべてのシトシン残基は、５‐メチルシトシンである、オリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項２９】
前記化合物のアンチセンス鎖が、配列番号：２１３、２１５、２１７、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、もしくは３３７の少なくとも８つの核酸塩基部分を含む、請求項１〜２１または２４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項３０】
前記化合物のアンチセンス鎖が、配列番号：２１３、２１５、２１７、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、もしくは３３７を含む、請求項１〜２１または２４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項３１】
前記化合物のアンチセンス鎖が、配列番号３３９〜３９４のうちの１つの少なくとも８つの核酸塩基部分を含む、請求項１〜２１または２４のいずれか一項記載の化合物。
【請求項３２】
ナトリウム塩の形態である、請求項２２〜３１のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩。
【請求項３３】
請求項１〜３２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物もしくはこれらの薬学的に許容される塩と、薬学的または生理的に許容されるキャリア、賦形剤、もしくは希釈液とを含む、薬学的または獣医学的組成物。
【請求項３４】
細胞、組織、または器官におけるｅＩＦ４Ｅの発現を阻害する方法であって、ｅＩＦ４Ｅの発現が阻害されるように、前記細胞、組織、または器官と、前記請求項１〜３２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量とを接触させることを含む方法。
【請求項３５】
ｅＩＦ４Ｅが発現される細胞の増殖を減少する方法であって、前記細胞の増殖が阻害されるように、前記細胞と前記請求項１〜３２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量とを接触させることを含む方法。
【請求項３６】
ｅＩＦ４Ｅ発現もしくは過剰発現と関連する症状または疾患を予防または処置する方法であって、患者に対して請求項１〜３２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
【請求項３７】
前記症状または疾患が、過剰増殖症状または疾患である、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記過剰増殖症状または疾患が、感受性の癌、腫瘍、または異常もしくは不必要な血管形成によって特徴づけられる症状である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ｅＩＦ４Ｅ発現もしくは過剰発現と関連する過剰増殖症状または疾患が、乳癌、頭頚部癌、結直腸癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、卵嚢癌、腎癌、およびグリア芽細胞腫からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
血管形成を予防または減少させる方法であって、患者に対して前記請求項１〜３２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
【請求項４１】
患者における腫瘍成長を予防または減少させる方法であって、患者に対して請求項１〜３２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
【請求項４２】
前記患者が哺乳類である、請求項３６〜４１のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
前記患者がヒトである、請求項３６〜４１のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
配列番号：４０および配列番号：９７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むアンチセンス・オリゴヌクレオチドであって、
すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート結合であり、５’末端から３’末端に読んでヌクレオチド１〜５および１６〜２０は、２’−Ｏ−メトキシメチル糖を含み、ヌクレオチド６〜１５は、２’−デオキシヌクレオチドであり、すべてのシトシン残基は、５−メチルシトシンであり、かつ、
ナトリウム塩の形態である、アンチセンス・オリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記請求項４４記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドと、薬学的または生理的に許容されるキャリア、賦形剤、もしくは希釈液とを含む、薬学的または獣医学的組成物。
【請求項４６】
ｅＩＦ４Ｅ発現もしくは過剰発現と関連する症状を予防または処置する方法であって、患者に対して請求項４４記載のオリゴヌクレオチドの有効な量を投与することを含む方法。
【請求項４７】
前記ｅＩＦ４Ｅ発現または過剰発現と関連する症状が、乳癌、頭頚部癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、卵嚢癌、腎癌、およびグリア芽細胞腫からなる群より選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
血管形成を減少する方法であって、患者に対して請求項４４記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量を投与することを含む方法。
【請求項４９】
細胞、組織、または器官におけるｅＩＦ４Ｅの発現を阻害する方法であって、前記細胞、組織、または器官と、前記請求項４４記載のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の有効な量とを接触させること、およびｅＩＦ４Ｅの発現を阻害することを含む方法。
【請求項５０】
ｅＩＦ４Ｅ発現もしくは過剰発現と関連する症状の予防または処置のための薬物の製造のための、請求項１〜３２のいずれか一項記載のオリゴマー化合物もしくはこれらの薬学的に許容される塩、または請求項４４記載のアンチセンス・オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項５１】
前記化合物が、ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の５’−キャップ領域に特異的にハイブリダイズできるアンチセンス核酸分子を含む、請求項１記載の化合物。
【請求項５２】
少なくとも１つのＰＮＡまたは２’−Ｏ−メトキシメチル部分を有する一本鎖化合物である、請求項５１記載の化合物。
【請求項５３】
均一にＰＮＡまたは均一に２’−Ｏ−メトキシメチルである、請求項５２記載の化合物。
【請求項５４】
配列番号：３９５、３９６、３９７、または３９８の少なくとも８つの核酸塩基部分を含む、請求項５１記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｅＩＦ４Ｅの発現を調整するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、一本鎖または二本鎖アンチセンス化合物、特にｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド化合物に関する。このような化合物は、ｅＩＦ４Ｅの発現を調整することを本明細書において示してある。
【背景技術】
【０００２】
真核生物遺伝子発現は、細胞が広範な異なる条件に迅速に応答することができるように調節されなければならない。ｍＲＮＡ翻訳のプロセスは、遺伝子発現が高度に調節される一つの段階である。ホルモン、成長因子、サイトカイン、および栄養素との反応において、動物細胞は、一般に増殖反応に備えて翻訳を活性化する。タンパク質合成速度は、典型的には、酸化的または浸透圧性ストレス、ＤＮＡ損傷、または栄養素離脱などのストレスの多い条件下において減少する。ｍＲＮＡ翻訳の活性化または抑制は、数分で生じ、このプロセスを通じた制御は、タンパク質合成の開始期に及ぶと考えられる（Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８，２５０７−２５１７；ＳｔｒｕｄｗｉｃｋおよびＢｏｒｄｅｎ，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００２，７０，１０−２２）。
【０００３】
翻訳開始は、いくつかの真核生物の開始因子（ｅＩＦｓ）（古典的には、これらが細胞質に位置すること、およびタンパク質合成の開始期を調節する能力によって定義されたタンパク質）の活性の調整を必要とする。これらの因子の一つ、真核生物開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）（真核生物翻訳開始因子４Ｅ、真核生物翻訳開始因子４Ｅ様１（ｅＩＦ４ＥＬ１）、キャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）、およびメッセンジャーＲＮＡキャップ結合タンパク質としても知られる）は、最初に翻訳に関与する２５ｋＤａのｍＲＮＡキャップ結合タンパク質として単離され（Ｒｙｃｈｌｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８７，８４，９４５−９４９）、以来、最も高度に特徴づけられたｅＩＦｓのうちの一つとなった。ｅＩＦ４Ｅは、その他の開始因子と比較して限られた量が存在し、ｅＩＦ４Ｆ開始複合体の１つの成分であり、また、骨格タンパク質ｅＩＦ４ＧおよびＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａで構成されている。細胞質において、ｅＩＦ４Ｅは、ほとんど全ての成熟細胞ｍＲＮＡに存在する５’末端７−メチルＧｐｐｐＸキャップ構造に対して特異的に結合することにより、キャップ依存的なタンパク質合成の律速段階を触媒し、これは、ｍＲＮＡをｅＩＦ４Ｆ複合体に送達するのに役立つ。一旦結合すると、ｅＩＦ４Ｆ複合体は、キャップの５’から３’末端へ走査して、ｅＩＦ４ＡのＲＮＡヘリカーゼ活性により５’非翻訳の領域（ＵＴＲ）に存在する任意の二次構造を分解し、こうして翻訳開始コドンを明らかにして、ｍＲＮＡに対するリボソームのロードを容易にする（Ｇｒａｆｆら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２００３，２０，２６５−２７３；Ｓｔｒｕｄｗｉｃｋら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００２，７０，１０−２２）。
【０００４】
ｅＩＦ４Ｅ複合体へ組み入れるためのｅＩＦ４Ｅ利用の可能性は、リン酸化を介して、並びに阻害タンパク質の結合を介して調節される。ｅＩＦ４Ｅは、分裂促進因子で活性化されるプロテインキナーゼ相互作用キナーゼＭｎｋ１によってセリン２０９でリン酸化されるリンタンパク質である（Ｆｌｙｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９５，２７０，２１６８４−２１６８８；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，９３７３−９３７７；およびＷａｓｋｉｅｗｉｃｚら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，１９９７，１６，１９０９−１９２０）。ｅＩＦ４Ｅのリン酸化は、ｍＲＮＡキャップに対するその親和性を増大し、したがって、翻訳速度を上昇させる（Ｗａｓｋｉｅｗｉｃｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９，１９  １８７１−１８８０）。ホルボールエステル、細胞ストレス、およびサイトカインによるｅＩＦ４Ｅのリン酸化の増大は、ｐ３８分裂促進因子−活性化（ＭＡＰ）キナーゼおよび／またはＥｒｋシグナリング経路を含み、これが次々にＭｎｋ１活性を刺激する。熱ショック、ソルビトール、および過酸化水素などのその他のストレスは、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼを刺激し、Ｍｎｋ１活性を増大するが、しかし、これらの刺激は、ｅＩＦ４Ｅ結合タンパク質１（４Ｅ−ＢＰ１）に対するｅＩＦ４Ｅの結合を増大する（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，９３７３−９３７７）。ｅＩＦ４Ｅに対する４Ｅ−ＢＰ１の結合は、Ｍｎｋ１によるｅＩＦ４Ｅのリン酸化をブロックする（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，２７３，９３７３−９３７７）。４Ｅ結合タンパク質１および２は、ｅＩＦ４Ｅの背面に対する結合に関して、ｅＩＦ４Ｇと競合することによって有効な翻訳阻害剤として作用する（Ｐｔｕｓｈｋｉｎａら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，１９９９，１８，４０６８−４０７５）。ＭＴＯＲによる結合タンパク質のリン酸化は、これらのｅＩＦ４Ｅからの分離を引き起こして、ｅＩＦ４Ｅ活性が可能になる。
【０００５】
ますます多くの観察により、翻訳因子が、核に、並びに細胞質に局在化して機能することを示唆する。転写および翻訳は、伝統的に、真核生物においては、空間的に分離されていると考えられるが；しかし、対になった転写とび翻訳が、哺乳動物細胞の核において観察される（Ｉｂｏｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３，１１３９〜１１４２）。一部分のｅＩＦ４Ｅは、核に局在化し、この翻訳因子が、核における翻訳を通じて、その制御の一部を示し得ることを示唆している（Ｌｅｊｂｋｏｗｉｃｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，６１２−９６１６）。ｅＩＦ４Ｅは、核細胞質輸送タンパク質ｅＩＦ４Ｅ−輸送体（４Ｅ−Ｔ）によって、インポルチンα／β経路を介して核に輸入される（Ｄｏｓｔｉｅら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，２０００，１９，３１４２−３１５６）。核において、ｅＩＦ４Ｅは、哺乳類細胞増殖およびアポトーシスの重要な調節因子である前骨髄球性白血病タンパク質（ＰＭＬ）に直接結合することができる（Ｃｏｈｅｎら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，２００１，２０，４５４７−４５５９）。ＰＭＬは、そのＲＩＮＧドメインを介して、ｍＲＮＡの５’キャップに対するその親和性を非常に減少させることによって、ｅＩＦ４Ｅ活性を調整する（Ｃｏｈｅｎら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，２００１，２０，４５４７−４５５９）。
【０００６】
過剰のｅＩＦ４Ｅにより、全体的な高い翻訳速度に至ることはなく、むしろ選択的に、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子（ＯＤＣ）、およびサイクリンＤ１などの増殖刺激因子を含むｅＩＦ４Ｅ感受性のものとして分類されるｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の合成を増大する（Ｋｅｖｉｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，６５，７８５−７９０；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，９８，７７−８２；およびＳｈａｎｔｚら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９４，５４，２３１３−２３１６）。ＯＤＣおよびＶＥＧＦタンパク質レベルは、翻訳開始の増大を介して上昇される一方で、サイクリンＤ１レベルは、細胞質へのサイクリンＤ１  ｍＲＮＡの多量の輸送によって上昇する（Ｋｅｖｉｌら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９６，６５，７８５−７９０；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，９８，７７−８２；Ｒｏｕｓｓｅａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，１０６５−１０７０）。従って、翻訳開始における役割を有することに加えて、ｅＩＦ４Ｅは、ｍＲＮＡ核原形質の輸送にも影響を及ぼすことができる。
【０００７】
ｅＩＦ４Ｅの機能は、全体的な細胞タンパク質合成および増殖に必須な決定因子である（Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１，５４３５−５４４５）。正常細胞において、ｅＩＦ４Ｅは、限られた量が存在し、これが翻訳を制限する。細胞の増殖および生存のために必要なタンパク質をコードするｍＲＮＡは、典型的には複雑な高度に構築された５’ＵＴＲを含み、これらのｍＲＮＡを翻訳に関して乏しい基質にしてしまう。しかし、これらのｍＲＮＡの多くは、過剰なｅＩＦ４Ｅの存在下では十分に翻訳され、さらに腫瘍によってもアップレギュレートされる（ＧｒａｆｆおよびＺｉｍｍｅｒ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２００３，２０，２６５−２７３）。また、上皮肺腫瘍細胞株を含むいくつかの分化している細胞株において、ｅＩＦ４Ｅのレベルの増大が見いだされるため、細胞分化に関連したｍＲＮＡの翻訳は、ｅＩＦ４Ｅによって増強される可能性がある（Ｗａｌｓｈら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２００３，７１，１２６−１３４）。
【０００８】
ｅＩＦ４Ｅの過剰発現は、多くのヒト癌および癌由来細胞株において報告されており、さらに細胞の腫瘍化転換および動物モデルにおける浸潤性／転移性表現型を生じる。形質転換されていない、培養細胞とは異なり、形質転換された細胞株は、血清成長因子の存在とは無関係にｅＩＦ４Ｅを発現する（Ｒｏｓｅｎｗａｌｄ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，９８，７７−８２）。過剰のｅＩＦ４Ｅは、ＨｅＬａ細胞において異常増殖および新生物の形態を引き起こし、更に足場非依存的な増殖、培養における形質転換された病巣の形成、およびヌードマウスにおける腫瘍形成によって判断される、ＮＩＨ  ３Ｔ３およびＲａｔ２線維芽細胞の腫瘍化を生じさせる（Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７，８２１２−８２１６；およびＬａｚａｒｉｓ−Ｋａｒａｔｚａｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４５，５４４−５４７）。さらにまた、ｅＩＦ４Ｅを過剰発現する細胞によって示される腫瘍性形質転換は、ＯＤＣの翻訳の増大と関連する（Ｌａｚａｒｉｓ−Ｋａｒａｔｚａｓら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４５，５４４−５４７）。加えて、ｅＩＦ４Ｅ発現の増大と関連するサイクリンＤ１の核外移行の上昇は、形質転換活性に直接結びついている（Ｃｏｈｅｎら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．，２００１，２０，４５４７−４５５９）。これらの知見は、過剰に存在するときは、ｅＩＦ４Ｅが増殖調節ｍＲＮＡの発現または核外移行を増大することができることを実証する。結果として、影響を受けた細胞は、正常な増殖制御メカニズムに非依存的に増殖することができる。ｓｒｃチロシンキナーゼ腫瘍性タンパク質を形質転換した細胞では、ｅＩＦ４Ｅリン酸化の増強が観察されており、ｅＩＦ４Ｅ活性の上昇が、過剰発現に加えて、形質転換された細胞における増殖調節の減少に寄与することを示唆している（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１，２８９６−２９００）。
【０００９】
ｅＩＦ４Ｅは、非ホジキンリンパ腫、結腸腺腫、癌腫、並びに喉頭癌、頭頸部癌、前立腺癌、乳癌、および膀胱癌を含むが、これらに限定されないいくつかのヒト癌において上昇が見いだされる（Ｃｒｅｗら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０００，８２，１６１−１６６；Ｇｒａｆｆら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２００３，２０，２６５−２７３；Ｈａｙｄｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ，２０００，８８，２８０３−２８１０；Ｋｅｒｅｋａｔｔｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，６４，２７−３１；Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８，２５０７−２５１７；Ｗａｎｇら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１９９９，１５５，２４７−２５５）。ｅＩＦ４Ｅのアップレギュレーションは、結腸発癌における初期のイベントであり、サイクリンＤ１レベルの増加を伴うことが多い（Ｒｏｓｅｎｗａｌｄら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９９，１８，２５０７−２５１７）。また、過剰のｅＩＦ４Ｅは、頭頸部癌腫の腫瘍再発の信頼できる判断材料であり、浸潤性膀胱癌腫において選択的にアップレギュレートされ、喉頭扁平上皮癌における乏しい組織学的段階およびより高度な転移状態と相関している（Ｃｒｅｗら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２０００，８２，１６１−１６６；Ｌｉａｎｇら、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，２００３，１１３，１２３８−１２４３；およびＮａｔｈａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９７，１５，５７９−５８４）。これらの知見は、ｅＩＦ４Ｅの高いレベルが癌の進行、並びに開始に関与することを示唆する。
【００１０】
ｅＩＦ４Ｅ発現および活性の阻害は、アンチセンス機構の使用を介して達成された。３’−オーバーハンギング・ヌクレオチドを備えたアンチセンス・オリゴヌクレオチドは、５’−キャップされたオリゴリボヌクレオチドに対するｅＩＦ４Ｅの結合を調整する（Ｂａｋｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，１１４９５−１１４９９）。ｅＩＦ４Ｅの翻訳開始領域の２０ヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを発現するように設計されたエピソーム・ベクターのＨｅＬａ細胞への導入により、ｅＩＦ４Ｅのレベルが減少し、同時に細胞増殖およびタンパク質合成の速度を減少させ、ｅＩＦ４Ｅが細胞増殖に必要とされることを実証する（Ｂｏｍｍｅｒら、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．，１９９４，４０，６３３−６４１；Ｄｅ  Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，１１，５４３５−５４４５）。ｅＩＦ４Ｆ複合体の骨格タンパク質成分のｅＩＦ４Ｇのレベルも減少される。ｅＩＦ４Ｅ阻害に続く翻訳レベルの減少にもかかわらず、一定のタンパク質が合成され続け、これらの多くが、ストレス誘導性または熱ショックタンパク質として同定された（Ｊｏｓｈｉ−Ｂａｒｖｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，２１０３８−２１０４３）。同じベクターが、ラット胚線維芽細胞においても５０〜６０パーセントまでｅＩＦ４Ｅを減少し、これらの細胞のｒａｓを媒介した形質転換および腫瘍形成を阻害するために十分である（Ｇｒａｆｆら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９５，６０，２５５−２６３；Ｒｉｎｋｅｒ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９３，５５，８４１−８４７）。さらに、ＯＤＣ翻訳およびポリアミン輸送も減少し、この観察は、ｒａｓで誘導される悪性化、ｅＩＦ４Ｅ活性、およびポリアミン代謝の間の関連を提供する（Ｇｒａｆｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９７，２４０，１５−２０）。ｅＩＦ４Ｅアンチセンス・ベクターでの乳癌株および頭頸部扁平上皮癌細胞株の安定な形質転換により、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）の発現の減少、並びにマウスにおける細胞の腫瘍化および血管形成能の阻害を生じ、腫瘍血管新生におけるｅＩＦ４Ｅの思いがけない役割を示唆している（ＤｅＦａｔｔａら、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，２０００，１１０，９２８−９３３；Ｎａｔｈａｎら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９７，１５，１０８７−１０９４）。
【００１１】
若い成虫に注射された小さな干渉ＲＮＡによるヒトｅＩＦ４Ｅの線虫相同体、ＩＦＥ−３のターゲットされた不活性化は、子孫の１００％において胎児死亡を引き起こす（Ｋｅｉｐｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５，１０５９０−１０５９６）。また、ｅＩＦ４Ｅにターゲットされる小干渉二本鎖ＲＮＡは、ｅＩＦ４Ｅ制御の欠如が細胞形質転換に関与することを明らかにした。ヒトｅＩＦ４Ｅの一部のコード領域にターゲットされる遺伝子特異的な２１ヌクレオチドの小干渉ＲＮＡを使用したｅＩＦ４Ｅの機能的な不活性化により、悪性胆管細胞の足場非依存的な増殖（形質転換された細胞に付随する表現型）の有意な減少を生じる。加えて、悪性胆管細胞におけるｅＩＦ４Ｅのリン酸化は、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ・シグナリングに依存的であり、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ・シグナリングと胆管癌増殖進行におけるタンパク質合成の制御との間の結びつきを実証している（Ｙａｍａｇｉｗａら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００３，３８，１５８−１６６）。
【００１２】
ｅＩＦ４Ｅ活性の阻害が細胞の腫瘍化の可能性を減少することのさらなる証拠は、ｅＩＦ４Ｅ阻害剤４ＥＢＰ−１の恒常的に活性な形態を発現する乳癌細胞において見られ、サイクリンＤ１のダウンレギュレーションおよびサイクリン依存的キナーゼｐ２７Ｋｉｐ１のアップレギュレーションに付随して細胞周期停止に至る（Ｊｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．，２００３，３，２）。ｅＩＦ４Ｅレベルが正常組織におけるよりも有意に高い胃腸癌における４Ｅ−ＢＰ１の過剰発現は、遠隔転移の減少と関連がある（Ｍａｒｔｉｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０００，３２，６３３−６４２）。
【００１３】
米国特許第５，６４６，００９号は、１つのＤＮＡセグメントがｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４Ｅ因子、またはこれらの変異体からなるキャップ結合タンパク質をコードするハイブリッド・ベクターを請求し、開示する。また、この特許は、ヒトｅＩＦ４Ｅをコードする核酸配列を開示する。
【００１４】
癌細胞に対して、その発現を制御するプロモータに関して３’から５’配向にヒトｅＩＦ４Ｅを含む群より選択される遺伝子のコード配列の少なくとも１２ヌクレオチドを含むアンチセンス構築物を投与することによって患者の癌を治療するための方法が、米国特許第６，１７１，７９８号に開示されている。
【００１５】
米国特許第６，５９６，８５４号は、ヒトｅＩＦ４Ｅの変異体をコードする単離された核酸分子であって、前記変異体が、アミノ酸１１２および１１４−１２１、または位置１１８もしくは位置１１９、または位置１１５または位置１２１の領域にアミノ酸置換を有する核酸分子を主張し、開示する。
【００１６】
欧州の公開特許公報第１  ０３３  ４０１号および日本国の公開特許公報第２００１２６９１８２号は、ヒトｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の一部を含むＥＳＴ関連配列の群から選択される配列の少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む精製された核酸を主張する。また、これらの刊行物は、遺伝子治療に使用するためのアンチセンス構築物およびオリゴヌクレオチドの調製並びに使用を開示する。
【００１７】
ＰＣＴ刊行物国際公開公報第０１／９６３８８号および国際公開公報第０１／９６３８９号は、以下から選択される配列を含む単離されたポリヌクレオチドを開示し、および請求する：ヒトｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子を含む配列表に提供された配列、配列の相補物、配列の少なくとも２０個の隣接する残基からなる配列、配列にハイブリダイズする配列、または配列に少なくとも７５％もしくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を開示する。また、この刊行物は、患者に対して請求されたポリヌクレオチドの組成物を投与することを含む、患者における癌の治療のための方法を請求する。
【００１８】
ＰＣＴ刊行物国際公開公報第０３／０３９４４３号は、ヒトｅＩＦ４Ｅ核酸分子を含む群より選択されるマーカーに対応するタンパク質をコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス・オリゴヌクレオチド相補物を薬学的化合物と混合することを特徴とする、白血病の治療のための薬学的組成物の調製のための方法を主張し、開示する。
【００１９】
米国付与前公開（Ｕ．Ｓ．ｐｒｅ−ｇｒａｎｔ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第２００３００８７８５２号は、ｅＩＦ４ＥアンチセンスｍＲＮＡをコードするプラスミドおよびこのプラスミドでトランスフェクトされた培養マウス細胞を開示する。
【００２０】
ｅＩＦ４Ｅを含む、本発明の核酸配列もしくはタンパク質の発現を減少し、またはなくすために使用してもよいアンチセンス分子が、米国プレ研究費刊行物第２００３０１４４１９０号に開示されている。また、ｅＩＦ４ＥアンチセンスｍＲＮＡおよびこのプラスミドを恒常的に発現するプラスミドをコードする培養ラット線維芽細胞も開示されている。
【００２１】
多くの疾患におけるｅＩＦ４Ｅ関与の結果として、効率的にｅＩＦ４Ｅを調節することができるさらなる薬剤の必要が長く感じられたままである。したがって、ｅＩＦ４Ｅ発現のアップレギュレーションがこのように多くの異なるタイプの癌と関連していることを考えると、阻害は、特に癌の治療で重要である。
【００２２】
アンチセンス技術は、特異的な遺伝子産物の発現を減少させるための有効な手段であり、多くの治療的、診断的、および研究的適用において独特に有用であることが証明されてきた。本発明は、ｅＩＦ４Ｅ発現を調整するための組成物および方法を提供する。
【発明の開示】
【００２３】
発明の概要
本発明は、ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子にターゲットされ、かつｅＩＦ４Ｅの発現を阻害するアンチセンス化合物およびこれらの薬学的に許容される塩などのオリゴマー化合物に向けられる。オリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ様またはＤＮＡ様のオリゴマー化合物であってもよい。オリゴマー化合物は、一本鎖または部分的に、もしくは完全に二本鎖オリゴマー化合物であってもよく、化学的に修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。また、これらの化合物を含む薬学的組成物およびその他の組成物も提供される。
【００２４】
ｅＩＦ４Ｅのモジュレーターをスクリーニングする方法、および細胞、組織、または動物におけるｅＩＦ４Ｅの発現を調整する方法であって、前記細胞、組織、または動物を本発明の化合物または組成物のうちの１つもしくは複数と接触させることを含む方法がさらに提供される。また、動物、特にヒトを治療する方法も本明細書に記載される。このような方法は、本発明の化合物または組成物の１つもしくは複数の治療的または予防的に有効な量を投与することを含む。
【００２５】
発明の詳細な説明
Ａ．  本発明の概要
本発明は、ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の機能または効果を調整するために使用するための、アンチセンス化合物、一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチド、および同様の種などのオリゴマー化合物を使用する。これは、ｅＩＦ４Ｅをコードする１つまたは複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴマー化合物を提供することによって達成される。本明細書に使用される「標的核酸」および「ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子」という用語は、便宜上、ｅＩＦ４ＥをコードするＤＮＡ、このようなＤＮＡから転写されるＲＮＡ（これらのプレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡまたは一部を含む）、更にはこのようなＲＮＡに由来するｃＤＮＡを包含するために使用した。これにハイブリダイズする化合物による、この標的核酸の機能の調整は、一般に「アンチセンス」といわれている。
【００２６】
干渉されるＤＮＡの機能は、複製および転写を含むことができる。複製および転写は、たとえば内因性細胞テンプレート、ベクター、プラスミド構築物、またはその他に由来することができる。干渉されるＲＮＡの機能は、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位置、ＲＮＡ合成部位から遠く離れた細胞内部位へのＲＮＡの転位置、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、およびＲＮＡに関与し、またはＲＮＡによって容易にされ得る、ＲＮＡに関与する触媒活性または複合体形成などの機能を含むことができる。標的核酸機能とのこのような干渉の１つの結果は、ｅＩＦ４Ｅの発現の調整である。本発明の状況において、「調整」および「発現の調整」は、遺伝子をコードする核酸分子、たとえばＤＮＡもしくはＲＮＡの量またはレベルの増大（刺激）または減少（阻害）のいずれかを意味する。阻害は、発現の調整の１つの形態であり、たいていｍＲＮＡが標的核酸となる。
【００２７】
本発明の状況において、「ハイブリダイゼーション」は、実質的にオリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の１つの機構は、水素結合を含み、これは、オリゴマー化合物の鎖の相補ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間のワトソン−クリック、フーグスティーン型、または逆フーグスティーン型水素結合であってもよい。たとえば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を介して対になる相補核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、いろいろな状況下で生じさせることができる。
【００２８】
アンチセンス化合物は、標的核酸に対する化合物の結合が、標的核酸の正常機能を妨害して活性の減少を生じさせるときに、「特異的にハイブリダイズ可能」であり、特異的な結合が要求される条件下で、すなわちインビボアッセイ法または治療的処置の場合には生理学的条件下で、およびインビトロでのアッセイ法の場合にはアッセイ法が行われる条件下で、非標的核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合を回避するために十分な程度の相補性がある。
【００２９】
本発明において、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という句は、本発明の化合物がその標的配列にハイブリダイズするが、その他の配列の最小数にしかハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なり、本発明の状況において、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする状態での「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成並びにこれらが調査されるアッセイ法によって決定される。一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、Ｎａ＋＋またはＫ＋＋などの無機カチオンとの低濃度（＜０．１５Ｍ）の塩（すなわち低イオン強度）、オリゴマー化合物：標的配列複合体のＴｍ以下の２０℃〜２５℃より高い温度、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、または洗浄剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの変性剤の存在を含む。たとえば、ハイブリダイゼーション率は、それぞれ１％のホルムアミドについて１．１％減少する。高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、０．１×塩化ナトリウム−クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳＳＣ）／０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、６０℃で３０分間である。
【００３０】
本明細書に使用される「相補的」は、１つまたは２つのオリゴマー鎖上の２つの核酸塩基間で正確に対形成する能力をいう。たとえば、アンチセンス化合物の一定の位置の核酸塩基が、標的核酸の一定の位置において核酸塩基と水素結合することができる場合（前記標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子である）、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は、相補的位置であると考えられる。オリゴマー化合物、およびさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子は、それぞれの分子中の相補的位置において十分な数が核酸塩基によって占められており、これらが互いに水素結合することができるときは、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能な」および「相補的」は、オリゴマー化合物と標的核酸との間で安定かつ特異的な結合が生じるように、十分な数の核酸塩基にわたる正確な対形成または十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。
【００３１】
オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸に対して１００％相補的である必要はないことが当技術分野において理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメント（たとえば、ループ構造、ミスマッチ、またはヘアピン構造）がハイブリダイゼーションイベントに関与しないように、１つまたは複数のセグメントにわたってハイブリダイズしてもよい。本発明のオリゴマー化合物は、これらがターゲットされる標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の配列相補性を含む。たとえば、アンチセンス化合物の２０核酸塩基のうちの１８個が、標的領域に対して相補的であり、従って特異的にハイブリダイズするアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を示す。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、相補核酸塩基とクラスターを形成するか、または点在していてもよく、互いに、もしくは相補核酸塩基に隣接する必要はない。したがって、標的核酸と完全に相補的な２つの領域に隣接する４つの非相補的核酸塩基を有する長さが１８核酸塩基であるアンチセンス化合物は、標的核酸と７７．８％の全体的相補性を有し、したがって、本発明の範囲内に入る。標的核酸の領域とのアンチセンス化合物のパーセント相補性は、当技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム（塩基の局部的整列検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用してルーチンで決定することができる。パーセント相同性、配列同一性、または相補性は、たとえば、デフォルト設定を使用して、ＳｍｉｔｈおよびＷａｒｗｅｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）を使用するギャップ・プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）によって決定することができる。
【００３２】
また、本発明のオリゴマー化合物は、化合物のヌクレオチド位置の１つまたは複数に異なる塩基が存在する変異体を含む。たとえば、第１のヌクレオチドがアデノシンである場合、この位置にチミジン、グアノシン、またはシチジンを含む変異体を作製してもよい。これは、アンチセンス化合物の任意の位置で行ってもよい。次いで、これらの化合物をこれらがｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの発現を阻害する能力を決定するための本明細書に記載されている方法を使用して試験する。
【００３３】
いくつかの態様において、アンチセンス化合物と標的との間の相同性、配列同一性、または相補性は、約５０％〜約６０％である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約６０％〜約７０％である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約７０％〜約８０％である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約８０％〜約９０％である。一部の態様において、相同性、配列同一性、または相補性は、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％である。
【００３４】
Ｂ．  本発明の化合物
本発明の状況において、「オリゴマー化合物」という用語は、核酸分子の領域にハイブリダイズすることができる重合体構造をいう。この用語は、これらのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド擬態、およびキメラ組み合わせを含む。オリゴマー化合物は、通常直線状に調製されるが、環状に連結すること、またはさもなければ調製することができ、また分枝を含んでいてもよい。オリゴマー化合物は、たとえば、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成する２つの鎖、または十分な自己相補性をもち、完全に、もしくは部分的に二本鎖化合物のハイブリダイゼーションおよび形成が可能な一本鎖などの二本鎖構築物を含むことができる。本発明の一つの態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）を包含する。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という用語は、第１および第２の鎖を有する二本鎖化合物として定義され、前記第１と第２の鎖の間の中心的相補的部分と、任意に前記第１と第２の鎖の間に、または標的ｍＲＮＡと相補である末端部とを含む。それぞれの鎖は、約８〜約８０核酸塩基の長さ、１０〜５０核酸塩基の長さ、１２もしくは１３〜３０核酸塩基の長さ、１２もしくは１３〜２４核酸塩基の長さ、または１９〜２３核酸塩基の長さであってもよい。中心的相補的部分は、約８〜約８０核酸塩基の長さ、１０〜５０核酸塩基の長さ、１２もしくは１３〜３０核酸塩基の長さ、１２もしくは１３〜２４核酸塩基の長さ、または１９〜２３核酸塩基の長さであってもよい。末端部は、１〜６核酸塩基の長さであることができる。また、ｓｉＲＮＡｓは、末端部を有していなくてもよい。ｓｉＲＮＡの２本の鎖は、内部に３’もしくは５’末端を残したままで連結することができ、または連続的なヘアピン構造もしくはループを形成するように連結することができる。ヘアピン構造は、５’または３’末端のいずれかに一本鎖文字の伸張を生じるオーバーハングを含んでいてもよい。
【００３５】
本発明の一つの態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、標準的ｓｉＲＮＡｓである。本明細書に使用される「標準的ｓｉＲＮＡ」という用語は、それぞれの鎖が２１核酸塩基の長さであって、鎖が１９核酸塩基にわたって相補的である第１の鎖および第２の鎖を有し、かつそれぞれの鎖のそれぞれの３’末端に、二本鎖化合物において３’オーバーハングとして作用するデオキシチミジンダイマー（ｄＴｄＴ）を有する二本鎖オリゴマー化合物として定義される。
【００３６】
もう一つの態様において、二本鎖アンチセンス化合物は、平滑末端化されたｓｉＲＮＡｓである。本明細書に使用される、「平滑末端化されたｓｉＲＮＡ」という用語は、末端オーバーハングを有さないｓｉＲＮＡとして定義される。すなわち、二本鎖化合物の少なくとも１つの末端は、平滑である。ｓｉＲＮＡｓは、標準的または平滑であるかにかかわらず、ｄｓＲＮＡｓｅ酵素を導いて、ＲＮＡｉアンチセンス機構の動員または活性化をトリガーするように作用する。さらなる態様において、ＲＮＡｉアンチセンス機構を経て作用する一本鎖ＲＮＡｉ（ｓｓＲＮＡｉ）化合物も想定される。
【００３７】
二本鎖化合物に対してさらなる修飾を行うことができ、末端のうちの１つに、選択された核酸塩基位置、糖位置、またはヌクレオシド間結合のうちの１つに付着された抱合基を含んでもよい。あるいは、２つの鎖を非核酸部分またはリンカー基を経て連結することができる。１本の鎖だけから形成されるときは、ｄｓＲＮＡは、自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成することができる。従って、ｄｓＲＮＡは、完全に、または部分的に二本鎖であることができる。２本の鎖、または自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成する１本の鎖から形成されるときは、２本の鎖（または１本の鎖の二重鎖形成領域）は、ワトソン−クリック法で塩基対形成する相補的ＲＮＡ鎖である。
【００３８】
本発明によれば、「アンチセンス化合物」は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、ｓｉＲＮＡ化合物などの一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、および少なくとも標的核酸の一部にハイブリダイズし、その機能を調整するその他のオリゴマー化合物を含む。したがって、これらは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ様、ＲＮＡ様、もしくはこれらの混合物であってもよく、またはこれらの１つもしくは複数の擬態であってもよい。これらの化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、またはヘアピンオリゴマー化合物であってもよく、および内部または末端隆起、ミスマッチ、またはループなどの構造エレメントを含んでもよい。アンチセンス化合物は、通常直鎖状に調製されるが、環状および／または分枝状に連結すること、またはさもなければ調製することができる。アンチセンス化合物は、たとえば、ハイブリダイズして、完全に、もしくは部分的に二本鎖化合物を形成する２本の鎖、または完全に、もしくは部分的に二本鎖化合物のハイブリダイゼーションおよび形成が可能な十分な自己相補性を有する一本鎖などの構築物を含むことができる。２本の鎖は、内部に３’もしくは５’末端を残したままで連結することができ、または連続的なヘアピン構造もしくはループを形成するように連結することができる。ヘアピン構造は、５’または３’末端のいずれかに一本鎖文字の伸張を生じるオーバーハングを含んでいてもよい。二本鎖化合物は、任意に末端上にオーバーハングを含むことができる。さらなる修飾は、末端のうちの一方に、選択された核酸塩基位置、糖位置、またはヌクレオシド間結合のうちの一方に付着された抱合基を含むことができる。あるいは、２つの鎖は、非核酸部分またはリンカー基を経て連結することができる。１本の鎖だけから形成されるときは、ｄｓＲＮＡは、自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成することができる。従って、ｄｓＲＮＡは、完全に、または部分的に二本鎖であることができる。遺伝子発現の特異的な阻害は、トランスジェニック細胞株におけるｄｓＲＮＡヘアピンの安定な発現によって達成することができる（Ｈａｍｍｏｎｄら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９１，２，１１０−１１９；Ｍａｔｚｋｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，２００１，１１，２２１−２２７；Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００１，１５，４８５−４９０）。２本の鎖、または自己相補的なヘアピン型分子の形態をとって、それ自体が戻って二重になって二重鎖を形成する１本の鎖から形成されるときは、２本の鎖（または１本の鎖の二重鎖形成領域）は、ワトソン−クリック法で塩基対形成する相補的ＲＮＡ鎖である。
【００３９】
一旦系に導入されると、本発明の化合物は、１つもしくは複数の酵素または構造タンパク質の作用を導き出して、標的核酸の切断もしくはその他の修飾を行ってもよく、または占有に基づいた機構を経て作用してもよい。一般に、核酸（オリゴヌクレオチドを含む）は、「ＤＮＡ様」（すなわち、一般に１つまたは複数の２’−デオキシ糖、および一般にＵよりもむしろＴ塩基を有する）または「ＲＮＡ様」のもの（すなわち、一般に１つまたは複数の２’−ヒドロキシルまたは２’−修飾された糖、および一般にＴよりもむしろＵ塩基を有する）として記載され得る。核酸ヘリックスは、複数の型の構造、最も一般的にはＡおよびＢ型構造を採用することができる。一般に、Ｂ型様構造の構造を有するオリゴヌクレオチドは、「ＤＮＡ様」であり、Ａ型様構造を有するものは、「ＲＮＡ様」と考えられる。いくつかの（キメラ）態様において、アンチセンス化合物は、ＡおよびＢ型領域の両方を含んでいてもよい。
【００４０】
標的核酸を修飾する酵素の一つの例は、ＲＮＡｓｅ  Ｈ（ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼ）である。当技術分野において、約３または４つの連続した核酸塩基よりも長い「ＤＮＡ様」領域（たとえば、２’−デオキシ領域）を含む一本鎖アンチセンス化合物は、ＲＮＡｓｅ  Ｈを動員することができることが公知である。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性化により、ＲＮＡ標的の切断を生じ、これによりオリゴヌクレオチドを媒介した遺伝子発現の阻害の効率が非常に増強する。近年、ｄｓＲＮＡｓｅは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）プロセスにおいて観察されるＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖の切断に関与するという仮説がなされた。
【００４１】
アンチセンス化合物の１つの十分に受け入れられた形態は、一本鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドであるが、その他の状況において、二重鎖ＲＮＡまたはこれらの類似体も有用である。多くの種において、二重鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）分子などの二本鎖建造物の導入は、機能の強力かつ特異的な、遺伝子またはその関連する遺伝子産物のアンチセンスを媒介した減少を誘導することが示された。この現象は、植物および動物の両方において生じ、進化的にウイルスの防御およびトランスポゾン・サイレンシングと関連を有すると考えられている（Ｇｕｏら、Ｃｅｌｌ，１９９５，８１，６１１−６２０；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２−１５５０７）。二重鎖ＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）に対する曝露によって生じる線虫において定義される転写後アンチセンス機構は、それ以来ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称された。この用語は、内因性のターゲットされたｍＲＮＡレベルの配列特異的な減少を生じるｄｓＲＮＡの導入を含むアンチセンスを媒介した遺伝子サイレンシングを意味するように一般化された（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６−８１１）。ＲＮＡｉ化合物は、短い干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡｓと称されることが多い。近年では、これが、実際に、ＲＮＡｉの強力な誘導因子であるｄｓＲＮＡのアンチセンスポラリティーの一本鎖ＲＮＡオリゴマーであることが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４−６９７）。ＲＮＡｉ化合物（すなわち、一本鎖もしくは二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様化合物）および一本鎖ＲＮａｓｅ  Ｈ依存的アンチセンス化合物は両方とも、塩基対形成（すなわち、ハイブリダイゼーション）によってこれらのＲＮＡターゲットに結合して、特異的ＲＮＡｓｅｓによる標的ＲＮＡの部位特異的切断を誘導する；すなわち、両方ともアンチセンス機構を経て作用する。Ｖｉｃｋｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８，７１０８−７１１８。
【００４２】
本発明の状況において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）および／またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーもしくは重合体、またはこれらの擬態、キメラ、類似体、または相同体をいう。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖および共有結合ヌクレオシド間（バックボーン）結合、並びに同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドを含む。このような修飾されたか、または置換されたオリゴヌクレオチドは、たとえば、細胞取り込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増大などの望ましい性質のため、天然の形態以上に望まれることが多い。
【００４３】
本発明に従ったアンチセンス化合物は、約８〜約８０核酸塩基の長さのアンチセンス部分（すなわち約８〜約８０の連結されたヌクレオシド）を含む。これは、アンチセンス鎖の全長またはアンチセンス化合物の一部をいう。言い換えると、本発明の一本鎖アンチセンス化合物は、８〜約８０核酸塩基を含み、本発明の二本鎖アンチセンス化合物（たとえば、ｄｓＲＮＡなど）は、８〜約８０核酸塩基の長さのアンチセンス鎖または一部を含む。当業者であれば、これが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、もしくは８０核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を含むことを理解するであろう。
【００４４】
一つの態様において、本発明のアンチセンス化合物は、１０〜５０核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、もしくは５０核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
【００４５】
一つの態様において、本発明のアンチセンス化合物は、１２または１３〜３０核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
【００４６】
一部の態様において、本発明のアンチセンス化合物は、１２または１３〜２４核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４の核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
【００４７】
一部の態様において、本発明のアンチセンス化合物は、１９〜２３核酸塩基の長さのアンチセンス部分を有する。当業者であれば、これが１９、２０、２１、２２、もしくは２３核酸塩基の長さ、またはその中のいずれかの範囲のアンチセンス部分を有するアンチセンス化合物を含むことを理解するであろう。
【００４８】
例示したアンチセンス化合物から選択される少なくとも８つの連続した核酸塩基のひと配列を含む長さのアンチセンス化合物８〜８０核酸塩基も、同様に適切なアンチセンス化合物であると考えられる。
【００４９】
例示的な化合物は、例示のアンチセンス化合物のうちの１つの５’末端から少なくとも８つの連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列を含む（残りの核酸塩基は、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズ可能な、アンチセンス化合物の５’末端のすぐ上流で開始し、オリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含むまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続したひと配列である）。その他の化合物は、例示のアンチセンス化合物のうちの１つの３’末端から少なくとも８つの連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列によって表される（残りの核酸塩基は、標的核酸に対して特異的にハイブリダイズ可能な、アンチセンス化合物の３’末端のすぐ下流で開始し、オリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含むまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続したひと配列である）。また、化合物は、例示の化合物の配列の内部部分からの少なくとも８つの連続した核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列によって表されてもよく、オリゴヌクレオチドが約８〜８０核酸塩基を含むまで、一方向または両方向に伸長してもよいことが理解される。
【００５０】
本発明のオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、核酸塩基配列５’−ＡＧＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＡＧＡＴＣＧＡＴ−３’（配列番号：４５４）または５’−ＡＧＵＣＧＣＣＡＵＣＵＵＡＧＡＵＣＧＡＵ−３’（配列番号：４５５）を含まないことに留意すべきである。  さらに、本発明によって包含されるオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩は、本明細書に開示された特定のヌクレオチド配列からなり、本質的になり、または含むことができる。「本質的になる」、「本質的になっている」等の句は、本発明によって包含されるオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩に適用されるときは、本明細書に開示したものなどのヌクレオチド配列をいうが、これは、さらなるヌクレオチド（本明細書において論議したリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれらの類似体もしくは誘導体）を含む。しかし、このようなさらなるヌクレオチドは、本明細書に開示された対応するオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩に対応するパラメーターと比較して、ｅＩＦ４Ｅ遺伝子発現またはＲＮＡ機能（これらの分子の特定の定量的効果を含む）を調整し、減弱し、もしくは阻害する際に、これらのオリゴマー化合物またはこれらの薬学的に許容される塩の塩基性および新規の特徴に著しい影響を及ぼさない。
【００５１】
本明細書に例示されたアンチセンス化合物を備えている当業者であれば、過度の実験なしで、さらにアンチセンス化合物を同定することができるであろう。
【００５２】
Ｃ．  本発明の標的
特定の核酸分子にオリゴマー化合物を「ターゲットする」ことは、本発明の状況において、多段階プロセスであることができる。本プロセスは、通常、その機能が調整される標的核酸を同定することから始まる。この標的核酸は、たとえば、その発現が特定の障害もしくは疾病状態と関連する細胞遺伝子（または遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、または感染因子に由来する核酸分子であってもよい。本発明において、標的核酸は、ｅＩＦ４Ｅをコードする。
【００５３】
また、ターゲティング・プロセスは、通常、アンチセンス相互作用を生じさせ、その結果所望の効果、例えば発現の調整を生じさせるための、標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント、または部位を決定することを含む。本発明の状況の範囲内で、「領域」という用語は、少なくとも１つの定義可能な構造、機能、または特徴を有する標的核酸の一部として定義される。標的核酸の領域内がセグメントである。「セグメント」は、標的核酸内の領域のより小さなまたはサブ部分として定義される。本発明に使用される「部位」は、標的核酸内の位置として定義される。
【００５４】
公知のように、翻訳開始コドンは、典型的には５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子においては、５’ＡＴＧ）であるので、翻訳開始コドンは、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」ともいわれる。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ、または５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ、および５’−ＣＵＧは、インビボで機能することが示された。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、各例においてイニシエーターアミノ酸が、典型的にはメチオニン（真核生物において）またはホルミルメチオニン（原核生物において）である場合であっても、多くのコドン配列を包含することができる。また、真核生物および原核生物遺伝子は、２つ以上の代わりの開始コドンを有し、そのうちのいずれを特定の細胞型もしくは組織において、または特定の条件設定下において、翻訳開始のために優先して利用してもよいことが当技術分野において公知である。本発明の状況において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、このようなコドンの配列に関係なく、ｅＩＦ４Ｅをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳を開始するためにインビボで使用されるコドンをいう。また、遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、３つの配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ、および５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ、および５’−ＴＧＡである）のうちの１つを有してもよいことが当技術分野において公知である。
【００５５】
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの向き（すなわち、５’または３’）で、約２５〜約５０個の隣接するヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子などの一部をいう。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンからいずれかの向き（すなわち、５’または３’）で、約２５〜約５０個の隣接するヌクレオチドを包含するｍＲＮＡまたは遺伝子などの一部をいう。従って、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「終止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は全て、本発明のアンチセンス化合物で効率的にターゲットされ得る領域である。
【００５６】
また、当技術分野において翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域をいうことが公知であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」も、効率的にターゲットされ得る領域である。本発明の状況の範囲内で、１つの領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを包含する遺伝子内の領域である。
【００５７】
その他の標的領域は、当技術分野において翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分をいい、したがって、ｍＲＮＡ（または、遺伝子上の対応するヌクレオチド）の５’キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチドを含むことが公知の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、並びに当技術分野において翻訳終止コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分をいい、したがって、ｍＲＮＡ（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）の翻訳終止コドンと３’末端との間のヌクレオチドを含むことが公知の３’非翻訳の領域（３’ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸エステル結合を経てｍＲＮＡの最も５’の残基に連結されたＮ７メチル化されたグアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体、並びにキャップ部位に隣接した最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。また、５’キャップ領域も標的である。
【００５８】
いくつかの真核生物のｍＲＮＡ転写物は、直接翻訳されるが、多くは、「イントロン」として公知の１つまたは複数の領域を含み、これが翻訳される前に転写物から切除される。残りの（したがって、翻訳される）領域は、「エキソン」として公知であり、共にスプライスされて連続的なｍＲＮＡ配列を形成する。また、スプライス部位（すなわちイントロン−エキソン接合部またはエキソン−イントロン接合部）をターゲットすることは、特に異常なスプライシングが疾患に関係するか、または特定のスプライス産物の過剰産生が疾患に関係する状況に有用な可能性がある。再編成または欠失による異常な融合接合部も、適切な標的部位である。異なる遺伝子源に由来する２つの（または、より多くの）ｍＲＮＡのスプライシングのプロセスを経て産生されるｍＲＮＡ転写物は、「融合転写物」として公知である。また、イントロンは、たとえばＤＮＡまたはプレｍＲＮＡにターゲットされるアンチセンス化合物を使用して効率的にターゲットすることができることも公知である。ＲＮａｓｅ  Ｈ機構を経て作用するオリゴヌクレオチド化合物などの一本鎖アンチセンス化合物は、プレｍＲＮＡをターゲットするために有効である。
【００５９】
また、オルターナティブＲＮＡ転写物をＤＮＡの同じゲノム領域から産生することができることも当技術分野において公知である。これらのオルターナティブ転写物は、一般に「変異体」として公知である。より詳細には、「プレｍＲＮＡ変異体」は、同じゲノムのＤＮＡから産生される転写物であって、これらの開始または停止位置のいずれかが同じゲノムＤＮＡから産生されるその他の転写物とは異なり、かつイントロンおよびエキソンの両配列を含む転写物である。
【００６０】
スプライシングの間の１つもしくは複数のエキソンまたはイントロン領域、またはこれらの一部の切除により、プレｍＲＮＡ変異体は、より小さな「ｍＲＮＡ変異体」を生じる。従って、ｍＲＮＡ変異体は、プロセスされたプレｍＲＮＡ変異体であり、それぞれの独特のプレｍＲＮＡ変異体は、スプライシングの結果として常に独特のｍＲＮＡ変異体を生じなければならない。また、これらのｍＲＮＡ変異体は、「オルターナティブスプライス変異体」としても公知である。プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングが生じない場合は、プレｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同一である。
【００６１】
また、変異体は、転写を開始または停止するためのオルターナティブシグナルを使用することによって産生することができること、並びにプレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡは、複数の開始コドンまたは終止コドンを有することができることが、当技術分野において公知である。オルターナティブ開始コドンを使用するプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから生じる変異体は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「オルターナティブ開始変異体」として公知である。オルターナティブ終止コドンを使用するこれらの転写物は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「オルターナティブ停止変異体」として公知である。オルターナティブ停止変異体の１つの特定タイプは、産生される複数の転写物が、転写機構による「ポリＡ停止シグナル」のうちの１つのオルターナティブ選択によって生じ、これにより独特のポリＡ部位で終わる転写物を産生する「ポリＡ変異体」である。本発明の状況の範囲内において、本明細書に記載されている変異体のタイプも適切な標的核酸である。
【００６２】
適切なオリゴマー化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、以下において「適切な標的セグメント」と称する。本明細書に使用される「適切な標的セグメント」という用語は、活性なオリゴマー化合物がターゲットされる標的領域の少なくとも８核酸塩基部分として定義される。理論によって拘束されることは望まないが、現在、これらの標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのためにアクセスできる標的核酸の部分を表すと考えられる。
【００６３】
一定の適切な標的セグメントの特定の配列を本明細書に記載してあるが、当業者であれば、これらが本発明の範囲内の特定の態様を例示し、記載する役割を果たすことを認識するであろう。当業者によって、さらなる適切な標的セグメントが同定される可能性がある。「適切な標的セグメント」は、この用語によって同定され、またはあるとしても「適切な標的セグメント」の表に含まれることは必要でない。
【００６４】
例示の適切な標的セグメントから選択された少なくとも８つの連続した核酸塩基のひと配列を含む８〜８０核酸塩基の長さの標的セグメントは、同様にターゲットするために適していると考えられる。
【００６５】
標的セグメントは、例示の適切な標的セグメントのうちの１つの５’末端から少なくとも８つの連続した核酸塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含む（残りの核酸塩基は、標的セグメントの５’末端のすぐ上流で開始し、ＤＮＡまたはＲＮＡが約８〜約８０核酸塩基を含むまで続く、同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続したひと配列である）。同様の適切な標的セグメントは、例示の適切な標的セグメントのうちの１つの３’末端から少なくとも８つの連続した核酸塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列によって表される（残りの核酸塩基は、標的セグメントの３’末端のすぐ下流で開始し、ＤＮＡまたはＲＮＡが約８〜約８０核酸塩基を含むまで続く、同じＤＮＡまたはＲＮＡの連続したひと配列である）。また、適切なオリゴマーの標的セグメントは、例示の適切な標的セグメントの配列の内部部分からの少なくとも８つの連続した核酸塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列によって表されてもよく、オリゴヌクレオチドが約８〜８０核酸塩基を含むまで、一方向または両方向に伸長してもよいことが理解される。本明細書に例示した適切な標的セグメンを備えている当業者であれば、過度の実験なしで、さらに適切な標的セグメントを同定することができるであろう。
【００６６】
一旦、１つもしくは複数の標的領域、セグメント、または部位が同定されたら、所望の効果を得るために、標的に対して十分に相補的、すなわち十分によく、および十分な特異性でハイブリダイズするオリゴマー化合物が選択される。
【００６７】
また、オリゴマー化合物は、核酸塩基１〜８０、８１〜１６０、１６１〜２４０、２４１〜３２０、３２１〜４００、４０１〜４８０、４８１〜５６０、５６１〜６４０、６４１〜７２０、７２１〜８００、８０１〜８８０、８８１〜９６０、９６１〜１０４０、１０４１〜１１２０、１１２１〜１２００、１２０１〜１２８０、１２８１〜１３６０、１３６１〜１４４０、１４４１〜１５２０、１５２１〜１６００、１６０１〜１６８０、１６８１〜１７６０、もしくは１７６１〜１８４２、またはこれらの任意の組み合わせを含む標的核酸塩基配列の領域（たとえば、下記の実施例に開示したものなどの）にターゲットしてもよい。
【００６８】
Ｄ．  スクリーニングおよび標的バリデーション
さらなる態様において、本明細書において同定された「適切な標的セグメント」は、ｅＩＦ４Ｅの発現を調整するさらなる化合物をスクリーンする際に使用してもよい。「モジュレーター」は、ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の発現を減少または増大し、適切な標的セグメントに対して相補的（すなわち、アンチセンス）である少なくとも８核酸塩基部分を含む化合物である。スクリーニング法は、ｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の適切な標的セグメントを、１つまたは複数の候補モジュレーターと接触させる工程、およびｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の発現を減少または増大する１つもしくは複数の候補モジュレーターを選択する工程を含む。一旦、候補モジュレーターがｅＩＦ４Ｅをコードする核酸分子の発現を調整する（たとえば減少するか、または増大する）ことができることが示されれば、次いでモジュレーターは、ｅＩＦ４Ｅの機能のさらなる調査研究において、または本発明の研究薬、診断薬、もしくは治療薬として使用するために使用してもよい。
【００６９】
一般に、ｄｓＲＮＡ構築物の活性は、同じ部位にターゲットされたＲＮａｓｅ  Ｈ依存的な一本鎖アンチセンス化合物の活性と相関する。Ｖｉｃｋｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８，７１０８。したがって、いずれかの一本鎖アンチセンス化合物（たとえば、ＲＮａｓｅ  Ｈ依存的化合物）として活性な配列を、二本鎖アンチセンス化合物（たとえば、ｓｉＲＮＡ）をデザインするために、およびその逆に使用することができる。本発明の適切な標的セグメントをこれらのそれぞれの相補アンチセンス化合物と組み合わせて、安定化された二本鎖（二重化された）化合物を形成してもよい。このような二本鎖オリゴマー化合物部分は、当技術分野において、標的発現を調整すること、翻訳並びにアンチセンス機構を経たＲＮＡプロセシングを調節することが示された。さらに、二本鎖部分を化学修飾に供してもよい（Ｆｉｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６−８１１；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９５，８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓら、Ｇｅｎｅ，２００１，２６３，１０３−１１２；Ｔａｂａｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，４３０−４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２−１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９９，１３，３１９１−３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４−４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００１，１５，１８８−２００）。たとえば、このような二本鎖部分は、古典的な、標的に対する二本鎖のアンチセンス鎖のハイブリダイゼーションによって標的を阻害し、これにより標的の酵素的分解をトリガーすることが示された。（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４−６９７）。ＲＮａｓｅ  Ｈに基づいたアンチセンス（通常、一本鎖化合物を使用する）およびｓｉＲＮＡ（通常、二本鎖化合物を使用する）は両方とも、典型的には標的ＲＮＡ機能の損失を生じるアンチセンス機構である。最適化されたｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅ  Ｈ依存的オリゴマー化合物は、作用の強度、最大効果、特異性、および期間、並びに効率に関して同様に挙動する。さらに、一般に、ｄｓＲＮＡ構築物の活性は、同じ部位にターゲットされるＲＮａｓｅ  Ｈ依存的一本鎖アンチセンス化合物の活性に相関されることが示された。一つの主な例外は、ＲＮａｓｅ  Ｈ依存的アンチセンス化合物が、一般にプレｍＲＮＡの標的部位に対して活性であったが、ｓｉＲＮＡｓはそうでなかったということである。Ｖｉｃｋｅｒｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０３，２７８，７１０８。
【００７０】
また、本発明のオリゴマー化合物は、創薬および標的バリデーションの領域にも適用することができる。本発明は、ｅＩＦ４Ｅと疾病状態、表現型、または症状との間に存在する関係を解明するために、創薬の試みにおいて本明細書において同定された化合物および適切な標的セグメントの使用を包含する。これらの方法は、試料、組織、細胞、または生物体を、本発明の１つまたは複数のアンチセンス化合物と接触させる工程、処置後のしばらくの間に、ｅＩＦ４Ｅの核酸もしくはタンパク質レベル、および／または関連した表現型もしくは化学的指標を測定する工程、並びに任意に無処置の試料もしくは本発明のさらなる化合物で処置した試料と計測値を比較する工程を含むｅＩＦ４Ｅを検出または調整することを含む。また、これらの方法は、標的バリデーションのプロセスのための未知の遺伝子の機能を決定すること、または特定の疾患、症状、もしくは表現型の治療または予防のための標的としての特定の遺伝子産物の有効性を決定するためのその他の実験と平行して、または組み合わせて行うことができる。
【００７１】
Ｅ．  キット、研究試薬、診断法、および治療
本発明のオリゴマー化合物は、診断、治療、予防のために、並びに研究試薬およびキットとして利用することができる。さらにまた、洗練された特異性で遺伝子発現を阻害することができるオリゴマー化合物は、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の種々のメンバーの機能間を区別するために、当業者によって使用されることが多い。
【００７２】
キットおよび診断に使用するためには、本発明の化合物を単独で、またはその他の化合物もしくは治療と組み合わせて、細胞および組織内に発現された遺伝子の一部または全てを補完するもの（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）の発現パターンを解明するためのディファレンシャルおよび／または組み合わせ解析におけるツールとして使用することができる。
【００７３】
一つの非限定の例として、１つもしくは複数の化合物で処置した細胞または組織内の発現パターンを化合物で処置されていない対照細胞または組織と比較し、生じるパターンを、遺伝子発現のディファレンシャル・レベルについて、これらが、たとえば検査した遺伝子の疾患関連、シグナリング経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造、または機能に属することを解析する。これらの解析を、刺激されたか、または刺激されていない細胞で、および発現パターンに影響を及ぼすその他の化合物の存在または非存在下において行うことができる。
【００７４】
当技術分野において公知の遺伝子発現解析法の例は、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（Ｂｒａｚｍａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，１７−２４；Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６）、ＳＡＧＥ（ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｍａｄｄｅｎら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｇｅｓｔｅｄ  ｃＤＮＡｓ）  （Ｐｒａｓｈａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９，３０３，２５８−７２）、ＴＯＧＡ（ｔｏｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００−１０）、発現シーケンス・タグ（ＥＳＴ）シーケンシング（Ｃｅｌｉｓら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０００，８０，１４３−５７）、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリント法（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１−９８；Ｌａｒｓｏｎら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３−２０８）、サブトラクティブ・クローンニング・ディファレンシャル・ディスプレイ（ＤＤ）（Ｊｕｒｅｃｉｃら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼイション）技術（Ｇｏｉｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５−９０）、および質量分析法（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５−４１）を含む。
【００７５】
また、アンチセンスの特異性および感受性も、当業者によって治療的用途のために利用される。アンチセンス化合物は、ヒトを含む動物における疾患状態の治療の際に、治療的部分として使用されてきた。リボザイムを含むアンチセンス薬は、ヒトに対して、安全に、かつ効率的に投与されており、現在多くの臨床試験が行われている。したがって、アンチセンス化合物は、細胞、組織、および動物、特にヒトの治療のための治療法において有用となるように構成することができる有用な治療様式であることが確立される。ネコ、イヌ、齧歯類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、その他を含むが、これらに限定されないペット、動物園にいる動物、および家畜から選択される動物の治療も本発明によって想定される。
【００７６】
治療のためには、ｅＩＦ４Ｅの発現を調整することによって治療することができる疾患または障害を有する疑いがあるヒトなどの動物は、本発明に従った化合物を投与することによって治療される。たとえば、一つの非限定の態様において、本方法は、治療の必要がある動物に対して、ｅＩＦ４Ｅを阻害するオリゴマー化合物の治療上有効な量を投与する工程を含む。本発明のｅＩＦ４Ｅ化合物は、ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡをコードする核酸の活性または発現を効率的に阻害する。同様に、ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルの減少により、ｅＩＦ４Ｅタンパク質レベルの減少を生じるので、タンパク質発現またはレベルの減少も測定することができる。一部の態様において、動物は、治療の前に疾患または障害について診断される。一つの態様において、オリゴマー化合物は、少なくとも約１０％まで、少なくとも約２０％まで、少なくとも約２５％まで、少なくとも約３０％まで、少なくとも約４０％まで、少なくとも約５０％まで、少なくとも約６０％まで、少なくとも約７０％まで、少なくとも約７５％まで、少なくとも約８０％まで、少なくとも約８５％まで、少なくとも約９０％まで、少なくとも約９５％まで、少なくとも約９８％まで、少なくとも約９９％まで、もしくは１００％までｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの活性または発現を調整する。
【００７７】
たとえば、ｅＩＦ４Ｅの発現の減少は、動物の血清、脂肪組織、肝臓、もしくはその他のいずれかの体液、組織、または器官において測定してもよい。解析される前記液体、組織、または器官内に含まれる細胞は、ｅＩＦ４Ｅタンパク質をコードする核酸分子および／またはｅＩＦ４Ｅタンパク質自体を含むことができる。
【００７８】
本発明の化合物は、適切な薬学的もしくは生理的に許容される賦形剤、希釈液、またはキャリアに化合物の有効な量を添加することによって、薬学的組成物において利用することができる。また、本発明の化合物および方法の使用は、予防的にも有用であり得る。従って、本発明は、医薬としての本明細書に開示された化合物の使用、並びに本明細書に開示された障害の治療のための薬物の調製のための、今回開示された化合物の使用を包含する。
【００７９】
本発明の化合物は、ｅＩＦ４Ｅの発現を阻害する。これらの化合物は、ｅＩＦ４Ｅ活性化の効果を阻害するので、本化合物は、ｅＩＦ４Ｅ発現に関連した障害の治療に有用である。従って、本発明の化合物は、抗悪性腫瘍薬である。
【００８０】
本化合物は、中枢神経系の新生物などの癌腫：多形性神経膠芽腫、星細胞腫、オリゴデンドログリア腫、上衣および脈絡叢腫瘍、松果体腫瘍、ニューロン腫瘍、髄芽腫、シュワン腫、髄膜腫、髄膜肉腫；目の新生物：基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、横紋筋肉腫、網膜芽細胞腫；内分泌腺の新生物：下垂体腫瘍、甲状腺の新生物、副腎皮質の新生物、神経内分泌系の新生物、胃腸膵臓内分泌系の新生物、生殖腺の新生物；頭頸部の新生物：頭頚部癌、口腔、咽頭、喉頭、歯性腫瘍；胸部の新生物：大細胞肺癌腫、小細胞肺癌腫、非小細胞肺癌腫、胸部の新生物、悪性中皮腫、胸腺腫、胸部の一次胚細胞腫瘍；消化管の新生物：食道の新生物、胃の新生物、肝臓の新生物、胆嚢の新生物、膵臓外分泌部の新生物、小腸の新生物、虫垂および腹膜、結腸および直腸の腺癌、肛門の新生物；尿生殖路の新生物：腎細胞癌、腎盂および輸尿管の新生物、膀胱の新生物、尿道の新生物、前立腺の新生物、陰茎の新生物、精巣の新生物；女性生殖器の新生物：外陰部および膣の新生物、頸部の新生物、子宮体の腺癌、卵嚢癌、婦人科の肉腫；乳房の新生物；皮膚の新生物：基底細胞癌、扁平上皮癌、皮膚線維肉腫、メルケル細胞腫瘍；悪性黒色腫；骨および軟部組織の新生物：骨原性肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原始的神経外胚様性腫瘍、血管肉腫；造血系の新生物：脊髄形成異常症候群、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、ＨＴＬＶ−１およびＴ細胞白血病／リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ヘアリーセル白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、肥満細胞白血病；および児童の新生物：急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、骨腫瘍、横紋筋肉腫、リンパ腫、腎臓腫瘍を治療する際に有用であると考えられている。
【００８１】
従って、一つの態様において、本発明は、感受性の新生物の治療のための方法であって、これらの必要な患者に対して、ｅＩＦ４Ｅに向けられた単離された一本鎖ＲＮＡまたは二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの有効な量を投与することを含む方法を提供する。ｓｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、修飾されていても、または修飾されていなくてもよい。すなわち、本発明は、感受性の新生物の治療のための、ｅＩＦ４Ｅに対してターゲットされる単離された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはこれらの薬学的組成物の使用を提供する。
【００８２】
もう一つの態様において、本発明は、ｅＩＦ４Ｅ発現または過剰発現を阻害するための医薬の製造における、単離された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの化合物の使用を提供する。従って、本発明は、上に記載されている方法によって感受性の新生物の治療のための薬物の製造における、ｅＩＦ４Ｅに対してターゲットされる単離された二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００８３】
本発明の化合物は、高増殖性障害の治療のために有用である。特に、本発明の化合物は、癌の治療のために有用である。本発明の化合物は、特に固形腫瘍の治療のために有用である。従って、本発明の化合物は、特に乳癌、大腸癌、前立腺癌、肺癌、肝臓癌、膀胱癌、卵嚢癌、腎癌、およびグリア芽細胞腫の治療のために有用である。本発明のアンチセンス化合物は、特に固形腫瘍の治療のために有用である。
【００８４】
Ｆ．  修飾
周知のとおり、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基（時に「核酸塩基」または単に「塩基」とも称される）である。このような複素環塩基の２つの最も一般的な分類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合性に連結されたリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドに関して、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分のいずれに対しても連結することができる。オリゴヌクレオチドを形成する際には、リン酸基を互いに隣接したヌクレオシドを共有結合性に連結して、直鎖状の重合体化合物を形成する。次に、この直鎖状重合体化合物のそれぞれの末端をさらに連結して、環状の化合物を形成することができるが、一般に直鎖状化合物が望まれる。加えて、直鎖状化合物は、内部核酸塩基相補性を有してもよく、従って、完全に、または部分的に二本鎖化合物を生じる様な方法で折りたたまれてもよい。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間バックボーンを形成するものといわれる。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常な結合またはバックボーンは、５’に対する３’のホスホジエステル結合である。
【００８５】
修飾された糖およびヌクレオシド間結合
本発明に有用なオリゴマー・アンチセンス化合物の具体例は、修飾された、たとえば天然に存在しないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において定義したように、修飾されたヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合およびリン原子を有さないヌクレオシド間結合を含む。本明細書の目的のために、および時に当技術分野において参照されるとおり、これらのヌクレオシド間バックボーンにおけるリン原子を有しない修飾されたオリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。
【００８６】
本発明のオリゴマー化合物は、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシド間結合を有することができる。１つのリンを含有する修飾されたヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアート・ヌクレオシド間結合である。リン原子をその中に含むその他の修飾されたオリゴヌクレオチド・バックボーンは、たとえば、ホスホロチオアート、キラルなホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、リン酸トリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル、並びに３’−アルキレンホスホナート、５’−アルキレンホスホナート、およびキラルホスホナートを含むその他のアルキルホスホナート、ホスフィナート、３’−アミノホスホラミダートおよびアミノアルキルホスホラミダートを含むホスホラミダート、チオノホスホラミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ホスホノアセテート、並びにチオホスホノアセテート（Ｓｈｅｅｈａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，３１（１４），４１０９−４１１８およびＤｅｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，９４０−９５０を参照されたい）、セレノホスフェート、および正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、および逆の極性を有するものであって、１つまたは複数のヌクレオチド間結合が３’から３’、５’から５’、または２’から２’に対するものを含む。逆の極性を有するオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間結合に単一の３’から３’への結合、すなわち塩基が無く（ａｂａｓｉｃ）てもよい単一の逆位のヌクレオシド残基（核酸塩基は、ヒドロキシル基を失っているか、またはその所定の位置に有する）を含む。種々の塩、混合塩、および遊離酸の形態も含まれる。
【００８７】
Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホラミダートは、相補的ＲＮＡ鎖に対する高い親和性およびヌクレアーゼ耐性の両方を示すことが報告された（Ｇｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９４，１１６，３１４３−３１４４）。Ｎ３’−Ｐ５’−ホスホラミダートは、インビボでｃ−ｍｙｃ遺伝子の発現を特異的にダウンレギュレートすることが研究されいくつかが成功した（Ｓｋｏｒｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９７，９４，３９６６−３９７１；およびＦａｉｒａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，１９，４０−４４）。
【００８８】
上記のリン含む結合の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、それぞれが、本明細書に参照として組み入れられる：第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号、および第５，６２５，０５０号。
【００８９】
本発明のいくつかの態様において、オリゴマー化合物は、１つもしくは複数のホスホロチオアートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特にＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして公知）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（式中、天然のリン酸ジエステルヌクレオチド間結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として表される）を有してもよい。ＭＭＩ型ヌクレオシド間結合は、上述した米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。アミドヌクレオシド間結合は、上述した米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
【００９０】
その中にリン原子を含まないいくつかのオリゴヌクレオチド・バックボーンは、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるバックボーンを有する。これらは、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン・バックボーン；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン・バックボーン；ギ酸アセチルおよびチオギ酸アセチル・バックボーン；メチレンギ酸アセチルおよびチオギ酸アセチル・バックボーン；リボアセチル・バックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファミン酸・バックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ・バックボーン；スルホナートおよびスルホンアミド・バックボーン；アミド・バックボーン；並びに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成要素を有するその他のものを含む。
【００９１】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、それぞれが、本明細書に参照として組み入れられる：第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号、および第５，６７７，４３９号。
【００９２】
本発明に受け入れられるオリゴマー化合物のもう一つの群は、オリゴヌクレオチド擬態を含む。擬態という用語は、これがオリゴヌクレオチドに適用される場合、フラノース環、またはフラノース環とヌクレオチド間結合とが、新規の基で置換されているオリゴマー化合物を含むことが企図され、フラノース環のみの置換は、当技術分野において糖代用物であるともいわれる。複素環塩基部分または修飾された複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。
【００９３】
このようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されたオリゴヌクレオチド擬態は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）といわれる。Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００。ＰＮＡは、有利なハイブリダイゼーション特性、高い生物学的安定性を有し、静電気的に中性の分子である。１つの最近の研究において、ＰＮＡ化合物が、トランスジェニック・マウスモデルにおいて正確な異常スプライシングに使用された（Ｓａｚａｎｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００２，２０，１２２８−１２３３）。ＰＮＡオリゴマー化合物では、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンが、アミドを含むバックボーン、特にアミノエチルグリシン・バックボーンと置換されている。核酸塩基は、直接または間接的に、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に結合されている（以下に示すように−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−）。ＰＮＡオリゴマー化合物の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、それぞれが、本明細書に参照として組み入れられる：第５，５３９，０８２号；第５，７１４，３３１号；および第５，７１９，２６２号。ＰＮＡ化合物は、商業的にＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）から得ることができる。塩基性ＰＮＡバックボーンに対する多くの修飾は、当技術分野において公知であり；一方または両方の末端に抱合された１つまたは複数のアミノ酸をもつＰＮＡ化合物が、特に有用である。特に、ＰＮＡ分子の末端に抱合されるときは、１〜８つのリジンまたはアルギニン残基が有用である。
【００９４】
研究されたオリゴヌクレオチド擬態のもう一つのクラスは、モルホリノ環に付着された複素環塩基を有する連結されたモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸のモルホリノ単量体単位に連結される多くの連結基が報告された。連結基の１つのクラスは、非イオン性オリゴマー化合物を与えるように選択された。非イオン性モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、細胞タンパク質と望まれない相互作用を有する可能性が低い。モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望まれない相互作用を形成する可能性が低いオリゴヌクレオチドの非イオン性擬態である（Ｂｒａａｓｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）。モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、ゼブラフィッシュの胚において研究されてきた（Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ３０，ｉｓｓｕｅ  ３，２００１およびＨｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４を参照されたい）。また、モルホリノに基づいたオリゴマー化合物のさらなる研究も報告された（Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０；および  Ｌａｃｅｒｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６を参照されたい）。モルホリノに基づいたオリゴマー化合物は、１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。単量体サブユニットを連結する種々の異なる連結基を有するオリゴマー化合物のモルホリノ・クラスが調製された。連結基は、キラルなものからアキラルなものに、また荷電したものから中性のものに変更することができる。米国特許第５，１６６，３１５号は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｎ（ＣＨ３）２）−Ｏ−を含む結合を開示し；米国特許第５，０３４，５０６号は、アキラルなモルホリノ間結合を開示し；および米国特許第５，１８５，４４４号は、キラルなモルホリノ間結合を含むリンを開示する。
【００９５】
オリゴヌクレオチド擬態のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）といわれる。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子に通常存在するフラノース環は、シクロヘニル環で置換されている。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護されたホスホラミダイト単量体は、古典的なホスホラミダイト化学に従って調製され、オリゴマー化合物合成のために使用された。ＣｅＮＡで修飾された特異的位置を有する完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物およびオリゴヌクレオチドが調製され、研究された（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２を参照されたい）。一般に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡ単量体の組み込みは、そのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増大する。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体と同様の安定性をもつＲＮＡおよびＤＮＡ相補物と複合体を形成した。天然の核酸構造にＣｅＮＡ構造を組み込むための研究は、ＮＭＲおよび円偏光二色性によって簡単な高次構造適応で進行することが示された。さらに、配列ターゲティングＲＮＡへのＣｅＮＡの組み込みは、血清に対して安定であり、大腸菌ＲＮａｓｅを活性化して標的ＲＮＡ鎖の切断を生じることができる。
【００９６】
さらなる修飾は、リボシル糖骨格環の２’−ヒドロキシル基が、糖骨格環の４’炭素原子に連結することにより、２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成して二環式の糖残基が形成された「ロック核酸」（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：ＬＮＡ）などの二環式の糖残基を含む（Ｅｌａｙａｄｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２００１，８  １−７；およびＯｒｕｍら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００１，３，２３９−２４３に概説されており；また、米国特許第６，２６８，４９０号および第６，６７０，４６１号も参照されたい）。結合は、２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であることができ、これに関して、ＬＮＡという用語は、二環式部分のために使用され；この位置におけるエチレン基の場合、ＥＮＡＴＭという用語が使用される（Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６；ＥＮＡＴＭ：Ｍｏｒｉｔａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，１１，２２１１−２２２６）。ＬＮＡおよびその他の二環式糖類似体は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０  Ｃ）、３’−エキソヌクレオ溶解性分解に対する安定性、および優れた溶解性を示す。ＬＮＡは、ＰｒｏＬｉｇｏ（Ｐａｒｉｓ，ＦｒａｎｃｅおよびＢｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ，ＵＳＡ）から商業的に入手可能である。
【００９７】
また研究されたＬＮＡの異性体も、３’−エキソヌクレアーゼに対して優れた安定性を有することが示されたα−Ｌ−ＬＮＡである（Ｆｒｉｅｄｅｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５−６３７２）。α−Ｌ−ＬＮＡは、強力なアンチセンス活性を示したアンチセンス・ギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）およびキメラに組み入れられた。
【００９８】
調製され、および研究されたもう一つの同様の二環式の糖残基は、３’−ヒドロキシル基から単一のメチレン基を経て糖骨格環の４’炭素原子に向かう架橋を有し、これにより３’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成する（米国特許第６，０４３，０６０号を参照されたい）。
【００９９】
２Ｄ  ＮＭＲ分光法によって決定されるＬＮＡの高次構造により、一本鎖ＬＮＡおよび二重鎖の両方において、ＬＮＡヌクレオチドの向きがロックされていることにより、より高いＮ型高次構造の集団を導入するような方法で、リン酸バックボーンを拘束することを示した（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，２０００，１３，４４−５３）。これらの高次構造は、核酸塩基のスタッキングの改善と関連する（Ｗｅｎｇｅｌら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９９，１８，１３６５−１３７０）。
【０１００】
ＬＮＡは、非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖を形成することが示された（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１３２５２−１３２５３）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、最も熱的に安定な核酸型二重鎖系であることが示され、ＬＮＡのＲＮＡを模倣する特徴が二重鎖レベルで確立した。３つのＬＮＡ単量体（ＴまたはＡ）の導入により、ＤＮＡ相補物に対して有意に融点を増大した（Ｔｍ＝＋１５／＋１１）。ＬＮＡを媒介したハイブリダイゼーションの一般性は、非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖の形成によって強調された。ＬＮＡのＲＮＡ模倣は、単量体のＮ型高次構造の制限に関して、およびＬＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の二次構造に関して反映された。
【０１０１】
また、ＬＮＡは、高い熱的親和性で相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＬＮＡと二重鎖を形成する。円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、完全に修飾されたＬＮＡを含む二重鎖（特に、ＬＮＡ：ＲＮＡ）が、構造的にＡ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に似ていることを示した。ＬＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の核磁気共鳴（ＮＭＲ）調査により、ＬＮＡ単量体の３’エンド（３’−ｅｎｄｏ）高次構造を確認した。また、二本鎖ＤＮＡの認識が証明されたことから、ＬＮＡによる鎖侵入を示唆している。ミスマッチ配列の研究は、ＬＮＡが対応する無修飾参照鎖と比較して、一般に改善された選択性でワトソン−クリック型塩基対規則に従うことを示す。ＤＮＡ  ＬＮＡキメラは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ内の種々の領域（５’非翻訳領域、開始コドン領域、またはコード領域）にターゲットされるときに、効率的に遺伝子発現を阻害することを示した（Ｂｒａａｓｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０，５１６０−５１６７）。
【０１０２】
強力かつ無毒のＬＮＡを含むアンチセンス・オリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。著者は、ＬＮＡがアンチセンス薬に対していくつかの所望の性質を与えることを証明した。ＬＮＡ／ＤＮＡ共重合体は、血清および細胞抽出物で容易に分解されなかった。ＬＮＡ／ＤＮＡ共重合体は、生きたラット脳におけるＧタンパク質結合受容体シグナリングおよび大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるリポーター遺伝子の検出とは異なり、アッセイ系において強力なアンチセンス活性を示した。また、生きているヒト乳癌細胞へのＬＮＡのリポフェクチンを媒介した効率的なデリバリーが達成された。ＬＮＡのものを含むさらに良好なインビボ研究は、毒性を伴わないラット・デルタ・オピオイド受容体のノックダウンを示し（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）、もう一つの研究は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットの翻訳の遮断を示した（Ｆｌｕｉｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００３，３１，９５３−９６２）。
【０１０３】
ＬＮＡ単量体アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、およびウラシルの合成並びに調製は、これらのオリゴマー形成、および核酸認識性質と共に、記載された（Ｋｏｓｈｋｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＬＮＡおよびこれらの調製は、国際公開公報第９８／３９３５２号および国際公開公報第９９／１４２２６号にも記載されている。
【０１０４】
ＬＮＡの最初の類似体、ホスホロチオアート−ＬＮＡおよび２’−チオ−ＬＮＡも調製された（Ｋｕｍａｒら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼのために基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロック・ヌクレオシド類似体の調製も記載されていた（Ｗｅｎｇｅｌら、国際公開公報第９９／１４２２６号）。さらに、２’−アミノ−ＬＮＡの合成、新規の高次構造的に制限された高い親和性のオリゴヌクレオチド類似体が当技術分野において記載されていた（Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−および２’−メチルアミノ−ＬＮＡも調製されており、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ鎖とのこれらの二重鎖の熱安定性も、以前に報告された。
【０１０５】
もう一つの、調製され、および研究された本発明に受け入れられるオリゴヌクレオチド擬態は、トレオース核酸である。このオリゴヌクレオチド擬態は、リボース・ヌクレオシドの代わりにトレオース・ヌクレオシドに基づく。（３’，２’）−α−Ｌ−トレオース核酸（ＴＮＡ）の最初の関心は、ＴＮＡを複製するであろうＤＮＡポリメラーゼが存在するかどうかの問題に向けられた。一定のＤＮＡポリメラーゼが、ＴＮＡテンプレートの限定された範囲を複製することができることが判明した（Ｃ＆ＥＮ／２００３年１月１３日において報告された）。もう一つの研究では、ＴＮＡが相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＴＮＡオリゴヌクレオチドと逆平行ワトソン−クリック型塩基対形成できることが決定された（Ｃｈａｐｕｔら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，８５６−８５７）。
【０１０６】
１つの研究では、（３’，２’）−α−Ｌ−トレオース核酸を調製し、２’および３’アミダート類似体と比較した（Ｗｕら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，４（８），１２７９−１２８２）。アミダート類似体は、ＲＮＡ／ＤＮＡのものに匹敵する強度でＲＮＡおよびＤＮＡと結合することが示された。
【０１０７】
二環式および三環式ヌクレオシド類似体を含むように、さらなるオリゴヌクレオチド擬態が調製された（Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，８０，２４２６−２４３９；Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，３２４９−３２５５；Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４，５９９３−６００２；および  Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０，２７５１−２７５７を参照されたい）。これらの修飾されたヌクレオシド類似体は、ホスホラミダイト・アプローチを使用してオリゴマー形成され、生じる三環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれ自体にハイブリダイズするときに、熱安定性（Ｔｍ）の増大を示した。二環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ二重鎖のものに近い熱安定性を示した。
【０１０８】
オリゴヌクレオチド擬態のもう一つのクラスは、ホスホノモノエステル核酸といわれ、バックボーンにリン基を組み込む。オリゴヌクレオチド擬態のこのクラスは、遺伝子発現を阻害する領域において（アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、および三重鎖形成オリゴヌクレオチド）、核酸の検出のためのプローブとして、および分子生物学に使用するための補助として、有用な物理的および生物学的および薬理学的性質を有することが報告されている。本発明に受け入れられるさらなるオリゴヌクレオチド擬態（シクロブチル環が天然に存在するフラノシル環と置換する）が調製された。
【０１０９】
また、オリゴマー化合物は、１つまたは複数の置換された糖残基を含んでいてもよい。適切な化合物は、２’位に以下のうちの１つを含むことができる：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、式中、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換されたか、または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであってもよい。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２は、特に適しており、式中ｎおよびｍは、１〜約１０である。その他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロ・シクロアルキル、ヘテロシクロアルクカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換されたシリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドおよび同様の性質を有するその他の置換基の薬力学的性質を改善するための基。１つの修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらなる修飾は、以下に実施例に記載されているように、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、並びに以下に実施例にも記載されているように、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野において２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１１０】
その他の修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置にあってもよい。１つの２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。また、オリゴヌクレオチドのその他の位置に、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位または２’−５’連結されたオリゴヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドの５’位に、同様の修飾を行ってもよい。また、アンチセンス化合物は、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖擬態を有してもよい。このような修飾された糖構造の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書にその全体が参照として組み入れられる：第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；および第５，７００，９２０号。
【０１１１】
本発明の一つの局面において、オリゴマー化合物は、３’−エンド糖高次構造を誘導するように合成で修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、所望の３’−エンド糖高次構造を誘導するために、複素環塩基、糖残基、または両方の合成で修飾を組み入れることができる。これらの修飾されたヌクレオシドは、望ましい３’−エンド高次構造上の形状を維持すると共に、オリゴマー化合物の特定の性質を増強することができるように、ＲＮＡ様ヌクレオシドを模倣するために使用される。ＲＮＡ干渉の要求（たとえばトリガー）として、ＲＮＡ型二重鎖（Ａ型ヘリックス、主に３’−エンドである）に対して明らかな優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）があり、これは、２’−デオキシ−２’−Ｆ−ヌクレオシドで構成される二重鎖が線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）系においてＲＮＡｉ反応をトリガーする際に効率的に見えるという事実により、部分的に支持される。より安定な３’−エンドヌクレオシドを使用することによって増強される性質は、以下を含むが、これらに限定されない：タンパク質結合、タンパク質解離速度、吸収およびクリアランスの修飾を介した薬物動態学的性質の調整；ヌクレアーゼ安定性、および化学的安定性の調整；オリゴマーの結合親和性および特異性（酵素に対する、並びに相補配列に対する親和性および特異性）の調整；並びにＲＮＡ切断の有効性の増大。本発明は、Ｃ３’−エンド型高次構造を支持するような方法で、修飾された１つまたは複数のヌクレオシドを有するＲＮＡｉのオリゴマー性トリガーを提供する。
【０１１２】
ヌクレオシド高次構造は、ペントフラノシル糖の２’、３’、または４’−位での置換を含む種々の因子によって影響される。電気陰性置換基は、一般に軸方向の位置を好むが、立体的要求がきびしい置換基は、一般にエクアトリアル位を好む（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｓａｎｇｅｒ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ．）。３’−エンド高次構造に有利な２’位の修飾は、図２において以下に図示したとおり、一方で認識エレメントとして２’−ＯＨを維持しつつ達成することができる（Ｇａｌｌｏら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００１，５７，５７０７−５７１３．Ｈａｒｒｙ−Ｏ’ｋｕｒｕら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６２（６），１７５４−１７５９およびＴａｎｇら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，６４，７４７−７５４）。
【０１１３】
あるいは、３’−エンド高次構造に対する優先は、２’デオキシ−２’Ｆ−ヌクレオシドによって例示される２’−ＯＨの欠失によって達成することができ（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１）、これは、軸位置に電気陰性フッ素原子が位置する３’−エンド高次構造を採用する。リボース環のその他の修飾、たとえば、４’−Ｆ修飾されたヌクレオシドを得るための４’−位の置換（Ｇｕｉｌｌｅｒｍら、ＢｉｏｏｒｇａｎｉｃおよびＭｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９５，５，１４５５−１４６０；およびＯｗｅｎら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７６，４１，３０１０−３０１７）、またはたとえばメタノカルバ（ｍｅｔｈａｎｏｃａｒｂａ）ヌクレオシド類似体を得るための修飾（Ｊａｃｏｂｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０００，４３，２１９６−２２０３；およびＬｅｅら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１，１１，１３３３−１３３７）も、３’−エンド高次構造に対する優先を誘導する。同系統に沿って、ＲＮＡｉ反応のオリゴマーのトリガーは、高次構造がＣ３’−エンド型高次構造に閉じ込められるような方法で修飾された１つまたは複数のヌクレオシド、すなわちロック核酸（ＬＮＡ，Ｓｉｎｇｈら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６）、およびエチレン架橋された核酸（ＥＮＡ，Ｍｏｒｉｔａら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００２，１２，７３−７６）で構成されるかもしれない。
【０１１４】
一つの修飾されたヌクレオシドおよびこれらのオリゴマーの高次構造は、分子動力学計算、核磁気共鳴分光法、およびＣＤ測定などの種々の方法によって推定することができる。それ故、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドに使用するために、ＲＮＡ様高次構造、オリゴマーの状況にＡ型二重鎖形状を誘導することが予測される修飾が選択される。本発明に受け入れられる多くの修飾されたヌクレオシドの合成は、当技術分野において公知である（たとえば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌ  １−３，ｅｄ．Ｌｅｒｏｙ  Ｂ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，１９８８，Ｐｌｅｎｕｍ  ｐｒｅｓｓ、および下記の実施例の節を参照されたい）。
【０１１５】
ホモ二重鎖核酸の高次構造上の形状を記載するために使用される用語は、ＲＮＡに関して「Ａ型」およびＤＮＡに関して「Ｂ型」である。ＲＮＡおよびＤＮＡ二重鎖に関するそれぞれの高次構造上の形状は、核酸繊維のＸ線回折解析から決定された（Ａｒｎｏｔｔ  ａｎｄ  Ｈｕｋｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９７０，４７，１５０４）。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、より安定であり、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖よりも高い融解温度（Ｔｍ）を有する（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ．；Ｌｅｓｎｉｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，１０８０７−１０８１５；Ｃｏｎｔｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，２６２７−２６３４）。ＲＮＡの安定性の増大は、いくつかの構造的な特徴、最も著しくはＡ型構造形状から生じる改善された塩基スタッキング相互作用に起因していた（Ｓｅａｒｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，２０５１−２０５６）。ＲＮＡに２’ヒドロキシルが存在すると、Ｃ３’エンドの方に糖の歪みが偏り（すなわちノーザン歪み（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｐｕｃｋｅｒ）としても示される）、二重鎖がＡ型構造形状の方を生じる。加えて、ＲＮＡの２’ヒドロキシル基は、水を媒介した水素結合のネットワークを形成してＲＮＡ二重鎖の安定化を補助することができる（Ｅｇｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５，８４８９−８４９４）。一方で、デオキシ核酸は、Ｃ２’エンド糖の歪みを好み（すなわち、サザン歪み（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｐｕｃｋｅｒ）としても知られる）、あまり安定でないＢ型形状を与えると考えられる（Ｓａｎｇｅｒ，Ｗ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。本明細書で使用される、Ｂ型構造形状は、Ｃ２’エンドの歪みおよびＯ４’エンドの歪みの両方を含む。これは、Ｂ型構造二重鎖を生じるフラノース高次構造を考える際に、Ｏ４’エンドの歪みの寄与も考慮されるべきであることを指摘したＢｅｒｇｅｒ，ｅｔ．  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，２６，２４７３−２４８０と一致する。
【０１１６】
しかし、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重鎖は、通常、純粋なＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖よりも安定ではなく、これらの配列に応じて、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖よりも安定化、または安定でないかもしれない（Ｓｅａｒｌｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，２０５１−２０５６）。ハイブリッド二重鎖の構造は、Ａ型とＢ型の構造形状間の中間体であり、不十分なスタッキング相互作用を生じ得る（Ｌａｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１５，２９７−３０６；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２３３，５０９−５２３；Ｇｏｎｚａｌｅｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，４９６９−４９８２；Ｈｏｒｔｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，２６４，５２１−５３３）。標的ＲＮＡと合成配列との間で形成される二重鎖の安定性は、アンチセンスおよびＲＮＡ干渉など（しかし、これらに限定されない）の療法において、これらの機構がＲＮＡ標的鎖に対する合成オリゴマー鎖の結合を必要とするために、中心となる。アンチセンスの場合、ｍＲＮＡの有効な阻害は、アンチセンスＤＮＡがｍＲＮＡと非常に高結合親和性を有することが必要である。さもなければ、合成オリゴマー鎖と標的ｍＲＮＡ鎖との間の所望の相互作用は、めったに生じず、有効性が減少してしまう。
【０１１７】
１つの通常使用される糖の歪みを修飾する方法は、糖形状に影響を及ぼす置換基での２’−位の糖の置換である。環の高次構造に対する影響は、２’位での置換基の性質に依存する。多くの異なる置換基の糖を歪める効果を決定するために、これらが研究されている。たとえば、２’−ハロゲンが研究されており、２’−フルオロ誘導体がＣ３’エンド形で最も大きな集団（６５％）を示し、および２’−ヨードが最も低い集団（７％）を示すことを示している。アデノシン（２’−ＯＨ）対デオキシアデノシン（２’−Ｈ）の集団は、それぞれ３６％および１９％である。さらにまた、アデノシン二量体（２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン−２’−デオキシ−２’−フルオロ−アデノシン）の２’−フルオロ基の効果は、積み重ねられた高次構造の安定化に対してさらに相関される。
【０１１８】
予想通り、相対的な二重鎖安定性は、２’−Ｆ基で２’−ＯＨ基を置換することによって増強することができ、これによりＣ３’エンド集団を増大することができる。２’−Ｆ結合の高い極性状態およびＣ３’エンドの糖の歪みに対する極度の優先により、Ａ型二重鎖における積み重ねられた高次構造を安定化し得る。ＵＶ淡色性、円偏光二色性、および１Ｈ  ＮＭＲからのデータは、ハロ置換基の電気陰性度が減少するにつれてスタッキングの程度も減少することを示す。さらにまた、糖残基の２’位の立体的な嵩は、Ｂ型構造二重鎖よりもＡ型構造二重鎖においてよりうまく収められている。従って、ジヌクレオシド一リン酸の３’末端上２’置換基は、スタッキング高次構造に対して多くの効果を及ぼすことが考えられる：立体反発、フラノースの歪みの優先、静電反発、疎水性引力、および水素結合能力。これらの置換基の効果は、置換基の分子サイズ、電気陰性度、および疎水性によって決定されると考えられる。また、相補鎖の融解温度は、２’置換されたアデノシン二リン酸で増大される。高次構造の３’エンド優先または置換基の存在が、結合の増大の原因となるかどうかは明らかではない。しかし、隣接した塩基の優れた重なり（スタッキング）は、３’エンド高次構造で達成することができる。
【０１１９】
ＲＮＡ標的鎖にターゲットされる修飾されたオリゴヌクレオチドにおけるＣ３’エンド糖の割合を増大するには、ＲＮＡに対する結合のためのこの鎖を予め組織化する（ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅ）べきである。文献に報告され、および研究されたいくつかの糖修飾のうち、２’−フルオロまたは２’−アルコキシなどの電気陰性置換基を組み入れることにより、糖高次構造が３’エンド（ノーザン）歪み高次構造の方に変化する。これにより、オリゴヌクレオチドを予め組織化して、Ａ型高次構造形状を有するようにこのような修飾を組み入れる。このＡ型高次構造は、標的ＲＮＡ鎖に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性の増大を生じる。
【０１２０】
本発明に受け入れられる、生じる二重鎖に対してＡ型の高次構造特性を与える代表的な２’置換基（３’−エンド）は、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−置換されたアルキル、および２’−フルオロ置換基を含む。種々のアルキルおよびアリールエーテルおよびチオエーテル、アミンおよびモノアルキルおよびジアルキル置換アミンは、置換基のために適している。選択された適用における活性（しかし、限定されない）などの性質を増強するために、本発明のオリゴマー化合物の１つもしくは複数に対して、１つもしくは複数の単量体サブユニット（ヌクレオシドが適している）の複数部位およびまたはヌクレオシド間結合に、複数の修飾を行うことができることがさらに企図される。
【０１２１】
天然および修飾された核酸塩基
また、オリゴマー化合物は、核酸塩基（当技術分野において、複素環塩基として、または単に「塩基」といわれることが多い）の修飾または置換を含んでいてもよい。本明細書に使用される、「無修飾」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、５‐メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５‐ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル並びにアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、２−プロピル並びにアデニンおよびグアニンのその他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン並びにピリミジン塩基のその他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、並びにその他の８置換されたアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、並びにその他の５置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどのその他の合成および天然の核酸塩基を含む。さらに修飾された核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換されたフェノキサジンシチジン（たとえば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧ−クランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）などの三環系のピリミジンを含む。また、修飾された核酸塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が、その他の複素環、たとえば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、および２−ピリドンで置換されたものを含んでもよい。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されたもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉ��ｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されたものを含む。一定のこれらの核酸塩基は、特に本発明の化合物の結合親和性を増大するために有用である。これらは、５−置換されたピリミジン、６−アザピリミジン、並びに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換されたプリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０．６〜１．２℃まで核酸二重鎖安定性を増大すること、および特に２’−Ｏ−メトキシメチル糖修飾と組み合わせたときに、現在適切な塩基置換であることが示された。
【０１２２】
いくつかの上記の修飾された核酸塩基、並びにその他の修飾された核酸塩基の調製を教示する代表的な米国特許は、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、並びに以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる：第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号；および第５，６８１，９４１号、並びに米国特許５，７５０，６９２号（これは、本明細書に参照として組み入れられる）。
【０１２３】
また、本発明のオリゴマー化合物は、１つまたは複数の複素環塩基部分の代わりに多環式複素環化合物を含むことができる。多くの三環系の複素環化合物が以前に報告されている。これらの化合物は、標的鎖に対する修飾された鎖の結合性質を増大するために、アンチセンス適用において日常的に使用されている。最も研究された修飾は、グアノシンに対してターゲットされ、それゆえ、これらは、Ｇ−クランプまたはシチジン類似体と呼ばれた。第２の鎖のグアノシンと３つの水素結合を生じる代表的なシトシン類似体は、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１〜Ｒ１４＝Ｈ）（Ｋｕｒｃｈａｖｏｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，１８３７−１８４６）、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｓ、Ｒ１１〜Ｒ１４＝Ｈ）（Ｌｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９５，１１７，３８７３−３８７４）、および６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１〜Ｒ１４＝Ｆ）（Ｗａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９８，３９，８３８５−８３８８）を含む。オリゴヌクレオチドに組み入れると、これらの塩基修飾は、相補的なグアニンとハイブリダイズすることが示され、後者がアデニンとハイブリダイズし、スタッキング相互作用を拡張することによってヘリックスの熱安定性を増強することが示された（また、２００２年５月２４日に出願された表題「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」の米国特許出願第１０／１５５，９２０号；および２００２年５月２４日に出願された表題「Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の米国特許出願第１０／０１３２９５号を参照されたい（これらは両方とも、これらの全体が共通に本明細書に参照として組み入れられる））。
【０１２４】
シトシン類似体／置換が、強固な１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン足場（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１＝−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｒ１２−１４＝Ｈ）に付着されたアミノエトキシ部分を有するときに、さらなるヘリックス安定化特性が観察された（Ｌｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，８５３１−８５３２）。結合研究により、単一の組み込みにより、５−メチルシトシン（ｄＣ５ｍｅ）と比較して、１８°までのΔＴｍで、モデル・オリゴヌクレオチドの、その相補的標的ＤＮＡまたはＲＮＡに対する結合親和性を増強することができることが証明され、これは、なおも単一の修飾について公知の最高の親和性の増強である。一方、ヘリックスの安定性の増加は、オリゴヌクレオチドの特異性を損なわない。
【０１２５】
本発明に使用することが受け入れられるさらなる三環系の複素環化合物およびこれらを使用する方法は、２０００年５月２２日に発行された米国特許第６，０２８，１８３号、および１９９９年１２月２８日に発行された米国特許第６，００７，９９２号に開示されている（いずれの内容も、これらの全体が本明細書に組み入れられる）。
【０１２６】
フェノキサジン誘導体の増強された結合親和性は、これらの配列特異性が損なわれていないことと共に、これらをより強力なアンチセンスに基づいた薬物の開発のための価値のある核酸塩基の類似体にする。実際に、フェノキサジン置換を含むヘプタヌクレオチドが、ＲＮａｓｅ  Ｈを活性化すること、細胞取り込みを増強すること、およびアンチセンス活性の増大を示すことができることを証明する有望なデータが、インビトロでの実験で導き出された（Ｌｉｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，８５３１−８５３２）。単一の置換により、２０ｍｅｒの２’−デオキシホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドのインビトロでの能力を有意に改善することが示されたとおり（Ｆｌａｎａｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，３５１３−３５１８）、活性の増強は、Ｇ−クランプの場合にさらに明白であった。それにもかかわらず、オリゴヌクレオチド・デザインを最適化するために、および生物活性に対するこれらの複素環式修飾の影響をよりよく理解するために、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性に対するこれらの効果を評価することが重要である。
【０１２７】
複素環塩基として有用なさらなる修飾された多環式複素環化合物は、上記の米国特許第３，６８７，８０８号、並びに以下の米国特許：第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４３４，２５７号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号；第５，５９６，０９１号；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，６４６，２６９号；第５，７５０，６９２号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号；および第５，６８１，９４１号、並びに２００１年１１月２８日に出願された米国特許出願第０９／９９６２９２号に開示されているが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる。
【０１２８】
抱合体
本発明のアンチセンス化合物のもう一つの修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、もしくは細胞取り込みを増強する１つまたは複数の部分または抱合体をオリゴマー化合物に対して化学的に連結することを含む。これらの部分または抱合体は、一級または二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合された基を含むことができる。本発明の抱合体基は、インターカレーター、リポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的性質を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態学的性質を増強する基を含む。典型的な抱合基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレッセイン、ローダミン、クマリン、および染料を含む。薬力学的性質を増強する基は、本発明の状況において、取り込みを改善する基、耐崩壊性を増強する基、および／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。薬物動態学的性質を増強する基は、本発明の状況において、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排出を改善する基を含む。代表的抱合体基は、１９９２年１０月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号および米国特許第６，２８７，８６０号（その全ての開示が、参照として本明細書に組み入れられる）に開示されている。抱合体部分は、コレステロール部分、コール酸、チオエーテル、たとえば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪族鎖、たとえば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、たとえば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホナート、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール部分などの脂質部分を含むが、これらに限定されない。また、本発明のアンチセンス化合物は、活性な原体、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾサイアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈｉｃｉｎ）、バルビツール剤、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬、または抗生物質に対して抱合してもよい。オリゴヌクレオチド−薬物複合体およびこれらの調製は、米国特許出願第０９／３３４１３０号（１９９９年６月１５日に出願された）に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２９】
このようなオリゴヌクレオチド抱合体の調製を教示する米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる：第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，２１８，１０５号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号；第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４１号；第４，８３５，２６３号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号；第５，３９１，７２３号；第５，４１６，２０３号；第５，４５１，４６３号；第５，５１０，４７５号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号；第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号。
【０１３０】
また、たとえばヌクレアーゼ安定性などの性質を増強するために、オリゴマー化合物を、一般にオリゴマーの鎖の一方または両方の末端に付着されている１つまたは複数の安定化基を有するように修飾することができる。安定化基に含まれるものには、キャップ構造がある。「キャップ構造または末端キャップ部分」は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端組み込まれた化学修飾を意味する（たとえばＷｉｎｃｏｔｔら、国際公開公報第９７／２６２７０号を参照されたい、参照として本明細書に組み入れられる）。これらの末端修飾は、エキソヌクレアーゼ分解から末端核酸分子を有するオリゴマー化合物を保護して、細胞内のデリバリーおよび／または局在化を補助することができる。キャップは、５’末端（５’−キャップ）に、または３’末端（３’−キャップ）に、いずれかに存在することができ、または一本鎖の両方の末端に、もしくは二本鎖化合物の両方の鎖の１つもしくは複数の末端に存在することができる。このキャップ構造は、天然のｍＲＮＡ分子の５’末端に存在する反転したメチルグアノシン「５’キャップ」と混乱しないことである。非限定の例において、５’−キャップは、以下を含む：反転した塩基のない残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド（ｒｉｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、３’−３’反転したヌクレオチド部分；３’−３’反転した塩基のない部分；３’−２’反転したヌクレオチド部分；３’−２’反転した塩基のない部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；３’−ホスホラミダート；ヘキシルホスフェート；アミノヘキシルホスフェート；３’−ホスフェート；３’−ホスホロチオアート；ホスホロジチオアート；または架橋もしくは非架橋メチルホスホナート部分（より詳細については、Ｗｉｎｃｏｔｔら、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ９７／２６２７０号を参照されたい、本明細書に参照として組み入れられる）。ｓｉＲＮＡ構築物については、５’末端（５’キャップ）は、一般に５’−ヒドロキシルまたは５’−ホスフェートであるが、これらに限定されない。
【０１３１】
特に適した３’−キャップ構造は、例えば４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノアルキル−ホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１，２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；α−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオアート；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’反転したヌクレオチド部分；５’−５’反転した塩基のない部分；５’−ホスホラミダート；５’−ホスホロチオアート；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホラミダート、ホスホロチオアート、および／またはホスホロジチオアート、架橋もしくは非架橋メチルホスホナート、および５’−メルカプト部分（より詳細については、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＴｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５を参照されたい；本明細書に参照として組み入れられる）。
【０１３２】
ヌクレアーゼ安定性を与えるためにオリゴマー化合物のキャップの一方または両方の末端に使用することができるさらなる３’および５’安定化基は、２００３年１月１６日に発行された国際公開公報第０３／００４６０２号に開示されたものを含む。
【０１３３】
キメラ化合物
所与のアンチセンス化合物の全ての位置を均一に修飾することは必要とされず、実際に、上述した修飾のうちの１つ以上が、単一化合物に、またはアンチセンス化合物内の単一のヌクレオシド内にさえ組み入れてもよい。
【０１３４】
また、本発明は、キメラ化合物であるアンチセンス化合物を含む。「キメラ」アンチセンス化合物または「キメラ」は、本発明の状況において、それぞれが少なくとも１つの単量体単位（すなわちオリゴヌクレオチド化合物の場合、ヌクレオチド）で作製された２つ以上の化学的に異なった領域を含む一本鎖または二本鎖アンチセンス化合物（例えばオリゴヌクレオチド）である。キメラ・アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の１つの形態である。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的にはオリゴヌクレオチドに対して、ヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大、電荷の変化、安定性の増大、および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を与えるように修飾された少なくとも１つの領域を含む。オリゴヌクレオチドのさらなる領域は、ＲＮＡｓｅｓまたはその他の酵素の基質として役立ってもよい。例として、ＲＮＡｓｅ  Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮａｓｅ  Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、これにより遺伝子発現のオリゴヌクレオチドを媒介した阻害の効率が非常に増強する。ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの切断は、同様の様式で、細胞およびウイルスのＲＮＡの両方を切断するＲＮａｓｅ  ＩＩＩまたはＲＮＡｓｅＬなどのエンドリボヌクレアーゼの作用を介して達成することができる。ＲＮＡ標的の切断産物は、ゲル電気泳動および必要に応じて、当技術分野において公知の関連した核酸ハイブリダイゼーション技術によってルーチンで検出することができる。
【０１３５】
本発明のキメラ・アンチセンス化合物は、上記の通りに、２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチド擬態の複合構造として形成されてもよい。また、このような化合物は、当技術分野においてハイブリッドまたはギャップマーともいわれる。このようなハイブリッド構造物の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書にその全体が参照として組み入れられる：第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；および第５，７００，９２２号。
【０１３６】
塩、プロドラッグ、および生物学的同等物
本発明のアンチセンス化合物は、任意の薬学的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物に対して投与することにより、これらの生物学的に活性な代謝産物または残基を（直接または間接的に）提供することができる任意のその他の化合物を包含する。従って、たとえば、本開示は、本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容される塩、このようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、およびその他の生物学的同等物ももたらす。
【０１３７】
「プロドラッグ」という用語は、内因性酵素もしくはその他の化学物質および／または条件の作用によって、これらの体または細胞内で活性型（すなわち薬物）に変換される不活性型または低活性型に調製される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ・バージョンは、１９９３年１２月９日に公表されたＧｏｓｓｅｌｉｎらに対する国際公開公報第９３／２４５１０号に、またはＩｍｂａｃｈらに対する国際公開公報第９４／２６７６４号に開示された方法に従って、ＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチルリン酸）誘導体として調製される。
【０１３８】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理的および薬学的に許容される塩：すなわち、親化合物の所望の生物活性を保持し、かつそれに対して望まれない中毒学的効果を与えない塩をいう。
【０１３９】
薬学的に許容される塩基付加塩は、アルカリおよびアルカリ土類金属もしくは有機アミンなどの金属またはアミンで形成される。陽イオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、等である。適切なアミンの例は、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、およびプロカインである（たとえば、Ｂｅｒｇｅら、“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１−１９を参照されたい）。前記酸性化合物の塩基付加塩は、遊離酸形態を所望の塩基の十分な量と接触させて、慣用的方法で塩を生成することによって調製される。遊離酸形態は、塩形態を酸と接触させること、および慣用的方法で遊離酸を単離することによって再生してもよい。遊離酸形態は、極性溶媒中における溶解度などの一定の物性において、これらのそれぞれの塩形態といくぶん異なるが、さもなければ、塩は、本発明の目的のためのこれらのそれぞれの遊離酸と同等である。本明細書で使用される「薬学的付加塩」は、本発明の組成物の成分のうちの１つの酸形態の薬学的に許容される塩を含む。これらは、アミンの有機または無機酸の塩を含む。酸性塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸、硝酸塩、およびリン酸塩である。その他の適切な薬学的に許容される塩が当業者に周知であり、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸またはリン酸などの無機酸と；有機カルボン酸、スルホン酸、スルホ酸、もしくはホスホ酸、またはＮ置換されたスルファミン酸、たとえば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシ・マレイン酸、シトラコン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、乳酸、シュウ酸、グルコン酸、グルカル酸、グルクロン酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、サリチル酸、４−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、２−アセトキシ安息香酸、エンボ酸（ｅｍｂｏｎｉｃ）、ニコチン酸、またはイソニコチン酸と；および、天然においてタンパク質の合成に関与する２０αアミノ酸、たとえばグルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸と、更にフェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、エタン−１，２−二スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−メチルベンゼンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ナフタレン−１，５−二スルホン酸、２−もしくは３−ホスホグリセリン酸、グルコース−６−リン酸、Ｎ−シクロヘキシルスルファミン酸（シクラメートを形成して）と、またはアスコルビン酸などのその他の酸性有機化合物となどの、たとえば種々の無機酸および有機酸の塩基性塩を含む。また、薬学的に許容される陽イオンで、化合物の薬学的に許容される塩を調製してもよい。適切な薬学的に許容される陽イオンは、当業者に周知であり、アルカリ、アルカリ土類、アンモニウム、および四級アンモニウムカチオンを含む。また、炭酸塩または酸性炭酸塩であることもできる。
【０１４０】
オリゴヌクレオチドについては、薬学的に許容される塩の例は、以下を含むが、これらに限定されない：（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどの陽イオン、スペルミンおよびスペルミジン、その他などのポリアミンと形成された塩；（ｂ）無機酸、たとえば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成された酸付加塩；（ｃ）たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロ酸などの有機酸と形成された塩；並びに（ｄ）塩素、臭素、およびヨウ素などの基本的陰イオンから生じた塩。アンチセンス・オリゴヌクレオチドのナトリウム塩は、有用であり、ヒトに対する治療的投与のために十分に受け入れられる。もう一つの態様において、ｄｓＲＮＡ化合物のナトリウム塩も提供される。
【０１４１】
Ｇ．  製剤
また、本発明の化合物は、取り込み、分布、および／または吸収を助けるために、混合され、カプセル化され、抱合され、またはさもなければその他の分子、分子構造、もしくは化合物の混合物、たとえばリポソーム、受容体にターゲットされる分子、経口、直腸、局所的、またはその他の製剤と結合されていてもよい。このような取り込み、分布、および／または吸収を助ける製剤の調製を教示する代表的な米国特許は、以下の米国特許を含むが、これらに限定されず、そのそれぞれが、本明細書に参照として組み入れられる：第５，１０８，９２１号；第５，３５４，８４４号；第５，４１６，０１６号；第５，４５９，１２７号；第５，５２１，２９１号；第５，５４３，１５８号；第５，５４７，９３２号；第５，５８３，０２０号；第５，５９１，７２１号；第４，４２６，３３０号；第４，５３４，８９９号；第５，０１３，５５６号；第５，１０８，９２１号；第５，２１３，８０４号；第５，２２７，１７０号；第５，２６４，２２１号；第５，３５６，６３３号；第５，３９５，６１９号；第５，４１６，０１６号；第５，４１７，９７８号；第５，４６２，８５４号；第５，４６９，８５４号；第５，５１２，２９５号；第５，５２７，５２８号；第５，５３４，２５９号；第５，５４３，１５２号；第５，５５６，９４８号；第５，５８０，５７５号；および第５，５９５，７５６号。
【０１４２】
また、本発明は、本発明のアンチセンス化合物を含む薬学的組成物および製剤を含む。本発明の薬学的組成物は、局部的または全身性の治療が要求されるかどうかに応じて、および治療される領域に応じて、多くの方法で投与してもよい。投与は、局所的（眼並びに膣および直腸のデリバリーを含む粘膜を含む）、経肺、たとえば噴霧器によるものを含む粉末もしくはエアロゾルの吸入またはガス注入によって；気管内、鼻腔内、経上皮、および経皮）、経口的、または非経口的であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射または注入；または頭蓋内、たとえばクモ膜下もしくは心室内投与を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシメチル修飾をもつオリゴヌクレオチドは、特に経口投与のために有用であると考えられている。透過増強剤は、経口的に投与されたオリゴヌクレオチドの生物学的利用能を増強することが見いだされた。透過増強剤は、界面活性物質、胆汁酸塩、脂肪酸、キレート薬、または非キレート界面活性物質を含む。カプリン酸（Ｃ１０）および／またはラウリン酸（Ｃ１２）、並びにこれらの塩は、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能（ｂｉａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を増強するための有効な脂肪酸であることが示されたものの一つである；ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）およびケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）は、オリゴヌクレオチドの生物学的利用能（ｂｉａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）を増強するための有効な胆汁酸塩であることが示されたものの一つである。また、遅放性（たとえば、パルスまたは拍動性放出）製剤および徐放性製剤は、生物学的利用能を増強するために有用である。生体付着性材料は、粘膜の膜に対する薬物キャリア粒子を付着して、取り込みを増強するために添加してもよい。
【０１４３】
局所的投与のための薬学的組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体、および粉末を含んでもよい。従来の薬学的キャリア、水性、粉末、または油性基材、増粘剤等が必要であっても、または望ましくかもしれない。また、被覆コンドーム、手袋なども有用かもしれない。
【０１４４】
本発明の薬学的製剤は、便利には、単位用量形態で提示されてもよく、医薬品工業において周知の従来技術に従って調製してもよい。このような技術は、薬学的キャリアまたは賦形剤と活性成分を結合させる工程を含む。一般に、製剤は、液体キャリアもしくは微粉固体キャリア、または両方と活性成分を均一かつ完全に結合させ、次いで、必要に応じて、生成物を成形することによって調製される。
【０１４５】
本発明の組成物は、タブレット、カプセル、ゲル・カプセル、液体シロップ、柔らかいゲル、坐薬、および浣腸などの（しかし、これらに限定されない）任意の多くの可能性剤形に処方してもよい。また、本発明の組成物は、水溶性、非水溶性、または混合された媒体中に懸濁液として処方してもよい。水性懸濁液は、たとえば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増大する物質をさらに含んでもよい。また、懸濁液は、安定剤を含んでもよい。
【０１４６】
本発明の薬学的組成物は、溶液、エマルジョン、フォーム、およびリポソームを含む製剤を含むが、これらに限定されない。本発明の薬学的組成物および製剤は、１つまたは複数の透過増強剤、キャリア、賦形剤、またはその他の活性もしくは不活性成分を含んでもよい。
【０１４７】
エマルジョンは、典型的には、通常直径０．１μｍを越える液滴の形態で別のものに分散された１つの液体の不均一な系である。エマルジョンは、分散相と活性薬物（これは、水相、油相、または分離相としてそれ自体のいずれかに溶液として存在してもよい）とに加えてさらなる成分を含んでもよい。ミクロエマルジョンは、本発明の態様として含まれる。エマルジョンおよびこれらの用途は、当技術分野において周知であり、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。
【０１４８】
本発明の製剤は、リポソーム製剤を含む。本発明に使用される「リポソーム」という用語は、球面二重層に配置された両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料および送達される組成物を含む水性内部から形成された膜を有する単層または多層状の小胞である。陽イオン性リポソームは、正に荷電したリポソームであり、負に荷電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられている。ｐＨ感受性または負に荷電したリポソームは、これと複合体をなすのではなく、むしろＤＮＡに入り込むと考えられている。陽イオン性および非陽イオン性リポソームは、ＤＮＡを細胞に送達するために使用されてきた。
【０１４９】
また、リポソームは、「立体的に安定化された」リポソームを含み、本明細書に使用されるこの用語は、リポソームに組み込まれたときに、このような特定化された脂質を欠いているリポソームと比較して、増強された循環寿命を生じる１つまたは複数の特定化された脂質を含むリポソームをいう。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が１つもしくは複数の糖脂質を含むか、または１つもしくは複数のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの親水性重合体で誘導体化されたものである。リポソームおよびこれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。
【０１５０】
また、本発明の薬学的製剤および組成物は、界面活性物質を含んでいてもよい。製剤、処方、およびエマルジョンにおける界面活性物質の使用は、当技術分野において周知である。界面活性物質およびこれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。
【０１５１】
一つの態様において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的なデリバリーを行うために種々の透過増強剤を使用する。また、透過増強剤は、細胞膜全体の非親油性薬物の拡散を助けることに加えて、親油性薬物の透過性を増強する。透過増強剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性物質、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート薬、非キレート非界面活性物質のうちの１つに属するものとして分類してもよい。透過増強剤およびこれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。透過増強剤として作用する種々の脂肪酸およびこれらの誘導体は、たとえば、オレイン酸、ラウリン酸（Ｃ１２）、カプリン酸（Ｃ１０）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、レシンレアート（ｒｅｃｉｎｌｅａｔｅ）、モノレイン酸（ａ．ｋ．ａ．  １−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン酸、カプリル酸、アラキドン酸（ａｒｉｃｈｉｄｏｎｉｃ）、グリセリル  １−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、モノ−およびジ−グリセリド、並びにこれらの生理的に許容される塩（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩、その他）を含む（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，８：２，９１−１９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７：１，１−３３；Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。いくつかの脂肪酸の例には、カプロン酸ナトリウム（Ｃ１０）およびラウリン酸ナトリウム（Ｃ１２）があり、０．５〜５％の濃度で単独または組み合わせて使用される。
【０１５２】
例示的な胆汁酸塩は、たとえば、コール酸（または、その薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ）（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシ−コール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシ−コール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）を含む（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ  ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０，ｐａｇｅｓ  ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。ＵＤＣＡおよびＣＤＣＡは、オリゴヌクレオチドのための透過増強剤として効率的に使用されており、組み合わせらたときに、より効率的であった。
【０１５３】
１つまたは複数の胆汁酸塩および１つまたは複数の脂肪酸を含む複合製剤、特にラウリン酸塩およびカプリン酸塩と組みあわせたＣＤＣＡ（ＵＤＣＡの有無にかかわらず）は、さらに有効であった（１９９８年７月１日に出願された米国特許出願第０９／１０８６７３号、Ｔｅｎｇ  ａｎｄ  Ｈａｒｄｅｅ）。
【０１５４】
当業者であれば、これらの使用目的、すなわち投与の経路にしたがってルーチンで製剤がデザインされることを認識するであろう。
【０１５５】
局所的投与のための製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが局所的なデリバリー薬剤（例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート薬および界面活性物質）との混合物中にあるものを含む。脂質およびリポソームは、中性の（たとえば、ジオレイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、負の（たとえば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、および陽イオン性の（たとえば、ジオレイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）ものを含む。
【０１５６】
局所的またはその他の投与については、本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内にカプセル化してもよく、またはそれに対して、特に陽イオン性リポソームに対して複合体を形成させてもよい。あるいは、オリゴヌクレオチドは、脂質に、特にカチオン脂質に対して複合となってもよい。脂肪酸およびエステル、これらの薬学的に許容される塩、並びにこれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。局所製剤は、１９９９年５月２０日に出願された米国特許出願第０９／３１５２９８号に詳述されており、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
経口投与のための組成物および製剤は、粉末または顆粒、ミクロ粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体の懸濁液または溶液、カプセル、ゲル・カプセル、サッシェ、タブレット、またはミニタブレットを含む。増粘剤、香料、希釈液、乳化剤、分散援助剤、または結合剤が望ましい。経口製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドを１つまたは複数の透過増強剤界面活性物質およびキレート薬とともに投与するものである。界面活性物質は、脂肪酸および／またはエステルまたはこれらの塩、胆汁酸および／またはこれらの塩を含む。胆汁酸／塩および脂肪酸並びにこれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。また、透過増強剤、例えば胆汁酸／塩との組み合わせた脂肪酸／塩の組み合わせも適している。１つの組み合わせは、ラウリン酸のナトリウム塩、カプリン酸、およびＵＤＣＡである。さらなる透過増強剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧された乾燥粒子を含む粒状形態で、またはマイクロもしくはナノ粒子を形成するように複合体にして経口的に送達してもよい。オリゴヌクレオチド複合化剤およびこれらの使用は、米国特許第６，２８７，８６０号にさらに記載されており、その全体が本明細書に組み入れられる。オリゴヌクレオチドのための経口製剤およびこれらの調製は、米国出願第０９／１０８６７３号（１９９８年７月１日に出願された）、第０９／３１５２９８号（１９９９年５月２０日に出願された）、および２００２年２月８日に出願された第１０／０７１８２２号に詳述されており、そのそれぞれが、参照としてこれらの全体が本明細書に組み入れられる。
【０１５８】
非経口的、くも膜下腔内、または脳室内投与のための組成物および製剤は、透過増強剤、キャリア化合物、およびその他の薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤などの（しかし、限定されない）緩衝液、希釈液およびその他の適切な添加物をまた含んでもよい無菌の水溶液を含んでもよい。
【０１５９】
本発明のある態様は、１つまたは複数のオリゴマー化合物と１つまたは複数の非アンチセンス機構によって機能するその他の化学療法薬とを含む薬学的組成物を提供する。このような化学療法薬の例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、マホスファミド（ｍａｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素（ｂｉｓ−ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロランブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素（ｍｅｔｈｙｌｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ニトロゲンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホルアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、テニポシド、シスプラチン、ペメトレキシド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、およびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）などの癌化学療法薬。本発明の化合物と共に使用するときに、このような化学療法薬は、個々に（たとえば、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、経時的に（たとえば、期間中の５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、続くＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１つもしくは複数のその他のこのような化学療法薬と組み合わせて（たとえば、５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射線療法、およびオリゴヌクレオチド）使用してもよい。また、リビビリン（ｒｉｂｉｖｉｒｉｎ）、ビダラビン、アシクロビル、およびガンシクロビルを含むが、これらに限定されない非ステロイド系抗炎症薬および副腎皮質ステロイド、並びに抗ウイルス剤を含むが、これらに限定されない抗炎症剤は、本発明の組成物中に組み合わせてもよい。また、アンチセンス化合物およびその他の非アンチセンス薬物の組み合わせも、本発明の範囲内である。２つ以上組み合わせた化合物を、共に、または経時的に使用してもよい。
【０１６０】
もう一つの関連した態様において、本発明の組成物は、第１の核酸にターゲットされた１つまたは複数のアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドと、第２の核酸標的にターゲットされた１つまたは複数のさらなるアンチセンス化合物とを含んでもよい。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域に対してターゲットされる２つ以上のアンチセンス化合物を含んでもよい。アンチセンス化合物の多数の例が、当技術分野において公知である。２つ以上組み合わせた化合物を、共に、または経時的に使用してもよい。
【０１６１】
Ｈ．  投薬
本明細書に使用される「患者」という用語は、ｅＩＦ４Ｅ発現または過剰発現と関連する１つもしくは複数の障害で苦しむ哺乳類をいう。最も望まれる患者は、ヒトであることが理解される。また、本発明は、哺乳類ｅＩＦ４Ｅ発現または過剰発現の特異的阻害に関することが理解される。
【０１６２】
当業者は、現在障害で苦しむ患者を本発明の化合物の有効な量で治療することによって、ｅＩＦ４Ｅ発現または過剰発現と関連する障害に影響を及ぼし得ることが認識される。従って、「治療」および「治療すること」という用語は、本明細書に記載されている障害の進行を緩徐化し、中断し、抑え、制御し、遅延し、または中止し得る全てのプロセスをいうことが企図され、必ずしも全ての症状の全体を除去することを示すわけではない。
【０１６３】
本明細書に使用される、本発明の化合物の「有効な量」または「治療上有効な量」という用語は、本明細書に記載されている障害を治療または防止する際に有効である量をいう。
【０１６４】
治療組成物の製剤およびこれらのその後の投与（投薬）は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。投薬は、数日から数月続く治療期間、または治癒が遂行されるか、もしくは疾病状態の縮小が達成されるまでと共に、治療される疾病状態の重篤さおよび応答性に依存的である。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積を測定することにより算出することができる。当業者であれば、最適用量、投薬法、および反復速度を容易に決定することができる。最適用量は、個体のオリゴヌクレオチドの相対的な能力に応じて変化してもよく、一般にインビトロで、およびインビボでの動物モデルにおいて有効であることが見いだされたＥＣ５０に基づいて推定することができる。一般に、用量は、体重のｋｇあたり０．０００１μｇ〜１００ｇであり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年、またはさらに２〜２０年ごとに一度、一回または複数回与えてもよい。一部の態様において、用量は、体重のｋｇあたり０．０００１μｇ〜１００μｇ、体重のｋｇあたり０．００１μｇ〜１０ｇ、体重のｋｇあたり０．０１μｇ〜１ｇ、体重のｋｇあたり０．１μｇ〜１００ｇ、体重のｋｇあたり１μｇ〜１０ｍｇ、体重のｋｇあたり１０μｇ〜１ｍｇ、体重のｋｇあたり１００μｇ〜５００ｍｇであり、毎日、毎週、毎月、もしくは毎年、またはさらに２〜２０年ごとに一度、一回または複数回与えてもよい。二本鎖化合物については、用量は、第２の鎖の増大された核酸負荷（２つの鎖を含む化合物について）またはさらなる核酸長（自己相補的な化合物について）に相当するように算出しなければならない。当業者であれば、測定された体液または組織中の薬物の滞流時間および濃度に基づいて、投薬に関する反復割合を容易に推定することができる。
【０１６５】
オリゴヌクレオチドの吸光度、分布、代謝、および排出（ひとまとめにして、ＡＤＭＥとして公知）に対して多くの研究がなされてきた。ＡＤＭＥは、所与の化学の全ての配列（たとえば、Ｐ＝Ｓバックボーンをもつ全て２’ＭＯＥギャップマー）が水溶性、分子量（約７０００）、およびｐＫａなどの同様の物理的／化学的性質を有する独立した配列である。オリゴヌクレオチドは、組織に、主に（しかし、限定されない）肝臓、腎臓、脾臓、および骨髄に分布することによって比較的迅速に血漿から除去される（分布半減期約１時間、２４時間までに完全な分布）。腎臓、肝臓、骨髄、脂肪組織、脾臓、リンパ節、肺（エアロゾルを経て）、および中枢神経系（脳室内に与える）を含む組織において、薬物動態と薬動力学との間の強力な相関が証明された。組織半減期は、第一世代アンチセンス医薬（ホスホロチオアート・バックボーンをもつ２’−デオキシ）について１〜５日であり、ホスホロチオアート・バックボーンをもつ２’−ＭＯＥギャップド・オリゴヌクレオチドについて１０〜２８日である。Ｈｅｎｒｙら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ，２００１，２，１４４４−１４４９。
【０１６６】
治療成功に続いて、疾病状態の再発を防止するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましく、オリゴヌクレオチドが、体重のｋｇあたり０．０００１μｇ〜１００ｇまでの範囲での維持量で、毎日から２０年ごと一度、一回または複数回投与される。
【０１６７】
本発明は、一定のその態様に従った特異性で記載してあるが、以下の実施例は、本発明を例示するだけであり、これを限定することは企図されない。本出願において引用された各々の参照、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号などは、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６８】
実施例１：ヌクレオシド・ホスホラミダイトの合成
アミダイトおよびこれらの中間体を含む以下の化合物は、米国特許第６，４２６，２２０号および発行されたＰＣＴ国際公開公報第０２／３６７４３号に記載されているように調製した；５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン中間体、５−メチル−ｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−５−メチルシチジン中間体、５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン最後から２番目の中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（５−メチルｄＣアミダイト）、２’−フルオロデオキシアデノシン、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、２’−フルオロデオキシシチジン、２’−Ｏ−（２−メトキシメチル）修飾アミダイト、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン中間体、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン最後から２番目の中間体、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥ  Ｔアミダイト）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−シチジン最後から２番目の中間体、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥ  ５−Ｍｅ−Ｃアミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥ  Ａ  アミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−イソブチルグアノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（ＭＯＥ  Ｇアミダイト）、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、および２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（（２−フタリミドオキシ）エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（（２−ホルマドキシミノオキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅ��ｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ  ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト）、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト）、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル））−５−メチルウリジン、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル））−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホラミダイト。
【０１６９】
２’−デオキシおよび２’−メトキシアミダイト
２’−デオキシおよび２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトは、市販の供与源（たとえば、Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ  または  Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）から購入した。その他の２’−Ｏ−アルコキシ置換されたヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，５０６，３５１号（これは、本明細書に参照として組み入れられる）に記載されているように調製した。２’−アルコキシアミダイトを使用して合成されるオリゴヌクレオチドについては、テトラゾールおよび塩基のパルス・デリバリー後の待機工程を３６０秒まで増大したことを除いて、無修飾オリゴヌクレオチドのための標準的なサイクルは利用した。
【０１７０】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−Ｍｅ−Ｃ）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、商業的に入手可能なホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡまたは  ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を使用して、発行された方法（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ  ｏｒ  Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）にしたがって合成した。
【０１７１】
２’−フルオロアミダイト
２’−フルオロ・オリゴヌクレオチドは、以前（Ｋａｗａｓａｋｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１）および米国特許第５，６７０，６３３号（本明細書に参照として組み入れられる）に記載されているとおりに合成した。簡潔には、保護されたヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを、出発原料として商業的に入手可能な９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを利用して、文献手順を修飾することによって合成し、これにより、２’−α−フルオロ原子が２’−β−トリチル基のＳＮ２−置換によって導入される。こうして、Ｎ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを３’，５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体として適度な収率で選択的に保護した。ＴＨＰおよびＮ６−ベンゾイル基の脱保護は、標準的な方法論を使用して達成し、５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホラミダイト中間体を得るために標準的な方法を使用した。
【０１７２】
２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンの合成は、開始材料としてテトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護された９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを、および中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンへの転換を使用して達成した。ＴＰＤＳ基の脱保護をＴＨＰでのヒドロキシル基の保護によって行い、ジイソブチリルジ−ＴＨＰ被保護アラビノフラノシルグアノシンを得た。選択的なＯ−脱アシルおよびトリフレート化（ｔｒｉｆｌａｔｉｏｎ）をフッ化物での粗生成物の処置によって行い、次いでＴＨＰ基を脱保護した。５’−ＤＭＴ−および５’−ＤＭＴ−３’−ホスホラミダイトを得るために、標準的な方法を使用した。
【０１７３】
２’−デオキシ２’−フルオロウリジンの合成は、２，２’−無水−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルを７０％のフッ化水素−ピリジンで処置するという文献手順を修飾することによって達成した。標準的方法を使用して５’−ＤＭＴおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホラミダイトを得た。
【０１７４】
２’−デオキシ２’−フルオロシチジンを２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化、続く選択的な保護を経て合成し、Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得た。標準的な方法を使用して５’−ＤＭＴおよび５’−ＤＭＴ−３’ホスホラミダイトを得た。
【０１７５】
２’−Ｏ−（２−メトキシメチル）修飾されたアミダイト
２’−Ｏ−メトキシメチル置換されたヌクレオシドアミダイトは、Ｍａｒｔｉｎ，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０．の方法に従って調製される。
【０１７６】
２’−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
アミノオキシエチルおよびジメチルアミノオキシエチルアミダイトは、米国特許出願第６，１２７，５３３号（本明細書に参照として組み入れられる）の方法に従って調製される。
【０１７７】
実施例２：オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成
本発明に従って使用されるオリゴマー化合物は、周知の固相合成の技術を介して、便利かつルーチンで作製してもよい。このような合成のための設備は、たとえば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含むいくつかの売り手によって販売されている。加えて、またはあるいは、当技術分野において公知のこのような合成のための任意のその他の手段を使用してもよい。ホスホロチオアートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製するために同様の技術を使用することも周知である。
オリゴヌクレオチド：非置換および置換されたリン酸ジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドは、ヨウ素による酸化での標準的なホスホラミダイト化学を使用して自動化ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４）で合成される。
【０１７８】
ホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）は、以下の例外を除いてリン酸ジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成される：硫化は、亜リン酸結合の酸化のための、３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシドの１０％  ｗ／ｖアセトニトリル溶液を利用することによって遂行した。硫化反応段階の時間は、１８０秒まで増大し、正常なキャッピング工程の後におこなった。ＣＰＧカラムからの切断および５５℃（１２〜１６時間）での濃水酸化アンモニウム中におけるデブロッキングの後、オリゴヌクレオチドを１ＭのＮＨ４ＯＡｃ溶液から＞３体積のエタノールで沈殿させることによって回収した。ホスフィナートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，５０８，２７０号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
【０１７９】
アルキルホスホナートオリゴヌクレオチドは、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８０】
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホナートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６１０，２８９号または第５，６２５，０５０号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８１】
ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８２】
アルキルホスホノチオアートオリゴヌクレオチドは、発行されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号および第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６号（それぞれ、国際公開公報第９４／１７０９３号および国際公開公報第９４／０２４９９号として公表された）に記載されているように調製され、これらは、本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８３】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホラミダート・リゴヌクレオチドは、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されているように調製され、これは本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８４】
リン酸トリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，０２３，２４３号に記載されているように調製され、これは明細書に参照として組み入れられる。
【０１８５】
ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第５，１３０，３０２号および第５，１７７，１９８号に記載されているように調製され、これらは、両方とも本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８６】
４’−チオ含有オリゴヌクレオチドは、米国特許第５，６３９，８７３号に記載されているように合成され、その内容は、これらの全体が本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８７】
オリゴヌクレオシド：メチレンメチリミノ連結されたオリゴヌクレオシド（ＭＭＩ連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定された）、メチレンジメチルヒドラゾ連結されたオリゴヌクレオシド（ＭＤＨ連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定された）、およびメチレンカルボニルアミノ連結されたオリゴヌクレオシド（アミド−３連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定される）、およびメチレンアミノカルボニル連結されたオリゴヌクレオシド（アミド−４連結されたオリゴヌクレオシドとしても同定された）、並びに例えば、交互にＭＭＩおよびＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ結合を有する混合されたバックボーン化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、第５，３８６，０２３号、第５，４８９，６７７号、第５，６０２，２４０号、および第５，６１０，２８９号に記載されているように調製され、これらの全てが、本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８８】
ギ酸アセタールおよびチオギ酸アセタール連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および第５，２６４，５６４号に記載されているように調製され、これらは、本明細書に参照として組み入れられる。
【０１８９】
エチレンオキシド連結されたオリゴヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載されているように調製され、これは、本明細書に参照として組み入れられる。
【０１９０】
ＰＮＡ合成
ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３において言及される種々の手順のいずれかに従って調製される。これらは、また米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７００，９２２号、および第５，７１９，２６２号に従って調製してもよく、これらは、本明細書に参照として組み入れられる。
【０１９１】
実施例３：ＲＮＡ合成
一般に、ＲＮＡ合成化学は、ストラテジーの中間反応において、種々の保護基を選択的に組み入れることに基づく。当技術分野の当業者であれば、有機合成において、シリルエーテルを含む保護基の有用なクラスの保護基の使用を理解するであろう。特に大きなシリルエーテルが、２’−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルソエステル保護基と組み合わせて、５’−ヒドロキシルを保護するために使用される。次いで、この保護基のセットを標準的な固相合成技術と共に使用する。他の全ての合成工程後に、最後に酸に不安定なオルソエステル保護基を除去することが重要である。さらに、合成の間にシリル保護基を早めに使用すると、必要に応じて、２’ヒドロキシルの望まれない脱保護を伴わずに安易な除去が確実になる。
【０１９２】
差動的に除去され、かつ差動的に化学的に不安定である保護基による２’−ヒドロキシルの保護と組み合わせた５’−ヒドロキシルの経時的保護のためのこの手順に続いて、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１９３】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、段階的な方法で合成される。それぞれのヌクレオチドを経時的に（３’−から５’−方向に）固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドに添加する。鎖の３’末端の第１ヌクレオシドは、固体支持体に共有結合で付着されている。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホラミダイト、および活性化因子を添加して第２の塩基を第１のヌクレオシドの５’−末端に対して結合する。支持体を洗浄し、任意の反応していない５’−ヒドロキシル基を無水酢酸でキャップして５’−アセチル部分を得る。次いで、結合をより安定な、かつ最終的に望まれるＰ（Ｖ）結合へと酸化する。ヌクレオチド添加サイクルの終了後、５’−シリル基をフッ化物で切断する。本サイクルを、それぞれのその後のヌクレオチドに対して繰り返す。
【０１９４】
合成に続いて、リン酸上のメチル保護基は、１Ｍの二ナトリウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオラート３水和物（Ｓ２Ｎａ２）のＤＭＦ溶液を利用して３０分間切断する。脱保護溶液を、水を使用して固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドから洗浄する。次いで、支持体を５５℃で１０分間、４０％のメチルアミン水溶液中で処置する。これにより、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを溶液に放出して、環外のアミンを脱保護し、２’基を修飾する。オリゴヌクレオチドは、この段階で陰イオン交換ＨＰＬＣによって解析することができる。
【０１９５】
２’−オルソエステル基が、最後に除去される保護基である。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）によって開発されたエチレングリコールモノアセテートオルソエステル保護基は、以下の重要な性質を有する有用なオルソエステル保護基の一例である。これは、ヌクレオシド・ホスホラミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定である。しかし、オリゴヌクレオチド合成の後、オリゴヌクレオチドをメチルアミンで処置すると、これにより、オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断するだけでなく、オルソエステルからアセチル基を除去する。生じるオルソエステル上の２−エチル−ヒドロキシル置換基は、アセチル化された前駆体よりも電子吸引性が低い。その結果、修飾されたオルソエステルは、酸接触加水分解に対してより不安定になる。特に、切断速度は、アセチル基が除去された後に約１０倍速い。従って、このオルソエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合する十分な安定性を有し、さらに、その後に修飾されたときに、最終的なＲＮＡオリゴヌクレオチド産物に適合する比較的穏やかな水性条件下で脱保護を行うことができる。
【０１９６】
加えて、ＲＮＡ合成の方法は、当技術分野において周知である（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ，１９９６；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１１８２０−１１８２１；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８１，１０３，３１８５−３１９１；Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９−１８６２；Ｄａｈｌら、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，１９９０，４４，６３９−６４１；Ｒｅｄｄｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｍ  Ｌｅｔｔ．，１９９４，２５，４３１１−４３１４；Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９５，２３，２６７７−２６８４；Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，２３０１−２３１３；Ｇｒｉｆｆｉｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，２３１５−２３３１）。
【０１９７】
本発明のＲＮＡアンチセンス化合物（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、本明細書の方法によって合成することができ、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ  （Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入することができる。一旦合成されれば、次いで、当技術分野において公知の方法によって相補的ＲＮＡアンチセンス化合物をアニールさせて、二本鎖（二重鎖）アンチセンス化合物を形成することができる。たとえば、二重鎖は、３０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチドの各々の相補鎖（５０μＭ  ＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）と１５μｌの５×アニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）を組み合わせ、続いて９０℃で１分、次いで３７℃で１時間の加熱することによって形成することができる。生じる二重化アンチセンス化合物は、キット、アッセイ法、スクリーニング法、または標的核酸の役割を調査するため、または診断もしくは治療的な目的のその他の方法に使用することができる。
【０１９８】
実施例４：キメラ・オリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラ・オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合されたオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプのものであることができる。これらは、連結されたヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、連結されたヌクレオシドの５’および３’「ウイング」セグメントの間に位置する第１型と、「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’または５’末端のいずれかに位置する第２の「開放末端」を含む。また、第１型のオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー」またはギャップド・オリゴヌクレオチドとして当技術分野において公知である。また、第２型のオリゴヌクレオチドは「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒｓ）」、または「ウイングマー（ｗｉｎｇｍｅｒｓ）」として当技術分野において公知である。
【０１９９】
（２’−Ｏ−Ｍｅ）−−（２’−デオキシ）−−（２’−Ｏ−Ｍｅ）キメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオアートおよび２’−デオキシホスホロチオアート・オリゴヌクレオチド・セグメントを有するキメラ・オリゴヌクレオチドは、上記のように、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動ＤＮＡ合成装置モデル３９４を使用して合成する。オリゴヌクレオチドは、自動合成機、並びにＤＮＡ部分のための２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−アルキル部分のための５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイトを使用して合成される。標準的な合成サイクルは、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホラミダイトのために反応時間を増大したカップリング工程を組み入れることによって修飾されている。完全に保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、５５℃で１２〜１６時間、濃アンモニア（ＮＨ４ＯＨ）中で脱保護する。次いで、脱保護されたオリゴを適切な方法によって回収する（沈澱、カラムクロマトグラフィー、真空中での体積の減少、およびキャピラリー電気泳動法による、および質量分析による収率についての、および純度についての質量測光法（ｓｐｅｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）による解析）。
【０２００】
（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））−−（２’−デオキシ）−−（２’−Ｏ−（メトキシエチル））キメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチド
（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））（−−（２’−デオキシ）−−（−２’−Ｏ（メトキシエチル））キメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルキメラ・オリゴヌクレオチドについての上記の手順に従って、２’−Ｏ−メチルアミダイトについての２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトの置換により調製した。
【０２０１】
（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル）−−（２’−デオキシホスホロチオアート）−−（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル）キメラ・オリゴヌクレオチド
（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル）−−（２’−デオキシホスホロチオアート）−−（２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル）キメラ・オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルキメラ・オリゴヌクレオチドについての上記手順に従って、２’−Ｏ−メチルアミダイトに対する２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトの置換、キメラ構造のウイング部分内のリン酸ジエステルヌクレオチド間結合を生じさせるためのヨウ素で酸化、中心のギャップに対してホスホロチオアートヌクレオチド間結合を生じさせるための３，Ｈ−１，２  ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を利用した硫化で調製した。
【０２０２】
その他のキメラ・オリゴヌクレオチド、キメラ・オリゴヌクレオシド、および混合されたキメラ・オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、米国特許第５，６２３，０６５号に従って合成され、これは明細書に参照として組み入れられる。
【０２０３】
実施例５：ｅＩＦ４Ｅをターゲットする二重化されたアンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明によれば、本発明のアンチセンス化合物およびこれらの相補体を含む一連の核酸二重鎖を、ｅＩＦ４Ｅをターゲットするようにデザインすることができる。二重鎖アンチセンス鎖の核酸塩基配列は、少なくとも表１のオリゴヌクレオチドの８−核酸塩基部分を含む。鎖の末端は、オーバーハングを形成するように１つもしくは複数の天然または修飾された核酸塩基を付加することによって修飾してもよい。次いで、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖の相補体としてデザインし、および合成し、また、いずれかの末端に修飾または付加を含んでいてもよい。たとえば、一つの態様において、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両方の鎖は、中心的核酸塩基を通して相補で、それぞれ一方または両方の末端にオーバーハングを有する。二重鎖の一端を平滑にすること、および他端にオーバーハング核酸塩基を有することができる。一つの態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、二重鎖のそれぞれの鎖の３’末端上の１〜６個である。もう一つの態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、二重鎖の一方の鎖のみの３’末端上の１〜６個である。さらなる態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、二重化された鎖の一方または両方の５’末端上の１〜６個である。もう一つの態様において、オーバーハング核酸塩基の数は、ゼロである。
【０２０４】
例として、配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号：４５６）を有するアンチセンス鎖を含み、かつデオキシチミジン（ｄＴ）の２核酸塩基オーバーハングを有する二重鎖は、以下の構造を有する：
【化１】
2007505627.tif 000002
【０２０５】
もう一つの態様において、同じ配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧを有するアンチセンス鎖を含む二重鎖は、以下に示したように平滑断端（一本鎖のオーバーハングがない）で調製してもよい：
【化２】
2007505627.tif 000003
二重鎖は、単分子でも、または二分子でもよく、すなわち、センスおよびアンチセンス鎖は、同じ分子の一部（これは、ヘアピンまたはその他の自己構造を形成する）または２つの（または、より多くの）別々の分子であってもよい。
【０２０６】
二重鎖のＲＮＡ鎖は、本明細書に開示される方法によって合成することができ、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から購入することができる。一旦合成されれば、相補鎖がアニールされる。一本鎖の一定分量をとり、５０μＭの濃度に希釈する。一旦希釈したら、３０μＬのそれぞれの鎖を１５μＬのアニーリング緩衝液の５×溶液と合わせる。前記緩衝液の終濃度は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、および２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終体積は、７５μＬである。この溶液を９０℃で１分間インキュベートして、次いで１５秒間遠心した。チューブを３７℃で１時間おいて、そのときにｄｓＲＮＡ二重鎖を実験に使用する。ｄｓＲＮＡ二重鎖の終濃度は、２０μＭである。この溶液を凍結させて（−２０℃）て貯蔵し、５回まで凍結融解することができる。
【０２０７】
一旦調製されたら、二重化アンチセンス化合物を、これらがｅＩＦ４Ｅ発現を調整する能力について評価する。
【０２０８】
細胞が８０％のコンフルエンシーに到達するときに、これらを本発明の二重化されたアンチセンス化合物で処置する。９６ウェル・プレートで培養した細胞については、ウェルを２００μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで１２μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および２００ｎＭの終濃度の所望の二重鎖アンチセンス化合物を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処置する。処置の５時間後、培地を新しい培地と置き換える。細胞を処置の１６時間後に集め、そのときに、ＲＮＡを単離して、標的減少をＲＴ−ＰＣＲによって測定する。
【０２０９】
実施例６：オリゴヌクレオチドの単離
制御された細孔ガラス固体支持体からの切断および濃水酸化アンモニウム溶液中において５５℃で１２〜１６時間デブロッキング後、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを＞３体積のエタノールで１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃから沈澱することによって回収する。合成されたオリゴヌクレオチドをエレクトロスプレー質量分析（分子量の決定）によって、およびキャピラリーゲル電気泳動によって解析し、少なくとも７０％の全長材料であると判断した。合成で得られたホスホロチオアートおよびホスホジエステル結合の相対量は、−１６原子質量単位産物（＋／−３２  ＋／−４８）と比較して正確な分子量比によって決定した。いくつかの研究については、オリゴヌクレオチドをＣｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，１８１６２−１８１７１によって記載されているとおりにＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣで精製した材料で得られた結果は、ＨＰＬＣで精製されていない材料で得られたものと同じであった。
【０２１０】
実施例７：オリゴヌクレオチド合成−９６ウェル・プレート形式
オリゴヌクレオチドは、９６ウェル形式で同時に９６配列を構築することができる自動合成機で固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホラミダイト化学を介して合成した。ホスホジエステルヌクレオチド間結合は、水性ヨウ素での酸化によって得た。ホスホロチオアートヌクレオチド間結合は、３，Ｈ−１，２  ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）のアセトニトリル無水物溶液を利用する硫化によって作製した。標準的な塩基で保護されたβ−シアノエチル−ジイソ−プロピルホスホラミダイトは、市販の売り手（たとえば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，またはＰｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から購入した。非標準的ヌクレオシドは、標準的または特許を受けた方法に従って合成する。これらは、塩基で保護されたβ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトを利用する。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、高温（５５〜６０℃）で１２〜１６時間濃ＮＨ４ＯＨで脱保護し、次いで放出された産物を真空中で乾燥した。次いで、乾燥産物を滅菌水に再懸濁してマスタープレートを提供し、次いでここから、全ての解析および試験プレート試料をロボット・ピペッターを利用して希釈した。
【０２１２】
実施例８：オリゴヌクレオチド解析−９６ウェル・プレート形式
それぞれのウェルにおけるオリゴヌクレオチドの濃度を試料およびＵＶ吸収分光学の希釈によって評価した。個々の産物の全長完全性は、９６ウェル形式（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭＭＤＱ）か、または個々に調製された試料については、市販のＣＥ装置（たとえば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭ５０００、ＡＢＩ  ２７０）で、いずれかでキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）によって評価した。塩基およびバックボーン組成物は、エレクトロスプレー−質量分光法を利用する化合物の質量分析によって確認した。全てのアッセイ試験プレートは、単一およびマルチ・チャンネル・ロボット・ピペッターを使用してマスタープレートから希釈した。プレートは、プレート上の化合物の少なくとも８５％で、少なくとも８５％が全長である場合に許容されると判断した。
【０２１３】
実施例９：細胞培養およびオリゴヌクレオチド処置−一本鎖アンチセンス化合物
標的核酸発現に対するアンチセンス化合物の効果は、標的核酸が測定可能なレベルで存在することを条件として、任意の種々の細胞型で試験することができる。これは、たとえば、ＰＣＲまたはノーザンブロット解析を使用してルーチンで決定することができる。以下の細胞型は、例示の目的で提供されるが、その他の細胞型も、標的が選択される細胞型に発現されていることを条件として、ルーチンで使用することができる。これは、当技術分野においてルーチンの方法、たとえばノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法、またはＲＴ−ＰＣＲによって容易に決定することができる。
【０２１４】
Ｔ−２４細胞：
ヒト移行細胞膀胱癌腫細胞株Ｔ−２４は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。Ｔ−２４細胞は、１０％  ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１ｍＬにつき１００ユニットのペニシリンおよび１ｍＬにつき１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補った完全マッコイ５Ａ基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でルーチンで培養した。細胞は、これらが９０％のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ解析に使用するために、７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２）に接種した。
【０２１５】
ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞を、１００ｍｍまたはその他の標準的組織培養プレート上にまいてもよく、培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に処置してもよい。
【０２１６】
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌腫細胞株Ａ５４９は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。Ａ５４９細胞は、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１ｍＬにつき１００ユニットのペニシリン、および１ｍＬにつき１００マイクログラムのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補ったＤＭＥＭ基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でルーチンで培養した。細胞は、これらが９０％のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。
【０２１７】
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生児の真皮性線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ＮＨＤＦは、供給元によって推奨されるとおりに補った線維芽細胞成長培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中でルーチンで維持した。細胞は、供給元によって推奨されるとおりに最高１０継代の間維持した。
【０２１８】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胚ケラチのサイト（ＨＥＫ）は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。ＨＥＫは、供給元によって推奨されるとおりに処方されたケラチノサイト増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中でルーチンで維持した。細胞は、供給元によって推奨されるとおりに最高１０継代の間維持した。
【０２１９】
ｂ．  ＥＮＤ細胞：
マウス脳内皮細細胞株ｂ．ＥＮＤは、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｋ  Ｉｎｓｔｉｔｉｔｕｔｅ  （Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、Ｄｒ．Ｗｅｒｎｅｒ  Ｒｉｓａｕから得た。ｂ．ＥＮＤ細胞は、ＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を補った高グルコース（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））中でルーチンで培養した。細胞は、これらが９０％のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ解析に使用するために、３０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａａ  ＃３８７２）にまいた。ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞を、１００ｍｍまたはその他の標準的組織培養プレート上にまいてもよく、培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に処置してもよい。
【０２２０】
ＨｅＬａ細胞：
ヒト上皮癌腫細胞株ＨｅＬａは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。ＨｅＬａ細胞は、ＤＭＥＭ（１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補った高グルコース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中でルーチンで培養した。細胞は、これらが９０％のコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、約５０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８４６）に、またはＲＴ−ＰＣＲ解析に使用するためには、約５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまいた。ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、これらが約９０％のコンフルエンスに到達したときに、細胞を集めた。
【０２２１】
Ｕ−８７  ＭＧ細胞：
ヒト・グリア芽細胞腫Ｕ−８７  ＭＧ細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得た。Ｕ−８７  ＭＧ細胞は、１０％のウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および抗生物質を補ったＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。細胞は、これらが適切なコンフルエンスに到達したときに、トリプシン処置および希釈によってルーチンで継代した。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ解析に使用するために、約１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）にまいた。
【０２２２】
ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞は、１００ｍｍまたはその他の標準的な組織培養プレート上へ接種してもよい、および培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に治療してもよい。ノーザンブロッティングまたはその他の解析については、細胞を、１００ｍｍまたはその他の標準的組織培養プレート上にまいてもよく、培地およびオリゴヌクレオチドの適切な量を使用して、同様に処置してもよい。
【０２２３】
ＭＨＳ細胞：
マウスＭＨ−Ｓ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。細胞は、１０％の熱で不活性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持した。細胞は、５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにおいてプレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０２２４】
アンチセンス化合物での処置：
細胞が６５〜７５％のコンフルエンシーに到達したときに、これらをオリゴヌクレオチドで処置した。９６ウェル・プレート中で培養した細胞については、ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１減少血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で一旦洗浄し、次いで３．７５ｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および所望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１で処置した。細胞を処置し、データを三通りで得る。３７℃での処置の４〜７時間後、培地を新しい培地と置き換えた。オリゴヌクレオチド処置の１６〜２４時間後に細胞を集めた。
【０２２５】
使用されるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株間で変更する。特定の細胞株のための最適のオリゴヌクレオチド濃度を決定するために、細胞を濃度の範囲の陽性対照オリゴヌクレオチドで処置する。ヒト細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓにターゲットされるＩＳＩＳ  １３９２０：
【化３】
2007505627.tif 000004
またはヒトＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ−２（ＪＮＫ２）にターゲットされるＩＳＩＳ  １８０７８：
【化４】
2007505627.tif 000005
のいずれかから選択される。両対照は、ホスホロチオアート・バックボーンでをもつ２’−Ｏ−メトキシエチル・ギャップマー（太字で示した２’−Ｏ−メトキシエチル）である。マウスまたはラット細胞については、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ  １５７７０：
【化５】
2007505627.tif 000006
配列番号：３、マウスおよびラットｃ−ｒａｆの両方にターゲットされるホスホロチオアート・バックボーンをもつ２’−Ｏ−メトキシメチル・ギャップマー（太字で示した２’−Ｏ−メトキシエチル）である。次いで、ｃ−Ｈ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ  １３９２０に対する）、ＪＮＫ２（ＩＳＩＳ  １８０７８に対する）、またはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ  １５７７０に対する）ｍＲＮＡの８０％の阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株に対するその後の実験において新たなオリゴヌクレオチドをスクリーニングする濃度として利用する。８０％の阻害が達成されない場合、ｃ−Ｈ−ｒａｓ、ＪＮＫ２、またはｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡの６０％の阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドでの最も低い濃度を、その細胞株に対するその後の実験においてオリゴヌクレオチドをスクリーニングする濃度として利用する。６０％の阻害が達成されない場合、その特定の細胞株は、オリゴヌクレオチド・トランスフェクション実験のために適していないとみなされる。本明細書に使用されるアンチセンス・オリゴヌクレオチドの濃度は、５０ｎＭ〜３００ｎＭである。
【０２２６】
実施例１０：ｅＩＦ４Ｅ発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析
ｅＩＦ４Ｅ発現のアンチセンス調整は、当技術分野において公知の種々の方法でアッセイすることができる。たとえば、ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルは、とえば、ノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって定量化することができる。リアルタイム定量的ＰＣＲは、現在適している。ＲＮＡ解析は、総細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡに対して行うことができる。本発明のＲＮＡ解析の１つの方法は、本明細書のその他の実施例に記載されているように、総細胞ＲＮＡの使用である。ＲＮＡ単離の方法は、当該技術分野において周知である。また、ノーザンブロット解析も当技術分野においてルーチンである。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）は、便利には、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡから入手可能な、商業的に入手可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ７６００、７７００、または７９００配列検出システムをおよび使用して達成することができ、製造業者の説明書に従って使用される。
【０２２７】
ｅＩＦ４Ｅのタンパク質レベルは、免疫沈降、ウエスタンブロット解析（免疫ブロッティング）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ方（ＥＬＩＳＡ）、またはＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ）などの当該技術分野において周知の種々の方法で定量化することができる。ｅＩＦ４Ｅに向けられた抗体は抗体のＭＳＲＳカタログ  （Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）などの種々の供与源から同定すること、および得ることができ、または従来のモノクローナルまたは当該技術分野において周知のポリクローナル抗体生成方法を経て調製することができる。
【０２２８】
実施例１１：ｅＩＦ４Ｅ阻害剤の使用のための表現型アッセイ法のデザイン
一旦、本明細書に開示される方法によってｅＩＦ４Ｅ阻害剤が同定したら、化合物を、それぞれ、予測的な特定の疾病状態または症状の治療における有効性を予測する測定可能な指標を有する１つまたは複数の表現型アッセイ法でさらに調査する。
【０２２９】
表現型アッセイ法、キット、およびこれらに使用するための試薬については、当業者に周知であり、本明細書において、健康と疾患におけるｅＩＦ４Ｅの役割および／または関連を調査するために使用される。いくつかの市販の売り手のいずれか一つから購入することができる代表的な表現型アッセイ法は、細胞生存度、細胞障害性、増殖または細胞生存（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、酵素アッセイ法を含むタンパク質に基づいたアッセイ法（Ｐａｎｖｅｒａ，ＬＬＣ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、細胞制御、シグナル伝達、炎症、酸化プロセス、およびアポトーシス（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｉｎｃ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ），ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、血管形成アッセイ法、チューブ形成アッセイ法、サイトカインおよびホルモン・アッセイ法、並びに代謝アッセイ法（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を決定するためのものを含む。
【０２３０】
一つの非限定の例において、特定の表現型アッセイ法に適していることが決定された細胞（すなわち、ＭＣＦ−７細胞は、乳癌研究のために；脂肪細胞は、肥満研究のために選択された）を、上記した方法によって決定された最適濃度で、インビトロ研究から同定されたｅＩＦ４Ｅ阻害剤、並びに対照化合物で処置する。処置期間の終わりに、処置された細胞および未処置の細胞を表現型の結果および指標を決定するためのアッセイ法に特異的な１つもしくは複数の方法によって解析する。
【０２３１】
表現型の指標は、時間にわたる細胞形態の変化または治療用量、並びにタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類、または金属などの細胞成分のレベルの変化を含む。ｐＨ、細胞周期の段階、細胞による生物学的指標の摂取または排出を含む細胞状態の測定も関心対象の指標である。
【０２３２】
ｅＩＦ４Ｅ阻害剤の有効性または能力の指標のように、処置後の細胞の遺伝子型の解析（細胞の遺伝子の１つまたは複数の発現の測定）も使用される。ホールマーク遺伝子、または特定の疾病状態、症状、もしくは表現型と関連することが疑われる遺伝子が、処置した細胞および未処置の細胞の両方において測定される。
【０２３３】
実施例１２：ＲＮＡ単離ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、Ｍｉｕｒａら、（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，４２，１７５８−１７６４）に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離のためのその他の方法は、当技術分野においてルーチンのものである。簡単には、９６ウェル・プレート上で培養した細胞については、増殖培地を細胞から除去して、それぞれのウェルを２００μＬの冷却ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを穏やかに撹拌して、室温で５分間インキュベートした。５５μＬの可溶化液をＯｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）被覆された９６ウェル・プレート（ＡＧＣＴ  Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ  ＣＡ）へ移した。プレートを室温で６０分間インキュベートして、２００μＬの緩洗浄衝液（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄の後、プレートを紙タオル上で吸い取って過剰な洗浄緩衝液を除去し、５分間風乾させた。７０℃に予熱した６０μＬの溶離緩衝液（５ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）をそれぞれのウェルに添加し、プレートを９０℃ホットプレート上で５分間インキュベートして、次いで溶出液を新たな９６ウェル・プレートに移した。
【０２３４】
１００ｍｍまたはその他の標準的なプレートの上で培養した細胞を、全ての溶液の適切な量を使用して同様に処置してもよい。
【０２３５】
総ＲＮＡ単離
総ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から購入したＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭキットおよび緩衝液を使用して、製造業者の推奨される手順にしたがって単離した。簡単には、９６ウェル・プレート上で培養した細胞については、増殖培地を細胞から除去し、それぞれのウェルを２００μＬの冷却ＰＢＳで洗浄した。１５０μＬ  緩衝液  ＲＬＴをそれぞれのウェルに添加して、プレートを２０秒間激しく撹拌した。次いで、１５０μＬの７０％のエタノールをそれぞれのウェルに添加し、上下に３回をピペッティングすることによって内容物を混合した。次いで、廃物の収集トレイと共に装着されたＱＩＡＶＡＣＴＭマニフォールドに付着され、かつ負圧源に付着されたＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭウェル・プレートに試料を移した。真空は、１分間適用した。５００μＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートのそれぞれのウェルに添加して、１５分間インキュベートし、再び真空を１分間適用した。さらに５００μＬの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートのそれぞれのウェルに添加して、真空を２分間適用した。次いで、１ｍＬの緩衝液ＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ９６ＴＭプレートのそれぞれのウェルに添加して、真空を９０秒間適用した。次いで、緩衝液ＲＰＥ洗浄を繰り返して、真空をさらに３分間適用した。次いで、プレートをＱＩＡＶＡＣＴＭマニフォールドから除去して、紙タオル上で吸い取って乾燥させた。次いで、プレートを、１．２ｍＬの収集管を含む収集管ラックに装着されたＱＩＡＶＡＣマニフォールドに再び付けた。次いで、それぞれのウェル内で１４０μＬのＲＮＡｓｅのない水をピペッティングすること、１分インキュベートすること、次いで３分間真空を適用することによってＲＮＡを溶出した。
【０２３６】
繰り返しピペッティングおよび溶出工程は、  ＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ  ９６０４  （Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ  ＣＡ）を使用して自動化してもよい。本質的には、培養プレート上で細胞を溶解した後に、プレートをロボット・デッキへ移して、ここでピペッティング、ＤＮａｓｅ治療、および溶出工程が実施される。
【０２３７】
実施例１３：ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ解析
ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルの定量化は、製造業者の説明書に従ってＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ７６００、７７００、または７９００のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用してリアルタイム定量的ＰＣＲによって達成した。これは、閉管の、ゲルに基づかない蛍光検出システムであり、リアルタイムにポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）産物の高スループットの定量化が可能である。増幅産物が、ＰＣＲの完了後に定量化される標準的なＰＣＲに対して、リアルタイム定量的ＰＣＲの産物は、これらが蓄積するにつれて定量化される。これは、ＰＣＲ反応に、フォワードおよびリバースのＰＣＲプライマー間で特異的にアニールし、かつ２つの蛍光色素を含むオリゴヌクレオチドプローブを含むことによって達成される。レポーター色素（たとえば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡもしくはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡのいずれかから得られるＦＡＭまたはＪＯＥ）がプローブの５’末端に付着されており、クエンチャー色素（たとえばＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡまたはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡのいずれかから得られるＴＡＭＲＡ）がプローブの３’末端に付着されている。プローブおよび色素が無処置のときには、レポーター色素発光が、近くの３’クエンチャー色素によってクエンチされる。増幅の間に、標的配列に対するプローブのアニーリングにより、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって切断することができる基質を生じる。ＰＣＲ増幅サイクルの伸張期の間に、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断により、プローブの残部（およびそれ故、クエンチャー部分）からレポーター色素が放出され、配列特異的蛍光性シグナルが生じる。それぞれのサイクルで、さらなるレポーター色素分子がこれらのそれぞれのプローブから切断され、蛍光強度は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍに組み込まれたレーザー光学によって規則的な間隔でモニターされる。それぞれのアッセイ法において、無処置の対照試料に由来するｍＲＮＡの段階希釈を含む一連の平行反応により検量線を作製し、これを試験試料のアンチセンス・オリゴヌクレオチド処置後のパーセント阻害を定量化するために使用する。
【０２３８】
定量的ＰＣＲ解析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブ・セットを、これらのＧＡＰＤＨ増幅反応で「多重化される」能力について評価する。多重化の際に、標的遺伝子および内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの両方が、単一の試料中で並行して増幅される。この解析において、未処置の細胞から単離されたｍＲＮＡは、連続的に希釈してある。それぞれの希釈を、ＧＡＰＤＨだけ、標的遺伝子（「一重化（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）だけ、または両方（多重化）に特異的なプライマー−プローブ・セットの存在下で増幅させる。ＰＣＲ増幅に続いて、希釈の関数として、ＧＡＰＤＨと標的ｍＲＮＡシグナルの検量線を一重化および多重化試料から作製する。多重化試料から作製されたＧＡＰＤＨおよび標的シグナルの勾配並びに相関係数が、一重化された試料から作製される対応する値の１０％に入る場合、その標的に特異的なプライマー−プローブ・セットは、多重化可能であると考えられる。ＰＣＲのその他の方法も、当技術分野において公知である。
【０２３９】
ＰＣＲ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２０μＬのＰＣＲカクテル（２．５×ＰＣＲ緩衝液マイナスＭｇＣｌ２、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ３７５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰ、それぞれ３７５ｎＭのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、１２５ｎＭのプローブ、４  Ｕｎｉｔ  ＲＮＡｓｅ阻害剤、１．２５  Ｕｎｉｔ  ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５  Ｕｎｉｔ  ＭｕＬＶ逆転写酵素、および２．５×ＲＯＸ色素）を３０μＬの総ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）を含む９６ウェル・プレートに添加することによって実施した。ＲＴ反応は、４８℃で３０分間インキュベーションすることによって実施した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化するための９５℃での１０分間のインキュベーションに続いて、二段階のＰＣＲプロトコルを４０サイクル実施した：９５℃を１５秒（変性）、続く６０℃を１．５分（アニーリング／拡張）。
【０２４０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られた遺伝子標的量は、ＧＡＰＤＨ（その発現が一定である遺伝子）の発現レベル、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して総ＲＮＡを定量化することによって、いずれかを使用して規準化する。ＧＡＰＤＨ発現は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、標的と共に同時に実行すること（多重化）によって、または別々に定量化される。総ＲＮＡは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して定量化される。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭによるＲＮＡ定量化法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．ら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）に教示されている。
【０２４１】
このアッセイ法では、１７０μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ作業試薬（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５に１：３５０希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬）を、３０μＬの精製された細胞ＲＮＡを含む９６ウェル・プレートにピペットで移す。プレートを４８５ｎｍでの励起および５３０ｎｍでの発光を備えたＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で読み込む。
【０２４２】
ヒトｅＩＦ４Ｅに対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ１５３５３．１、配列番号：４として本明細書に組み入れられる）を使用して、ヒトｅＩＦ４Ｅ配列にハイブリダイズするように設計した。  ヒトｅＩＦ４Ｅについては、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＴＧＧＣＧＡＣＴＧＴＣＧＡＡＣＣＧ（配列番号：５）、
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧ（配列番号：６）、
およびＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＣＣＣＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号：７）であって、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。ヒトＧＡＰＤＨについては、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号：８）、
リバースプライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号：９）、
およびＰＣＲプローブは：５’ＪＯＥ−ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ  ３’（配列番号：１０）であって、ＪＯＥは蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０２４３】
マウスｅＩＦ４Ｅに対するプローブおよびプライマーは、公表された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ００７９１７．１、配列番号：１１として本明細書に組み入れられる）を使用して、マウスｅＩＦ４Ｅ配列にハイブリダイズするように設計した。マウスｅＩＦ４Ｅについては、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＡＧＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号：１２）、
リバースプライマー：ＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号：１３）、
およびＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＧＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号：１４）であって、ＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。マウスＧＡＰＤＨについては、ＰＣＲプライマーは：
フォワードプライマー：ＧＧＣＡＡＡＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＴ（配列番号：１５）、
リバースプライマー：ＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴ（配列番号：１６）、
およびＰＣＲプローブは：５’ＪＯＥ−ＡＡＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣ−ＴＡＭＲＡ  ３’（配列番号：１７）であって、ＪＯＥは蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０２４４】
実施例１４：ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット解析
アンチセンス処置の１８時間後に、細胞単層を冷却ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのＲＮＡＺＯＬＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）に溶解する。総ＲＮＡは、製造業者の推奨プロトコルに従って調製する。２０マイクログラムの総ＲＮＡをＭＯＰＳ緩衝系（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）を使用して１．１％のホルムアルデヒドを含む１．２％のアガロースゲルによる電気泳動法によって分画する。ＲＮＡは、ノーザン／サザン・トランスファー・緩衝系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ“Ｂ”Ｉｎｃ．，Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ，ＴＸ）を使用して、一晩キャピラリー転移によってゲルからＨＹＢＯＮＤＴＭ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に移す。ＲＮＡ転移は、ＵＶ視覚化によって確認する。膜をＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＴＭＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してＵＶ架橋によって固定して、ストリンジェント条件についての製造業者の推奨を使用してＱＵＩＣＫＨＹＢＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してプローブした。
【０２４５】
ヒトｅＩＦ４Ｅを検出するために、フォワードプライマーＴＧＧＣＧＡＣＴＧＴＣＧＡＡＣＣＧ（配列番号：５）およびリバースプライマーＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧ（配列番号：６）を使用するＰＣＲにより、ヒトｅＩＦ４Ｅ特異的なプローブを調製した。充填および転写効率におけるバリエーションを規準化するために、膜をはがして、ヒト・グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）をプローブする。
【０２４６】
マウスｅＩＦ４Ｅを検出するために、フォワードプライマーＡＧＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＡ（配列番号：１２）およびリバースプライマーＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＡ（配列番号：１３）を使用するＰＣＲにより、マウスｅＩＦ４Ｅ特異的なプローブを調製した。充填および転写効率におけるバリエーションを規準化するために、膜をはがして、マウス・グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）をプローブする。
【０２４７】
ハイブリダイズした膜を視覚化して、ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭソフトウエアＶ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量化する。データを未処置の対照におけるＧＡＰＤＨレベルに対して規準化する。
【０２４８】
実施例１５：２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドによるヒトｅＩＦ４Ｅ発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７９１７．１、配列番号：４として本明細書に組み入れられる）を使用して、一連のアンチセンス化合物をヒトｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの異なる領域をターゲットするようにデザインした。化合物は、表１に示してある。「標的部位」は、化合物が結合する特定のヒトｅＩＦ４Ｅ標的配列上の最初の（最も５’の）ヌクレオチド番号を示す。表１の全ての化合物は、２０ヌクレオチドの長さのキメラ・オリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５ヌクレオチド「ウイング」に両側（５’および３’方向）で隣接する１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心の「ギャップ」領域からなる。ウイングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたってホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０２４９】
第２の一連の化合物アンチセンスは、発行された配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７９１７．１、配列番号：１１として本明細書に組み入れられる）を使用して、マウスｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの異なる領域をターゲットするようにデザインした。化合物は、表１に示してある。「標的部位」は、化合物が結合する特定のヒトｅＩＦ４Ｅ標的配列上の最初の（最も５’の）ヌクレオチド番号を示す。表１の全ての化合物は、２０ヌクレオチドの長さのキメラ・オリゴヌクレオチド（「ｇａｐｍｅｒｓ」）であり、５ヌクレオチド「ウイング」に両側（５’および３’方向）で隣接する１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心の「ギャップ」領域からなる。表１の全ての化合物は、２０ヌクレオチドの長さのキメラ・オリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、５−ヌクレオチド「ウイング」に両側（５’および３’方向）で隣接する１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中心の「ギャップ」領域からなる。ウイングは、２’−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドで構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチドの全体にわたってホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０２５０】
表１の中の化合物は、ヒトおよびマウスｅＩＦ４Ｅ配列に対して相補的であるので、本明細書のその他の実施例に記載されているように、化合物を定量的リアルタイムＰＣＲによってヒトｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルに対するこれらの効果について解析した。データは、Ａ５４９細胞を本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処置した３回の実験からの平均である。それぞれのデータポイントに対する陽性対照は、表において配列番号によって同定される。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「データなし」を示す。
【０２５１】
表１
２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドによるヒトｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルの阻害
【表１−１】
2007505627.tif 000007
【表１−２】
2007505627.tif 000008
【表１−３】
2007505627.tif 000009
【０２５２】
表１に示すように、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３７、３８、３９、４０、４２、４３、４４、４６、４７、５１、５２、５４、５６、５７、５８、５９、６０、６３、６４、６５、６６、６７、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０７、１１０、１１１、１１２、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、および１２２は、このアッセイ法においてヒトｅＩＦ４Ｅ発現の少なくとも５０％阻害を証明し、従って、適切である。配列番号８０、６５、４０、９７、および１０５も適切である。
【０２５３】
これらの適切な配列に対して相補である標的領域は、本明細書において「適切な標的セグメント」といい、従って、本発明の化合物によってターゲットするために適している。これらの適切な標的セグメントを表３に示してある。これらの配列は、チミン（Ｔ）を含むことが示されているが、当業者であれば、チミン（Ｔ）が一般にＲＮＡ配列においてウラシル（Ｕ）に置換されることを認識するであろう。本配列は、表１に示した適切なアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初の（最も５’の）ヌクレオチド番号を示す。また、各々の適切な標的セグメントが見いだされた種も表３に示してある。
【０２５４】
実施例１６：２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドによるマウスｅＩＦ４Ｅ発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、ヒトおよびマウスｅＩＦ４Ｅ（たとえば、マウスｅＩＦ４Ｅ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００７９１７．１、配列番号：１１として本明細書に組み入れられる）の両方に対して相補的である表１の中の化合物を、本明細書のその他の実施例に記載されているように、定量的リアルタイムＰＣＲによってマウスｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルに対するこれらの効果についてさらに解析した。表２において、「標的部位」は、化合物が結合する特定のマウスｅＩＦ４Ｅ標的核酸上の最初の（最も５’の）ヌクレオチド番号を示す。表２に示したデータは、ｂ．ＥＮＤ細胞を本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチドで処置した３回の実験からの平均である。それぞれのデータポイントに対する陽性対照は、表において配列番号によって同定される。存在する場合、「Ｎ．Ｄ．」は「データなし」を示す。
【０２５５】
表２
２’−ＭＯＥウイングおよびデオキシ・ギャップを有するキメラ・ホスホロチオアート・オリゴヌクレオチドによるマウスｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルの阻害
【表２−１】
2007505627.tif 000010
【表２−２】
2007505627.tif 000011
【表２−３】
2007505627.tif 000012
【表２−４】
2007505627.tif 000013
【０２５６】
表２に示したように、配列番号２１、２３、２４、２９、３０、４０、４５、５７、５８、５９、６０、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１５、１１６、１１７、１１８、１２０、１２２は、この実験においてマウスｅＩＦ４Ｅ発現の少なくとも７０％の阻害を証明し、従って適切である。配列番号１０５、４０、９７、および８０も適切である。
【０２５７】
これらの適切な配列に対して相補である標的領域は、本明細書において「適切な標的セグメント」といい、従って、本発明の化合物によってターゲットするために適している。これらの適切な標的セグメントを表３に示してある。これらの配列は、チミン（Ｔ）を含むことが示されているが、当業者であれば、チミン（Ｔ）が一般にＲＮＡ配列においてウラシル（Ｕ）に置換されることを認識するであろう。本配列は、表１およびに示した適切なアンチセンス化合物の逆相補体を表す。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的核酸上の最初の（最も５’の）ヌクレオチド番号を示す。また、各々の適切な標的セグメントが見いだされた種も表３に示してある。
【０２５８】
表３
ｅＩＦ４Ｅにおいて同定された適切な標的セグメントの配列および位置
【表３−１】
2007505627.tif 000014
【表３−２】
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【表３−３】
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【０２５９】
これらの「適切な標的セグメント」は、本発明のアンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションのために開放されていること、およびアクセスできることが実験によって見いだされたので、当業者であれば、ルーチン試験だけを使用して、これらの適切な標的セグメントに特異的にハイブリダイズし、従ってｅＩＦ４Ｅの発現を阻害するその他の化合物を包含する本発明のさらなる態様を認識し、または確認することができる。
【０２６０】
本発明によれば、アンチセンス化合物は、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズして、その機能を調整するその他のオリゴマー化合物を含む。
【０２６１】
実施例１７：ｅＩＦ４Ｅタンパク質レベルのウエスタンブロット分析
ウエスタンブロット分析（免疫ブロット分析）は、標準的な方法を使用することによって行ってもよい。細胞をオリゴヌクレオチド処置の１６〜２０時間後に集め、ＰＢＳで一度洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ／ウェル）に懸濁して、５分間煮沸し、１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填する。ゲルを１５０Ｖで１．５時間流し、ウエスタンブロッティングのための膜に転写した。ｅＩＦ４Ｅに向けられた適切な一次抗体を、一次抗体種に向けられた放射ラベルされたか、または蛍光ラベルされた二次抗体と共に使用する。バンドをＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  ＣＡ）を使用して視覚化する。
【０２６２】
実施例１８：細胞増殖に対するｅＩＦ４Ｅ発現のアンチセンス阻害の効果
ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）、１×１０６細胞／１００μｌを、３．２５、７．５、１５、および３０μＭオリゴヌクレオチドで電気穿孔した。使用したｅＩＦ４Ｅ  ＩＳＩＳのアンチセンス阻害剤は、ＩＳＩＳ  １８３７５０（配列番号：４０）およびＩＳＩＳ  ２９８８１５（配列番号：９７）であった。使用した対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ  ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；配列番号：２０７であって、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの混合物である）および無関係な対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １２９６８８（ＴＴＣＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＴＣＡＧ；配列番号：２０８）であった。ニセものをトランスフェクトした対照も使用した。細胞増殖は、ＣｙＱＵＡＮＴ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ  ＯＲ）を使用して１５μＭオリゴヌクレオチドで処置した細胞において測定した。ヒトｅＩＦ４Ｅ  ＩＳＩＳ  １８３７５０およびＩＳＩＳ  ２９８８１５のアンチセンス・オリゴヌクレオチド阻害剤は、ニセもので処置した対照と比較して、７２時間後の細胞増殖をそれぞれ３１％および３６％まで阻害した。対照オリゴヌクレオチドで処置した細胞は、少なくともニセもので処置した対照と同程度で増殖する。
【０２６３】
また、ｅＩＦ４Ａ標的ｍＲＮＡの減少をこの実験で測定した。ＩＳＩＳ  １８３７５０およびＩＳＩＳ  ２９９８１５は、３μＭ未満（ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルを５０％まで阻害するために必要な濃度）のＩＣ５０を生じ、７．５μＭ以上のオリゴヌクレオチド濃度で７０〜８０％の阻害を示した。対照オリゴヌクレオチド２９８４８および１２９６８８は、２０％（７．５μＭ  １２９６８８）の最大阻害を生じたが、その他の濃度では、一般に約１０％の阻害を与えた。
【０２６４】
また、細胞増殖に対するｅＩＦ４Ｅのアンチセンス阻害の効果をＵ８７−ＭＧヒト・グリア芽細胞腫細胞において測定した。Ｕ８７−ＭＧ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）、１×１０６  細胞／１００μｌをＩＳＩＳ  １８３７５０（配列番号：４０）およびＩＳＩＳ  ２９８８１５（配列番号：９７）、並びに無関係な（対照）オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １２９６９９（ＧＧＡＴＡＧＡＡＣＧＣＧＡＡＡＧＣＴＴＧ；配列番号：２０９）で７．５μＭで電気穿孔した。ｅＩＦ４Ｅ、ＩＳＩＳ  １８３７５０、およびＩＳＩＳ  ２９８８１５の２つのアンチセンス阻害剤は、対照（ＩＳＩＳ  １２９６９９）と比較して、９６時間後にそれぞれ約１２％および１０％までＵ８７−ＭＧ細胞増殖を減少した。ＥＩＦ４Ｅ標的ｍＲＮＡを処置の開始の４８時間後に測定し、無処置対照と比較したときに、ＩＳＩＳ  １８３７５０によって約３１％まで、およびＩＳＩＳ  ２９８８１５によって３６％まで減少された。ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルは、対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １２９６９９によって減少されず、実際にわずかに増大した。
【０２６５】
実施例１９：細胞周期に対するｅＩＦ４Ｅ発現のアンチセンス阻害の効果
細胞周期に対するｅＩＦ４Ｅアンチセンス化合物の効果を検査した。ＨｅＬａ細胞を３０μＭアンチセンス・オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ  １８３７５０または２９９８１５）もしくは対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ  ２９８４８またはＩＳＩＳ  １２９６８８）で電気穿孔するか、またはニセものをトランスフェクトした。フローサイトメトリを使用して４８時間でのＤＮＡ含量を測定するために、蛍光性のＤＮＡインターカレーターヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用した。結果（２回行った）を表４に示してある。
【０２６６】
表４
アンチセンス処置後の細胞周期プロフィール
【表４】
2007505627.tif 000017
【０２６７】
表４に示した結果から、両方のｅＩＦ４Ｅアンチセンス化合物（ＩＳＩＳ  １８３７５０またはＩＳＩＳ  ２９８８１５）での処置により、一般にアポトーシスを表すＳｕｂＧ１期の細胞部分を増大したことが分かる。また、Ｇ２Ｍの細胞部分は、ＩＳＩＳ  ２９８８１５処置後に増大される。
【０２６８】
実施例２０：血管形成／管形成に対するｅＩＦ４Ｅ発現のアンチセンス阻害の効果
血管形成は、互いに、および細胞外基質分子で内皮細胞の相互作用を促進する多数の因子によって刺激されて、毛細管の形成を生じる。このプロセスは、組織培養において、内皮細胞による管状構造の形成によって再生することができる。インビトロでの管形成の減少は、インビボでの血管形成の阻害と関連があり（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０７，２４９−２５７；およびＺｈａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，６２，２０３４−４２）、これは、血管形成の指標としてのインビトロでの管形成の使用を支持する。
【０２６９】
管形成アッセイ法は、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、または成長因子減少Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して行われる。ＨＵＶＥＣを９６ウェル・プレートに４０００細胞／ウェルでプレートにまいた。１日後、細胞をリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中の７５ｎＭオリゴヌクレオチドを使用して、標準的な公表された手順（Ｍｏｎｉａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８（１９），１４５１４−２２）に従って、アンチセンスおよび対照オリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。形質移入の約５０時間後、細胞をＥＣＭａｔｒｉｘＴＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）で被覆した９６ウェル・プレートか、または成長因子減少Ｍａｔｒｉｇｅｌに移した。これらの条件下で、無処置のＨＵＶＥＣは、管状構造を形成する。３７℃において一晩インキュベーション後、処置した細胞および未処置の細胞を光学顕微鏡によって検査した。個々のウェルは、管形成の程度に応じて、１〜５までの別々のスコアを割り当てた。１のスコアは、管形成のないウェルを指し、一方５のスコアは、全ての細胞が広範な管状ネットワークを形成するウェルを示す。
【０２７０】
割り当てられた別々のスコアから算出すると、アンチセンス阻害剤ＩＳＩＳ  １８３７５０およびＩＳＩＳ  ２９８８１５で処置した細胞は、それぞれ、約１．５および２．２５の平均管形成スコアを有した。ランダムな対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ；配列番号：２０７であって、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物である）で処置した細胞は、約４．２５の平均管形成スコアを有し、ＩＳＩＳ  ３３４１６３（ＴＧＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴＧＴＡＣＣＣＴＴ；配列番号：２１０）、ＩＳＩＳ  １８３７５０の６塩基ミスマッチで処理した細胞は、約４．５の平均管形成スコアを有した。従って、チューブ形成は、ｅＩＦ４Ｅアンチセンス・オリゴヌクレオチドによって４７〜６７％まで特異的に阻害される。従って、ｅＩＦ４Ｅのアンチセンス阻害剤は、血管形成を阻害することができる。
【０２７１】
実施例２１：マウスにおけるｅＩＦ４Ｅ発現の阻害
８週齢のＣ５７ＢＬ６マウスに、毎週２回３週間（合計６用量）、４０ｍｇ／ｋｇのオリゴヌクレオチド濃度でオリゴヌクレオチドの塩類溶液を腹腔内に注射した。使用した化合物は、ｅＩＦ４Ｅアンチセンス化合物ＩＳＩＳ  １８３７５０（配列番号：４０）、ＩＳＩＳ  ２９９８１５（配列番号：９７）、ＩＳＩＳ  ２９８７９７（配列番号：８０）、およびＩＳＩＳ  ２９８８２３（配列番号：１０５）であった。全てが、ヒトおよびマウスｅＩＦ４Ｅに対して交差−種アンチセンス・オリゴヌクレオチドである。ＩＳＩＳ  １４１９２３は、無関係な（対照）オリゴヌクレオチドである（ＣＣＴＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＴＴＣＣＴＣＣ；配列番号：２１１）。塩類（媒体）対照も使用した。塩類対照と比較して、ＩＳＩＳ  １８３７５０は、マウス肝臓におけるｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルを対照の２０％未満に減少させた（８０％以上の阻害）。また、ＩＳＩＳ  ２９８８１５は、対照の約２０％までｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルを減少させた。ＩＳＩＳ  ２９８７９７処置は、対照の約３０％にｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルを減少させ（７０％の阻害）、ＩＳＩＳ  ２９８８２３処置は、対照の約３７％にｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルを減少させた（６３％の阻害）。対照的に、ＩＳＩＳ  １４１９２３での処置は、ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルを減少させず、実際にこれらを塩類対照の約１４０％に増大した。
【０２７２】
また、マウス肝臓におけるｅＩＦ４Ｅタンパク質レベルを測定した。塩類対照と比較して、ＩＳＩＳ  １８３７５０、ＩＳＩＳ  ２９９８１５、ＩＳＩＳ  ２９８７９７、およびＩＳＩＳ  ２９８８２３での処置は、それぞれ７７％、４７％、５０％、および４７％までｅＩＦ４Ｅタンパク質レベルを減少させ；対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４１９２３での処置は、１２％までｅＩＦ４Ｅタンパク質レベルを減少させた。
【０２７３】
ｅＩＦ４Ｅアンチセンス化合物のいずれか１つで処置したマウスは、肝臓、脾臓、または総体重に本質的に変化を示さなかった。肝酵素レベル（ＡＳＴ／ＡＬＴ）に有意な変化もなく、肝臓組織学は、塩類処置した対照マウスと同じように見えた。
【０２７４】
実施例２２：マウスにおけるヒト腫瘍異種移植に対するｅＩＦ４Ｅ発現のアンチセンス阻害の効果
雄のヌードマウスには、５×１０６  ＰＣ−３ヒト前立腺癌腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）を横腹に皮下注射した。腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに到達したときに（移植後約３〜３．５週）、アンチセンス処置を開始した。マウスには、最初の投与でｅＩＦ４Ｅに対するアンチセンス、ＩＳＩＳ  １８３７５０（配列番号：４０）または対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４１９２３（配列番号：２１１）の静脈内注射によって５０ｍｇ／ｋｇを、次いで、その後に月曜日、水曜日、および金曜日ごとに２５ｍｇ／ｋｇを与えた。腫瘍移植後の５４日まで、ＩＳＩＳ  １８３７５０で処置したマウスにおける腫瘍は、サイズが約４５０ｍｍ３で、対照ＩＳＩＳ  １４１９２３（約９３０ｍｍ３）で処置したマウスの腫瘍と比較してほぼ５０％の減少であった。この減少のレベルは、５７日目の研究の終わりまで続いた。
【０２７５】
また、異種移植は、雌のマウスにおけるＭＤＡ−２３１ヒト乳がん細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）を使用して同様に行った。この実験においてＩＳＩＳ  １８３７５０およびＩＳＩＳ  ２９８８１５の両方を試験し、塩類対照と比較して、それぞれ５５％および５０％の腫瘍細胞増殖とほとんど同じ減少を示した。ｅＩＦ４Ｅタンパク質発現をウエスタンブロット解析（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡからのｅＩＦ４Ｅに対する抗体を使用する）によってこれらのＭＤＡ−２３１異種移植において測定し、無関係な対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ  １４１９２３、配列番号：２１１）で処置したマウスにおける異種移植と比較して、ＩＳＩＳ  １８３７５０（配列番号：４０）で処置したマウスにおいて４５％まで、およびＩＳＩＳ  ２９８８１５（配列番号：９７）で処置したマウスにおいて３９％まで減少されることが見いだされた。
【０２７６】
ｅＩＦ４Ｅは、インビボにおいてヒト配列のセリン残基２０９をリン酸化することができる。リン酸化された形態は、タンパク質の活性な状態と考えられることが多く、リン酸化の増大は、タンパク質合成の割合のアップレギュレーションと相関されることが多い。リン酸化（ｐＳ２０９）ｅＩＦ４Ｅに特異的な抗体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ  ＣＡ）を使用するウエスタンブロットにより、アンチセンス化合物ＩＳＩＳ  １８３７５０および２９８８１５での処置後にｅＩＦ４Ｅのリン酸化された形態が減少するが、アンチセンス対照（ＩＳＩＳ  １２９６９９）では減少しないことを確認した。
【０２７７】
サイクリンＤ１は、ｅＩＦ４Ｅ標的タンパク質であり、サイクリンＤ１タンパク質は、ｅＩＦ４Ｅに対するアンチセンスで処置したマウスにおいてＭＤＡ−２３１異種移植片を減少することも見いだされた。サイクリンＤ１は、無関係な対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  １４１９２３で処置したマウスにおける異種移植片のサイクリンＤ１発現と比較したときに、ＩＳＩＳ  １８３７５０での処置後に４０％までおよびＩＳＩＳ  ２９８８１５での処置後にほとんど５０％まで減少された。
【０２７８】
同じように行われた第３の異種移植研究では、雌のヌードマウスに、５×１０６のＨ４６０ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）を横腹に皮下注射した。一旦腫瘍が１００ｍｍ３の平均サイズに到達したら、オリゴヌクレオチドでの静脈内投薬を開始した。アンチセンス処置スケジュールは、５０ｍｇ／ｋｇでの単一用量のＩＳＩＳ  １４１９２３またはＩＳＩＳ  １８３７５０で開始し、その後に月曜日、水曜日、および金曜日ごとに２５ｍｇ／ｋｇで、１７日間の合計処置時間続いた。研究終了後、ＩＳＩＳ  １４１９２３対照処置群の平均腫瘍体積は、ＩＳＩＳ  １８３７５０に対して約２０００ｍｍ３対５５０ｍｍ３であった（ｐ＜０．００１）。
【０２７９】
実施例２３：短い二本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドによるｅＩＦ−４Ｅの阻害
ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計および合成
ヒトｅＩＦ−４Ｅ配列Ｇｅｎｂａｎｋ  ＃Ｍ１５３５３の配列を照会した。選択された配列のＧ＋Ｃ含量は、３０％〜７０％に及ぶ。ｅＩＦ−４Ｅに特異的で、下記に示した各々のｄｓＲＮＡ配列は、ＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖のそれぞれの鎖の３’末端に２つのデオキシチミジン・ヌクレオチドを含む（図示せず）。遺伝子特異的ｓｉＲＮＡｓの合成、二重鎖形成、および精製は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．によって行われた。３つのｅＩＦ−４Ｅ  ｓｉＲＮＡ配列を選択して試験し、以下に示してある：
ｅＩＦ４Ｅ＿１：
遺伝子配列の位置：１４１−１５９
ＧＣ含量：５３％
５’−ＣＡＧＡＵＧＧＧＣＡＣＵＣＵＧＧＵＵＵ−３’  配列番号：２１２
３’−ＧＵＣＵＡＣＣＣＧＵＧＡＧＡＣＣＡＡＡ−５’配列番号：２１３
ｅＩＦ４Ｅ＿２：
遺伝子配列の位置：１９５−２１３
ＧＣ含量：６３％
５’−ＣＣＵＧＣＧＧＣＵＧＡＵＣＵＣＣＡＡＧ−３’  配列番号：２１４
３’−ＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＵＡＧＡＧＧＵＵＣ−５’  配列番号：２１５
ｅＩＦ４Ｅ＿３：
遺伝子配列の位置：１０１０−１０２８
ＧＣ含量：３７％
５’−ＣＡＡＣＵＵＧＧＣＡＵＵＵＣＵＡＵＡＣ−３’  配列番号：２１６
３’−ＧＵＵＧＡＡＣＣＧＵＡＡＡＧＡＵＡＵＧ−５’  配列番号：２１７。
【０２８０】
対照ｄｓＲＮＡ化合物（また、それぞれの鎖の３’末端に２つのデオキシチミジン・ヌクレオチドを含み、かつｐＧＬ３ルシフェラーゼに対して相補的である）は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．から購入し、下記のアッセイ法に使用した。
対照：
５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ−３’  配列番号：２１８
３’−ＧＡＡＵＧＣＧＡＣＵＣＡＵＧＡＡＧＣＵ−５’  配列番号：２１９
【０２８１】
細胞培養
ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＨＣＴ１１６、ＭＤＡ−２３１、ＭＣＦ−７、Ｔ２４、およびＣＷＲ２２ＲＶ１細胞株は、ＡＴＣＣを介して得て、Ｌ−グルタミンを含み、フェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ）を含まない１０％のＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を含むＲＰＭＩ  Ｍｅｄｉｕｍ  １６４０中で培養する。
【０２８２】
哺乳動物細胞に対するｓｉＲＮＡのトランスフェクション
トランスフェクションの２４時間前に、哺乳類細胞株を２４ウェル・プレート内に１×１０５細胞でプレートにまく。一過性トランスフェクションは、オリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して行う。簡単には、５〜５００ｎＭ（最終量）の間の濃度の個々のｄｓＲＮＡをＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に希釈し、一方でＯｐｔｉＭＥＭおよびオリゴフェクトアミンの別々の溶液を室温で５分間インキュベートする。２つの溶液を混合して、続いて室温で３０分インキュベーションする。血清含有培地を、０．５ｍｌ／ウェルの最終量に向けてトランスフェクション複合体に添加する。既存の細胞培地を吸引し、トランスフェクション複合体と置き換えて、３７℃（５％のＣＯ２）で４８〜７２時間インキュベートする。
【０２８３】
免疫ブロット
７２時間後、トランスフェクション混合物を穏やかに吸引し、細胞を完全タブレットプロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｔａｂｌｅｔ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、１ｍＭの活性化された  Ｎａ３ＶＯ５を含む１５０μｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．２５％Ｎａ−デオキシコレート、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、室温で３０分間インキュベートし、−２０℃で１〜２４時間貯蔵する。３０μｌの解凍した可溶化液を０．２ＭのＤＴＴを含む１０μｌの４×ＮｕＰａｇｅ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加する。試料を８５℃で５分間加熱し、４〜２０％のトリス−グリシン・ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に充填する。ゲルを１×転写緩衝液／２０％のメタノール中で１１００ｍＡＨでＨｙｂｏｎｄ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に転写する。膜を５％の脱脂乳を含むＰＢＳ中で１時間ブロックする。一次抗体、抗ｅＩＦ４Ｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および抗アクチン（Ｓｉｇｍａ）をそれぞれ１：５００および１：１０，０００でブロッキング緩衝液に希釈して、４℃で１６時間インキュベートした。膜をＰＢＳ中で３×洗浄し、続いて室温で２時間の抗マウス二次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）をインキュベーションする。ブロットをＰＢＳ中で３×洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）で１分間処置する。捕獲されたシグナルをＬｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ  Ｆ１（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で記録する。ｅＩＦ４Ｅおよびアクチンに対応するバンドをＬｕｍｉＡｎａｌｙｓｔソフトウエアを使用して定量化し、ゲル充填および転写を調節するためにアクチンに対して規準化した後にｅＩＦ４Ｅ発現レベルを決定する。
【０２８４】
ＬＮＣａＰ細胞株では、ｅＩＦ４Ｅ−１、ｅＩＦ４Ｅ−２、およびｅＩＦ４Ｅ−３のそれぞれが、５０ｎＭ未満の濃度でｅＩＦ−４Ｅタンパク質レベルを５０％以上阻害した。ＣＷＲ２２ＲＶ１細胞株において、５ｎＭ未満のｅＩＦ４Ｅ−２の濃度により、ｅＩＦ−４Ｅタンパク質レベルを５０％以上阻害した。ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、ＨＣＴ１１６、ＭＤＡ−２３１、およびＭＣＦ−７細胞株のそれぞれにおいて、５０ｎＭ未満のｅＩＦ４Ｅ−１およびｅＩＦ４Ｅ−２の濃度により、ｅＩＦ−４Ｅタンパク質発現を５０％以上減少させた。
【０２８５】
細胞増殖アッセイ法
細胞をトランスフェクションの２４時間前に１．５〜３．０×１０３細胞／ウェルの間の細胞密度でポリ−Ｄ−リジン被覆した９６ウェル・プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にまく。ｅＩＦ−４Ｅおよび対照ｓｉＲＮＡｓのトランスフェクションは、５ｎＭ〜５００ｎＭまでの範囲のｓｉＲＮＡ濃度で三通りに行う。細胞を５０μｇ／ｍｌ終濃度でヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって３、６、および８日に集め、光から保護して室温で３０分間インキュベーションする。プレートを凍結前および後にＶｉｃｔｏｒ２  １４２０多重ラベルカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で測定する。凍結後から凍結前の測定を減算することによって修正した合計を得る。
【０２８６】
ＬＮＣａＰ、ＰＣ３、およびＭＤＡ−２３１細胞株のそれぞれにおいて、５０ｎＭ未満のｅＩＦ４Ｅ−１およびｅＩＦ４Ｅ−２の濃度により、細胞増殖を５０％以上減少させた。
【０２８７】
実施例２４：ＨｅＬａ細胞におけるｅＩＦ４ＥにターゲットされたｓｉＲＮＡ構築物の活性
下記の表５に示される二重化したオリゴマーＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用した培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。比較のために、いくつかの一本鎖キメラ・アンチセンスオリゴヌクレオチドも試験した。
【０２８８】
細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  のＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき２５ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡと２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定し、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎに対して規準化した。ヒト・プライマー／プローブ・セットは、以前の例において使用した配列番号：５、６、および７である。
【０２８９】
結果を表５に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表５に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖であり、特に明記しない限り平滑末端である（ｄＴｄＴまたはその他のオーバーハングはない）。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド１〜５および１６〜２０に２’−ＭＯＥと、位置６〜１５に２’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるＣにホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）バックボーンおよび５−メチルシトシンをもつ。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０２９０】
表５
ＨｅＬａ細胞においてｅＩＦ４Ｅ−活性にターゲットされるｓｉＲＮＡ構築物
【表５−１】
2007505627.tif 000018
【表５−２】
2007505627.tif 000019
【表５−３】
2007505627.tif 000020
【表５−４】
2007505627.tif 000021
【表５−５】
2007505627.tif 000022
【表５−６】
2007505627.tif 000023
【０２９１】
「％阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、ｓｉＲＮＡ二重鎖（または、示したとおりのその他の化合物）で処置した細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの％減少を示す。ＲＮＡ定量化は、ＲＴ−ＰＣＲによって示される。この場合、「％阻害」は、ネガティブであり、標的ＲＮＡが増大された。
「標的部位」は、化合物が特異的にハイブリダイズするＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１５３５３．１の標的部位の最も５’のヌクレオチド位置を示す。
「種」は、アンチセンス配列が完全にヒト（ｈ）、ラット（ｈ）、マウス（ｍ）、および／またはウサギ（ｒａｂ）ｅＩＦ４Ｅに対して相補的であるかどうかを示す、
【０２９２】
このスクリーニングにおいて、ｅＩＦ４Ｅを導くＭＯＥ  ギャプマーは、最高のｓｉＲＮＡ（８８％の阻害）よりもわずかに活性である（９４％の阻害）ことが見いだされた。以前に同定されたＭＯＥ  ギャプマー導出部位における５つのｓｉＲＮＡ構築物のうちの３つが活性である。８つのｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡ構築物は、７０％以上の標的減少を示し、７つは、７５％以上の減少を示す。これは、Ｖｉｃｋｅｒｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８，７１０８−７１１８）の結論と一致しており、すなわち、一般にｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド二重鎖の活性は、同じ部位にターゲットされるＲＮａｓｅ  Ｈ依存的なオリゴヌクレオチド（たとえば、ＭＯＥ  ギャプマー）の活性と相関され、最適化されたｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅ  Ｈ依存的なオリゴヌクレオチドは、効力、最大効果、特異性、並びに作用および効率の期間に関して同様に挙動する。
【０２９３】
また、上記の表中の化合物がＨｅＬａ細胞においてＰＴＥＮ  ＲＮＡレベルを減少させる能力を試験した。ｅＩＦ４Ｅターゲットされた化合物（ｓｉＲＮＡまたは一本鎖のＭＯＥギャプマー）のいずれも、約２０％以上までＰＴＥＮ標的ＲＮＡレベルを減少させなかった。ｓｉＲＮＡ陽性対照３３５４４９構築物は、約８５％までＰＴＥＮ  ＲＮＡを阻害し、一本鎖ＭＯＥギャプマー陽性対照ＩＳＩＳ  １１６８４７は、約８０％までＰＴＥＮ  ＲＮＡを阻害した。
【０２９４】
実施例２５：ＭＨ−Ｓ細胞におけるｅＩＦ４ＥにターゲットされるｓｉＲＮＡ構築物の活性
以前の表中のｓｉＲＮＡ化合物のほとんど全ては、完全にマウスおよびヒトｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡに対して相補的である。本明細書において、これらをマウスＭＨ−Ｓネズミ肺胞マクロファージ細胞株で試験する。マウスＭＨ−Ｓ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。細胞は、１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持した。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまいて、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いでオリゴマー化合物の鎖につき２０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡと２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とを含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭの１３０μＬで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置き換えた。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離し、標的減少を測定した。
【０２９５】
結果を表６に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１つのアンチセンス鎖および１つのセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表６に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二重鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド１〜５および１６〜２０に２’−ＭＯＥと、位置６〜１５に２’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、Ｃごとにホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）バックボーンおよび５−メチルシトシンをもつ。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０２９６】
標的部位、種、化学、および配列を以前の表に記載してある。
【０２９７】
表６
マウスＭＨ−Ｓ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡ構築物の活性
【表６−１】
2007505627.tif 000024
【表６−２】
2007505627.tif 000025
【０２９８】
実施例２６：ｅＩＦ４ＥにターゲットされるさらなるｓｉＲＮＡ構築物およびＨｅＬａ細胞における活性
さらなる遺伝子歩行により、ｅＩＦ４Ｅを阻害するさらなるｓｉＲＮＡｓを同定した。構築物は、ＨｅＬａ細胞において５０ｎＭの濃度でスクリーニングした。
【０２９９】
下記の表７に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用した培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。比較のために、いくつかの一本鎖キメラ・アンチセンスオリゴヌクレオチドも試験した。
【０３００】
細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき５０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡと２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０３０１】
結果を表７に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表７に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二重鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド１〜５および１６〜２０に２’−ＭＯＥと、位置６〜１５に２’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるＣにホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）バックボーンおよび５−メチルシトシンをもつ。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０３０２】
表７
ＨｅＬａ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡの活性
【表７−１】
2007505627.tif 000026
【表７−２】
2007505627.tif 000027
【表７−３】
2007505627.tif 000028
【表７−４】
2007505627.tif 000029
【０３０３】
「％阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、ｓｉＲＮＡ二重鎖（または、示したとおりのその他の化合物）で処置した細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの％減少を示す。この場合、「％阻害」は、ネガティブであり、標的ＲＮＡが増大された。ＲＮＡ定量化は、ＲＴ−ＰＣＲによって示される。
「標的部位」は、化合物が特異的にハイブリダイズするＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１５３５３．１の標的部位の最も５’のヌクレオチド位置を示す。
「種」は、アンチセンス配列が完全にヒト（ｈ）、ラット（ｈ）、マウス（ｍ）、および／またはウサギ（ｒａｂ）ｅＩＦ４Ｅに対して相補的であるかどうかを示す。
【０３０４】
実施例２７：ＭＨ−Ｓ細胞においてｅＩＦ４ＥにターゲットされるｓｉＲＮＡ構築物の活性
以前の表におけるｓｉＲＮＡ化合物のほとんど全ては、完全にマウスおよびヒトｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡに対して相補的である。本明細書において、これらをマウスＭＨ−Ｓネズミ肺胞マクロファージ細胞株で試験する。マウスＭＨ−Ｓ細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。細胞は、１０％の熱不活性化されたウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で維持した。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまいて、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いでオリゴマー化合物の鎖につき５０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡと２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置き換えた。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離し、標的減少を測定した。結果を表８に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１つのアンチセンス鎖および１つのセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）を示してあり；センス鎖、標的部位、種、化学、および配列を以前の表と同じである。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０３０５】
特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド１〜５および１６〜２０に２’−ＭＯＥと、位置６〜１５に２’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるＣにホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）バックボーンおよび５−メチルシトシンをもつ。
【０３０６】
表８
マウスＭＨ−Ｓ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡ構築物の活性
【表８】
2007505627.tif 000030
【０３０７】
「％阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、ｓｉＲＮＡ二重鎖（または、示したとおりのその他の化合物）で処置した細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの％減少を示す。「％阻害」がネガティブである場合、標的ＲＮＡが増大される。ＲＮＡ定量化は、ＲＴ−ＰＣＲによって示される。
「標的部位」は、化合物が特異的にハイブリダイズするＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１５３５３．１の標的部位の最も５’のヌクレオチド位置を示す。
「種」は、アンチセンス配列が完全にヒト（ｈ）、ラット（ｈ）、マウス（ｍ）、および／またはウサギ（ｒａｂ）ｅＩＦ４Ｅに対して相補的であるかどうかを示す。
【０３０８】
実施例２８：ＨｅＬａ細胞におけるｅｉＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡ構築物の用量反応の実験−ＩＣ５０
用量反応実験を上記の処置方法および０．１ｎＭ、１．０ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を使用して、ＨｅＬａ細胞において行い、ＩＣ５０（未処置の制御と比較したｅＩＦ４Ｅの５０％の阻害を生じる化合物の濃度）を上記化合物において確実に算出した。結果を表９に示してある。アンチセンス鎖同一性を示してある。センス鎖、標的部位、種、化学、および配列は、以前の表に記載してある。
【０３０９】
表９
ＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡ化合物のＩＣ５０
【表９】
2007505627.tif 000031
【０３１０】
上記のｓｉＲＮＡ構築物のうちの４つをさらなる評価およびＳＡＲ（構造活性相関）解析のために選択した。ｓｉＲＮＡ  ＳＡＲ解析のためのこれらの親構築物は、本明細書に示したとおりである。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
「３３８９１８の構築物」
センス：５’−ＵＡＧＡＧＣＵＡＡＡＧＧＵＧＡＵＡＡＧＡ−３’  ＩＳＩＳ  ３３８９４３（配列番号：２３７）
ＡＳ：３’−ＡＵＣＵＣＧＡＵＵＵＣＣＡＣＵＡＵＵＣＵ−５  ＩＳＩＳ  ３３８９１８（配列番号：２３６）
「３３８９１０の構築物」
センス：５’−ＡＡＧＧＡＵＣＣＡＧＧＡＡＵＡＵＧＡＣＡ−３’  ＩＳＩＳ  ３３８９３５（配列番号：２２１）
ＡＳ：３’−ＵＵＣＣＵＡＧＧＵＣＣＵＵＡＵＡＣＵＧＵ−５’  ＩＳＩＳ  ３３８９１０（配列番号：２２０）
「３３８９２７の構築物」
センス：５’−ＡＧＡＡＧＡＣＡＣＣＵＵＣＵＧＡＧＵＡＵ−３’  ＩＳＩＳ  ３３８９５２（配列番号：２５５）
ＡＳ：３’−ＵＣＵＵＣＵＧＵＧＧＡＡＧＡＣＵＣＡＵＡ−５’  ＩＳＩＳ  ３３８９２７（配列番号：２５４）
「３３８９１４の構築物」
センス：５’−ＣＡＵＵＧＧＵＧＡＡＧＧＡＵＣＣＡＧＧＡ−３’  ＩＳＩＳ  ３３８９３９（配列番号：２２９）
ＡＳ：３’−ＧＵＡＡＣＣＡＣＵＵＣＣＵＡＧＧＵＣＣＵ−５’  ＩＳＩＳ  ３３８９１４（配列番号：２２８）。
【０３１１】
実施例２９：他の２’修飾をもつｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡ構築物
以前の実施例において選択した４つのｓｉＲＮＡ構築物（「親」構築物）を他の２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅまたは２’ＯＭｅ）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾を有するｓｉＲＮＡ構築物と比較した。
【０３１２】
下記の表１０において示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用した培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。比較のために、いくつかの一本鎖キメラ・アンチセンスオリゴヌクレオチドも試験した。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  のＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．２、２および２０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡと２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０３１３】
結果を表１０に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。他の２’−ＯＭｅ／２’−Ｆ修飾された化合物については、センスおよびアンチセンス鎖の両方を修飾して、２種類の修飾が二重鎖化された分子においてレジスタ外となるようにセンス鎖に対して最も５’ヌクレオシドを２’−Ｆにし、またアンチセンス鎖に対して最も５’ヌクレオシドを２’−Ｏ−Ｍｅにする。親化合物は、２０ｍｅｒｓであり、示した２’修飾された化合物は、１９ｍｅｒｓであり、センス鎖の（すなわち、示したとおりの二重鎖の）最も５’の対に対応する塩基対を欠いていることに留意すべきである。これらを表１０に示してある。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してあり；２’−フルオロは、下線を引いてある。無修飾リボースは、無装飾の大文字テキストで示してある。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０３１４】
表１０
他の２’−Ｏ−Ｍｅおよび２’−Ｆ修飾をもつｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡ構築物
【表１０】
2007505627.tif 000032
【０３１５】
「％阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、ｓｉＲＮＡ二重鎖（または、示したとおりのその他の化合物）で処置した細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの％減少を示す。
通常のタイプの大文字＝（ＮＯＲＭＡＬ  ＵＹＰＥ  ＵＰＰＥＲ  ＣＡＳＥ  ＝リン酸バック）ボーンで修飾されていないＲＮＡ。
２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり；２’−フルオロは、下線を引いてある。
【０３１６】
いくつかの構築物については、他の２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロ（２’−ＯＭｅ／２’Ｆ）構築物が、ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡ減少の有効性において、親（無修飾ＲＮＡ）構築物と同等か、またはより優れていることが示された。さらにまた、試験した修飾された構築物の安定性は、無修飾化合物の８倍を超えた（以下の実施例に詳細）。
【０３１７】
実施例３０：マウス血漿における他の２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロｓｉＲＮＡ構築物の安定性
無処置の二重鎖ＲＮＡは、前述したものと同様の抽出およびキャピラリー電気泳動法を使用して、希釈したマウス血漿から解析した（Ｌｅｅｄｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，２３５，３６−４３；Ｇｅａｒｙら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，２４１−２４８）。３〜６ヵ月の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂ）由来のヘパリン処置したマウス血漿を−８０℃から融解し、リン酸緩衝食塩水（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  リン酸カリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム）で２５％（ｖ／ｖ）に希釈した。約１０ｎｍｏｌのプレ・アニールされたｓｉＲＮＡを、１００μＭの濃度で２５％の血漿に添加し、０、１５、３０、４５、６０、１２０、１８０、２４０、３６０、および４２０分間３７℃でインキュベートした。一定分量を示した時間に除去し、ＥＤＴＡで処置して２ｍＭの終濃度にし、キャピラリーゲル電気泳動（ｅＣａｐ  ＤＮＡ  キャピラリーチューブでのＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ−ＵＶ）によって解析するまで０℃で氷上に置いた。ｓｉＲＮＡ二重鎖ピークの領域を測定して、残っている無処置のｓｉＲＮＡの割合を算出するために使用した。内部較正標準のように、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をそれぞれの注射に対して２．５ｍＭの濃度で添加した。０時間点を、リン酸緩衝食塩水中にｓｉＲＮＡを希釈し、続いてキャピラリー電気泳動法によって採取した。パーセント無処置のｓｉＲＮＡを時間に対してプロットし、疑似一次半減期を算出した。結果を表１１に示してある。
【０３１８】
表１１
マウス血漿における他の２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロ  ｓｉＲＮＡ構築物の安定性
【表１１】
2007505627.tif 000033
【０３１９】
親（無修飾）構築物は、３０分後に約５０％分解され、４時間後にほとんどなくなる（６時間で完全になくなる）。対照的に、他の２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロ構築物は、比較的不変のままであり、６時間後でさえも７５％が残っている。
【０３２０】
実施例３１：ｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡのさらなる修飾
種々の修飾をもつさらなるｓｉＲＮＡ構築物を調製し、以前の実施例に記載されているように試験した。
【０３２１】
下記の表１２に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用した培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき濃度範囲の所望のｄｓＲＮＡと２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。安定性解析については、ｓｉＲＮＡ二重鎖を２５％ヘパリン処置したマウス血漿中で３７℃においてインキュベートし、内部参照標準と共にキャピラリーゲル電気泳動によって解析した。
【０３２２】
結果を表１２に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド１〜５および１６〜２０に２’−ＭＯＥと、位置６〜１５に２’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるＣにホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）バックボーンおよび５−メチルシトシンをもつ。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、太字で示してある；２’−フルオロは、下線を引いてあり、４’−チオヌクレオシドは、小文字で示してあり、無修飾リボースは、無装飾の大文字テキストで示してある。
【０３２３】
化合物３３８９１８＿３３８９４３は、無修飾（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）親構築物である。３４９８９２＿３３８９４３は、アンチセンス鎖の位置１〜５、８、９、１２〜１７に２’Ｆを、および位置６，７、１０、１１、１８〜２０に２’ＯＭｅを有し；センス鎖は、修飾されていない（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）。
【０３２４】
３４５８４７＿３４５８４９は、両方の鎖に他のリボースおよび２’ＯＭｅヌクレオシド（レジスタの外）をもつ１９ｍｅｒである。センス鎖の最も５’のヌクレオシドは、リボースであり、アンチセンス鎖の最も５’のヌクレオシドは、２’ＯＭｅである。
【０３２５】
３５１８３１＿３５１８３２は、両方の鎖に他の２’−Ｆおよび２’ＯＭｅヌクレオシド（レジスタの外）をもつ１９ｍｅｒである。センス鎖の最も５’のヌクレオシドは、２’−Ｆであり、アンチセンス鎖の最も５’のヌクレオシドは、２’ＯＭｅである。
【０３２６】
３５２８２４＿３４２７６４は、アンチセンス鎖のそれぞれの末端に３つの４’−チオヌクレオシドをもつ１９ｍｅｒである（センス鎖は、変更されていない）。
【０３２７】
３５２８２７＿３４２７６４は、アンチセンス鎖の５’末端に３つの４’−チオヌクレオシド、およびアンチセンス鎖の３’末端に３つの２’−ＯＭｅヌクレオシドをもつ１９ｍｅｒである（センス鎖は、変更されていない）。
【０３２８】
３４９８９０＿３３８９３５は、混合されたアンチセンス鎖の２’−Ｆ／２’−ＯＭｅ修飾をもつ２０ｍｅｒである（センス鎖は、変更されていない）。アンチセンス鎖は、位置１〜５、８、９および１２〜１７に２’−Ｆを、位置６、７、１０、１１、１８〜２０に２’−ＯＭｅを有する（５’末端で始まる）。
【０３２９】
３４９８９１＿３３８９３９は、混合されたアンチセンス鎖の２’−Ｆ／２’−ＯＭｅ修飾をもつ２０ｍｅｒである（センス鎖は、変更されていない）。アンチセンス鎖は、位置１〜５、８、９、および１２〜１７に２’−Ｆを、位置６、７、１０、１１、１８〜２０に２’−ＯＭｅを有する（５’末端で始まる）。
【０３３０】
３５１０９７＿３３８９５２は、混合されたアンチセンス鎖の２’−Ｆ／２’−ＯＭｅ修飾をもつ２０ｍｅｒである（センス鎖は、変更されていない）。アンチセンス鎖は、位置１〜５、８、９、および１２〜１７に２’−Ｆを、位置６、７、１０、１１、１８〜２０に２’−ＯＭｅを有する（５’末端で始まる）。
【０３３１】
親化合物は、２０ｍｅｒｓであり、示した２’修飾された化合物は、１９ｍｅｒｓであり、センス鎖の（すなわち、示したとおりの二本鎖の）最も５’の対に対応する塩基対を欠いていることに留意すべきである。これらを表１２に示してある。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してあり；２’−フルオロは、下線を引いてあり、４’−チオヌクレオシドは小文字で示してあり、無修飾リボースは、無装飾の大文字テキストで示してある。
【０３３２】
表１２
ｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡおよび活性のさらなる修飾−概要
【表１２】
2007505627.tif 000034
【０３３３】
通常タイプの大文字＝ホスフェートバックボーンで修飾されていないリン酸バックボーン
太字＝リン酸バックボーンをもつ２’−Ｏ−メチルＲＮＡ；
下線＝リン酸バックボーンをもつ２’−フルオロＲＮＡ、
小文字＝リン酸バックボーンをもつ４’−チオＲＮＡ、
「％阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、ｓｉＲＮＡ二重鎖（または、示したとおりのその他の化合物）で処置した細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの％減少を示す。
２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり；２’−フルオロは下線を引いてある。
【０３３４】
混合された（ブロック）２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロ（２’−ＯＭｅ／２’Ｆ）構築物３４９８９２＿３３８９４３は、ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡ減少の有効性において、親（無修飾ＲＮＡ）構築物と同等か、またはより優れていることが示された。
【０３３５】
他の２’−Ｏ−メチル／無修飾構築物３４５８４７＿３４５８４９構築物を２回試験して、ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡ減少の有効性において親（無修飾ＲＮＡ）構築物と同等か、またはより優れていることが示され、安定性が増強された。
【０３３６】
４’−チオブロック修飾された構築物３５２８２４＿３４２７６４は、親よりも活性ではなかったが、非常に安定であった。
【０３３７】
４’−チオ／２’−Ｏ−メチル構築物３５２８２７＿３４２７６４は、有効性において親と同等であった。安定性データは、いまだ得られなかった。
【０３３８】
実施例３２：ＨｅＬａ細胞におけるギャップのある修飾されたｓｉＲＮＡ構築物−活性
さらなるｓｉＲＮＡ構築物をＨｅＬａ細胞において試験した。下記の表１３に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用した培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  のＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．１、１、１０、および１００ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡと２．５μ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０３３９】
安定性解析については、ｓｉＲＮＡ二重鎖を２５％ヘパリン処置したマウス血漿中で３７℃においてインキュベートし、内部参照標準と共にキャピラリーゲル電気泳動によって解析した。結果を表１３に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。特に明記しない限り、一本鎖アンチセンス分子は、ヌクレオチド１〜５および１６〜２０に２’−ＭＯＥと、位置６〜１５に２’−デオキシヌクレオチドとをもつキメラのギャップのあるオリゴヌクレオチドであり、あらゆるＣにホスホロチオアート（Ｐ＝Ｓ）バックボーンおよび５−メチルシトシンをもつ。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０３４０】
化合物３３８９１８＿３３８９４３は、無修飾（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）親構築物である。３４９８９２＿３３８９４３は、アンチセンス鎖の位置１〜５、８、９、１２〜１７に２’Ｆを、位置６、７、１０、１１、１８〜２０に２’Ｏｍｅで有し；センス鎖は、修飾されていない（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）。
【０３４１】
３４９８９６＿３３８９４３は、ＡＳ鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の位置１〜５に２’Ｆを、位置６〜１５にリボースを、および位置１６〜２０に２’Ｏｍｅを有し；センス鎖は、修飾されていない（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）。
【０３４２】
３４９８９４＿３３８９３５は、ＡＳ鎖の５’末端から数えてアンチセンス鎖の位置１〜５に２’Ｆを、位置６〜１５にリボースを、および位置１６〜２０に２’Ｏｍｅを有し；センス鎖は、修飾されていない（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）。
【０３４３】
３４９８９５＿３３８９３９は、ＡＳ鎖の５’末端から数えて位置１〜５に２’Ｆを、位置６〜１５にリボースを、および位置１６〜２０に２’Ｏｍｅを有し；センス鎖は、修飾されていない（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）。
【０３４４】
３４９８９７＿３３８９５２は、ＡＳ鎖の５’末端から数えて位置１〜５に２’Ｆを、位置６〜１５にリボースを、およびアンチセンス鎖の位置１６〜２０に２’Ｏｍｅを有し；センス鎖は、修飾されていない（リボース、Ｐ＝Ｏバックボーン）。
【０３４５】
これらは、表１３に示してある。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり；２’−フルオロは、下線を引いてあり、４’−チオヌクレオシドは、小文字で示してあり、無修飾リボースは、非修飾テキストで示してある。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０３４６】
表１３
ギャップのある修飾されたｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡの活性
【表１３】
2007505627.tif 000035
【０３４７】
通常タイプの大文字＝ホスフェートバックボーンで修飾されていないリン酸バックボーン
太字＝リン酸バックボーンをもつ２’−Ｏ−メチルＲＮＡ；
下線＝リン酸バックボーンをもつ２’−フルオロＲＮＡ、
小文字＝リン酸バックボーンをもつ４’−チオＲＮＡ、
「％阻害」は、無処置の対照細胞と比較した、ｓｉＲＮＡ二重鎖（または、示したとおりのその他の化合物）で処置した細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡの％減少を示す。
２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、太字で示してあり；２’−フルオロは下線を引いてある。
【０３４８】
実施例３３：ＨｅＬａ細胞における他の２’−Ｏｍｅ修飾された平滑断端（ｄＴオーバーハングがない）１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡの活性−ｅＩＦ４Ｅ＿１（３４１８８７）周辺のミクロ歩行
下記の表１４に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．２、２、および２０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０３４９】
結果を表１４に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表１４に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
【０３５０】
３３８９３２は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒであり、ｅＩＦ４Ｅ＿１（３４１８８７）１９ｍｅｒの部位にターゲットされる。
【０３５１】
３３８９５７は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０３５２】
３４６６５８は、リン酸バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒであり、ｅＩＦ４Ｅ＿１（３４１８８７）部位（ｄＴでない）にターゲットされる。
【０３５３】
３４６６６０は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０３５４】
３４６６６１は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸を持つ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  １９ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に２’ＯＭｅ。
【０３５５】
３４６６５９は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸を持つ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  １９ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ。
【０３５６】
３４６６６２は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０３５７】
３４６６６４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０３５８】
３４６６６５は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  １９ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に２’ＯＭｅ。
【０３５９】
３４６６６３は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  １９ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ。
【０３６０】
３４６６６６は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０３６１】
３４６６６８は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０３６２】
３４６６６９は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  １９ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に２’ＯＭｅ。
【０３６３】
３４６６６７は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  １９ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および、１９に２’ＯＭｅ。
【０３６４】
表１４
他の２’−Ｏ−Ｍｅ／リボース平滑末端１９ｍｅｒｓのｅＩＦ４Ｅ＿１（３４１８８７）周辺のミクロ歩行
【表１４】
2007505627.tif 000036
【０３６５】
実施例３４：ＨｅＬａ細胞における他の２’−Ｏｍｅ修飾された平滑断端２１ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡの活性−ｅＩＦ４Ｅ＿１（３４１８８７）周辺のミクロ歩行
下記の表１５に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用する培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  のＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．２、２、および２０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０３６６】
結果を表１５に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表１５に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
【０３６７】
３３８９３２は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒであり、ｅＩＦ４Ｅ＿１部位にターゲットされる。
【０３６８】
３３８９５７は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０３６９】
３４６６７４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２１ｍｅｒである。
【０３７０】
３４６６７６は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２１ｍｅｒである。
【０３７１】
３４６６７５は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  ２１ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１に２’ＯＭｅ。
【０３７２】
３４６６７７は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  ２１ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０に２’ＯＭｅ。
【０３７３】
３４６６７８は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２１ｍｅｒである。
【０３７４】
３４６６８０は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２１ｍｅｒである。
【０３７５】
３４６６７９は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  ２１ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、および２１に２’ＯＭｅ。
【０３７６】
３４６６８１は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ他のリボースおよび２’−ＯＭｅ  ２１ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０に２’ＯＭｅ。
【０３７７】
表１５
ＨｅＬａ細胞における他の２’−Ｏｍｅ修飾された平滑末端２１ｍｅｒのｓｉＲＮＡ−ｅＩＦ４Ｅ＿１（３４１８８７）周辺のミクロ歩行
【表１５】
2007505627.tif 000037
【０３７８】
実施例３５：ＨｅＬａ細胞における４’−チオリボース修飾された１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡの活性
下記の表１６に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用する培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  のＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．２、２、および２０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０３７９】
結果を表１６に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表１６に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で、無修飾リボース・ヌクレオシドは、無装飾の大文字で、チオ４’は小文字で示してある。表１６中の全ての配列は、配列番号：３０１（アンチセンス鎖）／配列番号：３０２（センス鎖の）１９ｍｅｒｓである。
【０３８０】
３４２７４４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０３８１】
３４２７６４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０３８２】
３５２８２４は、ヌクレオシド位置１、２、３、１７、１８、および１９（すなわち、それぞれの末端に３つ）に４’−チオを有し、位置４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０３８３】
３５２８１９は、位置１、２、３、４、１６、１７、１８、および１９（すなわち、それぞれの末端に４つ）に４’−チオを有し、位置５〜１４にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０３８４】
３５２８２７は、位置１、２、３に４’−チオヌクレオシドを、位置１７、１８、および１９に２’−ＯＭｅを有し、位置４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０３８５】
３５２８２６は、位置１、２、３、１０、１３および１７〜１９に４’−チオヌクレオシドを有し、位置４〜９、１１、１２、および１４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０３８６】
３５２８２５は、位置１、２、３、７、１０、１３、および１７〜１９に４’−チオヌクレオシド、位置４、５、６、８、９、１１、１２、および１４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０３８７】
表１６
４’−チオリボース修飾された１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡの活性
【表１６】
2007505627.tif 000038
【０３８８】
いくつかの４’−チオ構築物は、ピコモル範囲のＩＣ５０を有することが示された。
【０３８９】
実施例３６：３３８９１４の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓの活性
下記の表１７に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用する培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．５、５、および５０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０３９０】
結果を表１７に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表１７に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で、無修飾リボース・ヌクレオシドは、無装飾の大文字で示してある。
【０３９１】
３３８９１４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０３９２】
３３８９３９は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０３９３】
３４５８４０は、他のリボースおよび２’−ＯＭｅをもつ１９ｍｅｒであり、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ。
【０３９４】
３４５８４２は、他のリボースおよび２’−ＯＭｅをもつ１９ｍｅｒであり、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に２’ＯＭｅ。
【０３９５】
３４５７３５は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒであり、５’末端から開始して位置１６〜２０に２’Ｏ−Ｍｅヌクレオシドおよび位置１〜１５にリボースを持つ。
【０３９６】
３４５８４３は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒであり５’末端から開始して位置２〜１９に２’Ｏ−Ｍｅヌクレオシド並びに位置１および２０にリボースを持つ。
【０３９７】
３４５８３８は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒであり、５’末端から開始して位置６、１２、１５、および１８〜２０に２’Ｏ−Ｍｅヌクレオシド並びに位置１〜５、７〜１１、１３、１４、１６、１７、および２０にリボースをもつ。
【０３９８】
３４５８３９は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒであり、５’末端から開始して位置６、７、１０、１１、１８〜２０に２’Ｏ−Ｍｅヌクレオシド並びに位置１〜５、８、９、および１２〜１７にリボースをもつ。
【０３９９】
表１７
３３８９１４の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓの活性
【表１７】
2007505627.tif 000039
【０４００】
実施例３７：３３８９１０の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓ
下記の表１８に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用する培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬ  のＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．５、５、および５０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０４０１】
結果を表１８に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表１８に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
【０４０２】
３３８９１０は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４０３】
３３８９３５は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４０４】
３４５７３１は、他のリボースおよび２’−ＯＭｅをもつ１９ｍｅｒであり、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ。
【０４０５】
３４５７３３は、他のリボースおよび２’−ＯＭｅをもつ１９ｍｅｒであり、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に２’ＯＭｅ。
【０４０６】
３４５７１３は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜１５にリボースおよび位置１６〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４０７】
３４５７３４は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１および２０にリボース並びに位置２〜１９に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４０８】
３４５７２９は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜５、７、８、１０、１３、１４、１６、および１７にリボース並びに位置６、９、１２、１５、および１８〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４０９】
３４５７３０は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸で２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜５、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、および１７にリボース並びに位置６、７、１０、１１、および１８〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４１０】
表１８
３３８９１０の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓ
【表１８】
2007505627.tif 000040
【０４１１】
実施例３８：３３８９２７の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓ
下記の表１９に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用する培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．５、５、および５０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０４１２】
結果を表１９に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表１９に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
【０４１３】
３３８９２７は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４１４】
３３８９５２は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４１５】
３４５８５４は、他のリボースおよび２’−ＯＭｅをもつ１９ｍｅｒであり、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ。
【０４１６】
３４５８５６は、他のリボースおよび２’−ＯＭｅをもつ１９ｍｅｒであり、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８に２’ＯＭｅ。
【０４１７】
３４５８５１は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜１５にリボースおよび位置１６〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシドをもつ。
【０４１８】
３４５８５７は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１および２０にリボース並びに位置２〜１９に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４１９】
３４５８５２は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、および１７にリボース並びに位置６、９、１２、１５、および１８〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４２０】
３４５８５３は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜５、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、および１７にリボース並びに位置６、７、１０、１１、および１８〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４２１】
表１９
３３８９２７の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓ
【表１９】
2007505627.tif 000041
【０４２２】
実施例３９：３３８９１８の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓ
下記の表２０に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用する培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．５、５、および５０ｎＭの濃度の所望のｄｓ鎖ＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０４２３】
結果を表２０に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表２０に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してある。
【０４２４】
３３８９１８は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４２５】
３３８９４３は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４２６】
３４５８４７は、他のリボースで１９ｍｅｒおよびリン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２’−ＯＭｅである。５’末端から開始してヌクレオシド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、および１９に２’ＯＭｅ。
【０４２７】
３４５８４９は、他のリボースおよび２’−ＯＭｅをもつ１９ｍｅｒであり、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ。５’末端から開始してヌクレオシド２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、および１８に２’ＯＭｅ。
【０４２８】
３４５８４４は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜１５にリボースおよび位置１６〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４２９】
３４５８５０は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１および２０にリボース並びに位置２〜１９に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４３０】
３４５８４５は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜５、７、８、１０、１１、１３、１４、１６、および１７にリボース並びに位置６、９、１２、１５、および１８〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４３１】
３４５８４６は、リン酸バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ２０ｍｅｒである。５’末端から開始してヌクレオシド１〜５、８、９、１２、１３、１４、１５、１６、および１７にリボース並びに位置６、７、１０、１１、および１８〜２０に２’ＯＭｅヌクレオシド。
【０４３２】
表２０
３３８９１８の構築物に基づく２’−Ｏ−メチル修飾をもつさらなるｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓ
【表２０】
2007505627.tif 000042
【０４３３】
実施例４０：ＨｅＬａ細胞における４’−チオリボース修飾された、および混合された１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ
下記の表２１に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。ＨｅＬａ細胞のために使用する培養方法は、ＡＴＣＣから入手可能であり、たとえば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見いだしてもよい。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．０２、０．２、２、および２０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０４３４】
結果を表２１に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表２１に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してある。全てが、配列番号：３０１（アンチセンス鎖）／配列番号：３０２（センス鎖）の１９ｍｅｒｓである。
【０４３５】
３４２７４４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０４３６】
３４２７６４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース１９ｍｅｒである。
【０４３７】
３５２８２４は、ヌクレオシド位置１、２、３、１７、１８、および１９（すなわち、それぞれの末端に３つ）に４’−チオを有し、位置４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０４３８】
３５２８１９は、位置１、２、３、４、１６、１７、１８、および１９（すなわち、それぞれの末端に４つ）に４’−チオヌクレオシドを有し、位置５〜１４にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０４３９】
３５２８２７は、位置１７、１８および１９で、位置１、２、３、および２’−ＯＭｅに４’チオヌクレオシドを有し、位置４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０４４０】
３５２８２６は、位置１、２、３、１０、１３、および１７〜１９に４’−チオヌクレオシドを有し、位置４〜９、１１、１２、および１４〜１６でリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０４４１】
３５２８２５は、位置１、２、３、７、１０、１３、および１７〜１９に４’−チオヌクレオシドを有し、位置４、５、６、８、９、１１、１２、および１４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０４４２】
３５４６０４は、位置１、２、３に４’−チオヌクレオシドを、並びに位置１７、１８、および１９に２’−ＯＭｅを有し、位置４〜１６にリボースをもつ。バックボーンは、Ｐ＝Ｏ（５’末端リン酸）である。
【０４４３】
表２１
ＨｅＬａ細胞における４’−チオリボース修飾され、および混合された１９ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ
【表２１】
2007505627.tif 000043
【０４４４】
いくつかの４’−チオ構築物は、ピコモル範囲のＩＣ５０を有することが示された。
【０４４５】
実施例４１：Ｕ−８７  ＭＧグリア芽細胞腫細胞においてｅＩＦ４ＥにターゲットされるｓｉＲＮＡ構築物の活性
以前の表に示した修飾されたか、または無修飾ｓｉＲＮＡ構築物は、上に記載された方法を使用して、これらがＵ−８７  ＭＧ細胞においてヒトｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡのレベルを減少させる能力について試験する。Ｕ−８７ヒト・グリア芽細胞腫細胞株は、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍｄ．）から得て、熱不活性化した１０％ウシ胎児血清を補ったＩｓｃｏｖｅ’ｓ  ＤＭＥＭ培地中で維持する。用量反応の実験は、ＩＣ５０値を得るための以前の実施例に記載したとおりに行う。
【０４４６】
実施例４２：ヒトｅＩＦ４ＥにターゲットされるさらなるｓｉＲＮＡｓ
さらなるｓｉＲＮＡｓをヒトｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡに対してデザインした（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１５３５３．１、配列番号：４）。全て、アンチセンス鎖に他の２’−Ｏ−メチル／２’−ＯＨがあり、センス鎖に他の２’−ＯＨ／２’−Ｏ−メチルがある。バックボーンはホスフェート（Ｐ＝Ｏ）であり、かつ５’末端は、５’−ＯＨであるが、これらおよびその他のｓｉＲＮＡ構築物も、５’−リン酸基で合成してもよいことが理解されるであろう。
【０４４７】
アンチセンス鎖を表２２に示してあり；センス鎖は、完全には相補的であり、示していない。
【０４４８】
「標的部位」は、オリゴヌクレオチドがターゲットされるＭ１５３５３．１ヒトｅＩＦ４Ｅ配列（配列番号：４）上の標的領域の最も５’の位置をいう。
【０４４９】
表２２
ヒトｅＩＦ４Ｅに対してターゲットされるさらなるｓｉＲＮＡｓ
【表２２−１】
2007505627.tif 000044
【表２２−２】
2007505627.tif 000045
【０４５０】
実施例４３：ｅＩＦ４Ｅにターゲットされるさらなるアンチセンス化合物
全てがｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの５’キャップ領域、すなわち５’キャップに隣接したｍＲＮＡの極５’末端にターゲットされる、均一な２’−Ｏ−メトキシメチル（２’−ＭＯＥ）ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドのセットを合成した。これらを表２３に示してある。全てのシトシンは、５−メチルシトシンである。理論によって拘束されることは望まないが、完全には、２’−ＭＯＥオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅ  Ｈのための基質であると考えられておらず、したがって、ｍＲＮＡ標的の分解を経る以外に、占有のみ、または立体的妨害メカニズムを経てタンパク質翻訳を妨害すると考えられる。「標的部位」は、ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡ上の位置（示したとおりの配列番号：４または１１）をいう。
【０４５１】
表２３
ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの５’キャップ領域にターゲットされる２’−Ｏ−メトキシメチルアンチセンスオリゴヌクレオチド
【表２３】
2007505627.tif 000046
【０４５２】
表２３において、オリゴヌクレオチドと同じ部位にターゲットされる一連のＰＮＡオリゴマーも合成した。これらを表２４に示してある。それぞれが、オリゴマーの３’末端上にリジンを有する。完全に修飾された２’ＭＯＥ化合物と同様に、ＰＮＡオリゴマーは、ＲＮＡｓｅ  Ｈの基質であるとは考えられていない。
【０４５３】
表２４
ｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの５’キャップ領域にターゲットされるＰＮＡアンチセンス・オリゴマー
【表２４】
2007505627.tif 000047
【０４５４】
実施例４４：ＬＮＡおよび２’−ＯＭｅ修飾されたｓｉＲＮＡ
下記の表１４に示した二重化されたオリゴマーのＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）化合物は、以前の実施例に記載されているように調製し、ＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ  ＶＡ）において評価した。細胞を５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェル・プレートにまき、高グルコース、１０％  ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭ減少血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗浄し、次いで、オリゴマー化合物の鎖につき０．２、２、および２０ｎＭの濃度の所望のｄｓＲＮＡプラス２．５μｌ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１ＴＭで処置した。処置は、二回行った。処置の４または５時間後、培地を新しい培地と置換した。ｄｓＲＮＡ処置の１６または１８時間後に細胞を集め、その時に、以前の実施例に記載されているようにＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡを単離して標的減少を測定した。
【０４５５】
結果を表２５に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表２５に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。特に明記しない限り、全ての二本鎖構築物は、無修飾ＲＮＡ、すなわちリン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’−末端ヒドロキシル基をもつリボース糖である。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを太字で示してある。ＬＮＡヌクレオシドは、イタリックである。
【０４５６】
３３８９１０は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４５７】
３３８９３５は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４５８】
３５２４９３は、位置６、９、１２、および１５（イタリック）にＬＮＡを、位置１８〜２０（太字）に２’−Ｏ−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ２０ｍｅｒである。
【０４５９】
３３８９１４は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４６０】
３３８９３９は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４６１】
３５２４９４は、位置６、９、１２、および１５（イタリック）にＬＮＡを、位置１８〜２０（太字）に２’−Ｏ−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ２０ｍｅｒである。
【０４６２】
３３８９１８は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４６３】
３３８９４３は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４６４】
３５２４９５は、位置６、９、１２、および１５（イタリック）にＬＮＡを、位置１８〜２０（太字）に２’−Ｏ−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ２０ｍｅｒである。
【０４６５】
３３８９２７は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４６６】
３３８９５２は、リン酸（Ｐ＝Ｏ）バックボーンおよび５’末端リン酸をもつ無修飾リボース２０ｍｅｒである。
【０４６７】
３５２４９６は、位置６、９、１２、および１５（イタリック）にＬＮＡを、位置１８〜２０（太字）に２’−Ｏ−メチルを、並びに残りの位置にリボースをもつ２０ｍｅｒである。
【０４６８】
表２５
ＬＮＡおよび２’−ＯＭｅ修飾されたｓｉＲＮＡ
【表２５】
2007505627.tif 000048
【０４６９】
実施例４５：ヒトｅＩＦ４Ｅ  ｓｉＲＮＡｓにターゲットされるさらなるｓｉＲＮＡｓの活性
表２２からのｓｉＲＮＡｓを、ＨｅＬａ細胞においてｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルを減少させる能力について試験した。これらの化合物は、ヒトｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡに対してデザインされた（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ１５３５３．１、配列番号：４）。強調されない限り、アンチセンス鎖は、位置１の２’−Ｏ−メチルで開始する他の２’−Ｏ−メチル／リボースであり（すなわち、奇数の位置は、２’−Ｏ−メチルであり、偶数の位置はリボースである）、センス鎖は、位置１のリボースで開始するほかのリボース／２’−Ｏ−メチルである（すなわち、奇数の位置はリボースであり、偶数の位置は２’−Ｏ−メチルである）。バックボーンはホスフェート（Ｐ＝Ｏ）であり、かつ５’末端は、５’−ＯＨであるが、これらおよびその他のｓｉＲＮＡ構築物も、５’−リン酸基で合成してもよいことが理解されるであろう。ＩＳＩＳ  ３５１８３１＿３５１８３２構築物は、３４５８４７＿３４５８４９構築物と同じ配列を有するが、前者のものは、他の２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロであることに留意されたい（アンチセンス鎖は、奇数の位置に２’−Ｏ−メチルを、偶数に２’−フルオロを有し；センス鎖は、奇数の位置に２’Ｆを、偶数に２’−Ｏ−メチルを有する）。
【０４７０】
表２６に示した化合物を、上記実施例と同様に、ＨｅＬａ細胞において５ｎＭの低用量で試験した。結果を表２６に示してある。示したｓｉＲＮＡ構築物は、１本のアンチセンス鎖および１本のセンス鎖からなる。アンチセンス鎖（ＡＳ）は、下記の表に最初に示してあり、続いてセンス鎖（Ｓ）は、次の列に示してある。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。結果は、表２６においてｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡのパーセント減少（「％阻害」）として示してある。「標的部位」は、オリゴヌクレオチドがターゲットされるＭ１５３５３．１ヒトｅＩＦ４Ｅ配列（配列番号：４）上の標的領域の最も５’位置をいう。
【０４７１】
表２６
ヒトｅＩＦ４ＥにターゲットされるさらなるｓｉＲＮＡｓの活性
【表２６−１】
2007505627.tif 000049
【表２６−２】
2007505627.tif 000050
【表２６−３】
2007505627.tif 000051
【表２６−４】
2007505627.tif 000052
【表２６−５】
2007505627.tif 000053
【表２６−６】
2007505627.tif 000054
【０４７２】
アンチセンス鎖が、配列番号：２３６、３０１、３４３、３４７、３５５、３５９、３６０、３６１、３６３、３６４、３６５、３６７、３７０、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３８４、３８７、または３９１を有するｓｉＲＮＡ二重鎖は、このアッセイ法において少なくとも１０％までｅＩＦ４Ｅを阻害した。
【０４７３】
実施例４６：ｅＩＦ４Ｅにターゲットされる一本鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）
ヒトｅＩＦ４Ｅ（配列番号：４）にターゲットされる一連の一本鎖ＲＮＡアンチセンス・オリゴヌクレオチドを合成した。全てが、全体にホスホロチオアート・バックボーン結合および５’リン酸・キャップをもつＲＮＡ（リボース糖）である。ヒト臍静脈内皮細胞株ＨｕＶＥＣは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から得られる。ＨｕＶＥＣ細胞は、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  （Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を補ったＥＢＭ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中でルーチンで培養する。細胞は、これらが９０％のコンフルエンスに到達するときに、トリプシン処置して希釈することによってルーチンで継代し、１５継代まで維持する。細胞をＲＮＡオリゴヌクレオチド（３０ｎＭオリゴヌクレオチド濃度）で処置するために、１００００細胞／ウェルの密度、９６ウェル・プレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）にまく。処置（ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルの減少）の順序および結果を表２７に示してある。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。上記の実施例のように、「標的部位」は、オリゴヌクレオチドがターゲットされるＭ１５３５３．１ヒトｅＩＦ４Ｅ配列（配列番号：４）上の標的領域の最も５’の位置をいう。「％阻害」は、ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡのパーセント減少をいう（示した±標準偏差）。
【０４７４】
表２７
ＨｕＶＥＣ細胞におけるｅＩＦ４Ｅにターゲットされる一本鎖アンチセンスＲＮＡの活性
【表２７】
2007505627.tif 000055
【０４７５】
上記の表に示したように、一本鎖アンチセンスＲＮＡ化合物の全ては、ヒトｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルを少なくとも１０％まで減少させることができた。ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルを少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％まで減少した化合物は、ｅＩＦ４Ｅ発現の阻害剤として使用するために特に適している。
【０４７６】
ＩＳＩＳ  ３４７４０２（配列番号：２２８）は、この実験においてｅＩＦ４Ｅ発現に最も優れた減少をもたらした。この一本鎖アンチセンスＲＮＡ化合物の用量反応解析は、１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭのアンチセンスＲＮＡ濃度を使用してＨｅＬａ細胞で行った。ＩＳＩＳ  ３４７４０２は、ｅＩＦ４Ｅ発現の用量依存的な阻害をもたらし、１０ｎＭでｅＩＦ４Ｅ発現の４１％の減少および１００ｎＭで６７％の減少であった（この実験では、１ｎＭ用量で効果が観察されなかった）。
【０４７７】
実施例４７：一本鎖アンチセンスＲＮＡ化合物に対応するアンチセンス鎖配列をもつ二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の活性
以前の実施例と同様に二本鎖ＲＮＡ化合物を調製した。二重鎖のアンチセンス鎖は、配列が、以前の実施例に使用した一本鎖アンチセンスＲＮＡ化合物と同一であるが、リン酸ジエステル（Ｐ＝Ｏ）バックボーンで作製した。センス鎖は、完全にアンチセンス鎖に対して相補的であって（したがって、平滑末端２０ｍｅｒ二重鎖を形成する）、さらにＰ＝Ｏバックボーンを有する。両方の鎖とも無修飾ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ二重鎖を２５ｎＭの濃度で使用し、以前のｓｉＲＮＡ実施例に記載されたとおりにＨｅＬａ細胞を処置した。ＨｅＬａ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルに対する処置の効果は、表２８に示したとおりである。「％阻害」は、ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡのパーセント減少をいう（示した±標準偏差）。アンチセンス鎖の配列のみを表２８に示してある。ＲＮＡ配列については、Ｕ（ウラシル）は、一般に、ＤＮＡまたはＤＮＡ様配列において通常見いだされるＴ（チミン）に置き換わることが、当技術分野において十分に理解されている。
【０４７８】
表２８
一本鎖のアンチセンスＲＮＡ化合物に対応する二本鎖ｓｉＲＮＡ化合物の活性
【表２８】
2007505627.tif 000056
【０４７９】
アンチセンス鎖が配列番号：２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２６０、２６２、２６４、２６６、または２６８を有する二本鎖ＲＮＡアンチセンス化合物は、ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルの少なくとも１０％の阻害を与えた。アンチセンス鎖が配列番号：２２０、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３６、２３８、２４０、２４６、２５０、２５４、２５６、２６０、２６２、２６４、または２６８を有する二本鎖ＲＮＡアンチセンス化合物は、ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルの少なくとも５０％の阻害を与え、従って、特にｅＩＦ４Ｅ発現の適切な阻害剤である。
【０４８０】
したがって、一本鎖および二本鎖アンチセンスＲＮＡ化合物は、ｅＩＦ４Ｅ  ＲＮＡレベルの阻害を生じさせることができる。一本鎖および二本鎖バージョンにおいて活性である化合物（すなわち、相補的センス鎖有無において活性なアンチセンス鎖）は、特に有用であると考えられる。
【０４８１】
本発明の種々の修飾は、本明細書に記載されているものに加えて、前述の説明から当業者には明らかであろう。このような修飾は、添付の請求の範囲内にはいることが企図される。本出願において引用されるそれぞれの参照（学術誌論文、米国および米国以外の特許、特許出願刊行物、国際特許出願刊行物、遺伝子バンクアクセッション番号などを含むが、これらに限定されない）は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。２００４年９月１８日に出願の米国仮出願第６０／５０４，１１０号、および２００４年６月３日に出願の米国仮出願  第６０／５７６，５３４号は、それぞれその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【配列表】
2007505627000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月17日(2006.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007505627000001.app
【国際調査報告】
2007505627.tif 000148
2007505627.tif 000149
2007505627.tif 000150
2007505627.tif 000151
2007505627.tif 000152
2007505627.tif 000153