(57)【要約】  エーロゾル投与により送達するためのホスホマイシンとトブラマイシンの組合せ製剤について記載されている。有効量のホスホマイシンとトブラマイシンを含んでいる濃厚なホスホマイシンとトブラマイシンの組合せ製剤は、感受性細菌を阻害することができる。ホスホマイシン及びトブラマイシンは、再構成したときにｐＨが約４．５〜８．０であるように二重アンプル内に独立して製剤されているか、又は、ドライパウダーとして製剤されている。ジェット噴霧器若しくは超音波噴霧器（又は、等価物）又はドライパウダー吸入器により生成された主として１〜５μｍの範囲の浮遊粒子平均粒子径を有するエーロゾルとして送達された製剤により、気道感染症を治療する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の気道における感受性細菌に起因する感染症を予防及び治療するためのエーロゾル製剤であって、
該製剤は、約１ｍｇ〜約３００ｍｇのホスホマイシン、約１ｍｇ〜約３００ｍｇのトブラマイシン、及び、３０ｍＭを越える塩化物濃度を有する約０．５〜７ｍＬの溶液を含んでおり；
該製剤は、主として１〜５μｍの粒度分布を有するエーロゾルを生成させることが可能な噴霧器を用いて、エーロゾル投与される；
前記エーロゾル製剤。
【請求項２】
各抗生物質が水の中に別々に配合されるように前記製剤が二重ブローフィルシールアンプルに入れられており、また、ホスホマイシン溶液が８〜１３のｐＨを有し、トブラマイシン溶液が１〜６のｐＨを有し、且つ、該二重アンプルを開けて内容物を再構成させたときに得られた溶液が約４．５〜８．０のｐＨを有するようにｐＨが調節されている、請求項１に記載のエーロゾル製剤。
【請求項３】
トブラマイシンに対するホスホマイシンの重量比が、約１部〜約５部のトブラマイシンに対して約５部〜約９部のホスホマイシンである、請求項１に記載のエーロゾル製剤。
【請求項４】
トブラマイシンに対するホスホマイシンの重量比が、約１部〜約３部のトブラマイシンに対して約７部〜約９部のホスホマイシンである、請求項１に記載のエーロゾル製剤。
【請求項５】
トブラマイシンに対するホスホマイシンの重量比が、約２部のトブラマイシンに対して約８部のホスホマイシンである、請求項１に記載のエーロゾル製剤。
【請求項６】
細菌に起因する気道の感染症を予防及び治療する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、約０．５〜７ｍＬの生理学的に適切な溶液に懸濁させた約１〜約３００ｍｇのホスホマイシン及び約１〜約３００ｍｇトブラマイシンを含んでいるエーロゾル製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項７】
前記製剤が、３０ｍＭを越える塩化物濃度を有する水の中で約４．５〜８．０のｐＨを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ジェット噴霧器、超音波噴霧器、加圧噴霧器若しくは振動多孔板噴霧器を使用するか、又は、前記製剤を鼻腔若しくは肺気道に送達することが可能な他の装置を使用して前記製剤をエーロゾル投与し、また、該エーロゾルは主として１〜５μｍの粒度分布を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記感染症が、緑膿菌（P. aeruginosa）又は黄色ブドウ球菌（S. aureus）である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記感染症が、細菌性副鼻腔炎、嚢胞性線維症、肺シュードモナス、病院及び地域関連肺炎（hospital and community associated pneumonia）並びに人工呼吸器関連肺炎からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
患者の気道における感受性細菌に起因する感染症を予防及び治療するためのエーロゾルドライパウダー製剤であって、
該製剤は、約１ｍｇ〜約３００ｍｇのホスホマイシン、約１ｍｇ〜約３００ｍｇのトブラマイシン、及び、製薬上許容される賦形剤を含んでおり；
該製剤は、１〜５μｍの粒度を有し；
及び、
該製剤は、ドライパウダー吸入器によって肺気道に投与されるように適合させてある；
前記エーロゾルドライパウダー製剤。
【請求項１２】
緑膿菌（P. aeruginosa）に起因する気道の感染症を予防及び治療する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、約０．５〜７ｍＬの生理学的に適切な溶液に懸濁させた約１〜約３００ｍｇのホスホマイシン及び約１〜約３００ｍｇトブラマイシンを含んでいるエーロゾル製剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
約０．５〜７ｍＬの生理学的に適切な溶液に懸濁させた約１〜約３００ｍｇのホスホマイシン及び約１〜３００ｍｇのホスホマイシン及び約１〜約３００ｍｇトブラマイシンからなる再構成された溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セパシア菌（Burkholderia cepacia）、シトロバクター属（Citrobacter species）、大腸菌（Escherichia coli）、腸内細菌属（Enterobacter species）、フゾバクテリウム属（Fusobacterium species）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎杆菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ菌（Klebsiella oxytoca）、モラクセラ・カタラーリス菌（Moraxella catarrhalis）、プロテウス・ミラビリス菌（Proteus mirabilis）、プレボテラ属（Prevotella species）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、霊菌（Serratia marcescens）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア菌（Stenotrophomonas maltophilia）及びアルカリゲネス・キシロースオキシダンス菌（Alcaligenes xylosoxidans）などのグラム陰性細菌、並びに、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus）、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）及びβ−溶血性連鎖球菌（β-hemolytic Streptococcus species）などのグラム陽性細菌により引き起こされる呼吸器の細菌性感染症の治療に適した、安全で、非刺激性で、且つ、生理学的に適合性を有する、ホスホマイシンとアミノグリコシドの吸入可能な新規組合せ製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
嚢胞性線維症の患者においてグラム陰性細菌によって引き起こされた呼吸器の感染症を治療するために最も広く受け入れられている療法は、単一の抗生物質又は抗生物質の組合せを静脈内投与することを含んでいる（Gibson et al., 2003; Ramsey, 1996）。この治療方法には、幾つかの重要な制限があり、そのような制限には以下のものがある：（１）現存する抗生物質の活性スペクトルが狭い、（２）気道に達する抗生物質の濃度が、殺細菌作用を迅速に示し且つ高い殺細菌率を示すことを確実なものとするのには不充分である、及び（３）薬物の全身濃度が高いために有害な副作用が発症する。
【０００３】
抗生物質のエーロゾル投与（Conway, 2005; O'Riordan, 2000）は、非経口投与に関する制限の幾つかに対するものである（Flume and Klepser, 2002; Kuhn, 2001）。それは、気管支内の空間に高濃度の薬物を局所的に送達することを可能とし、抗生物質に対して全身的に晒されることを少なくすることにより副作用を低減する。しかしながら、嚢胞性線維症の患者は、典型的には、成人としての生涯の全期間にわたって、抗生物質療法を長期間繰り返して受ける（Gibson et al., 2003; Ramsey, 1996）。従って、累積されたアミノグリコシドの毒性及び耐性の発達は、依然として重要な問題である。
【０００４】
ホスホマイシン
ホスホマイシンは、広いスペクトルを有するホスホン酸系抗生物質であり（Kahan et. al., 1974; Woodruff et al., 1977）、シトロバクター属（Citrobacter spp.）、大腸菌（E. coli）、腸内細菌属（Enterobacter spp.）、肺炎杆菌（K. pneumoniae）、緑膿菌（P. aeruginosa）、サルモネラ属（Salmonella spp．）、赤痢菌属（Shigella spp．）及び霊菌（S. marcescens）などのグラム陰性細菌に対して殺細菌活性を示し（Greenwood et. al., 1992; Grimm, 1979; Marchese et. al., 2003; Schulin, 2002）、また、バンコマイシン耐性腸球菌属（vancomycin resistant enterococci）、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌（methicillin-resistant S. aureus）（ＭＲＳＡ）、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌（methicillin-sensitive S. aureus）（ＭＳＳＡ）及び肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）などのグラム陽性細菌に対しても殺細菌活性を示す（Greenwood et. al., 1992; Grimm, 1979; Perri et. al., 2002）。ホスホマイシンは、大腸菌（E. coli）、プロテウス属（Proteus spp．）、サルモネラ属（Salmonella spp．）、赤痢菌属（Shigella spp．）及び霊菌（S. marcescens）に対して最大の活性を示す。これらは、一般に、６４μｇ／ｍＬ以下の濃度のホスホマイシンで阻害される（Forsgren and Walder, 1983）。ホスホマイシンは、緑膿菌（P. aeruginosa）に対しては中程度の活性を示し（Forsgren and Walder, 1983）、特に、トブラマイシンと比較した場合に中程度の活性を示す（Schulin, 2002）。
【０００５】
ホスホマイシンは殺細菌性であるが、大腸菌（E. coli）及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）に対して時間依存性殺細菌作用を示す（Grif et al., 2001）。殺細菌の速度と程度は、ホスホマイシンが標的器官と接触している時間の長さに依存する（Craig, 1998; Mueller et al., 2004）。ホスホマイシンの濃度を増大させても、それに相応する殺細菌活性の速度又は程度の増大は得られない。この特性は、緑膿菌（P. aeruginosa）感染症が濃度依存性殺細菌活性を示す抗生物質で治療するのが好ましい（Craig, 1998; Mueller et. al., 2004）という理由により重要である。
【０００６】
ホスホマイシン単独療法は、通常、併発症を伴っていない大腸菌（E. coli）に起因する尿路感染症の治療で使用され、嚢胞性線維症患者における細菌性呼吸器感染症を包含する細菌性呼吸器感染症の治療においては使用頻度はそれほど多くはない（Kamijyo et al., 2001; Katznelson et al., 1984; Kondo et al., 1996; Reeves, 1994; Bacardi et al., 1977; Bonora et al., 1977; Honorato et al., 1977; Menendez et al., 1977）。しかしながら、ホスホマイシン単独では、これまで、緑膿菌（P. aeruginosa）に起因する感染症の治療に対して広くは使用されてはいない。ホスホマイシンは、心内膜炎（Moreno、et. al., 1986）及び嚢胞性線維症（Mirafchur et. al., 2003）を治療するために、異なった種類の抗生物質と組み合わせて非経口投与されてきたが、エーロゾル投与による肺環境への直接的な送達は成されていない。
【０００７】
ホスホマイシンは、経口用製剤（ホスホマイシンカルシウム及びホスホマイシントロメタモール）及び静脈注射用製剤（ホスホマイシン二ナトリウム）の両方で利用可能である（Woodruff et al., 1977）。ホスホマイシントロメタモールは、ホスホマイシンカルシウムと比較して血中に容易に吸収されるので、経口投与用の好ましい製剤である。２ｇのホスホマイシンを静脈内又は筋肉内に１回投与した後、最大血清濃度は、１〜２時間以内に２５〜９５μｇ／ｍＬの範囲である（Woodruff et al., 1977）。ちなみに、同程度の用量のホスホマイシンを非経口投与した後、正常な肺内では、濃度は１〜１３μｇ／ｍＬに達するが（Bonora et al., 1977）、これは、殆どの病原細菌（特に、緑膿菌（P. aeruginosa））を殺すのには不充分である（Forsgren and Walder, 1983; Schulin, 2002）。嚢胞性線維症を患っている患者は、分配される量の増大とクリアランス速度の増大を特徴とする改変された薬理動態を有するが（Tan et al., 2003）、これは、非経口投与されたホスホマイシンの効力をさらに低下させると思われる。
【０００８】
ホスホマイシンは、様々な体内組織及び体液中に広く分配されるが、血漿タンパク質に有意には結合しない（Mirakhur et al., 2003）。従って、ホスホマイシンが感染部位において充分な濃度に達するのであれば、ホスホマイシンを用いて抗細菌効果を発揮させることができる。嚢胞性線維症患者の気道は、痰と称される粘性の分泌物で塞がれている（Ramsey, 1996）。アミノグリコシド系及びβ−ラクタム系などの数種類の抗生物質の有効性は、痰への浸透性が不足しているという理由により、減じられている。その上、これらの抗生物質の活性は、痰の成分に結合することによりさらに減じられる（Hunt et al., 1995; Kuhn, 2001; Ramphal et al., 1988; Mendelman et al., 1985）。
【０００９】
尿路感染症についてホスホマイシンでの治療を受けた患者から分離した細菌では、耐性の発達はめったに起こらない（Marchese et al., 2003）。ホスホマイシンは、他の抗生物質の標的とはならない酵素ホスホエノールピルベート（ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグリコサミンエノールピルバル−トランスフェラーゼ）に作用するので、別の種類の細胞壁阻害性抗生物質との交差耐性は起こらない（Kahan et al., 1974; Woodruff et al.,1977）。ホスホマイシンは、２つの輸送系（構成的に機能するＬ−α−グリセロリン酸輸送、及び、ヘキソースリン酸取り込み系）により、細菌の細胞に活発に取り込まれる（Kahan et al., 1974）。ホスホマイシン耐性が生じた場合、それは、典型的には、染色体上にコードされた輸送系の一方又は両方における遺伝子突然変異に起因し、また、頻度は低いものの、酵素を改変することによる（Area et al., 1997; Nilsson et al., 2003）。
【００１０】
トブラマイシン
トブラマイシンは、緑膿菌（P. aeruginosa）、大腸菌（E. coli）、アシネトバクター属（Acinetobacter spp．）、シトロバクター属（Citrobacter spp.）、腸内細菌属（Enterobacter spp.）、肺炎杆菌（K. pneumoniae）、プロテウス属（Proteus spp．）、サルモネラ属（Salmonella spp．）、霊菌（S. marcescens）及び赤痢菌属（Shigella spp．）などのグラム陰性好気性細菌に対して活性を示すアミノグリコシド系抗生物質である（Vakulenko and Mobashery, 2003）。特に、トブラマイシンは、緑膿菌（P. aeruginosa）に対して高い活性を示す。トブラマイシンの感受性緑膿菌（P. aeruginosa）に対するＭＩＣは、典型的には、２μｇ／ｍＬ未満である（Shawar et al., 1999; Spencker et al., 2002; Van Eldere, 2003）。黄色ブドウ球菌（S. aureus）及び表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を除いて、殆どのグラム陽性細菌は、トブラマイシンに対して耐性を示す（Vakulenko and Mobashery, 2003）。
【００１１】
トブラマイシンは、迅速に殺細菌作用を示し、また、濃度依存性殺細菌作用を示す（Vakulenko and Mobashery, 2003）。トブラマイシンの濃度を増大させることにより、殺細菌の速度と程度の両方が増大する。従って、首尾よい治療を達成するためには、感染部位の標的器官のＭＩＣよりも５〜１０倍大きな最大トブラマイシンレベルを生じさせるのに充分大きな用量を投与することが必要である。緑膿菌（P. aeruginosa）感染症は、濃度依存性殺細菌活性を示す抗生物質で治療するのが好ましい（Ansorg et al., 1990）。
【００１２】
トブラマイシンは、通常、グラム陰性細菌によるそれほど重篤でない感染症を治療するために投与される（Vakulenko and Mobashery, 2003）。しかしながら、それは、尿路及び腹部の重篤な感染症や、心内膜炎及び菌血症を治療するために、他の種類の抗生物質と組み合わせることができる（Vakulenko and Mobashery, 2003）。呼吸器感染症、特に、ＣＦ患者において緑膿菌（P. aeruginosa）に起因する呼吸器感染症を治療するために、トブラマイシンと細胞壁阻害性抗生物質を組み合わせたものの非経口投与が使用されてきた（Gibson et al., 2003;Lang et al., 2000; Ramsey et al., 1999; Ramsey et al., 1993; Smith et al., 1999; Spencker et al., 2003）。
【００１３】
トブラマイシンは、経口的にはあまり吸収されず、非経口的に投与することが必要である（Hammett-Stabler and Johns, 1998）。トブラマイシンは、静脈内注射用製剤及びエーロゾル製剤の両方で利用可能である。非経口投与された後、トブラマイシンは、主に、細胞外液内に分配される。トブラマイシンは、糸球体濾過により急速に排出され、その結果、血漿半減期は、１〜２時間である（Tan et al., 2003）。トブラマイシンの呼吸器分泌物への浸透性は非常に劣っており、痰に結合することにより、その活性はさらに減じられる（Kuhn, 2001）。トブラマイシンをエーロゾル投与することにより、非経口投与した場合と比較して痰内のレベルは１０００μｇ／ｍＬ以上と有意に高くなるが（Geller et al., 2002）、痰への結合は、依然として重要な問題である（Hunt et al., 1995; Mendelman et al., 1985; Ramphal et al, 1988）。
【００１４】
腎毒性及び内耳神経毒性は、トブラマイシン療法に伴う副作用である（Al-Aloui et al., 2005; Hammett-Stabler and Johns, 1998）。腎毒性は、近位尿細管の輪郭を成している上皮細胞のリソソーム内にトブラマイシンが蓄積することにより起こる。これは、細胞の機能を変質させ、最終的には、細胞の壊死を引き起こす（Mingeot- Leclercq and Tulkens, 1999）。臨床的には、これは、非尿量過少性（nonoliguric）腎不全として現れる。嚢胞性線維症患者における腎毒性の有病率は、３１〜４２％であると見積もられている（Al-Aloui et al., 2005）。聴力の損失とめまいを特徴とする内耳神経毒性の発生率は、アミノグリコシド系で治療された患者の２５％もあると見積もられている（Hammett-Stabler and Johns, 1998）。腎毒性とは異なって、内耳神経毒性は回復不能である。毒性の発症に関する最も大きな危険因子は、大用量のトブラマイシンに累積的に晒されることである（Hammett-Stabler and Johns, 1998; Mingeot-Leclercq and Tulkens, 1999）。嚢胞性線維症患者は、その全生涯にわたり、高投与量のトブラマイシンで繰り返し長期間にわたって治療され（Tan et al., 2003）、累積的に腎不全を発症する大きなリスクを有している（Al-Aloui et al., 2005）。
【００１５】
細菌のトブラマイシンに対する耐性は、ますます広く行きわたってきているが、それは、長期間にわたり繰り返し行われる抗生物質単独療法に起因している（Conway et al., 2003; Van Eldere, 2003; Mirakhur et al., 2003; Pitt et al., 2005; Schulin, 2002）。例えば、嚢胞性線維症患者では、トブラマイシン、ゲンタマイシン、セフタジジム（ceftazidinme）、ピペラシリン及びシプロフロキサシンに対して概ね耐性を示す緑膿菌（P. aeruginosa）が定着している（Eldere, 2003; Pitt et al., 2005; Pitt et al., 2003; Weiss and Lapointe, 1995）。かくして、現在の抗生物質療法は、薬剤耐性のために、緑膿菌（P. aeruginosa）感染症の治療に対して効果が無くなってきている。
【００１６】
グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌、特に、多剤耐性緑膿菌（P. aeruginosa）により引き起こされる急性及び慢性の呼吸器感染症について、改善された治療方法が引き続き求められているのは明白である。このことは、現行療法が毒性と耐性発達の問題により制限されている嚢胞性線維症患者において、特に明らかである。その様な治療方法は、好ましくは、ホスホマイシンとアミノグリコシド（例えば、トブラマイシン）からなるエーロゾル化された抗生物質の組合せを吸入させることを含むであろう。吸入させることにより、治療上有効な量の薬物が気道の気管支内空間又は鼻腔（nasal passage）に直接送達される。そのような治療は、有効であり、薬物耐性の頻度を低減させ、安全性を向上させるであろう。
【００１７】
エーロゾル化可能で且つ主に気管支内空間に送達可能なできる限り少ない容積の溶液又はできるだけ少ない重量のドライパウダーを含んでいる濃厚化形態にある充分な用量のホスホマイシンとアミノグリコシド（例えば、トブラマイシン）を送達するための製剤及びシステムを提供することは、極めて有利であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、本発明の目的は、ホスホマイシン＋アミノグリコシドの濃厚化された液体製剤又はドライパウダー製剤を提供することであり、ここで、該製剤は、充分な量ではあるが過剰量ではない量のホスホマイシンとアミノグリコシドを含んでおり、噴霧化により主として１〜５μｍの範囲のエーロゾル粒度に効率よくエーロゾル化可能であり、患者に充分に許容されるようなホスホマイシン＋アミノグリコシドのエーロゾルの生成が可能となるように調節されている塩分を含んでおり、及び、充分な貯蔵寿命を有している。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一態様は、グラム陰性細菌及びグラム陽性細菌に起因する、細菌性副鼻腔炎などの上気道感染症及び嚢胞性線維症などの下気道（肺）感染症、嚢胞性線維症患者における慢性肺シュードモナス（pulmonary Pseudomonas）感染症、一次感染後のシュードモナス（Pseudomonas）感染症、気管支拡張症、院内肺炎及び市中肺炎（hospital and community acquired pneumonia）並びに人工呼吸器関連肺炎（ＶＡＰ）の治療方法であり、ここで、該治療方法は、そのような治療を必要としている患者の気管支内空間又は鼻内空間に、ホスホマイシンとトブラマイシンを含んでいる有効量のエーロゾル製剤を投与する段階を含んでいる。
【００２０】
本発明の別の態様は、下部呼吸器細菌感染症及び上部呼吸器細菌感染症を治療するために患者の気管支内空間又は鼻内空間にホスホマイシンとトブラマイシンの組合せを送達するのに適した、液体又はドライパウダーいずれかの濃厚化製剤である。
【００２１】
本発明のさらに別の態様は、患者の気管支内空間及び鼻内空間にアミノグリコシドとホスホマイシンを送達するのに適した液体又はドライパウダーいずれかの製剤であり、ここで、該製剤は、いずれかの薬物を単独で使用した場合と比較して抗生物質耐性の発達を低減させる。
【００２２】
本発明のさらに別の態様は、患者の気管支内空間又は鼻内空間にアミノグリコシドとホスホマイシンを送達するのに適した液体又はドライパウダーいずれかの製剤であり、ここで、該製剤は、いずれかの薬物を単独で使用した場合の抗生物質持続効力（ＰＡＥ）と比較してＰＡＥを増大させる。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、３０ｍＭを越える塩化物濃度を有する０．５〜７ｍＬの水の中に１〜３００ｍｇのホスホマイシンと１〜３００ｍｇのアミノグリコシドを含んでいる製剤であり、ここで、該製剤は、４．５〜８．０のｐＨを有し、エーロゾル投与により送達される。このエーロゾルは、主として１〜５μｍの浮遊粒子平均粒子径（mass medium average diameter）（ＭＭＡＤ）を有する粒子を含んでおり、所要の寸法の粒子を霧化可能な噴霧器を用いて投与される。
【００２４】
本発明のさらに別の態様は、約１〜約３００ｍｇのホスホマイシン、約１〜約３００ｍｇアミノグリコシド及び少なくとも１種類の製薬上許容される賦形剤を微粉化されたドライパウダーの形態で含んでいるドライパウダー製剤であり、ここで、該ドライパウダー製剤は、エーロゾル投与されたときに、１〜５μｍの浮遊粒子平均粒子径（mass medium average diameter）（ＭＭＡＤ）を有する粒子を送達する。
【００２５】
本発明は、急性及び慢性の肺細菌感染症、特に、β−ラクタム系及びアミノグリコシド系での治療に対して耐性を示すグラム陰性細菌である多剤耐性緑膿菌（P. aeruginosa）に起因する急性及び慢性の肺細菌感染症の治療に適した、ホスホマイシン＋アミノグリコシドを含有する吸入可能な製剤に関する。該エーロゾル製剤は、容積は小さくても、治療上有効な用量のホスホマイシン＋アミノグリコシドを、感染部位に、細菌による呼吸器感染症を治療するのに充分な量で送達する。該ドライパウダー及び再構成されたアミノグリコシド＋ホスホマイシンの製剤は、長い貯蔵寿命を有し、貯蔵安定性を有する。
【００２６】
本発明の製剤は、好ましくは、５〜９重量部のホスホマイシンと１〜９重量部のアミノグリコシドを含み、好ましくは、約７〜９重量部のホスホマイシンと１〜３重量部のアミノグリコシドを含み、さらに好ましくは、約８重量部のホスホマイシンと約２重量部のアミノグリコシドを含んでいる。最も好ましいアミノグリコシドは、トブラマイシンである。
【００２７】
用語の定義
本明細書で使用される場合：
「四分の一生理食塩水（quarter normal saline）」又は「１／４ＮＳ」は、０．２２５％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌを含んでいる四分の一の濃度に希釈された生理食塩水を意味する。
【００２８】
「９：１のホスホマイシン：トブラマイシン」は、９：１の重量比のホスホマイシン酸対トブラマイシン塩基を含んでいる水溶液製剤又はドライパウダー製剤を意味する。
【００２９】
「８：２のホスホマイシン：トブラマイシン」は、ホスホマイシンの量がトブラマイシンの量の８倍となるように、８：２の重量比のホスホマイシン酸対トブラマイシン塩基を含んでいる水溶液製剤又はドライパウダー製剤を意味する。
【００３０】
「７：３のホスホマイシン：トブラマイシン」は、７：３の重量比のホスホマイシン酸対トブラマイシン塩基を含んでいる水溶液製剤又はドライパウダー製剤を意味する。
【００３１】
「５：５のホスホマイシン：トブラマイシン」は、５：５の重量比のホスホマイシン酸対トブラマイシン塩基を含んでいる水溶液製剤又はドライパウダー製剤を意味する。
【００３２】
「最小発育阻止濃度（minimal inhibitory concentration）（ＭＩＣ）」は、３５℃で１８〜２０時間インキュベーションした後で、視覚的に認識できる増殖を阻止する抗生物質の最低濃度を意味する。
【００３３】
「最小殺細菌濃度（minimal bactericidal concentration）（ＭＢＣ）」は、３Ｌｏｇ１０以上の殺細菌作用が得られる抗生物質の最低濃度を意味する。
【００３４】
「時間依存性殺細菌作用（time-dependent killing）」は、薬物濃度を増大させても細菌を殺す速度が速くならないか又は細菌を殺す程度が増大しないことを意味する。
【００３５】
「濃度依存性殺細菌作用（concentration-dependent killing）」は、薬物の濃度を高くすることにより、殺細菌の速度及び程度が増大することを意味する。
【００３６】
「静菌性（bacteriostatic）」は、抗生物質が細菌の増殖を阻害することにより作用することを意味する。
【００３７】
「殺細菌性（bactericidal）」は、抗生物質が細菌を殺すことにより作用することを意味する。
【００３８】
「相乗作用（synergy）」は、組合せた被験抗生物質の効果が、いずれの薬物の単独の効果よりも有意に高いことを意味する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、エーロゾル投与により気管支内空間又は鼻内空間に有効に送達するのに適した、ホスホマイシン＋トブラマイシンの濃厚化製剤に関する。本発明は、好ましくは、細菌感染症（特に、多剤耐性緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に起因する細菌感染症）を治療するために、気管支内空間又は鼻内空間にホスホマイシン＋トブラマイシンを効果的に送達するのに必要な１〜５μｍの範囲のエーロゾル粒子を生成するジェット噴霧器、超音波噴霧器又は等価な噴霧器でエーロゾル投与するための濃厚化したホスホマイシン＋トブラマイシンの製剤に適している。該製剤は、患者に充分に許容されるようなホスホマイシン＋トブラマイシンのエーロゾルの生成が可能となるように調節されている塩分を含んでいるが気管支痙攣及び咳などの二次的な望ましくない副作用の発症を最小にする、できる限り少ない容積の生理学的に許容される溶液中に製剤された最小量ではあるが有効量である量のホスホマイシン＋トブラマイシンを含んでいる。
【００４０】
どのようなエーロゾル化製剤であっても、それについての主要な要件は、その安全性及び有効性である。付加的な有利点は、より低いコスト、特に、使用にかかる低いコスト、長い貯蔵寿命、保管及び噴霧器の操作である。
【００４１】
エーロゾル化ホスホマイシン＋トブラマイシンは、肺の空間、気管支内空間又は鼻内空間にホスホマイシン＋トブラマイシンを効果的に送達するために製剤される。噴霧器は、主として１〜５μｍの範囲の浮遊粒子平均粒子径（mass medium average diameter）を有するホスホマイシン＋トブラマイシンのエーロゾルが形成され得るように選択する。そのように製剤され且つ送達された量のホスホマイシン＋トブラマイシンは、細菌による肺感染症（特に、多剤耐性緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に起因する肺感染症）の治療に有効である。該製剤は、患者に充分に許容されるようなホスホマイシン＋トブラマイシンのエーロゾルの生成が可能となるように調節された塩分、浸透強度（osmotic strength）及びｐＨを有する。該製剤は、有効用量のホスホマイシン＋トブラマイシンを感染部位に送達可能な、できる限り少ないエーロゾル化可能な容積を有する。さらに、該エーロゾル化製剤は、気道又は鼻腔の機能を損なわず、望ましくない副作用を最小限にする。
【００４２】
Ｉ．  抗生物質の組合せの評価
ホスホマイシン：アミノグリコシドの組合せを、実施例１に記載してあるように製剤した。ホスホマイシンは固有の安全性を有し、また、アミノグリコシドの毒性を低減することが必要であったので、ホスホマイシンが当該組合せの主要成分を構成した。ホスホマイシン：アミノグリコシドの組合せ、特に、ホスホマイシン：トブラマイシンを、（ａ．）インビトロにおける効能、（ｂ．）殺細菌速度、（ｃ．）耐性の頻度、及び（ｄ．）動物における効力について評価した。
【００４３】
ａ．  インビトロにおける効能
人工呼吸器関連肺炎、副鼻腔炎、気管支拡張症及び嚢胞性線維症における気道感染症を引き起こす種類の代表的なグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌のパネルに対するホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独及びそれらの組合せのインビトロにおける効能について、表１及び表２に示してある。該データは、ホスホマイシン：トブラマイシンの組合せが広いスペクトルのグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対して抗菌活性を有することを示している。ホスホマイシン：トブラマイシンの組合せのＭＩＣは、ホスホマイシン単独又はトブラマイシン単独にくらべて改善されなかった。
【００４４】
【表１】
2007538075.tif 000002
【００４５】
【表２】
2007538075.tif 000003
【００４６】
表３は、嚢胞性線維症患者からの肺の痰のサンプルから分離した１００種類の緑膿菌（P. aeruginosa）菌株に対する、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独及びそれらの組合せのＭＩＣ５０値及びＭＩＣ９０値について示している。この研究により、ムチンの非存在下ではトブラマイシンが最も活性の強い抗生物質であることが示された。ホスホマイシンとトブラマイシンを組み合わせることにより、ホスホマイシン単独と比較して、ＭＩＣ５０値及びＭＩＣ９０値が有意に改善された。ＣＦムチン結合モデル（＋ムチン）では、ホスホマイシン：トブラマイシンの組合せは、トブラマイシン単独に匹敵するＭＩＣ５０値及びＭＩＣ９０値を示した。
【００４７】
【表３】
2007538075.tif 000004
【００４８】
表４は、ホスホマイシンと９種類のアミノグリコシドの間のチェッカーボード相乗効果試験（checkerboard synergy study）の結果について示している。ホスホマイシン：アミノグリコシドの９種類の異なった組合せの間の相互作用は、全て、「普通（indifferent）」として分類された。該組合せは、いずれも、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対して、相乗作用的な活性は示さなかった。このデータは、ホスホマイシンとアミノグリコシド系を組み合わせるこにより効力が改善されるであろうということは明らかではないことを示している。
【００４９】
【表４】
2007538075.tif 000005
【００５０】
表５は、緑膿菌（P. aeruginosa）、大腸菌（E. coli）、インフルエンザ菌（H. influenzae）及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）の臨床株に対する、ホスホマイシンとトブラマイシンの間のチェッカーボード相乗効果試験の結果について示している。ホスホマイシンとトブラマイシンの間の相互作用は、被験分離株の大部分について「普通」として分類された。ホスホマイシンとトブラマイシンの組合せの間の相互作用は、緑膿菌（P. aeruginosa）のただ１種類の菌株及び大腸菌（E. coli）の１種類の菌株に対して相乗作用的であった。このデータは、さらに、ホスホマイシンとトブラマイシンを組み合わせるこにより効力が改善されるであろうということは明らかではないことを示唆している。
【００５１】
【表５】
2007538075.tif 000006
【００５２】
表６は、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独、並びに、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せのＭＢＣ／ＭＩＣ値について示している。ＭＢＣ／ＭＩＣ値が１以下である抗生物質が好ましいが、それは、そのような抗生物質が、増殖を遅くさせるのではなく殺すことにより細菌を阻止するからである。この研究により、意外にも、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せのＭＢＣ／ＭＩＣ値が、トブラマイシン単独のＭＢＣ／ＭＩＣ値と同等であることが示された。ホスホマイシン単独のＭＢＣ／ＭＩＣ比は８以上であることから、この発見は予想外であった。この研究により、さらに、ホスホマイシン：アミノグリコシドの他の組合せでは、どのような組合せでも同様の発見は観察されないことが示された。
【００５３】
【表６】
2007538075.tif 000007
【００５４】
表７は、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３、大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ２９２１３に対する、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独、並びに、それらの、９：１、８：２及び７：３の組合せのＭＢＣ／ＭＩＣ値について示している。緑膿菌（P. aeruginosa）に関して、９：１、８：２及び７：３の組合せのＭＢＣ／ＭＩＣ値は、トブラマイシン単独のＭＢＣ／ＭＩＣ値と同等であった。この発見は、そのようなことが大腸菌（E. coli）及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）では観察されなかったことから、予想外であった。
【００５５】
【表７】
2007538075.tif 000008
【００５６】
ｂ．  殺細菌速度
表８は、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：アミノグリコシドの組合せの時間−殺細菌の研究の結果について示している。時間の経過に伴う殺細菌についての試験により、ホスホマイシン：トブラマイシンの組合せ、ホスホマイシン：ゲンタマイシンの組合せ、及び、ホスホマイシン：アルベカシンの組合せの間の相乗作用が明らかになった。残ったホスホマイシン：アミノグリコシドの組合せは、相乗作用的ではなかった。このデータは、ホスホマイシン：アミノグリコシドのどの組合せが相乗作用的であるかは明らかではなく、また、ホスホマイシン：アミノグリコシドのどのような比率が相乗作用的であるかは明らかではなかったことを示している。
【００５７】
【表８】
2007538075.tif 000009
【００５８】
表９は、ホスホマイシン：アミノグリコシドの種々の組合せによる緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する殺細菌作用を達成するための時間を示している。抗生物質は３２μｇ／ｍＬの濃度で評価した。この研究により、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せが、ホスホマイシン：アミノグリコシドの他のどの組合せよりも速く殺細菌を達成したことが示された。このデータにより、さらに、ホスホマイシン：アミノグリコシドの組合せのうちの３種類は殺細菌作用を示さないことが明らかになった。トブラマイシン単独では１時間で殺細菌を達成し、ホスホマイシンでは殺細菌作用を示さなかったので、これらの結果は予想外であった。
【００５９】
【表９】
2007538075.tif 000010
【００６０】
図１及び図２は、９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独による静菌的殺細菌作用（bacteriostatic killing）と比較して、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。チェッカーボード試験の解析ではホスホマイシンとトブラマイシンの間の相乗効果は示されなかったので、これは、予想外であった。
【００６１】
図３及び図４は、８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。３２μｇ／ｍＬの濃度で、上記組合せの殺細菌活性は、ホスホマイシンよりも著しく優れており、トブラマイシンよりもわずかに優れていた。１６μｇ／ｍＬでは、上記組合せは、トブラマイシン単独及びホスホマイシン単独よりも優れていた。
【００６２】
図５、図６及び図７は、７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。１６μｇ／ｍＬ及び３２μｇ／ｍＬの濃度で、上記組合せの殺細菌活性は、ホスホマイシンよりも著しく優れており、トブラマイシン単独よりもわずかに優れていた。８μｇ／ｍＬでは、上記組合せは、トブラマイシン単独及びホスホマイシン単独のどちらよりも優れていた。
【００６３】
図８及び図９は、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せとトブラマイシン単独についての緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する殺細菌曲線を比較している。３２μｇ／ｍＬの濃度では、全ての抗生物質は、殺細菌の同じような速度及び程度を示した。１６μｇ／ｍＬでは、トブラマイシンが最も活性の高い抗生物質であり、それに、Ｆ７：Ｔ３、Ｆ８：Ｔ２及びＦ９：Ｔ１が続いた。
【００６４】
図１０、図１１及び図１２は、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する濃度依存性殺細菌作用を示している。当該組合せの主要成分であるホスホマイシンが時間依存性殺細菌作用を示すことから、これは予想外であった。トブラマイシン単独は、濃度依存性殺細菌作用を示す。
【００６５】
ｃ．  耐性の頻度
表１０は、緑膿菌（P. aeruginosa）の５種類の菌株に関して、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独及び９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せに対する耐性の発達頻度を示している。この研究により、９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せに対する耐性の発達頻度は、ホスホマイシン単独に対する発達頻度より１０００〜１００，０００倍少なく、トブラマイシン単独に対する発達頻度より１０〜１０００倍少ないことが示された。
【００６６】
【表１０】
2007538075.tif 000011
【００６７】
表１１は、ホスホマイシン、トブラマイシン又は９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せに１回接触させたあとで分離した緑膿菌（P. aeruginosa）突然変異株の、ＭＩＣにおける上昇倍数（fold increase）を示している。この研究により、ホスホマイシン突然変異株（１２８−＞５１２倍）又はトブラマイシン突然変異株（２−１６倍）と比較して、（９：１）突然変異株ではＭＩＣ（１−２倍）があまり上昇しなかったことが示された。
【００６８】
【表１１】
2007538075.tif 000012
【００６９】
表１２は、ホスホマイシン、トブラマイシン又は９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せに２８日間連続して接触させたあとの緑膿菌（P. aeruginosa）の臨床株における耐性の発達を示している。９：１の組合せに接触させることにより、第１４日までにＭＩＣは８倍上昇したが、そのＭＩＣは、ホスホマイシン耐性限界値（resistance breakpoint）の２５６μｇ／ｍＬを越えることはなかった。トブラマイシンに接触させることによりＭＩＣは１２８倍上昇したが、これは、トブラマイシン耐性限界値の１６μｇ／ｍＬを越えていた。ホスホマイシン単独に接触させた緑膿菌（P. aeruginosa）では、耐性の急激で劇的な発達が観察された。
【００７０】
【表１２】
2007538075.tif 000013
【００７１】
ｄ．  動物における効力
図１３、  図１４及び図１５は、それぞれ、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与した後の、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対する殺細菌作用を示している。この研究により、処理の４０〜６０分後には、大腸菌（E. coli）による肺感染が完全に撲滅されたことが示された（５−６Ｌｏｇ１０ＣＦＵ）。
【００７２】
図１６及び図１７は、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独の１ｌｏｇ１０未満の殺細菌作用に比較して、９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対して５ｌｏｇ１０を越える殺細菌作用が得られたことを示している。
【００７３】
図２０は、トブラマイシン単独による２ｌｏｇ１０の殺細菌作用に比較して、８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対して５ｌｏｇ１０を越える殺細菌作用が得られたことを示している。インビトロでの効能についてのデータでは、当該組合せがトブラマイシン単独よりも優れているということは示されなかったので、これは、予想外であった。
【００７４】
図１９及び図２０は、８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の緑膿菌（P. aeruginosa）に対して、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独に比較して優れた殺細菌作用が得られたことを示している。
【００７５】
図２１は、８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの６０ｍｇ／ｍＬ溶液及び９０ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の緑膿菌（P. aeruginosa）に対して、著しい殺細菌作用が得られたことを示している。
【００７６】
ＩＩ．  ホスホマイシン／トブラマイシンエーロゾル製剤
本発明において有用なアミノグリコシドは、トブラマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシンＢ、アミカシン、アルベカシン、ジベカシン、ストレプトマイシン、ネオマイシン及びネチルマイシンなどの抗生物質である。本発明において特に有用なホスホマイシン化合物は、ホスホマイシントロメタモール、ホスホマイシン二ナトリウム塩及びホスホマイシンカルシウムなどの抗生物質である。
【００７７】
本発明による好ましいホスホマイシン＋トブラマイシン製剤は、３０ｍＭを越える塩化物濃度を有する約０．５〜７ｍＬの水当たり、１０〜５００ｍｇのホスホマイシン＋トブラマイシンを含んでいる。これは、特定の範囲の感受性微生物の定着を予防し、また、そのような微生物に起因する重症の上気道感染症及び下気道感染症を治療するのに必要とされるであろう投与量に相当する。
【００７８】
患者は、噴霧された溶液のｐＨ、浸透圧重量モル濃度及びイオン含有量の影響を受けやすい。従って、これらのパラメータは、ホスホマイシン＋トブラマイシンに適合し且つ患者に許容されるように調節されるべきである。ホスホマイシン＋トブラマイシンの最も好ましい溶液又は懸濁液は、ｐＨ４．５〜８．０で３０ｍＭを越える濃度の塩化物を含んでいる。
【００７９】
本発明の製剤は、主として、感染及び定着に際して細菌が存在している終末細気管支及び呼吸細気管支又は鼻腔に該薬物を送達することを可能とする粒径に霧化する。ホスホマイシン＋トブラマイシンをエーロゾルとして気道の肺気管支内空間に効率よく送達するためには、主として１〜５μｍの範囲の浮遊粒子平均粒子径（mass medium average diameter）を有するエーロゾルを形成させることが必要である。気管支内の感染症(特に、緑膿菌（P. aeruginosa）に起因する感染症）を治療及び予防するためには、製剤され且つ送達された量のホスホマイシン＋トブラマイシンは、効率よく肺表面を標的としなければならない。該製剤は、感染部位に有効な用量のホスホマイシン＋トブラマイシンを送達することが可能なできる限り少ないエーロゾル投与可能な容積でなければならない。該製剤は、さらに、気道及び鼻腔の機能に悪影響を与えないようなコンディションを提供しなければならない。従って、該製剤は、薬物の効果的な送達を可能とするような条件下で製剤された充分な量の薬物を含んでいなければならないが、一方では、望ましくない反応は避けなければならない。本発明の新規製剤は、これらの全ての要件を満たすものである。
【００８０】
本発明では、細菌による上部呼吸器感染症若しくは下部呼吸器感染症を患っているか又は患う危険を有する患者による吸入療法のための液体投与形態に、ホスホマイシン＋トブラマイシンを製剤する。そのような患者は、世界中に存在しているので、該液体製剤は、適当に長い貯蔵寿命を有していることが必要である。従って、貯蔵条件及び包装も重要になってくる。
【００８１】
ホスホマイシン＋トブラマイシンの該製剤は、各抗生物質を独立して水の中に配合してｐＨを調節できるように、二重ブローフィルアンプル内の水溶液として無菌的に調製されなければならない。トブラマイシンは酸性ｐＨ（１〜６）で配合し、一方、ホスホマイシンは塩基性ｐＨ（８〜１３）で配合する。トブラマイシンに対しては低ｐＨ製剤とすることで、その塩基性窒素原子が全てプロトン化されることによって確実に当該分子がアミン酸化及びアミン分解から保護されるようにすることができる（トブラマイシン溶液は、室温で黄色に変わる）。かくして、トブラマイシンの低ｐＨ溶液は、室温では無期限に安定である。ホスホマイシンは、酸性又は低ｐＨでは反応性エポキシド環が加水分解（開環）される傾向を有するので、高ｐＨで最も安定である。ホスホマイシンの高ｐＨ溶液も、室温では安定である。従って、二重アンプルブローフィル容器により、室温で安定な、独立した、各抗生物質の高ｐＨ製剤及び低ｐＨ製剤が可能となり、当該薬物製品組合せ及び最終ｐＨは、使用直前に噴霧器内で両方の溶液を混合することにより作り出される。該製剤は貯蔵に適していることにより、エーロゾル投与に適した製剤されたホスホマイシン＋トブラマイシンを安心して使用することができる。
【００８２】
ＩＩＩ．  抗生物質の組合せを肺に送達するための噴霧器
本発明の製剤を粒径が主として１〜５μｍの範囲にあるエーロゾル粒子に霧化することが可能な装置を用いて、本発明の製剤を投与する。本明細書における「主として（predominantly）」は、生成された全てのエーロゾル粒子の少なくとも７０％、好ましくは、９０％を越える粒子が、１〜５μｍの範囲内にあることを意味する。典型的な装置としては、ジェット噴霧器、超音波噴霧器、加圧エーロゾル発生噴霧器（pressurized aerozol generating neburizer）及び振動多孔板噴霧器（vibrating porous plate nebulizer）などがある。代表的な適する噴霧器賭しては、Ｐａｒｉ  Ｉｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓ（Midlothian, VA）から入手可能なｅＦｌｏｗ（登録商標）噴霧器、Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ （West Sussex, United Kingdom）から入手可能なｉＮｅｂ（登録商標）噴霧器 、Ｏｍｅｒｏｎ，  Ｉｎｃ．（Chicago, IL）から入手可能なＯｍｅｒｏｎ  ＭｉｃｒｏＡｉｒ（登録商標）噴霧器、及び、Ａｅｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Mountain View, CA）から入手可能なＡｅｒｏＮｅｂＧｏ（登録商標）噴霧器などを挙げることができる。
【００８３】
ジェット噴霧器は、空気圧を用いて、液体溶液を砕いてエーロゾル液滴とする。超音波噴霧器は、液体を剪断して小さなエーロゾル液滴とする圧電結晶により作動する。加圧系は、一般に、小さな孔に溶液を強制的に通して小さな粒子を生成させる。振動多孔板装置（vibrationg porous plate device）は、急速振動を用いて液体流を剪断することにより適切な寸法の液滴とする。しかしながら、そのような装置は、該製剤の物理特性及び化学特性の影響を受けやすいので、効果的に噴霧できるのは、ホスホマイシン＋トブラマイシンの製剤のほんの一部に過ぎない。
【００８４】
本発明は、感受性細菌に起因する感染症の危険を有しているか又はそのような感染症に罹患しているヒトの気道に、有効濃度のホスホマイシン＋トブラマイシンをエーロゾルとして送達し得る、ホスホマイシン＋トブラマイシンの小容積で高濃度の製剤である。その製剤は、安全であり、充分に許容され、且つ、費用効率が極めて高い。さらに、その製剤は、商品流通のための充分な貯蔵寿命を提供する。上述のことは、以下の実施例からさらによく理解することができるが、ここで、該実施例は、例証を目的として提供されており、本発明の概念の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８５】
実施例１
エーロゾル投与用ホスホマイシン／トブラマイシン溶液の調製
９：１のホスホマイシン／トブラマイシン溶液
ホスホマイシン二ナトリウム（１８．０５７ｇ，  １３．９９ｇ遊離酸）を２５０ｍＬの水に溶解させ、１．５３ｍＬの４．５Ｎ  ＨＣＬを滴下して加えてｐＨを７．４１に調節した。得られた溶液に、１．５６ｇの９７．５％トブラマイシン塩基を添加した。その溶液のｐＨを、２．４５ｍＬの４．５Ｎ  ＨＣｌを滴下して加えることにより、７．６０に調節した。その溶液を水で５００ｍＬに希釈し、０．２μｍ  Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  １６７−００２０  メンブランフィルターで濾過した。最終的なｐＨは７．７６であり、浸透圧重量モル濃度は５３７ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、ホスホマイシン／トブラマイシンの比率は９：１と計算され、塩化物濃度は３５．８ｍＭであった。
【００８６】
８：２のホスホマイシン／トブラマイシン溶液
８：２の比率のホスホマイシン／トブラマイシンの溶液を調製した。３．１６８０ｇのホスホマイシン二ナトリウム（２．４０１３ｇ遊離酸）を５０ｍＬの水に溶解させた。そのホスホマイシン溶液に、０．６１５４ｇの９７．５％トブラマイシン塩基（０．６０００ｇの純粋なトブラマイシン塩基）を溶解させた。０．９１０ｍＬの６Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨを調節した。その溶液を水で１００ｍＬに希釈した。その溶液の最終的なｐＨは７．６５であり、浸透圧重量モル濃度は４７７ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、塩化物濃度は５４．６ｍＭであった。ホスホマイシン／トブラマイシンの最終的な比率は、８：２と計算された。
【００８７】
７：３のホスホマイシン／トブラマイシン溶液
９：１の溶液に関して上記で記載した手順を用いて、７：３の比率のホスホマイシン／トブラマイシンの溶液を調製した。１７．４６６ｇのホスホマイシン二ナトリウム（１３．２３９ｇ遊離酸）を水に溶解させ、１．４６ｍＬの４．５Ｎ  ＨＣｌを添加してｐＨを７．４３に調節し、５．８１９ｇの９７．５％トブラマイシン塩基（５．６７４ｇの純粋なトブラマイシン塩基）、得られた複合溶液のｐＨを、９．２０ｍＬの４．５Ｎ  ＨＣｌを添加して調節した。その溶液の最終的なｐＨは７．６８であり、浸透圧重量モル濃度は５６０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、ホスホマイシン／トブラマイシンの比率は７：３であり、塩化物濃度は９５．９ｍＭであった。
【００８８】
実施例２
ホスホマイシンとトブラマイシンの８：２の高浸透圧溶液の調製
７．９１６５ｇのホスホマイシン二ナトリウム（６．０００７ｇのホスホマイシン遊離酸）及び１．５３８２ｇの９７．５％トブラマイシン塩基（１．４９９７ｇの純粋なトブラマイシン塩基）を５０ｍＬの水に溶解させた。２．３ｍＬの６Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨを７．６２に調節した。得られた複合溶液を１００ｍＬに希釈した。最終的なｐＨは７．６４であり、浸透圧重量モル濃度は１２１５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、最終的な塩化物濃度は１３８ｍＭであり、ホスホマイシン／トブラマイシンの比率は８：２であった。
【００８９】
実施例３
再構成するための高ｐＨホスホマイシンと低ｐＨトブラマイシンの別々の溶液の調製
５．８９１ｇのホスホマイシン二ナトリウム（４．４６５ｇのホスホマイシン遊離酸）を水に溶解させ、１００ｍＬに希釈して、ホスホマイシン溶液を調製した。ｐＨは９．４２であり、浸透圧重量モル濃度は７９５ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであった。
【００９０】
１．８６９ｇの９７．５％トブラマイシン塩基（１．８２２ｇの純粋なトブラマイシン塩基）を６０ｍＬの水に溶解させ、１８．８ｍＬの１Ｍ  ＨＣｌを添加してｐＨを４．９０に調節し、水で１００ｍＬに希釈して、トブラマイシン溶液を調製した。ｐＨは４．８９であり、浸透圧重量モル濃度は１４８ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであった。
【００９１】
１ｍＬのホスホマイシン 溶液と１ｍＬのトブラマイシン溶液を合した。得られた複合薬物溶液に関しては、ｐＨは７．３０であり、浸透圧重量モル濃度は４７７ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇであり、塩化物濃度は９４．０ｍＭであり、ホスホマイシン／トブラマイシンの比率は７：３であった。
【００９２】
実施例４
市販されている吸入液用トブラマイシン（ＴＯＢＩ）と凍結乾燥ホスホマイシン二ナトリウム（ＦＯＳＦＯ）からの８：２のホスホマイシン／トブラマイシン溶液の調製
２つの５ｍＬアンプルの吸入用トブラマイシン溶液（ＴＯＢＩ，  ６００ｍｇのトブラマイシン塩基）（６０ｍｇ／ｍＬ）に４０ｍＬの水を加え、それに、３．１６６５ｇのホスホマイシン二ナトリウム（ＦＯＳＦＯ，  ２．４００２ｇのホスホマイシン遊離酸）を溶解させた。その溶液の初期ｐＨは７．５０であった。その溶液に、６６７μＬの４．５Ｍ  ＮａＣｌを添加した。得られた複合溶液を水で１００ｍＬに希釈した。最終的な製剤は、以下の特性を有していた：ｐＨ７．４９、  浸透圧重量モル濃度５０２ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、  塩化物濃度３３．８ｍＭ、  ホスホマイシン／トブラマイシンの比率８：２、  薬物濃度２４ｍｇ／ｍＬのホスホマイシン及び６ｍｇ／ｍＬのトブラマイシン。
【００９３】
実施例５〜実施例１０では、本出願における表及び図面で提供されているデータを得るのに用いた手順について説明する。
【００９４】
実施例５
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定
嚢胞性線維症、気管支拡張症、副鼻腔炎及び人工呼吸器関連肺炎を患っている患者における呼吸器感染症を引き起こす種類の代表的なグラム陽性細菌及びグラム陰性細菌に対する抗生物質及び抗生物質組合せの効力について、ＭＩＣアッセイで評価した。緑膿菌（P. aeruginosa）菌株は、嚢胞性線維症患者から集めた肺の痰のサンプル、血液培養、気道感染症及び皮膚又は軟組織の感染症から分離した。大腸菌（E. coli）、インフルエンザ菌（H. influenzae）、セパシア菌（B. cepacia）、ステノトロフォモナス・マルトフィリア菌（S. maltophilia）、肺炎杆菌（K. pneumoniae）、モラクセラ・カタラーリス菌（M. catarrhalis）、黄色ブドウ球菌（S. aureus）、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）及び腸球菌（E. faecalis）は、気道感染症から分離した。大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ２９２１３を精度管理株として用いた。
【００９５】
方法Ａ：
ＮＣＣＬＳガイドライン（ＮＣＣＬＳ，２００３）に従う寒天平板希釈法により、ホスホマイシン単独のＭＩＣ、トブラマイシン単独のＭＩＣ又はホスホマイシン＋トブラマイシンの組合せのＭＩＣについて測定した。ヒツジの５％脱繊維素血液を含んでいるＴｒｙｐｉｃ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒプレート（PML Microbiological, Wilsonville, Or.）（以下、血液寒天平板と称する）の上に菌株を筋状に塗りつけ、３５℃で一晩インキューベーションした。一晩培養物から得た２〜３の細菌コロニーを３ｍＬの無菌生理食塩水に接種し、少しの間渦状にかき混ぜ（vortexed）、０．５マクファーランド標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）に調節した。その細菌懸濁液を１：４０に無菌生理食塩水で希釈し、イノキュラムとして用いた。１６ｇのアガロース（Becton-Dickinson, Sparks, MD）と２２ｇのミューラー−ヒントンブロスパウダー（Becton-Dickinson, Sparks, MD）を合し、蒸留水で１Ｌに調節することにより、ミューラー−ヒントン寒天平板（以下、ＭＨＡと称する）を調製した。寒天を高圧滅菌し、５５℃に冷却し、２５μｇ／ｍＬのグルコース−６−リン酸（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.）を加えた。冷却した２５ｍＬの寒天を５０ｍＬのコニカルチューブの中に等分して入れ、適切な濃度の抗生物質を加えて、０．０６μｇ／ｍＬ〜５１２μｇ／ｍＬの範囲の濃度とした。その寒天と抗生物質を緩やかに混合した後、得られた懸濁液を滅菌した１００ｍｍシャーレに注ぎ入れ、室温で固化させた。その抗生物質寒天平板に、４８ポイントイノキュレーター（Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.）を用いて約２×１０４ＣＦＵ／スポットを接種した。３５℃で１８〜２０時間インキュベーションしたあとで視覚的に確認できる増殖を阻止した抗生物質の最低濃度としてＭＩＣを定義した。ＭＩＣ５０値又はＭＩＣ９０値を計算することにより、特定の抗生物質又は抗生物質組合せの緑膿菌（P. aeruginosa）の大集団に対する効力を求めた。ＭＩＣ５０値は、当該緑膿菌（P. aeruginosa）菌株の５０％を阻害した抗生物質の濃度として定義した。ＭＩＣ９０値は、当該緑膿菌（P. aeruginosa）菌株の９０％を阻害した抗生物質の濃度として定義した（Wiedemann and Grimm, 1996）。
【００９６】
方法Ｂ：
ブタ胃ムチンの存在下で、ホスホマイシン単独、トブラマイシン単独又はホスホマイシン＋トブラマイシンの組合せの緑膿菌（P. aeruginosa）菌株に対するＭＩＣを求めることにより、ムチン及びタンパク質結合が抗生物質の活性に及ぼす影響について評価した。手順は、高圧滅菌に付す前にＭＨＡに２％（重量／容積）のブタ胃ムチン（Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo）を添加した以外は、実施例５の方法Ａで記載した手順と同様であった。
【００９７】
方法Ｃ：
ＮＣＣＬＳ標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）に従う肉汁微量希釈法により、アミカシン単独、アルベカシン単独、ジベカシン単独、ゲンタマイシン単独、カナマイシン単独、ネチルマイシン単独、ネオマイシン単独、ストレプトマイシン単独及びトブラマイシン単独についての緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対するＭＩＣを求めた。大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ２９２１３を精度管理株として用いた。血液寒天平板の上に菌株を筋状に塗りつけ、３５℃で１８時間インキューベーションした。一晩培養物から得た２〜３の細菌コロニーを３ｍＬの無菌生理食塩水に接種し、少しの間渦状にかき混ぜ（vortexed）、０．５マクファーランド標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）に調節した。その細菌懸濁液をカチオン調節したミューラー−ヒントンブロス（以下、ＣＡＭＨＢと称する）中で１：１００に希釈した。５０μＬの細菌イノキュラム（約２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）をピペットで量り、０．１２５μｇ／ｍＬ〜１２８μｇ／ｍＬの濃度範囲にある２倍希釈の抗生物質を加えた５０μＬのＣＡＭＨＢ（Remel, Lenexa, Kanas）を含んでいる９６ウェルプレートの個々のウェルに移した。３５℃で１８〜２４時間インキュベーションしたあとで視覚的に確認できる増殖を阻止した抗生物質の最低濃度としてＭＩＣを定義した。
【００９８】
実施例６
チェッカーボード相乗効果試験
チェッカーボード法（Eliopoulos and Moellering, 1996）により、ホスホマイシンとアミカシン、アルベカシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシンＢ、ネオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン又はトブラマイシンの間の相互作用の可能性について確認した。ホスホマイシンとアミノグリコシド類の２倍連続希釈（これは、両方の化合物について期待されるＭＩＣ値を一括して扱った）について評価した。血液寒天平板の上に菌株を筋状に塗りつけ、３５℃で１８〜２４時間インキューベーションした。一晩培養物から得た２〜３の細菌コロニーを３ｍＬの無菌生理食塩水に接種し、少しの間渦状にかき混ぜ（vortexed）、０．５マクファーランド標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）に調節した。５０μＬの細菌イノキュラム（約２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）をピペットで量り、対象の２倍希釈した２種類の抗生物質を加えた５０μＬのＣＡＭＨＢを含んでいる９６ウェルプレートの個々のウェルに移した。第二の化合物と組み合わせた第一の化合物のＭＩＣを第一の化合物単独のＭＩＣで除したものとして、分画阻害濃度（fractional inhibitory concentration）（ＦＩＣ）を計算した。第一の化合物及び第二の化合物の個々のＦＩＣの合計として、各薬物の組合せについてＦＩＣの総計（ＳＦＩＣ）を計算した。
３５℃で１８〜２０時間インキュベーションしたあとで視覚的に確認できる増殖を阻止した抗生物質の最低濃度としてＦＩＣを計算した。相乗効果は、ＳＦＩＣが０．５以下であるとして定義し、ＳＦＩＣが０．５を越えて４未満である場合を普通（indifference）と定義し、ＳＦＩＣが４を越える場合、拮抗的であると定義した。薬物相互作用についての最終的な判定には、最も低いＳＦＩＣを用いた。
【００９９】
実施例７
時間−殺細菌作用動力学
２％ブタ胃ムチンの存在下で時間−殺細菌実験を実施して、ムチン及びタンパク質結合が抗生物質の活性に及ぼす影響について評価した。２〜３の細菌コロニーを１０ｍＬのＣＡＭＨＢに接種し、振盪恒温水槽（２５０ｒｐｍ）中３５℃で１８〜２４時間インキュベーションした。一晩培養物の１：４０希釈物を１０ｍＬの新たに作製したＣＡＭＨＢ中で調製し、振盪恒温水槽（２５０ｒｐｍ）中で３５℃で１〜２時間インキュベーションした。得られた培養物を０．５マクファーランド標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）に調節した。多種多様の抗生物質を比較したときの細菌イノキュラムのサイズにおけるバラツキを小さくするために、２％（重量／容積）のブタ胃ムチンを含んでいるＣＡＭＨＢの１つのマスターチューブに細菌イノキュラム（約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）の１：２００希釈物を接種し、２５μｇ／ｍＬのグルコース−６−リン酸を添加し、少しの間渦状にかき混ぜた（vortexed）。次いで、１０ｍＬアリコートをピペットで量り、５０ｍＬのコニカルチューブの中に移した。ホスホマイシン単独、トブラマイシン単独、及び、ホスホマイシンとアミカシン、アルベカシン、ジベカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン又はトブラマイシンの組合せを、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対するホスホマイシンのＭＩＣ（４μｇ／ｍＬ）と等しい濃度、２倍濃度、４倍濃度及び８倍濃度で、培地に添加した。ホスホマイシン＋アミカシン、ホスホマイシン＋アルベカシン、ホスホマイシン＋ジベカシン、ホスホマイシン＋ゲンタマイシン、ホスホマイシン＋カナマイシン、ホスホマイシン＋ネチルマイシン、ホスホマイシン＋ネオマイシン、ホスホマイシン＋ストレプトマイシン又はホスホマイシン＋トブラマイシンの殺細菌活性についても、それらの個々の成分単独の殺細菌活性と比較した。例えば、３２μｇ／ｍＬの９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せを、２８．８μｇ／ｍＬのホスホマイシン単独の殺細菌活性及び３．２μｇ／ｍＬのトブラマイシン単独の殺細菌活性と比較した。各実験において、非薬物対照は実施しなかった。培養物を、抗生物質と一緒に、振盪（２５０ｒｐｍ）恒温水槽内で３５℃で２４時間インキュベーションした。その培養物を無菌生理食塩水で１０倍連続希釈し、その１００μＬアリコートを血液寒天平板の上に散布することにより、０時間、１時間、２時間、４時間、６時間及び２４時間における殺細菌作用を確認した。培養皿を３５℃で１８〜２４時間インキュベーションし、コロニーの数を手作業で数えた。コロニー計数方法の検出限界は、１Ｌｏｇ１０であった。時間に対してＬｏｇ１０（ＣＦＵの数／ｍＬ培養）をプロットすることにより、時間−殺細菌曲線を描いた。最初のイノキュラムを３Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ以上低下させる抗生物質の濃度を殺細菌性であると見なし、最初のイノキュラムを２Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ以下しか低下させない抗生物質の濃度は静菌性であると定義した（ＮＣＣＬＳ，１９９９）。相乗作用は、最も活性が高い単一の抗生物質と比較した抗生物質組合せによる細菌コロニー数の減少が２Ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ以上であると定義した（ＮＣＣＬＳ，１９９９）���
【０１００】
実施例８
最小殺細菌濃度（ＭＢＣ）の測定
ＮＣＣＬＳ標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）に従う肉汁微量希釈法により、ホスホマイシン単独、アミカシン単独、アルベカシン単独、ジベカシン単独、ゲンタマイシン単独、カナマイシンＢ単独、ネチルマイシン単独、ネオマイシン単独、ストレプトマイシン単独又はトブラマイシン単独についての緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３、大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２及び黄色ブドウ球菌（S. aureus）ＡＴＣＣ２９２１３に対するＭＢＣを測定した。血液寒天平板の上に菌株を筋状に塗りつけ、３５℃で１８〜２４時間インキューベーションした。一晩培養物から得た２〜３の細菌コロニーを３ｍＬの無菌生理食塩水に接種し、少しの間渦状にかき混ぜ（vortexed）、０．５マクファーランド標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）に調節した。５０μＬの細菌イノキュラム（約２×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）をピペットで量り、０．１２５μｇ／ｍＬ〜１２８μｇ／ｍＬの濃度範囲にある２倍希釈の抗生物質を加えた５０μＬのＣＡＭＨＢ（Remel, Lenexa, Kanas）を含んでいる９６ウェルプレートの個々のウェルに移した。プレートを３５℃で１８〜２４時間インキュベーションし、実施例５の方法Ｃで記載したように、ＭＩＣを測定した。増殖を示さない（ＭＩＣ及び上記）ウェルの内容物をピペットを用いて混合し、２つの同じ１０μＬサンプルを血液寒天平板の上に散布した。培養皿を３５℃で１８〜２４時間インキュベーションし、各培養皿上の細菌コロニーの数を手作業で数えた。最終的なイノキュラムのサイズ、１回サンプリング又は二重サンプリング、ピペット操作上のエラー及びサンプル応答のポアソン分布について考慮するＮＣＣＬＳ法（ＮＣＣＬＳ，１９９９）により、不合格判定値（rejection values）を確定した。例えば、最終的なイノキュラムが５×１０５ＣＦＵ／ｍＬであり且つ２つの同じサンプルについて評価した場合は、コロニー総数が２５より少ない最も低い希釈物をＭＢＣと見なした。ＭＢＣは、ＮＣＣＬＳ標準（ＮＣＣＬＳ，２００３）により記述されているように、最初のイノキュラムのＣＦＵ／ｍＬにおける減少が３Ｌｏｇ１０以上であると定義した。ＭＢＣをＭＩＣで除することにより、ＭＢＣ／ＭＩＣ比を計算した。
【０１０１】
実施例９
一段階耐性（single-step resistance）の頻度の測定
緑膿菌（P. aeruginosa）の５種類の感受性菌株について、一段階自然耐性突然変異（single-step spontaneous resistance mutation）の頻度を測定した。２〜３の細菌コロニーを５ｍＬのＣＡＭＨＢに接種し、振盪恒温水槽（２５０ｒｐｍ）中で３５℃で１８時間インキュベーションすることにより、細菌イノキュラムを調製した。一晩培養物の１：２０希釈物を、１２５ｍＬ容エーレンマイヤーフラスコ内の５０ｍＬの新たに作製したＣＡＭＨＢ中で調製し、振盪恒温水槽（２５０ｒｐｍ）中で３５℃で８時間インキュベーションした。培養物を、室温で、２，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清をデカントし、５０ｍＬの培養物に由来する細胞ペレットを５００μＬ〜１０００μＬのＣＡＭＨＢ中に再懸濁させた。無菌生理食塩水で１０倍連続希釈し、その１００μＬアリコートを血液寒天平板の上に散布することにより、細菌懸濁液中のＣＦＵ／ｍＬを求めた。培養皿を３５℃で１８〜２４時間インキュベーションし、コロニーの数を手作業で数えた。１２８μｇ／ｍＬのホスホマイシン、８μｇ／ｍＬのトブラマイシン、又は、１２８μｇ／ｍＬのホスホマイシン＋８μｇ／ｍＬのトブラマイシンを含んでいるＭＨＡプレート上に、１００μＬの細菌細胞懸濁液（約１０９ＣＦＵ）を散布した。培養皿を３５℃で４８〜７２時間インキュベーションし、各培養皿上の細菌コロニーの数を手作業で数えた。示されている濃度の抗生物質において増殖した細菌の数を最初のイノキュラム中の細菌の数で除することにより、耐性の頻度を計算した。代表的な突然変異体を、実施例５の方法Ａで記載したように、ホスホマイシン単独、トブラマイシン単独及びホスホマイシン＋トブラマイシンの組み合わせに対するＭＩＣの変化について評価した。
【０１０２】
実施例１０
多段階耐性（multistep resistance）についての分析
継続的な連続継代中の耐性の発達について、ホスホマイシン（ＭＩＣ＝８μｇ／ｍＬ）及びトブラマイシン（ＭＩＣ＝０．５μｇ／ｍＬ）に対して感受性を有する緑膿菌（P. aeruginosa）の臨床株を用いて評価した。緑膿菌（P. aeruginosa）ＣＯＲ−０１４の単一のコロニーを５ｍＬのＭＨＣＡＢに接種し、少しの間渦状にかき混ぜた（vortexed）。ＣＡＭＨＢ中で、１μｇ／ｍＬ〜５１２μｇ／ｍＬの範囲にわたるホスホマイシン単独の２倍連続希釈、０．０６２５μｇ／ｍＬ〜５１２μｇ／ｍＬの範囲にわたるトブラマイシン単独の２倍連続希釈、及び、０．０６２５μｇ／ｍＬ〜５１２μｇ／ｍＬの範囲にわたる９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組み合わせの２倍連続希釈を行った。１０μＬの細菌懸濁液をピペットで量って３ｍＬの各抗生物質希釈物中に移し、３５℃で１８〜２４時間静的にインキュベーションした。各抗生物質希釈系列から視覚的に確認可能な細菌増殖が認められる抗生物質の最大濃度の管を選択し、１００μＬのその培養物をピペットで量って抗生物質の新たに調製した希釈系列に移した。管を３５℃で１８〜２４時間静的にインキュベーションした。この手順を合計２８回繰り返した。親株について、ホスホマイシン単独、トブラマイシン単独及びホスホマイシン＋トブラマイシンのＭＩＣを測定し、実施例５の方法Ｃで記載したように、各継代後に耐性を示した分離菌を収集した。
【０１０３】
実施例１１
動物における効力の測定
エーロゾル化したホスホマイシン単独、トブラマイシン単独及びホスホマイシン＋トブラマイシンの組み合わせのインビボにおける効力を、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２及び緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対して評価した。ラットの肺感染症を確立させるのに用いた細菌イノキュラムは、細菌とアガロースビーズの混合物で構成されていた。血液寒天平板の上に大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２又は緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３を筋状に塗りつけ、３５℃で１８〜２４時間インキューベーションした。２〜３のコロニーを１０ｍＬのＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（以下、ＴＳＢと称する）に接種し、３５℃で１．５〜２時間静的にインキュベーションした。その培養物を、新たに調製したＴＳＢ中で光学濃度０．１（６２５ｎｍ）に調節し、次いで、ＴＳＢ中で１：５に希釈した。１ｍＬの細菌懸濁液（約１０７ＣＦＵ／ｍＬ）を１０ｍＬの２％上質寒天溶液（noble agar solution）に添加し、少しの間反転により混合させた。その混合物を５５℃に保たれている１５０ｍＬの重質流動パラフィン（heavy white mineral oil）に添加し、氷上で５分間撹拌した。その冷却した懸濁液を２５０ｍＬ容の遠心分離管の中に注ぎ入れ、４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、得られたペレットを２５ｍＬの無菌生理食塩水に再懸濁させ、５０ｍＬ容のコニカル遠心分離管に移した。４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清をデカントし、得られたペレットを１０ｍＬの生理食塩水に再懸濁させた。その懸濁液を４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をデカントした。得られたペレットを約１０ｍＬの無菌生理食塩水に再懸濁させ、次いで、無菌２％アガロースビーズ溶液で１：３０に希釈して、約１０〜１０００ＣＦＵ／ｍＬとした。
【０１０４】
細菌イノキュラムを気管内に導入する前に、イソフルランに５分間さらすことによって雄スプラーク-トーレーラット（２００〜２５０ｇ）に麻酔をかけた。気管内に気管内ニードルを挿入し、１ｍＬシリンジを用いて、約１０〜１００ＣＦＵの大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２又は緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３を含んでいる８０μＬのアガロースビーズを肺に点滴注入した。ラットを個々のケージの中に置いて、約１８時間回復させた。
【０１０５】
エーロゾル暴露装置（aerosol exposure device）（In Tox Products, New Mexico）を用いて、ホスホマイシン単独、トブラマイシン単独及びホスホマイシン＋トブラマイシンの組み合わせをラットに投与した。そのシステムは、独立したエーロゾル供給を有する中央チャンバーと排出路から構成されていた。その中央チャンバーは、エーロゾル供給システムに直接連結した２４のポートを有していた。ラットを個々のエーロゾル暴露チューブの中に配置し、調節可能な押し板とエンドキャップアセンブリで束縛して、向きを変えたり又はチューブの末端から後ずさりできないようにした。ラットを含んでいるこの束縛チューブを上記中央チャンバーのポートにロードし、空気流を１リットル／分に調節した。ＰＡＲＩ  ＬＣ  Ｓｔａｒ噴霧器への空気（呼吸に適した質の空気）流は、１分間当たり６．９リットルの一定に保った。ホスホマイシン単独、トブラマイシン単独又は９：１、８：２若しくは７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せを０．２ｍＬ／分で噴霧し、エーロゾル供給路を介してラットに送達した。追加の空気（以下、希釈用空気と称する）を噴霧器に送達して、（そこで）エーロゾル化薬物をラットに送達するのに用いた空気の過剰圧力とのバランスを取った。連続して３日間、１日に２回、齧歯類をエーロゾル化抗生物質に最大で２時間晒した。各処理群は、１群当たり５〜８匹の動物から構成されていた。各実験には、処置を行わない対照を含ませた。
【０１０６】
抗生物質に最後に晒してから１８時間後に、殺細菌作用について評価した。イソフルランでラットに麻酔をかけ、５００μＬのフェノバルビタールを腹腔内投与して安楽死させた。肺を無菌的に取り出し、余分な組織を除去し、肺の重量を測定した。肺を１０ｍＬ容のガラス瓶の中に入れ、組織１ｇ当たり３ｍＬの無菌生理食塩水を添加した。サンプルをハンドヘルドホモジナイザーで３０秒間ホモジナイズした。その肺ホモジネートを無菌生理食塩水で１０倍連続希釈し、その１００μＬアリコートを血液寒天平板の上に散布することにより、殺細菌を測定した。培養皿を３５℃で１８〜２４時間インキュベーションし、細菌コロニーの数を手作業で数えた。非処理対照群のＣＦＵ／肺を処理群と比較することにより、抗生物質の効力を測定した。
【０１０７】
【表１３】
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【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独による静菌的殺細菌作用（bacteriostatic killing）と比較して、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。
【図２】９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独による静菌的殺細菌作用（bacteriostatic killing）と比較して、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。
【図３】８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。
【図４】８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。
【図５】７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。
【図６】７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。
【図７】７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せについての時間−殺細菌曲線を示しており、緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する急速な殺細菌作用を実証している。
【図８】９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せとトブラマイシン単独についての緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する殺細菌曲線を比較している。
【図９】９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せとトブラマイシン単独についての緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する殺細菌曲線を比較している。
【図１０】９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する濃度依存性殺細菌作用を示している。
【図１１】９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する濃度依存性殺細菌作用を示している。
【図１２】９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの緑膿菌（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３に対する濃度依存性殺細菌作用を示している。
【図１３】それぞれ、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与した後の、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対する殺細菌作用を示している。
【図１４】それぞれ、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与した後の、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対する殺細菌作用を示している。
【図１５】それぞれ、９：１、８：２及び７：３のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与した後の、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対する殺細菌作用を示している。
【図１６】ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独の１ｌｏｇ１０未満の殺細菌作用に比較して、９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対して５ｌｏｇ１０を越える殺細菌作用が得られたことを示している。
【図１７】ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独の１ｌｏｇ１０未満の殺細菌作用に比較して、９：１のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対して５ｌｏｇ１０を越える殺細菌作用が得られたことを示している。
【図１８】トブラマイシン単独の４０ｍｇ／ｍＬ溶液のエーロゾル投与による２ｌｏｇ１０の殺細菌作用に比較して、８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の大腸菌（E. coli）に対して５ｌｏｇ１０を越える殺細菌作用が得られたことを示している。
【図１９】８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の緑膿菌（P. aeruginosa）に対して、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独に比較して優れた殺細菌作用が得られたことを示している。
【図２０】８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの３１．１ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の緑膿菌（P. aeruginosa）に対して、ホスホマイシン単独及びトブラマイシン単独に比較して優れた殺細菌作用が得られたことを示している。
【図２１】８：２のホスホマイシン：トブラマイシンの組合せの６０ｍｇ／ｍＬ溶液及び９０ｍｇ／ｍＬ溶液をエーロゾル投与することにより、ラットの肺内の緑膿菌（P. aeruginosa）に対して、著しい殺細菌作用が得られたことを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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