(57)【要約】  本発明は、遺伝子改変緑色植物および微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法ならびに材料に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｉｉ）ハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼの内因性供給源；ならびに
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
を有すること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項２】
ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；ならびに
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
を有すること、および
ｂ）工程ａ）において産生される緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項３】
ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）  配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｖ）活性なグルコシルトランスフェラーゼ酵素の内因性供給源；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項４】
ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項５】
ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
ｖ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｖｉ）活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素の内因性供給源；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項６】
ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
ｖ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｖｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項７】
プロモーターが、３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターよりなる群から選択される、請求項１、２、５、または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）輸送ペプチドが、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、カノーラ、キビ、豆類、エンドウ、ライムギ、アマ、またはイネ科牧草（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓｅｓ）に由来する、請求項１、２、５、または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
緑色植物細胞が、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、およびサトウキビよりなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
コリスミ酸リアーゼ発現カセットが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１、２、５、または６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片が、配列番号３８に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）において回収されるハイドロキノン配糖体が、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１０％を超える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）において回収されるハイドロキノン配糖体が、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１５％を超える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）において回収されるハイドロキノン配糖体が、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり２０％を超える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ａ）適切な炭素源の存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、組換え微生物が、
ｉ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１６】
ａ）パラ−ヒドロキシ安息香酸の存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、組換え微生物が、
ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１７】
ａ）ハイドロキノンおよびＵＤＰ−グルコースの存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、組換え微生物が、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなること；および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１８】
ａ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｂ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｃ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなる組換え微生物。
【請求項１９】
宿主微生物が、
ａ）サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）、およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される細菌；
ｂ）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）よりなる群から選択される酵母；または
ｃ）糸状菌類
である、請求項１８に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項１９に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
ａ）適切な炭素源を含んでなる水性培地において、適切な条件下で混合型微生物培養を増殖させることであって、混合型微生物培養が、
ｉ）１）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
２）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片
を含んでなる組換えハイドロキノン産生微生物；ならびに
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなる組換えハイドロキノン配糖体産生微生物；
を、ハイドロキノン配糖体産生させるために、約１×１０６〜約２×１０１０細胞／ｍＬの各組換え微生物の細胞密度でかつ１：１超〜約１：２０の細胞比で過剰のハイドロキノン産生微生物対ハイドロキノン配糖体産生微生物を伴って含んでなること；および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項２２】
ａ）    ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物；および
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物；
を、ハイドロキノン配糖体産生させるために、パラ−ヒドロキシ安息香酸を含有する水性培地において適切な条件下で、約１×１０６〜約２×１０１０細胞／ｍＬの各組換え微生物の細胞密度でかつ１：１超〜約１：２０の細胞比で過剰のハイドロキノン産生微生物対ハイドロキノン配糖体産生微生物を伴ってなる混合型微生物培養を増殖させること、
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項２３】
ａ）１）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片および２）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物と、水性培地とを適切な条件下で接触させ、ハイドロキノン含有培地を生成し；
（ｂ）工程ａ）において生成されるハイドロキノン含有培地に、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物を接種し、ハイドロキノン配糖体を産生するのに十分な時間、インキュベートし；ならびに
（ｃ）工程ｂ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項２４】
ａ）パラ−ヒドロキシ安息香酸の存在下で、配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒド
ロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物を接触させて、ハイドロキノン含有培地を産出すること；
（ｂ）工程ａ）において生成されるハイドロキノン含有培地に、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物を接種し、ハイドロキノン配糖体を産出するのに十分な時間、インキュベートすること；および
（ｃ）工程ｂ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項２５】
宿主微生物が、
ａ）サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される細菌；
ｂ）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）よりなる群から選択される酵母；または
ｃ）糸状菌類
である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ａ）水性反応混合物において、適切な条件下で、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素と、ハイドロキノンおよびＵＤＰ−グルコースを接触させ；ならびに
ｂ）工程（ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を単離すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項２８】
ａ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
ｂ）デフォルトパラメータ下のＮｅｅｄｌｅｍａｎ（ニードルマン）およびＷｕｎｓｃｈ（ヴンシュ）アルゴリズムに基づいて、配列番号２３に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子；ならびに
ｃ）ａ）またはｂ）に完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択されるパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片。
【請求項２９】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素。
【請求項３０】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるトランスジェニック緑色植物。
【請求項３１】
配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片をさらに含んでなる、請求項３０に記載のトランスジェニック緑色植物。
【請求項３２】
宿主緑色植物が、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、およびサトウキビよりなる群から選択される、請求項３０または３１に記載のトランスジェニック緑色植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物遺伝子発現、分子生物学、および微生物学の分野に関する。遺伝子改変緑色植物および微生物ならびにインビトロにおけるハイドロキノン配糖体（アルブチン）の産生のための方法ならびに材料を提示する。
【背景技術】
【０００２】
アルブチン（ハイドロキノン配糖体）およびそのアグリコン、ハイドロキノンは、皮膚美白剤として使用される化合物である。皮膚の色素沈着は、主に、メラノサイトから産生されるメラニンの量によって決定される。メラニン形成をもたらす生合成経路は、酵素チロシナーゼ（ＥＣ１．１４．１８．１）を介するチロシンからジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）への変換から始まる。チロシナーゼを阻害すると、メラノサイトによって産生されるメラニンの量が減少し、皮膚の褪色がもたらされる。アルブチンおよびアルブチンのモノエステル誘導体は、チロシナーゼを阻害することによって、メラノサイトから産生されるメラニンの量を減少することが明らかにされている（特許文献１）。
【０００３】
ハイドロキノンおよびハイドロキノンエステルなどのハイドロキノンの誘導体もまた、脱色素剤として使用されている。しかし、これらの化合物の使用に由来するネガティブな副作用が報告されている。これらの化合物は、特に刺激性であり、メラノサイトに対して細胞障害性がある（特許文献１）。アルブチンはアグリコンと比較して毒性が低いため、脱色素剤としてのアルブチンを使用することは、ハイドロキノンより好適である。
【０００４】
アルブチンはまた、抗酸化剤、抗微生物剤、抗炎症剤、およびおそらく、発癌（黒色腫）の阻害薬として有用であることが報告されている。しかし、コストが高いため、アルブチンの商業的使用は制限されている。この化学物質に対する低コストの商業的生産は存在していない。生産のための現在の方法として、化学合成（特許文献２；特許文献３；および特許文献４）；アルブチンを天然に産生する植物からの抽出；微生物宿主もしくは植物細胞培養物、ハイドロキノンおよびＵＤＰ−グルコースに接触される適切なグルコシルトランスフェラーゼを発現する種子、もしくは種苗（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；および特許文献５）を使用するか、またはグルコースおよびハイドロキノンの混合物がβ−グルコシダーゼと接触される類似のプロセス（特許文献６）による生体内変化が挙げられる。
【０００５】
化学合成は、アルブチンを生成するのに費用効果の高い方法ではない。化学合成方法は、通常、高価な出発物質、多様な高価かつ毒性の溶媒および触媒、顕著なエネルギー入力、ならびに不純物を除去するための以後の精製工程を必要とする。再生不可能資源への投資は高価でありかつ環境に調和しない。
【０００６】
多くの高等植物がアルブチンを天然に産生する。ツツジ科（Ｅｒｉｃａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、およびユキノシタ科（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ）のメンバーは、２０％乾燥重量（葉）までの量でアルブチンを産生することが報告されている。しかし、これらの植物は乏しい農業形質を免れない（非特許文献４）。植物におけるアルブチンの費用効果の高い生産は、高い農業形質および確立されたプロセシング構造基盤を伴う作物植物種を必要とする。
【０００７】
アルブチンの生産のための多様な経路が存在するが、化学物質の商業的生産のための高い農業形質を伴う緑色植物を使用する可能性は、注目を集めている代替物である。有機合成とは対照的に、緑色植物は、再生可能なエネルギー資源を構成する。それらの独特な光
合成能力のため、緑色植物において炭素系化合物を産生させるのに必要な唯一の原材料は、二酸化炭素、水、および土壌であり、日光は究極的なエネルギー源を提供する。サイズが制限される現存の発酵施設と比較して、緑色植物は、高容積、低コストアプリケーションを必要とする化学物質の大規模生産に容易に順応し得る利用可能な巨大なバイオマスを構成する。
【０００８】
インビボでの植物産生は潜在的により大きなバイオマスを付与するが、微生物産生もまた、高価で、エネルギーが掛かり、環境に調和しない化学合成と比較して、魅力的な代替物である。産業的微生物は、所望される遺伝的最終産物を産生するように遺伝子を改変することができる。非特許文献３は、内因性ハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ（ＨＱＧＴ）を発現するインドジャボク（Ｒａｕｖｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）の細胞懸濁培養物または同酵素を発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のいずれか一方にハイドロキノン（毒性のある高価な基質）を外部から供給することによって、アルブチンを産生させた。しかし、商業的に有用なレベルのアルブチンを産生するように改変された適切な組換え微生物は、現在のところ存在しない。
【０００９】
非特許文献５は、グルコースを中間体のキナ酸に変換するために微生物触媒を使用して、ハイドロキノンの産生方法を教示している。キナ酸は、その後、単離され、化学的にハイドロキノンに変換される。非特許文献５は、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を使用し、ｐＨＢＡ中間体を介して、グルコースが理論的にハイドロキノンに変換され得ると仮定している。しかし、非特許文献５は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を単離すること、遺伝子の配列、または植物および微生物においてアルブチンを産生させる方法のいずれも教示していない。
【００１０】
従って、解決しようとする課題は、トランスジェニック植物、微生物またはインビトロにおいて、商業的に有用なレベルで、アルブチン（ハイドロキノン配糖体）の産生方法および材料がないことである。
【００１１】
【特許文献１】米国特許第６３０６３７６号明細書
【特許文献２】米国特許第３２０１３８５号明細書
【特許文献３】米国特許第６３８８１０３号明細書
【特許文献４】特開昭６２−２２６９７４Ａ号公報
【特許文献５】特開平０７２２４０８３Ａ号公報
【特許文献６】特開平０５１７６７８５Ａ号公報
【非特許文献１】アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３：１８７−１９３（２０００）
【非特許文献２】アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７６（２）：１２６−１３１（２００１）
【非特許文献３】ヘフナー（Ｈｅｆｎｅｒ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０：１７３１−１７４１（２００２）
【非特許文献４】アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３：１８７−１９３（２０００）
【非特許文献５】ラーン（Ｒａｎ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２３：１０９２７−１０９３４（２００１）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の実施態様は、いずれかの機能的ＣＰＬ（配列番号３０を参照のこと）（緑色植物における産生のために葉緑体に標的化されるかまたはサイトゾル微生物発現に対して標
的化されていない）および／またはｐＨＢＡの発現増加のためのＨＣＨＬ（配列番号３８を参照のこと）（サイトゾル）を発現させることを含む。好適な実施態様では、緑色植物または微生物において、ＣＰＬおよびＨＣＨＬが同時発現され、ｐＨＢＡ産生を最大にする。産生されるｐＨＢＡは、新規の酵素ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ（配列番号２３を参照のこと）（脱炭酸化）の基質として作用することができ、ここで、それは、ハイドロキノンに変換される。宿主細胞に対して内因性であるかまたは宿主細胞に組換え操作されているＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（配列番号４２を参照のこと）は、ハイドロキノンをグルコシル化し、ハイドロキノン配糖体（アルブチン）を形成する。好適な実施態様では、本発明において使用されるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ｐＨＢＡまたは他のフェノール代謝物よりもハイドロキノンを好適にグルコシル化する。
【００１３】
作成された緑色植物における出願人らの好適な方法は、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１０％を超えるハイドロキノン配糖体を回収し；作成されたより好適な方法は、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１５％を超えるハイドロキノン配糖体を回収し；作成された最も好適な方法は、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり２０％を超えるハイドロキノン配糖体を回収した。
【００１４】
本発明の好適な実施態様は、ＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼの発現を可能にする合成オペロンを担持するプラスミド（図６）で形質転換され、適切な炭素源を供給された微生物細胞である。ｐＨＢＡは、ＣＰＬの非存在下で、組換えｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を有する微生物に供給してもよい。あるいは、ハイドロキノンは、組換えハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素を有する微生物に、但し、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の非存在下で供給してもよい。あるいは、ハイドロキノン配糖体は、ハイドロキノン配糖体産生させるために、約１×１０６〜約２×１０１０細胞／ｍＬの各組換え微生物の細胞密度でかつ１：１超〜約１：２０の細胞比で過剰のハイドロキノン産生微生物対ハイドロキノン配糖体産生微生物を伴って記載の成分を含有する組換えハイドロキノン産生微生物およびハイドロキノン配糖体産生生物体を有する混合型微生物培養を使用して、産生させることができる。方法は、連続的にまたは単一の培養培地において微生物を使用してもよい。
【００１５】
本発明の好適な実施態様は、ｐＨＢＡに対して＜１μＭのＫｍおよび少なくとも約９．５／秒のＫｃａｔを有するカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素ならびにハイドロキノンに対して＜１μＭのＫｍおよび少なくとも４２／秒のＫｃａｔを有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＵＧＴ７２Ｂ１）由来のグルコシルトランスフェラーゼ酵素である。
【００１６】
本発明には、配列表に記載の核酸およびアミノ酸、発現カセット、ならびに記載の成分を含有するトランスジェニック緑色植物および微生物が含まれる。
【００１７】
配列の説明および生物学的寄託
本発明は、本出願を共になす配列表、図面、生物学的寄託、および詳細な説明によりさらに完全に理解することができる。
【００１８】
以下の配列の説明およびそれに付属された配列表は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条に記載の特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に適用される規則に従う。配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ２１９（第２号）：３４５−３７３（１９８４）（参考として本明細書に引用される）
に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＹＵＢ標準に従って規定される通り、ヌクレオチド配列文字の１文字記号およびアミノ酸の３文字記号を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に従う。
【００１９】
配列番号１は、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ７３３６）から精製される酵素のエドマン分解によって決定されるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの最初の２４アミノ酸（開始メチオニンを含まない）の配列である。
【００２０】
配列番号２は、精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素のトリプシン消化によって作製される断片のペプチド４のアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号３は、精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素のトリプシン消化によって作製される断片のペプチド５のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号４は、精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素のトリプシン消化によって作製される断片のペプチド６のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号５は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡ由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５１８ｂｐ断片を増幅するためのＲＴ−ＰＣＲ実験において有用な５’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号６は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡ由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５１８ｂｐ断片を増幅するためのＲＴ−ＰＣＲ実験において有用な３’プライマーのヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号７は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡ由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５１８ｂｐ断片を増幅するのに有用な５’プライマー逆転写されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号８は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡ由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５１８ｂｐ断片を増幅するのに有用な３’プライマー逆転写されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号９は、配列番号５および配列番号６のプライマーを使用して、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡから増幅することができるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物のＤＮＡ断片のコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号１０は、配列番号５および配列番号６のプライマーを使用して、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡから増幅することができるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物のＤＮＡ断片の推定アミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号１１は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で増殖させたカンジダ・パラプシロー
シス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞のＲＮＡ由来のｃＤＮＡの合成のための３’ＲＡＣＥ実験において有用なプライマーである。
【００３０】
配列番号１２は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡ由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の１１５９ｂｐ断片を増幅するための３’ＲＡＣＥ実験において有用な５’プライマーである。
【００３１】
配列番号１３は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡ由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の１１５９ｂｐＤＮＡ断片を増幅するための３’ＲＡＣＥ実験において有用な３’プライマーである。
【００３２】
配列番号１４は、配列番号９と、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡ由来の配列番号１２および配列番号１３のプライマーで増幅することができるＤＮＡ配列とのアラインメントによって得られるコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列番号１５は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼのオープンリーディングフレームの変異体を提示する配列番号１４における１４４０ｂｐのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号１６は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼのオープンリーディングフレームの変異体を提示する配列番号１４における１４４０ｂｐのオープンリーディングフレームの推定アミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１７は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞のＲＮＡ由来のｃＤＮＡの合成のための５’ＲＡＣＥ実験において有用なプライマーである。
【００３６】
配列番号１８は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５’末端を提示する２６４ｂｐの断片を増幅するための５’ＲＡＣＥ実験において有用な５’プライマーである。
【００３７】
配列番号１９は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５’末端を提示する２６４ｂｐの断片を増幅するための５’ＲＡＣＥ実験において有用な３’プライマーである。
【００３８】
配列番号２０は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５’を提示する５’ＲＡＣＥによって得られる２６４ｂｐのＤＮＡ断片のヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列番号２１は、ＲＴ−ＰＣＲ、３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ実験において得られるＤＮＡ配列のアラインメントによって得られたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物のコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号２２は、ＲＴ−ＰＣＲ、３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ実験において得られるＤＮＡ配列のアラインメントによって得られた転写物上に存在するｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードするコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列番号２３は、ＲＴ−ＰＣＲ、３’ＲＡＣＥおよび５’ＲＡＣＥ実験において得られるＤＮＡ配列のアラインメントによって得られた転写物上に存在するｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの推定アミノ酸である。
【００４２】
配列番号２４は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現ベクター、ｐＥＴ−２９ａ（＋）におけるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子のＯＲＦを導入するのに有用な３’プライマーである。
【００４３】
配列番号２５は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現ベクター、ｐＥＴ−２９ａ（＋）におけるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子のＯＲＦを導入するのに有用な５’プライマーである。
【００４４】
配列番号２６は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現ベクター、ｐＥＴ−２９ａ（＋）におけるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【００４５】
配列番号２７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０由来のゲノムＤＮＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｂｉＣ遺伝子（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｍ９６２６８）のヌクレオチド配列を増幅するため、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ−２４ａ（＋）へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００４６】
配列番号２８は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０由来のゲノムＤＮＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｂｉＣ遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するため、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００４７】
配列番号２９は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）におけるＰＣＲ増幅ＣＰＬのＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００４８】
配列番号３０は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）におけるＰＣＲ増幅ＣＰＬのＯＲＦの推定１次アミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号３１は、プラスミドｐＴＳＳ１−９１（＃２）−ＩＢＩ由来のルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体由来の輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を増幅するため、および発現ベクターｐＥＴ−２４ａ−ＣＰＬへのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００５０】
配列番号３２は、プラスミドｐＴＳＳ１−９１（＃２）−ＩＢＩ由来のルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体由来の輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列の増幅、および発現ベクターｐＥＴ−２４ａ−ＣＰＬへのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００５１】
配列番号３３は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現ベクター、ｐＥＴ２４ａ−ＴＰ−ＣＰＬにおけるＰＣＲ増幅ＴＰ−ＣＰＬのＯＲＦのヌクレオチド配列である。
【００５２】
配列番号３４は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の発現ベクター、ｐＥＴ２４ａ−ＴＰ−ＣＰＬにおけるＰＣＲ増幅ＴＰ−ＣＰＬのＯＲＦの推定１次アミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号３５は、プラスミドｐＭＨ４０由来の短縮された３’ＮＯＳターミネーター配列を増幅するため、およびプラスミドｐＭＬ６３を産出するプラスミドｐＭＬ３へのその
挿入に有用な５’プライマーである。
【００５４】
配列番号３６は、プラスミドｐＭＨ４０由来の短縮された３’ＮＯＳターミネーター配列を増幅するため、およびプラスミドｐＭＬ６３を産出するプラスミドｐＭＬ３へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００５５】
配列番号３７は、トランスジェニック植物においてｐＨＢＡを産生させるのに有用なシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ＤＳＭ１２５８５）由来のＨＣＨＬ遺伝子のヌクレオチド配列（ムハイム（Ｍｕｈｅｉｍ）およびレルヒ（Ｌｅｒｃｈ）、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５１（４）：４５６−４６１（１９９９））である。
【００５６】
配列番号３８は、トランスジェニック植物においてｐＨＢＡを産生させるのに有用なシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）のＨＣＨＬタンパク質の推定アミノ酸配列（ムハイム（Ｍｕｈｅｉｍ）およびレルヒ（Ｌｅｒｃｈ）、上掲）である。
【００５７】
配列番号３９は、ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子の全長ｃＤＮＡクローン由来のプラスミドＤＮＡを使用するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するため、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００５８】
配列番号４０は、ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子の全長ｃＤＮＡクローン由来のプラスミドＤＮＡを使用するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子のヌクレオチド配列を増幅するため、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）の発現ベクターｐＥＴ−２８ａ（＋）へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００５９】
配列番号４１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列である。
【００６０】
配列番号４２は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子のヌクレオチド配列から推定されるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１酵素のアミノ酸配列である。
【００６１】
配列番号４３は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子（配列番号２６）を含有するｐＥＴ２９ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を増幅すること、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００６２】
配列番号４４は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子（配列番号２６）を含有するｐＥＴ２９ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を増幅すること、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）細胞発現ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００６３】
配列番号４５は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子を含有するｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１酵素をコードするヌクレオチド配列を増幅する、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００６４】
配列番号４６は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子を含有するｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１酵素をコードするヌクレオチド配列を増幅する、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００６５】
配列番号４７は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２４ａ（＋）においてＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびＵＧＴ７２Ｂ１酵素をコードする核酸断片のヌクレオチド配列である。
【００６６】
配列番号４８は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子（配列番号２６）を含有するｐＥＴ２９ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を増幅すること、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＰＭＴ３へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００６７】
配列番号４９は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子（配列番号２６）を含有するｐＥＴ２９ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子をコードするヌクレオチド配列を増幅すること、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＰＭＴ３へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００６８】
配列番号５０は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子を含有するｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１酵素をコードするヌクレオチド配列を増幅する、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＣＬ１９２０へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００６９】
配列番号５１は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子を含有するｐＥＴ２８ａ（＋）プラスミドのプラスミドＤＮＡを使用するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）ＵＧＴ７２Ｂ１酵素をコードするヌクレオチド配列を増幅する、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＣＬ１９２０へのその挿入に有用な３’プライマーである。
【００７０】
配列番号５２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬ酵素をコードするヌクレオチド配列を増幅するため、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２９ａ（＋）へのその挿入に有用な５’プライマーである。
【００７１】
配列番号５３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬ酵素をコードするヌクレオチド配列を増幅するため、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２９ａ（＋）へのその挿入に有用な３
’プライマーである。
【００７２】
配列番号５４は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＥＴ２９ａ（＋）においてＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片のヌクレオチド配列である。
【００７３】
生物学的寄託の簡単な説明
本出願人らは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき、以下の生物学的寄託を行った。
【００７４】
【表１】
2007525966.tif 000002
【００７５】
本明細書で使用する「ＡＴＣＣ」は、米国、バージニア州２０１１０−２２０９、マナサス、ユニバーシティー大通り１０８０１（１０８０１Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に所在するアメリカン・タイプ・コレクション国際寄託当局（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を指す。「ＡＴＣＣ番号」は、ＡＴＣＣによる寄託された培養物に対する受入番号である。
【００７６】
列挙した寄託物は、少なくとも３０年間、上記の国際寄託機関において保管され、それを開示している特許の付与時に一般に利用可能となる。寄託物の入手可能性は、政府の措置によって付与された特許権を逸脱した本発明の実施許諾を構成するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
本出願人らは、商業的に有用なレベルのアルブチン（４−ヒドロキシフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド；ＣＡＳ４８７−７６−７）を産生するトランスジェニック植物および微生物を提供することによって、上記の課題を解決した。インビボ方法は、アルブチンを産生するように操作された新規の生合成経路において、高いレベルの初期の基質、パラ−ヒドロキシ安息香酸（ｐＨＢＡ）を産生するトランスジェニック植物に依存する。ほとんどの植物は、あまり理解されていない経路を介して極めて低レベルのｐＨＢＡを天然に産生する。細菌性タンパク質コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＣＰＬ）の機能的発現もしくは４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ（ＨＣＨＬ）の発現のいずれか一方、または両方の組み合わせによって、高レベルのｐＨＢＡを産生するように、植物を遺伝子操作することができる。産生されたｐＨＢＡは、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ７３３６）から単離される新規の菌・カビ性タンパク質、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを使用して、ハイドロキノンに変換される。産生されたハイドロキノンは、内因性植物ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼによって、迅速にグルコシル化される。場合により、外来性ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＵＧＴ７２Ｂ１）を形質転換植物細胞に導入することができる。ハイドロキノン配糖体（アルブチン）は、その後、植物の液胞に隔離される。
【００７８】
トランスジェニック植物（タバコおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））は、酵素コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＣＰＬ）の改変されたバージョンをコードする
遺伝子を機能的に発現するように改変された。ＣＰＬは、１モルのコリスミ酸から１モルのピルビン酸および１モルのｐＨＢＡへの直接変換を触媒する。トランスジェニック植物はまた、４−クマロイル−ＣｏＡからｐＨＢＡへの変換を触媒する４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ（ＨＣＨＬ）をコードする遺伝子を機能的に発現するように改変することもできる。ＣＰＬおよびＨＣＨＬもしくは他の任意の酵素またはハイドロキノン、究極的に、アルブチンに実質的に変換されるｐＨＢＡ前駆体の高レベルの産生に適切である酵素の組み合わせを同時発現するように操作されたトランスジェニック植物が開示される。
【００７９】
トランスジェニック植物において産生されたｐＨＢＡは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子の機能的発現によって、ハイドロキノンに変換される。該方法の最後の工程は、機能的に発現されるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子に依存する。ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、植物に対して内因性であるかまたは植物に組換え導入され得る。この酵素は、産生されたハイドロキノンをハイドロキノン配糖体（アルブチン）に変換する。
【００８０】
使用する特定の酵素の組み合わせにかかわらず、出願人らの好適な方法は、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１０％を超えるハイドロキノン配糖体を回収した。出願人らのより好適な方法は、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１５％を超えるハイドロキノン配糖体を回収した。出願人らの最も好適な方法は、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり２０％を超えるハイドロキノン配糖体を回収した。
【００８１】
本出願人らは、ハイドロキノンに対して有意な活性（４２／秒の代謝回転数）を示すアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７２Ｂ１；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）１１６３３７．１）を使用する。この代謝回転数は、基質としてハイドロキノンを使用することが報告されている他のＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼよりも有意に高かった（ヘフナー（Ｈｅｆｎｅｒ）ら、Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０：１７３１−１７４１（２００２）；アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３：１８７−１９３（２０００））。
【００８２】
ハイドロキノンの抱合に対する酵素の独特な有用性は、ハイドロキノンとの活性を有する先に開示された他の任意のグルコシルトランスフェラーゼの効率を明らかに超える１４０のｋｃａｔ（ｓ−１）／Ｋｍ（μＭ）として表される触媒効率によって、例示されている（実施例７を参照のこと）。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼおよびハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ遺伝子の分子を同定することによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物系におけるアルブチンの産生が可能になる。この目的のために、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＣＰＬ）遺伝子および適切なグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子との組み合わせで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現される（実施例６）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこれらの３種の酵素を発現させることで、コリスミ酸からアルブチンへの３段階の経路を作製することによって、安価な発酵可能な炭素源（グルコースなど）からアルブチンへの経路が提供される（図１）。
【００８３】
従って、本発明の好適なポリペプチドは、本明細書において同定されるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である活性な該タンパク質である。より好適なアミノ配列は、本明細書において同定される酸配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告されるアミノ酸断片に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列が最も好適である。同様に、本ＯＲＦに対応する好適な核酸配列は、活性なタンパク質をコードし、本明細書において同定される核酸配列に少なくとも８０％同一な配列である。より好適な核酸配列は、本明細
書において同定される酸配列に少なくとも９０％同一である。本明細書において報告される核酸配列に少なくとも９５％同一な核酸配列が最も好適である。
【００８４】
本出願人らはまた、微生物における単純な炭素源からアルブチンを産生させる方法を提供する。高いレベルのｐＨＢＡ基質を産生するように遺伝子改変された微生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））は、その後、ｐＨＢＡをハイドロキノンに変換するｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの組換えバージョンを産生するように操作される。同じ微生物株においても発現されるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＵＧＴ７２Ｂ１）は、ハイドロキノンを迅速にグルコシル化して、アルブチンを産生する。（米国特許出願第１０／３５９３６９号明細書（参考としてその全体が援用される）を参照のこと。）
【００８５】
この株は、コリスミ酸の内因性プールをｐＨＢＡに変換し、次いでこれがｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼによってハイドロキノン変換されることによって、ハイドロキノンを産生した。この場合のグルコースからのアルブチンの産生は、それぞれ、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼならびに実施例６に記載のハイドロキノン特異的グルコシルトランスフェラーゼを発現する２種の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株の同時培養によって、達成された。
【００８６】
グルコースからアルブチンへの発酵経路の可能性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＣＰＬ、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ酵素によって提供される経路を使用する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における最初の２種の酵素の発現は、培地に拡散するかまたは能動的に排出されるハイドロキノンの形成をもたらし、ハイドロキノン特異的グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞に取り込まれる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞における合成後、ハイドロキノン配糖体がさらに、培地に拡散するかまたは能動的に排出されていく。
【００８７】
これらの経路に必要なすべての補因子、補酵素、補基質（ＦＡＤ、ＮＡＤＨ、Ｏ２、およびＵＤＰＧなど）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞質に存在する。炭素のシキミ酸経路への流動の増加から生じる高いレベルのコリスミ酸を伴う大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が開示されおり（ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４（７）：２５０−２５６（１９９６）；ボンガエルツ（Ｂｏｎｇａｅｒｔｓ）ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（４）：２８９−３００（２００１）；タタールコ（Ｔａｔａｒｋｏ）およびロミオＴ．（Ｒｏｍｅｏ  Ｔ．）、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３（１）：２６−３２（２００１）；米国特許第６２１０９３７Ｂ１号明細書；米国特許第５７７６７３６Ａ号明細書；および国際公開第７３４８４Ａ１号パンフレット）、以下に記載の分子ツールを使用して、グルコースからアルブチンを産生させるのに使用することができる。
【００８８】
本開示では、多数の用語および略語が使用される。以下の定義が提供される。
【００８９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと省略される。
【００９０】
「パラ−ヒドロキシ安息香酸」または「ｐ−ヒドロキシ安息香酸」は「ｐＨＢＡ」と省略される。
【００９１】
「コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ」は「ＣＰＬ」と略称され、コリスミ酸からピルビン酸およびｐＨＢＡへの変換を触媒する酵素をコードする遺伝子を指す。コリスミ酸ピルビ
ン酸リアーゼ発現カセットは次の構造を有する。Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ、式中、Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている。
【００９２】
「４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ」は「ＨＣＨＬ」と略称され、ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡチオエステルの二重結合の水和、続いて、ベンゾイルアルデヒドおよびアセチルＣｏＡを産生する逆アルドール開裂反応を触媒する酵素を指す。
【００９３】
用語「パラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ」、「パラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ（脱炭酸化）」、「パラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ」、および「ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ」は交換可能に使用され、ｐＨＢＡからハイドロキノンへの変換を触媒する酵素をコードするカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ７３３６）から単離される核酸断片を指す（エピンク（Ｅｐｐｉｎｋ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９（２）：６６８０−６６８７（１９９７））。
【００９４】
用語「ハイドロキノン配糖体」および「アルブチン」は、ハイドロキノンおよびグルコース分子を含んでなる抱合体を指す。
【００９５】
用語「ｐ−ヒドロキシ安息香酸配糖体」および「ｐＨＢＡ配糖体」は、ｐＨＢＡおよびグルコース分子を含んでなる抱合体を指す。
【００９６】
用語「ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ」および「グルコシルトランスフェラーゼ」は「ＧＴ」と略称され、グルコース抱合分子の形成に関与する酵素を指す。そのようなタンパク質は、ＵＤＰ−グルコースとアクセプター分子との間の反応を触媒して、ＵＤＰおよびグルコシル化アクセプター分子を形成させる。ほとんどの場合、β−Ｄ−グルコースのＣ１上の水酸基は、１−Ｏ−β−Ｄ−結合を介してアクセプター分子に付着される。基質としてのハイドロキノンに対して有意な活性を示すＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは「ハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ」と称され、「ＨＧ−ＧＴ」と略称される。
【００９７】
用語「アグリコン」は、グルコース部分を欠く本発明の基質（即ち、ハイドロキノンおよびｐＨＢＡ）を指す。
【００９８】
用語「ｐＨＢＡ誘導体」は、ｐＨＢＡの任意の抱合体を指し、ＣＰＬ酵素の触媒活性の結果として植物において形成され得る。
【００９９】
用語「輸送ペプチド」または「葉緑体輸送ペプチド」（「ＴＰ」と略称される）は、葉緑体前駆体タンパク質を葉緑体に配向し、その後、葉緑体プロセシングプロテアーゼによって切断される葉緑体前駆体タンパク質のＮ末端部分を指す。
【０１００】
用語「葉緑体標的化配列」は、葉緑体への転移の目的のために、外来性タンパク質のＮ末端へ付着される任意のポリペプチド伸長を指す。天然に存在する葉緑体前駆体タンパク質の場合、輸送ペプチドが葉緑体標的化配列であると考えられるが、最適な取り込みおよ
びタンパク質分解プロセシングについては、その一部が「成熟な」葉緑体タンパク質の部分に依存してもよい。
【０１０１】
用語「輸送ペプチドドナー配列」は、葉緑体前駆体タンパク質のＮ末端部分から最初のいくらか（約２０まで）のアミノ酸に由来する葉緑体標的化配列の当該部分を指す。輸送ペプチドドナー配列は、常に、成熟葉緑体タンパク質から輸送ペプチドを分離する輸送ペプチド切断部位の下流かつすぐ隣に存在する。
【０１０２】
用語「葉緑体プロセシングプロテアーゼ」は、輸送ペプチドと成熟葉緑体タンパク質との間の切断可能な結合を切断することができるプロテアーゼ酵素を指す。
【０１０３】
用語「輸送ペプチド切断部位」は、葉緑体プロセシングプロテアーゼが作用する葉緑体標的化配列の２アミノ酸間の部位を差す。
【０１０４】
本明細書において使用される「単離された核酸断片」は、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーであり、場合により、合成、非天然または改変されたヌクレオチド塩基を含有する。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなり得る。
【０１０５】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含む特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「生来の遺伝子」は、それ自体の調節配列と共に天然に見出されるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には一緒に見出されない調節およびコード配列を含んでなる、生来の遺伝子ではないあらゆる遺伝子を指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ起源から由来するが、しかし天然に見出されるものとは異なる様式で配列される調節配列およびコード配列を含んでなることができる。「内因性遺伝子」は、生物体のゲノム内の天然の位置にある生来の遺伝子を指す。「外来」遺伝子は、宿主生物体内に通常は見出されない遺伝子を指すが、しかしこれは遺伝子導入により宿主生物体内に導入される。「外来」は、核酸配列が導入される野生型宿主には認められない当該核酸配列を説明するために使用してもよい。外来遺伝子は、非生来の生物体内に挿入された生来の遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノム中に導入されている遺伝子である。
【０１０６】
「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド基礎単位から集成することが可能である。これらの基礎単位は連結およびアニーリングされて、その後に遺伝子全体を構築するように酵素的に集成される。ＤＮＡの配列に関するところの「化学的に合成される」は、成分ヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味する。ＤＮＡの人的な化学合成は、十分に確立された手順を使用して達成することができるか、または、多数の商業的に入手可能な機械の１つを使用して自動化学合成を実施することが可能である。従って、該遺伝子は、宿主細胞のコドンの偏りに反映するヌクレオチド配列の至適化に基づいた最適な遺伝子発現を適応させることが可能である。当業者は、コドンの使用を宿主に好まれるコドンに偏らせる場合に、成功裏の遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことが可能である。
【０１０７】
「コード配列」は特定のアミノ配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、内、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【０１０８】
「プロモーター」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なヌクレオチド配列を指す。一般に、コード配列はプロモーター配列に対し３’側に配置される。プロモーター配列は、近接およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはしばしばエンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することが可能でありかつプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるように挿入されたプロモーターの先天的エレメントまたは異種エレメントであり得るヌクレオチド配列である。プロモーターはそっくりそのまま生来の遺伝子に由来し得るか、または、天然に見出される多様なプロモーター由来の多様なエレメントから構成され得るか、または合成ヌクレオチドセグメントさえ含んでなり得る。多様なプロモーターは、多様な組織もしくは細胞型において、または発生の多様な段階で、あるいは多様な環境条件に応答して、遺伝子の発現を指令することができることが、当業者に理解される。大部分の時間で大部分の細胞型において核酸断片を発現させるプロモーターは普遍的に「構成プロモーター」と称される。植物細胞において有用な多様なタイプの新規プロモーターが常に発見されている。多数の例がオカムロ（Ｏｋａｍｕｒｏ）およびゴールドベルグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ）、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、第１５巻、（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、マサチューセッツ州バーリントン（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より出版、１〜８２頁（１９８９））収集された。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に規定されていないため、多様な長さの核酸断片が同一のプロモーター活性を有することができることがさらに認識される。
【０１０９】
「３’非コード配列」は、コード配列の下流に配置されるＤＮＡ配列を指し、かつ、ポリアデニル化認識配列（通常真核生物ｍＲＮＡに限られる）、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。真核生物のポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。
【０１１０】
用語「作動的に結合している」は、一方の機能が他方により影響を受けるような単一核酸断片上の核酸配列の対合（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現を影響することができる（即ち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、プロモーターはコード配列に作動的に結合されている。コード配列はセンスまたはアンチセンスの配向で調節配列に作動的に結合することができる。
【０１１１】
本明細書において使用する用語「発現」は、本発明の核酸断片に由来するセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指すことができる。
【０１１２】
「成熟」タンパク質は、転写後にプロセシングされたポリペプチド（即ち、一次翻訳産物中に存在するいかなるプレ−もしくはプロペプチドが除去されている）を指す。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（即ち、プレ−およびプロペプチドがなお存在する）を指す。プレ−およびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであってもよい。
【０１１３】
「形質転換」は、遺伝子的に安定な遺伝をもたらす核酸断片の宿主生物体のゲノムへの伝達を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物体は「トランスジェニック」、「組換え」、または「形質転換された」生物体と称される。
【０１１４】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、しばしば細胞の中心的代謝の部分ではない遺伝子を担持する染色体外エレメントを指し、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ
分子の形態である。そのようなエレメントは、任意の起源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡあるいはＲＮＡの自律的複製配列、ゲノム組込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列で、線状あるいは環状であってもよく、ここで、プロモーター断片および適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物に対するＤＮＡ配列を細胞に導入することが可能である独特な構築物に、多くのヌクレオチド配列が接続または再結合されている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を容易にするエレメントを有する特異的ベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、該外来遺伝子に加えて、外来宿主における該遺伝子の発現の増強を可能にするエレメントを有する特異的ベクターを指す。
【０１１５】
本明細書において使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッシュＥ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９）（以後、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；ならびにシルハビー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンナン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）、およびエンクイスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４）（以後「シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）」）；ならびにアウスベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（グリーン・パブリッシング・アソシ・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７）から出版）（以後「アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）」）により記載されている。
【０１１６】
ＣＰＬおよびＨＣＨＬを使用するトランスジェニック植物におけるｐＨＢＡ産生
ｐＨＢＡは、極微量ではあるが、ほぼすべての植物、動物、および微生物に天然に存在する。多くの細菌は、コリスミ酸（フェニルアラニン、チロシン、ｐ−アミノ安息香酸、およびユビキノンを含む多数の芳香族化合物の合成における重要な分岐点中間体）によってｐＨＢＡを作製する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、コリスミ酸は、異なる５種の酵素反応を経て、異なる５種の産物を産出する。ｐＨＢＡの合成を究極的に担う酵素は、ＣＰＬとして公知であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼである。後者は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｂｉＣ遺伝子の産物であり、異なる２つのグループによって、独立してクローニングされた（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ３０７：３４７−３５０（１９９２）；ニコルズ（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５３０９−５３１６（１９９２））。酵素は、１９ｋＤａの単量体タンパク質であり、既知の補因子またはエネルギー要件は認められていない。その唯一の基質のＣ３エノールピルビル側鎖の除去を介して、ＣＰＬは、１モルのコリスミ酸から１モルのピルビン酸および１モルのｐＨＢＡへの直接変換を触媒する。組換えＣＰＬは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において過剰発現され、均質に精製され、生化学的および動力学的に部分的に特徴付けされている（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：８９７−９０４（１９９４）；ニコルズ（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７４：５３０９−５３１６（１９９２））。さらに、ＣＰＬ酵素反応の詳細な機構も提唱されている（ウォルシュ（Ｗａｌｓｈ）ら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，９０：１１０５−１１２９（１９９０））。
【０１１７】
植物では、ｐＨＢＡは、ニンジン組織（シュニッツラー（Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔａ，１８８：５９４（１９９２））、様々なイネ科および作物植物（リュドン（Ｌｙｄｏｎ）ら、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．，３６：８１３（１９８８））、ポプラの樹木のリグニン（テラシマ（Ｔｅｒａｓｈｉｍａ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１４：１９９１（１９７２））、他の多くの植物組織（ビルケ（Ｂｉｌｌｅｋ）ら、Ｏｅｓｔｅｒｒ．Ｃｈｅｍ．，６７：４０１（１９６６））において見出されている。植物がｐＨＢＡを合成するのに必要なすべての酵素機構を有するという事実から、それらは、このモノマーの産生に有用なプラットホームであることが示唆される。例えば、再生可能な資源として、植物プラットホームは、モノマーを生成するための石油または微生物方法のいずれよりもはるかにより少ないエネルギーおよび材料消費しか必要としない。同様に、植物プラットホームは、モノマー生成について、微生物系よりもはるかにより利用可能なバイオマスを提示する。最終的に、植物においてｐＨＢＡが天然に存在することは、宿主毒性（化合物の過剰発現の結果）は問題ではないことを示唆している。それでもやはり、ｐＨＢＡを生成するための手段として植物を使用する明確な利益にもかかわらず、モノマーの高レベル生成は達成困難である。
【０１１８】
植物組織におけるコリスミ酸の代謝運命は困難な問題である。実際に、高等植物はＣＰＬに機能的に等価な酵素を欠くため、コリスミ酸からのｐＨＢＡの産生は、微生物よりも高等植物の方がはるかに複雑である。例えば、ムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）においてｐＨＢＡをもたらす生合成経路は、１０までの連続反応よりなると考えられ（ローシャー（Ｌｏｓｃｈｅｒ）およびハイデ（Ｈｅｉｄｅ）、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０６：２７１−２７９（１９９２））、おそらく各反応が異なる酵素によって触媒されている。さらに、これらの反応を触媒する酵素のほとんどが同定されておらず、それらの遺伝子もクローニングされていない。他の植物種においてどのようにｐＨＢＡが合成されるかに関する情報もなおあまり入手できない。さらに複雑なことに、植物のｐＨＢＡ産生に参加していることが公知であるそれらの該酵素は、個別に調節され、異なる細胞コンパートメントに局在する２つの異なる経路に及んでいる。具体的には、コリスミ酸は、葉緑体および他のタイプの色素体に概ね限定されているシキミ酸経路の中間体である（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６）；ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８））一方、フェニルアラニンより下流のすべての中間体は、サイトゾルおよび小胞体の両方で生じるフェニルプロパノイド経路に属する。
【０１１９】
野生型植物よりも有意に高いレベルのｐＨＢＡを蓄積するトランスジェニック植物が記載されている。例えば、カズフミ・ヤザキ（Ｋａｚｕｆｕｍｉ  Ｙａｚａｋｉ）（バイオサイエンスとインダストリー（Ｂａｉｏｓａｉｅｎｓｕ  ｔｏ  Ｉｎｄａｓｕｔｏｒｉ）、５６（９）：６２１−６２２（１９９８））は、昆虫耐性を付与するのに十分な量のｐＨＢＡの産生のためのＣＰＬをコードする遺伝子のタバコへの導入について考察している。同様に、シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６））は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬ（「ＴＰ−ＵｂｉＣ」と称される）の構成的に発現される葉緑体標的化バージョンで形質転換されたタバコ植物（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））が、野生型植物よりも少なくとも３桁を超える大きさである高いレベルのｐＨＢＡを有することを実証した（国際公開第９６／００７８８号パンフレット）。遺伝子改変タバコ植物は、極微量の遊離の非抱合型ｐＨＢＡを含有した。事実上すべての化合物（約９８％）が約３：１の比で存在する２種のグルコース抱合体、フェノール配糖体およびエステル配糖体に変換された（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６）；リー（Ｌｉ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３８（７）：８４４−８５０（１９９７））。両方のグルコース抱合体は、ｐＨＢＡの水酸基またはカルボキシル基に共有結合した単一のグルコース残基を有する１−β−Ｄ−グルコシドであった。本研究において同定された最も良好なトランスジェニック植物は、乾燥重量（植物葉組織）の約０．５２％の全ｐＨＢＡ配糖体含有量を有した。関連するグルコース残基について訂正すると、トランスジェニックタバコ植物において産生されたｐＨＢＡの実際の量はこの値の僅か約半分であった。
【０１２０】
より最近の研究では、同じ人工融合タンパク質が、構成性プロモーター（ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８））および誘導性プロモーター（ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１７：８９１−８９６（１９９８））の両方を使用して、形質転換されたタバコ細胞培養物において発現された。ｐＨＢＡ配糖体の蓄積が植物全体による本来の研究よりも僅かに高かった一方、いずれの場合においても、レベルが乾燥重量の０．７％を超えることはなかった。対照的に、ＴＰ−ＵｂｉＣをムラサキ（Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｅｒｙｔｈｒｏｒｈｉｚｏｎ）の毛状根培養物において試験した場合（ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３９：６８３−６９３（１９９９））、ｐＨＢＡ配糖体の含有量は、非形質転換コントロール培養物における内因性レベルについて訂正後、乾燥重量の０．８％の高いレベルに到達した。
【０１２１】
これらの研究は、遺伝子操作を使用して、高等植物におけるｐＨＢＡのレベルを増加する可能性を実証しているが、上記のＴＰ−ＵｂｉＣ人工融合タンパク質では、商業的に有用な量で化合物を作製することはできない。そのような量を得るには、先に報告された植物よりも１０〜２０倍高いレベルにまで、農地経営学的に適切な植物のｐＨＢＡ含有量を増加させることが必要である。従って、これらのレベルを達成するためには、既知のシステムの１つもしくはそれ以上の改変が必要である。コリスミ酸（ＣＰＬの基質）は色素体で合成されるため、改良のための１つの潜在的領域は、目的の細胞コンパートメントにおけるより高いレベルの酵素活性を達成するためのより良好な葉緑体標的化配列の設計にあり得る。ＣＰＬ酵素活性とｐＨＢＡ配糖体の蓄積との間には正の相関関係があり、上記のいくらかの研究において明らかである（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６）；ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８）；ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１７：８９１−８９６（１９９８））。さらに、これらの研究のうち、ＴＰ−ＵｂｉＣ人工融合タンパク質を使用して、システムがＣＰＬ酵素活性で飽和されたことを示唆する証拠は認められていない。
【０１２２】
最も多く天然に存在する葉緑体タンパク質は、核においてコードされ、輸送ペプチドと呼ばれる切断可能なＮ末端ポリペプチド伸長を有するより大きな分子量の前駆体として合成される。後者は、葉緑体への転移に必要であるすべての情報を含有することが一般に認められている。タンパク質輸送機構の詳細についてはまだ解明されていないが、いくらかの重要な事実が出現している。（ａ）前駆体の取り込みは翻訳後に生じ（チュア（Ｃｈｕａ）およびシュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７５：６１１０−６１１４（１９７８）；ハイフィールド（Ｈｉｇｈｆｉｅｌｄ）およびエリス（Ｅｌｌｉｓ）、Ｎａｔｕｒｅ，２７１：４２０−４２４（１９７８））、葉緑体包膜に存在するタンパク質の受容体によって仲介される（クライン（Ｃｌｉｎｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：３６９１−３６９６（１９８５））；（ｂ）ＡＴＰ加水分解は転移のための唯一の駆動力である（グロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２８５：６２５−６２８（１９８０）；クライン（Ｃｌｉｎｅ）ら、上掲）；（ｃ）輸送ペプチドの外来タンパク質への融合は、常にではないが、時々、インビボ（バン・デ・ブロック（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３１３：３５８−３６２（１９８５））；シュライヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２５−３２（１９８５））およびインビトロ（バスマン（Ｗａｓｍａｎｎ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０５：４４６−４５３（１９８６））の両方で、葉緑体への取り込みを誘発するのに十分である；ならびに最後に、（ｄ）葉緑体インポート後、輸送ペプチドは前駆体タンパク質からタンパク質分解により取り出され、「成熟」ポリペプチドを生じる。数千の輸送ペプチドの完全な配列が現在公知であるが、最適な標的化および植物の葉緑体コンパートメントにおける外来タンパク質の発現を達成するためにこれらの配列を操作することは、まだ試行錯誤の段階である。輸送ペプチドを外来タンパク質に単純に付着させるには、それが葉緑体に効率的に取り込まれるかまたは適切に処理されることを必ずしも保障する必要はない。同じ標的化配列が異なるタンパク質に融合される場合であっても、結果を完全に予想することはできず（ラベン（Ｌｕｂｂｅｎ）ら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１：１２２３−１２３０（１９８９））、異なるパッセンジャータンパク質が異なる効率で輸送される。この理由は明らかではない。しかし、葉緑体の輸送ペプチドの取り込みおよび除去が何らかの方法で結合されること、ならびに所定の人工融合タンパク質は処理されないかまたは非効率的に処理されることが示唆されている。例えば、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体の天然の切断部位付近の極めて僅かな変化でも、異常なプロセシング（ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）およびエリス（Ｅｌｌｉｓ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４２：３４２−３４６（１９８４）；ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）およびエリス（Ｅｌｌｉｓ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１５２：６７−７３（１９８５））、ならびに葉緑体取り込みの減弱をもたらし得る（バスマン（Ｗ��ｓｍａｎｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：６１７−６１９（１９８８））ことが明らかにされている。
【０１２３】
葉緑体標的化配列に輸送ペプチドおよび切断可能な結合だけではなく、輸送ペプチドドナーの成熟Ｎ末端の小さな部分をも含めることによって、この領域にいくつかの程度の改善が達成されている。実際、このアプローチは、別の細菌タンパク質、即ち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴ  ＩＩ）に対し、インビボおよびインビトロの両方で作用した（バン・デ・ブロック（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ）ら、上掲；シュライヤー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）ら、上掲；バスマン（Ｗａｓｍａｎｎ）ら、上掲；ＥＰ０１８９７０７号明細書；米国特許第５７２８９２５号明細書；および米国特許第５７１７０８４号明細書））。従って、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体の輸送ペプチド＋ＮＰＴ  ＩＩのＮ末端に融合された成熟ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の最初の２２残基よりなるキメラタンパク質は、輸送ペプチドおよび切断可能な結合のみを含有するより小さな構築物よりも葉緑体の方にかなり良好に取り込まれた。しかし、このストラテジーにはなお、パッセンジャータンパク質に不可避の予測不能な事項を高い程度で伴うため、該ストラテジーはそれほど簡単ではない。このことは、葉緑体を標的としてＣＰＬを配向する文献的試行において最も容易に認められる。例えば、ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８））は、輸送ペプチドに対しＮ末端で融合したＣＰＬ遺伝子産物およびルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニットの最初の２１アミノ酸残基を含んでなる類似の人工融合タンパク質（例えば、「ＴＰ２１ＵｂｉＣ」）について記載している。この改変は、葉緑体の取り込みおよびプロセシングを改善するために行われたが、本来の構築物、ＴＰ−ＵｂｉＣを含有する細胞は、意外なことに、ＣＰＬ酵素活性およびｐＨＢＡ配糖体の両方でかなりより高いレベルを有した。従って、異なるタンパク質で適用する場合、バスマン（Ｗａｓｍａｎｎ）ら（上掲）の教示内容の適用は有害な影響を及ぼした。
【０１２４】
特許出願（米国特許出願第０９／８５５３４１号明細書；本明細書において参考として援用される）は、植物においてｐＨＢＡを産生させるのに有用なコリスミ酸ピルビン酸発現カセット（配列番号３３、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードしている）を教示している。ポリペプチドは細胞葉緑体に効率的に輸送され、ここで、その後、該ポリペプチドはタンパク質分解により処理され、活性な葉緑体標的化ＣＰＬとなった。葉緑体標的化ＣＰＬは、植物におけるパラ−ヒドロキシ安息香酸の産生を可能にした。
【０１２５】
シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＮ１０３から単離される４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ（ＨＣＨＬ）は、トランスジェニックタバコ（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）ｃｖ．クサンシ（Ｘａｎｔｈｉ）ＸＨＦＤ８）において発現される場合、ｐＨＢＡ配糖体の有意な蓄積を生じた別の細菌性酵素である（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．，１３：１６６９−１６８２（２００１））。トランスジェニック植物のサイトゾルにおけるＨＣＨＬの発現により、炭素流動がフェニルプロパノイド経路からｐＨＢＡ配糖体の産生へ転送された。ＨＣＨＬは４−クマロイル−ＣｏＡからｐＨＢＡへの変化を触媒し、ここで、内因性ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼはｐＨＢＡをグルコシル化した。
【０１２６】
機能的ＣＰＬ（緑色植物における産生のために葉緑体を標的とするかもしくはサイトゾル性微生物発現のために標的を有さない）またはｐＨＢＡの発現増加のためのＨＣＨＬ（サイトゾル性）のいずれかを発現させてもよい。好適な実施態様では、ＣＰＬおよびＨＣＨＬを同時発現させ、ｐＨＢＡ産生を最大にする。産生されるｐＨＢＡは、新規の酵素ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ（脱炭酸化）の基質として作用することができ、ここで、それは、ハイドロキノンに変換される。宿主細胞に対して内因性であるかまたは宿主細胞に組換え操作されているＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ハイドロキノンをグルコシル化し、ハイドロキノン配糖体（アルブチン）を形成する。好適な実施態様では、本発明において使用されるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ｐＨＢＡまたは他のフェノール代謝物よりもハイドロキノンを好適にグルコシル化する。
【０１２７】
ＣＰＬ発現カセット
本発明は、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＣＰＬ）の十分に活性な改変されたバージョンの発現および該ポリペプチドの宿主植物の葉緑体への標的化に有用な発現カセットを提供する。典型的に、発現カセットは、（１）５’および３’調節配列の転写制御下にあるクローニングされたＣＰＬ遺伝子および（２）優勢な選択マーカーを含んでなる。本発明の発現カセットはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導性もしくは構成性、環境によりもしくは発達により調節される、または細胞もしくは組織特異的／選択的発現を与える領域）、転写開始部位、リボゾーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、ならびに／あるいはポリアデニル化シグナル（通常、真核生物に限定される）を含有してもよい。好適な実施態様では、カセットは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の色素体への効率的な標的化を可能にする配列をさらに含有する。これらの成分は、輸送ペプチドならびに宿主植物細胞の葉緑体プロセシングプロテアーゼによるプロセシングを受けやすい輸送ペプチド切断部位を含有する輸送ペプチドドナーの部分をコードする配列を含む。場合により、カセットはまた、発現を容易にするために１つもしくはそれ以上のイントロンを含んでなり得る。別の好適な実施態様では、ＣＰＬ遺伝子は葉緑体ゲノムに組み入れられ、このオルガネラにおける効率的な翻訳および転写を可能にするＤＮＡ配列エレメントの制御下で発現される。本発明において特に使用されるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセットは、以下の構造を有する。
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
式中、Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている。
【０１２８】
ＨＣＨＬ発現カセット
ｐＨＢＡ産生はまた、植物細胞の細胞質における細菌起源の４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ（ＨＣＨＬ）酵素の発現を介して達成させることもできる（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１３（７）：１６６９−１６８２（２００１）；ミトラ（Ｍｉｔｒａ）ら、ＰＬＡＮＴＡ，２１５（１）：７９−８９（２００２）；および国際公開第９７３５９９９Ａ２号パンフレット）。植物におけるｐＨＢＡの産生に有用な発現カセットは、ＨＣＨＬの十分に活性なバージョンをコードする遺伝子よりなる。典型的に、発現カセットは、（１）５’および３’調節配列の転写制御下にあるクローニングされたＨＣＨＬコード配列および（２）優勢な選択マーカーを含んでなる。本発明の発現カセットはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導性もしくは構成性、環境によりもしくは発達により調節される、または細胞もしくは組織特異的／選択的発現を与える領域）、転写開始部位、リボゾーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、ならびに／あるいはポリアデニル化シグナルを含有してもよい。場合により、カセットはまた、ＨＣＨＬ発現を容易にするために１つもしくはそれ以上のイントロンを含んでなり得る。
【０１２９】
ＨＣＨＬ遺伝子は、１モルのｐＨＣＡＣｏＡを１モルのアセチルＣｏＡおよび１モルのｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドに変換する酵素をコードする。ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドは、その後、細胞質に存在する内因性植物酵素の作用を介して、ｐＨＢＡに変換される。最も良好に特徴付けされたＨＣＨＬ遺伝子は、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＡＮ１０３）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｙ１３０６７．１）から単離されている。シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）由来のＨＣＨＬ遺伝子のＤＮＡ配列（ムハイム（Ｍｕｈｅｉｍ）およびレルヒ（Ｌｅａｒｃｈ）、Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，５１（４）：４５６−４６１（１９９９））およびこの生物体のＨＣＨＬタンパク質の推定アミノ酸配列は、それぞれ配列番号３７および配列番号３８として本明細書に記載されている。この遺伝子は、本出願人らによって単離されており、また、トランスジェニック植物においてｐＨＢＡを産生させるのに有用である。
【０１３０】
カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ（脱炭酸化）を使用するｐＨＢＡからハイドロキノンへの変換
本発明の方法は、ｐＨＢＡからハイドロキノン（１，４−ジヒドロキシベンゼン）への酵素変換のための子嚢菌酵母カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ  ７３３６）から単離される新規の酵素、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ（脱炭酸化）を提供する。この酵素を精製するための６工程のストラテジーが先に報告されている（エピンク（Ｅｐｐｉｎｋ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９（２１）：６６８０−６６８７（１９９７））。しかし、該開示物に記載の最終調製物は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素活性において高度に富化されているが、タンパク質の複雑な混合物よりなることを強調することは重要である。部分精製された酵素調製物の有力な種は、クマシー染色されたゲルから判定されるように５２ｋＤａのポリペプチドであり、従って、これが目的のタンパク質であると想定された。しかし、最終調整物におけるその相対量のほかには、５２ｋＤａのポリペプチドがｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素活性を担うと結論付ける理由はなかった。また、遺伝子をクローニングしてこの仮説を試験することが可能な５２ｋＤａのポリペプチドの任意の分子特徴付けも存在しなかった。
【０１３１】
本発明では、出願人らはカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを均質に精製し、遺伝子をクローニングするのに十分なアミノ酸配列情報を得た。全長遺伝子のＤＮＡ配列全体を決定し（配列番号２２）、該遺伝子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させた。実際にクローニングされた遺伝子がｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼをコードする明白な証拠を提供するために、得られた組換えタンパク質（配列番号２３）を均質に精製し、ｐＨＢＡからハイドロキノンへの酵素変換を触媒することを示した（実施例１〜３；図３および４）。
【０１３２】
ＢＬＡＳＴＰ解析（デフォルト値を設定）を使用して得たジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）においてｐＨＢＡ−１−ヒドロキシラーゼアミノ酸配列（配列番号２３）に最も近い一致から、バークホルデリア・ファンゴラム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｆｕｎｇｏｒｕｍ）由来の仮想タンパク質が同定された（ＧＩ：２２９８８８１７；３２％同一性；５０％類似性；Ｅ値＝６ｅ−４５）。配列番号２３に対して最も高い同一性を伴う配列に割り当てられた未知の機能との組み合わせで観察される低い同一性パーセントでは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を同定したりまたは機能を割り当てることはできない。さらに、配列番号２３は、６−ヒドロキシニコチン酸の酸化的脱炭酸を触媒するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）ＴＮ５の６−ヒドロキシニコチン酸３−ヒドロキシラーゼ酵素と３０．０８１％同一性および３９．２９５％類似性（ＧＡＰアラインメント、ギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）：８  長さウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）：２）を共有する（ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６０（１）：１２０−１２６（１９９９））。これは、配列番号２３の酵素によって触媒されるｐＨＢＡの酸化的脱炭酸に密接に関連する反応である。しかし、この酵素と配列番号２３との間の低レベルの配列類似性は、ハイブリダイゼーションまたは分子生物学のＰＣＲに基づく技術を使用してｐＨＢＡ１−ｈヒドロキシラーゼ酵素を単離するための手段を提供しない。
【０１３３】
ｐＨＢＡ１−ｈヒドロキシラーゼはフラビンタンパク質モノオキシゲナーゼである。酵素は、式１に示すようなｐＨＢＡまたは４−ヒドロキシ安息香酸のハイドロキノンへの酸化的脱炭酸のために、補因子ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および強固に結合した補因子フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を必要とする。
式１
ｐＨＢＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋＋Ｏ２→ハイドロキノン＋ＣＯ２＋Ｈ２Ｏ＋ＮＡＤ＋
【０１３４】
出願人らは、遺伝子を単離し、２種の異なるトランスジェニック植物、タバコおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において機能的酵素を発現させた（実施例５）。ｐＨＢＡを過剰発現させることが可能なトランスジェニック植物において酵素を発現させる能力を例示する。葉組織の分析によって、ＣＰＬなどのｐＨＢＡ産生酵素、およびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の両方を発現するトランスジェニック植物は、ハイドロキノン配糖体（アルブチン）の出現によって測定されるハイドロキノンを産生することが可能である一方、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く植物ではハイドロキノン配糖体を検出することができないことが示された（実施例５；図４）。産生されるハイドロキノンの大部分は内因性ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼによって迅速にグルコシル化されるため、配糖体産生が測定された。出願人らは、２種の関連しない植物種において、（ｐＨＢＡ産生酵素およびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの同時発現を介して）トランスジェニック植物における高レベルのアルブチン産生を達成するためには、必ずしもハイドロキノン特異的グルコシルトランスフェラーゼを伴う植物を形質転換する必要はないことを最終的に実証した。植物は、効率的にアルブチン合成を仲介する内因性グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する。
【０１３５】
ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ発現カセット
ｐＨＢＡ産生植物細胞の細胞質における酵母起源のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の発現によって、アルブチン産生を達成することができる。植物、菌・カビ性、または微生物起源の適切なｐＨＢＡ産生酵素によって、ｐＨＢＡを発現させることができる。ｐＨＢＡをハイドロキノンに変換するのに有用な発現カセットはｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の十分に活性なバージョンを含む。典型的に、発現カセットは、実施例５に記載のように、（１）５’および３’調節配列の転写制御下にあるクローニングされたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼコード配列および（２）優勢な選択マーカーを含んでなる。本発明の発現カセットはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導性もしくは構成性、環境によりもしくは発達により調節される、または細胞もしくは組織特異的／選択的発現を与える領域）、転写開始部位、リボゾーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位、ならびに／あるいはポリアデニル化シグナルを含有してもよい。場合により、カセットはまた、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ発現を容易にするために１つもしくはそれ以上のイントロンを含んでなり得る。好適な実施態様では、カセットは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の色素体への効率的な標的化を可能にする配列をさらに含有する。これらの成分は、輸送ペプチドならびに宿主植物細胞の葉緑体プロセシングプロテアーゼによるプロセシングを受けやすい輸送ペプチド切断部位を含有する輸送ペプチドドナーの部分をコードする配列を含む。別の好適な実施態様では、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子は葉緑体ゲノムに直接組み入れられ、このオルガネラにおける効率的な翻訳および転写を可能にするＤＮＡ配列エレメントの制御下で発現される。アルブチンを産生させるこの方法は、ｐＨＢＡ産生酵素（即ち、ＣＰＬ）が色素体にも存在する場合に特に使用される。
【０１３６】
ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、１モルのｐＨＢＡを１モルのＣＯ２および１モルのハイドロキノンに変換する酵素をコードする。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素のアミノ酸配列を配列番号２３として開示する。
【０１３７】
植物遺伝子発現
本発明において使用される遺伝子（ＣＰＬ、ＨＣＨＬ、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ）を駆動するのに有用なプロモーターは多数あり、当該分野において周知である。適切なプロモーターは植物において作動するプロモーターであり、一般に発現カセットが存在する植物宿主に由来する。遺伝子の発現を誘導することが可能ないかなるプロモーターおよびいかなるターミネーターのいかなる組み合わせも、本発明に使用することができる。プロモーターおよびターミネーターのいくつかの適切な例として、３５Ｓプロモーターならびにノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）およびカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）遺伝子由来のものが挙げられる。本発明の遺伝子配列と作動的に結合されているそのようなプロモーターは、本発明の遺伝子産物の発現を促進することが可能である。本発明において使用することができる高レベル植物プロモーターとして、ダイズ由来のリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓ）のプロモーター（ベリー−ロウ（Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｗｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ．Ｇｅｎ．，１：４８３−４９８（１９８２））、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターが挙げられる。これらの２つのプロモーターは、植物細胞において光誘導性であることが既知である（例えばＧｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ，ａｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、Ａ．キャシュモア（Ａ．Ｃａｓｈｍｏｒｅ）、ニューヨーク州プレヌム（Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８３）、２９〜３８頁；コルジ，Ｇ．（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．）ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２５８：１３９９（１９８３）；およびダンスムイル（Ｄｕｎｓｍｕｉｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐ．Ｇｅｎ．，２：２８５（１９８３）を参照のこと）。
【０１３８】
ポリペプチドの発現を所望する場合、本発明における各遺伝子のコード領域の３’末端
にポリアデニル化領域を含むことが一般に望ましい。ポリアデニル化領域は、様々な植物遺伝子またはＴ−ＤＮＡから誘導することができる。例えば、付加しようとする３’末端配列は、ノパリンシンターゼまたはオクトピンシンターゼ遺伝子、あるいは別の植物遺伝子、またはあまり好ましくはないが、他の任意の真核生物の遺伝子から誘導することができる。
【０１３９】
イントロン配列を部分コード配列の５’非翻訳領域またはコード配列に付加して、サイトゾルに蓄積する成熟メッセージの量を増加することができる。植物および動物両方の発現構築物の転写単位にスプライシング可能なイントロンを含めると、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方で遺伝子発現が１０００倍まで増加することが示されている（ブックマン（Ｂｕｃｈｍａｎ）およびベルク（Ｂｅｒｇ）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８：４３９５−４４０５（１９８８）；カリス（Ｃａｌｌｉｓ）ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１：１１８３−１２００（１９８７））。遺伝子発現のそのようなイントロンの増強は、典型的に、転写単位の５’末端付近に配置される場合に最も大きい。トウモロコシイントロンＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、および６、ブロンズ（Ｂｒｏｎｚｅ）−１イントロンの使用が当該分野において公知である（一般に、Ｔｈｅ  Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１６章、フリーリング（Ｆｒｅｅｌｉｎｇ）およびヴァウボト（Ｗａｌｂｏｔ）編、スプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９４）を参照のこと）。
【０１４０】
ＣＰＬタンパク質を葉緑体および他の色素体に指向することは有用である。典型的に、このことは、発現されたタンパク質を色素体に向ける葉緑体輸送ペプチドを導入することによって達成され、また、オルガネラへのその転移を容易にする。エンドウ（Ｐｉｓｕｍ）（特開昭６１２２４９９０号公報；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｅ００９７７）、ニンジン（ルオ（Ｌｕｏ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３（４）：７０９−７２２（１９９７）；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｚ３３３８３）、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）（ＥＰ０３５９６１７号明細書；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ａ０９０２９）、オリザ（Ｏｒｙｚａ）（デ・ペイター（ｄｅ  Ｐａｔｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５（３）：３９９−４０６（１９９０）；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｘ５１９１１）に由来するペプチド、ならびに合成配列（ＥＰ０１８９７０７号明細書；米国特許第５７２８９２５号明細書；米国特許第５７１７０８４号明細書（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ａ１０３９６およびＡ１０３９８））を含むが、これらに限定されない多くの葉緑体輸送ペプチドが既知であり、ＣＰＬタンパク質を葉緑体に指向するために本発明において使用し得る。あらゆる植物から単離されるリブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ））小サブユニット前駆体タンパク質の葉緑体輸送ペプチドが好適である。ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニットは様々な植物から良好に特徴付けられ、それらのいずれか由来の輸送ペプチドが本発明における使用に適している。例えば、フィスコミトレラ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＷ５９９７３８）；ロータス（Ｌｏｔｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＷ４２８７６０）；キトルルス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受入番号ＡＩ５６３２４０）；ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）（アップルビー（Ａｐｐｌｅｂｙ）ら、Ｈｅｒｅｄｉｔｙ，７９（６）：５５７−５６３（１９９７））；アルファルファ（クーディ（Ｋｈｏｕｄｉ）ら、Ｇｅｎｅ，１９７（１／２）：３４３−３５１（１９９７））；ポテトおよびトマト（フリッツ（Ｆｒｉｔｚ）ら、Ｇｅｎｅ，１３７（２）：２７１−４（１９９３））；コムギ（ガリリ（Ｇａｌｉｌｉ）ら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８１（１）：９８−１０４（１９９１））；ならびにイネ（シェイ（Ｘｉｅ）ら、Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．，Ｓｅｒ．Ｂ（英語版（Ｅｎｇｌ．Ｅｄ．）），３０（７）：７０６−１９（１９８７））に関連する開事物を参照のこと
。例えば、輸送ペプチドは、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、タバコ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、カノーラ、キビ、豆類、エンドウ、ライムギ、アマ、およびイネ科牧草を含むがこれらに限定されない植物から単離されるルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニットから誘導してもよい。トマトルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体タンパク質が本発明における使用に好適である。
【０１４１】
葉緑体標的化配列は所望のタンパク質を葉緑体に向けるだけではなく、オルガネラへのその転移も容易にする。これは、葉緑体に生来の葉緑体プロセシングプロテアーゼによる適切な輸送ペプチド切断部位での成熟ポリペプチドまたはタンパク質からの輸送ペプチドの切断によって、達成される。従って、葉緑体標的化配列は、葉緑体内に含有される活性な成熟ポリペプチドへのプレタンパク質の正確なプロセシングに適切な切断部位を含んでなる。成熟ポリペプチドから輸送ペプチドを分離する天然に存在するＣｙｓおよびＭｅｔ残基間に切断部位を有するトマトルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体タンパク質の葉緑体標的化配列が本発明において好適である。
【０１４２】
機能的ＣＰＬ発現カセットは、適切な植物宿主を形質転換して、ＣＰＬを発現させ、葉緑体においてｐＨＢＡを産生させるために使用される。事実上、本発明における遺伝子の発現を指示することが可能であるあらゆる植物宿主が適切である；しかし、収穫の容易さおよび大きなバイオマスのため、作物植物が好適である。適切な植物宿主として、ダイズ、アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｌ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、カノーラ、キビ、豆類、エンドウ、ライムギ、アマ、およびイネ科牧草などの単子葉植物および双子葉植物の両方が挙げられるが、これらに限定されない。好適な植物宿主はタバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、サトウキビ、およびテンサイである。
【０１４３】
植物の形質転換
植物細胞宿主に構築物を導入するためのさまざまな技術が利用可能であり、当業者に公知である。これらの技術には、形質転換因子としてＡ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＡ．リゾゲネス（Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を用いるＤＮＡの形質転換、エレクトロポレーション、および粒子加速法が含まれる（ＥＰ２９５９５９号明細書およびＥＰ１３８３４１号明細書）。１つの適切な方法は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐｐ．のＴｉおよびＲｉプラスミドのバイナリータイプベクターの使用に関与する。Ｔｉ由来ベクターは、ダイズ、ワタ、セイヨウアブラナ、タバコ、およびイネなどの単子葉植物および双子葉植物を含む広範な高等植物を形質転換する（パシオッティ（Ｐａｃｃｉｏｔｔｉ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：２４１（１９８５）；ビルネ（Ｂｙｒｎｅ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，８：３（１９８７）；シュクハピンダ（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２０９−２１６（１９８７）；ローズ（Ｌｏｒｚ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１７８（１９８５）；ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１８３（１９８５）；パーク（Ｐａｒｋ）ら、Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．，３８（４）：３６５−７１（１９９５）；およびハイエイ（Ｈｉｅｉ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６：２７１−２８２（１９９４））。植物細胞を形質転換するためのＴ−ＤＮＡの使用は広範な研究を受容しており、そして詳細に記載されている（ＥＰ１２０５１６号明細書；ホエケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）、Ｔｈｅ  Ｂｉｎａｒｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｆｆｓｅｔ−ｄｒｕｋｋｅｒｉｊ  Ｋａｎｔｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．；アルブラッセルダム（Ａｌｂｌａｓｓｅｒｄａｍ）（１９８５）、第Ｖ章；クナウフ（Ｋｎａｕｆ）ら、アグロバクテリウムによる宿主範囲発現の遺伝子解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｏｓｔ  Ｒａｎｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ−Ｐｌａｎｔ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、ピューラー，Ａ．（Ｐｕｈｌｅｒ，Ａ．）編、スプリンガー出版（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８３、２４５頁；およびアン（Ａｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：２７７−２８４（１９８５））。植物への導入のために、キメラ遺伝子をバイナリーベクターに挿入することができ、実施例に記載されている。
【０１４４】
他の形質転換方法も当業者に公知である。例として、外来ＤＮＡ構築物の直接取り込み（ＥＰ２９５９５９号明細書）、エレクトロポレーションの技術（フロム（Ｆｒｏｍｍ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３１９：７９１（１９８６））、ならびに核酸構築物を被覆した金属粒子による高速弾道衝撃（クライン（Ｋｌｉｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン（Ｌｏｎｄｏｎ））３２７：７０（１９８７）；および米国特許第４９４５０５０号明細書）が挙げられる。一旦形質転換すると、細胞は、当業者によって再生することができる。アブラナ（デ・ブロック（Ｄｅ  Ｂｌｏｃｋ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９１：６９４−７０１（１９８９））、ヒマワリ（エベレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：１２０１（１９８７））、ダイズ（マッケイブ（ＭｃＣａｂｅ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３（１９８８）；ヒンチー（Ｈｉｎｃｈｅｅ）ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：９１５（１９８８）；チー（Ｃｈｅｅ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：１２１２−１２１８（１９８９）；クリスト（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：７５００−７５０４（１９８９）；ＥＰ３０１７４９号明細書）、イネ（ハイエイ（Ｈｉｅｉ）ら、上掲）、ならびにトウモロコシ（ゴードン−カム（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，２：６０３−６１８（１９９０）；およびフロム（Ｆｒｏｍｍ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３−８３９（１９９０））などの商業的に重要な作物に外来遺伝子を形質転換するための最近記載された方法が特に妥当である。
【０１４５】
トランスジェニック細胞を選択するために、トランスジェニック植物細胞を適切な選択培地に配置し、次いで、該トランスジェニック細胞をカルスに成長させる。カルスからシュートを生育し、そして発根培地（ｒｏｏｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）で生育することによって、シュートから苗木を発生させる。多様な構築物が、通常、植物細胞の選択のためのマーカーに接続される。簡便に、マーカーは、生物致死剤（特に、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、クロラムフェニコール、除草剤など）に耐性であってもよい。使用される特定のマーカーは、導入されているＤＮＡを欠く細胞と比較して、形質転換された細胞を選択する。転写カセットを含むＤＮＡ構築物の成分は、宿主に対して生来（内因性）または外来（外因性）である配列から調製してもよい。異種構築物は、転写開始領域が誘導される遺伝子に対して生来ではない少なくとも１つの領域を含有する。トランスジェニック細胞および植物における導入遺伝子の存在を確認するために、当業者に既知の方法を使用して、サザンブロット分析を実施することができる。
【０１４６】
葉緑体へのＣＰＬ転移および以後のプロセシング
本発明は、葉緑体標的化配列を操作し、十分な酵素活性を伴う葉緑体へのＣＰＬ遺伝子産物の転移を引き起こして、適切な量のｐＨＢＡ基質を産出させる。出願人らは、輸送ペプチドだけではなく、天然に存在する葉緑体切断部位および輸送ペプチドドナーの成熟Ｎ末端の小さな部分をも含めることによって、葉緑体取り込みおよび外来タンパク質のプロ
セシングが改善され、より高い割合のコリスミ酸からｐＨＢＡへの変換が得られることを発見した。しかし、オルガネラへの取り込み後、輸送ペプチドは、葉緑体プロセシング酵素によってタンパク質分解により取り出され、そのＮ末端に付着された小さなポリペプチド伸長を有するＣＰＬ変異体が産出される。意外なことに、これらの付加アミノ酸残基はＣＰＬ酵素活性を妨害しない。本キメラタンパク質を発現する形質転換された植物は、先に報告されたものより有意に大きな量のｐＨＢＡ誘導体を蓄積する。ｐＨＢＡ産生に関して、このタイプの特異性についての要件は、当該分野において以前には理解されていない。
【０１４７】
生体植物の葉緑体においてＣＰＬを発現させる試みについて唯一の報告された例が、シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１２：８１１−８１９（１９９６））に記述されている。しかし、本キメラタンパク質（例えば、ＴＰ−ＣＰＬ；配列番号３４）は、米国特許出願第０９／８５５３４１号明細書に記載の多くの重要な局面においてシーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、（上掲、１９９６）において記述された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬの葉緑体標的化バージョン（例えば、ＴＰ−ＵｂｉＣ）とは異なる。例えば、本キメラは、輸送ペプチドの効率的な取り出しのための良好に規定された切断部位を有する葉緑体標的化配列を含む。さらに、この特異的部位での輸送ペプチドの取出しにより、成熟ＣＰＬポリペプチドのＮ末端領域において過剰な５アミノ酸の付加が生じる。対照的に、シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、（上掲１９９６）に記述されているＴＰ−ＵｂｉＣは、良好に規定された切断部位を欠き、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬの推定輸送ペプチド切断部位とイニシエーターメチオニン残基との間に挿入された９アミノ酸のストレッチを含有する。
【０１４８】
ＴＰ−ＣＰＬタンパク質は、トマトルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体の葉緑体輸送ペプチド＋大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬのイニシエーターＭｅｔ残基に融合した「成熟」ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の最初の４アミノ酸残基よりなる。従って、ＴＰ−ＣＰＬは輸送ペプチド全体だけではなく、高度に保存された切断部位を含有し、ここで、（例えば、矢印で示したようにＣｙｓおよびＭｅｔ残基の間で）輸送ペプチドの取出しが正常に生じる。ＴＰ−ＣＰＬもまた葉緑体においてこの位置で切断されると仮定すると、得られるタンパク質は、そのＮ末端にさらなる５アミノ酸を伴うＣＰＬ変異体である。ＴＰ−ＣＰＬの予測される葉緑体切断産物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、酵素活性についてそれが十分に機能的であることが示された（配列番号３４）。
【０１４９】
微生物におけるアルブチンのｐＨＢＡからの産生
ｐＨＢＡ微生物系において産生されている。例えば、特開平０６０７８７８０号公報は、安息香酸をｐＨＢＡに酸化する微生物（好ましくは、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））の存在下で安息香酸を培養することによるｐＨＢＡ産生を教示する。さらに、ｐ−クレゾールをｐＨＢＡに変換するエンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の株が土壌から単離されている（特開平０５３２８９８１号公報）。さらに、特開平０５３３６９８０号公報および特開平０５３３６９７９号公報は、ｐ−クレゾールからｐＨＢＡを産生するシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）の単離された株を開示している。同様に、保有者共通の国際公開第９８５６９２０号パンフレットは、パラ−ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ｐＨＢＨ）を発現する能力を欠くシュードモナス・メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）変異体を使用するｐＨＢＡのトルエンからの産生のための方法を教示している。最後に、米国特許第６０３０８１９号明細書は、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＣＰＬ）遺伝子を発現する遺伝子操作された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐＨＢＡの産生について教示している。
【０１５０】
ハイドロキノンからアルブチンを産生させるために使用される生体内変化方法について
は、先に記載されている（アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３：１８７−１９３（２０００）；アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７６（２）：１２６−１３１（２００１）；ヘフナー（Ｈｅｆｎｅｒ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０：１７３１−１７４１（２００２）；および特開平０７２２４０８３Ａ号公報）。これらの方法は、一般に、適切なグルコシルトランスフェラーゼを発現する植物細胞培養物、種子、または種苗にハイドロキノンを外因的に供給することに関与する。アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら（Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７６（２）：１２６−１３１（２００１））による類似の方法は、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼを発現する組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用して、ハイドロキノン（高価および毒性の化合物）ならびにＵＤＰ−グルコースをアルブチンに変換する。これらの生体内変化方法は、外因的に供給されるハイドロキノンの使用に依存する。対照的に、本発明は、グルコースなどの安価、非毒性、発酵可能な炭素源からアルブチンの産生方法を提供する。
【０１５１】
出願人らが説明するｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子の分子同定および単離はまた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物系におけるアルブチン産生を可能にする（実施例７および８に詳細を記載）。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子は、コリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子および適切なグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子との組み合わせで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞において発現される（実施例６および８）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるこれらの３種の酵素を発現させることで、コリスミ酸からアルブチンへの３段階の経路を作製することによって、安価な発酵可能な炭素源（グルコースなど）からアルブチンへの経路が提供される（図１）。当業者であれば、ＦＡＤ、ＮＡＤＨ、Ｏ２、およびＵＤＰ−グルコース（ＵＤＰＧ）などのこの経路に必要なすべての補因子、補酵素および補基質が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞質に存在することを認識するであろう。さらに、炭素のシキミ酸経路への流動の増加から生じる高いレベルのコリスミ酸を伴う大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が開示されおり（ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４（７）：２５０−２５６（１９９６）；ボンガエルツ（Ｂｏｎｇａｅｒｔｓ）ら、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（４）：２８９−３００（２００１）；タタールコ（Ｔａｔａｒｋｏ）およびロミオ（Ｒｏｍｅｏ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４３（１）：２６−３２（２００１）；米国特許第６２１０９３７号明細書；米国特許第５７７６７３６号明細書；および国際公開第７３４８４Ａ１号パンフレット）、以下に記載の分子ツールを使用して、グルコースからアルブチンを産生させるのに使用することができる。
【０１５２】
ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ
アルブチンはハイドロキノンよりも価値の高い産物である。従って、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼと適切なグルコシルトランスフェラーゼとを組み合わせることにより、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの同時発現を介して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物においてハイドロキノンを産生させる代わりにアルブチンを産生させることが好ましい。ハイドロキノン配糖体を産生させることにより、細胞から増殖培地への分子の放出が生じ、ここで、それを容易に回収し、精製することができる（アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．，７６（２）：１２６−１３１（２００１））。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアルブチンを産生させるには、ハイドロキノンを効率的にグルコシル化する酵素をコードするグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子が必要である。この特性を伴う酵素は開示されている（アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３：１８７−１９３（２０００）および国際公開第０１０７６３１Ａ２号パンフレット）。
【０１５３】
出願人らは、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）のアルブチンシンターゼのアミノ酸配列レベルで６２％同一性を共有するシロイヌナズナ（Ａｒａ
ｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）由来の酵素を特徴付けした（Ｇｉ：２８３８００７８；６２％同一性；７８％類似性；Ｅ値＝ｅ−１７４）。出願人らは、ハイドロキノンによるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）酵素の極めて高い触媒効率（Ｋｍ０．３μＭ、Ｋｃａｔ４２／秒）の予想外の観察について開示している（実施例６）。本発明の好適な実施態様は、ＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼの発現を可能にする合成オペロンを担持するプラスミド（図６）で形質転換された微生物細胞である。典型的に、発現カセットは、適切なプロモーターの制御下で順番に３つのコード配列およびリボゾーム結合部位を含んでなる。さらに、プロモーター調節領域を使用して、誘導性、構成性、または環境により調節される発現を付与してもよい。それは転写開始部位、リボゾーム結合部位、および転写終結部位を含有する。別の好適な実施態様では、３つの遺伝子が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において同時に存在することができる複製開始点を所有する個別のプラスミド上に導入される。各プラスミド上の発現カセットは、ＣＰＬまたはｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子またはアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子および誘導性、構成性、もしくは環境により調節される発現を付与する適切なプロモーター調節領域からなる。さらに、各プラスミドは転写開始部位、リボゾーム結合部位、および転写終結部位を含有する。
【０１５４】
インビトロ方法を使用して、全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つもしくはそれ以上の成分、部分精製された酵素、または精製された酵素の形態で、１）ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性および２）ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素触媒を使用し、ｐＨＢＡを酸化的に脱炭酸化して、ハイドロキノンを形成させ、その後ハイドロキノン配糖体（アルブチン）に変換する。好ましくは、酵素触媒の形態は全微生物細胞または部分精製されたもしくは精製された酵素である。異なる形態の酵素触媒を、可溶性または不溶性支持体上もしくは中に固定化することができる。
【０１５５】
微生物発現
本発明の遺伝子および遺伝子産物は、微生物宿主細胞に導入してもよい。本遺伝子および核酸分子の発現のための好適な宿主細胞は、菌類または細菌ファミリー内において広範に見出すことができ、広範な範囲の温度、ｐＨ値、および溶媒耐性で増殖する微生物宿主である。細胞バイオマスを作製するのに使用される炭素供給材料にかかわらず、機能的遺伝子が発現される。大規模微生物増殖および機能的遺伝子発現は、広範な単純あるいは複雑な炭水化物、有機酸およびアルコール、メタンなどの飽和炭化水素あるいは光合成もしくは化学合成独立栄養宿主の場合の二酸化炭素を利用することができる。しかし、機能的遺伝子は、窒素、リン、イオウ、酸素、炭素もしくは（小さな無機イオンを含む）任意の微量栄養物の形態および量含む特定の増殖条件によって、調節することができる。さらに、機能的遺伝子の調節は、培養物に添加され、典型的に栄養もしくはエネルギー源とはみなされない特定の調節分子の存在または非存在によって達成することができる。増殖速度もまた、遺伝子の発現において重要な調節因子であり得る。適切な宿主株の例としては、菌・カビ性またはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの酵母種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）、およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）などの細菌種が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５６】
細菌の発現系および外来タンパク質の高レベルの発現を指令する調節配列を含有する発現ベクターは、当業者に周知である。これらのいずれも、本配列の任意の遺伝子産物の賛成のためのキメラ遺伝子を構築するために使用し得る。次いで、これらのキメラ遺伝子は、酵素の高レベル発現を提供するために、形質転換を介して、適切な微生物に導入し得る。
【０１５７】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該分野において周知である。典型的に、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指令する配列、選択マーカー、および自律複製もしくは染色体組込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始の制御を所有する遺伝子の５’側領域および転写の終結を制御するＤＮＡ断片の３’側領域を含んでなる。両方の制御領域とも形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来する場合が最も好ましいが、そのような制御領域は、産生宿主として選択される特定種に生来である遺伝子に由来する必要はないことが理解される。
【０１５８】
所望の宿主細胞において、本ＯＲＦの発現を駆動するのに有用である、開始制御領域またはプロモーターは多数あり、かつ当業者に馴染みである。事実上、これらの遺伝子を駆動することができるいかなるプロモーターも本発明に適し、これらは、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）での発現に有用）；ＡＯＸ１（ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）での発現に有用）；ならびにｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）での発現に有用）ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）での発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび多様なファージプロモーターを含むが、これらに制限されない。
【０１５９】
終了制御領域もまた、好適な宿主に生来の多様な遺伝子由来であり得る。終結部位は必要ではない；しかし、含まれている場合が最も好ましい。
【０１６０】
一旦、本発明の１つもしくはそれ以上の遺伝子を含んでなる適切な発現カセットが構築されると、それを使用して、適切な宿主に形質転換することができる。次いで、宿主を使用して、ハイドロキノンまたはハイドロキノン配糖体の形成を好適に触媒することができる。
【０１６１】
培養系
古典的なバッチ培養方法は閉鎖系であり、ここで、培地の組成は培養の開始時に設定され、培養プロセス中に人工的に変更されることはない。従って、培養プロセスの開始時に、培地に所望の生物体または複数の生物体を接種し、増殖または代謝活動を可能にして、系には何も添加しない。しかし、典型的に、「バッチ」培養は、炭素源の添加についてのバッチ処理であり、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子を制御することが試みられる。バッチ系では、系の代謝物およびバイオマス組成は、培養が終了する時点まで一定に変化する。バッチ培養物内で、細胞は静的対数期を穏やかに通過して高対数増殖期に達し、最終的に、増殖速度が減少または停止する定常期に達する定常状態に達する。処理を行わなければ、定常期の細胞は最終的に死滅する。対数期の細胞は、しばしば、最終産物産生の大部分を担うかまたはいくつかの系において中間的である。定常または指数期後産生は他の系で得ることができる。
【０１６２】
標準的なバッチ系の１つのバリエーションは流加培養系である。流加培養プロセスも本発明に適切であり、培養の進行に伴って基質を徐々に増量しながら添加することを除いて、典型的なバッチ系を含んでなる。異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害し易い場合、および培地中の基質量を制限することを所望する場合、流加培養系が有用である。流加培養系における実際の基質濃度の測定は困難であるため、ｐＨ、溶存酸素および二酸化炭素などの排気体分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて見積もられる。バッチおよび流加培養方法は当該分野において一般的かつ周知であり、その例はトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版（１９８９）シナウエル・アソシエート社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（以後「ブロック（Ｂｒｏｃｋ）」）またはデスパンデ・ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２２７（１９９２）（本明細書において参考として援用される）に見出すことができる。
【０１６３】
商業的産生は連続培養によっても達成することができる。連続培養は開放系であり、ここで、規定された培養培地を連続的にバイオリアクターに添加し、同時に等量の順化培地を処理のために取り出す。一般に、連続培養は細胞を一定の高液体相密度で維持し、ここで、細胞は主に対数増殖期にある。あるいは、連続培養を固定化された細胞によって実施してもよく、ここで、炭素および栄養物が連続的に添加され、価値のある産物、副産物または不要産物が細胞塊から連続的に取り出される。細胞の固定化は、天然および／または合成材料からなる広範な固相支持体を使用して実施することができる。
【０１６４】
連続または半連続培養によって、細胞増殖または最終産物の濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいくつかの因子を変調することが可能である。例えば、１つの方法は、炭素源などの制限されている栄養物または窒素レベルを一定速度で維持し、他のすべてのパラメータを中位にすることが可能である。他の系では、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響を及ぼす多くの因子を連続的に変更することができる。連続系は定常状態の増殖条件を維持しようとし、従って、培地を取り出すことによって失われる細胞は培養物中の細胞増殖速度に対して均衡を保たなければならない。連続培養プロセスの栄養および増殖因子を変調するための方法ならびに生成物の形成速度を最大にするための技術は、産業微生物学の分野において周知であり、様々な方法がブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上掲によって詳述されている。
【０１６５】
酵素動力学
触媒効率は、通常、Ｋｃａｔ／Ｋｍとして表現される。酵素触媒反応の重要なパラメータは以下のものを含む。
１）代謝回転数（Ｋｃａｔ）、１μｍｏｌの酵素あたり１秒間あたりに形成される産物のμｍｏｌとして表される単量体酵素触媒の触媒能力の単位、および
２）Ｋｍ、最大速度の５０％が達成される基質濃度として表される、特定の基質に対する酵素の親和性の単位。
【０１６６】
本発明の好適な実施態様は、ｐＨＢＡに対して＜１μＭのＫｍおよび少なくとも約９．５／秒のＫｃａｔを有するカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）由来のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素ならびにハイドロキノンに対して＜１μＭのＫｍおよび少なくとも４２／秒のＫｃａｔを有するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）（ＵＧＴ７２Ｂ１）由来のグルコシルトランスフェラーゼ酵素である。
【実施例】
【０１６７】
本発明を以下の実施例でさらに規定する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示している一方で、具体的説明のみとして示されることを理解すべきである。
【０１６８】
一般的方法
実施例において使用した標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（上掲）により記載されている。
【０１６９】
細菌培養の維持および増殖に適切な材料および方法は当該分野において周知である。以下の実施例での使用に適切な技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（フィリップ・ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ
Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーク（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）（１９９４））またはブロック（Ｂｒｏｃｋ）（上掲）に記載の通りに見出すことができる。細菌細胞の増殖および維持のために使用したすべての試薬、制限酵素ならびに材料は、他に特定しない限りアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウィスコンシン州、ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ミシガン州、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、ギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）（メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））より入手した。
【０１７０】
遺伝子配列の操作は、ジェネティクス・コンピュータ・グループ・インク（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）から入手可能なプログラム一式（ウィスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、ジェネティクス  コンピュータ  グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州マディソン）を使用して成し遂げられた。ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」は、１２のギャップ作成デフォルト値、および４のギャップ伸長デフォルト値を使用した。ＧＣＧ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムは、５０のデフォルトギャップ作成ペナルティおよび３のデフォルトギャップ伸長ペナルティを使用した。ＧＣＧプログラムのパラメータが即時的でない場合、これらまたは他の任意のＧＣＧプログラムにおいて、デフォルト値を使用した。
【０１７１】
略語の意味は次のようである。「ｈ」は時間を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｄ」は日を意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「μＭ」はマイクロモルを意味する。
【０１７２】
実施例１
カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）ＡＴＣＣ７３３６の増殖およびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性の分析
凍結乾燥したＡＴＣＣ培養物ストックから、酵母培養物をＹＭ培地プレート（１リット
ルあたりの処方；３ｇ酵母抽出物、３ｇ麦芽抽出物、５ｇペプトン、１０ｇグルコース、および１５ｇ寒天）上で確立した。酵母細胞を３０℃、無菌条件下、２倍濃度のリーダーの培地（Ｒｅａｄｅｒ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（１リットルあたりの処方；３ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１．４ｇＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇＮａＣｌ、０．４ｇＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２ｇＫＨ２ＰＯ４、０．２ｇＫ２ＨＰＯ４、０．４ｍｇＨ３ＢＯ３、０．４ｍｇＭｎＣｌ２、０．４ｍｇＮａ２ＭｏＯ４、０．４ｍｇＺｎＳＯ４、０．２ｍｇＫＩ、０．２ｍｇＣｏＣｌ２、０．０８ｍｇＣｕＳＯ４、０．１ｍｇＦｅＣｌ３、０．４ｍｇパントテン酸、０．４ｍｇニコチン酸、０．４ｍｇピリドキシン、０．４ｍｇパラ−アミノ安息香酸、０．８ｍｇイノシトール、および０．００２５ｍｇビオチン）を含有する液体培地または寒天プレートにおいて増殖させた。炭素源は１００ｍＭグルコースまたは１ｍＭ、１０ｍＭ、もしくは１００ｍＭｐＨＢＡであった。出願人は、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ７３３６）が唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で増殖可能であることを決定した。固化培地上での最も良好な増殖は１０ｍＭ  ｐＨＢＡで観察された。１００ｍＭグルコースまたは下記の濃度でｐＨＢＡを含有する濃縮リーダー培地（Ｒｅａｄｅｒ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）の培養物（５００ｍＬ）に、１０ｍＭ  ｐＨＢＡプレートから得られた酵母細胞の単一のコロニーを接種した。
【０１７３】
唯一の炭素源としてｐＨＢＡを含有する培養物の増殖を、以下の通りに行った。１ｍＭ
ｐＨＢＡを含有する濃縮リーダー培地（Ｒｅａｄｅｒ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（２５０ｍＬ）に接種し、２４時間、３０℃で増殖させた。次いで、培養物を、５０ｍＭ  ｐＨＢＡを含有する濃縮リーダー培地（Ｒｅａｄｅｒ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）で５ｍＭ  ｐＨＢＡの最終ｐＨＢＡ濃度に調整した。さらに２４時間後、ｐＨＢＡ濃度を１０ｍＭの最終濃度に調整した。細胞をさらに２４時間増殖させ、続いて、１０ｍＭの最終濃度に対応するｐＨＢＡをさらに添加した。さらに２４時間後、細胞を遠心分離（５０００×ｇ、１０分間）によって回収した。唯一の炭素源としてグルコースまたはｐＨＢＡの存在下で増殖させた細胞を１０ｍＬの２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ
ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１０μＭ  ＦＡＤ中に再懸濁した。フレンチプレスに２回通過させ、続いて３００００×ｇ、２０分間、４℃での遠心分離によって、無細胞抽出物を調製した。ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））を使用して、タンパク質濃度を決定した。
【０１７４】
ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を以下の通り測定した。２００μｇの全タンパク質に対応する無細胞抽出物を３７℃、１００μｌの最終容積中、５０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ｐＨＢＡ、および２ｍＭ  ＮＡＤＨの存在下でインキュベートした。１２％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する等容積のメタノール（ＭｅＯＨ）を添加することによって、反応を停止した。遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間）によって反応生成物を澄明にし、以下のようなＨＰＬＣによって分析した。反応生成物（１０μｌ）をノバ・パック（Ｎｏｖａ  Ｐａｋ）Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ、６０Å、４μｍ）（米国マサチューセッツ州ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ））上に注入した。カラムを、１ｍＬ／分の流速、以下の次の条件下で展開した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ，／１．５％ＨＰＯ４）、溶媒Ｂ（４８％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／１．５％ＨＰＯ４）；０〜５分０％Ｂ、５〜２０分０〜１００％Ｂ（直線勾配）、２０〜２１分１００〜０％Ｂ、２１〜２５分０％Ｂ。ｐＨＢＡの吸収を２５４ｎｍで、ハイドロキノンについては２８８ｎｍで検出した。真正のｐＨＢＡおよびハイドロキノン標準物質と識別不能である保持時間およびＵＶ吸収スペクトルに基づき、酵素反応生成物においてｐＨＢＡおよびハイドロキノン真正品に対応する化合物を同定した。ＨＰＬＣ分析は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で増殖させた細胞のタンパク質抽出物がＮＡＤＨの存在下でｐＨＢＡをハイドロキノンに変換することが可能である酵素活性を含有することを示した。酵素アッセイ中のハイドロキノン濃度は２０分後に２６０μＭであったことから、最初のｐＨＢＡの２６％がハイドロキノンに変換されたことが示された。グルコースの存在下で増殖させた細胞のタンパク質抽出物を同一の条件下で使用した場合、ハイドロキノンの形成は検出されなかった。
【０１７５】
ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性の測定
特定のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を以下の通り測定した。１００μｇのカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）タンパク質（ＡＴＣＣ７３３６）を、０．１ｍＭ  ｐＨＢＡ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０μＭ  ＦＡＤ、および５０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．６）を含有する５００μｌの反応媒体に添加した。３４０ｎｍの吸収をモニターすることによって、ＮＡＤＨ酸化の割合を測定した。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性に関連しないカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）タンパク質抽出物におけるＮＡＤＨオキシダーゼ活性を、ｐＨＢＡの非存在下で同一条件下で測定した。ＮＡＤＨの吸収係数として６２５０Ｍ−１を使用して、特定のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を算出し、唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に対し０．１４Ｕ／ｍｇタンパク質であることを見出した。出願人らは、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ７３３６）では、唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で細胞を増殖させる場合、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ発現が高度に誘導されることを示した。
【０１７６】
実施例２
ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の精製、精製されたタンパク質の部分アミノ酸配列の決定、ならびにｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定
それぞれ１ｍＭのｐＨＢＡを含有する１Ｌの２倍濃縮リーダー培地（Ｒｅａｄｅｒ’ｓ
ｍｅｄｉｕｍ）（カラセビチ（Ｋａｒａｓｅｖｉｃｈ）およびイロイロブ（Ｉｖｏｉｌｏｖ）、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ，４６（５）：８４６−５６（１９７７））を含有する２つの５Ｌフラスコに唯一の炭素源として１０ｍＭ  ｐＨＢＡを伴うプレート上で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ７３３６）のコロニーを接種した。各培養物は、２４時間間隔で、５０ｍＭのｐＨＢＡを含有する１００、３００、および６００ｍＬの２倍濃縮リーダー培地（Ｒｅａｄｅｒ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）の連続添加を受けた。最後のｐＨＢＡの添加の２４時間後、細胞を回収した。このようにして、９６時間の間にｐＨＢＡ濃度が１ｍＭから２６ｍＭの最終濃度にまで緩徐に増加する条件下で４Ｌの酵母培養物を増殖させた。
【０１７７】
遠心分離（５０００×ｇ、１０分間）により細胞を回収し、３５ｍＬの２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１０μＭ  ＦＡＤに再懸濁した。細胞懸濁液をフレンチプレスに２回通過させ、遠心分離（３００００×ｇ、２０分間、４℃）により澄明にした。グリセロールを７％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加した。この抽出物を、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素活性の消失を伴わずに−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度は１６．２５ｍｇ／ｍＬであり、比活性は０．１２９Ｕ／ｍｇタンパク質であった。培養物は、８４ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を含有する合計で６５０ｍｇのタンパク質を提示する４０ｍＬのタンパク質抽出物を提供した。
【０１７８】
粗抽出物の２０ミリリットルをＰＤ−１０カラム（ファルマシア・バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））上２．５ｍＬアリコートにおいて１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０μＭ  ＦＡＤにバッファー交換し；この工程後の最終容積は２８ｍＬであり、本来の酵素活性の８５％を回収した。この材料の１４ミリリットルを、２５℃、緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）Ｑ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０μＭ  ＦＡＤ）で予め平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ１０／１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））に適用した。カラムを、４ｍＬ／分、緩衝液Ｑで最初に１２分間展開させた。これに続けて、（緩衝液Ｑ中）０〜１００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４の直線勾配（８０ｍＬ）を適用した。画分（８ｍＬ）を勾配開始時から回収し、以後の酵素活性の決定のために氷上で保持した。次いで、カラムを（緩衝液Ｑ中）１Ｍ  Ｎａ２ＳＯ４で広範囲に洗浄し、初期条件を再確立させた。
【０１７９】
ＰＤ−１０溶出液の残りの１４ｍＬを同様の様式で処理し、分光光度アッセイを使用して、両ＭｏｎｏＱカラム由来の画分をｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性についてアッセイした。最も活性の高い画分をプールし（第１のカラム由来のフラクション番号３ならびに第２のカラム由来のフラクション番号３および４）、５０ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４および７％（ｖ／ｖ）グリセロールで補充し；２６ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を回収した。プールした画分を、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）−１０（ミリポア・コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））を使用して２．３ｍＬに濃縮し、０．２μｍアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）フィルター（ゲルマン−パル・ライフ・サイエンス（Ｇｅｌｍａｎ−Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）：カタログ番号４１９２）に通過させた。次いで、この材料の２ミリリットルを、２１×６００ｍＭ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷゲルろ過カラム（トーソー・バイオセプ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ）ＬＬＣ．、ペンシルバニア州モンゴメリービル（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ））上で分画した。カラムを４ｍＬ／分、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．７）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および１５μＭ  ＦＡＤ（２５℃）で展開し、２ｍＬ画分を回収した。後者を、分光光度アッセイを使用して、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性について分析し、４つの最も活性の高い画分をプールした。カラムからの酵素活性の回収率は５５％（１２．５Ｕ）であった。
【０１８０】
プールした画分を５ｍＬに濃縮し、２つのＰＤ−１０カラム（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））を使用して、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１０μＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、および２０μＭ  ＦＡＤ（緩衝液Ｗ）にバッファー交換した。次いで、７ｍＬサンプル全体を、２５℃、緩衝液Ｗで予め平衡化した７．８×１００ｍＭ
Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＰＨＴハイドロキシアパタイトカラム（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））に適用した。カラムを、０．５ｍＬ／分、緩衝液Ｗで１４分間展開し、これに続いて、緩衝液Ｗ中１０〜３５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）の直線勾配（３０ｍＬ）に適用し；１ｍＬ画分を回収した。分光光度アッセイに基づき、４０〜５０分間の間でｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを溶出させ、ほとんどの活性を伴う２つの画分をプールした。プールした材料は４．９Ｕの酵素活性を含有した。次いで、サンプルを５０ｍＭ  ＮａＳＯ４および７％（ｖ／ｖ）グリセロールで補充し、さらなる操作のために−８０℃で貯蔵した。
【０１８１】
クマシー染色ゲル上でのハイドロキシアパタイトプールの目視検査により、４９および５２ｋＤａの見かけの分子量を有する２本のバンドの存在が認められた。これらのポリペプチドのうちどれがｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼであるかを決定するために、ハイドロキシアパタイトプールの１ｍＬアリコートを、ＰＤ−１０カラムを使用して、緩衝液Ｚ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）にバッファー交換した。最終容積は３．５ｍＬであり、サンプルは分光光度アッセイに基づいて１．２８Ｕの酵素活性を含有した。次いで、サンプル全体を、２５℃、緩衝液Ｚで予め平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ５／５カラム（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））に適用した。カラムを、１ｍＬ／分、緩衝液Ｚで最初の５分間、展開し、続いて、（緩衝液Ｚ中）０〜１００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４の直線勾配（２０ｍＬ）に適用した。
【０１８２】
２つの主な２８０ｎｍ吸収極大がカラムから出現し、両方を回収した。８．１〜８．９分間の間に溶出した大きい方のピークは、クマシー染色ゲルから判定されるように、５２ｋＤａのポリペプチドのみを含有した。このピークはまた、ＭｏｎｏＱカラムに適用された全活性の約９０％である１．１４ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を含有した。８．９〜１０．２分間の間に溶出した小さい方のピークは、４８ｋＤａポリペプチドおよび多種の少量の混入物を含有した。しかし、重要なことに、このピークは、カラムに適用された本来の酵素活性の２％未満の０．０２ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性しか含有しなかった。これらの観察に基づいて、ＭｏｎｏＱカラムの最初のピークの５２ｋＤａポリペプチドは、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ７３３６）のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼであると結論された。カラム画分を１００ｍＭ  Ｎａ２ＳＯ４および７％（ｖ／ｖ）グリセロールで補充し、−８０℃で貯蔵した。最終容積は１．０ｍＬであり、サンプルは約５０μｇの精製された酵素を含有した。下記のように、この材料のアリコートを、トリプシン消化に使用し、アミノ酸配列分析のためのペプチド断片を作製した。粗抽出物の出発物質（０．１２９Ｕ／ｍｇのタンパク質）および精製されたタンパク質の最終調製物（２２．８Ｕ／ｍｇ）の比活性に基づくと、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼは、上記の手順を使用して約１８０倍精製された。
【０１８３】
アミノ酸配列決定
無傷な（ｉｎｔａｃｔ）ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定するために、部分精製されたタンパク質を含有する８００μｌのハイドロキシアパタイトプールを乾燥状態にし、ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁した。サンプルを、プレキャストノベックス（Ｎｏｖｅｘ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）に適用し、製造者の指示に従って電気泳動に供した。分離したタンパク質をポリビニリデンジフルオリド膜（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）、米国カリフォルニア州（ＣＡ，ＵＳＡ））上にエレクトロブロットし、その後、脱イオン水で洗浄し、０．１％クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｌｕｅ）Ｇ２５０（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国）で染色した。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼに対応する染色された５２ｋＤａバンドを、ベックマン−コールタール（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＬＦ３０００気相タンパク質シークエンサーを使用して、自動化されたエドマン分解に供した。エドマン分解の最初の２４サイクルから以下のアミノ酸配列を得た。
配列番号１：Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ
【０１８４】
精製されたタンパク質のタンパク質分解消化、続くＨＰＬＣ分離および得られるペプチド断片のエドマン分解から、さらなるアミノ酸配列情報を得た。精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０（ミリポア・コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）、マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））において、ミリリットルあたり約０．３３ｍｇのタンパク質に濃縮した。トリプシンストック溶液を実験の直前に調製し、使用するまで氷上で保持した。後者は、２６６μｌの氷酢酸に溶解した２０μｇのＴＰＣＫ処置配列決定用トリプシン（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））よりなった。トリプシン消化反応は、１．５ｍＬポリプロピレン製マイクロ遠心チューブにおいて集成された。完全な反応系は次の成分を含有した。（ａ）２０μｌの精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ（６．６μｇのタンパク質）、（ｂ）２０μｌのトリプシン反応緩衝液（１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２Ｈ２Ｏ）、および（ｃ）４μｌのトリプシンストック溶液。次いで、集成された反応混合物を水浴中の３７℃に移した。９０分間のインキュベーション期間後、４．８μｌの新たに調製したイソプロパノールに溶解された１０ｍＭ  ＰＭＳＦフェニルメタンスルホニルフルオリド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で、反応を停止した。終結反応物を、下記のような以後のＨＰＬＣ分析のために−２０℃で貯蔵した。
【０１８５】
消化されたタンパク質サンプルを５０μｌの水中０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡで補充し、８０μｌを、次の条件を使用して、ディメンション２．１×１５０ｍＭ（１００Å、５μｍ）、０．４ｍＬ／分の流速で、ＲＰ８シンメトリー・シールド（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ）ＴＭカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、米国マサチューセッツ州（ＭＡ，ＵＳＡ））上で分離した。溶媒Ａ：Ｈ２Ｏ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ；０〜２分間２％Ｂ、２〜５分間２〜１０％Ｂ、５〜５５分間１０〜３５％Ｂ、５５〜８５分間３５〜８５％Ｂ、８５〜８６分間８５〜１００％Ｂ、８６〜９０分間１００％Ｂ、９０〜９１分間１００〜２％Ｂ、１００分２％Ｂ。ペプチドの溶出を２１０ｎｍでモニターし、手動で画分を回収した。注意深く制御された実験により、Ｎ末端配列分析のために回収されたポリペプチドのピークがｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼのトリプシン消化から生じたことが確立された。言い換えると、これらのピークは、トリプシンまたはｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼのいずれかが消化反応混合物から脱落した場合には観察されなかった。タンパク質分解断片を含有する３つの画分をシークエロン（Ｓｅｑｕｅｌｏｎ）ＡＡ膜（アリール−アミノ誘導体ＰＶＤＦ、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国（ＵＳＡ））上で乾燥させ、ベックマン−コールタール（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＬＦ３０００気相タンパク質シークエンサーを使用する自動化エドマン分解に供した。ペプチド４は配列Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ（配列番号２）を産出した。ペプチド５は配列Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ）（配列番号３）を産出した。ペプチド６は配列Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（配列番号４）を産出した。
【０１８６】
６リットルのカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）培養物（ＡＴＣＣ７３３６）を、上記のように、唯一の炭素源として２５ｍＭ  ｐＨＢＡの存在下で９６時間増殖させた。培養物（２００ｍＬ）を回収し、無細胞抽出物において特定のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を決定することによりｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性の導入を確認した。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性は０．１３Ｕ／ｍｇと決定された。残りの培養物を遠心分離によって回収し、脱イオン水で洗浄した。
【０１８７】
全ＲＮＡを、熱酸性フェノールでの抽出によって単離した。簡単に説明すると、細胞ペレットを、５ｍＬの１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳに再懸濁し、等容積の液化水飽和フェノールを添加した。酵母／フェノール懸濁液を激しく撹拌し、時々かき混ぜながら４５分間、６５℃でインキュベートした。細胞溶解物を遠心分離（１００００×ｇ、２０分間）し、水相をフェノールおよびクロロホルムによる連続抽出に供した。水相を酢酸ナトリウム（ｐＨ５．３）で補充し、０．３Ｍの最終濃度に到達させた。２容積（１０ｍＬ）のエタノールを添加することによって核酸を沈殿させ、続いて、遠心分離に供した。ＲＮＡを７０％エタノールで洗浄し、水に再懸濁し、変性アガロースゲルにおける電気泳動によって可視化し、分光光度により定量した。６Ｌの酵母培養物から約４ｍｇの全ＲＮＡを単離することができた。１００ｍＭグルコースの存在下で増殖させた１Ｌのカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）培養物からも、同様の様式で全ＲＮＡを単離した。
【０１８８】
製造者の指示に従い、ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）（アムヘルスト（Ａｍｈｅｒｓｔ）、ニューヨーク（ＮＹ））由来の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用して、唯一の炭素源としてグルコースまたはｐＨＢＡのいずれかの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）培養物から単離された５μｇの全ＲＮＡを使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の部分アミノ酸配列によって提供される配列情報に従って、２つの縮重オリゴヌクレオチド（プライマー１およびプライマー２）を合成した。
【０１８９】
プライマー１−（配列番号５）
５’−ＡＴＧＧＣＮＧＴＮＣＡＲＧＣＮＣＣＮＷＳＮＡＡＲＡＣＮＴＡＹＧＧ−３’
【０１９０】
プライマー２−（配列番号６）
５’−ＣＣＲＴＣＲＴＡＮＣＣＮＡＣＤＡＴＮＡＣＲＴＣＮＣＣＮＡＣＲＴＡ−３’
ＲはＡ／Ｇを示し、ＷはＡ／Ｔを示し、ＳはＣ／Ｇを示し、ＤはＡ／Ｇ／Ｔを示し、Ｎは、イノシンヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドに組み入れられた場所を示す（ＭＷＧバイオテック（Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ノースカロライナ州ハイ・ポイント（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ））。プライマー１はイニシエーターメチオニン（通常翻訳後に取り出されるため、エドマン分解では検出することができない）を含む精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質のＮ末端の最初の１１アミノ酸の配列から逆転写された。この配列（Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ）は配列番号７に記載されている。プライマー２は、ペプチド５の１１アミノ酸の配列から逆転写されるＤＮＡ配列の逆相補鎖である。１１アミノ酸（Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ）の配列は配列番号８に記載されている。
【０１９１】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー１およびプライマー２、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ならびに２μＬのｃＤＮＡテンプレートを含有するＰＣＲ反応混合物（４００μＬ）を作製した。ＰＣＲ混合物を８つの５０μｌアリコートに分割し、アニーリング温度が４０℃〜５４℃の範囲（２℃刻みで）である個々のＰＣＲ反応を実施した。４０サイクルの増幅を行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、それぞれのアニーリング温度で４５秒間、および７２℃で１分間を含んでなった。すべてのアニーリング温度で５００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させることができた。この断片は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡテンプレートに特異的であった。ＰＣＲ断片をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキット（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））を使用して、ｐＣＲ２．１ベクター（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））にクローニングした。１０個の独立して誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供した。レーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）ソフトウェア・パッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のＳｅｑＭａｎプログラムを使用して、ＤＮＡ配列を整列させ、配列番号９に記載の５１８ヌクレオチドのコンセンサスＤＮＡ配列を作製した。このＤＮＡ配列は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を伴うタンパク質断片に翻訳され得る。推定アミノ酸配列は、精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質のエドマン分解によって決定されたＮ末端の１４アミノ酸を含んでなる。このアミノ酸配列はオリゴヌクレオチド設計には使用されなかったため、出願人らは、ＰＣＲ断片は精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の最初の１７３アミノ酸残基をコードすると結論した。興味深いことに、タンパク質断片は、フラビン結合モチーフ（Ｇｌｙ−ｘ−Ｇｌｙ−ｘ−ｘ−Ｇｌｙ）（原核生物および真核生物のフラビン依存性モノオキシゲナーゼの統一する特徴）に一致するＧｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１０、２５〜３０位）配列を含有した。
【０１９２】
ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの残りの部分は、以下の通りに３’ＲＡＣＥ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により単離された。製造者の指示に従い、ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）由来の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットおよびプライマー３を使用して、唯一の炭素源としてグルコースまたはｐＨＢＡのいずれかの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）培養物から単離された５μｇの全ＲＮＡを使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。
【０１９３】
プライマー３−（配列番号１１）
５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’
【０１９４】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー４およびプライマー５、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、ならびに２μｌのｃＤＮＡテンプレートを含有するＰＣＲ反応混合物（４００μＬ）を作製した。ＰＣＲ混合物を４つの１００μｌアリコートに分け、アニーリング温度が５４℃〜６０℃の範囲（２℃刻みで）である個々のＰＣＲ反応を実施した。４０サイクルの増幅を行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、それぞれのアニーリング温度で４５秒間、および７２℃で１分間を含んでなった。
【０１９５】
プライマー４−（配列番号１２）
５’−ＧＧＴＴＧＡＴＡＧＡＧＣＣＧＡＡＧＡＡＴＴＧＧＧＧＧＴＴＧＡＡＡＴＣＣ−３’
【０１９６】
プライマー５−（配列番号１３）
５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣ−３’
【０１９７】
ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡの先に単離されたＰＣＲ断片のヌクレオチド３８４〜４１８に対応するプライマー４およびプライマー５は、プライマー３で作製される各ｃＤＮＡの３’末端でアニールする。すべてのアニーリング温度で１１００ｂｐのＤＮＡ断片を増幅させることができた。この断片は、唯一の炭素源としてｐＨＢＡ上で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）細胞に由来するｃＤＮＡテンプレートに特異的であった。ＤＮＡ断片をゲル精製した。２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー４およびプライマー５、ならびに２０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１ｍＬ）を作製し、１００μＬのアリコートに分けた。アリコートはゲル精製されたＰＣＲ産物の１：１００希釈物の１〜１０μＬを収容した。４０サイクルの増幅を行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、６０℃で４５秒間、および７２℃で１分間を含んでなった。再増幅させたＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。
【０１９８】
４個の独立して誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンからプラスミドＤＮＡを単
離し、ＤＮＡ配列決定に供した。レーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）ソフトウェア・パッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）のＳｅｑＭａｎプログラムを使用して、新規のＤＮＡ配列およびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼｃＤＮＡ（配列番号９）の先にクローニングされた断片を整列させ、配列番号１４に記載の１５２６ヌクレオチドのコンセンサスＤＮＡ配列を作製した。この配列は、４８０アミノ酸のタンパク質（配列番号１６）に翻訳された１４４０ヌクレオチド（配列番号１５）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有した。このタンパク質のアミノ酸配列は、２アミノ酸残基を除く精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質から作製されたすべての配列情報を含有する（配列番号１〜４を参照のこと）。配列番号１６の残基７はトリプトファンである一方、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質（配列番号１）のＮ末端配列分析は、この位置でセリンを表した。すべての１０個のＰＣＲにより誘導されたクローン（上記を参照のこと）の配列アラインメントの注意深い調査により、プライマー１（配列番号５）の配列ＷＳＮは、１０個のクローンのうち６個において、ＴＧＧ（Ｔｒｐをコードする）に変換されていたことが示された。他の４個のクローンでは、配列ＴＣＧ（Ｓｅｒをコードする）が決定された。従って、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の実験により決定された配列とＰＣＲにより誘導されたｃＤＮＡの推定アミノ酸配列との間の不一致は、縮重オリゴヌクレオチドプライマーの使用に帰することができる実験的人工物である。
【０１９９】
タンパク質の部分アミノ酸配列とＰＣＲにより誘導されたｃＤＮＡの推定アミノ酸配列との間の第２の不一致は、配列番号１６においてセリンであるペプチド５の第３のアミノ酸（バリン）に関係がある。ペプチド５のエドマン分解の出力の注意深い調査により、第３の分解サイクルにおいて、セリンに対応する第２のピークが検出され、このピークはバリンとほぼ同じ量であることが示された。
【０２００】
５’ＲＡＣＥ実験を行って、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５’領域の正確な配列を決定した。簡単に説明すると、製造者の指示に従い、ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）由来の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットおよびプライマー６を使用して、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）培養物から単離された５μｇの全ＲＮＡを使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。このプライマーは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼオープンリーディングフレーム（配列番号１５）のヌクレオチド３８４〜４１８由来の配列の逆相補鎖を提示する。
【０２０１】
プライマー６−（配列番号１７）
５’−ＧＧＡＴＴＴＣＡＡＣＣＣＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴＣＴＡＴＣＡＡＣＣ−３’
【０２０２】
逆転写反応が完了した後、製造者の指示に従って、ＲＮＡをＲＮＡｓｅＨ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア州ラホヤ（Ｌａ  Ｙｏｌｌａ，ＣＡ））で分解した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、メリーランド州（ＭＤ））を使用して、ｃＤＮＡを清浄にし、製造者の指示に従い、組換え的に産生された仔ウシ胸腺（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））のターミナルトランスフェラーゼを使用して、Ｃテール付加（Ｃ−ｔａｉｌｅｄ）した。
【０２０３】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー７およびプライマー８、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）と、２μＬのＣテール付加ｃＤＮＡテンプレートとを組み合わせた。ＰＣＲ混合物を２つの１００μＬアリコートに分割し、それぞれ５０℃および５２℃のアニーリング温度で２つのＰＣＲ反応を実施した。４０サイクルの増幅を行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、それぞれのアニーリング温度で４５秒間、および７２℃で１分間を含んでなった。プライマー７はｃＤＮＡのＣテールにアニールした。プライマー８は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼオープンリーディングフレーム（配列番号１５）のヌクレオチド１７５〜２０４由来の配列の逆相補鎖を提示する。
【０２０４】
プライマー７−（配列番号１８）
５’−ＧＧＣＣＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＧＴＡＣＧＧＧＮＮＧＧＧＮＮＧＧＧＮＮＧ−３’
【０２０５】
プライマー８−（配列番号１９）
５’−ＣＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＡＣＣ−３’
「Ｎ」は、イノシンヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドに組み入れられた位置を示す。２００〜４００ｂｐのＰＣＲ産物をゲル精製した。ゲル精製されたＤＮＡを１：１０００に希釈し、１０μｌを、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー７およびプライマー８、ならびに２０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１ｍＬ）において使用した。ＰＣＲ混合物を１０個の１００μＬアリコートに分割し、４０サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、５２℃で４５秒間、および７２℃で１分間を含んでなった。再増幅させたＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。２個の独立して誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供した。これらのクローンは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼオープンリーディングフレームの最初の２０４ヌクレオチドおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５’非翻訳領域を提示する新規の配列の６０ヌクレオチドを含んでなる２６４ｂｐの同一ＤＮＡ断片を含有することを見出した。５’ＲＡＣＥ産物のヌクレオチド配列を配列番号２０に記載する。
【０２０６】
レーザージーン（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ）ソフトウェア・パッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ）のＳｅｑＭａｎプログラムを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ実験、３’ＲＡＣＥ実験（配列番号１４のコンセンサス配列によって提示される）、および５’ＲＡＣＥ実験（配列番号２０のコンセンサス配列によって提示される）に由来するＤＮＡ配列を整列させ、配列番号２１に記載の１５８６ヌクレオチドのコンセンサスＤＮＡ配列を作製した。この配列は、６０ヌクレオチドの５’非翻訳領域、１４４０ヌクレオチドのコード領域、６６ヌクレオチドの３’非翻訳領域、および２０ヌクレオチドのポリＡテールを含むｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の正確な配列である。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを配列番号２２に記載する。この配列のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の一次アミノ酸配列への概念上の翻訳を配列番号２３に記載する。
【０２０７】
実施例３
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子の発現および組換え的に産生されるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の生化学的特徴付け
本研究は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の明白な配列（配列番号２１）が公知になる前に開始した。製造者の指示に従い、ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）由来の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットを使用して、唯一の炭素源としてｐＨＢＡの存在下で増殖させたカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）（ＡＴＣＣ７３３６）培養物から単離された５μｇの全ＲＮＡを使用して、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を作製した。新たなプライマー（プライマー９）を合成した。
【０２０８】
プライマー９−（配列番号２４）
５’−ＣＣＣＧＣＡＣＡＴａａｇｃｔｔＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＡＡＴＧＧ−３’
プライマー９の下線を付したヌクレオチドはｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの３’末端でアニールする。小文字で表したヌクレオチドは、終止コドンの直前にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する。
【０２０９】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー１（配列番号５）およびプライマー９、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）と、２μＬのｃＤＮＡテンプレートとを組み合わせた。３５サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、５４℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。
【０２１０】
６個の独立して誘導された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供した。ＤＮＡ配列を配列番号１４と比較すると、２つのクローンのヌクレオチド配列は、ＰＣＲにより誘導される変異体を含まないことが認められた。しかし、上記で考察した理由のため、２つのクローンは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の７位でＴＣＧコドン（セリン残基をコードする）の代わりにＴＧＧコドン（トリプトファン残基をコードする）を担持し、これは、精製されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質のＮ末端のエドマン分解によって決定された。従って、これらのクローンのＤＮＡ挿入物は、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子の異種発現のためには直接使用し得ない。その代わり、新たなプライマー（プライマー１０、配列番号２５）を合成した。
【０２１１】
プライマー１０−（配列番号２５）
５’−ＧＡＡＴＴＣＧＣＣｃａｔＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＧＣＣＧＴＣＧＡＡＧＡＣＧ−３’
プライマー１０の下線を付したヌクレオチドはｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ転写物の５’末端でアニールする。小文字で表したヌクレオチドは、開始コドンでＮｄｅＩ制限部位を導入する。大文字で表したヌクレオチドは、プライマー１で作製されるＰＣＲ産物のＴＧＧコドンを、セリンをコードするＴＣＧコドンに変更する。斜字体で表した下線を付したヌクレオチドは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質のコード領域を提示するＰＣＲ産物をクローニングするために使用されるｐＣＲ２．１ベクターの配列にアニールする。
【０２１２】
上記のＰＣＲエラーのないクローンのプラスミドＤＮＡならびにプライマー９および１０を使用して、ｐＥＴ２９Ａベクターへのクローニングに適したＰＣＲ断片を増幅した。２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー１０およびプライマー９、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼ、ならびに１０ｎｇのプラスミドＤＮＡを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）を作製した。２５サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、６０℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲル精製し、同じ酵素で消化されているｐＥＴ２９Ａ  ＤＮＡに連結した。
【０２１３】
３つの組換えクローンを回収した。プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定した。ＰＣＲ
により誘導された変異体は発見されなかった。ｐＥＴ２９ａベクターにクローニングされた挿入物のＤＮＡ配列を配列番号２６に記載する。それは、配列番号２３の配列に同一のアミノ酸配列を伴う酵素をコードした。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ挿入物を所有するｐＥＴ２９ａ構築物のプラスミドＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））にエレクトロポレートした。組換えクローンを使用して、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する１００ｍＬのＬＢ培地に接種した。細胞が０．６のＯＤλ＝６００ｎｍの密度に達するまで、培養物を３７℃で増殖させた。続いて、培養物を氷上で室温まで冷却し、ＩＰＴＧを０．２ｍＭの最終濃度まで添加し、培養物の増殖を２３℃で２４時間、処理させた。
【０２１４】
培養物を遠心分離により回収した（１．５ｍＬ）。細胞を１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μＭ  ＦＡＤで洗浄し、最終的に１５０μＬの同じ緩衝液に再懸濁した。トルエン（１５μＬ）を細胞懸濁液に添加し、細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。１ｍＭ  ｐＨＢＡ、２ｍＭ  ＮＡＤＨ、１０μＭ  ＦＡＤ、および１０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．６）を含有する２５μＬの反応混合物を合わせ、この反応混合物は、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）から精製される１５μＬのｐＨＢＡ１ヒドロキシラーゼ酵素（１．１４Ｕ／ｍＬ）または１５μＬのトルエン処置した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞懸濁液のいずれか一方を収容した。酵素反応を３０℃で３０分間、インキュベートした。１２％（ｖ／ｖ）酢酸を含有する等容積のＭｅＯＨを添加することによって、反応を停止した。
【０２１５】
遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間）によって反応生成物を澄明にし、以下のようなＨＰＬＣによって分析した。反応生成物（１０μｌ）をノバ・パック（Ｎｏｖａ  Ｐａｋ）Ｃ１８カラム（３．９×１５０ｍｍ、６０Å、４μｍ）（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、米国マサチューセッツ州（ＭＡ，ＵＳＡ））上に注入した。カラムを、１ｍＬ／分の流速、以下の次の条件下で展開した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ，／１．５％ＨＰＯ４）、溶媒Ｂ（４８％アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／１．５％ＨＰＯ４）；０〜５分０％Ｂ、５〜２０分０〜１００％Ｂ、２０〜２１分１００〜０％Ｂ、２１〜２５分０％Ｂ。ｐＨＢＡを２５４ｎｍで、ハイドロキノンを２８８ｎｍで検出した。真正のｐＨＢＡおよびハイドロキノン標準物質と識別不能である保持時間およびＵＶ吸収スペクトルに基づき、ｐＨＢＡおよびハイドロキノンに対応する化合物を同定した。ＨＰＬＣ分析は、ｐＥＴ２９ａ  ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼプラスミドを所有するトルエン処置した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞がＮＡＤＨの存在下でｐＨＢＡをハイドロキノンに変換することが可能である酵素活性を含有することを示した。この活性は、空のｐＥＴ２９ａベクター（コントロール）を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞では観察されなかった。このことは、単離されたｃＤＮＡがｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードすることの決定的な証拠である。
【０２１６】
酵素の動力学的特性の分析に十分な材料を得るために、組換え的に産生されたｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質を均質になるまで精製した。簡単に説明すると、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを補充した１ＬのＬＢ培地を含有する４つの５リットルフラスコにｐＥＴ２９Ａ  ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ構築物を含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞を接種した。０．６の細胞密度（ＯＤλ＝６００ｎｍ）が達成されるまで、培養物を２６℃で増殖させた。次いで、ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度で添加し、続いて、２６℃で３６時間、培養を継続した。遠心分離（５０００×ｇ、１０分間）により細胞を回収し、３０ｍＬの２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、および１０μＭ  ＦＡＤに再懸濁した。細胞懸濁液をフレンチプレスに２回通過させ、遠心分離（３００００×
ｇ、２０分間、４℃）により澄明にした。グリセロールを７％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加した。この抽出物を、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素活性の消失を伴わずに−８０℃で貯蔵した。タンパク質濃度は３５ｍｇ／ｍＬであり、比活性は０．５２Ｕ／ｍｇタンパク質であった。このように、培養物は、５４７ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を含有する合計で１０４４ｍｇのタンパク質を提示する３０ｍＬのタンパク質抽出物を提供した。
【０２１７】
酵素抽出物（１５ｍＬ）を、２．５ｍＬアリコート、ＰＤ１０カラム上で、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０μＭ  ＦＡＤへバッファー交換した。バッファー交換したタンパク質を合わせて、２１ｍＬの全容積を得た。バッファー交換したタンパク質は、１２３ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を提示する２１６ｍｇのタンパク質よりなった。バッファー交換した抽出物（７ｍＬ）をＱ−セファロース（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラム（１５ｍＬゲルベッドボリューム）に充填した。カラムを、２ｍＬ／分の流速、４℃で、以下の通りに展開した。溶媒Ａ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１０μＭ  ＦＡＤ）、溶媒Ｂ（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／Ｈ２ＳＯ４（ｐＨ７．８）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μＭ  ＦＡＤ、および１Ｍ  ＮａＳＯ４）；０〜９分間０％Ｂ、９〜４４分間（直線勾配）０〜２０％Ｂ、４４〜５４分間（直線勾配）２０〜６０％Ｂ、５４〜５５分間６０〜０％Ｂ、５５〜６５分間０％Ｂ。画分（４ｍＬ）を回収し、上記の分光光度アッセイを使用して、画分中のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性をモニターした。残りの１４ｍＬのバッファー交換したタンパク質を、同一条件下で行った２つのさらなるクロマトグラフィー測定において処理した。８つの４ｍＬ画分におけるすべてのクロマトグラフィー測定から、カラム充填量の約８７％を提示する合計で１２４ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を回収することができた。画分をプールし、セントリプレップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ）遠心濃縮器を使用して、２．５ｍＬの最終容積にまで濃縮した。
【０２１８】
１０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ６．８）、１０μＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１０μＭ  ＦＡＤを使用して、ＰＤ１０カラム上でタンパク質を脱塩した。７２ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を含有する２２．８９ｍｇのタンパク質を提示する脱塩したサンプルを、１容積（３．５ｍＬ）の脱塩緩衝液で希釈し、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、１０μＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１０μＭ  ＦＡＤで予め平衡化した１１８×１５ｍｍバイオ−スケール（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ）ＣＨＴ２０−１ハイドロキシアパタイトカラム（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州ヘラクレス（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ））に注入した。カラムを、２ｍＬ／分（４℃）、１０〜３５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８；０．０１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、および１０μＭ  ＦＡＤを含有する）の直線勾配（２５ｍＬ）で展開した。画分（８ｍＬ）を回収し、クロマトグラフィー画分のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を分光光度によりモニターした。６３ＵのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を含有するタンパク質（７ｍｇ）を、単一の８ｍＬの画分に回収した。この画分の２０μｌアリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。クマシー染色ゲルの可視調査より、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質は＞９５％の純度であることが示された。
【０２１９】
セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）−１０（ミリポア・コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
Ｃｏｒｐ．））を使用して、タンパク質（２ｍＬ）を４００μｌの最終容積にまで濃縮した。精製された組換えｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の最終濃度は、９５．７６３μＭの単量体濃度に相当する５．０３３ｍｇ／ｍＬであった。タンパク質濃度は、配列番号２３に示されるアミノ酸組成を使用するＧＣＧペプチドソート（Ｐｅｐｔｉｄｅｓｏｒｔ）プログラムによって決定されるように、２８０ｎｍでの７１，２７０Ｍ−１の吸光係数を使用して算出した。
【０２２０】
タンパク質を５０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ６．８）および１０μＭ  ＦＡＤで１０倍に希釈した。希釈された酵素（２μＬ）を使用して、５００μＬの最終容積中５０ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ６．８）、０．１ｍＭ  ｐＨＢＡ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＨ、および１０μＭ  ＦＡＤの存在下で、分光光度的にｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ活性を測定した。活性は４回反復で測定した。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの以下の速度を２５℃で決定した。２３．７７６、２０．４１６、２３．５５２、および２２．２５６μＭ／分。この情報および５２５５９．４４ＤａのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の分子量から、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素のＫｃａｔを９．７７±０．６９ｓ−１と算出することができた。
【０２２１】
類似の条件下で酵素のＫｍを決定した。０．９０３μＭ  ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素の５マイクロリットルを、上記の標準的５００μｌアッセイに使用した。３４０ｎｍ、１５秒間隔、０．２〜４００μＭの範囲のｐＨＢＡの多様な濃度で、初期速度を測定し；得られたデータをミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）の式に適合させた。これらの条件下で、見かけのＫｍおよびＶｍａｘ値は、それぞれ０．３１μＭおよび６．４μｍｏｌ／分／ｍｇであった（図２）。
【０２２２】
実施例４
ｐＨＢＡを過剰産生するトランスジェニック植物の作製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬのＰＣＲクローニング
２つのＰＣＲプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡから大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｂｉＣ遺伝子を増幅する一方、高コピー数プラスミドへのその後の連結のために、そのフランキング領域に独特な制限部位を付加した。この遺伝子はコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ（ＣＰＬ）をコードする。この目的のために使用されるプライマーは、以下のような大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｂｉＣ遺伝子（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｍ９６２６８）の公開されたＤＮＡ配列に基づいた。
【０２２３】
プライマー１１−（配列番号２７）：
５’−ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴｃａｔａｔｇＴＣＡＣＡＣＣＣＣＧＣＧＴＴＡＡ−３’
【０２２４】
プライマー１２−（配列番号２８）：
５’−ＣＡＴＣＴＴＡＣＴａｇａｔｃｔＴＴＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣ−３’
下線を付した塩基は標的遺伝子にハイブリダイズする一方、小文字はＰＣＲプライマーの末端に付加された制限部位（ＮｄｅＩまたはＢｇｌＩＩ）を示す。
【０２２５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｕｂｉＣ遺伝子の増幅は、プライマー１１（配列番号２７）および１２（配列番号２８）ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｗ３１１０由来のゲノムＤＮＡを使用して、達成した（キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７５：２２７６−２２８４（１９７８））。プライマー１１は遺伝子の開始部でハイブリダイズし、タンパク質の開始コドンでＮｄｅＩ部位を導入する一方、プライマー１２は対向末端でハイブリダイズし、終結コドンの直後にＢｇｌＩＩ部位を提供する。１００μＬのＰＣＲ反応は、約１００ｎｇのゲノムＤＮＡおよび０．５μＭの最終濃度で両プライマーを含有した。他の反応成分は、製造者のプロトコルに従い、ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ試薬キット（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））から入手した。増幅は、ＤＮＡサーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）４８０（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））において２２サイクルで行い、各サイクルは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間を含んでなった。最後のサイクル後、７２℃で７分間の伸長期間があった。
【０２２６】
ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、得られた断片を、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化していた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター、ｐＥＴ−２４ａ（＋）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に連結した。連結反応混合物を使用し、製造者のプロトコルに従い、ＢＴＸトランスフェクター（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｒ）１００（バイオテクノロジーズ・アンド・エクスペリメンタル・リサーチ・インク（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（ギブコＢＲＬ−ライフ・テクノロジーズ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））を形質転換し；カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地上で増殖を選択した。ＣＰＬ挿入物を伴うプラスミドを含有する形質転換体を、プライマー１１（配列番号２７）および１２（配列番号２８）ならびにテンプレートの供給源としての個々の再懸濁されたコロニーを使用しるＰＣＲ反応を介して同定した；ここで、この技術は、単に「コロニーＰＣＲ」と称される。
【０２２７】
正確なサイズのＰＣＲ産物を算出する代表的なコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。ＣＰＬに対応する挿入物全体を完全に配列決定して、ＰＣＲエラーについて確認したところ；認められなかった。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以下、「ｐＥＴ２４ａ−ＣＰＬ」と称する。ｐＥＴ２４ａ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現構築物におけるＣＰＬに対するＯＲＦのヌクレオチド配列およびその推定一次アミノ酸配列を、それぞれ配列番号２９および配列番号３０に記載する。
【０２２８】
ＣＰＬ：ＴＰ−ＣＰＬの葉緑体標的化バージョンの構築
コリスミ酸は葉緑体および他のタイプのプラスチドに局在する（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６））ため、それ故、外来タンパク質を葉緑体（コリスミ酸産生の部位）に効率的に指向するＮ末端葉緑体標的化配列を伴うＣＰＬを提供することは必須である。このことは、ＣＰＬのイニシエーターＭｅｔ残基に融合されたトマトルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体タンパク質に由来する葉緑体標的化配列を含むキメラタンパク質を構築することによって達成された；得られる融合タンパク質は「ＴＰ−ＣＰＬ」と称される。ＰＣＲを用いて、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニットの輸送ペプチドおよび「成熟」ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の最初の４アミノ酸残基に対応するＤＮＡ断片を作製した。増幅のための標的はプラスミドｐＴＳＳ１−９１−（＃２）−ＩＢＩ（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６））であったが、これはｒｂｃＳ２に対するトマトルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体の全長ｃＤＮＡクローンを含有する（スギタ（Ｓｕｇｉｔａ）ら、Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．，２０９：２４７−２５６（１９８７）；シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６））。以下のプライマーをこの反応に使用した。
【０２２９】
プライマー１３−（配列番号３１）：
５’−ＣＴＡＣＴＣＡＣＴＴＡＧＡＴＣＴｃｃａｔｇｇＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴ−３
【０２３０】
プライマー１４−（配列番号３２）：
５’−ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｃａｔａｔｇＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣ−３’
プライマー１３（配列番号３１）の下線を付した部分はルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体の最初の２１ヌクレオチドにハイブリダイズし、葉緑体標的化配列の開
始部分でイニシエーターＭｅｔ残基でＮｃｏＩ部位（小文字）を導入する。示されるように、このプライマーもまた、ＮｃｏＩ部位よりすぐ上流にあるその５’末端でＢｇｌＩＩ部位（太字）を含有する。プライマー１４（配列番号３２）は、葉緑体標的化配列の他の末端で、ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット前駆体のＯＲＦのヌクレオチド１６７〜１８４にハイブリダイズする。
【０２３１】
独特なＮｄｅＩ部位をこのプライマー（小文字）に操作し、葉緑体標的化配列を含有するＰＣＲ断片のｐＥＴ−２４ａ発現構築物におけるＣＰＬの開始コドンに位置するＮｄｅＩ部位への付着を可能にした。１００μＬのＰＣＲ反応は約７５ｎｇのｐＴＳＳ１−９１−（＃２）−ＩＢＩならびに両方とも約０．９μＭの最終濃度でプライマー１３（配列番号３１）および１４（配列番号３２）を含有した。増幅は、ＤＮＡサーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）４８０（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ））において２５サイクルで行い、各サイクルは、９４℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１分間を含んでなった；最後のサイクルに続いて、７２℃で７分間の伸長期間があった。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＮｄｅＩで消化し、Ｔ７プロモーターを含むベクター配列のみを含有する小さなＤＮＡ断片（１０６ｂｐ）を取り出すために同じ制限酵素で切断していたｐＥＴ２４ａ−ＣＰＬに連結した。エレクトロポレーションを使用して、連結反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞に導入し、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を伴うＬＢ培地上で増殖を選択した。挿入された葉緑体標的化配列を伴うプラスミドを所有する形質転換体を、プライマー１２（配列番号２８）および１３（配列番号３１）を使用するコロニーＰＣＲによって同定した。正確なサイズのＰＣＲ産物を産出する代表的なプラスミドを、さらなる操作のために選択した；このプラスミドは、以下、「ｐＥＴ２４ａ−ＴＰ−ＣＰＬ」と称される。ＰＣＲエラーの不在を確認するため、増幅された葉緑体標的化配列に対応するプラスミドの領域を、注文設計したプライマーを使用して、完全に配列決定した。ＴＰ−ＣＰＬに対するＯＲＦのヌクレオチド配列およびその推定一次アミノ酸配列を、それぞれ配列番号３３および配列番号３４に記載する。
【０２３２】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびタバコ形質転換のために使用される発現プラスミドの構築
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびタバコにおける構成性発現のための使用し得る構築物を作製するために、全長ＴＰ−ＣＰＬ融合タンパク質に対応するＤＮＡ断片をプラスミドｐＭＬ６３の改変されたバージョンにサブクローニングした。後者は、次の遺伝子エレメントを含有するｐＭＬ４０から誘導した。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ｃａｂリーダー配列、ｕｉｄＡコード領域、およびＮＯＳポリアデニル化シグナル配列。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、転写開始部位の後に８塩基対が延在する１．３ｋｂのＤＮＡ断片である（オデル（Ｏｄｅｌｌ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０３：８１０−８１２（１９８５））。その３’末端に、ｃａｂリーダー配列、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子２２Ｌから得られたＤＮＡの６０ｂｐ非翻訳二本鎖片が作動的に結合される（ハルプスター（Ｈａｒｐｓｔｅｒ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１２：１８２−１９０（１９８８））。タンパク質β−グルクロニダーゼ（例えば、「ＧＵＳ」）をコードするｕｉｄＡ遺伝子（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：３９０１（１９８７））は、ｃａｂリーダーの３’末端に融合される。最終的に、ノパリンシンターゼ（例えば、「ＮＯＳ」）遺伝子由来のポリアデニル化シグナル配列を含有する８００ｂｐのＤＮＡ断片がＧＵＳ遺伝子の３’末端に付着される（デピカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：５６１−５６４（１９８２））。３５Ｓ−ＧＵＳキメラ遺伝子を共に含んでなるこれらのＤＮＡ断片を、ベクターｐＧＥＭ９Ｚｆ（−）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））への標準的なクローニング技術によって挿入し、プラスミドｐＭＨ４０を産出させた。
【０２３３】
プラスミドｐＭＬ６３（ｐＭＨ４０と基本的に同じであるが、３’ＮＯＳターミネーター配列の短縮型バージョンを有する）を以下の様式で作製した。最初に、ｐＭＨ４０をＳａｌＩで消化し、４．０３ｋｂおよび２．９ｋｂの２つの得られたＤＮＡ断片を再連結して、対抗する配向に３５Ｓプロモーター／ｃａｂ２２リーダー／ＧＵＳ遺伝子／３’ＮＯＳターミネーターカセットを伴うプラスミド、ｐＭＬ３を産出させた。次いで、ｐＭＬ３をＡｓｐ７１８ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、３’ＮＯＳターミネーター配列を含有する７７０ｂｐの断片を放出させた。後者を廃棄し、テンプレートとしてｐＭＨ４０ならびにプライマー１５（配列番号３５）および１６（配列番号３６）を使用するＰＣＲによって作製したより短いバージョンで置き換えた。
【０２３４】
プライマー１５−（配列番号３５）：
５’−ＣＣＣＧＧＧＧＧＴＡＣＣＴＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＴＧＣＧＴＣＧＡＡＧ−３’
【０２３５】
プライマー１６−（配列番号３６）：
５’−ＧＡＴＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＴＧＡ−３’
【０２３６】
ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化して、公開された配列のヌクレオチド１２７７（ＴＡＡ終止コドン）で開始し、ヌクレオチド１５５６で終了する２７９ｂｐの３’ＮＯＳターミネーター配列を含有する２９８ｂｐ断片を産出させた（デピカー（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：５６１−５７４（１９８２））。このＰＣＲ断片のｐＭＬ３の関連部分への連結により、プラスミドｐＭＬ６３を産出させた。
【０２３７】
上記に示すように、ｐＭＬ６３は、３５Ｓプロモーターおよび３’ＮＯＳターミネーターの短縮型バージョンの制御下でＧＵＳコード領域を含有する。従って、それは、植物におけるＧＵＳの構成性発現に必要であるすべての転写情報を含有する。ＴＰ−ＣＰＬに対する類似の構築物を作製するために、プラスミドｐＭＬ６３をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。この操作により、ＧＵＳ遺伝子挿入物のみが放出され、調節フランキング配列およびベクターの残りの部分は無傷（ｉｎｔａｃｔ）のまま残る。プラスミドｐｅｔ２４ａ−ＴＰ−ＣＰＬもＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩで処置したが、このことによりＴＰ−ＣＰＬ融合タンパク質のコード領域全体が解放される。後者に対応する小さなＤＮＡ断片（６９３ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動によって精製し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩにより切断されているｐＭＬ６３から入手された大きなベクター断片（４．６３ｂｐ）との標準的な連結反応に供した。エレクトロポレーションを使用して、連結反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入し、増殖をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地上で選択した。挿入されたＴＰ−ＣＰＬコード配列を伴うプラスミドを所有する形質転換体をプライマー１２（配列番号２８）および１３（配列番号３１）を使用するコロニーＰＣＲによって同定した。正確なサイズのＰＣＲ産物を産出する代表的なプラスミドをさらなる操作のために選択したが、この構築物は「ＴＰ−ＣＰＬ−ｐＭＬ６３」と称される。
【０２３８】
タバコのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介リーフディスク形質転換に使用されるバイナリーベクターはプラスミドｐＺＢＬ１（ＡＴＣＣ２０９１２８）であった。ｐＺＢＬ１は、ｐＢＲ３２２由来の複製開始点、細菌性ｎｐｔＩカナマイシン耐性遺伝子、シュードモナス・エアルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）プラスミドｐＶＳ１の複製および安定性領域（イトウ（Ｉｔｏｈ）ら、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、１１（３）：２０６−２２０（１９８４））、バン・デン・エルゼン（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｌｚｅｎ）ら、（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５（３）：１４９−１５４（１９８５））により記載のＴ−ＤＮＡ境界（ここで、右境界断片の一部であるＯＣＳエンハンサー（ＯＣＳプロモーター（グレーヴ（Ｇｒｅｖｅ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：４９９−５１１（１９８３））の３２０から１１６まで延在する）が取り出される）、ならびにカナマイシン耐性植物選択マーカーとしての役割を果たすためのＮＯＳ／Ｐ−ｎｐｔＩＩ−ＯＣＳ３’遺伝子を含有する。
【０２３９】
ＴＰ−ＣＰＬの発現のために、プラスミドｐＺＢＬ１を、外来遺伝子の挿入および植物ゲノムへの安定な組込みに理想的に適した左右境界間の独特な部位で切断するＳａｌＩで消化した。挿入を伴わない再連結の可能性を最小限にするため、製造者の推奨に従って仔ウシ小腸アルカリホスファターゼ（ギブコＢＲＬ−ライフ・テクノロジーズ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を使用し、切断されたベクターを脱リン酸化した。バイナリーベクターに挿入される断片を得るために、プラスミドＴＰ−ＣＰＬ−ｐＭＬ６３もまたＳａｌＩで消化した。この処置により、２．４ｋｂのＤＮＡ断片としてＴＰ−ＣＰＬ融合遺伝子（例えば、３５Ｓプロモーター／ｃａｂ２２リーダー／ＴＰ−ＣＰＬ／３’ＮＯＳターミネーター）の転写単位が放出される。後者をアガロースゲル電気泳動によって精製し、上記のｐＺＢＬ１から得られた脱リン酸化された１１．０ｋｂ断片との標準的な連結反応に供した。エレクトロポレーションを使用して、連結反応混合物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂに導入し、増殖をカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を伴うＬＢ培地上で選択した。ＴＰ−ＣＰＬ融合遺伝子を伴うプラスミドを所有する形質転換体を、プライマー１２（配列番号２８）および１３（配列番号３１）を使用するコロニーＰＣＲによって同定し、ＫｐｎＩを使用する制限消化によって挿入物の配向を決定した。さらなる操作のために選択されたプラスミドは「ＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１」と称される。以下により詳述するように、この発現構築物を使用して、ｐＨＢＡの過剰発現のためのタバコおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）を形質転換した。
【０２４０】
ＴＰ−ＣＰＬを発現するトランスジェニックタバコ植物の作製
凍結融解形質転換手順（ホルスタース（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ）ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６３：１８１−１８７（１９７８））を使用して、プラスミドＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４（ホエケマ（Ｈｏｅｋｅｍａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３０３：１７９−１８０（１９８３））に導入した。細胞を、２８℃で、カナマイシン（１０００μｇ／ｍＬ）およびリファンピシン（２０μｇ／ｍＬ）をも含有するＹＥＰ培地（１リットルあたり１０ｇトリプトン、１０ｇ酵母抽出物、および５ｇＮａＣｌ）に配置した。適切なプライマーを使用するＰＣＲによって、バイナリー構築物を所有するコロニーを同定した。
【０２４１】
リーフディスク感染のためにポット栽培したタバコ植物（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ））を、約８０％相対湿度、白色蛍光および白熱光の混合下で、１４時間、２１℃日中／１０時間、１８℃夜サイクルを維持した育成チャンバにおいて、育成した。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介リーフディスク形質転換を、本質的にデ・ブラエレ（Ｄｅ  Ｂｌａｅｒｅ）ら、（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５３：２７７−２９２（１９８７））による記載の通りに、以下の改変を加えて実施した。滅菌ペーパーパンチおよび４〜６週齢の植物を使用して、リーフディスク（直径８ｍｍ）を葉全体から調製した。ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地においてＯＤλ＝６００ｎｍ＝０．８の密度で再懸濁されたＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１を所有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の濃縮溶液に３０分間リーフディスクを浸漬することによって、リーフディスクに接種した。接種されたリーフディスクを、（１リットルあたり）３０ｇのスクロース、１ｍｇの６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、０．１ｍｇのナフタレン酢酸、８ｇの寒天、およびギブコＢＲＬ−ライフ・テクノロジーズ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カタログ番号２３１１８−０２９）より得た１パッケージのムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）
最小有機培地を含有する培地上に直接配置した。３日間、２８℃、照明下でのインキュベーション後、リーフディスクを、カナマイシン（３００μｇ／ｍＬ）およびセフォタキシム（５００μｇ／ｍＬ）をも含有する同じ組成の新鮮培地に移し、形質転換されたタバコ細胞の増殖のために選択し、残りのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を除去した。リーフディスクを上記の増殖条件下で３週間インキュベートし、次いで、根誘導のために最適なシュートサイズが得られるまで３週間間隔で同じ組成の新鮮培地に移した。シュートを、（１リットルあたり）１パッケージのムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地、８ｇの寒天、および１０ｇのスクロースを含有する培地上で発根させた。約４週間後、植物を土壌に移し、上記の条件下の育成チャンバにおいて成熟期まで成長させた。
【０２４２】
タバコ葉サンプルの調製およびｐＨＢＡグルコース抱合体のＨＰＬＣ分析
健常な葉組織（５０〜１００ｍｇ新鮮重量）を、葉の３分の１遠位部から迅速に取り出し、セラミックビーズを含有するバイオパルベリザー（Ｂｉｏｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ）ＴＭｈチューブ（カタログ番号６５７０−２０１または６５４０−４０１）に配置した；後者は両方ともＱＢｉｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））から得られる。１ｍＬの５０％メタノール（ｖ／ｖ）の添加後、チューブにキャップを取り付け、５ｍ／秒の速度で稼動しているファストプレップ（ＦａｓｔＰｒｅｐ）（登録商標）ＦＰ１２０（ＱＢｉｏｇｅｎ）組織破砕装置を使用して、室温で４０秒間、機械的に撹拌した。次いで、チューブを回転式振盪器に配置し、４００ｒｐｍで１時間、室温で激しく振盪した。簡便な卓上型遠心分離機を使用して、抽出物を遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）により澄明にし、両ｐＨＢＡグルコース抱合体（フェノールおよびエステル配糖体）を含有する上清を注意深く空のチューブに取り出した。次の工程では、メタノール抽出物の５０μＬアリコートを新しいマイクロ遠心チューブに移し、任意の加熱装置を使用して、スピード−バック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）（登録商標）（テルモ・サーバント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ）、ニューヨーク州ホルブルック（Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，ＮＹ））において、減圧下でサンプルを完全な乾燥状態にした。乾燥残渣を１００μＬの５ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８）に溶解し、サンプルを０．２２μｍ酢酸セルロースフィルターを介して通過させ、小さな粒子を取り出した；スピン−Ｘ（Ｓｐｉｎ−Ｘ）遠心チューブフィルター（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）（登録商標）コーニング・インク・ライフサイエンシズ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マサチューセッツ州アクトン（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）；カタログ番号８１６０）をこの目的に使用した。
【０２４３】
次いで、ろ過したサンプルのアリコート（１０〜８０μＬ）を、１ｍＬ／分、９０％緩衝液Ａ（水中０．１％ギ酸）および１０％緩衝液Ｂ（メタノール）で予め平衡化したバイダック（Ｖｙｄａｃ）２１８ＴＰ５４プロテイン・アンド・ペプチド（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ）Ｃ１８カラム（グレイス・バイダック（Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ）、カリフォルニア州ヘスペリア（Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ））に適用した。サンプル注入後、カラムを、１ｍＬ／分、１０〜５０％緩衝液Ｂの直線勾配で、２０分間展開した。ｐＨＢＡグルコース抱合体の溶出を分光光度により２５４ｎｍでモニターした。化学合成されたｐＨＢＡフェノールおよびエステル配糖体標準物質を使用して、保持時間についてＨＰＬＣ測定を校正し、用いた条件下で、両化合物の吸光係数を正確に決定した。ヒューレット・パッカード・ケムステーション（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ）により提供されるソフトウェアパッケージを使用して、ピーク領域を積分し、既知量の化学標準物質により得られた値を使用して、注入あたりのｐＨＢＡ配糖体のマイクログラムを定量した。カラムに注入した本来のメタノール抽出物の画分を考慮して、抽出された葉サンプル全体からの回収に反映するように数字を補正した。このことは、（例えば、同じ植物の同じ葉から同じ分析日に入手した）分析した葉組織の乾燥重量の個々の測定値と合わせて、全乾燥重量の百分率としてｐＨＢＡ配糖体の定量を可能にした。グルコースに付着したｐＨＢＡの合計量を算出し、この数字を全乾燥重量の百分率（即ち、「ｐＨＢＡ（乾燥重量の％）」）として表すために、フェノールおよびエステル配糖体を共に加えて、０．４６を乗じた。この操作により、関連するグルコース部分（両グルコース抱合体の全質量の５４％）の質量が補正される。
【０２４４】
ＴＰ−ＣＰＬを発現するトランスジェニックタバコ植物の分析
上記のように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）仲介リーフディスク形質転換を使用して、ＴＰ−ＣＰＬをタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に導入し、ｐＨＢＡ配糖体の蓄積に対するその影響を決定した。異なる形質転換事象から生じた１５のタバコ植物（１次形質転換体）から得られる葉組織に対して分析を行った。土壌において５週間後、植物は、全乾燥重量の０〜２．３％の範囲の多様なレベルのｐＨＢＡ配糖体を示した。表現型のばらつきは、ほぼすべての植物形質転換実験において典型的に観察され、おそらく、いわゆる「位置」効果（例えば、ゲノムにおける異なる位置での形質遺伝子の安定な組込み）および導入遺伝子のコピー数から生じる異なるレベルの遺伝子発現に反映する。本研究においても類似の現象が生じたことは、精製された組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬに対する抗血清を使用するタバコ形質転換体のウエスタンブロット分析によって支持される。例えば、大部分の植物（１５中１４）は免疫学的に検出可能なレベルの外来タンパク質を有したが、発現レベルにはかなりのばらつきが認められた。しかし、一般的に言って、ウエスタン（Ｗｅｓｔｅｒｎ）シグナルの強度とｐＨＢＡ配糖体の蓄積との間には正の相関関係が認められたが、これは、先の観察と一致する（シーベルト（Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１１２：８１１−８１９（１９９６）；ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３９（１１）：１２４０−１２４４（１９９８）；ゾンマ（Ｓｏｍｍｅｒ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，１７：８９１−８９６（１９９８））。ウエスタンブロットでは、葉緑体標的化配列がタバコにおいて効率的に切断されることも確認された。
【０２４５】
５週齢のタバコ植物の平均ｐＨＢＡ配糖体含有量（±ＳＥＭ）は乾燥重量の１．１２％±０．１８６％であった。しかし、最も良好な植物の１つ（形質転換体番号３４）は、乾燥重量の２．３％のｐＨＢＡ配糖体含有量を有した。ＴＰ−ＣＰＬを発現する他のすべてのトランスジェニックタバコ植物と同様に、形質転換体番号３４におけるｐＨＢＡ配糖体の蓄積は、植物が成熟すると、継続して増加した。実際、土壌で１３週間育成した後、この特定の植物におけるｐＨＢＡ配糖体の葉含有量は、乾燥重量の約８％のレベルに達した。後者の値は、関連するグルコース分子の質量に対する補正後、乾燥重量の約３．７％の全ｐＨＢＡ含有量に対応する。下記に詳述するように、１次形質転換体番号３４（ＣＰＬ３４）を自家交雑させ、得られるＴ１種子を使用して、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ導入遺伝子による形質スタッキング実験のためのｐＨＢＡ過剰発現タバコ植物を作製した。重要なことに、ＣＰＬ３４は、自家交雑植物由来のＴ１種子の観察された分離パターン（カナマイシン耐性）に基づく、単一部位の組込み事象から生じた。
【０２４６】
ＴＰ−ＣＰＬを発現するトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の作製および分析
人工融合タンパク質、ＴＰ−ＣＰＬをアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に導入して、ｐＨＢＡ配糖体レベルを決定した。利用可能なプロトコル（マイヤー（Ｍｅｙｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６４：１４５２−１４５５（１９９４））を使用し、エレクトロポレーションによって、ＣａＭＶ３５Ｓ−ＣＰＬ発現カセット（例えば、ＴＰ−ＣＰＬ−ｐＺＢＬ１）を担持するバイナリーベクターを、ディスアームドＴｉ（ビルレンス）プラスミドｐＭＰ９０（コンズ（Ｋｏｎｃｚ）およびシェル（Ｓｃｈｅｌｌ）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２０４：３８３−３９６（１９８６））を担持するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株Ｃ５８Ｃ１Ｒｉｆ（株ＧＶ３１０１としても公知である）に形質転換した。ＣＰＬ発現構
築物を伴うバイナリーベクターを担持するＭＰ９０株を使用し、減圧浸潤技術（クラフ（Ｃｌｏｕｇｈ）およびベント（Ｂｅｎｔ）、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，１６（６）：７３５−４３（１９９８））の公開されたプロトコルを使用して、野生型ｆａｈ１−２（チャプレ（Ｃｈａｐｐｌｅ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，４：１４１３−１４２４（１９９２））、ｓｎｇ１−１（ロレンツェン（Ｌｏｒｅｎｚｅｎ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１１２：１６２５−１６３０（１９９６））遺伝子背景を伴う生態型コロンビア（Ｃｏｌｕｍｂｉａ）のシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）植物を形質転換した。選択のためにカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を使用し、無菌条件下、標準的な植物育成培地上でトランスジェニック種苗を同定した。カナマイシン耐性種苗を土壌に移し、土壌／パーライト混合物において、明期１２時間／暗期１２時間の明暗周期下、１００μＥｍ−２ｓ−１、１８℃（暗）および２１℃（明）で培養した。この手順により、独立した形質転換事象に由来する３０１個の１次形質転換体の集団が作製される。土壌への転移６週間後、下記のような逆相ＨＰＬＣを使用して、トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物を、ｐＨＢＡ配糖体について分析した。
【０２４７】
ｐＨＢＡ配糖体の分析
新鮮切断葉材料を５０％ＭｅＯＨ（１ｍｇ湿重量あたり５μＬ）中で均質化し、得られた抽出物を低速遠心分離によって澄明にした。次いで、１．５％リン酸を含有するアセトニトリル（６％〜４８％）の勾配を使用して、葉抽出物のアリコートをノバ−パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）Ｃ１８カラム（６０オングストロームのポアサイズ、４μｍ粒度）に適用した。２５４ｎｍでのＵＶ吸収によってｐＨＢＡフェノールおよびエステル配糖体を検出し、真正の化学標準物質から得られる吸光係数を使用して定量した。分析した２７２のトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物のうち、２３９（または約８８％）は検出可能なレベルの両グルコース抱合体を含有し、これらはほぼ等量存在した。最も良好な過剰産生体の全ｐＨＢＡ配糖体含有量は乾燥重量の１０．７３％であったが、これは、同じ構築物を使用してタバコで観察された最も高いレベルに極めて類似する。トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の集団全体の平均値は３．３５％（±０．１３％）であった；括弧内の数字は平均の標準誤差である。トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）系統（番号４１）は、トランスジェニック系統のこの大きな集団において同定された。発芽６週間後にアッセイした場合、ＣＰＬ導入遺伝子に半接合であるこの形質転換体のＴ１植物は、７．５％ＤＷのｐＨＢＡ抱合体を含有したが、これは３．４２％ＤＷの遊離のｐＨＢＡに等しい。この系統のＴ２子孫は、カナマイシン耐性遺伝子について３：１に分離したことから、トランスジェニック系統は、単一の遺伝子座にＴ−ＤＮＡ挿入物を担持することが示された。個々のＴ２子孫から種子を回収した。Ｔ−ＤＮＡ挿入に半接合であるＴ２植物に由来するＴ３種子のバッチを同定した。これらのＴ３種子バッチは、カナマイシンを含有する培地上で発芽させた場合、もはやカナマイシン感受性子孫を分離しなかった。このトランスジェニック系統の半接合子孫は、制御された上記の条件下で８週間育成した場合、葉組織において２．６％ｐＨＢＡＤＷを含有した。
【０２４８】
実施例５
トランスジェニック植物におけるハイドロキノン配糖体の産生のためのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子の有用性
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）におけるハイドロキノン配糖体（アルブチン）の産生
植物におけるｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの構成性発現のための構築物を作製するために、全長ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼＯＲＦ（配列番号２６）および開始コドンのすぐ下流の４２ｂｐの５’非翻訳ＤＮＡ（ｐＥＴ２９Ａベクターに由来する）を含有する１４８２ｂｐのＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩＤＮＡ断片を、組換え酵素産生のために使用されるｐＥＴ２９ａ構築物から切り出し、ＸｂａＩおよびＨｐａＩを伴うバイナリーベクターｐＢＥ８５６（ＳＣＰ１−ＦｌｐＭ）にクローニングした。連結反応において使用される挿入ＤＮＡを、プラスミドＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化によって作製した。線状化プラスミドＤＮＡを精製し、製造者の指示に従って、オーバーハングしているＤＮＡ末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、米国マサチューセッツ州（ＭＡ，ＵＳＡ））で満たした。平滑化したプラスミドＤＮＡをＸｂａＩで消化し、ＸｂａＩ  ＨｐａＩ消化したｐＢＥ８５６ＤＮＡに連結した。これにより、構成性ＳＣＰ１プロモーターとポテトプロテイナーゼインヒビターＩＩ（ＰＩＮ  ＩＩ）遺伝子の３’非翻訳領域との間に位置するｐＢＥ８５６におけるＦｌｐＭリコンビナーゼＯＲＦのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼＯＲＦによる置き換えが生じた。得られたバイナリーベクター、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ発現構築物（「ｐＢＥ８５６（ＳＣＰ１−ｐＨＢＡ１Ｈ）」）を、以下に記載の植物形質転換に使用した。
【０２４９】
バイナリーベクターｐＢＥ６７３をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断した後、該バイナリーベクターｐＢＥ６７３（以下に記載）の複数のクローニング部位にキメラＳＣＰ１：ＦｌｐＭ：３’Ｐｉｎ遺伝子を含有する２１７２ｂｐのＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をクローニングすることによって、プラスミドｐＢＥ８５６（ＳＣＰ−ＦｌｐＭ）を予め構築した。ＳＣＰ１：ＦｌｐＭ：Ｐｉｎ遺伝子は、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）プロテイナーゼインヒビターＩＩ遺伝子（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｌ３７５１９）由来の３’ＰＩＮ領域に対しその３’末端で融合したＦｌｐＭリコンビナーゼのＯＲＦに対しその３’末端で融合した合成３５Ｓプロモーター（ＳＣＰ１）（ボウエン（Ｂｏｗｅｎ）ら、米国特許出願第６０／７２０５０号明細書（２０００−０６−０６）、米国特許出願第６６１，６０１号明細書（放棄）の一部継続出願）よりなる。プラスミドｐＢＥ６７３は、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）プロモーターの３’末端、ｎｐｔＩＩ（カナマイシン耐性）ＯＲＦ、および３’ｎｏｓ領域を含有するｐＢｉｎ１９の１８３６ｂｐのＢｓｕ３６ａ−ＣｌａＩ断片を、（５’から３’で）：ｎｏｓプロモーターの３’末端（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｖ０００８７およびＪ０１５４１；また、ベバン（Ｂｅｖａｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１（２），３６９−３８５（１９８３）も参照のこと、に記載のヌクレオチド４６８〜５７４）を含んでなる１０６ｂｐの断片、５ｂｐのＧＡＴＣＣ配列、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ホスホトリシン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼ（バスタ耐性）ＯＲＦ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｘ１７２２０）に対応しているが、但し、終結コドンがＴＧＡからＴＡＧに変更された５５１ｂｐの断片、８ｂｐのＴＣＣＧＴＡＣＣ配列、ならびに２７９ｂｐの３’ｎｏｓ領域（上記のジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｖ０００８７およびＪ０１５４１のヌクレオチド１８２４〜２１０２）を含有する９４９ｂｐのＢｓｕ３６Ｉ−ＣｌａＩ断片で置き換えることによって、ｐＢｉｎ１９（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号Ｕ０９３６５）から誘導した。
【０２５０】
ｐＢＥ８５６  ＳＣＰ１−ｐＨＢＡ  １Ｈプラスミドを、エレクトロポレーションによって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８ＭＰ９０に導入した。簡単に説明すると、１μｇのプラスミドＤＮＡを、氷上で１００μＬのエレクトロコンピテント細胞と混合した。細胞懸濁液を１００μＬのエレクトロポレーションキュベット（１ｍｍギャップ幅）に移し、１ｋＶ、４００Ωおよび２５μＦに設定したＢＩＯＲＡＤエレクトロポレーターを使用して、エレクトロポレートした。細胞を１ｍＬのＬＢ培地に移し、２時間、３０℃でインキュベートした。細胞を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬのリファンピシンを含有するＬＢ培地上に配置した。プレートを３０℃で６０時間、インキュベートした。組換えアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物（５００ｍＬのＬＢ、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび１０μｇ／ｍＬのリファンピシン）を形質転換されたアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞の単一のコロニーから接種し、３０℃で６０時間、増殖させた。細胞を遠心分離（５０００×ｇ、１０分間）によって回収し、０．０５％（Ｖ／Ｖ）シルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）を含有する１Ｌの５％（Ｗ／Ｖ）スクロースに再懸濁した。
【０２５１】
ＣａＭＶ３５Ｓ  ＣＰＬ導入遺伝子（上記）に半接合であるアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物（系統番号４１）を、メトロミックス（ｍｅｔｒｏｍｉｘ）３６０土壌混合物において、１００ｃｍ２ポットあたり３０植物の密度で、土壌中、４週間育成した（２２℃、明期１６時間／暗期８時間、１００μＥｍ−２ｓ−１）。植物を、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液に反復的に浸し、暗所、高湿度環境で２４時間保持した。植物を、上記の標準的な植物育成条件下で３〜４週間育成し、植物材料を回収し、１週間、周囲温度、紙袋中で乾燥させた。種子を、０．４２５ｍｍメッシュ真鍮篩を使用して、回収した。清浄にしたアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）種子（１．５ｇ、約７５０００個の種子に対応する）を、４５ｍＬの８０％エタノール、０．０１％トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、続いて４５ｍＬの水中３０％（Ｖ／Ｖ）の家庭用漂白剤、０．０１％トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００における洗浄、および最後に、滅菌水で濯ぎを繰り返すことによって、滅菌した。７５００個の種子のアリコートを１０ｇ／Ｌ寒天で固化した０．５×ＭＳ塩、１．５％（Ｗ／Ｖ）スクロース、０．０５ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ５．８）、２００μｇ／ｍＬチメンチン（ｔｉｍｅｎｔｉｎ）、および１０μｇ／ｍＬホスフィノトリシンからなる滅菌植物育成培地を含有する１３ｍｍφペトリディッシュに移した。培地上での種子の均質な分散は、水性種子懸濁液と等容積の融解した植物育成培地とを混合することによって、容易にされた。植物を、標準的な育成条件下で１０日間インキュベートした。ホスフィノトリシン耐性種苗を、ホスフィノトリシンを伴わない植物育成培地に移し、１８日間、育成した。
【０２５２】
トランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物におけるアルブチンレベルの決定
葉組織（４〜１５ｍｇ）を切り出し、１．５ｍＬのスクリューキャップ付チューブ（ザルスタット・インク（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｉｎｃ．）、ノースカロライナ州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ））に移した。水（２００μＬ）を各葉サンプルに添加し、１００℃で１時間のインキュベーションによって小さな分子を抽出した。遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間）によって葉抽出物を澄明にし、以下のようなＨＰＬＣによって分析した。反応生成物（１０μＬ）をノバ・パック（Ｎｏｖａ  Ｐａｋ）Ｃ８カラム（３．９×１５０ｍｍ、６０Å、４μｍ）上に注入した。カラムを、１ｍＬ／分の流速、以下の次の条件下で展開した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ，／１．５％ＨＰＯ４）、溶媒Ｂ（１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／１．５％ＨＰＯ４）；０〜５分０％Ｂ、５〜２０分０〜１００％Ｂ、２０〜２１分１００〜０％Ｂ、２１〜２５分０％Ｂ。ハイドロキノン配糖体（アルブチン）はλ＝２８２ｎｍで検出し、ハイドロキノンはλ＝２８８ｎｍで検出した。アルブチンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から得られる化学合成された真正のアルブチン（ハイドロキノンβ−Ｄ−グルコピラノシド）と識別不能である保持時間およびＵＶ吸収スペクトルに基づいて、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を同時発現する植物の水性抽出物において検出された。ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する植物の水性抽出物では、遊離のハイドロキノンを検出することはできなかった（図４）。
【０２５３】
これらの植物抽出物において検出されるアルブチンの同一性を、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）によって確認した。簡単に説明すると、４０μＬの植物抽出物を、ＺＯＲＢＡＸエクリプセ（Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、８０Å、３．５μｍ）（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、米国カリフォルニア州（ＣＡ，ＵＳＡ））上に注入した。カラムを以下の条件で展開した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）、溶媒Ｂ（１００％アセトニトリル）；０〜２５分間０％〜６０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）、２５〜２５．５分間６０〜１００％Ｂ（０．４ｍＬ／分）、２５．５〜３０分間１００％Ｂ（０．４ｍＬ／分）、３０〜３１分間１００％〜０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）、３１〜４０分間０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）。エレクトロスプレー・インターフェースを具備したヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）質量分析器ＭＳＤ１１００（アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、デラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））を使用して、分析物を検出した。データは、陽イオンモード、３ｋＶのキャピラリー電圧で獲得した。脱溶媒ガス流量は１２Ｌ／分の窒素であった。脱溶媒およびソースブロック温度は３５０℃であった。計器は単位分解能に同調させた。データは、ＭＳ実験について１秒間における８０〜６００ダルトンのスキャニングによって回収した。ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの両方を発現するトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の水性抽出物は、質量分析により分析する場合、３１０．９および２９０．０の質量電荷比（ｍ／ｚ＋）を示すエレクトロスプレー陽イオン化モードにおいて分子イオンを生成する新規の化合物を含有した。これらの分子イオンの特性は、ハイドロキノン配糖体（ＭＷ２７２．２５）のそれぞれカリウム付加物（ＭＷ３１１．３５）およびアンモニウム付加物（ＭＷ２９０．２９）の予想されるｍ／ｚ＋に極めて緊密に一致する。さらに、化合物は、一貫して、グルコース（ＭＷ＝１８０．１６）に対して予想されるｍ／ｚ＋と緊密に一致するｍ／ｚ＋＝１８０の断片を生成する。
【０２５４】
ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する植物の組織におけるアルブチン濃度を、既知濃度の化学合成されたアルブチンの標準物質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で確立した検量線を使用して、ＨＰＬＣ分析によって、決定した。表１は、異なるレベルのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を発現するＴ１植物の集団におけるアルブチン濃度を示す。表は、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物組織におけるＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子の同時発現によって、５．２８ｍｇ／ｇ新鮮重量までのアルブチン産生のレベルが、植物育成の僅か２８日後に達成され得ることを示す。
【０２５５】
【表２】
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【０２５６】
【表３】
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【０２５７】
【表４】
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【０２５８】
高レベルのハイドロキノン配糖体を産生するトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）系統（系統番号３２、３１、１６、１４）およびコントロール系統番号６９（ハイドロキノン配糖体の蓄積を示さない）を土壌に移し、８週間、２１℃、６０％相対湿度、および明期１４時間／暗期１０時間サイクルで育成した。葉組織におけるハイドロキノンおよびｐＨＢＡレベルを決定した。単一の葉を１．５ｍＬスクリューキャップ付ポリプロピレン製チューブに移し、５００μｌの１Ｍ  ＨＣｌを補充した。１００℃、１時間に設定した加熱ブロック中、密封したポリプロピレン製チューブのインキュベーションによって、組織を加水分解した。組織加水分解物に１００μＬの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を補充し、４３０μＬの１．１Ｎ  ＮａＯＨを添加した。中和した組織加水分解物の中性のｐＨを、ｐＨ指示紙によって確認した。葉ホモジネートを遠心分離によって澄明にした。１０μｌの澄明にされた組織加水分解物を、１．５％リン酸（溶媒Ａ）〜５０％ＭｅＯＨ、１．５％リン酸（溶媒Ｂ）の直線勾配ならびにｐＨＢＡの検出のために２５４ｎｍおよびハイドロキノンの検出のために２８９ｎｍでのＵＶ検出を使用するノバ−パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）（登録商標）Ｃ１８カラム（６０Åポアサイズ、４μＭ粒度）（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、米国（ＵＳＡ））上でのＨＰＬＣによって分析した。以下の溶媒の購買を適用した。０〜５分１００％溶媒Ａ；２０分１００％溶媒Ｂ；２１〜２５分１００％溶媒Ａ。ハイドロキノンおよびｐＨＢＡを、市販のｐＨＢＡおよびハイドロキノン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））によって作成した標準曲線を使用して定量した。
【０２５９】
表２に、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを発現するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）系統におけるｐＨＢＡおよびハイドロキノンレベルをまとめる。データは、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを発現するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物が、土壌に移した後も継続して、ｐＨＢＡからハイドロキノンを合成することを示す。いくつかのアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）系統では、６０％を超えるＣＰＬにより産生されるｐＨＢＡがハイドロキノンに変換される。ハイドロキノン（１１０．１）とアルブチン（２７２．１）との間の分子量の差異を考慮すると、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを発現する土壌育成アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物におけるアルブチンレベルは、４％乾燥重量（ＤＷ）に達する。
【０２６０】
【表５】
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【０２６１】
タバコにおけるハイドロキノン配糖体（アルブチン）の産生
ＴＰ−ＣＰＬ発現構築物を所有するトランスジェニックタバコ系統番号３４（ＣＰＬ３４）由来のＴ１種子の表面を滅菌し、発芽させ、滅菌条件下、カナマイシン（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含有するＭＳ培地上で育成した。２つの植物の節を含有する茎の外植体から再生される植物を、カナマイシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）およびチメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）ＴＭ（０．１ｍｇ／ｍＬ）（グラクソ・スミスクライン・リサーチ・トライアングル・パート（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｔ）ノースカロライナ州（ＮＣ））を含有するＭＳ培地上、マゼンタ・ボックス（Ｍａｇｅｎｔａ  ｂｏｘ）において育成した。植物を、１６時間、２３℃日中／８時間、２１℃夜間のサイクルに設定した温度および照明調節育成チャンバにおいて、４週間育成した。
【０２６２】
ｐＢＥ８５６（ＳＣＰ１：：ｐＨＢＡ１Ｈ）を所有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株の５０ｍＬ培養物を、ＬＢ培地中、３６時間、３０℃で増殖させた。細胞を遠心分離（７０００×ｇ）によって回収し、５０ｍＬ滅菌ＭＳ培地で２回洗浄し、最後に、４０ｍＬの同溶液に再懸濁した。上記の再生された１つのＴＰ−ＣＰＬタバコ植物体由来の葉を滅菌条件下で回収し、約１．５ｃｍ２の片に切断し、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の懸濁液中、３０分間、室温でインキュベートした。葉外植体を、シュート誘導プレート（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地、３％スクロース、１ｍｇ／Ｌベンジルアミノプリン、０．１ｍｇ／Ｌナフタレン酢酸、および０．８％寒天）に対し向軸側に配置し、室温で３日間インキュベートした。葉外植体を、５ｍｇ／Ｌグルホシネート−アンモニウム（フルカ／シグマ・アルドリッチ（Ｆｌｕｋａ／Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））、２５ｍｇ／Ｌカナマイシン、および１００ｍｇ／Ｌチメンチン（Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）ＴＭ（グラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））を含有するシュート誘導培地に移し、３週間ごとに新たな培地に継代培養した。プレートを、１６時間、２３℃日中／８時間、２１℃夜間のサイクルに設定した育成チャンバに配置した。切り出し可能なシュートを発根培地（ムラシゲ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ）最小有機培地、１％スクロース、および０．８％寒天）に移した。発根したシュートを終局的に土壌に移し、得られる植物を温室で育成した。
【０２６３】
トランスジェニックタバコ植物におけるアルブチンレベルの決定
葉組織（１０〜５０ｍｇ）を、滅菌条件下、発根培地で２１日間育成した植物から切り出した。組織を１．５ｍＬのスクリューキャップ付チューブ（ザルスタット・インク（Ｓａｒｓｔｅｄｔ  Ｉｎｃ．）、ノースカロライナ州ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ，ＮＣ））に移した。水（４００μＬ）を各葉サンプルに添加し、１００℃で１時間のインキュベーションによって小さな分子を抽出した。遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間）によって
葉抽出物を澄明にし、以下のようなＨＰＬＣによって分析した。反応生成物（１０μｌ）をノバ・パック（Ｎｏｖａ  Ｐａｋ）Ｃ８カラム（３．９×１５０ｍｍ、６０Å、４μｍ）上に注入した。カラムを、１ｍＬ／分の流速、以下の次の条件下で展開した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ，／１．５％ＨＰＯ４）、溶媒Ｂ（１００％ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ／１．５％ＨＰＯ４）；０〜５分０％Ｂ、５〜２０分０〜１００％Ｂ、２０〜２１分１００％Ｂ〜０％Ｂ、および２１〜２５分０％Ｂ。ハイドロキノン配糖体（アルブチン）はλ＝２８２ｎｍで検出し、ハイドロキノンはλ＝２８８ｎｍで検出した。
【０２６４】
アルブチンは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から得られる化学合成された真正のアルブチンと識別不能である保持時間およびＵＶ吸収スペクトルに基づいて、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を同時発現する植物の水性抽出物において検出された（図４）。さらに、これらの植物抽出物において検出されるアルブチンの同一性を、質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）によって確認した。４０μＬの植物抽出物を、ＺＯＲＢＡＸエクリプセ（Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、８０Å、３．５μｍ）（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）、米国（ＵＳＡ））上に注入した。カラムを以下の条件で展開した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）、溶媒Ｂ（１００％アセトニトリル）；０〜２５分０％〜６０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）、２５〜２５．５分６０〜１００％Ｂ（０．４ｍＬ／分）、２５．５〜３０分１００％Ｂ（０．４ｍＬ／分）、３０〜３１分１００％〜０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）、および３１〜４０分０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）。エレクトロスプレー・インターフェースを具備したヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）質量分析器ＭＳＤ１１００を使用して、分析物を検出した。データは、陽イオンモード、３ｋＶのキャピラリー電圧で獲得した。脱溶媒ガス流量は１２Ｌ／分の窒素であった。脱溶媒およびソースブロック温度は３５０℃であった。計器は単位分解能に同調させた。データは、ＭＳ実験について１秒間における８０〜６００ダルトンのスキャニングによって回収した。
【０２６５】
ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの両方を発現するトランスジェニックアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物の水性抽出物は、新たな化合物を含有した。質量分析によって分析する場合、３１１．０および２９０．０の質量電荷比（ｍ／ｚ＋）を示すエレクトロスプレー陽イオン化モードにおける分子イオンが生成される。これらの分子イオンの特性は、ハイドロキノン配糖体（ＭＷ２７２．２５）のそれぞれカリウム付加物（ＭＷ３１１．３５）およびアンモニウム付加物（ＭＷ２９０．２９）の予想されるｍ／ｚ＋に極めて緊密に一致する。さらに、化合物は、一貫して、グルコース（ＭＷ＝１８０．１６）に対して予想されるｍ／ｚ＋と緊密に一致するｍ／ｚ＋＝１８０．０の断片を生成する。
【０２６６】
ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を発現する植物の組織におけるアルブチン濃度を、既知濃度の化学合成されたアルブチンの標準物質で確立した検量線を使用して、ＨＰＬＣ分析によって、決定した。表３は、異なるレベルのｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を発現するＴ１植物の集団におけるアルブチン濃度を示す。この表は、タバコ植物組織におけるＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子の同時発現により、植物育成の僅か２１日後に、５．２９ｍｇ／ｇ新鮮重量もの高いレベルのアルブチンが産生され得ることを示す（図４）。
【０２６７】
【表６】
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【０２６８】
【表７】
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【０２６９】
高レベルのハイドロキノン配糖体を産生するトランスジェニックタバコ系統（系統番号１３、１１、４２、８、２４、４５、１９、１０、２７、４４、６、４３、３５、９、および１４）ならびにコントロール系統３４（ＣＰＬ３４、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を欠く）を土壌に移し、７７日間、温室条件下で育成した。土壌において育成したタバコ系統の葉組織におけるハイドロキノンおよびｐＨＢＡレベルを以下のように決定した。従来のコルクボーラーを使用して、各トランスジェニック系統の成熟葉から、４枚のリーフディスク（１ｃｍ直径）を回収した。３枚のリーフディスクの重量を、回収直後、および組織サンプルを６５℃で２４時間乾燥後に再度決定した。第４のリーフディスクを１．５ｍＬスクリューキャップ付ポリプロピレン製チューブに移し、５００μｌの１Ｍ  ＨＣｌを補充した。１００℃、１時間に設定した加熱ブロック中、密封したポリプロピレン製チューブのインキュベーションによって、組織を加水分解した。組織加水分解物に１
００μＬの１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を補充し、４３０μＬの１．１Ｎ  ＮａＯＨを添加した。中和した組織加水分解物の中性のｐＨを、ｐＨ指示紙（ＶＷＲ、米国（ＵＳＡ））を使用して、確認した。葉ホモジネートを遠心分離によって澄明にし、水で５倍に希釈した。１０μＬの希釈した組織加水分解物を、１．５％リン酸（溶媒Ａ）〜５０％ＭｅＯＨ、１．５％リン酸（溶媒Ｂ）の直線勾配ならびにｐＨＢＡの検出のために２５４ｎｍおよびハイドロキノンの検出のために２８９ｎｍでのＵＶ検出を使用するノバ−パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）（登録商標）Ｃ１８カラム（６０Åポアサイズ、４μＭ粒度）上でのＨＰＬＣによって分析した。以下の溶媒の勾配を適用した。０〜５分１００％溶媒Ａ；２０分１００％溶媒Ｂ；２１〜２５分１００％溶媒Ａ。ハイドロキノンおよびｐＨＢＡを、市販のｐＨＢＡおよびハイドロキノンによって作成した標準曲線を使用して定量した。
【０２７０】
表４に、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを発現するタバコ系統におけるｐＨＢＡおよびハイドロキノンレベルをまとめる。表は、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを発現するタバコ植物が、土壌に移した後も継続して、ｐＨＢＡからハイドロキノンを合成することを示す。いくつかのタバコ系統では、ＣＰＬにより産生される９５％を超えるｐＨＢＡがハイドロキノンに変換される。ハイドロキノン（１１０．１）とアルブチン（２７２．２５１）との間の分子量の差異、およびトランスジェニック系統の非処置組織抽出物のＨＰＬＣ分析によって遊離の非抱合ハイドロキノンが検出されなかった事実を考慮すると、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを発現する土壌育成タバコ植物におけるアルブチンレベルは、温室条件下の育成の７７日後に２４．９％ＤＷに達する。
【０２７１】
【表８】
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【０２７２】
実施例６
ハイドロキノンを効率的にグルコシル化してアルブチンを形成させるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の発現クローニングおよび生化学的特徴付け
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）の発現配列タグ（ＥＳＴ）に関する出願人らのデータベースの解析により、この植物がインドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）のアルブチンシンターゼタンパク質に６２％配列同一性を示すポリペプチドをコードするグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＵＧＴ７２Ｂ１）を構成的に発現することが示される（アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３：１８７−１９３（２０００）：ヘフナー（Ｈｅｆｎｅｒ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１０：１７３１−１７４１（２００２））。酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において先に組換え的に産生されており、安息香酸誘導体によるその活性が記載されている（リム（Ｌｉｍ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１）：５８６−５９２（２００２）：国際公開第０２／１０３０２２Ａ２号パンフレット）。本研究において分析した安息香酸誘導体のうち、ＵＧＴ７２Ｂ１酵素は、２，５−ジヒドロキシ安息香酸による最も高い特異的活性を示した。この基質による酵素の特異的活性（１１．７２ｐｋａｔ／μｇタンパク質）は、３０℃で約０．６／秒の代謝回転数に変換される。このタンパク質の生化学的変換（具体的には、他の基質によるその活性）は、本開示以前は不明であった（ヘフナー（Ｈｅｆｎｅｒ）ら、上掲）。ＴＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、ＵＧＴ７２Ｂ１酵素（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号１１６３３７．１）の公開された配列を使用し、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＥＳＴ配列の出願人らのデータベースを調査した。ＵＧＴ７２Ｂ１転写物の５’末端に対応する配列を含有するＥＳＴクローンを同定した。
【０２７３】
アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＧＴ７２Ｂ１の発現クローニング
ＵＧＴ７２Ｂ１のＯＲＦのフランキング領域を、高レベル大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター、ｐＥＴ２８ａ（＋）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））への挿入のためのＰＣＲによって修飾した。この挿入は、プライマー１７および１８ならびに増幅のための標的として本来のｃＤＮＡクローンから精製されたプラスミドＤＮＡを使用して達成した。
【０２７４】
プライマー１７−（配列番号３９）
５’−ＧＡＡＴＡＴＴＴＧＣＡＴｃｃａｔｇｇＡＧＧＡＡＴＣＣ−３’
【０２７５】
プライマー１８−（配列番号４０）
５’−ＧＡＡＣＡＴＣｇｔｃｇａｃＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣ−３’
【０２７６】
下線を付した塩基は、標的遺伝子にハイブリダイズする一方、小文字はＰＣＲプライマーの末端に付加された制限部位（ＮｃｏＩまたはＳａｌＩ）を示す。プライマー１７は遺伝子の開始部でハイブリダイズし、開始コドンでＮｃｏＩ部位を導入する一方、プライマー１８は対向末端でハイブリダイズし、終止コドンのすぐ後にＳａｌＩ部位を提供する；いずれのプライマーもＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子のＯＲＦの推定アミノ酸配列を変更しない。ＰＣＲ反応は、５０ｍｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、５単位のＴａｑ（登録商標）ポリメラーゼ（ＭＢＩファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））、１０ｎｇのｃＤＮＡプラスミドテンプレート、および０．２μＭの最終濃度で両ＰＣＲプライマーを含有した。２５サイクルの増幅を行い、各サイクルは９４℃で１．５分間、５５℃で１．５分間、および７２℃で２．５分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、ゲル精製し、得られた断片を、同じ制限酵素で消化した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター、ｐＥＴ−２８ａ（＋）（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））に連結した。連結反応混合物を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂを形質転換し、代表的なコロニー由来のプラスミドＤＮＡを完全に配列決定して、ＰＣＲエラーを確認したが；エラーは認められなかった。さらなる操作のために選択したプラスミドを、以下、「ｐＥＴ２８ａ／ＵＧＴ７２Ｂ１」と称する。ＵＧＴ７２Ｂ１オープンリーディングフレームの配列および酵素の推定アミノ酸配列を、それぞれ配列番号４１および配列番号４２に記載する。
【０２７７】
エレクトロポレーションによって、ｐＥＴ２８ａ／ＵＧＴ７２Ｂ１を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞に導入した。組換えクローンを、５０ｍｇｌ−１カナマイシンの存在下、ＬＢ培地上で増殖させた。
【０２７８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換えＵＧＴ７２Ｂ１の産生
１０Ｌ発酵槽の稼動（ブラウン・インスツルメンツ（Ｂｒａｕｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、バイオスタット（Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｃ  １５Ｌファーメンター、ペンシルバニア州アレンタウン（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ））を行って、組換え産生されたＵＧＴ７２Ｂ１タンパク質を精製するのに十分な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞塊を産生させた。下記の組成を伴う９．５Ｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）増殖培地に、ｐＥＴ２８ａ／ＵＧＴ７２Ｂ１構築物を所有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞の種培養物（５００ｍＬ  ＬＢ５０ｍｇ／Ｌカナマイシン）を接種した。種培養物を３５℃で、約１０時間、３のＯＤ５５０ｎｍまで増殖させた。
【０２７９】
発酵培地の組成（１Ｌあたり）：
【０２８０】
【表９】
2007525966.tif 000010
【０２８１】
ＩＬ２微量栄養素ストック溶液の組成（１Ｌあたり）：
【０２８２】
【表１０】
2007525966.tif 000011
【０２８３】
培地の滅菌後、以下の組成物を、滅菌ストック溶液から指示された最終濃度で添加した
。
【０２８４】
【表１１】
2007525966.tif 000012
【０２８５】
発酵稼働中、以下の設定ポイントを使用した。
撹拌：３７５ｒｐｍ
気流量：６ｓｌｐｍ（１分間あたりの標準リットル）
温度：１７℃
ＣＯ２：１０％、カスケード撹拌機、次いで気流
圧力：０．５バール
ｐＨ：６．８
【０２８６】
培養物を、約２５時間、１５のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。続いて、ＩＰＴＧを滅菌ストック溶液から０．４ｍＭの最終濃度で添加し、発酵をさらに２４時間、継続させた。細胞ペーストを回収し、−８０℃で貯蔵した。
【０２８７】
組換え産生されたＵＧＴ７２Ｂ１酵素の大規模精製
上記のようにして得られた細胞ペースト（５０ｇ湿重量）を、９５ｍＬの氷冷１００ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭジチオスレイトール、０．０３ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡｓｅＩ、および０．５ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドに再懸濁し、フレンチ・プレッシャー・セル（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）に２０，０００ｐｓｉで２回通過させた。他に示さない限り、以後の工程は０〜４℃であった。細胞破砕物を遠心分離（４３，０００×ｇ、９０分間）によって取り出し、得られた無細胞抽出物（約１１０ｍＬ）（１ｍＬあたり約４０ｍｇのタンパク質を含有する）に、グリセロール（５％）を補充し、以後の精製のために−８０℃で貯蔵した。
【０２８８】
ＵＧＴ７２Ｂ１の精製の第１の工程は陰イオン交換クロマトグラフィーであった。粗抽出物（１２．５ｍＬ）を２．５ｍＬアリコートにおいて、ＰＤ−１０カラム上、Ｑ緩衝液（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）、１０ｍＭ亜硫酸ナトリウム、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）へバッファー交換し、０．２μｍアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）フィルター（ゲルマン−パル・ライフ・サイエンシズ（Ｇｅｌｍａｎ−Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を介してろ過した。次いで、サンプル全体（１７．５ｍＬ）を、２５℃、緩衝液Ｑで予め平衡化したＭｏｎｏＱ  ＨＲ１６／１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に適用した。カラムを、４ｍＬ／分、緩衝液Ｑで最初の２０分間、展開し、続いて、これに（緩衝液Ｑ中）０〜２５０ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配（１４０ｍＬ）を適用した。勾配の最初から画分（８ｍＬ）を回収した。各カラム画分のアリコート（１０μＬ）を、基質としてｐ−ニトロフェノール（ｐＮＰ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を使用し、ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ活性について試験した。このアッセイの基礎は、グルコースがｐＮＰのフェノール性水酸基に付着する場合の黄色の消失である。室温で実施された１００μＬの反応物は、４０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２４０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース、および１４８μＭ  ｐＮＰを含有した。視覚的アッセイに基づいて、究極的に、すべての組換えタンパク質がフラクション８で検出された。
【０２８９】
勾配の終了時に、カラムを１Ｍ  ＮａＣｌ（緩衝液Ｑ中）で広範に洗浄し、初期条件を再確立した。活性画分に１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．３４）、１０ｍＭジチオスレイトール、および５％グリセロールを補充し、氷上で保持する一方、無細胞抽出物のさらに５つの１２．５ｍＬアリコートを同一の様式で処理した。６つのすべての行程由来の活性画分を合わせて、以後のプロセシングのために−８０℃で貯蔵した。
【０２９０】
次の工程では、プールした画分（６０ｍＬの総容積）をサイズ排除クロマトグラフィーに供した。４つのセントリペップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｅｐ）−３０デバイス（ミリポア・コープ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．））を使用して、サンプル全体を６ｍＬの最終容積に濃縮し、０．２μｍアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）フィルターを介してろ過し、次いで、ＴＳＫ−Ｇｅｌ（登録商標）Ｇ３０００ＳＷゲルろ過カラム（２１×６００ｍｍ）（トーソー・バイオセプ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｅｐ）ＬＬＣ．、ペンシルバニア州モンゴメリービル（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ））上、２ｍＬアリコートにおいて分画した。カラムを、４ｍＬ／分、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、３３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（２５℃）で展開した。３２．５〜３４．４分の間で溶出した材料（基質としてのｐＮＰによるＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ活性のピークに対応する）を回収し、５．８％グリセロールで補充した。この手順をさらに２回繰り返したところで、サンプル全体を使い果たした。３つのすべてのろ過カラム由来の活性画分を合わせて、さらなるプロセシングのために、さらになる４．８５ｍＭジチオスレイトールで補充した。
【０２９１】
ＵＧＴ７２Ｂ１酵素を、ハイドロキシアパタイト上でのクロマトグラフィーによって、さらに精製した。簡単に説明すると、上記の材料をセントリペップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｅｐ）−３０において３ｍＬにまで濃縮し、０．２μｍアクロディスク（Ａｃｒｏｄｉｓｃ）フィルターを介してろ過した。濃縮した材料の４分の１（０．７５ｍＬ）を、１０ｍＬの緩衝液ｈ（１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．３４）、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で希釈した。次いで、サンプル全体を、緩衝液Ｈで予め平衡化した１００×７．８ｍｍ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＰＨＴハイドロキシアパタイトカラム上に注入した。カラムを、１ｍＬ／分（２５℃）、緩衝液ｈで最初の１２分間、展開し、続いて、これに（緩衝液Ｈ中）１０〜３５０ｍＭリン酸ナトリウムの直線勾配（２５ｍＬ）を適用した。約１０９〜１６０ｍＭの間のリン酸ナトリウムにおいて溶出した画分をプールし、６．５２％グリセロールおよび１０ｍＭジチオスレイトールで補充し、ドライアイス上で凍結する一方、サンプルの残りを３つの同一の行程において同一の様式で処理し、サンプル全体を使い果たした。４つのすべての行程由来のプールした画分を合わせて、１４ｍＬの合計容積を得、この材料を−８０℃で凍結した。下記の酵素アッセイの前に、ＵＧＴ７２Ｂ１酵素調製物をさらに濃縮した。７ミリリットルの上記のプールしたハイドロキシアパタイト材料を、３つのＰＤ−１０カラムを使用して、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣＬ（ｐＨ７．０）および１ｍＭ  ＤＴＴへバッファー交換した。ＰＤ溶出液を合わせて、セントリペップ（Ｃｅｎｔｒｉｐｅｐ）−３０デバイスを使用して、１．１ｍＬに濃縮した。濃縮したサンプルにおけるＵＧＴ７２Ｂ１タンパク質の最終タンパク質濃度は、１４．６４ｍｇ／ｍＬであった。５０，２５０Ｍ−１の２８０ｎｍでの吸光係数を使用して、タンパク質濃度を分光光度により決定した（配列番号４２を使用して、ＧＣＧのペプチドソート（Ｐｅｐｔｉｄｅｓｏｒｔ）プログラムによって算出される）。過剰に充填されたクマシー染色ゲルが目視で認められたことから、精製された組換えＵＧＴ７２Ｂ１タンパク質は少なくとも９５％の純度であることが示された。
【０２９２】
ハイドロキノンによるＵＧＴ７２Ｂ１の動力学的特性の分析
基質ハイドロキノンによるＵＧＴ７２Ｂ１の動力学的特性を決定した。５０ｍＭトリス
（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２ｍＭ  ＤＴＴを使用して、酵素を０．１１５  ｎｇ／μＬの最終濃度にまで希釈した。５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）ＨＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｍＭ  ＵＤＰＧ、および４ｍＭ〜７．８μＭの範囲のハイドロキノンの存在下、２５μＬの最終容積の５μＬ（０．５７ｎｇ）のＵＧＴ７２Ｂ１を使用して、５分間、３７℃で、ハイドロキノンＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼ（ＨＱ−ＧＴ）活性をアッセイした。アルブチン形成を、ＨＰＬＣ分析によって、以下のように定量した。１０μＬの分析物を、ノバ−パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）（登録商標）Ｃ１８カラム（６０Åポアサイズ、４μＭ粒度）上、２％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ａ）〜４８％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ｂ）の勾配を使用して、分離した。以下の溶媒の勾配が適用される。０〜５分１００％溶媒Ａ；５〜２０分０〜１００％溶媒Ｂの直線勾配；２１〜２５分１００％溶媒Ａ。アルブチンを２２１ｎｍ吸収波長で検出し、市販のアルブチンの標準物質で作成した検量線を使用して定量した。
【０２９３】
データをミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）の式に適合した。これらの条件下、見かけのＫｍおよびＶｍａｘ値は、それぞれ約０．３μＭおよび約７９６ｐｍｏｌ／秒／μｇであった。７．８、１５．６、３１．２５、および６２．５μＭのハイドロキノン濃度で決定される速度を使用して、速度／基質濃度対速度をプロットすることによって、ホフスティ（Ｈｏｆｓｔｅｅ）プロットを使用して、これらのパラメータを決定した（図５）。このプロットでは、Ｋｍの推定値は、ポイントを介して線形回帰曲線を提示する直線の傾きとして提供され、Ｖｍａｘは回帰曲線のｙ軸切片として提供される。図５は、酵素アッセイデータのミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）プロットを示す。図は、酵素が、１００μＭを超えるハイドロキノン濃度で、有意な基質阻害に供されることを示す。
【０２９４】
ハイドロキノンによるＵＧＴ７２Ｂ１酵素のＶｍａｘは、ＵＧＴ７２Ｂ１酵素および安息香酸基質で決定されるＶｍａｘ値（リム（Ｌｉｍ）ら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７７（１）：５８６−５９２（２００２））よりも有意に（約６８倍）高い。ハイドロキノンに対するＵＧＴ７２Ｂ１酵素のＶｍａｘは、３７℃で４２／秒の代謝回転数を提示する。この代謝回転数は、ＧＣＧのＰＥＰＩＤＥＳＯＲＴソフトウェア・パッケージにより算出された５３，０１５．３３ＤａのＵＧＴ７２Ｂ１酵素の分子量を使用して、算出した。この代謝回転数は、１ｍＭハイドロキノンの存在下、５０℃で２６．３２ｐｋａｔ／μｇのＶｍａｘを有することが報告されたインドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ  ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）アルブチンシンターゼの代謝回転数（アレンド（Ａｒｅｎｄ）ら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５３：１８７−１９３（２０００））よりも有意に高かった。このＶｍａｘは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（登録商標）受入番号ＡＪ３１０１４８．１を使用して算出されたアルブチンシンターゼタンパク質の分子量の５１，７９３．０１Ｄａを使用し、ＧＣＧのＰＥＰＩＤＥＳＯＲＴソフトウェア・パッケージにより、５０℃で約１．４／秒の代謝回転数に変換することができる。
【０２９５】
出願人らは、ハイドロキノンの抱合のためのＵＧＴ７２Ｂ１酵素の予想外および独特な有用性について開示する。酵素の特有性は、ハイドロキノンとの活性を有する先に開示された他の任意のグルコシルトランスフェラーゼの効率を明らかに超える１４０のｋｃａｔ（ｓ−１）／Ｋｍ（μＭ）として表される触媒効率によって、例示される。
【０２９６】
実施例７
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−Ｈおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＨＱ−ＧＴの発現のための合成オペロンの構築
単一の転写単位から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてアルブチンを産生させるのに必要な３種のすべての酵素の翻訳を可能にするポリシストロニックな転写物を発現するプラ
スミドが構築される。これを達成するためのクローニングストラテジーを図６に概略する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＣＰＬ遺伝子（配列番号２９）を所有するｐＥＴ２４ａ構築物のプラスミドＤＮＡを、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩでの制限消化によって、線状化する。線状化されたプラスミドＤＮＡを２つの制限断片と組み合わせるが、それぞれの断片は、リボゾーム結合部位ならびにそれぞれｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームを含有する。両遺伝子の制限断片は以下のようにして作製される。
【０２９７】
実施例３に記載のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の組換え産生のためのｐＥＴ２９Ａ構築物のプラスミドＤＮＡを、プライマー１９（配列番号４３）および２０（配列番号４４）を使用するＰＣＲ反応において使用する。
【０２９８】
プライマー１９−（配列番号４３）：
５’−ｇｔｃｇａｃＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣ−３’
【０２９９】
プライマー２０−（配列番号４４）：
５’−ｇｔｃｇａｃＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＡＡＴＧＧ−３’
大文字で表した下線を付したヌクレオチドは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの組換え発現のためのｐＥＴ２９Ａ構築物の配列に対応する。小文字で表したヌクレオチドは、ＰＣＲ産物の５’および３’末端にそれぞれＳａｌＩ制限部位を導入する。太字で表した配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における効率的な翻訳のためのリボゾーム結合部位に対応する。
【０３００】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー１９およびプライマー２０、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）と１００ｎｇのｐＥＴ２９Ａ−ｐＨＢＡ１−Ｈ  ＤＮＡテンプレートとを組み合わせた。２５サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングする。組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地において増殖させる。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供する。ＰＣＲにより誘導される変異体を欠くプラスミドＤＮＡをＳａｌＩで消化する。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を提示する１．４ｋｂＳａｌＩ制限断片をゲル精製する。
【０３０１】
実施例６に記載のアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼタンパク質の組換え産生のためのｐＥＴ２８Ａ構築物のプラスミドＤＮＡを、プライマー２１（配列番号４５）および２２（配列番号４６）を使用するＰＣＲ反応において使用する。
【０３０２】
プライマー２１−（配列番号４５）：
５’−ｇｔｃｇａｃＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣ−３’
【０３０３】
プライマー２２−（配列番号４６）：
５’−ｃｔｃｇａｇＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣ−３’下線を付したヌクレオチドは、先に記載のアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼタンパク質の組換え発現のためのｐＥＴ２８Ａ構築物の配列に対応する。小文字で表したヌクレオチドは、ＰＣＲ産物の５’および３’末端にそれぞれ、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限部位を導入する。太字で表した配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における効率的な翻訳のためのリボゾーム結合部位に対応する。
【０３０４】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー２１およびプライマー２２、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）と１００ｎｇのｐＥＴ２８Ａ−ＨＱ  ＧＴ  ＤＮＡテンプレートとを組み合わせた。２５サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングする。組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地において増殖させる。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供する。ＰＣＲにより誘導される変異体を欠くプラスミドＤＮＡを、ＳａｌＩおよびＸｈｏＩで順に消化する。ＨＱ  ＧＴ酵素を提示する１．４ｋｂＳａｌＩ／ＸｈｏＩ制限断片をゲル精製する。
【０３０５】
１００ｎｇのＳａｌＩ  ＸｈｏＩ線状化され、ゲル精製されたｐＥＴ２４ａ−ＣＰＬ  ＤＮＡならびに各５０ｎｇのＳａｌＩ  ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼおよびＳａｌＩ／ＸｈｏＩハイドロキノンＧＴ断片からなる５μＬの最終容積において、連結反応が集成される。連結産物は、製造者の指示に従って、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国（ＵＳＡ））に導入される。組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地上で回収し、液体ＬＢ培地中、選択条件下で増殖させる。プラスミドＤＮＡを単離し、ＸｂａＩによる診断的制限消化に供する。図６に例示される配向で３種のすべての遺伝子を含有するプラスミドクローンを使用して、５ｋｂのｐＥＴ２４ａベクター断片ならびにＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−Ｈ、および１．２ｋｂのＨＱ−ＧＴ遺伝子からなる３．２ｋｂの断片を産生させる。ＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−Ｈ、およびＨＱ−グルコシルトランスフェラーゼタンパク質の同時発現のためのｐＥＴ２４ａベクター構築物のＤＮＡ挿入物の配列を配列番号４７に記載する。
【０３０６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−Ｈ、およびＨＱ−グルコシルトランスフェラーゼ酵素の同時発現によって容易にされるアルブチン産生のために、上記のｐＥＴ２４ａプラスミド構築物を、誘導性プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に導入する。この特性を伴う適切な宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３である（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、米国ウィスコンシン州（ＷＩ，ＵＳＡ））。この株では、Ｔ７ポリメラーゼの発現はｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。プラスミドを、エレクトロポレーションによって発現宿主に導入する。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地上で選択する。
【０３０７】
グルコースからアルブチンを産生させるために、アルブチン産生プラスミドを所有するＢＬ２１ＤＥ３宿主の単一のコロニーを使用して、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する１００ｍＬの滅菌Ｍ９培地（１リットルあたり：６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのグルコース、１ｇのＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭチアミン、および０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に接種した。細胞を、連続振盪（２５０ｒｐｍ）下、２５℃で、０．６のＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、０．２５ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって、アルブチン産生を誘導する。２４時間後、培養培地および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるアルブチン濃度を以下のように決定する。培養物（１ｍＬ）を遠心分離により回収する。培養上清を、下記のようなＨＰＬＣ分析供する。細胞ペレットを５０μＬの水に再懸濁する。水性細胞懸濁液に等容積の１００％ＭｅＯＨを補充することによって、細胞含有物を抽出する。細胞懸濁液を遠心分離によって澄明にし、培養培地およびメタノール精細胞抽出物を以下のようなＨＰＬＣ分析に供する。１０μＬの分析物を、ノバ−パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）（登録商標）Ｃ１８カラム（６０Åポアサイズ、４μＭ粒度）上、２％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ａ）〜４８％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ｂ）の勾配および２８２ｎｍでのＵＶ検出を使用して、分離する。以下の溶媒の勾配を適用した。０〜５分１００％溶媒Ａ；５〜２０分０〜１００％溶媒Ｂの直線勾配；２１〜２５分１００％溶媒Ａ。アルブチンを２８２ｎｍ吸収波長で検出し、市販のアルブチンの標準物質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で作成した検量線を使用して定量した。
【０３０８】
最も高いアルブチン産生に適したレベルでＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼの同時発現を可能にするプラスミドベクターの作製
先に記載のＤＮＡ構築物は、同じ、極めて強力なＴ７プロモーターの制御下で、単一のプラスミドからのアルブチン産生に必要な３種のすべての遺伝子を発現する。アルブチン産出およびそれらの力価の改良を生じるアルブチン産生の分野のさらなる進歩には、アルブチン産生に必要な酵素の触媒効率の差異を考慮する必要がある。例えば、コリスミ酸からアルブチンへの変換に必要な３種の酵素の触媒効率（Ｋｃａｔ（ｓ−１）／Ｋｍ（μＭ）として表される）は、ＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−Ｈ、およびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＨＱ  ＧＴ酵素に対し、それぞれ０．０８３、３２、および１４０である。従って、アルブチン合成経路の後者の２つの酵素は、流動に影響を及ぼすことなく、従って、高いレベルのタンパク質発現に関連する有害な影響を緩和して、ＣＰＬよりも有意に低いレベルで発現され得る。この原理では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞質における３種の酵素の安定性の可能な差異を説明されない。いずれにせよ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における改善された生成物の形成のための酵素の発現レベルの精巧な同調には、アルブチン経路において使用される３種の酵素の発現レベルを独立して調節する能力が必要である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における異種遺伝子の発現レベルは、プラスミドのコピー数およびプロモーターの強度の両方によって制御される。
【０３０９】
出願人らは、ｐＨＢＡ  １−Ｈ遺伝子およびＨＱ  ＧＴ遺伝子の発現がｌａｃプロモーターの制御下にある２つの共存可能なプラスミドｐＭＰＭＴ３  ｐＨＢＡ１−ＨおよびｐＣＬ１９２０  ＨＱ  ＧＴの構築について説明している。このプロモーターは、Ｔ７プロモーターより弱い。さらに、ｐＭＰＭＴ３のｐ１５ａ  ｏｒｉ（１０〜１２コピー／細胞）（メイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら、Ｇｅｎｅ，１６３：４１−４６（１９９５））およびｐＣＬ１９２０のｐＳＣ１０１  ｏｒｉ（５コピー／細胞）（レナー（Ｌｅｒｎｅｒ）およびイノウエ（Ｉｎｏｕｙｅ）、ＮＡＲ，１８（１５）：４６３１（１９９０））は、上記のｐＥＴ２４ベクターよりも有意に低い細胞あたりのコピー数を生じる。新たな発現プラスミドのプロモーター強度およびプラスミドコピー数の両方は、ｐＥＴ２４ａベクターにおいてＣＰＬ遺伝子よりも有意に低いｐＨＢＡ１−ＨおよびＨＱ−ＧＴ遺伝子の発現をもたらし、従って、提唱されるアルブチン経路の３種の触媒の効率において劇的な差異を説明する。
【０３１０】
ｌａｃプロモーターの制御下でｐＨＢＡ  １−Ｈ遺伝子を発現するｐＭＰＭＴ３誘導性プラスミドを作製する。実施例３に記載のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の組換え産生のために使用されるｐＥＴ２９Ａ構築物のプラスミドＤＮＡを、プライマー２３（配列番号４８）および２４（配列番号４９）を使用するＰＣＲ反応において使用する。
【０３１１】
プライマー２３−（配列番号４８）：
５’−ｇｇｔａｃｃＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣ−３’
【０３１２】
プライマー２４−（配列番号４９）：
５’−ｇａｇｃｔｃＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＡＡＴＧＧ−３’
大文字で表した下線を付したヌクレオチドは、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの組換え発現のためのｐＥＴ２９Ａ構築物の配列に対応する。小文字で表したヌクレオチドは、ＰＣＲ産物の５’および３’末端にそれぞれ、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ制限部位を導入する。太字で表した配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における翻訳の効率的な開始ためのリボゾーム結合部位に対応する。太字の斜字体で表した配列は、ｐＭＰＭＴ３ベクターのβ−ガラクトシダーゼα−断片遺伝子のイニシエーターメチオニンからの翻訳を終結する終止コドンである。
【０３１３】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー２３およびプライマー２４、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）と１００ｎｇのｐＥＴ２９Ａ−ｐＨＢＡ１−Ｈ  ＤＮＡテンプレートとを組み合わせた。２５サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングする。組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地において増殖させる。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供する。ＰＣＲにより誘導される変異体を欠くプラスミドＤＮＡをＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化する。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を提示する１．４ｋｂの制限断片をゲル精製し、ＫｐｎＩおよびＳａｃＩ制限酵素で消化しておいたｐＭＰＭＴ３ベクターに連結する。連結産物をエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換し、形質転換体を、１０ｇ／Ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上で選択する。プラスミドＤＮＡは標準的なプロトコルを使用して、単離される。
【０３１４】
ｌａｃプロモーターの制御下でアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＨＱ−ＧＴ遺伝子を発現するｐＣＬ１９２０誘導性プラスミドを作製する。実施例６に記載のグルコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ７２Ｂ１）タンパク質の組換え産生のためのｐＥＴ２８Ａ構築物のプラスミドＤＮＡを、プライマー２５（配列番号５０）および２６（配列番号５１）を使用するＰＣＲ反応において使用する。
【０３１５】
プライマー２５−（配列番号５０）：
５’−ｇｇａｔｃｃＧＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣ−３’
【０３１６】
プライマー２６−（配列番号５１）：
５’−ａａｇｃｔｔＴＴＡＧＴＧＧＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＧＣＴＣＴＡＡＣＴＣ−３’大文字で表した下線を付したヌクレオチドは、ＵＧＴ７２Ｂ１グルコシルトランスフェラーゼの組換え発現のためのｐＥＴ２８Ａ構築物の配列に対応する。小文字で表したヌクレオチドは、ＰＣＲ産物の５’および３’末端にそれぞれ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する。太字で表した配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における翻訳の効率的な開始ためのリボゾーム結合部位に対応する。太字の斜字体で表した配列は、ｐＣＬ１９２０ベクターのβ−ガラクトシダーゼα−断片遺伝子のイニシエーターメチオニンからの翻訳を終結する終止コドンである。
【０３１７】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２  ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、
１μＭのプライマー２５およびプライマー２６、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）と１００ｎｇのｐＥＴ２８Ａ−ＵＧＴ７２Ｂ１  ＤＮＡテンプレートとを組み合わせた。２５サイクルのＰＣＲを行い、それぞれは９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングする。組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地において増殖させる。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供する。ＰＣＲにより誘導される変異体を欠くプラスミドＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。ＵＧＴ７２Ｂ１遺伝子を提示する１．４ｋｂの制限断片をゲル精製し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化しておいたｐＭＰＭＴ３ベクターに連結する。連結産物をエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に形質転換し、形質転換体を、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシンを含有するＬＢ培地上で選択する。プラスミドＤＮＡは標準的なプロトコルを使用して、単離される。
【０３１８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−Ｈ、およびＨＱ−グルコシルトランスフェラーゼ酵素の同時発現によって容易にされるアルブチンのために、ｐＥＴ２４ａＣＰＬ（実施例４）、ｐＭＰＭＴ３ｐＨＢＡ１−Ｈ、およびｐＣＬ１９２０  ＨＱ−ＧＴプラスミドベクターを、誘導性プロモーターの制御下でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に導入する。この特性を伴う適切な宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３である（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））。この株では、Ｔ７ポリメラーゼの発現はｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。プラスミドを、エレクトロポレーションによって発現宿主に同時に導入する。５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含有するＬＢ培地上で、形質転換体を選択する。
【０３１９】
グルコースからアルブチンを産生させるために、３種のアルブチン産生プラスミドを所有するＢＬ２１ＤＥ３宿主の単一のコロニーを使用して、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、５０ｍｇ／Ｌスペクチノマイシン、および１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含有する１００ｍＬの滅菌Ｍ９培地（１リットルあたり：６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのグルコース、１ｇのＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭチアミン、および０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に接種した。細胞を、連続振盪（２５０ｒｐｍ）下、２５℃で、０．６のＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、１ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することによって、アルブチン産生を誘導する。２４時間後、培養培地および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるアルブチン濃度を以下のように決定する。培養物（１ｍＬ）を遠心分離により回収する。培養上清を、下記のようなＨＰＬＣ分析供する。細胞ペレットを５０μＬの水に再懸濁し、水性細胞懸濁液に等容積の１００％ＭｅＯＨを補充することによって、細胞含有物を抽出する。細胞懸濁液を遠心分離によって澄明にし、培養培地およびメタノール精細胞抽出物を以下のようなＨＰＬＣ分析に供する。１０μＬの分析物を、ノバ−パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）（登録商標）Ｃ１８カラム（６０Åポアサイズ、４μＭ粒度）上、２％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ａ）〜４８％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ｂ）の勾配および２８２ｎｍでのＵＶ検出を使用して、分離する。以下の溶媒の勾配を適用した。０〜５分１００％溶媒Ａ；５〜２０分０〜１００％溶媒Ｂの直線勾配；２１〜２５分１００％溶媒Ａ。アルブチンを２８２ｎｍ吸収波長で検出し、市販のアルブチンの標準物質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で作成した検量線を使用して定量した。
【０３２０】
実施例８
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−Ｈの発現のための合成オペロンの構築
単一の転写単位から、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてハイドロキノンを産生させるの
に必要な酵素の翻訳を可能にするポリシストロニックな転写物を発現するプラスミドを構築した。ｐＥＴ２９ａベクターのプラスミドＤＮＡをＮｄｅＩおよびＸｈｏＩでの制限消化により線状化した。線状化したプラスミドＤＮＡを、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を担持する２つの制限断片と組み合わせた。両遺伝子の制限断片は以下のようにして作製される。
【０３２１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３の単一のコロニーを、プライマー２７（配列番号５２）および２８（配列番号５３）を使用するＰＣＲ反応において使用した。
【０３２２】
プライマー２７−（配列番号５２）：
５’−ＣＴＡＣＴＣＡＴＴＴｃａｔａｔｇＴＣＡＣＡＣＣＣＣＧＣＧＴＴＡＡ−３’
【０３２３】
プライマー２８−（配列番号５３）：
５’−ＣＡＴＣＴＴＡＣＴｇｔｃｇａｃＴＴＡＧＴＡＣＡＡＣＧＧＴＧＡＣＧＣＣ−３’
大文字で表した下線を付したヌクレオチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＰＬ遺伝子配列に対応する。小文字で表したヌクレオチドは、ＰＣＲ産物の５’および３’末端にそれぞれ、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩ制限部位を導入する。
【０３２４】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー２７およびプライマー２８、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）を合わせ、ＢＬ２１ＤＥ３細胞の単一のコロニー由来の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を補充した。２５サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地において増殖させた。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供した。ＰＣＲにより誘導される変異体を欠くプラスミドＤＮＡをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化する。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を提示する０．４９ｋｂの制限断片をゲル精製する。
【０３２５】
実施例３に記載のｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の組換え産生のためのｐＥＴ２９Ａ構築物のプラスミドＤＮＡを、プライマー１９（配列番号４３）および２０（配列番号４４）を使用するＰＣＲ反応において使用した。
【０３２６】
２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０８％ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０、１μＭのプライマー１９およびプライマー２０、１０Ｕ  Ｔａｑ（登録商標）ポリメラーゼを含有するＰＣＲ反応混合物（１００μＬ）と１００ｎｇのｐＥＴ２９Ａ−ｐＨＢＡ１−Ｈ  ＤＮＡテンプレートとを組み合わせる。２５サイクルのＰＣＲを行い、各サイクルは９４℃で４５秒間、５８℃で４５秒間、および７２℃で２分間を含んでなった。ＰＣＲ産物をゲル精製し、製造者の指示に従い、ＴＯＰＯ  Ｔ／Ａクローニングキットを使用して、ｐＣＲ２．１ベクターにクローニングした。組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地において増殖させた。プラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ配列決定に供した。ＰＣＲにより誘導される変異体を欠くプラスミドＤＮＡをＳａｌＩで消化した。ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を提示する１．４ｋｂＳａｌＩ制限断片をゲル精製した。
【０３２７】
連結反応は、１００ｎｇのＮｄｅＩ  ＸｈｏＩ線状化され、ゲル精製されたｐＥＴ２９
ａ  ＤＮＡならびにそれぞれＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子に対応する各５０ｎｇのＮｄｅＩ  ＳａｌＩおよびＳａｌＩ制限断片からなる５μＬの最終容積において集成された。連結産物は、製造者の指示に従って、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細胞に導入した。
【０３２８】
組換えクローンを、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地上で回収し、液体ＬＢ培地中、選択条件下で増殖させた。プラスミドＤＮＡを単離し、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子を含有する２ｋｂの制限断片を切り出すＸｂａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩよる診断的制限消化に供した。ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ遺伝子からなるＤＮＡ挿入物の配列を配列番号５４に記載する。
【０３２９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるグルコースからのハイドロキノンまたはアルブチンの産生を以下のように達成した。上記のアルブチン産生のためのポリシストロニックな構築物および実施例６に記載のハイドロキノン特異的グルコシルトランスフェラーゼの発現のための構築物を、独立して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＢＬ２１ＤＥ３の細胞に導入した。この株では、Ｔ７ポリメラーゼの発現はｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。形質転換体を５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有するＬＢ培地上で選択した。グルコースからアルブチンを産生させるために、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼまたはＨＱ−ＧＴ遺伝子のいずれか一方を所有するＢＬ２１ＤＥ３宿主の単一のコロニーを使用して、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを含有する５０ｍＬの滅菌Ｍ９培地（１リットルあたり：６ｇのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇのＫＨ２ＰＯ４、２ｇのグルコース、１ｇのＮＨ４Ｃｌ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭチアミン、および０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２（リン酸でｐＨ６に調製した）に接種した。細胞を、連続振盪（３００ｒｐｍ）下、３７℃、０．６のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。細胞を遠心分離によって回収し、５ｍＬのＭ９培地に再懸濁した。
【０３３０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるハイドロキノン産生を、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの新鮮Ｍ９培地においてＣＰＬ／ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ構築物を含有する２つの５０ｍＬ培養物の回収した細胞を合わせることによって、達成した。細胞を、連続振盪（３００ｒｐｍ）下、２６℃、１４時間で増殖させた。
【０３３１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるアルブチン産生を、２５ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを含有する１００ｍＬの新鮮Ｍ９培地においてＣＰＬ／ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼまたはＨＱ−ＧＴ構築物のいずれか一方を含有する５０ｍＬ培養物の回収した細胞を合わせることによって、達成した。細胞を、連続振盪（３００ｒｐｍ）下、２６℃、１４時間で増殖させた。
【０３３２】
コントロールの目的のために、ＨＱ−ＧＴ構築物のみを所有する細胞のみを含有する第３の培養物を、同一の条件下で設定した。
【０３３３】
培養物を遠心分離によって澄明にし、以下の通りにＨＰＬＣ分析に供した。１０μＬの培養上清を、ノバ−パック（Ｎｏｖａ−Ｐａｋ）（登録商標）Ｃ１８カラム（６０Åポアサイズ、４μＭ粒度）上、１．５％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ａ）〜４８％アセトニトリル、１．５％リン酸（溶媒Ｂ）の勾配および２２１ｎｍでのＵＶ検出を使用して、分離した。以下の溶媒の勾配を適用した。０〜５分１００％溶媒Ａ；５〜２０分０〜１００％溶媒Ｂの直線勾配；２１〜２５分１００％溶媒Ａ。アルブチンおよびハイドロキノンを２２１ｎｍの吸収波長で検出し、市販の標準物質で作成した検量線を使用して定量した。
【０３３４】
図７は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の培地の組成を例示するＨＰＬＣトレースを示す。トレース１およびトレース３の比較から、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼの同時発現によって、ハイドロキノン標準物質と同一である保持時間を伴う新たな化合物の産生がもたらされることが示される。さらに、トレース１およびトレース４／５の比較から、ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼおよびＨＱ−ＧＴを発現する培養物を混合し、ＩＰＴＧを添加することによって酵素産生を誘導すると、推定ハイドロキノン中間体がアルブチンと同一の保持時間を伴う新たな化合物に変換されることが示される。微生物により産生されるアルブチンの同一性を、以下のようにＬＣ−ＭＳ分析によって確認した。１００マイクロリットルの無細胞培養上清を上記のようにＨＰＬＣによって分離し、推定アルブチンピークを手動で回収した。精製されたアルブチンをＬＣ−ＭＳによって分析した。１００μＬのＨＰＬＣ精製された化合物を、ＺＯＲＢＡＸエクリプセ（Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２．１×１５０ｍｍ、８０Å、３．５μｍ）（バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）、米国（ＵＳＡ））上に注入した。カラムを以下の条件で展開した。溶媒Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸）、溶媒Ｂ（１００％アセトニトリル）；０〜２５分０％〜６０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）、２５〜２５．５分６０〜１００％Ｂ（０．４ｍＬ／分）、２５．５〜３０分１００％Ｂ（０．４ｍＬ／分）、３０〜３１分１００％〜０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）、および３１〜４０分０％Ｂ（０．３ｍＬ／分）。エレクトロスプレー・インターフェースを具備したヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）質量分析器ＭＳＤ１１００を使用して、分析物を検出した。データは、陽イオンモード、３ｋＶのキャピラリー電圧で獲得した。脱溶媒ガス流量は１２Ｌ／分の窒素であった。脱溶媒およびソースブロック温度は３５０℃であった。計器は単位分解能に同調させた。データは、ＭＳ実験について１秒間における８０〜６００ダルトンのスキャニングによって回収した。
【０３３５】
ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼを発現する細胞ならびにアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）由来のハイドロキノン特異的グルコシルトランスフェラーゼを発現する細胞の混合型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物の培地は、新たな化合物を含有した。質量分析によって分析する場合、新たな化合物は、２９０．１の質量電荷比（ｍ／ｚ＋）を示すエレクトロスプレー陽イオン化モードにおける分子イオンを生成する。この分子イオンの特性は、ハイドロキノン配糖体（ＭＷ２７２．２５）のアンモニウム付加物（ＭＷ２９０．２９）の予想されるｍ／ｚ＋に極めて緊密に一致する。さらに、化合物は、一貫して、グルコース（ＭＷ＝１８０．１６）に対して予想されるｍ／ｚ＋と緊密に一致するｍ／ｚ＋＝１８０．０の断片を生成する。
【０３３６】
ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞の培養培地は、１４時間の発酵後、２９．３ｍｇ／Ｌハイドロキノンを含有した。ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼならびにＨＱ−ＧＴ酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞の混合培養培地は、１４時間の発酵後、６３．５ｍｇ／Ｌのアルブミンを含有した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物におけるアルブチン蓄積のさらなる改良は、実施例７に記載するような単一細胞におけるアルブチン産生に必要とされる３種類のすべての酵素を発現させることによって、達成されよう。
【図面の簡単な説明】
【０３３７】
【図１】トランスジェニック植物においてｐＨＢＡからアルブチンを産生させるための酵素経路を示す。改変されたＣＰＬは、葉緑体においてコリスミ酸をｐＨＢＡに変換する一方、発現されたＨＣＨＬは、サイトゾルにおいて４−クマロイル−ＣｏＡをｐＨＢＡに変換する。菌・カビ性酵素ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼは、ｐＨＢＡをハイドロキノンに変換する。ＵＤＰ−グルコシルトランスフェラーゼは、ハイドロキノンをグルコシル化して、ハイドロキノン配糖体を産生させる。ハイドロキノン配糖体（アルブチン）は、その後、植物の液胞に貯蔵および蓄積される。
【図２】基質としてのｐＨＢＡによる精製された組換えｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質の動力学解析を示す。産物形成の初速度は基質濃度に対してプロットされる。
【図３】酵素の特徴付けのために使用した精製されたタンパク質（レーンＣ）のクマシーブルー染色された１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。他のレーン（Ａ、Ｂ）は、実施例３に記載の精製手順の様々な段階での組換えｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼタンパク質を示す。
【図４】単独でもしくはｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素との組み合わせでＣＰＬ酵素を発現するアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはタバコ植物組織のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図５】基質としてのハイドロキノンによる精製された組換えＵＧＴ７２Ｂ１タンパク質の動力学解析を示す。産物形成の初速度は基質濃度に対してプロットされる。
【図６】Ｔ７プロモーターの制御下でのコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼの発現を可能にする合成オペロンを担持するプラスミドベクターを作製するために使用されるクローニングストラテジーを示す。これらの遺伝子の同時発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの微生物におけるアルブチン産生を可能にする。
【図７】ＣＰＬ、ｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ、およびハイドロキノン特異的グルコシルトランスフェラーゼ酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物由来の培地のＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１】
2007525966.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｉｉ）ハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼの内因性供給源；ならびに
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
を有すること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項２】
ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；ならびに
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
を有すること、および
ｂ）工程ａ）において産生される緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項３】
ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）  配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｖ）活性なグルコシルトランスフェラーゼ酵素の内因性供給源；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項４】
ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項５】
ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
ｖ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｖｉ）活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素の内因性供給源；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項６】
ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
ｖ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｖｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項７】
ａ）適切な炭素源の存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、
組換え微生物が、
ｉ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項８】
ａ）パラ−ヒドロキシ安息香酸の存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、組換え微生物が、
ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項９】
ａ）ハイドロキノンおよびＵＤＰ−グルコースの存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、組換え微生物が、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなること；および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１０】
ａ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｂ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｃ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなる組換え微生物。
【請求項１１】
ａ）適切な炭素源を含んでなる水性培地において、適切な条件下で混合型微生物培養を増殖させることであって、混合型微生物培養が、
ｉ）１）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
２）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片
を含んでなる組換えハイドロキノン産生微生物；ならびに
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなる組換えハイドロキノン配糖体産生微生物；
を、ハイドロキノン配糖体産生させるために、約１×１０６〜約２×１０１０細胞／ｍＬ
の各組換え微生物の細胞密度でかつ１：１超〜約１：２０の細胞比で過剰のハイドロキノン産生微生物対ハイドロキノン配糖体産生微生物を伴って含んでなること；および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１２】
ａ）    ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物；および
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物；
を、ハイドロキノン配糖体産生させるために、パラ−ヒドロキシ安息香酸を含有する水性培地において適切な条件下で、約１×１０６〜約２×１０１０細胞／ｍＬの各組換え微生物の細胞密度でかつ１：１超〜約１：２０の細胞比で過剰のハイドロキノン産生微生物対ハイドロキノン配糖体産生微生物を伴ってなる混合型微生物培養を増殖させること、
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１３】
ａ）１）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片および２）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物と、水性培地とを適切な条件下で接触させ、ハイドロキノン含有培地を生成し；
（ｂ）工程ａ）において生成されるハイドロキノン含有培地に、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物を接種し、ハイドロキノン配糖体を産生するのに十分な時間、インキュベートし；ならびに
（ｃ）工程ｂ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１４】
ａ）パラ−ヒドロキシ安息香酸の存在下で、配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物を接触させて、ハイドロキノン含有培地を産出すること；
（ｂ）工程ａ）において生成されるハイドロキノン含有培地に、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物を接種し、ハイドロキノン配糖体を産出するのに十分な時間、インキュベートすること；および
（ｃ）工程ｂ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１５】
ａ）水性反応混合物において、適切な条件下で、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素と、ハイドロキノンおよびＵＤＰ−グルコースを接触させ；ならびに  ｂ）工程（ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を単離すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
【請求項１６】
ａ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
ｂ）デフォルトパラメータ下のＮｅｅｄｌｅｍａｎ（ニードルマン）およびＷｕｎｓｃｈ（ヴンシュ）アルゴリズムに基づいて、配列番号２３に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子；ならびに
ｃ）ａ）またはｂ）に完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択されるパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片。
【請求項１７】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素。
【請求項１８】
配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるトランスジェニック緑色植物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３６】
ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼ酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞の培養培地は、１４時間の発酵後、２９．３ｍｇ／Ｌハイドロキノンを含有した。ＣＰＬおよびｐＨＢＡ１−ヒドロキシラーゼならびにＨＱ−ＧＴ酵素を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ＤＥ３細胞の混合培養培地は、１４時間の発酵後、６３．５ｍｇ／Ｌのアルブミンを含有した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物におけるアルブチン蓄積のさらなる改良は、実施例７に記載するような単一細胞におけるアルブチン産生に必要とされる３種類のすべての酵素を発現させることによって、達成されよう。
以下に、本発明の主な特徴と態様を列挙する。
１．  ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｉｉ）ハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼの内因性供給源；ならびに
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
を有すること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
２．ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；ならびに
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、
Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
を有すること、および
ｂ）工程ａ）において産生される緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
３．ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）  配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｉｖ）活性なグルコシルトランスフェラーゼ酵素の内因性供給源；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
４．ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
５．ａ）適切な条件下で緑色植物を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、  Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
ｖ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｖｉ）活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素の内因性供給源；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
６．ａ）適切な条件下で緑色植物細胞を増殖させることであって、緑色植物が、
ｉ）パラ−クマロイル−ＣｏＡの内因性供給源；
ｉｉ）コリスミ酸の内因性供給源；
ｉｉｉ）活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｖ）構造：
Ｐ−Ｔ−Ｃ−Ｄ−ＣＰＬ
（式中、Ｐはコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ遺伝子の発現を駆動するのに適切なプロモーターであり；Ｔはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドをコードする核酸分子であり；Ｃはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチド切断部位をコードする核酸分子であり；Ｄはルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）葉緑体輸送ペプチドドナーポリペプチドのＮ末端部分の４連続アミノ酸をコードする核酸分子であり；ＣＰＬは配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸分子であり；Ｐ、Ｔ、Ｃ、Ｄ、およびＣＰＬは相互に作動的に結合されている）
を有するコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ発現カセット；
ｖ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｖｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）の緑色植物由来のハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、緑色植物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
７．プロモーターが、３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、オクトピンシンターゼプロモーター、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーター、およびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターよりなる群から選択される、１、２、５、または６項のいずれか一項に記載の方法。
８．ルビスコ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）輸送ペプチドが、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、サトウキビ、ダイズ、アブラナ、ヒマワリ、ワタ、トウモロコシ、アルファルファ、コムギ、オオムギ、カラスムギ、モロコシ、イネ、カノーラ、キビ、豆類、エンドウ、ライムギ、アマ、またはイネ科牧草（ｆｏｒａｇｅ  ｇｒａｓｓｅｓ）に由来する、１、２、５、または６項のいずれか一項に記載の方法。
９．緑色植物細胞が、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、およびサトウキビよりなる群から選択される、１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
１０．コリスミ酸リアーゼ発現カセットが、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、１、２、５、または６項のいずれか一項に記載の方法。
１１．活性な４−ヒドロキシシナモイル−ＣｏＡヒドラターゼ／リアーゼ酵素をコードする核酸断片が、配列番号３８に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一である、３〜６項のいずれか一項に記載の方法。
１２．工程（ｂ）において回収されるハイドロキノン配糖体が、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１０％を超える、１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
１３．工程（ｂ）において回収されるハイドロキノン配糖体が、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり１５％を超える、１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
１４．工程（ｂ）において回収されるハイドロキノン配糖体が、植物葉バイオマスの乾燥重量あたり２０％を超える、１〜６項のいずれか一項に記載の方法。
１５．ａ）適切な炭素源の存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、
組換え微生物が、
ｉ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
１６．ａ）パラ−ヒドロキシ安息香酸の存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、組換え微生物が、
ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなること、および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
１７．ａ）ハイドロキノンおよびＵＤＰ−グルコースの存在下、適切な条件下で組換え微生物を増殖させることであって、組換え微生物が、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなること；および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、組換え微生物におけるハイドロキノン配糖体の産生方法。
１８．ａ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片；
ｂ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
ｃ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片；
を含んでなる組換え微生物。
１９．宿主微生物が、
ａ）サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）、およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される細菌；
ｂ）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）よりなる群から選択される酵母；または
ｃ）糸状菌類
である、１８項に記載の組換え微生物。
２０．宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、１９項に記載の組換え微生物。
２１．ａ）適切な炭素源を含んでなる水性培地において、適切な条件下で混合型微生物培養を増殖させることであって、混合型微生物培養が、
ｉ）１）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片；および
２）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片
を含んでなる組換えハイドロキノン産生微生物；ならびに
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなる組換えハイドロキノン配糖体産生微生物；
を、ハイドロキノン配糖体産生させるために、約１×１０６〜約２×１０１０細胞／ｍＬ
の各組換え微生物の細胞密度でかつ１：１超〜約１：２０の細胞比で過剰のハイドロキノン産生微生物対ハイドロキノン配糖体産生微生物を伴って含んでなること；および
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
２２．ａ）ｉ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物；および
ｉｉ）配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物；
を、ハイドロキノン配糖体産生させるために、パラ−ヒドロキシ安息香酸を含有する水性培地において適切な条件下で、約１×１０６〜約２×１０１０細胞／ｍＬの各組換え微生物の細胞密度でかつ１：１超〜約１：２０の細胞比で過剰のハイドロキノン産生微生物対ハイドロキノン配糖体産生微生物を伴ってなる混合型微生物培養を増殖させること、
ｂ）工程ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
２３．ａ）１）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片および２）配列番号３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なコリスミ酸ピルビン酸リアーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物と、水性培地とを適切な条件下で接触させ、ハイドロキノン含有培地を生成し；
（ｂ）工程ａ）において生成されるハイドロキノン含有培地に、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物を接種し、ハイドロキノン配糖体を産生するのに十分な時間、インキュベートし；ならびに
（ｃ）工程ｂ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
２４．ａ）パラ−ヒドロキシ安息香酸の存在下で、配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン産生微生物を接触させて、ハイドロキノン含有培地を産出すること；
（ｂ）工程ａ）において生成されるハイドロキノン含有培地に、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるハイドロキノン配糖体産生微生物を接種し、ハイドロキノン配糖体を産出するのに十分な時間、インキュベートすること；および
（ｃ）工程ｂ）において産生されるハイドロキノン配糖体を回収すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
２５．宿主微生物が、
ａ）サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、バークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、スピンゴモナス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、パラコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）、パンドレア（Ｐａｎｄｏｒａｅａ）、デルフチア（Ｄｅｌｆｔｉａ）およびコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）よりなる群から選択される細菌；
ｂ）アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）よりなる群から選択される酵母；または
ｃ）糸状菌類
である、２１〜２４項のいずれか一項に記載の方法。
２６．宿主微生物が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である、２５項に記載の方法。
２７．ａ）水性反応混合物において、適切な条件下で、配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素と、ハイドロキノンおよびＵＤＰ−グルコースを接触させ；ならびに  ｂ）工程（ａ）において産生されるハイドロキノン配糖体を単離すること、
を含んでなる、ハイドロキノン配糖体の産生方法。
２８．ａ）配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子；
ｂ）デフォルトパラメータ下のＮｅｅｄｌｅｍａｎ（ニードルマン）およびＷｕｎｓｃｈ（ヴンシュ）アルゴリズムに基づいて、配列番号２３に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子；ならびに
ｃ）ａ）またはｂ）に完全に相補的である単離された核酸分子
よりなる群から選択されるパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片。
２９．配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素。
３０．配列番号２３に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なパラ−ヒドロキシ安息香酸１−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸断片を含んでなるトランスジェニック緑色植物。
３１．配列番号４２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する活性なハイドロキノングルコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする核酸断片をさらに含んでなる、３０項に記載のトランスジェニック緑色植物。
３２．宿主緑色植物が、タバコ、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、テンサイ、およびサトウキビよりなる群から選択される、３０項または３１項に記載のトランスジェニック緑色植物。
【国際調査報告】
2007525966.tif 000050
2007525966.tif 000051
2007525966.tif 000052
2007525966.tif 000053
2007525966.tif 000054