(57)【要約】  内因子とビタミンB12との複合体形成を妨害する自己抗体などの、患者サンプル中の自己抗体を検出するためのイムノアッセイ法及び試験キット。標識受容体、すなわち、内因子が上記サンプルと混合され、そして固相に結合した内因子に対する自己抗体と競争的に結合する抗−内因子抗体と混合され、そしてサンプル中の自己抗体の存在が決定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己抗体の存在を検出するための方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記自己抗体を含むことが疑われる液体サンプルを、標識受容体と混合し、ここで、該受容体は前記自己抗体のための特異的結合部位を有し；
（ｂ）ステップ（ａ）からの上記混合物を、上記サンプル中に存在する自己抗体の存在又は量に関連した量の上記標識受容体に結合する結合対メンバーがそこへ結合した固相と接触させ；
（ｃ）上記固相を上記液相から分離し；そして、
（ｄ）上記液相中に残っているか又は上記固相上の上記結合対に結合した標識受容体の存在又は量を決定することによって、自己抗体の存在又は量を決定する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
上記液体サンプル中の物質に結合する妨害遮断試薬を混合することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、ここで、前記物質は上記標識受容体の上記自己抗体結合部位に結合することができ、さらにここで、上記妨害遮断試薬は、上記標識受容体の前に、又はそれと同時に上記液体サンプルと混合される。
【請求項３】
上記標識受容体が標識内因子であり、そして、上記自己抗体がそこへ結合するとビタミンＢ１２の内因子受容体への結合を遮断する結合部位において、上記内因子に上記自己抗体が結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、上記標識内因子の前に又はそれと同時に、妨害遮断試薬を上記液体サンプルと混合することを含み、ここで、上記妨害遮断試薬が特異的にビタミンＢ１２に結合する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記固相に結合した上記結合対メンバーがモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
液体サンプル中の抗−内因子自己抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記液体サンプルに標識内因子を加え、ここで、該標識内因子は、抗−内因子自己抗体が上記液体サンプル中に存在するいかなるビタミンＢ１２とも競争的に結合する結合部位を有し；
（ｂ）上記標識内因子の前又はそれと同時に、妨害遮断試薬を上記液体サンプルに加え、ここで、上記妨害遮断試薬は特異的にビタミンＢ１２に結合することができ；
（ｃ）上記（ａ）および（ｂ）の混合物に、上記液体サンプル中に存在する自己抗体の存在又は量に関連した量の標識内因子が結合する結合対メンバーが結合している固相を加え；そして、
（ｄ）上記液相中に残っているか、又は上記固相上の上記結合対メンバーに結合した標識内因子の存在又は量を決定することによって、自己抗体の存在又は量を決定する、
を含む、前記方法。
【請求項７】
上記結合対メンバーが、上記内因子が上記サンプル中に存在する自己抗体に結合していない場合にのみ、標識内因子に結合する抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記標識内因子の存在が、検出システムを用いて決定される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
上記検出システムが、以下の：放射性同位体、酵素、酵素反応の基質、蛍光標識及び化学発光標識からなる群から選ばれる標識並びにかかる標識を検出するための手段の使用を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
上記標識が酵素である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
上記標識がアルカリホスファターゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
結合した標識内因子を有する上記固相を、上記液相から分離し、そして上記固相を化学発光基質と混合することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
サンプル中の自己抗体の存在又は量を検出するためのアッセイを実施するための試験キットであって、以下の：
（ａ）標識受容体を含む容器、ここで、該受容体は前記自己抗体のための特異的結合部位を有し；
（ｂ）上記自己抗体のための上記結合部位において上記標識受容体に結合することのできる結合対メンバーを含む容器、ここで、前記結合対メンバーは固相に結合しており；そして、
（ｃ）上記サンプル中の物質に特異的に結合する妨害遮断試薬、ここで、該物質は上記標識受容体の上記自己抗体結合部位に結合することができる、
を含む、前記試験キット。
【請求項１４】
（ｂ）の前記固相が常磁性粒子である、請求項１３に記載の試験キット。
【請求項１５】
前記標識が、以下の：酵素、酵素反応の基質、蛍光標識及び化学発光標識からなる群から選ばれる、請求項１３に記載の試験キット。
【請求項１６】
上記標識受容体が標識内因子であり、そして上記妨害遮断試薬が特異的にビタミンＢ１２に結合することができる、請求項１３に記載の試験キット。
【請求項１７】
上記妨害遮断試薬がビタミンＢ１２に対する抗体である、請求項１６に記載の試験キット。
【請求項１８】
上記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１７に記載の試験キット。
【請求項１９】
上記妨害遮断試薬がＲ−タンパク質である、請求項１６に記載の試験キット。
【請求項２０】
上記標識がアルカリホスファターゼである、請求項１６に記載の試験キット。
【請求項２１】
上記結合対メンバーが内因子のビタミンＢ１２結合部位に結合する抗−内因子抗体であり、そして上記固相が常磁性粒子である、請求項１６に記載の試験キット。
【請求項２２】
上記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中の自己抗体の検出のための装置及び方法に関する。特別には、本発明は、イムノアッセイを用いる、ビタミンB１２の内因子への結合を遮断する内因子自己抗体の検出のための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、１つ以上の体の構成要素を自身のものであると免疫系が認識できず、そしてその構成要素に対する自己抗体を形成する場合に生じる。正常な生物学的相互作用が起こるために、生体内の多様な分子又はタンパク質がそれに対して結合しなくてはならない、多様な受容体物質が生体内には存在する。分子の結合を遮断する部位において特異的に受容体物質に結合する自己抗体が形成された場合、該自己抗体は「遮断自己抗体」と呼ばれる。
【０００３】
この型の1つの一般的自己免疫疾患は、悪性貧血である。悪性貧血は、ビタミンB12（B12）が体に適切に吸収されない場合に生じる。通常の患者においては、B12は胃腸管に入り、そしてB12を捕らえてこれを胃を通って小腸まで輸送する（コバロフィリン、ハプトコリン、及びトランスコバラミンとしても知られる）R-タンパク質と結合する。胃の細胞もまた、小腸へ移動する内因子を産生する。コリノイド−R-タンパク質複合体が小腸に到達すると、膵臓で作られた酵素によってコリノイドはR-タンパク質から遊離する。遊離されたコリノイドの中で、コバラミンのみが内因子に結合する。そして、内因子はコバラミンを小腸の最後の部分、回腸まで運ぶ。B12は、内因子と結合しない限り体に吸収されることができない。B12は内因子上の特異的エピトープに結合する。この結合は内因子において構造変化を引き起こし、それによって内因子−B12結合体が体に吸収されることが可能となる。
【０００４】
ある場合には、ヒトの免疫系は間違って内因子を外来性物質とみなして内因子に対する抗体を産生する（抗−内因子抗体）。かかる抗−内因子抗体の一つの型は、内因子上のB12結合部位を遮断し、B12が内因子に結合するのを妨害する。結果として、B12は体によって適切に吸収されず、悪性貧血が起こる。
【０００５】
特別な自己抗体の検出のための方法が開発され、該検出はその特別な自己抗体の存在により生じる自己免疫疾患の診断のためのツールとして役立つ。
【０００６】
遮断自己抗体の検出及び／又は定量のために、イムノアッセイが使用されてきた。典型的には、かかる自己抗体の存在を検出するためにラジオイムノアッセイ（RIA）が使用される。抗−内因子抗体を検出するために使用されるRIAはかかるアッセイの典型的なものである。抗−内因子抗体の検出のために最近使用されるRIAにおいては、内因子は固相に結合される。B12はコバルト５７などの放射性同位体で標識され、コバルト５７−B12トレーサーを生じる。患者サンプルは先ず固相と混合される。このステップの間、患者の抗−内因子抗体は固相上で内因子と結合する。そして、コバルト５７−B12トレーサーは患者サンプル及び固相と混合される。コバルト５７−B12トレーサーは自己抗体が結合していない固相上の内因子に結合する。固相に結合していないすべての物質を洗い流すために洗浄が行われる。固相上の内因子に結合したトレーサーからの放射能が検出され、そして放射能量は、サンプル中に存在する患者の抗−内因子抗体の量に反比例する。
【０００７】
このRIAの１つの欠点は、患者サンプル中に存在するB12が、試験結果を間違って高くさせるかもしれないことである。B12欠乏症のためのB12注射を受けている患者においては、高レベルのB12が存在するかもしれない。B12は固相上の内因子に結合し、抗−内因子抗体及び／又はトレーサーに結合することのできる内因子の量を減少させる。内因子−固相に結合する非標識B12は、洗浄に耐え、そしてしたがって検出されない。検出される放射能のレベルは減少し、そして、これは患者サンプル中に存在すると考えられる抗−内因子抗体の量を間違って高くさせる。
【０００８】
RIAの同様の欠点は、患者サンプル中に存在するB12結合タンパク質もまた、間違って、試験結果を高くさせるかもしれないということである。B12結合タンパク質はコバルト５７−B12トレーサーに結合し、これは、固相上に残った内因子へのトレーサーの結合量を減少させる。洗浄後には固相上に残っているトレーサーがより少ないため、検出される放射能レベルが減少し、これは、患者サンプル中に存在すると考えられる抗−内因子抗体の量を高くさせる。
【０００９】
これらの既知の方法は、自己抗体の存在を判定する多様な技術を研究者に提供する一方、これらの技術は上記のようないくつかの不利益を有する。液体サンプル中の遮断自己抗体を検出するための、感度の高い、部分的又は完全に自動化されることの可能なイムノアッセイ法が望まれる。
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明は、液体サンプル中における、生体内の受容体の結合部位に特異的に結合する自己抗体の存在を判定するための方法を提供する。１の側面において、該方法は自己抗体を含むことが疑われる液体サンプルと前記自己抗体のための特異的結合部位を有する標識受容体を混合することを含む。受容体は、自己抗体がそこへ結合することができ、且つ受容体に自然に結合する分子若しくはタンパク質の結合を遮断するか又は結合したときにホルモンの放出を刺激して体の中でかかるホルモンのレベルが過剰となる、いかなる体内のタンパク質又は結合因子でもある。受容体の例は、内因子、甲状腺刺激ホルモン、葉酸刺激因子、インスリン受容体などを含む。
【００１１】
標識受容体がサンプル中の自己抗体に結合可能となったあと、サンプルは、サンプル中の自己抗体の量又は存在に関連した量の標識受容体に結合するであろう結合対メンバーが結合した固相と接触させられる。そして、固相は液相から分離され、そして1つの実施態様においては、固相は緩衝溶液で洗浄されていかなる未結合の標識受容体も除去される。分離ステップの後、サンプル中の自己抗体の存在又は量が、液相又は固相のいずれかの中の標識受容体の存在又は量を検出することによって決定される。
【００１２】
固相は、標識受容体に特異的に結合する抗体がそこへ固定された粒子の懸濁液であることができる。1つの実施態様において、標識はアルカリホスファターゼであり、標識受容体は、化学発光基質を含む溶液を分離された固相に添加することによって検出され、該基質は、酵素によって活性化されて検出可能なシグナルを発生させるように適合されている。
【００１３】
1つの実施態様において、該方法はさらに、サンプルを標識受容体の前又はそれと同時に妨害遮断試薬と混合することを含み、該妨害遮断試薬は、サンプル中に存在するかも知れず、標識受容体に対して自己抗体と競争的に結合する物質に特異的に結合することができる。
【００１４】
１つの側面において、受容体は内因子であり、自己抗体は内因子上のB12結合部位に結合する遮断自己抗体であり、そして妨害遮断試薬はサンプル中に存在するB12に特異的に結合することができる。1つの側面において、その試薬はB12に特異的に結合する抗体であって、他の側面においては、該試薬はB12に結合するR-タンパク質である。
【００１５】
本発明はまた、自己抗体についてのアッセイを実施するための試験キットを提供する。該試験キットは、（ａ）測定される自己抗体のための特異的結合部位を有する標識受容体を含む容器；（ｂ）固相に結合している結合対メンバーであって、自己抗体のための結合部位において標識受容体に結合することのできる結合対メンバーを含む容器；及び（ｃ）サンプル中の物質であって標識受容体の自己抗体結合部位に結合することのできる該物質に特異的に結合することのできる妨害遮断試薬、を含む。
【００１６】
詳細な説明
本発明は、液体サンプル中の自己抗体の検出のためのイムノアッセイを提供する。本発明によって検出されることのできる自己抗体は、生体内の受容体に対する抗体である。生体内で検出される自己抗体の存在は、典型的には自己免疫疾患と関連する。典型的には、自己抗体は受容体上の１つ以上の結合部位に結合し、且つ受容体に自然に結合する分子又はタンパク質の結合を遮断するか又はホルモンの放出を刺激する。受容体の例は、内因子、葉酸結合タンパク質、インスリン、チログロブリン、甲状腺マイクロペルオキシダーゼ、及び甲状腺刺激ホルモンを含む。本明細書中で「タンパク質」という用語は、タンパク質構成成分、ポリペプチド及びペプチド断片を含む分子を含む。
【００１７】
本発明の方法において、着目の自己抗体がそこへ特異的に結合する結合部位を有する受容体は、シグナルを発生する化合物で標識される。「標識」「標識された」及び「標識コンジュゲート」などは、酵素、蛍光化合物、放射性同位体、発色団、又は他の検出可能ないずれかの化学種と、内因子、抗体、受容体又は他の結合要素のコンジュゲートを指し、該コンジュゲートはその結合パートナーに特異的に結合する能力を保持している。以下に例示される「検出システム」などは、検出可能なシグナルを提供する化学的システムをさす。例示的な標識の例は、酵素、色素、染料、蛍光団、放射性同位体、化学発光物質、生物発光物質などの安定なフリーラジカルである発光物質などを含む。本発明の方法において有用なシグナル検出システムにおいては、標識は酵素であり、検出可能なそのシグナルは、標識試薬を特別な基質に曝露し、そして色、蛍光又は発光の発生のためにインキュベートすることによって発生させられることができる。
【００１８】
本発明の１つの側面においては、標識受容体は標識内因子であり、ここで、標識は望ましくはアルカリホスファターゼなどの酵素である。
【００１９】
標識受容体は、自己抗体を含むことが疑われる液体サンプルと、サンプル中に存在する自己抗体が標識受容体に結合するのに充分な時間、混合される。本発明の１つの側面において、妨害遮断試薬は、標識受容体の前に又はそれと同時に液体サンプルと混合される。妨害遮断試薬は、サンプル中に存在するかもしれない物質と特異的に結合することができ、その物質は標識受容体の自己抗体結合部位に結合して該部位への自己抗体の結合を遮断又は妨害する。本発明の1つの側面において、妨害遮断試薬はさらに、アッセイの実施を妨害する、サンプル中に存在する物質に結合するか又はこれと反応する成分を含む。これらの成分は、制限されることなく、スカベンジャーアルカリホスファターゼ、ヤギ及びマウスイムノグロブリン（IgG）を含む。スカベンジャーアルカリホスファターゼは、アルカリホスファターゼ標識が使用されるこのようなアッセイにおいて妨害を引き起こすかもしれない、アルカリホスファターゼに対するヒト抗体の結合を望ましく遮断するであろう。マウスIgGは、ヒト抗−マウス抗体を望ましく遮断し、そしてヤギIgGは多様な種由来のタンパク質間の非特異的妨害を望ましく遮断するであろう。ウシIgG、ウサギIgG、ロバIgG（又はこれらのいずれかの血清タンパク質）などの他の遮断タンパク質も使用されることができる。当業者は、サンプル中に存在するかもしれない物質からの妨害を減少させるに最も適した成分をどのように選択するかを知っているであろう。そしてそのような成分は、アッセイにおいて使用される標識の種類、特異的結合対メンバー、受容体又は他の試薬によって変化する。例えば、ウシIgG、ウサギIgG、ロバIgG（又はこれらのいずれかの血清タンパク質）などの他の遮断タンパク質も使用されることができる。１つの側面において、ヒト抗−マウス抗体を遮断する凝集したモノクローナル抗体は、妨害遮断試薬中に含まれる。
【００２０】
本明細書中で使用される「特異的結合」及び「特異的に結合した」は、該試薬、物質又は自己抗体が、特異的に所望の物質又は要素を結合するか又はそこに結合される結合対のメンバーであること、すなわち、他のいかなる部分よりも該物質又は要素にたいして高い結合親和性及び／又は特異性を有することを意味する。かかる結合対は、周知であり、以下の：抗原−抗体、成長因子−受容体、核酸−核酸結合タンパク質、核酸の相補対などを含む。結合対のメンバー又は試薬は、本明細書において、抗体として記載され、「抗体」という用語は物質又は要素に対する特異的結合活性を保持しているその有効部分を包含することを意図される。有効部分は、例えば、Fv、scFv、Fab、Fab2及び重鎖可変領域又は該部分のいずれかを含むキメラ分子若しくは組換え分子若しくは工学処理されたタンパク質を含む。結合対メンバーの具体的な例は、以下の：ビタミンB１２及び内因子、ビタミンB１２及びR-タンパク質、ビオチン及びアビジン、炭水化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列、相補的ペプチド配列、エフェクター及び受容体分子、酵素補因子及び酵素、酵素阻害剤及び酵素、ペプチド配列及び該配列タンパク質に特異的な抗体、酸及び塩基重合体、染料及びタンパク質結合剤、ペプチド及び特異的タンパク質結合剤（例えば、リボヌクレアーゼ、S-ペプチド及びリボヌクレアーゼS-タンパク質）などを含む。さらに、特異的結合対は、本来の特異的結合メンバーの類似体であるメンバーを含むことができ、例えばシアノコバラミン類似体、コビナミド、はR-タンパク質を結合することができる。
【００２１】
本明細書において使用される、物質の結合対のメンバーへの結合に関する「競争的に、競争的な、及び競争する」という語は、サンプル中のかかる１つの物質（分析物）の、結合対メンバー上の同じ結合部位について他の物質と競争する能力をさし、すなわち、該２つの物質がその結合対メンバーについて同じ結合特異性を有するということを意味する。
【００２２】
標識受容体が、該サンプル中に存在する少なくともいくらかの自己抗体が受容体に結合するのに充分な時間の間、液体サンプルと混合された後、固相に結合した結合対メンバーが上記混合物と接触させられ、該結合対メンバーは、サンプル中に存在する受容体に対する自己抗体の存在又は量に関連した量の標識受容体に結合することができる。
【００２３】
本明細書中で、固相に関して使用される「に結合した」は、固相がサンプルと混合され、結合対メンバーがその周囲の環境と相互作用するときに結合対メンバーが表面と結合したままであるように、直接的又は間接的に固相表面に抗体及びタンパク質が結合するためのすべてのメカニズムを包含する。かかるメカニズムは、共有結合を介する化学的又は生物学的連結、特異的生物学的結合を介する結合（例えば、ビオチン／ストレプトアビジン）、キレート／金属結合などの配位結合などである。本発明の１つの側面において、結合対メンバーは固相表面に結合した抗−マウス抗体を介して固相に結合したマウス抗−内因子抗体である。
【００２４】
本明細書中で使用される「固相」は、アッセイの１つの要素が結合することのできる不溶性材料をさす。この種類の知られた材料は、ポリスチレン及びポリプロピレンのような炭化水素ポリマー、ガラス、金属及びゲルを含む。かかる支持体は、ビーズ、管、線条、円盤などの形態であることができる。磁性粒子は、本発明のアッセイで使用するのに特別に好ましい。
【００２５】
受容体に対する自己抗体は、遮断及び非遮断の少なくとも２つの種類であることができる。遮断自己抗体は、受容体結合部位について物質又は分析物と直接的に競争し、そして非遮断自己抗体は、受容体を構造変化させること又は結合部位への結合を立体的に障害することによって、物質又は分析物が受容体に結合することを妨害する。内因子に対する２つの種類の抗−内因子抗体が同定されており：B１２の内因子への結合を遮断する遮断抗体（I型）及び内因子−B１２複合体と反応する非遮断抗体（II型）（この抗体は結合抗体とも呼ばれる）である。本発明の１つの実施態様においては、II型抗体が標識内因子に結合した場合、標識内因子が結合対メンバーで被覆された固相への結合から妨害されるように、固相に結合した結合対メンバーが選択される。
【００２６】
標識受容体がサンプル中の自己抗体の存在又は量に関連した量の結合対メンバーに結合することを可能とする充分な時間及び適切な条件下で、結合対メンバーで被覆された固相がサンプルと接触した後、固相は液相から分離され、そしていずれかの相における標識受容体の存在が決定される。
【００２７】
他の実施態様においては、本発明は、自己抗体についてのアッセイを実施するための試験キットを提供する。試験キットは、（ａ）測定される自己抗体のための特異的結合部位を有する標識受容体を含む容器；（ｂ）自己抗体のための結合部位において標識受容体に結合することのできる、固相に結合されている結合対メンバーを含む容器；及び（ｃ）標識受容体の自己抗体結合部位に結合することのできるサンプル中の物質に特異的に結合することのできる妨害遮断試薬を含む。本明細書中で使用される「容器」は、成分同士がお互いに接触しないように保つために、その中に単独の成分が入れられる試薬パックの１つの部分であることができる。本発明の１つの側面においては、キットはそれぞれがFullerton, CAのBeckman Coulter,Inc.から入手可能なACCESS（登録商標）Immunoassay System、ACCESS（登録商標）２Immunoassay System、UniCel（商標）DxI 800 Immunoassay System及びSynchron LX（登録商標）I 725 Clinical System(「Beckman Systems」)などの自動イムノアッセイ分析器とともに使用されるように適合されている。
【００２８】
この実施態様においては、試験キットは典型的には、Beckman Systemとともに使用されるのに適合された複数のウエルを含む試薬パックであって、ここで、1つの試薬ウエル（容器）は、標識受容体に結合することのできる結合対メンバーがそこに結合した常磁性粒子を含み、他の試薬ウエルは標識受容体を含み、他の試薬ウエルは妨害遮断試薬を含む。
【００２９】
本明細書で使用される「キット」は、通常、必要な緩衝液、塩及び安定化剤とともに配合される試薬の組み合わせをさし、該試薬は少なくとも実質的にアッセイ感度を最適化するように予め測定される。
【００３０】
本発明の１つの側面は、自動分析器を使用して、内因子に対する自己抗体の存在又は量を検出するための試験キットの使用を提供する。この実施態様においては、所定量の妨害遮断試薬が試薬ウエルから取り出されて反応容器に送られ、続いて既知量の液体サンプル及び試薬ウエルから取り出された所定量の標識受容体が加えられる。混合物は、システム上でインキュベートされる。インキュベーション時間の後、そこに結合対メンバーが結合した、所定量の固相が試薬ウエルから吸引され、そして反応混合物に送達される。固相は、磁石を用いて懸濁液から常磁性粒子を取り出すことによって、液相から分離される。固相は洗浄されていかなる非捕捉試薬も除去され、そして標識検出用基質が添加される。発生したシグナルは、サンプル中に存在する自己抗体の量に関連している。
【００３１】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、添付された請求項に記載された本発明の範囲を制限することを意図するものでない。
【実施例】
【００３２】
実施例I−内因子に対する自己抗体（I型自己抗体）についてのアッセイ
酵素標識された内因子を、その教示が参考文献として本明細書中に援用されているカナダ特許出願公開第２，１１０，０１９号に記載のとおりに調製した。すなわち、３〜６倍モル過剰の０．２Mイミダゾール、pH９．０中、スルホサクシニミジル４−（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートとの反応によって、マレイミド基をアルカリホスファターゼ（ALP）上に導入し；PBS中SephadexG-50上のゲル濾過によって過剰の試薬を除去した。精製された内因子を、０．２Mイミダゾールおよび１．０ｍM EDTA、pH9.0中、４０ｍM N-アセチルホモシステインチオラクトンと反応させ；過剰の試薬を１ｍM EDTAを含むPBS中の第２のゲル濾過カラム上で除去した。修飾内因子を６倍モル過剰の修飾酵素とともに室温で２時間、続いて２〜８℃で１６時間インキュベートすることによって、コンジュゲーションを達成した。トリス緩衝化食塩水、pH８．０中のSuperdex 200上のサイズ抽出クロマトグラフィーによって、コンジュゲートを精製した。
【００３３】
内因子のB12結合部位に結合する抗−内因子マウスモノクローナル抗体を、粒子１mgあたり１．５μgのレベルで、磁性粒子上に固定化されたヤギ抗−マウス抗体に結合させることによって、固相を調製し、１mg/mlの粒子懸濁液原液として使用した。抗体を懸濁液中で２〜３時間吸着させた。その後、粒子を２回洗浄し、pH８．００の０．１Mトリス緩衝液（０．１Mトリス、０．１％BSA、２．０mM MgCl3、２．０ｍM MgCl2、０．１mM ZnCl2、０．１５M NaCl、０．０２％Tween20、０．１％アジ化ナトリウム、０．１％ProClin）中に再懸濁した。精製抗−内因子マウスモノクローナル抗体を、カナダ特許出願公開第２，１１０，０１９号中に記載のとおりに得た。かかるモノクローナル抗体を得るための他の方法は、本明細書中に参考文献として援用されている米国特許第５，５０６，１０９号に記載されたとおりである。
【００３４】
この実施態様においては、妨害遮断試薬を自己抗体についてのアッセイにおいて使用した。試薬は、精製抗−ビタミンB１２マウスモノクローナル抗体（Sigma-Aldrich, CO. St. Louis, MO, USAから購入したCone CD-29）を用いて調製した。試薬は、制限されることなく、スカベンジャーアルカリホスファターゼ、ヤギ及びマウスイムノグロブリン（IgG）も含んだ。
【００３５】
内因子に対する自己抗体の存在又は量を測定するためのアッセイを、ACCESS（登録商標）Immunoassay Analyzerを用いて行った。５５マイクロリッターの妨害遮断試薬を、抗−B12抗体を約４．３マイクログラム／ミリリッターの濃度で含む試薬ウエルから取り出し、５０マイクロリッターを反応容器中へ入れた。そして、５０マイクロリッターのサンプルを反応容器に加えた。５０マイクロリッターの内因子−アルカリホスファターゼコンジュゲートを反応容器に添加し、そして混合物を約３７℃で２０分間インキュベートした。抗−内因子抗体で被覆された固相５５マイクロリッターを、固相を約１．０ミリグラム／ミリリッターの濃度で含む試薬ウエルから吸引した。５０マイクロリッターを反応容器に加え、そして混合物を約３７℃で５分間インキュベートした。固相を液相から分離し、そして３回洗浄した。アルカリホスファターゼと反応して検出可能なシグナルを発生する化学発光基質（Lumigen,Inc., Detroit, MIから購入可能なLumi-Phos（登録商標）５３０）を反応容器に加え、そしてルミノメーターでシグナルを測定した。アッセイは準定量的なものである。結果を、サンプルの相対発光量（RLU）で標準物質の総RLUを割った相対発光量の比として報告した。内因子に対する自己抗体の量が増加すると、シグナルは減少し、その結果、比が増加する。結果は、自己抗体について陰性、疑わしい、又は陽性として報告されることができる。定量結果が望まれれば、サンプル中に存在する自己抗体量の測定値が記憶されたキャリブレーションから決定されることができる。結果は抗体単位／ミリリッター（AU／mL）で表される。
【００３６】
本発明にしたがって実施した抗−内因子抗体についてのアッセイの感度及び範囲を、Diagnostics Products Corporationから商業的に入手可能なRIAと比較して、より広くそして、陰性及び陽性サンプルの間のより良好な判別を可能することを発見した。
【００３７】
本発明の実施態様を記載したが、本発明の精神及び添付された請求の範囲を離れることなく、多様な変更、適合及び改変が行われうることは理解されるべきである。
【国際調査報告】
2007538228.tif 000002
2007538228.tif 000003