(57)【要約】  生物学的サンプルを分析するためのマイクロ流体デバイスは、入口ポート、入口ポートおよび入口チャンバと連通した毛管通路を備えたサンプル流入区画を備えている。入口チャンバは、サンプル液体を入口チャンバ全体にわたって均一に分配し、はじめに含有されている空気を除去する手段を含む。
2007520693.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０μL以下の液体の生物学的サンプルを分析するためのマイクロ流体デバイスであって、
（ａ）前記サンプルを受け入れるための入口ポートと、
（ｂ）前記入口ポートと流体連通した毛管通路と、
（ｃ）（ｂ）の毛管通路と流体連通した入口チャンバとを含み、
それにより前記サンプルを前記入口チャンバに流入することが可能になり、前記入口チャンバは、前記入口チャンバ全体にわたり前記サンプルを均一に分配し、前記入口チャンバの空気を置換する手段を有しており、そして、
（ｄ）前記液体サンプルで置換された空気を除去するための少なくとも１つの通気通路を含む、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記サンプルを均一に分配する前記手段が、前記入口チャンバを横切って延びる少なくとも１つの溝である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記サンプルを均一に分配する前記手段が、前記入口チャンバを横切って延びる少なくとも１つの堰である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記の少なくとも１つの溝または少なくとも１つの堰が、前記サンプルの均一な流れを容易にするために楔型カットアウト部を有する、請求項２または３に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記サンプルを均一に分配する前記手段が、前記入口チャンバ全体にわたり配置された柱状体の配列部を含むマイクロ構造体である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記柱状体が、前記サンプルの均一な流れを容易にするための楔型カットアウト部を有する、請求項５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記入口ポートが、前記サンプルを入れる対応するピペットの形状と係合するためにテーパー状である、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記入口チャンバ内に入れられた抗凝血剤を更に含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記入口チャンバと流体連通した溢流液チャンバを更に含み、前記溢流液チャンバが、前記入口チャンバの充填に必要な量を超過した前記サンプルを受け入れるためのものである、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
前記溢流液チャンバが、前記サンプルの過剰分の存在を検出するためのインジケータを含有する、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
毛管通路を介して入口チャンバと流体連通している入口ポートを有するマイクロ流体デバイスに液体を供給する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記液体の一部を前記入口ポート内に導入すること、
（ｂ）正圧または毛管力により、（ａ）の前記液体部分を、前記毛管通路を介して前記入口チャンバへ移送すること、
（ｃ）（ａ）の前記液体部分を前記入口チャンバ全体にわたり均一に分配し、そして前記チャンバから空気を完全に除去すること、とを含む方法。
【請求項１２】
前記入口チャンバが一杯になると、前記サンプルの過剰分を溢流液チャンバに進路を変える、請求項１１に記載の方法
【請求項１３】
前記過剰分の存在を、前記溢流液チャンバ内のインジケータにより検出する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体デバイス、特に、生物学的サンプルの分析に使用するマイクロ流体デバイスに関する。マイクロ流体デバイスは、生物学的サンプルの中央分析室への送付に固有の遅延を回避して、迅速な分析に使用するためのものである。このようなデバイスは、非常に微量の血液、尿などのサンプルを受け入れることを意図している。サンプルを、サンプル中で測定される分析対象物の存在および量を示すことができる試薬に接触させる。
【背景技術】
【０００２】
患者の近くで分析を行う多くのデバイスが提案されてきたが、そのいくつかを以下に記述する。一般に、このようなデバイスは、極めて少量のサンプル、代表的には０．１〜２００μLを使用する。マイクロ流体デバイスの開発に伴ないサンプルはより少量で済むようになり、該デバイス使用の好ましい特徴となっている。しかし、より少量のサンプルは難かしい問題をもたらす。マイクロ流体デバイスでは、少量のサンプル、代表的には約０．１〜２０μLを、サンプルが後の分析のために準備されるか、または反応して分析対象物の存在（または不在）を示す１つ以上のウェルと接触させる。空気は液体の移動と分析結果に悪影響を及ぼすため、サンプルをウェル内へ移動する際に、液体を均一に分配し、ウェル内の全ての空気を追い出すことが重要である。これ以外の問題は、マイクロ流体デバイスへのサンプルの導入初期に関連したものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
まず、このようなデバイスの入口ポートは空気を含有しており、これを追い出す必要がある。空気を強制的に追い出すが、サンプルをデバイスの表面上ではなく入口ポートに残すという条件下で、少量の液体を入れる。表面上の被検体物は、分析と分析の間のキャリーオーバおよび汚染をもたらす。ポート内の空気は、充填不足、および分析結果の過小評価をもたらす。入口ポートまたは受け入れ用入口チャンバ内の気泡は、特に側方の毛管流を用いて流れを更に促進する場合に、更なる液体のハンドリングを妨げる可能性がある。一つの解決法は、サンプル液体を含有するピペットに対する入口ポートをシールし、ピペット内のプランジャが入口ポートに対して圧力を付加できるようにすることである。入口ポートから第１ウェルまで延びる毛管を通る流れは、毛管内、または第１ウェルへの入口部分に気泡が形成されないよう、滑らかでなくてはならない。毛管が第１ウェルに入る際、通路が広がるので、液体はウェル内に均一に分配されるはずである。更にここでも、液体の移動は、空気が液体よりも先に移動し、通気路から追い出されるように制御されなければならない。
【０００４】
サンプルを試薬を含有するウェルへ速やかに向かわせることができる一方で、多くの場合、サンプルは先ず、サンプルの量を定めるのに用いるウェルへと送られ、次いで、引き続く試薬との接触のためにサンプルを準備するための別のウェルへと送られる。第１ウェルがサンプルの計量ウェルである場合には、このウェルは完全に充填されること、好ましくは過剰の液体が溢流液ウェル内へ溢れ出る程に充填されることが重要である。ここでもまた、正確な計量を行うために、ウェル内に最初からある空気の全てを追い出すことが必要である。こうすることで、サンプル液体の流れが空気をトラップするのを防止し得るはずである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、上述した問題を克服し、そして、本発明の改善された入口ポートを含むマイクロ流体デバイスは正確かつ再現性のある結果をもたらし、かつ、充填不足および過剰充填を抑制し防ぐことを可能にすることを保証するために開発された。
【０００６】
本発明は、特に、０．１〜２０μＬの少量のサンプルをマイクロ流体チップに供給するのに適合し、その結果サンプル中の対象の分析対象物の正確かつ再現性のあるアッセイを可能とする入口ポートに関する。このような入口ポートは、少量のサンプルを利用するようにしてあり、そしてマイクロ流体チップから空気を除去しながら、サンプルを入口チャンバ内に均一に移送するようにしてある。サンプルの均一な分配は、入口チャンバ全体にわたって溝または堰を設けることで行うことができ、溝または堰は、サンプルの流れを均一にするのを助けるための、楔型カットアウト部または他の構造を有していてもよい。
【０００７】
いくつかの実施態様では、マイクロ流体チップは、入口チャンバの完全な充填を確実にするインジケータを含有する溢流液チャンバを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
マイクロチャネルにおける流れ
本発明のマイクロ流体デバイスは、代表的には、本分野における先行の技術者により提案されてきたチャネルよりも小さなチャネルを使用する。特に、本発明で使用するチャネルは約１０〜５００μm、好ましくは約２０〜１００μmの範囲の幅を有するのに対し、毛管力を利用して流体を移動させる場合に、ほかでは、一般に、１桁大きいチャネルを使用してきた。より小さなチャネルは、分析されるサンプルの成分を効率的にろ過できるため、チャネルの最小寸法は約５μmと考えられる。本発明における好ましい範囲のチャネルは、毛管力のみによって液体サンプルを移動させることができる。サンプル流体に対して疎水性になるように処理された毛管壁により移動を停止させることも可能である。毛管抵抗力は、例えば、遠心力、ポンプ注入、減圧、電気浸透、加熱、または追加的な毛管力を適用することによる圧力差によって克服できる。その結果、実施する分析の必要性に応じて、液体を計量し、デバイスの或る領域から別の領域へと移動させることができる。
【０００９】
遠心力、流体物理特性、流体表面張力、毛管壁の表面エネルギー、毛管サイズ、および分析される流体中に含有される粒子の表面エネルギーを関係づけた数学的モデルが導き出されている。毛管内を通る流体の流速および所望する疎水性度または親水性度を予測することが可能である。以下の一般則を、これらの要因間の関係から導き出すことができる。
【００１０】
任意の所与の通路に関して、液体と通路表面との相互作用は、液体の移動に有意な影響を及ぼすこともあれば、及ばさないこともある。通路の容積に対する表面の比が大きい場合、すなわち、断面積が小さい場合には、液体と通路の壁との相互作用は非常に有意になる。これは特に、定格直径が約２００μm未満の通路に関する場合であり、液体サンプルと壁との表面エネルギーに関連する毛管力が支配的である場合である。壁が液体で濡れている場合には、外力を付加することなく液体は通路を通って移動する。逆に、壁が液体で濡れていない場合には、液体は通路から引こうとする。これらの一般的な傾向を利用して、液体を、通路を通って移動させるか、または、断面積の異なる別の通路との接合点で移動を停止させることができる。液体が静止状態にある場合、例えば遠心力を適用することによる圧力差によってこれを移動させることができる。これ以外の手段として、空気圧、減圧、電気浸透、加熱などを使用することができ、これらの手段は、異なる断面積または表面エネルギーを有する通路間の接合点において必要とする圧力変化を引き起こさせることができる。本発明では、それを通って液体が移動する通路はこれまで使用されてきた通路よりも小さい。本発明の通路は、より高い毛管力を得ることを可能とし、毛管停止を克服しなけばならない短い時間を除き、外力を必要とせずに毛管力のみで液体を移動させることを可能としている。しかし、通路は小さいほど、本質的に、生物学的サンプルまたは試薬中の粒子からの障害物に影響され易い。したがって、検査しようとするサンプル流体、例えば、血液、尿などの使用のために、必要に応じて通路壁の表面エネルギーを調整する。この特徴は、作製しようとする分析デバイスのより柔軟な設計を可能にする。このデバイスは、当該技術分野で使用されてきたディスクよりも小型であることができ、かつ、より少量のサンプルでも動かすことができる。しかし、使用するサンプルをより少量にすることで新たな問題も生じるが、本発明により克服される。このような問題の１つは、デバイスに均一に充填し、空気を追い出す方法による少量のサンプルの導入に関連している。デバイス内にトラップされた空気は、充填不足を生じさせたり、または一般に液体搬送に関連したより下流における全ての液体ハンドリングステップ、特に毛管停止の弁作用による液体の流れの調節を阻止または妨害する可能性が生じ、他方、過剰充填はキャリーオーバを生じさせる可能性がある。適切な充填を行い、不適切な充填が生じたか否かを検出する機能が、正確な分析を行うために必要である。
【００１１】
マイクロ流体分析デバイス
本発明の分析デバイスは「チップ」と呼ぶこともできる。これらは一般に小型であり、代表的には約１〜２インチ平方（２５〜５０mm平方）の平型であるか、または約４０〜８０mmの半径を有するディスクである。サンプル量は少量になる。例えば、被検体物の総量は１０〜２００μLの範囲内で変動してもよいが、各々のアッセイにつき約０．１〜１０μLを含有するのみである。サンプルを見易くし、サンプルの反応から生じた変化を適切な装置で測定できるようにするために、サンプル流体用ウェルは比較的幅広く浅くしてある。相互接続した毛管通路は、１０〜５００μm、好ましくは２０〜１００μmの範囲の幅を有し、その形状は通路を形成するのに用いる方法により決まる。通路の深さは少なくとも５μmなくてはならない。
【００１２】
毛管およびサンプルウェルを形成することができる方法はいくつかあり、例えば、射出成形法、レーザ切除法、ダイアモンド平削り法、またはエンボス加工法が挙げられるが、チップのコストを低減するには射出成形法を用いるのが好ましい。一般的に、チップの基部は、所望のサンプルウェルと毛管のネットワークを形成するべく切削され、次に、試薬化合物をウェル内に所望のとおりに配置した後に、基部を覆って頂部を取り付けてチップを完成させる。
【００１３】
チップは１回使用したら使い捨てとするものである。したがって、試薬および分析しようとするサンプルとの適合性を得ながら、チップは可能な範囲で安価な材料で製造される。多くの場合、チップは、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアクリレートまたはポリウレタンのようなプラスチックで製造されるが、あるいはまた、ケイ酸塩、ガラス、ろうまたは金属で製造することもできる。
【００１４】
毛管通路は、疎水性または親水性となるよう調整されるが、これらの特性は、液体サンプルまたは試薬により固体面で生じる接触角と関連して定まる。表面は、一般的に、接触角が９０度未満である場合に親水性とみなされ、接触角が９０度より大きい場合に疎水性であるとみなされる。好ましくは、通路の表面で、プラズマ誘導重合を行う。本発明の分析デバイスは、親水性もしくは疎水性材料によるコーティング、グラフティング技術、またはコロナ処理のような、毛管壁の表面エネルギーを制御するために使用される他の方法によっても製造することができる。毛管壁の表面エネルギーを調整すること、すなわち、親水性または疎水性の度合いを目的のサンプル流体の使用に合わせて調整することが好ましい。例えば、疎水性の通路の壁への付着を防止するために、または通路内に液体が確実に全く残留しないようにするために調整を行う。本発明のほとんどの通路で、表面は概して親水性になっているが、それは、液体が表面を濡らす傾向にあり、表面張力が通路内で液体を流動させるためである。例えば、毛管通路の表面エネルギーは、通路が全血と接触する場合には水の接触角が１０〜６０°となるように、または、通路が尿と接触する場合には接触角が２５〜８０°となるように、公知の方法で調整することができる。
【００１５】
毛管を通っての液体の移動は毛管停止部により妨げられるが、この毛管停止部は、その名が示すとおり、毛管を通っての液体の流れを妨げる。毛管通路が親水性であり液体の流れを促進する場合には、疎水性の毛管停止部、すなわち疎水性の壁を有するより小さな通路を使用することができる。小さなサイズと非濡れ性の壁との組み合わせが液体が入るのに対抗する表面張力をもたらすため、液体は疎水性の停止部を通過することができない。一方、毛管が疎水性である場合には、サンプルウェルと毛管の間に停止部は不要である。十分な力が例えば遠心力により付加されることによって、液体が対抗する表面張力に打ち勝ち、そして疎水性通路を通過するようになるまで、サンプルウェル内の液体は毛管内へ入ることを妨げられる。液体の流れがデバイス内で停った際に、この流れを開始させるためにのみ力を必要とするのが本発明の特徴である。一旦疎水性通路の壁が液体と完全に接触すると、液体の存在が疎水性表面と関連したエネルギー障壁を低くするために、対抗力は低下する。その結果として、もはや、液体が流動するために力を必要としない。必須ではないが、高速分析を容易にするために、毛管通路を通って液体が流動している間、継続して力を付加することが、場合により好都合であるかもしれない。遠心力、吸収性材料ならびに空気または液体減圧および空気または液体圧力を使用して流体の流れを維持することができる。流れは、圧力差の助けを得て、または得ずに、毛管力により開始できる。
【００１６】
毛管通路が親水性である場合には、サンプル液体（水性と仮定する）は、付加的な力を必要とせずに毛管を通って自然に流動する。毛管停止部が必要である場合には、上述の停止部としての役割を果たすことができるより狭い疎水性区画を使用する代替法がある。毛管が親水性であっても、親水性の停止部を使用することも可能である。このような停止部は、「毛管ジャンプ」を形成している毛管よりも幅広く、深いものであり、したがって液体の表面引張力が液体の流れを促進する、より低い力を生じさせる。毛管とより幅広の停止部との間の寸法の差が十分であれば、毛管停止部の入口で液体は停止する。液体は最終的には停止部の親水性の壁に沿ってゆっくり進むが、形状を適切に設計することで、この移動を十分に遅らせ、壁が親水性であっても効果的な停止を行うことが見い出された。
【００１７】
疎水性の停止部が親水性の毛管内に配置されている場合には、圧力差を付加することで疎水性停止部の影響に打ち勝たなければならない。一般に、必要とされる圧力差は、液体の表面張力、親水性毛管との液体の接触角のコサインおよび毛管の寸法の変化量の関数である。すなわち、高い表面張力を有する液体では、疎水性停止部に打ち勝つのに要する力は、低い表面張力を有する液体よりも低い。親水性毛管の壁を濡らせる、すなわち小さい接触角を有する液体が疎水性停止部に打ち勝つには、より大きな接触角を有する液体よりも強い力を要する。疎水性のチャネルが小さいほど、付加すべき力は大きくなる。この力は、停止後よりも停止前により大きな圧力を可能とする任意の手段によって生じさせることができる。実際には、プランジャが、停止前に液体をポート内へ押し入れるか、または停止後に通気孔から空気を抜くことにより、遠心力を付加するのと同様に効果的に、停止に打ち勝つ力をもたらすことができる。
【００１８】
チップ（このチップ内で、親水性または疎水性停止部に打ち勝つために力が付加される）を設計するために、実験または計算による流れのシミュレーションを使用して、液体含有ウェルをチップ上に位置決めし、そして相互接続する毛管チャネルを大きさ順に並べることで、付加された力を調整して必要な力を与えることにより、液体サンプルを必要に応じて移動できるようにすることを可能とする有益な情報を提供することができる。
【００１９】
マイクロ流体デバイスは、対象とする分析対象物を測定する分析手法の必要に応じて多くの形態を取ることができる。マイクロ流体デバイスは、一般に、乾燥試薬もしくは液体試薬またはコンディショニング材料を含有するウェルを接続する毛管通路のシステムを採用している。分析手順は、サンプルを希釈することで、計量されたサンプルを用意し、分析対象物を事前反応させて後続の反応への準備を整わせ、妨害成分を除去し、試薬を混合し、細胞を溶解し、生体分子を捕捉し、酵素反応を行い、または結合事象、着色もしくは析出を醸成することを含む。このような準備ステップは、サンプルの計量前または計量中に、あるいは計量後の、分析対象物の測定値を得る反応を行う前に実施することができる。
【００２０】
液体サンプルの導入
一般に、サンプルを入口ポートで、非常に短時間、好ましくは僅か約１秒間で導入することが望ましい。通常、マイクロ流体チップの通路およびチャンバは空気で満たされている。サンプルと試薬との接触から正確な結果を確実に得るために、０．１〜２μLといった少量のサンプルで通路とチャンバを完全に充填する必要がある。試薬を含有するチャンバから空気が完全に除去されていないと、試薬の部分的な反応しか得られない。以下の実施例に記述するように、工程は入口ポートから開始し、反応チャンバへの入口であってよい第１チャンバへと続く。
【００２１】
液体サンプルはいくつかの方法で導入できるため、入口ポートの開口部の実際の形状は一様でない。いくつかの開口部形状が満足なものであることがわかっているため、開口部の形状は性能にとって重要であるとは考えられない。例えば、内部にサンプルを入れる単なる円形の開口部であってもよい。あるいはまた、サンプルを入れておくピペット内の対応する形状と係合するように、開口部をテーパー状にさせることもできる。しかし、その嵌合は、嵌合の取り外しにより負圧を生じさせてしまうことがないよう、余り密に行うべきではない。一つの実施態様では、開口部は、特定タイプのピペットチップと係合するよう設計されているプラスチックポートと嵌合している。このようなポートは開閉可能で、ポートがピペットと係合するまでマイクロ流体チップ内に何も入ることができないようにすることができる。搬送タイプによっては、プランジャを使用してサンプルを入口ポート内に押し入れる際に、サンプルを正圧により導入することができる。しかし、ピペットからの計量は不要である。あるいはまた、サンプルを単に入口ポートの開口部に配置し、毛管作用を用いてサンプルをマイクロ流体チップ内へ引き入れてもよい。また、サンプルを単に入口ポートの開口部に配置し、減圧を用いてサンプルをマイクロ流体チップ内に引き入れることもできる。既に述べたように、開口部が小さい場合、通路壁と液体の表面張力の相互作用により十分な毛管力が生じる。一般に、生物学的サンプルは水を含有しているので、入口ポートおよび関連する通路の壁が親水性であるなら、正圧が無くても、サンプルはマイクロ流体チップ内へ引き入れられる。しかし、入口ポートにおける負圧は、入口チャンバから液体を引き出す恐れがあるので、望ましくないことに留意すべきである。サンプルの導入中に負圧の発生を防止する手段を提供する必要がある。この目的のために、プランジャを使用してサンプルを移動させるか、またはサンプル液体の後方に大気への通気孔を設けることで、正圧を発生させることを利用することができる。
【００２２】
液体が均一に分配されると仮定した場合、入口開口部と第１チャンバとを接続する入口通路が、チャンバ内の様々な場所に配置された開口部から第１チャンバへ入ってもよいことが見い出された。図３は、入口通路がとり得る３つの可能な経路を示す。図３ａでは、液体は、チップ底部における毛管通路を通り、入口ポートに最も近い地点にて上方向に向かって入口チャンバに入る。図３ｂでは、毛管通路はチップの頂部に沿って延び、最も近い地点にてチャンバ内に入る。図３ｃに示す第３の可能性では、毛管通路がチップ底部に沿って延び、チャンバの下を通り、図３ａで使用した端部とは反対に位置する端部にてチャンバ内に入る。各々の場合において、チャンバ全体にわたって液体を均一に分配する手段を含むことが重要である。液体がランダムにチャンバを充填できるようにしておくと、空気がチャンバ内にトラップされ、完全には除去されなくなる可能性がある。このような場合には、空気は、後に計量チャンバまたは試薬チャンバ内に移送される液体量に影響を与えやすい。当然ながら、分析結果の正確性は明らかに損なわれる。
【００２３】
液体サンプルの試薬への到達を制約するか、またはチャンバに完全には充填させない気泡の形成を避けるためには、空気を均一に除去することが重要であることがわかった。何れの結果も望ましくない。例えば、第１サンプルウェル内の流量規制を使用することで、液体が入口ポートから毛管通路を経て流入するにつれ、液体は、サンプルウェル全体にかけて均一に広がり、空気を通気孔から押し出すようにすることができる。
【００２４】
非常に満足できることが見出された、流量規制の一つのタイプは、入口毛管と空気用の通気孔との間の入口チャンバを横切って延びる溝または堰である。この溝または堰は、液体の均一な分配を更に助けるための、チャンバを横切って間隔をおいて配置した、楔型状の多辺形構造または湾曲形状を有する。あるいはまた、以下で説明するようなマイクロ構造体は、入口チャンバ全体にサンプル液体の均一な分配をもたらすことができる。既述の手段によって液体を分配する場合、入口毛管の上流で必要な圧力はより高くなり、下流の通路への液体の移動にも影響する。入口チャンバは常に空ではないことにも言及しておかねばならない。入口チャンバは試薬および／またはフィルタを含有していてもよい。例えば、血球が血漿の分析を妨害しないようにするために、入口チャンバが血漿から赤血球を分離させるためのガラス繊維を含有している場合には、チャンバ全体にわたるサンプルの流れを制御する構造部に遭遇する前にこのステップが実施される。入口チャンバ内に抗凝血剤を含有することもできる。
【００２５】
いくらかのマイクロ流体チップでは、意図する分析手法に十分な量のサンプル液体が導入されることを確実にするために、過剰なサンプルが溢流液チャンバまたは溢流液ウェルに移送される。サンプルの色および/または小さなサイズのためにサンプルを見るのが困難な場合には、溢流液チャンバはインジケータを含有していてもよい。サンプルが溢流液チャンバに流入する際に、例えば色の変化により、インジケータが、入口チャンバが一杯になったことを、分析を行っている人に示す。このようなインジケータ試薬の１つに、バッファおよびｐＨインジケータ色素の使用が挙げられるが、このｐＨインジケータ色素は、インジケータ試薬が濡れると、ｐＨによって染料の色がその乾燥状態から変化する。多くのこのような色の変化や、そして還元化学反応および反応を生ずる電気化学信号が当業者に公知である。
【００２６】
マイクロ構造体
本発明書で使用する用語「マイクロ構造体」は、マイクロリットル規模の液体サンプルを、液体ではなく、基板上に固定化された試薬またはコンディショニング剤と確実に均一に接触させることを確実にする手段に関する。一般に、試薬は液体であるが、多孔質支持体上にコーティングされ、乾燥させてある。液体サンプルの均一な分配と、これと同時に行うウェルからの空気の排除は、様々なタイプのマイクロ構造体を用いて実施できる。したがって、これらは上述の入口チャンバにおいても有効である。
【００２７】
一つの好ましいマイクロ構造体では、液体が入口チャンバを直線的に通過することができないようにするために、柱状体の配列部が配置されている。液体は、柱状体の配列部を通過する際、絶え間なく方向が変わるように強制される。同時に、柱状体の間隔の寸法は、液体の流れを引き起こす毛管力を生じさせるのに十分狭くしてある。サンプルが柱状体配列部を通って押し寄せてくるにつれて、試薬領域から空気が排去される。各々の柱状体は、米国特許第６，２９６，１２６号に開示されているように、液体の移動を容易にするための１つ以上の楔型カットアウト部を有していてよい。楔型カットアウト部は、約９０°以下の楔角度と２００ミクロン未満の楔縁における曲率半径とを有する。
【００２８】
これ以外のタイプのマイクロ構造体は、円形、星形、三角形、四角形、五角形、八角形、六角形、七角形、楕円形、十字形、短形、またはこれらの組み合わせの断面形状を有する３次元の柱形状などが有効である。平坦域上の試薬に至る傾斜路のような２次元形状のマイクロ構造体の使用も有効である。
【００２９】
用途
本発明のマイクロ流体デバイスには多くの用途がある。血液、尿、水、唾液、脊髄液、腸液、食品、血漿を含むが、これらに限定されることはなく、多くの生物学的流体のサンプルに対して分析を行うことができる。血液と尿は特に対象とするものである。検査する流体のサンプルをサンプルウェル内に配置し、その後、１つ以上の計量ウェル内で分析分量に計測する。計量したサンプルを、例えば、タンパク質、細胞、有機小分子、または金属を含む対象の分析対象物についてアッセイする。このようなタンパク質の例には、アルブミン、ＨｂＡ１ｃ、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、ＣＲＰ、エステラーゼおよびＢＮＰが含まれる。分析できる細胞には、大腸菌、シュードモナス菌、白血球、赤血球、ｈ．ピロリ菌、Ａ群連鎖球菌、クラムジア、単核細胞が含まれる。検出できる金属には、鉄、マンガン、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウムが含まれる。
【００３０】
多くの用途において、試薬とサンプルとの反応により発現する色の変化が測定される。チップ内の小ウェル内に配置した電極を使用してサンプルの電気的測定も実行可能である。このような分析の例には、電流測定、インピーダンス測定、電位測定の検出方法に基づいた電気化学的信号トランスデューサが挙げられる。例には、酸化および還元化学反応の検出、および結合事象の検出が含まれる。
【００３１】
本発明のチップに使用できる様々な試薬法がある。試薬が変化を受けることで、発生した信号の強度は臨床被検体物中で測定される分析対象物の濃度と比例する。これらの試薬は、担体上で乾燥されており、インジケータ色素、金属、酵素、ポリマー、抗体、電気化学反応性成分およびその他の、様々な化学薬品を含有している。頻繁に使用される担体は、様々なサンプルを吸い上げそして移送する性質を備えた、紙、メンブレンまたはポリマーである。試薬ストリップを使用する分析において遭遇する問題を克服するために、これらの担体を、本発明のチップ内部の試薬ウェル内に導入することができる。
【００３２】
図４は、尿中の、白血球、亜硝酸塩、ウロビリノーゲン、タンパク質、アルブミン、クレアチニン、ウリスタチン、カルシウム、シュウ酸塩、ミオグロビン、ｐＨ、血液、比重、ケトン、ビリルビンおよびグルコースについての分析に使用するマイクロ流体ディスク１０を示す。このディスクは、尿サンプルを分析するための１６本の平行な経路を含む。平行経路の各々は、８個の半径方向位置（１０−１〜１０−８）に対として等間隔に配置され、９個目の半径方向位置に配置されたサンプルチャンバ１２から分配されたサンプルを受ける。サンプルは入口ポート１４から導入される。各々の平行経路は、毛管リング１６を介してサンプルの一部を受け、ディスクの中央を介して通気される。平行経路は以下のとおりに記述することができる：計量チャンバ（１８−１〜１８−１６）に接続する毛管であり、停止部を有する毛管を介して第１試薬ウェル（２０−１〜２０−１６）と接続し、停止部を有する別の毛管を介して第２試薬ウェル（２２−１〜２２−１６）と接続している。第２試薬ウェルは、停止部を有する毛管を介して液体試薬ウェル（２４−１〜２４−１６）と接続し、そして、停止部を有する毛管を介して廃棄物チャンバ（２６−１〜２６−１６）と接続している。全てのチャンバは、空気を追い出す通気孔がつけてある。２本の経路用のチャンバ通気孔が共通の共用通気孔に集められ、ディスクの底部へ排出されている。
【００３３】
第１ウェル内で分析対象物が試薬と反応し、次に、反応した試薬が、更なる反応のために第２ウェルへ送られる分離ステップが可能である。更に、試薬を、第１ウェル内で再懸濁させて、反応のために第２ウェルへ移動させることができる。分析対象物または試薬を、第１または第２ウェル内にトラップし、遊離試薬対結合試薬の決定を行ってもよい。第２ウェル内にトラップされた材料を洗浄し、材料を廃棄物チャンバへ移動させるために、第３の液体試薬を使用することもできる。
【００３４】
遊離試薬対結合試薬の決定は、マルチゾーン免疫アッセイおよび核酸アッセイに特に有効である。このデバイスに適合できる様々なタイプのマルチゾーン免疫アッセイがある。免疫クロマトグラフィアッセイを適合させる場合、試薬フィルタを別々のウェル内に配置し、クロマトグラフィ力（chromatographic force）が働かない時には物理的に接触させる必要はない。免疫アッセイまたはＤＮＡアッセイを、グラム陰性種（例えば、大腸菌、エンテロバクター菌、シュードモナス菌、クレブシエラ菌）、およびグラム陽性種（例えば、ブドウ球菌アウレウス、腸球菌）のようなバクテリアを検出するために、発展させることができる。免疫アッセイは、アルブミン、ヘモグロビン、ミオグロブリン、α−１−ミクログロブリン、免疫グロブリン、酵素、グリオプロテイン（glyoprotein）、プロテアーゼ阻害剤、薬剤およびサイトカインのようなペプチドとタンパク質の完全なパネルに発展させることができる。例えば、米国特許第４，８０６，３１１号（Greenquist, Multizone analytical Element Having Labeled Reagent Concentration Zone，1989年2月21日）、米国特許第４，４４６，２３２号（Liotta, Enzyme Immunoassay with Two-Zoned Device Having Bound Antigens, 1984年5月1日）、を参照されたい。
【００３５】
図５に、免疫アッセイに使用できる一つのマイクロ流体チップを示す。サンプルポート１０にサンプルを入れ、ここから毛管作用によって、空気を確実に完全に除去するための堰または溝を有する事前チャンバ１２へ送られる。その後、液体は計量毛管１４内に入る。ウェル１８は変成剤/酸化液を含有している。混合チャンバ２０は、血液サンプルをウェル１８からの液体と混合するための空間およびマイクロ構造体を備えている。ウェル２２は、ウェル２０から流出する混合液に加える洗浄液を含有している。チャンバ２４は、事前コンディショニングしたサンプルと、乾燥基板上に配置された標識した単クローン抗体との均一な接触をもたらすための柱状体配列部を有している。チャンバ２６内で、基板上に配置した標識したサンプルは、接触により凝集を起こし、色を生じ、その色で、サンプル中のグリコヘモグロビンの量が測定され、定量される。残りのウェルは、過剰のサンプル（２８）、過剰の変成されたサンプル（３０）のため、そしてチャンバ２６内の基板上へとサンプルを吸い込むのに用いるための吸い上げ材料（３２）のための空間を提供する。
【００３６】
乾燥試薬を再溶解させる潜在的な用途には、濾過、沈降分析、細胞選別、細胞分類（質量差）および遠心分離が含まれる。固相（例えばマイクロビーズ）上のサンプル分析対象物の富化（濃縮）を感度の向上に用いることができる。富化したマイクロビーズを、連続な遠心分離により分離することができる。多重化（例えば、様々な試薬チャンバを平行および/または逐次的に計量する）を用いることで、多数のチャネルを可能にし、各々が明らかになった離散結果をもたらす。多重化は、入口ポートと流体接続した多数の計量毛管ループを折衷させる毛管配列、または計量毛管ループの各々と接続した一回分の供給チャネルおよび/または毛管停止部の配列によって行うことができる。磁力のような２次的な力との組み合わせをチップ設計に使用することができる。磁気ビーズのような粒子は、試薬の担体として、または分析対象物もしくは妨害物質のようなサンプル成分を捕捉するための担体として使用される。密度のような物理特性による粒子の分離（分割分別（split fractionation）と類似）もある。
【００３７】
実施例１
図３ｃのものと同様の検査チップにおいて、入口ポート開口部の形状を、開口部の形状が入口チャンバの充填にとってクリティカルでないことを示すために、変更した。これらの試験の結果を以下の表に示す。
【００３８】
【表１】
2007520693.tif 000003
【００３９】
入口ポートとして毛管を使用することで、入口にアダプタが有っても無くても、入口チャンバは２秒間未満で充填された。充填時間は、使用した流体、ならびに毛管の表面エネルギー、および毛管の長さ、幅または形状に依存した。
【００４０】
実施例２
実施例１のものと同様の検査チップを使用して、ポート開口部を介して流体を入口チャンバに加えるのに用いる圧力および量を変更した。入口チャンバ容積は５μLであり、入口チャンバ充填時に、計量ループは０．３μL容の受け入れた液体を有していた。血液と尿に対して実験を行った。
【００４１】
【表２】
2007520693.tif 000004
【００４２】
毛管作用によるか、またはプランジャの使用により付加された圧力が、サンプル容積４〜６μLの幅広い範囲にわたる許容し得る充填を可能とした。過剰充填の場合には、過剰分の液体が入口チャンバ通気孔から排出された。そのため、溢流液チャンバで過剰のサンプルを受けるのが望ましい。このチャンバは、計量ループが完全に充填され、過剰のサンプルが溢れた場合に充填される。
【００４３】
実施例３
図１および図２のマイクロ流体デバイスを、血中のグルコース含有量を測定するために使用した。ヘパリンで前処理した全血を２５０℃で醸成し、血液サンプル中にもともと存在するグルコースを分解した。ＹＳＩグルコース測定器（YSI Instruments Inc.）でアッセイする際に、血液に、０、５０、１００、２００、４００、および６００mg/μLのグルコースを加えた。Ｂｅｌｌの米国特許第５，３６０，５９５号に記載のグルコース試薬（クロマジェニックグルコース(chromagenic glucose)）を、プラスチック基板上に配置したナイロンメンブレンにコーティングした。この試薬のサンプルをチャンバ３４内に配置し、デバイスの底部をＥｘｃｅｌ  Ｓｅａｌｐｌａｔｅ（Excel Scientific Inc.）で覆った。
【００４４】
プランジャを有する２μLの毛管（Drumond Aqua）を使用して、１つの前記濃度のグルコースを含有する血液のサンプルを入口ポート３０内に導入した。サンプル分配時に入口ポートはシールされているため、サンプルを流入通路３２内、更に試薬領域３４内へ強制流入させる正圧を設定した。サンプルが試薬と反応して色の変化をもたらし、これを、分光計で６８０nmで読み取り、黒色と白色の標準に対して補正した。
【００４５】
一連の血液サンプルと共に２つのプラスチック基板、ＰＥＳ、ＰＥＴを使用した。試薬でコーティングしたＰＥＴを使用した場合は、５００〜９５０nmの透過率計を用いてサンプルとの反応を読み取った。試薬でコーティングしたＰＥＳを使用した場合は、底面反射率読み取り計を使用して、サンプルとの反応を読み取った。
【００４６】
結果を通常の手法、すなわちＹＳＩ法の結果と比較した。以下の表からわかるように、匹敵するな結果が得られた。
【００４７】
【表３】
2007520693.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】５０個のサンプル中のグルコースを測定するためのマイクロ流体チップの一部分を示す。
【図２】図１のマイクロ流体チップの断面図を示す。
【図３】３ａ、３ｂ及び３ｃは、一組の入口ポートを示す。
【図４】尿の分析のためのマイクロ流体ディスクを示す。
【図５】免疫分析のためのマイクロ流体チップを示す。
【図１】
2007520693.tif 000006
【図２】
2007520693.tif 000007
2007520693.tif 000008
【図４】
2007520693.tif 000009
【図５】
2007520693.tif 000010
【国際調査報告】
2007520693.tif 000011
2007520693.tif 000012