(57)【要約】  胃潰瘍を引き起こす細菌を含む細菌の増殖を阻害するのに有用な組成物を提供する。さらに、そのような組成物を製造できるトランスジェニック生体を提供する。また、この組成物を使用してヒトを含む個体の胃潰瘍を治療又は予防する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体分子に相互作用して結合した少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有することを特徴とする天然非存在の化合物。
【請求項２】
前記担体分子が、Ｏ−グリカンを有していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記Ｏ−グリカンが、コア２分岐型のＯ−グリカンであることを特徴とする請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記担体分子が、ポリペプチドを有していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有することを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、Ｏ−グリカンを有していることを特徴とする請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
前記Ｏ−グリカンが、コア２分岐型のＯ−グリカンであることを特徴とする請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
前記担体分子が、ムチン様ポリペプチドを有していることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記ムチン様ポリペプチドが、ＣＤ４３（ロイコシアリン）、ＣＤ３４、又はＭｕｃ６を有していることを特徴とする請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記Ｏ−グリカンが、コア１型のＯ−グリカンであることを特徴とする請求項５に記載の化合物。
【請求項１１】
複数のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
合成したオリゴ糖を有することを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する糖タンパク質を製造する方法であって、ポリペプチドのグリコシル化条件下で、
α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）と、
コア２型のβ１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）又はコア１型の伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）と、
少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドとを接触させ、
該ポリペプチドを、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化して、少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する糖タンパク質を製造する方法。
【請求項１４】
前記担体ポリペプチドが、可溶性ポリペプチドであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記担体ポリペプチドが、ＣＤ４３（ロイコシアリン）、ＣＤ３４、又はＭｕｃ６であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記担体ポリペプチドが、哺乳類の母乳中に分泌されるムチン型糖タンパク質であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ムチン型糖タンパク質を含む母乳に、α４ＧｎＴと、必要に応じてＣ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとを接触させることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記糖タンパク質が、複数のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記糖タンパク質を単離することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載の方法により製造されることを特徴とする、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質。
【請求項２１】
請求項１７に記載の方法により製造される母乳であって、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質を含むことを特徴とする母乳。
【請求項２２】
少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する組換え型の糖タンパク質を製造する方法であって、
α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）をエンコードする第一のポリヌクレオチドと、
コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）又はコア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）をエンコードする第二のポリヌクレオチドと、
少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとを
真核細胞内で発現させる工程を含み、
該第一のポリヌクレオチドと、該第二のポリヌクレオチドと、及び該第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかが、真核細胞に導入された外因性ポリヌクレオチドであり、
該担体ポリペプチドを、該Ｃ２ＧｎＴ−Ｉと該α４ＧｎＴとによって、又は該Ｃ１−β３ＧｎＴと該α４ＧｎＴとによってグリコシル化して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を製造する方法。
【請求項２３】
前記担体ポリペプチドが、可溶性ポリペプチドであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記担体ポリペプチドが、ＣＤ４３（ロイコシアリン）、ＣＤ３４、又はＭｕｃ６であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換え型の糖タンパク質が、複数のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記真核細胞が、哺乳類の細胞であることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換え型の糖タンパク質を単離することを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２２に記載の方法により製造され、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有することを特徴とする組換え型の糖タンパク質。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法により製造され、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有することを特徴とする単離された組換え型の糖タンパク質。
【請求項３０】
少なくともα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）をエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと；
コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）をエンコードし、又はコア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）をエンコードする第二のポリヌクレオチドと；
少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとを、
少なくともゲノム中に、安定に組み込まれて有する非ヒトのトランスジェニック哺乳類であって、
該第一のポリヌクレオチドと、該第二のポリヌクレオチドと、該第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかが外因性ポリヌクレオチドであり；
該第一のポリヌクレオチドと、該第二のポリヌクレオチドと、該第三のポリヌクレオチドとが、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合されており；
該第三のポリヌクレオチドが、該担体ポリペプチドを母乳内に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列に相互作用して結合しており；
該Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又は該Ｃ１−β３ＧｎＴと、該α４ＧｎＴと、該担体ポリペプチドとの発現により、該担体ポリペプチドが、該Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又は該Ｃ１−β３ＧｎＴと該α４ＧｎＴとでグリコシル化されて、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を製造することを特徴とする非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３１】
前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかが、外因性のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする請求項３０に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３２】
前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとが、夫々外因性のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする請求項３０に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３３】
前記プロモータが、乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモータ、α−カゼインプロモータ、β−カゼインプロモータ、γ−カゼインプロモータ、α−ラクトアルブミンプロモータ、又はβ−ラクトグロブリンプロモータを含んでいることを特徴とする請求項３０に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３４】
前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、及び前記第三のポリヌクレオチドとが、乳腺特異的遺伝子の３’制御配列、又は乳腺中で活性化した３’制御配列にも相互作用して結合していることを特徴とする請求項３０に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３５】
前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとが夫々、前記５’制御配列と前記３’制御配列とに相互作用して結合していることを特徴とする請求項３４に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３６】
前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとが、単一の核酸分子を構成しており、該核酸分子が前記５’制御配列と前記３’制御配列とに相互作用して結合していることを特徴とする請求項３４に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３７】
前記哺乳類が、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又はウシのいずれかであることを特徴とする請求項３０に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３８】
前記トランスジェニック哺乳類が、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類であり、抗菌活性型の組換え型糖タンパク質を、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類により製造された母乳中に、分泌することを特徴とする請求項３０に記載の非ヒトのトランスジェニック哺乳類。
【請求項３９】
請求項３８に記載の非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類によって製造された母乳。
【請求項４０】
非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の母乳中に、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を製造させる方法であって、
ａ）α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）をエンコードする少なくとも第一の外因性ポリヌクレオチドを、非ヒトの哺乳類の胚に導入し；
該第一の外因性ポリヌクレオチドが、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合し、α４ＧｎＴの発現により、乳腺上皮細胞中の担体ポリペプチドが、α４ＧｎＴによってグリコシル化して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を製造するもので；
ｂ）子孫を出産する宿主の雌哺乳類に、該ａ）の胚を移植し；
ｃ）前記のｂ）の雌の子孫によって、５’制御配列に相互作用して結合しゲノム中で安定に組み換えられた第一の外因性ポリヌクレオチドを含む母乳を、製造させる工程を有することにより、
非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の母乳中に、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を製造させる方法。
【請求項４１】
該非ヒトの哺乳類の胚に、
ａ）外因性のコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）をエンコードし、又は外因性のコア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）をエンコードする第二の外因性ポリヌクレオチド；又は
ｂ）少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する外因性の担体ポリペプチドをエンコードする第三の外因性ポリヌクレオチド；又は
ｃ）該第二の外因性ポリヌクレオチド及び該第三の外因性ポリヌクレオチド
をさらに導入する工程を有しており、
該第二の外因性ポリヌクレオチドが共存する場合、該第三の外因性ポリヌクレオチドが共存する場合、又は該第二の外因性ポリヌクレオチド及び該第三の外因性ポリヌクレオチドが共存する場合、それが、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合しており；
該第三の外因性ポリヌクレオチドが共存する場合、それが、外因性の担体ポリペプチドを母乳内に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列に相互作用して結合しており；
該Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又は該Ｃ１−β３ＧｎＴが共存する場合、α４ＧｎＴと外因性の担体ポリペプチドとが共存する場合、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴがあるときはそれと、α４ＧｎＴとによって、該担体ポリペプチドが、グリコシル化されて、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を製造させることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｃ）の雌の子孫から搾乳する工程を有することにより、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を含む母乳を得ることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記母乳から少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を単離する工程をさらに有することにより、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を得ることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法により得られる母乳。
【請求項４５】
請求項４３に記載の方法により単離されて得られ、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質。
【請求項４６】
コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ）を発現する細菌の細胞壁の形成を抑制乃至阻害する方法であって、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物に接触させて、該ＣＧＬ合成を抑制乃至阻害する工程を有することによって、該細菌の細胞壁の形成を抑制乃至阻害することを特徴とする方法。
【請求項４７】
前記化合物が、グラム陰性細菌中のＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を抑制乃至阻害することを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記細菌が、ヘリコバクター種の細菌であることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ヘリコバクター種の細菌が、ヘリコバクター  ピロリであることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が、単離された胃腺粘液細胞型ムチンであることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ）を発現する細菌の増殖を抑制乃至阻害する方法であって、少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する化合物に、該細胞を接触させて、該ＣＧＬ合成を抑制乃至阻害する工程を有することによって、該細菌の増殖を抑制乃至阻害することを特徴とする方法。
【請求項５２】
前記化合物が、細菌のＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を抑制乃至阻害することを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細菌が、ヘリコバクター種の細菌であることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヘリコバクター種の細菌が、ヘリコバクター  ピロリであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物が、単離された胃腺粘液細胞型ムチンであることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記化合物が、Ｏ−グリカンを含んでいることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物が合成されたオリゴ糖を含んでいることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
ヘリコバクター種の細菌が個体に感染することによる胃潰瘍の兆候又は症状を改善する方法であって、該個体に、少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する化合物が投与されて、該化合物が該ヘリコバクター種の細菌に接触し該ヘリコバクター種の細菌の増殖を抑制乃至阻害する工程を含むことによって、胃潰瘍の兆候又は症状を改善することを特徴とする方法。
【請求項５９】
前記ヘリコバクター種の細菌が、ヘリコバクター  ピロリであることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記個体が哺乳類であることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記哺乳類が、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、又はフェレットであることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記個体がヒトであることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物が、単離された胃腺粘液細胞型ムチンを含んでいることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物が、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンを含んでいることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記化合物が、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３（ロイコシアリン）を含んでいることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記化合物が、合成されたオリゴ糖を含んでいることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
前記化合物が経口投与されることを特徴とする請求項５８に記載の方法。
【請求項６８】
請求項２１に記載の母乳を飲用することを特徴とする請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
胃潰瘍感受性の個体にヘリコバクター種の細菌が感染することによる胃潰瘍を予防する方法であって、該個体に少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する化合物が投与されて、該化合物が該ヘリコバクター種の細菌の増殖を妨げる工程を有することによって、該ヘリコバクター種の細菌の感染による胃潰瘍を予防することを特徴とする方法。
【請求項７０】
前記個体への前記化合物の投与が、請求項２１に記載の母乳を飲用する工程を有していることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
ヘリコバクター種の細菌が個体に感染して胃潰瘍又は胃癌を発症した個体の胃潰瘍又は胃癌を改善する方法であって、該個体に少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する化合物が投与されて、該化合物が該ヘリコバクター種の細菌の増殖を妨げる工程を有することによって、該ヘリコバクター種の細菌の感染による胃潰瘍又は胃癌を改善することを特徴とする方法。
【請求項７２】
前記個体への前記化合物の投与が、請求項２１に記載の母乳を飲用する工程を有していることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
少なくともα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）をエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと；
コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）をエンコードし、又はコア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）をエンコードする第二のポリヌクレオチドと；
少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとが、
ゲノム中に安定に組み込まれているトランスジェニック植物であって、
該第一のポリヌクレオチドと、該第二のポリヌクレオチドと、該第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかが外因性ポリヌクレオチドであり；
該第一のポリヌクレオチドと、該第二のポリヌクレオチドと、該第三のポリヌクレオチドとが、プロモータを含む植物遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合されており；
Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴと、α４ＧｎＴと、担体ポリペプチドとの発現により、該担体ポリペプチドが、該Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又は該Ｃ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化されて、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を製造することを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項７４】
前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかが、外因性のポリヌクレオチドを含んでいることを特徴とする請求項７３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７５】
前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとが、夫々外因性のポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項７３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７６】
前記プロモータが、構成プロモータ、誘導プロモータ、又は組織特異プロモータを含んでいることを特徴とする請求項７３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７７】
前記プロモータが、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ユビキチンプロモータ、テトラサイクリン応答プロモータ、ｒｂｃＳ遺伝子光誘導プロモータ、種子特異的オレオシン遺伝子プロモータ、又はコメアクチンプロモータを含んでいることを特徴とする請求項７３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７８】
前記植物がダイズ又はコメであることを特徴とする請求項７３に記載のトランスジェニック植物。
【請求項７９】
請求項７３に記載のトランスジェニック植物から収穫された種子。
【請求項８０】
請求項７３に記載のトランスジェニック植物から収穫された穀類。
【請求項８１】
請求項７３に記載のトランスジェニック植物から収穫された乳液。
【請求項８２】
トランスジェニック植物中に、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性組換え型の糖タンパク質を製造させる方法であって、
ａ）植物細胞に少なくとも、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）をエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを導入し；
該第一の外因性ポリヌクレオチドが、プロモータを含む植物遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合されており；
該α４ＧｎＴの発現により、該植物の細胞中の該担体ポリペプチドが、該α４ＧｎＴによってグリコシル化され、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を製造するもので；
ｂ）該ａ）の植物細胞から植物を生育させ、トランスジェニック植物を得ることによって、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質をトランスジェニック植物中に製造させる工程を有することを特徴とする、抗菌性の組換え型の糖タンパク質の製造方法。
【請求項８３】
ａ）外因性のコア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）をエンコードし、又は外因性のコア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）をエンコードする第二の外因性ポリヌクレオチド；又は
ｂ）少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する外因性の担体ポリペプチドをエンコードする第三の外因性ポリヌクレオチド；又は
ｃ）該第二の外因性ポリヌクレオチド及び該第三の外因性ポリヌクレオチド
をさらに植物細胞に導入する工程を有しており、
該第二の外因性ポリヌクレオチドが共存する場合、該第三の外因性ポリヌクレオチドが共存する場合、又は該第二の外因性ポリヌクレオチド及び該第三の外因性ポリヌクレオチドが共存する場合、それが、プロモータを含む植物遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合しており；
該Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又は該Ｃ１−β３ＧｎＴが共存する場合、α４ＧｎＴと外因性の担体ポリペプチドとが共存する場合、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴがあるときはそれと、α４ＧｎＴとによって、該担体ポリペプチドが、グリコシル化されて、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質をトランスジェニック植物中に製造させることを特徴とする請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記トランスジェニック植物から、種子、葉、根、又は花の少なくともいずれかを含むトランスジェニック植物収穫物を分取することを特徴とする請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記トランスジェニック植物収穫物から、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を単離することにより、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を得る工程を有することを特徴とする請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記トランスジェニック植物収穫物を加工して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を含む乳液を得る工程を有することを特徴とする請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
請求項８５に記載の方法により製造されることを特徴とする、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質。
【請求項８８】
請求項８６に記載の方法により得られることを特徴とする乳液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国特許法（３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．）１１９条に従い、２００４年２月２０日に出願された米国出願番号６０／５４６，６００に基づく優先権を主張するもので、その全内容が本明細書に含まれている。
【０００２】
この発明は、国立癌研究所から授与されたＣＡ７１９３２及びＣＡ３３０００の助成金に基づく政府支援により、なされたものである。米国政府は、本発明についてのある種の権利を有している。
【０００３】
本発明は、概要すると抗菌性組成物に関するもので、特に、末端α１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するＯ−グリカン、末端α１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有するこのような物質を含んでいる組成物、及びその組成物を用いて細菌の感染を予防及び／又は治療する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
胃は、食物を消化し易くするために強い酸性環境となっている。これによって、栄養分が分解されて腸で吸収される。一般に、胃の内壁の細胞は、胃の細胞が産生する粘液層で保護されている。胃の内壁がむき出しとなったりびらんによる穴を生じたりして、胃壁が酸性環境に晒されると、胃潰瘍が惹き起こされる。
【０００５】
胃潰瘍は、胃酸の分泌の増加や酸性物質の摂取によって惹き起こされる。アスピリンやイブプロフェンのような非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤｓ）を服用したり、多量のアルコールやカフェインを飲用したりするヒトに特に惹き起こされ易い。胃潰瘍患者の約７０％がヘリコバクター  ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ：  Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に感染している。これらのＮＳＡＩＤｓ治療による胃潰瘍のうちの約５０％は、ヘリコバクター  ピロリによって胃炎が惹き起こされたものでないが、ＮＳＡＩＤｓによる治療を行っていないほとんどの胃潰瘍は、胃内に穴が開いた胃炎やヘリコバクター  ピロリ感染を伴う。ＮＳＡＩＤｓによって惹き起こされた潰瘍患者を除けば、胃潰瘍患者のヘリコバクター  ピロリ感染率は約９６％にも達する。
【０００６】
ヘリコバクター  ピロリは、微好気性、グラム陰性の桿菌であり、全世界の人口のおよそ半分のヒトの胃の内壁上に棲息し、胃炎、慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍などの主な原因であると言われている。また、胃癌等の疾患との関連性が報告されている。この為、ヘリコバクター  ピロリによって惹き起こされる疾患に対する治療薬の開発は、ヒトが健康で快適な生活を維持していくために重要な課題の一つである。
【０００７】
抗ヘリコバクター  ピロリ剤として、例えば、ペニシリン系、テトラサイクリン系、セファロスポリン系、ニューロキノン系等の抗生物質が知られている。しかし、これらの抗生物質は、ヘリコバクター  ピロリに対する抗菌作用を示すものの、単独での投与では十分な抗菌効果が得られない。このため、現在では、これらの抗生物質に加えて、ビスマス剤、プロトンポンプ阻害薬との３剤併用療法が主に行われている。また、特開平１１−１８９５２９号公報に、ベンゾヒドロキサム酸を含有する抗ヘリコバクター  ピロリ剤が提案されている。しかし、これらの場合、投与したときに下痢や吐き気などの副作用があり、安全性に劣るという問題がある。
【０００８】
また、前記の治療薬とは別に、例えば、特開２００３−７３２７８号公報に、植物等から抽出したステリルグルコピラノシドを含有する抗ヘリコバクター  ピロリ剤が提案されている。また、特開２００２−３７０９９５号公報に、オウレン等の生薬から抽出された成分と、炭酸水素アルカリ金属塩とを含有する抗ヘリコバクター  ピロリ薬が提案されている。しかし、これらの場合、ヒトの生体内で発現したものではないため副作用があり、さらに、ヘリコバクター  ピロリの抗菌効果が十分ではないという問題がある。また、前記のいずれの提案にも、ヘリコバクター  ピロリの運動性の低下、及び形態異常については何ら開示されていない。
【０００９】
胃潰瘍治療の目的は、痛みの軽減、潰瘍の治癒、合併症の予防、及び潰瘍の再発の予防である。未治療の潰瘍による合併症には、出血、胃壁の穿孔、及び瘢痕による閉塞症などがある。さらに、胃潰瘍患者の約２〜３％が胃癌を発症する。ヘリコバクター  ピロリに感染した胃潰瘍患者の治療に、抗生物質が使用される。抗生物質により治療すると、ヘリコバクター  ピロリ感染を治癒した後に潰瘍を治癒することができる。また、治療が成功した場合、翌年に再発する患者は５％未満である（ヘリコバクター  ピロリ感染が治癒していない場合の再発率は６０〜８０％である）。
【００１０】
ヘリコバクター  ピロリは胃の内壁を覆っている粘液層の深部に棲息するため、この細菌を胃内から根絶することは困難である。また、抗生物質が、細菌を殺すのに十分な濃度でこの粘液層を透過させるのも困難である。一般に、単剤療法は、感染してしまったヘリコバクター  ピロリの除去に効果を奏しない。例えば、アモキシシリンを用いた場合、この細菌の根絶率は２０％未満であり、メタロニダゾールを用いた場合、根絶率は１０％未満であるが、クラリスロマイシンを併用すると、細菌の根絶率は約４０％となる。そのため、２剤（例えば二種の抗生物質、又は一種の抗生物質と一種の酸低下薬）の併用療法や、３剤（例えば二種の抗生物質と一種の酸低下薬）の併用療法が行われる。二種の抗生物質の併用療法の根絶率は４０〜６０％である。また、最も優れた３剤併用療法で治療した患者のヘリコバクター  ピロリ感染の根絶率は、現在のところ９０％以上である。
【００１１】
あいにく、ヘリコバクター  ピロリも他の細菌のように、抗生物質に対して耐性を生じるようになるため、治療の成功率が低下してしまう。例えば、メタロニダゾールに対する耐性は部位によっては、４０％の高率に達すると報告されている。また、クラリスロマイシンに対する耐性も僅か（２％未満）であるが報告されている。抗生物質に対する耐性は通常経時的に増加するので、それらがヘリコバクター  ピロリの根絶と胃潰瘍の治療とに次第にそれほど有効でなくなるかもしれないという懸念がある。しかし、十分な抗菌効果を有し、副作用がなく、安定性に優れる物質やそれを用いた治療法は、いまだ提案されていない。そのため、胃潰瘍を予防し、また治療するための組成物と、そのための方法とが求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、胃に感染して胃潰瘍を引き起こすヘリコバクター  ピロリの増殖を抑制する胃腺粘液細胞型ムチン、特に末端α１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有するムチンを見出したことに基づきなされたものである。この胃腺粘液細胞型ムチンにこのような活性があることが分かったので、α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する典型的な糖タンパク質を調製したところ、それらがコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド合成やヘリコバクター  ピロリ増殖に対して抑制効果を有するということが、判明した。これによってなされた本発明は、胃潰瘍の治療、十二指腸潰瘍の治療、抗ヘリコバクター  ピロリ剤、胃炎の治療、慢性胃炎の緩和に好適に使用される医薬物質；その物質の製造工程；その物質を用いた胃潰瘍の治療方法；及びその物質を製造できるトランスジェニック哺乳類を提供するというものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、担体分子と相互作用して結合した少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する天然非存在の化合物に関するものである。担体分子は一つ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基に結合することができる分子であり、例えばＯ−グリカン（例えばコア２分岐型Ｏ−グリカン）、ポリペプチド、特に少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチド、又は糖タンパク質（例えば、コア２分岐型Ｏ−グリカンを含むポリペプチドのような、Ｏ−グリカンを一つ以上含むポリペプチド）である。その一つの形態は、担体分子が、例えばＣＤ４３（ロイコシアリン）やＣＤ３４のようなムチン様ポリペプチドであるというものである。別な形態は、前記化合物が、例えば２、３、４、５又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基のような複数のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するというものである。さらに別な形態は、前記化合物が、合成されたオリゴ糖を有するというものである。
【００１４】
また、本発明は、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質の製造方法に関するものである。その方法は例えば、ポリペプチドのグリコシル化に適した条件下で、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）と、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）又はコア１伸長酵素（例えばコア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素であるコア１−β３ＧｌｃＮＡｃＴ又はＣ１−β３ＧｎＴ）と、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドとを、接触させて、該ポリペプチドを、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質を製造するというものである。この担体ポリペプチドは、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ（又はＣ１−β３ＧｎＴ）とα４ＧｎＴとの活性によって一つ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を結合し得るもので、例えば可溶性ポリペプチド（具体的には、可溶性ＣＤ４３ポリペプチド又は可溶性ＣＤ３４ポリペプチド）である。
【００１５】
前記担体ポリペプチドの具体例の一つは、哺乳類の母乳中に通常存在するムチン型糖タンパク質を含むというものである。この具体例の一つの形態として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、哺乳類の母乳と、少なくともα４ＧｎＴと、必要に応じてＣ２ＧｎＴ−Ｉ及び／又はＣ１−β３ＧｎＴとを接触させ、母乳中のムチン型糖タンパク質を、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質に変換する方法が、挙げられる。この具体例の別な形態として、前記ムチン型糖タンパク質を哺乳類の母乳から単離し、哺乳類の母乳から単離されたムチン型糖タンパク質と、少なくともα４ＧｎＴと、必要に応じてＣ２ＧｎＴ−Ｉ及び／又はＣ１−β３ＧｎＴとを接触させ、母乳中のムチン型糖タンパク質を、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質に変異させる方法が挙げられる。
【００１６】
少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質の製造方法は、糖タンパク質を単離する工程を含んでいてもよい。それによって、本発明の方法で製造された少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質は、そのような方法で製造して単離された糖タンパク質として、得られる。
【００１７】
さらに、本発明は、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質の製造方法に関するものである。この方法は例えば、少なくとも異型のα４ＧｎＴをエンコードするポリヌクレオチドを真核細胞内で発現させ、細胞により産生される内因性であってもよいポリペプチドを、細胞内に発現したＣ２ＧｎＴ−Ｉ（又はＣ１−β３ＧｎＴ）とα４ＧｎＴとによって、グリコシル化することができるというものである。例えば、哺乳類の細胞は、外因性（異型）発現α４ＧｎＴの存在下で、内因性Ｃ２ＧｎＴ−Ｉと前記のようにグリコシル化され得るポリペプチドとを発現させて、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を産生して製造する。この方法で注意すべき点は、真核細胞内でα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する天然非存在の糖タンパク質に変異されるため、糖タンパク質が“組換え型”糖タンパク質とみなされるが、この糖タンパク質は、細胞中の異型α４ＧｎＴの発現によってのみ産生されるということである。別な形態として、例えば真核細胞が天然に内因性Ｃ２ＧｎＴ−Ｉや所望の担体ポリペプチドを発現してもしなくても、異型Ｃ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードするポリヌクレオチド及び／又は少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する異型担体ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが細胞内に発現して、担体ポリペプチドが内因性又は外因性（異型）であってもよいＣ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴとによってグリコシル化されるというものである。
【００１８】
前記担体ポリペプチドは、可溶性ポリペプチドであってもよく、例えば可溶性ＣＤ４３又は可溶性ＣＤ３４であってもよい。また、前記組換え型の糖タンパク質は、一つ又は複数のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有していてもよい。前記真核細胞は、エンコードするポリヌクレオチドを発現できる如何なる真核細胞であってもよい。真核細胞は、内因性Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ、異型Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ、異型α４ＧｎＴのいずれかが、内因性担体ポリペプチドや異型ポリペプチドであってもよい担体ポリペプチドに一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を結合できるような酵素活性を有するものであってもよい。例えば前記真核細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞のような哺乳類の細胞や、ヒトのような哺乳類の上皮細胞等の細胞であってもよい。さらに前記方法は、前記組換え型の糖タンパク質を単離する工程を含んでいてもよい。それによって、本発明の方法で製造されて、単離された組換え型の糖タンパク質を含む組換え型の糖タンパク質が、得られる。
【００１９】
また、本発明は、少なくとも、α４ＧｎＴをエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと、さらにＣ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードするポリヌクレオチドと、担体ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドとを、ゲノム中に安定に組み込まれて有する非ヒトのトランスジェニック哺乳類であって、該第一の外因性ポリヌクレオチドが、細胞中又は関連する細胞中にエンコードされたＣ２ＧｎＴを発現させる５’制御配列に相互作用して結合されている非ヒトのトランスジェニック哺乳類に関するものである。５’制御配列は、活性な構成プロモータ、誘導プロモータ、組織特異プロモータ、又はそれと同様のものであってもよい。一つめの具体例として、前記５’制御配列は、乳腺特異的プロモータを含んでいるものである。そのＣ２ＧｎＴと担体ポリペプチドとをエンコードするポリヌクレオチドは、内因性ポリヌクレオチド（例えば非ヒトの動物のゲノムに含まれる遺伝子）であってもよいが、必ずしも必要ではない。二つめの具体例として、Ｃ２ＧｎＴをエンコードするポリヌクレオチドがＣ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードする第二の外因性ポリヌクレオチドであり；及び／又は、担体ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドが少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三の外因性ポリヌクレオチドであるものが挙げられる。この具体例の一つの形態として、前記第一の外因性ポリヌクレオチドと、共存するなら前記第二の外因性ポリヌクレオチドと、共存するなら前記第三の外因性ポリヌクレオチドとが夫々、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合しているものが挙げられる。この具体例の別な形態として、共存するなら前記第三の外因性ポリヌクレオチドは、担体ポリペプチドを母乳内に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列と相互作用して結合しているものが挙げられる。本発明のトランスジェニック哺乳類中のＣ２ＧｎＴ−Ｉと、α４ＧｎＴと、担体ポリペプチドとの発現により、前記担体ポリペプチドは、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴとによってグリコシル化され、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質が産生される。
【００２０】
本発明の目的に有用であって、乳腺特異的遺伝子の５’制御配列のすべて又は一部を構成するプロモータは、乳腺特異的な発現を示すプロモータであってもよい。そのようなプロモータとして、例えば乳清酸性タンパク質プロモータ、α−カゼインプロモータ、β−カゼインプロモータ、γ−カゼインプロモータ、α−ラクトアルブミンプロモータ、又はβ−ラクトグロブリンプロモータが挙げられる。前記第一の外因性ポリヌクレオチドと、前記第二の外因性ポリヌクレオチドと、及び前記第三の外因性ポリヌクレオチドとが、乳腺特異的遺伝子の３’制御配列、又は乳腺中の活性３’制御配列と、さらに相互作用して結合していてもよい。
【００２１】
本発明の非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、一つ、二つ、又は三つの導入遺伝子を用いて作製されて製造されるものであってもよい。これの一つの形態は、前記第一の外因性ポリヌクレオチドと、前記第二の外因性ポリヌクレオチドと、前記第三の外因性ポリヌクレオチドとが、夫々独立に、５’制御配列と、必要に応じ３’制御配列とに、前記のように相互作用して結合し得るというものである。別な形態は、前記第一の外因性ポリヌクレオチドと、前記第二の外因性ポリヌクレオチドと、前記第三の外因性ポリヌクレオチドとが、互いに相互作用して結合し、さらに５’制御配列と、必要に応じ３’制御配列とに、相互作用して結合し、単一の導入遺伝子を形成するというものである。さらに別な形態は、二つの導入遺伝子、例えば、第二の外因性ポリヌクレオチドに相互作用して結合した第一の外因性ポリヌクレオチドを含む第一の導入遺伝子と、第三の外因性ポリヌクレオチドを含む第二の導入遺伝子とであり、前記第一及び第二の導入遺伝子は夫々、５’制御配列と、必要に応じて３’制御配列とに、前記のように相互作用して結合し得るというものである。
【００２２】
本発明の非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又はウシのような如何なる哺乳類であってもよい。具体例として、トランスジェニック哺乳類は、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類であって、抗菌活性型で、前記非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類によって産生された組換え型糖タンパク質を、母乳中に分泌するというものである。それによって前記非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類によって産生された母乳も、得られる。
【００２３】
また、本発明は、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の母乳中に、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を、産生させて製造する方法に関するものである。この方法は、例えば、非ヒトの哺乳類の胚にα４ＧｎＴをエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと、必要に応じてＣ２ＧｎＴ−Ｉ又はコア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）をエンコードする第二の外因性ポリヌクレオチド；及び／又は必要に応じて少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三の外因性ポリヌクレオチドを導入し、前記第一の外因性ポリヌクレオチドと、共存するなら前記第二の外因性ポリヌクレオチドと、共存するなら前記第三の外因性ポリヌクレオチドとが、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合され、共存するなら前記第三の外因性ポリヌクレオチドが、担体ポリペプチドを母乳中に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列と相互作用して結合され；子孫を出産するような宿主の雌哺乳類に前記の胚を移植し；５’制御配列に相互作用して結合した第一の外因性ポリヌクレオチドと前記第二の外因性ポリヌクレオチドと前記第三の外因性ポリヌクレオチドとを含んで、ゲノム中に安定に組み込まれ、前記の雌の子孫に、母乳を産生させることによって行われるというものである。本発明の方法によって製造された非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類中にＣ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴと担体ポリペプチドとが発現し、前記担体ポリペプチドが、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ（又はＣ１−β３ＧｎＴ）とα４ＧｎＴとによってグリコシル化されて、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有し、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の母乳中に分泌される抗菌性の組換え型の糖タンパク質が、産生される。
【００２４】
このような非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の製造方法は、さらに前記雌の子孫から搾乳して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を含む母乳を得る工程を、含むものであってもよい。また前記の方法は、さらに前記母乳から少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を単離することにより、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を得る工程を含んでいてもよい。それによって、本発明は、このような方法で製造される非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類と、その雌トランスジェニック哺乳類から産生される母乳と、この方法で得られる少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する単離された組換え型の糖タンパク質とを、提供することができるというものである。
【００２５】
また、本発明は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ）を発現する細菌の細胞壁の形成を、抑制又は阻害する方法に関するものである。この方法は、例えば、この細菌を、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物に接触させ、ＣＧＬ合成を抑制又は阻害して、前記細菌の細胞壁の形成を抑制又は阻害するというものである。一つの形態として、前記化合物が、細菌のＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を抑制又は阻害して、前記ＣＧＬ合成を抑制又は阻害するというものが挙げられる。前記細菌は、ＧＧＬを発現する細菌であればよく、ヘリコバクター種の細菌、特にヘリコバクター  ピロリも範疇に含んでいる。前記化合物は、本発明の化合物、例えば本発明の組換え型の糖タンパク質、又は胃腺粘膜細胞から単離された胃腺粘液細胞型ムチンも範疇に含んでいる。
【００２６】
さらに本発明は、ＣＧＬを発現する細菌の増殖を抑制又は阻害する方法に関するものである。この方法は、例えば、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物に細菌を接触させ、ＣＧＬ合成を抑制又は阻害して、前記細菌の増殖を抑制又は阻害するというものである。前記方法は例えば、培養中の細菌細胞に前記化合物を添加してｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させたり、細菌に感染した個体、例えばヘリコバクター種の細菌に感染した哺乳類（例えばヘリコバクター  ピロリに感染したヒト）の胃に前記化合物を直接投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏで接触させたりして行なうというものである。前記化合物は、本明細書で示した方法を用いて得られるもので、例えばＯ−グリカンのような少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物であれば如何なるものであってもよく、胃腺粘膜細胞から単離された胃腺粘液細胞型ムチンであってもよい。
【００２７】
さらに、本発明は、ヘリコバクター種の細菌の感染による胃潰瘍を治療又は予防する方法に関するものである。それによって本発明は、ヘリコバクター種の細菌が個体に感染することによる胃潰瘍の兆候又は症状を改善する方法を提供することができるというものである。この方法は、例えば、個体に少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物を投与し、前記化合物が前記ヘリコバクター種の細菌に接触し、前記ヘリコバクター種の細菌の増殖を抑制又は阻害して、胃潰瘍及び／又は胃癌の兆候又は症状を改善するというものである。
【００２８】
本発明は、別な具体例として、胃潰瘍感受性の個体にヘリコバクター種の細菌が感染することによる胃潰瘍を、予防する方法を提供するというものである。この方法は、例えば、胃潰瘍感受性の個体に、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物を投与し、前記化合物が前記ヘリコバクター種の細菌の増殖を妨げて、前記ヘリコバクター種の細菌による胃潰瘍の形成を予防するというものである。
【００２９】
本発明は、さらに他の具体例として、胃潰瘍又は胃癌を有する個体に少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物を投与して、前記ヘリコバクター種の細菌の感染による胃潰瘍又は胃癌を、改善する方法に関するというものである。前記化合物が、前記ヘリコバクター種の細菌の増殖を妨げて、前記ヘリコバクター種の細菌の感染による胃潰瘍又は胃癌が、改善される。例えば前記の方法は、本明細書中で示した非ヒトのトランスジェニック哺乳類から得られる前記化合物を含有する母乳を、前記個体が飲用することも範疇に含んでいる。
【００３０】
本発明の方法により治療される個体は、胃粘膜がヘリコバクター感染しているかヘリコバクター感受性である如何なる個体であってもよい。それによる前記個体は例えばウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、フェレット、又はそれと同等のものであってもよい。具体例として、前記個体はヒトである。また、ヘリコバクター種の細菌は胃潰瘍形成に関係する如何なる細菌種であってもよく、例えばヒトの胃潰瘍形成に関係するヘリコバクター  ピロリが挙げられる。
【００３１】
前記化合物は、少なくとも一つの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するもので、本明細書で示したように、ヘリコバクター種の細菌の増殖を抑制又は阻害できるものである。前記化合物は、合成されたオリゴ糖、一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質（例えば末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３ポリペプチド）、一つ又はそれ以上の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有し、Ｏ−グリカンを含む化合物、又は胃腺粘膜細胞から単離することができる胃腺粘液細胞型ムチンを含む化合物であってもよい。少なくとも一つの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するそのような化合物を製造する方法は、慣用された公知の方法に準じる。例えば、担体分子のために有用な合成オリゴ糖を製造する方法として、コア２オリゴ糖を製造する方法（例えばSenguptaら、Tetrahedron  Lett.44:6037-6042,2003;Ongら、J.Biol.Chem.277:18182-18190,2002参照;いずれも参考文献としてここに示す）、コア１伸長オリゴ糖を製造する方法（例えばBelotら、Tetrahedron  Lett.74:2-6,2002参照;参考文献としてここに示す）、コア２分岐型Ｏ−グリカンにα１，４−ＧｌｃＮＡｃを添加する方法（Nakayamaら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA  96:8991-8996,1999参照;参考文献としてここに示す）が挙げられる。さらに、前記化合物は、特に胃に直接投与できる経口投与のような便利な方法で投与されてもよい。一つの形態として、前記投与は、ヘリコバクター感染による胃潰瘍を有している個体又は前記胃潰瘍感受性の個体が、本明細書中で示した非ヒトのトランスジェニック哺乳類から得られる前記化合物を含有した母乳を、飲用することによって行われるというものである。
【００３２】
また、本発明は、必須のα４ＧｎＴをエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと；Ｃ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードし、又はＣ１−β３ＧｎＴをエンコードする第二のポリヌクレオチドと；少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとをゲノム中に安定に組み込んで有するトランスジェニック植物であって、該第一のポリヌクレオチド、該第二のポリヌクレオチド、及び該第三のポリヌクレオチドの少なくともいずれかが外因性ポリヌクレオチドであり；該第一のポリヌクレオチドと、該第二のポリヌクレオチドと、該第三のポリヌクレオチドとが、プロモータを含む植物遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合され；Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴと、α４ＧｎＴと、担体ポリペプチドとの発現により、該担体ポリペプチドを、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を産生して製造するトランスジェニック植物に関するものである。そのようなトランスジェニック植物中、前記第二のポリヌクレオチド及び／又は前記第三のポリヌクレオチドが、外因性のポリヌクレオチドであってもよく、一つの具体例として、前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとが、夫々外因性のポリヌクレオチドであるというものである。
【００３３】
本発明のトランスジェニック植物中、外因性の核酸分子に相互作用して結合したプロモータは、構成プロモータ、誘導プロモータ、又は組織特異プロモータであってもよい。前記プロモータは、例えば種、花、葉及び／又は根のような植物の所望の細胞中でエンコードされたポリペプチド（例えばα４ＧｎＴ）を転写する。例えば、前記プロモータは、構造的に活性な３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモータ、ユビキチンプロモータ、コメアクチンプロモータ、誘導テトラサイクリン応答プロモータ、ｒｂｃＳ遺伝子光誘導プロモータ、又は種子特異的オレオシン遺伝子プロモータであってもよい。
【００３４】
本発明のトランスジェニック植物は、如何なる植物であってもよく、単子葉植物、双子葉植物、裸子植物、被子植物も範疇に含むものである。さらに、前記トランスジェニック植物は、ヒトや動物の食材源として、用いられるものであってもよく、例えば農業経営（例えば遺伝子操作された作物の生産）のように商業上有用なものであってもよい。このような前記トランスジェニック植物は、例えば、ダイズ植物、コメ植物、トウモロコシ植物、又はコムギ植物であってもよい。それによって本発明は、例えばこのようなトランスジェニック植物によって産出された種；このようなトランスジェニック植物から産出された穀類のような産物；種や穀類に由来する産物、又はそれらの同等品例えば豆乳やライスミルクのような乳液を提供することができるというものである。
【００３５】
また、本発明は、トランスジェニック植物中で、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を産生させて製造する方法に関するものである。この方法は例えば、植物細胞にα４ＧｎＴをエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドを少なくとも導入し；該第一の外因性ポリヌクレオチドが、プロモータを含んでいる植物遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合され；α４ＧｎＴの発現により、該植物の細胞中の該担体ポリペプチドをα４ＧｎＴによってグリコシル化して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を産生させ；導入された外因性核酸分子を含む植物細胞から植物を生育させ、トランスジェニック植物を得て、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質をトランスジェニック植物中に産生させることができるというものである。この方法はさらに、外因性のＣ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードし、又は外因性のＣ１−β３ＧｎＴをエンコードする第二の外因性ポリヌクレオチド；及び／又は少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する外因性の担体ポリペプチドをエンコードする第三の外因性ポリヌクレオチドをさらに植物細胞に導入する工程を含み、共存するなら該第二の外因性ポリヌクレオチド、及び共存するなら該第三の外因性ポリヌクレオチドが夫々、プロモータを含む植物遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合され；共存するならＣ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴと、α４ＧｎＴと、共存するなら外因性の担体ポリペプチドとの発現により、該担体ポリペプチドを、共存するならＣ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質をトランスジェニック植物中に産生させるものであってもよい。
【００３６】
トランスジェニック植物中で、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を産生させて製造する方法は、さらに、例えば種子、葉、根、及び／又は花のようなトランスジェニック植物収穫物を、トランスジェニック植物から分取する工程を含んでいてもよい。前記の方法は、さらに、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を、前記トランスジェニック植物又は前記トランスジェニック植物収穫物から単離する工程を含んでいてもよい。一つの具体例として、この方法は、さらに前記トランスジェニック植物又は前記トランスジェニック植物収穫物を加工して、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を含む乳液製品を得る工程を含んでいてもよい。これにより、本発明の方法で産生されて単離された少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質、本発明の方法で産出されたトランスジェニック植物産出物、本発明の方法により得られた乳液も、供給することができる。
【発明を実施するための好ましい形態】
【００３７】
本発明は、例えばヒトの胃潰瘍の原因となるヘリコバクター  ピロリのようなヘリコバクター種の細菌に感染することによる胃潰瘍を、予防又は治療するのに有用な組成物と方法とを提供するというものである。本発明は、ヘリコバクター属に対する増殖性及び運動性を阻害し、また形態異常性を発現させるもので、抗菌活性を有し、ヘリコバクター属に対する抗菌活性が選択的及び特異的であるため副作用がなく、安全性に極めて優れる分子、機能性分子、組成物、医薬、飲食物、及び母乳、及びトランスジェニック哺乳類を提供することを目的とする。また、本発明は、前記機能性分子の効率的な製造方法、及び、機能性分子を投与することにより、副作用がなく、安全性に極めて優れる胃癌の治療方法、胃潰瘍の治療方法、及び胃潰瘍の予防方法を提供することを目的とする。
【００３８】
図１に示すように、ヘリコバクター  ピロリに感染した患者を検査したところ、細菌は、胃の内壁表面部を構成する表面粘液細胞から分泌される表面粘液細胞型ムチンにのみ関連しており、胃の内壁の深部に存在する腺粘液細胞部分にコロニーを形成しないということが観察される。腺粘液細胞から分泌される腺粘液細胞型ムチンは、末端でα−１，４−グルコシド結合（以下ＧｌｃＮＡｃα（残基）と呼ぶことがある。）により結合されているＮ−アセチルグルコサミン残基を含んでいることも見出された。末端ＧｌｃＮＡｃα残基は、ヘリコバクター  ピロリの細胞壁に含まれるコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ）の合成を阻害し、おそらくその結果、ヘリコバクター  ピロリの増殖特性を阻害し、さらに、その運動性を阻害し、かつその形態異常性を発現させるということも見出された。図１中、「ＧｌｃＮＡｃα（＋）」は、ＧｌｃＮＡｃα残基を含むムチンが存在することを意味し、「ＧｌｃＮＡｃα（−）」は、ＧｌｃＮＡｃα残基を含むムチンが存在しないことを意味する。このことは、α１，４−ＧｌｃＮＡｃ残基がＰＣＳに染色されるものであり、またＧＯＣＴＳがムチン表面を染色するという事実から、推察される（実施例１参照）。
【００３９】
本発明は、複数のモノマーユニットからなり、その少なくとも一つのモノマーユニットがＮ−アセチルグルコサミン残基である分子を提供するというものである。本明細書で開示したように、本発明の分子は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成を抑制及び阻害し、同様に前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖を抑制及び阻害する。さらに、前記分子は前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制及び阻害し、さらにはその細菌の形態異常を発現させる。一つの具体例として、前記分子は糖鎖を含み、その末端にＮ−アセチルグルコサミン残基を有していてもよい。一つの形態として、Ｎ−アセチルグルコサミン残基は、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基である。このα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成を抑制及び阻害することができる。同様に、前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖を抑制及び阻害することができる。さらにα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基は、前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制及び阻害し、また、その細菌の形態異常を発現させる。本発明の分子は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基に隣接してガラクトース残基を有していてもよい。前記分子は直鎖又は分岐鎖であってもよい。
【００４０】
本発明の分子は、Ｎ−アセチルグルコサミン（「ＧｌｃＮＡｃ」と称する）残基を一部に含み、必要に応じて適宜選択した分子構成ユニットを含む。前記ＧｌｃＮＡｃ残基は、化学合成した物質に由来する基であってもよく、天然物から抽出物に由来した基であってもよく、生体内に存在する基であってもよい。前記ＧｌｃＮＡｃの製造方法は、特に制限はなく、例えば、キチンを塩酸で加水分解し、加水分解物を単離することにより製造することができる。
【００４１】
前記分子構成ユニットは、本明細書に示したように目的に応じて適宜選択することができ、糖残基、樹脂ユニット等が挙げられる。これらを、１種単独で使用してもよく、２種以上併用してもよい。前記糖残基は、単糖残基であってもよいし、二糖以上の多糖残基であってもよい。前記単糖残基、又は多糖残基を構成する単糖残基として、例えば、ガラクトース残基、テトロース残基、エリトロース残基、トレオース残基、ペントース残基、リボース残基、アラビノース残基、キシロース残基、リキソース残基、ヘキソース残基、アロース残基、アルトロース残基、グルコース残基、マンノース残基、グロース残基、イドース残基、タロース残基、テトルロース残基、エリトルロース残基、２−ペンチロース残基、リブロース残基、キシルロース残基、プシコース残基、フルクトース残基、ソルボース残基、タガトース残基、２−ヘプツロース残基、セドヘプツロース残基、キノボース残基、ラムノース残基、フコース残基、ジギトキソース残基、アベクオース残基、チベロース残基、２−ベオキシリボース残基、２−デオキシグルコース残基、グルコサミン残基、マンノサミン残基、ガラクトサミン残基、フコサミン残基、キノボサミン残基、ラムノサミン残基、ノイラミン酸残基、ムラミン酸残基、ノジリマイシン残基などが挙げられる。これらの中でも、前記ＧｌｃＮＡｃ残基に隣接する糖残基として、ガラクトース残基が特に好ましい。前記糖残基は、１種単独でもよく、２種以上を併用してもよく、置換基が挿入されていてもよく、別な置換基でさらに置換されていてもよい。前記樹脂ユニットとして、例えば、Ｌ−ラクタイド、Ｄ−ラクタイド等が挙げられる。前記のユニットや別なユニットとして、生体適合性分子を構成する公知のユニットが用いられてもよい。
【００４２】
前記ＧｌｃＮＡｃ残基は、本発明の前記分子のどこに位置していてもよく、例えば、分子の末端でもよく、末端以外の部分でもよい。しかし、前記ＧｌｃＮＡｃ残基が前記分子の末端に位置していると、優れた抗菌効果を示す。前記分子が糖鎖である場合、前記ＧｌｃＮＡｃ残基の結合はどのようなものでもよく、例えば、α−グルコシド結合やβ−グルコシド結合であってもよい。一つの形態として、前記結合はα１，４−グルコシド結合である。
【００４３】
前記ＧｌｃＮＡｃ残基をα−１，４−グルコシド結合で前記分子に結合させるために酵素を使用する場合、その酵素を目的に応じて適宜選択することができる。前記酵素として、例えば、特開２００１−４６０７７号公報に記載のＮ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）が挙げられる。前記α４ＧｎＴは、例えば、特開２００１−４６０７７号公報に記載の方法に準じて前記α４ＧｎＴをエンコードするＤＮＡを形成させ、このＤＮＡを組み込んだベクターを各種細胞にトランスフェクトさせることにより、前記α４ＧｎＴを発現させることによって、調製することができる（Nakayamaら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96,8991,1999参照）。
【００４４】
前記分子は、前記ＧｌｃＮＡｃα残基や付加ユニットを含む所望のモノマーユニットを多く含んでいてもよい。このモノマーユニットは、目的に応じて適宜選択される。例えば、前記分子は、２以上、特に２〜３０（例えば５〜２０）のモノマーユニットを含んでいてもよい。一般に、前記モノマーユニットの数が２未満であると、前記分子は抗菌効果を有しない。
【００４５】
本発明の分子は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい。前記分子が分岐である場合、分岐数は特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。一般に分岐数が多いほど、抗菌効果は高い。前記分子を分岐させるために酵素を使用してもよい。そのような酵素として、例えば、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）を挙げることができ、このＣ２ＧｎＴ−Ｉは例えば細胞への遺伝子の導入、遺伝子組み換えによるＣ２ＧｎＴ−Ｉの調製、生物からの単離精製などにより調製することができる（例えばBierhuizen,Fukuda、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,9326,1992参照）。同様に、前記分子中で糖残基を結合させるために酵素を使用してもよい。そのような酵素として、例えば、コア１伸長β１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（Ｃ１−β３ＧｎＴ）を使用してもよい（Yehら、Cell,105:957-969,2001参照）。
【００４６】
本発明の分子がＧｌｃＮＡｃα残基を含む糖鎖を有している場合、前記分子はヒトの胃壁深部に存在する腺粘液細胞から分泌される腺粘液細胞型ムチンが有する分子、又はその骨格構造を有する類似分子であってもよい。そのため、前記分子を、医薬や、食物や飲料のような飲食材として使用した場合、副作用がなく、極めて安全性が高い。
【００４７】
また、本発明は、複数のモノマーユニットを含む分子であって、それの少なくとも一つのユニットがＮ−アセチルグルコサミン残基を有している分子を含んでいる組成物を提供するというものである。この組成物は、例えば薬物のような有用な医薬であってもよく、また食物や飲料のような飲食物用の組成物であってもよい。
【００４８】
さらに、本発明は、機能性分子を提供するというものである。この機能性分子は、複数のモノマーユニットを含む分子であり、その少なくとも一つのモノマーユニットがＮ−アセチルグルコサミン残基であるというものである。この機能性分子はコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成を抑制及び／又は阻害し、同様に前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖を抑制及び／又は阻害することができる。一つの形態として、前記機能性分子は、前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制又は阻害し、さらにはその細菌の形態異常を発現させる。そのような機能性分子は、主鎖と側鎖とを有する分子であってもよく、その側鎖が複数のモノマーユニットを含みその少なくとも一つのモノマーユニットがＮ−アセチルグルコサミン残基である分子であってもよい。
【００４９】
本発明の機能性分子は、本発明の前記の分子と、必要に応じて少なくとも一つの別な分子とで構成されている。一般に機能性分子は主鎖と側鎖とを有し、好ましくは本発明の分子は側鎖を有している。前記分子は主鎖に対してクラスター状に存在している。ここで用いられている前記「クラスター状」という用語は、ひとつの前記主鎖に対して、１０以上の前記分子が末端で結合された状態をいう。前記主鎖の数と前記側鎖の数との比は特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記主鎖がタンパク質の場合、タンパク質を構成するアミノ酸残基の種類により比率は限定される。一般に、ひとつの主鎖に存する側鎖の数が多いほど、機能性分子の抗菌効果は高くなる。
【００５０】
本発明の分子に結合される別な分子は、目的に応じて適宜選択することができる。前記その他の分子として、例えば、糖鎖、ポリペプチド、脂質、糖脂質、糖タンパク、ヌクレオチド、ポリ乳酸等の樹脂が挙げられ、これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。一例として、前記その他の分子は、例えばＣＤ４３、ＣＤ３４、及び／又はＭｕｃ−６を含むポリペプチドを有する分子である。前記分子と結合する前記ポリペプチド中のアミノ酸は、特に制限されない。前記アミノ酸として、例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）、セリン（Ｓｅｒ）、プロリン（Ｐｒｏ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、リジン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、システイン（Ｃｙｓ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、アルギニン（Ａｒｇ）、グリシン（Ｇｌｙ）等が挙げられる。一般に、セリン及び／又はトレオニンが用いられる。
【００５１】
本明細書に示したように、本発明の分子は、前記ＣＧＬの合成を抑制及び／又は阻害することができるものである。前記ＣＧＬの合成を抑制又は阻害することにより、前記ＣＧＬを必須とする細菌の増殖を抑制また阻害することができる。前記ＣＧＬを必須とする細菌として、例えば、ヘリコバクター種の細菌、特にヘリコバクター  ピロリが挙げられる。前記ヘリコバクター種の細菌は、その細胞壁にα−コレステリルグルコシド（α−ＣＧｓ）を含有する。このα−ＣＧｓの主要成分として、例えば、ＣＧＬ、コレステリル−６−Ｏ−テトラデカノイル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＡＧ）、及びコレステリル−６−Ｏ−ホスファチジル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＰＧ）が挙げられる。このため、ヘリコバクター種の細菌は、ＣＧＬの合成が生存に必須となる細菌の一つである。
【００５２】
本発明の機能性分子は、ヘリコバクター種の細菌に対して選択的及び特異的に抗菌活性を有し、ヒトの腸内の細菌層を損傷しない。さらに、本発明の機能性分子がＧｌｃＮＡｃα残基を含む場合、それは、ヒトの胃壁深部に存在する腺粘液細胞から分泌される腺粘液細胞型ムチン、又はムチンと類似の構造を有する他の機能性分子と同様なものである。したがって、本発明の機能性分子は、医薬、食物又は飲料として使用した場合でも副作用がなく、極めて安全性が高い点で有用である。
【００５３】
機能性分子の主鎖が、例えばポリペプチドであってもよい。その一形態として、複数のモノマーユニットを含み、その少なくとも一つのモノマーユニットがＮ−アセチルグルコサミン残基であって、主鎖に対してクラスター状に存在する分子が挙げられる。そのような機能性分子は、複数のモノマーユニットを含んでおり、その少なくとも一つのモノマーユニットがＮ−アセチルグルコサミン残基であり主鎖に対してクラスター状に存在していると、前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成を抑制及び阻害することができ、同様に前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖を抑制及び阻害することができる。さらに前記機能性分子は、前記コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制又は阻害し、さらにはその細菌の形態異常を発現させる。
【００５４】
このように、本発明の機能性分子は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ）の合成を抑制及び／又は阻害することができ、及び／又はコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖を抑制及び／又は阻害することができる。さらに本発明の機能性分子は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制及び／又は阻害し、また、その細菌の形態異常を発現させる。本発明の機能性分子は、例えばポリペプチドがＣＤ４３、ＣＤ３４、又はＭｕｃ−６である分子が挙げられる。一つの形態として、主鎖に対する側鎖の数の比は１０以上である。
【００５５】
本発明の機能性分子は、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、抗ヘリコバクター  ピロリ剤、胃炎、及び／又は慢性胃炎の予防、治療、及び／又は改善のために、使用されるものであってもよい。また、機能性分子は、食物や飲料のような飲食物のために使用されるものであってもよい。これによって、このような機能性分子を含む組成物は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成を抑制及び／又は阻害することができ、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖を抑制及び／又は阻害することができ、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制及び／又は阻害することができ、及び／又はその細菌の形態異常を発現させることができる。また、本発明は、このような機能性分子を含むことにより前記のような抑制及び／又は阻害活性を奏する医薬を提供するというものである。この医薬組成物は、種々の形態で提供される。例えば、治療されるべき個体の胃及び／又は腸の粘膜層に前記医薬組成物を噴射又は塗布してもよい。また、別な形態として、前記医薬組成物をフィルム及び／又はシートに含浸又は含有させて、胃又は腸の粘膜層に付してもよい。本発明の医薬組成物は、コレステロールを分解するコレステロール分解酵素及びグルコースを分解するグルコース分解酵素の少なくともいずれかを有していてもよい。それにより、医薬組成物は前記したような抑制及び／又は阻害活性を有することができる。
【００５６】
さらに、本発明は、機能性分子を含有する飲食物を提供するというものである。この機能性分子は、複数のモノマーユニットを含み、その少なくとも一つのモノマーユニットがＮ−アセチルグルコサミン残基であるというものである。このような飲食物は、前記と同様に、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの合成を抑制及び／又は阻害することができ、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖を抑制及び／又は阻害することができ、生体内に存在しコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制及び／又は阻害することができ、その細菌の形態異常を発現させることができる。
【００５７】
また、本発明は、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子の製造方法に関するものである。この方法は例えば、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを接触させ、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子を生成させて製造することができるというものである。本発明の方法の一つの具体例によれば、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとが接触すると、機能性分子が製造される。この具体例の一つの形態として、前記ポリペプチドは、可溶性ポリペプチド（例えばＣＤ４３、ＣＤ３４、又はＭｕｃ−６）であるというものである。また、別な形態として、前記ポリペプチドは哺乳類の母乳中に分泌されるムチンであるというものである。
【００５８】
本発明の機能性分子の製造方法は、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子を生成させた後に、単離する工程を含んでいてもよい。それによって本発明は、この方法により得られ、前記したような抑制及び／又は阻害活性を有する機能性分子を提供することができるというものである。例えば、単離された機能性分子を例えば医薬として投与することにより、生体内に存在しコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制及び／又は阻害することができ、その細菌の形態異常を発現させることができる。
【００５９】
また、本発明は、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する組換え型の機能性分子の製造方法に関するものである。この方法は例えば、α４ＧｎＴをエンコードする第一のポリヌクレオチドと、Ｃ２ＧｎＴ−ＩとＣ１−β３ＧｎＴとの少なくともいずれかをエンコードする第二のポリヌクレオチドと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとを真核細胞内で発現させるというものである。この方法によれば、第一のポリヌクレオチドと、第二のポリヌクレオチドと、第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかは、真核細胞に導入される外因性ポリヌクレオチドである。例えばこの方法は、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとが発現することによって、行われるというものである。その後、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを互いに接触させて、機能性分子を生成させることができる。前記で示したように、前記ポリペプチドは可溶性ポリペプチド（例えばＣＤ４３、ＣＤ３４、又はＭｕｃ−６）であってもよい。組換え型機能性分子がつくられる真核細胞は、例えば哺乳類の細胞であってもよい。
【００６０】
本発明によれば、前記組換え型の機能性分子の製造方法は、さらに、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを接触させ、その発現後に、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する組換え型の機能性分子を生成させるというものであってもよい。この方法はさらに、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する組換え型機能性分子を生成後に単離させる工程を含んでいてもよい。それにより、本発明の方法で製造され、単離された組換え型機能性分子が、提供される。この単離された組換え型機能性分子は、前記したような抑制及び／又は阻害活性を有する。
【００６１】
また、本発明は、母乳を分泌する非ヒトのトランスジェニック哺乳類を提供するというものである。本発明の非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、α４ＧｎＴをエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと、Ｃ２ＧｎＴ−ＩとＣ１−β３ＧｎＴとの少なくともいずれかをエンコードする第二のポリヌクレオチドと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとをゲノム中に有することができるというものである。このようなトランスジェニック哺乳類は、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを発現することができる。その後、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを、互いに接触させ、機能性分子を生成することができる。
【００６２】
本発明の非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、外因性の第一のポリヌクレオチド、第二のポリヌクレオチド、及び／又は第三のポリヌクレオチドを有していてもよい。一つの形態として、前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかが、ゲノム中に導入され、哺乳類の乳腺遺伝子の５’制御配列及び３’制御配列の少なくともいずれかに相互作用して結合する。別な形態として、第三のポリヌクレオチドが、ゲノム中に導入され、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドを母乳内に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列と相互作用して結合する。ポリヌクレオチドが相互作用して結合する５’制御配列は、例えば乳清酸性タンパク質（ＷＡＰ）プロモータ、α−カゼインプロモータ、β−カゼインプロモータ、γ−カゼインプロモータ、α−ラクトアルブミンプロモータ、又はβ−ラクトグロブリンプロモータのようなプロモータを含んでいてもよい。さらに別な形態として、前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとが、単一の核酸分子を形成し、この核酸分子が非ヒトのトランスジェニック哺乳類のゲノム中に導入されて、乳腺遺伝子の５’制御配列と３’制御配列とのいずれかに相互作用して結合する。トランスジェニック哺乳類は、母乳を分泌するものであれば如何なる哺乳類であってもよく、例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又はウシが挙げられる。
【００６３】
前記トランスジェニック哺乳類が前記第二の外因性のポリヌクレオチドを必要としているか否かは、本発明の機能性分子を産生する細胞が、自然の状態で内因性の前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉを発現するか否かによって決定され、それが発現する場合には導入しなくてもよい。また、前記トランスジェニック哺乳類が前記第三の外因性のポリヌクレオチドを導入する必要があるか否かは、本発明の機能性分子を産生する細胞が、自然の状態で前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する内因性のポリペプチドを発現するか否かによって決定され、それが発現する場合には導入しなくてもよい。例えば、前記細胞が乳腺上皮細胞である場合には、この乳腺上皮細胞は前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及び前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドを発現するので、前記乳腺上皮細胞を有するトランスジェニック哺乳類は、前記第二及び第三のポリヌクレオチドを導入しなくてもよい。
【００６４】
本発明のトランスジェニック哺乳類は、前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドが、前記α４ＧｎＴと、前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかとによってグルコシル化されて、母乳を分泌する雌の場合には、その母乳中に本発明の機能性分子を分泌させることができる。組換え型のポリペプチドを母乳中に分泌できる非ヒトのトランスジェニック哺乳類の生産方法は、公知の方法に準じて製造することができるというものである（例えば、米国特許  第6,344,596号;第6,548,735号;第6,222,094号;第5,962,648号;第5,891,698号;第5,850,000号の各明細書参照）。
【００６５】
また、本発明は、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する組換え型の機能性分子を生成させて製造する方法に関するものである。その方法は例えば、α４ＧｎＴをエンコードする第一のポリヌクレオチドを非ヒトの哺乳類の胚に導入し；導入した胚を宿主の雌哺乳類に移植し；宿主の雌哺乳類に子孫を出産させ；出産した子孫の内、雌の子孫に母乳の産生を行わせるというものであってもよい。この方法によれば、この子孫の体内で、α４ＧｎＴが発現する。一つの形態として、α４ＧｎＴは子孫の体内に存在するポリペプチドと少なくとも接触し、それによって機能性分子を生成する。他の形態として、第一のポリヌクレオチドは、哺乳類の乳腺に関する遺伝子の５’制御配列及び３’制御配列の少なくともいずれかと互いに相互作用して結合するように胚に導入される。一つの具体例として、前記組換え型の機能性分子の製造方法は、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかをエンコードする第二のポリヌクレオチドと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとを胚に導入する工程を含む。別な具体例として、前記の方法は、雌の子孫に母乳を産生させた後、その母乳を搾乳する工程を含み、さらに前記母乳から組換え型の機能性分子を単離する工程を含んでもよい。これによって本発明は、前記の方法で得られ、特に前記組換え型の機能性分子を含み、前記したような抑制及び／又は阻害活性を有する母乳を提供することができるというものである。
【００６６】
本発明の機能性分子は前記したいずれの方法によっても製造することができるが、本発明に基づいて公知で通常の別な方法で製造されてもよい。本発明の機能性分子の製造方法として、三つの形態を例示する。なお、本発明の母乳は、本発明の機能性分子の説明を通して明らかにする。前記第一の形態は、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子の製造方法であって、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを互いに接触させる工程を少なくとも含むものである。前記第二の形態は、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する組換え型の機能性分子の製造方法であって、α４ＧｎＴをエンコードする第一のポリヌクレオチドと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかをエンコードする第二のポリヌクレオチドと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとを真核細胞内で発現させる発現工程を少なくとも含むものである。前記第三の形態は、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する組換え型の機能性分子の製造方法であって、α４ＧｎＴをエンコードする第一のポリヌクレオチドを非ヒトの哺乳類の胚に導入し、導入した胚を宿主の雌哺乳類に移植し、子孫を出産させ、出産した子孫の内、雌の子孫に母乳の産生を行わせる工程を含むものである。前記α４ＧｎＴ、前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ、及び前記Ｃ１−β３ＧｎＴについては前記の通りである。前記ポリペプチドは、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチド（例えばＣＤ４３、ＣＤ３４、Ｍｕｃ−６、ムチン）であって、哺乳類の母乳中に分泌される。
【００６７】
前記第一の形態では、前記α４ＧｎＴと、前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとの他に、前記ＧｌｃＮＡｃと糖とをさらに接触させてもよい。前記第二の形態では、前記発現工程の後、前記α４ＧｎＴと、前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及びＣ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかと、前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを互いに接触させることにより前記機能性分子を製造することができる。前記ＧｌｃＮＡｃと糖とをさらに接触させてもよい。また、前記第二の形態中、前記第一から第三のポリペプチドは、外因性であってもよく、内因性であってもよい。なお、本明細書中、「内因性」という用語は、ポリヌクレオチドに関して使用されている場合、ある特定の細胞内又は生物の細胞内で前記ポリヌクレオチドが自然状態で見出されることを意味し、「外因性」という用語は、ポリヌクレオチドに関して使用されている場合、ある特定の細胞内又は生物の細胞内で前記ポリヌクレオチドが自然状態では見出されないことを意味する。
【００６８】
本発明の方法に、真核細胞を使用することができる。一般に、前記細胞は哺乳類の細胞であり、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）や乳腺細胞が挙げられる。前記真核細胞が乳腺細胞である場合には、前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉと、前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを発現することができるため、前記α４ＧｎＴを外因性のものとして供給することにより前記機能性分子を産生することができる。また、前記真核細胞が前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉを発現する場合には、前記α４ＧｎＴと、前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドとを外因性のものとして供給することにより前記機能性分子を産生することができる。
【００６９】
前記第二の形態の製造方法の一例として、以下の方法がある。前記ＣＤ４３の細胞外ドメイン全体を含むＤＮＡ断片（配列番号１におけるアミノ酸配列の２０番目から２５４番目に相当する部分）をＰＣＲ法で増幅し、ｐＳｅｃＴａｇ２（インビトロジェン社製）のようなベクターにサブ・クローニングすることにより、Ｉｇκリーダー・ペプチドと、それに続くｍｙｃエピトープ、及び（Ｈｉｓ）６をエンコードするベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２−ｓＣＤ４３）を作製する。次に、（１）Ｃ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）と、（２）α４ＧｎＴをエンコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）と、（３）可溶性ＣＤ４３をエンコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）と、（４）ポリオーマ・ウイルス  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原をエンコードするポリヌクレオチド（ｃＤＮＡ）とを、夫々別々に前記ｐＳｅｃＴａｇ２−ｓＣＤ４３に組み込んだベクター４つを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標、インビトロジェン社製）を用いて前記培養したＣＨＯ・Ｌｅｃ２細胞にトランスフェクトさせ、そのトランスフェクトさせたＣＨＯ・Ｌｅｃ２細胞内で、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ、α４ＧｎＴ、可溶性ＣＤ４３、及びポリオーマ・ウイルス  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原を発現させ、接触させることにより、前記機能性分子として、末端ＧｌｃＮＡｃα残基を含む可溶性ＣＤ４３を発現させることができる。
【００７０】
前記第三の形態の製造方法では、非ヒトの哺乳類の胚に、前記第一のポリヌクレオチドと、必要に応じて前記第二のポリヌクレオチド及び前記第三のポリヌクレオチドの少なくともいずれかを導入する。前記第一のポリヌクレオチドは、哺乳類の乳腺に関する遺伝子の５’制御配列及び３’制御配列の少なくともいずれかと互いに相互作用して胚に導入されてもよい。その場合、前記第二のポリヌクレオチドと前記第三のポリヌクレオチドとのいずれか又は両方が、哺乳類の乳腺に関連する遺伝子の５’制御配列及び３’制御配列の少なくともいずれかと互いに相互作用して胚に導入されてもよい。前記乳腺に関連する遺伝子は特に制限はないが、一般には乳腺特異的遺伝子である。前記５’制御配列は所望の制御要素であってもよく、前記したように一般にプロモータを有している。
【００７１】
前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドをエンコードしている第三のポリヌクレオチドが、５’制御配列及び３’制御配列の少なくともいずれかの制御要素（例えば、乳腺特異的プロモータ等）に互いに相互作用して結合して、導入されると、前記制御要素は、前記ポリヌクレオチドに対して、通常の細胞内に関連付けられている別のポリヌクレオチド配列に対して行うように、その制御を行い、例えば、乳腺上皮細胞内で、前記エンコードされたポリペプチドが組織特異的に発現することができる。また、前記第一のポリヌクレオチド配列を前記第二のポリヌクレオチド配列に互いに相互作用させて結合させて導入し、二つ又はそれ以上のポリペプチドを前記相互作用させて導入したポリヌクレオチドから発現させることも可能である。また、必要に応じて、前記互いに相互作用させて導入したポリヌクレオチドからキメラの（組み合わされた）ポリペプチドを発現させることも可能である。前記キメラのポリペプチドは、融合ポリペプチドであってもよい。前記融合ポリペプチドとは、前記二つ又はそれ以上のエンコードされたポリペプチドが単一のポリペプチドに翻訳されたもの、つまり、それらがペプチド結合により共有結合したものである。
【００７２】
前記第三のポリヌクレオチドは、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドを母乳内に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列と互いに相互作用させて結合させて、胚に導入される。前記雌の子孫に母乳を産生させた後、母乳を搾乳してもよく、前記母乳から前記機能性分子を単離してもよい。前記第三の形態の製造方法では、前記雌の子孫の体内で前記第一のポリヌクレオチドから前記α４ＧｎＴが発現し、内因性又は外因性の前記少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有するポリペプチドが前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ及び前記Ｃ１−β３ＧｎＴの少なくともいずれかによりグリコシル化され、前記機能性分子が産生される。前記機能性分子は、前記雌の子孫の母乳中に含まれ、該母乳を搾乳することにより効率的に産生することができる。
【００７３】
前記したように、本発明の機能性分子は各種分野で使用可能である。前記機能性分子は、特に組成物、医薬及び／又は飲食物として供給される場合に、ヘリコバクター  ピロリが原因である病気の治療薬、例えば、胃潰瘍治療薬、十二指腸潰瘍治療薬、胃炎治療薬、慢性胃炎緩和治療薬として好適に用いることができる。本発明の組成物、医薬及び飲食物は、本発明の分子及び機能性分子の少なくともいずれかを含有してなり、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含有してなる。本発明の前記組成物、医薬、又は飲食物の全量中での前記分子及び機能性分子の少なくともいずれかの含有量は、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。本発明の前記分子、前記機能性分子、前記医薬、又は前記組成物の全量に対する前記分子の含有量は、必要に応じて適宜選択することができるが、一般に、前記含有量が高ければ高いほど、抗菌効果が高くなる。
【００７４】
種々の形状の前記組成物は、その他の成分を含んでいてもよい。前記その他の成分は特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。前記その他の成分として、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、水溶性高分子、塩基性無機塩、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、酸味剤、発泡剤、香料などが挙げられる。また、ＣＧＬの合成を効率的に抑制又は阻害する観点から、コレステロール分解酵素やグルコース分解酵素の添加も有用である。前記賦形剤として、例えば、乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸、酸化チタンなどが挙げられる。前記滑沢剤として、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク、ステアリン酸などが挙げられる。前記結合剤として、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、結晶セルロース、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム粉末、ゼラチン、プルラン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。前記水溶性高分子として、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、グアーガムなどが挙げられる。前記塩基性無機塩として、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムの塩基性無機塩が挙げられる。前記ナトリウムの塩基性無機塩として、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムが挙げられる。前記カリウムの塩基性無機塩として、例えば、炭酸カリウム、炭酸水素カリウムが挙げられる。前記マグネシウムの塩基性無機塩として、例えば、重質炭酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、珪酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウム、合成ヒドロタルサイト（Ｍｇ６Ａｌ２（ＯＨ）１６・ＣＯ３・４Ｈ２Ｏ）、酸化アルミナ・マグネシウムが挙げられる。前記カルシウムの塩基性無機塩として、例えば、沈降炭酸カルシウム、水酸化カルシウムが挙げられる。前記溶剤として、例えば、注射用蒸留水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油などが挙げられる。前記溶解補助剤として、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムが挙げられる。前記懸濁化剤として、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンのような界面活性剤；ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースのような親水性高分子が挙げられる。前記等張化剤として、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールが挙げられる。前記緩衝剤として、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩が挙げられる。前記無痛化剤として、例えば、ベンジルアルコールが挙げられる。前記防腐剤として、例えば、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸が挙げられる。前記抗酸化剤として、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールが挙げられる。前記着色剤として、例えば、食用黄色５号、食用赤色２号、食用青色２号のような食用色素；食用レーキ色素；ベンガラが挙げられる。前記甘味料として、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン二カリウム、アスパルテーム、ステビア、ソーマチンが挙げられる。前記酸味料として、例えば、クエン酸（無水クエン酸）、酒石酸、リンゴ酸が挙げられる。前記発泡剤として、例えば、重曹が挙げられる。前記香料として、例えば、レモン、ライム、オレンジ、メントール、ストロベリーの抽出物が挙げられる。
【００７５】
本発明の組成物及び／又は医薬は、投与の目的に合わせて、どのような形態、方法で投与されてもよい。その方法は、経口投与するものであってもよく、ヒトの胃及び腸の少なくともいずれかの粘膜層に前記組成物（又は機能性分子）を直接噴霧又は塗布するものであってもよい。また、本発明の組成物又は医薬を、フィルム又はシートに含浸させ、そのフィルム又はシートを胃及び／又は腸に付して使用してもよい。この投与方法は、胃又は腸の粘膜層表面で、噴霧又は塗布された前記組成物や医薬が流れ落ちることなく、一定時間保持されることにより、目的量の組成物又は医薬を投与でき、十分な抗菌効果を得ることができるため、有用である。また、前記使用方法は、内視鏡などの公知の医療器具を使用する場合に、好適に用いることができる。患部が胃である場合には、前記フィルム又はシートはキチン、糖、脂肪成分を含むことが好ましい。患部が腸である場合には、前記フィルム又はシートはキチンを含むことが好ましい。これにより、前記機能性分子は、胃や腸の中での胃液や腸液によって分解されることなく、長時間に亘って患部に接触することができる。
【００７６】
本発明の組成物、医薬、及び飲食物は、十分な抗菌効果を有するが、抗菌効果をさらに向上させるために、抗生物質、生薬のような公知の胃潰瘍治療薬、十二指腸潰瘍治療薬、抗ヘリコバクター  ピロリ薬、胃炎治療薬、及び慢性胃炎改善薬の少なくともいずれかと併用して使用してもよい。本発明の組成物、医薬及び飲食物は、本発明の機能性分子（又は分子）を含有するため副作用がなく、極めて安全性が高い点で有用であり、各種分野で使用可能である。本発明の組成物は例えば、ヘリコバクター  ピロリに対する治療薬（例えば、胃潰瘍治療薬、十二指腸潰瘍治療薬、抗ヘリコバクター  ピロリ薬、胃炎治療薬、慢性胃炎改善薬）に好適に用いることができ、本発明の医薬及び飲食物に特に好適に用いることができる。本発明の飲食物は、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料、栄養補助食品、冷菓、麺類、菓子類、水産物、乳製品、加工食品、調味料、錠剤、カプセル剤などとして好適に使用することができる。
【００７７】
このように、本発明は細菌の増殖抑制方法に関するものである。この方法は例えば、少なくとも一つのα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子に、ＣＧＬを発現する細菌を接触させ、細菌の増殖と、細菌の細胞壁の形成との少なくともいずれかを抑制又は阻害するものである。この方法によれば、前記機能性分子はコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの発現（即ち合成）を抑制又は阻害し、同様に、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の増殖と、細菌の細胞壁の形成との少なくともいずれかを抑制又は阻害する。さらに前記機能性分子は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とする細菌の運動性を抑制又は阻害し、さらにはその細菌の形態異常を発現させる。α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する前記機能性分子は、ＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を抑制又は阻害することができる。増殖が抑制及び／又は阻害される細菌として、例えばヘリコバクター属の細菌（例えばヘリコバクター  ピロリ）が挙げられる。
【００７８】
さらに、本発明は胃潰瘍の治療方法を提供するというものである。この方法は例えば、ヘリコバクター種の細菌が個体に感染することによって起こる胃潰瘍の兆候又は症状を改善するために、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子を投与するものである。この胃潰瘍治療方法では、前記機能性分子はコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの発現（合成）を抑制又は阻害し、同様に、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とするヘリコバクター種の細菌に感染することによって起こる胃潰瘍の兆候又は症状を改善する。前記ヘリコバクター種の細菌はヘリコバクター  ピロリであってもよい。前記個体は例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシのような哺乳類であって、特にヒトであるとなおよい。
【００７９】
胃潰瘍の治療方法では、胃腺粘液細胞型ムチンを含みα１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子を利用することができる。前記機能性分子は種々の方法で投与される。投与方法として、例えば、経口投与、胃粘膜層への噴霧及び／又は塗布、前記機能性分子を含むフィルム及び／又はシートの貼付が挙げられる。一つの形態として、前記機能性分子は、前記のようにして生産された母乳を用いて投与される。
【００８０】
さらに、本発明は胃潰瘍を予防する方法に関するものである。この方法は例えば、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子の投与により、個体にヘリコバクター種の細菌が感染することによって起こる胃潰瘍の兆候又は症状を妨げ、前記機能性分子がコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの発現（合成）を抑制又は阻害し、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドを必須とするヘリコバクター種の細菌に感染することによって起こる胃潰瘍の兆候又は症状を予防するというものである。α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子は胃腺粘液細胞型ムチンを含んでいてもよい。また前記機能性分子は、前記した方法や公知の方法に準じて、投与される。
【００８１】
さらに本発明は、胃癌を治療する方法に関するものである。この方法は例えば、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子の投与により、個体にヘリコバクター種の細菌が感染することによって起こる胃癌の兆候又は症状を改善し、前記機能性分子がコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの発現（合成）を抑制又は阻害し、同様に、ヘリコバクター種の細菌に感染することによって起こる胃癌の兆候又は症状を改善するものである。
【００８２】
本発明は、担体分子と相互作用して結合した少なくとも一つの末端α１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン（α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ）残基を有する非天然化合物を提供するというものである。「相互作用して結合」という用語は、本明細書中で、二つ以上の分子が一つの単位として働き、さらに一つ又は両方の分子、又はそれらの組み合わせによる機能効果を奏するような位置関係である二つ又はそれ以上の分子に関して広く使用される。例えば、担体分子と相互作用して結合したα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基とは、ヘリコバクター  ピロリのようなヘリコバクター種の細菌の増殖を抑制又は阻害する効果を奏するように、α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基が位置しているということを意味している。そのように相互作用して結合したα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基は例えば、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を含むＣＤ４３分子やＣＤ３４分子で例示される。それらの化合物は他の担体分子へのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基の相互作用した結合を確認する基準となる。
【００８３】
二つ又はそれ以上のポリヌクレオチド配列もまた、相互作用して結合し得る。例えば、ポリペプチド（例えば担体ポリペプチド）をエンコードするポリヌクレオチドは、制御要素（例えば乳腺特異的プロモータ）に相互作用して結合することができ、前記制御要素は、通常細胞内に制御要素と関係するポリヌクレオチド配列をもたらすのと同様に、前記ポリヌクレオチドに対してその制御効果を与える（例えば、乳腺上皮細胞内で、前記エンコードされたポリペプチドが組織特異的に発現することができる）。また、前記第一のポリヌクレオチド配列を前記第二又はそれ以上のポリヌクレオチド配列に互いに相互作用させて導入し、二つ又はそれ以上のポリペプチドを前記相互作用させて導入したポリヌクレオチドから発現させることも可能である。また、必要に応じて、前記互いに相互作用させて導入したポリヌクレオチド配列からキメラのポリペプチドを発現させることも可能である。前記キメラのポリペプチドは、融合ポリペプチドであってもよい。前記融合ポリペプチドとは、前記二つ又はそれ以上のエンコードされたポリペプチドが単一のポリペプチドに翻訳されたもの、つまり、それらがペプチド結合により共有結合したものである。
【００８４】
「担体分子」という用語は、ヘリコバクター増殖抑制活性を示す一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を相互作用させて導入できる分子に関して使われている。そのような担体分子として、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴ糖、脂質、糖タンパク質、ヌクレオチドタンパク質、又は同様のものがある。担体分子は例えばＯ−グリカン（例えばコア２分岐型Ｏ−グリカン）で例示される。担体分子はさらにＣＤ４３やＣＤ３４のようなポリペプチドと相互作用して結合して、糖タンパク質を製造することができる。
【００８５】
本明細書で示したように、一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物は、コレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ）を発現する細菌の種々の機能、例えば細菌の増殖、細菌の運動性、細菌によるＣＧＬの合成の一つ又はそれ以上の機能を抑制又は阻害することができる。「抑制又は阻害」という用語は、前記化合物の存在下で検査した機能が、前記化合物の非存在下での機能レベルと比較して、減少するか全く機能がなくなる状態となることを意味する。例えば一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物は、その非存在下の場合と比べて、ヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬ合成の量を抑制又は阻害していることが本明細書に明示されている（実施例１参照）。「抑制又は阻害」という用語は、機能レベルが特別な分析によって検知できるレベル以下にまで減少すると認められるので、本明細書では通常一緒に使用している。例えば、前記化合物と接触したヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬ合成が完全に抑制されたかどうか、又は特別な分析による検知レベル以下のその合成レベルが維持されているかどうかという分析は確定できないかもしれない。しかし、制御レベルの減少は、前記化合物との接触によるものである。
【００８６】
微好気性、グラム陰性の細菌であって、全世界の人口のおよそ半分のヒトの胃に感染しているヘリコバクター  ピロリは、胃潰瘍の原因となり、また、胃の悪性腫瘍の原因となる（Marshall  and  Warren,  Lancet  1311,  1984;  Peek  and  Blaser,Nat.Rev.Cancer  2:28,2002;Du  and  Isaccson,  Lancet  Oncol.3:97,  2002参照）。感染しているほとんどのヒトは無症候群であるか、慢性胃炎のみを患い、患者の一部が消化性潰瘍、胃癌、悪性リンパ腫を患う（Cave,Semin.Gastrointest.Dis.12:196,2001参照、参考文献としてここに示す）。無症候群であるヒトは自己防御能を有しているのかもしれない。ヘリコバクター  ピロリは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンを発現する胃粘膜の深部でめったにみられないので、これらのＯ−グリカンがヘリコバクター  ピロリの増殖に影響を及ぼすかどうか調べた。
【００８７】
組織化学特性に基づき、胃粘素を二つに分類した（Otaら、Histochem.J.23:22,1991参照、参考文献としてここに示す）。一つは粘液細胞表面から分泌される表面粘液細胞型ムチンである。もう一つは粘液深部でみられ、粘液頚細胞、心腺細胞、幽門腺細胞のような腺粘液細胞から分泌される腺粘液細胞型ムチンである。ヘリコバクター  ピロリに感染した胃粘液では、微生物が単独で表面粘液細胞型ムチンに接合しており、このムチンにヘリコバクター  ピロリが付着するための糖質リガンドが存在する。ルイスｂやシアリル−ルイスＸとして知られる糖質構造はヘリコバクター付着特異リガンドＢａｂＡとＳａｂＡとを夫々供給する。両方の糖質リガンドは粘液細胞表面に専ら発現する（Ilverら、Science 279:373,1998; Mahdaviら、Science 297:573,2002）。対照的に、ヘリコバクター  ピロリは、コア２分岐型Ｏ−グリカン（ＧｌｃＮＡｃa１→４Ｇａ１β１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（ＧｌｃＮＡｃa１→４Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃa→Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）に結合した末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する腺粘液細胞型ムチンを製造する胃粘液の深部に、コロニーを殆ど形成しない（Hidakaら、前出,2001）。腺粘液の損失に伴い洞萎縮すると、洞萎縮のない慢性胃炎に比べて、消化性潰瘍や胃癌の危険性が２〜３倍に高まってしまう（Sipponen  and  Hyvarinen,  Scand.J.Gastroenterol.196(Suppl.3):3,1993参照、参考文献としてここに示す）。この観察と、ヘリコバクター  ピロリ感染した大多数のヒトが無症候群である（Cave,前出,2001）という知見に基づき、深部ムチンに発現した末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンがヘリコバクター  ピロリ感染からヒトを保護できるかについて研究した。
【００８８】
本明細書に示したように、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンはヘリコバクター  ピロリに対する抗菌活性を有し、その細胞壁の主成分であるコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシドの生合成を抑制する。したがって、胃ムチン中のＯ−グリカン特有のサブセットは天然抗生物質としての機能を発揮し、ヘリコバクター  ピロリ感染から宿主を保護する。これらのムチンがヘリコバクター  ピロリ感染から宿主を保護することを確認できたことから、少なくとも一部がＣＧＬの発現によって特徴づけられる他の細菌による感染だけでなく、ヘリコバクター種の細菌による感染を治療又は予防するのに有用な化合物を創り出すことができた（実施例１参照）。これによって、ヘリコバクター感染を治療するための組成物、その製造方法及びその使用方法が提供される。
【００８９】
一つの具体例として、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質の製造方法を示す。それの一形態として、例えば、ポリペプチドのグリコシル化に適した条件下で、α４ＧｎＴと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドとを接触させ、このポリペプチドを、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化し、少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する糖タンパク質を製造するものである。第二の形態として、前記Ｃ２ＧｎＴ−Ｉとの組み合わせに代えて、Ｃ１−β３ＧｎＴのようなコア１伸長酵素と、Ｃ１−β３ＧｎＴに対する基質である担体ポリペプチドとを使用してもよい（Yahら、Cell 105:957-969,2001参照、参考文献としてここに示す）。この形態によれば、担体ポリペプチドはＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化され、少なくとも一つのα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を有する糖タンパク質が製造される。前記担体ポリペプチドは、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ（又はＣ１−β３ＧｎＴ）とα４ＧｎＴとの活性により、一つ以上のα１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミン残基を結合できるものであればよく、例えば、可溶性ポリペプチド（例えば可溶性ＣＤ４３ポリペプチド又は可溶性ＣＤ３４ポリペプチド）が挙げられる。前記製造方法はさらに、前記糖タンパク質を単離する工程を含んでいてもよい。このようにして、本発明の方法で製造された糖タンパク質が単離された糖タンパク質として提供される。
【００９０】
前記の通り、ＣＧＬを発現する細菌、特にヘリコバクター種の細菌の感染を治療又は予防するのに有用な組成成分は、担体分子と相互作用して結合した少なくとも一つの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する。このような組成成分はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでつくられる。例えば、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するポリペプチド担体分子を含む糖タンパク質は、ポリペプチドのグリコシル化に適した条件下で、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）と、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）と、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドとを接触させて製造される。この方法によれば、前記ポリペプチドはＣ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴとによってグリコシル化され、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する糖タンパク質が製造される。
【００９１】
このような糖タンパク質は、組み換えＤＮＡの技術を用いて製造することもできる。例えば少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質は、α４ＧｎＴをエンコードする第一のポリヌクレオチドと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードする第二のポリヌクレオチドと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとを真核細胞内で発現させて製造できる。一般に、一つ、二つ、又は三つのポリヌクレオチドは真核細胞に対して内因性ではなく、一つ、二つ又は三つ全てのエンコードされたポリペプチド（α４ＧｎＴ、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ、担体ポリペプチド）は真核細胞に対して異型である。この方法で製造した組換え型の糖タンパク質は例えば、α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＣＤ４３（ロイコシアリン）分子、α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＣＤ３４分子で例示される（実施例１参照）。
【００９２】
別な具体例として、本発明は、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類も範疇に含む非ヒトのトランスジェニック哺乳類に関するものである。この非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型糖タンパク質を製造する一つ又はそれ以上の導入遺伝子を含んでいる。前記糖タンパク質は非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の母乳中に分泌される。本発明の非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、少なくともα４ＧｎＴをエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと、必要に応じてＣ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードする第二の外因性ポリヌクレオチド及び／又は少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三の外因性ポリヌクレオチドとをゲノム中に安定に組み込んで有している。本明細書に示したように、前記トランスジェニック哺乳類がさらに前記第二の外因性のポリヌクレオチド及び／又は前記第三の外因性のポリヌクレオチドを導入するか否かは、細胞、又は一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型糖タンパク質を産生する細胞が、自然の状態で内因性のＣ２ＧｎＴ−Ｉ及び／又は所望の担体ポリペプチドを発現するか否かに依存する。例えば、乳腺上皮細胞は、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉとムチン型糖タンパク質とを発現する。よって、非ヒトのトランスジェニック哺乳類がその母乳中に一つ又はそれ以上のα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型糖タンパク質を発現できる場合は、第二及び／又は第三のポリヌクレオチドを導入してもよいが、必ずしもその必要はない。したがって、種々の具体例では、本発明の非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、一つの、又は二つの、又は三つの外因性ポリヌクレオチドを有している。一つの形態として、非ヒトのトランスジェニック哺乳類は、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合された第一の外因性ポリヌクレオチドを、ゲノム中に安定に組み込んで有している。第二の形態として、非ヒトのトランスジェニック哺乳類はさらに、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合された第二及び／又は第三のポリヌクレオチドを、夫々必要に応じてゲノム中に安定に組み込んで有している。さらに、第三のポリヌクレオチドは、共存するときには担体ポリペプチドを母乳内に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列と相互作用して結合している。
【００９３】
さらに別な形態として、本発明は、少なくともα４ＧｎＴをエンコードする第一の外因性ポリヌクレオチドと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードし、又はＣ１−β３ＧｎＴをエンコードする第二のポリヌクレオチドと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとをゲノム中に安定に組み込んで有し、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドと前記第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかが外因性ポリヌクレオチドであり、前記第一のポリヌクレオチドと前記第二のポリヌクレオチドと前記第三のポリヌクレオチドとがプロモータを含む植物遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合され、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴと担体ポリペプチドとの発現により、前記担体ポリペプチドを、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ又はＣ１−β３ＧｎＴとα４ＧｎＴとによってグリコシル化するトランスジェニック植物を提供するというものである。例えばエンハンサー及び／又は翻訳制御要素をさらに含む５’制御要素を構成する、相互作用して結合されたプロモータは、構成プロモータ、誘導プロモータ、又は組織特異プロモータであってもよく、例えば種、花、葉、及び／又は根のような植物の所望の細胞中のエンコードされたポリペプチド（例えばα４ＧｎＴ）を転写するものである。さらに本発明は、前記トランスジェニック植物によって産出された種子、前記トランスジェニック植物から産生された穀類や小麦粉のような産物、前記トランスジェニック植物やその種、花、葉、又は根に由来する産物、豆乳やライスミルク等の乳液のような産物を提供するというものである。植物から前記のような産物を収穫して生産する方法は通常、公知の方法に準じて行われ、例えば豆乳を生産する方法（例えば、米国特許  第4,119,733号;第4,409,256号;第4,902,526号;第6,316,043号;第6,322,846号;第6,451,359号の各明細書参照、夫々参考文献としてここに示す）や、ライスミルクを生産する方法（例えば、米国特許  第4,744,992号;第4,894,242号;第5,609,895号;第6,599,552号の各明細書参照、夫々参考文献としてここに示す）がある。
【００９４】
ポリヌクレオチドに関して使用されている「外因性」という用語は、ある特定の細胞内又は生物の細胞内で前記ポリヌクレオチドが自然状態では発見されないことを意味する。「異型」という用語も同様の意味で使用している。「異型」という用語はさらに、通常自然状態では発見されない二つ又はそれ以上のヌクレオチド配列を有するキメラのポリヌクレオチドに関して使用している。例えば、一つの遺伝子のコードされた配列が、第二の遺伝子のコードされた配列及び／又はプロモータ又は他の第二の制御配列（又は他の遺伝子）に結合（相互作用して結合）している場合、第一のコードされた配列は、第二のコードされた配列及び／又は制御配列に対して異型である。外因性のポリヌクレオチドは通常組換えＤＮＡ法を用いて細胞（例えば非ヒトの胚の細胞）中に導入される。本発明のトランスジェニック哺乳類中にＣ２ＧｎＴ−Ｉと、α４ＧｎＴと、担体ポリペプチドとが発現することにより、担体ポリペプチドはＣ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴとによってグリコシル化され、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質が製造される。製造された糖タンパク質は、雌の動物が生産する母乳中に分泌される。
【００９５】
組換え型の糖タンパク質を含む組換え型のポリペプチドを母乳中に分泌可能な非ヒトのトランスジェニック哺乳類の生産方法は公知である（例えば、米国特許  第6,344,596号;第6,548,735号;第6,222,094号;第5,962,648号;第5,891,698号;第5,850,000号の各明細書参照、夫々参考文献としてここに示す)。そのような非ヒトのトランスジェニック哺乳類はどのような哺乳類でもよく、例えばマウス、ラット、ウサギ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、又はウシが挙げられる。一つの形態として、前記トランスジェニック哺乳類は非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類であって、組換え型糖タンパク質が抗菌活性型で、前記非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類によって生産された母乳中に分泌される。
【００９６】
本発明は、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の母乳中に、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質を製造する方法を提供するというものである。「抗菌性」という用語は、ここでは少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物について使用しているが、前記化合物の非存在下での増殖レベル又は機能レベルと比較して、前記化合物がＣＧＬを発現する細菌の増殖又は機能を抑制又は阻害することができることを意味している。ヘリコバクター  ピロリのようなヘリコバクター種の細菌等の増殖又は機能が抑制又は阻害されていることは、本明細書に示した方法又は公知の方法を用いて確認できる。例えば化合物の抗菌活性は、その化合物の非存在下での運動性と比較して細菌の運動性が減少することを検出することにより、又は細菌増殖に適した培地で培養した細菌の数が減少することを検出することにより、確認できる。
【００９７】
非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の母乳中に前記抗菌性の組換え型の糖タンパク質を製造する方法は次のようにして行われる。１）非ヒトの哺乳類の胚に、α４ＧｎＴをエンコードする第一のポリヌクレオチドと、Ｃ２ＧｎＴ−Ｉをエンコードする第二のポリヌクレオチドと、少なくとも一つのＯ−グリコシル化部位を有する担体ポリペプチドをエンコードする第三のポリヌクレオチドとの少なくともいずれかを導入し、これら三つのポリヌクレオチドを全て前記胚に導入しないときには前記胚の細胞は対応する内因性のポリヌクレオチドを有し、前記第一のポリヌクレオチドと、前記第二のポリヌクレオチドと、前記第三のポリヌクレオチドとが、プロモータを含む乳腺特異的遺伝子の５’制御配列に相互作用して結合され、前記第三のポリヌクレオチドが、担体ポリペプチドを母乳内に分泌させる効果を有する信号配列をエンコードするヌクレオチド配列と相互作用して結合し、２）前記胚を、子孫を生産するような宿主の雌哺乳類に移植し、３）前記雌の子孫に、５’制御配列に相互作用して結合しゲノム中に安定に組み込まれた第一の外因性ポリヌクレオチドと第二の外因性ポリヌクレオチドと第三の外因性ポリヌクレオチドとを含む母乳の生産を行わせる。母乳は、その動物をつがいにして妊娠させ、乳腺上皮で生産させるか、あるいは母乳を生産するように非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類のホルモン処理を行うことで、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類により産生される。前記非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類中にＣ２ＧｎＴ−Ｉと、α４ＧｎＴと、担体ポリペプチドとが発現することにより、担体ポリペプチドはＣ２ＧｎＴ−Ｉとα４ＧｎＴとによってグリコシル化され、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する抗菌性の組換え型の糖タンパク質が製造される。製造された糖タンパク質は、非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類が産生する母乳中に分泌される。
【００９８】
少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を母乳中に分泌する非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類の生産方法はさらに、雌トランスジェニック哺乳類から搾乳することにより、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を含む母乳を得る工程を含んでいてもよい。さらに前記方法は、前記母乳から少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を単離することにより、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を得る工程を含んでいてもよい。本発明によれば、本発明の方法で生産される非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類、その雌トランスジェニック哺乳類から生産される母乳、及びその母乳から得られる単離された少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質を提供することができる。
【００９９】
本発明は、ヘリコバクター種の細菌に感染することによる胃潰瘍の治療又は予防方法を提供するというものである。一つの具体例として、本発明はヘリコバクター種の細菌が個体に感染することによる胃潰瘍の兆候又は症状を改善する方法であって、個体に少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物が投与され、この化合物が前記ヘリコバクター種の細菌に接触して前記ヘリコバクター種の細菌の増殖を抑制又は阻害することにより、胃潰瘍の兆候又は症状を改善する方法を提供することができるというものである。第二の具体例として、本発明は、胃潰瘍感受性の個体にヘリコバクター種の細菌が感染することによる胃潰瘍の予防方法であって、前記胃潰瘍感受性の個体に少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物が投与され、この化合物が前記ヘリコバクター種の細菌の増殖を妨げることによって、前記ヘリコバクター種の細菌の感染による胃潰瘍を予防する方法を提供することができるというものである。
【０１００】
ここで使用される「改善」という用語は、胃潰瘍の兆候や症状が緩和することを意味する。胃潰瘍の兆候や症状は、兆候や条件を監視する方法と同様に、熟練した臨床医によく知られている。胃潰瘍の症状として、例えば、腹部の灼熱痛、食べたり制酸剤を服用したりすると改善する痛み、食事の２〜３時間後にひどくなる痛みがある。潰瘍が出血している場合は、鮮血を含む嘔吐や、黒やタール色の排便のような症状がみられる。本発明の方法は、胃潰瘍の改善、例えば、患者の痛みを緩和させるものである。同様に、例えば、液体バリウムの摂取後に胃腸上部にＸ線を照射し、減少した潰瘍の大きさを検出したり、抗ヘリコバクター  ピロリ抗体やヘリコバクター  ピロリに対する血液検査を行い、抗体又は細菌の夫々の数の減少や欠乏を測定したり、検便中の潜血の減少又は欠乏を検出したり、出血性胃潰瘍による貧血の減少を検出したり、胃粘膜を内視鏡で検査したりすることによって、胃潰瘍の臨床学的兆候が緩和することを、熟練した臨床医は熟知している。
【０１０１】
ヘリコバクター感染は、本明細書で示した方法や、他の公知の方法で検知できる。例えば、らせん状細胞を直接観察するワルティン−スターリー銀染色のスタイネル変異による組織学的検査では、電子顕微鏡でヘリコバクター種の細菌を検知できる。糞粒又は盲端塗抹標本の微生物学的培養もまた、特異培地と微好気性培養条件とを用いたヘリコバクター種の細菌の確認のために使用される。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）法もまたヘリコバクター種の細菌を検出するために使用され、制限エンドヌクレアーゼは、種々のヘリコバクター種の細菌を区別することができる。
【０１０２】
本発明の方法によって治療される個体は、胃粘膜がヘリコバクター種の細菌に感染しているか、又は感染しやすい感受性の個体である。したがって、前記個体は例えばウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、フェレット、又は同様のもののような哺乳類である。一つの具体例として、前記個体はヒトである。同様に、ヘリコバクター種の細菌は胃潰瘍形成に関与するもので、例えばヒトの胃潰瘍形成に関与するヘリコバクター  ピロリである。さらに、胃潰瘍に関係するヘリコバクター  ピロリ、ヘリコバクター種の細菌として、例えば胃炎のチーターから単離したＨ．ａｃｉｎｏｎｙｃｈｉｓ、シリアンハムスターの胃腸組織から培養したＨ．ａｕｒａｔｉ、犬の胃にみられるＨ．ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｉｉ、ブタオザル（Ｍａｃａｃａ  ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａ）の胃にみられるＨ．ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａｅ、鳥やブタの排泄物から単離したＨ．ｐａｍｅｔｅｎｓｉｓ、家禽や胃腸炎のヒト患者から単離したＨ．ｐｕｌｌｏｒｕｍ（Microbiology,140:3441-3449,1994参照）、Ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓやＨｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｚｚｏｚｅｒｏｎｉｉに関係する犬胃ヘリコバクター種の細菌であるＨ．ｓａｌｏｍｏｎｉｓ（JP  Euzeby,List  of  Bacterial  Names  with  Standing  in  Nomenclature  Genus  Helicobacter,URL:http/www/bacterio.cict.fr/h/helicobacter.html参照）、ペットのフェレットに広く存在するＨ．ｍｕｓｔｅｌａｅ、ヘリコバクター  ピロリに類似しブタに感染するＨ．ｈｅｉｌｍａｎｎｉｉなどが挙げられる。さらに、本発明の組成物と方法とは、細胞壁の段階でコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ；Ｇｌｃα１→コレステロール）を発現する細菌による病的状態を改善するために使用される。
【０１０３】
前記で示したように、本発明で使用される化合物は少なくとも一つの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物であればよい。また前記化合物は、単独で使用してもよく、潰瘍患者の治療に有用であると臨床医が認めた一種又はそれ以上の治療剤や栄養剤と併用してもよい。前記化合物として、例えば、少なくとも一つの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する組換え型の糖タンパク質（例えば末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３ポリペプチド）、Ｏ−グリカンを含み、一つ又はそれ以上の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物、胃腺粘液細胞型ムチンを含み、胃腺粘液細胞から単離され得る化合物が挙げられる。
【０１０４】
個体に投与される化合物は、その種類に応じた特有な如何なる方法により処方されてもよい。また、前記化合物は適切であれば如何なる方法で投与されてもよく、特に経口投与や胃へ直接挿管する方法であってもよい。治療方法のためだけではなく予防方法のためにも、例えば前記で示した非ヒトの雌トランスジェニック哺乳類から得られた母乳のような前記化合物を含む母乳を、ヘリコバクター感染による胃潰瘍を有していたり胃潰瘍になり易かったりする個体が、飲用することによって、前記化合物の投与が行われる。
【０１０５】
前記化合物が母乳に含まれる以外の形態の場合、前記化合物は個体への投与に適した組成に処方される。このように、本発明は少なくとも一つの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物を含み、ヘリコバクター感染による胃潰瘍の予防又は改善に有効で、製剤学的に許容される担体をさらに含むことができる組成物を提供するというものである。そのような化合物やその化合物を含む組成物は、胃潰瘍を有しているか、又は胃潰瘍になりやすい個体の治療に用いる医薬として有用である。
【０１０６】
製剤学的に許容される担体は公知であり、例えば水、生理食塩水、他の溶媒、グリコールやグリセロールで例示されるビヒクルを含む水溶液；オリーブオイルや注射可能な有機エステルのような油状物が挙げられる。製剤学的に許容される担体は、例えば少なくとも一つの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物（例えば前記組換え型の糖タンパク質）の吸収を安定化又は増大させる、生理的に許容される化合物を、含んでいてもよい。そのような生理的に許容される化合物として、例えば、グルコース、スクロース、デキストランのような糖質；アスコルビン酸、グルタチオンのような抗酸化剤；キレート化剤；低分子量タンパク質；他の安定化剤や賦形剤が挙げられる。例えば前記治療効果のある化合物や予防効果のある化合物の物理化学的特性や、一般的な経口投与のみならず静脈注射、注射、挿管、又は他の公知の方法のような非経口投与という組成物投与方法に応じて、生理的に許容される化合物を含む製剤学的に許容される担体を、選択すべきであることは、よく知られている。前記のように、前記組成物は、例えば、診断試薬、栄養物質、毒素、制酸剤及び／又は栄養補助剤等の治療有効剤のような別な薬剤を、さらに含んでいてもよい。
【０１０７】
本発明の方法で投与される、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物が、治療目的で投与されるのか予防目的で投与されるのかに応じて、その総量を、一度に又は長期にわたって複数回に分けて、投与してもよい。個体の病状を治療するための前記化合物の量は、個体の歳、全身の健康状態、投与経路、投与回数、ヘリコバクター感染の重症度のような多くの要因によるべきであることが知られている。専門医は、これらの要因から、第１相及び第２相臨床試験結果に基づき、必要に応じて、投与量を調整し、さらに組成物の形状とその投与経路、投与量と投与頻度を、決定する。
【０１０８】
経口投与用として、前記化合物は錠剤、溶液又は懸濁液として処方され、通常無毒で製剤学的に許容される担体を含む錠剤、ペレット剤、カプセル、座薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、又は使用に適した形状に調剤されてもよい。前記担体として前記のもの以外に、グルコース、ラクトース、マンノース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイダルシリカ、ポテトスターチ、尿素、中鎖長トリグリセリド、デキストラン、又は使用に適した他の担体を固体、半固体、又は液体の形状で用いてもよい。さらに、補助剤、安定化剤、農厚化剤、着色剤、香料を使用することもできる。例えば、トリウロースのような安定乾燥剤（例えば米国特許  第5,314,695号明細書参照）を使用してもよい。
【０１０９】
また、本発明は、ＣＧＬを発現する細菌の細胞壁形成を抑制又は阻害する方法を提供するものである。その方法は例えば、前記細菌を、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物に接触させ、ＣＧＬ合成を抑制又は阻害して、この細菌の細胞壁の形成を抑制又は阻害するというものである。前記化合物は、ＣＧＬ合成の抑制又は阻害によって細菌のＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を抑制又は阻害するものであってもよいが、必ずしも必要ではない。また、本発明はＣＧＬを発現する細菌の増殖を抑制又は阻害する方法を提供するというものである。その方法は例えば、前記細菌を、少なくとも一つのα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する化合物に接触させ、ＣＧＬ合成を抑制又は阻害して、前記細菌の増殖を抑制又は阻害するというものである。この方法では、前記細菌と前記化合物とをｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させてもよく、例えば培養中の細菌細胞に前記化合物を添加して行われる。また、前記細菌と前記化合物とをｉｎ  ｖｉｖｏで接触させてもよく、例えばヘリコバクター種の細菌に感染した哺乳類、特にヘリコバクター  ピロリに感染したヒトのような、細菌感染した個体の胃に、前記化合物を直接投与して行われる。
【０１１０】
以下、本発明の実施例について説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
【０１１１】
１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したα−ＭＥＭ培地中で、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター欠損の突然変異体チャイニーズハムスター卵巣・Ｌｅｃ２細胞（ＣＨＯ・Ｌｅｃ２細胞）を培養した。ＣＤ４３の細胞外ドメイン全体を含むＤＮＡ断片（配列番号１におけるアミノ酸配列の２０番目から２５４番目に相当する部分）をＰＣＲ法で増幅し、ｐＳｅｃＴａｇ２（インビトロジェン社製）にサブ・クローニングすることにより、Ｉｇκリーダー・ペプチドと、それに続くｍｙｃエピトープ、及び（Ｈｉｓ）６をエンコードするベクター（ｐＳｅｃＴａｇ２−ｓＣＤ４３）を作製した。次に、（１）コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ）をエンコードするｃＤＮＡと、（２）α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ）をエンコードするｃＤＮＡと、（３）ポリオーマ・ウイルス  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原をエンコードするｃＤＮＡとを、夫々別々に前記ｐＳｅｃＴａｇ２−ｓＣＤ４３に組み込んだベクター４つを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標、インビトロジェン社製）を用いて前記培養したＣＨＯ・Ｌｅｃ２細胞にトランスフェクトさせた。トランスフェクトさせたＣＨＯ・Ｌｅｃ２細胞内で、末端ＧｌｃＮＡｃα残基を含む可溶性ＣＤ４３（以下、「ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３」と称する）を発現させることによりＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を調製した。
【０１１２】
前記調製したＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３の活性は、前記ＧｌｃＮＡｃα残基に特異的なＨＩＫ１０８３抗体（胃ムチン検知用ＨＩＫ１０８３ラテックス、関東化学社製）（例えば悪性腺腫と病変の新診断方法：新モノクローナル抗体（ＨＩＫ１０８３；Clinica Chimica Acta 312(2001)231-233）存在下でのラテックス凝集テスト）を用いて市販のＥＬＩＳＡキット（胃腺粘液細胞型ムチン測定用：関東化学社製）により測定し、発色反応にはＥＬＩＳＡ  ＥＬＡＳＴ増幅システム（パーキン  エルマー社製）を用いた。この結果、発色を確認することができ、ＧｌｃＮＡｃα残基が発現していることが確認できた。さらに、市販の定量システム（ＢＣＡタンパク質検定キット、ピエルスバイオテクノロジー社製、商品番号２３２２５，２３２２７）を用いてタンパク質の定量を行った。その結果、前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３中の側鎖（糖鎖）の数は、主鎖（ＣＤ４３）夫々に対して８０であり、該糖鎖は、該主鎖に対してクラスター状に存在していることが判った。さらに別な市販の定量キット（糖タンパク  糖質評価キット、ピエルスバイオテクノロジー社製、商品番号２３２６０）を用いて糖鎖の分析を行った。前記糖鎖は、ＧｌｃＮＡｃα１→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（ＧｌｃＮＡｃα→４Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃα→Ｓｅｒ／Ｔｈｒで構成され、該糖鎖中の分岐数は１であり、モノマーユニット数は６であることが判った。前記「Ｓｅｒ／Ｔｈｒ」は、主鎖としてのＣＤ４３中、セリン（Ｓｅｒ）及びトレオニン（Ｔｈｒ）のいずれかに結合していることを表す。
【０１１３】
なお、前記トランスフェクトしたＣＨＯ・Ｌｅｃ２細胞は、ポリオーマ・ウイルス  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原により、前記ＣＤ４３を効率的に合成することができた。また、前記α４ＧｎＴをエンコードするｃＤＮＡは、特開平２００１−４６０７７号公報に記載の方法に準じて調製した。α型Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含まないＣＤ４３の調製は以下のようにして行った。コントロール測定用として、前記α４ＧｎＴのｃＤＮＡのみを組み込んでいないｐｃＤＮＡＩベクター（インビトロジェン社製）を用いた以外は、ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３の調製と同様にして、Ｏ−グリカンのコア２分岐にＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３を調製した。なお、前記調製した該ＧｌｃＮＡｃαを含まないＣＤ４３をＧｌｃＮＡｃα残基に特異的なラテックス粒子抗体を用いて縮合反応を行ったところ、縮合は見られなかった。この結果、該ＧｌｃＮＡｃαを含まないＣＤ４３はＧｌｃＮＡｃα残基を含まないことがわかった。さらに、前記ＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３中の側鎖（糖鎖）は、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃα→Ｓｅｒ／Ｔｈｒで構成されることがわかった。前記「Ｓｅｒ／Ｔｈｒ」は、主鎖としてのＣＤ４３中のセリン（Ｓｅｒ）及びトレオニン（Ｔｈｒ）のいずれかに結合していることを表す。
【０１１４】
前記調製したＧｌｃＮＡｃα残基を含む可溶性ＣＤ４３、及びＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３を用いて、以下のようにして細菌増殖性、細菌の運動性、及び細菌の形態異常発現性、並びに、ＧｌｃＮＡｃα残基によるＣＧＬ生合成の抑制又は阻害性についての評価を行った。細菌増殖性は以下のとおりである。微量液体希釈法（microbroth dilution method）により、１０％ウマ血清を添加したブルセラ培地（ベクトン  デッキンソン  マイクロバイオテクノロジー  システムズ社製）でヘリコバクター  ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）を前培養した。続いて、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した前記ヘリコバクター  ピロリと、図２Ａに示す濃度のＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３とを９６穴のプレートに投入し、３５℃、１５％ＣＯ２の環境下で４日間培養した。図２Ａ中、「αＧｌｃＮＡｃ（＋）」は、前記培地中に前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３が含まれていることを意味し、「αＧｌｃＮＡｃ（−）」は、前記培地中に前記ＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３が含まれていることを意味し、前記培地中の前記ＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３の濃度は、１２５．０ｍＵ／ｍｌである。培養したヘリコバクター  ピロリの増殖は、ＯＤ６００ｎｍの条件下、マイクロプレート分光光度計ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ３８４（モレキュラーデバイス社製）を用いて測定した。結果を図２Ａに示した。なお、前記ブルセラ培地に代えて、ミューラーヒントン培地（栄研化学社製）を使用した以外は、前記の方法と同様にして最小発育阻止濃度を測定したところ、同様の結果を得ることができた。
【０１１５】
この結果、図２Ａに示すように、ＧｌｃＮａｃα残基の存在の有無に関わらず、最初の２．５日間での増殖はごくわずかであるが、これはヘリコバクター  ピロリの増殖の誘導期の特徴である。培養が３日を超えると増殖期に入り、ＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３含有の培地では、ヘリコバクター  ピロリの急速な増殖が観られた。しかし、ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３と共に培養した場合には、ヘリコバクター  ピロリの増殖が抑制又は阻害されていることがわかった。なお、１ｍＵは、１μｇのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃα−ＰＮＰ）と当量である。細菌運動性は以下のようにして測定した。３１．２ｍＵ／ｍｌのＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を含有するブルセラ培地を用いてヘリコバクター  ピロリを３日間培養した。培養したヘリコバクター  ピロリの運動性をレーザー共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ（カルル  ツァィス社製）を用いて、１秒間隔で低速度写真を撮影し、代表的なヘリコバクター  ピロリを矢印で示した。結果を図２Ｂに示した。また、ＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３についても同様に撮影をした。結果を図２Ｂに示した。
【０１１６】
なお、図２Ｂ中、「αＧｌｃＮＡｃα（＋）」は、前記培地中に前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３が含まれていることを意味し、「αＧｌｃＮＡｃα（−）」は、前記培地中に前記ＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３が含まれていることを意味し、濃度は、夫々３１．２ｍＵ／ｍｌである。また、図２Ｂ右下に記載した下線は、５０μｍを表し、図はすべて等倍率で撮影した低速度写真である。
【０１１７】
この結果、ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を含む培地（αＧｌｃＮＡｃα（＋））で培養された７個のヘリコバクター  ピロリの平均速度は３．１±３．５μｍ／ｓｅｃであり、ＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３を含む培地（αＧｌｃＮＡｃα（−））で培養された７個のヘリコバクター  ピロリの平均速度は２１．１±２．６μｍ／ｓｅｃであり、ｔ検定による有意性は、Ｐ＜０．００１であった。従って、ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を含む培地では、ヘリコバクター  ピロリの運動性が著しく減少することがわかった。
【０１１８】
細菌形態異常は以下のようにして検出した。ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３、又はＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３を３１．２ｍＵ／ｍｌ濃度で含有するブルセラ培地を用いてヘリコバクター  ピロリを３日間培養させた。培養したヘリコバクター  ピロリは、走査電子顕微鏡（日本電子社製、ＪＳＭ−６３６０ＬＶ）を用いて加速電圧１５ｋＶの条件でＳＥＭ写真を撮影した。結果を図２Ｃに示した。なお、図２Ｃ中、「αＧｌｃＮＡｃ（＋）」は、前記培地中に前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３が含まれていることを意味し、「αＧｌｃＮＡｃ（−）」は、前記培地中に前記ＧｌｃＮＡｃα残基を含まない可溶性ＣＤ４３が含まれていることを意味し、濃度は、夫々３１．２ｍＵ／ｍｌである。また、図２Ｃ右下に記載した下線は、１μｍを表し、図はすべて等倍率で撮影したＳＥＭ写真である。この結果、ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を含む培地（αＧｌｃＮＡｃα（＋））で培養されたヘリコバクター  ピロリは、伸び、狭窄、屈曲などの形態異常が観られるのに対し、ＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３を含む培地（αＧｌｃＮＡｃα（−））で培養されたヘリコバクター  ピロリは、形態異常が観られなかった。
【０１１９】
ＣＧＬ生合成の阻害性を測定した。ＧｌｃＮＡｃα残基によるＣＧＬ生合成の阻害性の分析は、以下のようにして、（１）ヘリコバクター  ピロリのｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＧＬ生合成、及び、（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＧＬ生合成の２つの場合について行った。ヘリコバクター  ピロリ生体内でのＣＧＬ生合成の阻害性を測定した。ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３存在下でのヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬの合成を行った。コレステロール及びＵＤＰ−グルコースを用いたヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬの合成をＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３の存在下で行い、以下の様にしてヘリコバクター  ピロリ生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で生合成したＣＧＬについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。１０％ウマ血清を添加したブルセラ培地（ベクトン  デッキンソン  マイクロバイオテクノロジー  システムズ社製）でヘリコバクター  ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）を前培養した後、希釈した前記ヘリコバクター  ピロリ（１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）と、４．０ｍＵ／ｍｌ濃度に調整したＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３とを９６穴のプレートに投入して、３５℃で２日間培養した。培養したヘリコバクター  ピロリを回収し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳで３回洗浄した後、１ｍｌの蒸留水で懸濁し、懸濁した液を毎分６，０００回転で１０分間遠心することにより菌体を得た。得られた菌体を、２ｍｌのクロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノールの質量比＝２：１）を用いて４℃で一晩かけて抽出し、抽出液をろ過して、窒素気流で乾燥させた。乾燥して得られた試料を４ｍｌのクロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノールの質量比＝２：１）に溶解させた。
【０１２０】
Ｆｏｌｃｈらの方法に準じ、混合液に１ｍｌの水を添加した。得られた混合液の下相を窒素気流で乾燥させ、１ｍｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム・メタノール溶液を用いて、５０℃で１時間の処理を行った。さらに処理液を６Ｎ塩酸水溶液を用いて中和した後、反応管に１ｍｌの石油エーテルを添加した。次に、上相を除去した後、さらに２ｍｌの石油エーテルを下相に添加した。下相を乾燥させた後、１ｍｌのクロロホルム・メタノール・水（クロロホルム：メタノール：水の質量比＝８６：１４：１）の混合液（ＴＬＰ）に溶解させ、同じ反応管に０．５ｍｌの別のクロロホルム・メタノール・水（クロロホルム：メタノール：水の質量比＝３：４８：４７）混合液（ＴＵＰ）を添加した。得られた混合液の下相を回収し、窒素気流で乾燥させ、５０μｌのクロロホルムに溶解させた。次に、この試料を１μｌ量り取り、１μｌの２，５−ジヒドロキシ安息香酸、又は１μｌのｔｒａｎｓ−３−インドールアクリル酸を添加し、これをマトリックスとして用いた。前記資料の質量スペクトルは、ＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰＥ  アプライド  バイオシステムズ社製）を用い、リフレクターモード、レーザー強度２３００の条件で、陽イオンモード又は負イオンモードで測定した。なお、ヘリコバクター  ピロリに内生発現するホスファチジン酸を内部基準とし、２点外部較正を行った。結果を図３Ｂに示した。
【０１２１】
また、コントロールとして、前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を、ＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３に代えた以外は前記の方法と同様にしてＣＧＬの質量スペクトルを測定した。結果を図３Ａに示した。図３Ａ及び３Ｂに示したように、前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３が存在する場合、及びＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３が存在する場合のいずれの場合についても、ｍ／ｚが５７１．６の位置にＣＧＬのピークが検出された。しかし、前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３の存在下でのＣＧＬのピークは、コントロールで測定したＣＧＬのピークと比較して２９．５％と大きく減少していた。この結果、前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３が、ヘリコバクター  ピロリ生体内でのＣＧＬの生合成を阻害していることがわかった。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（試験管内）でのＣＧＬ生合成の阻害性を測定した。ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３存在下でのヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬの合成を行った。コレステロール及びＵＤＰ−グルコースを用いて、超音波処理したヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬの合成を行い、以下の様にしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成したＣＧＬについてのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行った。１０％ウマ血清を添加したブルセラ培地（ベクトン  デッキンソン  マイクロバイオテクノロジー  システムズ社製）でヘリコバクター  ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）を前培養した後、希釈した前記ヘリコバクター  ピロリ（５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を５％ウマ血清添加のブルセラ培地中で、３５℃で２日間培養した。培養した２ｍｌのヘリコバクター  ピロリ（５×１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を回収し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳで３回洗浄した後、１ｍｌの蒸留水で懸濁し、懸濁した液を毎分６，０００回転で１０分間遠心することにより脂質成分を得た。
【０１２３】
次に、１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）と、１５質量％グリセロールと、５ｍＭのＤＴＴと、２００μＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（メルク社製）と、０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームとを含有する反応緩衝液１ｍｌ中にヘリコバクター  ピロリを懸濁し、２０℃で５分間培養した。これらのサンプルを氷浴上で、超音波ウォーターバスにて３０秒間の超音波処理を３０秒間隔で１０回行った。次に、８０μｌの超音波処理済ヘリコバクター  ピロリと、８ｍＭコレステロールエタノール溶液５μｌと、７．２μＭのＵＤＰ−Ｇｌｃ（ＵＤＰ−グルコース）５μｌと、トリトンＣＦ−５４（シグマケミカル社製）１μｌと、反応緩衝液９μｌとを含有する１００μｌの反応混合液を、３０℃で３時間定温放置（インキュベート）した。その後、０．４５％  ＮａＣｌ溶液９００μｌ、及びクロロホルム・メタノール混合液（２：１）４ｍｌを添加して反応を停止させた。
【０１２４】
次に、添加後の混合液の下相をろ過し、窒素気流下で乾燥させた。乾燥して得られた脂質試料を４ｍｌのクロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノールの質量比＝２：１）に溶解させ、Ｆｏｌｃｈらの方法に準じ、混合液に１ｍｌの水を添加した。得られた混合液の下相を窒素気流で乾燥させ、１ｍｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム・メタノール溶液を用いて、５０℃で１時間の処理を行った。さらに処理液を６Ｎ塩酸水溶液を用いて中和した後、反応管に１ｍｌの石油エーテルを添加した。次に、上相を除去した後、さらに２ｍｌの石油エーテルを下相に添加した。乾燥させた下相は、１ｍｌのクロロホルム・メタノール・水（クロロホルム：メタノール：水の質量比＝８６：１４：１）の混合液（ＴＬＰ）に溶解させ、同じ反応管に０．５ｍｌの別のクロロホルム・メタノール・水（クロロホルム：メタノール：水の質量比＝３：４８：４７）混合液（ＴＵＰ）を添加した。得られた混合液の下相を回収し、窒素気流で乾燥させ、５０μｌのクロロホルムに溶解させた。
【０１２５】
次に、この試料を１μｌ量り取り、１μｌの２，５−ジヒドロキシ安息香酸、又は１μｌのｔｒａｎｓ−３−インドールアクリル酸に添加し、これをマトリックスとして用いた。ＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳのＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰＥ  アプライド  バイオシステムズ社製）を用い、リフレクターモード、レーザー強度２５００の条件で、陽イオンモードでのＣＧＬの質量スペクトルを測定した。なお、ヘリコバクター  ピロリに内生発現するホスファチジン酸を内部基準とし、２点外部較正を行った。結果を図３Ｃに示した。
【０１２６】
次に、前記反応緩衝液に５．０ｍＵのＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を含有させた以外は前記の方法と同様にしてＣＧＬの質量スペクトルを測定した。結果を図３Ｄに示した。さらに、前記反応緩衝液に５．０ｍＵのＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３を含有させた以外は前記の方法と同様にしてＣＧＬの質量スペクトルを測定した。結果を図３Ｅに示した。
【０１２７】
ＵＤＰ−Ｇｌｃとコレステロールとから超音波処理したヘリコバクター  ピロリにより合成された試料についてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行ったところ、図３Ｃから明らかなように、ｍ／ｚが５７１．６の位置にＣＧＬのピークが検出された。これは、下記スキームに示すようにヘリコバクター  ピロリが、ＵＤＰ−ＧｌｃをコレステロールのＣ３の位置に転移するＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を有するためであると考えられる。
【化１】
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【０１２８】
しかし、前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３の存在下で同様にして培養した場合には、図３Ｄに示したように、ｍ／ｚが５７１．６の位置にＣＧＬのピークが検出されなかった。また、前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３に代えて、前記ＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３の存在下で同様にして培養した場合、ｍ／ｚが５７１．６の位置にＣＧＬのピークが検出され、前記反応緩衝液に前記ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３及び前記ＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３を添加しない場合、ＣＧＬのピークに変化が観られなかった。これらの結果から、ＧｌｃＮＡｃα残基が、最終的にＣＧＬの生合成を阻害していることが証明された。
【０１２９】
α−ＣＧｓの生合成に関わる糖転移酵素の同定を含むヘリコバクター  ピロリの細胞壁の生成機構は解明されていないが、ＧｌｃＮＡｃα残基と、ＣＧＬに含まれるα結合型Ｇｌｃとの構造の類似性を考慮すると、前記分析結果から、ＧｌｃＮＡｃα残基と、ＵＤＰ−Ｇｌｃとが互いに競合し、ＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素の供与体基質を互いに奪い合っているか、又は、ＧｌｃＮＡｃα残基が最終生成物阻害機構によって直接的にＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を阻害し、ＣＧＬの生合成を阻害しているものと考えられる。前記細菌増殖性、細菌の運動性、及び細菌の形態異常発現性、並びに、ＧｌｃＮＡｃα残基によるＣＧＬ生合成の抑制乃至阻害性の評価結果から、α１，４アセチルグルコサミン残基を有する機能性分子を投与することにより、個体がヘリコバクター属の細菌に感染して引き起こされる胃潰瘍及び胃癌の兆候及び症状を改善及び予防できることがわかった。
【０１３０】
コレステロールの有無に対するヘリコバクター  ピロリの生存状況、及びヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬの合成について実験を行った。コレステロールの有無に対するヘリコバクター  ピロリの生存状況を調べた。コレステロールの生合成に関わる遺伝子は、ヘリコバクター  ピロリのゲノムデータからは発見されていない。このため、ヘリコバクター  ピロリは、外因性のコレステロールの存在がなければＣＧＬを合成できない可能性があることから以下の実験を行った。即ち、コレステロールを含まないＨａｍ'ｓ  Ｆ−１２培地でヘリコバクター  ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）を３５℃の標準嫌気条件にて５日間培養すると、ヘリコバクター  ピロリの増殖は同条件でコレステロールを含むＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地に対して５０％のレベルにとどまった。結果を表１に示した。
【０１３１】
コレステロールを含まない培地では、ヘリコバクター  ピロリは運動性を示さず、異常伸長（形態異常）として図２Ｃ左に見られるようなヘリコバクター  ピロリの伸びがみられた。このヘリコバクター  ピロリにコレステロールの非存在下でさらに２１日間培養すると、ヘリコバクター  ピロリは完全に死滅した。一方、コレステロールを加えた培地でヘリコバクター  ピロリを培養すると、ヘリコバクター  ピロリは順調に増殖し、形態異常は観られなかった（表１）。これらの結果から、ヘリコバクター  ピロリの生存には、コレステロールを用いたＣＧＬの合成が必要であることがわかった。
【０１３２】
ヘリコバクター  ピロリによるＣＧＬの合成を行った。コレステロールの有無に対するヘリコバクター  ピロリでのＣＧＬの発現レベルを調べるため、ヘリコバクター  ピロリの糖脂質部のＣＧＬを含むα−ＣＧｓの発現レベルの変化を以下の様にして薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分析した。コレステロールを含むブルセラ培地と、コレステロールを含まない培地で培養されたヘリコバクター  ピロリについて、夫々の培地から１×１０８個のヘリコバクター  ピロリを回収し、クロロホルム・メタノール混合液（クロロホルム：メタノールの質量比＝２：１）を用いて室温で１時間かけて糖脂質部を抽出した。抽出液を窒素気流下で乾燥させ、クロロホルム・メタノール・水混合液（クロロホルム：メタノール：水の質量比＝１６：６：１）を用いて薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行った。単離した糖脂質部は、オルシノール硫酸緩衝液により１１０℃で染色し、可視化した。結果を図４に示した。なお、図４中、レーン１は、コレステロールを含まないブルセラ培地で培養されたヘリコバクター  ピロリから抽出した糖脂質部の分析結果であり、レーン２は、コレステロールを含むブルセラ培地で培養されたヘリコバクター  ピロリから抽出した糖脂質部の分析結果である。この結果、コレステロールを含む培地で培養したヘリコバクター  ピロリの場合には、ヘリコバクター  ピロリの特徴である、ＣＧＬを含むα−ＣＧｓの典型的な隣接三重線が検出された（レーン２）。しかし、コレステロールを含まない培地で培養したヘリコバクター  ピロリでは、α−ＣＧｓ（ＣＧＬ）は検出されなかった（レーン１）。
【０１３３】
α型Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含むＣＤ３４の調製を行った。実施例１中のｐＳｅｃＴａｇ２に代えてｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社製）を用いたこと、及び、可溶性ＣＤ４３をエンコードするｃＤＮＡに代えて、可溶性ＣＤ３４−ＩｇＧキメラをエンコードするｐｃＤＮＡ３−ＣＤ３４−ＩｇＧを用いた以外は以下の実施例１と同様にして、ＧｌｃＮＡｃα残基を含む可溶性ＣＤ３４を調製した。調製したＧｌｃＮＡｃα残基を含む可溶性ＣＤ３４について、実施例１と同様にして細菌増殖性、細菌の運動性、及び細菌の形態異常発現性の分析、及びＧｌｃＮＡｃα残基によるＣＧＬ生合成の阻害性についての評価を前記のようにして行ったところ、実施例１と同様の結果が得られた。
【０１３４】
α型Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含むＣＤ４３を発現するＡＧＳ細胞の調製を行った。実施例１中のＣＨＯ・Ｌｅｃ２細胞を胃腺癌細胞（ＡＧＳ細胞）に代えた以外は以下の実施例１と同様にして、ＧｌｃＮＡｃα−ＣＤ４３を安定的に発現するＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞を調製した。α型Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含まないＣＤ４３を発現するＡＧＳ細胞の調製を行った。コントロール測定用として、前記α４ＧｎＴのｃＤＮＡのみを組み込んでいないｐｃＤＮＡＩベクター（インビトロジェン社製）を用いた以外は、ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞の調製と同様にして、ＧｌｃＮＡｃα残基を含まないＣＤ４３を安定的に発現するＭｏｃｋ−トランスフェクトされたＡＧＳ細胞を調製した。前記調製したＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞、又はＭｏｃｋ−トランスフェクトされたＡＧＳ細胞は、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヘリコバクター  ピロリと共に２４時間共同培養を行った。培養後の状態をノマルスキー顕微鏡を用いて写真撮影した。結果を図５下段に示した。
【０１３５】
次に、２０％緩衝ホルマリンで固定した後、ヘリコバクター  ピロリに対するウサギ・ポリクローナル抗血清（ダコ社製）、及びマウス・モノクローナルＨＩＫ１０８３抗体（関東化学社製）の混合物と共に前記ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞、又はＭｏｃｋ−トランスフェクトされたＡＧＳ細胞をインキュベートし、前記マウス・モノクローナルＨＩＫ１０８３抗体により蛍光染色した。二次抗体として、ローダミン標識の抗ウサギ免疫グロブリン（抗ヘリコバクター  ピロリ抗体用）と、イソチオシアン酸フルオレセイン標識抗マウスＩｇＭ（ＨＩＫ１０８３抗体用）を添加してスライドを作製した。該スライドは、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（ベクター  ラボラトリーズ社製）で封入し、レーザー共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ（カルル  ツァィス社製）を用いて写真撮影した。結果を図５上段に示した。
【０１３６】
図５右上段に示した図は、ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞を蛍光染色した写真である。白色で表された部分は、蛍光発色した前記ＨＩＫ１０８３抗体を表し、ＨＩＫ１０８３抗体が、前記ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞を取り囲むように位置していることが確認できた。前記ＨＩＫ１０８３抗体は、ＧｌｃＮＡｃα残基に特異的な抗体であることから、前記ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞によりＧｌｃＮＡｃα残基が発現していることがわかる。また、図５右下段に示すように、ＧｌｃＮＡｃα残基が発現している前記ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞では、細胞の損傷がみられなかった。
【０１３７】
これに対し、図５左上段に示した図は、Ｍｏｃｋ−トランスフェクトされたＡＧＳ細胞をＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞と同様に蛍光染色した写真である。白色で表された部分は、ヘリコバクター  ピロリを表し、前記Ｍｏｃｋ−トランスフェクトされたＡＧＳ細胞を取り囲むようにヘリコバクター  ピロリが位置していること、及び、蛍光発色した前記ＨＩＫ１０８３抗体が存在しないことからＧｌｃＮＡｃα残基が発現していないことが確認できた。また、図５左下段に示すように、ＧｌｃＮＡｃα残基が発現していない前記ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞では、顕著に細胞の損傷がみられた。
【０１３８】
公知の酵素合成法（例えば、Murata, Usui、Trends Glycsci. Glycotech., 12,161-174,2000）に従って、６残基から成る糖鎖、ＧｌｃＮＡｃα1→４Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃβ１→６（ＧｌｃＮＡｃα→４Ｇａｌβ１→３）ＧａｌＮＡｃαを得た。前記の方法（以下の実施例１参照）と同様にして細菌増殖性、細菌の運動性、及び細菌の形態異常発現性の分析、並びに、ＧｌｃＮＡｃα残基によるＣＧＬ生合成の阻害性についての評価を行ったところ、前記したものと同様の結果が得られた（以下の実施例１参照）。
【０１３９】
これらの結果から、ヘリコバクター  ピロリの増殖にはＣＧＬが必須であり、ＧｌｃＮＡｃα残基は、ＣＧＬの生合成を阻害することにより、ヘリコバクター  ピロリに対する抗菌性を示すことが明らかとなった。
【実施例】
【０１４０】
（実施例１）末端α１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミンを有するＯ−グリカンが持つ抗菌活性
この実施例では、胃腺粘液細胞型ムチン中で製造されたＯ−グリカンが、ヘリコバクター  ピロリ増殖の天然由来阻害剤として作用すること、また末端α１，４結合−Ｎ−アセチルグルコサミンを有する合成組成物が抗菌活性を有することを実証する。
【０１４１】
材料及び方法
細菌株
ヘリコバクター  ピロリの標準菌株（ＡＴＣＣ４３５０４）は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；バージニア州ナマサス）から購入し、本明細書に示す実験に使用した。さらに細胞増殖評価に使用した細菌株は、次の通りである：ＡＴＣＣから購入したヘリコバクター  ピロリ（ＡＴＣＣ４３５２６）及びヘリコバクター  ピロリの臨床的単離物（＃７４９、＃７５０、＃７５１）、大腸菌（Escherichia  coli）、緑膿菌（Pseudomonas  aeruginosa）、肺炎桿菌（Klebsiella  pneumoniae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）、Ｉ−レンサ球菌（I-Streptococcus）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus  pneumoniae）。全ての臨床的単離物は、信州大学医学部附属病院臨床検査部で確認されたものである。
【０１４２】
α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３、及びα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ４３の製造
１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したα−ＭＥＭ培地中で、ＣＭＰ−シアル酸トランスポーター欠損の突然変異体チャイニーズハムスター卵巣・Ｌｅｃ２細胞（Deutscherら、Cell 39;295,1984参照、参考文献としてここに示す）を、培養した。ＣＤ４３の細胞外ドメイン全体を含むＤＮＡ断片（アミノ酸残基の２０番目から２５４番目）をＰＣＲ法で増幅し、ＩｇＰリーダー・ペプチドと、それに続くｍｙｃエピトープ、及び（Ｈｉｓ）６をエンコードするｐＳｅｃＴａｇ２ベクター（インビトロジェン社製；カリフォルニア州カールズバッド）にサブ・クローニングした（ｐＳｅｃＴａｇ２−ｓＣＤ４３）。次に、Ｃ２ＧｎＴ−ＩをエンコードするｃＤＮＡ（Bierhuizen、Fukuda、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA89:9326,1992参照、参考文献としてここに示す）と、α４ＧｎＴをエンコードするｃＤＮＡ（Nakayamaら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA96:8991,1999参照、参考文献としてここに示す）と、可溶性ＣＤ４３をエンコードするｃＤＮＡと、ポリオーマ・ウイルス  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原をエンコードするｃＤＮＡとを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ（登録商標、インビトロジェン社製）を用いて前記Ｌｅｃ２細胞にトランスフェクトさせた。ポリオーマ・ウイルス  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原により、前記トランスフェクトされたＬｅｃ２細胞は、効率よく組換え型タンパク質を産生した（Bierhuizen,Fukuda、前出,1992）。
【０１４３】
前記α４ＧｎＴのｃＤＮＡを組み込んでいないｐｃＤＮＡＩベクター（インビトロジェン社製）を用いて、Ｏ−グリカンのコア２分岐に末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ４３を調製し、コントロール測定用とした。一週間後、ＣＥＮＴＲＩＰＲＥＰ  ＹＭ３０フィルター（ミリポア社製：マサチューセッツ州ベッドフォード）を用いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したα−ＭＥＭ培地中に投入した可溶性ＣＤ４３を濃縮し、測定用とした。前記調製した末端α−１，４−結合−ＧｌｃＮＡｃを有する可溶性ＣＤ４３の活性は、前記ＧｌｃＮＡｃα残基に特異的なＨＩＫ１０８３抗体（関東化学社製、Ishiharaら、Biochem.J.318:409,1995参照、参考文献としてここに示す）を用いて市販のＥＬＩＳＡキットにより測定し、発色反応にはＥＬＩＳＡ  ＥＬＡＳＴ増幅システム（パーキン
エルマー社製；マサチューセッツ州ボストン）を用いた。この分析において、１ユニットは製造元の指示に従いｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−α−グルコサミニド（ＧｌｃＮＡｃα−ＰＮＰ）の１ｍｇ（２．９Ｔｍｏｌ）に相当する免疫反応力と定義した。これらの組換え体のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質分析（ピエルス社製；イリノイ州ロックフォード）を用いて測定した。同様に、ｐＳｅｃＴａｇ２−ｓＣＤ４３に代えて可溶性ＣＤ３４−ＩｇＧキメラをエンコードするｐｃＤＮＡ３−ＣＤ３４−ＩｇＧ（Yehら、Cell  104:957,2001参照、参考文献としてここに示す）を用いて、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ３４タンパク質と、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ３４タンパク質とを調製した。
【０１４４】
細胞増殖試験
微量液体希釈法（Piccolominiら、J.Clin.Microbiol.35:1842,1997参照、参考文献としてここに示す）により、１０％ウマ血清を添加したブルセラ培地（ベクトン  ディッキンソン  マイクロバイオロジー  システムズ社製；メリーランド州スパークス）でヘリコバクター  ピロリを前培養した。続いて９６穴のプレート中、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ３４又は末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ３４の種々の量を含む、５％ウマ血清を添加したブルセラ培地で、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した細菌を３５℃、１５％ＣＯ２の環境下で４日間培養した。細菌増殖は、ＯＤ６００ｎｍの条件下、マイクロプレート分光光度計ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  ＰＬＵＳ３８４（モレキュラーデバイス社製；カリフォルニア州サニーベール）を用いて測定した。また、前記ブルセラ培地に代えて、微量液体希釈法のミューラーヒントン培地（栄研化学社製、東京都）を使用した以外は、前記の方法と同様にして最小発育阻止濃度を測定した。
【０１４５】
細胞運動性試験
３１．２ｍＵ／ｍｌの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３又は同じタンパク質濃度の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しないＣＤ４３含有するブルセラ培地を用いてヘリコバクター  ピロリを３日間培養した。培養したヘリコバクター  ピロリの細胞運動性を、レーザー共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ（カルル  ツァィス社製；ドイツ国ジェナ）を用いて、１秒間隔で低速度写真を撮影し、評価した。
【０１４６】
走査電子顕微鏡
３１．２ｍＵ／ｍｌの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３又は同じタンパク質濃度の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しないＣＤ４３を含有するブルセラ培地を用いてヘリコバクター  ピロリを３日間培養した。培養したヘリコバクター  ピロリを走査電子顕微鏡ＪＳＭ−６３６０ＬＶ（日本電子社製；東京都）を用いて加速電圧１５ｋＶの条件で観察し、走査電子顕微鏡写真を撮影した。
【０１４７】
質量分析によるＣＧＬの検出
１０％ウマ血清を添加したブルセラ培地でヘリコバクター  ピロリを前培養した後、５％ウマ血清と、４．０ｍＵ／ｍｌの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３又は同じタンパク質濃度の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しないＣＤ４３とを含有するブルセラ培地を用いて、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌの微生物を３５℃で２日間培養した。培養したヘリコバクター  ピロリを回収し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄した後、１ｍｌの蒸留水で再度懸濁した。毎分６，０００回転で１０分間遠心した後、得られた脂質画分を、２ｍｌのクロロホルム・メタノール混合液（２：１）を用いて４℃で一晩かけて抽出し、抽出液をろ紙でろ過して、窒素気流で乾燥させた。得られた脂質試料を４ｍｌのクロロホルム・メタノール混合液（２：１）に溶解させ、Ｆｏｌｃｈらの方法（J.Biol.Chem.226:497,1957参照、参考文献としてここに示す）に準じ、混合液に１ｍｌの水を添加した。得られた混合液の下相を試験管中、窒素気流で乾燥させ、１ｍｌの０．５Ｎ水酸化ナトリウム・メタノール溶液により５０℃で１時間の処理し、処理液を６Ｎ塩酸水溶液で中和した後、１ｍｌの石油エーテルを添加した。
【０１４８】
上相を除去した後、さらに２ｍｌの石油エーテルを下相に添加した。下相を乾燥させた後、１ｍｌのクロロホルム・メタノール・水（８６：１４：１）の混合液（ＴＬＰ）に溶解させ、同じ反応管に０．５ｍｌの別のクロロホルム・メタノール・水（３：４８：４７）混合液（ＴＵＰ）を添加した。得られた混合液の下相を回収し、窒素気流で乾燥させ、５０μｌのクロロホルムに溶解させた。次に、この試料の１μｌに、１μｌの２，５−ジヒドロキシ安息香酸、又は１μｌのｔｒａｎｓ−３−インドールアクリル酸を添加し、これをマトリックスとして用いた。陽イオンモード又は負イオンモードでのＣＧＬの質量スペクトルは、ＤＥ  マトリックス支援イオン化−飛行時間型質量分析（ＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）装置のＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＰＥ  アプライド  バイオシステムズ社製；カリフォルニア州フォスターシティ）を用い、前記のようにリフレクターモード、レーザー強度２３００の条件で測定した（Taketomi,Sugiyama、Meth,Enzymol.312:80,2000参照、参考文献としてここに示す）。ヘリコバクター  ピロリ中に内生発現するホスファチジン酸（Inamotoら、前出,1993）を内部基準とし、２点外部較正を行った。
【０１４９】
超音波処理したヘリコバクター  ピロリによるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＧＬ合成
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＣＧＬ合成は、前記で示したように変異体を用いて分析した（Warneckeら、J.Biol.Chem.274:13048,1999参照、参考文献としてここに示す）。すなわち、１０％ウマ血清を添加したブルセラ培地でヘリコバクター  ピロリを前培養した。次に、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した細菌を、５％ウマ血清を添加したブルセラ培地を用いて３５℃で２日間培養した。培養した２ｍｌのヘリコバクター  ピロリ（５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌを毎分６，０００回転で１０分間遠心し、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋を含まないＰＢＳで３回洗浄した。その後１００ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．５）と、１５％グリセロールと、５ｍＭのＤＴＴと、２００ＴＭのＰＥＦＡＢＬＯＣプロテアーゼ阻害剤（メルク社製；ドイツ国ダルムスタッド）と、０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームとを含有する反応緩衝液１ｍｌ中にヘリコバクター  ピロリを懸濁させ、２０℃で５分間培養した。これらのサンプルを氷浴上で超音波ウォーターバスにて３０秒間隔で３０秒間の超音波処理を１０回行った。
【０１５０】
次に、超音波処理したヘリコバクター  ピロリの８０μｌと、８ｍＭコレステロールのエタノール溶液５μｌと、７．２μＭのＵＤＰ−グルコース５μｌと、１μｌのＣＦ−５４と、９μｌの反応緩衝液又は５．０ｍＵの末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３又は同じタンパク質濃度の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しないＣＤ４３を含有する同様の緩衝液とを含有する１００μｌの反応混合液を、３０℃で３時間培養した。その後、０．４５％のＮａＣｌ溶液９００μｌ、及びクロロホルム・メタノール混合液（２：１）の４ｍｌを添加して反応を停止させた。その混合液の下相をろ過し、窒素気流下で乾燥させた。その後、乾燥して得られた試料を前記で示した方法と同様にして連続処理した。陽イオンモードでのＣＧＬの質量スペクトルは、ＤＥ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装置のＶｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（アプライド  バイオシステムズ社製）を用い、リフレクターモード、レーザー強度２５００の条件で、前記の方法（Taketomi, Sugiyama、前出,2000）で測定した。なお２点外部較正を行った。
【０１５１】
コレステロール存在下、又はコレステロール非存在下でのヘリコバクター  ピロリの培養
１０％ウマ血清を添加したブルセラ培地でヘリコバクター  ピロリを前培養した。次に、５％ウマ血清を添加したブルセラ培地で、１×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌに希釈した細菌を４０時間培養し、その後、標準培養条件下で、０．００５％コレステロールを含み又はコレステロールを含まないウマ血清除去ブルセラ培地（ＴＬＣ分析用）と、０．００５％コレステロールを含んでいるか又はコレステロールを含まないＦ−１２培地（細胞増殖分析用）とで、１×１０７ｃｅｌｌのヘリコバクター  ピロリを５〜２１日間培養した。Ｆ−１２培地での培養では、培地体積の半分量を注意深く除去し、除去した培地と同体積量の新鮮な培地で置き換えるという作業を２〜３日おきに２１日間繰り返した。
【０１５２】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
１×１０８ｃｅｌｌのヘリコバクター  ピロリからクロロホルム−メタノール混合液（２：１）を用いて室温で１時間かけて糖脂質の分画を抽出し、窒素気流で乾燥させ、クロロホルム−メタノール−水（１６：６：１）混合液を用いて（８）で示したようにしてＴＬＣを行った。単離した糖脂質は、オルシノール含有硫酸緩衝液を用い１１０℃で、目視できるように発色させた。
【０１５３】
ヘリコバクター  ピロリと、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを安定に発現するＡＧＳ細胞との共生培養
末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを安定に発現する胃腺癌ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞を、前記の方法（Nakayamaら、前出,1999）で製造した。ＡＧＳ−Ｉ４ＧｎＴ細胞とＭｏｃｋ−トランスフェクトしたＡＧＳ細胞とを、１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌのヘリコバクター  ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）と共に２４時間、共培養した。２０％の緩衝ホルマリンで固定した後、ヘリコバクター  ピロリに対するウサギ・ポリクローナル抗血清（ダコ社製；デンマーク国グロストラップ）と、マウス・モノクローナルＨＩＫ１０８３抗体（関東化学社製；Ishiharaら、前出,1996）との混合物と共に前記細胞をインキュベートした。二次抗体として、ローダミン標識の抗ウサギ免疫グロブリン（抗ヘリコバクター  ピロリ抗体用）と、イソチオシアン酸フルオレセイン標識抗マウスＩｇＭ（ＨＩＫ１０８３抗体用）とを使用した。スライドは、ＶＥＣＴＯＲＳＨＩＥＬＤシールド溶液（ベクターラボラトリーズ社製；カリフォルニア州ブーリンガム）で封入し、レーザー共焦点顕微鏡ＬＳＭ５１０  ＭＥＴＡ（カルル  ツァィス社製）を用いて観察した。
【０１５４】
結果
本明細書に示したように、培養時のヘリコバクター  ピロリに対する効果を調べるために、α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するムチン型糖タンパク質を調製した。前記のように、ＣＤ４３（ロイコシアリン）は前記Ｏ−グリカンの優先的コアタンパク質としての役割を果たす。ヘリコバクター  ピロリのＯ−グリカンのサブセットの活性を調べるために、α１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（α４ＧｎＴ；Nakayamaら、前出,1999）のｃＤＮＡと、コア２β１，６−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素−Ｉ（Ｃ２ＧｎＴ−Ｉ；Bierhuizen,
Fukuda、前出,1992）のｃＤＮＡと、可溶性ＣＤ４３のｃＤＮＡとでトランスフェクトすることによって、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンを含む組換え型の可溶性ＣＤ４３を、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に発生させた。コントロールとして、α４ＧｎＴｃＤＮＡを使用しないこと以外は前記と同様の方法でＣＨＯにトランスフェクトして、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ４３を製造した。
【０１５５】
異なる量の組換え型可溶性ＣＤ４３を含む培地でヘリコバクター  ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）をインキュベートした。最初の２．５日間での微生物の増殖は、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基の有無に関係なくごくわずかであり（図２Ａ）、これはヘリコバクター  ピロリの増殖の遅滞期の特徴である。培養が３日を超えると増殖期に入り、微生物は急速に増殖した。しかし、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３と共に細菌をインキュベートした場合は、ヘリコバクター  ピロリの増殖速度が劇的に抑制された。この抑制効果は、可溶性ＣＤ４３の濃度が６２．５ｍＵ／ｍｌを超えたときに顕著となった（１ｍＵは、１μｇのｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃα−ＰＮＰ）と当量である；Warneckeら、J.Biol.Chem.274:13048,1999参照、参考文献としてここに示す）。さらに、α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを発現する可溶性ＣＤ４３が３１．２ｍＵ／ｍｌで存在する培地で培養したヘリコバクター  ピロリの運動性が、著しく抑制されることが、低速度写真からわかった（図２Ｂ）。また、電子顕微鏡写真は、ヘリコバクター  ピロリの伸び、分節狭窄、屈曲のような顕著な形態異常を示した（図２Ｃ）。
【０１５６】
末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３の阻害効果について、１５．６ｍＵ／ｍｌから１２５．０ｍＵ／ｍｌの最小阻害濃度で、別の標準菌株であるＡＴＣＣ４３５２６や、３種の臨床的単離物（Warneckeら、前出,1999）を含む種々のヘリコバクター  ピロリの菌株を用いて観察した。前記とは対照的に、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ４３と共にヘリコバクター  ピロリをインキュベートした場合は、増殖阻害効果も形態異常もみられなかった（図２）。これらの結果は、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンが、抗菌剤と同様に、ヘリコバクター  ピロリの増殖を抑制することを示している。また、ヘリコバクター  ピロリに対する同様の阻害効果は末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を結合した別のムチン様タンパク質であるＣＤ３４（Horiiら、Helicobacter  7:39,2002参照、参考文献としてここに示す）を使用した場合にも観察された。この結果は、骨格タンパク質ではなく末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基が、ヘリコバクター  ピロリに対する増殖阻害活性のために必須であることを示している。
【０１５７】
末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンによって引き起こされるヘリコバクター  ピロリの形態異常は、β−ラクタマーゼ阻害剤のような抗生物質によって引き起こされる形態異常と類似しており、多くの細菌株の細胞壁の主成分であるペプチドグリカンの生合成を妨げる（Finalyら、J.Antimicrob.Chemother.52:18,2003参照、参考文献としてここに示す；Horiiら、前出,2002）。このように、これらのＯ−グリカンがヘリコバクター  ピロリの細胞壁生合成を阻害する作用について調べた。ヘリコバクター種の細菌の細胞壁はα−コレステリルグルコシド（α−ＣＧｓ）を特徴的に有しているが、その細胞壁の主成分はコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ；Ｇｌｃα１→コレステロール）、コレステリル−６−Ｏ−テトラデカノイル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＡＧ）、コレステリル−６−Ｏ−ホスファチジル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＰＧ；Hiraiら、J.Bacteriol.177:5327,1995；Haqueら、J.Bacteriol.178:2065,1996参照、夫々参考文献としてここに示す）である。
【０１５８】
末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンがヘリコバクター  ピロリのＣＧＬ生合成を妨げるかどうかを調べるために、Ｏ−グリカン存在下で培養したヘリコバクター  ピロリ中のＣＧＬの発現レベルを分析した。末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しないＯ−グリカンを含む培地で培養したヘリコバクター  ピロリの細胞壁成分を質量分析したところ、ＣＧＬに起因する明確なシグナルが現れた（図３Ａ）。対照的に、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンを含む培地で培養したヘリコバクター  ピロリサンプルの並行分析では、ＣＧＬは顕著な抑制を示し、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しないコントロール群の２９．５％に減少した（図３Ｂ）。これらの結果は、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンが、ヘリコバクター  ピロリのｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＧＬの生合成を阻害していることを示している。
【０１５９】
α−ＣＧｓの生合成に関わる糖転移酵素の同定をはじめとしてヘリコバクター  ピロリ細胞壁の根本的な生成機構はあまり解明されていないが、ＣＧＬはおそらく、グルコース（Ｇｌｃ）をＵＤＰ−ＧｌｃからコレステロールのＣ３位に転移させるＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素によって形成されていると考えられる。超音波処理されたヘリコバクター  ピロリのＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性の発現を調べ、その発現が見られた場合は、それらの活性が末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンによって阻害されるかどうかが分かる。コレステロールとＵＤＰ−Ｇｌｃとを超音波処理したヘリコバクター  ピロリと共にインキュベートし、生成物を質量分析した。多くの量のＣＧＬが検出された（図３Ｃ）。これは、超音波処理したヘリコバクター  ピロリが酵素学的にＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を発現したことを示している。
【０１６０】
末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３を前記評価分析にかけたところ、ＣＧＬ生成は抑制された（図３Ｄ）が、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ４３を前記評価分析にかけても何の効果もみられなかった（図３Ｅ）。腺粘液細胞型ムチン中に存在するα−結合型ＧｌｃＮＡｃと、ＣＧＬ中に存在するα−結合型Ｇｌｃとの構造的類似性を考慮すると、これらの結果は、α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基がＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素のドナー基質のためにＵＤＰ−Ｇｌｃと互いに競合し、又はα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基が最終生成物を阻害するメカニズムによって直接的にＵＤＰ−Ｇｌｃ：ステロール糖転移酵素活性を阻害する（Nakayamaら、J.Biol.Chem.271:3684,1996参照、参考文献としてここに示す）ことによって、ＣＧＬの生合成を減少させていることを示している。
【０１６１】
コレステロールはＣＧＬの前駆体である。しかし、コレステロールの生合成に関係する遺伝子はヘリコバクター  ピロリのゲノムデータベースにはみられない（Tombら、Nature 388:539,1997；Maraisら、Microbiol.Mol.Biol.Rev.63:642,1999）。よって、ヘリコバクター  ピロリは外因性のコレステロールが存在しない状態ではＣＧＬを合成できないかもしれない。コレステロールが存在しない培地でヘリコバクター  ピロリを５日間培養した場合、微生物の細胞増殖はコレステロール存在下で培養した場合の約５０％のレベルにとどまった（以下の表１参照）。コレステロール非存在下での培養において、運動性微生物は検出されず、形態異常、特にヘリコバクター  ピロリの伸長がはっきりとみられた（図２Ｃで示したものと同様）。コレステロールが存在しない培地でヘリコバクター  ピロリをさらに２１日目まで培養すると、微生物は完全に死滅した。対照的に、コレステロールを補充した培地でヘリコバクター  ピロリを培養した場合、細胞はよく増殖し形態異常の兆候はみられなかった（表１）。これらの結果は、ヘリコバクター  ピロリの生存のために、外因的に補給されたコレステロールによるＣＧＬの合成が必須であることを、示している。
【０１６２】
【表１】
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【０１６３】
ヘリコバクター  ピロリの標準菌株（ＡＴＣＣ４３５０４）の１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌを３５℃の標準嫌気性条件下で、０．００５％のコレステロールを補充したＨａｍ'ｓ  Ｆ−１２培地で５日間、及びコレステロールを含まない培地で２１日間、夫々インキュベートした。ＣＦＵはコロニー形成ユニットである。
【０１６４】
コレステロールを含み、又は含まない培地で培養したヘリコバクター  ピロリのＣＧＬ発現レベルを調べるために、ヘリコバクター  ピロリの糖脂質分画のＣＧＬを含むα−ＣＧｓの発現過程をＴＬＣにより分析した。コレステロール存在下で培養したヘリコバクター  ピロリでは、ヘリコバクター  ピロリの特徴であるＣＧＬを含むα−ＣＧｓの典型的な三本線が検出された（図４、レーン２）。しかしコレステロール非存在下で培養したヘリコバクター  ピロリでは、α−ＣＧｓは検出されなかった（図４、レーン１）。これらの結果を合わせると、これらの結果は、ＣＧＬがヘリコバクター  ピロリ細胞増殖に必須であること、また末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンはＣＧＬの生合成を阻害するためヘリコバクター  ピロリに対して抗菌活性を有することを、示している。さらに、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンの抗菌活性は、ＣＧＬを発現する細菌の菌株に限定されるのかもしれない。実際に、ヘリコバクター  ピロリ以外の菌株やＣＧＬ欠損菌株（例えば大腸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、黄色ブドウ球菌、α−レンサ球菌、肺炎レンサ球菌）を末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３存在下でインキュベートしても、抗菌効果はみられなかった。
【０１６５】
前記の結果は、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンを発現する粘液細胞は、ヘリコバクター  ピロリ感染から自分自身を保護していることを示している。この効果を確認するため、胃腺癌ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞をα４ＧｎＴ  ｃＤＮＡに安定にトランスフェクトし（Nakayamaら、前出,1999）、ヘリコバクター  ピロリ感染による細胞の損傷を調べた。ヘリコバクター  ピロリと共にインキュベートしてＭｏｃｋ−トランスフェクトされた細胞は、細胞の扁平や萎縮のような顕著な荒廃を示した（図５矢印参照）。対照的に、ヘリコバクター  ピロリと共に培養したＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞ではごくわずかな損傷しか観察されなかった（図５）。これらの結果から、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するムチン型Ｏ−グリカンを発現する細胞はヘリコバクター  ピロリ感染に対して抗力を示すことがわかった。
【０１６６】
グリカン鎖は、細胞間相互作用における細胞表面レセプターのリガンドとして（Lowe,Cell  104:809,2001；Akamaら、Science  295:124,2002；Perilloら、Nature  378:736,1995）、またレセプターや粘着タンパク質のモジュレーターとして（Moloneyら、Nature  406:369,2000；Demitriouら、Nature  409:733,2001；Nakayamaら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA  92:7031,1995）、種々の役割を果たしている。これらの結果は、哺乳類のグリカンが天然抗菌剤としても機能することを示している。末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンはヒト胃腺粘液細胞により生成される。そのためこれらの結果は、副作用を引き起こすことなくヒトへのヘリコバクター  ピロリ感染を予防及び治療する新規な医薬品を開発できるという、根拠となるものである。
【０１６７】
前記の実施例を参照しながら本発明を説明したが、本発明の本質や技術的範囲には、その改良や差異も包含される。したがって、本発明は、特許請求の範囲により定められるものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、通常のヒトの胃壁の断面概略図であって、ＧＯＣＴＳで表面のムチンを染色し、ＰＣＳ染色剤により染色されたα１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を示すものである。
【０１６９】
【図２】図２Ａから図２Ｃは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンがヘリコバクター  ピロリの増殖と運動性とを抑制することを示すものである。
【０１７０】
図２Ａは末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを有する（αＧｌｃＮＡｃ（＋））可溶性ＣＤ４３、及び末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを有しない（αＧｌｃＮＡｃ（−））可溶性ＣＤ４３を用いて培養したヘリコバクター  ピロリの増殖曲線を示す。αＧｌｃＮＡｃ（＋）の１ミリユニット（ｍＵ）が、ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−α−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃα−ＰＮＰ）の１Ｔｇと等量の免疫反応性として定義される。αＧｌｃＮＡｃ（−）のタンパク質濃度は、αＧｌｃＮＡｃ（＋）の１２５．０ｍＵ／ｍｌでのタンパク質濃度と同等であった。
【０１７１】
図２Ｂは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを有する（αＧｌｃＮＡｃ（＋））可溶性ＣＤ４３の３１．２ｍＵ／ｍｌ、又は同タンパク質濃度の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを有しない（αＧｌｃＮＡｃ（−））可溶性ＣＤ４３を用いて、３日間培養したヘリコバクター  ピロリの運動性を１秒間隔で経時的に記録した図を示す。典型的なヘリコバクター  ピロリを矢印で示している。αＧｌｃＮＡｃ（＋）の存在下で培養された７個のヘリコバクター  ピロリの平均速度は３．１±３．５μｍ／ｓｅｃ（平均±標準偏差）であり、αＧｌｃＮＡｃ（−）の存在下で培養された７個のヘリコバクター  ピロリの平均速度は２１．２±２．６μｍ／ｓｅｃであり、スチューデントｔ検定による有意性は、Ｐ＜０．００１であった。スケールバーは５０μｍである。
【０１７２】
図２Ｃは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを有する（αＧｌｃＮＡｃ（＋））可溶性ＣＤ４３の３１．２ｍＵ／ｍｌ、又は同タンパク質濃度の末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃを有しない（αＧｌｃＮＡｃ（−））可溶性ＣＤ４３を用いて、３日間培養したヘリコバクター  ピロリの走査電子顕微鏡写真である。αＧｌｃＮＡｃ（＋）で培養されたヘリコバクター  ピロリは伸び、分節狭窄、屈曲などの形態異常がみられた。写真はすべて等倍率で撮影したものであり、スケールバーは１Ｔｍを示す。
【０１７３】
【図３】図３Ａから図３Ｅは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３が、ヘリコバクター  ピロリのｉｎ  ｖｉｖｏでのコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ＣＧＬ）の生合成（図３Ａ、図３Ｂ）と、同様なヘリコバクター  ピロリのｉｎｖｉｔｒｏでの生合成（図３Ｃ〜図３Ｅ）とを阻害することを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ｍａｓｓ）で測定した結果を示す図である。
【０１７４】
図３Ａは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ４３を用いて培養したヘリコバクター  ピロリの分画液中、ｍ／ｚ５７１．６の位置にナトリウム付加ＣＧＬ{Ｍ＋Ｎａ}＋が検出されたことを示す（矢印）ものである。
【０１７５】
図３Ｂは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３の４．０ｍＵ／ｍｌを用いて培養した試料のＣＧＬを同様に測定した結果を示す。内部標準としてホスファチジン酸（Inamotoら、J.Clin.Gastroenterol. 17:S136,1993参照、参考文献としてここに示す）に対するＣＧＬの相対量は対照実験（図２Ａ矢印）の２９．５％まで顕著に減少している。２回測定した平均値を示してある。
【０１７６】
図３Ｃは、超音波処理したヘリコバクター  ピロリによってＵＤＰ−グルコース及びコレステロールから生合成された生成物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ｍａｓｓの測定結果を示す。ＣＧＬ{Ｍ＋Ｎａ}＋がｍ／ｚ５７１．６の位置が現れている。
【０１７７】
図３Ｄは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有する可溶性ＣＤ４３の５０．０ｍＵ／ｍｌの存在下で、超音波処理したヘリコバクター  ピロリによってＵＤＰ−グルコース及びコレステロールから生合成された生成物の質量分析の結果を示す。この条件下では、ＣＧＬのピークは検知できなかった。
【０１７８】
図３Ｅは、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有しない可溶性ＣＤ４３の存在下で、超音波処理したヘリコバクター  ピロリによってＵＤＰ−グルコース及びコレステロールから生合成された生成物の質量分析の結果を示す。この条件下でＣＧＬは合成されていた。
【０１７９】
【図４】図４は、コレステロール非存在下で培養したヘリコバクター  ピロリにＣＧＬが存在しないことを示す図である。コレステロールを含まないブルセラ培地（レーン１）又は０．００５％のコレステロールを含むブルセラ培地（レーン２）で培養したヘリコバクター  ピロリの１×１０８個から抽出した全糖脂質を薄層クロマトグラフィーで分析した。使用した溶媒系はクロロホルム・メタノール・水混合液（１６：６：１）であり、糖脂質は、オルシノール硫酸緩衝液を用いて呈色させた。ＣＡＧはコレステリル−６−Ｏ−テトラデカノイル−α−Ｄ−グルコピラノシド；ＣＧＬはコレステリル−α−Ｄ−グルコピラノシド；ＣＰＧはコレステリル−６−Ｏ−ホスファチジル−α−Ｄ−グルコピラノシドである。
【０１８０】
【図５】図５は、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基を有するＯ−グリカンが、胃腺癌細胞をヘリコバクター  ピロリによる細胞損傷から保護していることを示すものである。ＡＧＳ細胞に付着した多くのヘリコバクター  ピロリはベクターのみにトランスフェクトされ、細胞の平面化や縮小のような細胞損傷がみられた（矢印）。一方、ＡＧＳ−α４ＧｎＴ細胞に不完全に付着したヘリコバクター  ピロリはα４ＧｎＴに安定にトランスフェクトされ、細胞損傷はみられなかった。抗ヘリコバクター  ピロリ抗体（赤）と、末端α１，４結合−ＧｌｃＮＡｃ残基特異的のＨＩＫ１０８３抗体（緑）（Ishiharaら、Biochem.J.318:409,1996参照、参考文献としてここに示す）とによりＡＧＳ細胞を二重の免疫組織化学的により示す図である。同じ領域のノマルスキー顕微鏡写真を図５下段に示す。スケールバーは５０Ｔｍである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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