(57)【要約】  誘導体は、出発原料、通常、還元性末端にシアル酸を有するポリサッカライドから合成され、ここで、還元性末端ユニットは、アルデヒド基に変換される。ポリサッカライドが非還元性末端にシアル酸ユニットを有する場合、それは、例えば、ヒドロキシル置換された部分に変換されることにより、不動態化され得る。該誘導体は、例えばアミンまたはヒドラジン基を含む基質と反応し得、非架橋ポリシアル化化合物を形成する。該基質は、例えば、治療的に有用な薬物、ペプチドまたはタンパク質、あるいは、ドラッグデリバリーシステムであり得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元性末端にシアル酸ユニットを有する出発原料が、以下の連続するステップ：
ａ）還元性末端シアル酸ユニットの環を還元的開環し、それによってビシナルジオール基を形成するための還元；及び
ｂ）ビシナルジオール基を酸化してアルデヒド基を形成するための選択的酸化
に供される、シアル酸のアルデヒド誘導体の製造方法。
【請求項２】
還元性末端のシアル酸ユニットが、第８炭素原子を介して隣接するユニットと結合し、それによって、ステップｂ）において、第６，７ビシナルジオール基が酸化され、第７炭素原子でアルデヒドを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
出発原料が、ビシナルジオール基を有する非還元性末端において、末端サッカライドユニットを有し、そして、該出発原料を、ステップａ）より前に、ビシナルジオール基をアルデヒドに酸化するために選択的に酸化する予備ステップに供し、それによって、ステップａ）において、アルデヒドも還元され、ビシナルジオール基の一部ではないヒドロキシ基を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
非還元性末端におけるサッカライドユニットがシアル酸ユニットである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
出発原料がジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドである、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
ポリサッカライドが、実質的にシアル酸ユニットのみからなるポリシアル酸である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリサッカライドが、少なくとも２、好ましくは少なくとも５またはさらに好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０のシアル酸ユニットを分子中に有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予備酸化ステップが、実質的にポリサッカライド鎖の中間鎖(mid-chain)の開裂がないような条件下で行われる、請求項２及び請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
予備酸化ステップが、水溶液中で、１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲の過ヨウ素酸塩の存在下、３〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）が、出発原料のペンダントカルボキシル基が還元されない条件下で行われる、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）が、水溶液中で、１μＭ〜０．１Ｍの濃度範囲のボロヒドリドの存在下、６．５〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アルデヒド誘導体が、第１級アミン基またはヒドラジド基を有する基質と反応する、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
生成物が還元される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
基質が、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
基質が、ぺプチド治療剤(peptide therapeutic)である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
基質が、アミンまたはヒドラジド基及び官能基に結合する官能基置換基及び二塩基性有機基を有する化合物である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
生成物を、次にチオール基を有する化合物、好ましくはタンパク質と反応させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
基質が、ドラッグデリバリーシステム、細胞、好ましくは微生物の細胞または動物細胞、ウィルスまたは合成高分子である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのシアル酸ユニットを含むジ−、オリゴまたはポリ−サッカライドのアルデヒド誘導体である化合物であって、ここで、還元性末端の末端ユニットが、アルデヒド部分を含み、基または、ここで、Ｒは、
【化１】
2007501889.tif 000018
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１、ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１及びＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１から選択され、ここでＲ１はＨ、Ｃ１−２４アルキル、アリールＣ２−６アルカノイル、あるいは、リシン残基のＮ末端またはγ−アミン基によって結合するポリペプチドまたはタンパク質、ドラッグデリバリーシステムである、または、スルフヒドリル基との反応に適応した官能性置換基を有する有機基である、化合物。
【請求項２０】
化合物が、非還元性末端に不動態化されたユニットを有する、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
一般式Ｉ
【化２】
2007501889.tif 000019
ここで、Ｒ３及びＲ４が、
ｉ）Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＯＨである
ii）ＲがＣＨ（ＣＨＯ）ＣＨ２ＯＨまたは−ＣＨ２ＣＨＯである場合、Ｒ３とＲ４が一緒になって＝Ｏである；
iii）ＲがＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＮＨＲ１または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１である場合、Ｒ３がＨであり、そしてＲ４が−ＮＨＲ１である；
iv）Ｒが−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１である場合、Ｒ３がＨであり、そしてＲ４が−ＮＨＮＨＲ１である；または、
ｖ）−ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１、Ｒ３とＲ４が一緒になって＝Ｎ−ＮＨＲ１である；
から選択され、
Ａｃがアセチルである、
を有する、請求項１９または２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ３がＨであり、ＲＹがＯＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
実質的に全てのサッカライドユニットがシアル酸のサッカライドユニットであり、互いに２−８、２−９または２−８／２−９交互で結合しているポリサッカライドである、請求項１９〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
ポリサッカライド鎖中に、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０のシアル酸ユニットを有する、請求項２３のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１が、タンパク質またはペプチドあるいはドラッグデリバリーシステムである、請求項１９〜２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒが、
【化３】
2007501889.tif 000020
である、請求項１９〜２５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒが、
【化４】
2007501889.tif 000021
である、請求項１９〜２５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１が、ペプチドまたはタンパク質治療剤、好ましくは抗体またはフラグメントである、請求項２５または２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ１が、基
【化５】
2007501889.tif 000022
であり、ここで、Ｒ２が、二塩基性有機基、好ましくはＣ２−１２アルカンジイル基である、請求項１９〜２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれかに記載の化合物と希釈剤とを含む組成物。
【請求項３１】
請求項２５または２８に記載の化合物と薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項３２】
非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発原料を、以下のステップ：
ｃ）非還元性末端のシアル酸ユニットを第７，８ビシナルジオール基において酸化し、第７アルデヒド(7-aldehyde)を形成するための選択的酸化ステップ；及び、
ｄ）第７アルデヒド基を対応するアルコールに還元するための還元ステップ
に供する方法。
【請求項３３】
出発原料が、ジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリサッカライドが、中鎖シアル酸ユニットを含み、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
還元ステップに続いて、還元性末端ユニットを酸化するが、非還元性末端ユニットの酸化及び還元反応において製造された部分を酸化しない酸化ステップを行う、請求項３２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
ステップｃ）酸化ステップが、水溶液中で、１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲の過ヨウ素酸塩の存在下、３〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
還元ステップｄ）が、水溶液中で、１μＭ〜０．１Ｍの濃度範囲のボロヒドリドの存在下、６．５〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項３２〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
一般式II
【化６】
2007501889.tif 000023
ここで、Ａｃがアセチルであり；
ｍが０以上であり；
Ｇｌｙ１Ｏがグリコシルであり；そして、
Ｒ５が有機基である、
を有する化合物。
【請求項３９】
Ｒ５が、Ｒが、
【化７】
2007501889.tif 000024
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１、ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１及びＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１から選択され、ここで、Ｒ１がＨ、Ｃ１−２４アルキル、アリールＣ２−６アルカノイル、あるいは、リシン残基のＮ末端またはγ−アミン基によって結合するポリペプチドまたはタンパク質、ドラッグデリバリーシステムである、または、スルフヒドリル基との反応に適応した官能性置換基を有する有機基である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｒ５が、一般式III
【化８】
2007501889.tif 000025
の基である、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
ＧｌｙＯ基が、シアル酸ユニットを含み、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなる、請求項３８〜４０のいずれかに記載の化合物。
【請求項４２】
Ｒ５が、
【化９】
2007501889.tif 000026
である、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｒ１が、ペプチドまたはタンパク質治療剤、好ましくは抗体またはフラグメントである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の化合物と薬学的賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項４５】
請求項３８〜４３のいずれかに記載の化合物と希釈剤とを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、還元性末端において基質と反応するためのアルデヒド基を有する、少なくとも末端シアルユニットを有し、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなるポリサッカライドのような化合物の誘導体及びこれらを製造する方法に関する。該誘導体は、他の反応性誘導体への転化、及び、ペプチド、タンパク質、薬物、ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム）、ウィルス、細胞、例えば、動物細胞、微生物、合成高分子等のような、アミン基含む基質への結合に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポリシアル酸（ＰＳＡｓ）は、所定の菌株により、及び、哺乳動物において所定の細胞で製造される、天然に存在するシアル酸の非分枝ポリマーである（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。それらは、制限された酸加水分解により、または、ノイラミニダーゼを用いた消化により、あるいは、天然の、細菌由来のポリマー形態の分別により、ｎ＝約８０以上のシアル酸残基から、下はｎ＝２までの様々な重合度で製造することができる。ホモポリマー形態、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１株及びグループ−Ｂ髄膜炎菌のカプセル状ポリサッカライドを含む、アルファ−２，８−結合したポリシアル酸（神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）の初期形態においても見出される）が存在するように、種々のポリシアル酸の組成も、変化する。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ９２株及びＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのグループＣポリサッカライドの、アルファ−２，８、アルファ−２，９交互のポリシアル酸のような、ヘテロポリマー形態も存在する。シアル酸は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのグループＷ１３５またはグループＹのようなシアル酸とは異なるモノマーとの交互のコポリマーにおいても、見出され得る。哺乳動物において、ポリシアル酸についてのレセプターは知られていないにもかかわらず、ポリシアル酸は、病原細菌による免疫及び補体系の回避、並びに、胎児成長期における幼若な神経のグリアの接着(glial adhesiveness)の調節（ここで、該ポリマーは抗接着機能を有する）を含む、重要な生物学的機能を有する(Muhlenhoff et al., 1998; Rutishauser, 1989; Troy, 1990, 1992; Cho and Troy, 1994)。Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１株のアルファ−２，８−結合したポリシアル酸は、「コロミン酸」としても知られており、本発明を例証するために（様々な長さで）用いられている。
【０００３】
細菌のポリサッカライド中の、ポリシアル酸のアルファ−２，８−結合形態は、ユニークに非免疫原性（哺乳類の対象において、免疫原性キャリアタンパク質に結合した場合でさえも、Ｔ−細胞または抗体の反応のいずれも誘発しない）であり、これは哺乳類の（同様に細菌の）ポリマーとしてのそのステータスを反映するのかもしれない。ポリマーのより短い形態（ｎ＝４まで）は、体内に広く分布しており、ポリシアル酸に対する免疫寛容を効果的に課し、維持すると考えられている、細胞表面ガングリオシドにおいて見出される。近年、ポリシアル酸の生物学的特性、特にアルファ−２，８−結合したホモポリマーのポリシアル酸のそれらは、タンパク質及び低分子量薬物分子の薬物動力学的特性を改良するために活用されてきた(Gregoriadis, 2001; Jain et.al., 2003; US-A-5846,951: WO-A-0187922)。ポリシアル酸の誘導体化は、カタラーゼ及びアスパラギナーゼを含む、多くの治療タンパク質についての循環半減期において、劇的な向上をもたらし(Fernandes and Gregoriadis, 1996 and 1997)、そして、そのようなタンパク質を、治療タンパク質への事前曝露の望ましくない（及び、時には避けられない）結果として生じる、以前から存在する(pre-existing)抗体に直面して用いることも可能にする。多くの点で、ポリシアリル化されたタンパク質の改良された特性は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて誘導体化されたタンパク質に匹敵する。例えば、それぞれの場合において、半減期は増大し、タンパク質及びペプチドは、タンパク質消化に対してより安定であるが、生物学的活性の維持は、ＰＥＧを用いた場合よりも、ＰＳＡを用いた場合のほうが優れていると思われる(Hreczuk-Hirst et.al., 2002)。また、ＰＥＧは、非常にゆっくりしか生物分解せず(Beranova et. al., 2000)、高分子量の形態は組織中に蓄積する傾向がある(Bendele, et al., 1998; Convers, et al., 1997)ため、ＰＥＧの、慢性的に投与しなければならない治療剤との使用については疑問がある。ＰＥＧ化されたタンパク質は、血液循環中における複合体の滞留時間にも影響を与えることができる抗ＰＥＧ抗体を生じることが見出された(Cheng et. al., 1990)。治療剤に結合され、非経口投与されるポリマーとしてのＰＥＧの確立した歴史にもかかわらず、その免疫毒性学、薬理学及び代謝についてのよりよい理解が求められるだろう(Hunter and Moghimi, 2002; Brocchini, 2003)。同様に、ＰＥＧの蓄積は毒性につながり得るため、高投与量を必要とし得る治療剤におけるＰＥＧの有用性についての懸念が存在する。従って、アルファ−２，８−結合したポリシアル酸（ＰＳＡ）は、本来人体の一部である、免疫学的に見えない(immunologically invisible)生物分解性ポリマーであり、組織のノイラミニダーゼにより、非毒性サッカライドであるシアル酸に分解される、魅力的なＰＥＧの代替物を提供する。
【０００４】
我々のグループは、以前の学術論文及び登録特許において、タンパク質治療剤の薬物動力学的特性の改善における、天然のポリシアル酸の有用性について記載した(Gregoriadis, 2001; Fernandes and Gregoriadis; 1996, 1997, 2001; Gregoriadis et. al., 1993, 1998, 2000; Hreczuk-Hirst et. al., 2002; Mital, 2003; Jain et. al., 2003, 2004; US-A-05846,951; WO-A-0187922)。今回、我々は、新規な組成物及び、ＰＳＡ誘導体化タンパク質（及び治療剤の他の形態）を製造する新規な方法をもたらす、新規なＰＳＡｓの誘導体を記載する。これらの新規な原料及び方法は、医療倫理及び監督機関（例えば、ＦＤＡ、ＥＭＥＡ）の安全要求事項のため、薬物(drug entity)の化学的及び分子的定義(definition)が非常に重要なヒト及び動物における使用を意図されるＰＳＡ誘導体化治療剤に対し、特に有用である。
【０００５】
タンパク質のような治療剤へのポリサッカライドの付着のための方法は、以前に記載された(Jennings and Lugowski 1981, US-A-5846,951 ;WO-A-0187922)。これらの方法のうちのいくつかは、タンパク質反応性アルデヒド部分を生じるための、ポリマーの「非還元性末端」の化学的誘導体化（図１）に依存する。これは、ＰＳＡ及び他のポリサッカライドの還元性末端は、結合の間のタンパク質の配座(conformation)並びにＰＳＡとタンパク質の化学的結合性(integrity)を保護するために必要な穏和な条件下で、タンパク質と弱い反応性しか示さないためである。非還元性シアル酸テクニカルユニットはビシナルジオールを含むため、過ヨウ素酸塩を用いて容易に（及び選択的に）酸化され、タンパク質に対してより反応的であり、還元アミノ化及び他の化学反応によるタンパク質の結合に好適な反応性エレメントを含むモノアルデヒド形態を生じる。我々は、これについて、ＵＳ−Ａ−５８４６，９５１；ＷＯ−Ａ−０１８７９２２に記載した。該反応は、図１中に図説され、ここで、
ａ）は、非還元性末端においてタンパク質反応性アルデヒドを形成するための、過ヨウ素酸塩を用いた、コロミン酸（Ｅ．ｃｏｌｉからの、アルファ−２，８結合ポリシアル酸）の酸化を示し、
ｂ）は、タンパク質アミノ基との安定で不可逆性の共有結合を形成するための、ソディウムシアノボロヒドリドを用いた、シッフ塩基の選択的還元を示す。
【０００６】
様々な方法で、ポリシアル酸を治療剤に結合することが記載されている(US-A-5846,951; WO-A-01879221)が、これらのうちのどれも、治療タンパク質に対するその弱い反応性のため、還元性末端を介して結合することを特に意図していない。理論上は有用反応であるにもかかわらず、ＰＳＡの還元性末端のヘミケタールとのタンパク質の反応による複合体化の許容できる収率の達成には、タンパク質の安定性につながらない反応時間を必要とする。次に、達成し得ない、または非経済的であり得る反応物濃度（ポリマー過剰の）を必要とする。それでも、この反応の効率の悪さにもかかわらず、我々は、ポリマーの(反対側の)非還元性末端において導入されたアルデヒドを介した、タンパク質との複合体を生成することを意図した複合体化反応中に、意図しない副生成物が生じることを観察した。そのような副生成物の可能性は、カタラーゼ、インシュリン及びアスパラギナーゼの発表されている研究において明らかであり(Fernandes and Gregoriadis; 1996, 1997, 2001; Jain et.al., 2003)、ここで、ポリマーの天然の(化学的に修飾されていない)形態のヘミケタールは、還元アミノ化中、低レベルの効率性（５％未満のタンパク質が誘導体化される、下記の参考例及び表１をさらに参照）でタンパク質複合体を生じる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
コロミン酸の還元性末端の反応性は、タンパク質標的に対して弱いにもかかわらず、ヒト及び動物における治療的使用について監督機関により推奨されやすい種類の化学的に定義された複合体の製造において問題となるのに充分である。弱い単官能性である天然のコロミン酸ポリマーと異なり、ＰＳＡの過ヨウ素酸塩により酸化された形態（１つの末端にアルデヒドを有し、他の末端にヘミケタールを有する）は、分子的に定義され、薬学的に許容される複合体の生成のタスクを深刻に複雑にする、生成物の複雑さを必然的に生じる（図２）。図２ａは、ポリシアリル化（もとの方法）中の副生成物の形成を示す概略図である。図２ｂは、ポリシアリル化（もとの方法）中の副生成物、特に、
i）非対称二量体；
ii）線状ポリマー；
iii）分枝状ポリマー；及び
iv）様々なより複雑な構造
の形成を示す、詳細な概略図である。
【０００８】
一見、目的の反応生成物を、図２に記載される様々な意図されたものでない生成物から精製することは、簡単な事柄のように見えるが、目的形態のうちのいくつかの物理化学的性質（サイズ電荷等）は、生成物の目的形態のそれらと非常に類似しており、実際にほとんど同一であるため、これは決して容易ではない。このことは、イオン交換クロマトグラフィー及びゲル浸透クロマトグラフィー（それぞれ、電荷及び大きさに基づいて分離する）のようなテクニックにより、反応混合物から意図された種を精製する試みを阻み、そして、多くの他の精製方法も阻むだろう。そのため、今回我々は、還元性末端の弱い反応性が有益な効果のために活用されることができ、過ヨウ素酸塩で酸化された天然コロミン酸を用いたタンパク質の還元アミノ化の確立された方法（図１）を用いた図２（ｂ）に記載される生成物の複雑さを回避する、還元性末端にシアル酸基を有するポリサッカライドのタンパク質への結合のための新規な方法の開発により、この問題を解決した。
【０００９】
Ｊｅｎｎｉｎｇｓ及びＬｕｇｏｗｓｋｉは、ＵＳ４，３５６，１７０において、予備還元ステップ後、酸化ステップを含む、活性化された還元末端ユニットを介した細菌性ポリサッカライドのタンパク質への誘導体化を記載する。彼らは、還元性末端ユニットがＮ−アセチルマンノサミン、グルコース、グルコサミン、ラムノース及びリボースである場合にこのアプローチを提案する。
【００１０】
ＥＰ−Ａ−０４５４８９８において、タンパク質のアミノ基は、グリコサミノグリカンの還元性末端糖部分の還元及び部分的酸化により製造されたアルデヒド基に結合する。この方法で処理されるグリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、及びデルマタン硫酸を含む。これらの化合物のいずれも、還元性末端にシアル酸ユニットを有さない。
【００１１】
本発明において、還元性末端にシアル酸ユニットを有する出発原料が、
ａ）還元性末端シアル酸ユニットの環を還元的開環し、それによってビシナルジオール基を形成するための還元；及び
ｂ）ステップａ）で形成されるビシナルジオール基を酸化してアルデヒド基を形成するための選択的酸化
の連続するステップに供される、シアル酸化合物のアルデヒド誘導体を生産する新規な方法が提供される。
【００１２】
出発原料は、好ましくはジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドであるが、本発明は他の出発原料に対して有用性を有し得る。
【００１３】
本発明の方法において使用される出発原料は、好ましくは、隣接するユニットに第８炭素原子を介して結合する還元性末端にシアル酸ユニットを有するべきである。ステップｂ）において、６，７−ジオール基は酸化され、第7炭素原子でアルデヒドを形成する。
【００１４】
代替の実施形態において、還元性末端のシアル酸ユニットが隣接するユニットに第９炭素原子を介して結合する場合、ステップｂ）において、第７，８ジオール基が形成され、そして酸化され、第８炭素原子でアルデヒドを形成する。
【００１５】
本発明の方法において、出発原料がジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドである場合、出発原料は、ビシナルジオール基を有する非還元性末端において末端サッカライドユニットを有するのが好ましく、該方法において、出発原料は、ステップａ）の前に、ビシナルジオール基をアルデヒドに酸化するための選択的酸化の予備ステップに供され、それにより、ステップａ）において、アルデヒドも還元され、ビシナルジオール基の一部でないヒドロキシ基を形成する。本発明は、出発原料の還元性末端の末端ユニットがシアル酸ユニットである場合に特に有用である。代替の実施形態において、出発原料は、出発原料の非還元性末端サッカライドユニットでステップａ）に対してそれ自体を保つビシニナルディド(vicininaldid)基を有し得る。それは、還元ステップによっては修飾されないだろうが、酸化ステップにおいて酸化され、アルデヒド基を形成するだろう。生成物は二官能性であり、基質上の好適な官能基と両方のアルデヒド基における反応によって基質を架橋する能力に由来する有用な治療活性を有し得る。
【００１６】
本発明の第二の側面によれば、非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発原料を、以下のステップに供する新規な方法が提供される：
ｃ）非還元性末端のシアル酸ユニットを第７，８ビシナルジオール基において酸化し、第７アルデヒドを形成するための選択的酸化ステップ；及び、
ｄ）第７アルデヒド基を対応するアルコールに還元するための還元ステップ。
【００１７】
本発明のこの側面は、不動態化された非還元性末端を有し、その後の反応のために還元性末端の活性化を可能にするシアル酸誘導体を提供する。活性化は、アルデヒド基を他の基に転化する、任意の後続のステップ（アミンを形成するためのアミノ化のような）を有する還元／酸化方法（例えば、本発明の第一の側面の）であり得る。還元性末端を活性化するための他のステップは、工夫され得る。
【００１８】
好ましくは、本発明のこの第二の側面は、出発原料が還元性末端ユニットを有し、後にそのユニットを介して他の分子に結合することを要求される方法の一部である。そのような方法において、還元性末端ユニットは、通常、例えば、もし不動態化プロセスがなかったならば、ある割合のシアル酸非還元性末端ユニットが活性化されていたであろう反応により、活性化される。そのような反応は、例えば、ビシナルジオール部分の選択的酸化であり、ステップｄ）の後に行われる。
【００１９】
本発明において、好ましいポリサッカライド出発原料は、分子中のシアル酸とは異なるユニットを含み得る。例えばシアル酸ユニットは、他のサッカライドユニットで代替し得る。しかしながら、好ましくは、ポリサッカライドは実質的にシアル酸のユニットのみからなる。好ましくは、それらは、２→８及び／または２→９結合する。
【００２０】
好ましくは、好ましいポリサッカライド出発原料は少なくとも２、より好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、例えば少なくとも５０のサッカライドユニットを有する。例えば、ポリサッカライドは、少なくとも５のシアル酸ユニットを含み得る。
【００２１】
ポリシアル酸は、任意のソース、好ましくは、細菌ソース（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１またはＫ９２、グループＢ髄膜炎菌）、または牛乳、またはＮ−ＣＡＭのような天然のソースから得られ得、該シアル酸ポリマーは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓのグループ１３５またはグループＶのようなヘテロ多量体ポリマーであり得る。
【００２２】
ポリシアル酸は、塩または遊離酸の形態であり得る。それは、細菌ソースから回収後、分子量が低減されるような加水分解された形態であり得る。ポリシアル酸は、１．３以上、例えば２程度またはそれ以上の多分散性を有するような広範囲の分子量を有する材料であり得る。好ましくは、分子量の多分散性は、１．２未満、例えば１．０１である。
【００２３】
広い分子量分布を有するポリシアル酸の集団は、より低い多分散性を有する画分、即ち異なる平均分子量を有する画分へ、分画され得る。分画は、好ましくは、溶出のために好適な塩基性バッファーを用いたアニオン交換クロマトグラフィーである。我々は、好適なアニオン交換媒体ｉ）第４級アンモニウムイオンペンダント基（即ち、強塩基）を有する、活性化されたアガロースに基づく強イオン交換体のようなプレパラティブ媒体を見出した。溶出バッファーは、非反応性であり、所望の生成物を各画分の塩基から蒸発によって回収し得るように、好ましくは揮発性である。好適な例は、トリエタノールアミン(trethanolamine)のようなアミンである。回収は、例えば、凍結乾燥であり得る。該分画方法は、誘導体に対してと同様に、ポリシアル酸出発原料について好適である。該技術は、本発明の必須のプロセスステップの前または後に、このように適用し得る。
【００２４】
イオン交換クロマトグラフィーを、約５ｋＤａより上の分子量を有するイオン性ポリサッカライド、特にそのような分子量のポリシアル酸の、分子量に基づいた分画に適用したのはこれが初めてであると考えられる。本発明のさらなる側面によれば、イオン化可能なポリサッカライドのポピュレーションを、溶出バッファーに好ましくは揮発性の塩基または酸を用いたイオン交換クロマトグラフィーを用いて５ｋＤａより高い分子量で分画する方法が提供される。好ましくは、ポリサッカライドはカルボン酸基を有し、イオン交換はアニオン交換である。好ましくは、溶出バッファーはアミンを含み、さらに好ましくはトリエタノールアミンを含む。最も好ましくは、ポリサッカライドは凍結乾燥により画分から回収される。この方法は、他の反応性部分（マレイミドまたはヨードアセタート等）並びに他の天然（例えば、硫酸デキストラン）及び合成（例えば、ポリグルタミン酸；カチオン交換クロマトグラフィーよる後のケースにおけるポリリシン）の荷電ポリマーを有するＣＡの分画に適用することができる。さらに、ＩＥＣを、イオン化されたポリサッカライドを分離するために、沈殿技術及び／または限外濾過法と組み合わせて用いたのも初めてであると考えられる。該ＩＥＣ方法は、市販のＰＳＡｓ及びＣＡｓ中に残存する、エンドトキシンのような生成の副生成物を除去することが見出された。
【００２５】
予備酸化ステップ及びステップｃ）における選択的酸化は、好ましくは、実質的に、長鎖（高分子量の）出発原料のバックボーンの中鎖(mid-chain)の開裂がなく、実質的に分子量の減少がないような条件下で行われべきである。このステップを行なうことができる酵素を使用し得る。最も都合よくは、酸化は、化学的酸化である。反応は、ポリマーベースの過ルテニウム酸塩のような固定された試薬を用いて実行し得る。最も直接的な方法は、溶解した試薬を用いて実行される。オキシダントは好適には過ルテニウム酸塩、または、好ましくは過ヨウ素酸塩である。酸化は、１ｍＭ〜１Ｍの範囲の濃度の過ヨウ素酸塩を用いて、３〜１０の範囲のｐＨで、０〜６０℃の範囲の温度で、１分〜４８時間行われ得る。
【００２６】
本方法において、ステップａ）は、還元性末端においてシアル酸ユニットが還元されるステップである。通常、出発原料の還元性末端における該ユニットは、ケタール環の形態であり、ステップａ）における還元は、該環を開環し、ケトンをアルコールに還元する。第６炭素原子におけるヒドロキシル基はこのように、ビシナルジオール部分の一部である。
【００２７】
好適な還元条件（ステップａ）及びｄ）について）は、触媒を伴った水素または、好ましくは、ボロヒドリドのような水素化物を利用し得る。これらは、アンバーライト（商品名）で支持されたボロヒドリドのように、固定し得る。好ましくは、ソディウムボロヒドリドのようなアルカリ金属水素化物を、還元剤として、１μＭ〜０．１Ｍの範囲の濃度で、６．５〜１０の範囲のｐＨで、０〜６０℃の範囲の温度で、１分〜４８時間の範囲の期間で用いる。反応条件は、出発原料上のペンダントカルボキシル基が還元されないように選択される。予備酸化ステップが行われる場合、生成されたアルデヒド基は、ビシナルジオール基の一部ではないアルコール基に還元される。他の好適な還元剤は、酸性条件下のシアノボロヒドリド、例えば、ポリマー支持されたシアノボロヒドリドまたはアルカリ金属シアノボロヒドリド、Ｌ−アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、Ｌ−セレクトリド、トリアセトキシボロヒドリド等である。
【００２８】
いかなる予備酸化ステップとステップａ）との間、及び、ステップｂ）の後の酸化ステップｃ）と還元ステップｄ）との間、及び、ステップｄ）とその後に続く任意の酸化ステップとの間においても、それぞれの中間生成物は、その後に続くステップに供する前に、それぞれ酸化剤及び還元剤から単離しなければならない。ステップが液相中で行われる場合、単離は、エチレングリコールを用いた余剰の酸化剤の消尽、ポリサッカライドの透析及び水溶液を濃縮するための限外濾過のような慣用の技術により行われる。還元ステップからの生成物混合物は、透析及び限外濾過により、再度単離し得る。反応を、固定された酸化剤及び還元剤上でおこない、生成物の単離を簡単にするよう工夫することが可能であり得る。選択的酸化ステップ、ステップｂ）は、好適には、上述の予備酸化ステップと同様の条件下で行われる。同様に、酸化剤は、生成物の回収の前に、エチレングリコールを用いて使い尽くされるべきである。生成物はその後、透析及び限外濾過のような好適な手段により回収される。
【００２９】
本発明の第一の側面の方法及び、還元性末端サッカライドユニットを活性化するための、ステップｄ）の後に続く酸化ステップを含む、第二の側面の好ましい実施形態の方法は、還元性末端に由来する反応性アルデヒド部分を有する活性化された誘導体を生成する。酸化後、還元し、その後酸化するステップを含む好ましい方法は、単一の反応性アルデヒド部分を有する活性化された生成物を生成する。予備酸化ステップがなく、出発原料が、ビシナルジオール基（例えば、シアル酸）を有する非還元性末端ユニットを有する場合、生成物は、有用性を有し得るアルデヒド基を、各末端に有するだろう。
【００３０】
アルデヒド基は、アミン基含有基質またはヒドラジン化合物に結合するために好適である。酸化ステップの活性化された生成物が、その後基質化合物に結合する方法は、本発明のさらなる側面を形成する。好ましくは、結合反応は、アミンと結合してシッフ塩基を形成し、好ましくはその後、還元により第２級アミン部分を形成することを含む、上述の我々の以前の刊行物に記載されるのと同様である。該方法は、タンパク質の誘導体化に特に有用であり、該方法のアミン基は好適には、リシン基のイプシロンアミン基またはＮ−末端アミノ基である。該方法は、サイトカイン、成長ホルモン、酵素、ホルモン、抗体またはフラグメントのような、タンパク質またはペプチド治療活性剤の誘導体化に特に有用である。または、該方法は、例えば、アルデヒドをリポソームの形成成分のアミン基と反応させることにより、リポソームのようなドラッグデリバリーシステムに用い得る。他のドラッグデリバリーシステムは、我々の以前のケースＵＳ−Ａ−５８４６９５１に記載されている。誘導体化され得る他の材料は、ウイルス、細菌、細胞（動物の細胞を含む）及び合成ポリマーを含む。
【００３１】
あるいは、基質は、ヒドラジン基を有し得、その場合、生成物はヒドラゾンである。これは、望まれれば、さらなる安定性のために、アルキルヒドラジドに還元し得る。
【００３２】
他の好ましい実施形態において、酸化ステップｂ）またはステップｄ）の後に続く酸化ステップの後、該また各アルデヒドの、アミン基またはヒドラジド基、及び、タンパク質または他の治療活性化合物またはドラッグデリバリーシステムの選択的誘導体化に好適な他の官能基を含むリンカー化合物との反応が行われる。そのようなリンカーは、例えば、スルフヒドリル基及び、アミンまたはヒドラジド基と官能基とを結合する二塩基性有機基との特異的な反応のための官能基置換基を有する化合物を含み得る。アルデヒド部分の、アミノまたはヒドラジド基との反応は、チオール（スルフヒドリル）基を有する基質への結合に好適な反応性複合体を形成する。そのような複合体は、タンパク質およびペプチドの、選択的及び部位特定的誘導体化に特に有用である。
【００３３】
タンパク質及びドラッグデリバリーシステムの誘導体化は、増大された半減期、改善された安定性、減少された免疫原性、及び／または、溶解性並びにそれによるバイオアベイラビリティー及び薬物動力学的性質の調節を生じ得、または、活性剤(active)の溶解性または誘導体化された活性剤を含む溶液の粘性を高め得る。
【００３４】
本発明によれば、シアル酸部分を含む、ジ−、オリゴまたはポリサッカライドのアルデヒド誘導体である新規な化合物がさらに提供される：ここで、還元性末端における末端ユニットはＯＲであり、ここで、Ｒは、
【００３５】
【化１】
2007501889.tif 000002
【００３６】
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１、ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１及びＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１から選択され、ここでＲ１はＨ、Ｃ１−２４アルキル、アリールＣ２−６アルカノイル、あるいは、Ｎ末端またはリシン残基の側鎖アミン基によって結合したポリペプチドまたはタンパク質、ドラッグデリバリーシステムである、または、スルフヒドリル基との反応に適応した官能性置換基を有する有機基であり、そして、好ましくは非還元性末端の末端部分は不動態化されている。
【００３７】
該新規化合物は、２つの末端ユニット間に、中鎖サッカライドユニットを含み得る。該中鎖ユニットは、シアル酸ユニットのみからなり得、または、シアル酸ユニット由来の末端ユニットに加え、他のサッカライドユニットを含み得る。該化合物は、通常、本発明の第一の側面について上述されたようにして、形成され得る。
【００３８】
該新規化合物は、基質の各分子において結合する少なくとも１つのポリシアル酸（ポリサッカライド）基を含むポリシアリル化された基質であり得、該結合は、第２級アミン、ヒドラゾンまたはポリシアル酸の還元性末端を介したアルキルヒドラジド結合を含み、実質的に、基質の他の分子への、ポリシアル酸基の非還元性末端を介した架橋はない。該基質は、例えば、生物学的に活性な化合物、例えば薬学的に活性な化合物、特にペプチドまたはタンパク質治療剤(therapeutic)、あるいはドラッグデリバリーシステムであり得る。そのような活性剤は、通常、上述されるようなものである。
【００３９】
該新規化合物は、一般式Ｉを有し得る：
【００４０】
【化２】
2007501889.tif 000003
【００４１】
ここで、Ｒは
【００４２】
【化３】
2007501889.tif 000004
【００４３】
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１、ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１及びＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１から選択され、ここでＲ１はＨ、Ｃ１−２４アルキル、アリールＣ２−６アルカノイル、あるいは、Ｎ末端またはリシン残基のγ−アミン基を介して結合したポリペプチドまたはタンパク質、ドラッグデリバリーシステムであり、または、スルフヒドリル基との反応に適応する官能基置換基を有する有機基であり；
Ｒ３及びＲ４が、
ｉ）Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＯＨである
ii）ＲがＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＯＨまたは−ＣＨ２ＣＨＯである場合、Ｒ３とＲ４が一緒になって＝Ｏである；
iii）ＲがＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＮＨＲ１または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１である場合、Ｒ３がＨであり、そしてＲ４が−ＮＨＲ１である；
iv）Ｒが−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１である場合、Ｒ３がＨであり、そしてＲ４が−ＮＨＮＨＲ１である；または、
ｖ）−ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１、Ｒ３とＲ４が一緒になって＝Ｎ−ＮＨＲ１である；
から選択され、
Ａｃがアセチルであり、
ｎが０以上であり；そして、
ＧｌｙＯはグリコシル基である。
【００４４】
Ｒが、基
【００４５】
【化４】
2007501889.tif 000005
【００４６】
である場合、一般式Ｉの化合物は、還元性末端ユニットにアルデヒド基を有するポリシアル酸誘導体であるポリサッカライドである。
【００４７】
Ｒが、基
【００４８】
【化５】
2007501889.tif 000006
【００４９】
ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１である場合、化合物は、ポリシアル酸のアルデヒド誘導体をヒドラジドＲ１ＮＨＮＨ２と反応させることにより形成される複合体である。ヒドラジドは、好ましくは、アシルヒドラジド（Ｒ１が末端カルボニル基を有する）である。
【００５０】
Ｒが、基
【００５１】
【化６】
2007501889.tif 000007
【００５２】
またはＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１である場合、化合物は、ポリシアル酸のアルデヒド誘導体を第１級アミン基含有化合物Ｒ１ＮＨ２と反応させることにより形成される複合体である。
【００５３】
Ｒ１は、ペプチドまたはタンパク質治療剤（例えば、抗体またはフラグメント、酵素または上述するような他の生物学的活性化合物）の残基であり得る。基Ｒ１は、活性化合物からポリシアル酸への、リンカー部分を含み得る。
【００５４】
あるいは、Ｒ１は、リンカー試薬の残基（例えば、活性化合物上のアミン基またはヒドラジド以外の基と結合するのに好適な誘導体化されたポリシアル酸を形成するための）であり得る。例は、Ｎ−マレイミド化合物である、式
【００５５】
【化７】
2007501889.tif 000008
【００５６】
のリンカー試薬である：
ここで、Ｒ２は、二塩基性有機基、例えば、アリーレンオリゴ（アルコキシ）アルカンまたは、好ましくはアルカンジイル基、例えば、Ｃ２−１２アルカンジイル基である。
【００５７】
本発明は、該新規化合物が単官能性であり、非還元性末端の末端ユニットにおいて不動態化されている場合に、最も有用である。そのような化合物において、Ｒ３はＨであり、Ｒ４はＯＨである。Ｒは、上記の意味のいずれかであり得る。グリコシル基は、好ましくはシアル酸ユニットを含み、さらに好ましくは、互いに２−８及び／または２−９結合（例えば、２−８／２−９交互）するそのようなユニットのみからなる。
【００５８】
本発明は、新規化合物及び希釈剤を含む組成物、並びに、新規化合物（ここで、Ｒ１は生物学的活性を有する）及び薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、経鼻、皮内、局所または気管内投与し得る。
【００５９】
本発明の第２の側面において、一般式II
【００６０】
【化８】
2007501889.tif 000009
【００６１】
ここで、Ａｃはアセチルであり；
ｍは０以上であり、
Ｇｌｙ１Ｏはグリコシルであり；そして、
Ｒ５は有機基、好ましくは末端還元性サッカライドユニットの還元形態、アルデヒドまたはそのようなアルデヒドの反応生成物（例えば、アミンまたはヒドラジド）であるそれらの酸化された誘導体である、
第２方法の側面による方法の生成物である新規化合物が提供される。
【００６２】
好ましくは、Ｒ５は、上記Ｒと同じ基から選択される。あるいは、Ｒ５は、第８または９炭素の一方を介して
【００６３】
【化９】
2007501889.tif 000010
【００６４】
に結合する（それによって第８または９炭素の他方が、還元性末端シアル酸の開環を伴う還元生成物であるヒドロキシで置換される）基IIIである。
【００６５】
【化１０】
2007501889.tif 000011
【００６６】
好ましくは、Ｇｌｙ１Ｏは、シアル酸ユニットを含み、最も好ましくは、シアル酸ユニットからなる。ｍの値は、好ましくは２以上、さらに好ましくは５〜１０００、例えば１０〜５００、さらに好ましくは１０〜５０である。
【００６７】
該新規方法は、単官能性ポリシアル酸（ＰＳＡ）の製造に特に価値がある。それは、ＰＳＡ（例えば、コロミン酸（ＣＡ））の還元性末端の環の互変平衡の理解（図３に記載される）に基づいている。ＰＳＡの還元性末端シアル酸残基は、互変により、自発的に開環型ケトンを形成する（図３）。還元性末端シアル酸残基の環と線状構造の間の動的平衡において、ケトン部分は、任意の瞬間にＰＳＡ分子のサブポピュレーションのみにおいて存在する。しかしながら、上述のように、還元性末端ヘミケタールの反応性は、タンパク質へのＰＳＡの結合のための実用には不十分であることがここで強調され、それが以前に記載された方法が、タンパク質または他の薬物への結合のために、ポリマー上のこの部位を用いなかった理由である。このように、図３に図示されるように、溶液中で、ポリシアル酸の還元性末端における末端シアル酸残基は、互変平衡で存在する。開環形態は、平衡における低い発生度にもかかわらず、タンパク質アミン基に弱い反応性を示し、ソディウムシアノボロヒドリドの存在下で、タンパク質と共有結合性付加生成物を生じ得る。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態において、ＰＳＡｓとのタンパク質複合体の、より良い定義された生成物を得るために、我々は、今回、単官能性である、ポリシアル酸の化学的に修飾された形態を製造した。該新規形態は、天然のポリシアル酸分子の両方の末端への化学的修飾を含む。ポリマーが最も外側の「還元性末端」により、主に２位から８位の方向で結合する、反応の元の形態（図１）とは異なり、ポリマーの新規形態はもっぱら、反対の方向で結合する。
【００６９】
ポリシアル酸または他のポリサッカライドアルデヒドから誘導体への新規な好ましい単官能性形態は、薬学的に許容される生成物の合成及び製造をより助ける。なぜなら、それは、修飾されていない還元性末端を有するポリマー形態の使用により意図されることなく引き起こされる相当な複雑さを避けることができるからである（図２）。ポリマーの新規な形態の生成（図４）は、非還元性末端にアルデヒド官能性を導入するための選択的酸化（好ましくは我々の以前の開示のような過ヨウ素酸による）を含む。しかしながら、図１に図説される従来技術とは異なり、このアルデヒド部分は、その後、例えばボロヒドリドを用いて、還元により破壊される。ポリマーの他の末端において、ボロヒドリド還元ステップはさらに同時に、ヘミケタールの還元により、還元性末端の環構造の開環を固定する。この同時に起こるケトンのヒドロキシル部分への還元は、第二の酸化ステップにおける選択的酸化に反応しやすい新たなジオール官能性を導入する。天然のポリマーが（首尾よく）過ヨウ素酸塩を用いて酸化され、ボロヒドリドを用いて還元され、そして、過ヨウ素酸塩を用いて２度目の酸化をされた場合、厳密に単官能性であり、還元性末端のみにおいて単一の反応性基（アルデヒド）を有する新規なポリマー形態が作られる（図３）。
【００７０】
図４の「２回酸化」方法に記載される様々な中間生成物のタンパク質反応性（還元アミノ化による）は、表２に示される。特に、これらのデータは、過ヨウ素酸塩により酸化されたポリマーのボロヒドリド還元により作られた中間生成物「ＣＡＯＲ」（酸化／還元されたコロミン酸−ポリシアル酸）が、タンパク質標的に対して不活性である（そのアルデヒド部分及びヘミケタール部分の両方が、ボロヒドリドによる還元により破壊されることを証明する）ことを実証する。「タンパク質不活性」ＣＡＯＲ中間生成物の、過ヨウ素酸塩酸化の第二サイクルにおいて、タンパク質に対し再び反応性であり（表２）、さらに、厳密に単官能性の特性であり、ポリマーの還元性末端に単一のアルデヒド基を有し、そして、他の末端においてタンパク質に対し非反応性である、新規なポリシアル酸誘導体が作られる（ＣＡＯＲＯ）。該単官能性ＰＳＡは、単一の方向に対してのみ、最も外側の非還元性末端を用いてタンパク質への付着を生じることができ、そして、意図されたものではなくタンパク質を架橋することができない（図５）。「２回酸化」方法として知られるこの新規な反応スキームは、様々な意図されたものではない生成物（図２に記載の）（この新規な反応スキームにおいて完全に回避されている）から、意図する生成物を精製する必要をあざやかに回避する。
【００７１】
本発明は、添付の実施例において、さらに例証される。
【実施例】
【００７２】
原料
炭酸アンモニウム、エチレングリコール、ポリエチレングリコール（８ＫＤａ）、ソディウムシアノボロヒドリド（＞９８％純度）、メタ過ヨウ素酸ナトリウム及び分子量マーカーは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（英国）から入手した。使用されるコロミン酸、鎖状α−（２→８）結合Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１ポリシアル酸（平均２２．７ｋＤａ、高多分散性１．３４、３９ｋＤａ  ｐ．ｄ．  １．４；１１ｋＤａ、ｐ．ｄ．  １．２７）はＣａｍｉｄａ（アイルランド）から、放射性ヨウ化物（Ｎａ１２５Ｉ）はＡｍｅｒｓｈａｍ（英国）から入手した。他の材料は、２，４ジニトロフェニルヒドラジン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、英国）、透析チューブ（３．５ＫＤａ及び１０ＫＤａのカットオフ限界；Ｍｅｄｉｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）、セファロースＳＰハイトラップ（ＨｉＴｒａｐ）、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、英国）、トリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（４〜２０％及び１６％）、トリス−グリシンドデシル硫酸ナトリウムランニングバッファー及びローディングバッファー（Ｎｏｖｅｘ、英国）を含む。脱イオン水は、エルガスタットオプション４水精製ユニット(Elgastat Option 4 water purification unit)（Ｅｌｇａ  Ｌｉｍｉｔｅｄ、英国）から得た。使用される全ての試薬は、分析用グレードである。プレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国）を、タンパク質またはＣＡアッセイにおける分光学的測定のために用いた。ＣＤ１非近交系マウス（８〜９週齢；体重２９〜３５ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（英国）から購入し、これらを使用する前に少なくとも１週間順化させた。
【００７３】
方法
タンパク質及びコロミン酸測定
レゾルシノール試薬を用いたポリシアル酸(シアル酸としての)の量的評価は、別記されるようなレゾルシノール法(Svennerholm 1957)によって行われた(Gregoriadis et.al., 1993; Fernandes and Gregoriadis, 1996, 1997)。Ｆａｂ（タンパク質）を、ＢＣＡ比色法によって測定した。
【００７４】
参考例１
共有結合ＰＳＡ−タンパク質複合体は、天然の形態のＥ．ｃｏｌｉ由来のポリシアル酸（コロミン酸，ＣＡ）を用い、その弱反応性還元性末端を介して、ソディウムシアノボロヒドリドを用いて還元アミノ化することによって製造された。ＣＡ＝コロミン酸；  ＣＡＯ＝酸化されたコロミン酸（Fernandes and Gregoriadis, 1996; Jain et al., 2003におけるような）。ソディウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３）を、４ｍｇ  ｍｌ−１の濃度で用いた。
【００７５】
結果を第１表に示す。第１欄のモル比は、タンパク質に対する開始ＣＡ（Ｏ）の比である。ｎ＝３、±標準偏差。
【００７６】
【表１】
2007501889.tif 000012
【００７７】
実施例１−単官能性ポリシアル酸の調製：
１ａ  コロミン酸の活性化
新たに調製した０．１Ｍメタ過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）溶液を２０℃でＣＡと混合し（１００ｍｇ  ＣＡ／ｍｌ  ＮａＩＯ４）、該反応混合物を暗所で１５分間、磁気的に攪拌した。その後、２倍体積のエチレングリコールを該反応混合物に添加して過剰のＮａＩＯ４を消費し、混合物を２０℃でさらに３０分間攪拌した。酸化されたコロミン酸を、４℃で、０．０１％炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７．４）に対して充分に（２４時間）透析（カットオフ分子量３．５ＫＤａの透析チューブ）した。限外濾過（カットオフ分子量３．５ＫＤａ以上）を、透析チューブからのＣＡＯ溶液を濃縮するために用いた。必要な体積に濃縮した後、該濾液を凍結乾燥し、後に使用するまで−４０℃で保存した。
【００７８】
１ｂ  コロミン酸の還元
酸化されたコロミン酸（ＣＡＯ；２２．７ｋＤａ）を、ソディウムボロヒドリドの存在下で還元した。新たに調製した０．１５ｍＭソディウムボロヒドリド（ＮａＢＨ４；希Ｈ２ＳＯ４溶液で希釈することにより、ｐＨ８〜８．５に希釈した０．１Ｍ  ＮａＯＨ中の）を２０℃でＣＡＯと混合し（１００ｍｇ  ＣＡ／ｍｌ）、該反応混合物を暗所で２時間に達するまで攪拌した。反応の完了により、ｐＨは７に低下した。該酸化／還元されたコロミン酸（ＣＡＯＲ）を、４℃で、０．０１％炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７）に対して透析（カットオフ分子量３．５ＫＤａの透析チューブ）した。限外濾過を、透析チューブからのＣＡＯＲ溶液を濃縮するために用いた。該濾液を凍結乾燥し、さらに必要とされるまで４℃で保存した。いずれのアルデヒド含有量の測定も、「ＣＡの酸化の測定」に記載されるようにして測定された。
【００７９】
１ｃ  ＣＡの再酸化
アルデヒドが含まれていないことを確認した後、酸化／還元されたコロミン酸（ＣＡＯＲ）を再度、ＣＡＯＲを過ヨウ素酸塩溶液と共により長時間（1時間まで）インキュベートした以外は、「コロミン酸の活性化」に報告されているのと同様にして酸化した。該ＣＡＯＲＯ生成物における酸化の程度を、このステージから同様にして得られた凍結乾燥粉末について測定した。
【００８０】
１ｄ  ＣＡ及び誘導体の酸化状態の測定
コロミン酸の酸化の程度の定量的評価は、カルボニル化合物との相互作用において、やや溶けにくい２，４ジニトロフェニルヒドラゾンを生じる２，４ジニトロフェニルヒドラジン（２，４−ＤＮＰＨ）を用いて行われた。非酸化（ＣＡ）、酸化（ＣＡＯ）、還元（ＣＡＯＲ）及び再酸化（ＣＡＯＲＯ）（各５ｍｇ）を、２，４−ＤＮＰＨ試薬（１．０ｍｌ）に添加し、該溶液を振り混ぜ、その後、結晶性沈殿が観察されるまで３７℃で放置した(Shriner et al., 1980)。ＣＡの酸化の程度（量的）は、アルカリ性溶液中のフェリシアニドイオンのフェロシアン化第二鉄（ペルシアンブルー）への還元（その後６３０ｎｍで測定する）に基づく方法(Park and Johnson, 1949)を用いて測定された。この例では、グルコースを標準液(standard)として用いた。
【００８１】
１ｅ  ゲル浸透クロマトグラフィー
コロミン酸試料（ＣＡ、ＣＡＯ、ＣＡＯＲ及びＣＡＯＲＯ）をＮａＮＯ３（０．２Ｍ）、ＣＨ３ＣＮ（１０％；５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、２ｘ以上のＧＭＰＷＸＬカラム上で、屈折率を検出しながら（ＧＰＣシステム：ＶＥ１１２１  ＧＰＣ  溶媒ポンプ、ＶＥ３５８０  ＲＩ検出器及びトライセック３ソフトウェア(Viscotek Europe Ltd)による照合）、クロマトグラフした。試料（５ｍｇ／ｍｌ）を、０．４５μｍナイロン膜で濾過し、移動相として０．２Ｍ  ＮａＮＯ３及びＣＨ３ＣＮ（１０％）を用いて０．７ｃｍ／ｍｉｎで流した(run)。
【００８２】
結果
コロミン酸（ＣＡ）（ポリシアル酸）は、鎖状のアルファ−２，８結合した、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）残基のホモポリマーである（図１ａ）。しかしながら、過ヨウ素酸塩は、強力な酸化剤であり、それにもかわらず、隣接した炭素原子においてヒドロキシル基を含む炭水化物に対して選択的(Fleury and Lange, 1932)であり、内部のＮｅｕ５Ａｃ残基に時間−依存性の開裂を生じることができる。従って、本研究において、酸化のためのコロミン酸の曝露は、室温で１００ｍＭの過ヨウ素酸塩を用いて、１５〜６０分間に制限された(Lifely et al., 1981)。さらに、過ヨウ素酸塩が光に曝露して分解し、より反応的な種を生じる(Dyer, 1956)ので、反応混合物は暗所で保存された。過ヨウ素酸塩及びボロヒドリド処理後の内部のアルファ−２，８結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基の完全性(integrity)を、ゲル浸透クロマトグラフィーによって分析し、酸化（ＣＡＯ）、酸化還元（ＣＡＯＲ）、２回酸化（ＣＡＯＲＯ）原料について得られたクロマトグラフを、天然のＣＡのそれと比較した。酸化（１５分間）（ＣＡＯ）（６ｂ）、還元（ＣＡＯＲ）（６ｃ）、２回酸化（１時間）（ＣＡＯＲＯ）（６ｄ）及び天然（６ａ）のＣＡは、ほとんど同一の溶出プロフィールを示すことが見出され（図６）、連続する酸化及び還元ステップが、ポリマー鎖の顕著なフラグメント化を生じさせる証拠はないことが見出された。小さなピークは、緩衝塩を示す。
【００８３】
ＣＡの酸化状態の定量的測定は、グルコースを標準液として用い、アルカリ性溶液中でフェリシアニドイオンをフェロシアン化物（プルシアンブルー）に還元する(Park and Johnson, 1949)ことにより行われた（結果を第２表に示す）。第２表は、酸化されたコロミン酸が、化学量論以上（＞１００％）の量の還元剤を有する、即ち、還元性末端ヘミケタール及び（他の末端において）導入されたアルデヒドの組み合わされた還元力を含む、１１２モル％の見かけのアルデヒド含有量を有することが見出されたことを示す。ＣＡＯＲでは反応性が見られなかったことは、ＣＡＯのアルデヒド及びヘミケタール両者の中和が、ボロヒドリド還元により首尾よく遂行されたことを証明する。過ヨウ素酸塩酸化の第二サイクル後、ＣＡＯＲＯにおけるポリマーのアルデヒド含有量が９５％まで回復され（実験誤差１０％の範囲内で）、還元性末端における新たなアルデヒド部分の首尾よい導入を証明する。
【００８４】
２回酸化プロセスにおけるコロミン酸中間生成物の、フェリシアニドを用いた定量分析の結果（第２表）は、天然のＣＡと淡黄色の沈殿物を生じ、ポリマーのアルデヒド含有形態と濃橙色を生じ室温での１０分間の反応後に濃橙色沈殿を生じる、２，４ジニトロフェニルヒドラジンを用いた定性試験の結果と一致する。
【００８５】
【表２】
2007501889.tif 000013
【００８６】
第２表：グルコースを標準液（１００％、グルコース１モルあたり１モルのアルデヒド）として用いた、２回酸化反応スキームにおける様々なコロミン酸中間生成物の酸化の程度。ｎ＝３±ｓ．ｄ．
実施例２−Ｆａｂ−コロミン酸複合体の調製
Ｆａｂを０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、種々のコロミン酸（ＣＡ、ＣＡＯ、ＣＡＯＲ及びＣＡＯＲＯ）に、ソディウムシアノボロヒドリド（ＮａＣＮＢＨ３）の存在下で還元アミノ化することにより、共有結合させた。ＣＡ：Ｆａｂモル比（１００：１）でのＦａｂとの合成の各ステップから得られたコロミン酸（出発原料及び実施例１ａ〜ｃそれぞれの生成物）を、３５±２℃のオーブン中で、磁気的に攪拌しながら、封をした容器中で、ソディウムシアノボロヒドリド（４ｍｇ／ｍｌ）を含む０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４；２ｍｌ）と反応させた。該混合物を、継続的に攪拌しながら、飽和度７０％  ｗ／ｖに達するまでゆっくり添加することにより、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）沈殿反応に供した。該試料（４℃で1時間攪拌した）を、１５分間遠心分離（５０００ｘｇ）し、ポリシアリル化されたＦａｂを含むペレットを（ＮＨ４）２ＳＯ４の飽和溶液に懸濁し、再度１５分間遠心分離した（５０００ｘｇ）。回収した沈殿を、０．９％  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４；ＰＢＳ）を追加した１ｍｌの０．１５Ｍ  Ｎａホスフェートバッファーに再溶解し、４℃で、同様のＰＢＳに対して充分に（２４時間）透析した。その後、該透析物を、シアル酸及びＦａｂ含有量について分析し、複合体収量を、ＣＡ：Ｆａｂモル比の観点から示した。コントロールは、天然のタンパク質を、記載された条件下で、非酸化ＣＡの存在下またはＣＡの非存在下、結合の手順に供することを含む。攪拌は、付随するタンパク質の変性を避けるため、最小限に保たれた。ポリシアリル化されたＦａｂを、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、さらに特徴付けた。
【００８７】
２ｂ  イオン交換クロマトグラフィー
ゼロ（コントロール）及び反応混合物からの４８時間の試料（０．５ｍｌ）を、セファロースＳＰカチオン交換カラム上で、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）に供した（１ｍｌ；フローレート１ｍｌ／ｍｉｎ；結合／洗浄バッファー  ５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ４．０；溶出バッファー、１Ｍ塩化ナトリウム含有５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ４．０）。該カラムを洗浄し、溶出し、溶出画分を、ＣＡ及びタンパク質（Ｆａｂ）含有量について分析した。ＰＤ−１０カラムを、カラムにアプライする前の試料を脱塩するために用いた。
【００８８】
２ｃ  ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(MiniGel, Vertical Gel Unit, model VGT 1, power supply model Consort E132; VWR, UK)を、ポリシアリル化におけるＦａｂの分子サイズの変化を検出するために使用した。反応混合物からのＦａｂ及びその複合体（ＣＡ、ＣＡＯ、ＣＡＯＲ及びＣＡＯＲＯとの）の０（コントロール）及び４８時間の試料、並びに方法コントロール（非酸化ＣＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを、４〜２０％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。該試料は、幅広い分子量マーカーに対して較正された。
【００８９】
他のタンパク質を用いた従来の実験(Jain et al.,2003; Gregoriadis, 2001)において、最適のＣＡ：Ｆａｂ（羊ＩｇＧ由来）モル結合収率は、０．１５Ｍ  ＰＢＳバッファー中、ｐＨ６〜９、４８時間で、３５±２℃の温度を必要とすることが見出された。これらの条件下で、ポリマーアルデヒドとタンパク質間で形成されるイミン（シッフ塩基）種は、ＮａＣＮＢＨ３で首尾よく還元され、安定な第２級アミンを形成した(Fernandes and Gregoriadis, 1996; 1997)。タンパク質の、過ヨウ素酸塩で酸化された天然のＣＡへの曝露は、準安定のシッフ塩基ＣＡ−タンパク質付加物を生じる（カタラーゼのポリシアリル化について報告されているように）(Fernandes and Gregoriadis, 1996)。同様に、ＣＡの酸化形態のＦａｂとの反応において、我々はまず、準安定なシッフ塩基付加物を、酸化ポリマーをＦａｂと３７℃で４８時間インキュベートすることにより生じさせ、その後それをＮａＣＮＢＨ３（シッフ塩基イミン構造を還元するが、ポリマーのアルデヒド部分を還元しない）を用いた選択的還元（還元アミノ化）により強化した。「２回酸化方法」の種々のＣＡ中間生成物のタンパク質反応性を特徴付けるため、Ｆａｂを、天然のＣＡ（ＣＡ）、酸化されたＣＡ（ＣＡＯ）、酸化−還元されたＣＡ（ＣＡＯＲ）及び「２回酸化された」ＣＡ（ＣＡＯＲＯ）の存在下で、還元アミノ化に供した。これらの研究のために、２２．７ｋＤａ  ＰＳＡが、１００：１のＣＡ：Ｆａｂモル比で使用された。ＮａＣＮＢＨ３の存在下で４８時間インキュベート後、Ｆａｂ複合体を反応混合物から、硫酸アンモニウムとの沈殿により単離し（「実施例」に記載されるように）、得られた複合体におけるＣＡ：Ｆａｂモル比の観点から、結果を示した（第3表）。
【００９０】
【表３】
2007501889.tif 000014
【００９１】
天然の、非酸化ＣＡ（シアノボロヒドリドの存在下）を用いた場合、有意であるが低い程度の結合が、ＣＡのヘミアセタール基との、その還元末端における反応により観察される（０．２１：１、ＣＡ：Ｆａｂモル比）ことが、第3表から明白である。
【００９２】
ＣＡ−Ｆａｂ複合体の形成は、（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＣＡ自体は、該塩の存在下では沈殿しない）を添加した際の２つの部分の共沈殿により、さらに確認される。結合の証拠はまた、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ、示されていない）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；Ｆｉｇ．７）により確認される。
【００９３】
イオン交換クロマトグラフィーのために、（ＮＨ４）２ＳＯ４沈殿により得られたポリシアリル化されたＦａｂを、リン酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ、ｐＨ４．０）に再溶解し、セファロースＳＰハイトラップ(HiTrap)カラム（カチオン交換）を用いたＩＥＣに供した。ＣＡ（洗浄液中の）及びＦａｂ（溶出画分中の）の完全な転換(resolution)を示す結果と対照的に、４８時間の反応試料からのＣＡ及びＦａｂ両者とも、洗浄画分に共溶出し、ＣＡ−Ｆａｂ複合体の存在を証明した。
【００９４】
図7は、上述の抗体Ｆａｂ複合体の分析を説明する。これらのデータは、２つの複合体の分子量の分布が非常に類似している（非対称の二官能性ＣＡから得られる副生成物は、総分子数の低いパーセンテージしか構成しないことから予想されるように）ことを確認する。Ｆａｂ複合体が、非対称性二官能性ＣＡ（すなわち過ヨウ素酸塩酸化された天然ＣＡ）または単官能性ＰＳＡからのいずれから調製されるのかということ、非誘導体化Ｆａｂコントロールの分子量から高められた広い分子量分布の複合体が生じることも、図７から明白である。このことは、我々の以前に公表した研究で報告された、天然のポリマーの既知の多分散性と一致している。図7は、単官能性ＣＡを用いた還元アミノ化が、Ｆａｂ複合体を、過ヨウ素酸塩−酸化天然ＣＡによる以前の方法の収率（図１に記載）に匹敵する収率で生じることも証明する。図７から、各複合体試料中に、微量の非誘導体化Ｆａｂしか残存していないことも明白である。微量の残存Ｆａｂは、これらの複合体から、ｉｎ  ｖｉｖｏ研究（下記実施例３）の前に、イオン交換クロマトグラフィーにより除去される。
【００９５】
実施例３−Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
羊ＩｇＧＦａｂフラグメント、あるいはＣＡＯまたはＣＡＯＲＯとの複合体試料を、以下のようにＩ１２５で放射性標識した。
【００９６】
それぞれ１０体積％のこれらの試料を除去し（〜１００μｌ）、新しいＩＯＤＯ−ｇｅｎチューブに入れた。２００ｍＣｉの１２５Ｉ（ＮａＩとして）を含有するＰＢＳの試料２０μｌを、タンパク質または複合体に添加し、チューブにふたをし、室温で１０分間インキュベートした。その後、チューブの内容物を５００μｌの遠心フィルター（３．５ｋＤａ分子量カットオフ）に移し、該試料をマイクロ遠心機において、６，５００ｒｐｍで回転した。溶離液を捨て、未透過物（膜の上の）の体積を５００μｌにした。このプロセスをさらに５回繰り返した後、５μｌの試料について、膜の上（タンパク質）及び下（遊離ヨウ素）の放射能を、Packard Cobra ガンマカウンターを用いて評価した。フリーのＩ１２５によるカウントが、結合した画分におけるそれの５％未満である場合、さらなる精製は行わなかった。フリーのＩ１２５が＞５％である場合、精製サイクルを繰り返し、試料を再評価した。
【００９７】
ＣＤ１マウス（体重２９〜３５ｇ）に、マウスあたりタンパク質４０μｇ（ＰＢＳ中に体積１００μｌ）（〜１．６ｍｇ／ｋｇ）を、静脈経路（尾静脈）により、単回注射として投与し、５０μｌの血液試料をその後、時間間隔をおいて異なる尾静脈から採取（ヘパリン処理した目盛りつきキャピラリーを用いて）し、５００μｌのＰＢＳ中に添加した。記録された最後の出血は十分なカウントを得るために総出血であった。その後、試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、記録された(recorded)上清を除去し、ガンマカウンターチューブに入れた。試料を、注射されたタンパク質の代表的な試料と共に、Packard Cobra IIオートガンマカウンターでカウントした。記録されたカウントを、注射されたもとの投与量のパーセンテージとして示した。
【００９８】
放射性ヨウ素化されたＦａｂ、並びにＣＡＯ及びＣＡＯＲＯ  Ｆａｂ複合体の試料を、マウスに静脈注射し、血液循環における半減期をモニターした。図8は、天然のＦａｂ対オリジナルの方法（ＣＡＯを用いた）及び新規な２回酸化方法（ＣＡＯＲＯを用いた）により調製されたＦａｂ−コロミン酸複合体の薬物動力学を示す。これらの結果は、ＣＡＯ−Ｆａｂ及びＣＡＯＲＯ−Ｆａｂが、循環において、天然のＦａｂと比較してＡＵＣ値で６．２８倍及び５．２８倍（それぞれ）の増加を生じ、非誘導体化Ｆａｂの場合よりも、著しく、有意に長い滞留時間を生じることを証明する。
【００９９】
実施例４−マレイミド複合体の合成
上記実施例１ｃで合成したＣＡＯＲＯを、５モル当量のＮ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジドと、０．１Ｍ酢酸ナトリウム中、３７℃で２時間反応させた。生成物ヒドラゾンを、エタノール中で沈殿させ、酢酸ナトリウムに再懸濁し、エタノール中で再び沈殿させ、水に再溶解し、凍結乾燥した。該生成物は、タンパク質及びペプチド中のシステイン部分のチオール基への部位特異的な結合に有用である。
【０１００】
単官能性ポリシアル酸アルデヒド誘導体は、ヒドラジド部分及びＮ−マレイミド部分を有し、チオール基との反応に有用な活性マレイミド官能性を有する安定なヒドラゾンを形成する連結化合物と反応させることもできる。
【０１０１】
参考例２−イオン交換クロマトグラフィー（ＣＡ、２２．７ｋＤａ、ｐｄ１．３４）による、コロミン酸の分画(fractionation)
参考例２．１−大スケール(large scale)における分画
ＸＫ５０カラム(Amersham Biosciences, UK)を、９００ｍｌのセファロースＱ  ＦＦ(Amersham Biosciences)と共に装填し、３カラム体積の洗浄バッファー（２０ｍＭトリエタノールアミン；ｐＨ７．４）を用いて、５０ｍｌ／ｍｉｎのフローレートで平衡させた。ＣＡ（２００ｍｌの洗浄バッファー中に２５グラム）をシリンジポートを介して毎分５０ｍｌでカラムにロードした。その後、１．５カラム体積（１３５０ｍｌ）の洗浄バッファーでカラムを洗浄した。
【０１０２】
結合したＣＡを、１．５カラム体積の種々の溶出バッファー（ＮａＣｌを２５ｍＭ刻みで０ｍＭ〜４７５ｍＭ有するトリエタノールアミンバッファー、２０ｍＭ  ｐＨ７．４）及び最終的に１０００ｍＭのＮａＣｌを含む同様のバッファーを用いて溶出し、全ての残余ＣＡ及び他の残余物（もしあれば）を除去した。
【０１０３】
試料を、５ｋＤａの膜(Vivascience, UK)上における高圧限外濾過によって２０ｍｌまで濃縮した。これらの試料を、４℃での限外濾過を繰り返すことにより、脱イオン水へバッファー交換した。試料は、ＧＰＣ（実施例１ｅで報告されたように）及びネイティブ(native)ＰＡＧＥ（アルシアンブルーで染色される）によって、平均分子量及び他のパラメーターについて分析された。
【０１０４】
参考例２．２
小規模の(at smaller scale)分画
以下の試料を、同一の洗浄及びグラジエントシステムを小規模（１〜５ｍｌのマトリックス；０．２〜３グラムのコロミン酸）で用い、分画した：
コロミン酸（ＣＡ、２２．７ｋＤａ、ｐｄ  １．３４；ＣＡ、３９ＫＤａ、ｐｄ＝１．４）、コロミン酸−アルデヒド（ＣＡＯ、２２．７ｋＤａ、ｐｄ  １．３４）、単官能性コロミン酸（ＣＡＯＲＯ、２２．７ｋＤａ；ｐｄ  １．３４）、コロミン酸−アミン（ＣＡ−ＮＨ２、２２．７ｋＤａ、ｐｄ  １．３４）、コロミン酸マレイミド（ＣＡＭ、実施例４による）そして、製造されたＣＡの分子量を終始モニターした。
【０１０５】
上記の手順を用いて製造されたＣＡの狭い画分を、１０ｍＭの過ヨウ素酸塩で酸化し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）及びネイティブ(native)ＰＡＧＥを用い、ポリマーへの総変化(gross alteration to the polymer)について分析した。
【０１０６】
結果
【０１０７】
【表４】
2007501889.tif 000015
【０１０８】
コロミン酸及びその誘導体（２２．７ｋＤａ）は、１．１未満の多分散性、４６ｋＤａまでの平均分子量、種々の％のポピュレーションを有する様々な狭い種(narrow species)に、首尾よく分画された。図９及び１０；第4表は、５ｍｌのスケールにおける、２２．７ｋＤａの材料の分離の結果を示す。図９はＧＰＣの結果であり、図１０はネイティブ(native)ＰＡＧＥである。
【０１０９】
この方法は、各スケールでほとんど同一の分画プロフィールを有する、１ｍｌから９００ｍｌのマトリックスに、拡大縮小可能である（全ての結果は示されていない）。
【０１１０】
より大きなポリマー（ＣＡ、３９ｋＤａ、ｐｄ  １．４）の分画は、９０ｋＤａまでの種を生じる。この方法は、ポリマーの大きなバッチの分画にさえ、首尾よく用いることができる。図１１は、供給される３つのＣＡ試料及び第4表中のようなイオン交換分析により分離された画分についての、ネイティブ(native)ＰＡＧＥの結果を示す。該ＰＡＧＥの結果は、イオン交換画分が狭く分散することを示す。これは、２２．７ｋＤａのＣＡから分離された３つの画分についての結果を示す、図１２に示されるＧＰＣのデータと一致する。保持容量(retention volumes)を第5表に示す。
【０１１１】
【表５】
2007501889.tif 000016
【０１１２】
２２．７ｋＤａの材料を、大スケールで分離する。ＧＰＣを用いて、イオン交換からの画分を分析する。第6表（図参照）に示される以下の画分を回収した。
【０１１３】
全ての狭い画分は、１０ｍＭ過ヨウ素酸塩を用いて首尾よく酸化され、製造プロセスの種々の段階から採取し、ＧＰＣ及びネイティブ(native)ＰＡＧＥにより分析した試料は、分子量及び多分散性における変化を示さなかった。いくつかの試料についてのデータは、図１３中に示される。
【０１１４】
２．３  コロミン酸の沈殿
分別(Differential)エタノール沈殿を、種々の鎖長のコロミン酸を沈殿させるために用いた。
【０１１５】
結果
分別エタノール沈殿は、より小さなＣＡｓはより多くのエタノール（ＥｔＯＨ）を必要とすることを示す。ブロードｐ．ｄ．２２．７ｋＤａポリマーを、７０％ＥｔＯＨを用い、製造物ポリマーの収率＞８０％で沈殿させた。８０％ＥｔＯＨの濃度は、より低い分子量６．５ＫＤａ（ｐｄ＜１．１）を＞８０％沈殿させるために必要である。このプロセスは、さらに、生成物を汚染するいかなる塩も除去する。
【０１１６】
２．４  濾過によるコロミン酸の分画
２２．７ｋＤａの試料を、種々のカットオフ分子量の膜（５、１０、３０、５０、及び１００ｋＤａ）上での限外濾過により、精製した。全ての場合において、未透過物をＧＰＣ及びネイティブ(native)ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１７】
結果
種々のカットオフ分子量の膜上での限外濾過により、精製された２２．７ｋＤａの試料は、ポリマーの多分散性の低下及び、膜のカットオフの増加に伴うより高い分子量へのシフトが存在することを示す（図１４）。組み合わされた方法及びイオン対クロマトグラフィーも、ポリマーの分画に用いられ得る。
【０１１８】
実施例５−成長ホルモン（ＧＨ）−コロミン酸複合体（広く及び狭く分散した）の合成
参考例２．２において調製された、酸化されたコロミン酸（ＣＡＯ；２２．７ｋＤａ）及び狭く分散した酸化されたコロミン酸（ＮＣＡＯ；２７．７ｋＤａ  ｐｄ＝１．０９；４０．９ｋＤａ．ｐｄ＝１．０２）を、ＧＨ複合体の調製のために用いた。
【０１１９】
成長ホルモン−コロミン酸複合体の調製
成長ホルモンを０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、種々のコロミン酸（ＣＡＯ及びＮＣＡＯ）に共有結合させた。種々のＣＡｓ（２２ｋＤａ、ＣＡＯ；２７．７ｋＤａ及び４０．９ｋＤａ、ＮＣＡ）を、ＣＡ：ＧＨモル比（１２．５：１）でＧＨ（２ｍｇ）にそれぞれ添加し、ソディウムシアノボロヒドリドを最終濃度４ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。反応混合物に封をし、３５±２℃で２４時間、磁気的に攪拌した。その後、混合物を、継続的に攪拌しながら、飽和度７０％  ｗ／ｖに達するまで硫酸アンモニウムをゆっくり添加することにより、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）沈殿反応に供し、４℃で１時間攪拌した後、１５分間遠心（５０００ｘｇ）し、ペレットを飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４に再懸濁し、再び１５分間遠心した（５０００ｘｇ）。回収した沈殿を１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再溶解し、４℃で、同様のバッファーに対して、充分に（２４時間）透析した。コントロールは、天然のタンパク質を、非酸化ＣＡの存在下またはＣＡの非存在下、結合の手順に供することを含む。攪拌は、付随するタンパク質の変性を避けるため、最小限に保たれた。ポリシアリル化されたＧＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、特徴付けた。ポリシアリル化されたＧＨは、参考例２に記載されているように、アニオン交換クロマトグラフィーを通過され、生成物画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥに供した。
【０１２０】
結果
結果（図１５）は、対照ウェル（ＧＨを有する）において、試料の移動は、新鮮なＧＨについてのそれと似ていることを示す。複合体のレーンには、ポリシアリル化されたＧＨを示す質量の増大を典型的に示す、バンドのシフトが存在する。バンドの幅は、広く分散したポリマーとの複合体に比べ、狭く分散したポリマーとの複合体の場合において、有意に狭くなっていた。さらに、ＧＨ複合体（広く分散したポリマーとの）を、アニオン交換クロマトグラフィーにより、種々の種に分離した（図１６）。
【０１２１】
実施例６−インシュリン−コロミン酸複合体の合成
実施例１で調製された、活性化されたポリシアル酸（酸化されたコロミン酸（ＣＡＯ））及び単官能性ポリシアル酸（酸化−還元−酸化されたコロミン酸（ＣＡＯＲＯ））を、ｒｈ−インシュリン複合体の調製に用いた。
【０１２２】
インシュリン−コロミン酸複合体の調製
インシュリンを、最小限の体積の１５ｍＭ  ＨＣｌに溶解し、その後、０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、種々のコロミン酸（ＣＡ、ＣＡＯ及び単官能性ＣＡＯＲＯ）に共有結合させた。コロミン酸（２２ｋＤａ）を、ＣＡ：インシュリンモル比２５：１で、インシュリン（２ｍｇ）と共に、ソディウムシアノボロヒドリド（４ｍｇ／ｍｌ）を含む０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４；２ｍｌ）中で４８時間、封をした容器に入れて磁気的に攪拌しながら、３５±２℃のインキュベーター中で反応させた。その後、混合物を、継続的に攪拌しながら、飽和度７０％  ｗ／ｖに達するまで硫酸アンモニウムをゆっくり添加することにより、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）沈殿反応に供した。試料を４℃で１時間攪拌した後、１５分間遠心（５０００ｘｇ）し、ペレットを（ＮＨ４）２ＳＯ４の飽和溶液に懸濁し、再び１５分間遠心した（５０００ｘｇ）。回収した沈殿を、０．９％ＮａＣｌを追加した１ｍｌの０．１５Ｍ  Ｎａリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＰＢＳ）に再溶解し、４℃で、同じＰＢＳに対して、充分に（２４時間）透析した。その後、該透析物を、シアル酸及びタンパク質含有量について分析し、生じた複合体を、ＣＡ：インシュリンモル比の観点から示した（実施例１のように）。コントロールは、天然のタンパク質を、記載された条件下で、非酸化ＣＡの存在下またはＣＡの非存在下、結合の手順に供することを含んだ。攪拌は、付随するタンパク質の変性を避けるため、最小限に保たれた。ポリシアリル化されたインシュリンを、イオン交換クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、さらに特徴付けた。結果を、得られた複合体における、ＣＡ：インシュリンモル比の観点から示す（第7表）。
【０１２３】
【表７】
2007501889.tif 000017
【０１２４】
天然の、非酸化ＣＡ（シアノボロヒドリドの存在下）を用いた場合、有意であるが低い程度の複合体が、ＣＡのヘミアセタール基との、その還元末端における反応により観察される（０．０７：１、ＣＡ：インシュリンモル比）ことが、第4表から明白である。
【０１２５】
ＣＡ−インシュリン複合体の形成は、（ＮＨ４）２ＳＯ４（ＣＡ自体は、該塩の存在下では沈殿しない）を添加した際の２つの部分の共沈殿により、さらに確認される。結合の証拠はまた、イオン交換クロマトグラフィ（ＩＥＣ）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により確認される。
【０１２６】
実施例７−Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
実施例６のインシュリン及びポリシアリル化されたインシュリン構造物(constructs)を、正常な雌性Ｔ／Ｏ非近交系マウス（体重２２〜２４グラム）における、これらの血中グルコースレベル低減能について試験した。動物を５つのグループに分け、インシュリン（０．９％塩化ナトリウム中にマウスあたり０．３単位、または同様のポリシアリル化されたインシュリンのタンパク質等価物を有する）を皮下注射（ｓ．ｃ．）し、血液試料中のグルコースレベルを、グルコースアッセイキット(Accu-Chek Advantage, Roche, UK)を用い、時間間隔をおいて測定した。
【０１２７】
結果
ポリシアリル化されたインシュリン構造物の薬裡学的活性は、皮下注射され、時間間隔をおいて採血された(bled)正常なマウスにおけるインタクトなインシュリンのそれに匹敵した。３種類のインシュリンについてのマウスの血中グルコースレベルを、図１７に示す。データポイントは、５つの試料の平均を示し、エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ値である。図１７における結果は、ポリシアリル化されたインシュリン（元来の方法（ＣＡＯを用いた）及び新規な２回−酸化方法（単官能性ＣＡＯＲＯを用いた）により調製された）が、血中グルコースレベルのより延長された低減を発揮したことを明白に示す。このように、グルコースレベルが、インタクトなインシュリンを用いた処置の０．７５時間後に底値に到達し、２時間後に正常なレベルに戻るのに対し、ポリシアリル化されたペプチドを用いて処置されたマウスにおけるグルコースレベルは、同様に０．７５時間において最低であるが、６時間で正常値に戻った。
これらの結果は、ＣＡＯ−インシュリン及びＣＡＯＲＯ−インシュリンが、非誘導体化インシュリンの場合よりも、著しく、有意に長い滞留時間を循環中で生じ、天然のインシュリンと比較し、カーブの上の領域において増大を生じることを証明する。
【０１２８】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１ａ】図１ａは、非還元性シアル酸末端ユニットの従来技術による活性化を示す反応スキームである。
【図１ｂ】図１ｂは、反応スキーム１ａの生成物のアルデヒド部分の、タンパク質−アミン部分を用いた、従来技術による還元アミノ化を示す反応スキームである。
【図２ａ】図２ａは、還元性末端に関連する図１ｂの反応において生じる可能性のある副反応を示す概略図である。
【図２ｂ】図２ｂは、図２ａの副反応の、可能性のある副生成物を、図式的に示す。
【図３】図３は、ＰＳＡの還元性末端シアル酸ユニットの、ケタールと閉環形態間の、互変異性を示す反応スキームである。
【図４ａ】図４ａは、ＰＳＡの好ましい酸化−還元酸化反応を示す反応スキームである。
【図４ｂ】図４ｂは、図４のスキームのステップに好適な条件を示し、出発原料、中間生成物及び最終生成物について用いられる略語を説明する。
【図５】図５は、図２ｂと同様であるが、図４の反応生成物を示す、該略図である。
【図６】図６は、実施例１の生成物のＧＰＣ分析の結果を示す。
【図７】図７は、実施例２のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図８】図８は、実施例3でマウスにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験された複合体の循環半減期の薬物動力学を示す。
【図９】図９は、参考例２におけるＣＡ２２．７ｋＤａについての、ＩＥＣの結果を示す。
【図１０】図１０は、参考例２におけるＣＡ２２．７ｋＤａについての、ネイティブ(native)ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１】図１１は、参考例２．２におけるようにして供給されたいくつかのＣＡ材料及び分離された画分についてのネイティブ(native)ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１２】図１２は、参考例２．２におけるようにして分離されたＣＡの３つの画分についてのＧＰＣクロマトグラムを示す。
【図１３】図１３は、図１２で用いられた２つの試料並びに参考例２．２に記載されるような他のＣＡ及びＣＡＯの試料についてのネイティブ(native)ＰＡＧＥを示す。
【図１４】図１４は、参考例２．４に記載のようなＣＡ（２２．７ｋＤａ）の限外濾過の結果を示す。
【図１５】図１５は、実施例５についての、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを示す。
【図１６】図１６は、実施例５のようにして形成された、分画されたＧＨ−ＣＡ複合体についてのＳＤＳ  ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１７】図１７は、実施例７の結果を示す。
【図１ａ】
2007501889.tif 000027
【図１ｂ】
2007501889.tif 000028
【図２ａ】
2007501889.tif 000029
【図２ｂ】
2007501889.tif 000030
【図３】
2007501889.tif 000031
【図４ａ】
2007501889.tif 000032
【図４ｂ】
2007501889.tif 000033
【図５】
2007501889.tif 000034
【図６ａ】
2007501889.tif 000035
【図６ｂ】
2007501889.tif 000036
【図６ｃ】
2007501889.tif 000037
【図６ｄ】
2007501889.tif 000038
【図７】
2007501889.tif 000039
【図８】
2007501889.tif 000040
【図９】
2007501889.tif 000041
【図１０】
2007501889.tif 000042
【図１１】
2007501889.tif 000043
【図１２】
2007501889.tif 000044
【図１３】
2007501889.tif 000045
【図１４】
2007501889.tif 000046
【図１５】
2007501889.tif 000047
【図１６】
2007501889.tif 000048
【図１７】
2007501889.tif 000049
【図１８】
2007501889.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成17年1月11日(2005.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元性末端にシアル酸ユニットを有する出発原料が、以下の連続するステップ：
ａ）還元性末端シアル酸ユニットの環を還元的開環し、それによってビシナルジオール基を形成するための還元；及び
ｂ）ビシナルジオール基を酸化してアルデヒド基を形成するための選択的酸化
に供される、シアル酸のアルデヒド誘導体の製造方法。
【請求項２】
還元性末端のシアル酸ユニットが、第８炭素原子を介して隣接するユニットと結合し、それによって、ステップｂ）において、第６，７ビシナルジオール基が酸化され、第７炭素原子でアルデヒドを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
出発原料が、ビシナルジオール基を有する非還元性末端において、末端サッカライドユニットを有し、そして、該出発原料を、ステップａ）より前に、ビシナルジオール基をアルデヒドに酸化するために選択的に酸化する予備ステップに供し、それによって、ステップａ）において、アルデヒドも還元され、ビシナルジオール基の一部ではないヒドロキシ基を形成する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
非還元性末端におけるサッカライドユニットがシアル酸ユニットである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
出発原料がジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドである、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項６】
ポリサッカライドが、実質的にシアル酸ユニットのみからなるポリシアル酸である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリサッカライドが、少なくとも２、好ましくは少なくとも５またはさらに好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０のシアル酸ユニットを分子中に有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
予備酸化ステップが、実質的にポリサッカライド鎖の中間鎖(mid-chain)の開裂がないような条件下で行われる、請求項２及び請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
予備酸化ステップが、水溶液中で、１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲の過ヨウ素酸塩の存在下、３〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）が、出発原料のペンダントカルボキシル基が還元されない条件下で行われる、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）が、水溶液中で、１μＭ〜０．１Ｍの濃度範囲のボロヒドリドの存在下、６．５〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
アルデヒド誘導体が、第１級アミン基またはヒドラジド基を有する基質と反応する、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
生成物が還元される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
基質が、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
基質が、ぺプチド治療剤(peptide therapeutic)である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
基質が、アミンまたはヒドラジド基及び官能基に結合する官能基置換基及び二塩基性有機基を有する化合物である、請求項１２または請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
生成物を、次にチオール基を有する化合物、好ましくはタンパク質と反応させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
基質が、ドラッグデリバリーシステム、細胞、好ましくは微生物の細胞または動物細胞、ウィルスまたは合成高分子である、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのシアル酸ユニットを含むジ−、オリゴまたはポリ−サッカライドのアルデヒド誘導体である化合物であって、ここで、還元性末端の末端ユニットが、アルデヒド部分を含む、または、基ＯＲであり、ここで、Ｒは、
【化１】
2007501889.tif 000051
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１、ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１及びＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１から選択され、ここでＲ１はＨ、Ｃ１−２４アルキル、アリールＣ２−６アルカノイル、あるいは、リシン残基のＮ末端またはγ−アミン基によって結合するポリペプチドまたはタンパク質、ドラッグデリバリーシステムである、または、スルフヒドリル基との反応に適応した官能性置換基を有する有機基である、化合物。
【請求項２０】
化合物が、非還元性末端に不動態化されたユニットを有する、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
一般式Ｉ
【化２】
2007501889.tif 000052
ここで、Ｒ３及びＲ４が、
ｉ）Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＯＨである
ii）ＲがＣＨ（ＣＨＯ）ＣＨ２ＯＨまたは−ＣＨ２ＣＨＯである場合、Ｒ３とＲ４が一緒になって＝Ｏである；
iii）ＲがＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＮＨＲ１または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１である場合、Ｒ３がＨであり、そしてＲ４が−ＮＨＲ１である；
iv）Ｒが−ＣＨ（ＣＨ２ＯＨ）ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１または−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１である場合、Ｒ３がＨであり、そしてＲ４が−ＮＨＮＨＲ１である；または、
ｖ）−ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１、Ｒ３及びＲ４が一緒になって＝Ｎ−ＮＨＲ１である；
から選択され、
Ａｃがアセチルである、
を有する、請求項１９または２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ３がＨであり、Ｒ４がＯＨである、請求項２１に記載の化合物。
【請求項２３】
実質的に全てのサッカライドユニットがシアル酸のサッカライドユニットであり、互いに２−８、２−９または２−８／２−９交互で結合しているポリサッカライドである、請求項１９〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
ポリサッカライド鎖中に、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０のシアル酸ユニットを有する、請求項２３のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１が、タンパク質またはペプチドあるいはドラッグデリバリーシステムである、請求項１９〜２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒが、
【化３】
2007501889.tif 000053
である、請求項１９〜２５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒが、
【化４】
2007501889.tif 000054
である、請求項１９〜２５のいずれかに記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１が、ペプチドまたはタンパク質治療剤、好ましくは抗体またはフラグメントである、請求項２５または２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ１が、基
【化５】
2007501889.tif 000055
であり、ここで、Ｒ２が、二塩基性有機基、好ましくはＣ２−１２アルカンジイル基である、請求項１９〜２４のいずれかに記載の化合物。
【請求項３０】
請求項１９〜２９のいずれかに記載の化合物と希釈剤とを含む組成物。
【請求項３１】
請求項２５または２８に記載の化合物と薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項３２】
非還元性末端に末端シアル酸を有するシアル酸出発原料を、以下のステップ：
ｃ）非還元性末端のシアル酸ユニットを第７，８ビシナルジオール基において酸化し、第７アルデヒド(7-aldehyde)を形成するための選択的酸化ステップ；及び、
ｄ）第７アルデヒド基を対応するアルコールに還元するための還元ステップ
に供する方法。
【請求項３３】
出発原料が、ジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ポリサッカライドが、中鎖シアル酸ユニットを含み、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
還元ステップに続いて、還元性末端ユニットを酸化するが、非還元性末端ユニットの酸化及び還元反応において製造された部分を酸化しない酸化ステップを行う、請求項３２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
酸化ステップ（ｃ）が、水溶液中で、１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲の過ヨウ素酸塩の存在下、３〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
還元ステップｄ）が、水溶液中で、１μＭ〜０．１Ｍの濃度範囲のボロヒドリドの存在下、６．５〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項３２〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
一般式II
【化６】
2007501889.tif 000056
ここで、Ａｃがアセチルであり；
ｍが０以上であり；
Ｇｌｙ１Ｏがグリコシルであり；そして、
Ｒ５が有機基である、
を有する化合物。
【請求項３９】
Ｒ５が、Ｒが、
【化７】
2007501889.tif 000057
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１、ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１及びＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１から選択され、ここで、Ｒ１がＨ、Ｃ１−２４アルキル、アリールＣ２−６アルカノイル、あるいは、リシン残基のＮ末端またはγ−アミン基によって結合するポリペプチドまたはタンパク質、ドラッグデリバリーシステムである、または、スルフヒドリル基との反応に適応した官能性置換基を有する有機基である、請求項３８に記載の化合物。
【請求項４０】
Ｒ５が、一般式III
【化８】
2007501889.tif 000058
の基である、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
ＧｌｙＯ基が、シアル酸ユニットを含み、好ましくは実質的にシアル酸ユニットのみからなる、請求項３８〜４０のいずれかに記載の化合物。
【請求項４２】
Ｒ５が、
【化９】
2007501889.tif 000059
である、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｒ１が、ペプチドまたはタンパク質治療剤、好ましくは抗体またはフラグメントである、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の化合物と薬学的賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項４５】
請求項３８〜４３のいずれかに記載の化合物と希釈剤とを含む、組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月20日(2006.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
還元性末端にシアル酸ユニットそしてビシナルジオール基（vicinal diol group）を有する非還元性末端に末端サッカライドを有する出発原料が、以下の連続するステップ：
ａ）ビシナルジオール基をアルデヒドに酸化するための予備選択的酸化、
ｂ）還元性末端シアル酸ユニットの環を還元的開環し、それによってビシナルジオール基を形成するための還元（そしてここで、ステップａ）において形成されたアルデヒドも還元され、ビシナルジオール基の一部ではないヒドロキシ基を形成する）；及び
ｃ）ステップｂ）で形成されたビシナルジオール基を酸化してアルデヒド基を形成するための選択的酸化
に供される、シアル酸のアルデヒド誘導体の製造方法。
【請求項２】
還元性末端のシアル酸ユニットが、第８炭素原子を介して隣接するユニットと結合し、それによって、ステップｂ）において、第６，７ビシナルジオール基が酸化され、第７炭素原子でアルデヒドを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非還元性末端におけるサッカライドユニットがシアル酸ユニットである請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
出発原料がジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドである、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
ポリサッカライドが、実質的にシアル酸ユニットのみからなるポリシアル酸である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ポリサッカライドが、少なくとも２、好ましくは少なくとも５またはさらに好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０のシアル酸ユニットを分子中に有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
予備酸化ステップが、実質的にポリサッカライド鎖の中間鎖(mid-chain)の開裂がないような条件下で行われる、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
予備酸化ステップが、水溶液中で、１ｍＭ〜１Ｍの濃度範囲の過ヨウ素酸塩の存在下、３〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）が、出発原料のペンダントカルボキシル基が還元されない条件下で行われる、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｂ）が、水溶液中で、１μＭ〜０．１Ｍの濃度範囲のボロヒドリドの存在下、６．５〜１０の範囲のｐＨ、０〜６０℃の範囲の温度及び１分〜４８時間の範囲の時間で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
アルデヒド誘導体が、第１級アミン基またはヒドラジド基を有する基質と反応する、上記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１２】
生成物が還元される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
基質が、ペプチドまたはタンパク質である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
基質が、ペプチド治療剤(peptide therapeutic)である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
基質が、アミンまたはヒドラジド基及び官能基に結合する官能基置換基及び二塩基性有機基を有する化合物である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
生成物を、次にチオール基を有する化合物、好ましくはタンパク質と反応させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
基質が、ドラッグデリバリーシステム、細胞、好ましくは微生物の細胞または動物細胞、ウィルスまたは合成高分子である、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのシアル酸ユニットを含むジ−、オリゴまたはポリ−サッカライドのアルデヒド誘導体である化合物であって、ここで、還元性末端の末端ユニットが、アルデヒド部分を含む、または、基ＯＲであり、ここで、Ｒは、
【化１】
2007501889.tif 000060
−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１、ＣＨ２ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＲ１及びＣＨ２ＣＨ２ＮＨＮＨＲ１から選択され、ここでＲ１はＨ、Ｃ１−２４アルキル、アリールＣ２−６アルカノイル、あるいは、リシン残基のＮ末端またはγ−アミン基によって結合するポリペプチドまたはタンパク質、ドラッグデリバリーシステムである、または、スルフヒドリル基との反応に適応した官能性置換基を有する有機基であり、
そして非還元性末端に不動態化されたユニットを有する、化合物。
【請求項１９】
一般式Ｉ
【化２】
2007501889.tif 000061
［ここで、Ｒ３はＨであり、そしてＲ４はＯＨである］
を有する、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
実質的に全てのサッカライドユニットがシアル酸のサッカライドユニットであり、互いに２−８、２−９または２−８／２−９交互で結合しているポリサッカライドである、請求項１８または請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
ポリサッカライド鎖中に、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、さらに好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも５０のシアル酸ユニットを有する、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ１が、タンパク質またはペプチドあるいはドラッグデリバリーシステムである、請求項１８〜２１のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒが、
【化３】
2007501889.tif 000062
である、請求項１８〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒが、
【化４】
2007501889.tif 000063
である、請求項１８〜２２のいずれかに記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１が、ペプチドまたはタンパク質治療剤、好ましくは抗体またはフラグメントである、請求項２１または請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ１が、基
【化５】
2007501889.tif 000064
であり、ここで、Ｒ２が、二塩基性有機基、好ましくはＣ２−１２アルカンジイル基である、請求項１８〜２１のいずれかに記載の化合物。
【請求項２７】
請求項１８〜２６のいずれかに記載の化合物と希釈剤とを含む組成物。
【請求項２８】
請求項２１または請求項２５に記載の化合物と薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
我々のグループは、以前の学術論文及び登録特許において、タンパク質治療剤の薬物動力学的特性の改善における、天然のポリシアル酸の有用性について記載した(Gregoriadis, 2001; Fernandes and Gregoriadis; 1996, 1997, 2001; Gregoriadis et. al., 1993, 1998, 2000; Hreczuk-Hirst et. al., 2002; Mital, 2004; Jain et. al., 2003, 2004; US-A-05846,951; WO-A-0187922)。今回、我々は、新規な組成物及び、ＰＳＡ誘導体化タンパク質（及び治療剤の他の形態）を製造する新規な方法をもたらす、新規なＰＳＡｓの誘導体を記載する。これらの新規な原料及び方法は、医療倫理及び監督機関（例えば、ＦＤＡ、ＥＭＥＡ）の安全要求事項のため、薬物(drug entity)の化学的及び分子的定義(definition)が非常に重要なヒト及び動物における使用を意図されるＰＳＡ誘導体化治療剤に対し、特に有用である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
タンパク質のような治療剤へのポリサッカライドの付着のための方法は、以前に記載された(Jennings and Lugowski 1981, US-A-5846,951 ;WO-A-0187922)。これらの方法のうちのいくつかは、タンパク質反応性アルデヒド部分を生じるための、ポリマーの「非還元性末端」の化学的誘導体化（図１）に依存する。これは、ＰＳＡ及び他のポリサッカライドの還元性末端は、結合の間のタンパク質の配座(conformation)並びにＰＳＡとタンパク質の化学的結合性(integrity)を保護するために必要な穏和な条件下で、タンパク質と弱い反応性しか示さないためである。非還元性シアル酸末端ユニット（terminal unit）はビシナルジオールを含むため、過ヨウ素酸塩を用いて容易に（及び選択的に）酸化され、タンパク質に対してより反応的であり、還元アミノ化及び他の化学反応によるタンパク質の結合に好適な反応性エレメントを含むモノアルデヒド形態を生じる。我々は、これについて、ＵＳ−Ａ−５８４６，９５１およびＷＯ−Ａ−０１８７９２２に記載した。該反応は、図１中に図説され、ここで、
ａ）は、非還元性末端においてタンパク質反応性アルデヒドを形成するための、過ヨウ素酸塩を用いた、コロミン酸（Ｅ．ｃｏｌｉからの、アルファ−２，８結合ポリシアル酸）の酸化を示し、
ｂ）は、タンパク質アミノ基との安定で不可逆性の共有結合を形成するための、ソディウムシアノボロヒドリドを用いた、シッフ塩基の選択的還元を示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の方法において、出発原料がジ−、オリゴ−またはポリ−サッカライドである場合、出発原料は、ビシナルジオール基を有する非還元性末端において末端サッカライドユニットを有するのが好ましく、該方法において、出発原料は、ステップａ）の前に、ビシナルジオール基をアルデヒドに酸化するための選択的酸化の予備ステップに供され、それにより、ステップａ）において、アルデヒドも還元され、ビシナルジオール基の一部でないヒドロキシ基を形成する。本発明は、出発原料の還元性末端の末端ユニットがシアル酸ユニットである場合に特に有用である。代替の実施形態において、出発原料は、出発原料の非還元性末端サッカライドユニットでステップａ）に対してそれ自体を保つビシナルジオール(vicininal diol)基を有し得る。それは、還元ステップによっては修飾されないだろうが、酸化ステップにおいて酸化され、アルデヒド基を形成するだろう。生成物は二官能性であり、基質上の好適な官能基と両方のアルデヒド基における反応によって基質を架橋する能力に由来する有用な治療活性を有し得る。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
本発明によれば、シアル酸部分を含む、ジ−、オリゴまたはポリサッカライドのアルデヒド誘導体である新規な化合物がさらに提供される：ここで、還元性末端における末端ユニットは基ＯＲであり、ここで、Ｒは、
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
ポリシアル酸または他のポリサッカライドアルデヒド誘導体の新規な好ましい単官能性形態は、薬学的に許容される生成物の合成及び製造をより助ける。なぜなら、それは、修飾されていない還元性末端を有するポリマー形態の使用により意図されることなく引き起こされる相当な複雑さを避けることができるからである（図２）。ポリマーの新規な形態の生成（図４）は、非還元性末端にアルデヒド官能性を導入するための選択的酸化（好ましくは我々の以前の開示のような過ヨウ素酸による）を含む。しかしながら、図１に図説される従来技術とは異なり、このアルデヒド部分は、その後、例えばボロヒドリドを用いて、還元により破壊される。ポリマーの他の末端において、ボロヒドリド還元ステップはさらに同時に、ヘミケタールの還元により、還元性末端の環構造の開環を固定する。この同時に起こるケトンのヒドロキシル部分への還元は、第二の酸化ステップにおける選択的酸化に反応しやすい新たなジオール官能性を導入する。天然のポリマーが（首尾よく）過ヨウ素酸塩を用いて酸化され、ボロヒドリドを用いて還元され、そして、過ヨウ素酸塩を用いて２度目の酸化をされた場合、厳密に単官能性であり、還元性末端のみにおいて単一の反応性基（アルデヒド）を有する新規なポリマー形態が作られる（図３）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
参考例２．２
小規模の(at smaller scale)分画
以下の試料を、同一の洗浄及びグラジエントシステムを小規模（７５ｍｌまでのマトリックス；０．２〜３グラムのコロミン酸）で用い、分画した：
コロミン酸（ＣＡ、２２．７ｋＤａ、ｐｄ  １．３４；ＣＡ、３９ＫＤａ、ｐｄ＝１．４）、コロミン酸−アルデヒド（ＣＡＯ、２２．７ｋＤａ、ｐｄ  １．３４）、単官能性コロミン酸（ＣＡＯＲＯ、２２．７ｋＤａ；ｐｄ  １．３４）、コロミン酸−アミン（ＣＡ−ＮＨ２、２２．７ｋＤａ、ｐｄ  １．３４）、コロミン酸マレイミド（ＣＡＭ、実施例４による）そして、製造されたＣＡの分子量を終始モニターした。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
【表４】
2007501889.tif 000065
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０８】
コロミン酸及びその誘導体（２２．７ｋＤａ）は、１．１未満の多分散性、４６ｋＤａまでの平均分子量、種々の％のポピュレーションを有する様々な狭い種(narrow species)に、首尾よく分画された。図９及び１０；第4表は、７５ｍｌのスケールにおける、２２．７ｋＤａの材料の分離の結果を示す。図９はＧＰＣの結果であり、図１０はネイティブ(native)ＰＡＧＥである。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
成長ホルモン−コロミン酸複合体の調製
成長ホルモンを０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解し、種々のコロミン酸（ＣＡＯ及びＮＣＡＯ）に共有結合させた。種々のＣＡｓ（２２．７ｋＤａ、ＣＡＯ；２７．７ｋＤａ及び４０．９ｋＤａ、ＮＣＡ）を、ＣＡ：ＧＨモル比（１２．５：１）でＧＨ（２ｍｇ）にそれぞれ添加し、ソディウムシアノボロヒドリドを最終濃度４ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。反応混合物に封をし、３５±２℃で２４時間、磁気的に攪拌した。その後、混合物を、継続的に攪拌しながら、飽和度７０％  ｗ／ｖに達するまで硫酸アンモニウムをゆっくり添加することにより、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）沈殿反応に供し、４℃で１時間攪拌した後、１５分間遠心（５０００ｘｇ）し、ペレットを飽和（ＮＨ４）２ＳＯ４に再懸濁し、再び１５分間遠心した（５０００ｘｇ）。回収した沈殿を１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に再溶解し、４℃で、同様のバッファーに対して、充分に（２４時間）透析した。コントロールは、天然のタンパク質を、非酸化ＣＡの存在下またはＣＡの非存在下、結合の手順に供することを含む。攪拌は、付随するタンパク質の変性を避けるため、最小限に保たれた。ポリシアリル化されたＧＨを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、特徴付けた。ポリシアリル化されたＧＨは、参考例２に記載されているように、アニオン交換クロマトグラフィーを通過され、生成物画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥに供した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
インシュリン−コロミン酸複合体の調製
インシュリンを、最小限の体積の１５ｍＭ  ＨＣｌに溶解し、その後、０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈し、種々のコロミン酸（ＣＡ、ＣＡＯ及び単官能性ＣＡＯＲＯ）に共有結合させた。コロミン酸（２２．７ｋＤａ）を、ＣＡ：インシュリンモル比２５：１で、インシュリン（２ｍｇ）と共に、ソディウムシアノボロヒドリド（４ｍｇ／ｍｌ）を含む０．１５Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４；２ｍｌ）中で４８時間、封をした容器に入れて磁気的に攪拌しながら、３５±２℃のインキュベーター中で反応させた。その後、混合物を、継続的に攪拌しながら、飽和度７０％  ｗ／ｖに達するまで硫酸アンモニウムをゆっくり添加することにより、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）沈殿反応に供した。試料を４℃で１時間攪拌した後、１５分間遠心（５０００ｘｇ）し、ペレットを（ＮＨ４）２ＳＯ４の飽和溶液に懸濁し、再び１５分間遠心した（５０００ｘｇ）。回収した沈殿を、０．９％ＮａＣｌを追加した１ｍｌの０．１５Ｍ  Ｎａリン酸バッファー（ｐＨ７．４；ＰＢＳ）に再溶解し、４℃で、同じＰＢＳに対して、充分に（２４時間）透析した。その後、該透析物を、シアル酸及びタンパク質含有量について分析し、生じた複合体を、ＣＡ：インシュリンモル比の観点から示した（実施例１のように）。コントロールは、天然のタンパク質を、記載された条件下で、非酸化ＣＡの存在下またはＣＡの非存在下、結合の手順に供することを含んだ。攪拌は、付随するタンパク質の変性を避けるため、最小限に保たれた。ポリシアリル化されたインシュリンを、イオン交換クロマトグラフィー及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、さらに特徴付けた。結果を、得られた複合体における、ＣＡ：インシュリンモル比の観点から示す（第7表）。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
天然の、非酸化ＣＡ（シアノボロヒドリドの存在下）を用いた場合、有意であるが低い程度の複合体が、ＣＡのヘミアセタール基との、その還元末端における反応により観察される（０．０７：１、ＣＡ：インシュリンモル比）ことが、第７表から明白である。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
参考文献
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【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2007501889.tif 000066
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2007501889.tif 000067
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2007501889.tif 000068
【国際調査報告】
2007501889.tif 000069
2007501889.tif 000070
2007501889.tif 000071
2007501889.tif 000072
2007501889.tif 000073