(57)【要約】  本発明は癌の治療に関する。特に、本発明はシラメシンを含む癌治療用医薬調合物を提供する。本発明はさらに、シラメシンを癌を患っている患者に投与することを含む治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に使用される医薬調合物を製造するために、シラメシンまたはその薬学的に許容される塩を使用する方法。
【請求項２】
癌の治療において化学療法剤の高められた効果を増強するおよび／または提供するのに有用な医薬調合物を製造するために、シラメシンまたはその薬学的に許容される塩を使用する方法。
【請求項３】
癌の治療において化学療法剤と組み合わせて使用される医薬調合物を製造するために、シラメシンまたはその薬学的に許容される塩を使用する方法。
【請求項４】
医薬調合物がさらに別の化学療法剤を含む、癌の治療に使用するための医薬調合物を製造するために、シラメシンまたはその薬学的に許容される塩を使用する方法。
【請求項５】
癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、神経膠腫、神経芽腫、黒色腫、白血病、骨髄癌または皮膚癌から選択される、請求項1〜4のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項６】
化学療法化合物が、エトポシド、ドキソルビシン、スタウロスポリン、ビンクリスチンおよびタモキシフェン、またはその薬学的に許容される塩から選択される、請求項2〜4のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項７】
前記癌の治療が放射線治療と組み合わされる、請求項1〜6のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項８】
シラメシンがフマル酸塩または塩酸塩として使用される、請求項1〜7のいずれか1つに記載の使用方法。
【請求項９】
シラメシンまたはその薬学的に許容される塩、および場合により薬学的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含む医薬調合物。
【請求項１０】
シラメシンまたはその薬学的に許容される塩、および化学療法剤、および場合により薬学的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含む医薬調合物。
【請求項１１】
シラメシンまたはその薬学的に許容される塩、および化学療法剤、および場合により薬学的に許容されるキャリアーまたは希釈剤を含むキット。
【請求項１２】
有効量のシラメシンまたはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを含む癌の治療方法。
【請求項１３】
癌が、肺癌、前立腺癌、乳癌、神経膠腫、神経芽腫、黒色腫、白血病、骨髄癌または皮膚癌から選択される、請求項12記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の治療に有用な薬剤を製造するためにシラメシンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍細胞は、古典的なカスパーゼが介在するアポトーシスのような古典的な治療様式に対してしばしば耐性を獲得する。しかし、癌の治療のための新規で有効な薬剤に対する大きな需要は今なお満たされていない。
【０００３】
シグマ2受容体は多くの異なるタイプの癌を示す細胞においてアップレギュレートされることが知られており（非特許文献1）、さらにシグマ2受容体リガンドが腫瘍細胞において細胞増殖を阻害し、アポトーシスを誘導することが知られている（非特許文献2；非特許文献3）。さらに、シグマ2リガンドは抗腫瘍薬の活性を増強することが示されている（非特許文献3）。
【０００４】
特許文献1には、精神疾患および神経疾患の領域における治療に有用であると考えられる、一連のシグマ受容体リガンドが開示されている。これらの化合物の構造活性相関もさらに非特許文献4により調べられている。
【０００５】
その他の数多くの化合物の中にあって、特許文献1は化合物1’-[4-[1-(4-フルオロフェニル)-1H-インドール-3-イル]-1-ブチル]-スピロ[イソベンゾフラン-1(3H)-4’--ピペリジン] （シラメシン（Siramesine））
【０００６】
【化１】
2007514666.tif 000002
【０００７】
を開示しており、その新規の用途が本発明の対象である。
【特許文献１】国際公開（WO）第92/22554号パンフレット
【非特許文献１】Bem et al. 1991, Cancer Res. 51, 6558; Vilner et al. 1995, Cancer Res. 55, 408
【非特許文献２】Brent & Pang, 1995, Eur. J. Pharmacol. 278, 151
【非特許文献３】Crawford & Bowen, 2002, Cancer Res. 62, 313
【非特許文献４】Perregaard, J. et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 11, p. 1998-2008
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今回、驚くべきことに、シラメシンが参照のシグマ2リガンドよりも、その抗発癌活性において有意に強力であることが見出された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明により癌の治療用薬剤が提供される。
【００１０】
シグマ2受容体リガンドは、種々の由来の癌細胞においてアポトーシスを誘導することが知られている。驚くべきことに、単独で使用した場合に、本発明のシラメシンがハロペリドールのようなシグマ2活性な参照化合物よりも、癌細胞でのアポトーシス誘導においてより強力であることが今回見出された。さらに、エトポシド、ドキソルビシン、スタウロスポリン、ビンクリスチンおよびタモキシフェンのような既知の化学療法剤化合物と併用した場合に、シラメシンの有意な相乗効果が観察された。従って、本発明により、シラメシンを癌治療用医薬調合物の製造に使用できること、および前記調合物を他の化学療法的癌治療薬と組み合わせておよび／または放射線治療と組み合わせて使用できることが示される。シラメシンおよび抗癌化学療法薬剤の併用において、該薬剤は同時にまたは連続して投与することができる。
【００１１】
1つの実施態様において、本発明は、活性成分の同時投与に適合する上述のような医薬調合物を製造するために、シラメシンまたはその薬学的に許容される塩を、化学療法薬と一緒に相乗効果を有する用量で使用する方法に関する。特に、前記医薬調合物は、同一の単位剤形（unit dosage form）、例えば同一の錠剤またはカプセル剤内に活性成分を含むことができる。前記単位剤形は、活性成分を均一な混合物として、または単位剤形の別々の区画（compartments）において含むことができる。
【００１２】
もう1つの実施態様において、本発明は、活性成分の連続投与に適合する上述のような医薬調合物またはキットを製造するために、シラメシンまたはその薬学的に許容される塩を、化学療法薬と一緒に相乗効果を有する用量で使用する方法に関する。特に、前記医薬調合物は、別々の単位剤形、例えば活性成分のそれぞれを含んでいる別々の錠剤またはカプセル剤に活性成分を含むことができる。これらの別々の単位剤形は、同一の容器またはパッケージ、例えばブリスターパックに含まれていてもよい。
【００１３】
本明細書において使用される場合に、キットという語句はそれぞれの活性成分を含むが、別々の単位剤形において含む医薬調合物を意味する。
【００１４】
本明細書において使用される場合に、「相乗効果を有する用量」という語句は、それらの併用により相乗効果、好ましくは最大限の獲得可能な相乗効果がもたらされるシラメシンおよび化学療法剤の用量を意味する。
【００１５】
本発明の医薬調合物またはキットは、上述のような活性成分の同時投与または活性成分の連続投与に適用することができる。
【００１６】
さらに具体的には、本発明は、癌治療用薬剤を製造するために、一般式
【００１７】
【化２】
2007514666.tif 000003
【００１８】
を有するシラメシンまたはその薬学的に許容される塩の新規の使用方法に関する。
【００１９】
さらに本発明は、それを必要とする個体に薬学的に許容される量のシラメシンまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、癌の治療方法に関する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、化学療法剤で治療される、または化学療法剤での治療を受けている個体に、シラメシンまたはその薬学的に許容される塩を投与することを含む癌の治療方法に関する。
【００２１】
本発明において、化合物1’-[4-[1-(4-フルオロフェニル)-1H-インドール-3-イル]-1-ブチル]-スピロ[イソベンゾ-フラン-1(3H),4’-ピペリジン]（シラメシン）は、該化合物の塩基として、またはその薬学的に許容される酸付加塩として、または前記塩の無水物（anhydrate）または水和物として使用することができる。本発明に使用される化合物の塩は、非毒性の有機酸または無機酸で形成する塩である。前記有機塩の例としては、マレイン酸、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、コハク酸、シュウ酸、ビスメチレンサリチル酸（bis-methylenesalicylic）、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸（ethane-disulfonic）、酢酸、プロピオン酸、酒石酸、サリチル酸、クエン酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、桂皮酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、イタコン酸、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸およびテオフィリン酢酸（theophylline acetic acids）ならびに8-ハロテオフィリン（8-halotheophyllines）、例えば8-ブロモテオフィリン（8-bromo-theophylline）による塩が挙げられる。前記無機塩の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸による塩が挙げられる。好ましくは前記化合物はフマル酸塩または塩酸塩として使用される。
【００２２】
1’-[4-[1-(4-フルオロフェニル)-1H-インドール-3-イル]-1-ブチル]-スピロ[イソベンゾ-フラン-1(3H),4’-ピペリジン]のフマル酸塩は、「Perregaard, J. et al., J. Med. Chem., 1995, 38, 11, 1998-2008 (化合物14f)」に記載されるとおりに製造することができ、塩基およびその他の薬学的に許容される塩は標準的な手法により得ることができる。
【００２３】
従って、本発明の酸付加塩は、不活性溶剤中における1’-[4-[1-(4-フルオロフェニル)-1H-インドール-3-イル]-1-ブチル]-スピロ[イソベンゾ-フラン-1(3H),4’-ピペリジン]の酸での処理、それに続く公知の方法による沈殿、単離および場合により再結晶化、および必要な場合には結晶質生成物の湿式または乾式粉砕もしくはその他の慣用の工程による微粒子化、または溶剤−乳化工程からの粒子の製造により得ることができる。
【００２４】
前記塩の沈殿は、好ましくは不活性溶剤、例えばアルコール（例えばエタノール、2-プロパノールおよびn-プロパノール）のような不活性極性溶剤中において実施される。
【００２５】
本発明において、1’-[4-[1-(4-フルオロフェニル)-1H-インドール-3-イル]-1-ブチル]-スピロ[イソベンゾフラン-1(3H),4’-ピペリジン]またはその薬学的に許容される塩は、適当な経路、例えば経口または非経口において投与することができ、前記投与のために適当な形態で、例えば錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤または注射用の液剤または分散剤で存在することができる。好ましくは、そして本発明の目的に従って、本発明の化合物は固体の医薬調合物の形態で、適当には錠剤またはカプセル剤としてまたは注射用の懸濁剤、液剤または分散剤の形態で投与される。
【００２６】
固体の医薬調合物を製造する方法は、本技術分野において公知である。従って、錠剤は、活性成分を通常のアジュバントおよび／または希釈剤と混合し、引き続いて該混合物を慣用の打錠機において圧縮することにより製造することができる。アジュバントまたは希釈剤の例には、コーンスターチ、ラクトース、滑石（talcum）、ステアリン酸マグネシウム、ゼラチン、ラクトース、増粘剤（gums）等が含まれる。着色剤（colourings）、香料（aroma）、保存剤等のようなその他のアジュバントまたは添加剤はいずれも、活性成分と適合することを条件として使用することができる。
【００２７】
本明細書において使用される場合に、「調合物」という語句は、一定の量における一定の成分を含む生成物、ならびに一定の量における一定の成分の組み合わせから直接的にまたは間接的に得られる生成物を包含するものである。
【００２８】
活性成分を含む医薬調合物は、経口で使用するために適している形態、例えば錠剤、トローチ剤、ドロップ剤（lozenges）、水性または油性懸濁剤、分散可能な散剤または顆粒、乳剤、硬または軟カプセル剤、またはシロップ剤またはエリキシル剤でよい。経口で使用するための調合物は、医薬調合物の製造に関する当業者に公知の方法に従って製造され、上品なおよび口当たりのよい医薬調合物を提供するために、前記調合物は甘味剤、香料添加剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される1つまたはそれ以上の物質を含むことができる。錠剤は、錠剤の製造に適した非毒性の薬学的に許容される賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性な希釈剤；造粒剤および崩壊剤、例えば微結晶性セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コーンスターチまたはアルギン酸；結合剤、例えばスターチ、ゼラチン、ポリビニル-ピロリドンまたはアカシア、および平滑剤（lubricating agents）、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクでよい。
【００２９】
本発明の調合物は哺乳類、好ましくはヒトにおける癌の治療に使用することができる。
【００３０】
本発明の用途のためのシラメシンまたはその塩は、最も都合よくは、約0.01 μg/kg/日〜100 mg/kg/日、好ましくは体重1 kgあたり1日約0.01 μg〜100 mg、最も好ましくは体重1 kgあたり1日0.5 mg 〜7.0 mgの量で活性成分（遊離形態として計算）を含む錠剤またはカプセル剤のような単位剤形で、経口的に投与される。
【００３１】
大きな効果を得るために、または副作用を最小限にするためにその他の化合物を通常以下の用量で使用するために、シラメシンをその他の化合物と組み合わせる場合には、通常以下の用量のシラメシンおよび／またはその他の化合物を治療に使用することができる。患者に特異的な用量の計算は、当業者であれば通常実施できることである。
【００３２】
本発明により提供される医薬調合物および方法は、皮膚癌、乳癌、脳腫瘍、子宮癌、精巣癌等のような固形癌を含む癌の治療に特に有用であると考えられる。さらに具体的には、本発明の化合物、調合物および方法により治療することができる癌には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：心臓：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支癌（扁平上皮細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞細胞癌（細気管支癌）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨腫様過誤腫、中皮腫；胃腸：食道（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管腺癌（ductal adenocarcinoma）、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ベポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫[腎芽細胞腫]、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胎生期癌、奇形癌、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、胚芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨原性肉種（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫、脊索腫、骨軟骨腫（osteochronfroma）（骨軟骨性の外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫瘍；神経系：頭蓋（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳（星状細胞腫、髄芽細胞腫、神経膠腫、脳室上衣細胞腫、胚細胞腫[松果体腫]、多形性神経膠芽腫、乏突起膠腫、神経鞘腫、網膜芽腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；婦人科医学的：子宮（子宮内膜癌）、頚部（頚癌（前腫瘍性子宮頚部形成異常））、卵巣（卵巣癌[漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類されていない癌]、顆粒膜−莢膜細胞腫、セルトーリ−ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌）；血液学的：血液（骨髄性白血病[急性および慢性]、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫[悪性リンパ腫]；皮膚：悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、異形成性母斑（moles dysplastic nevi）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬；および副腎：神経芽腫。
【００３３】
従って本明細書において使用される場合に、「癌細胞」という語句には、上記に同定された状態のいずれか1つに苛まれている細胞も含まれ、そして「癌」という語句には、上記に同定された状態のいずれも含まれるがそれに限定はされない。上述される状態はいずれも単一の実施態様として考えられ、従って、癌という語句が使用される場合に、それぞれの状態の治療に向けられる調合物が個々に特許請求され得るか、または特許請求の範囲に含まれ得る。上記の癌の適用のいずれか1つが、シラメシン、医薬調合物、キット、治療方法の使用方法に関連して言及される場合にはいつでも、それが個々の実施態様となる。従って、上記で特定される適用は、シラメシン、医薬調合物、キット、治療方法および治療に有用な化合物に同定方法の使用方法と一緒に個々に特許請求され得る。
【実施例】
【００３４】
細胞培養
マウス線維肉腫細胞WEHI-S、Wn902、Wn912およびWEHI-R4は、それぞれ正常細胞、ベクターコントロール細胞、Hsp70過剰発現細胞およびhTNF耐性細胞である。試験されるその他の細胞のタイプには、ヒト乳癌細胞タイプのMCF7-S1およびMDA-MB-468、および非腫瘍性の不死化乳房上皮細胞HBL100が含まれる。MCF7 casp3.1および-3.3およびneo2は、カスパーゼ3およびベクターを発現する単一の細胞クローンである。MCF7 pCEP、-Bcl2 WT、-Bcl2 NT、-Bcl2 Actaおよび-Bcl2 Cb5は、ベクター、野生型Bcl2、細胞質局在Bcl2、ミトコンドリア局在Bcl2およびER局在Bcl2を発現する単一の細胞クローンである（Maria Hoyer Hansen、アポトーシス研究所（Apoptosis Laboratory）、デンマーク癌協会（Danish Cancer Society））。ヒト神経芽細胞腫由来細胞株SK-N-MC細胞（ATCC、USA）。さらにヒト子宮頚癌由来細胞株Hela（デンマーク癌協会のDr. J. Lukasより贈答）およびME180を用いて試験を行った。HEK293-A、前立腺癌由来細胞株PC3、および非腫瘍性の不死化前立腺上皮細胞株PNT1Aを同様に用いて試験を行った。形質転換されていないNIH3T3マウス線維芽細胞はC. Holmberg（コペンハーゲン大学、デンマーク）より贈答された。記載されているとおりに（Fehrenbacher et al, 2004）、線維芽細胞をpBabe-puro mock、-SV40LT、-v-Ha-ras、-c-srcにより形質導入した。細胞は、10%の非働化仔ウシ血清（Biological Industries社、Beit Haemek、イスラエル）、0.1 mMの非必須アミノ酸（Invitrogen社）および抗生物質を添加したDMEM (Invitrogen社、ペーズリー、英国)、または6%の非働化仔ウシ血清および抗生物質を添加したRPMI-1640 (Invitrogen社)中で、加湿した5% CO2雰囲気下において37℃で培養した。細胞は繰り返し試験され、ヘキスト染色（H-33342、Molecular Probes社、ユージーン、オレゴン州）によりマイコプラズマ陰性であることが確認された。
【００３５】
細胞膜または組織膜への[3H]シラメシンの結合
上述された細胞株から調製した組織、またはげっ歯類またはヒト由来の組織上におけるシラメシン感受性結合部位の存在を、「Soby, K. et al., Neuropharmacol., 2002, 43, 95-100」に記載されている[3H]Lu 28-179 (シラメシン)結合試験を用いて実証した。簡単にいうと、細胞を上述のように培養し、細胞スクレーパー（cell scraber）を用いてリン酸緩衝食塩水に回収して、遠心分離を行った（1000 x g、10分）。得られるペレットを「Soby et al., 2002」に記載される[3H]Lu 28-179結合試験に使用した。
【００３６】
アポトーシス刺激
以下のアポトーシス刺激について試験を行った： シラメシン (Lu-28-179)、シラメシン類似体：28131M、28134M、29288O、32160F、32124Cおよび 32168F、およびハロペリドール (H. Lundbeck A/S社、コペンハーゲン、デンマーク)、ヒトTNF-a (Strathmann Biotech Gmbh社、ドイツ)、タプシガルジン、エトポシド、ドキソルビシン、スタウロスポリン、ビンクリスチン、タモキシフェン(SIGMA-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)、コンカナマイシンA (Alexis Biochemicals社、サンディエゴ、カリフォルニア州)。
【００３７】
薬理学的阻害剤および薬剤
以下のプロテアーゼ阻害剤を使用した：zVAD-fmk、DEVD-fmk (Bachem Bubendorf社、スイス)、DEVD-CHO (Neosystems社、ストラスブール、フランス)、LEHD-CHO、zFA-fmk (Enzyme System Products社、リバーモア、カリフォルニア州)、CA-074-Me (Peptides International社、ルイビル、ケンタッキー州)、APC11138 (Celera Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア州、USA)、ペプスタチンA、PD150606および カルパイン阻害剤I (CI) (Calbiochem社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州)、TPCK (Boehringer Mannheim社)、ペファブロック（pefabloc） (AEBSF) (Roche Diagnostics社、DK)。
【００３８】
以下の抗酸化剤を使用した：ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、α-トコフェロール、γ-トコフェロール、グルタチオンエチルエステル (GSH)、N-アセチル-システイン (NAC) (SIGMA-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州)。細胞を、薬剤に先がけて阻害剤および抗酸化剤とともにプレ-インキュベートした。
【００３９】
さらに、以下の薬剤のシラメシン細胞毒性における効果の試験を行った：シグマ2-受容体アンタゴニストBD1047 (Tocris社) およびAC927 (米国Brown 大学の W. Bowen氏より贈呈)、3-メチル-アデニン、アクチノマイシンD、シクロヘキサミドおよびコレステロール。
【００４０】
細胞死の検出
細胞生存率
細胞生存率をMTT還元アッセイを用いて測定した。テトラゾリウム塩3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラソディウムブロミド (MTT、SIGMA-Aldrich社)  の青色ホルマザン生成物への変換を、Versamaxマイクロプレートリーダー（Molecular Devices社）を用いて570 nmにおける吸収により分光光度法で評価した。生存率は、無処理細胞または阻害剤処理細胞の比率として測定した。細胞を200μLの培地を含む96ウェルプレートに播種し、次の日に薬剤で処理した。細胞の生存における効果を、100μLの培地を除去し、25μLのMTT溶液（1 mg/mLのPBS溶液、ろ過滅菌済み）を添加することにより、薬剤添加24〜60時間後に評価した。次の日に、暗所における37℃での3時間のインキュベーション後、細胞を100μLの可溶化緩衝液（50 %ジメチルホルムアミド溶液中における20 %のSDS）を用いて透過させ、分光光度計により解析を行った。
【００４１】
細胞死および細胞毒性
細胞死および細胞毒性を、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）放出アッセイ（Roche社、マンハイム、独国）を用いて概算した。細胞質LDHを培養液中に放出する原形質膜の破裂が、細胞毒性または細胞の溶解の尺度である。ラクテートをピルベートに酸化し、NAD+をNADH + H+に還元するLDHの酵素活性を、テトラゾリウム塩（黄色）のホルマザン塩（赤色）への変換により分光光度法で測定した。細胞を播種し、MTTアッセイの記載のとおりに処理した。解析において、50μLの培地を除去し、50μLの反応緩衝液を加えて混合した。残った培地を除去し、細胞を1 %のTriton X-100において37℃で20分間溶解させた。細胞溶解液におけるLDH量を測定し、LDH放出%の推定値を計算した。
【００４２】
細胞毒性 (LDH放出%)= LDH培地中/ (LDH培地中+ LDH細胞溶解液中) x 100 %。
【００４３】
核凝縮
細胞死モードを、薬剤処理細胞の核凝縮のタイプおよびヘキスト染色（細胞透過性のHoechst 33342、SIGMA-Aldrich社）を行うことにより調べた。細胞非透過性のSytox Green (Molecular Probes社)を、膜完全性（membrane integrity）の欠失を評価するために使用し、ヘキストを用いた際に観察された核の形態的変化と比較した。細胞を25 mg/mLのヘキストの10000倍希釈したものおよび／または5 mMのsytox greenの10000倍希釈したものとともに37℃で5分間インキュベートし、その後、核凝縮のタイプおよび得られる共染色をオリンパス社の倒立顕微鏡IX-70を用いて解析した。
【００４４】
DNAラダーリング（DNA laddering）の検出のためのゲル電気泳動
細胞を回収し、50℃で120μLの溶解緩衝液（100 mMのNaCl、100 mMのTris-HCl (pH 8.0)、25 mMのEDTA、0.5%のSDSおよび100 μg/mLのプロテイナーゼK）において一晩インキュベートした。該サンプルを6MのNaClを用いて沈殿させ、4℃、13,000 rpmで5分間遠心分離を行った。引き続き、2.5倍容量の96％エタノールにより上清からゲノムDNAを沈殿させた。4℃、20,000 rpmで10分間遠心分離を行い、70%エタノールで洗浄した後、ペレットを10 mMのTris-HCl (pH 8.0)および1 μg/mLのRnase Aを含む1 mMのEDTAに溶解した。該サンプルを37℃で1.5時間インキュベートし、DNA濃度を260 nmにおける吸光度（A）から概算した。DNA（5μg／レーン）を1.5%アガロースゲルにおいて電気泳動して、エチジウムブロマイド染色により可視化した。
【００４５】
カスパーゼおよびカテプシン活性
細胞質システインカテプシン酵素活性を測定するために、24ウェルプレートに播種したサブコンフルエントにある細胞を、20 μg/mLのジギトニンを含む抽出緩衝液（250 mMのスクロース、20 mMのHEPES、10 mMのKCl、1.5 mMのMgCl2、1mMのEDTA、1 mMのEGTA、1mMのぺファブロック；pH 7.5）で、氷上において12〜15分間処理した。細胞全体のシステインカテプシン酵素活性を測定するために、細胞を200 μg/mLのジギトニンを含む上述の抽出緩衝液で、氷上において12〜15分間処理した。カスパーゼ3／7様活性の解析のために、サブコンフルエントにある細胞を氷上においてカスパーゼ抽出緩衝液（0.5 %のTriton X-100、25 mMのHEPES、5 mMのMg2Cl、1 mMのEGTA、1 mMのぺファブロック、pH 7.5）で20分間処理した。カスパーゼ3／7様活性およびシステインカテプシン活性を、それぞれ一倍容量の、カスパーゼ反応緩衝液（100 mM HEPES、20 % グリセロール、0.5 mM EDTA、0.1 % CHAPS、5 mM DTT、1 mM ぺファブロック、pH 7.5）における20 μM Ac-DEVD-AFC (Biomol社)またはカテプシン反応緩衝液（50 mM 酢酸ナトリウム、4 mM EDTA、8 mM DTT、1 mM ぺファブロック、pH 6.0）における20 μM zFR-AFC (Enzyme System Products社)を添加することにより評価した。AFCの遊離（励起400 nm、発光489 nm）のVmaxを、Spectramax Gemini蛍光光度計 (Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州)を用いて30℃で20分かけて解析した。
【００４６】
リソソーム安定性試験、細胞培養
細胞を、リソソーム向性の（lysomotropic） 弱塩基および酸性部分に蓄積する異染性の蛍光色素アクリジンオレンジ (AO、Molecular Probes社)に暴露させた。酸性のリソソームにおいて高濃縮されると、AOは赤色蛍光を示すが、細胞質においては緑色蛍光が再局在化する。リソソームの完全性を観察するために、サブコンフルエントな薬剤処理細胞を0.1〜0.5 μg/mLのAOに37℃で3時間暴露させた。細胞をオリンパス社の倒立顕微鏡IX-70を用いて評価するか、または基体（substratum）から剥がして、出力波長が488 nmのアルゴンイオンレーザーを有しFACSort (Becton Dickinson社、サンノゼ、カリフォルニア州)を用いるフローサイトメトリーによって解析し、CELLQuestソフトウェアを用いて解析した。
【００４７】
リソソーム安定性インビトロ試験
14 cmプレートに播種したMCF-7細胞をFe-デキストランに9時間暴露させ、引き続いて16時間培養液の中においた。その後、細胞をPBSで洗浄し、基体から剥がした。細胞ペレットをSCA緩衝液（20 mM Hepes KOH、10 mM KCl、1.5 mM Mg2Cl、 1 mM EDTA、1 mM EGTA、250 mM スクロース、pH 7.5）に再懸濁し、氷上で20分間平衡化した。該細胞ペレットをテフロン(R)の乳棒を用いて150〜200ストロークにより均質化した。750 gで5分間遠心分離を行った後に、上清を単離し、遠心分離段階を繰り返した。得られた上清を磁気カラム（column contained in a magnetic field）に移した。リソソーム画分を2回洗浄し、カラムから溶出させた。引き続き、リソソームカテプシンの放出をcostar 社の96ウェル黒色プレートにおける25 μLのリソソーム溶液中で、カテプシン活性測定に関する記載のように測定した。37℃で1.5時間反応させた後に、AFCの遊離のVmaxを、Spectramax Gemini蛍光光度計(Molecular Devices社、サニーベール、カリフォルニア州)を用いて30℃で20分かけて解析した。
【００４８】
免疫ブロット解析および免疫蛍光法
使用される一次抗体には、カテプシンB（Oncogene Research Products社、ボストン、マサチューセッツ州）、カテプシンL（Transduction Laboratories社、レキシントン、ケンタッキー州）、シトクロムc（BD Pharmingen社）およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH、Biogenesis社、プール、英国）、Hsp70（2H9; Boris Margulis（サンクト・ペテルスブルク、ロシア）より贈答）に対するマウスモノクローナル抗体、またはウサギポリクローナルカテプシンD（DAKO社、カリフォルニア州）およびAIF（アポトーシス研究所、デンマーク癌研究所）が含まれる。免疫ブロット解析においては、タンパク質を6〜12%のSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。室温で1時間または4℃で一晩、一次抗体とのインキュベーションの後、転写した膜をセイヨウワサビ-ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスまたは抗ウサギIgG二次抗体とともに室温で1時間インキュベートした。引き続いて、タンパク質の検出をECLまたはECL plus（Amersham Biosciences社、バッキンガムシャー州、英国）を用いて行った。
【００４９】
カテプシン、AIFおよびcyt Cを可視化するために、25℃において10分間、-20℃メタノール中で細胞の固定化および透過処理を行った。5%のヤギ血清（PBSにおける1%のBSA、0.3%のTriton X-100中において）で20分間プレブロッキングを行った後、細胞を一次抗体（PBSにおける0.25%のBSA、0.1%のTriton X-100中において）とともに、記載されたように1.5時間インキュベートした。IgG Alexa Fluor-488または-546標識抗マウスIgGまたは抗ウサギ二次抗体（Molecular Probes社）とともに1時間インキュベーションを行った後、細胞をPBSにおける0.05%のTween 20中で3回洗浄し、ProLong Antifadeキット(Molecular Probes社)を用いて標本にした（mounted）。LSM 510ソフトウェアとともにZeiss Axiovert 100M 顕微鏡を使用して、共焦点解析を行った。 
【００５０】
インビボ実験
WEHI-R4細胞（5 x 106）を免疫応答性の雌BALB/cマウスの背中の皮下に移植した。シラメシン治療を腫瘍移植の2日前に開始した。マウスを群に分け（5〜9／群）、200μLの1）ビヒクル（vehicle）（0.9%NaCl溶液中における0.5%のメチルセルロース15）、2）懸濁液における100 mg/kg/日のシラメシン（0.9%NaCl溶液中の0.5%のメチルセルロース15における）を1週間あたり7日経口で投与した。組み合わせのインビボ研究のために、50 mg/kgのシラメシンを30 mg/kgまでのエトポシドの単回投与（腹腔内）（1日目に投与）と組み合わせて7日／週で投与した。腫瘍容積をカリパスを使用することにより概算した。腫瘍増殖における薬剤の効果を、マウスを屠殺する前に14〜21日間観察した。
【００５１】
＜結果＞
用量依存的に、シラメシンは前立腺、乳房および頚の腫瘍に由来する細胞株を含む、種々の由来の培養腫瘍細胞株において、細胞のプログラム死を効率的に誘導する。細胞のシラメシンに対する感受性は、rasまたはsrcによる発癌性の形質転換によって増加し、このことは、その効果を癌細胞において選択的に誘導し、正常細胞においては限定的な効果のみを有するという制癌剤の所望の能力を、シラメシンが有することを示唆する。    
【００５２】
さらに、WEHI-SおよびMCF7細胞において、ハロペリドールおよびペンタゾシンのような参照のシグマリガンドに対して試験を行った場合に、シラメシンはハロペリドールおよびペンタゾシンよりも有意に強力にアポトーシスを誘導した。
【００５３】
シラメシンにより誘導される死の様式は、死のプロセスの間の核の形態的変化、薬理的なカスパーゼ阻害剤による保護の欠失、およびエフェクターカスパーゼ活性化の欠失に基づき、カスパーゼ非依存性のものである。それよりむしろ、リソソームカテプシンの細胞質への放出が、死のプロセスの実行に関与しているようである。この発見は、リソソームカテプシンBおよびLの免疫組織化学的染色、ならびに精製リソソームからのカテプシンのインビトロでの放出に基づいている。また、カテプシンの薬理的阻害剤を使用することにより、シラメシンによって誘導される死を減少させることができる。
【００５４】
Bcl-2の異所発現によりその他のほとんどの抗癌剤に対して保護される腫瘍細胞が、シラメシンにより効率的に殺される。化学療法剤のいくつかは、p53依存性の死の経路を活性化するが、シラメシンはp53を活性化しない。これは、p53依存性の死の経路はしばしば癌において損なわれているので、死の経路がDNA損傷剤（例えばエトポシド）により誘導される経路とは大きく異なり、シラメシンの癌適用範囲の広さを示すデータを支持する結果を示している。このことはさらに、シラメシンがBcl-2によって阻害されない腫瘍細胞死を誘導するという上述の観察によっても支持される。
【００５５】
重要なことには、シラメシンはインビボでよく許容され、BALB/cにおける同系の腫瘍移植片モデルにおいて抗腫瘍効果を示した。さらに、シラメシンおよびエトポシドそれぞれでの単独治療群と比較した、シメラシンおよびエトポシドの併用効果が、インビボにおいて観察された。さらに、シラメシンは、WEHI-S細胞における細胞死の誘導において、エトポシド、ドキソルビシン、スタウロスポリン、ビンクリスチンおよびタモキシフェンと一緒に相乗的に作用した。
【００５６】
これらの結果より、シラメシンが新規な抗癌剤であり、これは特にその他の参照シグマリガンドと比較して有効であって、単独で、または慣用の化学療法剤と組み合わせて癌の治療に使用できることが示される。
【国際調査報告】
2007514666.tif 000004
2007514666.tif 000005
2007514666.tif 000006
2007514666.tif 000007