(57)【要約】  本発明は、心血管疾患を有する患者の血漿において増加したレベルで循環するヒト分泌型ポリペプチドを開示する。本発明はまた、診断、予後および創薬のための、これらポリペプチド、それらをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのポリペプチドに特異的な抗体を含む組成物の使用方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において心血管疾患をスクリーニングおよび／または診断する方法であって、
ａ）前記対象の生体サンプルにおけるポリペプチドのレベルを検出および／または定量するステップ、なお、このポリペプチドは
ｉ）心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）１４９〜４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）ＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体；および
ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチドの断片
から選択される；
ｂ）前記レベルを対照サンプルのレベルと比較するステップ
を含み、対照レベルに対する前記レベルの上昇が心血管疾患の指標となる、方法。
【請求項２】
対象において心血管疾患を予測する方法であって、
ａ）前記対象の生体サンプルにおけるポリペプチドのレベルを検出および／または定量するステップ、なお、このポリペプチドは
ｉ）心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）１４９〜４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）ＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上の  アミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％配列同一性を有する変異体；および
ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチドの断片
から選択される；
ｂ）前記レベルを対照サンプルのレベルと比較するステップ
を含み、対照レベルに対する前記レベルの上昇が心血管疾患発症の危険性を示す、方法。
【請求項３】
前記心血管疾患が冠動脈疾患（ＣＡＤ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記生体サンプルが血漿である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法がｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが質量分析により検出および／または定量される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチドが酵素免疫測定法により検出および／または定量される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）１４９〜４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、異種ポリペプチド配列と融合された、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
ＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと選択的に結合する、抗心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）抗体。
【請求項１０】
抗体を心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）に結合する方法であって、
ｉ）抗体結合を可能にする条件下で、請求項９に記載の抗体を生体サンプルと接触させるステップ；
ｉｉ）混入物を除去するステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
前記抗体が標識基と結合している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体サンプルがヒト血漿である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）モジュレーターを同定する方法であって、
ｉ）試験化合物をＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択されるポリペプチドと、少なくとも１つのＣＰＰ生物活性が許容される条件下で接触させるステップ；
ｉｉ）前記の少なくとも１つのＣＰＰ生物活性のレベルを判定するステップ；
ｉｉｉ）前記レベルを、前記試験化合物を含まない対照サンプルのレベルと比較するステップ；および
ｉｖ）心血管疾患の予防および／または治療処置のためのＣＰＰモジュレーターとしてのさらなる試験に向け、前記レベルを変化させる試験化合物を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項１４】
ＣＰＰ１５４、１５５、１８１〜１９２、１９７、１９８、２１０、２１４、２５８〜２６８、２７３、２７５〜２８９、２９２、２９４〜２９７、３０２〜４０２からなる群から選択される心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）のアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１６】
心血管疾患のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）心血管疾患に罹患しやすい、または心血管疾患に罹患している非ヒト試験動物に候補薬剤を投与するステップ；
（ｂ）心血管疾患に罹患しにくい、または心血管疾患に罹患していない、対応する対照非ヒト動物に（ａ）の候補薬剤を投与するステップ；
（ｃ）ステップ（ａ）の非ヒト試験動物から得られた生体サンプルとステップ（ｂ）の対照動物から得られた生体サンプルにおける、
ｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体；および
ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチドの断片
から選択されるポリペプチドのレベルを検出および／または定量するステップ；および
（ｄ）ステップ（ｃ）のポリペプチドのレベルを比較するステップ
を含み、非ヒト試験動物から得られた生体サンプルにおけるそのポリペプチドのレベルの、対照動物から得られた生体サンプルにおけるそのポリペプチドのレベルへの移行が、その候補薬剤が心血管疾患のモジュレーターであることを示す、方法。
【請求項１７】
心血管疾患に罹患しやすい、または心血管疾患に罹患している非ヒト試験動物が
ｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体；および
ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチドの断片
から選択されるポリペプチドの血漿レベルの増加を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
心血管疾患を有している、または心血管疾患を発症する危険性を有している対象の薬剤による処置の有効性をモニタリングするための方法であって、
（ａ）その薬剤の投与前にその対象から投与前生体サンプルを得ること；
（ｂ）前記対象の生体サンプルにおける、
ｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｉｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体；および
ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチド
から選択されるポリペプチドのレベルを検出および／または定量すること；
（ｃ）その対象から１以上の投与後生体サンプルを得ること；
（ｄ）その投与後サンプルにおけるそのポリペプチドのレベルを検出すること；
（ｅ）その投与前サンプルにおけるそのポリペプチドのレベルを、その投与後サンプルにおけるそのポリペプチドのレベルと比較すること；および
（ｆ）それに応じて、その薬剤の投与を調整すること
を含む、方法。
【請求項１９】
胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動障害に関連する症候および症状の処置のための方法であって、前記疾病を患うヒトを含む哺乳類に有効量のＣＰＰ２３２ポリペプチドを投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記腸管運動障害が、過敏性腸症候群、糖尿病、胃不全麻痺、食道痙攣、ヒルシスプルング病、慢性腸偽閉塞、硬皮症およびアカラシアからなる群から選択される胃腸運動障害である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記の腸運動障害に関連する症候が、嚥下困難、胸やけ、ガス、膨満感、悪心、嘔吐、便秘および下痢からなる群から選択される症候である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動障害に関連する症候および症状のモジュレーターを同定する方法であって、
ｉ）試験化合物をＣＰＰ２３２と、ＣＰＰ２３２生物活性が許容されるサンプル条件下で接触させるステップ；
ｉｉ）前記ＣＰＰ２３２生物活性のレベルを判定するステップ；
ｉｉｉ）前記レベルを、前記試験化合物を含まない対照サンプルのレベルと比較するステップ；および
ｉｖ）胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動障害に関連する症候および症状心血管疾患の予防および／または治療処置のためのＣＰＰ２３２モジュレーターとしてのさらなる試験に向け、前記レベルを変化させる試験化合物を選択するステップ
を含む、方法。
【請求項２３】
ＣＰＰ２３２生物活性のレベルが表４に示される１以上の遺伝子の発現レベルを判定することにより測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
胆石またはセリアック病の予後または診断のための方法であって、ＣＰＰ２３２の血漿レベルを検出することを含み、レベルの上昇が胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動障害に関連する症候および症状の指標となる、方法。
【請求項２５】
胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動障害に関連する症候および症状の予後または診断のための方法であって、
ｉ）対象から得られる好適な組織のサンプルにおいて、表４に示される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを検出して第一の値を得ること；および
ｉｉ）その第一の値を無病対象からの前記遺伝子の発現レベルと比較することを含み、無病対象からのサンプルに比べた場合の、対象サンプルにおける発現レベルの大小が、その患者が胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動障害に関連する症候および症状に罹りやすいか、または罹患していることを示す、方法。
【請求項２６】
表４に示される少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの遺伝子の発現レベルが検出される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＰＰ２３２が、配列番号７０６に示されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体である、請求項１９〜２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、心血管疾患を有する個体の血漿において示差的に分泌されるポリペプチド種、そのようなポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、その多型変異体、ならびに心血管疾患診断のため、および創薬のための検出アッセイにおける該核酸およびポリペプチドまたはその組成物の使用に関する。
【０００２】
心血管疾患は、あらゆる先進工業国において重大な健康危機である。冠動脈疾患（ＣＡＤ）は、アテローム性動脈硬化症または動脈硬化を特徴とする。アテローム性動脈硬化症は、最も有病率の高い心血管疾患で、心臓発作、卒中および四肢壊疽の主因であり、そのため、米国では主要な死因となっている。アテローム性動脈硬化症は、多くの細胞種および分子的因子が関与する複雑な疾病である（例えば、Ross, 1993, Nature 362: 801-809に記載）。普通の状況では、動脈壁の内皮および平滑筋細胞（ＳＭＣ）の損傷に対する防御応答は、炎症に先行し、かつ、炎症を伴う繊維脂肪および繊維病変または斑の形成よりなっている。アテローム性動脈硬化症の進行病変は、関連する動脈の閉塞であり、多くの異なる形態の損傷に対する過剰な炎症性の繊維増殖応答に起因すると考えられている。血管内皮の損傷または機能不全は、個体がアテローム動脈硬化性心血管疾患の加速的進行を受けやすい多くの症状に共通した特徴である。
【０００３】
アテローム斑が関連する血管を閉塞させ、血流を制限するために、虚血が起こる。虚血は、灌流が不十分なために起こる器官の組織への酸素供給の欠乏を特徴とする状態である。このような不十分な灌流には、アテローム動脈硬化性もしくは再狭窄性病変、貧血または卒中をはじめとする多くの自然原因が考えられる。心臓虚血の最も多い原因は、心外膜冠動脈のアテローム動脈硬化性疾患である。アテローム性動脈硬化症では、これらの脈管の内腔が小さくなることによって、基礎的状態での心筋灌流の絶対減少が起こるか、または流量要求が増大した際に灌流の適切な増加が制限される。冠血流量は、動脈血栓、痙攣、および、まれに、冠動脈塞栓、ならびに、梅毒性大動脈炎が原因で起こる入口部狭窄によっても制限され得る。肺動脈から左冠動脈前下行枝の異常起始のような先天性異常が幼児期の心筋虚血および梗塞の原因と考えられているが、成人ではこのことが原因で起こることは非常にまれである。
【０００４】
心筋虚血は、高血圧症または大動脈狭窄が原因で起こる重篤な心室肥大において見られるような、心筋酸素要求が異常に高まった場合にも起こり得る。後者は、冠動脈アテローム性動脈硬化症によって起こるものと区別できないアンギナを伴う可能性がある。極度に重症の貧血の場合またはカルボキシヘモグロビンの存在下で見られるような、血液の酸素運搬能の低下が、心筋虚血の原因であることがまれにある。虚血には、しばしば、左心室肥大による酸素要求の増大や冠動脈アテローム性動脈硬化症に伴う酸素供給の減少のような２つ以上の原因が共存している。
【０００５】
広範囲にわたる臨床研究によって、心血管疾患の危険性を高める因子が確認された。これらの危険因子のうち、年齢、性別および家族歴のような一部のものは変えることのできないものである。他の危険因子としては、以下のものが挙げられる：喫煙、高血圧、高脂肪食および高コレステロール食、糖尿病、運動不足、肥満症およびストレス。
【０００６】
幸いにも、多くの誘因は、ライフスタイルの変化を通じて制御可能なものである。喫煙者の心血管疾患の危険性は、非喫煙者の２倍を上回っている。これまでの喫煙量には関係なく、喫煙を止めることで、疾患を発症する危険性が急速に低下する。血清コレステロールレベルは、心血管疾患の有病率と直接関連しており、高血圧症または高血圧は重要な危険因子である。物理的活性によって、種々の機構を通じて心血管疾患を発症する危険性が低下すると仮定されており、その活性により心筋酸素供給が増大し、酸素要求が低下し、かつ、心筋収縮が促進され、その電気インパルスの安定性が高まる。酸素要求および心筋運動の低下は、安静時の心拍数および血圧の低下により示される。物理的活性により、冠動脈の径が大きくなり、引き延ばし能力が高まり、側副動脈形成が増加し、かつ、冠動脈アテローム性動脈硬化症の進行速度も低下する。活性により、肥満症および血清脂肪酸が減少する。
【０００７】
安静時では、心血管疾患の目立った症候はないが、活性またはストレスが高まったときに胸部圧迫感のような症候が起こり得る。現れる他の最初の徴候としては、胸やけ、悪心、嘔吐、しびれ、息切れ、ひどい冷や汗、原因不明の疲労および不安感がある。心血管疾患のより重篤な症候が、胸痛（狭心症）、調律異常（不整脈）、卒中または心臓発作（心筋梗塞）である。卒中および心臓発作は、脳組織および心臓組織各々での動脈閉塞に起因する。症候が異なるため、患者によって選択する検査および処置が全く異なる。
【０００８】
心血管疾患の範囲および重篤性の判定に有用な診断テストとしては、心電図（ＥＫＧ）、負荷試験、核医学検査、冠動脈血管造影、安静時ＥＫＧ、ＥＫＧ多面的情報診断指標、ホルターモニター、遅延電位、ＥＫＧマッピング、心エコー図、タリウムスキャン、ＰＥＴ、ＭＲＩ、ＣＴ、血管造影図およびＩＶＵＳが挙げられる。さらなる危険因子対策および有用な診断法も一般的であり、医療分野の技術を有する者によって用いられることが最良である。疾患の重症度に応じて、多くの異なる治療的アプローチがある。多くの人にとって、心血管疾患は、ライフスタイルの変化および投薬によって管理される疾患であるが、手術の必要性を示すより重篤な診断もある。
【０００９】
虚血性アテローム性動脈硬化症の処置への外科アプローチとしては、バイパス移植術、冠動脈血管形成術、レーザー血管形成術、アテローム切除術、動脈内膜切除術および経皮経管血管形成術（ＰＣＴＡ）が挙げられる。これらのアプローチ後の再狭窄（閉塞が再発し、さらに悪化することが多い）による再発率は非常に高い（３０〜５０％）。再狭窄の多くは、さらなる炎症、平滑筋蓄積および血栓症によるものと思われる。心血管疾患へのさらなる治療的アプローチには、虚血性心疾患および四肢疾患のような症状において脈管形成を促す処置も加えられている。
【００１０】
大部分のＣＡＤおよび心血管疾患の症候の性質が明らかではないため、確定診断は難しい。より定量的な診断方法では、個体間の変動と個々人の測定値間の変動との両方に悩まされる。そのため、診断的測定法を標準化し、十分に立証された広範囲にわたる病歴を有する個体に適用しなければならない。さらに、現在の診断方法では、得られた観察または測定値についての根底にある原因が明らかにならないことが多い。そのため、特定の陽性結果に基づいた治療戦略では原因となる問題が解決できないと思われ、さらに、それは個体に有害である可能性もある。
【００１１】
ヌクレオチド検出を利用する診断方法としては、遺伝学的アプローチおよび発現プロファイリングがある。例えば、心血管疾患に関連していることが分かっている遺伝子を、配列決定、ハイブリダイゼーションに基づく技術またはＰＣＲのような一般的な遺伝子型決定法を利用して、突然変異についてスクリーニングし得る。もう１つの例では、既知遺伝子の発現を、ＲＴＰＣＲ、種々のハイブリダイゼーションに基づく技術および配列決定をはじめとする標準的な技術により追跡し得る。これらの戦略では、医師が、ｍＲＮＡプロセシングおよびスプライシング、翻訳速度、ｍＲＮＡ安定性、ならびにタンパク質分解プロセシング、リン酸化、グリコシル化およびアミド化のような翻訳後修飾における違いを検出できないことが多い。
【００１２】
心血管疾患に関する技術分野の診断事情において現行の欠点に取り組むために、本発明は、冠動脈疾患を有する個体の血漿において、対照血漿に対して示差的に増加する特定の血漿ポリペプチドを提供する。実際のポリペプチド種を提供することによって、ｍＲＮＡプロセシングおよびスプライシング、翻訳速度、ｍＲＮＡ安定性、ならびにタンパク質分解プロセシング、リン酸化、グリコシル化およびアミド化のような翻訳後修飾における違いが明らかになる。従って、本発明のポリペプチドは、「心血管疾患血漿ポリペプチド」またはＣＰＰと称する。これらのポリペプチド配列はＣＰＰ１４９〜４０２として示し、表３のトリプシン作用ペプチドから選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つを含む。
【００１３】
本発明は、冠動脈疾患（ＣＡＤ）を有する個体から得られる血漿において高いレベルで存在している「心血管疾患血漿ポリペプチド」（ＣＰＰ）、ＣＰＰの断片および翻訳後修飾種を開示する。よって、本発明のＣＰＰは、ＣＡＤ、冠動脈性心臓病（ＣＨＤ）、末梢血管疾患、脳虚血（卒中）、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧症および他の心血管疾患の危険性を判定するための重要な診断ツールである。ＣＰＰは分泌因子であり、それ自体、容易に検出可能であり、創薬、診断、および心血管疾患の予防に有用である。
【００１４】
発明の概要
本発明は、好ましくは、心血管疾患の患者からの血漿中で増加する分泌ポリペプチド種に関連する組成物を対象とする。これらのポリペプチド種は、本明細書では「心血管疾患血漿ポリペプチド(Cardiovascular disorder Plasma Polypeptides)」またはＣＰＰと呼ぶ。このような心血管疾患血漿ポリペプチドは、ＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択されるポリペプチドを含む。好ましいＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜２９７からなる群から選択されるポリペプチドを含む。さらにより好ましいＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜１９４からなる群から選択されるポリペプチドを含む。いっそうより好ましいＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜１５１からなる群から選択されるポリペプチドを含む。組成物には、ＣＰＰ前駆体、モノクローナル抗体をはじめとするＣＰＰに特異的な抗体、およびそれに由来する他の結合組成物が含まれる。さらに、これらの組成物を作製および使用する方法が含まれる。本発明の前駆体としては、非修飾前駆体、表３に挙げられているトリプシン作用ペプチドのタンパク質分解前駆体、およびＣＰＰ１４９〜４０２のアミノ酸配列の別のタンパク質分解部位から生じた前駆体が挙げられる。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態は、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、アミド化のような翻訳後修飾を受けているか、またはＣ−、Ｎ−またはＯ−結合型炭水化物基を有しているCＰＰを含む。さらに好ましいのは、高次構造をもたらす、例えば、ジスルフィド結合および水素結合のような分子内または分子間相互作用を有するCＰＰである。また、示唆的なｍＲＮＡプロセシングまたはスプライシングによって生じるＣＰＰも好ましい。好ましくは、これらのＣＰＰは、心血管疾患患者の血漿中に存在する翻訳後修飾種、構造変異体、またはスプライス変異体である。
【００１６】
別の態様において、本発明は、ＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択される配列と少なくとも７５パーセント同一の配列を含むＣＰＰを含む。好ましくは、本発明は、ＣＰＰ１４９〜４０２から選択される配列のいずれか１つと少なくとも８０パーセント、好ましくは少なくとも８５パーセント、より好ましくは少なくとも９０パーセントの同一性を含むポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明は、ＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択される配列と少なくとも９５パーセント同一の配列を含むポリペプチドを含む。
【００１７】
別の態様において、本発明は、抽出集団において少なくとも２パーセントの頻度で存在するＣＰＰの天然変異体を含む。より好ましくは、このような天然変異体は、抽出集団において少なくとも５パーセント、さらにより好ましくは少なくとも１０パーセントの頻度で存在する。最も好ましくは、このような天然変異体は、抽出集団において少なくとも２０パーセントの頻度で存在する。抽出集団とは、集団遺伝学の分野における試験の、認められた任意の集団であり得る。好ましくは、抽出集団は白色人種、黒色人種またはアジア人種である。より好ましくは、抽出集団はフランス人、ドイツ人、イギリス人、スペイン人、スイス人、日本人、中国人、アイルランド人、韓国人、シンガポール人、アイスランド人、北アメリカ人、イスラエル人、アラブ人、トルコ人、ギリシア人、イタリア人、ポーランド人、太平洋諸島系人、フィンランド人、ノルウェー人、スウェーデン人、エストニア人、オーストリア人またはインド人である。より好ましくは、抽出集団はイスランド人、サーミ人、フィンランド人、白色人種系フランス人、スイス人、中国人系シンガポール人、韓国人、日本人、ケベック州人、北米ピマ族インディアン、ペンシルベニア州アマン派の人々およびアマン派の信徒、ニューファンドランド人またはポリネシア人である。
【００１８】
本発明の好ましい態様は、単離されたＣＰＰ、すなわち、ＣＰＰとは有意に異なる等電点を有するか、あるいは有意に異なる見掛けの分子量を有するタンパク質またはタンパク質イソ型を含まないＣＰＰを含む組成物を提供する。ＣＰＰの等電点および分子量は、親和性およびサイズに基づく分離クロマトグラフィー、二次元ゲル解析および質量分析により示し得る。
【００１９】
好ましい態様において、本発明は表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択される配列を含む特定のポリペプチド種を提供する。好ましくは、ＣＰＰ１４９〜４０２は、表１に示されるように、公開データベースの対応するポリペプチドエントリーの配列に由来するさらなる連続するアミノ酸を含む。好ましい種は、ｉ）ＣＰＰ１４９〜４０２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み；ｉｉ）心血管疾患を有する個体の血漿により高いレベルで見られ；かつｉｉｉ）表１に示される対応するポリペプチドエントリーの配列に由来するさらなるアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、修飾型ＣＰＰを含む。このような修飾としては、基の保護／ブロッキング、抗体分子または他の細胞リガンドとの結合、ならびにタンパク質の検出および単離を可能にする、酵素標識、蛍光標識、同位元素標識またはアフィニティー標識のような検出可能な標識が挙げられる。化学修飾は、限定されるものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元またはツニカマイシンの存在下での代謝合成をはじめとする公知の技術により実施し得る。
【００２１】
ポリペプチドの溶解度の上昇、安定性の増大および循環時間の延長、または免疫原性の低下などのさらなる利点を提供し得る本発明のポリペプチドの化学修飾した誘導体も本発明により提供される（例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールのような水溶性ポリマー）。ＣＰＰは、分子内の任意の位置で修飾されているか、または分子内の所定の位置で修飾されており、１、２、３以上の結合した化学的部分を含み得る。
【００２２】
他の実施様態において、本発明は、少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性のモジュレーターを同定する方法であって、ｉ）ＣＰＰ生物学的活性の試験モジュレーターを、表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択される配列を含むポリペプチドと接触させるステップ、ｉｉ）前記ＣＰＰ生物学的活性のレベルを検出するステップ、およびｉｉｉ）前記ＣＰＰ生物学的活性のレベルを、前記試験モジュレーターを含まない対照試料のものと比較するステップを含む方法を提供する。ＣＰＰタンパク質生物学的活性のレベルにおける差が低下である場合、試験モジュレーターは、少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性のインヒビターである。ＣＰＰ生物学的活性のレベルにおける差が増加である場合、前記試験物質は、少なくとも１つのＣＰＰ生物学的活性のアクチベーターである。
【００２３】
本発明の別の態様では、心血管疾患のモジュレーターを同定する方法が提供され、その方法は、（ａ）心血管疾患に罹患しやすい、または心血管疾患に罹患している非ヒト試験動物に候補薬剤を投与するステップ；（ｂ）心血管疾患に罹患しにくい、または心血管疾患に罹患していない、対応する対照非ヒト動物に（ａ）の候補薬剤を投与するステップ；（ｃ）ステップ（ａ）の非ヒト試験動物から得られた生体サンプルとステップ（ｂ）の対照動物から得られた生体サンプルにおける、（ｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体；および（ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチドの断片から選択される少なくとも１つのポリペプチドのレベルを検出および／または定量するステップ；および（ｄ）ステップ（ｃ）のポリペプチドのレベルを比較するステップを含み、非ヒト試験動物から得られた生体サンプルにおけるそのポリペプチドのレベルの、対照動物から得られた生体サンプルにおけるそのポリペプチドのレベルへの移行が、その候補薬剤が心血管疾患のモジュレーターであることを示す。本発明の好ましい実施形態は、心血管疾患に罹患しやすい、または心血管疾患に罹患している非ヒト試験動物が、（ｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体；および（ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチドの断片から選択される少なくとも１つのポリペプチドの血漿レベルの上昇を含む場合を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、本発明のＣＰＰをコードするポリヌクレオチド、表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、診断的および分析的アッセイ（例えば、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーションに基づく技術）のための、ＣＰＰ遺伝子配列に相補的なオリゴヌクレオチド、ならびにＣＰＰを発現させるためのベクターを含む。
【００２５】
別の態様では、本発明は、ＣＰＰをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明はまた、このようなベクターを含む宿主細胞およびトランスジェニック非ヒト動物も含む。また、ＣＰＰまたはＣＰＰ前駆体を作製する方法も提供される。１つの好ましい方法には、（ａ）上記で開示した発現ベクターを含む宿主細胞を準備するステップ、（ｂ）その宿主細胞を、ＤＮＡセグメントが発現する条件下で培養するステップ、および（ｃ）そのＤＮＡセグメントによってコードされているタンパク質を回収するステップが含まれる。別の好ましい方法には、（ａ）ＣＰＰを発現し得る宿主細胞を準備するステップ、（ｂ）その宿主細胞を、前記ＣＰＰの発現を可能とする条件下で培養するステップ、および（ｃ）前記ＣＰＰを回収するステップが含まれる。一実施様態では、発現ベクターはさらに、ＤＮＡセグメントに作動可能なように連結された分泌シグナル配列を含み、細胞は、培養培地中にそのタンパク質を分泌し、そのタンパク質を培地から回収する。ＣＰＰを作製する特に好ましい方法には、「ＣＰＰ組成物の化学製造」と題された節および実施例２で記載するように、標準的なペプチド合成技術を用いた化学合成が含まれる。
【００２６】
別の態様において、本発明は、上記のポリペプチド、ペプチド断片またはペプチドのいずれかに特異的な単離された抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。ＣＰＰと排他的に結合する抗体、すなわち、高親和性を有する他のポリペプチドを認識しない抗体がさらに好ましい。抗ＣＰＰ抗体は、精製、診断および予後適用を有する。精製および診断に好ましい抗ＣＰＰ抗体は、標識基と結合される。診断に関して好ましいＣＰＰ関連疾患としては、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、末梢血管疾患、脳虚血（卒中）、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧症および他の心血管疾患が挙げられる。診断方法としては、限定されるものではないが、ＣＰＰ抗原に特異的な抗体または抗体由来組成物を使用する方法が挙げられる。特定の組織サンプルおよび体液（好ましくは、血漿）中のＣＰＰを検出するための診断方法も、組織におけるＣＰＰの発現レベルを検出するための診断方法も、本発明の一部をなす。例えば、in vivo診断法および薬物スクリーニングアッセイのための、１以上の上記抗体とともに、医薬上許容される担体を含む組成物もまた、本発明の範囲内である。
【００２７】
本発明はさらに、体液、好ましくは血液血漿のサンプルにおいて、少なくとも１つのＣＰＰのレベルを検出することを含む、心血管疾患の診断のための方法を提供する。最も好ましくは、この診断方法はex vivoで実施される。さらに、組織および体液、好ましくは血漿中のＣＰＰの量を検出および測定するために、ＣＰＰ遺伝子および／またはメッセンジャーＲＮＡ、および抗ＣＰＰ抗体と相補的なプライマーを含む、ＣＰＰ組成物を使用する方法が含まれる。これらの方法はまた、臨床スクリーニング、予後、治療結果のモニタリング、特定の治療処置に最も応答しやすい患者の同定、薬物スクリーニングおよび創薬、ならびに薬物処置のための新規標的の同定のために適している。
【００２８】
本発明のなおさらなる態様は、心血管疾患を有している、または心血管疾患を発症する危険性を有している対象の薬剤による処置の有効性をモニタリングするための方法に関し、その方法は、（ａ）その薬剤の投与前にその対象から投与前生体サンプルを得ること；（ｂ）前記対象の生体サンプルにおける、（ｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｉｉ）表３に挙げられているアミノ酸配列（ＣＰＰ１４９〜４０２）からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して１以上のアミノ酸置換、欠失または挿入を有し、少なくとも７５％の配列同一性を有する変異体；および（ｉｉｉ）少なくとも１０アミノ酸長の、上記ｉ）またはｉｉ）で定義したようなポリペプチドから選択される少なくとも１つのポリペプチドのレベルを検出および／または定量すること；および（ｃ）その対象から１以上の投与後生体サンプルを得ること；（ｄ）その投与後サンプルにおけるその少なくとも１つのポリペプチドのレベルを検出すること；（ｅ）その投与前サンプルにおけるその少なくとも１つのポリペプチドのレベルを、その投与後サンプルにおけるその少なくとも１つのポリペプチドのレベルと比較すること；および（ｆ）それに応じて、その薬剤の投与を調整することを含む。
【００２９】
本発明は、上記の方法に使用し得る、単回用もしくは複数回用調製物または抗体とともに、他の試薬、標識基、基質、必要に応じて、使用説明書を含み得るキットを提供する。このキットを疾患の診断に用いることができるし、または、新規診断薬および／または治療薬の同定のためにアッセイすることもできる。
【００３０】
一実施形態において、冠動脈疾患（ＣＡＤ）は、少なくとも１つの症候の発現により定義される。このような症候は、その疾患が進行するにつれて重症度が高まる。ＣＡＤは、多くの場合、左心室容量と拍出量の減少を伴う。ＣＡＤ初期症候としては、コレステロールおよび低密度リポタンパク質（特に、酸化型）、ならびに多血小板血漿凝集体の血漿レベルの上昇が挙げられる。血管内皮が炎症に応答し、それを受けて、斑形成が増加し、炎症性因子およびフィブリノーゲン因子のレベルが上昇する。さらに、ＣＡＤまたはアテローム性動脈硬化症は、血管石灰化および動脈硬化を特徴とする。生じた血管の部分的閉塞によって、高血圧症および虚血性心疾患が引き起こされる。最終的な完全血管閉塞によって、心筋梗塞、卒中または壊疽が起こる。
【００３１】
好ましい実施形態では、本発明の少なくとも１つのＣＰＰの血漿レベルの上昇の検出が、個体がＣＡＤを発症する危険性の増加を示す。好ましくは、前記検出が、個体がＣＡＤを発症する可能性が少なくとも１．０５倍、１．１倍、１．１５倍、より好ましくは、少なくとも１．２倍増大するということを示す。あるいは、本発明の少なくとも１つのＣＰＰの血漿レベルの上昇の検出が、個体がＣＡＤを有しているということを示す。対照サンプルと比べた場合に認められた増加量が、ＣＡＤの予測または診断の確からしさと相関する。個々の血漿ＣＰＰレベルは、家族歴およびその他の危険因子によって変わるため、それぞれを個別に調べることが好ましい。好ましい実施形態においては、本発明の方法により、ヒト血漿サンプルにおいてＣＰＰが検出される。特に好ましい技術は、質量分析と免疫検出である。好ましくは、ＣＡＤの予測または診断は、対照に対する試験ＣＰＰレベルが、少なくとも１．１倍、１．１５倍、１．２倍、１．２５倍、より好ましくは１．５倍高いことに基づく。
【００３２】
本発明はさらに、個体におけるＣＰＰ１４９〜４０２ＣＰＰの異常な発現またはプロセシングと関連した疾患予防または処置するために、ＣＰＰ調節組成物を用いる方法が含まれる。好ましいＣＰＰ関連疾患としては、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）、末梢血管疾患、脳虚血（卒中）、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧症および他の心血管疾患が挙げられる。本発明の好ましい実施様態は、個体においてＣＰＰ関連疾患を予防または処置する方法であり、その方法は、ＣＰＰ関連疾患に罹患している、またはＣＰＰ関連疾患の危険性のある個体を決定するステップ、およびＣＰＰ調節組成物を前記個体に導入するステップを含む。
【００３３】
本発明のさらなる態様は、明細書および特許請求の範囲においても記載されている。
【００３４】
発明の詳細な説明
以下に詳述する本発明は、哺乳動物個体における心血管疾患のスクリーニング、診断および予後のために；特定の治療処置に最も応答しやすい個体を同定するために；心血管疾患治療の結果をモニタリングするために；ＣＰＰモジュレーターをスクリーニングするために、および創薬のために有用な、方法、組成物、キットを提供する。本発明はまた、心血管疾患を処置または予防するために、治療組成物を哺乳類個体に投与することを含む。哺乳類個体は、非ヒト哺乳類であり得るが、好ましくはヒト、より好ましくは成人である。限定するものではないが、開示を明確にするために、本発明は、血液血漿サンプルの解析に関して記載される。しかしながら、当業者ならば、以下で記載されるアッセイおよび技術が、心血管疾患を有する、または発症する危険性のある個体からの、他の体液サンプル（例えば、脳脊髄液、リンパ液、胆汁、血清、唾液または尿）または組織サンプルに適用可能であることが分かるであろう。本発明の方法および組成物は、生個体のスクリーニング、診断および予後のために有用であるが、また、同疾病を発症する危険性のある家族員を特定するために、個体における死後診断にも有用であり得る。
【００３５】
定義
本明細書において、「核酸」および「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は、一本鎖であってもよいし、または二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本明細書を通じて、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を区別しないで呼ぶために使用される。より正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は、核物質そのものを包含するものであるため、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、４塩基文字から選択される文字の連続）に限定されない。また、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に用いられる。
【００３６】
「単離された」核酸分子とは、その核酸の天然源に存在している他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸が、その核酸が得られる生物体のゲノムＤＮＡ内でその核酸に自然にフランキングする配列（すなわち、その核酸の５’および３’末端に存在する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離されたＣＰＰ核酸分子は、その核酸が得られる細胞のゲノムＤＮＡにおいてその核酸分子に自然状態でフランキングしている約５ｋｂ未満、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂのヌクレオチド配列を含み得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、他の細胞材料を実質的に含まないものであってもよく、あるいは、組換え技術により作製する場合には培養培地を実質的に含まず、または、化学的に合成する場合には化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まないものであり得る。ＣＰＰ核酸分子は、核酸の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用し、標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術（例えば、Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989に記載されているようなもの）を利用して単離することができる。
【００３７】
本明細書において、「〜とハイブリダイズする」とは、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション用の条件、好ましくは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、互いに少なくとも６０％相同であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズした状態となるような条件を表すものとする。好ましくは、その条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％相同である配列が一般に互いにハイブリダイズした状態となるようなものである。ストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出すことができる。好ましい限定されない例において、核酸の総合作用のためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のとおりである：ハイブリダイゼーションステップは、６×ＳＳＣバッファー、５×デンハートの溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡの存在下で６５℃にて実現される。ハイブリダイゼーションステップに続いて４種類の洗浄ステップ：
好ましくは、６５℃にて２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファーによる、５分間の洗浄２回、
好ましくは、６５℃にて２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファーによる、３０分間の洗浄１回、
好ましくは、６５℃にて０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファーによる、１０分間の洗浄１回
が行われ、これらのハイブリダイゼーション条件は約２０ヌクレオチド長の核酸分子に好適なものである。当然のことではあるが、上記のハイブリダイゼーション条件は、所望の核酸の長さに応じて、当業者に周知の技術によって調整すべきものであり、例えば、Hames B. D. and Higgins S. J. (1985) Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach. Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford；およびCurrent Protocols in Molecular Biologyにて開示されている教示に従って調整する。
【００３８】
「相同性パーセント」は、本明細書において、核酸配列およびアミノ酸配列の両方に対して用いられる。アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同じことである。２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性パーセントを決定するため、最良の比較を目的としてそれらの配列をアラインする（例えば、第２のアミノ酸または核酸配列との最良のアラインメントを得るために、第１のアミノ酸または核酸配列の配列内にギャップを挿入することができるし、比較を目的として非相同配列を無視することもできる）。比較を目的としてアラインする参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは、少なくとも４０％、より好ましくは、少なくとも５０％、さらに好ましくは、少なくとも６０％、さらにいっそう好ましくは、少なくとも７０％、８０％、９０％または９５％である。次いで、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置に第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが存在している場合には、それらの分子はその位置で相同である。２配列間の相同性パーセントは、それらの配列が一致する位置の数の関数である（すなわち、％相同性＝一致する位置の数／位置の総数１００）。
【００３９】
配列の比較および２配列間の相同性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを利用して行うことができる。配列の比較に利用される数学アルゴリズムの好ましい限定されない例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68のアルゴリズムを、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77に見られるように改変したものであり、これらの開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２により実行して、本発明の配列と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３により実行して、本発明のポリペプチド配列と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的としてギャップを入れたアラインメントを得るため、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25 (17) : 3389-3402に記載されているように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用してもよい。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合には、プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）それぞれのデフォルトパラメーターが使用できる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照（これらの開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）。配列の比較に利用される数学アルゴリズムのもう１つの好ましい限定されない例は、Myers and Miller, CABIOS (1989)のアルゴリズムである（これらの開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表(weight residue table)、ギャップ長ペナルティー１２およびギャップペナルティー４が使用できる。
【００４０】
「ポリペプチド」とは、重合体の長さに関係なく、アミノ酸の重合体を指す。よって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質がポリペプチドの定義に含まれる。また、この用語は、ポリペプチドの翻訳後修飾を明示も排除もせず、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、アミド基、脂質基、カルボキシル基、アシル基または炭水化物基の共有結合を含むポリペプチドがポリペプチドという用語に明らかに包含される。また、アミノ酸の１以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸、無関係の生物系において単に自然発生するアミノ酸、哺乳類系由来の改変アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、置換結合や当技術分野で公知の他の修飾がなされた天然および非天然双方のポリペプチドも定義に含まれる。
【００４１】
「タンパク質」とは、本明細書において「ポリペプチド」と同義的に使用でき、この用語は、さらに、ペプチド結合以外の結合によって連結され得る２以上のポリペプチドの複合体を指す場合もあり、例えば、タンパク質を構成するこのようなポリペプチドはジスルフィド結合によって連結されていてもよい。「タンパク質」とは、同一アミノ酸配列を有しているが、特に、このようなタンパク質が真核生物宿主において発現される際に付加され得るような異なる翻訳後修飾を有しているポリペプチドファミリーも包含し得る。
【００４２】
「単離された」または「精製された」タンパク質もしくはその生物学的に活性な部分は、本発明のタンパク質（すなわち、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な断片）が誘導される細胞または組織起源由来の細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、あるいは化学的に合成する場合には化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まないか、または化学的に合成する場合には、化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」とは、そのタンパク質が、それが単離または組換え生産される細胞の細胞成分と分離されている、本発明のタンパク質の調製物を含む。一実施形態において、「細胞物質を実質的に含まない」とは、本発明のタンパク質以外のタンパク質が約３０％（乾燥重量で）未満である、より好ましくは、本発明のタンパク質以外のタンパク質が約２０％未満である、さらに好ましくは、本発明のタンパク質以外のタンパク質が約１０％未満である、最も好ましくは、本発明のタンパク質以外のタンパク質が約５％未満である、本発明のタンパク質の調製物を含む。本発明のタンパク質またはその生物学的に活性な部分を組換え生産する場合には、それが培養培地を実質的に含まないことも好ましく、すなわち、培養培地がタンパク質調製物量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００４３】
「化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない」とは、そのタンパク質が、そのタンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学薬品と分離されている、本発明のタンパク質の調製物を含む。一実施形態において、「化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない」とは、化学的前駆体または非タンパク質化学薬品が約３０％（乾燥重量で）未満である、より好ましくは、化学的前駆体または非タンパク質化学薬品が約２０％未満である、さらに好ましくは、化学的前駆体または非タンパク質化学薬品が約１０％未満である、最も好ましくは、化学的前駆体または非タンパク質化学薬品が約５％未満である、本発明のタンパク質の調製物を含む。
【００４４】
「組換えポリペプチド」とは、本明細書において、人為的に設計されたポリペプチドであり、それらの最初の自然環境では連続したポリペプチド配列としては見られない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチドを指すか、または組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを指す。
【００４５】
「心血管疾患血漿ポリペプチド」または「ＣＰＰ」とは、表３に挙げられているペプチド配列のいずれか１つで示される配列を含むポリペプチドを指す。表３に挙げられている各ペプチドは、表１に示されているようなＣＰＰ１４９〜４０２の１つに相当する。従って、ＣＰＰ１４９〜４０２のポリペプチド配列は、表３に挙げられている対応するペプチドのアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＣＰＰ１４９〜４０２は、表１に示されているような公開データベースにおける対応するポリペプチドエントリーの配列からの、さらなる連続するアミノ酸を含む。このようなポリペプチドは本明細書に記載のように翻訳後修飾を受けていてもよい。ＣＰＰはまた、複雑な二次構造および三次構造をもたらすジスルフィド結合または水素およびアミド結合のようなアミノ酸側鎖相互作用などの他の構造修飾または化学修飾を有していてもよい。ＣＰＰはまた、欠失突然変異体、付加突然変異体、交換突然変異体または切断突然変異体のような突然変異ポリペプチド、このようなポリペプチドを含む融合ポリペプチド、およびＣＰＰ１４９〜４０２の配列の少なくとも３個、好ましくは、８個、１０個、１２個、１５個または２１個の連続したアミノ酸のポリペプチド断片も包含する。さらに、ＣＰＰ１４９〜４０２からなる群から選択される配列のＣＰＰタンパク質分解前駆体および中間体も含まれる。本発明は、ＣＰＰ遺伝子またはＣＰＰ  ｍＲＮＡ種、好ましくはヒトＣＰＰ遺伝子およびｍＲＮＡ種の核酸配列によってコードされるポリペプチドを包含し、ＣＰＰ１４９〜４０２の配列からなるか、それから実質的になるか、またはそれを含む単離されたＣＰＰを含む。好ましいＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜４０２の少なくとも１つの生物活性を保有している。
【００４６】
「生物活性」とは、本明細書において、ＣＰＰによって果たされる任意の１つの機能を指す。これらとしては、限定されるものではないが：（１）個体が心血管疾患を有しているか、または有することになるということを示すこと；（２）心血管疾患を有する個体の血流を通じて通常よりも高いレベルで循環すること；（３）抗原性または抗ＣＰＰ特異的抗体と結合する能力；（４）免疫原性または抗ＣＰＰ特異的抗体を生成する能力；（５）水素結合、アミド結合、または好ましくはジスルフィド結合にような分子内アミノ酸側鎖相互作用を形成すること；（６）ＣＰＰ標的分子との相互作用；およい（７）特異的タンパク質分解のような翻訳後プロセシングを受けることが挙げられる。
【００４７】
本明細書において、「ＣＰＰモジュレーター」とは、本発明のＣＰＰの発現または生物活性のいずれかを調節（すなわち、増強または低減）し得る分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子または抗体）である。ＣＰＰ発現または活性を増強するＣＰＰモジュレーターは、ＣＰＰアクチベーターまたはアゴニストといわれている。逆に、ＣＰＰ発現または活性を抑制するＣＰＰモジュレーターは、ＣＰＰ阻害剤またはアンタゴニストといわれている。ＣＰＰモジュレーターが、発現または活性を少なくとも５、１０または２０％増強／低減することが好ましい。ＣＰＰ阻害剤としては、抗ＣＰＰ抗体、そのフラグメント、アンチセンスポリヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、および本明細書において記載するようなスクリーニングアッセイによって同定された分子が挙げられる。ＣＰＰアゴニストとしては、ポリヌクレオチド発現ベクターおよび本明細書において記載するようなスクリーニングアッセイによって同定された分子が挙げられる。
【００４８】
「ＣＰＰ関連疾患」または「ＣＰＰ関連疾病」とは、心血管疾患を表す。好ましい疾患としては、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、冠動脈性心臓病（ＣＨＤ）、末梢血管疾患、脳虚血（卒中）、鬱血性心不全、アテローム性動脈硬化症、高血圧症および他の心血管疾患が挙げられる。好ましくは、個体がこのような疾患を発症する可能性またはこのような疾患を既に有している可能性が、少なくとも１つのＣＰＰのが通常の血漿レベルよりも高いことで示される。
【００４９】
本発明の別の態様は、抗ＣＰＰ抗体に関する。「抗体」とは、本明細書において、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な断片もしくは相同体のような、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を有する分子を指す。好ましい抗体はＣＰＰと排他的に結合し、高い親和性を有する他のポリペプチドを認識しない。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例としては、抗体をペプシンのような酵素で処理することによって作製し得るＦ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられる。本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な断片もしくは相同体と結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を提供する。「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において、ＣＰＰの特定のエピトープと免疫反応し得る唯一の種類の抗原結合部位を有する抗体分子の集団を指す。よって、モノクローナル抗体組成物は、一般に、それが免疫反応する特定のＣＰＰに対して単一種の結合親和性を示す。好ましいＣＰＰ抗体は標識基と結合されている。
【００５０】
本明細書において、「標識基」とは、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド（抗体を含む）と結合して、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの検出または精製を可能にするいずれかの化合物である。標識基は、直接検出または精製し得るし、あるいは前記標識基に特異的な抗体をはじめとする二次的化合物によって間接的に検出または精製し得る。有用な標識基としては、放射性同位元素（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ、１２５Ｉ）、蛍光化合物（例えば、５−ブロモデオキシウリジン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリトリンアセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）、発光化合物（例えば、ルミノール、ＧＦＰ、ルシフェリン、エクオリン）、酵素もしくは酵素補助因子検出標識（例えば、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ガラクトシダーゼもしくはアセチルコリンエステラーゼ）またはストレプトアビジン、ＧＳＴもしくはビオチンのような二次因子により認識される化合物が挙げられる。好ましくは、標識基は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの生物活性を妨げないように結合される。
【００５１】
放射性同位元素は、例えば、放射能放出、フィルム露光の直接計数により、またはシンチレーション計数により検出し得る。酵素標識は、適当な基質の生成物への変換（通常、蛍光反応を生じる）の測定により検出し得る。蛍光および発光化合物、ならびに蛍光および発光反応は、例えば、放射能放出、蛍光顕微鏡、蛍光活性化細胞選別または照度計により検出し得る。
【００５２】
本明細書において、抗体に関し、抗体が目的の標的を認識し、それと結合するが、目的の標的を含むサンプル、例えば、生体サンプル中の他の分子を実質的に認識せず、それと結合もしない場合に、抗体は標的と「選択的に結合する」または「特異的に結合する」という。
【００５３】
本明細書において、「ベクター」とは、核酸分子と連結されている別の核酸を輸送し得る前記核酸分子を指す。１つのタイプのベクターが「プラスミド」であり、これは、付加的なＤＮＡセグメントを連結し得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。もう１つのタイプのベクターが、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結し得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらのベクターが導入される宿主細胞で自己複製可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入した際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その結果、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらのベクターが作動可能なように連結される遺伝子の発現を命令することができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形態であるように、互換的に用いられる。しかしながら、本発明では、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）のような発現ベクターのその他の形態を含むものとする。
【００５４】
本明細書において、「有効量」とは、所望の効果を与えるのに十分な薬剤、好ましくは、本発明のＣＰＰモジュレーターの量を表す。例えば、抗心血管疾患有効量は、個体における心血管疾患の症候を少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％または好ましくは、２５％軽減するのに必要な薬剤の量である。この用語は、個体における心血管疾患に起因する症候を改善するのに必要な薬剤の量も表し得る。心血管疾患の一般的な症候としては、胸部圧迫感、胸やけ、悪心、嘔吐、しびれ、息切れ、ひどい冷や汗、原因不明の疲労および不安感が挙げられる。心血管疾患のより重篤な症候が、胸痛（狭心症）、調律異常（不整脈）、卒中または心臓発作である。患者に対する有効量は、評価される症候の診断方法、処置する病状、患者の全般的な健康状態、投与方法および副作用の重篤性のような因子によって変動し得る。
【００５５】
本発明のＣＰＰ
本発明の心血管疾患血漿ポリペプチド（ＣＰＰ）はＣＰＰ１４９〜４０２で示され、表３に挙げられているペプチド配列からなる群から選択される配列を含む。ＣＰＰ１４９〜４０２は心血管疾患を有する、または心血管疾患を発症する危険性のある個体の血液血漿中に分泌され、通常より高いレベルで循環する。好ましいＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜２９７からなる群から選択されるポリペプチドを含む。さらにより好ましいＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜１９４からなる群から選択されるポリペプチドを含む。いっそうより好ましいＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜１５１からなる群から選択されるポリペプチドポリペプチドを含む。
【００５６】
さらに、ＣＰＰは、表３に挙げられているペプチド配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。好ましくは、ＣＰＰ１４９〜４０２は、表１に示されている対応するポリペプチドエントリーの配列からの付加的な連続するアミノ酸を含む。このような付加的アミノ酸を選択されたＣＰＰ配列とインフレームで融合させて連続するアミノ酸配列を形成する。
【００５７】
興味深いことに、本発明のＣＰＰのレベルは心血管疾患を患っている個体の血漿中で劇的に増加する。本発明のＣＰＰはそれ自体、有用な診断ツールを提供し、そこでは、通常レベルより高いＣＰＰが、心血管疾患の発症の危険性の増大または心血管疾患の存在を示す。さらに、ＣＰＰは心血管疾患の予防または処置を目的とした、薬物設計のため、また、治療戦略のために有用である。
【００５８】
本明細書において「心血管疾患血漿ポリペプチド」および「ＣＰＰ」は、本発明のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質のいずれか、および全てを含めて用いられる。また、本発明のポリヌクレオチドによってコードされているポリペプチド、ならびにそのようなポリペプチドを含む融合ポリペプチドも本発明の一部をなす。本発明は、表３に示されているペプチド配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるか、それから実質的になるか、またはそれを含む、単離または精製されたＣＰＰをはじめ、ヒトに由来するＣＰＰを包含する。さらに、表３に示されているペプチド配列からなる群から選択される配列の非修飾前駆体、タンパク質分解前駆体および中間体も含む。
【００５９】
本発明は、ＣＰＰ生物活性を有する、少なくとも３つアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸の連続スパンを含む単離ポリペプチド、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドを包含する。好ましい実施形態では、この連続するアミノ酸のストレッチは、ＣＰＰ配列におけるアミノ酸の欠失、付加、交換または末端切断を含む突然変異または機能的突然変異の部位を含む。本発明はまた、本発明のＣＰＰヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド、またはその相補配列もしくはその断片に関する。
【００６０】
本発明の一態様は、単離されたＣＰＰ、およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗ＣＰＰ抗体を作製するための免疫原としての使用に好適なポリペプチド断片に関する。一実施形態では、標準的なタンパク質精製技術を利用した適当な精製スキームにより、血漿、細胞または組織源から天然のＣＰＰペプチド単離することができる。別の実施形態では、組換えＤＮＡ技術によりＣＰＰを作製する。組換え発現の代わりに、「ＣＰＰ組成物の化学製造」と題した節および実施例２に記載するようなペプチド合成技術を利用して、ＣＰＰを化学的に合成してもよい。
【００６１】
一般に、生物学的に活性な部分は、ＣＰＰの少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。生物学的に活性なＣＰＰは、例えば、表３に挙げられているペプチド配列からなる群から選択される配列に少なくとも１個、２個、３個または５個のアミノ酸の変化を含むか、あるいはこのような配列のアミノ酸に少なくとも１％、２％、３％、５％、８％、１０％または１５％の変化を含み得る。
【００６２】
ＣＰＰの特性決定
本発明のポリペプチドＣＰＰ１４９〜４０２は表１および３に示されている。これらのポリペプチドは冠動脈疾患患者の血漿から高いレベルで単離され、実施例１に記載のようにＭｉｃｒｏＰｒｏｔ（登録商標）法に従って特性決定した。
【００６３】
各ＣＰＰに関し、表１は次のような内容を示している。
・関連のポリペプチド配列に相当する、公開データベースにおける受託番号
・タンパク質のタイプ、および
・公開データベースにおけるポリペプチドに関する、観測されたポリペプチドを定義するアミノ酸の位置
【００６４】
タンパク質のタイプについては、「親」は、その長さがアミノ酸の欄に挙げられている位置で示されるが、それ以外には公開データベースの配列との違いが知られていないポリペプチド配列を表す。「断片」は、アミノ酸の欄に示されている位置にわたる特定の新たに定義された断片を表す。「非トリプシン作用断片」は、非トリプシン作用部分で始まるか、または終わる、新たに定義された断片を表す。これらはそれ自体、これまでには知られていないタンパク質のin vivoプロセシングを反映している。「イソ型」は、そのポリペプチド種が実施例１に記載の方法により、いくつかの異なる溶出クラスターとして検出されたことを表す。これらは表２において明白であり、トリプシン作用ペプチドに関する一次元および二次元分画における溶出位置を示している。同様に、「断片のイソ型」は、アミノ酸の欄で定義されている新たに定義された断片であるポリペプチド種がいくつかの異なる溶出クラスターとして検出されたことを表す。最後に、「変異体」は、公開データベースに由来するポリペプチドを表す。この変異体の性質は括弧内に記載されている。
【００６５】
表１に挙げられている受託番号の大部分はＳｗｉｓｓＰＲＯＴ／ＴｒＥＭＢＬデータベースを参照したものであり、双方とも、例えばhttp://www.expasy.ch.で公開されている。しかしながら、ＣＰＰ１９５、２６７、２８５、２８８、２８９、２９８〜３０１、３２０、３５９、３６７、３６８、３９６および４０１は、表１に詳細に示されているように、公開特許出願に見られる配列として定義されている。さらに、ＣＰＰ３０２〜３０７、３８９、３９７および４０２の受託番号は、表１に詳細に示されているように、ＧｅｎＢａｎｋエントリー上でいくつかのソフトウエアを実行することによって得られる推定タンパク質配列に相当する。最後に、ＣＰＰ１９６、１９９、３８１、３８３および３８５に関する受託番号は、ＮＣＢＩ、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/から得られるタンパク質エントリーを表す。
【表１】
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【００６６】
【表２】
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【表３】
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【００６７】
【表４】
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【表５】
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【００６８】
【表６】
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【表７】
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【００６９】
【表８】
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【表９】
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【００７０】
【表１０】
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【表１１】
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【００７１】
【表１２】
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【００７２】
本発明のＣＰＰは、血漿サンプルがまず分子量をもとに分離されることから、全て分子量約２０ｋＤ以下である。より分子量の大きなポリペプチド種は別の方法で分離され、特性決定される。実施例１に記載されるように、血漿サンプルに対して幾種類かのクロマトグラフィー分離を行う。これらのクロマトグラフィー法についての詳細は実施例１に示されている。
【００７３】
最初の分離は、塩濃度を高めて溶出する陽イオン交換クロマトグラフィーカラムにて行う。１８の画分を回収する。表３のＣＥＸの欄は、どの画分が各トリプシン作用ペプチドを含んでいたかを示したものである。表２は、本明細書の実施例１のステップ３に記載のプロトコールに従い、各画分が溶出するＮａＣｌ濃度を示している。陽イオン交換による分離は、あるポリペプチド種全体の正電荷を示したものである。陽イオン交換の後、逆相ＨＰＬＣ分離を行う。表３のＲＰ１の欄は、３０画分のうちどれに各トリプシン作用ペプチドが溶出したかを示している。表２は実施例１のステップ４に記載のプロトコールに従う溶出条件（％Ｂ）を示している。逆相による分離は、あるポリペプチド種全体の疎水性を示している。最後の欄は、５番目の欄の各トリプシン作用配列に対して、対応するＣＥＸおよびＲＰ１画分において対応するプロテオームに関してトリプシン作用配列が見られたＲＰ２画分数を示す（第二の逆相ＨＰＬＣ分離、実施例１参照）。最後の欄の各ＲＰ２画分数の次の括弧内にＯｌａｖスコアが示されているが、これらのスコアは、とりわけ、ＭＳ−ＭＳデータ同定ソフトウエアにより検出した際のノイズに対する試験ＭＳ−ＭＳシグナル強度を反映していることから、サンプル中のタンパク質濃度を示す。
【表１３】
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【００７４】
表１に示されるように、ＣＰＰ１９１および１９２はポリペプチド断片のイソ型であり、それ自体、ユニークな溶出プロフィールを示す。ＣＰＰ１９１で示されるイソ型はＲＰ１カラムから、画分２４またはその前に溶出するが（表３参照）、ＣＰＰ１９２はＲＰ１カラムから画分２９に溶出する。同様に、ＣＰＰ１９３および１９４は同じ親ポリペプチドのイソ型である。ＣＰＰ１９３は、ＣＥＸカラムからの溶出がＣＰＰ１９４と異なる。ＣＰＰ１９３は画分９またはその前に溶出するが、ＣＰＰ１９４は画分５またはその前に溶出する。同様に、ＣＰＰ２７１および２７２は同じ親ポリペプチドのイソ型であり、それ自体、ユニークな溶出プロフィールを示す。ＣＰＰ２７１で示されるイソ型はＣＥＸカラムから画分１５に溶出するが（表３参照）、ＣＰＰ２７２はＣＥＸカラムから画分１０に溶出する。同様に、ＣＰＰ２７５および２７６は新たに定義された同じポリペプチド断片のイソ型である。ＣＰＰ２７５はＣＥＸカラムから画分６に溶出するが、ＣＰＰ２７６は画分１に溶出する。これは、この血漿ポリペプチドの示差的なタンパク質分解または修飾（例えば、リン酸化、グリコシル化、アミド化）などの翻訳後プロセシングから生じる各イソ型の化学特性の違いを示す。
【００７５】
ＣＰＰ２７４、２９０、２９１および２９３は特異的な溶出プロフィールを有するイソ型である。これら各々について、１以上のさらなるイソ型が存在し、本発明の方法により検出されたが、表１または３には挙げられていない。ＣＰＰ２７４はＲＰ１画分２６およびその上に溶出するが、同じ親ポリペプチドについて検出された他のイソ型はＲＰ１画分２３およびその下に溶出する。ＣＰＰ２９０はＣＥＸ画分１１およびその上に溶出するが、同じ親ポリペプチドについて検出された他のイソ型はＣＥＸ画分１２および１３に溶出する。ＣＰＰ２９１はＣＥＸ画分１６およびその上に溶出するが、同じ親ポリペプチドについて検出された他のイソ型はＣＥＸ画分１５およびその下に溶出する。ＣＰＰ２９３はＣＥＸ画分１３およびその下に溶出するが、同じ親ポリペプチドについて検出された他のイソ型はＣＥＸ画分１４およびその下に溶出する。最後に、ＣＰＰ１８７は、  ＣＥＸ画分１４またはその後に溶出する、新たに定義された断片のイソ型である。ＣＥＸ画分１０に溶出する同じ断片の別のイソ型も存在するが、この他のイソ型は本発明の方法によって示差的に発現されたものとは認められなかったため、表１および３には挙げられていない。
【００７６】
適用可能であれば、ＣＡＤにおけるタンパク質レベルと対照血漿サンプルの比は２つの方法で算出される。第一の方法は、ＣＰＰを含む各サンプルからの画分数によりＣＡＤ／対照比を算出する。例えば、ＣＰＰ１５１では、この計算は７／  １（表３参照）となり、ＣＡＤ血漿においてＣＰＰ１５１が７倍高いことを示し；ＣＰＰ１７０では、この計算は７／２となり（表３参照）、ＣＡＤ血漿においてＣＰＰ１７０が３．５倍高いことを示し；ＣＰＰ２３１では、この計算は１６／７となり（表３参照）、ＣＡＤ血漿においてＣＰＰ２３１が２．３倍高いことを示し；ＣＰＰ３４５では、この計算は１３／４となり（表３参照）、ＣＡＤ血漿においてＣＰＰ３４５が３．２５倍高いことを示す。あるいは、もっと正確には、質量分析データ解析ソフトウエアにおいて各ペプチドについて得られたＯｌａｖスコアを用いてウエイト比を得る。ＣＰＰ１５１では、計算は２８６．６９／１６．８１で、１７．０５となる。よって、ＣＰＰ１５１はＣＡＤ血漿において対照よりも１７．０５倍高いレベルで存在する。ＣＰＰ１７０では、計算は２４１．０２／４４．９８で、５．４となる。よって、ＣＰＰ１７０はＣＡＤ血漿において対照よりも５．４倍高いレベルで存在する。ＣＰＰ２３１では、計算は８３２．６／３１２．４で、２．７となる。よって、ＣＰＰ２３１はＣＡＤ血漿において対照よりも２．７倍高い濃度で存在する。ＣＰＰ３４５では、計算は３２６．４／１１０．７で、２．９５となる。よって、ＣＰＰ３４５はＣＡＤ血漿において対照よりも２．９５倍高い濃度で存在する。ＣＰＰ１４９、１５３〜１５５、１７３〜１７４、１８３、１８５〜１８８、１９１〜１９２、１９４、１９６、１９８〜２０３、２０５、２０８、２１５、２１７、２２１〜２２６、２２８〜２３０、２３２、２３３、２３８、２４０、２４１、２４３、２４４、２４６、２４８、２５２〜２５８、２６０、２６２、２６６、２６８、２６９〜２７３、２７５、２８０〜２８３、２８７、２９７、２９９〜３０４、３０６、３０８〜３１３、３１５〜３１８、３２０、３２２、３２４〜３３１、３３３、３３４、３３６、３３７、３４０、３４２〜３４４、３４６〜３４８、３５０〜３５５、３５７〜３７３、３７５、３７６、および３７８〜４０２はＣＡＤ血漿サンプルでしか検出されなかった。ＭｉｃｒｏＰｒｏｔ（登録商標）プロセスは、数百ｐＭの範囲の血漿濃度という存在量の極めて小さいタンパク質を検出することができる。従って、このポリペプチドは正常な血漿中にはほとんど存在しないような低レベルで存在する。ＣＰＰはそれ自体、有用な診断ツールを提供し、ＣＰＰレベルの上昇は心血管疾患の発症の高い危険性、または心血管疾患の存在を示す。
【００７７】
【表１４】
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【表１５】
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【００７８】
【表１６】
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【表１７】
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【００７９】
【表１８】
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【表１９】
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【００８０】
【表２０】
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【表２１】
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【００８１】
【表２２】
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【表２３】
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【００８２】
【表２４】
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【表２５】
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【００８３】
【表２６】
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【表２７】
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【００８４】
【表２８】
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【表２９】
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【００８５】
【表３０】
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【表３１】
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【００８６】
【表３２】
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【表３３】
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【００８７】
【表３４】
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【表３５】
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【００８８】
【表３６】
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【表３７】
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【００８９】
【表３８】
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【表３９】
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【００９０】
【表４０】
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【表４１】
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【００９１】
【表４２】
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【表４３】
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【００９２】
【表４４】
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【表４５】
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【００９３】
【表４６】
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【表４７】
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【００９４】
【表４８】
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【表４９】
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【００９５】
【表５０】
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【表５１】
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【００９６】
【表５２】
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【表５３】
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【００９７】
【表５４】
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【表５５】
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【００９８】
【表５６】
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【表５７】
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【００９９】
【表５８】
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【表５９】
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【０１００】
【表６０】
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【表６１】
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【０１０１】
【表６２】
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【表６３】
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【０１０２】
【表６４】
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【表６５】
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【０１０３】
【表６６】
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【表６７】
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【０１０４】
【表６８】
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【表６９】
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【０１０５】
【表７０】
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【表７１】
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【０１０６】
【表７２】
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【表７３】
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【０１０７】
【表７４】
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【表７５】
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【０１０８】
【表７６】
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【表７７】
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【０１０９】
【表７８】
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【表７９】
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【０１１０】
【表８０】
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【表１００】
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【表１３２】
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【表１７６】
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【表１８２】
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【表１８４】
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【表１８６】
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【表１８７】
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【０１６４】
【表１８８】
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【表１８９】
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【０１６５】
【表１９０】
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【表１９１】
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【０１６６】
【表１９２】
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【０１６７】
【表１９４】
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【表１９５】
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【表１９７】
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【０１６９】
【表１９８】
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【表１９９】
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【０１７０】
【表２００】
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【表２０１】
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【０１７１】
【表２０２】
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【表２０３】
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【０１７２】
【表２０４】
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【表２０５】
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【表２０６】
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【表２０７】
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【０１７４】
【表２０８】
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【表２０９】
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【０１７５】
【表２１０】
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【表２１１】
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【０１７６】
【表２１２】
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【表２１３】
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【０１７７】
【表２１４】
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【表２１５】
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【０１７８】
【表２１６】
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【表２１７】
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【０１７９】
【表２１８】
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【表２１９】
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【０１８０】
【表２２０】
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【表２２１】
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【０１８１】
【表２２２】
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【表２２３】
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【０１８２】
【表２２４】
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【表２２５】
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【０１８３】
【表２２６】
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【表２２７】
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【０１８４】
【表２２８】
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【表２２９】
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【０１８５】
【表２３０】
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【表２３１】
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【０１８６】
【表２３２】
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【表２３３】
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【０１８７】
【表２３４】
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【表２３５】
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【０１８８】
【表２３６】
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【表２３７】
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【０１８９】
【表２３８】
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【表２３９】
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【０１９０】
【表２４０】
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【表２４１】
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【０１９１】
【表２４２】
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【表２４３】
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【０１９２】
【表２４４】
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【表２４５】
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【０１９３】
【表２４６】
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【表２４７】
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【０１９４】
【表２４８】
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【表２４９】
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【０１９５】
【表２５０】
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【表２５１】
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【０１９６】
【表２５２】
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【表２５３】
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【０１９７】
【表２５４】
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【表２５５】
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【０１９８】
【表２５６】
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【表２５７】
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【０１９９】
【表２５８】
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【０２００】
ＣＰＰ核酸
本発明の１つの態様は、本明細書においてさらに記載するＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分をコードする精製または単離された核酸分子、ならびにその核酸断片に関する。このような核酸は、本明細書においてさらに記載する、例えば治療（ＤＮＡワクチン）および診断方法および薬物スクリーニングアッセイに使用することができる。
【０２０１】
本発明の目的は、ＣＰＰをコードする精製、単離または組換え核酸、それに相補的な配列、およびその断片である。本発明はまた、ＣＰＰをコードするポリヌクレオチドと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有する、有利には、ＣＰＰ、またはそれと相補的な配列もしくはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドと９９％のヌクレオチド同一性を有する、好ましくは、９９．５％のヌクレオチド同一性を有する、最も好ましくは９９．８％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含む、精製または単離核酸に関する。本発明の他の目的は、本明細書で定義したストリンジェントハイブリッド形成条件下で、ＣＰＰ、またはそれと相補的な配列、またはその変異体、またはその生物学的に活性な断片をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、精製、単離または組換え体核酸に関する。
【０２０２】
他の好ましい態様において、本発明は、ＣＰＰの部分または変異体をコードする精製または単離された核酸分子に関し、そこではその部分または変異体はＣＰＰ生物活性を示す。好ましくは、この部分または変異体は、天然に存在するＣＰＰ、またはその前駆体のものである。
【０２０３】
本発明の他の目的は、表３に挙げられているペプチド配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから実質的になる、またはそれからなるＣＰＰをコードする精製、単離または組換え体核酸であり、そこでは、この単離された核酸分子は、標的結合部位またはジスルフィド結合のような１以上のモチーフをコードする。
【０２０４】
ＣＰＰコード遺伝子のクローニングから決定したヌクレオチド配列によって、他のＣＰＰ（例えば、新規な機能的ドメインを共有する）、ならびに、他種由来のＣＰＰ相同体を同定および／またはクローニングする上で使用するために設計したプローブおよびプライマーの作製が可能になる。
【０２０５】
「ＣＰＰの生物学的に活性な部分」をコードする核酸断片は、ＣＰＰ生物活性を有するポリペプチドをコードする、ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列の部分を単離すること、そのＣＰＰのコード部位を発現させること（例えば、in vitroまたはin vivoでの組換え発現による）、およびＣＰＰのコード部分の活性を評価することによって作製することができる。
【０２０６】
本発明はさらに、遺伝的コードの縮重のために、本発明のＣＰＰヌクレオチド配列とは異なり、本発明の同一のＣＰＰをコードする核酸配列を含む。
【０２０７】
当業者ならば、上記のＣＰＰヌクレオチド配列に加えて、ＣＰＰのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、集団（例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが分かるであろう。そのような遺伝的多型は、天然対立遺伝子変異によって、集団内の個体間で存在し得る。そのような天然対立遺伝子変異は、一般に、ＣＰＰコード遺伝子または核酸配列のヌクレオチド配列に１〜５％の変化をもたらし得る。
【０２０８】
本発明のＣＰＰ核酸の天然対立遺伝子変異体および相同体に対応する核酸分子を、標準的なハイブリダイゼーション技術に従い、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書において開示するｃＤＮＡまたはその一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、本明細書において開示するＣＰＰ核酸とのそれらの相同性に基づいて単離することができる。
【０２０９】
当然のことではあるが、本発明は本発明のポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２１０】
ＣＰＰ核酸の使用
ＣＰＰをコードするポリヌクレオチド配列（またはその相補体）は、ハイブリダイゼーションプローブとしての使用、染色体および遺伝子マッピングでの使用、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡの作製をはじめとする種々の用途を有する。さらに、本明細書に記載のように、ＣＰＰコード核酸は、薬理学的介入のため、例えばＤＮＡワクチンの開発のため、また、組換え技術によるＣＰＰの作製のための標的として有用である。その配列変異体を含む、本明細書に記載のポリヌクレオチドを、診断アッセイで使用することができる。従って、体液または組織サンプル中のそのようなポリヌクレオチドの存在を検出することに基づく、診断方法は本発明の特徴である。本発明に従った、核酸に基づく診断アッセイの例としては、限定されるものではないが、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えば、in situハイブリダイゼーションおよびＰＣＲに基づくアッセイが挙げられる。本明細書において記載するような伸長ポリヌクレオチド、その配列変異体および断片を含むポリヌクレオチドを使用して、このようなアッセイに用いるハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーを作製することができる。このようなプローブおよびプライマーは、本明細書において記載するＣＰＰポリヌクレオチドと類似しているか、またはそれと相補的なゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することができる。
【０２１１】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのセグメントを増幅する目的でＰＣＲを実施するためのプライマー対を含む。プライマー対の各プライマーは、ｉ）その対の一方のプライマーが本発明のポリヌクレオチドの一方の鎖と完全にマッチした二本鎖を形成し、その対のもう一方のプライマーが同じポリヌクレオチドの相補鎖と完全にマッチした二本鎖形成し、かつ、ii）プライマー対のプライマーが、１０〜２５００ヌクレオチドの間の距離で隔てられているそのポリヌクレオチド上の位置で、そのような完全にマッチした二本鎖を形成するように、１５〜３０ヌクレオチドの間の長さを有するオリゴヌクレオチドである。好ましくは、プライマー対の各プライマーの、その各々の相補配列とのアニーリング温度が実質的に同じである。
【０２１２】
本発明のポリヌクレオチドから得られるハイブリダイゼーションプローブを、例えば、顕微鏡用スライド上に準備した固定もしくは冷凍した組織切片または細胞懸濁液のような組織サンプルでin situハイブリダイゼーションを実施するのに使用することができる。要するに、標識したＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、制御された条件下で、顕微鏡プレパラート上の組織切片中のそのＤＮＡまたはＲＮＡ標的サンプルと結合させる。一般に、プラスミドまたはバクテリオファージＤＮＡベクターにクローニングされる目的のＤＮＡで構成されるｄｓＤＮＡプローブがこの目的に使用されるが、ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡプローブを用いてもよい。プローブは、一般に、約１５〜４０ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチドである。あるいは、これらのプローブは、ＰＣＲランダムプライミングプライマー伸長またはプラスミドからのＲＮＡのin vitro転写（リボプローブ）によって作製されるポリヌクレオチドプローブであり得る。これら後者のプローブは、一般に、数百塩基対の長さである。これらのプローブは、多くの標識基のいずれかで標識することができ、その特定の検出方法はプローブに用いられた標識の種類に応じたものとする（例えば、必要に応じて、オートラジオグラフィー、Ｘ線検出、蛍光または視覚顕微鏡分析）。その反応物を、蛍光標識プローブに存在するフルオレセイン部分に対する抗体のような、使用した検出分子の標識に対する免疫細胞化学的技術を利用して、in situでさらに増幅させることもできる。具体的な標識およびin situでの検出方法は、例えば、出典明示により本明細書の一部とされるHoward, G. C., Ed., Methods in Nonradioactive Detection, Appleton & Lange, Norwalk, Conn., (1993)に見出せる。
【０２１３】
ハイブリダイゼーションプローブおよびＰＣＲプライマーは、天然に存在するポリペプチドをコードする遺伝子のプロモーター、エンハンサーエレメントおよびイントロンを含む、本発明に従って同定される全長タンパク質に対応するゲノム配列からも選択し得る。ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列は、ＣＰＰをコードする遺伝子のマッピング用および個体の遺伝分析用のハイブリダイゼーションプローブの構築にも使用できる。種々の技術により、本発明のＣＰＰをコードする遺伝子のバリエーションまたは突然変異を有する個体をＤＮＡレベルで検出し得る。診断に用いる核酸は、例えば、組織生検および剖検試料をはじめ、患者の細胞から得ることができる。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよいし、または解析の前にＰＣＲ(Saiki, et al. Nature 324: 163-166 (1986))利用して、酵素的に増幅させてもよい。ＲＮＡまたはｃＤＮＡも同じ目的で使用し得る。例として、本発明の核酸と相補的なＰＣＲプライマーは、本発明の遺伝子における突然変異を同定および分析するために使用することができる。欠失および挿入は、正常な遺伝子型と比べたときの増幅産物のサイズの変化によって検出することができる。点突然変異は、増幅したＤＮＡと、放射性標識した本発明のＲＮＡ、あるいは、放射性標識した本発明のアンチセンスＤＮＡ配列とをハイブリダイズさせることによって確認することができる。特定位置での配列変化も、ＲＮアーゼおよびＳ１プロテクションまたは化学切断法のようなヌクレアーゼプロテクションアッセイ（例えば、Cotton, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397-4401 (1985)）により、あるいは融解温度の違いにより示すことができる。「分子指標（Molecular beacons）」(Kostrikis L. G. et al., Science 279: 1228-1229 (1998))、すなわち、本発明の核酸と相補的なプローブ配列を含むヘアピン型一本鎖合成オリゴヌクレオチドも、点突然変異または他の配列変化の検出、ならびにＣＰＰの発現レベルのモニタリングに使用することができる。
【０２１４】
オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス化合物
ＰＣＲプライマーおよびアンチセンス化合物を含む本発明のオリゴヌクレオチドは、従来の方法により、市販の自動ＤＮＡ合成装置、例えば、Applied Biosystems (Foster City, CA)型３８０Ｂ、３９２もしくは３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置または同等の機器で合成される。好ましくは、例えば、以下の参考文献で開示されているホスホロアミダイト化学を使用する：Beaucage and Iyer, Tetrahedron, 48: 2223-2311 (1992)；Molko et al, 米国特許第４，９８０，４６０号；Koster et al, 米国特許第４，７２５，６７７号；Caruthers et al, 米国特許第４，４１５，７３２号；同第４，４５８，０６６号；および同第４，９７３，６７９号など。治療上の使用には、ヌクレアーゼ耐性骨格が好ましい。ヌクレアーゼ耐性を与える多くの種類の改変オリゴヌクレオチド、例えば、多くの参考文献、例えば、ホスホロチオエート：Stec et al, 米国特許第５，１５１，５１０号；Hirschbein, 米国特許第５，１６６，３８７号；Bergot, 米国特許第５，１８３，８８５号；ホスホルアミダート：Froehler et al, 国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３１３８；およびさらに適用可能な化学の総説に関する：Uhlmann and Peyman（上記）に記載されているホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダートなどが利用可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、所望の標的ポリヌクレオチドにおいてのみ特異的結合が起こり、他の意図しない部位では起こらないことを確実にするために十分に大きくなければならない。長さの上限は、約３０〜４０ヌクレオチド長より大きなオリゴマーの合成および精製の不都合と費用、長いオリゴヌクレオチドのミスマッチ耐性が短いオリゴヌクレオチドよりも高いことなどを含むいくつかの因子によって決定される。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは約１５〜４０ヌクレオチドの範囲である。より好ましくは、オリゴヌクレオチド部分の長さは約１８〜２５ヌクレオチドの範囲である。
【０２１５】
二本鎖ＲＮＡ、すなわち、センス−アンチセンスＲＮＡ（小干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子とも呼ばれる）もまた、ＣＰＰをコードする核酸の発現を阻害するために使用できる。ＲＮＡ干渉は、一方の鎖が標的ｍＲＮＡのコード領域に相当する外因性の短いＲＮＡ二重らせんが投与される方法である(Elbashir et al., Nature 2001, 411: 494-498)。細胞へ入ると、ｓｉＲＮＡ分子は外因性のＲＮＡ二重らせんの分解を引き起こすだけでなく、内因性のメッセンジャーＲＮＡをはじめ、同じ配列を有する一本鎖ＲＮＡの分解も引き起こす。よって、この技術は触媒機構を介して働くと考えられていることから、従来のｓｉＲＮＡはアンチセンスＲＮＡの方法論よりも強力かつ有効であり得る。好ましいｓｉＲＮＡ分子は一般に、１９〜２５ヌクレオチド長さ、好ましくは、約２１ヌクレオチド長であり、ＣＰＰの核酸配列を含む。ｓｉＲＮＡを標的細胞に送達するための有効な戦略としては、例えば、物理的または化学的トランスフェクションを用いる形質導入が挙げられる。あるいは、例えば、機能的ｓｉＲＮＡまたはその前駆体の転写を可能とする種々のＰｏｌＩＩＩプロモーター発現カセットを用いて、細胞においてｓｉＲＮＡを発現させることもできる。例えば、Scherr et al., Curr. Med. Chem. 2003, 10(3):245-256; Turki et al., Hum. Gene Ther. 2002, 13(18):2197-2201; Cornell et al., Nat. Struct. Biol. 2003, 10(2):91-92参照。
【０２１６】
プライマーとプローブ
本発明のプライマーとプローブは、例えば、Narang SA et al (Methods Enzymol 1979; 68: 90-98)のホスホジエステル法、Brown EL et al (Methods Enzymol 1979; 68: 109-151)のホスホジエステル法、Beaucage et al (Tetrahedron Lett 1981, 22: 1859-1862)のジエチルホスホロアミダイト法およびＥＰ  ０  ７０７  ５９２に記載されている固相支持体法（これらの開示内容は出典明示によりそのまま本明細書の一部とする）のような方法による適当な配列のクローニングおよび制限ならびに直接化学合成を含む、好適ないずれの方法によって調製してもよい。
【０２１７】
検出プローブは、一般に、核酸配列であり、または例えば、国際特許出願ＷＯ９２／２０７０２に開示されているペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号；同第５，０３４，５０６号および同第５，１４２，０４７号に記載されているモルホリノ類似体のような非荷電核酸類似体である。所望により、プローブが、プローブにさらなるｄＮＴＰを付加し得ないという意味で「非伸長性」を示し得るものである。本質的に類似体は、通常、非伸長性であり、核酸プローブには、プローブの３’末端を、ヒドロキシル基が伸長に関与し得ないように改変することによって非伸長性を与えることができる。例えば、プローブの３’末端を捕捉または検出標識を用いて官能基化し、それによってヒドロキシル基を消費し得るか、そうでなければヒドロキシル基をブロックし得る。
【０２１８】
本発明のポリヌクレオチドはいずれも、所望により、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能である、当技術分野で公知の任意の標識基を組み込むことによって標識し得る。さらなる例としては、Urdea et al. (Nucleic Acids Research. 11: 4937-4957, 1988)またはSanchez-Pescador et al. (J. Clin. Microbiol. 26 (10): 1934-1938, 1988)に記載されているような核酸断片の非放射性標識が挙げられる。さらに、本発明のプローブは、それらがシグナル増幅を可能にするような構造特性を有していることもあり、そのような構造特性が、例えば、Urdea et al (Nucleic Acids Symp. Ser. 24: 197-200, 1991)によりまたは欧州特許番号ＥＰ  ０２２５８０７(Chiron)で記載されているもののような分枝鎖ＤＮＡプローブである。
【０２１９】
標識は、プライマーまたは増幅したＤＮＡのようなプライマー伸長産物のいずれかの固相支持体への固定化を容易にするために、プライマーの捕捉にも使用され得る。捕捉標識は、プライマーまたはプローブに付着させ、固相試薬の特異的結合メンバー（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）と結合対を形成する特異的結合メンバーであり得る。従って、捕捉標識は、ポリヌクレオチドまたはプローブに付着させる標識の種類に応じて、標的ＤＮＡの捕捉または検出に使用され得る。さらに、当然のことながら、本明細書において提供するポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブは、それ自体、捕捉標識としての機能を果たし得る。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合には、それは、それがプライマーまたはプローブの相補的部分と結合し、それによって、プライマーまたはプローブを固相に固定するように選択される。当業者ならば、ポリヌクレオチドプローブ自体が結合メンバーとしての機能を果たす場合には、そのプローブが標的と相補的ではない配列または「テール」を含有するということが分かるであろう。ポリヌクレオチドプライマー自体が捕捉標識としての機能を果たす場合には、プライマーの少なくとも一部が固相上の核酸と自由にハイブリダイズする。ＤＮＡ標識技術は当業者には周知の技術である。
【０２２０】
本発明のプローブは多くの用途に有用である。それらは、特に、ゲノムＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションに使用できる。それらのプローブは、ＰＣＲ増幅産物の検出にも使用できる。それらは他の技術を用いたＣＰＰをコードする遺伝子またはｍＲＮＡにおけるミスマッチの検出にも使用し得る。
【０２２１】
本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれのものも、便宜に、固相支持体上に固定することができる。固相支持体は当業者に公知のものであり、それらとしては、反応トレイのウェル壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜、ラテックス粒子のような微小粒子、ヒツジ（または他の動物）赤血球、デュラサイト(duracyte)などが挙げられる。固相支持体は決定的なものではなく、当業者ならば選択可能である。よって、ラテックス粒子、微小粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスまたはシリコンチップ、ヒツジ（または他の好適な動物）赤血球およびデュラサイトは全て好適な例である。核酸を固相に固定するのに好適な方法としては、イオン相互作用、疎水性相互作用、共有結合性相互作用などが挙げられる。固相支持体とは、本明細書において、不溶性であるかまたは後の反応によって不溶性となり得るあらゆる物質を指す。固相支持体は、捕捉試薬を誘引し、固定するその固有の能力に対して選択され得る。あるいは、固相は、捕捉試薬を誘因し、固定する能力を有するさらなる受容体を保有し得る。さらなる受容体としては、捕捉試薬自体または捕捉試薬とコンジュゲートした荷電物質と逆帯電した荷電物質を挙げることができる。さらに別の例としては、受容体分子が、特異的結合反応を通じて捕捉試薬を固定する能力を有する、固相支持体と結合されている特異的結合メンバーであり得る。受容体分子が、アッセイの実施前またはアッセイの実施中に捕捉試薬と固相支持体材料の間接的結合を可能にする。よって、固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン表面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微小粒子、チップ、ヒツジ（または他の好適な動物）赤血球、デュラサイトおよび当業者に公知の他の形態であり得る。本発明の核酸、ポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブを、個別にまたは１つの固相支持体に対し、少なくとも２個、５個、８個、１０個、１２個、１５個、２０個もしくは２５個の異なる本発明のポリヌクレオチドをまとめて、固相支持体と結合することができ、または固相支持体に固定することができる。さらに、本発明のもの以外のポリヌクレオチドを、１以上の本発明のポリヌクレオチドと同じ固相支持体と結合してもよい。
【０２２２】
本明細書において提供するいずれのポリヌクレオチドも、固相支持体上の重複している領域に結合してもよいし、または任意の位置に結合してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを、各ポリヌクレオチドがその他のポリヌクレオチドの結合部位と重複しない固相支持体の異なる領域に結合されるように整列されたアレイにおいて結合してもよい。好ましくは、ポリヌクレオチドのこのような整列アレイが、異なる位置が記録され、アッセイ手法の一部としてアクセス可能である場所に「アドレス可能な」ように設計される。アドレス可能なポリヌクレオチドアレイは、一般に、種々の既知の位置で支持体の表面と結合している複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチド位置の正確な位置の認識により、これらの「アドレス可能な」アレイが、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用なものとなる。当技術分野で公知のいずれのアドレス可能なアレイ技術も、本発明のポリヌクレオチドとともに使用することができる。これらのポリヌクレオチドアレイの１つの特定の実施形態は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓとして知られており、出典明示によりその開示内容がそのまま本明細書の一部とされる米国特許第５，１４３，８５４号；ＰＣＴ公報ＷＯ９０／１５０７０および９２／１００９２に概要が示されている。
【０２２３】
核酸およびポリペプチド変異体を得るための方法
当業者ならば、集団内に存在し得るＣＰＰ配列の自然発生対立遺伝子変異体の他、ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列に突然変異によって変化を導入し、そうすることにより、コードされたＣＰＰのアミノ酸配列に、ＣＰＰの機能活性を改変する変化または改変しない変化をもたらし得ることが分かるであろう。
【０２２４】
１）１以上のアミノ酸残基が保存もしくは非保存アミノ酸残基で置換されており、このような置換アミノ酸残基がその遺伝子コードによってコードされている場合もあるし、そうでない場合もあるというもの、あるいは２）１以上のアミノ酸残基が置換基を含むというもの、あるいは３）突然変異型ＣＰＰがポリペプチドの半減期を延長する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）のようなもう１つの化合物と融合されているというもの、あるいは４）リーダー配列、シグナル配列もしくはアンカー配列、ＣＰＰの精製に使用される配列または前駆体タンパク質由来の配列のようなさらなるアミノ酸がＣＰＰと融合されているというものを含む、いくつかの種類の変異体が意図される。このような変異体は、当業者の範囲内であると考えられる。
【０２２５】
例えば、アミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換を、タンパク質の生物活性を実質的に変化させない配列内で行うことができる。アミノ酸残基が、生物活性を改変することなく、ＣＰＰをコードする野生型配列またはその生物学的に活性な断片もしくは相同体から改変され得る。一般に、本発明のＣＰＰに共通しているアミノ酸残基が改変の影響を受けにくいものと予測される。
【０２２６】
別の態様において、本発明は、生物活性を増強させる、または生物活性を改変させるアミノ酸残基の変化を含むＣＰＰをコードする核酸分子に関する。別の態様において、本発明は、ＣＰＰ生物活性に必須のアミノ酸残基の変化を含むＣＰＰをコードする核酸分子に関する。このようなＣＰＰは、ＣＰＰ１４９〜４０２のアミノ酸配列が異なっており、活性の低下を示すか、または１以上のＣＰＰ生物活性を本質的に欠損している。
【０２２７】
部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲを介した突然変異誘発のような標準的な技術により、ＣＰＰ１４９〜４０２のいずれにも、突然変異、置換、付加または欠失を導入することができる。例えば、１以上の推定非必須アミノ酸残基において保存的アミノ酸置換を行い得る。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられることである。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。よって、ＣＰＰの推定非必須アミノ酸残基またはその生物学的に活性な断片もしくは相同体は、同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置き換えられ得る。あるいは、別の実施形態では、飽和突然変異誘発によるなどＣＰＰコード配列の全てまたは一部に沿ってランダムに突然変異を導入することができ、得られた変異株をＣＰＰ生物活性についてスクリーニングして、活性を保有する変異株を同定することができる。ＣＰＰ１４９〜４０２の１つをコードするヌクレオチドを突然変異誘発した後、コードされたタンパク質を組換え発現させ、そのタンパク質の活性を、例えば、本明細書において提供するような好適なアッセイにより判定することができる。
【０２２８】
本発明はまた、ＣＰＰキメラタンパク質または融合タンパク質も提供する。本明細書において、ＣＰＰ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」とは、非ＣＰＰポリペプチド配列に作動可能なように連結されるか、またはインフレームで融合された本発明のＣＰＰもしくはその断片を含むものである。好ましい実施形態では、ＣＰＰ融合タンパク質は、ＣＰＰの少なくとも１つの生物学的に活性な部分を含む。別の実施形態では、ＣＰＰ融合タンパク質は、ＣＰＰの少なくとも２つの生物学的に活性な部分を含む。例えば、一実施形態において、融合タンパク質は、ＣＰＰドメイン配列がＧＳＴ配列のＣ末端と融合されたＧＳＴ−ＣＰＰ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えＣＰＰの精製を容易にし得る。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有し、例えば、特定の宿主細胞において所望の細胞局在を可能にするＣＰＰである。さらに別の実施形態では、融合物は、ＣＰＰ生物活性断片および免疫グロブリン分子である。このような融合タンパク質は、例えば、ＣＰＰ結合部位の結合価を高めるのに有用である。例えば、二価ＣＰＰ結合部位は、生物学的に活性なＣＰＰ断片とＩｇＧ  Ｆｃタンパク質とを融合することにより形成し得る。
【０２２９】
本発明のＣＰＰ融合タンパク質は、対象において抗ＣＰＰ抗体を生産するための免疫原として、また、ＣＰＰまたはＣＰＰリガンドを精製するために、また、ＣＰＰモジュレーターを同定するためのスクリーニングにおいて使用できる。
【０２３０】
さらにまた、ＣＰＰの単離された断片を、このようなペプチドをコードする核酸の対応する断片から組換え生産したペプチドをスクリーニングすることにより得ることもできる。さらに、従来のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のような当技術分野で公知の技術を用いて、断片を化学合成することもできる。例えば、本発明のＣＰＰを、断片の重複なく所望の長さの断片に任意に分割してもよいし、あるいは、好ましくは、所望の長さの重複する断片に分割してもよい。これらの断片を作製し（組換えまたは化学合成による）、例えば、マイクロインジェクションアッセイまたはin vitroタンパク質結合アッセイにより、ＣＰＰ生物活性を有するこれらのペプチジル断片を同定することができる。ある例示的な実施形態では、ＣＰＰ標的結合領域のようなＣＰＰのペプチジル部分を、チオレドキシン融合タンパク質（各々、個別のＣＰＰ断片を含む）として発現させることにより、ＣＰＰ活性に関して試験することができる（例えば、その開示内容が出典明示により本明細書の一部とされる、米国特許第５，２７０，１８１号および同第５，２９２，６４６号；ならびにＰＣＴ公報ＷＯ９４／０２５０２参照）。
【０２３１】
さらに、ＣＰＰコード配列の断片のライブラリーを用いて、ＣＰＰの変異体のスクリーニングおよびその後の選択のための、ＣＰＰ断片の変化に富んだ集団を作り出すこともできる。一実施形態では、ＣＰＰコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、１分子につき約１回しかニッキングが起こらない条件下においてヌクレアーゼで処理し、その二本鎖ＤＮＡを変性させ、そのＤＮＡを再生して、異なるニック産物に由来するセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させ、再形成した二重らせんから、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により一本鎖部分を除去し、さらに、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結することにより、コード配列断片のライブラリーを作製することができる。この方法により、ＣＰＰの種々のサイズのＮ末端断片、Ｃ末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０２３２】
ペプチドのアミノ酸配列の変化が機能的なＣＰＰ同族体を生じるかどうかは、変異体ペプチドの少なくとも１つのＣＰＰ生物活性を評価することにより容易に判定することができる。１を超える置換が起こったペプチドも、同様に容易に試験することができる。
【０２３３】
ＣＰＰ組成物の化学製造
本発明のペプチドは、標準的な技術（例えば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984）により合成される。好ましくは、市販のペプチド合成装置、例えば、Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA)型４３０Ａを使用し、本発明のポリペプチドを収束合成アプローチ、例えば、Kent et al、米国特許第６，１８４，３４４号およびDawson and Kent, Annu. Rev. Biochem., 69: 923-960 (2000)により、別途合成し、精製した複数のペプチドから構成し得る。本発明のペプチドを固相合成により架橋ポリスチレン支持体上で構成してもよく、カルボキシル末端残基から開始し、完全ペプチドが形成されるまでアミノ酸を段階的に添加する。以下の参考文献は、合成中に使用される化学の指針となる：Schnolzer et al, Int. J. Peptide Protein Res., 40: 180-193 (1992)；Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., Vol. 85, pg. 2149 (1963)；Kent et al., pg 185, in Peptides 1984, Ragnarsson, Ed. (Almquist and Weksell, Stockholm, 1984)；Kent et al., pg. 217 in Peptide Chemistry 84, Izumiya, Ed. (Protein Research Foundation, B.H. Osaka, 1985)；Merrifield, Science, Vol. 232, pgs. 341-347 (1986)；Kent, Ann. Rev. Biochem., Vol. 57, pgs. 957-989 (1988)およびこれらの最後の２つの参考文献に引用されている参考文献。
【０２３４】
好ましくは、本発明のポリペプチドの化学合成は、Dawson et al, Science, 266: 776-779 (1994)およびKent el al, 米国特許第６，１８４，３４４号により記載されているような自然化学的連結によるペプチド断片の構成により行われる。要するに、上記アプローチでは、第１のペプチド断片に非酸化スルフヒドリル側鎖を有するＮ末端システインを設け、第２のペプチド断片にＣ末端チオエステルを設ける。Ｎ末端システインの非酸化スルフヒドリル側鎖がＣ末端チオエステルと縮合して、第１のペプチド断片と第２のペプチド断片がβ−アミノチオエステル結合によって連結された中間体ペプチド断片を生じる。その中間体ペプチド断片のβ−アミノチオエステル結合が、その後、分子内転移を受けて、第１ペプチド断片と第２ペプチド断片がアミド結合によって連結されたペプチド断片産物を生じる。好ましくは、内部断片のＮ末端システインが、以下に記載するように、環状チアゾリジン保護基により望ましくない環化および／または連鎖反応から保護される。好ましくは、このような環状チアゾリジン保護基はチオプロリニル基である。
【０２３５】
Ｃ末端チオエステルを有するペプチド断片は、出典明示により本明細書の一部とされる以下の参考文献に記載されているように作製し得る：Kent et al, 米国特許第６，１８４，３４４号；Tam et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 12485-12489 (1995)；Blake, Int. J. Peptide Protein Res., 17: 273 (1981)；Canne et al, Tetrahedron Letters, 36: 1217-1220 (1995)；Hackeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 7845-7850 (1997)；またはHackeng et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 96: 10068-10073 (1999)。好ましくは、Hackeng et al (1999)により記載されている方法を使用する。要するに、ペプチド断片は、出典明示により本明細書の一部とされるSchnolzer et al, Int. J. Peptide Protein Res., 40: 180-193 (1992)により開示されているＢｏｃ化学に関するin situ中和／ＨＢＴＵ活性化手法を使用することにより、固相支持体上で、一般に、０．２５ｍｍｏｌ規模で合成される（以下に記載する）。（ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、Ｂｏｃはｔ−ブトキシカルボニルである）。各合成サイクルは、１〜２分間の純ＴＦＡでの処理によるＮα−Ｂｏｃ除去、１分間のＤＭＦ流洗浄、ＤＩＥＡの存在下、１．０ｍｍｏｌの予め活性化したＢｏｃ−アミノ酸との１０〜２０分間の結合時間および２回目のＤＭＦ流洗浄で構成される。（ＴＦＡはトリフルオロ酢酸であり、ＤＭＦはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである）。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸（１．１ｍｍｏｌ）は、過剰のＤＩＥＡ（３ｍｍｏｌ）の存在下、１．０ｍｍｏｌのＨＢＴＵ（ＤＭＦ中０．５Ｍ）で３分間予め活性化する。各結合ステップ後、収量を、例えば、Sarin et al, Anal. Biochem., 117: 147-157 (1981)で開示されているように、従来の定量ニンヒドリンアッセイを用いて残留遊離アミンを測定することにより決定する。Ｇｌｎ残基の結合後、ＴＦＡの使用による脱保護の前後にＤＣＭ流洗浄を利用して、起こり得る高温（ＴＦＡ／ＤＭＦ）触媒によるピロリドン形成を防ぐ。鎖構成が完了した後、そのペプチド断片を脱保護し、スカベンジャーとして４％ｐ−クレゾールを用いて無水ＨＦで０℃にて１時間処理することにより樹脂から切り離す。ｄｎｐ除去手法がＣ末端チオエステル基と適合しないため、イミダゾール側鎖２，４−ジニトロフェニル（ｄｎｐ）保護基は、Ｈｉｓ残基に残る。しかしながら、ｄｎｐは、連結反応中にチオールにより徐々に除去される。切断後、ペプチド断片を氷冷ジエチルエーテルにより沈降させ、水性アセトニトリルに溶かし、凍結乾燥させる。
【０２３６】
以上で記載したチオエステルペプチド断片は、好ましくは、Hackeng et al (1999)または同等のプロトコールにより開示されているように作製されたトリチル結合メルカプトプロピオン酸−ロイシン（ＴＡＭＰＡＬ）樹脂上で合成される。要するに、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ（４ｍｍｏｌ）を６ｍｍｏｌのＤＩＥＡの存在下、３．６ｍｍｏｌのＨＢＴＵで活性化し、それと２ｍｍｏｌのｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂またはその同等物と１６分間結合させる。次に、３ｍｍｏｌのＳ−トリチルメルカプトプロピオン酸を６ｍｍｏｌのＤＩＥＡの存在下、２．７ｍｍｏｌのＨＢＴＵで活性化させ、それとＬｅｕ−ＭＢＨＡ樹脂と１６分間結合させる。得られたＴＡＭＰＡＬ樹脂は、ＴＦＡ中３．５％トリイソプロピルシランおよび２．５％Ｈ２Ｏでの１分間の処理を２回行ってトリチル保護基を除去した後、ポリペプチド鎖構成の開始樹脂として使用することができる。Schnolzer et al（上記）で開示されているように、標準的なin situ中和ペプチド結合プロトコールを１時間使用することにより、任意の所望のアミノ酸とのチオエステル結合を形成することができる。最終的なペプチド断片を無水ＨＦで処理することにより、Ｃ末端活性化メルカプトプロピオン酸−ロイシン（ＭＰＡＬ）チオエステルペプチド断片が得られる。
【０２３７】
好ましくは、チアゾリジン保護チオエステルペプチド断片中間体が、Hackeng et al (1999)により記載されている条件または同等の条件下で自然化学的連結に使用される。要するに、６Ｍグアニジン、４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ベンジルメルカプタンおよび４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）チオフェノールを含有する０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ８．５）を連結しようとする乾燥ペプチドに添加して、約ｐＨ７にて最終ペプチド濃度１〜３ｍＭとする。このｐＨは凍結乾燥ペプチドからチオールとＴＦＡが加わることにより低下する。好ましくは、加熱ブロックにより３７℃にて連結反応を行い、それを定期的に攪拌して、チオール添加物を平衡化する。ＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化ＭＳにより、この反応の進行度をモニタリングすることができる。
【０２３８】
自然化学的連結反応が完了または停止した後、産物のＮ末端チアゾリジン環を、Ｏ−メチルヒドロキシルアミンのようなシステイン脱保護剤（０．５Ｍ）でのｐＨ３．５〜４．５、３７℃にて２時間の処理により開環し、その後、従来の分取ＨＰＬＣによる産物の精製の前に、１０倍過剰のＴｒｉｓ−（２−カルボキシエチル）−ホスフィンを反応混合物に添加して、酸化反応成分を完全に還元する。好ましくは、連結産物を含有する画分をエレクトロスプレーＭＳにより確認し、それらをプールし、凍結乾燥させる。
【０２３９】
合成が完了し、最終産物を精製した後、最終ポリペプチド産物を従来の技術、例えば、Creighton, Meth. Enzymol., 107: 305-329 (1984)；White, Meth. Enzymol., 11: 481-484 (1967)；Wetlaufer, Meth. Enzymol., 107: 301-304 (1984)などによりリフォールディングさせることができる。好ましくは、最終産物を下記などによる空気酸化によりリフォールディングさせる：還元した凍結乾燥産物を１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭメチオニンを含有する１Ｍ塩酸グアニジン（または同等のカオトロピック剤）ｐＨ８．６に溶かす（約０．１ｍｇ／ｍＬに）。ゆっくりと一晩攪拌した後、リフォールディングした産物を従来のプロトコールを用いた逆相ＨＰＬＣにより単離する。
【０２４０】
組換え発現ベクターと宿主細胞
本明細書において記載するポリヌクレオチド配列は、適当な宿主細胞中で対応するポリペプチドの発現を命令する組換えＤＮＡ分子に使用することができる。遺伝子コードの縮重により、他のＤＮＡ配列が等価なアミノ酸配列をコードすることがあるため、それらもＣＰＰのクローニングおよび発現に使用し得る。特定の宿主細胞に好ましいコドンを選択し、それを天然に存在するヌクレオチド配列に使用して、発現速度および／または効率を上げてもよい。所望のＣＰＰをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）をクローニング（ＤＮＡの増幅）用または発現用の複製可能なベクターに挿入し得る。当技術分野で公知の方法(Ausubel, et al., editors, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1990)に従い、多くの発現系のいずれにおいても、ポリペプチドを組換え発現させることができる。適当な宿主細胞としては、酵母、細菌、始原細菌、真菌、ならびに昆虫細胞および哺乳類細胞を含む動物細胞、例えば、限定されるものではないが、骨髄幹細胞をはじめとする幹細胞を含む初代細胞が挙げられる。より詳しくは、これらのものとしては、限定されるものではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターによる形質転換を受けた細菌、および酵母発現ベクターによる形質転換を受けた酵母のような微生物が挙げられる。また、組換え昆虫ウイルス（バキュロウイルスなど）に感染した昆虫細胞、および哺乳類発現系も含まれる。種々の手法により、発現させようとする核酸配列をベクターに挿入し得る。一般に、ＤＮＡを当技術分野で公知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。ベクター成分としては、一般に、限定されるものではないが、１以上のシグナル配列、複製起点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終止配列が挙げられる。１以上のこれらの成分を含有する好適なベクターの構築には、当業者に公知の標準的な連結技術を使用する。
【０２４１】
本発明のＣＰＰは、ＣＰＰをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、タンパク質の発現を誘導または引き起こすための適当な条件下で培養することにより作製される。ＣＰＰの発現に適当な条件は、当業者によって確認されるように、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変わる。例えば、発現ベクターに構成プロモーターを使用する場合には宿主細胞の成長および増殖の定期的な最適化が必要であり、一方、誘導プロモーターを使用する場合には、誘導に適当な成長条件が必要である。さらに、いくつかの実施形態では、回収の時期が重要である。例えば、昆虫細胞の発現に使用されるバキュロウイルス系は溶解ウイルスであるため、収穫時間の選択は産物の収量にとって重要なものとなり得る。
【０２４２】
宿主細胞株は、挿入配列の発現を調節するまたは所望の様式で発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択される。タンパク質のこのような修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、アミド基、脂質基、カルボキシル基、アシル基または炭水化物基が挙げられる。タンパク質の「プレプロ」型を分断する翻訳後プロセシングも、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能に重要であり得る。一例として、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８などのような宿主細胞は、このような翻訳後活性の特異的な細胞機構および特性メカニズムを有しており、導入された異種タンパク質の正確な修飾およびプロセシングが確実に行われるように選択される。特に注目されるものとして、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)細胞、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)および他の酵母、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ＳＦ９細胞、Ｃｌ２９細胞、２９３細胞、アカパンカビ属(Neurospora)、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＯＳおよびＨｅＬａ細胞、繊維芽細胞、神経鞘腫細胞系統、不死化哺乳類骨髄およびリンパ細胞系、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ヒト細胞ならびに他の初代細胞がある。
【０２４３】
ＣＰＰをコードする核酸は、それをもう１つの核酸配列と機能的関係をもたせることによりにより「作動可能なように連結され」ていなければならない。例えば、プレ配列または分泌リーダーのＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合には、それはポリペプチドのＤＮＡに作動可能なように連結されている；プロモーターまたはエンハンサーが配列の転写に影響を及ぼす場合には、それはコード配列に作動可能なように連結されている；あるいはリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されている場合には、それはコード配列に作動可能なように連結されている。一般に、「作動可能なように連結された」ＤＮＡ配列は隣接しており、分泌リーダーまたは他のポリペプチド配列の場合には、隣接して読み取り位相（reading phase）に存在する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は、便宜な制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合には、従来の実施に従って合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。プロモーター配列は構成プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかをコードする。プロモーターは、天然に存在するプロモーターであってもよいし、またはハイブリッドプロモーターであってもよい。２以上のプロモーターのエレメントを合わせ持つハイブリッドプロモーターも当技術分野で公知であり、本発明において有用である。発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得る、例えば、発現ベクターは２つの複製系を有してもよく、そのため、それを２つの生物体、例えば、発現用の哺乳類または昆虫細胞とクローニングおよび増幅用の原核生物宿主で維持することが可能である。発現ベクターとクローニングベクターはいずれも、１以上の選択された宿主細胞でのベクターの複製を可能にする核酸配列を含有している。種々の細菌、酵母およびウイルスに関するこのような配列はよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点は、大部分のグラム陰性菌に好適であり、２：プラスミド起点は酵母に好適であり、種々のウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳類細胞でのクローニングベクターに有用である。さらに、組込み発現ベクターの場合、発現ベクターは宿主細胞ゲノムと相同である少なくとも１つの配列、好ましくは、発現構築物にフランキングする２つの相同配列を含有している。組込みベクターへの封入に適当な相同配列を選択することにより、その組込みベクターを宿主細胞の特定の遺伝子座に向け得る。組込みベクターの構築物は当技術分野では周知である。さらなる実施形態において、異種発現制御エレメントは、相同組換えにより宿主細胞の内因性遺伝子に作動可能なように連結され得る（その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第６４１０２６６号および第６３６１９７２号に記載）。この技術は、選択された制御エレメントによる所望のレベルまでの発現の調節を可能にする一方で、宿主細胞によって内因的に発現されるＣＰＰの適切なプロセシングおよび修飾を確実に行わせるものである。有用な異種発現制御エレメントとしては、限定されるものではないが、ＣＭＶ前初期��ロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のものなどレトロウイルスＬＴＲのプロモーター、ならびにメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【０２４４】
発現ベクターは、形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含有していることが好ましい。選択遺伝子は、当技術分野では周知であり、使用する宿主細胞によって異なる。発現およびクローニングベクターは、一般に、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有している。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性の欠如を補足する、または（ｃ）天然培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、バチルス属(Bacillus)のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。
【０２４５】
ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、コードされたタンパク質の発現および細胞培養物からの回収に好適な条件下で培養し得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用した配列および／またはベクターに応じて、分泌され、膜結合され、あるいは細胞内に含有される。当業者には明らかなように、ＣＰＰをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを、原核生物または真核生物細胞膜を通じたＣＰＰの分泌を命令するシグナル配列を有するように設計することができる。所望のＣＰＰは、組換えにより直接作製し得るだけでなく、シグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端に特異的な切断部位を有している他のポリペプチドであり得る異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても作製し得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であってもよいし、またはベクターに挿入されるＣＰＰをコードするＤＮＡの一部であってもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物のシグナル配列であってもよい。酵母の分泌では、シグナル配列が、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロミセス属(Saccharomyces)およびクルイベロミセス属(Kluyveromyces)ａ−因子リーダーを含む、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載）または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．アルビカンス(C. albicans)グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ  ３６２，１７９）、あるいは１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０１１３６４６に記載されているシグナルである。哺乳類細胞の発現では、哺乳類シグナル配列が、タンパク質の分泌を命令するのに使用でき、例えば、同じ種または関連種の分泌ポリペプチドのシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダーである。選択される発現系に応じて、コード配列が適当なベクターに挿入されると、次に、それには特定の特徴を有する「制御エレメント」または「調節配列」の存在が必要となる。適当な構築物は、当技術分野では一般に知られており(Ausubel, et al., 1990)、多くの場合、Invitrogen(San Diego, Calif.)、Stratagene(La Jolla, Calif.)、Gibco BRL(Rockville, Md.)またはClontech(Palo Alto, Calif.)のような供給業者から入手可能である
【０２４６】
細菌系における発現
細菌細胞の形質転換は、「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」ファージミド(Stratagene)または「ｐＳＰＯＲＴ１」(Gibco BRL)のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導プロモーターを使用して実現し得る。さらに、容易に検出および／または精製することができる切断可能な融合タンパク質を作製するために、細菌細胞で使用される、限定されるものではないが、「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」（ａ−ガラクトシダーゼ；Stratagene）またはｐＧＥＸ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；Promega, Madison, Wis.）を含む、数多くの発現ベクターも選択し得る。好適な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ＣＰＰのコード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得るいずれかの核酸配列である。細菌プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置している転写開始領域を有している。この転写開始領域は、一般に、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位を含む。代謝経路酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、ガラクトース、ラクトースおよびマルトースのような糖の代謝酵素由来のプロモーター配列、ならびにトリプトファンのような生合成酵素由来の配列が挙げられる。バクテリオファージのプロモーターも使用でき、それらは当技術分野で公知である。さらに、合成プロモーターとハイブリッドプロモーターも有用である；例えば、ｔａｔプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列とｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を開始し得る能力を有する非細菌起源の天然に存在するプロモーターも含み得る。効率的リボソーム結合部位も望ましい。発現ベクターは、細菌においてＣＰＰの分泌をもたらすシグナルペプチド配列も含み得る。当技術分野で周知のように、シグナル配列は、一般に、細胞からのタンパク質の分泌を命令する疎水性アミノ酸からなるシグナルペプチドをコードする。タンパク質は、増殖培地に分泌される（グラム陽性菌）か、または細胞周辺腔に分泌され、細胞の内膜と外膜との間に存在する（グラム陰性菌）。細菌発現ベクターは、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マーカー遺伝子も含み得る。好適な選択遺伝子としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリンなどの薬剤の耐性遺伝子が挙げられる。選択マーカーとしては、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路のもののような生合成遺伝子も含む。例えば、抗体の誘導を目的として、多量のＮＰＰが必要な場合、容易に精製される融合タンパク質の高度発現を命令するベクターが望ましいかもしれない。このようなベクターとしては、限定されるものではないが、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ(Stratagene)（ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴでは、ハイブリッドタンパク質が作製されるように、ＣＰＰコード配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとそれに続く７残基の配列にインフレームでベクターに連結され得る）；ＰＩＮベクター(Van Heeke & Schuster J Biol Chem 264: 5503-5509 1989)；ＰＥＴベクター(Novagen, Madison Wis.)などのような多機能大腸菌クローニングおよび発現ベクターが挙げられる。細菌の発現ベク���ーは、上記の種々の成分を含み、それらのベクターは当技術分野では周知である。例としては、とりわけ、枯草菌、大腸菌、ストレプトコッカス・クレモリス(Streptococcus cremoris)およびストレプトコッカス・リビダンス(Streptococcus lividans)のベクターが挙げられる。細菌発現ベクターは、塩化カルシウムを介するトランスフェクションまたはエレクトロポレーションなどのような当技術分野では周知の技術を利用して、細菌宿主細胞に形質転換される。
【０２４７】
酵母における発現
酵母発現系は、当技術分野で周知であり、それらとしては、サッカロミセス・セレビシエ、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)およびＣ．マルトサ(C. maltosa)、ハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセス・フラギリス(Kluyveromyces fragilis)およびＫ．ラクティス(K. lactis)、ピキア・ギレルモンジー(Pichia guillermondii)およびＰ．パストリス(P. pastoris)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)およびヤローウィア・リポリチカ(Yarrowia lipolytica)の発現ベクターが挙げられる。酵母宿主での使用に好適なプロモーターの例としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073 (1980))または、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、α因子、ＡＤＨ２ＩＧＡＰＤＨプロモーター、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼおよびＰＧＨのような、他の糖分解酵素(Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149 (1968); Holland, Biochemistry 17: 4900 (1978))のプロモーターが挙げられる。例えば、Ausubel, et al., 1990; Grant et al., Methods in Enzymology 153: 516-544, (1987)参照。誘導可能な他の酵母プロモーターは、転写が増殖条件によって制御されるというさらなる利点を有しており、それらとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムｃ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素のプロモーター領域が挙げられる。酵母発現での使用に好適なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ  ７３，６５７にさらに記載されている。酵母選択マーカーとしては、ツニカマイシン耐性を与えるＡＤＥ２．ＨＩＳ４．ＬＥＵ２．ＴＲＰｌ．およびＡＬＧ７；Ｇ４１８耐性を与えるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子；ならびに銅イオンの存在下で酵母を増殖させるＣＵＰ１遺伝子が挙げられる。目的のＣＰＰをコードするＤＮＡからＣＰＰを細胞内生産し、分泌させるための酵母発現ベクターを構築することができる。例えば、選択したシグナルペプチドと適当な構成的プロモーターまたは誘導プロモーターを、ＣＰＰの直接細胞内発現用に選択したプラスミドの好適な制限部位に挿入してもよい。ＣＰＰを分泌させるために、ＣＰＰをコードするＤＮＡを、ＣＰＰを発現させるための、プロモーターをコードするＤＮＡ、酵母α−因子分泌シグナル／リーダー配列およびリンカー配列（必要に応じて）とともに、選択したプラスミドにクローニングすることができる。よって、酵母細胞を以上で記載した発現プラスミドで形質転換し、適当な発酵培地で培養することができる。このような形質転換酵母により産生されたタンパク質を、次いで、１０％トリクロロ酢酸での沈降により濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離とクーマシーブルー染色剤によるゲル染色を行うことにより解析することができる。組換えＣＰＰを、次いで、当業者に公知の技術により発酵培地から単離し、精製することができる。
【０２４８】
哺乳類系における発現
ＣＰＰを哺乳類細胞で発現させてもよい。哺乳類発現系は、当技術分野では公知であり、それらとしては、レトロウイルスベクターによる発現系が挙げられる。哺乳類宿主細胞をアデノウイルスのような数多くの異なるウイルスに基づくいずれの発現系で形質転換してもよく、その発現系では、コード領域が後期プロモーターと３部分からなるリーダー配列で構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結することができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域に挿入することによって、感染宿主細胞において目的のポリペプチドを発現可能である生存ウイルスが得られる。好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０１０４８にて概要が示されているようなレトロウイルスベクター系である。好適な哺乳類発現ベクターは、哺乳類ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ＣＰＰのコード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得るいずれかのＤＮＡ配列である哺乳類プロモーターを含む。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置している転写開始領域と転写開始部位上流に位置する２５〜３０塩基対を使用するＴＡＴＡボックスを有している。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに正確な部位でのＲＮＡ合成の開始を命令すると考えられている。哺乳類プロモーターは、一般に、ＴＡＴＡボックスの上流の１００〜２００塩基対内に位置する、上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）も含む。上流プロモーターエレメントは、転写を開始する速度を決定し、いずれの方向にも作用することができる。ウイルス遺伝子は高度に発現される場合が多く、広範囲にわたる宿主に対応するため、哺乳類ウイルス遺伝子由来のプロモーターが哺乳類プロモーターとして特に有用である。例としては、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ  ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ならびに熱ショックプロモーターが挙げられ、示した上記のようなプロモーターは宿主細胞系と適合する。高等真核生物によるＮＰＰをコードするＤＮＡの転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加させ得る。エンハンサーは通常、約１０〜３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントであり、その転写を増加するようにプロモーターに作用する。哺乳類遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、ａ−フェトプロテインおよびインスリン）から多くのエンハンサー配列が現在分かっている。しかしながら、一般に、真核細胞ウイルスのエンハンサーを使用する。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点後半のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、好ましくは、プロモーターの部位５’に位置する。一般に、哺乳類細胞によって認識される転写終止配列および���リアデニル化配列は、翻訳停止コドンの３’に位置し、従って、プロモーターエレメントとともに存在する調節領域であり、コード配列にフランキングする。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーターとポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０から得られたものが挙げられる。組換えタンパク質の長期間の高収率生産は、安定した発現系で行うことができる。この目的では、ウイルスの複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含有する発現ベクターを使用し得る。哺乳類細胞に使用する選択マーカーを含有する適当なベクターは、容易に、商業的に入手可能であり、それらは当業者には公知である。このような選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、ｔｋ−またはｈｐｒｔ−細胞各々に用いる、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられる。外因性核酸を哺乳類宿主や他の宿主に導入する方法は、当技術分野では周知であり、使用する宿主細胞によって異なる。それらの技術としては、デキストランを介するトランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレンを介するトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、ポリヌクレオチドのリポソームによるカプセル封入およびＤＮＡの核への直接マイクロインジェクションが挙げられる。
【０２４９】
ＣＰＰをコードする配列を有する発現ベクターにより一時的にトランスフェクトした、または安定的に形質転換した哺乳類細胞の培養上清からＣＰＰを精製することができる。好ましくは、ｐｃＤ発現ベクターにより一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞の培養上清からＣＰＰを精製する。ＣＯＳ７細胞のｐｃＤでのトランスフェクションは、以下のように進める：トランスフェクションの１日前に、およそ１０６のＣＯＳ７サル細胞を、１０％ウシ胎児血清および２ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）の入った１００ｍｍプレートそれぞれに播種する。トランスフェクションを実施するため、各プレートから培地を吸引し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．４、４００ｍｇ／ｍｌ  ＤＥＡＥ−デキストランおよび５０μｇのプラスミドＤＮＡを含有する４ｍｌのＤＭＥに置き換える。それらのプレートを３７℃にて４時間インキュベートした後、ＤＮＡを含有する培地を取り出し、プレートを５ｍｌの血清フリーＤＭＥで２回洗浄する。ＤＭＥをプレートに戻し、その後、それを３７℃にてさらに３時間インキュベートする。それらのプレートをＤＭＥで１回洗浄し、その後、４％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／Ｌ）を含有するＤＭＥを標準的な濃度で添加する。次いで、それらの細胞を３７℃にて７２時間インキュベートし、その後、ＣＰＰを精製するためにその増殖培地を集める。トランスフェクション用のプラスミドＤＮＡは、大腸菌ＭＣ１０６１(Casadaban and Cohen, J. Mol. Biol., Vol. 138, pgs. 179-207 (1980)によって記載) または同様の生物においてＣＰＰをコードするｃＤＮＡ挿入部を含有するｐｃＤ（ＳＲα）または同様の発現ベクターを増殖させることにより得られる。標準的な技術、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)またはAusubel et al (1990, 上記)により、培養物からそのプラスミドＤＮＡを単離する。
【０２５０】
昆虫細胞における発現
ＣＰＰを昆虫細胞で作製してもよい。昆虫細胞の形質転換用発現ベクター、特に、バキュロウイルスに基づく発現ベクターは、当技術分野で周知である。１つのこのような系では、ＣＰＰをコードするＤＮＡを、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流で融合する。オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)Ｓｆ９細胞またはトリコプルシア(Trichoplusia)幼虫において外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。ＣＰＰをコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。ＣＰＰをコードする配列の挿入が上手くいけば、ポリヘドリン遺伝子が不活性となり、外殼タンパク質の外殼のない組換えウイルスを生じる。次に、その組換えウイルスを使用してＳ．フルギペルダ細胞またはトリコプルシア幼虫を感染させ、そこでＣＰＰを発現させる(Smith et al., J. Wol. 46: 584 (1994)；Engelhard E K et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91: 3224-3227 (1994))。ＣＰＰをコードするＤＮＡとの融合に好適なエピトープタグとしては、ポリ−ｈｉｓタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）が挙げられる。ｐＶＬ１３９３(Novagen)のような市販のプラスミドをはじめとする種々のプラスミドを使用し得る。要するに、ＣＰＰをコードするＤＮＡまたはＣＰＰをコードするＤＮＡの所望の部分を、５’および３’領域と相補的なプライマーを用いてＰＣＲにより増幅する。その５’プライマーにフランキング制限部位を組み込んでもよい。次いで、ＰＣＲ産物を選択した制限酵素で消化し、発現ベクターにサブクローニングする。リポフェクチン（GIBCO-BRL社製の市販品）または当業者に公知な他の方法を用いた上記プラスミドとＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ(Pharmingen)をスポドプテラ・フルギペルダ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）に同時トランスフェクトすることにより、組換えバキュロウイルスを作製する。Ｓｆ９細胞で２８℃にて４〜５日の培養によりウイルスを作製し、それをさらなる増幅に使用する。手順としては、O'Reilley et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL, Oxford University Press (1994)でさらに記載されているように行う。Rupert et al., Nature 362: 175-179 (1993)に記載されているように、組換えウイルスに感染したＳｆ９細胞から抽出物を調製してもよい。また、発現されたエピトープタグ付きＣＰＰをアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる、例えば、ＩｇＧタグ付き（またはＦｃタグ付き）ＣＰＰの精製は、Ａタンパク質またはＧタンパク質カラムクロマトグラフィーをはじめとするクロマトグラフィー技術を利用して行うことができる。
【０２５１】
遺伝子発現の評価
適当な標識を施したプローブを使用し、本明細書において提供する配列に基づいて、例えば、当技術分野で公知の標準的な技術、例えば、ｍＲＮＡの転写を判定するためのノーザンブロット法、ドットブロッティング（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはin situハイブリダイゼーションにより、サンプルにおいて遺伝子発現を直接評価してもよい。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む特異的な二本鎖のようなポリペプチド、核酸の検出アッセイに抗体を使用してもよい。このような抗体を標識し、表面で二本鎖が形成されたら、二本鎖と結合している抗体の存在を検出することができるように、二本鎖が表面と結合している場所でアッセイを実施する。あるいは、細胞または組織切片の免疫組織化学的染色と細胞培養物または体液のアッセイにより遺伝子発現を測定して、ＣＰＰポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を直接評価してもよい。そのような免疫学的アッセイに有用な抗体はモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよく、天然配列ＣＰＰに対して調製したものでもよい。タンパク質レベルを質量分析により検出してもよい。さらなるタンパク質検出方法では、タンパク質チップを使用する。
【０２５２】
発現タンパク質の精製
発現後、当業者に公知の種々の方法のいずれによっても、発現したＣＰＰを精製または単離することができる。その適当な技術は、どのような他の成分がサンプル中に存在しているかによって異なる。単離または精製によって除去する混入成分は、一般に、ポリペプチドの診断上または治療上の使用を妨げるであろう物質であり、それらとしては、酵素、ホルモンおよび他の溶質を含み得る。精製段階の選択は、例えば、使用する生産工程の性質および生産される特定のＣＰＰに依存する。ＣＰＰは分泌されるため、それらを培養培地から回収することができる。あるいは、ＣＰＰを宿主細胞溶解物からも回収することができる。膜結合するものであれば、好適な清浄液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用してまたは酵素切断により、膜からそれを放出させることができる。あるいは、ＣＰＰの発現に使用された細胞を、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破砕のような種々の物理的または化学的手段により、または細胞溶解剤を使用して破壊することができる。典型的な精製方法としては、限定されるものではないが、イオン交換カラムクロマトグラフィー；シリカゲルまたはＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂を使用したクロマトグラフィー；例えば、セファデックスＧ−７５を使用したゲル濾過；ＩｇＧのような混入物を除去するためのＡタンパク質セファロースカラム；エピトープタグ付き形態のＣＰＰと結合するための金属キレートカラムを使用したクロマトグラフィー；エタノール沈降；逆相ＨＰＬＣ；等電点クロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；および硫安沈殿が挙げられる。通常、単離されたＣＰＰは少なくとも１つの精製段階によって調製される。例えば、標準的な抗ＣＰＰ抗体カラムを使用して、ＣＰＰを精製し得る。限外濾過技術や透析技術とタンパク質濃縮との併用も有用である(例えば、Scopes, R., PROTEIN PURIFICATION, Springer-Verlag, New York, N.Y., 1982参照)。必要な純度は、ＣＰＰの使用によって異なる。精製する必要のない場合もある。本発明のＣＰＰおよび核酸が、発現され、必要に応じて精製されれば、本明細書において詳述する多くの用途において有用である。
【０２５３】
トランスジェニック動物
本発明の宿主細胞を使用して、非ヒトトランスジェニック動物を作製することもできる。例えば、一実施形態において、本発明の宿主細胞は、ＣＰＰをコードする配列が導入されている、受精卵母細胞または胚幹細胞である。このような宿主細胞をさらに使用して、外因性ＣＰＰ配列がゲノムに導入されている非ヒトトランスジェニック動物または内因性ＣＰＰ配列が改変されている相同組換え動物を作出することができる。このような動物は、ＣＰＰもしくはその断片の機能および／または活性の研究に、さらに、ＣＰＰ生物活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書において、「トランスジェニック動物」とは、その動物の１以上の細胞が導入遺伝子を含んでいる、非ヒト動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ラットまたはマウスのような齧歯類である。トランスジェニック動物の他の例としては、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが挙げられる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の発生起源である細胞のゲノムに組み込まれ、その成熟した動物のゲノムに存在するため、トランスジェニック動物の１以上の細胞種または組織においてコードされた遺伝子産物の発現を命令する、外因性ＤＮＡである。本明細書において、「相同組換え動物」とは、内因性遺伝子が内因性遺伝子と、動物の発生前に動物の細胞、例えば、動物の胚細胞に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって改変されている、非ヒト動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、マウスである。
【０２５４】
本発明のトランスジェニック動物は、ＣＰＰをコードする核酸を、例えば、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染により受精卵母細胞の雄性前核に導入し、卵母細胞を偽妊娠雌里親動物において発達させることによって作出することができる。ＣＰＰ  ｃＤＮＡ配列またはその断片を導入遺伝子として非ヒト動物のゲノムに導入することもできる。あるいは、ヒトＣＰＰをコードする遺伝子のマウスまたはラット由来の非ヒト相同体を導入遺伝子として使用することもできる。また、導入遺伝子の発現効率を高めるために、導入遺伝子にイントロン配列およびポリアデニル化シグナルを含めることもできる。特定細胞に対するＣＰＰの発現を命令するために、組織特異的調節配列をＣＰＰ導入遺伝子に作動可能なように連結することもできる。胚操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物、特に、マウスのような動物を作製する方法は、当技術分野では従来の方法であり、例えば、Leder et al.による米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号、Wagner et al. and in Hogan, B.による米国特許第４，８７３，１９１号、Manipulating the Mouse Embryo, (その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)で記載されている。他のトランスジェニック動物の作製にも同様の方法が使用される。その動物のゲノムにおけるＣＰＰ導入遺伝子の存在および／または動物の組織もしくは細胞におけるＣＰＰ  ｍＲＮＡの発現に基づいて、トランスジェニック初代動物を同定することができる。このようなトランスジェニック初代動物を使用して、導入遺伝子を有するさらなる動物を繁殖させることができる。さらに、ＣＰＰをコードする導入遺伝子を有するトランスジェニック動物を、他の導入遺伝子を有する他のトランスジェニック動物とさらに交配することもできる。
【０２５５】
所望の核酸が相同組換えを介してゲノムに導入されている動物を作出するため、ＣＰＰコード配列を改変する、例えば、機能的に破壊するように欠失、付加または置換が導入されているＣＰＰコード配列の少なくとも一部を含むベクターを作製する。ＣＰＰコード配列はヒト遺伝子であってもよいが、より好ましくは、ヒトＣＰＰコード配列の非ヒト相同体（例えば、ＣＰＰをコードするヌクレオチド配列とのストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離されたｃＤＮＡ）である。例えば、マウスＣＰＰコード配列を使用して、マウスゲノムの内因性遺伝子の改変に好適な相同組換えベクターを構築することができる。好ましい実施形態では、相同組換えの際に、内因性ＣＰＰコード配列が機能的に破壊される（すなわち、機能タンパク質をコードしなくなるようにベクターを設計する；「ノックアウト」ベクターとも呼ばれる）。あるいは、相同組換えの際に、内因性ＣＰＰコード配列が突然変異するか、あるいは変化してもなお機能タンパク質をコードするようにベクターを設計することができる（例えば、上流調節領域を改変することによって内因性ＣＰＰコード配列の発現を変更することができる）。相同組換えベクターでは、ＣＰＰコード配列の改変部分に、その５’および３’末端でＣＰＰ遺伝子の付加的核酸配列がフランキングして、ベクターが含有する外来配列と胚幹細胞の内因性遺伝子との間に相同組換えを起こさせる。付加的フランキング核酸配列は、内因性遺伝子との相同組換えを首尾よく行うのに十分な長さを有している。一般に、ベクターには数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’末端両方に）を含める（相同組換えベクターの記載に関しては、例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるThomas, K. R. and Capecchi, M. R. (1987) Cell 51: 503参照）。ベクターを胚幹細胞株（例えば、エレクトロポレーションにより）に導入し、導入されたＣＰＰコード配列が内因性遺伝子と相同組換えされている細胞を選択する（例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるLi, E. et al. (1992) Cell 69: 915参照）。次いで、選択した細胞を動物（例えば、マウス）の胚盤胞に注入して、凝集キメラを形成させる（例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるBradley, A. in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) pp. 113-152参照）。そのようなキメラ胚を好適な偽妊娠雌里親動物に移植し、その胚を出産させることができる。生殖細胞に相同組換えされたＤＮＡを有する後代を使用して、導入遺伝子の生殖細胞系伝達により、動物の全細胞が相同組換えされたＤＮＡを含有している動物を繁殖させることができる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるBradley, A. (1991) Current Opinion in Biotechnology 2: 823-829ならびにLe Mouellec et al.によるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４；Smithies et al.によるＷＯ９１／０１１４０；Zijlstra et al.によるＷＯ９２／０９６８；およびBerns et al.によるＷＯ９３／０４１６９でさらに記載されている。
【０２５６】
別の実施形態では、導入遺伝子の調節発現を可能にする選択した系を含むトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。このような系の１つの例が、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系である。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の記載については、例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるLakso et al. (1992) PNAS 89: 6232-6236参照。リコンビナーゼ系のもう１つの例が、サッカロミセス・セレビシエのＦＬＰリコンビナーゼ系である(その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるO'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355)。導入遺伝子の発現の調節にｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を使用する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含有する動物が必要である。このような動物は、例えば、選択したタンパク質をコードする導入遺伝子を含有する動物とリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含有する動物という２種類のトランスジェニック動物の交配による「ダブル」トランスジェニック動物の構築を通じて提供することができる。
【０２５７】
ＣＰＰ活性の評価
当然のことではあるが、本発明はさらに、ＣＰＰおよびＣＰＰ配列の機能的断片および変異体の活性を試験するか、またはＣＰＰおよびＣＰＰ配列の機能的断片および変異体を得る方法を提供する。このような方法は、変異型もしくは修飾型ＣＰＰコード核酸を提供することおよびコードされているポリペプチドがＣＰＰ生物活性を示すかどうかを評価することを含む。よって、（ａ）ＣＰＰまたはその生物学的に活性な断片もしくは相同体を提供すること；および（ｂ）前記ＣＰＰまたはその生物学的に活性な断片もしくは相同体をＣＰＰ生物活性について、ＣＰＰ活性に好適な条件下で試験すること含むＣＰＰの機能を評価する方法も包含する。無細胞アッセイ、細胞に基づくアッセイおよびin vivoアッセイを用いてＣＰＰ活性を試験することができる。例えば、前記アッセイが宿主細胞においてＣＰＰ核酸を発現させることおよび前記細胞および他の罹患細胞においてＣＰＰ活性を観察することを含む。別の例では、ＣＰＰ、またはその生物学的に活性な断片もしくは相同体を細胞と接触させ、ＣＰＰ生物活性を観察する。
【０２５８】
ＣＰＰ生物活性は、（１）個体が心血管疾患を有している、または有することになるということを示すこと；（２）心血管疾患を有する個体の血流を通じて通常よりも高いレベルで循環すること；（３）抗原性または抗ＣＰＰ特異的抗体と結合する能力；（４）免疫原性または抗ＣＰＰ特異的抗体を作製する能力；（５）水素結合、アミド結合または好ましくは、ジスルフィド結合のような分子間アミノ酸側鎖相互作用を形成すること（６）ＣＰＰ標的分子との相互作用；および（７）翻訳後プロセシング、例えば、特異的タンパク質分解を受けることなどのいずれの活性であってもよい。
【０２５９】
ＣＰＰ生物活性は、当技術分野で公知のいずれの好適な方法によってもアッセイすることができる。例えば、「抗ＣＰＰ抗体」および「ＣＰＰ抗体の使用」と題する節に記載されているように、抗原性および免疫原性を検出してもよい。「診断および予後上の使用」に記載されているように血漿中の循環を検出してもよい。ＣＰＰの、ＣＰＰ標的分子と結合または相互作用する能力の判定は、当技術分野で一般的なように、直接的または間接的に結合を判定する方法によって行うことができる。このような方法は、「薬物スクリーニングアッセイ」と題する節でさらに記載する。
【０２６０】
心血管疾患は、当業者によって個体に適切であると判断された方法により診断することができる。症候および診断のさらなる例は、背景技術の節に見出すことができ、当業者により患者のプロフィールに基づいて最良のものが適切に決定される。
【０２６１】
分子内相互作用は、配列に基づく構造推定により検出することができる。このような推定は、一般に、類似の配列を有するポリペプチドに関するＸ線結晶学またはＮＭＲ構造データに基づく。分子内相互作用の検出はまた、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて行うこともできる。ジスルフィド結合の例では、あるタンパク質の異なる部位の間で形成された結合はよりコンパクトなタンパク質をもたらすことから、見掛けの分子量が小さくなる。ジスルフィド結合は還元剤、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）により崩壊させることができる。このように、還元剤で処理したタンパク質サンプルと非処理対照とをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較し、見掛けの分子量の変化を検出することができる。このような方法は当技術分野で一般的なものである。
【０２６２】
サンプルペプチドの分子量を既知分子量のペプチドのものと比較することにより、特異的タンパク質分解を検出してもよい。当技術分野では一般的な、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲルクロマトグラフィーまたは質量分析のようないずれかの方法によって、分子量が容易に比較される。好ましくは、質量分析により試験ペプチドの分子量を得、翻訳後修飾を有するペプチドの分子量を含むデータベースと比較する。データベースの例としては、Ｇｅｎｐｅｐｔ、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＥＭＢＬ、およびタンパク質配列データベースが挙げられる。
【０２６３】
抗ＣＰＰ抗体
本発明は、ＣＰＰに特異的な抗体および結合組成物を提供する。このような抗体および結合組成物としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そのＦａｂおよび単鎖Ｆｖフラグメント、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲートならびにヒト化抗体が挙げられる。このような抗体および結合組成物は、ハイブリドーマ培養、細菌または哺乳類細胞培養による組換え発現、およびトランスジェニック動物での組換え発現を含む種々の方法により作製し得る。特定の作製方法論を選択するための豊富な指針が文献に見られる、例えば、Chadd and Chamow, Curr. Opin. Biotechnol., 12: 188-194 (2001)。
【０２６４】
製造方法論の選択は、所望の抗体構造、抗体の炭水化物部分の重要性、培養および精製の容易性、および費用をはじめとするいくつかの因子に依存する。全長抗体、ＦａｂおよびＦｖフラグメントのような抗体フラグメント、ならびに異なる種の成分を含むキメラ抗体をはじめとする多くの異なる抗体構造は、標準的な発現技術を用いて作製し得る。ＦａｂおよびＦｖフラグメントのような、エフェクター機能がなく、薬物動力学的活性がわずかな小さなサイズの抗体フラグメントは、細菌発現系で作製し得る。単鎖Ｆｖフラグメントは、in vivo腫瘍に対して選択性が高く、優れた腫瘍浸透と低免疫原性を示し、血液から迅速にクリアランスされる、例えば、Freyre et al, J. Biotechnol., 76: 157-163 (2000)。よって、放射免疫検出法にはこのような分子が望ましい。
【０２６５】
ポリクローナル抗体
本発明の抗ＣＰＰ抗体はポリクローナル抗体であってよい。このようなポリクローナル抗体は、例えば、免疫剤、好ましくは、アジュバントの１回以上の注射を行うことによって、哺乳類で作製することができる。一般に、一連の皮下または腹腔内注射により、免疫剤および／またはアジュバントを哺乳類に注射する。免疫剤がＣＰＰまたはその融合タンパク質を含んでいてもよく、それは、免疫性を与えられた哺乳類において免疫原性であることが分かっているタンパク質との抗原のコンジュゲートに有用であるかもしれない。このような免疫原性タンパク質の例としては、限定されるものではないが、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、メチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、血清アルブミン、ウシサイログロブリンおよび大豆トリプシンインヒビターが挙げられる。アジュバントとしては、例えば、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノ−ミコレート）が挙げられる。当業者が標準的なプロトコールに基づきまたは通常の試験により免疫化プロトコールを決定することもできる。
【０２６６】
あるいは、ＣＰＰまたはその部分について濃縮された未精製のタンパク質調製物を使用して、抗体を作製することができる。このようなタンパク質、断片または調製物を適当なアジュバントの存在下で非ヒト哺乳類に導入する。血清が望ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体を含有している場合には、免疫アフィニティークロマトグラフィーによりポリクローナル抗体を精製する。
【０２６７】
有効なポリクローナル抗体生産量は、抗原および宿主種の両方に関連する多くの因子の影響を受ける。また、宿主動物は、接種部位および用量に応じて変化し、抗原用量が不十分であっても過剰であっても低力価の血清が生じる。少用量（ｎｇレベル）の抗原を複数の皮内部位に投与するのが最適であるものと思われる。ポリクローナル血清を作製し、処理する技術は、当技術分野で公知であり、例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるMayer and Walker (1987)参照。ウサギに有効な免疫化プロトコールは、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるVaitukaitis, J. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 33: 988-991 (1971)に見出すことができる。半定量的に、例えば、既知濃度の抗原と対照する寒天二重免疫拡散法により測定されるその抗体力価が低下し始めたときには、追加免疫注射を定期的に施与し、抗血清を採取することができる。例えば、Ouchterlony, O. et al., Chap. 19 in: Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell (1973)参照。抗体のプラトー濃度は、通常、血清０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの範囲である。例えば、Fisher, D., Chap. 42 in: Manual of Clinical Immunology, 2d Ed. (Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. For Microbiol., Washington, D. C. (1980)により記載されているように、競合的結合曲線を作成することにより抗原に対する抗血清の親和性を決定する。
【０２６８】
モノクローナル抗体
あるいは、抗ＣＰＰ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって作製することができ、この際、マウス、ハムスターまたは他の適当な宿主動物に免疫剤で免疫性を与えて、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することが可能なリンパ球を誘導する、例えば、Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)。免疫剤は、一般に、ＣＰＰまたはその融合タンパク質、所望により、担体を含む。あるいは、in vitroでリンパ球に免疫性を与えてもよい。一般に、非ヒト哺乳類起源が望ましい場合には脾臓細胞またはリンパ節細胞を使用し、また、ヒト起源の細胞が望ましい場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）を使用する。ポリエチレングリコールのような好適な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞系統と融合して、ハイブリドーマ細胞を作製する、例えば、Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE, Academic Press, pp. 59-103 (1986)；Liddell and Cryer, A Practical Guide to Monoclonal Antibodies (John Wiley & Sons, New York, 1991)；Malik and Lillenoj, Editors, Antibody Techniques (Academic Press, New York, 1994)。一般に、不死化細胞系統は、形質転換哺乳類細胞、例えば、ラット、マウス、ウシまたはヒト起源の骨髄腫細胞である。ハイブリドーマ細胞を、好ましくは、非融合不死化細胞の増殖または生存を抑制する１以上の物質を含む好適な培養培地で培養する。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を有していない場合、ハイブリドーマの培養培地は、一般に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ）、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる物質を含む。好ましい不死化細胞系統は、効率的に融合し、抗体の安定した高レベル生産を支え、ＨＡＴ培地のような培地に反応しやすいものである。より好ましい不死化細胞系統は、例えば、American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MDから入手できるマウスまたはヒト骨髄腫系である。ヒトモノクローナル抗体の作製に関して、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系統も記載されている、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 51-63 (1987)。
【０２６９】
ＣＰＰに対して向けられたモノクローナル抗体の存在について、ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地（上清）をアッセイする。好ましくは、免疫沈降によりまたは放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）のようなin vitro結合実験により、ハイブリドーマ上清に存在するモノクローナル抗体の結合特異性を測定する。適当な技術およびアッセイは、当技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem. 107: 220 (1980)のスキャッチャード解析法により測定することができる。所望の抗体産生ハイブリドーマ細胞を同定した後、それらの細胞を制限希釈手法によりクローニングし、標準的な方法により増殖させてもよい（Goding, 1986, 上記）。この目的に好適な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を哺乳類の腹水としてin vivoで増殖させてもよい。選択したクローンによって分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、Ａタンパク質−セファロース、ヒドロキシル−アパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような、当業者が通常使用する免疫グロブリン精製手法により、培養培地または腹水から単離または精製し得る。
【０２７０】
モノクローナル抗体を米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているもののような組換えＤＮＡ方法によって作製してもよい。ＣＰＰ特異的ハイブリドーマ細胞から本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを単離し、例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより配列決定することができる。単離されたら、そのＤＮＡを発現ベクターに挿入し、次いで、それをサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトし（他の形では免疫グロブリンタンパク質が生成されない）、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成物を得てもよい。また、ＤＮＡを、例えば、相同ヒト配列の代わりにマウス重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を使用することにより(Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851-6855 (1984)；Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)；Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985))、または免疫グロブリンコード配列と非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部とを共有結合することにより改変してもよい。本発明の抗体の定常ドメインの代わりに、または本発明の抗体の１抗原結合部位の可変ドメインの代わりに、非免疫グロブリンポリペプチドを使用して、キメラ二価抗体を作出することができる。抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体を作製する方法は、当技術分野では周知である。例えば、in vitro方法が一価抗体の作製に好適である。そのフラグメント、特に、Ｆａｂフラグメントを作製するための抗体の消化は、当技術分野で公知の通常の技術を用いて実施することができる。
【０２７１】
また、本発明のハイブリドーマに特有の抗体および抗体フラグメントを、メッセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、抗体分子のセグメントをコードするクローンを選択することによる組換え手段によって作製することもできる。以下のものは、抗体を作製するための組換え技術を開示する典型的な参考文献である：Wall et al., Nucleic Acids Research, Vol. 5, pgs. 3113-3128 (1978)；Zakut et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, pgs. 3591-3601 (1980)；Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 81, pgs. 3273-3277 (1984)；Boss et al., Nucleic Acids Research, Vol. 12, pgs. 3791-3806 (1984)；Amster et al., Nucleic Acids Research, Vol. 8, pgs. 2055-2065 (1980)；Moore et al., 米国特許第４，６４２，３３４号；Skerra et al, Science, Vol. 240, pgs. 1038-1041 (1988)；Huse et al, Science, Vol. 246, pgs. 1275-1281 (1989)；および米国特許第６，０５４，２９７号；同第５，５３０，１０１号；同第４，８１６，５６７号；同第５，７５０，１０５号；ならびに同第５，６４８，２３７号（これらの特許は出典明示により本明細書の一部とされる）。特に、このような技術を使用して、種間モノクローナル抗体を作製することができ、この際、免疫原性を低下させるために、ある種の結合領域を別種の抗体の非結合領域と組み合わせる、例えば、Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 84, pgs. 3439-3443 (1987)および米国特許第６，０５４，２９７号および同第５，５３０，１０１号。好ましくは、組換えにより作製したＦａｂおよびＦｖフラグメントを細菌宿主系で発現させる。好ましくは、哺乳類細胞培養技術により全長抗体を作製する。より好ましくは、全長抗体をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはＮＳＯ細胞で発現させる。
【０２７２】
ＥＬＩＳＡによりポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方をスクリーニングすることができる。他の固相免疫アッセイなどの場合、その試験は、高分子のプラスチックに非特異的に吸着する傾向に基づいたものである。この反応の不可逆性によって、免疫学的活性を喪失することなく、抗原−抗体複合体の形成とそのような複合体の結合していない物質からの簡易な分離が可能になる。抗ペプチド血清を、力価を測定するため、免疫化に使用するものとは異なる担体とコンジュゲートしたペプチドを、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに吸着させる。次いで、吸着した抗原をウェル内で抗ペプチド血清の希釈物と反応させる。結合していない抗体を洗い流し、残る抗原−抗体複合体を、免疫動物のＩｇＧに特異的な抗体と反応させる。この第２の抗体をアルカリ性ホスファターゼのような酵素とコンジュゲートする。酵素基質を添加すると視認できる着色反応が生じて、どのウェルが抗ペプチド抗体と結合しているかが分かる。分光光度計による測定値を用いることにより、結合したペプチド特異的抗体の量のより優れた定量が可能になる。高力価抗血清では、１０−３〜１０−５希釈物間で線形力価測定曲線が得られる。
【０２７３】
ＣＰＰペプチド担体
本発明は、ＣＰＰから得られた免疫原および担体と本発明のペプチドとのコンジュゲートを含む免疫原を含む。免疫原とは、本明細書において、免疫応答を引き起こし得る物質を指す用語である。担体とは、本明細書においては、本発明のペプチドと化学的にコンジュゲートしたときに、それが、その結果として得られたコンジュゲートで免疫性を与えた宿主生物体に、そのコンジュゲートしたペプチドに対して特異的な抗体を作製させるあらゆる物質を指す用語である。担体としては、赤血球、バクテリオファージ、タンパク質またはアガロースビーズのような合成粒子が挙げられる。好ましくは、担体が、血清アルブミン、γ−グロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、オボアルブミン、またはフィブリノーゲンのようなタンパク質である。
【０２７４】
合成ペプチドを担体と連結するための一般的な技術は、いくつかの参考文献に記載されている、例えば、Walter and Doolittle, 「Antibodies Against Synthetic Peptides,」 in Setlow et al., eds., Genetic Engineering, Vol. 5, pgs. 61-91 (Plenum Press, N. Y., 1983)；Green et al. Cell, Vol. 28, pgs. 477-487 (1982)；Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol. 78: pgs. 3403-3407 (1981)；Shimizu et al., 米国特許第４，４７４，７５４号；およびGanfield et al., 米国特許第４，３１１，６３９号。よって、これらの参照文献は出典明示により本明細書の一部とされる。また、ハプテンの担体との連結に使用される技術も上記の技術と本質的に同じである、例えば、chapter 20 in Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, New York, 1985)。ペプチドを担体に付着させるための最も一般に使用される４つのスキームは、（１）例えば、Kagan and Glick, in Jaffe and Behrman, eds. Methods of Hormone Radioimmunoassay, pgs. 328-329 (Academic Press, N. Y., 1979)およびWalter et al. Proc. Natl. Acad. Sci.,  Vol. 77: pgf. 5197-5200 (1980)により開示されているような、アミノカップリング用グルタルアルデヒド；（２）例えば、Hoare et al., J. Biol. Chem., Vol. 242: pgs. 2447-2453 (1967)により開示されているような、カルボキシルのアミノカップリング用水溶性カルボジイミド；（３）例えば、Bassiri et al., pgs. 46-47, in Jaffe and Behrman, eds. （上記）およびWalter et al. （上記）により開示されているような、チロシンのチロシン側鎖カップリング用ビス−ジアゾベンジジン（ＢＤＢ）；ならびに（４）例えば、Kitagawa et al., J. Biochem. (Tokyo), Vol. 79: pgs. 233-239 (1976)およびLerner et al. （上記）により開示されているような、システイン（または他のスルフヒドリル）のアミノ基カップリング用マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）である。特定のペプチドのタンパク質担体とのカップリングに適当な方法を選択する一般的なルールを記載すると以下のとおりである：配列内で一度だけ、好ましくは、セグメントの適当な末端で結合に関わる基が生じるべきである。例えば、チロシン残基がその潜在的な抗原的特徴で選択された配列の主要部分に存在する場合には、ＢＤＢを使用すべきではない。同様に、中央にリジンが位置している場合には、グルタルアルデヒド方法を除外し、アスパラギン酸およびグルタミン酸が発生する場合には、カルボジイミドアプローチを除外することが多い。他方で、好適な残基は、それらが「天然」タンパク質配列に存在するかどうかに関わらず、結合部位として選択された配列セグメントのいずれかの末端に存在し得る。内部セグメントは、アミノおよびカルボキシ末端とは違って、ポリペプチド主鎖が連続している天然タンパク質で見られるように、同じ配列の「非結合末端」において大きく異なる。α−アミノ基をアセチル化した後に、そのカルボキシ末端を通じてペプチドと結合することにより、ある程度は、問題を改善できる。担体タンパク質とのカップリング効率は、合成の一段階で放射性アミノ酸を使用することによるか、またはチロシン残基のヨウ素化により完全ペプチドを標識することによって調製した、放射性標識ペプチドを使用することにより便宜に測定される。所望により、ペプチド中のチロシンの存在により、高感度放射性免疫分析を計画することもできる。そのため、チロシンが天然ポリペプチドによ���定義されるペプチド配列の一部ではない場合には、それを末端残基として導入することができる。
【０２７５】
好ましい担体はタンパク質であり、好ましいタンパク質担体としては、ウシ血清アルブミン、ミオグロブリン、オボアルブミン（ＯＶＡ）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）などが挙げられる。Liu et al., Biochemistry, Vol. 18, pgs. 690-697 (1979)により開示されているＭＢＳによりペプチドを、システインを通じてＫＬＨに連結することができる。ペプチドをリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）、０．１Ｍホウ酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．０）または１．０Ｍ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）に溶かす。ペプチド溶解度を最適にするようにペプチドの溶解ｐＨを選択する。可溶性ペプチドの遊離システイン含量をエルマンの方法, Ellman, Arch. Biochem. Biophys., Vol. 82, pg. 7077 (1959)により測定する。各ペプチドに対し、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）０．２５ｍｌ中４ｍｇのＫＬＨを０．７ｍｇのＭＢＳ（ジメチルホルムアミドに溶かしたもの）と反応させ、室温にて３０分間攪拌する。ＫＬＨが＞３０％ホルムアミドで不溶性となるため、ホルムアミドの局所濃度が高くなりすぎないように、ＭＢＳを滴下する。その反応性生物、ＫＬＨ−ＭＢＳを、次いで、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．０）で平衡化したセファデックスＧ−２５に流して遊離ＭＢＳを除去し、カラム溶出液のピーク画分（ＯＤ２８０でモニタリングした）からのＫＬＨ回収率がおよそ８０％であると推定される。ＫＬＨ−ＭＢＳを、さらに、１ｍｌの選択したバッファーに溶かした５ｍｇペプチドと反応させる。そのｐＨを７〜７．５に調整し、その反応物を室温にて３時間攪拌する。放射性ペプチドを用いて、コンジュゲートのサンプルをリン酸緩衝生理食塩水で透析することにより、カップリング効率をモニタリングし、その効率は８％〜６０％の間であり得る。ペプチド−担体コンジュゲートを得ることができれば、例えば、Campbell, Monoclonal Antibody Technology (Elsevier, New York, 1984)；Hurrell, ed. Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications (CRC Press, Boca Raton, FL, 1982)；Schreier et al. Hybridoma Techniques (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1980)；米国特許第４，５６２，００３号などより開示されているような標準的な技術により、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を作製する。特に、米国特許第４，５６２，００３号は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０２７６】
ヒト化抗体
本発明の抗ＣＰＰ抗体は、ヒト化抗体またはヒト抗体をさらに含み得る。「ヒト化抗体」とは、非ヒト抗体から得られる配列のある部分を含有するそのキメラ抗体、免疫グロブリン鎖またはフラグメント（抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）または他の抗原−結合部分配列など）であるヒト化型非ヒト（例えば、マウス）抗体を指す用語である。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の結合特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲの残基に置き換えられているヒト免疫グロブリンを含む。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、一般には、２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そのＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般に、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む(Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992))。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、ヒト抗体によりよく似るように、非ヒトである起源から１以上のアミノ酸が導入されている一方で、抗体にもともとある結合活性を保持している。抗体のヒト化方法は、Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332: 323-327 (1988)；およびVerhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988)でさらに詳述されている。このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより少ないものが非ヒト種の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である。
【０２７７】
ヘテロコンジュゲート抗体
共有結合された２つの抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。架橋剤を必要とするものを含む合成タンパク質化学による公知の方法を利用して、ヘテロコンジュゲート抗体をin vitroで調製してもよい。例えば、ジスルフィド交換反応を利用するかまたはチオエーテル結合の形成により免疫毒素複合体を調製し得る。
【０２７８】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。このような抗体はモノクローナル抗体、好ましくは、ヒトまたはヒト化抗体である。本発明の二重特異性抗体の結合特異性の１つは、ＣＰＰに向けられ、もう１つは、好ましくは、細胞表面タンパク質または受容体もしくは受容体サブユニットに向けられる。二重特異性抗体を作製するための方法は当技術分野で公知であり、一般に、二重特異性抗体の組換え生産は、２つの重鎖が異なる特異性を有しているハイブリドーマ細胞での２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている、例えば、Milstein and Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)。免疫グロブリン重鎖および軽鎖の任意の組合せによって、ハイブリドーマにより異なる１０種類の抗体分子が産生される可能性があることを考えれば、正確な分子の精製には、通常、ある種のアフィニティー精製、例えば、アフィニティークロマトグラフィーが必要である。
【０２７９】
ＣＰＰ抗体の使用
ＣＰＰ抗体は、好ましくは、本発明のＣＰＰに対して特異的であるため、それ自体、高親和性を有する他のタンパク質由来のペプチドとは結合しない。本明細書において、「重鎖可変領域」とは、重鎖のＮ末端アミノ酸から（１）１１０〜１２５アミノ酸長であり、かつ（２）そのアミノ酸配列が本発明の抗体の重鎖のものと対応する、ポリペプチドを意味する用語である。同様に、「軽鎖可変領域」とは、軽鎖のＮ末端アミノ酸から（１）９５〜１１５アミノ酸長であり、および（２）そのアミノ酸配列が本発明の抗体の軽鎖のものと対応する、ポリペプチドを意味する用語である。本明細書において、「モノクローナル抗体」とは、ＣＰＰと特異的に結合し得る免疫グロブリンの均質集団を指す用語である。
【０２８０】
ＣＰＰ抗体は機能的モジュレーターとして使用できる。好ましくは、本発明の抗体モジュレーターは、ＣＰＰに特異的なモノクローナル抗体に由来する。ＣＰＰをブロックまたは中和できるモノクローナル抗体は、それらのＣＰＰ生物活性を阻害する能力により選択される。
【０２８１】
抗体フラグメントの使用もまた周知である、例えば、Ｆａｂフラグメント：Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevier, Amsterdam, 1985)；およびＦｖフラグメント：Hochman et al. Biochemistry, Vo. 12: pgs. 1130-1135 (1973)、Sharon et al., Biochemistry, Vol. 15: pgs. 1591-1594 (1976)およびEhrlich et al., 米国特許第４，３５５，０２３号；ならびに抗体半分子：Auditore-Hargreaves, 米国特許第４，４７０，９２５号。
【０２８２】
好ましくは、本発明のモノクローナル抗体から得られるモノクローナル抗体、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメントまたは他の結合組成物は、ＣＰＰに対して高親和性を有している。モノクローナル抗体および関連分子のＣＰＰに対する親和性は、プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡまたは平衡透析をはじめとする従来の技術によって測定し得る。例えば、製造業者推奨のプロトコールに従って、ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用して、プラズモン共鳴技術による親和性測定を実施してもよい。好ましくは、ＥＬＩＳＡにより親和性を測定する、例えば、米国特許第６，２３５，８８３号に記載されている。好ましくは、ＣＰＰと本発明のモノクローナル抗体間の解離定数が１０−５モル濃度未満である。より好ましくは、この解離定数が１０−８モル濃度未満であり；さらに好ましくは、この解離定数が１０−９モル濃度未満であり；最も好ましくは、この解離定数が１０−９〜１０−１１モル濃度の範囲である。
【０２８３】
さらに、本発明の抗体はＣＰＰの検出のために有用である。このような検出方法は、心血管疾患、特に冠動脈疾患の診断に有利に適用される。抗原−抗体反応を伴う大部分のアッセイに、本発明の抗体を使用し得る。アッセイは、均一アッセイでも不均一アッセイでもよい。均一アッセイアプローチでは、サンプルは、血清、尿、全血、リンパ液、血漿、唾液、細胞、組織およびin vitroで培養した細胞もしくは組織から分泌される物質のような生体サンプルまたは体液であり得る。必要に応じて、サンプルを前処理して、不要な物質を除去することができる。免疫学的反応は、通常、特異的抗体、標識アナライト、および抗原を含んでいると疑われるサンプルを必要とする。抗体と標識アナライトが結合すると、その標識から生じるシグナルが直接的または間接的に修飾される。免疫反応およびその範囲の検出の双方が均一溶液中で行われる。使用可能な免疫化学標識としては、フリーラジカル、蛍光色素、酵素、バクテリオファージ、補酵素などが挙げられる。
【０２８４】
不均一アッセイアプローチでは、試薬が、通常、サンプル、特異的抗体および検出可能なシグナルを発生するための手段である。一般に、試料をプレートまたはスライドのような支持体に載せ、液相中の抗体と接触させる。その支持体を、次いで、液相から離し、支持体相または液相のいずれかを、検出可能なシグナルについて、シグナルを生じさせるための手段またはシグナル生成系を使用して調べる。シグナルはサンプル中の抗原の存在と関係している。検出可能なシグナルを発生させるための手段としては、放射性標識、蛍光化合物、酵素などの使用が挙げられる。不均一免疫アッセイの例としては、ラジオ免疫アッセイ、免疫蛍光法、酵素結合免疫アッセイなどがある。
【０２８５】
上記免疫アッセイ技術のさらに詳しい考察については、Edward T. Maggio, CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1980の「Enzyme-Immunoassay」を参照。また、例えば、米国特許第３，６９０，８３４号；同第３，７９１，９３２号；同第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，５７８号；同第３，８５３，９８７号；同第３，８６７，５１７号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９６６，３４５号；および同第４，０９８，８７６号も参照（この列挙は網羅を意図したものではない）。標識を抗体および抗体フラグメントとコンジュゲートする方法は当技術分野で周知のものである。このような方法は米国特許第４，２２０，４５０号；同第４，２３５，８６９号；同第３，９３５，９７４号；および同第３，９６６，３４５に見出せる。本発明の抗体が使用できる技術のもう１つの例として、免疫ペルオキシダーゼ標識がある(Sternberger, Immunocytochemistry (1979) pp. 104-169)。あるいは、これらの抗体を放射性物質または薬物と結合させて、それぞれ放射性医薬または医薬を作出してもよい(Carrasquillo, et al., Cancer Treatment Reports (1984) 68:317-328)。
【０２８６】
本発明の抗体を使用するアッセイの１つの実施形態は、本発明のモノクローナル抗体が結合される表面の使用を必要とする。表面の基本構造は、異なる形態をとってもよいし、異なる組成を有していてもよいし、組成物または積層物もしくはその組合せの混合物であってもよい。表面は、使用および測定方法に応じて、種々の形状および形態をとり、多様な特徴を有する。実例となる表面は、平面、凹面または凸面のパッド、ビーズ、ディスクまたはストリップであってよい。厚みは重要でなく、一般に、約０．１〜２ｍｍ厚、任意の便宜な径、あるいは他の寸法である。表面は、一般に、ロッド、チューブ、キャピラリー、ファイバー、ストリップ、ディスク、プレート、キュベット上にあり、一般に、抗体を共有結合し、検出可能なシグナルを生じさせるための手段の一部をなす他の化合物を結合し得るように、多孔性および多機能性であるか、または多機能化することが可能である。固体表面用材料として、幅広い種類の有機および無機ポリマーが、天然のものも合成のものも、そしてその組合せも使用し得る。実例となるポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、レーヨン、ナイロン、ポリ（ビニルブチラート）、シリコン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、酢酸セルロース、ニトロセルロースおよびラテックスが挙げられる。他の表面としては、紙、ガラス、セラミック、金属、メタロイド、半導体、セメント、珪酸塩などが挙げられる。ゲル、ゼラチン、リポ多糖、珪酸塩、アガロースおよびポリアクリルアミドまたはいくつかの水相を形成する、デキストラン、ポリアルキレングリコール（２〜３個の炭素原子のアルキレン）もしくはリン脂質のような界面活性剤のようなポリマーを形成する物質も含まれる。抗体の表面との結合は、文献で一般に入手可能な周知の技術により行ってよい（例えば、「Immobilized Enzyme,」 Ichiro Chibata, Press, New York (1978)およびCuatrecasas, J. Bio. Chem., 245: 3059 (1970)参照）。本発明のこの態様に従ってアッセイを実施する場合には、サンプルを水性培地と混合し、その培地を抗体が結合されている表面と接触させる。表面と結合する検出可能なシグナルを提供するために、標識を水性培地に含めて同時に、またはその後に添加しもよい。検出可能なシグナルを生じさせるための手段では、標識した分析物の組込みを行う場合もあるし、または標識がそれとコンジュゲートされている第２のモノクローナル抗体の使用してもよい。必要に応じて、分離および洗浄工程を実施する。検出されたシグナルは、サンプル中のＣＰＰの存在と関係している。同じ支持体での検定を含むことも本発明の範囲内である。本発明に従うアッセイの特定の実施形態は、限定ではなく、例示として、スライドまたはペトリ皿のウェルのような支持体の使用を必要とする。その技術では、分析しようとするサンプルを適当な固定材料で支持体に固定し、スライド上のサンプルをモノクローナル抗体とともにインキュベートする。例えば、リン酸緩衝生理食塩水のような適当なバッファーで洗浄した後、支持体を抗体に対して特異的な標識した結合パートナーと接触させる。必要に応じて、インキュベートした後、スライドの２回目の洗浄を水性バッファーで行い、標識モノクローナル抗体と抗原との結合の測定をする。標識が蛍光であるならば、スライドに蛍光抗体封入液を載せ、その上にカバースリップをかけた後、蛍光顕微鏡で検査して、結合の程度を判定してもよい。また、標識がモノクローナル抗体とコンジュゲートされた酵素である場合には、スライドを酵素活性の存在について検査することにより結合の程度を判定することができ、この際、沈殿物の形成、色、他によって示される。本抗体を利用するアッセイの特定の例が、二重決定因子ＥＬＩＳＡアッセイである。例えば、ガラスまたはビニルプレートのような支持体を、従来の技術によりＣＰＰに特異的な抗体でコーティングする。その支持体を、通常、水性培地中、ＣＰＰを含んでいると疑われるサンプルと接触させる。３０秒〜１２時間のインキュベーション時間後、その支持体を培地から離し、例えば、水または水性緩衝培地で洗浄して、結合していないＣＰＰを除去し、それを、通常、水性培地中のＣＰＰに対して特異的な抗体と接触させる。抗体は、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリ性ホスファターゼのような酵素で直接または間接的に標識する。インキュベーション後、その支持体を培地から離し、上記のように洗浄する。支持体または水性培地の酵素活性を測定する。この酵素活性は、サンプル中のＣＰＰの量と関係している。  
【０２８７】
本発明は、キット、例えば、上記で開示した方法を実施するための診断アッセイキットも含む。一実施形態において、キットは、パッケージ化された組合せとして（ａ）モノクローナル抗体、より詳しくは、上記で定義されたモノクローナル抗体および（ｂ）上記モノクローナル抗体に対して特異的な結合パートナーと検出可能なシグナルを生成し得る標識のコンジュゲートを含む。試薬として、緩衝剤およびタンパク質分解防止剤、例えば、多糖類などのような補助剤も含めてよい。キットには、必要に応じて、標識が一メンバーであるシグナル生成系の他のメンバー、試験におけるバックグラウンド干渉を低減するための薬剤、対照試薬、試験を実施するための装置などもさらに含めてよい。別の実施形態では、診断キットは、本発明のモノクローナル抗体と検出可能なシグナルを発生させ得る標識のコンジュゲートを含む。上記のような補助剤も含まれていてよい。
【０２８８】
さらに、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降のような標準的な技術によりＣＰＰを単離するために、抗ＣＰＰ抗体（例えば、モノクローナル抗体）を使用することができる。例えば、抗ＣＰＰ抗体が、細胞からの天然ＣＰＰの精製や宿主細胞で発現された組換え生産ＣＰＰの精製を容易にすることがある。さらに、低濃度のＣＰＰ（例えば、血漿、細胞溶解物または細胞上清中のもの）の検出を補助するＣＰＰを単離する目的でまたはＣＰＰの発現の量およびパターンを評価する目的で抗ＣＰＰ抗体を使用することができる。例えば、特定の処置計画の有効性を判定するための臨床試験手順の一環として組織中のタンパク質レベルをモニタリングするために、抗ＣＰＰ抗体を診断使用することができる。抗体と標識基を結合（すなわち、物理的連結）することにより検出を容易にすることができる。
【０２８９】
タンパク質アレイ
その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第６２２５０２７号および米国特許出願２００１００１４４６１により記載されているような、レテンテート・クロマトグラフィー(retentate chromatography)（好ましくは、タンパク質アレイまたはチップ）を利用して、本発明のポリペプチドの検出、精製およびスクリーニングを行ってよい。要するに、レテンテート・クロマトグラフィーとは、ポリペプチド（および／または他のサンプル成分）を吸着剤（例えば、アレイまたはチップ）上に保持し、その後、検出するといった方法である。このような方法では、（１）複数の異なる吸着剤／溶離剤の組合せ（「選択性条件」）下で、サンプル由来のポリペプチドを基質に選択的に吸着させ、（２）吸着したポリペプチドの保持を脱離分光分析により（例えば、質量分析により）検出する。従来のクロマトグラフ方法では、検出の前にポリペプチドを吸着剤から溶出させる。吸着クロマトグラフィーと脱離分光分析による検出との組合せによって、驚くべき感度、種々の異なる選択性条件によって保持成分を迅速に分析する能力、そして異なる溶出条件下でアレイ上の異なる部位（すなわち、「親和性部位」または「スポット」）に吸着した成分の並行処理が提供される。
【０２９０】
これらの方法は、ＣＰＰのコンビナトリアルな、生物化学的分離および精製；示差的遺伝子発現の研究；タンパク質レベルの違いの検出（例えば、診断目的）；ならびに分子の認識事象の検出（例えば、スクリーニングおよび創薬目的）に有用である。よって、本発明は、ポリペプチド並行多重処理能力を有することを特徴とする分子発見診断装置を提供する。本発明のポリペプチドとＣＰＰが結合する物質が、好ましくは、標識基と結合しており、その結果、それらが直接検出され、単位操作中に同じ「回路」（すなわち、アドレス可能な「チップ」の場所）からの２以上のシグナルの同時伝達が可能になる。
【０２９１】
質量分析によるＣＰＰの検出
本発明に従って、いずれの機器、方法、工程などを利用しても、サンプル中のタンパク質の同一性およびその存在量を測定することができる。同一性を得る好ましい方法は、サンプル中のタンパク質分子をイオン化した後、生じたタンパク質イオンの質量と電荷を検出し、測定する質量分析による方法である。
【０２９２】
タンパク質の解析に質量分析を使用するため、タンパク質がガス−イオン相に変換されることが好ましい。タンパク質イオン化の種々の方法が有用であり、それらとしては、例えば、高速イオン照射（ＦＡＢ）、プラズマ脱離、レーザー脱離、熱脱離、好ましくは、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）およびマトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）が挙げられる。ペプチドおよびタンパク質解析には多くの異なる質量分析器が利用可能であり、それらとしては、限定されるものではないが、飛行時間型（ＴＯＦ）、イオントラップ（ＩＴＭＳ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン（ＦＴＭＳ）、四重極イオントラップおよびセクター（電気および／または磁気）分光計が挙げられる。例えば、イオントラップＭＳについての米国特許第５，５７２，０２５号参照。質量分析器は単独で使用できるし、他の質量分析器と組み合わせ、質量分析計を縦一列に並べても使用できる。後者の場合では、タンパク質イオン（前駆体イオン）を互いに分離し、サンプル中の種々のタンパク質構成成分の分子量を測定するために、第１の質量分析器を使用する。分離された各々の構成成分を、例えば、前駆体イオンを生成物イオンに細分する（例えば、不活性ガスの使用により）ことによって解析するために、第２の質量分析器を使用する。質量分析器のいずれの所望の組合せも使用でき、それらとしては、例えば、三連四重極、タンデム飛行時間型、イオントラップおよび／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０２９３】
タンパク質イオンを検出するために、異なる種類の検出器を使用することができる。例えば、イオン電子増倍管または低温検出器のような破壊検出器を利用することもできる（例えば、米国特許第https://www.delphion.com/details?pn10=US05640010&s_all=1号）。さらに、四重極イオントラップ質量分析器またはＦＴＭＳにおいてイオン電流ピックアップ手段として使用するイオントラップのような非破壊検出器を使用することができる。
【０２９４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦでは、液滴乾燥(Karasand Hillenkamp, Anal. Chem., 60: 2299-2301, 1988)、真空乾燥(Winberger et al., In Proceedings of the 41st ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, San Francisco, May 31-June 4, 1993, pp. 775a-b)、結晶粉砕(Xiang et al., Rapid Comm. Mass Spectrom., 8: 199-204, 1994)、結晶成長遅滞(Xiang et al., Org. Mass Spectrom, 28: 1424-1429, 1993)；活性フィルム(Mock et al., Rapid Comm. Mass Spectrom.,6: 233-238, 1992；Bai et al., Anal. Chem., 66: 3423-3430, 1994)、空気スプレー(Kochling et al., Proceedings of the 43rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics; Atlanta, GA, May 21-26, 1995, p1225)；エレクトロスプレー(Hensel et al., Proceedings of the 43rd ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics; Atlanta, GA, May 21-26, 1995, p947)；高速溶媒蒸発(Vorm et al., Anal. Chem., 66: 3281-3287, 1994)；サンドイッチ(Li et al., J. Am. Chem. Soc., 11 8: 11662-11663, 1996)；および二層法(Dal et al., Anal. Chem., 71: 1087-1091, 1999)をはじめとする多くのサンプル調製方法を利用することができる。例えば、Liang et al., Rapid Commun. Mass Spectrom., 10: 1219-1226, 1996；van Adrichemet al., Anal. Chem., 70: 923-930, 1998も参照。
【０２９５】
ＭＡＬＤＩ分析では、液相中でサンプルをエネルギー吸収化合物またはコロイド（マトリックス）と混合し、最後に、不活性プローブの表面でその溶液を乾固させることにより、それらを固体状態の共結晶または薄膜として調製する。場合によっては、エネルギー吸収分子（ＥＡＭ）がサンプル提示表面の不可欠な構成成分であることもある。ＥＡＭ適用手法に関わらず、レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析計（ＬＤＩＭＳ）への導入前に、プローブ内容物を乾固させる。
【０２９６】
ＴＯＦ質量分析によるイオン検出は、一般に、電子増倍管（ＥＭＰ）またはマイクロチャンネルプレート（ＭＣＰ）のような電子放射検出器の使用によって得られる。これらの装置はいずれも、一次入射荷電粒子を一連の二次電子、三次電子、四次電子などに変換することによって機能する。二次電子が単一入射荷電粒子の衝撃により発生する可能性がこの荷電粒子のイオン−電子変換効率（または、簡単に言えば、変換効率）と考えられる。入射荷電粒子の総数と比較した際の一連の事象の全電子収率が、一般に、検出器ゲインであるといわれている。一般に、ＭＣＰの全応答時間がＥＭＰのものよりはるかに上回るため、ＭＣＰが質量／電荷分解能の増強に好ましい電子放射検出器である。しかしながら、ＥＭＰは、迅速な応答時間と広い周波数帯域幅を必要としない分配された運動エネルギーを有するイオン集団の検出には十分に機能を発揮する。
【０２９７】
好ましい態様において、消化されたタンパク質の解析に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ−ＴＭＳ）を使用する。この系は、液体クロマトグラフの後にタンデム質量分析を用いることによってサンプル分離の付加的ステップを提供する。
【０２９８】
好ましい態様において、実施例１に記載の系に従ってカラムから溶出されるタンパク質は、ＭＳおよびＭＳ−ＭＳ分析の双方を用いて分析する。例えば、ＲＰ２から溶出する完全なタンパク質の一部少量を、ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳを用いるオンライン検出へと迂回させてもよい。これらのタンパク質を、消化を行わせるプレート、またはトリプシンを含まない、マトリックスの異なるＭＡＬＤＩ−ＭＳ用、ならびにＥＳＩ−ＭＳ用、ならびにＭＡＬＤＩ用プレートのの調製など、多くのプレートに分注される。従って、これらの方法では、完全な質量に関する情報の他、ペプチド質量のフィンガープリントおよびＭＳ−ＭＳ技術の双方による分析の実施が可能となる。
【０２９９】
本明細書に記載する、タンパク質を分離および分画する方法により、少数の異なるタンパク質を含有する個々のタンパク質または画分が得られる。その分画によって得られたタンパク質およびペプチドの分子量の質量スペクトル測定により、これらのタンパク質を同定することができる。タンパク質配列データベースの利用可能な情報を用いて、in silicoで作製されたタンパク質分解ペプチドの質量パターンと試験によって観察されたペプチドの質量との比較を行うことができる。あるいは、ヌクレオチド配列データベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）の６フレーム翻訳を行うことによりタンパク質データベースを構築することができる。（いくつかある判定基準の中で特に）理論的タンパク質分解断片と試験的タンパク質分解断片間のマッチ数に基づいて、データベースの候補タンパク質を順位付けし、「ヒットリスト」を作成することができる。ペプチドマッピングと配列データベース検索手法に基づいた、オンライン上のタンパク質同定用ソフトウエアを提供するいくつかのウェブサイトにアクセス可能である（例えば、http://www.expasy.ch）。ＭＳを利用してペプチドマッピング法および配列決定する方法は、ＷＯ９５／２５２８１９、米国特許第５，５３８，８９７号、米国特許第５，８６９，２４０号、米国特許番号第５，５７２，２５９号および米国特許第５，６９６，３７６号に記載されている。Yates, J. Mass Spec., 33: 1 (1998)も参照のこと。
【０３００】
質量分析計で収集したデータは、一般に、検出された各事象の強度と質量電荷比を含む。スペクトルデータを、例えば、デジタル形式またはアナログ形式のいずれかでのグラフ書式、数値書式または電子書式を含むいずれかの好適な形式で記録することができる。好ましくは、スペクトルを、例えば、フロッピーディスク、テープもしくはハードディスクのような磁気媒体；ＣＤ−ＲＯＭもしくはレーザーディスクのような光媒体；またはＲＯＭ−チップをはじめとする保存媒体に記録する。
【０３０１】
サンプルの質量スペクトルでは、一般に、タンパク質強度、質量電荷比および分子量についての情報が得られる。本発明の好ましい実施形態において、サンプル中のタンパク質の分子量がデータベースに問い合わせを行うためのマッチング基準として使用される。分子量は、通常、例えば、一価プロトン化分子イオンのイオン化プロトンの質量を減ずることにより、測定された質量／電荷比に多価イオンの電荷数を乗じ、イオン化プロトン数を差し引くことにより計算される。
【０３０２】
種々のデータベースが、本発明に有用である。有用なデータベースとしては、ゲノム配列、発現遺伝子配列および／または発現タンパク質配列を含むデータベースを含む。好ましいデータベースは、既知生物、器官、組織または細胞型に存在するタンパク質のヌクレオチド配列から得られた分子量を含んでいる。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定し、ヌクレオチド配列をタンパク質配列および分子量情報へと変換するための多くのアルゴリズムが存在している。ＳｗｉｓｓＰＲＯＴ／ＴｒＥＭＢＬデータベース（http://www.expasy.ch）をはじめとするいくつかの公開データベースが利用可能である。
【０３０３】
一般に、質量分析計は、特定の閾値を越えるピークを同定し、検出されたイオンの質量、電荷および強度を計算する市販のソフトウエアを装備している。分子量と特定の出力ピークとの相関は、スペクトルデータから直接行うことができる、すなわち、ここでは、イオンの電荷が一価であり、そのため、その分子量がイオン化プロトンの質量を差し引いた分子の値に等しい。しかしながら、タンパク質イオンは、Ｎ、ＣおよびＫのもののような種々の対イオンおよび付加物と複合体を形成する可能性がある。このような場合では、特定のタンパク質イオンが三重ピークのような多重ピークを示し、これにより同じタンパク質において異なるイオン状態（または種）が示されることが予測される。よって、同じタンパク質から起こるピーク群を決定するためには、スペクトルデータを分析し、加工する必要があることがある。通常、例えば、Mann et al., anal. Chem., 61: 1702-1708 (1989)により記載されているようにこの分析を実施することができる。
【０３０４】
質量分析計から計算された分子量とゲノムまたは発現遺伝子データベースのようなデータベースから予測される分子量とのマッチングにおいては、翻訳後プロセシングを考えなければならないかもしれない。タンパク質構造を改変する、タンパク質分解プロセシング、Ｎ末端メチオニンの除去、アセチル化、メチル化、グリコシル化、リン酸化などを含む種々のプロセシング事象がある。
【０３０５】
データベースには、未知のものの分子量とマッチングさせるタンパク質の範囲についての問い合わせを行うことができる。範囲ウインドウは、機器の精度、サンプルを調製するための方法などによって決定される。スペクトルのヒット数に基づいて（この際、ヒットが適合である）、未知タンパク質またはペプチドが同定または分類される。
【０３０６】
１以上のＣＰＰを質量分析により同定する方法は、心血管疾患の診断および予後に有用である。好ましくは、このような方法を用いてヒト血漿中に存在する１以上のＣＰＰを検出する。技術例としては、米国特許出願０２／００６０２９０、０２／０１３７１０６、０２／０１３８２０８、０２／０１４２３４３、０２／０１５５５０９に記載されており、それらの開示内容は出典明示によりそのまま本発明の一部とされる。
【０３０７】
診断および予後の使用
以下の１以上の方法において、本明細書に記載する核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体および抗体を使用することができる：本明細書においてさらに記載するような、診断アッセイ、予後アッセイ、モニタリング臨床試験、薬物スクリーニングおよび薬理遺伝学。
【０３０８】
本発明は、さらに記載するような、ＣＰＰ核酸およびタンパク質を検出するための診断および予後アッセイを提供する。また、ＣＰＰとＣＰＰ標的分子、特に、天然アゴニストとアンタゴニスト間の相互作用を検出するための診断および予後アッセイも提供する。
【０３０９】
本発明は、２以上のサンプル間で示差的に発現されるポリペプチドを同定するための方法を提供する。「示差的発現」とは、サンプル間のポリペプチドの量または質の違いを指す。このような違いは、転写から翻訳後修飾までのタンパク質発現のいずれの段階においても起こり得る。例えば、タンパク質アレイ方法を用いて、２つのサンプルを異なるセットの吸着剤（例えば、チップ）上の親和性スポットと結合させ、認識マップを比較して、２つのセットの吸着剤に示差的に保持されているポリペプチドを同定する。示差的保持とは、ポリペプチドの量的保持だけでなく質的な違いも含む。例えば、タンパク質の翻訳後修飾における違いによって、結合特性の違い（例えば、レクチン吸着剤と示差的に結合するグリコシル化タンパク質）または質量の違い（例えば、翻訳後切断産物）として検出可能な認識マップの違いが起こり得る。特定の実施形態において、吸着剤が、疾病または症候群の診断用マーカーの組合せに選択された親和性スポットのアレイを有している。
【０３１０】
サンプル（例えば、血漿サンプル中で示差的に発現するＣＰＰ）間のポリペプチドレベルの違いを、脱離分光分析（例えば、質量分析）により解析するための種々の条件にサンプルを曝すことにより、確認することができる。物理化学的特性（例えば、分子量）を検出することによって、未知タンパク質を同定することができ、この情報を利用して、同様のプロフィールを有するタンパク質に関してデータベースを検索することが可能である。
【０３１１】
ＣＰＰを検出する好ましい方法では、質量分析技術を利用する。このような方法により、診断または予後について調べられるサンプル、例えば、生体サンプルに存在する特定のＣＰＰイソ型のサイズおよび特徴についての情報が得られる。質量分析技術は、「質量分析によるＣＰＰの検出」と題する節で詳述している。実施例１は好ましい検出スキームの概要を示し、ここでは、生体サンプルは質量分析による特性決定の前にクロマトグラフィーにより分離する。本発明は、生体サンプルにおけるＣＰＰを検出する方法であって、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程により生体サンプル（例えば、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液、特定組織の細胞溶解物）を分画する段階；画分を質量分析に付す段階；および質量分析で観察されたペプチド種の特性をＣＰＰの既知特性と比較する段階を含む方法を提供する。
【０３１２】
本発明の単離された核酸分子を、例えば、ＣＰＰ  ｍＲＮＡ（例えば、生体サンプル中）、またはＣＰＰコード遺伝子中の遺伝子変化を検出するため、および以下でさらに記載するようなＣＰＰ活性を調節するために使用することができる。さらに、ＣＰＰを、天然に存在するＣＰＰ標的分子に関してスクリーニングするため、および、ＣＰＰ活性を調節する薬剤または化合物に関してスクリーニングするために使用可能である。さらに、本発明の抗ＣＰＰ抗体は、ＣＰＰを検出および単離するため、ＣＰＰのバイオアベイラビリティーを調節するため、およびＣＰＰ活性を調節するために使用可能である。
【０３１３】
従って、本発明の一実施様態には、本発明の分子（例えば、ＣＰＰ、ＣＰＰ核酸またはＣＰＰモジュレーター、または抗体）を、例えば、上述のＣＰＰ活性のいずれかが示される疾患の診断および／または予後のために使用する、使用の方法が含まれる。別の実施様態において、本発明は、本発明の分子を、例えば、上述のいずれかの活性が、病理学的に混乱する対象、好ましくはヒト対象の診断および／または予後のために使用する使用方法が含まれる。
【０３１４】
例えば、本発明は、ＣＰＰが生体サンプル内で発現されているかどうかを判定する方法であって、ａ）前記生体サンプルを、ｉ）ストリンジェントな条件下でＣＰＰ核酸とハイブリダイズするポリヌクレオチド；またはｉｉ）ＣＰＰと選択的に結合する検出可能なポリペプチド（例えば、抗体）と接触させること；およびｂ）前記ポリヌクレオチドと前記サンプル内のＲＮＡ種間のハイブリダイゼーションの存在もしくは不在、または前記検出可能なポリペプチドと前記サンプル内のポリペプチドとの結合の存在もしくは不在を検出することを含む方法を包含する。前記ハイブリダイゼーションまたは前記結合の検出により、前記ＣＰＰが前記サンプル内で発現されていることが示される。好ましくは、ポリヌクレオチドはプライマーである（この際、前記ハイブリダイゼーションが前記プライマー配列を含む増幅産物の存在を検出することにより検出される）か、または検出可能なポリペプチドが抗体である。
【０３１５】
特定の実施形態において、検出では、アンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ  ＰＣＲのようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号参照）、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるLandegren et al. (1988) Science 241: 1077-1080；およびNakazawa et al. (1994) PNAS 91: 360-364参照）においてプローブ／プライマーが使用され、その後者の使用がＣＰＰコード遺伝子の点突然変異を検出するのに特に有用であり得る（その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるAbravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 675-682参照）。
【０３１６】
また、哺乳類、好ましくは、ヒトのＣＰＰの発現レベルが上昇または低下しているかどうかを判定する方法であって、ａ）前記哺乳類の生体サンプルを準備すること；およびｂ）前記生体サンプル内のＣＰＰまたはＣＰＰをコードするＣＰＰ  ＲＮＡ種の量を、対照サンプルで検出されるか、または対照サンプルから予測されるレベルと比較することを含む方法も考案される。前記生体サンプル内の前記ＣＰＰまたは前記ＣＰＰ  ＲＮＡ種の量が、前記対照サンプルで検出されるか、または前記対照サンプルから予測される前記レベルと比べて増加していれば、前記哺乳類でのＣＰＰの発現レベルが上昇していることが示され、前記生体サンプル内の前記ＣＰＰまたは前記ＣＰＰ  ＲＮＡ種の量が前記対照サンプルで検出されるか、または前記対照サンプルから予測される前記レベルと比べて減少していれば、前記哺乳類でのＣＰＰの発現レベルが低下していることが示される。
【０３１７】
本発明はまた、予後目的で診断アッセイ、予後アッセイおよびモニタリング臨床試験を使用する予知医学の分野にも関する。よって、本発明の一態様は、生体サンプル（例えば、血液、血漿、細胞、組織）においてＣＰＰおよび／または核酸発現ならびにＣＰＰ活性を測定し、それに応じて、個体がＣＰＰ発現または活性の異常に関連した疾病もしくは疾患を患っているか、または疾患を発症する危険性を有しているかどうかを判定するための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体がＣＰＰ、核酸発現または活性に関連した疾患を発症する危険性を有しているかどうかを判定するための予後（または予知）アッセイも提供する。例えば、生体サンプルにおいてＣＰＰコード遺伝子の突然変異をアッセイすることができる。このようなアッセイを予後または予知目的で使用して、それに応じて、ＣＰＰ発現もしくは活性を特徴とする、またはそれらに関連した疾患の発症前に個体を予防的に処置することができる。
【０３１８】
「生体サンプル」とは、個体から単離された組織、細胞および体液、ならびに個体内に存在している組織、細胞および体液を含むものとする。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生体サンプル中のＣＰＰ  ｍＲＮＡ、タンパク質またはゲノムＤＮＡをin vitro同様、in vivoでも検出することができる。好ましい生体サンプルは、リンパ液、脳脊髄液、血液、特に、血漿のような体液である。例えば、ＣＰＰ  ｍＲＮＡを検出するためのin vitro技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションとin situハイブリダイゼーションが挙げられる。ＣＰＰを検出するためのin vitro技術としては、質量分析、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光測定法が挙げられる。ＣＰＰをコードするゲノムＤＮＡを検出するためのin vitro技術としては、サザンハイブリダイゼーションが挙げられる。さらに、ＣＰＰを検出するためのin vivo技術としては、標識抗ＣＰＰ抗体の個体への導入が挙げられる。
【０３１９】
好ましい実施形態において、対象の方法が、一般に、個体（例えば、ヒト患者）の組織サンプルにおいて、（ｉ）対象ＣＰＰの１つをコードする遺伝子の突然変異または（ｉｉ）ＣＰＰコード遺伝子の誤発現、の少なくとも１つを特徴とする遺伝子病変の存在または不在を検出することを含むことを特徴とする。例えば、（ｉ）ＣＰＰコード遺伝子の１以上のヌクレオチドの欠失、（ｉｉ）その遺伝子への１以上のヌクレオチドの付加、（ｉｉｉ）その遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換、（ｉｖ）その遺伝子の著しい染色体再配列または増幅、（ｖ）その遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの著しい変化、（ｖｉ）その遺伝子の修飾異常、例えば、そのゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常、（ｖｉｉ）その遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、および（ｖｉｉｉ）調節エレメントの損傷またはＣＰＰをコードする転写物の安定性の低下を示す発現レベルの低下、の少なくとも１つが存在することを確かめることによって、このような遺伝病変を検出することができる。
【０３２０】
さらにもう１つの典型的な実施形態では、患者サンプルのゲノムＤＮＡを、メチル化に感受性を示し、およびその認識部位がＣＰＰコード遺伝子に存在している（フランキングおよびイントロン配列に含む）１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ＣＰＰ核酸の異常なメチル化パターンを検出することができる。例えば、Buiting et al. (1994) Human Mol Genet 3: 893-895参照。消化したＤＮＡをゲル電気泳動により分離し、それを、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列由来のプローブとハイブリダイズさせる。サンプルＤＮＡから作成された制限パターンを、既知メチル化の標準のものと比較することによって、ＣＰＰコード遺伝子のメチル化状態を決定することができる。
【０３２１】
さらに別の実施様態において、細胞表面または細胞外タンパク質に結合するＣＰＰの能力を検出する診断アッセイが提供される。例えば、細胞内で適切なレベルで発現している一方で、（標的に対する結合親和性が低下または増強した）ＣＰＰ標的タンパク質の結合において欠陥がある、ＣＰＰ突然変異体を検出することが望ましい。そのような突然変異は、例えば、点突然変異などの突然変異から生じる場合があり、診断的ＤＮＡ配列決定技術によって、または上記の免疫アッセイによって検出するのが実用的な場合がある。よって、本発明はさらに、通常、サンプル組織から１以上のＣＰＰコード遺伝子をクローニングすること、およびクローニングした遺伝子を、組換え体遺伝子産物と標的タンパク質間の相互作用の検出を可能にする条件下で発現させることを含む、診断的スクリーニングアッセイを意図する。本明細書に示されている種々の薬物スクリーニングアッセイの記載から明らかなように、多様な技術を、他の成分に結合するＣＰＰの能力を判定するために使用可能である。これらの技術は、野生型ＣＰＰと比較して、ＣＰＰ標的タンパク質に対して、より高い、またはより低い結合親和性を有する、突然変異タンパク質を生じる、ＣＰＰコード遺伝子における突然変異を検出するために使用可能である。逆に、ＣＰＰ標的タンパク質およびＣＰＰのどちらが「ベイト(bait)」であるか、どちらが患者サンプルに由来のものであるかを切り替えることで、この対象アッセイを用い、ＣＰＰ標的タンパク質の野生型と比較して、ＣＰＰに対して、より高い、またはより低い結合親和性を有するＣＰＰ標的タンパク質突然変異体を検出することもできる。
【０３２２】
例示的実施様態において、標的タンパク質は、本明細書で記載したように、ＧＳＴ融合タンパク質およびグルタチオン処理マイクロタイタープレートを使用することなどによって、固定化タンパク質（「標的」）として提供することができる。
【０３２３】
別の実施形態では、その方法は、対照対象から対照生体サンプルを得ること、その対照サンプルを、その生体サンプルにおいてＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのレベルが測定されるように、ＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る化合物または薬剤と接触させること、およびその対照サンプル中のＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのレベルを、試験サンプルにおけるレベルと比較することをさらに含む。本発明はまた、生体サンプル中のＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、そのキットは、生体サンプル中のＣＰＰ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出し得る標識化合物または薬剤；そのサンプル中のＣＰＰの量を測定するための手段；およびそのサンプル中のＣＰＰの量を標準と比較するための手段を含む。この化合物または薬剤は好適な容器にパッケージングすることができる。このキットは、そのキットをＣＰＰまたは核酸の検出に使用するための使用説明書をさらに含んでもよい。
【０３２４】
薬物スクリーニングアッセイ
本発明は、ＣＰＰ発現またはＣＰＰ生物活性を増強または抑制する候補モジュレーター（例えば、小分子およびペプチド、抗体、ペプチドミメティクスまたはその他の薬物）を同定するための方法（本明細書では「スクリーニングアッセイ」とも呼ぶ）を提供する。いくつかの実施形態では、小分子は、コンビナトリアル化学を利用して作製することができるし、天然物ライブラリーから得ることもできる。アッセイは細胞に基づくアッセイまたは非細胞に基づくアッセイである。薬物スクリーニングアッセイは、さらに記載されるように、結合アッセイであり、より優先的には機能アッセイである。
【０３２５】
本発明が薬剤開発に、例えば、ＣＰＰモジュレーターまたは薬物候補の抗心血管疾患応答を引き起こす能力を判定する目的で使用される場合、少なくとも１つのＣＰＰのレベルについて解析される体液は、好ましくは非ヒト哺乳類由来のものである。非ヒト哺乳類において内因性および／または外因性の要因により抗心血管疾患応答を誘導することによってヒトにおけるそのような応答の誘導が予測されることが好ましい。齧歯類（マウス、ラットなど）および霊長類が本発明のこの態様における使用に特に好適である。
【０３２６】
本明細書でさらに記載されるスクリーニングアッセイを使用して、ＣＰＰ活性を少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％調節することが分かった薬剤は、予防用および／または治療用抗心血管疾患薬として、さらなる試験に向けて選択され得る。
【０３２７】
別の態様では、本明細書でさらに記載されるスクリーニングアッセイを使用して、ＣＰＰ発現を少なくとも５％、より好ましくは少なくとも１０％、さらに好ましくは少なくとも３０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、いっそう好ましくは少なくとも９０％調節することが分かった薬剤は、予防用および／または治療用抗心血管疾患薬として、さらなる試験に向けて選択され得る。
【０３２８】
ＣＰＰ活性を調節することが分かった薬剤は、例えば、心血管疾患に対する処置計画を調整するため、あるいは単独またはその他の適当な薬剤もしくは処置との組合せで心血管疾患の症候を軽減するために使用し得る。
【０３２９】
タンパク質アレイ法は、スクリーニングおよび創薬に有用である。例えば、受容体／リガンド対の一メンバーを吸着剤とドッキングさせ、試験物質の存在下で、その結合パートナーへの結合能を判定する。吸着試験の迅速さから、試験物質のコンビナトリアルライブラリーを、それらの相互作用を調節する能力について容易にスクリーニングすることができる。好ましいスクリーニング法では、ＣＰＰを吸着剤とドッキングさせる。好ましくは、相互作用の検出を可能にするために、結合パートナーを標識する。あるいは、特定の実施形態では、試験物質を吸着剤とドッキングさせる。本発明のポリペプチドを試験物質に曝露し、結合についてスクリーニングする。
【０３３０】
他の実施形態では、アッセイが細胞に基づくアッセイであり、その細胞に基づくアッセイではＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を試験化合物と接触させ、ＣＰＰ活性を調節する試験化合物の能力を判定する。ＣＰＰ活性を調節する試験化合物の能力の判定は、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の生物活性をモニタリングすることにより行うことができる。細胞は、例えば、哺乳類起源の細胞、昆虫起源の細胞、細菌起源の細胞または酵母細胞である。
【０３３１】
一実施形態では、本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の標的分子である候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の実施形態では、本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分に結合するまたはＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法による多数のアプローチのいずれかを利用して得ることができ、コンビナトリアルライブラリー法としては、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能なパラレル固相または液相ライブラリー；デコンボルーションを要する合成ライブラリー法；１−ビーズ１−化合物ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を利用した合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーとともに使用され、他の４つのアプローチは化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用できる(その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるLam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145)。
【０３３２】
分子ライブラリーの合成法の例は、当技術分野において、例えば、DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059 and 2061;およびGallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233（それらの開示内容は出典明示によりそのまま本明細書の一部とする）に見出せる。
【０３３３】
化合物のライブラリーは、溶液中(例えば、Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421)に存在するかまたはビーズ上(Lam (1991) Nature 354: 82-84)、チップ上(Fodor (1993) Nature 364: 555-556)、細菌(Ladner 米国特許第５，２２３，４０９号)、胞子(Ladner 米国特許第’４０９号)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869)もしくはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-310); (Ladner 前記参照)に存在する。
【０３３４】
ＣＰＰ活性を調節する試験化合物の能力の判定はまた、例えば、複合体中の標識されたＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分を検出することによりＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分とその同起源の標的分子との結合を判定することができるように、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分を標識基と結合させることによっても行うことができる。例えば、複合体を免疫沈降させるかまたはゲル電気泳動を実施して、複合体形成量を測定してもよい。
【０３３５】
その同起源の標的分子と相互に作用する化合物の能力を、反応体を標識することなく判定することもまた、本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーターを使用することにより、化合物も標的分子も標識することなく、化合物とその同起源の標的分子との相互作用を検出することができる。その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされるMcConnell, H. M. et al. (1992) Science 257: 1906-1912。マイクロフィジオメーター（例えば、サイトセンサー）は、光アドレス可能電位計測法（ＬＡＰＳ）により細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物と受容体との相互作用の指標として使用することができる。
【０３３６】
好ましい実施形態では、アッセイには、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分を発現する細胞を標的分子と接触させて、アッセイ混合物を作製すること、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、およびＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物の能力を判定することが含まれる。ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物の能力の判定には、ＣＰＰ発現細胞の生物活性を調節する試験化合物の能力（例えば、上記のようにＣＰＰ標的分子との相互作用）の判定が含まれる。
【０３３７】
別の好ましい実施形態では、アッセイには、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分と反応する細胞をＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分と接触させて、アッセイ混合物を作製すること、そのアッセイ混合物を試験化合物と接触させること、およびＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物の能力を判定することが含まれる。ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物の能力の判定には、ＣＰＰ応答性細胞の生物活性を調節する試験化合物の能力の判定が含まれる。
【０３３８】
別の実施形態では、アッセイが細胞に基づくアッセイであり、その細胞に基づくアッセイではＣＰＰ標的分子（すなわち、ＣＰＰが相互に作用する分子）を発現する細胞を試験化合物と接触させ、ＣＰＰ標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を判定する。ＣＰＰ標的分子の活性を調節する試験化合物の能力の判定は、例えば、標的分子の活性を評価することによるかまたはＣＰＰ標的分子へと結合するまたはＣＰＰ標的分子と相互に作用するＣＰＰの能力を評価することによって行うことができる。
【０３３９】
ＣＰＰ標的分子へと結合するまたはＣＰＰ標的分子と相互に作用するＣＰＰの能力の判定は、例えば、上記の、結合を直接または間接的に判定する方法の１つによって行うことができる。好ましい実施形態では、アッセイには、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分を前記ＣＰＰと結合する既知化合物（例えば、ＣＰＰ抗体または標的分子）と接触させて、アッセイ混合物を作製すること、前記既知化合物の前後でＣＰＰを試験化合物と接触させること、およびＣＰＰと相互に作用する試験化合物の能力を判定することが含まれる。ＣＰＰと相互に作用する試験化合物の能力の判定には、既知化合物との比較によりＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分へと優先的に結合する試験化合物の能力を判定することが含まれる。ＣＰＰ標的分子へのＣＰＰの結合能の判定も、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）などの技術により行うことができる。その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、Sjolander, S. and Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345およびSzabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705。本明細書において、「ＢＩＡ」とは、反応体を標識することなく、生体特異的な相互作用をリアルタイムで調査するための技術である（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。生体分子間のリアルタイム反応の指標として、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）による光学現象の変化を利用することもできる。
【０３４０】
別の実施形態では、アッセイが無細胞アッセイであり、その無細胞アッセイではＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物の能力を判定する。好ましい実施形態では、ＣＰＰ標的分子を調節するまたはＣＰＰ標的分子と相互に作用するＣＰＰの能力の判定は、標的分子の活性を判定することによって行うことができる。例えば、標的分子の活性は、標的分子をＣＰＰまたはその断片と接触させ、標的の細胞セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、ＳＴＡＴ３、Ａｋｔ、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の誘導を測定し、標的の適当な基質に対する触媒／酵素活性を検出し、リポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えば、ルシフェラーゼをコードする核酸に作動可能なように連結された標的応答性調節エレメントを含む）の誘導を検出するか、または標的によって調節された細胞応答、例えば、シグナル変換またはタンパク質：タンパク質相互作用を検出することによって判定することができる。
【０３４１】
本発明の無細胞アッセイは、可溶型および／または膜結合型の単離タンパク質（例えば、ＣＰＰ標的が結合するＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分もしくは分子）いずれの使用にも適している。膜結合型の単離タンパク質を使用する無細胞アッセイの場合では、膜結合型の単離タンパク質が溶解状態で維持されるように可溶化剤を使用することが望ましい。このような可溶化剤の例としては、非イオン性洗剤（例えば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ  ＴＭ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  ＴＭ  Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ  ＴＭ、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）が挙げられる。
【０３４２】
本発明の上記アッセイ法の２以上の実施形態では、複合体を形成していない一方または両方のタンパク質からの複合体形成種の分離を容易にし、さらに、アッセイの自動化に対応するために、ＣＰＰまたはその標的分子のいずれかを固定することが望ましい。候補化合物の存在下および不在下での試験化合物の、ＣＰＰへの結合または標的分子とのＣＰＰの相互作用は、反応物の収容に好適ないずれの容器においても、本明細書に記載されるいずれの固定プロトコールによっても行うことができる。あるいは、複合体をマトリックスから解離し、標準的な技術を用いてＣＰＰ結合または活性のレベルを測定することもできる。
【０３４３】
また、タンパク質をマトリックスに固定するための他の技術も本発明のスクリーニングアッセイに使用することができる。例えば、ビオチンとストレプトアビジンの結合を利用して、ＣＰＰまたはＣＰＰ標的分子のいずれかを固定することができる。当技術分野では周知の技術（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill.）を利用して、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からビオチン化ＣＰＰまたは標的分子を調製し、ストレプトアビジンコーティング９６ウェルプレート(Pierce Chemical)のウェル内に固定することができる。あるいは、ＣＰＰまたは標的分子とよく反応するが、ＣＰＰとその標的分子との結合を妨げない抗体でプレートのウェルをコーティングし、結合していない標的またはＣＰＰを抗体結合によりウェルで捕捉することができる。このような複合体を検出するための方法は、ＧＳＴ固定化複合体に関して以上で記載したものに加え、ＣＰＰまたは標的分子とよく反応する抗体を使用した複合体の免疫検出、さらにＣＰＰまたは標的分子と結合する酵素の活性の検出に基づいた酵素結合アッセイもある。
【０３４４】
別の実施形態では、細胞を候補化合物と接触させ、細胞内でのＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を判定する方法により、ＣＰＰ発現のモジュレーターを同定する。候補化合物の存在下でのＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを候補化合物の不在下でのＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルと比較する。この比較に基づき、その候補化合物がＣＰＰ発現のモジュレーターであると確認できる。例えば、候補化合物の存在下でのＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がその不在下よりも高い（統計的に有意に高い）場合、その候補化合物はＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質発現の促進剤であると確認される。また、候補化合物の存在下でのＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質の発現がその不在下よりも低い（統計的に有意に低い）場合、その候補化合物はＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害剤であると確認される。細胞内でのＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルは、本明細書にて記載される、ＣＰＰｍＲＮＡまたはタンパク質を検出するための方法により判定することができる。
【０３４５】
本発明のさらに別の態様では、ＣＰＰを、２−ハイブリッドアッセイまたは３−ハイブリッドアッセイ（例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、米国特許第５，２８３，３１７号; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693-1696; およびBrent ＷＯ９４／１０３００参照）において「ベイト(beit)タンパク質」として使用して、ＣＰＰ活性に関係している、ＣＰＰと結合するまたはＣＰＰと相互に作用する他のタンパク質（「ＣＰＰ結合タンパク質」または「ＣＰＰ−ｂｐ」）を同定することができる。このようなＣＰＰ結合タンパク質は、例えば、ＣＰＰが媒介するシグナル伝達経路の下流エレメントとしてＣＰＰまたはＣＰＰ標的によるシグナルの伝搬にも関与している可能性が高い。
【０３４６】
２−ハイブリッド系は、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインで構成される大部分の転写因子のモジュール性に基づいている。要するに、アッセイでは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。１つの構築物では、ＣＰＰまたはその断片についてコードする遺伝子が既知転写因子（例えば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合されている。もう１つの構築物では、ＤＮＡ配列ライブラリーの、同定されていないタンパク質（「プレイ(prey)」または「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列が既知転写因子の活性化ドメインについてコードする遺伝子と融合されている。「ベイト」タンパク質と「プレイ」タンパク質がin vivoで相互作用し、ＣＰＰ依存的複合体を形成する可能性があるならば、転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインを近接させる。このように近接させることによって、転写因子に応答する転写調節部位に作動可能なように連結されたリポーター遺伝子（例えば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。リポーター遺伝子の発現は検出可能であり、機能的転写因子を含む細胞を単離し、それらのコロニーを使用して、ＣＰＰと相互作用するタンパク質をコードするクローニング遺伝子を得ることができる。
【０３４７】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤およびこれらのアッセイによってそのような薬剤を作製するための手法に関する。従って、一実施形態では、本発明は、上記のスクリーニングアッセイ（例えば、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイ）の任意の１つの段階を含む方法によって得られる化合物または薬剤を含む。
【０３４８】
従って、適当な動物モデルにおいて本明細書に記載されるように同定された薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように同定された薬剤（例えば、ＣＰＰ調節剤またはＣＰＰ結合パートナー）を動物モデルに使用して、そのような薬剤を用いた処置の有効性、毒性または副作用を判定することができる。あるいは、本明細書に記載されるように同定された薬剤を動物モデルに使用して、そのような薬剤の作用機序を解明することができる。さらに、本発明は、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤の本明細書に記載されるような処置への使用に関する。
【０３４９】
本発明はまた、上記のスクリーニングアッセイによって同定された新規薬剤の、本明細書に記載されるような診断、予後、予防および処置への使用にも関する。従って、そのような薬剤を、本明細書に記載されるように、診断、予後または処置に用いる薬物または医薬組成物の設計、処方、合成、製造および／または生産において使用することも本発明の範囲内である。例えば、一実施形態では、本発明は、上記のスクリーニングアッセイの１つによって得られる化合物の構造および／または特性を参照することによって、薬物または医薬組成物を合成または生産する方法を含む。例えば、薬物または医薬組成物は、ＣＰＰ標的分子を発現する細胞を試験化合物と接触させ、ＣＰＰ標的分子と結合するまたはＣＰＰ標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を判定する方法によって得られる化合物の構造および／または特性に基づいて、合成することができる。別の例示的様態では、本発明は、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分を試験化合物と接触させ、ＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分と結合するまたはＣＰＰまたはその生物学的に活性な部分の活性を調節する試験化合物の能力を判定する方法によって得られる化合物の構造および／または特性に基づいた、薬物または医薬組成物の合成または生産方法を含む。
【０３５０】
動物に基づく薬物スクリーニング
また、薬物スクリーニングアッセイをin vivoで実施することも有利である。心血管疾患に関与し得る効果的なＣＰＰモジュレーターを見つけるために、in vivoスクリーニングアッセイを非ヒト動物において実施する。心血管疾患の動物に基づくモデル系としては、限定されるものではないが、非組換え動物およびトランスジェニック動物が挙げられる。
【０３５１】
心血管疾患に関する非組換え動物モデルとしては、例えば、遺伝的モデルが含まれ得る。そのような心血管疾患の遺伝的モデルとしては、ａｐｏＢまたはａｐｏＲ欠損ブタ(Rapacz, et al., 1986, Science 234: 1573-1577)およびワタナベ遺伝性高脂血症（ＷＨＨＬ）ウサギ(Kita et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84: 5928-5931)が挙げられる。アテローム性動脈硬化症の非組換え型非遺伝的動物モデルとしては、例えば、動物を、ＬＤＬの食事補給を通じた化学的損傷またはバルーンカテーテル血管形成術を通じた機械的損傷のいずれかに曝した、例えば、ブタ、ウサギまたはラットモデルが含まれ得る。
【０３５２】
当技術分野で示されている(Ferns, G. A. A. et al. (1991) Science, 253: 1129-1132)ように、再狭窄のラット頚動脈損傷モデルが有力な治療効果の有用な指標であり得る。この方法の一例が、その開示内容が出典明示により本明細書の一部とされる米国特許第６５００８５９号に記載されている。要するに、National Institute on Aging Animal Care and use Committeeの承認を受けたプロトコールでは、腹膜内に２０ｍｇ／ｋｇ体重のペントバルビタール、２ｍｇ／ｋｇ体重のケタミンおよび４ｍｇ／ｋｇ体重のキシラジンで麻酔した、ＧＲＣコロニーの６ヶ月のＷｉｓｔａｒラットを使用した。左外頚動脈に、２−フレンチフォガーティ塞栓摘出カテーテルを用いてカニューレ挿入し、生理食塩水で膨潤させ、総頚動脈上下を３回通過させて、膨潤させた内皮脱落傷害の２時間後に開始する腹腔内注射によって、適切な用量の試験物質またはビヒクル単独（例えば、１：２：２：１６５  ＤＭＳＯ：Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ：脱水エタノール：リン酸緩衝生理食塩水などの適当な溶液中の体重に基づく１日用量）で動物を処置した。試験物質またはビヒクル単独を腹腔内注射として、次の４日間、１日１回投与した。１１日後、上記のように動物（８個体処置および１０個体ビヒクル処置）に麻酔をかけ、頚動脈を取り出し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。頚動脈の横断切片を顕微鏡スライドに載せ、ヘマトキシリンおよびエオジン染色液で染色した。頚動脈のイメージをデジタル変換ボードに映し出し、内膜および中膜の断面積を測定した。新生内膜領域（肥厚）の減少が、試験物質が効果的な再狭窄防止薬であることを示す。
【０３５３】
因果関係から、腸管内腔からの胆汁酸の再循環を干渉することによって、血清コレステロールのレベルが減少することが分かっている。疫学的データが蓄積され、それらのデータによってそのような減少がアテローム性動脈硬化症の病態の改善を導くことが示されている(Stedronsky, Biochimica et Biophysica Acta, 1210, 255-287 (1994))。コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）の阻害は、血漿ＨＤＬ／ＬＤＬ比を効果的に調節することが示されており、特定の心血管疾患の進行および／または形成を抑制することが期待される。ＣＥＴＰを阻害することによって、血漿ＨＤＬコレステロールの上昇および血漿ＬＤＬコレステロールの低下が起こり、その結果として、治療上有益な血漿脂質プロファイルが提供されるはずである(McCarthy, Medicinal Res. Revs., 13, 139-59 (1993))。１４Ｃ−タウロコール酸塩の胆汁内へのラット回腸取り込みを阻害する化合物（ＣＥＴＰ阻害）についてのin vivoアッセイは、その開示内容が出典明示により本明細書の一部とされる、米国特許第６４８９３６６号およびUne, et al. Biochimica et Biophysica Acta, 833, 196-202 (1985)に開示されている。
【０３５４】
要するに、雄Ｗｉｓｔａｒラット（２００〜３００ｇ）をイナクチン（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔する。１０インチ長のＰＥ１０チューブを用いて胆管にカテーテル挿入する。小腸は、露出させ、ガーゼパッド上に広げる。小腸と盲腸の連結部から１２ｃｍのところにカニューレ（１／８”ルアーロック型、テーパーメスアダプター）を挿入する。この同じ連結部から４ｃｍのところでスリットを切る（８ｃｍ長の回腸を用いる）。１２ミリリットルの温ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ６．５（ＰＢＳ）を腸セグメントの洗浄に使用する。遠位開口部に２０ｃｍ長のシリコーンチューブ（０．０２”Ｉ．Ｄ．×０．０３７”Ｏ．Ｄ．）を用いてカニューレ挿入する。近位カニューレを蠕動ポンプにつなぎ、腸を温ＰＢＳにより０．２５ｍｌ／分にて２０分間洗浄する。腸セグメントの温度を連続的にモニタリングする。試験開始時に、３ｍｌシリンジで２．０ｍｌの対照サンプル（５ｍＭ非放射性標識タウロコール酸塩を含有する０．０５ｍＣｉ／ｍＬの１４Ｃ−タウロコール酸塩）を腸セグメントに加え、胆汁サンプルの回収を開始する。対照サンプルを０．２５ｍｌ／分の速度にて２１分間注入する。胆汁サンプル画分は、処置の最初の２７分間、３分ごとに回収する。回腸ループは、サンプル注入の２１分後、２０ｍｌの温ＰＢＳにより洗浄（３０ｍｌシリンジを使用）した後、温ＰＢＳにより０．２５ｍｌ／分にて２１分間洗浄する。２回目の潅流を上記のように開始するが、この際、試験化合物を同様に投与し（２１分間の投与、続いて２１分間の洗浄）、最初の２７分間、３分ごとに胆汁をサンプリングする。必要に応じて、３回目の潅流（一般に対照サンプルを含む）を上記のように実施する。
【０３５５】
さらに、肝臓コレステロール濃度の測定は、心血管疾患に対する試験物質の有効性の判定に有用なアッセイである。このアッセイでは、肝臓組織の重量を量り、クロロホルム：メタノール（２：１）でホモジナイズする。ホモジナイゼーションと遠心分離の後、上清を分離し、窒素下で乾燥させる。残渣をイソプロパノールに溶かし、出典明示により本明細書の一部とするAllain, C. A. et al., Clin. Chem., 20, 470 (1974)により記載されているように、酵素的に、コレステロールオキシダーゼとペルオキシダーゼの組合せを用いてコレステロール含量を測定する。
【０３５６】
同様に、血清コレステロールを以下のように測定し得る。総血清コレステロールをWako Fine Chemicals (Richmond, Va.)社製の市販のキット；コレステロールＣ１１、カタログ番号２７６−６４９０９を用いて酵素的に測定する。ＨＤＬコレステロールは、Sigma Chemical Co.  ＨＤＬコレステロール試薬、カタログ番号３５２−３を用いてＶＬＤＬおよびＬＤＬを沈殿させた（硫酸デキストラン法）後、この同じキットを用いてアッセイする。総血清トリクリセリド（ブランク）（ＴＧＩ）もまた、Sigma Chemical Co.  ＧＰＯ−Ｔｒｉｎｄｅｒ、カタログ番号３３７−Ｂを用いて酵素的にアッセイする。ＶＬＤＬおよびＬＤＬ（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）コレステロール濃度は、総コレステロールとＨＤＬコレステロールとの差として算出される。対照と比較した、試験物質で処置したサンプルのＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールの減少が効果的な抗心血管疾患薬であることを示す。
【０３５７】
また、脂質低下薬を評価するためのイヌモデルも、例えば、米国特許第６４８９３６６号に記載されているように使用することができる。
【０３５８】
要するに、専門業者（例えば、Marshall farms）から入手した体重６〜１２ｋｇの雄ビーグル犬に、１日１回２時間給餌し、水を自由に与える。イヌを無作為に各々６〜１２個体の犬からなる投与群（例えば、ビヒクル、ｉ．ｇ．；１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｇ．；２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｇ．；４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｇ．；２ｍｇ／ｋｇ、ｐ．ｏ．（カプセルに入った粉末））に割り当てる。水溶液（例えば、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０溶液［モノオレイン酸ポリオキシエチレン、Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.］）に溶かした治療用物質の胃内投与を、栄養補給チューブを用いて実施する。投与の開始に先立ち、血清コレステロール（総コレステロールおよびＨＤＬコレステロール）およびトリグリセリドを評価するため、朝、給餌前に橈側皮静脈から血液サンプルを採取する。連続して数日間、朝、給餌前に動物に投与する。動物には、２時間餌を食べさせ、その後、残った餌を取り除く。糞便は、本試験の最後に、２日間をかけて回収し、胆汁酸または脂質含量について解析する。また、試験前の血清脂質レベルと比較するために、血液サンプルも処置期間の終わりに採取する。統計的有意性は、標準的なスチューデントｔ検定（ｐ＜０．０５）を用いて決定する。
【０３５９】
血清脂質量も同様に測定する。絶食させたイヌの橈側皮静脈から血清分離管(Vacutainer SST, Becton Dickinson and Co., Franklin Lakes, N. J.)に血液を採取する。血液を２０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、血清をデカントする。総コレステロールは、過酸化水素を生成するコレステロールオキシダーゼ反応（その過酸化水素を比色定量する）を利用し、Wako酵素診断キット（コレステロールＣＩＩ）(Wako Chemicals, Richmond, Va.)を用いて９６ウェル形式で測定する。プレートの最初の２カラムよりコレステロール０．５〜１０ｕｇの標準曲線を作成する。血清サンプル（推定脂質濃度に応じて、２０〜４０μｌ）または既知血清対照サンプルを独立したウェルに加える（二重試験）。各ウェルに水を加え、容量を１００μｌとする。１００μｌアリコートの呈色試薬を各ウェルに加え、３７℃にて１５分間のインキュベーション後、プレートを５００ｎｍにて読み取る。
【０３６０】
ＨＤＬコレステロールは、Sigmaキット番号３５２−３(Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)（ＬＤＬおよびＶＬＤＬを選択的に沈殿させるために硫酸デキストランとＭｇイオンを利用する）を用いてアッセイする。各血清サンプルの１５０μｌ量を各マイクロフュージチューブに加え、続いて、１５μｌのＨＤＬコレステロール試薬（Sigma ３５２−３）を加える。サンプルを混合し、５０００ｒｐｍにて５分間遠心分離する。次いで、５０μｌアリコートの上清を２００μｌの生理食塩水と混合し、総コレステロール測定の場合と同じ手順を用いてアッセイする。
【０３６１】
トリグリセリドは、Sigmaキット番号３３７を用いて９６ウェルプレート形式で測定する。この手順では、グリセロールを、トリグリセリドとリポタンパク質リパーゼの反応によってそれを放出させた後に測定する。１〜２４μｇの範囲のグリセロール（Sigma ３３９−１１）の標準溶液を使用して、標準曲線を作成する。血清サンプル（推定脂質濃度に応じて、２０〜４０μｌ）をウェルに加える（二重試験）。水を加えて各ウェルの容量を１００μｌとし、１００μｌの呈色試薬も各ウェルに加える。混合と１５分間のインキュベーションの後、プレートを５４０ｎｍにて読み取り、標準曲線からトリグリセリド値を算出する。また、反復試験用の１プレートもブランク酵素試薬を用いて実施して、血清サンプル中の内因性グリセロールを補正する。
【０３６２】
その開示内容が出典明示により本明細書の一部とされるＵＳ  ６４６２０４６に記載されているように、試験化合物をｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７８ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ  Ｊｃｌ）において血清グルコースおよび血清インスリンに対するそれらの効果について評価する。化合物をビヒクル（例えば、蒸留水中２％Ｔｗｅｅｎ８０で構成される）に溶かし、経口投与する。用量は体重より決定する。試験および動物の処分をはじめとする作業の全ての態様は、一般に、International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals (CIOMS Publication No.ISBN 92 90360194, 1985)に従って実施する。血清グルコースの定量にはグルコース−ＨＡアッセイキット(Wako, Japan)を使用し、インスリンの定量にはＥＬＩＳＡマウスインスリンアッセイキット(SPI bio, France)を使用する。適当な陽性対照はトログリタゾン(Helios Pharmaceutical, Louisville, Ky.)である。
【０３６３】
各群４個体の動物からなる２０の群に動物を分ける。動物は、体重５２＋／−５グラムで８〜１０週齢のものである。試験期間中、動物には試験食(Fwusow Industry Co., Taiwan)と水を自由に与える。処置に先立ち、各動物から血液サンプルを採取する（処置前血液）。４群の動物（ビヒクル群）には、ビヒクルの投与のみ行う。各ビヒクル群には、１００、３０、１０または１ｍｌ／ｋｇ体重のビヒクルを経口投与する。トリグリタゾン溶液（ｔｗｅｅｎ８０／水中、１０ｍｌ／ｋｇ体重）を４陽性対照群に、それぞれ１００、３０、１０および１ｍｌ／ｋｇ体重の用量で経口投与する。試験化合物を同様に、溶液として４群の動物に経口投与し、各群には異なる用量の化合物を与える。ビヒクル、陽性対照および試験化合物溶液は、処置前血液採取の２４時間後および４８時間後、直ちに群に投与する。最終用量の投与の１．５時間後に採血する（処置後血液）。血清グルコースを酵素的に（Ｍｕｔａｒａｔｏｓｅ−ＧＯＤ）測定し、ＥＬＩＳＡ（マウスインスリンアッセイキット）によってインスリンレベルを測定する。各群の平均ＳＥＭを計算し、処置前血液と処置後血液の比較によって血清グルコースおよびインスリンの阻害率を得る。処置前血液に対する処置後血液での血清グルコースおよびインスリンレベルの減少率を決定し、対照および試験溶液群とビヒクル群間の比較に対応のないスチューデントｔ検定を適用する。Ｐ＜０．０５で有意差を検討する。効果的な抗心血管疾患薬としてのトログリタゾンは、１０ｍｇ／ｋｇ体重にてグルコースレベルを減少させる（２５＋／−２％）。
【０３６４】
その開示内容が典明示により本明細書の一部とされる米国特許第６１２１３１９号は、高コレステロール血症ウサギにおけるアテローム性動脈硬化症の進行についてのアッセイを記載している。ウサギを屠殺し、大動脈を得る。この大動脈をスダン−４で染色し、染色の程度を解析する。試験物質で処置した脂質給餌ウサギおよび未処置の脂質給餌ウサギにおいて病変が及ぶ大動脈表面積率をグラフにする。効果的な抗アテローム性動脈硬化症薬で処置したウサギの大動脈はあまり染まらず、このことにより、アテローム性動脈硬化症の減少が示される。さらに、大動脈の切片を、ＶＣＡＭ−１またはＲａｍ−１１抗原に対する抗体を用いて、ＶＣＡＭ−１発現およびマクロファージ蓄積について免疫染色する。対照処置サンプルと比較したＶＣＡＭ−１発現およびマクロファージ蓄積の減少が、効果的な薬剤であることを示す。
【０３６５】
ＬＤＬコレステロールの減少はまた、霊長類モデルでも測定し得る。例えば、カニクイザルを、試験化合物の投与前に高脂肪コレステロール食を給餌することによって高コレステロール血症にする。次いで、このサルに、試験化合物または対照ビヒクルを２週間経口投与する。この期間にわたるサルにおける血清ＬＤＬコレステロールの割合の減少が、効果的な抗アテローム性動脈硬化症薬であることを示す。
【０３６６】
医薬組成物
本発明のポリペプチドが、例えば形質転換酵母または哺乳類細胞の分泌産物として可溶形態で発現される場合、それらは、精製における指針を提供する例えば、”Enzyme Purification and Related Techniques,” Methods in Enzymology, 22:233-577 (1977), and Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice (Springer-Verlag, New York, 1982)に従い、硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーのステップをはじめとする当業者に標準的な手順に従って精製することができる。同様に、本発明のポリペプチドが、例えば凝集物または封入体として不溶形態で発現される場合、それらは、遠心分離し、その封入体をカオトロピック剤および還元剤で可溶化し、その可溶化混合物を希釈し、そのポリペプチドが生物学的に活性なコンホメーションをとるようにカオトロピック剤および還元剤の濃度を低くすることにより、破壊した宿主細胞から封入対を分離することをはじめ、適当な技術により精製することができる。後者の手順は、出典明示により本明細書の一部とされる次の参照文献：Winkler et al, Biochemistry, 25: 4041-4045 (1986); Winkler et al, Biotechnology, 3: 992-998 (1985); Koths et al、米国特許第号４，５６９，７９０；および欧州特許出願８６３０６９１７．５および８６３０６３５３．３に開示されている。
【０３６７】
本発明の小分子、ペプチド、ＣＰＰ核酸分子、および抗ＣＰＰ抗体をはじめとする、ＣＰＰまたはＣＰＰ生物活性を検出または調節し得る化合物を投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、一般に、医薬上許容される担体を含む。本明細書において「医薬上許容される担体」とは、医薬投与に適合するいずれか、また、いずれもの溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤および吸収遅延剤などを含むものとする。このような媒体および薬剤の医薬上有効な物質としての使用は当技術分野で周知である。通常の媒体または薬剤が有効化合物に不適合である場合以外、組成物におけるその使用が意図される。補助的有効化合物も組成物に組み込んでよい。
【０３６８】
本発明の医薬組成物はその意図する投与経路に適合するように処方する。投与経路の例としては、非経口投与、例えば、静脈投与、皮内投与、皮下投与、経口投与（例えば、吸入）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および直腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は以下の成分を含み得る：注射水、生理食塩水、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶剤のような無菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌薬；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムのような抗酸化薬；エチレンジアミンテトラ酢酸のようなキレート化剤；酢酸、クエン酸またはリン酸のようなバッファー；および塩化ナトリウムまたはデキストロースのような張力調節剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに封入することができる。
【０３６９】
注射用途に好適な医薬組成物としては、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末が挙げられる。静脈投与では、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）(BASF, Parsippany, N.J.)またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合にも、この組成物は無菌でなければならず、かつ、容易なシリンジ性が存在する程度の流動性がなければならない。組成物は製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保存性がなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンのような被覆剤の使用により、また分散液の場合には必要な粒径を維持することにより、また界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。活動微生物の抑制は種々の抗菌薬および抗真菌薬、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖類、マンニトールやソルビトールのようなポリアルコール、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射組成物の吸収の長期化には、組成物中に吸収を遅延する薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることにより行うことができる。
【０３７０】
有効化合物がタンパク質、例えば、抗ＣＰＰ抗体である場合、無菌注射溶液は、適当な溶媒中に必要な量の有効化合物を、必要に応じて上記に挙げた１つの成分、または成分の組合せとともに配合した後、濾過除菌することにより調製することができる。一般に、分散液は、塩基性分散媒と上記に挙げたものからの他の必要な成分を含む無菌ビヒクルに有効化合物を配合することにより調製される。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過除菌したその溶液から有効成分と付加的な目的成分との粉末を得る真空乾燥および凍結乾燥である。
【０３７１】
経口組成物は一般に、不活性希釈液または可食担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入するか、または打錠して錠剤とすることができる。経口治療投与の目的では、有効化合物は賦形剤とともに配合することができ、錠剤、トローチ、またはカプセル剤の形態で使用できる。吸入による投与では、これらの化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからのエアゾールスプレーの形態で送達される。全身投与もまた、経粘膜手段または経皮手段によって可能である。経粘膜投与または経皮投与では、処方物中に、その障壁を透過させるのに適している浸透剤を用いる。このような浸透剤は一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与には、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は鼻腔用スプレーまたは坐剤の使用によって達成することができる。経皮投与では、これらの有効化合物は、一般に当技術分野で公知の軟膏(ointments, salves)、ゲル、またはクリーム剤に処方される。最も好ましくは、有効化合物は静注により対象に送達される。
【０３７２】
一実施形態において、これらの有効化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル送達系をはじめとする徐放性処方物のような、化合物が身体から急速に排除されるのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用できる。このような処方物の調製方法は当業者に明らかである。材料もまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的とするリポソームを含む）をまた、薬理学的に許容される担体として使用可能である。これらは、例えば、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に公知の方法に従って調製できる。
【０３７３】
さらなる実施様態において、有効化合物を、マイクロチップ薬物送達ディバイスにコーティングすることができる。そのようなディバイスは、タンパク質性組成物を、消化にかけたり、個体に注射したりせずに、血流、脳脊髄液、リンパ、または個々の組織へ制御伝達するために有用である。マイクロチップ薬物送達ディバイスを用いる方法は、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる米国特許第６，１２３，８６１号および同第５，７９７，８９８号、および米国特許出願第２００２０１１９１７６Ａ１号に記載されている。
【０３７４】
用量の投与および均質化を容易にするため、単位投与形で、経口、または好ましくは非経口組成物を処方するのが特に有利である。本明細書で使用するような単位投与形は、処置する対象に対する単位用量として適切な、物理的に分離した単位を意味し、各単位は、必要な医薬担体とともに所望の治療効果をもたらすように計算した、所定量の有効化合物を含む。本発明の単位投与形の明細は、有効化合物の独特な特性、および達成すべき特定の治療効果、およびそのような有効化合物を個体の処置のために化合させるという当技術分野に内在する制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０３７５】
このような化合物の毒性および治療効力は、細胞培養物または試験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な用量）を決定するためのものにより判定することができる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を用いてもよいが、感染していない細胞への傷害を最小限とし、それにより副作用を軽減するよう、このような化合物を罹患組織部位にターゲッティングする送達系を設計すべく留意しなければならない。
【０３７６】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトでの使用のための用量範囲を処方するために使用可能である。そのような化合物の用量は、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む、循環濃度の範囲内であることが好ましい。用量は、使用した用量形態、使用した投与経路に応じて、この範囲内で可変である。本発明の方法で使用する任意の化合物に関して、治療上有効な用量は、まず、細胞培養アッセイから評価することができる。より正確に、ヒトでの有用な用量を決定するために使用する循環を達成するために、動物モデルで用量処方を行ってもよい。血漿中のレベルを、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定してよい。
【０３７７】
これらの医薬組成物は、投与説明書とともに、容器、パックまたはディスペンサー内に含めることが可能である。
【０３７８】
心臓血管疾患治療
本発明のＣＰＰモジュレーターおよびＣＰＰ関連組成物はＣＰＰ関連疾患の処置または予防において使用できる。従って、一態様において、本発明は、抗体、抗体フラグメント、またはＣＰＰのペプチドモジュレーターを含む、好ましくは薬理学的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物に関する。担体または希釈剤は、好ましくは、経口投与、静脈投与、筋肉投与、または皮下投与に適合可能である。医薬組成物は、本明細書で記載したＣＰＰ関連組成物、ＣＰＰモジュレーター、抗ＣＰＰ抗体、または抗ＣＰＰ抗体フラグメントを含むか、または本質的にこれらからなり得る。
【０３７９】
多くの薬剤が心血管疾患の処置および予防に有用である。このような薬剤はＣＰＰ関連組成物と組み合わせて用い得ることが有利である。
【０３８０】
例えば、細胞周期阻害剤およびプロトオンコジーン(Simari and Nabel, Semin. Intervent. Cardiol. 1:77-83 (1996))；ＮＯ（一酸化窒素）供与薬；ｂｃｌ−ｘ(Pollman et al., Nature Med. 2:222-227 (1998))のようなプロアポトーシス薬；ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子および全身用ガンシクロビル(Ohno et al., Science 265:781-784 (1994); Guzman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10732-10736 (1994); Chang et al., Mol. Med. 1:172-181 (1995); and Simari et al., Circulation 92:1-501 (1995))はアテローム性動脈硬化症、再狭窄および新脈管内膜平滑筋増殖に採用されている。上記の参照文献の開示内容は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【０３８１】
本発明の組成物との組合せに有用な抗血栓薬としては、例えば、ＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリン阻害剤；組織因子阻害剤；および抗トロンビン薬が挙げられる。また、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、Vukmir, Am. J. Emer. Med. 13:459-470 (1995); Grant, PACE 20:432-444 (1997); Assmann I., Curr. Med. Res. Opin. 13:325-343 (1995);およびLipka et al., Am. Heart J. 130:632-640 (1995)に記載されているような局所麻酔薬（クラスＩ薬）、交感神経拮抗薬（クラスＩＩ薬）、抗心房細動薬（クラスＩＩＩ薬）、カルシウムチャネル薬（クラスＩＶ薬）またはアニオン拮抗薬（クラスＶ薬）のような抗不整脈薬も使用できる。クラスＩ薬の例としては、プロカインアミド；キニジンまたはジソピルアミド；リドカイン；フェニトイン；トカイニドまたはメキシレチン；エンカイニド；フレカイニド；ロルカイニド；プロパフェノン（ＩＩＩ）またはモリシジンが挙げられる。交感神経拮抗薬としては、プロプラノロール、エスモロール、メトプロロール、アテネラルまたはアセブトロールが挙げられる。抗心房細動薬の例としては、ブレチリウム、アミオダロン、ソテロール（ＩＩ）またはＮ−アセチルプロカインアミドが挙げられる。クラスＩＶ薬としては、ベラパミル、ジルチアゼム、およびベプリジル、ならびにアリニジンにようなアニオン拮抗薬が挙げられる。
【０３８２】
鬱血性心不全治療薬としては、Ｅｍｂｒｅｌ（商標）(Immunex Corp.; Seattle, Whsh.)、ＴＢＣ１１２５１のようなＴＮＦ阻害剤、またはＮａｔｒｅｃｏｒ（ネシリチド；Scios, Inc.）のようなＡＣＥ（アンギオテンシン変換酵素）阻害剤が挙げられる。脈管形成薬、例えば、Genentechにより開発されたｒｈＶＥＧＦのような組換えＶＥＧＦイソ型；ＶＥＧＦの１２１アミノ酸のイソ型をコードする核酸分子(BioByPass（商標）; GenVec/Parke Davis)；またはＶＥＧＦ−２をコードする核酸(Vascular Genetics, Inc.)；Scios, Inc. (Mountain View, Calif.)およびWyeth Ayerst Laboratories (Radnor, Pa.)により開発されたＦＧＦ−２の組換え形態であるＦＩＢＬＡＳＴ（商標）；ＧＥＮＥＲＸ（商標）、すなわち、Collateral Therapeutics (San Diego, Calif.)およびSchering AG(Miller and Abrams, Gen. Engin. News 18:1 (1998)参照（その開示内容は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる）)により開発されたＦＧＦ−４をコードするアデノウイルス遺伝子療法ベクターも本発明のＣＰＰ関連組成物と組み合わせるのに有用である。最後に、アムロジピン(Marche et al., Int. J. Cardiol. 62(Suppl.):S17-S22 (1997); Schachter, Int. J. Cardiol. 62(Suppl.):S85-S90 (1997))のようなカルシウム拮抗薬；ニカルジピン；ニフェジピン；プロパノロール；二硝酸イソソルビド；ジルチアゼム；およびイスラジピン(Nayler (Ed.) Calcium Antagonists pages 157-260 London: Academic Press (1988); Schachter, Int. J. Cardiol. 62(Suppl.):S9-S15 (1997))も心血管疾患の有利な治療薬である。
【０３８３】
その他の疾病の治療
本発明によって提供されるＣＰＰは、心血管疾患を有する個体の血漿において優先的に増加するものであるため、心血管疾患治療において有用である。しかしながら、本発明のＣＰＰの有用性は心血管疾患治療に限定されない。実施例４で例示されるように、本発明のＣＰＰは、例えば、本発明のＣＰＰのレベルの上昇または低下によって引き起こされるまたは影響を受ける種々のその他の疾病または疾患の診断、予後および／または処置にも使用し得る。実施例４では、本発明のＣＰＰを治療法、予後法および／または診断法として使用し得る疾病および疾患の判定に好適な方法を提供する。しかしながら、当然のことではあるが、この目的に使用できる当技術分野で公知の他の好適な方法もある。特に好ましい実施形態では、本発明は、胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状の処置を目的としたまたは前記疾病の予後または診断を目的としたＣＰＰ２３２を提供する。
【０３８４】
ポリペプチドＣＰＰ２３２（配列番号７０６）は、本発明に従ってヒト血漿で検出されたペプチドであり、モチリンの一部であるアミノ酸配列（受託番号Ｐ１２８７２）を有することが分かった。モチリンは十二指腸上皮のモチリン細胞によって合成される消化管調節ポリペプチドである。このポリペプチドは空腹時状態の間、約１００分間隔で全身循環に放出され、空腹時伝播性収縮の制御において最も重要な因子である。モチリンはまた、膵臓内分泌部の内因性放出も刺激する。セリアック病ではモチリンの血漿レベルが上昇することが報告されている(Sjolund K, et al., Peptides 24 (2003) 483-486)。プロモチリンのモチリンへのタンパク質分解プロセシングの障害によって、プロモチリンから多数のモチリン断片が産生する。そのため、セリアック病では、最も重要な生物学的に活性なモチリン断片が産生されない。本発明はそこで、セリアック病では不足しているか減少している生物学的に活性なペプチドを補う好適な治療薬としてＣＰＰ２３２を提供する。
【０３８５】
セリアック病の粘膜では、モチリン産生細胞の数が減少している(Johnston CF et al., Hepatogastroenterology. 35: 285-288 1988)。従って、本発明はそこで、モチリン産生細胞不足を克服するのに好適な治療薬としてＣＰＰ２３２を提供する。
【０３８６】
胆石形成がアポトーシスを伴うことは知られている。例えば、胆石の処置の１つである、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）はアポトーシスを抑制する。表４の遺伝子発現データは、ＣＰＰ２３２が盲腸でのアポトーシスを抑制することを示している。従って、本発明はそこで、胆石の処置に好適な治療薬としてＣＰＰ２３２を提供する。
【０３８７】
本発明に従い、ＣＰＰ２３２はジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼおよび関連遺伝子（表４の最後の３つの遺伝子）の遺伝子発現をダウンレギュレートする。ジヒドロリポアミドアセチルトランスフェラーゼは胆汁性肝硬変の主要な自己抗原である(Surh CD, et al., J Immunol 1990; 144: 3367-74)。従って、本発明はそこで、胆汁性肝硬変の主要な自己抗原の発現の低減に好適な治療薬としてＣＰＰ２３２を提供する。ＣＰＰ２３２はさらに、β−２−ミクログロブリンの遺伝子をダウンレギュレートする。従って、本発明はさらに、抗原提示（または自己抗原提示）の抑制に好適な治療薬としてＣＰＰ２３２を提供する。さらに、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼがＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症に見られる自己抗原であることが分かってきた(Wu Y.Y. et al., Clin Exp Immunol 2002; 128: 347-352)。よって、本発明は、ＨＣＶ感染症またはＨＣＶ感染に関係する問題（例えば、肝硬変など）の処置を目的とした治療薬としてＣＰＰ２３２を提供する。
【０３８８】
ＣＰＰ２３２（配列番号７０６）は、GeneProt, Inc (Geneva, Switzerland)によって、実施例４に記載されているようなアプローチにより合成されたものであり、そのペプチドをマウスに注射し、多くの器官についての遺伝子発現プロファイリングを実施した。表４は、ＣＰＰ２３２が遺伝子の発現に影響を及ぼし、その遺伝子の発現への影響がモチリンの潜在的標的領域である盲腸に限定されることを示している。主効果はアポトーシスおよび胆汁性肝硬変に関与している遺伝子の示差的発現に見られ、それらの遺伝子の大部分がダウンレギュレーションに向かうため、アポトーシスの抑制および胆汁性肝硬変の主要な自己抗原であるジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼの発現の低減が起こる。胆石形成はアポトーシスを伴い、胆石患者のモチリンの血漿レベルは健常患者に比べて高い。従って、本発明は、胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状の処置のための治療用物質としてだけでなく、前記疾病のモジュレーター、特に、胆汁性肝硬変またはコレステロール胆石症のモジュレーターを同定するための標的としてＣＰＰ２３２を提供する。腸管運動機能障害としては、例えば、過敏性腸症候群、糖尿病、胃不全麻痺、食道痙攣、ヒルシュスプリング病、慢性腸偽閉塞、硬皮症、アカラシアが挙げられる。腸管運動機能障害に関連する症候としては、例えば、嚥下困難、胸やけ、ガス、膨満感、悪心、嘔吐、便秘、下痢が挙げられる。また、前記疾病の予後および／または診断のための方法も提供される。
【表２５９】
2007501605.tif 000260
【表２６０】
2007501605.tif 000261
【０３８９】
本発明の一態様によれば、胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状の処置のための方法であって、有効量のＣＰＰ２３２ポリペプチドを、前記疾病を患っている哺乳類（ヒトを含む）に投与することを含む方法が提供される。本発明の関連する態様では、胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状の処置に用いる医薬の製造を目的としたＣＰＰ２３２ポリペプチドの使用を提供する。好ましい実施形態では、疾病が胆汁性肝硬変またはコレステロール胆石症である。別の好ましい実施形態では、腸管運動機能障害が過敏性腸症候群、糖尿病、胃不全麻痺、食道痙攣、ヒルシュスプリング病、慢性腸偽閉塞、硬皮症、アカラシアからなる群から選択される胃腸管運動機能障害である。また別の好ましい実施形態では、腸管運動機能障害に関連する症候が嚥下困難、胸やけ、ガス、膨満感、悪心、嘔吐、便秘、下痢からなる群から選択される症候である。
【０３９０】
別の態様によれば、本発明は、胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状のモジュレーターを同定するための方法であって、ｉ）ＣＰＰ２３２生物活性に対して許容されるサンプル条件下で試験化合物をＣＰＰ２３２と接触させること；ｉｉ）前記少なくとも１つのＣＰＰ２３２生物活性のレベルを決定すること；ｉｉｉ）前記レベルを、前記試験化合物を含まない対照サンプルのものと比較することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、前記レベルを変化させる前記試験化合物が胆石またはセリアック病の予防的および／または治療的処置用のＣＰＰ２３２モジュレーターとしてさらなる試験に向けて選択される。好ましい実施形態では、ＣＰＰ２３２生物活性のレベルを表４に記載される１以上の遺伝子の発現レベルを検出することによって測定する。
【０３９１】
別の態様によれば、本発明は、胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状の予後または診断のための方法であって、ＣＰＰ２３２の血漿レベルを検出すること（ここで、レベルの上昇が胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状を示す）を含む方法を提供する。本発明におけるＣＰＰ２３２の血漿レベルの上昇は、胆石またはセリアック病に罹患していない個体で認められるＣＰＰ２３２の血漿レベルに対する上昇である。その上昇は、好ましくは少なくとも１．２倍、より好ましくは少なくとも１．５倍、２倍、３倍、５倍または１０倍である。本発明の好ましい実施形態によれば、本方法は、ｉ）対象から得られた好適な組織のサンプルにおいて表４に記載されている少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを検出して、第１の値を提供する段階；およびｉｉ）その第１の値を無病対象由来の前記遺伝子の発現レベルと比較する段階（ここで、無病対象由来のサンプルと比較した対象サンプルにおける発現レベルの上昇または低減が、その対象が胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状の素因を有するまたは胆汁性肝硬変、胆石、セリアック病または腸管運動機能障害に関連する症候および症状に罹患していることを示す）を含む。遺伝子発現は、ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルについて検出される。好適な組織としては、限定されるものではないが、胆管、十二指腸、胆嚢、盲腸、結腸、回腸、腸組織、肝臓、胃が挙げられる。ｍＲＮＡ発現レベルは、例えば、マイクロアレイ解析、ノーザンブロット解析、逆転写ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＰＣＲなどの任意の好適な技術によって検出し得る。同様に、タンパク質レベルも、例えば、そのタンパク質に特異的な標識プローブを利用したウエスタンブロッティングによるなどの任意の好適な技術によって検出し得る。
【０３９２】
上記態様の好ましい実施形態では、遺伝子が表４に記載されている、アップレギュレートされているかまたはダウンレギュレートされている遺伝子から選択される。好ましくは遺伝子が表４に記載されている、１．２倍以上、１．３倍以上もしくは１．５倍以上にアップレギュレートされている遺伝子から選択され；または表４に記載されている、０．８倍以下、０．７倍以下もしくは０．６倍以下にダウンレギュレートされている遺伝子から選択される。上記態様のさらに別の好ましい実施形態では、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つまたは５つの遺伝子の発現が測定される。上記態様のさらに別の好ましい実施形態では、疾病がコレステロール胆石症である。
【０３９３】
本発明を一般的に記載してきたが、特定の具体例を参照することによってさらなる理解が得られる。それらの特定の具体例は例示目的のためだけに本明細書に提供されており、特に断りのない限り、それらは限定を意図するものではない。
【実施例】
【０３９４】
実施例１：疾病集団および対照集団のＣＰＰレベルの特性決定
心血管疾患のＤｕｋｅデータバンクに登録している対象を冠動脈疾患（ＣＡＤ）に基づき選択した。全部で２４１名のＣＡＤ患者と対照個体を、性別、年齢、および民族を揃え、血漿が異常な個体は除いた。５３名のＣＡＤ患者のセットと５３名の対照個体のセットを設定した。各セットから６リットルの血漿をプールした。各個体から血漿の一部を保持していたので、プールサンプルの陽性結果を集団の各メンバーに関して確認することができる。このような確認は、心血管疾患に関連のない特定のポリペプチドが異常なレベルにある個体の、交絡効果の可能性を消去するのに有用である。各集団からプールした血漿２．５リットルを、次のようなＭｉｃｒｏｐｒｏｔ（登録商標）法に従い、多段階クロマトグラフィーにより分離した。
ステップ１：ＨＳＡ／ＩｇＧの枯渇
１２５ｍｌの冷凍血漿を解凍し、無菌フード内にて０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過した。
【０３９５】
濾液を、それぞれ内径５ｃｍ、長さ５ｃｍの３００ｍｌＨＳＡリガンドセファロースファーストフローカラム(Amersham, Upsala, Sweden)；および内径５ｃｍ、長さ５ｃｍの１００ｍｌＧタンパク質セファロースファーストフローカラム(Amersham, Upsala, Sweden)の２本直列カラムに注入した。
【０３９６】
カラムは、５０ｍＭ  ＰＯ４バッファーｐＨ７．１、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで平衡化および洗浄した。流速は５ｍｌとした。
【０３９７】
保持されなかった画分（３５０ｍｌ）を、第二のステップまで冷凍した。２０回実施した。
【０３９８】
ステップ２：ゲル濾過／逆相捕捉ステップ
ステップ１から得られたサンプルを解凍し、無菌フード内にて０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過した。
【０３９９】
濾液を、２本の直列ゲル濾過カラム：２本の内径１４ｃｍ、長さ６２ｃｍの９．５リットルスパーデックス７５(Amersham, UK)カラムに注入した。カラムは、５０ｍＭ  ＰＯ４バッファーｐＨ７．４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、８Ｍ尿素で平衡化した。疎水性の不純物は逆相プレかラム：１５０ｍｌ  ＰＬＲＰＳ(Polymer Labs, UK)に保持された。サンプル注入のためプレカラムを切り替えた。ゲル濾過は流速４０ｍｌ／分で行った。
【０４００】
低分子量タンパク質（＜２０ｋＤａ）を直列逆相捕捉カラム：５０ｍｌ  ＰＬＲＰＳ  １００オングストローム(Polymer Labs, UK)に送り込んだ。ＰＬＲＰＳカラムへの注入を制御する三方向バルブをカットオフ値３３ｍＡＵ（２８０ｎｍ）で切り替え、ゲル濾過溶出液を逆相捕捉カラムへ送った。このカットオフ値は、まず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＯＤ値の評価範囲を求め、次に、３種類のカットオフ値（高い値、中間の値および低い値のＯＤ範囲）を評価することにより設定した。最終的なカットオフ値は、得られる低分子量タンパク質を最大限とするよう、低分子量タンパク質集団が少なくとも８５％となるように選択した。  低分子量タンパク質およびペプチドを、１カラム容量の、水中０．１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮの勾配により逆相捕捉ＰＬＲＰＳカラムから溶出させた。
【０４０１】
溶出液画分（５０ｍｌ）を次のステップまで冷凍した。２０回実施した。このステップの終わりに、全ての逆相溶出液を解凍し、プールし（１リットル）、７つのポリプロピレン容器に分けた（１４３ｍｌ）。容器は、次のステップに使用するまで−２０℃で維持した。
【０４０２】
ステップ３：陽イオン交換
ステップ２から得られたサンプル（１４７ｍｌ）を解凍し、同量の陽イオン交換バッファーＡ（Ｇｌｙ／ＨＣｌバッファー５０ｍＭ、ｐＨ２．７、尿素８Ｍ）と混合した。
【０４０３】
サンプルを、内径３５ｍｍ、長さ１００ｍｍの１００ｍｌスクロース１５Ｓカラム(Amersham, Upsala, Sweden)に注入した。カラムはバッファーＡで平衡化および洗浄した。流速は１０ｍｌ／分とした。
【０４０４】
タンパク質およびペプチドを、１００％バッファーＡから１００％バッファーＢ（１Ｍ  ＮａＣｌを含有するバッファーＡ）までの段階的勾配：
３カラム容量の７．５％Ｂ（７５ｍＭ  ＮａＣｌ）
３カラム容量の１０％Ｂ（１００ｍＭ  ＮａＣｌ）
３カラム容量の１７．５％Ｂ（１７５ｍＭ  ＮａＣｌ）
２カラム容量の２２．５％Ｂ（２２５ｍＭ  ＮａＣｌ）
２カラム容量の２７．５％Ｂ（２７５ｍＭ  ＮａＣｌ）
２カラム容量の１００％Ｂ（１Ｍ  ＮａＣｌ）
で溶出させた。
【０４０５】
ピークをもとに４５〜６０画分を採集した。７回実施した。７回目が終わった後、画分を実施内外でプールし、１８画分を得た。画分は、次のステップに使用するまで−２０℃で維持した。
【０４０６】
ステップ４：還元／アルキル化および逆相ＨＰＬＣ分画１
ｐＨを濃Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで８．５に調整した後、これら１８の各陽イオン交換画分をジチオエリスリトール（ＤＴＥ、３０ｍＭ、３７℃で３時間）で還元し、ヨードアセタミド（１２０ｍＭ、暗所２５℃で１時間）でアルキル化した。後者の反応はＤＴＥ（３０ｍＭ）を添加した後に酸性化（ＴＦＡ、０．１％）することにより停止させた。次に、これらの画分を、内径２１ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＵｐｔｉｓｐｈｅｒ  Ｃ８、５μｍ、３００オングストロームカラム(Interchim, France)に注入した。注入は流速１０ｍｌ／分で行った。
【０４０７】
Ｃ８カラムを水中０．１％ＴＦＡ（溶液Ａ）で平衡化および洗浄した。タンパク質およびペプチドを、６０分で１００％Ａから１００％Ｂ（水中０．１％ＴＦＡ、８０％ＣＨ３ＣＮ）までの二相勾配で溶出した。流速は２０ｍｌ／分とした。４０ｍｌずつ３０画分を採集した。
【０４０８】
その画分のタンパク質濃度を反映する、各画分の２８０ｎｍで測定した光学密度（ＯＤ）に基づき、各画分に対して同等のタンパク質含量のアリコートを作製した。
【０４０９】
各画分につき１アリコートを、過剰な乾燥を防ぐために各画分に水中１０％グリセロール５００μｌを加えた後にＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Savant, Fischer, Geneva）で乾燥させた以外、全てのアリコートを冷凍し、さらなる使用まで維持した。乾燥させた画分は次のステップに使用するまで−２０℃で維持した。
【０４１０】
ステップ５：逆相ＨＰＬＣ分画２
ステップ４から得られた乾燥サンプルを１ｍｌの溶液Ａ（水中０．０３％ＴＦＡ）に懸濁し、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのＶｙｄａｃ  ＬＣＭＳ  Ｃ４カラム、５μｍ、３００オングストローム(Vydac, USA)に注入した。流速は０．８ｍｌ／分とした。
【０４１１】
Ｃ４カラムを溶液Ａで平衡化および洗浄し、タンパク質およびペプチドを、逆相ＨＰＬＣ分画１におけるサンプルの溶出点に適合させた二相勾配で溶出させた。エレクトロスプレーイオントラップ質量分析法を用い、完全な質量データを得た。１６の異なる勾配を、溶媒濃度に相当するＲＰ１画分のＣＨ３ＣＮ濃度範囲±５％のＣＨ３ＣＮとともに使用した。３０％ＣＨ３ＣＮに相当するか、またはそれより高い溶媒濃度でＲＰ１中に溶出したタンパク質については、ＲＰ２勾配の溶出開始条件を、ＣＨ３ＣＮパーセンテージにおいて、ＲＰ１溶出濃度−３０％に設定した。２４の溶出画分を、最適ＳｐｅｅｄＶａｃ濃度およびさらなるロボット処理のために設計された、最適化された種々の採集形態に対応したディープウェルプレートに採集した。
【０４１２】
ステップ６：質量検出
逆相ＨＰＬＣ分画２の後に約１３，０００画分を９６ウェルディープウェルプレート（ＤＷＰ）に採集した。このうち少量（２．５％）を、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ(Bruker Esquire)を用いたオンライン分析に回した。未消化のタンパク質アリコートをＭＡＬＤＩマトリックスと混合し、質量較正標準および感度標準とともにＭＡＬＤＩプレートにスポットした。自動スポット装置（Ｂｒｕｋｅｒ  ＭＡＬＤＩサンプル調製ロボット）を用いた。シナピン酸(synapinic acid)としても知られるシナピン酸(synapic acid)（ＳＡ）、すなわち、トランス−３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸とα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＨＣＣＡ）の２種の異なるＭＡＬＤＩマトリックスを用いた。ＭＡＬＤＩプレートには、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ装置を用いて質量検出を行った。これらの９６ウェルプレートを＋４℃で保存した。
【０４１３】
９６ウェルプレート（ＤＷＰ）を回収し、２段階の一連の濃縮工程を行った。ＳｐｅｅｄＶａｃで乾燥させることにより、１ウェル当たり０．８ｍｌから約５０μｌに容量を減らし、次に、約２００μｌに再溶解し、再び１ウェル当たり約５０μｌまで濃縮し、＋４℃で保存した。次に、タンパク質を再緩衝化し、各ウェルにトリプシンを加え、密閉し、このプレートを３７℃で１２時間インキュベートした後、クエンチ（ｐＨが２．０に下がるまで蟻酸を添加）することにより消化した。ウェルに加えるトリプシンの濃度は、特定の画分各々に対して記録された２８０ｎｍでのＯＤをもとに調整した。これによりトリプシンの最適な使用と最も濃度の高い画分の完全な消化を確保した。自動スポット装置（Ｂｒｕｋｅｒ  ＭＡＬＤＩサンプル調製ロボット）を用い、各ウェルからの一定量をＨＣＣＡと予め混合したものを、ＭＡＬＤＩプレート上に、感度標準および質量較正標準とともに付着させた。ＭＡＬＤＩプレートは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ装置を用いて分析した。９６ウェルプレートの各ウェルの含量は、ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｅｓｑｕｉｒｅ  ＥＳＩ  Ｉｏｎ−Ｔｒａｐ  ＭＳ装置で分析した。
【０４１４】
ステップ７：ヒト血漿中の少量ペプチドの検出および同定
分離した画分をさらに、分離および検出のために、質量分析（マトリックス補助レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）およびＭＳ−ＭＳの双方）にかけた。
【０４１５】
完全質量データ、ペプチド質量フィンガープリントおよびペプチド配列データを、タンパク質同定および特性決定のために統合した。タンパク質を、Ｍａｓｃｏｔソフトウェア(Matrix Science Ltd., London, UK)を用いて同定し、ペプチド同定からの結果を、スペクトルの手動解析によって確認した。
【０４１６】
この方法によって同定されたタンパク質のうち、カルグラニュリンＡ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０５１０９号のＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ８）が、ＣＡＤ患者からのプールしたサンプルよりも、対照からのプールしたサンプル中で、より大きな程度まで発現していることが分かった（例えば、疾患画分と比較した多くの対照画分で２倍、このタンパク質からのペプチドが観察され、このタンパク質の質量スペクトル同定の間に得られた蓄積スコアは、対照サンプルに関して２．５倍高かった）。カルグラニュリンＡは炎症タンパク質として特性決定されている（Odink,et al., Nature 330 (6143), 80-82(1987)および多数のその後の参考文献）。炎症応答の間に滲出している脊髄細胞によって発現され、そこで、上皮細胞上のグルコサミノグリカン構造に結合する(Robinson, et al., JBC 277:3658-65(2002))。興味深いことに、ＰＣＴ公報ＷＯ００／６１７４２が、例えばアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる心不全の処置のためのカルグラニュリンＡの使用を開示している。さらに、ＰＣＲ公報ＷＯ００／１８９７０は、心筋梗塞および高血圧の予防のための、血管膜増殖の阻害剤として、カルグラニュリンＡの使用を開示している。従って、本明細書に記載のタンパク質分離および同定アプローチが、疾患サンプル中よりも対照サンプル中でより高いレベルで検出された場合に、研究中の疾患の処置に有益な効果を持つ、タンパク質の提供に効果的であることが明らかである。
【０４１７】
これに対し、本実施例で記載したタンパク質分離および同定の方法は、対照からプールしたサンプルとの比較によって、ＣＡＤ患者からのプールしたサンプル中で過剰発現したようなＭａｔｒｉｘ  Ｇｌａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８４９３）の同定を可能にした（例えば、タンパク質からのペプチドが、対照画分と比較して、多くの疾患画分でほぼ２倍観察され、このタンパク質の質量スペクトル同定の際に得られた蓄積スコアは、疾患サンプルに関して２倍高かった）。ＭＧＰは、骨および軟骨の有機マトリックスに関連した、ビタミンＫ依存性タンパク質である。Ｍｏｒｉ，ｅｔ ａｌ．が、ＭＧＰが、血管石灰化を阻害可能であることを実証している(FEBS Letters 433:19-22(1998))。ＭＧＰレベルは、血管石灰化への起こり得るフィードバック応答として、アテローム性動脈硬化斑内で増加する。ＰＣＴ公報ＷＯ０１／０２８６３およびＷＯ０１／２５４２７が、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患に関するバイオマーカーとしてＭＧＰを記載している。従って、本明細書で記載のタンパク質分離および同定アプローチが、研究中の疾病の診断における認識された使用を持つ、タンパク質の提供に効果的であることが明らかである。
【０４１８】
最後に、表３に挙げられているトリプシン作用ペプチドが、冠動脈疾患サンプルにおいて高いレベルで、タンデム質量分析によって観察された。トリプシン作用ペプチドの存在は、そのペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、ＣＡＤの個体からの開始血漿サンプル中に高いレベルで存在したことを示唆している。そのようなポリペプチドには、ＣＰＰ１４９〜４０２が含まれる。ＭＡＬＤＩ質量分析によって観察されたものに加えて、ペプチドの配列は、本発明のＣＰＰペプチドＣＰＰ１４９〜４０２を定義する。
【０４１９】
本発明に従ったタンパク質分離および同定の方法は、極めて感度が高い。ＭｉｃｒｏＰｒｏｔ（登録商標）法は、数百ｐＭの範囲の血漿濃度である、極めて少量のタンパク質を検出可能である。精度は、これまでに記載した方法を実施する中で確認されたものである。特に、アテローム性動脈硬化症およびＣＡＤにて、よく特性決定された役割を有するタンパク質が、ＣＡＤおよび対照サンプルで異なって検出された（前掲）。
【０４２０】
実施例２：ＣＰＰの化学の合成
この実施例では、本発明のＣＰＰを合成する。ペプチド断片中間体をまず合成し、次に、所望のポリペプチドへと組み立てる。
【０４２１】
ＣＰＰをまず、結合させる断片のＮ末端のＣｙｓ残基を持つように選択した、例えば５つの断片で、調製可能である。断片１をまず、断片２に結合させて第一の産物を得、次に、分取ＨＰＬＣ精製の後、前記第一の産物を断片３に結合させて第二の産物を得る。分取ＨＰＬＣ精製の後、第二の産物を断片４に結合させて第三の産物を得る。最後に、分取ＨＰＬＣ精製の後、第三の産物を断片５に結合させて所望のポリペプチドを得、これを精製し、リフォールディングする。
【０４２２】
チオエステル形成
断片２、３、４および５を、上記のように、チオエステル生成樹脂上で合成する。この目的のために、以下の樹脂を調製する：Ｓ−アセチルチオグルコール酸ペンタフルオロフェニルエステルを、本質的にＨａｃｋｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）が記載しているような条件下で、Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂に結合させる。第一の場合、得られた樹脂を、ＤＭＦ中１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンによる３０分の処理でのアセチル保護基の除去の後、０．２ｍｍｏｌスケールでのペプチド鎖伸長のための開始樹脂として使用する。断片２〜５のＮ末端ＣｙｓのＮαを、Ｂｏｃ−チオプロリン（Ｂｏｃ−ＳＰｒ、すなわちＢｏｃ−Ｌ−チオプロリン）を、従来のＮαまたはＳβ保護を持つＣｙｓの代わりにそれぞれの鎖の末端に結合することで保護する（例えば、Brik et al, J. Org. Chem, 65:3829-3825(2000)）。
【０４２３】
ペプチド合成
固相合成を、Schnolzer et al, Int. J. Peptide Protein Res., 40:180-193(1992)によって記載したように、段階的Ｂｏｃ化学鎖伸長のための、in situ中和／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，１，３，３−テトライエチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ）活性化プロトコールを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのカスタム改変４３３Ａペプチド合成装置上で実施する。各合成サイクルは、ニートＴＦＡでの１〜２分間処理、１分間ＤＭＦフロー洗浄、過剰なＤＩＥＡの存在下での、予め活性化した２．０ｍｍｏｌのＢｏｃ−アミノ酸との１０分間結合時間、および第二のＤＭＦ流での洗浄による、Ｎα−Ｂｏｃ−除去からなる。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸（２ｍｍｏｌ）を、過剰なＤＩＥＡ（６ｍｍｏｌ）の存在下で、１．８ｍｍｏｌのＨＢＴＵ（ＤＭＦ中０．５Ｍ）で３分間予め活性化させる。Ｇｌｎ残基の結合の後、ジクロロメタン流での洗浄を、ＴＦＡを用いた脱保護の前後で使用し、可能性のある高温（ＴＦＡ／ＤＭＦ）により触媒されるピロリドンカルボン酸の形成を防止する。側鎖保護アミノ酸は、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（ｐ−トルエンスルホニル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｎ（キサンチル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−シクロヘキシル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（４−メチルベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｏ−シクロヘキシル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ジニトロフェニルベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（ベンジル）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｒｐ（シクロヘキシルカルボニル）−ＯＨ、およびＢｏｃ−Ｔｙｒ（２−Ｂｒ−Ｚ）−ＯＨ(Orpagen Pharma, Heidelberg, Germany)である。他のアミノ酸を、側鎖保護なしに使用する。Ｃ末端断片１を、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ−ＣＨ２−Ｐａｍ樹脂（負荷した樹脂に対して０．７１ｍｍｏｌ／ｇ）上で合成し、一方、断片２〜５の機械補助合成は、Ｂｏｃ−Ｘａａ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｌｅｕ−Ｐａｍ樹脂上で開始する。この樹脂は、標準条件下での、Ｓ−アセチルチオグルコール酸ペンタフルオロフェニルエステルの、Ｌｅｕ−ＰＡＭ樹脂への結合によって得られる。得られた樹脂を、ＤＭＦ中１０％メルカプトエタノール、１０％ピペリジンでの３０分間の処理での、アセチル保護基の除去の後、０．２ｍｍｏｌスケールで、ペプチド鎖伸長のための開始樹脂として使用する。
【０４２４】
鎖のアセンブリが完了した後、ペプチド断片を脱保護し、スカベンジャーとして、５％ ｐ−クレソールで、０℃にて１時間、無水フッ化物水素での処理によって、樹脂から切断する。断片１を除く全ての場合で、イミダゾール側鎖２，４−ジニトロフェニル（ＤＮＰ）保護基が、ＤＮＰ除去手順がＣ末端チオエステル基と不適合であることから、Ｈｉｓ残基上に残る。しかしながら、ＤＮＰは、連結反応の際にチオールによって徐々に除去し、無保護Ｈｉｓを得る。切断の後、ペプチド断片を氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリル中に溶解し、凍結乾燥する。ペプチド断片を、バッファーＡ（Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）中のバッファーＢ（アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配および２１４ｎｍでのＵＶ検出を用いることによって、Ｗａｔｅｒｓ製のＣ１８カラムでのＲＰ−ＨＰＬＣによって精製する。サンプルをＥｓｑｕｉｒｅ装置(Bruker, Bremen, Germany)または類似の装置を用いて、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳＭＳ）によって解析する。
【０４２５】
天然化学連結反応
下記にさらに詳しく記載するように、非保護断片の連結反応は次のようにして実施する：乾燥ペプチドを、ｐＨ７前後で１〜８ｍＭの最終ペプチド濃度を得るために、６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）、０．２Ｍリン酸ｐＨ７．５中に等モル量で溶解し、１％ベンジルメルカプタン、１％チオフェノールを加える。通常、反応は一晩実施し、ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレー質量分析でモニタリングする。連結産物を、続いて、処理して、まだ存在する保護基を除去する。Ｎ末端チアゾリジン環の開環にはさらに、ｐＨ３．５での最終濃度０．５Ｍまでの固形メトキサミンの添加、および３７℃で２時間のさらなるインキュベーションが必要である。１０倍過剰のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを、分取ＨＰＬＣ精製の前に加える。ポリペプチド鎖を含む画分をＥＳＭＳにより同定し、プールし、凍結乾燥する。
【０４２６】
断片４および５の連結反応を、６Ｍ  ＧｕＨＣｌ中、ｐＨ７．０にて実施する。各反応物の濃度は８ｍＭであり、１％ベンジルメルカプタンおよび１％チオフェノールを加えて還元環境をつくり、連結反応を促進する。ほとんどの定量的連結反応は、３７℃での一晩の撹拌の後に観察される。反応のこの時点で、ＣＨ３−Ｏ−ＮＨ２ＨＣｌをこの溶液に加えて、最終濃度０．５Ｍとし、Ｎ末端チアゾリジン環を開環するためにｐＨを３．５に調整する。３７℃で２時間のインキュベーションの後、ＥＳＭＳを使用して、反応の完了を確認する。続いて、反応混合液を、ペプチド断片に比べて１０倍過剰のトリス（２−カルボキシエチルホスフィン）で処理し、１５分後、連結産物を分取ＨＰＬＣ（例えば、Ｃ４  ２０〜６０％  ＣＨ３ＣＮ  ０．５％／分）を用いて精製し、凍結乾燥し、−２０℃にて保存する。
【０４２７】
同様の手順を、若干改変して、残りの連結反応のために繰り返す。
【０４２８】
ポリペプチドフォールディング
全長ペプチドを、１Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭメチオニン、ｐＨ８．６中で、還元凍結乾燥タンパク質（約０．１ｍｇ／ｍＬ）を溶解することによって、空気酸化によりリフォールディングする。穏やかに一晩撹拌した後、タンパク質溶液を、上記のように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製する。
【０４２９】
実施例３：ＣＰＰ抗体組成物の調製
実質的に純粋なＣＰＰまたはその部分を得る。最終調製物中のタンパク質の濃度は、例えば、Ａｍｉｃｏｎフィルター装置上での濃縮によって、数マイクログラム／ｍｌのレベルまで調整する。次に、タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を、「モノクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体」と題した節で記載したように調製する。
【０４３０】
要するに、抗ＣＰＰモノクローナル抗体を生産するために、数週間の期間にわたり、マウスに数マイクログラムのＣＰＰまたはその断片を繰り返し接種する。次に、このマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。この脾臓細胞を、ポリエチレングリコールの手段によりマウス骨髄細胞に融合させ、過剰な非融合細胞を、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上での系の増殖によって破壊する。うまく融合した細胞を希釈し、希釈液のアリコートをマイクロタイタープレートのウェル中に入れ、そこで培養物の増殖を継続する。抗体産生クローンを、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、Engvall, E., Meth. Enzymol. 70:419(1980)によって初めに記載されたように、ＥＬＩＳＡのような免疫アッセイ法によって、ウェルの上清液中の抗体を検出することによって同定する。選択した陽性クローンを拡張し、そのモノクローナル抗体産物を使用のために回収することができる。モノクローナル抗体産生に関する詳細な手順は、その開示内容が出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる、Davis, L. et al. Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York, Section 21-2に記載されている。
【０４３１】
免疫によるポリクローナル抗体の産生に関して、ＣＰＰまたはその一部中の異種エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清を、免疫原性を増強するように改変できない、または改変できる、ＣＰＰまたはその一部でマウスを免疫することによって調製する。ラット、ウサギ、ヤギまたはウマをはじめとする任意の好適な非ヒト動物、好ましくは非ヒト哺乳類を選択することができる。
【０４３２】
モノクローナルまたはポリクローナルプロトコールのいずれかに従って調製した抗体調製物が、生体サンプル中のＣＰＰの濃度を決定する定量的免疫アッセイにおいて有用であり、またはそれらは生体サンプル中の抗原の存在を同定するために、半定量的または定性的に使用することもできる。抗体はまた、タンパク質を発現している細胞を死滅させるため、または体内のタンパク質のレベルを減少させるための、治療組成物において使用可能である。
【０４３３】
実施例４：in vivoにおけるＣＰＰポリペプチドの特定決定
ＣＰＰ２３２を、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに６００μｇ／日の用量で７日間皮下投与する。この処置期間の終了時に、剖検時に全ての器官からのサンプルを急速冷凍し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）発現プロファイリングを用いて解析する。
【０４３４】
全ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従い、ＴＲＩｚｏｌ試薬(Life Technologies)を用いてこれらの冷凍組織から抽出する。全ＲＮＡはλ＝２６０ｎｍ（Ａ２６０ｎｍ）における吸光度によって定量し、Ａ２６０ｎｍ／Ａ２８０ｎｍ比により純度を見積もる。完全性は変性ゲル電気泳動により確認する。ＲＮＡは分析まで−８０℃で保存する。
【０４３５】
十分量の全ＲＮＡを用い、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ(Life Technologies)を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、このｃＤＮＡをin vitro転写させ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７キット，Ambion）、ビオチン標識ｃＲＮＡを形成させる。次に、１２〜１５ｍｇの標識ｃＲＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマウスＭＯＥ４３０Ａ発現プローブアレイと４５℃で１６時間ハイブリダイズさせる。その後、アレイをＥｕｋＧＥ−ＷＳ２プロトコール(Affymetrix)に従って洗浄し、１０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−フィコエリトリンコンジュゲート(Molecular Probs)で染色する。シグナルを、２ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡ(Life Technologies)、１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ［Ｎａ＋］、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．００５％Ａｎｔｉｏｆｏａｍ(Sigma)、 ０．１ｍｇ／ｍｌヤギＩｇＧおよび０．５ｍｇ／ｍｌビオチニル化抗体を用いて抗体増幅し、ストレプトアビジン溶液で再染色する。洗浄後、アレイをＧｅｎｅ  Ａｒｒａｙ（登録商標）スキャナー(Affymetrix)でスキャンする。
【０４３６】
発現レベルは、所定のプローブのオリゴヌクレオチド対によって測定されるシグナル強度の違いの平均をとる（ＡｖｇＤｉｆｆ値）ことにより評価する。この研究に用いる画像取得および数量翻訳ソフトウエアはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅバージョン５（ＭＡＳ５）である。
【０４３７】
処置により影響を受ける遺伝子を同定するため、これらのデータセットをまずふるいにかけ、その値が体系的に、実験ノイズが高い低発現域にある第一波の分析遺伝子におけるもの（いずれの実験点についても最小の複製数に相当する実験数において少なくともＡｖｇＤｉｆｆ値８０）を除く。２回目の選抜において、閾値ｔ検定ｐ値（０．０５）が、二成分誤差モデル（Ｇｌｏｂａｌ  Ｅｒｒｏｒ  Ｍｏｄｅｌ）に基づき、また、可能であれば、多重仮説検定(Benjamini and Hochberg false discovery rate)のステップダウン補正を用いて、処置と処置無しの間で値の異なる遺伝子を同定する。
【０４３８】
次に、選択された遺伝子リストを、フィッシャーの直接確率検定を用い、経路および細胞成分に関して確立されている遺伝子リストと比較する。ベン図を用いて、種々の器官間で共通の遺伝子変化を特定する。関連の高い遺伝子の発現プロフィールを用い、いくつかのディスタンス・メトリクス（標準、Ｐｅａｒｓｏｎ）を用い、個々の実験点で相関的変化を有する遺伝子を見つける。
【０４３９】
特定の遺伝子関連を考慮するという判断は、上記のような探索的ふるい分けと統計学的アルゴリズムによって確認される数量的変化の関連、ならびに共通の生物学的テーマを指し示す他の調節された遺伝子との関係に基づくものである。
【０４４０】
表４は、ＣＰＰ２３２のＲＮＡレベルがアポトーシス経路、プロテオソーム、ユビキチン経路ならびにリボソームＲＮＡおよびタンパク質に関連する遺伝子に影響を及ぼすことを示している。ほとんどの遺伝子は少なくとも１．２倍より高くアップレギュレーションされるか、少なくとも０．８倍より低くダウンレギュレーションされる。
【配列表】
2007501605000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月10日(2006.5.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007501605000001.app
【国際調査報告】
2007501605.tif 000391
2007501605.tif 000392
2007501605.tif 000393
2007501605.tif 000394
2007501605.tif 000395
2007501605.tif 000396