(57)【要約】  国際公開第９５／０７９２９号、国際公開第９８／２９４４３号および国際公開第０３／９５４７９号から知られるものを含めた所定の抗ウイルス性多分枝ペプチド構築物の活性および細胞膜親和性は、そのペプチドのＣ末端に、（ａ）４から１０個までの炭素原子と、０から２個までの炭素−炭素二重結合を有するω−アミノ脂肪酸か、または（ｂ）ペプチド性細胞膜貫通剤のいずれかであるターミネーターを結合させることによって改善されうる。改善は、とても目立っているので、いくつかの場合には、分枝の数は、しばしば単独分枝まで減少され得て、および／またはその分枝は縮められうる。好ましいω−アミノ脂肪酸は、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸およびε−アミノカプロン酸である。ペプチド性細胞膜貫通剤は、好ましくは、ＴＡＴ由来のペプチド、ペネトラチン（登録商標）またはＫパムである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＧＰＧおよびＲＱＧＹの内の１つを含む水溶性抗ウイルス性ペプチドと、そのペプチドのＣ末端に結合したターミネーターとを含有しており、該ターミネーターは、（ａ）４〜１０個の炭素原子と０〜２個の炭素−炭素間の二重結合とを有するω−アミノ脂肪酸又は（ｂ）ペプチド性細胞膜貫通剤のいずれかである化合物。
【請求項２】
上記ペプチドは、多分枝ペプチド構築物（ＭＢＰＣ）であり、その各分枝は、ペプチド配列ＧＰＧを含有し、そしてそのコアは、リシン残基から形成され、そして上記ターミネーターは、その基礎となるリシン残基に結合されている請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
上記ＭＢＰＣの各分枝は、ペプチドＧＰＧＲＡＦである請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
上記ペプチドは、上記多分枝ペプチド構築物（ＭＢＰＣ）であり、その各分枝は、ペプチド配列ＲＱＧＹを含有し、そしてそのコアは、リシン残基から形成され、そして上記ターミネーターは、その基礎となるリシン残基に結合されている請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
上記ＭＢＰＣの各分枝は、ペプチドＲＱＧＹＳＰＬである請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
上記ＭＢＰＣの各分枝は、ペプチドＲＱＧＹＳである請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
上記ＭＢＰＣは、２つの分枝を有する請求項３、請求項５または請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
上記ＭＢＰＣは、８つの分枝を有する請求項３、請求項５または請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
上記ペプチドは、ＧＰＧ、ＧＰＧＲ、ＧＰＧＲＡまたはＧＰＧＲＡＦである請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
上記ペプチドは、ＲＱＧＹＳまたはＲＱＧＹＳＰＬである請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
上記ターミネーターは、４〜８個の炭素原子を有するω−アミノ飽和脂肪酸である前述のいずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項１２】
上記ターミネーターは、４〜６個の炭素原子を有するω−アミノ飽和脂肪酸である前述のいずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項１３】
上記ターミネーターは、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸またはε−アミノカプロン酸である前述のいずれかの請求項に記載の化合物。
【請求項１４】
上記ターミネーターは、ＴＡＴ−由来ペプチド、ペネトラチン（登録商標）またはＫパムである請求項１〜１０のいずれか1項に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜相互作用および／または細胞膜貫通が可能な構造の当初の抗ウイルス性分子に対する電子対を共有する接ぎ木（グラフト）により、抗ウイルス性活性、特に抗−ＨＩＶ活性が増大した化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多分枝ペプチド構築物（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｂｒａｎｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ；ＭＢＰＣ）は、小型ペプチドが結合したコア・マトリックスを包含する。コア・マトリックスは、自然状態において枝分かれした樹枝状重合体であり、その分枝は各々同一である方が好ましい。他のコア分子も可能であるが、好ましいコア分子は、リシンである。コア・マトリックスは、しばしばＭＢＰＣの「根」と呼ばれる中央のリシン残基から構築され得る。その中央のリシン残基には二つのリシン残基が結合しており、これらのリシン残基はそれぞれ、そのカルボキシル基を通じて、中央のリシン残基の異なるアミノ基にそれぞれ結合される。その結果、４つのアミノ基を有する分子が提供され、その分子は、４つのペプチドを有するＭＢＰＣに用いられるコア・マトリックスになりうる。あるいは、さらに４つのリシン残基を、そのカルボキシ残基を通じて上述の４つの異なるアミノ基にそれぞれ結合することによって、８つの分枝を有する分枝を有する分枝を提供することができる。この分子は、８つのペプチドを有するＭＢＰＣに用いられるコア・マトリックスとして役割を果たしうるか、あるいは、上記手段で８個のリシン残基を受け取って、１６個のペプチドを有するＭＢＰＣに用いられるコア・マトリックスを形成しうる。ペプチドのＣ末端は、コア・マトリックスの各分枝に共有結合してＭＢＰＣを形成しうる。これらのペプチドは、好ましくは同じペプチドであるが、互いに異なっていてもよい。得られる分子は、表面にペプチドのクラスターを有し、内側にコア・マトリックスを有している。内側のコア・マトリックスは提示されていないので抗原性を示さない。
【０００３】
所望により、ペプチドとコア・マトリックスとの間に、スペーサーを入れてもよい。第一リシン残基のカルボキシル基は、そのままにしておくか、アミド化するか、またはβ−アラニン（β−アミノプロピオン酸）等の遮断化合物にカップリングさせてもよい。ペプチドは、Ｄ−またはＬ−アミノ酸残基を含んでいてもよい。Ｄ−アミノ酸類は、ペプチダーゼによって切断されにくいので、生体内でより長時間存在することができる。一方、Ｌ−アミノ酸類はより優れた活性を示す。さらに、ペプチド類似体、即ちペプチドの炭素骨格を用いるが、ペプチド結合−ＣＯＮＨ−を省いた合成構築物を、ペプチドの代わりに用いることができる。したがって、本願において、ペプチドは、ペプチド類似体を含むものと解すべきである。ペプチド類似体は、ペプチダーゼに対して一層耐性があり、生体内でより長期間存在しうると考えられる。ペプチドの長さが長すぎる場合には、ＭＢＰＣは抗原性になる。したがって、各ペプチドにおいては、アミノ酸残基が１０個以下であることが好ましく、９個以下であることがより好ましい。
【０００４】
ＨＩＶ感染の治療において用いられるＭＢＰＣは、ジェイ  エム  サバティエ（Ｊ−Ｍ．Ｓａｂａｔｉｅｒ）らが国際公開第９５／０７９２９号に初めて記述した。そこに記述されたＭＢＰＣは、０〜４個のアミノ酸残基が先行し、２〜４個のアミノ酸残基が続いた配列ＧＰＧＲ（ＨＩＶの表面エンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０のＶ３ループ由来）を含有するペプチドを有している。アミノ酸配列ＩＧＰＧＲとＩＸＸＧＰＧＲ（ここでＸは、アミノ酸残基である）は、排除される。これらのＭＢＰＣのうち最も好ましいものは、ペプチドＧＰＧＲＡＦが８個結合したリシン残基のコアを有するものである。そのＭＢＰＣは、(ＧＰＧＲＡＦ)8−Ｋ4−Ｋ2−Ｋ−βＡ−ＯＨで表され、そのＯＨ末端は、β−アラニンのカルボキシル基を示す。そのカルボキシル基を修飾して、カルボキサミド末端を形成することもできる。この化合物は、ここではＳＰＣ３と称する。
【０００５】
国際公開第９８／２９４４３号において、ジェイ  エム  サバティエ（Ｊ−Ｍ．Ｓａｂａｔｉｅｒ）らは、ＨＩＶ感染の治療に有効でありうる別のＭＢＰＣを記述した。これらは、ＨＩＶエンベロープの膜貫通糖タンパク質ｇｐ４１由来のペプチドを利用している。そのペプチドは、０〜４個のアミノ酸残基が先行し、２〜４個のアミノ酸残基が後に続く配列ＲＱＧＹを含有する。これらのＭＢＰＣの中で最も好ましいものは、ペプチドＲＱＧＹＳＰＬが８個結合したリシン残基のコアを有する。そのＭＢＰＣは、(ＲＱＧＹＳＰＬ)8−Ｋ4−Ｋ2−Ｋ−βＡ−ＯＨで表され、そのＯＨ末端は、β−アラニンのカルボキシル基を示す。そのカルボキシル基を修飾して、カルボキサミド末端を形成することもできる。この化合物は、過去に、ＳＰＣ  ＲＬと、およびＲＬ４１と称されていたが、ここではＲＬとして称する。
【０００６】
国際公開第９８／２９４４３号以降、ＭＢＰＣ(ＲＱＧＹＳＰＬ)2−Ｋ−βＡ（以降、ＲＬ二量体という）は効果があるが、ＭＢＰＣ(ＲＱＧＹＳＰ)2−Ｋ−βＡは、効果が低いことが立証された。このことから、ＭＢＰＣのペプチド分枝においては、６アミノ酸という下限値が確認された考えられた。しかし、ケイ  マブロウ（Ｋ．Ｍａｂｒｏｕｋ）らは、国際公開第０３／０９５４７９号において、いくつかのより短いペプチド、特に(ＲＱＧＹＳ)2−Ｋ−βＡ−ＯＨ（以降、ＲＳという。しかし過去には、短ＲＬとも称されていた）及び(ＲＱＧＹ)8−Ｋ4−Ｋ2−Ｋ−βＡ−ＯＨが利用できることを示した。
【０００７】
ＳＰＣ３およびＲＬは両方とも、８つの分枝を有し、八量体であるとされている。ＲＳは、２つの分枝を有し、二量体であるされている。モノマー、即ち、線状のペプチドＧＰＧＲＡＦ、ＲＱＧＹＳＰＬ、及びＲＱＧＹＳは、いずれもなんら活性を示さなかった。
【０００８】
ＳＰＣ３及びＲＬのような抗ＨＩＶ剤は、細胞膜レセプターと直接相互作用することを通じて、レトロウイルスの感染の融合段階を遮断することが示された。エンフュヴィルタイドおよびＴ−１２４９（トリメリス・インク（Ｔｒｉｍｅｒｉｓ  Ｉｎｃ））のような他の融合阻害剤は、ウイルスエンベロープの糖タンパク質と直接的に相互作用する。後者の活性は、このような糖たんぱく質の構造に依存するため、ウイルス株に依存する。結局のところ、ウイルスの糖たんぱく質を直接的に阻害する分子は、耐性株を選出するという結果に至るだろう。これに対し、細胞膜レセプターを遮断できる分子は、全ての株が同様に阻害されるので、当然ウイルスの選出という結果には至らないであろう。
【０００９】
細胞レセプター遮断型のＨＩＶ阻害剤は、このようなレセプター（例えば、ＣｘＣＲ４またはＣＣＲ５）の表面だけでなく、上述のレセプターの細胞膜内構成要素にも、さらには細胞膜直下の領域や事象にさえ相互作用する可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
例えば、水溶性に優れたペプチドであるＳＰＣ３は、インビトロで、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）及びマクロファージだけでなく、Ｃ８１６６培養細胞においても抗ＨＩＶ活性を示す。ビー  ド  ルージュ（Ｂ  ｄｅ  Ｒｏｕｇｅ）は、国際公開第９９／３４７７７号において、ＳＰＣ３とある特定のリポソームとを結びつけたときに、おそらく細胞膜との相互作用がよくなるため、この活性が、５〜５０倍に増大することを示した。しかしながら、ＳＰＣ３は、５６個のアミノ酸残基からなる重合化ペプチドである。それのリポソームとの結合は困難であり、そして収率は完全ではないため、技術的なリスクだけでなく、コストの増大を引起す。したがって、ＳＰＣ３のような分子の有効性を改善する他の手法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、配列ＧＰＧおよびＲＱＧＹの内の１つを含む水溶性の抗ウイルス性ペプチドと、そのペプチドのＣ末端に結合したターミネーターとを含有しており、該ターミネーターは、（ａ）４〜１０個の炭素原子と０〜２個の炭素−炭素間の二重結合とを有するω−アミノ脂肪酸又は（ｂ）ペプチド性細胞膜貫通剤のいずれかである化合物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記抗ウイルス性ペプチドは、リシン・コア・マトリックスを有するＭＢＰＣであってもよい。このような場合には、ターミネーターは、根のリシン残基に結合される。上述のＭＢＰＣ、すなわち、ＧＰＧＲＡＦの８個の分枝を有するＳＰＣ３、ＲＱＧＹＳＰＬの８個の分枝を有するＲＬ、およびＲＱＧＹＳの２個の分枝を有するＲＳが使用されうる。しかしながら、抗ウイルス性ペプチドのＣ末端に対するターミネーターの結合によって奏される改善は非常に大きいので、ＳＰＣ３およびＲＬは、２個の分枝（それぞれ、ＳＰＣ３二量体およびＲＬ二量体）に、または１個の分枝（それぞれ、ＳＰＣ３単量体およびＲＬ単量体）にさえ減少されうる。その一方で、ＲＳも、１個の分枝（ＲＳ単量体）に減少されうる。さらなる研究によれば、ＳＰＣ３単量体（ＧＰＧＲＡＦ）は、ＧＲＧＲＡ、ＧＰＧＲまたはＧＰＣに縮められうることが示された。これらは、非常に小型の分子であるため、作るのがいっそう容易でそして安く、そしてその理由のため好まれる。
【００１３】
ω−アミノ脂肪酸は、飽和されていることが好ましい。炭素数が１０個より長い鎖は、その効果がほとんど得られないので不必要であり、そしてより長鎖は、脂質度が高すぎる可能性がある。好ましい長さは、炭素数４〜８個、そしてさらに好ましくは、炭素数４〜６個である。最も好ましいω−アミノ脂肪酸は、γ−アミノ酪酸、δ−アミノ吉草酸およびε−アミノカプロン酸である。
【００１４】
他のペプチドも適切でありうるが、ペプチド性細胞膜貫通剤は、適切にはＴＡＴ−由来のペプチド、ペネトラチン（登録商標）またはＫパムである。
【実施例】
【００１５】
（実験）
我々は、最初に、コア・リシン残基上に、長さを４から８個の炭素まで増大した飽和脂肪酸鎖のグラフトを有するＳＰＣ３八量体、およびリシン残基上に３個の異なるペプチド鎖、即ちＴＡＴ由来のペプチド、ペネトラチンおよびＫパム・ペプチド（全て膜貫通および架橋を増強すると報告されている）を有するＳＰＣ３八量体を合成した。我々は、ＮＬ４−３ＨＩＶ株に感染したＣ８１６６細胞について、その後同じ株に感染したＰＢＬについて、上記分子をテストした。結果を表１および２に示す。
【００１６】
陽性の結果が観察されると、費用抑制の観点で、水溶性ペプチド上の膜親和性鎖のグラフトが、その効力（ＳＰＣ３、ＲＬおよびそれらの誘導体は、小型ペプチドの重合体、しばしば八量体である；単量体は、不活性であることが示された）を失うことなくそれらのサイズを減少させうるかどうかを試験するための更なる試みがなされた。この目的を達成するために、我々は、好ましいグラフト化配列をつけて、ＳＰＣ３、ＲＬおよびＲＳの配列の単量体および二量体を合成し、そしてそれらを、Ｃ８１６６、ＰＢＬおよびＰＢＭＣについて試験した。結果は、表３〜５に示す。
【００１７】
我々は、ＧＰＧＲＡＦ、特にＧＲＧＲＡ、ＧＰＧＲおよびＧＰＧであるＳＰＣ３単量体に関連する短ペプチドも合成し、そしてδ−アミノ吉草酸ターミネーターがついたこれらを試験した。これらを、ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３に対するＣ８１６６細胞（結果は、表６および７に示される）について、そしてＨＩＶ−１  ＮＤＫに対するＣ８１６６細胞（結果は、表８で示される）について、８日ごとに、２回試験した。
【００１８】
行われた実験は今までのところインビトロであるが、本発明でなされた改良は、インビボのリンパ系で、化合物のより優れた有用性につながるであろうことが予想される。
【００１９】
（試験方法）
（細胞およびウイルス）
ＨＩＶ−１  ＮＬ４−３単離物（アダチ（Ａｄａｃｈｉ）他、１９８６年；バーレ・シノウシ（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ）他、１９８３年）および高細胞変性のザイールのＨＩＶ−１  ＮＤＫ単離物（エルロッド（Ｅｌｌｒｏｄｔ）他、１９８４年）を、許容性ＣＥＭ細胞（ナラ（Ｎａｒａ）他、１９８７年）で増殖させた。未感染ＣＥＭおよびＣ８１６６（サラフディン（Ｓａｌａｈｕｄｄｉｎ）他、１９８３年）は、ウルトラグルタミン（カンブレックス（ｃａｍｂｒｅｘ）、ベルビエ（Ｖｅｒｖｉｅｒ）、ベルギー国）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１０％熱不活化ウシ胎仔血清（カムブレックス（ｃａｍｂｒｅｘ））を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｒ１０）中で維持した。
【００２０】
ＨＩＶ−１陰性のドナーから得られた末梢血リンパ球を、先に記述されるとおりに培養し、ウルトラグルタミン、ＩＬ２（２０μｇ／ｍｌ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、および１０％加熱不活化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。細胞を、フィトヘマグルチニン（２０Ｕ／ｍｌ  ＰＨＡ  Ｐ、ジフコ（Ｐ，ＤＩＦＣＯ）、ミズーリー州デトロイト）が添加された培養液中で３日間刺激した。
【００２１】
（Ｃ８１６６細胞のＨＩＶ−１感染）
３×１０５／１００μＬのＣ８１６６細胞のサンプルを、９６穴マイクロタイタープレート内で、種々の濃度のペプチドを含有する培養液中で前（予備）培養した。３７℃で１時間処理後、ＨＩＶ−１の希釈ウイルス溶液１００μｌを添加した。細胞を、３７℃で１時間、ｍｌ当たり１０００ＴＣＩＤ50という感染の多重度でウイルスにさらした。その細胞を、３回洗浄し、３７℃で、２４穴プレート内でＲ１０培養液中にて３×１０5／μｌで培養した。Ｃ８１６６培養液は、感染後４日目に交換した。その処理は、ウイルス吸収の前も、ウイルス吸収の間も、そして感染の後も永続した。Ｃ８１６６細胞についてのアッセイは、少なくとも２回、そして二重で行われた。毒性の評価を、毎日の細胞計数およびトリパンブルー排除アッセイによって行った。ＨＩＶ−１でのＣ８１６６Ｔ細胞の感染を、ウイルス誘導細胞変性効果（シンシチウム形成）によって、そして、培養上清中における、細胞不含のｐ２４ウイルスタンパク質の定量によって評価した。培養上清中のＨＩＶ−１のｐ２４gag濃度の測定は、ＥＬＩＳＡ（アライアンス（ＡＬＬＩＡＮＣＥ（登録商標）、ＨＩＶ−１ｐ２４キット、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、ライフサイエンシズ、米国（ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＵＳＡ））によって行った。
【００２２】
（ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の感染）
１０６／１００μＬのＰＢＬ細胞のサンプルを、９６穴マイクロタイタープレート内で、種々の濃度のペプチドを含有する培養液中で前（予備）培養した。３７℃で１時間処理後、ＨＩＶ−１の希釈ウイルス溶液１００μｌを添加した。細胞を、３７℃で、１時間、ｍｌ当たり１０００ＴＣＩＤ50という感染の多重度でウイルスにさらした。その細胞を、３回洗浄し、そして、３７℃、５％ＣＯ2で、２４穴プレート内で、ペプチドを含んだ培養液中にて１１０6／ｍｌで培養した。その処理は、ウイルス吸収の前も、ウイルス吸収の間も、そして感染の後も永続した。ＰＢＬ培養液は、常にペプチドの存在下で、３週間の間３−４日毎に交換した。細胞計数およびトリパンブルー排除アッセイによって、細胞生存性を評価した。先述のとおり、培養上清中のウイルス産出を、ｐ２４ＥＬＩＳＡ試験によって定量した。実験は全て、盲検試験で行われた。試験は、二重で行われた。
【００２３】
（結果）
2007531705.tif 000002
【００２４】
2007531705.tif 000003
【００２５】
2007531705.tif 000004
【００２６】
2007531705.tif 000005
【００２７】
2007531705.tif 000006
【００２８】
試験に用いられた全ての類似物（アナログ）は全て、ＳＰＣ３と比較して増大した活性（５〜１５０倍の間）を示した。
類似の結果が、ＰＢＬで得られた：
2007531705.tif 000007
最も優れた作用物質は、Ｓ５およびＳ６、即ちそれぞれＳＰＣ３−（δ−アミノ吉草酸）およびＳＰＣ３−（γ−アミノ酪酸）であり、最大１０μＭまでの投与量で、０．１から０．０１μＭのＩＣ50で、そして細胞に毒性なしであった。
【００２９】
2007531705.tif 000008
【００３０】
上の表は、ペプチドＲＬとＳＰＣ３の単量体への吉草酸のグラフトが、Ｃ８１６６細胞に対するそれらの活性を増大させることを示す。ＳＰＣ３の場合には、活性は、当初の重合化ペプチドのものより大きくなった。
【００３１】
2007531705.tif 000009
【００３２】
結果は、当初のペプチドの単量体または二量体が、その八量体のものに匹敵する活性を有することを示す。正常なＳＰＣ３が２μｍ、ＳＰＣ３吉草酸が０．５μＭであるのに対して、ＳＰＣ３単量体吉草酸は、０．１μＭのＩＣ100を示す。これは、ＳＰＣ３が、５６個のアミノ酸残基を含むのに対して、単量体は、わずか６個のみを含有するので重要である。
【００３３】
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【００３４】
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【００３５】
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【００３６】
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【００３７】
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【００３８】
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【００３９】
2007531705.tif 000016
【００４０】
2007531705.tif 000017
【００４１】
2007531705.tif 000018
【００４２】
2007531705.tif 000019
【００４３】
2007531705.tif 000020
【国際調査報告】
2007531705.tif 000021
2007531705.tif 000022
2007531705.tif 000023