(57)【要約】  本発明は、改良された不活化ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）ワクチンに関する。本発明はまた、安定化不活化ＦＣＶを製造する方法、及びＦＣＶ免疫原性組成物の製造におけるそのような安定化不活化ＦＣＶの使用を提供する。本発明はさらに、本発明による免疫原性組成物を用いて、ネコ科の動物、好ましくはネコにおいて免疫応答を誘発する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又は複数の不活化剤によって不活化され、アルデヒド化合物によって安定化されたネコカリシウイルス（ＦＣＶ）を含む、ＦＣＶに対する不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物であって、前記アルデヒド化合物は、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル鎖を含み、前記免疫原性組成物は、許容される賦形剤又はビヒクルと混合されている不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物。
【請求項２】
賦形剤又はビヒクルが獣医学的に許容される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
組成物が、凍結乾燥されており、凍結乾燥賦形剤又はビヒクルと混合されている、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
不活化剤が、エチレンイミン、アセチルエチレンイミン、プロピレンイミン、及びβ−プロピオラクトンからなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
不活化剤がβ−プロピオラクトンである、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
不活化剤がエチレンイミンであり、エチレンイミンは約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ存在する、請求項４記載の組成物。
【請求項７】
不活化剤がエチレンイミンであり、エチレンイミンは約１ｍＭ〜約１０ｍＭ存在する、請求項４記載の組成物。
【請求項８】
アルデヒド化合物が直鎖Ｃ１アルキル鎖を含み、アルデヒド化合物は１つのアルデヒド基を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
アルデヒド化合物が直鎖Ｃ２〜Ｃ５アルキル鎖を含み、アルデヒド化合物は２つのアルデヒド基を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
２つのアルデヒド基の１つがケトン又はエポキシ基で置換されている、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
アルデヒド化合物が、ホルムアルデヒド、グリシドアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、又はメチルグリオキサールからなる群から選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
アルデヒド化合物がホルムアルデヒドであり、ホルムアルデヒドは約０．０５ｇ／ｌ〜約０．８ｇ／ｌ存在する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
アルデヒド化合物がホルムアルデヒドであり、ホルムアルデヒドは約０．１ｇ／ｌ〜約０．５ｇ／ｌ存在する、請求項１１記載の組成物。
【請求項１４】
チオスルフェート及びシステインを含む中和化合物をさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
少なくとも１種の付加的なＦＣＶ株をさらに含み、少なくとも１種又は両方のＦＣＶ株が、不活化及び安定化されている、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
少なくとも１種の付加的なＦＣＶ株が、ＦＣＶ  ＵＳ１００８６９（ＦＣＶ  ＰＴＡ  ５９３０）、ＦＣＶ  Ｆ９、ＦＣＶ２５５、ＦＣＶ２２８０、ＦＣＶ４３１、ＦＣＶ  Ｇ１、ＦＣＶ  ＬＬＫ、ＦＣＶ  ＫＣＤ、ＦＣＶ  ＣＦＩ、及びＦＣＶ  Ｍ８からなる群から選択される、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
ネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原をさらに含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１８】
ネコ病原体が、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス、及びネコクラミジアからなる群から選択される、請求項１７記載の組成物。
【請求項１９】
ネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原が、生弱毒化微生物、又はネコ病原体由来の少なくとも１種の免疫原を発現する組換えベクターを含む、請求項１７記載の組成物。
【請求項２０】
ＦＣＶを不活化及び安定化する方法であって、ＦＣＶを不活化剤及びアルデヒド化合物と反応させるステップ及び不活化及び安定化ＦＣＶを回収するステップを含み、前記アルデヒド化合物は、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル鎖を含む方法。
【請求項２１】
不活化剤が、エチレンイミン、アセチルエチレンイミン、プロピレンイミン、及びβ−プロピオラクトンからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
不活化剤がβ−プロピオラクトンである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
不活化剤がエチレンイミンであり、エチレンイミンは約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ存在する、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
不活化剤がエチレンイミンであり、エチレンイミンは約１ｍＭ〜約１０ｍＭ存在する、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
アルデヒド化合物が直鎖Ｃ１アルキル鎖を含み、アルデヒド化合物は１つのアルデヒド基を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
アルデヒド化合物が直鎖Ｃ２〜Ｃ５アルキル鎖を含み、アルデヒド化合物は２つのアルデヒド基を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
２つのアルデヒド基の１つがケトン又はエポキシ基で置換されている、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
アルデヒド化合物が、ホルムアルデヒド、グリシドアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、又はメチルグリオキサールからなる群から選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
アルデヒド化合物がホルムアルデヒドであり、ホルムアルデヒドは約０．０５ｇ／ｌ〜約０．８ｇ／ｌ存在する、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
アルデヒド化合物がホルムアルデヒドであり、ホルムアルデヒドは約０．１ｇ／ｌ〜約０．５ｇ／ｌ存在する、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
不活化及び安定化ＦＣＶを中和化合物と反応させるステップをさらに含み、中和化合物がチオスルフェート及びシステインを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項３２】
不活化及び安定化ＦＣＶが、サイズ排除クロマトグラフィ、超遠心分離、及び選択的沈殿によって回収される、請求項２０記載の方法。
【請求項３３】
不活化及び安定化ＦＣＶを凍結乾燥賦形剤中で凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項２０記載の方法。
【請求項３４】
不活化非アジュバント免疫原性組成物を製造する方法であって、ＦＣＶに対する免疫応答を誘発するのに十分な量の請求項１記載の不活化及び安定化ＦＣＶと、獣医学的に許容される賦形剤又はビヒクルとを混合することを含む方法。
【請求項３５】
長期貯蔵用の不活化非アジュバント免疫原性組成物を製造する方法であって、ＦＣＶに対する免疫応答を誘発するのに十分な量の請求項１記載の不活化及び安定化ＦＣＶと、凍結乾燥賦形剤とを混合し、組成物を凍結することを含む方法。
【請求項３６】
ネコ科動物においてＦＣＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、そのネコ科動物に、請求項１記載の不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物を投与し、それによって免疫応答を誘発することを含む方法。
【請求項３７】
ネコ科動物においてＦＣＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、そのネコ科動物に請求項１７記載の不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物を投与し、それによって免疫応答を誘発することを含む方法。
【請求項３８】
ネコ科動物において、ＦＣＶ、及びネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、前記ネコ科動物に、請求項１記載の不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物、及び他のネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原を投与し、それによって免疫応答を誘発することを含む方法。
【請求項３９】
少なくとも１種のさらなるネコ病原体が、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス、及びネコクラミジアからなる群から選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
ネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原が、生弱毒化微生物、又はネコ病原体由来の少なくとも１種の免疫原を発現する組換えベクターを含む、請求項３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１月２１日出願の米国特許仮出願第６０／５７３８４９号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本出願、及び本出願に引用された各文献（「出願引用文献」）、並びにその本文又はそれらの出願の審査中、及びそのような審査中に提出された特許性を支持するすべての議論において、出願引用文献に参照又は引用された各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。種々の文献もこの本文に引用される（「出願引用文献」）。各出願引用文献、及び出願引用文献に引用又は参照された各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、改良された不活化及び安定化ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）免疫原性組成物に関する。本発明はまた、不活化及び安定化ＦＣＶを製造する方法、及びＦＣＶ免疫原性組成物の製造におけるそのような不活化及び安定化ＦＣＶの使用を提供する。本発明はさらに、本発明による免疫原性組成物を用いて、ネコ科の動物、好ましくはネコにおいて、免疫応答を誘発する方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、１９５７年（Fastier, L. B. (1957) Am. J. Vet. Res. 18: 382-389）に最初に記載された。ＦＣＶは、ネコ科の多数の動物に影響を及ぼし、臨床的に健常な家ネコの１５〜２０％までがＦＣＶを保有している（Coutts et al (1994) Vet. Rec. 135: 555-556; Ellis, T. M. (1981) Australian Vet. J. 57: 115-118; Harbour et al. (1991) Vet. Rec. 128: 77-80; Reubel et al. (1992) Feline Dentistry 22: 1347-1360）。カリシウイルスは、家ネコ及び野生のネコ科動物において、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、鼻気管炎ウイルス、又はクラミジア症などの、他の上気道感染と共に生じることが多い。ＦＣＶは水平伝播し、妊娠中に母ネコから子ネコに垂直伝播するという証拠はない（Johnson, R. P. (1984) Res. Vet. Sci. 31: 114-119）。ＦＣＶの伝播は、主として感染動物と健常動物との接触によって、又はくしゃみ時の気道によって起こる（Wardley R C. (1976) Arch. Virol 52: 243-249）。ＦＣＶは、いくつかの殺菌剤に対してかなり耐性であり、したがって直接接触がなくても広がり得る。
【０００５】
ＦＣＶは一般に、結膜炎、鼻炎、気管炎、及び肺炎によって、また口腔上皮の小胞形成／潰瘍形成によって特徴付けられる疾患を引き起こすことが知られている。他の症状には、熱、食欲不振、嗜眠、強直性歩行、並びに時として鼻漏、及び眼漏が含まれる。ＦＣＶは通例、咽喉、及び時として肺に影響を及ぼし、腸にも感染することがあり、糞便から単離されている。これらの呼吸器疾患では一般に、初期の高熱後、口腔潰瘍形成（口蓋、舌、唇、及び鼻）、鼻炎、結膜炎、さらに場合によって食欲不振、及び無力症が起こる。ＦＣＶは、肺炎、腸炎、及び関節痛（跛行症候群）を引き起こす恐れもある。罹患率は高い可能性があり、回復後に長期の保菌状態となる。ＦＣＶによって引き起こされる疾患症状の類型はＦＣＶ株によって決まり、一部の株はほとんど又はまったく疾患を生じないが、より毒性の強い他の株は、発熱、食欲不振、機能低下、又は肺炎を引き起こす。ある特定の株は、足並びに口内に潰瘍を生じ得る。
【０００６】
カリシウイルス科（Caliciviridae）のネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、ポリアデニル化され、約７．７キロベースのサイズである１本鎖プラスセンスＲＮＡゲノムを含む、非エンベロープウイルスである（Radford et al. (1997) Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 93-99）。ＦＣＶカプシドは、６６ｋＤａ（キロダルトン）の単一の大きなカプシドタンパク質、ｐ６６タンパク質からなる。カリシウイルスの分子生物学は、Clarke and Lambden (1997) J. Gen. Virol. 8: 291-301に概説されている。多くのＲＮＡウイルスと同様に、ＦＣＶのウイルス集団内には大きな不均質性が存在する。１９７０年代初頭から交差血清中和実験によって実証されている抗原変異によって、ＦＣＶはいくつかのウイルス株又は擬似種に分類することができる（Radford et al. (1997) Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 93-99）。いくつかのＦＣＶ株が同定、分離されており、具体的にはＦ９株（アクセッション番号ＶＲ−７８２でAmerican Type Culture Collection、ＡＴＣＣに寄託）、２２８０株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２０５７）、ＫＣＤ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５１）、ＣＦＩ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５４）、ＦＣＶ−ＬＬＫ株、及びＦＣＶ−Ｍ８株である。
【０００７】
ＦＣＶ感染から回復後の保菌状態が長く、またＦＣＶは殺菌剤耐性があるため、特に近接している動物群間、例えば動物保護施設、又は獣医クリニックにおいて、非常に感染性が強く、容易に蔓延する。したがって、有効なＦＣＶワクチンが依然として当分野で強く求められている。
【０００８】
ＦＣＶに対するワクチン接種は、弱毒化ＦＣＶ株、主として１９５８年にBittleによって米国で分離されたＦ９株（Bittle et al. (1960) Am. J. Vet. Res. 21: 547-550）、或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ継代によってＦ９から得られた株（「Ｆ９様株」）を用いて、１９７０年代末に導入された。
【０００９】
不活化ＦＣＶ株をベースとするワクチンも利用可能である。これらのワクチンは主として２５５株及び２２８０株を用いるが、これらの株はそれぞれ米国で１９７０年に肺炎を有するネコ（Kahn and Gillepsie (1970) Cornell Vet. 60: 669-683; Povey et al. (1980) J. Am. Vet. Med. Assoc. 177: 347-350）、及び１９８３年に跛行を罹患しているネコ（Pedersen et al. (1983) Fel. Prac. 13: 26-35; Pedersen N. C. and Hawkins K. F. (1995) Vet Microbiol. 47: 141-156）から分離された。
【００１０】
経時的な連続抗原変異のため、１９６０年代及び１９７０年代に分離されたワクチン株、例えばＦ９株、２５５株、又は２２８０株などに対して作製された抗血清は、１９９０年代に分離された株の分離体をわずかしか中和しない。例えば、抗Ｆ９血清は、１９８０〜８９年の分離株の５６％、１９５８〜７９年の分離株の８６％を中和できるのに対して、１９９０〜１９９６年の米国分離株では４３％を中和し、１９９０〜９６年の英国分離株では１０％のみ中和する（Lauritzen et al. (1997) Vet. Microbiol. 56: 55-63）。したがって、古いＦＣＶ株から得られた弱毒化及び不活化ワクチンは現在、近年分離されたＦＣＶ株に対してはもはや十分な防御を提供しない。
【００１１】
米国特許第６５３４０６６号は、ＦＣＶワクチンを製造するための、ＦＣＶの新しい株の使用を記載している。これらの株の中で、ＦＣＶ４３１株（アクセッション番号Ｉ−２１６６でＣＮＭＣに寄託）は、その抗血清が多数の異種野外分離株を中和することが示された分離株である。これは、その抗血清が非常に限定された数の近年の野外ＦＣＶ分離株を中和するＦ９及びＦＣＶ−２２５などの従来のワクチン株とは対照的である。
【００１２】
大多数の市販されているＦＣＶワクチンは弱毒化ワクチンである。わずか少数の不活化ワクチンが入手可能であり、そのすべてがアジュバントを含有する。Povey等（Povey et al. (1978) Feline Practice 8 (3): 35-42）は、子ネコに用いるホルマリン不活化アジュバント化ＦＣＶ調剤を記載している。
【００１３】
ワクチンを不活化するとき、不活化は通常、加熱処理の存在下又は不在下、ホルマリン又はホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミン、バイナリーエチレンイミンなどの薬剤で化学処理することによって行われる。米国特許第６５３４０６６号では、例えば、ＦＣＶはエチレンイミンで不活化され、水中油型エマルジョンでアジュバント化される。米国特許第６３５５２４６号は、ネコの尿から分離された弱毒化ＦＣＶワクチンを記載している。ＦＣＶの不活化は、ホルムアルデヒド又はバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）で処理することによって達成できる。特に、米国特許第６３５５２４６号は、ＦＣＶを不活化する方法を当業者に指示又は提供していない。
【００１４】
ＦＣＶに対して従来用いられている不活化ワクチンは、免疫応答を改善し、ネコ個体群に出現している異種ＦＣＶ株に対するより良好な防御を誘発するために、ワクチン又は免疫原性組成物にアジュバントを必要とするか、又はアジュバントを用いることが好ましい。しかし、アジュバントワクチンは、非アジュバントワクチンに比べて高率で局所有害反応を誘発し（Gobar et al. (2002) JAVMA 220 (10): 1477-1482）、それによって注射部位でのワクチン関連線維肉腫のリスクが増大する（Baker R. J. (1998) Feline Practice 26 (5): 18-20）。
【００１５】
現在、非アジュバントＦＣＶワクチンは、通常Ｆ９株を含有する改良生ワクチンである。ＦＣＶ  Ｆ９の残存毒性は、接種後カリシウイルス病のいくつかの研究によって実証されている（Dawson et al. (1993) Vet. Rec. 132: 346-350）。ＦＣＶ血清型が１つだけ存在するが、ＦＣＶ分離株間の高い抗原変異が観察されており、新しい野外分離株が恒常的に同定される（Lauritzen et al. (1997) Vet. Microbiol. 56: 55-63）。この高い抗原変異は、Ｆ９ワクチンをベースとする抗血清によるＦＣＶ中和の不成功率の上昇をもたらすことが多い。さらに、ＦＣＶ変性生菌株は、野外での新しい抗原変異株の出現に関与している（Radford et al. (1997) Vaccine 15 (12/13): 1451-1458）。したがって、これらの改良生ワクチンの安全性には問題がある。
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／５７３８４９号
【特許文献２】米国特許第６５３４０６６号
【特許文献３】米国特許第６３５５２４６号
【非特許文献１】Fastier, L. B. (1957) Am. J. Vet. Res. 18: 382-389
【非特許文献２】Coutts et al (1994) Vet. Rec. 135: 555-556
【非特許文献３】Ellis, T. M. (1981) Australian Vet. J. 57: 115-118
【非特許文献４】Harbour et al. (1991) Vet. Rec. 128: 77-80
【非特許文献５】Reubel et al. (1992) Feline Dentistry 22: 1347-1360
【非特許文献６】Johnson, R. P. (1984) Res. Vet. Sci. 31: 114-119
【非特許文献７】Wardley R C. (1976) Arch. Virol 52: 243-249
【非特許文献８】Radford et al. (1997) Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 93-99
【非特許文献９】Clarke and Lambden (1997) J. Gen. Virol. 8: 291-301
【非特許文献１０】Bittle et al. (1960) Am. J. Vet. Res. 21: 547-550
【非特許文献１１】Kahn and Gillepsie (1970) Cornell Vet. 60: 669-683
【非特許文献１２】Povey et al. (1980) J. Am. Vet. Med. Assoc. 177: 347-350
【非特許文献１３】Pedersen et al. (1983) Fel. Prac. 13: 26-35
【非特許文献１４】Pedersen N. C. and Hawkins K. F. (1995) Vet Microbiol. 47: 141-156
【非特許文献１５】Lauritzen et al. (1997) Vet. Microbiol. 56: 55-63
【非特許文献１６】Povey et al. (1978) Feline Practice 8 (3): 35-42
【非特許文献１７】Gobar et al. (2002) JAVMA 220 (10): 1477-1482
【非特許文献１８】Baker R. J. (1998) Feline Practice 26 (5): 18-20
【非特許文献１９】Dawson et al. (1993) Vet. Rec. 132: 346-350
【非特許文献２０】Radford et al. (1997) Vaccine 15 (12/13): 1451-1458
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、異種ＦＣＶ株に対する強い免疫応答を誘発することができ、安全性が改善された有効な不活化非アジュバントＦＣＶワクチン又は免疫原性組成物が当分野で依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
以前の不活化ＦＣＶワクチン又は免疫原性組成物は通常、ＦＣＶビリオンとウイルスカプシドの分解によって生じるタンパク質画分との混合物を含む。本発明者等は、非アジュバントワクチン又は免疫原性組成物では、ウイルスカプシドの分解を制限し、できる限り無傷ビリオンを保持することが不可欠であることを見出した。
【００１８】
驚いたことに、ウイルスを不活化する不活化剤による処理、及びビリオンを安定化することのできるホルムアルデヒドによる処理にＦＣＶを供することによって、アジュバントの不在下であっても、良好な有効性を有する不活化ＦＣＶ組成物が得られることが見出された。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ホルムアルデヒドが存在するとウイルスカプシドが安定化されると考えられる。ウイルスカプシドの安定性の増大は、長期貯蔵中及び動物への投与前のＦＣＶワクチン又は免疫原性組成物の安定性の上昇をもたらす。同様にウイルスカプシドを安定化するように作用する他の化合物を、ホルムアルデヒドの代わりに用いることができる。
【００１９】
本発明の第１の態様は、１種又は複数の不活化剤によって不活化され、アルデヒド化合物によって安定化されたネコカリシウイルス（ＦＣＶ）を含む、ＦＣＶに対する不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物であって、前記アルデヒド化合物は、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル鎖を含み、前記免疫原性組成物は、許容されるビヒクル又は賦形剤と混合されている不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物を提供する。
【００２０】
好ましくは、賦形剤又はビヒクルは、獣医学的に許容される。他の実施形態において、免疫原性組成物は凍結乾燥されており、凍結乾燥賦形剤又はビヒクルと混合されている。
【００２１】
好ましい不活化剤は、エチレンイミン、アセチルエチレンイミン、プロピレンイミン、及びβ−プロピオラクトンからなる群から選択することができる。好ましくは、不活化剤は、エチレンイミンである。
【００２２】
不活化剤としてエチレンイミンが用いられるとき、エチレンイミンは、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭ存在する。
【００２３】
アルデヒド化合物が直鎖Ｃ１アルキル鎖を含むとき、アルデヒド化合物は、１つのアルデヒド基を含む。アルデヒド化合物が直鎖Ｃ２〜Ｃ５アルキル鎖を含むとき、アルデヒド化合物は、２つのアルデヒド基を含む。他の実施形態において、２つのアルデヒド基の１つは、ケトン又はエポキシ基と置換できる。アルデヒド化合物は、ホルムアルデヒド、グリシドアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、又はメチルグリオキサールからなる群から選択することができる。アルデヒド化合物がホルムアルデヒドであるとき、ホルムアルデヒドは、約０．０５ｇ／ｌ〜約０．８ｇ／ｌ存在する。好ましくは、ホルムアルデヒドは、約０．１ｇ／ｌ〜約０．５ｇ／ｌ存在する。
【００２４】
さらなる一実施形態は、チオール基を含む中和化合物をさらに含む（例えば、チオスルフェート及びシステイン）。本発明はまた、少なくとも１種のＦＣＶ株を含み、そのＦＣＶ株の少なくとも１種又はそのすべては、不活化及び安定化されている。ＦＣＶ株は、ＦＣＶ  Ｆ９、ＦＣＶ２５５、ＦＣＶ２２８０、ＦＣＶ４３１、ＦＣＶ  Ｇ１、ＦＣＶ  ＬＬＫ、ＦＣＶ  ＫＣＤ、ＦＣＶ  ＣＦＩ、ＦＣＶ  Ｍ８、及びＦＣＶ  ＵＳ１００８６９（ＡＴＣＣアクセッション番号ＦＣＶ  ＰＴＡ  ５９３０）からなる群から選択することができる。
【００２５】
他の実施形態において、本発明の免疫原性組成物は、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス、及びクラミジアからなる群から選択することのできる、ネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原をさらに含む。好ましくは、ネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原は、生弱毒化微生物、又はネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原を発現する組換えベクターを含む。
【００２６】
本発明の第２の態様は、ＦＣＶを不活化及び安定化する方法であって、ＦＣＶを不活化剤及びアルデヒド化合物と反応させるステップ及び不活化及び安定化ＦＣＶを回収するステップを含み、前記アルデヒド化合物は、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル鎖を含む方法を提供する。好ましい一実施形態は、サイズ排除クロマトグラフィ、超遠心分離、及び選択的沈殿によって、不活化及び安定化ＦＣＶを回収する。
【００２７】
本発明の他の態様において、長期貯蔵用の、ＦＣＶに対する不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物を製造する方法が提供され、この方法は、ＦＣＶに対する免疫応答を誘発するのに十分な量の本発明の不活化及び安定化ＦＣＶと、凍結乾燥賦形剤とを混合し、組成物を凍結することを含む。
【００２８】
さらに他の態様は、ＦＣＶに対する不活化安定化非アジュバント免疫組成物を製造する方法であって、ＦＣＶに対する免疫応答を誘発するのに十分な量の本発明の不活化及び安定化ＦＣＶと、獣医学的に許容される賦形剤又はビヒクルを混合することを含む方法を提供する。
【００２９】
本発明ではまた、ネコ科動物においてＦＣＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、前記ネコ科動物に本発明の不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物を投与し、それによってそのネコ科動物において免疫応答を誘発することを含む方法が提供される。
【００３０】
さらなる一態様は、ネコ科動物において、ＦＣＶ、及びネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原に対する免疫応答を誘発する方法であって、そのネコ科動物に本発明の不活化安定化非アジュバント免疫原性組成物、及び他のネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原を投与し、それによってそのネコ科動物において免疫応答を誘発することを含む方法を提供する。
【００３１】
これらの実施形態、及び他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示されるか、或いは以下の詳細な説明から明白であり、それらに包含される。
【００３２】
以下の詳細な説明は、例として記載され、記載した特定の実施形態に本発明を限定するものではないが、添付の図と併せ読めば理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
本開示、特に特許請求の範囲において、「含む（comprises）」、「含まれる（comprised）」、「含んでいる（comprising）」などの用語は、米国特許法においてそれぞれに付与されている意味を有することができ、例えば「含む（includes）」、「含まれる（included）」、「含んでいる（including）」などを意味することができ、「から本質的になっている（consisting essentially of）」及び「から本質的になる（consists essentially of）」などの用語は、米国特許法においてそれぞれに付与されている意味を有し、例えば明示されていない成分を許容するが、従来技術に見出されるか、或いは本発明の基本的又は新規な特徴に影響を及ぼす成分は除外する。
【００３４】
「免疫原性組成物」という用語は、本発明の条件下で標的種に投与されると、ＦＣＶに対する免疫応答を誘発することのできる任意の組成物を包含する。「ワクチン」という用語は、有効な防御を誘発することのできる組成物を意味する。標的種は、ネコ科動物、好ましくはネコである。
【００３５】
本発明は、不活化剤及び安定化アルデヒド化合物に供せられたＦＣＶを含む、不活化安定化非アジュバントＦＣＶ免疫原性組成物又はワクチンに関する。好ましい安定化化合物群は、鎖がＣ１であるとき、１つのアルデヒド基を含み、鎖がＣ２〜Ｃ５であるとき、２つの末端アルデヒド基を含み、鎖がＣ２〜Ｃ５鎖であるとき、場合によってアルデヒド基の１つは、ケトン又はエポキシ基で置換されていてもよい、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル鎖の形であるアルデヒドであり、免疫原性組成物又はワクチンは、凍結乾燥賦形剤又はビヒクルと混合され、凍結乾燥されているか、或いは獣医学的に許容される賦形剤又はビヒクルと混合されている。
【００３６】
「不活化剤」は、不可逆反応、これに限定されるものではないが、主としてウイルス核酸との反応によってウイルスの増殖を遮断することのできる薬剤であり、ウイルスの免疫原性に実質的に影響を及ぼさない。不活化剤の好ましい例は、エチレンイミン、及びアミド誘導体（例えば、アセチルエチレンイミン）、プロピレンイミン、β−プロピオラクトンである。好ましい一実施形態において、不活化剤は、エチレンイミンである。
【００３７】
好ましい一実施形態において、ＦＣＶはエチレンイミンで不活化される。エチレンイミンの最終濃度は、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、好ましくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭとすることができる。温度は、約２℃〜約４０℃、好ましくは約５℃〜約３０℃とすることができる。
【００３８】
好ましい安定化アルデヒド化合物は、アミノ基（例えば、リシン、アルギニン、又はヒスチジンアミノ酸のアミノ基）、及びタンパク質のヒドロキシル基（例えば、チロシンアミノ酸のヒドロキシル基）と反応し、２つのタンパク質間及び／又はタンパク質内に結合を形成することができる。安定化アルデヒド化合物は、好ましくはホルムアルデヒド（又はメタナール）、グリシドアルデヒド（又は２，３−エポキシ−１−プロパナール）、グルタルアルデヒド（又は１，５−ジアール−ペンタン）、グリオキサール（又は１，２−ジアール−エタン）、メチルグリオキサール（又はピルブアルデヒド）からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、安定化アルデヒド化合物は、ホルムアルデヒドである。
【００３９】
安定化アルデヒドとしてホルムアルデヒドが用いられるとき、最終濃度は、約０．０５ｇ／ｌ〜約０．８ｇ／ｌ、好ましくは約０．０７５ｇ／ｌ〜約０．６ｇ／ｌ、より好ましくは約０．１ｇ／ｌ〜約０．５ｇ／ｌとすることができる。温度は、約２℃〜約３７℃、好ましくは約２℃〜約２２℃、より好ましくは約４℃〜約７℃とすることができる。
【００４０】
安定化条件（温度、安定化アルデヒド化合物の濃度、及び時間）を調整するために、ＦＣＶビリオンの定量を行うことができる。ビリオンを定量する任意の適切な技法を用いることができ、例えば、ＦＣＶカプシドタンパク質に特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を用いる酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡによる定量前に、ビリオンは、当業者に知られている技法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、ショ糖勾配超遠心、塩化セシウム勾配超遠心、及び選択的沈殿、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって処理ウイルス培養から分離することができる。
【００４１】
免疫原性組成物又はワクチンに用いられるＦＣＶ懸濁液は、好ましくは不活化前、用量当たり約１０８．５〜約１０１１のＣＣＩＤ５０、より好ましくは不活化前、用量当たり約１０９〜約１０１０のＣＣＩＤ５０を含有する。不活化及び／又は安定化完了後、不活化剤及び／又は安定化アルデヒド化合物は、当業者に知られている中和法によって、例えば、チオール基を含む中和化合物（例えば、チオスルフェート、システイン）を添加することによって、懸濁液から除去することができる。
【００４２】
不活化剤及び／又は安定化アルデヒド化合物の除去、或いは懸濁液からの不活化及び安定化ＦＣＶの回収は、当業者に知られている技法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、ショ糖勾配超遠心、塩化セシウム勾配超遠心、選択的沈殿、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって達成できる。
【００４３】
ウイルス不活化及び安定化後、懸濁液からのビリオンの回収は、不活化剤及び／又は安定化アルデヒドを除去する処理ステップにおいて付随して達成することができる。別の実施形態において、不活化及び安定化ビリオンの回収は、不活化剤及び／又はアルデヒド化合物を除去するステップに付随しない個別のステップで達成することができる。このビリオン回収ステップは、当業者に知られている技法、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、ショ糖勾配超遠心、塩化セシウム勾配超遠心、選択的沈殿、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって達成することができる。
【００４４】
本発明による免疫原性組成物及びワクチンは、不活化及び安定化されている少なくとも２種のＦＣＶ株の組合せ、又は少なくとも１種のＦＣＶ株が不活化及び安定化されている少なくとも２種のＦＣＶ株の組合せを含むことができる。
【００４５】
好ましくは、１種又は複数のＦＣＶ株は、近年野外から分離された株から選択される。好ましい株には、４３１株（アクセッション番号Ｉ−２１６６でＣＮＣＭに寄託。又はアクセッション番号Ｉ−２２８２でＣＮＣＭに寄託されているハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体４４と反応する任意の株。米国特許第６５３４０６６号を参照のこと）、ＦＣＶ  Ｇ１（アクセッション番号Ｉ−２１６７でＣＮＣＭに寄託）（ＣＮＣＭ＝Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Pasteur Institute, Paris, France）、ＦＣＶ  ＵＳ１００８６９（ＦＣＶ  ＰＴＡ  ５９３０とも称される。２００４年４月２２日にＡＴＣＣに寄託）（ＡＴＣＣ＝American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA）、より一般的には文献に記載されている強毒性の新しい任意の株（Pedersen et al. (2000) Vet. Microbiol. 73: 281-300; Schorr-Evans et al. (2003) JFMS 5: 217-226; Hurley et al. (2003) Vet. Clin. Small Anim. 33: 759-772）が含まれる。好ましい一実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、不活化及び安定化ＦＣＶ４３１（又はモノクローナル抗体４４と反応する任意の株）、並びに不活化及び安定化ＦＣＶ  Ｇ１を含む。他の好ましい実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、不活化及び安定化ＦＣＶ  ＵＳ１００８６９（ＡＴＣＣアクセッション番号ＦＣＶ  ＰＴＡ  ５９３０）を含む。本発明に用いることができる、又は本発明に加えて用いることができるＦＣＶの他の株には、これに限定されるものではないが、ＦＣＶ  Ｆ９、ＦＣＶ２５５、ＦＣＶ２２８０、ＦＣＶ  ＬＬＫ、ＦＣＶ  ＫＣＤ、ＦＣＶ  ＣＦＩ、及びＦＣＶ  Ｍ８が含まれる。
【００４６】
不活化及び安定化ＦＣＶ免疫原性組成物及びワクチンは、１種又は複数の他のネコ疾患に用いられる１種又は複数の生弱毒化又は不活化ワクチン又は免疫原性組成物と容易に組み合わせることができる。したがって、本発明の他の目的は、少なくとも１種の安定化及び不活化ＦＣＶ、並びに宿主において少なくとも１種の他のネコ病原体に対する免疫応答を誘発するための少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原性成分を含む非アジュバント複合免疫原性組成物又はワクチンであり、前記非ＦＣＶ免疫原性成分は、他のネコ病原体由来の免疫原、又はこの免疫原を発現する組換えベクターとすることができ、非アジュバント複合免疫原性組成物又はワクチンは、凍結乾燥賦形剤又はビヒクルと混合され凍結乾燥されているか、或いは獣医学的に許容されるビヒクル又は賦形剤と混合されている。凍結乾燥形態が好ましい。
【００４７】
好ましい一実施形態において、非アジュバント複合免疫原性組成物又はワクチンは、生弱毒化微生物の形態であるか、又はネコ病原体由来の少なくとも１種の免疫原を発現する組換えベクターの形態である、非ＦＣＶ免疫原性成分を含む。組換えベクターは、プラスミド又はウイルスベクターとすることができ、例えば、ベクターは、ポックスウイルス、アデノウイルス、又はヘルペスウイルスとすることができる。凍結乾燥形態が好ましい。
【００４８】
付加的な非ＦＣＶネコ病原体は、好ましくはネコ鼻気管炎、又はネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス、又はネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス、及びクラミジア（例えば、クラミドフィラフェリス（Chlamydophila felis）を含む群から選択される。
【００４９】
好ましくは、複合免疫原性組成物又はワクチンは、以下のような非ＦＣＶ免疫原性成分に加えて、少なくとも１種のＦＣＶ免疫成分を組み合わせる。
−  ＦＨＶ、ＦＰＶ、ＦｅＬＶ、及びクラミジア
−  ＦＨＶ、ＦＰＶ、及びＦｅＬＶ
−  ＦＨＶ、ＦＰＶ、及び狂犬病
−  ＦＨＶ、ＦＰＶ、及びクラミジア
−  ＦＨＶ、ＦＰＶ、クラミジア、及び狂犬病
−  ＦＨＶ、及びＦＰＶ
−  ＦＨＶ、及びクラミジア
−  ＦＨＶ
【００５０】
これらの種々の組合せの好ましい実施形態において、弱毒化生微生物は、ＦＨＶ、ＦＰＶ、及びクラミジアに関して用いられ、ＦｅＬＶを発現する１種又は複数の組換えベクターは、ＦｅＬＶに関して用いられる。組換えベクターは、ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ  ＦｅＬＶ遺伝子を発現するカナリア痘ウイルス（例えば、米国特許第５７５３１０３号に記載のｖＣＰ９７）とすることができる。狂犬病の場合、組換えベクターを用いることができ、特にＧ糖タンパク質狂犬病遺伝子を発現するカナリア痘ウイルス（例えば、米国特許第５８４３４５６号に記載のｖＣＰ６５）である。
【００５１】
本発明の他の目的は、ＦＣＶを不活化及び安定化する方法であって、ＦＣＶを、不活化剤、及び鎖がＣ１であるとき、１つのアルデヒド基を含み、鎖がＣ２〜Ｃ５であるとき、２つの末端アルデヒド基を含み、鎖がＣ２〜Ｃ５鎖であるとき、場合によってアルデヒド基の１つは、ケトン又はエポキシ基で置換されていてもよい、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキル鎖の形である安定化アルデヒド化合物と反応させることを含む方法である。不活化剤及び安定化アルデヒド化合物、並びにそれらの使用条件に関する好ましい実施形態は、上述のとおりである。
【００５２】
本発明の方法は、適切な宿主細胞でのＦＣＶの培養、不活化剤及び安定化アルデヒド化合物による処理を含む。ＦＣＶウイルスの培養及び増殖は、好ましくはネコの細胞、特にCrandell-Reese Feline Kidney、ＣＲＦＫ細胞（番号ＣＣＬ−９４でAmerican Type Culture Collectionから入手可能）において、細胞当たり２〜０．０１の５０％細胞培養感染量（ＣＣＩＤ５０）、好ましくは０．５ＣＣＩＤ５０／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で行われる。
【００５３】
安定化アルデヒド化合物の添加は、不活化ステップ前、ステップ中、ステップ後に行うことができる。不活化剤及び／又は安定化アルデヒド化合物の中和は、上述のとおり行うことができる。
【００５４】
安定化不活化ＦＣＶビリオンは、通常の濃縮技法、例えば、限外濾過、次いで場合によって通常の精製手段、例えば、サイズ排除クロマトグラフィ、ショ糖勾配超遠心、塩化セシウム勾配超遠心、又は選択的沈殿、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）存在下での選択的沈殿による精製によって、懸濁液から濃縮及び／又は回収することができる。
【００５５】
一実施形態において、免疫原性組成物及びワクチンは、凍結乾燥安定化及び不活化ＦＣＶ、並びに凍結乾燥賦形剤及びビヒクルを含み、凍結乾燥賦形剤及びビヒクルは、アミノ酸、例えば、グルタミン酸、又は炭水化物、例えば、乳糖、及びそれらの混合物、例えば、ＳＰＧＡ（ショ糖／ホスフェート／グルタメート／アルブミン、欧州特許出願第０４９６１３５号も参照のこと）を含むことができる。不活化及び安定化ＦＣＶは、約５℃で長期貯蔵することができ、或いは当業者に知られている技法によって凍結又は凍結乾燥（freeze-dried又はlyophilized）することができる。
【００５６】
したがって、本発明の免疫原性ＦＣＶ組成物を製造するために、免疫原性組成物を製造するのに十分な量でウイルス懸濁液を製造するのに十分な力価に、適切なネコ細胞系、即ちＣＲＦＫでの細胞培養でＦＣＶを増殖させる。ＦＣＶは当分野でよく知られている方法によって採取する。次いで、カリシウイルスを濃縮、凍結し、−７０℃で貯蔵するか、又は凍結乾燥し、４℃で貯蔵する。
【００５７】
本発明の他の目的は、免疫原性組成物又はワクチンを製造する方法であって、免疫応答を誘発するのに十分な量で不活化及び安定化ＦＣＶを提供すること、並びに前記ＦＣＶを凍結乾燥する（場合によって、凍結乾燥安定剤を添加する）か、或いは前記ＦＣＶを獣医学的に許容される賦形剤又はビヒクルと混合することによって液体形態とすることを含む方法である。適切な賦形剤は、例えば、水、等張溶液、生理食塩水、例えばこれに限定されるものではないが、ＮａＣｌ、及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、乳糖、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組合せである。所望であれば、ワクチンはさらに、少量の補助剤、例えばこれに限定されるものではないが、湿潤剤又は乳化剤、及びｐＨ緩衝剤などを含有してもよい。
【００５８】
本発明による免疫原性組成物及びワクチンは、１種又は複数のアジュバントを含むことができるが、必要ではない。好ましくは、本発明の組成物は、アジュバントの不在下でも免疫原性である不活化及び安定化ＦＣＶを含む。しかしながら、所望であれば、許容されるアジュバントを本発明の組成物に混入することができる。許容されるアジュバントは、水溶性アジュバントである。そのような許容されるアジュバントは、アクリル酸又はメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸及びアルケニル誘導体のポリマー、免疫刺激配列（ＩＳＳ）、特に１つ又は複数の非メチル化ＣｐＧモチーフを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman D. M. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2879-2883; WO-A1-98/16247）、水中油型エマルジョン、特に「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」M. Powell, M. Newman編、Plenum Press 1995の147頁に記載のＳＰＴエマルジョン、及び同文献の183頁に記載のＭＦ５９エマルジョン、第四級アンモニウム塩を含有するカチオン脂質、サイトカイン、或いはそれらの組合せ又は混合物とすることができる。
【００５９】
本発明の他の目的は、新生児、子ネコ、雄、雌、及び妊娠中の雌を含むネコ科の動物、好ましくはネコに、ＦＣＶ疾患に対する免疫を付与する方法であり、この方法は、本発明による非アジュバント不活化及び安定化ＦＣＶ免疫原性組成物又はワクチンを投与することを含む。
【００６０】
本発明のさらなる目的は、新生児、子ネコ、雄、雌、及び妊娠中の雌を含むネコ科の動物、好ましくはネコに、ＦＣＶ疾患を含む少なくとも２種のネコ疾患に対する免疫を付与する方法であり、この方法は、本発明による不活化及び安定化ＦＣＶ、及び他のネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原、又は他のネコ病原体由来の少なくとも１種の非ＦＣＶ免疫原を発現する組換えベクターを含む非アジュバント複合ワクチンを投与することを含む。
【００６１】
種々の経路で本発明による免疫原性組成物又はワクチンの投与を行うことができる。これらの経路には、これに限定されるものではないが、非経口経路、口鼻、筋内、皮内、皮下、及び粘膜（例えば、口腔）が含まれる。好ましい投与経路には、皮下又は筋内注射経路が含まれる。ワクチン又は免疫原性組成物は、これに限定されるものではないが、注射器、無針注射器具を含む任意の手段によって投与できる。無針注射器は、経皮送達（皮内及び皮下送達、場合によって筋内送達）に用いることができる。無針注射装置を用いるとき、投与量は、ＦＣＶ免疫原性組成物の送達に必要な量によって決定され、０．１ｍｌ〜１ｍｌとすることができる。
【００６２】
注射器を用いるとき、ワクチン及び免疫原性組成物の投与量は、一般に０．２〜２．０ｍｌ、好ましくは約１．０ｍｌである。ネコは、約６週齢からワクチン接種することができる。例えば３〜５週の間隔で、２回以上の投与を行うことができる。好ましくは、例えば年に１回、ブースター投与を行うことができる。或いは、ネコは、１回のみの注射で感作され得る。
【００６３】
以下の非限定的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
[実施例]
【実施例１】
【００６４】
ホルムアルデヒドによるＦＣＶの不活化
ＣＲＦＫ細胞（Crandell-Reese Feline Kidney細胞、ＣＣＬ−９４でAmerican Type Culture Collectionから入手可能）を、２．５％ラクトアルブミン加水分解物、及び５％ウシ胎児血清を添加した改変イーグル培地（ＭＥＭ、Gibco BRL社製）を用いて、２リットルのローラーフラスコ中（８５０ｃｍ２）、３７℃で培養した。１ｍｌ当たり約１００，０００の細胞を含有するＭＥＭ培地中の細胞懸濁液３００ｍｌを各ローラーフラスコに添加した。３日後、細胞層はコンフルエントになった。次いで、細胞培地を無血清ＭＥＭに代え、ＦＣＶウイルス４３１株を０．５ＣＣＩＤ５０／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で添加した。全細胞層に細胞変性効果が得られるまで、ウイルス培養を３７℃で２４〜４８時間持続した。ウイルス懸濁液を採取し、その後、１．５μｍの孔を有するフィルタで清澄し、５℃で貯蔵した。採取時のＦＣＶウイルス力価は、８．５±０．３ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌであった。
【００６５】
このウイルス懸濁液を、２２℃で１８時間、８ｍＭの濃度でエチレンイミンを用いて不活化した。エチレンイミンは、３６ｇの水酸化ナトリウムペレットを２５７．５ｍｌの蒸留水に溶解し、エチレンイミンの１．２Ｍ溶液にほぼ相当する８７．５ｇのブロモエチルアミン（ＢＥＡ）を添加することによって調製した。不活化終了時に、不活化ウイルス懸濁液の一部を、５℃（±３℃）で２４時間、最終濃度０．５ｇ／ｌでホルムアルデヒドを添加することによって安定化した。不活化ウイルス懸濁液の一部は、コントロール懸濁液として、未安定化のままとした。
【００６６】
不活化及び安定化ウイルス懸濁液の一部、並びにコントロール懸濁液の一部を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下、選択的沈殿に供した。ＰＥＧ６０００を濃度６％で懸濁液に添加し、５℃（±３℃）で３時間攪拌した。次いで、懸濁液を、約１３３０ｇで９０分間遠心分離した。可溶性ｐ６６タンパク質を含有する上清と、ビリオンを含有する沈殿物とを分離し、回収した。沈殿物を、カルシウム及びマグネシウムを含まない滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。
【００６７】
不活化ステップ終了から２〜３日後、不活化及び安定化ウイルス懸濁液、コントロール懸濁液、上清、並びに溶液中沈殿物において、ＦＣＶ  ｐ６６タンパク質をＥＬＩＳＡ滴定によって定量した。滴定プレートを抗ＦＣＶポリクローナル抗体でコーティングし、異なる希釈の不活化及び安定化ウイルス懸濁液、コントロール懸濁液、上清、並びに溶液中沈殿物を添加して、ＥＬＩＳＡ滴定を行った。滴定プレートを３７℃で３時間保持し、その後、洗浄バッファで滴定プレートを洗浄し、続いて、ペルオキシダーゼと結合したＦＣＶ  ｐ６６カプシドタンパク質に特異的なモノクローナル抗体を添加した。滴定プレートをさらに３７℃で１時間インキュベートし、その後、プレートを洗浄バッファで洗浄した。洗浄したプレートに、ウェル当たり１００μｌのＴＭＢ溶液（５，５’−テトラメチルベンジジン）を２０℃で添加し、２０℃で３０分間暗所に保った。ウェル当たり５０μｌの２Ｍ硫酸を添加して、発色を阻害した。ＥＬＩＳＡ力価は、光学的に測定し、ｌｏｇ１０ＯＤ５０（５０％光学密度）として表したが、これは常用対数に相当し、最大光学密度の５０％を示す。ＥＬＩＳＡ滴定の標準偏差は０．０７である。
【００６８】
2007522127.tif 000003
【００６９】
これらの結果から、安定化していない不活化後ＦＣＶビリオンの分解、及びホルムアルデヒドの安定化効果が実証される。
【実施例２】
【００７０】
種々の条件下でのＦＣＶに対するホルムアルデヒドの安定化効果
ＦＣＶ４３１株を、本質的に実施例１に記載のとおり培養した。
【００７１】
３つの不活化方法を試験した。
１）２０℃で２４時間、濃度約４ｍＭのエチレンイミン
２）２０℃で２４時間、濃度約８ｍＭのエチレンイミン
３）５℃で２４時間、濃度約８ｍＭのエチレンイミン
【００７２】
ウイルス懸濁液を、５℃（±３℃）で５日間、０．１ｇ／ｌ〜０．５ｇ／ｌの様々な最終濃度のホルムアルデヒドで安定化した。コントロール懸濁液はホルムアルデヒドを含まなかった。
【００７３】
ＦＣＶ  ｐ６６タンパク質を、選択的ＰＥＧ沈殿の前後に、ＥＬＩＳＡ滴定によって実施例１に記載のとおり定量した。ＥＬＩＳＡ力価は、ｌｏｇ１０ＯＤ５０で表す。
【００７４】
2007522127.tif 000004
【００７５】
これらの結果から、様々な不活化条件に関して、０．１ｇ／ｌ及び０．５ｇ／ｌホルムアルデヒド溶液の安定化効果が実証される。
【実施例３】
【００７６】
不活化ＦＣＶビリオンの免疫原性
ＦＣＶ４３１株を、本質的に実施例１に記載のとおり、培養、不活化、及び安定化した。このウイルス懸濁液を、それぞれビリオン（ウイルスｐ６６分画とも称する）、及び可溶性ｐ６６タンパク質（可溶性ｐ６６分画とも称する）を含む２つの分画に、サイズ排除クロマトグラフィによって分離した。分離後、２つの分画を５℃で貯蔵した。
【００７７】
希釈するか又は希釈せず（１／１、１／４、１／１６）、１ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、カルシウム及びマグネシウムを含まない）で製剤化した１ｍｌのウイルスｐ６６分画；希釈するか又は希釈せず（１／１、１／４、１／１６）、１ｍｌの水中油型エマルジョン（パラフィン油、脂肪アルコールエーテル及びポリオール、ポリオキシエチレン脂肪酸）で製剤化した１ｍｌのウイルスｐ６６分画；希釈するか又は希釈せず（１／１、１／４、１／１６）、ＰＢＳで製剤化した１ｍｌの可溶性ｐ６６分画；希釈するか又は希釈せず（１／１、１／４、１／１６）、水中油型エマルジョンで製剤化した１ｍｌの可溶性ｐ６６分画を含有する、合わせて１２種のワクチンを調製した。
【００７８】
希釈していないワクチンは、１０ｍｌの未精製ウイルス培養にほぼ相当する量のタンパク質を含有する。ウイルスｐ６６分画及び可溶性ｐ６６分画は、カルシウム及びマグネシウムを含まないＰＢＳを添加して希釈した。
【００７９】
それぞれ約８〜９週齢である２４匹の特定病原体を有していない（ＳＰＦ）子ネコを、ランダムに１２の群に分け、それらのワクチン２ｍｌを２８日間隔で２回、皮下投与した。ｐ６６タンパク質の注射量に関する影響は観察されなかった。以下の結果は、第４６日にＦＣＶ４３１毒性株で口鼻経路によってチャレンジしたすべてのネコを反映している（各鼻孔０．２５ｍｌ、及び経口で０．５ｍｌ、１０５．５ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）
【００８０】
チャレンジ後２週間、臨床的徴候を観察した。臨床スコアの算出に用いた評点は以下のとおりである。
【００８１】
2007522127.tif 000005
【００８２】
総臨床スコアは、チャレンジ後２週間に、あるネコで観察されたすべての臨床徴候を加算したものである。ワクチンの種類ごとの平均総臨床スコアを以下の表及び図１に示す。
【００８３】
2007522127.tif 000006
【００８４】
最大臨床スコアは、チャレンジ後２週間に、あるネコの観察結果から得られたもっとも高い臨床スコアである。ワクチンの種類ごとの平均最大臨床スコアを以下の表及び図２に示す。
【００８５】
2007522127.tif 000007
【００８６】
ウイルスｐ６６分画／ＰＢＳ群と可溶性ｐ６６分画／ＰＢＳ群とから得られた平均最大臨床スコア間には有意差があった（ｐ値、ｐ＝０．０４９５）。
【００８７】
これらの結果から、不活化ビリオンがアジュバント不在下で免疫原性を維持していることが実証される。これに反して、可溶性ｐ６６タンパク質は、アジュバントの存在下でのみ、良好な免疫応答を誘発する。
【実施例４】
【００８８】
不活化ＦＣＶによるネコのワクチン接種
ＦＣＶ４３１を、本質的に実施例１に記載のとおり、培養し、エチレンイミンで不活化し、ホルムアルデヒドの作用によって安定化した。ＦＣＶ  Ｇ１株にも同じ手順を適用した。
【００８９】
複合ワクチン（ワクチンＡ）は、弱毒化ネコ鼻気管炎ウイルス（ＦＨＶ−１）用量当たり５．６０ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０、弱毒化ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）用量当たり４．１７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０、ｅｎｖ及びｇａｇ／ｐｏｌ  ＦｅＬＶ遺伝子を発現するカナリア痘ｖＣＰ９７組換えベクター用量当たり８．２９ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０（ＵＳ−Ａ−５７５３１０３号を参照）、弱毒化クラミジア用量当たり４．８ｌｏｇ１０ＥＬＤ５０、不活化及び安定化ＦＣＶ４３１用量当たり８．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０（不活化前ＦＣＶの等力価）、不活化及び安定化ＦＣＶ  Ｇ１用量当たり８．７ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０（不活化前ＦＣＶの等力価）、及び生理水（physiological water）を含んだ。
【００９０】
８から９週齢の１８匹の特定病原体を有していない子ネコを、ランダムに３つの群に分けた（１群子ネコ６匹）。Ａ群の子ネコは、１用量のワクチンＡでワクチン接種した。Ｂ群の子ネコは、凍結乾燥形態の変性生ＦＣＶ  Ｆ９株、変性生ＦＨＶ−１、及び変性生ＦＰＶを含有する市販のワクチンと、凍結乾燥市販ワクチンの希釈剤として作用する、不活化ＦｅＬＶ及びＣａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）アジュバントを含有する市販のワクチンとの混合物でワクチン接種した。Ｃ群の子ネコは、コントロールとしてワクチン接種しなかった。ワクチンは、２８日間隔で２回、皮下経路で投与した。最終ワクチン接種の４週後、すべてのネコをＦＣＶ２５５毒性異種株で口鼻経路によってチャレンジした（Scott FW, Am. J. Vet. Res. 1977, 38(2), 229-34）（各鼻孔０．２５ｍｌ、及び経口で０．５ｍｌ、１０８．２ＣＣＩＤ５０／ｍｌ）
【００９１】
抗ＦＣＶ２５５中和抗体、動物体重、直腸温度、全身状態、全身症状及び局所症状、並びにウイルス排出を、チャレンジ後２週間観察した。カリシウイルス抗体価（ｌｏｇ１０として表す）を以下の表及び図３に示す。
【００９２】
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【００９３】
第０日には、抗体価はすべての群で陰性であった。
【００９４】
１回目のワクチン注射後、ワクチンを接種されたネコはいずれもＢ群を除いてセロコンバージョンしなかった。２回目の注射後、すべてのネコが中和抗体価を有した。チャレンジ時（５６日）の平均抗体価は、ワクチン接種群間で相違はなかったが（Ｔｕｋｅｙ検定）、コントロール群に比べて有意に高かった（分散分析、ｐ＝０．０００２）。
【００９５】
全スコアの算出に用いた評点は以下のとおりである。
【００９６】
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＊全般的な身体状況、口鼻の潰瘍、鼻漏、及び眼漏を加算したものが、図４に示す臨床症状のスコアである。
【００９７】
臨床スコアの結果を以下の表及び図４に示す。
【００９８】
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【００９９】
コントロールのネコは、１匹を除いてすべて、典型的なＦＣＶ感染臨床症状を示した。Ｔｕｋｅｙ検定による対比較は、Ａ群がコントロール群と有意差のある唯一のワクチン接種群であることを示した。
【０１００】
咽頭拭い液を採取し、ウイルス排出を試験した。ＦＣＶ排出の結果（ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌとして表す）を以下の表及び図５に示す。
【０１０１】
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【０１０２】
チャレンジ後、すべての群でウイルス排出が観察されたが、ワクチン接種群ではコントロール群に比べて低減していた（分散分析、ｐ＜０．００００１）。ワクチン接種群間で相違はなかった（Ｔｕｋｅｙ検定）。
【０１０３】
ワクチンは共に、臨床症状及びウイルス排出を強く低減することによって、異種ＦＣＶ２５５のチャレンジに対してネコを防御した。本発明によるワクチンの防御レベルは、市販の変性生Ｆ９ワクチンと少なくとも同程度に良好であった。これは、アジュバントの不在下で不活化及び安定化ＦＣＶワクチンを用いてＦＣＶに対する有効なワクチン接種が達成される可能性があり、防御レベルは市販の生ワクチンで得られるものと少なくとも同程度に良好であることを実証している。
【０１０４】
不活化及び安定化ＦＣＶ４３１／Ｇ１と他のワクチン成分（ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコ伝染性汎白血球減少症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、及びクラミジア）とのｉｎ  ｖｉｖｏ融和性も実証された。
【０１０５】
このように本発明の好ましい実施形態を詳細に述べてきたが、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく本発明の多くの明白な変形が可能であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明は上述の説明に記載の特定の詳細に限定されるものではないことが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】図１は、投与された組成物の種類ごとの、チャレンジ後２週間の総臨床スコアの平均を示すグラフである（実施例３）。
【図２】図２は、投与された組成物の種類ごとの、チャレンジ後２週間のネコで観察される最大臨床スコアの平均を示すグラフである（実施例３）。
【図３】図３は、群及び日数ごとの、平均抗ＦＣＶ２５５中和抗体価（ｌｏｇ１０で表す）を示すグラフである（実施例４）。
【図４】図４は、群ごとの全スコアを示すグラフである（実施例４）。
【図５】図５は、群及び日数ごとの、ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌで表される、チャレンジ後の平均ＦＣＶ排出を示す図である（実施例４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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