(57)【要約】【課題】本発明は、炎症状態を有するか又はその発症の危険がある被験者についての予後を得るための方法及びキットを提供する。【解決手段】一般的に当該方法は、１以上のＳＮＰｓに対する被験者のトロンボモジュリン遺伝子型を判定し、判定された遺伝子型を炎症状態から回復する被験者の能力に対応する多型についての既知の遺伝子型と比較し、そしてそれらの予後に基づいて被験者を同定することを含む。【選択図】なし
2007525980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症状態を有するか、又はその発症危険性のある被験者についての予後を得る方法であって、当該方法は被験者のトロンボモジュリン配列における１つ以上の多型部位を含む前記被験者の遺伝子型を判定することを含み、
前記遺伝子型は前記被験者の炎症状態から回復する能力の指標をなすことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記多型部位は、配列番号１の位置５３１８であるか又はそれと連鎖不平衡にある多型部位である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記位置５３１８と連鎖不平衡にある多型部位が、配列番号１の位置４００７に相当する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記位置５３１８と連鎖不平衡にある多型部位が、０．８以上のＤ’値（又は０．８以上のｒ２値）を有する請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
そのように判定された前記遺伝子型と、（ｉ）前記被験者の炎症状態の型；又は（ｉｉ）他の炎症状態、からの回復の予測指標として知られている既知遺伝子型とを比較することを、更に含む請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記被験者についての前記トロンボモジュリン配列情報を決定することを更に含むことを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子型の判定が、前記被験者からの核酸試料について行われることを特徴とする請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者からの核酸試料の取得を更に含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子型の判定が、（ａ）制限酵素断片長解析；（ｂ）シークエンシング；（ｃ）ハイブリダイゼーション；（ｄ）；オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ；（ｅ）ライゲーションローリングサークル増幅；（ｆ）５’ヌクレアーゼアッセイ；（ｇ）ポリメラーゼプルーフリーディング法；（ｈ）アレル特異的ＰＣＲ；及び、（ｉ）配列データの読み取りのうちの１以上を含むことを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験者のリスク遺伝子型が、炎症状態から回復する可能性の減少又は結果不良となるリスクの増加の指標であることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験者が重症であり、且つ、前記リスク遺伝子型が重篤な心血管又は呼吸不全の予後の指標であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記リスク遺伝子型が、配列番号１の位置５３１８に少なくとも一つのＡヌクレオチド、又は位置４００７に少なくとも一つのＣヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記被験者のプロテクティブ遺伝子型が、炎症状態から回復する可能性の増加の指標であることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験者が重症であり、且つ、前記プロテクティブ遺伝子型が心血管不全又は呼吸不全の重篤性が弱まる予後の指標であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記プロテクティブ遺伝子型が、配列番号１の位置５３１８においてＣヌクレオチドのホモ接合性、又は位置４００７においてＴヌクレオチドのホモ接合性であることを特徴とする請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記炎症状態が、腐敗症、敗血症、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺障害、吸引間質性肺炎（aspiration pneumanitis）、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、臓器若しくは組織の虚血‐再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法若しくは放射線療法に起因する組織傷害、及び、経口摂取された、吸入された、注入された、注射された若しくは送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染、日和見感染、及び、大手術若しくは透析を受ける患者、免疫無防備状態の患者、免疫抑制剤を投与された患者、ＨＩＶ／エイズの患者、疑わしい心内膜炎の患者、発熱した患者、未知の原因で発熱した患者、嚢胞性線維症の患者、糖尿病の患者、慢性腎不全の患者、気管支拡張の患者、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫若しくは喘息の患者、熱性好中球減少の患者、髄膜炎の患者、敗血性関節炎の患者、尿路感染の患者、壊死性筋膜炎の患者、他の疑わしいグループＡ連鎖球菌感染の患者、脾臓摘出を受けた患者、再発性若しくは疑わしい腸球菌感染の患者に対して、感染リスクの増大と関係するその他の内科的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、髄膜炎菌血症、ポスト-ポンプ症候群、心臓機能不全症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疸、毒素ショック症候群、子癇前症、子癇、ＨＥＬＰ症候群、放線菌の結核、カリニ肺炎、肺炎、レーシュマニア症、溶血性尿毒症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング熱、骨盤炎症性疾病、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、ＥＢウイルス、脳炎、 関節リウマチ、汎発性強皮症、骨関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾病、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過感受性間質性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症を含む炎症性及び自己免疫性の疾病、 心臓、肝臓、肺、腎臓及び骨髄を含む移植、 移植片対宿主疾病、移植(片)拒絶反応、鎌形赤血球貧血、ネフローゼ性症候群、ＯＫＴ３のような有毒性薬剤、サイトカイン療法、及び、硬変 から成る群より選択されることを特徴とする請求項１〜１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記炎症状態が、ＳＩＲＳであることを特徴とする請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
被験者の炎症状態からの回復の予後と相関するトロンボモジュリン配列における多型を同定する方法であって、
（ａ）炎症状態の被験者グループからのトロンボモジュリン配列情報の取得；
（ｂ）前記被験者中の前記トロンボモジュリン配列中の少なくとも一つの多型性のヌクレオチド位置の同定；
（ｃ）前記グループ中の個々の被験者についての、前記多型部位における遺伝子型の判定；
（ｄ）前記グループ中の個々の被験者の前記炎症状態からの回復能力の判定；及び、
（ｅ）ステップ（ｃ）で判定された遺伝子型と、ステップ（ｄ）で判定された前記回復能力との関連付け、
を含み、それにより、回復と関連する該トロンボモジュリン多型を同定することを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記炎症状態が、腐敗症、敗血症、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺障害、吸引間質性肺炎（aspiration pneumanitis）、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、臓器若しくは組織の虚血‐再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法若しくは放射線療法に起因する組織傷害、及び、経口摂取された、吸入された、注入された、注射された若しくは送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染、日和見感染、及び、大手術若しくは透析を受ける患者、免疫無防備状態の患者、免疫抑制剤を投与された患者、ＨＩＶ／エイズの患者、疑わしい心内膜炎の患者、発熱した患者、未知の原因で発熱した患者、嚢胞性線維症の患者、糖尿病の患者、慢性腎不全の患者、気管支拡張の患者、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫若しくは喘息の患者、熱性好中球減少の患者、髄膜炎の患者、敗血性関節炎の患者、尿路感染の患者、壊死性筋膜炎の患者、他の疑わしいグループＡ連鎖球菌感染の患者、脾臓摘出を受けた患者、再発性若しくは疑わしい腸球菌感染の患者に対して、感染リスクの増大と関係するその他の内科的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、髄膜炎菌血症、ポスト-ポンプ症候群、心臓機能不全症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疸、毒素ショック症候群、子癇前症、子癇、ＨＥＬＰ症候群、放線菌の結核、カリニ肺炎、肺炎、レーシュマニア症、溶血性尿毒症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング熱、骨盤炎症性疾病、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、ＥＢウイルス、脳炎、 関節リウマチ、汎発性強皮症、骨関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾病、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過感受性間質性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症を含む炎症性及び自己免疫性の疾病、 心臓、肝臓、肺、腎臓及び骨髄を含む移植、 移植片対宿主疾病、移植(片)拒絶反応、鎌形赤血球貧血、ネフローゼ性症候群、ＯＫＴ３のような有毒性薬剤、サイトカイン療法、及び、硬変 から成る群より選択されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
炎症状態から回復する被験者の能力の予測を可能にするための、該被験者のトロンボモジュリン配列内における多型部位内の規定されたヌクレオチド位置における遺伝子型を判定するためのキットであって、
（ａ）該多型部位における変化したヌクレオチドを識別し得る制限酵素；又は、
（ｂ）該多型部位における変化したヌクレオチドと十分な相補性（該変化したヌクレオチド配列と特異的にハイブリット形成が可能なような）を有し、それにより該多型部位の遺伝子型を判定し得る標識化オリゴヌクレオチド；及び、
（ｃ）必要に応じ、該遺伝子型判定のためのキットの使用説明書、
を含むキット。
【請求項２１】
多型部位が配列番号１の位置５３１８、又は位置４００７に相当することを特徴とする請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記多型部位を包含する領域の増幅に好適な１つのオリゴヌクレオチド若しくは複数オリゴヌクレオチドのセットを、更に含むことを特徴とする請求項２０又は２１に記載のキット。
【請求項２３】
重合剤を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
炎症状態の治療に有用であることが既知か又は推測される薬剤候補の効果を判定するために被験者グループを選択するための方法であって、各被験者についての該トロンボモジュリン配列中の１以上の多型部位の遺伝子型を判定すること（但し、該遺伝子型は、該炎症状態から被験者が回復する能力の指標である）及びその遺伝子型に基づいて被験者を分類することを含む方法。
【請求項２５】
前記被験者又は被験者の下位集合（subset）へ前記候補薬剤を投与すること、及び各被験者が前記炎症状態から回復する能力を判定することを、更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験者の遺伝子型に基づいて、前記候補薬剤に対する該被験者の反応を比較することを、更に含むことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号１からなるヒト標的配列、該標的配列の相補的な配列、又は該標的配列のＲＮＡ相当物に含まれる配列と特異的にハイブリダイズする凡そ１０から凡そ４００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドは、多型の遺伝子型判定において使用可能である）。
【請求項２８】
配列番号１からなるヒト標的配列、該標的配列の相補的な配列、又は該標的配列のＲＮＡ相当物に含まれる配列と特異的にハイブリダイズする凡そ１０から凡そ４００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（但し、該ハイブリダイゼーションは、多型の遺伝子型判定において実施可能である）。
【請求項２９】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドプローブ：
（ａ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置５３１８にＡを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置５３１８にＣを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ；
（ｂ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置５３１８にＣを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置５３１８にＡを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ；
（ｃ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置４００７にＣを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置４００７にＴを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ；及び
（ｄ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置４００７にＴを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置４００７にＴを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ。
【請求項３０】
固体支持体に付着した核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置５３１８のヌクレオチドがＡである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置５３１８の前記ヌクレオチドがＣである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイ。
【請求項３１】
固体支持体に付着した核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置５３１８のヌクレオチドがＣである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置５３１８の前記ヌクレオチドがＡである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイ。
【請求項３２】
固体支持体に付着した核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置４００７のヌクレオチドがＣである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置４００７の前記ヌクレオチドがＴである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイ。
【請求項３３】
固体支持体に付着した核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置４００７のヌクレオチドがＴである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置４００７の前記ヌクレオチドがＣである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイ。
【請求項３４】
検出可能な標識、消光剤、移動度修飾因子、前記標的配列の５’又は３’側に位置する連続する非標的配列のうち１以上のものを更に含むことを特徴とする請求項２７〜３３の何れか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
表２Ｂ中のトロンボモジュリン遺伝子型の相関より選択される複数の数値的に符号化された遺伝子型相関を含む、コンピューターで読み取り可能な媒体（但し、該複数の各相関は、炎症状態から回復する能力を表す値である）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野は、炎症状態の被験者の評価（診断）に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子型は、炎症性及び感染性疾患における被験者結果の予測に役割を果たすことが示されている（MCGUIRE W. et al. Nature (1994) 371: 508-10； NADEL S. et al. Journal of Infectious Diseases (1996) 174: 878-80； MIRA JP. et al. JAMA (1999) 282: 561-8； MAJETSCHAK M. et al. Ann Surg (1999) 230: 207-14； STUBER F. et al. Crit Care Med (1996) 24: 381-4； STUBER F. et al. Journal of Inflammation (1996) 46: 42-50； 及び、WEITKAMP JH. et al. Infection (2000) 28: 92-6）。更に、夫々細菌内毒素及び人工心肺（ＣＰＢ）のような敗血性及び非敗血性刺激は、血液凝固システムを活性化し、そして、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を誘発する。
【０００３】
トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）はイントロンのない遺伝子にコードされている。ＴＨＢＤは内皮細胞表面に見出され、トロンビンと高親和性複合体を形成してトロンビンの凝血原活性を阻害する。ＴＨＢＤは１つの内皮特異的Ｉ型膜受容体（糖タンパク質受容体）である。トロンビンがＴＨＢＤに結合するとプロテインＣを活性化し、活性化プロテインＣによる抗凝固経路が働く。活性化プロテインＣは、プロテインＳに結合し、次に凝固因子Ｖａ及びＶＩＩＩａを分解し、生成するトロンビンの量を減少させる。活性化プロテインＣはまた、内皮プロテインＣ受容体及び白血球上のプロテインＣ受容体に結合し、炎症性サイトカインの阻害と接着分子応答へと導く細胞内シグナル伝達を開始する。このように、ＴＨＢＤもまたサイトカインの形成阻害と白血球−内皮細胞接着の両方を阻害するという抗炎症活性を有する。
【０００４】
ＴＨＢＤ−トロンビン複合体によるプロテインＣの活性化は敗血症において減少し、凝固系の撹乱と散在性の血管内凝固をもたらす。ＴＨＢＤの生合成はエンドトキシン及び低酸素の両方によって減少することが示されている。この超凝固性状態で生じた微小血栓は、多重システム臓器不全に導く。
【０００５】
全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）は、（抗炎症過程に関して）亢進した炎症、（抗凝固過程に関して）亢進した凝固、及び、低下した線維素溶解によって特徴付けられる。ＴＨＢＤは、循環するトロンビンに結合する内皮細胞表面受容体である。このトロンボモジュリン：トロンビン複合体はプロテインＣを活性化し、下流の抗炎症効果をも有する。
【０００６】
プロテインＣは、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）を形成するように活性化されたとき、３つの生物学的プロセス又は生物学的状態における主要な役割を果たす、すなわち、凝固、線溶及び炎症である。急性炎症状態はプロテインＳの遊離型のレベルを減少させ、遊離型プロテインＳはＡＰＣの重要な補助因子であるからＡＰＣ機能を減少させる。敗血症、急性炎症及びサイトカインは、内皮細胞上のトロンボモジュリンの発現を減少させ、ＡＰＣ活性又はレベルの低下をもたらす。敗血症ショックもまた循環しているトロンボモジュリンレベルを増加させ、それは内皮細胞トロンボモジュリンの切断の増加に関連するものである。敗血症における低下したＡＰＣの他のメカニズムは、エンドトキシンやＴＮＦ−αなどのサイトカインが内皮細胞プロテインＣ受容体（ＥＰＣＲ）の発現を下方制御（減少）し、それによってＥＰＣＲを介したプロテインＣ及びＡＰＣシグナル伝達を減少させる。髄膜炎菌血症(meningococcemia)のような重篤な敗血症状態もまたプロテインＣ消費をもたらす。低下したプロテインＣレベルは紫斑病、指趾梗塞(digital infarction)、及び髄膜炎菌血症による死亡と関連する。
【０００７】
プロテインＣはまた、人工心肺（ＣＰＢ）後の非敗血症患者において変化する。総プロテインＣ、ＡＰＣ及びプロテインＳはＣＰＢの間に減少する。大動脈固定解除（ＣＰＢ後の再灌流）に続いてプロテインＣはさらに活性化され、残存する非活性化プロテインＣの割合は大きく減少する。ＣＰＢの間及びその後のプロテインＣの減少は血栓症、播種性血管内血液凝固（ＤＩＣ）、臓器虚血及び手術中及び手術後の炎症の危険性を増加させる。プロテインＣ活性化の程度が少ない患者は一般的に心機能回復が遅く、これは低レベルのプロテインＣが微小血管の血栓症及び心筋虚血の危険性を増加させるという概念と一致する。アプロチニンはＡＰＣの競争的阻害剤であり、しばしば心臓手術及びＣＰＢに用いられる。アプロチニンは、深部低体温循環停止(deep hypothermic circulatory arrest)後の手術後血栓合併症の原因であると考えられている。
【０００８】
細菌内毒素（エンドトキシン）や人工心肺（ＣＰＢ）等の敗血性及び非敗血性刺激は、血液凝固系を活性化し、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を引き起こす。プロテインＣレベルの低下は敗血症ショック(GRIFFIN JH. etal. (1982) Blood 60: 261-264; TAYLOR FB. et al. (1987) J. Clin. Invest. 79: 918-925; HESSELVIK JF. et al. (1991) Thromb. Haemost. 65: 126-129; FIJNVANDRAAT K.et al. (1995) Thromb. Haemost. 73(1) : 15-20)、重症感染症(HESSELVIK JF. et al. (1991) Thromb. Haemost. 65: 126-129)、及び大手術後(BLAMEY SL. et al. (1985) Thromb. Haemost. 54: 622-625)の患者において見られる。この低下はプロテインＣの転写の減少によって起こることが示唆されている(SPEK CA. et al. J. Biological Chemistry (1995) 270 (41): 24216-21 at 24221)。プロテインＣ活性化に必要な内皮経路は重症髄膜炎菌性敗血症において損なわれていることも示された(FAUST SN. et al. New Eng. J. Med. (2001) 345: 408-416)。敗血症患者の低プロテインＣレベルは悪性の予後と関連している(YAN SB. and DHAINAUT J-F. Critical Care Medicine (2001) 29 (7): S69-S74 ; FISHER CJ. and YAN SB. Critical Care Medicine (2000) 28 (9 Suppl): S49-S56 ; VERVLOET MG. et al. Serin Thromb Hemost. (1998) 24(1) : 33-44; LORENTE JA. et al. Chest (1993) 103 (5): 1536-42)。組換えヒト活性化プロテインＣは、重症敗血症又は敗血症ショックの患者の死亡率を低下させる(BERNARD GR. et al. New Eng. J. Med. (2001) 344: 699-709)。このように、プロテインＣは全身性炎症反応症候群における役割を果たしているらしい。
【０００９】
ヒトトロンボモジュリンの配列は染色体の２０ｐ１２〜セントロメアに位置づけられ、８．５ｋｂにわたって広がっている。代表的なホモサピエンストロンボモジュリン配列はＧｅｎＢａｎｋに受託番号ＡＦ４９５４７１（８５３２塩基対）として収載されている。
【００１０】
かなりの数の多型がトロンボモジュリン配列のプロモーター領域（配列番号１の２７９１番目及び２３８８番目に夫々対応するＧ−２０１Ａ、Ｇ−３３Ａ）及びコード化領域（配列番号１の２７１６番目、４００７番目及び４０４５番目に夫々対応するＦ１２７Ａ、Ｃ１４１８Ｔ及びＧ１４５６Ｔ）に認められており、血栓症現象や循環器疾患の発症や危険性との関連について調べられている(Doggen CJ. et al. (1998)ThrombHaemost 80: 743-8; Ireland H. et al. (1997) Circulation 96: 15-8; Kunz G. et al. (2002) Blood 99: 3646-3653; Nakazawa F. T. et al. (2002)Atherosclerosis 164:385-7 ; and Ohnishi YT. et al. (2000) Hum Genet 106: 288-92)。−３３Ａアレルは、トロンボモジュリンのプロモーター領域のプロモーター活性を減少させることが見いだされ、可溶性トロンボモジュリンの血清レベルの変化や冠動脈疾患、頚動脈のアテローム硬化症、及び心筋梗塞と関連しているであろう。Ｇ−２０１Ａ及びＧ１４５６Ｔ多型は、重症の血栓形成傾向の患者においては稀であることが見いだされ、おそらく機能的に無関係であろう。Ｇ１２７Ａ多型は、若い男性において喫煙のような追加の危険因子が存在した場合に、心筋梗塞の危険性が増えることと弱く関連していた。
【００１１】
トロンボモジュリン遺伝子のプロモーター領域の−３３番目の位置（配列番号１の２３８８番目）におけるＧからＡへの多型は、アジア人種において特に高頻度である。トロンボモジュリンのＧ−３３Ａ多型は、転写調節因子のためのコンセンサス配列の近くにあり、レポーター遺伝子アッセイの結果では−３３Ａアレルがプロモーター活性を低下させることが示された。興味深いことに、−３３Ｇアレルのホモ接合性のＣＡＤ患者において、ＣＡＤの程度により可溶性トロンボモジュリンレベルが増加することが見出された。−３３Ａアレルについてのホモ接合性又はヘテロ接合性のＣＡＤ患者においては血管性疾患の程度によって可溶性トロンボモジュリンのレベルは変化しなかった。
【００１２】
Ｃ１４１８Ｔ（配列番号１の４００７番目の位置）多型は静脈瘤の形成と関連していた。Ｃ１４１８Ｔ多型と関連する心筋梗塞の危険性は、先行する研究においては一致していない（矛盾する）(Chao et al. (2004) Am J Cardio 93 (2): 204-207; Park et al. (2002)Hypertens Res 3: 389-94; Wu et al. (2001) Circulation 103 (10): 1386-1389; and Norlund et al. (1997) ThrombHaemost 77 (2): 248-51)。さらに、この部位は静脈の血栓塞栓症の危険性とは関連していないことが見いだされ(Faioni et al. (2002) Br JHaematol 118 (2): 595-9)、後期流産の危険性とも関連していない(Franchi et al.(2001) Brit JHaematology 114 (3): 641)。これらの多型と種々の血栓性の現象及び循環器疾患との関連性は不確かであり、数多くの否定的な研究結果もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従来の研究では、トロンボモジュリンの多型と全身性炎症反応症候群や敗血症のような致命的な病気の臨床結果との関連性については検討されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、ヒトトロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）配列中の特定の一塩基多型（ＳＮＰｓ）が、炎症状態からの被験者結果の予測因子で有り得るという、驚くべき発見に部分的には基づいている。
【００１５】
本発明は、トロンボモジュリンＳＮＰｓが、炎症状態の被験者における改善された予後又は被験者の結果と関連するという、驚くべき発見に部分的には基づいている。更に、種々のＴＨＢＤ ＳＮＰが、被験者の結果の指標として被験者のスクリーニングのために、又は、炎症状態からの回復の予測のために有用である。
【００１６】
本発明は、炎症状態からの回復可能性減少と関連する所与のＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（すなわち、「リスク遺伝子型」）、又は、炎症状態からの回復可能性増加と関連する所与のＳＮＰ部位における特定のヌクレオチド（すなわち、「プロテクティブ遺伝子型」）の同定に、部分的には基づいている。
【００１７】
本発明の一側面によれば、炎症状態を有するかその発症の危険がある被験者に関する予後又は回復能力の予測を得るための方法であって、該被験者のＴＨＢＤ配列の１以上の多型部位を含む該被験者における遺伝子型を判定すること含み、前記遺伝子型は該被験者が炎症状態から回復する能力の指標をなす方法が提供される。
【００１８】
本発明の他の側面によれば、炎症状態を有するかその発症の危険がある被験者に関する予後又は回復能力の予測を得るための方法であって、当該方法は該被験者のハプロタイプを判定する工程を含む。該ハプロタイプは、配列番号１の位置５１１０、５３１８及び６２３５に相当しうる。リスクハプロタイプは、５１１０Ｇ／５３１８Ａ／６２３５Ａ、５１１０Ｇ／５３１８Ａ／６２３５Ｇ、又は５１１０Ａ／５３１８Ａ／６２３５Ｇで示される。プロテクティブハプロタイプは、５１１０Ａ／５３１８Ｃ／６２３５Ａで示される。当該方法は、前記被験者のハプロタイプを判定する前に当該被験者の遺伝的配列情報を取得する工程を更に含んでいてもよく、更になお、遺伝的配列情報を含む被験者からの生物学的試料を取得する工程を含んでいてもよい。追加的に、当該方法は炎症状態を有するか又はその発症の危険がある患者を同定することを含む。
【００１９】
本発明のもう一つの側面によれば、炎症状態を有するかその発症の危険がある被験者に関する予後又は回復能力の予測を得るための方法であって、該被験者のＴＨＢＤ配列の１以上の多型部位を含む該被験者における遺伝子型を判定する工程を含み、該遺伝子型は該被験者が炎症状態から回復する能力の指標をなす方法が提供される。前記方法は、前記遺伝子型を判定する前に、被験者の遺伝子配列情報を取得する工程を更に含んでもよく、そして、前記方法は、遺伝子配列情報を含む前記被験者から生物学的試料を取得する工程を更に含んでもよい。更に、前記方法は、炎症状態を有するかその発症の危険がある患者の同定を含んでもよい。
【００２０】
本発明のもう一つの側面によれば、炎症状態を有するかその発症の危険がある被験者に関する予後又は回復能力の予測を得るための方法が提供され、該方法は、以下の工程のうち任意の１以上を含む：
（ａ）炎症状態を有するかその発症の危険がある患者の同定；
（ｂ）前記被験者からの生物学的試料の取得；
（ｃ）前記被験者の遺伝子配列情報の取得；
（ｄ）前記被験者のＴＨＢＤ配列の１以上の多型部位を含む前記被験者の遺伝子型の判定（但し、該遺伝子型は該被験者が炎症状態から回復する能力の指標をなす）。
【００２１】
前記多型部位は、配列番号１の位置５３１８であるか又はそれと連鎖不平衡にある多型部位でありうる。或いは、前記位置５３１８と連鎖不平衡にある多型部位が、配列番号１の位置４００７に相当しうる。位置５３１８と連鎖不平衡にある多型部位は、０．８以上のＤ’値（又は０．８以上のｒ２値）を有していてもよい。当該方法は、そのように判定された前記遺伝子型と、（ｉ）前記被験者の炎症状態の型；又は（ｉｉ）他の炎症状態、からの回復の予測指標として知られている既知遺伝子型とを比較することを、更に含んでいてもよい。この方法は、前記被験者についてのトロンボモジュリン配列情報を決定すること、及び前記遺伝子型の判定が、前記被験者から取得された核酸試料について行われることを更に含んでいてもよい。前記遺伝子型の判定は、制限酵素断片長解析；シークエンシング；ハイブリダイゼーション；オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ；ライゲーションローリングサークル増幅；５’ヌクレアーゼアッセイ；ポリメラーゼプルーフリーディング法；アレル特異的ＰＣＲ；及び配列データの読み取りのうちの１以上を含みうる。
【００２２】
前記被験者のリスク遺伝子型は、炎症状態から回復する可能性の減少又は結果不良となるリスクの増加の指標となり得る。前記被験者が重症である場合、前記リスク遺伝子型は、重篤な心血管又は呼吸性の機能障害の予後の指標と成り得る。前記リスク遺伝子型は、配列番号１の位置５３１８に少なくとも一つのＡヌクレオチド、又は位置４００７に少なくとも一つＣを含み得る。
【００２３】
前記被験者のプロテクティブ遺伝子型は、炎症状態から回復する可能性の増加の指標となり得る。前記被験者が重症である場合、前記プロテクティブ遺伝子型は、心血管又は呼吸性の機能障害の重篤性が弱まる予後の指標となり得る。前記プロテクティブ遺伝子型は、配列番号１の位置５３１８においてＣヌクレオチドのホモ接合性、又は位置４００７においてＴヌクレオチドのホモ接合性でありうる。
【００２４】
本発明のもう一つの側面によれば、被験者の炎症状態からの回復の予後と相関するトロンボモジュリン配列における多型を同定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）炎症状態の被験者グループからのトロンボモジュリン配列情報の取得；
（ｂ）前記被験者の前記トロンボモジュリン配列中の少なくとも一つの多型性のヌクレオチド位置の同定；
（ｃ）前記グループ中の個々の被験者についての、前記多型部位における遺伝子型の判定；
（ｄ）前記炎症状態からの、前記グループ中の個々の被験者の回復能力の判定；及び、
（ｅ）工程（ｃ）で判定された遺伝子型と、工程（ｄ）で判定された前記回復能力との関連付けと、を含み、それにより回復と関連する該トロンボモジュリン多型を同定する。
【００２５】
前記炎症状態は、腐敗症、敗血症、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺障害、吸引間質性肺炎（aspiration pneumanitis）、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、臓器若しくは組織の虚血‐再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法若しくは放射線療法に起因する組織傷害、及び、経口摂取された、吸入された、注入された、注射された若しくは送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染、日和見感染、及び、大手術若しくは透析を受ける患者、免疫無防備状態の患者、免疫抑制剤を投与された患者、ＨＩＶ／エイズの患者、疑わしい心内膜炎の患者、発熱した患者、未知の原因で発熱した患者、嚢胞性線維症の患者、糖尿病の患者、慢性腎不全の患者、気管支拡張の患者、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫若しくは喘息の患者、熱性好中球減少の患者、髄膜炎の患者、敗血性関節炎の患者、尿路感染の患者、壊死性筋膜炎の患者、他の疑わしいグループＡ連鎖球菌感染の患者、脾臓摘出を受けた患者、再発性若しくは疑わしい腸球菌感染の患者に対して、感染リスクの増大と関係するその他の内科的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、髄膜炎菌血症、ポスト-ポンプ症候群、心臓機能不全症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疸、毒素ショック症候群、子癇前症、子癇、ＨＥＬＰ症候群、放線菌の結核、カリニ肺炎、肺炎、レーシュマニア症、溶血性尿毒症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング熱、骨盤炎症性疾病、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、ＥＢウイルス、脳炎、 関節リウマチ、汎発性強皮症、骨関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾病、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過感受性間質性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症を含む炎症性及び自己免疫性の疾病、 心臓、肝臓、肺、腎臓及び骨髄を含む移植、 移植片対宿主疾病、移植(片)拒絶反応、鎌形赤血球貧血、ネフローゼ性症候群、ＯＫＴ３のような有毒性薬剤、サイトカイン療法、及び硬変から成る群より選択され得る。本明細書において、用語「炎症状態」とは、特異的に心筋梗塞を除く。更なる実施形態において、うっ血性心不全は炎症状態から特異的に除かれる。なお更なる実施形態において、ポンプ後症候群は炎症状態から特異的に除かれる。そして、なお更なる実施形態において、心筋虚血不全症候群は炎症状態から特異的に除かれる。
【００２６】
前記遺伝子型の判定は、当業者既知の任意の技術により達成され得る：制限酵素断片長解析；シークエンシング；ハイブリダイゼーション；オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ；ライゲーションローリングサークル増幅；５’ヌクレアーゼアッセイ；ポリメラーゼプルーフリーディング法；アレル特異的ＰＣＲ； マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）−マイクロシークエンス解析；ジーンチップハイブリダイゼーションアッセイ； 及び、配列データの読み取り、のうちの１以上を含み得るがこれらに限定されるものではない。
【００２７】
本発明のもう一つの側面によれば、炎症状態から回復する被験者の能力の予測を可能にするための、該被験者のトロンボモジュリン配列内における多型部位内の規定されたヌクレオチド位置における遺伝子型を判定するためのキットが提供され、該キットは前記多型部位における変化したヌクレオチドを識別し得る制限酵素、又は、該多型部位と十分な相補性を有し且つ該変化したヌクレオチドを識別し得る標識化オリゴヌクレオチドを含む。前記キットは、以下のうちの１以上を含んでもよい：パッケージ；遺伝子型判定のためのキットの使用説明書；バッファー、ヌクレオチド及び酵素のような試薬類。本書で記載されるキットには、以下のうちの任意の組み合わせを含んでよい：トロンボモジュリン多型部位における変化したヌクレオチドを識別し得る制限酵素；及び／又は、該トロンボモジュリン多型部位と十分な相補性を有し且つ該変化したヌクレオチドを識別し得る標識化オリゴヌクレオチド、及び／又は、該トロンボモジュリン多型部位を含む領域を増幅するのに適したオリゴヌクレオチド若しくはオリゴヌクレオチドのセット。前記キットはまた、以下のうちの１以上を含んでもよい：パッケージ；遺伝子型判定のためのキットの使用説明書；バッファー、ヌクレオチド及び酵素のような試薬類；及び／又は容器。
【００２８】
前記制限酵素を有するキットは、多型部位を包含する領域の増幅に好適な１つのオリゴヌクレオチド若しくは複数オリゴヌクレオチドのセット、重合剤、及び、遺伝子型を決定するためのキットの使用説明書も含み得る。
【００２９】
本発明のもう一つの側面によれば、炎症状態からの被験者の回復能力の予測を可能にするための、該被験者のトロンボモジュリン配列内における多型部位内の規定されたヌクレオチド位置における遺伝子型を判定するためのキットが提供され、該キットは、該多型部位における変化したヌクレオチドを識別し得る制限酵素、又は、該多型部位と十分な相補性を有し且つ該変化したヌクレオチドを識別し得る標識化オリゴヌクレオチドをパッケージ内に含む。前記多型部位は配列番号１の位置５３１８又は位置４００７に相当し得る。
【００３０】
本発明のもう一つの側面によれば、本書に記載された前記方法に従ったトロンボモジュリン多型の同定に使用され得るオリゴヌクレオチドが提供され、該オリゴヌクレオチドは、配列番号１によって規定される配列の一つの領域又はその相補鎖と、通常のハイブリダイゼーション条件下で、ハイブリダイズする特徴を有するオリゴヌクレオチドである。
【００３１】
本発明のもう一つの側面によれば、配列番号１の一部又はその相補鎖を含むオリゴヌクレオチドプライマーが提供され、ここで、該プライマーは１０〜５４ヌクレオチド長であり且つ該プライマーは配列番号１の領域又はその相補鎖に特異的にハイブリダイズし本書に記載されたトロンボモジュリン多型を特異的に同定し得る。或いは、前記プライマーは、１６〜２４ヌクレオチド長であってもよい。
【００３２】
本発明のもう一つの側面によれば、（ａ）被験者からトロンボモジュリン配列情報を得、及び（ｂ）該配列中の１以上の多型であって被験者が炎症状態から回復する能力を示し得る１以上の多型の個性を決定する工程、を含む被験者スクリーニングのための方法が提供される。
【００３３】
本発明のもう一つの側面によれば、（ａ）炎症状態を発症する危険又は炎症状態を現に有していることに基づき被験者を選択し、（ｂ）該被験者からトロンボモジュリン配列情報を得、及び（ｃ）トロンボモジュリン配列中の１以上の多型であって被験者が炎症状態から回復する能力を示す多型を検出する工程、を含む被験者のスクリーニングのための方法が提供される。
【００３４】
本発明のもう一つの側面によれば、炎症状態の治療に有用であることが既知か又は推測される薬剤候補の効果を判定するために被験者グループを選択するための方法が提供され、該方法は、各被験者についてのトロンボモジュリン配列中の１以上の多型部位の遺伝子型判定（但し、該遺伝子型は、被験者が炎症状態から回復する能力の指標である）及びその遺伝子型に基づいた被験者の分類を含む。前記方法はまた、前記被験者（複数）又は被験者（複数）の下位集合（subset）への前記候補薬剤の投与、及び各被験者が炎症状態から回復する能力の判定を含んでもよい。前記方法はまた、被験者の遺伝子型に基づいて、前記候補薬剤に対する該被験者の反応を比較する更なる工程を含んでもよい。前記候補薬剤に対する反応は、前記炎症状態から各被験者が回復する能力を判定することにより決定してもよい。
【００３５】
リスク遺伝子型は、配列番号１の以下のトロンボモジュリンアレル：５３１８Ａ；及び４００７Ｃから選択される少なくとも一つヌクレオチド単独又はその組み合わせであってもよい。
【００３６】
リスク遺伝子型は、炎症状態から回復しない危険性（リスク）が増大する指標であり得る。リスクアレルの１つのコピー（ヘテロ接合性）又は２つのコピー（ホモ接合性）を有する被験者（すなわち、５３１８ＡＣ若しくは５３１８ＡＡ、又は４００７ＣＴ若しくは４００７ＣＣ又はそれらの組み合わせ）は、炎症状態から回復しない当該被験者の危険性が増加する程度がへテロ接合性よりもホモ接合性の方が大きいかもしれないが、「リスク遺伝子型」を有すると考えられる。
【００３７】
非リスク遺伝子型又はプロテクティブ遺伝子型は、配列番号１における以下のトロンボモジュリンアレル：５３１８Ｃ；及び４００７Ｔから選択される単独又は組み合わせであってよい。
【００３８】
プロテクティブ遺伝子型は、炎症状態から回復しない危険性の減少か又は炎症状態から回復する見込みの増加の指標となりうる。プロテクティブアレルの２つのコピー（ホモ接合性）を有する被験者（すなわち、５３１８ＣＣ又は４００７ＴＴ又はそれらの組み合わせ）は、「プロテクティブ遺伝子型」を有すると考えられる。
【００３９】
本発明の他の側面によれば、配列番号１からなるヒト標的配列、該標的配列の相補的な配列、又は該標的配列のＲＮＡ相当物に含まれる配列と特異的にハイブリダイズする凡そ１０から凡そ４００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドはリスク遺伝子型多型判定において使用可能である）が提供される。
【００４０】
本発明の他の側面によれば、配列番号１からなるヒト標的配列、該標的配列の相補的な配列、又は該標的配列のＲＮＡ相当物に含まれる配列と特異的にハイブリダイズする凡そ１０から凡そ４００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド（但し、該ハイブリダイゼーションはリスク遺伝子型多型判定において使用可能である）が提供される。
【００４１】
本発明の別の側面によれば、以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドプローブが提供される：
（ａ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置５３１８にＡを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置５３１８にＣを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ；
（ｂ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置５３１８にＣを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置５３１８にＡを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ；
（ｃ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置４００７にＣを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置４００７にＴを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ；及び
（ｄ）高ストリンジェントな条件（high stringency conditions）下で、位置４００７にＴを有する配列番号１を包含する核酸分子とはハイブリダイズするが、位置４００７にＴを有する配列番号１を包含する核酸分子とハイブリダイズしないプローブ。
【００４２】
本発明の別の側面において、固体支持体に付着させられた核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置５３１８のヌクレオチドがＡである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置５３１８の前記ヌクレオチドがＣである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイが提供される。
【００４３】
本発明の別の側面において、固体支持体に付着させられた核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置５３１８のヌクレオチドがＣである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置５３１８の前記ヌクレオチドがＡである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイが提供される。
【００４４】
本発明の別の側面において、固体支持体に付着させられた核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置４００７のヌクレオチドがＣである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置４００７の前記ヌクレオチドがＴである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイが提供される。
【００４５】
本発明の別の側面において、固体支持体に付着させられた核酸分子のアレイであって、配列番号１の位置４００７のヌクレオチドがＴである核酸分子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（但し、該オリゴヌクレオチドが、位置４００７の前記ヌクレオチドがＣである配列番号１からなる核酸分子と実質的にハイブリダイズしない条件下において）を含むアレイが提供される。
【００４６】
前記オリゴヌクレオチドは、検出可能な標識、消光剤、移動度修飾因子、前記標的配列の５’又は３’側に位置する近接する非標的配列のうち１以上のものを更に含んでもよい。
【００４７】
本発明の別の側面において、表２Ｂ中のトロンボモジュリン遺伝子型の相関より選択される複数の数値的に符号化された遺伝子型相関を含む、コンピューターで読み取り可能な媒体（但し、該複数の各相関は、炎症状態から回復する能力を表す値である）が提供される。
【００４８】
上記同定された配列位置は、示されているように、前記ＴＨＢＤ配列のセンス鎖を基準としている。被験者結果を判定するためにアンチセンス鎖について解析を行い得ることは、当業者には明白であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
１． 定義
本明細書中において、広範に使用される多くの用語があるが、以下の定義は本発明の理解を促進する目的で提供されるものである。
【００５０】
「遺伝物質（Genetic material）」は、任意の核酸を含み、一本鎖又は２本鎖型のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドで有り得る。
【００５１】
「プリン」は、融合ピリミジン及びイミダゾール環を含む複素環の有機化合物であり、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）の親化合物として機能する。「ヌクレオチド」は、一般に、ペントース、通常、リボース又はデオキシリボースと共有結合したプリン（Ｒ）又はピリミジン（Ｙ）塩基である。なお、この糖は、１又はそれ以上のリン酸基を含有する。核酸は、一般に、３’‐５’リン酸ジエステル結合により結合したヌクレオチドのポリマーである。本書で使用する場合、「プリン」は、プリン塩基、即ちＡ及びＧを指称するために使用するが、広義では、ポリヌクレオチド鎖の成分としての、ヌクレオチドモノマー、即ち、デオキシアデノシン−５’−リン酸及びデオキシグアノシン−５’−リン酸をも意味するものとする。
【００５２】
「ピリミジン」は、ヌクレオチド塩基、即ちシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）を構成する単環式有機塩基である。本書で使用する場合、「ピリミジン」は、ピリミジン塩基、即ちＣ、Ｔ及びＵを指称するために使用されるが、広義では、プリンヌクレオチドと共にポリヌクレオチド鎖の成分をなすピリミジンヌクレオチドモノマーをも意味するものとする。
【００５３】
記号Ｍによって表されるヌクレオチドは、Ａ又はＣの何れかであってよく、記号Ｗによって表されるヌクレオチドは、Ｔ又はＡの何れかであってよく、記号Ｙによって表されるヌクレオチドは、Ｃ又はＴの何れかであってよく、また、記号Ｒによって表されるヌクレオチドは、Ｇ又はＡの何れかであってよい。
【００５４】
「多型性部位（polymorphic site）」又は「多型部位（polymorphism site）」又は「多型（polymorphism）」又は「一塩基多型部位」（ＳＮＰ部位）は、本書で使用される場合、所定の配列内において相違が生じている遺伝子座（座位）ないし位置である。「多型」は、集団内において、２以上の遺伝子の型又は遺伝子内の位置の型（アレル）が、最も稀な型の存在が突然変異だけで説明できない程の頻度で、生じていることである。多型性アレルは、宿主において、いくらかの淘汰における利点を享受している可能性がある。好ましい多型性部位は、選択された母集団において１％以上の頻度、好ましくは１０％又は２０％以上の頻度でそれぞれ現れる少なくとも２つのアレルを有する。多型部位は、ある核酸配列内の既知の位置であってもよく、本書に記載した方法によって存在が特定されてもよい。多型は、コーディング領域及び非コーディング領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び、イントロン）の両者において、出現してよい。
【００５５】
通常、集団遺伝学において使用される用語「連鎖」とは、同一染色体においてその遺伝子座が近接していることによる、対立遺伝子でない（nonallelic）２以上の遺伝子の共遺伝を指し、それにより、減数分裂後も、それらの遺伝子は非連鎖遺伝子で期待される５０％より高い頻度で随伴したままになる。しかしながら、減数分裂の間の、個々の染色分体間の物理的交差により組み換えが生じてもよい。「組み換え」は一般にＤＮＡの大きな区域の間で生じ、そのため、近接した区域のＤＮＡと遺伝子が組み換えイベント（交差）において同時に移動させられることが見込まれる。逆に、所与の染色体において離れて存在するＤＮＡ領域は、互いに近接したＤＮＡ領域と比較して交差の過程で別々になる可能性が高い。一塩基多型（ＳＮＰｓ）のような多型性分子マーカーは、染色体における位置的マーカーとして減数分裂の組み換えイベントを追跡するのに有用である。
【００５６】
本書において使用される場合「リスク遺伝子型」とは、本書に記載されたトロンボモジュリン配列内の１以上の多型部位における対立遺伝子（アレル）変異体（遺伝子型）であって、炎症状態から回復する可能性の減少又は不良な結果となるリスクの増加の指標である。リスクアレルが少なくとも１コピー存在するならば、前記リスク遺伝子型は、一倍体遺伝子型又は二倍体遺伝子型の何れかについて判定されてもよい。そのような「リスクアレル」又は「リスク遺伝子型」は、配列番号１（トロンボモジュリン）の位置５３１８Ａ及び４００７Ｃから選択されてよい。
【００５７】
「クレード（clade）」は、系統学的に近い関係にあるハプロタイプの群である。例えば、ハプロタイプが系統（進化的な）樹で表される場合、一つのクレードは同じ枝内に含まれる全てのハプロタイプを含む。
【００５８】
本書では、「ハプロタイプ」とは、染色体上の密接に連鎖する遺伝子座のアレルのセット又はマーカーセットのパターン（それらは一緒に遺伝する傾向にある）を言う。したがって、同一の小さい染色体区画上のアレル群は、一緒に伝達される傾向にある。所与の染色体区画上にあるハプロタイプは、一般的に、組み換えが生じない限り一緒に子孫に伝達される。組み換えが存在しない場合、ハプロタイプは、マッピングにおいて単一の高度に多型性な遺伝子座のアレルとして扱われ得る。「ハプロタイプ」は、図１で表された表（ハプロタイプマップ）中の列として示される。
【００５９】
一般に、試料及びそのサブタイプ中の核酸の検出は、特異的な核酸ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成法）に依存する（ここで、前記オリゴヌクレオチドプローブは「高厳密性」条件下で該試料中の核酸にアニールし、該首尾よくアニールしたプローブは引き続いて検出される）（Spiegelman, S., Scientific American, Vol. 210, p. 48 (1964) ）。高厳密性条件下のハイブリッド形成は、第一に、ハイブリッド形成に使用される方法に依存する。高厳密性のハイブリッド形成はまた、高厳密性のＰＣＲ、ＤＮＡシークエンス、一本鎖高次構造多型解析、及び、in situハイブリッド形成法のような、分子生物学者により日常的に使用されている多数の技術の成功に頼っている。ノーザン及びサザンブロット法とは対照的に、これらの技術は、通常、相対的に短いプローブ（例えば、通常、ＰＣＲ及びシークエンスについては凡そ１６ヌクレオチド以上の長さ、並びに、in situハイブリッド形成法については凡そ４０ヌクレオチド以上の長さ）で実施される。これらの技術で使用される前記高厳密性条件は、分子生物学分野の当業者に周知されており、そして、それらの例は、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N., 1998 中に見出され、これは参照に本書に組み込まれる。
【００６０】
本書において、「連鎖不平衡（linkage disequilibrium）」（ＬＤ）とは、遺伝子座におけるアレル頻度から予想されるよりも大きな割合で、連鎖したアレルの確実な結合が、集団内で生じていることを言う。例えば、ＳＮＰのような連鎖マーカーの特定のアレルと関連した又は連鎖マーカーの特定のアレル間における疾患遺伝子の優先的出現は、ＬＤにあるとみなされる。この不平衡の識別は、一般に、前記疾患染色体のほとんどが同じ変異を保有し、また、調べられるべき前記マーカーが前記疾患遺伝子に相対的に近接していることを意味する。したがって一つ目の遺伝子座の前記遺伝子型が二つ目の遺伝子座（又は３番目の遺伝子座など）とＬＤにあるのであれば、一つの遺伝子座についてだけアレルを判定すれば、必然的に、他の遺伝子座のアレルも判定可能である。ＬＤについて遺伝子座を評価する場合、高度に連鎖不平衡にある所与の集団内のそれらの部位（すなわち、Ｄ’の絶対値≧０．８又はｒ２≧０．８）は、目的の（すなわち、目的の前記状態と関連する）アレルの個性を予測するのに潜在的に有用である。或いは、高度の連鎖不平衡は、Ｄ’の絶対値≧０．８５若しくはｒ２≧０．８５によって、又は、Ｄ’の絶対値≧０．９又はｒ２≧０．９によって表されてもよい。したがって、高度にＬＤにある二つのＳＮＰｓは、目的のアレル又は疾患アレルの個性を判定するのに同等に有用で有り得る。それゆえ、一つのＳＮＰのアレルの個性を知ることは、ＬＤにあるもう一つのＳＮＰにおけるアレルの個性を代理しているものと想定してよい。例えば、本ハプロタイプマップが形成される元となった集団において、配列番号１の位置５３１８のＳＮＰは、配列番号１の位置４００７とＬＤにあり、そのため、該５３１８の遺伝子型がＡである場合は該４００７の遺伝子型はＣである。したがって、この単一遺伝子座の前記遺伝子型の判定は、それとＬＤにある任意の遺伝子座の前記遺伝子型の個性を提供し、より高い連鎖不平衡にあるほど恐らく二つのＳＮＰｓは互換的に使用されてよい。
【００６１】
多数の部位が前記トロンボモジュリン配列内の多型部位として同定されてもよいが、それらの多型は、配列番号１の位置５３１８の前記多型と連鎖しそれ故に被験者の予後の指標と成り得てもよい。配列番号１の前記位置４００７は、配列番号１の位置５３１８とＬＤにあることが示されている。
【００６２】
更に連鎖したＳＮＰ部位が判定され得ることが当業者に認識されるであろう。ＴＨＢＤについての前記ハプロタイプが、予想極大化アルゴリズムを有するプログラム（すなわちＰＨＡＳＥ）を用いて、正常被験者における前記ＴＨＢＤ配列の前記ＳＮＰｓ又はＴＨＢＤ配列を調べることにより創出され得る。構築されたＴＨＢＤハプロタイプは、配列番号１の位置５３１８又は位置４００７と連鎖不平衡（ＬＤ）にあるＳＮＰｓの組み合わせを見出すために使用されてよい。そのため、個体の前記ハプロタイプは、配列番号１の位置５３１８又は位置４００７とＬＤにある他のＳＮＰｓを遺伝子型判定することにより判定され得る。連鎖する一塩基多型部位又は組み合わされた多型部位もまた、被験者の予後の評価のために遺伝子型判定され得る。
【００６３】
配列内の多型位置の数的命名は、上掲のChao et al. (2004); Park et al. (2002); Wu et al. (2001); 及び、 Norlund et al. (1997) において同じ多型が異なる番号付けで表されているように、番号の付け方や選ばれた配列に依存して異なる命名がなされてよいことは、当業者には認識されるであろう。更に、挿入又は欠失のような集団内の配列変異により、相対的位置が変化し得、そして、多型部位における及びその周囲の特定のヌクレオチドについての数的命名が変化し得る。
【００６４】
ヒト トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）配列の代表的なものは、本書で配列番号１として規定され、アクセッション番号ＡＦ４９５４７１としてＧｅｎＢａｎｋに収載された配列を含む。配列番号１の位置５３１８、４００７、５１１０及び６２３５の多型部位、並びに、配列番号１の位置５３１８、４００７、５１１０及び６２３５の主要な及び主要でないアレルは以下の通りである：
位置５３１８において、該最もよく見られるヌクレオチド（主要なアレル）はａであり、該主要でないアレルはｃであり、
位置４００７において、該最もよく見られるヌクレオチド（主要なアレル）はｃであり、該主要でないアレルはｔであり、
位置５１１０において、該最もよく見られるヌクレオチド（主要なアレル）はａであり、該主要でないアレルはｇであり；及び、
位置６２３５において、該最もよく見られるヌクレオチド（主要なアレル）はａであり、該主要でないアレルはｇである。
【００６５】
下の表１Ａは、前記配列Ｍ及びＹの夫々内で且つ前記遺伝子内の、関連するＳＮＰ位置に加えて、ＴＨＢＤのＳＮＰｓ Ａ５３１８Ｃ（ｒｓ３１７６１２３）及びＣ４００７Ｔ（ｒｓ１０４２５７９）の隣接配列を示している。表１Ａには、その主要でないアレル頻度も示す。
【００６６】
【表１−Ａ】
2007525980.tif 000003
【００６７】
上の表１Ａ内の及び配列番号１内の所与の配列は、当業者がプライマー及びプローブ又はＴＨＢＤ ＳＮＰアレル及び／又は本書に記載されたような遺伝子型を同定するための他のオリゴヌクレオチドを設計するのに有用であろう。
【００６８】
下の表１Ｂは、トロンボモジュリンＳＮＰｓと、炎症状態から回復する能力又は予測される患者結果を表す値との関連を示している。しかし、前記炎症状態患者スコアが優性／劣性の関係にあるかもしれず、それによりヘテロ接合体はホモ接合体の者と同じスコアとなることも、当業者に認識されるであろう。前記関係は、テストされる集団に依存し得る。
【００６９】
【表１−Ｂ】
2007525980.tif 000004
【００７０】
「アレル（対立遺伝子）」は、染色体上の特定の遺伝子座における所与の遺伝子の１以上の変わり得る任意の型として定義される。異なるアレルは、髪の色又は血液型のような遺伝する形質における変異を形成する。二倍体細胞又は生物においては、アレル対のメンバー（即ち、所与の遺伝子の２つのアレル）は、一対の相同染色体において対応する位置（座位ないし遺伝子座）を占有する。特定の遺伝子に関し、これらアレルが遺伝的に同一であれば、当該（二倍体）細胞又は生物は「ホモ接合体」と指称され、遺伝的に異なる場合は、当該（二倍体）細胞又は生物は「ヘテロ接合体」と指称される。一個体において、アレルの一つの型（主要な）は、もう一つの型（主要でない）よりも、多く発現されてよい。「遺伝子」が単純にヌクレオチド配列の区域として見なされる場合、アレルとは、該配列の特定位置における変化し得るヌクレオチドの各々である。例えば、ＣＣＴ［Ｃ／Ｔ］ＣＣＡＴのようなＣＴ多型は、Ｃ及びＴの二つのアレルを有する。
【００７１】
「遺伝子」は、特定の機能的産物をコードする特定の染色体の特定の位置に位置するヌクレオチドの規則正しい配列であるが、当該コード領域に近接する非翻訳・非転写配列も含み得る。そのような非コード配列は、コード配列の転写・翻訳に必要な制御配列又はイントロン等を含み得る。
【００７２】
「遺伝子型」は、生物の遺伝的構成として定義されるが、通常特定の状態と関連する１つの遺伝子又は２〜３の遺伝子又は１つの遺伝子の１つの領域（例えば、特定の表現型の原因をなす遺伝子座）に関する。遺伝子領域は、一塩基多型の場合には、単一のヌクレオチドと同じ小部分で有り得る。
【００７３】
「表現型」は、生物の観察可能な性質として定義される。
【００７４】
「一塩基多型」（ＳＮＰ：スニップ）は、１つの塩基によって占有される多型性部位において生じるが、これは、複数のアレル配列間で相違する部位に相当する。この部位の前後には、通常、アレルの高保存配列（例えば、母集団の１／１００ないし１／１０００未満の構成員において変化する配列）が存在する。一塩基多型は、通常、多型性部位における１つの塩基の他の塩基による置換によって生じる。「トランジション」は、１つのプリンの他の１つのプリンによる置換又は１つのピリミジンの他の１つのピリミジンによる置換である。「トランスバージョン」は、１つのプリンの１つのピリミジンによる置換又は１つのピリミジンの１つのプリンによる置換である。また、一塩基多型は、基準アレル（reference allele）に関連する１つのヌクレオチドの削除（「−」又は「ｄｅｌ」によって表す）又は１つのヌクレオチドの挿入（「＋」又は「ｉｎｓ」によって表す）からも生じ得る。更に、所与の配列内における挿入又は削除により、相対的な位置関係が変化され、従って当該配列内における他の多型の位置番号も変化し得ることは、当業者であれば認識できるであろう。
【００７５】
「全身性炎症反応症候群」ないし（ＳＩＲＳ）は、敗血性全身性炎症反応（即ち、敗血症ないし腐敗症又は敗血性ショック）及び非敗血性全身性炎症反応（即ち、術後の反応）の両者を含むものとして定義される。「ＳＩＲＳ」は、更に、ＡＣＣＰ（アメリカ胸部内科学会）ガイドラインに応じ、（Ａ）温度＞３８℃又は＜３６℃、（Ｂ）心拍数＞９０拍／分、（Ｃ）呼吸数＞２０息／分、及び、（Ｄ）白血球数＞１２，０００／ｍｍ３又は＜４，０００／ｍｍ３の条件のうちの２又は３以上が存在するものとして定義される。以下の記載においては、「ＳＩＲＳ」基準のうちの２つ、３つ又は４つの存在が、２８日間の観察期間の間毎日記録された。
【００７６】
「敗血症ないし腐敗症（sepsis）」は、少なくとも２つの「ＳＩＲＳ」基準の存在として定義され、既知の又は疑いのある感染源である。敗血症ショックは、腐敗症と、ブリュッセル基準による１つの更なる臓器の機能不全と、昇圧剤投与の必要性との３つによって定義されている。
【００７７】
本書で使用する場合の患者の結果又は予後とは、炎症状態から回復する患者の能力ないし可能性をいうものとする。炎症状態は、腐敗症、敗血症、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺障害、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、臓器若しくは組織の虚血‐再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法若しくは放射線療法に起因する組織傷害、及び、経口摂取された、吸入された、注入された、注射された若しくは送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染、日和見感染、及び、大手術若しくは透析を受ける患者、免疫無防備状態の患者、免疫抑制剤を投与された患者、ＨＩＶ／エイズの患者、疑わしい心内膜炎の患者、発熱した患者、未知の原因で発熱した患者、嚢胞性線維症の患者、糖尿病の患者、慢性腎不全の患者、気管支拡張の患者、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫若しくは喘息の患者、熱性好中球減少の患者、髄膜炎の患者、敗血性関節炎の患者、尿路感染の患者、壊死性筋膜炎の患者、他の疑わしいグループＡ連鎖球菌感染の患者、脾臓摘出を受けた患者、再発性若しくは疑わしい腸球菌感染の患者に対して、感染リスクの増大と関係するその他の内科的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、髄膜炎菌血症、ポスト−ポンプ症候群、心臓機能不全症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疸、毒素ショック症候群、放線菌の結核、カリニ肺炎、肺炎、レーシュマニア症、溶血性尿毒症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング熱、骨盤炎症性疾病、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、ＥＢウイルス、脳炎、 関節リウマチ、骨関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾病、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過感受性間質性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症を含む炎症性及び自己免疫性の疾病、 心臓、肝臓、肺、腎臓及び骨髄を含む移植、 移植片対宿主疾病、移植(片)拒絶反応、鎌形赤血球貧血、ネフローゼ性症候群、ＯＫＴ３のような有毒性薬剤、サイトカイン療法、及び、硬変 からなる群から選択され得る。
【００７８】
被験者結果又は予後の評価は、種々の方法で実行することができる。例えば、“ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ”スコアは、Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（急性生理機能及び慢性健康評価）として定義され、本書においては、生の臨床及び実験変数（データ）から毎日計算した。ヴィンセント（Vincent JL. Ferreira F. Moreno R., systems for assessing organ dysfunction and survival. Critical Care Clinics. 16:353-366, 2000）は、ＡＰＡＣＨＥスコアについて以下のように要約している：「（ＡＰＡＣＨＥスコアは）１９８１年、クナウス（Knaus）et al.によって初めて開発された。ＡＰＡＣＨＥスコアは、世界中で最も一般的に使用されるＩＣＵ生存予測モデルとなった。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアは、オリジナルのプロトタイプを修正・簡略化したバージョンであるが、１２の常用生理学的尺度の初期値、年齢及び以前の健康状態に基づいたポイントスコアを使用して、疾患の重症度の一般的尺度を提供する。記録される値（複数）は、ＩＣＵにおける被験者の最初の２４時間の間に得られる最悪の値（複数）である。スコアは、疾患特異的死亡率（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ予測致死リスク）を評価するために、３４の入院診断の１つに適用される。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアの可能な最大値は７１であり、大きなスコアは、死亡との関連性が大きかった。ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアは、臨床試験に入る際の疾患の重症度により、腐敗症の被験者を含む重病被験者の種々のグループ間での等級分類及び比較のために広く使用された」。
【００７９】
「ブリュッセルスコア」スコアは、ベースラインと比較した臓器の機能障害を評価するための方法である。ブリュッセルスコアが２以上の場合（即ち、中度、重度、又は極重度）、臓器不全が、その特定の日に存在するものとして記録された（後掲 表２Ａ参照）。以下の記載では、観察期間中の死亡を補正するために、生存しており且つ臓器不全から免れている日数（ＤＡＦ）が、以前に記載した方法で計算された。例えば、急性肺障害は、以下のようにして計算された。急性肺障害は、被験者が以下の４つの基準を全て充足した場合に存在するものとして定義される。この４つの基準とは、１）機械による人工呼吸の必要、２）急性肺障害と一致する胸部Ｘ線写真における両側の肺の浸潤（の存在）、３）ＰａＯ２／ＦｉＯ２比が３００未満、４）鬱血性心不全の臨床的証拠の不存在又は肺動脈カテーテルが臨床目的のために適用される場合、肺毛細管楔入圧が１８ｍｍＨｇ（１）未満、である。急性肺障害の重症度は、２８日間の観察期間にわたって生存しており且つ急性肺障害から免れている日数を測定することによって評価される。急性肺障害は、前記ヒトがブリュッセルスコアで定義されるような中度、重度又は極重度の機能障害を有する日毎に存在するものとして記録される。生存しており且つ急性肺障害から免れている日数は、所定の観察期間（２８日間）の間に急性肺障害が発症した後で被験者が生存しており且つ急性肺障害を免れている日数として計算される。従って、生存しており且つ急性肺障害から免れている日数のより低いスコアは、急性肺障害がより深刻であることを示す。生存しており且つ急性肺障害から免れている日数が、急性肺障害の単なる存在又は不存在よりも好まれる理由は、急性肺障害は急性死亡率が大きく、（２８日以内の）早期の死亡は死亡した被験者における急性肺障害の存在又は不存在の計算を妨げることである。心血管系、腎臓、神経系、肝臓及び凝固の機能障害は、前記ヒトがブリュッセルスコアによって定義されるような中度、重度又は極重度の機能障害を有する日毎に存在するものとして同様に定義された。生存しており且つステロイドから免れている日数は、ヒトが生存し且つ外因性副腎皮質ステロイド（例えば、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン）で治療されていない日数である。生存しており且つ昇圧剤から免れている日数は、ヒトが生存し且つ静脈内昇圧剤（例えば、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリン、フェニレフリン）で治療されていない日数である。生存しており且つ国際標準化比（ＩＮＲ：International Normalized Ratio）＞１．５から免れている日数は、ヒトが生存し且つＩＮＲ＞１．５ではない日数である。
【００８０】
【表２−Ａ】
2007525980.tif 000005
【００８１】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）は、測定のセット間の統計的有意差を試験するための標準的な統計的手法である。
【００８２】
フィッシャー正確検定は、異なるグループにおいて測定された特徴の比率及び割合の間の統計的有意差を試験するための標準的な統計的手法である。
【００８３】
２． 一般的方法
本発明の一側面は、炎症状態の発症の危険を有するか又は既に炎症状態を有する被験者の同定ないし被験者の選択を含み得る。例えば、大手術を受けた又は大手術の予定ないし計画のある被験者は、炎症状態の発症の危険があるとみなすことができる。更に、被験者は、医療分野で既知の診断方法及び臨床評価を用いて炎症状態を有すると決定されてもよい。炎症状態は、腐敗症、敗血症、肺炎、敗血症ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺障害、吸引間質性肺炎（aspiration pneumanitis）、感染、膵炎、菌血症、腹膜炎、腹部膿瘍、外傷に起因する炎症、手術に起因する炎症、慢性炎症疾患、虚血、臓器若しくは組織の虚血‐再灌流損傷、疾患に起因する組織傷害、化学療法若しくは放射線療法に起因する組織傷害、及び、経口摂取された、吸入された、注入された、注射された若しくは送達された物質に対する反応、糸球体腎炎、腸感染、日和見感染、及び、大手術若しくは透析を受ける患者、免疫無防備状態の患者、免疫抑制剤を投与された患者、ＨＩＶ／エイズの患者、疑わしい心内膜炎の患者、発熱した患者、未知の原因で発熱した患者、嚢胞性線維症の患者、糖尿病の患者、慢性腎不全の患者、気管支拡張の患者、慢性閉塞性肺疾患、慢性気管支炎、肺気腫若しくは喘息の患者、熱性好中球減少の患者、髄膜炎の患者、敗血性関節炎の患者、尿路感染の患者、壊死性筋膜炎の患者、他の疑わしいグループＡ連鎖球菌感染の患者、脾臓摘出を受けた患者、再発性若しくは疑わしい腸球菌感染の患者に対して、感染リスクの増大と関係するその他の内科的及び外科的状態、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌敗血症、髄膜炎菌血症、ポスト-ポンプ症候群、心臓機能不全症候群、脳卒中、うっ血性心不全、肝炎、喉頭蓋炎、大腸菌０１５７：Ｈ７、マラリア、ガス壊疸、毒素ショック症候群、子癇前症、子癇、ＨＥＬＰ症候群、放線菌の結核、カリニ肺炎、肺炎、レーシュマニア症、溶血性尿毒症候群／血栓性血小板減少性紫斑病、デング熱、骨盤炎症性疾病、レジオネラ、ライム病、インフルエンザＡ、ＥＢウイルス、脳炎、 関節リウマチ、汎発性強皮症、骨関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾病、特発性肺線維症、サルコイドーシス、過感受性間質性肺炎、全身性血管炎、ウェゲナー肉芽腫症を含む炎症性及び自己免疫性の疾病、 心臓、肝臓、肺、腎臓及び骨髄を含む移植、 移植片対宿主疾病、移植(片)拒絶反応、鎌形赤血球貧血、ネフローゼ性症候群、ＯＫＴ３のような有毒性薬剤、サイトカイン療法、及び、硬変 から成る群より選択され得る。
【００８４】
被験者が炎症状態を発症する危険を有するか又は既に有していると同定されると、遺伝子配列情報は、当該被験者から得ることができる。或いは、遺伝子配列情報は、当該被験者から既に（上記同定前に）得られたものであってもよい。例えば、被験者は、他の目的のための生物学的試料を既に提供していてもよく、全部又は一部が決定されかつ将来の使用のために保存された遺伝子配列を有していてもよい。遺伝子配列情報は、種々の異なる方法で得ることができ、遺伝物質を含有する生物学的試料の採取を伴ってもよい。とりわけ、遺伝物質は、１又はそれ以上の目的の配列を含み得る。身体試料を採取するための及び当該試料から遺伝物質を抽出するための多くの方法が当業者には知られている。遺伝物質は、血液、組織及び毛髪及びその他の試料から抽出することができる。生物物質からＤＮＡ及びＲＮＡを分離単離するための方法は多数知られている。典型的には、ＤＮＡは生物試料から単離され得る。この場合、まず生物試料が溶解され、次いで時間の長さが変化可能な種々の多段階プロトコールの何れか１つに応じてライセートからＤＮＡが単離される。ＤＮＡ単離法は、フェノールの使用を伴い得る（サンブルック（Sambrook J.）et al., "Molecular Cloning", Vol.2, pp.9.14-9.23, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)及びAusubel, Frederick. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Vol.1, pp. 2.2.1-2.4.5, John Wiley & Sons, Inc. (1994)）。典型的には、生物試料を界面活性剤溶液で溶解し、ライセートのタンパク質成分を１２〜１８時間タンパク質分解酵素で消化する。次に、ライセートをフェノールで抽出して細胞成分の大部分を除去し、残余の水相を更に処理してＤＮＡを単離する。ヴァンネス（Van Ness）et al.（米国特許第5,130,423号）に記載されたような他の方法では、非腐食性フェノール誘導体を用いて核酸を単離する。得られた調製物は、ＲＮＡとＤＮＡの混合物である。
【００８５】
ＤＮＡ単離の他の方法では、非腐食性カオトロピック試薬を用いる。この方法は、グアニジン塩、尿素及びヨウ化ナトリウムの使用を基礎とするのであるが、カオトロピック水溶液中での生物試料の溶解及びそれに続く低級アルコールによる未精製ＤＮＡフラクションの沈殿を伴う。沈殿された未精製ＤＮＡフラクションの最終精製は、カラムクロマトグラフィー（アナレクツ（Analects）, (1994) Vol. 22, No.4, ファルマシア・バイオテック社）又はコーラー（Koller）（米国特許第5,128,247号）に記載されたような未精製ＤＮＡのポリアニオン含有タンパク質への曝露を含む幾つかある方法のうち何れか１つによって達成することができる。
【００８６】
ボットウェル（Botwell）, D.D.L.（Anal. Biochem. (1987) 162: 463-465）に記載されているＤＮＡ単離の更なる方法は、６Ｍ塩酸グアニジン中における細胞の溶解、２．５倍量のエタノールの添加による酸性ｐＨでのライセートからのＤＮＡの沈殿、及びエタノールでのＤＮＡの洗浄を伴う。
【００８７】
チョムジンスキー（Chomezynski）（米国特許第５，９４５，５１５号）によって記載された方法のような、ＲＮＡとＤＮＡの両方を単離するための他の方法も当業者には数多く知られている。チョムジンスキーの方法では、僅かに２０分程度で遺伝物質を効率的に抽出することができる。エバンズ（Evans）とヒュー（Hugh）（米国特許第５，９８９，４３１号）は、中空膜フィルターを用いたＤＮＡの単離方法を記載している。
【００８８】
被験者の遺伝子配列情報が当該被験者から得られたら、当該情報に対し、ＴＨＢＤ配列中の１以上の多型の個性又は遺伝子型を検出ないし決定するために更に評価を行うことができる。得られた遺伝物質が目的の配列を含有するとすれば、とりわけ、目的の被験者の前記ＴＨＢＤ遺伝子型であって配列番号１の位置５３１８又は配列番号１の位置４００７に対応する（１つの）ヌクレオチドを含む遺伝子型の決定に関心がもたれるであろう。また、この目的の配列は、更に、他のＴＨＢＤ遺伝子多型を含み得、又は目的の多型を包囲する配列の幾つかを含み得る。ヌクレオチド個性の検出若しくは決定、又は１以上の一塩基多型の遺伝子型決定（ＳＮＰ遺伝子型決定）は、当業者には既知の多数の方法ないしアッセイの任意の１つによって達成することができる。多くのＤＮＡ遺伝子型判定の方法論は、アレルの識別及びＳＮＰｓの検出に有用である。更に、アレル識別の反応又はアッセイは、１以上の検出方法により検出されてもよい。前記の大部分のＳＮＰ遺伝子型判定の反応又はアッセイは、４つの広範なグループ（アレル特異的ハイブリッド形成法、プライマー伸長法、オリゴヌクレオチド連結、及び、侵入型切断）のうちの１つに該当し得る。さらに、各々の型の反応産物を分析／検出する多数の方法が存在する（例えば、蛍光、発光、質量測定、電気泳動法等）。更に、反応は、溶液中で、又は、スライドガラス、チップ、ビーズ等のような固形支持体上で生じ得る。
【００８９】
一般に、アレル特異的ハイブリッド形成法は、ハイブリッド形成法により、一つのヌクレオチド位置において相違する二つのＤＮＡ標的間の差異を識別し得るハイブリダイゼーションプローブを含む。通常、プローブは、該プローブ配列の中心位置に多型性塩基があるように設計され、それにより、最適化されたアッセイ条件下で、完全に対応するプローブ標的ハイブリッドは安定であり、１塩基のミスマッチがあるハイブリッドは不安定となる。結合の検出及びアレルの識別の戦略は「分子標識（molecular beacon）」の使用であり、それにより、ハイブリダイゼーションプローブ（分子標識）は３’及び５’レポーター並びに消光剤分子を有し、介在配列に対する適切な結合標的を欠くような相補的な３’及び５’配列の該プローブは、ヘアピンループを形成するであろう。前記ヘアピンループは前記レポーターと消光剤とを近接させ、その結果フルオロフォア（レポーター）の消光がもたらされ蛍光の発光が減少する。しかしながら、前記分子標識が前記標的にハイブリッド形成した場合は前記フルオロフォアと消光剤が十分に分離され蛍光が前記フルオロフォアから発光される。
【００９０】
同様に、プライマー伸長反応法（すなわちミニ配列決定、アレル特異的伸長、又は、単純ＰＣＲ増幅）は、アレルの識別反応において有用である。例えば、ミニ配列決定において、プライマーは、ＳＮＰのすぐ上流にあるその標的ＤＮＡにアニールし、そして、多型性部位に相補的な単一ヌクレオチドへと伸長する。前記ヌクレオチドが相補的でない場合、伸長は起こらない。
【００９１】
オリゴヌクレオチド連結アッセイは、ＳＮＰごとに二つのアレル特異的プローブと一つの共通連結プローブを必要とする。前記共通連結プローブは、アレル特異的プローブに隣接してハイブリッド形成し、適切なアレル特異的プローブの完全対応がある場合には、連結酵素がアレル特異的プローブと前記共通プローブとを結合させる。完全対応でない場合には、前記連結酵素が前記アレル特異的プローブと前記共通プローブとを結合させることが出来ない。
【００９２】
或いは、侵襲性切断法は、インベーダープローブと呼ばれるオリゴヌクレオチドと、１ヌクレオチドの重複で前記標的ＤＮＡにアニールするアレル特異的プローブとを、必要とする。前記アレル特異的プローブが前記多型性部位に相補的である場合、前記インベーダーオリゴヌクレオチドの３’末端の重複は、前記アレル特異的プローブの５’腕を遊離するフラップ エンドヌクレアーゼによって認識及び切断される構造を形成する。
【００９３】
５’エキソヌクレアーゼ活性又はＴａｑＭａｎ（商標）アッセイ（Applied Biosystems）は、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性に基づいている（ここで、該ポリメラーゼは、前記標的ＤＮＡとハイブリッド形成し且つ蛍光シグナルを生成するオリゴヌクレオチドプローブを、置換及び切断する）。前記多型部位において異なる二つのプローブが必要となる（但し、一つのプローブは前記主要なアレルに相補的であり前記他のプローブは前記主要でないアレルに相補的である）。これらのプローブが、該プローブの蛍光を消光するために蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）により前記フルオロフォアと相互作用する無傷の前記消光剤である場合には、該プローブは、前記５’末端に付着する異なる蛍光色素と前記３’末端に付着する消光剤とを有している。前記ＰＣＲアニーリング過程の間に、前記ハイブリダイゼーションプローブは、標的ＤＮＡとハイブリッド形成する。前記伸長過程において、前記５’蛍光色素は、Ｔａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記レポーター色素の蛍光の増大がもたらされる。ミスマッチなプローブは、断片無しに置換される。ミスマッチなプローブは、断片化無しに置換される。試料の前記遺伝子型は、二つの異なる色素の前記シグナル強度の測定により、判定される。
【００９４】
アレルの識別及び検出のための多数の他の方法が当業者既知であることが認識されることであろうし、また、それらのうち幾つかは以下に詳述する。配列プライマー伸長法ミニ配列決定、タグマイクロアレイ、及び、アレル特異的伸長法、のような反応が、マイクロアレイにおいて実行可能であることも認識されるであろう。そのようなアレイに基づいた一つの遺伝子型判定プラットフォームが、微粒子ベースtag-itハイスループット遺伝子型判定アレイである（Bortolin S. et al. Clinical Chemistry (2004) 50 (11): 2028-36）。この方法は、ゲノムＤＮＡを、アレル特異的伸長プライマーとユニバーサルタグ付加遺伝子型判定プライマーのＰＣＲにより増幅する。そして、その産物を、tag-itアレイ上で仕分けし、Ｌｕｍｉｎｅｘ ｘＭＡＰシステムを用いて検出する。
【００９５】
ＳＮＰ遺伝子型判定法は以下を含むがこれらに限定されるものではない：
【００９６】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）ストラテジー ―ＲＦＬＰゲル解析は、１つの遺伝子の複数の多型部位における複数のアレル間の識別に使用することができる。要約すれば、ＤＮＡの短セグメント（典型的には数百塩基対）をＰＣＲで増幅する。可能であれば、一方の変異体アレルが存在すれば該短ＤＮＡセグメントを切断し、他方の変異体アレルが存在すれば該短ＤＮＡセグメントを切断しない特異的な制限酵素が選択される。この制限酵素で、ＰＣＲ増幅したＤＮＡをインキュベートした後、反応生成物をゲル電気泳動法を用いて分離する。そのため、このゲルを検査したとき現れる２つのより低分子量のバンド（電気泳動中、分子は、分子量がより小さいほど一層下方にゲル内を進行する。）は、元のＤＮＡ試料が選択された制限酵素によって切断可能なアレルを有していたことを示す。これに対し、（ＰＣＲ産物の分子量に関し）より大きい分子量のバンドが１つしか観察されない場合は、もとのＤＮＡ試料は、選択された制限酵素によっては切断不能なアレル変異体を有していたことを示す。最後に、より大きい分子量の１つのバンドとより小さい分子量の２つのバンドの両方が観察される場合は、元のＤＮＡ試料は、両方のアレルを含んでいた、従って、被験者はこの一塩基多型に対しヘテロ接合体であったことを示す；
【００９７】
シークエンシング（塩基配列決定法） ―例えばシークエンシングのためのマクサム−ギルバート法（マクサムAM及びギルバートW. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74(4): 560-564）は、末端で標識されたＤＮＡの特異的化学的切断を伴う。この方法では、標識された同じＤＮＡの４つの試料が、それぞれ異なる化学反応にかけられて、特異的な塩基個性の１又はそれ以上のヌクレオチドにおいてＤＮＡ分子の優先的な切断が実行される。部分的切断のみが得られるように条件ないし状態が調節されるため、ＤＮＡフラグメントは各試料において生成されるが、その長さは、当該切断にかけられる（１又は複数の）ヌクレオチドのＤＮＡ塩基配列内での位置に依存する。部分的切断が行われた後、各試料は、異なる長さのＤＮＡフラグメントを含むが、各フラグメントは、４つのヌクレオチドのうちの同じ１又は２のフラグメントで終端する。とりわけ、第１の試料では、個々のフラグメントはＣで終端し、第２の試料では、個々のフラグメントはＣ又はＴで終端し、第３の試料では、それぞれＧで終端し、第４の試料では、それぞれＡ又はＧで終端する。これら４つの反応の産物が、ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によりサイズによって分離されるならば、ＤＮＡ配列は、放射性バンドのパターンから読み取ることができる。この方法により、標識部位から少なくとも１００塩基のシークエンシングが可能となる。他の方法としては、サンガー等によって刊行されたシークエンシングのジデオキシ法（Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74(12): 5463-5467）がある。サンガー法は、ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性に基づいて種々の長さの配列依存性フラグメントを合成する。フラグメントの長さは、ジデオキシヌクレオチド塩基特異的ターミネーターのランダム導入によって決定される。次に、これらのフラグメントは、マクサム−ギルバート法の場合のようにゲルで分離され、視覚化され、配列が決定される。これらの方法を洗練しシークエンシング手順を自動化するために様々な改良が試みられた。また、ＲＮＡシークエンシング法も知られている。例えば、脳心筋炎ウイルスＲＮＡのシークエンシングのためにジデオキシヌクレオチドと共に逆転写酵素が使用された（ツィンメルン（Zimmern）D.及びケースベルク（kaesberg）P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75(9): 4257-4261）。ミルズ（Mills）DR.及びクラーマー（Kramer）FR.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76(5): 2232-2235）は、連鎖停止反応機構においてＲＮＡのシークエンシングを行うためのＱβレプリカーゼ及びヌクレオチドアナログイノシンの使用を記載している。ＲＮＡシークエンシングのための直接的化学的方法も知られている（ピアッティ（Peattie）DA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1979) 76(4): 1760-1764）。その他の方法としては、例えば、ドニス（Donis）−ケラー（Keller）et al.（1977, Nucl. Acids Res. 4: 2527-2538）、シモンクシッツ（Simoncsits）A. et al.（Nature (1977) 269(5631): 833-836）、アクセルロッド（Axelrod）VD. et al.（Nucl. Acids Res. (1978) 5(10): 3549-3563）、及びクラーマーFR.及びミルズDR.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75(11): 5334-5338）等がある。これらの文献は、引用を以って本書に繰り込み、ここに記載されているものとする。核酸配列は、レーザーによって切断されたヌクレオチドの自然蛍光の刺激によって読み取ることもでき���が、このシングルヌクレオチドは蛍光増強マトリックスに含有されている（米国特許第5,674,743号）；
ミニ配列決定反応においては、ＳＮＰに隣接した標的ＤＮＡにアニールするプライマーが、ＤＮＡポリメラーゼによって、前記多型部位に相補的な単一ヌクレオチドに、伸長する。この方法は、ＤＮＡポリメラーゼによる、ヌクレオチド取り込みの高度な正確さに基づく。前記プライマー伸長産物を解析するための様々な技術が存在する。例えば、前記ミニ配列決定反応における標識された若しくは非標識のヌクレオチド、ｄＮＴＰと組み合わされたｄｄＮＴＰ、又は、ｄｄＮＴＰ単独の使用は、前記産物の検出のために選択される方法に依存する；
【００９８】
ＳＮＰｓ同定のためのハイブリダイゼーション法については、米国特許第6,270,961号及び同第6,025,136号に記載されている；
【００９９】
鋳型指向性色素ターミネーター取込蛍光分極検出（template-directed dye-terminator incorporation with fluorscent polarization-detection）(ＴＤＩ−ＦＰ)法は、（FREEMAN BD. et al. J Mol Diagnostics (2002) 4 (4): 209-215）によって、大規模スクリーニングについて記載されている;
【０１００】
オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）―は、ポリメラーゼ連鎖反応単位複製配列ストランドにアニールしたプローブと検出用オリゴヌクレオチドのライゲーションに基づき、酵素免疫法により検出される（ビヤエルモサ（Villahermosa）ML. J Hum Virol (2001) 4(5): 238-48; ロンパネン（Romppanen）EL. Scand J Clin Lab Invest (2001) 61(2): 123-9; イアノネ（Iannone）MA. et al. Cytometry (2000) 39(2): 131-40）；
【０１０１】
ライゲーション−ローリングサークル増幅法（Ｌ−ＲＣＡ）もまた、チー（Qi）X. et al. Nucleic Acids Res (2001) 29(22): E116に記載されているように、一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用することができた；
【０１０２】
５’ヌクレアーゼアッセイもまた、一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用することができた（アイディン（Aydin）A. et al. Biotechniques (2001) (4): 920-2, 924, 926-8）；
【０１０３】
ポリメラーゼプルーフリーディング法は、ＷＯ ０１８１６３１に記載されているように、ＳＮＰｓの個性の決定に使用される；
【０１０４】
酵素増幅‐電子的変換による一塩基対変異の検出（Detection of single base pair DNA mutations by enzyme-amplified electronic transduction）は、PATOLSKY F et al. Nat Biotech. (2001) 19 (3): 253-257で、記載されている；
【０１０５】
ジーンチップ技術もまた、一塩基多型識別において知られており、これにより多数の多型を単一アレイ上で同時に調べることが可能である（EP 1120646 and Gilles PN. etal.Nat. Biotechnology (1999) 17 (4): 365-70）；
【０１０６】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化法−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計もまた、マイクロシークエンス産物の解析を介して一塩基多型の遺伝子型判定において有用である（Haff LA. and Smirnov IP. Nucleic Acids Res. (1997) 25 (18): 3749-50； Haff LA. and Smirnov IP. Genome Res. (1997) 7: 378-388； Sun X. et al. Nucleic Acids Res. (2000) 28 e68; Braun A. et al. Clin. Chem. (1997) 43: 1151-1158； Little DP. et al. Eur.J. Clin. Chem. Clin. Biochem. (1997) 35: 545-548； Fei Z. et al. Nucleic Acids Res. (2000) 26: 2827-2828； 及び、Blondal T. et al.Nucleic 
Acids Res. (2003) 31 (24):e155）；又は
【０１０７】
アレル特異的ＰＣＲ法もまた一塩基多型の遺伝子型決定に首尾よく使用することができた（ホーキンス（Hawkins）JR. et al. Hum Mutat (2002) 19(5): 543-553）。
【０１０８】
また、被験者の配列データが既に分かっている場合には、（遺伝情報の）獲得は、当該被験者の核酸配列データをデータベースから検索し、多型部位における当該被験者の核酸配列を読み取ることにより当該多型部位における核酸又は遺伝子型の個性を決定ないし検出することを含んでもよい。
【０１０９】
前記１又は複数の多型の個性が決定ないし検出されると、当該目的多型の前記遺伝子型（前記位置における前記ヌクレオチド）に基づき被験者結果ないし予後に関する指標又は炎症状態から回復する被験者の能力の指標が得られてよい。本発明では、トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）配列における多型が、予後を得るために又は前記被験者が炎症状態から回復する能力に関して判定するために使用される。被験者の予後を判定するための方法又は被験者スクリーニングのための方法は、炎症状態から回復する被験者の能力（ないし可能性）を判定するために有用であり得る。また、単独の多型部位又は複数の多型部位の組み合わせは、それらが炎症状態から回復する被験者の能力を示すものとして判定された多型と連鎖しているならば、炎症状態から回復する被験者の能力の指標として使用することも可能である。前記方法は、更に、多型について判定された遺伝子型と既知遺伝子型との比較を含んでもよい（該比較は、被験者について同じ炎症状態又は別の炎症状態から回復する予後を示す）。したがって、炎症状態から被験者が回復する能力についての判定は、前記多型部位について判定された遺伝子型に基づいてなされてよい。
【０１１０】
被験者結果ないし予後が決定されると、そのような情報は、可能な治療方針の選択を支援し、被験者をモニターすべき程度及び当該モニターの頻度の決定に役立つので、内科医及び外科医によって関心が持たれ得る。究極的には、治療の決定は、特定の被験者に特異的な要因及び被験者の治療に携わる内科医又は外科医の経験に基づく要因の両方に応じてなされ得る。
【０１１１】
改善された応答には、前記治療剤の投与に続く改善を含んでもよく、それにより、前記被験者は、生存可能性の増加、臓器障害若しくは臓器不全（ブリュッセルスコア）の可能性の減少、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアの改善、生存していて且つ昇圧剤、変力作用薬（イノトロープ）から免れている日数（の改善）、及び、全身性機能障害（心血管の、呼吸性、人工呼吸の、中枢神経系の、凝固［ＩＮＲ＞１．５］、腎臓の、及び／又は、肝臓の）の減少に至る。
【０１１２】
上述のように、遺伝子配列情報ないし遺伝子型情報は（一つの）被験者から獲得可能であるが、該配列情報は、ＴＨＢＤ遺伝子中の１又はそれ以上の一塩基多型部位を含む。同様に、上述したように、１又はそれ以上の被験者の、ＴＨＢＤ遺伝子における１又はそれ以上の一塩基多型の配列個性も検出ないし決定することができる。更に、被験者結果ないし予後は、上述のように、評価することができる。例えば、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアリングシステム又はブリュッセルスコアを使用して、治療前後における被験者のスコアを比較することにより、被験者結果ないし予後を評価することができる。被験者結果ないし予後が評価されたら、被験者結果ないし予後は、１以上の一塩基多型配列の個性と関連付けることができる。被験者結果ないし予後の関連付けは、更に、複数の被験者の被験者結果スコア及び１若しくは複数の多型の統計解析を含むことができる。
【０１１３】
臨床上の表現型
第一次結果（primary outcome）変数は、病院を退院するまでの生存（日数）であった。第二次結果（secondary outcome）変数は、生存していて且つ心血管（cardiovascular）、呼吸器（respiratory）、腎臓（renal）、肝臓（hepatic）、血液学的（hematologic）、及び、神経学的（neurologic） 器官系の障害から免れている日数、並びに、生存していて且つＳＩＲＳ、敗血症の発生、及び、敗血性ショックの発生から免れている日数であった。４つのＳＩＲＳ診断基準のうち少なくとも２つに被験者が合致した場合、ＳＩＲＳであるとみなした。ＳＩＲＳ診断基準は、１）高熱（＞３８℃）又は低体温（＜３６℃）、２）頻脈（β遮断薬非存在下で心拍数＞１００拍／分）、３）頻呼吸（呼吸数＞２０呼吸／分）又は機械換気の必要、及び、４）白血球数＞１１，０００／μＬ （Anonymous. Critical Care Medicine (1992) 20 (6): 864-74）。ＳＩＲＳ診断基準に合致した暦上の日より、被験者を、このコホートに含めた。
【０１１４】
記録された被験者の基礎統計には、年齢、性別、入院のための内科若しくは外科的診断（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩＩ診断コード(KNAUS WA et al. Chest(1991) 100 (6): 1619-36)に従った）、及び、入院時ＡＰＡＣＨＥ ＩＩスコアが含まれた。以下の付加的データを、臓器不全、ＳＩＲＳ、敗血症、及び、敗血性ショックを評価するために、２８日間における各２４時間（午前８時から午前８時）について記録した。
【０１１５】
ブリュッセル（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ）診断基準（表２Ａ）（RUSSELL JA et al. Critical Care Medicine (2000) 28 (10): 3405-11）を用いて少なくとも中等度の臓器不全の証拠がある場合に、各器官系における臨床的に重要な臓器不全が、２４時間の間に存在するものと規定した。各臓器不全変数について各２４時間の間、必ずしもデータが有効であるわけではないので、我々は、以前に定義した（Anonymous. New England Journal of Medicine (2000) 342 (18): 1301-8）ように、「進展（carry forward）」仮定を用いた。簡潔に述べると、変数の測定がなされなかった任意の２４時間について、我々は、その前の２４時間の「存在」又は「不存在」を、進展（carried forward）した。任意の変数が、決して測定できなかった場合は、正常であるものと仮定した。
【０１１６】
更に、心血管、呼吸器、及び、腎臓 の機能を評価するために、我々は各２４時間の、昇圧剤のサポート、機械換気、及び、腎臓のサポートの各々についても記録した。昇圧剤の使用は、ド−パミン＞５μｇ／ｋｇ／ｍｉｎ又は任意の用量のノルエピネフリン、エピネフリン、バソプレッシン、若しくはフェニレフリンとして規定した。機械換気は、挿管及び陽性気道内圧（すなわち、T-piece及びマスク 換気は、換気とはみなさない）の必要性として規定した。腎臓のサポートは、血液透析、腹膜透析、又は、任意の連続的な腎臓サポート様式（例えば、veno‐静脈血液透析）として規定した。さらに、呼吸機能障害の重症度を、包含判定基準を満たす時間における、急性肺障害の発生の測定により評価した。急性肺障害は、ＰａＯ２／ＦｉＯ２比＜３００、胸部Ｘ線写真における広汎性浸潤パターン、及び、ＣＶＰ＜１８ｍｍ Ｈｇを有するものとして定義した。
【０１１７】
以前に報告した（BERNARD GR et al. New England Journal of medicine (1997) 336 (13): 912-8）ように、２８日の観察期間における臓器不全の期間を評価し、及び、死亡に関わる臓器不全スコアを補正するため、生存していて且つ臓器不全から免れている日数（ＤＡＦ）が算出された。簡潔に説明すると、各変数について各２４時間の間、被験者が生きていて臓器不全を免れている場合（正常か弱い臓器不全、表２Ａ）は、ＤＡＦを１とスコアリングした。２４時間の間、被験者が臓器不全（中程度、重度、又は、極度）を起こすか又は生存していない場合は、ＤＡＦが０であるとスコアリングした。ＩＣＵ入院した後の各２８日、各被験者において、このようにスコアリングをおこなった。ゆえに、各変数について有り得る最も低いスコアは０であり、また、有り得る最も高いスコアは２８であった。より低いスコアは、生存及び臓器不全から免れたのがより少ない日数であるために、より重い臓器不全を示している。
【０１１８】
同様に、生存していて且つＳＩＲＳから免れている日数（ＤＡＦ ＳＩＲＳ）を計算した。各２４時間の間、４つのＳＩＲＳ診断基準の各々についての存在又は非存在を記録した。各２４時間の期間のＳＩＲＳの存在は、４つのＳＩＲＳ診断基準のうち少なくとも２つを有することによって規定した。敗血症については、２４時間の間、４つのＳＩＲＳ診断基準のうち少なくとも２つを有すること、且つ、既知の若しくは疑わしい感染を有することによって、存在するものと規定した（Anonymous. Critical Care Medicine (1992) 20 (6): 864-74）。コンタミネーション又はコロニー形成のために陽性であると判断される培養物は、除外した。敗血性ショックは、同一の２４時間の間の、敗血症の存在と低血圧（収縮期血圧＜９０ｍｍＨｇ又は昇圧剤の必要性）の存在の併存として規定した。
【０１１９】
微生物学
感染していることが疑われる任意の患者について微生物学的培養を行った。これがＳＩＲＳの危篤状態の患者のコホートの場合は、ほとんどの患者で培養を行った。混入又はコロニー形成が疑われる陽性培養菌は、除外した。臨床的に不適切であると見なされる陽性培養菌も、除外した。培養菌は、グラム陽性、グラム陰性、真菌、又は、その他として分類した。培養菌の採取源は、呼吸器、消化管、皮膚、軟部組織若しくは創傷、尿生殖器、又は、血管内であった。
【０１２０】
ハプロタイプ及びｈｔＳＮＰｓの選択
非位相（unphased）の白人遺伝子型データ（from the Coriell registry pga. mbt. washington. edu (RIEDER MJ et al. SeattleSNPs. NHLBI Program for Genomic Applications, UW-FHCRC, Seattle, WA(2001))を用いて、ＰＨＡＳＥソフトウエア（STEPHENS M. et al. Am J Hum Genet (2001) 68: 978-89）によりハプロタイプを推測した（図１）。そして、ＴＨＢＤの主要なハプロタイプ クレードを同定するために、ＭＥＧＡ２（KUMAR S. et al. (2001) 17: 1244-5）を用いて系統樹を推測した（図２）。ハプロタイプは系統樹にしたがって分類し、そして、ハプロタイプ構造をハプロタイプタグＳＮＰｓ（ｈｔＳＮＰｓ）を選択するために調べた（JOHNSON GC. et al. Nat Genet (2001) 29: 233-7; and GABRIEL SB. et al. Science (2002) 296: 2225-9）。３つのｈｔＳＮＰｓが、白人におけるＴＨＢＤの主要ハプロタイプクレードを同定するものとして選択された。一番目のＳＮＰは前記転写開始点から５１１０番目のヌクレオチドがＧからＡへのトランジションであり（ｒｓ１０４２５８０）、２番目のＳＮＰは前記転写開始点から５３１８番目のヌクレオチドがＡからＣへのトランスバージョンであり（ｒｓ３１７６１２３）、そして、３番目のＳＮＰは前記転写開始点から６２３５番目のヌクレオチドがＡからＧへのトランスバージョンであった（ｒｓ１９６２）（ＮＣＢＩトロンボモジュリン アクセッション番号ＡＦ４９５４７１）（配列番号１）。それから、ハプロタイプ及びハプロタイプクレードを規定するために、我々の被験者コホートにおいて、このＳＮＰについて遺伝子型判定がなされた。「タグ」ＳＮＰｓ（ｔＳＮＰｓ）又は「ハプロタイプタグ」ＳＮＰｓ（ｈｔＳＮＰｓ）は、クレードを特異的に規定し、そして、該クレードのハプロタイプ内にある全てのＳＮＰｓのマーカーとして働く。
【０１２１】
血液収集／遺伝子型判定過程
全血より、そのバフィーコートを抽出し、試料を１．５ ｍｌのクラリオチューブに移し、そして、−８０℃で貯蔵した。ＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ商標）を用いて、末梢血試料のバフィーコートから抽出した。遺伝子型の解析は、臨床情報無しに、ブラインドで行われた。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴシークエンス検出システム（Applied Biosystems,Inc.-Livak KJ. (1999) Genet Anal 14: 143-9）で特異的蛍光ラベル‐ハイブリダイジェーションプローブを用いたリアルタイム ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により、多型の遺伝子型を同定した。簡潔に説明すると、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴは、蛍光発生的レポーター色素及び蛍光発生的消光剤で標識されたアレル特異的プローブをＰＣＲ反応に含む５’ヌクレアーゼアッセイを使用する。前記プローブ標的が増幅されているのであれば、前記プローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断され、前記レポーター色素が遊離し、そして、特異的な蛍光の強度が増加をもたらす。ミスマッチなプローブは、効率的に切断されず、よって、認識し得るような最終的な蛍光性シグナルには寄与しない。一つの特異的色素蛍光の増加は、該色素特異的なアレルについてホモ接合性であることを示している。両方のシグナルにおける増加は、ヘテロ接合性を表している。Coriell Cell Repository（細胞バンク）から得られたリンパ球株化細胞からのＤＮＡが、遺伝子型同定の正確さを確実にするために使用された。Ｇ５１１０Ａ、Ａ５２１８Ｃ及びＡ６２３５における、これらの株化細胞の遺伝子型は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７９００ＨＴシークエンス検出システムを用いて判定され、そして、www. pga.mbt. washington. edu (SeattleSNPs 2003, posting date. Thrombomodulin. SeattleSNPs. NHLBI Programs for Genomic Applications. UW-FHCRC. [Online.]) により提供されたダイレクトシークエンスによって判定された同一の株化細胞の該遺伝子型と比較された。
【０１２２】
データ収集
データは、２８日間又は退院するまでの間、記録された。生の臨床的及び実験上の変数は、Glasgow Comaスコアの例外と共に、各２４時間の間の、最悪な又は最も異常な変数を用いて、記録された。入院日の欠落データは正常値を割り当て、そして、その日以降の欠落データはその前日の値を進展（carrying forward）することにより置換した。個体群統計学的及び微生物学的データを記録した。各被験者についてデータ収集が完了した際に、全ての記録から全ての被験者識別名を除去し、そして、該被験者ファイルに独特の無作為の数字（該数字は血液試料と交差して関連付けられている）を割り当てた。前記完了した生データファイルは、標準的定義を用いた記述的な重症度の疾患スコア（すなわち、ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ、及び、生存しており且つブリュッセル判定基準を用いて計算された臓器不全から免れた日数）を算出するために変換された。
【０１２３】
χ二乗検定を、２８日の死亡率とハプロタイプクレードとの関連をテストするために用いた。この初期解析により、Ａ／Ｃ／Ａハプロタイプクレードが、他の全てのクレードと別個のものとして同定された。続く解析のために、臨床結果の差異が、Ａ／Ｃ／Ａハプロタイプクレードと他のハプロタイプの組み合わせ全てとの間で、比較された。２分の結果(２８日の生存率、ＳＩＲＳ発症時の敗血症及びショック) の比率を、χ二乗検定を用い、２つのグループのハプロタイプクレード間で比較した。Ａ／Ｃ／Ａハプロタイプクレードと他の全てのハプロタイプクレードとの間の連続的な結果変数における差異は、ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いて調べた。基礎的な記述的特性は、カイ二乗検定、適当な場合にはＡＮＯＶＡを用いて比較した。更に、Ａ／Ｃ／Ａハプロタイプクレードと他の全てのハプロタイプクレードとの間の２８日目の生存率について、他の混乱要素（Ａ／Ｃ／Ａハプロタイプクレードと他の全てのハプロタイプクレードとの間の）を調整した上で、Kaplan-Meier解析と共にコックス回帰モデルを用いて、比較した。
【０１２４】
統計解析
我々は、コホート研究デザインを用いた。２分の割合の結果（２８日の死亡率、ＳＩＲＳ発症時の敗血症及びショック）を、優性遺伝モデルを想定したχ二乗検定を用いて、ハプロタイプクレード間で比較した。ハプロタイプクレード間の連続的結果変数における差異を、分散分析を用いて試験した。Kaplan-Meier解析と共にコックス回帰モデルを用いて、他の混乱要因（年齢、性、及び、内科的 vs. 外科的診断）を調整して、２８日の死亡率をハプロタイプクレード間で更に比較した。ハプロタイプクレード相対的リスクを計算した。この解析は、全部のコホートにおいて行われ、そして次に、ＳＩＲＳ発症時に敗血症である被験者及びＳＩＲＳ発症時に敗血症ショックである被験者の下位集団（sub-group）において行われた。遺伝子型の分布は、Hardy-Weinbergの平衡（GUO SW. and THOMPSON EA. (1992) 48: 361-72）について調べた。我々は、平均値、及び、９５％信頼区間について報告する。統計学的有意性は、ｐ＜０．０５と定めた。前記データは、Windows（登録商標）用ＳＰＳＳ １１．５及びＳｉｇｍａＳｔａｔ ３．０ソフトウェア（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ、シカゴ、イリノイ州、２００３）を用いて解析された。
【実施例】
【０１２５】
聖パウロ病院のＩＣＵに入院した７００人の継続性重症患者を治験に組み入れるために選別した。これらの中で６００人の患者（９４％）は、我々の４つのＳＩＲＳ基準の少なくとも２つ有するという組み入れ基準に合致した。このグループからの２２３人の白人は首尾よく遺伝子型判定され、本研究のための最終的なコホートに使用した。
【０１２６】
［実施例１］トロンボモジュリンのハプロタイプ解析
ハプロタイプクレードの推論
コリエル細胞保存機関(Coriell Cell Repository(2003, posting date. Thrombomodulin. SeattleSNPs. NHLBI Programs for Genomic Applications. UW-FHCRC. [Online. ]))における２３人の白人の完全なＴＨＢＤ塩基配列から、ＰＨＡＳＥソフトウェア(Stephens M. et al. (2001) A new statistical method for haplotype reconstruction from population data. Am J Respir Crit Care Med 68: 978-89. )を用いてハプロタイプを推測することは可能であり、ＭＥＧＡ２ソフトウェアを用いて２つの主要なハプロタイプクレードを同定した（図１及び図２）。これらの５つのクレードは、我々の２２３人の患者コホート（同齢集団）の遺伝子型を解析することにより３つのｈｔＳＮＰｓ：Ｇ５１１０Ａ、Ａ５３１８Ｃ及びＡ６２３５Ｇに分離することができた。５１１０Ｇ／５３１８Ａ／６２３５Ａ（Ｇ／Ａ／Ａ）ハプロタイプクレードは３６％の頻度で生じ、Ａ／Ａ／Ａハプロタイプクレードは２２．４％の頻度で生じ、ａ／Ａ／Ｇハプロタイプクレードは２１．５％の頻度で生じ、Ａ／Ｃ／Ａハプロタイプクレードは１８．４％の頻度で生じ、そしてＧ／Ａ／Ｇハプロタイプクレードは１．３％の頻度で生じた。３つのｈｔＳＮＰｓ全ての遺伝子型は、他の利用可能な白人データ(2003, posting date. Thrombomodulin. SeattleSNPs. NHLBI Programs for Genomic Applications. UW- FHCRC. [Online.])から推測される頻度と同様であり、ハーディ-ワインベルグ平衡を示した（表３）(Guo SW. and Thompson EA. (1992) Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportion for multiple alleles. Biometrics 48: 361-72)。
【０１２７】
【表３】
2007525980.tif 000006
【０１２８】
４つのＳＩＲＳ判定基準の少なくとも２つを有する白人患者のコホートから遺伝子型を判定された２２３人の個人に対して、何れのＴＨＢＤハプロタイプクレードも、年齢、性別又は病気の重症度の違いと有意に関連していなかった（ＡＰＡＣＨＥＩＩスコアによる推定）（表４）。
【０１２９】
【表４】
2007525980.tif 000007
【０１３０】
偶然にも、Ａ／Ｃ／ＡハプロタイプクレードはＩＣＵへの入院に対する外科的診断の高い割合と関連した（表５）。 
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
Ａ／Ｃ／Ａハプロタイプは、参照又は「保護的（予防的）」な群であり、「危険（リスク）」ハプロタイプ（Ｇ／Ａ／Ａ、Ａ／Ａ／Ａ、Ｇ／Ａ／Ｇ、又はＡ／Ａ／Ｇ）の何れかを有する個人が、性別、年齢及び外科治療診断を調整した後で、ＡＣＡハプロタイプを有する個人より１．９５倍も不良な結果（予後）を示すことにつながる。この結果を別の方法で記述すると、ＡＣＡハプロタイプを有する個人は他のすべてのハプロタイプを有する個人よりも１．９５倍もより生存しやすく又は良好な結果を有する。このモデルのｐ値は約０．０３であり、一方、相対的危険性（ＣＰＨ回帰係数）のｐ値は約０．０４２である。従って、ハプロタイプはアレル又は遺伝子型に比べてより強力な関連性検定へと導くことができる。
【０１３３】
［実施例２］アレルと患者の結果
ＡＮＯＶＡによる予備的な解析によると、５３１８Ｃアレルは５３１８Ａアレルよりも２８日目のより低い死亡率と関連しているように思われた（図３）。この傾向は、調べられたときに敗血症か又は敗血症ショックを有する患者において顕著であった（図４）。続いて、２８日目の死亡率の増加と関連していた５３１８Ａアレルを５３１８Ｃアレルと比較するために選択した。更なる解析は、調べられたときに敗血症か又は敗血症ショックを有する１３０人の患者に限定された。これらの患者のＡＰＡＣＨＥＩＩ平均値は２１．４±７．９であった。この下位集団（subgroup）の患者には、内科的に対する外科的診断の割合におけるクレード間に違いはなかった。
【０１３４】
調べられたときに敗血症か又は敗血症ショックを有する患者において、５３１８Ａアレルは、５３１８Ｃアレルよりも有意に大きい２８日目の死亡率と関連していた（ｐ＝０．０３）（図５ａ）。２８日目の死亡率のカプラン−マイヤー解析は、５３１８Ａアレルが２８日間の観察期間の全てにわたって増加する死亡率と有意に関連していることを検証した（ｐ＜０．０３）（図５ｂ）。Ｃｏｘ重回帰モデルは、５３１８Ａアレルが他の生存予知（年齢、性別、入院時の内科的対外科的診断）の調整後の独立した死亡率を予知するものであることを示した（ｐ＜０．０３）（表４）。
【０１３５】
５３１８Ａアレルは、より激しい免疫応答と関連していた。我々の２２３人の患者コホート全体において、５３１８Ａアレルは、生存しており且つ４つのＳＩＲＳ診断基準の４つから免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルについて２０．６日間、対５３１８Ｃアレルについて２３．１日間、ｐ＝０．０５）、生存しており且つ４つのＳＩＲＳ診断基準の３つから免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルについて２０．３日間、対５３１８Ｃアレルについて２２．７日間、ｐ＝０．０６）及び生存しており且つ４つのＳＩＲＳ診断基準の２つから免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルについて１９．９日間、対５３１８Ｃアレルについて２２．４日間、ｐ＝０．０５）と関連していた。調べられたときに敗血症か又は敗血症ショックを有する１３０人の患者の下位集団において、５３１８Ａアレルは、なおより強く生存しており且つ４つのＳＩＲＳ診断基準の４つから免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルについて２０．０日間、対５３１８Ｃアレルについて２３．９日間、ｐ＝０．０１）、生存しており且つ４つのＳＩＲＳ診断基準の３つから免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルクレードについて１９．７日間、対５３１８Ｃアレルについて２３．１日間、ｐ＝０．０２）、及び生存しており且つ４つのＳＩＲＳ診断基準の２つから免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルについて１９．１日間、対５３１８Ｃアレルについて２３．０日間、ｐ＝０．０１）と関連していた。
【０１３６】
５３１８Ａアレルは、生存しており且つ多重システム臓器不全から免れているより少ない日数と関連していた。５３１８Ｃアレルは、生存しており且つ心血管不全から免れているより少ない日数（ｐ＝０．０２）、及び生存しており且つ昇圧剤を必要としないより少ない日数（ｐ＝０．０３）と有意に関連した（図６）。５３１８Ａアレルは生存しており且つ呼吸不全から免れているより少ない日数（ｐ＝０．０２）及び生存しており且つ人工呼吸から免れているより少ない日数（ｐ＝０．００８）と関連していた（図７）。５３１８Ａアレルはまた、生存しており且つ血液系不全から免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルが２３．８日間に対し、５３１８Ｃアレルは２６．５日間、ｐ＝０．０４）、生存しており且つ神経性不全から免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルが１８．４日間に対し、５３１８Ｃアレルは２２．１日間、ｐ＝０．０２）、及び生存しており且つ肝性不全から免れているより少ない日数（５３１８Ａアレルが１８．１日間に対し、５３１８Ｃアレルは２１．６日間、ｐ＝０．０４）と関連していた。
【０１３７】
独立して解析した場合には、Ｇ５１１０Ａ、Ａ５３１８Ｃ、又はＡ６２３５ＧのｈｔＳＮＰｓと２８日間の死亡率又は多重臓器不全との間に有意な関連性はなかった。
【０１３８】
臨床的意味
敗血症、重症敗血症又はＳＩＲＳの被験者は、彼らのトロンボモジュリンの５３１８及び４００７の遺伝子型、又はこれらのＳＮＰｓと連鎖不平衡の多型部位の遺伝子型を評価するために遺伝子型を同定され得る。被験者は次いで遺伝子型によるユニークな死亡危険性に関する危険カテゴリーへ遺伝子型によって分類され得る。
【０１３９】
上述した発明は、その理解を明確にする目的で実例を挙げて詳細に記述したが、当業者においては本発明の開示に照らして、添付される特許請求の範囲の精神から離れることなく、容易にそれらに変更や修飾を加えることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】トロンボモジュリン（ＴＨＢＤ）のハプロタイプ及びハプロタイプクレードを示す。
【図２】ＭＥＧＡ２を用いて作成されたＴＨＢＤハプロタイプの系統樹を示す。
【図３】ＴＨＢＤハプロタイプクレードによる２８日間の死亡率を示す。
【図４】一日目に敗血症又は敗血症性ショックを伴った被験者のＴＨＢＤハプロタイプクレードによる２８日間の死亡率を示す。
【図５】一日目に敗血症又は敗血症性ショックを伴った１３０人の被験者におけるＴＨＢＤ５３１８Ａ及びＣと関連する２８日間の死亡率を示す。
【図６】ＴＨＢＤ５３１８Ａ及びＣアレルによる生存しており且つ心血管不全から免れている日数（ＤＡＦ）を示す。
【図７】ＴＨＢＤ５３１８Ａ及びＣアレルによる生存しており且つ呼吸不全から免れている日数（ＤＡＦ）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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