(57)【要約】  本発明は、ニトリルヒドラターゼ-生成菌株ロドコッカス属ロドクロウスM33を培養する方法に関し、培養の間に、培養培地が使用され、この培養培地は、12〜60mMホスフェート緩衝液をベースとし、細胞の燐要求を満たし、pH値は5.5と9.0の間に維持され、およびグルコースの利用可能な量が使用された後に、新規な炭素源として作用する酢酸が添加される。本発明はまた、本方法で使用する培養培地に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
12から60mMホスフェート緩衝液をベースとし、細胞の燐要求を満足し、培養の間に、pHを5.5から9.0の範囲内に維持し、最初に供給されたグルコースの全てが消費されたときに、新規な炭素源として酢酸を計量供給する培養培地を使用することを特徴とする、ニトリルヒドラターゼ-生成菌株ロドコッカス属ロドクロウスM33[DSMZ,Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH),Marschroder Weg  1b,D  38,124 Brunswick,Germanyにおいて、ファイリング参考文献DSM  14,230の下に表示されている]の培養方法。
【請求項２】
前記培養培地において増殖因子として、コーン抽出物を使用することを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
コーン抽出物としてコーン浸漬汁および/またはコーン浸漬溶液を使用することを特徴とする請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記コーン抽出物を前記培養培地中で、1から10g/Lの濃度において使用することを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
培養培地中で、炭素源としてグルコースおよび酢酸を使用することを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記培養培地が、炭素源として、20から90g/Lの濃度においてグルコースを含むことを特徴とする請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
酢酸を、その水溶性塩の形態で、最初に添加することを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
使用される酢酸の水溶性塩が、酢酸ナトリウムであることを特徴とする請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
酢酸の水溶性塩を最初のバッチにおいて使用し、pHが7.5から8.5に上昇したときに酢酸を計量供給することを特徴とする請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
グルコースの消費の後で、酢酸の水溶性塩を1から4g/Lおよび好ましくは3g/Lの濃度において計量供給することを特徴とする請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
引き続いて酢酸の添加を、20から50%強度、好ましくは30%強度水溶液の形態で実施することを特徴とする請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
酢酸水溶液を、7.5から8.5のpHで、好ましくはpH7.9で、pH-スタット供給によって計量供給することを特徴とする請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
尿素およびCoCl2×6H20を前記培養培地中に計量供給することを特徴とする請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
誘導物質として作用する尿素の一部分を、最初のバッチとして使用される培地中に含ませ、最初に供給されたグルコースが消費されたときに、尿素を再び計量供給することを特徴とする請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
CoCl2×6H20を、炭素源としてのグルコースをベースとして、指数増殖期の開始時に培地に添加し、前記グルコースが消費された後に、再び計量供給することを特徴とする請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
発酵器中の培養の間に、相対O2分圧が30%より大きく、好ましくは≧50%であるように、酸素供給を制御することを特徴とする請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
a.)  Na2HPO4×12H2O 7.9g/L
b.)  CH2PO4 1.8g/L
c.)  CoCl2×6H2O 0.02から0.04g/L
d.)  MgSO4×7H2O 1.0g/L
e.) コーン抽出物、0から10g/L
f.) グルコース、20から90g/L
g.) 尿素、4から20g/L
を含む請求項1から16のいずれか一項に記載の方法において使用するための培養培地。
【請求項１８】
培養培地が、コーン抽出物を培養培地の1から10g/Lの濃度で含むことを特徴とする請求項17に記載の培養培地。
【請求項１９】
培養培地が、12から60mMホスフェート緩衝液をベースとし、細胞の燐要求を満足し、培養の間にpHを5.5から9.0の範囲内に維持することを特徴とする請求項17または請求項18に記載の培養培地。
【請求項２０】
前記培地が、さらなる炭素源として酢酸を含むことを特徴とする請求項17から19のいずれか一項に記載の培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニトリルヒドラターゼ-生成菌株ロドコッカス属ロドクロウス(Rhodococcus rodochrous)M33を培養する生物工学的方法に関し、高ニトリルヒドラターゼ活性を示すバイオマスの収量を増加させる方法に使用する培養培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
化合物の工業的生物工学的製造方法の開発は、選択された生物触媒反応に使用することができる特別な酵素を含む微生物において、大きな関心を呼んできた。その例は、アミド合成のための生物工学的製造変換方法であり、この方法は、ニトリルヒドラターゼ(有機酸のニトリルの対応するアミドへの変換を触媒する酵素)を合成するいくつかの微生物の能力に基づいている。この点に関して、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換することができる細菌株が特に興味深い。
【０００３】
それぞれの微生物の培養方法は、触媒的活性なバイオマスまたは生物触媒の製造において重要な役割を果たす。通常、培養液の単位体積当たりの酵素活性収量(U/mLにおける総活性)を増加させるために、2つの選択肢が利用可能である;
1.(細菌)細胞の酵素合成を活性化すること、または換言すれば、比酵素活性(乾燥バイオマスのU/mg)を増大させること
2.培養液の単位体積当たりの活性細胞(活性バイオマス)の収量を上げること。
【０００４】
英国特許2087926Aおよびこの特許に引用されている特許文献において、とりわけコリネバクテリウム(Corynebacterium)菌株N-774(Fermentation Research Instituteのファイリング番号FERM4446)の培養方法が記載されている。ニトリルヒドラターゼを示すこの菌株は、カゼインヒドラターゼ(カザミノ酸)の1重量%と一緒に、少なくとも0.2mg/lの濃度において水溶性鉄化合物を含む鉱物培地中で培養される。この方法の欠点は、カゼインヒドラターゼのコストが高いことおよび実現されるニトリルヒドラターゼ活性が低いことである。
比活性=53.3U/mg、乾燥バイオマス=5.66mg/mL、総活性=301.7U/mL。
【０００５】
有機酸のニトリルおよびアミド、特にプロピオン酸およびイソ酪酸は、ニトリルヒドラターゼの誘導をすることが知られている。この点に関して、酵素誘導剤または誘導物質として知られているこのような化合物を、Pseudomonas chlororaphis菌株B23(FERM BP-187)およびPseudomonas sp.菌株PS1(FERM BP-188)に添加することは、62.65U/mgの比活性および335.8U/mLの総活性を有するバイオマス(乾燥バイオマス5.36g/l)を得ることを可能にすることが米国特許第4555487号から推測できる。
【０００６】
この方法の欠点は、コスト高の誘導物質の使用および得られた細胞のニトリルヒドラターゼ活性が低いことにある。
【０００７】
Pseudomonas chlororaphis菌株  B23(FERM BP-187)およびPseudomonas sp.菌株PS1(FERM BP-188)をインキュベートするためにEP0115781に記載されている培養培地は、酵素活性を増大するための薬品として、例えば米国特許第4555487号に記載されている誘導物質だけでなく、1種または複数のα-アミノ酸も含む。例えば、シスチン、システイン、アラニン、バリン、メチオニンなどのα-アミノ酸が、0.1〜10.0g/lの範囲における濃度において使用される。それにもかかわらず、このように得られたバイオマスの比活性は、105.7U/mgを超えず、総活性は428.1U/mLを超えない。
【０００８】
より高いニトリルヒドラターゼ活性が、ドイツ特許4480132に記載されているように、ロドコッカス属ロドクロウス菌株M33をインキュベートすることにより実現された。この発表は、グルコース(濃度5g/l)を含む合成培地における菌株の培養の間に、200U/mgまでの比活性および360U/mLまでの総活性を示す細胞を得ることが可能であることを示す。提案された方法の実質的利点は、いかなる高価な成分も含まない培地の単純さにある。しかし、グルコース濃度を20g/lに上げると、1368U/mLを超えない総活性の増大を生じる。
【０００９】
工業的に適切な方法は、ロドコッカス属ロドクロウス菌株J1(FERM BP-1478)の培養について欧州特許0362829に記載されているものである。高価でない誘導物質(尿素(濃度15g/l)および二価コバルトの化合物)を含む培地において、提案された培養方法は、578U/mgの比活性を示す細胞を得ることを可能にする。細胞収量(バイオマス収量)を増大するためには、培地にペプトンおよび酵母抽出物を添加する。しかし、実現される総活性は、バイオマス収量が4.3g/lに過ぎないので、2480U/mLを超えない。工業的条件下で、培養プロセスの規模を拡大させると、細胞収量は28g/lに増大し、比ニトリルヒドラターゼ活性は76U/mgに低下し、総活性は2100U/mLに低下する(Yamada H.,Kobayashi M.,“Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide”,Biosci. Biotech. Biochem.,60(9),1391-1400,1996)。
【００１０】
ロドコッカス属ロドクロウス菌株M33の他の培養方法は、文献(Kim B-Y.,Kim J-C.H-H.,Hyun H-H.,“Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rodochrous M33”,Biotechnol.Bioprocess Eng.,6:11-17,2001)に記載されている。この方法は、KH2PO4、K2HPO4、FeSO4×7H2O、EDTA-2Na、MgSO4×7H2O、NaCl、CoCl2×6H2O、尿素およびグルコースからなる純粋に合成した培養培地を含む5リットル容の発酵器中の、グルコースに限定した、バッチ仕込み発酵を含む。40%強度グルコース溶液の一定の計量、およびグルコース溶液にCoCl2×6H2O(0.01g/l)を3回定期的に添加することによって、24g/lの細胞収量および120U/mgの比ニトリルヒドラターゼ活性が実現された。それにもかかわらず、約115時間の比較的長い発酵時間後に得られた総活性は、2880U/mLを超えなかった。
【特許文献１】英国特許2087926A
【特許文献２】米国特許第4555487号
【特許文献３】EP0115781
【特許文献４】ドイツ特許4480132
【特許文献５】欧州特許0362829
【非特許文献１】Yamada H.,Kobayashi M.,“Nitrile hydratase and Application to Industrial Production of Acrylamide”,Biosci. Biotech. Biochem.,60(9),1391-1400,1996
【非特許文献２】Kim B-Y.,Kim J-C.H-H.,Hyun H-H.,“Fed-batch Fermentation for Production of Nitrile Hydratase by Rhodococcus rodochrous M33”,Biotechnol.Bioprocess Eng.,6:11-17,2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、高ニトリルヒドラターゼ活性を示すバイオマスの工業的収量を増大することを可能にする、ニトリルヒドラターゼ-生成菌株を培養する生物工学的方法が依然として求められている。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、このような方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことには、ニトリルヒドラターゼ-生成ロドコッカス属ロドクロウス、例えば、菌株M33[これは、DSMZ,Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH),Marschroder Weg  1b,D-38124 Brunswick,Germanyにより供託番号DSM  14230の下に供託されている]を培養する方法が、ある培養培地(この培養培地は、12〜60mMホスフェート緩衝液をベースにしており、細胞の燐要求を満足し、培養の間に、pHを5.5〜9.0の範囲において維持し、およびこの培養培地には、最初に供給されたグルコースが消費された後に、新規な炭素源として酢酸を計量して入れる)を使用して培養を実施したときに本発明の目的を実現することが分かった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明によれば、細胞の燐要求を満足し、培養の間に、pHを5.5〜9.0の範囲で維持することを可能とする培養培地が使用される。好ましくは、このような培養培地は、その他の増殖因子としてコーン抽出物を含む。
【００１５】
本発明の方法においては、培養培地中で、その他の増殖因子としてコーン抽出物を、例えば1〜10g/lの濃度で、例えばコーン浸漬汁の形態で添加して使用することが特に好ましい。使用されるコーン抽出物は、通常の浸漬プロセスの結果として濃縮された形態で溶液中に移行した、コーン粒成分を含む任意のコーン浸漬汁であってよい。本発明によれば、好ましくはCerestar Deutschland GmbH,Krefeldによって名称Cerestar15840の下に供給されるコーン浸漬汁が使用される。
【００１６】
本発明の方法において、好ましく使用される培養培地(以後、本明細書においてSIと略記する)は、以下の組成(g/lにおいて)を有する。
【００１７】
a.)Na2HPO4×12H2O 7.9g/l
b.)KH2PO4 1.8g/l
c.)CoCl2×6H2O 0.02〜0.04g/l
d.)MgSO4×7H2O 1.0g/l
e.)コーン抽出物 0〜10g/l
f.)グルコース 20〜90g/l
g.)尿素 4〜20g/l
【００１８】
特に、コーン抽出物を1〜10g/l、好ましくは2〜8g/l、さらに好ましくは2〜6g/lの濃度で添加したような培養培地を使用する。最も好ましくはコーン抽出物を培養培地中で4g/lの濃度において使用する。
【００１９】
培養培地のベースは、12〜60mMホスフェート緩衝液であり、この緩衝液は、細胞の燐要求を満足し、培養の間に、pHを5.5〜9.0の範囲で維持できるようにし、炭源としてグルコースおよび酢酸を使用し、グルコース以外の新規な他の炭素源として酢酸を使用する。
【００２０】
非常に好ましくは、本発明の方法においては、35.3mMホスフェート緩衝液を使用する。
【００２１】
有利には、培養培地は、特に、振とうフラスコ中の培養では、炭源としてグルコースの20〜90g/l、好ましくは20〜60g/l、およびさらに好ましくは20〜40g/lを含む。グルコース以外、酢酸を炭源として使用することができ、炭源は、特に実験室の発酵器中または工業規模の培養に対しては、好ましくは二相法によって添加される。
【００２２】
この方法の第1の相は、培地に最初に供給された炭素の第1の供給源、好ましくは20g/lのグルコースをベースとする、ロドコッカス属ロドクロウスM33の開始された、強化された細胞増殖を特徴とする。グルコースの消費の後に、発酵は第2の相において、いわゆる仕込みバッチ法プロセスにおいて継続され、この第2の相においては、酢酸を炭源として使用する。より安価な酢酸が、培養に適するグルコースを代替することができ、前記酢酸が高いニトリルヒドラターゼ活性および高い総活性を確保する。
【００２３】
有利には、酢酸を、別法としてこの水溶性塩の形態で添加することができ、酢酸ナトリウムが水溶性酢酸塩として特に好ましい。本発明の1つの実施形態において、本発明によって使用されるべき水溶性酢酸塩は、グルコースの消費の後に、計量供給され、この場合、好ましく使用される酢酸ナトリウムは、1〜4g/lの仕込み濃度で添加することができる。3g/lの仕込み濃度の酢酸ナトリウムの添加が特に好ましい。
【００２４】
本発明の方法の他の実施形態において、酢酸の水溶性塩、好ましくは酢酸ナトリウムは、最初のバッチ中に存在する。pHが7.5〜8.5に上昇した後に、次いで、酢酸を20〜50%、好ましくは30%強度水溶液として、計量供給する。有利には、水性の酢酸溶液を7.5〜8.5のpH、特にpH7.9でpHスタット供給によって計量供給する。
【００２５】
さらに、本発明の方法は、添加されるべき成分、好ましくはCoCl2×6H2Oおよび尿素を、発酵の間に一定の回数で、適切な濃度で、計量供給することによって実施することができ、コバルトは補助因子として作用し、尿素は誘導物質として作用する。
【００２６】
特に、尿素4〜20g/lおよびCoCl2×6H2O 0.02〜0.04g/lが、ニトリルヒドラターゼの誘導のために、培養培地に計量供給される。好ましくは、いくらかの尿素が培地の最初のバッチにおける誘導物質として、好ましくは4g/lの濃度で存在し、残余は、最初に供給されたグルコースの消費の後に、好ましくは6g/lの供給濃度で計量供給される。
【００２７】
本発明によれば、CoCl2×6H2O補助因子の添加は、好ましくは0.01g/lの供給濃度において、炭素源としてのグルコースに基づいた指数増殖期の開始時に、CoCl2×6H2Oを、培地と混合すること、次いで、グルコースの消費の後に、さらに好ましくは0.03g/lの供給濃度で、計量供給することによって行うことができる。
【００２８】
驚くべきことには、指数増殖期の開始時から、CoCl2×6H2Oを、好ましくは0.01g/lの供給濃度で計量供給することによって本発明の方法を実施した場合に、発酵時間を短縮することができることが分かった。
【００２９】
本発明の方法による菌株培養は、48〜170時間の培養時間にわたり25〜30℃で、バッフルフラスコ(振とう培養)中で、および実験室および工業的発酵器中で行う。本発明の方法の好ましい実施形態において、特に工業的発酵器における培養の間の酸素供給は、相対O2分圧が30%より大きく、好ましくは≧50%であるように制御される。
【００３０】
ニトリルヒドラターゼ-生成菌株ロドコッカス属ロドクロウスM33の培養に対する本発明の方法の利点は、本発明の培養培地を使用することによって、特にその他の増殖因子としてコーン抽出物を使用する場合、多量のニトリルヒドラターゼ含有バイオマス(乾燥バイオマスの39.5g/lまでの収量)を生成するだけでなく、バイオマスはまた、高比ニトリルヒドラターゼ活性(315U/mgまで)を示し、一方、以下の実施例から推測し得るように、7169U/mLのニトリルヒドラターゼ総活性を実現することができる。
【００３１】
ニトリルヒドラターゼ-生成菌株を培養する知られた方法とは異なり、本発明による本方法は、12〜60mMホスフェート緩衝液をベースとする培養培地の使用を特徴とし、このホスフェート緩衝液は、細胞の燐要求を満足し、培養の間に、5.5〜9.0の範囲でpHを維持し、およびグルコースの最初に供給された量が消費された後に、新規な炭素源として酢酸を計量供給することを特徴とする。さらに、コーン浸漬汁の形態でコーン抽出物をその他の増殖因子として使用することができる。さらに、培養培地中で培養に使用することができるグルコースを、より安価な酢酸によって置き換えることができることが利点であり、それによって、本発明の方法を使用したときに、高比ニトリルヒドラターゼ活性および高総活性が確実なものになる。
【００３２】
ニトリルヒドラターゼ活性の標準測定方法
【００３３】
10mMホスフェート緩衝液(pH7.5)中の2%強度アクリロニトリル溶液1mlを、培養液を前もって遠心分離することによって得られたM33細胞懸濁液の1mlと混合し、洗浄し、引き続いて10mMホスフェート緩衝液中(pH7.5)に細胞を再懸濁した。この懸濁液は、細胞の0.08〜0.16mg(乾燥重量)を含む。反応を20℃で5分間行い、その後、濃HClの20μlを添加することによって反応を停止する。形成されたアクリルアミドの濃度は、ガスクロマトグラフィまたは測光方法によって求められる。
【００３４】
ニトリルヒドラターゼ活性は、以下の単位において与えられる。
非活性;アクリルアミドのモル/分×乾燥バイオマスのmg=[U/mg]において。
総活性;アクリルアミドのモル/分×培養液のml=[U/mL] において。
【００３５】
本発明を以下の実施例により例示する。
【００３６】
(実施例)
(実施例１)
培養培地「SI」(g/lにおける組成:Na2HPO4×12H2O 7.9;KH2PO4 1.8;CoCl2×6H2O 0.02;MgSO4×7H2O 1.0;コーン抽出物2.0;pH7.2±0.2)50ml含み、グルコース50g/lおよび尿素(4〜20g/l)を含むバッフルフラスコ(250ml)をロドコッカス属ロドクロウスM33接種材料培養液の1mlにより接種した。接種材料を同様な培地中で24時間にわたりインキュベートした。培養を、振とう培養器中で、180rpm(円形動作)および30℃で、96時間にわたり行った。バイオマスの収量および細胞のニトリルヒドラターゼ活性を求めた。結果を表1に示す。
【００３７】
【表１】
2007531535.tif 000002
【００３８】
(実施例２)
培養培地「SI」(g/lにおける組成:Na2HPO4×12H2O 7.9;KH2PO4 1.8;CoCl2×6H2O 0.02;MgSO4×7H2O 1.0;尿素16.0;pH7.2±0.2)を含み、グルコース(50g/l)およびコーン抽出物(0〜10g/l)50mlを含むバッフルフラスコ(250ml)をロドコッカス属ロドクロウスM33接種材料培養液1mlにより接種した。接種材料を同様な培地中で24時間にわたりインキュベートした。培養は、振とう培養器中で、180rpm(円形動作)および30℃で、96時間にわたり行った。バイオマスの収量および細胞のニトリルヒドラターゼ活性を求めた。結果を表2に示す。
【００３９】
【表２】
2007531535.tif 000003
【００４０】
上述のデータから、コーン抽出物の添加は、比活性および総ニトリルヒドラターゼ活性の増大をもたらすことが明らかである。コーン抽出物の最適濃度は、4g/lであった。
【００４１】
(実施例３)
培養培地「SI」(g/lにおける組成:Na2HPO4×12H2O 7.9;KH2PO4 1.8;CoCl2×6H2O 0.02;MgSO4×7H2O 1.0;尿素16.0;コーン抽出物4.0;pH7.2±0.2)50mlを含むバッフルフラスコ(250ml)は、20〜90g/lの濃度でグルコースを含む。このフラスコの接種および培養を実施例1におけるように行った。計量されたバイオマス収量および細胞のニトリルヒドラターゼ活性を表3に要約する。
【００４２】
【表３】
2007531535.tif 000004
【００４３】
表3から分かるように、細胞収量および総ニトリルヒドラターゼ活性は、培養培地中のグルコース濃度の増大に比例して増大する。これは、培養培地の全ての成分が限定されない濃度で存在したことからもたらされた。
【００４４】
(実施例４)
培地「SI」(g/lにおける組成:Na2HPO4×12H2O 7.9;KH2PO4 1.8;CoCl2×6H2O 0.01;MgSO4×7H2O 1.0;尿素16g;コーン抽出物 4.0;pH7.2±0.2)1.5リットルを含み、グルコースの5g/lを含む3リットル容の実験室発酵器をロドコッカス属ロドクロウスM33接種材料培養液100mlにより接種した。接種材料を同様な組成の培地中で24時間にわたりインキュベートした。
【００４５】
培養条件
・温度        30℃
・撹拌速度    560rpm
・通気速度    1.5vvm(体積/体積/分)
【００４６】
18時間の発酵時間の後に、グルコース1.5g/lを、40g/lの最終濃度に達するまで2時間毎に計量供給した。この結果は、215U/mgの比活性を示す乾燥バイオマス16.4g/lが生成されたことを示した。総活性は、3526U/mlであった。
【００４７】
(実施例５)
培地「SI」(g/lにおける組成:Na2HPO4×12H2O 7.9;KH2PO41.8;CoCl2×6H2O 0.01;MgSO4×7H2O 1.0;尿素16.0;コーン抽出物4.0;pH7.2±0.2)1.5リットルを含み、グルコース20g/lを含む3リットル容の実験室発酵器を実施例4におけるように接種した。また、培養条件は、実施例4における通りであった。24〜36時間の発酵時間および全てのグルコースの消費の後に、尿素6g/l、酢酸ナトリウム3g/l、およびCoCl2×6H2O 0.03g/lを計量供給した。培地のpHの上昇の後に、30%強度酢酸(仕込みバッチ)を計量供給した。これらの条件下で、72時間にわたり、315比活性U/mgを示す乾燥バイオマス19.6g/lが生成したことが分かった。総活性は、6174U/mlであった。
【００４８】
(実施例６)
培地「SI」(g/lにおける組成:Na2HPO4×12H2O 7.9;KH2PO4 1.8;MgSO4×7H2O 1.0;尿素 4.0;コーン抽出物 4.0;pH7.2±0.2)7.0リットルを含み、グルコース20g/lを含む15リットル容の実験室発酵器を4%(v/v)のロドコッカス属ロドクロウスM33接種材料培養液により接種した。接種材料を同様な組成の培地において振とう培養として24時間にわたりインキュベートした。
【００４９】
培養条件:
・温度              29〜30℃
・通気速度          0.5vvm
・オーバレイ圧      0.3バール
・相対酸素分圧      ≧50%(撹拌速度により制御)
・撹拌速度          300〜600rpm
【００５０】
12時間の発酵時間(指数増殖期の開始)の後に、CoCl2×6H2O 0.01g/lを計量供給した。21〜23時間の発酵時間の後および全てのグルコースの消費の後に、尿素6g/l、酢酸ナトリウム3g/lおよびCoCl2×6H2O 0.03g/lを計量供給した。培養液のpHが7.9に上昇した後に、酢酸(30%)の形態の新規な炭源を、pHを7.9(pHスタット供給)に規定して計量供給した。このような条件下で、わずか66.5時間で、294U/mgの比活性を有する乾燥バイオマス19.9g/lを生成することが可能であった。総活性は、5851U/mlであった。
【００５１】
CoCl2×6H2Oを、指数増殖期が開始する前に培地に添加しなかったことにより、実施例5に比較して発酵時間を低減することが可能であった。
【００５２】
(実施例７)
15m3の容積を有する、グルコース20g/lを含む培養培地「SI」(g/lにおける組成:H3PO4 3.48;KOH 0.74pHを6.9に調整するためのNaOH;CoCl2×6H2O 0.01;MgSO4×7H2O 1.0;尿素 4.0;コーン抽出物 4.0;pH 7.2±0.2)10M3を含む工業的生産発酵器を5%(v/v)のロドコッカス属ロドクロウスM33接種材料培養液で接種した。接種材料の培養を再び培地「SI」を使用して、予備発酵器中で、24時間にわたり前もって完了した。
【００５３】
培養条件
・温度      28〜30℃
・撹拌速度  160〜165rpm
・通気速度  0.5vvm
【００５４】
24〜36時間の後およびグルコースの消費の後に、培地に尿素6g/l、酢酸ナトリウム3g/l、およびCoCl2×6H2O 0.03g/lを計量供給した。酢酸の仕込みは、実施例6で記載したのと同様な方法で行った。72時間の発酵時間の後に、290U/mgの比活性を示す乾燥バイオマス18.8g/lが生成されたことが分かった。総活性は、5452U/mLであった。
【国際調査報告】
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