(57)【要約】  本発明は、ＨＳＶ-２糖タンパク質Ｇ２に由来し、そしてＨＳＶ-２型特異的エピトープに由来するペプチドに関する。本発明は、ＨＳＶ-２感染の型特異的血清学的診断用のペプチドを含む組成物を提供する。ＨＳＶ-２抗体の型特異的検出のためにこれらのペプチドを用いる方法及びＨＳＶ-１ウイルス感染及び他のヘルペス・ファミリー・ウイルス感染からＨＳＶ-２ウイルス感染を区別する方法がさらに提供されうる。
2007526919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の２４〜３６個の連続アミノ酸からなるＨＳＶ-２ペプチドを含む組成物。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸５〜３２からなる配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなる配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドが、配列番号１の配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが、二量化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して二量化される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ペプチドが、キャリアに結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記キャリアが、カルボキシル化されたマイクロスフィアである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記キャリアが、カルボキシル化されたラテックス又は磁性マイクロスフィアである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが、当該ペプチドのＮ末端又はＣ末端において、リンカーを介してキャリアに結合される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが、当該ペプチドの内部アミノ酸残基においてリンカーを介してキャリアに結合される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リンカーが、異種ペプチドを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リンカーが、異種タンパク質からなる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記リンカーが、異種タンパク質をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記異種タンパク質が、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記異種タンパク質が、キーホール・リンペット・ヘモシアニンである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記リンカーが、異種ペプチドからなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記異種ペプチドが、１のシステイン残基、１のリジン残基、及び少なくとも２個のグリシン残基を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１９】
前記リンカーが、分枝状アミノ酸ポリマーを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項２０】
前記分枝状アミノ酸ポリマーが、以下の：
【化１】
2007526919.tif 000016
で表される構造を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアが、カルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり；
(３)  前記リンカーが、４-(マレイミドメチル)-１-シクロヘキサンカルボン酸(ＳＭＣＣ)及び異種ペプチドであって、ＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドを含み；並びに
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＣ-末端において当該ペプチドに結合する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項２２】
前記リンカーが、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡをさらに含み、ここでＳＭＣＣがＢＳＡに結合され、そして異種ペプチドを介して前記ペプチドに結合される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸５〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアが、カルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり；
(３)  前記リンカーが、ＳＭＣＣ及び異種ペプチドであって、ＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドを含み；そして
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合する、
請求項１２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記リンカーがさらに、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡを含み、ここで、ＳＭＣＣがＢＳＡに結合され、そして前記異種ペプチドを介して前記ペプチドに結合される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアが、カルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり；
(３)  前記リンカーが、ＳＭＣＣ及び異種ペプチドであって、ＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドを含み；そして
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＣ末端で当該ペプチドに結合される；
請求項１２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記リンカーがさらに、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡを含み、ここで、ＳＭＣＣがＢＳＡに結合され、そして前記異種ペプチドを介して前記ペプチドに結合される、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアがカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり；
(３)  前記リンカーが、ＳＭＣＣ及び異種ペプチドであって、ＫＣＧＧＧＧのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドを含み；そして
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＮ末端において当該ペプチドに結合される、
請求項１２に記載の組成物。
【請求項２８】
前記リンカーが、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡを含み、ここでＳＭＣＣがＢＳＡに結合され、そして前記異種ペプチドを介して前記ペプチドに結合される、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアがカルボキシル化されたマイクロスフィアであり；そして
(３)  前記分枝状アミノ酸ポリマーがさらに、ＣＫという短いペプチドを含み、ここで当該短いペプチドは、そのＣ残基を介して、前記分枝状アミノ酸ポリマーの末端Ｋ残基に直接結合される、
請求項２０に記載の組成物。
【請求項３０】
生物学的サンプルにおけるＨＳＶ-２抗体の特異的検出方法であって、以下のステップ：
(ａ)  配列番号１の２４〜３６個の連続アミノ酸からなるペプチドであって、キャリアに結合される上記ペプチドを含む組成物と、生物学的サンプルを接触させ、
(ｂ)  抗原-抗体結合が、上記ペプチドと上記生物学的サンプルの抗体構成要素との間で生じるかを検出し、ここで当該抗原-抗体結合の検出が、上記生物学的サンプル中におけるＨＳＶ-２抗体の存在を指す、
を含む、前記検出方法。
【請求項３１】
前記ステップ(ｂ)が、フローサイトメトリーにより行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的サンプルが全血、血清、血漿、脳脊髄液、精嚢液、又は粘液である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸５〜３２からなる配列を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなる配列を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ペプチドが、配列番号１の配列を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記キャリアが、カルボキシル化されたマイクロスフィアである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記キャリアが、カルボキシル化されたラテックス又は磁性マイクロスフィアである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ペプチドが、二量化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して二量化される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ペプチドが、当該ペプチドのＮ-末端又はＣ-末端でリンカーを介して前記キャリアに結合される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記ペプチドが、当該ペプチドの内部アミノ酸残基においてリンカーを介して前記キャリアに結合される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記リンカーが、異種ペプチドを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記リンカーが、異種タンパク質からなる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記リンカーがさらに異種タンパク質を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記異種タンパク質が、ＢＳＡである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記異種タンパク質が、ＫＬＨである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記リンカーが、異種ペプチドからなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記異種ペプチドが、１のシステイン残基、１のリジン残基、及び少なくとも２のグリシン残基を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記リンカーが、分枝状アミノ酸ポリマーを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
前記リンカーが、以下の：
【化２】
2007526919.tif 000017
で表される構造を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアが、カルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり；
(３)  前記リンカーが、ＳＭＣＣ及び異種ペプチドであって、ＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドであり；
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合され；そして
(５)  前記ステップ(ｂ)がフローサイトメトリーにより行われる、
請求項４２に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンカーが、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡをさらに含み、ここでＳＭＣＣがＢＳＡに結合され、そして当該異種ペプチドを介して、前記ペプチドに結合される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸５〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアが、カルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり：
(３)  前記リンカーが、ＳＭＣＣ及び異種ペプチドであって、ＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドを含み、
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合され；そして
(５)  前記ステップ(ｂ)がフローサイトメトリーにより行われる、
請求項４２に記載の方法。
【請求項５４】
前記リンカーが、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡをさらに含み、ここでＳＭＣＣがＢＳＡに結合し、そして前記異種ペプチドを介して前記ペプチドに結合される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアが、カルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり；
(３)  前記リンカーが、ＳＭＣＣ及び異種ペプチドであって、ＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドを含み；
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合され；
(５)  前記ステップ(ｂ)が、フローサイトメトリーにより行われる、
請求項４２に記載の方法。
【請求項５６】
前記リンカーがさらに、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡを含み、ここでＳＭＣＣがＢＳＡに結合され、そして前記異種ペプチドを介して前記ペプチドに結合される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアが、カルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり；
(３)  前記リンカーが、ＳＭＣＣ及び異種ペプチドであって、ＫＣＧＧＧＧのアミノ酸配列を有する当該異種ペプチドを含み；
(４)  上記異種ペプチドが、上記ペプチドのＮ末端において当該ペプチドに結合され；そして
(５)  前記ステップ(ｂ)が、フローサイトメトリーにより行われる、
請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】
前記リンカーがさらに、前記キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡを含み、ここで、ＳＭＣＣがＢＳＡに結合され、そして前記異種ペプチドを介して前記ペプチドに結合される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
(１)  前記ペプチドが、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し；
(２)  前記キャリアがカルボキシル化されたマイクロスフィアであり；
(３)  前記分枝状アミノ酸ポリマーが、ＣＫの短いペプチドをさらに含み、ここで、短いペプチドは、そのＣ残基を介して、当該分枝状アミノ酸ポリマーの末端Ｋ残基に直接結合され；そして
(４)  前記ステップ(ｂ)がフローサイトメトリーにより行われる、
請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＳＶ-２型特異的診断において使用することができるＨＳＶ-２の糖タンパク質Ｇ２の新規ペプチド配列を提供する。
【背景技術】
【０００２】
[0001]  単純ヘルペスウイルス２型(ＨＳＶ-２)の感染により引き起こされる陰部ヘルペスは、人における最も一般的な性感染症である。ＨＳＶ-２感染の有病率は、米国の成人の間で、２０％を超える(Ashley及びWald, Clin. Microbiol. Rev. 12:1-8, 1999)。この疾患は、その疾病率、再発頻度、及び分娩感染後にウイルス感染した新生児の場合における生命を脅かす重篤度のため、公衆健康における主要な関心事である。
【０００３】
[0002]  しかしながら、ＨＳＶ-２感染の血清学的診断は、ＨＳＶ-２抗体のヘルペス単純ウイルス１型(ＨＳＶ-１)への強い交差反応性が存在するという事実により、妨げられてきた。ＨＳＶの２個のサブタイプは、疫学及び自然史における重要な違いを有する：ＨＳＶ-１は通常口唇疾患を引き起こし、一方、ＨＳＶ-２は、ほとんどの場合陰部ヘルペスを引き起こす。ＨＳＶの疫学及び診断の一般的な総説については、上記Brughaら、Int. J. Epidemiol. 26: 698-709, 1997; Ashley及びWaldを参照のこと。
【０００４】
[0003]  ＨＳＶ-２特異的抗体を同定しようとして、様々なアプローチが開発されてきた。ＨＳＶ-２型抗体の型特異的検出についての今日までの最も信頼できる方法は、免疫ブロット検定、好ましくはウエスタン・ブロット検定である。当該方法の重大な欠点は、当該方法が労働集約型であり、そして明確な結果を達成するために、調査人があるレベルの技術を有することを必要とすることである。この１０年やそこらで、幾つかのＨＳＶ糖タンパク質は、型特異的エピトープを含むウイルスタンパク質として同定されてきた。免疫学的検定は、ＨＳＶ-２感染の型特異的決定のために、これらの糖タンパク質に基づいて開発されてきた。例えば、Leeら、J. Clin. Microbiol. 22: 641-644(1985); Eis-Hubingerら, J. Clin. Microbiol. 37: 1242-1246(1999); Groenら, J. Clin. Microbiol. 36: 845-847(19989; Ashleyら, J. Clin. Microbiol. 36: 294-295(1998); Hashidoら、J. Med. Virol. 53: 319-323(1997); 及び米国特許第4,764,459号を参照のこと。
【０００５】
[0004]  これらの方法が様々な感度及び特異性を示すので、ＨＳＶ-２抗体の型特異的検出のためのこれらの糖タンパク質に基づく免疫学的検定に付随する一般的な問題が存在する。全長糖タンパク質は、天然ウイルスタンパク質又は組換え発現されたタンパク質を単離することから得られる。これらの方法は高価であり、そして不純物の影響をうけやすく、そうして交差反応性の影響を受けやすい。
【０００６】
[0005]  ＨＳＶ-２のあるウイルスタンパク質の部分的な配列に対応するペプチドが、幾つかのＨＳＶ-２型特異的エピトープを表しうるので、ＨＳＶ-２型特異的検出において有用であるということが研究により示されてきた。例えば、Leviら, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 3:265-269( 1996); Ackermannら, J. Med. Virol. 55: 281-287(1998); Marsdenら, J. Med. Virol. 56: 79-84(1998); Lijeqvistら, J. Gen. Virol. 79: 1215-1224(1998); Grabowskaら, J. Gen. Virol. 80: 1789-1798(1999); 米国特許第5,919,616号及び第5,965,357号を参照のこと。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、ＨＳＶ-２型特異的診断において使用することができるＨＳＶ-２の糖タンパク質Ｇ２の新規ペプチド配列を提供する。
[0006]  本明細書に引用される全ての開示文献及び特許は、本明細書中に援用される。
[0007]  一の態様では、本発明は、ＨＳＶ-２抗体に特異的に結合し、そしてＨＳＶ-１特異的抗体又は他のヘルペス・ファミリー・ウイルスに対する抗体に最小限にしか反応しないペプチドを含む組成物に関する。当該ペプチドは、配列番号１の２４〜３６個の連続アミノ酸からなる。一の好ましい実施態様では、当該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸５〜３２からなる配列を有する。より好ましい実施態様では、当該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなる配列を有する。最も好ましい実施態様では、当該ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【０００８】
[0008]  幾つかの実施態様では、当該ペプチドは二量化されている。かかる二量化は、ジスルフィド結合を介して達成されうる。別の実施態様では、当該ペプチドはキャリアに結合されている。適切なキャリアの例は、カルボキシル化されたマイクロスフィアであり、好ましくはカルボキシル化されたラテックス又は磁性マイクロスフィアである。
【０００９】
[0009]  幾つかの実施態様では、当該ペプチドは、当該ペプチドのＮ末端又はＣ末端においてリンカーを介してキャリアに結合されている。その一方で、他の実施態様において、当該ペプチドは、当該ペプチドの内部アミノ酸残基においてリンカーを介してキャリアに結合されている。幾つかの場合、リンカーは、異種ペプチドであるか、又は異種ペプチドを含む。他の場合では、リンカーは、異種タンパク質であるか又は異種タンパク質を含む。さらに別の場合、異種タンパク質及び異種ペプチドの両方が使用される。幾つかの他の実施態様では、リンカー全体が異種ペプチドである。一の好ましい実施態様では、異種タンパク質は、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)であり、一方、別の好ましい実施態様では、異種タンパク質は、キーホール・リンペット・ヘモシアニン(ＫＬＨ)である。幾つかの実施態様では、異種ペプチドは、１個のシステイン残基、１個のリジン残基、及び少なくとも２個のグリシン残基を含む。幾つかの他の実施態様では、リンカーは、分枝状のアミノ酸ポリマーを含み、その構造は好ましくは以下の構造：
【化１】
2007526919.tif 000003
で示される。
【００１０】
[0010]  一の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーは４-(マレイミドメチル)-１-シクロヘキサンカルボン酸(ＳＭＣＣ)及びＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、そして当該異種ペプチドは上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合されている。別の好ましい実施態様では、リンカーは、キャリアに直接結合された異種タンパク質ＢＳＡを含み、そしてＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして異種ペプチドを介して当該ペプチドに結合される。
【００１１】
[0011]  別の好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸５〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーはＳＭＣＣ及びＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、そして当該異種ペプチドは上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合されている。別の好ましい実施態様では、当該リンカーは、さらに、キャリアに直接結合された異種タンパク質ＢＳＡを含み、そしてＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして異種ペプチドを介して当該ペプチドに結合される。
【００１２】
[0012]  さらに別の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーはＳＭＣＣ及びＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、そして当該異種ペプチドは、上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合されている。別の好ましい実施態様では、リンカーはさらにキャリアに直接結合された異種タンパク質ＢＳＡを含み、そしてＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして異種ペプチドを介して当該ペプチドに結合される。
【００１３】
[0013]  さらに別の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーはＳＭＣＣ及びＫＣＧＧＧＧのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、そして当該異種ペプチドは上記ペプチドのＮ末端において当該ペプチドに結合される。別の好ましい実施態様では、リンカーはさらにキャリアに直接結合された異種タンパク質ＢＳＡを含み、そしてＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして異種ペプチドを介して当該ペプチドに結合される。
【００１４】
[0014]  さらに好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化されたマイクロスフィアであり、そしてリンカーは、以下の構造を有する分枝状アミノ酸ポリマーを含み、そしてさらに、Ｃ残基を介して以下の：
【化２】
2007526919.tif 000004
で表される構造の末端Ｋ残基に直接結合されるＣＫという短いペプチドを含む。
【００１５】
[0015]  第二態様では、本発明は、ＨＳＶ-２感染の型特異的診断方法に関する。生物学的サンプルにおけるＨＳＶ-２抗体の特異的検出方法は、２つのステップを含む。第一ステップは、生物学的サンプルを、配列番号１の２４〜３６連続アミノ酸からなり、キャリアに結合されたペプチドを含む組成物と接触させることである。第二ステップは、抗原-抗体結合がペプチドと生物学的サンプルの抗体構成要素との間で生じているかを検出することである。このステップでは、抗原-抗体結合の検出は、当該生物学サンプル中にＨＳＶ-２抗体が存在することを指し示す。幾つかの好ましい実施態様では、第二ステップは、フローサイトメトリーにより行われる。生物学的サンプルが全血、血清、血漿、脳髄液、綿棒から得た組織(tissue from a swab device)、又は精嚢液であることが好ましい。
【００１６】
[0016]  一の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸５〜３２からなる配列を有する。より好ましい実施態様では、ペプチドは、配列番号１のアミノ酸９〜３２からなる配列を有する。最も好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１７】
[0017]  幾つかの実施態様では、当該ペプチドは二量化されている。かかる二量化は、ジスルフィド結合を介して達成されうる。幾つかの他の実施態様では、当該ペプチドはカルボキシル化されたマイクロスフィア、カルボキシル化されたラテックス又は磁性マイクロスフィアに結合される。
【００１８】
[0018]  幾つかの実施態様では、当該ペプチドは、当該ペプチドのＮ末端又はＣ末端においてリンカーを介してキャリアに結合されている。一方、他の実施態様では、ペプチドは、当該ペプチドの内部のアミノ酸残基においてリンカーを介してキャリアに結合されている。幾つかの実施態様では、当該リンカーは、異種ペプチドを含む。幾つかの別の実施態様では、リンカーは異種タンパク質を含む。幾つかの他の実施態様では、リンカーは、異種ペプチドに加えて異種タンパク質を含む。幾つかの別の実施態様では、リンカーは異種ペプチドである。一の好ましい実施態様では、異種タンパク質はＢＳＡであり、一方別の好ましい実施態様では異種タンパク質はＫＬＨである。幾つかの実施態様では、異種ペプチドは１のシステイン残基、１のリジン残基、及び少なくとも２のグリシン残基を含む。幾つかの別の実施態様では、リンカーは以下の分枝状アミノ酸ポリマーを含み、その構造は好ましくは以下の：
【化３】
2007526919.tif 000005
で表される。
【００１９】
[0019]  一の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーはＳＭＣＣ及びＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、当該異種ペプチドは上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合され、そしてそして抗原-抗体結合の検出はフローサイトメトリーにより行われる。他の好ましい実施態様では、リンカーはさらに、キャリアに直接結合されている異種タンパク質ＢＳＡを含み、ＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして当該異種ペプチドを介して当該ペプチドに結合されている。
【００２０】
[0020]  別の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸５〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーはＳＭＣＣ、及びＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、当該異種ペプチドは上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合され、そして抗原-抗体結合の検出は、フローサイトメトリーにより達成される。別の好ましい実施態様では、リンカーはさらに、キャリアに直接結合される異種タンパク質ＢＳＡを含み、そしてＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして異種ペプチドを介してペプチドに結合される。
【００２１】
[0021]  さらに別の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーはＳＭＣＣ、及びＧＧＧＧＣＫのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、当該異種ペプチドは上記ペプチドのＣ末端において当該ペプチドに結合され、そして抗原-抗体結合の検出がフローサイトメトリーにより達成される。別の好ましい実施態様では、リンカーはさらに、キャリアに直接結合された異種タンパク質ＢＳＡを含み、そしてＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして異種ペプチドを介してペプチドに結合される。
【００２２】
[0022]  さらに別の好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化された磁性マイクロスフィアであり、リンカーはＳＭＣＣ、及びＫＣＧＧＧＧのアミノ酸配列を有する異種ペプチドを含み、そして当該異種ペプチドは、上記ペプチドのＮ-末端において当該ペプチドに結合される。別の好ましい実施態様では、リンカーはさらに、キャリアに直接結合された異種タンパク質ＢＳＡを含み、そしてＳＭＣＣはＢＳＡに結合され、そして異種タンパク質を介してペプチドに結合される。
【００２３】
[0023]  一の更なる好ましい実施態様では、ペプチドは配列番号１のアミノ酸９〜３２からなるアミノ酸配列を有し、キャリアはカルボキシル化されたマイクロスフィアであり、そしてリンカーは以下の構造を有する分枝状アミノ酸ポリマーを含み、そしてさらにＣ残基を介して以下の：
【化４】
2007526919.tif 000006
で表される構造の末端Ｋ残基に直接結合されるＣＫという短いペプチドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
Ｉ.導入
[0029]  本発明は、ＨＳＶ-２糖タンパク質Ｇ２の部分的な配列からなり、そしてＨＳＶ-２型特異的エピトープを表すペプチドに関する。配列番号１の２４〜３６個の連続アミノ酸からなるＨＳＶ-２ペプチドが、高特異性及び高感度でＨＳＶ-２抗体に結合し、一方そのＨＳＶ-１抗体への交差反応性が最小であることが、本実験により示された。こうして、これらのペプチドは、ＨＳＶ−２感染の型特異的血清学的診断、特にＨＳＶ−１感染からＨＳＶ-２感染を区別することに有用である。
【００２５】
[0030]  本発明のペプチドを含む組成物は、ＨＳＶ-２感染の型特異的血清学的診断に提供される。好ましい実施態様では、本発明のペプチドは、異種ペプチド及び/又はタンパク質、例えばウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)及びキーホール・リンペット・ヘモシアニン(ＫＬＨ)を含むリンカーを介して、キャリア、例えばカルボキシル化されたラテックス又は磁性マイクロスフィアに結合される。他のリンカー、例えば分枝状アミノ酸ポリマー、直鎖又は分子鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー(例えば、ＳＭＣＣ)、又はポリエーテル・リンカーは、本発明を実行する際にも使用されうる。本発明のＨＳＶ-２ペプチドは、当該ペプチドのＮ又はＣ末端において、又は内部のアミノ酸残基を介してキャリアに結合されうる。
【００２６】
[0031]  さらに、ＨＳＶ-２抗体の型特異的検出のためにこれらのペプチドを使用する方法が提供される。好ましい実施態様では、ＨＳＶ-２特異的抗体の検出は、フローサイトメトリーにより行われる。
【００２７】
ＩＩ.  定義
[0032]  「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然アミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸ミメティクス及びアミノ酸アナログを指す。天然アミノ酸は、遺伝コードによりコードされているアミノ酸、並びに後に改変されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、及びＯ-ホスホセリンである。「アミノ酸アナログ」という用語は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、つまり、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基により結合されるα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン・スルホキシド、メチオニン・メチル・スルホニウムを指す。かかるアナログは、改変Ｒ基(例えば、ノルロイシン)又は改変されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。「アミノ酸ミメティクス」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
【００２８】
[0033]  アミノ酸は、本明細書中で、その一般的に知られている３文字表記により表されるか、又はＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ 生物化学命名法委員会により推奨される１文字表記により記載されうる。
【００２９】
[0034]  「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書中で交換可能なように使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学ミメティクスであるアミノ酸ポリマーに適用され、そして天然のアミノ酸ポリマー及び非天然のアミノ酸ポリマーにも適用される。本明細書中に使用されるとき、当該用語は、全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を含み、ここで当該アミノ酸残基は、共有ペプチド結合により結合される。本出願において使用されるＨＳＶ-２ペプチドは、ＨＳＶ-２糖タンパク質Ｇ２の断片に対応する配列を有するペプチドを指す。
【００３０】
[0035]  本明細書中で使用される「キャリア」は、天然物質、例えば、ガラス及びコラーゲン、又は合成物質、例えばアクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、シリコーン・ラバー、ポリスチレン、ポリエチレン・ビニル・アセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリシリケート、ポリエチレン・オキシド、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ酢酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸などの不活性の固体支持体を指す。キャリアの表面上に元々存在する幾つかの官能基、例えば、カルボン酸(-ＣＯＯＨ)、遊離アミン(-ＮＨ2)、及びスルフヒドリル(-ＳＨ)基は、ペプチド結合に使用されうる。元々利用できるそうした基がない場合、所望の官能基、例えば、カルボン酸基、又は結合相互作用のパートナーとして知られている部分(例えばビオチンを結合することができるアビジンなど)が、かかる固体支持体に結合されうる。本発明の好ましい担体は、カルボキシル化されたラテックス又は磁性マイクロスフィアである。
【００３１】
[0036]  本明細書中に使用される「リンカー」は、本発明のペプチドをキャリアに結合する任意の手段を指す。リンケージは、ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに位置しうる。幾つかの実施態様では、リンケージは、ペプチドの内部アミノ酸残基の側鎖、例えばペプチドのＮ又はＣ末端に存在しないアスパラギン酸の第二カルボキシル基を通して達成されうる。リンカーは、本発明のペプチドとは異種性であるペプチド(例えば、ＧＧＧＧＣＫ又はＧＧＣＫといった短いアミノ酸配列)又はタンパク質(例えば、ＢＳＡ又はＫＬＨ)を含みうる。異種ペプチドに加えて、リンカーは、さらに異種タンパク質、例えばＢＳＡ又はＫＬＨをさらに含んでもよい。非ポリペプチドリンカー、例えば直鎖又は分枝鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、又はポリエチレンリンカーは、本発明のペプチドをキャリアに結合する目的のために適しているか、複数の構成要素リンカーの一部として適切でありうる。一の好ましい非ポリペプチド・リンカーはＳＭＣＣである。さらに、リンカーは、１超の本発明のペプチドをキャリアに結合できる分枝状のアミノ酸ポリマーを含みうる。異種二機能性及び同一二機能性リンカーは、本発明の実行の際に適している。リンカーは、本発明のペプチドがキャリアに直接結合される場合、共有結合、例えばペプチド結合又はジスルフィド結合、又は非共有結合、例えばイオン結合又は疎水結合を含みうる。非共有結合の例は、抗原-抗体間、又はビオチン-アビジン間の相互作用である。
【００３２】
[0037]  リンカー又はリンカーの構成要素としてペプチド又はタンパク質を記載する文脈において使用される場合、「異種」という用語は、リンカーペプチド又はリンカータンパク質と、リンカーを介してキャリアに結合される本発明のペプチドとが、互いに本来同じ関係に見られることがないということを指す。言い換えれば、リンカーペプチド及び/又はリンカータンパク質と、本発明のペプチドとは、本発明の特定の実施態様において結合されるとき、本来発見されるアミノ酸配列を産生しない。例として、本発明のペプチドは、ＨＳＶ-２糖タンパク質Ｇ２に由来し、それゆえ異種ペプチド又はタンパク質は、本発明のペプチドの由来元である配列に隣接するＨＳＶ-２糖タンパク質Ｇ２の配列に由来しない。
【００３３】
[0038]  本明細書中で使用される「特異的検出」は、しばしば他の抗体及びタンパク質の異種集合において、本発明のペプチドに結合する任意の抗体の検出が、ＨＳＶ-２抗体の存在を決定するという事実を意味する。特に、ＨＳＶ-１抗体の存在は、当該ペプチドに結合された検出可能量の抗体をもたらさないだろう。そうして、「特異的検出」という用語は、ＨＳＶ-１感染からＨＳＶ-２感染を区別するために、本発明のＨＳＶ-２ペプチドを使用することを特に含む。指定された免疫学的検定の条件下で、検出可能なシグナルは、バックグランド・シグナルの少なくとも二倍であるシグナルを指す。こうして、特異的抗体-ポリペプチド結合は、バックグランドの少なくとも２倍、好ましくは１０倍、そしてより好ましくは１００倍のシグナルを産生するべきである。
【００３４】
[0039]  本発明のペプチドを記載するために使用される場合、「二量化」又は「二量体」という用語は、同じペプチドを共有結合、例えばジスルフィド結合を介して、又は非共有結合、例えば、既知のタグとタグ結合対(例えばビオチンとアビジン)との間の結合相互作用を介して、同じペプチドを含む２個の分子により形成される複合体をさす。共有結合又は非共有結合は、典型的に２個のペプチド含有分子のリンカー部分のあいだで生じる。
【００３５】
[0040]  本明細書中に使用される「内部アミノ酸残基」という用語は、本発明のＨＳＶ-２ペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかの一番目の残基ではない任意のアミノ酸残基を指す。
【００３６】
[0041]  「生物学的サンプル」という用語は、生検及び検視解剖サンプルなどの組織切片、及び組織学的目的のためにとられた凍結切片を指す。かかるサンプルは、全血、血清、血漿、脳髄液、唾液、組織、培養細胞、例えば初代培養、外植片、形質転換細胞、大便、尿、精嚢液、粘液、及び他の体分泌物、又は綿棒でサンプリングされうる組織を含みうる。典型的に、生物学的サンプルは、ＨＳＶ-２に感染した可能性のあるヒトから得られる。
【００３７】
[0042]  「抗体」という用語は、免疫グロブリン・ファミリーのタンパク質又は非共有結合により、可逆的に、そして特異的に対応する抗原に結合できる免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを指す。代表的な抗体の構造ユニットは、四量体を含む。四量体の各々は、２個の同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各対は１の軽鎖(約２５ｋＤ)及び１の重鎖(約５０〜７０ｋＤ)を有し、１以上のジスルフィド結合を通して結合されている。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμ定常領域遺伝子を含み、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖は、κ又はλとして分類される。重鎖は、γ、μ、α、δ、又はεとして分類され、これらは次にそれぞれ免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを規定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に寄与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(ＶL)及び可変重鎖(ＶH)という用語は、それぞれ、軽鎖及び重鎖の可変領域を指す。
【００３８】
[0043]  「相補性決定ドメイン」又は「ＣＤＲ］という用語は、ＶL及びＶHの超可変領域を指す。ＣＤＲは、標的タンパク質に対する特異性を有する抗体鎖の標的タンパク質結合部位である。各ヒトＶL又はＶHにおける３個のＣＤＲ(ＣＤＲ１〜３、Ｎ末端から順次名づける)が存在し、可変領域の約１５〜２０％を構成する。ＣＤＲは、構造的に標的タンパク質のエピトープに相補し、そして結合特異性に直接寄与する。残りのＶL又はＶHのストレッチ、いわゆるフレームワーク領域は、アミノ酸配列について低い変動性しか示さない(Kuby, Immunology, 第四版, 第四章、W.H. Freeman＆ Co., New York, 2000)を示す。
【００３９】
[0044]  ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当該技術分野の様々な周知定義、例えば、Kabat, Chothia, International ImMunoGeneTics(IMGT)データーベース、及びAbM(例えば、Johnsonら、Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia及びLesk, J. MoI. Biol, 196:901-917(1987); Chothiaら、Nature, 342:877-883(1989); Chothiaら、J. MoI. Biol., 227:799-817 (1992); Al-Lazikaniら、J.Mol.Biol, 273:927-748 (1997)を参照のこと)を用いて決定される。抗原結合部位の定義は、また以下に記載される：Ruizら、Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000);及びLefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallumら、J. MoI. Biol, 262:732-745 (1996);及びMartinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martinら、Methods Enzymol, 203:121-153 (1991); and Reesら、In Sternberg MJ.E. (編), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996).
【００４０】
[0045]  「抗体軽鎖」及び「抗体重鎖」という用語は、それぞれＶL又はＶHを指す。ＶLは、遺伝子断片Ｖ(可変部)及びＪ(接合部)によりコードされ、そしてＶHは、Ｖ、Ｄ(相違部)、及びＪによりコードされる。ＶL又はＶHの各々は、ＣＤＲ、並びにフレームワーク領域を含む。
【００４１】
[0046]  抗体は、無傷の免疫グロブリンとして存在するか、又は様々なペプチダーゼでの切断により産生される多くの良く特徴付けられた断片として存在する。こうして、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合より下の抗体を切断して、Ｆ(ab)’2、つまりＦab’の二量体をもたらす。Ｆab’自身は、ジスルフィドによりＶH-ＣH１に連結された軽鎖である。Ｆ(ab)’2は、温和な条件下で還元されて、ヒンジ領域のジスルフィド結合が破壊され、それによりＦ(ab)’2ダイマーをＦａｂ’モノマーへと変換する。 Ｆａｂ’モノマーは、実質的に、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂである(Paul, Fundamental Immunology 第三版、1993)。様々な抗体断片は、無傷の抗体を切断する観点について定義されている一方、当業者により、かかる断片が化学的に又は組換えＤＮＡ方法論を使用することにより合成されうるということが認められよう。こうして、抗体という用語は、本明細書中に使用されるとき、全抗体の改変により産生される抗体断片、又は組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成される抗体断片(例えば一本鎖ＦＶ)、又はファージ・ディスプレー・ライブラリーを用いて同定される抗体断片を含む(例えば、McCaffertyら、Nature, 348:552-554(1990)を参照のこと)。
【００４２】
[0047]  モノクローナル又はポリクローナル抗体の調製のため、当該技術分野に知られている任意の技術が使用されうる(例えば、Kohler＆Milstein, Nature, 256:495-497(1975)；Kozborら、Immunology Today, 4:72(1983); Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985を参照のこと)。一本鎖抗体を製造するための技術(米国特許第4,946,778号)は、本発明のポリペプチドに対する抗体を産生する為に適用することができる。また、トランスジェニックマウス、又は他の生物、例えば他の哺乳動物は、ヒト化抗体を発現するために使用されうる。或いは、ファージ・ディスプレイ技術は、抗体、及びヘテロメリックＦａｂ断片、又は選択された抗原に特異的に結合するｓｃＦＶ断片を同定するために使用されうる(例えば、上記McCaffertyら；Marksら、Biotechnology, 10:779-783(1992)を参照のこと)。
【００４３】
[0048]  この適用において使用される「ＨＳＶ-２抗体」は、ＨＳＶ-２抗原に特異的に反応するが、他の起源、特にＨＳＶ-１の抗原には反応しない抗体を指す。
【００４４】
ＩＩＩ.ペプチド合成
Ａ.  化学方法によるペプチドの合成
[0049]  本発明のペプチドは、慣用されているペプチド合成又は他の当該技術分野に周知のプロトコルを用いて化学的に合成されうる。
【００４５】
[0050]  ペプチドは、Merrifieldら、J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2156 (1963); Barany及びMerrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology Gross and Meienhofer (編), Academic Press, N. Y., vol. 2, pp.3-284 (1980); 及びStewartら、Solid Phase Peptide Synthesis 第二版, Pierce Chem. Co., Rockford, 111. (1984)により記載される方法に類似の方法を用いて固相ペプチド合成方法により合成されうる。合成の間、保護された側鎖を有するＮ-α-保護アミノ酸を、Ｃ末端により結合された伸張ポリペプチド鎖に、及び固体支持体、つまりポリスチレンビーズに順次加えた。ペプチドは、Ｎ-α-脱保護アミノ酸のアミノ基を、Ｎ-α-保護アミノ酸のα-カルボキシ基に結合させることにより合成される。当該Ｎ-α-保護アミノ酸は、これをジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反応させることにより活性化された。遊離アミノ基の活性化カルボキシル基への結合は、ペプチド結合の形成をもたらす。最も一般的に使用されるＮ-α-保護基は、酸に不安定であるＢｏｃ、及び塩基に不安定であるＦｍｏｃを含む。
【００４６】
[0051]  固体支持体として使用するために適した物質は、当業者に周知であり、そして非限定的に以下の：ハロメチル・レジン、例えば、クロロメチル・レジン、又はブロモメチルレジン；ヒドロキシメチル・レジン；フェノール・レジン、例えば４-(α-[２,４-ジメトキシフェニル]-Ｆｍｏｃ-アミノメチル)フェノキシ・レジン；ｔｅｒｔ-アルキルオキシカルボニル-ヒドラジド化レジンなどを含む。かかるレジンは、市販されており、そしてその製造方法は、当業者により知られている。
【００４７】
[0052]  簡潔に記載すると、Ｃ末端Ｎ-α-保護アミノ酸が、最初に固体支持体に結合される。次に、Ｎ-α-保護基を取り除く。脱保護されたα-アミノ基を、次に、Ｎ-α-保護アミノ酸の活性化α-カルボキシル基に結合する。この過程を所望のペプチドが合成されるまで繰り返す。得られたペプチドを、次に不溶性のポリマー支持体から切断し、そしてアミノ酸側鎖を脱保護する。より長いペプチドは、保護されたペプチド断片を縮合することにより得ることができる。適切な化学反応、レジン、保護基、保護アミノ酸、及び試薬についての詳細は、当該技術分野において周知であり、そして本明細書中には詳細に記載しない(Athertonら、Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press (1989), 及びBodanszky, Peptide Chemistry, A Practical Textbook, 第二版, Springer- Verlag (1993)を参照のこと)。
【００４８】
Ｂ.組換え法によるペプチドの製造
[0053]  当業者が知ることであろうが、本発明のペプチドは、組換え方法によっても作成されうる。上で記載される方法に従ってペプチドを化学合成することが好ましいことが多いが、ある場合においては組換え法によりペプチドを得ることにいくらかの利点がありうる。例えば、本発明のＨＳＶ-２ペプチドが、異種ペプチド及び/又は異種タンパク質と結合される場合、ＨＳＶ-２ペプチドをコードする核酸配列は、適切な発現ベクターに導入され、そして続いて、異種ペプチド及び/又はタンパク質のコード配列とフレーム内で融合させる。その結果、適切な宿主細胞系列にトランスフェクション又はトランスフォーメーションすると、ＨＳＶ-２ペプチドと異種ペプチド/タンパク質の融合ポリペプチドが産生され、そして精製されうる。当業者によく知られている多種多様の発現ベクター及び宿主細胞は、この目的のために使用されうる。
【００４９】
Ｃ.ペプチド精製
[0054]  合成ペプチドの精製は、様々な方法のクロマトグラフィー、例えば逆相ＨＰＬＣ、ゲル浸透、イオン交換、サイズ排除、アフィニティー、分配、又は向流分配などの様々な方法のクロマトグラフィーを使用して達成される。適切なマトリクス及び緩衝液の選択は、当該技術分野に周知である。
【００５０】
[0055]  実質的に純粋になるまで組換え産生されたペプチドを精製することは、硫酸アンモニウムなどの物質での選択的沈殿、カラム・クロマトグラフィー、免疫精製法、及び他の方法を含む標準技術を用いて達成されうる。例えば、Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982);米国特許第4,673,641号; Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (1994);及びSambrook及びRussell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第三版(2001)を参照のこと。特に、組換えポリペプチドが既知の接着性質を有する異種タンパク質へと融合されたＨＳＶ-２ペプチド含む場合、適切な結合パートナーが固定化されたカラムを通すことにより比較的容易に、そして比較的高純度で精製することができる。
【００５１】
Ｄ.ペプチド配列の確認
[0056]  ＨＳＶ-２型特異的検出用に調製されるペプチドのアミノ酸配列を、多くの確立された方法により確認することができる。例えば、エドマン分解の慣用方法は、ペプチドのアミノ酸配列を決定するために使用されうる。エドマン分解に基づく配列決定法のいくつかのバリエーション、例えばマイクロ配列決定法及び質量分析法に基づく方法は、本目的のために頻繁に用いられる。
【００５２】
Ｅ.ペプチド改変
[0057]  本発明のペプチドは、よりのぞましい性質を達成するために改変されうる。化学的に改変されたペプチド及びペプチド擬似物であって、タンパク質分解酵素による分解に抵抗性であるか又は改善された溶解度又は結合能力を有するものは、周知である。
【００５３】
[0058]  ＨＳＶ-２型特異的検出に用いられるペプチドの改変アミノ酸又は化学誘導体は、通常糖タンパク質Ｇ２の一部ではない改変アミノ酸の付加的な化学部分を含む。当該ペプチドの共有改変は、本発明の範囲内である。かかる改変は、ペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側さ又は末端残基と反応できる有機誘導体剤と反応させることにより、ペプチド中に導入されうる。化学誘導体についての以下の例は、例示の目的により提供され、そして制限する目的により提供されるわけではない。
【００５４】
[0059]  タンパク質分解酵素による分解に抵抗性を有するペプチド擬似物の設計は、当業者に知られている。例えば、Sawyer, Structure-Based Drug Design, P. Verapandia編., N. Y. (1997); 米国特許第5,552,534号及び第5,550,251号を参照のこと。ペプチド骨格及び側鎖の両方の改変は、２次構造を真似て設計する際に使用されうる。可能な改変は、Ｄ-アミノ酸、Ｎ-α-Ｍｅ-アミノ酸、Ｃα-Ｍｅ-アミノ酸、及びデヒドロアミノ酸への置換を含む。 今日までに、様々な二次構造ミメティクスが設計され、そしてペプチド又はペプチドミメティクス中に取り込まれてきた。
【００５５】
[0060]  他の改変は、天然アミノ酸を、非天然ヒドロキシル化アミノ酸と置換すること、酸性アミノ酸のカルボキシ基をニトリル誘導体に置換すること、塩基性アミノ酸の水酸基をアルキル基に置換すること、又はメチオニンをメチオニン・スルホキシドに置換することを含む。さらに、ＨＳＶ-２の型特異的検出用のペプチドのアミノ酸は、同じアミノ酸であるが、反対のキラリティを有するアミノ酸により置換されうる。つまり、天然Ｌ-アミノ酸は、そのＤ立体配置により置換されてもよい。
【００５６】
[0061]  本発明のペプチドは、ＨＳＶ-２抗体に特異的に結合する能力を高めるように改変されうる。例えば、異種ペプチド、異種タンパク質、及び/又は事実上非ポリペプチドの化学物質を含みうるリンカーは、特許請求されるペプチドのキャリアへの固定を促進するために、並びに当該ペプチドをＨＳＶ-２抗体へとよりよく提示するために、本発明のペプチドのいずれかの末端に導入されうる。他の例と同様に、本発明のペプチドは、ＨＳＶ-２抗体への特異的結合の高レベルを達成するために二量体化されうる。様々な方法が、二量体化に使用され、そして最も一般的に使用される方法は、ジスルフィド結合を通した方法である。天然システイン残基がペプチド中に存在しないので、システイン残基はリンカーの一部として含まれうる。リンカーを本発明のペプチドに加える方法は、次のセクションにおいて詳細に記載されよう。
【００５７】
ＩＶ.ペプチドのキャリアへの固定
[0062]  ＨＳＶ-２抗体の型特異的検出のため本発明に開示されるペプチドは、好ましくは固体支持体又はキャリアへと固定される。キャリアは、しばしば合成ポリマー物質であるが、天然物質であってもよい。キャリア物質の例は、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン・ビニル・アセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリシリケート、ポリエチレン・オキシド、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコーン・ゴム、コラーゲン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ酢酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸である。キャリアは、薄いフィルム又は膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織ファイバー、成形ポリマー、粒子、及び微粒子、例えばマイクロスフィアを含む。支持体の好ましい形態は、プレート及びビーズである。ビーズの最も好ましい形態は、磁性ビーズ又はラテックスビーズである。
【００５８】
Ａ.リンカーへの結合
[0063]  本発明のペプチドは、様々なリンカーを介してキャリアに結合されうる。リンカーは、ペプチドのＮ又はＣ末端に結合されうる。ペプチドとキャリアとの間の間接的な結合の場合、リンカーは、本発明のペプチドとは異種性である第二ペプチドからなってもよく、又は異種ペプチドに加えてさらに本発明のペプチドとは異種性であるタンパク質をさらに含む。分枝状のアミノ酸ポリマーは、リンカーとして使用されることもあり、リジン残基上の２個のアミン基などのアミノ酸残基上の複数の官能基を利用する。当業者に周知である他の適切なリンカーが存在し、非限定的に直鎖又は分子鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー(例えばＳＭＣＣ)、又はポリエーテル・リンカーを含む。これらのリンカーは、異種ペプチド及び/又はタンパク質に加えて又は変わりに使用されうる。
【００５９】
[0064]  直接結合の場合、リンカーは、ペプチドとキャリアとの間の共有結合(例えばジスルフィド結合)又は非共有結合(例えばイオン性結合)でありうる。 
【００６０】
１.間接的な結合
[0065]  本発明のペプチドが合成方法を介して獲得される場合、リンカーとして役に立つ異種ペプチドは、ペプチド合成の際に含められてもよい。例えば、１個のシステイン残基、１個のリジン残基、及び少なくとも２個のグリシン残基からなるリンカーは、Ｎ又はＣ末端において合成されるペプチド配列の一部として含められうる。直鎖又は分枝鎖炭素リンカー、複素環炭素リンカー、又はポリエチレンリンカーなどの他のリンカーは、異種ペプチド及び/又はタンパク質と組み合わせて又は単独で本発明のＨＳＶ-２ペプチドを連結するために使用されてもよい。リンカー中の異種ペプチドに加えて、異種タンパク質、例えばＢＳＡ及びＫＬＨが使用される場合、当該異種タンパク質は、ペプチドの合成及び精製後に化学的方法によって当該ペプチドに連結されうる。ここで当該ペプチドに対して、合成の間において異種ペプチドが既に加えられていた。かかる結合は、α-炭素アミノ及び末端アミノ酸残基のカルボキシル基を通して、例えばペプチド結合を通してペプチドと異種タンパク質とを連結することにより、又は側鎖基を通して、例えばジスルフィド結合を通して、ペプチドのアミノ酸残基と異種タンパク質とを連結することにより達成されうる。異種ペプチド及び/又はタンパク質などのリンカーは、ＨＳＶ-２ペプチドの内部アミノ酸残基(例えば、アスパラギン酸残基の第二カルボキシル基)の官能基を通して、本発明のＨＳＶ-２ペプチドに連結されうる。
【００６１】
[0066]  本発明のペプチドが、組換え法を介して得られる場合、異種ペプチド又はタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、サブクローニング法の間に含められ、こうして得られた組換えポリペプチドは、結合された適切なリンカーをすでに有するであろう。
【００６２】
[0067]  適切な官能基、例えば炭素リンカー、又はポリエーテル・リンカーを有する種々の他のリンカーは、本発明を実行するために有用であろうということが、当業者により認識されるであろう。これらのリンカーは、(例えば、システインに対するジスルフィド結合を介して)アミノ酸の側鎖の基を通してペプチドの構成アミノ酸に連結されうる。リンカーは、ペプチドの末端アミノ酸のα-炭素アミノ基又はカルボキシル基に連結されうる。
【００６３】
２.直接結合
[0068]  本発明のペプチドは、不溶性のキャリアに対して直接固定されうる。ペプチドをキャリアに結合させる戦略(当該戦略のペプチドは、通常カルボン酸(-ＣＯＯＨ)、遊離アミン(-ＮＨ2)、又はスルフヒドリル(-ＳＨ)基などの様々な官能基であって、キャリア上の適切な官能基と反応して、結合をもたらすために利用できる官能基を含む）は、ペプチド又はタンパク質リンカーをキャリアに結合させる幾つかのアプローチに類似しており、その詳細は次のセクションに記載されている。
【００６４】
Ｂ.キャリアへの結合
１.  共有結合
[0069]  ＨＳＶ-２型特異的検出のためのペプチドは、リンカーを伴って又は伴わずに共有結合を介してキャリアに結合されうる。しばしば、キャリアは、幾つかの官能基、例えばアミン、カルボン酸、及びスルフヒドリル基を有する。ここで、これらの官能基と、ペプチド又はリンカーの官能基とは、容易に反応し、そしてペプチドとキャリアを結合する共有結合を作り出しうる。本発明のペプチドとキャリアとを連結する共有結合は、キャリアとペプチドの末端アミノ酸残基との間に存在しうるか、又はキャリアとペプチドの内部アミノ酸残基との間に存在しうる。この目的に適し、キャリア上に元々存在する官能基が存在しない場合、キャリアは、結合前に誘導体化させて、付加的な反応性官能基を露出させるか又は取り付ける。誘導体化は、Pierce Chemical Company, Rockford, Illinoisから市販される多くの分子のいずれかを取り付けることを含みうる。
【００６５】
２.  非共有結合
[0070]  或いは、ペプチドは、タグとタグ結合物質の既知の相互作用を介して、キャリアに結合されうる。当該結合相互作用のうちの一のパートナー、例えば、タグは、ペプチドにリンカーとして結合され、一方、もう一方のパートナー、例えば、タグ結合物質は、キャリアに結合されうる。文献に記載された分子相互作用に基づいて、多くのタグとタグ結合物質を使用することができる。例えば、タグは、天然の結合物質、例えばビオチンを有する場合、ビオチンは、適切なタグ結合物質(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラビジンなど)と併せて使用することができる。受容体-リガンド相互作用はまた、タグとタグ結合物質の対として適切である。細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニト(例えば、細胞受容体-リガンド）の相互作用、例えばトランスフェリン、ｃ-ｋｉｔ、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチン・ファミリーなどについては、例えばPigott＆Power, The Adhesion Molecule Facts Book I(1993)を参照のこと。同様に、トキシン及び毒、ウイルス・エピトープ、ホルモン(例えば、アヘン剤、ステロイドなど)、細胞内受容体(例えば、ステロイド、チロイド・ホルモン、レチノイド及びビタミンＤ；ペプチドを含む様々な小さいリガンドの効果を媒介する受容体)、薬剤、レクチン、糖、核酸(直鎖及び環状ポリマー形態)、オリゴ糖類、タンパク質、リン脂質、及び抗体などはすべて、様々な細胞受容体と相互作用しうる。さらに、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレン・スルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、及びポリアセテートなどのいくつかの合成ポリマーは、適切なタグ又はタグ結合物質を同様に形成しうる。
【００６６】
[0071]  タグを含むリンカーは、上で記載されるように多くの方法を介してペプチドに結合されうる。一方、タグ結合物質は、現在利用できる様々な方法のいずれかを使用して、固体担体(つまり、キャリア)に固定されうる。固体担体は、一般的に、担体の全て又は一部を、化学基を表面に固定する化学試薬に晒すことにより誘導体化又は官能基化され、そして当該化学基は次に、タグ結合物質の一部と反応する。例えば、長鎖部分に結合させるために適した基は、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基を含むであろう。アミノアルキルシラン及びヒドロキシアルキルシランは、様々な表面、例えばガラス表面を官能基化するために使用されうる。かかる固相バイオポリマー・アレイの構築は、文献によく記載されている。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154(1963)(例えば、ペプチドの固相合成を記載する)；Geysenら、J. Immun. Meth. 102:259- 274 (1987) (ピン上での固相構成要素の合成を記載する)；Frank & Doting, Tetrahedron 44:6031-6040 (1988) (セルロース・ディスク上での種々のペプチド配列の合成を記載する); Fodorら、Science, 251:767-777 (1991); Sheldonら、Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993); 及びKozalら、Nature Medicine 2(7):753759 (1996) (これらは皆、固体担体に固定されたバイオポリマーのアレイを記載する)を参照のこと。タグ結合物質を担体に固定するための非化学的アプローチは、他の一般的な方法、例えば、加熱、ＵＶ放射による架橋などを含む。
【００６７】
Ｖ.型特異的ＨＳＶ-２抗体検出のための検定
Ａ.本発明のペプチドを用いたＨＳＶ-２抗体の検出
[0072]  本発明のペプチドが、ＨＳＶ-２型特異的検出に有用であるために、本発明のペプチドは、特異性を持ってＨＳＶ-２抗体と結合できなければならない。特異的結合性を試験するために、多くの周知の免疫学的結合検定が行われうる。例えば、米国特許第4,366,241号；第4,376,110号;第4,517,288号;及び第4,837,168号を参照のこと。免疫学的検定法の一般的な総説として、Asai, Methods in Cell Biology, Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. NY (1993)を参照こと。
【００６８】
[0073]  典型的に、本発明のペプチドは、固定化され、そしてＨＳＶ-２抗体に対するいわゆる「補足剤」として使用されうる。ＨＳＶ-２抗体を含むが、ＨＳＶ１抗体を含まないと知られているサンプルは、特異性を有してＨＳＶ-２抗体に結合できるペプチドをスクリーニングする結合検定において使用されてもよい。適切な結合条件は、当該技術分野において知られており、そしてかかる結合検定を行うことについての一般的な指示は、多くの化学文献に見つけることができる。例えば、Harlow及びLane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照のこと。抗体-ペプチド複合体を形成した際に、かかる複合体の存在を指し示すために標識剤が使用される。この場合において、この目的のために標識剤を使用する方法がいくつか存在する。例えば、標識剤は、抗体ペプチド複合体を認識でき、そして標識を有する二次抗体であってもよい。或いは、当該二次抗体は、それ自身標識を有してなくても良く、代わりに二次抗体の由来元の種の抗体に特異的な標識三次抗体により結合されうる。当該二次抗体は、検出できる部位、例えばビオチンを用いて改変されていてもよい。ここで、当該ビオチンに対し三次標識分子(例えば標識を有するストレプトアビジン)は特異的に結合できる。さらに、免疫グロブリン定常領域に特異的に結合できる他のタンパク質、例えばタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇは、標識剤としても使用されうる。これらのタンパク質は、連鎖球菌細胞壁の通常の構成要素であり、そして様々な種由来の免疫グロブリン定常領域に対する強い非免疫原性の反応性を示す。一般的に、Kronvalら、J. Immunol, 111:1401-1406 (1973);及びAkerstromら、J. Immunol, 135:2589-2592 (1985)を参照のこと。
【００６９】
[0074]  検定を通して、インキュベーション及び/又は洗浄ステップは、試薬の各組合せの後に必要とされうる。インキュベーション・ステップは、約５秒〜数時間、好ましくは、約５分〜２４時間で変わりうる。インキュベーション時間は、検定様式、特定のペプチド、溶液体積、濃度などに依存して変化するであろう。当該検定は、しばしば室温で行われるが、当該検定は約１０℃〜約４０℃などの温度範囲で行われうる。
【００７０】
[0075]  異なる標識方法は、抗体-ペプチド複合体の検出に使用されうる。標識部分は、例えば、二次抗体又は三次抗体に結合された蛍光分子(例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサス・レッド、及びフィコエリトリン)又は酵素分子(例えば、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びβ-ガラクトシダーゼ)であり、蛍光発光又は酵素により触媒される化学反応産物に基づいて検出を可能にする。種々のアイソトープ、例えば3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、又は32Ｐを含む放射性標識は、適切な分子へと結合され、そして抗体-ペプチド複合体の検出は、放射活性を記録する任意の適切な方法、例えばオートラジオグラフィーにより行われうる。例えば、Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays," Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon and van Knippenberg編, Elsevier (1985), pp. 9-20を参照のこと。標識の導入、標識方法、及び標識の検出はPolak及び Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 第二版, Springer Verlag, NY (1997); 及びHaugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,  Molecular Probes, Inc.により刊行される便覧とカタログの組合せ(1996)において見つけることができる。
【００７１】
Ｂ.フローサイトメトリー
[0076]  フローサイトメトリーは、ＨＳＶ-２型特異的抗体の存在を検出するための好ましい方法の一つであり、ここで、本発明のペプチドは、適切な粒子に結合され、そしてＨＳＶ-２抗体の特異的結合は、例えば蛍光で標識された第三分子の結合を介して検出される。フローサイトメトリー法及びフローサイトメトリー用の装置は、当該技術分野に知られており、そして本発明の実行の際に使用されうる。一般的なフローサイトメトリーは、レーザービームを横切る流れとして微粒子の懸濁液を通過させ、そして光電子増倍管チューブにより各粒子からの蛍光発光を検出することである。フローサイトメトリー用の装置及び方法についての詳細な記載は、文献に記載されている。文献の例は以下の：McHugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Methods in Cell Biology 42, Part B (Academic Press, 1994); McHughら, "Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry Instrumentation," Clinical Flow Cytometry, Bauer, K.D.ら編. (Baltimore, Maryland, USA: Williams and Williams, 1993), pp. 535-544; Lindmoら、"Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity," J. Immunol. Meth. 126: 183-189 (1990); McHugh, "Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays," Immunochemica 5: 116 (1991); Horanら、"Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis: Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry," Immunoassays in the Clinical Laboratory, 185-189 (Liss 1979); Wilsonら, "A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry," J. Immunol. Meth. 107: 225-230 (1988); Fulwylerら、"Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Meth. Cell Biol. 33: 613-629 (1990); Coulter Electronics Inc., 英国特許第1,561,042号(１９８０年２月１３日公開)；及びSteinkampら, Review of Scientific Instruments 44(9): 1301-1310 (1973)である。
【００７２】
[0077]  本発明を実行する際に使用される粒子は、好ましくは顕微鏡サイズであり、そしてポリマー性物質から形成される。微粒子として有用であるポリマーは、生物学的サンプルの構成要素に比較して、及び微粒子表面に固定される結合メンバー皮膜以外の検定試薬に比較して化学的に不活性である。適切な微粒子物質は、最小の自己蛍光しか有さず、固体でありそしてサンプル中及び当該アッセイに使用される任意の緩衝液、溶媒、キャリア、希釈剤、又は懸濁剤中で不溶性であり、そして、好ましくは共有結合を介して適切な皮膜物質を固定できよう。適切なポリマーの例は、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアルキレン・オキシド、ポリアミド、ポリウレタン、多糖類、セルロース、及びポリイソプレンである。架橋は、多くのポリマーに構造的な統合性及び剛性を与えるのに有用である。微粒子の大きさの範囲は変化し、そして粒子サイズの範囲は本発明に決定的ではない。多くの場合、微粒子は、約０.５μｍ〜約１００μｍ、そして好ましくは約０.３μｍ〜約４０μｍの直径範囲であろう。
【００７３】
[0078]  粒子の回収及び検定の洗浄ステップを高めるために、粒子は、好ましくは磁気反応性物質、つまり磁場に反応する任意の物質を含む。インキュベーションの後又は洗浄ステップの後の固相及び液相の分離は、次に懸濁液をインキュベーションする反応容器に磁場をかけ、当該容器の壁に粒子をくっつけ、それにより液体をデカンテーション又はアスピレーションにより取り除くことを可能にすることにより達成されうる。磁気反応性の本発明の関心の物質は、常磁性物質、強磁性物質、フェリ磁性物質、及びメタ磁性物質を含む。常磁性物質が好ましい。この例は、鉄、ニッケル、及びコバルト、並びにＦｅ3Ｏ4、ＢａＦｅ12Ｏ19、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ2Ｏ3、Ｃｒ2Ｏ3、及びＣｏＭｎＰなどの金属酸化物である。
【００７４】
[0079]  磁気反応性の物質は、ポリマーを介して分散され、ポリマー表面上の皮膜として又は表面上の２以上の皮膜のうちの一つとして適用されるか、又は当該物質を粒子内へと固定する他の任意の様式で取り込まれるか若しくは固定されうる。粒子中の磁気反応性物質の量は決定的でなく、そして広い範囲で変化しうる。その量は微粒子の密度に影響しうるが、量及び粒子サイズの両方は、液体と固相との間の最大接触を達成するため、そしてフローサイトメトリーを実行するために懸濁状態で微粒子を維持することの容易さに影響しうる。微粒子における磁気反応性物質の過剰量は、検定結果を邪魔するのに十分高いレベルの自己蛍光を産生しうる。それゆえ、磁気反応性物質の濃度は、物質から放出される自己蛍光を最小にするように十分低くなければならないということが好まれる。これらを考慮して、本発明に従った粒子における磁気反応性物質は、粒子の重量を全体として約０.０５％〜約７５％の範囲である。より好ましい重量パーセント範囲は、約１％〜約５０％であり、さらに好ましい重量パーセント範囲は、約２％〜約２５％、そしてさらにより好ましい重量範囲は、約２％〜約８％である。
【００７５】
[0080]  適切な検定試薬で粒子表面を皮膜することは、静電気的引力、特異的アフィニティー相互作用、疎水性相互作用、又は共有結合により達成されうる。共有結合が好ましい。ポリマーは、慣用方法により、特に官能基を含むモノマーを使用することにより、当該検定試薬を共有結合する官能基で誘導体化されうる。かかるモノマーは、単一のモノマーとして又は共モノマーとして役に立つ。適切な官能基の例は、アミン基(-ＮＨ2)、アンモニウム基(-ＮＨ3+又は-ＮＲ3+)、水酸基(-ＯＨ)、カルボン酸基(-ＣＯＯＨ)、及びイソシアネート基(-ＮＣＯ)である。カルボン酸基をポリオレフィンに導入するのに有用なモノマーは、例えばアクリル酸及びメタクリル酸である。
【００７６】
[0081]  リンカーは、粒子表面上に存在するエピトープであって、抗体が認識できるエピトープの密度を増加し、そして立体障害を低減する手段として使用されうる。これは、当該検定の範囲及び感度を増加する。本発明の特定の皮膜物質を固定する必要がある場合、リンカーは特異的タイプの反応基を固相表面に加える方法として使用されうる。適切で有用な官能基の例は、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、及びポリアルギニンである。
【００７７】
[0082]  一般的に、強い自己蛍光を示す粒子の使用を避けるように注意すべきである。従来の懸濁液ポリマー化技術により多様な開始モノマーから形成される粒子は、一般的に適切である。なぜなら、最大でも低いレベルの自己蛍光しか示さないからである。逆に、その多孔性を高め、そうしてその表面積を増加させるように改変された粒子、つまり当該文献において「マクロ多孔性」と呼ばれる粒子は、望ましくない。なぜなら、それらは高い自己蛍光を示しがちだからである。さらに、大きさを増加するにつれて、そしてジビニルベンゼン・モノマーの割合を増加するにつれて、自己蛍光が増加するということが考慮される。
【００７８】
[0083]  標識された結合メンバーにおいて使用される標識は、検出可能なシグナルを放出できる任意の標識であってもよい。好ましいかかる標識は、フルオロフォアである。あらゆるフルオロフォアが文献に報告され、そうして当業者に知られており、そしてその多くが、バイオテクノロジー工業の市販の供給元から容易に利用できる。フルオロフォアについての文献は、Cardulloら, Proc. Natl. Acad. ScL USA 85:8790-8794 (1988); Dexter, D.L., J. of Chemical Physics 21: 836- 850 (1953); Hochstrasserら、Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992); Selvin, P., Methods in Enzymology 246: 300-334 (1995); Steinberg, I. Ann. Rev. Biochem., 40: 83- 114 (1971); Stryer, L. Ann. Rev. Biochem., 47: 819-846 (1978); Wangら、Tetrahedron Letters 31: 6493-6496 (1990); Wangら, Anal Chem. 67: 1197-1203 (1995)を含む。
【００７９】
[0084]  以下は、フルオロフォアの一例である。
４-アセトアミド-４’-イソチオシアナトスチルベン-２,２’ジスルホン酸アクリジン
イソチオシアン酸アクリジン
５-(２’-アミノエチル)アミノナフタレン-１-スルホン酸(ＥＤＡＮＳ)
４-アミノ-Ｎ-［３-ビニルスルホニル)フェニル］ナフタルイミド-３,５ジスルホネート
Ｎ-(４-アニリノ-１-ナフチル)マレイミド
アンスラニルアミド
ＢＯＤＩＰＹ
ブリリアント・イエロー、
クマリン
７-アミノ-４-メチルクマリン(ＡＭＣ,クマリン１２０)
７-アミノ-４-トリフルオロメチルクマリン(クマリン１５１)
シアニン色素
シアノシン
４’,６-ジアミジノ-２-フェニルインドール(ＤＡＰＩ)
５’,５”-ジブロモピロガロール-スルホナフタレン(ブロモピロガロール・レッド)
７-ジエチルアミノ-３-(４’-イソチオシアナトフェニル)-４-メチルクマリン
ジエチレントリアミン・ペンタアセテート
４,４’-ジイソチオシアナトジヒドロ-スチルベン-２,２’-ジスルホン酸
４,４’-ジイソチオシアナトスチルベン-２,２’-ジスルホン酸
５-［ジメチルアミノ］ナフタレン-１-スルホニル・クロリド(ＤＮＳ,ダンシルクロリド)
４-(４’-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(ＤＡＢＣＹＬ)
４-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-４’イソチオシアネート(ＤＡＢＩＴＣ)
エオシン
イソチオシアン酸エオシン
エリスロシンＢ
イソチオシアン酸エリスロシン
エチジウム
５-カルボキシフルオレセイン(ＦＡＭ)
５-(４,６-ジクロロトリアジン-２-イル)アミノフルオレセイン(ＤＴＡＦ)
２’,７’ジメトキシ-４’５’ジクロロ-６-カルボキシフルオレセイン(ＪＯＥ)
フルオレセイン
イソチオシアン酸フルオレセイン
フルオレサミン
ＩＲ１４４
ＩＲ１４４６
マラカイト・グリーン・イソチオシアネート
４-メチルウンベリフェロン
オルト・クレゾールフタレイン
ニトロチロシン
パラロサニリン
フェノール・レッド
フィコビリンタンパク質(Ｂ-フィコエリトリン、Ｒ-フィコエリトリンなど)
ｏ-フタルジアルデヒド
ピレン
ピレン・ブチレート
スクシニミジル１-ピレン・ブチレート
量子ドット
リアクティブ・レッド(Cibacron（登録商標）ブリリアント・レッド３B-A)
６-カルボキシ-Ｘ-ローダミン(ＲＯＸ)
６-カルボキシローダミン(Ｒ６Ｇ)
リサアミン・ローダミンＢスルホニル・クロリド・ローダミン(Ｒｈｏｄ)
ローダミンＢ
ローダミン１２３
ローダミンＸイソチオシアネート
スルホローダミンＢ
スルホローダミン１０１
スルホローダミン１０１のスルホニル・クロリド誘導体(テキサス・レッド)
Ｎ,Ｎ,Ｎ’,Ｎ’-テトラメチル-６-カルボキシローダミン(ＴＡＭＲＡ)
テトラメチル・ローダミン
テトラメチル・ローダミン・イソチオアネート(ＴＲＩＴＣ)
リボフラビン
ロゾル酸(rosolic acid)
ランタニドキレート誘導体
【００８０】
[0085]  これらのフルオロフォアのいずれかを上記結合性分子へ取り付けて、本発明を実行する際に使用する検定試薬を形成することは、フルオロフォア上の適切な官能基と結合性メンバー上の適切な官能基を用いた慣用される共有結合により達成される。かかる基を認識すること及び結合を形成する反応は、当業者に容易に明らかであろう。
【００８１】
[0086]  同様に、自動化検定の一部として磁場を適用し、そして外す方法及び装置は、当業者に知られており、そして文献に報告されている。文献の例は、Forrestら、米国特許第4,141,687号(Technicon Instruments Corporation, 1979年2月27日);Ithakissios, 米国特許第4,115,534号(Minnesota Mining and Manufacturing Company, 1978年９月19日); Vlieger, A.M.,ら、Analytical Biochemistry 205:1-7 (1992); Dudley, Journal of Clinical Immunoassay 14:77-82 (1991);及びSmart, Journal of Clinical Immunoassay 15:246- 251 (1992)である。この段落及び前の段落における全ての引用文献は、本明細書中に援用される。
【００８２】
Ｃ.  本発明のペプチドのＨＳＶ-１への非反応性
[0087]  ＨＳＶ-２型特異的検出のために使用されるペプチドに必須の特徴の別の同等に重要な態様は、ＨＳＶ-２抗体検出に使用される試験様式において、検出可能な特異性でＨＳＶ-１抗体に結合してはならないということである。ペプチドがＨＳＶ-２抗体に特異的に反応することが示されると、それらのペプチドはＨＳＶ-１抗体及びヘルペス・ファミリーなどの他のウイルスに対する抗体への潜在的な交差反応性についてさらに試験された。ＨＳＶ-１抗体への非反応性を試験するために、ペプチドを固定し、そして当該ペプチドを、最後のセクションにおいて記載される免疫学的検定と実質的に同一の免疫学的検定において「捕捉剤」として使用する。但し、ＨＳＶ-１抗体を含む(ＨＳＶ-２抗体は含まない)ことが確認されているサンプルが、結合性検定に使用される。
【００８３】
[0088]  以下の例は例示の目的で提供され、そして制限する目的で提供されるものではない。
【実施例】
【００８４】
Ｉ.ペプチド合成
[0089]  表１に記載されるペプチドを、Ｎ-α-保護基であるＢｏｃ又はＦｍｏｃを用いてモノマーとして合成した。
【表１】
2007526919.tif 000007
【００８５】
ＩＩ.二量化
[0090]  ペプチド二量化の任意のステップは、以下の通りに行われる：モノマー・ペプチドを脱イオン水又は０.１Ｍ炭酸水素ナトリウム中で溶解し、そして４℃で一晩攪拌した。得られた酸化された二量化ペプチドをＣ１８カラムを用いて調製ＨＰＬＣにより精製した。
【００８６】
ＩＩＩ.モノマーペプチド-ＢＳＡ結合体の調製
[0091]  ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)を含む０.１ｍＭホウ酸緩衝液(ｐＨ８.０)(１０ｍｇ/ｍｌ)の溶液に、１５４μｌのＳＭＣＣ、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドを含むジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)(１０ｍｇ/ｍｌ)を加えた。混合物を室温で２時間インキュベーションし、１０ｍＭリン酸生理食塩水(ＰＢＳ、ｐＨ７.４)で予め平衡化したセファデックスＧ-２５カラム(３０ｍｌ)に適用し、そしてＰＢＳで溶出した。第一ピークを制御し、そしてタンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸光度により見積もった。
【００８７】
[0092]  モノマー・ペプチド(１ｍｇ)を１ｍｇの改変ＢＳＡと混合し、そして４℃で一晩貯蔵した。ペプチド-ＢＳＡ複合体をサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製した。
【００８８】
ＩＶ.  二量化ペプチド-ＢＳＡ複合体の調製
[0093]  二量化ペプチド-ＢＳＡ複合体は、以下の記載に従って調製されうる。
【００８９】
１.  ＳＭＣＣ-ペプチド二量体
[0094]  ＳＭＣＣを含む５０μｌのＤＭＳＯ溶液(１０ｍｇ/ｍｌ)をペプチド二量体を含む１ｍｌの１００ｍＭホスフェート(ｐＨ８.０)溶液に加える。２時間のインキュベーションの後、改変されたペプチドを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製する。
【００９０】
２.  ２-メルカプトアセチル-ＢＳＡ
[0095]  Ｎ-スクシンイミジルＳ-アセチルチオアセテート(ＳＡＴＡ)(１０ｍｇ/ｍｌ)を含む５０μｌのＤＭＳＯを、ＢＳＡ(１０ｍｇ/ｍｌ)を含む１ｍｌの１００ｍＭホスフェート(ｐＨ８.０)に加える。２時間のインキュベーション後に、１０ｍＭ・ＥＤＴＡを含有する１００μｌの２００ｍＭ・Ｎ-エチル・マレイミドを加える。反応混合物を室温で１時間インキュベーションし、そして次にＳｅｐｈａｄｅｘＧ-２５カラムに亜ぷら胃する。改変ＢＳＡをカラムから１０ｍＭ・ＰＢＳで溶出する。
【００９１】
３.  ペプチド二量体-ＢＳＡ複合体
[0096]  ４ｍｇの改変ＢＳＡを４ｍｇの改変ペプチドと２〜８℃で混合し、そして混合液を一晩インキュベーションする。複合体ペプチドをサイズ排除クロマトグラフィーにより精製する。
【００９２】
Ｖ.  ペプチド又はペプチド-ＢＳＡで皮膜された磁性ビーズの調製
[0097]  ２５ｍＭ・２-[Ｎ-モルフォリノ］エタンスルホン酸(ＭＥＳ)(ｐＨ６.１)で２回洗浄された６ｍｇ磁性ビーズに、５８８μｌの脱イオン水、０.５Ｍ・ＭＥＳ(ｐＨ６.１)を含む８０μｌの脱イオン水、１００ｍｇ/ｍｌのＮ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)を含む９２μｌの脱イオン水、及び５０ｍｇ/ｍｌの１-エチル-３-(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)を含む４０μｌの脱イオン水を加え、そして混合物を室温で３０分間ボルテックスした。活性化ビーズを２５ｍＭ・ＭＥＳ(ｐＨ６.１)で二回洗浄した。次に、１００μｌの０.５Ｍ・ＭＥＳ(ｐＨ６.１)、７２０μｌの脱イオン水、及び１８０μｌのペプチド(１ｍｇ/ｍｌ)又はペプチド-ＢＳＡ複合体(１ｍｇ/ｍｌ)を加え、そして混合物をボルテックスした。混合物をさらに室温でローター上で２時間インキュベーションし、そして７０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を捨てた後に、ビーズを１ｍｌの１％ＢＳＡを含むＰＢＳであって２０ｍＭのＴｒｉｓ塩基を含むＰＢＳを加え、ローテーター上で２時間室温で混合し、そして次に遠心して上清を取り除いた。ビーズを１％ＢＳＡを含む１０ｍＭ・ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍｌの１％ＢＳＡ中に貯蔵した。スキーム１は、Ｃ末端においてＳＭＣＣにすでに結合されている異種ペプチドを介して、ＨＳＶ-２を結合させる方法を示す。これは、次にＢＳＡを介してマイクロスフィアに結合される：
【化５】
2007526919.tif 000008
【００９３】
ＶＩ.フローサイトメトリー免疫学的検定(ＦＣＩＡ)
[0098]  ペプチド又はペプチド-ＢＳＡ複合体、例えば表１の複合体は、予め決められた磁性ビーズに結合され(全てのペプチド又はペプチド-ＢＳＡ複合体を磁性ビーズに結合させ、この磁性ビーズの蛍光が特定の色素量範囲を示す)、そして磁性ビーズの各範囲について同様のビーズ数で一緒に混合した。混合されたビーズを１％ＢＳＡ、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中に希釈して、１ｍｌあたり、１０００コピーの各範囲の磁性ビーズへと希釈した。
【００９４】
[0099]  マイクロタイターチューブに、１００μｌのサンプル希釈液、５μｌの患者サンプル、及び１００μｌのビーズ混合物を加え、そして３７℃で、シェーカー上で２０分間インキュベーションした。磁性分離の後に、ビーズを洗浄緩衝液(０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を伴う１０ｍＭ・ＰＢＳ)で二回洗浄した。５０μｌの抗ヒトＩｇＧ(Ｆｃ特異的)-Ｂ-フィコエリトリン複合体を加えた。シェーカー上での３７℃、１０分のインキュベーションの後に、ビーズを再び洗浄緩衝液で２回洗浄し、そして５０μｌの洗浄緩衝液中で懸濁した。ビーズを計数し、そしてＬｕｍｉｎｅｘ１００装置で分析した。磁性ビーズに結合した抗体(ＩｇＧ)の量を、フィコエリトリンに結合された抗ヒトＩｇＧで測定した。
【００９５】
ＶＩＩ.市販の検定システムとの比較
[0100]  １３７の臨床的に規定される患者サンプルを使用した研究により、本発明のペプチド-ＢＳＡ複合体を用いた検定システムが、市販のｇＧ-２に基づくＨＳＶ-２型特異的ＩＧＧ検定システムより優れており、そしてウエスタン・ブロット検定の確認試験で１００％の整合性を有する(表２)ことが示された。
【００９６】
【表２】
2007526919.tif 000009
【００９７】
ＶＩＩＩ.  ＨＳＶ-１・ＩｇＧに対する非反応性
[0101]  本発明のＨＳＶ-２型特異的免疫学的検定システムが、ヘルペス・ファミリーの他のウイルス、特にＨＳＶ-１に対する抗体への交差反応性がないことについて試験された。表３は、２の市販のＨＳＶ-２型特異的検定システム及びウエスタン・ブロット検定により確認した際にＨＳＶ-１ＩｇＧに交差反応性を有さないことを示す。
【００９８】
【表３】
2007526919.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、配列番号１：
【化６】
2007526919.tif 000011
を示す。
【図２】図２は、市販のＨＳＶ-２型特異的酵素結合免疫学的検定を用いたＨＳＶ-２特異的抗体の検出と、ペプチド１-ＳＭＣＣ-ＢＳＡ複合体：
【化７】
2007526919.tif 000012
をＨＳＶ-２特異的抗原として用いる本発明の方法を使用したＨＳＶ-２特異的抗体の検出との間の相関を示す。
【図３】図３は、市販のＨＳＶ-２型特異的酵素結合免疫学的検定を用いたＨＳＶ-２特異的抗体の検出と、ペプチド２-ＳＭＣＣ-ＢＳＡ複合体：
【化８】
2007526919.tif 000013
をＨＳＶ-２特異的抗原として用いる本発明の方法を使用したＨＳＶ-２特異的抗体の検出との間の相関を示す。
【図４】図４は、市販のＨＳＶ-２型特異的酵素結合免疫学的検定を用いたＨＳＶ-２特異的抗体検出と、ＢＳＡ-ＳＭＣＣ-ペプチド５複合：
【化９】
2007526919.tif 000014
をＨＳＶ-２特異的抗原として用いる本発明の方法を使用したＨＳＶ-２特異的抗体の検出との間の相関を示す。
【図５】図５は、市販のＨＳＶ-２型特異的酵素結合免疫学的検定を用いたＨＳＶ-２特異的抗体検出と、ペプチド５：
【化１０】
2007526919.tif 000015
をＨＳＶ-２特異的抗原として用いる本発明の方法を使用したＨＳＶ-２特異的抗体の検出との間の相関を示す。
【図１】
2007526919.tif 000018
【図２】
2007526919.tif 000019
【図３】
2007526919.tif 000020
【図４】
2007526919.tif 000021
【図５】
2007526919.tif 000022
【国際調査報告】
2007526919.tif 000023
2007526919.tif 000024