(57)【要約】新規なヒト脱ユビキチン化酵素ＤＵＢ−３（配列番号１）ならびにそのバリアントおよびフラグメントが記載される。この酵素をコードする核酸分子、ならびに癌の治療、アッセイにおけるこのポリペプチドおよび核酸分子の使用もまた、記載される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１でＤＵＢ−３（配列番号１）、ＤＵＢ−４（配列番号４）、ＤＵＢ−５（配列番号５）、ＤＵＢ−６（配列番号６）、ＤＵＢ−７（配列番号７）、ＤＵＢ−８（配列番号８）、ＤＵＢ−９（配列番号９）、ＤＵＢ−１０（配列番号１０）、ＤＵＢ−１１（配列番号１１）もしくはＤＵＢ−１２（配列番号１２）として示したアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはそれらのバリアントもしくはフラグメント。
【請求項２】
前記単離されたペプチドがバリアントであり、前記バリアントにはＲＳ４４７配列（アクセッション番号Ｄ３８３７８）は含まれない、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、図１でＤＵＢ−３（配列番号１）、ＤＵＢ−４（配列番号４）、ＤＵＢ−５（配列番号５）、ＤＵＢ−６（配列番号６）、ＤＵＢ−７（配列番号７）、ＤＵＢ−８（配列番号８）、ＤＵＢ−９（配列番号９）、ＤＵＢ−１０（配列番号１０）、ＤＵＢ−１１（配列番号１１）またはＤＵＢ−１２（配列番号１２）として示したアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、図１でＤＵＢ−３（配列番号１）、ＤＵＢ−４（配列番号４）、ＤＵＢ−５（配列番号５）、ＤＵＢ−６（配列番号６）、ＤＵＢ−７（配列番号７）、ＤＵＢ−８（配列番号８）、ＤＵＢ−９（配列番号９）、ＤＵＢ−１０（配列番号１０）、ＤＵＢ−１１（配列番号１１）またはＤＵＢ−１２（配列番号１２）として示したアミノ酸配列からなる、請求項１または３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、ＤＵＢ−３（配列番号１）として示したアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ＤＵＢ−３（配列番号１）として示したアミノ酸配列からなる、請求項５に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
図１中のＤＵＢ−３（配列番号１）、図１のＤＵＢ−４（配列番号４）、ＤＵＢ−５（配列番号５）、ＤＵＢ−６（配列番号６）、ＤＵＢ−７（配列番号７）、ＤＵＢ−８（配列番号８）、ＤＵＢ−９（配列番号９）、ＤＵＢ−１０（配列番号１０）、ＤＵＢ−１１（配列番号１１）もしくはＤＵＢ−１２（配列番号１２）として示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸分子、またはそれらのバリアントもしくはフラグメント。
【請求項８】
前記核酸分子が、図７で示されるヌクレオチド配列（配列番号２）またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む、請求項７に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記核酸分子が、図７で示されるヌクレオチド配列（配列番号２）からなる、請求項７または８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が、図７でＤＵＢ−４（配列番号１４）、ＤＵＢ−５（配列番号１５）、ＤＵＢ−６（配列番号１６）、ＤＵＢ−７（配列番号１７）、ＤＵＢ−８（配列番号１８）、ＤＵＢ−９（配列番号１９）、ＤＵＢ−１０（配列番号２０）、ＤＵＢ−１１（配列番号２１）またはＤＵＢ−１２（配列番号２２）として示したヌクレオチド配列からなる、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドに結合する、特異的結合メンバー。
【請求項１２】
生物学的サンプル中の請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの存在を同定するための方法であって、
ａ）前記生物学的サンプルを請求項１１に記載の特異的結合メンバーと接触させるステップと、
ｂ）前記特異的結合メンバーの前記サンプルへの結合を判定するステップと
を含み、前記特異的結合メンバーの結合が、前記サンプル中の前記ポリペプチドの存在を示す方法。
【請求項１３】
患者における癌に対する感受性を判定する方法であって、
ａ）患者由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）前記生物学的サンプルを請求項１１に記載の特異的結合メンバーと接触させるステップと、
ｃ）前記特異的結合メンバーの前記サンプルへの結合を検出するステップと
を含み、前記特異的結合メンバーの結合が、癌に対する感受性を示す方法。
【請求項１４】
患者における癌に対する感受性を判定する方法であって、
ａ）前記サンプル由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）前記サンプル中のＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２核酸またはそれらのフラグメントの存在を判定するステップと
を含み、前記核酸またはそのフラグメントの存在または所定の最低量を超える存在が、癌に対する素因を示す方法。
【請求項１５】
ａ）患者由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記生物学的サンプルを、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子と接触させるステップと、
ｃ）核酸のハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
患者における癌の診断の方法であって、
ａ）前記サンプル由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）前記サンプル中のＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２核酸またはそれらのフラグメントの存在または相対量を判定するステップと
を含み、前記核酸またはそのフラグメントの存在または所定の最低量を超える存在が癌を示す方法。
【請求項１７】
ａ）患者由来の生物学的サンプルを提供するステップと、
ｂ）実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、前記生物学的サンプルを、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子と接触させるステップと、
ｃ）核酸のハイブリダイゼーションを検出するステップと
を含み、ハイブリダイゼーションの検出が癌の存在を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
治療を必要とする患者における癌の治療の方法であって、癌細胞中の、ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１およびＤＵＢ−１２のうち少なくとも１つの発現を調節する薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
前記薬剤が、ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１およびＤＵＢ−１２のうち少なくとも１つの発現を増強する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記薬剤が、ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１およびＤＵＢ−１２のうち少なくとも１つの発現を阻害する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
抗増殖活性を有する薬剤を同定するためのアッセイ方法であって、
ａ）候補薬剤を請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させるステップと、
ｂ）前記候補薬剤と前記ポリペプチドとの間の相互作用または結合を判定するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
癌の治療のための医薬の調製における、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の核酸、請求項１１に記載の特異的結合メンバーまたは請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現を調節する薬剤の使用。
【請求項２３】
医学における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の核酸、請求項１１に記載の特異的結合メンバーまたは請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現を調節する薬剤。
【請求項２４】
癌の治療における使用のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の核酸、請求項１１に記載の特異的結合メンバーまたは請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドの発現を調節する薬剤。
【請求項２５】
前記癌が、造血癌、肺癌、皮膚癌、小腸癌または胸腺癌である、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法、請求項２１に記載の使用または請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記癌が、前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、バーキットリンパ腫、脾臓の癌、肺の癌または脾臓の癌である、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法、請求項２１に記載の使用または請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記癌が、１つ以上のＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の発現の増大に関連した癌である、請求項１２〜２０、２５および２６のいずれか一項に記載の方法、請求項２１、２５および２６のいずれか一項に記載の使用または請求項２２、２５および２６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記癌が、Ｒａｓの発現の増大に関連した癌である、請求項１２〜２０、２５、２６および２７のいずれか一項に記載の方法、請求項２１、２５、２６および２７のいずれか一項に記載の使用または請求項２２、２５、２６および２７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
細胞中のＲａｓ変換酵素１（ＲＣＥ１）の濃度を調節する方法であって、細胞中のＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つの発現を調節する薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項３０】
細胞中のＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の濃度を調節する方法であって、細胞中のＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ、好ましくはＤＵＢ−３の発現を調節する薬剤を投与するステップを含む方法。
【請求項３１】
治療を必要とする患者における癌を治療する方法であって、前記患者に、ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つの発現を増大させる薬剤を投与するステップを含み、前記癌が、ＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の発現の増大に関連した癌である方法。
【請求項３２】
ＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の発現の増大に関連した癌の治療のための医薬の調製における、ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つの発現を増大させる薬剤の使用。
【請求項３３】
前記ＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質がＲａｓである、請求項３１に記載の方法または請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
前記薬剤が、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の核酸または請求項１１に記載の特異的結合メンバーである、請求項１８、１９、２９、３０、３１もしくは３３のいずれか一項に記載の方法または請求項３２に記載の使用。
【請求項３５】
前記薬剤がＤＵＢ−３である、請求項３１もしくは請求項３３に記載の方法または請求項３２もしくは請求項３３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規な遺伝子およびタンパク質ならびに異常細胞および癌の治療および検出におけるそれらの使用に関する。さらに、本発明は、癌の診断、癌の治療、および癌の治療のための治療剤の開発のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ユビキチンプロテアソーム経路が、細胞周期１、転写２、アポトーシス３、レセプター内在化および小胞輸送４、５のような多数の細胞プロセスの調節において重要な役割を果たすことが明らかになっている。これは、この経路を調節するタンパク質に焦点を当てた注目を導いている。これらには、Ｅ３−リガーゼと呼ばれる酵素複合体のグループ、ならびにその標的へとユビキチンを運搬するためにそれらが相互作用するＥ２結合酵素が含まれる６。このプロセスに関与するタンパク質の別の大きなグループは脱ユビキチン化酵素であり、これは、ユビキチンにコンジュゲートしたタンパク質からユビキチンを開裂し、ポリユビキチン前駆体プロセシング、分解から基質をレスキューするための基質からのユビキチンの除去、およびプロテアソーム分解を補助するための残留ユビキチンの除去を含むユビキチン経路中のいくつかのポイントで作用すると考えられている、ユビキチン特異的プロテアーゼのファミリーである７。
【０００３】
これらの酵素は、２つの主要なサブファミリー、ユビキチンプロセシングプロテアーゼ（ＵＢＰ）およびユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼ（ＵＣＨ）に分類され、これらは共にシステインプロテアーゼであり、それらの活性部位はシステイン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸残基を含む８。ＵＢＰは、サイズおよび構造的な複雑さにおいて大きく異なるが、それらすべてが、保存された相同ドメイン（ＤＨＩ−ＤＨＶＩ）を６つ含む。ＵＣＨは、これら６つのドメインを欠く、密接に関連した小さいタンパク質のファミリーである７。これら２つの主要なサブファミリーに加えて、ＪＡＭＭファミリーのメタロプロテアーゼ９、ならびにＯＴＵファミリーのイソペプチダーゼ１０が、脱ユビキチン化酵素として最近同定された。
【０００４】
ほとんどの脱ユビキチン化酵素の基質は未知であるものの、それらが多数の細胞プロセスの調節において重要な役割を果たすことは明らかである。例えば、ＦＡＦ（ｆａｔ  ｆａｃｅｔｓ）は、ショウジョウバエの眼の発生を調節でき１１、ＦＡＭ（マウスのｆａｔ  ｆａｃｅｔｓ）（ＵＳＰ９）は、マウスにおける胚発生に重要であり１２、ＵＢＰ３１３およびＤ−ｕｂｐ−６４Ｅ１４は、転写サイレンシングにおいて役割を果たし、他のＵＢＰは、ｐ５３１５、Ｒｂ１６、１７、β−カテニン１８、ＢＲＣＡ１１９およびＶＨＬ２０のような重要な細胞シグナル伝達タンパク質と相互作用することが示されている。
【０００５】
脱ユビキチン化酵素はまた、細胞形質転換に関与している。特に、哺乳動物ＵＢＰの短縮型アイソフォームであるｔｒｅ−２（これは、脱ユビキチン化活性を有さない）は、３Ｔ３線維芽細胞を形質転換することが示されている２１。また、別の哺乳動物ＵＢＰであるｕｎｐ（ＵＳＰ４）の過剰発現は、胸腺欠損マウスに注射されたＮＩＨ３Ｔ３細胞の形質転換を誘導し２２、上昇したレベルのそのヒトオルソログであるｕｎｐｈは、肺の小細胞癌および腺癌において見出されている２３。
【０００６】
ＤＵＢファミリーのＵＢＰは、マウスにおいて、サイトカイン刺激に際して迅速に誘導される造血特異的脱ユビキチン化酵素として同定された。ＤＵＢ−１は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦによって誘導され、多数の造血細胞型において発現されるが２４、一方でＤＵＢ−２は、ＩＬ−２によって特異的に調節されるようであり、その発現はＴ細胞に限定される２５。ＤＵＢ−２Ａはこのファミリーに最近加えられ、これもまた造血細胞において主に発現される２６。これら３つすべての遺伝子が、縦列重複事象から生じたマウス第７染色体上のＤＵＢ遺伝子の頭から尾への反復の一部を形成すると考えられている２５。ＤＵＢは、細胞の増殖および生存の調節において役割を果たす可能性があると示唆されている。ＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２は共に、サイトカイン誘導性の最初期遺伝子であり２４、２５、ＤＵＢ−１の高レベルの発現は、Ｓ期前での細胞周期停止を生じる２７。さらに、本発明者らは最近、ＤＵＢ−２の発現が、サイトカインの撤回によって誘導されるアポトーシスを顕著に阻害できることを示した２８。
【０００７】
ＤＵＢ−２についての本発明者らの以前の研究は、ヒトＴリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−１）で形質転換された細胞におけるＩＬ−２経路の研究に起源した。ＨＴＬＶ−１は、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）の病因的因子であり２９、ＩＬ−２シグナル伝達経路の構成的活性化にしばしば関連する３０、３１。活性なＩＬ−２シグナル伝達経路にもかかわらず、ＣＩＳおよびＳＯＣＳ３のような増殖阻害遺伝子産物は発現されなかった。しかし、マウスＤＵＢ−２に対して惹起された抗体は、これらのＨＴＬＶ−１で形質転換されたＴ細胞株において構成的に発現されるバンドと交差反応した２８。Ｂａ／Ｆ３細胞中で発現される場合、ＤＵＢ−２は、サイトカインの撤回２８ならびに長引いたＳＴＡＴ５リン酸化によって誘導されるアポトーシスを顕著に阻害することが示された。このことは、ＤＵＢ−２の発現が、おそらくはＳＴＡＴ５の活性化を調節することによって、細胞の生存に影響を与え得ることを示した。興味深いことに、構成的なＳＴＡＴの活性化は、ＨＴＬＶ−１依存的なＴ細胞白血病、バーキットリンパ腫および骨髄腫、ならびにある範囲の固形腫瘍を含む、多数の血液悪性腫瘍において重要な役割を果たす。ＳＴＡＴの活性化はまた、ｓｒｃ、ｒｅｔおよびｌｃｋを含むある範囲のオンコジーンの作用のために必要とされる３２、３３。
【０００８】
ＤＵＢ酵素はマウスにおいて同定されているものの、今日まで、ＤＵＢ遺伝子はヒトにおいては同定されていない。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本明細書中で記載するように、本発明者らは今回、ＤＵＢファミリーの脱ユビキチン化酵素の新規なヒトメンバーを同定し、ｍＲＮＡレベルでのその発現を、ある範囲の組織および細胞株において示した。さらに、本発明者らは、この酵素（本明細書中でＤＵＢ−３と呼ぶ）、つまり活性な脱ユビキチン化酵素が、ＩＬ−４刺激に応答して、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で誘導されることを実証する。さらに、本発明者らは、ＤＵＢ−３の構成的な発現が増殖をブロックし、アポトーシス細胞の数を増加させることを実証した。このことは、その発現が、細胞の増殖および生存の両方に影響を与え得ることを示唆する。さらに、本発明者らは、多数のＤＵＢ−３アナログ（本明細書中で、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１およびＤＵＢ−１２と呼ぶ）をさらに同定した。これらもまた本発明により包含される。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様において、図１でＤＵＢ−３（配列番号１）として示したアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはそのバリアントもしくはフラグメントが提供される。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態において、このポリペプチドは、図１でＤＵＢ−３（配列番号１）として示したアミノ酸配列を含む。本発明のさらに好ましい実施形態において、このポリペプチドは、図１でＤＵＢ−３（配列番号１）として示した酸配列からなる。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、配列番号１のバリアントまたはフラグメントは、配列番号１の配列と、９０％より高い相同性、好ましくは９５％より高い相同性、さらにより好ましくは９７％より高い相同性、なおより好ましくは９８％より高い相同性、最も好ましくは９９％より高い相同性を示す。好ましくは、バリアントには、ＲＳ４４７配列（アクセッション番号Ｄ３８３７８）（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｏｌ  ６７  ｐ２９１（２０００））は含まれない。
【００１３】
好ましい実施形態において、この単離されたポリペプチドはヒトのポリペプチドである。
【００１４】
図１でＤＵＢ−４（配列番号４）、ＤＵＢ−５（配列番号５）、ＤＵＢ−６（配列番号６）、ＤＵＢ−７（配列番号７）、ＤＵＢ−８（配列番号８）、ＤＵＢ−９（配列番号９）、ＤＵＢ−１０（配列番号１０）、ＤＵＢ−１１（配列番号１１）もしくはＤＵＢ−１２（配列番号１２）として示したアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド、またはそれらのバリアントもしくはフラグメントが提供され、これらもまた本発明の第１の態様によって包含される。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態において、配列番号４〜配列番号１２のいずれか１つのバリアントまたはフラグメントは、対応するポリペプチドの（即ち、配列番号４〜配列番号１２の）配列と、９０％より高い相同性、好ましくは９５％より高い相同性、さらにより好ましくは９７％より高い相同性、なおより好ましくは９８％より高い相同性、最も好ましくは９９％より高い相同性を示す。好ましくは、バリアントには、ＲＳ４４７配列（アクセッション番号Ｄ３８３７８）（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｏｌ  ６７  ｐ２９１（２０００））は含まれない。
【００１６】
第２の態様において、図１でＤＵＢ−３（配列番号１）として示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸配列、またはそのバリアントもしくはフラグメントが提供される。本発明の好ましい態様において、この核酸分子は、図７で示されるヌクレオチド配列（配列番号２）またはそのバリアントもしくはフラグメントを含む。さらなる好ましい実施形態において、この核酸分子は、図７で示されるヌクレオチド配列（配列番号２）からなる。
【００１７】
本発明の好ましい実施形態において、配列番号２のバリアントまたはフラグメントは、配列番号２の配列と、９０％より高い相同性、好ましくは９５％より高い相同性、さらにより好ましくは９７％より高い相同性、なおより好ましくは９８％より高い相同性、最も好ましくは９９％より高い相同性を示す。好ましくは、バリアントには、ＲＳ４４７配列（アクセッション番号Ｄ３８３７８）（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｏｌ  ６７  ｐ２９１（２０００））をコードする核酸配列は含まれない。
【００１８】
図１のＤＵＢ−４（配列番号４）、ＤＵＢ−５（配列番号５）、ＤＵＢ−６（配列番号６）、ＤＵＢ−７（配列番号７）、ＤＵＢ−８（配列番号８）、ＤＵＢ−９（配列番号９）、ＤＵＢ−１０（配列番号１０）、ＤＵＢ−１１（配列番号１１）もしくはＤＵＢ−１２（配列番号１２）として示したアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸配列、またはそれらのバリアントもしくはフラグメントが提供され、これらもまた本発明の第２の態様によって包含される。本発明の好ましい態様において、この核酸分子は、図７中のＤＵＢ−４（配列番号１４）、ＤＵＢ−５（配列番号１５）、ＤＵＢ−６（配列番号１６）、ＤＵＢ−７（配列番号１７）、ＤＵＢ−８（配列番号１８）、ＤＵＢ−９（配列番号１９）、ＤＵＢ−１０（配列番号２０）、ＤＵＢ−１１（配列番号２１）もしくはＤＵＢ−１２（配列番号２２）について示されるヌクレオチド配列またはそれらのバリアントもしくはフラグメントのうちの１つを含む。
【００１９】
さらなる好ましい実施形態において、この核酸分子は、図７でＤＵＢ−４（配列番号１４）、ＤＵＢ−５（配列番号１５）、ＤＵＢ−６（配列番号１６）、ＤＵＢ−７（配列番号１７）、ＤＵＢ−８（配列番号１８）、ＤＵＢ−９（配列番号１９）、ＤＵＢ−１０（配列番号２０）、ＤＵＢ−１１（配列番号２１）もしくはＤＵＢ−１２（配列番号２２）として示したヌクレオチド配列からなる。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態において、配列番号１４〜配列番号２２のいずれか１つのバリアントまたはフラグメントは、対応するポリペプチドの（即ち、配列番号１４〜配列番号２２の）配列と、９０％より高い相同性、好ましくは９５％より高い相同性、さらにより好ましくは９７％より高い相同性、なおより好ましくは９８％より高い相同性、最も好ましくは９９％より高い相同性を示す。好ましくは、バリアントには、ＲＳ４４７配列（アクセッション番号Ｄ３８３７８）（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｏｌ  ６７  ｐ２９１（２０００））をコードする核酸配列は含まれない。
【００２１】
第３の態様において、本発明のポリペプチドに結合する抗体のような、特異的結合メンバーもまた、本発明により提供される。
【００２２】
このような特異的結合メンバーは、サンプル中の本発明のポリペプチドの存在を同定するためのアッセイおよび診断方法を含む、種々の目的のために使用してもよい。
【００２３】
したがって、本発明のさらなる態様において、生物学的サンプル中の本発明の第１の態様に従うポリペプチドの存在を同定するための方法が提供され、この方法は以下のステップを含む：
ａ）当該生物学的サンプルを本発明の第３の態様の特異的結合メンバーと接触させるステップ、
ｂ）当該特異的結合メンバーの当該サンプルへの結合を判定するステップであって、当該特異的結合メンバーの結合は、当該サンプル中の当該ポリペプチドの存在を示す。
【００２４】
本明細書中で記載するように、ＤＵＢ−３は、ある種の組織の正常細胞および腫瘍細胞において差示的に発現されることが見出されている。したがって、本発明のポリペプチドおよび核酸は、特定の組織の癌に対する感受性を判定するためのアッセイまたは実際に組織中の癌を診断するためのアッセイにおいて使用してもよい。
【００２５】
したがって、本発明の第５の態様において、患者における癌に対する感受性を判定する方法が提供され、この方法は、以下のステップを含む：
ａ）患者由来の生物学的サンプルを提供するステップ、
ｂ）当該生物学的サンプルを本発明の第３の態様の特異的結合メンバーと接触させるステップ、
ｃ）当該特異的結合メンバーの当該サンプルへの結合を検出するステップであって、当該特異的結合メンバーの結合は、癌に対する感受性を示す。
【００２６】
本発明の好ましい態様において、この癌は、造血癌、肺癌、皮膚癌、小腸癌または胸腺癌である。
【００２７】
本発明の特に好ましい実施形態において、この癌は、前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病、バーキットリンパ腫、肺の癌または脾臓の癌である。
【００２８】
本発明はまた、患者における癌の予後を診断および／またはモニターするために使用してもよい。
【００２９】
したがって、第６の態様において、患者における癌の診断の方法が提供され、この方法は、以下のステップを含む：
ａ）患者由来の生物学的サンプルを提供するステップ、
ｂ）当該生物学的サンプルを、本発明の第３の態様の特異的結合メンバーと接触させるステップ、
ｃ）当該特異的結合メンバーの当該サンプルへの結合を検出するステップであって、当該特異的結合メンバーの結合が癌を示す。
【００３０】
代替的実施形態において、ＤＵＢ−３遺伝子（または実際にはＤＵＢ−４〜ＤＵＢ−１２遺伝子のいずれか１つ）の発現を、感受性を判定するためにアッセイしてもよい。
【００３１】
したがって、本発明の第７の態様において、患者における癌に対する感受性を判定する方法が提供され、この方法は、以下のステップを含む：
ａ）当該サンプル由来の生物学的サンプルを提供するステップ、
ｂ）当該サンプル中のＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２核酸またはそれらのフラグメントの存在を判定するステップであって、当該核酸またはそのフラグメントの存在が、癌に対する素因を示す。
【００３２】
好ましい実施形態において、この方法は、以下のステップを含む：
ａ）患者由来の生物学的サンプルを提供するステップ、
ｂ）実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、当該生物学的サンプルを、本発明の第２の態様に従う核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子と接触させるステップ、
ｃ）核酸のハイブリダイゼーションを検出するステップ。
【００３３】
第８の態様において、癌の診断の方法が提供され、この方法は以下のステップを含む：
ａ）当該サンプル由来の生物学的サンプルを提供するステップ、
ｂ）当該サンプル中のＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２核酸またはそれらのフラグメントの存在または相対量を判定するステップであって、当該核酸またはそのフラグメントの存在または所定の最低量を上回る存在が、癌を示す。
【００３４】
一実施形態において、所定の最低量とは、癌性細胞を含まないことが既知の対照サンプル中の当該核酸またはフラグメントの発現レベルである。
【００３５】
好ましい実施形態において、この方法は以下のステップを含む：
ａ）患者由来の生物学的サンプルを提供するステップ、
ｂ）実質的に相補的な核酸のハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、当該生物学的サンプルを、本発明の第２の態様に従う核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子と接触させるステップ、
ｃ）核酸のハイブリダイゼーションを検出するステップであって、ハイブリダイゼーションの検出が、癌の存在を示す。
【００３６】
実施例においてさらに記載されるように、本発明者らは、ＤＵＢ−３の構成的な発現が増殖をブロックし、観察されるアポトーシス細胞の数の増大を導くことを示している。このことは、ＤＵＢ−３発現（または実際にはＤＵＢ−４〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つの発現）の調節が、癌の治療の方法において利用される可能性があることを明らかに示唆している。
【００３７】
したがって、本発明の第９の態様は、治療を必要とする患者における癌の治療の方法を提供し、この方法は、癌細胞中の、ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ、好ましくはＤＵＢ−３の発現を調節する薬剤を投与するステップを含む。
【００３８】
一実施形態において、ペプチドであっても非ペプチドであってもよいこの薬剤は、ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ、好ましくはＤＵＢ−３の発現を増強する。
【００３９】
しかし、多数の癌細胞株におけるＤＵＢ−３の発現の増強およびＤＵＢ−３発現の観察された厳密な調節を考慮して、本発明者らは、多くの場合、例えば増殖因子を奪った腫瘍細胞において、ＤＵＢ−３（または実際にはＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ）の過剰発現が、実際に腫瘍増殖を刺激する可能性があると考えている。
【００４０】
したがって、本発明の第９の態様のさらなる実施形態において、この薬剤は、ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ、好ましくはＤＵＢ−３の発現を阻害する。適切な薬剤は、ペプチドであっても非ペプチドであってもよい。一実施形態において、この薬剤は、本発明の第３の態様に従う特異的結合メンバーである。さらなる実施形態において、本発明の第９の態様における使用のための薬剤は、核酸分子、例えばアンチセンスポリヌクレオチドであってもよく、このとき、このポリヌクレオチドは、本発明の第１の態様の核酸に対してアンチセンスである。
【００４１】
さらに、本発明は、本発明の方法において有用な薬剤を同定するために使用してもよい。したがって、本発明の第１０の態様において、抗増殖活性を有する薬剤を同定するためのアッセイ方法が提供され、この方法は以下のステップを含む：
ａ）候補薬剤を本発明の第１の態様に従うポリペプチドと接触させるステップ、
ｃ）当該候補薬剤と当該ポリペプチドとの間の相互作用または結合を判定するステップ。
【００４２】
このような本発明の方法によって同定された新規な薬剤は、本発明の範囲内である。これらの薬剤は、医薬へと処方してもよい。
【００４３】
本発明はさらに、癌の治療のための医薬の調製における、本発明の第１の態様に従うポリペプチド、本発明の第２の態様に従う核酸または本発明の第１の態様に従うポリペプチドの発現を調節する薬剤の使用を提供する。
【００４４】
医薬における使用のため、好ましくは癌の治療における使用のための、本発明の第１の態様に従うポリペプチド、本発明の第２の態様に従う核酸または本発明の第１の態様に従うポリペプチドの発現を調節する新規な薬剤もまた、提供される。
【００４５】
実施例において記載されるように、本発明者らは、ＤＵＢ−３発現が、ＲＡＳ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路をダウンレギュレートすることを示した。本発明者らは、ＤＵＢ−３発現の存在下で、Ｒａｓのより遅く移動する形態が観察されることを示した。さらに、本発明者らは、ＲＣＥ１がＤＵＢ−３基質であることを示した。
【００４６】
いずれか１つの理論によって制限されることなく、本発明者らは、ＤＵＢ−３が、Ｒａｓ変換酵素１（Ｒａｓ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ  １）（ＲＣＥ１）の分解をブロックすると考えている。ＲＣＥ１は、Ｒａｓ（例えば、Ｒｈｏ、Ｒａｐ、ＣＤＣ４２）に加えて、複数のＣＡＡＸモチーフ（ここで、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ａ＝脂肪族アミノ酸、Ｘ＝任意のアミノ酸である）含有タンパク質のプロセシングに関与し、したがって、ＤＵＢ−３発現は、そのＲＣＥ１に対する影響を介して、それらの活性化に影響し得るものと推量できる。
【００４７】
したがって、本発明のさらなる態様において、細胞中のＲＣＥ１レベルを調節する方法が提供され、この方法は、当該細胞中のＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ、好ましくはＤＵＢ−３の発現を調節する薬剤を投与するステップを含む。
【００４８】
別の態様において、細胞中のＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の濃度を調節する方法が提供され、この方法は、当該細胞中のＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ、好ましくはＤＵＢ−３の発現を調節する薬剤を投与するステップを含む。
【００４９】
一実施形態において、このＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質はＲａｓである。他の実施形態において、このＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質は、Ｒｈｏ、ＲａｐまたはＣＤＣ４２である。
【００５０】
このようなＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の発現増強は、腫瘍原性であると考えられる。
【００５１】
したがって、ＤＵＢ−３調節因子、特にＤＵＢ−３を増大させる薬剤の使用は、このようなＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の活性化を減少させるのに有利である可能性があり、したがって、癌の治療において使用してもよい。
【００５２】
したがって、さらなる態様において、治療を必要とする患者における癌の治療の方法が提供され、この方法は、当該癌細胞において、ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ、好ましくはＤＵＢ−３の発現を増大させる薬剤を投与するステップを含む。好ましい実施形態において、この癌は、ＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の発現の増大に関連する癌である。
【００５３】
ＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質の発現の増大に関連する癌の治療のための医薬の調製における、ＤＵＢ−３〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つの発現を増大させる薬剤の使用もまた、提供される。
【００５４】
本発明の各々の態様の好ましい特徴は、文脈がそれ以外を要求しないかぎり、必要な変更を加えた他の態様の各々と同様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５５】
詳細な説明
【００５６】
ポリペプチド
用語ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、本明細書内で相互交換可能に使用される。
【００５７】
本明細書に記載されるとおり、本発明者らは、腫瘍細胞において差示的に発現される新規な脱ユビキチン化酵素を見出した。本発明のポリペプチドは、ＤＵＢ−３と命名されている。その配列は、図１の配列番号１として示される。
【００５８】
しかし、文脈がそれ以外を要求しないかぎり、ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１またはＤＵＢ−１２のいずれか１つのバリアントまたはフラグメントには、ＲＳ４４７配列（アクセッション番号Ｄ３８３７８）（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｖｏｌ  ６７  ｐ２９１（２０００））は含まれない。さらに、このようなバリアントまたはフラグメントには、図１で示されるＤＵＢ−１配列もＤＵＢ−２配列も含まれない。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、本発明のＤＵＢ−３ポリペプチドは、配列番号１として示したアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる。
【００６０】
配列番号１の好ましいバリアントは、配列番号１の配列と、９０％より高い相同性、好ましくは９５％より高い相同性、さらにより好ましくは９７％より高い相同性、なおより好ましくは９８％より高い相同性、最も好ましくは９９％より高い相同性を示す。相同性の比較は、眼で実施してもよく、より通常は、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けで実施してもよい。
【００６１】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の％同一性は、最適な比較目的のために配列を整列させ（例えば、ギャップが、その配列との最良のアラインメントのために第１の配列に導入され得る）、対応する位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較することによって、判定してもよい。「最良のアラインメント」とは、最も高い％同一性を生じる２つの配列のアラインメントである。％同一性は、比較される配列中の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数によって判定される（即ち、％同一性＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。
【００６２】
２つの配列間の％同一性の判定は、当業者に公知の数学的アルゴリズムを使用して達成できる。２つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの一例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７と同様に改変された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムは、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得るために、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実施できる。本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施できる。比較目的のためにギャップ付アラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記載されるようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用できる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施できる（同上）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００６３】
配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ  ＆  Ｍｉｌｌｅｒ、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、このようなアルゴリズムを組み込んでいる。当該分野で公知の配列分析用の他のアルゴリズムには、Ｔｏｒｅｌｌｉｓ  ＆  Ｒｏｂｏｔｔｉ（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．、１０：３−５に記載されるようなＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ；ならびにＰｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−８に記載されるＦＡＳＴＡが含まれる。ＦＡＳＴＡ内で、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定する対照オプションである。
【００６４】
高い程度の配列同一性が存在する場合、アミノ酸配列には比較的小さい差異だけが存在するであろう。したがって、例えば、４０未満、例えば３０未満、２０未満、１０未満またはさらに５未満の差異が存在してもよい。
【００６５】
本発明に従うＤＵＢペプチドのフラグメントは、関連するＤＵＢポリペプチド（ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１またはＤＵＢ−１２）の全長までの任意の長さのものであり得る。例えば、本発明に従うＤＵＢ−３ポリペプチドのフラグメントは、配列番号１に示したＤＵＢ−３ポリペプチドの全長までの任意の長さであり得る；したがってこれは、数アミノ酸、例えば２０アミノ酸未満短縮されたＤＵＢ−３ポリペプチド、ならびにより短いフラグメントを包含する。ポリペプチドのフラグメントとは一般に、少なくとも５個、典型的には少なくとも１０個、好ましくは少なくとも２０個連続するアミノ酸のアミノ酸のストレッチを意味する。最も好ましくは、本発明のポリペプチドのフラグメントは、少なくとも４０個以上、例えば５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個連続するアミノ酸を有する。１つの好ましい実施形態において、本発明に従うフラグメントは、約１０アミノ酸と５０アミノ酸との間である。
【００６６】
同様に、ＤＵＢ４〜ＤＵＢ１２のいずれか１つのフラグメントは、関連するＤＵＢポリペプチドの全長までの任意の長さであってよい。
【００６７】
本発明のフラグメントは、関連するＤＵＢ配列の一部に対する抗体を惹起する際に有用であり得る。したがって、本発明の好ましい実施形態において、本発明のフラグメントは、ＤＵＢ−３（または実際にはＤＵＢ−４〜ＤＵＢ−１２のいずれか１つ）に特徴的な少なくとも１つの抗原判定基（エピトープ）を含む。特定のポリペプチドフラグメントがこのような抗原性特性を保持するか否かは、当該分野の慣用方法によって容易に判定できる。
【００６８】
核酸
本発明の「核酸」は、上記のようなＤＵＢ−３ポリペプチド（または実際にはＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２ポリペプチド）、好ましくはヒトＤＵＢ−３ポリペプチドをコードする核酸である。この用語はさらに、天然に存在する上記で同定した核酸にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド、またはその相補体を含む。
【００６９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０ｐｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃での一晩のインキュベーションと、その後の０．１×ＳＳＣ中で約６５℃でのフィルターの洗浄とをいう。
【００７０】
本発明に従うフラグメントをコードする核酸は、ＤＵＢ−３遺伝子の特定の領域（または実際にはＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２遺伝子の特定の領域）の核酸増幅の結果であり得、本発明に従う変異を組み込む。
【００７１】
本明細書中でいうところの核酸は、一般には自然に見出される天然核酸であるが、この用語は、当該分野で公知のような、改変された骨格または塩基を有する、改変された人工核酸をその範囲内に含むことができる。
【００７２】
本発明に従う使用のための核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、全体的または部分的に合成であってもよい。好ましい態様において、本発明における使用のための核酸は、上で規定したような本発明の結合メンバーをコードする。当業者は、本発明における使用のために適切な結合メンバーをなお提供する、このような核酸に対する置換、欠失および／または付加を判定することができよう。
【００７３】
本発明に従うペプチドをコードする核酸配列は、本明細書に含まれる情報および参考文献ならびに当該分野で公知の技術を使用して、当業者によって容易に調製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９２を参照されたい）。これらの技術には、以下が含まれる：（ｉ）例えばゲノム供給源由来のこのような核酸のサンプルを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、コードするＤＮＡを採取すること、発現すべき部分のいずれかの側の適切な制限酵素認識部位を同定すること、およびＤＮＡから当該部分を切り出すことによるものを含む、当業者に公知の任意の適切な方法で、生成および使用してもよい。次いで、この部分は、標準的な市販の発現系において適切なプロモーターに作動可能に連結してもよい。別の組換え体アプローチは、適切なＰＣＲプライマーを用いてＤＮＡの適切な部分を増幅することである。改変されたペプチドの発現を導くため、または核酸を発現するために使用される宿主細胞におけるコドンの優先性を考慮するために、例えば部位指向性変異誘発を使用して、配列に対する改変がなされ得る。
【００７４】
改変されたペプチドの発現を導くため、または核酸を発現するために使用される宿主細胞におけるコドンの優先性を考慮するために、例えば部位指向性変異誘発を使用して、配列に対する改変がなされ得る。
【００７５】
核酸配列の発現を得るために、これらの配列は、その発現を制御するために、その核酸に作動可能に連結される１つ以上の制御配列を有するベクターに組み込むことができる。これらのベクターは、挿入された核酸の発現を駆動するためのプロモーターもしくはエンハンサー、ペプチドが融合物として産生されるような核酸配列、および／または宿主細胞中で産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるような分泌シグナルをコードする核酸のような、他の配列を含んでもよい。
【００７６】
次いで、ペプチドは、ベクターがその中で機能的である宿主細胞にベクターを形質転換し、ペプチドが産生されるように宿主細胞を培養し、そして当該宿主細胞または周囲の培地から当該ペプチドを回収することによって、得ることができる。
【００７７】
したがって、本発明はまた、本発明の第１の態様のペプチドを作成する方法を包含し、この方法は、ペプチドをコードする核酸（一般に、本発明の第２の態様に従う核酸）からの発現を含む。これは、当該ポリペプチドの発現を引き起こすかまたは可能にする適切な条件下で、培養物中でこのようなベクターを含む宿主細胞を増殖させることによって達成できる。
【００７８】
適切な調節配列（プロモーター配列、ターミネーターフラグメント、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および適切な場合には他の配列が含まれる）を含む適切なベクターが、選択または構築できる。
【００７９】
ベクターは、適切な場合、プラスミド、ウイルス（例えばファージ）またはファージミドであってよい。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。例えば、核酸構築物の調製、変異誘発、配列判定、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における、核酸の操作のための多数の公知の技術およびプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９２に詳細に記載されている。
【００８０】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、真核細胞（例えば、哺乳動物および酵母）およびバキュロウイルスの系が含まれる。
【００８１】
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書で開示されるような異種核酸を含む宿主細胞を提供する。
【００８２】
本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込んでもよい。
【００８３】
組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって促進してもよい。この核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在してもよく、そうでなければ細胞にとって同定可能に異種または外来であってもよい。
【００８４】
一般に「形質転換」のことをいい得る（特にｉｎ  ｖｉｔｒｏ導入について）がこれに限定されない導入は、任意の適切な技術を使用してもよい。
【００８５】
真核細胞について、適切な技術には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションおよびレトロウイルスもしくは他のウイルス（例えば、ワクシニア、または昆虫細胞についてはバキュロウイルス）を使用する形質導入が含まれ得る。細菌細胞について、適切な技術には、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用するトランスフェクションが含まれ得る。代替法として、核酸の直接インジェクションが使用できよう。
【００８６】
導入の後に、例えば、宿主細胞（細胞は形質転換された細胞の子孫である可能性がより高いものの、これは、実際に形質転換された細胞を含み得る）を、コードされたポリペプチド（またはペプチド）が産生されるような遺伝子発現のための条件下で培養することによって、核酸からの発現を引き起こすかまたは可能にしてもよい。ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドに結合されて発現される場合、このポリペプチドは、細胞から培養倍地中に分泌されてもよい。発現による産生の後、ポリペプチドまたはペプチドは、宿主細胞および／または培養培地から単離および／または精製してもよく、場合によっては、例えば、１種以上のさらなる成分を含んでもよい組成物（例えば、１種以上の医薬的に許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む医薬組成物）の製剤化において、所望の場合に引き続き使用してもよい（例えば以下を参照されたい）。
【００８７】
例えばそれらの天然の環境から、実質的に純粋または均質な形態で、あるいは核酸の場合には、要求される機能を有するポリペプチドをコードする配列以外の核酸または遺伝子の起源を含まないかまたは実質的に含まずに単離および／または精製された、本発明に従う使用のための核酸分子およびベクターが提供され得る。
【００８８】
種々の異なる宿主細胞におけるポリペプチドのクローニングおよび発現のための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳動物細胞、酵母およびバキュロウイルスの系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のための当該分野で入手可能な哺乳動物細胞株には、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞および他多数が含まれる。一般的な好ましい細菌細胞は大腸菌である。
【００８９】
核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば染色体）に組み込んでもよい。組み込みは、標準的な技術に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含むことによって促進してもよい。この核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在してもよく、そうでなければ細胞にとって同定可能に異種または外来であってもよい。
【００９０】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を使用する遺伝子治療の方法に及ぶ。
【００９１】
結合メンバー
本発明の文脈において、「結合メンバー」は、別の分子（特にＤＵＢ−３（または実際にはＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２）ポリペプチドまたはそのフラグメント）に対する結合特異性を有する分子である。結合メンバーは、特異的結合メンバーの対の一方のメンバーであってもよい。結合対のメンバーは、天然由来であるか、または全体的もしくは部分的に合成により生成してもよい。本発明の、および本発明における使用のための結合メンバーは、ＤＵＢ−３ポリペプチド（またはＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１もしくはＤＵＢ−１２ポリペプチド）に特異的に結合できる任意の部分（例えば、抗体またはリガンド）であり得る。
【００９２】
抗体
「抗体」は、天然であろうと部分的または全体的に合成により産生されようと、免疫グロブリンである。この用語はまた、抗体結合ドメインであるかまたは抗体結合ドメインに相同な結合ドメインを有する、任意のポリペプチド、タンパク質またはペプチドをカバーする。これらは、天然供給源に由来し得るか、または部分的もしくは全体的に合成により産生してもよい。抗体の例は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄのような、抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンアイソタイプならびにそれらのアイソタイプサブクラスおよびフラグメント；およびディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）である。
【００９３】
本発明の結合メンバーは、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体のような抗体またはそれらのフラグメントであってもよい。抗体の定常領域には、ヒトクラスＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥが含まれるがこれらに限定されない任意のクラスのものであってもよい。抗体は、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）に属していてもよい。ＩｇＧ１が好ましい。
【００９４】
抗体は多数の方法で改変できるので、用語「抗体」は、必要な特異性を有する結合ドメインを有する、任意の結合メンバーまたは物質をカバーすると解釈すべきである。したがって、この用語は、天然であろうと全体的もしくは部分的に合成であろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチドを含む、抗体の抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物およびホモログをカバーする。したがって、別のポリペプチドに融合した、免疫グロブリン結合ドメインを含むキメラ分子または等価物が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、ＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載される。
【００９５】
抗体全体のフラグメントは、抗原を結合する機能を果たし得ることが示されている。このような結合フラグメントの例は以下である：（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単鎖抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、２つのドメインを結合させて抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーによって連結された、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８））；（ｖｉｉｉ）二重特異的単鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｉｘ）遺伝子融合によって構築された多価または多重特異的フラグメントである「ディアボディ」（国際公開第９４／１３８０４号パンフレット；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））。
【００９６】
本発明における使用のための抗体またはポリペプチドのフラグメントとは、一般に、少なくとも５〜７個連続するアミノ酸、しばしば少なくとも約７〜９個の連続するアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３個連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０〜３０個以上連続するアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも約３０〜４０個以上連続するアミノ酸のアミノ酸残基のストレッチを意味する。
【００９７】
このような抗体もしくはポリペプチドまたはフラグメント抗体の「誘導体」とは、タンパク質のアミノ酸配列を変化させること、例えば、そのタンパク質をコードする核酸の操作またはタンパク質自体を変更することによって改変された抗体またはポリペプチドを意味する。天然アミノ酸配列のこのような誘導体は、好ましくはＤＵＢ活性を有するペプチドを提供しながらの、１個以上のアミノ酸の挿入、付加、欠失および／または置換を含んでもよい。好ましくは、このような誘導体は、２５個以下のアミノ酸、より好ましくは１５個以下、なおより好ましくは１０個以下、より好ましくはなお４個以下、そして最も好ましくは１個または２個だけのアミノ酸の、挿入、付加、欠失および／または置換を含む。
【００９８】
用語「抗体」は、「ヒト化」された抗体を含む。ヒト化抗体を作成するための方法は当該分野で公知である。方法は、例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号に記載されている。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する改変抗体であってもよい。したがって、結合メンバーは、ヒト定常領域を含んでもよい。
【００９９】
超可変領域以外の可変領域もまた、ヒト抗体の可変領域に由来してもよく、および／またはモノクローナル抗体由来であってもよい。このような場合において、可変領域の全体がマウスモノクローナル抗体由来であってもよく、この抗体は、キメラ化されていると言われる。キメラ化抗体を作製するための方法は当該分野で公知である。このような方法としては、例えば、Ｂｏｓｓ（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）およびＣａｂｉｌｌｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）による米国特許に記載された方法が含まれる。米国特許第４，８１６，３９７号および同第４，８１６，５６７号をそれぞれ参照されたい。
【０１００】
元の抗体の特異性を保持する他の抗体もしくはキメラ分子を生成するために、モノクローナル抗体および他の抗体を取り、組換えＤＮＡ技術を使用することが可能である。このような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域即ち相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域または定常領域＋フレームワーク領域に導入することを含んでもよい。例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ  ２１８８６３８ＡまたはＥＰ−Ａ−２３９４００を参照されたい。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞は、産生された抗体の結合特異性を変更してもしなくてもよい、遺伝子変異または他の変化に供してもよい。
【０１０１】
結合メンバーの生成
本発明における使用のための結合メンバーは、天然にか、または全体的にもしくは部分的に化学合成によって生成してもよい。結合メンバーは、十分確立された標準的な液相または好ましくは固相ペプチド合成方法（その一般的な記載は、広く利用可能である（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９８４）、Ｍ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ  ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ、Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ  Ｕｓｅｒｓ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＢＩ  Ｉｎｃ．、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａを参照されたい））に従って容易に調製でき、あるいは、結合メンバーは、液相方法、または固相、液相および溶液化学の任意の組合せによって、例えば、それぞれのペプチド部分を最初に完成させ、次いで所望かつ適切な場合、存在する任意の保護基の除去後に、それぞれのカルボン酸もしくは硫酸またはその反応性誘導体の反応による残基Ｘの導入によって、溶液中で調製してもよい。
【０１０２】
本発明における使用に適切な結合メンバーを生成する別の都合のよい方法は、発現系における核酸の使用によって、結合メンバーをコードする核酸を発現させることである。したがって、本発明はさらに、以下の使用を提供する：（ａ）本発明のポリペプチドに結合する特異的結合メンバーをコードする核酸、および任意選択で（ｂ）癌を治療するための医薬の調製における化学療法剤。
【０１０３】
大腸菌のような原核細胞における抗体および抗体フラグメントの発現は、当該分野で十分確立されている。概説については、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照されたい。培養物中の真核細胞における発現もまた、結合メンバーの生成のための選択肢として、当業者に利用可能である。最近の概説については、例えばＲｅｆｆ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６（１９９３）；Ｔｒｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．６：５５３−５６０（１９９５）を参照されたい。
【０１０４】
医薬組成物
上記のように、本発明は、癌の治療のための医薬組成物に及び、この組成物は、ａ）本発明の核酸、ポリペプチド、結合メンバーおよび／または組成物、ならびにｂ）医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む。
【０１０５】
本発明に従う、本発明での使用のための医薬組成物は、活性成分に加えて、当業者に周知の医薬的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または他の物質を含んでもよい。このような物質は、非毒性でなければならず、かつ活性成分の効力を妨害すべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、経口または注射（例えば静脈内）であり得る投与経路に依存しよう。
【０１０６】
製剤は、液体、例えば、非リン酸塩緩衝液を含む生理的塩溶液（ｐＨ６．８〜７．６）、または凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１０７】
投与
本発明の核酸、ポリペプチド、結合メンバーおよび／または組成物は、任意の適切な方法で投与してもよい。さらに、それらの各々は、他の治療（例えば他の化学療法剤）との併用療法で使用してもよい。このような実施形態において、本発明の核酸、ポリペプチド、結合メンバーおよび／または組成物は、別の化学療法剤と同時に、別個にまたは連続的に投与してもよい。
【０１０８】
別個にまたは連続的に投与する場合、これらは、互いに任意の適切な時間内に、例えば、１時間以内、２時間以内、３時間以内、６時間以内、１２時間以内、２４時間以内、４８時間以内または７２時間以内に投与してもよい。好ましい実施形態において、これらは、互いに６分以内、好ましくは２分以内、より好ましくは１分以内、最も好ましくは２０分以内に投与される。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明の核酸、ポリペプチド、結合メンバーおよび／または組成物は、意図される投与経路に依存して選択される適切な医薬的賦形剤、希釈剤または担体を一般に含む医薬組成物として投与される。
【０１１０】
本発明における使用のための核酸、ポリペプチド、結合メンバーおよび／または組成物（薬剤）は、任意の適切な経路を介して治療を必要とする患者に投与してもよい。
【０１１１】
いくつかの適切な投与経路には、経口、直腸、鼻、局所（頬および舌下を含む）、膣または非経口（皮下、筋内、静脈内、皮内、くも膜下腔内および硬膜外）投与が含まれる（がこれらに限定されない）。静脈内投与が好ましい。
【０１１２】
静脈内注射または罹患部位での注射について、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水性溶液の形態であろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸化リンゲル注射液のような等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を調製することが十分可能である。防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／または他の添加剤を、必要に応じて含んでもよい。
【０１１３】
経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤または液体形態であってもよい。錠剤は、ゼラチンのような固体担体またはアジュバントを含んでもよい。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油もしくは植物油、鉱油または合成油のような液体担体を含む。生理的食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖溶液またはグリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）を含んでもよい。
【０１１４】
本発明の核酸、ポリペプチド、結合メンバーおよび／または組成物はまた、ミクロスフィア、リポソーム、他の微粒子送達系または血液を含む特定の組織中に置いた徐放性製剤を介して投与してもよい。徐放性担体の適切な例には、分割された物品、例えば坐剤またはマイクロカプセルの形態の、半透性ポリマーマトリクスが含まれる。移植可能なまたはマイクロカプセルの徐放性マトリクスには、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ−Ａ−００５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２（１）：５４７−５５６、１９８５）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはエチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７、１９８１およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５、１９８２）が含まれる。ポリペプチドを含むリポソームは、周知の方法によって調製される：ＤＥ  ３，２１８，１２１Ａ；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、８２：３６８８−３６９２、１９８５；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、７７：４０３０−４０３４、１９８０；ＥＰ−Ａ−００５２５２２；Ｅ−Ａ−００３６６７６；ＥＰ−Ａ−００８８０４６；ＥＰ−Ａ−０１４３９４９；ＥＰ−Ａ−０１４２５４１；ＪＰ−Ａ−８３−１１８０８；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００Å）単層型のものであり、その脂質含量は、約３０ｍｏｌ．％より多いコレスレロールであり、選択された割合が、最適な速度のポリペプチド漏出のために調整される。
【０１１５】
上記の技術およびプロトコルならびに本発明に従って使用され得る他の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｌｏ，Ａ．（ｅｄ）、１９８０に見出すことができる。
【０１１６】
核酸、ポリペプチド、結合メンバー、薬剤、製品または組成物は、腫瘍部位または他の所望の部位に局所的様式で投与してもよく、あるいは腫瘍または他の細胞を標的化する様式で送達してもよい。標的化治療は、標的化システム（例えば、抗体または細胞特異的リガンド）の使用によって、特定の型の細胞により特異的に活性薬剤を送達するために使用され得る。例えば、その薬剤が許容できない毒性のものである場合、またはそうでなければ高すぎる投薬量を必要とする場合、またはそうでなければ標的細胞に入ることができない場合のような種々の理由のために、標的化が所望される可能性がある。
【０１１７】
用量
本発明の核酸、ポリペプチド、結合メンバーおよび／または組成物は、好ましくは、「治療有効量」で個体に投与され、これは、その個体に対して利益を示すのに十分な量である。投与される実際の量ならびに投与の速度およびタイムコースは、治療されるものの性質および重篤度に依存しよう。治療の処方（例えば、投薬量の判定など）は、最終的には、一般的な実施者および他の医師の責任の範囲内ならびに判断であり、典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および実施者に公知の他の要因を考慮する。
【０１１８】
治療使用
本発明のペプチドおよび方法は、任意の癌の治療において使用してよい。
【０１１９】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」には、ヒトまたは非ヒト動物に有益であり得る任意の型が含まれる。治療は、既存の状態に関するものであっても、予防的（予防的治療）であってもよい。治療には、治癒効果、緩和効果または予防効果が含まれ得る。
【０１２０】
本発明の核酸、ポリペプチド、特異的結合メンバー、組成物および方法は、既存の癌の治療において、および最初の治療または手術の後の癌の再発の予防において特に有用であり得る。
【０１２１】
好ましい実施形態において、この核酸、ポリペプチド、特異的結合メンバー、組成物および方法は、造血癌、肺癌、皮膚癌、小腸癌または胸腺癌の治療のために使用される。
【０１２２】
アッセイ
種々のさらなる態様において、本発明は、スクリーニングおよびアッセイの方法および手段、ならびにそれにより同定された物質に関する。
【０１２３】
したがって、本発明のさらなる態様は、ポリペプチドもしくはペプチド、特に開示されるような本発明のポリペプチドのフラグメントおよび／またはそれをコードする核酸の、当該ポリペプチドもしくはペプチドと相互作用および／もしくは結合する物質ならびに／あるいはその機能もしくは活性または別の物質（例えば、本発明のポリペプチドまたはペプチドと相互作用および／または結合するポリペプチドまたはペプチド）の機能もしくは活性を妨害する物質（例えば、ペプチドまたは化合物）をスクリーニングもしくは探索することにおける、および／または獲得／同定するための使用を提供する。
【０１２４】
例えば、本発明の１つの態様に従う方法、本発明のポリペプチドまたはペプチド、およびそれを物質と接触させ、その接触は、このポリペプチドまたはペプチドと物質との間の結合を生じ得る。結合は、定性的および定量的の両方の、当該分野で利用可能な多数の技術のいずれによって判定してもよい。
【０１２５】
さらなるアッセイは、本発明のポリペプチドと相互作用するかまたは本発明のポリペプチドを結合し、および／またはその活性のうち１つ以上を調節する物質に対するものである。
【０１２６】
本発明の１つの態様は、以下を含むアッセイを提供する：
（ａ）本発明に従うポリペプチドまたはペプチドと推定結合分子または他の試験物質とを接触させるステップ；および
（ｂ）当該ポリペプチドまたはペプチドと試験物質との間の相互作用または結合を判定するステップ。
【０１２７】
本発明のポリペプチドまたはペプチドと相互作用する物質は、議論されるようなその活性を調節するために、単離および／または精製、製造および／または使用してもよい。
【０１２８】
本発明のさらなる態様は、以下を含むアッセイ方法を提供する：
（ａ）ＤＵＢポリペプチドまたはそのフラグメント、変異体、バリアントもしくは誘導体を含む物質と、第二のポリペプチドのフラグメントまたは当該第二のポリペプチドのフラグメント、変異体、バリアントもしくは誘導体を含む物質（これは、ＤＵＢポリペプチドに結合できる）と、試験化合物とを、２つの当該物質の相互作用のインヒビターである試験化合物が存在しない条件下で接触させるステップ（ここで、当該ＤＵＢポリペプチドは、ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１またはＤＵＢ−１２ポリペプチドである）；
（ｂ）当該物質間の相互作用を判定するステップ。
【０１２９】
本発明はここで、以下の非限定的な実施例において、添付の図面を参照してさらに説明される。
【実施例】
【０１３０】
実験手順
データベース分析
基本的な配列操作は、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡＳｔａｒ）パッケージソフトのプログラムを用いて実施した。より進んだ分析は、ＵＫ  ＨＧＭＰ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＣｅｎｔｒｅのウェブベースのポータルＮＩＸ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｒｅｇｉｓｔｅｒｅｄ／Ｗｅｂａｐｐ／ｎｉｘ／）を通じて実施した。これは、ｔｒｅｍｂｌ、ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、ｅｍｂｌ、ｅｓｔおよびｈｔｇを含む同時ＢＬＡＳＴ検索のための複数のデータベースに対するインターフェースを提供し、集合的なアウトプットを、単純化したハイパーリンクした画像提示として示す。
【０１３１】
ｃＤＮＡクローニング
ＲＮＡサンプルを、Ｓｔａｔ−６０試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ  ＩＮＣ、ＴＸ、ＵＳＡ）を使用して、５×１０６個のＲＡＪＩ細胞から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを、ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）およびプライマーセット：
D1  5'-CAGTGAATTCGTGGGAATGGAGGACGACTCACTCTAC-3'
D2  5'-AGTCATCGATCTGGCACACAAGCATAGCCCTC-3'
を使用して実施した。
ＲＴ−ＰＣＲ産物を、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ  Ｂｌｕｎｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｐＴ７Ｂｌｕｅ−３（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を使用してクローニングし、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１キット、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）およびプライマー：
D3  5'-CTCATGTTCACTGTGGATGC-3'
D4  5'-GATGATCTACCTGCTTGTGG-3'
D5  5'-CGGACATTACTTCTCTTATG-3'
D6  5'-GGACAGAAGTGATGCTAGAG-3'
D7  5'-TTGCCAACTACATGCTGTCC-3'
D8  5'-CTGGGTGGAGTTGTCACAAC-3'
を使用して配列判定した。
【０１３２】
ノザンブロッティング
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｄｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞株から抽出し、分光測定法によって定量した。各サンプル由来の２０μｇの総ＲＮＡを、１％アガロースホルムアルデヒドゲルでの電気泳動に供した。ゲルを水で３回洗浄し、次いで５０ｍＭのＮａＯＨ−１０ｍＭのＮａＣｌ中で３０分間変性させ、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で３０分間すすぎ、１０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５ＭのＮａＣｌ＋０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムである）中に３０分間置いた。ゲルを、ナイロンメンブレン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ、Ｎ．Ｈ．、ＵＳＡ）上に一晩移した。移した後、メンブレンを２×ＳＳＣですすぎ、ＵＶ  Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で架橋させた。メンブレンを５ｍｌのＲａｐｉｄ−ｈｙｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）中でプレハイブリダイズさせ、次いで、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＤＮＡ標識システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してランダムプライマーによって標識したｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、メンブレンを、６５℃で０．１×ＳＳＣ−０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）での最終洗浄に供し、その後フィルムに露光させた。
【０１３３】
プラスミド
ＤＵＢ−３  ｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲベースの方法によって、それらのＣ末端をＦＬＡＧエピトープでタグ化した。各ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ部位およびＡＴＧコドンを含む５’オリゴヌクレオチドならびにＣｌａＩ部位を含む３’オリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲによって増幅した。このＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ  ＰＣＲフラグメントを、改変されたｐＭＥ１８ＳベクターのＥｃｏＲＩ部位とＣｌａＩ部位との間に、ＦＬＡＧエピトープとインフレームでサブクローニングした。触媒的に不活性なＤＵＢ−３Ｃ／Ｓ変異体を生成するために、８９位のシステイン残基を、Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、セリンに変化させた。ＤＵＢ−３を発現するｐＵＨＤ１０−３プラスミドを、ＤＵＢ−３−ＦＬＡＧ  ｃＤＮＡをサブクローニングすることによって構築した。ＤＵＢ−３およびＤＵＢ−３Ｃ／Ｓを発現するｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰプラスミドを、ＤＵＢ−３−ＦＬＡＧおよびＤＵＢ−３Ｃ／Ｓ−ＦＬＡＧのｃＤＮＡをサブクローニングすることによって構築した。
【０１３４】
細胞培養およびトランスフェクション
ＩＬ−３依存的なプロＢ細胞株Ｂａ／Ｆ３およびＢａ／Ｆ３ｂ／ｔＴＡ２８を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含むＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ中で増殖させた。ＲＡＪＩ細胞およびＫ５６２細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ中で増殖させた。ＰｌａｔｉｎｕｍＥ（ＰｌａｔＥ：２９３Ｔ線維芽細胞由来、Ｄｒ  Ｔ．Ｋｉｔａｍｕｒａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎからの贈与）およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地／１０％ＦＢＳ中で増殖させた。Ｂａ／Ｆ３ｂ／ｔＴＡ細胞のトランスフェクタントを、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ−ｒａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ；３００Ｖ、９６０ｍＦ）を使用して、ＤＵＢ−３を含む線状化したｐＵＨＤ１０−３プラスミドで１０７個の細胞をエレクトロポレーションすることによって生成し、１．２μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを使用して選択した。テトラサイクリン（４μｇ／ｍｌ）もまた添加し、４８時間毎に置換した。ＤＵＢ−３／ＤＵＢ−３Ｃ／Ｓの発現を誘導するために、細胞を２４〜４８時間、テトラサイクリンの非存在下で増殖させた。ＰｌａｔＥ細胞のトランスフェクタントを、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｅａｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を製造者に指定されたとおりに使用し、空のベクターまたはＤＵＢ−３−ＦＬＡＧもしくはＤＵＢ−３Ｃ／Ｓ−ＦＬＡＧ融合タンパク質を発現するｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰのいずれかを使用して、生成した。
【０１３５】
抗体産生
ＤＵＢ−３ポリクローナル抗体を、Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｂｅｌｆａｓｔ、ＵＫ）から得た。免疫化を、ＤＵＢ−３タンパク質の残基３７８〜５３０を含む、アフィニティ精製した組換え６ＨＩＳタグ化融合タンパク質を使用して実施した。
【０１３６】
細胞溶解、免疫沈降およびウェスタンブロッティング
全細胞溶解物を生成するために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．８７５％のＢｒｉｊ  ９７、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４、１０μｇ／ｍｌのロイペプチン、１０μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）中で溶解し、１２０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した。免疫沈降は、ウサギポリクローナルＤＵＢ−３抗体（Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）またはＭ２抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用して実施した。次いで、免疫沈降物を溶解緩衝液中で５回洗浄した。細胞溶解物および免疫沈降物を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）上に移し、適切な場合にはＤＵＢ−３またはＦＬＡＧのいずれかに対する抗体を使用してイムノブロットした。これらのブロットを、高感度化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって可視化した。
【０１３７】
脱ユビキチン化アッセイ
ユビキチン−β−ガラクトシダーゼ（ｕｂ−β−ｇａｌ）融合タンパク質の開裂に基づく脱ユビキチン化アッセイは、以前に記載されている３４。ＤＵＢ−３  ＯＲＦ（アミノ酸１〜５３０）に対応する１５９０塩基対（ｂｐ）のフラグメントおよび触媒的に不活性な変異形態ＤＵＢ−３Ｃ／Ｓ（Ｃ８９Ｓ）を含む等価なＯＲＦを、ＰＣＲによって生成し、ＧＳＴエピトープとインフレームでｐＧＥＸベクターにインフレームで挿入した。Ｕｂ−Ｍｅｔ−ｂ−ガラクトシダーゼを、ｐＡＣＹＣ１８４ベースのプラスミドから発現させた。プラスミドを、ＭＣ１０６１大腸菌に同時形質転換した。プラスミド保有大腸菌ＭＣ１０６１細胞を溶解し、ウサギ抗β−ガラクトシダーゼ抗血清（Ｃａｐｐｅｌ、ＮＣ、ＵＳＡ）を用いてイムノブロットすることによって分析した。
【０１３８】
増殖因子刺激
ＲＡＪＩ細胞を洗浄し、無血清培地中で４時間インキュベートした。次いで、無血清培地に残る細胞を、特定の時間にわたって１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４で処理し、その後、溶解物をＤＵＢ−３抗体での免疫沈降のために取ったか、またはＲＴ−ＰＣＲのためにＳｔａｔ−６０試薬（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ  ＩＮＣ）を使用してＲＮＡサンプルを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲを、以下のプライマーセット：
D1  5'-CAGTGAATTCGTGGGAATGGAGGACGACTCACTCTAC-3'
D2  5'-AGTCATCGATCTGGCACACAAGCATAGCCCTC-3'
および
GAPDH F  5'-TGATGACATCAAGAAGGTGG-3'
GAPDH R  5'-TTACTCCTTGGAGGCCATGT-3'
と共にＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。
【０１３９】
レトロウイルス感染
ビシストロニックベクターｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰを、パッケージング細胞株ＰｌａｔＥにトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培地を取り出し、Ｂａ／Ｆ３細胞を２．５×１０５細胞／ｍｌで再懸濁するために使用した（５０単位／ｍｌのＩＬ−３、１０μｇ／ｍｌのポリブレン、Ｓｉｇｍａ）。細胞を６ウェルプレート中で２７０分間２０００ｒｐｍで室温で遠心分離し、その後培地をＲＰＭＩ  １６４０／５％ＦＢＳ（５０単位／ｍｌのＩＬ−３）で置換した。２４時間後、細胞を洗浄し、無血清培地に再懸濁し、その後ソートした。細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣＳ  ＡＬＴＲＡおよびＥＸＰＯソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用してＧＦＰの存在についてソートした。
【０１４０】
トリパンブルー排除アッセイ
ＩＬ−３および血清の両方を欠く培地中で１２時間培養した細胞を、２×１０５細胞／ｍｌで播種し、４μｇ／ｍｌのテトラサイクリンの存在下または非存在下で、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含むＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ中で増殖させた。特定された時間後、生存細胞数を、０．４％のトリパンブルー染色溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を使用して標準的なトリパンブルー排除アッセイによって判定した。細胞計数を、二連で実施した。
【０１４１】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色
選択されたＢａ／Ｆ３クローンの細胞周期プロフィールを評価するために、これらをヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。簡潔に述べると、細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、０．１％のノニルフェノキシポリエトキシエタノール（ＮＰ−４０、Ｓｉｇｍａ）、０．１％のクエン酸ナトリウムおよび５０ｍｇ／ｍｌのＰＩ（Ｓｉｇｍａ）を含む低張緩衝液に再懸濁し、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリー分析に供した。
【０１４２】
結果
ヒトＤＵＢ遺伝子の同定
ＤＵＢファミリーの脱ユビキチン化酵素のヒトメンバーは知られていなかったので、利用可能なヒトＥＳＴおよびゲノムデータベースの広範な分析を、マウスＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２の配列を使用して実施し、可能性のあるヒトファミリーメンバーを同定した。これにより、ヒト第４染色体および第８染色体由来の複数の相同ゲノム配列（付属の図面を参照されたい）が明らかとなり、このうち１つは、推定脱ユビキチン化酵素であるＵＳＰ１７を含むことが以前に報告されている３５、第４染色体の縦列反復ＲＳ４４７であった。これらの配列を基礎として使用して、プライマーを、ＲＡＪＩ細胞株由来の全長ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列判定を可能にするように設計し、ｍＲＮＡレベルで発現された配列を同定した。いくつかの異なるｃＤＮＡが観察され（結果は示さず）、そのうち最も頻繁に検出されたものを、本発明者らはＤＵＢ−３と称した（図１）。
【０１４３】
図１は、マウスＤＵＢ−１、ＤＵＢ−２およびＤＵＢ−２Ａ、ならびに代表的なヒトメンバーとしてのＤＵＢ−３を含む、ＤＵＢファミリーの脱ユビキチン化酵素のメンバーのタンパク質配列のアラインメントを示す。このアラインメントは、以前に同定されたＵＢＰの保存されたドメイン（ＤＨ  Ｉ→ＤＨ  ＶＩ）ならびにそれらの活性部位で保存されたシステイン残基、アスパラギン酸残基およびヒスチジン残基７、８を含むこれらの酵素の触媒コアにわたる、ＤＵＢタンパク質ファミリーのヒトメンバーとマウスメンバーとの間の広範囲な相同性を示す。さらに、ＤＵＢ−２／２Ａに３回存在し、ＤＵＢ−１に２回存在するが、ヒトＤＵＢには１回しか存在しない、１９ＡＡの反復配列を強調する（破線の下線）。このことの意味は不明である。
【０１４４】
組織分布
ＤＵＢ−３がｍＲＮＡレベルで発現されたことを実証するために、複数の組織由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡのノザンブロットハイブリダイゼーションを、全長ＤＵＢ−３  ｃＤＮＡをプローブとして使用して実施した（図２ａ）。２つの転写物が観察され、１つは約１．６ｋｂで心臓、骨格筋、結腸、腎臓および肝臓を含む多数の組織で観察され、約１．７ｋｂの２つ目の転写物が脳および肝臓の両方に存在した。
さらに、本発明者らは、ある範囲の造血腫瘍（例えば、前骨髄球性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ芽球性白血病およびバーキットリンパ腫）ならびにある範囲の固形腫瘍に由来するものを含む多数の細胞株由来のＲＮＡのノザンブロットハイブリダイゼーションを実施した（図２ｂ）。１つの細胞株を除いて、試験したすべての細胞株は、１．６ｋｂの転写物の高レベルの発現を示した。これらの観察は、正常な末梢血白血球および脾臓（図２ａ）が無視できるレベルの発現を示した複数の組織のノザンでの観察と対照をなした。
【０１４５】
脱ユビキチン化アッセイ
ＤＵＢ−３をクローン化したので、それが活性酵素であることを実証することが重要となり、結果として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの脱ユビキチン化アッセイを実施した。ＤＵＢ−３を、ユビキチン−Ｍｅｔ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質と共に大腸菌細胞中で同時発現させた。活性を、ユビキチン−Ｍｅｔ−β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質からのユビキチンの開裂によって評価し、抗β−ガラクトシダーゼポリクローナル抗体を使用してイムノブロットすることによって可視化した。これらの結果は、ＤＵＢ−３が少なくともＤＵＢ−１と等価な脱ユビキチン化活性を示したこと、およびこの活性が、他の脱ユビキチン化酵素において触媒活性に必須であることが以前に示された活性部位内の保存されたシステイン残基の変異（Ｃ８９Ｓ）６によって除去されたことを実証した（図３）。
【０１４６】
ＤＵＢタンパク質発現の調節
内因性タンパク質の研究を容易にするため、アミノ酸残基３７８〜５３０（認識された触媒コア（ＤＨＩ−ＤＨＶＩ）の外側の領域）（図１）を含む精製された組換え融合タンパク質を使用して、ＤＵＢ−３のカルボキシ末端に対するウサギポリクローナル抗体を開発した。この抗体を、ＴＥＴ−Ｏｆｆ発現構築物からＤＵＢ−３−ＦＬＡＧタグ化融合タンパク質を発現するＢａ／Ｆ３細胞を使用して試験した。これらの知見は、この抗体が、免疫沈降可能であり、ＤＵＢ−３タンパク質をイムノブロットできることを実証した（図４ａ）。これらの結果は、抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２を使用した免疫沈降およびブロッティングによって確認した（データ示さず）。ＤＵＢ−３抗体が過剰発現されたＤＵＢ−３タンパク質を認識したことが実証されたので、次に、それが内因的に発現されたタンパク質を認識できるか否かを試験することが重要であった。本発明者らは、細胞株ＲＡＪＩが高レベルのＤＵＢ−３  ｍＲＮＡを発現することを以前に示している（図２および結果示さず）。したがって、この細胞株を、内因性タンパク質の存在について試験するために選択した。ＲＡＪＩ細胞由来の溶解物を、ＤＵＢ−３抗体を使用して免疫沈降し、ウェスタンブロッティングによって試験した。ＤＵＢ−３タンパク質の構成的発現がＲＡＪＩ細胞株において検出され（図４ａ）、このことは、これらの細胞がｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でＤＵＢ−３を発現したことを実証する。ＤＵＢ−３  ｍＲＮＡを発現しなかったＫ５６２細胞（図２ｂ）は、タンパク質発現も示さなかった（図４ａ）。
ＤＵＢ−１およびＤＵＢ−２はもともと、サイトカイン刺激の際に迅速に誘導される最初期遺伝子として同定された。特に、ＤＵＢ−１は、ＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦによって誘導されることが示されているが２４、ＤＵＢ−２はＩＬ−２に応答して誘導された２５。ＤＵＢ−３が同様の様式で挙動するか否かを判定するために、ＩＬ−２刺激およびＩＬ−４刺激に応答したその誘導性を評価するための研究を実施した。ＤＵＢ−３のｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルは、増殖因子刺激の前に４時間無血清培地に細胞を置くことによって、有意に低減された（図４ｂおよびｃ）。刺激後、ｍＲＮＡ発現を、ＤＵＢ−３を増幅できるプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって判定し、タンパク質レベルで、以前に特徴付けられたＤＵＢ−３抗体を使用する免疫沈降およびブロッティングによって判定した。ＤＵＢ−３の発現は、ＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）に応答して、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で誘導された（図４ｂおよびｃ）。ＤＵＢ−３  ｍＲＮＡのアップレギュレーションが、ＩＬ−４処理のわずか５分後に採取したサンプルにおいて観察され、少なくとも３０分間そのレベルで維持され、９０分の前にベースラインに戻った。さらに、特定の転写物がこの誘導を担うか否かを判定するために、これらの実験の間に得られたＲＴ−ＰＣＲ産物をクローニングし、１０個のコロニーを配列判定のために選択した。ＤＵＢ−３に加えて、いくつかの異なる転写物が提示され、このことは、この誘導が、特定の転写物のアップレギュレーションではなく、複数のＤＵＢ転写物の同時アップレギュレーションに起因することを示唆した（データ示さず）。したがって、ＤＵＢ−３タンパク質産生の誘導は、ｍＲＮＡの誘導の後に起こり、タンパク質レベルのアップレギュレーションは、３０分後に観察され、レベルは９０分後までベースラインに戻らなかった。これらの結果は、ヒトＤＵＢ−３が、ＩＬ−４刺激の際に一過的に発現されるサイトカイン誘導性の最初期遺伝子であることを示唆した。
【０１４７】
発現研究
ＤＵＢ−３をサイトカイン誘導性の一過的に発現されるタンパク質として同定したので、本発明者らは次に、その発現の機能的重要性を調査した。これを試験するために、ＴＥＴ−Ｏｆｆ発現系からＤＵＢ−３を発現するＢａ／Ｆ３細胞株を使用した（図４ａ）。増殖に対するＤＵＢ−３発現の効果を評価するために、ＩＬ−３および血清を欠く培地中で１２時間培養した細胞を、２×１０５細胞／ｍｌで播種し、テトラサイクリンの存在下および非存在下で１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３を含むＲＰＭＩ  １６４０／１０％ＦＢＳ中で培養した。サンプルを１２時間毎に採取し、生存細胞の数を、トリパンブルー排除アッセイを使用して判定した。試験したＤＵＢ−３発現クローンは、ＤＵＢ−３が発現されると増殖速度の実質的な低減を示した（図５ａ）。示された結果は、２つの別個のＤＵＢ−３発現クローンを使用して再現され、５回の実験の代表を示す。さらに、テトラサイクリンの除去の２４〜４８時間後、観察された細胞の約１０％は、非生存であったことに注目した（結果示さず）。このことは、ＤＵＢ−３発現が、増殖を遅延させることに加えて、細胞死を誘導することを示した。ＤＵＢ−１の発現が、Ｓ期の前の細胞周期停止を生じ得ることは、以前に観察されている２７。このことは、ＤＵＢ−３発現が、細胞周期ブロックとして作用し得るという可能性を生じた。これをより詳細に試験するために、テトラサイクリンの存在下および非存在下で培養した細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色して、それらの細胞周期プロフィールを判定した（図５ｂ）。ＤＵＢ−３を発現する細胞は、Ｓ期およびＧ２Ｍにある細胞数の５０％の低減を示し、このことは、ＤＵＢ−３を発現する細胞がＧ１を出ることができない可能性があることを示唆する。さらに、テトラサイクリンを除去した場合、約１０％の細胞がサブＧ１領域で観察され、このことは、細胞がアポトーシスを受けていることを示す。このことは、トリパンブルー排除アッセイでなされた観察を確認し、ＤＵＢ−３の発現が増殖をブロックし、アポトーシスを開始できることを示した。
【０１４８】
ＤＵＢ−３の効果が細胞型特異的であるか否かを判定するために、ビシストロニックベクターｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰを使用して、ＤＵＢ−３またはＤＵＢ−３Ｃ／Ｓのいずれかを発現するＢａ／Ｆ３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞を樹立した。このｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰベクターは、ＤＵＢ−３構築物およびＧＦＰの両方を発現し、これにより、緑色蛍光について発現細胞を選択することが可能となる。ＰｌａｔＥパッケージング細胞株を、ｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ、またはＤＵＢ−３もしくはＤＵＢ−３Ｃ／Ｓを含むｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰのいずれかによって一過的にトランスフェクトし、上清を使用して、Ｂａ／Ｆ３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の両方に感染させた。次いで、ＧＦＰ発現に基づいて細胞をソートすることによって、感染細胞の割合を富化した（図６ａおよび示さず）。ＤＵＢ−３およびＤＵＢ−３Ｃ／Ｓの発現を、ＤＵＢ−３抗体を使用して、免疫沈降およびイムノブロッティングによって確認した（図６ｂおよび示さず）。富化した細胞集団（このときには、最低８０％の細胞が感染していた）を１週間培養し、感染細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して再評価した。ベクター単独またはＤＵＢ−３Ｃ／Ｓを感染させた集団中の、ＧＦＰを発現する細胞の割合は、ソート後のレベルの１０％以内を維持した。しかし、Ｂａ／Ｆ３細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞の両方において、ｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ−ＤＵＢ−３を感染させた細胞集団中の、ＧＦＰを発現する細胞の割合は、１％未満に低下した（図６ａおよび示さず）。これらの結果は、以前に観察したように、ＤＵＢ−３を発現する細胞が、未感染の細胞よりも有意に遅く増殖していることを示唆し、これにより、元々集団の約１０〜２０％のみを占めた未感染集団が、ＤＵＢ−３発現細胞よりも迅速に増殖することが可能となった。これらの観察をさらに確認するために、Ｂａ／Ｆ３細胞の集団を、以前と同様に感染させ、それらの増殖速度を、トリパンブルー排除アッセイを使用してソート後に試験した（図６ｃ）。再び、ｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ−ＤＵＢ−３を感染させた細胞集団は、対照細胞よりもゆっくりと増殖した。これらの結果は、ＤＵＢ−３発現が増殖をブロックしたことを確認し、Ｂａ／Ｆ３細胞株およびＮＩＨ３Ｔ３細胞株の両方でそれが生じたので、これが細胞型特異的な現象ではないことを示した。重要なことには、触媒的に不活性なＤＵＢ−３Ｃ／Ｓを発現する細胞の集団が、ベクターのみの対照を感染させた集団と類似の様式で挙動し、このことは、増殖に対するＤＵＢ−３の効果が、その脱ユビキチン化活性に依存することを示唆していることにも留意した。
【０１４９】
ＤＵＢ−３が如何に細胞増殖をブロックするかを判定するために、本発明者らは、ＤＵＢ−３発現の存在下および非存在下で多数の細胞内シグナル伝達分子の活性化を試験した。結果を図８に示す。Ｔｅｔ−Ｏｆｆ発現ベクターからＤＵＢ−３を発現するＢａ／Ｆ３細胞を、２×１０５細胞／ｍｌで播種し、＋／−テトラサイクリンで４８時間培養した。次いで、これらの細胞を−ＩＬ−３およびＦＣＳで４時間培養し、その後１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３で刺激した。溶解物を示された時点で採取し、ウェスタンブロッティングによって分析した。ＥＲＫリン酸化の有意なダウンレギュレーションが、ＤＵＢ−３を発現する細胞において観察され、このことは、Ｒａｓ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路がダウンレギュレーションされたことを示す（図８）。引き続き、本発明者らは、ＭＥＫリン酸化もまたダウンレギュレーションされたことを実証し、このことは、ＤＵＢ−３がＥＲＫおよびＭＥＫの両方の上流のこの経路に影響を与えることを示す（図８）。最後に、本発明者らは、ＤＵＢ−３発現の存在下で、Ｒａｓのより遅く移動する形態が観察されることを示した（図８）。このより遅く移動する形態は、Ｒａｓプロセシングの破壊を示し、ＤＵＢ−３が、Ｒａｓのプロセシングを破壊することによってＲａｓ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路をダウンレギュレートするように作用することを示す。
【０１５０】
ＤＵＢ−３が如何にＲａｓのプロセシングを破壊できたのかを判定するために、本発明者らは、この経路に関与する多数の酵素に対するＤＵＢ−３発現の影響を試験した。２９３Ｔ細胞を、示されたタンパク質を発現する構築物でトランスフェクトし、溶解物を２４時間後に採取した。次いで、これらをウェスタンブロッティングによって分析して、ＲＣＥ１の発現（図９Ａの上のパネル）およびＤＵＢ−３／ＤＵＢ−３ＣＳの発現（図９Ａの下のパネル）を判定した。２９３Ｔ細胞を、ＲＣＥ１を発現する構築物でトランスフェクトし、２４時間後、これらのトランスフェクションを、１ｍＭのＭＧ１３２（プロテアソームのインヒビター）で処理したかまたはモック処理し、その後溶解物を採取した。次いで、これらをウェスタンブロッティングによって分析して、ＲＣＥ１の発現を判定した（図９Ｂ）。この経路の他の成分は影響を受けなかったが、本発明者らは、酵素ＲＣＥ１（Ｒａｓ変換酵素１）がプロテアソームにより調節され（図９ｂ）、ＲＣＥ１およびＤＵＢ−３の同時発現によりＲＣＥ１のレベルが有意に増大することを観察した（図９Ａ）。これらの結果は、ＲＣＥ１タンパク質レベルがユビキチン−プロテアソーム経路を介した分解によって調節され、ＤＵＢ−３発現がこの分解をブロックすることを示している。このことは、脱ユビキチン化酵素ＤＵＢ−３の基質がＲＥＣ１であり、ＤＵＢ−３が、分解のためにＲＣＥ１を標的化するユビキチン鎖を除去することによって、ＲＣＥ１をプロテアソームに標的化するのをブロックすることを示すのであろう。ＲＣＥ１は、Ｒａｓ（Ｒｈｏ、Ｒａｐ、ＣＤＣ４２）に加えて複数のＣＡＡＸモチーフ含有タンパク質のプロセシングに関与し、したがって、ＤＵＢ−３発現がＲＣＥ１に対するその効果を介してそれらの活性化に影響を与え得ることが推測できる。
【０１５１】
議論
この研究において、本発明者らは、ＤＵＢ−３（ＤＵＢファミリーの脱ユビキチン化酵素のヒトメンバー）のクローニングを報告し、ある範囲の組織および細胞株におけるｍＲＮＡレベルでのその発現を示す。本発明者らはまた、活性な脱ユビキチン化酵素であることを本発明者らが示したＤＵＢ−３が、ＬＩ−４刺激に応答してｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で誘導され、ＤＵＢ−３の構成的発現が増殖をブロックし、観察されたアポトーシス細胞の数の増加を導くことを実証する。
この報告の前には、ＤＵＢファミリーのヒトメンバーは同定されていなかった。しかし、いくつかの研究により、マウスＤＵＢが、免疫細胞における増殖および生存の調節に重要であり得ることが示されている。ＤＵＢ−１（ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＧＭ−ＣＳＦ）２４およびＤＵＢ−２（ＩＬ−２）２５は、サイトカイン刺激に応答して誘導される造血特異的な再初期遺伝子であり、ＤＵＢ−１の過剰発現は、Ｓ期の前での細胞周期停止を生じる２７。さらに、本発明者らは、ＤＵＢ−２発現が増殖因子の除去に応答して誘導されるアポトーシスを顕著に阻害できることを最近実証した２８。
本発明者らの最初のデータベース分析は、特にそれらの触媒ドメイン内でマウスＤＵＢに対する広範囲な相同性を示す、多数の高度に類似する配列を同定した。非常に多数の配列が、これらの配列のうち１つの反復（ＲＳ４４７）としての同定とあわせて、高レベル（９５％より高い）の同一性を示すという観察は、これらの配列が、ヒト第４染色体および第８染色体上に存在する反復単位の一部を形成することを示した。このことはまた、これらの配列の多くが非機能的な偽遺伝子を示し得ることを示唆した。したがって、機能的遺伝子を同定するために、本発明者らは、ｍＲＮＡレベルで発現されたこれらの配列をクローニングすることを企図した。多数の異なる転写物がＲＡＪＩ細胞株において、ＩＬ−４刺激に応答して観察され、このことは、複数の機能的遺伝子が存在することを示唆する。しかし、高レベルの類似性が、これらの転写物が機能的に重複するタンパク質をコードすることを示唆しているので、本発明者らは、最も頻繁に観察される転写物ＤＵＢ−３を、すべてのさらなる実験における使用のために選択した。
ＤＵＢ−３と以前に同定されたマウス遺伝子との間の関係は不明である。観察された相同性のレベル、ならびにＩＬ−４に応答したＤＵＢ−３の誘導は、これがＤＵＢファミリーの酵素のメンバーであることを示唆しよう。しかし、ＤＵＢ−１、ＤＵＢ−２およびＤＵＢ−２Ａとは対照的に、主に造血細胞で発現されることが以前に示されており２４、２５、２６、ＤＵＢ−３は、末梢血白血球および脾臓においてほとんど検出できない発現を示した。したがって、ＤＵＢ−３は、ＩＬ−４に応答したその誘導にもかかわらず造血特異的ではないようであり、そして多数の白血病およびリンパ腫細胞株におけるその発現は、高度に調節された様式で白血球においてそれが発現されることを示唆しよう。
ＩＬ−４によるＤＵＢ−３の調節は、そのマウス対応物と同様に、ＤＵＢ−３が免疫機能を調節し得ることを示唆した。ＩＬ−４は、Ｔｈ２の発生および拡大の指向３６、Ｂ細胞の増殖および分化の調節３７、ＩｇＥおよびＩｇＧ４の分泌３８、ならびに肥満細胞の増殖３９を含む、免疫系におけるいくつかの役割を有する。したがって、ＤＵＢ−３の発現は、これらのプロセスのすべてにおいて十分に役割を果たす可能性があると仮説を立てることができよう。ＤＵＢは、免疫系において役割を果たす唯一のＵＢＰではない。ＵＢＰ４３（Ｕｓｐ１８）は、ＩＦＮ（１型）およびリポポリサッカリド（ＬＰＳ）に応答して誘導されることが示されており、ユビキチン様タンパク質ＩＳＧ１５をＩＳＧコンジュゲート化基質から開裂することが示されている４０。ＩＳＧ１５はまた、ＩＦＮおよびＬＰＳに応答して強く誘導され、ＩＳＧ１５およびＵＢＰ４３が、それらがある種の免疫応答を調節するのをおそらく可能にするＪＡＫ−ＳＴＳＴ経路を介したシグナル伝達を一緒になって調節する可能性があると提案されている４１。さらに、脱ユビキチン化酵素ＣＹＬＤは、ＴＮＦＲファミリーメンバーによるＮＦ−κＢ経路の活性化を調節することが、最近実証された４２。ＤＵＢ−３の発現が増殖をブロックし、アポトーシスを誘導するという観察は、ＤＵＢ−３が、マウスＤＵＢと同様に、増殖および生存に影響を与えることができることを示した。ＤＵＢ−３は、増殖の負の調節に関与するタンパク質の分解をブロックするように作用することもまた示唆される。特に、多数の細胞がＧ１を脱することができないことは、ＤＵＢ−３が、Ｇ１Ｓ移行の調節に関与するタンパク質の分解をブロックすることを示唆しよう。多数の研究が、これまでに、ユビキチン−プロテアソーム系を増殖および細胞周期の制御に結びつけている。特に、Ｅ３リガーゼＳＣＦｓｋｐ２は、分解のためにサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２７ｋｉｐ１を標的化し、ｋｓｐ２のレベルが、ｐ２７ｋｉｐ１レベルを低下させてＧ１／Ｓ移行を可能にするために、細胞周期依存的な様式で変動することが示されている。上昇したレベルのｓｋｐ２は、ｓｋｐ２が既知の腫瘍サプレッサーｐ２７Ｋｉｐ１を分解することによって腫瘍増殖を促進すると考えられている腫瘍においてもまた、報告されている４３。また、多数の脱ユビキチン化酵素が、細胞周期の制御に関与した。ＤＵＢ−１発現は、Ｓ期の前での細胞周期のブロックを生じ２７、ヒストンＨ２Ａを脱ユビキチン化する脱ユビキチン化酵素Ｕｂｐ−Ｍの変異形態の発現は、最終的にアポトーシスを導く細胞周期のブロックを生じることが示されている４４。
ユビキチン−プロテアソーム系が、アポトーシスの調節において重要な役割を果たすという証拠がますます増えてもいる。ｐ５３のようなＮＦ−κＢ経路の成分およびＢｃｌ−２ファミリーメンバーのような、アポトーシスに重要な多数の分子が、プロテアソームにより調節されることが示されている３。さらに、アポトーシスのインヒビター（ＩＡＰ）タンパク質のある種のメンバーは、Ｅ３リガーゼ活性を示すことが判明した４５。脱ユビキチン化酵素は、アポトーシスにも関連付けられている。ｐ５３に対して作用するＨＡＵＳＰ（ＵＳＰ７）脱ユビキチン化酵素は、胸腺細胞におけるアポトーシスの開始の際の、カスパーゼ−３依存的なタンパク質分解開裂のために標的化されることが示されている４６。また、ＵＢＰ４１の過剰発現は、アポトーシスを生じることが示されている４７。したがって、ＤＵＢ−３はおそらく、アポトーシス促進性分子の分解をブロックすることによって、アポトーシスを開始する可能性がある。しかし、ＤＵＢ−３発現が、Ｇ１Ｓ移行を防止する可能性があるという観察は、観察されたアポトーシスが、細胞周期の調節解除に応答して誘導されることを示唆しよう。ＤＵＢ−３発現の際に実証された表現型は、本発明者らの他の多くの観察を参照するといくつかの疑問を生じた。ＤＵＢ−３の構成的発現が増殖をブロックするとしても、ＤＵＢ−３の高レベル発現は、迅速に増殖するある範囲の細胞株において観察されている。しかし、血清の非存在下で４時間培養したＲＡＪＩ細胞は、劇的により低いレベルのＤＵＢ−３発現を示し、このことは、ＤＵＢ−３が細胞周期依存的な様式で発現されることを示唆する。このことは、ＤＵＢ−３が、細胞周期の間の短い期間にわたってのみ存在し得、増殖に対するいかなる影響をも打ち消すことを示した。また、ＤＵＢ−３の発現は、ＩＬ−４に応答して誘導された。ＤＵＢ−３とは対照的に、最も特徴付けられたＩＬ−４の機能は、増殖および生存の促進に関連している。しかし、ＤＵＢ−３は、ＩＬ−４に応答して一過的にのみ発現され、再度、増殖に対するいかなる影響をもおそらく打ち消す。また、そのより特徴付けられた機能に加えて、いくつかの報告は、ＩＬ−４処理により、多数の異なる腫瘍細胞株の増殖が低下することを示しており４８、４９、５０、５１、１つの研究において、これは、アポトーシス細胞数の増大の観察とも関連した５１。これにより、ＩＬ−４刺激の際のＤＵＢ−３の発現が、これらの研究において観察された増殖阻害を担い、ＩＬ−４およびしたがってＤＵＢ−３の機能が細胞型特異的である可能性があることを示唆できよう。
結論として、本発明者らは、ＩＬ−４に応答して誘導され、ある範囲の組織および細胞株において発現される、ヒトＤＵＢ脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ−３）を同定した。本発明者らはまた、ＤＵＢ−３の構成的発現が増殖をブロックし、アポトーシスの割合を増大させることを実証した。このことは、そのマウス対応物と同様に、ＤＵＢ−３が、細胞の増殖および生存に影響を与えることによって、免疫応答を調節するように十分機能する可能性があることを示唆する。本発明者らは、ＤＵＢ−３が、Ｒａｓ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路をダウンレギュレートし、ＲＣＥ１がＤＵＢ−３基質であることを見出した。
【０１５２】
文脈が他を要求しない限り、本議論におけるＤＵＢ−３に対する言及は、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１およびＤＵＢ−１２を包含する。
【０１５３】
ＤＵＢ−３で得られた結果は、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１またはＤＵＢ−１２のいずれか１つについて本明細書中で記載された使用を支持する。
【０１５４】
本明細書中で参照されたすべての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された実施形態に対する種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。特定の好ましい実施形態と関連させて本発明を記載してきたが、特許請求された発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解すべきである。実際、当業者に明らかな、本発明を実施する記載された様式の種々の改変を、本発明によってカバーすることを意図する。
【０１５５】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１Ａ】ＤＵＢ脱ユビキチン化酵素のＣｌｕｓｔａｌＸアラインメントを示す図である。このｃｌｕｓｔａｌは、マウス（ＤＵＢ−１、ＤＵＢ−２、ＤＵＢ−２Ａ）メンバーおよびヒト（ＤＵＢ−３）メンバーの両方を含む、ＤＵＢファミリーの脱ユビキチン化酵素の代表的メンバーを示す。ｕｂｐの６つの保存されたドメイン（ＤＨＩ→ＤＨＶＩ）の位置に下線が付され、カルボキシ末端の反復配列の各コピーは点線で下線を付されており、活性部位を構成するシステイン残基、ヒスチジン残基およびアスパラギン酸残基は、星印（＊）により示される。配列アクセッション番号は以下である：ＤＵＢ−１→ＮＭ＿００７８８７；ＤＵＢ−２→ＮＭ＿０１００８９；ＤＵＢ−２Ａ→ＡＦ３９３６３７；ＤＵＢ−３→ｘｘｘｘｘｘｘｘ。
【図１Ｂ】ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１またはＤＵＢ−１２のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ＤＵＢ発現のノザンブロット分析を示す図である。Ａ）Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｂｌｏｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）。２つの転写物が観察され、そのうち１つは約１．６Ｋｂで、心臓、骨格筋、結腸、腎臓および肝臓を含む多数の組織において観察され、２つ目は約１．７Ｋｂで、脳および肝臓において観察された；Ｂ）腫瘍細胞株のノザンブロット。Ｋ６５２以外の試験したすべての細胞株において、１．６Ｋｂの転写物の発現が観察された。発現細胞株は、ある範囲の色々なヒト腫瘍に由来した。
【図３】ＤＵＢ−３が機能的脱ユビキチン化酵素であることを示す図である。ユビキチン−β−ガラクトシダーゼ（Ｕｂ−Ｍｅｔ−β−ｇａｌ）融合タンパク質を発現するベクターならびに以下のプラスミドで同時形質転換した大腸菌から、抽出物を調製した：ｐＧＥＸ−２ＴＫ（ＤＵＢ発現なし）（レーン１）；ｐＧＥＸ−ＤＵＢ−１（レーン２）；ｐＧＥＸ−ＤＵＢ−１（Ｃ６０Ｓ）（レーン３）；ｐＧＥＸ−ＤＵＢ−３（レーン４）；ｐＧＥＸ−ＤＵＢ−３Ｃ８９Ｓ（レーン５）。脱ユビキチン化活性は、Ｕｂ−Ｍｅｔ−β−ｇａｌ融合物の開裂によって、ＤＵＢ−１融合タンパク質およびＤＵＢ−３融合タンパク質の両方について実証された。ＤＵＢ−１Ｃ６０Ｓ（レーン３）およびＤＵＢ−３Ｃ８９Ｓ（レーン５）は、触媒的に不活性である。
【図４】ＤＵＢタンパク質発現の調節を示す図である。Ａ）タンパク質溶解物を、１０７細胞のＫ５６２（慢性骨髄性白血病）およびＲＡＪＩ（バーキットリンパ腫）、ならびに＋／−テトラサイクリンで培養したＤＵＢ３発現Ｂａ／Ｆ３クローン１および２から抽出した。溶解物を、ＤＵＢ−３抗体を用いて免疫沈降およびイムノブロットした；Ｂ）ＲＡＪＩ細胞を無血清培養中で４時間培養し、その後ＩＬ−４（５０Ｕ／ｍｌ）で示された時間にわたって処理し、ＲＴ−ＰＣＲを実施した；Ｂ）タンパク質溶解物を、Ｂと同様に処理した１０７のＲＡＪＩ細胞から抽出し、免疫沈降物をＡと同様に調製して処理した。
【図５】ＤＵＢ−３発現が、増殖を遅延させ、アポトーシスの割合を増大させることを示す図である。Ａ）２×１０５細胞／ｍｌで播種し、＋／−テトラサイクリンで培養したＤＵＢ３発現Ｂａ／Ｆ３細胞を、１２時間間隔で、トリパンブルー排除アッセイによって分析した；Ｂ）ＤＵＢ３発現Ｂａ／Ｆ３細胞を、４８時間の＋／−テトラサイクリン後にヨウ化プロピジウムを使用して染色し、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【図６】ＤＵＢ−３およびＤＵＢ−３Ｃ／Ｓを発現するレトロウイルスベクターによる、Ｂａ／Ｆ３細胞の感染を示す図である。ｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ−ＤＵＢ−３、ｐＭＸ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ−ＤＵＢ−３Ｃ／Ｓまたは空のベクターをトランスフェクトしたＰｌａｔＥ細胞由来の上清を使用して、Ｂａ／Ｆ３細胞を感染させた：Ａ）Ｂａ／Ｆ３細胞を、ＧＦＰの存在についてフローサイトメトリーを使用して４８時間で試験した。パネル１は、細胞ソート後の、感染した細胞集団の割合を示す。パネル２は、ソートの１週間後の、感染した細胞集団の割合を示す；Ｂ）タンパク質溶解物を、前と同様に感染した１０７のＢａ／Ｆ３細胞から抽出し、ＤＵＢ−３抗体を用いて免疫沈降およびイムノブロットした；Ｃ）Ａと同様に感染させてソートした細胞集団を培養し、生存細胞の数を、トリパンブルー排除アッセイを使用して、２４時間毎に判定した。
【図７】ＤＵＢ−３、ＤＵＢ−４、ＤＵＢ−５、ＤＵＢ−６、ＤＵＢ−７、ＤＵＢ−８、ＤＵＢ−９、ＤＵＢ−１０、ＤＵＢ−１１およびＤＵＢ−１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図８】Ｒａｓ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路を介したシグナル伝達をＤＵＢ−３発現がダウンレギュレートすることを示すウェスタンブロットを示す図である。上および中央のパネルは、ＥＲＫおよびＭＥＫのリン酸化が、ＤＵＢ−３を発現する細胞において低下することを示す。下のパネルは、ＤＵＢ−３が発現されるサンプルにおける、Ｒａｓのより遅く移動する形態を示す。
【図９】ＲＣＥ１がＤＵＢ−３の基質であることを示すウェスタンブロットを示す図である。
【図１ａ】
2007514410.tif 000002
【図１ｂ（ｉ）】
2007514410.tif 000003
【図１ｂ（ｉｉ）】
2007514410.tif 000004
【図１ｂ（ｉｉｉ）】
2007514410.tif 000005
【図１ｂ（ｉｖ）】
2007514410.tif 000006
【図１ｂ（ｖ）】
2007514410.tif 000007
【図２】
2007514410.tif 000008
【図３】
2007514410.tif 000009
【図４】
2007514410.tif 000010
【図５】
2007514410.tif 000011
【図６】
2007514410.tif 000012
【図７（ｉ）】
2007514410.tif 000013
【図７（ｉｉ）】
2007514410.tif 000014
【図７（ｉｉｉ）】
2007514410.tif 000015
【図７（ｉｖ）】
2007514410.tif 000016
【図７（ｖ）】
2007514410.tif 000017
【図７（ｖｉ）】
2007514410.tif 000018
【図７（ｖｉｉ）】
2007514410.tif 000019
【図７（ｖｉｉｉ）】
2007514410.tif 000020
【図７（ｉｘ）】
2007514410.tif 000021
【図７（ｘ）】
2007514410.tif 000022
【図８】
2007514410.tif 000023
【図９】
2007514410.tif 000024
【配列表】
2007514410000001.app
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2007514410.tif 000030