(57)【要約】  本発明は、本明細書でアポＡ−１ミラノ変異体と呼ぶ好ましい実施形態であるアポＡ−１変異体の発現をもたらす標的化スプライセオソーム仲介型ＲＮＡトランススプライシングによって、新規の核酸分子を作製するための方法及び組成物を提供する。本発明の組成物は、標的前駆体メッセンジャーＲＮＡ分子（標的プレｍＲＮＡ）と相互作用し、アポＡ−１ミラノ変異体をコードすることができる新規のキメラＲＮＡ分子（キメラＲＮＡ）の生成をもたらすトランススプライシング反応を仲介するように設計した、プレトランススプライシング分子（ＰＴＭ）を含む。この変異体タンパク質の発現は、プラークの蓄積から生じる血管障害、即ち脳卒中及び心臓発作に対する防御をもたらす。特に本発明のＰＴＭは、アポＡ−１標的プレｍＲＮＡと相互作用して、アポＡ−１ミラノ変異体の発現をもたらすように遺伝子工学的手法によって処理したＰＴＭを含む。さらに本発明のＰＴＭは、アポＢ又はアルブミン又は他の特定の標的プレｍＲＮＡと相互作用して、アポＢ／アポＡ−１及び／又はアルブミン／アポＡ−１野生型又はミラノ融合タンパク質の発現をもたらし、それによってアポＢの発現を低下させ、アポＡ−１の機能を同時に生み出すように遺伝子工学的手法によって処理したＰＴＭを含む。
2007518423.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項２】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項３】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項４】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項６】
前記核酸分子が前記５’スプライシング部位の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全配列をさらに含む、請求項１、２又は３に記載の細胞。
【請求項７】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項１、２又は３に記載の細胞。
【請求項８】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項１、２又は３に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項１、２又は３に記載の細胞。
【請求項１０】
前記標的プレｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項１、２又は３に記載の細胞。
【請求項１１】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１、２又は３に記載の細胞。
【請求項１２】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１、２又は３に記載の細胞。
【請求項１３】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１４】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１５】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１６】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１７】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１８】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３、１４又は１５に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項１３、１４又は１５に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項１３、１４又は１５に記載の細胞。
【請求項２１】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項１３、１４又は１５に記載の細胞。
【請求項２２】
前記標的プレｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項１３、１４又は１５に記載の細胞。
【請求項２３】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１３、１４又は１５に記載の細胞。
【請求項２４】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、核酸分子の一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて細胞中でキメラＲＮＡを形成する条件下において、細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡと核のスプライシング要素によって認識される核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２５】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、核酸分子の一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて細胞中でキメラＲＮＡを形成する条件下において、細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡと核のスプライシング要素によって認識される核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項２６】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡと核のスプライシング要素によって認識される核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される方法。
【請求項２７】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項２４、２５又は２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項２４、２５又は２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項２４、２５又は２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項２４、２５又は２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的プレｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項２４、２５又は２６に記載の方法。
【請求項３４】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項２４、２５又は２６に記載の方法。
【請求項３５】
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される核酸分子。
【請求項３６】
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される核酸分子。
【請求項３７】
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される核酸分子。
【請求項３８】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項３９】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項４０】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３５、３６又は３７に記載の核酸分子。
【請求項４１】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項３５、３６又は３７に記載の核酸分子。
【請求項４２】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項３５、３６又は３７に記載の核酸分子。
【請求項４３】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項３５、３６又は３７に記載の核酸分子。
【請求項４４】
前記標的プレｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項３５、３６又は３７に記載の核酸分子。
【請求項４５】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項３５、３６又は３７に記載の核酸分子。
【請求項４６】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識されるベクター。
【請求項４７】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識されるベクター。
【請求項４８】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるプレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１ミラノ変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識されるベクター。
【請求項４９】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項４６に記載のベクター。
【請求項５０】
前記核酸分子がピリミジン部位をさらに含む、請求項４６に記載のベクター。
【請求項５１】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５２】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５３】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５４】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５５】
前記標的プレｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５６】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５７】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５８】
前記核酸分子の発現が肝細胞特異的プロモーターによって制御される、請求項４６、４７又は４８に記載のベクター。
【請求項５９】
被験体中でアポＡ−１変異体を発現させるための方法であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、及び
ｂ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記被験体に投与することを含み、前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される方法。
【請求項６０】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記標的プレｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞。
【請求項６６】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６７】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６８】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６９】
前記標的ｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項６５に記載の細胞。
【請求項７０】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項６５に記載の細胞。
【請求項７１】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現する細胞。
【請求項７２】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項７１に記載の細胞。
【請求項７３】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項７１に記載の細胞。
【請求項７４】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項７１に記載の細胞。
【請求項７５】
前記標的ｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項７１に記載の細胞。
【請求項７６】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項７１に記載の細胞。
【請求項７７】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、核酸分子の一部分が標的ｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて細胞中でキメラＲＮＡを形成する条件下において、細胞内で発現される標的ｍＲＮＡと核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項７８】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
前記標的ｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項８４】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８５】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８６】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８７】
前記標的ｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８８】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項８３に記載の核酸分子。
【請求項８９】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現するベクター。
【請求項９０】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９１】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９２】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９３】
前記標的ｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９４】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９５】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９６】
前記核酸分子の発現が肝細胞特異的プロモーターによって制御される、請求項８９に記載のベクター。
【請求項９７】
被験体中でアポＡ−１変異体を発現させるための方法であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現される標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、アポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項９８】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＡ−１標的である、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記細胞内で発現される標的ｍＲＮＡがヒトアポＢ標的である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡがヒトアルブミン標的である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記標的ｍＲＮＡが肝細胞内で発現される、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１０４】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１０５】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１０６】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項１０３に記載の細胞。
【請求項１０７】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項１０３に記載の細胞。
【請求項１０８】
前記核酸分子が前記５’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全配列をさらに含む、請求項１０３、１０４又は１０５に記載の細胞。
【請求項１０９】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１０３、１０４又は１０５に記載の細胞。
【請求項１１０】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１０３、１０４又は１０５に記載の細胞。
【請求項１１１】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１１２】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１１３】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される細胞。
【請求項１１４】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項１１１に記載の細胞。
【請求項１１５】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項１１１に記載の細胞。
【請求項１１６】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１１、１１２又は１１３に記載の細胞。
【請求項１１７】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１１１、１１２又は１１３に記載の細胞。
【請求項１１８】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、核酸分子の一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて細胞中でキメラＲＮＡを形成する条件下において、細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡと核のスプライシング要素によって認識される核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項１１９】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、核酸分子の一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて細胞中でキメラＲＮＡを形成する条件下において、細胞内で発現される標的プレｍＲＮＡと核のスプライシング要素によって認識される核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項１２０】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡと核のスプライシング要素によって認識される核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される方法。
【請求項１２１】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２２】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１１８、１１９又は１２０に記載の方法。
【請求項１２４】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１１８、１１９又は１２０に記載の方法。
【請求項１２５】
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される核酸分子。
【請求項１２６】
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される核酸分子。
【請求項１２７】
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される核酸分子。
【請求項１２８】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項１２５に記載の核酸分子。
【請求項１２９】
前記３’スプライシング領域がピリミジン部位をさらに含む、請求項１２５に記載の核酸分子。
【請求項１３０】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１２５、１２６又は１２７に記載の核酸分子。
【請求項１３１】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１２５、１２６又は１２７に記載の核酸分子。
【請求項１３２】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）分岐点及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識されるベクター。
【請求項１３３】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）３’スプライシング受容体部位、
ｃ）標的結合ドメインから３’スプライシング領域を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識されるベクター。
【請求項１３４】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミンプレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）５’スプライシング部位、
ｃ）標的結合ドメインから５’スプライシング部位を隔てるスペーサー領域、及び
ｄ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現し、
前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識されるベクター。
【請求項１３５】
前記核酸分子が５’ドナー部位をさらに含む、請求項１３２に記載のベクター。
【請求項１３６】
前記核酸分子がピリミジン部位をさらに含む、請求項１３２に記載のベクター。
【請求項１３７】
前記核酸分子が前記３’スプライシング領域の片側又は両側と結合する１つ又は複数の相補配列を含む安全ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３２、１３３、又は１３４に記載のベクター。
【請求項１３８】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１３２、１３３、又は１３４に記載のベクター。
【請求項１３９】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１３２、１３３、又は１３４に記載のベクター。
【請求項１４０】
前記核酸分子の発現が肝細胞特異的プロモーターによって制御される、請求項１３２、１３３、又は１３４に記載のベクター。
【請求項１４１】
被験体中でアポＡ−１変異体を発現させるための方法であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的プレｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、及び
ｂ）標的プレｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記被験体に投与することを含み、前記核酸分子が細胞内の核のスプライシング要素によって認識される方法。
【請求項１４２】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
核酸分子を含む細胞であって、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞。
【請求項１４４】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１４３に記載の細胞。
【請求項１４５】
組換えベクターを含む細胞であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ベクターが発現する細胞。
【請求項１４６】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１４５に記載の細胞。
【請求項１４７】
細胞中でキメラＲＮＡ分子を生成する方法であって、核酸分子の一部分が標的ｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて細胞中でキメラＲＮＡを形成する条件下において、細胞内で発現される標的ｍＲＮＡと核酸分子を接触させることを含み、前記核酸分子が
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む方法。
【請求項１４８】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１５０】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１４９に記載の核酸分子。
【請求項１５１】
真核生物の発現ベクターであって、前記ベクターが
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を発現するベクター。
【請求項１５２】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１５１に記載のベクター。
【請求項１５３】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１５１に記載のベクター。
【請求項１５４】
前記核酸分子の発現が肝細胞特異的プロモーターによって制御される、請求項１５１に記載のベクター。
【請求項１５５】
被験体中でアポＡ−１野生型又は変異体を発現させるための方法であって、
ａ）核酸分子と細胞内で発現されるアルブミン標的ｍＲＮＡの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、
ｂ）リボザイム活性を有する配列、及び
ｃ）標的ｍＲＮＡにトランススプライシングされたヌクレオチド配列であって、野生型アポＡ−１又はアポＡ−１変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項１５６】
前記アポＡ−１変異体がアポＡ−１ミラノである、請求項１５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その開示の全容が参照として本明細書に組み込まれる、２００４年１月２３日に出願された米国仮出願第６０／５３８，７９６号、及び２００４年６月３０日に出願された第６０／５８４，２８０号の優先権を主張するものである。
【０００２】
１．イントロダクション
本発明は、野生型アポＡ−１又は変異体、例えばアポＡ−１ミラノ変異体などの発現をもたらす標的化スプライセオソーム仲介型ＲＮＡトランススプライシングによって、新規の核酸分子を作製するための方法及び組成物を提供する。本発明の組成物は、標的前駆体メッセンジャーＲＮＡ分子（標的プレｍＲＮＡ）と相互作用し、野生型アポＡ−１又は、ミラノ変異体などの変異体をコードすることができる新規のキメラＲＮＡ分子（キメラＲＮＡ）の生成をもたらすトランススプライシング反応を仲介するように設計した、プレトランススプライシング分子（ＰＴＭ）を含む。このタンパク質の発現は、プラークの蓄積から生じる心臓血管障害、即ち脳卒中及び心臓発作に対する防御をもたらす。
【０００３】
特に本発明のＰＴＭは、アポＡ−１標的プレｍＲＮＡと相互作用して、アポＡ−１ミラノ変異体の発現をもたらすように遺伝子工学的手法によって処理したＰＴＭを含む。さらに本発明のＰＴＭは、アポＢ標的プレｍＲＮＡ及び／又は任意の他の選択した標的プレｍＲＮＡと相互作用して、アポＢ／アポＡ−１ミラノ融合タンパク質の発現をもたらし、それによってアポＢの発現を低下させ、アポＡ−１ミラノの機能を生み出すように遺伝子工学的手法によって処理したＰＴＭを含む。さらに本発明は、アポＡ−１ミラノキメラｍＲＮＡ及びタンパク質を作製するための、トランススプライシングリボザイムなどの他の方法の使用を含む。本発明の組成物は、本発明のＰＴＭを発現することができる組換えベクター系、及び前記ＰＴＭを発現する細胞をさらに含む。
【０００４】
本発明の方法は、ＰＴＭの一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされてｍＲＮＡ分子を形成し、（ｉ）アポＡ−１の発現とアポＡ−１ミラノ変異体の発現が置き換わっている、及び／又は（ｉｉ）アポＢの発現とアポＢ／アポＡ−１ミラノ融合タンパク質の発現が置き換わっており、アポＢの発現のレベルが同時に低下する条件下において、本発明のＰＴＭとアポＡ−１標的プレｍＲＮＡ、及び／又はアポＢ標的プレｍＲＮＡを接触させることを含む。本発明の方法は、ＰＴＭの一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされてｍＲＮＡ分子を形成し、十分に発現されるタンパク質の発現と野生型アポＡ−１又はミラノ変異体の発現が置き換わっている条件下において、十分に発現され有効に分泌される肝臓タンパク質をコードする他の標的プレｍＲＮＡと本発明のＰＴＭを接触させることも含む。本発明の組成物は、他のコレステロールを低下させる物質又は脂質制御物質と組合せて投与することができる。本発明の方法及び組成物を使用して、心臓血管疾患と通常関係がある血管のプラーク蓄積のレベルを抑制又は低下させることができる。
【０００５】
アルブミン遺伝子は肝臓中で十分に発現され、したがって標的用の多量の標的プレｍＲＮＡを与える。本発明のＰＴＭは、アルブミン標的プレｍＲＮＡと相互作用して野生型アポＡ−１、又はミラノ変異体などのアポＡ−１変異体の発現をもたらすように、遺伝子工学的手法によって処理したＰＴＭを含む。本発明の方法は、ＰＴＭの一部分がアルブミン標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされてキメラｍＲＮＡ分子を形成し、アルブミンの発現と野生型アポＡ−１、又はアポＡ−１ミラノ変異体などのアポＡ−１変異体の発現が置き換わっている条件下において、このようなＰＴＭとアルブミン標的プレｍＲＮＡを接触させることを含む。
【背景技術】
【０００６】
２．発明の背景
２．１．ＲＮＡスプライシング
染色体中のＤＮＡ配列は、コード領域（エクソン）を含み、介在非コード領域（イントロン）も通常含むプレｍＲＮＡに転写される。シススプライシングと呼ばれる正確なプロセスにおいて、イントロンはプレｍＲＮＡから除去される（Ｃｈｏｗら、１９７７、Ｃｅｌｌ  １２：１〜８；及びＢｅｒｇｅｔ，Ｓ．Ｍ．ら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：３１７１〜３１７５）。スプライシングは、いくつかの核内低分子リボ核タンパク質粒子（ｓｎＲＮＰ）と、凝集してスプライセオソームとして知られる酵素複合体を形成する多くのタンパク質因子との共同相互作用として起こる（Ｍｏｏｒｅら、１９９３、ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ中、Ｒ．Ｆ．Ｇｅｓｔｌａｎｄ及びＪ．Ｆ．Ａｔｋｉｎｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）；Ｋｒａｍｅｒ、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５：３６７〜４０４；Ｓｔａｌｅｙ及びＧｕｔｈｒｉｅ、１９９８、Ｃｅｌｌ  ９２：３１５〜３２６）。
【０００７】
大抵の場合、スプライシング反応は同じプレｍＲＮＡ分子内で起こり、これはシススプライシングと呼ばれる。独立に転写される２つのプレｍＲＮＡ間のスプライシングは、トランススプライシングと呼ばれる。トランススプライシングは、トリパノソーム（Ｓｕｔｔｏｎ  ＆  Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ、１９８６、Ｃｅｌｌ４７：５２７；Ｍｕｒｐｈｙら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４７：５１７）において最初に、後に線虫（Ｋｒａｕｓｅ  ＆  Ｈｉｒｓｈ、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４９：７５３）；扁形動物（Ｒａｊｋｏｖｉｃら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：８８７９；Ｄａｖｉｓら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１８１３）及び植物ミトコンドリア（Ｍａｌｅｋら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５５３）において発見された。寄生虫Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉでは、全ｍＲＮＡがトランススプライシングによってその５’末端にスプライスリーダー（ＳＬ）ＲＮＡを得る。５’リーダー配列も、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓではいくつかの遺伝子にトランススプライシングされる。この機構は、１つの共通な配列を多くの異なる転写産物に加えるのに適している。
【０００８】
従来のシススプライシングの機構とほぼ同一である、スプライスリーダーのトランススプライシングの機構は、２つのリン酸基転移反応を介して進行する。最初の反応は２’−５’ホスホジエステル結合の形成を引き起こし、シススプライシングにおける投げ縄型中間体と等しい「Ｙ」形状の分岐型中間体を生成する。第２の反応、エクソン連結は、通常のシススプライシングと同様に進行する。さらに、３’スプライシング部位の配列及びトランススプライシング反応を触媒するいくつかのｓｎＲＮＰは、シススプライシングに関与するそれらの相当物と非常に似ている。
【０００９】
トランススプライシングは、１つのプレｍＲＮＡのイントロンが別のプレｍＲＮＡのイントロンと相互作用し、通常の２つのプレｍＲＮＡ間のスプライシング部位の組換えを増大させる別のプロセスを指す。この型のトランススプライシングが、ヒト免疫グロブリン可変領域配列をコードする転写産物がトランスジェニックマウスの内因性定常領域と連結する原因であると仮定された（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８０２０）。さらに、ｃ−ｍｙｂのプレｍＲＮＡのトランススプライシングは実証されてきており（Ｖｅｌｌａｒｄ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２  ８９：２５１１〜２５１５）、互いにトランススプライシングされたクローン化ＳＶ４０由来のＲＮＡ転写産物は、培養細胞及び核抽出物中で検出された（Ｅｕｌら、１９９５、ＥＭＢＯ．Ｊ．１４：３２２６）。しかし、哺乳動物のプレｍＲＮＡの自然に起こるトランススプライシングは、珍しい事象であると考えられる（Ｆｌｏｕｒｉｏｔ  Ｇ．ら、２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ：Ｆｉｎｔａ，Ｃ．ら、２００２  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７７：５８８２〜５８９０）。
【００１０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランススプライシングをモデル系として使用して、いくつかの群によるスプライシングの機構が調査されている（Ｋｏｎａｒｓｋａ  ＆  Ｓｈａｒｐ、１９８５、Ｃｅｌｌ  ４６：１６５〜１７１  Ｓｏｌｎｉｃｋ、１９８５、Ｃｅｌｌ  ４２：１５７；Ｃｈｉａｒａ  ＆  Ｒｅｅｄ、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：５１０；Ｐａｓｍａｎ及びＧａｒｃｉａ−Ｂｌａｎｃｏ、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１６３８）。妥当に有効なトランススプライシング（シススプライシングされる類似体の３０％）が、互いに塩基対形成することができるＲＮＡ間で得られ、塩基対形成によって繋がれていないＲＮＡのスプライシングは１／１０にさらに低下した。基質間の明らかなＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を必要としない他のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランススプライシング反応は、Ｃｈｉａｒａ  ＆  Ｒｅｅｄ（１９９５、Ｎａｔｕｒｅ  ３７５：５１０）、Ｂｒｕｚｉｋ  Ｊ．Ｐ．＆  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９９２、Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：６９２）及びＢｒｕｚｉｋ  Ｊ．Ｐ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、（１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７０５６〜７０５９）によって観察された。これらの反応は比較的低い頻度で起こり、下流５’スプライシング部位又はエクソンスプライシングエンハンサーなどの特殊要素を必要とする。
【００１１】
多数のタンパク質がｍＲＮＡ前駆体に結合し、次いでこれが作用してＲＮＡを正確に切断し連結するスプライシング機構以外に、第３の機構は、イントロン自体により、即ち触媒ＲＮＡ分子又はリボザイムと呼ばれるものによりＲＮＡが切断及び連結するものである。別個の「ハイブリダイゼーション」領域をリボザイムに工学処理することにより、リボザイムの切断活性は、特定のＲＮＡに向けられている。標的ＲＮＡとのハイブリダイゼーションによって、リボザイムの触媒領域が標的を切断する。このようなリボザイム活性は、外来性の異常なＲＮＡの生成によって特徴付けられるヒト疾患を治療するなど、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的ＲＮＡを不活性化又は切断するのに有用であるはずであると示唆されている。このような場合、標的ＲＮＡとハイブリッド形成するように、小さなＲＮＡ分子を設計し、標的ＲＮＡと結合させることにより、それが標的ＲＮＡの翻訳を妨げ、或いはヌクレアーゼの活性化によるＲＮＡの破壊を引き起こす。特定のＲＮＡを標的とし破壊するための他の機構として、アンチセンスＲＮＡの使用も提案されている。
【００１２】
テトラヒメナのグループＩリボザイムを使用することによって、大腸菌（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  Ｂ．Ａ．及びＣｅｃｈ．Ｔ．Ｒ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：６１９〜６２２）、マウス繊維芽細胞（Ｊｏｎｅｓ，Ｊ．Ｔ．ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：６４３〜６４８）、ヒト繊維芽細胞（Ｐｈｙｌａｃｔｏｎ，Ｌ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：３７８〜３８１）、及びヒト赤血球前駆体（Ｌａｎら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１５９３〜１５９６）において標的化トランススプライシングが実証された。ＲＮＡを改変するための臨床上関連がある技術の総説に関しては、Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＧｉｌｂｏａ、２００２  Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：２５２〜８を参照のこと。本発明は、標的ｍＲＮＡのコード配列を再編成又は改変するための、本来の哺乳動物のスプライシング機構、即ちスプライセオソームによって仲介される標的化トランススプライシングの使用に関する。
【００１３】
米国特許第６，０８３，７０２号、第６，０１３，４８７号及び第６，２８０，９７８号は、標的ｍＲＮＡ前駆体を接触させて新規のキメラｍＲＮＡを作製することによって、トランススプライシング反応を仲介するためのＰＴＭの使用を記載している。
【００１４】
２．２．心臓血管疾患
心臓血管疾患（ＣＶＤ）は西洋社会における最も一般的な死因であり、その有病率は世界中で増大している。リスクの最も強力な予測変数の１つは、アテローム性動脈硬化症及び冠状動脈疾患の進行と反比例の関係を示す（Ｓｉｒｔｏｒｉ  ＣＲら、１９９９、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １４２：２９〜４０；Ｇｅｎｅｓｔ  Ｊ  ２００３、Ｊ．Ｉｎｈｅｒｉｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓ．２６：２６７〜２８７）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）又はＨＤＬの主要なタンパク質成分であるアポリポタンパク質Ａ１（アポＡ−１）の血漿中濃度である。アポＡ−１はＨＤＬの主要なアポリポタンパク質であり、１．０〜１．５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する比較的豊富な血漿タンパク質である。アポＡ−１は、排出用に肝臓に移動させるための末梢細胞及び組織からの過剰なコレステロールの流出、即ちコレステロール逆転送（ＲＣＴ）と呼ばれるプロセスを促進する上である重要な役割を果たす。多数のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ試験で、アテローム性動脈硬化症のプラーク進行に対するアポＡ−１及びＨＤＬの防御効果が実証されている（Ｒｕｂｉｎ  ＥＭら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１、３５３：２６５〜７；Ｐｌｕｍｐ  ＡＳら、１９９４  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６０７〜１１；Ｐａｓｚｔｙ  Ｃら、１９９４  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９４：８９９〜９０３；Ｄｕｖｅｒｇｅｒ  Ｎら、１９９６、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４：７１３〜７）。
【００１５】
アポＡ−１ミラノは、野生型アポＡ−１のいくつかの天然に存在する変異体の１つである。アポＡ−１ミラノは、１９８０年にあるイタリアの家族において初めて同定された（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  Ｇら、１９８０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６６：８９２〜９００；Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ  ＫＨら、１９８０  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．６６：９０１〜９０７）。今日まで４０例の保因者が同定されており、すべてが異型である。これらの保因者は、血漿中ＨＤＬ−コレステロールレベルが低く、トリグリセリドが適度に高レベルであり、即ちそれは冠状動脈疾患に関する高リスク予測変数と通常関係がある状態である。血漿中ＨＤＬ−コレステロールレベル及びアポＡ−１濃度の激しい低下にもかかわらず、罹患した保因者は冠状動脈疾患を発症しない。実際、精製された組換えアポＡ−１ミラノを注入するか、又はウサギ及びアポＥ欠損マウス中でアポＡ−１ミラノを発現させると、プラーク形成及びアテローム性動脈硬化症に対する防御が示される（Ａｍｅｌｉ  Ｓら、１９９４、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９０：１９３５〜４１；Ｓｏｍａ  ＭＲら、１９９５  Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７６：４０５〜１１；Ｓｈａｈ  ＰＫら、１９９８、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：７８０〜５；Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ  Ｇら、１９９９、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９：１２５７〜１２６２；Ｃｈｉｅｓａ  Ｇら、２００２、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．９０：９７４〜８０；Ｃｈｉｅｓａ  Ｇ及びＳｉｒｔｏｒｉ  Ｃ、２００３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｄｏｌ．１４：１５９〜１６３）。しかし、臨床試験の結果は、より適度なレベルの低下を示している。プラーク減少の程度は、投与するタンパク質の限られた数の用量及び量、及び／又は循環中のその時間（薬物動態学）と関連がある可能性がある。
【００１６】
血漿中のアポ−１は２４３アミノ酸の単一のポリペプチド鎖であり、その主な配列は知られている（Ｂｒｅｗｅｒら、１９７８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．８０：６２３〜６３０）。アポＡ−１は、細胞中で２６７アミノ酸の前駆体として合成される。このプレプロアポリポタンパク質Ａ−１は、１８アミノ酸のＮ末端切断によって最初に細胞内で処理されてプロアポリポタンパク質Ａ−１が生成し、次いで特異的プロテアーゼの活性によって血漿又はリンパ液中で６アミノ酸がさらに切断されて、成熟アポリポタンパク質Ａ−１が生成する。アポＡ−１分子の主な構造要件は、両親媒性のらせん状立体配座で存在すると推定される、１１又は２２アミノ酸の反復単位の存在であると考えられる（Ｓｅｇｒｅｓｔら、１９７４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ３８：２４７〜２５３）。この構造は、アポＡ−１の主な生物活性、即ち脂質の結合、及びレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化を可能にする。
【００１７】
ヒトアポリポタンパク質Ａ１ミラノ（アポＡ−１ミラノ）は、アポＡ−１の天然の変異体である（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒら、１９８０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ６６：９０１〜９０７）。アポＡ−１ミラノ中では、アミノ酸アルギニン１７３がアミノ酸システイン１７３によって置換されている。アポＡ−１ミラノはポリペプチド鎖当たりに１個のシステイン残基を含むので、それは単量体、ホモ二量体、又はヘテロ二量体の形で存在する可能性がある。これらの形は化学的に交換可能であり、用語アポＡ−１ミラノは本文脈では、これらの形を区別しない。ＤＮＡレベルではこの変異体は、アミノ酸位置１７３においてアルギニンの代わりにシステインの翻訳を可能にする、遺伝子配列中でのＣからＴへの置換、即ちコドンＣＧＣからＴＧＣへの変化によって生じる。しかし、アポＡ−１ミラノ被験体はＨＤＬ−コレステロールレベルが顕著に低下するが、動脈疾患の明らかな高いリスクがないことによって特徴付けられる点で、アポＡ−１のこの変異体は、最も興味深い変異体の１つである（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９８０、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ６６：８９２〜９００）。
【００１８】
アポＡ−１の他の有用な変異体は、アルギニン１５１がシステインで置換されているパリ変異体である。
【００１９】
実験動物及び初期のヒト臨床試験（Ｎａｎｊｅｅら、１９９９、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１９：９７９〜９８９及びＥｒｉｋｓｓｏｎら、１９９９、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：５９４〜５９８）において、アポＡ−１のみ（Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９９５、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．１５：１８８２〜１８８８）又はＨＤＬ（Ｂａｄｉｍｏｎら、１９８９、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．６０：４５５〜４６１及びＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１２３４〜１２４１、１９９０）を全身注入することによって相当な生化学的変化が生じ、アテローム性動脈硬化症の病変の程度及び重症度も低下することが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
ヒト遺伝子療法は、アポＡ−１ミラノなどの遺伝子の長期の連続的な発現をもたらすことによって、プラークの減少を達成するための優れた手法を与えることができる。アポＡ−１全ｃＤＮＡを加える従来の遺伝子療法手法の場合、このｃＤＮＡの制御不能な発現が毒性をもたらす恐れがある。スプライセオソーム仲介型ＲＮＡトランススプライシングを使用して野生型アポＡ−１、又はアルブミンをミラノ又は他の有用なアポＡ−１変異体に転換することによって、これらの問題を克服することができると思われる。
【００２１】
同様に、スプライセオソーム仲介型ＲＮＡトランススプライシングを使用して、低密度リポタンパク質の主要成分であるアポＢの発現を同時に低下させ、ＨＤＬを生成し、即ちアポＡ−１野生型又はミラノ変異体を発現させ、或いはアルブミンなどの他の発現されたタンパク質を転換してアポＡ−１−ミラノの機能を生み出すことができる。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
３．発明の概要
本発明は、スプライセオソーム仲介型の標的化ＲＮＡトランススプライシング、リボザイム仲介型トランススプライシング、又はｍＲＮＡを転換する他の手段によって、新規の核酸分子を作製するための組成物及び方法に関する。本発明の組成物は、本来の標的プレｍＲＮＡ分子（本明細書では以後「プレｍＲＮＡ」と呼ぶ）と相互作用し、新規のキメラＲＮＡ分子（本明細書では以後「キメラＲＮＡ」と呼ぶ）の生成をもたらすスプライセオソームによるトランススプライシング反応を仲介するように設計された、プレトランススプライシング分子（本明細書では以後「ＰＴＭ」と呼ぶ）を含む。本発明の方法は、ＰＴＭの一部分が本来のプレｍＲＮＡにトランススプライシングされて新規のキメラＲＮＡを形成する条件下において、本発明のＰＴＭと本来の標的プレｍＲＮＡを接触させることを含む。トランススプライシング反応から生じる新規のキメラＲＮＡが、健康的利点を与えるタンパク質をコードすることができるように、本発明のＰＴＭを遺伝子工学的手法によって処理する。一般には標的プレｍＲＮＡを選択する、何故なら、標的プレｍＲＮＡは特定の細胞型中で発現され、選択した細胞型に対する新規のキメラＲＮＡの発現を標的化するための手段をもたらすからである。例えばＰＴＭは、アポＡ−１及び／又はアルブミンプレｍＲＮＡなどの、肝臓中で発現されるプレｍＲＮＡを標的化することができる。
【００２３】
特に本発明の組成物は、アポＡ−１標的プレｍＲＮＡ分子（本明細書では以後「アポＡ−１プレｍＲＮＡ」と呼ぶ）と相互作用し、新規のキメラＲＮＡ分子（本明細書では以後「キメラＲＮＡ」と呼ぶ）の生成をもたらすスプライセオソームによるトランススプライシング反応を仲介するように設計された、プレトランススプライシング分子（本明細書では以後「ＰＴＭ」と呼ぶ）を含む。
【００２４】
本発明の組成物は、アルブミン標的プレｍＲＮＡ分子（本明細書では以後「アルブミンプレｍＲＮＡ」と呼ぶ）と相互作用し、新規のキメラＲＮＡ分子の生成をもたらすスプライセオソームによるトランススプライシング反応を仲介するように設計されたＰＴＭをさらに含む。
【００２５】
本発明の組成物は、アポＢ標的プレｍＲＮＡ分子（本明細書では以後「アポＢプレｍＲＮＡ」と呼ぶ）と相互作用し、新規のキメラＲＮＡ分子の生成をもたらすスプライセオソームによるトランススプライシング反応を仲介するように設計されたＰＴＭをさらに含む。
【００２６】
本発明の組成物は、アポＡ−１標的プレｍＲＮＡ分子、アルブミン標的プレｍＲＮＡ、又はアポＢ標的プレｍＲＮＡ、又は他のプレｍＲＮＡ標的と相互作用し、新規のキメラＲＮＡ分子の生成をもたらすスプライセオソームによるトランススプライシング反応を仲介するように設計されたＰＴＭを含む。このようなＰＴＭは、アテローム性動脈硬化症に対して防御するのに有用な、アポＡ−１又はミラノを含めた他のアポＡ−１変異体を生成するように設計される。
【００２７】
ＰＴＭの一般的設計、構築及び遺伝子工学処理、並びに細胞内のトランススプライシング反応を首尾良く仲介するそれらの能力の証明は、その開示の全容が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０８３，７０２号、第６，０１３，４８７号及び第６，２８０，９７８号、並びに米国特許第０９／７５６，０９５号、第０９／７５６，０９６号、第０９／７５６，０９７号及び第０９／９４１，４９２号中に詳細に記載されている。
【００２８】
トランススプライシングするリボザイムの一般的設計、構築及び遺伝子工学処理、並びに細胞内のトランススプライシング反応を首尾良く仲介するそれらの能力の証明は、その開示の全容が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第５，６６７，９６９号、第５，８５４，０３８号及び第５，８６９，２５４号、並びに米国特許第２００３００３６５１７号中に詳細に記載されている。
【００２９】
本発明の方法は、ＰＴＭの一部分が標的プレｍＲＮＡにスプライシングされて新規のキメラＲＮＡを形成する条件下において、本発明のＰＴＭとアポＡ−１標的プレｍＲＮＡ、アルブミン標的プレｍＲＮＡ、又はアポＢ標的プレｍＲＮＡ、又は他の発現されるプレｍＲＮＡ標的を接触させることを含む。本発明の方法は、ＰＴＭが細胞によって取り込まれＰＴＭの一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて、アポＡ−１ミラノ又は他の変異体の発現をもたらす新規のキメラＲＮＡ分子を形成する条件下において、本発明のＰＴＭとアポＡ−１標的プレｍＲＮＡ、又はアポＢ標的プレｍＲＮＡ、又はアルブミンプレｍＲＮＡなど他の発現されるプレｍＲＮＡ標的を発現する細胞を接触させることを含む。或いは例えば、アルブミン又はアポＢプレｍＲＮＡを標的化すると、この新規のキメラＲＮＡは野生型アポＡ−１タンパク質をコードすることができる。
【００３０】
或いは、本発明のＰＴＭをコードする核酸分子を標的細胞に送達して、次にその核酸分子を発現させて、トランススプライシング反応を仲介することができるＰＴＭを形成することができる。トランススプライシング反応から生じる新規のキメラＲＮＡが、血管疾患の予防又は治療において有用である可能性があるプラークの蓄積を低下させることが示されてきている、アポＡ−１ミラノ変異体タンパク質をコードすることができるように、本発明のＰＴＭを遺伝子工学的手法によって処理する。或いはキメラｍＲＮＡは、野生型アポＡ−１タンパク質をコードすることができる。したがって本発明の方法及び組成物は、心臓発作及び脳卒中と関係がある危険因子であるプラークの蓄積から生じる血管障害を、予防及び治療するための遺伝子療法において使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
５．発明の詳細な説明
本発明は、プレトランススプライシング分子（ＰＴＭ）を含む新規の組成物、及び新規の核酸分子を作製するためのこのような分子の使用に関する。本発明のＰＴＭは、（ｉ）アポＡ−１又はアポＢ標的プレｍＲＮＡ、又はアルブミンプレｍＲＮＡなど他の発現されるプレｍＲＮＡ標的と特異的に結合するように設計された１つ又は複数の標的結合ドメイン、（ｉｉ）分岐点、ピリミジン部位及び３’スプライシング受容体部位及び／又は５’スプライシングドナー部位を含む３’スプライシング領域、及び（ｉｉｉ）野生型アポＡ−１又はアポＡ−１ミラノ変異体をコードするヌクレオチド配列などの他のヌクレオチド配列を含む。本発明のＰＴＭは、標的結合ドメインからＲＮＡスプライシング部位を隔てる１つ又は複数のスペーサー領域をさらに含むことができる。
【００３２】
本発明の方法は、ＰＴＭの一部分が標的プレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングされて、アポＡ−１ミラノ変異体、野生型アポＡ−１、又はアポＢ／アポＡ−１ミラノ融合タンパク質、又はアポＡ−１の他の変異体をコードする他の融合タンパク質の発現をもたらす新規のキメラＲＮＡを形成する条件下において、本発明のＰＴＭとアポＡ−１標的プレｍＲＮＡ、又はアポＢ標的プレｍＲＮＡ、又はアルブミン標的プレｍＲＮＡなど他の発現されるプレｍＲＮＡ標的を接触させることを含む。
【００３３】
５．１．プレトランススプライシング分子の構造
本発明は、標的化トランススプライシングによって新規のキメラ核酸分子を作製する際に使用するための組成物を提供する。本発明のＰＴＭは、（ｉ）ＰＴＭとアポＡ−１又はアポＢプレｍＲＮＡ又は他の発現されるプレｍＲＮＡ標的、例えばアルブミンプレｍＲＮＡなどの結合を標的とする１つ又は複数の標的結合ドメイン、（ｉｉ）分岐点、ピリミジン部位及び３’スプライシング受容体部位を含む３’スプライシング領域、及び／又は５’スプライシングドナー部位、並びに（ｉｉｉ）アポＡ−１ミラノ、アポＡ−１又は野生型アポＡ−１の他の変異体に関するコード配列を含む。本発明のＰＴＭは、少なくとも１つの以下の特徴：（ａ）標的イントロンの３’又は５’スプライシングシグナルと非常に近いイントロン配列を標的化する結合ドメイン、（ｂ）ミニイントロン、（ｃ）シス作用要素と同様のＩＳＡＲ（イントロンスプライシング活性化因子及び抑制因子）、及び／又は（ｄ）リボザイム配列も含むことができる。本発明のＰＴＭは、標的結合ドメインからＲＮＡスプライシング部位を隔てるための１つ又は複数のスペーサー領域をさらに含むことができる。
【００３４】
このようなＰＴＭの一般的設計、構築及び遺伝子工学処理、並びに細胞内の首尾良いトランススプライシング反応を仲介するそれらの能力の証明は、その開示の全容が参照として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０８３，７０２号、第６，０１３，４８７号及び第６，２８０，９７８号、並びに米国特許第０９／９４１，４９２号、第０９／７５６，０９５号、第０９／７５６，０９６号及び第０９／７５６，０９７号中に詳細に記載されている。
【００３５】
ＰＴＭの標的結合ドメインは、標的プレｍＲＮＡ、即ちアポＡ−１又はアポＢ標的プレｍＲＮＡ、又は他のプレｍＲＮＡ標的、例えばアルブミンプレｍＲＮＡなどに関する結合親和性をＰＴＭに与える。本明細書で使用する標的結合ドメインは、核のスプライセオソームによるプロセシング機構がＰＴＭの一部分をプレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングすることができるように、結合の特異性を与えプレｍＲＮＡをＰＴＭの非常に近くに固定する、任意の分子、即ちヌクレオチド、タンパク質、化学化合物などとして定義する。標的プレｍＲＮＡは、マウス、ラット、ウシ、ヤギ、又はヒトなどだけには限られないがこれらの哺乳動物のプレｍＲＮＡであってよい。
【００３６】
ＰＴＭの標的結合ドメインは、選択するプレｍＲＮＡ、即ちアポＡ−１、アポＢ又はアルブミン標的プレｍＲＮＡの標的領域と相補的でありそれらとアンチセンス方向にある、多数の結合ドメインを含むことができる。標的結合ドメインは、数千個までのヌクレオチドを含むことができる。本発明の好ましい実施形態では、結合ドメインは少なくとも１０〜３０個、及び数百個以上までのヌクレオチドを含むことができる。ＰＴＭの有効性及び／又は特異性は、標的結合ドメインの長さを増大させることによって有意に増大させることができる。例えば標的結合ドメインは、数百個以上のヌクレオチドを含むことができる。さらに、標的結合ドメインは「直線状」であってよいが、ＲＮＡは折りたたまれて、ＰＴＭがそのプレｍＲＮＡ標的と遭遇するまでＰＴＭスプライシング部位を封鎖し得る二次的な「安全」構造を形成する可能性が非常に高く、それによってトランススプライシングの特異性を増大させることは理解されよう。第２の標的結合領域は分子の３’端に置くことができ、本発明のＰＴＭ中に取り込ませることができる。絶対的な相補性が好ましいが、必要とされるわけではない。本明細書で言及するＲＮＡの一部分と「相補的な」配列は、標的プレｍＲＮＡとハイブリダイズし、安定した二重らせんを形成することができるほど十分な相補性を有する配列を意味する。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度と核酸の長さの両方に依存すると思われる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨークを参照のこと）。一般には、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、多くの塩基がＲＮＡとミスマッチし、配列は安定した二重らせんを含みさらにそれを形成することができる。当業者は標準的な手順を使用することにより、二重らせんの許容可能なミスマッチ又は長さの程度を確かめて、ハイブリダイズした複合体の安定性を決定することができる。
【００３７】
他の機構によって、例えば三重らせん形成、アプタマー相互作用、抗体相互作用又はタンパク質／核酸相互作用、ＰＴＭが工学処理されて特定のＲＮＡ結合タンパク質、即ち特定の標的プレｍＲＮＡと結合したタンパク質を認識する相互作用などによって結合を得ることもできる。或いは、本発明のＰＴＭを設計して、例えばＲＮＡ分子内のヌクレオチド間の分子間塩基対形成から生じるヘアピン構造などの、二次構造を認識することができる。
【００３８】
本発明の特定の実施形態では、標的結合ドメインはアポＡ−１、アポＢ又はアルブミン標的プレｍＲＮＡの配列と相補的でありそれらとアンチセンス方向にあり、これによってトランススプライシングの標的の非常に近くにＰＴＭを保つ。例えば、標的結合ドメインは、核のスプライセオソームによるプロセシング機構がＰＴＭの一部分をアポＡ−１、又はアポＢ、又はアルブミンプレｍＲＮＡの一部分にトランススプライシングすることができるように、結合の特異性を与えＰＴＭの非常に近くにアポＡ−１、又はアポＢ、又はアルブミンプレｍＲＮＡを固定する任意の分子、即ちヌクレオチド、タンパク質、化学化合物などとして定義する。
【００３９】
ＰＴＭ分子は、分岐点配列及び３’スプライシング受容体ＡＧ部位を含む３’スプライシング領域及び／又は５’スプライシングドナー部位も含む。３’スプライシング領域は、ポリピリミジン部位をさらに含むことができる。ＲＮＡスプライシングにおいて使用される、５’スプライシングドナー部位及び３’スプライシング領域に関するコンセンサス配列は当分野ではよく知られている（Ｍｏｏｒｅら、１９９３、ＲＮＡ  Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ｐ．３０３〜３５８を参照）。さらに、５’スプライシングドナー部位及び３’スプライシング領域として機能する能力を維持する修飾型コンセンサス配列は、本発明を実施する際に使用することができる。簡潔には、５’スプライシング部位のコンセンサス配列は、ＡＧ／ＧＵＲＡＧＵ（この場合Ａ＝アデノシン、Ｕ＝ウラシル、Ｇ＝グアニン、Ｃ＝シトシン、Ｒ＝プリン及び／＝スプライシング部位）である。３’スプライシング部位は、３つの別個の配列要素：分岐点又は分岐部位、ポリピリミジン部位及び３’コンセンサス配列（ＹＡＧ）からなる。哺乳動物中の分岐点のコンセンサス配列は、ＹＮＹＵＲＡＣ（Ｙ＝ピリミジン；Ｎ＝任意のヌクレオチド）である。下線部のＡは分岐形成の部位である。ポリピリミジン部位は分岐点とスプライシング部位受容体の間に位置し、有効な分岐点の使用及び３’スプライシング部位の認識のために重要である。近年、ジヌクレオチドＡＵで始まりジヌクレオチドＡＣで終わるプレｍＲＮＡイントロンが同定されてきており、Ｕ１２イントロンと呼ばれている。スプライシング受容体／ドナー配列として機能するＵ１２イントロン配列及び任意の配列を使用して、本発明のＰＴＭを作製することもできる。
【００４０】
標的結合ドメインからＲＮＡスプライシング部位を隔てるスペーサー領域を、ＰＴＭ中に含めることもできる。スペーサー領域を設計して、（ｉ）任意の非スプライシングＰＴＭの翻訳を阻害するために機能すると思われる停止コドン、及び／又は（ｉｉ）標的プレｍＲＮＡに対するトランススプライシングを増大させる配列などの特徴を含ませることができる。
【００４１】
本発明の好ましい実施形態では、「安全」もＰＴＭ中のスペーサー、結合ドメイン、又は他の場所中に取り込んで、非特異的トランススプライシングを防止する（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら、１９９９  Ｎａｔ．Ｂｏｉｏｔｅｃｈ、１７：２４６〜２５２；Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ  ＳＧら、２０００、Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ、７：１８８５〜１８９５）。「安全」は、比較的弱い相補性によってＰＴＭの３’及び／又は５’スプライシング部位の要素を補い、非特異的トランススプライシングを防止するＰＴＭの領域である。ＰＴＭの結合／標的部分のハイブリダイゼーションによって、３’及び／又は５’スプライシング部位が露出され完全に活性状態になるようにＰＴＭを設計する。
【００４２】
このような「安全」配列は、ＰＴＭ分岐点、ピリミジン部位、３’スプライシング部位及び／又は５’スプライシング部位（スプライシング要素）の片側又は両側と結合するか、或いはスプライシング要素自体の一部分と結合すると思われる、シス配列の１つ又は複数の相補的延長部を含む（或いは第２の、別個の核酸の鎖であってよい）。この「安全」の結合は、スプライシング要素が活性化されるのを妨げる（即ち、Ｕ２ｓｎＲＮＰ又は他のスプライシング因子がＰＴＭスプライシング部位認識要素と結合するのを妨げる）。「安全」の結合はＰＴＭの標的結合領域と標的プレｍＲＮＡの結合によって阻害することができ、これによってＰＴＭスプライシング要素を露出及び活性化させることができる（それらを標的プレｍＲＮＡへのトランススプライシングに利用可能にすることができる）。
【００４３】
アポＡ−１ミラノ変異体のエクソン４、エクソン３〜４、又はエクソン２〜４をコードするヌクレオチド配列も、本発明のＰＴＭの中に含まれる。例えばヌクレオチド配列は、知られている遺伝疾患において欠失又は改変される遺伝子産物をコードする配列を含むことができる。さらに、細胞を同定又は画像化するために使用することができるマーカータンパク質又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を、本発明のＰＴＭ中に含めることができる。本発明のさらに他の実施形態では、ＨＩＳタグ（６個の連続したヒスチジン残基）（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：８９７２〜８９７６）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のＣ末端（Ｓｍｉｔｈ及びＪｏｈｎｓｏｎ、１９８６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８７０３〜８７０７）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ＦＬＡＧ（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ／ＩＢＩ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ニューヨーク）、又はＣＤＣ２ＰＳＴＡＩＲＥエピトープタグなどの親和性タグをコードするヌクレオチド配列を、親和性による精製において使用するためにＰＴＭ分子中に含めることができる。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＰＴＭは、位置１７３でアルギニンがシステインに置換されており（本明細書では以後「アルギニン→システイン」と呼ぶ）、したがってアポＡ−１ミラノ変異体タンパク質の発現をもたらす、アポＡ−１エクソン４を含む。様々な異なるＰＴＭ分子を合成して、位置１７３で置換（アルギニン→システイン）を行うことができる。本発明のＰＴＭはアポＡ−１エクソン又はエクソンを含むことができ、アポＡ−１、又はアポＢ、標的プレｍＲＮＡ又は他のプレｍＲＮＡ標的にトランススプライシングされると、アポＡ−１ミラノ変異体タンパク質、又はアポＢ／アポＡ−１ミラノ変異体タンパク質をコードすることができる複合又はキメラＲＮＡの形成をもたらすと思われる。アポＡ−１遺伝子のヌクレオチド配列、及びミラノ変異体の発現をもたらす突然変異は知られており、その全容は本明細書に組み込まれている（図３Ａ〜Ｂ）。同様に、アポＢ遺伝子のヌクレオチド配列が知られている（図６）。
【００４５】
ＰＴＭの構造中に含まれるアポＡ−１エクソン配列は、図４中に示すようなアポＡ−１エクソン４配列を含むように設計されると思われる。このような場合３’エクソンの置換は、位置１７３にアルギニン→システインの置換を有するアポＡ−１ミラノ変異体タンパク質をコードするキメラＲＮＡ分子の形成をもたらすと思われる。
【００４６】
本発明のＰＴＭを工学処理して、１つのアポＡ−１エクソン配列、多数のアポＡ−１エクソン配列、又は代替的に４エクソン配列の完全な組を含ませることができる。ＰＴＭ中に使用されるアポＡ−１配列の数及び同一性は、トランススプライシング反応の型、即ち５’エクソンの置換、３’エクソンの置換又は内部エクソンの置換、並びにプレｍＲＮＡ標的に依存すると思われる。
【００４７】
本発明の特定のＰＴＭは、アポＡ−１エクソン４配列をコードする核酸を含むＰＴＭだけには限られないがそれらを含む。図５、９及び２１中に示すような３’エクソンの置換トランススプライシング反応を仲介するために、このようなＰＴＭを使用することができる。
【００４８】
本発明の特定のＰＴＭは、アポＡ−１ミラノをコードする核酸配列を含むＰＴＭだけには限られないがそれらを含む。５’エクソンの置換トランススプライシング反応を仲介するために、このようなＰＴＭを使用することができる。これらのＰＴＭは、ミラノ突然変異を含むコード配列のＮ末端部分を含むと思われる。さらに本発明のＰＴＭは、１つのアポＡ−１変異体エクソン又は２つ以上のアポＡ−１変異体エクソンの任意の組合せを含むことができる。
【００４９】
さらに本発明のＰＴＭは、野生型アポＡ−１をコードする核酸配列を含むＰＴＭだけには限られないがそれらを含む。
【００５０】
本発明はさらに、ＰＴＭのコード領域をミニイントロンを含むように工学処理したＰＴＭ分子を提供する。ＰＴＭのコード配列中へのミニイントロンの挿入を設計して、エクソンの明確さを増大させＰＴＭスプライシング部位の認識を高める。ＰＴＭのコード領域中に挿入されるミニイントロン配列は、小さな天然に存在するイントロン、又は代替的に、合成ミニイントロンを含めた任意のイントロン配列を含み、これらは５’コンセンサスドナー部位及び３’コンセンサス配列を含み、分岐点、３’スプライシング部位、及びいくつかの場合ピリミジン部位を含む。
【００５１】
ミニイントロン配列は約６０〜１５０のヌクレオチド長であることが好ましいが、しかし、増大した長さのミニイントロン配列も使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、ミニイントロンは内因性イントロンの５’及び３’端を含む。本発明の好ましい実施形態では、５’イントロン断片は約２０ヌクレオチド長であり、３’端は約４０ヌクレオチド長である。
【００５２】
本発明の特定の実施形態では、以下の配列を含む５２８ヌクレオチドのイントロンを使用することができる。イントロン構築体の配列は以下の通りである：
５’断片配列：
【化１】
2007518423.tif 000003
３’断片配列：
【化２】
2007518423.tif 000004
【００５３】
本発明の一実施形態では、Ｔｉａ−１結合配列を５’ドナー部位由来の１００ヌクレオチド内に挿入する（Ｄｅｌ  ＧＡｔｔｏ−Ｋｏｎｃｚａｋら、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０：６２８７〜６２９９）。本発明の好ましい実施形態では、Ｔｉａ−１結合配列を５’ドナー部位由来の５０ヌクレオチド内に挿入する。本発明のより好ましい実施形態では、Ｔｉａ−１配列を５’ドナー部位由来の２０ヌクレオチド内に挿入する。
【００５４】
本発明の組成物は、シス作用リボザイム配列を含むように工学処理したＰＴＭをさらに含む。このような配列の封入体は、トランススプライシングの不在下でのＰＴＭ翻訳を減少させる、或いは特定の長さ又は明確な端部を有するＰＴＭを生成するように設計する。ＰＴＭ中に挿入することができるリボザイム配列には、シス作用（自己切断）ＲＮＡスプライシング反応を仲介することができる任意の配列がある。このようなリボザイムには、ハンマーヘッド状、ヘアピン状及びデルタ肝炎ウイルスのリボザイムがあるがこれらだけには限られない（Ｃｈｏｗら、１９９４、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２５８５６〜６４を参照のこと）。
【００５５】
本発明の一実施形態では、例えばエクソンスプライシングエンハンサーと呼ばれる配列などのスプライシングエンハンサーを、ＰＴＭ設計において含ませることもできる。トランス作用スプライシング因子、即ちセリン／アルギニン多量（ＳＲ）タンパク質は、このようなエクソンスプライシングエンハンサーと相互作用し、スプライシングを調節することが示されてきている（Ｔａｃｋｅら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：３５８〜３６２；Ｔｉａｎら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７６：３３８３３〜３３８３９；Ｆｕ、１９９５、ＲＮＡ１：６６３〜６８０を参照のこと）。核局在化シグナルをＰＴＭ分子中に含ませることもできる（Ｄｉｎｇｗｅｌｌ及びＬａｓｋｅｙ、１９８６、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：３６７〜３９０；Ｄｉｎｇｗｅｌｌ及びＬａｓｋｅｙ、１９９１、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１６：４７８〜４８１）。このような核局在化シグナルを使用して、トランススプライシングが起こる核への合成ＰＴＭの輸送を増大させることができる。
【００５６】
ポリアデニル化シグナルなどの翻訳可能なタンパク質をコードするヌクレオチド配列の後又は前に、他の特徴をＰＴＭ分子に加えて、ＲＮＡの発現／安定性、又は５’スプライシング配列を改変し、スプライシング、他の結合領域、「安全」自己相補領域、他のスプライシング部位、又は保護基を増大させ、分子の安定性を調節し、分解を妨げることができる。さらに、停止コドンをＰＴＭ構造中に含ませて、非スプライシングＰＴＭの翻訳を妨げることができる。３’ヘアピン構造、環状ＲＮＡ、ヌクレオチド修飾塩基、又は合成類似体などの他の要素をＰＴＭ中に取り込ませて、核局在化及びスプライセオソームの取り込み、及び細胞内の安定性を促進又は助長することができる。
【００５７】
キメラトランススプライシング産物を作製するために二重トランススプライシング反応を必要とする、ＰＴＭを作製することもできる。例えばこのようなＰＴＭを使用して、アポＡ−１変異体タンパク質を発現させるために使用し得る、内部の１つ又は複数のエクソンを置換することができると思われる。２つのトランススプライシング反応を促進するように設計したＰＴＭは前に記載したように工学処理されるが、しかし、それらは５’ドナー部位と３’スプライシング受容体部位の両方を含む。さらにＰＴＭは、２つ以上の結合ドメイン及びスプライシング領域を含むことができる。スプライシング領域は多数の結合ドメインとスプライシング部位の間、又は代替的に多数の結合ドメインの間に位置することができる。
【００５８】
野生型アポＡ−１、又はアルブミンプレｍＲＮＡなどの他のプレｍＲＮＡ標的用の最適なＰＴＭは、スプライセオソーム仲介型トランススプライシングの高性能スクリーニングによって選択することができる。このようなスクリーニングには、特許出願第１０／６９３，１９２号中に記載されたスクリーニングがあるが、これらだけには限られない。簡潔には、それぞれの新しいＰＴＭライブラリーは、細菌プロトプラスト又はＰＴＭをコードするウイルスベクターのトランスフェクションによって、標的細胞にクローンとして送達する。５’ＧＦＰ−アポＡ−１、アポＢ、又はアルブミン標的はリポフェクタミン試薬を使用してトランスフェクトし、細胞はＦＡＣＳによってＧＦＰ発現に関して分析する。全ＲＮＡサンプルを調製し、正しくスプライシングされた修復産物の存在及び修復産物のレベルに関して、標的及びＰＴＭ特異的プライマーを使用する定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、トランススプライシングを分析することもできる。それぞれのトランススプライシングドメイン（ＴＳＤ）及び結合ドメインは、（ＧＦＰ機能のレベル及びｑＲＴ−ＰＣＲデータに基づいて）適切な配列を同定すると、完全ＴＳＤの一部分をＰＴＭカセットに容易にサブクローニングして本発明のＰＴＭを生成することができるように、数箇所の独自の制限部位を工学処理する。
【００５９】
特異的なＰＴＭがｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成されると（合成ＰＴＭ）、このようなＰＴＭは塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格において修飾し、例えば分子の安定性、標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション、細胞への輸送などを改善することができる。例えば、全体的な電荷を低下させるためのＰＴＭの修飾によって、分子の細胞への取り込みを増大させることができる。さらに、修飾を施してヌクレアーゼ又は化学的分解に対する感受性を低下させることができる。ペプチドなどの他の分子（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏで宿主細胞の受容体を標的化するため）、又は細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３〜６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：６４８〜６５２；１９８８年１２月１５日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０を参照のこと）、又は血液脳関門（例えば、１９８８年４月２５日に公開されたＰＣＴ公開ＷＯ８９／１０１３４を参照のこと）を介した輸送を容易にする物質、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤（例えば、Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８〜９７６を参照のこと）、又は挿入剤（例えば、Ｚｏｎ、１９８８、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９〜５４９を参照のこと）と結合させるような方法で、核酸分子を合成することができる。この目的のために、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発型架橋剤、輸送物質、ハイブリダイゼーション誘発型切断剤などの他の分子と核酸分子を結合させることができる。
【００６０】
核酸分子に対する様々な他のよく知られている修飾を、細胞内の安定性及び半減期を増大させる手段として導入することができる。考えられる修飾には、分子の５’及び／又は３’端へのリボヌクレオチドの側面配列の付加があるが、これだけには限られない。増大した安定性が望まれるいくつかの状況では、２’−Ｏ−メチル化などの修飾型ヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましい可能性がある。修飾型ヌクレオシド間結合を含む核酸は、当分野でよく知られている試薬及び方法を使用して合成することができる（Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０：５４３〜５８４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９９０、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３１：３３５、及びその中に引用されている参照文献を参照のこと）。
【００６１】
本発明の合成ＰＴＭは、細胞中でのそれらの安定性を増大させるような方法で修飾することが好ましい。ＲＮＡ分子は細胞のリボヌクレアーゼによる切断に対して敏感なので、ＲＮＡ結合配列の作用は似ているがヌクレアーゼによる切断に対する感受性が低い、１つの化学的に修飾されたオリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチドの組合せ）を、競合阻害剤として使用することが好ましい可能性がある。さらに、合成ＰＴＭを増大した安定性を有するヌクレアーゼ耐性環状分子として生成させて、ヌクレアーゼによる分解を防ぐことができる（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．３３：４９〜５１；Ｐｕｔｔａｒａｊｕら、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：４２５３〜４２５８）。例えば結合を増大させるため、細胞への取り込みを増大させるため、薬理学又は薬物動態を改善するため、或いは他の薬剤として望ましい特性を改善するために、他の修飾も必要とされる可能性がある。
【００６２】
合成ＰＴＭの構造に施すことができる修飾には、
（ｉ）ホスホロチオエート（Ｘ又はＹ又はＷ又はＺ＝Ｓ、或いは２つ以上とＯとしての残り部分の任意の組合せ）。例えばＹ＝Ｓ（Ｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ａ．ら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９〜３２２１）、Ｘ＝Ｓ（Ｃｏｓｓｔｉｃｋ，Ｒ．ら、１９８９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３０：４６９３〜４６９６）、Ｙ及びＺ＝Ｓ（Ｂｒｉｌｌ，Ｗ．Ｋ．−Ｄ．ら、１９８９、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１１：２３２１〜２３２２）；（ｉｉ）メチルホスホネート（例えばＺ＝メチル（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら、１９８０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：９６５９〜９６６５）；（ｉｉｉ）ホスホラミデート（Ｚ＝Ｎ−（アルキル）２例えばアルキルメチル、エチル、ブチル）（Ｚ＝モルホリン又はピペラジン）（Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．ら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７０７９〜７０８３）（Ｘ又はＷ＝ＮＨ）（Ｍａｇ，Ｍ．ら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３５２５〜３５４３）；（ｉｖ）ホスホトリエステル（Ｚ＝Ｏ−アルキル、例えばメチル、エチルなど）（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら、１９８２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２１：５４６８〜５４７４）；及び（ｖ）無リン結合（例えばカルバメート、アセトアミデート、アセテート）（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．ら、１９７４、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ、１６８４〜１６８６；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊら、１９７９、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ、１３８９〜１３９４）の使用などの骨格修飾があるが、これらだけには限られない。
【００６３】
さらに、糖の修飾を本発明のＰＴＭ中に取り込むことができる。このような修飾には、（ｉ）２’−リボヌクレオシド（Ｒ＝Ｈ）；（ｉｉ）２’−Ｏ−メチル化ヌクレオシド（Ｒ＝ＯＭｅ）（Ｓｐｒｏａｔ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：３３７３〜３３８６）；及び（ｉｉｉ）２’−フルオロ−２’−リボヌクレオシド（Ｒ＝Ｆ）（Ｋｒｕｇ，Ａ．ら、１９８９、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、８：１４７３〜１４８３）の使用がある。
【００６４】
さらに、ＰＴＭに施すことができる塩基の修飾には、（ｉ）５−位置で（例えばメチル、ブロモ、フルオロなどで）置換されたピリミジン誘導体、又はカルボニル基とアミノ基の置換（Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｉ，Ｊ．Ａ．ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４３：３３〜３７）；（ｉｉ）特定の窒素原子を欠くプリン誘導体（例えば７−デアザアデニン、ヒポキサンチン）、又は８−位置が官能化したプリン誘導体（例えば８−アジドアデニン、８−ブロモアデニン）（総説に関しては、Ｊｏｎｅｓ，Ａ．Ｓ．、１９７９、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌｏｇ．Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１：１９４〜２０７を参照のこと）の使用などがあるが、これらだけには限られない。
【００６５】
さらにＰＴＭは、（ｉ）ソラレン（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｐ．Ｓ．ら、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２０、１１３〜１１４）、フェナンスロリン（Ｓｕｎ，Ｊ−Ｓ．ら、１９８８、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７：６０３９〜６０４５）、マスタード（Ｖｌａｓｓｏｖ，Ｖ．Ｖ．ら、１９８８、Ｇｅｎｅ、７２：３１３〜３２２）（共試薬を必要とするか或いは必要としない不可逆的架橋剤）；（ｉｉ）アクリジン（挿入剤）（Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ら、１９８５、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、６７：７７７〜７８３）；（ｉｉｉ）チオール誘導体（タンパク質との可逆的ジスルフィド形成）（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｂ．Ａ．、及びＮｅｗｍａｎ，Ｐ．Ｃ．、１９８９、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７：４９５７〜４９７４）；（ｉｖ）アルデヒド（シッフ塩基形成）；（ｖ）アジド、ブロモ基（ＵＶ架橋）；又は（ｖｉ）エリプチシン（光分解架橋）（Ｐｅｒｒｏｕａｕｌｔ，Ｌ．ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４４：３５８〜３６０）などの反応性官能基と共有結合することができる。
【００６６】
本発明の一実施形態では、糖及びヌクレオシド間結合、即ちヌクレオチド単位の骨格が新規の基に置換されているオリゴヌクレオチド模倣体を使用することができる。例えば、天然のオリゴヌクレオチドより高い親和性でＤＮＡ及びＲＮＡと結合することが示されている、１つのこのようなオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれている（総説に関しては、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．１９９８、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：１０４５〜５２を参照のこと）。したがって、ＰＮＡを合成ＰＴＭ中に取り込ませて、それらの安定性及び／又は標的プレｍＲＮＡに関する結合親和性を増大させることができる。
【００６７】
本発明の他の実施形態では、細胞による取り込みを改善することができる脂肪親和性の基又は他の試薬と、合成ＰＴＭを共有結合させることができる。例えばＰＴＭ分子は、（ｉ）コレステロール（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．ら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６５５３〜６５５６）；（ｉｉ）ポリアミン（Ｌｅｍａｉｔｒｅ，Ｍ．ら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８〜６５２）；他の可溶性ポリマー（例えばポリエチレングリコール）と共有結合させて、ＰＴＭを細胞に送達する有効性を改善することができる。さらに、前述の確認済みの修飾の組合せを使用して、ＰＴＭの安定性及び標的細胞へのＰＴＭの送達を増大させることができる。本発明のＰＴＭは、標的細胞中で新規のキメラＲＮＡを生成させるために設計した方法中で使用することができる。
【００６８】
本発明の方法は、当業者により使用される任意の形、例えばＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡベクターであってよいＰＴＭを標的細胞に送達することを含み、前記ＰＴＭはプレｍＲＮＡと結合し、プレｍＲＮＡの一部分にスプライシングされるＰＴＭ分子の一部分を含むキメラＲＮＡの形成をもたらすトランススプライシング反応を仲介する。さらに本発明は、トランススプライシングリボザイムの使用などのｍＲＮＡを修飾又は転換するための他の方法、及び当業者に知られている他の手段も含む。
【００６９】
本発明の特定の実施形態では、標的細胞中で新規のキメラＲＮＡを生成させてアポＡ−１ミラノ又は他の変異体タンパク質の発現をもたらすように設計した方法において、本発明のＰＴＭを使用することができる。本発明の方法は、当業者によって使用される任意の形、例えばＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡベクターであってよいＰＴＭを細胞に送達することを含み、前記ＰＴＭはアポＡ−１又はアポＢプレｍＲＮＡと結合し、プレＲＮＡの一部分にスプライシングされたアポＡ−１ミラノ突然変異体を有するＰＴＭ分子の一部分を含むキメラＲＮＡの形成をもたらすトランススプライシング反応を仲介する。
【００７０】
本発明の他の特定の実施形態では、標的細胞中で新規のキメラＲＮＡを生成させてアルブミン発現と野生型アポＡ−１、アポＡ−１ミラノ又は他の変異体タンパク質の発現の置換をもたらすように設計した方法において、本発明のＰＴＭを使用することができる。本発明の方法は、当業者によって使用される任意の形、例えばＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子に転写されるＤＮＡベクターであってよいＰＴＭを細胞に送達することを含み、前記ＰＴＭはアルブミンプレｍＲＮＡと結合し、プレＲＮＡの一部分にスプライシングされた野生型アポＡ−１、又はアポＡ−１ミラノ変異体をコードするＰＴＭ分子の一部分を含むキメラＲＮＡの形成をもたらすトランススプライシング反応を仲介する。
【００７１】
５．２．トランススプライシング分子の合成
本発明の核酸分子はＲＮＡ又はＤＮＡ、或いはその誘導体又は改変型、一本鎖又は二本鎖であってよい。核酸によって、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオシドから構成されている、ホスホジエステル結合又は修飾結合から構成されている、ＰＴＭ分子又はＰＴＭ分子をコードする核酸分子を意味する。用語核酸は、５つの生物学上存在する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基から構成されている核酸も詳細には含む。さらに本発明のＰＴＭは、ＰＴＭの安定性を増大させるように設計した、ＤＮＡ／ＲＮＡ、ＲＮＡ／タンパク質又はＤＮＡ／ＲＮＡ／タンパク質キメラ分子を含むことができる。
【００７２】
本発明のＰＴＭは、核酸分子を合成するための当分野で知られている任意の方法によって調製することができる。例えば核酸は、当分野でよく知られている方法によって、市販の試薬及び合成装置を使用して化学的に合成することができる（例えばＧａｉｔ、１９８５、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オクスフォード、イングランドを参照のこと）。
【００７３】
或いは、当該のＰＴＭをコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、合成ＰＴＭを作製することができる。このようなＤＮＡ配列は広く様々なベクター、Ｔ７、ＳＰ６、又はＴ３ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターから下流に取り込むことができる。コンセンサスＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、以下の配列を含む：
【化３】
2007518423.tif 000005
【００７４】
太字の塩基は、転写中にＲＮＡに最初に取り込まれる塩基である。下線は、効率の良い転写に必要とされる最小限の配列を示す。
【００７５】
ＳＰＳ６５及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などのプラスミドを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、ＲＮＡを高い収率で生成することができる。さらに、Ｑ−β増幅などのＲＮＡ増幅法を使用して当該のＰＴＭを生成することができる。
【００７６】
当分野でよく知られているように、任意の適切な手段によってＰＴＭを精製することができる。例えば、ゲル濾過、親和性又は抗体相互作用、逆相クロマトグラフィー又はゲル電気泳動によってＰＴＭを精製することができる。当然ながら当業者は、精製法は精製する核酸の大きさ、電荷及び形状に部分的に依存するであろうことを理解していると思われる。
【００７７】
本発明のＰＴＭは、化学的、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで合成されようと、修飾又は置換ヌクレオチドの存在下で合成して、安定性、取り込み又はＰＴＭと標的プレｍＲＮＡの結合を増大させることができる。さらに、ＰＴＭの合成後、例えばペプチド、化学物質、抗体、又は核酸分子を用いてＰＴＭを修飾して、ＰＴＭ分子の物理的性質を高めることができる。このような修飾は当業者にはよく知られている。
【００７８】
ＰＴＭをコードする核酸分子を使用する場合、核酸分子を発現ベクターにクローニングするための、当分野で知られているクローニング技法を使用することができる。使用することができ組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら、（編集）、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク；及びＫｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク中に記載されている。
【００７９】
当該のＰＴＭをコードするＤＮＡは、様々な宿主ベクター系中に組換えによって工学処理することができ、これらの系は大規模なＤＮＡの複製ももたらし、ＰＴＭの転写を指示するのに必要な要素を含む。患者中の標的細胞をトランスフェクトするためのこのような構築体の使用は、十分な量のＰＴＭの転写をもたらし、これは内因的に発現されるプレｍＲＮＡ標的、例えばアポＡ−１又はアポＢプレｍＲＮＡ標的などと相補的塩基対を形成し、それによって複合核酸分子間のトランススプライシング反応を容易にする。例えばベクターは、それが細胞によって取り込まれＰＴＭ分子の転写を指示するようにｉｎ  ｖｉｖｏに導入することができる。このようなベクターは、それを転写して所望のＲＮＡ、即ちＰＴＭを生成することができる限り、エピソームに留まるか或いは染色体に組み込まれた状態になり得る。このようなベクターは、当分野で標準的な組換えＤＮＡ技術法によって構築することができる。
【００８０】
当該のＰＴＭをコードするベクターは、哺乳動物細胞中での複製及び発現に使用するための、プラスミド、ウイルス、又は当分野で知られている他のものであってよい。ＰＴＭをコードする配列の発現は、当分野で知られている任意のプロモーター／エンハンサー配列によって制御して、哺乳動物、好ましくはヒト細胞中で作用させることができる。このようなプロモーター／エンハンサーは、誘導性又は構成性であってよい。このようなプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ，Ｃ．及びＣｈａｍｂｏｎ，Ｐ．１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復単位中に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７〜７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼのプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９〜４２）、ウイルスＣＭＶプロモーター、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−βプロモーター（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １０６：１１１〜１１９）などがあるが、これらだけには限られない。
【００８１】
本発明の特定の実施形態では、肝臓特異的プロモーター／エンハンサー配列を使用して、アポＡ−１ミラノ変異体タンパク質を発現させるために肝臓細胞中でのＰＴＭの合成を促進することができる。このようなプロモーターには、例えばアルブミン、トランスサイレチン、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリのβ−アクチンプロモーター、アポＥエンハンサーα１−抗トリプシンプロモーター及び内因性アポＡ−１又はアポ−Ｂプロモーター要素がある。さらに、アポＡ−１又はアポ−Ｂ遺伝子の発現用に最適化した肝臓特異的マイクログロブリンプロモーターカセット、及びウッドチャックの転写後制御要素（ＷＰＲＥ）などの転写後要素を使用することができる。
【００８２】
任意の型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを使用して、組織部位に直接導入することができる組換えＤＮＡ構築体を調製することができる。或いは、所望の標的細胞に選択的に感染するウイルスベクターを使用することができる。本発明を実施する際に使用するためのベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスのクラスに由来するウイルスなどのウイルスの発現ベクターだけには限られないがこれらを含めた、任意の真核生物の発現ベクターがある。
【００８３】
それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−欠損細胞中での、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼタンパク質の発現に関する選択だけには限られないがこれらを含めた、いくつかの選択系を使用することもできる。さらに、メトトレキセートに対する耐性を与えるジヒドロ葉酸トランスフェラーゼ（ｄｈｆｒ）；マイコフェノール酸に対する耐性を与えるキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるネオマイシン（ｎｅｏ）；及びハイグロマイシンに対する耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒｏ）に関する選択の基盤として、抗代謝耐性を使用することができる。本発明の好ましい実施形態では、細胞培養物をベクターと細胞の比を小さく形質転換して、任意の一細胞中にただ１つのベクター、又は限られた数のベクターが存在するようにする。
【００８４】
５．３．トランススプライシング分子の使用及び投与
５．３．１．アポＡ−１ミラノ変異体を発現させるためのＰＴＭ分子の使用
本発明の組成物及び方法は、アポＡ−１、又はアポＢ発現、或いは他のプレｍＲＮＡ標的、例えばアルブミン、野生型アポＡ−１、アポＡ−１ミラノ又は他のアポＡ−１変異体などの発現の代わりを果たすように設計する。特に、二重トランススプライシング反応、３’エクソン置換及び／又は５’エクソン置換を含めた、標的化トランススプライシングを使用して、アポＡ−１、アポＢ、又はアルブミン配列を、アポＡ−１野生型又はミラノ変異体の発現をもたらす野生型アポＡ−１又はアポＡ−１ミラノ配列と置換することができる。
【００８５】
様々な送達系が知られており、これらを使用して本発明の組成物を細胞中に移動させることができる、例えばリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセル中への被包、本発明の組成物を発現することができる組換え細胞、受容体仲介のエンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照のこと）、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又は他のベクターの一部分としての核酸の構築、ＤＮＡの注入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションなど。
【００８６】
本発明の組成物及び方法を使用して、野生型アポＡ−１、アポＡ−１ミラノ、アポＢ／アポＡ−１野生型又はミラノ、ａｌｂ／アポＡ−１野生型又はミラノ融合タンパク質をコードする遺伝子を個体の細胞に与えることができ、そこで前記遺伝子産物の発現がプラーク形成を減少させる。
【００８７】
特に、本発明の組成物及び方法を使用して、野生型アポＡ−１、アポＡ−１ミラノ変異体分子、或いはアポＢ／アポＡ−１又はａｌｂ／アポＡ−１融合タンパク質をコードする配列を個体の細胞に与えて、心臓発作及び脳卒中をもたらす血管障害と通常関係があるプラーク形成を減少させることができる。
【００８８】
好ましい実施形態では、ＰＴＭをコードする配列を含む核酸を投与して、宿主細胞中への遺伝子送達及び発現によってＰＴＭ機能を助長する。本発明のこの実施形態では、核酸はＰＴＭ生成を助長することによって影響を仲介する。当分野で利用可能な宿主細胞中に遺伝子を送達するための任意の方法を、本発明に従い使用することができる。遺伝子送達の方法の一般的な総説に関しては、Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍ．及びＢａｒｒａｎｇｅｒ，Ｊ．Ａ．、１９９７、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．、Ｂｅｒｌｉｎ；Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８〜５０５；Ｗｕ及びＷｕ、１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７〜９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３３：５７３〜５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６〜９３２；並びにＭｏｒｇａｎ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ、１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１〜２１７；１９９３、ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５〜２１５を参照のこと。代表的な方法は以下に記載する。
【００８９】
宿主細胞中へのＰＴＭの送達は、ＰＴＭ又は核酸分子をコードするＰＴＭに宿主を直接曝す直接的なもの、或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＭ又は核酸分子をコードするＰＴＭを用いて宿主細胞を最初に形質転換し、次いで宿主に移植する間接的なものであってよい。これら２つの手法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子送達としてそれぞれ知られている。
【００９０】
特定の実施形態では、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏに直接投与し、そこで核酸が発現されてＰＴＭが生成する。これは当分野で知られている多数の方法のいずれかによって、例えば適切な核酸発現ベクターの一部分として核酸を構築し、核酸が細胞内に存在する状態になるように核酸を投与することによって、例えば欠損又は弱毒レトロウイルス又は他のウイルスベクターを使用する感染（米国特許第４，９８０，２８６号を参照のこと）によって、又は裸ＤＮＡの直接注入によって、又はマイクロ粒子の衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）又は脂質又は細胞表面受容体又はトランスフェクト試薬でのコーティング、リポソーム、マイクロ粒子、又はマイクロカプセル中への被包の使用によって、又は核に入ることが知られているペプチドとの結合中に核酸を投与することによって、受容体仲介型エンドサイトーシスのためのリガンド対象との結合中に核酸を投与することによって実施することができる（例えば、Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２を参照のこと）。
【００９１】
特定の実施形態では、ＰＴＭを含むウイルスベクターを使用することができる。例えば、改変されてウイルスゲノムのパッケージ化及び宿主細胞ＤＮＡ中への組込みに必要ではないレトロウイルス配列が欠失している、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１〜５９９を参照のこと）。或いは、アデノウイルス又はアデノ関連ウイルスベクターを、細胞又は組織への遺伝子送達用に使用することができる（アデノウイルス系遺伝子送達の総説に関しては、Ｋｏｚａｒｓｋｙ及びＷｉｌｓｏｎ、１９９３、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３：４９９〜５０３を参照のこと）。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態では、アデノ関連ウイルスベクターを使用して、ＰＴＭをコードすることができる核酸分子を送達することができる。望まれる発現のレベルに応じて、好ましいプロモーター及び／又はエンハンサー要素をベクター中に挿入することができるように、ベクターを設計する。
【００９３】
細胞中に遺伝子を送達するための他の手法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム仲介トランスフェクション、又はウイルス感染などの方法による組織培養中の細胞への遺伝子の移動を含む。通常、移動の方法は選択可能なマーカーを細胞に移動させることを含む。次いで細胞を選択下に置いて、移動した遺伝子を取り込んで発現している細胞を単離する。生成する組換え細胞は、当分野で知られている様々な方法によって宿主に送達することができる。好ましい実施形態では、遺伝子送達のために使用する細胞は宿主細胞に自己由来する。
【００９４】
本発明の特定の実施形態では、肝臓幹細胞、卵形細胞、又は肝細胞を被験体から除去し、トランススプライシングによって野生型アポＡ−１、アポＡ−１ミラノ又は他のアポＡ−１変異体タンパク質及び／又はアポＢ／アポＡ−１又はａｌｂ／アポＡ−１融合タンパク質を生成するように設計されたＰＴＭをコードすることができる核酸分子を用いてトランスフェクトすることができる。核酸分子をゲノム中に組み込んでそれによって当該のＰＴＭを発現する安定した細胞系を与えるために、当業者に知られている通常の方法を使用して細胞をさらに選択することができる。次いでこのような細胞を被験体に移植して、それによって野生型アポＡ−１、又はアポＡ−１ミラノ変異体タンパク質の源を与える。
【００９５】
本発明は、有効量のＰＴＭ又はＰＴＭをコードする核酸、及び薬剤として許容可能な担体を含む医薬組成物も提供する。特定の実施形態では、用語「薬剤として許容可能な」は、連邦又は州政府の統制機関によって承認されたか、或いは米国薬局方又は動物、より詳細にはヒトにおいて使用するための他の一般に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、それと共に治療剤を投与する希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は賦形薬を指す。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に記載されている。
【００９６】
特定の実施形態では、血管系中のプラークの蓄積と関係がある疾患又は障害を有する被験体、例えば異常なレベルのアポＡ−１及びアポＢタンパク質が発現される宿主に、医薬組成物を投与する。ＰＴＭ仲介型トランススプライシング反応から生じるキメラｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の活性は、例えば宿主組織のサンプルを得て（例えば生検組織、又は血液サンプルから）、発現されたキメラｍＲＮＡのｍＲＮＡ又はタンパク質レベル又は活性に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイすることによって、容易に検出することができる。
【００９７】
特定の実施形態では、血管系中のプラークの蓄積と関係がある疾患又は障害において、例えばアポＡ−１及び／又はアポＢが異常に発現される宿主に、医薬組成物を投与する。このような障害には、心臓発作又は脳卒中につながることが多い血管障害があるが、これらだけには限られない。
【００９８】
キメラｍＲＮＡによってコードされるタンパク質、即ち野生型アポＡ−１、アポＡ−１ミラノ又はアポＢ／アポＡ−１ミラノ融合タンパク質を検出及び／又は視覚化するためのイムノアッセイ（例えばウェスタンブロット、免疫沈降次にドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学法など）、及び／又はキメラｍＲＮＡの存在を検出及び／又は視覚化することによりキメラｍＲＮＡ発現の形成を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンアッセイ、ドットブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び逆転写ＰＣＲなど）などだけには限られないがこれらを含めた、当分野で標準的な多くの方法をこのようにして使用することができる。
【００９９】
特定の実施形態では、治療の必要性がある領域、即ち肝臓組織に局所的に、本発明の医薬組成物を投与することが望ましい可能性がある。これは例えば非制限的に外科手術中の局所注入、例えば外科手術後の包帯を用いた局所施用によって、注射によって、カテーテル又はステントによって、座薬によって、唾液膜などの膜、又は繊維を含めた多孔質、非多孔質、又はゼラチン状材料であるインプラントによって、或いはナノ粒子、徐放性ポリマー、ヒドロゲルなどのマトリクスなどの他の徐放性ドラッグデリバリーシステムによって実施することができる。
【０１００】
標的細胞中で望ましい効果を生み出すのに有効な量で、ＰＴＭは投与されると思われる。ＰＴＭの有効用量は、生物学的半減期、生物学的利用能及び毒性などのパラメータを扱う当業者によく知られている手順によって決定することができる。有効であると思われる本発明の組成物の量は、治療される血管障害の重度に依存すると思われ、標準的な臨床技法によって決定することができる。このような技法は、アポＡ−１又はアポＢ／アポＡ−１又はａｌｂ／アポＡ−１融合タンパク質の発現のレベルを測定するための血液サンプルの分析を含む。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを場合によっては使用して、最適な用量範囲の確認を手助けすることができる。
【０１０１】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ又は複数の成分が充填された、１つ又は複数の容器を含む医薬パック又はキットを提供する。このような容器には、医薬品又は生物製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関により規定された形の、ヒト投与のための製造、使用又は販売の当該機関による認可を反映した情報を場合によっては付すことができる。
【実施例】
【０１０２】
６．実施例：ヒトアポリポタンパク質（アポＡ−１）の発現
６．１：アルブミン−ヒトアポＡ−１融合タンパク質
この試験に着手して、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要成分であるヒトアポＡ−１タンパク質又は他の変異体を生成するためのアルブミン標的化戦略（図２１）を評価し、続いて心臓血管疾患（ＣＨＤ）を有するか或いはその危険がある個体の治療としてＨＤＬ濃度を増大させた。標的としてアルブミンを選択する理由は、肝臓中でその発現が高いためである。高いアルブミンプレｍＲＮＡ濃度は、トランススプライシングの多量の標的をもたらす。その概念は、アルブミンプレｍＲＮＡ標的への野生型ヒトアポＡ−１又はアポＡ−１類似体の標的化トランススプライシングに関するものであり；その目的はアポＡ−１発現を増大させることである。この試験では、アルブミン配列ヒトアポＡ−１タンパク質の発現、分泌及び機能の影響が評価される。
【０１０３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの融合体（アルブミン−アポＡ−１）の機能を評価した。ヒト及びマウス型のアルブミン−ヒトアポＡ−１のｃＤＮＡ対照（図２２）を構築して、２９３及び肝臓癌細胞（ＨｅｐＧ２）における発現、プロセシング及び機能に関する最終トランススプライシング産物を模倣した。融合ｃＤＮＡ構築体を、長い相補的オリゴヌクレオチド並びにアルブミンエクソン１及びヒトアポＡ−１エクソン３及び４からなるＰＣＲ産物を使用して構築した。簡潔には、マウス及びヒトアルブミンエクソン１のコード配列を、以下の長いオリゴを使用して組み立てた：
マウスアルブミン正方向プライマー：
【化４】
2007518423.tif 000006
逆方向プライマー：
【化５】
2007518423.tif 000007
及びヒトアルブミン正方向プライマー：
【化６】
2007518423.tif 000008
逆方向プライマー：
【化７】
2007518423.tif 000009
下線のヌクレオチドは、アルブミンエクソン１配列の末端を示し、正方向プライマーの３’端における２つの「Ｃ」は、ヒトアポＡ−１と重複する。
【０１０４】
ヒトアポＡ−１コード配列を、ｃＤＮＡクローン（ＡＴＣＣ：クローン番号ＭＧＣ−１２４９）及びプライマーを使用してＰＣＲ増幅させた：
【化８】
2007518423.tif 000010
ＰＣＲ産物を５’端で平滑にし、次いでＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化した（太字で示す）。得られた産物をマウス又はヒトアルブミンエクソン１と最初に連結させ、次いでｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。また、野生型ヒトアポＡ−１を生成させるためのｐｃＤＮＡ３．１へのシグナルペプチドを含むヒトアポＡ−１のコード配列全体を含む発現プラスミド、及び位置１７３にアルギニンからシステインへの置換を含むミラノ変異体（Ｒ１７３Ｃ）発現プラスミドを陽性対照として構築した。最終構築体を塩基配列決定によって確認した。
【０１０５】
６．２：２９３細胞中でのアルブミンアポＡ−１融合タンパク質の生成、発現及び分泌
ヒトアポＡ−１タンパク質の発現及びプロセシングに対するアルブミンエクソン１配列の影響を、ヒト及びマウス融合ｃＤＮＡプラスミド、並びにネガティブ（欠失突然変異）及び陽性対照ｃＤＮＡ（野生型アポＡ−１）を２９３細胞にトランスフェクトすることによって評価した。トランスフェクション後、細胞を無血清ＤＭＥＭで２回洗浄し、無血清最新ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。トランスフェクションの４８時間後、培地を回収し、濃縮し、ヒトアポＡ−１タンパク質の発現に関して分析した。
【０１０６】
ゲルのクーマシーブルー染色によって、マウス及びヒト融合ｃＤＮＡは予想された約２８ｋＤａのタンパク質バンドを生成し、これは２９３細胞において良好な発現、プロセシング及び分泌を示した野生型アポＡ−１のバンドと共に移動したことが明らかになった（図２３．レーン２〜３、６〜７）。さらに、これらのデータから、その発現レベルは野生型アポＡ−１の発現レベルと同等であり（図２３．レーン４、８）、ヒトアポＡ−１発現及びプロセシングに対するアルブミン配列の悪影響は示されなかったことも示された。他方で、シグナルペプチド中に２ヌクレオチドの欠失があるマウス融合ｃＤＮＡを与えた擬似体及び細胞中では、このようなバンドは検出されなかった（図２３．レーン１及び５）。
【０１０７】
ヒトアポＡ−１と同様のＳＤＳゲル中で観察したバンドの同一性を、モノクローナルヒトアポＡ−１抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ、カタログ番号Ｈ４５６２５）を使用してウェスタン分析によって確認した。融合ｃＤＮＡ構築体をトランスフェクトした細胞からの上清又は全細胞溶解物、野生型アポＡ−１及びミラノ変異体由来の約５〜１０μｇの合計タンパク質を、１２％ＳＤＳゲル上で分析し、ナイロン膜上に移し、ヒト抗アポＡ−１抗体と共にインキュベートした。ウェスタンブロッティングの結果から、成熟タンパク質に関して予想された２８ｋＤａの見かけの分子質量を有するヒトアポＡ−１タンパク質の生成が確認された。ウェスタンブロッティングのデータから、２９３細胞において正常なプロセシング及び分泌を示した細胞溶解物と比較して、上清中の融合体又は野生型アポＡ−１由来の９０％を超える成熟ヒトアポＡ−１タンパク質の存在が示された（図２４；比較レーン１及び２及び３）。融合ｃＤＮＡ構築体をトランスフェクトした肝臓癌（ＨｅｐＧ２）細胞に関しても同様の結果が観察された。
【０１０８】
６．３：アルブミンアポＡ−１融合タンパク質は機能的に活性がある
ヒトアポＡ−１機能に対するアルブミン配列の影響を、ＡＴＰ結合カセット輸送タンパク質（ＡＢＣ１）仲介の細胞コレステロールのアポＡ−１受容体への移動を測定することによって評価した。放射標識した細胞コレステロールの無脂質ヒトアポＡ−１への放出を定量化し、融合タンパク質に関して得た流出値を、野生型アポＡ−１及び陰性対照サンプルからの値と比較した。ＡＢＣ１プラスミドを安定的にトランスフェクトした対照ＨｅＬａ及びＨｅＬａ細胞を、ほぼコンフルエントになるまで増殖させた。次いで細胞に１μＣｉ／ｍｌ３Ｈのコレステロールを充填した。２４時間平衡状態にした後、細胞を無血清培地で３回洗浄し、融合タンパク質（融合ｃＤＮＡ構築体をトランスフェクトした２９３細胞由来の上清、アポＡ−１タンパク質濃度に正規化したもの）を含む培地の一連の希釈物、又は陽性対照として１０μｇの野生型アポＡ−１タンパク質と共にインキュベートした。細胞を１８時間流出させた。流出期の後、培地を回収し、次いで培地のアリコートを液体シンチレーション計数によって計数した。細胞分画中の残りの数を、イソプロパノールを用いた一晩の抽出後に測定した。流出の割合を、流出媒体中の数を培地及び細胞分画中の合計数で割ることによって計算した。ＤＭＥＭ／ＢＳＡ培地を対照として使用し、流出媒体中で受容体の存在下で得られた放射活性数から差し引いた。
【０１０９】
融合タンパク質（マウスとヒトの融合タンパク質）に関して観察したＡＢＣ１仲介型流出の量は、野生型アポＡ−１のそれと同等であった（図２５）。流出値データから、融合タンパク質に関して観察した絶対的な流出活性が、試験した濃度範囲で野生型アポＡ−１タンパク質の活性に匹敵するか、或いはそれよりわずかに良好であったことも実証され、アポＡ−１機能に対する最終トランススプライシング産物中のアルブミン配列による、如何なる大きな悪影響も存在しなかったことが示された。これらの結果から、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて機能的な生物活性のあるタンパク質を生成するための、本発明の組成物の有効性についての強力な証拠がもたらされる。
【０１１０】
７．実施例：アルブミン標的の最適結合ドメインを単離するための高性能スクリーニング
マウスアルブミンプレｍＲＮＡ標的の最適結合ドメインを同定するための高性能スクリーニング（ＨＣＳ）を、以前に記載されたのと同様に（２００３年１０月２４日に出願された米国特許出願第１０／６９３，１９２号）（図２６Ａ）、様々に改変して（図２６Ｂ）行った。
【０１１１】
７．１：プレｍＲＮＡ標的の高性能スクリーニング
ヌクレオチド１１４〜８７７、合計７６３ｂｐからなるマウスアルブミンイントロン１及びエクソン２（参照配列ＮＣ＿００００７１）（図１８）を、ゲノムＤＮＡ及びプライマー
【化９】
2007518423.tif 000011
を使用してＰＣＲ増幅させた。次いで、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し（太字で示す）、既存のＨＣＳ標的プラスミド中にクローニングして、ｐｃ５’ｚｓＧ−ｍＩｎ１−Ｅｘ２プラスミドを作製した（図２７）。マウスアルブミン遺伝子のイントロン１及びエクソン２と結合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（ＣｌｏｎｔｅｃｈからのｚｓＧｒｅｅｎ）のコード配列の５’半分を発現する安定細胞を、標的プラスミドをトランスフェクトし、続いてハイグロマイシン選択を行うことによって２９３細胞において樹立した。選択の２週間後、ハイグロマイシン耐性クローンを集め、ＲＴ−ＰＣＲによって特徴付けし、ＨＣＳ用に使用した。
【０１１２】
７．２：マウスアルブミンＰＴＭ結合ドメインライブラリー
イントロン１及びエクソン２を含むマウスアルブミン配列を、前に記載したのと同様にゲノムＤＮＡ及びプライマーを使用してＰＣＲ増幅させ、ＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで消化し、連結させて大きなコンカテマー化断片（１０ｋｂまで）を作製した。このステップを導入してＢＤ複雑性を増大させた。次いでコンカテマー化ＤＮＡを超音波処理によって小片に断片化し、３％アガロースゲル上で分画化した。５０〜２５０ヌクレオチドにわたるサイズの断片をゲル精製し、末端を、クレノウ酵素を使用して修復し、以前に記載されたのと同様に（２００３年１０月２４日に出願された米国特許出願第１０／６９３，１９２号）ＰＴＭカセット中にクローニングした（図２８）。
【０１１３】
ライブラリーコロニーのＰＣＲ分析により、８７％を超える組換え効率、及び５０〜２５０ｎｔでサイズが様々なＢＤを含む１０６個を超える別個のクローンを有する複合ライブラリーが生成されたことが示された（図２９）。主要ライブラリーを細菌中で増幅させ、ＨＣＳによる最適ＢＤのスクリーニング用に使用した。
【０１１４】
７．３：ＰＴＭ選択戦略
以前に記載された（２００３年１０月２４日に出願された米国特許出願第１０／６９３，１９２号）ＦＡＣＳ系ＰＴＭ選択戦略の後に、５’ｚｓＧ−ｍＩｎ１−Ｅｘ２プレ−ｍＲＮＡ標的を発現するアッセイ細胞を使用して、ｍＡｌｂ結合ドメイン（ＢＤ）ライブラリーを試験した。図２６Ｂ中に概説したように、既存のステップのいくつかを改変し、いくつかの新しいステップを加えた。
【０１１５】
簡潔には、第１日にＣＯＳ−７細胞を平板培養し、Ｌｉｐｏ２０００試薬を使用して５’ｚｓＧ−ｍＩｎ１−Ｅｘ２標的プラスミドをトランスフェクトした。第２日に、１０６個までの別個のＰＴＭクローンを、プロトプラストとして５’ｚｓＧ−ｍＩｎ１−Ｅｘ２プレｍＲＮＡを発現するアッセイ細胞に送達した。図３０中に示したように、細胞をＦＡＣＳによって２４時間後に選別し、十分なＧＦＰ及びそれに比例してＲＦＰを発現する細胞を、以前に記載されたような１つの分画ではなく、２つの分画、即ち濃い緑色分画（ＨＧ）と薄い緑色（ＬＧ）分画に回収した。回収した細胞由来のＰＴＭをＨＩＲＴ  ＤＮＡ抽出によって取り出し、次にＥｃｏＲＶで消化して、最終ＨＩＲＴ  ＤＮＡ調製物中の標的プラスミド汚染を低下させた。ＬＧ及びＨＧ分画由来の約４０の結合ドメインを含むＰＴＭを、平行するトランスフェクションによって最初に試験した。これらのＰＴＭのトランススプライシング効率をＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０１１６】
予想通り、ＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）細胞の割合及び平均的なＧＦＰ蛍光性は、２：１の比であったＬＧ分画と比較してＨＧ分画由来のＰＴＭにおいて高かった（図３０）。
【０１１７】
ＨＧ分画由来の１００を超えるＢＤを含むクローンを単離し、平行するトランスフェクションによって試験し、その結果を図３１中に要約する。ＧＦＰの平均的な蛍光性を、個々のＰＴＭのトランススプライシング効率を評価するための指標として使用した。ＧＦＰの平均的な蛍光性に基づくと、ＨＣＳから選択した大部分のＰＴＭのトランススプライシング効率は、合理的に設計したモデルＰＴＭと同等か、或いはそれより若干高かった（図３１）。しかし、モデルＰＴＭと比較して相当高い（１．５〜２倍の）トランススプライシング効率を有する数個のＰＴＭが存在した。このスクリーニングでは、優れたＰＴＭと残りのＰＴＭの１：２０の比が得られた。
【０１１８】
このステップから、平行するトランスフェクションによってさらに特徴付けし、次に特異的トランススプライシングに関して逆転写（ＲＴ）リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を使用して分子的に分析するために、上位２０のＰＴＭを選択し、その結果を図３２中に要約する。全ＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲによってトランススプライシング効率を測定した。標的及びＰＴＭ特異的プライマーは特異的トランススプライシングを測定するために使用し、全体のスプライシングを、前に記載したように５’ｚｓＧエクソンに特異的なプライマーを使用して測定した。ｑＰＣＲ又はＧＦＰの平均的な蛍光性の値に基づいて、トランススプライシング効率の約５〜１０倍の増大（正規化後）を、合理的に設計したモデルＰＴＭと比較してＨＣＳから選択したＰＴＭに関して検出した（図３２）。同様の結果、即ちトランススプライシング効率の増大を、最初のライブラリーと比較して増大したライブラリー（ＬＧ及びＨＧサンプル）に関して観察し、それは以前のスクリーニングと一致する。
【０１１９】
トランススプライシング効率及び特異性に対するＢＤの方向及び配列位置の影響も分析した。最初のＰＴＭライブラリー由来のランダムなクローンの配列を、増大したライブラリー、即ち１ラウンドの増大後に選択したＰＴＭと比較した。
【０１２０】
最初のライブラリー由来のＰＴＭの配列分析によって、４９％の誤った方向のものと比較して約５１％のＢＤが正しい（アンチセンス）方向に存在したことが明らかになった。ＢＤの大きさは４０ｎｔから３３６ｎｔまで様々であり、ｍＡｌｂＢＤライブラリーの複雑性を示す良好な分布も示した。対照的に、増大したライブラリーから選択したＰＴＭの配列分析によって、正しい方向のＢＤの増大が予想通りに示され（８８％）、平均的なＢＤの長さは最初のライブラリーより有意に長く、これは、より長いＢＤがより効率的であることを示した以前の研究（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら、２００１）と一致する。分子及びＧＦＰの平均的な蛍光性の値に基づいて、主要なＰＴＭ番号８８、９７、１４３及び１５８を機能試験用に選択した。これらの主要なＰＴＭの配列及び相対的な位置を図３３中に示す。前述の主要なＰＴＭ以外に、有意に高いトランススプライシング値を有するいくつかのＰＴＭを選択し、モデルＰＴＭと比較した。実施例には８２、９０、９３、１２２、１２３及び１５２がある（図３３Ａ）。
【０１２１】
８．実施例：細胞中のヒトアポリポタンパク質アポＡ−１のトランススプライシング
８．１：ヒトアポリポタンパク質（アポＡ−１）ＰＴＭ
原理の証拠を示すためにこの実施例で使用したヒトアポリポタンパク質Ａ１（アポＡ−１）ＰＴＭの詳細な構造を、図３４中に示す。ＰＴＭカセットは、主要結合ドメイン（ＢＤ）のクローニング用の特有の制限部位、ＮｈｅＩ及びＳａｃＩＩを含むトランススプライシングドメイン（ＴＳＤ）、２４ヌクレオチドのスペーサー領域、共通酵母菌の分岐点（ＢＰ）を含む強烈な３’スプライシング部位、延長ポリピリミジン部位（１９ヌクレオチド長）、スプライシング受容体部位（ＣＡＧジヌクレオチド）、次に野生型ヒトアポＡ−１ｍＲＮＡのコード配列の大部分、ｎｔ１１８〜ｎｔ８４２（参照配列ＮＭ＿００００３９、図３Ａ中に示すものと同様）からなる。ＰＴＭカセットは、トランススプライシングメッセージの安定性を高めるために、ＳＶ４０ポリアデニル化部位及びウッドチャック肝炎の転写後制御要素（ＷＰＲＥ）も含む。カセット全体を、サイトメガロウイルスプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むｐｃＤＮＡ３．１ベクター骨格中にクローニングする。さらに、ベクター骨格をさらに改変してＭａｚ４（転写停止部位）配列を含ませ、ベクターアンピシリン遺伝子とＰＴＭ３’スプライシング部位の間の隠れたシススプライシングを減少させた。機能試験用に使用したＰＴＭ、ｍＡｌｂＰＴＭ９７Ｃ２及びｍＡｌｂＰＴＭ１５８を、ＰＴＭカセット中、ＮｈｅＩ部位とＳａｃＩＩ部位の間に２７９ｂｐ及び１４９ｂｐのＢＤ配列をクローニングすることによって作製し、塩基配列決定により確認した。
【０１２２】
８．２  マウスアルブミンミニ遺伝子標的プレｍＲＮＡ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアポＡ−１機能を実証するために、エクソン１、イントロン１及びエクソン２からなるマウスアルブミンミニ遺伝子標的を使用した。プレｍＲＮＡ標的の概略図を図３５中に示す。マウスアルブミンの対等物は、参照配列ＮＣ＿００００７１に記載したのと同様である。マウスアルブミンエクソン１−イントロン１−エクソン２プレｍＲＮＡ標的（ｍＡｌｂＥｘ１−Ｉｎ１−Ｅｘ２）を以下のように構築した：ヌクレオチド１〜８７７に対応する８７７ｂｐ断片を、以下のマウスゲノムＤＮＡ及びプライマー：
【化１０】
2007518423.tif 000012
を使用してＰＣＲ増幅させた。これらのプライマーは、断片の端に独自の制限部位を含む（太字で示す）。ＰＣＲ産物をＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで消化し、Ｆｌｉｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に使用するように設計した誘導性発現ベクターｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ／ＴＯ中にクローニングした。最終構築体（ｐｃＤＮＡＴＯｆｒｔ−ｍＡｌｂＥｘ１−Ｉｎ１−Ｅｘ２）は、安定細胞系を樹立するために、以下の特徴：ＣＭＶプロモーター、Ｔｅｔオペレーター、ＳＶ４０ポリアデニル化部位及びハイグロマイシン選択マーカーを含む。
【０１２３】
８．３：アルブミン標的を発現する安定細胞系の作製
前に記載した標的プラスミドを使用して、エクソン１、イントロン１及びエクソン２からなるマウスアルブミンミニ遺伝子標的を発現した安定した標的細胞系を作製した。ＲＴ−ＰＣＲによる標的プラスミド（ｐｃＤＮＡＴＯｆｒｔ−ｍＡｌｂＥｘ１−Ｉｎ１−Ｅｘ２）をトランスフェクトした細胞由来の全ＲＮＡの分析によって、予想されたシススプライシング産物が生じたが、アルブミンタンパク質は生じなかった。マウスアルブミンミニ遺伝子標的プレｍＲＮＡのスプライシングパターンを確認すると、Ｆｌｉｐ−Ｉｎ  Ｔ−Ｒｅｘ２９３細胞において安定細胞系を、標的プラスミドをトランスフェクトし、続いてハイグロマイシン選択によって樹立した。約２週間選択した後、ハイグロマイシン耐性クローンを集め、使用するまでハイグロマイシン中に保った。
【０１２４】
８．４：ヒトアポＡ１ＰＴＭの効率の良いトランススプライシング
ＨＣＳから選択したヒトアポＡ１ＰＴＭは、安定細胞においてマウスアルブミンプレｍＲＮＡへの有効で正確なトランススプライシングを示す。ＰＴＭ仲介のトランススプライシング、及びマウスアルブミンヒトアポＡ−１キメラｍＲＮＡの生成を、ｍＡｌｂＰＴＭ９７Ｃ２及びｍＡｌｂＰＴＭ１５８、並びにＴＳＤを欠くスプライシング突然変異体（スプライシング不能ＰＴＭ）を用いた安定細胞のトランスフェクション、及び擬似トランスフェクションによって評価した。これらの細胞から単離したすべてのＲＮＡを、マウスアルブミン標的及びヒトアポＡ−１ＰＴＭ特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって分析した。これらのプライマーによって、機能性ＰＴＭを与えた細胞においてのみ予想された３９０ｂｐの産物が生成された（図３６、レーン２〜４及び６）。スプライシング突然変異体をトランスフェクトした細胞、又は擬似トランスフェクションでは、このような産物は検出されなかった（図３６、レーン１及び５）。ＰＣＲ産物を精製し、直接塩基配列決定し、安定細胞におけるＰＴＭ及び標的プレｍＲＮＡの予想されたスプライシング部位への正確なトランススプライシングを確認した（図３６）。
【０１２５】
リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＰＴＭによってキメラｍＲＮＡに転換されたマウスアルブミンプレｍＲＮＡ転写産物の分画を定量化した。リアル−タイムｑＰＣＲ用のプライマーを設計して、標的エクソン１とトランススプライシングされたｍＲＮＡを区別した。前に記載されたプロトコルを使用して、ｍＡｌｂＰＴＭ９７Ｃ２及びｍＡｌｂＰＴＭ１５８のトランススプライシング効率を定量化した。
【０１２６】
マウスアルブミン特異的ＰＴＭ９７Ｃ２及び１５８は、それぞれ５．６％及び３．４５％のトランススプライシング効率を示した。これらのデータから、安定細胞におけるマウスアルブミンミニ遺伝子標的プレｍＲＮＡとＰＴＭの間の確固たるトランススプライシングが確認された。
【０１２７】
８．５：完全長タンパク質のトランススプライシング及び生成
安定細胞において完全長のマウスアルブミン−ヒトアポＡ−１融合タンパク質を生成する能力に関して、ＰＴＭ仲介のトランススプライシングを評価した。簡潔には、マウスアルブミンミニ遺伝子プレｍＲＮＡを発現するアッセイ細胞に、ｍＡｌｂＰＴＭ（９７Ｃ２及び１５８）、陽性対照としてヒトアルブミン−アポＡ−１融合体、及び陰性対照としてスプライシング接合部に点突然変異（Ｇ＞Ｔ）を有するスプライシング変異体をトランスフェクトした。細胞を５時間後に無血清培地で洗浄し、最新ＤＭＥＭ無血清培地と共にインキュベートした。４８時間後、培地を回収し、濃縮し、ウェスタンブロットによって分析した。完全長のヒトアポＡ−１タンパク質の生成を、前に記載したのと同様に抗ヒトアポＡ−１抗体を使用して実証した。
【０１２８】
マウスアルブミンエクソン１とＰＴＭの間の正確なトランススプライシングは、２８ｋＤａのアルブミン−ヒトアポＡ−１融合タンパク質をもたらすと思われる。トランススプライシング仲介の完全長成熟ヒトアポＡ−１タンパク質の生成は、機能的ＰＴＭ（９７Ｃ２及び１５８）をトランスフェクトした細胞において明らかであるが（図３７、レーン２〜３）、対照、即ちスプライシング変異体をトランスフェクトした細胞或いは擬似体では明らかではなく（図３７、レーン４〜５）、それはさらにｃＤＮＡ対照プラスミドを使用して生じたアルブミンアポＡ−１融合タンパク質と同時に移動した（図３７、レーン１〜３）。これらの試験によって、安定細胞において融合アルブミン−ヒトアポＡ−１タンパク質の生成をもたらす、マウスアルブミンエクソン１とヒトアポＡ−１ＰＴＭの間の正確なトランススプライシングが再度確認された。
【０１２９】
９．実施例：マウス中での内因性マウスアルブミンプレｍＲＮＡへのトランススプライシング
高性能スクリーニング（ＨＣＳ）から選択した主要なＰＴＭの有効性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。５０マイクログラムのｍＡｌｂＰＴＭ９７Ｃ２（ＰＴＭのみ）又は２０μｇのマウスアルブミンミニ遺伝子標的、及び３０μｇのｍＡｌｂＰＴＭ９７Ｃ２プラスミドをｊｅｔ−ＰＥＩ−Ｇａｌ（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎ）試薬と混合し、尾部静脈を介して正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに注射した。肝臓及び血清サンプルを、２４時間及び４８時間の時間地点で回収した。全ｍＲＮＡ及びポリＡｍＲＮＡを単離し、マウスアルブミンエクソン１特異的及びヒトアポＡ−１ＰＴＭ特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【０１３０】
ミニ遺伝子標的及びＰＴＭプラスミドを与えたマウスにおいて、並びにＰＴＭのみを与えたマウスにおいて、１ラウンド中にトランススプライシングを検出した（図３８、レーン３、８及び９）。それぞれの陽性ＲＴ−ＰＣＲ産物を精製及び塩基配列決定し、予想されたスプライシング部位におけるマウスアルブミンエクソン１のヒトアポＡ−１コード配列への正確なトランススプライシングが実証された（図３８、下図）。これらの結果から、マウスにおけるＰＴＭと内因性アルブミンプレｍＲＮＡ標的の間の正確なトランススプライシングが実証され、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるアルブミン標的化戦略がさらに確認された。
【０１３１】
図３９は、ヒトアルブミン配列を標的化することによってアポＡ１発現を増大させるための戦略を記載したものである。図４０は、最終トランススプライシング産物中のアルブミン配列を除去する手段、即ち如何なるアルブミンも含まない野生型ヒトアポＡ−１と同一である、トランススプライシング産物を生成するための手段を記載したものである。
【０１３２】
本発明は、本明細書に記載する特定の実施形態によって範囲が制限されるわけではない。実際、本明細書に記載した形態以外の本発明の様々な変更形態が、前述の記載事項及び添付の図面から当業者には明らかであると思われる。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれるものとする。様々な参照文献を本明細書に引用し、その開示の全容が参照として組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１（ａ）】異なるトランススプライシング反応の概略図である。標的５’スプライシング部位とＰＴＭの３’スプライシング部位の間のトランススプライシング反応の図である。
【図１（ｂ）】異なるトランススプライシング反応の概略図である。標的３’スプライシング部位とＰＴＭの５’スプライシング部位の間のトランススプライシング反応の図である。
【図１（ｃ）】異なるトランススプライシング反応の概略図である。ＰＴＭが３’スプライシング部位と５’スプライシング部位の両方を有する二重トランススプライシング反応による、内部エクソンの置換の図である。ＢＤ、結合ドメイン；ＢＰ、分岐点配列；ＰＰＴ、ポリピリミジン部位；及びｓｓ、スプライシング部位。
【図２】ヒトアポＡ−１遺伝子及びｍＲＮＡの図である。アポＡ−１遺伝子は１．８７ｋｂ長であり、非コードエクソン１を含めた４個のエクソンを含む。アポＡ−１ｍＲＮＡは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む８９７ヌクレオチド長である。アポＡ−１のアミノ酸配列はＮ末端に２４アミノ酸のシグナルペプチドを含む２６７残基からなり、成熟タンパク質は２４３のアミノ酸残基を有する１本のポリペプチド鎖である。
【図３Ａ】野生型アポＡ−１のヌクレオチド及びアミノ酸配列の図である。
【図３Ｂ】アポＡ−１ミラノ変異体の図である。
【図３Ｃ】アポＡ−１ミラノを作製するための戦略の図である。
【図４Ａ】標的遺伝子及びＰＴＭ構造の図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験用のヒト野生型アポＡ−１の完全長標的遺伝子の概略構造の図である。
【図４Ｂ】標的遺伝子及びＰＴＭ構造の図である。ヒトアポＡ−１ミラノＰＴＭ１（エクソン４）の概略構造の図である。
【図５】アポＡ−１標的プレｍＲＮＡとＰＴＭの間のトランススプライシング反応の概略図である。
【図６】アポＢ−１００遺伝子及びｍＲＮＡの図である。
【図７】アポＢ標的プレｍＲＮＡの概略構造の図である。
【図８Ａ】ミニ遺伝子標的及びＰＴＭ構造の図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験用のヒトアポＢミニ遺伝子標的の概略構造の図である。
【図８Ｂ】ミニ遺伝子標的及びＰＴＭ構造の図である。ヒトアポＡ−１ミラノＰＴＭ２の概略構造の図である。
【図９】アポＢ標的プレｍＲＮＡとＰＴＭの間のトランススプライシング反応の概略図である。
【図１０】ヒトアルブミン遺伝子構造の図である。（Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉら、１９８６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６７４７〜６７５７も参照のこと）。
【図１１】ヒトアポ−１の図である。
【図１２】ヒトアポＡ−１遺伝子及びｍＲＮＡ構造の詳細の図である。
【図１３】ヒト及びマウスアルブミンエクソン１／ヒトアポＡ−１融合体の概略図である。
【図１４】ヒトアルブミンエクソン１／ヒトアポＡ−１（野生型）融合体のヌクレオチド配列の図である。下線の配列はヒトアルブミンシグナルペプチドを表し；／アルブミンとアポＡ−１の間の融合体の接合部を示す。ＡＴＧ及び停止コドン、ＴＧＡはイタリックで示す。
【図１５】２９３細胞におけるマウス及びヒトアルブミン／アポＡ−１融合体のウェスタン分析の図である。
【図１６】２９３及びＨｅｐＧ２細胞におけるマウス及びヒトアルブミン／アポＡ−１融合体のウェスタン分析の図である。
【図１７】結合ドメインスクリーニング用の標的構築体の図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験用の５’ＧＦＰ−Ａｌｂｌｎ１Ｅｘ２標的遺伝子の概略構造の図である。標的プレｍＲＮＡ構築体は、ＧＦＰ蛍光タンパク質の部分的なコード配列、次に５’スプライシング部位、アルブミンイントロン１、３’受容体部位及びアルブミンエクソン２を含む。
【図１８】５’ＧＦＰ−Ａｌｂｌｎ１Ｅｘ２プレｍＲＮＡ標的配列の図である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験用の５’ＧＦＰ−Ａｌｂｌｎ１Ｅｘ２遺伝子のヌクレオチド配列。イタリックで示す配列は、ＧＦＰ蛍光タンパク質のコード配列の最初の半分、次にヒトアルブミンイントロン１及びエクソン２配列（下線）を示す。「／」は、５’及び３’スプライシング接合部を示す。
【図１９】結合ドメインのスクリーニングに使用するためのＰＴＭカセットの図である。原型ＰＴＭ発現カセットの概略構造を示す。それは、トランススプライシングドメイン（ＴＳＤ）、次に２４ヌクレオチドのスペーサー、共通酵母菌の分岐点（ＢＰ）を含む３’スプライシング部位、延長ポリピリミジン部位及びＡＧスプライシング受容体部位からなる。ＴＳＤは残りの３’ＧＦＰコード配列と融合させた。さらにＰＴＭカセットは、第２の蛍光レポーター（ＤｓＲｅｄ２）の完全長コード配列も含み、その発現は脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のリボゾーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）によって誘導される。
【図２０】結合ドメインのスクリーニング戦略の図である。
【図２１】アルブミン標的プレｍＲＮＡ中へのヒトアポＡ−１の標的化トランススプライシングの概略図である。
【図２２】ヒト及びマウスアポＡ−１融合構築体の概略図である。
【図２３】２９３細胞におけるヒトアポＡ−１発現を示す、ＳＤＳゲルの図である。
【図２４】２９３細胞における成熟ヒトアポＡ−１タンパク質の発現及び分泌を示す、ウェスタンブロットの図である。
【図２５】機能的ヒトアポＡ−１タンパク質の発現を実証する、２９３細胞におけるコレステロール流出の図である。
【図２６Ａ】ＦＡＣＳ系ＰＴＭ選択戦略の概略図である。
【図２６Ｂ】高性能スクリーニング（ＨＣＳ）プロトコルの比較の図である。
【図２７】ＨＣＳで使用するプレｍＲＮＡ標的の概略図である。
【図２８】ＨＣＳで使用するＰＴＭカセットの概略図である。
【図２９】マウスアルブミン結合ドメイン（ＢＤ）ライブラリーのＰＣＲ分析の図である。
【図３０】高性能スクリーニング（ＨＣＳ）法及び結果の要約の図である。
【図３１】ＨＣＳから選択したＰＴＭのトランススプライシング有効性の図である。
【図３２】トランススプライシング効率、及びＨＣＳから選択した様々なＰＴＭのＧＦＰの蛍光性を示す棒グラフである。
【図３３Ａ】機能性試験用に選択したマウスアルブミン主要結合ドメイン（ＢＤ）の、相対的な位置及び配列を示す概略図である。
【図３３Ｂ】ＨＣＳから選択した結合ドメインのヌクレオチド配列の図である。
【図３４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験の原理を証明するために使用した、ヒトアポＡ−１ＰＴＭ発現カセットを示す概略図である。
【図３５】マウスアルブミンミニ遺伝子プレｍＲＮＡ標的の概略図である。
【図３６】安定細胞におけるアルブミンエクソン１へのｍＡｌｂＰＴＭのトランススプライシングの図である。
【図３７】トランススプライシングされたヒトアポＡ−１タンパク質のウェスタンブロット分析の図である。
【図３８】マウスにおける内因性アルブミンエクソン１への、ＰＴＭ仲介型トランススプライシングの図である。
【図３９】アポＡ１発現を増大させるためのヒトアルブミン標的化戦略を示す概略図である。
【図４０】最終トランススプライシング産物におけるアルブミン配列の除去の図である。
【図１（ａ）】
2007518423.tif 000013
【図１（ｂ）】
2007518423.tif 000014
【図１（ｃ）】
2007518423.tif 000015
【図２】
2007518423.tif 000016
【図３Ａ】
2007518423.tif 000017
【図３Ｂ】
2007518423.tif 000018
【図３Ｃ】
2007518423.tif 000019
【図４Ａ】
2007518423.tif 000020
【図４Ｂ】
2007518423.tif 000021
【図５】
2007518423.tif 000022
【図６】
2007518423.tif 000023
【図７】
2007518423.tif 000024
【図８Ａ】
2007518423.tif 000025
【図８Ｂ】
2007518423.tif 000026
【図９】
2007518423.tif 000027
【図１０】
2007518423.tif 000028
【図１１】
2007518423.tif 000029
【図１２】
2007518423.tif 000030
【図１３】
2007518423.tif 000031
【図１４】
2007518423.tif 000032
【図１５】
2007518423.tif 000033
【図１６】
2007518423.tif 000034
【図１７】
2007518423.tif 000035
【図１８】
2007518423.tif 000036
【図１９】
2007518423.tif 000037
【図２０】
2007518423.tif 000038
【図２１】
2007518423.tif 000039
【図２２】
2007518423.tif 000040
【図２３】
2007518423.tif 000041
【図２４】
2007518423.tif 000042
【図２５】
2007518423.tif 000043
【図２６Ａ】
2007518423.tif 000044
【図２６Ｂ】
2007518423.tif 000045
【図２７】
2007518423.tif 000046
【図２８】
2007518423.tif 000047
【図２９】
2007518423.tif 000048
【図３０】
2007518423.tif 000049
【図３１】
2007518423.tif 000050
【図３２】
2007518423.tif 000051
【図３３Ａ】
2007518423.tif 000052
【図３３Ｂ】
2007518423.tif 000053
【図３４】
2007518423.tif 000054
【図３５】
2007518423.tif 000055
【図３６】
2007518423.tif 000056
【図３７】
2007518423.tif 000057
【図３８】
2007518423.tif 000058
【図３９】
2007518423.tif 000059
【図４０】
2007518423.tif 000060
【国際調査報告】
2007518423.tif 000061
2007518423.tif 000062