(57)【要約】  本発明は、式(Ｉ)(式中、R1-R12及びXは本明細書で定義されている変数である)で表される特定のスルホンアミドで置換され幾何学的に束縛されたインドリノン類に関する。本発明の好ましい実施態様の、スルホンアミドで置換され幾何学的に束縛されたインドリノン類は、プロテインキナーゼ(PK)類の活性を調節する。したがって、本発明の化合物は、異常なPKの活性に関連する障害を治療するのに有用である。これらの化合物を含有する医薬組成物、これらの化合物を含有する医薬組成物を利用して疾患を治療する方法、及びこれら化合物の製造方法も開示する。
2007501229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
2007501229.tif 000069
(式中、A、B、D及びEは各々、独立して、炭素及び窒素からなる群から選択され、Aが窒素であるときBとEは炭素であり、そしてEが窒素でかつAが炭素であるときBは炭素又は窒素であり、
A、B、D又はEが窒素であるときR2、R3、R4又はR5はそれぞれ存在せず、
A、Ｂ、D及びEを含有するリングが窒素を二つだけ含有する条件下で、
R1とR6は各々Hであり、
R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立して、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ヘテロ脂環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-R14SO2N(R13)-、N-トリハロメタンスルホンアミド、-C(O)R15、-C(O)OR15、R15C(O)O-、シアノ、ニトロ、ハロ、シアナト、イソシアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-OC(O)NR13R14、R14OC(O)NR13-、-OC(S)NR13R14、R14OC(S)NR13-、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
R2とR3又はR3とR4又はR4とR5又はR7とR8は、それらが連結されている原子と共に結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、脂環式リング又はへテロ脂環式リングを形成してもよく、
R13とR14は各々、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、-C(O)R15、アセチル、-SO2R15及び-(CH2)nNR13R14からなる群から選択され、又はR13とR14は、それらが連結されている原子と共に、5員又は6員のヘテロ脂環式リングを形成してもよく、
R15は、H、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロ脂環式基からなる群から選択され、
R9、R10、R11及びR12は各々、独立して、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、-SO2R15、-S(O)R15、-(CH2)nC(O)OR15、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
nは0〜20の整数であり、
Xは窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択され、そしてXが酸素又は硫黄であるときR6は存在しない)で表される化合物、又はそのプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩。
【請求項２】
A、B、D及びEが炭素である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Xが窒素である、請求項2に記載の化合物。
【請求項４】
R2、R3、R4、R5、R7及びR8が各々、独立して、H、アルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-C(O)OR15、ハロ及び-C(O)NR13R14からなる群から選択される、請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
A、B、D及びEが炭素である、請求項4に記載の化合物。
【請求項６】
Xが窒素である、請求項5に記載の化合物。
【請求項７】
2-メチル-6-[2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-(2,6-ジクロロ-フェニルメタンスルホニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸、
6-[5-メタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-ジメチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-イソプロピルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-エタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ヒドロキシ-3-ピロリジン-1-イル-プロピル)-アミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-プロピル)-アミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ジメチルアミノ-エチル)-アミド、
3-[2-メチル-3-((R)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル-6-[2-オキソ-5-スルファモイル-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[3-メタンスルホニル-2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
｛6-メトキシ-3-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-インダン-1-イル｝-酢酸、
5-フルオロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
6-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
4-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
7-クロロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-ピロロ[2,3-b]ピリジン-2-オン及び
6-(4-メトキシ-フェニル)-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
又はこれら化合物のプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩である、請求項1に記載の化合物。
【請求項８】
下記式：
【化２】
2007501229.tif 000070
(式中、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立して、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ヘテロ脂環基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-R14SO2N(R13)-、N-トリハロメタンスルホンアミド、-C(O)R15、-C(O)OR15、R15C(O)O-、シアノ、ニトロ、ハロ、シアナト、イソシアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-OC(O)NR13R14、R14OC(O)NR13-、-OC(S)NR13R14、R14OC(S)NR13-、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
R2とR3又はR3とR4又はR4とR5又はR7とR8は、それらが連結されている原子と共に結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、脂環式リング又はへテロ脂環式リングを形成してもよく、
R13とR14は各々、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、-C(O)R15、アセチル、-SO2R15及び-(CH2)nNR13R14からなる群から選択され、
又はR13とR14は、それらが連結されている原子と共に、5員又は6員のヘテロ脂環式リングを形成してもよく、
R15は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロ脂環式基からなる群から選択され、
R9、R10、R11及びR12は各々、独立して、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、-SO2R15、-S(O)R15、-(CH2)nC(O)OR15、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
nは0〜20の整数である)で表される化合物、又はそのプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩。
【請求項９】
R2、R3、R4、R5、R7及びR8が各々、独立して、H、アルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-C(O)OR15、ハロ及び-C(O)NR13R14からなる群から選択される、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
2-メチル-6-[2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-(2,6-ジクロロ-フェニルメタンスルホニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル- 6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル- 6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸、
6-[5-メタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-ジメチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-イソプロピルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-エタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ヒドロキシ-3-ピロリジン-1-イル-プロピル)-アミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-プロピル)-アミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ジメチルアミノ-エチル)-アミド、
3-[2-メチル-3-((R)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル-6-[2-オキソ-5-スルファモイル-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[3-メタンスルホニル-2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
｛6-メトキシ-3-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-インダン-1-イル｝-酢酸、
5-フルオロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
6-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
4-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
7-クロロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-ピロロ[2,3-b]ピリジン-2-オン及び
6-(4-メトキシ-フェニル)-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
又はこれら化合物のプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩である、請求項8に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項1、7、8又は10のいずれか一項に記載の化合物、プロドラッグ又は医薬として許容できる塩並びに医薬として許容できる担体又は添加物を含む医薬組成物。
【請求項１２】
プロテインキナーゼを、請求項1、7、8又は10のいずれか一項に記載の化合物、プロドラッグ又は医薬として許容できる塩と接触させることを含んでなるプロテインキナーゼの触媒活性を調節する方法。
【請求項１３】
前記プテインキナーゼが、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ及びセリン-トレオニンキナーゼからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
請求項1、７、8又は10のいずれか一項に記載の化合物、プロドラッグ又は医薬として許容できる塩並びに医薬として許容できる担体又は添加剤を含有する医薬組成物の治療上有効な量を生物体に投与することを含む生物体のプロテインキナーゼ関連障害を治療又は予防する方法。
【請求項１５】
前記プロテインキナーゼ関連障害が、受容体チロシンキナーゼ関連障害、非受容体チロシンキナーゼ関連障害及びセリン-トレオニンキナーゼ関連障害からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロテインキナーゼ関連障害が、PDGFR関連障害及びflk関連障害からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテインキナーゼ関連障害が、扁平上皮癌、星状細胞腫、カポジー肉腫、グリア芽細胞腫、肺癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、神経膠腫、結腸直腸癌、尿生殖器癌および胃腸癌からなる群から選択される癌である、請求項14に記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテインキナーゼ関連障害が、糖尿病、自己免疫障害、高増殖性障害、再狭窄、線維症、乾癬、フォン ヒッペル-リンダウ病、骨関節症、リウマチ様関節炎、新脈管形成、炎症性障害、免疫障害及び心臓血管障害からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
前記生物体がヒトである、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテインキナーゼ(「PK」)類の活性を調節する、特定のスルホンアミドで置換された幾何学的に束縛されたインドリノン類に関する。したがって、本発明のこれら化合物は、異常なPKの活性に関連する障害を治療するのに有用である。これらの化合物を含有する医薬組成物、これらの化合物を含有する医薬組成物を利用して疾患を治療する方法及びこれら化合物の製造方法も開示する。
【背景技術】
【０００２】
以下に記載することは、単に背景技術として提供するだけで、本発明の先行技術と認めているわけではない。
【０００３】
プロテインキナーゼ(「PK」)類は、タンパク質のチロシン、セリン及びトレオニンの残基のヒドロキシ基をリン酸化する反応を触媒する酵素である。この一見単純に見える活性の結果は驚くべきものであり、細胞の成長、分化及び増殖すなわち細胞の寿命のすべての側面が結局何らかの形で、PKの活性に依存している。さらに、異常なPKの活性は、乾癬などの比較的生命には関わらない疾患からグリア芽細胞腫(脳の癌)などの極めて悪性の疾患までの範囲の障害の宿主に関連している。
【０００４】
PK類は、便宜上、二つのクラス：プロテインチロシンキナーゼ(PTK)類とセリン-トレオニンキナーゼ(STK)類に分類できる。
【０００５】
PTKの活性の重要な側面の一つは、この活性が増殖因子の受容体に関与していることである。増殖因子の受容体は、細胞表面タンパク質である。増殖因子の受容体は、増殖因子のリガンドが結合すると、細胞膜の内部表面上のタンパク質と相互に反応する活性型に変換する。その結果、受容体などのタンパク質のチロシン残基がリン酸化されて、細胞の内側に、各種の細胞質シグナル伝達分子とのコンプレックスを形成し、そのコンプレックスは、細胞分裂(増殖）、細胞の分化、細胞の成長、細胞外微環境に対する代謝効果の発現などの多くの細胞応答を行う。より完全に考察するには、Schlessinger and Ullrich,Neuron 9:303-391(1992)を参照されたい。なおこの文献は、あたかも本明細書に完全に記載されているように、図面を含めて本明細書に援用するものである。
【０００６】
PTK活性を有する増殖因子受容体類は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)類として知られている。それらは、多様な生物活性を有する膜貫通受容体の大きいファミリーを構成している。現在、RTK類の少なくとも19種の別個のサブファミリーが同定されている。これらの一例は「HER」RTKと命名されているサブファミリーであり、そのサブファミリーはEGFR(上皮増殖因子受容体)、HER2、HER3及びHER4を含んでいる。これらのRTK類は、細胞外グリコシル化リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及びタンパク質のチロシン残基をリン酸化できる細胞内細胞質触媒ドメインからなっている。
【０００７】
別のRTKサブファミリーは、インスリン受容体(IR)、インスリン様増殖因子Ｉ受容体(IGF-1R)及びインスリン受容体関連受容体(IRR)からなっている。IRとIGF-1Rは、インスリン、IGF-I及びIGF-IIと相互に作用して、細胞膜を貫通してチロシンキナーゼドメインを含む二つの完全に細胞外のグリコシル化αサブユニット及び二つのβサブユニットからなるヘテロテトラマーを生成する。
【０００８】
別のRTKサブファミリーは、血小板由来増殖因子受容体(「ＰＤＧＦＲ」）グループと呼称され、PDGFRα、PDGFRβ、CSFIR、c-kit及びflt-3を含んでいる。これらの受容体は、五つの免疫グロブリン様ループで構成されたグリコシル化細胞外ドメイン、及びチロシンキナーゼドメインにキナーゼ挿入ドメインが割り込んでいる細胞内ドメインからなっている。
【０００９】
PDGFRサブファミリーに類似しているので、後者のグループに組み入れられることがある別のグループは、胎児肝臓キナーゼ(「flk」)受容体サブファミリーである。このグループは、キナーゼ挿入ドメイン受容体胎児肝臓キナーゼ-1(KDR/FLK-1)及びfms様チロシンキナーゼ1(flt-1とflt-4)で構成された細胞外免疫グロブリンループを含有している。
【００１０】
チロシンキナーゼ増殖因子受容体ファミリーの別のメンバーは、繊維芽細胞増殖因子(「FGF」)受容体のサブグループである。このグループは4種の受容体：FGFR1-4からなり多くのリガンドがある。かなりの選択的スプライシングがあるが、一般に、これら受容体は、三つの免疫グロブリン様ループを含有するグリコシル化細胞外ドメイン及びチロシンキナーゼ配列にキナーゼ挿入ドメインの領域が割り込んでいる細胞内ドメインからなっている。
【００１１】
チロシンキナーゼ増殖因子受容体ファミリーのさらに別のメンバーはMETであり、これはc-Metとしばしば呼称され、ヒトの肝細胞増殖因子受容体チロシンキナーゼ(hHGFR)としても知られている。ｃ-Metは、原発腫瘍が増殖し転移する際に役割を演じていると考えられている。
【００１２】
既知のRTKサブファミリーのより完全な一覧表は、Plowman et al., DN&P,7(6):334-339(1994)に記載されている。なおこの文献は、図面を含めて、あたかも本明細書に完全に記載されているように援用するものである。
【００１３】
上記RTK類に加えて、「非受容体チロシンキナーゼ」又は「細胞質チロシンキナーゼ」と呼称される完全細胞内PTK類のファミリーも存在する。本明細書では、この後者の名称を「CTK」と略して使用する。CTK類は細胞外ドメインと膜貫通ドメインを含有していない。現在、11種のサブファミリー(Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes、Fak、Jak、Limk及びAck)中に24種を超えるCTK類が同定されている。そのSrcサブファミリーが、今のところCTK類の中で最大のグループのようであり、Src、Yes、Fyn、Lyn、Lck、Blk、Hck、Fgr及びYrkを含んでいる。CTK類をより詳細に考察するには、Bolen,Oncogene,8:2025-2033 (1993)を参照されたい。なおこの文献は、図面を含めて、あたかも本明細書に完全に記載されているように援用するものである。
【００１４】
セリン/トレオニンキナーゼ類：STK類は、CTK類と同様に大部分が細胞内キナーゼであるが、STKタイプの少数種の受容体キナーゼがある。STK類は最も一般的な細胞質ゾルキナーゼ類、すなわち細胞質のオルガネラ及び細胞骨格以外の細胞質の部分でその機能を実行するキナーゼ類である。この細胞質ゾルは、多くの、細胞の中間代謝活性と生合成活性が生ずる細胞内の領域であり、例えば、タンパク質がリボソーム上に合成されるのは細胞質ゾル内である。STK類としては、CDk2、Raf、ZCファミリーのキナーゼ、NEKファミリーのキナーゼ及びBUB1がある。
【００１５】
RTK類、CTK類及びSTK類は、すべて特に癌を含む病原性症状の宿主に関連している。PTK類に関連するその外の病原性症状としては、限定されないが、乾癬、肝硬変、糖尿病、新脈管形成、線維症、再狭窄、眼疾患、リウマチ様関節炎などの炎症性障害、自己免疫疾患などの免疫障害、アテローム性動脈硬化症などの心臓血管疾患及び各種の腎臓障害がある。
【００１６】
癌については、腫瘍の発生を促す過剰の細胞増殖を説明するため発展した主要仮説のうち二つが、PKによって制御されていることが分かっている機能に関する仮説である。すなわち悪性の細胞増殖は、細胞の分裂及び/又は分化を制御する機構が破壊したことが原因であることを示唆している。多種類の癌原遺伝子のタンパク質産物が、細胞の増殖と分化を制御するシグナル伝達経路に関わっていることが分かっている。これら癌原遺伝子のタンパク質産物としては、先に述べたような、細胞外増殖因子類、膜貫通増殖因子PTK受容体(RTK)類、細胞質PTK(CTK)類及び細胞質ゾルSTK類がある。
【００１７】
PKが関連する細胞の活性と多種類のヒトの障害が関連していることは明らかなので、PKの活性を調節する方式を確認しようとして多大の努力がなされていることは驚くに当たらない。これら方式のいくつかは、実際の細胞プロセスに関与している分子に似せて製造した大分子(例えば、変異リガンド(米国特許願第4,966,849号)；可溶性の受容体と抗体(国際特許願公開第WO94/10202号、Kendall and Thomas,Proc.Nat'l Acad. Sci.,90:10705-10709(1994)、Kim et al.,Nature,362:841-844(1993))；RNAリガンド（Jelinek et al.,Biochemistry, 33:10450-56）、Takano et al.,Mol.Bio.Cell,4:358A(1993)、 Kinsella et al.,Exp.  Cell Res.,199:56-62(1992)、Wright et al.,J.Cellular Phys. 152: 448 -57)及びチロシンキナーゼ阻害剤(國際特許願公開第WO94/03428号、同第WO92/21660号、同第WO91/15495号、同第WO94/14808号、米国特許第5,330,992号、Mariani et al.,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.,35:2268(1994))を使う生物模倣法(biomimetic approach)を利用している。
【００１８】
上記試みに加えて、PK阻害剤として作用する小分子を同定する試みもなされている。例えば、ビス‐単環式、二環式およびヘテロアリール化合物(國際特許願公開第WO92/20642号)、ビニレンアザインドール誘導体(國際特許願公開第WO94/14808号)及び1-シクロプロピル-4-ピリジルキノロン類(米国特許第5,330,992号)が、チロシンキナーゼ阻害剤として記載されている。スチリル化合物(米国特許第5,217,999号)、スチリル置換ピリジル化合物(米国特許第5,302,606号)、キナゾリン誘導体(ヨーロッパ特許願第0 566 266 A1号)、セレナインドールとセレン化物類(國際特許願公開第WO94/03427号)、三環式ポリヒドロキシル化合物(國際特許願公開第WO92/21660号)及びベンジルホスホン酸化合物(國際特許願公開第WO91/15495号)は、すべて、癌を治療するのに有用なPTK阻害剤として記載されている。しかしより有効なPTK阻害剤が要求されている。
【発明の開示】
【００１９】
本発明は、一側面で、下記の式Ｉ：
【化１】
2007501229.tif 000003
(式中、A、B、D及びEは各々、独立して、炭素及び窒素からなる群から選択され、Aが窒素であるときBとEは炭素であり、そしてEが窒素でかつAが炭素であるときBは炭素又は窒素であり、
A、B、D又はEが窒素であるときR2、R3、R4又はR5はそれぞれ存在せず、
A、Ｂ、D及びEを含有するリングが窒素を二つだけ含有する条件下で、
R1とR6は各々Hであり、
R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立してH、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ヘテロ脂環基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-R14SO2N(R13)-、N-トリハロメタンスルホンアミド、-C(O)R15、-C(O)OR15、R15C(O)O-、シアノ、ニトロ、ハロ、シアナト、イソシアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-OC(O)NR13R14、R14OC(O)NR13-、-OC(S)NR13R14、R14OC(S)NR13-、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
R2とR3又はR3とR4又はR4とR5又はR7とR8は、それらが連結されている原子と共に結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、脂環式リング又はへテロ脂環式リングを形成してもよく、
【００２０】
R13とR14は各々、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、-C(O)R15、アセチル、-SO2R15及び-(CH2)nNR13R14からなる群から選択され、又はR13とR14は、それらが連結されている原子と共に、5員又は6員のヘテロ脂環式リングを形成してもよく、
R15は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロ脂環式基からなる群から選択され、
R9、R10、R11及びR12は各々、独立して、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、-SO2R15、-S(O)R15、-(CH2)nC(O)OR15、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
nは0〜20の整数であり、
Xは窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択され、そしてXが酸素又は硫黄であるときR6は存在しない)で表される化合物、又はそのプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩に関する。
【００２１】
好ましい実施態様で、本発明は、式Ｉ(式中、A、B、D及びEは炭素である)で表される化合物に関する。別の好ましい実施態様で、本発明は、式Ｉ(式中、A、B、D及びEは炭素でありかつXは窒素である)で表される化合物に関する。さらに別の好ましい実施態様で、本発明は、式Ｉ(式中、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立してH、アルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-C(O)OR15、ハロ及び-C(O)NR13R14からなる群から選択される)で表される化合物に関する。
【００２２】
別の好ましい実施態様で、本発明は、式Ｉ(式中、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立してH、アルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-C(O)OR15、ハロ及び-C(O)NR13R14からなる群から選択され、そしてA、B、D及びEは炭素である)で表される化合物に関する。さらに別の好ましい実施態様で、本発明は、式Ｉ(式中、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立してH、アルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-C(O)OR15、ハロ及び-C(O)NR13R14からなる群から選択され、A、B、D及びEは炭素であり、そしてXは窒素である)で表される化合物に関する。
【００２３】
さらに別の好ましい実施態様で、本発明は、式Ｉで表される化合物すなわち
2-メチル-6-[2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-(2,6-ジクロロ-フェニルメタンスルホニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル- 6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル- 6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸、
【００２４】
6-[5-メタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-ジメチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-イソプロピルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-エタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ヒドロキシ-3-ピロリジン-1-イル-プロピル)-アミド、
【００２５】
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-プロピル)-アミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ジメチルアミノ-エチル)-アミド、
3-[2-メチル-3-((R)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル-6-[2-オキソ-5-スルファモイル-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[3-メタンスルホニル-2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
【００２６】
｛6-メトキシ-3-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-インダン-1-イル｝-酢酸、
5-フルオロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
6-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
4-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
【００２７】
7-クロロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-ピロロ[2,3-b]ピリジン-2-オン及び
6-(4-メトキシ-フェニル)-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
又はこれら化合物のプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩に関する。
【００２８】
別の実施態様で、本発明は、下記式II：
【化２】
2007501229.tif 000004
(式中、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立して、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ヘテロ脂環基、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-R14SO2N(R13)-、N-トリハロメタンスルホンアミド、-C(O)R15、-C(O)OR15、R15C(O)O-、シアノ、ニトロ、ハロ、シアナト、イソシアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-OC(O)NR13R14、R14OC(O)NR13-、-OC(S)NR13R14、R14OC(S)NR13-、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
R2とR3又はR3とR4又はR4とR5又はR7とR8は、それらが連結されている原子と共に結合してメチレンジオキシ基、エチレンジオキシ基、脂環式リング又はへテロ脂環式リングを形成してもよく、
【００２９】
R13とR14は各々、独立して、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式基、-C(O)R15、アセチル、-SO2R15及び-(CH2)nNR13R14からなる群から選択され、又はR13とR14は、それらが連結されている原子と共に、5員又は6員のヘテロ脂環式リングを形成してもよく、
R15は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロ脂環式基からなる群から選択され、
R9、R10、R11及びR12は各々、独立して、H、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、トリハロアルキル、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、-SO2R15、-S(O)R15、-(CH2)nC(O)OR15、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、-C(O)NR13R14、R14C(O)NR13-及び-NR13R14からなる群から選択され、
nは0〜20の整数である)で表される化合物、又はそのプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩に関する。
【００３０】
好ましい実施態様で、本発明は、式II(式中、R2、R3、R4、R5、R7及びR8は各々、独立してH、アルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、-SOR13、-SO2R13、-SO2NR13R14、-C(O)OR15、ハロ及び-C(O)NR13R14からなる群から選択される)で表される化合物に関する。
【００３１】
別の好ましい実施態様で、式IIで表される化合物は、すなわち
2-メチル-6-[2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-(2,6-ジクロロ-フェニルメタンスルホニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル- 6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル- 6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸、
6-[5-メタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-ジメチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
6-[5-イソプロピルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
【００３２】
6-[5-エタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ヒドロキシ-3-ピロリジン-1-イル-プロピル)-アミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-プロピル)-アミド、
2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ジメチルアミノ-エチル)-アミド、
【００３３】
3-[2-メチル-3-((R)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
2-メチル-6-[2-オキソ-5-スルファモイル-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル、
3-[3-メタンスルホニル-2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド、
｛6-メトキシ-3-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-インダン-1-イル｝-酢酸、
5-フルオロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
【００３４】
6-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
4-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
7-クロロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン、
3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-ピロロ[2,3-b]ピリジン-2-オン及び
6-(4-メトキシ-フェニル)-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
又はこれら化合物のプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩である。
【００３５】
別の実施態様で、本発明は、式ＩもしくはIIで表される化合物又は式ＩもしくはIIで表される化合物のプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩、及び医薬として許容できる担体もしくは添加剤を含有する医薬組成物に関する。
【００３６】
さらに別の実施態様で、本発明は、プロテインキナーゼを、式ＩもしくはIIで表される化合物又は式ＩもしくはIIで表される化合物のプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩と接触させるステップを含んでなる、プロテインキナーゼの触媒活性を調節する方法に関する。好ましい実施態様で、前記プテインキナーゼは、受容体チロシンキナーゼ、非受容体チロシンキナーゼ及びセリン-トレオニンキナーゼからなる群から選択される。
【００３７】
さらに別の側面で、本発明は、式ＩもしくはIIで表される化合物又は式ＩもしくはIIで表される化合物のプロドラッグもしくは医薬として許容できる塩、及び医薬として許容できる担体もしくは添加剤を含有する医薬組成物の治療上有効な量を生体に投与するステップを含んでなる、生体のプロテインキナーゼ関連障害を治療又は予防する方法に関する。好ましい実施態様で、プロテインキナーゼ関連障害は、受容体チロシンキナーゼ関連障害、非受容体チロシンキナーゼ関連障害及びセリン-トレオニンキナーゼ関連障害からなる群から選択される。別の好ましい実施態様で、プロテインキナーゼ関連障害は、PDGFR関連障害及びflk関連障害からなる群から選択される。好ましい実施態様で、プロテインキナーゼ関連障害は、扁平上皮癌、星状細胞腫、カポジー肉腫、グリア芽細胞腫、肺癌、膀胱癌、頭頸部癌、黒色腫、卵巣癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、神経膠腫、結腸直腸癌、尿生殖器癌及び胃腸癌からなる群から選択される癌である。別の好ましい実施態様で、プロテインキナーゼ関連障害は、糖尿病、自己免疫障害、高増殖性障害、再狭窄、線維症、乾癬、フォン ヒッペル-リンダウ病、骨関節症、リウマチ様関節炎、新脈管形成、炎症性障害、免疫障害及び心臓血管障害からなる群から選択される。好ましい実施態様では、生物体はヒトである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
PK調節性能を示しかつ異常なPK活性に関連する障害に対して改善効果を有する、新規なスルホンアミドで置換された、幾何学的に束縛されたインドリノン類のファミリーが発見された。
【００３９】
本明細書に提示された化合物は、代表的なものだけであり、決して、本発明の範囲を限定するとみなしてはならない。
【００４０】
別の側面で、本発明は、1種もしくは2種以上の式(Ｉ)で表される化合物又はその医薬として許容できる塩及び医薬として許容できる添加剤を含有する医薬組成物に関する。
【００４１】
また、本発明の一側面で、本明細書に記載の化合物又はその塩は、上記疾患及び障害を治療するため他の化学療法剤と組み合わせることができる。例えば、本発明の化合物又は塩は、アルキル化剤の例えばフルオロウラシル(5-FU)だけと組み合わせることができ又はさらにロイコボリン(leukovorin)もしくは以下のその外のアルキル化剤と組み合わせることができる。このその外のアルキル化剤としては、限定されないが、他のピリミジン類似体例えばUFT、キャペシタビン(capecitabine)、ジェムシタビン及びシタラビン；アルキルスルホネート類例えばブスルファン(慢性顆粒球白血病の治療に使用)、インプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン類例えばベンゾデパ、カルボクオン(carboquone)、メーチャーデパ及びウレデパ；エチレンイミン類とメチルメラミン類、例えばアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド及びトリメチロールメラミン；並びにナイトロジェンマスタード類、例えばクロラムブシル(慢性リンパ性白血病、原発性マクログロブリン血症及び非ホジキンリンパ腫の治療に使用）、シクロホスファアミド(ホジキン病、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、肺癌、ウイリムス腫瘍及び横紋筋肉腫の治療に使用),エストラムスチン、イフォスファミド、ノベムブリチン、プレドニムスチン及びウラシルマスタード(原発性血小板増加症、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病及び卵巣癌の治療に使用)；並びにトリアジン類、例えばダカルバジン(軟組織肉腫の治療に使用)がある。
【００４２】
同様に、本発明の化合物又は塩は、その外の代謝拮抗薬の化学療法剤、例えば限定されないが、葉酸類似体、例えばメトトリキサレート(急性リンパ性白血病、絨毛癌、菌状息肉腫、乳癌、頭頸部癌および骨原性肉腫の治療に使用)及びプテロプテリン；並びにプリン類似体、例えば急性顆粒球白血病、急性リンパ性白血病及び慢性顆粒球白血病の治療に使用されるメルカプトプリン及びチオグアニンと組み合わせると有益な効果があると期待できる。
【００４３】
また、本発明の化合物又は塩は、天然産物ベースの化学療法剤、例えば、限定されないが、ニチニチソウ(vinca)アルカロイド類、例えばビンブラスチン(乳癌及び精巣癌の治療に使用)、ビンクリスチン及びビンデシン；エピポドフィロトキシン類、例えばエトポシド及びテニポシド(両者は精巣癌及びカポジー肉腫を治療するのに有用である)；抗生物質の化学療法剤、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン(胃癌、頸部癌、結腸癌、乳癌、膀胱癌及び膵臓癌の治療に使用)、ダクチノマイシン、テモゾロミド、プリカマイシン、ブレオマイシン(皮膚癌、食道癌及び尿生殖器管路癌の治療に使用)；並びに酵素の化学療法剤、例えばL-アスパラギナーゼと組み合わせると効力を発揮すると期待できる。
【００４４】
さらに、本発明の化合物と塩は、白金配位錯体(シスプラチンなど)；置換尿素類、例えばヒドロキシ尿素；メチルヒドラジン誘導体、例えばプロカルバジン；副腎皮質サプレッサント類、例えばミトータン、アミノグルテチミド；並びにホルモン及びホルモン拮抗薬、例えば副腎皮質ステロイド類(例えばプレドニゾン)、プロゲスチン類(例えば、ヒドロキシプロゲステロン カプロレート)、エステロゲン類(例えば、ヂエチルスチルベストロール)、抗エストロゲン類、例えばタモキシフェン、アンドロゲン類、例えばテストステロン プロピオネート及びアロマターゼ阻害剤(例えば、アナストロゾール)を組み合わせて使用すると有益な効果があると期待できる。
【００４５】
最後であるが、本発明の化合物は、充実性腫瘍癌、又は白血病、例えば限定されないが急性骨髄性(非リンパ性)白血病を治療するためミトザントロン又はパクリタクセルと組み合わせて使用すると特に有効であると期待できる。
【００４６】
上記方法は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、セルサイクル阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、生物学的応答調節剤、抗ホルモン、抗新脈管形成剤、例えばMMP-2、MMP-9及びCOX‐2阻害剤、並びに抗アンドロゲン剤からなる群から選択される化学療法剤と組み合わせて実施できる。
【００４７】
有用なCOX-II阻害剤としては、Vioxx(商標)、CELEBREX(商標)(alecoxib)、valdecoxib、paracoxib、rofecoxib及びCox 189がある。有用なマトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤は、國際特許願公開第WO96/33172号(1996年10月24日付けで公開)、同第WO96/27583号(1996年3月7日付けで公開)、ヨーロッパ特許願第97304971.1号(1997年7月8日付けで出願)、同第99308617.2号(1999年10月29日付けで出願)、國際特許願公開第WO98/07697号(1998年2月26日付けで公開)、同第WO98/03516号(1998年1月29日付けで公開)、同第WO98/34918号(1998年8月13日付けで公開)、同第WO98/34915号(1998年８月13日付けで公開)、同第WO98/33768号(1998年8月6日付けで公開)、同第WO98/30566号(1998年7月16日付けで公開)、ヨーロッパ特許願公開第606,046号(1994年7月13日付けで公開)、同第931,788号(1999年7月28日付けで公開)、國際特許願公開第WO90/05719号(1990年5月31日付けで公開)、同第WO99/52910号(1999年10月21日付けで公開)、同第WO99/52889号(1999年10月21日付けで公開)、同第WO99/29667号(1999年6月17日付けで公開)、國際特許願第PCT/IB98/01113号(1998年7月21日付けで出願)、ヨーロッパ特許願第99302232.1号(1999年3月25日付けで出願)、英国特許願第9912961.1号(1999年6月3日付けで出願)、米国仮特許願第60/148,464号(1999年8月12日付けで出願)、米国特許第5,863,949号(1999年1月26日付けで発行)、米国特許第5,861,510号(1999年1月19日付けで発行)及びヨーロッパ特許願公開第780,386号(1997年6月25日付けで公開)に記載されている。なお、これらの特許文献は全体を本明細書に援用するものである。
【００４８】
好ましいMMP-2とMMP-9の阻害剤は、MMP-1を阻害する活性をほとんど有していないか又は全く有していない阻害剤である。他のマトリックス-メタロプロテイナーゼ類(すなわち、MMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12及びMMP-13)に比べて選択的にMMP-2及び/又はMMP-9を阻害する阻害剤がより好ましい。本発明で有用なMMP阻害剤のいくつかの例はAG-3340、RO 32-3555、RS 13-0830及び以下に列挙する化合物である。
【００４９】
3-[[4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル]-(1-ヒドロキシカルバモイル-シクロペンチル)-アミノ]-プロピオン酸；3-エキソ-3-[4-(4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ)-8-オキサ-ビシクロ[3.2.1]オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；(2R,3R)１-［４-(２-クロロ-4-フルオロ-ベンジルオキシ)-ベンゼンスルホニル］-3-ヒドロキシ-3-メチル-ピペリジン-2-カルボン酸ヒドロキシアミド；4-[4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ]-テトラヒドロ-ピラン-4-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-[[4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル]-(1-ヒドロキシカルバモイル-シクロブチル)-アミノ]-プロピオン酸；4-[4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ]-テトラヒドロ-ピラン-4-カルボン酸ヒドロキシアミド；(R)3-[4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ]- テトラヒドロ-ピラン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；(2R,3R)１-［４-(4-フルオロ-2-メチル-ベンジルオキシ)-ベンゼンスルホニル］-3-ヒドロキシ-3-メチル-ピペリジン-2-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-[[4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル]-(1-ヒドロキシカルバモイル-1-メチル-エチル)-アミノ]-プロピオン酸；3-[[4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニル]-(4-ヒドロキシカルバモイル-テトラヒドロピラン-4-イル)-アミノ]-プロピオン酸；3-エキソ-3-[4-(4-(4-クロロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ)-8-オキサ-ビシクロ[3.2.1]オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；3-エンド-3-[4-(4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ)-8-オキサ-ビシクロ[3.2.1]オクタン-3-カルボン酸ヒドロキシアミド；及び(R)3-[4-(4-フルオロ-フェノキシ)-ベンゼンスルホニルアミノ]- テトラヒドロ-フラン-３-カルボン酸ヒドロキシアミド；並びにこれら化合物の医薬として許容できる塩及び溶媒和化合物。
【００５０】
他の抗新脈管形成剤も、他のCOX-II阻害剤と他のMMP阻害剤を含めて本発明に使用できる。
【００５１】
また、式(Ｉ)で表される化合物は、EGFR(上皮増殖因子受容体)の応答を阻害できる薬剤などのシグナル伝達阻害剤、例えばEGFR抗体、EGF抗体及びEGFR阻害剤である分子；VEGF(血管内皮増殖因子)阻害剤；及びerbB2受容体に結合する有機分子又は抗体などのerbB2受容体阻害剤、例えばHERCEPTIN（登録商標）（Genentech Inc.、米国、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在）と共に使用できる。EGFR阻害剤は、例えば、國際特許願公開第WO95/19970号(1995年7月27日付けで公開)、同第WO98/14451号(1998年4月9日付けで公開)、同第WO98/02434号(1998年1月22日付けで公開)及び米国特許第5,747,498号(1998年5月5日付けで発行)に記載されており、このような物質は、本明細書に記載されているようにして本発明に使用できる。
【００５２】
EGFR阻害剤としては、限定されないが、モノクローナル抗体のC225と抗EGFR 22Mab(米国ニューヨーク州ニューヨーク所在のImClonoe Systems Incorporated)、化合物のZD-1839(AstraZeneca)、BIBX-1382(Boehringer Ingel  heim)、MDX-447(米国ニュージャージー州アナンデイル所在のMedarex Inc.)及びOLX-103(米国、ニュージャージー州ホワイトハウスステーション所在のMerck & Co.)、VRCTC-310(Ventech Research)及びEGF融合毒素(米国、マサチューセッツ州ホプキントンシ所在のSeragen Inc.)がある。
【００５３】
これらの及び他のEGFR阻害剤は本発明で使用できる。
【００５４】
VEGF阻害剤、例えばSU-5416、SU-11248、SU-6668(米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在のSugen Inc.)も、式(Ｉ)で表される化合物と組み合わせることができる。VEGF阻害剤は、例えば國際特許願公開第WO99/24440号(1999年5月20日付けで公開)、國際特許願第PCT/IB99/00797号(1999年5月3日付けで出願)、國際特許願公開第WO95/21613号(1995年8月17日付けで公開)、同第WO99/61422号(1999年12月2日付けで公開)、米国特許第5,834,504号(1998年11月10日付けで発行)、國際特許願公開第WO01/60814号、同第WO98/50356号(1998年11月12日付けで公開)、米国特許第5,883,113号(1999年3月16日付けで発行)、同第5,886,020号(1999年3月23日付けで発行)、同第5,792,783号(1998年8月11日付けで発行)、國際特許願公開第WO99/10349号(1999年3月4日付けで公開)、同第WO97/32856号(1997年9月12日付けで公開)、同第WO97/22596号(1997年6月26日付けで公開)、同第WO98/54093号(1998年12月3日付けで公開)、同第WO98/02438号(1998年1月22日付けで公開)、同第WO99/16755号(1999年4月8日付けで公開)及び同第WO98/02437号(1998年1月22日付けで公開)に記載されている。なお、これらの特許文献はすべて、全体を本明細書に援用するものである。本発明に有用ないくつかの特定のVEGF阻害剤の他の例は、IM862（米国ワシントン州カークランド所在のCytran Inc.）；米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在のGenentech,Inc.の抗VEGFモノクローナル抗体；並びにアンギオザイム(angiozyme)すなわちRibozyme(米国コロラド州ボールダー所在)及びChiron(米国カリフォルニア州エマリービル所在)から入手できる合成リボザイムである。これらの及び他のVEGF阻害剤は、本明細書に記載されているようにして本発明に使用できる。
【００５５】
さらに、GW-282974(Glaxo Wellcome plc)及びモノクローナル抗体のAR-209(米国テキサス州ザウッドランズ所在のAronex Pharmaceuticals Inc.)と2B-1(Chiron)などのErbB2受容体阻害剤、例えば國際特許願公開第WO98/02434号(1998年1月22日付けで公開)、同第WO99/35146号(1999年7月15日付けで公開)、同第WO99/35132号(1999年7月15日付けで公開)、同第WO98/02437号(1998年1月22日付けで公開)、同第WO97/13760号(1997年4月17日付けで公開)、同第WO95/19970号(1995年7月27日付けで公開)、米国特許第5,587,458号(1996年12月24日付けで発行)及び同第5,877,305号(1999年3月2日付けで発行)に記載されている化合物は、式(Ｉ)で表される化合物と組み合わせることができる。なお、これらの特許文献はすべて、全体を本明細書に援用するものである。本発明に有用なErbB2受容体阻害剤は、米国仮特許願第60/117,341号(1999年1月27日付けで出願)及び同第60/117,346号(1999年1月27日付けで出願)にも記載されている。なお、この両文献は全体を本明細書に援用するものである。上記國際特許願、米国特許及び米国仮特許願に記載されているerbB2受容体阻害剤の化合物と物質並びにerbB2受容体を阻害する他の化合物と物質は、本発明によって、式(Ｉ)で表される化合物と共に使用できる。
【００５６】
また、式(Ｉ)で表される化合物は、限定されないが、抗腫瘍免疫応答を促進することができる薬剤、例えばCTLA4（細胞傷害性リンパ球抗原4）抗体類及びCTLA4をブロックできる他の薬剤；並びに他のファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、例えば米国特許第6,258,824 B1号の「Background」の章に引用された文献中に記載されているファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤などの抗増殖剤を含む癌を治療するのに有用な他の薬剤とともに使用できる。本発明で使用できる特異的なCTLA4抗体としては、米国仮特許願第60/113,647号(1998年12月23日付けで出願)(この出願は全体を本明細書に援用するものである)に記載の抗体があるが、他のCTLA4抗体も本発明に使用できる。
【００５７】
上記方法は、放射線治療法と組み合わせて実施することもでき、放射線治療法と組み合わせる式(Ｉ)で表される化合物の量は上記疾患を治療するのに有効な量である。投与される放射線治療法のレベルは、本発明の好ましい実施態様の化合物と組み合わせて投与すると、平均以下の効力の線量(sub-efficacy dose)まで減らすことができる。
【００５８】
放射線治療法を投与する方法は当該技術分野で公知あり、これらの方法は、本明細書に記載の組合わせ治療法で利用できる。この組合わせ治療法における本発明の化合物の投与は本明細書に記載されているようにして決定できる。
【００５９】
本発明の別の側面は、異常なタンパク質キナーゼの活性が仲介する疾患を治療するのに有用な医薬品を製造する際の式Ｉ又はIIで表される化合物の使用に関する。一側面で、本発明の好ましい実施態様は異常なタンパク質キナーゼの活性が仲介する疾患を治療するのに有用な医薬品を製造する際の式Ｉ又はIIで表される化合物の使用に関する。
【００６０】
用語「医薬として許容できる塩」又は「医薬として許容できるその塩」は、遊離塩基の生物学的有効性と特性を保持して、無機又は有機の酸との反応で得られる塩を意味し、その酸としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ-トルエンスルホン酸、サリチル酸、酢酸、ベンゼンスルホン酸(ベシレート)、安息香酸、ショウノウスルホン酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、粘液酸、pamoic acid、パントテン酸、コハク酸、酒石酸などがある。
【００６１】
用語「医薬組成物は」は、1種もしくは2種以上の本明細書に記載の化合物又はその生理学的に許容できる塩並びに他の化学成分例えば生理学的に許容できる担体及び添加剤の混合物を意味する。医薬組成物の目的は、生体に化合物を投与しやすくすることである。
【００６２】
用語「生理学的に許容できる担体」は、本明細書で使用する場合、生体に重大な刺激を起こさずかつ投与される化合物の生物活性と特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。
【００６３】
用語「添加剤」は、化合物をより投与しやすくするため医薬組成物に添加する不活性物質を意味する。添加剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖類とデンプン、セルロース誘導体(結晶セルロースを含む)、ゼラチン、植物油、ポリエチレングリコール類、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などがある。
【００６４】
用語「アルキル]は、直鎖、分枝鎖又は環状の基を含む飽和脂肪族炭化水素を意味する。このアルキル基は、好ましくは、1〜20個の炭素原子を有する(数字の範囲、例えば「1-20」が本明細書で述べられる場合はいつでも、その基は、この場合、アルキル基は、1個の炭素原子、2個の炭素原子、3個の炭素原子など20個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する)。より好ましいのは、1〜10個の炭素原子を有する中位の大きさのアルキルである。最も好ましいのは、1〜4個の炭素原子を有する低級アルキルである。そのアルキル基は置換されているか又は置換されていなくてもよい。置換されている場合、各置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、-COR’、‐COOR’、OCOR’、‐CONRR’、-RNCOR’、-NRR’、-CN、-NO2、-CZ3、-SR’、-SOR’、-SO2R’、-SO2OR’、-SO2NRR’、チオカルボニル、-RNSO2R’、ペルフルオロアルキル、Ｏ-カルバミル、Ｎ-カルバミル、O-チオカルバミル、Ｎ-チオカルバミル、シリル、アンモニウム、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ脂環、ヘテロアリール及びアリールから個々に選択された好ましくは1個又は2個以上の基である。RとR’は、独立してH、アルキル又はアリールであり、そのアルキル又はアリールは、さらに、ハロゲン、(CH2)nN(R”)2、(CH2)nCO2R”、(CH2)nOR”、(CH2)nOC(O)R”、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノカルボニル、ヘテロ脂環式リング、アリール、アルコキシ、-OCZ3、アリールオキシ、C(O)NH2又はヘテロアリールで置換されてもよい。R”はＨ、アルキル又はアリールである。Nは0〜3である。
【００６５】
用語「アルケニル」は、少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を有する直鎖、分枝鎖又は環式鎖を含む、少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を有する脂肪族炭化水素を意味する。アルケニル基は、好ましくは、2〜20個の炭素原子を有する(数字の範囲、例えば「2‐20」が本明細書で述べられる場合、その基、この場合、アルケニル基は、2個の炭素原子、3個の炭素原子など20個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する)。より好ましいのは、2〜10個の炭素原子を有する中位の大きさのアルケニルである。最も好ましいのは、2〜6個の炭素原子を有する低級アルケニルである。そのアルケニル基は置換されているか又は置換されていなくてもよい。置換されている場合、各置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、-COR’、‐COOR’、OCOR’、‐CONRR’、-RNCOR’、-NRR’、-CN、-NO2、-CZ3、-SR’、-SOR’、-SO2R’、-SO2OR’、-SO2NRR’、チオカルボニル、-RNSO2R’、ペルフルオロアルキル、Ｏ-カルバミル、Ｎ-カルバミル、O-チオカルバミル、Ｎ-チオカルバミル、シリル、アンモニウム、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ脂環、ヘテロアリール及びアリールから個々に選択された好ましくは1個又は2個以上の基である。RとR’は本明細書で定義される。
【００６６】
用語「アルキニル」は、少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を有する直鎖、分枝鎖又は環式鎖を含む、少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を有する脂肪族炭化水素を意味する。アルキニル基は、好ましくは、2〜20個の炭素原子を有する(数字の範囲、例えば「2‐20」が本明細書で述べられる場合、その基、この場合、アルキニル基は、2個の炭素原子、3個の炭素原子など20個までの炭素原子を含んでいてもよいことを意味する)。より好ましいのは、2〜10個の炭素原子を有する中位の大きさのアルキニルである。最も好ましいのは、2〜6個の炭素原子を有する低級アルキニルである。そのアルキル基は置換されているか又は置換されていなくてもよい。置換されている場合、各置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、-COR’、‐COOR’、OCOR’、‐CONRR’、-RNCOR’、-NRR’、-CN、-NO2、-CZ3、-SR’、-SOR’、-SO2R’、-SO2OR’、-SO2NRR’、チオカルボニル、-RNSO2R’、ペルフルオロアルキル、Ｏ-カルバミル、Ｎ-カルバミル、O-チオカルバミル、Ｎ-チオカルバミル、シリル、アンモニウム、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ脂環、ヘテロアリール及びアリールから個々に選択された好ましくは1個又は2個以上の基である。RとR’は本明細書で定義される。
【００６７】
「シクロアルキル」又は「脂環式」の基は、その1個又は2個のリングが完全な共役π電子系を有していない、すべて炭素の単環式リング又は縮合リング(すなわち炭素原子の隣接する対を共有するリング)の基を意味する。シクロアルキル基の例は、限定されないが、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、アダマンタン、シクロヘキサジエン、シクロヘプタン及びシクロヘプタトリエンである。シクロアルキル基は置換されているか又は置換されていなくてもよい。置換されている場合、各置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、-COR’、‐COOR’、OCOR’、‐CONRR’、-RNCOR’、-NRR’、-CN、-NO2、-CZ3、-SR’、-SOR’、-SO2R’、-SO2OR’、-SO2NRR’、チオカルボニル、-RNSO2R’、ペルフルオロアルキル、Ｏ-カルバミル、Ｎ-カルバミル、O-チオカルバミル、Ｎ-チオカルバミル、シリル、アンモニウム、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ脂環、ヘテロアリール及びアリールから個々に選択された好ましくは1個又は2個以上の基である。RとR’は本明細書で定義される。
【００６８】
「アリール」基は、完全な共役π電子系を有している、すべて炭素の単環式リング又は縮合リング多環式(すなわち炭素原子の隣接する対を共有するリング)の基を意味する。アリール基の例は、限定されないが、フェニル、ナフタレニル及びアントラセニルである。アリール基は置換されているか又は置換されていなくてもよい。置換されている場合、各置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、-COR’、‐COOR’、OCOR’、‐CONRR’、-RNCOR’、-NRR’、-CN、-NO2、-CZ3、-OCZ3、-SR’、-SOR’、-SO2R’、-SO2OR’、-SO2NRR’、チオカルボニル、-RNSO2R’、ペルフルオロアルキル、Ｏ-カルバミル、Ｎ-カルバミル、O-チオカルバミル、Ｎ-チオカルバミル、シリル、アンモニウム、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ脂環、ヘテロアリール及びアリールから選択された好ましくは1個又は2個以上の基である。RとR’は本明細書で定義される。
【００６９】
用語「ヘテロアリール」基は、本明細書で使用する場合、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される原子を1個又は2個以上、単一又は複数のリング中に有し、そしてさらに完全に共役したπ電子系を有する単環式リング又は縮合リング(すなわち隣接する原子の対を共有するリング)の基を意味する。ヘテロアリール基の例は、限定されないが、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピリミジン、キノリン、イソキノリン、プリン及びカルバゾールである。ヘテロアリール基は、置換されているか又は置換されていなくてもよい。置換されている場合、各置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、-COR’、‐COOR’、OCOR’、‐CONRR’、-RNCOR’、-NRR’、-CN、-NO2、-CZ3、-SR’、-SOR’、-SO2R’、-SO2OR’、-SO2NRR’、チオカルボニル、-RNSO2R’、ペルフルオロアルキル、Ｏ-カルバミル、Ｎ-カルバミル、O-チオカルバミル、Ｎ-チオカルバミル、シリル、アンモニウム、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ脂環、ヘテロアリール及びアリールから選択された好ましくは1個又は2個以上の基である(Zはハロゲンである)。RとR’は本明細書で定義される。
【００７０】
「ヘテロ脂環リング」又は「ヘテロ脂環基」は、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される原子を1個又は2個以上、単一又は複数のリング中に有する単環式リング又は縮合リングの基を意味する。そのリングは1個又は2個以上の二重結合を有していてもよい。しかし、それらリングは完全な共役π電子系を有していなくてもよい。ヘテロ脂環リングは置換されているか又は置換されていなくてもよい。ヘテロ脂環リングは1個又は2個以上のオキソ基を含有していてもよい。置換されている場合、その単一又は複数の置換基は、ハロゲン、ヒドロキシ、-COR’、‐COOR’、OCOR’、‐CONRR’、-RNCOR’、-NRR’、-CN、-NO2、-CZ3、-SR’、-SOR’、-SO2R’、-SO2OR’、-SO2NRR’、チオカルボニル、-RNSO2R’、ペルフルオロアルキル、Ｏ-カルバミル、Ｎ-カルバミル、O-チオカルバミル、Ｎ-チオカルバミル、シリル、アンモニウム、低級アルキル、低級アルケニル、低級アルキニル、シクロアルキル、ヘテロ脂環、ヘテロアリール及びアリールから選択された好ましくは1個又は2個以上の基である。RとR’は本明細書で定義される。
【００７１】
Zはフッ素、塩素、臭素及びヨウ素からなる群から選択されるハロゲン基を意味する。
【００７２】
「ヒドロキシ」基は-OH基を意味する。
【００７３】
「アルコキシ」基は、本明細書で定義されるような-O-アルキル基と-O-シクロアルキル基の両者を意味する。
【００７４】
「アルコキシカルボニル」は-C(O)-ORを意味する。
【００７５】
「アミノカルボニル」は-C(O)-NRR’を意味する。
【００７６】
「アリールオキシカルボニル」は-C(O)-Oアリールを意味する。
【００７７】
「アリールオキシ」基は、本明細書で定義されているような-O-アリール基と‐O‐ヘテロアリール基の両者を意味する。
【００７８】
「アリールアルキル」基は-アルキル-アリールを意味し、そのアルキルとアリールは本明細書で定義される。
【００７９】
「アルキルアリール」基は-アリール-アルキルを意味し、そのアルキルとアリールは本明細書で定義される。
【００８０】
「アリールスルホニル」基は-SO2-アリールを意味する。
【００８１】
「アルキルスルホニル」基は-SO2-アルキルを意味する。
【００８２】
「ヘテロアリールオキシル」基は、本明細書で定義されるようなヘテロアリールを有するヘテロアリール-O-基を意味する。
【００８３】
「ヘテロ脂環オキシ」基は、本明細書で定義されるようなヘテロ脂環基を有するヘテロ脂環-O-基を意味する。
【００８４】
「カルボニル」基は-C(=O)-Rを意味する。
【００８５】
「アルデヒド」基は、Rが水素であるカルボニル基を意味する。
【００８６】
「チオカルボニル」基は-C(=S)-R基を意味する。
【００８７】
「トリハロメタンカルボニル」基はZ3C-C(O)-基を意味する。
【００８８】
「C-カルボキシル」基は-C(O)O-R基を意味する。
【００８９】
「O-カルボキシル」基はR-C(O)O-基を意味する。
【００９０】
「カルボン酸」基は、Rが水素であるC-カルボキシル基を意味する。
【００９１】
「ハロ」又は「ハロゲン」の基はフッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
【００９２】
「トリハロメチル」基は-CZ3基を意味する。
【００９３】
「トリハロメタンスホニル」基はZ3CS(O)2基を意味する。
【００９４】
「トリハロメタンスルホンアミド」基はZ3CS(O)2NR-基を意味する。
【００９５】
「スルフィニル」基は-S(O)-R基を意味する。
【００９６】
「スルホニル」基は-S(O)2R基を意味する。
【００９７】
「S-スルホンアミド」基は-S(O)2NRR’基を意味する。
【００９８】
「N-スルホンアミド」基は-NR-S(O)2R基を意味する。
【００９９】
「O-カルバミル」基は‐OC(O)NRR’基を意味する。
【０１００】
「N-カルバミル」基はROC(O)NR-基を意味する。
【０１０１】
「O-チオカルバミル」基は‐OC(S)NRR’基を意味する。
【０１０２】
「N-チオカルバミル」基はROC(S)NR’-基を意味する。
【０１０３】
「アミノ」基は、-NH2基又は-NRR’基を意味する。
【０１０４】
「C-アミド」基は‐C(O)NRR’基を意味する。
【０１０５】
「N-アミド」基はR’C(O)NR-基を意味する。
【０１０６】
「ニトロ」基は-NO2基を意味する。
【０１０７】
「シアノ」基は-CN基を意味する。
【０１０８】
「シリル」基は-Si(R)3基を意味する。
【０１０９】
「ホスホニル」基は-P(=O)(OR)2基を意味する。
【０１１０】
「アミノアルキル」基は-アルキルNRR’基を意味する。
【０１１１】
「アルキルアミノアルキル」基は-アルキル-NR-アルキル基を意味する。
【０１１２】
「ジアルキルアミノアルキル」基は-アルキル-N-(アルキル)2基を意味する。
【０１１３】
「ペルフルオロアルキル]基は、すべての水素原子がフッ素原子で置換されているアルキル基を意味する。
【０１１４】
R1-R12、X、R、R’及びR”は本明細書で定義される。
【０１１５】
同じ分子式を有するが、その原子の結合の性質と配列又はその原子の空間における配置が異なる化合物は、「異性体」と呼称される。それら原子の空間における配置が異なる異性体は「立体異性体」と呼称される。
【０１１６】
互いに鏡像でない立体異性体は「ジアステレオマー」と呼称され、そして互いに重なり合わない鏡像の立体異性体は「エナンチオマー」と呼称される。例えば、化合物が不斉中心を有している場合、その中心は4種の異なる基に結合するので、1対のエナンチオマーが可能である。エナンチオマーは、その不斉中心の絶対配置で特徴付けることができ、かつカーンとプレローグのR-とS-の配列規則よって又はその分子が偏光面を回転する方式によって記述されて右旋性又は左旋性(すなわち、それぞれ(+)又は(‐)の異性体として)と呼称される。キラル化合物が、個々のエナンチオマー又はその混合物として存在しうる。エナンチオマーを同じ比率で含有する混合物を「ラセミ混合物」と称する。
【０１１７】
本発明の化合物は、1個又は2個以上の不斉中心を有していてもよく、したがって、かような化合物は、個々の(R)-又は(S)-の立体異性体として又はその混合物として製造することができる。特に断らない限り、本明細書又は特許請求の範囲における特定の化合物の説明又は命名には、個々のエナンチオマー及びその混合物、ラセミ混合物なども含まれているものとする。立体化学の測定方法及び立体異性体の分離方法は当該技術分野では公知である(J.March,「Advanced Organic Chemistry」第4版、John Wiley and Sons,New York, 1992の第4章の考察を参照)。
【０１１８】
式Ｉ又はIIで表される化合物は、互変異性及び構造異性の現象を示すことがある。例えば、本明細書に記載されている化合物は、分子中の二重結合の回りにE立体配置又はZ立体配置を取ることができる。本発明は、RTK、CTK及び/又はSTKを調節する性能を有しかつどのような互変異性又は構造異性の形態にも限定されない互変異性形又は構造異性形及びその混合物を含んでいる。
【０１１９】
「医薬組成物」は、本明細書に記載されている1種もしくは2種以上の化合物又はその生理学的に/医薬として許容できる塩もしくはプロドラッグと、他の化学成分、例えば生理学的に/医薬として許容できる担体及び添加剤との混合物を意味する。医薬組成物の目的は、化合物を生物体に投与しやすくすることである。
【０１２０】
式Ｉ又はIIで表される化合物はプロドラッグとしても作用できる。「プロドラッグ」は、生体内で親の医薬に変換する薬剤を意味する。プロドラッグは、場合によっては、親の医薬より投与しやすいから有用であることが多い。プロドラッグは例えば経口投与によって生物学的に有効であるが親の医薬はそうでないことがある。また、医薬組成物中のプロドラッグは、親医薬より溶解性が改良されている。プロドラッグの例は、限定されないが、水溶性であることが流動するのに有害な細胞膜を透過しやすいようにエステル(「プロドラッグ」)として投与されるが、次いで水溶性であることが有利である細胞内に入ると、代謝によって加水分解されて活性体のカルボンになる本発明の化合物である。
【０１２１】
プロドラッグのその外の例は、例えば短いポリペプチドであり、限定されないが、末端のアミノ基を通じて本発明の化合物のカルボキシル基に結合された2〜10個のアミノ酸ポリペプチドがあり、このポリペプチドは生体内で加水分解されるか又は代謝されて活性分子を放出する。式Ｉ又はIIで表される化合物のプロドラッグは本発明の範囲内に入っている。
【０１２２】
さらに、式Ｉ又はIIで表される化合物は、ヒトなどの生物の身体内で酵素によって加水分解されて、プロテインキナーゼ類の活性を調節できる代謝物を生成することを目的としている。かような代謝物は、本発明の範囲内に入っている。
【０１２３】
用語「生理学的に/医薬として許容できる担体」は、本明細書で使用する場合、生体に重大な刺激を起こさずかつ投与された化合物の生物活性と特性を阻害しない担体又は希釈剤を意味する。
【０１２４】
「医薬として許容できる添加剤」は、医薬組成物に加えて化合物を一層投与し易くする不活性の物質を意味する。添加剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種の糖類と各種のデンプン、セルロースの誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコール類がある。
【０１２５】
用語「医薬として許容できる塩」は、本明細書で使用する場合、親の化合物の生物学的有効性と特性を保持する塩を意味する。かような塩としては以下のものがある。
(1) 親化合物の遊離塩基と、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸など、又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、(D)もしくは（Ｌ）のリンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ-トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、コハク酸もしくはマロン酸などとの反応で得られる酸付加塩；又は
(2) 親化合物に存在している酸性プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンもしくはアルミニウムイオンによって置換されるか；又は有機塩基、例えばエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ-メチルグルカミンなどと配位結合するとき生成する塩。
【０１２６】
「PK」は、受容体タンパク質のチロシンキナーゼ(RTK類)、非受容体もしくは「細胞」のチロシンキナーゼ(CTK類)及びセリン-トレオニンキナーゼ(STK類)を意味する。
【０１２７】
「方法」は、限定されないが、化学、医薬、生物学、生化学、および医学の技術分野の従業者に知られているか又はこれら従業者が公知の方法、手段、技術及び手順から容易に開発する方法、手段、技術及び手順を含む、与えられた業務を達成するための方法、手段、技術及び手順を意味する。
【０１２８】
「調節」又は「調節する」は、RTK、CTK及びSTKの触媒活性を変えることを意味する。特に、「調節する」は、RTK、CTK又はSTKが暴露される化合物もしくは塩の濃度によって、RTK、CTK及びSTKの触媒活性を活性化すること、好ましくはRTK、CTK及びSTKの触媒活性を活性化もしくは阻害すること、又はより好ましくはRTK、CTK及びSTKの触媒活性を阻害することを意味する。
【０１２９】
「触媒活性」は、RTK及び/又はCTKの直接のもしくは間接的な作用下でのチロシンのリン酸化速度及び/又はSTKの直接のもしくは間接的な作用下でのセリンとトレオニンのリン酸化速度を意味する。
【０１３０】
「接触する」は、本発明の化合物が、ターゲットのPK自体と相互に作用して直接に又はPKの触媒活性が依存している他の分子と相互に作用して間接的に、PKの触媒活性に作用できる状態に、本発明の化合物とターゲットのPKをすることを意味する。かような「接触する」は、「生体外」ですなわち試験管内、ペトリ皿内などで達成できる。試験管内での接触は、対象の化合物とPKだけがかかわっているか又は全細胞がかかわっていてもよい。細胞は、細胞培養皿内に保持又は増殖させ、その環境中で化合物と接触させてもよい。この場合、特定の化合物がPK関連障害に作用する性能、すなわちその化合物の下記定義のIC50は、その化合物をより複雑な生物に生体内で使用する試みをする前に測定できる。生体外の細胞に対してPKを化合物と接触させる多数の方法があり当業者にはよく知られており、限定されないが、細胞に直接顕微注射する方法及び多くの膜貫通キャリアー法がある。
【０１３１】
「生体外」は、限定されないが、例えば試験管内又は培養培地内などの人工の環境内で実施する操作を意味する。
【０１３２】
「生体内」は、限定されないが、例えばマウス、ラット又はウサギなどの生きている生物内で実施する操作を意味する。
【０１３３】
「PK関連障害」、「PK誘導障害」及び「異常PK活性」はすべて、PK(その具体例はRTK、CTK又はSTKである)の触媒活性が不適切であり、すなわち低いか又はより一般的であるが過剰であることを特徴とする症状を意味する。不適切な触媒活性は、(1)正常にPKを発現しない細胞内でのPKの発現、(2)不要な細胞の増殖、分化及び/又は成長をもたらすPKの増大した発現、又は(3)細胞の増殖、分化及び/又は成長の望ましくない低下をもたらす低下したPKの発現が原因で起こりうる。PKの過剰活性は、特定のPKをコードする遺伝子の増幅、又は細胞の増殖、分化及び/又は成長の障害と関連するレベルのPK活性の生成(すなわち、PKのレベルが増大すると、細胞傷害の1種又は2種以上の症状の重篤度が増大する)を意味する。低い活性は、勿論、PK活性のレベルが低下すると、細胞の障害の1種又は2種以上の症状の重篤度が増大する逆の場合を意味する。
【０１３４】
「治療」、「治療する」及び「処置」は、PKが仲介する細胞の障害及び/又はこれに付随する症状を改善又は除く方法を意味する。特に癌については、これら用語は、単に、癌に冒されている個体の平均余命を増大させるか又はその疾患の1種又は2種以上の症状を軽減させることを意味する。
【０１３５】
「生物体」は、少なくとも一つの細胞を含有する生きている実体を意味する。生きている生物体は、例えば、単一の真核細胞のように単純なものであることもあり又はヒトを含む哺乳類のように複雑なものもある。
【０１３６】
「治療上有効な量」は、治療される障害の1種又は2種以上の症状を、ある程度軽減する、化合物の投与量を意味する。癌を治療する場合の治療上有効な量は、以下の作用：
(1)  腫瘍の大きさを小さくする、
(2)腫瘍の転移を阻害する(すなわち、ある程度遅らせる、好ましくは停止させる)、
(3)腫瘍の増殖をある程度阻害する(すなわち、ある程度遅らせる、好ましくは停止させる)及び/又は
(4)癌に付随する1種又は2種以上の症状を、ある程度軽減する(又は好ましくは除く)
を有する量を意味する。
【０１３７】
「監視する」は、化合物が特定のPKを発現する細胞と接触することによる作用を観察又は検出することを意味する。観察又は検出される作用は、PKの触媒活性における細胞表現型の変化又はPKと天然の結合相手の相互作用の変化である。かような作用を観察又は検出する方法は当該技術分野でよく知られている。
【０１３８】
上記作用は、本発明の最後の側面において、細胞表現型の変化もしくは変化の欠如、プロテインキナーゼの触媒活性の変化もしくは変化の欠如、又はプロテインキナーゼと天然の結合相手の相互作用の変化もしくは変化の欠如から選択される。
【０１３９】
「細胞表現型」は、細胞もしくは組織の外見又は細胞もしくは組織の生物学的機能を意味する。細胞表現型の例は、限定されないが、細胞の大きさ、細胞の成長、細胞の増殖、細胞の分化、細胞の生存、アポトーシス及び栄養の摂取と利用である。かような表現型の特性は当該技術分野で公知の方法で測定できる。
【０１４０】
「天然の結合相手」は、細胞内で特定のPKと結合するポリペプチドを意味する。天然の結合相手は、PKが仲介するシグナル伝達工程でシグナルを伝搬する役割を演じる。天然の結合相手とPKの相互作用の変化は、PK/天然の結合相手のコンプレックスの濃度の増加又は減少として現われ、その結果、PKのシグナル伝達を仲介する性能の変化を観察できるようになる。
【０１４１】
適応症
触媒活性を本発明の化合物で調節されるPKとしては、2種類のプロテインチロシンキナーゼすなわち受容体チロシンキナーゼ(RTK)と細胞チロシンキナーゼ(CTK)、及びセリン-トレオニンキナーゼ(STK)がある。RTKが仲介するシグナル伝達が、特異的増殖因子(リガンド)との細胞外での相互作用で始まり、これに続いて受容体の二量体化、固有のプロテインチロシンキナーゼの活性の一過性刺激及びリン酸化反応が起こる。その結果、細胞内シグナル伝達分子に対する結合部位が創生され、適切な細胞応答(例えば、細胞分裂、細胞外の微小環境に対する代謝作用など)をしやすくする細胞質のシグナル伝達分子のスペクトルとコンプレックスを形成する(Schlessinger and Ullrich Neuron 9:303-391 1992参照)。
【０１４２】
増殖因子受容体上のチロシンリン酸化部位は、シグナル伝達分子のSH2(src相同)ドメインに対する高アフィニティーの結合部位として機能することが分かっている(Fantl et al.,Cell 69:413-423 1992；Songyang et al.,Mol.Cell.Biol. 14:2777-2785 1994；Songyang et al.,Cell 72:767-778 1993及びKoch et al.,Science 252:668-678 1991)。RTKと会合するいくつもの細胞内基質タンパク質が同定されている。これらは、二つの基本的グループ：(1)触媒ドメインを有する基質及び(2)かようなドメインを欠いているが、アダプターとして作用して触媒として活性の分子と会合する基質に分類することができる(Songyang et al.,Cell 72:767-778 1993)。受容体とそれら気質のSH2ドメインとの相互作用の特異性は、リン酸化されたチロシン残基の直近のアミノ酸残基によって決定される。SH2ドメインと、特定の受容体上のホスホチロシン残基の近くのアミノ酸配列との間の結合アフィニティーの差は、それら基質のリン酸化の状態の差と一致している(Songyang et al.,Cell 72:767-778 1993)。これらの観察結果は、各RTKの機能が、その発現パターンやリガンドの有効性のみならず、特定の受容体で活性化される下流のシグナル伝達経路のアレイによって決定されることを示唆している。したがって、リン酸化反応は、分化因子受容体のみならず特異的な増殖因子受容体が採用するシグナル伝達経路の選択性を決定する重要な制御ステップを提供する。
【０１４３】
主として細胞質ゾルのキナーゼであるSTKは、しばしば、PTKの事象に対するダウンライン(down‐line)応答として、細胞内部の生化学反応に作用する。STKは、DNAの合成を開始するシグナル伝達工程と次の細胞の増殖をもたらす有糸分裂に関与している。
【０１４４】
したがって、PKのシグナル伝達によって、他の応答中に、細胞の増殖、分化、成長及び代謝が起こる。異常な細胞増殖によって、癌、肉腫、グリア芽細胞腫及び血管腫などの新形成；白血病、乾癬、動脈硬化症、関節炎及び糖尿病性網膜症などの障害；並びに制御されていない新脈管形成及び/又は新脈管形成に関連する他の障害の発生を含む広範囲の障害と疾患がをもたらされる。
【０１４５】
本発明を実施するために、本発明の化合物がPKを阻害する機構を正確に理解する必要はない。しかし、特定の機構又は理論にとらわれるべきではないが、本発明の化合物はPKの触媒領域のアミノ酸と相互に作用すると考えられる。本明細書に開示されている化合物は、PKとの相互作用によって生体内での治療効果を示すだけではなく、PKの生体外での検定法に利用できる。
【０１４６】
さらに、本発明の化合物は、限定されないが、癌、カポジー肉腫を含む肉腫、赤芽球腫、グリア芽細胞腫、骨髄腫、星状細胞腫、黒色腫及び筋芽細胞腫を含む多種類の充実性腫瘍の治療方法を提供する。白血病などの非充実性腫瘍の治療又は予防も本発明は目的としている。適応症としては、限定されないが、脳癌、膀胱癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、結腸癌、血液癌、肺癌及び骨癌がある。
【０１４７】
本明細書に記載の化合物が、予防、治療および研究をおこなうのに有用である不適正なPK活性に関連するタイプの障害のさらなる例は、限定されないが、細胞増殖障害、線維症性障害及び代謝障害である。
【０１４８】
本発明によって、予防し、治療し又はさらに研究することができる細胞増殖障害としては、癌、血管増殖障害及び血管間膜細胞増殖障害がある。
【０１４９】
血管増殖障害は、異常な脈管形成(vasculogenesis)(血管の形成)及び新脈管形成(angiogenesis)(血管の広がり)に関連する障害を意味する。脈管形成と新脈管形成は、胚の発生、黄体の生成、創傷の治癒及び器官の再生などの各種の正常な生理的プロセスにおいて重要な役割を演じているが、一方、腫瘍を生存し続けさせるために必要な新しい毛細血管を生成させて癌を成長させるときにも重要な役割を演じている。血管増殖障害の他の例としては、新しい毛細血管が関節に侵入して軟骨を破壊する関節炎及び網膜中の新しい毛細血管が硝子体に侵入し出血して失明を起こす糖尿病性網膜症のような眼の疾患がある。
【０１５０】
構造が類似している二つのRTKすなわちfms様チロシン1(flt-1)受容体(Shibuya et al.,Oncogene, 5: 519- 524, 1990；De Vries et al.,Science,255:989‐991,1992)及びVEGF-R2としても知られているKDR/FLK-1受容体が、高いアフィニティーでVEGFと結合することが確認されている。血管内皮増殖因子(VEGF)は、生体外で内皮細胞の増殖を促進する活性を有する内皮細胞に特異的なマイトジェンであると報告されている(Ferrara & Henzel,  Biochem.  Biophys.Res.Comm.,161:851-858,1989；Vaisman et al., J.Biol.Chem.,265: 19461-19566,1990)。米国特許願第08/193,829号、同第o8/038,596号及び同第07/975,750号に記載されている情報は、VEGFが、内皮細胞の増殖を引き起こしているだけでなく、正常な脈管形成と病的な新脈管形成の重要な調節因子であるということを強く示唆している(一般に、Klagsburn & Soker,Current Biology,3(10)699-702,1993；Houck et al.,J.Biol.Chem.,267:26031-26037,1992参照)。
【０１５１】
正常な脈管形成と新脈管形成は、胚の発生、創傷の治癒、器官の再生、及び排卵中の黄体における卵胞の発生や妊娠後の胎盤の成長などの女性の妊娠プロセスなどの各種の生理学的プロセスにおいて重要な役割を演じている(Folkman & Shing,J.Biological Chem.,267(16):10931-34,1992)。増殖するため脈管形成に依存している悪性の充実性腫瘍のみならず糖尿病などの疾患に付随して、制御されていない脈管形成及び/又は新脈管新生が起こっている(Klagsburn & Soker,Current Biology,3(10)：699-702,1993；Folkham，J.Natl.Cancer Inst.,82:4-6,1991；Weidner et al.,New Engl.J.Med.,324:1-5,1991)。
【０１５２】
脈管形成中及び新脈管形成中に内皮細胞が増殖及び移動している際のVEGFのさきに推測された役割は、これらプロセスにおけるKDR/FLK-1受容体に対する重要な役割を示している。悪性腫瘍の増殖のみならず真性糖尿病(Folkman,198,in XIth Congres of Thrombosis and Haemostasis(Verstraeta et al.,eds.),pp.583-596,Leuven University Press,Leuven)及び関節炎などの疾患は制御されていない新脈管形成から起こることがある(例えば、Folkman, ,New Engl.J.Med.,285:1182-1186,1971参照)。VEGFが特異的に結合する受容体は、脈管形成及び/又は新脈管形成並びにかようなプロセスによって起こる異常な細胞増殖を伴う各種重篤な疾患を制御及び調節するための重要かつ強力な治療ターゲットである(Plowman et al.,DN&P,7(6):334-339,1994)。さらに具体的に述べると、新脈管形成におけるKDR/FK-1受容体の役割は高度に特異的なので、この受容体は、制御されていない血管の形成を伴う癌などの疾患の治療法の優れたターゲットになる。
【０１５３】
したがって、本発明は、KDR/FL-1の受容体の触媒活性に作用して、KDR/FLK-1で伝達されるシグナルを阻害することによって、脈管形成及び/又は新脈管形成を制御、調節及び/又は阻害する化合物を提供する。したがって、本発明は、限定されないが、グリア芽細胞腫、黒色腫及びカポジー肉腫並びに卵巣、肺、乳房、前立腺、膵臓、結腸及び類表皮の癌を含む多種類の充実性腫瘍を治療する治療法を提供する。さらに、KDR/FLK-1が仲介するシグナル伝達経路を阻害する化合物の投与を、血管腫、再狭窄及び糖尿病性網膜症を治療するのに利用できることも、データが示唆している。
【０１５４】
さらに本発明は、flt-1受容体を含む経路を含む他の受容体が仲介する経路による脈管形成及び新脈管形成の阻害に関する。
【０１５５】
受容体チロシンキナーゼが仲介するシグナル伝達は、特異的増殖因子(リガンド)との細胞外相互作用によって開始され、これに受容体の二量体化、固有のプロテインチロシンキナーゼ活性の一過性刺激及び自己リン酸化反応が続く。これによって、適正な細胞応答、例えば細胞分裂及び細胞外微小環境に対する代謝作用をしやすくする細胞質シグナル伝達分子のスペクトルとコンプレックスを形成する細胞内シグナル伝達分子に対する結合部位が作製される(Schlessinger and Ullrich,Neuron,9:1-20,1992参照)。
【０１５６】
KDR/FLK-1の細胞内領域と、PDGF-β受容体(相同性50.3%)及び/又は類縁のflt-Ｉ受容体との相同性が高いことは、シグナル伝達経路のオーバーラップが誘発されることを示している。例えば、PDGF-β受容体に対しては、srcファミリーのメンバー(Twamley et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90;7696-7700,1993)のホスファチジルイノシトール-3’-キナーゼ(Hu et al.,Mol.Cell.Biol., 12: 981- 990,1992)、ホスホリパーゼcγ(Kashishian and Cooper, Mol.Cell. Biol., 4: 49- 51,1993)、ras-GTPアーゼ‐活性化タンパク質((Kashishian et al.,EMBO J.,11:1373-1382,1992)、PTP-ID/syp(Kazlauskas et al., Proc.Natl.Acad. Sci. USA,10 90:6939-6943,1993)、Grb2(Arvidsson et al., Mol.Cell. Biol.,14:6715- 6726,1994)及びアダプター分子ShcとNck(Nishimura et al., Mol.Cell. Biol., 13:6889-6896,1993)が、異なる自己リン酸化部位を含む領域に結合することが分かっている(一般に、Claesson-Welsh,Prog.Growth Factor Res.,5:37-54,1994を参照)。したがって、KDR/FLK-1によって活性化されるシグナル伝達経路としては、ras経路(Rozakis et al.,Nature,360:689-692,1992)、PI-3'-キナーゼ経路、src仲介経路及びPIcγ仲介経路がある。これら経路は各々、内皮細胞におけるKDR/FLK-1の新脈管形成及び/又は脈管形成の作用において非常に重要な役割を果たすことができる。その結果、本発明のさらに別の側面は、かようなプロセスがこれらの経路によって制御されるとき新脈管形成及び脈管形成を調節するための本明細書に記載の有機化合物の使用に関する。
【０１５７】
逆にいえば、再狭窄などの血管の縮小、収縮又は閉鎖に関連する障害も関与しており、本発明の方法で治療又は予防できる。
【０１５８】
線維症の障害は、細胞外マトリックスの異常な生成を意味する。線維症の障害の例としては、肝硬変、血管間膜細胞増殖障害及び肺線維症がある。肝硬変は、細胞外マトリックス成分が増大して肝臓瘢痕が生成するにいたることが特徴である。細胞外マトリックスが増大して肝臓瘢痕が生成することは、肝炎などのウイルス感染症によって起こることもある。脂肪細胞が肝硬変で重要な役割を演じているようである。関与している他の線維症障害としてはアテローム性動脈硬化症がある。肺線維症は、放射線治療又は化学療法剤による治療で起こることがある。
【０１５９】
血管間膜細胞増殖障害は、血管間膜細胞の異常な増殖によって起こる障害を意味する。血管間膜細胞増殖障害としては、血栓性微小血管障害症候群、移植体拒絶及び糸球体症などの障害のみならず、糸球体腎炎、糖尿病性腎障害及び悪性腎硬化症などの各種ヒトの腎臓疾患がある。RTK PDGFRは血管間膜細胞増殖の維持に関与している(Floege et al.,Kidney International, 43 : 47S- 54S, 1993)。
【０１６０】
多くの癌は、細胞増殖障害であり、先に述べたように、PKは細胞増殖障害に関与している。したがって、例えば、RTKファミリーのメンバーなどのPK類 が癌の発生に関与しているとしても驚くに当たらない。これらの受容体のいくつか、例えば、EGFR(Tuzi et al.,Br.J.Cancer,63:227-233,1991;Torp et al.,APMIS,100:713-719,1992)、HER2/neu(Slamon etal.,Science，244:707-712,  1989)及びPDGFR-R(Kumabe et al.,Oncogene,7:627-633,1992は、多くの腫瘍内で過剰発現されるか及び/又はオートクリンループ(autocrine loop)によって持続的に活性化される。実際に、大部分の通常の重篤な癌において、これらの受容体は過剰発現し(Akbasak and Suner-Akbasak et al., J.Neuro. Sci.,111: 119-133,1992；Dickson et al.,Cancer Treatment Res.,61:249-273,1992；Korc et al.,J.Clin.Invest.,90:1352-1360,1992)そしてオートクリンループ(Lee and Donoghue,J.Cell.Biol.,118:1057-1070,1992；Korc et al.の前掲の文献；Suner -Akbasak et al.の前掲の文献)が実証されている。例えば、EGFRは、扁平上皮細胞癌、星状細胞腫、グリア芽細胞腫、頭頸部癌、肺癌及び膀胱癌に関与している。HER2は、乳房、卵巣、胃、肺、膵臓及び膀胱の癌に関与している。PDGFRは、肺癌、卵巣癌及び前立腺癌のみならずグリア芽細胞腫と黒色腫に関与している。また、RTK c-metは悪性腫瘍の生成に関与している。例えば、c-metは、癌の中でもとりわけ、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、胃癌及び肝細胞癌並びにリンパ腫に関与している。さらに、c-metは白血病に関与している。また、c-met遺伝子の過剰発現は、ホジキン病やバーキット病の患者に検出されている。
【０１６１】
IGF-IRは、栄養補給とII型糖尿病に関与していることに加えて、数種類の癌にも関与している。例えば、IGF-IRは、数種類の腫瘍、例えばヒトの乳癌細胞(Arteaga et al.,J.Clin.Invest.,84:1418-1423,1989)及び小肺腫瘍細胞(Macauley et al.,Cancer Res.,50:2511-2517,1990)に対するオートクリン増殖スティミュレーター(autocrine growth stimulator)として関与している。さらに、IGF-Iは、神経系の正常な増殖と分化に完全に関与しながら、ヒトの神経膠腫のオートクリンスティミュレーターでもあるようである(Sandberg-Nordqvist et al.,Cancer Res.,53:2475-2478,1993)。IGF-IRとそのリガンドの細胞増殖における重要性は、培養中の多くの細胞型(線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、Ｔ−リンパ球、骨髄細胞、軟骨細胞及び骨芽細胞(骨髄の幹細胞))がIGF-Iによって刺激されて増殖するという事実によってさらに支持されている(Goldring and Goldring,Eukaryotic Gene Expression,1:301  -326,1991)。BasergaとCoppolaは、IGF-IRが形質転換の機構において中心的な役割を演じ、それ自体、広いスペクトルのヒトの悪性腫瘍に対して治療介入するための好ましいターゲットになりうることを示唆している(Baserga,Cancer Res.,55:249-252,1995；Baserga,Cell,79:927-930,1994；Coppola et al.,Mol.Cell.Biol.,14: 4588- 4595, 1994)。
【０１６２】
STKは、特に乳癌を含む多種類の癌に関与している(Cance et al.,Int.J.  Cancer,54:571-577,1993)。
【０１６３】
異常なPKの活性と疾患との関連は癌に限らない。例えば、PTKは、乾癬、真性糖尿病、子宮内膜症、新脈管形成、じゅく状斑の発生、アルツハイマー病、再狭窄、フォンヒッペル-リンダウ病、上皮の過剰増殖、神経変性病、加齢黄斑変性及び血管腫に関与している。例えば、EGFRは角膜や真皮の創傷が治癒するときに認められている。インスリン-R及びIGF-1Rの欠乏は、II型真性糖尿病に認められている。特異的RTKとそれらの治療適応症とのより完全な相関関係は、Plowman et al.,DN&P,7:334-339,1994に記載されている。
【０１６４】
先に述べたように、RTKのみならず、限定されないがsrc、abl、fps、yes、fyn、lyn、lck、blk、hck、fgr及びyrk(Bolen et al.,FASEB J.,6:3403-3409,1992に総説されている)を含むCTKは、増殖と代謝のシグナル伝達経路に関与しているので、本発明が目的とする多くのRTK仲介障害に関与していると考えられかつ分かっている。例えば、変異したsrc(v-src)は、鶏中の癌タンパク質(pp60v-src)であることが分かっている。さらに、その細胞ホモログの癌原遺伝子のpp60c-srcが多くの受容体の癌シグナルを伝達する。腫瘍中でEGFR又はHER2/neuが過剰発現すると、pp60c-srcの恒常的な活性化が起こり、これは悪性細胞の特徴であるが正常な細胞にはない。一方、c-src発現不全のマウスは、骨粗しょう症の表現型を示し、これは、c-srcが破骨細胞の機能に必ず参画して類縁疾患に関与している可能性があることを示している。
【０１６５】
同様に、Zap70が、自己免疫障害に関連するT細胞のシグナル伝達に関与ししている。
【０１６６】
STKは、炎症、自己免疫疾患、免疫応答並びに再狭窄、線維症、乾癬、骨間接症およびリウマチ様関節炎などの過剰増殖障害に関与している。
【０１６７】
PKは、胚子の着床にも関与している。したがって、本発明の化合物は、このような胚子の着床を妨げる有効な方法を提供できるので、受胎調節剤として有用である。本発明の化合物を使って治療又は予防できる追加の障害は、自己免疫疾患などの免疫疾患、AIDS、及びアテローム性動脈硬化症などの心臓血管障害である。
【０１６８】
最後になるが、RTKとCTKの両者は、現在、高度免疫疾患に関与しているのではないかと疑われている。
【０１６９】
提供した化合物とデータが本発明の範囲を限定すると、決してみなしてはならない。
【０１７０】
医薬組成物と使用
本発明の化合物もしくははその生理学的に許容できる塩は、それ自体ヒトの患者に投与することができ又は上記物質が適切な担体もしくは1種もしくは2種以上の添加剤と混合されている医薬組成物で投与できる。医薬の配合法と投与法は、米国ペンシルベニア州イーストン所在のMack Publishiing Co.発行の最新版「Remingtons Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【０１７１】
投与経路
適切な投与経路としては、限定されないが、経口、口内、直腸内、粘膜経由もしくは腸内投与、又は筋肉内、表皮内(epicutaneous)、非経口、皮下、経皮、髄内、くも膜下、直接脳室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内、硬膜内、呼吸器内(intrarespiratory)、経鼻吸入又は眼内の注射がある。好ましい投与経路は経口及び非経口の経路である。
【０１７２】
あるいは、化合物を、全身ではなくて局所に投与することができる。例えばしばしばデポー剤又は徐放剤の形態で、化合物を充実性腫瘍に直接注射することによって投与できる。
【０１７３】
さらに、医薬を、標的指向医薬デリバリー(送達)システム、例えば、腫瘍特異的抗体をコートされたリポソームに入れて投与できる。このリポソームは標的に向かって進み、腫瘍によって選択的に吸収される。
【０１７４】
組成物/配合
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知の方法、例えば通常の混合、溶解、造粒、糖衣剤製造、研和、乳化、カプセル充填、エントラッピング(entrapping)、凍結乾燥法又は噴霧乾燥法によって製造できる。
【０１７５】
本発明の方法に使用する医薬組成物は、どの薬剤学の方法でも製造できるが、すべての方法が、1種又は2種以上の必要成分を構成している有効成分を、担体と混合するステップを含んでいる。特に本発明で使用する医薬組成物は、活性化合物を医薬として使用できる製剤に加工しやすくする添加剤と補助剤を含む、1種又は2種以上の生理学的に許容できる担体を使って、通常の方法で配合できる。適正な配合は選択された投与経路によって決まる。
【０１７６】
剤形としては、錠剤、トローチ剤、分散剤、懸濁剤、水剤、カプセル剤、貼付剤、シロップ剤、エリキシル剤、ゲル剤、粉末剤、マグマ剤、ロゼンジ剤、軟膏、クリーム剤、パスタ剤、ローション剤、ディスク剤、坐剤、鼻腔内又は経口スプレー剤、エアゾール剤などがある。
【０１７７】
注射用に、本発明の化合物は、水溶液に、好ましくは生理学的に共存できる緩衝液(低濃度の界面活性剤もしくは補助溶剤を含有しているか又は含有していない)又は生理食塩水の緩衝液に配合できる。経粘膜投与用には、浸透すべきバリアーに適した浸透剤を配合に使用する。このような浸透剤は当該技術分野で広く知られている。
【０１７８】
経口投与用には、本発明の化合物は、その活性化合物を、当該技術分野で周知の医薬として許容できる担体と混合することによって配合できる。かような担体は、患者が経口摂取できるように、本発明の化合物を、錠剤、丸剤、ロゼンジ剤、糖衣剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして配合できる。経口用の医薬製剤は、固体の添加剤を使用し、生成した混合物を任意に粉砕し、次いで、必要に応じて他の適切な補助剤を添加した後に、その顆粒混合物を加工して錠剤又は糖衣剤のコアを得ることによって製造できる。有用な添加剤は、特に、乳糖、スクロース、マンニトール又はソルビトールなどを含む糖類などの充填剤；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン及びバレイショデンプンなどのセルロース製剤；並びにゼラチン、トガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び/又はポリビニルピロリドン(PVP)などの他の物質である。必要に応じて、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸などの崩壊剤を添加してもよい。アルギン酸ナトリウムなどの塩も使用できる。
【０１７９】
糖衣剤のコアには適切なコーティングをつける。この目的のため、任意に、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び/又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機の溶媒もしくは溶媒混合物を含有していてもよい糖の濃溶液を使用できる。活性化合物の投与量の異なる組合わせを識別し又は特徴付けるために、錠剤又は糖衣剤コーティングに、染料又は顔料を添加してもよい。
【０１８０】
経口で使用できる医薬組成物としては、ゼラチンとグリセリンもしくはソルビトールなどの可塑剤とで製造されるシールされた軟カプセル剤のみならず、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル剤(push-fit capsul)がある。そのプッシュフィットカプセル剤は、乳糖などの充填剤、デンプンなどの結合剤及び/又はタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤及び任意に安定剤と混合して、有効成分を含有していてもよい。軟カプセル剤の場合、その活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィン、液状ポリエチレングリコール、クレモフォア(cremophor)、キャップムル(capmul)、長さが中位もしくは長い連鎖のモノ-、ジ-もしくはトリ-グリセリドに溶解又は懸濁させることができる。安定剤は、これらの配合中に添加できる。
【０１８１】
吸入によって投与する場合、本発明で使用する化合物は、通常、加圧パックもしくはネブライザー、及び適切な噴射剤、例えば限定されないがジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン又は二酸化炭素を使って、エーロゾルスプレイの形態で送達される。加圧エーロゾルの場合、投与量単位(dosage unit)は、計量された量を送るためにバルブを設けることによって制御できる。本発明の化合物と乳糖もしくはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物が入った、吸入器又は吹入器で使用する例えばゼラチン製のカプセル及びカートリッジを配合できる。
【０１８２】
本発明の化合物は、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与用に配合できる。注射用配合物は、例えば、保存剤を添加したアンプル又は複数投与量コンテナー(multi-dose container)の単位剤形で提供できる。本発明の組成物は、油状又は水性の賦形剤による懸濁液、溶液又は乳濁液のような形態をとることができ、そして懸濁化剤、安定剤及び/又は分散剤などの配合物質を含有していてもよい。
【０１８３】
非経口投与用の医薬組成物としては、水溶性の形態の、例えば限定されないが活性化合物の塩の水溶液がある。さらに、活性化合物の懸濁液は、親油性賦形剤で製造できる。適切な親油性賦形剤としては、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルやトリグリセリドのような合成脂肪酸ステル又はリポソームのような物質がある。注射用水性懸濁液は、その懸濁液の粘度を増大する物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランなどを含有していてもよい。その懸濁液は、任意に、適切な安定剤及び/又は化合物の溶解性を増大して高濃度の溶液を製造できるようにする薬剤を含有させてもよい。
【０１８４】
あるいは、その活性成分は、使用する前に、適切な賦形剤、例えば、滅菌された発熱物質を含有しない水で構成させるための粉末の形態でもよい。
【０１８５】
本発明の化合物は、例えば、カカオバターなどのグリセリドのような通常の坐剤基剤を使って、坐剤又は保持浣腸剤などの直腸用組成物にも配合できる。
【０１８６】
上記配合物に加えて、本発明の化合物は、デポー製剤として配合することもできる。このような長期間作用する配合物は、移植(例えば、皮下又は筋肉内)又は筋肉内注射によって投与できる。本発明の化合物は、この投与経路用に、適切なポリマー又は疎水性物質を使って(例えば、生理的に許容できる油による乳濁液として)もしくはイオン交換樹脂を使って、又は限定されないがやや難溶性の塩などのやや難溶性の誘導体として配合できる。
【０１８７】
本発明の疎水性化合物用の医薬担体の非限定例は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー及びVPD補助溶媒系などの水性相を含有する補助溶媒系である。VPDは、3％w/vのベンジルアルコール、8%w/vの非極性界面活性剤Polysorbate 80及び65%w/vのポリエチレングリコール300を含有する無水エタノールによる溶液である。VPD補助溶媒系(VPD:D5W)は、5%のデキストリン含有水溶液で1:1の比率で希釈したVPDで構成されている。この補助溶媒系は疎水性化合物を良好に溶解し、それ自体、全身投与した場合の毒性は低い。当然のことであるが、この補助溶媒系の比率は、その溶解度や毒性の特性を破壊することなくかなり変更できる。さらに、その補助溶媒成分の本体は変えることができる。例えば、Polysorbate 80の代わりに、他の低毒性の非極性界面活性剤を使用することができ、ポリエチレングリコールの画分量は変えることができ、他の生体適合性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンをポリエチレングリコールの代わりに使用することができ、そして他の糖類すなわち多糖類をデキストロースの代わりに使える。
【０１８８】
あるいは、疎水性医薬化合物用の他の送達システムを採用できる。リポソームと乳濁液は、疎水性医薬用の送達賦形剤又は送達担体の周知の例である。さらに、ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒も採用できるが、毒性が高いという犠牲を払わねばならないことが多い。
【０１８９】
その上に、本発明の化合物は、治療剤を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性マトリックスなどの徐放システムを使って送達できる。各種の徐放性マトリックスが確立されており、当該技術分野ではよく知られている。徐放性カプセルは、その化学的性質によって、化合物を数週間から100日以上までも放出する。治療剤の化学的性質と生物学的安定性によって、タンパク質を安定化する追加の戦略を採用できる。
【０１９０】
本発明の医薬組成物は、適切な固相又はゲル相の担体又は添加剤を含有していてもよい。このような担体又は添加剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、各種糖類、デンプン類、セルロース誘導体、ゼラチン及びポリエチレングリコールなどのポリマーがある。
【０１９１】
本発明のPKを調節する化合物の多くは、特許請求化合物が負電荷又は正電荷の種を形成できる生理的に許容できる塩として提供できる。本発明の化合物が正電荷の部分を形成する塩の例としては、限定されないが、第四級アンモニウム塩(本明細書の別の場所で定義する)、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩及びメチルスルホン酸塩(CH3SO3)がある。なお第四級アンモニウム基の窒素原子は、適切な酸と反応した本発明の選択された化合物の窒素である。本発明の化合物が負電荷の種を形成する塩としては、限定されないが、本発明の化合物のカルボン酸基と適切な塩基(例えば、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化カリウム(KOH)、水酸化カルシウム(Ca(OH)2など)との反応によって形成されるナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩がある。
【０１９２】
投与量
本発明で使用するのに適した医薬組成物はとしては、有効成分が、意図する目的、すなわちPKの活性の調節又はPK関連障害の治療と予防を達成するために充分な量で含有されている組成物がある。
【０１９３】
さらに具体的に述べると、治療上有効な量は、疾患を予防し、疾患の症状を軽減もしくは改善し又は治療されている被検者の生存を延長するのに有効な化合物の量を意味する。
【０１９４】
治療上有効な量は、当業者が、特に本明細書に詳しく開示されていることを参照して決定することができる。
【０１９５】
本発明の方法で使用されるどの化合物も、治療上有効な量又は投与量は、最初、細胞培養検定法で推定できる。したがって、細胞培養で測定されるIC50（すなわち、c-Metの活性を最大50%阻止する被検化合物の濃度)を含む循環濃度範囲を得るため動物モデルに使用する投与量を案出できる。次いで、かような情報を使用して、ヒトの有用な投与量をより正確に決定することができる。
【０１９６】
本明細書に記載の化合物の毒性と治療効能は、標準の製薬法によって細胞培養又は実験動物で、例えば、被検化合物のIC50とLD50(この両者は本明細書の別の場所で考察する)を測定することによって測定できる。これら細胞培養検定法や動物実験から得たデータを使って、ヒトに使用する投与量の範囲を案出できる。その投与量は、採用される剤形及び利用される投与経路によって変えることができる。的確な配合、投与経路及び投与量は、個々の医師が患者の症状に照らして選択できる(例えば、Fingl et al.,「The Pharmacological Basis of Therapeutics」Ch.1p.1,1975参照)。
【０１９７】
投与量と投与間隔を個々に調節して、キナーゼを調節する作用を維持するのに充分な活性種の血漿濃度を提供することができる。これら血漿濃度は、最小有効濃度(MEC)と呼称される。このMECは、各化合物について変化するが生体外のデータから推定することができ、例えば、キナーゼを50~90%阻害するのに必要な濃度は、本明細書に記載の検定法を使って確認できる。MECを達成するのに必要な投与量は、投与の個々の特性と経路によって決まる。HPLC検定法又は生物検定法を使って、血漿濃度を測定できる。
【０１９８】
投与間隔も、MEC値を使って決定できる。化合物は、期間の10〜90%、好ましくは30〜90%、最も好ましくは50〜90%にわたって血漿濃度をMECを超える値に維持する方式を利用して投与しなければならない。現在、式(Ｉ)で表される化合物の治療上有効な量は、一日当たり約10mg/m2〜1000mg/m2の範囲内である。より好ましい範囲は25mg/m2〜500mg/m2である。
【０１９９】
局所投与又は選択摂取の場合、医薬の有効局所濃度は、血漿濃度に関連無しに、当該技術分野で公知の他の方法を利用して、正しい投与量と投与間隔を決定できる。
【０２００】
投与される組成物の量は、勿論、治療されている被験者、苦痛の重篤度、投与法、担当医師の判断などに依存している。
【０２０１】
包装
本発明の組成物は、必要に応じて、有効成分を含有する1個又は2個以上の単位剤形が入っているFDA認可キットなどのパック(pack)又はディスペンサーに入れて提供できる。そのパックは、例えば、ブリスターパック(blister pack)などの金属又はプラスチックのフォイルで構成されていてもよい。そのパック又はディスペンサーには投与に関する説明書が添付されている。そのパック又はディスペンサーには、その容器に、医薬の製造、使用又は販売を規制する政府当局が指示する書式の通達が添付されており、その通達には、その当局による、組成物の形態又はヒトもしくは家畜への投与形態の認可が示されている。かような通達は、例えば、米国食品医薬品局が認可した処方医薬に対する表示付け又は認可製品のインサート(insert)の通達でもよい。相溶性の医薬担体に配合された本発明の化合物を含有する組成物は、製造し、適正な容器に入れそして示した症状の治療法について表示される。ラベルに示される適切な症状の治療法としては、腫瘍の治療法、新脈管形成を阻止する方法、線維症、糖尿病などの治療法がある。
【０２０２】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供するものである。しかし、本発明は、これら実施例に記載されている特定の条件又は詳細事項に限定されないと解すべきである。本明細書の全体を通じて、引用された公的に入手できる文書は、具体的に本特許願に援用するものである。
【実施例】
【０２０３】
一般的合成方法
一般的方法
【化３】
2007501229.tif 000005
【０２０４】
中間体
実施例A：2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化４】
2007501229.tif 000006
【０２０５】
方法1
ポリリン酸(20 g)とP2O5(1.0 g)を混合して、70℃で20分間加熱した。その混合物に、3-(４-エトキシカルボニル-5-メチル-3-ピロリル）プロパン酸(1.0 g,4.44mmol)を添加し、加熱を20時間続けた。その反応混合物を氷水に注ぎいれEtOAcで抽出した。その有機層をブラインと飽和NaHCO3で洗浄し乾燥した(MgSO4)。溶媒を除いた後、粗製生成物を、CH2Cl2-ヘキサンから再結晶させて、(0.78g,85%)の2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステルを白色固体として得た。
【０２０６】
方法2
メタンスルホン酸(170.0g)とP2O5(17.0g)の混合物を、透明な溶液になるまで、室温から100℃まで1時間攪拌した。その溶液を、30℃まで放冷し、次いで３-（４-エトキシカルボニル-5-メチル-3-ピロリル）プロパン酸(10.0g,44.4 mmol)を攪拌しながら少しづつ添加した。その混合物を30-40℃で4時間攪拌して一夜静置した。その反応混合物を冷NaHCO3(60.0g)中にゆっくり注ぎいれた。沈澱を濾過で集め、水、飽和NaHCO3及び水で順に洗浄して標題の化合物8.95 g(97%)を灰白色の固体として得た。
【化５】
2007501229.tif 000007
【０２０７】
実施例 B：2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸
【化６】
2007501229.tif 000008
2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル(実施例A,8.28g,40mmol)の1N LiOH水溶液(150mL)による懸濁液を、50-60℃で48時間攪拌した。透明な黄色溶液を得た。その反応混合物を放冷し、氷中に注ぎいれ次いで6N HClでpH 3.0まで酸性にした。その固体を濾過して集め、水で洗浄し、乾燥して6.55g(91%)の標題化合物を白色固体として得た。
【化７】
2007501229.tif 000009
【０２０８】
実施例 C：2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸ベンジルアミド
【化８】
2007501229.tif 000010
乾燥DMF(5mL)中の、2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(実施例B,268.6mg,1.5mmol)、HOBt(202.5mg,1.5 mmol)及びEDC (573.5mg,3molの混合物を、室温にて20分間攪拌した。次にその混合物に、アニリン(3.0mmol)を添加し、攪拌を24時間続けた。その反応混合物を飽和NaHCO3と水で希釈し、固体を減圧濾過で集め、飽和NaHCO3と水で順に洗浄し乾燥して315mgの標題化合物を白色固体として得た。
【化９】
2007501229.tif 000011
【０２０９】
実施例 D：2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸4-クロロ-ベンジルアミド
【化１０】
2007501229.tif 000012
【０２１０】
4-クロロアニリン以外は実施例Cと同じ方法を利用して、403mgの標題化合物を白色固体として得た。
【化１１】
2007501229.tif 000013
【０２１１】
実施例 E：2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸2,6-ジフルオロ-ベンジルアミド
【化１２】
2007501229.tif 000014
【０２１２】
2,6-ジフルオロアニリン以外は実施例Cと同じ方法を利用して、401mgの標題化合物を白色固体として得た。
【化１３】
2007501229.tif 000015
【０２１３】
実施例 F：2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-6-オン
【化１４】
2007501229.tif 000016
【０２１４】
乾燥DMF(50mL)中の、2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(実施B,3.58g,20mmol)、HOBt(2.7g,20mmol)及びEDC(5.74g,30mmol)の混合物を、0℃から室温まで、20分間攪拌した。次に、(S)-(+)-1-(2-ピロリジニルメチル)ピロリジン(24mmol)を添加し、攪拌を48時間続けた。溶媒を減圧下除き、残留物をEtOAcに溶解し、飽和NaHCO3で洗浄し、乾燥し、濃縮し次いでシリカゲルのカラムで精製して、5.1g(81%)の標題化合物を黄色みを帯びた泡状物として得た。
【化１５】
2007501229.tif 000017
【０２１５】
実施例 1：2-メチル-6-[2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]- 1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化１６】
2007501229.tif 000018
【０２１６】
DMF(5mL)-ピペリジン(0.5mL)中の、オキシインドール(44mg,0.33mmol)と2-メチル-６-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル(実施例A,62mg,0.3mmol)の混合物を、攪拌しながら110℃で72時間加熱した。大部分の溶媒を減圧下で除き、残留物をエタノールで希釈した。生成した沈澱を濾過して集め、エタノールで洗浄し乾燥して、56 mg(58%)の標題化合物を黄色固体として得た。
【化１７】
2007501229.tif 000019
【０２１７】
実施例2：6-[5-(2,6-ジクロロ-フェニルメタンスルホニル)-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化１８】
2007501229.tif 000020
【０２１８】
実施例1と類似の手順で標題化合物(48%)を黄色固体として得た。
【化１９】
2007501229.tif 000021
【０２１９】
実施例3：2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化２０】
2007501229.tif 000022
【０２２０】
実施例1と類似の手順で標題化合物(65%)を黄色固体としてえた。
【化２１】
2007501229.tif 000023
【０２２１】
実施例4：3-[2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]‐2‐オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド
【化２２】
2007501229.tif 000024
実施例5参照
【化２３】
2007501229.tif 000025
【０２２２】
実施例5：2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸
【化２４】
2007501229.tif 000026
【０２２３】
DMF(50mL)とピペリジン(5mL)中の、2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド(905mg,4mmol)及び2-メチル-6-オキソ-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(実施B,716mg,4mmol)を攪拌しながら110℃で48時間加熱した。溶媒を除き、残留物をメタノール-氷-水中に懸濁させ次いで2N塩酸によって酸性にした。固体を濾過して集めDCM中に懸濁させた。その懸濁液を2N NaOH水溶液で3回洗浄した。合した水層をDCMで逆洗した。その水層を2N HClで酸性にし濾過して褐色の固体を得て、これをMeOHでトリチュレートして380mgの標題化合物を黄褐色の固体として得た。合した有機層を乾燥し(Na2SO4)蒸発させて、130mgの3-[2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]‐2‐オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド(実施例4)を黄色固体として得た。
【化２５】
2007501229.tif 000027
【０２２４】
実施例6：6-[5-メタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化２６】
2007501229.tif 000028
【０２２５】
実施例1と類似の手順で、標題化合物(65%)を黄色固体として得た。
【化２７】
2007501229.tif 000029
【０２２６】
実施例7：6-[5-ジメチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化２８】
2007501229.tif 000030
実施例1と類似の手順で標題化合物(59%)を黄色固体として得た。
【化２９】
2007501229.tif 000031
実施例8：6-[5-イソプロピルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化３０】
2007501229.tif 000032
【０２２７】
実施例1と類似の手順で、標題化合物(65%)を黄色固体として得た。
【化３１】
2007501229.tif 000033
【０２２８】
実施例9：6-[5-エタンスルホニル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-2-メチル-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化３２】
2007501229.tif 000034
実施例1と類似の手順で、標題化合物(40%)を黄色固体として得た。
【化３３】
2007501229.tif 000035
【０２２９】
実施例10：2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ヒドロキシ-3-ピロリジン-1-イル-プロピル)-アミド
【化３４】
2007501229.tif 000036
乾燥DMF(2mL)中の、2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(実施例5,78mg,0.2mmol)、HOBt(27mg,0.2mmol)及びEDC(77mg,0.4mmol)の混合物を、室温で30分間攪拌した。次に、1-アミノ-3-ピロリジン-1-イル-プロパン-2-オール(0.4mmol)を添加し、攪拌を48時間続けた。溶媒を減圧で除き次に残留物を結晶させ次いでシリカゲルカラムで精製して54mgの標題化合物を黄色固体として得た。
【化３５】
2007501229.tif 000037
【０２３０】
実施例11：2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(3-シクロプロピルアミノ-2-ヒドロキシ-プロピル)-アミド
【化３６】
2007501229.tif 000038
1-アミノ-3-シクロプロピルアミノ-プロパン-2-オール以外、実施例10と同じ手順を利用して53mgの標題化合物を黄色固体として得た。
【化３７】
2007501229.tif 000039
【０２３１】
実施例12：2-メチル-6-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸(2-ジメチルアミノ-エチル)-アミド
【化３８】
2007501229.tif 000040
N,N-ジメチルエチレンジアミン以外、実施例10と同じ手順を利用して55mgの標題化合物をオレンジ色固体として得た。
【化３９】
2007501229.tif 000041
【０２３２】
実施例13：3-[2-メチル-3-((R)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド
【化４０】
2007501229.tif 000042
(S)-(+)-1-(2-ピロリジニルメチル)ピロリジン以外、実施例10と同じ手順を利用して54mgの標題化合物を黄色固体として得た。
【化４１】
2007501229.tif 000043
【０２３３】
実施例14：2-メチル-6-[2-オキソ-5-スルファモイル-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-1,4,5,6-テトラヒドロ-シクロペンタ[b]ピロール-3-カルボン酸エチルエステル
【化４２】
2007501229.tif 000044
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(75%)を黄色固体として得た。
【化４３】
2007501229.tif 000045
【０２３４】
実施例15：3-シクロペンチリデン-2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド
【化４４】
2007501229.tif 000046
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(73%)を灰色固体として得た。
【化４５】
2007501229.tif 000047
【０２３５】
実施例16：3-[3-メタンスルホニル-2-メチル-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン] -2-オキソ-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸メチルアミド
【化４６】
2007501229.tif 000048
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(73%)を黄色固体として得た。
【化４７】
2007501229.tif 000049
【０２３６】
実施例17：｛6-メトキシ-3-[5-メチルスルファモイル-2-オキソ-1,2-ジヒドロ-インドール-(3Z)-イリデン]-インダン-1-イル｝-酢酸
【化４８】
2007501229.tif 000050
【０２３７】
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(28%)を緑黄色固体として得た。
【化４９】
2007501229.tif 000051
【０２３８】
実施例18：5-フルオロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
【化５０】
2007501229.tif 000052
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(62%)を緑黄色固体として得た。
【化５１】
2007501229.tif 000053
【０２３９】
実施例19：6-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
【化５２】
2007501229.tif 000054
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(70%)を黄色固体として得た。
【化５３】
2007501229.tif 000055
【０２４０】
実施例20：4-メトキシ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
【化５４】
2007501229.tif 000056
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(63%)を黄色固体として得た。
【化５５】
2007501229.tif 000057
【０２４１】
実施例21：7-クロロ-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
【化５６】
2007501229.tif 000058
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(57%)を緑黄色固体として得た。
【化５７】
2007501229.tif 000059
【０２４２】
実施例22：3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-ピロロ[2,3-b]ピリジン-2-オン
【化５８】
2007501229.tif 000060
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(21%)を黄色固体として得た。
【化５９】
2007501229.tif 000061
【０２４３】
実施例23：6-(4-メトキシ-フェニル)-3-[2-メチル-3-((S)-2-ピロリジン-1-イルメチル-ピロリジン-1-カルボニル)-4,5-ジヒドロ-1H-シクロペンタ[b]ピロール-(6Z)-イリデン]-1,3-ジヒドロ-インドール-2-オン
【化６０】
2007501229.tif 000062
【０２４４】
実施例1と類似の手順を利用して標題化合物(63%)を黄色固体として得た。
【化６１】
2007501229.tif 000063
化合物のどの与えられたシリーズでも、生物活性の範囲が観察されることは分かるであろう。本発明は、その現在好ましい側面で、プロテインキナーゼの活性を調節、制御及び/又は阻害できる新規の幾何学的に束縛された置換インドリノン類に関する。下記の検定法を採用して、必要な最適活性度を示すこれら化合物を選択できる。
【０２４５】
検定法の手順
下記の生体外検定法を使用して、1種又は2種以上のPKに対する、本発明の各種化合物の活性と作用のレベルを測定できる。当該技術分野で周知の技術を使って、どのPKについても同じ方法で類似の検定法を設計できる。
【０２４６】
本明細書に記載の検定法のいくつかは、ELISA(酵素結合免疫吸着サンドイッチ検定法)方式(Voller et al.,「Enzyme-Linked Immunosorbent Assay」Mnual of Clinical Immunology, 2d ed.,Rose and Friedman,Am.Soc.Of Microbiology, Washington,D.C.,pp.359-371,1980)で実施される。その概略の手順は、下記の通りである。すなわち、天然に又は遺伝子組換えによって被検キナーゼを発現する細胞に、化合物を導入し、選択された期間が経過した後、その被検キナーゼが受容体であれば、その受容体を活性化することが分かっているリガンドを添加する。その細胞は溶解され、次いでその細胞溶解液を、酵素によるリン酸化反応の基質を認識する特異的抗体で予めコートされたELISAプレートのウエルに移す。その細胞溶解液の非基質成分を洗い流し、次に基質に対するリン酸化の程度を、被検化合物と接触させなかった対照の細胞と比較して、ホスホチロシンを特異的に認識する抗体で検出する。
【０２４７】
特異的PKに対してELISA実験を行う現在の好ましいプロトコルを以下に述べる。しかし、このプロトコルを、CTK類やSTK類のみならず他のRTK類に対する化合物の活性を測定するのに適用することは、当業者の知識の範囲内に充分入っている。
【０２４８】
本明細書に記載の他の検定法は、増殖の応答の一般的な尺度である、被検キナーゼの活性化に対する応答で産生されるDNAの量を測定する。この検定法の概略の手順は下記の通りである。すなわち、天然に又は遺伝子組換えによって被検キナーゼを発現する細胞に、化合物を導入し、選択された期間が経過した後、その被検キナーゼが受容体であれば、その受容体を活性化することが分かっているリガンドを添加する。少なくとも一夜インキュベートした後、５-ブロモデオキシウリジン(BrdU)又はH3-チミジンなどのDNA標識剤を添加する。その標識を付けられたDNAの量を、抗BrdU抗体によって又は放射能を測定することによって検出し、次いで被検化合物と接触させなかった対照の細胞と比較する。
【０２４９】
GST-FLK-1生物検定法
この検定法は、ポリ(glu-tyr)ペプチド類に対するGST-Flk1のチロシンキナーゼ活性を分析する。
【０２５０】
材料及び試薬
1. Corning 96-ウエルELISAプレート(Corning Catalog No.25805-96)。
【０２５１】
2. ポリ(glu-tyr)4:1,lyophilizate(Sigma Catalog No.P0275),1mg/ml滅菌PBS中。
【０２５２】
3. PBS緩衝液：約900mlのdH2O中に0.2gのKH2PO4、1.15gのNa2HPO4、0.2 gのKCl及び8gのNaClを混合して1Lにした液。すべての試薬が溶解したとき、pHをHClで7.2に調整する。全容積をdH2Oで1Lにする。
【０２５３】
4. PBST緩衝液：１LのPBS緩衝液に1.0mlのTween-20を添加する。
【０２５４】
5. TBB-ブロッキング緩衝液：約900mlのdH2O中に1.21gのTRIS、8.77gのNaCl、1mlのTween-20を混合して1Lにした液。pHをHClで7.2に調整する。10gのBSAを添加し攪拌して溶解する。全容積を、dH2Oで1Lにする。濾過して粒状物質を除く。
6. PBS中1%のBSA：10gのBSAを約990mlのPBS緩衝液に添加し攪拌して溶解する。全容積を、PBS緩衝液で1 Lに調整し、濾過して粒状物質を除く。
7. 50mM Hepes pH 7.5。
【０２５５】
8. sf9組換えバキュロウイルス形質転換から精製したGST-Flk1cd(SUGEN,Inc.)。
【０２５６】
9. dH2O中4%のDMSO。
【０２５７】
10.dH2O中10mMのATP。
【０２５８】
11.40mMのMnCl2.
【０２５９】
12. キナーゼ希釈緩衝液(KDB)：10mlのHepes(pH 7,5)、1mlの5M NaCl、40 μlの100mMオルトバナジン酸ナトリウム及び0.4mlの5% BSAをdH2O中に、88,56mlのdH2Oを使って混合する。
【０２６０】
13. NUNC 96-ウエルV底ポリプロピレン製プレート、Applied Scientific Catalog#AS-72092。
【０２６１】
14. EDTA：14.12gのエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)を約70mlのdH2Oと混合する。10 N NaOHを、EDTAが溶解するまで添加する。pHを8.0に調整する。全容積をdH2Oで100mlに調整する。
15. 10及び20抗体希釈緩衝液：10mlの5%BSAをPBS緩衝液中に89.5mlのTBSTで混合する。
【０２６２】
16. 抗ホスホチロシンウサギポリクローナル抗血清(SUGEN,Inc.)。
【０２６３】
17. ヤギ抗ウサギHRPコンジュゲート。
【０２６４】
18. ABST溶液：約900mlのdH2Oに、19.21gのクエン酸及び35.49gのNa2HPO4を添加する。pHをリン酸で4.0に調整する。2,2’-アジノビス(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸(ABTS,Sigma,Cat.No.A-1888)を添加する。約30分間保持し、濾過する。
【０２６５】
19. 30%過酸化水素。
【０２６６】
20. ABST/H2O：3μlのH2O2を15mlのABST溶液に添加する。
【０２６７】
21. 0.2M HCl。
【０２６８】
手順：
1. Corning 96ウエルELISAプレートを、１ウエル当たり、100μl PBS中2μgのポリＥＹでコートし、室温で2時間保持するか又は4℃で一夜保持する。プレートは蒸発を防ぐためカバーする。
【０２６９】
2. プレートを逆さにすることによって結合していない液体をウエルから除く。TBSTで1回洗浄する。プレートをペーパータオルでたたいて過剰の液体を除く。
【０２７０】
3. PBS中1%のBS100μlを各ウエルに添加する。振盪しながら、室温で1時間インキュベートする。
【０２７１】
4. ステップ2を繰り返す。
【０２７２】
5. ウエルを、50mM HEPES(pH 7.5,150μl/ウエル)に浸す。
【０２７３】
6. 被検化合物を、dH2O/4%DMSOで4倍に希釈する(96ウエル ポリプロピレン製プレートにおける所望の最終検定濃度)。
【０２７４】
7. 25μlの希釈された被検化合物を、ELISAプレートの各ウエルに添加する。対照のウエルには25μlのdH2O/4%DMSOを入れる。
【０２７５】
8. GST-Flk1 0.005μg(5ng)/ウエルをKDBで希釈する。
【０２７６】
9. 50μlの希釈された酵素を各ウエルに添加する。
【０２７７】
10. 25μlの0.5M EDTAを負の対照のウエルに添加する。
【０２７８】
11. 25μlの4XATP(2μＭ)含有40mM MnCl2をすべてのウエルに添加する(最終容積100μl、各ウエル中の最終濃度0.5μM ATP)。
【０２７９】
12. 振盪しながら室温で15分間インキュベートする。
【０２８０】
13. 25μlの500mM EDTAを各ウエルに添加することによって反応を停止させる。
【０２８１】
14. TBSTで3回洗浄し、次いでプレートをペーパータオルでたたいて過剰の液体を除く。
【０２８２】
15. 1ウエル当たり100μlの抗ホスホチロシン抗血清(抗体希釈緩衝液で1:10,000の比率で希釈したもの)を添加する。振盪しながら、室温で90分間インキュベートする。
【０２８３】
16. ステップ14と同様に洗浄する。
【０２８４】
17. ヤギ抗ウサギHRPコンジュゲート(抗体希釈緩衝液中1:10,000の比率で希釈したもの)を100μl/ウエル添加する。振盪しながら、室温で90分間インキュベートする。
【０２８５】
18. ステップ14と同様に洗浄する。
【０２８６】
19. 室温のABST/H2O2溶液100μlを各ウエルに添加する。
【０２８７】
20. 振盪しながら、室温で15〜30分間インキュベートする。
【０２８８】
21. 必要に応じて、100μlの0.2M HClを各ウエルに添加して反応を停止させる。
【０２８９】
22． 410nMの試験フィルターと630nMの基準フィルターを使ってDynatech MR7000 ELISA readerで結果を読み取る。
【０２９０】
PYK2 生物検定法
この検定法を使用して、ELISA検定法におけるHAエピトープ-タッグ付全長のpyk2(FL.pyk2-HA)の生体外でのキナーゼ活性を測定する。
【０２９１】
材料と試薬：
1. Corning 96 ウエルELISAプレート。
【０２９２】
2. 12CA5モノクローナル抗HA抗体(SUGEN,Inc.)。
【０２９３】
3. PBS(ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水(Gibco Catalog#450-1300EB)。
【０２９４】
4. TBST緩衝液：約900mlのdH2Oに8.766gのNaCl、6.057gのTRIS及び1mlの0.1%Triton X-100を混合して1Lにした液。pHを7.2に調整し、容積を1Lにする。
【０２９５】
5. ブロッキング緩衝液：100gの10%BSA、12.1gの100mM TRIS、58.44gの1M NaCl及び10mLの1%Tween-20を混合して1Lにしたもの。
【０２９６】
6. sf9 細胞溶解液由来のFL.pyk2-HA(SUGEN,Inc.)。
【０２９７】
7. MilliQueH2O中4% DMSO
【０２９８】
8. dH2O中10mM ATP。
【０２９９】
9. 1M MnCl2。
【０３００】
10. 1M MgCl2。
【０３０１】
11. 1M ジチオトレイトール(DTT)。
【０３０２】
12. 10Xキナーゼ緩衝液リン酸化：2.8mlのdH2O中に5.0mlの1M  HEPES(pH 7.5)、0.2mlの1M MnCl2、1.0mlの1M MgCl2、1.0mlの10% Triton X-100を混合する。使用する直前に、0.1mlの1M DTTを添加する。
【０３０３】
13. NUNC 96 ウエルV底ポリプロピレン製プレート。
【０３０４】
14. dH2O中500mM EDTA。 
【０３０５】
15. 抗体希釈緩衝液：88mL TBS中に1mLの5%BSA/PBS及び1mLの10% Tween-20を混合し100mLにする。
【０３０６】
16. HRPコンジュゲート化抗Ptyr(PY99,Santa Cruz Biotech Cat.  No.SC  -7020)。
【０３０７】
17. ABTS,Moss,Cat.No.ABST-2000。
【０３０８】
18. 10% SDS。
【０３０９】
手順：
1. Corning 96ウエルELISAプレートを、１ウエル当たり、100μlPBS中12CA5抗HA抗体0.5μg でコートする。4℃で一夜保存する。
【０３１０】
2. プレートを逆さにして、未結合のHA抗体をウエルから除く。プレートをペーパータオルでたたいて過剰の液体を除く。
【０３１１】
3. 150μlのブロッキング緩衝液を各ウエルに添加する。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
【０３１２】
4. プレートをTBS-Tで4回洗浄する。
【０３１３】
5. 細胞溶解液をPBSで希釈する(1.5μg細胞溶解液/100μl PBS)。
【０３１４】
6. 希釈された細胞溶解液100μlを各ウエルに添加する。室温で1時間振盪する。
【０３１５】
7. ステップ4と同様に洗浄する。
【０３１６】
8. 50μlの2Xキナーゼ緩衝液を、捕獲されたpyk2-HAが入っているELISAプレートに添加する。
【０３１７】
9. 4% DMSO中400μMの被検化合物25μlを、各ウエルに添加する。対照ウエルには4%DMSOだけを使う。
【０３１８】
10. 25μlの0.5M EDTAを、負の対照のウエルに添加する。
【０３１９】
11. 25μlの20μM ATPをすべてのウエルに添加する。振盪しながら10分間インキュベートする。
【０３２０】
12. 25μlの500mM EDTA(pH 8.0)をすべてのウエルに添加して反応を停止させる。
【０３２１】
13. ステップ4と同様に洗浄する。
【０３２２】
14. 抗体希釈緩衝液で1:6000の比率で希釈したHRPコンジュゲート化抗Ptyr 100 μlを、各ウエルに添加する。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
【０３２３】
15. プレートをTBSTで3回及びPBSで1回洗浄する。
【０３２４】
16. 100 μlのABST溶液を各ウエルに添加する。
【０３２５】
17. 必要に応じて、20μlの10% SDSを各ウエルに添加することによってデベロップメント反応を停止させる。
【０３２６】
18. 410nMの試験フィルター及び630nMの基準フィルターを使って、ELISA readerでプレートを読み取る。
【０３２７】
FGFR1 生物検定法
この検定法を使用して、ELISA検定法におけるFGF1-Rの生体外キナーゼ活性を測定する。
【０３２８】
材料と試薬：
1. Costar 96 ウエルELISAプレート(Corning Catalog#3369)。
【０３２９】
2. ポリ(Glu-Tyr)(Sigma Catalog#P0275)
【０３３０】
3. PBS(Gibco Catalog#450-1300EB)。
【０３３１】
4. 50mM Hepes緩衝溶液。
【０３３２】
5. ブロッキング緩衝液(5% BSA/PBS)。
【０３３３】
6. 精製GST-FGFR1(SUGEN,Inc,)。
【０３３４】
7. キナーゼ希釈緩衝液。
【０３３５】
500μlの 1M Hepes(GIBCO)、20μlの5% BSA/PBS、10μlの100mMオルトバナジン酸ナトリウム及び50μlの5M NaClを混合する。
【０３３６】
8. 10mM ATP。
【０３３７】
9.  ATP/MnCl2 リン酸化混合物： 20μlのATP、400μlの1 M MnCl2及び9.56 mlのdH2Oを混合する。
【０３３８】
10. NUNC 96 ウエルV底ポリプロピレン製プレート(Applied Scientific Catalog#AS-72092)。
11. 0.5M EDTA。
【０３３９】
12. 0.05% TBST。
【０３４０】
500μlのTWEENを1LのTBSに添加する。
【０３４１】
13. ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清(SUGEN,Inc.)。
【０３４２】
14.ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(Biosource,Catalog#ALI0404)。
【０３４３】
15. ABTS溶液。
【０３４４】
16. ABTS/H2O2溶液。
【０３４５】
手順：
1. Costar 96 ウエルELISAプレートを、１ウエル当たり、100μl PBS中のポリ(Glu-Tyr)1μgでコートする。4℃で一夜保存する。
【０３４６】
2. コートされたプレートをPBSで1回洗浄する。
【０３４７】
3. 150μlの5%BSA/PBSブロッキング緩衝液を各ウエルに添加する。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
【０３４８】
4. プレートをPBSで2回、次いで50mM Hepesで1回洗浄する。プレートをペーパータオルでたたいて過剰の液体と泡を除く。
【０３４９】
5. 4% DMSO中の0.4mM被検化合物又は4% DMSOだけ(対照)を25μl 、プレートに添加する。
【０３５０】
6. 精製GST-FGFR1をキナーゼ希釈緩衝液で希釈する(5ngキナーゼ/50μl KDB/ウエル)。
【０３５１】
7. 50μlの希釈されたキナーゼを各ウエルに添加する。
【０３５２】
8. 新しく調製したATP/Mn++(0.4mlの1M MnCl2、40μlの10mM ATP、9.56mlのdH2O、新しく調製)を25μl/ウエル添加することによって、キナーゼ反応を開始させる。
【０３５３】
9. 25μＬの0.5M EDTAで反応を停止させる。
【０３５４】
10. プレートを、新しいTBSTで4回洗浄する。
【０３５５】
11. 抗体希釈緩衝液を調製する。5mlの5% BSA、250μlの5%ミルク及び50μlの100mM バナジン酸ナトリウムを混合し、0.05% TBSTで最終容積50mlにする。
【０３５６】
12. 抗ホスホチロシン(ADBで1:10000の比率で希釈)を、100μl/ウエル添加する。振盪しながら、室温で1時間インキュベートする。
【０３５７】
13. ステップ4と同様に洗浄する。
【０３５８】
14. Biosourceヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(ADBで1:6000の比率で希釈)を100μl/ウエル添加する。振盪しながら、室温で1時間インキュベートする。
【０３５９】
15. ステップ10と同様に洗浄し次いでPBSで洗浄して、泡と過剰のTweenを除く。
【０３６０】
16. 100μlのABTS/H2O2溶液を各ウエルに添加する。
【０３６１】
17. 振盪しながら、10〜20分間インキュベートする。泡をすべて除く。
【０３６２】
18. Dynatech MR7000 ELISA readerの検定結果を読み取る：410nMの試験フィルター、630nMの基準フィルター。
【０３６３】
PDGFR 生物検定法
この検定法を使用して、ELISA検定法におけるPDGFRの生体外キナーゼ活性を測定する。
材料と試薬：
1. Corning 96ウエルELISAプレート。
【０３６４】
2. 28D4C10モノクローナル抗PDGFR抗体(SUGEN,Inc.)。
【０３６５】
3. PBS。
【０３６６】
4. TBST緩衝液。
【０３６７】
5. ブロッキング緩衝液(EGFR 生物検定法の場合と同じ)。
【０３６８】
6. PDGFR-βを発現するNIH 3T3細胞の溶解液(SUGEN,Inc.)。
【０３６９】
7. TBS緩衝液。
【０３７０】
8. TBS+10% DMSO。
【０３７１】
9. ATP。
【０３７２】
10.MnCl2。
【０３７３】
11.キナーゼ緩衝液リン酸化混合物：250μlの1M TRIS、200μlの5M NaCl、100μlの1M MnCl2及び50μlの100mM Toriton X-100を充分なdH2Oと混合して10mlにする。
【０３７４】
12. NUNC 96 ウエルV底ポリプロピレン製プレート。
【０３７５】
13. EDTA。
【０３７６】
14. ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン血清(SUGEN,Inc.)。
【０３７７】
15. ヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(Biosource Cat.No.ALI0404)。
【０３７８】
16. ABTS。
【０３７９】
17. 過酸化水素、30%溶液。
【０３８０】
18. ABTS/H2O2。
【０３８１】
19. 0.2M HCl。
【０３８２】
手順：
1. Corning 96ウエルELISAプレートを、１ウエル当たり、100μl PBS中0.5μgの28D4C10でコートし、一夜4℃に保持する。
【０３８３】
2. プレートを逆さにして液体を除くことによって、ウエルから未結合の28D4C10を除く。dH2Oで1回洗浄する。プレートをペーパータオルでたたいて過剰の液体を除く。
【０３８４】
3. 150μlのブロッキング緩衝液を各ウエルに添加する。振盪しながら、室温で30分間インキュベートする。
【０３８５】
4. プレートを脱イオン水で3回洗浄し次いでTBSTで1回洗浄する。プレートをペーパータオルでたたいて過剰の液体と泡を除く。
【０３８６】
5. 細胞溶解液をHNTGで希釈する(10μg細胞溶解液/100μl HNTG)。
【０３８７】
6. 100μlの希釈された細胞溶解液を各ウエルに添加する。室温で60分間振盪する。
【０３８８】
7. プレートをステップ4に記載したのと同様に洗浄する。
【０３８９】
8. 80μlのワーキングキナーゼ緩衝液混合物を、捕獲されたPDGFRを含むELISAプレートに添加する。
【０３９０】
9 .被検化合物を、96ウエルポリプロピレン製プレート中で、TBSによって1:10の比率で希釈する。
【０３９１】
10. 10μlの希釈された被検化合物を、ELISAプレートに添加する。対照のウエルには10μlのTBS+10% DMSOを添加する。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
【０３９２】
11. 負の対照のウエル以外のすべてのウエルに直接10μlのATPを添加する(最終のウエル容積は、各ウエル、20μM ATPによって約100μlでなければならない)。振盪しながら30分間インキュベートする。
【０３９３】
12. 10μlのEDTA溶液を各ウエルに添加することによって、反応を停止させる。
【０３９４】
13. 脱イオン水で4回、次いでTBSTで2回洗浄する。
【０３９５】
14. 1ウエル当たり、100μlの抗ホスホチロシン(TBSTで1:3000の比率で希釈)を添加する。振盪しながら、室温で30〜45分間インキュベートする。
【０３９６】
15. ステップ4と同様に洗浄する。
【０３９７】
16. 100μlのBiosourceヤギ抗ウサギIgGペルオキシダーゼコンジュゲート(TBSTによって1:2000の比率で希釈)を各ウエルに添加する。振盪しながら室温で30分間インキュベートする。
【０３９８】
17. ステップ4と同様に洗浄する。
【０３９９】
18. 100μlのABTS/H2O2溶液を、各ウエルに添加する。
【０４００】
19. 振盪しながら10~30分間インキュベートする。泡を除く。
【０４０１】
20. 必要に応じて、1ウエル当たり、100μlの0.2M HClを添加して反応を停止させる。
【０４０２】
21. 410nMの試験フィルター及び630nMの基準フィルターを使ってDynatech MR7000 ELISA readerで検定結果を読み取る。
【０４０３】
CDK2/CYCLIN A検定法
この検定法を使用して、シンチレーションプロキシミティー検定法(Scintillation Proximity Assay)(SPA)におけるヒトcdk2/cyclinの生体外セリン/トレオニンキナーゼ活性を測定する。
材料と試薬：
1. Wallac 96ウエル ポリエチレンテレフタレート(flexi)製プレート(Wallac Catalog#1450-401)。
【０４０４】
2. Amersham Redivue[γ33P]ATP(Amersham Catalog#AH9968)。
【０４０５】
3. AmershamのストレプトアビジンをコートしたポリビニルトルエンSPAビーズ(Amersham Catalog#RPNQ0007)。このビーズは、マグネシウム又はカルシウムを含有しないPBSによって、20mg/mlの濃度で再構成しなければならない。
【０４０６】
4. Sf9細胞から精製した活性化cdk2/cyclinA酵素コンプレックス(SUGEN,Inc.)。
【０４０７】
5. ビオチニル化ペプチドの基質(Debtide)。ペプチドビオチン-X-PKTPKKAKKLを、5mg/mlの濃度でdH2Oに溶解する。
【０４０８】
6. dH2O中20%のDMSO。
【０４０９】
7. キナーゼ緩衝液：9.1mlのdH2O、0.5mlのTRIS(pH 7.4)、0.2mlの1M MgCl2、0.2mlの10%NP40及び0.02mlの1M DTTを、使用直前に新しく添加し10mlにする。
【０４１０】
8. dH2O中10mMのATP。
【０４１１】
9. HClでpHを7.4に調節した1M Tris。
【０４１２】
10. 1M MgCl2。
【０４１３】
11.1M DTT。
【０４１４】
12．PBS(Gibco Catalog#14190-144)。
【０４１５】
13. 0.5M EDTA。
【０４１６】
14. 停止溶液：9.25mlのPBS、0.05mlの10mM ATP、0.1mlの0.5M EDTA、0.1mlの10%Triton X-100及び1.5mlの50mg/ml SPAビーズを混合して10mlにする。
【０４１７】
手順：
1. 被検化合物を5% DMSOに所望の最終濃度の4倍の濃度で溶解した溶液を調製する。10μLを各ウエルに添加する。正と負の対照として、10μLの20%DMSOのみをそれぞれのウエルに使用する。
【０４１８】
2. ペプチド基質(deb-tide)をdH2Oによって1:250の比率で希釈して最終濃度を0.02mg/mlにする。
【０４１９】
3. 24μLの0.1mM ATPを、24μのCiγ33P ATP及び充分なdH2Oと混合して600μLにする。
【０４２０】
4. 希釈されたペプチド溶液とATP溶液を、1:1の比率(600μL+600μL/ウエル)で混合する。この溶液10μLを各ウエルに添加する。
【０４２１】
5.μLのcdk2/cyclin A溶液を、2.1mlの2Xキナーゼ緩衝液で希釈する(1プレート当たり)。20μL/ウエルの酵素を添加する。負の対照として、酵素なしの2Xキナーゼ緩衝液を20μL添加する。
【０４２２】
6. プレートシェーカー上で短時間混合し、60分間インキュベートする。
【０４２３】
7. 1ウエル当たり200μLの停止溶液を添加する。
【０４２４】
8. 少なくとも10分間、静置させる。
【０４２５】
9. プレートを、約2300rpmで10〜15分間、回転させる。
【０４２６】
10..プレートを、Trilux readerで計数する。
【０４２７】
MET リン酸基転移反応検定法
この検定法を使用して、ポリ(グルタミン酸：チロシン、4：1)基質上のホスホチロシンのレベルを、この基質のmet リン酸基転移反応のアゴニスト/アンタゴニストを識別する手段として測定する。
材料と試薬：
1. Corning 96ウエルELISAプレート、Corning Catalog#25805-96.。
【０４２８】
2. ポリ(glu-tyr),4：1,Sigma,Cat.No.P 0275。
【０４２９】
3. PBS,Gibco Catalog#450-1300EB。
【０４３０】
４. 500mM HEPES。
【０４３１】
5. ブロッキング緩衝液：25gのウシ血清アルブミン(Sigma Cat.No.A-7888)を500mlのPBSに溶解し、4μmフィルターで濾過する。
【０４３２】
6. Met キナーゼドメインを含有する精製GST融合タンパク質(SUGEN,Inc.)。
【０４３３】
7. TBST緩衝液。 
【０４３４】
8. 10%水性(MilliQue H2O)DMSO。
【０４３５】
9. 10mM アデノシン-5’-三リン酸水(dH2O)溶液、Sigma cat.no.A-5394。
【０４３６】
10. 2Xキナーゼ希釈緩衝液：10mlの1M HEPES(pH 7.5、0.4mlの5% BSA/PBSを含有)、0.2mLの0.1Mオルトバナジン酸ナトリウム及び1mlの5M塩化ナトリウムを88.4ml dH2Oに混合して100mlにする。
【０４３７】
11. 4X ATP反応混合物：0.4mLの1M 塩化マンガンと0.02mlの0.1M ATPを9.56mlのdH2Oに混合して10mLにする。
【０４３８】
12. 4X負の対照の混合物：0.4mLの1M 塩化マンガンを9.6mlのdH2Oに混合して10mLにする。
【０４３９】
13. NUNC 96 ウエルV底ポリプロピレン製プレート(Applied Scientific Catalog#S-72092)。
【０４４０】
14. 500mM EDTA。
【０４４１】
15. 抗体希釈緩衝液：10mLの5% BSA/PBS、0.5mLの5%Carnation（登録商標）Instant Milk)(PBS中)及び0.1mLの0.1M オルトバナジン酸ナトリウムを88.4mLのTBSTに混合して100mLにする。
【０４４２】
16. ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体(SUGEN, Inc.)。
【０４４３】
17. ヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート化抗体(Biosource,Inc.)。
【０４４４】
18. ABTS溶液：19.21gのクエン酸、35.49gのNa2HPO4及び500mgのABSを充分なdH2Oと混合して1Lにする。
【０４４５】
19. ABTS/H2O2：使用する5分前に、15mLのABST溶液を2μLのH2O2と混合する。
20. 0.2M HCl。
【０４４６】
手順：
1. ELISAプレートを、100μL PBS中2μgのポリ(Glh-Tyr)でコートし、一夜4℃で保存する。
【０４４７】
2. プレートを、150μLの5% BSA/PBSで60分間ブロックする。
【０４４８】
3. プレートを、PBSで2回次いで50mM Hepes緩衝液pH7.4で1回洗浄する。
【０４４９】
4. 50μLの希釈されたキナーゼをすべてのウエルに添加する(精製キナーゼをキナーゼ希釈緩衝液で希釈する。最終濃度は10ng/ウエルでなければならない)。
【０４５０】
5. 25μLの被検化合物(DMSO中4%)又はDMSOのみ(dH2O中4%)(対照)をプレートに添加する。
【０４５１】
6. 上記キナーゼ/化合物の混合物を15分間インキュベートする。
【０４５２】
7. 25μLの40mM MnCl2を負の対照のウエルに添加する。
【０４５３】
8..25μLのATP/MnCl2混合物を他のすべてのウエル(負の対照を除く)に添加する。5分間インキュベートする。
【０４５４】
9. 25μLの500mM EDTAを添加して反応を停止させる。
【０４５５】
10. プレートをTBSTで3回洗浄する。
【０４５６】
11. 100μLのウサギポリクローナル抗Ptyr(抗体希釈緩衝液で1:10,000の比率で希釈)を各ウエルに添加する。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
【０４５７】
12. プレートをTBSTで3回洗浄する。
【０４５８】
13. Biosource HRP複合抗ウサギ抗体を、1:6,000の比率で抗体希釈緩衝液によって希釈する。１ウエル当たり100μLを添加し次いで振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
【０４５９】
14. プレートをPBSで1回洗浄する。
【０４６０】
15. 100μLのABTS/H2O溶液を各ウエルに添加する。
【０４６１】
16. 必要に応じて、１ウエル当たり100μLの0.2M HClを添加することによってデベロップメント反応を停止させる。
【０４６２】
17.410nMの試験フィルター及び630nMの基準フィルターを使ってDynatech MR7000 ELISA readerでプレートを読み取る。
【０４６３】
IGF-1リン酸基転移反応検定法
この検定法を使用して、ポリ(グルタミン酸：チロシン、４：１)中のホスホチロシンのレベルを測定し、基質のgst-IGF-1リン酸基転移反応のアゴニスト/アンタゴニストを識別する。
材料と試薬：
1. Corning 96ウエルELISAプレート。
【０４６４】
2. ポリ(Glu-Tyr),4:1,Sigma Cat.No,P0275。
【０４６５】
3. PBS,Gibco Catalog#450-1300EB.
【０４６６】
4. 50mM HEPES。
【０４６７】
5. TBBブロッキング緩衝液：100gのBSA、12.1gのTRIS(pH 7.5)、58.44gの塩化ナトリウム及び10mLの1% TWEEN-20を混合して1Lにする。
【０４６８】
6. IGF-1キナーゼドメインを含有する精製GST融合タンパク質(SUGEN,Inc.)。
【０４６９】
7. TBST緩衝液：6.057gのTris、8.766gの塩化ナトリウム及び0.5mlのTWEEN-20を充分なdH2Oと混合して1Lにする。
【０４７０】
8. Milli-Q H2O中4%DMSO。
【０４７１】
9. 10mM ATP(dH2O中)。
【０４７２】
10. 2X キナーゼ希釈緩衝液：10mLの1M HEPES(pH 7.5)、0.4mLの5% BSA(dH2O中)、0.2mLの0.1M オルトバナジン酸ナトリウム及び1mLの5M 塩化ナトリウムを充分なdH2Oと混合して100mLにする。
【０４７３】
11. 4X ATP反応混合物：0.4mLの1M MnCl2、0.008mLの0.01M ATP及び9.56mLのdH2Oを混合して10mLにする。
【０４７４】
12. 4X 負の対照の混合物：0.4mLの1M MnCl2を9.60mLのdH2Oと混合する。
【０４７５】
13. NUNC 96ウエルV底ポリプロピレン製プレート。
【０４７６】
14. 500mM EDTA(dH2O中)。
【０４７７】
15. 抗体希釈緩衝液：10mLの5% BSA(PBS中）、0.5mLの5%Carnation Instant Non-fat Milk(PBS中)及び0.1mLの0.1M オルトバナジン酸ナトリウムを88.4mLのTBSTと混合して100mLにする。
【０４７８】
16. ウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗体(SUGEN,Inc.)。
【０４７９】
17. ヤギ抗ウサギHRP複合抗体(Biosource)。
【０４８０】
18. ABTS溶液。
【０４８１】
20. ABTS/H2O2：使用する5分前に、15mLのABSTを2μlのH2O2と混合する。
【０４８２】
21. 0.2M HCl(dH2O中)。 
【０４８３】
手順：
1. ELISAプレートを、１ウエル当たり、100μlのPBS中2.0μgのポリ(Glu,Tyr),4:1(Sigma P0275)でコートする。プレートを、4℃で一夜保存する。 
【０４８４】
2. プレートをPBSで1回洗浄する。
【０４８５】
3. 100μlのTBBブロッキング緩衝液を各ウエルに添加する。プレートを、振盪しながら、室温で1時間インキュベートする。
【０４８６】
4. プレートをPBSで1回、次に50mM HEPES緩衝液 pH 7.5で2回洗浄する。
【０４８７】
5. 25μlの被検化合物(４％DMSO中)(100%DMSO中10mMの被検化合物原液をdH2Oで希釈して得た)をプレートに添加する。
【０４８８】
6. 50μlのキナーゼ希釈緩衝液中10.0ngのgst-IGF-1キナーゼを、すべてのウエルに添加する。
【０４８９】
7. 25μlの4X ATP反応混合物を、すべての試験ウエル及び正の対照のウエルに添加することによって、キナーゼ反応を開始させる。25μlの4X 負対照混合物をすべての負の対照のウエルに添加する。振盪しながら、室温で1分間インキュベートする。
【０４９０】
8. 25μlの0.5M EDTA(pH 8.0)をすべてのウエルに添加する。
【０４９１】
9. プレートをTBST緩衝液で4回洗浄する。
【０４９２】
10. 100μlの抗体希釈緩衝液によって、1:10,000の比率で希釈したウサギポリクローナル抗ホスホチロシン抗血清を、すべてのウエルに添加する。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
【０４９３】
11. プレートをステップ9と同様に洗浄する。
【０４９４】
12. 抗体希釈緩衝液によって、1:10,000の比率で希釈した100μlのBiosource 抗ウサギHRPをすべてのウエルに添加する。振盪しながら、室温で1分間インキュベートする。
【０４９５】
13. プレートをステップ9と同様に洗浄し次いでPBSで1回洗浄して、泡と過剰のTween-20を除く。
【０４９６】
14. 100μl/ウエルのABTS/H2O2を各ウエルに添加することによってデべロップさせる。
【０４９７】
15. 約15分後に、410nmの試験フィルターと630nmの基準フィルターを使ってELISA readerで読み取る。
【０４９８】
BrdU取込み( BrdU incorporation)検定法
以下の検定法は、選択された受容体を発現するように遺伝子工学的に処理された細胞を使用して、リガンドが誘発するDNA合成の活性に対する対象化合物の作用を、そのDNA中へのBrdU 取込みを確認することによって評価する。
【０４９９】
以下の材料、試薬及び手順は、以下の各BrdU 取込み検定法に一般的なものである。特定の検定結果の分散値は記載してある
【０５００】
一般的な材料と試薬：
1, 適正なリガンド。
【０５０１】
2. 適正に遺伝子工学的に処理された細胞。
【０５０２】
3. BrdU Labeling Reagent：10mM、PBS中、pH 7.4(Roche Molecular Biochemicals、米国インディアナ州インディアナポリス所在)。
【０５０３】
4. FixDenat：固定溶液(Roche Molecular Biochemicals、米国インディアナ州インディアナポリス所在)。
【０５０４】
5. 抗-BrdU-POD：ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたマウスのモノクローナル抗体(Chemicon、米国カリフォルニア州テメキュラ所在)。
【０５０５】
6. TMB基質溶液：テトラメチルベンジジン(TMB、すぐに使用可能(ready to use)、Roche Molecular Biochemicals、米国インディアナ州インディアナポリス所在)。
【０５０６】
7. PBS洗浄溶液：1X PBS,pH 7.4。
【０５０７】
8．アルブミン、ウシ(BSA)、画分Vの粉末(Sigma Chemical Co.米国)。
【０５０８】
一般的手順：
1. 96ウエルのプレートにおいて、DMEM中10% CS,2mM Gln 内に8000細胞/ウエルで細胞を接種する。細胞を、5% CO2雰囲気下37℃で一夜インキュベートする。
【０５０９】
2. 24時間後、その細胞をPBSで洗浄し、次いで血清を含有しない培地（0.1%BSAを含有する0.%CS DMEM）中で、24時間、血清飢餓状態にする。
【０５１０】
3. 3日目に、適正なリガンドと被検化合物を、同時に細胞に添加する。負の対照のウエルには0.1%のBSAだけを含有する血清なしのDMEMを入れ、正の対照の細胞には、リガンドを入れるが被検化合物は入れない。被検化合物は、96ウエルプレート内でリガンドを含有する血清なしのDMEM中に調製して、順に7種の試験濃度に希釈した。
【０５１１】
4. リガンドを活性化して18時間後、希釈したBrdU標識剤(DMEM,01%BSA で1:100の比率で希釈)を添加し次いでその細胞をBrdU(最終濃度は10μMである)と共に1.5時間インキュベートする。
【０５１２】
5. 標識剤と共にインキュベートした後、逆さにしたプレートをデカントし次いでペーパータオル上でたたいて、培地を除く。FixDenat溶液を添加し(50μl/ウエル)、それらプレートを、プレートシェーカー上で室温にて45分間インキュベートする。
【０５１３】
6. 逆さにしたプレートをデカントし次いでペーパータオル上でたたいて、FixDenat溶液を除く。ブロッキング溶液としてミルクを添加し(PBS中5%乾燥ミルク、200μl/ウエル)次にプレートをプレートシェーカー上で室温にて30分間インキュベートする。
【０５１４】
7. デカントしてブロッキング溶液を除き次にウエルをPBSで1回洗浄する。抗-BrdU-POD溶液を添加し(PBSで1:200の比率で希釈、1% BSA、50μl/ウエル)、次にプレートをプレートシェーカー上で室温にて90分間インキュベートする。
【０５１５】
8. デカントし、次にウエルをPBSで5回すすぐことによって抗体コンジュゲートを除き次いでプレートを逆さにしてペーパータオル上でたたいて乾燥する。
【０５１６】
9. TMB基質溶液を添加し(100μl/ウエル)、次いで測光検定を行うため充分に発色するまで、プレートシェーカー上で室温にて20分間インキュベートする。
【０５１７】
10. 試料の吸光度を、Dynatech ELISＡplate readerで410nmにて測定する(基準波長の490nmで読み取るフィルターによる「二波長(dual wave length)」モード)。
【０５１８】
EGF誘発BrdU 取込み検定法
材料と試薬：
1. マウス EGF,201(東洋紡(株)、日本)。
【０５１９】
2. 3T3/EGFRc7。
【０５２０】
残りの材料と試薬及び手順は、先に述べたのと同じである。
【０５２１】
PDGF誘発BrdU 取込み検定法
材料と試薬：
1．ヒトPDGF B/B(Boehringer Mannheim,ドイツ)。
【０５２２】
2. 3T3/EGFRc7。
【０５２３】
残りの材料と試薬及び手順は、先に述べたのと同じである。
【０５２４】
FGF誘発BrdU 取込み検定法
材料と試薬：
1.   ヒトFGF2/bFGF(Gibco BRL,米国)。
【０５２５】
2. 3T3c7/EGFr。
【０５２６】
残りの材料と試薬及び手順は、先に述べたのと同じである。
【０５２７】
IGF1誘発BrdU 取込み検定法
材料と試薬：
1. ヒト組換え体(G511,Promega Corp.,米国)。
【０５２８】
2. 3T3/IGF1r。
【０５２９】
残りの材料と試薬及び手順は、先に述べたのと同じである。
【０５３０】
srcリン酸基転移反応検定法
この検定法を使用して、チロシンキナーゼsrcの阻害剤をスクリーニングする。 
材料と試薬：
1. コーティング緩衝液：アジ化ナトリウム(0.2mg/ml)を含有するPBS。
【０５３１】
2. PBS中1%w/vのBSA。
【０５３２】
3. 洗浄緩衝液：0.05%w/vのTween 20を含有するPBS(PBS-TWEEN)。
【０５３３】
4. 500mM HEPES pH7.4。
【０５３４】
5. 蒸留水中のATP(40μM)+MgCl2(80mM)
【０５３５】
6. 蒸留水中のMgCl2(80mM)(ATPなしのブランク用)。
【０５３６】
7. 被検化合物、DMSO中10mM。 
【０５３７】
8. 検定緩衝液：2mM DTT、0.2mM オルトバナジン酸ナトリウム及び0.2mg/mlBSAを含有する100mM HEPES,pH 7.4。
【０５３８】
9. 部分的に精製した組換えヒトsrc(UBI 14-117)。
【０５３９】
10. 抗ホスホチロシン(SUGEN ウサギポリクローナル抗PY)。
【０５４０】
11. HRP連結ヤギ抗ウサギIg(Biosource International #6430)。
【０５４１】
12. HRP基質ABTS又はPierce ペルオキシダーゼの基質。
【０５４２】
13. Corning ELISAプレート。
【０５４３】
手順：
1. 0.01%アジ化ナトリウムを含有するポリ(Glu-Tyr)(Sigma Cat.No.P0275)を1ml当たり20μg含有する液100μlでプレートをコートする。一夜4℃で保存する。
【０５４４】
2. 100μl/ウエルの1% BSAで、室温にて1時間ブロックする。 
【０５４５】
3. dH2Oで希釈し反応プレートにプレートするように準備したCosterプレートに、被検化合物(DMSO中10mM)を1ウエル当たり2μlプレートする。
【０５４６】
4. Srcキナーゼを反応緩衝液によって1:10,000の比率で希釈し、2.5mlの1M HEPES pH 7.4(4℃で滅菌保存)、21.85mlの蒸留水、0.1mlの5%BSA、0.5mlの10mM オルトバナジン酸ナトリウム(4℃で滅菌保存)、50μlの1.0M DTT(−20℃で凍結保存)及び2.5μlのSrcキナーゼ(−80℃で凍結保存)によって、５プレート用に25mlの液を調製する。
【０５４７】
5. 48μlの蒸留水を、希釈プレート中の各化合物2μlに添加し、次にこの液を反応プレートに1ウエル当たり25μl添加する。
【０５４８】
6. 50μlのHRPを各反応緩衝液のウエルに添加し次に1ウエル当たり25μlのATP-MgCl2を添加する(ATPなしのブランクにはMgCl2だけを添加する)。プレートシェーカー上で室温にて15分間インキュベートする。25μlの0,5M EDTAを各ウエルに添加することによって反応を停止させる。
【０５４９】
7. PBS-TWEENで4回洗浄する。
【０５５０】
8. 0.5%のBSA、0.025%の脱脂粉乳及び100μMのオルトバナジン酸ナトリウムを含有するPBS-TWEEN中に100μlの抗ホスホチロシン(抗pTyr血清で1:10,000の比率で希釈したか又は10%グリセリンで1:3,000の比率で希釈したPAアフィニティー精製抗体)を添加する。振盪を続けながら室温で1時間インキュベートする。
【０５５１】
9. プレートをPBS-TWENで4回洗浄する。
【０５５２】
10. 0.5%のBSA、0.025%の脱脂粉乳及び100μMのオルトバナジン酸ナトリウムを含有するPBS-TWEEN中に、100μlのHRP連結Ig(1:5,000)を添加する。振盪しながら室温で1時間インキュベートする。
【０５５３】
11. プレートを、PBS-TWEENで4回次いでPBSで1回洗浄する。
【０５５４】
12. ABTS又は他のペルオキシダーゼの基質を使って、プレートをデベロップさせる。
【０５５５】
細胞周期の分析：
標準増殖培地中のA431細胞を、所望濃度の被検化合物に37℃で20〜24時間暴露する。その細胞を集めてPBS中に懸濁させ、氷冷70%メタノールで固定し次いでヨウ化プロピヂューム(propidium iodide)で染色する。次に、DNA含量を、FACScan flow cytometerを使って測定する。次に、CellFITソフトウェア(Becton-Dickinson)を使って、細胞周期の位相分布(phase distribution)を推定できる。
【０５５６】
HUV-EC-C検定法
この検定法を使って、PDGF-R、FGF-R、VEGF、aFGF又はFlk-1/KDR(これらはすべてHUV-EC細胞によって天然に発現される)に対する化合物の活性を測定する。
【０５５７】
ゼロ日目
1. HUC-EC-C細胞(ヒトの臍静脈内皮細胞、American Type Culture Collection ,catalogue no.1730 CRL)を洗浄し次いでトリプシン処理を行う。ダルベッコのリン酸塩緩衝食塩水(Gibco BRLから入手したD-PBS Catalogue no.14190-029)で、組織培養フラスコの10cm2当たり約1ml使って2回洗浄する。非酵素の細胞解離溶液(Sigma Chemical Company,catalogue no.C-1544)中0.05%のトリプシン-EDTAでトリプシン処理を行う。その0.05%トリプシンは、0.25%トリプシン/1mM EDTA(Gibco,catalogue no.25200-049)を、前記細胞解離溶液で希釈することによって作製する。組織培養フラスコの25〜30cm2当たり約1mlによって、37℃で約5分間トリプション処理を行う。細胞を前記フラスコから分離させた後、等容積の検定培地を添加し次いで50mlの滅菌遠心分離管(Fisher Scientific,catalogue no.05-539-6)に移す。
【０５５８】
2. 検定培地を添加することによって、50ml滅菌遠心分離管内で約35mlの検定培地によって細胞を洗浄し、約200xgで10分間遠心分離し、上澄み液を吸引し次いで35mlのD-PBSで再び懸濁させる。D-PBSで洗浄をさらに2回繰返し、組織培養フラスコの15cm2当たり約1mlの検定培地に細胞を再び懸濁させる。検定培地は、F12K培地(Gibco BRL,catalogue no.21127-014)及び0.5%の熱失活させたウシ胎仔血清からなっている。細胞をCoulter Counter（登録商標）(Coulter Eiectronics,Inc.)で計数し、次いで検定培地を細胞に添加して0.8-1.0x105細胞/mlの濃度にする。
【０５５９】
3. 96ウエル平底プレートに、100μl/ウエル又は0.8-1.0x104細胞/ウエルで細胞を添加し、5%CO2雰囲気下、37℃で約24時間インキュベートする。
【０５６０】
1日目
1. 別の96ウエルプレートにて、一般に50μMから0μM までの被検化合物の二倍希釈式滴定(two-fold titration)を行う。上記0日目、ステップ2で記載したのと同じ検定培地を使う。滴定は、200μM(最終ウエル濃度の4倍の濃度)の被検化合物を1ウエル当たり90μl、特定プレートの縦列(column)のトップのウエルに添加することによって、滴定を行う。被検化合物原液は通常、DMSO中20mMであるから、200μMの医薬濃度は2%のDMSOを含有している。
【０５６１】
検定培地(F12K+0.5%ウシ胎仔血清)で2%DMSOまで希釈された希釈液を、被検化合物を希釈するがDMSOの濃度は一定に維持するための被検化合物滴定用希釈液として使用する。この希釈液を、前記縦列の残りのウエルに、60μl/ウエルで添加する。前記縦列のトップウエルの200μMの被検化合物希釈液120μlから60μlを採取し、この縦列の第二のウエルの60μlと混合する。このウエルから60μlを採取し、この縦列の第三のウエルの60μlと混合するなど二倍希釈式滴定が完了するまで行う。最後のウエルの隣のウエルに液が混合されたならば、このウエルの120μlから60μlを採取してそれを廃棄する。60μlのDMSO/培地希釈液を有する最後のウエルを、被検化合物を含有していない対照として残す。(1)VEGF(Pepro Tech Inc.から入手、catalogue no.100-200)、(2)内皮細胞増殖因子(EVGF)(酸性繊維芽細胞増殖因子すなわちaFGFとしても知られている)(Boehringer Mannheim Biochemicaから入手、catalogue no.1439 600)、又は(3)ヒトPDGF B/B(1276-956、Boehringer Mannheim、ドイツ)及び検定培地の対照、各々について3個ずつ一組のウエルを得るため充分な9縦列の滴定される被検化合物を作製する。ECGFはヘパリンナトリウム含有製剤である。
【０５６２】
2. 0日目由来のHUV-EC-C細胞が0.8-1.0x104個細胞/100μl/ウエル入っている96ウエル検定プレートに、１ウエル当たり50μlの被検化合物希釈液を移し、次いで5%CO2雰囲気下、37℃で約2時間インキュベートする。
【０５６３】
3. 各被検化合物の状態に対して、3個ずつ、80μg/mlのVEGF、20ng/mlのECGF又は培地の対照を、50μl/ウエル添加する。被検化合物の場合、増殖因子の濃度が所望の最終濃度の4倍である。0日目ステップ2由来の検定培地を使って、増殖因子の濃度をつくる。5%CO2雰囲気下、37℃で約24時間インキュベートする。各ウエルには、50μlの被検化合物希釈液、50μlの増殖因子もしくは培地、及び100μlの細胞が入っており、合計200μl/ウエルになるよう計画されている。したがって、被検化合物及び増殖因子の4倍の濃度は、一旦、全部をウエルに添加したならば1倍になる。
【０５６４】
2日目
1. 3Hチミジン(Amersham,catalogue no.TRK-686)を、1μCi/ウエル(RPMI培地+10%熱不活化ウシ胎仔血清で調製した100μCi/ml溶液の10μl/ウエル)で添加し、5%CO2雰囲気下、37℃で約24時間インキュベートする。RPMIはGibco BRLから入手できる(catalogue no.11875-051)。
【０５６５】
3日目
1. プレートを一夜−20℃で凍結させる。
【０５６６】
4日目
プレートを解凍し、９６ウエルプレートハーベスター(Tomtec Harvester 96（登録商標）)でフィルターメイト(filter mate)(Wallac,catalogue no.1205-401)上に採取し、Wallac Betaplate(商標)液体シンチレーションカウンターで計数値を読み取る。
【０５６７】
生体内動物モデル
異種移植動物モデル
ヒトの腫瘍が無胸腺マウス(例えば、Balb/c,nu/nu)中で、異種移植体として増殖できることが、ヒトの腫瘍の治療に対する生体応答を研究するための有用な生体内モデルを提供している。ヒトの腫瘍の無胸腺マウスへの異種移植に初めて成功して以来(Rygaard and Povlsen,Acta Pathol.Microbial.Scand.  77:758-760,1969)、多くの異なるヒトの腫瘍の細胞系(例えば、乳房、肺、尿生殖器、胃腸、頭頸部、グリア芽細胞腫、骨、及び悪性黒色腫)がヌードマウスに移植されて増殖させることに成功している。以下の検定法を使用して、本発明の各種化合物の活性、特異性及び作用を測定できる。3種類の一般的タイプの検定法すなわち細胞/触媒検定法、細胞/生体検定法及び生体内検定法が、化合物を評価するのに有用である。細胞/触媒検定法の目的は、細胞内の既知の基質のチロシンをリン酸化するTKの性能に対する化合物の作用を測定することである。細胞/生体検定法の目的は、細胞内のTKによって刺激される生体応答に対する化合物の作用を測定することである。生体内検定法の目的は、癌などの特定の障害の動物モデルにおける化合物の作用を測定することである。
【０５６８】
皮下異種移植体の実験に好適な細胞系としては、C6細胞(神経膠腫、ATCC#CCL 107)、A375細胞(黒色腫、ATCC#CRL 1619)、A431細胞(類表皮癌、ATCC#CRL 1555)、Calu 6細胞(肺、ATCC#HTB 56)、PC3細胞(前立腺、ATCC#CRL 1435)、SKOV3TP5細胞、S114(NCIからcMetとHGFを発現するように遺伝子工学的に処理したNIH3T3繊維芽細胞系)、U-87MG(ヒトの悪性神経膠腫、ATCC HTB 14)及びEGFR、PDGFR、IGF-1R又は他のどんな被検キナーゼも過剰発現するように遺伝子工学的に処理されたNIH 3T3線維芽細胞がある。以下のプロトコルを利用して異種移植体の実験を実施できる。
【０５６９】
雌の無胸腺マウス(BALB/c,nu/nu)は、Simonsen Laboratories(米国、カリフォルニア州ギルロイ所在)から入手する。すべての動物を、Alpha-dri beddingを有するMikro-isolator cage内にクリーンルーム条件下で維持する。これら動物は、滅菌されたげっ歯動物用餌と水を自由に受け取る。
【０５７０】
細胞系は適正な培地(例えば、MEM、DMEM、Ham'sF10もしくはHam’sF12  +5%-10%ウシ胎仔血清(FBS)及び2mM グルタミン(GLN))中で増殖させる。細胞培養培地、グルタミン及びウシ胎仔血清はすべて、特に断らない限り、Gibco LIfe Technologies(米国ニューヨーク州グランドアイランド所在)から購入する。細胞はすべて、90-95%の空気と5-10%のCO2の湿潤雰囲気内で37℃にて増殖させる。細胞系はすべて、常に、1週間当たり2回ずつ継代培養されるので、Mycotect method(Gibco)で測定するとマイコプラズマ陰性である。
【０５７１】
細胞を、0.05%トリプシン-EDTAで全面密集成長させた状態又はそれに近い状態で採取し次に450xgで10分間遠心分離してペレット化する。そのペレットを、滅菌したPBS又は培地(FBSなし)中に、特定の濃度まで、再び懸濁させ、次いでその細胞を、マウスの後側腹部に移植する(8−10匹のマウス/群、2−10x106細胞/動物)。腫瘍の増殖度を、ベニアーカリパス(venier calipers)を使って3~6週間にわたって測定する。腫瘍の容積は、特に断らない限り長さｘ幅x高さの積値として計算する。P値はスチューデントt-検定法を使って計算する。50-100μＬの添加剤(DMSO又はVPD:D5W)中の被検化合物を、異なる濃度でIP注射によって送達することができ、これは一般に移植後1日目から始める。
【０５７２】
腫瘍浸潤モデル
以下の腫瘍浸潤モデルが開発され、このモデルは、KDR/FLK-1受容体を選択的に阻害することが確認された化合物の治療上の価値と効力を評価するのに利用できる。
【０５７３】
手順
8週齢のヌードマウス(雌)(Simonsen Inc.)を実験動物として使用する。腫瘍細胞の移植は、層流フード内で実施できる。麻酔を行うためキシラジン/ケタミン カクテル(100mg/kgのケタミン及び5mg/kgのキシラジン)を腹腔内に投与する。正中線切開を行って腹腔を露出させ(約1.5cmの長さ)、容積が100μlの培地中107個の腫瘍細胞を注射する。この細胞は、膵臓の十二指腸葉に又は結腸の漿膜の下に注射する。腹膜と筋肉を、6-0絹連続縫合糸で閉鎖し、次いで皮膚を、創傷クリップを使って閉鎖する。動物を毎日観察する。
【０５７４】
分析
マウスを2-6週間、肉眼で観察した後、殺して、各種器官(肺、肝臓、脳、胃、脾臓、心臓、筋肉)への局所腫瘍転移部を切開して分析する(腫瘍の大きさの測定、浸潤のグレード、免疫化学、非浸潤性ハイブリッド形成の確認など)。
【０５７５】
Metリン酸化反応−細胞検定
材料と試薬：
1.   Falcon 10cm 培養皿。
【０５７６】
2. A549肺癌細胞。
【０５７７】
3. F12K増殖培地(2% FBS+2mM グルタミン含有)。
【０５７８】
4. F12K検定培地(0.1% BSA含有)。
【０５７９】
5. Fisher 細胞スクレーパー。
【０５８０】
6. 細胞溶解緩衝液(HNTG、1mM オルトバナジン酸ナトリウム、1mM PMSF及び2mM フッ化ナトリウム)。
【０５８１】
7. 1.5ml  エッペンドルフ管。
【０５８２】
8. エッペンドルフ遠心分離機。
【０５８３】
9. BCA検定試薬AとB(#23223及び23224、Pierce)。
【０５８４】
10. 試料管ローテーター。
【０５８５】
11. ゲルブロットコンテナーローテーター(gel blot container rotator)。
【０５８６】
12. 5X試料緩衝液。
13. Novex プレキャスト(pre-cast)トリス-グリシン8%アクリルアミドゲル。
【０５８７】
14. Bio Rad 電気泳動チャンバー。
【０５８８】
15. SDS PAGE緩衝液。
【０５８９】
16. TBS(pH 7.6)+0.1% Triton X-100( 5%のミルクを含有するもの及び含有しないもの)。
【０５９０】
17. ウエスターンブロット転移緩衝液。
【０５９１】
18. Osmonics ニトロセルロース紙。
【０５９２】
19. Bio Rad トランスブロット紙。
【０５９３】
20. ゲル転移装置。
【０５９４】
21. 抗ホスホチロシン(マウスモノクローナル)。
【０５９５】
22. Bio Rad Kaleidoscope Prestanied Standards(161-0324)。
【０５９６】
23. 抗-h-met(C-28)ウサギポリクローナルのアガロースとコンジュゲートしたものとコンジュゲートしていないもの(#sc-161AC及びsc-161、Sata Cruz Biotechnology,Inc.)。
【０５９７】
24. ロバ抗ウサギIg-HRP(NA934,Amersham)。
【０５９８】
25. ヒツジ抗マウスIg-HRP(NA931,Amersham)。
【０５９９】
26. SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(#34080,Pierce)。
【０６００】
27. サランラップ。
【０６０１】
28. Kodak BioMax 露出カセット(exposure cassette)。
【０６０２】
29. 富士X線フィルム。
【０６０３】
30. Kodak フィルム現像液。
【０６０４】
手順：
1.2% FBS+2mM グルタミンを含有する増殖培地の入っている10cm皿に細胞をプレートする。全面密集成長の近くまで増殖させる。
【０６０５】
2. 0.1% BSA含有検定培地内で一夜、細胞を血清飢餓状態にする。
【０６０６】
3. 1プレート当たり、医薬の1回投与量を、通常、二倍希釈式滴定方式でプレートに添加する。医薬なしの方には、検定培地(医薬と同じ濃度のDMSOを含有している)を添加する。
【０６０７】
4. 医薬の入っているプレートを4-5時間インキュベートし、次いでHGを50ng/ml、10分間かけて添加する。
【０６０８】
5. プレートをPBSで1回洗浄し、400μlの細胞溶解緩衝液を添加し、次いで細胞をはがし取る。1.5mlエッペンドルフ管に集める。
【０６０９】
6. 細胞溶解緩衝液中にて約10-20分間経過した後、その細胞溶解液を最高回転速度(14,000g)の微小遠心分離機で遠心分離し、その上澄み液を別のエッペンドルフ管に集める。
【０６１０】
7. BCA検定試薬で、タンパク質の濃度を測定する。
【０６１１】
8. 細胞溶解緩衝液を使って、試料濃度を、0.4ml中0.5mgタンパク質に調節する。
【０６１２】
9. 15μlの抗-h-met ACを添加して免疫沈降させ、試料を4℃で2時間回転させる。
【０６１３】
10. 試料を細胞溶解緩衝液で3回洗浄し次いで35μlの5X試料緩衝液中に再び懸濁させる。
【０６１４】
11. 試料を100℃で10分間煮沸し次いで最高設定の微小遠心分離機で30分間遠心分離してアガロースビーズをペレット化する。
【０６１５】
12. 二つのゲルの一方に抗リン酸化を、もう一方には抗-h-metを15μlずつ負荷する。また、１ゲル当たり1レーンに、10μlの予め染色した標準を負荷する。
【０６１６】
13. ゲルに100-125Vの電圧をかけ、次いでゲルをニトロセルロースに移し、70mAmpの電流を一夜流すか又は500mAmpの電流を1時間流す。
【０６１７】
14. TBS+0.1% Triton X-100(TBST)+5%PBS中の膜を、ローテーター上で1時間ブロックする。この時点からすべてのステップは特に断らない限り室温で行う。
【０６１８】
15. ローテーター上で、2時間又は一夜かけて、0.8μg/mlの抗ホスホチロシン及び0.25μg/mlの抗-h-metを添加する。
【０６１９】
16. 膜を、ローーテーター上でTBST中にて5分間ずつ3回洗浄する。
【０６２０】
17. HRPコンジュゲート化抗体(抗ホスホチロシンに対するヒツジ抗マウス抗体；nati-h-metに対するロバ抗ウサギ抗体)を、1:5000の比率で、ローテーター上で約45分間かけて添加する。
【０６２１】
18. 膜を、ローーテーター上でTBST中にて5分間ずつ3回洗浄する。
【０６２２】
19. 3e SuperSignal kitの2試薬を等容積ずつ(各ブロットに3ml+3ml）添加し1-2分間回転させる。
【０６２３】
20. ブロットをサランラップで巻き、次いで露光カセットの内側にテープでしっかり固定する。
【０６２４】
21. 安全光のみの暗室内で、1枚のフィルムを前記カセットの内側に配置する。割当て時間が経過した後、フィルムを取り出して自動処理用の現像機に入れる、適正な露光を行うため露光時間について実験を行う。
【０６２５】
ZC1シンチレーションプロキシミティー(scintillation proximity)検定法
シンチレーションプロキシミティー検定法(SPA)を利用して、ZC1のプロテインセリン/トレオニンキナーゼ活性を生体外で分析して同種の検定法でZC1の阻害剤をスクリーニングする。下記の検定法は、ZC1の阻害剤を迅速にスクリーニングする場合に適用できる。
材料と溶液：
1.   Wallac 96ウエル ポリエチレンテレフテレート(flexi)製プレート(Wallac Catalog#1450-401)。
【０６２６】
2. NEN Easy-Tide[γ33P]ATP(NEN Catalog#NEG602H)。
【０６２７】
3. AmershamのストレプトアビジンをコートしたポリビニルトルエンSPAビーズ(Amersham catalog#NIF107)−マグネシウム又はカルシウムを含有しないPBSでビーズを再構成する(50mg/mL)。再構成したビーズを4℃で保存する(最適のカウントを達成するためには、検定中、すべてのビオチニル化分子に結合するため、過剰のストレプトアビジンSPAビーズが存在することが重要である)。Sf9細胞から精製された活性化ZＣ1酵素−最終濃度：300ng/ウエル。
【０６２８】
4. ペプチド基質#902B(ビオチン-KRTLRRKRTLRRKRTLRR)−最終濃度：0.5μM/ウエル(2XKm)。
【０６２９】
手順：
1. 5%DMSO中、 所望の最終濃度の5倍の濃度の阻害剤溶液を調製する。前記flexiプレートの各ウエルに10μlを添加する。正と負の対照にはそれぞれ5%DMSOを10μL添加する。
【０６３０】
2. 先に示したようなATP混合物を調製する(一つの検定プレートに対してATP混合物2.1mlで充分である)。すべてのウエルに20μLを添加する。 
【０６３１】
3. 20μlの5M EDTAを、負の対照のウエルに添加する。
【０６３２】
4. 2.5Xキナーゼ緩衝溶液(50mM HEPES pH7.4、12.5mM MnCl2,500mM NaCl及び1mM DTT)による酵素溶液を調製する。最終酵素濃度は、0.30μg/ウエルである(例えば、0.5mg／mLの原液が与えられたならば、302μLのZC1酵素を10mLのキナーゼ緩衝液に添加する)。１ウエル当たり20μLを添加して反応を開始させる。
【０６３３】
5. キナーゼ反応を、室温で60分間進行させる。
【０６３４】
6. PBS中に、0.05mM ATP、5mM EDTA、0.1% TRITON x-100及び１ml当たり5mgのAmershamストレプトアビジンコートポリビニルトルエンSPAビーズ(Cat#NIF1077)を含有する停止溶液200μlを、各ウエルに添加する。15分間インキュベートする。
【０６３５】
7. プレートを2300 rpmで15分間回転させる。
【０６３６】
8. SPA flexiプレートのプロトコル(クエンチ曲線を含む)を使ってTrilux Readerでプレートを計数する。
【０６３７】
Aurora2シンチレーションプロキシミティー検定法
シンチレーションプロキシミティー検定法(SPA)を使用して、Aurora2のプロテインセリン/トレオニンキナーゼ活性を生体外で分析し、類似の検定法でAurora2の阻害剤をスクリーニングする。下記の検定法は、Aurora2の阻害剤を迅速にスクリーニングする場合に適用できる。
材料と溶液：
1. 1. Wallac 96ウエル ポリエチレンテレフタレート(flexi)製プレート(Wallac Catalog#1450-401)。
【０６３８】
2. NEN Easy-Tide[γ33P]ATP(NEN Catalog#NE602H)。
【０６３９】
3. AmershamのストレプトアビジンをコートしたポリビニルトルエンSPAビーズ(Amersham Catalog#NIF 107)−マグネシウム又はカルシウムを含有しないPBS中、50mg/mLでビーズを再構成する。再構成されたビーズを4℃で保存する(最適のカウントを達成するため、過剰のストレプトアビジンSPAビーズが、検定中のすべてのビオチニル化分子に結合するために存在することが重要である)。
【０６４０】
4. 酵素：BL21細胞から精製したGST-Aurora2酵素。1.0mg/ml；500μlずつのアリコート。0.125mg/検定ウエルを使用する。
【０６４１】
5. ビオチニル化ペプチドの基質：SUGENペプチド#800A。DMSOに10mg/mlの濃度で溶解したBiotin-LC-LC-LRRWSLGLRRWSLGLRRWSLGLRRWSLG。500μlずつのアリコート−最終濃度0.012mg/ウエル(2XKm)で−20℃にて保存する。
【０６４２】
手順：
1. 5%DMSO中、所望の最終濃度の5倍の濃度の阻害剤溶液を調製する。flexiプレートの各ウエルに10μlを添加する。正と負の対照には、10μLの5%DMSOを添加する。
【０６４３】
2. 先に述べたようにして、ATP混合物を調製する(2.1mlのATP混合物で1検定プレートに対して充分である)。すべてのウエルに20μlずつ添加する。
【０６４４】
【表１】
2007501229.tif 000064
【０６４５】
3. 20μlの5M EDTAを負の対照のウエルに添加する。
【０６４６】
４．2.5Xキナーゼ緩衝液(50mM HEPES pH 7.4、12.5mM MnCl2、500mM NaCl及び1mM DTT)による酵素溶液を調製する。最終酵素濃度は0.125μg/ウエルにする。１ウエル当たり20μl添加して反応を開始する。
【０６４７】
5. キナーゼ反応を、室温で60分間、進行させる。
【０６４８】
6. PBS中に、0.05mM ATP、5mM EDTA、0.1% Triton x-100及び1ml当たり5mgのAmersham ストレプトアビジン-コート ポリビニルトルエンSPAビーズ(Cat#NIF 1077)を含有する停止溶液を200μlずつ、各ウエルに添加する。
15分間インキュベートする。
【０６４９】
7. プレートを2300 rpmで15分間、回転させる。
【０６５０】
8. SPA flexiプレートのプロトコルを利用して、プレートをTrilux readerで計数する。
【０６５１】
追加の検定法
本発明の化合物を評価するため使用できる追加の検定法としては、限定されないが、bio-flk-1検定法、全細胞におけるEGF受容体-HER2キメラ受容体検定法、bio-src検定法、bio-lck検定法及びrafのリン酸化機能を測定する検定法がある。これら各検定法のプロトコルは、米国特許願第09/099,842号に見ることができる。なお、この特許文献は、図面を含めて本明細書に援用するものである。さらに、1996年6月5日付けで発行された米国特許第5,792,783号及び1999年5月28日付けで出願された米国特許願第09/322,297号は、あたかも本明細書に完全に記載されているように援用するものである。
【０６５２】
以下の表1は、本発明の好ましい実施態様の多数の化合物について得られたIC50値を示す。
【０６５３】
【表２】
2007501229.tif 000065
【０６５４】
【表３】
2007501229.tif 000066
【０６５５】
【表４】
2007501229.tif 000067
【０６５６】
【表５】
2007501229.tif 000068
【０６５７】
また当業者は、本発明が、目的を達成し、本発明に固有の目的と利益のみならず上記目的と利益を得られるように充分改良されることは分かるであろう。本明細書に記載された分子コンプレックス及び方法、手順、処理、分子、特定の化合物は、好ましい実施態様の現在の代表的な例であるので、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の本質に含まれかつ本明細書の特許請求の範囲の範囲で定義される本発明の変更及び他の使用は、当業者に思い浮かぶであろう。
【０６５８】
本発明の範囲と本質を逸脱することなく、本明細書に開示されている発明について置換と修飾を変更できることは、容易に分かるであろう。
【０６５９】
本明細書に引用されているすべての特許と刊行物は、本発明が関連する技術分野の当業者の技術レベルを示している。これら特許と刊行物はすべて、あたかも、個々の各刊行物が具体的にかつ個々に援用されているのと同じ程度に本明細書に援用するものである。
【０６６０】
本明細書に例示して記載された発明は、本明細書に具体的に開示されていないどのような単一もしくは複数の要素、単一もしくは複数の制限が無くても適切に実施できる。したがって、例えば、本明細書の各場合において、用語「comprising」、「consisting essentially of」及び「consisting of」はいずれも、他方の二つの用語のどちらかで置換できる。採用されている用語と表現は、説明のための用語として使用され、限定のための用語としては使用されているわけではなく、そしてかような用語及び表現を使用する場合、提示され説明されている特徴又はその一部の均等物を除外することを意図するものではなく、各種の変形が、特許請求されている本発明の範囲内で可能であることは明らかである。したがって、本発明は好ましい実施態様と任意の特徴によって具体的に開示されているが、当業者は、本明細書に開示されている思想の変形と変更を実施することができ、そしてかような変形と変更は、本明細書の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内にあるとみなされると解すべきである。
【０６６１】
さらに、本発明の特徴又は側面が、マーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群の個々のメンバー又はメンバーのサブグループによって記載されていることも分かるであろう。例えば、Xが臭素、塩素及びヨウ素からなる群から選択されると記載されている場合、Xが臭素である特許請求の範囲及びXが臭素及び塩素である特許請求の範囲は完全に記載されている。
【０６６２】
他の実施態様は本明細書の特許請求の範囲内にある。
【国際調査報告】
2007501229.tif 000071