(57)【要約】内皮細胞のＤＮＡ合成，ＭＡＰキナーゼ活性化および脈管形成を阻害する方法を提供する。また，血管形成および新生血管を阻害する方法に加え，前記方法に有用な組成物を提供する。
2007531708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動脈内皮細胞を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む，動脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ合成が血管内皮細胞増殖因子，塩基性繊維芽細胞増殖因子または血小板由来増殖因子によって誘導される，請求の範囲第１項に記載の方法。
【請求項３】
動脈内皮細胞を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む，動脈におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害する方法。
【請求項４】
前記ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化が，血管内皮細胞増殖因子，塩基性繊維芽細胞増殖因子，または血小板由来増殖因子によって誘導される，請求の範囲第３項に記載の方法。
【請求項５】
動脈内皮細胞を有効量のエフリンＢ２と接触させる工程を含む，動脈内皮細胞からの脈管形成を阻害する方法。
【請求項６】
前記脈管形成が，血管内皮細胞増殖因子，塩基性繊維芽細胞増殖因子，または血小板由来増殖因子によって誘導される，請求の範囲第５項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，血管形成および新生血管に関する。より詳しくは，血管形成および新生血管におけるエフリンＢ２の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管形成は，加齢黄斑変性，糖尿病性網膜症，および未熟児網膜症のような多種多様な眼病理症状の特徴である。血管形成カスケードは，多くのメディエータおよびケモカインによって惹き起こされる。例えば，多段階血管形成プロセスに関連する受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は，血管形成の重要なメディエータとして認識されている。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）を含む血管形成サイトカインが最初に産生することは，毛細血管の発生の概念によく当てはまる事象である。近年，アンジオポエチン／Ｔｉｅ２系が，血管アセンブリおよび成熟を媒介するリガンド−受容体系として同定されている。また，ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体およびアンジオポエチン／Ｔｉｅ２ファミリーもＲＴＫに属する。
【０００３】
参考文献
本出願において下記または本明細書中のどこかで引用される全ての刊行物，特許文献および特許出願は，それぞれの刊行物，特許文献および特許出願の開示が，具体的又は個別に明記されているかのように，それらの全体が本明細書中にとりこまれ，開示されたものとされる。
【非特許文献１】Ａｄａｍｓ， Ｒ．Ｈ.ら，（２００１）．Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｐｈｒｉｎＢ２  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｒａｎｉａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｒｅｓｔ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  Ｃｅｌｌ，１０４巻，１号，５７−６９頁
【非特許文献２】Ａｄａｍｓ， Ｒ．Ｈ．ら，（１９９９）．Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｅｐｈｒｉｎＢ  ｌｉｇａｎｄｓ  ａｎｄ  ＥｐｈＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  ｄｅｍａｒｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｅｒｉａｌ／  ｖｅｎｏｕｓ  ｄｏｍａｉｎｓ，ｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  ａｎｄ  ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．  ＧｅｎｅｓＤｅｖ．，１３巻，３号，２９５−３０６頁
【非特許文献３】Ｇａｌｅ， Ｎ．Ｗ．ら，（２００１）．ＥｐｈｒｉｎＢ２  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｍａｒｋｓ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ａｎｄ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ，  ｗｉｔｈ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ    ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｓｍｏｏｔｈ−ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ．  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２３０巻，２号，１５１−１６０頁
【非特許文献４】Ｇｅｒｅｔｙ， Ｓ．Ｓ．ら，（１９９９）．Ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ  ｍｕｔａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥｐｈＢ４  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｉｇａｎｄ  ｅｐｈｒｉｎＢ２  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４巻，３号，４０３−４１４頁
【非特許文献５】Ｋｅｎｙｏｎ，Ｂ．Ｍ．ら，（１９９６）．Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｃｏｒｎｅａ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．  Ｖｉｓ．  Ｓｃｉ．，３７巻，８号，１６２５−１６３２頁
【非特許文献６】Ａ Ｓｈｉｎ， Ｄ．ら，（２００１）．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｈｒｉｎＢ２  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ａｎｄ  ｖｅｎｏｕｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，  ａｎｄ  ｍａｒｋｓ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌｓ  ａｔ    ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２３０巻，２号，１３９−１５０頁
【非特許文献７】Ｗａｎｇ， Ｈ．Ｕ．ら，（１９９８）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｒｔｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  ｖｅｉｎｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｅｐｈｒｉｎＢ２  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｐｈ−Ｂ４．  Ｃｅｌｌ，９３巻，５号，７４１−７５３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
エフリンの受容体であるＥｐｈ受容体は，８つのＥｐｈＡ受容体および６つのＥｐｈＢ受容体からなる，チロシンキナーゼ受容体の最大のファミリーである。このＥｐｈ受容体チロシンキナーゼファミリーはＲＴＫの新しいクラスを表すが，血管形成におけるＥｐｈ受容体の役割ははっきりしていない。元来，Ｅｐｈ受容体は，神経経路開拓分子として同定されていたが，ノックアウトマウスおよび成熟エフリンＢ２−ｌａｃＺトランスジェニックマウス実験において，ＥｐｈＢ受容体およびエフリンＢリガンドが，動静脈分化および境界形成を編成する血管アセンブリの重要なレギュレータとして同定された（Ａｄａｍｓら，１９９９；Ｇａｌｅら，２００１；Ｓｈｉｎら，２００１）。一方，遺伝子標的実験では，エフリンＢ２は，動脈内皮細胞の初期マーカーであり，その受容体であるＥｐｈＢ４が脊椎動物胚においては静脈内皮細胞を相互にマークしていることが明らかにされている（Ｗａｎｇら，１９９８；Ａｄａｍｓら，１９９９；Ｇｅｒｅｔｙら，１９９９；Ａｄａｍｓら，２００１）。さらに，成人における内皮細胞は，その非対称的動静脈発現パターンを維持し，これは，エフリンＢ／ＥｐｈＢ系が，血管恒常性を制御する役割をし，そして成人において病理学的血管形成を制御する可能性を有することを示唆している（Ｇａｌｅら，２００１；Ｓｈｉｎら，２００１）。このように，エフリンの作用の態様を決定すること，ならびに特に病理学的状態において血管系を操作するためにこれらの分子を使用し得る手段が所望される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
我々は，エフリンＢ２が血管形成を抑制するメカニズムを研究した。そして，エフリンＢ２が内皮細胞（ＥＣ）のＤＮＡ合成および血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ），塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）によって誘導されるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を抑制することがわかった。特に，これらの効果は，動脈内皮細胞がエフリンＢ２に対する受容体を有することが解明されてないにもかかわらず，静脈および動脈内皮細胞（ＥＣｓ）で発揮される。エフリンＢ２はまた，ＥＣの脈管形成を阻害し，ｂＦＧＦに誘導された血管形成を抑制する。これらの結果は，エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４および，その抗血管形成シグナリング経路を標的にすることにより，血管形成依存的疾患を治療し得ることを示している。
【０００６】
したがって，本発明の一実施形態は，有効量のエフリンＢ２で動脈内皮細胞に接触させる工程を含む，内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻害する方法に関する。前記内皮細胞におけるＤＮＡ合成は，好ましくはＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたは血小板由来増殖細胞（ＰＤＧＦ）によって誘導され，前記内皮細胞は動脈内皮細胞であることが好ましい。
【０００７】
本発明はまた，有効量のエフリンＢ２で動脈内皮細胞を接触する工程を含む，内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害する方法に関する。前記内皮細胞における前記ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化は，好ましくはＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導され，前記内皮細胞は動脈内皮細胞であることが好ましい。
【０００８】
本発明の他の実施形態は，有効量のエフリンＢ２で動脈内皮細胞に接触させる工程を含む，内皮細胞からの脈管形成を阻害する方法に関する。前記内皮細胞の前記脈管形成は，好ましくはＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導され，前記内皮細胞は動脈内皮細胞であることが好ましい。
【０００９】
本発明におけるこれら全ての実施形態はｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施することができる。ｉｎｖｉｖｏで実施する場合，エフリンＢ２は当該技術分野において知られているいかなる方法によっても，内皮細胞を有する哺乳動物へ投与することができる。
【００１０】
さらに，本発明は有効量のエフリンＢ２を哺乳動物へ投与する工程を含む，哺乳動物における血管形成の阻害方法に関する。前記エフリンＢ２は，好ましくは全長エフリンＢ２である。
【００１１】
本発明はまた，有効量のエフリンＢ２を哺乳動物へ投与する工程を含む，哺乳動物における新生血管抑制方法に関する。前記エフリンＢ２は，好ましくは全長エフリンＢ２である。
【００１２】
本発明はさらに，有効量のエフリンＢ２を哺乳動物へ投与する工程を含む，哺乳動物における異常新生血管に関連する疾患または障害を治療する方法に関する。この疾患または障害は，好ましくは加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症，癌，関節リュウマチ，および子宮内膜症からなる群から選択される。
【発明の効果】
【００１３】
エフリンＢ２は血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができる。特に，エフリンＢ２は加齢黄斑変性症，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症，癌，関節リュウマチ，および子宮内膜症のような血管形成または新生血管に関連する疾患あるいは障害の治療に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４系は，脈管形成および血管形成において大変重要な役割を果たす。そこで，我々はエフリンＢ２が血管形成を抑制するメカニズムについて検討した。エフリンＢ２が内皮細胞（ＥＣ）のＤＮＡ合成，およびＶＥＧＦとＦＧＦ２が誘導するｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を抑制することがわかった。エフリンＢ２はまた，ＥＣの脈管形成をも阻害した。マウスにおける角膜のマイクロポケットアッセイおよび角膜の新生血管の定量も行った。エフリンＢ２はｂＦＧＦが誘導した角膜血管新生を抑制した。これらの結果は，エフリンＢ２／ＥｐｈＢ４，およびその抗血管形成シグナリング経路を標的にすることにより，血管形成依存的疾患を治療し得ることを示唆している。
【００１５】
本発明をさらに詳細に説明する前に，本明細書で用いられる用語は，他に指示がなければ，以下に定義されるとおりである。
【００１６】
定義
用語「エフリンＢ２」とは，異なる記載がない限り，（１）天然のエフリンＢ２またはその細胞外ドメイン，好ましくは天然のヒトエフリンＢ２と実質的な配列類似性を有し；そして（２）天然のエフリンＢ２または細胞外ドメインの生物学的活性を有する，ポリペプチドをいう。
【００１７】
天然の分子と「実質的な配列類似性」を有するポリペプチドは，天然の分子とアミノ酸レベルで少なくとも約３０％同一である。ポリペプチドは，好ましくは，天然の分子とアミノ酸レベルで少なくとも約４０％，５０％，６０％，７０％，８０％，８５％，９０％，９５％，もっとも好ましくは少なくとも約９８％同一である。
【００１８】
天然の分子とのアナログまたは改変体の用語「パーセント同一性」または「％同一性」とは，２つの配列をアラインした場合に，アナログまたは改変体においても見られる天然分子におけるアミノ酸配列のパーセントをいう。パーセント同一性は，ＬＡＬＩＧＮ，ＣｌｕｓｔａｌＷ，またはＢＬＡＳＴのような当該技術分野で確立された任意の方法または，アルゴリズムによって決定することができる。
【００１９】
ポリペプチドは，天然のエフリンＢ２の受容体と結合し得る場合，あるいはＥＣのＤＮＡ合成，ＥＣにおける細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ（ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ））リン酸化，ＥＣの脈管形成，血管形成または新生血管を阻害し得る場合に，天然のエフリンＢ２の「生物学的活性」を有する。ＥＣのＤＮＡ合成，ＥＣにおけるＥＲＫリン酸化，ＥＣの脈管形成，血管形成または新生血管を阻害する活性は，当該技術分野において公知の任意の方法によって決定することができ，特に，本明細書に記載の方法によって決定することができる。
【００２０】
天然のエフリンＢ２のような「天然の」分子は，人工的な介入なく天然に存在する分子である。しかし，天然のエフリンＢ２はまた，人工的な介入なく存在するエフリンＢ２の細胞外ドメインであってもよい。
【００２１】
「全長」エフリンＢ２は，細胞外および細胞内の両方のドメインを含むエフリンＢ２である。全長エフリンＢ２は，天然に存在しているものでもよく，あるいは天然のエフリンＢ２のアナログまたは改変体であってもよい。
【００２２】
「有効量」とは，所望の目的を達成するに十分な物質の量である。例えば，ＤＮＡ合成を阻害するためのエフリンＢ２の有効量は，ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの場合に応じて，ＤＮＡ合成の量を減少させるに十分な量である。疾患または障害を治療するためのエフリンＢ２の有効量は，疾患または障害の徴候を低減または除去するか，または疾患または障害を予防または遅延させるに十分なエフリンＢ２の量である。所定の物質の有効量は，物質の性質，投与経路，物質を受容する動物のサイズおよび種，ならびに物質を与える目的などの因子で変動する。各場合の有効量は，当該技術分野で確立された方法に従って，当業者によって経験的に決定することができる。
【００２３】
疾患または障害の「治療」という用語は，疾患または障害の徴候の低減または完全な除去をいう。
【００２４】
上皮細胞におけるエフリンＢ２の効果
内皮細胞はＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢのような増殖因子に応答して増殖を誘導されることが知られている。この現象におけるエフリンＢ２の影響を決定するために，エフリンＢ２がＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢと結合する動脈または静脈に添加された（実施例１）。その結果，エフリンＢ２がＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢといったこれら全ての刺激によって誘導されたＤＮＡ合成を阻害したことであるのに対し，ＥｐｈＢ４もエフリンＢ２とＥｐｈＢ４との組み合わせによるものも，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢといったこれら全ての刺激によって誘導されたＤＮＡ合成を阻害しなかった。図１Ａに示されるように，１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，またはＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されたＤＮＡ合成の増加量は，２００μｇ／ｍＬのエフリンＢ２によってそれぞれ４０％，３０％，および９０％阻害された。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）においても，ほとんど同一の結果が得られた（図１Ｂ）。特に細胞死は観測されなかったので，エフリンＢ２によるＤＮＡ合成の阻害は，細胞死によって惹き起こされるのではないと考えられる。
【００２５】
したがって，エフリンＢ２は，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，およびＰＤＧＦを含む種々の刺激によって誘導されるＥＣのＤＮＡ合成を阻害することができる。ＤＮＡ合成が静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の両方で阻害されることは，驚くべきことである。なぜなら，エフリンＢ２の受容体（ＥｐｈＢ４）は，静脈内皮細胞のマーカーであるが，動脈内皮細胞は，この受容体を有することが知られていないからである。
【００２６】
さらに誘導した脈管形成は，７日目には，コントロール群と比較してエフリンＢ２処理群で減少していた（図１Ｃ）。一方，ＶＥＧＦ誘導した脈管形成は，ＥｐｈＢ４処理によっては影響を受けなかった。
【００２７】
増殖因子によって誘導された分裂促進反応を，エフリンＢ２が阻害するメカニズムを解明するために，ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで刺激されたＥＲＫ（ｐ４２／４４）リン酸化におけるエフリンＢ２の効果を検討した（実施例２）。その結果は，エフリンＢ２は，動脈および静脈内皮細胞においてＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ誘導ＥＲＫリン酸化を抑制することを示している。しかし，エフリンＢ２は，ＶＥＧＦ受容体２の自己リン酸化を阻害しなかった（図２Ｂ）。このことは，エフリンＢ２は，ＶＥＧＦ機能を阻害するメカニズムとして，ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体２との間のシグナル伝達を妨害しないことを示している。したがって，エフリンＢ２は，動脈内皮細胞においても，あるいは静脈内皮細胞においてもＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ誘導ＥＲＫリン酸化を阻害するのに用いることができるといえる。
【００２８】
塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は，強力な血管形成因子であることが知られている。エフリンＢ２は，ｂＦＧＦによって誘導されたＥＣ細胞の増殖を阻害することができるので，エフリンＢ２が同様に血管形成を抑制することができるかどうかを検討した（実施例３）。実際，エフリンＢ２を投与することで，ｂＦＧＦによって誘導された血管形成は著しくブロックされたが，ＥｐｈＢ４投与によっては効果を示さなかった。
【００２９】
したがって，エフリンＢ２は，血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができるといえる。特に，これらの結果は，エフリンＢ２が加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症，癌，関節リュウマチ，および子宮内膜症のような血管新生または新生血管に関連する疾患や障害の治療に有用であることを示している。
【００３０】
本発明に有用なエフリンＢ２は，必要とされる活性を有する，アナログおよび改変体を含む任意のエフリンＢ２であってよい。前記エフリンＢ２は，全長エフリンＢ２であってもよく，細胞内ドメインを含まず，細胞外ドメインを含むものであってよい。
【００３１】
エフリンＢ２の投与
エフリンＢ２を含有する薬学的組成物の調製方法は，当該技術分野で周知である。
【００３２】
エフリンＢ２は，投与経路に適合した薬学的に許容可能なキャリアと混合して，例えば，経口的に，あるいは筋肉内または静脈内注射によって全身投与することができる。生理学的に許容可能な種々のキャリアをエフリンＢ２を投与するために使用することができる。そして，その処方は当業者に公知であり，例えば，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版），  Ａ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，およびＰｏｌｌｏｃｋらに記載されている。
【００３３】
エフリンＢ２は，好ましくは，非経口的に投与される（例えば，筋肉内，腹腔内，静脈内，眼内，硝子体内，または皮下注射によって，あるいは移植によって）。非経口投与のための処方物は，滅菌の水性または非水性溶液，懸濁液，あるいは乳化液を含むものであってもよい。例えば，水，緩衝化水，生理食塩液などの種々の水性キャリアが使用され得る。他の適切な溶媒の例としては，ポリプロピレングリコール，ポリエチレングリコール，植物油，ゼラチン，硬化ナファレン，およびオレイン酸エチルのような注射用有機エステルがあげられる。このような処方物はまた，保存剤，湿潤剤，緩衝化剤，乳化剤，および／または分散剤のような補助物質を含んでもよい。生体適合性，生分解性のラクチドポリマー，ラクチド／グリコシドコポリマー，またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーが，活性成分の放出を制御するために使用されてもよい。
【００３４】
あるいは，エフリンＢ２は，経口摂取によって投与することができる。経口使用を意図した組成物は，当該薬学的組成物の製造における技術分野で公知の，任意の方法に従って，固体または液体の形態に調製することができる。この組成物は，より嗜好性のよい調製物を提供するために，必要に応じて，甘味剤，香味剤，着色剤，着香剤，および保存剤を含んでいてもよい。
【００３５】
経口投与用の固体投与の形態としては，カプセル剤，錠剤，丸剤，粉剤，および顆粒剤があげられる。一般的に，これらの組成物は，非毒性の薬学的に許容可能な賦形剤と混合された活性成分を含む。
【００３６】
これらは，例えば，炭酸カルシウム，炭酸ナトリウム，ラクトース，スクロース，グルコース，マンニトール，セルロース，デンプン，リン酸カルシウム，リン酸ナトリウム，カオリンなどのような不活性希釈剤を含んでもよい。また，結合剤，緩衝化剤，および／または滑沢剤（例えば，ステアリン酸マグネシウム）を使用してもよい。
【００３７】
錠剤および丸剤は，さらに，腸溶コーティングとともに調製することができる。
【００３８】
経口投与用の液体投与の形態としては，薬学的に許容される乳化液，溶液，懸濁液，シロップ，および軟ゼラチンカプセルがあげられる。
【００３９】
これらの形態は，水または油培地のような当該技術分野で通常使用される不活性希釈剤を含み，そしてまた，湿潤剤，乳化剤，懸濁化剤などのアジュバントを含むことができる。
【００４０】
エフリンＢ２はまた，例えば，貼付剤によって，あるいは眼への直接適用によって，あるいはイオン浸透法によって，局所的に投与できる。
【００４１】
エフリンＢ２は，例えば，米国特許第５，６７２，６５９号および第５，５９５，７６０号に記載されるような徐放性組成物に含める形態で提供され得る。即時または徐放性組成物の使用は，治療される障害の性質に依存する。障害が急性または超急性障害からなる場合，即時放出形態での治療が，徐放性組成物よりも好適である。あるいは，予防または長期治療については，徐放性組成物が適切であり得る。
【００４２】
エフリンＢ２はまた，インプラントを用いて輸送されてもよい。このようなインプラントは，生分解性および／または生体適合性インプラントであってもよく，あるいは非生分解性インプラントであってもよい。インプラントは，活性成分に対して透過性または非透過性であり得る。眼用インプラントは，前眼房または後眼房のような眼房に挿入されてもよいし，あるいは強膜，脈絡膜横断腔，または硝子体の外面の無血管領域に移植されてもよい。好ましい実施態様として，眼用インプラントは，強膜上のような無血管領域に配置されてもよく，そのため，所望の治療部位，例えば，眼内腔および眼の黄斑への薬物の経強膜拡散を可能にする。さらに，経強膜拡散の部位は，好ましくは黄斑の近くである。
【００４３】
エフリンＢ２の輸送のためのインプラントの例として，米国特許第3,416,530；3,828,777；4,014,335；4,300,557；4,327,725；4,853,224；4,946,450；4,997,652；5,147,647；5,164,188；5,178,635；5,300,114；5,322,691；5,403,901；5,443,505；5,466,466；5,476,511；5,516,522；5,632,984；5,679,666；5,710,165；5,725,493；5,743,274；5,766,242；5,766,619；5,770,592；5,773,019；5,824,072；5,824,073；5,830,173；5,836,935；5,869,079；5,902,598；5,904,144；5,916,584；6,001,386；6,074,661；6,110,485；6,126,687；6,146,366；6,251,090；および6,299,895号；ならびにWO01/30323およびWO01/28474（これらのすべては，参考資料として本明細書に援用される。）に記載のデバイスがあげられるが，これらに限定されない。
【００４４】
投与量
単回投与剤形を製造するためにキャリア材料と合わせる活性成分の量は，処置する個体および特定の投与態様によって変動する。一般的には，エフリンＢ２は，疾患の徴候を低減または除去するに十分な量で投与されるべきである。
【００４５】
１回の投与あたりに約１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーでの投与レベルは，一般的に新生血管障害の治療に有用である。眼に直接投与する場合は，好ましい投与量範囲は，１眼あたり約０．３ｍｇ〜約３ｍｇである。投与量は，単回投与として投与されてもよく，あるいは多数回投与に分割してもよい。一般的に，所望の投与量は，長期間，通常は少なくとも数週間に設定された間隔で投与されるべきであるが，数ヶ月以上のより長い投与期間も必要とされ得る。
【００４６】
当業者は，正確な個々の投与量は，例えば，以下の種々の因子に依存して調節され得ることを認識する：投与時間；投与経路；処方物の性質；排泄速度；治療される特定の障害；障害の重篤度；ならびに患者の年齢，体重，健康状態，および性別などである。必要とされる投与量の広範囲にわたる変動は，様々な投与経路の異なる有効性を考慮して予測されるべきである。例えば，経口投与は，一般的に，静脈内または硝子体内注射による投与よりも高い投与量レベルを必要とすることが予測される。これらの投与量レベルの変動は，当該技術分野で周知の最適化に対する標準的経験則を用いて調節され得る。正確な治療的に有効な投与量レベルおよびパターンは，好ましくは，上記の因子を考慮して主治医によって決定される。
【００４７】
予め存在している新生血管疾患を治療することに加えて，エフリンＢ２は，これらの障害の発症を予防または遅延させるために予防的に投与することができる。予防的な適用において，エフリンＢ２は，特定の血管新生障害になる疑いのある，あるいはその危険性のある対象に投与される。また，投与される正確な量は，対象の健康状態，体重などのような様々な因子に依存する。
【００４８】
以下の実施例において，以下の略語は以下の意味を有する。定義されていない略語は，一般的に許容されている意味を有する：
℃＝摂氏度
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分
ｓｅｃ＝秒
μＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度
ｍＬ＝ミリリットル
μＬ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
μｇ＝マイクログラム
ＤＭＥＭ＝ダルベッコの改変イーグル培地
ＩＴＳ＝インスリン−トランスフェリン−セレニウム
ＦＢＳ＝ウシ胎児血清
ＭＥＭ＝改変イーグル培地
ＰＢＳ＝リン酸緩衝生理食塩水
ＶＥＧＦ＝血管内皮細胞増殖因子
ＦＧＦ＝繊維芽細胞増殖因子
ＰＤＧＦ＝血小板由来増殖因子
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＥＣ＝内皮細胞
ＨＵＶＥＣ＝ヒト臍帯静脈内皮細胞
ＨＡｏＥＣ＝ヒト大動脈内皮細胞
【００４９】
試料および方法
試薬
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（サンディエゴ，カリフォルニア，米国）から購入し，１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＥＧＭ培地中で維持した。1型コラーゲンでコーティングされたディッシュはイワキ（日本）から購入した。[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰはＡｍｅｒｓｈａｍから購入した。ＫＤＲ（ＳＣ−５０４）およびＦｌｇに対するウサギのポリクローナル抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルズ，カリフォルニア，米国）から購入した。
【００５０】
細胞培養
ＨＵＶＥＣを，１型コラーゲンでコーティングされたディッシュ（Ｉｗａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）上の内皮細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．， Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）中で，５％ＣＯ２，９５％空気中３７℃にて培養し，培地を２〜３日ごとに交換することにより維持した。
【００５１】
ノーザンブロット解析
全ＲＮＡ試料を，グアニジウムチオシアン酸塩−フェノール−クロロホルム抽出法を用いて，細胞から分離し，ノーザンブロット解析を行った。ＲＮＡを２．２Ｍのホルムアルデヒドを含んだ１％アガロースゲル上で分画し，ナイロン膜（ＮｅｎＴＭ  ライフサイエンスＰｒｏｄｕｃｔ，Ｉｎｃ）上へ転移させた。そして，０．２Ｊ／ｃｍ２でＵＶ架橋結合（クロスリンク）させた。そして，Ａｍｅｒｓｈａｍ  マルチプライムラベリングキットおよび[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰを使用してＫＤＲまたは３６Ｂ４ ｃＤＮＡの放射性プローブを発生させた。このナイロン膜をハイブリゾル（Ａｍｅｒｓｈａｍ，米国）中，４２℃で１６時間ハイブリダイズし，３２ＰでラベルしたＤＮＡプローブを作製した。そして，０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えた２Ｘ  ＳＳＰＥ（１Ｘ  ＳＳＰＥは，０．１５Ｍの塩化ナトリウムと０．０１５Ｍのナトリウムクエン酸塩を足したものである）中，室温で一度洗浄し，その後０．１％のＳＤＳを加えた０．５Ｘ  ＳＳＰＥで二回洗浄した。メッセンジャーＲＮＡレベルをＦｕｊｉｘ  ＢＡＳ  ２５００バイオイメージアナライザー（富士写真フィルム）を用いてデンシトメトリー（濃度測定）によって定量した。
【００５２】
[3Ｈ]チミジン取り込み―ＨＡｏＥＣおよびＨＵＢＥＣのＤＮＡ合成
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＢＥＣ）は上述のとおり維持した。４〜５継代の細胞を実験に用いた。ＥＣを，１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ， Ｊａｐａｎ）中，示した量のエフリンＢ２またはＥｐｈＢ４のいずれかの存在または不在下で，１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，またはＰＤＧＦ−ＢＢで１８時間処理した。次いで，細胞を，２０μＣｉ／ｍＬにて［メチル−３Ｈ］チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に６時間曝露した。この細胞を，トリプシン処理し，自動細胞採取機を用いてガラス繊維フィルター上に回収し，そして［メチル−３Ｈ］チミジン取り込みを，直接βカウンターで測定した。
【００５３】
内皮脈管形成アッセイ
コラーゲンゲルを，氷冷ゼラチン溶液（１０×Ｍ１９９，Ｈ２Ｏ，０．５３Ｍ ＮａＨＣＯ３，２００ｍＭ Ｌ−グルタミン，Ｉ型コラーゲン，０．１Ｍ ＮａＯＨ，１００：２７．２：５０：１０：７５０：６２．５（容量比））と，１×基本培地（以下を参照）中の３×１０６細胞／ｍＬの濃度の細胞とを，４容量のゼラチン溶液：１容量の細胞懸濁液の比で一緒に混合することによって形成した。３７℃で３０分間ゲル化した後，ゲルを，４０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ，４０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ，および８０ｎＭのＰＭＡを追加した，１％ＦＢＳ，１×ＩＴＳ，２ｍＭ Ｌ−グルタミン，５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸，２６．５ｍＭ ＮａＨＣＯ３，１００ユニット／ｍＬペニシリン，および１１０ユニット／ｍＬストレプトマイシンを補充したＭ１９９からなる１×基本培地で覆った。全薬品は，ゲル化の直後に１×基本培地に添加した。脈管形成を定量するために，高倍率（２０×）視野あたりの脈管の数を，基本培地に添加した４８時間後に測定した。脈管を，１００μｍの長さ（長軸）を超える１以上の内皮細胞で構成される延長された構造物として定義した。１００μｍの光学的区切りによって分離された５つの独立視野を，各ウェルについて評価し，そして２０×視野あたりの管の平均数を測定した。細胞傷害性を，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手した細胞増殖キットIIを用いて評価した。
【００５４】
タンパク質試料の調製およびウェスタンブロッティング
全細胞ライセート，サイトゾル抽出物，または核抽出物を，内皮細胞から単離した。ウエスタンブロッティングを，免疫沈降を用いておよび用いずに行った。タンパク質試料を，ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し，次いでニトロセルロース膜に電気泳動で転移した。スキムミルクでブロッキングした後，ブロットを，ホスホチロシンまたはＫＤＲ（ｓｃ−５０４）に対する抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）から購入）とともに４℃にて一晩インキュベートした（１：５００）。洗浄後，ニトロセルロース膜を，西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）（１：３０００）とともに室温にて１時間インキュベートした。可視化を，製造業者の指示書に従ってＡｍｅｒｓｈａｍ増強化学発光（ＥＣＬ）検出システムを用いて行った。
【００５５】
マウスにおける角膜マイクロポケットアッセイ
マウスにおける角膜マイクロポケットアッセイおよび角膜血管新生の定量を，いくらかの改変を加えて行った。簡単に言えば，９０ｎｇのヒトｂＦＧＦを含む０．３μＬのＨｙｄｒｏｎペレット（ＩＦＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ， ＵＳＡ）を調製し，雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの角膜に移植した。ｓエフリンＢ２またはｓＥｐｈＢ４（１００ｎｇ／ペレット）を，ｂＦＧＦ／Ｈｙｄｒｏｎ溶液に直接添加した。ペレットを，角膜縁から１．０ｍｍに配置した。移植後，オフロキサシン／点眼剤を各眼に適用した。６日後，動物を屠殺し，そして角膜血管を写真撮影した。マウス角膜における血管新生の定量分析を，ソフトウエアパッケージＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて行った。その結果，ペレットの移植の６日後，新しい血管の発芽を検査した。ｂＦＧＦは，マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。
および角膜血管新生の定量を，いくらかの改変を加えて行った。簡単に言えば，９０ｎｇのヒトｂＦＧＦを含む０．３μＬのＨｙｄｒｏｎペレット（ＩＦＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，  ＵＳＡ）を調製し，雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの角膜に移植した。エフリンＢ２またはＥｐｈＢ４（１００ｎｇ／ペレット）を，ｂＦＧＦ／Ｈｙｄｒｏｎ溶液に直接添加した。ペレットを，角膜縁から１．０ｍｍに配置した。移植後，オフロキサシン／点眼剤を各眼に適用した。６日後，動物を屠殺し，そして角膜血管を写真撮影した。マウス角膜における血管新生の定量分析を，ソフトウエアパッケージＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて行った。
【００５６】
統計解析
実験データはｍｅａｎｓ±ＳＤで表される。統計的な有意差は，標準的に分布した母集団においてスチューデント ｔ検定（有意差検定）
を用い，ｐ＜０．０５のときとした。
【実施例１】
【００５７】
エフリンＢ２による，増殖因子によって刺激されたＥＣの増殖および遊走の阻害
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣｓ）をＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，またはＰＤＧＦ−ＢＢ（各１０ｎg／ｍＬ）で処理することにより，未処理のコントロール群と比較して，ＤＮＡ合成が３〜１０倍に増加した。エフリンＢ２は，これらのすべての刺激物で刺激されたＤＮＡの合成を阻害したが，ＥｐｈＢ４およびエフリンＢ２＋ＥｐｈＢ４は，いずれも阻害しなかった。図１Ａに示すように，１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，またはＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されたＤＮＡ合成の増加は，２００μｇ／ｍＬのエフリンＢ２によって，それぞれ４０％，３０％，および９０％阻害された。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を用いてもほとんど同じ結果を得た（図１Ｂ）。このインキュベーション期間中に，顕著な死細胞は観察されなかった（データは示さず）。ＶＥＧＦ誘導した脈管形成は７日目には，コントロール群と比較して，エフリンＢ２処理群で減少した（図１Ｃ）。一方，ＶＥＧＦ誘導した脈管形成は，ＥｐｈＢ４処理によっては影響を受けなかった。
【００５８】
したがって，エフリンＢ２は，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦ，およびＰＤＧＦを含む種々の刺激によって誘導されるＥＣのＤＮＡ合成を阻害し得ることが分かった。エフリンＢ２の正確なメカニズムは明らかではないが，ＤＮＡ合成の減少は，顕著な死細胞が観察されなかったことから，細胞死によって引き起こされたのではないと考えられる。ＤＮＡ合成が静脈内皮細胞および動脈内皮細胞の両方で阻害されることは，驚くべきことである。なぜなら，エフリンＢ２の受容体（ＥｐｈＢ４）は，静脈内皮細胞のマーカーであるが，動脈内皮細胞は，この受容体を有することが知られていないからである。
【００５９】
ＤＮＡ合成における効果と一致したことは，エフリンＢ２は，ＶＥＧＦによって誘導されるＥＣ脈管形成をも阻害し得るといえる。
【実施例２】
【００６０】
増殖因子によって誘導されたｐ４２／４４ＥＲＫリン酸化および受容体自己リン酸化に対するエフリンＢ２の効果
【００６１】
ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣｓ）に対するＶＥＧＦまたはｂＦＧＦ誘導した分裂促進応答をエフリンＢ２が阻害するメカニズムについて検討するために，ＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで刺激したＥＲＫ（ｐ４２／４４）リン酸化に対するエフリンＢ２の効果をウエスタン分析によって実験した。ＥＲＫリン酸化は，１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦまたはｂＦＧＦの刺激によって増加した。エフリンＢ２はＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの両方が誘導したＥＲＫリン酸化を阻害した。例えば，２００μｇ／ｍＬのエフリンＢ２は，ＶＥＧＦ誘導したＥＲＫリン酸化を７０％阻害した（図２Ａ）。次に，ＶＥＧＦで刺激したヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）におけるＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）自己リン酸化について検討した。ＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）自己リン酸化は１０ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦによって１４倍増加した。エフリンＢ２は，ＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）自己リン酸化を阻害しなかった（図２Ｂ）。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）を用いてもほとんど同じ結果を得た（データは示さず）。
【００６２】
したがって，これらの結果は，エフリンＢ２が，動脈または静脈の内皮細胞においてＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで誘導されたＥＲＫリン酸化を阻害することを示している。この効果は，おそらく，少なくとも部分的に，エフリンＢ２がＶＥＧＦまたはｂＦＧＦで誘導したこれらの細胞の増殖を阻害するという活性を説明できる。しかし，エフリンＢ２は，ＶＥＧＦ受容体２の自己リン酸化を阻害しない。したがって，エフリンＢ２は，ＶＥＧＦ機能を阻害するメカニズムとして，ＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体２との間のシグナル伝達を妨害しないと考えられる。
【実施例３】
【００６３】
マウス角膜におけるエフリンＢ２の同時投与によってｂＦＧＦ誘導した血管形成の阻害
塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は，強力な血管形成因子であることが知られている。エフリンＢ２は，ｂＦＧＦによって誘導されたＥＣ細胞の増殖を阻害し得るので，エフリンＢ２が同様に血管形成を抑制し得るかどうかを検討した。
【００６４】
ヒトｂＦＧＦが浸み込んだＨｙｄｒｏｎペレットをマウスの角膜に移植した。ペレットの移植後６日目に，新しい血管の発芽を検査した。ｂＦＧＦは，マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。ｂＦＧＦは，マウス角膜において血管形成を劇的に誘導した。さらに，ｂＦＧＦ誘導した角膜新生血管に対するエフリンＢ２またはＥｐｈＢ４の効果を検討した。
エフリンＢ２の投与により，ｂＦＧＦによって誘導された血管形成は顕著にブロックされたが，ＥｐｈＢ４の投与では何の効果も示さなかった。定量分析によっても，ｂＦＧＦ誘導した角膜新生血管が，エフリンＢ２によって完全に阻害されたことが示された（図３）。
【００６５】
したがって，エフリンＢ２は血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができる。特に，これらの結果は，エフリンＢ２が加齢黄斑変性症，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症，癌，関節リュウマチ，および子宮内膜症のような血管形成または新生血管に関連する疾患あるいは障害の治療に有用であることを示している。
【００６６】
本発明の多くの実施例が述べられたが，発明の趣旨および範囲から逸脱しない範囲で，種々の改変をすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００６７】
エフリンＢ２は血管形成および新生血管を阻害するのに用いることができる。特に，エフリンＢ２は加齢黄斑変性症，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症，癌，関節リュウマチ，および子宮内膜症のような血管形成または新生血管に関連する疾患あるいは障害の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１Ａ】図１は，エフリンＢ２による，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＢＢが誘導したＥＣの増殖と脈管形成の阻害を示す。図１Ａは，ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣｓ）（１Ａ）における，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されるＤＮＡ合成に対するエフリンＢ２の影響を表す。ＨＡｏＥＣｓを低コンフルエントな10％DMEMを含む基本培地中で培養した。そして，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢ（各１０ｎｇ／ｍＬ）の存在または不存在下において，２００μｇ／ｍＬのエフリンＢ２またはＥｐｈＢ４それぞれとともに２４時間処理した。これらの実験を３回繰り返した。代表的な実験からのデータを示す（ｍｅａｎ±ＳＤ）。Ｃ：コントロール群（溶媒のみ）  Ｂ２：エフリンＢ２  Ｂ４：ＥｐｈＢ４である。
【図１Ｂ】図１は，エフリンＢ２による，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦおよびＰＤＧＦ−ＢＢが誘導したＥＣの増殖と脈管形成の阻害を示す。図１Ｂは，ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣｓ）（１Ｂ）における，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されるＤＮＡ合成に対するエフリンＢ２の影響を表す。ＨＵＶＥＣｓを低コンフルエントな10％DMEMを含む基本培地中で培養した。そして，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦ−ＢＢ（各１０ｎｇ／ｍＬ）の存在または不存在下において，２００μｇ／ｍＬのエフリンＢ２またはＥｐｈＢ４それぞれとともに２４時間処理した。これらの実験を３回繰り返した。代表的な実験からのデータを示す（ｍｅａｎ±ＳＤ）。Ｃ：コントロール群（溶媒のみ）  Ｂ２：エフリンＢ２  Ｂ４：ＥｐｈＢ４である。
【図１Ｃ】図１Ｃは，コントロール群，エフリンＢ２処理群およびＥｐｈＢ４処理群の，７日目におけるＶＥＧＦに応答した内皮細胞の脈管形成の結果を示す。
【図２Ａ】図２は，内皮細胞におけるＥＲＫリン酸化および受容体自己リン酸化に対するエフリンＢ２の効果を示す。図２Ａは，ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦで刺激したＨＡｏＣｓにおける細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化に対するエフリンＢ２の阻害効果を示す。ｐ４４／ｐ４２は全ＥＲＫであり，ｐｐ４４／ｐｐ４２はリン酸化ＥＲＫである。
【図２Ｂ】図２は，内皮細胞におけるＥＲＫリン酸化および受容体自己リン酸化に対するエフリンＢ２の効果を示す。図２Ｂは，エフリンＢ２が，ＶＥＧＦで刺激したＨＡｏＣｓにおけるＶＥＧＦ受容体２の自己リン酸化に対して，有意な効果を全くもたらさないことを示す。この受容体（ＫＤＲ）は細胞溶解液（細胞ライセート）から免疫沈降（ＩＰ）し，抗リン酸化チロシン抗体（ＰＹ２０）でブロットしたものである。
【図３】図３は，エフリンＢ２の投与によって，新生血管のｂＦＧＦによる誘導が顕著にブロックされたことを示す。ｂＦＧＦ存在下における新生血管領域を１００％と設定した。
【図１Ａ】
2007531708.tif 000003
【図１Ｂ】
2007531708.tif 000004
【図１Ｃ】
2007531708.tif 000005
【図２Ａ】
2007531708.tif 000006
【図２Ｂ】
2007531708.tif 000007
【図３】
2007531708.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月27日(2006.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のエフリンＢ２を含む，動脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ合成がＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
有効量のエフリンＢ２を含む，動脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための薬学的組成物。
【請求項４】
前記ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化が，血管内皮細胞増殖因子，塩基性繊維芽細胞増殖因子，または血小板由来増殖因子によって誘導される，請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
有効量のエフリンＢ２を含む，動脈内皮細胞からの脈管形成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項６】
前記脈管形成が，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項１から請求項６のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項８】
有効量のエフリンＢ２を含む，静脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＤＮＡ合成がＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
有効量のエフリンＢ２を含む，静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化が，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
有効量のエフリンＢ２を含む，静脈内皮細胞からの脈管形成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１３】
前記脈管形成が，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項８から請求項１３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
有効量のエフリンＢ２を含む，哺乳類の眼内の血管新生抑制するための薬学的組成物。
【請求項１６】
有効量のエフリンＢ２を含む，哺乳類の脈絡膜血管新生抑制するための薬学的組成物。
【請求項１７】
有効量のエフリンＢ２を含む，哺乳動物における異常新生血管に関連する疾患または障害を治療するための薬学的組成物。
【請求項１８】
前記疾患または障害が，加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症からなる群から選択される，請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記疾患または障害が，加齢黄斑変性である，請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項１５から請求項１９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月7日(2007.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のエフリンＢ２を含む，動脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ合成がＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
有効量のエフリンＢ２を含む，動脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための薬学的組成物。
【請求項４】
前記ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化が，血管内皮細胞増殖因子，塩基性繊維芽細胞増殖因子，または血小板由来増殖因子によって誘導される，請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
有効量のエフリンＢ２を含む，動脈内皮細胞からの脈管形成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項６】
前記脈管形成が，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項１又は請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項３又は請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項５又は請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
有効量のエフリンＢ２を含む，静脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ合成がＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
有効量のエフリンＢ２を含む，静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化が，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
有効量のエフリンＢ２を含む，静脈内皮細胞からの脈管形成を阻害するための薬学的組成物。
【請求項１５】
前記脈管形成が，ＶＥＧＦ，ｂＦＧＦまたはＰＤＧＦによって誘導される，請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項１０又は請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項１２又は請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項１４又は請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
有効量のエフリンＢ２を含む，哺乳類の眼内の血管新生抑制するための薬学的組成物。
【請求項２０】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
有効量のエフリンＢ２を含む，哺乳類の脈絡膜血管新生抑制するための薬学的組成物。
【請求項２２】
前記エフリンＢ２が，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない，請求項２１に記載の薬学的組成物。
【国際調査報告】
2007531708.tif 000009
2007531708.tif 000010