(57)【要約】  本発明は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を使用して非天然アミノ酸をペプチドに組込むための方法と組成物を提供する。特に、オパール突然変異によりコードされる位置に５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンを組込むための直交対を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
翻訳系と；
直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）、直交突然変異体トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）、及びその誘導体から構成される群から選択される直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む組成物であって、
前記Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸又は非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する前記組成物。
【請求項２】
翻訳系が細胞又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞が真核細胞、アフリカツメガエル細胞、又は哺乳動物細胞を含む請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系か細胞溶解液を含む請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
Ｏ−ＲＳが配列番号１、その保存変異体、及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
Ｏ−ＲＳが配列番号２、及びその保存置換配列から構成される群から選択されるアミノ酸を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
非天然アミノ酸がトリプトファン類似体又は５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
Ｏ−ＲＳがＫｍ及びＫｃａｔから構成される群から選択される天然アミノ酸に比較して非天然アミノ酸に関して改善又は強化された１種以上の酵素特性を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
Ｏ−ｔＲＮＡが翻訳系の内在アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼにより実質的にアミノアシル化されない請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号３、その保存変異体、及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識する請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
セレクターコドンが４塩基コドン、レアコドン、ＵＡＧ、ＵＡＡ、及びＵＧＡから構成される群から選択される配列を含む請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
産物ペプチドをコードする核酸を更に含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
核酸がＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドン配列を含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
産物ペプチドが野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその一部と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む組成物であって、前記Ｏ−ＲＳがｔＲＮＡを５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）で優先的にアミノアシル化する前記組成物。
【請求項１７】
Ｏ−ＲＳが配列番号１、その保存変異体、及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｏ−ＲＳが配列番号２、及びその保存置換配列から構成される群から選択されるアミノ酸を含む請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｏ−ＲＳがＫｍ及びＫｃａｔから構成される群から選択されるトリプトファンに比較して５−ＨＴＰＰのアミノアシル化に関して改善又は強化された１種以上の酵素特性を含む請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
ｔ−ＲＮＡがＯ−ｔＲＮＡである請求項１６に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｏ−ｔＲＮＡが内在アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼにより実質的にアミノアシル化されない請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号３、その保存変異体、及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｏ−ｔＲＮＡがセレクターコドンを認識する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
セレクターコドンが４塩基コドン、レアコドン、ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡから構成される群から選択される配列を含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
内在翻訳系を更に含む請求項１６に記載の組成物。
【請求項２６】
内在翻訳系が細胞又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系を含む請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
細胞が真核細胞又は哺乳動物細胞を含む請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
産物ペプチドをコードする核酸を更に含む請求項１６に記載の組成物。
【請求項２９】
ｔ−ＲＮＡがＯ−ｔＲＮＡであり、核酸がＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドン配列を含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
産物ペプチドが野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその一部と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列を含む請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
コーディングポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、前記コーディングポリヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１とその保存変異体から構成される群から選択されるコーディングポリヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２とその保存置換配列から構成される群から選択されるポリペプチドをコードするコーディングポリヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の相補的配列から構成される群から選択され；
前記ポリペプチドが５−ＨＴＰＰを負荷するアミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ活性を含む前記ポリペプチド。
【請求項３２】
ａ）配列番号３、又はその相補的ポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列；
ｂ）セレクターコドンを認識する（ａ）の保存変異体；及び
ｃ）ポリヌクレオチド配列（ａ）の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、セレクターコドンを認識するｔＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項３３】
セレクターコドンが４塩基コドン、レアコドン、ＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧから構成される群から選択される請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
アミノ酸又は非天然アミノ酸をペプチドに組込む方法であって、直交突然変異体トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）又はその誘導体をコードする核酸配列を含む構築物を作製する段階と；
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードする核酸を含む構築物を作製する段階と；
Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物とＯ−ｔＲＮＡ構築物を真核細胞に導入する段階と；
発現後のＯ−ｍｕＴｒｐＲＳの触媒作用下で発現後のＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸又は非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化することにより、前記アミノ酸又は非天然アミノ酸を細胞内のペプチドに組込む段階を含む前記方法。
【請求項３５】
非天然アミノ酸がトリプトファン類似体又は５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ペプチドに電圧を印加することにより、５−ＨＴＰＰを反応性分子と反応させる段階を更に含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
反応が架橋を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
反応性分子が別のペプチド中に非天然アミノ酸を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
ペプチドと別のペプチドの相互作用を検出する段階を更に含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記検出がフルオロスコピーを含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物が、
ａ）配列番号１とその保存変異体から構成される群から選択されるコーディングポリヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号２とその保存置換配列から構成される群から選択されるポリペプチドをコードするコーディングポリヌクレオチド配列；
ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；
ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の相補的配列；及び
ｅ）ｐＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳから構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物がトリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ又は類似アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼの構造データに基づいて１個以上のアミノ酸残基を突然変異させた突然変異トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼペプチド配列を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
突然変異トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼがＶａｌ１４４を突然変異させたバシラストリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼを含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
Ｏ−ｔＲＮＡ構築物が配列番号３、その保存変異体、及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｏ−ｔＲＮＡ構築物を作製する段階が細胞のＲＮＡポリメラーゼと機能的に相互作用する１個以上のｔＲＮＡフランキング配列の付加を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４６】
Ｏ−ｔＲＮＡ構築物がＡボックス真核転写制御エレメントを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
機能的Ａボックス真核転写制御エレメントを付加するように原核ｔＲＮＡ配列を突然変異させる段階を更に含む請求項３４に記載の方法。
【請求項４８】
前記突然変異段階が部位特異的突然変異誘発を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｏ−ｔＲＮＡ構築物又はＯ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物がレポータータグ又は精製タグを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物とＯ−ｔＲＮＡ構築物が同一構築物を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
Ｏ−ｔＲＮＡがペプチドをコードする核酸配列中のセレクターコドンを認識することにより、非天然アミノ酸を前記ペプチドに組込む請求項３４に記載の方法。
【請求項５２】
ペプチドをコードする核酸を細胞にトランスフェクトする段階を更に含む請求項３４に記載の方法。
【請求項５３】
細胞が真核細胞又は哺乳動物細胞を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物又はＯ−ｔＲＮＡ構築物を発現させる段階を更に含む請求項３４に記載の方法。
【請求項５５】
発現後のＯ−ｍｕＴｒｐＲＳ又は発現後のＯ−ｔＲＮＡを精製する段階を更に含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）、直交突然変異体トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）、及びその誘導体から構成される群から選択される直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含む哺乳動物細胞であって；
前記Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸又は非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する前記哺乳動物細胞。
【請求項５７】
Ｏ−ＲＳが配列番号１、その保存変異体、及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む核酸を含む請求項５６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項５８】
Ｏ−ＲＳが配列番号２、及びその保存置換配列から構成される群から選択されるアミノ酸を含む請求項５６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項５９】
Ｏ−ｔＲＮＡが細胞の内在アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼにより実質的にアミノアシル化されない請求項５６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６０】
Ｏ−ｔＲＮＡが配列番号３、その保存変異体、及びその相補的ポリヌクレオチド配列から構成される群から選択されるポリヌクレオチド配列を含む請求項５６に記載の哺乳動物細胞。
【請求項６１】
非天然アミノ酸がトリプトファン類似体と５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）から構成される群から選択されるアミノ酸を含む請求項５６に記載の哺乳動物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願とのクロスリファレンス）
本願は先願米国仮出願第６０／５４８，７６１号、発明の名称「哺乳動物細胞内の蛋白質への５−ヒドロキシトリプトファンの選択的組込み（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」、発明者Ｚｈａｎｇら、出願日２００４年２月２６日；及び先願米国仮出願第６０／５３１，３１２号、発明の名称「哺乳動物細胞内の蛋白質への５−ヒドロキシトリプトファンの選択的組込み（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ５−Ｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」、発明者Ｚｈａｎｇら、出願日２００３年１２月１８日の優先権を主張し、各々参考資料として本明細書に組込む。
【０００２】
（連邦政府支援研究開発から創出された発明の権利に関する陳述）
本発明の所定側面の研究開発には、助成番号ＤＥ−ＦＧ０３−００ＥＲ４５８１２及びＮＩＨ  ＧＭ６６４９４の下にＮＲＡＳ、ＤＯＥ及びＥＭＢＯからの政府資金を使用した。従って、米国政府は本発明に所定の権利を有することができる。
【０００３】
（発明の技術分野）
本発明は蛋白質発現の分野に関する。例えば、非天然アミノ酸残基を組込んだ蛋白質の直交発現のための組成物と方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
蛋白質は生命系における主要な構成単位であり、触媒である。組換え核酸技術による遺伝子操作と、天然及び組換え蛋白質の発現は遺伝子工学革命に伴う多くの利益をもたらしている。非天然アミノ酸のペプチド組込みを含む蛋白質工学は更に生命科学からの実用的利益をもたらすことができる。
【０００５】
核酸配列によりコードされるペプチドの翻訳は例えばリボソーム、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ、及びアミノ酸等の多くの翻訳系構成成分の複雑な相互作用により生命系で実施される。厳密な１組の規則と確実な反応が生細胞において内在翻訳系による著しく一貫した蛋白質翻訳を可能にする。一群のＲＮＡポリメラーゼがまずＤＮＡ配列の転写によりリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡを生成する。一群の内在アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼが各々（２０種の天然アミノ酸のうちの）特定アミノ酸を特定ｔＲＮＡと結合することができる。蛋白質とｒＲＮＡから組み立てられたリボソームは各ｔＲＮＡのユニークアンチコドンを翻訳すべきｍＲＮＡ鎖で提示される相補的コドンと整列させる。最後に、リボソームはｍＲＮＡ鎖に沿ってそのｔＲＮＡと共に整列されたアミノ酸間のペプチド結合の形成を触媒する。リボソームは隣接プロモーター配列に関連する開始コドン（ＡＵＧ−メチオニン）を認識し、翻訳開始位置と読み枠を決定する。リボソームは一般に翻訳を停止するためのシグナルとして関連するｔＲＮＡをもたない３種のｍＲＮＡ終止コドン（ＵＡＧ、ＵＧＡ、及びＵＡＡ）に応答する。
【０００６】
蛋白質に非天然側鎖基を付加する１つの方法は翻訳後に蛋白質を修飾する方法である。所定アミノ酸の側鎖基は化学的に反応性であり、化学修飾を受けやすい。例えばシステインのスルフヒドリル基、チロシンのヒドロキシル基、及びグルタミンのアミノ基は化学分野で周知の反応に加わり、その結果、修飾されるか又はアミノ酸残基の側鎖と共有結合することができる。例えば、ε−アミノ基を含むリジン残基側鎖はアセチルトランスフェラーゼの酵素作用又は例えばアセチルアセテート等の化学アセチル化剤との化学反応によりアセチルリジンに変換することができる。しかし、翻訳後修飾は非特異的及び／又は低特異性であることが多い。
【０００７】
化学合成により非天然アミノ酸をペプチドに組込むこともできる。固相支持体マトリックスでの自動化学合成は非天然アミノ酸を組込むための簡単な方法となり得る。しかし、通常の固相ペプチド合成は一般に１００残基未満の小ペプチド又は蛋白質に限られている。最近開発されたペプチドフラグメントの酵素ライゲーション又は天然化学的ライゲーション法ではもっと大型の蛋白質を作製することができるが、このような方法はスケールを変更むするのが容易ではない。
【０００８】
突然変異体転写系成分を使用して非天然アミノ酸を蛋白質に組込むこともできる。例えば、直交翻訳成分を天然内在翻訳系に付加すると、内在翻訳系により通常提供されないペプチドを翻訳することができる。“Ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ”，Ａ．Ｋ．Ｋｏｗａｌ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，２２６８−７３（２００１）では、３−ヨード−Ｌ−チロシンを真核ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系の蛋白質に部位特異的に組込むためにＬ−チロシンではなく３−ヨード−Ｌ−チロシンを優先的に認識するように大腸菌に由来するチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）を構築している。非天然チロシン類似体を哺乳動物系に組込むために同様の翻訳系が構築されている。“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｎ．Ａ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．２１４６９２−４６９９，（２００２）では、哺乳動物細胞でＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアンバーサプレッサーｔ−ＲＮＡと共に大腸菌ＴｙｒＲＳ構築物を発現させ、ＴＡＧコドンによりコードされるヨード−チロシン残基をもつｒａｓ蛋白質を提供している。この系はヨード−チロシン組込みに特異的であり、翻訳後のペプチドの有用なユニークな特性については記載されていない。
【非特許文献１】“Ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｙｒｏｓｙｌ−ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｆｏｒ  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｗｈｅａｔ  Ｇｅｒｍ  Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  Ｓｙｓｔｅｍ”，Ａ．Ｋ．Ｋｏｗａｌ，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８，２２６８−７３（２００１）
【非特許文献２】“Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”，Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｎ．Ａ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．２１４６９２−４６９９，（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記に鑑み、真核翻訳系を使用して非天然アミノ酸残基をペプチドの所望位置に特異的に組込むための改善方法が必要とされている。ハロゲン化チロシン残基以外の非天然残基をペプチドに組込む方法が得ることが望ましい。タグを付加せずに検出可能な非天然アミノ酸の組込みにより利益を得ることもできる。特異反応性化学結合基をもつ非天然アミノ酸の組込み方法は診断、治療及び材料科学で有用であると思われる。本発明は上記特徴及び以下の記載に明示される特徴を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は成長中のポリペプチド鎖の非典型位置にアミノ酸を組込むための組成物と方法に関する。組成物は、例えばアミノ酸（例えば５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ））をセレクターコドンによりコードされる位置に組込むことが可能な直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ／直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ）対のメンバーを含む。本発明は非天然アミノ酸をｉｎ  ｖｉｖｏ組込むための直交対を含む哺乳動物細胞にも関する。本発明の方法は例えばＯ−ＲＳがペプチドに組込むためのアミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する翻訳系で直交対を発現させるための直交対構築物を作製する段階を含む。
【００１１】
本発明の組成物は一般に翻訳系と；直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）、直交突然変異体トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）、又はその誘導体等の直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡをアミノ酸又は非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。翻訳系としては、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系、又は細胞（例えば真核細胞、アフリカツメガエル細胞、又は哺乳動物細胞）が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系としては一般に細胞溶解液成分を含む翻訳系が挙げられる。１好適態様では、組成物はｔＲＮＡ（場合によりＯ−ｔＲＮＡ）を５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）で優先的にアミノアシル化する直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。
【００１２】
組成物のＯ−ＲＳとしては改善又は強化された酵素特性（例えば天然アミノ酸よりも非天然アミノ酸に関して改善されたＫｍ及び／又はＫｃａｔ）をもつ直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。１好適態様では、Ｏ−ＲＳはコドンＣＣＣを使用してバリン１４４をプロリンで置換するように突然変異された枯草菌トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼのポリヌクレオチド配列、例えばＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ（配列番号１）の核酸配列、その保存変異体、及び／又は相補的ポリヌクレオチド配列をもつ核酸によりコードすることができる。別の好適態様では、Ｏ−ＲＳはアミノ酸配列Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ（配列番号２）、及び／又はその保存置換配列をもつことができる。
【００１３】
Ｏ−ｔＲＮＡはそのコグネイトＯ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化することができるが、Ｏ−ｔＲＮＡは内在翻訳系の内在アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼにより実質的にアミノアシル化されない。１好適態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは突然変異体直交オパールサプレッサーｔＲＮＡのポリヌクレオチド配列、例えばｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ（配列番号３）、その保存変異体、及び／又はその相補的ポリヌクレオチド配列をもつことができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡは一般に例えば４塩基コドン、レアコドン、ＵＵＡ、ＣＵＡ、又はＵＣＡ等のセレクターコドンを認識する。
【００１４】
直交対、内在翻訳系、非天然アミノ酸等は非典型アミノ酸を産物ペプチドに組込むために使用することができる。産物ペプチドは例えばＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドン配列をもつ核酸によりコードすることができる。多くの有用な産物ペプチドは野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその一部と少なくとも７５％一致するアミノ酸配列をもつ。
【００１５】
例えば、本発明の組成物は例えば生物、細胞又は細胞溶解液の天然翻訳系に内在性のＲＳ、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び他の成分の内在翻訳系を含むことができる。通常以外の転写産物を得るために、直交成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、ｍＲＮＡ）とセレクターコドン及び／又は非天然アミノ酸を内在翻訳系に付加することができる。内在翻訳系は細胞、溶解液、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に内在するものでもよいし、又はそれらから誘導されたものでもよい。
【００１６】
本発明は例えばａ）配列番号１、又はその保存変異体から選択されるコーディングポリヌクレオチド配列；ｂ）配列番号２、又はその保存置換配列のポリペプチドをコードするコーディングポリヌクレオチド配列；ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列；及び／又は、ｄ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のいずれかと相補的な配列等のコーディングポリヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をもつポリペプチドに関し；前記ポリペプチドは５−ＨＴＰＰ等のトリプトファン類似体をｔＲＮＡに負荷するアミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ活性をもつ。
【００１７】
本発明は例えばａ）配列番号１のポリヌクレオチド配列、又はその相補配列；ｂ）セレクターコドンを認識する（ａ）の保存変異体；及び／又は，ｃ）ポリヌクレオチド配列（ａ）の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、４塩基コドン、ＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧ等のセレクターコドンを認識するｔＲＮＡを含むポリヌクレオチド配列等のｔＲＮＡの配列をもつ核酸に関する。
【００１８】
本発明の１側面では、哺乳動物細胞がｍＲＮＡの翻訳中にトリプトファン類似体を組込むことができる。例えば、哺乳動物細胞が直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）、直交突然変異体トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）、及び／又はその誘導体等の直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を使用し、更にＯ−ＲＳにより天然又は非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を使用して成長中のペプチドにアミノ酸を組込むことができる。所定態様では、Ｏ−ＲＳは配列番号１のポリヌクレオチド配列、その保存変異体、又は相補的ポリヌクレオチド配列をもつ核酸によりコードされる。Ｏ−ＲＳは例えば配列番号２のアミノ酸配列又は保存置換変異体をもつことができる。多くの場合には、Ｏ−ｔＲＮＡは細胞の内在アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼにより実質的にアミノアシル化されない。Ｏ−ｔＲＮＡは例えば配列番号３のポリヌクレオチド配列、その保存変異体、又は相補的ポリヌクレオチド配列として細胞中に存在することができる。直交翻訳成分と共に哺乳動物細胞に組込むことができる典型的な非天然アミノ酸としては、例えばトリプトファン類似体と５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）が挙げられる。
【００１９】
本発明は一般に直交翻訳系成分を内在翻訳系に挿入することによりアミノ酸をペプチドに組込むための方法に関する。例えば、前記方法は直交突然変異体トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）及び／又はその誘導体をコードする核酸配列を含む構築物を作製する段階と、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をコードする核酸配列を含む構築物を作製する段階と、真核細胞にＯ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物とＯ−ｔＲＮＡ構築物をトランスフェクトする段階と、発現後のＯ−ｍｕＴｒｐＲＳを使用して発現後のＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸又は非天然アミノ酸を優先的に負荷し、アミノ酸を細胞内のペプチドに組込む段階を含む。
【００２０】
１好適態様では、非天然アミノ酸は５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）である。本発明の方法を使用して５−ＨＴＰＰを組込むペプチドは例えばペプチドに電圧を印加することにより他の分子と架橋させ、５−ＨＴＰＰを反応性分子と反応させ、例えばペプチドを反応性分子と架橋させることにより利用することができる。１態様では、反応性分子は５−ＨＴＰＰ等の非天然アミノ酸を組込んだ別のペプチドである。５−ＨＴＰＰを組込むペプチドは例えばフルオロスコピーによりペプチドと別のペプチドの相互作用を検出するために使用することもできる。
【００２１】
本発明の方法は例えばトリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ又は類似アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼの構造データに基づいて１個以上のアミノ酸残基を突然変異させたトリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼペプチド配列をコードするＯ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物を使用して実施することができる。例えば、突然変異トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼは残基１４４又はその近傍領域のバリンを突然変異させたバシラストリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼとすることができる。１好適態様では、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物はａ）配列番号１又は保存変異体、ｂ）配列番号２の配列又は保存置換配列をもつポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチド配列の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列、又はｄ）（ａ）、（ｂ）、もしくは（ｃ）の相補的配列のポリヌクレオチド配列によりコードすることができる。
【００２２】
本方法のＯ−ｔＲＮＡは内在翻訳系で機能するように改変された構築物の発現により提供することができる。Ｏ−ｔＲＮＡ構築物は配列番号３、保存変異体、又はその相補的ポリヌクレオチド配列をもつことができる。Ｏ−ｔＲＮＡ構築物は翻訳系として使用される細胞のＲＮＡポリメラーゼと機能的に相互作用する１個以上のｔＲＮＡフランキング配列を含むことができる。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ構築物は例えばＡボックス真核転写制御エレメントを付加するように原核ｔＲＮＡ配列を突然変異させることにより得られたＡボックス真核転写制御エレメントをもつことができる。このような突然変異は好ましくは部位特異的突然変異誘発により行うことができる。他の有用なＯ−ｔＲＮＡ構築物エレメントとしては、例えばレポータータグと精製タグが挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ構築物は非天然アミノ酸をペプチドに組込むためにペプチドをコードするｍＲＮＡセレクターコドンｍＲＮＡ配列に相補的なアンチコドンを含むことができる。２個以上の直交翻訳成分を同一構築物から発現させることができ、例えば同一構築物にＯ−ｍｕＴｒｐＲＳ配列とＯ−ｔＲＮＡ配列を含むことができる。
【００２３】
構築物を生細胞に導入してｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系で発現させることもできるし、及び／又は細胞から抽出してｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に組込むこともできる。本発明の方法で使用する導入としては複製及び／又は発現用生細胞に構築物を挿入するための任意手段が挙げられる。好適態様では、構築物を真核細胞又は哺乳動物細胞にトランスフェクトする。例えばアロ蛋白質、Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ等の発現産物は所望により未精製のままでもよいし、部分的に精製してもよいし、及び／又は高度に精製してもよい。
（定義）
【００２４】
本欄及び本明細書の他の欄で特に定義しない限り、本明細書で使用する全科学技術用語は本発明が属する分野の当業者に通常理解されている通りの意味をもつ。
【００２５】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定装置又は生物系に限定されず、当然のことながら種々のものに適用できると理解すべきである。同様に、本明細書で使用する用語は特定態様のみの説明を目的とし、限定的でないことも理解すべきである。本明細書と特許請求の範囲で使用する単数形はそうでないことが内容から明白である場合を除き、複数形も含む。従って、例えば「成分」と言う場合には２個以上の成分の組合せを含むことができ、「アミノ酸」と言う場合には適当なアミノ酸の混合物を含むことができ、他の用語についても同様である。
【００２６】
本発明の実施には過度の実験を要することなしに本明細書に記載するものの多数の類似、改変又は等価方法及び材料を使用することができるが、現時点で好ましい材料と方法は本明細書に記載するものである。本発明の記載及び特許請求の範囲において、以下の用語は以下の定義に従って使用する。
【００２７】
Ｏ−ＲＳはＯ−ＲＳが発現系で任意内在ｔＲＮＡに負荷するよりも効率的にＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を負荷するときにコグネイトＯ−ｔＲＮＡを「優先的にアミノアシル化する」。即ち、Ｏ−ｔＲＮＡと所与の任意内在ｔＲＮＡがほぼ等モル比で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ＲＳは内在ｔＲＮＡに負荷するよりも高頻度でＯ−ｔＲＮＡに負荷する。Ｏ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳにより負荷される内在ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましく、Ｏ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡが等モル濃度で翻訳系に存在する場合にはＯ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に負荷することが好ましい。Ｏ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳが等モル濃度で存在する場合にＯ−ＲＳにより負荷されるＯ−ｔＲＮＡと内在ｔＲＮＡの相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００２８】
（ａ）Ｏ−ＲＳが内在ｔＲＮＡに比較してＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するとき、及び（ｂ）Ｏ−ＲＳがＯ−ｔＲＮＡを任意天然アミノ酸でアミノアシル化する場合に比較してそのアミノアシル化が非天然アミノ酸に特異的であるときにＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを「非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する」。即ち、非天然アミノ酸と天然アミノ酸がＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを含む翻訳系に等モル量で存在するとき、Ｏ−ＲＳは天然アミノ酸よりも高頻度で非天然アミノ酸をＯ−ｔＲＮＡに負荷する。非天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡと天然アミノ酸を負荷されたＯ−ｔＲＮＡの相対比は高いことが好ましい。Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに排他的、又はほぼ排他的に非天然アミノ酸を負荷することがより好ましい。天然アミノ酸と非天然アミノ酸の両者が等モル濃度で翻訳系に存在するとき、Ｏ−ｔＲＮＡへの非天然アミノ酸の負荷とＯ−ｔＲＮＡへの天然アミノ酸の負荷の相対比は１：１を上回り、好ましくは少なくとも約２：１、より好ましくは５：１、更に好ましくは１０：１、更に好ましくは２０：１、更に好ましくは５０：１、更に好ましくは７５：１、更に好ましくは９５：１、９８：１、９９：１、１００：１、５００：１、１，０００：１、５，０００：１又はそれ以上である。
【００２９】
本明細書で使用する直交トリプトファニルｔＲＮＡ（ｔｒｐ−Ｏ−ｔＲＮＡ）とは該当翻訳系に直交するｔＲＮＡであり、ｔＲＮＡは（１）天然に存在するｔｒｐ−ｔＲＮＡと一致するかもしくは実質的に同様であるか、（２）天然もしくは人工突然変異誘発により天然に存在するｔｒｐ−ｔＲＮＡから誘導されるか、（３）（１）もしくは（２）の野生型もしくは突然変異体ｔｒｐ−ｔＲＮＡ配列の配列を考慮する任意プロセスにより誘導されるか、（４）野生型もしくは突然変異体ｔｒｐ−ｔＲＮＡに相同であるか、（５）Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ（配列番号２）の基質として設計された任意特定ｔＲＮＡに相同であるか、又は（６）Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳの基質として設計された任意特定ｔＲＮＡの保存変異体である。ｔｒｐ−ｔＲＮＡはアミノ酸を負荷された状態で存在することもできるし、未負荷状態で存在することもできる。「ｔｒｐ−Ｏ−ｔＲＮＡ」は場合によりコグネイトシンテターゼによりトリプトファン以外のアミノ酸（例えばアミノ酸ＨＴＰＰ）を負荷（アミノアシル化）される場合もある。実際に、当然のことながら本発明のｔｒｐ−Ｏ−ｔＲＮＡは翻訳中にセレクターコドンに応答して天然又は人工に関係なくほぼ任意のアミノ酸を成長中のポリペプチドに挿入するために使用すると有利である。
【００３０】
本明細書で使用する直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）とは該当翻訳系においてＯ−ｔＲＮＡ（例えばｔｒｐ−Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノ酸で優先的にアミノアシル化する酵素である。Ｏ−ＴｒｐＲＳがＯ−ｔＲＮＡに負荷するアミノ酸は天然又は人工に関係なく任意アミノ酸とすることができ、本明細書では限定しない。シンテターゼは場合により天然に存在するトリプトファニルアミノ酸シンテターゼと同一もしくは相同であるか、又はＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳと同一もしくは相同である。例えば、Ｏ−ＴｒｐＲＳは配列番号２のペプチドの保存変異体、配列番号１の核酸によりコードされるペプチド、及び／又は配列番号２で表されるかもしくは配列番号１によりコードされるＯ−ＲＳと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくはそれ以上一致するものとすることができる。
【００３１】
「セレクターコドン」なる用語は翻訳系でＯ−ｔＲＮＡにより認識され、翻訳系の内在ｔＲＮＡにより有意程度まで認識されないコドンを意味する。Ｏ−ｔＲＮＡアンチコドンループはそのアミノ酸（例えば優先的にアミノアシル化される非天然アミノ酸）をセレクターコドンによりコードされる位置でペプチドに組込むためにｍＲＮＡ上のセレクターコドンを認識することができる。セレクターコドンとしては例えばナンセンスコドン（例えばアンバー、オーカー及びオパールコドン等の終止コドン）；４塩基以上のコドン；天然又は非天然塩基対から誘導されるコドン等を挙げることができる。所与系では、セレクターコドンは更に天然３塩基コドンの１種を含むことができ、翻訳系の内在成分はこの天然３塩基コドンを効率的に使用せず、例えば天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡをもたない系又は天然３塩基コドンがレアコドンである系がこれに該当する。
【００３２】
本明細書で使用する「直交」なる用語は細胞又は翻訳系に内在する対応分子に比較して低効率で細胞又は翻訳系の内在成分と共働するか、又は細胞の内在成分と対合させたときに共働できない分子（例えば直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び／又は直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ））を意味する。ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼに関して直交とは、直交ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡシンテターゼと共働できないか又は適当な（例えば相同又は類似）内在ｔＲＮＡを内在相補的ｔＲＮＡシンテターゼと対合させたときに共働する効率に比較して低効率（例えば２０％未満の効率、１０％未満の効率、５％未満の効率、又は１％未満の効率）でしか共働できないか、あるいは、直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼが内在ｔＲＮＡと共働できないか又は適当な内在ｔＲＮＡシンテターゼを内在相補的ｔＲＮＡと対合させたときに共働する効率に比較して低効率でしか共働できないことを意味する。直交分子は細胞中に機能的に正常な内在相補的分子をもたない。例えば、細胞中の直交ｔＲＮＡがこの細胞の任意内在ＲＳによりアミノアシル化される効率は内在ｔＲＮＡが内在ＲＳによりアミノアシル化される効率に比較して低いか又は検出不能である。別の例では、直交ＲＳが該当細胞中の任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率は相補的内在ＲＳが内在ｔＲＮＡをアミノアシル化する効率に比較して低いか又は検出不能である。第１の直交分子と対合させた場合に共働する第２の直交分子を細胞に導入することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対は対照（例えば対応する（例えば類似）ｔＲＮＡ／ＲＳ内在対、又は活性直交対（例えばトリプトファニル直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対））の効率に対して所定の効率（例えば４５％の効率、５０％の効率、６０％の効率、７０％の効率、７５％の効率、８０％の効率、９０％の効率、９５％の効率、又は９９％以上の効率）で細胞内で共働する導入相補成分を含む。「直交性の改善」とは所与出発成分に比較して直交性が増加すること（例えば直交対の効率の改善及び／又は内在翻訳成分との対における直交成分の効率の低下）を意味する。
【００３３】
本明細書で使用する「類似」なる用語は同様の機能を提供するが、異なる系に由来する成分を意味する。例えば、バシラスｔＲＮＡＴｒｐとサッカロミセスｔＲＮＡＴｒｐは同様に機能するが、異なる翻訳系に由来する。本明細書で使用する生物系の誘導体（例えば人工）成分は天然成分と類似するとみなすことができる。
【００３４】
本明細書で使用する「誘導体」なる用語は例えば親化合物との反応、親化合物の突然変異誘発、又は修飾形態の親化合物の合成（従って、親化合物の化学的類似体の形成）により親化合物から誘導される化学的（例えば生物学的）化合物を意味する。誘導体は親化合物の化学的修飾（例えば化学基の付加もしくは除去、分子結合構造の変更、又はイオン状態の変更）により誘導される化合物とすることができる。誘導体核酸又はペプチドは（例えば突然変異により生産された）天然重合配列及び／又は精製もしくは公知親配列から改変した合成配列をもつことができる。本発明の誘導体核酸又はポリペプチドとしては例えば本明細書に記載する配列の機能的保存変異体が挙げられる。
【００３５】
「翻訳系」なる用語は成長中のポリペプチド鎖（例えば蛋白質）にアミノ酸を組込むために必要な成分を意味する。例えば、翻訳系はリボソーム、ｔＲＮＡ、シンテターゼ、ｍＲＮＡ等の完全な１組の内在翻訳成分を含むことができる。本発明の直交成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、セレクターコドンをコードする核酸、及び／又は非天然アミノ酸）は内在成分をもつｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系、例えば非真核細胞（例えば細菌（例えば大腸菌））、又は真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆虫細胞、及び／又は同等物）に付加することができる。
【００３６】
本明細書で使用する「真核生物」なる用語は系統発生分類の真核生物に属する生物を意味し、例えば動物（例えば哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等）、繊毛虫、植物（例えば単子葉植物、双子葉植物、藻類等）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等が挙げられる。
【００３７】
本明細書で使用する「非真核生物」なる用語は真核生物以外の生物を意味する。例えば、非真核生物は系統発生分類の真正細菌（例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等）、又は系統発生分類の古細菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍｊ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔ）、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ａｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（Ｐｈ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（Ａｐ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等）に属することができる。
【００３８】
翻訳系の成分に関して「相補的」なる用語は、共働することができる成分を意味する。例えばＯ−ｔＲＮＡを有効にアミノアシル化するように機能する直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は相補的対とみなすことができる。
【００３９】
「サプレッサーｔＲＮＡ」は例えばセレクターコドンに応答してポリペプチド鎖にアミノ酸を組込むためのメカニズムを提供することにより、所与翻訳系でメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の読取りを変更するｔＲＮＡである。例えば、サプレッサーｔＲＮＡは例えば終止コドン、４塩基コドン、レアコドン等を読み飛ばすことができる。
【００４０】
本明細書で使用する「抑圧活性」なる用語は一般に、読み飛ばさないと翻訳終結又は誤訳（例えばフレームシフト）をもたらすコドン（例えばアンバーコドン又は４塩基以上のコドンであるセレクターコドン）の翻訳読み飛ばしを行うｔＲＮＡ（例えばサプレッサーｔＲＮＡ）の能力を意味する。サプレッサーｔＲＮＡの抑圧活性は第２のサプレッサーｔＲＮＡ又は対照系（例えばＯ−ＲＳをもたない対照系）に比較して観察される翻訳読み飛ばし活性の百分率として表すことができる。
【００４１】
本明細書で使用する「コードする」なる用語は第１の分子又は配列とは異なる第２の分子又は配列の生産を導くためにポリマー巨大分子又は配列中の情報を使用する任意プロセスを意味する。本明細書ではこの用語を広義に使用し、種々に適用することができる。１側面では、「コードする」なる用語は新規に合成された相補的姉妹鎖をＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによりコードするための鋳型として２本鎖ＤＮＡ分子の１本の鎖を使用する半保存的ＤＮＡ複製プロセスを意味する。
【００４２】
別の側面では、「コードする」なる用語は第１の分子とは異なる化学的性質をもつ第２の分子の生産を導くためにある分子中の情報を使用する任意プロセスを意味する。例えば、ＤＮＡ分子は（例えばＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ酵素を含む転写プロセスにより）ＲＮＡ分子をコードすることができる。また、ＲＮＡ分子は翻訳プロセスのようにポリペプチドをコードすることができる。翻訳プロセスについて使用する場合には、「コードする」なる用語はアミノ酸をコードする三重項コドンにも適用する。所定側面では、ＲＮＡ分子は例えばＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含む逆転写プロセスによりＤＮＡ分子をコードすることができる。別の側面では、ＤＮＡ分子はポリペプチドをコードすることができ、この場合に使用する「コードする」とは当然のことながら転写プロセスと翻訳プロセスの両者を含む。
【００４３】
「コグネイト」なる用語は共働する成分、例えば直交ｔＲＮＡとコグネイト直交ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ；又は直交ＲＳ／ｔＲＮＡ対によりペプチドに有効に組込まれるコグネイト非天然アミノ酸を意味する。機能的対合成分は「相補的」であると言うこともできる。
【００４４】
本発明において、蛋白質及び／又は蛋白質配列は共通の祖先蛋白質又は蛋白質配列から天然又は人工的に誘導される場合に「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は共通の祖先核酸又は核酸配列から天然又は人工的に誘導される場合に相同である。例えば、１個以上のセレクターコドンを含むように任意天然核酸を入手可能な任意突然変異誘発法により改変することができる。この突然変異誘発した核酸は発現されると、１種以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードすることができる。突然変異法は当然のことながら更に１個以上の標準コドンを変異させ、得られる突然変異体蛋白質の１個以上の標準アミノ酸も変異させることができる。相同性は一般に２種以上の核酸又は蛋白質（又はその配列）間の配列類似度から推定される。相同性の判定に有用な配列間類似度の厳密な百分率は該当核酸及び蛋白質により異なるが、通常は２５％程度の低い配列類似度を使用して相同性を判定する。例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上のより高レベルの配列類似度を使用して相同性を判定することもできる。配列類似度百分率の決定方法（例えばデフォルトパラメーターを使用するＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は本明細書に記載し、一般に入手可能である。
【００４５】
本明細書で使用する「〜に由来」なる用語は特定分子もしくは生物から単離されているか又は特定分子もしくは生物からの配列情報を使用して作製された成分を意味する。
【００４６】
「保存変異体」なる用語は翻訳成分を意味し、例えば保存変異体の原成分（例えばＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳ）と機能的には同様であるが、配列に変異をもつ保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ＲＳである。例えば、Ｏ−ＲＳは相補的Ｏ−ｔＲＮＡ又は保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸（例えば５−ＨＴＰＰ）でアミノアシル化するが、Ｏ−ｔＲＮＡと保存変異体Ｏ−ｔＲＮＡは同一配列ではない。保存変異体は保存変異体が対応するＯ−ｔＲＮＡ又はＯ−ＲＳと対合したときに機能する（相補的である）限り、例えば配列の１カ所、２カ所、３カ所、４カ所、又は５カ所以上に変異をもつことができる。アミノ酸配列の典型的保存変異については表１参照。
【００４７】
本明細書で使用する「非天然アミノ酸」なる用語は大半の生体系の蛋白質に通常組込まれる２０種の天然アミノ酸の１種又は微量天然アミノ酸セレノシステインもしくはピロリジン以外のアミノ酸を意味する。「非天然アミノ酸」は２０種の遺伝的にコードされる以下のαアミノ酸、即ちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフアン、チロシン、及びバリン以外の任意アミノ酸、修飾アミノ酸又はアミノ酸類似体を意味する。αアミノ酸の一般構造は式Ｉ：
【化１】
2007514447.tif 000002
により表される。
非天然アミノ酸は一般に式Ｉをもつ任意構造であり、式中、Ｒ基は２０種の天然アミノ酸で使用されている以外の任意置換基である。２０種の天然アミノ酸の構造については、例えばＬ．Ｓｔｒｙｅｒ著Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３版，１９８８，Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ等の生化学教科書を参照されたい。なお、本発明の非天然アミノ酸は上記２０種のαアミノ酸以外の天然化合物でもよい。本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖のみが天然アミノ酸と異なるので、天然に存在する蛋白質と同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）とアミド結合を形成する。一方、非天然アミノ酸は天然アミノ酸と異なる側鎖基をもつことができる。例えば、式ＩにおけるＲは場合により通常以外のアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン基等又はその任意組合せを含む。他の該当非天然アミノ酸としては限定されないが、光架橋基をもつアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合性アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基をもつアミノ酸、他の分子と共有又は非共有的に相互作用するアミノ酸、フォトケージド及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、糖置換セリン等のグリコシル化アミノ酸、他の糖鎖修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に開裂可能及び／又は光開裂可能なアミノ酸、天然アミノ酸に比較して延長側鎖（例えばポリエーテル又は例えば約５もしくは約１０炭素長を上回る長鎖炭化水素等）をもつアミノ酸、炭素結合糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、及び１個以上の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられる。本発明の代表的な好ましい非天然アミノ酸としては、例えば５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）等のトリプトファン誘導体が挙げられる。
【００４８】
本明細書で使用する「構築物」なる用語は該当合成及び／又は組換え配列を含む核酸構築物を意味する。本発明の構築物は例えば直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼをコードする核酸配列、直交ｔＲＮＡ、及び／又はペプチドをコードする配列とセレクターコドンを含むことができる。構築物は例えば転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、フランキング配列、及び／又は発現の調節に有用なプロモーター等の他の配列も含むことができる。構築物は転写産物の同定と精製に有用なタグ及び／又はラベルをコードする配列を含むことができる。本発明の構築物は例えばｉｎ  ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写可能及び／又は翻訳可能な配列をもつプラスミドの形態とすることができる。
【００４９】
本発明の構築物に関して本明細書で使用する「導入」なる用語は一般に複製、転写、翻訳、及び／又は発現のために本発明の遺伝子構築物を生細胞に機能的に挿入するための当分野で公知の任意手段を意味する。例えば、構築物を細胞に導入する手段としては、形質転換、軽質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーション、及び／又は同等手段が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）等の非天然アミノ酸を翻訳プロセスでペプチドに組込むためには、本明細書に記載するように効率的に機能するアミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼとｔＲＮＡの直交対を利用することができる。直交対は翻訳系に内在するシンテターゼとｔＲＮＡから独立して例えば該当翻訳系で機能することができる。直交対の所望特徴としては、例えば内在ｔＲＮＡにより効率的にデコードされない特定新規コドン（例えばセレクターコドン）のみをデコード又は認識するｔＲＮＡと、５−ＨＴＰＰ等の特定非天然アミノ酸のみでそのｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化（又は負荷）するアミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼが挙げられる。直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は翻訳系の内在シンテターゼにより有意にアミノアシル化されないことも望ましい。例えば、大腸菌翻訳系では、直交対は例えば大腸菌には４０種類存在する内在ｔＲＮＡを実質的にアミノアシル化しないアミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼと、例えば大腸菌には２１種類存在する内在シンテターゼによりアミノアシル化されない直交ｔＲＮＡを含むことができる。
【００５１】
本発明では直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ、突然変異体直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）、及び／又は例えばアミノ酸又は非天然アミノ酸（例えばトリプトファン誘導体）をペプチドに組込むことが可能なその誘導体を含む新規直交シンテターゼ／ｔＲＮＡ対の作製について報告する。本発明は例えば核酸構築物を細胞に導入する段階を含む方法として、アミノ酸をペプチドに組込むためにＯ−ｔＲＮＡをＯ−ｍｕＴｒｐＲＳによりアミノ酸で優先的にアミノアシル化する方法に関する。
【００５２】
１典型的態様では、突然変異体ｔＲＮＡオパールサプレッサーと突然変異体直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼの直交対（Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を理論的に構築し、哺乳動物系で翻訳中に５−ヒドロキシトリプトファン（５−ＨＴＰＰ）をペプチドに特異的に負荷及び組込む能力についてスクリーニングする。Ｏ−ｔＲＮＡは例えばオパール突然変異アンチコドンループにより突然変異体枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐを構築することにより提供することができる。Ｏ−ＲＳは例えば恐らくｔＲＮＡに５−ＨＴＰＰを負荷するのを立体的に妨げると認められる位置に１９個の代替アミノ酸を提供する部位特異的突然変異をもつ突然変異体枯草菌トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼをスクリーニングすることにより提供することができる。５−ＨＴＰＰを含む培地の存在下の哺乳動物細胞中のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はＴＧＡ（終止）コドンによりコードされる位置で蛋白質に５−ＨＴＰＰを特異的に組込むことができる。
直交翻訳成分をもつ組成物
【００５３】
本発明の組成物は一般に例えばセレクターコドンにより指定される位置でペプチドに組込むようにＯ−ｔＲＮＡにアミノ酸を優先的に負荷するために直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）をもつ翻訳系を含む。場合により、シンテターゼはＯ−ｔＲＮＡに例えば５−ＨＴＰＰ等の特定非天然アミノ酸を負荷するように特異的に構築及び／又は選択された突然変異体直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼとすることができる。
【００５４】
本発明の直交翻訳系成分は一般に例えば該当内在翻訳系から独立して所定翻訳機能を実施することができる内在成分類似体（例えば突然変異成分及び／又は外来細胞に由来する成分）である。直交翻訳成分は多くの場合には所定内在翻訳系成分と低効率で共働するか、又は共働することができない。しかし、Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対（直交対）等の相補的直交成分は内在翻訳系の成分と効率的に共働し、配列の翻訳を助長することができる。例えば、直交対は翻訳系の一部として機能し、特定セレクターコドンにより決定される成長中のペプチドの位置に特定アミノ酸を効率的に組込むことができる。
【００５５】
本発明は２種以上の非天然アミノ酸（例えば５−ＨＴＰＰと別の非天然アミノ酸）の組込みを可能にするように、細胞又は他の翻訳系に複数のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む。例えば、細胞は本発明の直交対と別の付加Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対と第２の非天然アミノ酸を含むことができ、この付加Ｏ−ｔＲＮＡは第２のセレクターコドンを認識し、この付加Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対を含む細胞（Ｏ−ｔＲＮＡが例えばオパールセレクターコドンを認識する場合）は更に第２の直交対（例えばロイシル、リシル、グルタミル等）を含むことができる（第２のＯ−ｔＲＮＡが別のセレクターコドン、例えばアンバー、４塩基コドン、レアコドン等を認識する場合）。
直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ
【００５６】
本発明の直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）としては、例えば直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ、例えば外来翻訳系に由来する実質的に改変されていないＲＳ）、直交突然変異体トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ、例えば突然変異により改変された内在又は外来ＲＳ）、及び／又はその誘導体が挙げられる。本発明のＯ−ＲＳは例えば内在翻訳系では該当アミノ酸に通常利用できない位置でペプチドにアミノ酸を組込むためにｔＲＮＡにアミノ酸を負荷することができる。１典型的態様では、Ｏ−ＲＳはｔＲＮＡに５−ＨＴＰＰ等の非天然アミノ酸を負荷するＯ−ｍｕＴｒｐＲＳである。その場合、ｔＲＮＡのアンチコドンにより決定される位置で成長中のペプチド鎖に翻訳系により非天然アミノ酸を組込むことができる。別の態様では、Ｏ−ＴｒｐＲＳ又はＯ−ｍｕＴｒｐＲＳが直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）にアミノ酸を負荷することができる。正常翻訳には一般的でない位置で成長中のペプチドにアミノ酸が組込まれるように、Ｏ−ｔＲＮＡは例えばセレクターコドン又はアミノ酸を通常コードしない他のコドンに相補的なアンチコドンをもつことができる。１好適態様では、本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する。より好ましい態様では、非天然アミノ酸はトリプトファンの類似体（例えば誘導体）である。
【００５７】
本発明の直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼは例えばＯ−ｔＲＮＡを非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化することができる。本発明のＯ−ＴｒｐＲＳ又はＯ−ｍｕＴｒｐＲＳは特定アミノ酸を別のアミノ酸よりも優先的にｔＲＮＡに負荷することができる。例えば、ｔＲＮＡにコグネイトアミノ酸を負荷する天然ＲＳの突然変異体形として構築されたＯ−ｍｕＴｒｐＲＳは元のコグネイトアミノ酸よりも別のアミノ酸を優先的にｔＲＮＡに負荷することができる。本発明のＯ−ＲＳは元のコグネイトアミノ酸に対して＞１：１、約２：１、約４：１、約５：１、約２０：１、約１００：１、又はそれ以上の比率で別のアミノ酸を優先的にｔＲＮＡに負荷することができる。本発明のＯ−ＲＳは内在（例えば類似）ｔＲＮＡよりも天然又は非天然アミノ酸で優先的にＯ−ｔＲＮＡをアミノアシル化（負荷）することができる。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡが内在ｔＲＮＡの突然変異形態である場合には、本発明のＯ−ＲＳはｔＲＮＡに対して＞１：１、約２：１、約４：１、約５：１、約２０：１、約１００：１、又はそれ以上の比率でＯ−ｔＲＮＡに優先的に負荷することができる。
【００５８】
本発明のＯ−ＲＳの活性は有用な量の転写産物を提供するために十分とすることができる。１好適態様では、Ｏ−ＲＳは翻訳系内の内在ＲＳ／ｔＲＮＡ対の典型的率の実質的比率に相当する率でそのコグネイトアミノ酸をその対合（相補的）Ｏ−ｔＲＮＡに負荷するという意味で活性である。例えば、本発明の直交対（Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ）は翻訳系内の内在（場合により類似）ＲＳの約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約８０％、約９０％、約１００％又はそれ以上の活性でＯ−ｔＲＮＡにそのコグネイト（場合により非天然、例えば５−ＨＴＰＰ）アミノ酸を負荷することができる。別の側面では、該当翻訳系における本発明のＯ−ＲＳはコグネイト内在ＲＳによる内在ｔＲＮＡのアミノアシル化に比較した場合に低効率又はゼロ効率で任意内在ｔＲＮＡをアミノアシル化することができる。多くの場合には、本発明のＯ−ＲＳはコグネイトｔＲＮＡを非天然アミノ酸でアミノアシル化することができるが、ｔＲＮＡを天然アミノ酸でアミノアシル化するには比較的効果がない。本発明のこのようなＯ−ＲＳは改善又は強化された酵素特性をもち、例えば天然に存在するアミノ酸（例えば２０種の公知アミノ酸の１種）に比較して非天然アミノ酸のＫｍが低いか、ｋｃａｔが高いか、ｋｃａｔ／Ｋｍが高い等の特性をもつ。これはＯ−ＲＳによるｔＲＮＡの好ましいアミノアシル化とみなすことができる。ｋｃａｔとＫｍの値は当分野で周知のように、例えば非線形回帰分析を使用してミカエリス・メンテンの式の直接フィットにより計算することができる。
【００５９】
本発明のＯ−ＲＳ及び直交対は成長中のペプチドへのそのコグネイト（場合により非天然、例えば５−ＨＴＰＰ）アミノ酸の忠実な組込みを可能にする。Ｏ−ＲＳ及び直交対は成長中のペプチドにそのコグネイトアミノ酸を高い忠実度で正確に組込むことができる。例えば、＞７０％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％の忠実度、又は実質的に１００％の忠実度でペプチド鎖内の関連ｔＲＮＡ（例えばＯ−ｔＲＮＡ）のアンチコドンにより決定される位置に５−ＨＴＰＰ等のコグネイトアミノ酸を組込むことができる。本発明のＯ−ＲＳ及び直交対は他のアミノ酸のコドンに対応する位置への天然もしくは非天然アミノ酸の忠実な組込み、又はセレクターコドン（例えば終止コドン又は４塩基コドン）に対応する位置への天然もしくは非天然アミノ酸の組込みを可能にする。
【００６０】
１好適態様では、本発明のＯ−ＲＳは突然変異体直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）である。Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳは例えば該当翻訳系に内在するトリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）の修飾形、外来（例えば別の界、科、属、又は種）翻訳系に由来する修飾（例えば突然変異）ＴｒｐＲＳ、突然変異させ、該当天然もしくは非天然アミノ酸に対する活性についてスクリーニングしたＴｒｐＲＳ、突然変異させ、該当ｔＲＮＡもしくはＯ−ｔＲＮＡに対する活性についてスクリーニングしたＴｒｐＲＳ、構造（例えば結晶構造解析）データに基づいて決定された位置を（例えば部位特異的突然変異により）突然変異させたＴｒｐＲＳ、及び／又はその誘導体とすることができる。より好ましい態様では、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳはｔＲＮＡをトリプトファン類似体で優先的にアミノアシル化するように突然変異させた外来ＴｒｐＲＳとすることができる。より好ましい態様では、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳは約残基１４４に近傍の領域でバリンのコドンを突然変異させたバシラスＴｒｐＲＳとすることができる。より好ましい態様では、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳは配列番号２のアミノ酸配列（Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳアミノ酸配列）、又はその保存置換配列をもつ。より好ましい態様では、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳは配列番号１の核酸配列（Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳをコードする核酸配列）、又はその保存変異体によりコードされるアミノ酸配列をもつ。例えば、残基１４４でプロリンをコードするように、バリン残基１４４のコドンの最初から２個の塩基を「ＧＴ」から「ＣＣ」に突然変異させることができる。最も好ましい態様では、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳは哺乳動物翻訳系に５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンを組込むために使用される枯草菌ＴｒｐＲＳ突然変異Ｖａｌ１４４Ｐｒｏとすることができる。
直交ｔＲＮＡ
【００６１】
本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）は翻訳系の内在アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼにより例えば低効率でしか負荷することができないが、本発明のコグネイトＯ−ＲＳにより天然又は非天然アミノ酸を有効に負荷することができる。１典型的態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ＲＳにより非天然アミノ酸を負荷される。Ｏ−ｔＲＮＡにアミノアシル化される非天然アミノ酸はＯ−ｔＲＮＡのアンチコドンにより決定される位置で翻訳系により成長中のペプチド鎖に組込むことができる。別の態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡは例えばＯ−ｔＲＮＡのアンチコドンに従って成長中のペプチド鎖の通常以外の位置に組込むためのアミノ酸を提供するように、内在ＲＳにより天然又は非天然アミノ酸を負荷することができる。１好適態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡはＯ−ＲＳにより例えば５−ＨＴＰＰ等の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される。
【００６２】
トランスファーリボ核酸（ｔＲＮＡ）は一般に図１に示すように、Ｄアーム１０、アンチコドンループ１１、Ｃアーム１２、及びアクセプターアーム１３をもつ。ｔＲＮＡ中のＡ、Ｕ、Ｇ、及びＣ塩基（夫々アデノシン、ウラシル、グアニン、及びシトシン）の配列はそのコグネイトアミノ酸、それらが存在する細胞型、突然変異、遺伝子操作等に応じて相違し得る。ｔＲＮＡ配列の重要な部分は転写中にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）上の相補的コドンと結合して成長中のペプチド鎖に適切なアミノ酸を提示するアンチコドンループと関連アンチコドン１４である。４塩基が存在し、各コドン３塩基であるので、２０種の天然アミノ酸を指定すると考えられる三重項コドンは６４個存在する。６４個の三重項コドンのうち３個（ｍＲＮＡにおけるＵＵＡ、ＣＵＡ、及びＵＣＡ；ＤＮＡにおけるＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡからの対応する転写産物）は翻訳終結を指定し、通常はアミノ酸をコードするためには使用されない。終止位置にアミノ酸を提供するために終止コドンに相補的なアンチコドンをもつサプレッサーｔＲＮＡが天然に存在することは知られている。本発明の１側面では、Ｏ−ｔＲＮＡは終結コドンに相補的なアンチコドンを含み、従って終止コドンに対応する位置で成長中のペプチド鎖にアミノ酸を挿入することができる。
【００６３】
本発明は本発明の特定Ｏ−ｔＲＮＡに対応するＯ−ｔＲＮＡの保存変異体を含む。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡの保存変異体は配列表の配列番号３のＯ−ｔＲＮＡと同様に機能し且つ妥当な自己相補性によりｔＲＮＡ  Ｌ字形構造を維持するが、例えば本明細書の配列表、図面、又は実施例に記載するものと同一の配列をもたない分子を含む（野生型ｔＲＮＡ分子以外であることが望ましい）。下記「保存変異」の欄も参照。本発明のＯ−ｔＲＮＡは例えば天然に存在するｔＲＮＡのポリヌクレオチドと例えば少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上一致する人工ポリヌクレオチド（但し天然に存在するｔＲＮＡ以外のもの）であるか、あるいは本明細書の配列表又は実施例に記載する任意ｔＲＮＡを含むことができる。
【００６４】
本発明のＯ−ｔＲＮＡは場合により他の各種アンチコドンを含むことができる。Ｏ−ｔＲＮＡは通常アミノ酸１個に割り当てられたアンチコドン１個をもつことができるが、更に別のアミノ酸を負荷することができる。Ｏ−ｔＲＮＡは４塩基又は５塩基コドン等の４塩基以上のコドンに相補的なアンチコドンをもつことができる。Ｏ−ｔＲＮＡは非天然塩基を含むか又は非天然塩基を含むコドンに相補的なアンチコドンをもつことができる。セレクターコドンは拡張コドン（例えば４、５、６塩基以上のコドン等の４塩基以上のコドン）とすることができる。４塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵ等が挙げられる。５塩基コドンの例としては例えばＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣ等が挙げられる。本発明の方法はフレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは例えば１又は複数の非天然アミノ酸（例えば５−ＨＴＰＰ）を同一蛋白質に挿入することができる。他の態様では、アンチコドンループは例えば少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、又は少なくとも６塩基コドン又はそれ以上をデコードすることができる。４塩基コドンは２５６種が考えられるので、４塩基以上のコドンを使用する同一細胞で複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；及びＭａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  “Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９参照。
【００６５】
セレクターコドンは場合により非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対は更に既存遺伝アルファベットを拡張することができる。例えば、機能的塩基対を１個増やすと、三重項コドン数は６４から１２５に増す。第３の塩基対の望ましい性質としては安定的且つ選択的な塩基対合、高い忠実度でポリメラーゼによるＤＮＡへの効率的な酵素組込み、及び未完成非天然塩基対の合成後の効率的な持続的プライマー伸長が挙げられる。本発明の方法と組成物に適応可能な非天然塩基対に関する記載としては、例えばＨｉｒａｏら，（２００２）Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２が挙げられる。Ｗｕ，Ｙ．ら，（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：１４６２６−１４６３０も参照。ｉｎ  ｖｉｖｏ使用では、非天然ヌクレオシドは一般に膜透過性であり、リン酸化して対応する三リン酸塩を形成する。
【００６６】
１好適態様では、本発明のＯ−ｔＲＮＡはＵＧＡ、ＵＡＡ、及びＵＡＧ  ｍＲＮＡコドンを夫々相補するＵＣＡ、ＵＵＡ、又はＣＵＡアンチコドンをもつ突然変異体サプレッサーｔＲＮＡである。より好ましい態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは直交トリプトファン負荷ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡＴｒｐ）、又は例えば天然アミノ酸（例えばトリプトファン）もしくは非天然アミノ酸（例えば５−ＨＴＰＰ）を特異的に負荷することができる直交突然変異体ｔＲＮＡ（Ｏ−ｍｕｔＲＮＡＴｒｐ）である。好ましい態様では、Ｏ−ｔＲＮＡは例えばＵＧＡ終結セレクターコドンに相補的なアンチコドンで非天然アミノ酸を負荷することができる直交突然変異体オパールサプレッサーｔＲＮＡ（例えばｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ）等の直交サプレッサー突然変異体ｔＲＮＡである。
【００６７】
本発明の典型的なＯ−ｔＲＮＡは機能的相補的直交対のメンバーとしてのＯ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。直交対のメンバーとして、例えば、Ｏ−ｔＲＮＡは該当翻訳系の内在ＲＳにより実質的にアミノアシル化されず、Ｏ−ｔＲＮＡは該当コグネイト天然又は非天然アミノ酸を優先的に負荷され、他のｔＲＮＡにコグネイトアミノ酸を実質的に負荷しないコグネイトＯ−ＲＳ対メンバーにより優先的に負荷される。例えば、直交ｔＲＮＡは相補的Ｏ−ＲＳと対合させた場合に比較して内在ＲＳとのアミノアシル化反応効率が２０％未満、１０％未満、５％未満、又は例えば１％未満とすることができる。
【００６８】
本発明の１側面では、直交対は真核翻訳系に付加するために原核翻訳系から誘導されるＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ突然変異体とすることができ、Ｏ−ｔＲＮＡは成長中のペプチド鎖に組込むためにＯ−ＲＳにより非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化される。１好適態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはバシラス翻訳系から誘導され、バシラス翻訳系に由来するＯ−ＲＳと対合させる。より好ましい態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはバシラス翻訳系に由来する突然変異体ｔＲＮＡＴｒｐであり、Ｏ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに例えば５−ＨＴＰＰ等の非天然アミノ酸を優先的に負荷するように突然変異させたバシラスＲＳである。
産物ペプチドに組込まれる非天然アミノ酸
【００６９】
本発明の組成物は成長中のペプチド鎖に天然及び／又は非天然アミノ酸を組込むために本発明の方法で使用することができる。本発明の非天然アミノ酸は例えば当分野で周知の２０種の天然アミノ酸のメンバー以外の任意アミノ酸とすることができる。非天然アミノ酸は有益な性質を提供するために各種治療用、診断用、及び産業用蛋白質に組込むことができる。
【００７０】
本発明の非天然アミノ酸としては天然化合物、合成化合物、及び／又は修飾天然化合物が挙げられる。例えば、２０種の普通α−アミノ酸、又はセレノシステインとピロリジン以外の天然に存在するアミノ酸を本発明の非天然アミノ酸とみなすことができる。本発明の非天然アミノ酸は一般に側鎖基の修飾により天然アミノ酸と相違する。非天然アミノ酸は一般に天然に存在する蛋白質で形成されると同様に他のアミノ酸（例えば天然又は非天然アミノ酸）と共にアミド結合を形成する。１好適態様では、天然アミノ酸上の化学反応基を反応性分子と反応させ、付加化学基を天然アミノ酸側鎖に結合し、非天然アミノ酸を生成する。本発明の１側面では、非天然アミノ酸は例えばアルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ、スルホニル、硼酸、ボロン酸、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミン基、及び／又は同等基等の化学基の付加により修飾された天然アミノ酸である。
【００７１】
別の側面では、新規性質を提供するために本発明の非天然アミノ酸を蛋白質に組込むことができる。非天然アミノ酸は例えば新規化学的性質、抗原性の変化、架橋部位、吸光度の変化、蛍光の変化、レポーター基、及び／又は同等性質を提供することができる。例えば、化学基を蛍光アミノ酸に付加し、その励起プロフィル、発光プロフィル、及び／又は発光強度を変化させることができる。例えば、ヒドロキシル基をトリプトファンに付加して５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）を形成すると、５−ＨＴＰＰを組込む蛋白質プローブに有用な発光最大値の有意シフトが可能になる。蛍光化学基等の化学基を実質的に非蛍光性のアミノ酸に付加し、修飾非天然アミノ酸から蛍光シグナルを提供することができる。反応性基を天然アミノ酸に付加し、例えばヒドロキシスクシンイミドリンカー（第１級アミンに反応性）、マレイミドリンカー、ハロアセチル、ピリジルジスルフィド（スルフヒドリル基に反応性）、ヒドラジンリンカー（アルデヒドに反応性）、及び／又はエチルジエチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ，カルボキシル基に反応性）等の一般に入手可能なリンカーとの結合反応のための結合部位を提供する側鎖をもつ非天然アミノ酸を形成することができる。本発明の１側面では、非天然アミノ酸は例えば特定範囲の電位とｐＨで反応性のレドックス制御可能なリンカーとすることができる。例えば、５−ＨＴＰＰを組込んだ蛋白質は約ｐＨ７．４で８００ｍＶ電位の溶液中で他の反応性分子と反応することができる。１好適態様では、他の反応性分子は５−ＨＴＰＰを組込んだ別の蛋白質であり、反応の結果として蛋白質間の架橋（例えば二量化）が生じる。
【００７２】
本発明の産物ペプチド（例えばアロ蛋白質）は一般に該当治療用蛋白質、診断用蛋白質、及び／又は産業用酵素の誘導体である。産物ペプチドは該当蛋白質と例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％以上一致しており、１種以上の非天然アミノ酸を含む。１種以上の５−ＨＴＰＰを組込むように改変することができる治療用、診断用、産業用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、ＵＳＳＮ  ６０／４７９，９３１及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；並びにＷＯ  ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」に記載されているものが挙げられる。１種以上の５−ＨＴＰＰ残基を組込むように改変することができる治療用、診断用、及び他の蛋白質の例としては限定されないが、例えばα１アンチトリプシン、アンジオスタチン、抗血友病因子、抗体、アポリポ蛋白質、アポ蛋白質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えばＴ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ−４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば単球化学誘引蛋白質−１、単球化学誘引蛋白質−２、単球化学誘引蛋白質−３、単球炎症性蛋白質−１α、単球炎症性蛋白質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、Ｉ３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃキットリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＧＲＯβ、ＧＲＯγ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１δ、ＭＣＰ−１）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、表皮剥離毒素Ａ及びＢ、ＩＸ因子、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグ蛋白質（例えばソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２等）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病阻害因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成蛋白質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えばヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、プロテインＡ、プロテイン��、発熱外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原即ちブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲンアクチベーター、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ等が挙げられる。
【００７３】
５−ＨＴＰＰ残基のｉｎ  ｖｉｖｏ組込み用組成物及び方法を使用して生産することができる蛋白質の１類としては転写モジュレーター又はその部分が挙げられる。転写モジュレーターの例としては細胞増殖、分化、制御等を調節する遺伝子及び転写モジュレーター蛋白質が挙げられる。転写モジュレーターは原核生物、ウイルス及び真核生物（例えば真菌、植物、酵母、昆虫、及び哺乳動物を含む動物）に存在し、広範な治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写アクチベーターは例えば受容体との結合、シグナル伝達カスケードの刺激、転写因子の発現調節、プロモーターやエンハンサーとの結合、プロモーターやエンハンサーと結合する蛋白質との結合、ＤＮＡ巻き戻し、プレｍＲＮＡスプライシング、ＲＮＡポリアデニル化及びＲＮＡ分解等の多数のメカニズムにより転写を調節する。
【００７４】
本発明の産物ペプチド（例えば５−ＨＴＰＰ又は他のトリプトファン誘導体残基等の１種以上の非天然アミノ酸の組込みにより有効に改変することができる蛋白質）の１類としては発現アクチベーター（例えばサイトカイン、炎症性分子、増殖因子、その受容体、及び腫瘍遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８等）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−キット、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４）；シグナル伝達分子及び対応する腫瘍遺伝子産物（例えばＭｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ）；並びに転写アクチベーター及びサプレッサー（例えばｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ、及びステロイドホルモン受容体（例えばエストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロン））が挙げられる。
【００７５】
少なくとも１種の５−ＨＴＰＰ又は他のトリプトファン誘導体残基を組込んだ酵素（例えば産業用酵素又は医療用酵素）又はその部分も本発明により提供される。酵素の例としては限定されないが、例えばアミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０類）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、スブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼが挙げられる。
【００７６】
これらの蛋白質の多くは市販されており（例えばＳｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００３カタログ及び価格表参照）、対応する蛋白質配列と遺伝子及び、一般に多くのその変異体も周知である（例えばＧｅｎｂａｎｋ参照）。例えば１種以上の該当治療、診断又は酵素特性に関して蛋白質を改変するように本発明に従って１種以上の通常以外のアミノ酸又はトリプトファン誘導体を挿入することにより前記蛋白質の任意のものを修飾することができる。治療関連特性の例としては薬物動態改変、血清半減期、貯蔵半減期、安定性、免疫原性、治療活性、（例えば非天然アミノ酸（例えば５−ＨＴＰＰ）へのレポーター基（例えばラベル又はラベル結合部位）の付加による）検出性、ＬＤ５０又は他の副作用の低減、胃管を経由して体内に導入できること（例えば経口利用性）等が挙げられる。診断特性の例としては貯蔵半減期、安定性、診断活性、検出性等が挙げられる。該当酵素特性の例としては貯蔵半減期、安定性、耐熱性、酵素活性、産生能等が挙げられる。
【００７７】
他の各種蛋白質も本発明の１種以上の非天然アミノ酸を付加するように修飾することができる。例えば、本発明は例えば感染性真菌（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ種）；細菌、特に病原細菌モデルとして利用できる大腸菌や医学的に重要な細菌（例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ（例えばａｕｒｅｕｓ）又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））；原生動物（例えば胞子虫類（例えばＰｌａｓｍｏｄｉａ）、根足虫類（例えばＥｎｔａｍｏｅｂａ）及び鞭毛虫類（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ、Ｇｉａｒｄｉａ等））；ウイルス（例えば（＋）ＲＮＡウイルス（例えばポックスウイルス（例えばワクシニア）、ピコルナウイルス（例えばポリオ）、トガウイルス（例えば風疹）、フラビウイルス（例えばＨＣＶ）、及びコロナウイルス）、（−）ＲＮＡウイルス（例えばラブドウイルス（例えばＶＳＶ）、パラミクソウイルス（例えばＲＳＶ）、オルトミクソウイルス（例えばインフルエンザ）、ブンヤウイルス及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡ→ＤＮＡウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）、及び所定のＤＮＡ→ＲＮＡウイルス（例えばＢ型肝炎））に由来する蛋白質において、１種以上のワクチン蛋白質中の１種以上の天然アミノ酸を５−ＨＴＰＰで置換することができる。
【００７８】
昆虫耐性蛋白質（例えばＣｒｙ蛋白質）、澱粉及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性蛋白質、マイコトキシン解毒蛋白質、植物成長酵素（例えばリブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）カルボキシラーゼ等の農業関連蛋白質も本発明の非天然アミノ酸による修飾の適切なターゲットである。
資源及び宿主生物
【００７９】
本発明の直交翻訳成分は一般に非真核生物に由来する。例えば、Ｏ−ｔＲＮＡは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができ、直交Ｏ−ＲＳは非真核生物（又は生物組み合わせ）、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌や、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌に由来することができる。１態様では、例えば植物、藻類、原生動物、真菌類、酵母、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等の真核資源もＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳ資源として、あるいは突然変異体Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又は突然変異体Ｏ−ＲＳの構築用資源として使用することができる。
【００８０】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対の個々の成分は同一生物に由来するものでも異なる生物に由来するものでもよい。１態様では、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対は同一生物に由来する。あるいは、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは異なる生物に由来することができる。１好適態様では、例えば哺乳動物細胞翻訳系で枯草菌のトリプトファニルシンテターゼ／ｔＲＮＡ対を直交対として使用する。本明細書に記載するように、この対はオパール突然変異体セレクターコドンを認識するように修飾することができ、Ｏ−ｔＲＮＡに５−ＨＴＰＰ等の通常以外のアミノ酸又は非天然アミノ酸を負荷するように修飾することができる。この直交対（又はその修飾形）を上記直交対（例えば終止セレクターコドンを認識するように修飾された例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉに由来する直交対）と組み合わせることができる。こうして、該当翻訳系に２種の異なる非天然アミノ酸を含む蛋白質を生産することができる。
【００８１】
本発明の直交成分は各種生細胞に存在するｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系で機能することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ又はＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対はｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択又はスクリーニングすることができ、及び／又は５−ＨＴＰＰ残基を組込んだポリペプチドを翻訳系で生産するために細胞（例えば非真核細胞、又は真核細胞）で使用することができる。非真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等の真正細菌や、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えばＨａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種ＮＲＣ−１）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ  ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ（Ｍｍ）、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ａｂｙｓｓｉ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ（Ｓｓ）、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ｖｏｌｃａｎｉｕｍ等の古細菌が挙げられる。真核細胞は種々の資源の任意のものに由来することができ、例えば植物（例えば単子葉植物、又は双子葉植物等の複雑な植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、動物（例えば哺乳動物、昆虫、節足動物等）等が挙げられる。本発明の翻訳成分を導入した細胞の組成物も本発明の特徴である。
【００８２】
別の種で使用するためにある種でＯ−ｔＲＮＡ及び／又はＯ−ＲＳをスクリーニングすることについては、ＵＳＳＮ  ６０／４７９，９３１及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」も参照。
核酸及びポリペプチド配列変異体
【００８３】
本発明は核酸ポリヌクレオチド配列及びポリペプチドアミノ酸配列（例えばＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ）と、例えば前記配列を含む組成物と方法を提供する。例えば本発明のＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの代表的配列を本明細書に開示する。しかし、当業者に自明の通り、本発明はこれらの特定配列のみに限定されない。同様に当業者に自明の通り、本発明は例えば機能的Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ、Ｏ−ＴｒｐＲＳ、アロ蛋白質等を提供する多数の関連及び非関連配列も提供する。
【００８４】
同様に当業者に自明の通り、開示配列の多数の変異体も本発明に含まれる。例えば、機能的に同一配列となる開示配列の保存変異体も本発明に含まれる。変異体又は変異体の相補的配列が少なくとも１種の開示配列とハイブリダイズするとき、核酸ポリヌクレオチド配列の変異体は本発明に含まれるとみなされる。例えば標準配列比較法により本明細書に開示する配列のユニークサブ配列であるとみなされる配列も本発明に含まれる。開示するペプチド配列のユニーク保存置換配列も本発明に含まれる。
保存変異
【００８５】
遺伝コードの縮重により、「サイレント置換」（即ちコードされるポリペプチドに変化を生じない核酸配列の置換）はアミノ酸をコードする全核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、「保存アミノ酸置換」はアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ酸を高度に類似する特性をもつ別のアミノ酸で置換するものであり、このような置換も開示構築物と高度に類似することが容易に認められる。各開示配列のこのような保存変異は本発明の特徴である。
【００８６】
特定核酸配列の「保存変異」とは同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸（下表１参照）を意味し、核酸が厳密に同一のアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列を意味する。当業者に自明の通り、コードされる配列中の単一アミノ酸又は低百分率（一般に５％未満、より一般には４％、２％又は１％未満）のアミノ酸を置換、付加又は欠失させる個々の置換、欠失又は付加の結果としてアミノ酸を欠失するか、アミノ酸が付加されるか、又はアミノ酸が化学的に類似するアミノ酸で置換される場合には、これらの変異は「保存修飾変異」である。従って、本発明の配列表のポリペプチド配列の「保存変異」としては、ポリペプチド配列のアミノ酸の低百分率、一般に５％未満、より一般には２％又は１％未満が同一保存置換基の保存選択アミノ酸で置換される場合が挙げられる。最後に、非機能的配列又は補助機能をもつ配列の付加のように核酸分子のコードされる活性を変えない配列の付加も基本核酸の保存変異である。
【００８７】
【表１】
2007514447.tif 000003
表１中、あるアミノ酸を同一群の別のアミノ酸で置換する場合に保存置換とみなすことができる。
核酸ハイブリダイゼーション
【００８８】
本発明の核酸の保存変異体を含めて本発明の核酸を同定するためには比較ハイブリダイゼーションを使用することができる。比較ハイブリダイゼーション法は本発明の核酸を識別するための好ましい方法である。更に、ストリンジェント条件下、高、超高及び超々高ストリンジェンシー条件下で配列番号１又は配列番号３により表される核酸とハイブリダイズするターゲット核酸も本発明の特徴である。このような核酸の例としては所与核酸配列と比較して１又は数個のサイレント又は保存核酸置換をもつものが挙げられる。
【００８９】
試験核酸が完全にマッチする相補的ターゲットに比較して少なくとも１／２の割合でプローブとハイブリダイズする場合、即ちマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍〜１０倍で完全にマッチするプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合する条件下におけるプローブとターゲットのハイブリダイゼーションに比較してシグナル対ノイズ比が少なくとも１／２である場合に試験核酸はプローブ核酸と特異的にハイブリダイズすると言う。
【００９０】
核酸は一般に溶液中又は固相支持体上で会合するときに「ハイブリダイズ」する。核酸は水素結合、溶媒排除、塩基スタッキング等の種々の十分に特性決定された物理化学的力によりハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ  ｃｈａｐｔｅｒ  ２，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｕｓｕｂｅｌ，前出に記載されている。Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  １  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １）及びＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  ２  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ２）はオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡとＲＮＡの合成、標識、検出及び定量について詳細に記載している。
【００９１】
約５０％ＧＣ含有率と約１００個を上回る相補的残基をもつ相補的核酸のハイブリダイゼーションをサザン又はノーザンブロットでフィルター上で行うためのストリンジェントハイブリダイゼーション条件の１例は、５０％ホルマリンにヘパリン１ｍｇを加え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを実施する。ストリンジェント洗浄条件の１例は６５℃、０．２×ＳＳＣで１５分間洗浄する（ＳＳＣ緩衝液の説明についてはＳａｍｂｒｏｏｋ，前出参照）。多くの場合には高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄を実施してバックグラウンドプローブシグナルを除去する。低ストリンジェンシー洗浄の１例は４０℃、２×ＳＳＣで１５分間である。一般に、シグナル対ノイズ比が特定ハイブリダイゼーションアッセイで無関係プローブに観測される比の５倍（以上）である場合に特異的ハイブリダイゼーションが検出されたとみなす。
【００９２】
サザン及びノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験において「ストリンジェントハイブリダイゼーション」の洗浄条件は配列依存性であり、各種環境パラメーターにより異なる。核酸ハイブリダイゼーションの詳しい手引きはＴｉｊｓｓｅｎ（１９９３），前出やＨａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  １及び２に記載されている。ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件は任意試験核酸について経験により容易に決定することができる。例えば、高ストリンジェントハイブリダイゼーション及び洗浄条件を決定するには、一連の選択基準に合致するまで（例えばハイブリダイゼーション又は洗浄における温度上昇、塩濃度低下、界面活性剤濃度増加及び／又はホルマリン等の有機溶媒濃度増加により）ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加する。例えば、マッチしないターゲットとプローブのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも約５倍でプローブが完全にマッチする相補的ターゲットと結合するまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件を徐々に増加することができる。
【００９３】
「超ストリンジェント」条件は特定プローブの熱融点（Ｔｍ）に等しくなるように選択することができる。Ｔｍは（規定イオン強度及びｐＨ下で）試験配列の５０％が完全にマッチするプローブとハイブリダイズする温度である。本発明の目的には、一般に規定イオン強度及びｐＨで特定配列のＴｍよりも約５℃低くなるように「高ストリンジェント」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件を選択する。
【００９４】
「超高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【００９５】
同様に、該当ハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件を徐々に増加することにより更に高いレベルのストリンジェンシーを決定することもできる。例えば、完全にマッチする相補的ターゲット核酸とプローブの結合に観測されるシグナル対ノイズ比がマッチしないターゲット核酸の任意のものとのハイブリダイゼーションに観測されるシグナル対ノイズ比の少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、１００倍又は５００倍以上になるまでハイブリダイゼーション及び洗浄条件のストリンジェンシーを増加する条件である。完全にマッチする相補的ターゲット核酸のシグナル対ノイズ比の少なくとも１／２で前記条件下にプローブとハイブリダイズする場合にターゲット核酸は超々高ストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言う。
【００９６】
ストリンジェント条件下で相互にハイブリダイズしない核酸でも、これらの核酸によりコードされるポリペプチドが実質的に一致する場合にはやはり本発明の実質的に一致する核酸である。これは、例えば遺伝コードに許容される最大コドン縮重を使用して核酸のコピーを作製する場合に該当する。
ユニークサブ配列
【００９７】
１側面では、本発明は本明細書に開示するＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳの配列（例えば配列番号３又は配列番号１）から選択される核酸中にユニークサブ配列を含む核酸を提供する。ユニークサブ配列は例えばＧｅｎｂａｎｋに含まれるような従来公知の任意Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳ核酸配列に対応する核酸に比較してユニークである。例えばデフォルトパラメーターに設定したＢＬＡＳＴを使用してアラインメントを実施することができる。任意ユニークサブ配列は例えば本発明の核酸を同定するためのプローブとして有用である。
【００９８】
同様に、本発明は本明細書に開示するＯ−ＲＳの配列（例えば配列番号２）から選択されるポリペプチドのユニークサブ配列を含むポリペプチドに関する。この場合には、ユニークサブ配列は任意の公知ポリペプチド配列の対応するポリペプチドに比較してユニークである。
【００９９】
本発明はＯ−ＲＳの配列から選択されるポリペプチド中のユニークサブ配列をコードするユニークコーディングオリゴヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするターゲット核酸も提供し、この場合には、ユニークサブ配列は対照ポリペプチドの任意のものに対応するポリペプチドに比較してユニークである。ユニーク配列は上記のように決定する。
配列比較、一致度及び相同度
【０１００】
Ｏ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳは例えば本発明の成分配列と所定の相同度（例えば配列一致度）をもつ場合に本発明の翻訳成分であるとみなす。本発明の方法に従って翻訳され、野生型治療用蛋白質、診断用蛋白質、産業用酵素、又はその一部と少なくとも７５％、約９０％、約９５％、約９９％又はそれ以上一致するアミノ酸配列をもち、少なくとも１種の通常以外のアミノ酸又は非天然アミノ酸を組込んだ産物ペプチドを本発明の産物ペプチドとみなす。
【０１０１】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列に関して「一致」又は「一致度」百分率なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、以下に記載する配列比較アルゴリズム（又は当業者に入手可能な他のアルゴリズム）の１種を使用するか又は目視により測定した場合に相互に同一であるか又は同一のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの百分率が特定値であることを意味する。
【０１０２】
２種以上の核酸又はポリペプチド（例えばＯ−ｔＲＮＡもしくはＯ−ＲＳをコードするＤＮＡ又はＯ−ＲＳのアミノ酸配列）に関して「実質的に一致」なる用語は２種以上の配列又はサブ配列を最大限に対応するように対比及び整列させ、配列比較アルゴリズムを使用するか又は目視により測定した場合にヌクレオチド又はアミノ酸残基一致度が少なくとも約６０％、好ましくは約８０％、最も好ましくは約９０〜９５％であることを意味する。このような「実質的に一致」する配列は一般に実際の起源が記載されていなくても「相同」であるとみなす。少なくとも約２０残基長、少なくとも約５０残基長の配列の領域、より好ましくは少なくとも約１００残基長の領域にわたって「実質的一致」が存在していることが好ましく、少なくとも約１５０残基又は比較する２配列の全長にわたって配列が実質的に一致していることが最も好ましい。本発明は本発明のユニークな翻訳成分について本明細書に開示するものと実質的に一致する核酸配列及びアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
配列比較及び相同性判定には、一般に一方の配列を参照配列としてこれに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合には、試験配列と参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。こうすると、配列比較アルゴリズムは指定プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対して試験配列の配列一致度百分率を計算する。
【０１０４】
比較のための最適な配列アラインメントは例えばＳｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピューターソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視（一般にＡｕｓｕｂｅｌら，後出参照）により実施することができる。
【０１０５】
配列一致度及び配列類似度百分率を決定するのに適したアルゴリズムの１例はＡｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公共入手可能である。このアルゴリズムはデータベース配列中の同一長さの単語と整列した場合に所定の正の閾値スコアＴと一致するか又はこれを満足するクエリー配列中の長さＷの短い単語を識別することによりまず高スコア配列対（ＨＳＰ）を識別する。Ｔを隣接単語スコア閾値と言う（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，前出）。これらの初期隣接単語ヒットをシードとして検索を開始し、これらの単語を含むもっと長いＨＳＰを探索する。次に、累積アラインメントスコアを増加できる限り、単語ヒットを各配列に沿って両方向に延長する。ヌクレオチド配列の場合にはパラメーターＭ（１対のマッチ残基のリウォードスコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチ残基のペナルティースコア、常に＜０）を使用して累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合には、スコアリングマトリクスを使用して累積スコアを計算する。累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアが１カ所以上の負スコア残基アラインメントの累積によりゼロ以下になるか、又はどちらかの配列の末端に達したら各方向の単語ヒットの延長を停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸはアラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列用として、ＢＬＡＳＴＰプログラムは語長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスをデフォルトとして使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）。
【０１０６】
配列一致度百分率の計算に加え、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは２配列間の類似性の統計分析も実施することができる（例えばＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１尺度は２種のヌクレオチド又はアミノ酸配列間に偶然にマッチが起こる確率を示す最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸を参照核酸に比較した場合の最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合に核酸は参照核酸に類似しているとみなす。約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満の最小合計確率で本発明のユニーク核酸に類似している場合に核酸は本発明のユニーク核酸に類似しており、本発明の範囲に含まれるとみなす。
免疫反応性によるポリペプチドの定義
【０１０７】
本発明のポリペプチドは（例えば本発明の翻訳系で合成される蛋白質の場合には５−ＨＴＰＰ残基を含み、例えば新規シンテターゼの場合には標準アミノ酸の新規配列を含む）種々の新規ポリペプチド配列を提供するので、ポリペプチドは例えば免疫アッセイで認識することができる新規構造特徴も提供する。本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗血清の作製及び前記抗血清と結合するポリペプチドも本発明の特徴の１つである。例えば、本発明のペプチドは上記のように本発明のペプチドに対して特異的結合親和性をもつ抗体に免疫反応性であるが、他の公知ペプチドには有意に免疫反応性ではないペプチドを含む。
【０１０８】
本明細書で使用する「抗体」なる用語は限定されないが、検体（抗原）と特異的に結合してこれを認識する１又は複数の免疫グロブリン遺伝子又はそのフラグメントにより実質的にコードされるポリペプチドを意味する。例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、及び１本鎖抗体等が挙げられる。Ｆａｂフラグメントやファージディスプレイを含む発現ライブラリーにより生産されるフラグメント等の免疫グロブリンフラグメントも本明細書で使用する「抗体」なる用語に含まれる。抗体構造及び用語については、例えばＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，１９９９，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照。
【０１０９】
イムノアッセイ用抗血清を作製するためには、免疫原性ポリペプチドの１種以上を本明細書に記載するように作製し、精製する。例えば、組換え蛋白質を組換え細胞で生産することができる。（マウスの仮想遺伝子一致により結果の再現性が高いのでこのアッセイで使用する）近交系マウスに標準マウス免疫プロトコールに従って標準アジュバント（例えばフロイントアジュバント）と共に免疫原性蛋白質を免疫する（抗体作製、イムノアッセイフォーマット及び特異的免疫反応性を測定するために使用可能な条件の標準記載については例えばＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。蛋白質、抗体、抗血清等に関するその他の詳細はＵＳＳＮ６０／４７９，９３１、６０／４６３，８６９、及び６０／４９６，５４８、発明の名称「真核遺伝コードの拡張（Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ）」；ＷＯ２００２／０８５９２３、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（ＩＮ  ＶＩＶＯ  ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＵＮＮＡＴＵＲＡＬ  ＡＭＩＮＯ  ＡＣＩＤＳ）」；２００３年１月１６日付け特許出願、発明の名称「糖蛋白質合成（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ＵＳＳＮ６０／４４１，４５０）」に記載されている。
非天然アミノ酸をペプチドに組込む方法
【０１１０】
本発明の組成物と方法を使用すると、アミノ酸をユニークにペプチドに組込むことができる。本発明の直交転写成分を組み立て、内在転写系に挿入することができる。直交成分は成長中のペプチド鎖の通常以外の位置に天然又は非天然アミノ酸を導入することができる。得られたペプチドは医療、分析、生物学研究、工業加工等の技術開発分野で有用なユニークな性質をもつことができる。
【０１１１】
通常以外の位置へのアミノ酸の組込みとしては、標準コドン翻訳で提供されない位置のペプチドへの天然又は非天然アミノ酸の組込みが挙げられる。通常以外の位置への組込みとしては、例えば別の天然アミノ酸を通常コードする（即ち６１個の標準翻訳コドンによる）位置への天然アミノ酸の組込みが挙げられる。即ち、標準コドン三重項が所定の通常以外に負荷されたＯ−ｔＲＮＡのセレクターコドンとして機能することができる。天然又は非天然アミノ酸の組込みは終止コドン、非天然コドン、４塩基コドン等の通常はコードしないコドンに応答して行われる場合もある。ペプチドの任意位置への非天然アミノ酸の組込みは通常以外の位置への組込みとみなすことができる。
【０１１２】
アミノ酸は例えば本発明の直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）の構築物を作製し、本発明の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）の構築物を作製し、構築物を細胞にトランスフェクトし、構築物を発現させてＯ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを提供し、Ｏ−ＲＳとＯ−ｔＲＮＡを内在翻訳系に付加し、Ｏ−ＲＳを使用してＯ−ｔＲＮＡに負荷し、Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンに相補的なコドンをもつｍＲＮＡを翻訳して蛋白質の通常以外の位置にアミノ酸を組込むことにより、蛋白質の通常以外の位置に組込むことができる。構築物発現産物を精製し、内在翻訳系にｉｎ  ｖｉｔｒｏ付加するか、又は内在ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系をもつ生細胞で発現させることができる。本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡに天然又は非天然アミノ酸を負荷することができる。Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンは非標準セレクターコドンに相補的でもよいし、Ｏ−ＲＳによりＯ−ｔＲＮＡに負荷されるアミノ酸とは異なるアミノ酸に通常割り当てられるセレクターコドンに相補的でもよい。
【０１１３】
Ｏ−ｔＲＮＡ、Ｏ−ＲＳ、及び直交対を作製及び選択するための方法は例えば参考資料として本明細書に組込む米国特許出願第１０／１２６，９２７号、発明の名称「非天然アミノ酸のインビボ組込み（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ）」、発明者Ｓｈｕｌｔｚら、及び米国特許出願第１０／１２６，９３１号、発明の名称「直交ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を作製するための方法及び組成物（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌ  ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｐａｉｒｓ）」、発明者Ｓｈｕｌｔｚらに記載されている。例えば、第１の生物に由来する少なくとも１種のアミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）から誘導される（場合により突然変異体）ＲＳのライブラリーを作製し、ＲＳのライブラリーを選択（及び／又はスクリーニング）して直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性なＲＳのプールを提供し、非天然アミノ酸の存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性なＲＳのプールをスクリーニングすることにより、本発明の組換え直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生産することができる。別の例では、少なくとも１種のｔＲＮＡから誘導される突然変異体ｔＲＮＡのライブラリーを作製し、第１の生物に由来するＲＳの不在下で第２の生物に由来するアミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化されるｔＲＮＡのライブラリーを選択又はスクリーニングして機能的ｔＲＮＡのプールを提供し、導入された直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについてｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングし、例えばセレクターコドンを認識し、第２の生物に由来するＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される少なくとも１種の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供することにより、本発明の組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を生産することができる。このような本発明のＯ−ｔＲＮＡとＯ−ＲＳは例えば内在翻訳系と共働して非天然アミノ酸を本発明のペプチドに特異的且つ効率的に組込む本発明の相補的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対として提供することができる。
突然変異誘発及び他の分子生物学技術
【０１１４】
本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは分子生物学技術を使用して作製及び操作することができる。分子生物学技術について記載している一般教科書としてはＢｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００３年補遺）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」））が挙げられる。これらの教科書は突然変異誘発、ベクターの使用、プロモーター及び他の多くの関連事項について記載しており、例えばトリプトファン誘導体、直交ｔＲＮＡ、直交シンテターゼ及びその対を含む蛋白質を生産するためのセレクターコドンを含む遺伝子の作製についても記載している。
【０１１５】
例えばｔＲＮＡ分子を突然変異させるため、ｔＲＮＡのライブラリーを作製するため、シンテターゼを突然変異させるため、シンテターゼのライブラリーを作製するため、及び／又は該当蛋白質又はポリペプチドをコードする核酸にセレクターコドンを挿入するために、本発明では各種突然変異誘発法を使用することができる。突然変異誘発法としては限定されないが、部位特異的突然変異誘発、ランダム点突然変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の帰納的突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有鋳型を使用する突然変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップデュプレクスＤＮＡを使用する突然変異誘発等、又はその任意組み合わせが挙げられる。他の適切な方法としては点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を使用する突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、完全遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復等が挙げられる。例えばキメラ構築物を使用する突然変異誘発も本発明に含まれる。１態様では、天然分子又は改変もしくは突然変異させた天然分子の公知情報（例えば配列、配列比較、物性、結晶構造等）により突然変異誘発を行うことができる。
【０１１６】
本発明のポリヌクレオチド又は本発明のポリヌクレオチドを組込んだ構築物（例えばクローニングベクター及び／又は発現ベクター等の本発明のベクター）で宿主細胞を遺伝子組換え（例えば形質転換、形質導入又はトランスフェクション）することができる。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンテターゼ、及び通常以外のアミノ酸を組込もうとする蛋白質を所望宿主細胞で機能的な遺伝子発現制御エレメントに機能的に連結する。典型的なベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核系と真核系の両者の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製及び／又は組込みに適している。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。ベクターは例えばプラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンジュゲートの形態とすることができる。ベクターは例えばエレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、核酸を小ビーズもしくは粒子のマトリックスに埋込むか又は表面に付着させて小粒子形態で高速射入する方法（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，７０−７３（１９８７）、及び／又は同等方法等の標準方法により細胞及び／又は微生物に導入することができる。
【０１１７】
クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９６）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＳａｍｂｒｏｏｋ（前出），Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）及びＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。更に、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，世界ウェブｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ参照）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，世界ウェブｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ参照）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、その他多数の各種販売会社からほぼ任意核酸（及び標準又は標準外を問わずほぼ任意標識核酸）を注文することができる。
【０１１８】
遺伝子組換えした宿主細胞は例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞選択等の操作に合うように適宜改変した慣用栄養培地で培養することができる。これらの細胞は場合によりトランスジェニック生物で培養することができる。（例えば後期核酸単離のための）例えば細胞単離及び培養に関する他の有用な文献としてはＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋとその引用文献；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びＡｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられる。
Ｏ−ＲＳ構築物の作製
【０１１９】
本発明の直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ構築物は所望発現系、選択系、及び／又は翻訳系に適した各種エレメントを使用して作製することができる。Ｏ−ＲＳ構築物は例えば適当なプロモーターと選択マーカーをもつプラスミドを含むことができる。Ｏ−ＲＳ蛋白質をコードする構築物の配列はアミノ酸特異性、ｔＲＮＡ特異性、酵素活性、及び／又は発現される酵素の忠実度を増加する突然変異を含むことができる。発現された構築物は例えば精製タグと検出可能なマーカーを含むキメラとすることができる。
【０１２０】
一般に、本発明のＯ−ＲＳはＯ−ＲＳをコードする核酸配列と、発現を開始するためのプロモーターと、プラスミドを細胞中に維持する選択マーカーの配列を含むプラスミドを使用して発現させることができる。プロモーターは発現細胞型のＲＮＡポリメラーゼに適合可能な転写開始部位を含むＤＮＡ配列とすることができる。プロモーターは高度に活性で誘導性とすることができる。原核発現系で一般に使用されているプロモーターはｌａｃプロモーターである。哺乳動物細胞発現系で一般に使用されているプロモーターとしてはＣＭＶプロモーターとヒト細胞ＥＦ−１αプロモーターが挙げられる。発現ベクターによりコードされる選択マーカーは細胞宿主から脱離しないようにプラスミドを安定化し、ベクターをもつ細胞を同定する手段を提供することができる。ポジティブ選択マーカーは例えばベクターで形質転換された宿主細胞のみが抗生物質を含有する培地で増殖できるように抗生物質耐性遺伝子とすることができる。誘導毒素等のネガティブセレクターは毒素誘導剤の存在下で死滅するか又は活発に成長できない細胞クローンとしてベクターをもつ細胞クローンを同定することができる。
【０１２１】
ベクター及び／又は発現された蛋白質の検出と定量を助長するために構築物にレポーター配列を付加すると適切なことが多い。一般には、Ｏ−ＲＳ発現の存在と量を推定できるように、検出可能なマーカーペプチド配列をＯ−ＲＳ配列と融合する。例えば、緑色蛍光蛋白質（ＦＧＰ）配列を本発明のＯ−ＲＳ配列と融合すると、発現された融合蛋白質を特徴的蛍光励起／発光プロフィルにより検出することができる。発現されたＯ−ＲＳを簡便に検出及び定量する別の方法は配列を抗原配列（例えばＦＬＡＧ又はＶ５配列）と融合し、発現された融合蛋白質を例えばウェスタンブロット分析により分析する方法である。
【０１２２】
本発明の発現されたＯ−ＲＳの簡便な精製が望ましい場合には、特異的親和性を使用して蛋白質を他の生体分子から分離できるような精製タグを配列に付加することができる。例えば、キレートニッケルに対して親和性をもつｈｉｓ６タグ、又は抗体と結合した抗原タグを例えばアフィニティークロマトグラフィーカラムフォーマットで使用すると、発現された蛋白質を迅速に精製することができる。精製Ｏ−ＲＳ／タグ融合蛋白質をその後、例えば質量分析等で分析するか、又は翻訳系に付加することができる。
【０１２３】
本発明のＯ−ＲＳは例えばスクリーニング法、ランダム突然変異、特異的突然変異、及び／又は同等技術により得ることができる。内在翻訳系に付加する場合には外来ＲＳをＯ−ＲＳとすることができる。例えば、原核生物に由来するＲＳが真核生物の内在翻訳系でＯ−ＲＳとして機能することができる。場合により、外来又は内在ＲＳに当分野で公知のランダム突然変異法を実施し、例えばＯ−ｔＲＮＡ及び／又は非天然アミノ酸によりＯ−ＲＳ機能性をスクリーニングすることができる。より一般には、特にＲＳ活性部位の入手可能な構造情報を使用し、該当アミノアシル化ｔＲＮＡとのＲＳ相互作用の活性及び特異性に影響を与える可能性が最も高いアミノ酸位置を情報評価することができる。例えば、ＲＳ、又は類似ＲＳに関するＸ線結晶構造解析データに基づき、特定アミノアシル化ｔＲＮＡとの機能的適合及び相互作用を妨害又は助長することが可能なアミノ酸残基位置について推定することができる。１態様では、例えば、あるアミノ酸を負荷するように機能する直交（Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ）対を部位特異的突然変異により突然変異させ、もっと大きい（例えば誘導体化した）アミノ酸又は逆電荷のアミノ酸を負荷するように変異させることができる。結晶構造解析データから活性部位に延びていることが確認されたＯ−ＲＳアミノ酸残基を特異的に突然変異させ、例えばもっと短い側鎖をもつアミノ酸に交換し、活性部位の立体障害を少なくし、活性部位へのより大きいアミノ酸の適合を改善することができる。場合により、ＲＳ活性及び／又は特異性に関連する１種以上の特定アミノ酸残基を突然変異させ、例えば所望機能の最適突然変異をスクリーニング及び同定するために１９種の代替天然アミノ酸（又は、場合により非天然アミノ酸）の各々を組込んだＲＳを得ることもできる。
【０１２４】
本発明におけるＯ−ＲＳ構築物の態様では直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）、特に原核トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼが好ましい。本発明のＯ−ＲＳ構築物では直交突然変異体直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳ）が好ましい。１例では、本発明のＯ−ｍｕＴｒｐＲＳ構築物は酵素の活性部位に配置されたアミノ酸の部位特異的突然変異により原核ＴｒｐＲＳから誘導される。
【０１２５】
この例の１好適態様では、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳはＶａｌ１４４を突然変異させた枯草菌ＴｒｐＲＳである突然変異Ｖａｌ１４４Ｐｒｏ、又はその誘導体である。例えば、Ｏ−ｍｕＴｒｐＲＳはＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳをコードするヌクレオチド（即ち配列番号１）、相補配列、又はその保存変異体によりコードすることができる。最も好ましいＯ−ｍｕＴｒｐＲＳとしては、例えばＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳのアミノ酸配列（即ち配列番号２）又はその保存置換配列をもつものが挙げられる。
Ｏ−ＲＳ構築物のスクリーニング
【０１２６】
本発明のＯ−ＲＳ構築物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系又は（例えば生細胞中の）ｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系で発現させ、所望活性及び／又は特異性をスクリーニングすることができる。蛋白質設計工学の信頼度が高い場合や、構築物が既に特性決定されている場合には、本発明のＯ−ＲＳ（及び／又はＯ−ｔＲＮＡ）を発現及び生産するために構築物を宿主細胞に形質導入、形質転換、又はトランスフェクトすることができる。多くの場合には、例えば一連の発現、スクリーニング、及び選択段階のために代替候補構築物のライブラリーを作製し、特定直交転写サブシステムで望ましい特徴をもつ構築物を同定する。
【０１２７】
ターゲット核酸を細胞に導入する方法は数種の周知方法が入手可能であり、本発明ではその任意のものを使用することができる。これらの方法としては、ＤＮＡを含む細菌プロトプラストとレシピエント細胞の融合、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ウイルスベクターによる感染、及び／又は同等方法が挙げられる。本発明のＤＮＡ構築物を含むプラスミドの数を増幅するためには細菌細胞を使用することができる。対数期まで細菌を増殖させ、細菌内で複製されたプラスミドベクターを当分野で公知の各種方法により単離することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ参照）。更に、細菌からプラスミドを精製するために多数のキットが市販されている（例えばＥａｓｙＰｒｅｐ（登録商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（登録商標）（いずれもＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製品）；ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製品）；及びＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ製品））。単離精製したプラスミドはその後、例えば更に操作して他のプラスミドを作製するか、細胞にトランスフェクトするために使用するか、又は生物に感染させるために関連ベクターに組込むことができる。典型的ベクターは転写及び翻訳ターミネーターと、転写及び翻訳開始配列と、特定ターゲット核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含む。ベクターは場合により少なくとも１個の独立ターミネーター配列と、真核生物又は原核生物又は両者（例えばシャトルベクター）でカセットの複製を可能にする配列と、原核及び／又は真核系の選択マーカーを含む包括的発現カセットを含む。ベクターは原核生物、真核生物、又は好ましくは両者での複製と組込みに利用することができる。Ｇｉｌｉｍａｎ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ．ら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（いずれも前出）参照。クローニングに有用な細菌とバクテリオファージのカタログは例えばＡＴＣＣから入手でき、例えばＡＴＣＣから刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）が挙げられる。その他のシーケンシング、クローニング及び分子生物学の他の側面の基本手順と基礎理論事項もＷａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹに記載されている。
【０１２８】
所望Ｏ−ＲＳ機能に関するＲＳ候補酵素のスクリーニング又は選択は例えば候補を発現ベクターＤＮＡ形態のｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳系に導入するか、又はｍＲＮＡもしくはペプチド形態のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系に導入することにより実施できる。予想ｔＲＮＡ直交対メンバーに対するアミノアシル化活性の有無についてＲＳ候補を予めスクリーニングし、活性なＲＳのライブラリーを提供することができる。例えば適切に機能するＯ−ＲＳの存在下でしか発現することができないマーカー蛋白質の検出により活性なＲＳのライブラリーをスクリーニングすることができる。例えば、マーカー蛋白質は選択マーカー及び／又は検出可能なマーカーを含むことができる。マーカー蛋白質は例えば細胞生存性（例えば抗生物質耐性）、細胞毒性又は死（例えば毒素蛋白質）、蛍光シグナル（例えば蛍光蛋白質）、サンドイッチアッセイで検出可能な抗原、及び／又は同等物を提供することができる。マーカー蛋白質の核酸配列は活性なＲＳが相補的アンチコドンをもつｔＲＮＡに負荷する場合のみに機能的マーカー蛋白質が発現されるように、例えば内在翻訳系により所望アミノ酸として翻訳されないセレクターコドンを含むことができる。活性なＲＳがセレクターコドンに相補的なｔＲＮＡに間違ったアミノ酸を負荷する疑陽性結果は例えば通常以外のマーカー蛋白質機能、又はマーカー蛋白質産物の定性分析（例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析）により検出し、排除することができる。
【０１２９】
適正な機能についてスクリーニングしたＯ−ＲＳを更に試験し、改善された所望特異性をもつ本発明のＯ−ＲＳを選択することができる。対合ｔＲＮＡに第１のアミノ酸を正常に負荷し、ｔＲＮＡに第２の（場合により通常以外の）アミノ酸を負荷するＲＳから誘導される突然変異体Ｏ−ＲＳについては、対合ｔＲＮＡが第１のアミノ酸よりも第２のアミノ酸で優先的にアミノアシル化されるか否かについて突然変異体Ｏ−ＲＳを試験することができる。例えば、突然変異体ＲＳを含む翻訳系を第２のアミノ酸の存在下と不在下でマーカー発現について試験することができる。第２のアミノ酸を含まない翻訳系でマーカー蛋白質が発現される場合には、突然変異体ＲＳは例えば対合ｔＲＮＡに第１のアミノ酸を負荷している可能性がある。マーカー蛋白質が第２のアミノ酸の存在下では全長で発現され、第２のアミノ酸の不在下では短縮形でしか発現されない場合には、突然変異体ＲＳは例えば内在翻訳系の天然アミノ酸よりも第２のアミノ酸で優先的にｔＲＮＡをアミノアシル化している可能性がある。突然変異体ＲＳと第２のアミノ酸を付加した翻訳系で発現されるマーカー蛋白質を（例えばエレクトロスプレーイオン化質量分析又はウェスタンブロッティングにより）分析し、例えば突然変異体ＲＳによる対合ｔＲＮＡの不整合負荷に起因する翻訳エラーの存在及び／又は比率を検出することができる。本発明のＯ−ＲＳによる不整合負荷がある程度まで許容できる場合には、Ｏ−ＲＳはその対合ｔＲＮＡを所望アミノ酸で優先的にアミノアシル化することが好ましい。例えば、本発明のＯ−ＲＳはその対合ｔＲＮＡ（場合によりＯ−ｔＲＮＡ）を所期以外の（一般に天然）アミノ酸の負荷に対して＞１：１、約２：１、約４：１、約５：１、約２０：１、約１００：１、又はそれ以上の比率で所期（場合により非天然）アミノ酸で優先的にアミノアシル化することができる。
【０１３０】
適正な機能についてスクリーニングしたＯ−ＲＳを更に試験し、十分な活性をもつＯ−ＲＳを選択することができる。その対合ｔＲＮＡと共に内在翻訳系に付加されたＯ−ＲＳは同様の条件下の内在アミノ酸組込みと同様の比率でコグネイトアミノ酸（一般に非天然）をペプチドに組込むことができる。Ｏ−ＲＳの活性は例えば放射性コグネイトアミノ酸のペプチド組込みを検出するか、関連発現産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより定量するなどの方法により測定することができる。活性を例えば類似蛋白質の内在発現レベルと比較することができる。本発明では、Ｏ−ＲＳは典型的な内在（場合により類似）ＲＳの例えば約１％、約５％、約１０％、約２５％、約５０％、約８０％、約９０％、約１００％、又はそれ以上の活性をもつことができる。例えば、セレクターコドンを含むように突然変異させた野生型配列によりコードされる蛋白質（例えばアロ蛋白質）の発現と野生型蛋白質の発現を比較することができる。あるいは、当分野で公知の方法に従ってＯ−ＲＳのＫｍ及び／又はＫｃａｔを実験により評価し、Ｏ−ＲＳの活性を測定することができる。１好適態様では、天然アミノ酸に比較して非天然アミノ酸の例えばＫｍやＫｃａｔ等の酵素特性の改善又は強化に基づいて本発明の（例えば突然変異、スクリーニング、及び／又は予め選択されたＲＳライブラリーに由来する）Ｏ−ＲＳを選択する。
【０１３１】
Ｏ−ＲＳ候補のスクリーニング及び選択により所望活性及び／又は特異性をもつＯ−ＲＳが得られない場合には、外来ＲＳ、蛋白質設計、突然変異、スクリーニング、及び／又は選択の付加ラウンドにより調査を続けることができる。
Ｏ−ｔＲＮＡ構築物の作製
【０１３２】
本発明のＯ−ｔＲＮＡは上記と同様の組換え技術により作製したＤＮＡ構築物から発現させることができる。しかし、ｔＲＮＡは最終的にペプチドに翻訳されないリボ核酸として発現される。Ｏ−ｔＲＮＡ構築物とＲＮＡ発現産物は蛋白質発現用構築物には存在しない特徴がある。例えば、ｔＲＮＡ配列はｍＲＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼとは異なる特殊なＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ）により転写される。
【０１３３】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ配列は発現、活性、及び特異性に影響を与える可能性のある各種エレメントをもつことができる。例えば、多くの場合に、本発明のＯ−ｔＲＮＡは内在翻訳系とは異種のｔＲＮＡに由来することができる。真核生物のｔＲＮＡはＡボックスとＢボックスの２種の保存遺伝子内転写制御エレメントを認識するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写される。真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩは原核ｔＲＮＡ配列の開始シグナルを有効に認識しない場合がある。このような場合には、例えば図１に示すように例えば真核ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより認識される「Ａボックス」１５セグメントをコードするようにｔＲＮＡのＤアームの核酸残基を突然変異させることができる。真核生物における所定のｔＲＮＡ遺伝子の発現は所定の５’フランキング配列に依存する可能性もある。例えば、真核生物におけるｔＲＮＡＴｒｐの発現には明瞭にＡＴリッチであり、数個の可能なＴＡＴＡエレメントを含む５’フランキング配列が必要な場合がある。発現効率を増すためにこのような配列を本発明のＯ−ｔＲＮＡ構築物に付加することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡ構築物における別の有用な発現エレメントは３’フランキング配列に正しく配置されたターミネーターエレメントとすることができる。このような配列は例えば内在翻訳系資源生物、又は類似生物により使用される３’フランキング配列から誘導することができる。
【０１３４】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ構築物は一般に例えばセレクターコドンの認識を提供するアンチコドンループに突然変異を含む。本発明の１側面では、アンチコドンは２０種の天然アミノ酸の１種を通常指定する６１種のコドン（好ましくはレアコドン）の１種に相補的であるが、Ｏ−ｔＲＮＡは別の（通常以外、例えば非天然）アミノ酸を負荷される。１好適態様では、Ｏ−ｔＲＮＡのアンチコドンは例えばユニーク３塩基コドン、ナンセンスコドン（例えばアンバーコドン又はオパールコドン、オーカーコドン等の終止コドン）、非天然コドン、非天然塩基をもつコドン、４塩基（以上の）コドン、及び／又は同等物等のセレクターコドンに相補的である。例えば、本発明のＯ−ｔＲＮＡは例えばＵＣＡ、ＵＵＡ、又はＣＵＡ等のアンチコドンをもつサプレッサーとすることができる。１好適態様では、Ｏ−ｔＲＮＡはＵＣＡオパールサプレッサーアンチコドンをもつ。
【０１３５】
本発明のＯ−ｔＲＮＡは例えば本発明の対合相補的Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化することができる。即ち、例えばＯ−ＲＳは内在翻訳系の内在ｔＲＮＡよりもＯ−ｔＲＮＡに優先的に負荷する。Ｏ−ｔＲＮＡはＯ−ＲＳに優先的な基質となるように突然変異させることができる。より一般的には、本発明のＯ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ対は内在翻訳系とは異なる同一又は類似翻訳系から得られる。同一又は同様の（例えば類似）翻訳系に由来するので、対メンバーは相互に特異的に相互作用する傾向がある。場合により、Ｏ−ｔＲＮＡに導入された突然変異に応答してＯ−ｔＲＮＡに対する特異性を維持するように、例えば内在系で発現できるように、又は別のアミノ酸を優先的に負荷できるようにＯ−ＲＳを突然変異させる。別の態様では、例えば該当アミノ酸と組み合わせてＯ−ＲＳの優先的基質を同定するようにＯ−ｔＲＮＡのライブラリーをスクリーニングすることにより、Ｏ−ＲＳによる優先的アミノアシル化を得ることもできる。このようなスクリーニングはＯ−ＲＳスクリーニングについて上述したスクリーニング方法と同様の方法、又は当分野で公知の他のスクリーニング方法により実施することができる。本発明のＯ−ｔＲＮＡは内在ｔＲＮＡ等の他のｔＲＮＡの負荷に対して例えば＞１：１、約２：１、約４：１、約５：１、約２０：１、約１００：１、又はそれ以上の比率でその対合Ｏ−ＲＳにより所望アミノ酸で優先的にアミノアシル化されることが好ましい。
【０１３６】
非天然アミノ酸を負荷された本発明のｔＲＮＡはトリプトファン、トリプトファンから誘導されるアミノ酸、又はトリプトファン類似体を負荷した直交ｔＲＮＡが好ましい。本発明のＯ−ｔＲＮＡは例えばｔＲＮＡＴｒｐ、直交突然変異体ｔＲＮＡＴｒｐ（Ｏ−ｍｕｔＲＮＡＴｒｐ）、又はサプレッサーコドンをもつ直交突然変異体ｔＲＮＡＴｒｐ（例えばｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ）とすることができる。１好適態様では、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）やＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ等のバシラス種に由来する。最も好ましい態様では、構築物はＯ−ｔＲＮＡ配列５’ＡＧＧＧＧＣＧＵＧＧＣＵＵＡＡＣＧＧＵＡＧＡＧＣＡＧＡＧＧＵＣＵＵＣＡＡＡＡＣＣＵＣＣＧＧＵＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＵＵＣＣＵＡＣＣＧＣＣＣＣＵＧ３’（配列番号３）、相補的ポリヌクレオチド配列、又は保存変異体をコードする。場合により、本発明の構築物はセレクターコドンを認識する配列番号３の保存変異体又はポリヌクレオチド配列（配列番号３）の実質的に全長にわたって高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列をコードすることができる。
【０１３７】
本発明のＯ−ｔＲＮＡ構築物は生細胞に導入することにより複製及び／又は発現させることができる。遺伝子構築物を細胞に導入する方法は当分野で周知であり、例えば「Ｏ−ＲＳ構築物の作製」の項で上述した通りである。１好適態様では、細胞はトランスフェクトした真核細胞である。より好ましい態様では、真核細胞はヒト細胞株等の哺乳動物細胞である。
非天然アミノ酸のペプチド組込み
【０１３８】
本発明のＯ−ＲＳはＯ−ｔＲＮＡアンチコドンに相補的なコドンでコードされるペプチドに組込むことができる通常以外の（一般に非天然）アミノ酸を対合Ｏ−ｔＲＮＡに負荷することができる。非天然アミノ酸は得られるアロ蛋白質の特徴を変化させることができる。アロ蛋白質は治療、診断、工業加工、材料科学、ナノテクノロジー、コンピューターサイエンス、エレクトロニクス、及び／又は同等技術として有用なユニークな品質をもつことができる。
【０１３９】
本発明のアロ蛋白質の発現用核酸構築物はＯ−ＲＳ構築物の作製の項に上述したように例えば制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡ合成器、ベクター、宿主細胞を使用して組換え構築することができる。アロ蛋白質構築物は複製開始、選択マーカー、検出マーカー、転写開始等をコードする機能をもつベクターとすることができる。アロ蛋白質をコードする配列は例えば通常以外の（例えば非天然）アミノ酸の組込み位置を指定する１個以上のセレクターコドンを含むことができる。アロ蛋白質構築物は例えば同時トランスフェクション及び発現のために同一ベクターにＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡをコードする配列を組込むことができる。場合により、本発明の直交翻訳成分の配列は別々のベクター構築物に存在していてもよい。
【０１４０】
本発明のアロ蛋白質構築物はｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳のために生細胞に導入することができる。このような場合には、多くの場合に細胞を培養する培地の添加剤として非天然アミノ酸を供給することができる。例えば、非天然アミノ酸を組込んだアロ蛋白質の翻訳に適したコグネイト非天然アミノ酸１ｍＭを添加した最少必須培地で本発明の直交対とアロ蛋白質をコードする配列を含むベクターをトランスフェクトした哺乳動物細胞を増殖させることができる。本発明の非天然アミノ酸は一般に核酸配列からペプチド配列への翻訳中にｔＲＮＡのアミノアシル化とペプチド結合形成における基質として作用することが可能なαアミノ酸である。非天然アミノ酸は例えば化学的プロセスによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成することもできるし、及び／又は細胞内で生物学的に合成することもできる。多くの場合には、上述したように、非天然アミノ酸は天然アミノ酸の誘導体である。例えば、化学基を天然アミノ酸に化学的又は酵素的に付加し、アミノ酸上に（最終的にアロ蛋白質中に）例えば官能基、リンカー、イオン電荷、疎水性基、配位構造、親和性基、検出可能なマーカー、放射性ラベル、及び／又は同等物を提供することができる。本発明の方法の１側面では、非天然アミノ酸は５−ＨＴＰＰ等のトリプトファン誘導体であり、直交対は発現蛋白質構築物中のナンセンス突然変異セレクターコドンにより指定される位置にトリプトファン誘導体を組込むように機能するＯ−ｍｕ  ＴｒｐＲＳとＯ−ｔＲＮＡである。
【０１４１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳は例えば単に非天然アミノ酸をペプチドに組込むために内在翻訳系を含有する溶液に本発明の直交成分を直接添加することにより実施することができる。直交成分はｉｎ  ｖｉｔｒｏ内在翻訳系への添加前に未精製でもよいし、部分的に精製してもよいし、高度に精製してもよい。例えば、（多くの場合にはエッペンドルフチューブ等の容器で）（精製タグを付加した構築物からの）アフィニティー精製Ｏ−ＲＳ、全ｔＲＮＡ調製物からのＯ−ｔＲＮＡ、化学修飾及び結晶化非天然アミノ酸、並びにポリ−Ｔ精製全ｍＲＮＡ調製物を全長アロ蛋白質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産用コムギ胚芽溶解液翻訳系に適量で添加することができる。
【０１４２】
内在翻訳系は例えば２０種の普通天然アミノ酸を含む全長ペプチドにｍＲＮＡ核酸を翻訳するために必要な全成分を含む。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、翻訳系により正しく読み取られない内部コドンをもつ蛋白質の遺伝子、及び／又は非天然アミノ酸等の本発明の直交翻訳成分を内在翻訳系に付加し、内在翻訳系単独からは得られない翻訳産物を得ることができる。例えば、アミノ酸２１のコドンにナンセンス突然変異をもつ４０アミノ酸ペプチドをコードする遺伝子を内在翻訳系で２０アミノ酸ペプチドフラグメントとして発現させる。非天然アミノ酸と本発明の適当な直交対を翻訳系に付加することにより２１位に非天然アミノ酸を組込んだ該当４０アミノ酸全長アロ蛋白質を発現させることができる。
【０１４３】
５−ＨＴＰＰ等の非天然アミノ酸のｉｎ  ｖｉｖｏ組込みは宿主細胞をさほど撹乱せずに実施することができる。例えば、大腸菌等の非真核細胞では、終止セレクターコドン（例えばＵＣＡコドン）の抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡ（例えばオパールサプレッサーｔＲＮＡ）とＵＣＡコドンと結合してリボソームから成長中のペプチドの放出を開始する放出因子（ＲＦ）の競合に依存し得るので、例えばＯ−ｔＲＮＡの発現レベルを増加するか又はＲＦ欠損株を使用することにより抑圧効率を調節することができる。真核細胞では、ＵＣＡコドンの抑圧効率はＯ−ｔＲＮＡと真核放出因子（例えばｅＲＦ）の競合に依存し得るので、例えばＯ−ｔＲＮＡの発現レベルを増加することにより抑圧効率を調節することができる。更に、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の還元剤のように、放出因子作用を調節する付加成分も加えてもよい。
【０１４４】
本発明の１側面では、組成物は少なくとも１個、例えば少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸（例えば標準外にコードされるアミノ酸、トリプトファン類似体、誘導体、及び／又は他の非天然アミノ酸）を組込んだ少なくとも１種の蛋白質を含有する。通常以外のアミノ酸及び／又は非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよく、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０種以上の異なる通常以外のアミノ酸又は非天然アミノ酸を含む１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上の異なる部位が蛋白質に存在することができる。別の側面では、組成物は蛋白質に存在する特定アミノ酸の全部よりは少ないが少なくとも１個がトリプトファン誘導体で置換された蛋白質を含有する。２個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（例えば蛋白質は２個以上の異なる型の非天然アミノ酸を組込んでもよいし、２個の同一非天然アミノ酸を組込んでもよい）。３個以上の非天然アミノ酸を組込んだ所与蛋白質では、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよいし、同一種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の別の非天然アミノ酸の組み合わせでもよい。
【０１４５】
本発明の産物ペプチドをコードする核酸は非天然又は通常以外のアミノ酸を組込んだ産物蛋白質を大量の有用な量で提供するように例えば細胞の翻訳系で発現させることができる。１側面では、組成物は場合により、５−ＨＴＰＰ残基を組込んだ蛋白質を例えば少なくとも１０μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも２００μｇ、少なくとも２５０μｇ、少なくとも５００μｇ、少なくとも１ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ以上、又はｉｎ  ｖｉｖｏ蛋白質生産方法で達成可能な量で含有する（組換え蛋白質生産及び精製に関する詳細は本明細書に記載する）。別の側面では、蛋白質は場合により例えば細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液、又は他の懸濁液中（例えば約１ｎｌ〜約１００Ｌの任意の容量中）に例えば少なくとも１０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも７５μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも２５０μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも５００μｇ蛋白質／ｌ、少なくとも１ｍｇ蛋白質／ｌ、又は少なくとも１０ｍｇ蛋白質／ｌ以上の濃度で組成物中に存在する。少なくとも１種の５−ＨＴＰＰを組込んだ蛋白質を細胞で大量（例えば他の方法、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳で一般に可能な量よりも多量）に生産することも本発明の特徴である。
トリプトファン誘導体を組込んだアロ蛋白質の使用
【０１４６】
本発明の方法による非天然アミノ酸の組込みを含む蛋白質の改変発現は例えば医療、分析、製造及び加工分野で有用な産物を提供することができる。例えば改善されたバイオアベイラビリティ、低毒性、改善された安定性、新規活性、強化活性、結合オプション、改善されたトレーサビリティ、及び／又は同等性質をもつように治療用蛋白質を組換えることができる。例えば新規化学結合の可能性、マーカーとのより特異的な結合、シグナル強化、他の蛋白質からの分解能の改善、及び／又は同等性質を診断用蛋白質にもたせることができる。例えば新規活性、活性強化、安定性強化、触媒表面との結合の改善、基質特異性の改変、及び／又は同等性質をもつように産業用酵素を改善することができる。
【０１４７】
５−ＨＴＰＰのペプチド組込みは複合体又は精製混合物におけるペプチド産物の高感度検出と正確な測定のためのユニークな蛍光シグナルを提供することができる。５−ＨＴＰＰはトリプトファンから有意にシフトした蛍光励起及び発光最大値をもつ。例えば、トリプトファン残基をもつペプチドは３６７ｎｍに蛍光発光最大値λｍａｘをもつが、トリプトファンを５−ＨＴＰＰに置換すると、発光は例えば３３４ｎｍで得られる。天然ペプチドと５−ＨＴＰＰ修飾ペプチドの間には１０倍を上回る発光の差を観察することができる。励起波長の慎重な調節を使用して発光の差を更に大きくすることができる。本発明の上記及び他の技術を使用すると、他の蛋白質又は修飾ペプチド自体におけるトリプトファンからトリプトファン蛍光バックグラウンドに対して５−ＨＴＰＰを組込んだ蛋白質を観察することができる。
【０１４８】
別の側面では、５−ＨＴＰＰを組込んだペプチドをプローブとして使用して所定の相互作用を検出することができる。例えば、ペプチド鎖の該当領域に５−ＨＴＰＰを組込むようにペプチドを修飾することができる。この領域と例えば他の蛋白質又は細胞膜との相互作用は５−ＨＴＰＰ蛍光のシフト又はクエンチにより検出することができる。
【０１４９】
５−ＨＴＰＰのペプチド組込みはユニークなリンカー化学反応の可能性を提供することができる。組込まれた５−ＨＴＰＰは溶液中で電位の存在下にレドックス化学反応し、反応性トリプトファン−４，５−ジオンを生じることがでこきる。反応性基は例えばリンカー基又は検出可能なマーカーをペプチドに結合するために他の反応性分子と共有結合を形成することができる。場合により、５−ＨＴＰＰ修飾ペプチドを適切な電位の作用下で架橋させることができる。１好適態様では、リンカー反応のタイミングは修飾ペプチドを含有する溶液に適切なｐＨを提供すると共に例えば４００ｍＶ〜約１０００ｍＶの適当な電位を印加することにより調節することができる。
【実施例】
【０１５０】
以下、実施例により本発明を例証するが、これらの実施例により本発明を限定するものではない。当然のことながら、本明細書に記載する実施例及び態様は例証の目的に過ぎず、これらの記載に鑑みて種々の変形又は変更が当業者に想到され、このような変形又は変更も本願の精神及び範囲と特許請求の範囲に含むものとする。
実施例−ペプチドへの５−ＨＴＰＰの直交組込み
【０１５１】
哺乳動物細胞用として直交トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＴｒｐＲＳ）−オパールサプレッサー（ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ）対を作製した。枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐのアンチコドンループをＵＣＡに突然変異させ、Ｄアームの３個の位置を突然変異させて内部プロモーター配列を作製し、哺乳動物細胞におけるその発現を強化するようにアラビドプシスに由来するｔＲＮＡＴｒｐ１遺伝子の５’及び３’フランキング配列間にｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ遺伝子を挿入した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイとｉｎ  ｖｉｖｏオパール抑圧アッセイの結果、枯草菌ＴｒｐＲＳ（ＢｓＴｒｐＲＳ）はコグネイトｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡに負荷し、内在哺乳動物翻訳系の内在ｔＲＮＡには負荷しないことが判明した。同様に、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡは哺乳動物細胞において枯草菌ＴｒｐＲＳにより特異的に負荷され、内在シンテターゼにより負荷されなかった。次に部位特異的直交突然変異誘発を使用し、５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＴＰ）のみに負荷するようにＢｓＴｒｐＲＳの特異性を改変した。得られた突然変異体ＢｓＴｒｐＲＳ−ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ直交対はコドンＴＧＡに応答して哺乳動物蛋白質に５−ＨＴＰＰを効率的で選択的に組込むことができた。このアミノ酸はユニーク蛍光プローブペプチドに組込むか、及び／又はｉｎ  ｓｉｔｕ蛋白質架橋剤として作用するためのペプチドに組込むことができる。
材料と方法
【０１５２】
概説。哺乳動物細胞にＦｕｇｅｎｅ  ６試薬（Ｒｏｃｈｅ）をトランスフェクトした。放射性標識アミノ酸はＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手し、オリゴヌクレオチドはＰｒｏｌｉｇｏ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から入手した。ゲノムＤＮＡはＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。抗体、抗生物質及びＴＲＩＺＯＬ溶液はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。Ｖ５−抗体固相化アガロースはＢｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）から購入した。５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、それ以上精製せずに使用した。ＮｕｃｌｅｏｂｏｎｄカラムはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。
【０１５３】
細胞株。プラスミド増殖及び単離には大腸菌株ＤＨ１０Ｂ及びＴＯＰ１０を使用した。非天然アミノ酸の蛋白質組込みにはヒト腎２９３Ｔ細胞を使用した。
【０１５４】
プラスミド。枯草菌ＴｒｐＲＳ（ＢｓＴｒｐＲＳ）をコードするＤＮＡフラグメントをゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ）により増幅し、ｐＭＨ４ベクター（ＧＮＦ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＸｈｏＩ−ＰａｃＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドｐＭＨＴｒｐＲＳを使用してＮ末端にＨｉｓ６精製タグを付加したＢｓＴｒｐＲＳを大腸菌で発現させた。ＢｓＴｒｐＲＳを哺乳動物細胞で発現させるために、シンテターゼをコードするＰＣＲフラグメントをｐＥＦ６−Ｖ５−Ｈｉｓ６−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にライゲーションした。得られたプラスミドｐＥＦ６−ＴｒｐＲＳはＣ末端Ｖ５及びＨｉｓ６エピトープタグを付加した野生型枯草菌ＴｒｐＲＳをコードする。ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＸＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）と突然変異誘発プライマーを使用して部位特異的突然変異誘発により一連の突然変異体シンテターゼをこのベクターで作製した。
【０１５５】
サプレッサーｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ遺伝子は２個のオリゴデオキシヌクレオチドをアニールすることにより構築した。第１のオリゴヌクレオチドはｔＲＮＡＴｒｐ１遺伝子の５’フランキング配列（ＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＣＧＴＴＴＡＧＡＡＡＴＡＴＡＴＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＴＡＧＴＡＣＡＡ，配列番号５）に融合した対応するｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ配列をコードする。第２のオリゴヌクレオチドは３’フランキング配列ＧＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＧ（配列番号６）に融合した対応するｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡから構成される。Ｋｌｅｎｏｗフラグメントを使用してデュプレクスＤＮＡを作製し、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入した。得られたプラスミドｐＴｒｐｔＲＮＡを使用してｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡを哺乳動物細胞に転写した。
【０１５６】
ＰＣＲ増幅遺伝子フラグメントをｐＣＤＡ３．１−Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入することにより、２９３Ｔ細胞でバクテリオファージＴ４フィブリチンフォールドンドメインを発現することが従来から分かっているプラスミドｐＦｏｌｄｏｎを構築した。ＱｕｉｋｃｈａｎｇｅＸＬ法と対応するＨＰＬＣ精製プライマーを使用してｐＦｏｌｄｏｎの部位特異的突然変異誘発によりＴｒｐ６８ＴＧＡフォールドン突然変異体をコードするｐＦｏｌｄｏｎＴＧＡを構築した。
【０１５７】
哺乳動物細胞におけるｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの発現と検出
哺乳動物２９３Ｔ細胞にプラスミドｐＴｒｐｔＲＮＡをトランスフェクトし、３７℃で５％ＣＯ２下に６０時間インキュベートした。細胞ＲＮＡを製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示に従ってＴＲＩＺＯＬ溶液で抽出した後、製造業者のプロトコール（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に従ってＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄカラムを使用して全ｔＲＮＡを単離した。３％アガロースゲルを使用して精製ｔＲＮＡの収率と純度を分析した。ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡを検出するために、まず精製ｔＲＮＡをブロットした後、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ  ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して１分間ＵＶ照射によりナイロントランスファーメンブレン（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）に架橋した。照射後、メンブレンをハイブリダイゼーション緩衝液（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍクエン酸ナトリウム，ｐＨ７．０，１％ＳＤＳ，５Ｘデンハルト試薬＋２５μｇ／ｍｌクジラ精子ＤＮＡ）１００ｍｌ中でインキュベートし、６８℃で１時間静かに振盪した。サプレッサーｔＲＮＡのヌクレオチド２７−４４に相補的なオリゴヌクレオチドＣＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＣＴ（配列番号７）を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで５’標識し、５０℃で６時間メンブレンをプローブするために使用した。次にメンブレンを洗浄用緩衝液（１５ｍＭ  ＮａＣｌ，１．５ｍＭナトリウム，ｐＨ７．０，０．１％ＳＤＳ）で３回洗浄した。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して各ドットの強度を定量した。
【０１５８】
哺乳動物２９３Ｔ細胞における枯草菌ＴｒｐＲＳの発現。細胞にプラスミドｐＥＦ６−ＴｒｐＲＳをトランスフェクトし、３７℃で５％ＣＯ２下に６０時間インキュベートした。細胞を回収し、１Ｘ受動的溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で溶解し、細胞溶解液を２０，０００×ｇで遠心した。蛋白質を変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した後、ウェスタンブロット分析のためにニトロセルロースメンブレンに転写した。蛋白質を一次抗Ｈｉｓ６抗体でプローブした後、二次西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧでプローブした。基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ，Ｐｉｅｒｃｅ）を添加してシグナルを可視化した。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイ。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １１３，ｐｐ．５５−５９，Ｈｏｂｅｎ，Ｐ．＆  Ｓｏｌｌ，Ｄ．，（１９８５）の記載にほぼ従ってアミノアシル化アッセイを実施し、本発明のＲＳとｔＲＮＡを評価した。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，３０ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３ｍＭグルタチオン，０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ，１０ｍＭ  ＡＴＰ，１μＭ（３３Ｃｉ／ｍＭ）Ｌ−［５−３Ｈ］−トリプトファン，７５０ｎＭシンテターゼ、及び２０μＭ精製全ｔＲＮＡを含有する反応溶液２０μＬを調製した。変換率１０％までアッセイを実施した。
【０１６０】
哺乳動物細胞におけるオパール抑圧。９．５ｃｍ２プレート１枚当たりＤＮＡ合計２μｇを使用して製造業者のプロトコール（Ｒｏｃｈｅ）に従ってＦｕｇｅｎｅ  ６のトランスフェクションを実施した。最少必須α培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を増殖培地として使用した。トランスフェクションから４８時間後に細胞抽出物を調製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ免疫検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してウェスタンブロット分析を実施した。メンブレンをＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に露光することによりシグナルを検出した。
【０１６１】
哺乳動物細胞への非天然アミノ酸組込み。哺乳動物２９３Ｔ細胞に各プラスミドｐＴｒｐｔＲＮＡ、ｐＦｏｌｄｏｎＴＧＡ及び突然変異体ｐＥＦ６−ＴｒｐＲＳ（即ちｐＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ）を従来記載されているようにコトランスフェクトした。２４時間後に１ｍＭ  ５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンと適当な抗生物質を含有する最少必須α培地に培地を交換した。３７℃で５％ＣＯ２下に更に４８時間後に細胞を回収し、１Ｘ受動的溶解用緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で溶解し、細胞溶解液を２０，０００×ｇで遠心により集めた。５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンを含有するフォールドン蛋白質を細胞溶解液（５０ｍｌ培養プレート２０枚）から製造業者のプロトコール（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）に従ってＮｉ−ＮＴＡビーズと抗Ｖ５固相化アガロースビーズで順次精製した。精製蛋白質のアリコートで高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析を実施した。
【０１６２】
蛍光スペクトロスコピー。蛋白質を１０ｍＭ  Ｋ２ＰＯ４，１００ｍＭ  ＫＣｌ緩衝液，ｐＨ７．５で終濃度５０ｎＭまで希釈した。Ｆｌｕｒｏｍａｘ−２分光蛍光計で蛍光スペクトルを測定し、補正した。励起帯域４ｎｍ及び発光帯域８ｎｍで励起スペクトルを記録し、発光帯域４ｎｍで発光スペクトルを記録した。
【０１６３】
５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンを含有する蛋白質の電気化学的特性決定。金電極、ガラスフリットにより分離したガラス状カーボン補助電極、及びＬｕｇｇｉｎキャピラリーにより作用容積に接続した飽和カロメル電極（ＳＣＥ）から構成される従来の３電極セルを電気化学的測定に使用した。セルを接地ファラデーケージに入れた。ネットワーク操作ソフトウェアＥＣ−Ｌａｂ  ｖ６．６１に接続したポテンシオスタット（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，モデルＶＭＰ２，Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＴＮ）を使用してサイクリックボルタメトリー測定を実施した。全電気化学的測定はアルゴン雰囲気下に０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．４中で実施した。基質５−ＨＴＰＰを終濃度１０μｇ／ｍＬまで１００ｍＭリン酸緩衝液に溶かした。スキャン速度１Ｖ・ｓｅｃ−１で０−８００ｍＶの電位を測定した。架橋実験では、アルゴン雰囲気下で１０μｇ／ｍＬ野生型フォールドン又は５−ＨＴＰＰ−フォールドン蛋白質、０．１Ｍリン酸緩衝液，ｐＨ７．４の存在下に電極電位を８００ｍＶに３０分間設定した。その後、溶液を集め、蛋白質を透析により脱塩し、濃縮し、更に分析するためにゲルにロードした。
結果と考察
【０１６４】
哺乳動物細胞用直交オパールサプレッサーｔＲＮＡ。哺乳動物細胞で非天然アミノ酸を遺伝的にコードするために、哺乳動物内在翻訳系でアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼにより認識されないが、ユニークコドン（この場合にはオパールナンセンスコドンＴＧＡ）に応答してそのコグネイトアミノ酸を効率的に組込む直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を作製した。Ｏ−ｔＲＮＡのみを認識し、これに非天然アミノ酸を選択的に（優先的に）負荷するが、内在アミノ酸は負荷しない対応する（対合相補的）直交アミノミアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を準備した。Ｏ−ＲＳ／Ｏ−ｔＲＮＡ直交対の作製はｔＲＮＡ認識エレメントの種間差を利用した。例えば、枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐは一般に酵母及び哺乳動物細胞に由来するトリプトファン−ｔＲＮＡシンテターゼの基質ではないことが判明した。更に、本発明者ら以外の動態試験により、このｔＲＮＡのアンチコドンループの突然変異はコグネイト枯草菌ＴｒｐＲＳによるアミノアシル化に僅かな効果（＜５％）しかないことが立証されている。従って、枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐは哺乳動物細胞における直交サプレッサーｔＲＮＡ開発の良好な候補であった。
【０１６５】
しかし、驚くべきことに、この配列をトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から単離した全ｔＲＮＡをノーザンブロット分析した処、枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐは検出されなかった。従って、枯草菌サプレッサーｔＲＮＡＴｒｐ配列に一連の修飾を実施した（図１参照）。真核生物におけるｔＲＮＡは２種の保存遺伝子内転写制御エレメントＡボックス及びＢボックスを認識するＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写される。枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐ配列はＢボックスしか含まないので、疑似Ａボックスを作製するためにヌクレオチドＡ７、Ａ９、Ｕ１１を夫々Ｇ７、Ｇ９及びＣ１１に置換した。正しいアーム構造を維持するために、得られたミスマッチ塩基対Ｇ７−Ｕ６４及びＣ１１−Ａ２３を夫々Ｇ７−Ｃ６４及びＣ１１−Ｇ２３で置換した。真核生物におけるｔＲＮＡＴｒｐ遺伝子の発現は明白にＡＴリッチであり且つ数個の可能なＴＡＴＡエレメントを含む５’フランキング配列に依存することが分かっている。従って、ヒト２９３Ｔ細胞で植物ｔＲＮＡＴｒｐ遺伝子の転写を強化することが従来から分かっているアラビドプシス（Ｔｒｐ１）に由来するｔＲＮＡＴｒｐ１遺伝子からの５’フランキング配列を付加した。植物ｔＲＮＡＴｒｐ遺伝子の効率的な発現に必要な唯一の３’フランキング配列は正しく配置されたターミネーターエレメントであるので、同一ｔＲＮＡＴｒｐ１遺伝子の天然３’フランキング配列を使用した。最後に、トリヌクレオチドアンチコドン配列ＣＣＡをオパールサプレッサーＵＣＡに置換した（Ｃ３３Ｕ）。
【０１６６】
ノーザンブロットアッセイを使用して修飾オパールサプレッサーｔＲＮＡＴｒｐ（ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ）の発現を確認した。突然変異体ｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ遺伝子をその５’及び３’フランキング配列と共に哺乳動物ベクターｐＺｅｏＳＶ２（＋）にクローニングし、Ｆｕｇｅｎｅ  ６を使用して得られたプラスミドをヒト２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次に全ｔＲＮＡを単離し、メンブレンにブロットした。対照としてヒト２９３Ｔ細胞、ウシ肝細胞、及び大腸菌に由来する同一量のｔＲＮＡも同一メンブレンに転写した（図２Ａ）。ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡのヌクレオチド２７−４４に相補的であり、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで標識した合成オリゴヌクレオチドをｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡのプローブとして使用した。放射性オリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベートすると、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から単離した全ｔＲＮＡのみがシグナルを発生し（図２Ｂ，レーン４）、対照ｔＲＮＡはシグナルを発生しなかった（図２Ｂ，レーン１−３）。これらの結果から、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡは哺乳動物細胞で発現されることが立証された。
【０１６７】
ＢｓＴｒｐＲＳは哺乳動物細胞における直交シンテターゼである。直交哺乳動物サプレッサーｔＲＮＡを入手できたので、次に対応するＢｓＴｒｐＲＳがｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡを効率的にアミノアシル化することができ、内在哺乳動物ｔＲＮＡをアミノアシル化しないかどうかについて試験した。ＢｓＴｒｐＲＳによるｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡのアミノアシル化効率を測定するために、大腸菌から精製したＢｓＴｒｐＲＳでｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイを実施した。プラスミドｐＭＨＴｒｐＲＳを使用してＮ末端Ｈｉｓ６精製タグを付加したＢｓＴｒｐＲＳをＬ−アラビノースプロモーターの制御下に発現させた。ＢｓＴｒｐＲＳをＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、収量５ｍｇ／Ｌを得た。次に３Ｈ標識トリプトファンと各種全ｔＲＮＡを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイを実施した。ＢｓＴｒｐＲＳはコグネイト枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐを含む枯草菌細胞から単離した全ｔＲＮＡに効率的に負荷することが判明した。公開データに一致し、ＢｓＴｒｐＲＳは２９３Ｔ細胞から単離した哺乳動物全ｔＲＮＡを検出可能なレベルでアミノアシル化しなかった。他方、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡを発現するトランスフェクト２９３Ｔ細胞から単離した全ｔＲＮＡはＢｓＴｒｐＲＳにより３Ｈ−トリプトファンを効率的に負荷されなかった。哺乳動物全ｔＲＮＡにおけるｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡに対するＢｓＴｒｐＲＳの総アミノアシル化活性は細菌全ｔＲＮＡにおける枯草菌ｔＲＮＡＴｒｐに対する活性の約４０％であったが、これは哺乳動物細胞におけるｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの発現レベルのほうが低いためであると思われる。いずれにせよ、この実験の結果、ＢｓＴｒｐＲＳはｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡに効率的に負荷できるが、重要な点として内在哺乳動物ｔＲＮＡを明白な程度までアミノアシル化しないことが判明した。
【０１６８】
Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを付加したＢｓＴｒｐＲＳ遺伝子をもつプラスミドｐＥＦ６−ＴｒｐＲＳを使用してヒトプロモーターＥＦ−１αの制御下にＢｓＴｒｐＲＳを哺乳動物細胞で発現させた。Ｆｕｇｅｎｅ  ６を使用して哺乳動物２９３Ｔ細胞にプラスミドｐＥＦ６−ＴｒｐＲＳを一過的にトランスフェクトした。細胞溶解液からの蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、抗Ｃ末端Ｖ５抗体プローブを使用してウェスタンブロット分析した。全長原核ＢｓＴｒｐＲＳ蛋白質（〜３６ｋＤａ）に対応するバンドが観察され、シンテターゼを哺乳動物細胞で有用なレベルで発現させることができることが判明した（図４，レーン１）。外来枯草菌ＴｒｐＲＳを発現させた場合には、増殖率に有意効果は認められなかった。
【０１６９】
２９３Ｔ細胞におけるオパール抑圧はＢｓＴｒｐＲＳ−ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ直交対の発現に依存する。ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ−ＢｓＴｒｐＲＳ直交対が哺乳動物細胞においてオパール突然変異を効率的に抑圧する能力を調べた。バクテリオファージＴ４フィブリチンフォールドンの構築物のＴｒｐ６８のコドンをオパールコドン（ＴＧＡ）に突然変異させ、サプレッサー試験基質を準備した。従来のデータによると、フォールドン蛋白質の内側に配置されたＴｒｐ６８をトリプトファン類似体に突然変異させてもこの蛋白質の構造は壊れないと思われた。全長フォールドン蛋白質の発現を検出するために、検出可能なマーカーであるＶ５エピトープタグとＨｉｓ６精製タグを組換えＤＮＡ技術により野生型（ｐＦｏｌｄｏｎＷＴ）及び突然変異体フォールドン蛋白質（ｐＦｏｌｄｏｎＴＧＡ）のＣ末端に融合した。これらのフォールドン発現構築物をＢｓＴｒｐＲＳ及びｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ構築物の一方又は両方と共にヒト２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。発現された全長蛋白質を細胞抽出物の抗Ｖ５抗体ウェスタンブロット分析により検出した。
【０１７０】
２９３Ｔ細胞に突然変異体フォールドン構築物（ｐＦｏｌｄｏｎＴＧＡ）（図３，レーン１）単独又は突然変異体フォールドン構築物と野生型ＢｓＴｒｐＲＳ（図３，レーン２）をトランスフェクトした場合には全長蛋白質は発現されなかった。これらの結果から、ヒト２９３Ｔ細胞はＴＧＡ６８突然変異の内在オパールサプレッサーｔＲＮＡを含まないことが判明した。更に、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの存在下で野生型ＢｓＴｒｐＲＳの不在下ではオパール突然変異の抑圧は観察されず（図３，レーン３）、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡはヒト２９３Ｔ細胞で内在シンテターゼにより負荷されないことが確認された。他方、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ、野生型ＢｓＴｒｐＲＳ、及びＴＧＡ６８突然変異体フォールドン遺伝子の存在下では、全長蛋白質の発現が検出された（図３，レーン４）。比較のために、レーン５は２９３Ｔ細胞における野生型（ｗｔ）フォールドン蛋白質の発現を示す。レーン４及び５のウェスタンブロットシグナルの積分によると、抑圧効率は約３８％である。これらの実験と上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏアミノアシル化アッセイを総合すると、ＢｓＴｒｐＲＳはｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡのみをアミノアシル化し、他の内在哺乳動物ｔＲＮＡはアミノアシル化せず、発現されたｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡはそのコグネイトＢｓＴｒｐＲＳのみにより負荷され、他の内在哺乳動物シンテターゼにより負荷されないことが判明した。従って、枯草菌ＴｒｐＲＳ−ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡは哺乳動物細胞及び翻訳系で機能する直交対である。
【０１７１】
ｔＲＮＡＴｒｐ−ＴｒｐＲＳ（いずれも枯草菌に由来）のこのホモ対の抑圧効率は哺乳動物細胞で報告されているＢ．ｓｔｅａｒ．ｔＲＮＡＴｙｒ−Ｅ．ｃ．ＴｙｒＲＳのヘテロ対（Ｋ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，ら，Ｎ．Ａ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．２１４６９２−４６９９，（２００２））よりも有意に高く、ヒトサプレッサーｔＲＮＡＴｙｒ及び哺乳動物細胞で機能する他のサプレッサーｔＲＮＡについて報告されている効率（２０−４０％）と同等である。Ｓａｋａｍｏｔｏらは９個のサプレッサーｔＲＮＡコピーの遺伝子クラスターを含む構築物が哺乳動物細胞における抑圧効率を有意に増加できることを示した。しかし、ウェスタンブロット分析により検出可能なレベル（≧１０ｐｇ／細胞）で全長蛋白質を生産するためにＴＧＡ６８コドンを抑圧するにはｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ遺伝子１コピーで十分であったので、本実施例ではこの方法を利用しなかった。更に、トランスフェクションレベルを上げる（細胞１０６個当たりプラスミドｐＴｒｐｔＲＮＡ２μｇに対して４μｇ）と毒性が観察されたことから、２９３Ｔ細胞におけるこれらのｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ構築物の場合にはマルチコピー抑圧は望ましくないと思われた。
【０１７２】
哺乳動物細胞への５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）の部位特異的組込み。次にオパールナンセンスコドンに応答して５−ヒドロキシ−トリプトファン（５−ＨＴＰＰ）を哺乳動物細胞の蛋白質に選択的に組込むためにｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ−ＢｓＴｒｐＲＳ対を使用できるか否かを調べた。このアミノ酸は例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両者で蛋白質構造及び機能の有用なプローブとして利用できるユニークな分光学的及びレドックス性質をもつ。野生型枯草菌ＴｒｐＲＳは５−ＨＴＴＰを基質として利用しないことが知られている。従って、ＢｓＴｒｐＲＳを使用して５−ＨＴＰＰを蛋白質に選択的に組込むために、トリプトファンではなく５−ＨＴＰＰに負荷するようにシンテターゼの活性部位を突然変異させた。この場合にはＢｓＴｒｐＲＳの構造は蛋白質組換えに利用できないが、類縁Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ翻訳系に由来する高度に相同のトリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼの構造は１．９Å分解能まで分解されている。この酵素の活性部位は８の字状であり、２個の隣接する結合ポケットは残基Ａｓｐ１４０、Ｉｌｅ１４１、Ｖａｌ１４２、Ｐｒｏ１４３、Ｖａｌ１４４、及びＧｌｙｌ４５から構成されるαヘリックスペプチドにより分離されている。Ｖａｌ１４４はトリプトファンのＣ５の真向かいにあり、５位に付加化学置換基をもつトリプトファン類似体と望ましくない立体相互作用を生じると思われる。５置換トリプトファン類似体のスペースを提供するための１つのアプローチとしてＶａｌ１４４をより小さいアミノ酸に突然変異させることが論理的に想定された。
【０１７３】
この見解を確かめるために、野生型ＢｓＴｒｐＲＳのＶａｌ１４４を部位特異的突然変異誘発により他の１９種のアミノ酸の各々に突然変異させ、突然変異体フォールドン構築物におけるＴＧＡ６８の抑圧のためにｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡを５−ＨＴＰＰでアミノアシル化できるかどうかについて突然変異体をスクリーニングした。次に、トランスフェクトした細胞を１ｍＭ  ５−ＨＴＰＰの存在下又は不在下で増殖させ、抗Ｖ５抗体による細胞溶解液のウェスタンブロットにより全長蛋白質を検出した（図４）。理論的には、５−ＨＴＰＰの存在下で全長フォールドン蛋白質が発現されるならば、５−ＨＴＰＰ又は天然アミノ酸（恐らくトリプトファン）がフォールドン蛋白質の６８位に組込まれていると考えられる。他の条件は同一で５−ＨＴＰＰの不在下に全長蛋白質が発現されないことを示すことにより天然アミノ酸組込みの場合を排除することができる。本実施例では、１９種のＴｒｐＲＳ突然変異体のうち、Ｖａｌ１４４Ｇｌｙ突然変異体が１ｍＭ  ５−ＨＴＰＰとｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの存在下でＴＧＡ６８コドンを抑圧することができた。他方、５−ＨＴＰＰの不在下では、突然変異体ＢｓＴｒｐＲＳ及びｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡはオパール突然変異を抑圧することができ、Ｖａｌ１４４ＧｌｙＢｓＴｒｐＲＳ突然変異体も天然アミノ酸に負荷することが分かった。それ以外に１ｍＭ  ５−ＨＴＰＰとｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの存在下でＴＧＡ６８突然変異を抑圧することができたＴｒｐＲＳ突然変異体はＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳのみであった（図４，レーン５）。更に、Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢＳＴｒｐＲＳとＴＧＡ６８フォールドン遺伝子を含むヒト２９３Ｔ細胞は５−ＨＴＰＰ又はｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの不在下で全長蛋白質を生産することができなかった（図４，レーン２−４）。これらの結果から、Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ突然変異体はｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡを５−ＨＴＰＰで選択的にアミノアシル化し、内在天然アミノ酸ではアミノアシル化しないことが判明した。ＨＴＰＰ６８突然変異体蛋白質の収量は培養液１リットル当たり約１００μｇであるが、これに対してｗｔ蛋白質の収量は約１ｍｇ／リットルであり、１ｍＭ  ５−ＨＴＰＰを含有する培地における天然活性は約１０％であった。
【０１７４】
発現された突然変異体蛋白質が５−ＨＴＰＰを含有することを確認するために、蛋白質をまずＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィー、次いで抗Ｖ５固相化アガロースビーズを使用する免疫沈降により精製した。精製蛋白質のアリコートを高分解能エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量分析にかけた。ＨＴＰＰ６８突然変異体蛋白質の分子量計算値は１４３２３．６Ｄａであり、分子量実測値は１４３２３．６９Ｄａであった。野生型フォールドン蛋白質に対応するピークは観察されなかった。この結果、５−ＨＴＰＰは高い忠実度（＞９７％）でオパールコドンに応答して哺乳動物細胞の蛋白質に組込まれていることが判明した。
【０１７５】
直交アミノアシル化活性の特性決定。Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ突然変異体は多数の内在ＲＳ／ｔＲＮＡ対と同等の活性でｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡを５−ＨＴＰＰで選択的にアミノアシル化することが判明した。例えば、直交対は天然トリプトファン基質に対する活性が検出されず、５−ヒドロキシトリプトファン基質のミカエリス定数（Ｋｍ）と５−ＨＴＰＰの触媒速度定数（ｋｃａｔ）が内在成分に非典型的な範囲内にあるという点で選択的であった。これらのＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ−ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ対は５−ＨＴＰＰに対する直交対の選択性が翻訳系における天然トリプトファンに比較して少なくとも３３倍であった。このような触媒活性はその天然アミノ酸基質に対する多数の内在ＲＳ／ｔＲＮＡ対の活性と同等である。
【０１７６】
多少驚くべきことに、ＢｓＴｒｐＲＳの活性部位の単独突然変異はその特異性をＬ−トリプトファンから５−ＨＴＰＰに完全に変化させた。この特異性をコンピューター支援モデリング（Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．１，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．）により調査した処、Ｖａｌ１４４Ｐｒｏ突然変異はインドール環が回転するスペースを作り、インドールＮＨ−Ａｓｐ水素結合を消失させていることが示唆された。このため、Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳがＬ−トリプトファンに負荷しないと考えられる。他方、５−ＨＴＰＰの場合には新しい水素結合が形成され、５−ＯＨ基がＨｉｓ４４のイミダゾール側鎖及びＡｓｐ１３３のカルボン酸基と水素結合し、インドールＮＨがＳｅｒ７のヒドロキシル基と水素結合する（図５参照）。コンピューターモデルを使用して数個の他のランダムに突然変異させた部位をもつＢｓＴｒｐＲＳ（及び他のＲＳ）変異体のライブラリーを同様に調査及び／又は実験室でスクリーニングし、付加側鎖構造を選択的に認識する突然変異体を同定することができる。
【０１７７】
蛋白質構造及び機能のプローブとしての５−ＨＴＰＰ。ｐＨ７．５で３１０ｎｍにおけるトリプトファンの吸光度（ε＝６２Ｍ−１ｃｍ−１）に比較して５−ヒドロキシ−Ｌ−トリプトファンは有意な３１０ｎｍ吸光度（ε＝２４５０Ｍ−１ｃｍ−１）をもち、５−ＨＴＰＰが蛋白質における有用な分光光学的プローブとなり得ることを示唆している。野生型フォールドン蛋白質はトリプトファン残基が１個だけであり、突然変異体フォールドン蛋白質では５−ＨＴＰＰに置換される。これらの２種の蛋白質の蛍光特性を比較するために、これらの蛋白質を精製した後、その発光スペクトルを記録するためにｐＨ７．４で３１０ｎｍにて励起した（図６参照）。ＨＴＰＰ６８フォールドン蛋白質は３３４ｎｍ（破線）に発光最大値λｍａｘをもつが、野生型フォールドン蛋白質は３６７ｎｍ（実線）に蛍光λｍａｘをもつ。両者蛋白質を３１０ｎｍで励起した場合、ＨＴＰＰ６８フォールドン蛋白質からの３３４ｎｍの蛍光発光強度は野生型フォールドン蛋白質の１１倍であった。このようなスペクトルシフトにより５−ＨＴＰＰは所定用途に有用な光学プローブとなり得る。
【０１７８】
５−ＨＴＰＰをレドックス化学反応させ、トリプトファン−４，５−ジオンを得ることもできる。サイクリックボルタメトリーを使用してＨＴＰＰ６８フォールドン突然変異体で５−ＨＴＰＰのレドックス波を観察できるか否かを調べた。ＨＴＰＰ、ｗｔフォールドン、又はフォールドン突然変異体１０μＭを含有する溶液のボルタメトリー応答を測定した。突然変異体フォールドンの存在下又は遊離５−ＨＴＰＰの溶液中のみで夫々Ｅ＝４００ｍＶ及びＥ＝４５０ｍＶでＨＴＰＰ酸化に起因する陽極電流が出現し、突然変異体フォールドンには５−ＨＴＰＰが存在していることが判明した。突然変異体蛋白質の酸化電位が僅かに低下したのは、疎水性蛋白質コアに対する水溶液中の５−ＨＴＰＰの酸化及び還元形態の安定化の差に起因すると考えられる。野生型フォールドンを酸化しようと試みた場合には電流は観察されなかった。
【０１７９】
７．４リン酸緩衝液中電位８００ｍＶで５−ＨＴＰＰを電気化学的に酸化すると、二量体（図７Ａ，１）が形成された。同様に、５−ＨＴＰＰはそのシステイン残基を介してグルタチオンに酸化的に架橋することができた（図７Ａ，２）。従って、蛋白質に選択的に組込まれた５−ＨＴＰＰ残基はレドックス架橋剤として有用であると思われる。この見解を確かめるために、リン酸緩衝液中、ＨＴＰＰ６８フォールドン蛋白質又は野生型フォールドンを含有する溶液中で作用電極に８００ｍＶの正電位を３０分間印加することによりＨＴＰＰ６８フォールドン突然変異体を電気化学的に架橋しようと試みた。得られた蛋白質を脱塩し、濃縮し、変性させ、４−２０％グラジエント変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して分離した。得られたゲルをクーマシー染色した（図７Ｂ）。レーン１は分子量１４．５ｋＤａの全長ＨＴＰＰ６８フォールドン突然変異体である。レーン３は同一の見掛けの分子量をもつ野生型フォールドン蛋白質である。レーン２はＨＴＰＰ６８フォールドン蛋白質の電気化学的酸化生成物であり、分子量約２９ｋＤａであり、二量体突然変異体フォールドン蛋白質に対応する。バンド強度から収率は８０％であると推定された。他方、同一条件下で野生型フォールドン蛋白質を含むレーン４には架橋生成物が存在しない。この結果、ＨＴＰＰ６８フォールドンアロ蛋白質は組込まれた５−ＨＴＰＰを介して架橋することが判明した。
【０１８０】
以上、明確に理解できるように本発明を多少詳細に記載したが、本発明の真の範囲を逸脱することなく形態や細部に種々の変更が可能であることは以上の開示から当業者に自明である。例えば、上記技術及び構築物の多くは種々に組合せて使用することができ、あるいは代替突然変異体又は基質と併用することもできる。
【０１８１】
本明細書に引用した全刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献はその開示内容全体を全目的で参考資料として組込み、各刊行物、特許、特許出願、及び／又は他の文献を全目的で参考資料として組込むと個々に記載しているものとして扱う。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】枯草菌トリプトファンオパールサプレッサーｔＲＮＡ（配列番号４）のクローバーリーフ構造を示す模式図である。矢印は配列に組込んだ突然変異を示す。上部の四角で囲んだ部分は本発明のｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ（配列番号３）でアクセプターアームから欠失させたＣＣＡ配列を示す。
【図２】ｐＴｒｐｔＲＮＡをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から得られたｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの発現とノーザンブロット分析を示す。図２Ａは大腸菌（レーン１）、ウシ肝細胞（レーン２）、２９３Ｔ細胞（レーン３）、及びｐＴｒｐｔＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（レーン４）から単離した精製全ｔＲＮＡの３％アガロースゲル電気泳動を示す。図２Ｂは大腸菌（レーン１）、ウシ肝細胞（レーン２）、２９３Ｔ細胞（レーン３）、及びｐＴｒｐｔＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（レーン４）からの精製全ｔＲＮＡを別々にメンブレンにブロットし、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡのヌクレオチド２７−４４に相補的な５’−３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドでプローブしたドットブロットを示す。
【図３】２９３Ｔ細胞におけるオパール抑圧の検出のためのウェスタンブロット分析を示す。ＴＧＡ６８フォールドン構築物トランスフェクションからの溶解液をブロットのレーン１に示す。野生型フォールドン構築物トランスフェクションからの溶解液を陽性対照としてレーン５に示す。オパールサプレッサーｔＲＮＡＴｒｐ（レーン２）又はＢｓＴｒｐＲＳ（レーン３）の不在下では、抗Ｖ５抗体によるウェスタンブロットにより検出した場合に全長蛋白質は発現されなかった。オパールサプレッサーｔＲＮＡＴｒｐとＢｓＴｒｐＲＳの両者の存在下では、ＴＧＡ６８フォールドン構築物中のオパールコドンは抑圧され、全長フォールドン蛋白質が発現された（レーン４）。
【図４】２９３Ｔ細胞におけるフォールドン蛋白質への５−ＨＴＰＰの取り込みを示すウェスタンブロットを示す。Ｖ５タグを付加した野生型ＢｓＴｒｐＲＳは２９３Ｔ細胞で発現された（レーン１）。５−ＨＴＰＰ、ｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡ、又はＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳの不在下では、ＴＧＡ６８フォールドン構築物の全長蛋白質は翻訳されなかった（レーン２−４）。５−ＨＴＰＰ、Ｖａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳ及びｍｕｔＲＮＡＴｒｐＵＣＡの存在下では、抗Ｖ５抗体によるウェスタンブロットにより検出した場合に全長オパール突然変異体フォールドン蛋白質は発現されなかった（レーン５）。
【図５】Ｍａｃｒｏｍｏｄｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．１，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ．）を使用したＴｒｐＲＳとその基質の複合体のコンピューターシミュレーションを示す。水素結合を破線（−−−）で示す。左側の構造はｗｔ枯草菌ＴｒｐＲＳとそのコグネイト基質であるトリプトファン−５’ＡＭＰの結合を示し、インドールＮＨ基とＡｓｐ１３３の間に水素結合を含む。右側の構造はＶａｌ１４４ＰｒｏＢｓＴｒｐＲＳとその基質である５−ＨＴＰＰ−５’ＡＭＰの複合体を示す。インドールＮＨ基とＡｓｐ１３３の間の水素結合は消失し、５−ＯＨとＨｉｓ４４、Ａｓｐ１３３、及びインドールＮＨとＳｅｒ７の間に新しい水素結合が出現していることに留意されたい。
【図６】励起波長３１０ｎｍにおけるｗｔフォールドン蛋白質（ ）とＨＴＰＰ６８突然変異体蛋白質（……）の蛍光スペクトルを示す。
【図７】電気化学的蛋白質架橋の模式図を示す。図７Ａ１は酸化５−ＨＴＰＰ分子の二量化物を示し；図７Ａ２は酸化５−ＨＴＰＰとシステインの反応生成物を示す。図７Ｂは５−ＨＴＰＰと酸化的に架橋した蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。蛋白質は４−２０％グラジエントＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシー染色した。レーン１とレーン３は夫々精製ＨＴＰＰ６８フォールドン蛋白質と野生型フォールドン蛋白質を含む。レーン２はＨＴＰＰ６８フォールドンの架橋生成物を含み、レーン４は野生型フォールドン蛋白質の架橋生成物を含む。単量体分子量１４．５ｋＤａをもつ野生型フォールドンには検出可能な架橋生成物は認められなかった。ＨＴＰＰ６８フォールドンを架橋すると、二量体２９ｋＤａ蛋白質が得られた。
【図１】
2007514447.tif 000004
【図２】
2007514447.tif 000005
【図３】
2007514447.tif 000006
【図４】
2007514447.tif 000007
【図５】
2007514447.tif 000008
【図６】
2007514447.tif 000009
【図７】
2007514447.tif 000010
【配列表】
2007514447000001.xml
【国際調査報告】
2007514447.tif 000014
2007514447.tif 000015