(57)【要約】  本発明は、インターロイキン１５／Ｆｃ融合タンパク質を組成物から精製する方法であって、ａ）組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供して第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させ、そして、ｂ）工程ａ）の溶出物をイオン交換クロマトグラフィカラムに供して第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させることを含む前記方法；並びに精製インターロイキン１５／Ｆｃ融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質を含む組成物、特に医薬組成物に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体組成物からのＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の精製方法であって：
ａ）組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供して第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させ、そして
ｂ）工程ａ）の溶出物をイオン交換クロマトグラフィカラムに供して第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
イオン交換クロマトグラフィカラムが陰イオン交換クロマトグラフィカラム又は陽イオン交換クロマトグラフィカラムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更なる工程：
ｃ）工程ｂ）の溶出物をゲルろ過カラム又は疎水性相互作用クロマトグラフィカラムに供して第３のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させることを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）及びｂ）のうちの少なくとも１つの前又は後に、組成物をろ過及び／又は濃縮する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）、ｂ）、及びｃ）のうちの少なくとも１つの前又は後に、組成物をろ過及び／又は濃縮する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程ａ）の溶出物のｐＨを工程ｂ）の前に酸性にする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
親和性クロマトグラフィカラムが、プロテインＡクロマトグラフィカラム又はプロテインＧクロマトグラフィカラム、好ましくはプロテインＡクロマトグラフィカラムである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
陰イオン交換クロマトグラフィカラムが、ＤＥＡ−セファロースカラム又はＱ−セファロースカラム、好ましくはＱ−セファロースカラムである、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ゲルろ過カラムが、セファデックス、セファロース、バイオゲル−Ａ、セファクリル、又はバイオゲル−Ｐカラム、好ましくはスーパーデックス−２００カラムである、請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
精製後のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の純度が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
純度が、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％である、精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｎ−グリカンあたりの平均シアリル化が、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である、請求項１１に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１３】
アンテナあたりの平均シアリル化が、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％である、請求項１１又は１２に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、及びアシアロ−Ｎ−グリカンの合計のＮ−グリコリル−ノイラミン酸部分が、２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１１〜１４の少なくとも１項に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質、更に賦形剤及び添加剤を含む組成物。
【請求項１６】
ｐＨが７．４〜８．０である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
医薬組成物である、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１５／Ｆｃ融合タンパク質を組成物から精製する方法であって、ａ）組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供して第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させ、そして、ｂ）工程ａ）の溶出物をイオン交換クロマトグラフィカラムに供して第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させることを含む前記方法；並びに精製インターロイキン１５／Ｆｃ融合タンパク質、及びそのような融合タンパク質を含む組成物、特に医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
臓器又は組織の移植は標準法になりつつあり、多くの場合、生命を脅かす多くの疾患の唯一の救命処置である。しかしながら、レシピエントの生体による、移植片の外来細胞表面抗原に対する免疫応答によって引き起こされる拒絶に関してしばしば困難が生ずる。拒絶を抑制する１つの治療的アプローチは、免疫抑制剤、特にインターロイキン１５（ＩＬ−１５）又はインターロイキン２（ＩＬ−２）のアンタゴニスト抗体又はアゴニストによって液性又は細胞性免疫応答を抑制することである。これまでにＩＬ−１５又はＩＬ−２分子に対する抗体を用いたさまざまな療法が記載されている。有効なＩＬ−１５アンタゴニストの例は、Ｎ端の変異又は未変異ＩＬ−１５断片及びＣ端のＦｃ断片から成る融合タンパク質である（ＷＯ９７／４１２３２号；Ｋｉｍら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５７４２−５７４８）。
【０００３】
融合タンパク質を医薬品としてうまく使用できるためには、非常に高純度で大規模に生産し、安定な様式で保存できることが必要である。一般に、非天然タンパク質は遺伝子操作法によって生産される。このため、タンパク質は、タンパク質を産生するために目的ペプチドの遺伝子を含有する組換えプラスミドが細胞株に組み込まれるように遺伝子操作された哺乳動物又は細菌の細胞株を用いた細胞培養で生産される。次に、これらの細胞株を、例えば糖、アミノ酸、成長因子、塩、異なる動物由来の血清などを含有する複合細胞培地の存在下、好適な条件で培養する。続いて、治療剤としての使用に十分な純度が達成されるまで、目的タンパク質を培地成分、細胞の代謝産物、及び他の混入物質から分離することが必要である。
【０００４】
タンパク質を細胞培養物から精製する方法は、熟練した作業者に周知である。タンパク質は、細胞株から周囲の培地へ直接放出されるものもあれば、細胞内に保持されるものもある。後者は、まず細胞を破壊することが必要であり、これは、例えば機械的な剪断、浸透圧衝撃、又は酵素処理などの多様なプロセスで可能となる。この場合、ホモジネートには細胞の全内容物が含まれ、細胞内断片を除去するには追加のプロセスが必要とされる。後者のプロセスには、例えば分画遠心法又はろ過が含まれる。タンパク質を上清から直接得る場合、死細胞などの部分を除去するためにそのような工程がやはり必要であり得る。その後、タンパク質を通常さまざまなクロマトグラフィ技術の組み合わせによって更に精製する。これらの技術は、サイズ、荷電、疎水性、又は具体的な基質に対する親和性に応じてタンパク質の混合物を分離する。これらの技術のそれぞれに関し、多くのカラム材料が利用可能であり、目的タンパク質に応じて使用される。クロマトグラフィの目的は、目的タンパク質がカラムで混入物質とは異なる移動度を発揮することにあり、したがって、後者とは異なる時間に溶出する。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の目的は、できるだけ純粋なＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を保存可能な形態で提供することである。
この目的は、ＩＬ−１５／Ｆｃを組成物から精製する方法によって達成され、この方法は、以下の工程：
ａ）組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供して第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させ、そして
ｂ）工程ａ）の溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィカラムに供して第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させることを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本明細書において、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質（ＩＬ−１５／Ｆｃ）は、２つの融合部分、即ちＩＬ−１５成分とＦｃ成分とを含む融合タンパク質である。機能性タンパク質に加えて免疫グロブリンの融合部分を含む組換えタンパク質は、例えばＣａｐｏｎら（ＵＳ５，４２８，１３０号）に記載されている。
【０００７】
Ｎ端の変異又は未変異ＩＬ−１５部分と、Ｃ端のＦｃ部分とから成る融合タンパク質が好ましい。そのようなタンパク質は、例えばＷＯ９７／４１２３２号及びＫｉｍら（１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５７４２−５７４８）に開示されている。
【０００８】
融合タンパク質のＩＬ−１５部分は、例えば活性化Ｔ細胞で発現されるＩＬ−１５受容体(ＩＬ−１５Ｒ)への選択的な結合を介在する。したがって、ＩＬ−１５部分は天然ＩＬ−１５でもその変異体でもよい。
【０００９】
より好ましい態様では、ＩＬ−１５成分は野生型ＩＬ−１５である。これに関連して、ＩＬ−１５は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、又はサル、好ましくはヒトなどのあらゆる種のＩＬ−１５であることができる。さまざまなスプライス変異体及び天然の変異体も含まれる。本明細書において、哺乳動物の核酸、特にヒト又はマウス型の核酸が特に好ましい。
【００１０】
ＩＬ−１５変異体には、天然ＩＬ−１５に対して、例えば１以上の欠失、挿入、又は置換、又はそれらの組み合わせなどの変異を有するＩＬ−１５成分が含まれる。しかしながら、用いるＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質がＩＬ−１５Ｒに結合可能でなければならない。これは、例えば、標識ＩＬ−１５と、ＩＬ−１５受容体を有する膜又は細胞とを用いた放射性リガンド結合アッセイで確認されるであろう（Ｃａｒｓｏｎ  ＷＥら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０（４）：１３９５−１４０３）。
【００１１】
好ましい態様では、変異体は、ＩＬ−１５のような作用を有することができ（アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分）、その活性レベルは、ＩＬ−１５と比較して、同一、低下、又は上昇していることさえあり得る。アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に使用できる試験系は、マウスＣＴＬＬ−２細胞増殖をＩＬ−１５成分で刺激することである。
【００１２】
本発明によれば、ＩＬ−１５成分が少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは１００％、更により好ましくは１５０％、最も好ましくは少なくとも２００％の活性を有する場合は、その成分はアゴニスト作用を有する。アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の活性は、野生型ＩＬ−１５による刺激と比較した、ＩＬ−１５成分による反応の刺激の割合を意味する（野生型ＩＬ−１５は１００％活性に相当する）。ＩＬ−１５成分単独でも融合タンパク質でもアッセイに使用可能である。
【００１３】
アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の場合、残基が類似の特性を有する他のものに置換された保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸群内、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群内、酸性ラジカルを有するアミノ酸群内、アミド誘導体を有するアミノ酸群内、塩基性ラジカルを有するアミノ酸群内、又は芳香族ラジカルを有するアミノ酸内の置換である。典型的な保存的及び半保存的置換は以下の通りである。
【００１４】
【表１】
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【００１５】
本発明の他の態様では、アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を利用する。このタイプの成分は、ＩＬ−１５の作用、又はＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒへの結合を阻害し、完全に阻害することも一部のみを阻害することも可能である。アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に使用できる試験系は、ＷＯ９７／４１２３２号に記載の試験系である（ＢＡＦ−ＢＯ３細胞増殖アッセイ）。本発明によれば、ＩＬ−１５成分が少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９５％のＩＬ−１５介在作用又はＩＬ−１５ＲへのＩＬ−１５結合を阻害する場合は、その成分はアンタゴニスト作用を有する。ＩＬ−１５成分単独でも融合タンパク質でもアッセイに用いることが可能である。
【００１６】
アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の場合、残基が異なる特性を有する他のものに置換された非保存的アミノ酸置換が好ましい。ＩＬ−１５Ｒとの相互作用又はシグナル伝達に関与する分子領域内で生ずるこうした置換が更に好ましい。
【００１７】
好ましい態様では、用いるアンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分は、ＷＯ９７／４１２３２号に記載のＩＬ−１５変異体、又は５６位のアミノ酸（アスパラギン酸；ＡＡＡ２１５５１）に変異を有するＩＬ−１５成分である。インターロイキン１５の１４９位及び／又は１５６位のアミノ酸に点突然変異が組み込まれている変異体、特にグルタミンがアスパラギン酸に置換されている変異体が最も好ましい（ＷＯ９７／４１２３２号を参照されたい）。
【００１８】
１つの態様では、記載の変異を組み合わせることも可能である。
１つの態様では、融合タンパク質の変異ＩＬ−１５部分は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％、野生型ＩＬ−１５と、好ましくはヒト野生型ＩＬ−１５と（例えば全米バイオテクノロジー情報センターのデータベースの受託番号ＡＡＡ２１５５１）、又は他の天然変異体（例えば全米バイオテクノロジー情報センターのデータベースの受託番号ＣＡＡ６３９１４及びＣＡＡ７１０４４の変異体）と同一である。
【００１９】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の第２の機能性単位は、Ｆｃ成分である。Ｆｃ部分はパパインによる切断で調製でき、そのアミノ酸配列は高度に保存的である免疫グロブリンの定常（ｃ＝定常）断片を意味する。Ｆｃ断片は、通常、抗原に結合しない抗体断片である。本発明によるＦｃ部分も、上記のように免疫グロブリン断片を意味することが好ましく、更にヒンジ領域の他に定常ドメインＣＨ２及びＣＨ３も含む。
【００２０】
Ｆｃ成分は、抗体の、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、又はＩｇＭの、好ましくはＩｇＭ又はＩｇＧの、より好ましくはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ部分に由来する。
【００２１】
本発明の具体的な態様では、融合タンパク質のＦｃ部分は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ断片であり、ＩｇＧ軽鎖及び重鎖の可変領域を欠失している。
使用できるＩｇＧの例は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。ヒト又はマウスＩｇＧ１が好ましい。
【００２２】
抗体のＦｃ部分全体もその一部のみも本発明に使用可能である。しかしながら、Ｆｃ部分の一部は、好ましくは、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の血中循環半減期が免疫グロブリン成分のないＩＬ−１５成分よりも長いようにデザインされる必要がある。これは、１以上の実験動物に融合タンパク質及びＩＬ−１５成分を投与、例えば血流に注入し、血中循環半減期を比較することによって試験することができる。より長い半減期は、好ましくは少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも１００％の半減期の増加によって示される。
【００２３】
Ｆｃ部分は、少なくとも１つの変異を有するＦｃ部分でもよい。変異Ｆｃは、ＩＬ−１５部分に関して先に記載した様式で変異させることができる。
１つの態様では、融合タンパク質の変異Ｆｃ部分は、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％マウス又はヒトの野生型免疫グロブリンのＦｃ部分と、好ましくはヒトＩｇＧ１−Ｆｃ又は他の天然変異体と同一である。
【００２４】
本発明の好ましい態様では、融合タンパク質のＦｃ部分は天然型であるか又は保存的アミノ酸置換を有し、完全なＦｃＲ結合部位及び／又は補体結合部位を含有する。融合タンパク質のＦｃ部分は、補体系の活性化及びＦｃ受容体発現細胞への結合を介在することができ、したがって融合タンパク質のＩＬ−１５部分によって認識される細胞の枯渇をもたらす。補体活性化及びＦｃ受容体結合を介在するアミノ酸位置に変異、特に非保存的アミノ酸置換を組み込むことにより、これらの機能のスイッチを切ることが可能になる。これらの変異の例は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合部位又は補体結合部位（天然ヒトＩｇＧ１のアミノ酸位置２１４、３５６、３５８、及び／又は４３５、あるいは天然マウスＩｇＧ２ＡのＬｅｕ２３５、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及び／又はＬｙｓ３２２）の変異である。これらの位置のアミノ酸の置換は、通常、Ｆｃ部分の溶解機能及び補体活性化機能の欠失をもたらす（ＷＯ９７／４１２３２号）。
【００２５】
例えば分子間結合を妨げ、したがって発現したＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の凝集を妨げるためには、ヒトＦｃ部分のヒンジ領域の４位のアミノ酸のシステイン、より好ましくはヒトＩｇＧ１（ヒトＩｇＧ１の１６７位）のアミノ酸がアラニンに置換されている態様が更に好ましい。
【００２６】
他の好ましい態様では、Ｆｃ部分は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１又はマウス免疫グロブリンＩｇＧ２ＡのＦｃ部分であり、ヒンジ領域に加えて重鎖領域ＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【００２７】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質では、ＩＬ−１５成分が免疫グロブリン成分に直接又はリンカーを介して融合している。リンカーは、好ましくは２５アミノ酸以下、より好ましくは１５アミノ酸以下、更により好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは１、２、３、４、若しくは５アミノ酸から成る。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、融合タンパク質は、配列番号１の９０５〜２０１４位の核酸、配列番号２又は配列番号３の１９１１〜３０２０位の核酸によってコードされ、シグナル配列（ＣＤ５）はいずれの場合も最初の７４ヌクレオチドにコードされる。しかしながら、配列番号４又は配列番号５のタンパク質でもあり得る。配列が上記配列のいずれかと少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一であり、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質がＩＬ−１５Ｒに結合し、対応の免疫グロブリン成分のないＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては上記を参照されたい）タンパク質も含まれる。
【００２９】
融合タンパク質は、融合タンパク質をコードする核酸を細胞に組み込み、続いて好適な条件下で核酸を細胞内で発現させることによって作製することができる。このようにして作製した融合タンパク質は、次に、上清又は細胞自体から本発明の方法によって回収することができる。これには、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を含有する組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供して第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物を溶出させることが含まれる。
【００３０】
親和性クロマトグラフィとは、吸着クロマトグラフィの特殊形態を意味し、取り出すべき物質に対して高親和性を有し、したがって高結合強度を有する基が支持体上に存在し、その結果、その物質が優先的に吸着することができ、したがって他の物質から取り出される。
【００３１】
支持体は、例えば精製カラムの固相、不連続相、又は個々の粒子であり得る。固相の可能な例は、多孔質ガラスのカラム又はシリカカラムである。本発明の１つの態様では、混入物質による固相への非特異的結合を抑制するために、固相を試薬（例えばグリセロールなど）でコーティングすることができる。好ましい態様では、クロマトグラフィに使用する支持体材料は、特にプロテインＡ及び／又はプロテインＧをリガンドとして用いる場合は、セファロースである。
【００３２】
単離されるべき結合パートナーは、ａ）リガンドと回収すべき結合パートナーとを好適な条件下で結合させ、ｂ）必要に応じて非結合物質を洗浄除去し、ｃ）２つの分子がこれ以上結合できない条件を作ることによって、例えばバッファー溶液のｐＨ又はイオン強度を変えることによって結合パートナーをリガンドから分離することにより、回収することができる。
【００３３】
好ましい態様では、親和性クロマトグラフィは、プロテインＡ、特に好ましくは組換えプロテインＡをリガンドとして用いたプロテインＡクロマトグラフィである。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌の細菌細胞壁タンパク質であり、Ｇクラス免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃ領域に対して特異的親和性を有する。プロテインＡの分子量は４２ｋＤａ（組換えプロテインＡ：およそ３２〜４５ｋＤａ）であり、ｐＨ２〜１０で安定性が高い。プロテインＡは固相（支持体材料）に固定される。Ｆｃ部分に対する結合親和性はｐＨの関数であり、中性又はわずかにアルカリ性のバッファー存在下で結合後は、ｐＨ勾配を下げることによって免疫グロブリンを溶出させることができる。
【００３４】
プロテインＡクロマトグラフィ材料の１つの例は、細孔構造中でガラスに結合したプロテインＡから成るＰｒｏｓｅｐ−Ａ（ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｉｎｇ社、英国）である。他の好適なプロテインＡ製剤は、プロテインＡセファロース、例えばプロテインＡセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ファルマシア）、及びＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ６５０  プロテインＡ（ＴｏｓｏＨａａｓ）である。
【００３５】
あるいは、親和性クロマトグラフィは、用いるリガンドがプロテインＧのプロテインＧクロマトグラフィでもよい。プロテインＧは、Ｇ群連鎖球菌の表面タンパク質であり、プロテインＡとは異なる親和性スペクトルを有する。ＩｇＧ抗体のプロテインＡに対する親和性は、プロテインＧに対するものと異なっており、熟練した作業者は、用いるＦｃ部分に応じて好適な親和性クロマトグラフィを選択することが可能である。
【００３６】
更に、融合タンパク質のＦｃ部分又はＩＬ−１５部分に対する異種抗血清を用いることも可能である。
本発明の方法の工程ａ）を実施するために、精製用カラムを、例えば好適なバッファー溶液で更に平衡化することができる。バッファーは、その酸に基づいた共役によりｐＨを安定化させた緩衝化溶液である。カラムを平衡化するために用いるバッファーは、ｐＨが通常およそ６〜８の範囲にある等張バッファーが好ましい。平衡化バッファーの可能な例は、２０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ、２５ミリモル／ｌ  ＮａＣｌ、２５ミリモル／ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５である。
【００３７】
次に、好適なバッファー中にＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を含有する組成物を、カラムのローディングバッファー中に供する。１つの態様では、平衡化バッファーとローディングバッファーの組成は同一である。続いて、カラムを必要に応じて好適な洗浄バッファーで洗浄し、その後、選択した溶出バッファーでＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を溶出させる。
【００３８】
カラムのローディング（組成物を供すること）と溶出とのあいだに実施することができる最適な洗浄工程は、固相に非特異的に結合している混入物質を除去するために役立つ。目標は固相から融合タンパク質をできるだけ溶出させないことである。洗浄工程は、通常、例えば２０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ、１５０ミリモル／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４などの等張溶液で、あるいはｐＨを、融合タンパク質は依然として結合しているが、より低い値に、例えばｐＨ５．５に下げることによって実施することができる。
【００３９】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をカラムから溶出させるために溶出バッファーを用いる。溶出バッファーのｐＨは低いことが好ましく、そのため、リガンド、特にプロテインＡと融合タンパク質との相互作用を破壊する。溶出バッファーのｐＨは、好ましくは２〜５、より好ましくは３〜４の範囲である。ｐＨをこの範囲に制御するバッファーの例は、リン酸、酢酸、クエン酸、及びアンモニウムバッファー、並びにそれらの混合物である。好ましいバッファーはクエン酸バッファー及び酢酸バッファーでり、更に好ましいのはクエン酸ナトリウムバッファー又は酢酸ナトリウムバッファーであり、最も好ましくは０．１モル／ｌ  クエン酸バッファー、ｐＨ３．４である。しかしながら、高ｐＨ（例えばｐＨ９以上）の溶出バッファー、又はリガンド、特にプロテインＡと融合タンパク質との相互作用を妨げる他のバッファーを用いることも可能である。
【００４０】
工程ａ）の溶出物を必要に応じて希釈し、工程ｂ）においてイオン交換クロマトグラフィカラム、陽イオン交換クロマトグラフィカラム、又は好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィカラムに供して第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる。
【００４１】
本発明の好ましい態様では、工程ａ）の溶出物のｐＨを、塩基又はバッファーを添加することによって上昇させる。これは、融合タンパク質の起こり得る不活性化を妨げるために、溶出後直ちに行うことが好ましい。これは、例えば１／１０容量の１モル／ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を加えることによって行うことができる。
【００４２】
イオン交換クロマトグラフィでは、タンパク質は荷電に基づいて分離される。タンパク質はさまざまなアミノ酸から成り、その側鎖は、通常、非荷電ラジカルに加えて酸性ラジカル及び塩基性ラジカルも有することができ、したがってタンパク質全体の荷電に寄与する。タンパク質の等電点以下の低ｐＨでは、荷電側鎖のプロトン付加により全体に陽電荷になり、より高いｐＨでは、脱プロトン化により陰電荷になる。タンパク質は非常に多数の荷電基を有し、実際の電荷はｐＨ及び個々のアミノ酸の環境に依存するため、荷電による分離はタンパク質を分離する強力な方法である。イオン交換クロマトグラフィでは、選択したタンパク質がマトリックスに結合できるようにｐＨを選択する。陰イオン交換体の場合、このｐＨは通常タンパク質の等電点（タンパク質の正味の電荷が０のｐＨ）より少なくともｐＨが１単位上であり、陽イオン交換体の場合は等電点より下である。マトリックスへの結合は静電相互作用を介して生ずる。マトリックスに結合しないタンパク質をバッファーで洗浄除去する。結合したタンパク質は、塩を添加して溶出させる。ＮａＣｌを用いることが好ましい。例えば荷電したナトリウムイオン及び塩素イオンの存在によってタンパク質とマトリックスとの静電相互作用が阻止され、タンパク質はマトリックスから離れる。
【００４３】
陰イオン交換体又は塩基性イオン交換体は、陽イオン基が固体不溶性マトリックスに共有結合的に結合しているイオン交換体であるが、中和陰イオンはイオン結合的に結合しているだけであり、したがって他の陰イオンと置き換わることができる。陰イオン交換体によるクロマトグラフィは、通常、陰に荷電した分子を精製するために用いられる。陰イオン交換体の例は、ポリアクリルアミドゲル樹脂又は炭化水素ポリマー樹脂、例えばセルロース又はデキストランなどにカップリングしたアミノエチル、ジエチルアミノエチル、４級アミノエチル、及び４級アンモニウム基である。
【００４４】
陽イオン交換クロマトグラフィも類似の原理にしたがって機能する。ここで、精製すべき陽に荷電した分子は陰に荷電した基（例えばカルボキシメチル又はスルホン酸基）を含有する支持体マトリックスに結合する。用いる対イオンは通常ナトリウムイオン又はカリウムイオンであり、陽に荷電したサンプル分子と置き換わる。陽イオン交換体の例は、ポリアクリルアミドゲル樹脂又は炭化水素ポリマー樹脂、例えばセルロース又はデキストランなどにカップリングしたカルボキシメチル、スルホエチル、スルホプロピル、リン酸基、又はスルホン酸基である。
【００４５】
カラムの形態は、例えば、鉛直流の慣用のもの、又は放射状琉のものであることができる。
工程a)の溶出物を供する前に、通常、好適にはｐＨが５〜１０、好ましくは６〜９、より好ましくは７〜８の範囲のバッファーで樹脂を平衡化する。多様なバッファーがｐＨをこの範囲に維持可能である。これらのバッファーはいずれも使用に好適であるが、これまでのところ、Ｔｒｉｓバッファー、より好ましくは２０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０のバッファーが好ましい。
【００４６】
平衡化の後、工程ａ）の溶出物をイオン交換樹脂、好ましくは陰イオン交換樹脂に供する。次に、カラムを必要に応じて洗浄し、続いて、イオン強度を上昇させることによって及び／又はｐＨを変化させることによってＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を溶出させる。最適な洗浄工程は、通常平衡化段階と同一バッファーを使用する。しかしながら、異なるモル濃度、例えばより高いモル濃度、例えば２０ミリモル／ｌ  Ｔｒｉｓ、２００ミリモル／ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０のような洗浄バッファーを使用することも可能である。クロマトグラフ分離のためのバッファー濃度は、十分なバッファー容量を保証するためには、通常、例えば少なくとも１０ミリモル／ｌである。バッファーのイオン強度は、タンパク質のマトリックスへの結合に影響しないように、通常低く維持する（＜５ｍＳ／ｃｍ）。しかしながら、イオン強度は、タンパク質が変性又は沈殿するほど低くすべきではない。バッファーイオンは、反対電荷は分離工程に影響し、局所的なｐＨかく乱が生ずるため、マトリックスと同一電荷であるべきである。溶出は、電解質濃度の直線勾配、段階的増加を用いて、又は等張的に行うことができる。通常、最終モル濃度０．５モル／ｌ以下、好ましくは０．４モル／ｌ以下、より好ましくは０．３５モル／ｌ以下が得られ、用いる電解質は、例えば塩化ナトリウム、又は同一作用を有する他の電解質である。
【００４７】
好ましいバッファー濃度１０〜２００ミリモル／ｌを有する工程ａ）の溶出物を、平衡化したカラムに供する。溶出物のｐＨを５〜９、好ましくは７．５〜８．５に調整する。ｐＨは、好適な物質で、例えばＮａＯＨ又は他の好適な塩基を添加することによって適合させることができる。次に、カラムをバッファーで、好ましくは平衡バッファー又は洗浄バッファーで洗浄することができる。バッファー濃度は１０〜３００ミリモル／ｌが好ましい。ｐＨは好ましくは７．０〜９．０、より好ましくは７．７５〜８．２５の範囲である。
【００４８】
陰イオン交換クロマトグラフィの好ましい態様では、用いるカラムは、好ましくはＤＥＡ−セファロースカラム又はＱ−セファロースカラム、より好ましくはＱ−セファロースカラムである。
【００４９】
好ましい態様では、陰イオン交換クロマトグラフィは、ＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィ）装置、又はＡｋｔａ精製機（例えばＡｋｔａ  Ｐｉｌｏｔ又はＢｉｏＰｉｌｏｔ、アマシャム、英国）で行う。ＦＰＬＣ装置の場合、イオン交換カラムを出発バッファーで最初に平衡化し、次にサンプルループ中の分離すべきタンパク質混合物をカラムに供する。カラムに結合しないタンパク質は直ちに溶出される。バッファーを混合してバッファーのイオン強度を緩やかに上昇させ、タンパク質を１つずつカラムから溶出させ、フラクションコレクター中に回収する。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、本発明の精製工程は工程ｃ）を更に含む：
ｃ）工程ｂ）の溶出物をゲルろ過カラム又は疎水性相互作用クロマトグラフィカラムに供して第３のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる。
【００５１】
ここで、工程ｂ）の溶出物は、ゲルろ過又は疎水性相互作用クロマトグラフィによって精製する。
ゲルろ過は、クロマトグラフィによるタンパク質の分離に特に好適であり、その固定相は膨潤ゲルビーズから成り、粒子サイズにしたがって分離する：大きな粒子はゲルビーズを通過する液体と共に移動し、より小さな粒子は孔中に保持され、溶出物中に最後に現れる。溶出は通常等張的に、即ち濃度勾配のない唯一のバッファーで行われる。バッファーの組成は通常分離に影響せず、タンパク質の要求に依存する。多孔率が架橋度に依存する球状ポリマーをゲルマトリックスとして使用してもよい。その例は、セファデックス、セファロース、バイオゲルＡ、セファクリル、及びバイオゲルＰである。好適サイズの更に小さなタンパク質をこれらのマトリックスの孔中に拡散させることができる。これはゲルを通る流速を遅くする。タンパク質が大きすぎる場合、孔隙を通過して、より高速でゲルを通って溶出する。したがって、高分子量タンパク質は低分子量タンパク質の前に溶出する。物質の混合物は、球状タンパク質の場合は、通常分子量に比例するさまざまなストークス半径にしたがい分離する。十分な分離を得るには、供する容量は、好ましくはカラム容量の５％以下、より好ましくは１％以下である。濃度は、好ましくは５０ｍｇ／ｍｌ以下、より好ましくは２５ｍｇ／ｍｌ、更により好ましくは１０ｍｇ／ｍｌであることができる。
【００５２】
ゲルろ過クロマトグラフィカラムの固定相は、好ましくは５，０００〜６００，０００ｋＤａの範囲で分画するカラム材料を含む。スーパーデックス２００、スーパーデックス７５、スーパーロース６、スーパーロース１２、セファデックスＧ−７５、セファクリルＳ−２００ＨＲ、セファクリルＳ−３００ＨＲ、又はセファクリルＳ−４００ＨＲをカラム材料として用いることが好ましく、スーパーデックス２００を用いることがより好ましい。
【００５３】
工程ｂ）の溶出物を供する前に、通常、カラムを平衡バッファー、例えば５０ミリモル／ｌ  リン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１５０ミリモル／ｌ  塩化ナトリウムで平衡化する。次に、工程ｂ）の溶出物をカラムに供する。非常に低い塩濃度はカラムのクロマトグラフ分離特性に悪影響を及ぼし得るため、イオン強度は＞２０ｍＳ／ｃｍを意図する。
【００５４】
ゲルろ過の代替物として、疎水性相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）を行うことも可能である。疎水性相互作用は生化学的に非常に重要である。それは実質的にタンパク質の３次元の３次構造の安定化に関与する。疎水性相互作用とは、極性環境（例えば水）で自発的に凝集する２つの疎水性分子の現象を意味する。塩を溶解し、媒体のイオン強度を増加させても２つの非極性分子の疎水性相互作用を増加させる。タンパク質は、多かれ少なかれ疎水性表面構造の高い特性を有する。したがって、それらは適切に高いイオン強度で疎水性吸着体に接着可能である。相互作用の強度は、塩含量、及び吸着体の選択によって制御することができる。用いる官能基の例は、エチル、ブチル、プロピル、オクチル、又はフェニルラジカルである。高塩濃度存在下で吸着を行う；対応して、溶出は塩の濃度勾配を下げて行う。用いる塩は、通常硫酸アンモニウムである。
【００５５】
本発明の具体的な態様では、工程ａ）〜ｃ）のうちの少なくとも１つの前か後に、組成物又は溶出物をろ過及び／又は濃縮する。
溶液中でタンパク質を濃縮するために、さまざまな工程を用いることができる。これは、例えば限外ろ過で行うことができる。ここで、小さな分子のみ（塩、溶媒）が通過でき、より大きい分子、例えばタンパク質などは保持される膜を通してタンパク質溶液を加圧する。これは溶液の容量を減少させ、タンパク質濃度を上昇させる。ろ過に、例えば接線流ろ過システムを用いることが可能である。これに好適な膜は、タンパク質を保持する膜である。ろ過は、供給物が膜に対して垂直に押圧される加圧ろ過で行うことができる。これに対する代替物として、供給物が膜を通って接線方向に向いている直交流ろ過プロセスを用いることができる。通過物は流れの方向に対して垂直に膜を通過する。膜の連続的な接線方向の上層吸収により、カバー層の形成を減少させる精製効果を達成する。更に向上させるために、２枚の平行な膜間に繊維層を配置することもでき、これは更なる渦を生ずる。
【００５６】
濃縮又はその代替方法に加えて、組成物又は溶出物をろ過してもよい。使用できるフィルター材料は、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ＰＶＣ、テフロン（登録商標）、又は例えば酸化ジルコニウムでできたセラミック膜である。フィルターは個々の膜でもよいし、例えばモジュールなどの膜システムに集合していてもよい。モジュールは、管状モジュール、らせん状モジュール若しくは巻線形モジュール、又は中空繊維モジュールであることができる。
【００５７】
本発明の好ましい態様では、精製工程の工程ａ）の前に、組成物をろ過によって浄化する。清澄ろ過に用いるフィルターの孔径は、およそ５μｍ以下、好ましくは４μｍ、より好ましくは３μｍ、最も好ましくは１μｍである。
【００５８】
限外ろ過に用いるフィルターの孔径は、好ましくは１００，０００ＮＭＧＴ以下、より好ましくは７５，０００ＮＭＧＴ以下、更により好ましくは５０，０００ＮＭＧＴ以下、最も好ましくは３０，０００ＮＭＧＴ以下である。
【００５９】
滅菌ろ過に用いるフィルターの孔径は、好ましくは０．８μｍ以下、より好ましくは０．６μｍ以下、更により好ましくは０．４μｍ以下、最も好ましくは０．２２μｍ以下である。
【００６０】
本発明の好ましい態様では、工程ａ）の溶出物のｐＨを工程ｂ）の前に酸性にする。酸性ｐＨとは、７．０以下、好ましくは５．５以下、より好ましくは４．０以下、最も好ましくは３．５以下のｐＨである。３．５以下のｐＨ値はウイルスの不活化に好適である。ウイルスの不活化後、塩基、例えば１／１０容量の１モル／ｌ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０を添加してｐＨを再度上昇させる。ウイルスを除去するために、ｐＨを下げることに加えて、組成物又は溶出物を好適なフィルターでろ過することができる。好適なフィルターは熟練作業者に公知である。
【００６１】
本発明の特に好ましい態様では、精製工程に用いる親和性クロマトグラフィカラムはプロテインＡクロマトグラフィカラムであり、精製工程に用いる陰イオン交換クロマトグラフィカラムはＱ−セファロースカラムであり、精製工程に用いるゲルろ過カラムはスーパーデックス−２００カラムである。
【００６２】
更に、上記工程ａ）〜ｃ）を用い、必要に応じて記載の態様を組み込んだ精製方法は特に好ましく、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の精製後の純度は少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％である。純度は、実施例に記載するように、例えばＨＰＬＣ−ＳＥＣで確認することができる。
【００６３】
更に、本発明は、純度が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に関するものであり、純度は、実施例に記載するように、例えばＨＰＬＣ−ＳＥＣで確認することができる。
【００６４】
更に好ましい態様では、Ｎ−グリカンあたりの平均シアリル化、即ち精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質中のシアル酸が占めるＮ−グリカンの割合が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、更により好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％である。
【００６５】
更に他の好ましい態様では、アンテナあたりの平均シアリル化、即ち精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質中のシアル酸が占めるアンテナの割合が少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、更により好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％であり、アンテナ数はＮ−グリカンの分岐数に相当する。
【００６６】
平均シアリル化は、同様にＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（高速陰イオン交換クロマトグラフィ及びパルスアンペロメトリック検出）で決定することができ、アンテナ数はＨＰＬＣで決定される。シアル酸とは、Ｎ−アシル化及びＯ−アシル化ノイラミン酸誘導体の基の名称である。複合糖質の多様なオリゴ糖鎖の末端基として露出位置にあるため、シアル酸は前者の生物特性に相当寄与する。糖タンパク質中のシアル酸の酵素的切断はその血漿半減期をかなり短くするため、できるだけ多くシアリル化することは有益である。これは、ＩＬ−１５／Ｆｃを低用量で及び／又は長期間投与することを可能にする。本発明による精製方法は、上記の平均シアリル化値を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するために用いることができる穏やかな方法を提供する。
【００６７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸は最も頻繁に生ずるシアル酸であり、糖タンパク質の重要な成分である。他のシアル酸と同様に不活性化から保護するため、高率のＮ−アセチルノイラミン酸は有益である。
【００６８】
本発明の更なる態様では、精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質中のＮ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、及びアシアロ−Ｎ−グリカンの合計のうちのＮ−グリコリルノイラミン酸の割合は、２０％以下、好ましくは１５％以下、より好ましくは１０％以下である。Ｎ−グリコリルノイラミン酸は、通常ヒトに存在しないノイラミン酸であり、これが抗原性作用を有するかもしれないことを示唆している。したがって、その割合はできるだけ小さくすべきである。
【００６９】
Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、及びアシアロ−Ｎ−グリカンの合計の一部としてのＮ−グリコリルノイラミン酸量は、例えばＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（高速陰イオン交換クロマトグラフィ及びパルスアンペロメトリック検出）で、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、及びアシアロ−Ｎ−グリカンの合計面積のうちのＮ−グリコシルノイラミン酸の割合面積を決定することによって決定することができる。
【００７０】
原則として、タンパク質グリコシル化の多数のさまざまな生物機能が記載されている。そのため、オリゴ糖は、プロテアーゼ、微生物、及び抗体によるタンパク質の認識を妨げることによって保護機能又は遮蔽機能を発揮することが可能である。多くの場合、グリコシル化は粗面小胞体中のポリペプチドの正しいホールディングを補助し、タンパク質の構造を維持することによって、構造的な安定化の役割を果たす。更に、タンパク質のグリコシル化は、リガンド又は受容体との相互作用を調節し、細胞−細胞及び細胞−マトリックスの認識に役割を果たすことができる。
【００７１】
したがって、できるだけ多くの天然の又は細胞が産生したグリコシル化を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を提供することが好ましい。グリコシル化部位数、糖分子数、及び／又はアンテナ数は、この基準として役立つことができる。
【００７２】
更に、本発明は、精製ＩＬ−１５／Ｆｃタンパク質並びに賦形剤及び添加剤を含む組成物に関する。
例えばタンパク質の安定化に役立つ好適な賦形剤及び添加剤は熟練作業者に周知である（例えばＳｕｃｋｅｒ  Ｈ．ら（１９９１）Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ、第２版、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、シュトゥットガルト、ドイツ）。それらには、例えば生理食塩水、デキストロースリンゲル液、乳酸リンゲル液、脱塩水、安定剤、抗酸化剤、錯化剤、抗菌化合物、プロテアーゼインヒビター、及び／又は不活性ガスが含まれる。好ましい態様では、賦形剤及び添加在は、マンニトール、ショ糖、及び／又はグリシンである。
【００７３】
好ましい態様では、組成物のｐＨは、ＩＬ−１５／Ｆｃを含有し且つそのｐＨを有する液体組成物は特に安定であることが証明されているため、７．４〜８．０である。
更に好ましい態様では、本発明の組成物は医薬組成物である。医薬組成物は、医薬として使用することを意図し、使用に好適な組成物である。したがって、医薬的に好適な賦形剤及び添加剤を含む。それらの例は、Ａｑｕａ  ｓｔｅｒｉｌｉｓａｔａ（滅菌水）、ｐＨに影響を及ぼす物質、例えば有機及び無機の酸及び塩基並びにその塩など、ｐＨを調製するバッファー物質、等張剤、例えば塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、グルコース、及びフルクトースなど、界面活性剤又は表面活性物質及び乳化剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸部分エステル（Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、又は例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（クレモフォール（登録商標））など、脂肪油、例えばピーナッツ油、大豆油、及びヒマシ油など、合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、及び中性油（Ｍｉｇｌｙｏｌ（登録商標））など、並びにポリマー性賦形剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドンなど、有機溶媒の溶解性を増加させる添加剤、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコールなど、又は錯化剤、例えばクエン酸塩及び尿素など、保存剤、例えば安息香酸ヒドロキシプロピル及び安息香酸メチル、ベンジルアルコールなど、抗酸化剤、例えば亜硫酸ナトリウムなど、及び安定剤、例えばＥＤＴＡ、ＰＶＰなど、造粒剤又は徐放剤としてのセルロースエステル、例えばろう様物質及び／又はユードラジット（登録商標）、セルロース、又はクレモフォール（登録商標）に基づいたポリマー性物質など、抗酸化剤、甘味剤、例えばショ糖、キシリトール、又はマンニトールなど、着香料、芳香剤、保存剤、着色料、バッファー物質、直接打錠剤、例えば微晶性セルロース、デンプン及びデンプン加水分解物（例えばＣｅｌｕｔａｂ（登録商標））、乳糖、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、及びリン酸二カルシウムなど、滑剤、充填剤、例えば乳糖又はデンプンなど、乳糖の形態の結合剤、各種デンプン、例えばコムギ又はトウモロコシ又はコメのデンプンなど、セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなど、又はケイ土、滑石、ステアリン酸塩、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムなど、タルク、シリコン処理をしたタルク、ステアリン酸、セチルアルコール、又は硬化油脂である。
【００７４】
実施例及び図面によって本発明を以下に具体的に説明するが、限定されるものと解釈すべきではない。
実施例
【実施例１】
【００７５】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃの産生
ＩＬ−１５／Ｆｃ産生ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を作製するには、ＩＬ−１５／Ｆｃの発現構築体を形成し、その分泌特性、それが含有する断片の同一性／完全性、及び好適な耐性遺伝子に関して最適化する必要がある。
【００７６】
ａ）出発材料
ヒトＩＬ−１５／Ｆｃ発現構築体（変異ＩＬ−１５／ヒトＦｃ）は、「ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター」の免疫部門（ハーバード大学医学部、ボストン、米国）より提供された。
【００７７】
オリゴヌクレオチドは、ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（エーバースベルク、ドイツ）から入手した。関連シグナルペプチドの配列は遺伝子ライブラリーから入手した。
制限酵素（ＢｇｌＩＩ、ＸＢａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＢｓｔＸＩ、ＡｐａＩ）、リポフェクタミン２０００、他の分子生物試薬（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）、及びプラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ、ｐｃＤＮＡ３．１は、インビトロジェン（カルルスルーエ、ドイツ）又はアマシャム−ファルマシア（ＮｈｅＩ、プロテインＡセファロース、ウプサラ、スウェーデン）から入手した。
【００７８】
コンピテント大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞はストラタジーン（ラホーヤ、米国）から入手した。ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）はＫＭＦ  Ｌａｂｏｒｃｈｅｍｉｅ（Ｓａｎｋｔ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ、ドイツ）から購入した。
【００７９】
プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｅｎｄｏｆｒｅｅ−Ｍａｘｉキット、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ−Ｇｉｇａキット）はキアゲン（ヒルデン、ドイツ）から購入した。
抗体は、ＢＤ−ファーミンジェン（マウス抗ｈＩＬ−１５；カタログ番号５５４７１２；ハイデルベルグ、ドイツ）、及びＤｉａｎｏｖａ（ヤギ抗マウスＰＯＤ；カタログ番号１５−０３６−００３；ヤギ抗ヒトＰＯＤ；カタログ番号１０９−０３６−０８８；ハンブルグ、ドイツ）から入手した。
【００８０】
ｂ）方法／結果
出発プラスミドは、ｐＳｅｃＴａｇＡベクター骨格内に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒンジ領域、及びＣＨ２、ＣＨ３領域）に融合した改変ヒトＩＬ−１５を含む融合タンパク質のｃＤＮＡを含有する。プラスミドの構造は、本願で引用されたＦｃ部分がマウスＩｇg２ａであること以外はＫｉｍらによって記載されたもの（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：５７４２−５７４８；１９９８）に相当する。
【００８１】
ｐＳｅｃＴａｇＡベクター中に既に存在しているＩｇｋリーダーを、ＩＬ−１５／Ｆｃ部分のインフレームクローニングによって融合タンパク質の分泌に用いた。このため、本来のＩＬ−１５配列から固有のシグナル配列を除去した。しかしながら、クローニングにより、Ｉｇｋリーダー配列の３’端と、ＩＬ−１５コード配列の５’端とのあいだに追加の１０アミノ酸を組み込んだ。これはタンパク質のプロセシング後も分泌タンパク質中に保持された。これらの非特異的アミノ酸を除去し、タンパク質の分泌特性を向上させるために、他の分泌タンパク質又は細胞表面タンパク質のさまざまなリーダー配列について試験した：マウスＩｇｋ（Ｃｏｌｏｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５２：８９−１０４；１９９２；受託番号Ｘ９１６７０）、ヒトＣＤ５（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２３：３４６−３４９；１９８６；受託番号Ｘ０４３９１）、ＣＤ４（Ｈｏｄｇｅら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：９９−１０４；１９９１；受託番号Ｍ３５１６０）、ＭＣＰ−１（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｊｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４４：４８７−４９３；１９８９；受託番号Ｍ２４５４５）、及びＩＬ−２（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：３０５−３１０；１９８３；受託番号Ｋ０２０５６）（受託番号は全米バイオテクノロジー情報センターに基づいている）。Ｉｇｋリーダーと追加のアミノ酸を除去後、リーダーを、２本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることによって記載のシグナルペプチド配列で置換した。配列決定により同一性を確認した。続いて、得られた構築体を、リポフェクタミン２０００を用いたＨＥＫ−２９３細胞の一過性トランスフェクションによって試験した。さまざまな構築体でトランスフェクションされた細胞の細胞培養上清のタンパク質含量を、Ｍｏｌｌ及びＶｅｓｔｗｅｂｅｒの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、９６：７７−８４、１９９９）にしたがいプロテインＡ−セファロース精製後、ＢＣＡアッセイで測定した。融合タンパク質の両成分の存在を確かなものにするため、ＳＤＳゲルの銀染色、及びＦｃ部分又はＩＬ−１５部分に対するウエスタンブロットによってタンパク質の同一性を確認した。記載した実験のうち、ＣＤ５リーダーを用いた場合に最良の結果を得た。更にベクターを最適化し、リーダー自体はもはや分泌融合タンパク質中に存在しないようにするために後者を選択した。
【００８２】
Ｆｃ部分のｃＤＮＡを、エクソン／イントロン構造を含有するゲノムＤＮＡで置換してもタンパク質発現の向上に寄与するかどうかについて更に試験した。核のスプライス装置によって除去されるべきイントロンの存在は、核からのＲＮＡ輸送、及びＲＮＡ安定性を向上させることができる。したがって、ゲノムＦｃ部分を、スプライスドナー及びアクセプター部位を挿入することによってＩＬ−１５ｃＤＮＡ配列に結合させた。得られたプラスミドをさまざまなリーダー配列で同様に改変し、上記のように試験した。しかしながら、ウエスタンブロットによるタンパク質の解析は、さまざまな望ましくないスプライス変異体が存在することを示した。したがって、ｃＤＮＡ型のＦｃ部分を使用し続けることに決定した。
【００８３】
その結果、得られたプラスミドはヒトＣＤ５リーダーとｃＤＮＡ  Ｆｃ部分とを含む。
改変ＩＬ−１５／Ｆｃ発現構築体の配列決定は、Ｆｃ部分が、オリジナルの構築体中に既に存在する３つの変異を含有することを示した。これらの変異のうちの２つは、高度に保存的な位置のアミノ酸に関連する。第３の変異は、分子内及び分子間のシステイン結合の形成を阻止するために意図的に挿入した、ヒンジ領域の４位のＣｙｓ−Ａｌａ変異であった。
【００８４】
Ｃｙｓ−Ａｌａ変異を保持しながら２つの望ましくない変異を除去するために、ＲＴ−ＰＣＲでＦｃ  ｃＤＮＡをサブクローニングした。用いたＲＮＡ源は、ＶＣＡＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築体でトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。増幅したＦｃ  ｃＤＮＡ断片をＣＤ５−ｍｕｔＩＬ−１５プラスミドにクローニングし、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ制限処理でＦｃ部分を除去した。
【００８５】
得られたプラスミドを、異なる制限パターンに基づいて、及びその後の配列決定により再度解析し、ＣＤ５−６Ａｌａ７と称した。ＤＮＡ挿入剤としてのゼオシンの使用は変異を引き起こすため、ＩＬ−１５／Ｆｃの発現カセットをオリジナルのｐＳｅｃＴａｇＡ骨格から切り出し、ＳＶ４０プロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。得られたプラスミドの両方の鎖を配列決定したところ、ＩＬ−１５／Ｆｃ発現カセットとの完全な一致を示した。
【００８６】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションと細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、タンパク質発現について構築体を再度試験した。陽性対照として、平行した実験において、ＣＤ５−６Ａｌａプラスミドでトランスフェクションした。
【００８７】
この目的のため、トランスフェクションの前日に、細胞を５×１０５細胞／ウェルの濃度で３重に６ウェル組織培養プレートに蒔いた。２μｇのプラスミド及び４μｌのリポフェクタミン２０００をそれぞれ２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地で希釈し、トランスフェクションに用いた。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベーションした後、混合液をピペットに取り、組織培養プレートの培地に加えた。
【００８８】
トランスフェクション後２日目に培地を除去し、ヒトＩＬ−１５部分に対するウエスタンブロットでＩＬ−１５／Ｆｃ含量を解析した：２０μｌの細胞培養上清を５μｌの５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、８５℃で５分間インキュベーションした。次にサンプルを１２％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。次にセミドライブロッティングチャンバーを用いてゲルをブロットした。５％ミルクパウダーのＰＢＳ溶液、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含有するブロッキングバッファーでブロットを一晩処理した。次にブロッキング溶液で１：１０００に希釈したマウス抗ヒトＩＬ−１５モノクローナル抗体とともにブロットを４時間インキュベーションした。３回の洗浄工程（１０分間、ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）後、ヤギ抗マウス２次抗体  ペルオキシダーゼ（希釈１：５０００）とともにブロットを室温で更に２時間インキュベーションした。ブロットを再度３回洗浄し、次にＬｕｍｉｌｉｇｈｔ溶液をブロット表面に滴下し、Ｘ線フィルムをブロットに対して感光させた。
【００８９】
ＣＤ５−６Ａｌａ７でトランスフェクションした後に得たシグナル範囲内の特定のウエスタンブロットシグナルは、３回の平行したトランスフェクション全ての細胞培養上清がＩＬ−１５／Ｆｃをタンパク質として含有することを示した。したがって、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミド（図１〜３）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるタンパク質発現に使用できることが示された。
【００９０】
ｃ）結論
ＩＬ−１５／ＦｃプラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７を調製した。これは、ＣＭＶプロモーターの制御下、ヒトＩｇＧ１−ＦｃのｃＤＮＡに融合した改変ヒトＩＬ−１５とともにＣＤ５リーダーを含有する発現カセットを含有する。安定な真核細胞クローンを選択するために、ネオマイシン耐性遺伝子を導入した。プラスミドを配列決定したところ、ベクター骨格に関連性のないほんのわずかな不一致（３塩基対の反復）を有するものの、関連コード領域においては１００％の一致を示した。構築体の機能性はＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションによって確認した。
【実施例２】
【００９１】
所望の産物のＤＮＡを含有するプラスミドによる真核細胞株（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞）のトランスフェクションは、治療用タンパク質を産生するための標準的方法である。それにもかかわらず、このようにして作製した安定な細胞クローンによる低レベルの生産性は広く知られた問題である。したがって、既存の細胞株の生産性を増加させるためのさまざまな戦略がある。細胞においてプラスミドコピー数を増加させる（例えばメトトレキセート／ＤＨＦＲシステムを介した）試みは別として、発現構築体自体を改変することが更に可能である。強力なプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）に加えて、イントロンを導入することにより、より良いＲＮＡ安定性と、細胞のスプライス装置によって行われる核からのより良いＲＮＡ輸送をもたらす可能性がある。それにもかかわらず、イントロン／トランス遺伝子のどの組み合わせが好適か試験しなければならない。この目的のため、ＣＨＯ−Ｋ１細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃ産生を増加させる組み合わせを発見するためにさまざまなイントロンをヒトＩＬ−１５／Ｆｃと組み合わせた。
【００９２】
ａ）材料
出発プラスミドとして用いたプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドである。図１に図示されている。配列は配列番号１に開示されている。
【００９３】
用いた試験システムは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＤＳＭ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ、受託番号ＡＣＣ１１０）、又はＨＥＫ−２９３細胞（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、グリュンベルグ、ドイツ、ＡＥ８０５０３、ＱＢＩ−２９３Ａ）である。大腸菌細胞（ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ、ストラタジーン、ラ・ホーヤ、米国）も用いた。標準の培養条件（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤環境）で細胞を培養した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１週間に２回、１：２０の比で継代した。ＨＥＫ−２９３細胞は１：６の比で継代した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に用いた培地はＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％ＦＫＳ＋１％ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐであり、ＨＥＫ−２９３細胞に用いた培地はＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＫＳ＋１％ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐである。Ｏｐｔｉｍｅｍ１培地をトランスフェクションに用いた。培地は全てインビトロジェン、カルルスルーエ、ドイツ（カタログ番号３１３３１−０２８；３２４３０−０２７；５１９８５−０１８）製を用いた。用いたプラスミドは、ＣＭＶプロモーター及びキメライントロン、ヒトβ−グロブリン遺伝子の５’スプライスドナー部位及びＩｇＧ重鎖の可変領域の３’スプライスアクセプター部位を含有するｐＣｌ−Ｎｅｏ（プロメガ）である。ｐＭＧ（インビトロジェン）は、ＣＭＶ由来のイントロンＡを含有する持続性ＣＭＶプロモーターである。ｐＳｗｉｔｃｈ（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）は合成イントロンＩＶＳ８である。更に、以下の酵素及び制限酵素を用いた：ＡｐａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ、仔ウシ腸由来アルカリホスファターゼ。こらら及び他の分子生物試薬（リポフェクタミン２０００）はインビトロジェンから入手した。ＮｈｅＩはアマシャム−ファルマシア（ウプサラ、スウェーデン）から入手し、プラスミド精製キットはキアゲン、ヒルデン、ドイツから入手した。「エキスパンド  ハイフィディリティＰＣＲシステム」（カタログ番号１  ７３２  ６４１）はロシュ、マンハイム、ドイツから入手した。
【００９４】
ｂ）方法
ｉ）ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドのＩＬ−１５／Ｆｃ挿入物をＮｈｅＩ／ＡｐａＩ消化によって単離した。最初にプラスミドをＡｐａＩ制限処理で線状にし、Ｔ４−ポリメラーゼ処理で５’−突出末端を平滑末端にした。次にその後のＮｈｅＩ消化によってＩＬ−１５／Ｆｃ挿入物を単離した。断片を、ＮｈｅＩ及びＳｍａＩで消化したｐｃＩ  Ｎｅｏと連結した。
【００９５】
ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７のＣＭＶプロモーターを除去し、ｐＭＧ由来のイントロンＡを有する拡張性ＣＭＶプロモーターと置換した：ｐＭＧプラスミドをＰａｃＩで切断し、突出末端をＴ４−ポリメラーゼ処理で平滑末端にした。次のＸｂａＩ処理後、このようにして得た１．７ｋｂ断片はＣＭＶプロモーター＋イントロンＡを含有していたが、これをアガロースゲル電気泳動で精製した。ＣＭＶプロモーターを、ｐｃＤＮＡ３．ｈＣＤ５．６Ａｌａ７から、ＮｈｅＩ及びその後のＮｒｕＩ制限消化で除去した。得られた断片をｐＭＧ−プロモーター  イントロンと４℃で一晩連結させた。
【００９６】
ｉｉｉ）ＩＶＳ８イントロンをＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７内のＣＭＶプロモーターの３’端とＩＬ−１５挿入物の５’端とのあいだにクローニングした。プラスミドをＮｈｅＩ制限消化で線状にし、続いて仔ウシ腸由来アルカリホスファターゼで処理した。イントロンを、ＸｂａＩ制限部位を含有するプライマーを用いて、エキスパンド  ハイフィディリティＰＣＲシステムにて以下の条件下でＰＣＲにより増幅した：用いた反応混合物は、２μｌのｄＮＴＰｓ（キアゲン、Ｔａｑ  ｃｏｒｅキット、それぞれ２ミリモル／ｌ）、２５ｐｍｏｌのプライマー、５μｌの１０×バッファー、０．７５μｌのハイフィディリティＴａｑポリメラーゼ、１μｌ（およそ１５ｎｇ）のｐＳｗｉｔｃｈ−ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ断片から成り、水で容量５０μｌにした。ＰＣＲプログラム（２５サイクル）は以下の通りである：９５℃で５分、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、７２℃で５分。ＰＣＲ産物をＸｂａＩで切断し、０．８％アガロースゲルから溶離し、線状にしたプラスミドと連結させた。
【００９７】
得られたプラスミドで大腸菌ＸＬ１０  Ｇｏｌｄを形質転換し、プラスミドをミニプレップで解析した。好適な制限パターンを示すそれぞれのプラスミドのうち、１つのクローンをその後のエンドトキシンフリープラスミド調製に用いた。
【００９８】
ＩＬ−１５／Ｆｃの発現を、ＨＥＫ−２９３細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクション後に解析した。トランスフェクションの前日に、細胞を５×１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェル細胞培養プレートに２重に蒔いた。Ｆｅｌｇｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７；１９８７）にしたがい、２μｇのプラスミド及び４μｌのリポフェクタミン２０００をそれぞれ２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地に希釈することによってトランスフェクションを行った。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベーションした後、混合物をピペットに取り、細胞培養プレート中の細胞培地に加えた。トランスフェクション後２日目に培地を除去し、ＩＬ−１５／ＦｃのＦｃ部分に対するＥＬＩＳＡ試験でＩＬ−１５／Ｆｃ含量を測定した。
【００９９】
ｃ）結果
さまざまな発現構築体でトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃの分泌は、他のベクター成分にほとんど影響されなかった。逆に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃの発現は、イントロンをＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に挿入した後、２００〜３００倍に増加した。オリジナル構築体ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７は、タンパク質分泌レベルをほとんど検出できなかったが（１０ｎｇ／ｍｌ以下）、イントロンの挿入により、ｐＭＧ１０Ａｌａ７（図４〜６；配列番号２）で細胞をトランスフェクションした後のＩＬ−１５／Ｆｃレベルはおよそ３００ｎｇ／ｍｌであった。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃ発現レベルを示すＥＬＩＳＡデータを図４に示す。ｐＭＧ構築体でトランスフェクションした後の発現レベルが最高であったため、安定なＣＨＯ−Ｋ１発現細胞株を作製するために後者を選択した。
【０１００】
この目的のため、最初にプラスミドを１本鎖配列決定した。構築体の両方の鎖について、ＩＬ−１５／Ｆｃカセット、新たに挿入されたＣＭＶプロモーター、及びイントロン断片を含有する領域を配列決定した。プラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＩＬ−１５／Ｆｃカセットを含有していた。ＣＭＶ（ＭＧプラスミド）由来のイントロンＡは、プロモーターと翻訳開始部位とのあいだに位置していた。プラスミドは、ＩＬ−１５／Ｆｃ断片の下流にＢＧＨポリＡ部位を含有していた；ネオマイシン耐性遺伝子はＳＶ４０プロモーターによって制御され、ＳＶ４０ポリＡ部位も含有していた。プラスミドは、大腸菌における選択及び増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有していた。
【０１０１】
ｄ）考察及び結論
安定なＣＨＯ−Ｋ１−ＩＬ−１５／Ｆｃトランスフェクタントのタンパク質収率を上昇させるために、プロモーターとＩＬ−１５／Ｆｃカセットとのあいだにイントロンを組み込むことによって発現プラスミドを改変した。イントロン−トランス遺伝子−宿主細胞の組み合わせはタンパク質の発現に非常に影響を及ぼすため、解析した２種の細胞において、どのイントロンがＩＬ−１５／Ｆｃ発現増加に最も有効であるかを予測するのは不可能である。
【０１０２】
ＨＥＫ−２９３細胞はイントロンの導入にほとんど影響されなかったが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞ではＩＬ−１５／Ｆｃ分泌の大きな増加が検出された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃタンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーターとｐＭＧ由来イントロンＡとを含有するプラスミドを用いたところ、オリジナルのＩＬ−１５／Ｆｃ発現ベクターと比較して、１桁を越える規模で増加した。プラスミドは、予備臨床試験及び臨床試験のためのＩＬ−１５／Ｆｃの産生、又は工業的ＩＬ−１５／Ｆｃ産生に用いることができるＩＬ−１５／Ｆｃ産生細胞株の作製に用いることができる。
【実施例３】
【０１０３】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の精製
ａ）浄化及び濃縮
６回の実施で、実施例２（ｐＭＧ１０Ａｌａ７プラスミド）の上清およそ３１００リットルを浄化して濃縮し、滅菌ろ過した。これにはＰｒｏｆｉｌｅ  Ｓｔａｒフィルター（３μｍ、２０インチ、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ、ニューヨーク州、米国）による上清の浄化が含まれる。続いて、２．０ｍ２のＢｉｏｍａｘ−３０メンブラン（ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ州、米国）を用いた接線流ろ過システムで上清を全体で１０〜１５倍に濃縮した。入口圧力は２〜２．５ｂａｒ、出口圧力は１．５ｂａｒであった。濃縮後、前置フィルター（Ｐｏｌｙｓｅｐ  ＩＩ（０．２μｍ、１０インチ、ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ州、米国））と、最終フィルター（Ｄｕｒａｐｏｒｅ（０．２２μｍ、１０インチ、ミリポア、ビルリカ、マサチューセッツ州、米国））とから成るフィルターシステムで濃縮物を滅菌ろ過した。６回の濃縮に４．５〜８．５時間を要した。
【０１０４】
ｂ）ｒプロテインＡクロマトグラフィ
浄化及び濃縮工程の貯留産物およそ２４０リットルをｒプロテインＡカラム（２．６リットル）に供した。ローディング中の流速は１０〜１５．４リットル／時間（６５〜１００ｃｍ／時間）であった。続いて、１０カラム容量の２０ミリモル／リットルＴｒｉｓ、１５０ミリモル／リットルＮａＣｌ、ｐＨ７．５でカラムを洗浄した後、１０カラム容量の０．１モル／リットル  クエン酸バッファー、ｐＨ５．０で洗浄した。５カラム容量の０．１モル／リットル  クエン酸バッファー、ｐＨ３．４でＩＬ−１５／Ｆｃを溶出させ、５カラム容量の０．１モル／リットル  クエン酸バッファー、ｐＨ３．０でカラムを剥離させた。ＩＬ−１５／Ｆｃは１本の鋭いピークで溶出した。溶出物は帯黄色であり、粒状成分を含有した。１モル／リットル  クエン酸バッファーで溶出物を直ちにｐＨ３．５に調整した。室温で１時間撹拌を持続しながら、低ｐＨでウイルスを不活化した。１モル／リットル  Ｔｒｉｓを加えて処理を終了させ、ｐＨを８．０に調整した。Ｍｉｌｌｉｐａｋ−２０フィルターを用いて溶出物（８．６リットル）を滅菌ろ過し、１０リットルショットボトル中にて２〜８℃で保存した。
【０１０５】
ｃ）Ｑ−セファロースクロマトグラフィ
Ｑ−セファロース−ＦＦカラムを高さ１２．７ｃｍに充填した。これはカラム容量１．９リットルに相当する。平衡後、ＨＥＴＰ（理論段相当高さ）は０．０４１、非対称性は１．１であった。
【０１０６】
ｒプロテインＡクロマトグラフィの溶出物を、５０リットルのステディムバッグ中にて２０ミリモル／リットル  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で１：５に希釈した。４２．２ｋｇの希釈したｒプロテインＡ溶出物を１．９リットルのＱ−セファロースカラムに供した。カラムを５カラム容量の２０ミリモル／リットル  Ｔｒｉｓ、０．１モル／リットル  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した後、５カラム容量の２０ミリモル／リットル  Ｔｒｉｓ、０．２モル／リットル  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で洗浄した。ＩＬ−１５／Ｆｃは５カラム容量の２０ミリモル／リットル  Ｔｒｉｓ、０．３５モル／リットル  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０で溶出した。５カラム容量の２０ミリモル／リットル  Ｔｒｉｓ、１．０モル／リットル  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０でカラムを剥離させた。Ｑ−セファロースクロマトグラフィの溶出物（５．０リットル）をＭｉｌｌｉｐａｋ−２０フィルターを用いて１０リットルのショットボトル中に滅菌ろ過し、２〜８℃で保存した。黄色混入物の大部分を除去したが、溶出物は依然としてわずかに帯黄色であった。
【０１０７】
２８０ｎｍで光学密度をモニターしたところ、ＩＬ−１５／Ｆｃは溶出の終わる頃に１本の鋭いピークで溶出したことを示した。
ｄ）Ｑ−セファロースクロマトグラフィからの溶出物の、限外ろ過による濃縮
Ｑ−セファロースクロマトグラフィ溶出物を、ＯＤ２８０（２８０ｎｍで測定した光学密度）に基づいて終濃度８．８５ｇ／ｌまで濃縮した。これには０．１ｍ２  Ｂｉｏｍａｘ１０−ｋＤメンブランの使用が含まれる。入口圧力を１．０ｂａｒに、出口圧力を０．５ｂａｒに調整した。濃縮物（１．９リットル）を、５つのアリコートで０．５リットルのＰＥＴＧボトルに滅菌ろ過した。
【０１０８】
ｅ）スーパーデックス−２００クロマトグラフィ
３ｂａｒの圧力下、カラム材料でカラムを充填した。用いたカラムのＨＥＴＰは０．０１３ｃｍであり、非対称性は３．０であった。
【０１０９】
１３．５リットルのスーパーデックス−２００カラムによる連続５回の実施によって、濃縮物の５つのアリコートを精製した。クロマトグラムは、高分子量に小さなピークを、単量体ＩＬ−１５／Ｆｃに主要ピークを示した。画分を回収し、以下の画分を得た。
【０１１０】
【表２】
2007538006.tif 000004
【０１１１】
ｆ）スーパーデックス画分の貯留
スーパーデックス−２００精製画分を、ＨＰ−ＳＥＣ解析で測定した純度に基づいて更なる調製工程に用いた。通常、この目的のために画分５〜１１を貯留した。ＨＰ−ＳＥＣ解析のピーク面積に基づいてＩＬ−１５／Ｆｃ量を計算した。
【０１１２】
ｇ）ウイルスろ過
５回の実施全ての貯留スーパーデックス画分をステディムバッグに移し、貯留し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で最終ＩＬ−１５／Ｆｃ濃度０．８８ｇ／ｌに希釈した。希釈した貯留スーパーデックス画分を、１ｍ２  Ｐｌａｎｏｖａ−３５Ｎ及び１ｍ２  Ｐｌａｎｏｖａ−１５Ｎフィルターで連続的にろ過した。Ｐｌａｎｏｖａ−３５Ｎフィルターの場合、作動圧力は０．５ｂａｒであった。ろ過後、フィルターを３リットルのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄した。０．５ｂａｒでローディング中、ウイルスフィルターを通る流れは１時間あたり１２〜１５リットルであった。洗浄中、洗浄を０．４ｂａｒで実施したため、流れが１時間あたりおよそ１０リットルに減少した。
【０１１３】
ｈ）滅菌ろ過
１６．４ｋｇの最終産物を０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルターを用いて滅菌ろ過し、１リットルのＰＥＴＧボトルに入れた。更に使用するまでボトルを２〜８℃で保存した。
【実施例４】
【０１１４】
ＩＬ−１５/Ｆｃ融合タンパク質の規格
ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット解析
還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、その後の銀染色による解析は、Ｑ−溶出物、貯留スーパーデックス画分、及び最終産物中のＩＬ−１５／Ｆｃは、対照のＩＬ−１５／Ｆｃと類似の移動度であることを示した。数枚のゲルにおいて、Ｑ−溶出物に、低分子量及び高分子量で更なるバンドが見えたが、対照にも存在していた。いくつかの貯留スーパーデックス画分で高分子量の２本のバンドが見えた。これらのバンドは対照でも検出された。高分子量の更なるバンドは、おそらくゲルにローディングする前のサンプルの還元が不十分だったためであり、おそらく静置時間が長いために起きたものである。
【０１１５】
ＩＬ−１５／Ｆｃ最終産物の場合は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、その後の硝酸銀染色において、主要なＩＬ−１５／Ｆｃバンドの他に更なるバンドは検出できなかった。非還元ウエスタンブロットと、その後のＦｃの検出もＩＬ−１５／Ｆｃのみが主要バンドであることを示した。これは、ＩＬ−１５／Ｆｃの品質が全ての工程において同程度であるという事実を証明した。
【０１１６】
ｂ）ＩＬ−１５／ＦｃのＮ−グリコシル化
粗抽出物、浄化及び精製工程、精製中間体、及び最終産物におけるＩＬ−１５／ＦｃのＮ−グリコシル化特性を測定した。天然Ｎ−グリカンあたりの平均シアリル化、並びにＮ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−グリコシルノイラミン酸、及びアシアロ−Ｎ−グリカンの面積の合計に対するＮ−アセチルノイラミン酸の割合面積を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ解析（ＨＰＬＣ：ＢｉｏＬＣ、検出器ＰＡＤ、カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００分析用（２×２５０ｍｍ）、天然Ｎ−グリカンの測定には、バッファーＡ：０．１モル／ｌ  ＮａＯＨ；バッファーＢ：０．１モル／ｌ  ＮａＯＨ、０．６モル／ｌ  酢酸ナトリウム、あるいはアシアロ−Ｎ−グリカンの測定には、バッファーＡ：０．２モル／ｌ  ＮａＯＨ；バッファーＢ：０．２モル／ｌ  ＮａＯＨ、０．６モル／ｌ  酢酸ナトリウム）で決定した。結果を以下の表にまとめる。
【０１１７】
【表３】
2007538006.tif 000005
【０１１８】
より長時間サンプルを放置した場合、浄化及び濃縮とｒプロテインＡクロマトグラフィとのあいだに、平均シアリル化及びＮ−アセチルノイラミン酸の割合の低下が観察された。他の全ての精製工程のグリコシル化は同程度である。
【０１１９】
ｃ）宿主細胞タンパク質
慣用のＩＬＡ試験を用いて、ＮｅｗＬａｂ  ＡＧにて、異なる２日間に宿主細胞タンパク質に関する試験を行った。これは、２．１×１０３及び３．９×１０３ｎｇ／ｍｌの宿主細胞タンパク質の発見をもたらした。これはそれぞれ２．９×１０３ｐｐｍ及び５．３×１０３ｐｐｍに相当する。最終産物における宿主細胞タンパク質に関するＣｙｇｎｕｓ試験（記事番号Ｆ０１５）を用いた更なる試験は、２４０ｎｇ／ｍｌの外来タンパク質を生じた。これは３．３×１０２ｐｐｍに相当する。より短い放置時間では、より低い値も測定された。
【０１２０】
ｄ）Ｎ端配列
最終産物についてＩＬ−１５／Ｆｃの末端配列を決定した。この試験は、Ｎ端配列が（Ａｓｎ／Ａｓｐ）１−Ｔｒｐ２−Ｖａｌ３−Ａｓｎ４−Ｖａｌ５−Ｉｌｅ６−Ｓｅｒ７−Ａｓｐ８−Ｌｅｕ９−Ｌｙｓ１０であることを示した。この試験で決定したアミノ酸配列は、Ｎ端のＡｓｎがおよそ１０％脱アミド化されている（時により高い値もあるが２０％以下である）以外は、予想したＮ端ＩＬ−１５／Ｆｃ配列に相当した。エドマン法による１０％の標準脱アミド化が考慮されている。より長い放置時間はおよそ４５％の脱アミド化を生じた。
【０１２１】
ｅ）効能
最終産物におけるＩＬ−１５／Ｆｃの効能を生物活性試験で測定した。この試験は、ＩＬ−１５で刺激されたマウスＣＴＬＬ−２細胞に対する増殖阻害作用を試験することによって、ＩＬ−１５アンタゴニストであるＩＬ−１５／Ｆｃの生物活性を用量の関数として検出する。ＥＤ５０は１．６５ｎｇ／ウェルであった。
【０１２２】
ｆ）プロテインＡ残余物
ｒプロテインＡカラムから洗浄除去されたｒプロテインＡを最終産物においてｒプロテインＡ特異的ＥＬＩＳＡで測定した。この残余物は＜０．００１％であることがわかった。
【０１２３】
ｇ）ＤＮＡ
最終産物における残留ＤＮＡ含量をＱ−Ｏｎｅで測定した。５ｐｇ／０．５ｍｌ未満の残留ＤＮＡが見られ、これはＩＬ−１５／Ｆｃ  １ｍｇあたり１４ｐｇ未満の残留ＤＮＡに相当した。
【０１２４】
ｈ）ジェネティシン
発酵工程の予備培養中にジェネティシンを加えた。したがって、ジェネティシンが十分に除去されているかどうか調べた。ＩＬ−１５／Ｆｃ最終産物中のジェネティシン濃度は３０ｎｇ／ｍｌ未満であった。
【０１２５】
ｉ）規格
上記方法で得たＩＬ−１５／Ｆｃ産物は以下の規格を有していた：
産物濃度          ０．７０ｍｇ／ｍｌ
産物純度          ９９％
ｐＨ              ７．４
ＥＤ５０            ＜０．１μｇ／ウェル。
【０１２６】
ＩＬ−１５部分及びＦｃ部分を検出することによって産物の同一性を確認した。還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるバンドも対照のバンドと一致した。
【実施例５】
【０１２７】
製剤の調製
ａ）ｐＨの影響
ＩＬ−１５／Ｆｃを、表に示すように、さまざまなバッファー物質及び添加剤で１ｍｇ／ｍｌに希釈した。調整後、０．２μｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃシリンジフィルター、Ｐａｌｌ）を用いてバッファーをろ過した。得られた調製物を１０ｍｌのガラス容器（４ｍｌ／容器）中にて、４０℃及び相対湿度７５％で保存した。
【０１２８】
【表４】
2007538006.tif 000006
【０１２９】
ＩＬ−１５／Ｆｃ製剤の純度を、ＨＰ−ＳＥＣで測定した。ＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（３００×７．８ｍｍ）、及びガードカラムとしてＴＳＫ−ＧＥＬＳＷＸＬカラム（４０×６ｍｍ）をこの目的に用いた。２５℃、流速１ｍｌ／分で操作した。注入容量は５０μｌであった。検出は検出器を用いて２１４ｎｍで行った。用いたＩＬ−１５／Ｆｃサンプルはおよそ１５％の凝集産物を含有していたため、時間０の純度はわずか８５％であった。したがって、８５％の出発物質は活性２量体型である。ｐＨ４で、７日後、ＩＬ−１５／Ｆｃ２量体のピーク面積はおよそ８５％からおよそ４０％へ低下した。純度の低下はｐＨ５．５及びｐＨ６でも観察された。ｐＨ８及びｐＨ７．４の製剤は７日間にわたって４０℃で安定であることが証明された。これは、ｐＨの低下によるＩＬ−１５／Ｆｃの安定性の低下を示唆している。
【０１３０】
更に、製剤を７日保存後、４０℃で非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ｐＨ４の製剤は、およそ７０及び５０ｋＤに分解産物を有する２本のバンドを含有した。ｐＨ６及びｐＨ５．５の製剤も分解産物を有する２本のバンドを含有したが、これらのバンドの見掛けの分子量はおよそ６０及び８０ｋＤであった。ｐＨ４、５．５、及び６における分解産物の見掛けの分子量の差は、異なるｐＨ値における異なる分解工程を示している。
【０１３１】
ｐＨ７．４及び８の製剤は、主要バンドの下に更なるバンドを示さなかった。いずれの製剤においても、主要バンドの上のバンドの増加は観察されず、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、４０℃で７日間保存のあいだに凝集が増加しなかったことを示している。
【０１３２】
ｂ）ｐＨ及び添加剤の影響
ａ）で記載したように、さまざまな製剤を調製して保存した。以下のｐＨ値及び添加剤を用いた。
【０１３３】
【表５】
2007538006.tif 000007
【０１３４】
それぞれの製剤に関し、時間ｔ＝０で浸透圧を測定し、４０℃のｐＨを時間ｔ＝４週間で測定した。
【０１３５】
【表６】
2007538006.tif 000008
【０１３６】
全ての製剤において、製剤のｐＨは、Ｌ−アルギニン含有製剤以外は予測したものと一致した。Ｌ−アルギニン製剤のｐＨは予測ｐＨと比較して非常に高かった。これは、非常に塩基性のアミノ酸Ｌ−アルギニンの作用によって引き起こされた。製剤の安定性の結果を解析するときは、Ｌ−アルギニン製剤の非常に高いｐＨを考慮する必要がある。
【０１３７】
ｐＨ７．４で、グリシンを含有する製剤を除く全ての製剤は等張性であった（＝浸透圧が０．２７０〜０．３３０Ｏｓｍｏｌ／ｋｇ）。ｐＨ７．４のグリシン製剤はわずかに低張であった。
【０１３８】
さまざまな製剤を上記のようなＨＰ−ＳＥＣクロマトグラフィに供した。いくつかのサンプルはピークの形状に変化を示した（ピークの広がり又はテイリング）。ピークの形状は異なるが、全体のピーク面積を２量体のピーク面積と解釈し、純度を決定するために用いた。したがって、これらのピークの純度はおそらく過大評価されている。関係するサンプルをアスタリスク（＊）で表中に印を付した。
【０１３９】
結果は、クエン酸バッファー、ｐＨ６の製剤はいずれも４０℃で安定でなかったことを示している。少なくとも２０％のＩＬ−１５／Ｆｃ２量体の喪失が観察された。添加剤はいずれもクエン酸バッファー、ｐＨ６を用いた製剤において保護活性を示さなかった。同様に、Ｌ−アルギニン含有製剤（高ｐＨ）はいずれも４０℃で安定ではなかった。ショ糖及びグリシンを含有するｐＨ７．４の製剤は、４０℃で３週間安定であった。リン酸バッファー、ｐＨ７．４及びマンニトールを用いた製剤の４週間後の純度の大きな低下は微生物汚染によるものである。わずかだが持続的な純度の低下（８５〜７０％）がＴｒｉｓバッファー、ｐＨ８を用いた製剤で観察された。Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８を用いた製剤において、賦形剤であるショ糖、マンニトール、又はグリシンのあいだに差は観察されなかった。クエン酸バッファー、ｐＨ７．４を用いた製剤でも同様のことが観察された。
【０１４０】
【表７】
2007538006.tif 000009
【０１４１】
個々の製剤の純度もＲＰ−ＨＰＬＣで確認した。この目的のために、Ｖｙｄａｃ−２１４ＴＰ５４カラム（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を用い、２５℃及び流速１ｍｌ／分で操作した。用いた溶離液は、０．１％ＴＦＡを含有する１００％の水から０．１％ＴＦＡを含有する１００％アセトニトリルへの直線勾配である。検出は２１４ｎｍで行った。ＨＰ−ＳＥＣクロマトグラフィにおけるように、ピークの形状が変化した。影響されたサンプルは表中にアスタリスク（＊）で印を付した。一般に、ＲＰ−ＨＰＬＣの結果は、ｐＨ６の製剤及びＬ−アルギニン含有製剤は４０℃で安定でないことを示している。ショ糖及びグリシンを含有するｐＨ７．４及び８の製剤、並びにマンニトールを含有するｐＨ８の製剤は４０℃で少なくとも３週間安定である。マンニトール含有製剤のｐＨ７．４の純度の大きな低下は、微生物汚染が原因であり得る。
【０１４２】
【表８】
2007538006.tif 000010
【０１４３】
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）で更に試験した。３〜８％Ｔｒｉｓ酢酸を含有するゲルをこの目的に用いた。それぞれ０．５μｇのタンパク質２０μｌをゲルに充填した後、１３０Ｖ、１１０ｍＡ、２３Ｗで８０分間ゲル電気泳動を行った。銀染色でバンドを可視化した。ＩＬ−１５／Ｆｃの主要バンドの上のバンドは凝集を示し、主要バンドの下のバンドは分解を示した。ｐＨ６で保存したサンプルでは、４０℃で１週間後に分解が起こったが、ｐＨ８では２週間に凝集の増加が観察された。２週間後の製剤は、ｐＨ７．４で分解を示し、３週間後に分解と凝集を示した。ｐＨ７．４又は８のショ糖又はグリシンを含有するＩＬ−１５／Ｆｃ製剤、及びｐＨ８のマンニトールを含有するＩＬ−１５／Ｆｃ製剤は、４０℃で２週間安定であった。ｐＨ７．４におけるマンニトール含有製剤の分解は、微生物汚染によって引き起こされた。
【０１４４】
６つの製剤（ｐＨ６、７．４、及び８の、それぞれショ糖及びグリシンを含有するサンプルに対応する）を、４週間後の安定性について確認し、Ｔ細胞増殖試験においてＩＬ−１５／Ｆｃのないバッファーと比較して試験した。この目的のために、ＩＬ−１５で刺激したマウスＣＴＬＬ−２細胞に対する増殖阻害作用を調べることによって、ＩＬ−１５／Ｆｃの生物活性を用量の関数として確認した。この目的のために、ＣＴＬＬ−２細胞を最大半量に対する一定濃度のＩＬ−１５で刺激し、ＩＬ−１５／Ｆｃ濃度を増加させてインキュベーションした。Ｔ細胞増殖を比色試験（ロシュ製ＸＴＴ試験）で検出した。直線回帰で活性容量範囲に対して最大半量阻害（ＥＤ５０）を計算した。それぞれのサンプルについて２回測定した。結果は以下の通りである。
【０１４５】
【表９】
2007538006.tif 000011
【０１４６】
これらの結果は、全ての製剤においてＩＬ−１５／Ｆｃが生物学的に活性であることを示している。ショ糖又はグリシン含有リン酸バッファー、ｐＨ７．４で最高の活性を示した。しかしながら、顕著に異なるわけではないが、わずかに低い活性がｐＨ８で観察された。これとは逆に、ｐＨ６で保存した製剤は、ＩＬ−１５／Ｆｃの生物活性が顕著に低かった。バッファー製剤自体はバイオアッセイに全く影響しない。
【０１４７】
いくつかの製剤は、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤグリコシル化解析で安定性についても試験した。この場合、さまざまな製剤中のジシアロ構造、トリシアロ構造、及びテトラシアロ構造の割合を、４０℃で４週間保存後に試験した。
【０１４８】
【表１０】
2007538006.tif 000012
【０１４９】
上記の表が示すように、ジシアロ構造、トリシアロ構造、及びテトラシアロ構造の相対的比率に関し、試験した全ての製剤は同程度であった。アシアロ構造及びモノシアロ構造はさまざまな製剤のあいだで異なっていた。ショ糖を有する製剤は、ショ糖のない製剤及びＩＬ−１５／Ｆｃ対照と比較して、これらの特定の保持時間で複数のピークを含む。グリシン製剤とＩＬ−１５／Ｆｃ対照は、シアロ構造とモノシアロ構造の相対量に関して同程度であった。ショ糖製剤とグリシン製剤との差は、ショ糖を含有する対照製剤（ＩＬ−１５／Ｆｃなし）のバッファーも特定の保持時間にこの余分なピークを含んでいたため、おそらく製剤中のショ糖の存在によって引き起こされるものである。一般に、グリシン又はショ糖の存在下、ｐＨ６、７．４、又は８のＩＬ−１５／Ｆｃ製剤は、ＩＬ−１５／Ｆｃのグリコシル化特性に影響を及ぼさないと結論付けることができる。４０℃で４週間以上保存した後でさえ、グリコシル化パターンに変化は観察されなかった。
【０１５０】
ｃ）結論
ＩＬ−１５／Ｆｃを用いた安定性試験は、製剤の安定性は、ｐＨ４〜８の範囲で非常にｐＨ依存的であることを示唆している。この範囲でｐＨが低下するにつれて安定性が低下する。ｐＨ１０周辺の製剤は、ｐＨ８周辺の製剤よりも安定ではない。最高の安定性はｐＨ７．４及びｐＨ８で観察された。ショ糖、マンニトール、又はグリシンを添加剤として含有するＩＬ−１５／Ｆｃ製剤の中で安定性に特定の差は見られなかった。
【実施例６】
【０１５１】
さまざまなクローンのグリコシル化パターン
更なる実験では、異なる発現レベルを有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質のグリコシル化パターンについて試験した。イントロンのないＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３．１を用いてクローンＫ１４６を調製した。他の全てのクローンはＣＭＶプロモーターとイントロンＡとを有するｐＭＧ１０Ａｌａ７を用いて調製した。クローンＫ１４６の発現レベルは、およそ３〜５ｐｇのタンパク質／（細胞×日数）であった。クローンＫＮ１０及びＫＮ１３の発現レベルは、およそ９〜１３ｐｇのタンパク質／（細胞×日数）であった。最後にクローンＫＮ１１０及びＫＮ１２０の発現レベルは、およそ３０〜５０ｐｇのタンパク質／（細胞×日数）であった。グリコシル化データを以下の表にまとめる。
【０１５２】
【表１１】
2007538006.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体のマップを示す。
【図２】図２は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体の配列（配列番号１）を表す。
【図３】図３は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体の配列（配列番号１）を表す。
【図４】図４は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体のマップを表す。
【図５】図５は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号２）。
【図６】図６は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号２）。
【図７】図７Ａは、ＣＤ５リーダーを有するヒト変異ＩＬ−１５／Ｆｃの核酸配列を表す（配列番号３）。図７Ｂは、ＣＤ５リーダーを有するヒト変異ＩＬ−１５／Ｆｃのアミノ酸配列を表す（配列番号４）。図７Ｃは、ＣＤ５リーダーを有するマウス変異ＩＬ−１５／Ｆｃのアミノ酸配列を表す（配列番号５）。
【図８】図８は、その都度示したリーダー配列を有するｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドでトランスフェクションした後のＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞培養上清中のＩＬ−１５／Ｆｃ含量を表す。
【図９】図９は、さまざまな発現構築体でトランスフェクションした後のＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞培養上清中のＩＬ−１５／Ｆｃ含量を表す。それぞれのバーは、いずれの場合も２回の独立した実験における２回の測定の平均＋ＳＥＭを表す。ｐｃＤＮＡ３．１は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７ベクターに相当する。ｐＶＳ８−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＳｗｉｔｃｈプラスミド（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）に相当する。ｐＭＧ−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＭＧプラスミド（インビトロジェン）に相当する。ｐＣＩＮｅｏ−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＣＩ−Ｎｅｏプラスミド（プロメガ）に相当する。
【図１】
2007538006.tif 000014
【図２】
2007538006.tif 000015
【図３】
2007538006.tif 000016
【図４】
2007538006.tif 000017
【図５】
2007538006.tif 000018
【図６】
2007538006.tif 000019
【図７】
2007538006.tif 000020
【図８】
2007538006.tif 000021
【図９】
2007538006.tif 000022
【配列表】
2007538006000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月25日(2006.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体組成物からのＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の精製方法であって：
ａ）組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供して第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させ、そして
ｂ）工程ａ）の溶出物をイオン交換クロマトグラフィカラムに供して第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
更なる工程：
ｃ）工程ｂ）の溶出物をゲルろ過カラム又は疎水性相互作用クロマトグラフィカラムに供して第３のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる、
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）及びｂ）のうちの少なくとも１つの前又は後に、組成物をろ過及び／又は濃縮する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）の溶出物のｐＨを工程ｂ）の前に酸性にする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
精製後のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の純度が少なくとも９０％である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
純度が少なくとも９０％である、精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項７】
Ｎ−グリカンあたりの平均シアリル化が少なくとも７０％である、請求項６に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項８】
アンテナあたりの平均シアリル化が少なくとも５０％である、請求項６又は７に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項９】
Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、及びアシアロ−Ｎ−グリカンの合計のＮ−グリコリル−ノイラミン酸部分が２０％以下である、請求項６〜８のいずれか１項に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項６〜９の少なくとも１項に記載の精製ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と、賦形剤及び添加剤を含む組成物。
【国際調査報告】
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