(57)【要約】  コロナウイルス感染のための、画像化される動物モデルを説明する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光タンパク質と結合した標識コロナウイルスタンパク質もしくはその断片。
【請求項２】
タンパク質が構造タンパク質もしくは非構造タンパク質である、請求項１に記載の標識コロナウイルスタンパク質。
【請求項３】
構造タンパク質が、ヌクレオカプシド リン酸化タンパク質、スパイク糖タンパク質、膜糖タンパク質、スモールエンベロープタンパク質もしくは血球凝集素-エステラーゼ糖タンパク質からなる一群から選択される、請求項２に記載の標識コロナウイルスタンパク質。
【請求項４】
構造タンパク質が、SARSスパイク糖タンパク質（配列番号）である、請求項２に記載の標識コロナウイルスタンパク質。
【請求項５】
構造タンパク質が、SARSスモールエンベロープタンパク質（配列番号）である、請求項２に記載の標識コロナウイルスタンパク質。
【請求項６】
構造タンパク質が、SARSマトリックスタンパク質（配列番号）である、請求項２に記載の標識コロナウイルスタンパク質。
【請求項７】
蛍光タンパク質が緑色もしくは赤色タンパク質である、請求項１に記載の標識コロナウイルスタンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１つに記載の標識コロナウイルスタンパク質をコードしているコロナウイルスを含んでなる感染の、画像解析可能な動物モデル。
【請求項９】
蛍光タンパク質を発現する宿主である、請求項８に記載の画像解析可能な動物モデル。
【請求項１０】
動物モデルがトランスジェニック緑色蛍光タンパク質発現マウスを含んでなる、請求項９に記載の画像解析可能な動物モデル。
【請求項１１】
抗ウイルス薬をスクリーニングする方法であって、
テスト群の動物および対照群の動物を提供すること（ここで、各群の動物は請求項８〜１０のいずれか１つに記載の動物モデルを含んでなる）；
テスト群に抗ウイルス薬候補を投与すること；
テスト群および対照群によって生じる蛍光発光をモニターすること；
テスト群によって生じる蛍光発光を対照群と比較すること；および
対照群と比較してテスト群で蛍光を減少させる抗ウイルス薬候補を選択すること、
を含んでなる前記方法。
【請求項１２】
有効な抗ウイルス性ワクチンをスクリーニングする方法であって、
テスト群の動物および対照群の動物を提供すること（ここで、各群の動物は請求項８〜１０のいずれか１つに記載の動物モデルを含んでなる）；
テスト群に抗ウイルス性ワクチン候補を投与すること；
テスト群および対照群によって生じる蛍光発光をモニターすること；
テスト群によって生じる蛍光発光を対照群と比較すること；および
対照群と比較してテスト群で蛍光を減少させる抗ウイルス性ワクチン候補を選択すること、
を含んでなる前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第119条(e)項のもとで、米国仮特許出願第60/473,691号、出願日2003年5月27日、からの優先権の利益を主張するものであり、これは参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。
【０００２】
本発明はコロナウイルス感染のためのモデルに関する。より詳細には、本発明は、蛍光タンパク質で標識されたコロナウイルスに感染した動物に関する。
【背景技術】
【０００３】
最近、重症急性呼吸器症候群（SARS）の世界的な大流行が、相当数の死亡をもたらし、旅行計画を混乱させ、何千もの人々が検疫下におかれることとなった。相当短期間で、６カ国の患者から得られた臨床検体を用いて、その感染がコロナウイルスによって引き起こされることが立証された。たとえば、Ksiazek, T.G., et al., New England J. Med. (2003) 348:1947-1958を参照されたい。
【０００４】
コロナウイルス科のウイルスは、約30kbのプラス鎖RNAゲノムを有し、数多くのさまざまな種において呼吸器もしくは腸の感染症を引き起こす。たとえば、de Haan, C.A.M., et al., Virology (2002) 296:177-189を参照されたい。抗原性および遺伝子に関する基準に基づいて、コロナウイルスは3グループに分けられる。コロナウイルス科に共通の特徴は、複製および構造的機能をコードする必須遺伝子である。これらの遺伝子の間に散在するのがグループに特異的なオープンリーディングフレーム（ORF）であって、これはそれぞれのグループ内では相同であるが、グループの間では異なる。
【０００５】
主要な必須遺伝子（ORF）はゲノムの約3分の2を占め、ゲノムの5’末端に位置する。この遺伝子は、２つの大きな前駆体をコードするレプリカーゼ遺伝子であって、これらの前駆体は切断されて、RNA複製および転写のための生成物となる。その他の共通の必須遺伝子は４つの塩基性構造タンパク質N, M, E, およびSをコードする。ヌクレオカプシド（N）タンパク質は、ウイルスRNAをパッケージングしてビリオンのコアを形成する。このヌクレオカプシドコア構造は、膜（M）タンパク質を最も多く含む脂質エンベロープで囲まれている。スモールエンベロープ（E）タンパク質およびスパイク（S）タンパク質はMタンパク質と結合する。Sタンパク質はウイルス-細胞融合および細胞-細胞融合に関わるウイルスペプロマーを形成する。これらの遺伝子はウイルスゲノムの3’側の３番目に位置する。グループ特異的遺伝子の内容および位置はさまざまであって、その機能はいまだすべてが解明されたわけではない。グループ2のウイルスにはマウス肝炎ウイルス（MHV）が属するが、このグループは2つのグループ特異的遺伝子、遺伝子2aおよび血球凝集素-エステラーゼ（HE）ORFを、ORF 1bとS遺伝子の間に有する。さらに2つの、グループ2特異的遺伝子、遺伝子4および5aがS遺伝子とE遺伝子の間に存在する。
【０００６】
MHVは、約31 kbの一本鎖プラス鎖RNAゲノムを有する。Kim, K. H., et al., J. Virol. (1995)69: 2313-2321を参照されたい。MHVゲノムRNAの5’末端は、72から77ヌクレオチド長のリーダー配列を含有する。リーダー配列の下流にMHV特異的遺伝子があり、それらの遺伝子はそれぞれ、特別な、短い遺伝子間配列によって隔てられている。MHV感染細胞は7つの主要なウイルス特異的サブゲノムmRNAを生成する。コロナウイルスmRNAは構造的には多シストロン性であるが、モノシストロン性タンパク質を生成する。コロナウイルスmRNAはnested-set構造で3’末端を共有しており、この場合、各mRNAはその3’隣接遺伝子よりも１遺伝子だけ段階的に長く、各mRNAのいちばん5’側の遺伝子だけが翻訳される。これらのサブゲノムmRNAは、サイズが大きい方から小さくなる順に1から7まで名付けられた。mRNA配列はその5’末端でリーダー配列と融合している。
【０００７】
DBT細胞におけるMHV株JHMの無希釈の連続継代は、結果として2つのタイプに分類可能な欠損干渉(DI)RNAを生じる。一方は複製のためにヘルパーウイルスの感染が必要である。もう一方のDIタイプはDIssAを包含し、これは、大きさはゲノムに近く、ヘルパーウイルスの感染がなくてもそれ自体で複製し、パッケージされてMHV粒子となる。ほとんどすべてのMHV mRNA合成はDIssA複製細胞において強く阻害されるのに対して、mRNA7およびその産物であるNタンパク質の合成は阻害されない。DIssAのRNアーゼT1オリゴヌクレオチドフィンガープリント解析は、DIssAの遺伝子1および遺伝子7は基本的に無傷であるが、遺伝子2から6までに複数の欠失が存在することを示す。ｍRNA７はDIssA鋳型RNAから合成されるが、ヘルパーウイルスの鋳型RNAからは合成されず、遺伝子1産物およびNタンパク質はMHVのRNA合成に十分である。
【０００８】
したがって、DIタイプのDIssAを標識することができれば、複製をモニターするのに十分であると思われる。これが本発明において説明される方法である。
【０００９】
長年に渡って蛍光標識として蛍光タンパク質が使用されてきた。当初単離されたタンパク質は緑色の波長の光を放射したため緑色蛍光タンパク質（GFP）と呼ばれるようになった。このため、数ある中で赤色蛍光タンパク質（RFP）、青色蛍光タンパク質（BFP）、および黄色蛍光タンパク質（YFP）を含めて、さまざまな色のタンパク質が調製されたが、緑色蛍光タンパク質が一般に、こうした蛍光タンパク質の総称的な名称となった。これらのタンパク質の性質は、たとえば米国特許第6,232,523号; 第6,235,967号; 第6,235,968号; および第6,251,384号において検討されており、いずれも参考として本明細書に含めるものとする。これらの特許は、有用な腫瘍モデルであるトランスジェニックな齧歯動物において腫瘍の増殖および転移をモニターするために、さまざまな色の蛍光タンパク質を使用することを記載する。加えて、これらの蛍光タンパク質は、米国出願第09/812,710号ではプロモーターによる発現をモニターするために、米国特許出願第10/192,740号では細菌感染をモニターするために、さらに米国仮出願第60/425,776号ではセルソーティングをモニターするために使用されている。細胞の核および細胞質を標識するために異なる色の蛍光タンパク質を使用することが米国仮出願第60/404,005号および第60/427,604号に記載され、さらに、すべての組織で標識されているため、同じ色の、一貫した蛍光を有するマウスが米国仮出願第60/445,583号に記載されている。これらの文書はすべて、参考として本明細書に含めるものとする。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、蛍光標識されたコロナウイルスを用いて、感受性のある被験動物、好ましくは齧歯類もしくはウサギに感染させる動物モデルを提供するものであって、この場合感染の進行、すなわちコロナウイルスの複製は、蛍光をモニターすることによって追跡することができる。好ましい実施形態において、前記動物は、第1の色の蛍光を発する組織を含んでなるトランスジェニック動物であり、その色を背景として、複製するコロナウイルスを容易に視覚化することができる。このモデルを用いて、治療もしくはワクチン接種あり、およびなし、の場合の感染の進行を直接、見ることによって、ワクチンおよび薬物の有効性を判定することができる。モデルとして、MHVに由来するDIssA特異的な配列を用いて、以下に本発明を説明する。
【００１１】
したがって、ある態様において、本発明は、GFPもしくはRFPのような蛍光タンパク質で標識されたコロナウイルスに関する。別の態様において、本発明は、その標識されたウイルスに感染した動物に関する。また別の態様において、本発明は、本発明の動物モデルを用いて、感染の進行をモニターし、抗ウイルス薬の有効性を評価し、ワクチンの効果を評価する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において有用な手段は、上記の引用によって本明細書に含められる米国特許および特許出願に述べられている。全身イメージング、本発明に有用な蛍光タンパク質の性質、および動物全体を標識する方法は、上記文書に記載されている。
【００１３】
コロナウイルス科の中のさまざまなグループのコロナウイルスに適用可能な、開示される方法。説明のための実例において、ウイルスはRFPで標識されており、全組織でGFPを発現するヌードマウスを背景としてウイルスが見られるが、このような特定の色を選択することも、標識された動物を被験体として使用することも、必須ではない。
【００１４】
組換えコロナウイルス
本発明は、蛍光タンパク質のようなマーカーを発現するように操作された組換えコロナウイルスを使用する。モデル生物に前記の組換えコロナウイルスを感染させることによって、当業者は、宿主動物においてウイルス複製の進行を調べるために組換えウイルスを使用することができる。さらに、組換えコロナウイルスモデル系は、コロナウイルスの複製を遅延または抑制する抗ウイルス薬を同定するアッセイとして有用である。
【００１５】
Cornelisらの研究によれば、コロナウイルスは、ウイルス複製に対して深刻な影響なしに外来遺伝子を発現するように組換え操作することができる。Cornelis, et al., J. Virol. (2003) 77(21):11312-11323は、参考としてその全体を本明細書に含めるものとする。この研究の結果は、ウイルスゲノム内の外来遺伝子の位置が、組換えウイルスベクターのウイルスの複製に影響を与える可能性があることを示唆する。具体的にいうと、Cornelis および共同研究者らは、外来遺伝子の挿入がウイルスゲノムの3’末端に近いほど外来遺伝子の発現レベルが増加することを認めた。したがって、本発明の好ましい実施形態において、蛍光タンパク質コード配列はウイルスゲノム3’末端近くに配置される。
【００１６】
Cornelis および共同研究者らは、研究用にマウスコロナウイルスモデルを利用した。このウイルスの配列は当業者によく知られている。ヒトSARSウイルスの少なくとも１つの変異体が配列決定された（Marra, M.A., et al., “The Genome sequence of the SARS-associated coronavirus” Science 300 (5624), 1399-1404 (2003)）。この配列は公開され、アクセッション：NC 004718として入手可能である。このSARS変異体のゲノム配列は本明細書において、表１の配列番号XXとして与えられる。
【表１】
2007505163.tif 000002
2007505163.tif 000003
2007505163.tif 000004
2007505163.tif 000005
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2007505163.tif 000011
【００１７】
コロナウイルスゲノム内に蛍光タンパク質を配置することは好ましいが、本発明のもう一つの好ましい実施形態は、当業者が動物モデルにおいてウイルスの複製を追跡することを可能にする、ウイルス-蛍光融合タンパク質の構築を与える。ウイルス構造タンパク質も非構造タンパク質も融合タンパク質パートナーとして使用することができる。融合タンパク質パートナーとして使用するのに好ましい構造タンパク質には、ヌクレオカプシドリン酸化タンパク質、スパイク糖タンパク質、膜糖タンパク質、スモールエンベロープタンパク質または血球凝集素-エステラーゼ糖タンパク質があるがそれらに限定されない。これらの各タンパク質の配列は、マウス株およびSARS株を含めて、さまざまなコロナウイルスについて、当技術分野で明らかになっている。
【００１８】
モデル
本発明は、蛍光タンパク質のようなマーカーを発現するよう操作された組換えコロナウイルスを使用する。モデル生物に前記組換えコロナウイルスを感染させることによって、当業者は、組換えウイルスを使用して、宿主動物におけるウイルスの複製の進行を調べることができる。その上、組換えコロナウイルスモデル系は、コロナウイルス複製を遅らせ、または抑制する抗ウイルス薬を同定するためのアッセイとして有用である。
【００１９】
本発明のさまざまな態様で使用される標識は蛍光タンパク質である。このような生殖腺タンパク質、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする天然遺伝子が、生物発光クラゲAequorea victoriaからクローニングされた（(Morin, J., et al., J. Cell Physiol (1972) 77:313-318)）。この遺伝子が利用できることによって、GFPを遺伝子発現用マーカーとして使用することが可能となった。本来のGFPはそれ自体283個のアミノ酸からなる分子量27kDのタンパク質である。GFPは蛍光を発するために、その天然起源から追加のタンパク質を必要とせず、天然起源においてのみ利用できる基質もしくはコファクターも不要である（Prasher, D.C., et al., Gene (1992) 111:229-233; Yang, F., et al., Nature Biotechnol (1996) 14:1252-1256; Cody, C.W., et al., Biochemistry (1993) 32:1212-1218）。発現を強め、励起および蛍光を変更するために、本来のGFP遺伝子の変異体が有用であることが明らかとなり、その結果さまざまな色の“GFP”が、赤色や青色を含めて得られている。GFP-S65T（65位のセリンがスレオニンで置換されている）は、本発明の方法において特に有用であって、その単一励起ピークは490nmである（Heim, R., et al., Nature (1995) 373:663-664)：米国特許第5,625,048号）。また、他の変異体がDelagrade, S., et al., Biotechnology (1995) 13:151-154; Cormack, B., et al., Gene (1996) 173:33-38およびCramer, A., et al., Nature Biotechnol (1996) 14:315-319により発表された。さらに別の変異体が米国特許第5,625,048号において開示されている。適切な改変によって、GFPによる発光スペクトルを変更することができる。このように、”GFP”という用語が本出願においてよく使用されるが、この定義に含まれるタンパク質は、外見上は必ずしも緑色ではない。さまざまな種類のGFPが緑色以外の色を示すが、これらもまた”GFP”の定義の範囲に含まれるのであって、本発明の方法および材料として有用である。その上、本明細書の”GFP”に含まれる緑色蛍光タンパク質は、ウミシイタケ（Renilla reniformis）のような他の生物から分離された。適当で使いやすいどのような形のGFPも、天然型であれ変異型であれ、本発明において有用な病原体を改変するために使用することができる。
【００２０】
混乱を避けるために、単純な用語「蛍光タンパク質」を使用することとする；一般に、この用語は、当然のことながら、Renilla およびAequoreaといったさまざまな生物が生成する蛍光タンパク質、ならびに前記天然蛍光タンパク質の改変型を示すものであって、この改変型は、赤色、黄色およびコバルト色といった、さまざまな目に見える色の蛍光を発することができ、これらはそれぞれ赤色蛍光タンパク質（RFP）、黄色蛍光タンパク質（YFP）、またはコバルト色蛍光タンパク質(CFP)によって示される。一般に、「蛍光タンパク質」および”GFP”または”RFP”という用語は互換的に使用される。
【００２１】
さまざまな色の蛍光タンパク質が利用できるため、２色以上に関するイメージングを同時に行うことができる。たとえば、それぞれ特徴的な蛍光を発現する２つの異なる病原体、または３つの異なる病原体を生物に投与して、提案された治療の特異な効果が評価される。さらに、単一の病原体を単一色で構成的に標識し、異なる色を用いて、細胞内または分泌される遺伝子産物との融合物を作製することができる。したがって、生物標識するために使用するのとは異なる色の蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列それ自体を、調べるべき遺伝子座に挿入することができ、または融合タンパク質として調べるべきタンパク質とともにベクター内に挿入することができる。２色イメージングを用いて、肺のような、モデルの特定の部位に対するウイルスのターゲティングを可視化することができる。さらに、１つまたは複数の病原体をそれぞれ単一色で標識し、関心対象の遺伝子を別の色で、さらに宿主モデルの組織を第３の色で標識することができる。たとえば、蛍光発現コロナウイルスモデルは、全身イメージングによるウイルス複製の可視化を可能にすると思われる。
【００２２】
本発明の方法を用いて、上記の組換えコロナウイルスの複製をモニターすることができ、化学療法薬および抗ウイルス性ワクチンといったさまざまな抗ウイルス薬はコロナウイルスの複製に影響を与える。
【００２３】
本発明の方法は、好ましくは十分な蛍光強度をもつ蛍光タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を発現するように改変された病原体を利用するが、その蛍光は被験体において、侵襲的な技術を必要とせずに見ることができる。リアルタイム観察が可能となるため全身イメージングが好ましいが、たとえば、内視鏡技術を用いてもよく、必要ならば組織または臓器を直接観察もしくは組織化学的に観察するために切除することもできる。
【００２４】
蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、ウイルスゲノムの修飾といった直接修飾によって、病原体に導入し、蛍光タンパク質コード配列をウイルスに内在する調節配列の下で適当な位置に置くことができる、あるいは、適当な発現ベクターを用いて微生物系に導入してもよい。
【００２５】
適切に改変された病原体は次に、必要ならばその病原体が利用すると考えられる感染経路に倣って、または任意の経路で、被験体に投与される。投与は、一般に、注射、胃管栄養法、経口、呼吸器系への噴霧、座剤、粘膜表面との接触によって、または病原体を導入するのに適した当業界で公知の何らかの手段によって行うことができる。
【００２６】
内視鏡検査は個別の組織の切除術と同様に用いることができるが、蛍光イメージングによって、無傷の動物において病原体の移動および感染細胞を可視化することはとりわけ好都合である。これによって、可能性のある抗感染薬およびプロトコルを評価する際に、特にモデル系において、継続的なリアルタイム観察および感染経過のモニタリングが可能となる。このように、候補の薬物もしくはプロトコルを与えられた被験動物において、薬物もしくはプロトコルを与えられていない対照と比較して直接観察される、感染の抑制は、その候補薬物の有効性、および治療としてのその可能性を示すものである。感染を治療すべき被験体において、蛍光イメージングが利用できることによって、治療プロトコルを考案する者が継続的に、プロトコルを変更する、または変更しないことの適否について情報を得ることができる。ある実施形態において、有効な抗ウイルス薬をスクリーニングするために、蛍光標識されたウイルスタンパク質を発現する組換えコロナウイルスを、マウスモデルに注射してウイルスの複製を追跡する。ウイルス感染部位は強い蛍光を発し、CCDカメラおよびGFPフィルターの付いたライトボックス内で青色光励起によって容易に可視化される。
【００２７】
モデルとして使用するのに適した脊椎動物被験体は、好ましくは哺乳類被験体であるが、ウサギ、ラット、マウスなどといった使いやすい実験動物がもっとも好ましい。ヒト被験体により近いため、霊長類を用いることもできる。適当な脊椎動物被験体であればいずれも使用できるが、選択は主として、使いやすさ、および最終目標の系に類似していることによって決定される。最終的には、脊椎動物被験体はヒトとなる。
【００２８】
下記の実施例は本発明を説明するために提示されるが、それを制限するものではない。
【実施例１】
【００２９】
A. 背景
GFPトランスジェニックマウスで増殖したRFP発現腫瘍に基づく腫瘍-宿主相互作用に関するデュアルカラー蛍光イメージングモデルが、腫瘍血管新生、および腫瘍におけるリンパ球浸潤を含めた、腫瘍-間質相互作用のデュアルカラー可視化を可能にすることが、報告されている。ニワトリβ-アクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルスエンハンサーのもとで、GFPを発現するトランスジェニックマウスを宿主として使用した（Okabe, M., et al., FEBS Lett (1997) 407:315-319）。このトランスジェニック系統から得られる組織はすべて、青色励起光の下で緑色の蛍光を発する。RFP発現B16F0(B16F0-RFP)マウスメラノーマ細胞は、pLNCX2-DsRed-2-RFPプラスミドを用いて形質導入された。B16F0-RFP腫瘍およびGFP発現宿主細胞を、同時にクリアに画像化することができた。高解像度デュアルカラー画像によって、腫瘍細胞および宿主細胞を１つ１つの細胞レベルに至るまで解像することが可能となった。線維芽細胞、腫瘍浸潤リンパ球、樹状細胞、血管および毛細血管を含めた宿主細胞は、RFP発現腫瘍細胞から容易に区別することができた。このデュアルカラー蛍光イメージング系は、腫瘍増殖時および腫瘍血管新生時の腫瘍-宿主相互作用を理解するための研究を促進するはずである。デュアルカラーキメラ系も、治療および診断／分析目的で、腫瘍浸潤リンパ球、および他の、腫瘍と相互作用する宿主間質細胞を分析して分離する有力な手段を与える。このモデルの原理は、本発明のデュアルカラーイメージング可能なRFP-MHV-GFP-宿主感染モデルにおいて使用される。
【００３０】
B. 方法
ウイルスおよび細胞：de Haanらの方法（Virol. (2002) 296:177-189）に従う。MHV-A59温度感受性（ts）変異株LA16、プラーククローニングされたMHV-JHM、および元のプラーククローニングされたMHV-JHMを19回無希釈継代した後に得られたウイルスサンプル（JHM19th）を使用する。RNAトランスフェクションおよびウイルスの増殖のためにマウスDBT細胞を使用する。
【００３１】
以下の項ではKim, K. H.の方法（J. Virol. (1995) 69:2313-2321）に従う：
ウイルス特異的細胞内RNAの調製およびノーザン（RNA）ブロッティング：ウイルス特異的RNAをウイルス感染細胞から抽出する。細胞内RNA 1.5mgを変性させ、ホルムアルデヒド含有1%アガロースゲルで電気泳動する。分離されたRNAをナイロンフィルター上にブロットした。フィルター上のRNAをMHV RNAのさまざまな部分に特異的な32P-標識プローブとハイブリダイズする。
【００３２】
RNA転写およびトランスフェクション：プラスミドをXbaI消化によって線状とし、in vitroでT7 RNAポリメラーゼによって転写する。RNAトランスフェクションのために、リポフェクションを用いる。
【００３３】
DIssA-特異的配列を含有するクローンの単離：DIssA関連サブゲノムRNAを増幅するために、まずプライマーとしてオリゴヌクレオチド1116（5'-CTGAAACTCTTTTCCCT-3'）（配列番号XX）を用いてcDNAを細胞内RNAから合成するが、このオリゴヌクレオチドはプラス鎖MHV mRNAと、mRNA7の5’末端から250-267ヌクレオチドの位置で結合する。その後MHV-特異的cDNAをオリゴヌクレオチド78（5'-AGCTTTACGTACCCTCTCTACTATAAAACTCTTGTAGTTT-3'）（配列番号XX）とともにインキュベートするが、このオリゴヌクレオチドは、RCPバッファー（0.05 M KCl、0.01 M Tris-HCl [pH 8.3]、0.0025 M MgCl2、0.01% ゼラチン、0.17 mM の各デオキシヌクレオシド三リン酸、5 U Taq ポリメラーゼ [Promega]）中で93.8℃にて30秒、37.8℃にて45秒、および72.8℃にて100秒を25サイクル繰り返して、MHV RNAのアンチリーダー配列に結合する。DIssAサブゲノムRNAはアガロースゲル電気泳動によって分離され、MHVゲノムRNAの3’末端から1.5-1.7kbに相当するプローブとハイブリダイズした。このプローブはすべてのMHV mRNAとハイブリダイズする。DIssAサブゲノムRNA-特異的RT-PCR産物をゲルから溶出して、TAクローニングベクター（Invitrogen）中にクローニングする。DIssA-特異的配列を含有するクローンを、サザンブロット分析用に使用されたプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションによって単離する。DIssA RNAを増幅するために、まずcDNAを、プライマーとしてオリゴヌクレオチド1116を使用することによって、ゲルで精製されたDIssA RNAから合成する。DIssA-特異的cDNAを次に、オリゴヌクレオチド10121（5'-GAAGGGTTGTATGTGTTG-3'）（配列番号XX）とともにインキュベートするが、このオリゴヌクレオチドは、PCRバッファー中、上記PCR条件下で、マイナス鎖MHV RNAと、遺伝子2の5’末端からヌクレオチド798-815の位置で結合する。DIssA-特異的RT-PCR産物は調製用ゲルから溶出され、TAクローニングベクター中にクローニングする。DIssA-特異的配列を含有するクローンを、MHV遺伝子2-1でハイブリダイズするプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションによって単離する。
【００３４】
RFPと結合したマウス肝炎ウイルス完全長cDNAの構築：DIssAは上記のようにほとんど無傷のMHV遺伝子1および7を有する、天然に存在する自己複製DI RNAである。本発明者らは、MHVのcDNAの遺伝子1および7、ならびにRFP遺伝子を、細菌人工染色体(BAC)pBeloBACIIにおいて隣接させ、その5’末端では、CMV最初期プロモーターが続き、その3’末端ではポリ(A)テイルが続き、次々に肝炎デルタウイルス リボザイムおよびウシGH終止およびポリアデニル化配列pBAC-MHV-RFPが続く（Almazan, F., et al., PNAS (2000) 97:5516-5521を参照されたい）。
【００３５】
cDNAクローンから得られた感染性ウイルスのトランスフェクションおよび回収：この手順においてAlmazan, F.らの方法（PNAS (2000) 97:5516-5521）を使用する。pBAC-MHV-RFPによってトランスフェクトするためにマウスDBT細胞を用いる。2日間インキュベートした後、細胞上清を回収し、新調製DBT細胞上で6回継代した。細胞上清中に存在するウイルスは、plaque titrationおよびRT-PCRによって分析された。
【００３６】
RFP発現ベクター（Yang, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3824-3829を参照されたい）。pLNCX2ベクターはCLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)から購入する。pLNCX2ベクターは、真核細胞において抗生物質選択するためにネオマイシン耐性遺伝子を含有する。赤色蛍光タンパク質（RFP）（DsRed2, CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）は、pLNCX2ベクター内のEgl IIおよびNot I部位に挿入される。
【００３７】
RFPベクター作製（Yang, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3824-3829を参照されたい）。レトロウイルス形質導入のために、10 Alウイルスエンベロープを発現する、NIH3T3由来パッケージング細胞株であるPT67を、CLONTECH Laboratories, Inc.,から購入する。PT67細胞は、10%熱失活ウシ胎仔血清（FBS）（Gemini Bio-products, Calabasas, CA）を添加したDME（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）中で培養する。ベクター作製のために、70%コンフルエントな状態のパッケージング細胞（PT67）をDOTAP（商標名）試薬（Boehringer Mannheim）および飽和量のpLEIN-GFP または pLNCX2-DsRed-2-RFPプラスミドの沈降混合物とともに18時間インキュベートする。この時点で培地を補充する。トランスフェクションの48時間後、蛍光顕微鏡により細胞を検査する。選択のために、段階的に濃度を増加させたG418（500μg/ml-2000μg/ml）の存在下で（Life Technologies, Grand Island, NY）細胞を７日間培養する。
【００３８】
ウイルス-宿主相互作用のデュアルカラーイメージング：組換えコロナウイルスをGFPトランスジェニックマウスに感染させた後、新鮮な組織を〜1mm3の小片に切断する。検査前に、この組織を、トリプシン／EDTAを用いて37℃にて10分間消化する。トリプシン処理後、組織を前処理済み顕微鏡スライド（Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）に載せて、カバーガラス（Fisher Scientific）で覆う。カバーガラスを押すことによって、十分薄くなるように組織を押しつけ、スライドガラス上に無傷の脈管構造を示す。コロナウイルスに感染したGFP蛍光を発する宿主細胞を蛍光顕微鏡下で容易に観察することができる。キメラ系の全身デュアルカラーイメージングのためにレーザーに基づくシステムを用いることができる（下記を参照されたい）。蛍光によるすべての結果は、標準的な免疫組織化学的技法によって確認され、RFP-MHVに感染したあらゆるタイプの宿主を同定する。
【００３９】
蛍光イメージング（Yang, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3824-3829を参照されたい）。50W水銀ランプ電源を備えたライカ蛍光実体顕微鏡LZ12モデルを、最初の低解像度イメージングに使用する。GFPおよびRFP蛍光を両方とも同時に可視化するために、D425/60バンドパスフィルターおよび470 DCXRダイクロイックミラーを介して励起する。蛍光発光を、ロングパスフィルターGG475（Chroma Technology, Brattleboro, VT）を通して集める。マクロイメージングはライトボックス（Lightools Research, Encinitas, CA）内で行う。GFPおよびRFP腫瘍の両者の蛍光励起はスリットファイバーオプティクスにより、干渉フィルター（440+/-20nm）を通してライトボックス内で行う。520nmロングパスフィルターを通して蛍光が観察される。Hamamatsu C5810 3-チップ冷却カラーCCRカメラ(Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater, NJ)で、顕微鏡およびライトボックスから得られた画像を撮る。レーザーによるイメージングは、Spectra Physics製 3941-M1BB型 二光子レーザー、Photon Technology Intl.製GL-3300型窒素レーザーおよびPhoton Technology Intl.製GL-302型色素レーザーを用いて行う。画像は、Image Pro Plus 4.0 ソフトウェア(Media Cybernetics, Silver Springs, Maryland)を用いてコントラストと明度を加工し分析する。1024x724ピクセルの高解像度画像は直接IBM PCに記録され、またはビデオ出力を介して連続的に高解像度ソニーVCR SLV-R1000(ソニー株式会社、東京、日本)に記録される。
【００４０】
多光子レーザー共焦点顕微鏡法（Wang, W., et al., Cancer Research (2002) 6278-6288）。GFP蛍光に最適な波長である960nmで、Radiance 2000 マルチフォトンシステム(Bio-Rad, Hercules, CA)とともに、二光子レーザー（Spectra Physics製 3941-M1BB）をここでも使用する。画像はBio-Rad’s Lasersharp 2000ソフトウェアを用いて得られる。励起は観察すべき光学的断層面のみに限定される。フルオロフォアの励起は、焦点面にない960nmの波長では起こらない。Millenia, Tsunami Ti:サファイアレーザーはSpectra Physics製 3941-M1BB型 二光子レーザーの装備品であるが、RFP多光子イメージング用の長波長オプティクス（1,000nmを越える）を有する。画像はImage Pro Plus 4.0 ソフトウェアで加工する。
【００４１】
スペクトル分解。スペクトルイメージングは、すべての画素で高分解能光学スペクトルを有する画像を生じ、ウイルスRFPシグナルをGFP標識された宿主のシグナルから分離して混在しないようにする。標準的なGFP-マウスイメージングシステム（ロングパス発光フィルター）は、通常のカラーカメラを冷却モノクロカメラ（Roper Scientific CCD 冷却デジタルカメラ）に置き換えることによって改変され、液晶可変フィルター（CRI, Inc., Woburn, MA）を通常のマクロレンズの前に設置する。典型的には、一連の画像が500から650nmまで10nmごとに取得され、自動的にメモリーに集積されてスペクトルの「積重ね」となる。あらかじめ規定されたGFPもしくはRFPおよび自己蛍光スペクトルを用いて、一次結合ケモメトリクスに基づくアルゴリズムにより、イメージを、異なる画像に分解することができるが、それは自己蛍光シグナルのみ、またはGFPもしくはRFPシグナルのみを含有する画像を生じ、基本的には黒を背景に見ることができる。スペクトル自己蛍光除去法によって、シグナルのノイズ比が改善されることにより、感度が向上する。GFP-もしくはRFP標識腫瘍モデルにより与えられる利点は、非侵襲性で高選択的なイメージングを可能にするが、さらに、波長選択的なイメージング技術および肺のような深部臓器の腫瘍を画像化する分析法を使用することによって高められる（私信、Richard Levenson, CRI, Inc., Woburn, MA）。
【００４２】
イメージングの深度：内蔵にあるウイルス感染細胞の、単一細胞もしくは顕微鏡レベルのコロニーを外部から可視化することが本願の１つの目的である。このような能力のイメージングは、励起光および放射光の散乱を減少させることが必要である。生きた動物により深く透過するために多光子および単光子レーザーを使用することができると思われる。共焦点顕微鏡法も多光子レーザーと併せて使用することができる。比較的長波長の励起光、約470nm（GFP二光子については960nm、RFP二光子については1,220nm）は組織を損傷しないと思われる。多光子共焦点システムは、照射領域を高度に限定し、宿主組織をいっそう保護する。皮弁も散乱を大きく減少させるが、本発明者らはすでにこれにより外部からの単一細胞イメージングが可能となることを明らかにした。長波長Ds-Red-2-RFPの使用も散乱を減少させる。
【００４３】
C. 結果
感染マウスをさまざまな投薬計画で治療し、薬物の有無でウイルスの複製を評価する。ウイルスの複製を減少させることに成功した薬物を治療薬として有望な候補として同定する。
【００４４】
同様に、テストすべき免疫化手順を受けたマウスを、免疫化後、感染レベルのMHVコロナウイルスに曝露する。次に、曝露後に被験体が感染に抵抗する能力を評価する。
【国際調査報告】
2007505163.tif 000012
2007505163.tif 000013