(57)【要約】  クロストリジウム毒素、例えばボツリヌス毒素の経口投与によって食欲を抑制する方法。
2007501285.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃細胞によるグレリン分泌を抑制する方法であって、グレリンを分泌しうる胃細胞にボツリヌス毒素を投与し、それによって該胃細胞からのグレリン分泌を抑制するステップを含んでなる方法。
【請求項２】
ボツリヌス毒素が、A型、B型、C型、D型、E型、F型およびG型のボツリヌス毒素からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ボツリヌス毒素がA型ボツリヌス毒素である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
投与ステップが、ボツリヌス毒素の経口摂取のステップを含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ボツリヌス毒素投与から10日以内に、ボツリヌス毒素投与を受けた患者の血漿サンプルにおける血漿グレリンレベルが100fmol/ml患者血漿未満となる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
胃細胞によるグレリン分泌を抑制する方法であって、グレリン分泌胃細胞に対しA型ボツリヌス毒素を経口摂取させ、それによって該胃細胞からのグレリン分泌を抑制するステップを含んでなる方法。
【請求項７】
下垂体細胞からの成長ホルモン放出を抑制する方法であって、グレリンを分泌しうる胃細胞にボツリヌス毒素を投与し、それによって該胃細胞からのグレリン分泌を抑制し、下垂体細胞からの成長ホルモン放出を抑制するステップを含んでなる方法。
【請求項８】
ボツリヌス毒素が、A型、B型、C型、D型、E型、F型およびG型のボツリヌス毒素からなる群から選択される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ボツリヌス毒素がA型ボツリヌス毒素である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
投与ステップが、ボツリヌス毒素の経口摂取のステップを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ボツリヌス毒素を処置有効量で投与する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
食欲を抑制する方法であって、ボツリヌス毒素を経口投与し、それによって食欲を抑制するステップを含んでなる方法。
【請求項１３】
ボツリヌス毒素が、A型、B型、C型、D型、E型、F型およびG型のボツリヌス毒素からなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ボツリヌス毒素がA型ボツリヌス毒素である請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
投与ステップが、胃細胞からのグレリン放出を抑制するためのボツリヌス毒素の経口摂取のステップを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ボツリヌス毒素を処置有効量で投与する請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
食欲を抑制する方法であって、グレリンを分泌しうる胃細胞にA型ボツリヌス毒素を経口投与し、それによって該胃細胞からのグレリン分泌を抑制し、食欲を抑制するステップを含んでなる方法。
【請求項１８】
食欲を抑制する方法であって、ボツリヌス毒素を経口投与するステップを含んでなり、ボツリヌス毒素を、胃細胞によるグレリン分泌を抑制するのに充分であるがボツリヌス毒素の全身的毒性の症状を引き起こすには不充分な量で経口投与する方法。
【請求項１９】
ボツリヌス毒素が、A型、B型、C型、D型、E型、F型およびG型のボツリヌス毒素からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ボツリヌス毒素がA型ボツリヌス毒素である請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食欲を抑制する方法に関する。本発明は特に、クロストリジウム毒素の投与によって食欲を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食欲抑制剤
正常な消化においては、食物は口から食道を経て胃に移動する。胃は塩酸および酵素のペプシンを産生して食物を消化する。食物は胃から小腸上部である十二指腸に移動し、そこでも消化および栄養吸収が続けられる。肥満および過食は多くの人々における慢性病であり、肥満および過食を処置するためのさまざまな薬剤を入手することができる。体重減少薬剤の多くは食欲抑制剤であり、食欲の抑制または満腹感の増強によって体重減少を促進する。このような医薬は、気分および食欲に影響する２種の脳内化学物質のセロトニンまたはカテコールアミンを増加させることによって、食欲を抑制する。肥満および過体重の個体が体重を減少すると、健康に関する多くの危険性を、例えば血圧、コレステロールおよびトリグリセリド（脂肪）の低下によって、またインスリン抵抗性の低下によって、低下することができる。
【０００３】
一般的な体重減少剤は、オルリスタット（Xenical）、フェンフルラミン（Pondimin）、デクスフェンフルラミン（Redux）およびシブトラミン（Meridia）を包含する。しかしながら、さまざまな体重減少剤または食欲抑制剤の使用による重大な副作用（死亡を包含する）が報告されている。すなわち、食物脂肪の吸収能を約３分の１低減することによって作用するオルリスタットは、排ガス、急激な便意、油または脂肪質の便、腸運動頻度の増加、および腸運動を制御できないこと、といった副作用を示す。
【０００４】
更に、セロトニン放出および再吸収に影響する２つの承認された食欲抑制剤であるフェンフルラミンおよびデクスフェンフルラミンは、致命的な心臓弁膜症を起こす可能性に関連付けられたことにより、市場から回収された。また、カテコールアミンレベルに影響する医薬（例えばフェンターミン、ジエチルプロピオンおよびマジンドール）は、不眠、神経質および多幸感の症状をもたらしうる。
【０００５】
更に、体重制御剤のシブトラミンは、血圧および心拍数の顕著な上昇を招いている。すなわち、現在用いられている食欲抑制剤には、多くの短所、欠点がある。
【０００６】
グレリン
グレリン（Ghrelin）は、ヒトにおいてある種の内分泌腺、例えば胃細胞から産生および放出されるアミノ酸２７または２８個の関連ペプチドのファミリーの名称である（Kojima，M．ら，Nature，402，656-660，1999；Hosoda，H.ら，J. Biol. Chem.，May 8, 2000）。グレリンは、セリン残基に必ずオクタノイルエステルが結合していることをも特徴とする。グレリンは、動物およびヒトにおける成長ホルモン（ＧＨ）の強力な放出剤として知られている。
【０００７】
更に、グレリンは成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ）の内因性リガンドであり、下垂体成長ホルモン（ＧＨ）分泌を調節する。ＧＨＳ−Ｒは視床下部ニューロンおよび脳幹に分布している。グレリンは、エネルギー消費または運動活動にあまり変化を及ぼすことなく脂肪利用を減少することによってエネルギーバランスに関与しているようである。日常的にグレリンを末梢投与すると、脂肪利用の減少によって体重増加が起こることが示されている。グレリンを脳室内投与すると、用量依存的に食物摂取および体重が増加した。血清グレリン濃度は絶食によって上昇し、再摂食またはグルコース経口投与によって低下したが、水摂取によっては低下しなかった。脳腸ペプチドとしてのグレリンは、ＧＨ分泌を調節するという役割を担うことに加え、食物摂取および体重の調節にも関与することができる。
【０００８】
図１に示すように、グレリンは胃の内分泌細胞によって分泌され、より長いプロ-グレリンペプチドから解裂されて、下垂体からの成長ホルモン放出を誘発する。
【０００９】
ボツリヌス毒素
クロストリジウム属には127を越える種があり、形態学および機能に従って分類されている。嫌気性グラム陽性細菌であるボツリヌス菌（Clostridium botulinum）は、ボツリヌス中毒と呼ばれる神経麻痺性障害をヒトおよび動物において引き起こす強力なポリペプチドクロストリジウム毒素であるボツリヌス毒素を産生する。ボツリヌス菌の胞子は土壌中に見出され、滅菌と密閉が不適切な零細缶詰工場の食品容器内で増殖する可能性があり、これが多くのボツリヌス中毒症例の原因である。ボツリヌス中毒の影響は、通例、ボツリヌス菌の培養物または胞子で汚染された食品を飲食した18〜36時間後に現れる。ボツリヌス毒素は、消化管内を弱毒化されないで通過することができ、そして末梢運動ニューロンを攻撃することができるようである。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死にまで進行し得る。
【００１０】
A型ボツリヌス毒素は、人類に知られている最も致死性の天然の生物学的物質である。市販A型ボツリヌス毒素（精製されたクロストリジウム毒素複合体；100単位バイアルとして、BOTOX（登録商標）の商標でAllergan，Inc．（カリフォルニア州アービン）から入手可能である）の約50ピコグラムがマウスにおけるLD50（すなわち1単位）である。1単位のBOTOX（登録商標）は、約50ピコグラム（約56アトモル）のA型ボツリヌス毒素複合体を含む。興味深いことに、モル基準でA型ボツリヌス毒素の致死力はジフテリアの18億倍、シアン化ナトリウムの6億倍、コブロトキシンの3000万倍、コレラの1200万倍である。Natuaral Toxins II［B. R. Singhら編、Plenum Press、ニューヨーク（1996）］のSingh、Critical Aspects of Bacterial Protein Toxins、第63〜84頁（第4章）（ここで、記載されるA型ボツリヌス毒素LD50  0.3ng＝1Uとは、BOTOX（登録商標）約0.05ng＝1Uという事実に補正される）。1単位（U）のボツリヌス毒素は、それぞれが18〜20グラムの体重を有するメスのSwiss Websterマウスに腹腔内注射されたときのLD50として定義される。
【００１１】
7種類の血清学的に異なるボツリヌスクロストリジウム毒素が特徴付けられており、これらは、型特異的抗体による中和によってそのそれぞれが識別されるボツリヌスクロストリジウム毒素血清型A、B、C1、D、E、FおよびGである。ボツリヌス毒素のこれらの異なる血清型は、それらが冒す動物種、ならびにそれらが惹起する麻痺の重篤度および継続時間が異なる。例えば、A型ボツリヌス毒素は、ラットにおいて生じる麻痺率により評価された場合、B型ボツリヌス毒素よりも500倍強力であることが確認されている。また、B型ボツリヌス毒素は、霊長類では480U/kgの投与量で非毒性であることが確認されている。この投与量は、A型ボツリヌス毒素の霊長類LD50の約12倍である。Jankovic, J.ら編、"Therapy With Botulinum Toxin"(1994)（Mercel Dekker, Inc.）の第71-85頁、第6章の、Moyer Eら、Botulinum Toxin Type B: Experimental and Clinical Experience。ボツリヌス毒素は、コリン作動性の運動ニューロンに大きな親和性で結合して、ニューロンに移動し、アセチルコリン放出を阻止するようである。
【００１２】
血清型に関係なく、毒素中毒の分子メカニズムは類似し、少なくとも3つの過程または段階を含むようである。第1段階において、毒素は、重鎖（H鎖）と細胞表面受容体との特異的相互作用によって、標的ニューロンのシナプス前膜に結合する。受容体は、ボツリヌス毒素の各血清型および破傷風毒素で異なると考えられる。H鎖のカルボキシル末端セグメント(HC)は、毒素を細胞表面に指向させるのに重要であるようである。
【００１３】
第2段階において、毒素は、冒した細胞の形質膜を横切る。毒素は、初めに、受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞に包み込まれ、毒素を含有するエンドソームが形成される。次に、毒素は、エンドソームから該細胞の細胞質中に逃れ出る。この段階は、約5.5またはそれ以下のpHに反応して毒素のコンフォメーション変化を誘発するH鎖のアミノ末端セグメント(HN)によって媒介されると考えられる。エンドソームは、エンドソーム内pHを低下させるプロトンポンプを有することが既知である。コンフォメーションのシフトは毒素中の疎水性残基を露出させ、これが、毒素をエンドソーム膜内に埋込むことを可能にする。次に、毒素（または少なくともその軽鎖）が、エンドソーム膜を通って細胞質に移動する。
【００１４】
ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最終段階は、重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）を結合するジスルフィド結合の減少を伴うようである。ボツリヌス毒素および破傷風毒素の全毒素活性は、ホロトキシンのL鎖に含まれる。L鎖は亜鉛(Zn++)エンドペプチダーゼであり、これは、神経伝達物質を含有する小胞の認識および形質膜の細胞質表面とのドッキングならびに小胞と形質膜との融合に必須であるタンパク質を選択的に開裂する。破傷風クロストリジウム毒素、ボツリヌス毒素B、D、FおよびG型は、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプトブレビン[小胞関連膜タンパク質(VAMP)とも称される]の分解を引き起こす。シナプス小胞の細胞質表面に存在する大部分のVAMPは、これらの開裂現象のいずれかの結果として除去される。A型およびE型ボツリヌス毒素はSNAP-25を開裂する。C1型ボツリヌス毒素ははじめはシンタキシンを開裂すると考えられたが、シンタキシンおよびSNAP-25を開裂することがわかった。各毒素は異なる結合を特異的に開裂する。ただし、B型ボツリヌス毒素（および破傷風毒素）は同じ結合を開裂する。
【００１５】
すべてのボツリヌス毒素血清型が神経筋接合部における神経伝達物質アセチルコリンの放出を阻害するようであるが、そのような阻害は、種々の神経分泌タンパク質に作用し、かつ／またはこれらのタンパク質を異なる部位で切断することによって行われる。例えば、A型およびE型ボツリヌス毒素はいずれも、25キロダルトン（kD）のシナプトソーム関連タンパク質（SNAP-25）を切断するが、それぞれ異なるタンパク質内アミノ酸配列を標的とする。B型、D型、F型およびG型のボツリヌス毒素は小胞関連タンパク質（VAMP、これはまたシナプトブレビンとも呼ばれる）に作用し、それぞれの血清型によってこのタンパク質は異なる部位で切断される。最後に、C1型ボツリヌス毒素は、シンタキシンおよびSNAP-25の両者を切断することが明らかにされている。作用機序におけるこれらの相違が、様々なボツリヌス毒素血清型の相対的な効力および／または作用の継続時間に影響していると考えられる。明らかに、ボツリヌス毒素の基質は、多様な細胞種に見られる。例えばGonelle-Gispert, C.ら、SNAP-25a and -25b isoforms are both expressed in insulin-secreting cells and can function in insulin secretion, Biochem J. 1; 339 (pt 1): 159-65: 1999、並びにBoyd R.S.ら、The effect of botulinum Clostridial toxin-B on insulin release from a ∋-cell line、およびBoyd R.S.ら、The insulin secreting ∋-cell line, HIT-15, contains SNAP-25 which is a target for botulinum Clostridial toxin-A、いずれもMov Disord, 10(3):376:1995（膵島B細胞は少なくともSNAP-25およびシナプトブレビンを含有する）参照。
【００１６】
ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、既知のボツリヌス毒素血清型の7つのすべてについて約150kDである。興味深いことに、これらのボツリヌス毒素は、会合する非毒素タンパク質とともに150kDのボツリヌス毒素タンパク質分子を含む複合体としてクロストリジウム属細菌によって放出される。例えば、A型ボツリヌス毒素複合体は、900kD、500kDおよび300kDの形態としてクロストリジウム属細菌によって産生され得る。B型およびC1型のボツリヌス毒素は700kDまたは500kDの複合体としてのみ産生されるようである。D型ボツリヌス毒素は300kDおよび500kDの両方の複合体として産生される。最後に、E型およびF型のボツリヌス毒素は約300kDの複合体としてのみ産生される。これらの複合体（すなわち、約150kDよりも大きな分子量）は、非毒素のヘマグルチニンタンパク質と、非毒素かつ非毒性の非ヘマグルチニンタンパク質とを含むと考えられる。これらの2つの非毒素タンパク質（これらは、ボツリヌス毒素分子とともに、関連するクロストリジウム毒素複合体を構成し得る）は、変性に対する安定性をボツリヌス毒素分子に与え、そして毒素が摂取されたときに消化酸からの保護を与えるように作用すると考えられる。また、より大きい（分子量が約150kDよりも大きい）ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からのボツリヌス毒素の拡散速度を低下させ得ると考えられる。
【００１７】
すべてのボツリヌス毒素血清型は、神経活性となるためにはプロテアーゼによって切断またはニッキングされなければならない不活性な単鎖タンパク質としてボツリヌス菌によって合成される。A型およびG型のボツリヌス毒素血清型を産生する細菌株は内因性プロテアーゼを有するので、A型およびG型の血清型は細菌培養物から主にその活性型で回収することができる。これに対して、C1型、D型およびE型のボツリヌス毒素血清型は非タンパク質分解性菌株によって合成されるので、培養から回収されたときには、典型的には不活性型である。B型およびF型の血清型はタンパク質分解性菌株および非タンパク質分解性菌株の両方によって産生されるので、活性型または不活性型のいずれでも回収することができる。しかし、例えば、B型ボツリヌス毒素を産生するタンパク質分解性菌株でさえも、産生された毒素の一部を切断するだけである。
【００１８】
切断型分子と非切断型分子との正確な比率は培養時間の長さおよび培養温度に依存する。したがって、例えばB型ボツリヌス毒素の製剤はいずれも一定割合が不活性であると考えられ、このことが、A型ボツリヌス毒素と比較したB型ボツリヌス毒素の低い効力の原因であると考えられる。臨床製剤中に存在する不活性なボツリヌス毒素分子は、その製剤の総タンパク質量の一部を占めることになるが、このことはその臨床的効力に寄与せず、抗原性の増大に関連づけられている。
【００１９】
ボツリヌス毒素および毒素複合体は例えば、List Biological Laboratories, Inc.（キャンベル、カリフォルニア）；the Centre for Applied Microbiology and Research（ポートン・ダウン、イギリス）；Wako（日本、大阪）；およびSigma Chemicals（セントルイス、ミズーリ）から入手し得る。市販のボツリヌス毒素含有医薬組成物には、次のものが包含される：BOTOX（登録商標）（A型ボツリヌス毒素クロストリジウム毒素複合体とヒト血清アルブミンおよび塩化ナトリウムを含む。使用前に0.9％塩化ナトリウムで再構成する凍結乾燥粉末として、100単位バイアルで、カリフォルニア、アーヴィンのAllergan, Inc.から入手可能。）、Dysport（登録商標）（A型ボツリヌス毒素ヘマグルチニン複合体とヒト血清アルブミンおよびラクトースを製剤中に含む。使用前に0.9％塩化ナトリウムで再構成する粉末として、イギリス、バークシャーのIpsen Limitedから入手可能。）、およびMyoBloc（登録商標）（B型ボツリヌス毒素、ヒト血清アルブミン、コハク酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含むpH約5.6の注射可能な溶液。アイルランド、ダブリンのElan Corporationから入手可能。）。
【００２０】
種々の臨床症状の治療におけるボツリヌス毒素A型の成功は、他のボツリヌス毒素血清型への関心を高めている。更に、純粋なボツリヌス毒素がヒトの処置に用いられている。例えば、Kohl A. ら、Comparison of the effect of botulinum toxin (Botox(R)) with the highly-purified Clostridial toxin(NT201) in the extensor digitorum brevis muscle test, Mov Disord 2000;15(補遺3):165参照。すなわち、純粋なボツリヌス毒素を使用して医薬組成物を調製することができる。
【００２１】
A型ボツリヌス毒素はpH4〜6.8で希水溶液に可溶であることが知られている。約7を越えるpHでは、安定化非毒性タンパク質がクロストリジウム毒素から解離し、その結果、特にpHおよび温度が上がるほど、毒性が徐々に失われる。Jankovic, J.ら、Therapy with Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc (1994)の第3章のSchantz E.J.ら、Preparation and characterization of botulinum toxin type A for human treatment（特に第44-45頁）。
【００２２】
ボツリヌス毒素分子（約150kDa）およびボツリヌス毒素複合体（約300〜900kDa）、例えばA型毒素複合体はまた、表面変性、熱およびアルカリ性条件による変性に対して非常に感受性である。不活性化された毒素は、免疫原性であり得るトキソイドタンパク質を形成する。生じた抗体は、患者を毒素注射に対して非応答性にし得る。
【００２３】
インビトロでの研究により、ボツリヌス毒素が、脳幹組織の初代細胞培養物からのアセチルコリンおよびノルエピネフリンの両方の、カリウムカチオンにより誘導される放出を阻害することが示されている。また、ボツリヌス毒素は、脊髄ニューロンの初代培養物におけるグリシンおよびグルタメートの両方の誘発された放出を阻害すること、そして脳のシナプトソーム調製物において、ボツリヌス毒素が神経伝達物質のアセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン（Habermann E.ら、Tetanus Toxin and Botulinum A and C Clostridial toxins Inhibit Noradrenaline Release From Cultured Mouse Brain, J Neurochem 51(2); 522-527: 1988）、CGRP、サブスタンスPおよびグルタメート（Sanchez-Prieto, J.ら、Botulinum Toxin A Blocks Glutamate Exocytosis From Guinea Pig Cerebral Cortical Synaptosomes, Eur J. Biochem 165; 675-681: 1897）のそれぞれの放出を阻害することが報告されている。すなわち、充分な濃度を用いれば、大部分の神経伝達物質の刺激により誘発される放出はボツリヌス毒素によってブロックされる。
【００２４】
例えば、Pearce, L.B., Pharmacologic Characterization of Botulinum Toxin For Basic Science and Medicine, Toxicon 35(9); 1373-1412の1393; Bigalke H.ら, Botulinum A Clostridial toxin Inhibits Non-Cholinergic Synaptic Transmission in Mouse Spinal Cord Neurons in Culture, Brain Research 360; 318-324; 1985; Habermann E., Inhibition by Tetanus and Botulinum A Toxin of the release of [3H]Noradrenaline and [3H]GABA From Rat Brain Homogenate, Experientia 44; 224-226: 1988, Bigalke H.ら, Tetanus Toxin and Botulinum A Toxin Inhibit Release and Uptake of Various Transmitters, as Studied with Particulate Preparations From Rat Brain and Spinal Cord, Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol 316; 244-251: 1981, および；Jankovic J.ら, Therapy With Botulinum Toxin, Marcel Dekker, Inc. (1994), 第5頁参照。
【００２５】
A型ボツリヌス毒素は、既知の手順に従って、培養槽におけるボツリヌス菌の培養を確立して、生育させ、その後、発酵混合物を集め、精製することによって得ることができる。すべてのボツリヌス毒素血清型は、神経活性となるためにはプロテアーゼによって切断またはニッキングされなければならない不活性な単鎖タンパク質として最初に合成される。A型およびG型のボツリヌス毒素血清型を産生する細菌株は内因性プロテアーゼを有するので、A型およびG型の血清型は細菌培養物から主にその活性型で回収することができる。これに対して、C1型、D型およびE型のボツリヌス毒素血清型は非タンパク質分解性菌株によって合成されるので、培養から回収されたときには、典型的には不活性型である。B型およびF型の血清型はタンパク質分解性菌株および非タンパク質分解性菌株の両方によって産生されるので、活性型または不活性型のいずれでも回収することができる。しかし、例えば、B型ボツリヌス毒素を産生するタンパク質分解性菌株でさえも、産生された毒素の一部を切断するだけである。
【００２６】
切断型分子と非切断型分子との正確な比率は培養時間の長さおよび培養温度に依存する。したがって、例えばB型ボツリヌス毒素の製剤はいずれも一定割合が不活性であると考えられ、このことが、A型ボツリヌス毒素と比較したB型ボツリヌス毒素の知られている著しく低い効力の原因であると考えられる。臨床製剤中に存在する不活性なボツリヌス毒素分子は、その製剤の総タンパク質量の一部を占めることになるが、このことはその臨床的効力に寄与せず、抗原性の増大に関連づけられている。また、B型ボツリヌス毒素は、筋肉内注射された場合、同じ用量レベルのA型ボツリヌス毒素よりも、活性の継続期間が短く、そしてまた効力が低いことも知られている。
【００２７】
ボツリヌス菌のＨall  Ａ株から、≧３×１０７Ｕ／ｍｇ、Ａ２６０／Ａ２７８０．６０未満、およびゲル電気泳動における明確なバンドパターンという特性を示す高品質結晶Ａ型ボツリヌス毒素を生成し得る。Ｓhantz，Ｅ．Ｊ．ら、Ｐroperties  and  use  of  Ｂotulinum  toxin  and  Ｏther  Ｍicrobial  Ｃlostridial toxins  in  Ｍedicine、Ｍicrobiol  Ｒev．５６：８０−９９（１９９２）に記載されているように既知のＳhanz法を用いて結晶Ａ型ボツリヌス毒素を得ることができる。通例、Ａ型ボツリヌス毒素複合体を、適当な培地中でＡ型ボツリヌス菌を培養した嫌気培養物から分離および精製し得る。この既知の方法を用い、非毒素タンパク質を分離除去して、例えば次のような純ボツリヌス毒素を得ることもできる：比効力１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５０ｋＤの精製Ａ型ボツリヌス毒素；比効力１〜２×１０８ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５６ｋＤの精製Ｂ型ボツリヌス毒素；および比効力１〜２×１０７ＬＤ５０Ｕ／ｍｇまたはそれ以上の分子量約１５５ｋＤの精製Ｆ型ボツリヌス毒素。
【００２８】
純粋なボツリヌス毒素は（すなわち、１５０ｋＤのボツリヌス毒素分子）または毒素複合体を医薬組成物の調製に用いることができる。分子および複合体はいずれも、表面変性、熱およびアルカリ性条件による変性に対して感受性である。不活性化毒素はトキソイドタンパク質を形成し、これは免疫原性であり得る。その結果生じる抗体の故に、患者が毒素注射に対して応答しなくなり得る。
【００２９】
酵素一般について言えるように、ボツリヌス毒素（細胞内ペプチダーゼ）の生物学的活性は、少なくとも部分的にはその三次元形状に依存する。すなわち、Ａ型ボツリヌス毒素は、熱、種々の化学薬品、表面の伸長および表面の乾燥によって無毒化される。しかも、既知の培養、発酵および精製によって得られた毒素複合体を、医薬組成物に使用する非常に低い毒素濃度まで希釈すると、適当な安定剤が存在しなければ毒素の無毒化が急速に起こることが知られている。毒素をｍｇ量からｎｇ／ｍｌ溶液へ希釈するのは、そのような大幅な希釈によって毒素の比毒性が急速に低下する故に、非常に難しい。毒素含有医薬組成物を製造後、何箇月も、または何年も経過してから毒素を使用することもあるので、毒素をアルブミンおよびゼラチンのような安定剤で安定化することができる。
【００３０】
市販のボツリヌス毒素含有医薬組成物は、ＢＯＴＯＸ（登録商標）（カリフォルニア、アーヴィンのＡllergan，Ｉnc．から入手可能）の名称で市販されている。ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、精製Ａ型ボツリヌス毒素複合体、アルブミンおよび塩化ナトリウムから成り、無菌の減圧乾燥形態で包装されている。このＡ型ボツリヌス毒素は、Ｎ−Ｚアミンおよび酵母エキスを含有する培地中で増殖させたボツリヌス菌のＨall株の培養物から調製する。そのＡ型ボツリヌス毒素複合体を培養液から一連の酸沈殿によって精製して、活性な高分子量毒素タンパク質および結合ヘマグルチニンタンパク質から成る結晶複合体を得る。結晶複合体を、塩およびアルブミンを含有する溶液に再溶解し、滅菌濾過（０．２μ）した後、減圧乾燥する。減圧乾燥生成物は、−５℃またはそれ以下の冷凍庫内で保存する。ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、筋肉内注射前に、防腐していない無菌塩類液で再構成し得る。ＢＯＴＯＸ（登録商標）の各バイアルは、Ａ型ボツリヌス毒素精製クロストリジウム毒素複合体約１００単位（Ｕ）、ヒト血清アルブミン０．５ｍｇおよび塩化ナトリウム０．９ｍｇを、防腐剤不含有の無菌減圧乾燥形態で含有する。
【００３１】
減圧乾燥ＢＯＴＯＸ（登録商標）を再構成するには、防腐剤不含有の無菌生理食塩水；０．９％Ｓodium  Ｃhloride  Ｉnjectionを使用し、適量のその希釈剤を適当な大きさの注射器で吸い上げる。ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、泡立てまたは同様の激しい撹拌によって変性しうるので、そのバイアルに希釈剤を穏やかに注入する。滅菌性の理由から、ＢＯＴＯＸ（登録商標）は、バイアルを冷凍庫から取り出して再構成した後４時間以内に投与することが好ましい。その４時間の間、再構成ＢＯＴＯＸ（登録商標）は冷蔵庫（約２〜８℃）内で保管しうる。再構成し冷蔵したＢＯＴＯＸ（登録商標）は、その効力を少なくとも約２週間維持することが報告されている。Neurology, 48:249-53:1997。
【００３２】
ボツリヌス毒素は、活動過多な骨格筋によって特徴付けられる神経筋障害を処置するために臨床的状況において使用されている。A型ボツリヌス毒素（BOTOX（登録商標））は、本態性眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣を12歳を越える患者において処置するために米国食品医薬品局によって1989年に承認された。A型ボツリヌス毒素市販製剤（BOTOX（登録商標））およびB型ボツリヌス毒素市販製剤（MyoBloc（商標））が、頸部ジストニアの処置のためにFDAに2000年に承認された。A型ボツリヌス毒素（BOTOX（登録商標））が、ある種の過運動性（眉間）顔面しわの美容的処置のためにFDAに2002年に承認された。末梢筋肉内A型ボツリヌス毒素の臨床的効果は、通常、注射後1日またはしばしば数時間以内に認められる。A型ボツリヌス毒素の単回筋肉内注射による症候緩和（すなわち弛緩性筋肉麻痺）の典型的な継続時間は約3ヶ月であり得るが、ボツリヌス毒素が誘導する腺（例えば唾液腺）の神経支配除去効果は、数年間持続することが報告されている場合もある。例えばボツリヌス毒素A型は、最大12ヶ月の有効性を有し(Naumann M.ら、Botulinum toxin type A in the treatment of focal, axillary and palmar hyperhidrosis and other hyperhidrotic conditions, European J. Neurology 6(Supp 4), S111-S1150; 1999)、ある場合には27ヶ月間にもわたる有効性を有しうることが既知である(Ragona, R.M.ら、Management of parotid sialocele with botulinum toxin, The Laryngoscope 109; 1344-1346; 1999)。しかし、BOTOX(登録商標)筋肉注射の通常の持続期間は一般に約3〜4ヶ月間である。
【００３３】
A型ボツリヌス毒素は、例えば下記のように臨床的に様々に使用されていることが報告されている：
（1）頸部ジストニーを処置するための筋肉内注射（多数の筋肉）あたり約75単位〜125単位のBOTOX（登録商標）；
（2）眉間のしわを処置するための筋肉内注射あたり約5単位〜10単位のBOTOX（登録商標）（5単位が鼻根筋に筋肉内注射され、10単位がそれぞれの皺眉筋に筋肉内注射される）；
（3）恥骨直腸筋の括約筋内注射による便秘を処置するための約30単位〜80単位のBOTOX（登録商標）；
（4）上瞼の外側瞼板前部眼輪筋および下瞼の外側瞼板前部眼輪筋に注射することによって眼瞼痙攣を処置するために筋肉あたり約1単位〜5単位の筋肉内注射されるBOTOX（登録商標）；
【００３４】
（5）斜視を処置するために、外眼筋に、約1単位〜5単位のBOTOX（登録商標）が筋肉内注射されている。この場合、注射量は、注射される筋肉のサイズと所望する筋肉麻痺の程度（すなわち、所望するジオプター矯正量）との両方に基づいて変化する。
（6）卒中後の上肢痙性を処置するために、下記のように5つの異なる上肢屈筋にBOTOX（登録商標）が筋肉内注射される：
（a）深指屈筋：7.5U〜30U
（b）浅指屈筋：7.5U〜30U
（c）尺側手根屈筋：10U〜40U
（d）橈側手根屈筋：15U〜60U
（e）上腕二頭筋：50U〜200U。5つの示された筋肉のそれぞれには同じ処置時に注射されるので、患者には、それぞれの処置毎に筋肉内注射によって90U〜360Uの上肢屈筋BOTOX（登録商標）が投与される。
(7)偏頭痛を治療するために、25UのBOTOX(登録商標)を頭蓋周囲に注射する(眉間、前頭および側頭筋に対称的に注射する)：該注射は、偏頭痛頻度、最大重症度、付随嘔吐および急性薬剤使用の減少(25U注射後の3ヶ月間にわたる)によって評価した場合に、ビヒクルと比較して、偏頭痛の予防療法として有意な利益を与える。
【００３５】
さらに、筋肉内ボツリヌス毒素は、パーキンソン病の患者の振せんの治療にも使用されているが、結果は顕著でないことが報告されている。Marjama-Lyons,J.ら、"Tremor-Predominant Parkinson's Disease"，Drugs & Aging 16(4), 273-278, 2000。
【００３６】
ある種の胃腸疾患および平滑筋疾患をボツリヌス毒素で処置することが知られている。例えば米国特許第5427291号および第5674205号（Pasricha）参照。更に、ボツリヌス毒素を膀胱括約筋に経尿道注射して排尿障害を処置することが知られている（例えば、Dykstra D．D．ら、Treatment of detrusor-sphincter dyssynergia with botulinum A toxin: A double-blind study, Arch Phys Med Rehabil  1990年１月；71：24-6参照）。また、ボツリヌス毒素を前立腺に注射して前立腺肥大を処置することが知られている。例えば米国特許第6365164号（Schmidt）参照。
【００３７】
米国特許第5766605号（Sanders）には、種々の自律神経障害、例えば過流涎および鼻炎をボツリヌス毒素で処置することが提案されている。更に、鼻の過分泌は鼻腺（主としてコリン作動性支配下にある）の過活動によって主に起こることが知られており、哺乳動物の上顎洞鼻介の鼻粘膜組織にA型ボツリヌス毒素を適用することにより、鼻腺に一過性アポトーシスを誘発しうることが示されている。Rohrbach S.ら、Botulinum toxin type A induces apoptosis in nasal glands of guinea pigs, Ann Otol Rhinol Laryngol 2001 Nov; 110(11):1045-50。更に、内因性鼻炎の女性患者にA型ボツリヌス毒素を局所適用することによって、鼻の過分泌が5日以内に明らかに減少した。Rohrbach S.ら、Minimally invasive application of botulinum toxin type A in nasal hypersecretion, J Oto-Rhino-Laryngol 2001 Nov-Dec; 63(6):382-4。
【００３８】
ボツリヌス毒素で処置し得る種々の疾患、例えば多汗症および頭痛が、WO95／17904（PCT／US94／14717）（Aoki）に論じられている。EP第0605501B1号（Graham）には、ボツリヌス毒素による脳性麻痺の処置が論じられ、米国特許第6063768号（First）にはボツリヌス毒素による神経性炎症の処置が論じられている。
【００３９】
末梢部位における薬理作用を有する他に、ボツリヌス毒素は、中枢神経系における阻害作用も有しうる。Weigandら[125I-labelled botulinum A Clostridial toxin: pharmacokinetics in cats after intramuscular injection, Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1976, 292，161-165]、およびHabermann[125I-labelled Clostridial toxin from clostridium botulinum A: preparation, binding to synaptosomes and ascent to the spinal cord, Nauny-Schmiedeberg's Arch.Pharmacol. 1974, 281，47-56]の研究は、ボツリヌス毒素が逆行性輸送によって脊髄領域へ上行しうることを示している。従って、末梢部位(例えば筋肉内)に注射されたボツリヌス毒素は、脊髄に逆行輸送されうる。
【００４０】
インビトロでの研究により、ボツリヌス毒素が、脳幹組織の初代細胞培養物からのアセチルコリンおよびノルエピネフリンの両方の、カリウムカチオンにより誘導される放出を阻害することが示されている。また、ボツリヌス毒素は、脊髄ニューロンの初代培養物におけるグリシンおよびグルタメートの両方の誘発された放出を阻害すること、そして脳のシナプトソーム調製物において、ボツリヌス毒素が神経伝達物質のアセチルコリン、ドーパミン、ノルエピネフリン、CGRP、およびグルタメートのそれぞれの放出を阻害することが報告されている。
【００４１】
米国特許第5989545号は、特定の標的化成分に化学的に結合させるかまたは組換え的に融合させた改質クロストリジウム毒素またはそのフラグメント、好ましくはボツリヌス毒素を使用して、脊髄に薬剤を投与することによって痛みを治療できることを開示している。
【００４２】
ボツリヌス毒素は、次のような状態の処置にも提案されている：多汗（米国特許第5766605号）、頭痛（米国特許第6458365号）、片頭痛（米国特許第5714468号）、術後痛および内臓痛（米国特許第6464986号）、脊髄内投与による痛みの処置（米国特許第6133915号）、頭蓋内投与によるパーキンソン病の処置（米国特許第6306403号）、毛髪の成長および維持（米国特許第6299893号）、乾癬および皮膚炎（米国特許第5670484号）、筋肉障害（米国特許第6423319号）、種々の癌（米国特許第6139845号）、膵臓疾患（米国特許第6143306号）、平滑筋疾患（米国特許第5437291号、上部および下部食道、幽門および肛門括約筋へのボツリヌス毒素注射を包含する）、前立腺疾患（米国特許第6365164号）、炎症、関節炎および痛風（米国特許第6063768号）、若年性脳性麻痺（米国特許第6395277号）、内耳疾患（米国特許第6265379号）、甲状腺疾患（米国特許第6358513号）、副甲状腺疾患（米国特許第6328977号）。更に、制御放出毒素インプラントが知られている（米国特許第6306423号および第6312708号）。
【００４３】
ボツリヌス毒素の静脈内注射により、ラットにおいて、ペンタガストリン刺激による酸およびペプシン分泌が低下することが報告されているKondo T.ら、Modification of the action of pentagastrin on acid secretion by botulinum toxin, Experientia 1977;33:750-1。更に、胃腸分泌、例えば胃分泌を低下するためにボツリヌス毒素を使用しうると考えられている。WO95/17904の第16-17頁参照。更に、腸神経系疾患における胃腸筋肉障害をボツリヌス毒素で処置することが提案されており（米国特許第5437291号）、また、種々の自律神経疾患をボツリヌス毒素で処置することが提案されている（米国特許第5766605号）。ボツリヌス毒素がイヌの胃底に注射されている。Wang Z.ら、Effects of botulinum toxin on gastric myoelectrical and vagal activities in dogs, Gastroenterology 2001 Apr; 120(5 Suppl 1): A-718。更に、肥満の処置として、胃洞にボツリヌス毒素を筋肉内注射することが提案されている。Gui D.ら、Effects of botulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions.  A possible tool for correction of obesity?, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002 Jun; 365 (Suppl 2): R22; Albanase A.ら、The use of botulinum toxin on smooth muscles, Eur J Neurol 1995 Nov; 2(Supp 3): 29-33、およびGui D.ら、Botulinum toxin injected in the gastric wall reduces body weight and food intake in rats, Aliment Pharmacol Ther 2000 Jun; 14(6): 829-834参照。更にまた、胃における分泌制御のために、A型ボツリヌス毒素を処置適用することが提案されている。Rossi S.ら、Immunohistochemical localiation of SNAP-25 protein in the stomach of rat, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002; 365(Suppl 2): R37。
【００４４】
重要なことに、食道無弛緩症の処置のために下部食道括約筋にボツリヌス毒素を注射すると、食道に潰瘍が形成されることが報告されている。Eaker, E.Y.ら、Untoward effects of esophageal botulinum toxin injection in the treatment of achalasia, Dig Dis Sci 1997 Apr; 42(4): 724-7。幽門前潰瘍の患者の痙攣幽門括約筋にボツリヌス毒素を注射して、幽門筋を開けることが知られている。Wiesel P.H.ら、Botulinum toxin for refractory postoperative pyloric spasm, Endoscopy 1997; 29(2): 132。
【００４５】
胃の筋肉収縮を軽減することによって肥満を処置するために患者の胃壁にボツリヌス毒素を注射することが知られている。例えばRolnik J.ら、Antral Injections of botulinum toxin for the treatment of obesity, Ann Intern Med 2003 Feb, 18;138(4):359-360; 2003, Miller L., WO 02/13854 A1, Obesity controlling method, 2002年2月21日公開; Gui D.ら、Botulinum toxin injected in the gastric wall reduces body weight and food intake in rats, Aliment Pharmacol Ther 2000 Jun; 14(6):829-834; Gui D.ら、Effects of botulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions.  A possible tool for correction of obesity?, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002 Jun; 365 (Suppl 2): R22; Albanase A.ら、The use of botulinum toxin on smooth muscles, Eur J Neurol 1995 Nov; 2(Supp 3): 29-33; Albanese A.ら、Review article: the use of botulinum toxin in the alimentary tract, Aliment Pharmacol Ther 1995; 9: 599-604を参照されたい。
【００４６】
破傷風毒素ならびにその誘導体（すなわち非天然ターゲティング部分を持つもの）、断片、ハイブリッドおよびキメラも、治療有効性を持ちうる。破傷風毒素はボツリヌス毒素との類似点を数多く持っている。例えば、破傷風毒素とボツリヌス毒素はどちらも、クロストリジウム属の近縁種（それぞれ破傷風菌（Clostridium tenani）およびボツリヌス菌（Clostridium botulinum））によって産生されるポリペプチドである。また、破傷風毒素とボツリヌス毒素はどちらも、1つのジスルフィド結合によって重鎖（分子量約100kD）に共有結合している軽鎖（分子量約50kD）から構成される二本鎖タンパク質である。したがって、破傷風毒素の分子量と、7つの各ボツリヌス毒素（非複合体型）の分子量は、約150kDである。さらに、破傷風毒素でもボツリヌス毒素でも、軽鎖は細胞内生物活性（プロテアーゼ活性）を示すドメインを持ち、重鎖は受容体結合（免疫原）ドメインと細胞膜移行ドメインとを持っている。
【００４７】
さらに、破傷風毒素とボツリヌス毒素はどちらも、シナプス前コリン作動性ニューロンの表面にあるガングリオシド受容体に対して高い特異的親和性を示す。末梢コリン作動性ニューロンによる破傷風毒素の受容体仲介エンドサイトーシスは、逆行性軸索輸送、中枢シナプスからの抑制性神経伝達物質の放出の阻害および痙性麻痺をもたらす。これに対して、末梢コリン作動性ニューロンによるボツリヌス毒素の受容体仲介エンドサイトーシスは、逆行性輸送、中毒した末梢運動ニューロンからのアセチルコリンエキソサイトーシスの阻害、および弛緩性麻痺をもたらすことがなく、たとえあったとしても、ごくわずかである。
【００４８】
最後に、破傷風毒素とボツリヌス毒素は、その生合成および分子構造が互いに似ている。例えば、破傷風毒素とA型ボツリヌス毒素のタンパク質配列には全体で34％の一致度があり、いくつかの機能ドメインについては62％もの配列一致度がある。Binz T. ら、The Complete Sequence of Clostridial toxin Type A and Comparison with Other Clostridial toxins, J Biological Chemistry 265（16）;9153-9158:1990。
【００４９】
アセチルコリン
典型的には、単一タイプの小分子の神経伝達物質のみが、哺乳動物の神経系において各タイプのニューロンによって放出される。神経伝達物質アセチルコリンが脳の多くの領域においてニューロンによって分泌されているが、具体的には運動皮質の大錐体細胞によって、基底核におけるいくつかの異なるニューロンによって、骨格筋を神経支配する運動ニューロンによって、自律神経系（交感神経系および副交感神経系の両方）の節前ニューロンによって、副交感神経系の節後ニューロンによって、そして交感神経系の一部の節後ニューロンによって分泌されている。本質的には、汗腺、立毛筋および少数の血管に至る節後交感神経線維のみがコリン作動性であり、交感神経系の節後ニューロンの大部分は神経伝達物質のノルエピネフリンを分泌する。ほとんどの場合、アセチルコリンは興奮作用を有する。しかし、アセチルコリンは、迷走神経による心拍の抑制のように、抑制作用を一部の末梢副交感神経終末において有することが知られている。
【００５０】
自律神経系の遠心性シグナルは交感神経系または副交感神経系のいずれかを介して身体に伝えられる。交感神経系の節前ニューロンは、脊髄の中間外側角に存在する節前交感神経ニューロン細胞体から伸びている。細胞体から伸びる節前交感神経線維は、脊椎傍交感神経節または脊椎前神経節のいずれかに存在する節後ニューロンとシナプスを形成する。交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンはコリン作動性であるので、神経節にアセチルコリンを適用することにより、交感神経および副交感神経の両方の節後ニューロンが興奮し得る。
【００５１】
アセチルコリンは、ムスカリン性受容体およびニコチン性受容体の2種類の受容体を活性化する。ムスカリン性受容体は、副交感神経系の節後ニューロンによって刺激されるすべてのエフェクター細胞において、また、交感神経系の節後コリン作動性ニューロンに刺激されるエフェクター細胞において見られる。ニコチン性受容体は、副腎髄質、ならびに自律神経節内、すなわち交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンと節後ニューロンとの間のシナプスにおける節後ニューロンの細胞表面に見られる。ニコチン性受容体はまた、多くの非自律神経終末、例えば神経筋接合部における骨格筋繊維の膜にも存在する。
【００５２】
アセチルコリンは、小さい透明な細胞内小胞がシナプス前のニューロン細胞膜と融合したときにコリン作動性ニューロンから放出される。非常に様々な非ニューロン分泌細胞、例えば副腎髄質（PC12細胞株と同様に）および膵臓の島細胞が、それぞれカテコールアミン類および上皮小体ホルモンを大きな高密度コア小胞から放出する。PC12細胞株は、交感神経副腎発達の研究のために組織培養モデルとして広範囲に使用されているラットのクロム親和性細胞腫細胞のクローンである。ボツリヌス毒素は、（エレクトロポレーションによるように）透過性にされた場合、または脱神経支配細胞に毒素を直接注射することによって、両タイプの細胞からの両タイプの化合物の放出をインビトロで阻害する。ボツリヌス毒素はまた、皮質シナプトソーム細胞培養物からの神経伝達物質グルタメートの放出を阻止することが知られている。
【００５３】
神経筋接合部は、筋肉細胞への軸索の近接によって、骨格筋において形成される。神経系を介して伝達される信号は、イオンチャンネルを活性化して末端軸索における活動電位を生じ、例えば神経筋接合部の運動終板において、ニューロン内シナプス小胞からの神経伝達物質アセチルコリンの放出を生じる。アセチルコリンは、細胞外空間を通って、筋肉終板の表面のアセチルコリン受容体タンパク質と結合する。一旦、充分な結合が生じると、筋肉細胞の活動電位は、特異性膜イオンチャンネル変化を生じ、筋肉細胞収縮を生じる。次に、アセチルコリンが筋肉細胞から放出され、細胞外空間においてコリンエステラーゼによって代謝される。代謝産物は、さらなるアセチルコリンに再処理するために末端軸索に再循環される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００５４】
すなわち、処置に有効な医薬を使用して食欲を抑制する非外科的方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００５５】
概要
本発明は上記課題を解決し、処置に有効な医薬（ここでは医薬はクロストリジウム毒素）を使用して食欲を抑制する非外科的方法を提供する。本発明では、食欲抑制のためにボツリヌス毒素を筋肉内、皮下または腺内に直接注射することは除外するが、これは、そのような方法は侵襲的であり（すなわち内視鏡的投与を要し）、患者にとって簡便でないからである。
【００５６】
本発明では、ボツリヌス毒素を、好ましくは経口摂取により投与する。すなわち、患者の胃、胃または十二指腸のグレリン産生細胞もしくはその近傍でボツリヌス毒素活性成分を放出させるための経口製剤として、ボツリヌス毒素を調合しうる。ボツリヌス毒素の経口製剤の製造は、ボツリヌス毒素の凍結乾燥粉末を、穀粉、糖またはゼラチンなどの適当な担体と混合した後、その混合物を圧縮して摂取可能な錠剤にすることによって、容易に達成することができる。担体および圧縮量は、結果として生成する錠剤（または別法として、担体と混合されるかまたはされていない処置量の毒素を含有するカプセル剤を製造することもできる）が嚥下用となるように選択され、担体および担体の特徴は、担体が胃内で迅速に溶解してボツリヌス毒素活性成分を放出させるようなものである。また、胃壁を被覆するために用いられる数多くの既知の製剤のいずれかとして、ボツリヌス毒素を調合することもできる。
【００５７】
すなわち本発明は、ボツリヌス毒素経口製剤の使用によって食欲を抑制する方法を包含し、ボツリヌス毒素の反復ボーラスまたは皮下注射に伴う既知の問題、難点および欠点を克服し、それによって効果的な食欲抑制を可能にする。
【００５８】
本発明のボツリヌス毒素経口製剤は、担体材料、および担体と組み合わせたボツリヌス毒素を含有し得る。毒素を、担体と混合することによって、および担体で封入することによって担体と組み合わせ、それによりボツリヌス毒素送達システム、すなわちボツリヌス毒素経口製剤を形成し得る。経口製剤は、経口投与後、患者の胃内で、担体から処置量のボツリヌス毒素を放出し得る。
【００５９】
担体は、複数のポリマーミクロスフェア（すなわちポリマーマトリックス）を含有し得、実質的な量のボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素を担体と組み合わせる前に、ボツリヌストキソイドに変換されていない。すなわち、担体と組み合わせられたボツリヌス毒素の実質的な量は、ボツリヌス毒素を担体と組み合わせる前のボツリヌス毒素の毒性と比較して実質的に変化していない毒性を有する。
【００６０】
本発明によると、ボツリヌス毒素を胃腸管内で担体から放出させることができ、担体は、実質的に生分解性の物質から成る。ボツリヌス毒素はA型、B型、C1型、D型、E型、F型およびG型ボツリヌス毒素の1つであり、好ましくはA型ボツリヌス毒素である。ボツリヌス毒素は、約1単位から約10,000単位のボツリヌス毒素量で、担体と組み合わせることができる。担体と組み合わせるボツリヌス毒素の量は、好ましくは、約10単位から約2,000単位のA型ボツリヌス毒素である。ボツリヌス毒素がB型ボツリヌス毒素である場合、担体と組み合わせるボツリヌス毒素の量は、好ましくは、約500単位から約10,000単位のB型ボツリヌス毒素である。
【００６１】
本発明の具体的一実施態様は、生分解性ポリマーと、約10単位から約10,000単位のボツリヌス毒素とを含有するボツリヌス毒素経口製剤であって、ボツリヌス毒素がポリマー担体で封入され、それによって制御放出系を形成しており、処置量のボツリヌス毒素を患者の胃腸管内において担体から放出することができる経口製剤を含むことができる。
【００６２】
本発明の範囲に包含される経口製剤を製造する方法は、ポリマーを溶媒に溶解させてポリマー溶液を形成するステップと、ボツリヌス毒素をポリマー溶液と混合するか、ポリマー溶液に分散させて、ポリマー−ボツリヌス毒素混合物を形成するステップと、そのポリマー−ボツリヌス毒素混合物を固化または硬化し、それによってボツリヌス毒素放出用の経口製剤を形成するステップを持ちうる。この方法は、混合ステップの後に溶媒を蒸発させるという更なるステップを持ちうる。
【００６３】
本発明の範囲内でボツリヌス毒素経口製剤を使用する方法は、ボツリヌス毒素を含有するポリマー経口製剤を嚥下し、それによって、コリン作動性神経支配の影響を受けるか、またはボツリヌス毒素の作用に感受性のグレリン産生胃細胞を処置することによるものでありうる。
【００６４】
本発明のもう一つの実施態様は、ポリラクチドおよびポリグリコリドからなるポリマー群より選択されるポリマーを含む担体と、安定化ボツリヌス毒素とであることができ、安定化ボツリヌス毒素は担体と組み合わされ、それによりボツリヌス毒素経口製剤を形成し、ヒト患者が経口製剤を摂取すると、胃腸管内で処置量のボツリヌス毒素が担体から放出されうる。担体はボツリヌス毒素を組み込んだポリマーミクロスフェアの別個のセットを複数含むことができ、各ポリマーセットは異なるポリマー組成を有する。
【００６５】
本発明の経口製剤に使用されるボツリヌス毒素は、生理的条件下でニューロンの細胞表面受容体に特異的に結合することができる結合要素を含む第1要素と、ニューロンの細胞膜を横切るポリペプチドの輸送を促進することができるトランスロケーション要素を含む第2要素と、ニューロンの細胞質中に存在する時に、そのニューロンからのアセチルコリンのエキソサイトーシスを阻害することができる処置要素を含む第3要素とを含むことができる。上記処置要素はSNAREタンパク質を切断し、その結果として、ニューロンからのアセチルコリンのエキソサイトーシスを阻害することができ、前記SNAREタンパク質はシンタキシン、SNAP−25およびVAMPからなる群より選択されうる。一般に、ボツリヌス毒素による影響を受けるニューロンは、例えば胃または胃腸管分泌腺組織（グレリンを分泌しうる）を神経支配するシナプス前コリン作動性ニューロンである。コリン作動性ニューロンはボツリヌス毒素に対して高い親和性を（すなわち毒素に対する受容体によって）示しうるが、筋細胞および腺／内分泌細胞（例えば胃の）もまた、低親和性機構（すなわち飲作用）によって、または関連細胞に対する直接作用によって、毒素を直接取り込むことができる。したがって、ニューロンと非ニューロン細胞（例えば胃の内分泌細胞）はどちらも、ボツリヌス毒素の標的になりうる。
【００６６】
本発明の範囲に包含される連続的放出システムによって所定の期間中に投与されるボツリヌス毒素の量は、A型ボツリヌス毒素の場合は約10-3U／kgから約35U／kg、他のボツリヌス毒素、例えばB型ボツリヌス毒素などの場合は約2000U／kgまでであることができる。35U／kgまたは2000U／kgが上限であるのは、それが一定のクロストリジウム毒素、例えばそれぞれA型ボツリヌス毒素またはB型ボツリヌス毒素の致死量に近いからである。例えば、約2000単位／kgの市販B型ボツリヌス毒素調製物は、B型ボツリヌス毒素の霊長類致死量に近いことが報告されている。Meyer K.E. ら「A Comparative Systemic Toxicity Study of Neurobloc in Adult Juvenile Cynomolgus Monkeys（成体幼若カニクイザルにおけるNeuroblocの比較全身毒性試験）」Mov. Disord 15（Suppl 2）;54;2000。
【００６７】
ボツリヌス毒素はボツリヌス菌（Clostridium  botulinum）によって産生されうる。また、ボツリヌス毒素は修飾ボツリヌス毒素、すなわち、天然ボツリヌス毒素または野生型ボツリヌス毒素と比較して、そのアミノ酸の少なくとも1つが欠失しているか、修飾されているか、または置換されているボツリヌス毒素であることもできる。さらに、ボツリヌス毒素は組換え生産されたボツリヌス毒素またはその誘導体もしくは断片であることもできる。
【００６８】
注目すべきことに、ボツリヌス毒素によって処置された腺組織は、毒素の注射後27ヶ月もの間、低下した分泌活動を示すことができると報告されている。Laryngoscope 1999;109:1344-1346、Laryngoscope 1998;108:381-384。
【００６９】
すなわち本発明は、クロストリジウム毒素の胃腸（好ましくは胃）内放出のための経口製剤に関し、また、該経口製剤の製造方法および使用方法に関する。経口製剤は、ボツリヌス毒素を含有するポリマーマトリックスを含有し得る。経口製剤は、経口投与後に有効レベルのクロストリジウム毒素を投与するよう設計する。
【００７０】
本発明は更に、生物学的に活性な安定化されたクロストリジウム毒素の制御放出のための組成物、並びに該組成物の製法および使用法にも関する。本発明の制御放出組成物は、生体適合性ポリマーから成るポリマーマトリックス、および該生体適合性ポリマー中に分散された、生物学的に活性な安定化されたクロストリジウム毒素を含有し得る。
【００７１】
定義
本明細書では以下の定義が適用される。
「約」とは、そのように修飾された値の±10％を意味する。
「生体適合性」とは、前記のようなクロストリジウム毒素の経口製剤の摂取による炎症応答がごくわずかであることを意味する。
【００７２】
「生物学的に活性な化合物」とは、それを投与された対象に有益な変化をもたらすことができる化合物を意味する。例えば「生物学的に活性な化合物」にはクロストリジウム毒素が含まれる。
「クロストリジウム毒素」とは、ボツリヌス毒素または破傷風毒素を意味する。
【００７３】
生物学的に活性な化合物に適用される「有効量」という用語は、所望する変化を対象にもたらすのに一般に十分である化合物の量を意味する。例えば、所望する効果が食欲抑制である場合、化合物の有効量は、患者の食に対する欲望の一定期間にわたる患者の自覚によって評価して、少なくとも実質的な食欲減退を引き起こす量である。
【００７４】
経口製剤の非活性成分構成要素（例えばマトリックスまたはコーティング組成物を形成するのに使用するポリマー）に適用される「有効量」という用語は、所望の期間、所望の速度で起こる生物学的に活性な薬剤の放出に対して良い影響を及ぼすのに十分な非活性成分構成要素の量を指す。例えば、所望の効果が単一の経口製剤の使用による筋肉麻痺である場合、この「有効量」は、約60日から6年間の期間にわたる放出の延長を促進しうる量である。この「有効量」は、本明細書で教示する内容と、当技術分野の一般知識とに基づいて、決定することができる。
【００７５】
経口製剤の表面積の大きさに適用される「有効量」という用語は、所望の効果（例えば筋肉麻痺または腺分泌活性低下）を達成するように生物学的活性化合物を放出させるのに十分な経口製剤表面積の大きさである。必要な面積は、特定の活性化合物に関して得られる放出を測定することによって直接に決定および調節しうる。経口製剤の表面積、または経口製剤のコーティングの表面積とは、生物学的活性化合物を十分に封入するのに必要な膜の大きさである。表面積は経口製剤の幾何学に依存する。好ましくは、表面積は可能なら最小にして、経口製剤のサイズを小さくする。
【００７６】
「グレリン」とは、ヒトにおいてある種の内分泌腺、例えば胃細胞によって産生および放出されるアミノ酸27または28個のポリペプチドで、下垂体細胞からの成長ホルモン放出を引き起こしうるものを意味する。
【００７７】
「放出を抑制する」または「分泌を抑制する」とは、ある物質のエキソサイトーシスを、該抑制前後の該物質の血漿レベルによって測定して、10％〜100％低減するよう作用することを意味する。
【００７８】
「経口製剤」とは、経口摂取を意図した薬物送達システムを意味する。経口製剤は、生物学的活性を有する分子を含有するか、または生物学的活性分子の担体として機能しうる、生体適合性ポリマーまたは天然材料を含有しうる。
【００７９】
「食欲を抑制する」とは、本発明の食欲抑制方法の実施前（すなわちボツリヌス毒素の経口投与前）（ベースライン）および実施後の期間（前と後）の患者食欲評価（図2に示すような視覚アナログ尺度を使用）において、充分に顕著な空腹感の減少、満腹感の増加、食欲の減退、強い食欲の低下、および／または炭水化物軽食の減少が見られることを意味する。
【００８０】
「処置」は哺乳動物における疾患の任意の処置を意味し、（i）その疾患が発生するのを防止すること、または（ii）その疾患を抑制すること、すなわちその発達を停止させること、（iii）その疾患を軽減すること、すなわちその疾患の症状の発生率を低下させるか、その疾患の退縮を引き起こすこと、を包含する。
【００８１】
クロストリジウム毒素の制御放出のための本発明の範囲に包含される経口製剤を製造する方法は、生体適合性ポリマーをポリマー溶媒に溶解させてポリマー溶液を形成するステップと、生物学的に活性な安定化されたクロストリジウム毒素の粒子をポリマー溶液に分散させるステップと、その後、ポリマーを凝固させて、クロストリジウム毒素粒子を分散して含有するポリマーマトリックスを形成するステップを含みうる。
【００８２】
本発明は、ボツリヌス毒素および担体を含有し、担体がボツリヌス毒素と組み合わされ、それにより固形のボツリヌス毒素経口製剤を形成している、固形ボツリヌス毒素経口製剤を包含する。担体は、患者の胃腸管内で、グレリン分泌胃細胞の近傍で溶解し、それによって処置量のボツリヌス毒素を放出するように製剤化しうる。更に、固形ボツリヌス毒素製剤は、粘膜付着、浮遊、沈降、拡張、または胃内容物排出を遅延させる薬剤の同時投与から成る群より選択される方法によって、胃内滞留をも示しうる。「胃内滞留」とは、粘膜付着、浮遊、沈降、拡張の性質を示すように処置されていないか、または胃内容物排出を遅延させる薬剤と同時投与されていない通常に摂取された食物または栄養物の胃腸管内滞留時間と比較して、経口製剤の滞留時間が長いことを意味する。
【００８３】
経口製剤は好ましくは、ボツリヌス毒素を担体と組み合わせる前に、ボツリヌストキソイドに変換されたボツリヌス毒素を実質的な量で含有しない。すなわち、好ましくは、経口製剤が含有する担体と組み合わせられたボツリヌス毒素は、ボツリヌス毒素を担体と組み合わせる前のボツリヌス毒素の毒性と比較して実質的に変化していない毒性を有する。
【００８４】
経口製剤の担体は、穀粉、糖およびゼラチンから成る群より選択される生体適合性で生分解性の物質を含有し得る。経口製剤のボツリヌス毒素はA型、B型、C1型、D型、E型、F型およびG型ボツリヌス毒素から成る群より選択しうる。好ましくはボツリヌス毒素はA型ボツリヌス毒素である。担体と組み合わせるボツリヌス毒素量は、約1単位から約10,000単位のボツリヌス毒素、または、約10単位から約2,000単位のA型ボツリヌス毒素である。
【００８５】
ボツリヌス毒素は、生理的条件下でニューロンの細胞表面受容体に特異的に結合することができる結合要素を含む第1要素と、ニューロンの細胞膜を横切るポリペプチドの輸送を促進することができるトランスロケーション要素を含む第2要素と、ニューロンの細胞質中に存在する時に、そのニューロンからのアセチルコリンのエキソサイトーシスを阻害することができる処置要素を含む第3要素とを含むことができる。上記処置要素はSNAREタンパク質を切断し、その結果として、ニューロンからのアセチルコリンのエキソサイトーシスを阻害することができる。前記SNAREタンパク質はシンタキシン、SNAP−25およびVAMPからなる群より選択されうる。
【００８６】
本発明の範囲に含まれる別のボツリヌス毒素経口製剤は、A型ボツリヌス毒素および担体を含有し得、担体はA型ボツリヌス毒素と組み合わせられ、それによりボツリヌス毒素経口製剤を形成し、担体は胃潰瘍患者の胃腸管内で、顕著な免疫系応答を引き起こすことなく処置量のA型ボツリヌス毒素を放出するように製剤化されており、担体は、生体適合性で生分解性の物質を含有し、該固形形態の制御胃内滞留は、粘膜付着、浮遊、沈降、拡張から成る群より選択される方法によるか、または胃内容物排出を遅延させる薬剤の同時投与によって達成することができる。
【００８７】
本発明の範囲に含まれる他の製剤は、生物学的に活性なボツリヌス毒素、およびボツリヌス毒素と組み合わせた生体適合性で生分解性の非毒性担体を含有する、胃腸管を持つ患者への経口投与用のボツリヌス毒素製剤を含み得、担体は患者の胃腸系内で迅速に分解することによって患者の胃腸系に処置量の生物学的活性ボツリヌス毒素を放出するという特性を有し、摂取されたボツリヌス毒素に対する顕著な免疫系応答は起こらない。
【００８８】
経口製剤の担体は、複数のポリマーミクロスフェアを含み得るか、またはポリマーマトリックスを含み得る。本発明の範囲内の一方法は、ボツリヌス毒素経口製剤の使用方法を含み得、該方法は、ボツリヌス毒素の経口製剤の摂取のステップを含む。
【００８９】
本発明の範囲内の詳細な一態様は、ボツリヌス毒素経口製剤であって、
（ａ）ポリラクチド、ポリグリコリドおよびポリ無水物から成るポリマー群より選択されるポリマーを含む担体；
（ｂ）ボツリヌス経口製剤を形成するように担体と組み合わせた安定化されたボツリヌス毒素
を含有し、
患者の胃腸管内で担体から処置量のボツリヌス毒素を放出し得るボツリヌス毒素経口製剤であり得る。
【００９０】
本発明は、胃細胞によるグレリン分泌を抑制する方法を包含し、該方法は、グレリンを分泌しうる胃細胞にボツリヌス毒素を投与し、それによって胃細胞からのグレリン分泌を抑制するステップを含んでなる。ボツリヌス毒素は、A型、B型、C型、D型、E型、F型およびG型のボツリヌス毒素からなる群から選択することができ、好ましくはA型ボツリヌス毒素である。投与ステップは、ボツリヌス毒素の経口摂取のステップを含んでなりうる。ボツリヌス毒素投与から10日以内に、ボツリヌス毒素投与を受けた患者の血漿サンプルにおける血漿グレリンレベルが100fmol/ml患者血漿未満となり得、すなわち100〜10fmol/ml患者血漿となりうる。
【００９１】
本発明は、下記をも包含する：胃細胞によるグレリン分泌を抑制する方法であって、グレリン分泌胃細胞に対してA型ボツリヌス毒素を経口摂取させ、それによって胃細胞からのグレリン分泌を抑制するステップを含んでなる方法；下垂体細胞からの成長ホルモン放出を抑制する方法であって、グレリンを分泌しうる胃細胞にボツリヌス毒素を投与し、それによって胃細胞からのグレリン分泌を抑制し、下垂体細胞からの成長ホルモン放出を抑制するステップを含んでなる方法；並びに食欲を抑制する方法であって、ボツリヌス毒素を経口投与し、それによって食欲を抑制するステップを含んでなる方法。
【００９２】
説明
本発明は、クロストリジウム毒素、例えばボツリヌス毒素を患者に投与することにより、患者の食欲を抑制することができるという発見に基づいている。本発明の好ましい態様においては、ボツリヌス毒素（例えばA型ボツリヌス毒素）を、食欲抑制を希望する患者に、処置有効量のボツリヌス毒素の経口摂取によって投与する。本発明は、肥満の処置、または患者の胃内の食物滞留時間の延長を対象とするものではない。というのは、患者の健康をすぐにも脅かす状態としての肥満は、全身的分布を意図したより速効性の医薬によって、または手術によって、より良く処置されるからである。さらに、本発明によりクロストリジウム毒素を使用することによって期待される主たる作用は、グレリン拮抗剤として選択的に作用することであって、胃腸運動を抑制することではなく、すなわち主に食物の胃腸管内滞留時間を延長するように作用することではない。
【００９３】
本発明者は、クロストリジウム毒素が、ある胃壁ホルモン（グレリン）の放出を抑制し、それによって食欲を抑制するために使用することができることを見出した。すなわち、胃腸管内で溶解する適切な担体と組み合わされたA型ボツリヌス毒素などのボツリヌス毒素の摂取によって、処置量の生物活性ボツリヌス毒素をグレリン産生胃内分泌細胞およびその近傍に送達できることを、本発明者は発見した。典型的には、その後、数日以内に、患者の食欲は抑制される。
【００９４】
経口投与されるボツリヌス毒素の処置量は、腸内壁を通して循環系へ吸収されるボツリヌス毒素による全身的作用が取るに足りないか、ごくわずかであるような量である。例えば200単位のボツリヌス毒素を、糖尿病性胃不全麻痺を持つ患者の幽門（胃下部）括約筋に注射しても、それに続いて全身毒性が生じることはない。Crowell, M. D. ら「Botulinum toxin reduces pyloric dysfunction in patients with diabetic gastroparesis（ボツリヌス毒素は糖尿病性胃不全麻痺を持つ患者における幽門機能不全を軽減する）」Gastroenterology 2002 April;122（4 Supp 1）:A451-A452。ボツリヌス毒素による催奇形作用を示す証拠はないが、ここに開示する本発明の範囲に包含される方法は、妊娠中の患者、授乳中の患者、または処置期間中に妊娠する意思のある患者への適用またはそのような患者による適用を意図していない。
【００９５】
すなわち、本発明の範囲における食欲抑制方法は、ボツリヌス毒素の経口投与を含んでなり得、ボツリヌス毒素は、胃細胞によるグレリンの分泌を抑制するのに充分な量（例えばA型毒素少なくとも約5単位またはB型毒素少なくとも250単位）、かつボツリヌス毒素の全身的毒性の症状（例えばボツリヌス中毒の症状）を引き起こすには不充分な量（例えばA型毒素約200単位未満またはB型毒素約10000単位未満）で経口投与される。
【００９６】
理論に束縛されることは望まないが、本発明の効力に関して、生理学的機構を提唱することができる。例えば、ボツリヌス毒素がコリン作動性神経（胃腸筋の運動性を担う胃腸管のコリン作動性神経を含む）に作用することは、よく知られている。Pasricha, P.J.「Botulinum toxin for spastic gastrointestinal disorders（痙攣性胃腸障害のためのボツリヌス毒素）」Bailliere's Clin Gastroenterol 1999;13（1）:131-143。また、胃壁細胞によるガストリン分泌およびHCL産生は、胃腸管の神経腺接合部に作用する迷走神経線維および腸筋神経線維のコリン作動性活性に強く依存する。Rossi S. ら「Immunohistochemical localization of SNAP-25 protein in the stomach of rat（ラットの胃におけるSNAP−25タンパク質の免疫組織化学的局在）」Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002;365（Suppl 2）:R37。さらに、胃壁細胞にはA型ボツリヌス毒素BTX−Aの細胞内基質（SNAP−25）が存在する。Gui D. ら「Effects of botulinum toxin on gastric emptying and digestive secretions. A possible tool for correction of obesity?（胃内容排出および消化分泌液に対するボツリヌス毒素の作用。肥満矯正ツール候補？）」Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2002 Jun;365（Suppl 2）:R22。したがって、コリン作動性神経支配された胃内分泌細胞からのグレリン分泌を抑制することによって、食欲を抑制するために、ボツリヌス毒素の経口製剤を使用することができる。あるいは、胃の内分泌細胞からのグレリンのエキソサイトーシスを抑制するボツリヌス毒素の作用は、非コリン作動性仲介メカニズムによるもの（例えばグレリン産生胃細胞への直接作用によるもの）でありうる。
【００９７】
経口投与されるボツリヌス毒素は胃腸管の厳しい環境でも生物活性を保ちうる。すなわち、ボツリヌス毒素は、いくつかの非毒素タンパク質分子によって囲まれた約150kDaの単鎖タンパク質毒素分子を含む複合体として、クロストリジウム細菌によって分泌される。重要なことに、これらの非毒素タンパク質は、複合体が胃腸管を通過する際に、毒素を酸加水分解および酵素的分解から保護するように作用するため、毒素複合体は極端なpHおよびタンパク質分解酵素という厳しい条件に耐えて、依然として著しく強力な神経毒として機能することができる。ボツリヌス毒素分子と複合体を形成する非毒素タンパク質が、胃腸管内で150kDa毒素分子を消化酸から保護するように作用することは、証明されている。Brin M. F. ら編「Scientific and therapeutic aspects of botulinum Toxin」（Lippincott, Williams & Wilkins（2002））の第2章、11から27頁、Hanson, M.A. ら「Structural view of botulinum Clostridial toxin in numerous functional states（さまざまな機能的状態にあるボツリヌスクロストリジウム毒素の構造）」。
【００９８】
本発明の範囲に包含されるボツリヌス毒素経口製剤は、食欲抑制を希望する患者の胃に処置量のボツリヌス毒素を放出する能力を持つ。放出されるボツリヌス毒素の量は（A型ボツリヌス毒素の場合で）少なければ約10単位（例えば体重50kg未満の患者の食欲を抑制する場合）、多ければ500単位（例えば大きい成人を処置する場合）まで含むことができる。処置効力を得るのに必要なボツリヌス毒素の量は、異なるボツリヌス毒素血清型の既知の臨床力価に応じて、さまざまでありうる。例えば、B型ボツリヌス毒素の場合は、A型ボツリヌス毒素を使用することによって達成される生理学的効果に匹敵する生理学的効果を達成するのに、典型的には数桁多い単位数が必要である。
【００９９】
本発明の範囲に包含される経口製剤によって処置有効量で放出されるボツリヌス毒素は、好ましくは、実質上生物学的に活性なボツリヌス毒素である。言い換えると、経口製剤から放出されるボツリヌス毒素は、標的細胞に高い親和性で結合する能力、少なくとも一部がニューロンの膜を横切って移行される能力、そしてニューロンの細胞質ゾルにおけるその活性により、そのニューロンからのアセチルコリンのエキソサイトーシスを阻害する能力（グレリン産生胃細胞を神経支配するコリン作動性ニューロンの場合）またはグレリンの放出を抑制する能力（ボツリヌス毒素がグレリン産生胃細胞に直接作用する場合）を持つ。ボツリヌストキソイドを、該トキソイドの免疫原性の故に抗体を産生させる（免疫応答）ことによってボツリヌス毒素に対する免疫をもたらすための抗原として意図的に使用することは、本発明の範囲から除外されるものとする。本発明の目的は、患者の消化管内でインビボでエキソサイトーシスを阻害し、その結果として、胃腸管（例えば胃）における分泌細胞または腺からのグレリン分泌を抑制することにより食欲を抑制するという所望の処置効果を達成するために、胃腸管における経口投与製剤からの少量のボツリヌス毒素の放出を可能にすることである。
【０１００】
経口製剤は、ボツリヌス毒素が生分解性担体中に実質上均一に分散するように製造される。本発明の範囲に含まれる別の経口製剤は、生分解性コーティングでコーティングした担体を含んでよく、該コーティングの厚さまたはコーティング材料は変化することができる。
【０１０１】
経口製剤の厚さを使って、本発明の組成物による水の吸収を、したがって本発明の組成物からのクロストリジウム毒素の放出速度を、制御することができ、厚い経口製剤は薄いものよりもゆっくりとポリペプチドクロストリジウム毒素を放出する。
【０１０２】
クロストリジウム毒素制御放出組成物中のクロストリジウム毒素は、他の賦形剤、例えば増量剤または更なる安定剤、例えば凍結乾燥中のクロストリジウム毒素を安定化する緩衝剤とも混合し得る。
【０１０３】
担体は好ましくは、非毒性で非免疫学的な生体適合性の材料から成る。適当な経口製剤材料は、ポリマーであるポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐ−ＨＥＭＡ）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（ｐ−ＮＶＰ）＋、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、エチレン−ビニルアセテートコポリマー（ＥＶＡｃ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリビニルピロリドン／メチルアクリレートコポリマー、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ無水物、ポリ（オルトエステル）、コラーゲンおよびセルロース誘導体、並びにバイオセラミック、例えばヒドロキシアパタイト（ＨＰＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）およびリン酸アルミノカルシウム（ＡＬＣＡＰ）を包含しうる。
【０１０４】
生分解性担体は、ポリマーであるポリ（ラクチド）、ポリ（グリコリド）、コラーゲン、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリカーボネート、ポリエステラミド、ポリ無水物、ポリ（アミノ酸）、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（アルキレンオキサレート）、生分解性ポリウレタン、それらのブレンドおよびコポリマーから調製しうる。特に好ましい担体は、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（「ＰＬＧＡ」）のポリマーまたはコポリマーとして形成し、ここでラクチド：グリコリド比は所望の担体分解速度に応じて変化しうる。
【０１０５】
生分解性ＰＬＧＡポリマーは、吸収性縫合糸および骨プレートの形成のために、またいくつかの市販微粒子状製剤中に使用されている。ＰＬＧＡはバルク侵食によって分解して乳酸およびグリコール酸を生じるもので、分子量およびポリマー末端基（例えばラウリルアルコールまたは遊離酸）の異なるものが市販されている。
【０１０６】
人体への使用のために承認され、タンパク質および抗原の送達に用いられている他のポリマー群は、ポリ無水物である。ＰＬＧＡとは異なり、ポリ無水物は表面侵食によって分解して、担体表面で取り込んでいたクロストリジウム毒素を放出する。
【０１０７】
適当な経口製剤を製造するために、担体ポリマーを有機溶媒、例えば塩化メチレンまたは酢酸エチルに溶解し、次いでボツリヌス毒素をポリマー溶液中に混ぜ込むことができる。従来のミクロスフェア製剤の製法は、溶媒蒸発法および溶媒（コアセルベーション）法である。ＰＬＧＡミクロスフェアへのタンパク質抗原封入法として、水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）ダブルエマルジョン法が広く用いられている。
【０１０８】
ボツリヌス毒素の水溶液も、経口製剤の製造に使用しうる。クロストリジウム毒素の水溶液をポリマー溶液（適当な有機溶媒中にポリマーを予め溶解したもの）に加える。ミクロスフェアの放出性能と、クロストリジウム毒素封入効率（タンパク質担持量の理論値と実測値との比）とのいずれの決定に関しても、（クロストリジウム毒素の）水溶液体積と（ポリマーの）有機溶媒体積との比は重要なパラメータである。
【０１０９】
封入効率は、ポリマー溶液の動粘度を高めることによっても向上し得る。ポリマー溶液の動粘度は、処理温度を低下することによって、および／または有機溶媒中のポリマー濃度を高めることによって、大きくすることができる。
【０１１０】
すなわち、有機相（ポリマー）に対して水相（クロストリジウム毒素）の体積が小さい（すなわち、水相体積：有機相体積が≦０．１ml／ml）場合、実質的に１００％のクロストリジウム毒素をミクロスフェアに封入することができ、ミクロスフェアは３相放出、すなわち初期バースト（第１パルス）、ラグ相（クロストリジウム毒素放出が殆んどまたは全くない）、および第２放出相（第２パルス）を示しうる。
【０１１１】
ラグ相の長さは、ポリマー分解速度に依存し、ポリマー分解速度はポリマーの組成および分子量に依存する。すなわち、第１（バースト）パルスと第２パルスとの間のラグ相は、ラクチド含量が高いほど長くなり、またはラクチド：グリコリド比を一定に保ってポリマー分子量を高めるほど長くなる。水相（クロストリジウム毒素）体積を小さくすることに加えて、低温（２〜８℃）で処理することも、前記のように、封入効率を高め、また、初期バーストを抑制し、熱不活性化に対するクロストリジウム毒素安定性向上を促進する。
【０１１２】
クロストリジウム毒素（例えばボツリヌス毒素）のインビボ制御放出のための本発明の適当な経口製剤は、経口製剤がクロストリジウム毒素を胃腸管内で放出するように製造しうる。
【０１１３】
好ましくは、経口製剤のボツリヌス毒素放出に際し、毒素の血清レベルは極めて低い。本発明の経口製剤は、摂取用懸濁液として調製してもよい。そのような懸濁液は、製薬分野でよく知られた一般的な方法によって、例えば適当なメッシュ篩（例えば１２０メッシュ）を備えた超遠心ミル内でポリラクチド／ポリペプチド混合物を粉砕し、その粉砕し篩過した粒子を注射用溶媒（例えばプロピレングリコール、水）に、場合により従来の粘度上昇剤もしくは懸濁化剤、油または他の既知の適当な経口摂取用液体賦形剤と共に懸濁させることによって製造しうる。
【０１１４】
好ましくは、インビボでの生物学的活性クロストリジウム毒素の放出は、クロストリジウム毒素放出期間の間、顕著な免疫系応答を引き起こさない。
【０１１５】
ボツリヌス毒素経口製剤は好ましくは、生分解性ポリマーミクロスフェアからボツリヌス毒素が、生物学的に活性な形態で、すなわち実質的に天然の毒素コンフォメーションで放出されることを可能にする。クロストリジウム毒素を経口製剤マトリックスを形成し得る適当なポリマーとの混合のために有用とするフォーマット（例えば凍結乾燥したクロストリジウム毒素粉末）において、また、クロストリジウム毒素が選択されたポリマーのマトリックス中に存在または組み込まれている間に、クロストリジウム毒素を安定化するために、様々な医薬賦形剤を使用しうる。適当な賦形剤は、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、塩化ナトリウム、アルブミンおよび乾燥スキムミルクを包含しうる。クロストリジウム毒素経口製剤中のクロストリジウム毒素は、賦形剤、増量剤および安定剤、並びに凍結乾燥時にクロストリジウム毒素を安定化する緩衝剤と混合しうる。
【０１１６】
安定化されたクロストリジウム毒素は、生物学的に活性な非凝集クロストリジウム毒素が、＋２またはそれ以上の価数の多価金属カチオン少なくとも１種と複合したものを含み得ることがわかっている。
【０１１７】
適当な多価金属カチオンは、生体適合性金属カチオン成分に含まれる金属カチオンを包含する。金属カチオン成分は、該カチオン成分が使用量で被投与体に対して毒性でなく、しかも被投与体に顕著な悪影響（例えば製剤の経口投与による免疫学的反応）を及ぼさないならば、生体適合性である。
【０１１８】
クロストリジウム毒素を金属カチオンで安定化する場合の金属カチオン成分とクロストリジウム毒素とのモル比は、好ましくは約４：１ないし約１００：１、より好ましくは約４：１ないし約１０：１である。
【０１１９】
ボツリヌス毒素の安定化に使用する好ましい金属カチオンはＺn＋＋である。なぜなら、
ボツリヌス毒素は亜鉛エンドペプチダーゼであることが知られているからである。ボツリヌス毒素は二価亜鉛エンドペプチダーゼであることが知られているので、二価亜鉛カチオンが好ましい。最も好ましい態様においては、Ｚn＋＋カチオンを含む金属カチオン成分とクロストリジウム毒素とのモル比が約６：１である。
【０１２０】
クロストリジウム毒素安定化のための金属カチオンの適性は、当業者が様々な安定性評価法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、逆相クロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよび効力試験を、金属カチオン含有クロストリジウム毒素凍結乾燥粒子に対して、凍結乾燥後および粒子からの放出中に行ってクロストリジウム毒素の効力を測定することによって決定しうる。安定化されたクロストリジウム毒素において、クロストリジウム毒素がインビボで水和により微粒子内で凝集する傾向、および／または水和または徐放性組成物形成過程または徐放性組成物の化学的性質の故に生物学的活性または効力を失う傾向は、クロストリジウム毒素をポリマー溶液と接触させる前にクロストリジウム毒素を少なくとも１種の金属カチオンと複合体化させることによって減少する。
【０１２１】
本発明によって、安定化されたクロストリジウム毒素は、制御放出期間にわたってインビボで顕著な凝集に対して安定化される。顕著な凝集とは、ポリマーで封入されるかまたはポリマーマトリックスに取り込まれたクロストリジウム毒素の約１５％またはそれ以上の凝集をもたらす凝集量として定義される。好ましくは、凝集はクロストリジウム毒素の約５％未満に保たれる。より好ましくは、凝集はポリマー中に存在するクロストリジウム毒素の約２％未満に保たれる。
【０１２２】
他の一態様においては、クロストリジウム毒素制御放出組成物は第２の金属カチオン成分をも含有する。第２の金属カチオン成分は、安定化されたクロストリジウム毒素粒子内に含まれず、担体中に分散している。第２の金属カチオン成分は好ましくは、安定化されたクロストリジウム毒素中に含まれるものと同じ種の金属カチオンを含有する。あるいは第２の金属カチオン成分は、１種またはそれ以上の異なる金属カチオン種を含有し得る。
【０１２３】
第２の金属カチオン成分は、例えば、組成物中のクロストリジウム毒素の安定性を向上するように、金属カチオンによるクロストリジウム毒素安定化期間を更に延長する金属カチオン貯留として機能することによって、経口製剤のポリマーマトリックスからのクロストリジウム毒素放出を調製するよう機能する。
【０１２４】
調節放出に使用する金属カチオン成分は通例、少なくとも１種の多価金属カチオンを含む。クロストリジウム毒素放出の調節に適当な第２の金属カチオン成分の例は、例えば、Mg(OH)2、MgCO3（例えば4MgCO3Mg(OH)25H2O)、ZnCO3（例えば3Zn(OH)22ZnCO3）、CaCO3、Zn3(C6H5O7)2、Mg(OAc)2、MgSO4、Zn(OAc)2、ZnSO4、ZnCl2、MgCl2およびMg3(C6H5O7)2を包含または含有する。第２の金属カチオン成分とポリマーとの適当な重量比は、約１：９９ないし約１：２である。最適な比は、使用するポリマーおよび第２金属カチオン成分によって変化する。
【０１２５】
本発明のクロストリジウム毒素経口製剤は、多くの剤形、例えばフィルム、ペレット、円柱、円板またはミクロスフェアに製剤化することができる。本書において定義されるミクロスフェアは、安定化されたクロストリジウム毒素を中に分散させた、直径約１mm未満の担体成分を含む。ミクロスフェアは、球形、非球形または不規則形であってよい。ミクロスフェアは球形であることが好ましい。通例、ミクロスフェアは、適当な摂取用液体中に分散させるものであり得る。ミクロスフェアの好ましいサイズ範囲は、直径約１μから約１８０μである。
【０１２６】
生物学的に活性な非凝集クロストリジウム毒素の胃腸放出用組成物を製造する本発明の方法においては、生物学的に活性な安定化されたクロストリジウム毒素粒子を適量で担体に分散させる。
【０１２７】
本書において定義される適当なポリマー担体溶媒とは、ポリマーは溶解するが、安定化されたクロストリジウム毒素は実質的に不溶および非反応性である溶媒である。適当なポリマー溶媒の例は、極性有機液体、例えば塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチルおよびアセトンを包含する。
【０１２８】
生物学的に活性な安定化されたクロストリジウム毒素を調製するために、クロストリジウム毒素を、少なくとも１種の適当な金属カチオン成分と共に、金属カチオンとクロストリジウム毒素の複合体を形成するのに適当なｐＨ条件下に適当な水性溶媒中で混合する。通例、複合体化したクロストリジウム毒素は、溶媒に懸濁した濁った沈殿物の形態でありうる。しかし、複合体化したクロストリジウム毒素は溶解していることもある。より一層好ましい態様においては、クロストリジウム毒素をＺｎ＋＋と複合体化させる。
【０１２９】
クロストリジウム毒素複合体の形成に適当なｐＨ条件は通例、約５．０から約６．９の間のｐＨ値を包含する。適当なｐＨ条件は通例、水性緩衝剤、例えば炭酸水素ナトリウムを溶媒として使用することによって達成される。
【０１３０】
適当な溶媒は、例えば水性炭酸水素ナトリウム緩衝液中におけるように、クロストリジウム毒素および金属カチオン成分がそれぞれ少なくとも少しは可溶である溶媒である。水性溶媒用には、使用する水は脱イオン水または注射用水（ＷＦＩ）であることが好ましい。
【０１３１】
クロストリジウム毒素は、金属カチオン成分との接触前に固体または溶解状態であり得る。更に、金属カチオン成分も、クロストリジウム毒素との接触前に固体または溶解状態であり得る。好ましい態様においては、クロストリジウム毒素の緩衝水溶液を、金属カチオン成分の水溶液と混合する。
【０１３２】
通例、複合体化したクロストリジウム毒素は、溶媒に懸濁した濁った沈殿物の形態であり得る。しかし、複合体化したクロストリジウム毒素は溶解していることもある。好ましい態様においては、クロストリジウム毒素をＺn＋＋と複合体化させる。
【０１３３】
Ｚn＋＋複合体化クロストリジウム毒素を、次いで例えば凍結乾燥によって乾燥させて、安定化したクロストリジウム毒素の粒子を形成することができる。Ｚn＋＋複合体化クロストリジウム毒素（懸濁または溶解している）は、大量で凍結乾燥し得るか、またはより小さい体積に小分けしてから凍結乾燥し得る。好ましい態様においては、Ｚn＋＋複合体化クロストリジウム毒素懸濁液を、例えば超音波ノズルを用いて微小化し、次いで凍結乾燥して、安定化されたクロストリジウム毒素の粒子を形成する。Ｚn＋＋複合体化クロストリジウム毒素混合物を凍結乾燥するための許容可能な手段は、当分野で知られているものを包含する。
【０１３４】
他の一態様においては、安定化されたクロストリジウム毒素の粒子中に含まれない第２の金属カチオン成分をも、ポリマー溶液中に分散させる。
【０１３５】
第２の金属カチオン成分および安定化クロストリジウム毒素は、ポリマー溶液に、順次、逆の順序で、間欠的に、別々に、または同時に加えて分散させ得ると理解される。別法では、ポリマー、第２金属カチオン成分および安定化クロストリジウム毒素を、ポリマー溶媒に、順次、逆の順序で、間欠的に、別々に、または同時に加えて混ぜ込むことができる。この方法において、ポリマー溶媒を次いで凝固させて、安定化クロストリジウム毒素を分散して含有するポリマーマトリックスを形成する。
【０１３６】
ポリマー溶液からのクロストリジウム毒素経口製剤の適当な製法は、溶媒蒸発法であり、米国特許第3,737,337号; 第3,523,906号; 第3,691,090号; および第4,389,330号に記載されている。溶媒蒸発法は、クロストリジウム毒素経口製剤の製法として使用しうる。
【０１３７】
溶媒蒸発法においては、安定化クロストリジウム毒素粒子を分散して含有するポリマー溶液を、ポリマー溶媒が部分的に混和しうる連続相中に混合するか、または該連続相と共に撹拌して、エマルジョンを形成する。連続相は通例、水性溶媒である。エマルジョンの安定化のために、しばしば乳化剤を連続相に加える。次いで、ポリマー溶媒を数時間またはそれ以上にわたって蒸発させ、それによってポリマーを凝固させて、安定化クロストリジウム毒素粒子が内部に分散したポリマーマトリックスを形成する。
【０１３８】
ポリマー溶液からクロストリジウム毒素制御放出ミクロスフェアを形成する好ましい方法が、米国特許第5,019,400号に記載されている。このミクロスフェア形成方法は、相分離のような他の方法と比較して、特定のクロストリジウム毒素含量の経口製剤を製造するのに要するクロストリジウム毒素量を更に低下させる。
【０１３９】
この方法においては、安定化クロストリジウム毒素を分散して含有するポリマー溶液を処理して液滴を形成する。少なくとも実質的な割合の液滴がポリマー溶液および安定化クロストリジウム毒素を含有する。このような液滴を次いで、ミクロスフェアを形成するのに適当な手段によって凍結させる。ポリマー溶液分散液を加工して液滴を形成する方法の例は、分散液を超音波ノズル、プレッシャーノズル、Rayleighジェットを通す方法、または溶液から液滴を形成する他の既知の方法を包含する。
【０１４０】
凍結微小液滴中の溶媒を、固体および／または液体として非溶媒で抽出し、安定化クロストリジウム毒素を含有するミクロスフェアを形成する。ある種のポリマー、例えばポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーから溶媒を抽出するのに、エタノールを他の非溶媒（例えばヘキサンまたはペンタン）と混合すると、エタノールを単独で用いるよりも溶媒抽出速度を高めることができる。
【０１４１】
ポリマー溶液からクロストリジウム毒素経口製剤を形成する更に別の方法には、例えば型を用いてフィルムまたはシェイプを形成するフィルムキャスティングがある。例えば安定化クロストリジウム毒素を分散させて含有するポリマー溶液を型に入れ、次いでポリマー溶媒を当分野で既知の方法で除去するか、またはポリマー溶液の温度を低下して、乾燥恒重量のフィルムまたはシェイプを得る。
【０１４２】
生分解性ポリマー経口製剤の場合、クロストリジウム毒素の放出はポリマー分解によって起こる。分解速度は、ポリマーの水和速度に影響するポリマーの性質を変えることによって制御し得る。そのような性質は例えば、ポリマーを構成する複数種のモノマー（例えばラクチドおよびグリコリド）の比；ラセミ混合物に代わるモノマーのＬ−異性体の使用；およびポリマーの分子量を包含する。これらの性質はポリマーの親水性および結晶性に影響し得、それによりポリマーの水和速度が制御される。水和を促進し、ポリマー侵食速度を変化し得るように、親水性賦形剤、例えば塩、炭水化物および界面活性剤を組み合わせることもできる。
【０１４３】
生分解性ポリマーの性質を変更することによって、クロストリジウム毒素放出に対する、拡散および／またはポリマー分解の寄与を制御し得る。例えば、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）ポリマーのグリコリド含量を高め、ポリマー分子量を小さくすることによって、ポリマーの加水分解を促進し、それ故ポリマー侵食によるクロストリジウム毒素放出を促進することができる。更に、中性でないpＨにおいて、ポリマー加水分解速度が高まる。従って、ミクロスフェア形成に使用するポリマー溶液に酸性または塩基性の賦形剤を加えることによって、ポリマー侵食速度を変化させることができる。
【０１４４】
本発明の経口製剤をヒトに投与して、前記のように、様々な医学的状態のクロストリジウム毒素処置のために知られたパラメータに基づく所望の用量のクロストリジウム毒素を提供することができる。
【０１４５】
投与に適した経口製剤による特定の投与量は、上述した因子に応じて、当業者によって容易に決定される。投与量は、処置または除神経の対象である組織塊の大きさならびに毒素の市販調製物にも依存しうる。また、ヒトにおける適切な投与量の概算値は、他の組織の効果的な除神経に必要なボツリヌス毒素の量の測定値から推定することができる。例えば、注射すべきA型ボツリヌス毒素の量は、処置対象組織の大きさおよび活動レベルに比例的である。一般に、所望の食欲抑制を効果的に達成するために、単位期間あたり（例えば2〜4ヶ月間にわたって、または2〜4ヶ月に1回）、患者の体重1キログラムあたり約0.01単位から約35単位のボツリヌス毒素、例えばA型ボツリヌス毒素を、本経口製剤によって放出させることができる。約0.01U／kg未満のボツリヌス毒素は胃内分泌細胞に対して有意な処置効果を持たないことがあり、一方、約35U／kgを超えるボツリヌス毒素は、A型ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素の毒性用量に近い。経口製剤を注意深く製造することにより、顕著な量のボツリヌス毒素が全身的に現れるのを防止する。より好ましい用量範囲は、約0.01U／kgから約25U／kgのボツリヌス毒素、例えばBOTOX（登録商標）として製剤化されているものである。投与すべきボツリヌス毒素のU／kgの実際量は、処置対象組織の大きさ（量）および活動レベルならびに選択した投与経路などの因子に依存する。A型ボツリヌス毒素は、本発明の方法での使用に好ましいボツリヌス毒素血清型である。
【０１４６】
本発明の範囲に包含される方法を実施するために使用されるクロストリジウム毒素は、好ましくは、ボツリヌス毒素、例えばA、B、C、D、E、FまたはG血清型ボツリヌス毒素の一つである。使用するボツリヌス毒素は、好ましくは、A型ボツリヌス毒素である。というのも、これは、ヒトにおいて高い力価を持ち、容易に入手することができ、筋肉内注射によって局所投与する場合、骨格筋および平滑筋障害の処置に安全かつ有効に使用されることが知られているからである。
【０１４７】
本発明は、その範囲に、胃または胃腸管の細胞によるグレリン産生の抑制による食欲抑制に使用した場合に長時間持続する処置効果を持つ任意のクロストリジウム毒素の使用を包含する。例えば、毒素産生クロストリジウム細菌の任意の種によって産生されるクロストリジウム毒素、例えばボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）およびクロストリジウム・ベラッチ（Clostridium beratti）などによって産生されるクロストリジウム毒素を、本発明の方法で使用するか、本発明の方法での使用に適合させることができる。また、上述のようにA型は最も好ましい血清型であるが、ボツリヌス血清型A、B、C、D、E、FおよびGはいずれも、本発明の実施に有利に使用することができる。本発明を実施することにより、1ヶ月ないし約5または6年間にわたり効果的な食欲抑制による緩解を提供することができる。
【０１４８】
本発明は、その範囲に、（a）細菌培養、毒素抽出、濃縮、保存、凍結乾燥および／または復元によって取得または加工されるクロストリジウム毒素複合体および純粋なクロストリジウム毒素、ならびに（b）修飾神経毒または組換えクロストリジウム毒素、すなわち1つ以上のアミノ酸またはアミノ酸配列が、既知の化学的／生化学的アミノ酸修飾法によって、または既知の宿主細胞／組換えベクター組換え技術によって、故意に削除、修飾または置換されているクロストリジウム毒素、ならびにそのようにして作製されたクロストリジウム毒素の誘導体もしくは断片を包含し、細胞上に存在する細胞表面受容体に対するターゲティング部分が1つ以上結合しているクロストリジウム毒素を包含する。
【０１４９】
本発明に従って使用されるボツリヌス毒素は、凍結乾燥体または真空乾燥体として容器中に減圧下で保存することができる。凍結乾燥に先立って、ボツリヌス毒素を医薬的に許容できる賦形剤、安定剤および／または担体、例えばアルブミンと混合することができる。凍結乾燥材料または真空乾燥材料は、塩水または水で復元することができる。
【０１５０】
本発明は、有効な食欲抑制剤を提供するための経口製剤の使用をも本発明の範囲に包含する。すなわち、クロストリジウム毒素を、嚥下可能な適当なポリマーマトリックスに包埋し、吸収させ、または担持させることができる。
【０１５１】
適切な投与経路および投与量を決定する方法は一般にケースバイケースで担当医によって決定される。そのような決定は当業者にとっては日常的作業である（例えば Anthony Fauciら編「Harrison's Principles of Internal Medicine」（1998）、第14版、McGraw Hill 発行を参照されたい）。すなわち、本発明の経口製剤は、嚥下によって投与しうる。
【０１５２】
凍結乾燥破傷風トキソイドの水分含量が多いと、ミクロスフェア封入後のトキソイドの固相凝集および不活性化を引き起こし得ることが知られている。すなわち、破傷風トキソイド水分含量が１０％（タンパク質１００ｇ当たりの水のグラム数）では、毒素の約２５％が凝集し、水分含量５％では、わずか約５％のトキソイドが凝集する。例えばPark K., Controlled Drug Delivery Challenges and Strategies, American Chemical Society (1997)の第12章（第229-267頁）のSchwendeman S.P.ら, Peptide, Protein, and Vaccine Delivery From Oral formulationable Polymeric Systems, 第251頁参照。重要なことに、ＢＯＴＯＸ（登録商標）の製法により、水分含量約３％未満の凍結乾燥Ａ型ボツリヌス毒素複合体が得られ、この水分レベルでは固相凝集が非常に少ないと考えられる。
【０１５３】
生分解性ボツリヌス毒素経口製剤の通常の製法は下記の通りである。経口製剤は、乳酸単独のポリマーであるポリラクチドを約２５％から約１００％含みうる。経口製剤中のラクチド量を増加すると、経口製剤が生分解を受け始めるまでの時間を延長することができ、すなわち経口製剤からのボツリヌス毒素放出までの時間を延長することができる。経口製剤は、乳酸およびグリコール酸のコポリマーであってもよい。乳酸はラセミ体または光学活性形態であってよく、ベンゼンに可溶でインヘレント粘度が0.093（クロロホルム中、100ml当たり1g）から0.5（ベンゼン中、100ml当たり1g）であるかまたはベンゼンに不溶でインヘレント粘度が0.093（クロロホルム中、100ml当たり1g）から4（クロロホルムまたはジオキサン中、100ml当たり1g）であってよい。経口製剤は、担体ポリマー中に均一に分散したボツリヌス毒素0.001％から50％をも含有し得る。
【０１５４】
経口製剤が水を吸収し始めると、経口製剤は２つの連続した、通常は区別されるクロストリジウム毒素放出相を示し得る。第１相では、経口製剤の外表面に通じる水性クロストリジウム毒素部分からの初期拡散によってクロストリジウム毒素が放出される。第２相は、生分解性担体（例えばポリラクチド）が分解する結果、クロストリジウム毒素が放出されて起こる。この拡散相と分解誘導相とは、時間的に差があり得る。経口製剤を水性生理的環境中に置くと、水がポリマーマトリックス中に拡散し、クロストリジウム毒素とポリラクチドとの間に分配されて、水性クロストリジウム毒素部分を形成する。水性クロストリジウム毒素部分は水の吸収増加につれて増大し、水性クロストリジウム毒素部分の連続性が、経口製剤の外表面に通じるのに充分なレベルに達するようになる。このようにして、水性クロストリジウム毒素部分から形成された水性ポリペプチドチャネルを通っての拡散によってクロストリジウム毒素が経口製剤から放出され始め、第２相は、残りのクロストリジウム毒素が実質的に全部放出されてしまうまで続く。
【０１５５】
クロストリジウム毒素封入ミクロスフェアを適切な液体、例えば生理食塩水に懸濁することによって製造される懸濁液の形態をとっている、食欲抑制剤として使用するための経口製剤も、本発明の範囲に包含される。
【０１５６】
実施例
以下の実施例は本発明に包含される特定の組成物および方法を説明するものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【実施例１】
【０１５７】
経口摂取用ボツリヌス毒素錠剤を製造する方法
ボツリヌス毒素は、胃または十二指腸内に毒素活性成分を放出させるための経口製剤として調合することができる。これは、乳鉢と乳棒を使って（水または塩水を加えずに室温で）、50単位の市販凍結乾燥ボツリヌス毒素粉末、例えば非復元BOTOX（登録商標）（または200単位のDYSPORT（登録商標）粉末）を、穀粉または糖などの生分解性担体と混合することにより、容易に達成される。もう一つの選択肢として、均質化または超音波処理で担体中に粉末毒素の微細分散系を形成させることによって、ボツリヌス毒素を混合することもできる。次に、錠剤製造機（例えばScheu ＆ Kniss（ケンタッキー州40210ルイスビル、ウエスト・オームズビー・アベニュー1500）から入手できる打錠機）を使って、その混合物を圧縮することにより、摂取可能な錠剤を製造する。もう一つの選択肢として、周知の方法論により、ゼラチンを使って毒素を製剤化することにより、摂取可能なジェルタブを製造することもできる。
【実施例２】
【０１５８】
食欲を抑制する方法
厳格に自ら設定した範囲内での体重制御を希望する、性格俳優として働く４２歳の男性を、実施例１のボツリヌス毒素経口製剤を投与することにより処置することができる。患者は４日間毎日、Ａ型ボツリヌス毒素５０単位錠１個を嚥下しうる。２週間以内に患者の体重は１０ポンド減少し得、第４週の終りには減少体重は２０ポンドにまでなる。これは明らかに、胃内分泌細胞によるグレリン産生の減少、およびその結果としての食欲抑制によるものである。
【実施例３】
【０１５９】
生分解性ボツリヌス毒素経口製剤を製造する方法
ボツリヌス毒素および適当な担体ポリマーを含有する生分解性経口製剤を製造するために、揮発性有機溶媒（例えばジクロロメタン）中の生分解性ポリマーから成る連続相に、安定化したボツリヌス毒素製剤（例えば非復元ＢＯＴＯＸ（登録商標））を適量分散させうる。ＰＬＧＡおよびポリ無水物はいずれも水に不溶で、ミクロ封入法において有機溶媒を使用する必要がある。
【０１６０】
ミクロスフェア形成を促進するように、有機溶媒（例えば塩化メチレンまたは酢酸エチル）にポリマーを溶解させる。次いで、ボツリヌス毒素を均質化または超音波処理によって混ぜ込んで、ポリマー／有機溶媒中の毒素の微細な分散を形成する。これは、タンパク質水溶液を用いた場合にはエマルジョンとしてであり、タンパク質の固形製剤をポリマー／有機溶媒溶液と混合した場合には懸濁液としてである。従来のミクロスフェア形成方法は、溶媒蒸発法および溶媒（コアセルベーション）法である。ミクロスフェアを形成するために、タンパク質薬物とポリマー／有機溶媒との予め形成した懸濁液と、乳化剤（例えばポリビニルアルコール）を含有する水とを混合する。次いで、更に水を加えて、ミクロスフェアからの有機溶媒の除去を促進し、ミクロスフェアを硬化させる。最終的に生成したミクロスフェアを乾燥して、流動性粉末とする。
【０１６１】
使用するポリマーは、ＰＬＡ、ＰＧＡまたはそれらのコポリマーであり得る。別法として、クロストリジウム毒素の水溶液（例えば復元ＢＯＴＯＸ（登録商標））をポリマー／有機相中で乳化する（これによりＷ／Ｏエマルジョンを得る）ことによって、ボツリヌス毒素を組み込んだポリマーを調製することもできる。いずれの方法においても、毒素とポリマーの均一な混合を確実なものとするために、高速撹拌機または超音波を使用する。エマルジョンを高温空気流中に噴霧し、溶媒の蒸発による粒子形成を誘導することによって、直径１〜５０μｍの微粒子を形成することができる（噴霧乾燥法）。別法として、非溶媒（例えばシリコーン油）の添加によるポリマーのコアセルベーションによって（相分離法）、またはＷ／Ｏ／Ｗエマルジョンの形成によって（ダブルエマルジョン法）、粒子形成を達成することもできる。
【０１６２】
ボツリヌス毒素を混ぜ込むキャスティング溶液または他の溶液のｐＨは、ｐＨ４．２〜６．８に保つ。なぜなら、約７を越えるｐＨでは安定化非毒素タンパク質がボツリヌス毒素から解離し得、その結果、毒性が徐々に失われ得るからである。好ましくはｐＨは約５〜６である。更に、混合物／溶液の温度は約３５℃を越えないようにすべきである。なぜなら毒素は溶液／混合物中で約４０℃を越えるように加熱されると容易に毒性を失いうるからである。
【０１６３】
液滴を凍結して微粒子を形成する方法には、液滴を液化ガス（例えば液体アルゴンおよび液体窒素）に入れるかまたはその近傍に配置して凍結した微小液滴を形成し、次いでそれを液体ガスから分離する方法がある。次いで凍結微小液滴を液体非溶媒、例えばエタノール、またはヘキサンもしくはペンタンと混合したエタノールに暴露することができる。
【０１６４】
液滴サイズを、例えば超音波ノズル直径の変更によって変えることによって、広範なサイズのボツリヌス毒素経口製剤微粒子を製造することができる。非常に大きい微粒子を所望する場合は、微粒子をシリンジから直接に低温液体中に押出すことができる。ポリマー溶液の粘度を高めることによっても、微粒子サイズを大きくすることができる。この方法によって、微粒子、例えば直径が約１０００μｍよりも大きい微粒子ないし約１μｍの微粒子を製造することができる。次いで、ボツリヌス毒素を組み込んだ微粒子を摂取可能なカプセルに充填し、封止して、ボツリヌス毒素経口製剤とすることができる。
【０１６５】
別法として、適当な量の非復元ＢＯＴＯＸ（更にミクロスフェアに加工していないもの）の粉末を適当な量の不活性担体（例えば穀粉または糖）と混合し、カプセル充填に充分な体積の材料を提供するようにして、単にカプセルに充填することもできる。
【実施例４】
【０１６６】
ポリ無水物ボツリヌス毒素経口製剤を製造する方法
生分解性ポリ無水物ポリマーを、ポリ−カルボキシフェノキシプロパンおよびセバシン酸の２０：８０の比のコポリマーとして調製しうる。ポリマーおよびボツリヌス毒素（例えば非復元ＢＯＴＯＸ（登録商標））を室温で塩化メチレンに共に溶解し、実施例３に記載の方法を用いて噴霧乾燥によりミクロスフェアとする。塩化メチレンが残留していれば、減圧デシケーター内で蒸発させることができる。
【０１６７】
所望の経口製剤サイズに応じて、したがってボツリヌス毒素量に応じて、適当な量のミクロスフェアを約８０００ｐｓｉで５秒間、または約３０００ｐｓｉで１７秒間、型内で圧縮して、クロストリジウム毒素を組み込んだ円板状経口製剤を形成することができる。すなわち、ミクロスフェアを圧縮成形して直径１．４ｃｍ、厚さ１．０ｍｍの円板状とし、窒素雰囲気中でアルミニウムフォイル袋に包装し、２．２×１０４Ｇｙγ線照射により滅菌することができる。
【実施例５】
【０１６８】
生分解性ボツリヌス毒素経口製剤を製造するための油中水型法
ボツリヌス毒素経口製剤を製造するために、ポリグリコール酸およびポリ乳酸の８０：２０コポリマーを室温で１０％ｗ／ｖジクロロメタン中に、穏やかに撹拌しながら溶解させることができる。次いで、Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリオキシエチレン20ソルビタンモノオレエート、Acros Organics N.V., Fairlawn, NJから入手可能）とＳｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）との１：５混合物１部、および７５単位のＢＯＴＯＸ（登録商標）（Ａ型ボツリヌス毒素複合体）とＱｕｉｌ  Ａ（アジュバント）の水性混合物１１部に、前記ポリマー溶液８８部を加えることによって、油中水型エマルジョンを調製しうる。その混合物を高速ブレンダーで撹拌し、その直後に、６０／１００／１２０ノズルを備えたDrytec Compact Laboratory Spray Dryerを用いて、噴霧圧１５ｐｓｉおよび導入温度６５℃で噴霧乾燥する。得られるミクロスフェアは直径約２０μｍで、流動性粉末として得られる。微量の残留有機溶媒は、減圧蒸発によって除去する。
【実施例６】
【０１６９】
生分解性ボツリヌス毒素経口製剤を製造するための低温法
次のようにして、毒素の変性を抑制するように低温でボツリヌス毒素経口製剤を製造することができる。塩化メチレンまたは酢酸エチル１ｍｌ当たり０．３ｇＰＬＧＡと、ポリマー／有機溶液１ｍｌ当たり０．１ｍｌのクロストリジウム毒素溶液とを、低温（２〜８℃）で混合する。インヘレント粘度（ｄＬ／ｇ）約０．６２の７５：２５ラクチド：グリコリドポリマー（ＭＴＩから入手可能）から、実施例１に記載のように（ポリマーを塩化メチレンに溶解することによってポリマー溶液を形成する）、一次のボツリヌス毒素組み込みミクロスフェアを形成する。これは患者の胃腸管内で分解し得る。
【実施例７】
【０１７０】
食欲を抑制する方法
夜遅くの軽食に対する食欲の抑制を希望する２８歳の女性を、ボツリヌス毒素経口製剤を投与することにより処置する。患者はＢ型ボツリヌス毒素２０００単位の経口懸濁剤（３０ｍｌ）を１回嚥下する。１〜７日間以内に患者は食欲が明らかに抑制されたことを報告し得、この食欲抑制は４〜６ヶ月間持続しうる。この食欲抑制は、視覚アナログ尺度によって評価しうる。
【実施例８】
【０１７１】
食欲を短期間抑制する方法
５７歳の男性が、肉食に対する熱望を放置し続けることによってＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）に罹ることおよび心臓病の危険性が高まることを危惧していると訴える。この患者は、数週間にわたり食欲を抑制し、その後自身がどのように感じるかを調べたいと希望する。患者をＥ型ボツリヌス毒素製剤の経口摂取により処置する。患者は２日間にわたり１日１回、Ｅ型ボツリヌス毒素１００単位の経口懸濁剤（３０ｍｌ）または錠剤を嚥下する。１〜７日間以内に患者は、視覚アナログ尺度によって評価されるように、食欲が明らかに抑制されたことを報告し得、この食欲抑制は２〜４週間持続しうる。
【０１７２】
ここに開示する本発明の方法は、以下に挙げる利点を含む、多くの利点を持っている。
1．1年間またはそれ以上の期間にわたって処置に有効な食欲抑制を提供するために、一つのクロストリジウム毒素経口製剤を使用することができる。
2．顕著な量のクロストリジウム毒素が全身的に現れることなく、グレリン分泌胃内分泌細胞を含む局在組織部分にクロストリジウム毒素を送達することができる。
3．患者にとって経過観察処置の必要が減る。
4．食欲抑制のための定期的な医薬注射または経口投与の必要が減る。
5．注射の必要が一切無くなるので、患者の快適さが増す。
6．患者の服薬遵守性が向上する。
【０１７３】
本発明のクロストリジウム毒素経口製剤の利点には、胃腸標的組織（グレリン産生胃内分泌細胞）に一定処置レベルのクロストリジウム毒素を迅速に送達できることが含まれる。利点にはまた、患者の遵守および受容性の向上も含まれる。
本明細書に挙げた参考文献、論文、刊行物ならびに特許および特許出願は全て、参照により、そのまま本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
一定の好ましい方法に関して本発明を詳細に説明したが、本発明の範囲内で他の態様、変形および変更も可能である。例えば、本発明の方法では、多種多様なクロストリジウム毒素を有効に使用することができる。また、本発明は、2つ以上のボツリヌス毒素が同時にまたは逐次的に投与される経口製剤も包含する。例えば、臨床応答の喪失が起こるか、中和抗体が発生するまでは、A型ボツリヌス毒素を経口製剤によって投与し、その後は、B型またはE型ボツリヌス毒素の適当な経口製剤によって投与を行うことができる。あるいは、所望する処置成果の開始および持続時間を制御するために、ボツリヌス血清型AからGの任意の2つ以上を組み合せて、局所投与することもできる。また、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素がその処置効果を発揮しはじめる前に、補助的効果、例えば除神経の強化または除神経のより迅速な開始などを得るために、経口製剤によるクロストリジウム毒素の投与に先立って、または投与と同時に、または投与後に、非クロストリジウム毒素化合物を投与することもできる。
【０１７５】
また本発明は、食欲を抑制するための経口製剤を製造する際の、ボツリヌス毒素などのクロストリジウム毒素の使用も、その範囲に包含する。
したがって、本願請求項の精神と範囲は、上述の好ましい態様の説明に限定されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】ある種の胃内分泌細胞による、全身的循環へのグレリン放出、および下垂体細胞による成長ホルモン放出を誘発するグレリンの作用を説明する。
【図２】本発明の方法の実施による食欲抑制を評価するための視覚アナログ尺度の例。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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