(57)【要約】一本鎖のマイナス−センスＲＮＡゲノムＲＮＡの３’末端配列に相当する免疫刺激性の配列特異的なＲＮＡオリゴヌクレオチドが提供される。また５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’として提供される免疫刺激性４マーＲＮＡモチーフに関連する組成物および方法も提供される。この短いＲＮＡモチーフの組み込みは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む、新規および既存のオリゴヌクレオチドにおいて、新規のおよび変更された免疫刺激性特性を付与するのに十分である。また、インビトロおよびインビボにおいて免疫応答を誘導するため、そして被験体においてアレルギー、喘息、感染および癌を処置するための、本発明の本発明の免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ：ＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの使用のための方法も提供される。
2007526253.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、単離された１０〜３０ヌクレオチド長の核酸分子を含み、該核酸分子は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端配列によって与えられた配列を含み、安定化された骨格を有する、免疫刺激性組成物。
【請求項２】
前記核酸分子が１０〜２０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３】
前記核酸分子が１０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４】
一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムＲＮＡの３’末端によって与えられた前記配列が、配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含み、Ｕがウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕがシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、かつＧ／Ｕがグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５】
前記配列モチーフが５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項６】
前記配列モチーフが５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項７】
前記配列モチーフが５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項８】
前記配列モチーフが５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項９】
前記安定化された骨格が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１０】
前記安定化された骨格がホスホロチオエート骨格である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１１】
前記安定化された骨格が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１２】
前記安定化された骨格がピロリン酸骨格である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１３】
前記核酸分子が、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１４】
前記核酸分子がＲＮＡである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１５】
前記核酸分子がトール様レセプター（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１６】
前記核酸分子がＴＬＲ８のアゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１７】
前記核酸分子がＴＬＲ７のアゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１８】
前記核酸分子がＴＬＲ３のアゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１９】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがオルトミクソウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２０】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２１】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがラブドウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２２】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがフィロウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２３】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡがボルナウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２４】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがインフルエンザＡウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２５】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがインフルエンザＢウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２６】
前記核酸分子がカチオン性脂質と会合される、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２７】
さらに抗原を含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２８】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、４〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子であって、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端配列によって与えられた配列を含み、安定化された骨格を有する核酸分子と、抗原とを含む、免疫刺激性組成物。
【請求項２９】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、
５’−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−３’
を含む、７〜４０ヌクレオチド長の単離されたオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｎ１およびＮ２は独立して、０〜１０ヌクレオチド長のＲＮＡ配列であり、かつ該オリゴリボヌクレオチドは安定化された骨格を有する、免疫刺激性組成物。
【請求項３０】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３１】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３２】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３３】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３４】
５’−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−３’がＲＮＡ配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を含まない、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３５】
前記オリゴリボヌクレオチドがカチオン性脂質に会合される、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３６】
さらに抗原を含む、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３７】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、
５’−ｄＸ１−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−ｄＸ２−３’
を含む、７〜４０ヌクレオチド長のキメラＤＮＡ：ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、ｄＸ１およびｄＸ２は独立して、０〜６ヌクレオチド長のＤＮＡ配列であり、ｄＸ１およびｄＸ２の少なくとも１つは少なくとも１ヌクレオチド長であり、かつＮ１およびＮ２は独立して、０〜１０ヌクレオチド長のＲＮＡ配列である、免疫刺激性組成物。
【請求項３８】
Ｎ１およびＮ２が両方とも０ヌクレオチド長である、請求項３７に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
ｄＸ１が０ヌクレオチド長である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４０】
ｄＸ２が０ヌクレオチド長である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４１】
ｄＸ１、ｄＸ２またはｄＸ１およびｄＸ２の両方がＣｐＧモチーフを含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４４】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４５】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４６】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４７】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４８】
５’−ｄＸ１−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−ｄＸ２−３’がＲＮＡ配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を含まない、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４９】
前記キメラＤＮＡ：ＲＮＡオリゴリボヌクレオチドがカチオン性脂質に会合される、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５０】
さらに抗原を含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５１】
参照の免疫刺激性プロフィールを有する参照オリゴヌクレオチドの免疫刺激性プロフィールを変更させるための方法であって、該方法は、
ＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含むように３〜４０ヌクレオチド長の参照オリゴヌクレオチドを変更させる工程を包含し、ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、該参照オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性ＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含まず、該変更の結果として、該参照免疫刺激性プロフィールとは別個の変更された免疫刺激性プロフィールを有する変更されたオリゴヌクレオチドが生じる、方法。
【請求項５２】
前記参照オリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチドである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記参照オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記参照オリゴヌクレオチドがＣｐＧ  ＯＤＮである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項５１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５６】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項５１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５７】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項５１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５８】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項５１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５９】
前記参照オリゴヌクレオチドが安定化された骨格を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記参照の免疫刺激性プロフィールが非免疫刺激性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
参照の免疫刺激性プロフィールを有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）の免疫刺激性プロフィールを変更するための方法であって、該方法は、
ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＣ、ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＴ、またはＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＣ、およびＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＴをＵで置換する工程を包含し、Ｕはウラシルオキシリボヌクレオシドであり、該置換の結果として、該参照免疫刺激性プロフィールとは別個の変更された免疫刺激性プロフィールを有する変更されたオリゴヌクレオチドが生じる、方法。
【請求項６２】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣがＵによって置換される請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣおよびあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＧをＧによって、ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＡをＡによって、またはＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＧをＧによって、そしてＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＡをＡによって置換する工程をさらに包含し、ここで、Ｇはグアニンオキシリボヌクレオシドであり、Ａはアデニンオキシリボヌクレオシドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＧがＧによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＡがＡによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣおよびあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＧがＧによって置換され、かつ前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＡがＡによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣおよびあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記変更されたオリゴヌクレオチドが、配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含み、ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項７２】
前記変更されたオリゴヌクレオチドが、安定化された骨格を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項７３】
５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’（配列番号２８６）として提供された、単離された免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを含む組成物。
【請求項７４】
５’−ＴＵＧＴＵＧＴＴＴＴＧＴＵＧＴＴＴＴＧＴＵＧＴＴ−３’（配列番号２８７）として提供された、単離された免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを含む組成物。
【請求項７５】
免疫応答を刺激するための方法であって、
免疫系の細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量とを接触させて免疫応答を刺激する工程を包含する、方法。
【請求項７６】
Ｔｈ１様免疫応答を刺激するための方法であって、
免疫系の細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量とを接触させてＴｈ１様免疫応答を刺激する工程を包含する、方法。
【請求項７７】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、１型インターフェロンの発現を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の発現を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
ＴＬＲシグナル伝達を刺激するための方法であって、
ＴＬＲを発現する細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量とを接触させてＴＬＲによるシグナル伝達を刺激する工程を包含する、方法。
【請求項８０】
前記ＴＬＲがＴＬＲ９である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＴＬＲがＴＬＲ８である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＴＬＲがＴＬＲ７である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＴＬＲがＴＬＲ３である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
被験体における免疫応答を刺激するための方法であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量を被験体に投与して、該被験体における免疫応答を刺激する工程を包含する、方法。
【請求項８５】
被験体におけるＴｈ１様免疫応答を刺激するための方法であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量を被験体に投与して、該被験体におけるＴｈ１様免疫応答を刺激する工程を包含する、方法。
【請求項８６】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、前記被験体における１型インターフェロンの発現を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、前記被験体におけるＩＬ−１２の発現を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
被験体における抗原特異的免疫応答を刺激するための方法であって、
有効量の請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物および抗原を被験体に投与して、該被験体における抗原特異的免疫応答を刺激する工程を包含する、方法。
【請求項８９】
前記抗原がアレルゲンを含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記抗原がウイルス抗原を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗原が細菌抗原を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９２】
前記抗原が癌抗原を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９３】
被験体においてアレルギー性の状態を処置するための方法であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、アレルギー性状態を有するかまたは発症するリスクにある被験体に投与して、該アレルギー性の状態を処置する工程を包含する、方法。
【請求項９４】
被験体において喘息を処置するための方法であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、喘息を有するかまたは発症する危険にある被験体に投与して、該喘息を処置する工程を包含する、方法。
【請求項９５】
被験体において感染を処置するための方法であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、感染を有するかまたは発症する危険のある被験体に投与して、該感染を処置する工程を包含する、方法。
【請求項９６】
前記感染がウイルス感染を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記感染が細菌感染を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
被験体において癌を処置するための方法であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量を、癌を有するかまたは発症する危険にある被験体に投与して、該癌を処置する工程を包含する、方法。
【請求項９９】
ＴＬＲのアンタゴニストについてスクリーニングするための方法であって、
ＴＬＲを発現する参照細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量とを、該ＴＬＲの候補アンタゴニストの非存在下で接触させて、該ＴＬＲによるシグナル伝達の参照量を測定する工程；
該ＴＬＲを発現する試験細胞と、該組成物の有効量とを、該ＴＬＲの候補アンタゴニストの存在下で接触させて、該ＴＬＲによるシグナル伝達の試験量を測定する工程；および
該シグナル伝達の参照量が該シグナル伝達の試験量を超える場合に、該ＴＬＲの該候補アンタゴニストが該ＴＬＲのアンタゴニストであることを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１００】
前記ＴＬＲがＴＬＲ９である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＴＬＲがＴＬＲ８である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＴＬＲがＴＬＲ７である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＴＬＲがＴＬＲ３である、請求項９９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫刺激性核酸組成物およびその使用の方法に関する。さらに詳細には、本発明は、免疫刺激性ウイルスＲＮＡ配列、その改変体および結合体、ならびにそれらの使用に関する
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫応答は、概念的には、先天性免疫および適応免疫に分けられる。先天性免疫は、感染性微生物によって発現される特定のクラスの分子または外来の高分子によって通常共有される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識に関与すると考えられる。ＰＡＭＰは、特定の免疫細胞上でパターン認識レセプター（ＰＲＲ）によって認識されるものと考えられる。トール様（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ）レセプター（ＴＬＲ）はＰＲＲの重要なクラスに相当するということが、最近報告されている。
【０００３】
ＴＬＲは、哺乳動物における先天性免疫において重要な役割を果たす、高度に保存されたポリペプチドのファミリーである。現在、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１２と命名される１２個のファミリーメンバーが特定されている。種々のＴＬＲは、ロイシン−リッチリピートを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質のシグナル伝達ドメインの存在によって構造的に特徴付けられる。種々のＴＬＲの細胞質ドメインは、トール−インターロイキン１レセプター（ＴＩＲ）ドメインによって特徴付けられる。非特許文献１。ＴＬＲによる微生物侵襲の認識は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａおよび哺乳動物において進化的に保存されているシグナル伝達カスケードの活性化を誘発する。ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質ＭｙＤ８８は、ＴＬＲと会合すること、そしてＩＬ−１レセプター関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプター関連因子６（ＴＲＡＦ６）をＴＬＲに対して補充することが報告されている。ＴＩＲ−依存性および／またはＭｙＤ８８−依存性シグナル伝達経路は、免疫活性化および炎症性サイトカインの産生における重要な工程である、ＮＦ−κＢ転写因子およびｃ−Ｊｕｎ  ＮＨ２ターミナルキナーゼ（Ｊｎｋ）マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の活性化をもたらすと考えられる。概説については、非特許文献２を参照のこと。
【０００４】
多数のＴＬＲについてのリガンドが報告されている。ＴＬＲ２のリガンドとしては、ペプチドグリカンおよびリポペプチドが挙げられる。非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５。リポポリサッカリド（ＬＰＳ）はＴＬＲ４のリガンドである。非特許文献６；非特許文献７。細菌性フラゲリンは、ＴＬＲ５のリガンドである。非特許文献８。ペプチドグリカンは、ＴＬＲ２についてだけでなく、ＴＬＲ６についてもリガンドであることが報告されている。非特許文献９；非特許文献１０。
【０００５】
前述に加えて、特定のＴＬＲについての天然のリガンドは、特定のタイプの核酸分子を含むことが報告されている。細菌ＤＮＡ（ＣｐＧ  ＤＮＡ）は、ＴＬＲ９リガンドであることが報告されている。非特許文献１１；非特許文献１２。さらに最近では、ウイルス由来の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびｄｓＲＮＡの合成アナログであるポリＩ：ＣがＴＬＲ３のリガンドであることが報告された。非特許文献１３。
【０００６】
最近まで、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８の天然のリガンドは未知であった。特定の低分子量合成化合物であるイミダゾキノロンイミキモド（Ｒ−８３７）およびレシキモド（Ｒ−８４８）がＴＬＲ７およびＴＬＲ８のリガンドであることは以前に報告されていた。非特許文献１４；非特許文献１５。さらに最近では、Ｌｉｐｆｏｒｄらは、特定のＧ，Ｕ−含有オリゴリボヌクレオチドが免疫刺激性であり、かつＴＬＲ７およびＴＬＲ８を通じて作用することを発見した。特許文献１。Ｌｉｐｆｏｒｄらによって記載された免疫刺激性Ｇ，Ｕ−含有オリゴリボヌクレオチドは、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡを含むＲＮＡ供給源に由来すると考えられた。
【０００７】
Ｌｉｐｆｏｒｄらによって記載された特定の免疫刺激性ＲＮＡは、５’−ＲＵＲＧＹ−３’を含む塩基配列を有するＲＮＡを含み、ここでＲはプリンであり、Ｕがウラシルであり、Ｇがグアニンであり、そしてＹがピリミジンである。Ｌｉｐｆｏｒｄらによって記載された特定の免疫刺激性ＲＮＡは、ＧＵＡＧＵＧＵ、ＧＵＵＧＢ、ＧＵＧＵＧ、ＧＵＧＵＵＵＡＣ、ＧＵＡＧＧＣＡＣ、ＣＵＡＧＧＣＡＣ、ＣＵＣＧＧＣＡＣまたはＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧＧＵＵＧＵＧ（配列番号１）を含むか、またはその配列によって提供される塩基配列を有するＲＮＡを含み、ここでＡはアデニンであり、Ｃがシトシンであり、そしてＢがＵ、ＧまたはＣである。ある実施形態では、Ｌｉｐｆｏｒｄらによって記載される免疫刺激性ＲＮＡは、カチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３ジオレオイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）と合わされる。
【特許文献１】国際公開第０３／０８６２８０号パンフレット
【非特許文献１】Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ  Ｒら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  （１９９８年）２：ｐ．２５３〜８
【非特許文献２】Ａｄｅｒｅｍ  Ａら、Ｎａｔｕｒｅ  （２０００年）４０６：ｐ．７８２〜８７
【非特許文献３】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９９年）１６３：ｐ．１〜５
【非特許文献４】Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９９年）１６３：ｐ．１〜５
【非特許文献５】Ａｌｉｐｒａｎｔｉｓ  ＡＯら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９９年）２８５：ｐ．７３６〜９
【非特許文献６】Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９８年）２８２：ｐ．２０８５〜８
【非特許文献７】Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９９年）１６２：ｐ．３７４９〜５２
【非特許文献８】Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆら、Ｎａｔｕｒｅ  （２００１年）４１０：ｐ．１０９９〜１１０３
【非特許文献９】Ｏｚｉｎｓｋｙら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （２０００年）９７：ｐ．１３７６６〜７１
【非特許文献１０】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏら、Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００１年）１３：ｐ．９３３〜４０
【非特許文献１１】Ｈｅｍｍｉ  Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ  （２０００年）４０８：ｐ．７４０〜５
【非特許文献１２】Ｂａｕｅｒ  Ｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  （２００１年）９８，ｐ．９２３７〜４２
【非特許文献１３】Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ  （２００１年）４１３：ｐ．７３２〜８
【非特許文献１４】Ｈｅｍｍｉ  Ｈら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００２年）３：ｐ．１９６〜２００
【非特許文献１５】Ｊｕｒｋ  Ｍら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２００２年）３：ｐ．４９９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、比較的高度に保存され、かつ一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端でまたはその近位で見出され得る特定の短いＲＮＡ配列が免疫刺激性であるという本発明者らによる驚くべき発見に一部基づく。これらの配列は特定の接触ポイントを含み、これが、免疫細胞上で発現された特定のトール様レセプター（ＴＬＲ）を介するシグナル伝達を刺激することを可能にすると考えられる。関与するＴＬＲは、ＴＬＲ８およびＴＬＲ７のうち少なくとも１つを含むと考えられる。ＴＬＲ３はまた、これらの核酸分子についてのレセプターとして作用し得るが、本発明の免疫刺激性核酸分子の重要な特徴は塩基配列である。このように、配列非特異的な二本鎖ＲＮＡがＴＬＲ３についてのリガンドであることが報告されているが、本発明は、配列特異的な一本鎖ＲＮＡおよび関連の組成物の免疫刺激性の性質を開示する。本発明の免疫刺激性組成物は、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）およびマウス白血病単球マクロファージ（ＲＡＷ  ２６４）細胞において、１型インターフェロン、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を含む多数のサイトカインの強力な誘発物質として作用することが見出されている。
【０００９】
本発明はまた、配列５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’によって提供される免疫刺激性の４マーのＲＮＡモチーフの本発明者らによる驚くべき発見に一部は基づく。ちょうど記載された一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端の多くで見出されることに加えて、このモチーフは、このオリゴヌクレオチドに対して新規な免疫刺激性特性を付与するように別のオリゴヌクレオチドに接合され得ることが発見されている。例えば、このモチーフは、非免疫刺激性のオリゴヌクレオチドを、多数のサイトカインおよび免疫活性化の他の徴候を誘導し得るオリゴヌクレオチドに変換するのに十分である。さらに、このモチーフは、ＤＮＡの状況におかれても、またはＲＮＡの状況におかれてもよい。
【００１０】
本発明は概して、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの３’末端に存在する特定の高度に保存された核酸配列に関する免疫刺激性組成物、およびその使用のための方法を提供する。この組成物は、インビトロまたはインビボにおいて免疫応答を刺激するために有用であり、そしてワクチン接種；アレルギー、喘息、感染および癌を含む特定の条件を処置すること；または他の免疫調節性組成物のスクリーニングという目的のために、単独で、または抗原もしくは他の因子と組み合わせて用いられてもよい。
【００１１】
１局面では、本発明は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端によって提供される配列を含む１０〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子であって、安定化された骨格を有する核酸分子を含む免疫刺激性組成物を提供する。この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムがセグメント化されたゲノムである場合、このゲノムの３’末端によって提供される配列は、このセグメント化されたゲノムの任意のセグメントの３’末端によって提供される配列であってもよい。以下にさらに詳細に記載されるように、安定化された骨格を有する核酸とは、ホスホジエステル骨格を有する核酸に比較してヌクレアーゼ分解に対して比較的安定である核酸分子をいう。１実施形態では、この核酸分子は、１０〜２０ヌクレオチド長である。１実施形態では、この核酸分子は、１０ヌクレオチド長である。
【００１２】
１実施形態では、この核酸分子は、配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含み、Ｕがウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕがシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、かつＧ／Ｕがグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドである。本発明のこの局面および他の局面による種々の具体的な実施形態では、この配列モチーフは、５’−ＣＵＧＵ−３’、５’−ＵＵＧＵ−３’、５’−ＣＵＵＵ−３’または５’−ＵＵＵＵ−３’である。本発明のこの局面および他の局面による１実施形態では、この核酸分子は、配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を排除する。
【００１３】
１実施形態では、この安定化された骨格は、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む。例えば、１実施形態では、この安定化された骨格は、ホスホロチオエート骨格であり、すなわち、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合のみを含む。特定の実施形態では、この安定化された骨格は、少なくとも１つのピロリン酸ヌクレオシド間結合を含むか、またはこの安定化された骨格はピロリン酸骨格であり、すなわち、ピロリン酸ヌクレオシド間結合のみを含む。
【００１４】
１実施形態では、この単離された核酸分子はＲＮＡであるが、１実施形態では、この核酸分子は、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む。
【００１５】
本発明の免疫刺激性組成物は、少なくとも１つのトール様レセプター（ＴＬＲ）を介してシグナル伝達すると考えられる。１実施形態では、この核酸分子は、ＴＬＲアゴニストである。１実施形態では、この核酸分子は、ＴＬＲ８のアゴニストである。１実施形態では、この核酸分子は、ＴＬＲ７のアゴニストである。１実施形態では、この核酸分子は、ＴＬＲ３のアゴニストである。
【００１６】
特定の実施形態では、上記の一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスは、モノネガウイルス目（ｏｒｄｅｒ  Ｍｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ）に属し、かつセグメント化されるゲノムを有しても、またはセグメント化されないゲノムを有してもよい。１実施形態では、この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスは、オルトミクソウイルスである。１実施形態では、この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスは、パラミクソウイルスである。１実施形態では、この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスは、ラブドウイルスである。さらに別の実施形態では、この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスはフィロウイルスである。１実施形態では、この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡは、ボルナウイルスである。１実施形態では、この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスは、インフルエンザＡウイルスである。１実施形態では、この一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスは、インフルエンザＢウイルスである。
【００１７】
本発明の免疫刺激性組成物は、必要に応じて、上記核酸の免疫刺激性機能を増強し得るかそうでなければ改変し得る別の因子と会合されてもよい。１実施形態では、この核酸分子は、カチオン性脂質と会合される。
【００１８】
あるいは、またはさらに、本発明の免疫刺激性組成物は必要に応じて、抗原を含んでもよい。
【００１９】
１局面では、本発明は、単離された４〜３０ヌクレオチド長の核酸分子であって、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端によって与えられた配列を含み、この核酸分子が安定化された骨格を有する核酸分子と、抗原とを含む、免疫刺激性組成物を提供する。
【００２０】
１局面では、本発明は、
５’−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−３’
を含む、７〜４０ヌクレオチド長の単離されたオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）を含む免疫刺激性組成物であって、Ｕがウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕがシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕがグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｎ１およびＮ２が独立して、０〜１０ヌクレオチド長のＲＮＡ配列であり、かつこのオリゴリボヌクレオチドが安定化された骨格を有する、免疫刺激性組成物を提供する。
【００２１】
１局面では、本発明は、
５’−ｄＸ１−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−ｄＸ２−３’
を含む、７〜４０ヌクレオチド長のキメラＤＮＡ：ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む免疫刺激性組成物であって、Ｕがウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕがシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕがグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、ｄＸ１およびｄＸ２が独立して、０〜６ヌクレオチド長のＤＮＡ配列であり、ｄＸ１およびｄＸ２の少なくとも１つが少なくとも１ヌクレオチド長であり、かつＮ１およびＮ２が独立して、０〜１０ヌクレオチド長のＲＮＡ配列である、免疫刺激性組成物を提供する。本発明のこの局面に従う１実施形態では、Ｎ１およびＮ２が両方とも０ヌクレオチド長である。また本発明のこの局面によれば、１実施形態では、ｄＸ１は０ヌクレオチド長であり、そして１実施形態では、ｄＸ２が０ヌクレオチド長である。本発明のこの局面による種々の実施形態では、ｄＸ１、ｄＸ２またはｄＸ１およびｄＸ２の両方がＣｐＧモチーフを含んでもよい。このＣｐＧモチーフは、中央の５’−シトシン−グアノシン−３’（ＣＧ）ジヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を含み、このＣＧジヌクレオチドのＣは、メチル化されておらず、そしてＣＧジヌクレオチドは、グアノシン−チミジン（ＧＴ）、グアノシン−グアノシン（ＧＧ）、グアノシン−アデノシン（ＧＡ）、アデノシン−チミジン（ＡＴ）、およびアデノシン−アデノシン（ＡＡ）から好ましくは選択される５’ジヌクレオチドに、そしてチミジン−チミジン（ＴＴ）およびシトシン−チミジン（ＣＴ）から好ましくは選択される３’ジヌクレオチドに隣接する。
【００２２】
別の局面では、本発明は、参照免疫刺激性プロフィールを有する参照オリゴヌクレオチドの免疫刺激性プロフィールを変更するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、ＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含むように３〜４０ヌクレオチド長の参照オリゴヌクレオチドを変更させる工程を包含し、ここでＵがウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕがシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕがグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、この参照オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性ＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含まず、この変更の結果として、この参照免疫刺激性プロフィールとは別個の変更された免疫刺激性プロフィールを有する変更されたオリゴヌクレオチドが生じる。１実施形態におけるオリゴヌクレオチドの免疫刺激性プロフィールとは、このオリゴヌクレオチドが、ＴＬＲ９、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７およびＴＬＲ３から選択される１つ以上のＴＬＲによるシグナル伝達を刺激する能力をいう。１実施形態では、オリゴヌクレオチドの免疫刺激性プロフィールとは、このオリゴヌクレオチドが免疫応答に関連する１つ以上のサイトカイン、ケモカインまたは免疫グロブリンのクラスの分泌を刺激する能力をいう。１実施形態では、オリゴヌクレオチドの免疫刺激性プロフィールとは、このオリゴヌクレオチドが、免疫系における１つの細胞または細胞集団において免疫活性化に関連する同時刺激分子を含む１つ以上の細胞表面マーカーの発現を刺激する能力をいう。
【００２３】
１局面では、本発明は、参照免疫刺激性プロフィールを有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）の免疫刺激性プロフィールを変更するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＣ、ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＴ、またはＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＣ、およびＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＴをＵで置換する工程を包含し、ここでＵはウラシルオキシリボヌクレオシドであり、この置換の結果として、この参照免疫刺激性プロフィールとは別個の変更された免疫刺激性プロフィールを有する変更されたオリゴヌクレオチドが生じる。本発明のこの局面による変更されたオリゴヌクレオチドは常に少なくとも１つのＵを含む。本発明のこの局面による種々の実施形態では、この変更されたオリゴヌクレオチドは、部分的にＲＮＡであってもまたは完全にＲＮＡであってもよい。
【００２４】
本発明は、１局面では、単離された免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドであって、その配列が、５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’（配列番号２８６）として提供される、免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００２５】
本発明は、１局面では、単離された免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドであって、その配列が、５’−ＴＵＧＴＵＧＴＴＴＴＧＴＵＧＴＴＴＴＧＴＵＧＴＴ−３’（配列番号２８７）として提供され、その各々のＴがリボヌクレオチドの５−メチルウリジンである、免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００２６】
別の局面では、本発明は、免疫応答を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、免疫系の細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて免疫応答を刺激する工程を包含する。１実施形態では、免疫応答は、Ｔｈ１様免疫応答である。１実施形態では、この方法は、免疫系の細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて、１型インターフェロン、例えば、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）またはインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）の発現を刺激する工程を包含する。１実施形態では、この方法は、免疫系の細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて、ＩＬ−１２の発現を刺激する工程を包含する。
【００２７】
別の局面では、本発明は、ＴＬＲシグナル伝達を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面によるこの方法は、ＴＬＲを発現する細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させてＴＬＲによるシグナル伝達を刺激する工程を包含する。１実施形態では、このＴＬＲはＴＬＲ９である。１実施形態では、ＴＬＲはＴＬＲ８である。１実施形態では、ＴＬＲはＴＬＲ７である。１実施形態では、ＴＬＲはＴＬＲ３である。
【００２８】
本発明はまた、１局面では、被験体における免疫応答を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の組成物の有効量を被験体に投与して、この被験体における免疫応答を刺激する工程を包含する。１実施形態では、この被験体における免疫応答はＴｈ１様免疫応答である。１実施形態では、この方法は、本発明の組成物の有効量を被験体に投与して、この被験体における１型インターフェロンの発現を刺激する工程を包含する。１実施形態では、この方法は、本発明の組成物の有効量を被験体に投与して、この被験体におけるＩＬ−１２の発現を刺激する工程を包含する。
【００２９】
１局面によれば、本発明は、被験体における抗原特異的免疫応答を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面によるこの方法は、有効量の本発明の組成物および抗原を被験体に投与して、この被験体における抗原特異的免疫応答を刺激する工程を包含する。１実施形態では、この抗原は、アレルゲンであり、そしてこの抗原特異的免疫応答は被験体におけるアレルゲン特異的免疫応答である。１実施形態では、この抗原はウイルス抗原であり、そしてこの抗原特異的免疫応答は、この被験体におけるウイルス抗原特異的免疫応答である。１実施形態では、この抗原は細菌抗原であり、そしてこの抗原特異的免疫応答は、この被験体における細菌抗原特異的免疫応答である。１実施形態では、この抗原は癌抗原であり、そしてこの抗原特異的免疫応答は、この被験体における癌抗原特異的免疫応答である。
【００３０】
本発明は１局面では、被験体におけるアレルギー性の状態を処置するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の組成物の有効量を、アレルギー性状態を有するかまたは発症する危険にある被験体に投与して、このアレルギー性の状態を処置する工程を包含する。
【００３１】
本発明は１局面では、被験体における喘息を処置するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の組成物の有効量を、喘息を有するかまたは発症する危険にある被験体に投与して、この喘息を処置する工程を包含する。
【００３２】
本発明は１局面では、被験体における感染を処置するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の組成物の有効量を、感染を有するかまたは発症する危険にある被験体に投与して、この感染を処置する工程を包含する。１実施形態では、この感染はウイルス感染である。１実施形態では、この感染は細菌感染である。
【００３３】
本発明は１局面では、被験体において癌を処置するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の組成物の有効量を、癌を有するかまたは発症する危険にある被験体に投与して、この癌を処置する工程を包含する。
【００３４】
１局面では、本発明は、ＴＬＲのアンタゴニストについてスクリーニングするための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、ＴＬＲを発現する参照細胞と、本発明の組成物の有効量とを、ＴＬＲの候補アンタゴニストの非存在下で接触させて、ＴＬＲによるシグナル伝達の参照量を測定する工程と；ＴＬＲを発現する試験細胞と、この組成物の有効量とを、ＴＬＲの候補アンタゴニストの存在下で接触させて、ＴＬＲによるシグナル伝達の試験量を測定する工程と；このシグナル伝達の参照量がこのシグナル伝達の試験量を超える場合、ＴＬＲのこの候補アンタゴニストがＴＬＲのアンタゴニストであることを確認する工程、を包含する。１実施形態では、ＴＬＲはＴＬＲ９である。１実施形態では、ＴＬＲはＴＬＲ８である。１実施形態では、ＴＬＲはＴＬＲ７である。１実施形態ではＴＬＲはＴＬＲ３である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書において用いる場合、「アレルゲン」という用語は、アレルギー性反応またはアレルギー性状態を惹起し得る抗原をいう。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「アレルギー性状態」という用語は、ある物質（アレルゲン）に対する後天性の過感受性をいう。アレルギー性の状態としては、湿疹、アレルギー性鼻炎または鼻感冒、枯草熱、気管支喘息、蕁麻疹（じんま疹）および食物アレルギー、ならびに他のアトピー性状態が挙げられる。
【００３７】
本明細書において用いる場合、「抗原」という用語は、Ｔ細胞抗原レセプターまたはＢ細胞抗原レセプターによって認識され得る任意の分子を指す。この用語は広義には、宿主免疫系によって外来性として認識される任意のタイプの分子を包含する。抗原としては一般には、限定はしないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ポリサッカリド、ポリサッカリド結合体、ポリサッカリドおよび他の分子のペプチド模倣物および非ペプチド模倣物、低分子、脂質、糖脂質、ポリサッカリド、炭化水素、ウイルスおよびウイルス抽出物、ならびに寄生生物のような多細胞生物、ならびにアレルゲンが挙げられる。タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである抗原に関して、このような抗原は、このような抗原をコードする核酸分子を包含し得る。抗原としてはさらに具体的には、限定はしないが、癌細胞および癌細胞中でまたは癌細胞上で発現された分子を含む癌抗原；微生物または微生物中でまたは微生物上で発現された分子を含む微生物抗原；ならびにアレルゲンが挙げられる。
【００３８】
本明細書において用いる場合、「喘息」という用語は、炎症によって特徴付けられる呼吸器系の障害、気道の狭窄、および吸入された因子に対する機能の反応性の増大をいう。喘息は高頻度に、ただし排他的ではないが、アトピー性の症候群またはアレルギー性の症状に関連する。
【００３９】
核酸分子に関して本明細書において用いる場合、「骨格」という用語は、天然に存在する核酸の重合体の糖リン酸骨格、ならびにその修飾された対応物および模倣物であって、ここに特定の核酸分子の塩基配列を規定する核酸塩基が共有結合されるものを指す。
【００４０】
本明細書において用いる場合、「癌」という用語は、外部シグナルによる調節なしに増殖する異常な細胞の集団を指す。２つのタイプの癌または新生物、良性および悪性が存在する。ほぼ全ての良性の癌は、被膜で覆われており、非侵襲性である。対照的に、悪性の癌はほとんど、被膜で覆われることはないが、浸潤性の破壊的な増殖によって隣接する組織に侵入する。この浸潤性の増殖は、もとの癌と連続しない部位に移入する癌細胞を伴い得る。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「免疫系の細胞」という用語は、先天性の免疫応答または適応免疫応答に関与し得る任意の骨髄由来細胞を指す。免疫系の細胞としては、限定はしないが、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、Ｂリンパ球、形質細胞、Ｔリンパ球およびその前駆細胞を挙げることができる。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「有効量」という用語は、所望の生物学的効果をもたらすのに必須であるかまたは十分である物質の量を指す。有効量は、限定する必要はないが、単回投与で投与される量であり得る。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「免疫応答」という用語は、増殖するため、エフェクター免疫機能を行うため、または免疫応答に関与する遺伝子産物を産生するために、免疫細胞の活性化を反映する先天性免疫応答または適応免疫応答の任意の局面を指す。免疫応答に関与する遺伝子産物としては、分泌された産物（例えば、抗体、サイトカインおよびケモカイン）、ならびに免疫機能の特徴である細胞内および細胞表面の分子（例えば、特定の表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）（ＣＤ）抗原、転写因子、および遺伝子転写物）を挙げることができる。「免疫応答」という用語は、単独の細胞に適用されても、または細胞の集団に適用されてもよい。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「感染」という用語は、宿主における感染性微生物または感染性因子の異常な存在をいう。感染性微生物での感染とは具体的には、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物の感染、およびその任意の組み合わせを含む。
【００４５】
本明細書において用いる場合、ある化合物を記載するために用いられるときの「単離された」という用語は、この化合物が天然に存在する天然の環境から取り出されたことを意味するものとする。１実施形態では、単離されたとは、ある細胞の非核酸分子から取り出されたことを意味する。
【００４６】
本明細書において用いる場合、「核酸分子」という用語は、複数のヌクレオチドを含む任意の分子（すなわち、置換されたピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））または置換されたプリン（例えば、アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ））のいずれかである、リン酸基に対して、そして交換可能な有機塩基に対して結合された糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）を指す。以下にさらに記載されるとおり、塩基は、Ｃ、Ｔ、Ｕ、ＣおよびＧ、ならびにその改変体を含む。本明細書において記載されるように、この用語は、リボヌクレオチド（オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）を含む）、およびデオキシリボヌクレオチド（オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を含む）を指す。この用語はまた、ポリヌクレオシド（すなわち、ポリヌクレオチドからリン酸塩がない）およびポリマーを含む任意の他の有機塩基を含むものとする。核酸分子は、既存の核酸供給源（例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡ）に由来してもよいが、好ましくは合成である（例えば、オリゴヌクレオチド合成によって生成される）。
【００４７】
本明細書において用いる場合、「薬学的に受容可能なキャリア」という用語は、１つ以上の適合性の固体もしくは液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質であって、ヒトまたは他の脊椎動物に対する投与に適切であるものをいう。
【００４８】
本明細書において用いる場合、「ホスホロチオエート骨格」という用語は、核酸分子の安定化された糖リン酸骨格であって、非架橋リン酸酸素が、少なくとも１つのヌクレオシド間結合でイオウによって置き換えられる骨格を指す。１実施形態では、非架橋リン酸酸素は、各々およびあらゆるヌクレオシド間結合でイオウによって置換される。
【００４９】
本明細書において用いる場合、「一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルス」という用語は、モノネガウイルス目に属しており、脊椎動物宿主を有する任意のウイルスをいう。１実施形態では、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスは、５’末端および３’末端を有する、すなわち環状ではないゲノムＲＮＡを有する。
【００５０】
本明細書において用いる場合、「安定化された骨格」という用語は、ホスホジエステル骨格に比較してヌクレアーゼ分解に対して比較的安定である核酸分子の骨格をいう。
【００５１】
本明細書において用いる場合、「被験体」という用語は、ヒトまたは非ヒト脊椎動物を指す。非ヒト脊椎動物としては、家畜、ペットおよび実験室動物が挙げられる。非ヒト被験体としてはまた具体的には、非ヒト霊長類およびげっ歯類が挙げられる。非ヒト被験体としてはまた具体的には、限定はしないが、ニワトリ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ミンク、ウサギおよび魚が挙げられる。
【００５２】
本明細書において用いる場合、ある条件を「発症の危険のある被験体」という用語は、この条件を生じるかもしくはこの条件に関連することが公知である因子に対する既知のもしくは疑われる曝露、またはこの条件を発症することが公知のもしくは疑われる素因（例えば、この条件の家族歴についての遺伝子マーカー）を伴う被験体を指す。
【００５３】
本明細書において用いる場合、「Ｔｈ１様免疫応答」という用語は、１型インターフェロン、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、ＩＦＮ−γ−誘導性の１０ｋＤａのタンパク質（ＩＰ−１０）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、ＩｇＧ２ａ（マウスで）、ＩｇＧ１（ヒトで）の産生によって特徴付けられる任意の適応免疫応答またはその局面、または細胞媒介性免疫、またはその任意の組み合わせをいう。Ｔｈ１様免疫応答としては、限定はしないが、Ｔｈ１免疫応答が挙げられる。
【００５４】
本明細書において用いる場合、「Ｔｈ２様免疫応答」という用語は、インターロイキン４（ＩＬ−４）、ＩｇＥ、ＩｇＧ１（マウスで）、ＩｇＧ２（ヒトで）の産生によって特徴付けられる任意の適応免疫応答もしくはその局面、または体液性免疫、またはその任意の組み合わせをいう。Ｔｈ２様免疫応答としては、限定はしないが、Ｔｈ２免疫応答が挙げられる。
【００５５】
本明細書において用いる場合、「ＴＬＲシグナル伝達」という用語は、ＴＬＲを通じたシグナル伝達に関連する細胞内シグナル伝達の任意の局面をいう。
【００５６】
本明細書において用いる場合、「ＴＬＲアゴニスト」および等しく、「ＴＬＲのアゴニスト」という用語は、特定のＴＬＲによるシグナル伝達を誘導し得る任意の因子をいう。ＴＬＲシグナル伝達アゴニストとは詳細には、限定はしないが、本発明の免疫刺激性組成物を包含する。
【００５７】
本明細書において用いる場合、疾患もしくは状態に関して用いる「処置する」という用語は、このような疾患もしくは状態を邪魔して、これによってこの疾患もしくは状態を防ぐか、またはその発症を遅らせるか、その進行を防ぐか、遅らせるかもしくは妨害するか、または排除することを意味するものとする。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「１型インターフェロン」という用語は、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）またはインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）の任意のアイソフォームをいう。
【００５９】
（特定の実施形態）
本発明は、特定のＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの概して高度に保存された領域に存在する特定の核酸配列が高度に免疫刺激性であるという、本発明者らによる発見に一部関する。さらに詳細には、一本鎖マイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムのＲＮＡ分子の３’末端で見出される配列が免疫刺激性であるということが本発明者らによって発見されている。さらに、ちょうど記載された配列を保有する本発明の核酸分子が、特定のＴＬＲによるシグナル伝達のためのアゴニストとして作用するということが本発明者らによって現在発見されている。本発明の核酸分子は、Ｔｈ１様免疫応答の強力な誘発物質であり、従って、Ｔｈ１様免疫応答に向かう免疫応答を指向するために有用である。このような免疫のゆがみは、Ｔｈ２様免疫応答を減少させるかまたは再指向させることが所望される状況で、ならびにＴｈ１様免疫応答を誘発または増強することが所望される状況で有用である。Ｔｈ２様免疫応答を減少させるかまたは再指向することが所望され得る状態としては、限定はしないが、アレルギーおよび喘息を挙げることができる。Ｔｈ１様免疫応答を誘導または増強することが所望され得る状態としては、限定はしないが、ワクチン接種、種々の感染の処置、癌の処置、および抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）の増強を挙げることができる。
【００６０】
本発明の免疫刺激性組成物は、モノネガウイルス目に属するウイルスのゲノムＲＮＡにおいて見出される配列を有する比較的短い核酸分子を含む。このようなウイルスは一般に、マイナス−センス（ときに、（−）、ネガティブ鎖、ネガティブセンスまたはアンチセンスと呼ばれる）である一本鎖のＲＮＡ分子から構成されるセグメント化されるかまたはセグメント化されていないゲノムを有するウイルスを包含する。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、ゲノムＲＮＡを転写して、相補的な、ポジティブ鎖ＲＮＡ分子を作成し、これが次に、さらにマイナス−センスのゲノムＲＮＡを作成するため、そしてウイルスのポリペプチド遺伝子産物をコードするためのテンプレートとして機能する。この群のいくつかのウイルスは、環状のゲノムＲＮＡを有し、そして他のウイルスは直線（非環状）のゲノムＲＮＡを有する。各々の非環状ゲノムＲＮＡ分子は、５’末端および３’末端を有する。これらの５’末端および３’末端は、高度に保存されて、しばしば部分的にまたは正確に相補的である配列を有する。この保存は、ファミリー内でおよびファミリーにまたがっての両方で、特にファミリー内で存在する。これらの同じ５’末端および３’末端は、ウイルス複製に重要であると考えられるが、それらは一般に非コードであり、すなわち、ウイルスポリペプチド遺伝子産物には翻訳されない。
【００６１】
モノネガウイルス目は詳細には、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ボルナウイルス科（Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、およびアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスファミリーを包含する。オルトミクソウイルス科のファミリーとしては、限定はしないが、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、インフルエンザＣウイルス、トゴトウイルス、ドーリウイルスおよび感染性サケ貧血ウイルスが挙げられる。パラミクソウイルス科のファミリーとしては、限定はしないが、ヒトパラインフルエンザウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、センダイウイルス、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹（はしか）ウイルス、ヘンドラウイルス、トリニューモウイルスおよびイヌジステンパーウイルスが挙げられる。フィロウイルス科のファミリーとしては、限定はしないが、マールブルグウイルスおよびエボラウイルスが挙げられる。ラブドウイルス科のファミリーとしては、限定はしないが、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、モコラウイルス、ドウベンハーゲウイルス、ヨーロッパコウモリウイルス、サケ伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症ウイルス、コイ春ウイルス血症およびライギョラブドウイルスが挙げられる。ボルナウイルス科のファミリーとしては、限定はしないが、ボルナ病ウイルスが挙げられる。ブニヤウイルス科のファミリーとしては、限定はしないが、ブニヤンベラ（Ｂｙｎｙａｍｗｅｒａ）ウイルス、ハンタンウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、およびスナバエ熱ウイルスが挙げられる。アレナウイルス科のファミリーとしては、限定はしないが、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、ラッサ熱ウイルス、デルタ（Ｄ型肝炎）ウイルス、および南アメリカ出血熱ウイルスが挙げられる。
【００６２】
インフルエンザＡ型ウイルスは、人、鳥類、ブタ、ウマ、オットセイ（アザラシ）、クジラおよび他の動物に感染し得るが、野生の鳥類がこれらのウイルスの天然の宿主である。インフルエンザＡ型ウイルスは、ウイルスの表面上の２つのタンパク質に基づいてサブタイプに分けられる。これらのタンパク質は、ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）と呼ばれる。１５個の異なるＨＡサブタイプおよび９つの異なるＮＡサブタイプが存在する。インフルエンザＡウイルスのサブタイプは、それらのＨＡおよびＮＡの表面タンパク質に従って命名され、そしてＨＡおよびＮＡのタンパク質の多くの異なる組み合わせが可能である。例えば、「Ｈ７Ｎ２ウイルス」は、ＨＡ７タンパク質およびＮＡ２タンパク質を有するインフルエンザＡサブタイプを指名する。同様に「Ｈ５Ｎ１」ウイルスは、ＨＡ５タンパク質およびＮＡ１タンパク質を有する。いくつかのインフルエンザＡサブタイプのみ（すなわち、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２）が、現在一般に人々の間で循環している。他のサブタイプは、他の動物種において最も一般的に見いだされる。例えば、Ｈ７Ｎ７およびＨ３Ｎ８ウイルスは、ウマの病気を起こす。
【００６３】
ヒトは、インフルエンザＡ型、Ｂ型およびＣ型に感染され得る。しかし、人々に通常感染するインフルエンザＡウイルスのサブタイプは、インフルエンザＡのサブタイプＨ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、およびＨ３Ｎ２しかない。１９５７〜１９６８年に、Ｈ２Ｎ２ウイルスはまた、人々の間で流行したが、現在は流行していない。
【００６４】
種々のタイプのインフルエンザウイルスのなかでも、インフルエンザＡウイルスのみが鳥類に感染する。野生の鳥類は、インフルエンザＡウイルスの全てのサブタイプについての天然の宿主である。代表的には、野生の鳥類は、インフルエンザウイルスに感染した場合でも病気にはならない。しかし、シチメンチョウおよびニワトリのような家禽は、重篤な病気になり、トリのインフルエンザで死ぬことがあり、そしていくつかのトリのウイルスはまた、野性の鳥類で重篤な疾患および死亡を生じ得る。
【００６５】
３’末端の２０マーの配列の例としては、以下が挙げられ、ここでは５’から３’の読み取りを左から右に示している：
【００６６】
【数１】
2007526253.tif 000003
概して、最も高度に保存されている配列は、３’末端の最も近くに位置するようである。すなわち、一般には３’末端の１ダースのヌクレオチドは、３’の最後から２段階目の１ダースのヌクレオチドよりも高度に保存されている。全てではないがこれらの代表的な配列のうちいくつかは５’−ＣｐＧ−３’ジヌクレオチドを含むことも注目されるべきである。
【００６７】
以下にかなり詳細に記載されるように、本発明の免疫刺激性の一本鎖ＲＮＡ配列の多くが以下の４マーの配列モチーフ：
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’
であって、Ｃ／ＵはＣまたはＵを示し、そしてＧ／ＵはＧまたはＵを示すモチーフの存在によって特徴付けられ、このモチーフは代表的には、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムまたはそのセグメントの３’末端の１５程度のヌクレオチド内で見出され得ることが、本発明によって発見されている。従ってこの４マーの配列モチーフは以下の４マーの配列：ＣＵＧＵ、ＵＵＧＵ、ＣＵＵＵ、およびＵＵＵＵを含む。特定の理論にも機構にも束縛されることは意味しないが、この４マーの配列モチーフは、レセプターＴＬＲ８、ＴＬＲ７、および／またはＴＬＲ３との相互作用についての接触ポイントを含むと本発明者らは信じている。また特定の理論にも機構にも束縛されることは意味しないが、このモチーフの１位置は、ＣまたはＵであり、決定的にはこの塩基上に２つの酸素を含み；このモチーフの２位置は、決定的にＵであり；このモチーフの３位置は、ＧまたはＵであり、決定的にはこの塩基上にそれぞれ４つの酸素または６つの酸素を含み；そしてこのモチーフの４位置は、決定的にＵである。この４マーの配列モチーフは、非セグメント化ウイルスゲノムについての報告された転写開始位置、すなわち５’−ＣＵＧＵＵ−３’と全く同様であることが注目される。
【００６８】
本発明は１局面では、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端によって得られる配列を含む１０〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子であって、安定化された骨格を有する核酸分子を含む免疫刺激性組成物を提供する。１実施形態では一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端とは、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムであってこのゲノムがセグメント化されていないゲノムの３’末端を指す。別の実施形態における一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端とは、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムのセグメントであってこのゲノムがセグメント化されているゲノムの３’末端を指す。本発明のこの局面によれば、従って免疫刺激性組成物は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムまたはその直鎖状セグメントの最も３’側の少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。１実施形態では、この免疫刺激性組成物は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムまたはその直鎖状セグメントの１０個の最も３’側のヌクレオチドを含む。１実施形態では、この免疫刺激性組成物は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムまたはその直鎖状セグメントの１１個の最も３’側のヌクレオチドを含む。１実施形態では、この免疫刺激性組成物は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムまたはその直鎖状セグメントの１２個の最も３’側のヌクレオチドを含む。同様の方式で、特定の具体的な実施形態では、この免疫刺激性組成物は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムまたはその直鎖状セグメントの１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の最も３’側のヌクレオチドを含む。
【００６９】
以下は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムのＲＮＡの３’末端に存在する固有の１０〜３０マーのＲＮＡ配列の列挙である。２つ以上の配列が特定のアクセッション番号と関連して列挙される場合、短い方の配列は、この群における最長の配列の５’切断である。
【００７０】
（ウイルス；ｓｓＲＮＡ  ネガティブ鎖のウイルス；モノネガウイルス目；フィロウイルス科）
（フィロウイルス科；マールブルグ様ウイルス）
ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ１２１３２
ｖｐ３５、ｖｐ４０、ｖｐ３０、ｖｐ２４、糖タンパク質、核タンパク質、ポリメラーゼについてのマールブルグウイルスの遺伝子、
長さ＝１９１０４
【００７１】
【数２】
2007526253.tif 000004
【００７２】
【数３】
2007526253.tif 000005
【００７３】
【数４】
2007526253.tif 000006
【００７４】
【数５】
2007526253.tif 000007
【００７５】
【数６】
2007526253.tif 000008
【００７６】
【数７】
2007526253.tif 000009
【００７７】
【数８】
2007526253.tif 000010
【００７８】
【数９】
2007526253.tif 000011
【００７９】
【数１０】
2007526253.tif 000012
【００８０】
【数１１】
2007526253.tif 000013
【００８１】
【数１２】
2007526253.tif 000014
【００８２】
【数１３】
2007526253.tif 000015
【００８３】
【数１４】
2007526253.tif 000016
【００８４】
【数１５】
2007526253.tif 000017
【００８５】
【数１６】
2007526253.tif 000018
【００８６】
【数１７】
2007526253.tif 000019
【００８７】
【数１８】
2007526253.tif 000020
【００８８】
【数１９】
2007526253.tif 000021
【００８９】
【数２０】
2007526253.tif 000022
７ヌクレオチド長程度の短さであって、かつ免疫刺激性の４マーのＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含むオリゴヌクレオチドは免疫刺激性であるということが本発明者らによって見出されてきた。この配列モチーフは、ちょうど上記のウイルス配列の多くに存在する。従って、１局面では、本発明は、７ヌクレオチド長程度の短さであって、かつ免疫刺激性の４マーのＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドを提供する。この４マーのＲＮＡモチーフ外の配列は任意の配列であってもよい。１実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を含まない。この４マーのＲＮＡモチーフ以外の配列は、ＲＮＡであっても、ＤＮＡであっても、またはＲＮＡおよびＤＮＡの混合物であってもよい。このモチーフ以外の配列は、１つ以上の修飾されたリボヌクレオシド、１つ以上の修飾されたデオキシリボヌクレオシド、１つ以上の修飾されたヌクレオシド間結合、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。種々の実施形態では、この免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であってもよい。１実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、安定化された骨格を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される任意の方法で用いられてもよく、この方法としては、免疫応答を刺激、Ｔｈ１様免疫応答を刺激、ＴＬＲシグナル伝達を刺激、被験体における免疫応答を刺激、被験体におけるＴｈ１様免疫応答を刺激、被験体における抗原特異的免疫応答を刺激、被験体におけるアレルギー性状態を処置、被験体における喘息を処置、被験体における感染を処置、被験体における癌を処置、およびＴＬＲのアンタゴニストをスクリーニングするための方法が挙げられる。
【００９０】
以下の実施例６に開示されるように、少なくとも３ヌクレオチド長の非免疫刺激性のオリゴヌクレオチドは、このような非免疫刺激性のオリゴヌクレオチドに免疫刺激性の４マーのＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を導入することによって、免疫刺激性オリゴヌクレオチドに変換され得るということも本発明者らによって発見されている。この得られた免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも７ヌクレオチド長である。このモチーフは、このオリゴヌクレオチドのいずれの場所に、例えば、５’末端、３’末端、または５’および３’末端の内側に付加されても導入されてもよい。この４マーのＲＮＡモチーフ以外の配列は、任意の配列であってもよい。１実施形態では、得られたオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を含まない。４マーのＲＮＡモチーフ以外の配列は、ＲＮＡであっても、ＤＮＡであっても、またはＲＮＡおよびＤＮＡの混合物であってもよい。種々の実施形態では、得られた免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る。１実施形態では、この得られたオリゴヌクレオチドは、安定化された骨格を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される任意の方法で用いられてもよく、この方法としては、免疫応答を刺激、Ｔｈ１様免疫応答を刺激、ＴＬＲシグナル伝達を刺激、被験体における免疫応答を刺激、被験体におけるＴｈ１様免疫応答を刺激、被験体における抗原特異的免疫応答を刺激、被験体におけるアレルギー性状態を処置、被験体における喘息を処置、被験体における感染を処置、被験体における癌を処置、およびＴＬＲのアンタゴニストをスクリーニングするための方法が挙げられる。
【００９１】
少なくとも３ヌクレオチド長の弱い免疫刺激性のオリゴヌクレオチドは、このような非免疫刺激性のオリゴヌクレオチドに免疫刺激性の４マーのＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を導入することによって、さらに強力な免疫刺激性オリゴヌクレオチドに変換され得るということも本発明者らによって発見されている。この得られた免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、少なくとも７ヌクレオチド長である。このモチーフは、このオリゴヌクレオチドのいずれの場所に、例えば、５’末端、３’末端、または５’および３’末端の内側に付加されても導入されてもよい。この４マーのＲＮＡモチーフ以外の配列は、任意の配列であってもよい。１実施形態では、得られたオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を含まない。４マーのＲＮＡモチーフ以外の配列は、ＲＮＡであっても、ＤＮＡであっても、またはＲＮＡおよびＤＮＡの混合物であってもよい。種々の実施形態では、得られた免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長であり得る。１実施形態では、この得られたオリゴヌクレオチドは、安定化された骨格を有する。このようなオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示される任意の方法で用いられてもよく、この方法としては、免疫応答を刺激、Ｔｈ１様免疫応答を刺激、ＴＬＲシグナル伝達を刺激、被験体における免疫応答を刺激、被験体におけるＴｈ１様免疫応答を刺激、被験体における抗原特異的免疫応答を刺激、被験体におけるアレルギー性状態を処置、被験体における喘息を処置、被験体における感染を処置、被験体における癌を処置、およびＴＬＲのアンタゴニストをスクリーニングするための方法が挙げられる。
【００９２】
少なくとも特定の免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列は、ＵでＴおよびＣの両方を置換することによって、あるいはＵでＣを置換することによって本発明の免疫刺激性ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列に変換され得るということが本発明者らによって、現在見出されている。１実施形態では、出発ＣｐＧ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’（ＯＤＮ  ２００６、配列番号２８５）を有する。本発明の対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｕｕｇｕｕｇｕｕｕｕｇｕｕｇｕｕｕｕｇｕｕｇｕｕ−３’（配列番号２８６）を有する。本発明の別の対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｔｕｇｔｕｇｔｔｔｔｇｔｕｇｔｔｔｔｇｔｕｇｔｔ−３’（配列番号２８７）を有する。１実施形態では、出発ＣｐＧ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇ−３’（配列番号２８８）を有する。本発明の対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｕｕｇｕｕｇｕｕｕｕｕｇｇｕｇｇｕｕｇｕｕｇ−３’（配列番号２８９）を有する。本発明の別の対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドは、配列５’−ｔｕｇｔｕｇｔｔｔｔｕｇｇｕｇｇｕｕｇｕｕｇ−３’（配列番号２９０）を有する。このような変化は、驚くべきことに、免疫刺激性ＣｐＧ  ＤＮＡオリゴヌクレオチドに対する比較的保存的なヌクレオチド置換であって、得られたＲＮＡオリゴヌクレオチドがＴＬＲ９のパラログである、ＴＬＲ９以外のＴＬＲと相互作用することを可能にし得る置換であると考えられる。
【００９３】
詳細には、免疫刺激性の４マーのＲＮＡモチーフである５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含むようなＣｐＧ  ＯＤＮの変換は、得られたオリゴヌクレオチドに対して新規な免疫刺激性プロフィールを付与し得る、すなわち、得られたオリゴヌクレオチドは出発ＣｐＧ  ＯＤＮによって刺激されるＴＬＲ９に加えて、および／またはそれとは異なるＴＬＲを刺激すると考えられる。例えば、ＯＤＮ２００６のようなＣｐＧ  ＯＤＮの、免疫刺激性４マーＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含むオリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）への完全な変換によって、ＴＬＲ９を刺激する能力が失われ得、そしてＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７およびＴＬＲ８の両方を刺激する能力の獲得が生じ得る。部分的な変換でさらに異なるプロフィールが生じ得る。
【００９４】
ちょうど記載されたＤＮＡからＲＮＡへのＣｐＧ  ＯＤＮの変換または部分的変換に加えて、既存のＣｐＧ  ＯＤＮは、このＣｐＧ  ＯＤＮに免疫刺激性の４マーのＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を付加するかそうでなければ導入することによって、新規なプロフィールの免疫刺激性活性を有するように変換され得るということが本発明者らによって発見されている。得られた組み合わせのモチーフのオリゴヌクレオチドは、出発のＣｐＧ  ＯＤＮによって刺激されるＴＬＲ９に加えて、および／またはそれとは異なるＴＬＲを刺激する。
【００９５】
本発明の組成物は、天然に見出される塩基配列に相当する塩基配列、すなわち、一本鎖マイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端に見出される塩基配列を有する特定の人工的に合成されたオリゴヌクレオチドを含んでもよい。この組成物は、安定化された骨格の特徴を含むように人工的に合成される。オリゴヌクレオチドの骨格は、この安定化された骨格を有するオリゴヌクレオチドが、全てホスホジエステル骨格を有する対応するオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ分解に対して比較的耐性である条件では、任意の適切な化学的方法または修飾を用いて安定化されてもよい。
【００９６】
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、天然のＲＮＡおよびＤＮＡに比較して、ホスホジエステルヌクレオシド間架橋、β−Ｄ−リボース単位、および／または天然のヌクレオシド塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）を含む、種々の化学的修飾および置換を包含し得る。化学的修飾の例は、当業者に公知であり、そして例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４３；「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ＆  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＵＳＡ  １９９３；Ｃｒｏｏｋｅ  ＳＴら（１９９６）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３６：１０７〜２９；およびＨｕｎｚｉｋｅｒ  Ｊら（１９９５）Ｍｏｄ  Ｓｙｎｔｈ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：３３１〜４１７に記載される。本発明によるオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾を有してもよく、各々の修飾は、天然のＤＮＡまたはＲＮＡから構成される同じ配列のオリゴヌクレオチドに比較して、特定のヌクレオシド間架橋、および／または特定のβ−Ｄリボース単位、および／または特定の天然のヌクレオシド塩基の位置に位置する。
【００９７】
例えば、オリゴヌクレオチドは各々の修飾が：
ａ）修飾されたヌクレオシド間架橋による、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置換、
ｂ）脱リン酸架橋による、ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋の置換、
ｃ）糖リン酸骨格由来の糖リン酸単位の別の単位による置換、
ｄ）β−Ｄ−リボース単位の修飾された糖単位による置換、ならびに
ｅ）修飾されたヌクレオシド塩基による天然のヌクレオシド塩基の置換、
から独立して選択される１つ以上の修飾を含んでもよい。
【００９８】
オリゴヌクレオチドの化学的修飾のためのさらに詳細な実施例は以下のとおりである。
【００９９】
オリゴヌクレオチドは、上記のａまたはｂに記載されるような修飾されたヌクレオシド間結合を含み得る。これらの修飾された結合は、分解に対して部分的に耐性であり得る（例えば、安定化される）。「安定化されたオリゴヌクレオチド分子」とは、あるオリゴヌクレオチドが、このような修飾から生じるインビボ分解（例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼを介する）に対して比較的耐性であることを意味するものとする。ある実施形態では、ホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドは、最大活性を提供し得、そして細胞内のエキソおよびエンドヌクレアーゼによる分解からこのオリゴヌクレオチドを保護し得る。
【０１００】
ヌクレオシドの３’および／または５’末端に位置するホスホジエステルヌクレオシド間架橋は、修飾されたヌクレオシド間架橋によって置換されてもよく、この修飾されたヌクレオシド間架橋は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ１Ｒ２−ホスホラミデート、ボラノホスフェート、α−ヒドロキシベンジルホスホネート、ホスフェート−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート−［（Ｃ６−Ｃ１２）アリール−（Ｃ１−Ｃ２１）−Ｏ−アルキル］エステル、（Ｃ１−Ｃ８）アルキルホスホネートおよび／または（Ｃ６−Ｃ１２）アリールホスホネート架橋、（Ｃ７−Ｃ１２）−α−ヒドロキシメチル−アリール（例えば、ＷＯ  ９５／０１３６３に開示される）から選択され、（Ｃ６−Ｃ１２）アリール、（Ｃ６−Ｃ２０）アリール、および（Ｃ６−Ｃ１４）アリールは必要に応じて、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、ニトロ、シアノで置換され、Ｒ１およびＲ２は、互いに独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ１８）−アルキル、（Ｃ６−Ｃ２０）−アリール、（Ｃ６−Ｃ１４）−アリール−（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、好ましくは水素、（Ｃ１−Ｃ８）−アルキル、好ましくは（Ｃ１−Ｃ４）−アルキルおよび／またはメトキシエチル、であるか、あるいはＲ１およびＲ２は、それらが担持する窒素原子と一緒になって、５−６−員の複素環式環を形成し、これはさらに、Ｏ、ＳおよびＮの基からさらなるヘテロ原子を含んでもよい。
【０１０１】
ヌクレオシドの３’末端および／または５’末端に位置するホスホジエステル架橋の脱リン架橋による置換（脱リン架橋は、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ＥおよびＰｅｙｍａｎ  Ａの「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第２０巻、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ」、Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ  １９９３、第１６章、ｐｐ．３５５ｆｆに記載される）は、脱リン架橋ホルムアセタール、３’−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチル−ヒドラゾ、ジメチレンスルホン、および／またはシリル基から選択される脱リン架橋であってもよい。
【０１０２】
糖リン酸骨格（すなわち、糖リン酸骨格が糖リン酸単位から構成される）由来の糖リン酸単位（すなわち、一緒になって糖リン酸単位を形成するβ−Ｄ−リボースおよびホスホジエステルヌクレオシド間架橋）は、別の単位によって置換され得、この他の単位は、例えば、「モルホリノ−誘導」オリゴマーを構築するために適切である（例えば、Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ＥＰら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １７：６１２９〜４１に記載される）単位によって置換され得（すなわち、例えば、モルホリノ−誘導体化単位による置換）、またはポリアミド核酸（「ＰＮＡ」；例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ５：３〜７に記載される）を構築するために適切である単位によって置換され得る（すなわち、ＰＮＡ骨格単位による、例えば、２−アミノエチルグリシンによる置換）。オリゴヌクレオチドは、アリキルリンカーまたはアミノリンカーによる、リン酸基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（ＬＮＡ）および骨格部位を有するオリゴヌクレオチドの修飾および置換のような、他の炭化水素骨格の修飾および置換を有してもよい。アルキルリンカーは、分枝しても分枝しなくてもよいし、置換されても置換されなくてもよいし、キラルとして純粋でもラセミ混合物でもよい。
【０１０３】
上記で開示された安定化された骨格に加えて、本発明の組成物は、ピロリン酸ヌクレオシド間結合を、代替的にまたは追加して含んでもよい。３’，５’−ピロリン酸結合ヌクレオチドによる合成およびリボヌクレアーゼ阻害は、例えば、Ｒｕｓｓｏ  Ｎら（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：１４９０２〜８に記載されている。
【０１０４】
本発明の組成物は、少なくとも１つのヌクレオチドがデオキシヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドであるキメラＲＮＡ：ＤＮＡ骨格を代替的にまたは追加して含んでもよい。少なくとも１つのデオキシヌクレオチドの数および位置は、オリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性に影響し得る。種々の実施形態では、４マーの配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を有する本発明の免疫刺激性核酸におけるデオキシヌクレオチドの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６であってもよい。２つ以上のデオキシヌクレオチドが存在する、いくつかの実施形態では、デオキシヌクレオチドはお互いに対して隣接（すなわち直接結合）する。種々の実施形態では、連続的な隣接するデオキシヌクレオチドの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または２６であり得る。隣接するデオキシヌクレオチドの群はまた、デオキシヌクレオチドでない少なくとも１つの介在性のヌクレオチドによってお互いから隔てられて存在してもよい。２つ以上のデオキシヌクレオチドが存在する、いくつかの実施形態では、別のデオキシヌクレオチドに対して隣接するデオキシヌクレオチドはない。ある実施形態では、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドの位置は、厳密にＲＮＡである、相当するオリゴヌクレオチドに比較してオリゴヌクレオチドの免疫刺激性効果を増大し得る。他の実施形態では、少なくとも１つのデオキシヌクレオチドの位置は、厳密にＲＮＡである、相当するオリゴヌクレオチドに比較してオリゴヌクレオチドの免疫刺激性効果を低下させ得る。
【０１０５】
１実施形態では、本発明のキメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドが種々のＴＬＲを刺激し得る結合体を含むことが本発明によって発見されている。さらに詳細には、本発明の特定のキメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、ＴＬＲ９およびＴＬＲ８の両方を刺激し得ることが発見されている。１実施形態では、キメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ部分は、ＴＬＲ９活性を刺激するＣｐＧ  ＤＮＡである；同じキメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分は、ＴＬＲ８を刺激する本発明の免疫刺激性ＲＮＡである。１実施形態では、このようなキメラ結合体は、５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｕｕｇｕｕｕｕｇｕｕｇｕｕ−３’（配列番号２９１）であり、ここでｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔ（配列番号２９２）は、ＣｐＧ  ＤＮＡであり、そしてｇｕｕｇｕｕｕｕｇｕｕｇｕｕ（配列番号２９３）はＲＮＡである。ｇｕｕｇｕｕｕｕｇｕｕｇｕｕ（配列番号２９３）が４マーの配列モチーフ５’−ＵＵＧＵ−３’および５’−ＵＵＵＵ−３’を含むことが注目されるべきである。別の実施形態では、このようなキメラ結合体は、５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｕｇｇｕｇｇｕｕｇｕｕｇ−３’（配列番号２９４）であり、ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔ（配列番号２９２）はやはりＣｐＧ  ＤＮＡであり、そしてｕｇｇｕｇｇｕｕｇｕｕｇ（配列番号２９５）はＲＮＡである。ｕｇｇｕｇｇｕｕｇｕｕｇ（配列番号２９５）は４マーの配列モチーフ５’−ＵＵＧＵ−３’を含むことが注目されるべきである。
【０１０６】
１実施形態では、キメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡおよびＲＮＡ部分の両方が、３’−５’ヌクレオチド間結合を含む。別の実施形態では、キメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分は、２’−５’ヌクレオチド間結合（３’−５’ヌクレオチド間結合ではない）を含む。例えば、１実施形態では、ＲＮＡ：ＤＮＡキメラ結合体は、５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｇｕｕｇｕｇｕａａｔ−３’（配列番号２９６）を有し、ここでｔｃｇｔｃｇｔｔｔおよびａａｔは、ＤＮＡであり、そしてｇｕｕｇｕｇｕはＲＮＡであり、そして全てのヌクレオチド間結合が３’−５’ヌクレオチド間結合である。このキメラＲＮＡ：ＤＮＡ結合体は、ＴＬＲ９およびＴＬＲ８の両方を刺激すること、そしてＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γを誘導することが見出された。対照的に、同一の配列ならびにＤＮＡおよびＲＮＡ組成を有するが、ｇｕｕｇｕｇｕａが３’−５’ヌクレオチド間結合ではなく、２’−５’ヌクレオチド間結合によって相互接続されるオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９を刺激するがＴＬＲ８は刺激せず、そしてＩＦＮ−αは誘導するが、ＴＮＦ−αもＩＦＮ−γも誘導しないことが見出された。
【０１０７】
本発明の核酸組成物は、修飾された糖単位を含み得る。β−リボース単位またはβ−Ｄ−２’−デオキシリボース単位は、修飾された糖単位によって置換され、この修飾された糖単位は、例えば、β−Ｄ−リボース、α−Ｄ−２’−デオキシリボース、Ｌ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−２’−デオキシリボース、２’−Ｆ−アラビノース、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−リボース、２’−Ｏ−メチルリボース、２’−Ｏ−（Ｃ２−Ｃ６）アルケニル−リボース、２’−［Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル］−リボース、２’−ＮＨ２−２’−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロ−フラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ヘキソ−ピラノース、および炭素環式の（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ（１９９２）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １１４：８３２０に記載される）および／または開放型鎖の糖アナログ（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９：７２２３に記載される）および／またはビシクロ糖アナログ（例えば、Ｔａｒｋｏｖ  Ｍら（１９９３）Ｈｅｌｖ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ７６：４８１に記載）から選択される。
【０１０８】
１実施形態では、４マーの配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’の２位置のＵのリボースの２’ヒドロキシル基はインタクトであり、すなわちβ−リボース単位はこの位置では、前述の修飾された糖単位のいずれでも置換されない。１実施形態では、４マーの配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’の２位置のＵのリボースの２’ヒドロキシル基は、２’−Ｏ−メチルリボースによって置換されない。これらの位置における２’ヒドロキシル基は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドとＴＬＲとの間の相互作用に関与し得ると本発明者らは考えている。この概念の支持では、２’−５’ヌクレオチド間結合による、通常の３’−５’ヌクレオチド間結合の４−マーモチーフ内の置換は、このオリゴヌクレオチドの免疫刺激性活性を有意に低下させるということが発見されている。しかし、この４マーの配列モチーフの外側の位置で、このような２’−５’ヌクレオチド間結合、または他のヌクレアーゼ耐性結合を含むことは可能であり得る。このようなＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲを通じてシグナル伝達する能力、および分解に対して比較的抵抗性である特性という両方を保持する。
【０１０９】
本発明の核酸組成物は、グアノシン、シチジン、アデノシン、チミジンおよびウリジンを含む、天然に見出されるヌクレオシドを含んでもよいが、この核酸組成物はそのように限定はされない。本発明の核酸組成物は、修飾されたヌクレオシドを含んでもよい。修飾されたヌクレオシドは、塩基、糖、または塩基および糖の両方を含む修飾を有するヌクレオシド誘導体を含む。
【０１１０】
核酸はまた、Ｃ−５プロピンピリミジンおよび７−デアザ−７置換プリン修飾塩基のような置換されたプリンおよびピリミジンを含む。Ｗａｇｎｅｒ  ＲＷら（１９９６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：８４０〜４。プリンおよびピリミジンとしては限定はしないが、アデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシル、ならびに他の天然に存在するおよび天然に存在しない核酸塩基、置換された芳香族部分および非置換の芳香族部分が挙げられる。
【０１１１】
修飾された塩基とは、Ｔ，Ｃ、Ｇ、ＡおよびＵのようなＤＮＡおよびＲＮＡに代表的に見出される天然に存在する塩基とは化学的に異なるが、これらの天然に存在する塩基のうちの少なくとも１つと基本的な化学構造を共有する任意の塩基である。修飾されたヌクレオシド塩基は、例えば、ヒポキサンチン、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１−Ｃ６）−アルキルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、２，４−ジアミノ−プリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン（例えば、７−デアザ−７−置換プリンおよび／または７−デアザ−８−置換プリン）、５−ヒドロキシメチルシトシン、Ｎ４−アルキルシトシン、例えば、Ｎ４−エチルシトシン、５−ヒドロキシデオキシシチジン、５−ヒドロキシメチルデオキシシチジン、Ｎ４−アルキルデオキシシチジン、例えば、Ｎ４−エチルデオキシシチジン、６−チオデオキシグアノシン、およびニトロピロールのデオキシリボヌクレオシド、Ｃ５−プロピニルピリミジン、およびジアミノプリン、例えば、２，６−ジアミノプリン、イノシン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、または天然のヌクレオシド塩基の他の修飾から選択され得る。この列挙は、例示的であることを意味しており、限定されると解釈されるべきではない。
【０１１２】
本明細書に記載される特定の実施形態では、修飾された塩基が組み込まれてもよい。例えば、シトシンは、修飾されたシトシンで置換されてもよい。本明細書に用いられるような修飾されたシトシンは、シトシンの天然に存在するかまたは天然には存在しないピリミシン塩基アナログであって、このオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基を置換し得る。
【０１１３】
修飾されたシトシンとしては、限定はしないが、５置換シトシン（例えば、５−メチル−シトシン、５−フルオロ−シトシン、５−クロロ−シトシン、５−ブロモ−シトシン、５−ヨード−シトシン、５−ヒドロキシ−シトシン、５−ヒドロキシメチル−シトシン、５−ジフルオロメチル−シトシン、および非置換または置換５−アルキニル−シトシン）、６−置換シトシン、Ｎ４−置換シトシン（例えば、Ｎ４−エチル−シトシン）、５−アザ−シトシン、２−メルカプト−シトシン、イソシトシン、プソイド−イソシトシン、縮合した環系を有するシトシンアナログ（例えば、Ｎ，Ｎ’−プロピレンシトシンまたはフェノキサジン）、ならびにウラシルおよびその誘導体（例えば、５−フルオロ−ウラシル、５−ブロモ−ウラシル、５−ブロモビニル−ウラシル、４−チオ−ウラシル、５−ヒドロキシ−ウラシル、５−プロピニル−ウラシル）が挙げられる。本発明の特定の実施形態では、このシトシン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、３−ニトロピロール、Ｐ−塩基）、芳香族環系（例えば、フルオロベンゼンまたはジフルオロベンゼン）、または水素原子（スペーサー（Ｓｐａｃｅｒ）またはｄスペーサー）によって置換される。
【０１１４】
シチジン誘導体はまた一般に、限定はしないが、修飾された糖を有するシチジンを含む。修飾された糖を有するシチジンとしては、限定はしないが、シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）、リボ−Ｃ、および２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−シチジン（例えば、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−ＯＭｅ−Ｃ）が挙げられる。
【０１１５】
グアニンは、修飾されたグアニン塩基で置換されてもよい。本明細書において用いられる修飾されたグアニンは、グアニンの天然に存在するかまたは天然には存在しないプリン塩基アナログであって、このオリゴヌクレオチドの免疫刺激活性を損なうことなくこの塩基を置換し得る、プリン塩基アナログである。
【０１１６】
修飾されたグアニンとしては、限定はしないが、７−デアザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン（例えば、７−デアザ−７−（Ｃ２−Ｃ６）アルキニルグアニン）、７−デアザ−８−置換グアニン、ヒポキサンチン、Ｎ２−置換グアニン（例えば、Ｎ２−メチル−グアニン）、５−アミノ−３−メチル−３Ｈ，６Ｈ−チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−２，７−ジオン、２，６−ジアミノプリン、２−アミノプリン、プリン、インドール、アデニン、置換アデニン（例えば、Ｎ６−メチル−アデニン、８−オキソ−アデニン）、８−置換グアニン（例えば、８−ヒドロキシグアニンおよび８−ブロモグアニン）、および６−チオグアニンが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、グアニン塩基は、ユニバーサル塩基（例えば、４−メチル−インドール、５−ニトロ−インドール、およびＫ−塩基）、芳香族環系（例えば、ベンズイミダゾールまたはジクロロ−ベンズイミダゾール、１−メチル−１Ｈ−［１，２，４］トリアゾール−３−カルボン酸アミド）、または水素原子（スペーサーまたはｄスペーサー）によって置換される。
【０１１７】
本発明の核酸組成物は、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。しかし、４または５ヌクレオチド長程度の短いオリゴヌクレオチドがＴＬＲに対する結合に十分であり得るというのが本発明者らの見解である。種々の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。１実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、１０〜２０ヌクレオチド長である。１実施形態では、このオリゴヌクレオチドは１０ヌクレオチド長である。
【０１１８】
本発明の核酸組成物は、一本鎖であっても、部分的に二本鎖を含む二本鎖であってもよい。オリゴヌクレオチドが二本鎖核酸を含む場合、この二本鎖部分は、生理学的条件下で二本鎖構造を維持するのに十分な相補的な配列を含む。これは、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕ、Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｔ、およびＧ−Ｕから選択される複数の、隣接するかまたは隣接しない塩基対を含み得る。１実施形態では、この塩基対は、Ｇ−Ｃ、Ａ−Ｕ、およびＧ−Ｕから選択される。この二本鎖構造は、ＲＮＡ−ＲＮＡ二重鎖形成、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖形成、ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖形成、または少なくとも１つのキメラＲＮＡ：ＤＮＡ配列（すなわち、キメラＲＮＡ：ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖、キメラＲＮＡ：ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖、またはキメラＲＮＡ：ＤＮＡ−キメラＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖）を含む二重鎖形成を包含し得る。
【０１１９】
（本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの供給源および調製）
本発明における使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の任意の多数の手順、例えば、β−シアノエチルホスホラミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９）；またはヌクレオシドＨホスホン酸法（Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５１−４；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  ＢＣら（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １４：５３９９−４０７；Ｇａｒｅｇｇら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２７：４０５５−８；Ｇａｆｆｎｅｙら（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２９：２６１９〜２２）を用いて新規に合成され得る。これらの化学反応は、市販されている種々の自動的な核酸シンセサイザーによって行うことができる。これらのオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。単離されたオリゴヌクレオチドとは一般に、通常は自然にともなう成分から分離されているオリゴヌクレオチドをいう。例えば、単離されたオリゴヌクレオチドとは、細胞から、核から、ミトコンドリアから、またはクロマチンから分離されているオリゴヌクレオチドであり得る。１実施形態では、単離されたオリゴヌクレオチドは、合成オリゴヌクレオチドである。
【０１２０】
修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエートは、ホスホラミダイトまたはＨ−ホスホン酸化学のいずれかを使用する自動技術を用いて合成され得る。アリール−ホスホン酸およびアルキル−ホスホン酸は、例えば、米国特許第４，４６９，８６３号に記載されるように作成され得；そしてアルキルリン酸トリエステル（荷電された酸素部分は、米国特許第５，０２３，２４３号および欧州特許第０９２，５７４号に記載されるようにアルキル化される）は、市販の試薬を用いて自動的な固相合成によって調製され得る。他のＤＮＡおよびＲＮＡ骨格の修飾および置換を作成するための方法は、記載されている（例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  Ｅら（１９９０）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  ９０：５４４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １：１６５）。
【０１２１】
特定の実施形態では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、別の因子と結合体化され得る。１実施形態では、本発明の核酸分子と結合体化され得る因子は、ＴＬＲリガンドであってもよく、これには限定はしないが、本発明の別の核酸分子が挙げられる。１実施形態では、本発明の核酸分子と結合体化され得る因子は、本発明の免疫刺激性核酸ではない免疫刺激性核酸分子であってもよい。例えば、他の因子とは、ＣｐＧ−ＤＮＡ分子であってもよい（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；同第６，３３９，０８６号；同第６，４０６，７０５号；同第６，４２９，１９９号；および同第６，６５３，２９２号を参照のこと）。１実施形態では、本発明の核酸分子と結合体化され得る因子は、ＴＬＲアゴニストであってもよい。ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ媒介性シグナルを誘発または増強する任意の因子である。ＴＬＲアゴニストとしては、例えば、Ｒ−８３７（イミキモド（ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ））またはＲ−８４８（レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ））のような低分子が挙げられる。１実施形態では、本発明の核酸分子と結合体化され得る因子は、ＴＬＲアンタゴニストであってもよい。ＴＬＲアンタゴニストは、ＴＬＲ媒介性シグナルを阻害する任意の因子である。ＴＬＲアンタゴニストとしては、特定の低分子（例えば、Ｍａｃｆａｒｌａｎｅらに発行された、米国特許第６，２２１，８８２号；同第６，３９９，６３０号；および同第６，４７９，５０４号）および特定の免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、Ｌｅｎａｒｔ  Ｐら（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １１：２４７〜５６；Ｓｔｕｎｚ  ＬＬら（２００２）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：１２１２〜２２；Ｌｅｎｅｒｔ  Ｐら（２００３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ  １３：１４３〜５０；およびＬｅｎｅｒｔ  Ｐら（２００３）ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２２：６２１〜３１）が挙げられる。１実施形態では、本発明の核酸分子と結合体化され得る因子は、抗原であってもよく、これには、抗原自体または抗原をコードする核酸分子が挙げられる。１実施形態では、本発明の核酸分子と結合体化され得る因子は医薬であってもよい。これらの実施形態の各々では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、任意の適切な直接または間接的な物理化学的結合を通じて他の因子と結合体化され得る。１実施形態では、この結合は、共有結合である。１実施形態では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、リンカーを通じて他の因子と結合体化され得る。
【０１２２】
１局面では、本発明は、抗原または他の治療因子および本発明の単離された免疫刺激性オリゴヌクレオチドの結合体を含む組成物を提供する。１実施形態では、抗原または他の治療因子は、例えば共有結合を通じて、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドに直接結合される。１実施形態では、この抗原または他の治療因子は、例えば、リンカーを通じて、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドに直接結合される。この結合体の抗原または他の治療因子が、ペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである場合、この抗原または他の治療因子および単離された免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、単独の発現ベクターに組み込まれ得る。この結合体の抗原または他の治療因子が事前形成されたポリペプチドまたはポリサッカリドである場合、この抗原または他の治療因子および単離された免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の方法を用いて結合され得る。
【０１２３】
１実施形態では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、本発明の核酸分子の３’末端を含む結合を通じてこの抗原または他の治療因子と結合体化され得る。１実施形態では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、本発明の核酸分子の５’末端を含む結合を通じてこの抗原または他の治療因子と結合体化され得る。
【０１２４】
１実施形態では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、本発明の核酸分子の３’末端を含まない結合を通じてこの抗原または他の治療因子と結合体化され得る。１実施形態では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、本発明の核酸分子の５’末端を含まない結合を通じてこの抗原または他の治療因子と結合体化され得る。
【０１２５】
インビボの投与のためには、本発明の免疫刺激性核酸分子は、「核酸送達複合体（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」を形成するように、標的細胞（例えば、Ｂ細胞、単球細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞）表面に対するより高い親和性結合および／または標的細胞による増大された細胞取り込みを生じる分子と会合され得る。核酸は、当該分野で周知である技術を用いて適切な分子とイオン的にまたは共有結合的に会合され得る。種々のカップリング因子または架橋因子、例えば、プロテインＡ、カルボジイミド、およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）が用いられ得る。あるいは、核酸は、周知の技術を用いてリポソームまたはビロゾームにカプセル化されてもよい。
【０１２６】
ある実施形態では、本発明の免疫刺激性核酸分子は、カチオン性脂質と混合されてもそうでなければ会合されてもよい。カチオン性脂質と混合されるかそうでなければ会合される本発明の免疫刺激性核酸分子は、リポソームを含む、カチオン性脂質／核酸複合体の形態をとってもよい。本発明の免疫刺激性核酸分子は、単独で（すなわち、「裸の（ｎａｋｅｄ）」オリゴヌクレオチドとして）用いられる場合、生物学的に活性であるが、カチオン性脂質との会合は、本発明の免疫刺激性核酸分子の生物学的活性を増大することが観察されている。いかなる特定の理論にも機序にも束縛されることは意味しないが、カチオン性脂質の使用と関連される生物学的活性の増大は、本発明の免疫刺激性核酸分子の細胞取り込みの効率の増大に起因すると考えられる。このような脂質は、分子生物学におけるトランスフェクションの適用のために通常用いられる。本発明において有用なカチオン性脂質としては、限定はしないが、ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルサルフェート）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）、ＤＯＳＰＡ（２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）、ＤＭＲＩＥ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ビス（テトラデシルオキシ）−１−プロパンアミニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、コレステロール、リポソーム、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１２７】
カチオン性脂質との会合の代用として、本発明の免疫刺激性核酸分子は有利には、例えば、ポリカチオン性ペプチドであって、ポリアルギニン、ポリアルギニン／ポリリジンおよびプロタミンを含むポリカチオン性ペプチドを含む、他のタイプのカチオン性部分と会合されてもよい。
【０１２８】
本発明の前述の局面の各々では、本発明の免疫刺激性核酸分子は必要に応じて、遊離の核酸の塩または水和物として存在し得る。
【０１２９】
本発明の前述の局面の各々では、組成物はまた、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含んでもよく、その結果、本発明はまた、本発明の単離された免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物を提供する。このような薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと接触させて本発明の単離された免疫刺激性オリゴヌクレオチドを置くことによって調製され得る。
【０１３０】
（方法および用途）
本発明の組成物は、アレルギー、喘息、感染、癌または自己免疫疾患の処置に用いられ得る。
【０１３１】
本発明の組成物は、アレルギー、喘息、感染、癌または自己免疫疾患の処置のための医薬の調製に用いられ得る。この用途は、アレルギー、喘息、感染、癌または自己免疫疾患を処置するための本発明の組成物の治療上有効な量を薬学的に受容可能なキャリアと接触させる工程を包含する。
【０１３２】
本発明は、１局面では、免疫応答を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、免疫系の細胞を本発明の組成物の有効量と接触させて免疫応答を刺激する工程を包含する。この方法は、インビトロで行われても、またはインビボで行われてもよい。特定の実施形態では、免疫系の細胞は、免疫系の細胞の集団の一部であってもよく、この集団は、免疫系の種々のタイプの細胞の混合された集団であってもよいし、あるいは、免疫系の細胞の単一のタイプの精製された集団であってもよい。この集団が免疫系の単一のタイプの細胞の精製された集団である場合、１実施形態では、この選択された単一のタイプの細胞は、細胞集団の少なくとも９０％を占める。免疫系の単一のタイプの細胞の精製された集団を含む他の実施形態では、この選択された単一のタイプの細胞は、細胞集団の少なくとも９５％または少なくとも９９％を占める。１実施形態では、この方法は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）と、本発明の組成物の有効量とを接触させて免疫応答を刺激する工程を包含する。
【０１３３】
免疫応答は、免疫応答の少なくとも１つの特徴を検出し得る任意の適切な方法を用いて測定され得る。免疫刺激性効果、すなわち免疫応答を検出および測定するための方法は以下に記載される。
【０１３４】
本発明は１局面では、Ｔｈ１様免疫応答を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、免疫系の細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて、Ｔｈ１様免疫応答を刺激する工程を包含する。この方法は、インビトロで行われても、またはインビボで行われてもよい。１実施形態では、この方法は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）と、本発明の組成物の有効量とを接触させてＴｈ１様免疫応答を刺激する工程を包含する。Ｔｈ１様免疫応答は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、およびそれらの任意の組み合わせを含む、特定のサイトカインおよびケモカインの発現を包含し得る。ある実施形態では、Ｔｈ１−様免疫応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３を含む特定のＴｈ２関連サイトカインの抑制を含み得る。Ｔｈ１−様免疫応答は、ＩｇＥおよび（マウスでは）ＩｇＧ１を含む特定のＴｈ２関連抗体のアイソタイプの抑制の有無において、（マウスでは）ＩｇＧ２ａを含む特定の抗体アイソタイプの発現を包含し得る。
【０１３５】
本発明は１局面では、ＴＬＲシグナル伝達を刺激するための方法を提供する。この局面による方法は、ＴＬＲを発現する細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて、ＴＬＲによるシグナル伝達を刺激する工程を包含する。この方法は、インビトロで行われても、インビボで行われてもよい。一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムのＲＮＡの３’末端に存在する高度に保存されたＲＮＡ配列は、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ３を含む特定のＴＬＲの天然に存在するアゴニストであり、そしてその潜在的なリガンドであるということが本発明者らの考えである。一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムのＲＮＡの３’末端に存在する高度に保存されたＲＮＡ配列を組み込む、本発明の免疫刺激性核酸分子は、これらの同じＴＬＲ、すなわち、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、およびＴＬＲ３のアゴニストであり、そしてその潜在的なリガンドであるということが本発明者らの考えである。
【０１３６】
従って、１実施形態では、本方法は、ＴＬＲ８を発現する細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて、ＴＬＲ８によるシグナル伝達を刺激する工程を包含する。１実施形態では、この方法は、ＴＬＲ７を発現する細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて、ＴＬＲ７によるシグナル伝達を刺激する工程を包含する。１実施形態では、この方法は、ＴＬＲ３を発現する細胞と、本発明の組成物の有効量とを接触させて、ＴＬＲ３によるシグナル伝達を刺激する工程を包含する。
【０１３７】
前述の実施形態の各々では、ＴＬＲを発現する細胞は、ＴＬＲを天然に発現する細胞であってもよい。このような細胞は、天然に見出される細胞、例えばＰＢＭＣを包含し得る。あるいはそしてさらに、このような細胞は、クローニングされた細胞、または細胞株の一部を含んでもよい。
【０１３８】
あるいは、前述の実施形態の各々では、ＴＬＲを発現する細胞は、ＴＬＲを人工的に発現する細胞であってもよい。このような細胞は詳細には、ＴＬＲをコードするベクターで一過性にまたは安定にトランスフェクトされた細胞であって、その結果このトランスフェクトされた細胞がこのベクターによってコードされるＴＬＲを発現する細胞を含み得る。特定のＴＬＲをコードするベクターは、この特定のＴＬＲのコード領域のヌクレオチド配列を含む。このようなヌクレオチド配列は以下にさらに詳細に記載される、ＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから公的に入手可能である。
【０１３９】
人工的に発現されたＴＬＲは、ヒトＴＬＲであってもよい。１実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、ヒトＴＬＲ８の発現ベクターで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫヒト線維芽細胞である。１実施形態では、このトランスフェクトされた細胞は、ヒトＴＬＲ７の発現ベクターで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫヒト線維芽細胞である。１実施形態では、このトランスフェクトされた細胞は、ヒトＴＬＲ３の発現ベクターで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫヒト線維芽細胞である。
【０１４０】
人工的に発現されるＴＬＲは、非ヒトＴＬＲであってもよい。１実施形態では、このトランスフェクトされた細胞は、マウスＴＬＲ８の発現ベクターで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫヒト線維芽細胞である。１実施形態では、このトランスフェクトされた細胞は、マウスＴＬＲ７の発現ベクターで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫヒト線維芽細胞である。１実施形態では、このトランスフェクトされた細胞は、マウスＴＬＲ３の発現ベクターで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫヒト線維芽細胞である。
【０１４１】
特異的なＴＬＲを天然にまたは人工的に発現する細胞は必要に応じて、ＴＬＲによって媒介されるシグナル伝達に対して感受性であるレポーター構築物を含む。このレポーター構築物は、ＴＬＲシグナル伝達活性を検出するために用いられ得る。多数のこのようなレポーター構築物が、本発明の方法の実施に用いられ得る。１実施形態では、このレポーター構築物は、レポーター遺伝子を含み、その転写は、ＴＬＲシグナル伝達によって誘導される転写因子、例えば、ＮＦ−κＢの制御下である。１実施形態では、このレポーター構築物は、ＮＦ−κＢ応答エレメントの制御下に置かれたルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子、すなわち、ＮＦ−κＢ−ｌｕｃを含む。このような構築物は市販されている。
【０１４２】
本発明は、１局面では、被験体における免疫応答を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の組成物の有効量を被験体に投与して、この被験体における免疫応答を刺激する工程を包含する。被験体に対する本発明の組成物の投与に関与する本発明のこの局面および全ての局面では、有効量は、単回の用量で投与されてもよいし、または２回以上の用量で投与されてもよい。さらに、投与は、限定はしないが、腸内投与、非経口投与、粘膜投与、局所投与および全身投与を含む、任意の適切な経路または適切な投与経路の組合せを用いて達成され得る。被験体における免疫応答を検出する方法としては、限定はしないが、本明細書に記載される方法を含む、任意の適切な方法が挙げられる。
【０１４３】
核酸分子の「有効量」という用語は、所望の生物学的効果をもたらすのに必須であるかまたは十分である核酸分子の量をいう。例えば、障害を処置するための本発明の核酸分子の有効量とは、癌またはウイルス、細菌、真菌もしくは寄生生物の感染を排除するのに十分な大きさの免疫応答を誘導するのに必要な量であり得る。ワクチンとしての使用のための有効量は、被験体における防御免疫応答をプライミングおよびブーストするために有用な量であり得る。任意の特定の適用のための有効な量は、処置される疾患または状態、投与される特定の核酸、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重篤度のような要因に依存して変化し得る。当業者は、過度の実験を要することなく、特定のオリゴヌクレオチドの有効量を経験的に決定することが可能である。予防的ワクチンとしての使用のための有効量は、被験体における防御的な免疫応答をプライミングおよびブーストするために有用な量である。１実施形態では、防御免疫応答は、抗原特異的な免疫応答である。
【０１４４】
本発明は１局面では、Ｔｈ１様免疫応答を被験体において刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、被験体に対して本発明の組成物の有効量を投与してこの被験体においてＴｈ１−様免疫応答を刺激する工程を包含する。
【０１４５】
本発明は１局面では、被験体において抗原特異的免疫応答を刺激するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、本発明の組成物の有効量を被験体に投与する工程と、この被験体と抗原とを接触させて、この被験体における抗原特異的免疫応答を刺激する工程とを包含する。この被験体と抗原との接触の工程は、抗原との能動的な接触（例えば、意図的投与）または受動的な接触（例えば、環境的な曝露）を包含し得る。１実施形態では、この方法は、ある被験体に対して本発明の組成物の有効量を投与する工程と、この被験体に対して有効量の抗原を投与してこの被験体において抗原特異的免疫応答を刺激する工程とを包含する。１実施形態では、この抗原はアレルゲンであり、そしてこの抗原特異的応答はこのアレルゲンに特異的である。１実施形態では、この抗原はウイルス抗原であり、そしてこの抗原特異的な応答は、ウイルス抗原に特異的である。１実施形態では、この抗原は、細菌抗原であり、そしてこの抗原特異的な応答は、細菌抗原に特異的である。１実施形態では、この抗原は真菌抗原であり、そしてこの抗原特異的な応答は真菌抗原に特異的である。１実施形態では、この抗原は寄生生物の抗原であり、そして抗原特異的な応答は、寄生生物の抗原に特異的である。１実施形態では、この抗原は癌抗原であり、そしてこの抗原特異的な応答は癌抗原に特異的である。
【０１４６】
本明細書において用いる場合、「癌抗原」および「腫瘍抗原」とは、交換可能に用いられて、癌細胞によって示差的に発現され、それによって癌細胞を標的するために利用され得る抗原をいう。癌抗原は、明らかに腫瘍特異的免疫応答を潜在的に刺激し得る抗原である。これらの抗原のいくつかはコードされているが、正常な細胞によっては必ずしも発現されない。これらの抗原は、正常な細胞において通常はサイレント（すなわち、発現されない）抗原、分化の特定の段階でのみ発現される抗原、そして胚性抗原および胎児性抗原のように一時的に発現される抗原として特徴付けられ得る。他の癌抗原は、変異体細胞遺伝子、例えば、発癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ発癌遺伝子）、抑制遺伝子（例えば、変異体ｐ５３）、内部欠失または染色体転位から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原が、ＲＮＡおよびＤＮＡ腫瘍ウイルス上に担持されるウイルス遺伝子のようなウイルス遺伝子によってコードされ得る。
【０１４７】
本明細書において用いる場合、癌抗原とは、腫瘍または癌細胞の表面と関連しており、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子の状況では抗原提示細胞の表面で発現された場合、免疫応答を誘発し得る、ペプチド、タンパク質または糖タンパク質のような化合物である。癌抗原は、例えば、Ｃｏｈｅｎ  ＰＡら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：１０５５〜８に記載のように、癌細胞の粗抽出物を調製することによって、抗原を部分的に精製することによって、組み換え技術によって、または既知の抗原の新規な合成によって、癌細胞から調製され得る。癌抗原としては、限定はしないが、組み換え発現される抗原、腫瘍もしくは癌、またはそれらの細胞の免疫原性の一部、または全体が挙げられる。このような抗原は、組み換え的に、または当該分野で公知の任意の他の手段によって単離されても調製されてもよい。
【０１４８】
腫瘍抗原の例としては、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ−結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）およびその免疫原性エピトープＣＡＰ−１およびＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）およびその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、およびＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ−細胞レセプター／ＣＤ３−ζ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫様性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、ホドリン、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ  ３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２およびＧＤ２ガングリオシド、ウイルスの生成物、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶ−コード核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１およびＣＴ−７、ならびにｃ−ｅｒｂＢ−２が挙げられる。この列挙は限定を意味するものではない。
【０１４９】
本明細書において用いられる微生物抗原とは、微生物の抗原であって、これには限定はしないが、ウイルス、細菌、寄生生物および真菌が挙げられる。このような抗原としては、インタクトな微生物、ならびに天然の単離物およびそのフラグメント、または誘導体、そしてまた天然の微生物抗原に対して同一であるかまたは類似であり、その微生物に特異的な免疫応答を誘発する合成化合物が挙げられる。化合物は、これが天然の微生物抗原に対する免疫応答（体液性および／または細胞性）を誘発する場合、天然の微生物抗原と同様である。このような抗原は、当該分野で慣用的に用いられて、当業者に周知である。
【０１５０】
この抗原は、核酸ベクターによってコードされる抗原であってもよく、または核酸ベクターにコードされなくてもよい。前者の場合、この核酸ベクターは、被験体に投与されて、抗原がインビボで発現される。後者の場合、この抗原は被験体に直接投与され得る。本明細書において用いられる、核酸ベクターにコードされない抗原とは、核酸ではない任意のタイプの抗原をいう。例えば、本発明のある局面では、核酸ベクターにコードされない抗原はポリペプチドである。ポリペプチド抗原の一次アミノ酸配列のわずかな修飾はまた、修飾されていない対応のポリペプチドに比較して、実質的に等価な抗原活性を有するポリペプチドを生じ得る。このような修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような、故意であってもよいし、または自発性であってもよい。これらの修飾によって生じる全てのポリペプチドは、抗原性が存在さえすれば、本明細書に包含される。ポリサッカリド、低分子、模倣物などのような核酸ベクターによってコードされない他のタイプの抗原は、本発明内に含まれる。
【０１５１】
本発明はある実施形態では、抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを利用する。抗原は、この抗原がインビボで発現され得るように、この抗原をコードする核酸分子中で被験体に送達されてもよいことが想定される。核酸ベクター中で被験体に送達されるこのような抗原は、核酸ベクターによってコードされる抗原と呼ばれる。抗原をコードする核酸は、真核生物細胞内の抗原の核酸の発現を指向する遺伝子発現配列に対して作動可能に連結される。この遺伝子発現配列は、任意の調節性ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター配列またはプロモーター−エンハンサーの組み合わせであり、それが作動可能に連結されている抗原核酸の効率的な転写および翻訳を容易にする。この遺伝子発現配列は、例えば、哺乳動物プロモーターまたはウイルスプロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであってもよい。構成的な哺乳動物プロモーターとしては、限定はしないが、以下の遺伝子のプロモーターが挙げられる：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルベートキナーゼ、β−アクチン、および他の構成的プロモーター。真核生物細胞において構成的に機能する例示的なウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス由来のプロモーター、モロニー白血病ウイルスおよび他のレトロウイルスの長末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびに単純疱疹ウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成的プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターとしてはまた、誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターは、誘導性因子の存在下で発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、特定の金属イオンの存在下で転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に公知である。
【０１５２】
概して、この遺伝子発現配列は、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などのように、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する、５’非転写配列および５’非翻訳配列を必要に応じて含むものとする。特に、このような５’非転写配列は、作動可能に結合された抗原核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。この遺伝子発現配列は必要に応じて、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を所望の場合、含む。
【０１５３】
この抗原核酸は、遺伝子発現配列に対して作動可能に連結される。本明細書において用いる場合、この抗原核酸配列および遺伝子発現配列は、それがこの遺伝子発現配列の影響または制御下でこの抗原コード配列の発現または転写および／または翻訳を行なうように共有結合された場合、作動可能に連結されたと言われる。２つのＤＮＡ配列は、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導が抗原配列の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ配列の間の結合の性質が（１）フレームシフトの変異の導入を生じず、（２）プロモーター領域が抗原配列の転写を指向する能力を妨害せず、（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害もしない場合に、作動可能に連結されると言われる。従って、遺伝子発現配列は、この遺伝子発現配列がその抗原核酸配列の転写を果たし得、その結果、得られた転写物が所望のタンパク質またはポリヌクレオチドに翻訳される場合に抗原核酸配列に対して作動可能に連結されるものである。
【０１５４】
本発明の抗原核酸は、免疫系に対して単独で、またはベクターとともに送達され得る。広義では、ベクターとは、抗原が免疫細胞の表面上で発現されて提示され得るように、免疫系の細胞に対する抗原核酸の移入を促進し得る任意のビヒクルである。このベクターは一般に、ベクターの非存在下で生じる分解の程度に対して低下した分解でもって核酸を免疫細胞に輸送する。このベクターは必要に応じて、免疫細胞における抗原核酸の発現を増強するために、上記の遺伝子発現配列を含む。一般に、本発明において有用なベクターとしては、限定はしないが、プラスミド、ファージミド、ウイルス、この抗原核酸配列の挿入または取り込みによって操作されているウイルスまたは細菌の供給源に由来する他のビヒクルが挙げられる。ウイルスベクターは、好ましいタイプのベクターであり、そして限定はしないが、以下のウイルスに由来する核酸配列を含む：レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハービー・マウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルスおよびラウス肉腫ウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルス。当業者は、ここに挙げていないが当該分野で公知の他のベクターを容易に使用できる。
【０１５５】
好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子が目的の遺伝子で置換されている、非細胞変性真核生物ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスはレトロウイルスを含み、そのライフサイクルは、ゲノムのウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含み、これには引き続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療のトライアルについて承認されている。最も有用なのは、複製欠損である（すなわち、所望のタンパク質の合成を指向し得るが、感染性粒子を製造できない）レトロウイルスである。このような遺伝子操作されたレトロウイルス発現ベクターはインビボにおける遺伝子の高効率の形質導入に一般的有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを作製するための標準的プロトコール（プラスミドへの外因性の遺伝物質の組み込みと、プラスミドでのパッケージング細胞株のトランスフェクションと、パッケージング細胞株による組み換えレトロウイルスの産生と、組織培養培地からのウイルス粒子の収集と、ウイルス粒子での標的細胞の感染の工程を含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｍ．、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）ａｎｄ  Ｍｕｒｒａｙ、Ｅ．Ｊ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．７、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｌｉｆｆｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に示される。
【０１５６】
特定の適用のために好ましいウイルスは、二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損となるように操作されてもよく、そして広範な細胞タイプおよび種に感染し得る。これはさらに利点、例えば、熱および脂質溶媒に対する安定性；造血細胞を含む多様な系等の細胞での高い形質導入頻度；およびこれによって多系列での形質導入が可能になる、重複感染阻害の欠失を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位指向性の方式であって、これによって挿入の突然変異誘発の可能性およびレトロウイルス感染の特徴である挿入された遺伝子発現の変動を最小限にする方式で、ヒトの細胞ＤＮＡに組み込み得る。さらに、野性型のアデノ随伴ウイルス感染は、選択性の圧力の非存在下で１００継代を超えて組織培養中で継続されており、このことはアデノ随伴ウイルスのゲノムの組み込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の方式で機能し得る。
【０１５７】
他のベクターとしてはプラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当該分野で広く記載されており、そして当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと。ここ２〜３年間で、プラスミドベクターは、複製されず宿主ゲノムへ組み込まれないという理由で、インビボで細胞に遺伝子を送達するには特に有利であることが見出されている。しかし、宿主細胞と適合性であるプロモーターを有するこれらのプラスミドは、このプラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現し得る。いくつかの一般に用いられるプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドが当業者に周知である。さらに、プラスミドは、ＤＮＡの特定のフラグメントを除去および付加するために、制限酵素およびライゲーション反応を用いてカスタム設計されてもよい。
【０１５８】
遺伝子を担持するプラスミドが細菌を用いて免疫系に送達され得るということが最近発見されている。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａのような細菌の改変型は、プラスミドでトランスフェクトされてもよく、そして送達ビヒクルとして用いられてもよい。細菌送達ビヒクルは、経口的にまたは他の投与方法によって宿主被験体に投与され得る。細菌は、おそらく、腸の障壁を通過することによって、免疫細胞、例えば、Ｂ細胞およびＤＣに対してプラスミドを送達する。高レベルの免疫防御は、この方法論を用いて達成されている。このような送達方法は、抗原、免疫刺激性核酸および／または他の治療因子の全身送達を利用する、本発明の局面に有用である。
【０１５９】
被験体と抗原とを接触させる工程、または被験体に抗原を投与する工程は、免疫刺激性オリゴヌクレオチドの有効量を投与する前、本質的には同時に、またはその後に行なわれ得る。例えば、特定の実施形態における免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与は、被験体と抗原との接触の少なくとも１日前に行う。別の例では、特定の実施形態での免疫刺激性オリゴヌクレオチドの投与は、被験体と抗原との接触の少なくとも１日後に行う。少なくとも１日とは、２４時間を超えて、最大４週間までを含む任意の時間を含む。個々の実施形態では、少なくとも１日とは、少なくとも：２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、または４週である。他の実施形態では、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを投与することは、抗原との接触または投与の２４時間以内に行ってもよい。
【０１６０】
本発明は１局面では、被験体におけるアレルギー状態を処置するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、アレルギー状態を有するか、または発症する危険にある被験体に対して、本発明の組成物の有効量を投与して、このアレルギー状態を処置する工程を包含する。
【０１６１】
アレルギー状態を有する被験体とは、アレルゲンに応答するアレルギー性反応を有するか、またはそれを発症する危険にある被験体である。アレルギー性の状態とは、代表的には、アレルゲンに対する曝露によって誘発される偶発性のものである。１実施形態では、このアレルギー性の状態は、本発明の免疫刺激性組成物の投与の時点で活動的である。
【０１６２】
アレルギー性の状態を発症する危険にある被験体としては、アレルギー性状態を有するが、免疫刺激性核酸処置の時点では活動的な疾患を有さないと確認されている被験体、および遺伝的要因または環境要因のせいでアレルギー状態を発症するリスクがあるとみなされる被験体が挙げられる。
【０１６３】
アレルゲンのリストは、膨大であって、花粉、昆虫の毒液、動物の鱗屑、菌類胞子および薬物（例えば、ペニシリン）を挙げることができる。天然の動物および植物のアレルゲンの例としては、以下の属に特異的なタンパク質が挙げられる：イヌ属（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）；Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ（例えば、ヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｆａｒｉｎａｅ））；ネコ属（Ｆｅｌｉｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）；ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｉｓｆｏｌｉａ；ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）（例えば、Ｌｏｌｉｕｍ  ｐｅｒｅｎｎｅおよびＬｏｌｉｕｍ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；スギ属（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ）（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）；アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ａｌｔｅｒｎａｔａ）；ハンノキ属（Ａｌｄｅｒ）；ハンノキ属（Ａｌｎｕｓ）（Ａｌｎｕｓ  ｇｕｌｔｉｎｏｓａ）；カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ）（Ｂｅｔｕｌａ  ｖｅｒｒｕｃｏｓａ）；カシ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）（Ｑｕｅｒｃｕｓ  ａｌｂａ）；オレア属（Ｏｌｅａ）（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａ）；ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）；オオバコ属（Ｐｌａｎｔａｇｏ）（例えば、Ｐｌａｎｔａｇｏ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ）；ヒカゲミズ属（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）（例えば、Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓおよびＰａｒｉｅｔａｒｉａ  ｊｕｄａｉｃａ）；チャバネゴキブリ属（例えば、Ｂｌａｔｔｅｌｌａ  ｇｅｒｍａｎｉｃａ）；ミツバチ属（Ａｐｉｓ）（例えば、Ａｐｉｓ  ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）；イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）（例えば、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ  ａｒｉｚｏｎｉｃａおよびＣｕｐｒｅｓｓｕｓ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ）；ネズミサシ属（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ）（例えば、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｓａｂｉｎｏｉｄｅｓ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、およびＪｕｎｉｐｅｒｕｓ  ａｓｈｅｉ）；クロベ属（Ｔｈｕｙａ）（例えば、Ｔｈｕｙａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）；ヒノキ属（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ）（例えば、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｏｂｔｕｓａ）；ワモンゴキブリ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）（例えば、Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）；カモジグサ属（Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ）（例えば、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ  ｒｅｐｅｎｓ）；Ｓｅｃａｌｅ（例えば、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）；コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）（例えば、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）；カモガヤ属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）（例えば、Ｄａｃｔｙｌｉｓ  ｇｌｏｍｅｒａｔａ）；ウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ）（例えば、Ｆｅｓｔｕｃａ  ｅｌａｔｉｏｒ）；イチゴツナギ属（Ｐｏａ）（例えば、Ｐｏａ  ｐｒａｔｅｎｓｉｓおよびＰｏａ  ｃｏｍｐｒｅｓｓａ）；カラスムギ属（Ａｖｅｎａ）（例えば、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）；シラゲガヤ属（Ｈｏｌｃｕｓ）（例えば、Ｈｏｌｃｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ）；ハルガヤ属（Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕｍ）（例えば、Ａｎｔｈｏｘａｎｔｈｕ���  ｏｄｏｒａｔｕｍ）；オオカニツリ属（Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ）（例えば、Ａｒｒｈｅｎａｔｈｅｒｕｍ  ｅｌａｔｉｕｓ）；ヌカボ（コヌカグサ）属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）（例えば、Ａｇｒｏｓｔｉｓ  ａｌｂａ）；アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）（例えば、Ｐｈｌｅｕｍ  ｐｒａｔｅｎｓｅ）；クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）（例えば、Ｐｈａｌａｒｉｓ  ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）；スズメノヒエ属（Ｐａｓｐａｌｕｍ）（例えば、Ｐａｓｐａｌｕｍ  ｎｏｔａｔｕｍ）；モロコシ属（例えば、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｈａｌｅｐｅｎｓｉｓ）；およびスズメノチャヒキ属（Ｂｒｏｍｕｓ）（例えば、Ｂｒｏｍｕｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ）。
【０１６４】
本発明は１局面では、被験体における喘息を処置するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、喘息を有するかまたは喘息を発症する危険にある被験体に対して、本発明の組成物の有効量を投与して喘息を処置する工程を包含する。１実施形態では喘息はアレルギー性喘息である。
【０１６５】
喘息を有する被験体とは、喘息を有するか、またはそれを発症する危険にある被験体である。喘息とは、代表的には偶発性で、ある時点では活動的であり、他の時点では静止状態である。１実施形態では、喘息は、本発明の免疫刺激性組成物の投与の時点で活動的である。
【０１６６】
喘息を発症する危険にある被験体としては、喘息を有するが、免疫刺激性核酸処置の時点では活動的な疾患を有さないと確認されている被験体、および遺伝的要因または環境要因のせいで喘息を発症するリスクがあるとみなされる被験体が挙げられる。
【０１６７】
本発明は１局面では、被験体における感染を処置するための方法を提供する。この実施形態による方法は、感染を有するかまたは感染を発症する危険にある被験体に対して、本発明の組成物の有効量を投与してこの感染を処置する工程を包含する。
【０１６８】
感染を有する被験体とは、感染性の病原体に対して曝露されており、身体においてこの病原体の急性または慢性の検出可能なレベルを有する被験体である。免疫刺激性核酸は、抗原特異的な全身または粘膜の免疫応答を上昇させるために抗原とともに用いられてもよく、これによって感染性病原体のレベルを低下させるかまたは根絶し得る。
【０１６９】
感染を発症する危険にある被験体とは、特定のタイプの感染性因子が見出される地域で生活しているか、またはその地域に対する旅行を計画している被験体であってもよい。感染を発症する危険にある被験体は、ライフスタイル、環境または医学的手順が感染性生物体に暴露される被験体であってもよい。感染を発症する危険にある被験体としてはまた、医療機関が特定の感染性生物体抗原でのワクチン接種を推奨する一般的な集団が挙げられる。
【０１７０】
１実施形態では、感染とはウイルス感染である。この方法は特に、本発明の有効量の組成物がウイルス感染の早期に投与される場合、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスでのウイルス感染の処置においてさえ有用であり得ると本発明者らは考えている。いかなる理論にも機構にも束縛されることは意味しないが、本発明の組成物の早期の投与は、ウイルスに対する有効な免疫応答をブーストまたは加速して、それによってウイルス感染を処置すると本発明者らは、考えている。
【０１７１】
ヒトで見出されているウイルスの例としては、限定はしないが：レトロウイルス科（例えば、ヒト免疫不全ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも呼ばれる；および他の単離体、例えば、ＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カリシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、胃腸炎を生じる株）；トガウイルス科（例えば、ウマ脳症ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば、水泡性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルスおよびナイロビウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えば、レオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ボルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）１および２、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス；ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えば、アフリカ豚コレラウイルス（アフリカ豚熱ウイルス））；および非古典的ウイルス（例えば、δ肝炎の因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損性サテライトであると考えられる）、Ｃ型肝炎；ノーウォークおよび関連のウイルス、およびアストロウイルス）が挙げられる。
【０１７２】
別の実施形態では、感染は細菌感染である。細菌としては、限定はしないが、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）種、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種が挙げられる。感染性細菌の特異的な例としては、限定はしないが、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（マイコバクテリア）ｓｐｓ（例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ａ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群連鎖球菌）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ビリダンス群）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（嫌気性  ｓｐｓ．）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（病原性カンピロバクター）ｓｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ（腸球菌）ｓｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｓｐ．、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ（バクテロイデス）ｓｐ．、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、およびＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｉｉが挙げられる。
【０１７３】
別の実施形態では、感染は真菌の感染である。真菌としては、酵母およびカビが挙げられる。真菌の例としては、限定はしないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓを含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）ｓｐｐ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓを含むＣａｎｄｉｄａ（カンジダ）ｓｐｐ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐｐ、およびＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｐ．が挙げられる。
【０１７４】
他の感染性微生物（すなわち、原生生物）としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（プラスモジウム）ｓｐｐ．、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｏｖａｌｅ、およびＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。血液由来のおよび／または組織の寄生生物としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ（プラスモジウム）ｓｐｐ．、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｇａｍｂｉｅｎｓｅおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ（アフリカ睡眠病）、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ（シャーガス病）、およびＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが挙げられる。
【０１７５】
他の医学的に関連する微生物は、文献に広範に記載されている。例えば、その内容全体が参照によって本明細書に援用される、Ｃ．Ｇ．Ａ  Ｔｈｏｍａｓ、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ  Ｔｉｎｄａｌｌ、Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎ  １９８３を参照。
【０１７６】
本発明は１局面では、被験体において癌を処置する方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、癌を有するかまたは発症するリスクの被験体に対して、本発明の組成物の有効量を投与してこの癌を処置する工程を包含する。
【０１７７】
癌を有する被験体とは、検出可能な癌細胞を有する被験体である。癌とは、悪性の癌であっても非悪性の癌であってもよい。癌または腫瘍としては、限定はしないが、胆道癌；脳腫瘍；乳癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸癌；子宮内膜癌；食道癌；胃癌；上皮内新生物；リンパ腫；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞および非小細胞）；黒色腫；神経芽細胞腫；口腔癌；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；直腸癌；腎臓癌；肉腫；皮膚癌；精巣癌；および甲状腺癌、ならびに他の癌腫および肉腫が挙げられる。１実施形態では、癌は毛状細胞白血病（ｈａｉｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄性白血病、皮膚Ｔ−細胞白血病、多発性骨髄腫、濾胞性リンパ腫、悪性黒色腫、扁平上皮細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、膀胱細胞癌、または結腸癌である。
【０１７８】
癌を発症するリスクの被験体とは、癌を発症する可能性が高い被験体である。これらの被験体としては、例えば、遺伝的異常であってその存在は癌を発症する可能性の高さと相関関係を有することが示されているかまたは有することが実証され得る異常を有する被験体、およびタバコ、アスベストまたは多の化学的毒素のような癌発症因子に曝された被験体、または癌について以前に処置されており明白に寛解している被験体が挙げられる。癌を発症するリスクの被験体を、この被験体が発症する危険にあるタイプの癌に特異的な抗原および免疫刺激性核酸で処置した場合、この被験体は、癌が発症した場合この癌細胞を殺傷し得る。この被験体内で腫瘍が形成し始めた場合、この被験体は、この腫瘍抗原に対して特異的な免疫応答を発達させる。
【０１７９】
（スクリーニング方法）
本発明は、別の局面では、ＴＬＲのアンタゴニストをスクリーニングするための方法を提供する。本発明のこの局面による方法は、ＴＬＲを発現する参照細胞と本発明の組成物の有効量とを、ＴＬＲの候補アンタゴニストの非存在下で接触させて、ＴＬＲによるシグナル伝達の参照量を測定する工程と；ＴＬＲを発現する試験細胞とこの組成物の有効量とを、ＴＬＲの候補アンタゴニストの存在下で接触させて、ＴＬＲによるシグナル伝達の試験量を測定する工程と；シグナル伝達の参照量がシグナル伝達の試験量を超える場合、ＴＬＲのこの候補アンタゴニストがＴＬＲのアンタゴニストであることを確認する工程とを包含する。参照細胞および試験細胞は各々が、上記のように、ＴＬＲを天然に発現しても、または人工的に発現してもよい。１実施形態では、参照細胞および試験細胞は各々が、細胞の共通の集団、例えば、単一のドナーから採取されたＰＢＭＣ、またはＴＬＲについての発現ベクターで安定にトランスフェクトされた２９３ＨＥＫ細胞の代表である細胞である。種々の特異的な実施形態では、ＴＬＲは、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、またはＴＬＲ３から選択され得る。
【０１８０】
（免疫刺激性効果の測定）
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの免疫刺激性効果は、インビトロまたはインビボで任意の適切な方法を用いて測定され得る。このような測定の基礎は、細胞増殖；限定はしないが特にＴＬＲシグナル伝達を含む細胞内シグナル伝達；可溶性の産物、例えば、サイトカイン、ケモカインまたは抗体の発現；表面抗原分類（ＣＤ）抗原のような細胞表面マーカーの発現；またはアポトーシスおよびＮＫ細胞の細胞傷害性のような機能的活性；の測定に関与し得る。このようなタイプの測定を行うための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれには、限定はしないが、トリチウムチミジンの取り込み、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、バイオアッセイ、蛍光活性化細胞分類、イムノブロット（ウエスタンブロット）アッセイ、ノーザンブロットアッセイ、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、およびクロム遊離アッセイを挙げることができる。測定は、定量的であっても定性的であってもよい。
【０１８１】
特定の実施形態では、測定は、Ｔｈ１様免疫応答に特異的に行われる。このような測定は、上記のような、Ｔｈ１様免疫応答と関連している特定のサイトカイン、ケモカイン、抗体アイソタイプ、および細胞活性の測定を包含し得る。
【０１８２】
１実施形態では、測定は、特にＴＬＲシグナル伝達活性について行われる。このような測定は、直接的でも間接的でもよく、代表的には、それらの測定は、ＴＬＲによって媒介される細胞内シグナル伝達経路のいくつかの成分によって影響される遺伝子の発現または活性の測定を包含する。
【０１８３】
ヒトおよびマウスのＴＬＲ８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が公知である。例えば、その全ての内容が参照によって全体として本明細書に援用される、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２４６９７１、ＡＦ２４５７０３、ＮＭ＿０１６６１０、ＸＭ＿０４５７０６、ＡＹ０３５８９０、ＮＭ＿１３３２１２；およびＡＡＦ６４０６１、ＡＡＦ７８０３６、ＮＰ＿０５７６９４、ＸＰ＿０４５７０６、ＡＡＫ６２６７７、およびＮＰ＿５７３４７５を参照のこと。ヒトＴＬＲ８は、１つは１０４１アミノ酸長であって、もう一方は１０５９アミノ酸長である少なくとも２つのアイソマー、に存在することが報告される。マウスＴＬＲ８は、１０３２アミノ酸長である。ＴＬＲ８ポリペプチドは、ロイシン−リッチリピート領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【０１８４】
ヒトおよびマウスのＴＬＲ７のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公知である。例えば、その全ての内容が参照によって全体として本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＡＦ２４０４６７、ＡＦ２４５７０２、ＮＭ＿０１６５６２、ＡＦ３３４９４２、ＮＭ＿１３３２１１；およびＡＡＦ６０１８８、ＡＡＦ７８０３５、ＮＰ＿０５７６４６、ＡＡＬ７３１９１、およびＡＡＬ７３１９２を参照のこと。ヒトＴＬＲ７は、１０４９アミノ酸腸であることが報告されている。マウスＴＬＲ８は１０５０アミノ酸長であることが報告されている。ＴＬＲ７ポリペプチドは、ロイシン−リッチリピート領域を有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＴＩＲドメインを含む細胞内ドメインを含む。
【０１８５】
ヒトおよびマウスのＴＬＲ３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は公知である。例えば、その全ての内容が参照によって全体として本明細書に援用されるＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号、ＮＭ＿００３２５６およびＵ８８８７９（ヒト、ｃＤＮＡ）；ＮＰ＿００３２５６およびＡＡＣ３４１３４（ヒト、アミノ酸）；ＮＭ＿１２６１６６およびＡＦ３５５１５２（マウス、ｃＤＮＡ）；およびＮＰ＿５６９０５４およびＡＡＫ２６１１７（マウス、アミノ酸）。ヒトＴＬＲ３は、ロイシン−リッチリピートを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびインターロイキン１型レセプターのファミリーのシグナル伝達ドメインと同様の細胞内セグメントによって少なくとも一部は特徴付けられる９０４アミノ酸のポリペプチドである。マウスＴＬＲ３は、ロイシン−リッチリピートを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびインターロイキン１型レセプターのファミリーのシグナル伝達ドメインと同様の細胞内セグメントによって少なくとも一部は特徴付けられる９０５アミノ酸のポリペプチドである。
【０１８６】
ＴＬＲによるシグナル伝達は、他のＴＬＲファミリーのメンバーによるシグナル伝達と同様に、ＮＦ−κＢ活性化を生じる。ＴＬＲシグナル伝達は最近、いくつかの他のＴＬＲファミリーのメンバーによるシグナル伝達よりもいくらか複雑であることが報告されている。詳細には、ＴＬＲ３は、ＭｙＤ８８に依存してシグナル伝達経路を通じたサイトカイン産生を誘導するが、ポリ（Ｉ：Ｃ）は依然として、ＭｙＤ８８−依存性マクロファージにおけるＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼの活性化を誘導し得、さらに、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼのＴＬＲ３媒介性活性化が報告によれば、シグナル伝達成分ＴＬＲ３、ＴＲＡＦ６、ＴＡＫ１、ＴＡＢ２、およびプロテインキナーゼＲＮＡ−調節（ＰＫＲ）を使用するＩＲＡＫ依存性経路を通じて生じ得る。Ｊｉａｎｇ  Ｚら（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：１６７１３〜９。ＴＬＲ３シグナル伝達機構のいくつかの特異的な詳細にかかわらず、ＴＬＲ３シグナル伝達は、ＮＦ−κＢ活性化を生じることに注目すべきである。
【０１８７】
（投薬および投与）
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、単独で用いられてもよいし、それ自体と組み合わされてもよいし、別の因子と組み合わされてもよいし、またはそれ自体とそして別の因子と組み合わせて投与されてもよい。本明細書に記載される結合体に加えて、別の因子と組み合わせた免疫刺激性オリゴヌクレオチドはまた、所望の効果を達成するために一緒に用いられる、別々の組成物であってもよい。例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび第二の因子は、一緒に混合されて、そして被験体に投与されてもよく、または組み合わせとして細胞と接触させられてもよい。別の例としては、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび第二の因子は、被験体に投与されても、種々の時点で細胞と接触させられてもよい。さらに別の例として、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび第二の因子は、種々の投与部位で被験体に投与されてもよい。
【０１８８】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療剤は、単独で（例えば、生理食塩水または緩衝液中で）、または当該分野で公知の任意の送達ビヒクルを用いて投与され得る。例えば、以下の送達ビヒクルが記載されている：蝸牛状物（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら、１９９４、１９９６）；エマルゾーム（ｅｍｕｌｓｏｍｅ）（Ｖａｎｃｏｔｔら、１９９８、Ｌｏｗｅｌｌら、１９９７）；ＩＳＣＯＭ（Ｍｏｗａｔら、１９９３、Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９１、Ｈｕ  ｅｔ．、１９９８、Ｍｏｒｅｉｎら、１９９９）；リポソーム（Ｃｈｉｌｄｅｒｓら、１９９９、Ｍｉｃｈａｌｅｋら、１９８９、１９９２、ｄｅ  Ｈａａｎ  １９９５ａ、１９９５ｂ）；生きた細菌ベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、カルメット・ゲラン桿菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）（Ｈｏｎｅら、１９９６、Ｐｏｕｗｅｌｓら、１９９８、Ｃｈａｔｆｉｅｌｄら、１９９３、Ｓｔｏｖｅｒら、１９９１、Ｎｕｇｅｎｔら、１９９８）；生きたウイルスベクター（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、単純疱疹（ヘルペス））（Ｇａｌｌｉｃｈａｎら、１９９３、１９９５、Ｍｏｓｓら、１９９６、Ｎｕｇｅｎｔら、１９９８、Ｆｌｅｘｎｅｒら、１９８８、Ｍｏｒｒｏｗら、１９９９）；マイクロスフェア（Ｇｕｐｔａら、１９９８、Ｊｏｎｅｓら、１９９６、Ｍａｌｏｙら、１９９４、Ｍｏｏｒｅら、１９９５、Ｏ’Ｈａｇａｎら、１９９４、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、１９８９）；核酸ワクチン（Ｆｙｎａｎら、１９９３、Ｋｕｋｌｉｎら、１９９７、Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ｏｋａｄａら、１９９７、Ｉｓｈｉｉら、１９９７）；ポリマー（例えば、カルボキシメチルセルロース、キトサン）（Ｈａｍａｊｉｍａら、１９９８、Ｊａｂｂａｌ−Ｇｉｌｌら、１９９８）；ポリマー環（Ｗｙａｔｔら、１９９８）；プロテオソーム（Ｖａｎｃｏｔｔら、１９９８、Ｌｏｗｅｌｌら、１９８８、１９９６、１９９７）；フッ化ナトリウム（Ｈａｓｈｉら、１９９８）；トランスジェニック植物（Ｔａｃｋｅｔら、１９９８、Ｍａｓｏｎら、１９９８、Ｈａｑら、１９９５）；ビロゾーム（Ｇｌｕｃｋら、１９９２、Ｍｅｎｇｉａｒｄｉら、１９９５、Ｃｒｙｚら、１９９８）；ウイルス様粒子（Ｊｉａｎｇら、１９９９、Ｌｅｉｂｌら、１９９８）。他の送達ビヒクルが当該分野で公知である。
【０１８９】
上記のように、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」という用語は一般に、所望の生物学的効果をもたらすのに必要であるかまたは十分である量をいう。本明細書に提供される教示と組み合わせれば、種々の活性化合物のなかでの選択、ならびに、力価、相対的なバイオアベイラビリティー、患者の体重、有害な副作用の重篤度および好ましい投与形態のような因子の重み付けによって、実質的な毒性を生じず、さらに特定の被験体を処置するのに完全に有効である、有効な予防的または治療的な処置レジメンが計画され得る。任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患または状態、投与される特定のオリゴヌクレオチド、被験体のサイズまたは疾患もしくは状態の重篤度のような因子に依存し得る。当業者は、特定の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび／または抗原および／または他の治療因子の有効量を過度の実験の必要性なしに経験的に決定し得る。
【０１９０】
全身的または局所的な送達のための本明細書に記載される化合物の対象用量は代表的には、１投与あたり約１０ｎｇ〜１０ｍｇの範囲におよび、これは、適用次第で、毎日、毎週または毎月、そしてその間の任意の他の時間量で、またはそうでなければ必要時に投与されてもよい。さらに代表的には全身用量または局所用量は、１投与あたり約１μｇ〜１ｍｇ、そして最も代表的には約１０μｇ〜１００μｇにおよび、２〜４回の投与が数日または数週間離れて行われる。非経口投与にはより高用量が必要とされ得る。しかし、ある実施形態では、これらの目的のための非経口投与は、上記での代表的な用量よりも５〜１０，０００倍高い範囲で用いられてもよい。
【０１９１】
本明細書に記載される任意の化合物について、治療上有効な量は、動物モデルから最初に決定され得る。投与量は、投与される化合物の相対的なバイオアベイラビリティーおよび投与される化合物の力価に基づいて調節され得る。上記の方法および当該分野で周知の他の方法に基づいて最大の有効性を達成するための用量の調節は、当業者の能力の十分に範囲内である。
【０１９２】
（投与経路）
臨床的使用のためには、本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、単独で投与されてもよいし、または所望の治療的結果を達成するのに有効である任意の適切な投与経路を介して送達複合体として処方されてもよい。投与経路としては、経腸的および非経口的な投与経路が挙げられる。経腸的な投与経路の例としては、経口、胃、腸内および直腸が挙げられる。非経口的な投与経路の非限定的な例としては、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、クモ膜下腔内、局所注射、局所、鼻腔内、粘膜および肺が挙げられる。
【０１９３】
（処方物）
本発明の免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、被験体に対して直接投与されてもよいし、または核酸送達複合体と組み合わせて投与されてもよい。核酸送達複合体は、標的化手段（例えば、標的細胞に対してより高い親和性を生じる分子）と会合された（例えば、イオン的にまたは共有結合的に結合するか；またはその中にカプセル化されて）核酸分子を意味するものとする。核酸送達複合体の例としては、ステロール（例えば、コレステロール）、脂質（例えば、カチオン性脂質、ビロソーム、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはリポソーム）または標的細胞特異的な結合因子（例えば、標的細胞特異的なレセプターによって認識されるリガンド）と会合した核酸が挙げられる。好ましい複合体は、標的細胞による内部移行の前に有意なカップリングを妨げるようにインビボで十分に安定であり得る。しかし、この複合体は、オリゴヌクレオチドが機能的な形態で放出されるように、細胞内の適切な条件下で切断され得る。
【０１９４】
経口投与については、化合物（すなわち、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、抗原および／または他の治療因子）は、活性化合物（単数または複数）と当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアとを組み合わせることによって容易に処方され得る。このようなキャリアによって、本発明の化合物は、処置されるべき被験体による経口摂取のために錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ジェル、シロップ、スラリー、懸濁剤などとして処方することが可能になる。経口使用のための薬学的な調製物は、所望の場合、錠剤または糖衣錠コアを得るために、安定な補助剤の添加後に、必要に応じて、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を加工して、固体の賦形剤として得られてもよい。適切な賦形剤は詳細には、充填剤、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などである。所望の場合、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが添加されてもよい。必要に応じて経口処方物はまた、内部の酸性状態を中和するための生理食塩水もしくは緩衝液に処方されてもよく、または任意のキャリア内で投与されてもよい。
【０１９５】
糖衣錠のコアは、適切なコーティングを設けられる。この目的のために、濃縮された糖溶液が用いられてもよく、これは必要に応じて、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適切な有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。染料または顔料が、同定のために、または活性化合物の用量の種々の組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠のコーティングに加えられてもよい。
【０１９６】
経口的に用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチン製の押込み型のカプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトールから作成された軟性の密閉されたカプセルが挙げられる。この押込み型のカプセルは、ラクトースのような充填剤、デンプンのような結合剤、および／または、滑石もしくはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および必要に応じて安定化剤と混合して活性成分を含んでもよい。軟性のカプセルでは、活性化合物は、適切な液体、例えば、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解されても、または懸濁されてもよい。さらに、安定化剤が添加されてもよい。経口投与のために処方されたマイクロスフェアも用いられてもよい。このようなマイクロスフェアは、当該分野で十分に規定されている。経口投与のための全ての処方物が、このような投与のために適切な糖衣錠中であるべきである。
【０１９７】
口腔投与のためには、この組成物は、従来の様式で処方された錠剤またはトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）の形態をとってもよい。
【０１９８】
この化合物は、肺の気道に対する、特には気管支そしてさらに詳細には肺深部の肺胞への、標準的な吸入デバイスを用いた吸入によって投与されてもよい。この化合物は、圧縮パックまたはネブライザーからのエアロゾル噴霧提示の形態で、適切な噴霧剤、例えば、ジクロロフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切なガスの使用とあわせて、送達され得る。圧縮されたエアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するためのバルブを設けることによって決定され得る。吸入装置は、被験体に化合物を送達するために用いられ得る。本明細書において用いる場合、吸入装置とは、エアロゾル、例えば、化合物の乾燥粉末型を投与するための任意のデバイスである。このタイプの装置は、当該分野で周知であり、そしてＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、１９９５、Ｍａｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１６７６〜１６９２頁に見出される説明のように詳細に記載されている。米国特許第６，１１６，２３７号のような、多くの米国特許も、吸入デバイスを記載している。
【０１９９】
「粉末（ｐｏｗｄｅｒ）」とは、本明細書において用いる場合、微細に分散された固体粒子からなる組成物をいう。好ましくは、この化合物は、比較的自由流動し、吸入デバイスに分散され得、そして引き続いて被験体によって吸入されて、その結果その化合物は肺に到達して、肺胞への浸透が可能になる。「乾燥粉末（ｄｒｙ  ｐｏｗｄｅｒ）」とは、この粒子がエアロゾルを形成する吸入デバイスに容易に分散可能であるような含水量を有する粉末組成物をいう。この含水量は一般に、水が約１０重量％（％ｗ）未満であり、そしてある実施形態では、約５重量％未満、そして好ましくは約３重量％未満である。この粉末は、ポリマーと処方されてもよく、または必要に応じて、他の物質、例えば、リポソーム、アルブミンおよび／または他のキャリアとともに処方されてもよい。
【０２００】
エアロゾル投与および送達系は、例えば、Ｇｏｎｄａ、Ｉ．「Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ，」Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、６：２７３〜３１３（１９９０）、およびＭｏｒｅｎ、「Ａｅｒｏｓｏｌ  ｄｏｓａｇｅ  ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，」  Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ、Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｍｏｒｅｎら編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５に記載されるように、当業者による特定の治療適用のために選択され得る。
【０２０１】
この化合物は、それを全身に送達することが所望される場合、注射による、例えば、ボーラス注射または連続注入による、非経口投与のために処方され得る。注射用処方物は、単位用量の剤形で、例えば、アンプル中にまたは多用量の容器中に、添加された防腐剤とともに存在してもよい。この組成物は、油状または水性のビヒクル中で、懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよく、そして懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方因子を含んでもよい。
【０２０２】
非経口投与のための薬学的処方物としては、水溶性型での活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油状の注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド、またはリポソームが挙げられる。水性の注射溶液は、懸濁液の粘度を増大する物質、例えば、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、ソルビトールまたはデキストランを含んでもよい。必要に応じて、この懸濁液はまた、適切な安定化剤、または化合物の溶解度を向上して高度に濃縮された溶液の調製を可能にする因子を含んでもよい。
【０２０３】
あるいは、この活性化合物は、適切なビヒクル、例えば、滅菌のパイロジェンフリーの水との、使用前の、構成のために粉末型であってもよい。
【０２０４】
この化合物はまた、例えば、従来の坐剤の基剤、例えば、ココアバターまたは他のグリセリドを含む、坐剤または滞留式浣腸のような、直腸または膣の組成物に処方されてもよい。
【０２０５】
以前に記載された処方物に加えて、この化合物はまた、デポ調製物として処方されてもよい。このような長時間作用性処方物は、適切なポリマー性もしくは疎水性の物質（例えば、受容可能なオイル中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂とともに、または難溶性の誘導体として、例えば、難溶性の塩として処方されてもよい。
【０２０６】
この薬学的組成物はまた、適切な固相またはゲル相のキャリアまたは賦形剤を含んでもよい。このようなキャリアまたは賦形剤の例としては、限定はしないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリマー、例えばポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２０７】
適切な液体または固体の薬学的調製物の形態は、例えば、吸入のための水性もしくは生理食塩水の溶液であるか、マイクロカプセル化されるか、エンコヒレート（ｅｎｃｏｃｈｌｅａｔｅ）化されるか、顕微鏡的に金粒子上にコーティングされるか、リポソームに含まれるか、噴霧されるか、エアロゾルであるか、皮膚への移植のためのペレットであるか、または皮膚にスクラッチされる先鋭な物体上に乾燥される。薬学的組成物としてはまた、顆粒、粉末、錠剤、コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、エマルジョン、懸濁液、クリーム、ドロップまたは活性化合物の持続的な放出を伴う調製物であって、その調製物の賦形剤および添加物および／または補助剤、例えば、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤、香味料、甘味料または可溶化剤が上記のように習慣的に用いられる調製物が挙げられる。薬学的組成物は、種々の薬物送達系における使用のために適切である。薬物送達のための方法の簡潔な概説については、参照によって本明細書に援用される、Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜３３を参照のこと。
【０２０８】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび必要に応じて他の治療剤および／または抗原は、それ自体で（そのままで）、または薬学的に受容可能な塩の形態で投与されてもよい。医薬中で用いられる場合、塩は、薬学的に受容可能でなければならないが、薬学的に受容可能でない塩が、その薬学的に受容可能な塩を調製するために都合よく用いられ得る。このような塩としては、限定はしないが、以下の酸から調製される塩が挙げられる：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。また、このような塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えば、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製され得る。
【０２０９】
適切な緩衝剤としては：酢酸および塩（１〜２％ｗ／ｖ）；クエン酸および塩（１〜３％ｗ／ｖ）；ホウ酸および塩（０．５〜２．５％ｗ／ｖ）；ならびにリン酸および塩（０．８〜２％ｗ／ｖ）が挙げられる。適切な防腐剤（保存剤）としては、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ｗ／ｖ）；クロロブタノール（０．３〜０．９％ｗ／ｖ）；パラベン（０．０１〜０．２５％ｗ／ｖ）およびチメロサール（０．００４〜０．０２％ｗ／ｖ）が挙げられる。
【０２１０】
本発明の薬学的組成物は、有効量の免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよび必要に応じて抗原および／または必要に応じて薬学的に受容可能なキャリアに含まれる他の治療剤を含む。薬学的に受容可能なキャリアという用語は、ヒトまたは他の脊椎動物に対する投与に適切である１つ以上の適合性の固体または液体の充填剤、希釈剤またはカプセル化物質を意味する。キャリアという用語は、適用を容易にするための活性成分が組み合わされる、天然または合成の、有機または無機の成分をいう。薬学的組成物の成分はまた、本発明の化合物と、そしてお互いに、所望の薬学的な有効性を実質的に障害する相互作用のない様式で混ぜ合わされてもよい。
【０２１１】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、これはさらなる限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２１２】
（実施例１）
（ＴＬＲシグナル伝達を検出するためのインビトロの方法）
ヒトＴＬＲおよびＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーター構築物（ｈＴＬＲ３−ＮＦκＢ−２９３）で安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞上でＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ読み取りによって免疫刺激に関する分析を行った。要するに、細胞を免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたは他の試験因子またはコントロールの因子と、所定の期間、代表的には１６時間、接触させ、次いで、照度計で分析した。放射光は、ＮＦ−κＢ活性化に直接比例して変化した。
【０２１３】
免疫刺激のための分析も、ヒト末梢血単球性細胞（ＰＢＭＣ）アッセイで、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、およびＩＬ−１２  ｐ４０サイトカイン産生について行った。要するに、健常なヒトドナーから得たＰＢＭＣを、免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたは他の試験因子またはコントロールの因子と所定の期間、代表的には１６時間、接触させ、次いで、細胞上清を、適切なサイトカイン特異的な酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いてサイトカインについて分析した。
【０２１４】
免疫刺激性オリゴヌクレオチドの効果は、所定の実験でオリゴヌクレオチド濃度の量または濃度を滴定することによって評価した。免疫刺激性オリゴヌクレオチド濃度の効果は、ＥＣ５０（免疫刺激性オリゴヌクレオチドが最大効果に比較して５０％有効である濃度）として表した。所定の免疫刺激性オリゴヌクレオチドの力価を、最大刺激指数（ＳＩマックス；最大倍数は未処理のコントロールのものを超えるシグナルで増大する）または最大活性として表した。
【０２１５】
（実施例２）
（オルトミクソウイルス科）
以下は、オルトミクソウイルス科のファミリーに属する以下のウイルスの３’末端（左から右に読んで、５’から３’を示す、末端の２６マー）を列挙する。ダッシュ（−）は、示した位置での、インフルエンザＡ  ＰＲ／８／３４（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）Ｈ１Ｎ１  ＰＢ２との配列同一性を示す。
【０２１６】
【数２１】
2007526253.tif 000023
【０２１７】
【数２２】
2007526253.tif 000024
（実施例３）
（パラミクソウイルス科）
以下は、パラミクソウイルス科のファミリーに属する以下のウイルスの３’末端（左から右に読んで、５’から３’を示す、末端の２０マー）を列挙する。ダッシュ（−）は、示した位置での、センダイ（Ｓｅｎｄａｉ）ウイルスとの配列同一性を示す。
【０２１８】
【数２３】
2007526253.tif 000025
（実施例４）
（フラビウイルス科）
以下は、フラビウイルス科のファミリーに属する以下のウイルスの３’末端（左から右に読んで、５’から３’を示す、末端の２４マー）を列挙する。ダッシュ（−）は、示した位置での、マーブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）ウイルスとの配列同一性を示す。
【０２１９】
【数２４】
2007526253.tif 000026
（実施例５）
（ヒトＰＢＭＣは、一本鎖マイナス−センスＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡの３’末端の代表的な安定化されたＯＲＮに応答してサイトカインを分泌する）
一本鎖のネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの３’ゲノムのＲＮＡが免疫刺激性であるか否かに関する仮説を試験した。５つの実験ウイルスから２０マーのオリゴヌクレオチド（ＯＲＮ）を選択して、ホスホロチオエート骨格と化学的に合成した。コントロール配列として、配列特異性を実証するために、インフルエンザＡ配列の相補的な鎖を用いた（ＯＲＮ５）。この試験配列を、インビトロ培養物中でヒトＰＢＭＣに用量滴定して、サイトカインの放出パターンをモニターした。用量滴定の結果を分析して、ＥＣ５０および最大のサイトカイン放出値を得た。全ての試験配列は免疫刺激的であったが、コントロール配列はそうではなかった。このデータによって、一本鎖のネガティブ鎖ＲＮＡウイルスの３’のゲノムＲＮＡが、配列依存性の様式で免疫刺激性であることが実証される。
【０２２０】
健常な男性または女性のヒトのドナー由来の末梢血バフィーコート調製物は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ（Ｇｅｒｍａｎｙ）のＢｌｏｏｄ  Ｂａｎｋから入手して、これから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ）での遠心分離によってＰＢＭＣを精製した。精製されたＰＢＭＣは、あらゆるアッセイ中で新鮮に用い、従って、５％（ｖ／ｖ）熱不活性化ヒトＡＢ血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）または１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（全てＳｉｇｍａ由来）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培養培地中に再懸濁した。
【０２２１】
新鮮なＰＢＭＣは、３×１０６／ｍｌ〜５×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁して、９６−ウェルの丸底プレート（１５０μｌ／ウェル）に添加した。細胞をプレートした後、オリゴリボヌクレオチド（ＯＲＮ）に加えてＤＯＴＡＰを、３倍階段希釈を用いて、種々の時点で添加した。ＤＯＴＡＰの出発濃度は、５０μｇ／ｍｌで、ＯＲＮについては５μＭであった。湿式インキュベーター中で３７℃で細胞を培養した。培養上清を１６時間後に収集して、直ちに用いない場合は、必要になるまで−２０℃で凍結させた。
【０２２２】
上清中のサイトカインの定量的分析は、市販の抗体（それぞれ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ／ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＰＢＬ；ＧｅｒｍａｎｙまたはＵＳＡより）を用いて発色させた、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（ＩＦＮ−γまたはＴＮＦ−α；Ｄｉａｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ、ＩＬ−１２  ｐ４０；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）または独自仕様のＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ−α）を用いて評価した。代表的な結果を表２〜４に示す。
【０２２３】
【数２５】
2007526253.tif 000027
【０２２４】
【数２６】
2007526253.tif 000028
（実施例６）
（４マーのモチーフについての原理の証明）
本実施例は、提唱された４マーのモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’の免疫刺激能を実証する。原理の証明のためには、ＵＵＧＵまたはＵＵＵＵから選択された４マーのＲＮＡモチーフを、各々のＮが独立して任意の塩基Ａ、Ｇ、Ｕ、またはＣであるホスホロチオエートポリＮ組成物内でネスト化した。この骨格は、ＲＮＡ骨格またはキメラＲＮＡ：ＤＮＡ骨格のいずれかから構成され、このＮはＲＮＡを示し、ｄＮはＤＮＡを示す。オリゴヌクレオチドは、以下を含んだ：
【０２２５】
【数２７】
2007526253.tif 000029
ヒトＰＢＭＣを、実施例５に記載されたのと同様に刺激して、サイトカイン産生についてアッセイした。代表的な結果を表５〜７に示す。
【０２２６】
【数２８】
2007526253.tif 000030
【０２２７】
【数２９】
2007526253.tif 000031
（実施例７）
（キメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるサイトカイン誘導）
本実施例は、本発明の特定のキメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドがヒトＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を刺激する能力を記載する。サイトカインの誘導および検出は、オリゴヌクレオチドとして以下のキメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、実施例５に記載されるように行ったが、ここでｄＴ、ｄＣ、ｄＧ、およびｄＡはデオキシリボヌクレオチドを示しＧおよびＵは、リボヌクレオチドを示す。
【０２２８】
【数３０】
2007526253.tif 000032
ＯＲＮ１２およびＯＲＮ１３は両方とも、ホスホロチオエート骨格を有する。さらに、ＯＲＮ１２は排他的に３’−５’ヌクレオチド間結合を有するが、ＯＲＮ１３は、ＧＵＵＧＵＧＵｄＡを相互接続する２’−５’ヌクレオチド間結合を有する。代表的な結果を表８〜１０に示す。
【０２２９】
【数３１】
2007526253.tif 000033
【０２３０】
【数３２】
2007526253.tif 000034
（実施例８）
（キメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドによるＴＬＲ刺激）
本実施例は、キメラＲＮＡ：ＤＮＡ結合体オリゴヌクレオチドによるＴＬＲ８およびＴＬＲ９と、排他的に３’−５’ヌクレオチド間結合を有するホスホロチオエート骨格との組み合わせた刺激を実証する。ヒトＴＬＲ８またはヒトＴＬＲ９およびＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーター構築物のいずれかで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞において、シグナル形質導入の刺激および測定を、実施例１に本質的に記載されるとおり行った。キメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチドは実施例７に示したとおりであった。結果を表１１に示す。結果は、ＥＣ５０（μＭ）として表し、刺激指数（ＳＩ）＝リガンド−パルスした細胞におけるＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性の誘導倍数。
【０２３１】
【数３３】
2007526253.tif 000035
キメラＲＮＡ：ＤＮＡオリゴヌクレオチド  ＯＲＮ１２は、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９を通じて効果的に作用した。しかし、ＯＲＮにおける内部リボヌクレオチド結合が、２’−５’（ＯＲＮ  １３）に変化された場合、ＴＬＲ８活性は失われたが、ＴＬＲ９活性は維持された。この結果によって、ＴＬＲについて１つおよびＴＬＲ９について１つという、２つのＴＬＲモチーフを有するおかげでこのキメラは、それぞれのレセプターを特異的に刺激することができるということが実証される。
【０２３２】
（実施例９）
（新規な免疫刺激性プロフィールを有するＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドへのＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドの変換）
本実施例によって、ＴＬＲ９を刺激する能力を反映する免疫刺激性プロフィールを有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドが、特定のリボヌクレオチドによる特定のデオキシヌクレオチドの置換によって、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８を刺激する能力の反映であると考えられる新規でかつさらなる免疫刺激性特性を有するように改変され得るということが実証される。また、この実施例で示されるとおり、極めてよく特徴付けられたＣｐＧオリゴヌクレオチドでさえ、この方式で改変され得る。
【０２３３】
ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２００６（５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’、配列番号２８５）、ＯＤＮ  １０１０１（５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｇｃｃｇｃｃｇ−３’、配列番号２８８）、およびＯＤＮ  ８９５４（５’−ｇｇｇｇａｔｇａｔｇｔｔｇｔｇｇｇｇｇｇｇ−３’、配列番号＿）の配列を、出発位置としてとった。これらのＣｐＧ  ＯＤＮは、ＴをＵで、ＣをＵで、またはＴおよびＣの両方をＵで置換することによってＯＲＮとして再製した。ＯＤＮ  ２００６、１０１０１、および８９５４に相当する、得られたＯＲＮは、ＯＲＮ  １４〜１６、ＯＲＮ  １７〜１８、そしてＯＲＮ  １９〜２０であった。
【０２３４】
【数３４】
2007526253.tif 000036
ヒトＰＢＭＣを刺激して、実施例５に記載されるのと同様にサイトカイン産生についてアッセイした。代表的な結果を表１２および１３に示す。
【０２３５】
【数３５】
2007526253.tif 000037
【０２３６】
【数３６】
2007526253.tif 000038
（実施例１０）
（４マーモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’の原理のさらなる証明）
本実施例は、ＵＵＧＵおよびＵＵＵＵから選択された４マーのＲＮＡモチーフを用いて、非免疫刺激性ＯＲＮを免疫刺激性ＯＲＮになるように変換させることができることを示すことによって、実施例６における観察を拡大する。免疫刺激性活性を示さないＯＲＮ２１を出発位置としてとった。次いで、ＵＵＧＵ（ＯＲＮ  ２２）またはＵＵＵＵ（ＯＲＮ  ２３）を保有する関連のＯＲＮを合成して、アッセイで用いて、それらの免疫刺激性活性を評価した。
【０２３７】
【数３７】
2007526253.tif 000039
ヒトＰＢＭＣを、実施例５に記載されるのと同様に刺激して、サイトカイン産生についてアッセイした。代表的な結果を表１４および１５に示す。
【０２３８】
【数３８】
2007526253.tif 000040
【０２３９】
【数３９】
2007526253.tif 000041
（実施例１１）
（４マーモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’の原理のさらなる証明）
本実施例はさらに、４マーのＲＮＡモチーフの３マーへの減少が免疫刺激性活性の劇的な消失を生じることを示すことによって、実施例６および１１における観察を拡大する。ランダム配列デオキシヌクレオチドの状況に組み込まれるＲＮＡ配列ＧＵＵＧＵＧＵで開始して、リボヌクレオシドは、ｄＮデオキシヌクレオシドに首尾よく変化された。以下のデータからわかるとおり、４マーのモチーフＵＵＧＵはこの実験では活性であったが、３マーのＵＵＧおよび２マーのＵＧは活性ではなかった。
【０２４０】
【数４０】
2007526253.tif 000042
ヒトＰＢＭＣを、実施例５に記載されるのと同様に刺激して、サイトカイン産生についてアッセイした。代表的な結果を表１６および１７に示す。
【０２４１】
【数４１】
2007526253.tif 000043
【０２４２】
【数４２】
2007526253.tif 000044
（実施例１２）
（ウイルス由来のＯＲＮは、ヒトＰＢＭＣ由来のサイトカインの広範なパターンを刺激する）
ヒトＰＢＭＣを、２．５μＭのＯＲＮに加えてＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ単独、２．５μＭのＲ−８４８、２５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ、または０．５μＭのＣｐＧ  ＯＤＮ  ２３９５（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’、配列番号３４３）で刺激した。この実験で用いたＯＲＮは、ＯＲＮ  ４およびＯＲＮ  ５（実施例５、上記）を含んだ。上清を刺激の１６時間後に回収して、種々のＥＬＩＳＡに用いた。結果を図１に示す。この図で示されるように、インフルエンザウイルスに由来するＯＲＮ４による免疫刺激のプロフィールは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γの誘導を含んで、極めて広範であり、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２３９５の特徴的なプロフィールとは別個であった。
【０２４３】
（実施例１３）
（ウイルス由来のＯＲＮは、インビボでサイトカイン産生を刺激する）
マウスに５０μｇのＯＲＮ２１（実施例１０を参照のこと）、ＯＲＮ  ３（実施例５を参照のこと）、またはＯＲＮ  ３５（５’−ＣＣＧＵＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡＣＵＣ−３’、配列番号３４４）を、各々のＯＲＮを１００μｇのＤＯＴＡＰ、またはＤＯＴＡＰ単独と組み合わせて、注射した。マウスを、注射後１時間または３時間で採血して、ＩＬ−１２およびＩＰ−１０に特異的な別々のＥＬＩＳＡを行った。結果を図２（ＩＬ−１２）および図３（ＩＰ−１０）に示す。サイトカイン誘導の存在によって、ＯＲＮによる配列依存性の様式での免疫刺激が実証された。さらに、ＯＲＮは、疾患に対する免疫調節性の処方物において有用であり得ることが実証された。ＩＬ−１２の応答は、Ｔｈ１誘導の能力と相関している。ＩＰ−１０の応答は、Ｔｈ１誘導の能力と相関する、１型ＩＦＮの代用のマーカーである。
【０２４４】
（実施例１４）
（ヒトＣＤ１４＋細胞は、ウイルス由来ＯＲＮでの刺激の際にＣＤ８０を上方制御する）
本実施例は、ウイルス由来のＯＲＮでの刺激の際に同時刺激性の分子ＣＤ８０をヒトＣＤ１４＋細胞（単球、骨髄球系統の細胞）が上方制御するということを実証する。ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ、またはＲ−８４８、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２３９５、ＤＯＴＡＰ単独、または培地単独と混合した、１ｎＭ〜１０μＭにおよぶ種々の濃度のＯＲＮ（ＯＲＮ３、ＯＲＮ４、またはＯＲＮ５；実施例５を参照のこと）を用いて刺激した。１６時間後、細胞をＣＤ１９、ＣＤ１４、およびＣＤ８０について染色し、次いでＦＡＣＳ分析した。細胞をＣＤ１４＋染色について分類して、ＣＤ８０表面染色のレベルを図４に示す。この図によって、ＯＲＮ３およびＯＲＮ４、ならびにＲ−８４８が、ＣＤ１４＋細胞の表面上で同時刺激分子ＣＤ８０を、配列依存性の様式で誘導するということが実証される。
【０２４５】
（実施例１５）
（ヒトＣＤ１９＋細胞は、ウイルス由来ＯＲＮでの刺激の際に、ＣＤ８０を上方制御する）
本実施例によって、ヒトＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）が、ウイルス由来のＯＲＮでの刺激の際に同時刺激分子ＣＤ８０を上方制御することが実証される。ヒトＰＢＭＣを、ＤＯＴＡＰ、またはＲ−８４８、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２３９５、ＤＯＴＡＰ単独、または培地単独と混合した、１ｎＭ〜１０μＭにおよぶ種々の濃度のＯＲＮ（ＯＲＮ３、ＯＲＮ４、またはＯＲＮ５；実施例５を参照のこと）を用いて刺激した。１６時間後、細胞をＣＤ１９、ＣＤ１４、およびＣＤ８０について染色し、次いでＦＡＣＳ分析した。細胞をＣＤ１４＋染色について分類して、ＣＤ８０表面染色のレベルを図５に示す。この図によって、ＯＲＮ３およびＯＲＮ４、ならびにＣｐＧ  ＯＤＮ２３９５およびＲ−８４８が、ＣＤ１４＋細胞の表面上で同時刺激分子ＣＤ８０を、配列依存性の様式で誘導するということが実証される。
【０２４６】
（等価物）
前述で記載した明細書は、当業者が本発明を行うことを可能にするのに十分であるとみなされる。本発明は、示された実施例による範囲に限定されるとは解釈されるべきではない。なぜなら、本実施例は、本発明の１局面の単一の例示であって、他の機能的に等価な実施形態が本発明の範囲内であるからである。本明細書に示され、かつ記載されるものに加えて、本発明の種々の改変が、前述の詳細な説明から当業者に明らかとなり、そして添付の特許請求の範囲内におさまる。本発明の利点は、本発明の各々の実施形態によって包含される必要はない。
【０２４７】
本出願に引用される全ての引用文献、特許および特許刊行物は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２４８】
【図１】図１は、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２３９５（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’、配列番号３４３）、リポポリサッカリド（ＬＰＳ）、レシキモド（ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（Ｒ−８４８）、培地単独、カチオン性脂質単独（ＤＯＴＡＰ）、ネガティブコントロールのオリゴリボヌクレオチドＯＲＮ  ５（５’−ＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧＵＣＡＡＵＵＡＵ−３’、配列番号３２７）、およびウイルス由来ＲＮＡオリゴヌクレオチド  ＯＲＮ  ４（５’−ＡＵＡＡＵＵＧＡＣＣＵＧＣＵＵＵＣＧＣＵ−３’、配列番号５）を用いた一晩の刺激後にヒトＰＢＭＣにおける種々のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２  ｐ４０、ＩＦＮ−α、およびＩＦＮ−γ）の誘導を示す棒グラフである。
【図２】図２は、ネガティブコントロール  ＯＲＮ  ２１（５’−ＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣ−３’、配列番号３３７）、ウイルス由来のＯＲＮ  ３（５’−ＵＧＵＵＵＵＵＵＣＵＣＵＵＧＵＵＵＧＧＵ−３’、配列番号４）、ＯＲＮ  ３５（５’−ＣＣＧＵＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡＣＵＣ−３’、配列番号３４４）、またはカチオン性脂質単独（ＤＯＴＡＰ）を用いた注射後のマウスにおけるＩＬ−１２の誘導を示す棒グラフである。結果は、注射の１時間後および３時間後に得たサンプルについて示す。
【図３】図３は、ネガティブコントロールＯＲＮ  ２１（５’−ＧＣＣＡＣＣＧＡＧＣＣＧＡＡＧＧＣＡＣＣ−３’、配列番号３３７）、ウイルス由来のＯＲＮ  ３（５’−ＵＧＵＵＵＵＵＵＣＵＣＵＵＧＵＵＵＧＧＵ−３’、配列番号４）、ＯＲＮ  ３５（５’−ＣＣＧＵＣＵＧＵＵＧＵＧＵＧＡＣＵＣ−３’、配列番号３４４）、またはカチオン性脂質単独（ＤＯＴＡＰ）を用いた注射後のマウスにおけるＩＰ−１０の誘導を示す棒グラフである。注射の１時間後および３時間後に得られたサンプルについて結果を示す。
【図４】図４は、示した濃度のウイルス由来のＯＲＮ  ３（５’−ＵＧＵＵＵＵＵＵＣＵＣＵＵＧＵＵＵＧＧＵ−３’、配列番号４）、ウイルス由来のＯＲＮ  ４（５’−ＡＵＡＡＵＵＧＡＣＣＵＧＣＵＵＵＣＧＣＵ−３’、配列番号５）、ネガティブコントロールのオリゴリボヌクレオチドＯＲＮ  ５（５’−ＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧＵＣＡＡＵＵＡＵ−３’、配列番号３２７）、ＤＯＴＡＰ単独、培地単独、Ｒ−８４８、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２３９５（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’、配列番号３４３）、または培地単独との一晩のインキュベーション後のヒトＣＤ１４＋細胞におけるＣＤ８０の発現を示すグラフである。
【図５】図５は、示した濃度のウイルス由来のＯＲＮ  ３（５’−ＵＧＵＵＵＵＵＵＣＵＣＵＵＧＵＵＵＧＧＵ−３’、配列番号４）、ウイルス由来のＯＲＮ  ４（５’−ＡＵＡＡＵＵＧＡＣＣＵＧＣＵＵＵＣＧＣＵ−３’、配列番号５）、ネガティブコントロールのオリゴリボヌクレオチドＯＲＮ  ５（５’−ＡＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧＵＣＡＡＵＵＡＵ−３’、配列番号３２７）、ＤＯＴＡＰ単独、培地単独、Ｒ−８４８、ＣｐＧ  ＯＤＮ  ２３９５（５’−ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＣＧＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧ−３’、配列番号３４３）、または培地単独との一晩のインキュベーション後のヒトＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）でのＣＤ８０の発現を示すグラフである。
【図１】
2007526253.tif 000045
【図２】
2007526253.tif 000046
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2007526253000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月25日(2006.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、単離された１０〜３０ヌクレオチド長の核酸分子を含み、該核酸分子は、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端配列によって与えられた配列を含み、安定化された骨格を有する、免疫刺激性組成物。
【請求項２】
前記核酸分子が１０〜２０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３】
前記核酸分子が１０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４】
一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端によって与えられた前記配列が、配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含み、Ｕがウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕがシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、かつＧ／Ｕがグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５】
前記配列モチーフが５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項６】
前記配列モチーフが５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項７】
前記配列モチーフが５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項８】
前記配列モチーフが５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項４に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項９】
前記安定化された骨格が、少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１０】
前記安定化された骨格がホスホロチオエート骨格である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１１】
前記安定化された骨格が、少なくとも１つのピロリン酸ヌクレオシド間結合を含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１２】
前記安定化された骨格がピロリン酸骨格である、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１３】
前記核酸分子が、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１４】
前記核酸分子がＲＮＡである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１５】
前記核酸分子がトール様レセプター（ＴＬＲ）アゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１６】
前記核酸分子がＴＬＲ８のアゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１７】
前記核酸分子がＴＬＲ７のアゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１８】
前記核酸分子がＴＬＲ３のアゴニストである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項１９】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがオルトミクソウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２０】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがパラミクソウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２１】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがラブドウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２２】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがフィロウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２３】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡがボルナウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２４】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがインフルエンザＡウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２５】
前記一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスがインフルエンザＢウイルスである、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２６】
前記核酸分子がカチオン性脂質と会合される、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２７】
さらに抗原を含む、請求項１に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項２８】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、４〜３０ヌクレオチド長の単離された核酸分子であって、一本鎖のマイナス−センスＲＮＡウイルスゲノムの３’末端配列によって与えられた配列を含み、安定化された骨格を有する核酸分子と、抗原とを含む、免疫刺激性組成物。
【請求項２９】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、
５’−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−３’
を含む、７〜４０ヌクレオチド長の単離されたオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｎ１およびＮ２は独立して、０〜１０ヌクレオチド長のＲＮＡ配列であり、かつ該オリゴリボヌクレオチドは安定化された骨格を有する、免疫刺激性組成物。
【請求項３０】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３１】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３２】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３３】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３４】
５’−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−３’がＲＮＡ配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を含まない、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３５】
前記オリゴリボヌクレオチドがカチオン性脂質に会合される、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３６】
さらに抗原を含む、請求項２９に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項３７】
免疫刺激性組成物であって、該組成物は、
５’−ｄＸ１−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−ｄＸ２−３’
を含む、７〜４０ヌクレオチド長のキメラＤＮＡ：ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、
ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、ｄＸ１およびｄＸ２は独立して、０〜６ヌクレオチド長のＤＮＡ配列であり、ｄＸ１およびｄＸ２の少なくとも１つは少なくとも１ヌクレオチド長であり、かつＮ１およびＮ２は独立して、０〜１０ヌクレオチド長のＲＮＡ配列である、免疫刺激性組成物。
【請求項３８】
Ｎ１およびＮ２が両方とも０ヌクレオチド長である、請求項３７に記載のキメラオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
ｄＸ１が０ヌクレオチド長である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４０】
ｄＸ２が０ヌクレオチド長である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４１】
ｄＸ１、ｄＸ２またはｄＸ１およびｄＸ２の両方がＣｐＧモチーフを含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４２】
少なくとも１つの安定化されたヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４３】
少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４４】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４５】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４６】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４７】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４８】
５’−ｄＸ１−Ｎ１−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−Ｎ２−ｄＸ２−３’がＲＮＡ配列５’−ＧＵＵＧＵ−３’を含まない、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項４９】
前記キメラＤＮＡ：ＲＮＡオリゴリボヌクレオチドがカチオン性脂質に会合される、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５０】
さらに抗原を含む、請求項３７に記載の免疫刺激性組成物。
【請求項５１】
参照の免疫刺激性プロフィールを有する参照オリゴヌクレオチドの免疫刺激性プロフィールを変更させるための方法であって、該方法は、
ＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含むように３〜４０ヌクレオチド長の参照オリゴヌクレオチドを変更させる工程を包含し、ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、該参照オリゴヌクレオチドは、免疫刺激性ＲＮＡモチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含まず、該変更の結果として、該参照免疫刺激性プロフィールとは別個の変更された免疫刺激性プロフィールを有する変更されたオリゴヌクレオチドが生じる、方法。
【請求項５２】
前記参照オリゴヌクレオチドがオリゴリボヌクレオチドである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記参照オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記参照オリゴヌクレオチドがＣｐＧ  ＯＤＮである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＧＵ−３’である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＧＵ−３’である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＣＵＵＵ−３’である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−３’が５’−ＵＵＵＵ−３’である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記参照オリゴヌクレオチドが安定化された骨格を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記参照の免疫刺激性プロフィールが非免疫刺激性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
参照の免疫刺激性プロフィールを有するＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）の免疫刺激性プロフィールを変更するための方法であって、該方法は、
該ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＣ、該ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＴ、または該ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＣ、および該ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＴをＵで置換する工程を包含し、Ｕはウラシルオキシリボヌクレオシドであり、該置換の結果として、該参照免疫刺激性プロフィールとは別個の変更された免疫刺激性プロフィールを有する変更されたオリゴヌクレオチドが生じる、方法。
【請求項６２】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣがＵによって置換される請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣおよびあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＧをＧによって、該ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＡをＡによって、または該ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＧをＧによって、そして該ＣｐＧ  ＯＤＮの少なくとも１つのｄＡをＡによって置換する工程をさらに包含し、ここで、Ｇはグアニンオキシリボヌクレオシドであり、Ａはアデニンオキシリボヌクレオシドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＧがＧによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＡがＡによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣおよびあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＧがＧによって置換され、かつ該ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＡがＡによって置換される請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＣｐＧ  ＯＤＮのあらゆるｄＣおよびあらゆるｄＴがＵによって置換される請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記変更されたオリゴヌクレオチドが、配列モチーフ５’−Ｃ／Ｕ−Ｕ−Ｇ／Ｕ−Ｕ−３’を含み、ここで、Ｕはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｃ／Ｕはシトシン（Ｃ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドであり、Ｇ／Ｕはグアニン（Ｇ）オキシリボヌクレオシドまたはウラシル（Ｕ）オキシリボヌクレオシドである、請求項６１に記載の方法。
【請求項７２】
前記変更されたオリゴヌクレオチドが、安定化された骨格を有する、請求項６１に記載の方法。
【請求項７３】
５’−ＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵＵＵＧＵＵＧＵＵ−３’（配列番号２８６）として提供された、単離された免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを含む組成物。
【請求項７４】
５’−ＴＵＧＴＵＧＴＴＴＴＧＴＵＧＴＴＴＴＧＴＵＧＴＴ−３’（配列番号２８７）として提供された、単離された免疫刺激性オリゴリボヌクレオチドを含む組成物。
【請求項７５】
免疫応答を刺激するためのインビトロ方法であって、
免疫系の細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、免疫応答を刺激するのに有効な量とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７６】
Ｔｈ１様免疫応答を刺激するためのインビトロ方法であって、
免疫系の細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、Ｔｈ１様免疫応答を刺激するのに有効な量とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項７７】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、１型インターフェロンの発現を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）の発現を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
ＴＬＲシグナル伝達を刺激するためのインビトロ方法であって、
ＴＬＲを発現する細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、ＴＬＲによるシグナル伝達を刺激するのに有効な量とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項８０】
前記ＴＬＲがＴＬＲ９である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＴＬＲがＴＬＲ８である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＴＬＲがＴＬＲ７である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＴＬＲがＴＬＲ３である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
被験体における免疫応答を刺激するための組成物であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、該被験体における免疫応答を刺激するのに有効な量を含む、組成物。
【請求項８５】
被験体におけるＴｈ１様免疫応答を刺激するための組成物であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、該被験体におけるＴｈ１様免疫応答を刺激するのに有効な量を含む、組成物。
【請求項８６】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、前記被験体における１型インターフェロンの発現を含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記Ｔｈ１様免疫応答が、前記被験体におけるＩＬ−１２の発現を含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８８】
被験体における抗原特異的免疫応答を刺激するための組成物であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物および抗原の、該被験体における抗原特異的免疫応答を刺激するのに有効な量を含む、組成物。
【請求項８９】
前記抗原がアレルゲンを含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記抗原がウイルス抗原を含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９１】
前記抗原が細菌抗原を含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９２】
前記抗原が癌抗原を含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９３】
アレルギー性状態を有するかまたは発症するリスクにある被験体を処置するための組成物であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、該アレルギー性の状態を処置するのに有効な量を含む、組成物。
【請求項９４】
喘息を有するかまたは発症するリスクにある被験体を処置するための組成物であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、該喘息を処置するのに有効な量を含む、組成物。
【請求項９５】
感染を有するかまたは発症するリスクにある被験体を処置するための組成物であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、該感染を処置するのに有効な量を含む、組成物。
【請求項９６】
前記感染がウイルス感染を含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９７】
前記感染が細菌感染を含む、請求項９５に記載の組成物。
【請求項９８】
癌を有するかまたは発症するリスクにある被験体を処置するための組成物であって、
請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の、該癌を処置するのに有効な量を含む、組成物。
【請求項９９】
ＴＬＲのアンタゴニストについてスクリーニングするための方法であって、
ＴＬＲを発現する参照細胞と、請求項１〜２９および３７のいずれか１項に記載の組成物の有効量とを、該ＴＬＲの候補アンタゴニストの非存在下で接触させて、該ＴＬＲによるシグナル伝達の参照量を測定する工程；
該ＴＬＲを発現する試験細胞と、該組成物の有効量とを、該ＴＬＲの候補アンタゴニストの存在下で接触させて、該ＴＬＲによるシグナル伝達の試験量を測定する工程；および
該シグナル伝達の参照量が該シグナル伝達の試験量を超える場合に、該ＴＬＲの該候補アンタゴニストが該ＴＬＲのアンタゴニストであることを決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項１００】
前記ＴＬＲがＴＬＲ９である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ＴＬＲがＴＬＲ８である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ＴＬＲがＴＬＲ７である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ＴＬＲがＴＬＲ３である、請求項９９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007526253000001.app
【国際調査報告】
2007526253.tif 000124
2007526253.tif 000125
2007526253.tif 000126
2007526253.tif 000127
2007526253.tif 000128
2007526253.tif 000129