(57)【要約】本発明は、癌疾患のようなサイトカインに関係した疾患を治療するためであり、特定目標に対し効果的に用いることが出来、そして腫瘍に特定の免疫反応を引き起こすことの出来る製剤組成物としてのワクチンを提供することにある。さらに、ワクチンを生成する方法も含む。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍疾患の患者の治療のためのワクチンであって、遺伝学的に同種であるが同一人でない（異なる）ドナーの（同種異系の、allogenic）腫瘍細胞を含むものであり,
前記腫瘍細胞は、あらかじめエクソビボ（ex-vivo）でインターロイキン−７（interleukin-7;IL-7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子(granulocyte macrophage-colony-stimulating factor、GM-CSF), CD40L/CD154 及び B7.1/CD80をコードする核酸分子を移入された
前記ワクチン
【請求項２】
腫瘍疾患の患者の治療のためのワクチンであって、遺伝学的に同種であるが同一人でない（異なる）ドナーの（同種異系の、allogeneic）腫瘍細胞を含むものであり,
前記腫瘍細胞は、あらかじめエクソビボ（ex-vivo）でインターロイキン-７（interleukin-7;IL-7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子(granulocyte macrophage-colony-stimulating factor、GM-CSF), 及びCD40L/CD154をコードする核酸分子を移入された
前記ワクチン
【請求項３】
コードする前記核酸構築体 (nucleic acid construct) が一または二以上の発現構築体 (expression construct) に存在する請求項1又は2に記載のワクチン
【請求項４】
前記発現構築体が
1．   プラスミドであり、又は
2．   直線状二重鎖の共有結合した発現カセットであり、CMVプロモータ、イントロン、コードする遺伝子配列及びポリアデニル化配列（polyadenylation sequence）のみからなっており、配列カセットは二重鎖の両端が一本鎖ヌクレオシド残基の短ループにより結合している
請求項3に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ワクチンが、追加的免疫調整オリゴデオキシヌクレオチド（immuno modulating oligodeoxynucleotides）を補助剤として含む請求項1乃至4のいずれか1項に記載のワクチン。
【請求項６】
前記免疫調整オリゴデオキシヌクレオチドが
１．  塩基配列N1N2CGN3N4の配列を含み、ここでN1N2はGT, GG, GA, AT 又は AAを含む群から選択される一要素、N3N4 はCT 又はTTを含む群から選択される一要素、Cはデゾキシシトシン（desoxycytosin）、Gはデゾキシグアノシン（desoxyguanosin）、 Aはデゾキシアデノシン（desoxyadenosine）及びTはデゾキシチミジン（desoxythymidin）であり、及び
２．  部分的に相補的逆並行性塩基配列（complementary antiparallel base sequence）を持ち、亜鈴型をしている環状鎖デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid）を含む
請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
塩基配列N1N2CGN3N4を持つ配列が、オリゴデオキシリボヌクレオチド（oligodeoxyribonucleotide）の一本鎖領域に位置し、40から200のヌクレオチドを含む請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンが、薬剤のキャリアーとして受け入れられるキャリアーを含む請求項１乃至７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項９】
前記同種異系の腫瘍細胞が、結腸直腸癌、小細胞又は非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、及び悪性メラノーマから選択される請求項１又は２に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞が、DSMZ  (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) のアクセス番号DSM ACC 2635により寄託される 腎細胞癌に由来する請求項１乃至９に記載のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
腫瘍疾患の患者の治療のための請求項１乃至１０の何れか1項に記載のワクチンを製造する方法であって、遺伝学的に同種であるが非同一人である（異なる）ドナーの（同種異系の、allogeneic）腫瘍細胞が
１．  インターロイキン−７（IL−7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子（GM-CSF）、CD40L/CD154及びB7.1/CD80、又は
２．  インターロイキン−７（IL−7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子（GM-CSF）、及びCD40L/CD154
をコードする核酸分子をエクスビボで移入され、さらに適用可能な薬剤組成物に移転される、前記ワクチンの製造方法。
【請求項１２】
さらに、免疫調整オリゴデオキシリボヌクレオチド（oligodeoxyribonucleotide）を補助剤として用いる請求項１1に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫調整オリゴデオキシリボヌクレオチドが、部分的に相補的な逆並行性塩基配列を持つ環状鎖デジオキシリボ核酸を含み、亜鈴型をしている請求項1２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫調整オリゴデオキシリボヌクレオチドが、塩基配列N1N2CGN3N4の配列を含み、ここにN1N2はGT, GG, GA, AT 又は AAを含む群から選択される一要素、N3N4 はCT 又はTTを含む群から選択される一要素、Cはデゾキシシトシン（desoxycytosin）、Gはデゾキシグアノシン（desoxyguanosin）、 Aはデゾキシアデノシン（desoxyadenosine）及びTはデゾキシチミジン（desoxythymidin）である、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
塩基配列N1N2CGN3N4を持つ配列が、オリゴデオキシリボヌクレオチド（oligodeoxyribonucleotide）の一本鎖領域に位置し、40から200のヌクレオチドを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸分子が一または幾つかの発現構築体に存在する請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記移入方法が、弾道的転移（ballistic transfer）、ポリケーション移入（polycation transfection）、リン酸カルシウム沈殿（calcium phosphate precipitation）、ミクロインジェクション、プロトプラスト ヒュージョン（protoplast  fusion）、リポソーム フュージョン（liposome fusion）、ウイルス移入システム（viral transfection system）、リポフェクション（lipofection）及び/又は電気せん孔法（electroporation）であることを特徴とする請求項１１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記同種異系の腫瘍細胞が、結腸直腸癌、小細胞又は非小細胞肺癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、及び悪性メラノーマから選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍細胞が同じ症状を示す数人の患者に由来する請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
DSMZ  (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) のアクセス番号DSM ACC 2635により寄託されている前記腎臓癌細胞株の腫瘍細胞が使用される請求項１１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ヒトの腫瘍細胞であって、
１．  インターロイキン‐７（IL‐7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子（GM-CSF）、CD40L/CD154及びB7.1/CD80、又は
２．  インターロイキン‐７（IL−7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子（GM-CSF）、及びCD40L/CD154
をコードし、及び対応する発現構築体を含む核酸分子がエクスビボで移入された、前記腫瘍細胞。
【請求項２２】
前記発現構築体が
１．  プラスミドであり、又は
２．  直線状二重鎖の共有結合した発現カセットであり、CMVプロモータ、イントロン、コードする遺伝子配列及びポリアデニル化配列（polyadenylation sequence）のみからなっており、該配列カセットは二重鎖の両端が一本鎖ヌクレオシド残基の短ループにより結合している
請求項２１に記載のヒトの腫瘍細胞。
【請求項２３】
前記腫瘍細胞が腎細胞癌細胞株の同種異系の腫瘍細胞である請求項２１又は２２に記載のヒトの腫瘍細胞。
【請求項２４】
前記腫瘍細胞が、DSMZのアクセス番号DSM ACC 2635により寄託されている腎臓癌細胞株である請求項２３に記載のヒトの腫瘍細胞。
【請求項２５】
腫瘍疾患の治療のためのワクチンとして用いる請求項２１乃至２４のいずれかに１項に記載のヒトの腫瘍細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍疾患の治療法のための同種異系の腫瘍細胞をベースとしたワクチンの製造方法のみならず、そのワクチンに関する。さらに本発明は感染したヒトの腫瘍細胞をワクチンとして用いることに関する。
【背景技術】
【０００２】
1950年代から進行し拡がった腫瘍疾患を治療する唯一の選択肢としての照射及び化学療法のような従来の癌性疾患の治療法は別として、免疫療法は転移しつつある腫瘍に直面したときの有望なアプローチと思われる。
【０００３】
免疫療法は、遺伝子技術の分野に由来する修飾の手段により、腫瘍疾患に対して自然に備わっている反応を高めることを目的とするものであり、癌細胞に対して免疫システムの「警戒」を強め、そして身体自身が腫瘍と闘う様にその防御反応を向上させる。
【０００４】
進行した腎臓細胞の癌腫の様な悪性の病気は、免疫療法による治療に対して比較的敏感であるが、IL-2 及びIFN-αの様なサイトカインによるシステマチックな治療は時には深刻な副作用を伴う場合がある。そこで、他の免疫療法手順が開発されることとなった。
【０００５】
現在、殆どの臨床研究では腫瘍の切除、続いて治療遺伝子による腫瘍細胞の生体外（ex vivo）移入（transfection）、腫瘍細胞集団に対する照射、及びそれに続く修飾された腫瘍細胞の再移植に依存している。そのような腫瘍に対するワクチン接種により、抗腫瘍反応が増大し、移入された治療遺伝子によってその程度はそれぞれ異なることがありうる。
【０００６】
このアプローチ及び動物実験による研究結果に基づき、フェーズＩ及びＩＩの多くの臨床研究が承認された(Finke et al., 1997 ; Wittig et al., 2001)。
【０００７】
しかし、これらの研究による当初の検討結果では、治療の耐容性が良い点については別として、部分的または完全な沈静効果が見られるケースは殆ど見られなかった。
【０００８】
CD40L/CD154の遺伝子導入では、結腸癌腫のハツカねずみモデルでの腫瘍を根絶し、そして免疫力を引き出すことができた（Sun et al., 2000）。
【０００９】
本発明の出願人及び譲受人は、ヒトのインターロイキン７（interleukin7 (IL7)）の発現プラスミドを腫瘍細胞に移入することにより、特に自己移植（autologous transfer）の場合においては、免疫システムのエフェクター細胞に対する敏感度を増すことができることを示すことができた（Finke et al., 1997, Cancer Gene Ther. 4 : 260-268）。同様に、本発明者は、二つの治療遺伝子 (IL-7, GM-CSF)を自己の腫瘍細胞に移入させた後に、患者の50％に臨床的に重要な反応が観察されたことを示すことができた（WO 02/060476）。
【００１０】
米国特許5,681,562の教示より、ある種の癌を患っている患者にサイトカインをコードするDNA またはRNAが移入された細胞を接種することは知られている。患者の免疫システムは腫瘍抗原の刺激に対し反応するようになっている。発明の開示において、ネズミ化線維芽細胞（fibroblast）にIL-2をコードするレトロウィルスベクターが移入された実験例が示されている。インビボの実験で、ネズミ科結腸癌腫モデルでの治療の効果の実験例が記載されている。移入された線維芽細胞を皮下注射されたハツカネズミは、対照群と比較して腫瘍成長が極めて遅かった。ヒトの線維芽細胞が移入されたインビトロ実験では、IL-2の発現レベルが極めて高くなった。ハツカネズミモデル以外の臨床データがないことは別としても、これらの実験でウィルスベクターが発現ベクターとして用いられたことは、有益なことでないと看做されるべきであろう。弱毒ワクチン株が不安定なことより、毒性の強い株に逆戻りする可能性を除外することはできない。ウィルス成分は自らが免疫原性を持ち得、そのためにその効果は患者の免疫システムにより低下する結果となる。これらの不都合は、ここではウィルスシステムの不利益の一部としてのみ概観するが、遺伝子治療においてこのシステムをベクターとして用いる場合に、重大な不利益をもたらす。
【００１１】
最良の治療結果は、サイトカイン遺伝子を成長因子GM-CSF (Paillard, 1998, Hum. Gene Ther. 9 : 2457-2458 ; Schadendorf et al., 1995, J. Mol. Med. 73 : 473-477)と組み合わせることにより達成されることが刊行物の幾つかに記載されている。腫瘍抗原ワクチン接種でのGM-CSFの重要性はまた、ペプチドワクチン接種に対する臨床的及び免疫対腫瘍の反応の増大により示された。
【００１２】
（Jaeger et al., 1996）。抗原提示樹枝状細胞の活性化及びエフェクター細胞群への刺激はこの文脈では中心的な役割を持っているように思われる。
【００１３】
しかしながら、これまでの処、どのサイトカイン遺伝子が、免疫原性製剤及びGM-CSFと組み合わされて最も効果的な抗腫瘍反応を引き起こすかは明確ではない。
【００１４】
ハツカネズミでの実験では、IL-7をコードする発現構築体を持つワクチン接種は、抗腫瘍効果を生じることが示された(Miller et al., 1993, Blood 18 : 3686-3694 ; Murphy et al., 1993, J. Clin. Invest. 92 : 1918-1924)。また、IL-7又はIL-7を移入された細胞を持つ傷害性リンパ球（CTL）を培養することによりハツカネズミにおける腫瘍の軽減に繋がり (Jicha et al., 1991 ; Hock et al., 1993)、そしてIL-7及びＢ７．１／ＣＤ８０の移入によりCD28+CD25+T細胞の浸透及び免疫に繋がることは知られている(Cayeux et al., 1995)。
【００１５】
これまでのところ、治療での成功例はハツカネズミモデルにおいてさえも見られない。
【００１６】
さらに、プラスミドDNA又はオリゴヌクレオチド配列を持つ遺伝子治療による免疫反応への刺激に関する実験では、CpG（CpG＝非メチル化シトシン−グアノシン  ジヌクレオチドunmethylated cytosine-guanosine-dinucleotide）モチーフを持つある核酸配列は、非常に大きな免疫促進作用を持ち得ることが観測された。（Schmidt-Wolf et al., 1989, J. Immunol. Methods 125 : 185- 189）。免疫促進配列（immune stimulatory sequence; (ISS)）はこの理由により非常に早い時期から、感染性病原体に対するDNAに基づく免疫方法での補助剤として用いられてきた(Sato et al., 1996, Science 273 : 352-354)。ハツカネズミでの実験では、CpGの豊富なDNA配列を注射することによりＢ細胞の活性が強まり、例えば、IL-6及びGM-CSFのようなあるサイトカインの発現を刺激することが示された。また、ハツカネズミモデルにおいて、CpG オリゴオキシリボヌクレオシド（oligodesoxyribonucleoside (ODN)）を融合核酸と共に腫瘍接種の3日前に接種することにより、ハツカネズミの腫瘍の成長を抑えることができた（Lie et al.,1998）。免疫促進性のCpGを含むISSの使用及び合成については、WO 98/18810に詳細に説明されている。
【００１７】
国際出願WO 00/04918 より、例えば、インターフェロンガンマ、及びGＭ-CSFをコードする遺伝子を腫瘍細胞に移入することは知られている。発現ベクターとしてプラスミドが用いれられる。この出願では免疫療法により腫瘍疾患を治療する考えを開示する。請求項に記載されたワクチンの効果を証明する関連インビボ又はインビトロデータ、又は臨床結果は示していない。これらのプラスミドベースのベクターは、その治癒力のある配列は別として、その複製のために必要な遺伝子的機能単位を含むため、ヒトの遺伝子治療において制限なく使用することができるものではないことに触れておく必要がある。これらはまた、その選択に必要な対抗生物質抵抗遺伝子を含むこともある。その結果は治療的に望ましくない哺乳類又はバクテリアタンパク質の連続発現を生み出している。
【００１８】
多年にわたる調査及び有望なアプローチにも拘わらず、腫瘍疾患に対して免疫物質を適用する、免疫機能をベースとする有効な治療を開発することは出来ていない。
【発明の開示】
【００１９】
本発明の目的は、例えば、癌疾患のようなサイトカインに関係した疾患を治療するための、特定目標に対し効果的に用いることが出来、そして腫瘍に特定の免疫反応を引き起こすことの出来る製剤組成物としてのワクチンを提供することにある。さらに、ワクチンを生成する方法も含む。
【００２０】
この目的は特許請求の範囲の各独立項の構成により達成されうる。
【００２１】
本発明での文意においては、各用語は以下の意味で用いられる。
【００２２】
同種異系の(allogeneic)：  同種であるが、遺伝学的に異なる個体に由来することを言い、「自己の」（autologous）(同一体からの細胞)と対比されるものである。
【００２３】
APC            ：  抗原提示細胞（antigen presenting cells）
B7.1/CD80      ：  分化80の群
CD40/CD154     ：  分化40のリガンド群
DC             ：  樹枝状細胞
DSLIM          ：  二重ステムル−プ 免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチド
（double Stem-Loop Immunomodulating Oligodeoxyribonucleotides）
GM-CSF         :   顆粒球  マクロファージ−群−刺激因子（granulocyte makrophage-colony-stimulating factor）
IL-7           :  インターロイキン−７（interleukine-7）
ISS            ：  免疫促進核酸配列
（immune  stimulatory nucleic acid sequence） 
MIDGE          :  最小限免疫学的に定義された遺伝子発現ベクター（Minimalistic Defined Gene Expression Vector）
(MIDGE はMologen AGの登録商標である)
ODN            ：  オリゴデオキシリボヌクレオチド（oligodeoxyribonucleotide）
TAA            :  腫瘍関連抗原
（tumor-associated antigens）
以下において、多くの一般用語は次のように解される：
本発明における意味での「移入された細胞」（transfected cell）は、本発明に従いコードする発現ベクターによりエクソビボ（ex-vivo）で処理されたヒトの同種異系の腫瘍細胞であり、そして、この処理の結果コードされたサイトカイン及び共刺激因子配列を発現させ、そして腫瘍疾患に対し免疫治療法として用いることが出来る。
【００２４】
本発明における文意での「共刺激因子」（co-stimulatory factor）及び/又はサイトカインの用語は、少なくとも野生型共刺激因子及び/又はサイトカインの本質機能の幾つかが維持されている限り、共刺激因子及び/又はサイトカインのすべての修飾形、変異体形及び派生体、逆位、欠失、挿入、付着等のアミノ酸の修飾を含む遺伝子組み換え技術により作られた共刺激因子及び/又はサイトカインと共に、自然に発生する共刺激因子及び/又はサイトカインを表わす。そのような共刺激因子及び/又はサイトカインは、通常でないアミノ酸及び/又は、アルキル化、酸化、チオールによる修飾（thiol modification）、変性（denaturation）、及びオリゴ化（oligomerisation）等のような修飾を含んでいても良い。本発明における意味での共刺激因子及び/又はサイトカインは、他のタンパク質，ペプチド又はその一部と結合して、全体として又は部分的に共刺激因子及び/又はサイトカインを含むタンパク質、ペプチド及び/又は融合ペプチドであることがあり得る。本発明における、他の実施の形態においては、共刺激因子及び/又はサイトカインは自然発生の共刺激因子及び/又はサイトカインの端を切り取った形のものである。
【００２５】
免疫システム反応を調節するのに適した、上で述べたすべての共刺激因子は、本発明の文意において定義したような免疫原性物質である。本発明のワクチンは免疫原性物質の組み合わせを含んでおり、従って免疫原性組成物である。腫瘍細胞は特に細胞表面タンパク質の発現が異なる点で、通常の細胞と異なっている。特に腫瘍に関係する抗原（tumor-associated antigen; TAA）の発現は、理論的には免疫システムによるこれらの細胞の認識及び破壊を許すこととなる。しかし、多くのケースでは患者の免疫システムは非常に強く抑制されるため、これらの変異細胞を認識することはない。
【００２６】
明確な腫瘍疾患を持った患者の治療においては、ワクチンを接種することで問題は解決される。この場合ワクチンは他の患者の腫瘍細胞（同種異系の細胞）を含み、この腫瘍細胞は事前にエクソビボ（ex-vivo）でインターロイキン−７
（Interleukin-7;IL-7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子GM-CSF (granulocyte macrophage-colony-stimulating factor；GM-CSF), 及び共刺激因子CD49L/CD154 及び B7.1/CD80をコードする発現構築体により移入されたものである。本発明の他の実施の形態においては、対応するワクチンが入手され、この場合、腫瘍細胞は事前にインターロイキン−７（Interleukin-7;IL-7）、顆粒球マクロファージ群刺激因子GM-CSF (granulocyte macrophage-  colony-stimulating factor; GM-CSF), 及び共刺激因子CD49L/CD154をコードする発現構築体により移入されたものである。
【００２７】
使用される腫瘍細胞は、治療を受ける患者と同様の臨床像を示す患者に由来するものであるか、治療を受ける患者と異なる臨床像を示す患者に由来するものであっても良い。
【００２８】
ワクチン成分 (免疫原性成分)の組み合わせは、特定の免疫反応の誘発に基本的に必要なシグナルカスケード（signal cascade）の3段階のすべてを発生させることを保証するものでなければならない。その3つの段階には、抗原の提示、共刺激及び適当な局部環境の準備を含む。
【００２９】
GM-CSF 及びCD40L/CD154の発現により、抗原提示細胞（antigen presenting cell; APC）及び樹枝状細胞（dendritic cell; DC）は局所的に集められ活性化されることが確実になる。その結果、TAAの表出の増大が認められる。
【００３０】
B7.1/CD80の発現の結果、共刺激活動が活発化する。これにより、さらにTAA成分の抗原性とTAAに対抗して活性化するＴ-リンパ球の数が増大する。IL-7の発現はさらに腫瘍に特異的なＴ-リンパ球の増殖を誘発する。
【００３１】
本発明のワクチンは、このように、腫瘍細胞の表面にTAAと連携して溶解可能な増殖刺激性サイトカイン及び共刺激分子の高濃縮を誘発し、それにより適用部位において腫瘍特異のＴ細胞の活性化と増殖をもたらす。APC及びDCはまた適用部位に誘引される。
【００３２】
発現構築体は、プラスミドの形で存在するか、好ましくは、最小限免疫学的に定義される遺伝子発現構築体であるのが良い。これらは直線状二重鎖共有結合した発現カセットであり、CMVプロモータ、イントロン、コーディング遺伝子配列、及びポリアデニル化配列（polyadenylation sequence）のみからなる。配列カセットは二重鎖の両端で一本鎖ヌクレオシド残基の短ループにより共有結合している。これらの共有結合した最小限DNA構築体は、下記でMIDGEベクターと呼ぶ（MIDGE：Minimalstic Immunology Defined Gene Expression Vector）EP 0 941 318B1をご参照願いたい。MIDGE構築体は、それを用いることにより治療効果に重要でない構造を避けることができ、それにより共通の遺伝子運搬媒体用いるという不都合を回避できるという有利な点を持っことを示す。
【００３３】
特定の免疫反応の誘発を許容する局所的環境が、免疫促進核酸配列（immune stimulatory nucleic acid sequence:ISS）の形の補助剤を用いることにより提供される。この目的を達成するために、本発明では追加免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチド（additional immune modulating oligodeoxyribonucleotides）を補助剤として含むワクチンを提供する。ワクチンは、以下を含む免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチドを含むワクチンであるのが好ましい；
a) 塩基配列N1N2CGN3N4を含む配列であり、ここでN1N2はGT, GG, GA, AT 又は AAを含む群から選択される一要素であり、N3N4はCT 又はTTを含む群から選択される一要素であり、Ｃはデオキシサイトシン（deoxycytosin）、Ｇはデオキシグアノシン(deoxyguanosin), Ａはデオキシアデノシン(deoxyadenosin)、及びＴはデオキシチミジン(doexythymidin)である。
【００３４】
b) 部分的に相補的逆平行塩基配列を持つ、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid）の環状鎖（circular strand）であり、そして
亜鈴型の形を持つ。
【００３５】
ISSのCpGモチーフ(図２aを参照)は、TH1型細胞免疫反応の強い刺激を与えると共に、ＮＫ細胞及びマクロファージの活性を高める。このように、これらは免疫変調装置として機能し、腫瘍に特異な免疫反応を許容し、増大させる。好ましい実施の形態においては、WO 01/07055に記載のように、その長さが30塩基対の共有結合ISSが用いられる。この構築体は以下において、dSLIM (ダブルステムループ免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチド（double Stem-Loop Imunomodulating Oigodeoxyribonucleotides）と言う。
【００３６】
塩基配列N1N2CGN3N4を持つ配列は、オリゴデオキシリボヌクレオチド（oligodeoxyribonucleotide）の一本鎖部分に位置し、40から200のヌクレオチド（nucleotide）を持つ（図２ｂ参照願い度い）。
【００３７】
本発明の主題はまた、腫瘍疾患を持つ患者の治療のために上記のようなワクチンを製造する方法も提供し、その場合同種であるが遺伝子学的に同一でないドナー（同種異系；allogeneic）の腫瘍細胞に、エクスビボ（ex-vivo）において以下をコードする核酸分子が移入され；
a) インターロイキン−７（Interleukin-7 (IL-7)）, 顆粒球マクロファージ群刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)), CD40L/ CD154 及びB7.1/CD80, 又は
b) インターロイキンー７（Interleukin-7 (IL-7)）, 顆粒球マクロファージ群刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), 及びCD40L/ CD154 
及び、その後、その細胞は適用可能な製剤組成に移入される。上記に記載の免疫調節オリゴデオキシリボヌクレオチド（immune modulating oligodeoxyribo- nucleotides）は部分的に相補的逆平行塩基配列を持つデゾキシリボ核酸（desoxyribonucleic acid）の環状鎖（circular strand）を持ち、及び亜鈴型である。これはまた補助剤としての性質を持つことにおいて本発明の方法の一部である。
【００３８】
本発明においては、このように、連携した共刺激因子B7.1/CD80及びCD40L/ CD154  及びサイトカイン  インターロイキン−７及びGM-CSFをコードする少なくとも3つの、好ましくは4つの核酸分子を含む同種異系の腫瘍細胞を提供する。
【００３９】
従って、本発明の主題は、また以下をコードする核酸構成により、エクスビボで移入された同種異系のヒトの腫瘍細胞でもあり；
a) インターロイキン−７（Interleukin-7 (IL-7)）, 顆粒球マクロファージ群刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF)), CD40L/ CD154 及びB7.1/CD80, 又は
b) インターロイキン−７（Interleukin-7 (IL-7)）, 顆粒球マクロファージ群刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), 及びCD40L/ CD154 
及び、対応する発現構築体を含む。腫瘍細胞は、プラスミドの形、又はCMVプロモータ、イントロン、コード遺伝子配列及び二重鎖の両端を一本鎖のヌクレオシド残基の短ループにより、共有結合でポリアデニル化した配列のみよりなる直線二重鎖の共有結合発現カセットとしての発現構築体を含む。好ましくは、腎臓細胞癌腫細胞株の同種異系の腫瘍細胞が用いられることが望ましい。
【００４０】
ワクチンの場合のように、本発明の方法は核酸分子を発現構築体の一つ又はその幾つかとして提供する。そこで、以下の同義遺伝子発現（multiple gene expression）のためのDNA発現構築体を提供することができ、それは
―  少なくとも一つのプロモータ配列及びコード配列を含む直線状発現カセットを含む二重鎖領域よりなる、及び
−  これらの二重鎖領域はDNA一本鎖又は非コードDNA二重鎖によりリンクされている、及び
−  発現カセットは、DNA一本鎖又は非コードDNA二重鎖により他の発現カセットにリンクされていないその端においてエクソヌクレアーゼ分解よりから保護されている。
【００４１】
そのような同義遺伝子発現（multiple gene expression）のためのDNA発現構
築は、すでにPCT/DE03/02478に記載されている。従って、本発明に係るワクチンの主用要素である核酸の幾つかは、一つの単独発現構築体に含むことができる。
【００４２】
本発明の特に好ましい形態においては、核酸分子はDNAであり、特にcDNA又はゲノムDNAである。明らかに、核酸分子はRNA分子であることが期待できる。
【００４３】
同種異系の腫瘍細胞は結腸直腸癌、小細胞及び非小細胞肺癌、前立腺癌、乳房癌、卵巣癌及び腎臓細胞癌、及び悪性メラノーマの患者に由来する。
【００４４】
本発明においては、腎臓細胞癌細胞株が特に用いられたが、これは本発明のワクチンの製造には特に適している。好ましい腎臓細胞癌細胞株は、DSM ACC2635の番号でDSMZ (ドイツミクロ有機体収集および細胞培養会社Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)に培養可能なものとして預託された。DNA発現構築体は、望ましい遺伝子が細胞内で発現する様になる生物学的、化学的及び/又は物理的方法による移入の手法を用いてこの株種に移転される。好ましくはISSであり、最も好ましくはdSLIMである補助剤  (上記を参照)  は移入された同種異系の細胞に加えられる。ガンマ線により、移入された同種異系腫瘍細胞の放射線照射の後、本発明に係るワクチンは腫瘍疾患を持つ患者に接種される
自己細胞による治療とは対照的に、細胞が由来する身体は製剤により治療すべき身体とは別のものである。同種異系細胞を用いることの有利な点は、細胞を一度に特徴づけることができ、そして再生的に増殖することができる点であり、また他方で同種異系による効果は追加的補助剤の刺激として見ることができる点である。
【００４５】
修飾可能な細胞は単一(異なる個体)の身体から得るか、又は同じ疾患症状を持ついくつかの身体から採ってプールすることができる。
【００４６】
本発明の主題は、この様に発現させることができ、及び2つのサイトカイン及び一又は二つの共刺激因子をコードする3つ又は4つの核酸の組合せである。
【００４７】
ISS, 好ましくは、dSLIMは追加の免疫変調成分として用いることができる。
【００４８】
細胞が、移入後に三倍又は四倍陽性となっていることは、初代のヒトの細胞株（図1を参照）での細胞培養実験において示すことができた。ここで「三倍」又は「四倍」の意味は， GM-CSF, IL-7, CD40L/CD154 及び B7.1/CD80をコードする３つ又は４つの遺伝子の全てが旨く移入された細胞のパーセントの割合が高いことを言い、そしてこれらの3つ又は4つの遺伝子はその後これらの細胞により発現されたことを言う。実験で用いた結腸癌細胞株では、FACS (蛍光活性化細胞分類；flourescence activated cell sorting)分析により、全細胞の14.4％が4倍陽性になっていることが確かめられた。さらに、遺伝子とは別にすべての細胞の20.3％に１つの遺伝子が旨く移入されていることが確かめられ、19.9％の細胞が3つの異なる遺伝子が旨く移入していた。CD40L/CD154, GM-CSF, B7.1/CD80  及びIL-7をコードする発現構築体を4倍移入した結腸癌細胞の移入成功率は、全細胞の14.4％と確認された。この14.4%の細胞は４つの異なる遺伝子を移入され、これらを発現することに成功した。全体として、全細胞の69.4％が少なくとも一または二以上の遺伝子が移入された。
【００４９】
幾つかの遺伝子を移入することは有益である、何故なら、そうすることにより発現されるサイトカイン及び共刺激因子が免疫システムの効果器の空間的な近傍で発現されるからである。この空間的に近傍であるということは重要である。なぜなら、共刺激因子は抗原との関係においてはワクチンの効果を高めるだけであるからである。
【００５０】
移入においては、基本的に知られている生物学的、化学的及び/又は物理的方法を用いることができ、例えば、弾道的転移（ballistic transfer）（EP 0 686 697）、ポリケーション移入（polykation tramsfection）、リン酸カルシウム沈殿（calcium phosphate precipitation）、ミクロインジェクション、プロトプラスト ヒュージョン（protoplast  fusion）、リポソームフュージョン（liposome  fusion）、ウイルス移入システム（viral transfection system）、リポフェクション（lipofection）及び/又は電気せん孔法（electroporation）等である。本発明の好ましい実施の態様においては、移入は電気せん孔法により実施するのが良い。
【００５１】
さらに有利な方法には、受容体介在遺伝子転移の様な生物学的移入法がある。一つの例として、少なくとも一つ、好ましくは、二つの共刺激因子及び二つのサイトカインをコードするDNA発現構築体が、好ましくは、シミアンウィルス（simian virus） SV-40の核内保留シグナル（nuclear localization signal: NLS）であるオリゴペプチドに共有結合しているのが良い。
【００５２】
合成により作られる他のペプチドを用いて移入の効果を更に増大させることが可能である。この方法は特に静脈内で適用後のインビボでの遺伝子転移の細胞に特に適している。
【００５３】
本発明に係るワクチンであって、本発明の方法により同種異系細胞から作られるワクチンの効果は驚くべきものである。腫瘍特異の抗原に対する本来の免疫反応を高めるのみならず、腫瘍の患者の免疫システムの欠陥が修正され、それも両者が同時に且つ有利な方法で実行することができるのである。
【００５４】
更に、本ワクチンは、その腫瘍が切除された患者において、残余の腫瘍細胞に対する免疫反応を増進させ、また復元させ、又は残余の腫瘍の塊を消滅させるための補助治療として用いることができる。そこで、初期腫瘍を外科的に取り除き、見たところ転移もない患者にとって、その治療により再発の可能性を減少させ得る追加的な腫瘍特異の治療を受けることができるという展望が開かれるのである。
【００５５】
本発明の更なる有利な実施形態は、特許請求の範囲の従属項及び明細書に関係するものである。本発明は、本発明の治療の驚くべき治療効果を含み、本発明による方法のみならず、本発明による癌治療のためのワクチンについて、更に詳細を図面及び以下の実施例に記載する。
【００５６】
遺伝子生成物を示すために、4つの区別可能な蛍光塗料にリンクされた抗原を使用した。図1では、これを
CD80-FITC
hGMCSF-PE
IL7-PerCP
CD154-APC
で示す。
【００５７】
蛍光活性化細胞分類；flourescence activated cell sorting：FACS) はｘ座標上のFL1-H, FL2-H, FL3-H 及びFL4-Hと呼ぶ、4つの異なるチャンネルのこれらの色を認識する。ｘ軸上の指数は相対的蛍光発光の強度を示す。ｙ軸は検出されたおおよその細胞数の数値を示す。分析はあるエネルギーのゲート（gate）を通過した細胞のみを数える「ゲート」プロセスにより行う。下記の表１ではCD40L/CD154, GM-CSF 及びIL-7をコードする発現構築体により3倍移入された、又はCD40L/CD154, GM-CSF, B7.1/CD80及びIL-7をコードする発現構築体により４倍移入された後に、移入が成功した同種異系の腎臓細胞腫瘍細胞のパーセントを示す。
【表１】
2007516985.tif 000002
【００５８】
共刺激因子B7.1/CD80 及び CD40L/CD154の移入は細胞を蛍光によりマークをつけた抗原で細胞を着色することにより決められた。サイトカインIL-7及びGM-CSFによる移入の程度は、細胞培養体中のサイトカインの濃度の測定により決められた。
【００５９】
エクソビボで移入された同種異系細胞よりなる本発明のワクチンが、転移した固い腫瘍を持つ患者に，各回2回の注射を含む接種サイクルの形で7から10日の間隔で接種された。細胞はIL-7, GM-CSF, CD40L/CD154 及び/又は B7.1/CD80をコードする発現ベクターにより事前に移入されており、続いて免疫促進配列（immune stimulatory sequence; (ISS)）と混合されていた。最初の二つの注射は1日目に、左右上腕側面の皮膚の通常の接種箇所に（皮内）注射され、7日（から10日）目に左右大腿上部の皮膚の通常の接種箇所に（皮内）注射され、１４日（から２０日）目に、へその左右約30mmの箇所に皮膚の下（皮下）に、２１日（から３０日）目に再び上腕であるが、皮下に注射された。
【００６０】
患者は全て治療開始時において病状の進行した者であった。臨床効果を評価するために、以下に示す世界保健機関（World Health Organization (1979)）の用語を用いる。部分的反応 (partial response, (PR))は過去４週間の間に確認可能な腫瘍病巣の縮小が50％以上、及び新たな腫瘍の抑制があることをいう。安定的病状(stable disease, （SD）)はその状態が継続することをいう。混合反応（mixed response, (MR)）は混合した反応があること、例えば、転移の進行と他の部位での転移の減少が起きていることをいう。完全反応（complete Response (CR)）は腫瘍病巣が完全に沈静化したことをいう。
【００６１】
以下において、本発明を実施例により、より詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６２】
接種
小細胞肺癌腫を持つ患者に、本発明のワクチンを7日間の間隔をおいて4回連続接種した。同種異系腎臓細胞腫瘍細胞株は上記で述べたように処置されていた。移入後に24時間発現のコントロールを行った。共刺激因子B7.1/CD80 及び CD40L/CD154の発現のコントロールは、蛍光による標識を付した抗原により細胞を着色し、続くフローサイトメトリー（flow cytometry）による分析で行った。サイトカインIL-7及びCM-CSFの発現は、ELISAによる方法によって各濃度を測定することにより確認した。
【００６３】
移入の成功は、生存している陽性細胞があることを意味する。移入のデータは表1に記載の通りである。B7.1/CD80の移入が成功した細胞のパーセンテージは66.3から87.6％であった。CD40L/CD154の移入が成功した細胞のパーセンテージは21.6から29.5％であった。サイトカインIL-7の濃度は、1x106細胞当たり14.9から38.2ngであった。CM-CSFの濃度は、1x106細胞当たり370.6から1,567.2ngであった。
【００６４】
CD40L/CD154, GM-CSF 及びIL-7をコードする発現構築体による3倍接種用の移入では、CD40L/CD154の移入が成功した細胞のパーセンテージは60.8％であった。サイトカインIL-7の濃度は1x106細胞当たり21.7ngであった。GM-CSFの濃度は1x106細胞当たり698.9ngであった。
【００６５】
転移腫瘍疾患の治療
患者の選定基準：悪性メラノーマに加えて、結腸直腸癌、小細胞及び非小細胞肺癌、前立腺癌、乳房癌、卵巣癌及び腎臓細胞癌を持ち、年齢は18歳から70歳まで、及びカルノフスキィー指標（Karnofsky index）が70から100の間の患者を選定した。除外の基準：以前にサイトカイン治療又は化学療法を受けて28日経っていない、クレアチン値（creatine value）が265ミクロモル/l以上、ビリルビン値（bilirubin value）が51ミクロモル/l以上、非代償性心不全（non-compensated cardiac insufficiency）、心室リズム障害（venticular dysrhythmia）、重度神経障害、活動性A型,  B型、又はC型肝炎、HIVに感染した患者は除外した。
【００６６】
治療法：既往歴は別として、治療に先立ち以下のパラメータを確認した。すなわち、身体検査、血液検査（ヘモグロビン、ヘマトクリット、白血球及び血小板数測定）及び血液の化学分析及び尿の分析。血液は免疫状態を調べるために採取した。DHT (遅延型過敏症、delayed type hypersensitivity) 皮膚試験をMultitest Merieux 試験 (Leimen, Germany)により行った。上半身及び腹部のX線による走査検査、及びコンピュータ断層撮影を行った。患者は事前にエクソビボで処理された腫瘍細胞の、少なくとも8x106 から1.4x107の細胞を4回皮下注射された。総合的な免疫学的検査、血液検査及び一通りの臨床検査（身体検査、超音波検査、必要な場合は身体下部の検査）を各14日、28日、及び56日目に行った。登録前に行った検査と同様の完全な臨床的、免疫学的検査を84日目に行った。
【００６７】
最小限免疫学的に定義された遺伝子発現構築体（MIDGE）
(minimalistic immunologically defined gene expression construct)
共有結合した最小限DNA発現ベクターが、腫瘍細胞の移入に用いられた。発現ベクターがヒトのインターロイキンー７（IL7）、ヒトの顆粒球マクロファージ−群−刺激因子（GM-CSF）及び共刺激因子B7.1/CD80 及び CD40L/CD154を発現させるために用いられた。MIDGEベクターはクラスBとそれに続く品質管理に適合する実験室でのSOP手順に沿って合成された。
【００６８】
IL-7 (NCBI Acc. No.: J04156), GM-CSF (NCBI Acc. No.: M11220), B7.1/CD80 (NCBI Acc. No.: AF177937) 及び CD40L/CD154 (NCBI Acc. No.: S49008)  のコード配列（これらはNational Center for Biotechnology Informationのデータベース (www.ncbi.nim.nih.gov.)より取得した） は、プラスミドpMOKに挿入され、そしてMIDGEベクター合成の出発原料とされた。プラスミドpMOKは、CMVビールスから直接得られる初期の強いプロモータ、イントロン及びSV-40 ビールスのポリアデニル化配列を含む (MOLOGEN, Berlin)。
【００６９】
IL-7をコードするプラスミドpMOKは、制限酵素Eco311により37℃で一夜で完全消化された。制限酵素による消化により、2つのDNA断片が生み出された。一つはカナマイシン耐性遺伝子及び細菌中でプラスミドの伝播に必要な他の配列よりなっており、他の断片は、MIDGEベクターの部分である配列からなっていた、すなわち、強化されたCMVプロモータ、キメライントロン（chimeric intron）、IL-7の遺伝子配列、及びSV40 のポリアデニル化配列である。５’リン酸化  ヘアピン  オリゴデオキシヌクレオチド（５’ phosphory-  lated hairpin oligodeoxynucleotides）(TIM-MolBiol, Berlin, ODN 1 = Seq. ID 5 from WO 03/031469 A2 (Mologen et al.,)但し修飾塩基Xはない) 及びODN 2 = Seq. ID 6 from WO 03/031469 A2 (Mologen et al.,)はT4 DNAリガーゼ及び制限酵素Eco311の存在下で、37℃で一夜でMIDGE形成断片に結紮された。この文意において、WO 03/031469 A2 (Mologen et al.,)の記載、及びそこに含まれるオリゴデオキシヌクレオチド配列が参照される。反応は７０℃に過熱することにより停止された。結果の核酸の混合物は酵素T7-DNAポリメラーゼにより処理された。MIDGE DNAは陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製され、イソプロパノールにより沈殿させられた（EP 0 941 318を参照）。
【００７０】
同様にGM-CSF 、B7.1/CD80及びCD40L/CD154をコードするベクターの合成がなされた。
【００７１】
NLSリンクのMIDGEの合成
NLS-MIDGEの合成に関しては、WO 03/031469 A2 (Mologen et al.,)の記述、及びそこに含まれるオリゴデオキシヌクレオチド（ODN）の配列が参照される。NLSペプチド（Seq. ID 4 from WO 03/031469 A2 (Mologen et al.,)）はまずODNに結合される。ODN１はそのヘアピンループにおいてアミノ修飾を受けたデオキウラシル（XT）にリンクされ、WO 03/031469 A2 (Mologen et al.,)に記載の修飾されていないODN2がこの反応に用いられた。
【００７２】
まず、アミノ修飾を受けたオリゴデオキシヌクレオチドODN１（0.1mM）が室温においてPBS中でスルホKMUS(5mM)により活性化された。１２０分後に５０mMトリ−(ヒドロオキシメチル)−アミノメタン (tris-(hydroxy- methyl)-aminomethane)を加え反応は停止され、エタノールによる沈殿(300mM  NAOAc  pH 5.2, 5.5mM MgCl2, 70 % ethanol)、遠心分離、及び７０％エタノールによる一度の洗浄により活性化されたODN1が得られた。この様にして得られたODN１(0.1mM)はPBSで溶解され、そしてNLSペプチド（0.2mM）と室温で１時間反応させた。反応はゲル電気泳動（electrophresis）(3%)及びエチジウム染色（ethidium staining）によりコントロールされた。NLSと結合したODN1はHPLCにより精製され、上記に記載のようにODN2とともにMIDGE- NLS構築体の合成に用いられた。
【００７３】
二重鎖免疫調節オリゴデオキシヌクレオチド(d-SLIM)
(double stranded immune-modulatory oligodeoxynucleotides) 
二重鎖免疫調節オリゴデオキシヌクレオチドはCG配列を含む分子である。これを得るためには、直線状オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）が、エクソヌクレアーゼによる分解から保護するためにヌクレオチドループによる方法で共有結合されることが必要である。そこでdSLIM（ダブルステムループ  免疫調節装置、double stem-loop imunomodulator）と呼ばれる亜鈴型の分子がえられる（図２参照）。免疫調節活動は、トール様受容体（Toll-like receptor）と結合するメチル化されていないCG配列による免疫システムへの非特定活性活動をベースとしている。dSLIMの各ループは３つの非メチル化CGモチーフを含む。
【００７４】
ISS３０タイプの二重鎖免疫調節装置dSLIMは、SOP及びそれに続くクラスB実験室の品質コントロールに従い合成された。そのために、一本鎖ヘアピン型  ５’リン酸化  ヘアピン  オリゴデオキシリボヌクレオチド（５’ phosphory-  lated hairpin-shaped oligodeoxyribonucleotides）(ODN)がT4  DNAリガーゼにより結紮された。出発原料をT7 DNAポリメラーゼにより消化し、クロマトグラフによる精製後に、ODNはエタノール/酢酸マグネシウム・ナトリウム沈殿により濃縮され、PBS中で溶解された。詳細な手順はWO 01/07055に記載されている。図２ｂはd-SLIM分子を示す。
【００７５】
同種異系細胞株の特徴
（Characterization of the allogeneic tumour cell line）
使用される細胞株は、女性患者の原発性腎臓細胞腫瘍から採ったものである。細胞株はこれらの初代細胞から準備したもので、アクセス番号DSM ACC2635でDSMZ (ドイツミクロ有機体収集および細胞培養会社、German Collection of Microorganism and Cell Cultures)に培養可能なものとして寄託された。スクリーニング手続後に、細胞は多くの初代培養の中からマスタ−細胞バンクのための出発原料として用いられる事となったものである。細胞集団はTAAの安定した発現が可能であること、コンスタントに良い分裂率、及び好ましくは、均一な成長特性を持つことを示すことが必要であった。またウィルス又は細菌に汚染されていないことも確認されねばならなかった。
【００７６】
腎臓腫瘍細胞株は公認の試験機関により、HIウィルス、B型及びC型肝炎ウィルスが陰性であることが確認された。HLAタイプについてもまた、TAAの発現及びサイトカインの放出と同様に特徴が確認された。この目的のために、ELISAのような（例えば）TNF-アルファ、IL-6, GM-CSF及びIL-7の測定のための核異なる技術が確立された。さらに、細胞間FACSアッセイ及びリアルタイムPCRアッセイが確立された。移入後、細胞は表面抗原の発現、情報伝達分子及びレポータ遺伝子（reporter gene）のコントロールがなされた。細胞株は特定の表面マーカーについて、以下の免疫学上の指標により特徴づけられる。
【００７７】
EpCAM               陽性
Her-2/neu :         陰性
Cytokeratin 7+8 :   陽性
HLA-A1 :            陽性
HLA-A2 :            陽性
Fibroblaste :       陰性
腫瘍特異抗原の決定：
PRAME :             陽性        SCP-1:         陽性
MAGE-4 ::           陰性        Fertilin-beta  陰性
MAGE-3 :            陰性        RAGE-1 :       陽性
MAGE-1 :            陰性        G250 :         陽性
電気せん孔法（Electroporation）
エクソビボでの腫瘍細胞及びコントロール細胞核への遺伝子の移転のための好ましい方法は電気せん孔法である。腫瘍細胞は培養フラスコの表面からトリプシン/EDTA溶液により分離され、培養（FCSはない）又はPBS中で600μl当たり1-1.5x107細胞の密度に調整された。この600μl容量の細胞懸濁液は5-10 μgの発現ベクターと混合され、冷却した電気せん孔キュベット(Eurogentec)に移され、そしてEasyject 電気せん孔装置 (EquiBio)において、300ボルト電圧、1050マイクロファラッド容量で電気せん孔された。
【００７８】
その後、細胞は新しい培養液（5−20ml）に移され、細胞培養器で24時間培養された（(5% CO2、37℃、飽和湿度)。続いて4色フローサイトメトリー（flow cytometry）による表面分子 (CD40L/CD154 及び B7.1/CD80)、及びサイトカイン(GM-CSF及びIL-7)の測定がなされる。細胞数と活力もコントロールされる。
【００７９】
遺伝子の移転後直ちに、腫瘍細胞は10mlの暖めた細胞懸濁液で覆われ、注意深くピペットにより15ml遠心分離管に移される。細胞は300xG,及び4℃で5分間沈殿させた後、培養中で再懸濁された。再びアリコートは無菌試験、細胞の再構成及び活力のアッセイ、FACS分析及びサイトカイン発現の決定のため採取された。移入の効果がすでに述べた様な方法で確認された（(Foa et al., 1994, Nat. Immun. 13 :65-75)。
【００８０】
移入された腫瘍細胞懸濁液は再度乾燥され、1.5mlの冷凍培養で再懸濁され(80% FCS, 10％ DMSO, 10% 懸濁媒体)、2ml中の密封した冷凍管中で8x106から1.4x107細胞を含むアリコートに保存された。管は−80℃まで1℃/分の割合で冷却され、液体窒素中に保存された。
【００８１】
本発明に係るワクチンの完成
(Completion of the inventive vaccine)
冷凍管を注意深く解凍した後、細胞数が再度確認されてアリコ−トが無菌試験のために採取された。細胞を注意深くかつ繰り返し洗浄した後、細胞ペレット（cell pellet）はDulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS, Camprex Kat. No.: 17-512F)で再懸濁された。ロットにより、500マイクログラムのdSLIM補助剤が加えられた。完成されたワクチンは内毒素（endotoxin）を含まない反応容器に移された。各750ミクロリットルが注射針により注射器に取られた。接種の前に、注射器をガンマ線で、総投与量150Grayに相当する5倍の照射を行った。
【００８２】
リンパ球の準備
(Lymphocyte preparation)
抹消血単球（peripheral blood monocytes (PBMC)）は、Lymphoprep （GIBCO, Karlsruhe）及び密度勾配遠心法（density gradient centrifugation）によりヘパリン処理をした抹消血（peripheral blood）から準備された。細胞はPBSにより2度洗浄され、ELISPOT及び細胞毒アッセイのために20％以上のFCSの存在下で液体窒素中で冷凍乾燥された。
【００８３】
統計的分析
(Statistical analysis)
統計的な意味を分析するために、Wilcoxonsのペアー及び非ペアー試験を行った。0.05未満のｐ値（ｐ-value）が重要と考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】4倍移入されたヒトの直腸癌細胞のFACS強度である。移入はCD40L/CD154, GM-CSF, B7.1/CD80 及び IL-7をコードする発現ベクターにより電気せん孔法により達成された。
【図２ａ】免疫変調成分（dSLIM）の概要図：図に描かれたヘアピンループ構造に各3つのCGモチーフを持つ亜鈴型構造である。Iはループで、 IIは柄である。
【図２ｂ】免疫変調成分（dSLIM）の概要図：図に描かれたヘアピンループ構造に各3つのCGモチーフを持つ亜鈴型構造である。Iはループで、 IIは柄である。
【図１】
2007516985.tif 000003
【図２ａ】
2007516985.tif 000004
【図２ｂ】
2007516985.tif 000005
【国際調査報告】
2007516985.tif 000006
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2007516985.tif 000008
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