(57)【要約】  本発明は、粒子（１００）を選別する方法であって、前記粒子の屈折率を変えるためにその粒子を利用するものであり、支持体（１０８）の導波路（１０４）上に前記粒子（１００）を配置する段階と、前記導波路を介して光照射を入射して前記導波路上の粒子を変位し、粒子を分離する段階と、を備えた粒子選別方法に関するものである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子（１００）を選別する方法であって：
粒子の屈折率を変えるために粒子をマーキングする段階と、
支持体（１０８）の少なくとも一の導波路（１０４）上に前記粒子（１００）を配置する段階と、
前記導波路を介して光照射Ｒを入射して、前記導波路上の粒子を変位し、粒子を分離する段階と、を備えた粒子選別方法。
【請求項２】
前記粒子が導波路（１０４）上にクラスター（１１４，１１６，１１８）を形成する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
選別される粒子が同一の組成であるが、異なる寸法を有する請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
選別される粒子が同一若しくはほぼ同一の寸法を有するが、異なる組成である請求項１又は２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記粒子が細胞、マクロ分子、又は、ミクロボールである請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
入射される照射は近紫外と赤外との間のスペクトル範囲である請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粒子がミクロボールであり、ミクロボールが細胞をマークし、照射が赤外の範囲である請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
粒子のうちのいくつかは金属であるか、又は、金属粒子によってマークされている請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
粒子のうちのいくつかは金属粒子であるか、又は、金属粒子によってマークされている請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
導波路に入射される光は磁気的横波（ＴＭ）モードで偏光している請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子が液体媒体に浸漬される請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小粒子の選別方法及び分析方法の分野に関するものである。この粒子とは、リポゾーム、動物若しくは植物の細胞、ウィルス若しくは微生物等の生物学的粒子、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはタンパク質等のマクロ分子、マイクロボール等の無機物粒子であってもよい。応用分野としては化学的若しくは生物学的分析、又は、品質コントロール（微粒子の較正）がある。
【背景技術】
【０００２】
フロー・サイトメトリーのような粒子細胞選別による公知の手法は、特に希少な若しくは非常に小数の細胞数の分析、及び、１μm以下の粒子の操作について限界がある。
【０００３】
光学的クランプの技法は、連続的なレーザービームのウェストに形成されている強度勾配によって粒子（マイクロボール、細胞若しくはマクロ分子）の閉じ込めを基礎にしている。例えば、これについては、アシュキン（Ashkin）及びジーディック（Dziedic）によって“Observation of radiation-pressure trapping of particles by altering light beams”とのタイトルでPhysics Review Letters, 54(12), 1985に掲載された論文に記載されている。この操作は放射線圧力のバランスによって可能となっている。この操作を一旦行うと、粒子はビームを変位することによって変位する。
【０００４】
このタイプの装置における変位の距離は通常、数100ミクロンに制限される。
【０００５】
従って、金属粒子を選別することはできない。
【０００６】
図１は、このような装置の原理を示すものである。
【０００７】
粒子２は液体媒体６中にビーム４によって閉じ込められている。
【０００８】
図２は、レーザービーム４の両側において、装置によって生成された力場を示すグラフである；粒子は、それを捕捉し得る（レーザーの電場によって生じた放射線圧力によって誘起された）力学的な力の場に閉じ込められる。
【０００９】
このタイプの装置は２つの欠点がある：粒子の変位が、セットアップが難しく、高価な専用の機械システムの使用に基づいてなされることである。
【００１０】
さらに、その形状又は寸法の特性の関数として、いかなるタイプの種の分離を作製することは不可能である。
【００１１】
例えば、タナカ（Tanaka）らによってApplied Physics Letters, 77, p3131, 2000に掲載された論文に記載されているような最近の仕事では、誘導光学装置を利用しており、光学的な力による細胞の変位のために装置を設計する可能性を示唆している；この手法は生物学的（生体）細胞よりもはるかに小さい対象物（数ミクロンオーダーのサイズのボールやコロイド）に限定されている。
【００１２】
図３に示しているのは、この装置は基板１２上に形成されたストリップを有する導波路１０を用いたものである。粒子は、粒子における光強度に比例する光圧力を伴う力によって変位する。粒子は強度の勾配に比例する力によって導波路において適所に保持される。
【００１３】
導波路が単一モードであるならば、粒子が捕捉される場所で最大の光強度がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明は、粒子を簡単にかつ効率的に選別する方法及び装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、例えば、生物学的興味を有する粒子若しくは対象を選別する装置に関するものである。
【００１６】
本発明はまず、粒子選別方法に関するものであり：
ａ）支持体の少なくとも一つの導波路上に該粒子を配置する段階と、
ｂ）粒子の前記導波路上の粒子の変位及び分離について、前記導波路を介して光照射を注入する段階と、を備える。
【００１７】
粒子はその性質に従ってクラスターを形成することができる。
【００１８】
段階は粒子がその屈折率が変わるようにマーク（標識）を付けられる前に実行された。
【００１９】
例えば、選別される粒子は細胞、マクロ分子、又は、ミクロボールであってもよい。
【００２０】
用いられる照射は近紫外線と近赤外線との間のスペクトル範囲、好適には生物細胞については赤外線であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、添付図面を参照して、以下の純粋に例示の目的でかつ非制限的な方法で与えられた実施形態を読むことによってより理解が深まるだろう。
【００２２】
異なる図面の同一、類似若しくは等価な部分は、一の図面と他の図面との間の比較を容易にするために、同じ符号が付けられている。
【００２３】
図面で示された異なる部分は、図面をより容易に理解できるように、必ずしも同じスケールで描いているわけではない。
【００２４】
本発明による方法の一般例は、図４Ａ及び図４Ｂを参照して説明する。この方法では、その物理的性質に依存して粒子群を選別する。粒子とは、ナノメートルから100ミクロンの寸法を有する有機若しくは無機の要素若しくは対象を意味する。この粒子は例えば、動物若しくは植物の細胞、蛋白質、ＤＮＡ、ＲＮＡのようなマクロ分子であってもよい。
【００２５】
粒子は例えば、ミクロボールのようなミクロ対象物であってもよい。
【００２６】
物理的な特性とは、これらの粒子の寸法、質量、屈折率のような光学的特性を意味する。
【００２７】
粒子１００個の群を選別する第１段階はまず、支持体１０８に形成された光導波路上にこの群を配置することである。
【００２８】
アセンブリは液体媒体例えば、水（屈折率１．３３）に浸漬してもよい。生物学的用途として、この液体は、屈折率が１．３３に近いバッファー溶液又は細胞懸濁培地であってもよい。
【００２９】
さらに効率的に選別方法を作るために、支持体と、導波路と、支持体が配備された媒体とは、選別される粒子についての値と異なるか若しくは非常に異なる屈折率を有するのが好ましい。
【００３０】
例えば、支持体１０８はガラス等の透明材料又はシリコンのような半導体材料をベースにするものであってもよい。導波路１０４はマルチモード型若しくは単一モード型であってもよい（図４Ａ）。導波路は支持体１０８上で数ミクロンから数センチメートルの長さにわたって延びているものであってもよい。
【００３１】
粒子１００の群はまず、手動若しくは自動の方法を用いて導波路１０４の領域に配置されてもよい。
【００３２】
支持体に集積され又は集積されない光デバイスを用いて、光照射Ｒを導波路１０４に注入される。この照射は、所定の時間例えば、数秒から数分のオーダーの間、注入されてもよい。
【００３３】
注入される照射は、近紫外線から近赤外線例えば、３００ｎｍから１２００ｎｍの波長を有する。生物学的粒子又は細胞について、赤外線の波長例えば、ＹＡＧレーザーの１０６４ｎｍの波長で用いてもよい。注入されたパワーは数１０ミリワットから数１００ミリワットのオーダー例えば、５０ｍＷから１Ｗ例えば、１５０ｍＷ近傍のオーダーであってもよい。
【００３４】
従って、照射は選別される粒子の性質及び寸法に依存して選択される。
【００３５】
光照射の導波路１０４の通過によって、導波路表面上にエバネセント波を形成する。この波は、これらの粒子の光の散乱によって、導波路の上方に配置した粒子を変位させる。変位は、導波路に沿って、光照射の伝搬の方向に沿って行われる。
【００３６】
粒子は、寸法、質量、及び、屈折率に依存して、異なる速度で、互いに異なる長さに沿って変位する。
【００３７】
粒子の動きは照射による光注入時間後に停止できる。これにより、粒子は、寸法及び／又は質量及び／又は屈折率に依存して導波路１０４に沿って、対応する異なる長さに沿って変位する。
【００３８】
変位長は例えば、数１００ナノメートルから数センチメートルまであり得る。
【００３９】
粒子は通常、数個のクラスター１１４，１１６，１１８にグループ化され、それぞれのクラスターは導波路１０４上においてかなり広範囲を占める（図４Ｂ）。各粒子の変位長はその物理的な特性を特徴とし、このため、一クラスター内の粒子はいくつかの類似の又は同一の物理的特性を有する。
【００４０】
同一の組成であるが、異なる寸法の粒子を選別することができ、同じ若しくはほぼ同じ寸法であるが、異なる物理的組成及び／又は特性の粒子を選別することもできる。
【００４１】
図５Ａは第１の場合を示す；異なる寸法を有する粒子２１４，２１６，２１８はエバネセント照射の影響の下で異なる挙動を示し、選別され得る（図５Ｂ）。
【００４２】
他の実施例では、異なる屈折率を有する粒子はエバネセント照射の影響の下で異なる挙動を示す。この例は、同程度の寸法であるが、異なる屈折率を有して最初に混同された粒子３１４，３１６，３１８は本発明による方法を用いて連続的に選別される（図６Ｂ）。
【００４３】
赤外線領域での他の実施例では、生きている細胞又は生物学的粒子は、水（約１．３３）と同程度の屈折率（量子エレクトロニクスにおける特定トピックのＩＥＥＥジャーナルvol.2、No.4に掲載されたダン（A. Dunn）及びリチャード−コータム（R, Richards-Kortum）による論文“three dimensional computation of light scattering cell”（１９９６年１２月発行）に記載されているのは、細胞質は１．３７、核は１．３９、ミトコンドリアは１．４２）を有するが、より小さい金粒子ははるかに小さい屈折率（１０６４ｎｍの波長で約０．３）を有し、上述の波長ではより高い吸収（約７の屈折率の虚部）を示す。
【００４４】
金粒子は、金粒子上では細胞上より大きな効果を有するエバネセント照射によってより容易に変位するが、細胞は金粒子よりも大きい。
【００４５】
用途によっては、各細胞からなるアセンブリとそのマーキング粒子、及び、その環境との間の屈折率の差を増大し得る、細胞例えば、金粒子を有する細胞をマークすることは有利である。生物学的細胞については、ポリマー粒子は小さな金粒子の代わりに用いられ、生物学的対象が移植され得る他の材料を用いることができ；またしても、これらの粒子は細胞より小さく、その屈折率は水等の媒体の屈折率とは大きく異なっており、マーカー（標識）として用いられ得る。
【００４６】
本発明による方法の他の実施例では、想定している粒子はその寸法に依存して選別される動物若しくは植物細胞である。
【００４７】
その上で選別が行われるところの支持体は液体溶液、好適には細胞を保護するための生体適合性溶液に浸漬してもよい。
【００４８】
細胞選別はまず、屈折率を変更するために細胞をマーキングし、本発明による選別方法により反応し得るように改良され得る。
【００４９】
マークされた細胞の屈折率は支持体及び導波路の屈折率、及び、支持体が配備された媒体の屈折率と大きく異なっているのが好ましい。
【００５０】
マーキングは例えば、抗原−抗体モデル若しくはビオチン／ストレプトアビジン抗体モデルを用いて、前記細胞に付着若しくは移植された金属球若しくはポリマーを用いて実行されてもよい。
【００５１】
マークされた細胞の群をまず、例えばピペットを用いてサンプリングする。次の段階は支持体レセプタクルに前記サンプルを配備することである。このレセプタクルは例えば、ジーン・フレーム（登録商標）型チャンバ等のチャンバであってもよい。レセプタクルは気体に対して不透過であり、細胞を熱的に遮断するのが好ましい。
【００５２】
細胞群は、レセプタクルから例えば、一又は二以上の毛管を用いて導波路上に配備したゾーンへ移動してもよい。
【００５３】
次の段階は、例えば、数分のオーダーの所定の時間、光照射を導波路１０４に入射することである。細胞選別中に用いられる照射を細胞に対して無害であるのが好ましい。使用される光照射は、遠赤外線から近赤外線の波長例えば、１０００ｎｍから１２００ｎｍの間の例えば、１０６４ｎｍに近い波長で発光されるレーザー照射であってもよい。
【００５４】
光照射の導波路の通過によって、導波路表面上にエバネセント波を形成し、この波は、光照射の伝搬の方向に沿って、導波路上の細胞を導波路に直交する軸に沿って、細胞を変位する。細胞は、各細胞の寸法に依存して互いに異なる速度で変位する。
【００５５】
所定の入射時間が経過すると、細胞の移動は停止する。細胞は、図６Ｂに示したように数個のクラスター３１４，３１６，３１８にグループ化され、開始ゾーンから異なる平均距離に配置される。
【００５６】
本発明による選別方法のために装置であって、支持体と上述のような一又は数個の導波路を有する装置は、例えば、ＭＥＭＳ（マイクロ−エレクトロメカニカルシステム）又はチップ上のラボ内に集積されてもよい。
【００５７】
上述のような導波路は例えば、薄膜形成法によって、又は、イオン交換法によって作製することができる。
【００５８】
まず（図７Ａ）、（例えば、蒸着法又はスパッタリング法によって得られる）アルミニウム層をガラス表面１４０上に堆積し、次いでフォトレジスト樹脂層１４４を堆積する（スピンコーティング法による堆積）。次に、クロムリソグラフィマスク１４６を真空下で樹脂層に接触させる。マスクは最終パターン（導波路）のネガを表す。
【００５９】
次いで、マスクは、中央導波路が例えば約３５０ｎｍに配置されているものについて、かつ、樹脂がフォトレジスト樹脂についてインコヒーレント照射を用いて照射される。マスクで隠されていない部分の化学的構造は変性される。
【００６０】
次いで、支持体は樹脂１４４を現像する溶液にちょっと浸す（ディップする）。これにより、化学的構造が日光により変性される領域をエッチングする（図７Ｂ）。
【００６１】
次いで、プレートをアルミニウムエッチング溶液（ＡｕＥｔｃｈ）にディップする。この溶液は樹脂をエッチングしない。既に現像した部分だけがエッチングされる（図７Ｃ）。
【００６２】
最後に、樹脂はアセトンで溶解する。パターン１５０だけがプレート上に残る（図７Ｄ）。
【００６３】
次いで、イオン交換段階を実施して導波路を形成する。次いで、支持体は硝酸銀と硝酸ナトリウムを含む塩浴に浸す。これらの塩の間の比率によってガラス１４０内で交換された銀の含有量を決定する。浴は通常、用途に依存して銀を１０％から５０％を含む。塩溶融温度は約３１０℃なので、交換段階は３２０℃から３５０℃で実施する（図８）。
【００６４】
次いで、アルミニウムマスクを例えば、エッチングによって除去する。
【００６５】
アニーリングを行うこともできる；ガラスプレートは浴に接触することなく加熱される。この段階は、銀イオンをガラス支持体の内部へより深く浸透させる。導波路はこのようにして形成できる。
【００６６】
導波路の上面との摩擦によって生ずる粒子上のブレーキ（制動）力は、特別なコーティング例えば、テフロン（登録商標）をベースにした薄層で導波路を被覆することによって低減できる。
【００６７】
バイオロジー分野の一用途について説明する。
【００６８】
異種細胞サンプルにおいて、特定の表現型例えばタンパク質等のあるタイプの表面マクロ分子の存在によってキャラクタライズされた所定の亜母集団を孤立させる試みがなされた。さらに、抗体等のプローブ分子は、非常に強い親和性を有するこのような表現型マーカーを認識して、結合する能力を有する。抗体型プローブ分子の場合には、表現型マーカーは抗原と呼ばれる。抗体は、当業者が公知の手段によって例えば金ボール等の、特定の特性に対して選択されたボールに固定される。このような機能化された金ボールを細胞の表面に移植され、例えばこれらの細胞は血液から分離され、選別されるリンパ球である。
【００６９】
マークされた細胞は（例えば、カバーに集積された合焦装置によって）支持体上で、チャンバ内に堆積される。チャンバは例えば、ジーン・フレーム（登録商標）型（アブジーン（登録商標）の装置であってもよい。この小さな接着型チャンバは非常に簡単であり、気体を透過しない結合システムであり、９７℃までの高温に耐性があり、蒸発による試薬の損失を防止する。これは通常、生物学において、雑種を生じさせ、インシチューの増幅の処置に使用される。
【００７０】
レーザー光は導波路内に入射される。選択される波長は、赤外／近赤外の範囲、処置後の細胞の生存可能性を保証する透明生体スペクトル範囲である（生体分子や水が吸収されない）。細胞及び固定されていないボールは上述のように選別されない。
【００７１】
マークされた細胞は分析／回復（レキュペレーション）ウィンドウに変位させる。生体粒子は例えば、流体手段（毛管による回復）あるいはより常套的な手段（コーンの寸法に適した回復チャンバにおいてピペットによる回復）によって元に戻ってもよい。
【００７２】
一般に、観察手段は例えば、ＣＣＤカメラを導波路１０８の上方に備えてもよい。このような手段は上述のように作製した選別のモニタリングを可能とする。
【００７３】
図９は、本発明による導波路手段を組み込んだ支持体１０８上の粒子選別システム１００を湿す。対物３００はレーザーＲ（例えば、１０６４ｎｍのＹＡＧビーム）を導波路１０４に合焦する。選別される粒子はスライド２２０上に配置されたチャンバ内に含まれる。カメラ２３０は例えば、合焦装置又はズーム２４０を用いて選別の画像を作成するのに用いられる。透過した照射の画像を形成する手段２５０，２６０（対物、カメラ）を装置からの出力部に配置されてもよい。
【００７４】
本発明はマークされた細胞の選別だけでなく、他の領域、例えば、特にラテックス若しくは金からなるボール若しくはマイクロボールの較正にも適用できる。
【００７５】
他の実施例を示す。この例では、用いられる導波路はカリウムイオン交換によって作製された表面導波路（ガラススライド基板）である。これらのイオンは２時間から１５時間の交換時間で温度２８０℃で生成される。これらの導波路の損失は１０６４ｎｍの波長で０．２〜０．５ｄＢ／ｃｍのオーダーである。
【００７６】
変位されて選別される粒子は、屈折率１．５５で直径２μmのガラスボール、又は、直径１μmの金ボールである。
【００７７】
用いられる装置は図９で示したタイプである。光は連続ＹＡＧレーザーを１０６４ｎｍ（Ｐ＝１０Ｗ）で用いてエッジを介してカップリングし、ボールはその変位をモニタリングするためのビデオカメラ２３０に結合されたズームシステム２４０を用いて頂部を通して観察される。
【００７８】
１μm径の金ボール上で行われた実験により、導波路上でボールが自発的にグループ化し、その後、導波路に沿って４μm／ｓのオーダーの速度で変位するのを立証した。同様に、ガラスボールのグループ化及び変位の可能性が立証される。図１０Ａから図１２Ｃで示したのは：
−図１０Ａから図１０Ｄ；ｔ＝０ｓ（秒）、２ｓ、３ｓでの７０μmの距離を超えた金属粒子の変位であり、
−図１１；金属粒子凝集効果であり、
−図１２Ａ−図１２Ｃ；連続的にｔ＝０ｓ、４ｓ、８ｓで導波路の７０μm部に沿ったガラスボールのグループ化の進展である。
【００７９】
これらの結果は、選別を容易にする粒子のグループ化のために、本発明による方法で用いられるのに有利である。
【００８０】
さらに、導波路を伝搬する光の偏光は金属粒子（例えば、１μm径の金粒子）の平均速度に影響を与える。図１３Ａ及び図１３Ｂはそれぞれ、図１３ＡはＴＥ偏光で金ボールの変位速度（平均速度１．０７μm／ｓ±０．３５）のヒストグラムを示し、図１３ＢはＴＭ偏光で金ボールの変位速度（平均速度３．４６μm／ｓ±０．８１）のヒストグラムを示す。
【００８１】
従って、結果は、ＴＥ（電気的横波）モードよりＴＭ（磁気的横波）モードの方が約３倍変位速度が大きいことを示している。従って、等しい入射パワーであれば、導波路に入射される光の偏光は金粒子の速度を大きく変更し得る。
【００８２】
繰り返すが、これらの結果は、偏光効果に起因した改良された選別により、本発明による方法で用いられるのに有利である。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】公知技術を示す図である。
【図２】公知技術を示す図である。
【図３】公知技術を示す図である。
【図４Ａ】本発明による選別方法の実施例を示す図である。
【図４Ｂ】本発明による選別方法の実施例を示す図である。
【図５Ａ】本発明による選別方法の実施例を示す図である。
【図５Ｂ】本発明による選別方法の実施例を示す図である。
【図６Ａ】本発明による選別方法の実施例を示す図である。
【図６Ｂ】本発明による選別方法の実施例を示す図である。
【図７Ａ】本発明による選別方法で用いられ得る導波路の製造における各段階を示す図である。
【図７Ｂ】本発明による選別方法で用いられ得る導波路の製造における各段階を示す図である。
【図７Ｃ】本発明による選別方法で用いられ得る導波路の製造における各段階を示す図である。
【図７Ｄ】本発明による選別方法で用いられ得る導波路の製造における各段階を示す図である。
【図８】本発明による選別方法で用いられ得る導波路の製造における各段階を示す図である。
【図９】本発明による選別方法を観察する装置を示す図である。
【図１０Ａ】実験結果を示す図である。
【図１０Ｂ】実験結果を示す図である。
【図１０Ｃ】実験結果を示す図である。
【図１０Ｄ】実験結果を示す図である。
【図１１】実験結果を示す図である。
【図１２Ａ】実験結果を示す図である。
【図１２Ｂ】実験結果を示す図である。
【図１２Ｃ】実験結果を示す図である。
【図１３Ａ】２つの異なる偏光についての金粒子の変位速度のヒストグラムを示す図である。
【図１３Ｂ】２つの異なる偏光についての金粒子の変位速度のヒストグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００８４】
１００  粒子
１０４  導波路
１０８  支持体
１１４，１１６，１１８  クラスター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2007520332.tif 000018
【図１０Ｂ】
2007520332.tif 000019
【図１０Ｃ】
2007520332.tif 000020
【図１０Ｄ】
2007520332.tif 000021
【図１１】
2007520332.tif 000022
【図１２Ａ】
2007520332.tif 000023
【図１２Ｂ】
2007520332.tif 000024
【図１２Ｃ】
2007520332.tif 000025
【図１３Ａ】
2007520332.tif 000026
【図１３Ｂ】
2007520332.tif 000027
【国際調査報告】
2007520332.tif 000028
2007520332.tif 000029
2007520332.tif 000030