(57)【要約】抗体および／または融合タンパク質は、ＩｇＧ２由来部分およびＩｇＧ４由来部分を含む領域を含む。好ましくは、上記ＩｇＧ２由来部分は、少なくとも重鎖定常領域１およびヒンジ領域を含み、そして上記ＩｇＧ４由来部分は、重鎖定常領域２のほとんどおよび重鎖定常領域３の全体を含む。本開示に従う遺伝子操作された重鎖定常領域を有する、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する抗体は、所望されない抗体媒介性の細胞活性化および炎症事象を減少し（補体活性化の低下を含む）、これは、Ｆｃレセプター抗体の関与の結果としてもたらされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体媒介性の細胞活性化または炎症事象を減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、少なくともＣＨ１領域およびヒンジ領域は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来であり、そしてＣＨ２領域の少なくとも部分およびＣＨ３領域の少なくとも部分は、１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来である、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、ヒト補体成分に結合する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、サイトカインレセプターに結合する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、接着分子に結合する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、細胞分化抗原に結合する、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、細胞活性化抗原に結合する、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、サイトカインに結合する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、ケモカインに結合する、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、増殖因子に結合する、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、細胞分化を誘導する分子に結合する、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、細胞活性化を誘導する分子に結合する、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する、方法。
【請求項１５】
サイトカイン放出を防止または減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項１６】
サイトカイン放出症候群の重篤化を防止または減少するための方法であって、該方法は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を投与する工程を包含し、該抗体は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、方法。
【請求項１７】
非Ｆｃ成分およびＦｃ領域を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する、融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、少なくともＣＨ１領域の部分を含む、融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、ＣＨ１領域のどの部分も含まない、融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、少なくともヒンジ領域の一部を含む、融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、抗体フラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、単鎖、ｓｃＦｖ、ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）’２からなる群より選択されるメンバーである、融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも部分内に挿入されるかまたはその代わりに挿入される模倣ペプチドを有する抗体の可変領域を含む、融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、ペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、タンパク質またはそのフラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項２６】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、サイトカイン、ホルモン、酵素、リガンド、増殖因子、レセプターおよび抗体フラグメントからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すペプチド、ＧＨＲ活性を示すペプチド、プロラクチン活性を示すペプチド、神経増殖因子模倣物、ＩＬ−２模倣物、グリコーゲン様ペプチド−１、テトラペプチドＩ（Ｄ−リシン−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−トリシン）、ｖＭＩＰ−ＩＩのＮ−末端ペプチド、トロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド（ＡＦＬＡＲＡＡ）、ペプチドＣＧＲＰ、レセプターアンタゴニストＣＧＲＰ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）−１レセプターアンタゴニスト、酸性繊維芽細胞増殖因子結合ペプチド、ヒト脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ｈＢＮＰ）、エキセンディン４、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＰＬ−２（１−３４）、グルカゴン、ＰＡＣＡＰ−３８、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝増殖因子（ＨＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔ−２癌原遺伝子（ｗｎｔ−２）の産物およびヒト細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原４の結合ドメインからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項２８】
非Ｆｃ成分の半減期を上昇する方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項２９】
非Ｆｃ成分の、該非Ｆｃ成分が結合する分子に対するアビディティを上昇する方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項３０】
非Ｆｃ成分の二量体を形成する方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項３１】
非Ｆｃ成分の精製を容易にする方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項３２】
Ｆｃレセプター結合およびＦｃ融合タンパク質と関連する補体活性化を減少または除去する方法であって、該方法は、非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記Ｆｃレセプター結合および補体活性化は、インビトロで減少または除去される、方法。
【請求項３４】
哺乳動物細胞において、非Ｆｃ成分の発現を改善する方法であって、該方法は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域に融合された、該非Ｆｃ成分を有するＦｃ融合タンパク質を生成することによる、方法。
【請求項３５】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、前記非Ｆｃ成分のアミノ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、前記非Ｆｃ成分のカルボキシ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項３７】
請求項１７に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３８】
イントロンを含む、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
イントロンを含まない、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４０】
請求項３７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４１】
請求項３９に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項４２】
請求項１７に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、それぞれ、２００３年５月３０日および２００４年４月１９日に出願された、米国仮出願６０／４７５，２０２および６０／５６３，５００に対する優先権を主張し、これらの開示全体が、本明細書中でこの参考として援用される。
【０００２】
（背景）
（１．技術分野）
本開示は、遺伝的に操作された抗体および融合タンパク質の分野に関する。より詳細には、本開示は、ＩｇＧ２由来部分およびＩｇＧ４由来部分を含む領域を含む、抗体および／または融合タンパク質に関する。
【０００３】
（２．関連分野の背景）
抗体は、Ｂリンパ球によって産生され、そして感染から防御する。抗体の基本構造は、ジスルフィド結合によって一緒に連結された２つの同一の軽ペプチド鎖および２つの同一の重ペプチド鎖からなる。各鎖のアミノ末端に位置する第１のドメインは、アミノ酸配列が変化可能であり、各個体において見出される抗体結合特異性の広範な幅を提供する。これらは、可変重領域（ＶＨ）および可変軽領域（ＶＬ）として公知である。各鎖の残りのドメインは、アミノ酸配列が比較的変化せず、そして定常重領域（ＣＨ）および定常軽領域（ＣＬ）として公知である。抗体の主なクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭであり；そしてこれらのクラスは、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分割され得る。例えば、上記ＩｇＧクラスは、４つのサブクラス（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）を有する。上記種々のヒト抗体クラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＭのみが、補体系を有効に活性化することが公知である。
【０００４】
抗体クラス間の違いは、上記重鎖の違いに由来する。抗体の成熟の間にクラススイッチが生じることが、公知である。上記基本的な抗体分子は、二機能性構造であり、ここで、上記可変領域が抗原に結合し、他方、残りの定常領域は、特定のエフェクター機能を惹起する。上記ヒンジ領域は、タンパク分解性の切断に対して特に感受性であり；このようなタンパク分解は、切断の正確な部位に依存して、２つまたは３つのフラグメントを与える。上記ヒンジ領域は、上記抗原結合領域（各々は、軽鎖および重鎖の最初の２つのドメインからなる）が、抗体の残部に対して自由に移動または回転できるようにし、この抗体の残部は、残りの重鎖ドメインを含む。上記定常領域は、抗原結合部位を形成しないが、上記定常ドメインおよびヒンジドメインの配置は、それが上記抗原と結合できるようにする分子に対して、セグメント柔軟性を与える。
【０００５】
上記抗原と上記抗体との間の相互作用は、複数の結合および引力（例えば、水素結合、静電力およびファン・デル・ワールス力）の形成によってなされる。これらは一緒になってかなりの結合エネルギーを形成し、このエネルギーは、上記抗体が上記抗原に結合することを可能にする。抗体結合の親和性およびアビディティは、抗体の生理学的特性および病理学的特性に影響を与えることが見出されている。
【０００６】
遺伝子操作技術の出現は、均一な抗体（モノクローナル抗体）の非限定量を生成する種々の手段をもたらし、これらの抗体は、アイソタイプに依存して、種々の程度のエフェクター効果を示す。例えば、特定のマウスアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２）およびヒトアイソタイプ（特に、ＩｇＧ１）は、細胞（例えば、単球、Ｂ細胞およびＮＫ細胞）上のＦｃレセプターに結合し得、従って、上記細胞を活性化してサイトカインを放出する；このような抗体アイソタイプはまた、局所的または全身的な炎症結果を伴う補体活性化においても強力である。これらのＦｃレセプター結合定常領域を有する抗体が、インビボで注射される場合、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン２（ＩＬ−２）および／または他のサイトカインの一時的ではあるが著しい全身性の放出は、Ｆｃレセプター−抗体結合を介した複数の細胞型（リンパ球または単球を含む）の活性化の結果として、放出され得る。上記サイトカイン放出は、通常、高熱、悪寒および頭痛を伴うが、稀に、より深刻でかつ生命を脅かし得る症状（例えば、肺水腫、髄膜炎、神経毒性、低血圧および呼吸窮迫（サイトカイン放出症候群すなわちＣＲＳ））に進行し得る。マウス抗体ＯＫＴ３は、ＣＲＳを生じる重大なサイトカイン放出を引き起こすことが観察されている抗体の１つである。ヒトＣＤ３部分は、少なくとも４つの不変ポリペプチド鎖からなっており、このポリペプチド鎖は、Ｔ細胞表面上でＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）と非共有結合的に会合し、これは、代表的に、Ｔ細胞レセプター複合体と呼ばれる。上記Ｔ細胞レセプター複合体は、上記Ｔ細胞レセプターへの抗原結合の際に、Ｔ細胞活性化において重要な役割を担う。いくつかの抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）は、抗原−ＴＣＲ結合の非存在下で、Ｔ細胞を活性化し得る。このような活性化は、ｍＡｂのＦｃ部分とアクセサリー細胞上のＦｃレセプターとの間の相互作用に依存して、Ｔ細胞上のＣＤ３複合体の架橋を可能にする。可溶性抗ＣＤ３ｍＡｂは、それらが（人工的にＣＤ３架橋を促進する）プラスチックに結合されるか、またはＦｃレセプターを有する細胞に結合されなければ、Ｔ細胞を刺激してインビトロで増殖することをしない。
【０００７】
これらの事象が許容されないかおよび／または有害である環境における、抗体媒介性の細胞活性化事象（例えば、サイトカイン放出）を減少することが、所望される。多くの実験室は、減少したＦｃレセプター結合、補体活性化の欠如などのような特徴を示す種々の定常領域を有する抗体を遺伝子操作することにより、強力なエフェクター機能（例えば、ＯＫＴ３によって観察されるエフェクター機能）に関連する、負の効果を減少することを試みている。
【０００８】
従って、独自の定常領域の組み込みによって、遺伝子操作された抗体においてエフェクター機能を低下することは、本明細書中の目的である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（要旨）
遺伝子操作された重鎖定常領域を有する組み換え抗体が、本明細書中に記載される。上記遺伝子操作された定常領域は、ＩｇＧ２由来部分およびＩｇＧ４由来部分を含む。好ましくは、上記ＩｇＧ２由来部分は、少なくとも重鎖定常領域１およびヒンジ領域を含み、そして上記ＩｇＧ４由来部分は、重鎖定常領域２のほとんどおよび重鎖定常領域３の全体を含む。本開示に従う遺伝子操作された重鎖定常領域を有する、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する抗体は、所望されない抗体媒介性の細胞活性化および炎症事象を減少し（補体活性化の低下を含む）、これは、Ｆｃレセプター抗体の関与の結果としてもたらされる。
【００１０】
別の局面において、本開示は、抗体重鎖を生成するためのプロセスに関し、このプロセスは、以下の工程を包含する：（ａ）可変領域および定常領域を含む抗体重鎖をコードする配列を含むＤＮＡ配列を有する発現ベクターを生成する工程；（ｂ）上記定常領域を、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分から構成する工程；（ｃ）宿主細胞に上記ベクターをトランスフェクションする工程；および（ｄ）上記トランスフェクションされた細胞株を培養して、遺伝子操作された抗体重鎖分子を生成する工程であって、この抗体重鎖分子は、抗体軽鎖と会合して、機能的抗体分子を生成する、工程。
【００１１】
別の局面において、本開示は、軽鎖に結合して機能性抗体分子を生成する１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を有する抗体を使用し、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子を介して、抗体媒介性の細胞活性化および炎症性事象を減少するための方法に関する。
【００１２】
別の実施形態において、本開示によるＩｇＧ２由来の部分およびＩｇＧ４由来の部分を含む遺伝子操作された定常領域は、融合タンパク質のＦｃ領域として使用される。その融合タンパク質は、ＩｇＧ２由来の部分およびＩｇＧ４由来の部分を含むように遺伝子操作されたＦｃ領域に融合する非Ｆｃ成分を含む。好ましくは、ＩｇＧ２由来の部分は、少なくとも重鎖定常領域１およびヒンジ領域を含み、そしてＩｇＧ４由来の部分は、重鎖定常領域２のほとんど、および重鎖定常領域３の全体を含む。好ましくは、本開示によるその融合タンパク質は、非Ｆｃ成分の機能を維持し、および／または非Ｆｃ成分単独と比較して半減期を増大し、ならびに／またはＦｃレセプター抗体結合および補体活性化より生じる事象を含む所望されない抗体Ｆｃ媒介性の細胞活性化および炎症性性質を欠く。
【００１３】
そのような融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子がまた、提供される。トランスフェクトされた哺乳類細胞における異種発現の際に、その融合タンパク質は、安定な形態で強力に分泌され、抗体および非Ｆｃ成分前分子（ｐｒｅｄｅｃｅｓｓｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に特徴的な所望の性質を示す。これらの融合タンパク質は、モノクローナル抗体に関連する従来の適用（フローサイトメトリー、免疫組織化学、細胞ベースのアッセイおよび免疫沈降を含む）において使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
組み換え抗体は、抗体−Ｆｃレセプター相互作用より生じる抗体媒介性の細胞活性化および炎症性事象を減少するのに役立つ、遺伝子操作された重鎖定常領域とともに記載される。遺伝子操作された重鎖定常領域は、１つ以上のヒト抗体のＩｇＧ２サブクラス由来の部分および１つ以上のヒト抗体のＩｇＧ４サブクラス由来の部分を含む。当業者は、抗体重鎖が、可変領域および定常領域を含むことを理解する。重鎖定常領域は、重鎖定常領域１（ＣＨ１）、ヒンジ領域、重鎖定常領域２（ＣＨ２）、および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、またはＣＨ３のうちの１つの少なくとも一部は、現在の遺伝子操作された重鎖中のヒトＩｇＧ２抗体由来であり、遺伝子操作された重鎖の残りの少なくとも一部は、ヒトＩｇＧ４抗体由来である。好ましくは、遺伝子操作された重鎖全体は、ヒトＩｇＧ２部分およびヒトＩｇＧ４部分の組み合わせ由来である。
【００１５】
重鎖定常領域の２つ以上の不連続な部分が、ＩｇＧ２抗体由来であり得ることが理解されるべきである。そのような環境において、その部分は、ＩｇＧ２サブクラス内の同じ抗体か、または異なる抗体（すなわち、異なるアロタイプを有する抗体）由来であり得る。同様に、重鎖定常領域の２つ以上の不連続な部分は、ＩｇＧ４抗体由来であり得る（公知のＩｇＧ４アロタイプは１つのみであることに留意）。
【００１６】
図１に図式的に示される特定の有用な実施形態において、遺伝子操作された重鎖定常領域は、ＩｇＧ２サブクラスの１つ以上のヒト抗体由来のＣＨ１領域およびヒンジ領域、ならびに主にＩｇＧ４サブクラスの抗体由来のＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。遺伝子操作された抗体は、マウス−ヒトキメラ抗体（図１Ａ）；ヒト化抗体（図１Ｂ）；または完全なヒト抗体（図１Ｃ）の形態であり得る。
【００１７】
ヒトＩｇＧ２抗体由来の部分およびヒトＩｇＧ４抗体由来の部分は、定常領域および／またはヒンジ領域の間の接合部において、正確に終結する必要はない。例えば、以下に示される使用した実施例において（図２を参照のこと）、ＩｇＧ２抗体由来の部分は、２，３のアミノ酸までヒンジ領域をこえて定常領域２に伸び、重鎖定常領域の残りの部分は、ＩｇＧ４抗体由来の部分である。
【００１８】
本開示による、遺伝子操作された重鎖定常領域の１例は、図２に示される配列（配列番号１）を有する。図２はまた、遺伝子操作された重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【００１９】
重鎖定常領域のＩｇＧ２部分およびＩｇＧ４部分は、過剰なサイトカイン放出を生じ、強力にサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を誘導し得る細胞相互作用を軽減するように選択される。本開示による、遺伝子操作された重鎖定常領域はまた、炎症性事象（例えば、細胞活性化、サイトカイン放出、および補体の活性化）を誘発する抗体の能力を、減少する。
【００２０】
抗体の重鎖定常領域は、その結合特異性について選択され、そして任意の型（例えば、非ヒト、ヒト化、または完全なヒト）であり得る。その抗体の重鎖可変領域が非ヒト（例えば、マウス）であり、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合に、生じた組換え抗体は、キメラ抗体と称される（図１Ａを参照のこと）。抗体の重鎖可変領域が、ヒト化され、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合、生じた組換え抗体は、ヒト化抗体と称される（図１Ｂを参照のこと）。抗体の重鎖可変領域がヒトであり、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域と組換え結合される場合に、生じた組換え抗体は、完全なヒト抗体と称される（図１Ｃを参照のこと）。図１Ｂに示される実施形態において、その重鎖の可変領域は、ヒト化され、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（この場合はマウス）相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。そのフレームワーク領域が、１つ以上の供給源由来であり得、ＣＤＲが、１つ以上の供給源由来であり得ることが理解されるべきである。抗体のヒト化の方法は、当業者に公知であり、例えば、米国特許第６，４７９，２８４号；同第６，４０７，２１３号；同第６，３５０，８６１号；同第６，１８０，３７０号；６，５４８，６４０号；および２００２年１２月３日に出願された係争中の米国特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／３８４５０に開示される。これらの特許および特許出願の各々の開示は、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２１】
抗体の軽鎖は、ヒト、非ヒト、またはヒト化であり得る。図１Ｂに示される実施形態において、その軽鎖は、ヒト化され、ヒトフレームワーク領域、非ヒト（この場合マウス）のＣＤＲおよびヒト定常領域を含む。そのフレームワーク領域は、１つ以上の供給源由来であり得、そのＣＤＲ領域は、１つ以上の供給源由来であり得ることが理解されるべきである。
【００２２】
操作された重鎖定常領域を含む上記抗体は、細胞表面分子、または細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する能力に基づいて選択される。従って、例えば、上記抗体は、サイトカインレセプター（例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＴＮＦ−αＲ、ＩＬ−１５Ｒなど）；接着分子（Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｌ−セレクチン、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭなど）；細胞分化抗原または活性化抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ４０など）およびその他のような細胞表面分子に結合する、その能力に基づいて選択され得る。あるいは、上記抗体は、細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する、その能力に基づいて選択され得る。そのような可溶性分子としては、サイトカインおよびケモカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６など）；成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＰＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦなど）；細胞分化を誘導する分子（例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＰＴＮなど）およびその他が挙げられるが、これに限られない。
【００２３】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、完全な抗体およびＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも２つを含む抗体フラグメントを含む。完全なモノクローナル抗体が、好ましい。
【００２４】
一般的に、本明細書中に開示される上記抗体の構築は、遺伝子工学技術において利用される、認められた操作を使用して行われる。例えば、ＤＮＡの単離、ＤＮＡの発現のための、ベクターの作製および選択、核酸の精製および核酸の分析、組換えベクターＤＮＡを作製するための特定の方法、制限酵素を用いたＤＮＡの切断、ＤＮＡのライゲーション、安定なまたは過渡的な手段による、ベクターＤＮＡを含むＤＮＡの宿主細胞への導入、ＤＮＡを発現する細胞を選択および維持するための、選択培地または非選択培地における宿主細胞の培養に関する技術は概して、当該分野において公知である。
【００２５】
本明細書に開示される上記モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５）、または当業者にとって周知である、他の組換えＤＮＡ法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、リンパ球による抗体の産生を誘発するタンパク質によって、免疫化される。あるいは、リンパ球は、インビトロにおいて免疫化され得る。上記抗原に応じて作製された上記リンパ球は、その後、ハイブリドーマ細胞（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））を形成する適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、骨髄腫細胞と融合される。上記ハイブリドーマ細胞は、その後、好ましくは、融合していない、親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適切な培養培地中に播種され、および増殖させられる。好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、上記選択された抗体産生細胞による、抗体の安定した産生を支持し、そしてＨＡＴ培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．Ｈ−０２６２）のような培地に対して非感受性である骨髄腫細胞である。これらの内で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウスの骨髄腫株（例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡより入手可能なＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡより入手可能なＳＰ−２０、ＮＳ０またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞に由来するマウス骨髄腫株）である。
【００２６】
上記ハイブリドーマ細胞は、選択培養培地（例えば、ＨＡＴ）中で増殖させられ、そして生存する細胞は、上記抗原に対するモノクロナール抗体の産生のために、増やされおよびアッセイされる。ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクロナール抗体の結合特異性は、アッセイ（例えば、免疫沈降剤、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、細胞活性化アッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって決定され得る。
【００２７】
ハイブリドーマ細胞が所望の、特異性、親和性および／または活性を有する抗体を産生することが確認された後に、そのクローンは、限界希釈手順によってサブクローン化され得、そして標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））によって増殖され得る。さらに、上記ハイブリドーマ細胞は、インビボにおいて、動物の腹水腫瘍として増殖され得る。上記サブクローンによって分泌されたモノクロナール抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、またはアフィニティークロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水、または血清から適切に分離される。モノクロナール抗体をコードするＤＮＡは、通常の方法を使用して（例えば、モノクロナール抗体の、重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に、特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブの使用によって）、容易に単離され、配列決定される。上記ハイブリドーマ細胞は、好ましくはそのようなＤＮＡの供給源として機能する。一旦単離されると、上記ＤＮＡは発現ベクターの中に配置され得、この発現ベクターは、その後、他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、または哺乳動物細胞）にトランスフェクトされ、上記組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を達成する。抗体または抗体フラグメントはまた、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して作製される抗体ファージライブラリーから単離され得る。他の刊行物は、チェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）による高親和性（ｎＭ領域）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きいファージライブラリーを構築するためのストラテジーとして、感染およびインビボにおける組換えの組み合わせを記載する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））。従って、これらの技術は、モノクロナール抗体における代表的なモノクロナール抗体ハイブリドーマ技術についての実行可能な代替技術である。
【００２８】
本明細書中に記載される上記抗体は、その後、本発明の操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常ドメインについてのコード配列と、重鎖可変ドメインについてのコード配列とを組み合わせることによって改変され得る。本発明の組換え抗体が、特定のマウス抗体に基づく場合、例えば、この開示による操作された重鎖定常領域は、上記相同なマウス配列の位置に置換され得る。あるいは、機能的抗体フラグメントが（例えば、ヒトファージライブラリー、ｓｃＦｖライブラリーまたはＦａｂライブラリーのパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）によって）同定され得、ここで本発明の操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４由来のヒト重鎖定常ドメインが、操作され得る。
【００２９】
別の局面において、この開示は、上記操作された重鎖定常領域を作製するために必要な、合成の核酸フラグメント、ゲノム由来の核酸フラグメントまたはｃＤＮＡ由来の核酸フラグメントを含む、組換え発現ベクターを提供する。任意の上記操作された重鎖定常領域、またはこの開示による上記操作された重鎖定常領域を含む抗体をコードするヌクレオチド配列は、上記挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含む適切なベクター内に挿入され得る。任意の適切な宿主細胞ベクターは、キメラ重鎖およびキメラ軽鎖、またはＣＤＲ移植重鎖およびＣＤＲ移植軽鎖をコードするＤＮＡ配列の発現に使用され得る。細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）系および他の微生物系が、使用され得る。真核生物（例えば、哺乳動物）宿主細胞発現系もまた、本発明の抗体を得るために使用され得る。適切な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  Ｃ  Ｒ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２  １３６−１４５）；および骨髄腫細胞系およびハイブリドーマ細胞系（例えば、ＮＳＯ細胞（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，１０：１６９−１７５（１９９２））が挙げられる。
【００３０】
上記操作された重鎖定常領域を含む抗体はまた、治療薬とともに与えられる別々に投与される組成物として使用され得る。診断目的のため、上記抗体は、標識されても、または標識されなくともどちらでもよい。非標識抗体は、上記操作された抗体と反応する他の標識抗体（第２抗体）（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域に特異的な抗体）と組み合わせて使用され得る。あるいは、上記抗体は、直接標識され得る。多様な標識（例えば、放射性核種、蛍光、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド（特に、ハプテン）など）が、利用され得る。免疫学的アッセイの多くの型が利用可能であり、これらは、当業者に周知である。
【００３１】
本発明の操作された抗体は、薬学的キャリアーを含む組成物中で、患者に投与され得る。薬学的キャリアーは、患者への上記抗体の送達に適した任意の適合性のある、非毒性物質であり得る。滅菌水、アルコール、脂質、ワックス、および不活性な固体が、上記キャリアーに含まれ得る。薬学的に受容された補助剤（緩衝剤、分散剤）もまた、上記薬学的組成物中に組み込まれ得る。
【００３２】
上記抗体組成物は、多くの経路によって、患者に投与され得る。好ましくは、上記薬学的組成物は、非経口的に（例えば、皮下に、筋肉内に、または静脈内に）投与され得る。従って、非経口投与における組成物としては、抗体の溶液、抗体フラグメントの溶液、または受容可能なキャリアー、好ましくは水溶性のキャリアーに溶解したこれらの反応混液が挙げられ得る。多くの水溶性のキャリアーが使用され得る（例えば、水、緩衝化された水、０．４％食塩水、０．３％グリシンなど）。これらの溶液は、無菌であり、そして概して粒子状物質を含まない。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得る。上記組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤などのような適切な生理的条件のために必要とされる薬学的に受容可能な補助的物質（例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酪酸ナトリウムなど）を含み得る。これらの処方物における、抗体または抗体フラグメントの濃度は、大きく変動し得、例えば、約０．５重量％未満（通常は、約１重量％または少なくとも約１重量％）から１５重量％または２０重量％であり、そして選択された特定の投与形態に従い、主として流体容量、流体粘度などに基づいて選択される。
【００３３】
被験者への投与に必要な、非経口的に投与可能な組成物および調整剤を調製するための実際の方法は、当業者にとって公知であるか、または明白であり、そして、例えば、参考として本明細書中に援用されるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１７版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ（１９８５）中に、より詳細に記載される。
【００３４】
別の実施形態において、本開示は、ＩｇＧ２由来部分およびＩｇＧ４由来部分を含むために操作されたＦｃ領域に融合する非Ｆｃ成分を含む融合タンパク質を提供する。上記Ｆｃ領域は、抗体に関して上述した多様な実施形態のいずれかに従って操作された定常領域であり得る。上記Ｆｃ領域は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの全てまたは任意の部分を含み得、ただしＦｃ領域は少なくとも１つのＩｇＧ２由来部分および少なくとも１つのＩｇＧ４由来部分を含む。好ましくは、上記ＩｇＧ２由来部分は、少なくとも重鎖定常領域１およびヒンジ領域を含み、そして上記ＩｇＧ４由来部分は、上記重鎖定常領域２の大部分および重鎖定常領域３全体を含む。リンカーは必要に応じて、上記非Ｆｃ成分と上記Ｆｃ成分との間に提供され得る。存在する場合、上記リンカーは、３〜２５アミノ酸長であり得る。特に有用な実施形態において、上記リンカーは、適切なフォールディングおよびそれによる上記非Ｆｃ成分の機能の維持に役立つ。
【００３５】
本開示に従う好ましい融合タンパク質は、好ましくは上記タンパク質の非Ｆｃ部分の機能を維持しおよび／または上記非Ｆｃ部分単独に比べて、延長した半減期を有する。さらに、本開示に従う上記融合タンパク質は、好ましくは、不要な、抗体Ｆｃ媒介性の細胞活性化ならびにＦｃレセプターと抗体の結合および補体活性化により生じる事象を含む炎症特性を欠く。上記ヒンジ領域を含む本開示の特定の実施形態に従う融合タンパク質はまた、他の融合タンパク質分子とジスルフィド結合を形成する能力を有し、これにより、非Ｆｃ部分が結合する分子に対する結合力が向上し得る二量体形成を生じる。
【００３６】
本開示に従う融合タンパク質は、上記分子をコードしたＤＮＡをトランスフェクトした哺乳動物細胞によって、安定した形態で容易に分泌され得る。さらに、それらは、迅速で、効率的な精製（例えば、プロテインＡを使用する）をうけて均質になる。従って、これらの分子は、商業的に有用な量および形態で得ることが可能なため、本文中におけるモノクロナール抗体（例えば、流動細胞計測法、免疫組織化学、免疫沈降、細胞ベースのアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））についての有利な代用品である。
【００３７】
有用な特性を示す任意のペプチドまたはタンパク質は、上記融合タンパク質を調製する本発明の操作された抗体定常領域と結合される、上記非Ｆｃ成分としての使用に適している。ペプチド活性またはタンパク質活性およびペプチドの使用またはタンパク質の使用としては、タンパク質アゴニストまたはタンパク質アンタゴニストとしての働き、レセプターへの結合、表面分子が結合した膜への結合、可溶性タンパク質への結合、リガンドへの結合、酵素もしくは構造タンパク質への結合、レセプターの活性化または阻害、標的薬物の送達、または任意の酵素活性が挙げられるが、これらに限られない。Ｆｃドメインとの組み合わせで存在する場合に、そのペプチドまたはタンパク質に与えられる向上した安定性および向上した半減期からその有用性が増加し得るペプチドまたはタンパク質が、通常選択される。本明細書中で使用される「生物学的活性」としては、生物系における活性を有する分子に関連した任意の活性が挙げられ、活性は、タンパク質−タンパク質相互作用によって誘発される、促進的な活性または抑制的な活性、ならびにタンパク質−タンパク質複合体の安定性を含むそのような相互作用を取り巻く動態を含むが、これに限られない。従って、非Ｆｃ成分としての使用に適する分子の非限定的な例としては、サイトカイン、ホルモン、酵素、リガンド、成長因子、レセプターおよび抗体フラグメントが挙げられる。
【００３８】
本発明の融合タンパク質の調製に使用するのに適切な、適切な非Ｆｃ成分としては、以下が挙げられる：リガンド誘導性ホモ二量体化によって活性化されるレセプターに結合するペプチド（ＷｈｉｔｔｙおよびＢｏｒｙｓｅｎｋｏ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．，（１９９９）Ａｐｒ  ６（４）：Ｒ１０７−１８に記載されるような、Ｇ−ＣＳＦ活性、ＧＨＲ活性およびプロラクチン活性を示す活性フラグメントが挙げられる）；適切なペプチド他の例としては、Ｚａｃｃａｒｏら，Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（２０００）４３（１９）；３５３０−４０に記載されるようなＣＤループ由来の神経成長因子模倣体；Ｅｃｋｅｎｂｅｒｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６５（８）：４３１２−８に記載されるようなＩＬ−２模倣体；Ｅｖａｎｓら，Ｄｒｕｇｓ  Ｒ．Ｄ．（１９９９）２（２）：７５−９４に記載されるような、グルカゴン様ペプチド−１；Ｇａｇｎｏｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ（２０００）１８（１８）：１８８６−９２に記載されるような、マイトジェン活性化Ｂ細胞増殖を刺激する、テトラペプチドＩ（Ｄ−リジン−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシン）；ヒト細胞障害性Ｔリンパ球関連抗原４の結合ドメイン。レセプター拮抗性活性を示すペプチドもまた、企図される。例えば、Ｌｕｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９（４４）：１３５４５−５０に記載されるような、ＨＩＶ治療のためのＣＸＣＲ４のアンタゴニストとしての、ｖＭＩＰ−ＩＩのＮ−末端ペプチド；Ｐａｋａｌａら，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．（２０００）１００（１）：８９−９６に記載されるような、抗血栓治療のための、トロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド（ＡＦＬＡＲＡＡ）；Ｐｏｗｅｌｌら，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０００）１３１（５）：８７５−８４に記載されるような、麻酔薬への耐性を減弱させるための、ペプチドＣＧＲＰレセプターアンタゴニストＣＧＲＰ（８−３７）；Ｈｏａｒｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．（２０００）２９５（２）：７６１−７０に記載されるような、灰白隆起漏斗ペプチド（７−３９）として公知の副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）−１レセプターアンタゴニスト；Ｚａｇｏｎら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．（２０００）１７（５）：１０５３−６１に記載されるような、オピオイド増殖因子；Ｙａｎｏｆｓｋｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３，ｐｐ．７３８１−７３８６，Ｊｕｌｙ  １９９６およびＶｉｇｅｒｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ  ２７５，Ｎｏ  ４７，３６９２７−３６９３３頁，２０００に開示されるような、高親和性Ｉ型インターロイキン１レセプターアンタゴニスト；ならびに、Ｆａｎら，ＩＵＢＭＢ  Ｌｉｆｅ（２０００）４９（６）５４５−４８に記載されるような、酸性線維芽細胞増殖因子結合ペプチド。本開示に従う、Ｆｃ領域に融合し得る生物学的に活性なペプチドのさらなる例としては、うっ血性心不全に対する身体の応答の一部として、心臓によって分泌されるタンパク質（例えば、Ｍｕｋｏｙａｍａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７（４）：１４０２−１２（１９９１）およびＣｌｅｍｅｎｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘ���．Ｔｈｅｒ．２８７（１）：６７−７１（１９９８）に記載されるような、ヒト脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ｈＢＮＰ）など）が挙げられる。本開示にしたがって使用され得る、生物学的に活性なペプチドのさらなる例としては、（例えば、グルコース依存性インシュリン分泌作用によって）β細胞機能を保存もしくは改善する潜在能力を有するタンパク質（例えば、エキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＰＬ−２（１−３４）、グルカゴンもしくはＰＡＣＡＰ−３８など）が挙げられる（Ｒａｕｆｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７（３０）：２１４３２−７（１９９２）を参照のこと）。抗体フラグメントもまた、上記融合タンパク質の非Ｆｃ成分として利用され得ることが理解されるべきである。したがって、例えば、この非Ｆｃ成分は、ｓｃ−Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）もしくはＦ（ａｂ）１２であり得る。別の例として、この非Ｆｃ成分は、ＷＯ  ０２／４６２３８  Ａ２（この開示は、本明細書においてその全体が参考として援用される）に記載されるような、模倣ペプチドが挿入されているかまたは１つ以上のＣＤＲ領域と置き換えられている、抗体の可変領域であり得る。
【００３９】
したがって、例えば、上記融合タンパク質の作製のために使用される上記非Ｆｃ成分は、増殖因子であり得る。増殖因子の例としては、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インシュリン、神経成長因子（ＮＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝性増殖因子（ＨＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔ−２プロトオンコジーンの産物（ｗｎｔ−２）が挙げられる。Ａａｒｏｎｓｏｎ（上述）；Ｎｏｒｍａｎら，ＨＯＲＭＯＮＥＳ，ｐｐ．７１９−７４８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）。全般的には、Ｈｅａｔｈ（編），ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）もまた参照のこと。
【００４０】
（１．融合タンパク質の作製）
（Ａ．融合タンパク質発現ベクターの構築）
ＩｇＧ２由来部分およびＩｇＧ４由来部分、ならびに非Ｆｃ部分を含む融合タンパク質を作製するために、当業者の範囲内である任意の技術が使用され得る。適切な技術としては、米国特許第５，６７０，６２５号；同第５，７２６，０４４号；および同第６，４０３，７６９号に開示される方法が挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の１つにおいて、上記融合タンパク質は、哺乳動物細胞によって、適切な形態で分泌され、この融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞をトランスフェクトするのに使用される発現ベクターにサブクローニングされる。抗体配列を含む融合タンパク質の作製のための一般的技術は、Ｃｏｌｉｇａｎら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ｐｐ．１０．１９．１−１０．１９．１１（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２）に記載される（この内容は、本明細書において参考として援用される）。ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  ＣＯＭＰＡＮＩＯＮ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２（Ｎｏ．２），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１），およびＡＮＴＩＢＯＤＹ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＧＵＩＤＥ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ（１９９２）もまた参照のこと（これらにおいて、融合タンパク質の作製に関する記録は、それぞれの教科書全体にわたって散見される）。本発明の方法は、何らかの特定の発現方法に限定されない。したがって、発現は、真核生物（例えば、哺乳動物、昆虫）細胞または原核生物（例えば、細菌）細胞を用いて達成され得、そして上記融合タンパク質は、細胞によって分泌され得るか、または細胞内ペリプラズムもしくは細胞内封入体から回収され得る。
【００４１】
したがって、融合タンパク質の構築工程の１つは、融合タンパク質の一部をクローニングベクターにサブクローニングすることである。ここで、「クローニングベクター」は、宿主原核生物細胞中で自己複製し得るＤＮＡ分子（例えば、プラスミド、コスミドもいくはバクテリオファージ）である。クローニングベクターは、代表的に、１つまたは少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む。この部位においては、このベクターならびにクローニングベクターによって形質転換された細胞の同定および選別に使用するのに適切なマーカー遺伝子の本質的な生物学的機能を失うことなく、確定的な様式で外来ＤＮＡ配列が挿入され得る。マーカー遺伝子は、代表的に、テトラサイクリン抵抗性もしくはアンピシリン抵抗性を提供する遺伝子を含む。適切なクローニングベクターは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）（本明細書においては今後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」とする）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  １９８７）（本明細書においては今後「Ａｕｓｕｂｅｌ」とする）；およびＢｒｏｗｎ（編），ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＬＡＢＦＡＸ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）によって記載されている。適切なクローニングベクターは、市販されている。
【００４２】
上記融合タンパク質のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列は、当業者の範囲内である任意の技術を用いて得ることができる。この融合タンパク質の非Ｆｃ部分をコードするＤＮＡ配列はまた、当業者の範囲内である技術（例えば、非抗体タンパク質を産生する細胞から単離されたＲＮＡを用いたＰＣＲ）を用いて合成され得る。このＤＮＡは、イントロンを含み得るか、またはイントロンの一部もしくは全部を除去するように操作され得る。
【００４３】
上記融合タンパク質の非Ｆｃ成分をコードするＤＮＡ配列は、上記融合タンパク質のＦｃ領域部分のＮ末端を用いてインフレームにサブクローニングされる。サブクローニングは、当業者の範囲内である技術（例えば、適切な末端を提供するための制限酵素消化の使用、望ましくないＤＮＡ分子の結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理の使用、および適切なリガーゼによるライゲーション）によって行われる。このような操作に関する技術は、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌに記載されており、かつ当該分野で周知である。細菌宿主中でクローニングされたＤＮＡを増幅するため、および細菌宿主からのクローニングされたＤＮＡの単離のための技術は、周知である。
【００４４】
Ｆｃ領域が、所望される場合、非Ｆｃ成分のアミノ末端上にクローニングされ得ることは、当然理解されるべきである。
【００４５】
クローニングされた融合タンパク質は、クローニングベクターから切断され、発現ベクターに挿入される。適切な発現ベクターは、代表的に、以下を含む：（１）細菌の複製起点をコードする原核生物ＤＮＡ要素、ならびに細菌宿主中での発現ベクターの増殖および選別を提供するための抗生物質耐性マーカー；（２）転写の開始を制御する真核生物ＤＮＡ要素（例えば、プロモーター）；そして（３）転写産物のプロセシングを制御するＤＮＡ要素（例えば、転写終止配列／ポリアデニル化配列）。
【００４６】
本開示による融合タンパク質は、真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および酵母細胞）中で発現され得る。哺乳動物細胞は、特に好ましい真核生物宿主である。なぜなら、哺乳動物細胞は、適切な翻訳後改変（例えば、グリコシル化）を提供する。哺乳動物宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラットヘパトーム細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換サル腎臓細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）およびマウス胚性細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が挙げられる。
【００４７】
哺乳動物宿主に関して、転写調節シグナルおよび翻訳調節シグナルは、ウイルス源（例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、シミアンウイルスなど）に由来し得る。ここで、その調節シグナルは、高い発現レベルを有する特定の遺伝子に関連する。適切な転写調節配列および翻訳調節配列はまた、哺乳動物遺伝子（例えば、アクチン遺伝子、コラーゲン遺伝子、ミオシン遺伝子、およびメタロチオネイン遺伝子）からも得ることができる。
【００４８】
転写調節配列としては、ＲＮＡ合成の開始を指示するに十分なプロモーター領域が挙げられる。適切な真核生物プロモーターとしては、以下が挙げられる：マウス  メタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：２７３（１９８２））］；ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５（１９８２））；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４（１９８１））；ラウス肉腫ウイルスプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７（１９８２））；およびサイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，Ｇｅｎｅ  ４５：１０１（１９８０））。
【００４９】
あるいは、原核生物プロモーターが真核生物プロモーターによって調節される場合、原核生物プロモーター（例えば、バクテリオファージＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）が、融合遺伝子の発現を制御するために使用され得る。Ｚｈｏｕら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４５２９（１９９０）；Ｋａｕｆｍａｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５（１９９１）。
【００５０】
発現ベクターは、種々の技術を用いて宿主細胞に導入され得る（リン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔法などが挙げられる）。好ましくは、トランスフェクトされた細胞は、選別および増殖される（ここで、この発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに安定に組込まれて安定な形質転換体を産生する）。ベクターを真核生物細胞に導入するための技術、および有力な選択マーカーを用いて安定な形質転換体を選別するための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（２  ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  ＣＯＭＰＡＮＩＯＮ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  １３６（１９９１））、およびＭｕｒｒａｙ（編），ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）によって記載されている。
【００５１】
融合タンパク質を産生する適切な形質転換体は、種々の方法を用いて同定され得る。例えば、適切な形質転換体は、上記融合タンパク質の非抗体部分もしくはその融合タンパク質の抗体部分のいずれかに結合する抗体を用いてスクリーニングされ得る。細胞を同定するための免疫沈降の使用は、当業者に周知の技術である。
【００５２】
融合タンパク質産生細胞が同定された後、その細胞は培養され、そして融合タンパク質が培養上清から単離される。適切な単離技術としては、プロテインＡセファロースアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。プロテインＡは、融合タンパク質を上清から分離するために、特に有用である。
【００５３】
慣習的アッセイが実施されて、融合タンパク質の非Ｆｃ成分が、その機能性を保持しているか否かを決定し得る。
【００５４】
融合タンパク質は、任意の適切なマーカー部分（例えば、放射性同位体、酵素、蛍光色素、化学発光標識、生物発光標識、もしくは常磁性標識）によって、検出可能に標識され得る。このような検出可能に標識された融合タンパク質を作製および検出する方法は、当業者に周知である。
【００５５】
インビトロおよびインサイチュ検出法が使用されて、病的状態の診断および病期分類を補助するのに使用され得る。本開示はまた、インビボ診断のための融合タンパク質の使用を企図する。
【００５６】
本開示による融合タンパク質は、薬学的に受容可能な組成物へと処方され得、そして抗体の実施形態に関して先に記載された様式で投与され得る。
【実施例】
【００５７】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図するものであり、限定することを意図しない。それが代表的に使用され得るものである限り、当業者に公知の他の手順が代替的に使用され得る。
【００５８】
（実施例１）
（操作された重鎖定常領域を有する抗ＣＤ３抗体）
ＯＫＴ３の可変長鎖を、標準的組み換えＤＮＡ法を介して、ヒトＩｇＧ２由来の、第１重鎖定常領域（ＣＨ１）、ヒンジリンカー領域、および第２重鎖定常領域（ＣＨ２）由来の最初の数個のアミノ酸を含むゲノムＤＮＡカセットに結合した。次いで、ヒトＩｇＧ４由来の第２重鎖定常領域（ＣＨ２）の残りおよび第３重鎖定常領域（ＣＨ３）のを含むカセットを添加した。ＩｇＧ２ヒンジ領域およびそれに続くアミノ酸を、Ｆｃ−γレセプターへの抗体結合を最小限にするように選択し、そしてＩｇＧ４領域を、抗体媒介性補体活性を防ぐように選択した。
【００５９】
（操作された重鎖定常領域の調製）
ヒトＩｇＧ２重鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ００５５４；図３Ａ参照）をコードするゲノムＤＮＡ、またはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０１３１６；図３Ｂ参照）をコードするゲノムＤＮＡを、ＦＤＡのＥｄ  Ｍａｘ博士による細菌キャリアプラスミドｐＢＲ３２２におけるインサートとして提供した（図３Ｃ参照）。制限酵素分析および完全ＤＮＡ配列決定により、ヒトＩｇＧ４およびＩｇＧ２定常領域の正しい配列が得られたことを確認した。上記ＩｇＧ４由来インサートを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いた制限酵素消化によって、プラスミドから分離した。このインサートを精製し、切断し、そしてさらなる制限酵素分析に供して、公開されるヒトＩｇＧ４ゲノムＤＮＡの配列を確認した。ゲノムＩｇＧ４インサート（ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ制限酵素切断フラグメント；ＳｍａＩ部位は、翻訳終止部位のおよそ３０ｂｐ  ３’側の、３’未翻訳領域にある）を次いで、発現カセットＡＰＥＸ−１にライゲーションすることによってサブクローニングした（図４Ａおよび図４Ｂ参照、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＨｕＧａｍｍａ４）。ＤＮＡ配列分を行い、ヒトＩｇＧ４の所望の領域の正しい配列を確認した。
【００６０】
ヒトＩｇＧ２をコードするゲノムＤＮＡを含むｐＢＲ３２２プラスミドを、ＩｇＧ２  ＣＨ１、ヒンジ領域およびＣＨ２の第一部分の源として使用した。これらは、ＰｍＩＩおよびＢｓｔ  ＥＩＩで切断され、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＧａｍｍａ４へとサブクローニングされて、対応するＩｇＧ４由来配列と置き換えられる（図５Ａ参照）。得られたキメラＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域の配列を、図５Ｂに示す（ＡＰＥＸ１−３Ｆ４ＶＨＨｕＧ２／Ｇ４）。
【００６１】
（マウスＯＫＴ３可変領域およびヒトＧ２／Ｇ４重鎖定常領域に基づくキメラ抗体の調製）
マウスｍＡｂのＯＫＴ３の重鎖および軽鎖の可変配列は、すでに決定され、そしてＧｅｎＢａｎｋデータベースに委託されている（受入番号は、それぞれ、Ａ２２２６１（図６）およびＡ２２２５９（図７）である）。キメラ抗体を、２つの別個の発現系を用いて、ＯＫＴ３可変領域およびＨｕＧ２／Ｇ４定常領域を用いて生成した。重鎖および軽鎖の可変領域を、重複４０マーオリゴヌクレオチドおよびＰＵＣ１９クローニングベクター中への挿入のためのリガーゼ連鎖反応を用いて、遺伝子合成により構築した。発現系＃１に関して、マウス免疫グロブリンプロモーターおよびリーダーイントロンを有するマウスリーダー配列を含む配列を、５’末端に、そしてスプライスドナー部位を含む配列を３’末端に、ＰＣＲによりつけ加え、ＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩまでのフラグメントとして重鎖および軽鎖（κ）可変領域のための発現カセットを形成した。発現系＃１において使用される、構築されたマウスＯＫＴ３重鎖可変領域およびマウスＯＫＴ３軽鎖可変領域の全ＤＮＡ配列および全アミノ酸配列を、それぞれ図８および図９に示す。
【００６２】
次に、前述の遺伝子操作された重鎖定常領域を、別個のＰＵＣ１９クローニングベクター中へ以下のようにして挿入して、改変した：５’末端にＢａｍＨＩ部位を有する、ネイティブなヒトＩｇＧ４由来の５’未翻訳イントロン配列を、５’末端に加え、そして３’末端にＥｃｏＲＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位を有する天然のヒトＩｇＧ４由来の３’未翻訳配列を、３’末端に加えた。このＨｕＧ２／Ｇ４定常領域を、ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩフラグメントとしてＰｕｃ１９から切除し、重鎖発現ベクターｐＳＶｇｐｔ．ＨｕＧ２Ｇ４の固有のＢａｍＨＩ部位に、正しい向きが選択されるように挿入した。ＢａｍＨＩからＢｇｌＩＩのＨｕＧ２／Ｇ４フラグメントのこの全核酸配列を、図１０に示す。
【００６３】
同様に、構築されたマウスＯＫＴ３重鎖可変領域を、ＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩのフラグメントとしてＰＵＣ１９から切除し、そしてＨｕＧ２／Ｇ４挿入物を含むｐＳＶｇｐｔ．ＨｕＧ２Ｇ４発現ベクター中に移した。このＤＮＡ配列が正しいことを確かめた。重鎖発現ベクターｐＳＶｇｐｔ．ＨｕＧ２Ｇ４の模式的なマップを、図１１に示し、そしてこのベクター内に含まれる構築されたＯＫＴ３可変重領域に対するＨｕＧ２／Ｇ４定常領域の位置を示す。
【００６４】
この構築されたマウスＯＫＴ３軽鎖可変領域をまた、ＨｉｎｄＩＩＩからＢａｍＨＩのフラグメントとしてＰＵＣ１９から切除し、そしてヒトκ定常領域（ＨｕＣｋ）を含む発現ベクターｐＳＶｈｙｇＨｕＣκに、図１２に示されるように移した。
【００６５】
ヒトＧ２／Ｇ４定常領域に連結されたマウスＯＫＴ３可変重鎖領域の改変バージョンを含む第二の発現系をまた、生成した。このバージョン（発現系＃２）は、オリジナルなＯＫＴ３シグナル配列を含み、そして前の構築物中において記載された免疫グロブリンプロモーターおよびイントロン配列を含まなかった。キメラ抗体を、遺伝子合成により構築し、そして以前に記載されたＧ２／Ｇ４定常領域を含むＰＵＣ１９クローニングベクター中に連結した。ＯＫＴ３  ＶＨおよびヒトＧ２／Ｇ４挿入物（発現システム＃２）の配列を、図１３に示す。
【００６６】
このＧ２／Ｇ４定常領域を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩを用いた消化によりＰｕｃ１９から切除し、そしてゲルで単離した。次いで、このフラグメントを、ＢａｍＨＩ部位にて発現ベクターＡＰＥＸ−３Ｐ中に連結し、ＡＰＥＸ−３ＰＧ２／Ｇ４を生成する（図１４を参照のこと）。このマウスＯＫＴ３ＶＨを、上記ｐＵＣ１９ベクターよりＢｓｉＷＩ／ＢａｍＨＩ消化を用いて単離し、そして５’末端にＢａｍＨＩ−ＢｓｉＷＩアダプターを有するＢａｍＨＩ部位をつけ加えることにより改変した。ＢａｍＨＩ／ＢｓｉＷＩを産生するために使用される突出末端アダプター二重鎖は、以下の配列：
【００６７】
【化１】
2007501021.tif 000002
を有する。次いで、このＡＰＥＸ−３ＰＧ２／Ｇ４ベクターを、ＢａｍＨＩで開き、そしてこの改変ＯＫＴ３  ＶＨ領域を挿入し、発現ベクターＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４を生成した（図１５）。同様に、元のマウスＯＫＴ３  ＶＫシグナル配列および可変κ配列（イントロンを含まず）を含む代替のＯＫＴ３軽鎖カセットを、ヒトκ軽鎖定常領域に連結した。遺伝子合成によりＯＫＴ３  ＶＫ遺伝子配列を構築し、そしてこの配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントとして、前もってＰＵＣ１９クローニングベクターに挿入されたヒトκ定常領域に連結することにより、これを達成した。生じたプラスミド配列を、図１６に示す。次に、このＯＫＴ３ＶＫ配列を、ＢｓｉＷＩ／ＥｃｏＲＩでこのベクターから切り出し、そしてｈＣＫを、ＢｓｇＩ／ＥｃｏＲＩで、同一のベクターから切り出した。この２つのフラグメントを、発現ベクターＡＰＥＸ−３Ｐに移すために、市販されているシャトルベクターであるＬＩＴＭＵＳ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用した。ＬＩＴＭＵＳ２８を、ＢｓｉＷＩ／ＥｃｏＲＩ消化で開き、そしてＯＫＴ３  ＶＫフラグメントと連結し、ＬＩＴＭＵＳ２８ｍＯＫＴ３（ベクターは示さず）を生成し、次いでＥｃｏＲＩ／ＢｓｇＩ消化で開き、そして上記ｈＣＫフラグメントに連結して、ＬＩＴＭＵＳ２８ｍＯＫＴ３ＶＫｈＣＫを生成した（図１７）。次いで、この構築物を、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩを用いて消化し、ｍＯＫＴ３ＶＫｈＣＫフラグメント全体を単離した。この発現ベクターＡＰＥＸ−３Ｐを、ＢａｍＨＩで開き、そしてｍＯＫＴ３ＶＫｈＣＫフラグメントと連結し、ＡＰＥＸ−３ＯＫＴ３ＶＫ＋ＣＫを生成した（図１８）。
【００６８】
（ヒトＧ２／Ｇ４定常領域を含むキメラ抗体の、ＩｇＧ（ＦｃγＲＩ）に対するヒトのレセプターに結合する能力の評価）
Ｔ細胞レセプター複合体のＣＤ３ε成分に対する抗体（例えば、ＯＫＴ３）は、ＴＣＲを架橋することにより、ヒトのＴ細胞を活性化し得る。しかし、架橋は補助細胞を必要とすることが示されており、この補助細胞は、高親和性Ｆｃレセプターおよび低親和性Ｆｃレセプターを介して、抗体のＦｃ部分を結合する。この実施例に従って生成される抗体を試験し、そしてＩｇＧ（ＦｃγＲＩ）に対して高親和性のヒトのレセプターへの結合を評価した。Ｕ９３７系統の細胞を、指示濃度のビオチン化ｈＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と一緒に、４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）と共に、４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、次いで、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより分析した。図１９Ａにおいて観察されるように、生じた結合曲線は、約２〜４ｎｇ／ｍＬの濃度のビオチン化ｈＩｇＧが、さらなる競合研究のために適切であることを示した。Ｕ９３７細胞を、指示濃度の競合抗体と一緒に、３．０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ｈＩｇＧと、氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＳＡ−ＰＥと一緒に１５分間インキュベートし、洗浄し、そしてフローサイトメトリーにより分析した（図１９Ｂ）。ｍＯＫＴ３、ｈＩｇＧ１およびｈＩｇＧ４の調製物は、ビオチン化ｈＩｇＧの標的細胞への結合を効率的にブロックし、これらが、ＦｃγＲＩレセプターに結合することを示す。しかし、この実施例の組換えキメラ抗体（遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域を含む）は、これらの細胞上のＦｃγＲＩレセプターへの結合に関して競合しなかった。これは、この改変定常領域を含む抗体がＦｃγＲＩに結合しないことを示している。
【００６９】
（ＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩ）に対する低親和性ヒトレセプターへの結合の評価）
この実施例に従って産生された遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４のヒトの定常領域を含むキメラ抗体を、ＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩ）に対するヒト低親和性−レセプターに結合する能力に関して試験した。低親和性Ｆｃレセプターへの結合を明らかにするために、まず抗体調製物を、当量モル濃度のフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化ウサギＦａｂ’２抗ヒトＦａｂ’２抗体と一緒に、４℃で一晩インキュベートすることにより、複合体形成した。Ｋ５６２系統の細胞（ＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩ）に対して低親和性のヒトのレセプターのアロタイプの両方を保有する）を、指示濃度の抗体複合体と一緒に３０分間氷上でインキュベートし、洗浄し、そしてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、結合された抗体についてフローサイトメトリーにより分析した。図２０に見られるように、ヒトＩｇＧ１抗体複合体は、Ｋ５６２細胞への効果的な結合を示し、その一方、ｈＩｇＧ２抗体複合体は、ずっと低レベルの結合を示した。ヒトＩｇＧ４およびキメラＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４組換え抗体は、これらの細胞上の低親和性ＦｃγＲＩＩレセプターに結合し得ない抗体複合体を形成した。ＦＩＴＣ−ウサギＦａｂ’２抗ヒトＦａｂ’２抗体単独の結合もまた示す。
【００７０】
（ＰＢＬにおいてサイトカイン産生を誘導するための能力の評価）
ヒトＣＤ３に対し、そして遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域を含む実施例１のキメラ抗体を、末梢血白血球（ＰＢＬ）においてサイトカイン産生を誘導する能力について評価した。ドナーのパネルから新たに単離したヒト末梢血を、白血球画分について、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度沈降により濃縮した。このＰＢＬを、マウスＩｇＧ２ａ定常領域（ＯＫＴ３）またはヒトＩｇＧＧ２／Ｇ４定常領域（ＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４）のいずれかを保有する、指示濃度の抗ＣＤ３抗体と一緒にインキュベートした（図２１を参照のこと）。上清を、２４時間および３６時間に収集し、そしてＴＮＦ−α（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）の蓄積についてサンドウィッチＥＬＩＳＡにより評価した。図２１に示されるグラフは、所定のサイトカインの弱いピークが観察された時点（例えば、ＩＬ−２については２４時間、ＴＮＦ−αについては３６時間）を示す。このＯＫＴ３抗体（ヒトＦｃγＲＩレセプターおよびＦｃγＲＩＩレセプターの両方を結合する）は、両サイトカインの高いレベルを誘導した。しかし、キメラ組換え抗体ＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４（これは、同一のＣＤ３εエピトープをＯＫＴ３として結合するが、Ｆｃレセプターを結合する能力を喪失している）は、有意なレベルの任意の試験サイトカインの産生を刺激し得なかった。
【００７１】
（ヒトＰＢＬからの標的Ｔ細胞を活性化する能力の評価）
ヒトＣＤ３に対し、そして遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域を含む実施例１のキメラ抗体を、ヒトＰＢＬからの標的Ｔ細胞を活性化する能力について評価した。ＣＤ２５は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）に対するレセプターであり、そしてＣＤ２５の発現は、Ｔ細胞レセプター複合体を介して活性化されたＴ細胞の表面上でアップレギュレートされる。同様に、ＣＤ６９はまた、初期のＴ細胞活性化マーカーであり、ＣＤ６９の発現レベルは、Ｔ細胞レセプターの関与の際に増加する。その結果、両マーカーは、Ｔ細胞活性化の高感度の測定器具として役立つ。ドナーのパネルから新たに単離されたヒトの末梢血を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ濃度沈降により、この白血球画分について濃縮した。このＰＢＬを、マウスＩｇＧ２ａ定常領域（ＯＫＴ３）またはヒトＩｇＧＧ２／Ｇ４定常領域（ＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４）のいずれかを保有する、指示濃度の抗ＣＤ３抗体の存在下または非存在下でインキュベートした；図２２を参照のこと。２４時間の時点で、細胞を収集し、洗浄し、そしてヒトＣＤ２５およびヒトＣＤ６９に特異的なＦＩＴＣ−結合モノクローナル抗体と共に、氷上で３０分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより抗体結合について分析した。代表的な一人のドナーについてのデータを、図２２Ａおよび図２２Ｂに示し、そしてＣＤ２５（Ａ）またはＣＤ６９（Ｂ）を発現している細胞の百分率を示す。
【００７２】
（ヒトＬ−ＳＩＧＮ−Ｆｃ融合タンパク質およびヒトＧ２Ｇ４  Ｆｃ部分の産生および発現）
ヒトＬ−ＳＩＧＮ−ヒトＧ２Ｇ４融合タンパク質を、ヒトＬ−ＳＩＧＮ（非Ｆｃ成分として）をコードするｃＤＮＡおよびヒト免疫グロブリンＨｕＧ２Ｇ４のＦｃ部分をコードするｃＤＮＡに由来する２つのＰＣＲフラグメントを融合させることにより生成する。オリゴヌクレオチドＰ１、ｃａｇａｔｇｔｇａｔａｔｃＴＣＣＡＡＧＧＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＡＡＧ（配列番号５２）、およびＰ２、ｔｇｇｇｃｔｃｇａｇＴＴＣＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＧ（配列番号５３）を使用して、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリーからｈＬ−ＳＩＧＮの細胞外部分を増幅させる（ヒトＬ−ＳＩＧＮに対して相補的なプライマーの領域を、大文字で示す）。Ｐ１は、リーダー配列（ＫＬＶ５６）と融合するための、上流のＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。Ｐ２では、下流のＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を使用して、これをｈＧ２Ｇ４  Ｆｃ領域と融合させる。プライマーＰ３、ａｇａｃｇａａｃｔｃＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣＧＡＧＴ（配列番号５４）、およびＰ４、ｃｇｇｃｃｃｔｇｇｃａｃｔｃａＴＴＴＡＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＴ（配列番号５５）を用いて、ヒンジドメインのＧｌｕ９９からカルボキシ末端までのヒトＧ２Ｇ４ハイブリッドＦｃ領域をヒトＧ２Ｇ４定常領域を含むプラスミドを用いることにより増幅させる。大文字は、ヒトＧ２Ｇ４配列と相補的な領域を示す。Ｐ３では、上流のＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を設計し、ｈＬ−ＳＩＧＮと連結させる。Ｐ４は、一つの終止コドンの下流の配列およびＮｇｏＭＩＶ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。このＰＣＲ増幅されたヒトＬ−ＳＩＧＮおよびヒトＧ２Ｇ４  Ｆｃ領域のフラグメントを、ｐＣＲ２．１ベクター中にＴＡクローン化し、そして配列が正しいことを確かめる。生じたプラスミドｐＣＲ２．１ｈＬ−ＳＩＧＮを、ＥｃＲＶ／ＸｈｏＩで消化し、そしてプラスミドｐＣＲ２．１ｈＧ２Ｇ４を、ＸｈｏＩＮｇｏＭＩＶで消化する。生じたＬ−ＳＩＧＮおよびｈＧ２Ｇ４フラグメントを、改変Ａｐｅｘ３Ｐプラスミド（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）中に連結する。ＥｃｏＲＶ／ＮｇｏＭＩＶは、Ｋｏｚａｋ配列および開始メチオニンのためのコドンに相当するＡＴＧを有するＫＬＶ５６リーダー（５’−−ＣＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＴＧＡＧＧＧＴＣＣＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＴ−−３’（配列番号５６））を含む。
【００７３】
（細胞培養およびタンパク質精製）
Ａｐｅｘ３Ｐ−ｈＬ−ＳＩＧＮｈＧ２Ｇ４を用いてトランスフェクションした２９３ＥＢＮＡヒト胚腎細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００  ｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンおよび２５０ｕｇ／ｍｌのＧ４１８硫酸塩、および１ｕｇ／ｍｌのピュ−ロマイシンを含むＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ  ＃１０−０１３−ＣＶ）中で増殖させる。細胞を、３７℃、５％のＣＯ２にて増殖させ、選別を行う。血清タンパク質を除去するために、コンフルエントなＴ−１７５フラスコの選別された細胞を、１５ｍｌのＨＢＳＳで洗浄し、その後、Ｌ−グルタミン（ボトルに量が記載されている）およびペニシリン／ストレプトマイシンを各フラスコに補充されたＩＳ  Ｐｒｏ無血清培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ，Ｃａｔａｌｏｇ  ＃９１１０３）３０ｍＬを添加する。二日から三日、上清を濃縮し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーにより精製する。
【００７４】
本明細書を通して、種々の刊行物および特許の開示が参照される。これらの教示および開示は、その全体が、本発明に関する分野の現状をより十分に記載するために、本出願中に参考として援用される。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態および他の実施形態が、本明細書中に記載されているが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を逸脱することなくさらなる実施形態が、当業者により理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、キメラ組換え抗体の例を図式的に示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、ヒト化組換え抗体の例を図式的に示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、完全ヒト化組換え抗体の例を図式的に示す。
【図２】図２は、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号１）、およびその遺伝子操作された重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ヒトＩｇＧ２（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ｖ００５５４）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒトＩｇＧ４（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ｋ０１３１６）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、プラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ｊ０１７４９）の図示的マップを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＨｕγ４ベクターの図式マップを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、そのベクターの完全なヌクレオチド配列（配列番号３）を示し、無関係のＶＨ領域（３Ｆ４ＶＨ表示）に隣接するｈｌｇＧ４インサートのアミノ酸配列（配列番号４）およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の位置が、示されている。
【図５Ａ】図５Ａは、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＨｕ  Ｇ２／Ｇ４ベクターの図解マップを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、そのベクターのヌクレオチド配列（配列番号５）、Ｇ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号６）、および核酸配列を示し、そしてシグナル配列、無関係のＶｈ（本明細書中で３Ｆ４Ｖｈ表示）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図６】図６は、ＯＫＴ３重鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ａ２２２６１）の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、ＯＫＴ３軽鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ａ２２２５９）の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、発現ストラテジー＃１を使用して構築された、マウスＯＫＴ３重鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロ−モーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および３’末端にスプライス供与部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む。制限酵素部位が、示される。
【図９】図９は、発現ストラテジー＃１を使用して構築された、マウスＯＫＴ３軽鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および３’末端にスプライス供与部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む。制限酵素部位が、示される。
【図１０】図１０は、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＨｕＧ２／Ｇ４ベクターから切断され、５’末端において、Ｂａｍ  Ｈ１部位および天然のヒトＩｇＧ４からの５’の翻訳されないイントロン配列を添加し、３’末端において、Ｂｇｌ  ＩＩ部位および天然のヒトＩｇＧ４からの３’の翻訳されない配列を付加することによりＰＵＣ１９クローニングベクターにインサートして改変されたＨｕＧ２／Ｇ４フラグメントの完全ヌクレオチド配列（配列番号１１）を示す。
【図１１】図１１は、発現系＃１において使用される重鎖発現ベクターｐＳＶｇｐｔＨｕＧ２／Ｇ４の図解マップを示す。
【図１２】図１２は、発現系＃１において使用される発現ベクターｐＳＶｇｐｔＨｕＣｋの図解マップを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列（配列番号１３）を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１４Ａ】図１４Ａは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１４）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１４）を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１４）を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１４）を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＯＫＴ３可変重鎖領域およびＧ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１６）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＯＫＴ３可変重鎖領域およびＧ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１６）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ａ】図１６Ａは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列（配列番号１８）、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列（配列番号１９）、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列（配列番号１８）、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列（配列番号１９）、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列（配列番号１９）、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列（配列番号１８）、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列（配列番号１９）、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列（配列番号１８）、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列（配列番号１９）、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｆ】図１６Ｆは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列（配列番号１８）、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列（配列番号１９）、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１７】図１７は、発現系＃２において使用される、シャトルベクターＬＩＴＭＵＳ２８の全体の核酸配列（配列番号２０）およびＯＫＴ３ＶｋｈＣｋインサートのアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３  ＯＫＴ３Ｖｋ＋Ｃｋの全体の核酸配列（配列番号２２）ならびにＯＫＴ３ＶｋおよびＣｋインサートのアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３  ＯＫＴ３Ｖｋ＋Ｃｋの全体の核酸配列（配列番号２２）ならびにＯＫＴ３ＶｋおよびＣｋインサートのアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、Ｕ９３７細胞のＦｃγＲＩレセプターに結合するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図２０】図２０は、Ｋ５６２細胞のＦｃγＲＩＩレセプターに結合するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図２１】図２１は、ヒトＰＢＬ中のサイトカイン産生を誘導するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【図２２】図２２は、ヒトＴ細胞の活性マーカーのアップレギュレートを誘導するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【図１Ａ】
2007501021.tif 000003
【図１Ｂ】
2007501021.tif 000004
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2007501021.tif 000008
【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
2007501021.tif 000031
【図１６Ｃ】
2007501021.tif 000032
【図１６Ｄ】
2007501021.tif 000033
【図１６Ｅ】
2007501021.tif 000034
【図１６Ｆ】
2007501021.tif 000035
【図１７】
2007501021.tif 000036
【図１８】
2007501021.tif 000037
【図１８】
2007501021.tif 000038
【図１９】
2007501021.tif 000039
【図２０】
2007501021.tif 000040
【図２１】
2007501021.tif 000041
【図２１】
2007501021.tif 000042
【図２２】
2007501021.tif 000043
【図２２】
2007501021.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月14日(2006.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体媒介性の細胞活性化または炎症事象を減少するための組成物であって、該組成物は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を含み、該抗体は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物であって、少なくともＣＨ１領域およびヒンジ領域は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来であり、そしてＣＨ２領域の少なくとも部分およびＣＨ３領域の少なくとも部分は、１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来である、組成物。
【請求項３】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、ヒト補体成分に結合する、組成物。
【請求項４】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、サイトカインレセプターに結合する、組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、接着分子に結合する、組成物。
【請求項６】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、細胞分化抗原に結合する、組成物。
【請求項７】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、細胞活性化抗原に結合する、組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する可溶性分子に結合する、組成物。
【請求項９】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、サイトカインに結合する、組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、ケモカインに結合する、組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、増殖因子に結合する、組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、細胞分化を誘導する分子に結合する、組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、細胞活性化を誘導する分子に結合する、組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の組成物であって、前記抗体は、細胞表面分子に結合する、組成物。
【請求項１５】
サイトカイン放出を防止または減少するための組成物であって、該組成物は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を含み、該抗体は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、組成物。
【請求項１６】
サイトカイン放出症候群の重篤度を防止または減少するための組成物であって、該組成物は、細胞表面分子または細胞表面分子に結合する可溶性分子のいずれかに結合する抗体を含み、該抗体は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する遺伝子操作された重鎖定常領域を含む、組成物。
【請求項１７】
非Ｆｃ成分およびＦｃ領域を含む融合タンパク質であって、該融合タンパク質は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有する、融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、少なくともＣＨ１領域の部分を含む、融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、ＣＨ１領域のどの部分も含まない、融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、少なくともヒンジ領域の部分を含む、融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、抗体フラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項２２】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、単鎖、ｓｃＦｖ、ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ）’２からなる群より選択されるメンバーである、融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、少なくとも１つのＣＤＲの少なくとも部分内に挿入されるかまたはその代わりに挿入される模倣ペプチドを有する抗体の可変領域を含む、融合タンパク質。
【請求項２４】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、ペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、タンパク質またはそのフラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項２６】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、サイトカイン、ホルモン、酵素、リガンド、増殖因子、レセプターおよび抗体フラグメントからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記非Ｆｃ成分は、Ｇ−ＣＳＦ活性を示すペプチド、ＧＨＲ活性を示すペプチド、プロラクチン活性を示すペプチド、神経増殖因子模倣物、ＩＬ−２模倣物、グルカゴン様ペプチド−１、テトラペプチドＩ（Ｄ−リシン−Ｌ−アスパラギニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−チロシン）、ｖＭＩＰ−ＩＩのＮ−末端ペプチド、トロンビンレセプターのアンタゴニストペプチドリガンド（ＡＦＬＡＲＡＡ）、ペプチドＣＧＲＰ、レセプターアンタゴニストＣＧＲＰ、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）−１レセプターアンタゴニスト、酸性繊維芽細胞増殖因子結合ペプチド、ヒト脳ナトリウム排泄増加性ペプチド（ｈＢＮＰ）、エキセンディン４、ＧＬＰ−１（７−３６）、ＧＰＬ−２（１−３４）、グルカゴン、ＰＡＣＡＰ−３８、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン、神経増殖因子（ＮＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、肝増殖因子（ＨＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、Ｗｎｔ−２癌原遺伝子（ｗｎｔ−２）の産物およびヒト細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原４の結合ドメインからなる群より選択されるメンバーを含む、融合タンパク質。
【請求項２８】
非Ｆｃ成分の半減期を増加させる方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項２９】
非Ｆｃ成分の、該非Ｆｃ成分が結合する分子に対するアビディティを増加させる方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項３０】
非Ｆｃ成分の二量体を形成する方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項３１】
非Ｆｃ成分の精製を容易にする方法であって、該方法は、該非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合することによる、方法。
【請求項３２】
Ｆｃレセプター結合およびＦｃ融合タンパク質と関連する補体活性化を減少または除去する方法であって、該方法は、非Ｆｃ成分と、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域とを融合する工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、前記Ｆｃレセプター結合および補体活性化は、インビトロで減少または除去される、方法。
【請求項３４】
哺乳動物細胞における、非Ｆｃ成分の改善された発現のための組成物であって、該組成物は、１つ以上のヒトＩｇＧ２抗体由来の第１の部分および１つ以上のヒトＩｇＧ４抗体由来の第２の部分を有するＦｃ領域に融合された、該非Ｆｃ成分を有するＦｃ融合タンパク質を含む、組成物。
【請求項３５】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、前記非Ｆｃ成分のアミノ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項３６】
請求項１７に記載の融合タンパク質であって、前記Ｆｃ領域は、前記非Ｆｃ成分のカルボキシ末端に結合される、融合タンパク質。
【請求項３７】
請求項１７に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３８】
イントロンを含む、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
イントロンを含まない、請求項３７に記載の核酸。
【請求項４０】
請求項３７に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４１】
請求項４０に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項４２】
請求項１７に記載の融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含有する、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
（ヒトＧ２／Ｇ４定常領域を含むキメラ抗体の、ＩｇＧ（ＦｃγＲＩ）に対するヒトのレセプターに結合する能力の評価）
Ｔ細胞レセプター複合体のＣＤ３ε成分に対する抗体（例えば、ＯＫＴ３）は、ＴＣＲを架橋することにより、ヒトのＴ細胞を活性化し得る。しかし、架橋は補助細胞を必要とすることが示されており、この補助細胞は、高親和性Ｆｃレセプターおよび低親和性Ｆｃレセプターを介して、抗体のＦｃ部分を結合する。この実施例に従って生成される抗体を試験し、そしてＩｇＧ（ＦｃγＲＩ）に対して高親和性のヒトのレセプターへの結合を評価した。Ｕ９３７系統の細胞を、指示濃度のビオチン化ｈＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と一緒に、４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）と共に、４℃で１５分間インキュベートし、洗浄し、次いで、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより分析した。図１９Ａにおいて観察されるように、生じた結合曲線は、約２〜４ｎｇ／ｍＬの濃度のビオチン化ｈＩｇＧが、さらなる競合研究のために適切であることを示した。Ｕ９３７細胞を、指示濃度の競合抗体と一緒に、３．０ｎｇ／ｍＬのビオチン化ｈＩｇＧと、氷上で３０分間インキュベートし、洗浄し、ＳＡ−ＰＥと一緒に１５分間インキュベートし、洗浄し、そしてフローサイトメトリーにより分析した（図１９Ｂ）。ｍＯＫＴ３（黒丸）、ｈＩｇＧ１（黒四角）およびｈＩｇＧ４（黒三角）の調製物は、ビオチン化ｈＩｇＧの標的細胞への結合を効率的にブロックし、これらが、ＦｃγＲＩレセプターに結合することを示す。しかし、ｈＩｇＧ２抗体（白四角）、またはこの実施例の組換えキメラ抗体（遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域（例えば、ＯＫＴ３ｈＧ２／Ｇ４（白丸））を含む）は、これらの細胞上のＦｃγＲＩレセプターへの結合に関して競合しなかった。これは、この改変定常領域を含む抗体がＦｃγＲＩに結合しないことを示している。競合する抗体の非存在下でのビオチン化ｈＩｇＧの結合を、図１９Ｂ（＋）に示す。図１９Ａおよび図１９Ｂに示されるように、ＩｇＧＧ２／Ｇ４抗体は、ＩｇＧ（ＦｃγＲＩ）に対するヒト高親和性レセプターに結合しない。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
（ＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩ）に対する低親和性ヒトレセプターへの結合の評価）
この実施例に従って産生された遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４のヒトの定常領域を含むキメラ抗体を、ＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩ）に対するヒト低親和性−レセプターに結合する能力に関して試験した。低親和性Ｆｃレセプターへの結合を明らかにするために、まず抗体調製物を、当量モル濃度のフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識化ウサギＦａｂ’２抗ヒトＦａｂ’２抗体と一緒に、４℃で一晩インキュベートすることにより、複合体形成した。Ｋ５６２系統の細胞（ＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩ）に対して低親和性のヒトのレセプターのアロタイプの両方を保有する）を、指示濃度の抗体複合体と一緒に３０分間氷上でインキュベートし、洗浄し、そしてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、結合された抗体についてフローサイトメトリーにより分析した。図２０に見られるように、ヒトＩｇＧ１抗体複合体（黒丸）は、Ｋ５６２細胞への効果的な結合を示し、その一方、ｈＩｇＧ２抗体複合体（黒四角）は、ずっと低レベルの結合を示した。ヒトＩｇＧ４（黒三角）およびキメラＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４組換え抗体（例えば、ＯＫＴ３ｈｕＧ２／Ｇ４；白四角）は、これらの細胞上の低親和性ＦｃγＲＩＩレセプターに結合し得ない抗体複合体を形成した。ＦＩＴＣ−ウサギＦａｂ’２抗ヒトＦａｂ’２抗体単独の結合もまた示す（白三角）。図２０に示されるように、ＩｇＧＧ２／Ｇ４抗体は、ＩｇＧ（ＦｃγＲＩＩ）に対するヒト低親和性レセプターに結合しない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
（ＰＢＬにおいてサイトカイン産生を誘導するための能力の評価）
ヒトＣＤ３に対し、そして遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域を含む実施例１のキメラ抗体を、末梢血白血球（ＰＢＬ）においてサイトカイン産生を誘導する能力について評価した。ドナーのパネルから新たに単離したヒト末梢血を、白血球画分について、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度沈降により濃縮した。このＰＢＬを、マウスＩｇＧ２ａ定常領域（ＯＫＴ３）またはヒトＩｇＧＧ２／Ｇ４定常領域（ＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４）のいずれかを保有する、指示濃度の抗ＣＤ３抗体と一緒にインキュベートした（図２１を参照のこと）。上清を、２４時間および３６時間に収集し、そしてＴＮＦ−α（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）の蓄積についてサンドウィッチＥＬＩＳＡにより評価した。図２１に示されるグラフは、所定のサイトカインの弱いピークが観察された時点（例えば、ＩＬ−２については２４時間、ＴＮＦ−αについては３６時間）を示す。このＯＫＴ３抗体（アクセサリー細胞上のヒトＦｃγＲＩレセプターおよびＦｃγＲＩＩレセプターの両方の結合によりＴ細胞上のＴ細胞レセプターを架橋する）は、両サイトカインの高いレベルを誘導した。しかし、キメラ組換え抗体ＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４（これは、ＯＫＴ３可変領域を有し、そのため、同一のＣＤ３εエピトープをＯＫＴ３として結合するが、Ｆｃレセプターを結合する能力を喪失している）は、有意なレベルの任意の試験サイトカインの産生を刺激し得なかった。図２１に示されるように、ヒトＣＤ３に対するＩｇＧＧ２／Ｇ４抗体は、抹消血白血球におけるサイトカイン産生を誘導する能力の減少を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
（ヒトＰＢＬからの標的Ｔ細胞を活性化する能力の評価）
ヒトＣＤ３に対し、そして遺伝子操作されたＩｇＧ２／ＩｇＧ４ヒト定常領域を含む実施例１のキメラ抗体を、ヒトＰＢＬからの標的Ｔ細胞を活性化する能力について評価した。ＣＤ２５は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）に対するレセプターであり、そしてＣＤ２５の発現は、Ｔ細胞レセプター複合体を介して活性化されたＴ細胞の表面上でアップレギュレートされる。同様に、ＣＤ６９はまた、初期のＴ細胞活性化マーカーであり、ＣＤ６９の発現レベルは、Ｔ細胞レセプターの関与の際に増加する。その結果、両マーカーは、Ｔ細胞活性化の高感度の測定器具として役立つ。ドナーのパネルから新たに単離されたヒトの末梢血を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ濃度沈降により、この白血球画分について濃縮した。このＰＢＬを、マウスＩｇＧ２ａ定常領域（ＯＫＴ３；一重斜線）またはヒトＩｇＧＧ２／Ｇ４定常領域（ＯＫＴ３  ｈＧ２／Ｇ４；二重斜線）のいずれかを保有する、指示濃度の抗ＣＤ３抗体の存在下または非存在下でインキュベートした；図２２を参照のこと。２４時間の時点で、細胞を収集し、洗浄し、そしてヒトＣＤ２５およびヒトＣＤ６９に特異的なＦＩＴＣ−結合モノクローナル抗体と共に、氷上で３０分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて、フローサイトメトリーにより抗体結合について分析した。代表的な一人のドナーについてのデータを、図２２Ａおよび図２２Ｂに示し、そしてＣＤ２５（Ａ）またはＣＤ６９（Ｂ）を発現している細胞の百分率を示す。図２２に示されるように、ヒトＣＤ３に対するＩｇＧＧ２／Ｇ４抗体は、ヒトＰＢＬからの標的Ｔ細胞を活性化する能力の減少を示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
【図１Ａ】図１Ａは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、キメラ組換え抗体の例を図式的に示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、ヒト化組換え抗体の例を図式的に示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本開示による、遺伝子操作された重鎖の定常領域を有する、完全ヒト組換え抗体の例を図式的に示す。
【図２】図２は、本開示による遺伝子操作された重鎖定常領域のアミノ酸配列（配列番号１）、およびその遺伝子操作された重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、ヒトＩｇＧ２（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ｖ００５５４）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ヒトＩｇＧ４（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ｋ０１３１６）のアミノ酸配列および核酸配列を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、プラスミドｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ｊ０１７４９）の図示的マップを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＨｕγ４ベクターの図式マップを示す。
【図４Ｂ−１】図４Ｂは、そのベクターの完全なヌクレオチド配列を示し、無関係のＶＨ領域（３Ｆ４ＶＨ表示）に隣接するｈｌｇＧ４インサートのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の位置が、示されている。
【図４Ｂ−２】図４Ｂは、そのベクターの完全なヌクレオチド配列を示し、無関係のＶＨ領域（３Ｆ４ＶＨ表示）に隣接するｈｌｇＧ４インサートのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の位置が、示されている。
【図４Ｂ−２】図４Ｂは、そのベクターの完全なヌクレオチド配列を示し、無関係のＶＨ領域（３Ｆ４ＶＨ表示）に隣接するｈｌｇＧ４インサートのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列を示す。シグナル配列、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の位置が、示されている。
【図５Ａ】図５Ａは、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＨｕ  Ｇ２／Ｇ４ベクターの図解マップを示す。
【図５Ｂ−１】図５Ｂは、そのベクターのヌクレオチド配列、Ｇ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列、および核酸配列を示し、そしてシグナル配列、無関係のＶｈ（本明細書中で３Ｆ４Ｖｈ表示）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図５Ｂ−２】図５Ｂは、そのベクターのヌクレオチド配列、Ｇ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列、および核酸配列を示し、そしてシグナル配列、無関係のＶｈ（本明細書中で３Ｆ４Ｖｈ表示）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図５Ｂ−３】図５Ｂは、そのベクターのヌクレオチド配列、Ｇ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列、および核酸配列を示し、そしてシグナル配列、無関係のＶｈ（本明細書中で３Ｆ４Ｖｈ表示）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図５Ｂ−４】図５Ｂは、そのベクターのヌクレオチド配列、Ｇ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列、および核酸配列を示し、そしてシグナル配列、無関係のＶｈ（本明細書中で３Ｆ４Ｖｈ表示）、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の位置を示す。
【図６】図６は、ＯＫＴ３重鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ａ２２２６１）の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７】図７は、ＯＫＴ３軽鎖可変領域（ＧｅｎＢａｎｋ  受諾番号  Ａ２２２５９）の完全なヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８−１】図８は、発現ストラテジー＃１を使用して構築された、マウスＯＫＴ３重鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロ−モーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および３’末端にスプライス供与部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む。制限酵素部位が、示される。
【図８−２】図８は、発現ストラテジー＃１を使用して構築された、マウスＯＫＴ３重鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロ−モーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および３’末端にスプライス供与部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む。制限酵素部位が、示される。
【図８−３】図８は、発現ストラテジー＃１を使用して構築された、マウスＯＫＴ３重鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロ−モーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および３’末端にスプライス供与部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む。制限酵素部位が、示される。
【図９−１】図９は、発現ストラテジー＃１を使用して構築された、マウスＯＫＴ３軽鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および３’末端にスプライス供与部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む。制限酵素部位が、示される。
【図９−２】図９は、発現ストラテジー＃１を使用して構築された、マウスＯＫＴ３軽鎖可変領域の完全ヌクレオチド配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示し、この配列は、マウス免疫グロブリンプロモーター、５’末端にイントロンを有するマウスシグナル配列、および３’末端にスプライス供与部位（Ｂａｍ  ＨＩ）を含む。制限酵素部位が、示される。
【図１０】図１０は、ＡＰＥＸ−１  ３Ｆ４ＶＨＨｕＧ２／Ｇ４ベクターから切断され、５’末端において、Ｂａｍ  Ｈ１部位および天然のヒトＩｇＧ４からの５’の翻訳されないイントロン配列を添加し、３’末端において、Ｂｇｌ  ＩＩ部位および天然のヒトＩｇＧ４からの３’の翻訳されない配列を付加することによりＰＵＣ１９クローニングベクターにインサートして改変されたＨｕＧ２／Ｇ４フラグメントの完全ヌクレオチド配列を示す。
【図１１】図１１は、発現系＃１において使用される重鎖発現ベクターｐＳＶｇｐｔＨｕＧ２／Ｇ４の図解マップを示す。
【図１２】図１２は、発現系＃１において使用される発現ベクターｐＳＶｇｐｔＨｕＣｋの図解マップを示す。
【図１３Ａ−１】図１３Ａは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１３Ａ−２】図１３Ａは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１３Ｂ−１】図１３Ｂは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１３Ｂ−２】図１３Ｂは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１３Ｃ−１】図１３Ｃは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１３Ｃ−２】図１３Ｃは、発現ストラテジー＃２を使用して構築されたＯＫＴ３重鎖可変領域およびｈｕＧ２／Ｇ４定常領域のヌクレオチド配列（配列番号１２）およびアミノ酸配列を示す。その構築物は、５’のリーダーイントロンを欠き、原形のＯＫＴ３シグナル配列（示される）を使用する。制限酵素部位もまた、示される。
【図１４Ａ−１】図１４Ａは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１４Ａ−２】図１４Ａは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１４Ｂ−１】図１４Ｂは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１４Ｂ−２】図１４Ｂは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１４Ｃ−１】図１４Ｃは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１４Ｃ−２】図１４Ｃは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１４Ｄ−１】図１４Ｄは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１４Ｄ−２】図１４Ｄは、Ｇ２／Ｇ４のインサート部位および示された制限部位のアミノ酸配列（配列番号１５）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３Ｐ  Ｇ２／Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列を示す。
【図１５Ａ−１】図１５Ａは、ＯＫＴ３可変重鎖領域およびＧ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１６）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１５Ａ−２】図１５Ａは、ＯＫＴ３可変重鎖領域およびＧ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１６）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１５Ａ−３】図１５Ａは、ＯＫＴ３可変重鎖領域およびＧ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１６）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１５Ｂ−１】図１５Ｂは、ＯＫＴ３可変重鎖領域およびＧ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１６）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１５Ｂ−２】図１５Ｂは、ＯＫＴ３可変重鎖領域およびＧ２／Ｇ４インサートのアミノ酸配列（配列番号１７）を含む、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３ＰｍＯＫＴ３ＶｈＧ２Ｇ４発現ベクターの全体の核酸配列（配列番号１６）を示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ａ−１】図１６Ａは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ａ−２】図１６Ａは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｂ−１】図１６Ｂは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｂ−２】図１６Ｂは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｃ−１】図１６Ｃは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｃ−２】図１６Ｃは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｄ−１】図１６Ｄは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｄ−２】図１６Ｄは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｅ−１】図１６Ｅは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｅ−２】図１６Ｅは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｆ−１】図１６Ｆは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１６Ｆ−２】図１６Ｆは、発現系＃２において使用される、ＰＵＣ１９の全体の核酸配列、およびＯＫＴ３Ｖｋのアミノ酸配列、ならびにヒトＣｋ発現カセットを示す。制限酵素部位が示される。
【図１７−１】図１７は、発現系＃２において使用される、シャトルベクターＬＩＴＭＵＳ２８の全体の核酸配列およびＯＫＴ３ＶｋｈＣｋインサートのアミノ酸配列を示す。
【図１７−２】図１７は、発現系＃２において使用される、シャトルベクターＬＩＴＭＵＳ２８の全体の核酸配列およびＯＫＴ３ＶｋｈＣｋインサートのアミノ酸配列を示す。
【図１８Ａ−１】図１８Ａは、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３  ＯＫＴ３Ｖｋ＋Ｃｋの全体の核酸配列ならびにＯＫＴ３ＶｋおよびＣｋインサートのアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示される。
【図１８Ａ−２】図１８Ａは、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３  ＯＫＴ３Ｖｋ＋Ｃｋの全体の核酸配列ならびにＯＫＴ３ＶｋおよびＣｋインサートのアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示される。
【図１８Ｂ−１】図１８Ｂは、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３  ＯＫＴ３Ｖｋ＋Ｃｋの全体の核酸配列ならびにＯＫＴ３ＶｋおよびＣｋインサートのアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示される。
【図１８Ｂ−２】図１８Ｂは、発現系＃２において使用されるＡＰＥＸ−３  ＯＫＴ３Ｖｋ＋Ｃｋの全体の核酸配列ならびにＯＫＴ３ＶｋおよびＣｋインサートのアミノ酸配列を示す。制限酵素部位が示される。
【図１９】図１９Ａおよび図１９Ｂは、Ｕ９３７細胞のＦｃγＲＩレセプターに結合するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図２０】図２０は、Ｋ５６２細胞のＦｃγＲＩＩレセプターに結合するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価する試験の結果を示す。
【図２１−１】図２１は、ヒトＰＢＬ中のサイトカイン産生を誘導するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【図２１−２】図２１は、ヒトＰＢＬ中のサイトカイン産生を誘導するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【図２１−３】図２１は、ヒトＰＢＬ中のサイトカイン産生を誘導するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【図２２】図２２は、ヒトＴ細胞の活性マーカーのアップレギュレートを誘導するＧ２／Ｇ４重鎖定常領域を含む抗体の性能を評価するために設計された試験の結果を示す。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ａ】
2007501021.tif 000045
【図１Ｂ】
2007501021.tif 000046
【図１Ｃ】
2007501021.tif 000047
【図２】
2007501021.tif 000048
【図３Ａ】
2007501021.tif 000049
【図３Ｂ】
2007501021.tif 000050
【図３Ｃ】
2007501021.tif 000051
【図４Ａ】
2007501021.tif 000052
【図４Ｂ−１】
2007501021.tif 000053
【図４Ｂ−２】
2007501021.tif 000054
【図４Ｂ−３】
2007501021.tif 000055
【図５Ａ】
2007501021.tif 000056
【図５Ｂ−１】
2007501021.tif 000057
【図５Ｂ−２】
2007501021.tif 000058
【図５Ｂ−３】
2007501021.tif 000059
【図５Ｂ−４】
2007501021.tif 000060
【図６】
2007501021.tif 000061
【図７】
2007501021.tif 000062
【図８−１】
2007501021.tif 000063
【図８−２】
2007501021.tif 000064
【図８−３】
2007501021.tif 000065
【図９−１】
2007501021.tif 000066
【図９−２】
2007501021.tif 000067
【図１０】
2007501021.tif 000068
【図１１】
2007501021.tif 000069
【図１２】
2007501021.tif 000070
【図１３Ａ−１】
2007501021.tif 000071
【図１３Ａ−２】
2007501021.tif 000072
【図１３Ｂ−１】
2007501021.tif 000073
【図１３Ｂ−２】
2007501021.tif 000074
【図１３Ｃ−１】
2007501021.tif 000075
【図１３Ｃ−２】
2007501021.tif 000076
【図１４Ａ−１】
2007501021.tif 000077
【図１４Ａ−２】
2007501021.tif 000078
【図１４Ｂ−１】
2007501021.tif 000079
【図１４Ｂ−２】
2007501021.tif 000080
【図１４Ｃ−１】
2007501021.tif 000081
【図１４Ｃ−２】
2007501021.tif 000082
【図１４Ｄ−１】
2007501021.tif 000083
【図１４Ｄ−２】
2007501021.tif 000084
【図１５Ａ−１】
2007501021.tif 000085
【図１５Ａ−２】
2007501021.tif 000086
【図１５Ａ−３】
2007501021.tif 000087
【図１５Ｂ−１】
2007501021.tif 000088
【図１５Ｂ−２】
2007501021.tif 000089
【図１６Ａ−１】
2007501021.tif 000090
【図１６Ａ−２】
2007501021.tif 000091
【図１６Ｂ−１】
2007501021.tif 000092
【図１６Ｂ−２】
2007501021.tif 000093
【図１６Ｃ−１】
2007501021.tif 000094
【図１６Ｃ−２】
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【図１６Ｄ−１】
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【図１６Ｄ−２】
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【図１６Ｅ−１】
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【図１６Ｅ−２】
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【図１６Ｆ−１】
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【図１６Ｆ−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８Ａ−１】
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【図１８Ａ−２】
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【図１８Ｂ−１】
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【図１８Ｂ−２】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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