(57)【要約】  本発明は、椎間板（IVD）細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した、医薬として使うための単離された間葉間質幹細胞（MSSC）に関する。前記細胞を用いて椎間板の変性の特徴がある脊髄状態を治療することができる。椎間板の変性を低減するタンパク質をコードする外因性遺伝子で前記細胞を遺伝的に形質転換させることもできる。【選択図】図１３
2007525990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
椎間板（IVD）細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した、医薬として使用するための単離された間葉間質幹細胞（MSSC）。
【請求項２】
ａ）椎間板（IVD）細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化し；かつ
ｂ）椎間板の変性を低減するタンパク質をコードする外因性遺伝子で遺伝的に形質転換されている；
ことを特徴とする単離された間葉間質幹細胞（MSSC）。
【請求項３】
細胞が細胞外マトリックスを生成する、請求項１又は２記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項４】
細胞外マトリックスがIVD細胞外マトリックスとして同定でき、かつ軟骨細胞によって生成される細胞外マトリックスから区別できる、請求項３記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項５】
IVDマトリックスが少なくとも１つの以下の特徴がある、請求項４記載の単離された間葉間質幹細胞：
（ａ）アグリカン遺伝子発現がII型コラーゲン遺伝子発現より高い；
（ｂ）プロテオグリカンバーシカンが発現している；又は
（ｃ）GAG：ヒドロキシプロリン比（すなわち、プロテオグリカン：コラーゲン比）が１０：１より大きい。
【請求項６】
血液、骨髄、又は脂肪組織から得られる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項７】
胸骨、大腿骨又は腸骨稜内の骨髄由来である、請求項６記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項８】
以下の工程：
（ａ）TGFβ、CDMP1又はCDMP2を含有するIVD細胞誘導培地中における生長；
（ｂ）MSSCの被包化；
（ｃ）MSSCに負荷を加えること；
（ｄ）MSSCと髄核細胞／IVD細胞との共溶媒；
（ｅ）IVD細胞を以前に生長させたことがある馴化培地中におけるMSSCの培養；
（ｆ）低酸素圧下での培養；又は
（ｇ）IVD細胞分化の遺伝子調節因子を用いた遺伝的形質転換；
のいずれか１つの工程を用いて分化された、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項９】
工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）及び（ｇ）のいずれかの組合せを用いることよって分化が行われる、請求項８記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１０】
MSSCをゲル中で被包すること、および、被包した細胞を培地中で５週間まで培養し、その間in vivoで受けるのと等価な周期的な負荷を水圧または他の方法によって与えることによってMSSCが分化される、請求項９記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１１】
培地が請求項８の（ａ）に示した誘導培地である、請求項１０記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１２】
培地が請求項８の（ｅ）に示した馴化培地である、請求項１０記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１３】
前記MSSCが請求項８の（ｄ）に示した細胞と共培養される、請求項１０記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１４】
酸素圧が、細胞が培養される大気の５％未満に低下される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１５】
外因性遺伝子が、炎症の制御に関与する遺伝子群およびサイトカイン、サイトカインの抑制因子および分解酵素の阻害因子を含む遺伝子群から選ばれ得る、請求項２〜１４のいずれか１項に記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１６】
外因性遺伝子がインターロイキン１受容体アンタゴニスト（IL-1RA）をコードする、請求項２〜１５のいずれか１項に記載の単離された間葉間質幹細胞。
【請求項１７】
椎間板の変性の特徴がある脊髄状態の治療用医薬の製造における請求項１〜１６のいずれか１項に記載の単離された間葉間質幹細胞の使用。
【請求項１８】
脊髄状態が、腰痛、椎間板の変性、椎間板の年齢関連変化又は脊椎症である、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
細胞が、DIVDを示すIVDへの直接注入用である、請求項１７又は１８記載の使用。
【請求項２０】
細胞が、生体材料骨格又はゲルの上又は中への接種用である、請求項１７又は１８記載の使用。
【請求項２１】
椎間板の変性の特徴がある脊髄状態の治療方法であって、IVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した単離されたMSSCを、該治療が必要な対象者の病的椎間板に投与することを含む前記治療方法。
【請求項２２】
椎間板の変性の特徴がある脊髄状態の治療方法であって、IVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した単離されたMSSCを、該治療が必要な対象者の病的椎間板に投与することを含む方法において、前記MSSCが、
（ａ）IVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化し；かつ
（ｂ）椎間板の変性を低減するタンパク質をコードする外因性遺伝子で遺伝的に形質転換されている；
ことを特徴とする前記治療方法。
【請求項２３】
培養した間葉間質幹細胞を2.1MPa(30psi)までの増加圧力に曝露する工程を含む、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法。
【請求項２４】
NP細胞と間葉間質幹細胞（MSSC）とを一緒に共培養する工程を含む、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法。
【請求項２５】
以前にNP細胞に曝露したことがある培地中で間葉間質幹細胞を培養する工程を含む、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法。
【請求項２６】
酸素圧を５％未満に低下させた大気中で間葉間質幹細胞を培養する工程を含む、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法。
【請求項２７】
MSSCをゲル中で被包すること、および、被包した細胞を培地中で５週間まで培養し、その間in vivoで受けるのと等価な周期的な負荷を水圧または他の方法によって与えることを含む、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法。
【請求項２８】
培地が請求項８の（ａ）に示した誘導培地である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
培地が請求項８の（ｅ）に示した馴化培地である、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
MSSCを請求項８の（ｄ）に示した細胞と共培養する、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
酸素圧を、細胞を培養する大気の５％未満に低下させる、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、椎間板の変性(degeneration of the intervertebral disc)（DIVD）の特徴がある脊髄状態の治療に関する。
DIVDは、椎間板(intervertebral disc)（IVD）のマトリックス生産の損失又は変化によって引き起こされると考えられる。DIVDは、IVDの年齢関連変化、脊椎症などの結果としても起こりうる。
【０００２】
本発明の脊髄状態の一例は、腰痛(low back pain)（LBP）である。LBPは多因子性である。しかし、DIVDはLBPの非常に一般的な原因であると考えられる。毎月少なくとも１週間で英国の約1100万の人々がLBPを経験しており；このことは作業日の相当な損失につながる（2000年では１億800万日の損失であり、推定11兆ポンドの損失生産）。これは、国民保健サービス（例えば、１年に600万を超える臨床相談）及び社会サービスにもかなり影響を与える。LBPの多くの原因があるが、LBPにおけるDIVDの役割が明らかになってきている。イメージング研究はDIVDそれ自体とLBPとの関連を示す。さらに、本出願の発明者らは、変性IVDへの侵害性の神経生長を通じて、DIVDとLBPが機構的にどのように関連しているかを適切に示した。しかし、臨床的に最も有意な関係は、DIVDによるIVD空間狭小化と慢性LBP（CLBP）との間にある（特にIVD空間狭小化が脊髄運動セグメントの要素の異常なアラインメントと動きに関連している場合）。IVD空間狭小化はDIVDが進むにつれて発達する。今やMRイメージングを用いて初期段階のDIVD（すなわち、IVD空間の狭小化が起こる前）を認識することが可能なので、DIVDの初期診断とその進行を停止／逆行させるために有効な治療の組合せがCLBPの発生率を有意に低減するという期待を高めている。さらに、新規形態の組織操作がさらに進んだ段階のDIVDを治療するアプローチを提供する。
【０００３】
IVDは、脊柱に加えられる圧縮負荷、回転負荷及び引張り負荷に対する可逆的な抵抗性を与える。この特性は、その主要成分、すなわち内髄核(nucleus pulposus)（NP）、外線維輪(annulus fibrosus)（AF）並びに上位及び下位(superior and inferior)軟骨性終板(cartilaginous end plate)（CEP）の構造の関数である。これら成分は、一般的に、主にコラーゲンとプロテオグリカンである低細胞性及び無血管性組織である。これら組織にある細胞が組織の組成と統合性を維持する。細胞が相互に直接接触している多くの組織と異なり、IVD内では、細胞は広く離れており、かつそのマトリックスと密接な二方向動的関係(two-way dynamic relationship)を有している。インビボIVD細胞は、マトリックスを製造して維持するのみならず、マトリックスを横切る拡散とバルクフローによってすべての栄養素を受け、かつマトリックスとの相互作用を介して重要な制御情報、特に物理的環境に関係する情報を得る。
【０００４】
椎間板の変性の特徴がある脊髄状態の発生を予防する療法、及び／又は該脊髄状態を治療する療法を開発するために多くの試みが為されている。
研究の３つの道は以下のことに関する：
１）IVDの変性につながる分子プロセスを逆行させるための生物学的に活性な分子を送達する遺伝子療法の開発。
２）IVD変性プロセスで失われた組織に取って代わる正常なIVD組織を生成するように条件付けられた細胞の導入。
３）組織操作されたIVD移植片の作製。
これらの各道は、適切な細胞の使用を必要とする。しかし、今までのところ有用な細胞源が存在せず、上記１〜３で使うための細胞の生産及び形質転換の方法を提供することが本発明の１つの目的である。
【０００５】
本発明の第１局面により、IVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した、医薬として使うための単離された間葉間質幹細胞(mesenchymal stromal stem cell)（MSSC）が提供される。
本発明の第２局面により、椎間板の変性の特徴がある脊髄状態の治療用薬物の製造における、IVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した単離された間葉間質幹細胞（MSSC）の使用が提供される。
本発明の第３局面により、椎間板の変性の特徴がある脊髄状態の治療方法であって、IVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した単離された間葉間質幹細胞（MSSC）を該治療が必要な対象者の病的椎間板に投与することを含む方法が提供される。
【０００６】
用語“IVD細胞”は、IVDの内髄核（NP）、外線維輪（AF）並びに上位および下位(superior and inferior)軟骨性終板（CEP）にある細胞を意味する。本明細書では、これら３領域内の細胞をそれぞれNP細胞、AF細胞又はCEP細胞と称することもある。これら細胞をまとめてIVD細胞と総称する。
用語“IVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型にin vitroで分化した”は、MSSC細胞が、NP細胞、AF細胞又はCEP細胞系統に成熟するように処理されていることを意味する。さらに、MSSC細胞の形態及び特にMSSC細胞の機能性が、むしろNP細胞、AF細胞又はCEP細胞に近く変化している。分化ができるだけ完全であることが好ましいことは明かだろう。しかし、IVD系統への不完全な分化も本発明で有用な細胞となりうる。
【０００７】
IVD細胞に向かって、又はIVD細胞にin vitroで分化した細胞が関節軟骨又は他の型の軟骨の軟骨細胞（又は軟骨細胞系譜の前駆体）から区別できる表現型を有することが好ましい。従って、本発明で利用する分化手順は、好ましくは、結果として生じるNP、AF又はCEP細胞が軟骨細胞でないことを保証する。当業者がIVD細胞表現型に向かって、又は前記表現型に分化した細胞と、軟骨細胞に向かって、又は軟骨細胞に分化した細胞とを区別できる一方法は、各型の細胞によって生成される細胞外マトリックスを調べることである。軟骨細胞をウサギ椎間板の髄核中に移植すると、形成されるマトリックスは髄核の正常なゲル様マトリックスより堅く、かつ異なる組成を有することが分かった。従って、当業者は細胞によって生成されたマトリックスを分析することができ、かつIVD表現型の細胞か、又は軟骨細胞表現型の細胞か同定できるだろう。従って、好ましくは、結果として生成される細胞が正しいマトリックス（すなわち、軟骨細胞マトリックスではなくIVDマトリックス）を生成することを保証することによって、本発明で使う分化工程（下記参照）の適合性を評価することができる。この点に関して、当業者はIVDマトリックスが以下の少なくとも１つの特徴、好ましくは以下の各特徴があることが分かるだろう：
ａ）アグリカン遺伝子発現はII型コラーゲン遺伝子発現より多いべきである；
ｂ）プロテオグリカンバーシカンが発現しているべきである；及び
ｃ）GAG：ヒドロキシプロリン比（すなわち、プロテオグリカン：コラーゲン比）が10：１より大きいべきである。
【０００８】
本発明は、発明者らが行ったIVDに関する研究に基づいている。発明者らは、IVD組織の修復及び再生における重要な因子は修復／再生を媒介するのに適した細胞が該IVD内に確実に存在するようにすることであることが分かった。
以前に、適切な細胞をIVD中に注入し、それによってNPを再生しうることが提案されている。１つのアプローチは、患者のIVDから成熟IVD細胞を収集して、それらを損傷組織に再導入することであった。例えば、DE 42 19 626は、脊椎から体細胞性IVD細胞を除去してから該細胞を再導入すること（それらの修復性の質を改善するための遺伝子操作後）を考慮する。しかし、発明者らは、これら体細胞の生物学をさらに詳細に探索すると、驚くべきことに、このアプローチには欠陥があることを見出した。発明者らは、患者の損傷したIVDから得た細胞は老化表現型を有するので、不十分にしか機能せず、急速に死んでしまうことを発見したからである。さらに、発明者らは、このような収集した細胞を治療用遺伝子で感染させて外植片IVDに注入した場合、該細胞は導入遺伝子を不十分にしか発現しないことを見出した。発明者らは正常NPと変性NPの組織及び細胞内での細胞複製ポテンシャル（老化と共に低下する）とサイクリン依存性キナーゼインヒビターP16INK4Aタンパク質（細胞老化の間に上方制御される）の発現も調査した。これは年齢に関連し：正常NPでは複製ポテンシャルの低減；及びP16INK4Aの細胞発現の増加を示した。しかし、変性IVDのNP細胞は、若年患者から得た場合でさえ、40歳も年とった正常な個体と同等の複製ポテンシャルの低減とP16INK4Aの発現の増加を示した。さらに、リアルタイムRT PCRは、老化バイオマーカーの発現と、マトリックス分解酵素MMP3とMMP13；アグリカナーゼ(aggrecanase)、ADAMTs 5；及びＩ型コラーゲンの遺伝子の発現との間には直接的な関係があり、かつII型コラーゲン及びアグリカンの発現とは逆の関係があることを示した。
【０００９】
発明者らは、該データが、変性NP細胞は細胞代謝が変化した老化表現型を示し、この細胞代謝の変化がIVDの修復においてこの変性NP細胞が使われるのを阻止しているかもしれないことを示唆していることに気づいた。従って、先行技術（例えば、DE 42 19 626）で提案されているような細胞の使用は脊髄状態の治療に適さないことが分かった。
老化が、脊髄状態の治療のための細胞の使用における問題であることを確立したので、発明者らは、腰痛のような脊髄状態の調節で役立ちうる他の細胞型を同定するための試みで発明的努力を発揮した。
さらに詳細に、また実施例において後述するように、発明者らは、本発明の第１局面の細胞を用いて脊髄状態を治療できることを確立した。本発明の細胞の使用は、当業者によっては予想されなかっただろう。実際、本発明の細胞の使用は、反直観的であるとみなされるだろう。これは、先行技術がIVDから直接取った細胞が治療用の最良の細胞源であると示唆しているからである。（ａ）当業者は病的IVD由来のIVD細胞に付随する老化問題の知識がないので、このような細胞源を即座に選択し；かつ（ｂ）それら細胞は可能な操作及び病的IVDへの再導入のために正しい表現型を有している細胞なので、当業者は分化したIVD細胞を使用することに惹かれるだろう。
【００１０】
当業者は、健康なIVDからIVD細胞を単離すること及び該細胞を病的IVD中に注入する前に形質変換させることを考慮するかもしれない。このような細胞の選択は老化に関する問題が少ない。しかし、これら細胞の選択は、健康なIVD由来の該細胞の抽出は、その手順の結果として患者が苦しむかもしれないという容認できない危険をもたらし、かつ健康なIVDが損傷し、ひいては脊髄状態を悪化させるであろうから、臨床医は考慮しないであろう。
さらに、脊髄状態の治療で使うための間葉間質幹細胞の選択に対する技術的な偏見もあるだろう。幹細胞それ自体は有用でなく、今までのところ、MSSCのIVD細胞への十分な分化のための方法は知られていない。従って、本発明者らから老化に関する知識又はMSSCの分化における彼らのスキルの利益を受けない当業者は、既にIVD細胞に分化している細胞の使用を自動的に考えるだろう。本発明の細胞を開発するために用いられる分化技術は、さらに本発明の重要な局面に相当し、さらに詳細に後述される。
本発明では、いずれの形態の間葉間質幹細胞も使用しうる。技術的に既知の方法により、血液、骨髄、又は脂肪組織（自己MSSC）からこのような細胞を収集することができる。
MSSCは、好ましくは骨髄から（例えば、胸骨、大腿骨又は腸骨稜から）採取される。該細胞を収集する最も好ましい方法については実施例１の方法1.1.1で述べる。
幹細胞を収集することの代替として、分化用細胞源としてin vitroで増殖させた幹細胞系を使用しうることは明かだろう。
【００１１】
発明者らは、いくつかの分化技術を用いて（単独又は併用）間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させうることを確立した。本発明で利用しうる方法として以下の方法が挙げられる。
（Ａ）IVD細胞誘導培地−発明者らは、標準的な細胞培養基がMSSCのIVD細胞への分化を促進する活性成分を含むように操作できることを確立した。
NP細胞は、最初は、共通の表現型系譜を関節軟骨細胞と共有し、TGBβのような生長因子に富んだ培地内でそれらを生長させることによって、その共通の系譜経路に沿って進み得る。TGFβの使用は、通常、関節軟骨細胞／NP細胞の共通の前駆体を越えてはMSSCを進めない。従って、IVD表現型の細胞として区別可能な細胞の分化のためには、この分化工程を他の工程（下記参照）と併用することが好ましい。
例として、細胞培養基にTGF-β3を加えて分化を促進することができる。好ましいIVD細胞誘導培地は、グルコース、L-アスコルビン酸、適切な抗生物質、TGF-β3、デキサメタゾン、ピルビン酸ナトリウム、プロリン及びITS+1プレミックス（1mg/mlのインスリン、0.55mg/mlのトランスフェリン、0.5μg/mlの亜セレン酸ナトリウム；50mg/mlのBSA及び470μg/mlのリノール酸を含むプレミックスを有するSigma製のITSミックス）で補充したDMEM/HAM F12 1:1を含む。この培地で少なくとも１日、好ましくは少なくとも５日間、最も好ましくは約12日間細胞を培養しうる。最も好ましいIVD細胞誘導培地については実施例１の1.1.3.1で開示する。
【００１２】
培地中のTGF-βとは別に、NP表現型の誘導において、特に発現され／生成されるプロテオグリカンの量を増やすことにおいて、他の生長因子が同様の効果又はより大きい効果を有する。このような生長因子の１つは、軟骨由来生長因子(cartilage derived growth factor)（CDMP）1及び2である。発明者らは、10〜100ng/mlの濃度のCDMPはプロテオグリカンが実質的に増加したNP表現型へのMSSC分化を誘導できることを示した(実施例５参照)。
【００１３】
（Ｂ）ゲル被包化−アルギナート又は他のゲル中の幹細胞の被包化は分化を容易にする。アルギナート又は他のゲル中の被包化を用いて分化を促進することができ、特に別の技術と共に使用すると有用である（例えば、IVD細胞誘導培地）。この場合、少なくとも１日、好ましくは少なくとも５日、さらに好ましくは少なくとも12日間、35日までの期間、該培地に被包化細胞をさらすことができる。
被包化を利用する好ましい分化技術については、実施例１の1.1.3.2と1.1.3.3で述べる。
代替の、かつ最も好ましい被包化法は、0.15M NaCl中1.2%の中間粘度のアルギナートに約5x106細胞/mlの密度で細胞を再懸濁させてからアルギナートを重合させて層を形成する工程を含む。
【００１４】
（Ｃ）負荷を加えること−研究中、発明者らは0.0069MPa(1psi)ほどの低い圧力[正常なin vivo椎間板上の最小負荷は0.3MPaである]の負荷に対してNP細胞が超過敏らしいことを発見した。実験は、細胞の応答が細胞型及び加えられる負荷の頻度と量に依存することをも示した。例えば、0.0345MPa(5psi)及び0.0483MPa(7psi)の負荷をかけた変性NP細胞からの遺伝子発現では有意な差が観察された。
このことを見出したことによって、発明者らは、細胞の調製時に細胞に特定の負荷条件を適用することによって、腰痛の治療に有用な細胞を生じさせうることに気づいた。発明者らは、引き続き、MSSCに負荷をかけるとNP表現型を誘導することを示した。プラスチックリングで保持したゲル中に被包化した細胞の水圧負荷を含む種々の方法で；細胞を培養内に置いて、又は密封チャンバー内でゲルに被包化して、種々の圧力と送達周期、特に0.048MPa(7psi)までの圧力にて頻度を変えて（例えば、３秒オン及びオフ、又は５秒オン及びオフ）種々の時間（２〜４時間）5%のCO2流によって、又は平衡空気を加えて、圧力を加えることによって；負荷を細胞に及ぼすことができる。
上述し、また実施例で開示する方法で負荷を加えることは、本発明のさらなる重要な局面に相当する。従って、本発明の第６局面により、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法であって、培養した間葉間質幹細胞を0.048MPa(7psi)までの増加圧力にさらす工程を含む方法が提供される。
【００１５】
（Ｄ）MSSCと髄核（NP）細胞／IVD細胞との共培養−発明者らは、正常なNP細胞と間葉間質幹細胞（MSSC）を一緒に（接触させ、又は接触させずに）培養して、その結果MSSCがIVD細胞に向かって分化することを確立した。或いは、馴化培地（すなわち、前にNP細胞を増殖させた培地）でMSSCを培養することができる。
上述し、また実施例で開示する技術は（1.1.3.5参照）本発明のさらなる重要な局面に相当する。従って、本発明の第７局面により、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法であって、NP細胞と間葉間質幹細胞（MSSC）を一緒であるが、これら２種の細胞型間で接触させずに共培養する工程を含む方法が提供される。
本発明の第８局面により、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法であって、以前にNP細胞に曝露したことがある培地内で間葉間質幹細胞を培養する工程を含む方法が提供される。
IVD細胞に、又はIVD細胞に向けて分化させるための好ましい共培養技術については実施例６で説明する。
MSSCの活性化／分化のために使用する馴化培地は、好ましくは、正常なNP細胞の早期継代物（例えばP1及びP2）から調製してから遠心ろ過システムを用いて濃縮される。濃縮培地を標準培地中１〜30％の範囲の濃度で用いて分化を誘導する。
【００１６】
（Ｅ）遺伝子療法を用いて細胞の遺伝子発現プロフィールを変える−これは、NP表現型（特にTGFβ、Sox-6、Sox-9）の発生を制御する遺伝子を、MSSCのDNA中に組み込めるか又は組み込めないウイルスベクター又は非ウイルスベクターを用いてMSSCに挿入する工程を含む。この外因性遺伝子がSox-9であることが好ましい。配列番号１（図11参照）内に含まれる配列、又はアクセッション番号z46629としてGenBankで同定された遺伝子配列を有するSox-9遺伝子を用いてMSSCを感染させることが好ましい。図12に示されるように、SOX-9遺伝子がウイルス発現ベクター（下記参照）に挿入されることが最も好ましい。本発明のさらなる局面により、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法であって、NP表現型の発生を制御する発現ベクター中の遺伝子、特にSOX-9遺伝子をMSSCに挿入する工程を含む方法が提供される。
【００１７】
（Ｆ）酸素圧−発明者らは、培養したMSSC細胞の酸素圧を変えること、特に細胞を低酸素にすることがIVD細胞に向けた分化を促進しうることをも見出した。
例えば、0.1〜20％のＯ2中、４週間までの間、MSSCを培地中で単層培養することができる（例えば、上記（Ａ）で述べたような；又は実施例で述べるような従来の方法で）。10％未満のＯ2；好ましくは５％未満のＯ2、さらに好ましくは約１％のＯ2で分化を促進することができる。少なくとも１日、好ましくは少なくとも３日間、さらに好ましくは約１週間（又はそれ以上）前記酸素圧で細胞を培養すべきである。この分化手順の有用性を実証するデータは実施例３で与えられる。
上述した酸素圧法は、本発明のさらなる重要な局面に相当する。従って、本発明の第８局面により、間葉間質幹細胞をIVD細胞に向けて分化させる方法であって、５％以下の酸素を含む大気内で間葉間質幹細胞（MSSC）を培養する工程を含む方法が提供される。
【００１８】
分化工程（Ａ）〜（Ｆ）を単独で用いて、又は併用してMSSCを誘導してIVD細胞表現型を有する細胞に分化することができることは明かである。
好ましい一般的な分化手順により、MSSCを分化培地内で培養しながら（アルギナートのような）単純なゲル内に置いて、MSSCに負荷を加えることによって（上述したように）、NP表現型を採るようにMSSCを条件付ける。該培地は（ｉ）生長因子（例えば、TGFβ又はCDMP）を含んでよく；（ii）上述したような馴化培地でよく；又はIVD細胞を含んでよい（すなわち、共培養基）。
好ましい手順は、0.15MのNaCl中、1.2％の中間粘度アルギナートに約5x106細胞/mlの密度で細胞を再懸濁させてから前記アルギナートを重合させて被包化細胞の層を形成する工程を含む。TGFβを含有する培地内又は馴化培地（上述したような）内で２日〜６週間（その間に0.1〜2（典型的には0.5）Hzで0.0138〜0.689MPa(2〜100psi)の周期性圧縮負荷を用いて負荷を及ぼす）、被包化細胞を生長させることができる。
別の好ましい分化手順により、MSSCをアルギナート中に被包化し；上述したような培地内でインキュベートし；かつ１〜35日間、0.5〜３Hzの割合で動的な周期性圧縮負荷（０〜４mPa）にさらすことができる。さらに好ましくは、７日間48時間毎に４時間繰り返して１Hzで0.8〜1.7mPaとして負荷を加えることができる。この分化手順の有用性を実証するデータは実施例４で与えられる。
【００１９】
本発明の第１局面により分化した細胞は多くの治療用途で使用しうる。例えば、該治療が必要な対象者の病的椎間板に本細胞を投与してよく、或いは患者の椎間板に移植又は注入する予定の生体材料の上又は中に接種することによって投与しうる。生体材料は天然の化合物又は物質（例えばコラーゲン）でよく、或いは合成物質でよい。
本発明の好ましい態様により、未分化の多能性間葉間質幹細胞（本発明のMSSC）をIVD細胞に向けて分化させうる。該細胞を用いて生存可能な細胞を有するIVDを以前のように集団化させることができ、或いは該細胞を用いて本発明のDIVDの管理用の生体材料骨格及びゲルに播種することもできる。これら３つの療法の使用は、臨床要求が指示するように組み合わせることができる。
簡単に言えば、患者自身の骨髄、末梢血液及び／又は脂肪組織から自己未分化多能性間葉間質細胞を収集してからin vitroでコンフルレントに増殖させうる。次に、上述した好ましい手順によってMSSCが培地中に移され、前記培地中で髄核（NP）細胞に分化させられる。この後、この新しい分化かつ条件付けされたMSSC-由来IVD細胞を用いて：
（ａ）それらが新鮮なマトリックスを生産するという目的で病的IVD中への直接注入によって前記IVDを以前のように集団化させ；或いは
（ｂ）生体材料骨格及びゲルにin vitroで播種し、IVDのマトリックス及び／又は機能を修復するために好適な組織操作した移植片を生成させる。
【００２０】
発明者らは、IVDが無血管性であることにも気づいた。このことは、経口送達又は全身送達される薬剤の天然のIVD細胞へのアクセスを制限する。さらに、該薬剤のIVDへの直接的な反復注射も、重要な器官（例えば、大動脈、脊髄）に近いので、また感染を持ち込む危険のため問題がある。従って、発明者らは、IVDに治療薬を送達するための改良された手段を提供する必要があることに気づいた。これは、さらに詳細に後述する本発明のさらなる局面につながり、それによって本発明の第１局面の細胞を治療的に活性な薬剤の送達のために適合させることができる。
【００２１】
発明者らの研究は、生物学的薬剤（例えば、IL-1Ra、TGF、TIMPs）を治療的に治療的に用いることができることを示し、DIVDを管理することへの遺伝子療法アプローチの可能性を高めた。現在の風潮では、脊髄状態を治療するためにin vivo遺伝子療法を使用することは多くの問題を提起する。in vivoアプローチの使用は、未知の濃度（細胞当たりのベクターに関して）でIVD中に発現ベクター（通常ウイルスベクター）を注入することを必要とするだろう。高いMOIでのウイルスベクターの添加は細胞毒性を有し、かつ変性IVD中の細胞数は未知であり、容易には定量できないので、毒性濃度のウイルスベクターを添加する可能性が明らかにあるだろう。さらに（ａ）ウイルスベクターの血管への誤注入は致命的になりうる全身の免疫反応をもたらし；また（ｂ）Wallachらの最近の研究（2003: 84 International Society for the Study of the Lumbar Spine, Conference Abstract）は、IVD周囲の部位への高用量でのTGFβアデノウイルスベクターの誤注入後に麻痺を引き起こす強い可能性を実証した（Wallach et al. 2003 上記）。
【００２２】
変性背部状態の治療のためex vivo遺伝子療法アプローチの使用（すなわち、治療用遺伝子による細胞のin vitro形質転換後、該細胞を対象者に導入する）が考慮されている。このアプローチは、in vivo遺伝子導入の使用を超える多くの利点を有する。該アプローチの最も明かな利点の１つは、IVD中への細胞の挿入前に広範囲の安全管理を果たす能力だろう。さらに、IVDに注入する前に高レベルの治療用タンパク質の生産のための細胞を選択できるので、より高レベルの導入遺伝子が生成される可能性が高いだろう。脊髄状態の治療へのex vivo遺伝子療法アプローチの１つの試みはDE4219626に開示されている。
【００２３】
しかしながら、現在まで、これらin vivo又はex vivo遺伝子療法アプローチはいずれも臨床的に使用するには不十分である。発明者らは、MSSCから生成されるIVD細胞がこの能力において成功しうることを見出した。そこで、本発明の第９局面により、
（ａ）IVD細胞表現型に向かってin vitroで分化させられ；かつ
（ｂ）椎間板の変性を低減するタンパク質をコードする外因性遺伝子でトランスフェクトされた、
単離された間葉間質幹細胞（MSSC）が提供される。
本発明の第１局面のMSSC／IVD細胞は、完全分化のプロセスが完了する前又は後に外因性遺伝子で遺伝的に形質転換させることができる。
外因性遺伝子は該細胞から発現して（好ましくは、in vitro及び対象者に投与されたとき）椎間板の変性を低減するための活性を直接的又は間接的に有するタンパク質を生産できなければならない。“直接的”とは、遺伝子発現の産物自体が、必要な活性を有することを意味する。“間接的”とは、遺伝子発現の産物が少なくとも１つのさらなる反応を受けて、又は媒介して（例えば、酵素として）椎間板の変性を低減するために有効な物質を与えることを意味する。
【００２４】
炎症を低減することが分かっている活性を有する多くの遺伝子から外因性遺伝子を選択することができる。これには以下のものが挙げられる：サイトカイン（特にTGFβスーパーファミリーの分子）；サイトカインのインヒビター（特に特異的なインターロイキン-1インヒビター、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト[IL-1ra]及び可溶性II型インターロイキン-1受容体[IL-1RII]及び分解酵素のインヒビター（特にTIMP1、TIMP2、TIMP3並びにマトリックスメタロプロテイナーゼ及びADAMTsの他のインヒビター）。
好ましい外因性遺伝子はインターロイキン-1受容体アンタゴニスト（IL-1RA）をコードする。IL-1RAはIL-1の天然インヒビターである。発明者らは、IL-1RAが正常な椎間板細胞によってIL-1と共にであるが、IL-1活性を阻害するであろうサイトカインを超えて過剰に生成されることを示した。しかし、発明者らは、病的IVDでは、IL-1RA生産ではなくIL-1生産が上方制御されることを実証した。この発見の含意は、本発明の脊髄状態におけるIL-1RA生産に相対的な不足があるということである。従って、外因性遺伝子は好ましくはIL-1RAをコードする。
【００２５】
適切なベクター内に外因性遺伝子を包含して組換えベクターを形成することができる。このベクターは、例えばプラスミド、コスミド又はファージでよい。このような組換えベクターは、外因性遺伝子で細胞を形質転換するために非常に有用である。
組換えベクターが他の機能要素を含んでもよい。例えば、ベクターが細胞の核内で自律的に複製するように組換えベクターを設計することができる。この場合、組換えベクターにはDNA複製を誘導する要素が必要だろう。或いは、ベクターと組換えDNA分子が細胞ゲノムに組み込むように組換えベクターを設計することができる。この場合、目標とした組込み（例えば、相同的組換え）に有利なDNA配列が望ましい。組換えベクターは、選べるマーカーとしてクローニング過程で使用しうる遺伝子をコードするDNAをも有しうる。
組換えベクターは、要求どおりに遺伝子の発現をコントロールするためのプロモーター又は調節因子をさらに含みうる。
外因性遺伝子をレトロウイルスベクターに挿入することができる。このようなベクターは、有利には、宿主ゲノムに完全に組み込むことができる。この結果、長期遺伝子発現となり、組み込まれた遺伝子が娘細胞にパスされる。
しかしながら、最近、レトロウイルスベクターを用いて重症複合免疫不全症（SCID）の治療を受けている遺伝子療法患者は、SCIDは治癒されたが、該レトロウイルスの“挿入変異(insertional mutagensis)”によって引き起こされると考えられる白血病に似た状態を発症した。さらに、レトロウイルスはマウス内で白血病を引き起こすことも分かった。このことは、レトロウイルスベクターの使用には問題がありうることを示唆している。従って、アデノウイルスベクターに外因性遺伝子を挿入することが好ましい。アデノウイルスベクターはエピソーム状態のままであり、ゲノムに組み込まれないので、アデノウイルスベクターの使用は、挿入変異の危険を回避する。さらに、Adベクターは、静止状態の、非分裂性の、高度に分化した細胞への良い伝達能を有する。
発明者らは、IVD内での遺伝子導入へのex vivoアプローチにおけるアデノウイルスベクターが有用であると考える。遺伝子導入の多くの場合、アデノウイルスがゲノムに組み込めないことが、導入遺伝子（これは細胞分裂の間に失われるので）の短命性をもたらすと考えられる。しかし、細胞の代謝回転率が非常に低いIVD内では、このことは同じ問題を生じさせず、長期的遺伝子発現が起こりうる。
【００２６】
本発明の第10局面により、間葉間質幹細胞、又はそれらから本発明の第９局面の発明に従って生成されたIVD細胞を遺伝的に形質転換するために適した組換えベクターであって、DIVDを低減するタンパク質をコードする遺伝子を含有するアデノウイルス発現ベクターを含んでなる組換えベクターが提供される。
本発明の第10局面の好ましい組換えベクターについては実施例２で述べる。
外因性遺伝子をベクターに組み込まずにMSSCに送達できることは明かだろう。例えば、リポソーム又はウイルス粒子内に外因性遺伝子を取り込むことができる。或いは、適切な手段、例えば直接的エンドサイトーシス取込みによって“裸の”DNA分子をMSSC中に挿入することができる。
トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、プロトプラスト融合又は弾道ボンバードメント(ballistic bombardment)によって、外因性遺伝子（ベクター内に包含され、又はそうでない）をMSSCに（IVD細胞に向けた分化の前又は後）移入することができる。例えば、被覆金粒子による弾道ボンバードメント、外因性遺伝子を含有するリポソーム、及び直接DNA取込み（例えば、エンドサイトーシス）を与える手段によって移入しうる。
分化過程の間に外因性遺伝子で細胞を感染させることが好ましい。
細胞をゲル中に被包化する場合、ゲル被包化の際に感染が起こることが好ましい。ゲル中で感染させる細胞は、好ましくは重合前にゲル細胞懸濁液にウイルス懸濁液を添加することによって感染させられる。最も好ましい感染プロトコルについては実施例１で述べる。
本発明の第１局面の目的について上述したのと同じ目的で本発明の第９局面の細胞を使用できることは明かだろう。さらに、本発明の第９局面の細胞は、DIVDに対する効力を有しうる治療的に有効な物質を含有するように操作されているという利点を有する。
以下、実施例によって、添付図面を参照しながら本発明をさらに説明する。
【００２７】
実施例１：間葉間質幹細胞収集、細胞培養及びIVD細胞分化
1.1  方法
1.1.1  間葉間質幹細胞収集
腸骨稜骨髄吸引物から間葉間質幹細胞を収集した。収集時に、5〜10mlの骨髄を4.45mlのHBSS、0.05mlのPSA及び0.5mlのヘパリン(100単位)に入れる。該サンプルを10分間500gで遠心分離する。上清を除去し、ペレットを5mlのαMEMに再懸濁させる。次に、細胞懸濁液を15mlの遠心管に移し、5mlのhistopaque 1077を遠心管（培地の下）に加える。管を30分間500gで遠心分離して間質細胞を単離する。遠心分離後、穏やかな吸引によって、単核細胞を含有する灰色の界面層を取り出し、細胞ストレーナーに通して標準培地(T75培養フラスコ中、αMEM、10%のFCS、1%のグルタミン、1%のアスコルビン酸並びに1%のペニシリン、ストレプトマイシン及びアンホテリシン)に再懸濁させる。細胞を標準培養条件(5% CO2中37℃)でインキュベートする。培地を変えずに細胞を１週間静置してから培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、新鮮な培地を加える。その後、２〜３日毎に培地を変え、標準的な方法で２〜３継代を通じて細胞を増やす。
【００２８】
1.1.2  IVD細胞の細胞培養
T75フラスコ(Appleton woods)中10%の熱不活化ウシ胎児血清(FCS)(Gibco)、100U/mlのペニシリン(Sigma)、100μg/mlのストレプトマイシン(Sigma)、250ng/mlのアンホテリシン、2mMのグルタミン(Sigma)及び50μg/mlのアスコルビン酸(Sigma)で補充したDMEM+F12培地内でIVD細胞を培養し、5%のCO2を含む加湿大気内で37℃にて培養を維持する。一日おきに培地を変える。
【００２９】
1.1.3  間葉幹細胞からのIVD細胞の生産
以下のいくつかの分化技術を単独で又は組み合わせて使用した。
1.1.3.1  IVD細胞誘導培地−1.349gのグルコース、50μg/mlのL-アスコルビン酸、100単位/mlのペニシリン、100μg/ml mlのストレプトマイシン、250μg/ml 250ngのアンホテリシン、10ng/mlのTGF-β3、1x10-7Mのデキサメタゾン、100μg/mlのピルビン酸ナトリウム、40μg/mlのプロリン及び1% ITS+1プレミックスで補充したDMEM/HAMs F12 1:1(Sigma製ITSミックスと、1mg/mlのインスリン、0.55mg/mlのトランスフェリン、0.5μg/mlの亜セレン酸ナトリウム；50mg/mlのBSA及び470μg/mlのリノール酸を含むプレミックス)。
1.1.3.2  アルギナート被包化−単層間質細胞をトリプシン処理し、結果の細胞懸濁液を500gで遠心分離する。細胞ペレットを10mlの間質性培地に再懸濁させ、クールター計数器を用いて細胞を数える。さらに500gで遠心分離後、0.15MのNACl中1.2%の中間粘度アルギナートに細胞を1x106細胞/mlの密度で再懸濁させる。結果の懸濁液を、5mlの注射器を用いて22ゲージ針で、102nM CaCl2を含有する12ウェルプレートに押し出して重合微小球ビーズを形成する。10分後、重合アルギナートを生理食塩水で洗浄後、標準培養液で洗浄する。
1.1.3.3  IVD細胞表現型の誘導−アルギナート中に被包化した細胞をIVD細胞誘導培地に入れ、12日までの間、標準条件下で培養する。
1.1.3.4  負荷をかける−アルギナート構築物として、24ウェルプレート中で細胞に負荷をかける。プレートを密封チャンバーに入れ、種々の時間(２〜４時間)、頻度を変えて(３秒オンオフ、５秒オンオフ)0.048MPa(7psi)までの圧力にて5%のCO2、平衡空気流入によって圧力を加える。
1.1.3.5  MSSCと髄核(NP)細胞の共培養−正常なNP細胞(P3)とMSSC(P3)を単層としてコンフルテントに増殖させてからトリプシン処理し、細胞を数える。60,000個のNP細胞と30,000個のMSSCという割合で細胞を一緒に（しかし接触させずに）培養する。ウェル内で接触させないため、NP細胞をピペットでウェルの底に入れてから、組織培養挿入断片を該ウェルに入れ、MSSCを該挿入断片上にピペットで置く。各ウェルに2mlのDMEM-F12+FCSを加え、標準条件下で細胞をインキュベートする。
【００３０】
1.2  結果
発明者らは、実験を行い従来技術で用いられる細胞は変性IVDの治療には適さなかったことを確認した。
IVDの修復及び組織操作の戦略に重要なことは、NPに注入してNPを再生するために好適な細胞の生成である。１つのアプローチは患者のIVD由来の細胞を収集することだった。多くの研究者はこれら細胞を利用しているが、発明者らは、驚くべきことに、該細胞は老化表現型を有し、IVDの負荷に耐えられず、かつIL-1RAアデノウイルスで感染させて外植片に注入する場合、IVDが組織内でIL-1RAを増やせないので、このアプローチには欠陥があることを見出した。
【００３１】
1.2.1  細胞老化の証拠
発明者らは、正常NPと変性NPの組織及び細胞における細胞複製ポテンシャル(老化と共に低下する)及びサイクリン依存性キナーゼインヒビターP16INK4Aタンパク質(細胞老化の間に下方制御される)の発現を調べた。これは年齢に関連して：正常NPでは、複製ポテンシャルが低下し；P16INK4Aの細胞発現が増加することを示した。しかし、変性IVDのNP細胞は、若い患者由来の細胞でさえ、40歳も年とった正常な個体と同等の複製ポテンシャルの低下とP16INK4Aの発現の増加を示した。さらに、発明者らはリアルタイムRT PCRにより老化バイオマーカーの発現と、マトリックス分解酵素MMP3＆MMP13；アグリカナーゼ、ADAMTs 5；及びＩ型コラーゲンの遺伝子の発現との間には直接的な関係があり；かつII型コラーゲン及びアグリカンの発現と逆関係にあることを示した。このようなデータは、変性NP細胞は細胞代謝が変化した老化表現型を示し、この細胞代謝の変化がIVDの修復で変性NP細胞がその後使用されるのを阻止するかもしれないことを示唆している。
1.2.2  負荷の効果
予備データは、変性NP細胞が0.0069Mpa(1psi−椎間板上の最小負荷は0.3Mpaである)程度の低圧の負荷に超過敏のようであることを示す。我々の実験は、細胞の応答が細胞型及び加えられる負荷の頻度と量に依存することも示す。例えば0.0345MPa(5psi)と0.0483MPa(7psi)の負荷を加えた変性NP細胞の遺伝子発現では、有意な差異が観察された。
1.2.3  IL-1RAアデノウイルス感染IVD細胞
Ad-IL-1Raで感染させた細胞の該組織内でIL-1Raの総生産の増加に寄与する能力も研究した。変性IVD由来の細胞と非変性IVD由来の細胞をAd-IL-1Raで感染させ、CFDA-SEで標識し、変性ヒトIVDの外植片に注入した。すべての組織外植片でCFDA-SE標識細胞が同定された。Ad-IL-1Raで感染させた正常なIVD細胞を該組織外植片に注入した場合、IL-1Ra免疫陽性細胞の有意な増加が観察された。しかし、Ad-IL-1Ra感染変性細胞を該組織外植片に注入したときは、IL-1Ra免疫陽性細胞の生産の増加は観察されなかった。これは、変性IVD細胞の使用が変性IVDへのIL-1Raの導入に適さないことを実証している。
1.2.4  MSSCからのIVD細胞の生産
アルギナート中で培養し、IVD細胞誘導培地で処理した間葉細胞は11日後にSox9とアグリカンの遺伝子発現の増加を示す（図１）。
1.2.5  IVD細胞表現型誘導における負荷の効果
圧縮負荷下、アルギナート培養におけるMSSC細胞の培養は、同一条件下で培養したNP細胞に等価なプロテオグリカン生産をもたらし、培養の時間と共にプロテオグリカン含量が増加した（図２）。
1.2.6  MSSCとNP細胞の共培養
MSSCと正常NP細胞の共培養はMSSCのNP細胞への分化を惹起した。さらに、リアルタイムPCRは、NP細胞とMSSCの両者がSOX-9遺伝子の発現を増やすことを示した（図３）。細胞を接触させずに維持した。これはNP細胞によって放出される因子がMSSCをNP細胞に分化させることを示唆している。
【００３２】
実施例２：遺伝子導入
この実施例は、脱分化したNP細胞に外因性遺伝子(IL-1RA)を挿入するために発明者らが行った研究を示す。培養で２〜３回継代すると、NP細胞は培養内でMSSC表現型に向かって自律的に脱分化する傾向がある。従って、このような脱分化した細胞は本発明のMSSCの良いモデルに相当する。
2.1  ウイルスベクターの選択−レトロウイルスベクターが宿主ゲノムへ完全組み込まれる能力は長期遺伝子発現をもたらし、組み込まれた遺伝子が娘細胞へ移される。しかし、好ましくない部位にウイルス挿入が起こる場合には変異の誘発が起こる可能性がある。最近、レトロウイルスベクターを用いた重症複合免疫不全症（SCID）の治療を受けていた仏国の遺伝子治療患者において、SCIDは治癒されたが、レトロウイルスの「挿入変異」によって引き起こされると考えられる白血病に似た状態が発症した。さらに、レトロウイルスはマウス内で白血病を引き起こすことも分かった。これら研究は、レトロウイルス遺伝子導入の使用にとって好ましくないようだ。アデノウイルスベクターはエピソーム状態のままであり、ゲノムに組み込まれないので、アデノウイルスベクターの使用は挿入変異の危険を回避する。さらに、Adベクターは、静止した、非分裂性の高度に分化した細胞への良い伝達能を有する。アデノウイルスベクターはIVD内での遺伝子導入へのex vivoアプローチにおいて有用だろう。遺伝子導入の多くの場合、アデノウイルスがゲノムに組み込めないことが、導入遺伝子（これは細胞分割の間に失われるので）の短命をもたらすと考えられる。しかし、細胞の代謝回転率が低いIVD内では、このことは同じ問題を生じさせず、長期遺伝子発現が起こりうる。さらに、アデノウイルス遺伝子導入の失敗は、ウイルスタンパク質、又は該導入遺伝子によってコードされている外来タンパク質への免疫反応によって引き起こされることが多い。しかし、このことは、IVDは免疫特権部位と考えられるので、IVD内で問題を生じさせないだろう。
ウイルスベクター−Ad-IL-1Raベクターは、Professor Christopher H Evans (Harvard University, Boston)からの親切な供与物である。簡単に言うと、Bandaraら(1993 Proc, Natl. Cad. Sci USA 90: 10764-10768)によって詳述されているとおりにヒト単球cDNAライブラリーからIL-1Ra cDNAをクローン化した。次に、Hardyら(1997 J Virol 71, 1842-1849)のシステムによるCre-lox組換えによって、IL-1Raを含有する第１世代、E1、E3-欠失血清型５組換えアデノウイルスベクターを構築した。すべてのこれらアデノウイルス構築物を293細胞内で増殖させ、溶解後、CsCl密度勾配精製(Bet, Prevec et al. J Virol 67, 911-5921)を利用してウイルス懸濁液を精製した。
【００３３】
2.2  感染プロトコル−感染の好ましいタイミングはアルギナート被包化の間である。ウイルス懸濁液（単層に関して計算した正確な体積）を重合前のアルギンナート細胞懸濁液に添加することによって、アルギンナート内で感染させるべき細胞を感染させる。簡単に言えば、単層培養として増殖後、細胞をトリプシン処理し、細胞懸濁液を５分間300gで回転させて細胞ペレットを生成する。細胞ペレットを10mlのDMEM+F12に再懸濁させ、クールター計数器ZM(Coulter electronics)で細胞数を数える。さらにペレット化後、0.15MのNaCl中1x106細胞/mlの密度で1.2%の低粘度アルギン酸ナトリウムに細胞を再懸濁させ、適量のウイルス懸濁液を加える。混合後、200mMのCaCl2を含有する12ウェルプレートに細胞/ウイルス懸濁液を23ゲージ針を通すと、各液滴は即座に重合して半固形微球ビーズを形成した。ビーズを10分間37℃でインキュベートしてさらに重合させた後、0.15MのNaClで２回洗浄し、血清フリー培養液で２回洗浄する。２mlのIVD細胞インキュベーション培養液を各ウェルに加え、5%のCO2を含む加湿大気内で37℃にて培養を維持する。
【００３４】
2.3  細胞に及ぼすIL-1RA遺伝子導入の効果
2.3.1  ウイルス感染細胞の表現型の安定性−調べたいずれのマトリックスタンパク質の染色パターンにおいてもAd-LacZ感染細胞と非感染細胞との間に差異は見られなかった(アグリカン(p=0.499)、II型コラーゲンII(p=0.5)及びＩ型コラーゲン(p=0.498))。II型コラーゲンとアグリカンに陽性の細胞が高比率であり、培養４週間後でさえＩ型コラーゲンに陽性の細胞は低比率だった（図４）。Ad-GFP感染細胞では同様の結果が見られ、非感染細胞に比べ、調査したいずれのマトリックスタンパク質のいずれの細胞型内でも有意な差はなかった（図５）（全細胞の確率値：アグリカンp=0.786、II型コラーゲンp=0.954、Ｉ型コラーゲンp=0.3588）。
2.3.2  遺伝子導入後のIL-1Ra生産
アルギナート内での細胞の感染は、非感染細胞内でのIL-1Ra生産に比し、調査したすべての細胞型（正常NP p<0.05、変性NP p<0.05、正常AF p<0.1及び変性AF p<0.05)で感染48後にIL-1Raタンパク質の有意な増加をもたらした（図６）。
非感染の変性NP細胞は、非感染の変性AF細胞より有意に高レベルのIL-1Raを示した(p<0.05)。さらに、Ad-IL-1Ra感染した変性NP細胞もAd-IL-1Ra感染した変性AF細胞より高レベルのIL-1Raタンパク質を示した(p<0.05)(図６)。正常なIVD細胞は、NP細胞とAF細胞との間でIL-1Ra生産において何ら有意な差異を示さなかった。非感染の正常細胞は、非感染の変性IVD細胞に対してIL-1Ra生産で有意な差異を示さなかった。しかし、Ad-IL-1Ra感染した正常な細胞は、感染した変性細胞より高いIL-1Ra生産を示した(NP細胞(p<0.05)、AF細胞(p>0.1))(図６)。さらに５週間のアルギナート内での培養後、Ad-IL-1Ra感染細胞は、非感染細胞に比べて、すべての細胞型でIL-1Ra遺伝子発現の上昇を示した(正常NP p<0.05、変性NP p<0.1、正常AF p<0.05、変性AF p<0.05)(図７)。
【００３５】
2.3.4  アルギナート培養内での導入遺伝子発現の長さ
アルギナート内でAd-IL-1Raで感染させた(MOI 300及び1500)変性NP細胞は、感染２日後(MOI 300 p<0.05、MOI 1500 p<0.05)及びその後の全時点(すべてp値<0.05)で非感染コントロール細胞より有意に高レベルのIL-1Raタンパク質を生成した。レベルは300のMOIで感染させた細胞より1500のMOIで感染させた細胞で有意に高かった(p<0.05)(図8A)。Ad-GFPで感染させた細胞は、調査した時間経過にわたってIL-1Raタンパク質生産において何ら有意な差を示さなかった(すべてのp値>0.1)(図8A)。
アルギナート内でAd-IL-1Raで感染させた(MOI 300及び1500)変性AF細胞も、感染２日後(MOI 300 p<0.05、MOI 1500 p<0.05)で非感染コントロール細胞に比べて有意に高レベルのIL-1Raタンパク質を示した。さらに、300のMOIで感染させた細胞より1500のMOIでAd-IL-1Raにて感染させた細胞で有意に高レベルのIL-1Raタンパク質が見られた(p<0.05)(図8B)。Ad-GFP感染細胞では、非感染コントロールに比べてIL-1Raタンパク質のレベルに差異は見られなかった(すべてのp値>0.1)。研究した全時点で、Ad-IL-1Raで感染させた(MOI 300＆1500)変性AF細胞は、感染２日後に生成されたIL-1Raのレベルから有意な減少を示さなかった(すべてのp値>0.1)。Ad-IL-1Raで感染させた(MOI 300)正常なNP細胞とAF細胞は、感染２日後、非感染コントロール細胞より有意に高レベルのIL-1Raタンパク質を示した(p<0.05)。アルギナート培養で５週間後、タンパク質のレベルの有意な変化は見られなかった。感染細胞内のIL-1Raタンパク質のレベルは、アルギナート培養で５週間後でさえコントロール細胞より有意に高いままだった(p<0.05)。
2.3.5  IL-1RaによるIL-1の阻害
IL-1βによる48時間の単層培養IVD細胞の処理は、MMP3及びMMP13の遺伝子発現の有意な増加をもたらした(図９)。すべての細胞型において、Ad-IL-1Raによる細胞の感染(MOI 300)によりIL-1βに対する反応が阻害され、MMP3及びMMP13遺伝子発現が減少した。
【００３６】
2.4  脱分化したNP細胞のSox-9アデノウイルスによるトランスフェクション
単層の脱分化したNP細胞のアデノウイルスSOX-9によるトランスフェクションは、単層内でのNP表現型の発生をもたらし、これはTGF-β1の添加によって改善された(図10)。この結果は、TGF-β-刺激されたSOX-9トランスフェクト単層MSSCが、組織操作用途で使うために容易にアクセスしうるNP様表現型を有する分割細胞の大集団を生成することを示す。  この実施例で用いたSox-9ベクターの配列を図11に示し、制限地図を図12に示す。Sox-9遺伝子配列は塩基1265〜27222（GenBankアクセッション番号z46629）を包含した。
【００３７】
実施例３
MSSC細胞をNP細胞に向けて分化させる手段として酸素圧を低下させることの有効性を実証するための実験を行った。
MSSC細胞を単離し、実施例１の1.1.1及び1.1.2で述べたとおりに培養した。これら細胞を、分化のマーカーとしてSox-9の発現をモニターできるように実施例２で述べたとおりにSox-9で形質転換させた。アグリカンとII型コラーゲンの発現も分化のマーカーとしてモニターした。
図13は、１％の酸素中で２週間単層内で培養したMSSC細胞はNP細胞に向かって分化したが、20％の酸素中で２週間単層培養した細胞は無視しうる量の分化マーカーしか発現しなかったことを示す。
【００３８】
実施例４
発明者らは、上記分化工程（特に実施例１及び実施例３）を併用することによってさらに進んだ研究を行った。
発明者らは、１より多くの分化技術を使用すると分化を改善できることを見出した。例えば、アルギナート中に被包化し、かつ軽い負荷管理下(0.8〜1.7MPa,1Hz)で４週間、週に３回負荷を加えたMSSC細胞は、培養内で１〜３週間にわたってアルギナート構築物の総プロテオグリカン含量を二倍にした。このような細胞は、天然のNP細胞に密接に似た表現型を有していた。図14は、該細胞からのプロテオグリカン生産（分化マーカー）を示す。
【００３９】
実施例５
発明者らは、関節由来生長因子(CDMP)１及び／又は２を含むさらなるIVD細胞誘導生長因子培地を開発した。
標準培地(DMEM/hams F12、10% FCS、100U/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシン、250ng/ml アンホテリシン、2mM グルタミン及び50μg/ml アスコルビン酸)内、アルギナート層構築物中でMSSC細胞を培養した。次に、細胞を1、10又は100ng/mlのCDMP1又はCDMP2で処理した。処理48時間後、アルギナート層構築物を培養から取り出し、パパイン消化を行い、DMMBアッセイを用いてGAG含量を評価した。次に、GAGのアルギナート層構成物当たりの濃度を計算した。
図15に示したデータは、MSSC細胞のCDMP処理がそのプロテオグリカン(IVD細胞分化のマーカー)生産を増やしたことを実証している。1ng/mlのCDMP1又は100ng/mlのCDMP2による処理後に見られた効果が最適だった。
【００４０】
実施例６
発明者らは、標準培地内で直接接触させ、細胞比を変えた椎間板細胞とMSSCとの共培養がMSSCのNP細胞へ向かう分化を誘導することを実証するための実験を行った。TGFβ又はCDMPのような生長因子を入れない培地中でこの共培養法を実施したことに注目すべきである。
方法：
正常なヒトNP細胞とMSCを培養して単層内でコンフルエンスにしてからMSCを緑色蛍光、細胞永久色素(cell permanent dye)(CFDA)で標識した。次に、以下の比率で24-ウェルプレートのウェルに細胞を接種した。
100%のNP細胞
100%のMSC
75%のNP細胞：25%のMSC
50%のNP細胞：50%のMSC
25%のNP細胞：75%のMSC
７日時点と14日時点で、CFDA-標識MSCと非標識NP細胞との蛍光の差を利用するFACSによってMSC細胞とNP細胞を分離した。
セルソーティング後、TRIzol法を利用してRNAを抽出し、SYBR-緑色法を利用して実時間PCRを行った。２種のハウスキーピング遺伝子 (18s及びGAPDH)を用い、それらの発現レベルを平均した。標的遺伝子(II型コラーゲンおよびアグリカン−すなわちIVD細胞のマーカー)を分析し、それらの発現を2-ΔΔCT法用いて、平均したハウスキーピング遺伝子発現およびコントロール細胞における関連標的遺伝子の発現（それらも平均した自身のハウスキーピング遺伝子発現に対して正規化した）に対して正規化した。
結果：
共培養７日後(A)と14日後(B)のII型コラーゲンmRNAの発現及び共培養7日後(C)と14日後(D)のアグリカンmRNAの発現を示すデータを作製した。このデータは、共培養法がIVD細胞へ向かう分化を促進することを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例１に記載されたように、IVD細胞誘導培地内で培養したMSSCにおけるSox-9とアグリカンの遺伝子発現のレベルを示す。
【図２】実施例１に記載されるように、2.5時間、３秒オン３秒オフで0.0345MPa(5psi)にて負荷を加えたゲル構成物におけるプロテオグリカン生産を示す。
【図３】実施例１に記載されるように、単層MSSC及びNP細胞内での経時的なSOX-9 mRNA発現(A)及びアグリカンmRNA発現(B)の変化を示すリアルタイムPCRの結果を示す（GAPDHに正規化したサンプル及び単集合培養物内の細胞）。
【図４】実施例２に記載されるように、Ad-LacZで感染させたアルギナートビーズ培養(ii)及び非感染細胞(i)におけるアグリカン(A)、II型コラーゲン(B)、又はＩ型コラーゲン(C)の免疫組織化学的染色を示す（バー＝380nm）。
【図５】実施例２に記載されるように、アルギナートビード内でAd-GFPによる細胞の感染後のマトリックスタンパク質アグリカン、II型コラーゲン及びＩ型コラーゲンの、感染５週間後の遺伝子発現を示す。
【図６】実施例２に記載されるように、MOI 300培養したIL-1Raで感染させた細胞における感染２日後のIL-1Raタンパク質生産を示す（エラーバー＝平均の標準エラー。統計解析：正常なAF細胞についてｐ＜0.1、ｐ＜0.05＝他のすべての細胞、＊＝非感染細胞と感染細胞との差について確率値。■＝NP細胞とAF細胞との差についての確率値。▲＝正常細胞と変性細胞との差についての確率値）。
【図７】実施例２に記載されるように、アルギナート培養内で感染及びアルギナートビード内で培養５週間後のIL-1Raの遺伝子発現（エラーバー＝平均の標準エラー）；及び統計的有意性を示す。
【図８】実施例２に記載されるように、72日間アルギナート培養で感染した変性NP細胞(A)及びAF細胞(B)におけるIL-1Ra生産を示す。
【図９】実施例２に記載されるように、IL-1βで処理して単層培養したIVD細胞（非感染及びAd-IL-1Ra(MOI 300)で感染）におけるMMP3(A)及びMMP13(B)の遺伝子発現を示す（エラーバー＝平均の標準エラー；統計解析：ｐ＜0.1＝*又は▲、ｐ＜0.05＝**又は▲▲；アスタリスク＝非処理細胞と処理細胞との差についての確率値；三角＝非感染細胞と感染細胞との差についての確率値）。
【図１０】実施例２に記載されるように、単層MSSCのSOX-9トランスフェクション後(A)及びTGF-β1刺激とSOX-9トランスフェクション後(B)のマトリックス成分分子の相対的な遺伝子発現を示すリアルタイムPCRデータである（サンプルはGAPDH及びGFP-トランスフェクト、非刺激コントロールに正規化）。
【図１１】実施例２に記載されるようなSox9遺伝子を含むベクターの配列を示す。
【図１２】Sox9を含有する好ましい発現ベクターのベクター地図を示す。
【図１３】実施例３に従い、２週間１％と20％の酸素中、単層培養したMSSC細胞におけるSox-9、アグリカン及びII型コラーゲンの遺伝子発現を示す棒グラフである。
【図１４】実施例４に記載される好ましい分化技術を用いたプロテオグリカン生産（NP細胞に向けた分化のマーカー）を示す棒グラフである。
【図１５】実施例５に記載されるように、MSSC細胞のCDMP処理がプロテオグリカン生産を増加させたことを示す棒グラフである。
【図１】
2007525990.tif 000003
【図２】
2007525990.tif 000004
【図３】
2007525990.tif 000005
【図４】
2007525990.tif 000006
【図５】
2007525990.tif 000007
【図６】
2007525990.tif 000008
【図７】
2007525990.tif 000009
【図８】
2007525990.tif 000010
【図９】
2007525990.tif 000011
【図１０】
2007525990.tif 000012
【図１１】
2007525990.tif 000013
【図１１】
2007525990.tif 000014
【図１２】
2007525990.tif 000015
【図１３】
2007525990.tif 000016
【図１４】
2007525990.tif 000017
【図１５】
2007525990.tif 000018
【配列表】
2007525990000001.app
【国際調査報告】
2007525990.tif 000019
2007525990.tif 000020
2007525990.tif 000021
2007525990.tif 000022
2007525990.tif 000023
2007525990.tif 000024