(57)【要約】本発明は、ＡＩＤＳ感染に対する抵抗性増進などの生理学的状態に関連付け可能な、ヒトおよび／または非ヒト霊長類における、進化的に重要なポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を同定する方法を提供する。本発明はまた、ＩＣＡＭ１などの、疾患に対する感受性と相関する突然変異を持つ、進化的に重要なポリヌクレオチドを同定する方法も提供する。該方法は、統計的方法を用いて、ヒトおよび非ヒト霊長類の配列の比較を使用する。こうして同定された配列は、宿主療法ターゲットとして、そして／またはスクリーニングアッセイにおいて、有用でありうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト霊長類の生理学的形質と関連付けられてきたかまたは関連付け可能である非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列が、該生理学的形質をより少ない度合いで示すヒトに比較して、進化的に重要な（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）変化を経てきたかどうかを決定する方法であって：
（ａ）非ヒトポリヌクレオチド配列を、対応するヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド変化いずれかを同定し、ここでポリヌクレオチド配列は、ＩＣＡＭ−１ポリヌクレオチド配列、ＩＣＡＭ−２ポリヌクレオチド配列、ＩＣＡＭ−３ポリヌクレオチド配列、ＣＤ９８ポリヌクレオチド配列、ｐ４４ポリヌクレオチド配列、ＩＦＮ−ｐ５６ｋポリヌクレオチド配列、およびＳｔａｆ５０ポリヌクレオチド配列からなる群より選択される；そして
（ｂ）前記非ヒトヌクレオチド変化が進化的に重要であるかどうかを決定して、それによって、非ヒト霊長類の生理学的形質と関連付けられてきたかまたは関連付け可能である非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列が、該生理学的形質をより少ない度合いで示すヒトに比較して、進化的に重要な変化を経てきたかどうかを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６７、配列番号７０、配列番号７３、配列番号７９、配列番号８２、配列番号３７、配列番号４３、配列番号３１、および配列番号４９からなる群より選択される、請求項１の方法。
【請求項３】
生理学的形質を調節可能な剤を同定する方法であって、試験しようとする少なくとも１つの剤を、請求項１の対応するヒトポリヌクレオチド配列でトランスフェクションしておいた細胞と接触させ、該ポリヌクレオチド配列の機能を調節する能力によって、該剤を同定することを含む、前記方法。
【請求項４】
生理学的形質が、ウイルス疾患の進行に対する抵抗性であり、対応するヒトポリヌクレオチドが、ＩＣＡＭ−１ポリヌクレオチド、ＩＣＡＭ−２ポリヌクレオチド、およびＩＣＡＭ−３ポリヌクレオチド、ＣＤ９８ポリヌクレオチド、ｐ４４ポリヌクレオチド、ＩＦＮ−ｐ５６ｋポリヌクレオチド、およびＳｔａｆ５０ポリヌクレオチドからなる群より選択され、そして調節される機能が、ウイルス疾患の進行に対する抵抗性増加である、請求項３の方法。
【請求項５】
生理学的形質が、ポリペプチドのそのリガンドへの結合、ウイルスが仲介する細胞性発症、細胞間感染性、ウイルスが仲介する細胞融合、ウイルスが仲介する合胞体形成、およびウイルス発芽率からなる群より選択される、請求項３の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、ＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ９８、ｐ４４、ＩＦＮ−ｐ５６ｋ、およびＳｔａｆ５０からなる群より選択される、請求項５の方法。
【請求項７】
ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号５５、配列番号７６、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４６、および配列番号５２からなる群より選択されるポリヌクレオチド、または約１８〜２２５ヌクレオチドであり、そして非ヒト霊長類の進化的に重要なヌクレオチド変化に対応する少なくとも１つのヒトヌクレオチドを有する、前記ポリヌクレオチドの断片を含むポリヌクレオチドである、請求項４の方法。
【請求項８】
生理学的形質が、ウイルス疾患の進行に対する抵抗性であり、ポリヌクレオチドが、ＣＤ９８、ｐ４４、ＩＦＮ−ｐ５６ｋ、およびＳｔａｆ５０からなる群より選択され、そして調節される機能が、Ｃ型肝炎が引き起こす肝炎の進行に対する抵抗性増加である、請求項３の方法。
【請求項９】
生理学的形質が、ウイルス疾患の進行に対する抵抗性であり、ポリヌクレオチドが、ＣＤ９８、ｐ４４、ＩＦＮ−ｐ５６ｋ、およびＳｔａｆ５０からなる群より選択され、そして調節される機能が、ＡＩＤＳの進行に対する抵抗性増加である、請求項３の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチドが、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４６、および配列番号５２からなる群より選択されるポリヌクレオチドである、請求項９の方法。
【請求項１１】
生理学的形質が、ＡＩＤＳの進行に対する抵抗性であり、ポリヌクレオチドが、ヒトＩＣＡＭ−１ポリヌクレオチド、ヒトＩＣＡＭ−２ポリヌクレオチド、およびヒトＩＣＡＭ−３ポリヌクレオチドからなる群より選択され、そして調節される機能が、ＡＩＤＳの進行に対する抵抗性増加である、請求項３の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドが、配列番号１、配列番号５５、配列番号７６、ポリペプチド配列番号６をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド配列番号７をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド配列番号８をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド配列番号５７をコードするポリヌクレオチド、およびポリペプチド配列番号７８をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１１の方法。
【請求項１３】
生理学的形質が、ＡＩＤＳの進行に対する抵抗性であり、ポリヌクレオチドが、ヒトＩＣＡＭ−１ポリヌクレオチドであり、そして調節される機能が、２つのＩＣＡＭ−１ポリペプチドの二量体化である、請求項３の方法。
【請求項１４】
ポリヌクレオチドが、配列番号１、およびポリペプチド配列番号６をコードするポリヌクレオチドからなる群より選択される、請求項１３の方法。
【請求項１５】
生理学的形質を調節可能な剤を同定する方法であって、試験しようとする少なくとも１つの剤を、請求項１の対応するヒトポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物と接触させ、該ヒトポリペプチドの機能を調節する能力によって、該剤を同定することを含む、前記方法。
【請求項１６】
生理学的形質が、ＡＩＤＳの進行に対する抵抗性であり、ポリヌクレオチドが、ヒトＩＣＡＭ−１ポリヌクレオチド、ヒトＩＣＡＭ−２ポリヌクレオチド、およびヒトＩＣＡＭ−３ポリヌクレオチドからなる群より選択され、そして調節される機能が、ＡＩＤＳの進行に対する抵抗性増加である、請求項１５の方法。
【請求項１７】
生理学的形質が、ＡＩＤＳの進行に対する抵抗性であり、ポリヌクレオチドが、ヒトＩＣＡＭ−１ポリヌクレオチドであり、そして調節される機能が、２つのＩＣＡＭ−１ポリペプチドの二量体化である、請求項１５の方法。
【請求項１８】
非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列と、ヒトに比較して感染性疾患の進行に対するより高い抵抗性を相関させる方法であって：
（ａ）感染性疾患を引き起こす感染性病原体にヒト細胞が感染した際に発現が調節される、ヒトポリヌクレオチド配列を同定し；
（ｂ）（ａ）のヒトポリヌクレオチド配列と、感染性病原体が引き起こす疾患の進行に対してより高い抵抗性を示す非ヒト霊長類の対応するポリヌクレオチド配列を比較して、ヌクレオチド変化いずれかを同定し；そして
（ｃ）前記非ヒト霊長類ヌクレオチド変化が進化的に重要であるかどうかを決定して、それによって非ヒト霊長類のポリヌクレオチド配列と、ヒトに比較して感染性疾患の進行に対するより高い抵抗性を相関させる
ことを含む、前記方法。
【請求項１９】
療法介入に適する可能性もあるヒトポリペプチド上のターゲット部位を同定する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定された進化的に重要なヌクレオチド変化に対応するヒトポリペプチド中のアミノ酸変化を、ターゲット部位として同定することを含む、前記方法。
【請求項２０】
療法介入に適する可能性もあるヒトポリヌクレオチド上のターゲット部位を同定する方法であって、請求項１の方法記載の進化的に重要なヒトポリヌクレオチド中のヌクレオチド変化を、ターゲット部位として同定することを含む、前記方法。
【請求項２１】
生理学的形質を調節可能な剤を同定する方法であって、試験しようとする少なくとも１つの剤を、請求項１のヒトポリヌクレオチド配列でトランスフェクションしておいた細胞と接触させ、該ポリヌクレオチドの機能を調節する能力によって、剤を同定することを含む、前記方法。
【請求項２２】
生理学的形質を調節可能な剤を同定する方法であって、試験しようとする少なくとも１つの剤を、請求項１のポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド、または前記ポリペプチドを含む組成物と接触させ、該ポリペプチドの機能を調節する能力によって、剤を同定することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、分子的技術および進化的技術を用いて、ユニークなまたは増進されたヒト脳機能、より長いヒトの寿命、感染性疾患（ＡＩＤＳおよびＣ型肝炎など）の発展に対する感受性または抵抗性、癌の発展に対する感受性または抵抗性、並びに毛髪成長、座瘡に対する感受性または抵抗性、あるいは筋量増進などの、美学的形質など、ヒト疾患または状態に関連付け可能な進化形質に対応する、ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を同定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトは、最も近い進化的近縁種であるチンパンジーなどの非ヒト霊長類とは、ヒトの健康および幸福に重要な領域に関連する特定の生理学的形質および機能的形質の面で、異なる。例えば、（１）ヒトは、チンパンジーに比較して、ユニークなまたは増進された脳機能（例えば認知技能等）を有し；（２）ヒトは、非ヒト霊長類より長い寿命を有し；（３）チンパンジーは、ＡＩＤＳおよびＣ型肝炎などの、ヒトが罹患する特定の感染性疾患に抵抗性であり；（４）チンパンジーでは、特定の癌の発生率がヒトより低いようであり；（５）チンパンジーは座瘡または脱毛症（禿頭）を患わず；（６）チンパンジーは脂肪に対して筋肉の割合がより高く；（７）チンパンジーはマラリアにより抵抗性であり；（８）チンパンジーはアルツハイマー病により感受性でなく；そして（９）チンパンジーではアテローム性動脈硬化症の発症率がより低い。現時点では、上記のヒト／チンパンジーの相違の根底にある遺伝子は未知であり、また、より重要なことに、これらの能力を提供するため、これらの遺伝子中で進化してきた特定の変化も未知である。ヒトおよび我々の進化的近縁種の間のこれらの相違の基礎を理解することによって、関連するヒトの状態および疾患に有効な治療を開発するために有用な情報が提供されるであろう。
【０００３】
主に動物の解剖学的特徴を比較する、古典的な進化解析によって、ヒトおよび非ヒト霊長類の間の劇的な形態学的相違および機能的相違が明らかになってきた；しかし、ヒトゲノムは、他の霊長類のゲノムと、顕著な配列類似性を共有することが知られている。例えば、一般的に、ヒトＤＮＡ配列は、チンパンジーＤＮＡとおよそ９８．５％同一であり、そしてゴリラＤＮＡとはわずかにより類似でないだけであると結論付けられる。ＭｃＣｏｎｋｅｙおよびＧｏｏｄｍａｎ（１９９７）ＴＩＧ  １３：３５０−３５１。ヒトおよび近縁霊長類の間のゲノム相違が比較的わずかな割合であることを考慮すると、可能性が低いとしても、ゲノム配列中の比較的少数の変化が、上に列挙したものなどの、ヒトの健康および幸福にとって興味深い形質の原因である可能性もある。したがって、これらの形質の根底にある遺伝子を同定し、そしてこれらの遺伝子がコードするタンパク質中の進化した変化から、情報を拾い集めて、ヒトの健康および幸福に有益でありうる治療を開発することが望ましく、そして実行可能である。疾患を排除するかまたは最小限にしているか、あるいはユニークなまたは増進された機能を提供する、進化的解決法から利益を得るためには、これらの配列変化を同定し、そして性質決定することが非常に重要である。
【０００４】
ヒトゲノムプロジェクトの最近の発展は、ヒト遺伝子配列に関して、莫大な量の情報を提供してきた。さらに、多くのヒト遺伝子およびそのタンパク質産物の構造および活性が、培養中のヒト細胞において直接、または線虫、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュおよびマウスなどのいくつかの動物モデル系において、研究されてきている。これらのモデル系は、比較的単純であり、操作が容易で、そして世代時間が短い点で非常に好適である。多くの重要な遺伝子の基本的構造および生物学的活性は、進化を通じて保存されてきているため、巨大分子配列を比較することによって、多くの種で、相同遺伝子を同定することも可能である。重要な遺伝子産物および機能ドメインに関して、より低次の種から得られる情報を用いて、ヒトの相同遺伝子または機能ドメインを同定するのを補助することも可能である。例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）で最初に発見された、ＤＮＡ結合活性を持つホメオドメインを用いて、類似の活性を所持するヒト相同体が同定された。
【０００５】
ヒトおよびより低次のモデル生物間の相同遺伝子またはタンパク質の比較は、進化的に「保存された」分子配列および機能的特徴に関しては、有用な情報を提供することも可能であるが、このアプローチは、自然淘汰のため、配列が変化してきた遺伝子を同定する際には使用が制限される。洗練されたアルゴリズムおよび解析法が発展してきたため、ＤＮＡ配列変化から、はるかにより多くの情報を引き出すことも可能である。これらの方法のうち最も強力な「ＫＡ／ＫＳ」は、
【０００６】
【化１】
2007531493.tif 000002
【０００７】
（式中、非同義は、コードされるアミノ酸を変化させる置換を意味し、そして同義は、コードされるアミノ酸を変化させない置換を意味する）
の比の、並列させた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列間の対比較を伴う。「ＫＡ／ＫＳ型の方法」には、この方法および類似の方法が含まれる。これらの方法は、相同タンパク質において、アミノ酸相違を生じる、ダーウィン的な分子レベルの正の淘汰の発生を立証するのに用いられてきた。いくつかのグループが、こうした方法を用いて、特定のタンパク質が中立置換速度より迅速に進化してきており、そしてしたがってダーウィン的な分子レベルの正の淘汰の存在が裏付けられることを立証してきた。例えばＭｃＤｏｎａｌｄおよびＫｒｅｉｔｍａｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：６５２−６５４は、遺伝子座のコード領域において、同義置換にアミノ酸交換置換の数を比較することに基づく、中立タンパク質進化仮説の統計的検定を提唱している。彼らは、この検定を３種のショウジョウバエのＡｄｈ遺伝子座に適用した際、むしろ、該遺伝子座が選択的に好適な突然変異の適応固定を経て、そして大部分のタンパク質進化の説明としては、中立突然変異の規則正しい集積の代わりとして現実性のある案は、適応変異の選択的固定である可能性もあると結論付けている。Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  Ｂ  ２６１：２０３−２０７は、ＭｃＤｏｎａｌｄおよびＫｒｅｉｔｍａｎの検定を用いて、転写を調節する配列（非コード配列）において、適応進化が起こっているかどうかを調べている。
【０００８】
Ｎａｋａｓｈｉｍａら（１９９５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：５６０６−５６０９は、ＭｉｙａｔａおよびＹａｓｕｎａｇａの方法を用いて、ヘビ２種由来の１０のＰＬＡ２アイソザイム遺伝子のヌクレオチド配列の対比較を行っている；この方法は、イントロンを含む非コード領域の部位あたりのヌクレオチド置換の数（ＫＮ）およびＫＡおよびＫＳの比較を伴う。彼らは、タンパク質コード領域が、イントロンを含む非コード領域よりも、はるかに高い速度で進化してきたと結論付けている。非常に加速された置換速度が、ＰＬＡ２アイソザイム遺伝子が新規の生理学的活性を生じる、ダーウィン的な分子レベル進化の原因となっており、この新規活性が、獲物を捕らえるかまたは捕食者に対して防御するため、強い選択的利点を提供したに違いない。Ｅｎｄｏら（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（５）：６８５−６９０は、正の淘汰が作用する候補遺伝子を同定するため、ｄＮが非同義置換の数であり、そしてｄＳが同義置換の数である、ＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉの方法を用いている。ＭｅｔｚおよびＰａｌｕｍｂｉ（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（２）：３９７−４０６は、ＭｃＤｏｎａｌｄおよびＫｒｅｉｔｍａｎの検定とともに、ＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉ、ＮｅｉおよびＪｉｎ、並びにＫｕｍａｒ、Ｔａｍｕｒａ、およびＮｅｉに起因する方法を用いて；交換部位あたりの交換置換であるＰｎ、およびサイレント部位あたりのサイレント置換であるＰｓの平均比率を調べて、ウニのバインディン遺伝子に対する正の淘汰の証拠を探し、これらが種形成の前触れとして迅速に進化してきたかどうかを調べている。Ｇｏｏｄｗｉｎら（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（２）：３４６−３５８は、類似の方法を用いて、特定のネズミ遺伝子ファミリーの進化を調べ、そして該方法が、実験的に操作可能な系において、淘汰がどのように遺伝子相違を駆動するかに関して、重要な基本的洞察を提供すると結論付けている。Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９５）は、縮重プライマーを用いて、鳥類およびワニ（ａｌｌｉｇａｔｏｒ）種の多様な種からＭＨＣ遺伝子座を引き出し、次いで、これらをＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉの方法（ｄＮ：ｄＳ比）によって解析して、ＭＨＣ研究を非哺乳動物脊椎動物に拡張している。Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：７１３−７１５は、Ｋａ／Ｋｓ解析を用いて、ＳＲＹ遺伝子（オスの性を決定する）中の保存される領域に隣接する領域において、定方向選択（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を探している。彼らは、ＳＲＹの迅速な進化が生殖隔離の重要な原因であり、新規の種を導くと示唆している。Ｗｅｔｔｓｅｔｉｎら（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（１）：５６−６６は、Ｋｕｍａｒ、ＴａｍｕｒａおよびＮｅｉのＭＥＧＡプログラム、並びに系統学的解析を適用して、リスおよび関連げっ歯類において、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の多様化を調べている。ＰａｒｈａｍおよびＯｈｔａ（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：６７−７４は、ヒトＭＨＣクラスＩ多型の生成および維持を解析するには、選択に関する試験��ともに遺伝子変換および中立ドリフトに関する試験を含む、集団生物学的アプローチが必要であると述べている。Ｈｕｇｈｅｓ（１９９７）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １４（１）：１−５は、脊椎動物免疫系細胞で発現されるタンパク質が、異常に迅速に進化するという仮説を試験するため、ＮｅｉおよびＧｏｊｏｂｏｒｉの方法（ｄＮ：ｄＳ比）を用いて、ヒトおよびげっ歯類間で、１００を超えるオルソロガスな免疫グロブリンＣ２ドメインを比較した。ＳｗａｎｓｏｎおよびＶａｃｑｕｉｅｒ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：７１０−７１２は、ｄＮ：ｄＳ比を用いて、リジンおよびリジンの卵受容体間の協調した進化を立証し、そして新規の種が形成される際（種形成）のこうした協調した進化の役割を論じている。
【０００９】
ヒトおよびこれらのより低次の動物の間では、進化的関係が遠いため、自然淘汰によって固定された、適応上価値がある遺伝子変化は、しばしば、長期に渡る、中立的なランダム突然変異の集積に隠される。さらに、いくつかのタンパク質は、気まぐれな（ｅｐｉｓｏｄｉｃ）方式で進化し；こうした気まぐれな変化は、比較する２つのゲノムが十分に近くない場合は、隠される可能性もあり、結論の出ない結果を導きうる。ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４。実際、研究によって、タンパク質進化における適応淘汰の発生は、圧倒的に遠い関連の配列を比較する場合には、しばしば過小評価されていることが示されている。Ｅｎｄｏら（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３７：４４１−４５６；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４。
【００１０】
霊長類ファミリー内の分子進化研究が報告されてきているが、これらは主に、少数の既知の個々の遺伝子および遺伝子産物を比較して、分子変化の速度およびパターンを評価し、そしてこうした変化の原因である進化的機構を探究することに重点を置いている。一般的には、Ｌｉ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  マサチューセッツ州サンダーランド，  １９９７を参照されたい。さらに、系統学的解析に配列比較データが用いられており、異なる霊長類由来の調べた分子間の配列「類似性」の相対的な度合いに基づいて、霊長類の進化の歴史が再構築されている。例えば、異なる霊長類由来の酵素リゾチームに関するＤＮＡおよびアミノ酸の配列データを用いて、霊長類におけるタンパク質進化および特定の系統内での適応淘汰の発生が研究された。Ｍａｌｃｏｌｍら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：８６−８９；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。霊長類において、分子進化研究に供されてきた他の遺伝子には、ヘモグロビン、チトクロムｃオキシダーゼ、および主要組織適合複合体（ＭＨＣ）が含まれる。ＮｅｉおよびＨｕｇｈｅｓ：Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｕｌａｒ  Ｌｅｖｅｌ中，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  マサチューセッツ州サンダーランド  ２２２−２４７，  １９９１；ＬｉｅｎｅｒｔおよびＰａｒｈａｍ（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ７４：３４９−３５６；Ｗｕら（１９９７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ４４：４７７−４９１。多くの非コード配列もまた、霊長類の分子系統学的解析に用いられてきている。Ｌｉ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  マサチューセッツ州サンダーランド，  １９９７。例えば、霊長類系統間の遺伝的距離が、ベータ型グロビン遺伝子座のオルソロガスな非コードヌクレオチド配列およびその隣接領域から概算されており、そしてヌクレオチド配列オルソログに関して構築された進化樹は、形態学的特徴の系統学的解析由来の図と、ほぼ適合する分岐パターンを示す。Ｇｏｏｄｍａｎら（１９９０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３０：２６０−２６６。
【００１１】
ＺｈｏｕおよびＬｉ（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３（６）：７８０−７８３は、ＫＡ／ＫＳ解析を霊長類遺伝子に適用した。ヒトの進化中、赤色網膜色素遺伝子および緑色網膜色素遺伝子間で、イントロン２およびイントロン４において、遺伝子変換事象が起きた可能性があることが、先に報告されていた。しかし、１人の欧州人由来の赤色網膜色素遺伝子および緑色網膜色素遺伝子のイントロン４配列は、完全に同一であり、遺伝子変換事象が最近のものであることが示唆された。この遺伝子変換事象がその個体で、または欧州人の共通の祖先で、またはより初期のヒト科の祖先で起こったのか決定するため、著者らは、男性アジア人、オス・チンパンジー、およびオス・ヒヒ（ｂａｂｏｏｎ）由来の赤色色素遺伝子および緑色色素遺伝子のイントロン４の配列を決定し、そしてＫＡ／ＫＳ解析に適用した。彼らは、２つの遺伝子間の相違が、取り巻くエクソンよりもイントロン４で有意に低いことを観察し、配列均一化に対して、強い自然淘汰が働いたことを示唆した。
【００１２】
Ｗｏｌｉｎｓｋｙら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：５３７−５４２は、同義塩基置換に対する非同義塩基置換の比較を用いて、ＨＩＶウイルス自体（すなわち宿主種ではない）が、個々のヒト患者内で、適応進化にさらされていることを立証した。彼らの目的は、単に、短い時間枠（ヒト患者の疾患経過）での正の淘汰の発生を立証することであった。ＮｉｅｗｉｅｓｋおよびＢａｎｇｈａｍ（１９９６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ４２：４５２−４５８は、Ｄｎ／Ｄｓアプローチを用いて、ＨＴＬＶ−１ウイルスに関して関連する疑問、すなわち、ウイルス自体に作用する選択力が何かを検討した。おそらく、試料サイズが不十分であったため、選択力の性質を解明することは不能であった。これらの場合のどちらでも、ヒトウイルスに関連して、ＫＡ／ＫＳ型の方法が用いられているが、療法的目的（本出願におけるようなもの）で、これらの方法を用いる試みはなされておらず、狭い学術的目的が追究されてきた。
【００１３】
上に引用した論文からわかるように、迅速に進化する遺伝子を同定する分子進化の解析法（ＫＡ／ＫＳ型の方法）を適用して、多くの異なる目的を達成することも可能であり、最も一般的には、ダーウィン的な分子レベルの正の淘汰の存在を確認することも可能であるが、また、ダーウィン的な分子レベルの正の淘汰の頻度を評価し、系統学的関係を理解し、新規の種が形成される機構を解明し、または特定の遺伝子多型の単一の起源または多数の起源を確立することも可能である。上に引用した論文および他の文献から明らかなのは、ＫＡ／ＫＳ型の方法を適用して、ヒトの状態または疾患を防止するかまたは治癒させるか、あるいはユニークなまたは増進されたヒト機能を調節するための治療の開発において、模倣するかまたは用いることも可能な、進化的解決法、特異的に進化した変化を同定した著者はいないということである。彼らは、進化的に重要な（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）配列変化を含有するヒト遺伝子または非ヒト霊長類遺伝子を同定し、そしてヒトの状態または疾患のための治療の開発において、こうした遺伝子および同定された変化を利用するための体系的なツールとして、ＫＡ／ＫＳ型の解析を用いたことはいない。
【００１４】
相同チンパンジー遺伝子に比較して、ユニークなまたは増進されたヒト機能を与えるように進化してきたヒト遺伝子を同定して、これらのユニークなヒト機能を調節するか、または該遺伝子が欠損した際に機能を回復する剤の開発に適用することも可能である。根底にある、進化してきたチンパンジー（または他の非ヒト霊長類）遺伝子および特定のヌクレオチド変化の同定、並びにこれらの進化した遺伝子にコードされるタンパク質における物理的変化および生化学的変化のさらなる性質決定によって、例えばＨＩＶおよびＨＣＶなどの感染性ウイルスに対する感受性および抵抗性を何が決定しているのか、特定の癌の発展に対する感受性または抵抗性を何が決定しているのか、座瘡に対する感受性または抵抗性を何が決定しているのか、毛髪の成長はどのように調節可能であるのか、そして脂肪に対する筋肉形成はどのように調節すればよいのかに関して、価値ある情報が提供されうる。この価値ある情報を適用して、ヒトタンパク質が、よりチンパンジー相同体のように振舞うようにする剤を開発することも可能である。
【００１５】
本明細書に引用するすべての参考文献は、完全に本明細書に援用される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発明の概要
本発明は、医学的状態を含む、生理学的状態と関連付けられる、進化的に重要な変化を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を同定する方法を提供する。本発明は、比較霊長類ゲノミクスを適用して、生理学的状態、例えば医学的または商業的に適切な進化形質に関連付け可能であり、そしてしたがってその原因であることも可能な特定の遺伝子変化を同定し、そしてこれらの進化した遺伝子から得た情報を、ヒト治療の開発に使用する。本明細書記載の方法に使用する非ヒト霊長類配列は、いかなる非ヒト霊長類であることも可能であり、そして好ましくは、ヒト科のグループのメンバーであり、より好ましくは、チンパンジー、ボノボ（ｂｏｎｏｂｏ）、ゴリラおよび／またはオランウータンであり、そして最も好ましくはチンパンジーである。
【００１７】
１つの好ましい態様において、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、進化的に重要な正の変化を生じる自然淘汰を経ている（すなわち、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトに存在しない、正の特質を有する）。この態様において、正に淘汰されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の疾患に対する感受性または抵抗性と、あるいは他の商業的に適切な形質と関連付け可能である。この態様の例には、限定されるわけではないが、感染性疾患および癌に対する感受性または抵抗性と関連付け可能な、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーで正に淘汰されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。商業的に適切な形質の例には、毛髪成長、筋量、座瘡に対する感受性または抵抗性などの美的形質が含まれることも可能である。疾患抵抗性／感受性態様の例には、ＨＩＶ播種、増殖および／またはＡＩＤＳの発展に対する感受性または抵抗性と関連付けられるポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。本発明はしたがって、ＨＩＶ播種、増殖および／またはＡＩＤＳの発展に対する抵抗性の根底にある分子機構への洞察を得て、ＡＩＤＳの発展を防止し、そして／または遅延させる薬剤などの剤を発見し、そして／または設計するのにもまた有用でありうる情報を提供するのに、有用である可能性もある。ＡＩＤＳまたは他の感染性疾患に関連しうる、チンパンジーで正に淘汰された特定の遺伝子は、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＭＩＰ−１−α、ＣＤ５９およびＤＣ−ＳＩＧＮである。１７−β−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼＩＶ型は、癌に関連しうる、チンパンジーで正に淘汰されている特異的遺伝子である。さらに、ｐ４４遺伝子は、チンパンジーで正に淘汰され、そしてチンパンジーのＨＣＶ抵抗性に寄与していると考えられる遺伝子である。
【００１８】
別の好ましい態様において、ヒトポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、進化的に重要な正の変化を生じる自然淘汰を経ている（すなわち、ヒトポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、非ヒト霊長類に存在しない、正の特質を有する）。この態様の１つの例は、非ヒト霊長類に比較して、ヒト脳のユニークなまたは増進された機能的能力と、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを関連付けうるものである。別のものは、非ヒト霊長類に比較した、ヒトのより長い寿命である。第三のものは、商業的に重要な美的形質（例えば正常のまたは増進された乳房発達）である。本発明はしたがって、ユニークなまたは増進されたヒト機能または生理学的形質の根底にある分子機構への洞察を得て、こうしたユニークなまたは増進されたヒト機能または形質を調節する薬剤などの剤を設計する際に、そしてヒトに関連する疾患または状態の治療を設計する際にもまた有用でありうる情報を提供するのに、有用である可能性もある。例として、本発明はしたがって、ヒト認知機能の根底にある分子機構への洞察を得て、ヒト脳機能を増進する薬剤などの剤を設計する際に、そしてヒト脳に関連する疾患の治療を設計する際にもまた有用でありうる情報を提供するのに、有用である可能性もある。非ヒト霊長類に比較した際、進化的に重要な正の変化を有するヒト遺伝子の特定の例は、チロシンキナーゼ遺伝子、ＫＩＡＡ０６４１またはＮＭ＿００４９２０遺伝子である。
【００１９】
したがって、１つの側面において、本発明は、生理学的状態（例えば医学的または商業的に適切な進化的に重要な正の変化）と関連付け可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定する方法を提供する。進化的に重要な正の変化は、ヒトまたは非ヒト霊長類で発見可能である。好ましい態様において、本発明は、進化的に重要な変化と関連付けられるヒトＡＡＴＹＫポリペプチドをコードするヒトＡＡＴＹＫポリヌクレオチド配列を同定する方法を提供する。別の好ましい態様において、本発明は、ヒトに比較して、チンパンジーで増進したＨＣＶ抵抗性と関連付けられるｐ４４ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定する方法を提供する。
【００２０】
本発明のいずれの態様に関しても、生理学的状態は、いかなる生理学的状態であることも可能であり、本明細書に列挙されるもの、例えば、癌、感染性疾患（ＡＩＤＳまたはＨＣＶ関連慢性肝炎などのウイルス疾患を含む）などの疾患（疾患に対する感受性または抵抗性を含む）；寿命；認知機能または発生スカルプティング（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ）を含む脳機能；および美的性質または美容的性質、例えば増進された乳房発達などが含まれる。
【００２１】
本発明の１つの側面において、ヒト（単数または複数）に存在する生理学的状態と関連付け可能なヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定する方法であって：ａ）ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に比較して、ここで非ヒト霊長類は、該生理学的状態を持たない（またはより少ない度合いで有する）；そしてｂ）非ヒト霊長類の対応する配列に比較した際にヌクレオチド変化を含有するヒトポリヌクレオチド配列を選択する工程を含み、前記変化が進化的に重要である、前記方法を提供する。いくつかの態様において、ヒトタンパク質コード配列（および／またはコードされるポリペプチド）は、生理学的状態または形質、あるいは生物学的機能の発展および／または維持に関連付け可能である。いくつかの態様において、生理学的状態または生物学的機能は、寿命、脳または認知機能、あるいは乳房発達（脂肪、腺および管発達を含む）であることも可能である。ヌクレオチド変化、およびヌクレオチド変化の性質（単数または複数）を評価するのに用いる方法は、本明細書に記載され、そしてあらゆる態様に適用される。好ましい態様において、該方法は、ヒトＡＡＴＹＫポリペプチドをコードするヒトＡＡＴＹＫポリヌクレオチド配列を同定する方法である。
【００２２】
他の態様において：（ａ）ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、特定の医学的に適切な疾患状態に抵抗性である、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーのタンパク質をコードするヌクレオチド配列に比較して、ここでヒトタンパク質をコードする配列は、疾患の発展に関連付けられるか、または関連付けられると考えられる；そして（ｂ）ヒトの対応する配列に比較した際に、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含有する非ヒトポリヌクレオチド配列を選択する工程を含み、該変化が進化的に重要である、前記方法を提供する。これらの方法によって同定された配列をさらに性質決定し、そして／または解析して、疾患状態または異常の発展に関連付けられることを確認することも可能である。これらの方法に適用可能な最も好ましい疾患状態は、癌および感染性疾患であり、ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎およびハンセン病が含まれる。
【００２３】
１つの態様において、チンパンジーポリヌクレオチド配列をヒトポリヌクレオチド配列に比較して、進化的に重要であるｐ４４配列を同定する。ｐ４４タンパク質は、ヒトに比較して増進した、チンパンジーのＨＣＶ抵抗性と関連付けられる（または関連付けられると考えられる）。
【００２４】
別の側面において、ヒト脳ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列における進化的に重要な変化を同定する方法であって、ａ）ヒト脳ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類の対応する配列に比較して；そしてｂ）非ヒト霊長類の対応する配列に比較した際にヌクレオチド変化を含有するヒトポリヌクレオチド配列を選択する工程を含み、前記変化が進化的に重要である、前記方法を提供する。いくつかの態様において、ヒト脳ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ヒト脳ｃＤＮＡに対応する。好ましい態様において、ヒト脳ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＡＴＹＫ配列である。
【００２５】
本発明の別の側面には、正に淘汰される、進化的に重要なヒトの変化を同定する方法が含まれる。これらの方法は：（ａ）ヒトポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に比較して；そして（ｂ）非ヒト霊長類の対応する配列に比較した際に、少なくとも１つ（すなわち１以上）のヌクレオチド変化を含有するヒトポリヌクレオチド配列を選択する工程を含み、前記変化が進化的に重要である、前記方法を提供する。この方法によって同定された配列を、ヒトにおいてユニークなまたは増進された、生物学的または医学的に適切な機能または形質とのありうる関連に関して、さらに性質決定し、そして／または解析することも可能である。好ましい態様において、ヒトポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＡＡＴＹＫ配列である。
【００２６】
本発明の別の態様は、ヒトポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、および非ヒト霊長類、例えばチンパンジー由来のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列間の大規模な配列比較法であって：（ａ）ヒトポリヌクレオチド配列と、非ヒト霊長類由来の対応するポリヌクレオチド配列を、配列相同性にしたがって並列させ；そして（ｂ）非ヒト霊長類由来の相同配列に比較した際のヒト配列内のヌクレオチド変化いずれかを同定することを含み、前記変化が進化的に重要である、前記方法を提供する。いくつかの態様において、タンパク質をコードする配列は脳由来である。
【００２７】
いくつかの態様において、本明細書に記載する方法のいずれかによって同定されるヌクレオチド変化は、非同義置換である。いくつかの態様において、ヌクレオチド変化の進化的重要性は、ヌクレオチド配列の非同義置換率（ＫＡ）にしたがって決定される。いくつかの態様において、進化的に重要な変化は、ヒト遺伝子および非ヒト霊長類（例えばチンパンジー）由来の相同遺伝子間のＫＡ／ＫＳ比を決定することによって、評価され、そして好ましくは、比は少なくとも約０．７５であり、より好ましくは約１（一致）より大きく（すなわち、少なくとも約１であり）、より好ましくは少なくとも約１．２５であり、より好ましくは少なくとも約１．５０であり、そしてより好ましくは少なくとも約２．００である。他の態様において、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えばチンパンジーまたはゴリラ）間で、正に淘汰された遺伝子が同定されているなら、他の非ヒト霊長類とのさらなる比較を行って、ヒトまたは非ヒト霊長類（例えばチンパンジーまたはゴリラ）遺伝子が正の淘汰を経ているかどうかを確認する。
【００２８】
別の側面において、本発明は、進化的に重要なヒトヌクレオチド変化を、ヒト（単数または複数）における生理学的状態と相関させる方法であって、あるとすれば、本明細書に記載する方法いずれかによって同定されるポリヌクレオチド配列（の存在または非存在）の機能上の効果を解析する（機能上の効果の存在を決定することを含む）ことを含み、機能上の効果の存在が、進化的に重要なヌクレオチド変化および生理学的状態の間の相関の指標となる、前記方法を提供する。あるいは、これらの方法において、本明細書記載の方法いずれかによって同定されるヌクレオチド配列にコードされるポリペプチド配列（またはポリペプチド配列の一部）を用いて、機能上の効果（あるとすれば）を評価することも可能である。
【００２９】
好ましい態様において、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、ヒトまたはチンパンジーのｐ４４ポリヌクレオチド配列（配列番号３４または配列番号３１）またはポリペプチド配列（配列番号３６または配列番号３３）である。より好ましい態様において、ｐ４４ポリヌクレオチド配列は、配列番号３４（ヒト）のヌクレオチド１〜４５７および配列番号３１（チンパンジー）のヌクレオチド１〜４５７を有するエクソン２配列、あるいはエクソン２の進化的に重要なチンパンジーヌクレオチドまたは対応するヒトヌクレオチドを含有するその断片である。こうした断片は、好ましくは、長さ１８〜２２５ヌクレオチドの間である。
【００３０】
本発明はまた、進化的に重要な変化の構造的結果または生化学的結果を決定するため、当該技術分野に広く用いられる物理的方法および生化学的方法による、同定されたポリペプチドの比較も提供する。物理的方法は、適応進化を経たことが発見された遺伝子にコードされるタンパク質に対する構造的変化を調べるのに用いられる方法を含むことが意味される。タンパク質（ヒトまたは非ヒト霊長類）および進化した相同タンパク質（それぞれ非ヒト霊長類またはヒト）の三次元構造を並列比較すると、関連するヒトの状態および疾患に対する治療を発展させるために価値ある情報が提供されるであろう。例えば、本発明の方法を用いて、チンパンジーＩＣＡＭ−１遺伝子が、ヒトＩＣＡＭ−１に比較して、正の進化的変化を有すると同定された。ヒトＩＣＡＭ−１タンパク質の２つの機能ドメインの三次元モデルにおいて、チンパンジーで変化していた６つのアミノ酸のうち５つが、ＩＣＡＭ−１対受容体（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のＬＦＡ−１への結合に非常に重要であることが知られるアミノ酸残基にすぐ隣接している（すなわち物理的に接触している）ことがわかり；各場合で、ヒトアミノ酸は、チンパンジーＩＣＡＭ−１においては、より大きいアミノ酸に置換されていた。こうした情報は、適切な療法介入（単数または複数）を設計する際の洞察を可能にする。
【００３１】
したがって、別の側面において、本発明は、療法介入に適切でありうるターゲット部位（１以上のターゲット部位を含む）を同定する方法であって、本明細書記載の方法いずれかによって同定された配列にコードされるヒトポリペプチド（またはポリペプチドの一部）を、対応する非ヒトポリペプチド（またはポリペプチドの一部）と比較することを含み、あるとすれば、分子相違の位置が、ターゲット部位の指標となる、前記方法を提供する。
【００３２】
同様に、ヒトおよびチンパンジーのｐ４４ポリペプチドのコンピュータモデルまたはＸ線結晶構造を比較して、チンパンジーｐ４４エクソン２の進化的に重要なアミノ酸変化が、タンパク質構造をどのように改変するか、そしてチンパンジーｐ４４構造および／または機能を模倣することを可能にする方式で、ヒトｐ４４と相互作用する剤をどのように設計可能であるかを決定することも可能である。
【００３３】
別の側面において、本発明は、療法介入に適切でありうるターゲット部位（１以上のターゲット部位を含む）を同定する方法であって、本明細書記載の方法いずれかによって同定された配列にコードされるヒトポリペプチド（またはポリペプチドの一部）を、対応する非ヒト霊長類ポリペプチド（またはポリペプチドの一部）と比較することを含み、あるとすれば、アミノ酸相違などの分子相違の位置が、ターゲット部位の指標となる、前記方法を提供する。ターゲット部位はまた、ヒトまたは非ヒト霊長類において、本明細書に記載する方法いずれかによって同定された、正に淘汰されたポリヌクレオチド、およびその対応する配列間で観察される、非同義ヌクレオチド変化であることも可能である。好ましい態様において、ターゲット部位は、ヒトｐ４４ポリペプチド上の部位である。
【００３４】
生化学的方法は、適応進化を経た遺伝子にコードされるタンパク質に関して、結合特異性、結合強度、または最適結合条件などの機能的相違を調べるのに用いる方法を含むことが意味される。タンパク質（ヒトまたは非ヒト霊長類いずれか）および進化した相同タンパク質（それぞれ、非ヒト霊長類またはヒトいずれか）の生化学的特性の並列比較によって、関連するヒト状態および疾患のための治療を発展させるのに価値ある情報が明らかになるであろう。
【００３５】
別の側面において、本発明は、生理学的状態を調節可能な剤を同定する方法であって、本明細書記載の方法いずれかによって同定されたポリヌクレオチド配列でトランスフェクションしておいた細胞と、剤（すなわち試験しようとする少なくとも１つの剤）を接触させ、該ポリヌクレオチド配列の機能を調節する能力によって、該剤を同定することを含む、前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、生理学的状態を調節可能な剤を同定する方法であって、本明細書記載の方法いずれかによって同定されたポリヌクレオチド中または内にコードされるポリペプチド（あるいはポリペプチドの断片および／またはポリペプチドもしくはポリペプチドの断片を含む組成物）と、試験しようとする剤（すなわち少なくとも１つの剤）を接触させ、該ポリペプチドの機能を調節する能力によって、該剤を同定することを含む、前記方法を提供する。これらの方法の好ましい態様において、ポリヌクレオチド配列は、進化的に重要なチンパンジーｐ４４ポリヌクレオチド配列または対応するヒトポリヌクレオチドである。より好ましい態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３１（チンパンジー）のヌクレオチド１〜４５７、および配列番号３４（ヒト）のヌクレオチド１〜４５８、あるいは好ましくは、１８〜２２５ヌクレオチドおよびチンパンジーの少なくとも１つの進化的に重要なヌクレオチドまたは対応するヒトヌクレオチドを含有するその断片である。本発明はまた、本明細書記載のスクリーニング法を用いて同定される剤も提供する。
【００３６】
別の側面において、ヒトポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性を調節して、ユニークなまたは増進されたヒト機能または形質を調節するか、あるいは目的の非ヒト霊長類の形質、例えばＨＣＶ関連慢性肝炎またはＡＩＤＳなどの疾患の発展に対する感受性または抵抗性などを模倣することも可能な剤をスクリーニングする方法を提供する。これらの方法は、ポリヌクレオチド配列でトランスフェクションしておいた細胞を、試験しようとする剤と接触させ、そして該ポリヌクレオチドの機能を調節する能力に基づいて剤を同定するか、あるいはポリペプチド調製物を、試験しようとする剤と接触させて、そして該ポリペプチドの機能を調節する能力に基づいて、剤を同定することを含む。好ましい態様において、ポリヌクレオチド配列は、進化的に重要なチンパンジーｐ４４ポリヌクレオチド配列または対応するヒトポリヌクレオチド配列である。より好ましい態様において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号３１（チンパンジー）のヌクレオチド１〜４５７、または配列番号３４（ヒト）のヌクレオチド１〜４５７、あるいは好ましくは、１８〜２２５ヌクレオチドおよび少なくとも１つのチンパンジーの進化的に重要なヌクレオチドまたは対応するヒトヌクレオチドを含有するその断片である。
【００３７】
本発明の別の側面において、ヒトにおける疾患の発展に対する抵抗性減少と関連付け可能な候補ポリヌクレオチドを同定する方法であって、ヒトポリヌクレオチド配列を、対応する非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド変化いずれかを同定し；そして該ヒトヌクレオチド変化が進化的に重要であるかどうかを決定することを含む、前記方法を提供する。進化的に重要なヒトポリヌクレオチドは、ある場合には、癌などのヒト疾患の発展に対する感受性増加または抵抗性減少と関連付け可能であることが観察されてきている。本明細書に記載するように、強く正に淘汰されるＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン１１はまた、乳癌、卵巣癌および／または前立腺癌と関連付けられるいくつかの突然変異の位置でもある。したがって、この現象は、多機能ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける、１つの形質の発展の増進および別の形質の損失または減少の間のトレードオフに相当しうる。この方式で、正に淘汰されたヒトポリヌクレオチドを同定すると、ヒト疾患に対する感受性の候補である遺伝子プールを同定するのに役立ちうる。
【００３８】
この方式で同定された進化的に重要なポリヌクレオチドのヒト候補は、適切なモデル系において、候補ポリヌクレオチドにおける進化的に重要なヌクレオチド変化の機能上の効果を解析することによって、疾患に対する感受性を与える際の役割に関して評価可能である。このモデル系において、機能上の効果が存在すれば、候補ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド変化、およびヒトにおける疾患の発展に対する抵抗性の減少の間に相関があることの指標となる。例えば、進化的に重要なヌクレオチド変化をすべて含有する、進化的に重要なポリヌクレオチド、またはより少ない数のヌクレオチド変化を持つ類似のポリヌクレオチドが、非ヒト霊長類モデルにおいて、問題の疾患に対する感受性を増加させることが発見された場合、これが、ヌクレオチド変化および疾患を相関させる機能上の効果であろう。
【００３９】
あるいは、進化的に重要なポリヌクレオチドのヒト候補は、いくつかの個体において、進化的に重要なヌクレオチド変化とは別の突然変異であって、疾患に対する感受性増加を与える、前記突然変異を有することも可能である。これらの突然変異を、新生物表現型への変換などの機能上の効果に関する適切なモデル系で試験して、突然変異を疾患に相関させることも可能である。
【００４０】
さらに、本発明の方法は、本明細書に記載する方法によって、ポリヌクレオチドにおける突然変異の存在が、疾患の発展に対する抵抗性減少を診断すると決定された場合、進化的に重要なポリヌクレオチドにおける突然変異の存在に関して、患者の核酸をアッセイすることによって、ヒト患者が、疾患の発展に対する抵抗性を減少させる傾向にあるかどうかを決定する診断法を含む。１つの態様において、ポリヌクレオチドはＢＲＣＡ１エクソン１１であり、そして疾患は、乳癌、前立腺癌または卵巣癌である。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
発明の詳細な説明
本発明は、比較ゲノミクスを適用して、医学的または商業的に適切な進化形質などの、生理学的状態に関連付けられ、そしてしたがって寄与しうるか、またはその原因となりうる、特定の遺伝子変化を同定する。本発明は、他の非ヒトから、特に霊長類から、そして最も好ましくは２つの既知の種、一般的なチンパンジーおよびボノボ（ピグミーチンパンジー）を含むチンパンジーから、ヒトを区別する、機能および疾患の相違の原因となる特定の遺伝子変化を同定するための、比較ゲノミクスアプローチを含む。例えば、チンパンジーおよびヒトは、ＤＮＡ配列レベルで９８．５％同一であり、そして本発明は、ユニークなまたは増進されたヒト認知能または生理学的形質、並びにＨＣＶ、ＡＩＤＳおよび特定の癌に対するチンパンジーの抵抗性を含む、いくつかの領域における種間の相違の根底にある、適応分子変化を同定することも可能である。遺伝子を同定するだけの伝統的なゲノミクスとは異なり、本発明は、疾患を排除するか、あるいはユニークなまたは増進された機能または形質を提供する、進化的解決法に関する正確な情報を提供する。本発明は、進化的利点および特定の進化した変化を与えるように進化してきた遺伝子を同定する。
【００４２】
本発明は、ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、進化中の適応淘汰の結果として、ヒトでは見られるが、非ヒト霊長類などの他の進化的に近縁の種では見られない配列変化を含有しうるという観察に由来する。
【００４３】
本発明はさらに、非ヒト霊長類の遺伝子情報が、進化中の適応淘汰の結果として、特定の非ヒト霊長類では見られるが、ヒトでは見られない変化を含有しうるという観察に由来する。この態様において、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、進化的に重要な正の変化を生じる自然淘汰を経ている（すなわち、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトには存在しない正の特質を有する）。この態様において、正に淘汰されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の疾患に対する感受性または抵抗性、あるいは他の商業的に適切な特質と関連付け可能である。この態様の医学的に適切な例には、限定されるわけではないが、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーにおいて、正に淘汰される、感染性疾患および癌に対する感受性または抵抗性と関連付け可能な、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。この態様の例には、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳの発展への進行に対する感受性または抵抗性と関連付けられるポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。本発明はしたがって、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳの発展への進行に対する抵抗性の根底にある分子機構への洞察を得て、ＡＩＤＳの発展を防止し、そして／または遅延させる薬剤などの剤を発見し、そして／または設計するのにもまた有用でありうる情報を提供するのに、有用である可能性もある。同様に、本発明は、ヒトと比較した際のチンパンジーにおけるＨＣＶ抵抗性の根底にある機構への洞察を得るのに有用である可能性もある。商業的に適切な例には、限定されるわけではないが、毛髪成長、座瘡の非存在または筋量などの美的形質と関連付け可能な、非ヒト霊長類で正に淘汰される、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。
【００４４】
ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列において、正に淘汰される、ヒトの進化的に重要な変化は、特に進化的近縁種、チンパンジーと比較した際、競争力のある利点をヒトに提供するヒト能力、例えばユニークなまたは増進されたヒトの脳機能に起因することも可能である。本発明は、ユニークなまたは増進されたヒト認知能を提供するよう進化したヒト遺伝子を同定し、そして機能的相違を与える実際のタンパク質変化は、認知不全を治療する療法的アプローチとともに、一般集団のための認知増進に、非常に有用であろう。
【００４５】
他の正に淘汰されるヒトの進化的に重要な変化には、増進された乳房発達を含む、チンパンジーなどの進化近縁種に比較して、増進されたかまたはユニークな、ヒトの生理学的形質または状態に起因しうる配列が含まれる。本発明は、増進された乳房発達に関連付け可能なヒトのポリヌクレオチド配列が、近縁の非ヒト霊長類の対応するポリヌクレオチド配列に比較して、進化的に重要な変化を経たかどうかを決定する方法を提供する。ユニークなまたは増進されたヒト生理学的形質の発展に関与する、ヒトポリヌクレオチドの進化的に重要な変化の同定は、ヒトポリヌクレオチドまたはコードされるポリペプチドの活性または機能を調節可能な剤または薬剤の開発に重要である。
【００４６】
本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術範囲内である、分子生物学、遺伝学および分子進化の慣用的技術を使用する。こうした技術は、文献、例えば：“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，”  第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．  Ｇａｉｔ監修、１９８４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修、１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら監修、１９９４）；“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ”，（Ｌｉ、１９９７）に完全に説明されている。
【００４７】
定義
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドいずれか、あるいはその類似体である、いずれかの長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、そしてしたがって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡとともに、二本鎖および一本鎖ＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドにはまた、メチル化および／またはキャップ化ポリヌクレオチドなどの修飾ポリヌクレオチドも含まれる。用語「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド配列」は交換可能に用いられる。
【００４８】
本明細書において、「遺伝子」は、タンパク質をコードする配列を含む、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部を指す。当該技術分野では、遺伝子がまた、非コード配列、例えば５’および３’の隣接配列（プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、および他の制御配列など）とともにイントロンもまた含むことがよく理解されている。
【００４９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において、交換可能に用いられ、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語にはまた、グリコシル化、アセチル化およびリン酸化を含む反応を通じて翻訳後修飾されたタンパク質も含まれる。
【００５０】
「生理学的状態」は、当該技術分野に周知の用語であり、そして測定および／または観察可能な、いかなる異常または状態も意味する。「生理学的状態」には、限定されるわけではないが、体脂肪の度合い、脱毛症（禿頭）、座瘡または増進された乳房発達；平均寿命；疾患状態（疾患に対する感受性および／または抵抗性を含む）、例えば癌または感染性疾患などの身体状態が含まれる。生理学的状態の例を以下に（例えば「ヒトの医学的に適切な状態」、「ヒトの商業的に適切な状態」、「医学的に適切な進化形質」、および「商業的に適切な進化形質」の定義を参照されたい）、そして明細書全体に提供し、そしてこれらの用語および例が、生理学的状態を指すことが理解される。生理学的状態は、多数の要因の結果であって、このうちのいずれかを次に、生理学的状態と見なしうるものであることも可能であるが、そうである必要はない。ヒトまたは非ヒト霊長類に「存在する」生理学的状態は、既定の集団内で生じ、そして別の集団に比較した際、既定の集団で、ユニークなそして／または増進された生理学的状態が含まれる。
【００５１】
用語「ヒトの医学的に適切な状態」または「ヒトの商業的に適切な状態」は、本明細書において、医学的介入または非医学的介入が望ましいヒト状態を指す。
用語「医学的に適切な進化形質」は、本明細書において、解析すると、ヒト医学的治療の開発に適切な情報（例えば物理的データまたは生化学的データ）を提供しうる、ヒトまたは非ヒト霊長類で進化してきた形質を指す。
【００５２】
用語「商業的に適切な進化形質」は、本明細書において、解析すると、ヒトで使用する、医学的または非医学的製品または治療の開発に適切な情報（例えば物理的データまたは生化学的データ）を提供しうる、ヒトまたは非ヒト霊長類で進化してきた形質を指す。
【００５３】
用語「ＫＡ／ＫＳ型の方法」は、（常にではないが）しばしば比で示され、相同遺伝子における非同義置換および同義置換の数の間の相違を評価する方法を意味する（非同義部位および同義部位を決定する、より厳しい方法を含む）。これらの方法は、限定されるわけではないが、ＫＡ／ＫＳ、ｄＮ／ｄＳ、ＤＮ／ＤＳを含む、いくつかの命名法を用いて示される。
【００５４】
用語「進化的に重要な変化」または「適応進化的変化」は、正の選択圧に起因しうる、２種間の１以上のヌクレオチドまたはペプチド配列変化（単数または複数）を指す。進化的に重要な変化の存在を決定する１つの方法は、ＫＡ／ＫＳ型の解析法を適用すること、例えばＫＡ／ＫＳ比を測定することである。典型的には、少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０、より好ましくは少なくとも約１．２５、より好ましくは少なくとも約１．５、そして最も好ましくは少なくとも約２．０のＫＡ／ＫＳ比は、正の淘汰の作用の指標となり、そして進化的に重要な変化と見なされる。
【００５５】
厳密に言うと、１．０より大きいＫＡ／ＫＳ比のみが、正の淘汰の指標となる。ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）および他の公共データベースのＥＳＴは、配列決定の誤りをある度合いで有し、そしてヌクレオチドの誤りが２、３であっても、ＫＡ／ＫＳスコアに影響しうることが一般に認められている。したがって、公表ＥＳＴを伴うすべての対比較は、注意深く行わなければならない。公共に利用可能なデータベースに固有の誤りのため、これらの誤りが、ＫＡ／ＫＳ比を１．０未満に押し下げる可能性もある。このため、配列決定の誤りが正の淘汰の証拠を不明瞭にしたのかどうかを決定するために、０．７５〜１．０の間のＫＡ／ＫＳ比を注意深く調べなければならない。こうした誤りは、非常に正確であることが示されている配列決定法を通じても発見可能である。
【００５６】
用語「進化的に重要な正の変化」は、他の関連種に比較した際、正である適応変化を生じる、特定の種における進化的に重要な変化を意味する。進化的に重要な正の変化の例は、ヒトにおける、増進された認知能、あるいは増進されたかまたはユニークな生理学的状態を生じた変化、およびＨＩＶまたはＨＣＶに感染したチンパンジーが、感染の進行に対して抵抗性になる能力を生じた、チンパンジーにおける適応変化である。
【００５７】
用語「増進された乳房発達」は、非ヒト霊長類に比較して大きくなった、ヒトで観察される乳房を指す。大きくなったヒト乳房は、他の霊長類に比較して、増加した脂肪、管および／または腺組織を有し、そして最初の妊娠および授乳前に発達する。
【００５８】
用語「抵抗性」は、チンパンジーなどの生物が、好ましくは、非抵抗性生物、典型的にはヒトに比較した際、疾患状態および／または疾患の発展を回避するか、またはその度合いを減少させる能力を示すことを意味する。例えば、チンパンジーは、ＨＣＶ、ＨＩＶ、および他のウイルス感染の特定の影響に対して抵抗性であり、そして／またはチンパンジーは最終的な疾患（それぞれ慢性肝炎またはＡＩＤＳ）を発展させない。
【００５９】
用語「感受性」は、ヒトなどの生物が、好ましくは、抵抗性であることが知られる、チンパンジーなどの非ヒト霊長類などの生物に比較した際、疾患状態および／または疾患状態の発展を回避するか、またはその度合いを減少させるのに失敗することを意味する。例えば、ヒトは、ＨＣＶ、ＨＩＶ、および他のウイルス感染の特定の影響、並びに／あるいは最終的な疾患（慢性肝炎またはＡＩＤＳ）の発展に感受性である。
【００６０】
抵抗性および感受性は、個体間で多様であり、そして本発明の目的のため、これらの用語はまた、種内の個体群にも適用されることが理解され、そして種内の比較も使用可能ではあるが、抵抗性および感受性の比較は、一般的に、種間の全体の平均的な相違を指すことが理解される。
【００６１】
用語「相同な」または「相同体」または「オルソログ」は当該技術分野に知られており、そしてよく理解され、そして共通の祖先を共有し、そして配列同一性の度合いに基づいて決定される、関連配列を指す。これらの用語は、１つの種に見られる遺伝子、および別の種における対応するかまたは同等の遺伝子間の関係を説明する。本発明の目的のため、相同配列を比較する。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連すると考えられるか、または関連することが知られる。機能的関係をいくつかの方式のいずれか１つで示すことも可能であり、こうした方式には、限定されるわけではないが、（ａ）配列同一性の度合い；（ｂ）同一のまたは類似の生物学的機能が含まれる。好ましくは（ａ）および（ｂ）両方を示す。配列同一性の度合いは多様であることも可能であるが、好ましくは、少なくとも５０％（当該技術分野に知られる標準的配列並列プログラムを用いた際）、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％である。Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら監修、１９８７）補遺３０，  セクション７．７１８，  表７．７１に論じられるものなど、当該技術分野で容易に入手可能なソフトウェアプログラムを用いて、相同性を決定することも可能である。好ましい並列プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｔｄ、英国オックスフォード）およびＡＬＩＧＮ  Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ペンシルバニア州）である。別の好ましい並列プログラムは、デフォルトパラメーターを用いる、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ、ミシガン州アナーバー）である。
【００６２】
用語「ヌクレオチド変化」は、当該技術分野に周知であるように、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。
「ＡＩＤＳに対する感受性と関連付けられる」、用語「ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド配列」は、本明細書において、ＨＩＶ播種（生物の内部、すなわち生物内感染性）、増殖および／またはＡＩＤＳの発展と関連付けられるタンパク質をコードする、ヒトヌクレオチド配列を指す。ＨＩＶ感染からＡＩＤＳの発展への進行の根底にある機構における徹底的な研究のため、いくつかの候補ヒト遺伝子がこれらの現象の１以上と関連付けられると考えられるかまたは関連付けられることが知られている。ＡＩＤＳに対する感受性と関連付けられるポリヌクレオチド（コードされるいかなるポリペプチドも含む）配列は、ＨＩＶ播種、複製、および／またはそれに続く十分に発展した（ｆｕｌｌ−ｂｌｏｗｎ）ＡＩＤＳへの進行において役割を果たすことが知られるかまたはそれに関係するとされているものである。こうした候補遺伝子の例を以下に提供する。
【００６３】
「ＡＩＤＳ抵抗性」は、チンパンジーなどの生物が、好ましくはＡＩＤＳ感受性のヒトに比較した際、ＨＩＶ感染の結果（増殖および播種など）および／またはＡＩＤＳの発展を回避するか、またはその度合いを減少させる能力を示すことを意味する。
【００６４】
ＡＩＤＳに対する「感受性」は、ヒトなどの生物が、好ましくはＡＩＤＳ抵抗性であることが知られるチンパンジーなどの非ヒト霊長類などの生物に比較した際、ＨＩＶ感染の結果（増殖および播種など）および／またはＡＩＤＳの発展を回避するか、またはその度合いを減少させることに失敗することを意味する。
【００６５】
「ＨＣＶ感染に対する感受性と関連付けられる」、用語「ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド配列」は、本明細書において、ＨＣＶ播種（生物の内部、すなわち生物内感染性）、増殖および／または慢性肝炎の発展と関連付けられるポリペプチドをコードする、ヒトヌクレオチド配列を指す。候補ヒト遺伝子が、ＨＣＶ感染に対するヒト感受性と関連付けられると考えられるかまたは関連付けられることが知られている。慢性肝炎に対する感受性と関連付けられるポリヌクレオチド（コードされるいかなるポリペプチドも含む）配列は、ＨＣＶ播種、複製、および／またはそれに続く慢性肝炎または肝細胞癌への進行において役割を果たすことが知られるかまたはそれに関係するとされているものである。感受性と関連付けられるポリヌクレオチドの一例は、ヒトｐ４４エクソン２である。
【００６６】
「ＨＣＶ抵抗性」は、チンパンジーなどの生物が、好ましくはＨＣＶ感受性のヒトに比較した際、ＨＣＶ感染の結果（増殖および播種など）および／または慢性肝炎の発展を回避するか、またはその度合いを減少させる能力を示すことを意味する。
【００６７】
ＨＣＶ感染に対する「感受性」は、ヒトなどの生物が、好ましくはＨＣＶ感染抵抗性であることが知られるチンパンジーなどの非ヒト霊長類などの生物に比較した際、ＨＣＶ感染の結果（増殖および播種など）および／または慢性肝炎の発展を回避するか、またはその度合いを減少させることに失敗することを意味する。
【００６８】
用語「脳タンパク質をコードするヌクレオチド配列」は、本明細書において、タンパク質をコードし、脳で発現されるヌクレオチド配列を指す。「脳タンパク質をコードするヌクレオチド配列」の一例は、脳ｃＤＮＡ配列である。
【００６９】
本明細書において、用語「ヒトにおいてユニークなまたは増進された脳機能」または「ヒト脳のユニークな機能的能力」または「ヒトにおいてユニークであるかまたは増進された脳の機能的能力」は、他の非ヒト霊長類に比較して、ヒトにおいて、種類または度合いいずれかで、増進していることが同定および／または観察される、脳機能いずれかを指す。こうした脳機能には、限定されるわけではないが、情報プロセシング、保存能および検索能、創造性、記憶、言語能、脳が仲介する感情的反応、移動運動、疼痛／快楽の感覚、嗅覚、および気質の高い能力が含まれる。
【００７０】
「ハウスキーピング遺伝子」は、当該技術分野でよく理解されている用語であり、そして限定されるわけではないが、増殖、分裂、静止状態、代謝、および／または死を含む、一般的な細胞機能に関連付けられる遺伝子を意味する。「ハウスキーピング」遺伝子は、一般的に、１より多い細胞種で見られる機能を行う。対照的に、細胞特異的遺伝子は、一般的に、特定の細胞タイプ（ニューロンなど）および／または細胞クラス（神経細胞など）で機能を行う。
【００７１】
用語「剤」は、本明細書において、生物学的または化学的化合物を意味し、例えば単純なまたは複雑な有機分子または無機分子、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドである。多量の化合物が合成可能であり、例えばオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー、並びに多様なコア構造に基づく合成有機化合物および無機化合物があり、そしてこれらもまた、用語「剤」に含まれる。さらに、多様な天然供給源が、スクリーニング用の化合物を提供可能であり、例えば植物または動物抽出物などがある。化合物を個々に、または互いに組み合わせて試験することも可能である。
【００７２】
用語、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を調節する」は、剤を添加しないものと比較した際、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が改変されていることを意味する。調節は、機能に影響を及ぼす、いかなるレベルで生じることも可能である。ポリヌクレオチド機能またはポリペプチド機能は、直接または間接的であることも可能であり、そしてこうした機能を直接または間接的に測定することも可能である。
【００７３】
「ポリヌクレオチドの機能」には、限定されるわけではないが、複製；翻訳；および発現パターン（単数または複数）が含まれる。ポリヌクレオチド機能にはまた、ポリヌクレオチド内にコードされるポリペプチドと関連付けられる機能も含まれる。例えば、ポリヌクレオチドに対して作用し、そしてタンパク質発現、コンホメーション、フォールディング（または他の物理的特性）、他の部分（リガンドなど）への結合、活性（または他の機能特性）、制御および／またはタンパク質構造または機能の他の側面に影響を及ぼす剤は、ポリヌクレオチド機能を調節したと見なされる。
【００７４】
「ポリペプチドの機能」には、限定されるわけではないが、コンホメーション、フォールディング（または他の物理的特性）、他の部分（リガンドなど）への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質構造または機能の他の側面が含まれる。例えば、ポリペプチドに作用して、そしてそのコンホメーション、フォールディング（または他の物理的特性）、他の部分（リガンドなど）への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質構造または機能の他の側面に影響を及ぼす剤は、ポリペプチド機能を調節したと見なされる。有効な剤が作用して、ポリペプチドの機能を調節することも可能な方式には、限定されるわけではないが１）コンホメーション、フォールディングまたは他の物理的特性の変化；２）天然リガンドへの結合強度の変化またはリガンドへの結合の特異性の変化；および３）ポリペプチド活性の改変が含まれる。
【００７５】
用語「ＡＩＤＳの発展に対する感受性を調節する」および「ＡＩＤＳの発展に対する抵抗性を調節する」は、本明細書において、ＨＩＶの生物内細胞間伝染または感染性の調節を含む。該用語はさらに、ＡＩＤＳの発展および／またはＨＩＶの細胞間伝染または感染性に対する感受性の減少を含む。該用語はさらに、ＡＩＤＳの発展および／またはＨＩＶの細胞間伝染または感染性に対する抵抗性の増加を含む。剤が、ＡＩＤＳの発展に対する感受性または抵抗性を調節するものであるかどうかを評価する１つの手段は、本明細書に記載するような細胞に基づく系を用いて、適切な対照と比較した際、ＨＩＶ感受性の少なくとも１つの指標が影響を受けているかどうかを決定することである。ＨＩＶ感受性の指標には、限定されるわけではないが、ＨＩＶに感染した細胞の総数および合胞体形成によって測定されるような、ウイルスの細胞間伝染が含まれる。
【００７６】
用語「ＨＣＶ感染に対する感受性を調節する」および「ＨＣＶ感染に対する抵抗性を調節する」は、本明細書において、ＨＣＶの生物内細胞間伝染または感染性の調節を含む。該用語はさらに、慢性肝炎の発展および／またはＨＣＶの細胞間伝染または感染性に対する感受性の減少を含む。該用語はさらに、ＨＣＶによる感染および／またはＨＣＶの細胞間伝染または感染性に対する抵抗性の増加を含む。剤が、ＨＣＶに関連付けられる慢性肝炎の発展に対する感受性または抵抗性を調節するものであるかどうかを評価する１つの手段は、本明細書に記載するような細胞に基づく系を用いて、適切な対照と比較した際、ＨＣＶ感受性の少なくとも１つの指標が影響を受けているかどうかを決定することである。ＨＣＶ感受性の指標には、限定されるわけではないが、ＨＣＶに感染した細胞の総数によって測定されるような、ウイルスの細胞間伝染が含まれる。
【００７７】
用語「ターゲット部位」は、１以上のアミノ酸であることも可能であり、そして／または構造モチーフおよび／または機能モチーフの一部、例えば結合部位、二量体化ドメイン、または触媒活性部位である、ポリペプチドの位置を意味する。ターゲット部位にはまた、タンパク質コード領域中の１以上の非同義ヌクレオチド変化がある、ポリヌクレオチドの位置も含まれ、または正に淘汰された遺伝子の制御領域を指すことも可能である。ターゲット部位は、療法剤などの剤との直接または間接的相互作用に有用である可能性もある。
【００７８】
用語「分子相違」には、いかなる構造的相違および／または機能的相違も含まれる。こうした相違を検出する方法とともに、こうした相違の例を本明細書に記載する。
「機能上の効果」は、当該技術分野に周知の用語であり、そして直接または間接的いずれであっても、いずれかのレベルの活性に対して示されるいかなる効果も意味する。
【００７９】
ヒトｐ４４ポリペプチドと相互作用して、チンパンジーまたは他の非ヒト霊長類のｐ４４ポリペプチドの「構造を模倣する」複合体を形成する剤は、ヒトｐ４４ポリペプチドと該剤との相互作用が、ヒトｐ４４ポリペプチド単独と比較して、チンパンジーまたは非ヒトのｐ４４ポリペプチドの三次元構造に、より似ている複合体を生じるものを意味する。
【００８０】
ヒトｐ４４ポリペプチドと相互作用して、チンパンジーまたは他の非ヒト霊長類のｐ４４ポリペプチドの「機能を模倣する」複合体を形成する剤は、ヒトｐ４４ポリペプチドおよび該剤の複合体が、ヒトｐ４４ポリペプチド単独と比較して、チンパンジーまたは他の非ヒト霊長類のｐ４４ポリペプチドに特徴的な生物学的機能を獲得するか、またはこうした生物学的機能を増進させるものを意味する。チンパンジーｐ４４ポリペプチドのこうした生物学的機能には、限定なしに、ＨＣＶ感染後の微小管集合、および肝細胞のＨＣＶ感染に対する抵抗性が含まれる。
【００８１】
当該技術分野に知られる一般的な方法
本発明の目的のため、ヒトおよび非ヒトポリヌクレオチドの供給源は、いかなる適切な供給源、例えばゲノム配列またはｃＤＮＡ配列であることも可能である。好ましくは、ヒトおよび非ヒト霊長類由来のｃＤＮＡ配列を比較する。ヒトタンパク質をコードする配列を、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ  ＢａｎｋおよびＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースから得ることも可能である。これらのデータベースは、進行しつつある研究努力によって生成された分子配列データの寄託所として働く。あるいは、当該技術分野で周知の方法にしたがって、例えばヒト細胞で発現されるｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡを配列決定するか、またはＰＣＲ増幅後に配列決定することから、ヒトタンパク質をコードする配列を得ることも可能である。あるいは、ヒトゲノム配列を配列比較に用いることも可能である。ヒトゲノム配列を、公共データベースから、または商業的に入手可能なヒトゲノムＤＮＡライブラリーの配列決定から、あるいはＰＣＲ後のゲノムＤＮＡから、得ることも可能である。
【００８２】
例えば、非ヒト霊長類ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択したｃＤＮＡクローンを配列決定することによって、非ヒト霊長類タンパク質をコードする配列を得ることも可能である。当該技術分野で標準的な技術を用いて、霊長類細胞で発現される総ｍＲＮＡから、非ヒト霊長類ｃＤＮＡライブラリーを構築することも可能である。いくつかの態様において、決定した発生段階の組織から、または霊長類を特定の環境条件に供した後に得た組織から得たｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。当該技術分野の文献に完全に説明される慣用的ｃＤＮＡライブラリー構築技術を用いて、本発明の配列比較に用いるｃＤＮＡライブラリーを構築することも可能である。総ｍＲＮＡをテンプレートとして用いてｃＤＮＡを逆転写する。転写したｃＤＮＡを適切なベクターにサブクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを確立する。確立されるｃＤＮＡライブラリーの全長ｃＤＮＡ含量を最大にすることも可能であるが、全長未満のｃＤＮＡを用いることも可能である。さらに、例えばＢｏｎａｌｄｏら（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：７９１−８０６にしたがって、配列頻度を標準化することも可能である。標準的自動化配列決定技術を用いて、構築されたｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択したｃＤＮＡクローンを配列決定することも可能である。好ましくは、全長ｃＤＮＡクローンを配列決定に用いる。ｃＤＮＡライブラリー由来のすべてのまたは大部分のｃＤＮＡクローンを配列決定することも可能であるが、単一のｃＤＮＡまたはいくつかのｃＤＮＡクローン程度に少ないｃＤＮＡを配列決定することによって、本発明のいくつかの態様を実施することもまた可能である。
【００８３】
本発明の１つの好ましい態様において、発現特異性にしたがって、配列決定しようとする非ヒト霊長類ｃＤＮＡクローンをあらかじめ選択しておくことも可能である。特異的に発現される活性遺伝子に対応するｃＤＮＡを選択するため、同一の動物の他の臓器、組織または細胞から得たｍＲＮＡを用いたサブトラクション・ハイブリダイゼーションにｃＤＮＡを供することも可能である。適切なストリンジェンシーおよび濃度での特定のハイブリダイゼーション条件下で、非組織特異的ｍＲＮＡとハイブリダイズし、そしてしたがって「ハウスキーピング」遺伝子に相当する可能性があるｃＤＮＡは、ｃＤＮＡプールから排除されるであろう。したがって、配列決定しようとする、残りのｃＤＮＡは、組織特異的機能と関連付けられる可能性がより高い。サブトラクション・ハイブリダイゼーションのため、１つの臓器から、または好ましくは異なる臓器および細胞の組み合わせから、非組織特異的ｍＲＮＡを得ることも可能である。非組織特異的ｍＲＮＡの量を最大にして、組織特異的ｃＤＮＡに飽和させる。
【００８４】
あるいは、オンライン公共データベースからの情報を用いて、特定の機能と関連付けられる可能性がより高いｃＤＮＡを選択するか、またはこうしたｃＤＮＡに優先権を与えることも可能である。例えば、候補ヒトｃＤＮＡ配列から設計したプライマーを用いるＰＣＲによって、配列決定のための非ヒト霊長類ｃＤＮＡ候補を選択することも可能である。候補ヒトｃＤＮＡ配列は、例えば、脳または乳房などの特異的組織にのみ見られるもの、あるいは脳機能または乳房組織脂肪発達もしくは腺発達などの特定の機能において重要である可能性がある遺伝子に対応するものである。ｃＤＮＡ配列の発現プロフィールおよび／または生物学的活性に関する情報を明記する、ＧｅｎＢａｎｋなどのオンラインヒト配列データベースを検索することによって、こうしたヒト組織特異的ｃＤＮＡ配列を得ることも可能である。
【００８５】
ＧｅｎＢａｎｋなどの公共データベースから、またはＰＣＲ法（例えばＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲ系９７００サーモサイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を用いる）などの当該技術分野に標準的な方法を用いて、既知のヒト遺伝子に対する非ヒト霊長類（例えばＡＩＤＳまたはＨＣＶ抵抗性非ヒト霊長類由来）相同体（単数または複数）の配列を得ることも可能である。例えば、候補ヒトｃＤＮＡ配列から設計したプライマーを用いたＰＣＲによって、配列決定のための非ヒト霊長類ｃＤＮＡ候補を選択することも可能である。ＰＣＲのため、ＰＲＩＭＥＲ（登録商標）（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）などの公共に入手可能なプライマー設計プログラムを含む、当該技術分野で標準的な方法を用いて、ヒト配列からプライマーを作成することも可能である。次いで、自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）などの、当該技術分野で標準的な方法および装置を用いて、増幅した配列を配列決定することも可能である。
【００８６】
本発明の一般的な方法
本発明の一般的な方法は以下の通りである。簡潔には、ヒト供給源および非ヒト供給源からヌクレオチド配列を得る。ヒトおよび非ヒトのヌクレオチド配列を互いに比較して、相同である配列を同定する。相同配列を解析して、２種間で核酸配列相違を有するものを同定する。次いで、分子進化解析を行って、相違の進化的重要性を定量的および定性的に評価する。２種、例えばヒトおよびチンパンジー間で正に淘汰される遺伝子に関しては、相違が他の非ヒト霊長類で生じているかどうかを決定することが有用である。次に、分子／遺伝子同一性および生物学的機能に関して、配列を性質決定する。最後に、こうした情報を用いて、ヒトの医学的または商業的に適切な状態の診断および治療に有用な剤を同定することも可能である。
【００８７】
本発明の一般的な方法は、ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、非ヒト、好ましくは霊長類、そして最も好ましくはチンパンジーのタンパク質をコードするヌクレオチド配列に比較することを伴う。他の非ヒト霊長類の例は、ボノボ、ゴリラ、オランウータン、テナガザル（ｇｉｂｂｏｎ）、旧世界ザル、および新世界ザルである。ヒト科グループ内の霊長類の系統樹を図１に示す。この比較にバイオインフォマティクスを適用して、そして進化的に重要な変化（単数または複数）である単数または複数のヌクレオチド変化を含有する配列を選択する。本発明は、いくつかの進化的利点を与えるように進化してきた遺伝子の同定、および特定の進化した変化の同定を可能にする。
【００８８】
ヒトおよび別の非ヒト霊長類のタンパク質をコードする配列を比較して、相同配列を同定する。特定の生物学的機能を有することが知られるか、または有すると推定される、タンパク質をコードする配列が、比較の出発点として役立ちうる。この比較を完了する適切な機構のいずれも、本発明に意図される。並列を手動で、またはソフトウェアによって行うことも可能である（適切な並列プログラムの例が当該技術分野に知られる）。好ましくは、データベース検索、例えばＢＬＡＳＴ検索を通じて、非ヒト霊長類由来のタンパク質コード配列を、ヒト配列に比較する。高スコアの「ヒット」、すなわちＢＬＡＳＴ解析後に有意な類似性を示す配列が回収され、そして解析されるであろう。有意な類似性を示す配列は、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％の配列同一性を有するものであることも可能である。好ましくは、約８０％より高い同一性を示す配列をさらに解析する。Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９２）ＣＡＢＩＯＳ  ８：１８９−１９１による、一般的に用いられる単純な並列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖなどの、当該技術分野に知られ、そして利用可能である、配列並列法およびプログラムを用いて、データベース検索を通じて同定される相同配列を、完全に並列させることも可能である。
【００８９】
あるいは、新規に開発された配列決定チップ技術を用いることによって、配列決定、並びにヒトおよび非ヒト霊長類間のタンパク質コード配列の相同比較を同時に行うことも可能である。例えばＲａｖａら、米国特許第５，５４５，５３１号を参照されたい。
【００９０】
並列させたヒトおよび別の非ヒト霊長類のタンパク質コード配列を解析して、特定の部位でのヌクレオチド配列相違を同定する。再び、この解析を達成するのに適した方法はいずれも、本発明に意図される。ヌクレオチド配列相違がない場合、非ヒト霊長類タンパク質をコードする配列は、通常、さらには解析されない。検出された配列変化を、一般的に、そして好ましくは、正確さに関してまずチェックする。好ましくは、最初のチェックは、以下の工程の１以上を行うことを含み、これらはすべて、当該技術分野に知られる：（ａ）非ヒト霊長類配列およびヒト配列間で変化がある点を発見し；（ｂ）配列フルオログラム（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｍ）（クロマトグラム）をチェックして、非ヒト霊長類にユニークであるようである塩基が、喚起される塩基に特異的な、強く明確なシグナルに対応するかどうかを決定し；（ｃ）ヒトのヒットをチェックして、配列変化に対応する１より多いヒト配列があるかどうかを確認する。非ヒト霊長類配列において異なるヌクレオチドがある位置で、同一のヌクレオチドを有する同一の遺伝子に関するヒト配列エントリーが多数あれば、ヒト配列が正確であり、そして変化が重要であることの独立の裏付けが提供される。公共のデータベース情報および遺伝暗号を用いて、こうした変化を調べて、これらのヌクレオチド配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じるかどうかを決定する。「ヌクレオチド変化」の定義から明らかであるように、本発明は、非ヒト霊長類由来の対応する配列に比較した際、ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の、置換、欠失または挿入いずれかの、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。好ましくは、変化はヌクレオチド置換である。より好ましくは、同定されるヒト配列に１より多い置換が存在し、そしてこれを分子進化解析に供する。
【００９１】
いくつかの異なる分子進化解析またはＫＡ／ＫＳ型の方法のいずれを使用して、ヒト遺伝子配列および非ヒト霊長類配列間で同定されるヌクレオチド変化の進化的重要性を定量的および定性的に評価することも可能である。ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＡｋａｓｈｉ（１９９５）Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｅｃｏｌ．  Ｓｙｓｔ．  ２６：４０３−４２２；Ｌｉ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  マサチューセッツ州サンダーランド，  １９９７。例えば、同義部位あたりの同義置換（ＫＳ）に対する非同義部位あたりの非同義ヌクレオチド置換（ＫＡ）の比を対比較することによって、タンパク質コード遺伝子において、タンパク質に対する正の淘汰（すなわち分子レベル適応進化）を検出することも可能である（Ｌｉら、１９８５；Ｌｉ、１９９３）。ＫＡおよびＫＳの比較のいずれを用いることも可能であるが、これらの２つの変数を比として比較することが特に好適であり、そして最も有効である。標準的統計法を用いて、ＫＡおよびＫＳ間の統計的に有意な相違を示すことによって、配列を同定する。
【００９２】
好ましくは、ＬｉらによるＫＡ／ＫＳ解析を用いて、本発明を行うが、種間で、正に淘汰された遺伝子を検出可能な他の解析プログラムもまた、使用可能である。Ｌｉら（１９８５）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２：１５０−１７４；Ｌｉ（１９９３）；Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：９６−９９；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４；Ｎｅｉ（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ニューヨーク、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）もまた参照されたい。比に関して、遺伝子の相同タンパク質コード領域間で、非同義部位あたりの非同義置換の率と、同義部位あたりの同義置換の率を比較することを含むＫＡ／ＫＳ法を用いて、進化中の中立選択とは対照的に、適応淘汰によって駆動された可能性もある、配列置換を同定する。同義（「サイレント」）置換は、遺伝暗号の縮重のため、コードされるアミノ酸配列に変化が起きないものであり；非同義置換は、アミノ酸置換を生じる。各種の変化の度合いをそれぞれ、同義部位あたりの同義置換の数、および非同義部位あたりの非同義置換の数である、ＫＡおよびＫＳとして概算することも可能である。ＫＡ／ＫＳの計算を手動でまたはソフトウェアを用いることによって行うことも可能である。適切なプログラムの例は、ＭＥＧＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）である。
【００９３】
ＫＡおよびＫＳを概算するため、完全または部分的ヒトタンパク質コード配列を用いて、同義置換および非同義置換の総数とともに非同義部位および同義部位を計算する。解析するポリヌクレオチド配列の長さは、適切な長さいずれであることも可能である。好ましくは、あらゆる重要な変化を決定するため、全コード配列を比較する。Ｌｉ９３（Ｌｉ（１９９３）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：９６−９９）またはＩＮＡなどの公共に利用可能なコンピュータプログラムを用いて、すべての対比較に関して、ＫＡ値およびＫＳ値を計算することも可能である。この解析をさらに適応させて、少数の重要な変化が、全配列によって隠されないように、「スライディング・ウィンドウ」方式で、配列を調べることも可能である。「スライディング・ウィンドウ」は、遺伝子の連続重複小区分の検査を指す（小区分はいかなる長さのものであることも可能である）。
【００９４】
非同義置換率および同義置換率の比較は、ＫＡ／ＫＳ比に代表される。ＫＡ／ＫＳは、適応進化が研究中の配列で働いている度合いを反映することが示されている。コード配列の全長または部分的セグメントをＫＡ／ＫＳ解析に用いることも可能である。ＫＡ／ＫＳ比がより高ければ、配列が適応進化を経ており、そして非同義置換が進化的に重要である可能性がより高い。例えば、ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）を参照されたい。好ましくは、ＫＡ／ＫＳ比は少なくとも約０．７５、より好ましくは少なくとも約１．０、より好ましくは少なくとも約１．２５、より好ましくは少なくとも約１．５０、またはより好ましくは少なくとも約２．００である。好ましくは、すべての上昇したＫＡ／ＫＳ比に対して、限定されるわけではないが、スチューデントｔ検定およびＹａｎｇ（１９９８）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ．  ３７：４４１−４５６に記載される尤度比検定などの標準法を含む、統計解析を行う。
【００９５】
ＫＡ／ＫＳ比が一致より有意に高いならば、正の淘汰が、偶然のみの結果として期待されうるよりも多数のアミノ酸置換を固定したことが強く示唆され、そしてこれは、この比が１以下である、一般的に観察されるパターンとは対照的である。Ｎｅｉ（１９８７）；ＨｕｇｈｅｓおよびＨｅｉ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：１６７−１７０；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ４：９１１−９１３；ＫｒｅｉｔｍａｎおよびＡｋａｓｈｉ（１９９５）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｅｃｏｌ．  Ｓｙｓｔ．  ２６：４０３−４２２；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。１未満の比は、一般的に、負の淘汰または純化淘汰の役割を示し：機能する有効なタンパク質の一次構造が、不変のままであるようにする、強い圧がある。
【００９６】
ＫＡ／ＫＳ比を計算する方法はすべて、関連種由来の相同遺伝子のタンパク質コード領域に関する、同義部位あたりの同義置換の数に対する、非同義部位あたりの非同義置換の数の対比較に基づく。各方法は、「多数のヒット」（すなわち同じ部位での１より多いヌクレオチド置換）を概算するための異なる補正を実行する。各方法はまた、ＤＮＡ配列が進化の時間に渡ってどのように変化するかに関して、異なるモデルを用いる。したがって、好ましくは、異なるアルゴリズムの結果を組み合わせて用いて、正に淘汰される遺伝子の検出に関する感度のレベルおよび結果の信頼性を増加させる。
【００９７】
好ましくは、ＫＡ／ＫＳ比は、パラロガス遺伝子対と対照的に、オルソロガス遺伝子対（すなわち遺伝子複製の結果である遺伝子とは対照的に、種形成から生じた遺伝子）に関して計算されるべきである。ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）。系統樹構築を可能にする、ゴリラおよびオランウータンなどの、他の非ヒト霊長類とのさらなる比較を行うことによって、この区別を行うことも可能である。樹構築に用いる際、オルソロガス遺伝子は、既知の「種の樹」を生じ、すなわち、既知の生物学的樹を再生する樹を生じるであろう。対照的に、パラロガス遺伝子は既知の生物学的樹に反する樹を生じるであろう。
【００９８】
本明細書記載の方法が、ヒトタンパク質をコードする配列に機能的に関連するヒトポリヌクレオチド配列の同定につながりうることが理解される。こうした配列には、限定されるわけではないが、ヒトタンパク質をコードしない非コード配列またはコード配列が含まれることも可能である。これらの関連配列は、例えば、ヒトゲノムにおいて、ヒトタンパク質をコードする配列に物理的に隣接する、例えばイントロンまたは５’隣接配列および３’隣接配列（プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素を含む）であることも可能である。ＧｅｎＢａｎｋなどの公共のヒトゲノムデータベースを検索することによって、あるいはタンパク質をコードする配列をプローブとして用いて、ヒトゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして配列決定することによって、これらの関連配列を得ることも可能である。関連コード配列を用いて非コード配列を得るための方法および技術は、当業者に周知である。
【００９９】
ＫＡ／ＫＳ解析などの分子進化解析によって検出される、進化的に重要なヌクレオチド配列を、ヒト（または非ヒト霊長類）でのユニークな存在、またはこれらの変化がヒト（または非ヒト霊長類）でユニークである度合いに関して、さらに評価することも可能である。例えば、同定された変化を、他の非ヒト霊長類配列における存在／非存在に関して、試験することも可能である。ヒトおよび１つの非ヒト霊長類間の少なくとも１つの進化的に重要な変化を含む配列を、他の非ヒト霊長類タンパク質をコードする配列のＰＣＲ解析のプライマーとして用いることも可能であり、そして生じたポリヌクレオチドを配列決定して、他の非ヒト霊長類で同じ変化が存在するかどうかを確かめることも可能である。これらの比較によって、適応進化的変化が、他の非ヒト霊長類に比較した際、ヒト系列にユニークであるかどうか、または適応変化が、ヒトおよび他の非ヒト霊長類に比較した際、該非ヒト霊長類（すなわちチンパンジー）にユニークであるかどうかに関して、さらなる区別を可能にする。ヒトで検出されるが他の霊長類で検出されないヌクレオチド変化は、ヒト適応進化的変化に相当する可能性がより高い。あるいは、ヒトまたは他の非ヒト霊長類で検出されない、非ヒト霊長類（すなわちチンパンジー）で検出されるヌクレオチド変化は、チンパンジー適応進化的変化に相当する可能性が高い。比較に用いる他の非ヒト霊長類を、ヒトとの系統学的関連に基づいて、選択することも可能である。明らかに関連する霊長類は、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、およびオランウータンなど、ヒト科サブ系統内のものであることも可能である。非ヒト霊長類はまた、旧世界ザルおよび新世界ザルなど、ヒト科グループの外にあり、そしてしたがって、ヒトにそれほど近縁でないものであることも可能である。こうした比較の統計的有意性は、確立された利用可能なプログラム、例えば、ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４に用いられるようなｔ検定を用いて決定することも可能である。統計的に高いＫＡ／ＫＳ比を示す遺伝子は、適応進化を経た可能性が非常に高い。
【０１００】
異なるヒト集団のゲノムにおいて、重要な変化を含む配列をプローブとして用いて、１より多いヒト集団に該配列変化が共有されるかどうかを確かめることも可能である。例えばヒトゲノムプロジェクト、ヒトゲノム多様性プロジェクトによって入手可能となったデータベースから、あるいはいくつかの関連しない多様なヒト集団由来のＰＣＲ増幅ＤＮＡの直接配列決定から、異なるヒト集団由来の遺伝子配列を得ることも可能である。異なるヒト集団で同定される変化が存在することは、さらに、変化の進化的重要性の指標となるであろう。重要な変化を持つチンパンジー配列を得て、そして類似の方法を用いて評価して、該配列変化が多くのチンパンジー間で共有されるかどうかを決定することも可能である。
【０１０１】
一般の当業者に知られる方法および技術を用いて、種間の重要な変化を含む配列を、分子／遺伝子同一性および生物学的機能に関して、さらに性質決定することも可能である。例えば、公共に入手可能なバイオインフォマティクス・プログラムを用いて、ヒトゲノム内で、配列を遺伝的および物理的に位置決定することも可能である。ヌクレオチド配列内で新規に同定された重要な変化は、ヒト進化における該遺伝子の潜在的な役割、およびヒトにユニークな機能的能力との潜在的な関連を示唆しうる。同定される配列を持つと推定される遺伝子を、例えば相同体検索によって、さらに性質決定することも可能である。推定される遺伝子と既知の遺伝子に共有される相同性は、類似の生物学的役割または機能があることの指標となりうる。推定される遺伝子配列を性質決定する、別の典型的な方法は、既知の配列モチーフに基づく。特定の配列パターンが、シグナル配列、ＤＮＡ結合ドメイン、または膜貫通ドメインなどの特定の生物学的特性を有するタンパク質の領域をコードすることが知られる。
【０１０２】
組織特異性または細胞種特異性に関して、遺伝子がどこで発現されるかを探すことによって、重要な変化を持つと同定されたヒト配列をさらに評価することもまた可能である。例えば、同定されたコード配列をプローブとして用いて、配列の発現パターンを明らかにするであろうｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍＲＮＡハイブリダイゼーションを行うことも可能である。特定の組織で発現される遺伝子は、組織、例えば脳組織と関連する重要なヒト機能と関連付けられる、よりよい候補でありうる。ヒト発生の各段階中での遺伝子発現のタイミングを決定することもまた可能である。
【０１０３】
別の典型的な配列性質決定法として、酵母、線虫、ショウジョウバエ、およびマウスなどのモデル系において、同定された遺伝子の異なるアレルに関する機能アッセイを行うことによって、重要な変化を含むと同定されたヌクレオチド配列の機能的役割を評価することも可能である。モデル系は、細胞に基づくか、あるいはトランスジェニック動物またはキメラ臓器もしくは組織を持つ動物など、ｉｎ  ｖｉｖｏであることも可能である。好ましくは、トランスジェニックマウスまたはキメラ臓器マウス系を用いる。細胞に基づく系および／またはトランスジェニック／キメラ動物系を作成する方法は当該技術分野に知られ、そして本明細書において、詳細に記載する必要はない。
【０１０４】
配列性質決定の別の典型的な方法として、コンピュータプログラムを使用すると、ヒトおよびチンパンジー由来の相同タンパク質の三次元構造をモデリングし、そして視覚化することが可能になる。霊長類タンパク質（単数または複数）において、どのアミノ酸が置換されているか、特異的に正確に知ることによって、機能的相違と関連付け可能な構造的変化の検出が可能になる。したがって、モデリング技術の使用は、先の段落で論じた機能的役割の同定と緊密に関連付けられる。これらの技術を個々にまたは組み合わせて使用することは、本発明の一部を構成する。例えば、チンパンジーＩＣＡＭ−３は、ヒトＩＣＡＭ−３がプロリン（Ｐ１０１）を含有する部位で、グルタミン残基（Ｑ１０１）を含有する。ヒトタンパク質は、この位置で、鋭く屈曲することが知られる。チンパンジータンパク質では、プロリンがグルタミンで置換されており、この位置で、はるかに鋭くない屈曲が生じている可能性がある。これは、ＩＣＡＭ−３チンパンジータンパク質のＨＩＶビリオンへのパッケージングと明らかに関連する。
【０１０５】
同様に、チンパンジーｐ４４は、ヒトｐ４４エクソン２に比較して、いくつかの進化的に重要なヌクレオチド変化を有するエクソン（エクソン２）を含有することが発見されてきている。チンパンジーｐ４４ポリペプチドにおける非同義変化および対応するアミノ酸変化は、チンパンジーにＨＣＶ抵抗性を与えると考えられる。この機構は、肝細胞における、増進したｐ４４微小管集合を伴うことも可能である。
【０１０６】
本明細書記載の方法によって同定される配列は、医学的または商業的に適切なヒト状態の診断および治療に重要な使用を有する。したがって、本発明は、これらの配列を用いてヒトにユニークなまたはヒトで増進された機能的能力を調節し、そして／またはこれらの能力の欠損を修正するのに有用な剤を同定するための方法を提供する。これらの方法は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ系、細胞に基づく発現系およびトランスジェニック／キメラ動物系などの、当該技術分野に知られるスクリーニング技術を使用する。本発明が提供するアプローチは、迅速に進化する遺伝子を同定するだけでなく、タンパク質に行うことも可能な調節が、別の種に存在するため、さほど毒性でない可能性もあることを示す。
【０１０７】
スクリーニング法
本発明はまた、上述の方法を用いて同定され、そして性質決定されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いるスクリーニング法も提供する。これらのスクリーニング法は、ヒト治療に有用であろう方式で、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能（単数または複数）を調節可能な剤を同定するのに有用である。一般的に、該方法は、試験しようとする少なくとも１つの剤を、上述の方法によって同定されたポリヌクレオチド配列でトランスフェクションしておいた細胞、またはこうしたポリヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドの調製物のいずれかと接触させることを伴い、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチドいずれかの機能を調節する能力によって、剤を同定する。
【０１０８】
本明細書において、用語「剤」は、生物学的または化学的化合物を意味し、例えば単純なまたは複雑な有機または無機分子、ペプチド、タンパク質またはオリゴヌクレオチドである。多量の化合物が合成可能であり、例えばオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー、並びに多様なコア構造に基づく合成有機および無機化合物があり、そしてこれらもまた、用語「剤」に含まれる。さらに、多様な天然供給源が、スクリーニング用の化合物を提供可能であり、植物または動物抽出物などがある。化合物を個々に、または互いに組み合わせて試験することも可能である。
【０１０９】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「機能を調節する」は、剤を添加しないものと比較した際、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が改変されていることを意味する。調節は、機能に影響を及ぼす、いかなるレベルで生じることも可能である。ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能は、直接または間接的であることも可能であり、そしてこうした機能を直接または間接的に測定することも可能である。ポリヌクレオチドの「機能」には、限定されるわけではないが、複製、翻訳、および発現パターン（単数または複数）が含まれる。ポリヌクレオチド機能にはまた、ポリヌクレオチド内にコードされるポリペプチドと関連付けられる機能も含まれる。例えば、ポリヌクレオチドに対して作用し、そしてタンパク質発現、コンホメーション、フォールディング（または他の物理的特性）、他の部分（リガンドなど）への結合、活性（または他の機能特性）、制御および／またはタンパク質構造または機能の他の側面に影響を及ぼす剤は、ポリヌクレオチド機能を調節したと見なされる。有効な剤が作用してポリヌクレオチドの発現を調節することも可能な方式には、限定されるわけではないが、１）ポリヌクレオチドの転写因子応答要素への転写因子の結合を修飾し；２）ポリヌクレオチドの発現に必要な２つの転写因子間の相互作用を修飾し；３）ポリヌクレオチドの発現に必要な転写因子が、核に進入する能力を改変し；４）ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を阻害し；５）リガンドと通常、相互作用し、そしてそのリガンド結合がポリヌクレオチドの発現を生じる、細胞表面受容体を修飾し；６）ポリヌクレオチドの発現を導くシグナル伝達カスケードの構成要素の不活性化を阻害し；そして７）ポリヌクレオチドの転写に関与する転写因子の活性化を増進することが含まれる。
【０１１０】
ポリペプチドの「機能」には、限定されるわけではないが、コンホメーション、フォールディング（または他の物理的特性）、他の部分（リガンドなど）への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質構造または機能の他の側面が含まれる。例えば、ポリペプチドに作用して、そしてそのコンホメーション、フォールディング（または他の物理的特性）、他の部分（リガンドなど）への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質構造または機能の他の側面に影響を及ぼす剤は、ポリペプチド機能を調節したと見なされる。有効な剤が作用して、ポリペプチドの機能を調節することも可能な方式には、限定されるわけではないが１）コンホメーション、フォールディングまたは他の物理的特性の変化；２）天然リガンドへの結合強度の変化またはリガンドへの結合の特異性の変化；および３）ポリペプチド活性の改変が含まれる。
【０１１１】
ポリヌクレオチドの「機能」には、その発現、すなわち転写および／または翻訳が含まれる。機能にはまた、（限定なしに）コンホメーション、フォールディングおよび他の部分への結合も含まれることも可能である。
【０１１２】
一般的に、スクリーニングしようとする剤の選択は、いくつかのパラメータに支配され、これらには、例えば、特定のポリヌクレオチドまたはポリペプチドターゲット、明らかになっている機能、三次元構造（知られているかまたは推量される場合）、および合理的薬剤設計の他の側面がある。コンビナトリアル・ケミストリーの技術を用いて、候補の多くの順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を生成することもまた可能である。当業者は、試験するのに適した剤を考案し、そして／または得ることも可能である。
【０１１３】
本明細書記載のｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイは、慣用的な薬剤スクリーニングアッセイに勝る、いくつかの利点を有しうる：１）望ましい療法効果を得るために、剤が細胞に進入しなければならない場合、剤が細胞に進入可能であるかどうかに関して、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイが指標を与えうる；２）ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングアッセイは、剤がアッセイ系に添加された状態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能の調節と関連付けられる少なくとも１つの特性を誘発する効果がないが、細胞内に入ると、細胞構成要素によって、有効な剤になるように修飾される剤を同定することも可能である；３）最も重要なことに、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド機能に関連付けられる特性を最終的に生じる経路の構成要素いずれに影響を及ぼす剤の同定も可能にする。
【０１１４】
一般的に、本発明の方法を用いて同定されたポリヌクレオチドでトランスフェクションしておいた適切な細胞試料に、剤を添加し、そして効果、すなわち該ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチド内にコードされるポリペプチドの機能の調節を監視することによって、スクリーニングを行うことも可能である。この実験には、好ましくは、候補剤を添加されていない対照試料が含まれる。次いで、限定されるわけではないが、顕微鏡解析、生存度試験、複製能、組織学的検査、細胞と会合する特定のＲＮＡまたはポリペプチドのレベル、細胞または細胞溶解物に発現される酵素活性のレベル、感染性病原体、例えばＨＩＶに曝露された際の細胞の相互作用、および細胞が他の細胞または化合物と相互作用する能力を含む、適切な表現型上の基準いずれかによって、処理細胞および未処理細胞を比較する。例えば、トランスフェクション細胞を、試験しようとする剤に曝露して、そして剤での処理前、処理中、または処理後に、細胞をＨＣＶまたはＨＩＶなどのウイルスに感染させて、そして例えば、ウイルスに感染した後、細胞間ウイルス感染に対する細胞の感受性、ウイルスの複製、ウイルスタンパク質の産生、および／または合胞体形成を含む、ウイルス感染に対する細胞の感受性の指標いずれかに関して試験することも可能である。処理細胞および未処理細胞間の相違は、候補剤に起因する効果の指標となる。最適には、剤は、対照細胞よりも実験細胞に対して、より高い効果を有する。適切な宿主細胞には、限定されるわけではないが、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞が含まれる。細胞の選択は、少なくとも部分的に、意図されるアッセイの性質に依存するであろう。
【０１１５】
ポリヌクレオチドの発現を上方制御する剤に関して試験するため、目的のポリヌクレオチドが発現されるように（本明細書において、発現には転写および／または翻訳が含まれる）、該ポリヌクレオチドでトランスフェクションしておいた適切な宿主細胞を、試験しようとする剤と接触させる。剤は、ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの発現増加を生じる能力に関して試験されるであろう。ベクター作成法およびトランスフェクション法は、当該技術分野に周知である。「トランスフェクション」は、外因性配列を導入するいかなる方法も含み、例えばリポフェクション、形質導入、感染またはエレクトロポレーションが含まれる。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として維持されることも可能であるし、または宿主ゲノムに組み込まれることも可能である。
【０１１６】
転写を特異的に活性化する剤を同定するため、転写制御領域をレポーター遺伝子に連結し、そして構築物を適切な宿主細胞に添加することも可能である。本明細書において、用語「レポーター遺伝子」は、同定可能な遺伝子産物（すなわちレポータータンパク質）をコードする遺伝子を意味する。レポーター遺伝子には、限定されるわけではないが、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。レポーター遺伝子産物の同定法には、限定されるわけではないが、酵素アッセイおよび蛍光定量アッセイが含まれる。レポーター遺伝子およびその産物を検出するアッセイは、当該技術分野に周知であり、そして例えばＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７）および定期的な改訂版に記載される。レポーター遺伝子、レポーター遺伝子アッセイ、および試薬キットはまた、商業的供給源から容易に入手可能である。適切な細胞の例には、限定されるわけではないが、真菌、酵母、哺乳動物、および他の真核細胞が含まれる。一般の当業者は、真核細胞をトランスフェクションする技術に精通しており、こうした技術には、ウイルスベクターなどの適切なベクターを調製し；エレクトロポレーションによるなどでベクターを細胞内に搬送し；そしてレポーターまたは薬剤感受性要素を用いることによるなどで、形質転換されている細胞を選択することが含まれる。これらの構築物における制御領域からの転写に対する剤の効果は、レポーター遺伝子産物の活性を通じて評価されるであろう。
【０１１７】
上に言及する、通常抑制されている条件下での発現増加に加えて、通常、維持されるかまたは増加している際の発現を減少させることも可能である。剤は、転写率の減少を通じてこれを達成可能であり、そして上述のレポーター遺伝子系は、これに関してアッセイする手段となるであろう。こうした剤を評価する宿主細胞は、発現を許容するものである必要があるであろう。
【０１１８】
（目的のポリヌクレオチドから）細胞が転写するｍＲＮＡを用いて、ｍＲＮＡの半減期および／またはｍＲＮＡの翻訳を特異的に調節する剤を同定することも可能である。また、こうした細胞を用いて、ポリペプチドのプロセシングおよび／または翻訳後修飾に対する剤の効果を評価することも可能であろう。剤は、ポリペプチドのターンオーバーを修飾する（すなわち半減期を増加させるかまたは減少させる）ことによって、細胞におけるポリペプチドの量を調節することも可能である。ｍＲＮＡおよびポリペプチドに関する剤の特異性は、剤の非存在下での産物を調べることによって、そして関連しないｍＲＮＡおよびポリペプチドの産物を調べることによって、決定されるであろう。ｍＲＮＡ半減期、タンパク質プロセシング、およびタンパク質ターンオーバーを調べる方法は、当業者に周知である。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニング法もまた、ポリペプチドと直接相互作用することを通じて、ポリペプチド機能を調節する剤を同定する際に有用でありうる。こうした剤は、あるとすれば、通常のポリペプチド−リガンド相互作用を遮断するか、あるいはこうした相互作用を増進するかまたは安定化させることも可能である。こうした剤はまた、ポリペプチドのコンホメーションを改変することも可能である。免疫沈降反応を用いて、剤の効果を決定することも可能である。適切な抗体を用いて、ポリペプチドおよびポリペプチドと緊密に会合するいかなるタンパク質も沈殿させる。処理細胞から、そして未処理細胞から免疫沈降したポリペプチドを比較することによって、あるとすれば、ポリペプチド−リガンド相互作用を増大させるかまたは阻害するであろう剤を同定することも可能である。ポリペプチド−リガンド相互作用はまた、ポリペプチド間の緊密であるが非共有的な相互作用を、共有相互作用に変換する架橋剤を用いて評価することも可能である。タンパク質間相互作用を調べる技術は当業者に周知である。タンパク質コンホメーションを評価する技術もまた、当業者に周知である。
【０１２０】
スクリーニング法が、細胞不含転写または翻訳系などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を含むことも可能であることもまた、理解される。こうした系において、転写または翻訳が起こることを可能にし、そして機能を調節する能力に関して、剤を試験する。剤が、ｍＲＮＡまたはポリヌクレオチドの翻訳を調節するかどうか決定するアッセイのため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系を用いることも可能である。これらの系は商業的に入手可能であり、そして目的のポリヌクレオチド配列に対応するｍＲＮＡを産生するｉｎ  ｖｉｔｒｏの手段を提供する。ｍＲＮＡを作成した後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳し、そして翻訳産物を比較することも可能である。いかなる剤も含有しないｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系（陰性対照）と剤を含有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系間の翻訳産物の比較は、剤が翻訳に影響を及ぼすかどうかの指標となる。対照および試験ポリヌクレオチド間の翻訳産物の比較は、剤が、このレベルで作用しているのであれば、（翻訳全般に、非選択的または非特異的様式で影響を及ぼすのと対照的に）翻訳に選択的に影響を及ぼすかどうかの指標となる。ポリペプチド機能の調節を多くの方式で達成することも可能であり、これらには、限定されるわけではないが、上に列挙するｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとともに、タンパク質調製物を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイが含まれる。天然供給源または組換え供給源からポリペプチドを抽出し、そして／または精製して、タンパク質調製物を生成することも可能である。タンパク質調製物試料に剤を添加し、そして効果を監視することも可能であり；すなわち剤がポリペプチドに作用し、そしてそのコンホメーション、フォールディング（または他の物理的特性）、他の部分（リガンドなど）への結合、活性（または他の機能特性）、および／またはタンパク質構造または機能の他の側面に影響を及ぼすかどうか、そしてどのように影響を及ぼすかが、ポリペプチド機能を調節したと見なされる。
【０１２１】
本明細書記載の方法によって同定されたポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドに結合する剤に関するアッセイの例において、ポリペプチドをまず、天然タンパク質として、または（上述のように同定されたポリヌクレオチドにコードされる）ポリペプチドをよく性質決定されたエピトープもしくはタンパク質とコンジュゲート化した融合タンパク質として、原核生物発現系または真核生物発現系で、組換え的に発現する。次いで、例えば適切な抗体または抗エピトープ抗体を用いた免疫沈降によって、あるいはコンジュゲートの固定されたリガンドに結合させることによって、組換えポリペプチドを精製する。次いで、ポリペプチドまたは融合タンパク質で作成したアフィニティーカラムを用いて、適切に標識されている化合物混合物をスクリーニングする。適切な標識には、限定されるわけではないが、蛍光色素、放射性同位体、酵素および化学発光化合物が含まれる。当業者に日常的に使用される、多様な条件（例えば高塩、界面活性剤）を用いた洗浄によって、非結合化合物および結合化合物を分離することも可能である。単にコンジュゲートまたはエピトープを含有するアフィニティーカラムを用いて、化合物混合物をあらかじめ清浄にすることによって、アフィニティーカラムへの非特異的結合を最小限にすることも可能である。ポリペプチドへの結合に関して競合する剤（単数または複数）をスクリーニングするため、類似の方法を用いることも可能である。アフィニティークロマトグラフィーに加えて、別の分子との結合に際して変化するであろう、融点の変化またはタンパク質の蛍光異方性を測定するなどの他の技術がある。例えば、ポリペプチドに共有カップリングするセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒに供給される、Ｓｔｉｔｔら（１９９５）Ｃｅｌｌ  ８０：６６１−６７０）を用いたＢＩＡｃｏｒｅアッセイを行って、異なる剤の結合活性を決定することも可能である。
【０１２２】
本発明のｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニング法には、構造的薬剤設計または合理的薬剤設計が含まれることもまた、理解され、こうした設計では、ポリペプチドのアミノ酸配列、三次元原子構造または他の単数の特性（または複数の特性）が、ポリペプチドに結合すると期待される剤を設計する基礎を提供する。一般的に、この背景での剤の設計および／または選択は、いくつかのパラメータに支配され、例えばヒトポリペプチドおよび相同非ヒト霊長類ポリペプチドの構造の並列比較、ポリペプチドターゲットの明らかになっている機能、三次元構造（知られているかまたは推量される場合）、および合理的薬剤設計の他の側面がある。コンビナトリアル・ケミストリーの技術を用いて、候補剤の多くの順列を生成することも可能である。
【０１２３】
本発明のスクリーニング法にやはり意図されるのは、トランスジェニック動物系およびキメラ臓器または組織を含有する動物モデルであり、これらは当該技術分野に知られる。
上述のスクリーニング法は、一次スクリーニングに相当し、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を調節する活性を示しうる、いかなる剤も検出するように設計されている。当業者は、剤をさらに評価するためには、二次試験が必要である可能性があることを認識するであろう。例えば、二次スクリーニングは、当該技術分野に知られる、マウスおよび他の動物モデル（ラットなど）を用いた感染性アッセイにおいて、剤（単数または複数）を試験することを含むことも可能である。さらに、一次スクリーニングで陽性の結果が出た剤が、生存生物で使用するのに適していることのさらなる実証として、細胞毒性アッセイが行われるであろう。細胞毒性に関するいかなるアッセイも、この目的に適しており、こうしたアッセイには、例えばＭＴＴアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が含まれる。
【０１２４】
本発明にはまた、本明細書記載のスクリーニング法によって同定される剤も含まれる。
正に淘汰された非ヒト形質を同定するのに有用な方法
本発明の１つの側面において、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、進化的に重要な正の変化を生じる自然淘汰を経ている（すなわち、非ヒト霊長類ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、ヒトには存在しない、正の特質を有する）。本発明のこの側面において、正に淘汰されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定の疾患に対する感受性または抵抗性と、あるいは他の商業的に適切な特質と関連付け可能である。この態様の例には、限定されるわけではないが、非ヒト霊長類、好ましくはチンパンジーで正に淘汰されている、感染性疾患、癌、または座瘡に対する感受性または抵抗性と関連付け可能であるか、あるいは毛髪増殖または筋量などのヒトにとって関心がある美的状態と関連付け可能なポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。この態様の例には、ＨＩＶからＡＩＤＳへの進行に対する感受性または抵抗性と関連付けられるポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。本発明はしたがって、ＨＩＶ感染がＡＩＤＳに発展する進行に対する抵抗性の根底にある分子機構への洞察を得て、ＡＩＤＳの発展を防止し、そして／または遅延させる薬剤などの剤を発見し、そして／または設計するのにもまた有用でありうる情報を提供するのに、有用である可能性もある。例えば、白血球および赤血球タンパク質として同定され、その機能が、これらの細胞を体のＭＡＣ（膜攻撃複合体）防御系の補体の攻撃から保護することである、ＣＤ５９（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ６１６：９２３−９３５）が、チンパンジーで正に淘汰されていることが発見されている（実施例１６を参照されたい）。チンパンジーで発見されたＣＤ５９は、ヒトでは見られない、ＡＩＤＳ進行に対する抵抗性を与えていると考えられる。したがって、正に淘汰されたチンパンジーＣＤ５９は、実施例に記載するように、ヒトにおけるＡＩＤＳの進行を拘束するのに有用な剤または薬剤を開発するのに役立ちうる。
【０１２５】
別の例は、チンパンジーにおけるＨＣＶ感染に対する抵抗性と関連付けられる、ｐ４４ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを伴う。この発見は、チンパンジーにおけるＨＣＶ感染の慢性肝炎および／または肝細胞癌への進行に対する抵抗性の根底にある分子機構を明確に理解するのに、そして慢性肝炎または肝細胞癌を防止し、そして／または遅延させる剤の発見および／または設計に有用な情報を提供するのに、有用でありうる。
【０１２６】
商業的に適切な例には、限定されるわけではないが、毛髪増殖、座瘡、または筋量などの、美的形質と関連付け可能な、非ヒト霊長類で正に淘汰されているポリヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれる。したがって、１つの側面において、本発明は、医学的または商業的に適切で、進化的に重要な正の変化と関連付け可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定する方法を提供する。該方法は：（ａ）ヒトタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類タンパク質をコードするヌクレオチド配列に比較して；そして（ｂ）ヒトの対応する配列に比較した際に、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含有する非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列を選択する工程を含み、前記変化は進化的に重要である。この方法によって同定される配列を、さらに性質決定し、そして／または非ヒト霊長類において、ユニークなまたは増進された、生物学的または医学的に適切な機能とのありうる関連に関して解析することも可能である。
【０１２７】
正に淘汰されたヒト形質を同定するのに有用な方法
本発明は、ヒトのユニークなまたは増進された機能的能力または形質、例えば脳機能またはより長い寿命に関連付け可能なヒトポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。より具体的には、これらの方法は、限定されるわけではないが、高容量の情報プロセシング、保存能および検索能、創造性、および言語能など脳機能を含む、ヒトにおいてユニークなまたは増進された能力と関連付け可能な遺伝子配列を同定する。さらに、これらの方法は、ヒトの脳が、他の非ヒト霊長類と比較した際に、増進したレベルで行う、脳の他の機能的特徴と関連付け可能な配列を同定する；これらの相違には、脳が仲介する感情的反応、移動運動、疼痛／快楽の感覚、嗅覚、気質およびより長い寿命が含まれることも可能である。
【０１２８】
この方法において、本発明の一般的な方法を上述のように適用する。一般的に、本明細書記載の方法は、（ａ）ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類のものに比較して；そして（ｂ）非ヒト霊長類のものに比較して、ヒトのユニークなまたは増進された機能的能力と関連付け可能な、進化的に重要な変化を有するヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を選択することを含む。
【０１２９】
この態様において、ヒト配列には、進化的に重要な変化が含まれる（すなわち、ヒト配列は、変化が淘汰圧に反応したものであることを示唆する方式で、１より多い非ヒト霊長類種配列と異なる）。進化的に重要な変化を含有する遺伝子にコードされるタンパク質の同一性および機能を性質決定して、そしてタンパク質が、ユニークなまたは増進されたヒト機能に関与しうるかどうかの決定を行う。タンパク質が、ユニークなまたは増進されたヒト機能に関与しているならば、ユニークなまたは増進されたヒト機能を補足するかまたは別の方式で調節する剤を同定する方式で、この情報を用いる。
【０１３０】
本発明の限定されない例として、ヒト脳の機能的ユニークさの根底にある遺伝子（すなわちヌクレオチド配列）相違を同定することによって、ヒト脳機能を調節し、そして／または機能的欠損を修正するのを補助することも可能な剤を設計するための基礎を提供可能である。これらの配列はまた、診断試薬および／または生物医学的研究ツールを開発するのにも有用でありうる。本発明はまた、ヒト脳のタンパク質をコードする配列と非ヒト霊長類由来のものを大規模に比較する方法も提供する。
【０１３１】
同定されたヒト配列変化を、ヒト脳機能に関与しうる候補ヒト遺伝子のデータベースを確立するのに使用することも可能である。候補は、該遺伝子が、チンパンジーまたは他の非ヒト霊長類に比較して、ヒト脳で見出されるユニークなまたは増進された機能的能力の原因である見込みに応じて、ランク付けされる。さらに、データベースは、候補遺伝子の順序だったコレクションを提供するだけでなく、ヒトおよびチンパンジー（および他の非ヒト霊長類）間に存在する正確な分子配列相違も提供し、そしてしたがって機能的相違の根底にある変化も定義する。この情報は、薬学的剤の有用なターゲットとして働きうるタンパク質上の潜在的な部位を同定するのにも有用でありうる。
【０１３２】
したがって、本発明はまた、進化的に重要なヌクレオチド変化を、ヒトにおけるユニークなまたは増進された脳の機能的能力に相関させる方法であって、（ａ）上述の方法にしたがってヒトヌクレオチド配列を同定し；そして（ｂ）モデル系において、同定された配列の存在または非存在の機能上の効果を解析することを含む、前記方法もまた提供する。
【０１３３】
さらなる研究を行って、推定される機能を確認することも可能である。例えば、培養中の一過性または安定トランスフェクション哺乳動物細胞を用いるか、あるいは同定されたポリヌクレオチドの発現を阻害するアンチセンスクローンでトランスフェクションした哺乳動物細胞を用いて、コードされるポリペプチドの発現が存在しない効果を評価する、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、推定される機能をアッセイすることも可能である。１−ハイブリッド研究および２−ハイブリッド研究などの研究を行って、例えばポリペプチドが相互作用する他の巨大分子を決定することも可能である。トランスジェニック線虫またはショウジョウバエを、行動研究を含む、多様な機能アッセイに用いることも可能である。適切な研究は、同定されるポリヌクレオチドおよび該ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの性質に応じ、そして当業者には明らかであろう。
【０１３４】
本発明はまた、本発明の方法によって同定されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドも提供する。１つの態様において、本発明は、配列番号１４のヌクレオチド２１８０〜２３２９、配列番号１４のヌクレオチド２９７８〜３４７８、および配列番号１４のヌクレオチド３３８０〜３９８８からなる群より選択される単離ＡＡＴＹＫヌクレオチド配列；並びに先行する配列いずれかのヌクレオチド配列に、少なくとも８５％の相同性を有する単離ヌクレオチド配列を提供する。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドであって；前記のコードが配列番号１４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に基づく、前記ポリペプチド、並びに配列番号１７および配列番号１８からなる群より選択されるヌクレオチド配列に、少なくとも８５％の相同性を有するヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドであって；前記のコードが配列番号１４のオープンリーディングフレームに基づく、前記ポリペプチドからなる群より選択される単離ＡＡＴＹＫポリペプチドを提供する。
【０１３６】
さらなる態様において、本発明は、配列番号１７のヌクレオチド１〜５０１、配列番号１７のヌクレオチド１〜１５０、配列番号１７のヌクレオチド１００〜２４９、配列番号１７のヌクレオチド２０２〜３５１、配列番号１７のヌクレオチド３０１〜４５０、配列番号１７のヌクレオチド７９９〜９４８、配列番号１７のヌクレオチド９０１〜１０５０、配列番号１７のヌクレオチド７９９〜１２９９、および配列番号１７のヌクレオチド１２０１〜１８０９からなる群より選択されるヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドであって；前記のコードが配列番号１４のオープンリーディングフレームに基づく、前記ポリペプチド；並びに先行するヌクレオチド配列いずれかに、少なくとも８５％の相同性を有するヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドからなる群より選択される、単離ＡＡＴＹＫポリペプチドを提供する。
【０１３７】
さらに別の態様において、本発明は、配列番号１８のヌクレオチド１〜５０１、配列番号１８のヌクレオチド７９９〜１２９９、および配列番号１８のヌクレオチド１２０１〜１８０９からなる群より選択されるヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドであって；前記のコードが配列番号１４のオープンリーディングフレームに基づく、前記ポリペプチド；並びに配列番号１８のヌクレオチド１〜５０１、配列番号１８のヌクレオチド７９９〜１２９９、および配列番号１８のヌクレオチド１２０１〜１８０９に、少なくとも８５％の相同性を有するヌクレオチド配列にコードされるポリペプチドからなる群より選択される、単離ポリペプチドを提供する。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、配列番号１７を含む単離ポリヌクレオチドであって、該核酸分子のコード容量が配列番号１４のオープンリーディングフレームに基づく、前記ポリヌクレオチドを提供する。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ポリヌクレオチドである。
【０１３９】
別の態様において、本発明は、配列番号１８を含む単離ポリヌクレオチドであって、該核酸分子のコード容量が配列番号１４のオープンリーディングフレームに基づく、前記ポリヌクレオチドを提供する。好ましい態様において、ポリヌクレオチドは、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）ポリヌクレオチドである。
【０１４０】
いくつかの態様において、本発明の単離ＡＡＴＹＫポリヌクレオチドまたはポリペプチドに８５％の相同性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、非ヒト霊長類と比較した際、少なくとも０．７５、少なくとも１．００、少なくとも１．２５、少なくとも１．５０、または少なくとも２．００のＫＡ／ＫＳ比を生じる、相同体である。
【０１４１】
他の態様において、本発明の単離ＡＡＴＹＫポリヌクレオチドまたはポリペプチドに８５％の相同性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、機能アッセイにおいて、天然ＡＡＴＹＫポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を実行可能な相同体である。ＡＡＴＹＫポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を評価するのに適したアッセイには、Ｒａｇｈｕｎａｔｈら，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（２０００）７７：１５１−６２に記載されるものなどのニューロン分化アッセイ、またはＴｏｍｏｍｕｒａら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０（９）：１０２２−３２に記載されるものなどのチロシンリン酸化アッセイが含まれる。句「機能アッセイにおいて、天然ＡＡＴＹＫポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を実行可能」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、機能アッセイにおいて、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約１０％を有することを意味する。他の好ましい態様では、機能アッセイにおいて、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約２０％を有する。他の好ましい態様では、機能アッセイにおいて、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約３０％を有する。他の好ましい態様では、機能アッセイにおいて、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約４０％を有する。他の好ましい態様では、機能アッセイにおいて、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約５０％を有する。他の好ましい態様では、機能アッセイにおいて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約６０％を有する。より好ましい態様では、機能アッセイにおいて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約７０％を有する。より好ましい態様では、機能アッセイにおいて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約８０％を有する。より好ましい態様では、機能アッセイにおいて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの活性の少なくとも約９０％を有する。
【０１４２】
ＡＩＤＳ態様の説明（正に淘汰された非ヒト形質の例）
ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）流行は、世界中で３０００万人の人々を脅かしていると概算されている（ＵＮＡＩＤＳ／ＷＨＯ，  １９８８，  “Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＨＩＶ／ＡＩＤＳ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ”）。先進国では１００万を優に超える人々が感染しており、そしてサハラ以南のアフリカの地域では、現在、成人の４人に１人がウイルスを保持する（ＵＮＡＩＤＳ／ＷＨＯ、１９９８）。ワクチン開発の努力がなされている途上であるが、近い将来、優れたワクチンが開発される見込みは低い。ＢａｌｔｅｒおよびＣｏｈｅｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１５９−１６０；ＢａｌｔｉｍｏｒｅおよびＨｅｉｌｍａｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍ．  ２７９：９８−１０３。療法剤の開発をさらに複雑にしているのは、ＨＩＶ（ＡＩＤＳの原因である、ヒト免疫不全ウイルス）の突然変異速度が迅速であり、これがウイルスタンパク質に迅速な変化を生じることである。これらの変化は最終的に、ウイルスタンパク質をターゲットとする現在の療法から、ウイルスが逃れることを可能にする。Ｄｏｂｋｉｎ（１９９８）Ｉｎｆ．  Ｍｅｄ．  １５（３）：１５９。始めは非常に見込みがあることが示された薬剤カクテルでさえ、薬剤耐性突然変異体の出現にさらされている。ＢａｌｔｅｒおよびＣｏｈｅｎ（１９９８）；Ｄｏｂｋｉｎ（１９９８）。したがって、ＨＩＶ感染個体におけるＡＩＤＳの進行を遅延させるかまたは防止する療法の開発には、いまだに深刻な必要性がある。Ｃｈｕｎら（１９９７）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９４：１３１９３−１３１９７；Ｄｏｂｋｉｎ（１９９８）。
【０１４３】
ヒトに最も近い近縁種、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）は、予期せぬことに、ＨＩＶ−１感染後の疾患プロセスの研究モデルとしては劣っていることがわかった。Ｎｏｖｅｍｂｒｅら（１９９７）；Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１（５）：４０８６−４０９１。ＨＩＶ−１にひとたび感染すると、チンパンジーは疾患の進行に抵抗性を示す。現在まで、１００を超える捕獲チンパンジーを感染させたものの、十分に発展したＡＩＤＳを発症したのはチンパンジー１頭のみであることが知られている。Ｎｏｖｅｍｂｒｅら（１９９７）；Ｖｉｌｌｉｎｇｅｒら（１９９７）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｐｒｉｍａｔｏｌ．  ２６（１−２）：１１−１８。チンパンジーにおいて、疾患進行に対する抵抗性を与える機構（単数または複数）を理解することは、明らかに、ＨＩＶに感染したヒトのための療法剤を開発する努力にとって非常に有益であると立証されうる。
【０１４４】
一般的に、最近、ヒトに種間伝染する前に、野生チンパンジー集団は、ＨＩＶ−１ウイルスを宿していた（おそらく数千年間）と考えられている。Ｄｕｂｅら（１９９４）；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２：３７９−３８９；ＺｈｕおよびＨｏ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５０３−５０４；Ｚｈｕら（１９９８）；Ｑｕｉｎｎ（１９９４）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：２４０７−２４１４。この長い期間の間に、ウイルス／宿主同時進化が起こり、順応を生じたようであり、このことが、ＡＩＤＳ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明する。ＢｕｒｎｅｔおよびＷｈｉｔｅ（１９７２）；Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ケンブリッジ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ）；Ｅｗａｌｄ（１９９１）Ｈｕｍ．  Ｎａｔ．  ２（ｉ）：１−３０。本明細書に引用する参考文献はすべて、完全に本明細書に援用される。
【０１４５】
本発明の１つの側面は、（ａ）チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）が、ＨＩＶ感染には感受性であるが、ＡＩＤＳの発展に対して抵抗性を示す（Ａｌｔｅｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：５４９−５５２；Ｆｕｌｔｚら（１９８６）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５８：１１６−１２４；Ｎｏｖｅｍｂｒｅら（１９９７）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１（５）：４０８６−５０９１）一方、ヒトはこの破壊的な疾患の発展に感受性であるため、チンパンジーの特定の遺伝子が、この抵抗性に寄与している可能性もあり；そして（ｂ）他の種（チンパンジーなど）由来の相同遺伝子に比較した際、ヒト遺伝子の変化が進化的に重要である（すなわち正の選択圧を示す）かどうかを評価することが可能であるという観察から生じている。したがって、タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、おそらく進化中の正の適応淘汰の結果として、ヒトでは見られないが、チンパンジー（とともに他のＡＩＤＳ抵抗性霊長類）で見られる配列変化を含有することも可能である。さらに、ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列における、こうした進化的に重要な変化は、ＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類（チンパンジーなど）がＡＩＤＳの発展に抵抗する能力の原因である可能性もある。本発明の方法は、選択的比較解析を使用して、ＡＩＤＳに対する感受性または抵抗性と関連付け可能な候補遺伝子を同定し、該遺伝子は、療法介入の新規宿主ターゲットとともに、抵抗性を与えるように進化した変化に関する特定の情報を提供することも可能である。（ウイルスタンパク質および／または機構と対照的に）宿主タンパク質に関与する療法アプローチの発展は、耐性ウイルス突然変異体の出現を遅延させるかまたは回避することさえ可能である。本発明はまた、同定された配列および構造相違を用いたスクリーニング法も提供する。
【０１４６】
本発明は、ＡＩＤＳの感染後発展に対する感受性と関連付け可能なヒトポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を同定するための方法を提供する。逆に、本発明はまた、ＡＩＤＳの発展に対する抵抗性と関連付け可能なＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類（チンパンジーなど）由来のポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を同定するための方法も提供する。ＡＩＤＳの発展に対する感受性または抵抗性の根底にある、遺伝子（すなわちヌクレオチド配列）および生じるタンパク質の構造的相違および生化学的相違を同定すると、ＡＩＤＳへのＨＩＶ感染進行の防止および／または療法を提供しうる剤を発見し、そして／または設計するための基礎が提供される可能性もある。これらの相違は、診断試薬および／または生物医学的研究ツールを開発する際にも使用可能である。例えば、抵抗性を与えるタンパク質を同定すると、抵抗性タンパク質が役割を果たす疾患経路の破壊に基づく、診断試薬または生物医学的研究ツールの開発が可能になりうる。
【０１４７】
一般的に、本明細書記載の方法は、（ａ）ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、ＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類（チンパンジーなど）のものに比較して、ここでヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＩＤＳの発展と関連付けられる；そして（ｂ）ＡＩＤＳの発展に対する感受性と関連付け可能な進化的に重要な変化を有する、ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を選択することを伴う。別の態様において、該方法は、（ａ）ヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、ＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類（チンパンジーなど）のものに比較して、ここでヒトタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＩＤＳの発展と関連付けられる；そして（ｂ）ＡＩＤＳの発展に対する抵抗性と関連付け可能な進化的に重要な変化を有する、非ヒト霊長類タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を選択することを伴う。
【０１４８】
明らかであるように、本明細書記載の方法を他の感染性疾患に適用することも可能である。例えば、非ヒト霊長類が、かなりの期間（すなわち正の淘汰を可能にするのに十分な時間）、感染性疾患を宿していたことが知られるかまたはそう考えられ、そして該疾患の発展に対して抵抗性である状況で、該方法を用いることも可能である。したがって、他の態様において、本発明は、感染性疾患の発展に対する抵抗性と関連付け可能なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を同定する方法であって：（ａ）感染性疾患抵抗性の非ヒト霊長類のタンパク質をコードする配列を、ヒトタンパク質をコードする配列に比較して、ここでヒトタンパク質をコードする配列は、感染性疾患の発展と関連付けられる；そして（ｂ）対応するヒト配列に比較した際、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含有する感染性疾患抵抗性非ヒト霊長類配列を選択する工程を含み、該ヌクレオチド変化が進化的に重要である、前記方法を提供する。別の態様において、本発明は、感染性疾患の発展に対する感受性と関連付け可能なポリペプチドをコードするヒトポリヌクレオチド配列を同定する方法であって：（ａ）ヒトタンパク質をコードする配列を、感染性疾患抵抗性の非ヒト霊長類のタンパク質をコードする配列に比較して、ここでヒトタンパク質をコードする配列は、感染性疾患の発展と関連付けられる；そして（ｂ）感染性疾患抵抗性の非ヒト霊長類の対応する配列に比較した際、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含有するヒトポリヌクレオチド配列を選択する工程を含み、該ヌクレオチド変化が進化的に重要である、前記方法を提供する。
【０１４９】
本発明において、ＨＩＶ増殖（すなわち複製）、播種および／またはそれに続くＡＩＤＳへの進行との既知の関連または暗示される関連に基づいて、ＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類由来の相同体と比較しようとするヒト配列を選択する。こうした知識は、例えば、公開された文献および／または公共データベース（ＧｅｎＢａｎｋなどの配列データベースを含む）から得る。ＡＩＤＳの発展（ウイルス複製を含む）に関与する経路は、多くの遺伝子を伴うため、本発明の方法を用いて、いくつかの適切な候補を試験することも可能である。表１は、調べるべき遺伝子の典型的なリストを含有する。該配列は、一般的に当該技術分野に知られる。
【０１５０】
表１：調べるべき／調べたヒト遺伝子の抽出リスト
【０１５１】
【表１−１】
2007531493.tif 000003
【０１５２】
【表１−２】
2007531493.tif 000004
【０１５３】
ヒトおよびＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類、例えばチンパンジーの並列したタンパク質コード配列を解析して、特定の部位でヌクレオチド配列相違を同定する。検出した配列変化を、一般的に、そして好ましくは、上述のように、正確さに関してまずチェックする。ＫＡ／ＫＳ解析などの分子進化解析によって検出される進化的に重要なヌクレオチド変化をさらに評価して、非ヒト霊長類遺伝子またはヒト遺伝子が、正の淘汰にさらされてきたかどうかを決定することも可能である。例えば、他のＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類配列における存在／非存在に関して、同定された変化を試験することも可能である。ヒトおよび１つの種のＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類間で少なくとも１つの進化的に重要な変化を持つ配列を、他の非ヒト霊長類タンパク質をコードする配列のＰＣＲ解析のプライマーとして用いることも可能であり、そして生じたポリヌクレオチドを配列決定して、他の非ヒト霊長類で同じ変化が存在するかどうかを確かめる。これらの比較によって、他の非ヒト霊長類に比較した際、該適応進化的変化が、該ＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類（例えばチンパンジー）にユニークであるかどうかに関して、さらなる区別を可能にする。例えば、チンパンジーで検出されるが、他の霊長類で検出されないヌクレオチド変化は、チンパンジー遺伝子に対する正の淘汰に相当する可能性がより高い。比較に用いる他の非ヒト霊長類を、ヒトとの系統学的関係に基づいて、選択することも可能である。近縁の霊長類は、チンパンジー、ボノボ、ゴリラ、およびオランウータンなど、ヒト科サブ系統内のものであることも可能である。非ヒト霊長類はまた、旧世界ザルおよび新世界ザルなど、ヒト科グループの外にあり、そしてしたがって、ヒトにそれほど近縁でないものであることも可能である。こうした比較の統計的有意性は、確立された利用可能なプログラム、例えば、ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４に用いられるようなｔ検定を用いて決定することも可能である。
【０１５４】
さらに、異なるヒト由来のゲノムにおいて、重要な変化を含む配列をプローブとして用いて、１より多い個体によって該配列変化が共有されているかどうかを確かめることも可能である。例えば、特定の個体は、ＡＩＤＳに進行するのがより遅く（「進行が遅延したヒト」）、そして（ａ）チンパンジー配列および進行が遅延したヒト個体由来の相同配列間および／または（ｂ）ＡＩＤＳ感受性個体および進行が遅延した個体間の比較は、興味深いものであろう。例えばヒトゲノム多様性プロジェクトによって入手可能となったデータベースから、あるいはいくつかの関連しない多様なヒト集団由来のＰＣＲ増幅ＤＮＡの直接配列決定から、異なるヒト集団由来の遺伝子配列を得ることも可能である。進行が遅延したヒトに、同定された変化が存在していれば、変化の進化的重要性のさらなる指標となるであろう。
【０１５５】
本明細書に例示するように、ＡＩＤＳの進行に対するチンパンジーの抵抗性と関連付けられているＣＤ５９タンパク質は、ヒトＣＤ５９に比較して、進化的に重要なヌクレオチド変化を示す。ＣＤ５９（プロテクチン、１Ｆ−５Ａｇ、Ｈ１９、ＨＲＦ２０、ＭＡＣＩＦ、ＭＩＲＬ、およびＰ−１８としても知られる）は、末梢血白血球および赤血球上で発現され、そして補体によるヒト細胞の溶解を制限するように機能する（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１６：９２３）。より具体的には、ＣＤ５９は、細胞膜中に穴状の傷害を作る補体タンパク質、膜攻撃複合体の阻害剤として作用する。したがって、ＣＤ５９は、それ自体の防御系の補体の攻撃から、体の細胞を防御する（Ｍｅｒｉら、上記）。ヒト相同体は、感染した個体におけるＡＩＤＳへの進行に関係すると見なされるため、このタンパク質のチンパンジー相同体を調べた。ＣＤ５９が、ＨＩＶビリオンに選択的に取り込まれる、宿主細胞由来タンパク質の１つであることが示されている（Ｆｒａｎｋら（１９９６）ＡＩＤＳ  １０：１６１１）。さらに、宿主細胞ＣＤ５９を取り込んだＨＩＶビリオンが、補体の作用から保護されることが示されてきている。したがって、ヒトでは、ＨＩＶがＣＤ５９を使用して、感染者の免疫系による攻撃から自身を防御して、そしてしたがって、感染の経過を進めるようである。実施例において理論付けられるように、正に淘汰されたチンパンジーＣＤ５９が、疾患進行を阻害する適応変化を構成しうる。ウイルスは、チンパンジーＣＤ５９の防御上の役割を不当に使用することができず、それによってウイルスがチンパンジー免疫系に感受性になることも可能である。
【０１５６】
本明細書にさらに例示するように、ＤＣ−ＳＩＧＮタンパク質もまた、ヒトおよびゴリラに比較した際、チンパンジーで正に淘汰されていると決定されてきている。ＤＣ−ＳＩＧＮは、樹状細胞上で発現され、そしてＨＩＶ−１ウイルスをリンパ節に輸送する機構を提供し、ウイルスはリンパ節で、未分化Ｔ細胞を感染させることが立証されている（Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ，  Ｔ．Ｂ．Ｈ．ら（２０００）Ｃｅｌｌ  １００：５８７−５９７）。Ｔ細胞の感染は、最終的に、免疫系無防備状態（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）につながり、そして続いて十分に発展したＡＩＤＳにつながる。ＨＩＶ−１ウイルスは、ＤＣ−ＳＩＧＮの細胞外部分に結合し、そして次いでＣＤ４タンパク質を介して、Ｔ細胞へのアクセスを得る。ＤＣ−ＳＩＧＮは、リガンドとしてＩＣＡＭ−３を有し、ＩＣＡＭ−３は非常に高いＫＡ／ＫＳ比を有する。チンパンジーＩＣＡＭ−３に対する正の淘汰は、ＤＣ−ＳＩＧＮへの連続結合を可能にする補償変化の結果である可能性もある。実施例において理論付けるように、正に淘汰されたチンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮは、疾患進行を阻害する別の適応変化を構成する可能性もある。チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの三次元構造を解明し、そしてＨＩＶ−１がＤＣ−ＳＩＧＮに結合するのを防止する機構を同定すると、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮの通常の機能を中断させることなく、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮの効果を模倣する薬剤を設計することも可能になりうる。
【０１５７】
ＨＣＶ態様の説明（正に淘汰された非ヒト形質の例）
約４００万人のアメリカ人がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しており、そして世界中ではこの数は４０００万人近い（ＡＰ通信社、１９９９年３月１１日）。これらの感染者の多くは感染に気づかず、肝細胞癌を導きうる。この疾患は、ほぼ常に致死である。毎年おおよそ１４，５００人のアメリカ人が、肝細胞癌の影響の結果、死亡する（ＡＰ通信社、１９９９年３月１１日）。したがって、慢性感染の影響を軽減させることも可能な療法剤を同定することは、倫理的観点および商業的観点の両方で価値がある。
【０１５８】
チンパンジーはヒト以外にＨＣＶ感染に感受性であることが知られる唯一の生物である（Ｌａｎｆｏｒｄ，  Ｒ．Ｅ．ら（１９９１）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３４：１４８−１５３）。ＨＣＶの元来の宿主集団はまだ立証されていないが、このウイルスは、２つだけの既知の感受性種であるヒトまたはチンパンジーのいずれかに源を発したに違いないようである。ＨＣＶの発生大陸はアフリカであることが知られている（私信、Ａ．  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ、コロラド大学健康科学センター、デンバー州）。多くのＨＣＶ研究者が考えているように、チンパンジー集団が、ＨＣＶの元来の宿主であるならば（私信、Ａ．  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ、コロラド大学健康科学センター、デンバー州）、ＨＩＶウイルスで真実であることが知られているように、おそらく、チンパンジーは該ウイルスに対する抵抗性を発展させてきたのであろう。この仮説は、ＨＣＶに感染したチンパンジーが、Ｃ型肝炎に感染したヒトでしばしば起こる肝臓損傷に耐性であるという、よく立証された観察によって裏付けられる（Ｗａｌｋｅｒ，  Ｃ．Ｍ．（１９９７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  １９：８５−９８；ＭｃＣｌｕｒｅ，  Ｈ．Ｍ．，  ｐｐ．１２１−１３３  Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ中，  Ｅｄｅｒ，  Ｇ．ら監修，  １９９４，  Ｂａｓｅｌ；Ｋａｒｇｅｒ；Ａｇｎｅｌｌｏ，  Ｖ．ら（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８：５７３−５８４）。実際、ＨＣＶに感染したヒトの２％で、疾患の経過は肝細胞癌を導くが、ＨＣＶに感染したチンパンジーはこれらの腫瘍を発展させない（Ｗａｌｋｅｒ，  Ｃ．Ｍ．（１９９７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  １９：８５−９８）。チンパンジーが元来の宿主集団であり、そしてウイルスを長期間経験した結果、ＨＣＶが誘導する疾患の損害に対する抵抗性を発展させたという仮説は、ＨＣＶに感染したチンパンジーが、一般に、ヒトよりも穏やかな疾患経過（すなわち、肝臓の影響に単に制限されない）を有するという観察によってさらに裏付けられる（Ｌａｎｆｏｒｄ，  Ｒ．Ｅ．ら（１９９１）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３４：１４８−１５３；およびＷａｌｋｅｒ，  Ｃ．Ｍ．（１９９７）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  １９：８５−９８）。
【０１５９】
本明細書に例示するように、チンパンジーにおけるｐ４４遺伝子は、ヒト相同体に比較して正に淘汰されてきている。ｐ４４タンパク質は、ＨＣＶに実験的に感染させたチンパンジーの肝組織で最初に同定された（Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｙ．ら（１９８５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８２：２１３８）。
【０１６０】
ｐ４４遺伝子、およびコードされるタンパク質は、Ｃ型肝炎に慢性的に感染したヒトのための潜在的な療法ターゲット、あるいは療法剤への道に相当する。チンパンジーにおいて、この遺伝子にコードされるタンパク質は、捕獲チンパンジーを実験的に感染させた後、チンパンジー肝臓で上方制御されることが知られる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．ら（１９９０）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１：２００５−２０１１）。ｐ４４遺伝子は、α／βインターフェロン誘導性遺伝子ファミリーのメンバーであることが示されてきている（Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ａ．ら（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：８７７−８８３）。ｐ４４タンパク質は、インターフェロンの抗ウイルス活性の仲介因子であると推測される。
【０１６１】
上述のように、ＨＣＶに感染したチンパンジーが、ＨＣＶに感染したヒトでしばしば起こる肝臓損傷に耐性であることが立証されているため、これは非常に示唆に富む。このタンパク質がＣ型肝炎感染後のチンパンジー肝臓でのみ発現されるという観察、チンパンジーがヒトで起こりうる肝臓損傷に耐性であるという事実（Ａｇｎｅｌｌｏ，  Ｖ．ら（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８：５７３−５８４）、ＨＣＶに感染したチンパンジーが、一般的に、ヒトよりも穏やかな疾患経過を有し、そしてｐ４４遺伝子がチンパンジーで正に淘汰されているという観察を組み合わせると、チンパンジーｐ４４タンパク質が、チンパンジーにおいて、肝臓損傷に対して抵抗性を与えることが強く示唆される。該タンパク質が、感染したヒトでは起こらない、チンパンジーにおけるある種のカスケードを開始する原因となっているかどうか、または選択されたチンパンジー相同体が、何らかの重要な生化的機能において、ヒト相同体と異なるかどうかは、いまのところ明らかでない。チンパンジーで観察される疾患経過がより穏やかであるのは、部分的に、ウイルス複製レベルがより低いためであると推測されている（Ｌａｎｆｏｒｄ，  Ｒ．Ｅ．ら（１９９１）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３４：１４８−１５３）。
【０１６２】
本発明には、チンパンジーｐ４４がヒトｐ４４と異なる特定のアミノ酸残基の医学的使用が含まれる。チンパンジーが該ウイルスに対する順応を発展させてきた期間中に正に淘汰された、これらの残基は、慢性にＨＣＶに感染したヒトのための有効な療法アプローチの理にかなった設計を可能にする。感染したヒトにおいて、チンパンジー様の反応を誘導するいくつかの方法が、当業者には明らかであろう。可能性には、チンパンジー進化において選択された特定のアミノ酸残基のヒト相同体をターゲットとする小分子療法剤の理にかなった設計が含まれる。ヒトタンパク質がチンパンジータンパク質の三次元構造を模倣するようにする、小分子を設計することも可能であるため、ここでは、分子モデリング技術の使用が有用である可能性もある。別のアプローチは、ヒトｐ４４において、チンパンジー様の機能的反応を誘導する小分子療法剤の設計であろう。再び、これは、本発明で得た知識、すなわちチンパンジーにおいて、どのアミノ酸残基が正に淘汰されて、ＨＣＶに対する抵抗性を与えたのかに関する知識を使用することによってのみ、達成可能である。他の可能性は、当業者に容易に明らかであろう。
【０１６３】
ヒトｐ４４がチンパンジーｐ４４の構造および／または機能を模倣可能であるように、ヒトｐ４４（エクソン２）ポリペプチドと好都合に相互作用しうる候補剤をスクリーニングするのに加えて、本発明はまた、ヒトｐ４４ポリヌクレオチドプロモーターと相互作用して、それによってＨＣＶ感染に対するヒト患者の抵抗性を改善するように、ヒトｐ４４の発現を増加させることも可能である、候補剤のスクリーニングにも関する。したがって、本発明には、ヒトｐ４４ポリヌクレオチドプロモーターと少なくとも１つの候補剤を接触させ、そしてヒトｐ４４ポリヌクレオチドの発現が増進するかどうかを観察することによって、ヒトｐ４４ポリヌクレオチドの発現を調節する剤を同定する方法も含まれる。ヒトｐ４４プロモーターは、Ｋｉｔａｍｕｒａら（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：８７７（図４）に公開されている。
【０１６４】
乳房増進態様の説明（正に淘汰されたヒト形質の例）
非ヒト霊長類に比較して、ヒト女性は、妊娠前、授乳前に膨らむ乳房組織を提示する。実施例で論じるように、この二次性徴は、長期の一雌一雄関係の形成および長期の乳児育成に関連付けられる、ヒトにおいて発達した振る舞いを促進すると考えられる。本発明の１つの側面は、大きくなった乳房の発達において、正に淘汰されているヒト遺伝子を同定することに関する。具体的には、本発明は、ヒトにおける大きくなった乳房と関連付けられるヒトポリヌクレオチド配列が、大きくなった乳房を明示しない非ヒト霊長類に比較して、進化的に重要な変化を経たかどうかを決定する方法であって：ａ）ヒトポリヌクレオチド配列を、対応する非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド変化いずれかを同定し；そしてｂ）該ヒトヌクレオチド変化が、進化的に重要であるかどうかを決定することを含む、前記方法を含む。
【０１６５】
ヒトにおける正常乳房発達に関連付けられてきているヒトＢＲＣＡ１遺伝子は、チンパンジーおよび他の非ヒト霊長類のＢＲＣＡ１遺伝子に比較して、正に淘汰されていることが見出された。同定される進化的に重要なヌクレオチド変化は、ＢＲＣＡ１遺伝子またはタンパク質の機能を調節可能な剤を発展させるのに有用でありうる。
【０１６６】
剤を含む療法組成物
本明細書に記載するように、本発明の方法にしたがって同定された、正に淘汰されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの有効性を増加させるかまたは減少させる能力に関して、剤をスクリーニングすることも可能である。例えば、乳房発達を増進させるのに適している可能性もある剤には、ＢＲＣＡ１タンパク質またはそのリガンドと直接相互作用するもの、あるいはＢＲＣＡ１タンパク質の阻害剤を遮断するものが含まれることも可能である。あるいは、剤は、ＢＲＣＡ１発現を増加させることによって、乳房発達を増進させることも可能である。ＢＲＣＡ１の機構がさらに解明されるにつれて、その有効性を増進させるための戦略を工夫することも可能である。
【０１６７】
別の例において、ＡＩＤＳの進行を減少させるのに適している可能性もある剤には、おそらく、ヒトＣＤ５９を、ビリオン粒子内のパッケージングに不適切であるようにすることによって、または細胞膜に関するタンパク質の方向を変化させることによって（または何らかの他の機構を介して）、ＨＩＶビリオンに対して、ヒトＣＤ５９を使用不能にする方式で、ヒトＣＤ５９タンパク質と直接相互作用するものが含まれることも可能である。ヒトＣＤ５９を発現するＨＩＶ感染細胞と剤を接触させ、合胞体形成またはＡＩＤＳ進行の他の指標が減少するかどうかを決定するアッセイを用いて、ＣＤ５９機能を調節する能力に関して、候補剤をスクリーニングすることも可能である。このアッセイは、ＨＩＶビリオンが、ＣＤ５９を有効にパッキングして、そして／またはＣＤ５９を利用して、ＭＡＣ複合体による攻撃を阻害することも可能であるかどうか検出することを可能にしうる。
【０１６８】
ＡＩＤＳ進行を遅延させうる１つの剤は、多数のＧＰＩ連結を有するように修飾されたヒトＣＤ５９である。本明細書に記載するように、ヒトＣＤ５９では単一のＧＰＩ連結しか見られないのに比較して、３つのＧＰＩ連結を含有するチンパンジーＣＤ５９は、チンパンジーにおけるＨＩＶ感染の進行を遅延させる。好ましくは、修飾ヒトＣＤ５９は、３つのＧＰＩ連結をタンデムに含有する。
【０１６９】
ＡＩＤＳ進行を減少させるのに適している可能性もある剤の別の例は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮと直接相互作用して、ＤＣ−ＳＩＧＮがＨＩＶ−１に結合し、そしてＨＩＶ−１をリンパ節に輸送する能力を減少させる化合物である。こうした剤は、ＤＣ−ＳＩＧＮ上のＨＩＶ−１結合部位に直接結合することも可能である。候補剤を、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞と、またはＤＣ−ＳＩＧＮの精製細胞外断片と接触させて、そしてＨＩＶ−１結合を阻害する能力に関して試験することも可能である。
【０１７０】
本発明の方法にしたがって同定された剤を投与するのに使用可能な多様な搬送系が当該技術分野に知られる。こうした搬送系には、水性溶液、リポソーム中の被包、微小粒子または微小カプセル、あるいは細胞内進入を促進する部分へのコンジュゲート化などが含まれる。
【０１７１】
剤を含む療法組成物を注射によって非経口投与することも可能であるが、動脈内注射、吸入ミスト、経口活性配合物、経皮イオン導入法または座薬などの他の有効な投与型もまた想定される。キャリアーは、配合物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘性、透明度、色、無菌性、安定性、溶解率、または匂いを修飾するかまたは維持するための、他の薬理学的に許容しうる賦形剤を含有することも可能である。キャリアーはまた、安定性、溶解率、剤の遊離または吸収を修飾するかまたは維持するための、他の薬理学的に許容しうる賦形剤を含有することも可能である。こうした賦形剤は、単位用量または多用量型いずれかで非経口投与するための製剤を配合するのに、通常、そして習慣的に、使用する物質である。
【０１７２】
療法組成物を配合したら、無菌バイアル中に、溶液、懸濁物、ゲル、エマルジョン、固体、あるいは脱水または凍結乾燥粉末として、保存することも可能である。こうした配合物を、すぐ使用できる型または投与直前に再構築を要する型いずれで保存することも可能である。全身搬送のため、剤を含有する配合物を投与する方式は、皮下、筋内、静脈内、鼻腔内または膣または直腸座薬を介することも可能である。あるいは、配合物をターゲット臓器（例えば乳房）に直接投与することも可能である。
【０１７３】
特定の障害または状態の治療に有効であろう剤の量は、標準的臨床技術によって決定可能な、障害または状態の性質に応じるであろう。さらに、所望によってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイを使用して、最適投薬量範囲の同定を補助することも可能である。配合物中で使用すべき正確な用量はまた、投与経路、および疾患または状態の深刻さまたは進行に応じるであろうし、そして開業医および各患者の状況にしたがって決定されなければならない。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系由来の用量−反応曲線から外挿可能である。例えば、本発明の方法にしたがって同定される剤の有効量は、本発明の二価化合物の段階的な用量を投与して、そして望ましい効果を観察することによって、容易に決定される。
【０１７４】
ヒト疾患と関連付け可能な候補ポリヌクレオチドを得る方法、および該方法から得られる診断法の説明
本発明にしたがって、ＢＲＣＡ１エクソン１１は、チンパンジーに比較して、ヒトにおいて、正の淘汰を経た進化的に重要なポリヌクレオチドであり、そしてチンパンジーに比較して、ヒトで観察される増進した乳房発達と関連付けられる（実施例１４を参照されたい）。エクソン１１はまた、乳癌の発展と関連付けられる突然変異を有することも見出されている。ＢＲＣＡ１エクソン１１突然変異は、家族性乳癌および特発性乳癌の両方と関連付けられることが知られる（Ｋａｃｈｈａｐ，  Ｓ．Ｋ．ら（２００１）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ３９（５）：３９１−４００；Ｈａｄｊｉｓａｖｖａｓ，  Ａ．ら（２００２）Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｐ．  ９（２）：３８３−６；Ｋｈｏｏ，  Ｕ．Ｓ．ら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（３２）：４６４３−６）。
【０１７５】
本発明に含まれるのは、非ヒト霊長類に比較して進化的に重要であり、そしてヒトにおいて、改善された生理学的状態と関連付けられる、ヒトポリヌクレオチドがまた、１以上の疾患に対する抵抗性減少または感受性増加とも関連付け可能でありうるという原則に基づく方法である。１つの態様において、正に淘汰されたヒトＢＲＣＡ１ポリヌクレオチドエクソン１１の突然変異は、乳癌、卵巣癌および／または前立腺癌のリスク上昇と関連しうる。この現象は、多機能ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおける、１つの形質の発展の増進および別の形質の損失または減少の間のトレードオフに相当しうる。この方式で、正に淘汰されたヒトポリヌクレオチドを同定すると、ヒト疾患に対する感受性の候補である遺伝子プールを同定するのに役立ちうる。
【０１７６】
したがって、１つの態様において、本発明は、１以上のヒト疾患に対する感受性増加または抵抗性減少と関連付けられるポリヌクレオチドを同定するためのスクリーニングに有用な候補ポリヌクレオチドのプールを得るための方法を提供する。候補ポリヌクレオチドの同定法は、ヒトポリヌクレオチド配列を、非ヒト霊長類ポリヌクレオチド配列と比較して、ヌクレオチド変化いずれかを同定し、そしてこれらのヌクレオチド変化が進化的に重要であるかどうかを決定することを含む。進化的重要性は、ＫＡ／ＫＳ法を含む、本明細書記載の方法いずれによっても決定可能である。進化的重要性は、定義される長さのポリヌクレオチドに渡る、非サイレントヌクレオチド変化の数を伴うため、本明細書において、「進化的に重要」と称されるのは、ヌクレオチド変化の群を含有するポリヌクレオチドである。すなわち、ポリヌクレオチドの長さ、および定義されるポリヌクレオチド中の他の非サイレントヌクレオチド変化の存在または（非存在）を考慮することなしには、非ヒト霊長類に比較したヒトポリヌクレオチドにおける単一ヌクレオチド変化を、進化的重要性に関して解析することは不能である。したがって、「進化的に重要なポリヌクレオチド」およびその中のヌクレオチド変化に言及する際は、ポリヌクレオチドのサイズは、一般的に約３０〜ポリヌクレオチドまたは遺伝子配列に含まれるヌクレオチドの総数（例えば３，０００〜５，０００ヌクレオチドまで、またはそれ以上）の間であると見なされる。さらに、個々のヌクレオチド変化を、進化的重要性に関して分離して解析することは不能であるが、ポリヌクレオチドの進化的重要性に寄与するヌクレオチド変化を、本明細書において、「進化的に重要なヌクレオチド変化」と称する。
【０１７７】
本発明の方法は、候補ポリヌクレオチドにおける進化的に重要なヌクレオチド変化を、ヒトにおける疾患の発展に対する抵抗性減少と相関させる方法であって、本明細書に記載するように、進化的に重要な候補ポリヌクレオチドを同定し、そして適切なモデル系において、１以上の候補ポリヌクレオチドにおける進化的に重要なヌクレオチド変化（単数または複数）の機能上の効果をさらに解析することを含み、機能上の効果が存在するのであれば、ヒトにおいて、候補ポリヌクレオチドの進化的に重要なヌクレオチド変化、および疾患の発展に対する抵抗性減少の間に相関があることの指標となる、前記方法をさらに含む。本明細書に論じるように、モデル系は、細胞に基づいても、またはｉｎ  ｖｉｖｏでもよい。例えば、進化的に重要なヒトＢＲＣＡ１エクソン１１（またはより少ない進化的に重要なヌクレオチド変化を有するその変型）を、マウスまたは非ヒト霊長類（例えばチンパンジー）にトランスフェクションするか、またはノックアウトゲノム的に挿入して、試験動物において、乳癌、卵巣癌または前立腺癌の機能上の効果を誘導するかどうかを決定することも可能である。こうした試験の結果は、エクソン１１における、特定の進化的に重要な変化が、乳癌、卵巣癌または前立腺癌の発生率増加と関連付けられるかどうかの指標となるであろう。
【０１７８】
疾患の発展に対する関連性に関して、候補ポリヌクレオチドにおける進化的に重要なヌクレオチド変化を評価するのに加えて、本発明はまた、疾患の発展の原因でありうる、アレルまたは突然変異体ポリヌクレオチドなどの、候補ヒトポリヌクレオチドの他のヌクレオチド変化の評価も含む。例えば、進化的に重要なＢＲＣＡ１エクソン１１は、乳癌、卵巣癌または前立腺癌と関連付けられることが見出された、ヒト集団におけるいくつかのアレルまたは突然変異体エクソン１１を有する（Ｒｏｓｅｎ，  Ｅ．Ｍ．ら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １９（４）：３９６−４１２；Ｅｌｉｔ，  Ｌ．ら（２００１）Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  １１（３）：２４１−３；Ｓｈｅｎ，  Ｄ．ら（２０００）Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｍｅｄ．  Ａｓｓｏｃ．  ９２（１）：２９−３５；Ｋｈｏｏ，  Ｕ．Ｓ．ら（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（３２）：４６４３−６；Ｐｒｅｓｎｅａｕ，  Ｎ．ら（１９９８）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０３（３）：３３４−９；Ｄｏｎｇ，  Ｊ．ら（１９９８）Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０３（２）：１５４−６１；およびＸｕ，  Ｃ．Ｆ．ら（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  １８（２）：１０２−１０）。例えば、Ｇｒａｄｅ，  Ｋ．ら（１９９６）Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  １２２（１１）：７０２−６は、１９９６年までに公表された１２７のヒトＢＲＣＡ１突然変異のうち、５５％がエクソン１１に局在することを報告している。ＢＲＣＡ１エクソン１１中の、癌を引き起こす突然変異の多くは、ヒトに主に存在するとは見なされず、そしてしたがって、ＢＲＣＡ１エクソン１１の進化的重要性に寄与するとは見なされない。ヒトにおける１つの形質の発展に関して、強く正に淘汰されるポリヌクレオチドは、疾患の発展と関連付けられる（進化的に重要な、または他の）ヌクレオチド変化のホットスポットであることも可能である。したがって、本発明にしたがって、正に淘汰された候補ポリヌクレオチドを同定すれば、疾患と関連付けられる、対応する突然変異体またはアレルポリヌクレオチドを同定するための、非常に効率的な出発点となる。
【０１７９】
ヒトにおける進化的に重要なポリヌクレオチドの突然変異体またはアレルを、疾患に対する抵抗性減少または感受性増加と相関させることが可能であるかどうかを同定するため、適切なモデル系、例えばＭＣＦ１０ａ正常ヒト上皮細胞株（Ｆａｖｙ，  ＤＡら（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２７４（１）：７３−８）で、変異体ポリヌクレオチドを試験することも可能である。乳癌のこのモデル系は、ＭＣＦ１０ａ正常ヒト乳房上皮細胞株に、突然変異体またはアレルＢＲＣＡ１エクソン１１ポリヌクレオチドをトランスフェクションするかまたはノックアウトゲノム挿入して、突然変異体またはアレルポリヌクレオチド中のヌクレオチド変化が、新生物表現型、すなわち癌細胞株ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１またはＨＢＬ１００（Ｆａｖｙら、上記）に類似の表現型への細胞株の変換を生じるかどうかを決定することを伴うことも可能である。さらに、候補ポリヌクレオチドの突然変異体を、患者遺伝子データに比較して、例えばＢＲＣＡ１エクソン１１突然変異体ヌクレオチド変化が、家族性および／または散発性の乳房腫瘍、卵巣腫瘍および／または前立腺腫瘍に存在するかどうかを決定することも可能である。この方式で、候補の進化的に重要であるヒトポリヌクレオチドにおける突然変異を、機能上の効果、並びにヒトにおける乳癌、卵巣癌および／または前立腺癌の発展への相関に関して、評価することも可能である。
【０１８０】
以下の実施例を提供して、一般の当業者をさらに援助する。こうした実施例は、例示であると意図され、そしてしたがって、本発明を限定すると見なしてはならない。いくつかの典型的な修飾および変動を本出願に記載し、そして他のものは、当業者には明らかとなるであろう。こうした変動は、本明細書に記載され、そして請求されるような、本発明の範囲内に属すると見なされる。
【実施例】
【０１８１】
（実施例１）
ｃＤＮＡライブラリー構築
チンパンジー組織を用いて、チンパンジーｃＤＮＡライブラリーを構築する。組織から総ＲＮＡを抽出し（ＲＮｅａｓｙキット、Ｑｕｉａｇｅｎ；ＲＮアーゼ不含・迅速総ＲＮＡキット、５  Ｐｒｉｍｅ−−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）、そして慣用的な分子クローニング法にしたがって、ＲＮＡの完全性および純度を決定する。ポリＡ＋  ＲＮＡを単離し（ミニ−オリゴ（ｄＴ）セルローススピンカラム、５  Ｐｒｉｍｅ−−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）、そしてプライマーとしてのオリゴ（ｄＴ）とともに、ｃＤＮＡの逆転写のテンプレートとして用いる。商業的に入手可能なキットを用いて、合成したｃＤＮＡをクローニングのために処理し、そして修飾する。次いで、組換え体をパッケージングし、そして宿主細胞株において増殖させる。パッケージング混合物の一部を増幅し、そして残りを増幅前のままにしておく。ライブラリーを標準化して、そしてライブラリー中の独立組換え体の数を決定する。
【０１８２】
（実施例２）
配列比較
候補ヒト遺伝子に基づく適切なプライマーを調製し、そしてｃＤＮＡライブラリーまたはｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡいずれかに由来するチンパンジーｃＤＮＡをＰＣＲ増幅するために用いる。ＡＢＩ３７７などの自動化配列決定装置を用いて、ｃＤＮＡライブラリーから選択したチンパンジーｃＤＮＡクローンを配列決定する。Ｍ１３普遍的プライマーおよび逆方向プライマーなどの、クローニングベクターに対して一般的に用いられるプライマーを用いて、配列決定を行う。末端配列決定では完全には配列決定されない挿入物に関しては、色素標識ターミネーターを用いて、残ったギャップを埋める。
【０１８３】
例えば、チンパンジー配列およびヒト配列間で相違がある点を発見し；配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックして、ヒトにユニークであるようである塩基が、喚起される塩基に特異的な、強く明確なシグナルに対応するかどうかを決定し；ヒトのヒットをチェックして、配列変化に対応する１より多いヒト配列があるかどうかを確認することによって；そして必要に応じて、当該技術分野に知られる他の方法によって、検出された配列相違を、まず、正確さに関してチェックする。異なるチンパンジーヌクレオチドがある位置で、同一のヌクレオチドを有する同一の遺伝子に関するヒト配列エントリーが多数あれば、ヒト配列が正確であり、そしてチンパンジー／ヒトの相違が真実のものであることが独立に裏付けられる。公共のデータベース情報および遺伝暗号を用いて、こうした変化を調べて、これらのＤＮＡ配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じるかどうかを決定する。コードされるタンパク質を直接配列決定することによって、配列を調べることもまた可能である。
【０１８４】
（実施例３）
分子進化解析
比較しようとするチンパンジー配列およびヒト配列を、ＫＡ／ＫＳ解析に供する。この解析では、公共に入手可能なコンピュータプログラム、例えばＬｉ９３およびＩＮＡを用いて、上述のように研究しようとしている各配列に関して、部位あたりの非同義変化の数（ＫＡ）を部位あたりの同義変化の数（ＫＳ）で割った数値を決定する。全長コード領域またはコード領域の部分的セグメントを用いることも可能である。ＫＡ／ＫＳ比がより高ければ、配列が適応進化を経た可能性がより高い。ｔ検定などの確立された統計的方法および利用可能なプログラムを用いて、ＫＡ／ＫＳ値の統計的有意性を決定する。
【０１８５】
高いＫＡ／ＫＳ比の有意性をさらに裏付けるため、研究中の配列を、多数のチンパンジー個体、および他の非ヒト霊長類、例えばゴリラ、オランウータン、ボノボで比較することも可能である。これらの比較は、適応進化的変化が、他の非ヒト霊長類に比較して、ヒト系統にユニークであるかどうかに関して、さらに区別することを可能にする。いくつかの多様なヒト集団の代表から、目的の遺伝子を直接配列決定することによって、配列を調べて、配列が、ヒト種においてどの程度保存されているのか評価することもまた可能である。
【０１８６】
（実施例４）
正に淘汰されたＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の同定
本明細書記載の本発明の方法を用いて、細胞間接着分子ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３が、強く正に淘汰されていることが示されている。ＩＣＡＭ分子は、いくつかの免疫応答相互作用に関与し、そしてＨＩＶに感染したヒトにおいて、ＡＩＤＳへの進行に役割を果たすことが知られる。Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである、ＩＣＡＭタンパク質は、インテグリン白血球関連機能１分子（ＬＦＡ−１）のリガンドである。Ｍａｋｇｏｂａら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８６−８８。ＬＦＡ−１は大部分の白血球表面上で発現されるが、ＩＣＡＭ類は、白血球および他の細胞種両方の表面上で発現される。Ｌａｒｓｏｎら（１９８９）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０８：７０３−７１２。ＩＣＡＭおよびＬＦＡ−１タンパク質は、Ｔ細胞機能、および炎症領域への白血球のターゲティングを含む、いくつかの免疫応答相互作用に関与する。Ｌａｒｓｏｎら（１９８９）。
【０１８７】
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＲＮアーゼ不含・迅速総ＲＮＡキット（５  Ｐｒｉｍｅ−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）いずれかを用いて、霊長類組織（チンパンジーの脳および血液、ゴリラの血液および脾臓、オランウータンの血液）から、または以下のＢリンパ球細胞株：ＣＡＲＬ（チンパンジー）、ＲＯＫ（ゴリラ）、およびＰＵＴＩ（オランウータン）から採取した細胞から、総ＲＮＡを調製した。ミニ−オリゴ（ｄＴ）セルローススピンカラム（５  Ｐｒｉｍｅ−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）を用いて、総ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標））を用い、オリゴｄＴおよび／またはランダムプライミングを用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。公表されたヒト配列から手動で設計したプライマー（濃度＝１００ｎｍｏｌ／μｌ）を用いて、霊長類ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード領域をｃＤＮＡから増幅した。ＩＣＡＭ−１増幅のためのＰＣＲ条件は、９４℃の最初のプレ融解（４分間）、その後、３５周期の９４℃（１５秒間）、５８℃（１分１５秒間）、７２℃（１分１５秒間）、および最後の７２℃の伸長１０分間であった。Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ＧｏＴＭ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、５０μｌ総反応体積中で、ＰＣＲを達成した。ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、アガロースゲルから、適切な大きさの産物を精製した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて、増幅産物の両方の鎖を直接配列決定し、そして３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定装置（ＡＢＩ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）上で解析した。
【０１８８】
ヒト、ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）、およびオランウータン（Ｐｏｎｇｏｐｙｇｍａｅｕｓ）ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード部分を、チンパンジーのものと比較すると、統計的に有意なＫＡ／ＫＳ比が得られた（表２）。ヒトおよびチンパンジーＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード部分は先に公表されており、そしてゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）、およびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ）ＩＣＡＭ−１遺伝子のタンパク質コード部分をそれぞれ、図３および図４に示す。
【０１８９】
この実験のため、Ｌｉのアルゴリズム（１９８５；１９９３）を用いて、成熟タンパク質に関して、対ＫＡ／ＫＳ比を計算した。統計的に有意な比較（ｔ検定で決定）を太字で示す。チンパンジーのＩＣＡＭ−１が正に淘汰されたことを立証するには、ゴリラおよびヒトへの比較で十分であるが、アフリカにおけるゴリラの歴史的範囲を推測すると、ゴリラがＨＩＶ−１ウイルスに曝露された可能性もあることが示唆されるため、オランウータンＩＣＡＭ−１もまた比較した。ＮｏｗａｋおよびＰａｒａｄｉｓｏ（１９８３）Ｗａｌｋｅｒ’ｓ  Ｍａｍｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ（メリーランド州ボルティモア、Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。しかし、オランウータンは常に、東南アジアに限定されており、そしてしたがって進化の時間枠に渡って、ＨＩＶに曝露された可能性は低い（ＮｏｗａｋおよびＰａｒａｄｉｓｏ、１９８３）（ゴリラはヒトおよびチンパンジーに最も近縁であり、一方、オランウータンはより遠い）。
【０１９０】
表２．  ＫＡ／ＫＳ比：ＩＣＡＭ−１全タンパク質比較
【０１９１】
【表２】
2007531493.tif 000005
【０１９２】
正の淘汰が立証されたタンパク質の中でも、これらのＩＣＡＭ−１比較ほど高いＫＡ／ＫＳ比を示すものはほとんどない。ＬｅｅおよびＶａｃｑｕｉｅｒ（１９９２）Ｂｉｏｌ．  Ｂｕｌｌ．  １８２：９７−１０４；ＳｗａｎｓｏｎおよびＶａｃｑｕｉｅｒ（１９９５）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：４９５７−４９６１；ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）；Ｓｈａｒｐ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１１１−１１２。結果は、チンパンジーＩＣＡＭ−１分子において、適応変化を生じる強い選択圧があったことと一致する。
【０１９３】
ＬＦＡ−１に結合するＩＣＡＭ−１分子のドメイン（Ｄ１およびＤ２）が文書化されている。Ｓｔａｕｎｔｏｎら（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６１：２４３−２５４。霊長類ＩＣＡＭ−１遺伝子間の対ＫＡ／ＫＳ比較。Ｌｉのアルゴリズム（１９８５；１９９３）を用いて、Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインのみに関して、ＫＡ／ＫＳ比を計算した（表３）。統計的に有意な比較（ｔ検定で決定）を太字で示す。Ｄ１ドメインおよびＤ２ドメインに関するＫＡ／ＫＳ比が、非常に高く、統計的に有意であることによって、タンパク質のこれらの領域が、非常に強く正に淘汰されたことが示唆される。チンパンジーＩＣＡＭ−１のこれらの領域は、全タンパク質比較で見られるよりも、さらにより著しいＫＡ／ＫＳ比を示し（表３）、したがって、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１相互作用は、異常に強い選択圧にさらされてきたことが示唆される。
【０１９４】
表３．  ＫＡ／ＫＳ比：ＩＣＡＭ−１のドメインＤ１＋Ｄ２
【０１９５】
【表３】
2007531493.tif 000006
【０１９６】
（実施例５）
ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の正に淘汰された配列の性質決定
本発明の方法によって同定された配列を、細胞トランスフェクション実験によって、さらに試験し、そして性質決定することも可能である。例えば、培養中のヒト細胞を、本明細書記載の方法によって同定されたチンパンジーポリヌクレオチド（ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）など；以下を参照されたい）でトランスフェクションすると、当該技術分野において標準的なアッセイを用いて、ウイルス播種および／または増殖の減少に関して試験して、そして対照細胞と比較することも可能である。試験しようとするポリヌクレオチド／ポリペプチドの知覚される機能的性質または見かけの機能的性質に応じて、他の指標を測定することもまた可能である。例えば、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）の場合、合胞体形成を測定して、そして対照（未トランスフェクション）細胞と比較することも可能である。これは、感染細胞における合胞体形成の防止から抵抗性が生じるかどうかを試験するであろう。
【０１９７】
本発明の方法によって同定された配列、およびＨＩＶ−１による細胞間感染に対するその効果を性質決定するのに有用な細胞は、ＨＩＶ−１の感染に関して許容状態であるヒトＴ細胞株であり、例えばＡＴＣＣから入手可能なＨ９細胞株およびＨＵＴ７８細胞株が含まれる。
【０１９８】
細胞トランスフェクションアッセイのため、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡ（または本明細書記載の方法によって同定されるｃＤＮＡいずれか）を適切な発現ベクターにクローニングすることも可能である。最大発現を得るため、クローニングされたＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）コード領域は、ヒトＴ細胞で活性であるプロモーター、例えばＩＬ−２プロモーターに、機能可能であるように連結される。あるいは、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡを、強い恒常性プロモーター、または誘導性プロモーターの転写調節下に置くことも可能である。発現系は当該技術分野に周知であり、発現ベクターを細胞内に導入する方法も同様である。例えば、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡを含む発現ベクターを、ＤＥＡＥ−デキストランによって、またはエレクトロポレーションによって、あるいは他の既知の方法いずれかによって、細胞に導入することも可能である。次いで、クローニングされたＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）分子が、細胞表面上で発現される。ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）ｃＤＮＡが細胞表面上で発現されているかどうかの決定は、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）に特異的な抗体（単数または複数）を用いて達成可能である。ヒトＴ細胞表面上で発現されているチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）の場合は、チンパンジーおよびヒトのＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）を区別する抗体を用いることも可能である。この抗体を蛍光色素などの検出可能標識で標識することも可能である。よく確立された技術を用い、蛍光活性化細胞分取および適切に標識された抗ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）抗体を用いて、表面上にチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）を発現している細胞を検出することも可能である。
【０１９９】
次いで、細胞表面上にチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）を発現しているトランスフェクションヒト細胞を、合胞体形成、および／またはＨＩＶ複製、および／または細胞間感染の指標としての感染した細胞数に関して試験することも可能である。チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞を、適切な用量、例えば組織培養感染用量５０、すなわち細胞の５０％を感染させることが可能な用量のＨＩＶ−１に感染させることも可能である。細胞を、適切な組織培地中、約５ｘ１０５細胞／ｍｌの密度で蒔き、そして感染後、合胞体形成、および／またはウイルス複製、および／または対照の未感染細胞に比較した、感染した細胞数に関して監視することも可能である。チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）でトランスフェクションしていない細胞もまた、対照として役立つ。合胞体形成は、一般的に、感染のほぼ１０日後、ＨＩＶ−１感染細胞（チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）を発現しないもの）で観察される。
【０２００】
ＨＩＶ複製を監視するため、ｐ２４抗原の存在および量に関して、細胞上清をアッセイすることも可能である。ｐ２４を検出するいかなるアッセイ法も使用可能であり、これには、例えばウサギ抗ｐ２４抗体を捕捉抗体として用い、ビオチン化ウサギ抗ｐ２４抗体を検出抗体として利用し、そしてアビジン−西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼを用いてアッセイを発色させる、ＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。感染細胞数を決定するため、間接的免疫蛍光法を含む既知の方法いずれを使用することも可能である。間接的免疫蛍光法において、ヒトＨＩＶ陽性血清を、感染細胞に結合する抗ＨＩＶ抗体の供給源として使用することも可能である。ＦＩＴＣコンジュゲート化抗ヒトＩｇＧを用いて、結合した抗体を検出し、蛍光顕微鏡によって細胞を視覚化して、そして計数することも可能である。
【０２０１】
ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）などの分子の役割を評価する別の方法は、細胞をＨＩＶで連続的に感染させることを伴う。好ましくは内因性ＩＣＡＭを発現しないヒト細胞株（内因性ＩＣＡＭを発現する細胞株もまた、使用可能であるが）をヒトまたはチンパンジーのＩＣＡＭ−１または−２または−３いずれかでトランスフェクションする。１組の実験では、ＨＩＶに感染したヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞の上清からＨＩＶを収集し、そしてこれを用いて、チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞またはヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞を感染させる。上述のように測定する最初の感染性は、チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞およびヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞どちらでも、高いと予期されるであろう。チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）が抵抗性を与えるのであれば、数回の複製周期後、チンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞で、細胞間感染性が減少すると予期されるであろう。第二の組の実験では、ＨＩＶに感染したチンパンジーＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞の上清からＨＩＶを収集し、そしてこれを用いて、ヒトＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）発現細胞を感染させる。この場合、ＩＣＡＭ−１（またはＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３）がＨＩＶ進行に対する感受性に関与しているならば、最初の感染性は、第一の組の実験よりもはるかに低いと予期される。数回の複製周期後、細胞間感染性は増加すると予期されるであろう。
【０２０２】
ＡＩＤＳ感受性または抵抗性を与えるか、またはそれに寄与するのに関与しうる候補ヒト遺伝子のデータベースを確立する際に、同定されたヒト配列を用いることも可能である。さらに、データベースは、候補遺伝子の順序だったコレクションを提供するだけでなく、ヒトおよびＡＩＤＳ抵抗性非ヒト霊長類（チンパンジーなど）の間に存在する正確な分子配列相違も提供し、そしてしたがって、機能的相違の根底にある変化を定義する。
【０２０３】
（実施例６）
ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３の分子モデリング
ＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−３の三次元構造をモデリングすることによって、ＡＩＤＳ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明する際のこれらのタンパク質の役割のさらなる証拠が提供されている。
【０２０４】
ＩＣＡＭ−１の場合、チンパンジー系統にユニークである６つのアミノ酸置換のうち、５つは、ＬＦＡ−１結合に非常に重要であることが突然変異誘発研究によって同定されているアミノ酸に、すぐ隣接する（すなわち物理的に接触する）。これらの５つのアミノ酸置換は、ヒトＬ１８からチンパンジーＱ１８、ヒトＫ２９からチンパンジーＤ２９、ヒトＰ４５からチンパンジーＧ４５、ヒトＲ４９からチンパンジーＷ４９、およびヒトＥ１７１からチンパンジーＱ１７１である。この配置は、一次構造（すなわちアミノ酸の実際の配列）からは予測不能である。チンパンジーＩＣＡＭ−１タンパク質において、結合に非常に重要なアミノ酸残基はいずれも変化していない。
【０２０５】
こうした配置から、チンパンジーＩＣＡＭ−１タンパク質の基礎的な役割が、ヒトおよびチンパンジー間で不変である；が、進化によって、チンパンジーにＡＩＤＳの進行に対する抵抗性を与えるのを補助しうる微調整された変化が念入りに作られたことが強く主張される。療法介入のための剤を開発するため、三次元構造情報の利用が可能になるように、アミノ酸置換の性質が調べられている。著しいことに、５つのチンパンジー残基のうちの４つが、Ｎ連結グリコシル化部位と同定されている、非常に重要な結合残基に隣接している。これによって、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−１の（ＬＦＡ−１に対する）結合定数には、相違が存在することが示唆される。これらの結合定数を決定しているところである。チンパンジーＩＣＡＭ−１で結合定数が低いことが立証されれば、ＨＩＶに感染したヒトのための潜在的な療法戦略として、結合定数の変化を（立体障害によって）模倣する小分子剤を考案することが可能である。同様に、チンパンジーＩＣＡＭ−１でより強い結合定数が観察されたならば、ＨＩＶ−１に感染したヒトのための療法介入を発展させる、別の戦略が示唆されるであろう。
【０２０６】
ＩＣＡＭ−３の場合、モデリング研究から、プロリン（７人のヒトで観察される）からグルタミン（３頭のチンパンジーで観察される）への非常に重要なアミノ酸残基置換が、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−３のドメイン２およびドメイン３の間の配置角度を有意に変化させると予測される。ヒトタンパク質は、この接合部で鋭角を示す。Ｋｌｉｃｋｓｔｅｉｎら，  １９９６  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７：２３９  ２０−２７。この鋭角（屈曲）がなくなると、チンパンジーＩＣＡＭ−３がＨＩＶ−１ビリオンにパッケージングされるのがより容易でなくなると予測される（感染したヒトでは、ＩＣＡＭ類がＨＩＶビリオンにパッケージングされた後、細胞間感染が劇的に増加する。Ｂａｒｂｅａｕ，  Ｂ．ら，  １９９８  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：７１２５−７１３６）。チンパンジーＩＣＡＭ−３がＨＩＶビリオンに容易にパッケージングされず、次いで、これが感染したヒトで見られる細胞間感染性の増加を防止することも可能である。次いで、これがＡＩＤＳ進行に対するチンパンジー抵抗性の主な原因となるであろう。
【０２０７】
適切に設計した小分子が、ヒトプロリン残基に結合して、（立体障害の結果として）ヒトＩＣＡＭ−１タンパク質がチンパンジーＩＣＡＭ−３のより大きい（すなわちより鋭角でない）角度を模倣するようにする、小分子療法介入が可能である。非常に重要な結合残基が２つのタンパク質間で保存される（そしてヒトおよびチンパンジー間の免疫応答が一般的に似ている）ことから、この角度の改変は、ヒトＩＣＡＭ−３の基本的な機能を損なわないと主張される。しかし、ヒトＩＣＡＭ−３タンパク質は、ＨＩＶビリオンへのパッケージングに対して抵抗性を与えられ、したがって、感染したチンパンジーがＡＩＤＳへの進行に抵抗すると仮定される経路を（ＨＩＶに感染したヒトにおいて）模倣するようになるであろう。
【０２０８】
本質的に同じ方法を用いて、正に淘汰されたチンパンジーＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３が同定された（表４を参照されたい）。ＩＣＡＭ−１のリガンド結合ドメインが、特に著しい正の淘汰を示すものとして位置決定され、これはＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の正の淘汰がタンパク質全体でアミノ酸置換を生じたのとは対照的である。したがって、この比較ゲノム解析によって、チンパンジーにおけるＩＣＡＭに対する正の淘汰は、例えば重要な結合ドメインにおいて、タンパク質の一次構造を改変したことが明らかになる。これらの改変は、チンパンジーに、ＡＩＤＳ進行に対する抵抗性を与えた可能性もある。
【０２０９】
表４．  ＫＡ／ＫＳ比：ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３の全タンパク質比較
【０２１０】
【表４】
2007531493.tif 000007
【０２１１】
ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＩＣＡＭ−３の結合は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＩＶ感染細胞において、合胞体（すなわち巨大な多核細胞）の形成に必須の役割を果たすことが立証されてきた。Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９１）Ｊ．  Ｅｘ．  Ｍｅｄ．  １７３：５１１−５１４。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、合胞体形成に続いて、ＣＤ＋細胞の枯渇が起こる。Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９１）；Ｌｅｖｙ（１９９３）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５７：１８３−１８９；Ｂｕｔｉｎｉら（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：２１９１−２１９５；ＦｉｎｋｅｌおよびＢａｎｄａ（１９９４）Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：６０５−６１５。合胞体形成は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの検出が困難であるが、感染した個体のリンパ節では、感染細胞クラスターが見られる。Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９３）Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２８：３２７−３３５；ＦｉｎｋｅｌおよびＢａｎｄａ（１９９４）；Ｅｍｂｒｅｔｓｏｎら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３５９−３６２；Ｐａｎｔａｌｅｏら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：３５５−３５８。合胞体は単に、あまりにも迅速に体から取り除かれていて検出されない可能性もある。Ｆｏｕｃｈｉｅｒら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１９：８７−９５。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、合胞体が仲介するＣＤ４＋細胞の欠失が起こると推測され、これが免疫系無防備状態に直接寄与し、日和見感染および十分に発展したＡＩＤＳを導く可能性もある。Ｓｏｄｒｏｓｋｙら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：４７０−４７４；ＨｉｌｄｒｅｔｈおよびＯｒｅｎｔａｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０７５−１０７８；ＦｉｎｋｅｌおよびＢａｎｄａ（１９９４）。したがって、チンパンジーＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３の非常に重要な変化が、チンパンジーにおいて合胞体形成を抑止し、そしてＡＩＤＳ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明するのを補助しうる。ＩＣＡＭ類は多機能の性質を持つため、ＩＣＡＭ遺伝子中のこれらの正に淘汰された変化は、他の感染性疾患に対する抵抗性をさらに与えることも可能であるし、または他の炎症プロセスに役割を果たすことも可能であり、これが、ヒト療法剤の発展にもまた有用である可能性もある。ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、およびＩＣＡＭ−３のポリペプチド配列並列を、それぞれ、図５、図６、および図７に示す。
【０２１２】
（実施例７）
ＭＩＰ−１αの正の淘汰の同定
ＭＩＰ−１αは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト細胞において、ＨＩＶ−１複製を抑制することが示されたケモカインである（Ｃｏｃｃｈｉ，  Ｆ．ら，  １９９５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：１８１１−１８１５）。ヒトＭＩＰ−１α遺伝子のチンパンジー相同体をＰＣＲ増幅し、そして配列決定した。ＫＡ／ＫＳ比（２．１、ｐ＜０．０５）を計算し、そしてゴリラ相同体に比較することによって、チンパンジー遺伝子が正に淘汰されたことが明らかになる。本明細書に論じる他の遺伝子同様、療法介入にチンパンジータンパク質をどのように利用するかを決定するため、チンパンジーアミノ酸置換の性質を調べているところである。
【０２１３】
（実施例８）
１７−β−ヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼの正の淘汰の同定
本発明の方法を用いて、ヒト相同体（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ８７１７６）に比較した際、正に淘汰されている（ＫＡ／ＫＳ＝１．６）、脳で発現されるチンパンジー遺伝子が同定された。このヒト遺伝子、１７−βヒドロキシステロイド・デヒドロゲナーゼＩＶ型は、２つの最も強力なエストロゲン、β−エストラジオール、および５−ジオールを分解することが知られるタンパク質をコードする（Ａｄａｍｓｋｉ，  Ｊ．ら  １９９５  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３１１：４３７−４４３）。エストロゲンに関連する癌（例えば乳癌および前立腺癌を含む）は、ヒト癌のほぼ４０％を占める。興味深いことに、文献の報告によって、チンパンジーが腫瘍形成、特にエストロゲンに関連するものに抵抗性であることが示唆されている。このタンパク質は、チンパンジーで正に淘汰されて、エストロゲンのより効率的な分解を可能にし、したがって、チンパンジーに、こうした癌に対する抵抗性を与えた可能性もある。そうであるならば、チンパンジータンパク質で観察される特定のアミノ酸置換は、ヒト癌における療法介入に重要な情報を供給することも可能である。
【０２１４】
（実施例９）
チンパンジー脳組織のｃＤＮＡライブラリー構築
チンパンジー脳組織を用いて、チンパンジー脳ｃＤＮＡライブラリーを構築する。チンパンジー脳組織は、この研究のために動物を殺す必要がないように、自然死の後に得ることも可能である。しかし、脳で発現される、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ｍＲＮＡを得る機会を増加させるため、動物の死後、できるだけ速やかに脳を得る。好ましくは、動物の体重および年齢を死亡前に決定する。ｃＤＮＡライブラリーの構築に用いる脳組織は、全脳で発現されるｍＲＮＡの包含を最大限にするため、好ましくは全脳である。標準的外科手法にしたがって、動物から脳組織を切開する。
【０２１５】
脳組織から総ＲＮＡを抽出し、そして慣用的な分子クローニング法にしたがって、ＲＮＡの完全性および純度を決定する。ポリＡ＋  ＲＮＡを選択し、そしてプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）を用いたｃＤＮＡ逆転写のテンプレートとして用いる。商業的に入手可能なキットを用いて、合成したｃＤＮＡをクローニング用に処理し、そして修飾する。次いで、組換え体をパッケージングし、そして宿主細胞株で増殖させる。パッケージング混合物の一部を増幅し、そして残りを増幅前のままにしておく。ライブラリーを標準化して、そしてライブラリー中の独立組換え体の数を決定する。
【０２１６】
（実施例１０）
チンパンジーおよびヒトの脳ｃＤＮＡの配列比較
ＡＢＩ３７７などの自動化配列決定装置を用いて、ｃＤＮＡライブラリーからランダムに選択したチンパンジー脳ｃＤＮＡクローンを配列決定する。Ｍ１３普遍的プライマーおよび逆方向プライマーなどの、クローニングベクターに対して一般的に用いられるプライマーを用いて、配列決定を行う。末端配列決定では完全には配列決定されない挿入物に関しては、色素標識ターミネーターを用いて、残ったギャップを埋める。
【０２１７】
データベース検索、例えばＢＬＡＳＴ検索を通じて、生じたチンパンジー配列を、ヒト配列に比較する。高スコアの「ヒット」、すなわちＢＬＡＳＴ解析後に有意な（例えば＞８０％の）類似性を示す配列を回収し、そして解析する。次いで、Ｈｉｇｇｉｎｓらに開発された、並列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ  Ｖを用いて、２つの相同配列を並列させる。並列によって、ヌクレオチド置換、挿入および欠失を含む、いかなる配列多様性も検出し、そして記録することも可能である。
【０２１８】
チンパンジー配列およびヒト配列間で相違がある点を発見し；配列フルオログラム（クロマトグラム）をチェックして、ヒトにユニークであるようである塩基が、喚起される塩基に特異的な、強く明確なシグナルに対応するかどうかを決定し；ヒトのヒットをチェックして、配列変化に対応する１より多いヒト配列があるかどうかを確認することによって；そして必要に応じて、当該技術分野に知られる他の方法によって、検出された配列相違を、まず、正確さに関してチェックする。異なるチンパンジーヌクレオチドがある位置で、同一のヌクレオチドを有する同一の遺伝子に関するヒト配列エントリーが多数あれば、ヒト配列が正確であり、そしてチンパンジー／ヒトの相違が真実のものであることが独立に裏付けられる。公共のデータベース情報および遺伝暗号を用いて、こうした変化を調べて、これらのＤＮＡ配列変化が、コードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化を生じるかどうかを決定する。コードされるタンパク質を直接配列決定することによって、配列を調べることもまた可能である。
【０２１９】
（実施例１１）
他の霊長類に比較したヒト脳配列の分子進化解析
比較しようとするチンパンジー配列およびヒト配列を、ＫＡ／ＫＳ解析に供する。この解析では、公共に入手可能なコンピュータプログラム、例えばＬｉ９３およびＩＮＡを用いて、上述のように研究しようとしている各配列に関して、部位あたりの非同義変化の数（ＫＡ）を部位あたりの同義変化の数（ＫＳ）で割った数値を決定する。この比、ＫＡ／ＫＳは、適応進化、すなわち正の淘汰が、研究中の配列で働いている度合いを反映することが示されている。典型的には、これらの比較解析には、全長コード領域が用いられてきている。しかし、コード領域の部分的セグメントもまた、有効に使用可能である。ＫＡ／ＫＳ比がより高ければ、配列が適応進化を経た可能性がより高い。ｔ検定などの確立された統計的方法および利用可能なプログラムを用いて、ＫＡ／ＫＳ値の統計的有意性を決定する。チンパンジーおよびヒトの遺伝子間で、統計的に高いＫＡ／ＫＳ比を示す遺伝子は、適応進化を経ている可能性が非常に高い。
【０２２０】
高いＫＡ／ＫＳ比の有意性をさらに裏付けるため、研究中の配列を、他の非ヒト霊長類、例えばゴリラ、オランウータン、ボノボで比較することも可能である。これらの比較は、適応進化的変化が、他の非ヒト霊長類に比較して、ヒト系統にユニークであるかどうかに関して、さらに区別することを可能にする。いくつかの多様なヒト集団の代表から、目的の遺伝子を直接配列決定することによって、配列を調べて、配列が、ヒト種においてどの程度保存されているのか評価することもまた可能である。
【０２２１】
（実施例１２）
選択したヒト脳配列のさらなる配列性質決定
分子特性および遺伝子特性とともに、生物学的機能に関して、進化的に重要な変化を含有するヒト脳ヌクレオチド配列をさらに性質決定する。同定されたコード配列をプローブとして用いて、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｍＲＮＡハイブリダイゼーションを行い、配列が発現されるのはどの組織および細胞種であるか、そして発生経過中または細胞周期中、いつこれらが発現されるかに関してのいずれかまたは両方で、遺伝子の発現パターンを明らかにする。脳で発現される配列は、重要なヒト脳機能と関連付けられる候補としてより優れている可能性もある。さらに、配列がどの機能種に属するかを決定するため、同定された配列を含むと推定される遺伝子を、相同体検索に供する。
【０２２２】
さらに、いくつかのタンパク質に関して、同定されたヒト配列変化は、変化の機能上の結果を推定するのに有用でありうる。こうした基準を用いることによって、候補遺伝子のデータベースを生成することも可能である。遺伝子が、チンパンジーまたは他の非ヒト霊長類に比較して、ヒト脳で見られるユニークなまたは増進された能力、例えば高容量の情報プロセシング、保存能および検索能、言語能とともに他のものの原因である見込みに応じて、候補をランク付けする。この方式で、このアプローチは、こうした遺伝子を同定可能な新規戦略を提供する。最後に、データベースは、候補遺伝子の順序だったコレクションを提供するだけでなく、ヒトおよびチンパンジー（および他の非ヒト霊長類）間に存在する正確な分子配列相違も提供し、そしてしたがって機能的相違の根底にある変化も定義する。
【０２２３】
いくつかの場合、限定されるわけではないが、長期増強（ＬＴＰ）の指標などのｉｎ  ｖｉｔｒｏ解析、およびトランスジェニック動物または他の適切なモデル系の使用を含む、適切なモデル系において、機能的相違を評価する。これらは、当業者には直ちに明らかであろう。
【０２２４】
（実施例１３）
ヒトチロシンキナーゼ遺伝子における正の淘汰の同定
本発明の方法を用いて、ゴリラ相同体と比較した際、正に淘汰されている、脳で発現されるヒト遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ０１４５４１）が同定された。チロシンキナーゼをコードするこの遺伝子は、よく性質決定されているマウス遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ０１１９０８）に相同であり、ＡＡＴＹＫと称されるこの遺伝子の産物は、アポトーシスを誘発することが知られる（Ｇａｏｚｚａ，  Ｅ．ら  １９９７  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １５：３１２７−３１３５）。該文献は、発生中のマウス脳において、アポトーシス（したがって、実質的に、発生中の脳の「スカルプティング」）を調節すると示唆している。脳発生中に生じる、ＡＡＴＹＫが誘導するアポトーシスは、正常な脳発生に必要であることが立証されている。
【０２２５】
網膜変性、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病および遺伝性小児期運動ニューロンの疾患である脊髄性筋萎縮症を含む、ヒト神経変性疾患の病理に、不適切なアポトーシスが寄与するという証拠が増えつつある。一方、神経芽細胞腫および髄芽細胞腫細胞などの神経腫瘍細胞では、アポトーシス経路が無効にされ、そしてアポトーシスを誘導することによって癌細胞を殺す化学療法薬剤に、細胞が抵抗性となっている。アポトーシス経路およびアポトーシス遺伝子の機能をさらに理解すると、これらの状態がよりよく理解され、そしてこうした状態の診断において、ＡＡＴＹＫＩを使用することが可能になるはずである。
【０２２６】
正に淘汰されたヒトおよびチンパンジーのＡＡＴＹＫは、疾患進行に関連する別の適応変化を構成しうる。ヒトおよびチンパンジーのＡＡＴＹＫの三次元構造を解析すると、ヒトＡＡＴＴＫの正常な機能のいずれも破壊することなく、望ましい方式で、ＡＡＴＹＫの機能を調節する薬剤を設計することが可能となりうる。
【０２２７】
マウスＡＡＴＹＫが活性非受容体細胞質ゾルキナーゼであり、ヒト・アドレナリン作用性神経芽細胞腫（ＮＢ）：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において、ニューロン分化を誘導することが立証されてきている。ＡＡＴＹＫはまた、全トランス・レチノイン酸（ＲＡ）、１２−Ｏ−テトラデカノイル・ホルボール１３−アセテート（ＴＰＡ）およびＩＧＦ−Ｉを含む他の剤に誘導される分化も促進する。Ｒａｇｈｕｎａｔｈら，  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．（２０００）７７：１５１−６２。ラットを用いた実験において、嗅球、前脳、皮質、中脳、小脳および脳橋を含めて、ニューロンが存在する成体ラット脳の実質的にすべての領域で、ＡＡＴＹＫタンパク質が発現されることが見出された。成体脳切片の免疫組織化学標識によって、小脳および嗅球で最高レベルのＡＡＴＹＫ発現があることが示された。ＡＡＴＹＫの発現はまた、レチノイン酸が誘導するｐ１９胚性癌腫細胞のニューロン分化に応じてもまた上方制御され、このタンパク質が、成熟ニューロンおよびニューロン分化において、役割を果たすことが裏付けられた。Ｂａｋｅｒら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０：１０１５−２１。Ｎｉｃｏｌｉｎｉら，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（１９９８）１８：２４７７−８１は、レチノイン酸（ＲＡ）で分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞が、ニューロン分化を誘導するために一般的に用いられる神経栄養因子の入り組んだ効果を伴わずに、化学療法薬剤の神経毒性を試験するのに適切でそして信頼しうるモデルであることを示した。神経毒性効果および変化の経過は、臨床実施およびｉｎ  ｖｉｖｏ実験モデルにおいて観察されるものと同様である。したがって、このモデルは、化学療法薬剤の神経毒性を、そして神経保護分子および神経保護薬剤のありうる効果を試験するスクリーニング法として提唱される。同様に、化学療法薬剤を、そして神経保護分子および神経保護薬剤のありうる副作用をスクリーニングするモデルとして、ＡＡＴＹＫで分化したＳＹＳＹ−５Ｙ細胞を使用することもまた、可能である。
【０２２８】
ＡＡＴＹＫ  ｍＲＮＡが、成体マウス脳全体のニューロンで発現されることもまた示されてきている。ＡＡＴＹＫは、チロシンキナーゼ活性を所持し、そして２９３細胞で発現させると、自己リン酸化された。ＡＡＴＹＫ  ｍＲＮＡ発現は、ＫＣｌに誘導されたアポトーシス中、培養マウス小脳顆粒細胞において、迅速に誘導された。野生型ＡＡＴＹＫタンパク質を過剰発現しているアポトーシス性顆粒細胞の数は、チロシンキナーゼ活性を欠く突然変異体ＡＡＴＹＫを過剰発現しているアポトーシス性顆粒細胞の数よりも、有意に多かった。これらの知見によって、ＡＡＴＹＫは、チロシンキナーゼ活性を通じて、成熟ニューロンのアポトーシスにもまた、関与していることが示唆される。Ｔｏｍｏｍｕｒａら，  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００１）２０（９）：１０２２−３２。
【０２２９】
ＡＡＴＹＫタンパク質のチロシンキナーゼドメインは、マウス、チンパンジー、およびヒトの間で、非常に保存されている（大部分のチロシンキナーゼ同様）。しかし興味深いことに、シグナル伝達タンパク質が結合するタンパク質の領域は、ヒトにおいて正に淘汰されているが、チンパンジーおよびマウス両方で強く保存されている。シグナル伝達タンパク質が結合するヒトタンパク質の領域は、点ヌクレオチド突然変異の結果として正に淘汰されているだけでなく、さらに、マウスおよびチンパンジーでは単一コピーとしてしか存在しない、いくつかのｓｒｃ相同２（ＳＨ２）結合ドメインの重複を示す。これによって、異なる組のシグナル伝達タンパク質が、ヒトタンパク質に結合することも可能であり、これが次いで、マウスおよびチンパンジーのものと比較して異なる、発生中のヒトの脳におけるアポトーシスの経路を誘発している可能性もあることが示唆される。こうした遺伝子は、したがって、ユニークなまたは増進されたヒト認知能に寄与している可能性もある。ヒトＡＡＴＹＫは、染色体１７の２５．３領域にマッピングされている。Ｓｅｋｉら，  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（１９９９）４４：１４１−２。
【０２３０】
ハイスループット配列決定プロジェクトの一部として、ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００配列決定装置（ＡＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で、チンパンジーＤＮＡが配列決定された。ＧｅｎＢａｎｋデータベースのＢＬＡＳＴ検索において、ＤＮＡ配列をクエリー配列として用いた。ｓｔｃｈ８５６およびｓｔｃｈ６１０と称する２つのランダムチンパンジー配列が、ＧｅｎＢａｎｋの非冗長データベース中の２つの遺伝子：図１４Ａに示す、ＮＭ＿００４９２０（ヒトアポトーシス関連チロシンキナーゼ、ＡＡＴＹＫ）およびＡＢ０１４５４１（ヒトＫＩＡＡ６４１、ＮＭ＿００４９２０と同一ヌクレオチド配列）に関する結果を戻し、そしてまた、該チンパンジー配列はこれらのヒト配列に比較して高いＫＡ／ＫＳ比も示した。ＡＡＴＹＫのＰＣＲおよび配列決定のためのプライマーを設計した。チンパンジーおよびゴリラにおいて、この遺伝子の３’端の配列を得た。該遺伝子の５’端は、増幅が困難であり、そしてヒトおよびゴリラで、配列はまったく確認されなかった。ヒトＡＡＴＹＫ遺伝子（配列番号１４）は、３６２４ｂｐ（配列番号１４のヌクレオチド４１３〜４０３６）のコード領域を有し、そして１２０７アミノ酸（配列番号１６）のタンパク質をコードする。チンパンジーおよびゴリラ両方において、１８０９ｂｐを配列決定した。図１５Ａおよび１５Ｂを参照されたい。部分的配列（配列番号１７および配列番号１８）は、３’端の停止コドンに非常に近かった（２１コドン離れている）が、開始コドンまたは停止コドンを含まなかった。これらの配列は、以下に記載するギャップを考慮すると、対応するヒト配列のヌクレオチド２１７０〜３９７６または２１７９〜３９８８に対応する。
【０２３１】
コード領域には、チンパンジー、ヒトおよびゴリラ間で、アミノ酸挿入／欠失のいくつかの対もまたあった。以下の配列が読み枠中にある：
【０２３２】
【化２】
2007531493.tif 000008
【０２３３】
これらの挿入／欠失は、２つのアミノ酸に影響を及ぼし、そして配列の読み枠を変化させなかった。上記挿入／欠失領域を除く、チンパンジー対ヒト、チンパンジー対ゴリラ、およびヒト対ゴリラのスライディング・ウィンドウＫＡ／ＫＳは、いくつかの領域に関して、高いＫａ／Ｋｓ比を示した。表９を参照されたい。
【０２３４】
最高のＫａ／Ｋｓ比は、ヒト対ゴリラおよびチンパンジー対ゴリラであり、ヒトおよびチンパンジーの遺伝子がどちらも淘汰を経て、そして他の大型類人猿（例えばゴリラ）に比較して、この２種が、ある程度増進した認知能を共有するという考えと一致する。こうしたデータは、この遺伝子が、増進された認知機能に関する役割を果たしうるという見方を増強する。一般的に、ヒト含有対比較は、同様のチンパンジー含有比較より高いことにもまた、注目すべきである。
【０２３５】
表９．  チンパンジー、ヒト、およびゴリラのＡＡＴＹＫの多様なウィンドウに関するＫＡ／ＫＳ比
【０２３６】
【表５】
2007531493.tif 000009
【０２３７】
（実施例１４）
正に淘汰されたヒトＢＲＣＡ１遺伝子
いくつかの霊長類種のＢＲＣＡ１遺伝子を比較進化的に解析することによって、ヒトＢＲＣＡ１遺伝子が、正の淘汰にさらされていたことが明らかになった。まず、ヒトおよびチンパンジーのＢＲＣＡ１遺伝子のエクソン１１の１１４１コドン（Ｈａｃｉａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：１５５−１５８）を比較し、そしてＬｉの方法（Ｌｉ（１９９３）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：９６−９９；Ｌｉら（１９８５）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２：１５０−１７４）によって計算した際、著しく高いＫＡ／ＫＳ比、３．６が見出された。実際、用いた特定のアルゴリズムとは関わりなく、この比較に関して、統計的に有意な上昇した比が観察された（表５Ａを参照されたい）。この度合いの比を示すことが立証された遺伝子（または遺伝子の部分）はほとんどない（Ｍｅｓｓｉｅｒら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４；Ｅｎｄｏら（１９９６）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  １３：６８５−６９０；およびＳｈａｒｐ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１１１−１１２）。したがって、我々は、ヒト遺伝子の全長タンパク質コード配列と比較するため、チンパンジーＢＲＣＡ１遺伝子の完全タンパク質コード領域（５５８９ｂｐ）を配列決定することにした。正の淘汰が特定の遺伝子の限定される領域に対して作動したことが示されうる場合であっても、多くの場合で、全長タンパク質コード配列のＫＡ／ＫＳ解析は、正の淘汰の証拠を明らかにできない（Ｍｅｓｓｉｅｒら（１９９７）、上記）。これはおそらく、遺伝子の小さい領域のみが正に淘汰されている場合には、選択圧が特に強くない限り、正の淘汰のシグナルが、ノイズによって隠されうるためであろう。しかし、全長ヒトおよびチンパンジーのＢＲＣＡ１配列の比較はなお、使用したすべてのアルゴリズムで、１を超えるＫＡ／ＫＳ比を生じた（表５Ａ）。これによって、ＢＲＣＡ１に対する選択圧が非常に強かったことが示唆される。ヒトＢＲＣＡ１遺伝子内の淘汰のパターンを決定するため、多様な長さの間隔（１５０〜６００ｂｐ）を調べる、スライディング・ウィンドウＫＡ／ＫＳ解析もまた行った。この解析によって、正の淘汰は、エクソン１１に集中していることが示唆される。
【０２３８】
表５Ａ．  ヒト−チンパンジーのＫＡ／ＫＳ比較
【０２３９】
【表６】
2007531493.tif 000010
【０２４０】
表５Ｂ．  さらなる霊長類由来のＢＲＣＡ１のエクソン１１に関するＫＡ／ＫＳ
【０２４１】
【表７】
2007531493.tif 000011
【０２４２】
Ｌｉ（１９９３）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ３６：９６；Ｌｉら（１９８５）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ２：１５０にしたがって、表５Ｂの比を計算した。すべての比較のため、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：３７０８に示唆されるように、ｔ検定によって、統計的有意性を計算した。統計的に有意な比較を１以上のアスタリスクによって示し、Ｐ値は以下の通りである：＊、ｐ＜０．０５、＊＊、ｐ＜０．０１、＊＊＊、ｐ＜０．００５。エクソン配列はＨａｃｉａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８：１５５由来である。ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号：ヒト、ＮＭ＿００００５８．１、チンパンジー、ＡＦ０１９０７５、ゴリラ、ＡＦ０１９０７６、オランウータン、ＡＦ０１９０７７、アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ）、ＡＦ０１９０７８。
【０２４３】
ヒトおよびチンパンジーのＢＲＣＡ１配列の対比較によって明らかになった、ＫＡ／ＫＳ比の上昇によって、正の淘汰の作用が立証されるが、こうした変化のみでは、比較した２つの遺伝子、ヒトまたはチンパンジーのいずれが正に淘汰されたのかわからない。しかし、霊長類ＢＲＣＡ１配列を適切な系統学的枠組みで考慮すると、ヒト遺伝子を含む対比較のみが、１より大きい比を示し、ヒト遺伝子のみが正に淘汰されていることが示される（表５Ｂ）。ＢＲＣＡ１のエクソン１１に対して正の淘汰が作動したことを確認するため、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：３７０８−３７１３によって提唱される正の淘汰の統計的検定を用いた。この検定は、この場合（３４２３ｂｐ）のように、ヌクレオチドの数が大きい場合は、特に適切である。この方法はまず、系統樹の個々の分岐に関して、非同義部位あたりの非同義ヌクレオチド置換（ｂＮ）および同義部位あたりの同義置換（ｂＳ）を決定する（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、上記）。正の淘汰は、ｂＮ−ｂＳが統計的に有意であることが示されうる分岐に対してのみ、裏付けられる（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、上記）。ＢＲＣＡ１に関しては、これは、図９に示す霊長類樹の１つの分岐に関してのみ当てはまり：この分岐は、ヒト／チンパンジーの共通の祖先から、現代のヒトにつながるものであり、ｂＮ／ｂＳ＝３．６であった。したがって、ＢＲＣＡ１遺伝子の場合、正の淘汰は、ヒト系統に直接そしてこの系統にのみ作動したと考えられる。
【０２４４】
形式上は、上昇したＫＡ／ＫＳ比が、正の淘汰の影響ではなく、何らかの遺伝子座または染色体特異的変型（例えばＧＣ含量の等容積（ｉｓｏｃｈｏｒｉｃ）相違による、ＫＳの抑制など）を反映することもありうるが、これは、この場合には、いくつかの理由のため、ありそうでない。まず、ヒトを含むヒト科ＢＲＣＡ１遺伝子に関して概算されるＫＳ値を、リゾチーム（Ｍｅｓｓｉｅｒら（１９９７）、上記）およびＥＣＰ（Ｚｈａｎｇら（１９９８）、上記）を含めて、他のよく研究されているヒト科遺伝子座に関して先に概算されたものと比較した。これらの値には、統計的に有意な相違の証拠はない。これによって、ヒトＢＲＣＡ１中のＫＳに何らかの異常な抑制があることには異議が唱えられる。次に、霊長類ＢＲＣＡ１遺伝子のＧＣ含量（Ｓｕｅｏｋａ，  Ｎ．  Ｅｖｏｌｖｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ中（Ｂｒｙｓｏｎ，  Ｖ．  ＆  Ｖｏｇｅｌ，  Ｈ．Ｊ．監修）４７９−４９６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９６４））およびコドン使用パターン（Ｓｈａｒｐら（１９８８）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：８２０７−８２１１）を調べても、平均的な哺乳動物の値と有意な相違が示されない。
【０２４５】
ヒトＢＲＣＡ１遺伝子に対して強い正の淘汰が存在することがこのように立証され、人類学者がはるかに前進している理論を、初めて分子的に裏付けたことになる。ヒト乳児は、出生後、長期間の世話を必要とし、そして受ける。これは我々に近縁の霊長類いずれよりも長い。Ｓｈｏｒｔ，  Ｒ．Ｖ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  Ｂ  １９５：３−２４は、ヒト女性が、補助を提供する男性パートナーとの長期の一雌一雄関係の背景でのみ、ヒト乳児へのこうした長期間の世話を提供しうると、最初に推測した。長期の一雌一雄関係の維持は、大きくなった女性乳房を含む、（近縁霊長類と比較した際に）強調されたヒト二次性徴の発展によって、さらに強化された（Ｓｈｏｒｔ（１９７６）、上記）。したがって、強い選択圧の結果、ヒト科近縁種で見られるパターンとは対照的に、最初の妊娠および授乳前に発達する、大きくなったヒト乳房の発達が生じた（Ｄｉｘｓｏｎ，  Ａ．Ｆ．  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｓｅｘｕａｌｉｔｙ：Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｉｍｉａｎｓ，  Ｍｏｎｋｅｙｓ，  Ａｐｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｉｎｇｓ．中  ２１４（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ，  オックスフォード，  １９９８））。
【０２４６】
証拠によって、腫瘍抑制因子（Ｘｕら（１９９９）Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ３（３）：３８９−３９５；Ｓｈｅｎら（１９９８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １７（２４）：３１１５−３１２４；Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｃ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２：１０；およびＸｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２：３７−４３）としての機能に加えて、ＢＲＣＡ１タンパク質が、乳房組織の正常な発達（Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｃ．（１９９９）、上記；Ｘｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２：３７−４３；およびＴｈｏｍｐｓｏｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ９：４４４−４５０）、特に典型的な乳腺および管サイズの獲得（Ｄｅｎｎｉｓ，  Ｃ．（１９９９）、上記；およびＸｕら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２２：３７−４３）に重要な役割を果たすことが示唆される。ヒトにおけるこの遺伝子に対する正の淘汰が、ヒト女性乳房の拡大を促進し、そして最終的に、依存するヒト乳児の長期の世話の促進を補助したことが、これらの事実によって示唆される。ヒト乳児のこの長期の依存は、複雑なヒト文化の発展および伝達に必須であった。正の淘汰は、ＢＲＣＡ１のエクソン１１に集中していたようであるため、エクソン１１にコードされるＢＲＣＡ１タンパク質の領域は、通常の乳房発達において、特に役割を果たすという予測が、続いてなされる。本明細書に提供するデータによって、ヒト進化中の強い選択圧が、ＢＲＣＡ１におけるアミノ酸置換につながり、この置換が、ヒト女性において、ユニークなパターンの乳房発達を促進し、これがいくつかのヒトの振る舞いの進化を促進したことが示唆される。
【０２４７】
（実施例１５）
ＢＲＣＡ１ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの性質決定
ＢＲＣＡ１遺伝子における進化的に重要なヌクレオチド変化、およびＢＲＣＡ１タンパク質における対応するアミノ酸変化が同定されたため、次の工程は、適切なモデル系において、これらの分子を試験して、該モデルに対するヌクレオチド変化およびアミノ酸変化の機能上の効果を解析することである。例えば、ヒトＢＲＣＡ１ポリヌクレオチドを脂肪細胞などの培養宿主細胞にトランスフェクションして、細胞増殖または複製に対するその効果を決定することも可能である。
【０２４８】
（実施例１６）
正に淘汰されたＣＤ５９の同定
いくつかの霊長類種のＣＤ５９遺伝子を比較進化的に解析すると、チンパンジーＣＤ５９遺伝子が、正の淘汰にさらされていたことが明らかになった。ＣＤ５９タンパク質はまた、プロテクチン、１Ｆ−５Ａｇ、Ｈ１９、ＨＲＦ２０、ＭＡＣＩＦ、ＭＩＲＬ、およびＰ−１８としても知られる。ＣＤ５９は、すべての末梢血白血球および赤血球上で発現される（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１６：９２３−９３５）。その機能は、補体によるヒト細胞の溶解を制限することである（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。より具体的には、ＣＤ５９は、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）の阻害剤の１つとして作用する。ＭＡＣは、細胞膜中に穴状の傷害を作る、２０ほどの補体タンパク質の複合体である（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。これらのＭＡＣは、適切な制限要素（すなわちＣＤ５９およびいくつかの他のタンパク質）が存在しなければ、侵入する病原体とともに宿主細胞を破壊するであろう。本質的にはその結果、ＣＤ５９は、それ自体の防御系の補体の攻撃から、体の細胞を防御する（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。ヒト相同体は、感染した個体におけるＡＩＤＳへの進行に関係すると見なされるため、このタンパク質のチンパンジー相同体を調べた。ＣＤ５９が、ＨＩＶビリオンに選択的に取り込まれる、宿主細胞由来タンパク質の１つであることが示されている（Ｆｒａｎｋら（１９９６）ＡＩＤＳ  １０：１６１１−１６２０）。さらに、宿主細胞ＣＤ５９を取り込んだＨＩＶビリオンが、補体の作用から保護されることが示されてきている（Ｓａｉｆｕｄｄｉｎら（１９９５）Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８２：５０１−５０９）。したがって、ヒトでは、ＨＩＶがＣＤ５９を使用して、感染者の免疫系による攻撃から自身を防御して、そしてしたがって、感染の経過を進めるようである。
【０２４９】
霊長類ＣＤ５９  ｃＤＮＡ配列を得るため、霊長類組織（チンパンジー、ゴリラ、およびオランウータン由来の新鮮全血）から、総ＲＮＡを調製した（ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）、またはＲＮアーゼ不含・迅速総ＲＮＡキット（５  Ｐｒｉｍｅ−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）いずれかを用いる）。ミニ−オリゴ（ｄＴ）セルローススピンカラム（５  Ｐｒｉｍｅ−３  Ｐｒｉｍｅ，  Ｉｎｃ．）を用いて、総ＲＮＡからｍＲＮＡを単離した。第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔプレ増幅系（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用い、オリゴｄＴおよび／またはランダムプライミングを用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。公表されたヒト配列から設計したプライマー（濃度＝１００ｎｍｏｌ／μｌ）を用い、ｃＤＮＡから霊長類ＣＤ５９遺伝子のタンパク質コード領域を増幅した。ＣＤ５９増幅のためのＰＣＲ条件は、９４℃の最初のプレ融解（４分間）、その後、３５周期の９４℃（１５秒間）、５８℃（１分１５秒間）、７２℃（１分１５秒間）、および最後の７２℃の伸長１０分間であった。Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、５０μｌ総反応体積中、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ系９７００サーモサイクラー上で、ＰＣＲを達成した。ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、アガロースゲルから、適切な大きさの産物を精製した。Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットを用いて、増幅産物の両方の鎖を直接配列決定し、そして３７３Ａ  ＤＮＡ配列決定装置（ＡＢＩ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）上で解析した。
【０２５０】
表６に示すように、チンパンジーＣＤ５９配列に対するすべての比較は、１より大きいＫＡ／ＫＳ比を示し、正に淘汰されたのがチンパンジーＣＤ５９遺伝子であることが立証される。
【０２５１】
表６．  選択された霊長類ＣＤ５９  ｃＤＮＡ配列に関するＫＡ／ＫＳ比
【０２５２】
【表８】
2007531493.tif 000012
【０２５３】
（実施例１７）
ＣＤ５９の正に淘汰された配列の性質決定
強い選択圧が、チンパンジーＣＤ５９分子の適応変化を生じて、ウイルスがＣＤ５９の防御上の役割をウイルス自身のために不当に使用できなくするために、疾患進行が遅延するようになるという仮説を進めると、次には、当然、他の近縁非ヒト霊長類のＣＤ５９遺伝子をヒト遺伝子に比較すると、進化の期間に渡ってＨＩＶ−１ウイルスに直面していなかった種では、１未満のＫＡ／ＫＳ比を示すということになる。逆に、チンパンジー遺伝子へのすべての比較は、１より大きいＫＡ／ＫＳ比を示すはずである。これらの２つの試験を総合すると、チンパンジーまたはヒトの遺伝子が正に淘汰されたかどうかが明確になるであろう。ゴリラ（Ｇｏｒｉｌｌａ  ｇｏｒｉｌｌａ）は、ヒトおよびチンパンジーに最も近縁であるが、アフリカにおける推定上の歴史的範囲によって、ゴリラは、ある時期ＨＩＶ−１ウイルスに曝露されていた可能性もあることが示唆される。したがって、我々は、ゴリラおよびオランウータン（Ｐｏｎｇｏ  ｐｙｇｍａｅｕｓ）両方由来のＣＤ５９遺伝子を調べた。後者の種は、東南アジアに限定されており、進化の時間枠に渡って、ＨＩＶに曝露された可能性は低い。ヒトおよびオランウータンの２種から採取した新鮮全血由来の先に単離したＲＮＡから調製したｃＤＮＡを直接配列決定することによって、これらの遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。
【０２５４】
次の工程は、細胞培養におけるＨＩＶ複製アッセイを用いて、チンパンジーＣＤ５９が、十分に発展したＡＩＤＳへの進行に対するチンパンジー抵抗性にどのように寄与しているかを決定することである。チンパンジーＣＤ５９タンパク質でトランスフェクションし、そして該タンパク質を発現している、ヒト白血球細胞株は、トランスフェクションされていないヒト細胞の対照株と比較した際、（当業者に周知の標準的アッセイを用いて）ウイルス複製速度の減少を示すはずである。対照的に、ヒトＣＤ５９を発現するチンパンジー白血球細胞株は、対照のトランスフェクションされていないチンパンジー細胞株に比較した際、ウイルス積載量増加を示すはずである。
【０２５５】
（実施例１８）
ＣＤ５９の分子モデリング
ヒトの既知の三次元構造に対して、ＣＤ５９の推定されるチンパンジータンパク質配列をモデリングすることによって（Ｍｅｒｉら  １９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３１６：９２３−９３５）、ＡＩＤＳ進行に対するチンパンジー抵抗性を説明する際の、このタンパク質の役割のさらなる証拠が提供されている。ヒトＣＤ５９において、残基Ａｓｎ７７は、ＧＰＩアンカーに対する連結部であることが示されており（Ｍｅｒｉら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３１６：９２３−９３５）、このアンカーはタンパク質の機能に必須である。ＧＰＩアンカーは、細胞膜にタンパク質が係留される原因となる（Ｍｅｒｉら（１９９６）、上記）。チンパンジーＣＤ５９遺伝子を配列決定することによって、チンパンジーＣＤ５９の推定されるタンパク質構造が、ＧＰＩ連結を含有するタンパク質セクション、すなわちＮＥＱＬＥＮＧＧの重複を含有することが明らかになる（表７および図１０を参照されたい）。
【０２５６】
表７：ヒトおよびチンパンジーのＣＤ５９アミノ酸配列の比較
【０２５７】
【表９】
2007531493.tif 000013
【０２５８】
斜字／下線はアミノ酸の変動を示す。
これによって、ＣＤ５９の基本的機能は、チンパンジーおよびヒトの間で大部分保存されているようであるが、細胞膜に関するタンパク質の配向において、おそらく何らかの変化が生じているようであることが示唆される。この変化が、チンパンジータンパク質がＨＩＶビリオンに取り込まれる際に、該タンパク質が該ビリオンに利用されるのを不能にしている可能性もある。あるいは、チンパンジータンパク質は、ヒトＣＤ５９と対照的に、ＨＩＶビリオンによる取り込みにさらされない可能性もある。これらの（試験可能な）選択肢のいずれも、おそらく、チンパンジーにおいて、ＨＩＶビリオンがＭＡＣ複合体による攻撃にさらされることを意味するのであろう。したがって、これは、複製に使用可能なウイルスの量を減少させ、そしてしたがって、十分に発展したＡＩＤＳへの進行に対するチンパンジー抵抗性に寄与するであろう。これらの選択肢を試験して、どちらが正しいかが決定されたならば、この情報を用いて、十分に発展したＡＩＤＳへの進行に対するチンパンジー抵抗性を模倣する、感染したヒトのための療法介入を設計することも可能である。
【０２５９】
（実施例１９）
正に淘汰されたＤＣ−ＳＩＧＮの同定
ヒト、チンパンジーおよびゴリラのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の比較進化的解析によって、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子が正の淘汰にさらされていたことが明らかになった。図１１〜１３（配列番号６〜８）は、それぞれ、ヒト、チンパンジーおよびゴリラのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。表８は、ヒト、チンパンジーおよびゴリラのＤＣ−ＳＩＧＮ遺伝子の対比較によって計算されたＫＡ／ＫＳ値を提供する。チンパンジーとの比較のみが、１より大きいＫＡ／ＫＳ値を示し、チンパンジー遺伝子が正に淘汰されたことが示されることに注目されたい。
【０２６０】
表８．  選択された霊長類ＤＣ−ＳＩＧＮ  ｃＤＮＡ配列に関するＫＡ／ＫＳ比
【０２６１】
【表１０】
2007531493.tif 000014
【０２６２】
本明細書に論じるように、ＤＣ−ＳＩＧＮは、樹状細胞上で発現され、そしてＨＩＶ−１ウイルスをリンパ節に輸送する機構を提供することが知られる。ＨＩＶ−１はＤＣ−ＳＩＧＮの細胞外部分に結合し、そしてＣＤ４タンパク質を介して、リンパ節中の未分化Ｔ細胞に感染する。感染におけるこの拡大は、最終的に免疫系無防備状態を、そして続いて十分に発展したＡＩＤＳを導く。興味深いことに、ＤＣ−ＳＩＧＮの主なリガンドはＩＣＡＭ−３であるようである。本明細書に記載するように、チンパンジーＩＣＡＭ−３は、既知のあらゆるＡＩＤＳ関連タンパク質のうち、最高のＫＡ／ＫＳ比を示す。チンパンジーＩＣＡＭ−３に対する正の淘汰が、ＩＣＡＭ−３がＤＣ−ＳＩＧＮに結合する能力を保持するのを可能にする、補償的変化の結果であるかどうかはいまだ明らかでない。
【０２６３】
（実施例２０）
チンパンジーｐ４４に対する正の淘汰の検出
しばしば真実であるように、ヒトおよびチンパンジーのｐ４４の全タンパク質比較は、１未満のＫＡ／ＫＳ比を示す。これは、正の淘汰がタンパク質の小さいセクションで生じた場合、全長ＣＤＳにおけるサイレント置換の「ノイズ」集積が、正の淘汰のシグナルを不明瞭にしうるためである。しかし、チンパンジーおよびヒトの相同体のエクソン２を調べると、遺伝子のこの部分（およびコードされるポリペプチド）が正に淘汰されたことが明らかになる。エクソン２のＫＡ／ＫＳ比は１．５（Ｐ＜０．０５）である。本発明の使用によって、正に淘汰された、タンパク質の特定の領域を同定することが可能になった。
【０２６４】
チンパンジーにおいて、単一同義置換によって異なる、ｐ４４の２つのアレルが検出された（図１６を参照されたい）。ヒト対チンパンジーに対して、アレルＡに関する全タンパク質ＫＡ／ＫＳ比は０．４２であり、一方、アレルＢに関する比は０．４５である。
【０２６５】
図１６において、ヒト（寄託番号ＮＭ＿００６４１７）およびチンパンジー（寄託番号Ｄ９００３４）のｐ４４遺伝子のＣＤＳを並列させ、正に淘汰されたエクソン２を下線で示す（エクソン１が非コーディングであるため、エクソン２がＣＤＳの開始部位で始まることに注目されたい）。ヒトをＨｓ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）と示し、チンパンジーをＰｔ（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）と示す。２つの配列間の非同義相違を太字で示し、同義相違を斜字で示す。チンパンジーは、ＩＵＰＡＣコードを用いて「Ｍ」と示す、単一のヘテロ接合体塩基（２１２位）を有し、「Ｍ」は、アデニン（「Ａ」）またはシトシン（「Ｃ」）いずれかを意味する。これらの一方（「Ｃ」）がヒトからの非同義相違に相当し、一方、「Ａ」はヒト相同体における同じ位置と同一であることに注目されたい。したがって、これらの２つのチンパンジーアレルでは、ヒトｐ４４と比較したＫＡ／ＫＳ比がわずかに異なる。
【０２６６】
（実施例２１）
ヒトにおけるＨＣＶ治療に有用でありうる剤をスクリーニングする方法
精製ｐ４４、特にエクソン２との相互作用に関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで候補剤をスクリーニングすることも可能である。ヒトｐ４４がチンパンジーｐ４４の構造および／または機能を模倣可能であるように、ヒトｐ４４エクソン２と相互作用する候補剤を設計することも可能である。ヒトおよびチンパンジーのｐ４４は知られており、そして当該技術分野に知られる方法を用いて、これらを合成することも可能である。
【０２６７】
ターゲットとドッキングする小分子の分子モデリング、コンピュータが補助する新規リード化合物設計、およびコンピュータが補助する薬剤発見が当該技術分野に周知であり、そして例えばＣｏｈｅｎ，  Ｎ．Ｃ．（監修）Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に記載される。さらに、多くの商業的に入手可能な分子モデリングソフトウェアパッケージがある。
【０２６８】
アフィニティークロマトグラフィーを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒトｐ４４（特にエクソン２）に結合する候補剤を、結合しないものから分配することも可能である。アフィニティークロマトグラフィーはまた、ヒトｐ４４エクソン２に特異的に結合するのでない剤を除去するため、ヒトｐ４４エクソン２に結合するだけでなく、チンパンジーｐ４４エクソン２に結合しない候補剤を分配するのにも有用でありうる。
【０２６９】
場合によって、ｐ４４−剤複合体のＸ線結晶構造を、ヒトｐ４４およびチンパンジーｐ４４のＸ線構造と比較して、ヒトｐ４４−剤複合体が、チンパンジーｐ４４構造のＸ線構造によりよく似ているかどうかを決定することも可能である。
【０２７０】
さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの肝細胞のＨＣＶ感染中、ｐ４４との好ましい相互作用に関して、候補剤をスクリーニングすることも可能である。Ｆｏｕｒｎｉｅｒら（１９９８）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９：２３６７は、初代培養中の成人正常肝細胞を、ＨＣＶにうまく感染させることが可能であり、そしてこれをｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＨＣＶモデルとして使用可能であることを報告する（Ｒｕｍｉｎら（１９９９）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０：３００７もまた参照されたい）。Ｆａｖｒｅら（２００１）ＣＲ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＩＩＩ  ３２４（１２）：１１４１−８は、ヒト血清由来のウイルス接種材料を添加する前に、細胞に結合したリポタンパク質を除去することによって、ＨＣＶでの肝細胞の確固としたｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染が促進されることを報告する。さらに、Ｋｉｔａｍｕｒａら（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：８７７−８３は、ＩＦＮα／βが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの肝細胞において、ヒトｐ４４遺伝子を誘導することを報告する。ｐ４４タンパク質は、感染したヒト肝臓において、ｉｎ  ｖｉｖｏで産生される（Ｐａｔｚｗａｈｌ，  Ｒ．ら（２０００）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５（３）：１３３２）。現在、ＨＣＶ感染中、ｐ４４が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ヒト肝細胞によって産生されるかどうかは明らかでないが、産生されないのであれば、ＩＦＮα／βを添加して、ｐ４４を誘導することも可能である。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、ＨＣＶ感染肝細胞において、ヒトｐ４４と好適に相互作用する能力に関して、候補剤をスクリーニングする適切なモデルとして働きうる。
【０２７１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養細胞における、ｐ４４と候補剤の好適な相互作用に関するアッセイは、培養肝細胞における微小管へのｐ４４集合の増進であることも可能である。チンパンジーにおけるＮＡＮＢ肝炎感染と関連して集合したチンパンジーｐ４４微小管凝集体が、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．ら（１９９０）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１（Ｐｔ９）：２００５−１１に記載される抗体によって、検出されている。これらの抗体は、ヒトｐ４４微小管凝集体を検出する際に有用である可能性もある。あるいは、当該技術分野に知られる方法を用いて、ヒトｐ４４に対する抗体を作成することも可能である。
【０２７２】
チンパンジーまたはヒトにおける、ｐ４４微小管集合の増進およびＨＣＶ感染に対する抵抗性増加の間の直接の関連は、現時点では知られていない。しかし、文献によって、チンパンジーにおいて、ｐ４４微小管集合の増加がＨＣＶ感染と関連し、そしてチンパンジーがＨＣＶ感染に抵抗可能であることが示されている。特に、Ｐａｔｚｗａｈｌ，  Ｒ．ら（２０００）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７５：１３３２−３８は、ｐ４４が、「チンパンジーにおいて、ヒト非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎接種材料の静脈内投与後、肝細胞の細胞質における独特の改変として現れる、二重壁の膜状管の構成要素」であることを報告する。同様に、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｋ．ら（１９９０）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１（Ｐｔ９）：２００５−１１は、ｐ４４が、ＮＡＮＢ肝炎に感染したチンパンジーで発現され、そして宿主タンパク質である（そしてウイルスタンパク質でない）ことを報告する。さらに、Ｐａｔｚｗａｈｌ，  Ｒ．ら（２０００）、上記は、ｐ４４発現が、ＨＣＶに感染したヒト肝臓で増加しており；ヒトｐ４４が微小管に集合するかどうかは明らかでないことを報告する。最後に、Ｋｉｔａｍｕｒａ，  Ａ．ら（１９９４）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２２４：８７７は、８８２ページで、「ｐ４４が、微小管凝集体との会合を通じて、Ｃ型肝炎・・・感染に対する、インターフェロンの抗ウイルス活性の仲介因子として機能しうる」ことを示唆する。
【０２７３】
適切な対照は、ＨＣＶに感染しており、そしておそらく微小管に集合するｐ４４を発現し、そしてＨＣＶ感染に抵抗するであろう、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養チンパンジー肝細胞であることも可能である。
【０２７４】
前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、ヒトｐ４４と相互作用して、ＨＣＶ感染中のチンパンジーｐ４４に特徴的な機能（微小管集合またはＨＣＶ抵抗性）を生じる候補剤を同定するのに役立ちうる。ＨＣＶの阻害に関して、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて、候補剤をスクリーニングすることもまた可能である。いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏヒトＨＣＶモデルが文献に記載されている。Ｍｅｒｃｅｒ，  Ｄ．ら（２００１）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ７（８）：９２７−３３は、正常ヒト肝細胞が移植された、プラスミノーゲン活性化因子導入遺伝子（Ａｌｂ−ｕＰＡ）を所持するＳＣＩＤマウスが、ヒトＨＣＶに適した小動物モデルであることを報告する。該マウスは、キメラヒト肝臓を有し、そして感染したヒトの血清を接種することによってＨＣＶを投与すると、血清ウイルス力価が増加する。ＨＣＶウイルスタンパク質は、ヒト肝細胞結節（ｎｏｄｕｌｅ）に局在した。
【０２７５】
Ｇａｌｕｎ，  Ｅ．ら（１９９５）は、ＢＮＸ（ベージュ／ヌード／Ｘ連鎖免疫不全）マウスから発展させた、全身放射線照射によってプレコンディショニングし、そしてＳＣＩＤマウス骨髄細胞で再構築したキメラマウスモデルであって、ヒト患者由来のＨＣＶ感染肝臓断片、またはＨＣＶ血清とインキュベーションした正常肝臓を移植した、前記キメラマウスモデルを記載する。
【０２７６】
ＬａＢｏｎｔｅ，  Ｐ．ら（２００２）Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６（３）：３１２−９は、ヒト肝細胞癌細胞（ＨＣＣ）を無胸腺ヌードマウスに同所性に移植することによって発展させたマウスモデルを記載する。ヒト腫瘍はＨＣＶ  ＲＮＡを生じる。
【０２７７】
前述のマウスモデルのいずれもＩＦＮ−α／βで処理して、ｐ４４産生を誘導することも可能であり（必要な場合）、そして候補剤を添加して、例えば血清ウイルス力価の減少によって、ＨＣＶ感染のいかなる阻害を検出することも可能であった。
【０２７８】
対照として、チンパンジー肝臓細胞をＳＣＩＤまたは別の適切なマウスに移植して、キメラ肝臓を生成して、そしてＨＣＶに感染させることも可能である。おそらく、対照マウスモデル中のチンパンジー肝臓は、ｐ４４を発現し、そしてＨＣＶ感染により抵抗性であろう。
【０２７９】
ヒト肝細胞を含む実験マウスに候補剤を投与して、そして次いで、対照および実験モデルにおけるＨＣＶ感染（例えばウイルス力価）の経過を監視する。実験マウスにおいて、ヒトｐ４４の機能が、対照マウスモデルにおけるチンパンジーｐ４４の機能に近づく（またはおそらくこれを超える）点まで、抵抗性を改善する剤は、ヒト臨床試験に適する可能性もある剤である。
【０２８０】
（実施例２２）
チンパンジーＩＣＡＭ類における変化の構造／機能の関連
公表された結晶構造を用いて、結合および二量体化に非常に重要なアミノ酸に関して、ＩＣＡＭ１におけるユニークなチンパンジーアミノ酸置換の位置を調べた（Ｃａｓａｓｎｏｖａｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ  ９５：４１３４−４１３９；Ｂｅｌｌａら（１９９８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：４１４０−４１４５）。チンパンジー系統にユニークであることを我々が発見したアミノ酸置換の１つは、Ｌｅｕ−１８（より親水性のＧｌｕ−１８に置換される）であり、これは、ヒトＩＣＡＭ１二量体化に非常に重要な疎水性二量体化表面を生成するロイシンクラスター中のロイシンの１つである（Ｊｕｎら（２００１）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：２９０１９−２９０２７）（Ｌｅｕの３．８の疎水性スコアがＧｌｕの−３．５に置き換わる）。チンパンジーＩＣＡＭ−１には疎水性表面の歪みがあることから、チンパンジーでは、選択圧がＩＣＡＭ１二量体化の仲介に向けられたと示唆される。
【０２８１】
対照的に、我々は、ヒトＬＦＡ−１結合に関与すると考えられるすべてのＩＣＡＭ１残基（Ｄｉａｍｏｎｄら（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５：９６１−９７１；Ｆｉｓｈｅｒら（１９９７）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ８：５０１−５１５；Ｅｄｗａｒｄｓら（１９９８）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：２８９３７−２８９４４；Ｓｈｉｍａｏｋａら（２００３）Ｃｅｌｌ  １１２：９９−１１１）が、チンパンジーおよびヒトのＩＣＡＭ１で同一であることを見出した。実際、これらの非常に重要な残基は、我々が調べた霊長類ＩＣＡＭ類のすべてで非常に保存されている。さらに、我々は、ＩＣＡＭ１に結合するのに非常に重要であり（Ｓｈｉｍａｏｋａら、２００３；Ｈｕｔｈら（２０００）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９７：５２３１−５２３６）、それとともにＩＣＡＭ２およびＩＣＡＭ３と結合するのに非常に重要である、ＬＦＡ−１タンパク質中の残基もまた、チンパンジーおよびヒト間で同一であることを見出した。チンパンジーおよびヒトのＬＦＡ−１遺伝子の対Ｋａ／Ｋｓ比較もまた、保存を示唆する。（ＬＦＡ−１タンパク質はアルファおよびベータと称される２つのサブユニットを含有する：ヒトＬＦＡ−１アルファ・サブユニット対チンパンジーＬＦＡ−１アルファ・サブユニット＝Ｋａ／Ｋｓ＝０．３０；ヒトＬＦＡ−１ベータ・サブユニット対チンパンジーＬＦＡ−１ベータ・サブユニット＝Ｋａ／Ｋｓ＝０．０５３）。したがって、ＩＣＡＭ１／ＬＦＡ−１結合相互作用は、上述のように、適応進化の結果、チンパンジーで調節されているようであるＩＣＡＭ１二量体化の状態の影響を除いて、ヒトおよびチンパンジー間で基本的には同一であるようである。
【０２８２】
我々が同定したユニークなチンパンジーＩＣＡＭ１置換の１つ、Ｌｙｓ−２９からＡｓｐ−２９への置換は、ＩＣＡＭ１／ＬＦＡ−１結合残基のクラスター、特にＩＣＡＭ１／ＬＦＡ−１結合の接触表面の一部を形成する、Ａｓｎ−６６にすぐ隣接している。Ａｓｎ−６６のアミド側鎖は、ＬＦＡ−１のＧｌｕ−２４１と相互作用することが知られ、この相互作用は、ＩＣＡＭ１／ＬＦＡ−１結合に絶対的に重要であることが示されている。Ｇｌｕ−２４１とＡｓｎ−６６の相互作用は、塩基性Ｌｙｓ−２９（ヒト）を酸性Ａｓｐ−２９（チンパンジー）で置換することによって、影響を受ける可能性もある。
【０２８３】
Ｌｙｓ−２９は、ヒトＩＣＡＭ１を受容体として用いるヒト・ライノウイルスの主な群の結合アミノ酸であると報告されている（Ｒｅｇｉｓｔｅｒら（１９９１）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：６５８９−６５９６）。我々は、チンパンジーＩＣＡＭ１に作用した選択力が、ライノウイルスへの曝露であった可能性を考慮した。残基４９は、チンパンジーおよびヒト間で異なる、唯一の他のライノウイルス結合部位である；この場合、チンパンジー配列は祖先Ｔｒｐを保持し、一方、ヒトは、派生したＡｒｇを示し、すなわちヒトＩＣＡＭ１配列が変化している一方、チンパンジー配列が保存されてきている。したがって、この部位は、ライノウイルスへの曝露がチンパンジーＩＣＡＭ１に対する選択力ではなかったという証拠を提供する。
【０２８４】
上述のように、ＩＣＡＭ１は、Ｍａｃ−１にも結合する。ＬＦＡ−１に関するように、ＩＣＡＭ１およびＭａｃ−１がチンパンジーおよびヒト間の正の淘汰のターゲットとなった可能性は、３つの理由から高そうではない。まず、チンパンジーおよびヒトのＭａｃ−１遺伝子の対比較によって、保存が示唆される（ＬＦＡ−１同様、Ｍａｃ−１はアルファ・サブユニットおよびベータ・サブユニットを含有する。ヒトＭａｃ−１アルファ・サブユニット対チンパンジー・アルファ・サブユニット：Ｋａ／Ｋｓ＝０．３０。ヒトＭａｃ−１ベータ・サブユニット対チンパンジーＭａｃ−１ベータ・サブユニット：Ｋａ／Ｋｓ＝０．４２）。第二に、ＩＣＡＭ１のドメイン３は、Ｍａｃ−１結合に非常に重要であることが長い間知られている（Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９１）。上述のように、ドメイン１およびドメイン２とは異なり、このドメインは、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ１間でよく保存されている。第三に、我々は、Ｍａｃ−１結合に非常に重要であることが示された（Ｄｉａｍｏｎｄら、１９９１）ＩＣＡＭ１残基（Ａｓｐ−２２９、Ａｓｎ−２４０、Ｇｌｕ−２５４、Ａｓｎ−２６９）は、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ１間で同一であることを見出しており；実際、これらは、調べた霊長類ＩＣＡＭ１配列のすべてで、ほぼ完全に同一である。
【０２８５】
ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら（２００２  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９９：１１７４８−１１７５３）は、ＡＩＤＳへの進行に対するチンパンジー抵抗性が、現代のチンパンジーが保持するＭＨＣオルソログの限定される組から生じていると示唆するが、我々は、この説明には問題があることを主張する。第一に、ヒト集団は、比較的高い頻度で、これらの同じチンパンジーＭＨＣタンパク質の相同体を保持するが、ＨＩＶ−１が誘導する免疫不全に対して、ヒトが天然に抵抗性になるようであるのは、非常に限定される例外でしかない。第二に、ｄｅ  Ｇｒｏｏｔらに提示された解析（正の淘汰の作用に関する統計検定である、Ｔａｊｉｍａの「Ｄ」の使用に基づく）によると、これらの遺伝子は中立的に進化したことが示唆される。これらのチンパンジー遺伝子座に対する正の淘汰に関する裏付けはないが、他の種におけるＭＨＣ遺伝子は、分子レベルの選択を示すことが立証されている（ＨｕｇｈｅｓおよびＮｅｉ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：１６７−１７０；ＨｕｇｈｅｓおよびＮｅｉ（１９８９）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：９５８−９６２）。ＨＩＶ−１進行に対するチンパンジー抵抗性は、現在のチンパンジー集団において保持されているＭＨＣアレルによって与えられるのではないようである。
【０２８６】
上に詳述するように、チンパンジーＩＣＡＭ１において我々が同定した変化は、特に、チンパンジーＩＣＡＭ１の二量体化を調節するようである。ＩＣＡＭ−１が仲介する細胞接着機能（ＨＩＶ−１に利用されるようなもの）は、リガンドへの結合に依存し、そしてこうしたものとして、結合は、ＩＣＡＭ１二量体化の状態によって影響を受けることが示されているため、我々は、リガンドへのチンパンジーＩＣＡＭ１の結合が、遮断されるのではなく、調節され、こうしてＨＩＶ−１に必要な細胞接着機能を改変し、おそらくウイルス感染性を減少させると提唱する。
【０２８７】
（実施例２３）
２工程スクリーニングプロセス
我々は、チンパンジー疾患抵抗性の原因となる他の遺伝子を限定する厳しいフィルターとして、２工程スクリーニングプロセスを用いた。まず、我々は、ヒト細胞の実験的ＨＩＶ感染後、発現パターンが変化する遺伝子に、検索を限定した。次に、我々は、正の淘汰を経た遺伝子に関して、このサブセットをスクリーニングした。
【０２８８】
いくつかのグループが、文献において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト細胞の感染から生じる遺伝子発現パターンの改変に関する研究を報告してきた。各グループは、異なる細胞株および実験プロトコルを用い、したがって、これらの研究すべての結果には、ある程度の重複が存在するが、各研究はまた、ユニークな遺伝子セットも生じた。こうした研究において、影響を受けた遺伝子が多数であるため（我々の研究ではＴ細胞の遺伝子の３％が影響を受けた）、多くの研究者は、より完全に性質決定するため、少数のサブセットの遺伝子を選択している；例えばＳｃｈｅｕｒｉｎｇら（１９９８  ＡＩＤＳ  １２：５６３−５７０）は、１２の示差的に発現されるバンドを選択し、そして４つのホスト遺伝子を記載した。Ｒｙｏら（１９９９，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４６２（１−２）：１８２−１８６）は、ＳＡＧＥ解析によって、１４２の示差的に発現される遺伝子を見出し（発現に最小で５倍の相違）、このうち、既知の遺伝子にマッチする５３を選択し、そして、感染によって発現が上方制御される遺伝子が、ＨＩＶ複製加速に役割を果たし、そして下方制御される遺伝子は、宿主細胞防御に役割を果たすと結論付けた。彼らは続いて、１３のｃＤＮＡ断片を配列決定し、そして同定して、そして特定の遺伝子が協調して発現されることを観察した（Ｒｙｏら  ２０００  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １６：９９５−１００５）。Ｃｏｒｂｅｉｌら（２００１  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １１：１１９８−２０４）は、Ｔ細胞株において、８より多い時点で、６８００の特定の遺伝子を調べて、ミトコンドリア機能および完全性、ＤＮＡ修復、並びにアポトーシスに関与する遺伝子の発現を追跡したが、これらの著者らとともに他の著者らは、重要な遺伝子のレベルが、感染後の異なる時点で多様であると警告している。Ｖａｈｅｙら（２００３  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  ＆  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９：３６９−３８７）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染させた細胞由来の５６００の細胞性遺伝子の高密度アレイを用いて、そしてやはり、多くの遺伝子が時間的パターンで協調して発現されることを観察している。Ｓｕら（２００２  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：３５９２−６０２）は、ＨＩＶ−１に感染したアストロサイトにおける示差的遺伝子発現を調べた。２つのグループが、潜在的な抵抗性機構を調べてきている。Ｓｉｍｍら（２００１  Ｇｅｎｅ  ２６９：９３−１０１）は、ＨＩＶ−１抵抗性Ｔ細胞株対ＨＩＶ−１感受性Ｔ細胞株で、ＨＩＶ−１接種後に示差的に発現される１１の遺伝子を報告しており、そのうち５つが新規遺伝子である。Ｋｒａｓｎｏｓｅｌｓｋａｙａら（２００２  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １８：５９１−６０４）は、ＮＦ９０発現細胞（ウイルス複製を阻害可能）対対照細胞の間の遺伝子発現相違に注目し、そして発現に４倍以上の変化を有する９０の遺伝子を見出し、多くのものがインターフェロン反応と関係することを見出した。
【０２８９】
我々は、ＨＩＶの感染に際して、示差的に発現される遺伝子のサブセットを選択する方法を開発した。我々は、これらの他の研究者らによって、ヒト細胞がＨＩＶに感染した後、上方制御されるかまたは下方制御されると報告された遺伝子をランダムに選択し、そしてそれらに対するプライマーを設計した。我々は、チンパンジー血液（Ｂｕｃｋｓｈｉｒｅ  Ｌａｂｓ、ペンシルバニア州）を得て、そしてｍＲＮＡを単離した。ＲＴ−ＰＣＲによって、ヒト遺伝子のチンパンジー相同体を増幅した。各単位複製配列のＤＮＡ配列を決定した。次いで、ＥＧのＡＴＰソフトウェアによって、チンパンジー単位複製配列対相同ヒト配列の対Ｋａ／Ｋｓ比較を行った。正に淘汰されている、これらの遺伝子の小領域を同定するのを容易にするため、完全コード領域とともに、スライディング・ウィンドウ（タンパク質コード領域のより小さいセクションで構成される）に対して、解析を行った。Ｋａ／Ｋｓ比が上昇した候補遺伝子を増幅し、そしてこれらの遺伝子座に関して、２種で存在する遺伝子不均一性の度合いを確かめるため、多数のチンパンジーおよびヒト個体から配列決定した。
【０２９０】
この２工程プロセスの有効性が立証された：我々が調べた１００のチンパンジー遺伝子のうち、４つのみが正の淘汰の痕跡を示した。したがって、免疫不全ウイルス感染の結果、発現パターンが改変されている遺伝子のコレクションは多数であったが、我々は検索を４つの遺伝子／タンパク質に狭めることが可能であった。
【０２９１】
（実施例２４）
ＣＤ９８重鎖（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｊ０３５６９）
ＣＤ９８は、ヘテロ二量体膜貫通糖タンパク質である（Ｒｉｎｔｏｕｌら  ２００２）。ＣＤ９８は、非常に保存されているタンパク質であり、細胞種間でほぼ偏在性に発現されている。哺乳動物ＣＤ９８相同体間で高レベルの進化的保存が観察されていることから、ヒトおよびチンパンジー間でＣＤ９８が正に淘汰されているという観察が、さらにより特筆すべきものになる。コード配列の正に淘汰された部分（重鎖中のおよそ７３０ｂｐ）は、Ｋａ／Ｋｓ比＝１．７を示す。（しばしばそうであるように、ヒトおよびチンパンジー間のＣＤ９８の全長比較は、Ｋａ／Ｋｓ比＜１を示す。配列の短い部分のみが適応変換されている場合、全コード配列全体の同義置換の「ノイズ」が、正の淘汰のシグナルを圧倒するため、全長比較は、しばしば、正の淘汰の痕跡を隠す。）
ＣＤ９８は、細胞活性化に関連付けられている（Ｒｉｎｔｏｕｌら  ２００２）；証拠によって、チロシンキナーゼが調節するシグナル伝達経路を、ＣＤ９８が活性化することが示唆される（Ｗａｒｒｅｎら  １９９６）。ＣＤ９８が、Ｎａ＋／Ｃａ２＋交換体を通じて、細胞内カルシウム濃度を制御するという証拠もある（Ｍｉｃｈａｌａｋら  １９８６）。
【０２９２】
強い証拠によって、ＣＤ９８が炎症プロセスの調節と関連付けられている（Ｒｉｔｏｕｌら  ２００２）。興味深いことに、Ｒｉｎｔｏｕｌら（２００２）は、「ＣＤ９８およびウイルス誘導性細胞融合の間に関連があることに関して、説得力のある証拠が存在する」と言及する。Ｉｔｏら（１９９６）およびＯｈｇｉｍｏｔｏら（１９９５）は、ＣＤ９８に対する抗体が、ＨＩＶのｇｐ１６０エンベロープ糖タンパク質に誘導される細胞融合を促進することを示した。炎症プロセスおよびウイルス誘導性（および特にＨＩＶ誘導性）細胞融合の関連は有意である。ＩＣＡＭ類は、炎症応答の周知の剤であり、そしてＨＩＶ誘導性細胞融合におけるその役割は、よく立証されている（Ｃａｓｔｉｌｌｅｔｔｉら  １９９５；Ｏｔｔら  １９９７；Ｆｏｒｔｉｎら  １９９９）。したがって、正に淘汰されたチンパンジーＩＣＡＭ類は、正に淘汰されたチンパンジーＣＤ９８とともに、ＨＩＶ抵抗性を達成するのに関与する。
【０２９３】
（実施例２５）
ｐ４４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿００６４１７）
チンパンジーにおいて、２つのアレルが検出された（アレルＡおよびアレルＢ）。ヒト対チンパンジーの全長比較は、アレルＡに関して０．４２、そしてアレルＢに関して０．４５のＫａ／Ｋｓ比を生じた。しかし、チンパンジーおよびヒトの相同体のエクソン２を調べると、遺伝子のこの部分が正に淘汰されたことが明らかになった。
【０２９４】
タンパク質ｐ４４は、Ｓｈｉｍｉｚｕら（１９８５）によって発見された。これらの著者らは、チンパンジーを非Ａ非Ｂ肝炎（Ｃ型肝炎）に感染させて、そして感染の際に発現されるタンパク質としてｐ４４を同定した。ウイルスが１９８９年にクローニングされ、そして直接ウイルス診断技術が利用可能になるまでの数年間、ｐ４４は、Ｃ型肝炎感染のマーカーであった。チンパンジーは、ヒトＣ型肝炎のモデルとして用いられてきたが、おそらく、ウイルス複製レベルがより低いため、ＨＣＶに感染したチンパンジーが、ＨＣＶに感染したヒトでしばしば生じる肝臓損傷には抵抗性であることがよく立証されている（Ｌａｎｆｏｒｄら  １９９１）。ｐ４４は、アルファ／ベータ・インターフェロン誘導性遺伝子ファミリーのメンバーであり、そして二本鎖ＲＮＡ複製中間体に誘導されるインターフェロンの抗ウイルス活性の仲介因子と考えられている（Ｋｉｔａｍｕｒａら  １９９４）。ＨＩＶ感染は、二本鎖ＲＮＡ複製中間体に特徴付けられるため、ＨＩＶ感染に際して示差的に発現される遺伝子に関するＶａｈｅｙらの研究（２００３）において、報告される数百の遺伝子の中にｐ４４が挙げられているのは驚くべきことではない。しかし、Ｂ型肝炎ウイルスでの感染はｐ４４発現を誘導するが、やはり二本鎖ＲＮＡ中間体を介して複製すると予期されるＧ型肝炎ウイルスによる感染は、ｐ４４の発現を誘導しない（Ｓｈｉｍｉｚｕら  ２００１）。Ｃ型肝炎およびＨＩＶ−１による感染のどちらの後でも上方制御される、この正に淘汰されたタンパク質は、明らかに興味深い。
【０２９５】
（実施例２６）
ＩＦＮ−ｐ５６Ｋ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ２４５９４）
コード配列の正に淘汰された部分（およそ１２４５ｂｐ）は、Ｋａ／Ｋｓ比＝２．５を示す。著しいことに、このタンパク質に関しては、ヒトおよびチンパンジーの相同体の間の全長比較でさえ、１より大きいＫａ／Ｋｓ比を示す（１．３）。
【０２９６】
ＩＦＮ−ｐ５６ｋは、タンパク質合成の調節に役割を果たす、５６キロダルトンのタンパク質である。一般的に、タンパク質合成は、ｅＩＦ４Ｆ、ｅＩＦ４Ｇ、およびｅＩＦ４Ｅ、並びにｅＩＦ３が協調して働き、リボソームとメッセンジャーＲＮＡを集めた際に開始される。多くのウイルスが宿主タンパク質合成「機構」を不当に使用して、宿主タンパク質産生を停止し、そしてその代わりウイルスがコードするタンパク質を産生する。ＨＩＶ−１がコードする２つのタンパク質は、タンパク質合成をＨＩＶがコードするタンパク質に向け直す際に役割を果たすようである。ＨＩＶプロテアーゼがｅＩＦ４ＧＩを切断して（しかしＩＩは切断しない）、キャップ依存性ｍＲＮＡ翻訳の阻害を生じる一方、内部リボソーム進入部位を持つ非キャップ化ｍＲＮＡ（ＨＩＶ  ｍＲＮＡなど）を用いたタンパク質合成は、引き続き行われるかまたは刺激されさえすることが示されている（Ａｌｖａｒｅｚら  ２００３）。ＨＩＶ  Ｖｐｒは、ウイルスｍＲＮＡの発現増進を含む、いくつかの宿主細胞機能に作用することが示されている。Ｖｐｒは、ｅＩＦ３の１２のサブユニットの１つであるｅＩＦ３ｆと直接相互作用する。ＩＦＮ−ｐ５６Ｋが存在する場合、これは、ｅＩＦ３の別のサブユニット（ｅＩＦ３ｅ）と結合し、そしてタンパク質翻訳を停止する。ＩＦＮ−ｐ５６Ｋは、一般的な抗ウイルス性のインターフェロンが仲介する反応の一部として、ウイルス感染中に発現される宿主タンパク質に相当するようである。
【０２９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、ＩＦＮ−ｐ５６ｋをコードするｍＲＮＡは、インターフェロンまたはｄｓＲＮＡで処理しない場合には、細胞において検出不能である。インターフェロンまたはｄｓＲＮＡを添加すると、ＩＦＮ−ｐ５６Ｋ  ｍＲＮＡの量が増加する：１００を超えるＩＮＦ誘導性ｍＲＮＡのうち、ＩＦＮ−ｐ５６Ｋ  ｍＲＮＡが、最も豊富なインターフェロン誘導性ｍＲＮＡであることが報告されている（Ｄｅｒら  １９９８）。ＩＦＮ−ｐ５６Ｋは、インターフェロン・アルファ、ベータ、およびガンマによって、ウイルス感染（ＨＩＶ、Ｃ型肝炎、センダイウイルス、水疱性口内炎ウイルス、脳心筋炎ウイルス、およびサイトメガロウイルス）によって、あるいはｄｓＲＮＡの存在によって、誘導可能である。
【０２９８】
ＧｕｏおよびＳｅｎ（２０００）は、ＩＦＮ−ｐ５６Ｋを徹底的に性質決定した。ＩＦＮ−ｐ５６Ｋタンパク質は、８つのテトラトリコペプチドモチーフを有する；こうしたモチーフは、一般的に、タンパク質−タンパク質相互作用の仲介と関連する。インターフェロンの存在によって、ＩＦＮ−ｐ５６Ｋ遺伝子の発現が誘導される際、ＩＦＩ−５６ｐＫは細胞質に存在し、そしてｅＩＦ３ｅは核に位置する。
【０２９９】
ＨＩＶ  ＶｐｒとｅＩＦ３ｆが相互作用すると、後者は核内に転位置する。ＩＦＮ−ｐ５６ＫがｅＩＦ３ｅと相互作用すると、後者は細胞質内に転位置する。
【０３００】
（実施例２７）
Ｓｔａｆ５０（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ８２２００）
このタンパク質は、Ｉ型およびＩＩ型のヒトインターフェロン両方によって誘導されることが示されてきており（ＴｉｓｓｏｔおよびＭｅｃｈｔｉ  １９９５）、そして重要なことに、Ｓｔａｆ５０は、ＨＩＶ−１の末端反復配列の転写を下方制御することが示されてきている（ＴｉｓｓｏｔおよびＭｅｃｈｔｉ  １９９５）。したがって、このタンパク質がＨＩＶ−１感染後に上方制御されるという事実、およびＨＩＶ抵抗性チンパンジーにおいて正に淘汰されているという事実に加えて、このタンパク質はまた、ＨＩＶ−１感染の制御に役割を果たす。
【０３０１】
ＩＦＮ−ｐ５６Ｋに（そしておそらくｐ４４に）当てはまると報告されるように、Ｓｔａｆ５０は、インターフェロンに仲介される一般的な抗ウイルス反応の一部であるようである。ＣｈａｎｇおよびＬａｉｍｉｎｓ（２０００）は、マイクロアレイ解析によって、Ｓｔａｆ５０の制御が、ヒト・パピローマウイルス３１型による感染の結果、改変されることを立証した。ｐ４４およびＩＦＮ−ｐ５６Ｋ（Ｐａｔｚｗａｈｌら  ２００１）同様、Ｓｔａｆ５０は、Ｃ型肝炎感染後、チンパンジー肝臓で上方制御されることが示されている（Ｂｉｇｇｅｒら  ２００１）。
【０３０２】
Ｓｔａｆ５０は、ＩＬ−２受容体をコードする遺伝子を負に制御することが知られる、マウスＲｐｔ−１のヒト相同体である（Ｂｉｇｇｅｒら  ２００１）。
前述の発明は、明確にし、そして理解する目的で、例示および実施例によってある程度詳細に記載されてきているが、一般の当業者には、特定の変化および修飾を実行可能であることが明らかであろう。したがって、説明および実施例は、本発明の範囲を限定すると見なすべきではなく、本発明は、付随する請求項によって正確に概説される。
【図面の簡単な説明】
【０３０３】
【図１】図１は、ヒト科グループ内の霊長類に関する系統樹を示す。分岐の順序は、よく裏付けられているミトコンドリアＤＮＡ系統発生論に基づく。ＭｅｓｓｉｅｒおよびＳｔｅｗａｒｔ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：１５１−１５４。
【図２Ａ】図２Ａ（配列番号１〜３）は、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−１配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｘ０６９９０およびＸ８６８４８）間のヌクレオチド配列並列である。チンパンジー配列のアミノ酸翻訳を並列の下に示す。
【図２Ｂ】図２Ｂ（配列番号１〜３）は、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−１配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｘ０６９９０およびＸ８６８４８）間のヌクレオチド配列並列である。チンパンジー配列のアミノ酸翻訳を並列の下に示す。
【図２Ｃ】図２Ｃ（配列番号１〜３）は、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−１配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｘ０６９９０およびＸ８６８４８）間のヌクレオチド配列並列である。チンパンジー配列のアミノ酸翻訳を並列の下に示す。
【図２Ｄ】図２Ｄ（配列番号１〜３）は、ヒトおよびチンパンジーのＩＣＡＭ−１配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）寄託番号Ｘ０６９９０およびＸ８６８４８）間のヌクレオチド配列並列である。チンパンジー配列のアミノ酸翻訳を並列の下に示す。
【図３】図３は、ゴリラＩＣＡＭ−１のヌクレオチド配列（配列番号４）を示す。
【図４】図４は、オランウータンＩＣＡＭ−１のヌクレオチド配列（配列番号５）を示す。
【図５Ａ】図５（Ａ）〜（Ｅ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−１のポリペプチド配列並列（配列番号６）を示す。
【図５Ｂ】図５（Ａ）〜（Ｅ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−１のポリペプチド配列並列（配列番号６）を示す。
【図５Ｃ】図５（Ａ）〜（Ｅ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−１のポリペプチド配列並列（配列番号６）を示す。
【図５Ｄ】図５（Ａ）〜（Ｅ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−１のポリペプチド配列並列（配列番号６）を示す。
【図５Ｅ】図５（Ａ）〜（Ｅ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−１のポリペプチド配列並列（配列番号６）を示す。
【図６Ａ】図６（Ａ）〜（Ｂ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−２のポリペプチド配列並列（配列番号７）を示す。
【図６Ｂ】図６（Ａ）〜（Ｂ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−２のポリペプチド配列並列（配列番号７）を示す。
【図７Ａ】図７（Ａ）〜（Ｄ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−３のポリペプチド配列並列（配列番号８）を示す。
【図７Ｂ】図７（Ａ）〜（Ｄ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−３のポリペプチド配列並列（配列番号８）を示す。
【図７Ｃ】図７（Ａ）〜（Ｄ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−３のポリペプチド配列並列（配列番号８）を示す。
【図７Ｄ】図７（Ａ）〜（Ｄ）は、いくつかの霊長類種由来のＩＣＡＭ−３のポリペプチド配列並列（配列番号８）を示す。
【図８】図８は、ヒト／霊長類の脳ポリヌクレオチドを比較して、進化的に重要な変化を持つ配列を選択し、そして選択した配列をさらに性質決定するための方法の模式図を示す。図８の図は、本発明の好ましい態様を例示し、そして精錬および所望によるさらなる工程を伴って、説明とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。類似の方法によって、いかなるヒト／霊長類ポリヌクレオチド配列を比較することも可能であり、そして該方法は、脳ポリヌクレオチドに限定されないことが理解される。
【図９】図９は、適切な分岐上にマッピングされたｂＮ値およびｂＳ値とともに、実施例１４で比較する種に関する、既知の系統樹を例示する。ｂＮ値およびｂＳ値を、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：３７０８−３７１３に記載される方法によって計算した。値を分岐上に示し；すべての値は、明瞭にするため、１００Ｘで示している。表５の比較（実施例１４）と同様に統計的有意性を計算し、そして統計的有意性のレベルは表５に示すとおりである。ｂＮ−ｂＳに関しては、ヒト／チンパンジーの共通の祖先から現代のヒトにつながる分岐のみが、統計的に有意な値を示すことに注目されたい。
【図１０】図１０は、最も暗い影によって示す重複したＧＰＩ連結部（Ａｓｎ）を含むヒトＣＤ５９の空間充填モデルを例示する。このＧＰＩ連結部は、チンパンジーでは重複しているため、チンパンジーのＣＤ５９は３つのＧＰＩ連結部を含有する。図１０の中間の濃さの影の３つの領域は、チンパンジーおよびヒト間で異なる他の残基である。
【図１１】図１１は、ヒトＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｍ９８４５７）（配列番号９）を示す。
【図１２】図１２は、チンパンジーＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列（配列番号１０）を示す。
【図１３】図１３は、ゴリラＤＣ−ＳＩＧＮのコード配列（配列番号１１）を示す。
【図１４Ａ−１】図１４Ａは、ヒトＡＡＴＹＫ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび停止コドンを下線で示す（配列番号１４）。
【０３０４】
図１４Ｂは、ヒトＡＡＴＹＫ遺伝子の１２０７アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１４Ａ−２】図１４Ａは、ヒトＡＡＴＹＫ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび停止コドンを下線で示す（配列番号１４）。
【０３０５】
図１４Ｂは、ヒトＡＡＴＹＫ遺伝子の１２０７アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａは、ヒトＡＡＴＹＫ遺伝子のヌクレオチド配列を示す。開始コドンおよび停止コドンを下線で示す（配列番号１４）。
【０３０６】
図１４Ｂは、ヒトＡＡＴＹＫ遺伝子の１２０７アミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、チンパンジーＡＡＴＹＫ遺伝子の１８０６塩基対配列（配列番号１７）を示す。
【０３０７】
図１５Ｂは、ゴリラＡＡＴＹＫ遺伝子の１７８５塩基対配列（配列番号１８）を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａは、チンパンジーＡＡＴＹＫ遺伝子の１８０６塩基対配列（配列番号１７）を示す。
【０３０８】
図１５Ｂは、ゴリラＡＡＴＹＫ遺伝子の１７８５塩基対配列（配列番号１８）を示す。
【図１６Ａ】図１６は、並列したチンパンジー（配列番号３１）およびヒト（配列番号３４）のｐ４４遺伝子コード領域の１３３５ヌクレオチド領域を示す。下線部分はエクソン２であり、これは進化的に重要であることが決定された。２つの配列間の非同義相違を太字で示し、同義相違を斜字で示す。チンパンジーは、単一のヘテロ接合体塩基（２１２位）を有し、Ｍ（ＡまたはＣのＩＵＰＡＣコード）として示す。Ｃ塩基は、ヒトとの非同義相違に相当し、一方、Ａは、ヒト相同体の同じ位と同一である。したがって、これらの２つのチンパンジーアレルでは、ヒトｐ４４に比較したＫＡ／ＫＳ比がわずかに異なる。
【図１６Ｂ】図１６は、並列したチンパンジー（配列番号３１）およびヒト（配列番号３４）のｐ４４遺伝子コード領域の１３３５ヌクレオチド領域を示す。下線部分はエクソン２であり、これは進化的に重要であることが決定された。２つの配列間の非同義相違を太字で示し、同義相違を斜字で示す。チンパンジーは、単一のヘテロ接合体塩基（２１２位）を有し、Ｍ（ＡまたはＣのＩＵＰＡＣコード）として示す。Ｃ塩基は、ヒトとの非同義相違に相当し、一方、Ａは、ヒト相同体の同じ位と同一である。したがって、これらの２つのチンパンジーアレルでは、ヒトｐ４４に比較したＫＡ／ＫＳ比がわずかに異なる。
【図１６Ｃ】図１６は、並列したチンパンジー（配列番号３１）およびヒト（配列番号３４）のｐ４４遺伝子コード領域の１３３５ヌクレオチド領域を示す。下線部分はエクソン２であり、これは進化的に重要であることが決定された。２つの配列間の非同義相違を太字で示し、同義相違を斜字で示す。チンパンジーは、単一のヘテロ接合体塩基（２１２位）を有し、Ｍ（ＡまたはＣのＩＵＰＡＣコード）として示す。Ｃ塩基は、ヒトとの非同義相違に相当し、一方、Ａは、ヒト相同体の同じ位と同一である。したがって、これらの２つのチンパンジーアレルでは、ヒトｐ４４に比較したＫＡ／ＫＳ比がわずかに異なる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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