(57)【要約】  本発明は、リガンド結合アッセイにおいて使用することができる安定な組成物、例えば、限定ではないが、キャリブレータ、対照および供試試料、ならびに前記組成物の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためのリガンド結合アッセイにおいて使用するための、約４．０から約６．５のｐＨを有する安定な液体キャリブレータまたは対照。
【請求項２】
約５．０から約６．０のｐＨを有する、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３】
少なくとも一つのヒト合成ナトリウム利尿ペプチドを含む、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項４】
前記ヒト合成ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト合成心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト合成デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである、請求項３に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項５】
少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせを含む、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項６】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項５に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項７】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項５に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項８】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項５に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項９】
少なくとも一つの希釈剤を含む、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１０】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および少なくとも一つの殺生物剤を含む、請求項９に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１１】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項１０に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１２】
前記蛋白質が、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、または脱脂粉乳である、請求項１１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１３】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンである、請求項１１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１４】
前記希釈剤が、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含む、請求項９に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１５】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項１４に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１６】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項１４に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１７】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項１４に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１８】
約２から約８℃の温度で保管することができる、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項１９】
周囲温度または約３０から約４０℃の温度でのアッセイにおいて使用することができる、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２０】
供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためのリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な液体キャリブレータまたは対照であって、
少なくとも一つの希釈剤；および
少なくとも一つのヒト合成ナトリウム利尿ペプチド
を含み、約４．０から約６．５のｐＨを有するキャリブレータまたは対照。
【請求項２１】
約５．０から約６．０のｐＨを有する、請求項２０に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２２】
前記ヒト合成ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト合成心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト合成デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである、請求項２０に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２３】
少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせを含む、請求項２０に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２４】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項２３に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２５】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項２３に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２６】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項２３に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２７】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および少なくとも一つの殺生物剤を含む、請求項２０に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２８】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項２７に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項２９】
前記蛋白質が、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、または脱脂粉乳である、請求項２８に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３０】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンである、請求項２８に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３１】
前記希釈剤が、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含む、請求項２７に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３２】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項３１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３３】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項３１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３４】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項３１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３５】
約２から約８℃の温度で保管することができる、請求項２０に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３６】
周囲温度または約３０から約４０℃の温度でのアッセイにおいて使用することができる、請求項２０に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３７】
ａ．少なくとも一つの希釈剤を少なくとも一つのヒト合成ナトリウム利尿ペプチドと混合して、液体キャリブレータまたは対照を作る段階；
ｂ．このキャリブレータまたは対照のｐＨを測定する段階；および
ｃ．段階ｂ）において測定した液体キャリブレータまたは対照のｐＨに依存して、液体キャリブレータまたは対照のｐＨを約４．０から約６．５のｐＨに調整する段階
を含む、供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためのリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な液体キャリブレータまたは対照を製造する方法。
【請求項３８】
前記液体キャリブレータまたは対照のｐＨを約５．０から約６．０のｐＨに調整する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ヒト合成ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト合成心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト合成デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記液体キャリブレータまたは対照のｐＨが、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせで調整される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および少なくとも一つの殺生物剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記蛋白質が、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、または脱脂粉乳である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記希釈剤が、少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸、少なくとも一つの塩基、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用するための、約４．０から約６．５のｐＨを含む安定な供試試料。
【請求項５３】
少なくとも一つのヒト天然ナトリウム利尿ペプチドを含む、請求項５２に記載の供試試料。
【請求項５４】
前記ヒト天然ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである、請求項５３に記載の供試試料。
【請求項５５】
少なくとも一つの希釈剤を含む請求項５２に記載の供試試料。
【請求項５６】
前記希釈剤が、約４．０から約６．０のｐＨを有する、請求項５５に記載の供試試料。
【請求項５７】
前記希釈剤が、約５．４から約５．６のｐＨを有する、請求項５６に記載の供試試料。
【請求項５８】
約５％から約９５％（容量／容量）の希釈剤を含む、請求項５５に記載の供試試料。
【請求項５９】
約２０％から約９０％（容量／容量）の希釈剤を含む、請求項５８に記載の供試試料。
【請求項６０】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物を含む、請求項５５に記載の供試試料。
【請求項６１】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項６０に記載供試試料。
【請求項６２】
前記蛋白質が、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、または脱脂粉乳である、請求項６１に記載の供試試料。
【請求項６３】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンである、請求項６１に記載の供試試料。
【請求項６４】
前記希釈剤が、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含む、請求項６０に記載の供試試料。
【請求項６５】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項６４に記載の供試試料。
【請求項６６】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項６４に記載の供試試料。
【請求項６７】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項６４に記載の供試試料。
【請求項６８】
周囲温度または約３０から約４０℃の温度でのアッセイにおいて使用することができる、請求項５２に記載の供試試料。
【請求項６９】
供試試料中の天然ナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な供試試料であって、
約５％から約９５％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤；および
少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する血清、血漿、全血または他の体液由来の少なくとも一つの生体試料
を含み、
約４．０から約６．５のｐＨを有する供試試料。
【請求項７０】
前記希釈剤が、約５．０から約６．０のｐＨを有する、請求項６９に記載の供試試料。
【請求項７１】
前記希釈剤が、約５．４から約５．６のｐＨを有する、請求項７０に記載の供試試料。
【請求項７２】
約２０％から約９０％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を含む、請求項６９に記載の供試試料。
【請求項７３】
前記ヒト天然ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである、請求項６９に記載の供試試料。
【請求項７４】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物を含む、請求項６９に記載の供試試料。
【請求項７５】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項７４に記載供試試料。
【請求項７６】
前記蛋白質が、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、または脱脂粉乳である、請求項７５に記載の供試試料。
【請求項７７】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンである、請求項７５に記載の供試試料。
【請求項７８】
前記希釈剤が、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含む、請求項６９に記載の供試試料。
【請求項７９】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項７８に記載の供試試料。
【請求項８０】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項７８に記載の供試試料。
【請求項８１】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項７８に記載の供試試料。
【請求項８２】
周囲温度または約３０から約４０℃の温度でのアッセイにおいて使用することができる、請求項６９に記載の供試試料。
【請求項８３】
約４．０から約６．０のｐＨを有する約５％から約９５％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する血清、血漿、全血または他の体液由来の少なくとも一つの生体試料と混合して、約４．０から約６．５のｐＨを有する安定な供試試料を作る段階を含む、供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な供試試料を製造する方法。
【請求項８４】
前記ヒト天然ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
約７０％から約９０％（容量／容量）の希釈剤を少なくとも一つの生体試料と混合する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記希釈剤が、約５．４から約５．６のｐＨを有する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記蛋白質が、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、または脱脂粉乳である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記希釈剤が、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項９２】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
約４．０から約６．０のｐＨを有する約５％から約９５％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する血清、血漿、全血または他の体液由来の少なくとも一つの生体試料と混合して、約４．０から約６．５のｐＨを有する安定化された供試試料を作る段階を含む、供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な供試試料を安定化する方法。
【請求項９６】
前記ヒト天然ナトリウム利尿ペプチドが、ヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
約７０％から約９０％（容量／容量）の希釈剤を少なくとも一つの生体試料と混合する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記希釈剤が、約５．４から約５．６のｐＨを有する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記蛋白質が、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリン、または脱脂粉乳である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ポリマーが、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンである、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記希釈剤が、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０４】
前記緩衝液が、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液またはこれらの組み合わせである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記酸が、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記塩基が、水酸化ナトリウムである、請求項１０３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の記載）
本出願は、２００３年７月１６日出願の米国出願第１０／６２０，４７５号の一部係属出願である。前記出願は、本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明は、イムノアッセイなどのリガンド結合アッセイにおいて使用することができる、キャリブレータ、対照および供試試料を含む（しかし、これらに限定されない）安定な組成物、ならびに前記組成物を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
心房性ナトリウム利尿ペプチド（本明細書では、以後、「ＡＮＰ」と呼ぶ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（本明細書では、以後、「ＢＮＰ」と呼ぶ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（本明細書では、以後、「ＣＮＰ」と呼ぶ）、およびデンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（本明細書では、以後、「ＤＮＰ」と呼ぶ）は、各々、「ナトリウム利尿ペプチド」として知られているホルモンの一ファミリーの構成員である。ＡＮＰおよびＢＮＰは、広範な生物学的性質を共有しており、心臓ナトリウム利尿系に属する。ＡＮＰおよびＢＮＰは、両方とも、心筋細胞起源のものであるが、ＣＮＰは、内皮細胞起源のものである。ＤＮＰは、グリーンマンバ蛇の毒液から単離されたものであり、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰと構造的類似性を有する。
【０００４】
ＢＮＰは、ブタの脳から最初に単離されたためこの名を受け、故に、「ＢＮＰ」は、「脳性ナトリウム利尿ペプチド」を表すものであった。しかし、ＢＮＰは、心臓ナトリウム利尿システムに属するため、「脳」は、「Ｂ型」に変更された。従って、「ＢＮＰ」は、現在、「Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド」を指す。
【０００５】
ＡＮＰは、心房において心臓により分泌される。ＢＮＰは、主として心室から、冠状静脈洞を通して心臓より分泌される。ＢＮＰは、アミノ酸数１０８のポリペプチド前駆体として分泌される（Ｖａｌｌｉら．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１３４（５）：４３７−４４４（１９９９年１１月）参照）。ＢＮＰの成熟形は、二つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって閉環されたアミノ酸数１７の環と、アミノ酸数９のアミノ末端尾部と、アミノ酸数６のカルボキシ末端尾部とを有する、３２のアミノ酸から成る。ＡＮＰおよびＣＮＰも、二つのシステイン残基間のジスルフィド結合により閉環されたアミノ酸数１７の環を有する。この環内の１７のアミノ酸のうちの１１は、三分子間で保持されている。このアミノ酸数１７の環に加えて、ＡＮＰは、アミノ酸数６のアミノ末端尾部およびアミノ酸数５のカルボキシ末端尾部を有する。ＡＮＰは、ＡＮＰの主貯蔵形であるアミノ酸数１２６のプロＡＮＰ形として生産される。アミノ酸第９８と第９９の間の蛋白質分解性切断後、アミノ酸数２８の成熟ペプチドが、冠状静脈洞血漿において見いだされる（Ｙａｎｄｌｅ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄ．，２３５：５６１−５７６（１９９４）参照）。
【０００６】
ＣＮＰは、脳および脳脊髄液にあり、中枢神経系における三ペプチドのうち最も優勢である。ＣＮＰが心臓に存在することはまずない。プロＣＮＰは、活性ペプチドであるＣＮＰ−５３（アミノ酸第５１から第１０３）またはＣＮＰ−２２（アミノ酸第８２から第１０３）のいずれかに加工される、アミノ酸数１０３のペプチドである。アミノ酸数１７の環構造に加えて、ＣＮＰ−２２は、アミノ酸数５のアミノ末端尾部を有し、カルボキシ末端尾部は含有さない。ＣＮＰ−５３は、アミノ末端における３１のアミノ酸の伸長を除き、ＣＮＰ−２２と同じである。
【０００７】
前に述べたように、ＤＮＰは、グリーンマンバ蛇の毒液から単離された。ＤＮＰの成熟形は、３８以下のアミノ酸から成る。ＤＮＰ様免疫反応性（ＤＮＰ−ＬＩ）が、ヒト血漿において報告されており、このＤＮＰ−ＬＩの血漿中濃度は、うっ血性心不全の患者において高いことが判明した（Ｃａｔａｌｉｏｔｔｉら，Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．，７６：１１１−１１１９（２００１）参照）。加えて、合成ＤＮＰの注入は、血漿および尿のサイクリックグアノシン一リン酸増加に関連して、著しいナトリウム利尿および利尿を招く。同書。
【０００８】
一般大衆におけるヒト血漿中のＢＮＰの測定は、心臓病、例えばうっ血性心不全、虚血性心疾患、心房性細動および腎機能不全を反映することが判明した。実際、ヒト血漿中の高レベルのＢＮＰが、急性心筋梗塞後および無症状または潜在性心室機能不全中の心疾患において報告されている（Ｍｕｋｏｙａｍａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８７：１１４０２−１１４１２（１９９１）、Ｍｏｔｗａｎｉら，Ｌａｎｃｅｔ，３４１：１１０９−１１１３（１９９３）、Ｙｏｓｈｉｂａｙａｓｈｉら，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２７：４３４（１９９２）参照）。ＡＮＰの循環レベル上昇が、うっ血性心不全、慢性腎不全および重症高血圧症において見られる。ヒト血漿中のＣＮＰの存在は、ＣＮＰ−２２としてのこの不在または存在の報告とともに、未だ議論を呼んでいる（Ｙａｎｄｌｅ，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄ．，２３５：５６１−５７６（１９９４）参照）。
【０００９】
リガンド結合アッセイは、特異的結合蛋白質と選択的に反応するリガンドと一般に言われている物質の濃度を測定するための分析法である。特異的抗体と選択的に反応する抗原の濃度を測定するイムノアッセイは、リガンド結合アッセイの一類の一例である。
【００１０】
血漿中のヒトナトリウム利尿ペプチドを測定するためのリガンド結合アッセイ、例えばイムノアッセイは、当該技術分野では公知であり、市販されている。これらのイムノアッセイは、少なくとも一つのまたは二つの特定の抗体ならびに少なくとも一つのキャリブレータおよび理想的には少なくとも一つの対照の使用を要する。キャリブレータは、リガンド結合アッセイにおいて、試料の結果を計算する前に計器を較正するために使用される。こうしたアッセイにおいて使用されるキャリブレータおよび対照は、一般に、ヒト合成ナトリウム利尿ペプチドから作られる。ヒト合成ナトリウム利尿ペプチドは、様々な供給業者から市販されている。例えば、ヒト合成ＢＮＰは、株式会社ペプチド研究所（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；日本、大阪）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サニーヴェール）、Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州、ダブリン）およびＰｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、ベルモント）から市販されている。
【００１１】
天然および合成、両方のヒトナトリウム利尿ペプチドに伴う問題の１つは、これらが血漿および血清中で不安定であるということである。具体的には、プロテアーゼなどの酵素が、これらのペプチドを切断する。例えば、プロテアーゼは、ＢＮＰ（天然および合成）をこのアミノ酸鎖に沿って様々な位置で切断する。例えば、プロテアーゼ切断は、ＢＮＰのアミノ末端、アミノ酸第２−第３間で（Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，３１６：１２９−１３５（２００２））、およびこのカルボキシ末端、アミノ酸３０−３２間で、発生することが知られている。さらに、ＢＮＰのエンドペプチダーゼ切断も当該技術分野において知られている（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，１２：３２９−３３６（１９９４））。こうした切断は、問題である。キャリブレータおよび対照が、アッセイにおいて適切に機能するために、免疫反応性部位または特異的リガンド結合部位を有するヒトナトリウム利尿ペプチドが、このアッセイ中、所定の濃度で存在しなければならないためである。
【００１２】
この上、この不安定さの結果として、こうしたアッセイにおいて使用されるキャリブレータおよび対照は、（日本、大阪の塩野義製薬株式会社（Ｓｈｉｏｎｏｇｉ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）から入手できるシオノリア（Ｓｈｉｏｎｏｒｉａ）アッセイの場合のような）凍結乾燥形態または（カリフォルニア州、サンディエゴのＢｉｏｓｉｔｅ，Ｉｎｃ．から入手できるＴｒｉａｇｅ（登録商標）アッセイの場合のような）冷凍で、販売されている。凍結乾燥形態のキャリブレータおよび対照は、アッセイにおいて使用する前に溶媒中で再構成しなければならない。一旦再構成すると、これらのキャリブレータおよび対照は、非常に不安定なため、特定の時間内に使用しなければならない。（通常、約−２０℃またはこれより冷たい温度で）冷凍されているキャリブレータおよび対照は、アッセイにおいて使用するために解凍するまで、冷凍されたままである。これらのキャリブレータおよび対照は、試験前に、室温で解凍し、次いで、ボルテックスにかけるか転倒させてこれらのキャリブレータおよび対照を均質にする。冷凍キャリブレータおよび対照は、再冷凍することができず、一回しか使用することができず（すなわち、使い捨てである）、次いで、廃棄される。
【００１３】
キャリブレータおよび対照に加えて、イムノアッセイには、少なくとも一つの供試試料が必要である。通常、供試試料は、（通常、人間の患者からの）血清、血漿、全血または他の体液由来の生体試料である。この供試試料中の少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドのレベルは、イムノアッセイにおいて定量する。極めて高いナトリウム利尿ペプチドレベルを有する一部の試料は、分析前に希釈して、このペプチドレベルを正確に定量できるようにしなければならない。しかし、先だって説明したように、天然ヒトナトリウム利尿ペプチドに伴う問題の一つは、供試試料の場合でも、これらが不安定であることである。この上、この不安定さの結果として、供試試料を得て、一旦、これを希釈すると、短時間（すなわち、一時間未満；ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）Ａｓｓａｙ  Ｍａｎｕａｌ  ０６３００４９７，Ｒｅｖ．Ｃ，２００３−０６参照）のうちにイムノアッセイで使用しなければならない。こうした短い安定期間は、こうしたイムノアッセイを行う試験室にとって、特に、行わなければならないイムノアッセイの量が多い場合、問題になり得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
この結果、ヒトナトリウム利尿薬リガンド結合アッセイにおいて使用するために、こうしたアッセイにおいて長期間にわたって安定であり、簡単、迅速に使用でき、使用前に再構成または解凍する必要がない、新規キャリブレータおよび対照が、当該技術分野において必要とされている。加えて、こうしたアッセイにおいて使用することができる、長期間にわたって安定である供試試料も当該技術分野において必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要約）
１つの実施態様において、本発明は、供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためのリガンド結合アッセイ、例えばイムノアッセイにおいて使用することができる安定な液体キャリブレータおよび対照に関する。本発明の安定はキャリブレータおよび対照は、約４．０から約６．５、好ましくは約５．０から約６．０のｐＨを有する。
【００１６】
さらに、本発明のキャリブレータおよび対照は、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチド、好ましくは少なくとも一つのヒト合成ナトリウム利尿ペプチド、例えばヒト合成心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト合成デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドを含む。ナトリウム利尿ペプチドに加えて、本キャリブレータおよび対照は、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせを含むこともできる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【００１７】
本キャリブレータおよび対照は、少なくとも一つの希釈剤も含むことができる。この希釈剤は、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および少なくとも一つの殺生物剤を含むことができる。使用することができるナトリウム利尿安定化化合物の例には、蛋白質およびポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる蛋白質の例には、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリンまたは脱脂粉乳が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストラン、ポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。この希釈剤は、少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸、少なくとも一つの塩基、またはこれらの組み合わせをさらに含むことができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【００１８】
本発明のキャリブレータおよび対照は、様々な保管条件下で長期間にわたって安定を保つ。具体的には、本発明のキャリブレータおよび対照は、約２から約８℃の温度で長期間にわたって保管される場合、安定を保つ。加えて、本発明のキャリブレータおよび対照は、周囲温度で使用される場合、および約３０から約４０℃の温度、好ましくは約３４℃の温度で限られた期間（例えば、１分と６０分の間、好ましくは約２０から約３０分）使用される場合、安定を保つ。
【００１９】
第二の実施態様において、本発明は、リガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な液体キャリブレータおよび対照を製造する方法に関する。この方法の第一段階は、少なくとも一つの希釈剤を少なくとも一つのヒト合成ナトリウム利尿ペプチドと混合して、液体キャリブレータまたは対照を作ることを含む。第二段階は、この液体キャリブレータまたは対照のｐＨの測定を含む。第一段階における液体キャリブレータまたは対照のｐＨに依存して、液体キャリブレータまたは対照のｐＨを、このｐＨが約４．０から約６．５の範囲内、好ましくは約５．０から約６．０の範囲内になるように調整してもよい。このキャリブレータまたは対照のｐＨは、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせを使用して、調整することができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられる。
【００２０】
上に記載した方法において使用されるヒト合成ナトリウム利尿ペプチドは、ヒト合成心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト合成デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドであり得る。
【００２１】
上に記載した方法において使用される希釈剤は、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および少なくとも一つの殺生物剤を含むことができる。ナトリウム利尿安定化化合物の例には、少なくとも一つの蛋白質またはポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる蛋白質には、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリンまたは脱脂粉乳が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストランまたはポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。この希釈剤は、少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸、少なくとも一つの塩基またはこれらの組み合わせをさらに含有することができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
第三の実施態様において、本発明は、供試試料中の少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイ、例えばイムノアッセイにおいて使用することができる安定な供試試料に関する。本発明の安定な供試試料は、約４．０から約６．５、好ましくは約５．０から約６．０のｐＨを有する。
【００２３】
本発明の供試試料は、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチド、好ましくは少なくとも一つのヒト天然ナトリウム利尿ペプチド、例えばヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドを含有する少なくとも一つの生体試料を含む。本供試試料において使用される生体試料は、ヒト血清、ヒト血漿、ヒト全血または他のヒト体液由来のものである。本供試試料は、少なくとも一つの希釈剤も含有することができる。供試試料中の希釈剤の量は、約５％から約９５％（容量／容量）、好ましくは約２０％から約９０％（容量／容量）である。この希釈剤は、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および場合により少なくとも一つの殺生物剤を含むことができる。使用することができるナトリウム利尿安定化化合物の例には、少なくとも一つの蛋白質またはポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる蛋白質の例には、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリンまたは脱脂粉乳が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストランまたはポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。この希釈剤は、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含有することができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【００２４】
本発明の供試試料は、様々な保管条件下で長期間にわたって安定を保つ。具体的には、本発明の供試試料は、周囲温度で（少なくとも二十四（２４）時間の期間にわたって）使用される場合、安定を保つ。
【００２５】
第四の実施態様において、本発明は、リガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な供試試料を製造する方法に関する。この方法は、約５％から約９５％（容量／容量）、好ましくは約２０％から約９０％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を、血清、血漿、全血または他の体液由来の少なくとも一つの生体試料と混合して、約４．０から約６．５の、好ましくは約５．０から約６．０の範囲内のｐＨを有する安定な供試試料を作ることを含む。この生体試料は、ヒトナトリウム利尿ペプチド、例えば、ヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（しかし、これらに限定されない）であり得るヒトナトリウム利尿ペプチドを少なくとも１つ含有する。この生体試料は、血清、血漿、全血または他の体液由来のものである。
【００２６】
上に記載した方法において使用される希釈剤は、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および場合により少なくとも一つの殺生物剤を含むことができる。ナトリウム利尿安定化化合物の例には、少なくとも一つの蛋白質またはポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる蛋白質の例には、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリンまたは脱脂粉乳が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストランまたはポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。この希釈剤は、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含有することができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【００２７】
第五の実施態様において、本発明は、リガンド結合アッセイにおいて使用するための供試試料を安定させる方法に関する。この方法は、約５％から約９５％（容量／容量）、好ましくは約２０％から約９０％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を、血清、血漿、全血または他の体液由来の少なくとも一つの生体試料と混合して、約４．０から約６．５の、好ましくは約５．０から約６．０の範囲内のｐＨを有する安定な供試試料を作ることを含む。この生体試料は、ヒトナトリウム利尿ペプチド、例えば、ヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチド（しかし、これらに限定されない）であり得るヒトナトリウム利尿ペプチドを少なくとも１つ含有する。この生体試料は、血清、血漿、全血または他の体液由来のものである。
【００２８】
上に記載した方法において使用される希釈剤は、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および場合により少なくとも一つの殺生物剤を含むことができる。ナトリウム利尿安定化化合物の例には、少なくとも一つの蛋白質またはポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる蛋白質の例には、ウシ血清アルブミン、ウシガンマグロブリンまたは脱脂粉乳が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストランまたはポリビニルピロリドンが挙げられるが、これらに限定されない。この希釈剤は、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせをさらに含有することができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。
【００２９】
上で特定した方法により調製した安定化された供試試料は、調製した直後にリガンド結合アッセイにおいて使用することができ、またはもっと後でリガンド結合アッセイにおいて使用することができる。例えば、この安定化された供試試料は、試験室条件下、周囲温度で維持される場合、上に記載した方法に従って安定させてから少なくとも二十四（２４）時間後にリガンド結合アッセイにおいて使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（発明の詳細な説明）
１つの実施態様において、本発明は、イムノアッセイなどのリガンド結合アッセイにおいて使用することができる、安定なキャリブレータおよび対照に関する。より具体的には、本発明は、液体形態であり、供試試料中の少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用することができる、安定なキャリブレータおよび対照に関する。本供試試料は、血漿、血清、全血、または他の体液、例えば、限定ではないが、唾液、痰など（但し、前記体液が、これらの回収法において安定である場合に限る）に由来する少なくとも一つの生体試料を含む。この生体試料は、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドも含有する。本発明のキャリブレータおよび対照は、液体形態であるため、当該技術分野において知られている凍結乾燥および冷凍キャリブレータおよび対照のように使用前に再構成または解凍する必要がない。加えて、本発明のキャリブレータおよび対照は、様々な保管条件および温度のもとで長期間にわって安定である。
【００３１】
本発明のキャリブレータおよび対照は、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有し、故に、リガンド結合アッセイにおいて使用して供試試料中のこれらのペプチドのレベルを測定することができる。天然または合成、いずれかのナトリウム利尿ペプチドを、本発明のキャリブレータおよび対照において使用することができる。好ましくは、このナトリウム利尿ペプチドは、合成ナトリウム利尿ペプチドであり、ヒトのもの、例えばヒト合成心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト合成デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドである。ヒト合成心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト合成Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドおよびヒト合成デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドは、株式会社ペプチド研究所（日本、大阪）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サニーヴェール）、Ｓｙｎｐｅｐ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州、ダブリン）およびＰｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、ベルモント）を含む（しかし、これらに限定されない）様々な供給業者から市販されている。本発明のキャリブレータ中のナトリウム利尿ペプチドの量は、０から約１０，０００ｐｇ／ｍＬであり、好ましくは約２５から約５，０００ｐｇ／ｍＬの量である。本発明の対照中のナトリウム利尿ペプチドの量は、約２５から４０００ｐｇ／ｍＬであり、好ましくは約４０から約２０００ｐｇ／ｍＬの量である。
【００３２】
ナトリウム利尿ペプチドに加えて、本キャリブレータおよび対照は、多数の成分を含む希釈剤中に存する。あらゆる希釈剤を本発明のキャリブレータおよび対照において使用することができる。例えば、本発明のキャリブレータおよび対照において使用することができる希釈剤は、当該技術分野において知られている技法を使用して製造することができるか、市販供給業者から購入することができる。特注製の希釈剤、市場で購入した希釈剤、両方の較正も、本発明の範囲に包含される。
【００３３】
この希釈剤の組成物は、キャリブレータまたは対照によって変わり得る。例えば、希釈剤は、水を含むことができる。
【００３４】
この希釈剤は、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物も含むことができる。ここで用いる用語「ナトリウム利尿安定化化合物」は、ナトリウム利尿ペプチドを安定させるためおよびプロテアーゼなどの酵素による分解を防止するために使用することができる化合物を指す。幾つかのナトリウム利尿安定化化合物が、当該技術分野において知られており、本発明のキャリブレータおよび対照において使用することができる。これらの化合物には、蛋白質、ポリマーおよびプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる蛋白質の例には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシガンマグロブリン（ウシＩｇＧ）、または脱脂粉乳（Ｎｅｓｔｌｅ（登録商標）Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）Ｎｏｎｆａｔ  Ｄｒｙ  Ｍｉｌｋなど）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール（約２，０００から約２０，０００ダルトンの分子量を有するもの）、デキストラン（約５，０００から約６７０，０００ダルトンの分子量を有するもの）、硫酸デキストラン（約５，０００から約１，０００，０００ダルトンの分子量を有するもの）またはポリビニルピロリドン（約４０，０００ダルトンの分子量を有するもの）が挙げられるが、これらに限定されない。ウシ血清アルブミン、ウシＩｇＧ、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストランおよびポリビニルピロリドンは、すべて、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。使用することができるプロテアーゼ阻害剤の例には、ＥＤＴＡまたはアプロチニンが挙げられるが、これらに限定されない。血液のｍＬあたり約１ｍｇのＥＤＴＡおよび血液のｍＬあたり約５０ｋＩＵのアプロチニン（Ｍｕｒｄｏｃｈら，Ｈｅａｒｔ，７８：５９４−５９７（１９９７））を使用してＢＮＰ蛋白分解の防止を助長できることは、当該技術分野において知られている。ＥＤＴＡおよびアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤は、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。この希釈剤中のナトリウム利尿安定化化合物の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬであり得、好ましくは約１ｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬの量であり得る。
【００３５】
加えて、この希釈剤は、少なくとも一つの殺生物剤および／または保存薬も含むことができる。ここで用いる用語「殺生物剤」は、様々な異なる生物を殺すために使用することができる物質を指す。この希釈剤における使用に適する殺生物剤および／または保存薬は、当業者が常用法を使用して決めることができる。本発明において使用することができる適する殺生物剤および／または保存薬の例には、ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００の活性成分は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンである）およびアジ化ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００は、変性グリコールおよびアルキルカルボキシレートなどの多数の不活性成分も含有する。この希釈剤中の殺生物剤および／または保存薬の量は、約０．００１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬであり得、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの量であり得る。
【００３６】
さらに、この希釈剤は、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの希釈剤、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせも含むことができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。この緩衝液は、希釈剤および結果として生じるキャリブレータまたは対照のｐＨを安定させることができるように、所望のｐＨで良好な緩衝能力を有することが、好ましい。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、塩酸（ＨＣｌ）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。希釈剤中の緩衝液または酸の量は、約１ｍＭから約５００ｍＭであり得、好ましくは約５から約２００ｍＭの量であり得る。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が挙げられるが、これに限定されない。希釈剤中の塩基の量は、約０．０１ｍＭから約５０ｍＭであり得、好ましくは約１．０ｍＭから約１０ｍＭの量であり得る。
【００３７】
この希釈剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および／または少なくとも一つの界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０を含む（しかし、これらに限定されない）あらゆるタイプのＴｗｅｅｎ（登録商標）を使用することができ、これらは、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている］も含むことができる。希釈剤中のＮａＣｌの量は、約２５ｍＭから約５００ｍＭであり得、好ましくは約１００ｍＭから約４００ｍＭの量であり得る。希釈剤中の界面活性剤の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬであり得、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬの量であり得る。
【００３８】
加えて、上で述べたように、市販の希釈剤を使用することができる。例えば、本発明の譲受人であるＡｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＩＭｘ  ＭＥＩＡ  ＃２  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏ．８３７４−０４）として市販されている、「ＭＥＩＡ２」として知られている希釈剤を使用することができる。ＭＥＩＡ２は、０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓバッファ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％（重量／容量）ＮａＮ３を含有し、７．５のｐＨを有する。
【００３９】
希釈剤に加えて、本キャリブレータおよび対照は、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせも含有することができる。これらの緩衝液、塩基または酸は、希釈剤中の存在する緩衝液、塩基および／または酸に加えて、または希釈剤が緩衝液、塩基および／または酸を一切含有しない場合には別成分として、キャリブレータおよび対照中に存在し得る。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、塩酸（ＨＣｌ）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウムが挙げられるが、これに限定されない。本キャリブレータまたは対照中の緩衝液、酸、塩基またはこれらの組み合わせの量は、約１ｍＭから約５００ｍＭであり得、好ましくは約５から約２００ｍＭの量であり得る。
【００４０】
上で述べたように、本発明のキャリブレータおよび対照は、安定であり、液体形態である。本発明のキャリブレータおよび対照の安定性の鍵は、ｐＨである。より具体的には、本発明の液体キャリブレータおよび対照は、約４．０から約６．５のｐＨで安定であることを発見した。好ましくは、本発明の液体キャリブレータおよび対照のｐＨは、約５．０から約６．０である。
【００４１】
約４．０から約６．５のｐＨを有する本発明のキャリブレータおよび対照は、長期にわたって、様々な保管条件下で安定である。例えば、本発明のキャリブレータおよび対照は、約２から約８℃の温度で、約十二（１２）か月またはそれ以上の期間にわたって保管される場合、安定を保つ。約２℃から約８℃で本発明のキャリブレータおよび対照を保管できることは、非常に便利であり、これらの試薬の複数回使用を可能ならしめる。対照的に、当該技術分野において知られている冷凍キャリブレータおよび対照は、アッセイを行う前に解凍しなければならない使い捨て試薬である。これらのキャリブレータおよび対照は、再冷凍することができず、解凍し、アッセイにおいて使用した後、捨てなければならない。当該技術分野において知られている凍結乾燥対照は、再構成後、２から８℃で１週間しか安定でなく、廃棄しなければならない。
【００４２】
加えて、約４．０から約６．５のｐＨを有する本発明のキャリブレータおよび対照は、試験室条件下、周囲温度で使用される場合、数時間にわたって安定を保つ。加えて、本発明のキャリブレータおよび対照は、約３０から約４０℃の温度に暴露された場合、好ましくは３４℃の温度で、限られた期間にわたって（例えば、限定ではないが、約１分から約６０分、好ましくは約２０分から約３０分の期間にわたって）安定している。
【００４３】
もう１つの実施態様において、本発明は、イムノアッセイなどのリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定なキャリブレータおよび対照を製造する方法に関する。本発明のこの方法は、少なくとも一つの希釈剤を少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドと混合して、液体キャリブレータまたは対照を作ることを含む。この希釈剤は、本明細書において前に記載したいずれの組成物を有していてもよく、ならびにこのナトリウム利尿ペプチドは、これもまた本明細書において前に記載した、いずれのナトリウム利尿ペプチドであってもよい。好ましくは、この希釈剤は、所望のｐＨで良好な緩衝能力を有する少なくとも一つの緩衝液を含む。場合により、この希釈剤を調製したら、これを約３０分から約２４時間の期間にわたって、約５０から約６０℃の温度に、場合により加熱してもよい。好ましくは、この希釈剤は、水浴の中で、約５５℃の温度で、約１時間の期間にわたって加熱する。
【００４４】
この希釈剤とナトリウム利尿ペプチドは、均質溶液が得られるまで、約１５℃から約３０℃の温度、好ましくは約１９℃から約２３℃の温度で混合する。均質な液体キャリブレータまたは対照を調製したら、当該技術分野において知られている技法を用いてｐＨメータを使用してこのｐＨを測定する。液体キャリブレータまたは対照のｐＨが、約４．０から約６．５の範囲内にあると判定された場合には、この液体キャリブレータおよび対照のｐＨは、調整または安定化の必要が一切なく、下にさらに詳細に記載するものなどの後続の加工段階に付すことができる。しかし、液体キャリブレータまたは対照のｐＨが、約４．０から約６．５の範囲内にない場合には、当該技術分野において知られている常用法を使用して、このｐＨを調整するか、安定させる。例えば、液体キャリブレータまたは対照のｐＨが、約４．０未満であると判定された場合には、この液体キャリブレータまたは対照のｐＨが約４．０から約６．５の範囲内になるまで、繰り返し、少なくとも一つの塩基、例えば水酸化ナトリウム、少なくとも一つの緩衝液またはこれらの組み合わせを少量ずつ、好ましくは一滴ずつこの液体キャリブレータまたは対照に添加し、ｐＨを測定する。同様に、液体キャリブレータまたは対照のｐＨが、約６．５より高いと判定された場合には、この液体キャリブレータまたは対照のｐＨが約４．０から約６．５の範囲内になるまで、繰り返し、少なくとも一つの緩衝液、少なくとも一つの酸またはこれらの組み合わせを少量ずつ、好ましくは一滴ずつこの液体キャリブレータまたは対照に添加し、ｐＨを測定する。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸、塩酸またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
約４．０から約６．５の範囲内のｐＨを有する液体キャリブレータまたは対照を調製したら、このキャリブレータまたは対照を、約３０分から約２４時間の期間にわたって、約５０℃から約６０℃の温度に、場合により加熱することができる。好ましくは、このキャリブレータまたは対照は、水浴の中で約５５℃の温度で約１時間の期間にわたって加熱する。キャリブレータまたは対照を加熱した後、下に記載するものなどの後続の加工段階にこれを付すことができる。
【００４６】
約４．０から約６．５の範囲内のｐＨを有する液体キャリブレータまたは対照を調製したら、このキャリブレータまたは対照は、当該技術分野において知られている技法を使用して、後続の加工段階、例えばボルテックスにかける段階および／または濾過段階（しかし、これらに限定されない）に付すことができる。これらの段階が完了したら、キャリブレータまたは対照をバイオクリーンバイアルまたは滅菌バイアル（プラスチックまたはシリコーン処理したガラス）に入れ、これに合うようにラベルを貼り付ける。キャリブレータまたは対照をバイオクリーンバイアルまたは滅菌バイアルに入れたら、アッセイにおいて使用するために、約２℃から約８℃で、１２ヶ月までまたはそれ以上にわたって保管することができる。
【００４７】
第三の実施態様において、本発明は、イムノアッセイなどのリガンド結合アッセイにおいて使用することができる安定な供試試料に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する少なくとも一つの生体試料を含有する安定な供試試料に関する。この生体試料中の少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドのレベルは、リガンド結合アッセイにおいて定量することができる。この生体試料は、血漿、血清、全血または他の体液、例えば、限定でないが、唾液、痰など（但し、前記体液が、これらの回収法において安定である場合に限る）に由来する。加えて、本発明の供試試料は、少なくとも二十四（２４）時間にわたって安定であり、様々な保管条件および温度のもとで使用することができる。
【００４８】
上で簡単に述べたように、本供試試料は、血清、血漿、全血または他の体液に由来し、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する、少なくとも一つの生体試料を含有する。好ましくは、このナトリウム利尿ペプチドは、ヒトのものであり、ヒト血清、ヒト血漿、ヒト全血または他のヒト体液由来の生体試料から得られるか、ヒト血清、ヒト血漿、ヒト全血または他のヒト体液由来の生体試料の中に含有されている天然ナトリウム利尿ペプチドである。このヒトナトリウム利尿ペプチドは、ヒト天然心房性ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、ヒト天然Ｃ型ナトリウム利尿ペプチドまたはヒト天然デンドロアスピス（Ｄｅｎｄｒｏａｓｐｉｓ）ナトリウム利尿ペプチドであり得る。
【００４９】
この（これらの）生体試料に加えて、本供試試料は、多数の成分を含む希釈剤を含有する。あらゆる希釈剤を本発明の供試試料において使用することができる。例えば、本発明の供試試料において使用することができる希釈剤は、当該技術分野において知られている技法を使用して製造することができ、または市販供給業者から購入することができる。特注製の希釈剤、市場で購入した希釈剤、両方の較正も、本発明の範囲に包含される。
【００５０】
この希釈剤の組成物は、この供試試料によって変わり得る。例えば、希釈剤は、水を含むことができる。
【００５１】
この希釈剤は、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物も含むことができる。ここで用いる用語「ナトリウム利尿安定化化合物」は、ナトリウム利尿ペプチドを安定させるためおよびプロテアーゼなどの酵素による分解を防止するために使用することができる化合物を指す。幾つかのナトリウム利尿安定化化合物が、当該技術分野において知られており、本発明のキャリブレータおよび対照において使用することができる。これらの化合物には、蛋白質、ポリマーおよびプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができる蛋白質の例には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシガンマグロブリン（ウシＩｇＧ）、または脱脂粉乳（Ｎｅｓｔｌｅ（登録商標）Ｃａｒｎａｔｉｏｎ（登録商標）Ｎｏｎｆａｔ  Ｄｒｙ  Ｍｉｌｋなど）が挙げられるが、これらに限定されない。使用することができるポリマーの例には、ポリエチレングリコール（約２，０００から約２０，０００ダルトンの分子量を有するもの）、デキストラン（約５，０００から約６７０，０００ダルトンの分子量を有するもの）、硫酸デキストラン（約５，０００から約１，０００，０００ダルトンの分子量を有するもの）またはポリビニルピロリドン（約４０，０００ダルトンの分子量を有するもの）が挙げられるが、これらに限定されない。ウシ血清アルブミン、ウシＩｇＧ、ポリエチレングリコール、デキストラン、硫酸デキストランおよびポリビニルピロリドンは、すべて、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。使用することができるプロテアーゼ阻害剤の例には、ＥＤＴＡまたはアプロチニンが挙げられるが、これらに限定されない。血液のｍＬあたり約１ｍｇのＥＤＴＡおよび血液のｍＬあたり約５０ｋＩＵのアプロチニン（Ｍｕｒｄｏｃｈら，Ｈｅａｒｔ，７８：５９４−５９７（１９９７））を使用してＢＮＰ蛋白分解の防止を助長できることは、当該技術分野において知られている。ＥＤＴＡおよびアプロチニンなどのプロテアーゼ阻害剤は、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入することができる。この希釈剤中のナトリウム利尿安定化化合物の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約４００ｍｇ／ｍＬであり得、好ましくは約１ｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬの量であり得る。
【００５２】
加えて、この希釈剤は、少なくとも一つの殺生物剤および／または保存薬も含むことができる。ここで用いる用語「殺生物剤」は、様々な異なる生物を殺すために使用することができる物質を指す。この希釈剤における使用に適する殺生物剤および／または保存薬は、当業者が常用法を使用して決めることができる。本発明において使用することができる適する殺生物剤および／または保存薬の例には、アジ化ナトリウムおよびＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられるが、これらに限定されない（ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００の活性成分は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンおよび２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンである。ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００は、変性グリコールおよびアルキルカルボキシレートなどの多数の不活性成分も含有する）。この希釈剤中の殺生物剤および／または保存薬の量は、約０．００１ｍｇ／ｍＬから約５０ｍｇ／ｍＬであり得、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの量であり得る。
【００５３】
さらに、この希釈剤は、少なくとも一つの緩衝液、もしくは少なくとも一つの酸、もしくは少なくとも一つの塩基、または少なくとも一つの希釈剤、少なくとも一つの酸および／または少なくとも一つの塩基の組み合わせも含むことができる。使用することができる緩衝液の例には、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム／酢酸、酢酸カリウム／酢酸など）、クエン酸緩衝液（クエン酸ナトリウム／クエン酸、クエン酸カリウム／クエン酸など）、リン酸緩衝液（リン酸一ナトリウム／二ナトリウムなど）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液は、希釈剤および結果として生じるキャリブレータまたは対照のｐＨを安定させることができるように、所望のｐＨで良好な緩衝能力を有することが、好ましい。使用することができる酸の例には、酢酸、クエン酸、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、塩酸（ＨＣｌ）またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。希釈剤中の緩衝液または酸の量は、約１ｍＭから約５００ｍＭであり得、好ましくは約５から約２００ｍＭの量であり得る。使用することができる塩基の例には、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が挙げられるが、これに限定されない。希釈剤中の塩基の量は、約０．０１ｍＭから約５０ｍＭであり得、好ましくは約１．０ｍＭから約１０ｍＭの量であり得る。
【００５４】
この希釈剤は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および／または少なくとも一つの界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）［Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０を含む（しかし、これらに限定されない）あらゆるタイプのＴｗｅｅｎ（登録商標）を使用することができ、これらは、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている］も含むことができる。希釈剤中のＮａＣｌの量は、約２５ｍＭから約５００ｍＭであり得、好ましくは約１００ｍＭから約４００ｍＭの量であり得る。希釈剤中の界面活性剤の量は、約０．０１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬであり得、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬから約３．０ｍｇ／ｍＬの量であり得る。
【００５５】
加えて、上で述べたように、市販の希釈剤を使用することができる。例えば、本発明の譲受人であるＡｂｂｏｔｔ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからＩＭｘ  ＭＥＩＡ  ＃２  Ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｏ．８３７４−０４）として市販されている、「ＭＥＩＡ２」として知られている希釈剤を、下の実施例１、２および３に示すように希釈剤緩衝液を所望のｐＨに調整した後、使用することができる。ＭＥＩＡ２は、０．０６Ｍ  Ｔｒｉｓバッファ（ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇａｍ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％（重量／容量）ＮａＮ３を含有し、７．５のｐＨを有する。
【００５６】
本供試試料において使用される希釈剤のｐＨは、約４．０から６．０、好ましくは約５．４から約５．６である。本供試試料に含有される希釈剤の量は、約５％から約９５％（容量／容量）、好ましくは約２０％から約９０％（容量／容量）である。
【００５７】
上で述べたように、本発明の供試試料は、安定である。本発明の供試試料の安定性の鍵は、ｐＨである。より具体的には、本発明の供試試料は、約４．０から約６．５のｐＨで安定であることを発見した。好ましくは、本発明の供試試料のｐＨは、約５．０から約６．０である。
【００５８】
約４．０から約６．５のｐＨを有する本発明の供試試料は、試験室条件下、周囲温度で使用される場合、少なくとも二十四（２４）時間、安定である。対照的に、当該技術分野において知られている供試試料は、希釈された後、１時間またはそれ以下しか安定でない。
【００５９】
もう１つの実施態様において、本発明は、イムノアッセイなどのリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な供試試料を製造する方法に関する。本発明のこの方法は、約４．０から約６．０、好ましくは約５．４から５．６のｐＨを有する、約５％から約９５％（容量／容量）、好ましくは約２０％から約９０％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を、血漿、血清、全血または他の体液に由来し、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する少なくとも一つの生体試料と混合して、安定な供試試料を作ることを含む。この希釈剤は、本明細書において前に記載したいずれの組成物を有していてもよく、ならびにこのナトリウム利尿ペプチドは、これもまた本明細書において前に記載した、いずれのヒト天然ナトリウム利尿ペプチドであってもよい。好ましくは、この希釈剤は、所望のｐＨで良好な緩衝能力を有する少なくとも一つの緩衝液を含む。
【００６０】
この希釈剤および生体試料は、均質溶液が得られるまで、約１５℃から約３０℃の温度、好ましくは約１９℃から約２３℃の温度で混合することができる。結果として生じる均質な供試試料のｐＨは、約４．０から約６．５の範囲内であり得る。安定な供試試料を調製した後、標準的なプロトコルに従って、これをイムノアッセイにおいて使用することができる。
【００６１】
もう１つの実施態様において、本発明は、イムノアッセイなどのリガンド結合アッセイにおいて使用するための供試試料を安定させる方法に関する。本発明のこの方法は、約４．０から約６．０、好ましくは約５．４から５．６のｐＨを有する、約５％から約９５％（容量／容量）、好ましくは約２０％から約９０％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を、血漿、血清、全血または他の体液に由来し、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する少なくとも一つの生体試料と混合して、安定な供試試料を作ることを含む。この希釈剤は、本明細書において前に記載したいずれの組成物を有していてもよく、ならびにこのナトリウム利尿ペプチドは、これもまた本明細書において前に記載した、いずれのヒト天然ナトリウム利尿ペプチドであってもよい。好ましくは、この希釈剤は、所望のｐＨで良好な緩衝能力を有する少なくとも一つの緩衝液を含む。
【００６２】
この希釈剤および生体試料は、均質溶液が得られるまで、約１５℃から約３０℃の温度、好ましくは約１９℃から約２３℃の温度で混合することができる。結果として生じる均質な供試試料のｐＨは、約４．０から約６．５の範囲内であり得る。安定な供試試料を調製した後、標準的なプロトコルに従って、これをイムノアッセイにおいて使用することができる。より具体的には、安定化された供試試料は、調製直後にリガンド結合アッセイにおいて使用することができ、またはもっと後でリガンド結合アッセイにおいて使用することができる。例えば、この安定化された供試試料は、試験室条件下、周囲温度で維持される場合、上に記載した方法に従って安定させてから少なくとも二十四（２４）時間後にリガンド結合アッセイにおいて使用することができる。
【００６３】
さて、例として、限定としてではなく、本発明の実施例を与えよう。
【実施例１】
【００６４】
ＢＮＰイムノアッセイ
以下の処方を有するバルク希釈剤（「Ｄｉｌ」）を調製した：
試験対照希釈剤  ＝  ４％ＢＳＡ、１％ＰＥＧ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、１％デキストラン、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤。
Ｄｉｌ１  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤。
Ｄｉｌ２  ＝  Ｄｉｌ１と同じ。
Ｄｉｌ３  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤および０．１％Ｔｗｅｅｎ。
Ｄｉｌ４  ＝  Ｄｉｌ３と同じ。
Ｄｉｌ５  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤および１０ｍＭ  ＤＴＰＡ。
Ｄｉｌ６  ＝  Ｄｉｌ５と同じ。
Ｄｉｌ７  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤、０．１％Ｔｗｅｅｎ、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ。
Ｄｉｌ８  ＝  Ｄｉｌ７と同じ。
Ｄｉｌ９  ＝  Ｄｉｌ１と同じ。
Ｄｉｌ１０  ＝  Ｄｉｌ２と同じ。
Ｄｉｌ１１  ＝  Ｄｉｌ３と同じ。
Ｄｉｌ１２  ＝  Ｄｉｌ４と同じ。
Ｄｉｌ１３  ＝  Ｄｉｌ５と同じ。
Ｄｉｌ１４  ＝  Ｄｉｌ６と同じ。
Ｄｉｌ１５  ＝  Ｄｉｌ７と同じ。
Ｄｉｌ１６  ＝  Ｄｉｌ８と同じ。
【００６５】
上の希釈剤の各々を調製した後、ｐＨを判定した。希釈剤７から１６のｐＨは、調整した。具体的には、ＤＴＰＡを含有しなかった希釈剤について、ＨＣｌを（一滴ずつ）添加してこのｐＨを（約５．６に）調整した。ＤＴＰＡを含有した希釈剤については、ＮａＯＨを使用してｐＨを（約５．６または７．４に）調整した。希釈剤１から４については、ｐＨを調整しなかった。各希釈剤の最終ｐＨを下の表１に示す。
【００６６】
【表１】
2007531870.tif 000002
【００６７】
試験対照希釈剤のｐＨは、７．４であった。
【００６８】
＊ｐＨの最終調整後、これらの希釈剤（およびこの対照）を熱にも付した。具体的には、これらの希釈剤を、水浴の中で約５６℃の温度で約１時間加熱した。
【００６９】
上の希釈剤の各々を使用して、異なるレベルのヒト合成ＢＮＰ（株式会社ペプチド研究所（日本、大阪）から購入）を含有する三つの異なるキャリブレータを調製した。キャリブレータ＃Ａは、ヒト合成ＢＮＰを一切含有しなかった。キャリブレータ＃Ｂは、５０ピコグラム／ミリリットルのヒト合成ＢＮＰを含有した。キャリブレータ＃Ｆは、２０００ピコグラム／ミリリットルのヒト合成ＢＮＰを含有した。各キャリブレータを濾過し、キャリブレータびんに入れて、３７℃で１４日までの間、保管した。
【００７０】
ＢＮＰイムノアッセイは、ＡｘＳＹＭ（登録商標）計器（この計器は、米国特許第５，３５８，６９１号に記載されている）を用いて行った。上に記載したように調製したキャリブレータに加えて、以下の試薬をこのアッセイにおいて使用した。
【００７１】
１．モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１０６．３（捕捉抗体）。このＭＡｂは、ＢＮＰペプチドのアミノ酸第５−第１３に結合する。モノクローナル抗体１０６．３は、Ｓｃｉｏｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、サニーヴェール）から市販されており、米国特許第６，３７６，２０７号に記載されている。このアッセイにおいて使用するために、米国特許第６，３７６，２０７号に記載されている技法を使用して、ＭＡｂ  １０６．３を微粒子に塗布した。具体的には、ＥＤＡＣカップリングを利用して、ＭＡｂ  １０６．３を０．２μｍサイズのカルボキシレート変性ポリスチレン粒子（インディアナ州、インディアナポリスのＳｅｒａｄｙｎ，Ｉｎｃ．から市販されているもの）に塗布した（一般に、ＥＤＡＣは、第一アミンと結合させるアミドのためのカルボキシル活性化剤として使用される。加えて、これは、リン酸基と反応する。これは、蛋白質を核酸に架橋させるペプチド合成において、および免疫複合体の作成において使用される。ＥＤＡＣの化学式は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩である。ＥＤＡＣは、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランス）から市販されている）。粒子を洗浄し、ＢＳＡを上塗りした。最終洗浄後、スクロース、アジ化ナトリウムおよびＢＳＡを含有する緩衝液中、２から８℃で、粒子を保管した。
【００７２】
２．モノクローナル抗体ＢＣ２０３（レポーター抗体）。このＭＡｂは、ＢＮＰペプチドのアミノ酸第２７−第３２に結合する。モノクローナル抗体ＢＣ２０３は、塩野義製薬株式会社（日本、大阪）から入手できる。モノクローナル抗体ＢＣ２０３をアルカリホスファターゼに共有結合させる。ＢＣ２０３は、トラウト試薬（Ｔｒａｕｔ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（これは、２−イミノチオランであり、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランス）から市販されている）およびＳＭＣＣ（ＳＭＣＣは、ヘテロ二官能性架橋剤であり、この式は、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートである。ＳＭＣＣは、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ（フランス）から市販されている）を使用する典型的なカップリング手順で、Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｄｉａｇｏｎｓｔｉｃｓ（英国、スコットランドのＤｕｎｄｅｅ）により、アルカリホスファターゼに共有結合させた。このストック用共有結合体は、ＢＳＡ、魚ゼラチン、Ｂｒｉｊ−３５（Ｂｒｉｇ−３５は、ポリオキシエチレングリコールドデシルエーテルであり、ミズーリ州、セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている界面活性剤である）およびアジ化ナトリウムを含有する緩衝液中で保管した。
【００７３】
３．イリノイ州、アボットパークのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている、リン酸４−メチルウンベリフェリル基質（０．１  アジ化ナトリウムを含有する緩衝液中、１．２ｍＭ）。
【００７４】
４．ＡｘＳＹＭ（登録商標）計器システムは、二（２）つの緩衝液を使用する：Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌ  ＷａｓｈおよびＬｉｎｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔ。Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈは、アジ化ナトリウムおよび抗菌剤を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩水であり、粒状反応混合物を洗浄するために使用される。Ｌｉｎｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔは、アジ化ナトリウムおよび抗菌剤を含有するリン酸緩衝液であり、各々の吸引と吸引の間にＡｘＳＹＭ（登録商標）プローブをすすぐために使用される。Ｍｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌ  ＷａｓｈおよびＬｉｎｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている。
【００７５】
スクロース、アジ化ナトリウムおよびＢＳＡを含有する緩衝液中の捕捉抗体を塗布した０．２μｍ微粒子を、サンプリングプローブによってサンプリングセンター内の適切な反応容器壁にピペッティングした。上の表１に記載したキャリブレータのうちの１つを含有するアリコートを微粒子として同反応容器壁に加えて、反応混合物を作った。この反応容器をプロセッシングセンターに移した。反応混合物を約１２分間、約３４℃の温度でインキュベートした。インキュベートした後、この反応混合物のアリコートをＡｘＳＹＭ（登録商標）計器のマトリックスセルに移した。次いで、反応混合物を、１００μＬの適用量  ｘ  １のＭａｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈで洗浄して、捕捉されなかった一切のキャリブレータを除去した。
【００７６】
ＢＳＡ、魚ゼラチン、Ｂｒｉｊ−３およびアジ化ナトリウムを含有する緩衝液中、約０．７５μｇ／ｍＬのＭＡｂ  ＢＣ２０３共有結合体を、このマトリックスセルに計量分配し、得られた配合物を約１２分間、約３４℃の温度でインキュベートした。マトリックスセルを５０μＬの適用量  ｘ  ５のＭａｔｒｉｘ  Ｃｅｌｌ  Ｗａｓｈで洗浄して、結合していない材料を除去した。
【００７７】
アミノメチルリン酸緩衝液（１．２ｍＭ）中の基質、リン酸４−メチルウンベリフェリル（ＭＵＰ）の溶液をこのマトリックスセルに添加し、４−メチルウンベリフェロンの生成速度を蛍光反射率により測定した。この蛍光生成物、４−メチルウンベリフェロンを、ＡｘＳＹＭ（登録商標）計器の微粒子酵素免疫測定法（ＭＥＩＡ）光学集成装置により測定した。
【００７８】
ＡｘＳＹＭ（登録商標）システムは、ＭＵＰの４−メチルウンベリフェロン（ＭＵ）へのアルカリホスファターゼ変換を、蛍光生成物、ＭＵの生成速度によって測定する。前述の速度は、一般に、カウント毎秒毎秒で測定される。このアッセイは、各キャリブレータについて二回行った。下の表２Ａおよび図１の結果は、これら二回のアッセイの平均を示すものである。
【００７９】
【表２】
2007531870.tif 000003
2007531870.tif 000004
【００８０】
上の表２Ａに示した結果を基に、キャリブレータ１３、１４、１５および１６の安定性を、２１日、３５日、４９日、７７日、９６日および１８７日でさらに試験した。この結果を下の表２Ｂに示す。示す結果は、二回のアッセイの平均値である。
【００８１】
【表３】
2007531870.tif 000005
【００８２】
表２Ａおよび図１のデータは、約４．０から約６．５の範囲内のｐＨを有する、特にｐＨ５．６のキャリブレータが、約７．４のｐＨを有する同様の処方のものと比較して安定性加速の増進を示したことを示している。キャリブレータ１から８および試験対照希釈キャリブレータにおける「Ｆ」キャリブレータ、すなわち、１Ｆ、２Ｆ、３Ｆ、４Ｆ、５Ｆなど（本明細書では、以後、「Ｃａｌ−Ｆ」と呼ぶ）についての速度は、同様の処方であるが、異なるｐＨのキャリブレータ９から１６におけるＣａｌ−Ｆ速度より、１４日間の安定性試験を通して、ずっと速く低下している。
【００８３】
安定性加速増進は、同様の処方であるが、約ｐＨ５．６の八つのＦキャリブレータ（キャリブレータ９Ｆから１６Ｆ；平均Ｆキャリブレータ速度は、０．９％低下した）に対する約ｐＨ７．４の八つのＦキャリブレータ（キャリブレータ１Ｆから８Ｆ；平均Ｆキャリブレータ速度は、２７．１％低下した）についての、１４日間、３７℃でのＦキャリブレータ速度における平均変化率の比較により、定量することができる。処方は同じであるがｐＨは異なる、対のキャリブレータ希釈剤（例えば、１と９、２と１０など）各々において、Ｆキャリブレータ速度は、約ｐＨ５．６のものより約ｐＨ７．４のもののほうが大きく低下した（所期保管条件より高い温度で材料にストレスをかける安定性加速試験は、当該技術分野においてよく知られている。インビトロ診断用医療用具の安定性試験についてのヨーロッパ規格（ＥＮ  １３６４０：２００２）の記載において、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇは、安定性加速試験の例として、２５℃、３７℃または４０℃の上昇温度でのインキュベーションを記載している。米国食品医薬局（Ｔｈｅ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）も、安定性加速試験を認めている、例えば、米国医薬品評価センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、公的指針と手続きに関するマニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｉｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）、発行指令  ＭＡＰＰ  ５２６６．１．ジェネリックについての有効期限の再確認（Ｒｅａｆｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｉｒａｔｉｏｎ  ｄａｔｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄ  ｆｏｒ  ａｂｒｅｖｉａｔｅｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）。この指令の背景の段落には、ジェネリック薬品の安定性（有効期限）をサポートするための提示することができる安定性加速条件およびデータが、記載されている。）。
【実施例２】
【００８４】
ＢＭＰイムノアッセイ
以下の処方を有するバルク希釈剤（「Ｄｉｌ」）を調製した。
試験対照希釈剤  ＝  ４％ＢＳＡ、１％ＰＥＧ、０．１％Ｔｗｅｅｎ、１％デキストラン、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤。
Ｄｉｌ１  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤。
Ｄｉｌ２  ＝  Ｄｉｌ１と同じ。
Ｄｉｌ３  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤および０．１％Ｔｗｅｅｎ。
Ｄｉｌ４  ＝  Ｄｉｌ３と同じ。
Ｄｉｌ５  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤および１０ｍＭ  ＤＴＰＡ。
Ｄｉｌ６  ＝  Ｄｉｌ５と同じ。
Ｄｉｌ７  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、ＭＥＩＡ２希釈剤、０．１％Ｔｗｅｅｎ、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ。
Ｄｉｌ８  ＝  Ｄｉｌ７と同じ。
Ｄｉｌ９  ＝  Ｄｉｌ１と同じ。
Ｄｉｌ１０  ＝  Ｄｉｌ２と同じ。
Ｄｉｌ１１  ＝  Ｄｉｌ３と同じ。
Ｄｉｌ１２  ＝  Ｄｉｌ４と同じ。
Ｄｉｌ１３  ＝  Ｄｉｌ５と同じ。
Ｄｉｌ１４  ＝  Ｄｉｌ６と同じ。
Ｄｉｌ１５  ＝  Ｄｉｌ７と同じ。
Ｄｉｌ１６  ＝  Ｄｉｌ８と同じ。
【００８５】
上の希釈剤の各々を調製した後、ｐＨを判定した。希釈剤７から１６のｐＨは、調整した。具体的には、ＤＴＰＡを含有しなかった希釈剤については、ＮａＯＨを（一滴ずつ）添加してこのｐＨを（約５．６に）調整した。ＤＴＰＡを含有した希釈剤については、ＮａＯＨを使用してｐＨを（約５．６または７．４に）調整した。希釈剤１から４については、ｐＨを調整しなかった。各希釈剤の最終ｐＨを下の表３に示す。
【００８６】
【表４】
2007531870.tif 000006
【００８７】
試験対照希釈剤のｐＨは、７．４であった。
【００８８】
＊ｐＨの最終調整後、これらの希釈剤（およびこの対照）を熱にも付した。具体的には、これらの希釈剤を、水浴の中で、約５６℃の温度で、約１時間加熱した。
【００８９】
上の希釈剤の各々を使用して、異なるレベルのヒト合成ＢＮＰ（株式会社ペプチド研究所（日本、大阪）から購入）を含有する三つの異なるキャリブレータを調製した。キャリブレータ＃Ａは、ヒト合成ＢＮＰを一切含有しなかった。キャリブレータ＃Ｂは、５０ピコグラム／ミリリットルのヒト合成ＢＮＰを含有した。キャリブレータ＃Ｆは、２０００ピコグラム／ミリリットルのヒト合成ＢＮＰを含有した。各キャリブレータを濾過し、キャリブレータびんに入れて、２から８℃で２７１日までの間、保管した。
【００９０】
ＢＮＰイムノアッセイは、実施例１に記載したとおり、ＡｘＳＹＭ（登録商標）計器を用いて行った。このアッセイは、各キャリブレータについて二回行った。下の表４および図２の結果は、これら二回のアッセイの平均を示すものである。
【００９１】
【表５】
2007531870.tif 000007
2007531870.tif 000008
【００９２】
表４および図２のデータは、約４．０から約６．５の範囲のｐＨを有するキャリブレータ（キャリブレータ９から１６）が、約７．４のｐＨの対応するキャリブレータ１から８より少ないシグナル低下を示したことを示している。この長期安定性増進は、２から８℃で２７１日通して観察された。
【実施例３】
【００９３】
ＢＮＰイムノアッセイ
以下の処方のバルク希釈剤（「Ｄｉｌ」）を調製した。
Ｄｉｌ１  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ。
Ｄｉｌ２  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ３  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ４  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ５  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ６  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ７  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ８  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ９  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
Ｄｉｌ１０  ＝  ２％ＢＳＡ、０．１％Ｐｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％アジ化ナトリウム水溶液。
上に挙げた成分に加えて、希釈剤１は、基礎希釈剤としてＭＥＩＡ２も含有した。希釈剤３から６は、酢酸ナトリウムの溶液および酢酸の溶液も含有した。希釈剤７から１０は、一塩基性リン酸ナトリウムの溶液および二塩基性リン酸ナトリウムの溶液も含有した。
【００９４】
上の各希釈剤を調製した後、ｐＨを判定した。希釈剤３から１０のｐＨは、調整した。具体的には、希釈剤３から１０のｐＨは、ＮａＯＨで調整した。希釈剤１から２については、ｐＨを調整しなかった。各記希釈剤の最終ｐＨを下の表５に示す。
【００９５】
【表６】
2007531870.tif 000009
【００９６】
＊ｐＨの最終調整後、これらの希釈剤は、熱にも付した。具体的には、これらの希釈剤を水浴の中で、約６０℃の温度で、約１時間加熱した。
【００９７】
上の各希釈剤を使用して、異なるレベルのヒト合成ＢＮＰ（株式会社ペプチド研究所（日本、大阪）から購入）を含有する三つの異なるキャリブレータを調製した。キャリブレータ＃Ａは、ヒト合成ＢＮＰを一切含有しなかった。キャリブレータ＃Ｂは、５０ピコグラム／ミリリットルのヒト合成ＢＮＰを含有した。キャリブレータ＃Ｆは、２０００ピコグラム／ミリリットルのヒト合成ＢＮＰを含有した。各キャリブレータを濾過し、キャリブレータびんに入れて、３７℃および２から８℃で２５２日までの間、保管した。
【００９８】
ＢＮＰイムノアッセイは、ＢＳＡ、魚ゼラチン、Ｂｒｉｊ−３５およびアジ化ナトリウムを含有する共有結合体緩衝液中、０．５０μｇ／ｍＬのＭＡｂ  ＢＣ２０３−共有結合体を使用したことを唯一変更して、実施例１に記載したとおりＡｘＳＹＭ（登録商標）計器を用いて行った。このアッセイは、各キャリブレータについて二回行った。下の表６および図３の結果は、これら二回のアッセイの平均を示すものである。
【００９９】
【表７】
2007531870.tif 000010
2007531870.tif 000011
【０１００】
表６および図３のデータは、約４．０から約６．５の範囲のｐＨを有するキャリブレータ（キャリブレータ１、４から８）が、３７℃の安定性加速で、希釈剤２から３中のキャリブレータ２から３（３．９１および３．７４のｐＨで、注：０時間でさえ低シグナルを有した）および希釈剤９から１０注のキャリブレータ（ｐＨ７．０４および１０．０４で）より少ないシグナル低下を示したことを示している。２から８℃では、０時間でさえ低シグナルを有した希釈剤＃３および１８．５％低下した希釈剤＃１０を除き、１４日間通してＦ  Ｃａｌ速度の変化が殆ど観察されなかった。
【実施例４】
【０１０１】
２０００ｐｇ／ｍＬより高いＢＮＰレベルを有する三（３）つのヒト血漿試料を、心不全の患者から得た。１２０μＬの各披検物を、４８０μＬのＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ標準キャリブレータＡ（０．３２Ｍ酢酸緩衝液、２％ＢＳＡ（重量／容量）、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、０．０９％アジ化ナトリウム（重量／容量）、０．１  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（重量／容量）、ｐＨ５．５）（「キャリブレータＡ」）で希釈した。別の１２０μＬの各披検物を得、これらはキャリブレータＡで希釈しなかった（これらの試料を「未希釈血漿試料」と呼ぶ）。希釈直後、未希釈血漿試料（ここでは「ニート」と呼ぶ）および希釈血漿試料をＡｘＳＹＭ（登録商標）計器システムに配置し、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ試薬キットを使用してＢＮＰについて分析した（このＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ試薬キットには、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋ（このＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋには、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中の抗ＢＮＰ（マウスモノクローナル）塗被微粒子１びん（８．４ｍＬ）、蛋白質安定剤を含有するＴＲＩＳ緩衝液中の抗ＢＮＰ（マウス、モノクローナル）アルカリホスファターゼ共有結合体１びん（１３．２ｍＬ）、および界面活性剤を含有する洗浄緩衝液１びん（１４．１ｍＬ）が入っている）、反応容器およびマトリックスセルが入っている）。ニート試料をＡｘＳＹＭ（登録商標）計器による自動希釈（１／５）に付し、これらの希釈試料を直接試験した。分析後、残存するニート試料および希釈試料を室温（２２℃）で四（４）時間保管した。この期間の後、すべての希釈試料を、当初これらを試験したのと同じやり方で再分析した。この試験からの結果を下の表７に示す。結果は、キャリブレータＡで希釈した試料（上記）が、室温で四（４）時間後に安定を保っており（回収率９７％）、これに対して、同条件下で保管したニート試料は、８５％の回収率しか示さなかったことを示している。
【０１０２】
【表８】
2007531870.tif 000012
【実施例５】
【０１０３】
安定化した希釈試料
実施例４からの三つの試料を含む、４００ｐｇ／ｍＬのＢＮＰ試薬レベルを有する九（９）つのヒト血漿試料を、心不全の患者から得た。１２０μＬの各披検物を、４８０μＬのＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ標準キャリブレータＡ（０．３２Ｍ酢酸緩衝液、２％ＢＳＡ（重量／容量）、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、０．０９％アジ化ナトリウム（重量／容量）、０．１  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（重量／容量）、ｐＨ５．５）（「キャリブレータＡ」）で希釈した。別の１２０μＬの各披検物を得、これらはキャリブレータＡで希釈しなかった（これらの試料を「未希釈血漿試料」と呼ぶ）。希釈直後、すべての未希釈血漿試料（ここでは「ニート」と呼ぶ）および希釈血漿試料をＡｘＳＹＭ（登録商標）計器システムに配置し、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ試薬キットを使用してＢＮＰについて分析した（このＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ試薬キットには、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋ（このＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋには、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中の抗ＢＮＰ（マウスモノクローナル）塗被微粒子１びん（８．４ｍＬ）、蛋白質安定剤を含有するＴＲＩＳ緩衝液中の抗ＢＮＰ（マウス、モノクローナル）アルカリホスファターゼ共有結合体１びん（１３．２ｍＬ）、および界面活性剤を含有する洗浄緩衝液１びん（１４．１ｍＬ）が入っている）、反応容器およびマトリックスセルが入っている）。分析後、すべての希釈試料を室温（２２℃）で保管した。四（４）、五（５）および二十四（２４）時間保管した後、試料を、当初これらを試験したのと同じやり方で再分析した。この試験からの結果を下の表８に示す。希釈濃度にこれらの希釈率（５）を掛け、次に対応するニート値で割って、希釈回収率を計算した。結果は、キャリブレータＡで希釈した試料（上記）が、室温で４、５または２４時間保管した後に安定を保っていた（それぞれ、１０２％、９７％および１１１％の希釈回収率）ことを示している。
【０１０４】
【表９】
2007531870.tif 000013
【実施例６】
【０１０５】
他の試料希釈剤との比較
１８０ｐｇ／ｍＬより高いＢＮＰレベルを有する四（４）つのヒト血漿サンプルを心不全の患者から得た。１２０μＬの各披検物を、４８０μＬのＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ標準キャリブレータＡ（０．３２Ｍ酢酸緩衝液、２％ＢＳＡ（重量／容量）、１０ｍＭ  ＤＴＰＡ、０．０９％アジ化ナトリウム（重量／容量）、０．１  ＰｒｏＣｌｉｎ（登録商標）３００（重量／容量）、ｐＨ５．５）（「キャリブレータＡ」）で希釈した。別の１２０μＬの各披検物を、４８０μＬのＭｕｌｔｉ−ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｉ（ニューヨーク州、タリータウンのＢａｙｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＬＬＣ）で希釈した。別の１２０μＬの各披検物を得、これらはキャリブレータＡおよびＭｕｌｔｉ−ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｉで希釈しなかった（これらの試料を「未希釈血漿試料」と呼ぶ）。希釈直後、すべての未希釈血漿試料（ここでは「ニート」と呼ぶ）およびすべての希釈血漿試料（キャリブレータＡで希釈したものとＭｕｌｔｉ−ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｉで希釈したもの、両方）をＡｘＳＹＭ（登録商標）計器システムに配置し、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ試薬キットを使用してＢＮＰについて分析した（このＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ試薬キットには、ＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋ（このＡｘＳＹＭ（登録商標）ＢＮＰ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐａｃｋには、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ中の抗ＢＮＰ（マウスモノクローナル）塗被微粒子１びん（８．４ｍＬ）、蛋白質安定剤を含有するＴＲＩＳ緩衝液中の抗ＢＮＰ（マウス、モノクローナル）アルカリホスファターゼ共有結合体１びん（１３．２ｍＬ）、および界面活性剤を含有する洗浄緩衝液１びん（１４．１ｍＬ）が入っている）、反応容器およびマトリックスセルが入っている）。分析後、すべての希釈試料を室温（２２℃）で保管した。五（５）および二十四（２４）時間保管した後、試料を、当初これらを試験したのと同じやり方で再分析した。この試験からの結果を下の表９に示す。希釈濃度にこれらの希釈率（５）を掛け、次に対応するニート値で割って、希釈回収率を計算した。結果は、キャリブレータＡで希釈した試料（上記）が、１１０％（１０２％から１２０％の範囲）の希釈回収率が期待されながら、室温で五（５）または二十四（２４）時間保管した後に安定を保っている（それぞれ、１０６％、および１１２％の希釈回収率）ことを示している。Ｍｕｌｔｉ−ｄｉｌｕｅｎｔ  Ｉで希釈した試料は、５および２４時間での回収率が６７％および５４％で、経時的に進行する低下を示した。０時間希釈回収率は、１２１％（８４％から２１６％の範囲）であった。
【０１０６】
【表１０】
2007531870.tif 000014
【０１０７】
本明細書において引用したすべての要約、参考文献、特許および公開特許出願は、本明細書に参照により組み込まれる。
【０１０８】
上の記載および実施例によって本発明を説明する。上の記載は、本発明にかんがみて多数の変形が当業者には明らかになるであろうから、非限定的な説明と解釈する。
【０１０９】
本発明の概念および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載する本発明の方法の組成物、操作および配置を変更することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】様々なｐＨを有するキャリブレータの３７℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図１−１】様々なｐＨを有するキャリブレータの３７℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図１−２】様々なｐＨを有するキャリブレータの３７℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図２】様々なｐＨを有するキャリブレータの２から８℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図２−１】様々なｐＨを有するキャリブレータの２から８℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図２−２】様々なｐＨを有するキャリブレータの２から８℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図３】様々なｐＨを有するキャリブレータの３７℃および２から８℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図３−１】様々なｐＨを有するキャリブレータの３７℃および２から８℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図３−２】様々なｐＨを有するキャリブレータの３７℃および２から８℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図３−３】様々なｐＨを有するキャリブレータの３７℃および２から８℃での安定性を経時的に示すグラフである。
【図１】
2007531870.tif 000015
【図１−１】
2007531870.tif 000016
【図１−２】
2007531870.tif 000017
【図２】
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【図２−１】
2007531870.tif 000019
【図２−２】
2007531870.tif 000020
【図３】
2007531870.tif 000021
【図３−１】
2007531870.tif 000022
【図３−２】
2007531870.tif 000023
【図３−３】
2007531870.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月14日(2006.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためのリガンド結合アッセイにおいて使用するための、約４．０から約６．０のｐＨを有する安定な液体キャリブレータまたは対照。
【請求項２】
約５．０から約６．０のｐＨを有する、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項３】
少なくとも一つのヒト合成ナトリウム利尿ペプチドを含む、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項４】
少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物および少なくとも一つの殺生物剤を含む、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項５】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項４に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項６】
約２から約８℃の温度で保管することができる、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項７】
周囲温度または約３０から約４０℃の温度でのアッセイにおいて使用することができる、請求項１に記載のキャリブレータまたは対照。
【請求項８】
ａ．少なくとも一つの希釈剤を少なくとも一つのヒト合成ナトリウム利尿ペプチドと混合して、液体キャリブレータまたは対照を作る段階；
ｂ．このキャリブレータまたは対照のｐＨを測定する段階；および
ｃ．段階ｂ）において測定した液体キャリブレータまたは対照のｐＨに依存して、液体キャリブレータまたは対照のｐＨを約４．０から約６．５のｐＨに調整する段階
を含む、供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためのリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な液体キャリブレータまたは対照を製造する方法。
【請求項９】
供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用するための、約４．０から約６．５のｐＨを含む安定な供試試料。
【請求項１０】
供試試料中の天然ナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な供試試料であって、
約５％から約９５％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤；および
少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する血清、血漿、全血または他の体液由来の少なくとも一つの生体試料
を含み、
約４．０から約６．５のｐＨを有する供試試料。
【請求項１１】
前記希釈剤が、約５．０から約６．０のｐＨを有する、請求項１０に記載の供試試料。
【請求項１２】
前記希釈剤が、約５．４から約５．６のｐＨを有する、請求項１１に記載の供試試料。
【請求項１３】
約２０％から約９０％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を含む、請求項１０に記載の供試試料。
【請求項１４】
前記希釈剤が、少なくとも一つのナトリウム利尿安定化化合物を含む、請求項１０に記載の供試試料。
【請求項１５】
前記ナトリウム利尿安定化化合物が、蛋白質またはポリマーである、請求項１０に記載供試試料。
【請求項１６】
約４．０から約６．０のｐＨを有する約５％から約９５％（容量／容量）の少なくとも一つの希釈剤を、少なくとも一つのナトリウム利尿ペプチドを含有する血清、血漿、全血または他の体液由来の少なくとも一つの生体試料と混合して、約４．０から約６．５のｐＨを有する安定な供試試料を作る段階を含む、供試試料中のナトリウム利尿ペプチドのレベルを測定するためにリガンド結合アッセイにおいて使用するための安定な供試試料を製造する方法。
【国際調査報告】
2007531870.tif 000025
2007531870.tif 000026
2007531870.tif 000027