(57)【要約】  アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）およびホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍ）遺伝子に関連するプロモーター領域は、特に油性酵母における異種遺伝子の発現のために有効であることが判明した。本発明のプロモーター領域は、ω−３およびω−６脂肪酸の産生に関与する遺伝子の高水準発現を駆動することが示された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）（ｉ）ｇｐｍ遺伝子およびｇｐｄ遺伝子よりなる群から選択されるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子のプロモーター領域、および
（ｉｉ）酵母細胞において発現可能な当該コード領域
ここで、プロモーター領域は当該コード領域に操作可能に結合される、
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換された酵母細胞を準備し、そして
ｂ）ステップ（ａ）のキメラ遺伝子が発現されるような条件下で、ステップ（ａ）の形質転換された酵母細胞を増殖させる、
ことを含んでなる形質転換された酵母細胞における当該コード領域の発現方法。
【請求項２】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子が、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｇｐｍ遺伝子のプロモーター領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号４４よりなる群から選択される核酸断片内に含有される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ｇｐｄ遺伝子のプロモーター領域が、配列番号２３、配列番号２４および配列番号４３よりなる群から選択される核酸断片内に含有される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
プロモーター領域が、そのプロモーター活性を減弱させない少なくとも１つの突然変異を含有する請求項３または４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
プロモーター活性が、野生型プロモーター活性の少なくとも約２０％ないし少なくとも約４００％のプロモーター活性である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
形質転換される酵母細胞が油性（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ）酵母である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属の一員である請求項７の方法。
【請求項９】
油性酵母が、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃２０３６２、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃８８６２、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃１８９４４、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃７６９８２およびアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭ  Ｓ（７）１よりなる群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
当該コード領域が、デサチュラーゼ、エロンガーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ（ｃａｔａｌｙａｓｅｓ）、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ（ｍｕｔａｎａｓｅｓ）、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼおよびキシラナーゼよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）（ｉ）  ｇｐｍ遺伝子およびｇｐｄ遺伝子よりなる群から選択されるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子のプロモーター領域、および
（ｉｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の少なくとも１種の酵素をコードするコード領域
ここで、プロモーター領域とコード領域は操作可能に結合される、
を含んでなるキメラ遺伝子を含んでなる形質転換された油性酵母を準備し、
（ｂ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の少なくとも１種の酵素が発現され、且つω−３またはω−６脂肪酸が産生されるような条件下で、ステップ（ａ）の形質転換された油性酵母を接触させ、そして
（ｃ）場合によりω−３またはω−６脂肪酸を回収する、
ことを含んでなるω−３またはω−６脂肪酸の産生方法。
【請求項１２】
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子が、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ｇｐｍ遺伝子のプロモーター領域が、配列番号２７、配列番号２８および配列番号４４よりなる群から選択される核酸断片内に含有される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ｇｐｄ遺伝子のプロモーター領域が、配列番号２３、配列番号２４および配列番号４３よりなる群から選択される核酸断片内に含有される請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
当該コード領域が、デサチュラーゼおよびエロンガーゼよりなる群から選択されるポリペプチドをコードする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
デサチュラーゼが、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼおよびΔ４デサチュラーゼよりなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属の一員である請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
油性酵母がアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃２０３６２、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃８８６２、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃１８９４４、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃７６９８２およびアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭ  Ｓ（７）１よりなる群から選択される株である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ω−３またはω−６脂肪酸が、リノール酸、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ステアリドン酸、ジホモ−γ−リノール酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸よりなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
配列番号２３、配列番号２４および配列番号４３よりなる群から選択されるｇｐｄプロモーターを含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２２】
配列番号２７、配列番号２８および配列番号４４よりなる群から選択されるｇｐｄプロモーターを含んでなる単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本出願は、２００３年６月２５日に出願された米国仮出願第６０／４８２２６３号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジーの分野にある。より詳細には、本発明は、油性（ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ）酵母における遺伝子発現に有用なアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されるプロモーター領域に関する。
【背景技術】
【０００３】
油性酵母は、天然に油の合成および蓄積の能力をもつ生物と定義される。ここで、油の蓄積は、細胞の乾燥重量の少なくとも約２５％から約８０％まで変動する。油性酵母と一般的に同定される属には、それだけには限らないが、以下が含まれる。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）。より詳細には、例示的な油合成酵母には、以下が含まれる。ロドスポリジウム  トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス  スタルケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ  レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン  プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ  グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）およびアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ  リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）。
【０００４】
含油率が高い油性酵母を増殖させるための技術は、十分に開発されている（例えば、特許文献１；非特許文献１を参照のこと）。また、これらの生物は、従来、様々な目的のために商業的に使用されている。例えば、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の様々な株が、以下の製造および産生のために、歴史的に使用されている。イソクエン酸リアーゼ（特許文献２）、リパーゼ（特許文献３、特許文献４、特許文献５）、ポリヒドロキシアルカノエート（特許文献６）、クエン酸（特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３）、エリスリトール（特許文献１４）、２−オキソグルタル酸（特許文献１５）、γ−デカラクトン（特許文献１６、特許文献１７）、γ−ドデカラクトン（特許文献１８）およびピルビン酸（特許文献１９）。しかし、ごく最近、遺伝子工学の進歩によって、油性酵母の天然の能力が増強され、その結果、多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」）を産生することが可能な生物がもたらされた。具体的には、ピカタージョ（Ｐｉｃａｔａｇｇｉｏ）らは、ω−３／ω−６生合成経路をコードする遺伝子を導入および発現させることによって、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を、ω−３およびω−６脂肪酸の産生のために操作できることを実証している（同時係属の特許文献２０）。
【０００５】
任意の異種タンパク質の、組換えによる産生も通常、当該タンパク質をコードするＤＮＡが、宿主細胞に適したプロモーターの制御下に置かれた発現カセットを構築することによって達成される。発現カセットはその後、（通常、プラスミドが仲介する形質転換、または宿主ゲノムへの標的組み込みによって）宿主細胞に導入され、発現カセット内に含有されるプロモーターの適切な機能に必要な条件下で、形質転換された宿主細胞を培養することによって、異種タンパク質の産生が達成される。このように、タンパク質の組換えによる産生のための新しい宿主細胞（例えば油性酵母）の開発は一般に、宿主細胞における当該タンパク質の発現を制御するのに適したプロモーターの利用可能性を必要とする。
【０００６】
酵母における異種の遺伝子発現に有用であるサッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から、様々な強力なプロモーターが単離されている。例えば、非特許文献２によって、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）プロモーターが記載されており、また、非特許文献３によって、ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ１）プロモーターが調査されている。タンパク質の組換え発現に適したアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からも、いくつかのプロモーターが単離されている。例えば、特許文献２１および特許文献２２（ダビドゥ（Ｄａｖｉｄｏｗ）ら）は、ＸＰＲ２遺伝子（これは、誘導性のアルカリ性細胞外プロテアーゼをコードする）および異種タンパク質の発現に用いられる上流プロモーター領域の配列を開示している。しかし、このプロモーターは、好ましい炭素および窒素源を欠く培地上で、ｐＨ６．０超で活性であるに過ぎず、完全な誘導は、培地内に高レベルのペプトンを必要とする。ブランチン−ローランド．Ｓ（Ｂｌａｎｃｈｉｎ−Ｒｏｌａｎｄ，Ｓ．）ら（特許文献２３、非特許文献４）によるＸＰＲ２プロモーター配列のその後の分析によって、ＸＰＲ２プロモーター配列の一部のみを含有するハイブリッドプロモーターを、完全なプロモーター配列の使用に起因する制限無しで、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における高度発現を得るために使用できることが明らかになった。
【０００７】
特許文献２４（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら）は、酵母における発現クローニングおよびタンパク質の異種発現に非常に適した、翻訳伸長因子ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質およびリボソームタンパク質Ｓ７のための、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の酵母プロモーターを記載している。これらのプロモーターは、成長板（ｇｒｏｗｔｈ  ｐｌａｔｅ）（実施例９、特許文献２４）上で、酵母プロモーター活性について、４〜１１のｐＨ範囲におけるその活性に基づいて試験した場合、ＸＰＲ２プロモーターと比べて向上していた。
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ  ０  ００５  ２７７Ｂ１号明細書
【特許文献２】ＤＤ２５９６３７号明細書
【特許文献３】ＳＵ１４５４８５２号明細書
【特許文献４】国際公開第２００１０８３７７３号パンフレット
【特許文献５】ＤＤ２７９２６７号明細書
【特許文献６】国際公開第２００１０８８１４４号パンフレット
【特許文献７】ＲＵ２０９６４６１号明細書
【特許文献８】ＲＵ２０９０６１１号明細書
【特許文献９】ＤＤ２８５３７２号明細書
【特許文献１０】ＤＤ２８５３７０号明細書
【特許文献１１】ＤＤ２７５４８０号明細書
【特許文献１２】ＤＤ２２７４４８号明細書
【特許文献１３】ＰＬ１６００２７号明細書
【特許文献１４】ＥＰ７７０６８３号明細書
【特許文献１５】ＤＤ２６７９９９号明細書
【特許文献１６】米国特許第６，４５１，５６５号明細書
【特許文献１７】ＦＲ２７３４８４３号明細書
【特許文献１８】ＥＰ５７８３８８号明細書
【特許文献１９】特開平０９２５２７９０号公報
【特許文献２０】米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書
【特許文献２１】米国特許第４，９３７，１８９号明細書
【特許文献２２】ＥＰ２２０８６４号明細書
【特許文献２３】ＥＰ８３２２５８号明細書
【特許文献２４】米国特許第６，２６５，１８５号明細書
【非特許文献１】ラトリッジ，Ｃ．（Ｒａｔｌｅｄｇｅ．Ｃ）、「Ｐｒｏｇ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」１６：１１９〜２０６（１９８２年）
【非特許文献２】ビター，Ｇ．Ａ．（Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．）およびＫ．Ｍ．イーガン（Ｋ．Ｍ．Ｅｇａｎ）、「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」３２（３）：２６３〜２７４（１９８４年）
【非特許文献３】ロディーチョ，Ｒ．（Ｒｏｄｉｃｉｏ，Ｒ．）ら、「遺伝子（Ｇｅｎｅ）」１２５（２）：１２５〜１３３（１９９３年）
【非特許文献４】ブランチン−ローランド．Ｓ（Ｂｌａｎｃｈｉｎ−Ｒｏｌａｎｄ，Ｓ．）、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．」１４（１）：  ３２７〜３３８（１９９４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これらの既知のプロモーターの有用性にもかかわらず、（油性および非油性）酵母の代謝工学に関する、また、酵母における異種遺伝子の発現の制御のための、新規の改良された酵母プロモーターの必要性が存在する。さらに、酵母における様々な天然の増殖および誘導条件下で調整可能であるプロモーターのセットの所有は、ポリペプチドの経済的な産生のために、前記宿主において、商業的な量の異種のポリペプチドを発現させることが望ましい工業環境（ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ｓｅｔｔｉｎｇ）において重要な役割を果たすこととなる。したがって、様々な酵母培養株、好ましくはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）種培養株および他の油性酵母における遺伝子発現に有用となるこうしたプロモーターを提供することが、本発明の一目的である。
【００１０】
本出願人等は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）およびホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ）をコードする遺伝子、およびこれらの天然の遺伝子の発現を駆動するのを担うプロモーターを同定することによって、明示された問題を解決した。プロモーターはどちらも、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種遺伝子の発現に有用であり、かつＴＥＦプロモーターに対して活性が向上されている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）またはホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍ）遺伝子のプロモーターを使用して、形質転換酵母細胞における当該コード領域を発現させるための方法を提供する。したがって、本発明は、
ａ）（ｉ）ｇｐｍ遺伝子およびｇｐｄの遺伝子よりなる群から選択されるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子のプロモーター領域、および
（ｉｉ）酵母細胞において発現可能な当該コード領域
ここで、プロモーター領域は当該コード領域に操作可能に結合される、
を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換酵母細胞を準備し、そして
ｂ）ステップ（ａ）のキメラ遺伝子が発現されるような条件下で、ステップ（ａ）の形質転換された酵母細胞を増殖させる、
ことを含んでなる形質転換酵母細胞における当該コード領域の発現方法を提供する。
【００１２】
好ましい実施態様では、本発明は、
ａ）（ｉ）ｇｐｍ遺伝子およびｇｐｄ遺伝子よりなる群から選択されるヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）遺伝子のプロモーター領域、および
（ｉｉ）ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の少なくとも１種の酵素をコードするコード領域
ここで、プロモーター領域とコード領域は操作可能に結合される
を含んでなるキメラ遺伝子を含んでなる形質転換された油性酵母を準備し、
（ｂ）ω−３／ω−６脂肪生合成経路の少なくとも１種の酵素が発現され、且つω−３またはω−６脂肪酸が産生されるような条件下で、ステップ（ａ）の形質転換された油性酵母を接触させ、そして
（ｃ）場合によりω−３またはω−６脂肪酸を回収する、
ことを含んでなるω−３またはω−６脂肪酸の産生方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、配列番号２３、配列番号２４および配列番号４３よりなる群から選択されるｇｐｄプロモーターを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００１４】
同様に、本発明は、配列番号２７、配列番号２８および配列番号４４よりなる群から選択されるｇｐｍプロモーターを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００１５】
本発明は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明から、より十分に理解することができる。
【００１６】
以下の配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示含有する特許出願のための要件―配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、また、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、ならびに欧州特許庁およびＰＣＴの配列列挙要件（Ｒｕｌｅｓ  ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則のセクション２０８および付属書（Ａｎｎｅｘ）Ｃ）と一致している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記述される規則に準拠する。
【００１７】
配列番号１〜６はそれぞれ、サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク登録番号ＣＡＡ２４６０７）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（ジェンバンク登録番号ＮＰ＿５９５２３６）、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ジェンバンク登録番号ＡＡＫ０８０６５）、ヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（ジェンバンク登録番号ＢＡＡ８８６３８）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）（ジェンバンク登録番号Ｐ５１４６９）およびニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ジェンバンク登録番号ＤＥＣＨＧ３）のＧＰＤアミノ酸配列に相当する。
【００１８】
配列番号７および８は、ＧＰＤタンパク質の保存されるアミノ酸領域に相当する。
【００１９】
配列番号９および１０はそれぞれ、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤ遺伝子の内部部分を単離するために使用される、縮重するプライマーＹＬ１９３およびＹＬ１９４に相当する。
【００２０】
配列番号１１は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤ遺伝子の５０７ｂｐの内部の一部をコードするのに対し、配列番号１２は、対応するアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号１３は、サッカロミセス  セレビシエＧＰＭタンパク質（ジェンバンク登録番号ＮＰ＿０１２７７０）に相当する。
【００２２】
配列番号１４は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＭタンパク質の完全なヌクレオチドコード配列を含んでなるコンティグ（Ｃｏｎｔｉｇ）２２１７に相当する。
【００２３】
配列番号１５は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）  ＧＰＭコード領域の、推測されるヌクレオチド配列に相当するのに対し、配列番号１６は、アミノ酸配列に相当する。
【００２４】
配列番号１７〜２２はそれぞれ、ゲノムウォーキングのために使用されるプライマーＹＬ２０６、ＹＬ１９６、ＹＬ２０７、ＹＬ１９７、ＹＬ２０８およびＹＬ１９８に相当する。
【００２５】
配列番号２３は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＧＰＤ遺伝子の上流の１５２５ｂｐおよびＧＰＤ遺伝子の５’部分に相当するさらなる３２３ｂｐを含んでなる、「ＧＰＤＰ」と称される１８４８ｂｐ断片に相当する。
【００２６】
配列番号２４は、ＧＰＤ遺伝子の−１５２５〜＋７９１の領域に相当する、ＤＮＡの組み立てられた２３１６ｂｐコンティグに相当する（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置を＋１と指定する）。
【００２７】
配列番号２５は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤ遺伝子をコードする部分的なｃＤＮＡ配列に相当するのに対し、配列番号２６は、対応するアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号２７は、ＧＰＭ遺伝子の−８７５〜＋７８領域に相当する、「ＧＰＭＬ」と称される９５３ｂｐ断片に相当する（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置を＋１と指定する）。
【００２９】
配列番号２８は、ＧＰＭ遺伝子の−８７５〜＋６６２の領域に相当する、ＤＮＡの組み立てられた１５３７ｂｐコンティグに相当する（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置を＋１と指定する）。
【００３０】
配列番号２９および３０はそれぞれ、リポーター遺伝子ＧＵＳを増幅するために使用されるプライマーＹＬ３３およびＹＬ３４に相当する。
【００３１】
配列番号３１および３２はそれぞれ、ＴＥＦプロモーターを単離するために使用されるプライマーＴＥＦ５’およびＴＥＦ３’に相当する。
【００３２】
配列番号３３および３４はそれぞれ、ＸＰＲ２転写ターミネーターを単離するために使用されるプライマーＸＰＲ５’およびＸＰＲ３’に相当する。
【００３３】
配列番号３５〜４２はそれぞれ、ｐＹ５−１０プラスミドの構築中の部位特異的突然変異誘発のために使用されるプライマーＹＬ１、ＹＬ２、ＹＬ３、ＹＬ４、ＹＬ２３、ＹＬ２４、ＹＬ９およびＹＬ１０に相当する。
【００３４】
配列番号４３は、「ＧＰＤＰｒｏ」と称される９７１ｂｐ断片に相当し、本明細書では、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における推定のＧＰＤプロモーターと同定される。この断片は、ＧＰＤ遺伝子の−９６８〜＋３領域に相当する（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置を＋１と指定する）。
【００３５】
配列番号４４は、「ＧＰＭＬＰｒｏ」と称される８７８ｂｐ断片に相当し、本明細書では、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における推定のＧＰＭプロモーターと同定される。この断片は、ＧＰＭ遺伝子の−８７５〜＋３領域に相当する（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置を＋１と指定する）。
【００３６】
配列番号４５および４６はそれぞれ、推定のＧＰＤプロモーターを増幅するために使用されるプライマーＹＬ２１１およびＹＬ２１２に相当する。
【００３７】
配列番号４７および４８はそれぞれ、推定のＧＰＭプロモーターを増幅するために使用されるプライマーＹＬ２０３およびＹＬ２０４に相当する。
【００３８】
配列番号４９〜５４はそれぞれ、プラスミドｐＹ５−１３の構築のために使用されるプライマーＹＬ５、ＹＬ６、ＹＬ７、ＹＬ８、ＹＬ６１およびＹＬ６２に相当する。
【００３９】
配列番号５５および５６はそれぞれ、ＧＰＤＰｒｏを増幅するために使用されるプライマーＧＰＤｓｅｎｓｅおよびＧＰＤａｎｔｉｓｅｎｓｅに相当する。
【００４０】
配列番号５７は、フザリウム  モニリホルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４Δ１５デサチュラーゼコード領域のヌクレオチド配列に相当するのに対して、配列番号５８は、アミノ酸配列に相当する。
【００４１】
配列番号５９および６０はそれぞれ、Ｆ．モニリホルメ（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５デサチュラーゼを増幅するために使用されるプライマーＰ１９２およびＰ１９３に相当する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明によれば、本出願人等は、油性酵母、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの、プロモーターおよび遺伝子の単離および特徴づけを記述する。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）およびホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ）遺伝子の上流で単離されるこれらのプロモーター領域は、異種ポリペプチドの産生のためのアルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）および他の酵母における遺伝子工学に有用である。
【００４３】
本発明の好ましい異種ポリペプチドは、微生物油および特に多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の合成に関与するものである。ＰＵＦＡ（またはそれらの誘導体）は、本明細書で開示する手順によって、多くの用途に使用できる。例えば、ＰＵＦＡは、静脈内栄養補給を受けている患者のための食事の代用または補足、特に乳児用調製粉乳として、あるいは栄養失調を予防または治療するために使用できる。あるいは、精製されたＰＵＦＡ（またはそれらの誘導体）は、調製される料理用油、脂肪、またはマーガリンに組み込むことができ、その結果、通常の使用で、レシピエントが食事補充に対する所望の量を与えられることとなる。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤、または他の食品に組み込むこともでき、抗炎症またはコレステロール低下薬として使用することもできる。場合により、該組成物は、（ヒトまたは家畜用）医薬品使用のために使用されることができる。この場合、ＰＵＦＡは、通常、経口投与されるが、それらが首尾よく吸収されるような任意の経路によって、例えば、非経口的に（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内に）、直腸に、経膣的に、あるいは局所的に（例えば、皮膚軟膏またはローション剤として）投与することもできる、
【００４４】
したがって、本発明は、ａ）（ｉ）ｇｐｄ遺伝子またはｇｐｍ遺伝子のプロモーター領域、および（ｉｉ）宿主細胞において発現可能な当該コード領域を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換された酵母細胞を準備し（ここで、プロモーター領域は当該コード領域に操作可能に結合される）、そしてｂ）発酵可能な炭素源の存在下で、ステップ（ａ）の形質転換された酵母細胞を増殖させること（ここで、キメラ遺伝子は発現され、培養培地から場合により単離される）を含んでなる、形質転換酵母において当該コード領域を発現させるための方法を提供することによって、技術を進歩させる。好ましい実施態様では、プロモーター領域は、配列番号２３、２４、２７、２８、４３および４４よりなる群から選択される配列を含んでなる。
【００４５】
定義
この開示では、多くの用語および省略形が使用される。以下の定義が与えられる。
【００４６】
「グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素」は、ＧＰＤと省略される。
【００４７】
「ホスホグリセリン酸ムターゼ」は、ＧＰＭと省略される。
【００４８】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと省略される。
【００４９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＰＣＲと省略される。
【００５０】
「多価不飽和脂肪酸」は、ＰＵＦＡと省略される。
【００５１】
用語「油性」は、脂質の形でそのエネルギー源を貯蔵する傾向がある生物を指す。（ウェーテ（Ｗｅｅｔｅ）：「菌・カビ性の脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」中、第２版、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）、１９８０年）。通常、これらの微生物の細胞のＰＵＦＡ含量は、Ｓ字状曲線に従う。ここで、脂質の濃度は、それが後期の対数増殖期または初期の定常期で最大値に到達するまで増大し、その後、後期の静止期および死滅期中に徐々に減少する。（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびウォード（Ｗａｒｄ）「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」５７：４１９〜２５（１９９１年））。
【００５２】
用語「油性酵母」は、油として、それらの乾燥重量の少なくとも２５％を蓄えることができる酵母と分類される微生物を指す。油性酵母の例には、以下の属が含まれる（これらに限定されない）。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）。
【００５３】
用語「発酵可能な炭素源」は、微生物がエネルギーを引き出すために代謝することとなる炭素源を指す。本発明に用いられる典型的な炭素源には、以下が含まれるが、これらに限定されない。単糖、少糖、多糖、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセライド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルマートおよび炭素含有アミン。
【００５４】
用語「ＧＰＤ」は、ｇｐｄ遺伝子によってコードされるグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素酵素（Ｅ．Ｃ．１．２．１．１２）を指し、また、これは、解糖中に、３−リン酸Ｄ−グリセルアルデヒドを、リン酸３−ホスホＤ−グリセロイルに転換する。アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離される典型的なｇｐｄ遺伝子の部分的なコード領域は、配列番号２５および２６として提供され、具体的には、これらの配列は、（他の既知のｇｐｄ配列を用いるアラインメントに基づくと）この遺伝子のＣ末端をコードする約１１５アミノ酸を欠いている。
【００５５】
用語「ＧＰＤプロモーター」または「ＧＰＤプロモーター領域」は、ＧＰＤの「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前方の５’上流非翻訳領域を指し、また、これは、発現に必要である。適切なＧＰＤプロモーター領域の例は、配列番号２３および４３として提供されるが、これらに限定するつもりは全くない。
【００５６】
用語「ＧＰＭ」は、ｇｐｍ遺伝子によって、コードされるホスホグリセリン酸ムターゼ酵素（ＥＣ  ５．４．２．１）を指し、また、これは、解糖中に３−ホスホグリセリン酸と２−ホスホグリセリン酸の相互転換の役割を果たす。サッカロミセス  セレビシエ由来の典型的なｇｐｍ遺伝子は、ジェンバンク登録番号ＮＰ＿０１２７７０（配列番号１３）であり、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から単離されるｇｐｍ遺伝子は、配列番号１５として提供される。
【００５７】
用語「ＧＰＭプロモーター」または「ＧＰＭプロモーター領域」は、ＧＰＭの「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの前方の５’上流非翻訳領域を指し、また、これは、発現に必要である。適切なＧＰＭプロモーター領域の例は、配列番号２７および４４として提供されるが、これらに限定するつもりは全くない。
【００５８】
用語「プロモーター活性」は、プロモーターの転写効率の評価を指す。これは、例えば、プロモーターからのｍＲＮＡ転写の量の測定によって（例えば、ノーザンブロッティングまたはプライマー伸長法によって）直接的に、あるいは、プロモーターから発現される遺伝子産物の量を測定することによって間接的に決定できる。
【００５９】
本明細書では、「単離された核酸分子」は、一本鎖または二本鎖の、場合により合成の、非天然あるいは変更されたヌクレオチド塩基を含有する、ＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形の単離された核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つもしくはそれ以上のセグメントからなり得る。
【００６０】
核酸分子は、一本鎖の形の核酸分子が、適切な温度条件および溶液イオン強度下で、他の核酸分子にアニールすることができる場合、別の核酸分子（例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子）と「ハイブリダイズ可能である」。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、よく知られており、サムブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）「分子クローニング：研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ））（１９８９年）、特に第１１章およびその中の表１１．１（その内容全体を参照により本明細書に組み込む）に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似した断片（かすかに関連する生物由来の相同配列など）から、非常に類似した断片（密接に関連する生物由来の機能酵素を複製する遺伝子など）までをスクリーニングするように調整できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。一連の好ましい条件は、１５分間室温の６Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで開始し、その後、３０分間４５℃の２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで繰り返し、その後、３０分間５０℃の０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳで２回繰り返すという一連の洗浄を使用する。より好ましい一連のストリンジェントな条件は、より高い温度を使用する。ここでは、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ中での最後の２回の３０分の洗浄の温度を６０℃に上げることを除いて、上述のものと同一である。非常にストリンジェントな一連の別の好ましい条件は、６５℃の０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらなる一連のストリンジェントな条件には、例えば、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃のハイブリダイゼーション、さらに２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、それに続く０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳでの洗浄が含まれる。
【００６１】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含有する必要があり、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに依存するが、塩基間のミスマッチの可能性はある。核酸とハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補の程度、当分野でよく知られた変数に依存する。２つのヌクレオチド配列の類似性または相同性の程度が大きいほど、その配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに相当する）は、以下の順序で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００を超えるハイブリッドについては、Ｔｍを算出するための方程式が得られている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置が、より重要になり、オリゴヌクレオチドの長さが、その特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記、１１．７〜１１．８を参照のこと）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、長さは、少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度を、プローブの長さなどの因子に従って、必要に応じて調整できることを認識するであろう。
【００６２】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動評価によって、あるいは、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）（基本的な局所的なアラインメント調査ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；アルトシュル，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用する、コンピュータで自動化された配列の比較および同定によって、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定的に同定するために十分な、遺伝子のポリペプチドまたはヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなるその部分である。一般に、既知のタンパク質または遺伝子に対する相同体としてのポリペプチドまたは核酸配列を推定的に同定するためには、１０以上の隣接するアミノ酸または３０以上のヌクレオチドの配列が必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関しては、遺伝子同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）の配列依存的方法では、２０〜３０の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用できる。さらに、プライマーを含んでなる特定の核酸分子を得るために、１２〜１５塩基の短いオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲにおける増幅プライマーとして使用できる。したがって、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、その配列を含んでなる核酸分子を具体的に同定および／または単離するのに十分な配列を含んでなる。
【００６３】
本明細書は、１つもしくはそれ以上の特定の微生物タンパク質およびプロモーターをコードする部分的または完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書で報告される通りの配列の利益を受ける当業者は、当業者に知られている目的のために、開示する配列の全て、または実質的な部分を、直ちに使用できる。したがって、本発明は、添付の配列リストに報告される通りの完全な配列、ならびに上で定義した通りのその配列の実質部分を含んでなる。
【００６４】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ゲノムＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、またはｍＲＮＡ分子とハイブリダイズ可能である、一般に少なくとも１８のヌクレオチドの核酸を指す。一実施態様では、本発明による核酸の存在を検出するために、標識化オリゴヌクレオチドを、「プローブ」として使用できる。したがって、用語「プローブ」は、相補的な一本鎖の標的核酸と塩基対を成し、二本鎖分子を形成できる、一本鎖の核酸分子を指す。用語「標識」は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡに容易に付着でき、検出可能なシグナルを発生できる、任意の通常の分子を指し、その強度は、ＤＮＡ断片に対する標識されたプローブのハイブリダイゼーションの相対的な量を示す。
【００６５】
用語「相補的な」は、互いにハイブリダイズすることが可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために使用される。例えば、ＤＮＡについては、アデノシンはチミンと相補的であり、シトシンはグアニンと相補的である。したがって、本発明にはまた、添付の配列リストに報告する通りの完全な配列と相補的な単離された核酸分子、ならびにその実質的に類似した核酸配列も含まれる。
【００６６】
用語「％同一性」は、当分野で知られている通り、配列を比較することによって決定される通りの、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列あるいは２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当分野では、「同一性」はまた、場合によっては、こうした配列のストリング間のマッチによって決定される通りの、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、それだけには限らないが、以下に記述するものを含めた既知の方法によって、容易に算出することができる。１．）「コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（レスク，Ａ．Ｍ．（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）編）オックスフォード大学（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）：ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８８年）；２．）「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」（スミス，Ｄ．Ｗ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．）編）アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）：ニューヨーク州（ＮＹ）（１９９３年）；３．）「配列データのコンピュータ解析、パート１（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ）」（グリフィン，Ａ．Ｍ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．）およびグリフィン，Ｈ．Ｇ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．）編）フマナ（Ｈｕｍａｎａ）：ニュージャージー州（ＮＪ）（１９９４年）；４．）「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（フォン  ハイーネ，Ｇ．（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．）編）アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ）（１９８７年）；および５．）「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」（グリブスコフ，Ｍ．（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．）およびデベルー，Ｊ．（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．）編）ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ）：ニューヨーク州（ＮＹ）（１９９１年）。同一性を決定する好ましい方法は、試験される配列の間で最高のマッチを示すように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手できるコンピュータプログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の算出は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングセット（ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ）（ＤＮＡＳＴＡＲインコーポレイティッド（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））のメグアライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施できる。配列の複数のアラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法によるアラインメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、「ＣＡＢＩＯＳ．」５：１５１〜１５３（１９８９年））を使用して、デフォルトパラメータ（ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いて実施される。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメータは、以下の通りである。ＫＴＵＰＬＥ  １、ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５。
【００６７】
適切な核酸分子（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書で報告されるアミノ酸配列と、少なくとも約７０％同一である、好ましくは少なくとも約７５％同一である、好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸分子は、本明細書で報告されるアミノ酸配列と、約８５％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸分子は、本明細書で報告されるアミノ酸配列と、少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列をコードする。最も好ましいものは、本明細書で報告されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸分子である。適切な核酸分子は、上述の相同性を有するだけでなく、少なくとも５０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、好ましくは少なくとも１５０アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２００アミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０アミノ酸を有するポリペプチドを一般的にコードする。
【００６８】
同様に、適切なプロモーター領域（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書で報告するヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％同一である、好ましくは少なくとも約７５％同一である、好ましくは少なくとも約８０％同一であるプロモーター領域をコードする。好ましい核酸分子は、本明細書で報告されるヌクレオチド配列と、約８５％同一であり、より好ましい核酸分子は、少なくとも約９０％同一であり、最も好ましいものは、本明細書で報告されるヌクレオチド配列と、少なくとも約９５％同一の核酸分子である。適切なプロモーター領域は、上述の相同性を有するだけでなく、一般的に長さが少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは、長さが少なくとも１００ヌクレオチド、より好ましくは、長さが少なくとも２５０ヌクレオチド、より好ましくは、長さが少なくとも５００のヌクレオチドである。
【００６９】
「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼさずにヌクレオチド配列の変化を可能にする、遺伝暗号における性質を指す。したがって、本発明は、配列番号１６および２６に示す通りの当該微生物ポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたは実質的な部分をコードする任意の核酸分子に関する。当業者は、所与のアミノ酸を特定するための、ヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドン−バイアス」をよく知っている。したがって、宿主細胞における改良された発現のための遺伝子を合成する場合、コドン利用のその頻度が、宿主細胞の好ましいコドン利用の頻度に近づくように、遺伝子を設計することが望ましい。
【００７０】
「化学的に合成される」は、ＤＮＡの配列に関して、成分ヌクレオチドがｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられることを意味する。確立した手順を使用して、ＤＮＡの手動の化学合成を達成することもできるし、多くの商業的に入手可能な機械の１つを使用して、自動化された化学合成を実施することもできる。「合成遺伝子」は、当業者に知られている手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド基礎単位から組み立てることができる。これらの基礎単位を結合およびアニールさせて、遺伝子セグメントを形成し、その後、酵素による組み立てを行い、全遺伝子を構築する。したがって、遺伝子は、宿主細胞のコドンバイアスを反映するように、ヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整することができる。当業者は、コドン利用が、宿主によって、好まれるコドンの方へ偏る場合の、良好な遺伝子発現の可能性を理解する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手できる宿主細胞から得られる遺伝子の調査に基づくことができる。
【００７１】
「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）の調節配列を含めて、特定のタンパク質を発現する核酸分子を指す。「天然の遺伝子」は、独自の調節配列と共に天然に見られるような遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然には共に見られない調節およびコード配列を含んでなる、天然の遺伝子ではないいずれの遺伝子も指す。したがって、キメラ遺伝子は、別の起源から得られる調節配列およびコード配列、あるいは、同じ起源から得られるが、天然に見られるのとは異なる方式で配列された調節配列およびコード配列を含んでなる可能性がある。本発明のキメラ遺伝子は、当該コード領域に操作可能に結合されたＧＰＤまたはＧＰＭプロモーター領域を一般的に含んでなることとなる。「内因性遺伝子」は、生物のゲノムにおけるその天然の位置の天然の遺伝子を指す。「外来の」遺伝子は、その宿主生物には通常見られないが、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非生来の生物またはキメラ遺伝子に挿入された、天然の遺伝子を含んでなる可能性がある。「導入遺伝子」は、形質転換手法によって、ゲノムに導入された遺伝子である。「コドンを最適化された遺伝子」は、宿主細胞の好ましいコドン利用の頻度に似るように設計されたコドン利用の頻度を有する遺伝子である。
【００７２】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を指す。
【００７３】
「適切な調節配列」は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響を与える、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置する転写および翻訳ヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位およびステム−ループ構造が含まれ得る。
【００７４】
「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、その全体を天然の遺伝子から得ることもできるし、天然に見られる別のプロモーターから得られる別の成分からなるものでもよいし、合成のＤＮＡセグメントを含んでなるものでもよい。異なる組織または細胞タイプで、あるいは、発達の異なる段階で、あるいは、異なる環境的または生理学的条件に応答して、異なるプロモーターが、遺伝子の発現を導く可能性があることは、当業者により理解されている。最も多くの時点で最も多くの細胞タイプにおいて発現される遺伝子を引き起こすプロモーターは、「恒常的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」と一般に呼ばれる。大抵の場合では、調節配列の厳密な境界が、完全には定められていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有する可能性があることが、さらに認識される。
【００７５】
用語「変異プロモーター（ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、本明細書では、親のプロモーターと比較して、１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠損、および／または挿入を含んでなるヌクレオチド配列を有するプロモーターと定義される（ここで、変異プロモーターは対応する親のプロモーターよりもプロモーター活性が高いあるいは低い）。用語「変異プロモーター」は、当分野でよく知られた方法（例えば古典的な突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、および「ＤＮＡシャッフリング」）を使用して得られる天然の変異体およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生された変異体を包含することとなる。
【００７６】
用語「３’非コード配列」または「転写ターミネーター」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列および他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクト（ｔｒａｃｔ）の付加に影響を及ぼすことによって特徴づけられる。３’領域は、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響を与えることができる。
【００７７】
「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される、ＤＮＡ配列の転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、これは、一次転写産物と呼ばれる。あるいは、これは、一次転写産物の転写後プロセッシングから得られるＲＮＡ配列であり得、成熟したＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンが無く、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡと相補的であり、かつｍＲＮＡから得られる二本鎖ＤＮＡを指す。「センス」ＲＮＡには、ｍＲＮＡが含まれ、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写産物またはｍＲＮＡの全部または一部と相補的であり、標的遺伝子の発現を妨げるＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書；国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性が、特定の遺伝子転写物の任意の部分とのものである、すなわち、５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列とのものである可能性もある。「機能性ＲＮＡ」は、翻訳されないが、細胞過程に対する効果を有するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または他のＲＮＡを指す。
【００７８】
用語「操作可能に結合される」は、片方の機能がもう片方によって影響を受けるように、単一の核酸分子上に核酸配列を結合させることを指す。例えば、プロモーターは、それが、そのコード配列の発現に影響を及ぼすことが可能な場合、コード配列と操作可能に結合される（すなわち、コード配列は、プロモーターの転写制御下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で、調節配列に操作可能に結合することができる。
【００７９】
用語「発現」は、本明細書では、コード配列から得られるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指す可能性もある。
【００８０】
「イントロン」は、大抵の真核生物における遺伝子配列（コード領域、５’非コード領域、または３’非コード領域のいずれか）に見られる非コードＤＮＡの配列である。それらの完全な機能は、知られていないが、ある種のエンハンサーが、イントロン内に位置する（ジャコペリ  Ｆ（Ｇｉａｃｏｐｅｌｌｉ  Ｆ．）ら、「遺伝子発現（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒ．）」１１：９５〜１０４（２００３年））。これらのイントロン配列は、転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される前に、ｍＲＮＡ転写産物前駆体から除去される。イントロン除去のこのプロセスは、イントロンの両側での配列（エキソン）の自己スプライシングにより起こる。
【００８１】
用語「変更された生物活性」は、分析方法によって測定することができる、ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質に関する活性を指す。ここで、その活性は、天然の配列に関する活性より大きいか、小さいかのいずれかである。「増強された生物活性」は、天然の配列に関する活性よりも大きい、変更された活性を指す。「減弱された生物活性」は、天然の配列に関する活性よりも小さい、変更された活性である。
【００８２】
「形質転換」は、遺伝的に安定な遺伝形質をもたらす、宿主生物への核酸分子の転送を指す。核酸分子は、例えば、自律的に複製するプラスミドであってもよいし、宿主生物のゲノムに統合されてもよい。形質転換された核酸分子を含有する宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え型」または「形質転換された」生物と呼ばれる。
【００８３】
用語「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」は、細胞の中枢代謝の一部ではなく、通常、環状の二本鎖ＤＮＡ断片の形の、しばしば遺伝子を運ぶ、余分な染色体成分を指す。こうした成分は、任意の起源から得られる、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、線状または環状の、自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列（ここで、多くのヌクレオチド配列は選択される遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することが可能な独特の構築物に連結または再結合（ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ）されている）であり得る。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子の他に、特定の宿主細胞の形質転換を容易にする成分を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、かつ外来遺伝子の他に、外来の宿主におけるその発現増強を可能にする成分を有する特定のベクターを指す。
【００８４】
用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用な、任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、商業的に入手することもできるし、独自に開発してもよい。典型的な配列分析ソフトウェアには、それだけには限らないが、以下が含まれる。１．）ＧＣＧセット（ｓｕｉｔｅ）のプログラム（ウィスコンシンパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）９．０版（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ）；２．）ブラスト（ＢＬＡＳＴ）Ｐ、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）Ｎ、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）Ｘ（アルトシュルら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０（１９９０年））；３．）ＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲインコーポレイティッド（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））；および４．）スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを組み込んでいるＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、「Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．」［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、開催日（Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｄａｔｅ）１９９２年、１１１〜２０。スハイ，サンドール（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）編、プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）：ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、ニューヨーク州（ＮＹ））。本出願においては、配列分析ソフトウェアが、分析のために使用される場合、分析の結果が、特に明記しない限り、基準とされるプログラムの「デフォルト値」に基づくことが理解されよう。本明細書では、「デフォルト値」は、最初に初期化する場合に、ソフトウェアと共に最初にロードする任意の一連の値またはパラメータを意味する。
【００８５】
標準組換えＤＮＡおよび本明細書で使用される分子クローニング技術は、当分野でよく知られており、サムブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ．Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス，Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）「分子クローニング：研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８９年）（以下「マニアティス」）によって；シルハービー，Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．）、ベンアン，Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．）およびエンクウィスト，Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．）「遺伝子融合を用いる実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８４年）によって；また、グリーンパブリッシングアソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）により出版された、オースベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」によって記載されている。
【００８６】
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるｇｐｄおよびｇｐｍ遺伝子の同定
本発明は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノム内に含有される、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｐｄ）遺伝子の部分配列（コードされるタンパク質のＣ末端の約１１５アミノ酸は、本明細書では開示しない）、およびホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍ）遺伝子の完全な配列を同定する。
【００８７】
部分的なｇｐｄヌクレオチド塩基および推測されるアミノ酸配列（配列番号２５および２６）の、公共のデータベースとの比較により、最も類似した既知の配列は、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上記）を使用すると、２１５アミノ酸の長さにわたる本明細書で報告されるｇｐｄのアミノ酸配列と約８１％同一であることが示される。好ましいアミノ酸断片は、本明細書の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一である配列が特に適切であり、約９５％同一である配列が最も好ましい。同様に、当該ＯＲＦに相当する核酸配列をコードする好ましいｇｐｄは、活性なタンパク質をコードするものであり、これは、本明細書で報告されるｇｐｄの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％である配列が特に適切であり、約９５％同一である配列が最も好ましい。
【００８８】
ｇｐｍヌクレオチド塩基および推測されるアミノ酸配列（配列番号１５および１６）の、公共のデータベースとの比較により、最も類似した既知の配列は、スミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）アラインメントアルゴリズム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）、上記）を使用すると、２１６のアミノ酸の長さにわたる本明細書で報告されるｇｐｍのアミノ酸配列と約７１％同一であることが示される。好ましいアミノ酸断片は、本明細書の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一である配列が特に適切であり、約９５％同一である配列が最も好ましい。同様に、当該ＯＲＦに相当する核酸配列をコードする好ましいｇｐｍは、活性なタンパク質をコードするものであり、本明細書で報告されるｇｐｍの核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一である配列が特に適切であり、約９５％同一である配列が、最も好ましい。
【００８９】
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における天然のプロモーター領域の同定
本発明はまた、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＧＰＤおよびＧＰＭを天然に調節する推定のプロモーター領域を同定する。これらの推定のプロモーター領域は、形質転換された酵母細胞における当該任意の適切なコード領域の発現を駆動するのに有用であると同定されている。
【００９０】
本発明では、油性酵母中で有用なプロモーターは、以下の基準を満たすべきである。
１．）強度。強力な酵母プロモーターは、高い発現レベルのために不可欠な前提であり、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が宿主生物として使用される場合、ゲノムに組み込まれる低コピー数のａｒｓ１８（フォアニエー，Ｐ．（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｐ．）「酵母（Ｙｅａｓｔ）」７：２５〜３６（１９９１年））ベースの発現ベクターまたはキメラ遺伝子により、この必要性は、さらに重要になる。
２．）当該コード領域の発現に適した培地における活性、および当該そのコード領域の高い酵素的活性。
３．）ｐＨ耐性。当該コード領域が、例えば酸性の環境中でのみ産生されることが分かっている場合、当該前記コード領域に操作可能に結合されるプロモーターは、適切なｐＨで機能しなければならない。ｐＨ耐性は当然、宿主生物の耐性により制限される。
４．）誘導性。しっかりと調節される酵母プロモーターは、発現段階から増殖段階を分離することを可能にし、それによって、細胞増殖を抑制することが知られている生成物の発現を可能にする。
５．）ＰＵＦＡの蓄積のための油性酵母宿主における、増殖の安定期における活性。
【００９１】
さらに、新規の酵母プロモーターが、既知のアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＴＥＦおよび／またはＸＰＲ２プロモーターに対して、活性における違いを有することが好ましい（米国特許第４，９３７，１８９号明細書、ＥＰ２２０８６４号明細書、ＥＰ８３２２５８号明細書、米国特許第６，２６５，１８５号明細書）。ＴＥＦプロモーターと、本発明のＧＰＤおよびＧＰＭプロモーターの比較研究を、実施例７に提供する。本発明の酵母プロモーターが、ＴＥＦプロモーターと比べて向上された活性を有することが示される。当該ＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域は、いくつかの核酸分子、特に、配列番号２３、２４および４３内に含有される。一実施態様では、ＧＰＤプロモーターは、配列番号４３のヌクレオチド−５００〜＋１を含んでなることとなり（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置を＋１と指定する）、それによって、比較的に強力なプロモーター活性が可能になる。代替実施態様では、配列番号４３の−１００〜＋１領域は、プロモーターの基本的な活性のために十分でなければならない。
【００９２】
本発明のＧＰＭプロモーター領域は、配列番号２７、２８および４４を含めて、本明細書で開示するいくつかの核酸分子に含有される。一実施態様ではＧＰＭプロモーターは、配列番号４４のヌクレオチド−５００〜＋１を含んでなることとなり（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置を＋１と指定する）、それによって、比較的に強力なプロモーター活性が可能になる、あるいは、配列番号４４の−１００〜＋１領域は、プロモーターの基本的な活性のために十分でなければならない。
【００９３】
本発明のプロモーター領域は、上で述べたものに対するさらなるヌクレオチドを含んでなることができる。例えば、本発明のプロモーター配列は、配列番号２３または配列番号２７として示されるＤＮＡ配列に基づいて構築できる（配列番号４３および４４はそれぞれ、それらの結果である）。調節配列の厳密な境界が完全に定められていないので、長さを短くした様々なプロモーター断片も、同一のプロモーター活性を有することができることを認識するべきである。
【００９４】
代替実施態様では、プロモーターのＤＮＡ配列が、酵母プロモーター活性に影響を与えない（特に損なわない）１つもしくはそれ以上のヌクレオチド置換（すなわち配列中の１つもしくはそれ以上のヌクレオチドの欠損、挿入、置換、または付加）を有する変異プロモーターを構築できる。酵母プロモーター活性に有意に影響を及ぼさずに改変できる領域は、欠損研究によって同定することができる。本発明の変異プロモーターは、配列番号４３および４４として本明細書に記述するＧＰＤまたはＧＰＭプロモーター領域のプロモーター活性の、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約２００％、より好ましくは少なくとも約３００％、最も好ましくは少なくとも約４００％を有する。
【００９５】
突然変異誘発のための方法は、当分野でよく知られており、かつ変異プロモーターの産生に適している。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの突然変異誘発および選択、ＰＣＲベースのランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、または他の手段を使用して、本発明の天然に生じるプロモーターおよび遺伝子の突然変異を得ることができる。これは、宿主細胞におけるより望ましいレベルのプロモーター活性を有する推定のプロモーターの産生、または、宿主細胞における機能に関してより望ましい物理的および動態学的パラメータを有するポリペプチドの産生を可能にするであろう。
【００９６】
所望により、プロモーターまたは酵素活性にとって重要な当該ヌクレオチドの領域は、それぞれ、通常の突然変異誘発、得られる変異プロモーターまたはポリペプチドの発現、およびそれらの活性の決定を介して決定できる。変異体は、欠損、挿入および点突然変異、またはそれらの組み合わせを含んでなる可能性がある。典型的な機能解析は、以下のいずれかを決定するために、欠損突然変異誘発から始める。１．）活性に必要な推定のプロモーターの最小部分；または２．）機能に必要なタンパク質のＮ−およびＣ末端の端。その後、機能に必要な領域をさらに決定するために、内部欠損、挿入、または点突然変異体が作られる。カセット突然変異誘発または全合成（ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）などの他の技術も使用できる。
【００９７】
コード配列の欠損突然変異誘発は、例えば、エキソヌクレアーゼを用いて、連続的に５’または３’コード領域を除去することによって達成される。こうした技術のために、キットを利用できる。欠損の後、５’または３’欠損の後の、欠損させられたコード領域に、それぞれ、開始または終止コドンを含有するオリゴヌクレオチドを結合させることによって、コード領域を完成させる。あるいは、部位特異的突然変異誘発、突然変異誘発性のＰＣＲを含めた様々な方法によって、あるいは、既存の制限部位で消化されるＤＮＡへの連結によって、開始または終止コドンをコードするオリゴヌクレオチドを、コード領域に挿入させる。
【００９８】
推定プロモーター領域中またはコード配列内の内部欠損も、部位特異的突然変異誘発または突然変異誘発性のＰＣＲを介する突然変異誘発性のプライマーを使用することによって、ＤＮＡ内の既存の制限部位の使用を含めた様々な方法を介して、同様に作成することができる。挿入が、リンカー−スキャニング（ｌｉｎｋｅｒ−ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発または突然変異誘発性のＰＣＲなどの方法を介して作成されるのに対して、点突然変異は、部位特異的突然変異誘発または突然変異誘発性のＰＣＲなどの技術を介して作成される。
【００９９】
化学的突然変異誘発はまた、活性にとって重要な推定のプロモーター領域またはポリペプチドの、領域を特定するために使用できる。突然変異させた構築物を発現させ、得られた変更されたプロモーターまたはタンパク質の能力を、それぞれ分析する。こうした構造−機能分析により、どの領域が欠損している可能性があるか、どの領域が挿入を許容しているか、また、どの点突然変異によって、変異プロモーターまたはタンパク質が、天然のプロモーターまたはタンパク質と実質的に同じ方式で機能することが可能になるかを決定できる。本明細書で記述される本プロモーターおよび遺伝子から得られるポリペプチドをコードする全てのこうした変異プロモーターおよびヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【０１００】
ｇｐｄおよびｇｐｍ遺伝子および推定のプロモーター領域に対する相同体の単離
本発明のプロモーター領域および遺伝子が、様々な酵母種において、相同体を有すること、また、異種の遺伝子発現のためのプロモーターおよび遺伝子の使用は、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から得られたプロモーターおよび遺伝子に限定されず、他の酵母種における相同体に及ぶことが、当業者には理解されるであろう。例えば、本発明は、それだけには限らないが、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｙｐｏｍｙｃｅｓ）を含めた油性の属から誘導される相同体を包含し、これらの属内の好ましい種の例には、ロドスポリジウム  トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス  スタルケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ  レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン  プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ  グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）およびＲ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）が含まれる。
【０１０１】
相同性は一般的に、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。ここで、用語「配列分析ソフトウェア」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な、（商業的に入手可能な、あるいは独自に開発された）任意のコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。一般に、こうしたコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠損、および他の改変に対する相同性の程度を割り当てることによって、類似の配列とマッチさせる。
【０１０２】
当分野でよく知られている通り、配列依存的なプロトコルを使用する相同のプロモーター領域または遺伝子の単離は、様々な技術を使用して容易に可能である。配列依存的なプロトコルの例には、これらに限定されないが、以下が含まれる。１．）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２．）核酸増幅技術［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、テイバー，Ｓ．（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．）ら、「Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」ＵＳＡ  ８２：１０７４（１９８５年）、または鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」、８９：３９２（１９９２年）］の様々な使用によって例示されるような、ＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法；および３．）ライブラリ構築および相補性によるスクリーニングの方法。
【０１０３】
例えば、本発明のものと類似のタンパク質またはポリペプチドをコードする推定のプロモーター領域または遺伝子は、当業者によく知られた手順を使用して、任意の所望の微生物由来のライブラリをスクリーニングするためのＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして当該核酸分子の全てまたは一部を用いることによって、直接単離できるであろう。当該核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当技術分野で知られた方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記）によって、設計および合成できる。さらに、当業者に知られている方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ＤＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーションまたは末端標識技術）によってＤＮＡプローブ、あるいは、利用できるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写系を使用するＲＮＡプローブを合成するために、完全な配列を、直接使用することもできる。さらに、当該配列の一部（または全長）を増幅するために、特定のプライマーを設計および使用できる。得られる増幅生成物は、増幅反応中に直接標識してもよいし、増幅反応の後で標識してもよく、適切なストリンジェンシーの条件で、全長ＤＮＡ断片を単離するプローブとして使用できる。
【０１０４】
一般的に、ＰＣＲタイプの増幅技術では、プライマーは、異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件に応じて、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ正確な複製をもたらすように設計されなければならない。ＰＣＲプライマー設計の方法は、一般的であり、当分野でよく知られている（テイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ）、「ヒト遺伝病：実践手法（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」内、「遺伝的障害の診断における特異的なハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」、Ｋ．Ｅ．デイビス（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ）（編）、（１９８６年）３３〜５０ページ  ＩＲＬ：ハーンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ）、バージニア州（ＶＡ）；および、リフリーク，Ｗ．（Ｒｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．）「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」内、ホワイト，Ｂ．Ａ．（Ｗｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．）（編）、（１９９３年）第１５巻、３１〜３９ページ、ＰＣＲプロトコル：現在の方法および用途（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ）：トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州（ＮＪ））。
【０１０５】
通常、当該配列の２つの短いセグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルに使用し、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来の相同のポリヌクレオチドをコードする、より長い核酸分子を増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、クローニングされた核酸分子のライブラリに対して実施することもできる。ここで、片方のプライマーの配列が、当該核酸分子から得られ、もう一方のプライマーの配列は、微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
【０１０６】
あるいは、当該配列は、相同体の同定のためのハイブリダイゼーション試薬として使用できる。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的な構成要素には、プローブ、当該ヌクレオチド配列を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは一般的に、検出される核酸配列に相補的である一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブ長は、５塩基から数万もの塩基まで変動する可能性があり、行われる特定の試験に依存することとなる。一般的に、約１５塩基から約３０塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的である必要があるに過ぎない。さらに、プローブと標的配列との間の相補性は、完全である必要はない。ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズされる領域内の塩基のある種の部分が、正しい相補的塩基と対にされないという結果を伴う不完全に相補的な分子の間でも確実に起こる。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション法は、明確に定義されている。一般的に、プローブとサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなければならない。これは、適当な濃度および温度条件下、無機または有機塩の存在下で、プローブとサンプルを接触させることを含む。プローブとサンプル核酸は、プローブとサンプル核酸との間のどんな可能なハイブリダイゼーションも起こることができるような十分に長い時間接触していなければならない。混合物中のプローブまたは標的の濃度によって、ハイブリダイゼーションが起こるのに必要な時間が決定されることとなる。プローブまたは標的濃度が高くなる程、ハイブリダイゼーションに必要とされるインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を加えることができる。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を抑制することによって、核酸を安定させる。さらに、カオトロピック剤は、室温で、短いオリゴヌクレオチドプローブの、高感度かつストリンジェントなハイブリダイゼーションを可能にする（バン  ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」１９：５１４３〜５１５１（１９９１年））。適切なカオトロピック剤には、特に、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウムおよびトリフルオロ酢酸セシウムが含まれる。一般的に、カオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望により、ハイブリダイゼーション混合物に、ホルムアミドを、一般的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）加えることができる。
【０１０８】
様々なハイブリダイゼーション溶液を使用できる。一般的に、これらは、約２０〜６０％体積、好ましくは３０％の極性有機溶媒を含んでなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％  ｖ／ｖホルムアミド、約０．１５〜１Ｍ  塩化ナトリウム、約０．０５〜０．１Ｍ  緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム、トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳ、またはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）、約０．０５〜０．２％洗浄剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム）、または０．５〜２０ｍＭの間のＥＤＴＡ、フィコール（ファルマシアインコーポレイティッド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．））（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）および血清アルブミンを使用する。また、典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１から５ｍｇ／ｍｌの未標識キャリア核酸、断片化させた核ＤＮＡ（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡまたは酵母ＲＮＡ）、および場合により約０．５から２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。様々な極性の水溶性または膨潤性の薬剤（例えばポリエチレングリコール）、アニオンポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）、およびアニオン性糖ポリマー（例えば、デキストラン硫酸）を含めた体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）などの他の添加物もまた、含まれ得る。
【０１０９】
酵母における組換え発現
所望の宿主細胞における当該コード遺伝子の発現を駆動するのに有用である開始制御領域またはプロモーター領域は、ｇｐｄおよびｇｐｍ遺伝子（それぞれ、配列番号２５および１５）の上流部分から得られるものから選択される。プロモーター領域は、ｇｐｄおよびｇｐｍ遺伝子およびそれらの相同体の上流配列から同定することができ、一般的な方法（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、上記）に従って単離できる。一旦、プロモーター領域が、同定および単離されれば、それらは、適切な発現ベクター内で発現させるために、当該コード領域に、操作可能に結合できる。これらのキメラ遺伝子を、天然の宿主細胞および異種の宿主細胞内で、特に油性酵母宿主の細胞内で、その後発現させることができる。したがって、本発明の一態様は、本発明の酵母プロモーターを含んでなる組換え型発現ベクターを提供する。
【０１１０】
さらなる態様では、本発明は、形質転換された酵母細胞中で当該コード領域を発現させる方法であって、（ｉ）ＧＰＤまたはＧＰＭプロモーター領域、および（ｉｉ）宿主内で発現可能な当該コード領域（ここで、プロモーター領域は当該コード領域に操作可能に結合される）を含んでなるキメラ遺伝子を有する形質転換細胞をもたらし、キメラ遺伝子が発現される条件下で、この形質転換細胞を増殖させる方法を提供する。このようにして産生されるポリペプチドは、場合により培養株から回収できる。
【０１１１】
微生物発現系および発現ベクターは、当業者によく知られている。これらはいずれも、望ましい酵母宿主細胞における発現に適した当該任意の特定のコード領域の産生のための、ｇｐｍおよびｇｐｄ遺伝子から得られるプロモーター領域を含んでなるキメラ遺伝子を構築するために使用できるであろう。これらのキメラ遺伝子は、誘導に応じて酵素の高水準発現をもたらすために、形質転換を介する組み込みによって、適切な微生物にその後導入できるであろう。あるいは、プロモーターは、好ましい酵母宿主細胞中で形質転換および自己複製することが可能であるプラスミドにクローニングすることができる。発現させる当該コード領域を、プロモーターの下流にその後クローニングすることができる。一旦組換え型宿主が確立されると、適切な条件（以下）下で細胞を増殖することによって、遺伝子発現を達成できる。
【０１１２】
当該適切なコード領域
有用なキメラ遺伝子は、好ましい宿主細胞内で発現させるために、当該適切なコード領域に操作可能に結合させた、本明細書で定義する通りのｇｐｄおよびｇｐｍ遺伝子のいずれかのプロモーター領域またはそれらの変異プロモーターを含むこととなる。
【０１１３】
組換え型酵母宿主内で発現させる当該コード領域は、宿主に対して内因性であっても異種であってもよいが、宿主生物と適合性がなければならない。商業的価値のあるタンパク質をコードする遺伝子は、発現に特に適している。例えば、当該適切なコード領域には、（これらに限定されないが）、哺乳動物のポリペプチドを含めて、ウィルス、細菌、菌・カビ性、植物、昆虫、または脊椎動物の当該コード領域をコードするものが含まれ得る。さらに、これらの当該コード領域は、例えば、構造タンパク質、酵素（例えばオキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロリアーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ）、またはペプチドであり得る。非限定的なリストには、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ（ｃａｔａｌｙａｓｅｓ）、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グルカナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ（ｍｕｔａｎａｓｅｓ）、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素（ｐｅｃｔｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはキシラナーゼなどの酵素をコードする遺伝子が含まれる。
【０１１４】
本発明において好ましいものは、ある実施態様では、ω−６およびω−３脂肪酸を含めた微生物油の産生に関与する酵素のコード領域である。藻類、細菌、カビおよび酵母を含めた多くの微生物は、細胞の代謝の通常の過程で、ＰＵＦＡおよびオメガ脂肪酸を合成できる。とりわけ十分に研究されているものは、シゾキトリウム  アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｍ）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種、およびモルティエレラ  アルピナ（Ｍｏｒｔｅｒｉｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）を含めた菌・カビである。さらに、多くの渦鞭毛藻類（渦鞭藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａａｅ））は、高濃度のＰＵＦＡを天然に産生する。このように、油産生に関与する様々な遺伝子は、遺伝的手段を介して同定されており、これらの遺伝子のうちのいくつかのＤＮＡ配列は、公的に利用できる（例えば、ジェンバンク登録番号ＡＹ１３１２３８、Ｙ０５５１１８、ＡＹ０５５１１７、ＡＦ２９６０７６、ＡＦ００７５６１、Ｌ１１４２１、ＮＭ＿０３１３４４、ＡＦ４６５２８３、ＡＦ４６５２８２、ＡＦ４６５２８１、ＡＦ１１０５１０、ＡＦ４１９２９６、ＡＢ０５２０８６、ＡＪ２５０７３５、ＡＦ１２６７９９、ＡＦ１２６７９８、ＡＦ１９９５９６、ＡＦ２２６２７３、ＡＦ３２０５０９、ＡＢ０７２９７６、ＡＦ４８９５８８、ＡＪ５１０２４４、ＡＦ４１９２９７、ＡＦ０７８７９、ＡＦ０６７６５４、ＡＢ０２２０９７、ＡＦ４８９５８９．１、ＡＹ３３２７４７、ＡＡＧ３６９３３、ＡＦ１１０５０９、ＡＢ０２００３３、ＡＡＬ１３３００、ＡＦ４１７２４４、ＡＦ１６１２１９、Ｘ８６７３６、ＡＦ２４０７７７、ＡＢ００７６４０、ＡＢ０７５５２６、ＡＰ００２０６３、ＮＰ＿４４１６２２、ＢＡＡ１８３０２、ＢＡＡ０２９２４、ＡＡＬ３６９３４、ＡＦ３３８４６６、ＡＦ４３８１９９、Ｅ１１３６８、Ｅ１１３６７、Ｄ８３１８５、Ｕ９０４１７、ＡＦ０８５５００、ＡＹ５０４６３３、ＮＭ＿０６９８５４、ＡＦ２３０６９３、ＡＸ４６４７３１、ＮＭ＿１１９６１７、ＮＭ＿１３４２５５、ＮＭ＿１３４３８３、ＮＭ＿１３４３８２、ＮＭ＿０６８３９６、ＮＭ＿０６８３９２、ＮＭ＿０７０７１３、ＮＭ＿０６８７４６およびＮＭ＿０６４６８５のものを参照のこと）。さらに、特許文献が、油産生に関与する遺伝子の多くのさらなるＤＮＡ配列（および／またはいくつかの上述の遺伝子およびその単離の方法に関する詳細）を提供している。例えば、以下を参照のこと。米国特許第５，９６８，８０９号明細書（Δ６デサチュラーゼ）、米国特許第５，９７２，６６４号明細書および米国特許第６，０７５，１８３号明細書（Δ５デサチュラーゼ）、国際公開第９１／１３９７２号パンフレットおよび米国特許第５，０５７，４１９号明細書（Δ９デサチュラーゼ）、国際公開第９３／１１２４５号パンフレット（Δ１５デサチュラーゼ）、国際公開第９４／１１５１６号パンフレット、米国特許第５，４４３，９７４号明細書および国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット（Δ１２デサチュラーゼ）、米国特許出願公開第２００３／０１９６２１７  Ａ１号明細書（Δ１７デサチュラーゼ）、国際公開第００／１２７２０号パンフレットおよ���米国特許出願公開第２００２／０１３９９７４Ａ１号明細書（エロンガーゼ（ｅｌｏｎｇａｓｅ））（これらはそれぞれ、その内容全体を本明細書に組み込むものとする）。
【０１１５】
ベクター／ＤＮＡカセットの成分
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、当分野でよく知られている。構築物に存在する配列の具体的な選択は、所望の発現産物（上記）、宿主細胞の性質、および非形質転換細胞に対して形質転換細胞を分離する提案された手段に依存する。しかし、一般的に、ベクターまたはカセットは、関連する遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。両方の制御領域が、形質転換された宿主細胞由来の遺伝子から得られる場合が、最も好ましい。しかし、こうした制御領域を、産生宿主として選択される特定の種に対して天然の遺伝子から得る必要はないことを理解されたい。
【０１１６】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」の周囲のヌクレオチド配列は、酵母細胞における発現に影響を及ぼすことが判明している。所望のポリペプチドが酵母中で不十分にしか発現されない場合、外因性遺伝子のヌクレオチド配列は、最適な遺伝子発現を得るために、効率的な酵母翻訳開始配列モチーフを含んでなるように改変できる。酵母中での発現については、これは、非効率的に発現される遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって行い、好ましい翻訳開始モチーフを含むようにすることができる。
【０１１７】
終端領域は、その開始領域が、得られるあるいは異なる遺伝子由来であるような、遺伝子の３’領域から得ることができる。多数の終端領域は、知られており、（それらが得られたところと同じ属に利用される場合であっても、異なる属に利用される場合であっても）様々な宿主において、満足に機能する。終端領域は通常、任意の特定の特性を理由にするよりもむしろ、より便宜上選択される。好ましくは、終端領域は、酵母遺伝子、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、またはクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）から得られる。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類の遺伝子の３’−領域はまた、酵母における機能が知られている。停止制御領域はまた、好ましい宿主に対して天然の様々な遺伝子から得ることもできる。場合により、終止部位は、不必要であり得るが、含まれる場合が最も好ましい。
【０１１８】
当業者が知っている通り、単にキメラ遺伝子をクローニングベクターに挿入するだけでは、必要とされるレベルで、首尾よく発現されることが確実にはならない。高い発現率の必要性に対して、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素制限、および宿主細胞からの分泌の状況を制御する、多くの分化した発現ベクターが、多くの異なる遺伝的要素を操作することにより作成された。より詳細には、遺伝子発現を制御するために操作されるいくつかの分子的特徴には、以下が含まれる。１．）関連する転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質；２．）クローニングされた遺伝子のコピーの数、および遺伝子がプラスミドに載せられたか、あるいは宿主細胞のゲノムに組み込まれたかどうか；３．）合成された外来タンパク質の最終的な細胞内位置；４．）宿主生物における翻訳の効率；５．）宿主細胞内のクローニングされた遺伝子タンパク質の固有の安定性；および６．）その頻度が宿主細胞の好ましいコドン利用の頻度に近づくような、クローニングされた遺伝子内のコドン利用。こうしたタイプの改変はそれぞれ、当該適切なコード領域に操作可能に結合される、本明細書で定義する通りのｇｐｄおよびｇｐｍ遺伝子のいずれかのプロモーター領域またはそれらの変異プロモーターを含んでなるキメラ遺伝子の発現をさらに最適化する手段として、本発明に包含される。
【０１１９】
酵母細胞の形質転換
一旦、酵母細胞における発現に適した適切なキメラ遺伝子を構築したら、これを、宿主細胞中の自律複製が可能なプラスミドベクター内に配置するか、これを、宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内にランダムに起こる可能性もあるし、宿主遺伝子座との標的遺伝子組換えに十分な、宿主ゲノムとの相同領域を含有する構築物の使用を介して目標を定めることもできる。構築物が内在性の遺伝子座を標的にする場合、全てまたはいくつかの転写および翻訳制御領域は、内在性の遺伝子座によって提供され得る。
【０１２０】
２つもしくはそれ以上の遺伝子が、別々の自己複製ベクターから発現される場合、各ベクターは、安定な発現を維持し、かつ、構築物の間の要素の再集合（ｒｅａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を予防するために、望ましくは、選択の異なる手段を有し、他の構築物に対する相同性を欠いているべきである。導入される構築物の制御領域、選択手段、および増殖の方法の適切な選択は、実験に基づいて決定でき、全ての導入された遺伝子が、所望の生成物の合成を提供するために必要なレベルで発現されるようにできる。
【０１２１】
当該コード領域を含んでなる構築物は、任意の標準技術によって、宿主細胞に導入できる。これらの技術には、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１９４：１８６〜１８７（１９９１年）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃による衝撃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｉｍｐａｃｔ）、電気穿孔法、マイクロインジェクション、または宿主細胞に当該遺伝子を導入する他の任意の方法が含まれる。油性酵母（すなわちアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できる、より具体的な教示には、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および同第５，０７１，７６４号明細書、ならびにチェン，Ｄ．Ｃ．（Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．）ら（「Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」４８（２）：  ２３２〜２３５（１９９７年））が含まれる。
【０１２２】
ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むための任意の方法により操作された宿主細胞を、便宜のために、本明細書では、「形質転換された」または「組換え型」と呼ぶこととする。形質転換された宿主は、発現構築物の少なくとも１つのコピーを有することとなり、遺伝子がゲノムに組み込まれるか、増幅されるか、あるいは複数のコピー数を有する染色体外因子上に存在するどうかに応じて、２つもしくはそれ以上を有する可能性がある。形質転換された宿主細胞は、導入された構築物上に含有されるマーカーに対する選択によって、識別することができる。あるいは、多くの形質転換技術によって、多くのＤＮＡ分子が宿主細胞に導入されるので、別々のマーカー構築物を、所望の構築物と共に同時形質転換することもできる。一般的に、形質転換された宿主は、選択培地上で増殖するその能力について選択される。選択培地は、抗生物質を組み込んでいてもよいし、栄養または増殖因子などの非形質転換宿主の増殖に必要な因子を欠いてもよい。導入されたマーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性を与える、あるいは、必須発育因子または酵素をコードすることができ、それによって、形質転換された宿主内で発現させた場合に、選択培地上での増殖を可能にする。発現されたマーカータンパク質を、直接的または間接的に検出できる場合、形質転換された宿主の選択もまた、行うことができる。マーカータンパク質は、単独で、あるいは別のタンパク質との融合体として発現させることができる。マーカータンパク質は、以下によって検出できる。１．）その酵素活性（例えば、β−ガラクトシダーゼは、基質Ｘ−ガル［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］を、有色の生成物に転換することができ、ルシフェラーゼは、ルシフェリンを発光生成物に転換できる）；または２．）その光発生または変更特性（例えば、青色光で照らされる場合、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は蛍光を発する）。あるいは、例えば当該タンパク質上のマーカータンパク質または分子タグを検出するために、抗体を使用できる。例えば、視覚的に、あるいは、抗体を使用するＦＡＣＳまたはパニングなどの技術によって、マーカータンパク質またはタグを発現している細胞を選択することができる。酵母形質転換体の選択のために、酵母中で機能する任意のマーカーを使用できる。本明細書での使用のために好ましいものは、カナマイシン、ハイグロマイシンおよびアミノグリコシドＧ４１８に耐性があり、ウラシルまたはロイシンを欠く培地上で増殖する能力をもつ。
【０１２３】
当該コード領域に操作可能に結合されたＧＰＤまたはＧＰＭプロモーターを含んでなるキメラ遺伝子の発現を上方調節する技術
（本発明のプロモーターに操作可能に結合された）特定の当該コード領域のさらなるコピーを宿主に導入して、発現を増大できる。当該コード領域の発現はまた、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質由来の不安定化（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）配列を除去する／欠損させることによって、あるいは、ｍＲＮＡに安定化（ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ）配列を加えることによって、増大させることができる（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）。
【０１２４】
当該コード領域の発現を増加させるさらにもう一つの手法は、天然の遺伝子中のコドンを、選択された宿主微生物中での最適な遺伝子発現のためのもので置換することによって、コード化されたｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることである。当業者であれば理解できるであろうことだが、宿主に好まれるコドンの使用は、該ポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できる。一般に、宿主に好まれるコドンは、タンパク質（好ましくは、最も大量に発現されるもの）におけるコドン利用を試験し、どのコドンが最も高い頻度で使用されるか決定することによって、当該特定の宿主種内で決定できる。その後、当該ポリペプチドのためのコード配列を、宿主種において好まれるコドンを使用して、全体的にあるいは部分的に合成できる。
【０１２５】
好ましい宿主
本明細書の当該プロモーター分子に操作可能に結合された当該遺伝子および当該コード領域の発現のための好ましい宿主細胞は、（所望の使用が、微生物油（以下）の産生のためである場合、油性酵母が最も好ましい場合）、酵母細胞である。油性酵母は、油合成および蓄積が天然に可能である。ここで、細胞の乾燥重量の約２５％超、好ましくは細胞の乾燥重量の約３０％超、最も好ましくは細胞の乾燥重量の約４０％超の油を含んでなることができる。一般的に油性酵母とみなされる属には、これらに限定されないが、以下が含まれる。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）。より詳細には、例示的な油合成（ｏｉｌ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ）酵母には、以下が含まれる。ロドスポリジウム  トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポミセス  スタルケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェルス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ  レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン  プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ  グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）およびアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ  リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）と分類された）。
【０１２６】
最も好ましいものは、油性酵母であるアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様では、最も好ましいものは、ＡＴＣＣ  ＃２０３６２、ＡＴＣＣ  ＃８８６２、ＡＴＣＣ  ＃１８９４４、ＡＴＣＣ  ＃７６９８２および／またはＬＧＡＭ  Ｓ（７）１と称されるアルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラウＳ．（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．）およびアゲレス  Ｇ．（Ａｇｇｅｌｉｓ  Ｇ）、「Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」８２（１）：  ４３〜９（２００２年））。ＡＴＣＣ  ＃７６９８２と称されるアルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、ＧＰＤおよびＧＰＭプロモーターおよび遺伝子が本明細書で単離された、特別な株であった。
【０１２７】
当該適切なコード領域を発現する形質転換酵母を使用する工業生産
一般に、当該特定のコード領域の高水準発現のために最適化できる培地条件には、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素対窒素比、酸素レベル、増殖温度、ｐＨ、生体生産段階の長さ、および細胞回収の時間が含まれる。油性酵母などの当該微生物は、複合培地（例えば、酵母抽出物−ペプトン−デキストロースブロス（ＹＰＤ））中で、あるいは、増殖のための必要な成分を欠いており、それによって、所望の発現カセットが選択できるような定義された最少培地（例えば、イーストニトロジェンベース（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ）（ディフコ研究所（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州（ＭＩ））中で増殖させる。
【０１２８】
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなければならない。適切な炭素源には、これらに限定されないが、以下が含まれ得る。単糖（例えば、グルコース、フルクトース）、二糖（例えば、ラクトース、スクロース）、少糖、多糖（例えば、デンプン、セルロース、またはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセリン）、または再生可能なフィードストック（例えばチーズホエー浸透液、コーンスティープリカー、テンサイ糖蜜、大麦麦芽）由来の混合物。さらに、炭素源には、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、ならびに、植物油（例えばダイズ油）および動物脂肪を含めた脂肪酸の様々な商業的な供与源が含まれ得る。さらに、炭素源には、主要な生化学的中間体への代謝性の転換が実証されている、一炭素原子源（例えば二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルマート、炭素含有アミン）が含まれ得る。したがって、本発明に利用される炭素源は、非常に様々な炭素含有供給源を包含することができ、宿主生物の選択によって制限されるに過ぎないと考えられる。上述した炭素源およびその混合物の全てが、本発明に適切であると予想されるが、好ましい炭素源は、糖および／または脂肪酸である。最も好ましいものは、グルコースおよび／または１０〜２２の間の炭素を含有する脂肪酸である。
【０１２９】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機供給源（例えば尿素またはグルタミン酸）から供給できる。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、微生物の増殖に適した、当業者に知られている適切な無機質、塩、補助因子、緩衝液、ビタミンおよび他の成分を含有しなければならない。
【０１３０】
本発明において好ましい増殖培地は、イーストニトロジェンベース（Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ）（ディフコ研究所（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州（ＭＩ）などの、商業的に調製された一般の培地である。他の定義されたあるいは合成の増殖培地もまた、使用することができ、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者によって知られることとなる。発酵のための適切なｐＨ範囲は、一般的に約ｐＨ  ４．０とｐＨ  ８．０の間であり、ｐＨ  ５．５からｐＨ  ７．０が、初期の増殖条件のための範囲として好ましい。発酵は、好気的または嫌気性条件下で行うことができ、微好気的条件が好ましい。
【０１３１】
本発明のプロモーターに操作可能に結合された当該適切なコード領域を含んでなる宿主細胞は、当技術分野で知られた方法を使用して培養できる。例えば、細胞は、適切な培地内で、かつ当該コード領域の発現を可能する条件下で実施される、振とうフラスコ培養、実験用または工業用発酵槽内での小規模または大規模な発酵によって培養できる。
【０１３２】
当該遺伝的キメラに依存する生成物の商業的な産生が所望される場合、様々な培養手法を適用できる。例えば、組換え型宿主から過剰発現させる特定の遺伝子産物の大量産生は、回分、流加、または連続発酵プロセスによって産生できる。
【０１３３】
回分発酵法は、培地組成をプロセスの始めに固定し、プロセス中、ｐＨおよび酸素レベルの維持に必要とされる以上の添加をさらに受けることはない閉鎖系である。したがって、培養プロセスの始めに、培地に所望の生物を接種し、培地にさらなる供給源（すなわち炭素および窒素源）を加えなくても増殖または代謝活動が起こるようにする。回分プロセスでは、培養が終了するときまで、系の代謝産物およびバイオマス組成を、絶えず変化させる。典型的な回分プロセスでは、細胞は、静的な対数期から高増殖対数期に進み、最後に安定期に進行し、そこでは、増殖速度は、減弱または停止する。無処置のままにしておくと、安定期の細胞は、最終的には死滅する。標準の回分式の変形形態は、供給源が、発酵プロセスの過程にわたって発酵槽に絶えず加えられる流加プロセスである。流加プロセスはまた、本発明に適切である。異化代謝産物抑制によって、細胞の代謝が抑制されやすい場合、あるいは、どの時点においても培地中に限定量の供給源を含むことが望ましい場合、流加プロセスが、有用である。流加システムにおける供給源濃度の測定は、困難であるが、ｐＨ、溶存酸素および廃ガス（例えばＣＯ２）の分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定できる。回分および流加培養法は、一般的であり、当分野でよく知られており、その例は、トーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）「バイオテクノロジー：工業微生物学のテキスト（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、（１９８９年）内、シノエールアソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）：サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）、またはデシュパンデ，ムクンドＶ．（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．）、「Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、３６：２２７（１９９２年）（本明細書に組み込むものとする）内に、見出すことができる。
【０１３４】
商業的な産生はまた、定義された培地が、バイオリアクタに絶え間なく加えられるのに対して、等しい量の培養物体積が、生産物回収のために同時に除去される、連続発酵プロセスによって達成できる。連続培養は一般に、増殖の対数期の細胞を、一定の細胞密度に維持する。連続または半連続的な培養方法により、細胞増殖または最終産物濃度に影響を及ぼす１つの因子またはいかなる数の因子の調節も可能になる。例えば、ある手法は、炭素源を制限することができ、かつ、他の全てのパラメータを中程度の代謝にする。他の系では、増殖に影響を及ぼしている多くの因子を、連続的に変えることができるのに対して、細胞濃度（培地の濁度により測定される）は、一定に保たれる。連続系では、定常状態の増殖を維持しようとするので、細胞増殖の速度が、培養株から培地が抜き取られることによる細胞消失と釣り合わなければならない。連続培養プロセスのための栄養分および増殖因子を調節する方法、ならびに生成物形成の速度を最大にするための技術は、工業微生物学の分野でよく知られており、様々な方法が、ブロック（Ｂｒｏｃｋ）、上記により詳述されている。
【０１３５】
好ましい実施態様の説明
本発明のプロモーターは、油性酵母における当該任意の適切なコード領域の発現に適したものとなるが、好ましい実施態様では、プロモーターは、ＰＵＦＡに富んだ油を蓄える油性酵母の発達に利用されることとなる。このような目的で、例えば、ω−３および／またはω−６脂肪酸の合成および蓄積を可能にするデサチュラーゼおよびエロンガーゼを導入および発現させる必要がある。
【０１３６】
用語「脂肪酸」は、様々な鎖長の約Ｃ１２からＣ２２の（より長い、また、より短い鎖長の酸も知られているが）長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指す。最も優れた鎖長は、Ｃ１６とＣ２２の間である。脂肪酸の構造は、「Ｘ：Ｙ」の簡単な表記システムにより表され、ここで、Ｘは、炭素（Ｃ）原子の合計であり、Ｙは、二重結合の数である。
【０１３７】
通常、脂肪酸は、飽和または不飽和と分類される。用語「飽和脂肪酸」は、その炭素主鎖間に「二重結合」を有さない脂肪酸を指す。対照的に、「不飽和脂肪酸」は、その炭素主鎖に沿って「二重結合」を有するシス異性体である。「一価不飽和脂肪酸」が、炭素主鎖に沿って１つの「二重結合」のみを有する（例えばパルミトオレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）に関しては、通常９番目と１０番目の炭素原子の間）のに対して、「多価不飽和脂肪酸」（すなわち「ＰＵＦＡ」）は、炭素主鎖に沿って少なくとも２つの二重結合を有する（例えば、リノール酸（１８：２）に関しては、９番目と１０番目の間、および１２番目と１３番目の炭素原子の間、また、α−リノレン酸（１８：３）に関しては、９番目と１０番目の間、１２番目と１３番目の間、および１５番目と１６番目の間）。
【０１３８】
「ＰＵＦＡ」は、（脂肪酸炭素鎖のメチル末端に最も近い第１の二重結合の位置（ｎ）に応じて）２つの主要なファミリーに分類できる。したがって、「ω−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）は、分子のオメガ（メチル）末端から６炭素原子の、第１の不飽和二重結合を有し、さらに、合計２つもしくはそれ以上の二重結合を有する（それぞれ、次の不飽和は、分子のカルボキシル末端に向けてさらに３炭素原子先に存在する）。対照的に、「ω−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）は、分子のオメガ末端から３炭素原子離れた第１の不飽和二重結合を有し、さらに、合計３つもしくはそれ以上の二重結合を有する（それぞれ、次の不飽和は、分子のカルボキシル末端に向けてさらに３炭素原子先に存在する）。
【０１３９】
この開示の目的では、オメガ−基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）システムは、炭素の数、二重結合の数、およびオメガ炭素（この目的のために、１と番号をつけられる）から数えたオメガ炭素に最も近い二重結合の位置を示すために使用される。この名称は、下の表１の、「短縮表記」とタイトルをつけた列に示される。表の残りの部分は、ω−３およびω−６脂肪酸の一般名称、明細書の残りの部分全体を通して使用されることとなる省略形、および各化合物の化学名をまとめて示す。
【０１４０】
【表１】
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【０１４１】
微生物による脂肪酸の生合成
一般に、油性微生物における脂質蓄積は、増殖培地に存在する全炭素対窒素比に応答して引き起こされる。細胞の利用可能な窒素の供給が枯渇している場合（例えば、炭素対窒素比が、約４０超である場合）、細胞のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の枯渇により、ミトコンドリアにおけるＡＭＰ依存性イソクエン酸脱水素酵素活動の停止およびクエン酸の蓄積、クエン酸のサイトゾルへの輸送、およびアセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸を与えるＡＴＰ−クエン酸リアーゼによるクエン酸のその後の切断が引き起こされる。アセチル−ＣｏＡは、新規の脂肪酸の生合成のための主成分基礎単位である。脂肪酸生合成の最初に関与するステップは、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を介して産生される、マロニル−ＣｏＡの合成である。脂肪酸合成は、複合酵素である脂肪酸合成酵素複合体によって触媒され、８つの二炭素原子断片（アセチル−ＣｏＡ由来のアセチル基）の縮合によって起こり、１６炭素の飽和脂肪酸、パルミチン酸が形成される。
【０１４２】
パルミチン酸は、より長い鎖の飽和および不飽和脂肪酸（例えば、ステアリン（１８：０）、パルミトオレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１））の前駆体である（小胞体膜に存在するエロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を介する）。パルミチン酸およびステアリン酸塩は、Δ９デサチュラーゼの作用によって、それぞれそれらの不飽和誘導体、パルミトオレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）に転換される。
【０１４３】
オメガ−３およびオメガ−６脂肪酸の生合成
簡単に言うと、ＬＡを、ＧＬＡ、ＤＧＬＡおよびＡＲＡに（ω−６経路）、また、ＡＬＡを、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡおよびＤＨＡ（ω−３経路）に転換する代謝プロセスは、炭素原子の付加を介する炭素鎖の伸長、および二重結合の付加を介する分子の不飽和化を含む。これは、小胞体膜に存在し、以下では「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と呼ぶ、一連の特定の不飽和化および伸長酵素を必要とする。
【０１４４】
より詳細には、「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼを含めて、ＰＵＦＡの生合成に関連する以下のいずれの酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）も指すこととなる。本開示内でのさらなる明快さのために、用語「デサチュラーゼ」は、１つもしくはそれ以上の脂肪酸を不飽和化して、当該一価または多価不飽和脂肪酸または前駆体を産生できる、多酵素複合体のポリペプチド成分を指す。したがって、特定の脂肪酸に関するオメガ−基準システムの使用をよそに、デルタ−システムを使用して、供給源のカルボキシル末端から数えることによって、デサチュラーゼの活性を示すことが、より好都合である。例えば、Δ１７デサチュラーゼは、分子のカルボキシル末端の端から数えて１７番目と１８番目の炭素原子の間で脂肪酸を不飽和化することとなり、例えば、ＡＲＡのＥＰＡへの、および／またはＤＧＬＡのＥＴＡへの転換を触媒できる。対照的に、用語「エロンガーゼ」は、脂肪酸炭素鎖を延長し、エロンガーゼが作用する脂肪酸源よりも２炭素長い一価または多価不飽和脂肪酸を産生できる多酵素複合体のポリペプチド成分を指す。伸長のこのプロセスは、脂肪酸シンターゼと共同して多段機構で起こる（そこでは、ＣｏＡは、アシルキャリアである）（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら、「植物細胞（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ）」８：２８１〜２９２（１９９６年））。簡単に言うと、マロニル−ＣｏＡは、長鎖アシル−ＣｏＡと縮合され、ＣＯ２およびβ−ケトアシル−ＣｏＡを与える（そこでは、アシル部分は、２炭素原子だけ延長されている）。後続反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および延長されたアシル−ＣｏＡを与える第２の還元が含まれる。
【０１４５】
ω−６脂肪酸の合成は、以下の様式で起こる。オレイン酸（最初のω−６脂肪酸）は、Δ１２デサチュラーゼの作用によって、ＬＡ（１８：２）に転換される（図１０）。その後のω−６脂肪酸は、以下の通りに産生される。１．）ＬＡは、Δ６デサチュラーゼの活性によって、ＧＬＡに転換される；２．）ＧＬＡは、エロンガーゼの作用によって、ＤＧＬＡに転換される；さらに３．）ＤＧＬＡは、Δ５デサチュラーゼの作用によって、ＡＲＡに転換される。対照的に、ω−３脂肪酸は、全てリノール酸（ＬＡ）から得られる。具体的には、１．）ＬＡが、Δ１５デサチュラーゼの作用によって、ＡＬＡに転換される；２．）ＡＬＡが、Δ６デサチュラーゼの活性によって、ＳＴＡに転換される；３．）ＳＴＡが、エロンガーゼの活性によって、ＥＴＡに転換される；さらに４．）ＥＴＡが、Δ５デサチュラーゼの活性によって、ＥＰＡに転換される。あるいは、ＥＴＡおよびＥＰＡは、それぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから、Δ１７デサチュラーゼの活性によって産生できる。ＥＰＡは、さらに、エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼの活性によって、ＤＨＡに転換できる。
【０１４６】
ＰＵＦＡの産生
当業者には明らかである通り、特定のＰＵＦＡ最終産物の産生のために宿主生物に導入するために必要とされる特定の機能は、宿主細胞（およびその天然のＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼプロフィール）、基質の利用率、および所望の最終産物によって異なることとなる。図１０に示す通り、以下のＰＵＦＡ酵素機能の様々な組み合わせを導入することによって、ＬＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡは全て、油性酵母内で産生できる。Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、および／またはエロンガーゼ。当業者であれば、公的に利用できる文献（例えば、ジェンバンク）、特許文献、およびＰＵＦＡを産生する能力を有する微生物の実験分析に従って、各々の上述の酵素をコードする様々な候補遺伝子を特定することが可能であろう。したがって、様々なデサチュラーゼおよびエロンガーゼは、本発明における当該コード領域として適切である。当該これらのコード領域は、本発明のＧＰＤおよび／またはＧＰＭプロモーターまたはそれらの変異プロモーターに操作可能に結合することができ、当業者によく知られた技術を使用して、様々なω−６およびω−３脂肪酸の発現のためのキメラ遺伝子として使用することができる（例えば、参照によってその内容全体が本明細書に組み込まれる、同時係属米国特許出願第１０／８４０５７９号を参照のこと）。したがって、本発明は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の産生方法であって、以下を含んでなるを方法を提供する。
ａ）１）  ｇｐｍ遺伝子のプロモーター領域およびｇｐｄ遺伝子のプロモーター領域よりなる群から選択される遺伝子のプロモーター領域、および
２）機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の酵素をコードする油性酵母において発現可能な当該コード領域
を含んでなるキメラ遺伝子を含んでなる、形質転換された油性酵母宿主細胞を準備し（ここでプロモーター領域とコード領域は使用可能な状態で連結される）、そして
（ｂ）適切な増殖条件下で、ステップ（ａ）の宿主細胞を接触させ、それによって、１つもしくはそれ以上のω−３またはω−６脂肪酸を産生すること。
【０１４７】
好ましい実施態様では、プロモーター領域の核酸配列は、配列番号２３、２７、４３および４４、ならびにそれらの部分配列および変異プロモーターよりなる群から選択され、かつ、当該コード領域は、ω−３またはω−６脂肪酸の産生のための油性酵母における発現に適した任意のデサチュラーゼまたはエロンガーゼである。
【０１４８】
最も多量かつ最も経済的な収量のＰＵＦＡの産生のために、形質転換された油性酵母宿主細胞は、本発明のキメラ遺伝子の発現を最適化することによって、デサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性を最適にする条件下で増殖される。ここで、これらのキメラ遺伝子は、ｇｐｍまたはｇｐｄ遺伝子のプロモーター領域、およびＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする当該コード領域を含んでなる。
【０１４９】
発酵培地においては、脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２）に、特別な注意が払われる（ナカハラ，Ｔ．（Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．）ら「Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ」、Ｄ．Ｊ．カイル（Ｄ．Ｊ．Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｒ．Ｃｏｌｉｎ）編、６１〜９７ページ（１９９２年）。
【０１５０】
様々なω−６およびω−３脂肪酸を発現する油性酵母の産生のための好ましい「発酵可能な炭素源」には、それだけには限らないが、以下が含まれる。単糖、少糖、多糖、アルカン、脂肪酸、脂肪酸のエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルマートおよび炭素含有アミン。
【０１５１】
一般的に、代謝状態が、増殖および脂肪の合成／貯蔵の間で「釣り合わなければならない」ので、油性酵母細胞中での高レベルのＰＵＦＡの蓄積は、二段階プロセスを必要とする。したがって、最も好ましくは、油性酵母におけるＰＵＦＡの産生には、二段階発酵プロセスが必要である。この手法では、発酵の第１段階は、細胞集団の産生および蓄積に費やされ、迅速な細胞増殖および細胞分裂によって特徴づけられる。発酵の第２段階では、高レベルの脂質蓄積を促進するために、培養株における窒素源欠乏の条件を確立することが好ましい。この窒素源欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの有効濃度を低下させ、それによって、ミトコンドリアのＮＡＤ依存性イソクエン酸脱水素酵素の活性を低下させることである。これが起こると、クエン酸が蓄積し、したがって、細胞質中にアセチル−ＣｏＡの大量のプールを形成し、脂肪酸合成を刺激することとなる。したがって、この段階は、細胞分裂の停止、それに続く脂肪酸の合成および油の蓄積によって特徴づけられる。細胞は、一般的に約３０℃で増殖するが、ある種の研究は、より低い温度で不飽和脂肪酸の合成が増加されることを示している（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびウォード（Ｗａｒｄ）、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」５７：４１９〜２５（１９９１年））。プロセスの経済性に基づくと、生物の増殖の大部分が起こる場合、この温度シフトは、どちらかといえば二段階発酵のうちの第１段階の後で起こるべきである。
【０１５２】
ＰＵＦＡの精製
本明細書に記述する通りの宿主微生物中で産生されるＰＵＦＡは、遊離脂肪酸として、あるいはエステル型（アシルグリセロール、リン脂質、スルホリピド、またはグリコリピドなど）に見い出すことができ、従来技術においてよく知られた様々な手段を介して、宿主細胞から抽出できる。酵母脂質のための抽出技術、品質分析、および許容基準のレビューの１つは、Ｚ．ジェーコブス（Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ）のものである（「バイオテクノロジーのクリティカルレビュー（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」１２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２年））。下流プロセッシングの簡潔なレビューはまた、Ａ．シン（Ａ．Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ウォード（Ｏ．Ｗａｒｄ）によって入手可能である（「Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」４５：２７１〜３１２（１９９７年））。
【０１５３】
一般に、ＰＵＦＡの精製のための手段には、有機溶媒での抽出、超音波処理、超臨界流体抽出（例えば、二酸化炭素を使用する）、鹸化およびプレスなどの物理的手段、あるいはそれらの組み合わせが含まれ得る。特に興味深いものは、水の存在下でのメタノールおよびクロロホルムでの抽出である（Ｅ．Ｇ．ブライ（Ｅ．Ｇ．Ｂｌｉｇｈ）およびＷ．Ｊ．ダイアー（Ｗ．Ｊ．Ｄｙｅｒ）、「Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」３７：９１１〜９１７（１９５９年））。所望により、水層を酸性化して、負に荷電した部分をプロトン化し、それによって、所望の生成物の有機層への分配を増加させることができる。抽出後、有機溶媒を、窒素流下で、蒸発によって除去できる。結合形で単離される場合、生成物を、酵素によってあるいは化学的に切断して、当該遊離脂肪酸またはあまり複雑でない結合体を放出することができ、その後、さらなる操作にかけて、所望の最終産物を産生できる。望ましくは、脂肪酸の結合形は、水酸化カリウムを用いて切断される。
【０１５４】
さらなる精製が必要な場合、標準の方法を使用できる。こうした方法には、抽出、尿素での処理、分別結晶、ＨＰＬＣ、分別蒸留、シリカゲルクロマトグラフィ、高速遠心分離、または蒸留、あるいはこれらの技術の組み合わせが含まれ得る。酸またはアルケニル基などの反応基の保護は、既知の技術（例えばアルキル化またはヨウ素化）を介する任意のステップで行うことができる。使用される方法には、メチルエステルを産生するための、脂肪酸のメチル化が含まれる。同様に、保護基は、任意のステップで除去できる。望ましくは、ＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡおよびＥＰＡを含有する画分の精製は、尿素での処理および／または分別蒸留によって達成できる。
【実施例】
【０１５５】
本発明を、以下の実施例でさらに明確に述べる。本発明の好ましい実施態様を示すが、これらの実施例は、実例として示されるに過ぎないことを理解するべきである。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特性を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱せずに、様々な使用法および条件にこれを適合させるために、本発明の様々な改変および変更態様を作ることができる。
【０１５６】
一般的な方法
実施例において使用される標準の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当分野でよく知られており、以下によって記載されている。１．）サムブルック，Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）、フリッチュ，Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．）、「分子クローニング：研究所マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８９年）（以下「マニアティス」）；２．）Ｔ．Ｊ．シルハービー（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンアン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクウィスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、「遺伝子融合を用いる実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８４年）；および３．）グリーンパブリッシングアソシエーション（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．）およびワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）によって出版された、オースベル，Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら、「分子生物学の最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」。
【０１５７】
培養微生物の維持および増殖に適した材料および方法は、当分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、一般的な細菌学のための方法のマニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（フィリップ  ゲルハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マリイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クレイグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス  フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編）、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）：ワシントンＤＣ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４年）中で、あるいは、トーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）によって、「バイオテクノロジー：工業微生物学のテキスト（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」、第２版、シノエールアソシエーツ（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）：サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）（１９８９年）中で説明するものとして知ることができる。特に明記しない限り、微生物細胞の増殖および維持に使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、アルドリッチケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））、ディフコ研究所（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（デトロイト（Ｄｅｔｒｏｉｔ）、ミシガン州（ＭＩ））、ギブコ／ＢＲＬ（ゲーサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）、メリーランド州（ＭＤ））、またはシグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州（ＭＯ））から得られた。
【０１５８】
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のロイシン独立栄養株を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州（ＭＤ）、ＡＴＣＣ  ＃７６９８２）から購入し、機能分析のために使用した。アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は通常、ＹＰＤ寒天（１％酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上で、２８℃で増殖させた。形質転換体の選択のために、最少培地（硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％イーストニトロジェンベース（ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ）（ディフコ研究所（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ  ６．１）が使用された。アデニン、ロイシン、リシンおよび／またはウラシルを補充し、０．０１％の最終濃度にした。
【０１５９】
一般的な分子クローニングは、標準の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、上記）に従って実施した。オリゴヌクレオチドは、シグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）（スプリング（Ｓｐｒｉｎｇ）、テキサス州（ＴＸ））によって合成した。部位特異的突然変異誘発は、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）ＴＭ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）（サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して、製造者の説明書に従って実施した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または部位特異的突然変異誘発が、サブクローニングに関与する場合、構築物は、配列にエラーが導入されなかったことを確認するために配列決定された。ＰＣＲ産物は、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｐＧＥＭ−Ｔ−イージー（ｅａｓｙ）ベクター（マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））にクローニングした。
【０１６０】
遺伝子の配列の操作は、ジェネティクスコンピュータグループ社（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｉｎｃ．）から入手可能なプログラムのセット（ｓｕｉｔｅ）を使用して達成された（ウィスコンシン  パッケージバージョン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ）９．０、ジェネティクスコンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））。ＧＣＧプログラム「パイルアップ（Ｐｉｌｅｕｐ）」は、ギャップ作成（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ）デフォルト値１２およびギャップ伸張（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）デフォルト値４を用いて使用された。ＧＣＧ「ギャップ（Ｇａｐ）」または「ベストフィット（Ｂｅｓｔｆｉｔ）」プログラムは、デフォルトのギャップ作成ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）５０およびデフォルトのギャップ伸張ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）３を用いて使用された。特に明記しない限り、他の全ての場合では、ＧＣＧプログラムのデフォルトのパラメータが使用された。
【０１６１】
省略形の意味は、以下の通りである。「ｓｅｃ」は、秒を意味し、「ｍｉｎ」は、分を意味し、「ｈ」は、時間を意味し、「ｄ」は、日を意味し、「μＬ」は、マイクロリットルを意味し、「ｍＬ」は、ミリリットルを意味し、「Ｌ」は、リットルを意味し、「μＭ」は、マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍＭ」は、ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌａｒ）を意味し、「Ｍ」は、モル（ｍｏｌａｒ）を意味し、「ｍｍｏｌ」ミリモル（ｍｉｌｌｉｍｏｌｅ）を意味し、「μｍｏｌｅ」は、マイクロモル（ｍｉｃｒｏｍｏｌｅ）を意味し、「ｇ」は、グラムを意味し、「μｇ」は、マイクログラムを意味し、「ｎｇ」は、ナノグラムを意味し、「Ｕ」は、ユニットを意味し、「ｂｐ」は、塩基対を意味し、「ｋｂ」は、キロベースを意味する。
【０１６２】
実施例１
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤの一部の単離
本実施例は、他のＧＰＤ配列の保存される領域から得られるプライマーを使用することによる、ＧＰＤ（配列番号１１および１２）をコードする一部のアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定を記載する。
【０１６３】
サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク登録番号ＣＡＡ２４６０７、配列番号１）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（ジェンバンク登録番号ＮＰ＿５９５２３６、配列番号２）、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ジェンバンク登録番号ＡＡＫ０８０６５、配列番号３）、ヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（ジェンバンク登録番号ＢＡＡ８８６３８、配列番号４）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）（ジェンバンク登録番号Ｐ５１４６９、配列番号５）およびニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ジェンバンク登録番号ＤＥＣＨＧ３、配列番号６）由来の、様々なタンパク質配列をコードするＧＰＤ遺伝子の比較により、６つの異なる生物の間に、いくつかの範囲の保存されるアミノ酸配列が存在することを示した（図１Ａおよび１Ｂ）。したがって、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来のＧＰＤのコード領域の一部を増幅するために、（以下に示す）２つの縮重するオリゴヌクレオチド（それぞれ、保存される「ＫＹＤＳＴＨＧ」（配列番号７）および「ＴＧＡＡＫＡＶ」（配列番号８）アミノ酸配列に相当する）を、設計および使用した。
【０１６４】
【数１】
2007525969.tif 000003
【０１６５】
図１のＧＰＤ配列の全長配列に基づいて、上で述べた通りに増幅されるアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＤ遺伝子は、そのＮ−末端からの約５０アミノ酸およびそのＣ−末端からの約〜１１５アミノ酸を失っているであろうことが仮定された。
【０１６６】
ＰＣＲ増幅は、以下を含んでなる５０μｌの総体積で実施した。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含有）、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）、２００μＭ  各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ  ＃７６９８２）のゲノムＤＮＡ  ５０ｎｇ、および１μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンターテクノロジー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。サーモサイクラー条件は、９５℃１分間、５６℃３０秒間、および７２℃１分間を３５サイクル、それに続く７２℃１０分間の最終の伸張にセットした。
【０１６７】
ＰＣＲ産物は、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キット（バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して精製し、次いで、１％（ｗ／ｖ）アガロース中のゲル電気泳動を通じて精製した。その後、ＰＣＲ産物を、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））にクローニングした。連結されたＤＮＡを使用して、大腸菌ＤＨ５αの細胞を形質転換し、形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上で選択した。ある形質転換体からのプラスミドＤＮＡの分析により、予測されたサイズのプラスミドの存在が確認され、「ｐＴ−ＧＰＤ」と名付けられた。
【０１６８】
配列分析により、ｐＴ−ＧＰＤが５０７ｂｐ断片（配列番号１１）を含有することが示された。この配列の同一性は、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）「ｎｒ」データベース（全ての非重複性のジェンバンク  ＣＤＳ翻訳物、三次元構造ブルックヘブンプロテインデータバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）から得られる配列、スイス−プロット（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ）タンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に含有される配列に対する類似性について、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）（基本的な局所的なアラインメント調査ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）、アルトシュル，Ｓ．Ｆ．（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．）ら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０（１９９３年）調査を行うことによって決定された。「ｎｒ」データベースに含有される全ての公的に入手可能なＤＮＡ配列に対する類似性は、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって提供されるブラスト（ＢＬＡＳＴ）Ｎアルゴリズムを使用して決定された。ＤＮＡ配列は、全ての読み取り枠で翻訳させ、ＮＣＢＩによって提供されるブラスト（ＢＬＡＳＴ）Ｘアルゴリズム（ギッシュ，Ｗ．（Ｇｉｓｈ，Ｗ．）およびステーツ，Ｄ．Ｊ．（Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．）「Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」３：２６６〜２７２（１９９３年））を使用して、「ｎｒ」データベースに含有される全ての公的に入手可能なタンパク質配列に対する類似性について比較する。配列番号１１が最も類似性を有する配列をまとめて示す、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）比較の結果を％同一性、％類似性および期待値（Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ）によって報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質の間で同一であるアミノ酸の割合と定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質の間で同一であるあるいは保存されるアミノ酸の割合と定義される。「期待値」は、マッチの統計的有意差を推定し、全く偶然にこのサイズのデータベースの調査で予測されるスコアを与えて、マッチの数を特定する。
【０１６９】
５０７ｂｐのｐＴ−ＧＰＤは、１６９のアミノ酸（配列番号１２）をコードすることが判明した。このアミノ酸断片は、分裂酵母（ジェンバンク登録番号ＮＰ＿５９５２３６）のＧＰＤタンパク質配列との７７％同一性および８４％類似性（図２）を有しており、６ｅ−６８の期待値であった。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）配列は、そのＮ−およびＣ−末端に、（断片を増幅するために使用される縮重するプライマーに相当する）「ＫＹＤＳＴＨＧ」（配列番号７）および「ＴＧＡＡＫＡＶ」（配列番号８）アミノ酸配列を有していた。この部分的なＧＰＤ配列のさらなる配列比較により、これがまた、ニワトリ（ジェンバンク登録番号ＤＥＣＨＧ３）およびカエル（ジェンバンク登録番号Ｐ５１４６９）由来のＧＰＤタンパク質と、それぞれ約７２％および７４の％同一性をもつ（図２）ことが決定された。
【０１７０】
実施例２
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＧＰＭの同定
本実施例は、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムデータベースに対する問い合わせ配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＭタンパク質配列を使用することによる、ＧＰＭをコードするアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の同定を記載する。
【０１７１】
具体的には、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＭタンパク質配列（ジェンバンク登録番号ＮＰ＿０１２７７０、配列番号１３）を、「Ｙｅａｓｔ  ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ」（バイオインフォマティクスセンター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、ＬａＢＲＩ、Ｔａｌｅｎｃｅ  Ｃｅｄｅｘ、フランス）の公共のアルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）データベースに対して、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）調査（実施例１に記載される通り）に使用した。
【０１７２】
アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＧＰＭをコードする１つのコンティグ（「コンティグ２２１７（Ｃｏｎｔｉｇ  ２２１７）」、配列番号１４）が特定された。コンティグ２２１７は、長さが１０４９ｂｐであるが、５ヌクレオチド位置の配列が、曖昧である（ヌクレオチド位置１０２０が「ｎ」、位置３９、６２、３３１が「ｙ」、で位置１０７が「ｍ」である）。コンティグ２２１７のＤＮＡ配列を、全ての読み取り枠で翻訳させ、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）Ｘアルゴリズム（実施例１に記載される通り）を使用して、「ｎｒ」データベースに含有される全ての公的に入手可能なタンパク質配列に対する類似性について比較する。これらのＤＮＡおよびタンパク質配列分析に基づいて、以下が決定された。
・ＧＰＭ翻訳開始コドン「ＡＴＧ」は、配列番号１４内のｂｐ  ３８８であった、したがって、コンティグ２２１７は、「ＡＴＧ」コドンに対して約３８８ｂｐ上流の配列を有していた、また、
・コンティグ２２１７は、ヌクレオチド位置４７０で１つ塩基を失っており、これはフレームシフトをもたらした。
【０１７３】
コンティグ２２１７に相当するＧＰＭの推測されるコード領域配列は、長さ６５１ｂｐであり（配列番号１５）、タンパク質配列は、配列番号１６によってコードされていた。この２１６のアミノ酸タンパク質は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＰＭタンパク質配列との７１％同一性、８２％類似性、および３ｅ−８１の期待値を有していた（ジェンバンク登録番号ＮＰ＿０１２７７０、ゴフォ，Ａ．（Ｇｏｆｆｅａｕ，Ａ．）ら、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」２７４（５２８７）：５４６（１９９６年））（図３）。
【０１７４】
実施例３
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのｇｐｄおよびｇｐｍ遺伝子の５’上流領域の単離
実施例１および２において特定された遺伝子から、ＧＰＤおよびＧＰＭプロモーター領域を単離するために、ゲノムウォーキング技術（ＴＯＰＯ（登録商標）ウォーカーキット（Ｗａｌｋｅｒ  Ｋｉｔ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を利用した。
【０１７５】
簡単に言うとアルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のゲノムＤＮＡを、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩ、またはＰａｃＩで消化し、別々に、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＣＩＰ）で脱リン酸化した。その後、個々に、鋳型として脱リン酸化されたＤＮＡ、プライマーとして以下のオリゴヌクレオチドの１つを使用して、プライマー伸長反応を実施した。ＧＰＤについてＹＬ２０６（配列番号１７）およびＧＰＭについてＹＬ１９６（配列番号１８）。プライマー伸長生成物を、ＴＯＰＯ（登録商標）リンカーを用いて連結し、第１ＰＣＲ反応（ＬｉｎｋＡｍｐ  Ｐｒｉｍｅｒ１および第２の適切なオリゴヌクレオチドのプライマーを使用する）のための鋳型として使用した。具体的には、ＹＬ２０７（配列番号１９）を、ＧＰＤの上流プロモーター領域を標的にする第２のプライマーとして使用し、ＹＬ１９７（配列番号２０）を、上流のＧＰＭプロモーター領域を標的にするＰＣＲ反応のための第２のプライマーとして使用した。ＰＣＲ増幅を、以下を含んでなる５０μｌの総体積で実施した。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含有）、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）、２００μＭ各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、および１μｌのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（エピセンターテクノロジー（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））。サーモサイクラー条件は、９５℃１分間、５６℃３０秒間、および７２℃１分間を３５サイクル、それに続く７２℃１０分間の最終伸張にセットした。
【０１７６】
その後、鋳型として第１のＰＣＲ産物、ならびにＬｉｎｋＡｍｐプライマー２および適切なオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して、第２のＰＣＲ反応を実施した。具体的には、ＧＰＤに対する第１のＰＣＲ産物を、ＬｉｎｋＡｍｐプライマー２およびＹＬ２０８（配列番号２１）を含んでなる反応において、鋳型として使用し、対照的に、ＧＰＭに対する第１のＰＣＲ産物を、ＬｉｎｋＡｍｐプライマー２およびＹＬ１９８（配列番号２２）を含んでなる反応において、鋳型として使用した。ＰＣＲ増幅は、上で述べた通りに実施した。
【０１７７】
ＧＰＤおよびＧＰＭ遺伝子の５’上流領域を含んでなるＰＣＲ産物を、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キット、それに続く１％（ｗ／ｖ）アガロース中でのゲル電気泳動を使用して、それぞれ別々に精製した。その後、生成物を、ｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）、ウィスコンシン州（ＷＩ））にクローニングした。連結されたＤＮＡを使用して、大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、形質転換体を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）含有ＬＢ寒天上で選択した。
【０１７８】
ｇｐｄ遺伝子の５’上流領域を含んでなる、ある形質転換体由来のプラスミドＤＮＡの分析により、予測されたプラスミドの存在が確認され、これを「ｐＴ−ＧＰＤＰ」と名付けた。配列分析により、ｐＴ−ＧＰＤＰが、１８４８ｂｐ（配列番号２３）の断片を含有し、これには、ＧＰＤ遺伝子の翻訳開始コドン「ＡＴＧ」のヌクレオチド「Ａ」（＋１と指定される）からの１５２５ｂｐの５’上流配列が含まれることが示された。部分的に一致している配列番号２３と１１の完全なアセンブリによって、ＧＰＤ開始コドンの１５２５ｂｐ上流と、この遺伝子の７９１ｂｐを含んでなる単一のコンティグが与えられた（配列番号２４、図４）。部分的な遺伝子配列（＋１〜＋７９１）のさらなる分析により、イントロン（塩基対＋４９〜＋１９４）の存在が示された。したがって、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＧＰＤ遺伝子をコードする部分的なｃＤＮＡ配列は、長さがわずか６４５ｂｐ（配列番号２５）であり、対応するタンパク質配列（配列番号２６）は、２１５アミノ酸である。このタンパク質を、全ての公的に入手可能なタンパク質配列（実施例１に記載される通りに）との類似性について、ＢＬＡＳＴ分析を介して比較した。この分析に基づくと、部分的なＧＰＤタンパク質が、クリプトコッカス  サイルバタス（Ｃｒｙｏｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｙｒｖａｔｕｓ）（ジェンバンク登録番号Ｑ９Ｙ７９６およびＡＡＤ２５０８０のもの）のＧＰＤと最も類似（８１％同一性）であることが決定された。
【０１７９】
ｇｐｍ遺伝子の５’上流領域を含んでなる、ある形質転換体由来のプラスミドＤＮＡの分析により、予測されたプラスミドの存在が確認され、これを、「ｐＴ−ＧＰＭＬ」と名付けた。配列分析によると、ｐＴ−ＧＰＭＬが、９５３ｂｐ（配列番号２７）の断片を含有することが示された。このクローンは、ＧＰＭ遺伝子の翻訳開始コドンからの８７５ｂｐの５’上流配列を有していた。部分的に一致している配列番号２７と１５に相当するＤＮＡのアセンブリによって、配列番号２８と表されるＤＮＡの単一のコンティグが与えられた（図５）。したがって、このコンティグは、ＧＰＭ遺伝子の−８７５〜＋６６２の領域を含有していた（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」位置が＋１と指定された）。
【０１８０】
実施例４
ｐＹ５−３０の合成
本実施例は、ＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる、ｐＹ５−３０の合成を記載する。これは、ＴＥＦ、ＧＰＤおよびＧＰＭのプロモーター活性を調査する比較研究のために必要であった。ここでは、各プロモーターおよびリポーター遺伝子を含んでなる構築物を調製し、分析した（実施例５〜７）。具体的には、リポーターは、β−グルクロニダーゼをコードする大腸菌遺伝子であった（ＧＵＳ、ジェファーソン，Ｒ．Ａ．（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ．）」３４２（６２５１）：  ８３７〜８３８（１９８９年））。
【０１８１】
ＧＵＳコード領域の増幅
鋳型としてｐＢＩ１０１（ジェファーソン，Ｒ．Ａ（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ）ら、「ＥＭＢＯ  Ｊ．」６：３９０１〜３９０７（１９８７年））、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ３３（配列番号２９）およびＹＬ３４（配列番号３０）を使用して、ＧＵＳコード領域を増幅した。ＰＣＲ増幅を、以下を含んでなる５０μｌの総体積で実施した。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含有）、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）、２００μＭ各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、および１μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））。サーモサイクラー条件は、９５℃１分間、５６℃３０秒間、および７２℃１分間を３５サイクル、それに続く７２℃１０分間の最終伸張にセットした。このＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩおよびＰａｃＩで消化した。
【０１８２】
プラスミドｐＹ５−１０の合成
プラスミドｐＹ５、ｐＩＮＡ５３２の誘導体（クロード  ゲラルディン博士（Ｄｒ．Ｃｌａｕｄｅ  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ）、Ｉｎｓｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｃｓ、Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  Ａｇｒｏ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ、ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒｉｅ  ＩＮＲＡ−ＣＮＲＳ、Ｆ−７８８５０  Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ−Ｇｒｉｇｎｏｎ、フランス、から贈与されたもの）を、図６に図解する通りに、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種遺伝子の発現のために構築した。ｐＩＮＡ５３２のＡＲＳ１８配列およびＬＥＵ２遺伝子を含有する、部分的に消化された３５９８ｂｐ  ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、ｐＹ２を産生した。
【０１８３】
プライマーとしてＴＥＦ５’（配列番号３１）およびＴＥＦ３’（配列番号３２）を使用するＰＣＲによって、ＴＥＦプロモーター（ミュラーＳ．（Ｍｕｌｌｅｒ  Ｓ．）、ら「酵母（Ｙｅａｓｔ）」、１４：１２６７〜１２８３（１９９８年））を、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅は、以下を含有する５０μｌの総体積で実施された。１００ｎｇ  ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡ、ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含有）、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）、２００ｍＭ  各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、および１μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））。増幅は、以下の通りに実施した。９５℃３分間の最初の変性、それに続いて以下を３５サイクル：９５℃１分間、５６℃３０秒間、７２℃１分間。７２℃１０分間の最終の伸張サイクルを実施し、それに続いて４℃で反応を停止させた。４１８ｂｐのＰＣＲ産物を、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔに連結し、ｐＩＰ−ｔｅｆを産生した。ｐＩＰ−ｔｅｆのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ断片を、ｐＹ２のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にサブクローニングして、ｐＹ４を産生した。
【０１８４】
鋳型としてｐＩＮＡ５３２、プライマーとしてＸＰＲ５’（配列番号３３）およびＸＰＲ３’（配列番号３４）を使用するＰＣＲによって、ＸＰＲ２転写ターミネーターを増幅した。ＰＣＲ増幅は、上記の成分および条件を使用し、総体積５０μｌで実施した。１７９ｂｐのＰＣＲ産物を、ＳａｃＩＩで消化し、その後、ｐＹ４のＳａｃＩＩ部位に連結して、ｐＹ５を産生した。したがって、ｐＹ５（図６に示される）は、以下を含有していた。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ１８）、ＣｏｌＥ１プラスミド複製開始点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン−耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における選択のための、イソプロピルリンゴ酸イソメラーゼをコードするヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種遺伝子の発現のための、翻訳伸長プロモーター（「ＴＥＦ  Ｐ」）、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種遺伝子発現の転写終結のための細胞外プロテアーゼ遺伝子ターミネーター（ＸＰＲ２）。
【０１８５】
プラスミドｐＹ５−１０（図７Ａ）は、ｐＹ５の誘導体として構築された。最初に、鋳型としてのｐＹ５を使用する、３ラウンドの部位特異的突然変異誘発によって、ｐＹ５−４（図６）を構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ１およびＹＬ２（配列番号３５および３６）を使用して、ＬＥＵ２リポーター遺伝子に位置するＮｃｏＩ部位を、ｐＹ５から排除し、ｐＹ５−１を産生した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号３７および３８）を使用する部位特異的突然変異誘発によって、ＮｃｏＩ部位を、ｐＹ５−１のＴＥＦプロモーターとＸＰＲ転写ターミネーターとの間に導入し、ｐＹ５−２を産生した。その後、オリゴヌクレオチドＹＬ２３およびＹＬ２４（配列番号３９および４０）を使用して、ＰａｃＩ部位を、ｐＹ５−２のＴＥＦプロモーターとＸＰＲ転写ターミネーターと間に導入し、ｐＹ５−４を産生した。最後に、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ９（配列番号４１）およびＹＬ１０（配列番号４２）を使用する部位特異的突然変異誘発によって、ＳａｌＩ部位を、ｐＹ５−４のＴＥＦプロモーターとＬＥＵ２遺伝子と間に導入し、ｐＹ５−１０（図７Ａ）を産生した。
【０１８６】
プラスミドｐＹ５−３０の合成
ＧＵＳコード領域（上記）を含んでなるＮｃｏＩ／ＰａｃＩ  ＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ／ＰａｃＩで消化されたｐＹ５−１０に挿入することによって、ＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＹ５−３０（図７Ｂ）を合成した。
【０１８７】
実施例５
ｐＹＺＧＤＧおよびｐＹＺＧＭＧの合成
本実施例は、ｐＹＺＧＤＧ（ＧＰＤ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）およびｐＹＺＧＭＧ（ＧＰＭ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）の合成を説明する。これらのプラスミドの合成は、推定のＧＰＤおよびＧＰＭプロモーター領域の同定および増幅を第一に必要とした。次に、各推定のプロモーター領域を、ｐＹ５−３０の誘導体にクローニングした。
【０１８８】
推定のプロモーター領域の同定および増幅
ゲノムウォーキングによるＧＰＤおよびＧＰＭ遺伝子の５’上流配列の単離の後、翻訳開始「ＡＴＧ」コドン周辺でコンセンサスモチーフを探すことによって、また、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＧＰＤおよびＧＰＭ遺伝子の翻訳されるコード領域を、それぞれ、他の生物由来のＧＰＤおよびＧＰＭ遺伝子と比較することによって、翻訳開始部位を特定した。遺伝子「ＡＴＧ」開始部位の上流の領域は、推定のプロモーター領域を特定するために使用された。
【０１８９】
このようにして、ＧＰＤ遺伝子の−９６８位置と「ＡＴＧ」翻訳開始部位と間のヌクレオチド領域（ここで、「ＡＴＧ」翻訳開始コドンの「Ａ」ヌクレオチドを＋１と指定する）が、推定のプロモーター領域（「ＧＰＤＰｒｏ」、配列番号４３として提供される）を含有することが決定された。同様に、ＧＰＭ遺伝子の−８７５位置と「ＡＴＧ」翻訳開始部位との間のヌクレオチド領域が、推定のプロモーター領域（「ＧＰＭＬＰｒｏ」、配列番号４４として提供される）を含有することが決定された。
【０１９０】
上で特定された推定のプロモーター領域を、ＰＣＲによって増幅させた。具体的には、ＧＰＤＰｒｏは、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ２１１（配列番号４５）およびＹＬ２１２（配列番号４６）、鋳型としてｐＴ−ＧＰＤＰ（実施例３）を用いて増幅させた。ＧＰＭＬＰｒｏは、プライマーとしてオリゴヌクレオチドＹＬ２０３（配列番号４７）およびＹＬ２０４（配列番号４８）、鋳型としてｐＴ−ＧＰＭＬ（実施例３）を用いて増幅させた。ＰＣＲ増幅は、以下を含んでなる５０μｌの総体積で実施した。ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．７５）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含有）、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（最終濃度）、２００μＭ各デオキシリボヌクレオチド三リン酸、１０ｐｍｏｌｅの各プライマー、および１μｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（ＣＡ））。サーモサイクラー条件は、９５℃１分間、５６℃３０秒間、および７２℃１分間を３５サイクル、それに続く７２℃１０分間の最終の伸張にセットした。
【０１９１】
このＰＣＲ産物を、その後、キアゲンＰＣＲ精製キットを使用して精製し、以下の制限消化および連結反応にかけた。
・ＧＰＤＰｒｏを、ＳａｌＩで完全に消化し、その後、ＮｃｏＩで部分的に消化した。このＳａｌＩ／ＮｃｏＩ断片を、１％（ｗ／ｖ）アガロース中のゲル電気泳動を通じて精製し、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩで消化させたｐＹ５−３０ベクター（実施例４）に連結した（ここで、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化はｐＹ５−３０ベクター骨格からＴＥＦプロモーターを切り取るものであった）。
・ＧＰＭＬＰｒｏを、３７℃で１時間、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化し、その後、１％（ｗ／ｖ）アガロース中のゲル電気泳動を通じて精製した。ＮｃｏＩ／ＳａｌｌＩで消化させたＰＣＲ産物を、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩで消化させたｐＹ５−３０ベクターに連結した。
【０１９２】
各反応から得られた連結されたＤＮＡを、その後使用して、大腸菌ＤＨ５αを個々に形質転換させた。形質転換体は、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天上で選択した。
【０１９３】
ＧＰＤＰｒｏを含有する、ある形質転換体由来のプラスミドＤＮＡの分析により、予測されたプラスミドの存在が確認され、これを「ｐＹＺＧＤＧ」と名付けた（図７Ｃ）。したがって、このプラスミドは、ＧＰＤプロモーター、ＧＵＳリポーター遺伝子およびＸＰＲターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子を含有していた。
【０１９４】
ＧＰＭＬＰｒｏを含有する、ある形質転換体由来のプラスミドＤＮＡの分析により、予測されたプラスミドの存在が確認され、これを「ｐＹＺＧＭＧ」と名付け、また、これはＧＰＭ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなるものであった（図７Ｄ）。
【０１９５】
実施例６
ｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧおよびｐＹＺＧＭＧを用いるアルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換
プラスミドｐＹ５−３０（実施例４、ＴＥＦ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）、ｐＹＺＧＤＧ（実施例５、ＧＰＤ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）およびｐＹＺＧＭＧ（実施例５、ＧＰＭ：：ＧＵＳ：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなる）を、チェン，Ｄ．Ｃ．（Ｃｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．）らの方法（「Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年））に従って、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ  ＃７６９８２に別々に形質転換させた。
【０１９６】
簡単に言うと、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）のロイシン栄養要求株を、ＹＰＤプレート上に画線し、ほぼ１８時間、３０℃で増殖させた。細胞のいくつかの大きなループフル（ｌｏｏｐｆｕｌ）を、プレートからこそぎとり、以下を含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁させた。
・２．２５ｍＬの５０％  ＰＥＧ（平均ＭＷ  ３３５０）；
・０．１２５ｍＬの２Ｍ  酢酸Ｌｉ、ｐＨ  ６．０；
・０．１２５ｍＬの２Ｍ  ＤＴＴ；および
・５０μｇ  断片化サケ精子ＤＮＡ。
【０１９７】
約５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを、１００μｌの再懸濁された細胞中で保温し、１５分間隔でボルテックス混合しながら、３９℃で１時間維持した。細胞を、ロイシンを欠く最少培地プレート上に蒔き、２から３日間、３０℃に維持した。
【０１９８】
この技術を使用して、ｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧおよびｐＹＺＧＭＧをそれぞれ含有する形質転換体が得られた。
【０１９９】
実施例７
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＴＥＦ、ＧＰＤおよびＧＰＭプロモーター活性の比較分析
ＴＥＦ、ＧＰＤおよびＧＰＭプロモーターの活性は、ｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧおよびｐＹＺＧＭＧ構築物（それぞれ、ＧＵＳリポーター遺伝子とＸＰＲターミネーターを有する）を含有するアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において決定された。発現された構築物それぞれにおけるＧＵＳ活性を、組織化学的および蛍光定量的分析によって測定した（ジェファーソン，Ｒ．Ａ．（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．）「Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ」５：３８７〜４０５、１９８７年）。
【０２００】
組織化学的分析により決定されるＧＵＳ活性
具体的には、プラスミドｐＹ５−３０を含有する２つのアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株、プラスミドｐＹＺＧＤＧを含有する２つのアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株およびプラスミドｐＹＺＧＭＧを含有している２つのアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を各３ｍＬの最少培地（２０ｇ／Ｌグルコース、アミノ酸を含まない１．７ｇ／Ｌイーストニトロジェンベース、１ｇ／Ｌ  Ｌ−プロリン、０．１ｇ／Ｌ  Ｌ−アデニン、０．１ｇ／Ｌ  Ｌ−リシン、ｐＨ６．１）中で、単一のコロニーから、３０℃で約１．０のＯＤ６００まで増殖させた。その後１００μｌの細胞を、遠心分離によって収集し、１００μｌの組織化学的染色緩衝液に再懸濁し、３０℃で保温した。［染色緩衝液は、５０μｌジメチルホルムアミドに、５ｍｇの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）を溶解し、それに続いて５ｍＬ  ５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ  ７．０）を添加することによって調製された。］
【０２０１】
組織化学的染色の結果により、構築物ｐＹ５−３０におけるＴＥＦプロモーター、構築物ｐＹＺＧＤＧにおけるＧＰＤプロモーター、および構築物ｐＹＺＧＭＧにおけるＧＰＭプロモーターは、全て活性であることが示された。ＧＰＤプロモーターは、ＴＥＦプロモーターよりかなり強力であると思われた（図８Ａ）のに対し、ＧＰＭプロモーターは、少なくともＴＥＦプロモーターと同じくらい強力であった（図８Ｂ）。
【０２０２】
蛍光定量的分析により決定されるＧＵＳ活性
ＧＵＳ活性はまた、対応する基質β−グルクロニドからの４−メチルウンベリフェロンの産生の蛍光定量的測定によって分析された（ジェファーソン，Ｒ．Ａ．（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．）、上記）。
【０２０３】
プラスミドｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧおよびｐＹＺＧＭＧをそれぞれ含有するアルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株を、３ｍＬの最少培地（上述の通り）中で、単一のコロニーから、３０℃で約１．０のＯＤ６００まで増殖させた。その後３ｍＬの培養株を、それぞれ、５０ｍＬの最少培地を含有する５００ｍＬのフラスコに加え、約２４時間、３０℃で恒温振とう機内で増殖させる。細胞を、遠心分離によって収集し、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）細胞溶解緩衝液（Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）に再懸濁し、ＢＩＯ  １０１バイオ微粉砕機システム（Ｂｉｏｐｕｌｖｅｒｉｚｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）（ビスタ（Ｖｉｓｔａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して溶解した。遠心分離後、上清を除去し、氷上に維持した。
【０２０４】
各蛍光定量的分析のために、抽出物１００μｌを、ＧＵＳ分析緩衝液７００μｌ（２ｍＭ  ４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（「ＭＵＧ」）を抽出緩衝液に入れたもの）に加え、３７℃で静置した。０、３０および６０分の時点で、１００μｌのアリコートを取り出し、停止緩衝液（１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３）９００μｌに加えた。励起波長３６０ｎｍ、放出波長４５５ｎｍに設定した蛍光計（Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒＲシリーズ（Ｓｅｒｉｅｓ）４０００、フレイミンガム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））を使用して、各時間点の値を読んだ。各サンプルの総タンパク濃度は、抽出物１０μｌおよび２００μｌのバイオラッドブラッドフォード（ＢｉｏＲａｄ  Ｂｒａｄｆｏｒｄ）試薬を使用して決定した（ブラッドフォード，Ｍ．Ｍ．（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．）「Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」  ７２：２４８〜２５４（１９７６年））。ＧＵＳ活性は、４−ＭＵ／分／タンパク質１ｍｇのｎｍｏｌｅｓと示された。
【０２０５】
これらの蛍光定量的分析の結果は、図９に示される。具体的には、図９Ａは、ＧＰＤプロモーターが、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるベンチ−マーカーＴＥＦプロモーターより３倍強力であることを示しているのに対し、図９Ｂは、ＧＰＭプロモーターのＧＵＳ活性が、ベンチ−マーカーＴＥＦプロモーターに対して約１１０％活性であることを示している。
【０２０６】
実施例８
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）［ｋｃｎ１］におけるΔ１５デサチュラーゼ発現のためのＧＰＤプロモーターの使用
本実施例は、ＧＰＤプロモーター、菌・カビ性のΔ１５デサチュラーゼ、およびＸＰＲターミネーターを含んでなるキメラ遺伝子の構築、ならびに、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるこの遺伝子の発現を説明する。（野生型のアルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）は、いかなるΔ１５デサチュラーゼ活性も持っていないが）形質転換された宿主細胞は、ＡＬＡを産生することが可能であったので、これによって、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などの油性酵母細胞における異種のＰＵＦＡ生合成経路酵素の発現を駆動するＧＰＤプロモーターの能力が確認される。
【０２０７】
ＧＰＤ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含んでなるプラスミドｐＹ３４の構築
最初に、プラスミドｐＹ５−１３を、（実施例４から得られる）ｐＹ５の誘導体として構築した。具体的には、ｐＹ５−１３は、鋳型としてｐＹ５を使用して、６ラウンドの部位特異的突然変異誘発によって構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ５およびＹＬ６（配列番号４９および５０）を使用する部位特異的突然変異誘発によって、ＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位を両方とも、ｐＹ５から排除し、ｐＹ５−５を産生した。オリゴヌクレオチドＹＬ９およびＹＬ１０（配列番号４１および４２）を使用する部位特異的突然変異誘発によって、ＳａｌＩ部位を、ｐＹ５−５の、ＬＥＵ２遺伝子とＴＥＦプロモーターとの間に導入し、ｐＹ５−６を産生した。オリゴヌクレオチドＹＬ７およびＹＬ８（配列番号５１および５２）を使用して、ＰａｃＩ部位を、ｐＹ５−６の、ＬＥＵ２遺伝子およびＡＲＳ１８との間に導入し、ｐＹ５−８を産生した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号３７および３８）を使用して、ＮｃｏＩ部位を、ｐＹ５−８の、ＴＥＦプロモーターの翻訳開始コドン周辺に導入し、ｐＹ５−９を産生した。ＹＬ１およびＹＬ２オリゴヌクレオチド（配列番号３５および３６）を使用して、ｐＹ５−９のＬＥＵ２遺伝子内部のＮｃｏＩ部位を排除して、ｐＹ５−１２を産生した。最後に、オリゴヌクレオチドＹＬ６１およびＹＬ６２（配列番号５３および５４）を使用して、ＢｓｉＷＩ部位を、ｐＹ５−１２の、ＣｏｌＥＩとＸＰＲ領域との間に導入し、ｐＹ５−１３を産生した。
【０２０８】
（実施例５から得られる）ＧＰＤＰｒｏを含んでなる精製されたＳａｌＩ／ＮｃｏＩ断片を、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化させた（ここで、ＮｃｏＩ／ＳａｌＩ消化はｐＹ５−１３ベクター主鎖からＴＥＦプロモーターを切り取るものであった）ｐＹ５−１３のベクターに連結し、「ｐＹ５−１３ＧＰＤ」を与えた。したがって、ｐＹ５−１３ＧＰＤは、ＧＰＤプロモーター：：ＸＰＲターミネーター発現カセットを含んでなるものであった。
【０２０９】
ｐＹ５−１３ＧＰＤにおけるプロモーター断片の３’末端のＮｃｏ  Ｉ部位が、Ｎｏｔ  Ｉ部位に転換され、「ｐＹ５−１３ＧＰＤＮ」が与えられた。これのために、Ｎｏｔ  Ｉ部位を有するＧＰＤｓｅｎｓｅ（配列番号５５）およびＧＰＤａｎｔｉｓｅｎｓｅ（配列番号５６）プライマーを使用するＰＣＲによって、ＧＰＤプロモーターを、再び増幅させた。得られたプロモーター断片を、Ｓａｌ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し、ｐＹ５−１３の、Ｓａｌ／ＮｏｔＩ部位にクローニングし（したがって、ＴＥＦプロモーターを除去し）、ｐＹ５−１３ＧＰＤＮを産生した。
【０２１０】
鋳型として全長ｃＤＮＡを含有するｃＤＮＡクローンｆｆｍ１ｃ．ｐＫ００１．ｇ２３（Ｅ．Ｉ．デュポン  ド  ヌムール社（Ｅ．Ｉ．ｄｕ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．））、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、デラウェア州（ＤＡ））を使用して、また、上流および下流のプライマーＰ１９２（配列番号５９）およびＰ１９３（配列番号６０）を使用して、フザリウム  モニリホルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）株Ｍ−８１１４Δ１５デサチュラーゼをコードするＯＲＦ（配列番号５７、出願中の米国仮出願第６０／５１９１９１号を参照のこと）をＰＣＲ増幅させた。ＰＣＲは、製造者の勧告に従って、Ｐｆｕポリメラーゼを使用して、エッペンドルフマスターサイクラーグラジエントサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｙｃｌｅｒ）で実施した。増幅は、以下の通りに実施された。９５℃１分間の最初の変性、それに続く、３０サイクルの９５℃３０秒間の変性、５８℃１分間のアニーリング、および７２℃１分間の伸長。７２℃１０分間の最終の伸長サイクルを実施し、それに続いて４℃で反応停止させた。
【０２１１】
適切なサイズ（およそ１２４０ｂｐ）の断片が得られ、キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）ＤＮＡ精製キットを使用して、アガロースゲルから精製し、Ｎｏｔ  Ｉで消化し、プラスミドｐＹ５−１３ＧＰＤＮの、ＧＰＤプロモーターとＸＰＲターミネーターと間のＮｏｔ  Ｉ部位にクローニングした。これによって、プラスミド「ｐＹ３４」が作成され、これは、ＧＰＤ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲキメラ遺伝子を含有していた。
【０２１２】
アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるプラスミドｐＹ３４（ＧＰＤ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲ）の発現
ｐＹ５（ベクター単独の対照、実施例４から得られる）およびｐＹ３４（ＧＰＤＰ：：Ｆｍ１：：ＸＰＲ）を、実施例６に記載されている形質転換手法を使用して、それぞれ個々に野生型（ＷＴ）アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）  ＡＴＣＣ  ＃７６８９２に形質転換させ、Ｂｉｏ１０１  ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｌｅｕプレート上で選択した。
【０２１３】
野生型および形質転換体細胞の単一のコロニーを、３ｍＬの最少培地（処方／Ｌ：２０ｇ  グルコース、１．７ｇ  イーストニトロジェンベース、１ｇ  Ｌ−プロリン、０．１ｇ  Ｌ−アデニン、０．１  のＬ−リシン、ｐＨ  ６．１）で、３０℃で、約１．０のＯＤ６００まで、それぞれ増殖させた。細胞を、回収し、蒸留水中で洗浄し、高速真空乾燥させ、直接的なエステル転移反応およびＧＣ分析にかける。具体的には、脂肪酸については、分析細胞は、遠心分離によって収集し、脂質は、ブライ，Ｅ．Ｇ．（Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．）およびダイアー，Ｗ．Ｊ．（Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．）、（「Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」３７：９１１〜９１７（１９５９年））に記載される通りに抽出した。ナトリウムメトキシドを用いる脂質抽出物のエステル転移反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し（ローワン，Ｇ．（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．）およびニシダ  Ｉ．（Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｉ．）「Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．」２７６（１）：３８〜４６（１９９０年））、その後、３０ｍ×０．２５ｍｍ（ｉ．ｄ．）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸ（ヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ））カラムを取り付けられたヒューレット−パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣを用いて分析した。オーブン温度は、３．５℃／ｍｉｎで、１７０℃（２５分保持）から１８５℃であった。
【０２１４】
直接的な塩基エステル転移反応については、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養株（３ｍＬ）を回収し、蒸留水中で一回洗浄し、５〜１０分間、Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ内で減圧下で乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１％を１００μｌ）をサンプルに加え、次いで、サンプルをボルテックスにかけ、２０分間振動させた。１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μｌヘキサンを３滴加えた後、サンプルを、ボルテックス回転させた。上層を除去し、上で述べた通りのＧＣによって分析した。
【０２１５】
野生型のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）および各々の形質転換体の脂肪酸プロフィールは、以下の表２に示される。脂肪酸は、１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトオレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）および１８：３（ＡＬＡ）と特定され、各々の組成を、全脂肪酸の割合として示す。
【０２１６】
【表２】
2007525969.tif 000004
【０２１７】
上の結果は、該ＧＰＤプロモーターが、Δ１５デサチュラーゼの発現を駆動し、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）におけるＡＬＡの産生をもたらすのに適切であることを実証した。
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１Ａ−１Ｂ】配列アラインメント内の２つの保存される（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）領域を同定するために用いられる、サッカロミセス  セレビシエ（ジェンバンク登録番号ＣＡＡ２４６０７）、シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）（ジェンバンク登録番号ＮＰ＿５９５２３６）、アスペルギルス  オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（ジェンバンク登録番号ＡＡＫ０８０６５）、ヒラメ（Ｐａｒａｌｉｃｈｔｈｙｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）（ジェンバンク登録番号ＢＡＡ８８６３８）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）（ジェンバンク登録番号Ｐ５１４６９）およびニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ジェンバンク登録番号ＤＥＣＨＧ３）から得られる既知のグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）タンパク質のアラインメントを示す。
【図２】アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロミセス  ポンベ、ニワトリおよびアフリカツメガエル由来のＧＰＤタンパク質の一部をコードするアミノ酸のアラインメントを示す。
【図３】アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびサッカロミセス  セレビシエ由来のホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ）タンパク質のアラインメントを示す。
【図４】配列番号１１、１２、２３〜２６および４３（これらはそれぞれ、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤ）に関する）の関係を視覚的に表す。
【図５】配列番号１４〜１６、２７、２８および４４（これらはそれぞれ、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるホスホグリセリン酸ムターゼ（ＧＰＭ）に関する）の関係を視覚的に表す。
【図６】プラスミドベクターｐＹ５−４の構築を説明する。
【図７Ａ−７Ｄ】それぞれ、ｐＹ５−１０、ｐＹ５−３０、ｐＹＺＧＤＧおよびｐＹＺＧＭＧに関するプラスミド地図を提供する。
【図８Ａ】組織化学的染色によって決定される通りの、アルカン資化酵母（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＴＥＦおよびＧＰＤのプロモーター活性を比較している、細胞培養株の画像である。
【図８Ｂ】組織化学的染色によって決定される通りの、アルカン資化酵母（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるＴＥＦおよびＧＰＭのプロモーター活性を比較している、細胞培養株の画像である。
【図９Ａ】蛍光定量的に決定される通りの、ＴＥＦおよびＧＰＤのプロモーター活性を比較しているグラフである。
【図９Ｂ】蛍光定量的に決定される通りの、ＴＥＦおよびＧＰＭのプロモーター活性を比較しているグラフである。
【図１０】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を説明する。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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