(57)【要約】本発明はグルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A (HMG-CoA)還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、および/もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)、またはそれらの誘導体を含む組成物の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を治療または予防する方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) グルタチオン供与体; および
(b) 5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A (HMG-CoA)還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)、またはそれらの誘導体
の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法。
【請求項２】
患者が予防または治療の必要があることを判定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
予防または治療の必要がある患者を判定する段階が、患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階が家族歴または患者歴を取得する段階を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
グルタチオン供与体が薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する前に、投与する間に、または投与した後に、GSNOを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
GSNOを患者に投与する前に、投与する間に、または投与した後に、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する前に、投与する間に、および投与した後に、グルタチオン供与体を患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
グルタチオン供与体を患者に投与する前に、投与する間に、および投与した後に、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
グルタチオン供与体がグルタチオンを含む分子である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
グルタチオン供与体がグルタチオンの前駆体分子である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
グルタチオン供与体およびAICARを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
グルタチオン供与体およびHMG-CoA還元酵素阻害剤を患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
HMG-CoA還元酵素阻害剤がスタチンである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
グルタチオン供与体およびD-PDMPを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
グルタチオン供与体およびミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
グルタチオン供与体、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、およびミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
炎症性の疾患または症状が脳卒中、X-副腎白質ジストロフィー(X-ALD)、がん、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、心筋炎、関節炎、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、炎症性神経系疾患、炎症性肺疾患、炎症性眼疾患、慢性炎症性歯肉疾患、慢性炎症性関節疾患、皮膚疾患、骨疾患、心疾患、腎不全、慢性脱髄疾患、内皮細胞疾患、心臓血管疾患、肥満症、風邪、狼瘡、鎌状赤血球貧血、糖尿病、または神経変性疾患である、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
炎症性の疾患または症状が脳卒中である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
炎症性の疾患または症状が神経変性疾患である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ランドリーギランバレーストロール症候群、多発性硬化症、ウイルス性脳炎、後天性免疫不全症候群(AIDS)関連認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳損傷、または脊髄疾患である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
炎症性の疾患または症状を治療または予防するために使われる第二療法を施す段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
グルタチオン供与体が薬学的に許容される組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが別個の組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが同じ組成物中に含まれる、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
グルタチオン供与体がGSNOではない、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
(a) グルタチオン供与体; および
(b) 5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A (HMG-CoA)還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)、またはそれらの誘導体
を含む組成物。
【請求項３４】
薬学的に許容される組成物とさらに定義される、請求項33記載の組成物。
【請求項３５】
グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項33記載の組成物。
【請求項３６】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項33記載の組成物。
【請求項３７】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
グルタチオン供与体およびAICARを含む、請求項33記載の組成物。
【請求項３９】
グルタチオン供与体およびHMG-CoA還元酵素阻害剤を含む、請求項33記載の組成物。
【請求項４０】
HMG-CoA還元酵素阻害剤がスタチンである、請求項33記載の組成物。
【請求項４１】
スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項41記載の組成物。
【請求項４３】
グルタチオン供与体およびD-PDMPを含む、請求項33記載の組成物。
【請求項４４】
グルタチオン供与体およびミグラスタットを含む、請求項33記載の組成物。
【請求項４５】
グルタチオン供与体、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、およびミグラスタットを含む、請求項33記載の組成物。
【請求項４６】
グルタチオン供与体がGSNOではない、請求項33記載の組成物。
【請求項４７】
グルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、スタチン、D-PDMP、もしくはミグラスタット、またはそれらの誘導体
の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法。
【請求項４８】
グルタチオン供与体およびスタチン、またはその誘導体を含む、薬学的に許容される組成物。
【請求項４９】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項48記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５０】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項49記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５１】
スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項50記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５２】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項51記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５３】
グルタチオン供与体がL-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項48記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５４】
グルタチオン供与体がGSNOではない、薬学的に許容される組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
A. 発明の分野
本発明は全体として、生物科学の分野に関する。より具体的には、本発明は炎症性の疾患を治療または予防するための組成物およびその使用方法に関する。なお、本出願は、2004年4月2日付で出願した米国特許仮出願第60/559,112号および2003年12月23日付で出願した米国特許仮出願第60/531,828号の恩典を主張するものである。これらの仮出願は参照により組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
B. 関連技術の説明
炎症性の疾患および症状は今日の社会に深刻な健康上の懸念をもたらしている。そのような疾患および症状を治療する現行の方法は、患者に対しおよび医療制度に対し総じて、圧倒的にかつ財政的に負担となり得る。脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、ウイルス性脳炎、後天性免疫不全疾患(AIDS)による認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳損傷、脊髄疾患、およびその他の神経変性疾患にわたる、いくつかの異なる種類の炎症性疾患が存在するという単純な事実により、この状況は腹立たしくある。
【０００３】
例えば、脳卒中は米国内で死因の第3位であり、特に高齢の患者の場合、深刻な長期にわたる身体障害および認知障害を伴う(Feigin et al. 2003; Sarti et al. 2000)。脳卒中は、局所的な血流の低下を脳の一部分にもたらす事象である。天然ではほぼ85%の脳卒中が虚血性であり、これらの条件下で、酸素不足になった脳細胞、主に虚血中心(コア)にあるニューロンがATP枯渇およびイオン障害によって直ちにネクローシス(壊死)を起こす。このコアは環状の境界域(penumbra)(Leker and Shohami 2002)によって取り囲まれており、その部分は脳卒中の間、電気的にサイレントであるが、しかし依然としてかなりの血流を有する。境界域の機能は、脳卒中から最初の数時間以内に血液供給を回復(再灌流)することで正常な状態に戻ることができる。境界域の細胞死はアポトーシスによって起こり、緩徐である。酸素供給の遅延、アポトーシス、および再灌流が炎症およびフリーラジカル攻撃に対するこの領域の脆弱性の一因となる。最終的に、損傷が神経変性や脳機能の喪失につながる。中大脳動脈閉塞(MCAO)術による局所脳虚血のラットモデルは、ヒトにおける脳卒中の最良の臨床症状モデルとして広く受け入れられている(Ginsberg and Busto 1989)。
【０００４】
中枢神経系では、アポトーシスは虚血性傷害および白質疾患などの神経変性疾患において重要な病原的役割を果たしている可能性がある(Thompson, 1995; Bredesen, 1995)。X-関連副腎白質ジストロフィー(X-ALD)も多発性硬化症(MS)もどちらも炎症誘発性サイトカインが白質の炎症の徴候に関与する脱髄疾患である。X-ALD脳の星状細胞および小膠細胞中に免疫反応性の腫瘍壊死因子α(TNF-α)およびインターロイキン1 (IL-1β)が存在することは、これらのサイトカインがX-ALDおよびMSに合わせたX-ALD、つまりヒトで最も一般的な免疫介在性のCNS脱髄疾患の免疫病理学に関与することを示唆している(Powers, 1995; Powers et al., 1992; McGuinnes et al., 1995; McGuiness et al., 1997)。炎症誘発性サイトカインがMS患者の脳脊髄液および脳組織中においてタンパク質またはmRNAレベルで誘導されることを証明するいくつかの研究によって、炎症誘発性サイトカイン(TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、およびIFN-γ)がMSにおける炎症性部位と関連することが立証されている(Maimone et al., 1991; Tsukada et al., 1991; Rudick and Ransohoff, 1992)。
【０００５】
X-関連副腎白質ジストロフィー(X-ALD)、つまり劣性遺伝のペルオキシソーム病は、進行性の脱髄および副腎機能障害によって特徴づけられる(Singh, 1997; Moser et al., 1984)。これは少年15,000〜20,000人に1人に発生する最も一般的なペルオキシソーム病であり、神経性廃疾度が異なって現れる。小児期X-ALD、つまり主形態のX-ALDの発症は4歳〜8歳とその後の2年〜3年以内の死との間である。X-ALDは小児期X-ALD、副腎脊髄ニューロパシー(AMN)、およびアディソン病を含めて、さまざまな臨床表現型として現れるが、全ての形態のX-ALDはコレステロールエステル、リン脂質およびガングリオシドの構成成分としての極長鎖飽和脂肪酸(VLCFA) (22個を超える炭素原子を有するもの)の特徴的な蓄積(Moser et al., 1984)や二次的な神経炎症性の損傷(Moser et al., 1995)と関連している。X-関連副腎白質ジストロフィーにおける壊死損傷は、星状細胞の活性化や炎症誘発性サイトカインの誘導によって媒介されることができる。X-ALDの血漿中におよび線維芽細胞中に同じような濃度のVLCFAが存在することから、線維芽細胞は通常、この疾患の出生前および出生後の両診断に用いられている(Singh, 1997; Moser et al., 1984)。
【０００６】
X-ALDの線維芽細胞から単離された精製ペルオキシソームではリグノセロイル-CoAの通常の酸化に比べてリグノセロイル-CoAリガーゼの酸化活性が欠損していることから、VLCFAの酸化異常は、リグノセロイル-CoAに対しリグノセリン酸の活性化に必要なリグノセロイル-CoAリガーゼの活性欠損による可能性があることが示唆された(Hashmi et al., 1986; Lazo et al., 1988)。これらの代謝研究からリグノセロイル-CoAリガーゼ遺伝子がX-ALD遺伝子と示唆されたが、ポジショナルクローニング研究によって、トランスポーターのスーパーファミリーのATP結合カセット(ABC)と有意な相同性を持つ、あるタンパク質(ALDP)をコードする遺伝子の同定に至った(Mosser et al., 1993)。X-ALD遺伝子のトランスフェクション後のX-ALD細胞における脂肪酸の正常化(Cartier et al., 1995)は、脂肪酸代謝におけるALDPの役割を支持するものである; しかしながら、VLCFAの代謝におけるALDPの正確な機能は現在のところ知られていない。
【０００７】
中枢神経系に影響を与えるその他の遺伝的疾患と同様に、X-ALDにおける遺伝子治療は、近い将来の実際の選択肢になるとは思われない、およびそのような治療なしで、いくつかの治療用途が詳しく調べられている(Singh, 1997; Moser, 1995)。X-ALDに付随する副腎機能障害は、ステロイド補充療法に容易に反応するが、しかし、神経性廃疾に対する治療法としてまだ証明されていない(Moser, 1995)。X-ALD患者の培養皮膚線維芽細胞にモノエン脂肪酸(例えば、オレイン酸)を加えることで、おそらく同じ鎖伸長酵素に対する競合による飽和VLCFAの減少が起こる(Moser, 1995)。トリオレエートを用いてX-ALD患者を治療することで、結果的にVLCFAが50%低下した。トリオレエートとトリエルシエート(俗称をロレンツォの油という)の混合物を用いてX-ALD患者を引き続き治療することで、VLCFAの血漿レベルの減少も起こった(Moser, 1995; Rizzo et al., 1986; Rizzo et al., 1989)。残念ながら、その臨床効果は満足できるものではなかった。X-ALD患者におけるミエリン溶解性の炎症の減弱による、好ましい効果の証拠が認められていないからである(Moser, 1995)。さらに、不飽和VLCFAを外来的に加えることで、ヒト好中球によるスーパーオキシド、つまり極めて反応性に富む酸素ラジカルの生成が引き起こされる(Hardy et al., 1994)。X-ALDの脳の脱髄は食細胞がその障害部位に広く浸潤することを伴うので(Powers et al., 1992)、不飽和脂肪酸による治療はX-ALD患者にとって有毒でさえある場合もある。骨髄治療も手順の複雑さが理由でおよび患者の臨床状態を改善するうえでの不十分な効能が理由で、ごく限られた価値しかないように思われる(Moser, 1995)。
【０００８】
実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)は中枢神経系(CNS)の炎症性脱髄疾患であり、これはヒト脱髄疾患、つまり多発性硬化症(MS)に対するモデルとして役立つ。諸研究により、大多数の炎症細胞がTリンパ球とマクロファージで構成されることが明らかにされている(Merrill and Benveniste, 1996)。これらのエフェクター細胞や星状細胞は、一酸化窒素(NO)などの炎症性メディエータおよび/または組織損傷性の作用物質として働くいくつかの分子を分泌することにより、疾病病因に関与している。NOは有益なおよび有害な効果を併せ持つ分子である。EAEのような神経炎症性疾患では、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)により長時間にわたって産生された多量のNOが神経細胞に対する細胞障害性物質として働く。以前の研究から、NOそれ自体またはその反応生成物(ONOO-)が乏突起膠細胞、つまりCNSのミエリン産生細胞の死に関与し、神経炎症性疾患過程における脱髄の原因となりうることが明らかにされている(Merrill et al, 1993; Mitrovic et al., 1994)。
【０００９】
EAEでは浸潤性Tリンパ球がIL-12、TNF-αおよびIFN-γなどの炎症誘発性サイトカインを産生する(Merrill and Benveniste, 1996)。T細胞およびマクロファージに加えて、星状細胞がTNF-αを産生することも示されている(Shafer and Murphy, 1997)。EAEの発症におけるTNF-αとIFN-γの両者の役割を支持する説得力のある証拠が存在している(Taupin et al., 1997; Villarroya et al., 1996; Issazadeh et al., 1995)。TNF-αに対する抗体を用いた研究から、マウスでは、これらの抗体が活動的なおよび適応的に移入されたEAE疾患を防御することが示されている(Klinkert et al., 1997)。TNF-αおよびIFN-γは培養星状細胞およびマクロファージにおいてiNOSの強力な誘導物質であることが示されているので(Xie et al., 1994)、EAE疾患の間のTNF-αおよびIFN-γの発現がマクロファージおよび星状細胞においてiNOSの上方制御をもたらす可能性がある。このiNOSの誘導がNOの生成をもたらしうるはずであり、大量に生成された場合にはこのNOが細胞傷害効果を引き起こす場合がある。ペルオキシ亜硝酸(ONOO-)はMSとEAE CNSの両者で同定されている(Hooper et al., 1997; van der Veen et al., 1997)。EAEの発症におけるペルオキシ亜硝酸の役割はEAEに対する尿酸、つまりペルオキシ亜硝酸捕捉物質(スカベンジャー)の有益な効果によっておよびMS患者が対照のものよりも著しく低い血清中尿酸値であったことを示すその後の調査によって支持される(Hooper et al., 1998)。しかしながら、NOS活性の阻害剤(Ruuls et al., 1996)によるおよびiNOS遺伝子ノックアウト動物モデル(Fenyk-Melody et al., 1998)におけるEAEの悪化から、NOがEAE疾患過程における唯一の病的メディエータではない可能性があることが示唆される。NOに加えて、活性酸素中間体などのその他のフリーラジカル(O2-、H2O2、およびOH-)もサイトカインによって刺激されることができる(Merrill and Benveniste, 1996)。活性酸素中間体(ROI)およびNOは、炎症性疾患の過程の間に起こる病態生理的変化の重要なメディエータであると考えられている。スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシラジカルおよび過酸化水素などのROIもTNF-αにより刺激されることができる(Merrill and Benveniste, 1996)。したがって、炎症誘発性サイトカインによる細胞機能の直接的調節とROIおよび活性窒素種の毒性の両方がEAE疾患の発症に関与しうる可能性が高い。
【００１０】
MS患者由来の血漿、脳脊髄液(CSF)、脳組織、および培養血液白血球中のタンパク質および/またはmRNAレベルに関するいくつかの研究から、炎症誘発性サイトカイン(TNF-α、IL-1およびIFN-γ)がMSと関係することが立証されている(Taupin et al., 1997; Villarroya et al., 1996; Issazadeh et al., 1995)。iNOSに対するmRNAは同様に、MSおよびEAEの両脳でも検出可能であった(Bagasra et al., 1995; Koprowski et al., 1993)。MSの脳でのiNOS mRNAに対する半定量RT-PCR(商標)により、対照の脳よりもMSの脳において著しく高いiNOS mRNAの発現が示されている(Bagasra et al., 1995)。MS患者由来のCSFの分析により、健常対照と比べてナイトライトとナイトレートのレベル上昇も示されている(Merrill and Benveniste, 1996)。ペルオキシ亜硝酸ONOO-は、タンパク質のチロシン残基をニトロチロシンにニトロソ化できる強力なニトロソ化剤である。ニトロチロシンのレベル上昇がEAEマウスの脊髄やMSの脳の脱髄性病変で認められている(Hooper et al., 1998; Hooper et al., 1997)。MS患者においてCSFのサイトカインレベル、つまり血液脳関門の破壊と、高い血中サイトカインレベルとの間には強い相関関係が存在する(Villarroya et al., 1996; Issazadeh et al., 1995)。TNF-αおよびIFN-γレベルの増加はMSの再発を予測するように思われ、血中IFN-γ陽性血液細胞の数が能力障害の重症度と相関関係を有する。これらの知見はMSとEAEの両者で、炎症誘発性サイトカインの誘導およびiNOSを通じたNOの生成がこれらの疾患の発症に関与するという見解を支持するものである。
【００１１】
アルツハイマー病(AD)は主に高齢世代に発生する一般的な変性認知症である。この病気は複数の認知機能の衰退や中枢神経系におけるニューロンの進行性の消失によって特徴づけられる。β-アミロイドペプチドの沈着が同様に、ADと関連付けられている。複数の研究者が、ADの脳は免疫を介した損傷に関する古典的マーカーの多くを含むことに留意している。これらの中には、末梢マクロファージの内生的CNS型であると考えられる小膠細胞や、星状細胞の数の上昇が含まれる。とりわけ注目すべきは、補体タンパク質がADの脳内で免疫組織化学的に検出されており、それらはほとんどの場合、老人斑として知られるβ-アミロイドを含んだ病理学的構造と関連性があるように思われる(Rogers et al., 1992; Haga et al., 1993)。
【００１２】
ADで観察された神経変性における炎症性成分の存在を示唆するこれらの初期の知見は、臨床にまで拡大されている。非ステロイド系抗炎症薬インドメタシンを用いた小規模の臨床研究から、インドメタシンがこの疾患の進行を有意に遅らせることが示唆された(Neurology, 43 (8):1609 (1993))。さらに、ADの発症が3年以上隔てられた初老の双子50ペアのなかで発症年齢を調べる研究から、抗炎症薬がAD症状の初期発症を阻止できるかまたは遅延できることが示唆された(Neurology, 44:227 (1994))。
【００１３】
長年にわたって、多数の治療法がEAEまたはMS疾患に対して有益な効果の可能性がないか試験されてきたが、結果はさまざまである(Cross et al., 1994; Ruuls et al., 1996)。アミノグアニジン(AG)はiNOSの拮抗阻害剤およびその発現の抑制因子として報告されているが(Corbett and McDaniel, 1996; Joshi et al., 1996)、今日までにiNOSを阻害する化合物で潜在的な治療価値のあるものはほとんど同定されていない。特に慢性的な炎症性の病状において、iNOSを介した一酸化窒素毒性の結果として起こりうる著しい細胞傷害を考えれば、この不備は特に厄介である。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
本発明者は特定の化合物を利用して、ヒトで炎症性疾患を治療または予防することができることを見出した。これらの化合物はグルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、および/または1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)を含む。これらの化合物の誘導体を利用して、炎症性疾患を治療または予防することもできる。
【００１５】
本発明の1つの局面は、グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子(限定するものではない例にはHMG-CoA還元酵素阻害剤が含まれる)、D-PDMP、および/もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール、またはそれらの誘導体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法を含む。特定の態様では、グルタチオン供与体をAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/または1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトールとともに投与することができる。グルタチオン供与体の限定するものではない例としては、S-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、およびN-アセチルグルタチオンが挙げられる。特定の態様では、グルタチオン供与体はGSNOではないと考えられる。HMG-CoA還元酵素阻害剤はスタチンとすることができる。本発明で使用できるスタチンの限定するものではない例としては、アトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、もしくはセリバスタチン、またはそれらの誘導体が挙げられる。グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットは、薬学的に許容される賦形剤中に製剤化することができる。
【００１６】
限定するものではない局面では、グルタチオン供与体は薬学的に許容される組成物中に含まれてもよい。AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットは、薬学的に許容される組成物中に含まれてもよい。別の態様では、グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットは、同じまたは別の組成物中に含まれてもよい。
【００１７】
本発明の特定の局面では、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/または1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトールを患者に投与する前に、投与する間に、および/または投与した後に、グルタチオン供与体を患者に投与することができる。同様に、グルタチオン供与体を患者に投与する前に、投与する間に、および/または投与した後に、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMPおよび/または1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトールを患者に投与することができる。
【００１８】
本発明の方法は、患者が予防または治療を必要とするかどうかを判定する段階をさらに含むことができる。患者が予防または治療を必要とするかどうかを判定する段階は、患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階を含むことができる。患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階は、家族歴または患者歴を取得する段階を含むことができる。
【００１９】
本発明を用いて治療できるまたは予防できる炎症性の疾患または症状の限定するものではない例としては、脳卒中、X-副腎白質ジストロフィー(X-ALD)、がん、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、心筋炎、関節炎、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、炎症性神経系疾患、炎症性肺疾患、炎症性眼疾患、慢性炎症性歯肉疾患、慢性炎症性関節疾患、皮膚疾患、骨疾患、心疾患、腎不全、慢性脱髄疾患、内皮細胞疾患、心臓血管疾患、肥満症、風邪、狼瘡、鎌状赤血球貧血、糖尿病、眼の症状、子宮内/全身感染症、脳の発達(例えば脳性麻痺)、疱疹、認知症、臓器移植/バイパス疾患または神経変性疾患が挙げられる。神経変性疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ランドリーギランバレーストロール症候群、多発性硬化症、ウイルス性脳炎、後天性免疫不全症候群(AIDS)による認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳損傷、または脊髄疾患とすることができる。さらなる態様では、本方法は同様に、炎症性の疾患または症状を治療または予防するために使われる第二療法を施す段階を含む。
【００２０】
本発明の他の局面は、グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼ(例えば、HMG-CoA還元酵素阻害剤)、D-PDMP、および/もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトールまたはそれらの誘導体を含む薬学的に許容される組成物を含む。特定の局面では、グルタチオン供与体はGSNOではない。本発明の組成物は薬学的に許容される賦形剤または担体中に製剤化することができる。特定の局面では、組成物はグルタチオン供与体およびAICAR、グルタチオン供与体およびAMP活性化キナーゼの活性化因子(例えばHMG-CoA還元酵素阻害剤)、グルタチオン供与体およびD-PDMP、またはグルタチオン供与体および1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトールを含むことができる。グルタチオン供与体の限定するものではない例としては、S-ニトログルタチオン(GSNO)、プロシステイン、N-アセチルシステイン、またはN-アセチルグルタチオンが挙げられる。AMP活性化キナーゼはスタチンとすることができる。スタチンはアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンとすることができる。特定の局面では、本発明の組成物はグルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA 還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットを含むことができる。
【００２１】
他の態様では、グルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、スタチン、D-PDMP、および/またはそれらの誘導体の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法が提供される。本発明者は同様に、グルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、スタチン、およびD-PDMP、またはそれらの誘導体を含む薬学的に許容される組成物を企図する。特定の態様では、グルタチオン供与体はGSNOではない。
【００２２】
誘導体の限定するものではない例としては、炎症性の疾患または症状の治療または予防に対する所望の効果を依然として保持する、グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼ(例えばHMG-CoA還元酵素阻害剤)、D-PDMPおよび/またはミグラスタットの化学的に修飾された化合物が挙げられる。このような誘導体は親分子に対し1つまたは複数の化学基の付加、除去、または置換を有してもよい。修飾の限定するものではない例としては、メチル、エチル、プロピルなどの低級アルカン、またはヒドロキシメチル基もしくはアミノメチル基などの置換低級アルカン; カルボキシル基およびカルボニル基; ヒドロキシル; ニトロ基、アミノ基、アミド基、およびアゾ基; 硫酸基、スルホン酸基、スルホノ基、スルフヒドリル基、スルホニル基、スルホキシド基、リン酸基、ホスホノ基、ホスホリル基、およびハライド置換基の付加または除去を挙げることができる。さらなる修飾としては、原子骨格の1つまたは複数の原子の付加または除去、例えば、プロピルによるエチルの置換; より大きなまたは小さな芳香族基によるフェニルの置換を挙げることができる。あるいは、環または二環構造では、炭素原子の代わりにN、S、またはOなどのヘテロ原子が構造中に置換されてもよい。このような誘導体は当業者に公知の任意の方法によって調製されてもよい。このような誘導体の特性を本明細書に記載のまたは当業者に公知の任意の手段により、その所望の特性を目的にアッセイしてもよい。
【００２３】
本発明のその他の限定するものではない局面は、上記の組成物および方法を1つまたは複数の一酸化窒素合成酵素の誘導抑制因子および/またはサイトカインと組み合わせることを含む。そのような誘導抑制因子の例は、例えば、参照により具体的に組み入れられる米国特許第6,551,800号の中で見出すことができる。誘導抑制因子の限定するものではない例としては、N-アセチルシステイン、ロリプラム、シロミラスト、ロフルミラスト、フォルスコリン、PDTC、および4PBAが挙げられる。本発明と組み合わせて、または単独で使用できるさらなる化合物としては、炎症性の疾患または症状を治療するために使用できるβ-インターフェロン(限定するものではない例としては、ベタセロン、レビフなどが挙げられる)、モノクローナル抗体、炎症誘発性サイトカインとその受容体との間の相互作用の阻害剤、TNFαとその受容体との間の相互作用の阻害剤、エンブレル、レミケード、コパクソン、リツキサン、阻害剤IL-1およびその受容体、T細胞受容体もしくはその断片、治療ワクチン、カプセース(capsase)阻害剤、またはPDE-4阻害剤が挙げられる。本発明で使用できるモノクローナル抗体の限定するものではない例としては、炎症誘発性サイトカイン、炎症誘発性サイトカインとその受容体との間の相互作用の阻害剤、細胞表面分子または細胞表面受容体分子、TまたはB細胞表面マーカーまたはイディオタイプ、TNFα分子またはTNFα受容体、がん細胞上の細胞表面マーカーに対する抗体が挙げられる。
【００２４】
本発明の他の態様では、一酸化窒素合成酵素の誘導抑制因子および/またはサイトカインの治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法が提供される。さらなる化合物を誘導抑制因子とともに投与することもできると考えられる。さらなる化合物の限定するものではない例としては、本明細書を通じて論じられる化合物(例えば、β-インターフェロン、モノクローナル抗体、炎症誘発性サイトカインとその受容体との間の相互作用の阻害剤、TNFαとその受容体との間の相互作用の阻害剤、エンブレル、レミケード、コパクソン、リツキサン、阻害剤IL-1およびその受容体、T細胞受容体もしくはその断片、治療ワクチン、カプセース(capsase)阻害剤、またはPDE-4阻害剤)が挙げられる。本発明の組成物はこれらの化合物の任意の組合せを含むことができる。
【００２５】
「類似体」は構造等価体または構造模倣体を含んでもよい。
【００２６】
「患者」または「被験者」は動物であってもよい。好ましい動物はヒト、ブタ、ネコ、イヌ、齧歯類、ウマ、ウシ(cattle)、ヒツジ、ヤギおよびウシ(cows)を含むがこれらに限定されない、哺乳動物である。好ましい患者および被験者はヒトである。
【００２７】
「阻害する」、「軽減する」、「治療する」もしくは「予防」という用語、またはこれらの用語の任意の変化形は、特許請求の範囲および/または明細書の中で用いられる場合、所望の結果を達成するための任意の測定可能な減少または完全な阻害を含む。
【００２８】
特許請求の範囲および/または明細書において「を含む(comprising)」という用語とともに使われる「1つの(a)」または「1つの(an)」という単語の使用は、「1つの(one)」を指すことができるが、しかしそれは同様に「1つまたは複数の」、「少なくとも1つの」および「1つ以上の」という意味とも一致する。
【００２９】
本明細書において論じられる任意の態様が本発明の任意の方法または組成物に対して実施可能であり、逆の場合も同じであることが企図される。さらに、本発明の組成物およびキットを利用して、本発明の方法を達成することができる。
【００３０】
本出願を通じて、「約」という用語は、ある値がその値を測定するために利用される装置または方法に対する誤差の標準偏差を含むことを指すように用いられる。
【００３１】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、選択肢のみを指すように明示的に示されていない限りまたは選択肢が相互に排他的でない限り、「および/または」を意味するように用いられるが、その開示は唯一の選択肢および「および/または」を指すという定義を支持するものである。
【００３２】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる「を含む(comprising)」(および「含む(comprise)」や「含む(comprises)」などの、を含む(comprising)の任意形)、「を有する(having)」(および「有する(have)」や「有する(has)」などの、を有する(having)の任意形)、「を含む(including)」(および「含む(includes)」や「含む(include)」などの、を含む(including)の任意形)または「を含む(containing)」(および「含む(contains)」や「含む(contain)」などの、を含む(containing)の任意形)という単語は、包括的でありまたは非制限的であり、さらなる未列挙の要素または方法の段階を排除するものではない。
【００３３】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の特定の態様を示しているものの、この詳細な説明から本発明の精神および範囲内でのさまざまな変更および改変が当業者には明らかになると考えられるので、例証としてのみ与えられると理解されるべきである。
【００３４】
実施態様の説明
先述のとおり、炎症性の疾患および症状は、このような疾患で苦しめられている人々に数々の金銭上および健康上の負担を与える。脳卒中およびアルツハイマー病などの特定の炎症性疾患を治療しようとする先行する試みは完全に成功しているわけではない。さらに、これらの治療は患者に有害であり患者を衰弱させる可能性がある。
【００３５】
本発明はあらゆる種類の炎症性の疾患および症状を治療および予防するための新規の組成物およびその使用方法を開示する。本発明の組成物はグルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットのいずれか1つ、またはそれらの組合せを含んでもよい。本発明のこれらのおよびその他の局面は、以下により詳細に記述される。
【００３６】
A. 炎症性疾患
本明細書を通じて開示される方法および組成物を用いて治療可能および/または予防可能であると考えられる炎症性の疾患または症状としては、乾癬(Ruzicka et al., 1994; Kolb-Bachofen et al., 1994; Bull et al., 1994); ブドウ膜炎(Mandia et al., 1994); 1型糖尿病(Eisieik & Leijersfam, 1994; Kroncke et al., 1991; Welsh et al., 1991); 敗血症性ショック(Petros et al., 1991; Thiemermann & Vane, 1992; Evans et al., 1992; Schilling et al., 1993); 疼痛(Moore et al., 1991; Moore et al, 1992; Meller et al., 1992; Lee et al., 1992); 片頭痛(Olesen et al., 1994); 関節リウマチ(Kaurs & Halliwell, 1994); 変形性関節症(Stadler et al., 1991); 炎症性腸疾患(Miller et al., 1993; Miller et al., 1993); 喘息(Hamid et al., 1993; Kharitonov et al., 1994); Koprowski et al., 1993); 免疫複合体病(Mulligan et al., 1992); 多発性硬化症(Koprowski et al,, 1993); 虚血性脳浮腫(Nagafuji et al., 1992; Buisson et al., 1992; Trifiletti et al., 1992); 毒素性ショック症候群(Zembowicz & Vane, 1992); 心不全(Winlaw et al., 1994); 潰瘍性大腸炎(Boughton-Smith et al., 1993); アテローム性動脈硬化症(White et al., 1994); 糸球体腎炎(Muhl et al., 1994); パジェット病および骨粗鬆症(Lowick et al., 1994); ウイルス感染の炎症による後遺症(Koprowski et al., 1993); 網膜炎(Goureau et al., 1992); オキシダントにより誘導された肺損傷(Berisha et al., 1994); 皮膚炎(Ruzica et al., 1994); 急性同種移植拒絶反応(Devlin, J. et al., 1994); ならびにNOを生成する侵襲性の微生物によって引き起こされる感染症(Chen, Y and Rosazza, J. P. N., 1994)が挙げられるが、これらに限定されることはない。
【００３７】
本明細書を通じて論じられるその他の炎症性疾患や当業者に公知のものは同様に、開示される本発明の方法および組成物を用いて治療可能または予防可能であると考えられる。
【００３８】
B. グルタチオン供与体
グルタチオンはアミノ酸γ-グルタミン酸、システイン、およびグリシンを含むトリペプチドである。グルタチオンはγ-グルタミルシステイニルグリシンまたはGSHとしても知られる。GSHはヒトの肝臓中に見出すことができる。グルタチオン供与体として機能できる分子の限定するものではない例としては、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、N-アセチルグルタチオン、およびS-ニトログルタチオン(GSNO)が挙げられる。本発明により、グルタチオンを運搬できるあるいはグルタチオン産生の前駆体であるまたは前駆体として機能する任意の分子をグルタチオン供与体として使用できることも企図される。
【００３９】
例えば、N-アセチルシステイン(NAC)は単純アミノ酸システインのプレアセチル化型である。NACは公知の抗酸化物質であり、食料中に天然に見出される。NACは体内におけるグルタチオン合成のための重要な前駆体である。L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)は、アミノ酸システインの修飾型である。プロシステインはグルタチオンの合成に関与する。N-アセチルグルタチオンはグルタチオンの担体として機能する。
【００４０】
GSNOはグルタチオンの生理的代謝産物であり(GSH and NO (Megson 2000; Schrammel et al. 2003)、いくつかの薬理活性に関与する(Chiueh 2002)。GSNOは塞栓信号の頻度を減らし(Kaposzta et al. 2002a; Kaposzta et al. 2002b; Molloy et al. 1998)、急性の血管収縮(vasocontriction)に拮抗し、くも膜下出血後の虚血脳障害を防ぐことができる(Sehba et al. 1999)。さらに、GSNOはONOO-によって引き起こされる酸化ストレスに対してGSHよりも数倍強力である(Rauhala et al. 1998)。GSNOは有機ナイトレートまたは組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)に対する有用な代替物になる可能性がある。すなわちGSNOは内因性であるので、GSNOが耐性を生じてしまうことはない。
【００４１】
GSNOはGSHの存在下におけるNOの酸素依存的な酸化の間に形成される。GSNOの分解は自発的に起こらないので、GSNO還元酵素またはチオレドキシン系を含む付加的な作用物質または酵素が存在することを必要とする(Steffen et al. 2001; Zeng et al. 2001)。その分解は同様に、チオール、アスコルベート、または銅の存在によって加速される。GSNOおよび関連するS-ニトロソチオールは中枢神経系において、内皮細胞または星状膠細胞とニューロンとの間のシグナル伝達分子として機能することが認識されている(Chiueh and Rauhala 1999; Lipton 2001)。GSNOによって媒介されるS-ニトロソチオールシグナル伝達は、低酸素に対する正常な反応にきわめて重要である(Lipton et al. 2001)。GSNOはラット脳内にマイクロモル濃度で存在する(Kluge et al. 1997)。さらに、タンパク質S-ニトロシル化/脱ニトロシル化はアポトーシスシグナル伝達系(Gu et al. 2002)または他のシグナル伝達系(Choi and Lipton 2000; Stamler et al. 1997)の構成要素として機能する可能性があることが示唆されている。
【００４２】
C. 5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)
5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオシド(AICAR)は、さまざまな細胞種においてAMPKを活性化させるのに広く用いられている(Sullivan et al., 1994; Corton et al., 1995)。いったん細胞内に入ると、AICARはZMPにリン酸化され、ヌクレオチドのレベルを変化させることなくAMPKのアロステリック活性化に対するAMPの複合的な効果を模倣する(Corton et al., 1995)。AICARはアロステリック活性化を誘導するだけでなく、上流のキナーゼ、すなわちAMPKキナーゼのリン酸化および活性化も促進する(Moore et al., 1991; Sullivan et al., 1994)。AMPKα1およびα2触媒サブユニットの発現は、発生中のマウス脳内で報告されている(Turnley et al., 1999)が、その機能はまだ調査されていない。
【００４３】
炎症性の疾患および症状を治療または予防するために、AICARは単独で、または本明細書に開示されるその他の化合物と組み合わせて使用できることが企図される。
【００４４】
D. HMG-CoA還元酵素阻害剤
HMG-CoA還元酵素はヒドロキシメチルグルタリル-CoAのメバロン酸への変換、すなわちコレステロール生合成における初期の律速段階を触媒する。本発明で使用できる具体的なHMG-CoA還元酵素阻害剤としては、スタチンが挙げられる。臨床試験では、スタチンは総コレステロール、LDLコレステロール、アポリポタンパク質Bおよびトリグリセリドのレベルを低下させている。スタチンは同様に、HDLレベルを増加させることができる。本発明で有用であると考えられるスタチンとしては、アトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、およびセリバスタチンが挙げられるが、これらに限定されることはない。これらのスタチンの化学式は以下を含む。
2007516294.tif 000002
2007516294.tif 000003
【００４５】
炎症性の疾患および症状を治療または予防するために、HMG-CoA還元酵素阻害剤は単独で、または本明細書に開示されるその他の化合物と組み合わせて使用できることが企図される。
【００４６】
E. D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)
D-PDMPはグルコシルセラミド合成酵素およびラクトシルセラミド合成酵素阻害剤である。D-PDMPの分子式はC23H38N203HClである。D-PDMPは427.1の分子量を含み、水溶性である。D-PDMPの化学式は以下である。
2007516294.tif 000004
【００４７】
炎症性の疾患および症状を治療または予防するために、D-PDMPは単独で、または本明細書に開示されるその他の化合物と組み合わせて使用できることが企図される。
【００４８】
F. 1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)
1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)は、グルコシルセラミド合成酵素、つまり多くのスフィンゴ糖脂質の合成に関与するグルコシル転移酵素の阻害剤である。ミグラスタットは水溶性である。ミグラスタットの分子式はC10H21NO4であり、219.28の分子量を有する。ミグラスタットの化学式は以下である。
2007516294.tif 000005
【００４９】
炎症性の疾患および症状を治療または予防するために、ミグラスタットは単独で、または本明細書に開示されるその他の化合物と組み合わせて使用できることが企図される。
【００５０】
G. 第二世代の化合物
上述の化合物に加えて、本発明者は同様に、これらの化合物の重要な部分を模倣するようにその他の立体的に類似の化合物を構築できることが企図される。このような模倣化合物をグルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットと同じ方法で使用することができる。
【００５１】
さらなる構造等価体または構造模倣体の作出は、当業者に公知のモデリングや化学的デザインの技術によって達成することができる。コンピュータに基づく化学的モデリングの技術分野が現在ではよく知られている。このような方法を使って、グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットと同じ方法で作用する化合物をデザインし合成することができる。このような立体的に類似の構築体および第二世代の化合物は全て、本発明の範囲の中に入ることが理解されよう。
【００５２】
H. 治療法の最適化
被験者において炎症性疾患を治療または予防する能力を有すると同定された化合物は、単独でまたは他のそのような化合物と組み合わせて、その最適な治療用量によりアッセイすることができる。このようなアッセイは当業者に周知であり、組織培養またはそのような作用物質で治療できるさまざまな疾病の動物モデルを含む。
【００５３】
このようなアッセイの例には、本明細書に記述されるものおよび米国特許第5,696,109号に記述されるものが含まれる。例えば、分子の脳虚血(脳卒中)における治療可能性を判定するアッセイでは、生理条件下で維持された脳切片において無酸素症の発症によって引き起こされる不可逆的な損傷を阻止する作用物質の能力を評価する。神経毒MPTPによる医原性ヒドロキシルラジカル生成(Chiueh et al., 1992、参照により本明細書に組み入れられる)に関するパーキンソン病の動物モデルを利用して、iNOSまたは炎症誘発性サイトカイン誘導阻害剤の保護作用を評価してもよい。神経毒MPTPは、脳内でドーパミン作動性ニューロンの変性を引き起こすことが示されており、したがって実験的に誘発されたパーキンソン病(例えば、医原性の毒性)の良いモデルをもたらす。作用物質の保護的または治療的有用性を判定するため、単離された鉄過負荷ラットの心臓を用いる虚血再灌流傷害の動物モデルが報告されている。手短に言えば、ラットにデキストラン鉄溶液を筋肉内注射して、心臓組織での著しい鉄過負荷を達成する。その後、心臓を単離し、次いで常温全範囲虚血後、最初に使われた灌流培地による再灌流に供する。この再灌流の間に、心拍数、ならびに拡張期圧および収縮期圧をモニターした。心臓組織試料を電子顕微鏡評価して、膨潤および膜破裂などのミトコンドリアへの損傷、ならびに細胞壊死を判定する。虚血/再酸素化後の作用物質または鉄過負荷を有りまたは無しとして測定された心臓機能および細胞構造上の損傷の比較を利用して、作用物質の治療有効性を判定する。
【００５４】
I. 精製技術
本発明の化合物の精製に用いるのに適したさまざまな技術が当業者に周知であると考えられる。これらには、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ゲルクロマトグラフィーまたは分子篩クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。本発明で使用できるこれらのおよびその他の技術の例は、Sambrook et al., 2001に載っている。
【００５５】
本明細書で用いられる「精製された」という用語は、その他の化合物から分離できる化合物であって、その天然に得られる状態に比べて任意の程度まで精製された化合物のことを指すように意図される。したがって、精製された化合物とは、天然に存在しうる環境から遊離された化合物のことを指す。
【００５６】
J. 薬学的組成物および投与経路
本発明の1つの態様は、グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼ、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットのいずれか1つを必要のある患者に送達することにより、炎症性疾患を治療または予防する方法を含む。これらの化合物は、別個の賦形剤中で送達されてもよく、または1つの組成物の中に含まれてもよい。本発明の薬学的化合物および組成物の有効量は、一般に、疾患またはその症候の程度を検出可能にかつ繰り返し改善する、軽減する、最小化するまたは抑えるのに十分なその量と定義される。疾患の排除、根絶または治療を含めて、より厳密な定義が適用されることもある。
【００５７】
1. 薬学的組成物
本発明の薬学的組成物はグルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットを含むことができる。「薬学的または薬理学的に許容される」という語句は、例えば、ヒトなどの動物に投与された場合に副作用、アレルギー反応またはその他の有害反応をもたらさない分子的実体および組成物のことを指す。グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットを含む薬学的組成物の調製は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990などの、本開示に照らして当業者に公知であろう。さらに、動物(例えば、ヒト)投与の場合、調製物は生物学的標準品に関するFDA Office of Biological Standardsによって定められている無菌性、発熱性、一般的安全性および純粋性の基準を満たさなくてはならないことが理解されよう。
【００５８】
「治療的有効量」とは、受容動物または患者において有益な結果をもたらすのに有効な量である。このような量は既刊文献を精査することにより、インビトロ試験を行うことによりまたは健常な実験動物で代謝研究を行うことにより最初に決められてもよい。臨床の場で用いる前に、動物モデルで、好ましくは治療される特定の疾患に関し広く受け入れられている動物モデルで確認試験を行うことが有益かもしれない。ある種の態様で用いるのに好ましい動物モデルは、齧歯類モデルである。これらは、使用するのが経済的であるため、とりわけ、得られる結果が臨床的価値を予測するとして広く受け入れられているため好ましい。
【００５９】
本明細書で用いられる「薬学的に許容される担体」とは、当業者には知られているとおり、任意の全ての溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤(例えば、抗細菌剤、抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、そのような類似の材料およびその組合せを含む(Remington's, 1990)。従来の任意の担体が活性成分と適合しない場合を除いては、治療的または薬学的組成物におけるその使用が企図される。
【００６０】
動物患者に投与される本発明の組成物の実際の投与量は、体重、症状の重症度、治療される疾患の種類、事前のまたは同時の治療行為、患者の特発性疾患および投与経路などの物理的および生理的要因によって決定することができる。投与に対して責任がある専門家は、いずれも場合も、組成物中の活性成分の濃度や個々の被験者に適した用量を決定することができる。
【００６１】
ある種の態様では、薬学的組成物は、例えば、活性化合物を少なくとも約0.1%含むことができる。その他の態様では、活性化合物は、例えば、単位重量の約2%から約75%、または約25%から約60%、およびそれらの中で導き出せる任意の範囲を含むことができる。その他の限定するものではない例では、用量は同様に、投与当たり約1マイクログラム/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重、約10マイクログラム/kg/体重、約50マイクログラム/kg/体重、約100マイクログラム/kg/体重、約200マイクログラム/kg/体重、約350マイクログラム/kg/体重、約500マイクログラム/kg/体重、約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重、約200ミリグラム/kg/体重、約350ミリグラム/kg/体重、約500ミリグラム/kg/体重から約1000 mg/kg/体重またはそれ以上、およびそれらの中で導き出せる任意の範囲を含むことができる。本明細書に記載される数値から導き出せる範囲の限定するものではない例では、上記の数値に基づいて、約 5 mg/kg/体重から約100 mg/kg/体重、約5マイクログラム/kg/体重から約500ミリグラム/kg/体重などの範囲のものを投与することができる。
【００６２】
いずれも場合も、組成物は1つまたは複数の成分の酸化を遅らせるさまざまな酸化防止剤を含むことができる。さらに、微生物の作用の阻止は、パラベン(例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン)、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはその組合せを含むがこれらに限定されない、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤などの保存剤によってもたらすことができる。
【００６３】
本発明の組成物は、これが固体状で、液体状でまたはエアロゾル状で投与されるかどうか、およびこれが注射のような投与経路用に無菌でなければならないかどうかに応じて、異なる種類の担体を含むことができる。
【００６４】
組成物は遊離塩基型、中性型または塩型で組成物中に製剤化されてもよい。薬学的に許容される塩は、酸付加塩、例えば、タンパク性組成物の遊離アミノ基によって形成されるもの、あるいは、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸のような有機酸によって形成されるものを含む。遊離カルボキシル基によって形成される塩は同様に、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムもしくは水酸化第二鉄などの無機塩基またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインのような有機塩基から得ることができる。
【００６５】
組成物が液状で存在する態様では、担体は、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、脂質(例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム)およびその組合せを含むがこれらに限定されない溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、例えば、液体ポリオールまたは液体脂質などの担体中での分散による必要な粒径の維持によって、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤の使用によって、あるいはそのような方法のその組合せによって維持することができる。多くの場合には、例えば、糖類、塩化ナトリウムまたはその組合せなどの等張剤を含めることが好ましいであろう。
【００６６】
その他の態様では、本発明において点眼液、点鼻液もしくは鼻内噴霧、煙霧剤または吸入剤を使用してもよい。そのような組成物は一般に、標的組織型に適合するようにデザインされる。限定するものではない例では、点鼻液は通常、滴下または噴霧で鼻腔に投与されるようにデザインされる水溶液である。点鼻液はこれらが鼻分泌物に多くの点で類似するように調製され、その結果、正常な繊毛作用が維持される。すなわち、好ましい態様では、水溶性点鼻液は通常、等張性であるかまたは約5.5から約6.5のpHを維持するようわずかに緩衝剤で処理される。さらに、点眼薬に使われるものに類似の抗菌性保存剤、薬物、または適当な薬物安定剤が、必要に応じて、剤形の中に含まれてもよい。例えば、さまざまな市販の点鼻剤が知られており、抗生物質または抗ヒスタミン剤などの薬物を含んでいる。
【００６７】
ある種の態様では、組成物は経口摂取のような経路による投与用に調製される。これらの態様では、固体組成物は、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤(例えば、硬質または軟質シェルのゼラチンカプセル)、徐放性製剤、バッカル組成物、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、オブラート、またはそれらの組合せを含むことができる。経口組成物はダイエット食品を使って直接取り込まれてもよい。経口投与に好ましい担体は、不活性希釈剤、同化できる食用の単体またはその組合せを含む。本発明のその他の局面では、経口組成物はシロップ剤またはエリキシル剤として調製されてもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、例えば、少なくとも1つの活性剤、甘味剤、保存剤、香味剤、色素、保存剤、またはそれらの組合せを含んでもよい。
【００６８】
ある種の態様では、経口組成物は1つまたは複数の結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、香味剤、およびその組合せを含むことができる。ある種の態様では、組成物は以下の1つまたは複数を含むことができる: 例えば、トラガカントゴム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンもしくはその組合せなどの結合剤; 例えば、リン酸二カルシウム、マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムもしくはその組合せなどの賦形剤; 例えば、コーンスターチ、ポテトスターチ、アルギン酸もしくはその組合せなどの崩壊剤; 例えば、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤; 例えば、スクロース、ラクトース、サッカリンもしくはその組合せなどの甘味剤; 例えば、ペパーミント、ウィンターグリーン油、チェリー香料、オレンジ香料などのような香味剤; または前記のそれらの組合せ。投与単位剤形がカプセルである場合、これは上記の種類の材料に加えて、液体担体などの担体を含むことができる。さまざまなその他の材料が被覆剤としてまたは投与単位の物理的形状を別の方法で変えるように存在してもよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤はセラック、糖またはその両方で被覆されてもよい。
【００６９】
その他の投与方法に適したさらなる剤形は坐薬を含む。坐薬は直腸、膣または尿道への挿入用の、通常薬の入った、さまざまな重量および形状の固体投与剤形である。挿入後、坐剤は軟化し、腔液中に融解するかまたは溶解する。一般に、坐剤の場合、従来の担体としては、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはその組合せを挙げることができる。ある種の態様では、坐薬は、例えば、活性成分を約0.5%から約10%、および好ましくは約1%から約2%の範囲で含有する混合物から形成されてもよい。
【００７０】
無菌の注射可能な液剤は必要量の活性化合物を、必要に応じて、上記に列挙されるさまざまなその他の成分とともに適当な溶媒中に組み込み、その後ろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散媒はさまざまな滅菌活性成分を、基礎の分散媒および/またはその他の成分を含む無菌賦形剤の中に組み込むことによって調製される。無菌の注射可能な液剤、懸濁剤または乳剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加え任意の付加的な望ましい成分の粉末を予めろ過滅菌されたその液状賦形剤から生じる真空乾燥または凍結乾燥技術である。この液状賦形剤は必要に応じて適当に緩衝剤で処理されるべきであり、その液状希釈剤は注射の前に十分な生理食塩水またはグルコースを用いて最初に等張とされるべきである。直接注射用の高度に濃縮された組成物の調製も企図される。この場合、非常に素早い浸透を引き起こし、高濃度の活性剤を小領域に送達するよう、溶媒としてDMSOを使用することが想定される。
【００７１】
組成物は製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。外毒素の混入は安全水準で最低限に、例えば、0.5 ng/mgタンパク質未満に維持されるべきであることを理解されたい。
【００７２】
2. 投与経路
本発明は静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、子宮内に、直腸内に、局所的に(topically)、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、経口に、局所的に(topically)、 局所的に(locally)、吸入(例えば、エアロゾル吸入)により、注射により、注入により、持続注入により、直接標的細胞を限局性灌流槽に浸すことにより、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリーム中で、脂質組成物(例えば、リポソーム)中で、あるいは当業者に知られているその他の方法または前記の任意の組合せにより投与することができる(Remington's, 1990)。
【００７３】
K. 併用療法
グルタチオン供与体、AICAR、AMP活性化キナーゼの活性化因子、HMG-COA還元酵素阻害剤、D-PDMP、および/またはミグラスタットのいずれかの組合せを含む組成物などの、本発明の組成物を用いた治療の有効性を高めるため、これらの組成物を炎症性の疾患または症状の治療に有効なその他の治療法と組み合わせることが望ましい場合がある。
【００７４】
本発明の組成物は数分から数週間に及ぶ間隔だけ、その他の薬剤治療に先行するまたは続くことができる。両治療法を約12時間〜24時間の間隔で、より好ましくは、約6時間〜12時間の間隔で施すことができると考えられる。場合によっては、治療の期間をかなり延長することが望ましい場合があり、数日(2、3、4、5、6または7)から数週間(1、2、3、4、5、6、7または8)が各投与の間に経過する。
【００７５】
本発明により企図される組成物を含む組成物が「A」であり、第2の薬剤が「B」である場合に、次のさまざまな組合せが利用されてもよい。
2007516294.tif 000006
【００７６】
実施例
以下の例は本発明の好ましい態様を実例説明するために含まれる。以下に続く例に開示される技術は、本発明の実施に際して十分に機能することが本発明者により見出されている技術に相当し、したがって、好ましいその実施様式を構成すると考えられることは当業者によって理解されるはずである。しかしながら、当業者は本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の態様において多くの変更を行うことができ、それでも同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解するはずである。
【００７７】
実施例1
材料と方法I
試薬
組換えラットインターフェロンγ(IFNγ)およびマウスマクロファージ由来iNOSに対する抗体は、Calbiochem(CA)から入手した。DMEMおよびFBSはLife Technologies社から入手した。リポ多糖類(大腸菌(Escherichia coli)抗原型0111:B4由来)はSigma (MO)から入手した。グルコシルセラミド、ラクトシルセラミド、ガラクトシルセラミド、ガングリオシドおよびD-PDMP (C23H38N203・HCl; D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール・HCl)はMatreya社(PA)から入手した。14C-ガラクトースおよび3H UDP-ガラクトースはAmerican Radiolabeled Chemicals (MO)から入手した。
【００７８】
細胞培養
星状細胞に富んだ初代培養物は、既報(Pahan et al., 1998)のように1日齢のSprague-Dawley系ラットの全皮質から調製した。手短に言えば、既報(Won et al., 2001)のように、皮質をpH 7.4の氷冷カルシウム/マグネシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液(HBSS) (Gibco, Grand Island, NY)中で素早く解剖した。次いでこの組織を細かく切り刻み、トリプシン(2 mg/ml)含有HBSS中で20インキュベートし、10% FBSおよび10 μg/mlゲンタマイシンを含有する平板培地中で2回洗浄し、次にパスツールピペットに通してすり潰すことでバラバラにし、この後に細胞を75cm2の培養フラスコ(Falcon, Franklin, NJ)中で平板培養した。5% CO2中にて37℃で1日間インキュベーション後、この培地を培養培地(5% FBSおよび10 μg/mlゲンタマイシン含有DMEM)に完全に交換した。培養液は1週間に2回新鮮な培地で2分の1交換した。14日〜15日後、細胞を少なくとも1日オービタルシェーカー上で振盪して小膠細胞を取り去り、次いでマルチウェル組織培養ディッシュに蒔いた。薬物とのインキュベーションの前に、細胞を無血清DMEMで24時間インキュベートした。
【００７９】
ATCCから入手したC6ラット神経膠腫細胞は、10%ウシ胎仔血清(FBS)(GIBCO)および10 μg/mlゲンタマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (GIBCO, CA)中で維持した。培養細胞は全て5% CO2/95%空気中にて37℃で維持した。80%の集密度で、LPS/IFNγおよびその他の化学物質とのインキュベーションの前に、細胞を無血清DMEM培地で24時間インキュベートした。
【００８０】
NO生成のアッセイ
細胞を12ウェルのプラスチック製組織培養皿の中で培養した。適当な処理の後、NOの生成をナイトライトに対する培養上清のアッセイにより測定した(Green et al., 1982)。手短に言えば、培養上清100 μlをGriess試薬100 μlと反応させた。アッセイ試料の吸光度を570 nmで分光光度的に測定した。ナイトライト濃度は新鮮培地中でのNaNO2の反応から得られた標準曲線から算出した。
【００８１】
ウエスタンブロット解析
iNOSタンパク質の場合、細胞を冷Tris緩衝生理食塩水(TBS; 20 mMトリズマベース(Trizma base)、および137 mM NaCl, pH 7.5)で洗浄し、1×SDSサンプルローディングバッファー(62.5 mMトリズマベース、2 % w/v SDS、10%グリセロール)中に溶解し、超音波処理および1,5000×gで5分間の遠心の後、上清をiNOSウエスタン免疫ブロットアッセイに使用した。試料のタンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミン(BSA)を用い、界面活性剤適合性タンパク質アッセイ試薬(Bio-Rad Laboratories, CA)で測定した。試料を0.1容量の10%β-メルカプトエタノールおよび0.5%ブロモフェノールブルーミックスで3分間煮沸した。全細胞タンパク質50 μgを8%または12%ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動により分解し、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)フィルターに電気転写し、5%スキムミルク入りのTween 20含有Tris緩衝生理食塩水[TBST; 10 mMトリズマベース(pH 7.4)、1% Tween 20、および150 mM NaCl]でブロッキングした。このフィルターを、抗iNOS抗血清(BD PharMingen, CA)、または抗hRas抗血清(Upstate Biotechnology, CA)、または抗リン酸特異的MAPK(p42/44)抗血清(Signal Transduction)とPVDF緩衝液中にて室温で2時間インキュベーション後、TBST緩衝液で3回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギまたはマウスIgGと1時間インキュベートした。この膜をTBST緩衝液で洗浄後、ECL-plus (Amersham Pharmacia Biotech)を用いてオートラジオグラフにかけた。
【００８２】
核抽出および電気泳動移動度シフトアッセイ
細胞(細胞1×107個)由来の核抽出物は、既刊の方法(Dignam et al., 1983)を用い、若干の変更を加えて調製した。細胞を回収し、氷冷TBSで2回洗浄し、10 mM KCl、2 mM MgCl2、0.5 mMジチオスレイトール、プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma)、および0.1% Nonidet P-40の10 mM HEPES, pH 7.9を含有する緩衝液A 400 μl中に氷上で10分間溶解した。5,000×gで10分間遠心後、ペレット化された核をNonidet P-40不含の緩衝液Aで洗浄し、25% (v/v)グリセロール、0.42 M NaCl、1.5 mM MgCl2、0.2 mM EDTA、0.5 mMジチオスレイトール、およびComplete(商標)プロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)の20 mM HEPES, pH 7.9を含有する緩衝液B 40 μl中に氷上で30分間再懸濁した。この溶解物を15,000×gで15分間遠心し、核タンパク質を含む上清を、使用まで-70℃で保存した。AP-1、NFκB、およびC/EBP DNA結合活性を検出する電気泳動移動度シフトアッセイに、核タンパク質10 μgを使用した。DNAとタンパク質間の結合反応は、10 mMトリズマベース(pH 7.9)、50 mM NaCl、5 mM MgCl2、1 mM EDTA、1 mMジチオスレイトール、ポリ(dI-dC) 1 μg、5% (v/v)グリセロール、および末端デオキシヌクレオチジル転移酵素(Roche)を用いてDIG-ddUTPで標識したおよそ0.3 pmolのNFκB (Santa Cruz Biotech)中にて室温で20分間行った。タンパク質とDNAとの複合体を50 mM Tris, pH 8.3、0.38 Mグリシン、および2 mM EDTA中の室温の5%ポリアクリルアミドゲル中で無タンパク質DNAから分離し、プラスに帯電したナイロン膜上に電気ブロットした。DIG標識プローブの化学発光検出法は、先の非アイソトープノザンブロット解析について記述した方法と同じである。
【００８３】
一過性トランスフェクションおよびレポーター遺伝子アッセイ
トランスフェクションの前に、6ウェルプレート中で1ウェル当たり細胞3×105個を1日間培養した。トランスフェクションは一定のプラスミド濃度(2.5 μg/トランスフェクション)とFugeneトランスフェクション試薬(Roche Molecular Biochemicals) 8 μlで行った。トランスフェクションから1日後、細胞を無血清培地中に一晩置いた。適当な処理後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、かき集めて、溶解緩衝液(40 mMトリシンpH 7.8、50 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM MgSO4、5 mMジチオスレイトール、および1% Triton X-100) 100 μlを用いて再懸濁した。時折ボルテックスしながら室温中で15分間インキュベーション後、試料を遠心した。ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット(Stratagene, CA)およびβ-galアッセイキット(Invitrogen, CA)をそれぞれ用いることにより測定した。Spectra Max/Gemini XG (Molecular Device, CA)およびSpectraMax 190 (Molecular Device)を用いて、放射光および光学的吸収を測定した。
【００８４】
Ras活性化の定量化
刺激後、6ウェルプレート中の初代星状細胞をPBSで洗浄し、膜溶解緩衝液(MLB; 0.5 mlの25 mM HEPES, pH 7.5、150 mM NaCl、1% Igepal CA-630、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、10%グリセロール、10 mM MgCl2、1 mM EDTA、25 mM NaF、1 mMオルトバナジウム酸ナトリウム、およびEDTA不含のComplete(商標)プロテアーゼインヒビターカクテル)中に溶解した。4℃で5分間遠心(5,000×g)後、上清をRas活性化アッセイに使用した。既報(Herrmann et al., 1995)のとおり、pGEX-2T-GST-RBDを形質転換したBL21 (Invitrogen)大腸菌株中において0.1 mM IPTGの存在下で発現させた、アガロース結合Raf-1のRas結合ドメイン(RBD)との結合に、上清100 μgを使用した。結合反応はMLB中において4℃で30分間行った。MLBで3回洗浄後、2×SDSサンプルバッファーの添加によりRas-RBD複合体を変性させた。Upstate Biotechnologyから入手したRas抗体を用い、ウエスタン免疫ブロット解析によってRasタンパク質を同定した。
【００８５】
ラクトシルセラミド合成の測定
培養細胞を既報のように[14C]ガラクトース(5 μCi/ml)を含有する増殖培地中で24時間インキュベートした。培地を除去し、細胞単層を滅菌PBSで洗浄して、非特異的に吸着された放射活性を取り除き、新鮮な無血清培地を添加した。細胞をLPS/IFNγ(1 μg/ml; 10 U/ml)で各種時間刺激した後、細胞を回収し、氷冷PBSで洗浄し、超音波処理により溶解した。タンパク質定量化の後、クロロホルム:メタノール:HCl (100:100:1)による脂質の抽出にタンパク質200 μgを使用した。この有機層を窒素下で乾燥させた。高速薄層クロマトグラフィーにより、展開溶媒としてクロロホルム/メタノール/0.25% KCl (70:30:4, v/v/v)を用いてスフィンゴ糖脂質を分離した。このクロマトグラフプレートを風乾し、ヨウ素蒸気で染色した。LacCerに相当するゲル領域をかき取って、「liquiscint」(NEN Life Science Products)をシンチレーション液として利用し、放射活性を測定した。
【００８６】
C6細胞から精製されたラクトシルセラミドの同定および解析
LPS処理細胞由来のラクトシルセラミドをシリカゲル60 TLCプレートにより分離した。脂肪酸メチルエステル(FAME)を既報(Khan et al., 1998; Pahan et al., 1998)のように調製した。FAMEをシリカキャピラリーカラムでのガスクロマトグラフィー(Shimadzu, GC 17Aガスクロマトグラフ)により分析し、同定された全脂肪酸に占める割合として定量化した。質量分析データをFinnegan LCQクラシック(イオントラップ四重極子)質量分析計で記録した。
【００８７】
GalT-2活性アッセイ
GalT-2の活性は、既報(Yeh et al., 2001)のように[3H] UDP-ガラクトースをガラクトース供与体としておよびGlcCerを受容体として用い測定した。手短に言えば、細胞をPBS中に回収し、細胞ペレットをTriton X-100溶解緩衝液中に懸濁した。細胞溶解物を超音波処理し、タンパク質定量化の後、全量100 μl中に20 μMカコジル酸緩衝液(pH 6.8)、1 mM Mn/Mg、0.2 mg/ml Triton X-100 (1:2 v/v)、30 nmol GluCerおよび0.1 mmol UDP-[3H]ガラクトースを含有する反応混合物に、細胞溶解物100 μgを添加した。0.25 M EDTA 10 μl、0.5 M KCl 10 μlおよびクロロホルム/メタノール (2:1 v/v) 500 μlを添加することで反応を停止し、生成物を遠心により分離した。この下層を回収し、窒素下で乾燥させた。HPTLCプレート上で分離した後、ゲルを切り取り、放射活性をシンチレーションカウンタ中で測定した。外因性GluCerなしでのアッセイをブランクとし、その放射活性計数値を全ての各データポイントから差し引いた。
【００８８】
GalT-2アンチセンスオリゴヌクレオチド
DNA組込み技術により、ラット・ラクトシルセラミド合成酵素(GalT-2)を標的とする次の配列
2007516294.tif 000007
の20merアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。スクランブルオリゴヌクレオチド(5'-CTGATATCGTCGATATCGAT-3')を同様に合成し、対照として使用した。細胞をカウントし、トランスフェクションの前日に平板培養し、翌日にこれを無血清条件下でオリゴフェクタミン(Invitrogen)とオリゴヌクレオチドとの複合体(200 nMオリゴ)を用いて処理した。トランスフェクションから2日後、トランスフェクト細胞をLPS/IFNγ(1 μg/ml)で刺激し、刺激から24時間後に一酸化窒素のレベルを調べた。iNOSのmRNAおよびタンパク質のレベルをトランスフェクト細胞の刺激から6時間後および24時間後の時点でそれぞれ調べた。
【００８９】
RT-PCR増幅
製造元のプロトコルにしたがってTRIzol (GIBCO)を用い全RNAを抽出後、一本鎖cDNAを全RNAから合成した。1×PCR緩衝液および2 mM MgCl2を含有する18 μl容量中で、全RNA 5 μgを2 UのDNAse I (ウシ膵臓由来、Sigma)を用いて室温で15分間処理した。その後、25 mM EDTA 2 μlと65℃で15分間インキュベーションすることで、DNAse Iを不活性化した。製造元のプロトコルにしたがいランダムプライマー2 μlを添加し、RNAにアニールさせた。cDNAは全RNA 5 μgおよび50U〜100 Uの逆転写酵素を含有する反応液50 μl中で、この試験管を42℃で45分間インキュベートすることにより合成した。PCR増幅はcDNA 1.0 μl、0.5 mMの各プライマーが入った反応混合物25 μl中、製造元のTaqポリメラーゼ条件(Takara, takara Shuzo Co. Ltd, Japan)下で行った。PCR増幅に用いたプライマーの配列は次の通りである。
2007516294.tif 000008
PCRプログラムの中には、95℃で4分間のプレインキュベーション、94℃で1分間さらに50℃で1分間のアニーリングさらに74℃で1分間の伸長を30サイクルの増幅および74℃で10分間の最後の伸長が含まれた。このPCR産物10 μlを1.2%アガロースゲル上で分離し、UV下で視覚化した。
【００９０】
リアルタイムPCR
製造元のプロトコルにしたがってTrizol (GIBCO, BRL)を用い、ラット脊髄切片からの全RNAの単離を行った。Biorad iCycler (iCycler iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System; Biorad, Hercules, California, USA)を用いて、リアルタイムPCRを行った。一本鎖cDNAを全RNAから合成した。1×PCR緩衝液および2 mM MgCl2を含有する18 μl容量中で、全RNA 5 μgを2 UのDNAse I (ウシ膵臓由来、Sigma)を用いて室温で15分間処理した。その後、25 mM EDTA 2 μlと65℃で15分間インキュベーションすることで、DNAse Iを不活性化した。使用のためのプライマーセットをデザインし(Oligoperfect(商標) designer, Invitrogen)、組込みDNA技術(IDT, Coralville, IA, USA)より合成した。
2007516294.tif 000009
のプライマー配列。IQTM SYBR Green SupermixをBIO-RAD (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA)から購入した。熱サイクル条件は次のとおりとした: 95℃で10分間DNAポリメラーゼの活性化、その後95℃で30秒間および58.3℃で30秒間の増幅40サイクル。Microsoft Excelデータ表計算ソフトを用いて、GAPDHに対し正規化された標的遺伝子の発現を試料全てについてコンピュータ計算した。
【００９１】
ラットでのSCIの誘発
Sprague-Dawley系雌性ラット(体重225g〜250g)をSCIの誘発用に購入した(Harlan laboratories, Durham, NC)。全てのラットに適宜、水と食用固形飼料を与え、それらをUS Department of Health and Human Services(国立衛生研究所, Bethesda, MD, USA)の「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（実験動物の管理と使用に関する指針）」にしたがって維持した。ラットでのSCIの誘発のため、臨床的に関連する重錘装置を既報(Gruner, 1992)のように利用した。手短に言えば、ケタミン(80 mg/kg)に加えキシラジン(10 mg/kg)の腹腔内(i.p.)投与によりラットに麻酔をかけた後、T12の椎弓切除術を行った。脊椎を定位固定装置により固定化した状態で、6 cmの高さから5 gmのおもりを脊椎上にそっと載せたインパウンダに落下させることで、損傷(30 g/cm力)をもたらした。偽手術動物には椎弓切除術のみ施した。麻酔から回復後、動物を神経学的に評価し、食料および飲料摂取についてモニターした。また一方で、予防的な抗生物質または鎮痛剤は、SCIの実験的治療とのその相互作用の可能性を回避するために使用しなかった。
【００９２】
SCIの治療
SCIの誘発後10分以内に、ラットにスフィンゴ糖脂質阻害剤D-PDMP (Matreya Inc, Pleasant Gap, PA)を投与した。SCIラットへの腹腔内(i.p.)投与時に、D-PDMPを5% Tween 80の生理食塩水に溶解し、これを滅菌生理食塩水(0.85% NaCl)で希釈した。動物(1群当たり6匹)を無作為に選択して異なる4群を形成した: 賦形剤(5% Tween 80の生理食塩水)処置したシャム（偽手術）動物(椎弓切除術のみ)およびSCI動物(5% Tween 80の生理食塩水)、ならびにD-PDMP (5% Tween 80中で20 mg/kg)処置した偽手術動物およびSCI動物。D-PDMPの単回用量を初回投与(これはSCIから10分後に投与した)後から損傷後72時間後まで24時間毎に投与した。処置から1時間、4時間、12時間、24時間、48時間および72時間後、動物を麻酔下で殺処理した。
【００９３】
脊髄切片の調製
ラットを麻酔し、骨頭切除術により殺処理した。賦形剤処置した偽手術動物およびSCI動物ならびにD-PDMP処置した偽手術動物およびSCI動物から、発生地としての損傷部位を有する脊髄切片を注意深く抽出した。RNAおよびタンパク質抽出の使用に向けられた組織は速やかに、Trizol (GIBCO, BRL)中でホモジナイズし、液体窒素中で急速凍結し、さらに使用するまで-80℃で保存した。全RNAを製造元のプロトコルにしたがって抽出し、先述のとおりcDNA合成に使用した。組織学的検査および免疫組織化学に使用される脊髄切片は、10%中性緩衝ホルマリン(Stephens Scientific, Riverdale, NJ)中で固定した。この組織をパラフィン中に包埋し、4 μM厚の薄片に切った。
【００９４】
免疫組織化学解析
脊髄切片を脱パラフィン処理し、アルコール割合を段階的にし連続的に再水和させた。次にスライドを抗原脱マスキング液(Vector Labs, Burlingame, CA)中で10分間煮沸し、同じ溶液中でさらに20分間冷却し、その後、0.05% Tween-20 (TNT)入りのTris-ナトリウム緩衝液(0.1 M Tris-HCL, pH-7.4, 0,15 M NaCl)中で各5分間3回洗浄した。切片をトリプシン処理(0.1% 10分間)し、3%過酸化水素水中に10分間浸漬して内因性のペルオキシダーゼ活性を除いた。0.5%ブロッキング試薬入りのTrisナトリウム緩衝液(TNB) (TSA-Directキット、NEN Life Sciences, Boston MAに同梱されている)中で、切片を30分間ブロッキングして非特異的な染色を減らした。免疫蛍光二重標識の場合、切片を抗iNOS抗体(1:100、マウスモノクローナル、Santa Cruz, CA)と一晩インキュベートし、続いて星状細胞マーカーGFAPに対する抗体(1:100、ウサギポリクローナル、DAKO, Japan)と1時間インキュベートした。抗iNOSはフルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合抗マウスIgG (1:100、Sigma)を用いて視覚化し、GFAPはテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)結合抗ウサギIgG (1:100、Sigma)を用いて視覚化した。この切片を封入剤(EMS, Fort Washington, PA)中で封入し、Adobe Photoshopソフトウェアを利用した免疫蛍光顕微鏡検査法(Olympus)により視覚化した。対照の一次抗体として、ウサギポリクローナルIgGを使用した。切片を同様に、陰性対照として一次抗体なしでFITC結合抗ウサギIgG (1:100、Sigma, St. Louis, MO)と、またはTRITC結合IgG (1:100)とインキュベートした。H&E染色を(Kiernan, 1990)による報告のとおり行った。ルクソールファーストブルーPASを(Lassmann and Wisniewski, 1979)にしたがって行った。
【００９５】
蛍光TUNELアッセイ
APOPTAGフルオレセイン・インサイチュー・アポトーシス検出キット(Serological Corporation, Norcross, GA)を製造元のプロトコルにしたがって用い、TUNELアッセイを行った。二重標識の場合、切片をマウス抗ニューロン核1:100(NeuN, Chemicon, USA)とインキュベートした。切片をTRITC結合マウスIgG 1:100(Sigma)とインキュベートし、封入剤中で封入し、蛍光顕微鏡検査法により視覚化した。
【００９６】
統計分析
ステューデント・ニューマン・キュールズ(Student Newman- Keuls)検定を行うことにより、データを統計的に分析した。
【００９７】
実施例2
結果I
GSLにより媒介されるLPS/IFNγにより誘導されるNO生成およびiNOS遺伝子発現
iNOS遺伝子発現をもたらす初代星状細胞のLPS/IFNγ刺激は、複雑な多段階過程である。本研究ではGSLが何らかの方法で関与するかどうかを調べた。いくつかの濃度(0、10、25および50 μM)のスフィンゴ糖脂質阻害剤D-PDMPを用いて0.5時間予め処理し、その後LPS/IFNγ (1 μg/ml; 10 U/ml)で刺激した初代星状細胞は、一酸化窒素(NO)生成の用量依存的な減少(図1A)ならびにiNOSのmRNAおよびタンパク質レベルの用量依存的な減少(図1B)を示した。しかしながら、漸増用量のLacCerの存在下では、D-PDMPを介したNO生成の阻害(図1C)およびiNOS遺伝子発現の阻害(図1D)は、鈍化された。これがLacCer特異的な効果であったことを証明するため、その他のスフィンゴ糖脂質誘導体を同様に、外因的に補充した。しかしながら、Glucer(図2A)、GalCer(図2B)ならびに各種のガングリオシド-GM1(図2C)、GM3(図2D)およびGD3(図2E)の存在によっては、LPS/IFNγにより誘導されたNO生成のD-PDMPを介した阻害をLacCerの補充が逆行させたようには逆行させることはなかった。これらの研究は、スフィンゴ糖脂質経路の代謝産物LacCerがLPS/IFNγを介したiNOS遺伝子発現およびNO生成の誘導の調節に関与する可能性があることを示唆している。
【００９８】
LPS/IFNγ刺激によるラクトシルセラミドの脂質組成およびレベルの変化
LPS/IFNγにより誘導されるiNOS遺伝子発現のLacCerによる機構を理解するため、ラクトシルセラミドのインサイチューレベルを定量化した。材料と方法に記述されているように高速薄層クロマトグラフィーによって14C標識LacCerを分離し、市販されているLacCer標準物質を用いて、Rf値により特徴づけた。図3Aに示されるように、LacCerレベルの急増がLPS/IFNγによる刺激から2分〜5分後以内に観測された。LPS/IFNγ刺激後、LacCerレベルは、刺激されていない細胞で観測されたものの約1.5倍に増加した。D-PDMPによるラクトシルセラミド合成酵素(GalT-2、LacCer生合成に関与する酵素)の阻害によって、LPS/IFNγ刺激後のこのLacCer生合成の増加が阻害された。さらに、GalT-2活性をLPS/IFNγ刺激後にアッセイしたところ、LPS/IFNγ刺激から5分後の時点にピークを有する酵素活性の急増が観測された(図3B)。ラットGalT-2 mRNAに対するアンチセンスDNAオリゴマーおよび対照としてスクランブル配列のオリゴマーを用いることにより、iNOS遺伝子発現におけるGalT-2およびその産物LacCerの役割をさらに確認した。図3Cに示されるように、アンチセンスDNAオリゴマーは顕著に、LPS/IFNγを介したNO生成ならびにiNOS mRNAおよびタンパク質のレベルを低下させた(図3D)。さらに、iNOS遺伝子の調節におけるLacCerおよびGalT-2の役割の可能性を詳しく調べるため、これらの実験から単離され精製されたLacCerを同様に、その組成および構造確定を目的に詳しく調べた。刺激細胞から得られたLacCerの質量分析結果は、LacCer中の3つの主要な脂肪酸(18:0, 56.2%; 18:1, 26.4%; 16:0, 12.9%)と一致していた。18:0からなるLacCerはm/z 889 (M, 1.1%)、m/z 890 (M+H, 1.4%)およびm/z 740 (M-[5×OH+2×CH3OH], 41.6%)として特徴的に存在していた。同様に、LacCerの16:0種はm/z 861 (M+, 0.8%)、862 (M+H, 1.2%)、m/z 860 (M-H, 1.1%)およびm/z 711(860-[5×OH+2×CH3OH], 51.9%)に顕著なピークが存在していた。オレイン酸(18:1)からなるLacCer種は、m/z 888 (M+H, 1.8%)およびm/z 739 (888-[5×OH+2×CH3OH], 100%)に顕著なピークが存在していた。2つのさらに重要なピークの存在がm/z 342 (M-スフィンゴ脂質主鎖, 4.4%)およびm/z 529 (M-Lac主鎖-H2O, 1.5%)であった。LPS/IFNγ刺激細胞では、ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル分析によって明らかとされたように脂肪酸プロファイルが変化していた。対照細胞に比べ、14:0 (167%)、16:0 (65.8%)、18:0 (7.3%)および20:0 (5.7%)を含めて全ての飽和長鎖脂肪酸が増加していることが分かった。総合すれば、GCおよびMSから得られたデータにより、精製された化合物の構造が主要な脂肪酸をステアリン酸、オレイン酸およびパルミチン酸として有するLacCerと裏付けられ確認された。
【００９９】
LacCerによるC6神経膠腫細胞におけるLPS/IFNγにより誘導されるiNOSの発現の調節
C6神経膠腫細胞でのiNOS遺伝子発現におけるLacCerの役割を比較するため、C6細胞をLPS/IFNγ刺激の前に、漸増用量のD-PDMP (10、25、50 μM)を用いて0.5時間前処理した。図4の説明文に記述されているようにC6細胞をLPS/IFNγとインキュベーション後、NO生成ならびにiNOSのタンパク質およびmRNAレベルを測定した。LPS/IFNγにより誘導されたNO生成(図4A)ならびにiNOSのタンパク質およびmRNAレベル(図4B)は、漸増用量のD-PDMPの存在下では阻害される。しかし、外因性LacCerの補充によって、NO生成(図4C)ならびにiNOSのmRNAおよびタンパク質の発現(図4D)から明らかにその阻害は逆転されたが、GluCerでは効果がなかった。これらの研究は、LacCerを介したLPS誘導iNOSの調節が星状細胞とC6神経膠腫細胞で同じであることを示している。
【０１００】
低分子GTPase RasおよびERK1/2の活性化のLacCerを介したiNOS遺伝子発現の調節への関与
iNOSを誘導するLPS/IFNγ誘導性細胞シグナル伝達におけるLacCerの役割を理解するため、低分子GTPaseの活性化に対するLacCerの効果を詳しく調べた。低分子GTPase Rasの活性化はLPS/IFNγ誘導性のiNOS遺伝子発現にとって重大な意味を持つことが知られている(Pahan et al., 2000)。GST結合Raf-1 RBD (Ras結合ドメイン)を使用することで、Ras活性化を詳しく調べた。LPS/IFNγ刺激により、Rasの素早い活性化が観測された(図5A)。LPS/IFNγを介したRasの最大活性化(刺激から2分〜5分後以内に観測された)は、D-PDMPを用いた前処理によって低下し、外因的なLacCerの補充により、これは完全に逆転した(図5B)。これらの研究は、LacCerがLPS/IFNγによるRasの活性化に関与し、結果的にiNOS遺伝子発現の誘導を引き起こすことを示唆している。さらに、LPS/IFNγ刺激により、細胞外調節キナーゼ1 & 2 (これらはRasの下流標的である)の活性化も観測された。D-PDMPを用いた前処理はLPS/IFNγによるERK1/2のリン酸化を阻害し、これは外因性LacCerが存在する場合には逆転した(図5D)。さらに、ERKのリン酸化および活性化に関与するキナーゼMEK1/2のPD98059による阻害が、結果的にNO生成およびiNOS発現の阻害をもたらしたことは、ERK経路がiNOS遺伝子発現に関与していることを証明するものである(図5C)。外因性LacCerの補充はPD98059によるiNOS遺伝子発現阻害には影響せず、このことから、LPS/IFNγによるRas/MEK/ERKを介したiNOS遺伝子発現の調節を媒介する二次メッセンジャーとしてLacCerを上流に位置づけることができる。
【０１０１】
LacCerを介したiNOS遺伝子発現調節におけるNF-κBの役割
LacCerを介したiNOS遺伝子調節の機構をさらに理解するため、iNOSの誘導に必要であることが知られているIκB/NF-κB経路(Nunokawa et al., 1996; Pahan et al., 1998; Taylor et al., 1998; Keinanen et al., 1999)の関与について調べた。この可能性を検証するため、κBリピートルシフェラーゼ・トランスフェクト細胞において、ルシフェラーゼ活性に対するD-PDMPの効果を観測した。LPS/IFNγによるルシフェラーゼ活性はD-PDMP処理によって無効にされるが、これは外因性LacCerによって効果的に回避される(図6A)。図6Bに示されるように、電気泳動移動度シフトアッセイにより試験されたNF-κB DNA結合活性は、漸増用量のD-PDMPによって阻害されたが、これは外因性LacCerの存在下では逆転した。標識されたNF-κBの結合活性を打ち負かす、50倍量の非放射性プローブを用いることにより、NF-κBプローブの結合特異性が証明された。IκBのリン酸化と分解がNF-κBの活性化と核への移行に必要とされるので、リン酸化IκBレベルについても調べた。D-PDMPの存在下では、IκBリン酸化の減少が観測された。しかしながら、LacCerが加えられると、NF-κBの核移行やDNA結合活性の増大と相関するリン酸化IκBのレベルが増加した(図6C)。これらの研究は、LacCerを介したLPS/IFNγ誘導性iNOS遺伝子発現の転写調節機構がIκB/NF-κB経路を介していることを描き出した。
【０１０２】
脊髄損傷(SCI)でのiNOS誘導の制御におけるD-PDMPの効果
先の観測結果の生理的関連性を検証するためおよび神経炎症性疾患でのiNOS誘導におけるLacCerの役割をさらに詳しく調べるため、ラット脊髄損傷モデルでのD-PDMPの効果について調べた。ラットにおける脊髄損傷は、iNOS陽性の反応性星状細胞およびマクロファージによる病変部とその周辺部での急速な浸潤を引き起こすことが示されている(Wada et al., 1998a; Wada et al., 1998b)。図7に示されるように、ナイーブまたは偽手術の動物に比べて、リアルタイムPCRにより測定されたiNOS mRNAの強力な誘導(図7A)およびタンパク質発現(図7B)がSCIから12時間後に観測される。SCIから10分後以内のD-PDMP(20 mg/Kg)処置により、このiNOS発現の増加は著しく抑制される。賦形剤(VHC)およびD-PDMP処置SCIラットの損傷部位から得られた脊髄切片の二重免疫蛍光解析は、損傷から24時間後にGFAP(図8D)およびiNOS(図8E)レベルの顕著な増加とその共局在化(図8F)を示したが、D-PDMP処置SCIラットは著しく低下したGFAP(図8J)およびiNOS(図8K)発現を示したことから、星状細胞の反応性形質転換およびiNOS遺伝子発現の制御におけるD-PDMPのインビボ効果が実証された。これらの研究から、SCIおよび可能なその他の神経炎症性疾患のインビボモデルにおいて損傷部位での反応性星状細胞によるiNOS遺伝子発現にスフィンゴ糖脂質が関与することやiNOS生成、つまり二次損傷を悪化させる主要な炎症性事象を阻害するうえでのD-PDMPによるスフィンゴ糖脂質減少の効果が示唆された。
【０１０３】
D-PDMPによるSCI後のiNOS遺伝子発現阻害によるアポトーシスおよび髄鞘脱落の減弱
分子のレベルで外傷後の脊髄障害について、NOは外傷後空洞形成、ニューロン死、軸索変性およびミエリン破壊の発生に密接に関与することが報告されている。著しく多数のTUNEL陽性細胞がSCI後の病変部に点在し(図9E)、これらのうちのいくつかは同様に、抗ニューロン核(NeuN)抗血清を用いた二重免疫蛍光染色によってニューロンと同定された(図9Dおよび9F)。D-PDMPはラットSCIモデルにおいて二重の有益な効果があった。D-PDMPはSCI後のiNOS発現を阻害することができた。さらに図9J〜9Lに示されるとおり、D-PDMPは同様にアポトーシスからニューロンおよびその他の細胞を保護した。これはかなり重要である。その理由は、D-PDMPの副作用が偽手術動物でのニューロンの生存に対して認められず(図9G〜9I)、投与した用量が何ら明白な副作用なしにiNOSを効果的に阻害し、またニューロンの脱落という点でのSCI関連の病状の軽減につながったことを示しているからである。さらに、図10に示されるように、損傷ラット脊髄切片の組織学的検査によって観察されたSCIによる白質の空胞変性および組織壊死(図10B)は、D-PDMPによってiNOSが阻害されたSCIラットの組織切片では阻害された(図10D)。重錘による損傷は後肢の運動機能障害に至るミエリン空胞形成を引き起こすことも知られている(Suzuki, et al., 2001)。賦形剤処置SCIラットから得たミエリンに対する脊髄切片のLFB染色は、深在性の髄鞘脱落を示し(図10F)、これは同様に、D-PDMPを介したiNOS阻害によって減弱された(図10H)。総合すれば、これらの研究は、D-PDMPによる本研究でのiNOS発現などの炎症性事象の阻害がSCI動物モデルにおいて有益な効果を有することを実証している。それらは同様に、神経炎症性疾患におけるスフィンゴ糖脂質の重要性を明確に示すものである。
【０１０４】
実施例3
考察I
一酸化窒素を介した病態生理は、脳卒中および脊髄損傷(SCI)を含め、多くの神経炎症性疾患に共通している。炎症性疾患ではどの因子がiNOS遺伝子発現を誘導し調節しているかは完全に知られていないので、本研究では、スフィンゴ糖脂質の関与について詳しく調べ、初代星状細胞においてRas/ERK1/2およびIκ-B/NF-κB経路を含むLacCer媒介性の事象を通じたiNOS遺伝子調節の新たな経路を実証した。これらの結論は以下の所見に基づくものである。(1) LPS/IFNγはiNOS遺伝子発現を誘導し、LacCer生成はスフィンゴ糖脂質合成阻害剤D-PDMPによって阻害された。他のいかなるスフィンゴ糖脂質ではなく、外因性ラクトシルセラミドを加えることで、D-PDMPによるiNOS遺伝子発現の阻害が逆転した。(2) LPS/IFNγはGalT-2活性を5分以内に刺激し、細胞内ラクトシルセラミドのレベルを素早く増加させた。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてGalT-2をノックダウンさせると、結果的にNO生成およびiNOS発現が減少した。(3) D-PDMPはLPSによるRas活性化を無効としたことから、LacCerによるiNOS調節に関わる経路は低分子GTPase-Rasによって誘発される。ERK1/2キナーゼがさらにiNOS発現を媒介していた。MEK1/2阻害剤PD98059がLPS/IFNγを介したiNOS遺伝子発現を阻害したからである。(4) LacCer媒介性のiNOS転写調節はIκ-B/NF-κB経路を介している。D-PDMPは、LPS/IFNγを介したκBリピート最小プロモーターのレポーター遺伝子活性の誘導ならびにNF-κB転写促進およびIκB分解を阻害した。図11に図解されるように、LPS/IFNγ誘導性iNOS遺伝子調節のLacCerを介した調節と関連のある事象について、以下のモデルを提唱する。LPS/IFNγ刺激はLacCer合成酵素(GalT-2)を活性化し、細胞内のLacCerレベルを増加させた。これが結果として、どちらもサイトカイン誘導性のiNOS遺伝子発現およびNF-κB活性化を媒介することが以前に実証されている低分子G-タンパク質 Rasとその下流の細胞外調節キナーゼ1 & 2 (ERK1/2) (Pahan et al., 1998 ; Marcus et al., 2003)を活性化することになる。さらに、LacCerは、Ras活性化を介してであれそれ自体で媒介される事象を介してであれ、IκB-NFκB経路を誘発することができる。NF-κBは、iNOS遺伝子発現に対し立証された主要な転写因子である(Pahan et al., 1998)。IκBのリン酸化がその分解を引き起こし、これにより細胞質ゾル中でIκBによって隔離されていたNF-κBは核内に移行され、iNOS遺伝子の発現を開始することができる。本研究で示されたデータは、セラミド誘導体LacCerをiNOS遺伝子発現におけるシグナル伝達分子と同定するものである。
【０１０５】
スフィンゴミエリン(SM)サイクルの発見以来、いくつかの誘導因子(1a,25ジヒドロキシビタミンD3、放射線、抗体架橋結合(crosslining)、TNFα、IFNγ、IL-1β、神経成長因子およびブレフェルジンA)がスフィンゴミエリン-セラミドシグナル伝達事象に共役していることが示されている(Hannun, 1994; Kolesnick et al., 1994; Kanety et al., 1995; Linardic et al., 1996)。いくつかの研究がSMの加水分解の役割を、グリア細胞(膠細胞)および神経細胞を含むさまざまな細胞種で、セラミドが増殖抑制およびアポトーシスに関与するストレス活性化シグナル伝達機構として支持している(Brugg et al., 1996; Wiesner and Dawson, 1996)。活性酸素種(ROS)の産生増加やミトコンドリアグルタチオンの減少、すなわち酸化ストレスの生成をもたらすミトコンドリア機能の障害は、セラミドによる細胞毒性/アポトーシスの主な原因の1つとして詳細に叙述されている。SMシグナル伝達経路によるマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(MnSOD)の誘導は、初代星状細胞において、セラミドによる酸化ストレスを制御する方法の1つとして同定されている(Pahan et al., 1999)。酸化ストレスを引き起こす作用因子のなかで、NO生成は増殖を抑制することができ、神経変性疾患においてニューロンや乏突起膠細胞のアポトーシス/細胞毒性を誘導する重要な候補である。中性スフィンゴミエリナーゼの活性化の結果として生成されたセラミドは、星状細胞およびC6神経膠腫細胞において、LPSを介したおよびサイトカインを介したiNOSの誘導を増強することが最近になって証明された(Pahan et al, 1998)。さらに、セラミドを介したiNOS遺伝子発現はRas/ERK/NF-κB経路を介していることが示されている(Pahan et al., 1998)。セラミドそれ自体はiNOS遺伝子発現やNOの生成を誘導しないが、それはサイトカインによるiNOSの発現やNO生成を著明に刺激していることから、スフィンゴミエリンに由来するセラミド生成は、神経炎症性疾患においてニューロンおよび乏突起膠細胞でのサイトカインを介した細胞毒性の重要な要因でありうることを示唆している。さらに、星状細胞でのNF-κB活性化の抗酸化阻害剤(例えば、N-アセチルシステインおよびピロリジン(purrolidine)ジチオカルバミン酸)によるLPS誘導性のおよびセラミド誘導性のiNOS発現の阻害は、セラミド-LPSまたは炎症誘発性サイトカインによるNF-κBの活性化およびiNOSの誘導に細胞酸化還元が果たす役割を示唆している(Singh et al.,1998)。ROSのスカベンジャーおよびGSH (天然の抗酸化物質)の前駆物質として機能するN-アセチルシステイン(NAC)によるチオール/オキシダントバランスの維持は同様に、SM加水分解を介してサイトカイン媒介性のiNOS発現やセラミド生成を遮断し、すなわちセラミドおよびNOによる初代星状細胞および乏突起膠細胞の細胞死を阻止することができる(Singh et al., 1998)。さらに、TNFαなどの炎症誘発性サイトカインの発現、iNOSの誘導および細胞死を阻害することにより、ラットの局所脳虚血モデルにおいて損傷を防ぐNAC処置の効果も証明されている(Sekhon et al., 2003)。
【０１０６】
スフィンゴ脂質代謝の酵素を孤立したシグナル伝達分子と考える代わりに、これらの経路は、現在では、一方の酵素の産物が他方の基質として働きながら高度に相互関連しあうことが認められている。セラミドはスフィンゴシン、スフィンゴシン-1-リン酸またはスフィンゴ糖脂質などのその他の生物活性分子に変換されることができるので、これはSMサイクルまたはデノボを通じて生成されるセラミドにも当てはまる。膜内部の脂質を多く含むミクロドメイン中にセラミドならびにLacCerおよびガングリオシドなどのその他の誘導体が存在するという証拠が浮かび上がりつつあることで、これらの生物活性なスフィンゴ脂質の複雑さが強調されている。「脂質ラフト」と呼ばれるこれらのミクロドメインは、その内部に局在するまたはそれと会合したいくつかの受容体およびシグナル伝達分子を有し、すなわちミクロドメインはシグナル伝達事象のホットスポットになっている(Hakomori and Handa, 2003)。セラミドとスフィンゴシン、スフィンゴシン-1-リン酸(S-1-P)およびスフィンゴ糖脂質などのその他の脂質メディエータとの代謝の相互関連性によって、これらの中間体の特異作用やそのレベルを調節する酵素を予測することがかなり複雑になっている。例えば、スフィンゴシンは細胞種にもよるがセラミドに似たプロアポトーシス作用を有するものの(Spiegel and Merrill, 1996)、それは素早くS-1-Pに変換されて、スフィンゴシンおよびセラミドのその作用に拮抗する増殖性を有するようになる(Spiegel and Milstien, 2000)。スフィンゴ糖脂質のなかで、グルコシルセラミドとラクトシルセラミドはそれぞれ、薬剤耐性状態を促進すること(Liu et al., 1999)ならびに大動脈平滑筋細胞においてスーパーオキシド形成に対する酸化LDLおよびTNFαの効果や、MAPキナーゼの活性化や、増殖の誘導を媒介すること(Chatterjee, 1998)が示されている。サイトカインを介したiNOS遺伝子発現の複雑さを解読するようおよびこの過程におけるスフィンゴ脂質の役割をさらに分析するよう努力された。これらの研究により、その他の細胞系におけるそれらの他の公知機能に加えてiNOS遺伝子調節におけるスフィンゴ糖脂質の決定的な役割が明確にされた。GalT-2活性化やLacCer生合成は、LPS誘導性のおよびサイトカイン誘導性のiNOS発現にとって重大な意味を持つことが分かった。LacCerはその他の細胞系において炎症性事象を媒介することやROS生成、アポトーシスおよび細胞増殖に影響を与えることが示されているが、iNOS遺伝子発現におけるLacCerの役割はこれまでに確立されていない。
【０１０７】
本研究において示されるLacCerを介したiNOS遺伝子調節の新たな機構により、D-PDMPが脊髄損傷のラットモデルにおいて脊髄におけるiNOS発現を阻害した際にCNS外傷における生理学的関連性が判明した。D-PDMPは同様に、アポトーシスによる神経細胞の喪失を阻害し脱髄を軽減することができた。脊髄損傷を含むほとんどの神経変性疾患と同様に、アポトーシスブロック療法とともに損傷後に残った組織の量が行動的治療成績や損傷後の回復に有益であることが分かっており(Blight, 1983; Young, 1993; Liu et al., 1997)、サイトカイン誘導性のiNOS遺伝子発現の重要なメディエータとしてのLacCerの同定から、神経系の疾患においてアポトーシスやiNOS発現をブロックするような治療可能性を有する主な標的が明確に示される。
【０１０８】
活性酸素種の発生(Yeh et al., 2001)、接着分子の発現による内皮細胞への好中球付着(Arai et al., 1998; Bhunia et al., 1998)、細胞増殖(Bhunia et al., 1997)および好中球活性化(Iwabuchi and Nagaoka, 2002)などの炎症性事象におけるサイトカイン作用の媒介を含む、その他に報告されているLacCerの生物学的機能は、神経炎症の間に観測されるものに共通している。このように、これらの事象におけるLacCerの関与は、接着分子の発現制御を含んでおり、その結果、血液脳関門の崩壊、ならびに炎症誘発性サイトカインを合成し常在性の小膠細胞および星状細胞を活性化する結果としてROS発生、NO生成、神経細胞アポトーシス、脱髄および神経膠症を引き起こす、好中球などの、免疫細胞の浸潤をもたらし、これが損傷およびその後の機能回復に深刻な悪影響をもたらす可能性が高い(Hays, 1998; Akiyama et al., 2000a; Akiyama et al., 2000b)。NACやスタチンによる免疫反応の免疫調節や虚血およびEAEなどの疾患を用いた抗酸化治療の有益な効果は、それぞれ、既に知られている(Stanislaus et al., 2001; Sekhon et al., 2003)ので、本研究において報告されるiNOS誘導における役割に加えて、ROS発生、好中球の活性化や浸潤などの神経炎症性事象を媒介する際のLacCerの役割を確立することで、LacCerレベルの調節を、神経炎症を抑制する多面的なツールとすることができる。
【０１０９】
結論として、本研究は、炎症性疾患においてiNOSの誘導におけるラクトシルセラミドの役割を初めて報告する。これらの研究は、神経炎症性疾患における病態生理の改善を目的としたスフィンゴ糖脂質調節の新たな治療標的を特定するものである。
【０１１０】
実施例4
材料と方法II
試薬
ApopTag(登録商標)プラス・ペルオキシダーゼ・インサイチュー検出キット(S7101)は、Intergen (CITY, NY)から入手した。マウスモノクローナルTNF-抗体(SC-7317)およびウサギポリクローナルIL-1抗体(SC-7884)は、Santa Cruz Biotechnology社(Santa Cruz, CA)から入手した。ウサギポリクローナルiNOS抗体(N32030-050)は、Transduction Laboratories (San Diego, CA)から入手した。GSNOはWorld Precision Instruments社(Sarasota, Florida)から購入した。DMEM (4.5 gm グルコース/L)、RPMI 1640培地、ウシ胎仔血清およびハンクス塩類溶液はLife Technologies (Grand Island, NY)から購入した。使用したその他全ての化学物質および試薬は、特に明記しない限りSigma (St. Louis, MO)から購入した。
【０１１１】
動物
本研究では、体重250g〜300gの雌性Sprague-Dawley系ラット(Charles River Laboratories, Wilmington, MA)計60匹を使用した。サウスカロライナ医科大学(Medical University of South Carolina)のガイダンスおよび「Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(実験動物の管理と使用に関する指針)」に概説されているように人道的管理に関するNational Research Councilの基準にしたがい、全ての動物を人道的に管理した。体温を直腸プローブによってモニターし、恒温性ブランケット制御ユニット(Harvard Apparatus, Holliston, MA)によって37±0.5℃に維持した。頭蓋温度および平均動脈圧をそれぞれ、HSE Plugsys TAM-DおよびTCAM (Harvard Apparatus)により測定した。
【０１１２】
実験計画および薬物の投与
全ての動物手順はサウスカロライナ医科大学動物審査委員会(Medical University of South Carolina Animal Review Committee)によって承認されており、国立衛生研究所(National Institute of Health)によって発行されている動物使用に関するガイドラインにしたがった。動物を次の3群に分けた: (1) 対照(偽手術)群(Sham、n=20); (ii) 虚血(20分)および再灌流(24時間)群(賦形剤、n=20); (iii) GSNO処置群(GSNO、n=20)。処置群では、再灌流時に大腿静脈カニューレ挿入により、GSNO (1 mg/kg体重)の生理食塩水(約250 l)溶液をゆっくり注入した。虚血(賦形剤)および対照(sham)群のラットにはGSNOの代わりに、同量の生理食塩水を投与した。
【０１１３】
局所脳虚血モデル
ラットを終夜絶食としたが、ただし実験の前に水を自由に飲ませた。キシラジンの腹腔内注射(10 mg/kg体重)および塩酸ケタミンの筋肉内注射(100 mg/kg)により、ラットを麻酔した。直腸温プローブを導入し、加温パッドによって体温を37±0.5℃に維持した。本発明者の先の公開(Sekhon et al. 2003)に記述されているとおり、右MCAを塞いだ。外科的処置は15分のうちに完了したので、著しい失血はなかった。虚血期間の終了時に、ナイロン・モノフィラメントを引き抜き、総頸動脈鉗子を取り除いて、総頸動脈を通じた再灌流を顕微鏡によって確認した。動物をその後、加温パッド上で麻酔から回復させた。一定の再灌流時間の後に、動物を殺処理した。ラットの脳を、虚血性の脳半球(同側性)および虚血の影響がない(対側性)領域と同定された二つの部分に分けて、解析のためすぐに使用するかまたは後に解析するため液体窒素中で凍結し-70℃で保存した。
【０１１４】
生理的変数の測定
生理的変数をMCA閉塞の前に、その間に、再灌流時におよび再灌流から30分後に測定した。直腸温度をモニターし、約37℃から37.6℃に維持した。レーザードップラー血流計(Perimed Sweden and Oxford Optronix Ltd., Oxford, UK)を用い、実験動物および偽手術対照で局所脳血流(rCBF)を調べた。
【０１１５】
虚血性梗塞および神経学的スコアの評価
虚血性梗塞の評価に2,3,5-塩化トリフェニルテトラゾリウム(TTC)染色法を用い、その後コンピュータにより画像収集を行った。手短に言えば、ペントバルビタールの過剰摂取後、ラットを再灌流から24時間後に骨頭切除術により殺処理した。脳を素早く取り出し、氷冷生理食塩水の中に5分間入れておいた。Brain Matrix (Brain Tree Scientific)により、各脳から6連続切片を、前頭極から2 mmの間隔で切断した。この切片を2% TTC (Sigma, MO)中でインキュベートし、37℃で15分間生理食塩水に溶解した。染色された脳切片を10%ホルマリン中で保存し、さらなる加工処理および保存の場合には4℃で冷蔵保存した。冠状切片(2 mm)をコンピュータに接続された平床式カラースキャナ(HPスキャンジェット5400 C)に載せた。白で境界線の示された梗塞領域を画像解析ソフトウェア(Photoshop 4.0 Adobe System)により取得し、NIH画像ソフトウェアにより測定した。神経学的評価は、ラット群のアイデンティティに盲目的な観察者により行われた。神経学的欠損を再灌流後の30分、24時間、および72時間の時点(殺処理前)で評価し、次のようにスコア化した: 0、観察可能な神経学的欠損なし(正常); 1、尾部によって全身を持ち上げるときに左前肢を伸ばせず(軽度); 2、対側への旋回(中等度); 3、安静時に対側への傾斜または自発運動活性なし(重度)。本発明者の先の公開(Sekhon et al. 2003)に記述されているとおり、上記の時点で神経学的欠損を示さない動物は研究から除外された。生理食塩水またはGSNOで処置した動物の一部では、CBFをMCAOの前に、その間に、および再灌流の開始から3時間後に測定した。各動物を、麻酔下で、定位固定装置にセットし、針状プローブを次の座標(前後方向、-1.0 mm; 横方向、-4.0 mm)の十字縫合でセットした。
【０１１６】
ラット脳内のカスパーゼ-3活性の測定
以前に報告されている(Haq et al. 2003)とおりに、カスパーゼ-3酵素活性アッセイを行った。手短に言えば、反応混合物には緩衝液B (100 mM HEPES, pH 7.4; 20%グリセロール; および2 mMジチオスレイトール) 900 lの中に、ラット脳ホモジネートから調製された細胞質タンパク質50 gと500 M Ac-DEVD-AMC (カスパーゼ-3基質II、蛍光性; Caibiochemカタログ番号235425)が含まれた。基質を組織抽出物に加えることで酵素反応を開始し、37℃でインキュベートした。AMCフルオロフォアの切断による蛍光の変化を検出するため、蛍光分光光度計を用いて380 nmの励起波長および460 nmの発光波長でカスパーゼ-3様活性を測定した。
【０１１７】
細胞培養
生後1日〜3日齢のSprague-Dawley系ラット産仔から初代ラット星状細胞を調製し、10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を加えたDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。GFAP (グリア細胞繊維性酸性タンパク質)陽性の免疫染色に基づいて、星状細胞が95%を超える純度であることが確認された。BV2細胞は、Dr. Michael McKinneyにより提供していただいたマウス初代小膠細胞に由来する小膠細胞系であり、10% FBSおよび抗生物質を添加したDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)を用いて細胞の代謝活性を測定することによりおよびLDH放出アッセイ(Roche)により、処置の細胞毒性効果を測定した。
【０１１８】
ウエスタンブロット解析
新鮮なまたは凍結された脳組織または培養細胞をウエスタンブロット解析に使用した。20 mM Tris, pH 7.4; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1% Triton; 2.5 mMピロリン酸Na; 1 mMバナデート; ロイペプチン1 gを含有する氷冷緩衝液中で、組織(脳)をホモジナイズした。このホモジネート(各タンパク質160 g)を冷アセトンで処理し、ボルテックスし、-70℃で4時間保存した。この試料を12,000×gで10分間遠心して、タンパク質を沈殿させた。次に、この乾燥ペレットをローディングバッファー中で5分間煮沸した。等量(1レーン当たりタンパク質40 g)のタンパク質をSDS-PAGE解析に供し、これをニトロセルロース(Amersham)に転写した。免疫ブロット用に培養細胞から得た試料は、以前に報告されている(Giri et al. 2002)ように調製した。手短に言えば、細胞を回収し、その後、氷冷溶解緩衝液(50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、10%グリセロール、およびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する50 mM Tris-HCl, pH 7.4)中で溶解した。この試料をSEE P. 12で10分間遠心した。上清(タンパク質50 g/レーン)をSDS-PAGEにより解析し、ニトロセルロース(Amersham)にブロットした。ブロットを5%脱脂粉乳-TBS-0.1% Tween 20中で1時間ブロッキングし、洗浄し、その後、5% BSA-TBS-0.1% Tween 20中のiNOS抗体(1:1000)とともに4℃で一晩インキュベートした後、洗浄した。これに続けて、ペルオキダーゼ結合ウサギ二次抗体(1:5,000, Sigma)との1時間のインキュベーションを行った。製造元の使用説明書(Amersham Pharmacia Biotech)にしたがって高感度化学発光検出法を利用し、その後X線フィルムに膜を露出することにより、免疫反応性を検出した。デンシトメトリー解析をBio-Radデンシトメーター(モデルGS-670、イメージングデンシトメーター)で行った。Bio-Radから市販されているタンパク質定量色素(Bradford試薬)を使って、タンパク質濃度を測定した。
【０１１９】
転写アッセイ
記述(Giri et. al.報告)のように12ウェルプレート中で製造元の使用説明書にしたがい、星状細胞の場合にはリポフェクタミン2000 (Invitrogen)およびBV2細胞の場合にはリポフェクタミンプラス(Invitrogen)により、初代星状細胞または小膠細胞系(BV2)にβ-ガラクトシダーゼとともにNF-B-またはiNOS-ルシフェラーゼレポーター遺伝子(1.5 g/ウェル)を一過性にトランスフェクトした。コトランスフェクション研究の場合、細胞に、HA-IKKaまたはHA-IKKまたはp65またはp50発現ベクターの存在下でまたは非存在下でレポーターをトランスフェクトした。全DNA (3 g/ウェル)を一定に維持し、pcDNA3を使って全群を等しいDNA量に正規化した。ルシフェラーゼキット(Promega)を用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１２０】
TUNELアッセイによるアポトーシス
TUNEL (TdT仲介性dUTPニック末端標識)アッセイにより、アポトーシスを検出した。手短に言えば、切片をキシレンで脱パラフィン処理し、段階的アルコール液の3回交換を通じて再水和し、スライド上で直接的にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中にて室温で15分間、その後20 g/mlのプロテイナーゼK中にて室温で15分間インキュベートした。アポトーシスの検出にはApopTag (登録商標)プラスペルオキシダーゼキット(Intergen社)を用いた。3% H2O2のPBS液との5分間のインキュベーション、続いて平衡化緩衝液との10秒間のインキュベーションによって、脳切片の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。
【０１２１】
この切片を反応緩衝液中の末端デオキシヌクレオチジル転移酵素(TdT)と37℃で60分間インキュベートした。停止/洗浄緩衝液と室温でインキュベーションすることにより、この反応を停止させた。次に、切片をペルオキシダーゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体(アフィニティー精製されたヒツジポリクローナル)と室温で30分間インキュベートし、この反応物をジアミノベンジジン(DAB)基質によって室温で4分間発色させた。切片をメチルグリーンによって30秒間対比染色し、Permount (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)中で封入した。DABの代わりに蛍光基質シアニン3チラミド(TSA-Directキット、NEN Life Sciences, Boston, MAに同梱されているペルオキシダーゼ基質)を用いてペルオキシダーゼ反応物を発色させた後、ニューロン特異的エノラーゼ抗体(ウサギポリクローナル1:100、Chemicon, Temecula, CA)とのインキュベーションを行い、抗ウサギFITC (1:100、Vector Labs, CA)を用いて視覚化することによってTUNEL陽性細胞を同定するため、二重標識を利用した。
【０１２２】
免疫組織化学
特異抗体を用いた免疫組織化学解析により、サイトカイン(TNF- & IL-1)およびiNOSの発現を検出した。ホルマリン固定脳組織からのパラフィン包埋切片をTNF-、IL-1およびNOSについて染色した。手短に言えば、脳組織切片を脱パラフィン処理し、段階的アルコール液中で連続的に再水和し、その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS, pH 7.4)中に浸漬した。次にスライドを抗原脱マスキング液(Vector Labs, CA)中で2分間レンジ加熱し、冷却しPBS中で2分間3回洗浄した。切片を3%過酸化水素の蒸留水中に25分間浸漬して内因性のペルオキシダーゼ活性を除き、次いで免疫組織化学用の1%ウシ血清アルブミンのPBS中で1時間および希釈したヤギ血清中で30分間ブロッキングして非特異的な染色を減らした。切片を、ブロッキング緩衝液中に希釈した一次マウスモノクローナルTNF-抗体(1:50、Bio Source)、IL-1抗体(1:25、Santa Cruz Biotechnology, CA)およびウサギポリクローナルiNOS抗体(1:10、Transduction Labs, CA)と一晩インキュベートし、その後、0.1% Tween-20を含有するPBS中で6分間3回洗浄した。iNOSおよびIL-1はビオチン化抗ウサギ抗体により、TNF-は(ビオチン化)抗マウス抗体により、続いてアビジン-ビオチンHRP複合体(Vectastain ABC-Eliteキット, Vector Labs, CA)を用い、ジアミノベンジジンを基質として用い検出した。スライドを次に、段階的な一連のアルコール液を通じて脱水し、Permount中で封入し、これにカバーガラスをのせた。Olympus社製の顕微鏡を用いて全ての切片を解析し、Adobe Photoshop (Adobe Systems, CA)によって制御されるデジタルビデオカメラ(Optronics)を用いて画像をキャプチャした。
【０１２３】
免疫蛍光二重標識の場合、切片を最初に抗iNOS抗体(1:10)とインキュベートし、続いてマクロファージマーカーED1 (1:100、マウスモノクローナル、ARU0151、Biosource, Camarillo, CAから入手)または星状細胞マーカーGFAP (1:100、マウスモノクローナル、クローン6F-O1カタログ番号YM-3012、Accurate, Westbury, NYから入手)とインキュベートした。抗iNOSはTexas Red結合抗ウサギIgG (1:100、Vector Labs, CA)を用いて視覚化し、ED 1またはGFAPはFITC結合抗マウスIgG (1:100、Vector Labs, CA)を用いて視覚化した。対照の一次抗体として、ウサギまたはマウスポリクローナルIgGを使用した。切片を同様に、陰性対照として一次抗体なしでFITCまたはTexas Red結合IgGとインキュベートした。洗浄後、スライドを風乾し、水性封入剤(Vector Labs)で封入した。二重の波長フィルタをエピ蛍光用に備えたOlympus社製顕微鏡およびAdobe Photoshopソフトウェアを用い、スライドを免疫蛍光について調べた。Adobe Photoshopソフトウェアを用い、個別の色成分(赤または緑)を分離した。
【０１２４】
統計分析
全ての値は平均±SDとして表現されている。群の平均間の比較は、対応のない変数に関するスチューデントの両側t検定を用いて行った。群間の相違は、p < 0.05の場合に有意と考えられた。
【０１２５】
実施例5
結果II
GSNOの梗塞の縮小に対するおよび神経学的スコアの回復に対する効果
生理食塩水処置(賦形剤)による虚血脳およびGSNO処置(GSNO)による虚血脳から得た代表的なTTC染色切片(頭側から尾側領域まで並べられた計6切片のうちの3番および4番)を図12Aに示す。GSNOによる処置は、賦形剤と比べて、脳の白色域のうち相当な領域が消失したことから判断されるとおり、梗塞を減少させた。全6切片に基づいた梗塞体積(図12B)が大幅に減少していることが分かった。虚血動物とGSNO処置動物との間の神経学的スコアには著しい違いがあった(図12C)。20分のMCA閉塞と24時間の再灌流により、結果として神経学的スコアは2.70±0.48になった。GSNO処置動物は平均の神経学的スコアが1.10±0.32であった。GSNOの用量(1 mg/kg体重)の選択は、最大の脳保護(梗塞体積)に基づいている。この用量では安静時の血圧、頭蓋内圧、およびその他の生理的パラメータに影響しなかった。しかし、虚血の発症後のGSNO投与は、虚血から3時間後に11.2% (各群の動物2匹の平均値)に対して128.0%という脳血流(CBF)の著しい増加を伴っていた。GSNO処置と未処置の両群で、虚血から7日後まで、動物の生存を同様にモニターした。処置動物(n=7)は全て7日まで生存し、健康状態を維持し、神経学的欠損がなかったが、未処置動物(n=7)は虚血から3日後以内に死んだ。
【０１２６】
GSNOのサイトカインおよびiNOSの誘導に対する効果
脳の虚血および再灌流後のTNF-αを介したiNOSの誘導は、相当な量のNOの生成に関連している。その後、NOはO2-と反応して強力なオキシダントONOO-を形成し、これは直接的に細胞死に関与しており、間接的にヒドロキシルラジカルの生成を引き起こす。TNF-α (図13A〜C)およびIL-1β (図13D〜F)は虚血脳の同側半球(主に皮質)中で再灌流から24時間後に高度に発現されていることが判明し、この発現はGSNO処置動物では著しく低下した。再灌流から24時間後の免疫染色によって検出されたiNOSの発現(図13G〜I)は、TNF-αおよびIL-1βと類似のパターンにしたがっており、GSNOによる処置はiNOS陽性細胞の数を劇的に減少させた。偽手術群では調べた脳領域のどこにもiNOS陽性細胞が存在していなかった。虚血脳の同側半球中にiNOSの発現が有ることおよびGSNOにより処置した虚血脳の同側半球中にその発現が無いことは、図14Aおよび14Bに示されるようにウエスタンブロット解析によっても支持された。iNOSの発現は主にマクロファージ/小膠細胞に見られた。それはiNOSに対する染色がED-1の発現と重なり合っていたからである(図16D〜16I)。iNOSを発現しているマクロファージ/小膠細胞は、血管中(図16D〜16F)だけでなく皮質領域中(図16G〜16I)にも存在していた。iNOSの発現は活性化星状細胞のマーカーGFAPとも重なり合っており(図16A〜16C)、したがって活性化星状細胞がiNOS誘発性の窒素ストレスに関与することを示唆している。
【０１２７】
GSNOのED-1およびGFAP発現に対する効果
実験的証拠から、炎症性メディエータが関与するまでは、虚血性障害や梗塞の進行はゆっくりしたペースで進むことが示唆される。浸潤性の血液由来細胞によってまたは活性化グリア細胞によって分泌される炎症性メディエータは、酸化ストレスおよび窒素ストレスを増強し、アポトーシス細胞死を誘導する。EDIを使用して、活性化小膠細胞を含む、単球由来の細胞を検出した。同側半球の周辺部域内にEDIに著しく特異的な染色(図15B)が存在していた(賦形剤)。GSNOを用いた処置によって、EDI陽性細胞の数が低下した(図15C)。偽手術群ではEDIに対する染色がなかった(図15A)。虚血の場合、梗塞は、高レベルのグリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP、星状細胞特異的な細胞骨格タンパク質)を発現している多数の肥大型星状細胞で取り囲まれている。図15Eに示されるとおり、GFAP陽性の星状細胞は、虚血性の皮質領域中で顕著に増加しているのが認められた。GSNOを用いた処置によって、活性化星状細胞の数が減少した(図15F)。
【０１２８】
GSNOのアポトーシス細胞死およびカスパーゼ-3活性に対する効果
アポトーシスの指標としてDNA断片化を転移酵素仲介性d-UTP標識ニック末端標識(TUNEL)アッセイにより測定した。梗塞のとりわけ辺縁周囲の同側半球におけるDNA断片化が著しく増加した(図13J〜13L)。GSNO処置によって、アポトーシス細胞数の減少が起こった。対照脳および虚血脳の対側半球では、TUNEL陽性細胞が示されなかった。TUNEL陽性細胞が主にニューロンに存在していたという事実は、TUNEL染色をニューロン特異的マーカーNSEと重ね合わせることで確認された(図16J〜16L)。さらに、偽手術のものに比べて虚血脳の同側半球では、カスパーゼ-3活性が著しく増加していることが判明し、GSNO処置脳では、この活性が基礎レベルに戻った(図17)。
【０１２９】
ラット初代星状細胞および小膠細胞(BV2)におけるGSNOのサイトカイン誘導性iNOS発現に対する効果
サイトカインに応じたNOの生成は、脳虚血の病理生物学において重要であることが示されている。GSNO処置によるiNOSの阻害に関与する機構を詳しく調べるため、ラット初代星状細胞および小膠細胞をインビトロ研究に使用した。これらの細胞が虚血性傷害後の脳内における炎症の伝播に関与しているからである。これらの細胞を異なる濃度(0.1mM〜2mM)のGSNOで前処理し、その後、BV2の場合にはLPS (1 μg LPS/ml)でまたは星状細胞の場合にはLPS (1 μg LPS/ml) + IFN-γ (50 U IFN-γ/ml)で処理した。24時間後、ウエスタンブロットにより、iNOSタンパク質がないかどうか細胞を分析した。GSNOを用いた処理によって、星状細胞(図18A)とBV2(図18C)の両方で用量依存的にiNOSの発現が阻害された。GSNO (1 mM)単独ではiNOS発現に効果がなかった。GSNOのサイトカイン誘導性iNOS発現に対する阻害効果をさらに、星状細胞(図18B)とBV2 (図18D)細胞の両細胞でiNOSルシフェラーゼ活性測定法により確認した。
【０１３０】
ラット初代星状細胞およびBV2におけるGSNOのサイトカイン誘導性NF-κBルシフェラーゼ活性に対する効果
GSNOを介したiNOS発現の下方制御の機構を理解するため、LPS/IFN-γまたはLPSを介したNF-κB活性化に対するGSNOの効果を星状細胞とBV2細胞のそれぞれで詳しく調べた。刺激されていない細胞では、NF-κBはp65/p50ヘテロ二量体からなり、IγBとのその結合によって細胞質中に保持される。細胞質NF-κB/IγB複合体が解離し、遊離NF-κBが核に移行し、細胞の刺激後のiNOSを含むNF-κB応答性遺伝子の転写を調節する。上流のキナーゼIKKによるIγBのリン酸化が、NF-κBからのIγBの解離には不可欠である。NF-κBの活性化と核への移行(Hallenbeck 2002; Han et al. 2003)が、iNOSおよび炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-1βおよびIL-6β)の発現には極めて重要であることが示されている。NF-κBルシフェラーゼベクターをトランスフェクトした細胞において、LPS/IFN-γまたはLPS攻撃に応じたそのレポーター活性をモニターすることで、NF-κB活性に対するGSNOの阻害効果をさらに解析した。異なる濃度(0.1〜2MM)のGSNOを用いた処理により、ラット初代星状細胞とBV2細胞のそれぞれで、NF-κBルシフェラーゼレポーター活性のLPS/IFN-γまたはLPS依存的な活性化が低下した(図19A、19D)。NF-κBルシフェラーゼ活性に対するGSNOの直接的効果を詳しく調べるため、NF-κBルシフェラーゼレポーターに加えてNF-κBのp65とp50サブユニットの発現ベクターを、初代星状細胞とBV2細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、細胞を異なる濃度のGSNOで、続いてLPSまたはLPS/IFNγで5時間処理した。GSNO処理によって初代星状細胞でおよびBV2細胞系で(図19B、19E)、p65/p50を介したルシフェラーゼ活性が用量依存的に阻害された。GSNOはこれらの細胞でp65/p50を介したiNOSルシフェラーゼも減弱させた(図19C、19F)ことから、GSNOは同様に、NF-κBサブユニットに対し直接的にその効果を媒介し、損傷に関与する炎症誘発性遺伝子の転写のために、それらのサブユニットがDNAに結合する能力を変化させたことがさらに示唆された。IKKまたはIKKを介したiNOSのおよびNF-κBのルシフェラーゼ活性に対するGSNOの効果を同様に、星状細胞とBV2細胞で調べた。GSNOによる星状細胞およびBV2細胞の処理は、IKKおよびIKKを介したiNOSルシフェラーゼ活性およびNF-κBルシフェラーゼ活性を用量依存的に阻害した(データは示されていない)ことから、GSNOはNF-κB経路を阻害するIKKの上流に作用している可能性があることが示唆された。
【０１３１】
実施例6
考察II
GSNOによる処置は実験的脳卒中のラットモデルで、TNF-α、IL-1βおよびiNOSの発現を阻害し、脳の同側半球中のアポトーシスによる神経細胞死を低下させた。これが結果として、梗塞形成の減少(図12A〜12B)と神経学的スコアの改善(図12C)という両観点で保護作用をもたらした。GSNOによる神経保護作用という結論は、GSNO処置が星状細胞および小膠細胞/マクロファージの活性化を阻害し、炎症を減らしたという観測結果に基づいている。この処置は同様に、iNOS発現の誘導を阻害し、ニューロンのアポトーシスを低下させた。さらに、GSNOによるインビトロの処理によって、ラット初代星状細胞とBV2細胞の両細胞で、サイトカインによるiNOS誘導とサイトカンを介したNF-κBルシフェラーゼ活性が阻害された(図18〜19)。
【０１３２】
証拠によって、現在では、脳卒中は炎症性成分を有し、抗炎症剤による処置を施行できることが示唆されている(Barone and Feuerstein, 1999)。TNF-α(Hallenbeck, 2002)およびIL-1β(Rothwell, 2003)は、損傷した脳内での炎症性細胞の蓄積に関与すると考えられており、脳卒中の病理生物学において複雑なしかし重要な役割を果たしている。実際のところ、炎症は局所脳虚血モデルにおいて再灌流の間の主な傷害機序と同定されている(Kato et al. 1996; St oll et al. 1998)。本発明者らは既に、抗酸化物質N-アセチルシステインによるサイトカインおよびiNOSの阻害は神経防護作用があることを明らかにしている(Sekhon et al., 2003; Sekhon 2002)。このことはその他の研究によってさらに証明されており、それらの研究では、iNOSを阻害する化合物は、損傷後に投与された場合でさえも局所脳虚血で保護作用があることを明らかにしている(Ding-Zhou et al., 2002; Zhu et al., 2002)。iNOS遺伝子が欠損しているマウス(Zhao et al., 2000)は、各対照に比べて梗塞体積の減少を示す。選択的iNOS阻害剤アミノグアニジンが脳虚血マウスにおいてiNOS活性をiNOSノックアウトマウスで見られる活性に等しいレベルまで抑制することは、この酵素が虚血性傷害に関与することを裏付けている(Sugimoto and ladecola 2002)。L-アルギニンはiNOS欠損マウスにおいてではなく野生型マウスにおいて虚血性傷害を増大させることが明らかにされており、iNOSにより利用されてNOを生成するL-アルギニンが虚血性傷害においては有毒であることを示唆している(Zhao et al., 2003)。iNOSの発現は虚血/再灌流後の脳において多くの細胞種で示されている(Dirnagl et al., 1999)。虚血性梗塞後のヒトの脳にiNOSの発現が有るという証拠にまで及んでいる(Forster et al., 1999)。虚血動物の同側半球における免疫組織化学によって、マクロファージ/小膠細胞(EDI)におけるおよび活性化星状細胞(GFAP)におけるiNOSの発現が確認された(図16A、16G)。iNOS発現を示すEDI陽性細胞は同様に、他者によって観測されているとおり、血管中に存在していた(図16D)。NO供与体およびiNOS阻害剤を含めた抗炎症/神経保護物質による炎症の阻害は、脳虚血に関する興味深い仮説であった。ニトロプルシドナトリウム(SNP)もスペルミン/NOもどちらも局所脳虚血のラットモデルにおいて脳を損傷から保護することが示されている(Salom et al.,2000)。SNPは、恐らくグアニル酸シクラーゼとcGMPを通じたNOの作用により、脳を保護する塩である(Zhang et al., 1994a)。SIN-1、NOの供与体およびO'がもたらす保護は、その効果が虚血脳アシドーシスに依存するということが議論され主張されてきた(Coert et al., 2002)。本研究では、神経保護物質GSNOが使われた。これはNO供与体、抗酸化物質およびS-ニトロシル化剤として認識されている(Chiueh 2002)。これらの結果から局所脳虚血において、GSNOによる処置は、脳を虚血性傷害から保護しただけでなく、脳常在性の活性化細胞および浸潤した血液由来細胞におけるTNF-α、IL-1βおよびiNOSの発現の阻害によって炎症を改善したことも示唆される。
【０１３３】
GSNOはグルタチオンおよびNOの安定的な代謝産物であり、GSHの存在下でのNOの酸素依存的な酸化の間に形成される(Hogg, 2000; Jourd'heuil et al., 2003; Schrammel et al., 2003)。GSNOはラット脳内に高濃度で存在し、NOをゆっくり放出し、生理条件下でニトロシル化/脱ニトロシル化を調節している(Kluge et al., 1997)。その崩壊は複雑と考えられており、いくつかの要因に依存している(Ford et al., 2002; Zeng et al., 2001)。GSNOは強力な血小板凝集阻害剤であることが示されており(Langford et al., 1994)、ヒトにおいて塞栓形成を低下させる(Molloy et al., 1998)。GSNOはある患者セット群において塞栓信号の頻度を素早く低下させるのに非常に効果的である(Kaposzta et al., 2002a; Kaposzta et al., 2002b)。GSNOは急性の血管収縮を逆行させて、くも膜下出血後の虚血脳障害を阻止することができる(Sehba et al., 1999)。バルーン傷害法および冠動脈内放射線療法の間にGSNOを全身投与することで、結果的にブタにおいて血栓症率が低下した(Vodovotz et al., 2000)。GSNOは凝固第XIII因子を阻害して、血小板凝集を停止させる(Catani et al., 1998)。さらに、GSNOはONOO-およびHOに対する、GSHよりも強力な抗酸化物質である。S-ニトロシル化/トランスニトロシル化は、細胞内シグナル伝達を介してNOS含有細胞においてもその他の細胞においてもNO関連の生物活性の重要なメディエータとして働くという実質的証拠が存在する。最近になって、GSNOはNO、O2およびH2O2と同様に、内皮細胞または星状細胞とニューロンとの間で働くシグナル伝達分子であるということが実証されている(Chiueh and Rauhala 1999)。Rauhalaらは同様に、酸化ストレスからの脳ドーパミンニューロンのGSNOによる神経保護作用を実証している(Rauhala et al., 1998)。本研究では、閉塞の発症後でさえもGSNOの投与によって、梗塞形成から脳が保護されただけでなく、神経学的スコアも改善された。本急性脳卒中モデルにおいてGSNOがもたらす保護は、GSNOそれ自体のならびにNOおよびGSHを含むその代謝産物の多様な関与という観点で説明することができる(Chiueh and Rauhala 1999)。GSNOは血管緊張を調節する能力を有する(Rodriguez et al., 2003)。GSNOから放出されたNOは、少なくとも部分的に、グアニル酸シクラーゼとの結合を介して内皮機能を保持し、故にcGMPレベルや脳血流を増加させることができた。脳血流を虚血から3時間後までモニターし、脳血流の著しい増加が見られた(データは示されていない)。NOシグナル伝達の新たな側面は、一般にRSNOによるおよび特にGSNOによるS-ニトロシル化/脱ニトロシル化およびトランスニトロシル化を介したcGMP非依存的な直接作用である(Foster et al. 2003)。しかしながら、主な焦点は急性脳卒中におけるGSNOの抗炎症効果を詳しく調べることであった。この目的で、ラット初代星状細胞とBV2細胞系(小膠細胞系列)を含む、脳細胞を取り扱った。図18で明らかなように、GSNOはiNOS発現を用量依存的に阻害した。iNOSルシフェラーゼ活性によって、阻害がさらに確認された(図18C〜18D)。さらに、本発明者はGSNOによるiNOS阻害の機構を詳しく調べ、GSNOによって用量依存的にNF-κBルシフェラーゼ活性が阻害されたことから明らかなとおり、これがNF-κBによって媒介されることを見出した。GSNOはサイトカイン誘導性のiNOS遺伝子発現を、ラット初代星状細胞とBV2細胞において恐らくNF-κB不活性化を伴う機構を介して阻害した。この効果はNF-κB応答炎症遺伝子による細���への損傷を低下させることができる。S-ニトロシステインを用いたp50のチオール基のS-ニトロシル化によるNF-κBの阻害が、マウスマクロファージおよびヒト呼吸細胞で実証されている(Marshall and Stamler, 2001)。細胞種にもよるが、NF-κB活性化経路のNO阻害の少なくとも2つの標的が、一方は細胞質内(恐らくIKK複合体)におよび他方は核内(p50-p65)に存在する(Marshall and Stamler 2001)。この場合、GSNOはp50-p65をニトロシル化したと仮定された。図7に示されるように、p50のニトロシル化はiNOSのプロモーター領域中のDNAへのp50-p65の結合を阻害した。これはGSNOがNF-κB経路を含む、ラット初代星状細胞においてiNOS発現を阻害したことを示す最初の報告になるかもしれない。とはいえ、ケラチノサイトにおいてGSNOによるNF-κBおよびケモカインのサイトカイン媒介活性化の阻害が以前に報告されている(Giustizieri, 2002)。局所脳虚血/再灌流における細胞死は、ネクローシス(壊死)によってもアポトーシスによっても起こる(Kametsu et al., 2003; Yao et al,. 2001)。ネクローシスとアポトーシスとの比率は、いくつかの主要因子に依存している。虚血事象の時間、閉塞の種類、年齢および危険因子に対する素因は、脳卒中の重症度やアポトーシス細胞死の主な決定因子である(Love, 2003)。アポトーシスまたは抗アポトーシス時のNOの調節的な役割は複雑であり、異なる機構を含む(Chung et al., 2001; Kim et al., 2001; Kim et al., 1999)。細胞をアポトーシスから救う抗アポトーシス薬による処置は、臨床において達成可能な主要目的のうちの1つである(Waldmeier 2003)。ラット脳での実験的脳卒中後、酸化的DNA損傷はDNA断片化よりも先に起こるので(Cui et al., 2000)、抗酸化物質および神経保護薬を使用して、DNAを酸化や断片化から保護することができる。この目的から、抗虚血性のほかに抗アポトーシス性を持ちうる薬物を使用することになった。実験的脳虚血(Namura et al. 1998)において、TUNEL (図13J〜13L)およびカスパーゼ-3の活性化(図17)、つまりミトコンドリア経路のアポトーシスの顕著な特徴(Davoli et al. 2002; Mohr et al. 1997)から明らかなように、かなりの数のアポトーシスニューロンが境界域中に観察された(図16J〜16L)。カスパーゼ-3の活性化はその脱ニトロシル化を含む。カスパーゼ-3はそのニトロシル化型では不活性化されたままであることが示されている。Fasアポトーシス経路は、その活性化をもたらすカスパーゼ-3の脱ニトロシル化を活性化することが示されている(Mannick et al. 1999)。本発明者らのモデルにおいてGSNOを用いた処置は、虚血/再灌流によるカスパーゼ-3の活性化を下げ(図17)、図13および図16に見られるように、TUNEL陽性ニューロンの数を減らした。GSNOの効果がグルタチオン(GSH)を介して媒介されるかどうかを調べるため、本発明者は動物を外因性GSHで処置した。虚血の発症の後で直接的にGSHを投与すること(最大150 mg/kg体重まで)には、保護効果がなかった。脳虚血は膠細胞(常在性の小膠細胞および星状細胞)の活性化、ならびに好中球およびマクロファージを含む血液由来細胞の浸潤を促進する(Stoll et al., 1998)。活性化された星状細胞(GFAP陽性)および活性化された小膠細胞/マクロファージ(ED-1陽性)が梗塞および梗塞周囲の領域に見られた(図15)。正常な星状細胞の機能が急性脳卒中においてニューロン生存の後押しに重大な意味を持つと確認されているので(Anderson et al., 2003)、活性化を含めて、星状細胞の代謝の異常が損傷に関与すると考えられる。マクロファージおよび好中球の浸潤は内皮機能に依存しており、その機能は低酸素および虚血条件下で損なわれ、NOおよびNO供与体によって維持される(Johnson et al., 1998)。低または無酸素/グルコース条件では、eNOSは適切な内皮機能に必要なNOを供与することができない。ピコモル量のeNOSによって産生されたNOは、グアニル酸シクラーゼ-cGMP経路ならびに/またはタンパク質および小ペプチドのシステイン残基のニトロシル化/トランスニトロシル化を介して、内皮機能、脳血流および血管拡張の維持に関与する(Tseng et al., 2000)。内皮機能の損なわれた再酸化虚血脳では、活性化された星状細胞および小膠細胞/マクロファージがサイトカインおよびエイコサノイドに加えてiNOSおよびROSの主な供給源になる。iNOSは、いったん誘導されると、O'と反応してONOO-を形成できる爆発的なNO(ナノモル量)を放出する。生理的レベルのROS/O2-'に比べ過剰なROS/O2'が存在する場合、NOの役割が異なることは現在明らかである(Davis et al., 2001)。02-'が存在しない場合、NOは、脂質代謝酵素の酵素活性の調節、細胞シグナル伝達への関与およびヒドロキシルラジカルの生成を阻害する酸化還元活性な金属中心への結合を含めて、さまざまな機構により過酸化脂質を含むフリーラジカルの発生と伝播を終結することができる。他方では、NOはROSと協調的に作用するかまたはROS/O2と反応するかして、ONOO-とHO'を生成することができる。後者の2つのラジカルはDNA、タンパク質および脂質の崩壊に積極的に関与し、虚血性傷害において細胞死を引き起こす。局所脳虚血の発症後でさえも低用量のGSNO (1 mg/kg体重)がもたらす保護作用は、炎症性細胞の活性化(図15)および炎症性メディエータの生成(図13)を阻害するその能力を示すものである。DNAとのNF-κBサブユニットの結合の阻害がインビトロの研究で確かに見られた。GSNOは、NF-κBの関与のほかに、NMDA受容体およびカスパーゼ-3のニトロシル化を介してその抗炎症作用を及ぼすことができると提唱される。NMDA (Lipton et al., 2002)受容体およびカスパーゼ-3 (Mannick et al., 2001)のS-ニトロシル化は、脳虚血において十分に確立された損傷阻害機構である。NF-κBのサブユニットp65/p50を介した細胞培養物でのiNOS発現の阻害から、その神経保護作用が血管および循環細胞に対するGSNOの潜在的効果に依存するだけではなく、その作用が直接的な抗炎症作用を及ぼすことも明らかに示唆される。さらに、GSNOを用いたインビボの処置は虚血/再灌流によるカスパーゼ-3活性を阻害し、これにより、GSNOのカスパーゼ-3媒介性の細胞死阻害能が示唆された。後日、損傷脳にGSNOがもたらす保護作用と対比し処置の時間(最大で6時間まで)をこのモデルで調べた。GSNOは梗塞形成および神経学的スコアの点から見て、虚血の発症後に1 mg/kg体重の用量で、1.5時間以内に投与された場合、依然として保護が強力であった(データは示されていない)。
【０１３４】
脳卒中に対抗するGSNOの的確な保護機構にかかわらず、GSNOは望ましい神経救済剤(neurorescue agent)である。何故なら、得ることや投与することが容易であり、無害であり、そして最も重要なのは、抗アポトーシス性かつ抗炎症性であるからである。GSNOは以前に使用されており、動物でもヒトでも耐容性良好である。GSNOは虚血において抗炎症性かつ抗アポトーシス性であるが、GSNOによる神経保護作用に関与する機構には、インビボおよびインビトロ双方での、もっと多くの研究が必要である。
【０１３５】
実施例7
材料と方法III
細胞培養および試薬
初代ラット星状細胞および小膠細胞は、生後1日〜3日齢のSprague-Dawley系ラット産仔から調製し(McCarthy and de Vellis, 1980)、10%ウシ胎仔血清(FBS)および抗生物質を加えたDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。GFAP (グリア細胞繊維性酸性タンパク質)およびMAC1染色に基づき、星状細胞および小膠細胞が95%を超える純度であった。腹腔マクロファージを単離し、加熱不活性化した1% FBSを添加したRPMI 1640培地中で培養した(Pahan et al., 1997)。BV2は、Dr. Michael McKinney (Mayo Clinic, Jacksonville, FL)により提供していただいたマウス初代小膠細胞に由来する小膠細胞系であり、10% FBSおよび抗生物質を添加したDMEM (4.5 gmグルコース/L)中で維持した。DMEM (4.5 gmグルコース/L)、RPMI 1640培地、ウシ胎仔血清およびハンクス平衡塩類溶液はLife Technologies (Grand Island, NY)から入手した。LPS (大腸菌、抗原型055:B5)、GGPP、FPP、AICAR、メバロネートおよびプロテアーゼインヒビターカクテルはSigma (St. Louis, MO)から入手した。iNOSに対する抗体はUpstate (Waltham, MA)から入手した。[γ-32P]ATP (3000 Ci/mmol)および[γ-32P]dCTP (3000 Ci/mmol)はNEN (Boston, MA)から入手した。p65、p50、IKKα、C/EBP-α、-β、-γ、-δに対する抗体ならびにNF-κBおよびC/EBPに対するオリゴヌクレオチドは、Santa Cruz (Santa Cruz, CA)から入手した。組換えTNF-α、IL-1β、IFN-γならびにTNF-α、IL-1β、IL-6およびIFN-γに対するELISAキットはR & D Systems (Minneapolis, MN)から入手した。TRIZOLおよびトランスフェクション試薬(リポフェクタミン2000、リポフェクタミンプラスおよびオリゴフェクタミン)はInvitrogen (Carlsbad, California)から入手した。CAT ELISA、β-ガラクトシダーゼ、MTTおよびLDHキットはRoche (Nutley, New Jersey)から入手した。高感度化学発光(ECL)検出試薬はAmersham Pharmacia Biotech (Arlington Heights, IL)から購入した。ルシフェラーゼアッセイ系はPromega (Madison, WI)から入手した。炎症性サイトカインに対する遺伝子発現アレイはSuperarray (Bethesda, MD)から入手した。非リン酸化p42/44、p38、JNK1/2およびAMPKに対する抗体ならびにp42/44、p38、JNK1/2およびAMPKに対するリン酸特異的な抗体はCell Signaling (Beverly, MA)から入手した。NF-κBルシフェラーゼ、iNOSルシフェラーゼ(3.2 kb)およびAMPKα2ドミナントネガティブ発現ベクター(D157A)は、それぞれDr. W.J. Murphy、Dr. ZhangおよびDr. David Carlingにより親切にも提供していただいた。HA-IKKαに対する発現ベクターはDr. Zheng-Gang Liuからの贈与であった。iNOS (-1486/+145)ルシフェラーゼおよびiNOS-C/EBPdelルシフェラーゼは、Dr. Bruce C. Kone (Houston)により親切にも提供していただいた。iNOS (-234/+31)ルシフェラーゼおよびiNOS (-331/+31 NF-γB突然変異)ルシフェラーゼは、Dr. Mark A. Perrella (Boston)から親切にも贈呈していただいた。
【０１３６】
ナイトライト濃度
NOの合成は、以前に述べられている(Pahan et al., 1997; Giri et al., 2002)とおり、ナイトライト、つまり酸素分子とのNOの安定な反応生成物に対する培養上清のアッセイによって測定した。手短に言えば、96ウェルプレート中で上清を等量のGriess試薬と混合し、これを穏やかに振盪し、マイクロプレートリーダー中で570 nmにて測定した。このアッセイで、ナイトライト濃度はNaNO2の反応から得られた標準曲線から算出した。
【０１３７】
免疫ブロット解析
細胞を氷冷溶解緩衝液(50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、10%グリセロールおよびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する50 mM Tris-HCI, pH 7.4)中に回収し、Bradford試薬(Bio-Rad, USA)を用いてタンパク質量を推定した。1レーン当たり全タンパク質50マイクログラムをSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース(Amersham Pharmacia Biotech)にブロットした。ブロットを5%脱脂粉乳-TBS-0.1% Tween 20中で1時間ブロッキングし、5% BSA-TBS-0.1% Tween 20中の一次抗体(1:1000)とともに4℃で一晩インキュベートした。これに続けて、適当なペルオキダーゼ結合二次抗体(1:10,000, Sigma)との1時間のインキュベーションを行った。製造元の使用説明書(Amersham Pharmacia Biotech)にしたがって高感度化学発光検出法を利用し、その後X線フィルムに膜を露出することにより、免疫反応性を検出した。
【０１３８】
脂肪酸およびコレステロール生合成
6ウェルプレート(約80%の集密度)中で増殖されAICAR入りの無血清培地中で2時間プレインキュベートされた星状細胞に[2-14C]アセテート(5 μCi/ウェル)を与えた。2時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、かき落とした。以前に述べられているように(Khan et al., 2000)、脂肪酸およびコレステロール中の標識アセテートの取込みを分析した。
【０１３９】
アンチセンス実験
内因性AMPKのレベルを減少させるため、星状細胞を、AMPKのα1とα2の両サブユニットに直接的に向けられる25 μmのホスホチオエート(phosphothiorated)アンチセンス(AS)オリゴヌクレオチド
2007516294.tif 000010
で48時間前処理した(Culmsee et al., 2001)。ミスセンス(MS)オリゴヌクレオチド
2007516294.tif 000011
を対照培養に使用した。オリゴヌクレオチドは、製造元の使用説明書にしたがい、オリゴフェクタミン(商標)試薬を用いてトランスフェクトした。
【０１４０】
AMPKおよびIKKα/βアッセイ
AMPK活性を報告のとおり(Kim et al., 2001)、初代ラット星状細胞でアッセイした。IKKα/βアッセイの場合、初代星状細胞をAICAR (1 mM)で前処理し、その後、LPS (1 μg/ml-1)で30分間刺激した。細胞を冷PBSで洗浄し、溶解緩衝液(50 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、10%グリセロールおよびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有する50 mM Tris-HCI, pH 7.4)中で溶解した。細胞抽出物およそ200 μgを抗IKKα/β抗体(Santa Cruz)と2時間、その後、プロテインA/G PLUSアガロース30 μlを加え4℃でさらに1時間インキュベートした。この免疫複合体を溶解緩衝液中で2回およびキナーゼ緩衝液(20 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MgCl2)中で2回洗浄し、20 mMβ-グリセロホスフェート、20 mM p-ニトロフェニルホスフェート、1 mMジチオスレイトール、50 μM Na3VO4、20 μM ATP、および[γ-32P]ATP 5 μCiを含有するキナーゼ緩衝液30 μl中にて30℃でインキュベートした。各反応において、GST-IκBα融合タンパク質(Santa Cruz)およそ2 μgを基質として使用した。SDSローディングバッファー中での変性により、反応を30分後に停止させた。タンパク質をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、基質のリン酸化をオートラジオグラフィーによって視覚化した。
【０１４１】
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)
刺激されたまたは刺激されていない星状細胞から核抽出物を調製した。EMSAは、[γ-32P]ATPで末端標識されたNF-κBおよびC/EBPコンセンサス配列を用い、以前に報告されているように(Giri et al., 2002)行った。タンパク質濃度に基づいて核抽出物を正規化し、等量(5 μg)のタンパク質を負荷した。DNAとタンパク質との複合体を45 mM Tris、45 mMホウ酸、1 mM EDTA (0.5×TBE)中での5%未変性PAGEにて分離し、11 V/cmで泳動した。このゲルを乾燥後、X線フィルムを使い、-70℃でオートラジオグラフにかけた。
【０１４２】
サイトカイン発現に関するノザンブロット、遺伝子アレイ解析およびRT-PCR
製造元のプロトコルにしたがい、全RNAをTrizol (Gibco)で抽出した。iNOSに関するノザンブロットは、以前に報告されているように(Pahan et al., 1997)、1反応当たりRNA 15 μgを用いて行った。RNA負荷の対照として、β-アクチンを使用した。炎症性サイトカイン(TNFα、IL-1β、IL-6およびIFN-γ)に対する遺伝子発現アレイは、製造元のプロトコル(Superarray)にしたがって使用した。イメージングデンシトメーター(Bio-Rad Lab, Hercules, California)を用い、シグナルの定量化を行った。RT-PCRの場合、処置したラット脳の大脳皮質から、前記のようにTrizol中で抽出することによりRNAを単離した。製造元の使用説明書にしたがい、Moloneyマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Promega)とプライマーとしてポリdTを用いて、cDNAを全RNA 5 μgから調製した。cDNA 2 μlを使用して、以下の産物を増幅した[産物名、予想サイズ、ならびに使用したフォワード(F)およびリバース(R)プライマーとして示した]。
2007516294.tif 000012
エチジウムブロマイド0.5 μgを含有する1.2%アガロースゲル中の電気泳動によって、PCR産物を視覚化し、UVP Bio-docシステム(Upland, CA)によって写真撮影した。
【０１４３】
サイトカインアッセイ
製造元(R & D Systems, MN)が提供しているプロトコルによって酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を利用することにより、TNFα、IL-1βおよびIFN-γのレベルを培養上清でおよび血清で測定した。
【０１４４】
転写アッセイ
製造元の使用説明書にしたがい、リポフェクタミン-2000 (星状細胞)およびリポフェクタミン-プラス(BV2, Invitrogen)により、初代星状細胞または小膠細胞系(BV2)にドミナントネガティブなAMPKα2またはHA-IKKβの存在下または非存在下でβ-ガラクトシダーゼとともにNF-κB-またはiNOS-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を一過性にトランスフェクトした。pcDNA3を使って全群を等しいDNA量に正規化した。ルシフェラーゼキット(Promega)を用い、ルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１４５】
動物およびLPS処置
動物の使用は「Guide for the Care & Use of Laboratory Animals（実験動物の管理と使用に関する指針）」(National Institute of Health、出版番号86-23)およびMedical University of South Carolina, Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認されたプロトコルにしたがった。Sprague-Dawley系雌性ラット(200g〜250g; Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)を12時間:12時間の明暗条件下、適宜食料と水を与えながら室温で群飼育した。0.9%生理食塩水に溶解したLPS (0.5 mg/kg体重)または0.9%無菌生理食塩水のみの処置30分前に、動物にAICAR (100 mg/kg体重)を腹腔内注射(i.p.)した。6時間後、大脳皮質を単離し、さらに使用するまで液体窒素、その後-70℃の中で凍結させた。
【０１４６】
細胞生存性
3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)を用いて細胞の代謝活性を測定することによりおよびLDH放出アッセイ(Roche)により、処置の細胞毒性効果を測定した。
【０１４７】
統計分析
示された結果は平均±S.D.を表す。GraphPad InStatソフトウェア(San Diego, CA)を用い、ステューデント・ニューマン・キュールズ検定によるANOVAによって、統計分析を行った。
【０１４８】
実施例8
結果III
AICARによる脳グリア細胞および腹腔マクロファージにおけるLPSによる炎症誘発性サイトカインの発現の下方制御
活性化された星状細胞、小膠細胞およびマクロファージは、NOおよびサイトカイン生成の主要源であり、炎症性疾患に積極的に関与する(Benveniste, 1997)。ラット初代星状細胞、小膠細胞および腹腔マクロファージを異なる濃度のAICARで前処理し、その後LPS (1 μg/ml)にさらした。ELISAによって測定された星状細胞(図20a)、小膠細胞(図20b)およびマクロファージ(図20c)において、細菌性LPSは炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-1βおよびIL-6)の生成を著しく誘導した。AICARのみではサイトカインの生成に効果がなかった; しかしながら、それはこれらの細胞の上清中でLPSによるTNFα、IL-1βおよびIL-6の生成を用量依存的に強力に阻害した(図20)。サイトカイン生成の阻害にはmRNA発現の減少が付随して起きた(データは示されていない)。興味深いことに、マクロファージは星状細胞および小膠細胞に比べて、マイクロモル濃度のAICARで炎症誘発性サイトカインの生成を阻害するのに十分であったので、AICARに対し感受性がずっと高かった(図20c)。AICARまたはLPSは、LDHおよびMTTアッセイにより試験された細胞生存性に効果がなかった(データは示されていない)。
【０１４９】
AICARによる脳グリア細胞におけるLPSによるNO生成およびiNOS遺伝子発現の阻害
炎症誘発性サイトカインの生成に加えて、サイトカインに応じたNO生成が多くの炎症性疾患の病態生理に重要であることが示されている(Smith et al., 1999)。ラット初代星状細胞、小膠細胞およびマクロファージを異なる濃度のAICARで前処理し、その後LPS (1 μg/ml)にさらした。LPSは未処理細胞に比べて10倍高いNO生成(ナイトライトとして測定された)を誘導した。AICAR処理は初代星状細胞、小膠細胞および腹腔マクロファージにおいてLPSによるナイトライトの生成を用量依存的に阻害した(図21AおよびB)。サイトカインの生成と同様に、マクロファージは初代星状細胞および小膠細胞に比べて、AICAR処理に対し感受性がずっと高かった(図20c)。
【０１５０】
LPSを介したナイトライト生成に対するAICARの阻害機構を理解するため、ラット初代星状細胞においてiNOSタンパク質およびmRNAレベルに対するAICARの効果を調べた。ナイトライトの生成と一致して、LPSによるiNOSの発現はAICARにより、mRNAおよびタンパク質レベルで阻害された(図21CおよびD)。本発明者は次に、LPS処理に応じた初代星状細胞でのiNOSプロモーターの活性化およびその活性に対するAICARの効果を調べた。一過性トランスフェクションにより、ルシフェラーゼ遺伝子に結合されたラットiNOSプロモーターの3.2 kb部分(iNOS-Luc)を含むプラスミドを、サブコンフルエントな初代星状細胞の培養物に導入した。24時間後、培養物を異なる濃度のAICAR(0.25mM〜1mM)で前処理し、その後LPS処理をさらに6時間行った(図21E)。iNOSプロモーター活性はLPSとのインキュベーションによって大幅に(2.5倍)刺激された(図21e)。しかしながら、その活性はAICAR処理により用量反応的に有意に阻害された。既報(Hardie, 1992)ならびに本発明者の実験は、AICARが初代星状細胞においてコレステロール生合成を有意に阻害することを実証するものである(図22a)。さらに、本発明者はコレステロール生合成経路のいずれかの中間体または代謝体がAICARの抗炎症作用に関与しうるかどうかを調べた。メバロネート、ゲラニルゲラニルピロリン酸(GGPP)およびファルネシルピロリン酸(FPP)の添加によっては、初代星状細胞において、LPSによるiNOS-ルシフェラーゼ活性に対するAICARの阻害効果が逆転されなかった(図21f)。
【０１５１】
AICARによるAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)の活性化を介するiNOS遺伝子発現の阻害
AICARはAMPKを活性化することによりその効果を媒介する; 炎症過程の調節におけるAMPKの役割を確立することが不可欠であった。AMPKは、いったん活性化されると、アセチル-CoA-カルボキシラーゼ(ACC)およびHMG-CoA還元酵素をリン酸化することにより、脂肪酸およびコレステロール合成などのATP消費経路を下方制御する。AICAR (1 mM)を用いた初代星状細胞の処理がコレステロールおよび脂肪酸生合成の著しい阻害(約80%)をもたらした際(図22a)に、本発明者は同じことを観測した。AICARを用いた星状細胞の処理がACCのリン酸化も誘導したこと(図22b)は、AICARがAMPK活性を誘導したことを実証するものである。AMPKはAMPによりアロステリックに活性化されるだけでなく、上流のキナーゼAMP活性化プロテインキナーゼキナーゼ(AMPKK)の標的でもあり、AMPKKによるAMPKのリン酸化はその完全な活性化に必要である(Moore et al., 1991; Hawley et al., 1996; Hardie et al., 1998; Stein et al., 2000)。AICAR処理した星状細胞におけるAMPKのリン酸化は、AICARがAMPK活性を誘導(ACCのリン酸化を誘導)しただけでなく、(AMPKのリン酸化を誘導する)上流のキナーゼ(AMPKK)活性を誘導したことも明らかに示している(図22b)。AICARを用いた星状細胞の処理はAMPKおよびACCのリン酸化を誘導し(図23b)、これは5-ヨードツベルシジンおよびIC51、つまりAICARからのZMP (AICARの5'-リン酸化型)の形成を阻止するアデノシンキナーゼ(ADK)阻害剤によって阻止された。ZMPはAMP、ADPおよびATPのレベルを変化させることなくAMPKのアロステリック活性化におけるAMPの効果を模倣する(Corton et al., 1995)。ADK阻害剤はAICARによるAMPKのリン酸化を阻止することができ(図22b)、LPSによるiNOSタンパク質の発現に対するAICARの阻害効果を逆転させることができる(図22c)。
【０１５２】
iNOS発現を調節する際のAMPKの役割をさらに解明するため、本発明者はAMPKの触媒サブユニット(AMPKα1およびα2)をコードするmRNAの翻訳開始部位近くの配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを利用した(Culmsee et al., 2001)。初代星状細胞に25 μMのホスホチオエート(phosphothiorated)アンチセンス(AS)をトランスフェクションすることによって、触媒サブユニットAMPKα1が減少したが、ミスセンス(MS)では効果がなかった[図22d (i)]。次に、本発明者はLPSを介したiNOS遺伝子発現に対するAMPKα2サブユニット・アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べた。AMPKα2サブユニット・アンチセンス処理のみではiNOSの発現に何ら効果がなかったが、その処理は、初代星状細胞においてLPSを介したiNOSタンパク質の発現を顕著に誘導した[図22d (ii)]。これらの実験は炎症反応の調節にAMPKが関与することの明らかな証拠になる。炎症過程におけるAMPKの直接的な役割を規定するためにおよびこの機能におけるAMPKの分子機構/経路を解明するために、小膠細胞系(BV2)を利用した。マウス初代小膠細胞由来のこの細胞系は、トランスフェクションが容易であり、LPSに応答して炎症誘発性のサイトカインおよびメディエータを産生する(Kim et al,, 2002; Su et al., 2003)。一過性トランスフェクション試験では、BV2細胞系においてLPSはiNOS-luc活性を著しく(約4倍)誘導し、AICARの前処理は用量依存的にルシフェラーゼ活性を減少させた(図22e)。コトランスフェクション実験では、本発明者はiNOSプロモーター活性に対するドミナントネガティブ(DN)なAMPKα2 (D157A) (Stein et al., 2000)の発現の効果を調べた。DN AMPKα2はLPSによるiNOS-luc活性の顕著な増加をもたらしただけでなく、AICARによるiNOS-luc活性の阻害も顕著に逆転させた(図22e)。これらの実験は脳グリア細胞におけるAMPKと炎症性メディエータの発現との間の相関関係を明らかに示している。
【０１５３】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(ERK1/2、p38およびJNK1/2)は、炎症誘発性メディエータの発現において調節的役割を果たすことが知られている(Arbabi and Maier, 2002)。したがって、ラット初代星状細胞においてLPSを介したERK1/2、JNK1/2およびp38 MAPKの活性化に対するAICARの効果を詳しく調べた。立証されているMAPKの役割と合致し、LPSは3種全てのMAPKのリン酸化を誘導したのに対し、AICARはLPSを介したこれらのキナーゼのリン酸化を40%〜60%阻害した(図23)。AICARのみではこれらのMAPキナーゼのリン酸化に効果がなかった。
【０１５４】
AICARによるLPS誘導性のNF-κBおよびC/EBPの核移行の阻害による炎症反応の減弱
AICARを介した炎症過程の下方制御の機構を理解するため、本発明者はLPSを介したNF-κB活性化に対するAICARの効果を詳しく調べた。刺激されていない細胞では、NF-κBはp65/p50ヘテロ二量体からなり、IκBとのその結合によって細胞質中に保持される。さまざまな作用物質による細胞の刺激後、細胞質NF-κB/IκB複合体が解離し、遊離NF-κBが核に移行し、さまざまな遺伝子の転写を調節する。上流のキナーゼIKKによるIκBαのリン酸化が、NF-κBからのIκBαの解離およびその分解には不可欠である(Ghosh and Karin, 2002)。NF-κBの活性化が、iNOSおよび炎症誘発性サイトカイン(TNFαおよびIL-6)の発現には極めて重要であることが示されている(Zagariya et al., 1998; Zhang et al., 1998; Hu et al., 2000)。AICARの役割を初代星状細胞でのLPSを介したNF-κBの活性化で詳しく調べた。図24aに示されるように、LPS処理によって30分以内にNF-κBは活性化して核内に移行し、これが処理から3時間後まで持続する。AICARによる前処理はLPS誘導性のNF-κB DNA結合活性を有意に低下させた(図24a)。NF-κB依存的な転写レポーター(3×NF-κB-luc)を、ドミナントネガティブなAMPKをコードする発現ベクターとともにBV2細胞にコトランスフェクトすることにより、NF-κB転写活性の調節におけるAMPKの役割の可能性を詳しく調べた。図24bに描かれているように、AICARの前処理によってLPS誘導性のNF-κB-Luc活性が有意に阻害された。ドミナントネガティブなAMPKα2はLPS誘導性のNF-κB-Luc活性に効果がなかったが、しかしそれはAICAR誘導性の阻害を顕著に逆転させた(図24b)。LPSを介したNF-κB核移行におけるAICAR誘導性の阻害は、p65およびp50 (NF-κBファミリーのメンバー)に対する核抽出物の免疫ブロット解析の結果と一致していた(図24c)。さらに、これらの結論はAICAR処理によるIκBαの分解の阻害によってさらに支持される(図24d)。
【０１５５】
これに加えて、小膠細胞(BV2)にiNOS-luci (-234/+31)ベクター、つまりNF-κBの活性化に厳密に依存する構築体をトランスフェクトした。図24eが示すように、AICARはLPS処理によって誘導されたルシフェラーゼ活性を完全に無効とした。興味深いことに、κ-luci中で欠失されたNOS-2プロモーターの断片の使用によって、プロモーターの活性は完全に無効となり、すなわちLPS刺激に応じたレポーター遺伝子の発現にこのモチーフが必要であること(図24e)やAICARはNF-κB経路を下方制御することによってその効果を媒介することを反映するものであった。
【０１５６】
IκBαはそのユビキチン依存的な分解を誘発する部位で、触媒サブユニット(IKKα&β)とIKKγまたはNEMO調節サブユニットとを含むIKK複合体によってリン酸化される(Ghosh and Karin, 2002)。IKKα/βがAICAR作用の標的になりうるかどうかを確認するため、星状細胞をAICAR (1 mM)とプレインキュベートし、その後LPS処理を行った。図25aに示されているとおり、LPSはIKKα/β活性を刺激し、この刺激はAICAR処理によって顕著に阻止された。これらの観測結果を確認するため、本発明者は、野生型IKKβ発現ベクターをNF-κB-Lucとともに小膠細胞(BV2)および初代星状細胞にコトランスフェクトした。AICAR処理はBV2細胞および初代星状細胞において、IKKβを介したNF-κB-Luc活性を顕著に阻害した(図25bおよびc)。これらの観測結果は、AICARがある未知のIKK上流分子を阻害することでNF-κB DNA結合およびその転写活性を阻害することを明らかに示している。
【０１５７】
NF-κBのほかに、C/EBP結合モチーフがIL-6、IL-1β、TNFα、IL-8、IL-12、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、iNOS、リゾチーム、ミエロペルオキシダーゼ、好中球エラスターゼおよび顆粒球マクロファージ受容体などの、さまざまな炎症誘発性遺伝子の機能的な調節領域中に同定されている(Poli, 1998)。それ故に、LPSおよび/またはAICARを用いて処理した初代星状細胞において、C/EBP DNA結合活性を異なる時間周期(0.5時間から3時間まで異なる)でEMSAにより調べた。LPSはC/EBPの核移行を誘導し、AICARはLPS誘導性のC/EBP DNA結合活性を無効としたのに対し、AICARのみではC/EBPの核移行に効果がなかった(図26a)。さらに、C/EBP複合体に関与するC/EBPタンパク質を同定するため、C/EBP-α、-β、-δおよび-εに特異的な抗体を使ったスーパーシフトアッセイを行った。C/EBP-βおよび-δに特異的なIgGのみがC/EBP複合体を顕著にスーパーシフトさせた(図26b)。LPSおよびLPS/AICAR処理した初代星状細胞の核抽出物の免疫ブロットによって、C/EBP-βおよび-δの核移行を調べた。C/EBP-βは未処理細胞の核内に恒常的に発現し局在化しており、そのレベルはLPSおよび/またはAICARによって調節されなかった(図26c)。その一方で、高レベルのC/EBP-δが未処理細胞に比べてLPS処理細胞の核抽出物中で観測され、C/EBP-δの移行はAICAR処理によって完全に阻害された(図26c)。ラット初代星状細胞においてAICARがC/EBP δの核への移行またはその発現を阻害するかどうかを調べることが関心の対象になった。このため、本発明者はLPSおよびAICARを用いて処理した初代星状細胞におけるC/EBP-δの発現を調べた。LPSはC/EBP-δのmRNA発現を誘導し、AICARはLPSを介したC/EBP-δ発現を弱めた(図26d)。C/EBPはグリア細胞においてiNOS遺伝子発現の調節で重大な役割を果たすことを実証するため、本発明者は-150から-142のC/EBPボックスを欠くiNOS2プロモーター(iNOS-C/EBPdel-luc)を利用した。iNOS-lucをトランスフェクトしLPSを用いて処理した小膠(BV2)細胞は、正規化されたルシフェラーゼ活性の著しい増加を示し、AICAR処理はこのルシフェラーゼ活性を完全に無効とした(図26e)。対照的に、iNOS-C/EBPdel-lucをトランスフェクトした細胞は、LPS刺激後、正規化されたルシフェラーゼ活性のわずかな増加をもたらした(図26e)。これらの結果から、LPSに応じたiNOS遺伝子発現の調節におけるC/EBPの役割が示唆された。総合すれば、これらの観測結果は、AICARがC/EBP δの発現を下方制御することによりLPS誘導性のC/EBP核移行を阻害したことを実証するものである。
【０１５８】
AICARによるLPS処置ラットにおける炎症誘発性サイトカインおよびナイトライトの生成の阻害
AICARは培養細胞において(NF-κBおよびC/EBPの核移行を阻害することにより)抗炎症性を示したので、AICARのインビボでの同一効果を調べることがさらなる関心の対象になった。TNFα、IL-1βおよびIFN-γなどの、炎症誘発性サイトカインの発現はインビボのLPS腹腔内注射により誘導されることは十分に立証されている(Hesse et al., 1988)。それ故に、本発明者はLPS注射ラットにおいて血清中サイトカインレベルに対するAICARの効果を調べた。TNFα、IL-1βおよびIFN-γのレベルをLPS注射から6時間後の血清中で測定した。図27aに示されるように、LPSは炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-1βおよびIFN-γ)を効果的に誘導したのに対し、AICARによる前処理はLPSを介して増加した血清中IL-1βおよびIFN-γのレベルをほとんど無効にした。しかしながら、それはTNFαのレベルには効果がなかった。AICAR処理は同様に、これらの動物から単離された腹腔マクロファージにおけるLPS誘導性のiNOSの発現を顕著に阻害した(図27b)。さらに、本発明者は遺伝子アレイ解析により、脾臓においてこれらのサイトカインの発現に対するAICARの効果を調べた。血清中での観測結果と同様に、LPSの腹腔内注射は、脾臓においてTNFα、IL-1βおよびIFN-γの伝達暗号の発現を顕著に誘導した(図27c)。脾臓において、IL-1βおよびIFN-γのmRNA発現はAICARによって著しく低下したが、TNFαの発現に有意な変化は観測されなかった(図27c)。生理食塩水もAICARのみもこれらのサイトカインに対して検出可能なシグナルを誘導しなかった。
【０１５９】
末梢性免疫攻撃または末梢性炎症のモデルは脳内で炎症誘発性サイトカインの発現を誘導することが示されており(Pitossi et al., 1997)、したがって、本発明者はAICARを用いて処置したまたは処置していないLPS注射ラットの大脳皮質におけるTNFα、IL-1βおよびiNOSの発現を調べた。LPSは大脳皮質におけるTNFα、IL-1βおよびiNOSの発現を誘導したが、AICAR処置はこれらの分子の発現を顕著に低下させた(図27d)。これらの所見は、培養グリア細胞と同様に、AICARが動物モデルにおいて炎症誘発性分子(TNFαを除く)の発現を減弱させる際にも効果的であったことを実証するものである(図27)。
【０１６０】
実施例9
考察III
AMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)はもともと、アセチル-CoA-カルボキシラーゼ(脂肪酸合成)およびHMG CoA還元酵素(イソプレノイドおよびコレステロール生合成)などの、生合成経路に関与する重要な酵素をリン酸化し阻害するその能力によって同定された(Moore et al., 1991; Vincent et al., 1991; Hardie and Carling, 1997; Hardie et al., 1998; Winder and Hardie, 1999)。最近になって、コレステロール代謝産物は炎症過程を減弱することが報告されたので(Pahan et al., 1997; Kwak et al., 2000)、本発明者は培養細胞においておよびLPS注射動物において炎症過程の誘導におけるAMPKの役割の可能性を調べた。本明細書に示されたいくつかの証拠は、AICARによるAMPKの活性化がNF-κBおよびC/EBP転写因子の核移行を阻害することにより、ラット初代星状細胞、小膠細胞および腹腔マクロファージにおいてLPSを介した炎症誘発性サイトカイン、iNOSおよび一酸化窒素(NO)生成の誘導を下方制御するという結論を明らかに指示するものであり、したがってAMPKが炎症性メディエータの発現の調節に関与することを実証するものである。本研究は同様に、炎症性疾患にAICARまたはAMPKの他の薬理的活性化因子を治療的に使用することを示唆する。AICARは組織培養およびLPS注射ラットのCNSにおいて炎症誘発性サイトカインを阻害するが、しかしそれがLPS誘導性の血清中TNFαレベルに影響を与えなかった理由は、現時点では説明することができない。
【０１６１】
AICARはAMPKのリン酸化および活性化ならびにACCおよびHMG-CoA還元酵素の阻害を誘導したことから、AMPKおよびその上流のキナーゼ(AMPKK)の活性化を示唆している。スタチンなどのHMG-CoA還元酵素阻害剤は、免疫調節性および抗炎症性であることが報告されている(Pahan et al., 1997; Kwak et al., 2000)。しかしながら、本発明者は、AICAR/AMPKの作用の機構がメバロン酸経路を介していないことを見つけた。メバロネートおよびその他の代謝産物の添加によっては、LPS誘導性のNO生成に対するAICARの阻害効果が逆転しなかったからである。MAPKはTNFα、IL-1β、IL-6、IL-8、COX-2およびiNOSなどの炎症誘発性分子の発現において重要な役割を果たすことが知られているので(Arbabi and Maier, 2002)、AICARによって観測された、LPSによるMAPK 3種(ERK1/2、p38およびJNK1/2)全ての活性化の阻害はこれらのシグナル伝達経路の調節におけるAMPKの役割を示唆するものである。AMPKはRaf-1 Ser621のリン酸化により、内皮成長因子(EGF)およびインスリン成長因子(IGF)を介したERK経路を調節することが報告されている(Sprenkle et al., 1997; Kim et al., 2001)。本発明者の観測結果とは対照的に、ラット肝由来の形質転換されていない細胞系において、p38 MAPKの活性はAMPKにより活性化されることが示されている(Xi et al., 2001)。これはAMPKの細胞特異的な機能の1つであるかもしれない。
【０１６２】
本発明者の実験条件では、AMPKを活性化するAICARの特異性は、次のようないくつかの実験によって立証される: i) AMPKα2のドミナントネガティブ型はAICARによるiNOS-およびNF-κB-ルシフェラーゼ活性の阻害を反転させた。ii) アデノシンキナーゼの阻害剤(5'-ヨードツベルシジンおよびIC51)は、iNOSタンパク質の発現に対するAICAR誘導性の阻害を逆転させることができるだけでなく、AICARによるAMPKおよびACCのリン酸化も阻害した。iii) アンチセンスオリゴヌクレオチドによるAMPKの触媒サブユニットの下方制御により、初代星状細胞においてiNOSタンパク質レベルの発現が誘導された。最近になって、AMPKα2ノックアウトマウスが報告されており(Viollet et al., 2003)、そのマウスにおけるこれらの研究によって、炎症誘発性サイトカインの調節におけるAMPKの役割が確実に明らかにされるばずである。
【０１６３】
AMPKが転写調節複合体の成分であるという可能性は、まだ調べられていない。最近になって、p300、つまり転写補助活性化因子がインビボでおよびインビトロでAMPKの基質であることが報告されており、リン酸化によって、PPARγ、甲状腺受容体、RARおよびRXRなどのその他の核受容体とのその相互作用が劇的に低下した(Yang et al., 2001)。本発明者らの研究により、AMPKがNF-κBおよびC/EBPの転写活性を調節することが明らかに示された。AMPKの活性化はLPS誘導性のIKKα/β活性およびIκBαのリン酸化/分解を阻害することにより、NF-κBの核移行および転写活性を阻害することから、AMPKがIKKの上流のNF-κB経路を標的にすることが示唆される。その一方で、AICARは初代星状細胞においてC/EBPの核移行を阻害しただけではなく、LPSによるC/EBP-δの発現を下方制御した。C/EBPはTNFα、IL-1β、IL-6、iNOS、IL-8、IL-12およびGM-CSFの発現を調節することが知られている(Poli, 1998)ので、これらの観測結果は、C/EBP経路を炎症性疾患に対する治療法の有力候補の1つと同定するものである。
【０１６４】
炎症誘発性サイトカイン(TNFα、IL-1βおよびIL-6)およびNOは脱髄性および神経変性疾患の発症に関与している(Benveniste, 1997; Smith et al., 1999; Torreilles et al., 1999; Bauer et al., 2001)ので、本発明者の結果は、AMPKの活性化因子が神経損傷を阻止できるまたは改善できる潜在的に重要な機構を供与する。AMPKは、触媒αサブユニットならびに非触媒βおよびγサブユニットからなるヘテロ三量体プロテインキナーゼである(Hardie and Carling, 1997; Hardie et al., 1998; Winder and Hardie, 1999)。各サブユニットに対し、α1またはα2、β1またはβ2およびγ1、γ2またはγ3と名付けられた異なるイソ型が存在することが報告されている(Kemp et al., 1999)。AMPKに対する免疫染色によって、脳内のα2 AMPKサブユニットの発現が主に、ニューロンと白質星状細胞に限られることが実証された(Turnley et al., 1999)。通常、ほとんどの星状細胞は低レベルのAMPKを発現するが、しかし反応性神経膠症の間のような、代謝活性の増加があるとき、その発現(主にα2およびβ2)は増加し(Turnley et al., 1999)、その場合に星状細胞は肥大化し、損傷部位に遊走し、さまざまなサイトカインや増殖因子を放出する。反応性星状細胞で観測された一層高いAMPKの発現や核内におけるAMPKイソ型の共局在性の同定から、AMPKはエネルギー代謝の調節に加えて、その他の機能も持ちうることが示唆される(Salt et al., 1998; Turnley et al., 1999)。これらの所見は、本研究で報告された炎症過程におけるAMPKの役割と一致する。AMPKはニューロンにおけるグルコース欠乏の間に保護機能を有することが最近報告されており(Culmsee et al., 2001)、アポトーシスおよびネクローシスから星状細胞(Blazquez et al., 2001)および胸腺細胞(Stefanelli et al., 1998)を保護することが示されている。最近になって、神経変性およびAPPL/APPプロセッシングにおけるAMPKの新たな機能がショウジョウバエ(Drosophila)で実証されており、その機能はHMG-CoA還元酵素およびコレステロールエステルを通じて媒介されうるものと思われる(Tschape et al., 2002)。これら全ての観測は、CNSにおけるAMPKの重大な役割を示唆しており、本発明者の研究を支持している。このことは、AMPKが抗炎症分子として重要な役割を果たし、AICARなどの抗炎症薬に対する標的分子として利用可能であることを強く示唆している。さらに、AICARはレッシュ・ナイハン症候群を治療するための薬物として、比較的高用量(100 mg/kg体重)で、安全かつ何の副作用もなく以前に使用されている(Page et al., 1994)。健常人においてAICAR 10mg/kg〜100mg/kgの静脈内投与の安全性、許容性および薬物動態が以前に報告されている(Dixon et al., 1991)。AICARは高いクリアランスを有し、経口投与による生物学的利用性が低い。
【０１６５】
要約すると、本明細書に記述される研究は、炎症性疾患におけるAMPKの新たな役割を立証するものである。AMPKは多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中およびその他の神経変性疾患のような炎症性の症状における神経保護薬に対する興味深い標的でありうる。
【０１６６】
実施例10
炎症性疾患に対する治療法としてのスタチン
本実施例は、とりわけ、スタチンを利用して炎症性疾患を治療できるまたは予防できることを示すデータを提供する。例えば、表1は、ロバスタチンとFPP脱炭酸酵素の阻害剤(例えば、NaPA)の組合せがラット初代星状細胞、小膠細胞、およびマクロファージにおいてLPSによる一酸化窒素、TNF-α、IL-1β、およびIL-6の生成を阻害することを示す。
【０１６７】
【表１】
2007516294.tif 000013
*無血清条件において10 μMロバスタチンまたは5 mM NaPAと8時間プレインキュベートした細胞を1.0 μg/mlのLPSにより刺激した。24時間のインキュベーション後、NO、TNF-α、IL-1βおよびIL-6の濃度を前述のとおり、上清中で測定した。NOはnmol/24時間/mgタンパク質として表されており、一方でTNF-α、IL-1βおよびIL-6はng/24時間/mgタンパク質として表されている。データは3回の別実験の平均+/-SDとして表されている。
【０１６８】
図28〜図52は多発性硬化症、脊髄損傷、脳卒中、およびキナ酸誘導発作などの種々の炎症性疾患を治療する際のスタチンの有効性を示すさらなるデータを提供する。さらに、表2はスタチンによる多発性硬化症(MS)の治療に関するデータをその他2種の認可されているMS薬との比較として提供する。使用した公知の薬物はIFN-βおよび酢酸ガラティラメル(GA)であり、その効果を脳卒中モデルにおいてスタチン+GSNOの組合せと比較した。
【０１６９】
【表２】
2007516294.tif 000014
【０１７０】
脊髄損傷に関して、好ましいモデルはsprague-dawley系ラットである。6 cmの高さから5 gmのおもりを落下させることで損傷を誘発して、およそ30 g/cforceの治療上適切な損傷をもたらす。評価する損傷および回復の程度は、21ポイントの血液脳関門の神経学的スコアにより行った。その後、脊髄を抽出し、免疫細胞化学およびmRNA、タンパク質の発現を目的に処理する。その次に、実験のセットアップは次のように記述することができる。
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投与経路はD-PDMPの場合には腹腔内(IP)およびアトルバスタチンの場合には胃管補給とした。損傷から1時間、4時間、24時間、48時間、および1週間後に、脊髄組織を動物から抽出した。神経学的スコアリングを目的に、損傷した動物を15日間観察した。図39〜図42はラットでの脊髄損傷に対するアトルバスタチンの効果に関するデータを含む。
【０１７１】
本明細書において開示されるおよび特許請求される組成物および/または方法および/または装置は全て、本開示に照らして過度な実験なしに作製し実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい態様に関して記述してきたが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、さまざまな変形を本明細書に記述される組成物および/または方法および/または装置にならびに方法の段階においてまたはその段階の順序において適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の作用物質を本明細書に記述される作用物質に換えて用いることができ、その上同様のまたは類似の結果を達成できることが明らかであろう。当業者には明らかなそのような全ての類似の置換および変更は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
【０１７２】
参考文献
以下の参考文献は、これらが本明細書に記述されているものを補足する典型的な実施詳細またはその他の詳細となる程度に、参照により具体的に本明細書に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０１７３】
以下の図は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明のある種の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書に示される特定の態様の詳細な説明とともにこれらの図の1つまたは複数を参照することにより、いっそう理解されるものと思われる。
【０１７４】
【図１】（図１Ａ〜１Ｄ）スフィンゴ糖脂質は初代星状細胞においてLPS誘導iNOS遺伝子発現およびNO生成を調節する。D-PDMP (10、25および50 μM)のNO生成(A)、ならびにiNOS mRNAおよびiNOSタンパク質発現(B)の誘導に対する効果を、LPS/IFNγ (1 μg/ml；10 U/ml)処理の6時間後(iNOS mRNAレベルの場合)および24時間後(iNOSタンパク質およびNOレベルの場合)に調べた。細胞にはLPS/IFNγ処理前に0.5時間D-PDMP前処理を行った。星状細胞におけるLacCerのiNOS遺伝子発現阻害を介在するD-PDMPへの影響も検討した。細胞にはD-PDMP (50 μM)および／またはLacCer(5および10 μM)でLPS/IFNγ刺激の前に0.5時間前処理を行った。LPS/IFNγ刺激の6時間後および24時間後に、NO生成(C)ならびにiNOS mRNAおよびiNOSタンパク質レベルのそれぞれを定量した(D)。ナイトライトレベルは全タンパク質量を用いて標準化した。mRNAレベルの内部標準として、GAPDHレベルを用いた。mRNAおよびタンパク質ならびにNOの測定方法は材料と方法の項に記述した。データは3つの独立した実験の±S.Dの形で表した。(AおよびC)における***p＜.001は非刺激対照との比較；(A)における% p＜.01および# p＜.001はLPS/IFNγ刺激細胞との比較である。(B)における# p＜.001はLPS/IFNγ刺激細胞との比較；(B)における＠，% p＜.001はD-PDMP処理細胞との比較である。
【図２】（図２Ａ〜２Ｅ）スフィンゴ糖脂質代謝経路のさまざまな代謝物が、D-PDMPを介したLPS誘導性のiNOS遺伝子発現の阻害に与える効果。初代星状細胞には、LPS/IFNγ刺激の前に、D-PDMPおよび/またはGlucer(A)、GalCer(B)、GM1(C)、GM3(D)およびGD3(E)を用いて、全てそれぞれ5および10 μM濃度で0.5時間前処理した。NO生成を、図1の説明で述べたように、LPS/IFNγ刺激後24時間でアッセイした。
【図３】（３Ａ〜３Ｄ）細胞内LacCer生合成に対するLPS/IFNγ刺激の効果。初代星状細胞を、一晩、14Cガラクトースで処理し、過剰な量をPBSで洗い流した。LPS/IFNγ刺激0.5時間前のD-PDMP前処理時に、細胞を図に示した時点で採取し、材料と方法で述べた通りに、HPTLCを用いてLacCerを分析した(A)。LacCer量は全タンパク質量を用いて標準化した。ラクトシルセラミド合成酵素(GalT-2)の酵素活性は、(B)に示したように、さまざまな時間LPS/IFNγで刺激した細胞に由来する細胞溶解液を用いてインビトロでアッセイした。この酵素アッセイ法については材料と方法に記述している。酵素活性は全タンパク質量で標準化した。GalT-2発現をノックダウンするために、GalT-2アンチセンスDNAオリゴマーまたはそのスクランブル配列のDNAオリゴマーを用いて、材料と方法で述べたように、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、細胞をLPS/IFNγで刺激し、NO生成(C)ならびにiNOSタンパク質およびiNOS mRNA レベル(D)を測定した。データは3つの独立した実験の±S.Dとして表した。(A)における***p＜.001および(B) における***p＜.001は非刺激対照との比較である。(C)における***p＜.001は刺激したがトランスフェクトしなかった細胞との比較；(C)における# p＜.001はLacCerを入れずにトランスフェクトした細胞との比較である。
【図４】（図４Ａ〜４Ｄ）LacCerはC6神経膠腫細胞においてLPS誘導性のiNOS遺伝子発現を調節する。細胞には、LPS刺激の0.5時間前に、異なる濃度でD-PDMPの投与量をふやして (10、25および50 μM)前処理を施した。LPS/IFNαによって誘導されるNO生成、iNOSタンパク質およびiNOS mRNAレベルはD-PDMP濃度の上昇で阻害された(A)。LacCerおよび D-PDMPの前処理は、6時間(iNOS mRNAレベルの場合)および24時間(NO生成およびiNOSタンパク質レベルの場合)で材料と方法に述べたとおりに調べたLPS誘導NO生成、iNOSタンパク質およびiNOS mRNAレベルのD-PDMPによる阻害を鈍化させる。しかしながら、GluCer前処理はLacCerと同様の効果を持たない(B)。データは3つの独立した実験の±S.Dとして表した。(A)における***p＜.001は非刺激対照との比較；(A)における# p＜.001は刺激した細胞との比較；(B) における&p＜.001は刺激細胞との比較であり、(B)における***p＜.001はD-PDMP処理細胞との比較である。外因性LacCerの添加はiNOS mRNAおよびiNOSタンパク質発現(D)と同様にNO生成により阻害が逆転した(C)のに対して、GluCerは影響を与えなかった。
【図５】（図５Ａ〜５Ｄ）LacCerを介したLPS誘導性のiNOS遺伝子発現の調節における低分子GTPase RasおよびERK1/2の関与。Ras活性化は、GST結合Raf-1 Ras結合ドメインを用いて、材料と方法で述べたとおりに調べた。Ras活性化のタイムコースはLPS/IFNγ刺激にしたがった(A)。LacCerおよび／またはD-PDMP (50μM)で前処理し、5分間LPS/IFNγ刺激した後細胞溶解液を活性化Rasレベルの測定に使用した。Ras活性は全タンパク質量用に標準化した。ウエスタンブロット法およびオートラジオグラフのデンシトメトリーで検出したGST-Raf1結合Rasを(B)に示した。LacCerによるiNOS発現に対するERK1/2の関与をMEK1/2阻害剤PD98059を用いて検討した。LPS刺激前にPD98059を用いて0.5時間前処理し、その後、刺激から24時間のNO生成ならびにiNOSタンパク質レベルを測定した(C)。20分間のLPS/IFNγ刺激に先立ちLacCerおよび／またはD-PDMPで細胞の前処理を行う際、細胞溶解液についても材料と方法に述べた通りに免疫ブロット法を用いて活性化されたERK1/2レベルを調べた(D)。
【図６】（図６Ａ〜６Ｃ）LPS/IFNαを介したNFκB活性およびiNOS遺伝子発現におけるLacCerの関与。κB-ルシフェラーゼを用い一過性にトランスフェクションした24時間後、LPS/IFNγ刺激に先立つ0.5時間前に、遺伝子導入細胞にD-PDMP前処理を行った。細胞のルシフェラーゼ活性は材料と方法に述べた通りに測定した。データは3つの独立した実験の±SDとして表した(A)。NF-κB DNA結合活性は、45分間のLPS/IFNα刺激に先立ってLacCerおよび／または増量したD-PDMPで0.5時間前処理した核抽出液10 μgを用いて、ゲルシフトアッセイで検出した(B)。細胞質抽出液は、抗リン酸IκB抗体を用いた免疫ブロット法によってリン酸化IκBレベルおよび全IκBレベルを検出するのに使用された(C)。
【図７】（図７Ａ〜７Ｂ）SCI後の損傷部位でのiNOS mRNAおよびiNOSタンパク質発現。iNOS mRNA(A)およびiNOSタンパク質レベル(B)は、シャム対照の賦形剤(VHC)処理ラットでの値より有意に大きかった。D-PDMP処理ラットでは、賦形剤処理ラットに比べて、mRNAおよびタンパク質発現が有意に低かった。データは±SDとして表した。(A)における***p＜.001はVHC処理シャム対照との比較； # p＜.001は12時間のVHC処理との比較である。
【図８】（図８Ａ〜８Ｌ）iNOS/GFAP共発現検出のための病変中心部脊髄の二重免疫蛍光染色。SCIラットから採取した脊髄切片の免疫蛍光顕微鏡画像は、材料と方法で述べたとおり、iNOS(緑)およびGFAP(赤)に対する抗体を用いて染色された。(A〜C)は賦形剤処理したシャム対照におけるGFAP(A)、iNOS(B)およびそれらの重ね合わせ(C)を示している。(D〜F)はVHC処理したSCIにおけるGFAP(D)、iNOS(E)およびそれらの重ね合わせ(F)を示している。(G〜I)はD-PDMP処理したシャムにおけるGFAP(G)、iNOS(H)およびそれらの重ね合わせ(I)を示している。(J〜L)はD-PDMP処理したSCIラットにおけるGFAP(J)、iNOS(K)およびそれらの重ね合わせ(L)を示している。
【図９】（図９Ａ〜９Ｌ）TUNEL陽性核およびニューロン核(NeuN)検出のための損傷部由来の脊髄切片の二重免疫蛍光染色。SCIラットから採取した脊髄切片の免疫蛍光画像は、TUNEL陽性細胞検出用に、材料と方法で述べたとおりAPOPTAG検出キットおよび神経特異的マーカーNeuNに対する抗体を用いて染色した。(A-C)は賦形剤処理したシャムにおけるNeuN (A)、TUNEL (B)およびそれらの重ね合わせ(C)を示している。(D-F)は賦形剤処理したSCIにおけるNeuN (D)、TUNEL (E)およびそれらの重ね合わせ(F)を示している。(G-H)はD-PDMP処理したシャムにおけるNeuN (G)、TUNEL (H)およびそれらの重ね合わせ(I)を示している。(J-L)はD-PDMP処理したSCIラットにおけるNeuN (J)、TUNEL (K)およびそれらの重ね合わせ(L)を示している。
【図１０】（図１０Ａ〜１０Ｈ）SCIラットの損傷部由来の脊髄切片の組織学的検査およびミエリン含有量検査。(A-D)は賦形剤処理したシャム(A)、SCI (B)、D-PDMP処理したシャム(C)およびSCI(D)の各ラットから採取した脊髄切片のH&E検査を示している。(E-H)は賦形剤処理したシャム(E)およびSCI(F) 、D-PDMP処理したシャム(G) およびSCI(H)におけるミエリン検出を目的としたLFB-PAS染色を示している。
【図１１】LacCerの介在した LPS/IFNα誘導iNOS遺伝子発現の制御モデルを示した図。
【図１２】（図１２Ａ〜１２Ｃ）各グループ2枚のTTC染色脳切片(頭側から尾側への6枚の連続切片の3枚目および4枚目) (A)、梗塞体積(B)および神経学的スコア(C)。24時間再灌流を行った時点の写真から、MCAO(20分)開始後にGSNOを投与することにより、梗塞、梗塞体積が減少し、神経学的評価スコアが改善することが示された。生理食塩水を投与した虚血脳切片では(賦形剤)、線条と皮質のいずれの両領域においても染色されない白色部として梗塞が示されていた。GSNO処理した脳切片では(GSNO)、染色性が大幅に改善され、このために梗塞および梗塞体積ははるかに小さいものであった(p＜0.0001)。神経学的評価スコアは材料と方法で述べた方法で記録した。GSNO処理により、評価スコアは2.7(賦形剤)から1.1に減少した(p＜0.0001)。これらの結果は7つの異なる実験(各グループn=7)からのものである。
【図１３】20分のMCAO後24時間再灌流を行った時点のラット脳の免疫組織学的顕微鏡画像。反応の増強(茶色のDAB染色)から、TNF-、IL-1およびiNOSは処理(GSNO)動物よりも未処理(賦形剤)動物でより高度に発現していた。TUNELアッセイでは、処理(GSNO)動物よりも未処理(賦形剤)動物において、細胞死が明らかであった。(倍率 400×)。
【図１４】（図１４Ａ〜１４Ｂ）20分のMCAO後24時間再灌流を行った時点のラット脳のウエスタンブロット。異なる3セットの実験から得られたウエスタンブロットは、未処理(賦形剤)動物の同側大脳半球にあるiNOS発現を示している。シャム操作した動物(シャム)および処理動物(GSNO)では、脳における明らかなiNOS発現はまったく見られなかった(A)。(B)は(A)で示された結果をグラフ化したものである。
【図１５】（図１５Ａ〜１５Ｆ）20分のMCAO後24時間再灌流を行った時点のラット脳の免疫組織学的顕微鏡画像。シャム操作した動物(シャム)は、マクロファージ/小膠細胞活性化のマーカーであるED1に対する染色性を持っていなかった(A)。ED1発現(茶色)は、未処理(賦形剤)動物において増強されていた(B)。GSNO処理(C)により、ED1発現は減少した。(倍率 400×)。GFAP染色では、賦形剤において、かなりの活性星状細胞の存在が示された(E)(緑色蛍光)。GSNO処理動物においては、活性星状細胞数は減少していた(F)。シャム動物においては活性化星状細胞の存在は認められなかった(D)。(倍率 400×)。
【図１６】（図１６Ａ〜１６Ｌ）20分のMCAO後24時間再灌流を行った時点のGFAPおよびED1 陽性細胞におけるiNOS発現ならびにTUNELとニューロンの共局在性。ペナンブラ切片におけるiNOS(B)およびGFAP(C) の免疫染色は、共局在し、黄色味を帯びている(A)。全てのGFAP陽性細胞がiNOSと共局在しないわけではなかった。同様に、同側ペナンブラからの切片におけるiNOS(E-H)およびED1(FおよびI)は共局在している(DおよびG)。合成画像において、共局在部位は黄色く現れている。ペナンブラ領域から作成した切片において、TUNEL陽性細胞(K)およびNSE(ニューロンマーカー)陽性細胞(L)は共局在している(J)。(倍率 (A-I)400×、ならびに(J)L 200×)。
【図１７】20分のMCAO後24時間再灌流を行った時点のラット脳におけるカスパーゼ-3活性。ラット脳ホモジネート細胞質分画のカスパーゼ-3活性は、材料と方法で述べたとおりに測定した。カスパーゼ-3活性は未処理(賦形剤)動物において、有意に上昇していた。処理動物(GSNO)では、シャム処理した動物(シャム)と同様の基本的活性を有していた。
【図１８】（図１８Ａ〜１８Ｄ）GSNOは初代星状細胞および小膠細胞系(BV2)内でのLPSまたはLPS/IFNγが介在するiNOS遺伝子発現を阻害する。初代ラット星状細胞および小膠細胞BV2を図示したとおりに異なる濃度のGSNOで30分間培養した後、24時間のLPS(1 mg/ml)またはLPS/IFNγ(1 mg/50 U/ml)処理を行った。免疫ブロット法によるiNOSタンパク質発現検出のために、星状細胞(A)またはBV2(C)から細胞溶解液を作製し、材料と方法に記述したとおりに、iNOS抗体を用いてiNOSバンドを検出した。ブロットは2つの異なる実験の代表例である。初代星状細胞(B) およびBV2(D)は、製造元の使用説明書にしたがい、リポフェクタミン2000(初代星状細胞の場合)またはリポフェクタミンプラス(BV2の場合)とともに1.5 μgのiNOS-ルシフェラーゼを一時的にトランスフェクトし、その後、図示したとおりのGSNO処置をLPSまたはLPS/IFNγとともに6時間行って刺激した。データは3つの異なる値の平均+SDである。
【図１９】（図１９Ａ〜１９Ｆ）GSNOは初代星状細胞および小膠細胞系(BV2)内でのLPSまたはLPS/IFNγが介在するNF-κB受容体活性を阻害する。(A)初代星状細胞および BV2(D)に、製造元の使用説明書にしたがって、リポフェクタミン2000(初代星状細胞の場合)またはリポフェクタミンプラス(BV2の場合)とともに1.5 μgのp(NF-κB)3LdLucを一時的にトランスフェクトし、その後、図のとおりのGSNO処理をLPSまたはLPS/IFNαとともに行い、4時間刺激した。データは3つの異なる値の平均+SDである。(B) 初代星状細胞およびBV2(E)には0.5 mgのp65およびp50ならびに0.1 mgのpCMV-β-gal/ウェルとともに1.5 μgのp(NF-κB)3LdLucを一時的にコトランスフェクトした。細胞の処理とルシフェラーゼ活性は前述の通りに行った。データは3つの異なる実験の平均±SDである。初代星状細胞(C)およびBV2(F)には0.5 mgのp65およびp50ならびに0.1 mgのpCMV-β-gal/ウェルとともに1.5 μgのiNOS-ルシフェラーゼを一時的にコトランスフェクトした。細胞の処理とルシフェラーゼ活性は前述の通りに行った。データは3つの実験の平均±SDである。すべてのコトランスフェクト実験において、全DNA量を一定に保持し(全量2.5 mg/ウェル)、全DNAの正規化にはpcDNA3(Invitrogen)を用いた。トランスフェクション効率の正規化のために、0.1 mgのpCMV-β-gal/ウェルを導入し、β-ガラクトシダーゼアッセイキット(Invitrogen)を用いてβ-ガラクトシダーゼ活性を検出した。
【図２０】（図２０Ａ〜２０Ｃ）AICARはLPS誘導サイトカイン合成を用量依存的に阻害する。初代ラット星状細胞(A)、初代小膠細胞(B)および腹腔内マクロファージ(C)を異なる濃度のAICARで説明どおりに2時間培養した後、24時間のLPS(1 μg/ml)処理を行った。本発明者らは、培地に放出されたTNFα(左)、IL-1β(中央)、およびIL-6(右)の濃度をELISAにより測定した。TNFαレベル測定の場合には、培地をLPS処理6時間で取り出したが、IL-1βおよびIL-6測定の場合には24時間で取り出した。データは4つの結果の平均±SDである。*p＜0.001はLPS処理との比較であり、# p＜0.001は対照との比較である。
【図２１】（図２１Ａ〜２１Ｅ）AICARは初代星状細胞、小膠細胞および腹腔内マクロファージ内のiNOS発現を阻害する。24時間のLPS/AICAR処理後の初代星状細胞、小膠細胞(A)および腹腔内マクロファージ(B)上清中のNOを測定した。データは4つの異なる実験結果の平均±SDである。*p＜0.001はLPS処理との比較；# p＜0.001は対照との比較である。AICAR処理に応じたiNOSタンパク質発現を免疫ブロット法で検出するために、24時間のLPS処理後に星状細胞から細胞溶解液を調製した(C)。ブロットは3つの異なる実験結果の代表である。iNOSの伝達暗号を検出するために、LPS処理後6時間で星状細胞からRNAを分離し、「材料と方法」に記述した方法どおりにノザンブロット解析を行った(D)。*p＜0.001はLPS処理との比較；# p＜0.001は対照との比較である。ブロットは3つの異なる実験を代表するものである。初代星状細胞に、1.5 μg/ウェルのiNOS-ルシフェラーゼ受容体ベクターとリポフェクタミン2000試薬を0.1 μg/ウェルのpCMV-β-galとともに用いて、一時的トランスフェクトを行った。24時間のトランスフェクション後、図示した濃度のAICARで2時間前処理し、その後、LPS(1 μg/ml)処理を4時間行った。細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性(Promega)およびβ-ガラクトシダーゼ(Invitrogen)測定に用いた。β-ガラクトシダーゼ活性に関してルシフェラーゼ活性を正規化し、対照の活性との比較で表した。データは3つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較であり、@ p＜0.001はLPS処理との比較である(e)。初代星状細胞には前述のとおりに一時的トランスフェクトを行い、細胞を図示したとおりにGGPP(10 μM)、FPP(10 μM)、メバロネート(10 mM) 、AICAR(1 mM)およびLPS(1 μgml-1)で処理し、ルシフェラーゼ活性を決定した(f)。結果は3つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較であり、# p＜0.001はLPS処理との比較であり、NSはLPS処理との比較で有意差なしのことであり、!p>0.05(有意差なし)はLPS/AICAR処理との比較である。
【図２２】AICARはグリア細胞内でのNO生成とiNOS遺伝子発現をAMPKの活性化を通して阻害する: 初代星状細胞には、AICAR(1 mM)を用いた2時間の前処理後、2時間の[14C]-アセテートパルス処理を行った。脂質を分離し、コレステロールに標識したアセテートを組み込み、脂肪酸をHP-TLCにより測定した(a)。データは3つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は未処理細胞との比較である。アデノシンキナーゼの阻害剤(5'-ヨードツベルシジンおよびIC-51、0.1 μM)をAICAR(1 mM)添加に先立って30分間前培養した。AICAR での2時間の培養後、「材料と方法」に記述した方法どおりに免疫ブロット法によりp-AMPKα(p-Thr172)、AMPKα、p-ACCおよびβアクチン(等負荷用)を検出するために、初代星状細胞を処理した(b)。p-AMPKαおよびAMPKαまたはp-ACCおよびβアクチンの比率を推定するために、デンシトメトリー解析を行った。ブロットは2つの異なる実験を代表した結果である。iNOSタンパク質発現は、LPS(1 μg/ml)とともにまたはLPSなしで、細胞を5'-ヨードツベルシジン/IC-51/ AICAR処理した後、星状細胞の24時間での細胞溶解液で決定した(c)。ブロットは2つの異なる実験結果の代表である。初代ラット星状細胞を、オリゴフェクタミン導入試薬とともにアンチセンスまたはミスセンスオリゴ(25 μM)で48時間培養し、免疫ブロット解析でAMPKαレベルを決定した(d-i)。細胞はLPS(1 μg/ml)で処理し、前述のように、免疫ブロットを用いてiNOS(ii)およびAMPKαタンパク質を検出するために溶解させた(d)。デンシトメトリー解析を行い、AMPKαまたはiNOSおよびβアクチンの比率を推定した。ブロットは2つの異なる実験を代表したものである。小膠細胞(BV2)には、前述のように、ドミナントネガティブAMPKα(DN)(0.5 μg/ml)の存在下または非存在下で、リポフェクタミンプラスをβ-galとともにiNOS-ルシフェラーゼと一緒に一時的にトランスフェクトした。pcDNA3空ベクターを使用してコトランスフェクション研究における全DNA量を正規化した。48時間のトランスフェクション後、図示どおりに細胞をAICAR(1 mM)およびLPS(1 μg/ml)処理し、LPS刺激6時間後にルシフェラーゼ活性を決定した(e)。β-ガラクトシダーゼ活性に関してルシフェラーゼ活性を正規化した。データは3つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較であり、# p＜0.001はLPS処理との比較であり、!p＜0.001はLPS/AICAR(0.5mM)処理との比較であり、@ p＜0.01はLPS/AICAR (1 mM) 処理との比較である。
【図２３】AICARは初代星状細胞内でのLPS誘導マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(ERK1/2、p38およびJNK1/2)を阻害する: 初代星状細胞を異なる濃度のAICAR(0.5から1 mM)で2時間培養した後、30分間のLPS処理(1 μg/ml)を行った。材料と方法の記述どおりに、細胞を冷PBCで洗い、溶解緩衝液中に剥離させた。50 gの全タンパク質をSDS-PAGEにのせ、その後、p42/44、JNK1/2およびp38に対する蛍光特異抗体を用いて免疫ブロット解析を行った。等負荷のために、同一のブロットを剥がして、p42/44、JNK1/2およびp38に対するpan抗体でリプローブした。ブロットは2つの異なる実験結果の代表データである。
【図２４】AICARは初代星状細胞およびBV2細胞においてLPSが誘導するNF-κB転写反応を阻害する。 LPS/AICAR処理した初代星状細胞から、図示のように、核抽出物を調製し、EMSAを用いてNF-κBを解析した(a)。EMSAデータは2つの異なる実験の代表である。小膠細胞(BV2)には、1.5 μgのp(NF-κB)3LdLucを0.5 μgのAMPKα2ドミナントネガティブまたはpcDNA3とともに一時的にコトランスフェクトし、その後、図示のように、AICAR(1 mM)およびLPS(b)で処理することにより4時間の刺激を与えた。ルシフェラーゼ活性は、β-ガラクトシダーゼ活性に関して正規化した。データは3つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較、# p＜0.001はLPS処理との比較、!p＜0.05はLPS/AICAR(0.5mM)処理との比較であり、@ p＜0.05はLPS/AICAR(1 mM)処理との比較、NSはLPS処理との比較で有意差なし、である。AICARの存在下または非存在下で 、LPSに刺激された初代星状細胞から作製した核抽出液においてp65およびp50に関する免疫ブロットを行った(c)。ブロットは2つの異なる実験の代表データである。図のとおりの時間間隔で免疫ブロットによってIKBαを検出するために、初代星状細胞の総細胞溶解液を作製した(d)。ブロットは2つの異なる実験の代表である。小膠細胞(BV2)には、1.5 μgのiNOS(-234/+31)-ルシフェラーゼまたはiNOS(-331/+31 NF-κB変異)-ルシフェラーゼで一時的にトランスフェクトを行い、その後、図のように、AICAR(1 mM)およびLPS(e)で4時間処理して刺激を与えた。β-ガラクトシダーゼ活性に関して、ルシフェラーゼ活性を正規化した。データは4つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較、# p＜0.001はLPS処理との比較、NSは対照との比較で有意差なしであり、@ p＜0.001はLPS処理(iNOS(-234/+31)-ルシフェラーゼトランスフェクト細胞)との比較である。
【図２５】AICARは初代星状細胞およびBV2細胞においてLPSが誘導するIKKα/β活性およびIKKβが介在するNF-κBルシフェラーゼ活性を阻害する: LPS処理(1 μgml-1)に先立って、初代星状細胞細胞をAICAR(1mM)で培養した。30分後、「材料と方法」に記述したとおりに、IKKα/β活性を測定した。デンシトメトリー解析を行い、任意単位として表した(a)。データは3つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較、# p＜0.001はLPS処理との比較である。小膠細胞(BV2) および初代星状細胞には、0.5 μgの HA-IKKβまたはpcDNA3および 0.1μgのpCMV-β-gal/ウェルとともに1.5 μgのp(NF-KB)3LdLucを一時的にコトランスフェクトした。ルシフェラーゼおよびβ-ガラクトシダーゼ活性について、前記と同様に行った(b & c)。データは3つの異なる実験の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較、# p＜0.001はLPS処理との比較、!p＜0.001はLPS処理およびIKKβトランスフェクト細胞との比較である。
【図２６】AICARはC/EBPのLPS誘導核移行をC/EBP-δ発現の下方制御によって阻害する。LPS/AICAR処理された初代星状細胞から、図示したように核抽出物を調製し、EMSAを用いてC/EBPを解析した(a)。EMSAデータは、2つの異なる実験の結果を代表するものである。LPS処理(3時間)を行った初代ラット星状細胞および32P標識したC/EBPオリゴマーから作製した核抽出物のスーパーシフト実験においては、C/EBP-α、-β、-δおよび-εに対する特異的ポリクローナルIgGを用いた。オートラジオグラムは、核抽出物のそれぞれ別の組織標本で行った2つの独立した実験結果を代表するものである(b)。さまざまな処理から調製された核抽出物を用いて、C/EBP-βおよび-δタンパク質に対する免疫ブロットを行った(c)。初代星状細胞を1 mM のAICARとともにまたはAICARを用いずに、LPS(1 μgml-1)で培養した。決められた時間でRNAを単離し、C/EBP-βおよび-δのノザンブロット解析を行った(d)。ブロットは2つの異なる実験結果を代表している。小膠細胞(BV2)には、1.5 μgのiNOS(-1486/+145)- ルシフェラーゼまたはiNOS-C/EBPdel-ルシフェラーゼで一時的トランスフェクトを行い、その後、図のようにAICAR(1 mM)およびLPSで4時間処理して刺激を与えた(e)。β-ガラクトシダーゼ活性に関してルシフェラーゼ活性を正規化した。データは4つの異なる値の平均±SDである。***p＜0.001は対照との比較、#p＜0.001はLPS処理との比較、*p＜0.05は対照との比較、@p＜0.05はLPS処理との比較、&p＜0.01はLPS処理(iNOS(-1486/+145)-ルシフェラーゼトランスフェクト細胞)との比較である。
【図２７】AICARはLPS注射ラットの血清および大脳皮質における炎症誘発性メディエータの発現を阻害する。LPS投与(0.5mg/kg)前の１時間、ラットに、AICAR(100mg/kg)とともにまたはAICARを用いずに、生理食塩水を腹腔内(i.p.)投与した。LPS注射後6時間で血液と臓器を採取した。血清中のNO(i)、TNFα(ii)、IFNγ(iii)およびIL-1β(iv) 濃度を、「材料と方法」に記述したとおりに、ELISAで測定した(a)。結果は６つの値の平均±SDである。*p＜0.001はLPS処理との比較、# p＜0.001は対照との比較、NSは有意差なし、を表している。6時間で単離された腹腔内マクロファージにおけるiNOSタンパク質を調べるために免疫ブロットを行った(b)。サイトカインの発現を調べるためには、被験ラットから脾臓を分離し、遺伝子アレイ(Superarray)用にTrizol試薬(Life Technologies)によって全RNAを分離した(c)。結果は2つの独立した実験を代表させたものである。被験ラットから大脳皮質を取り出し、全RNAを前出のように分離した。iNOS、TNFαおよびIL-1βの発現は、「材料と方法」に記述したとおりに、RT-PCRを用いて測定した(d)。ブロットは2つの異なる実験結果を代表している。
【図２８】神経炎症性疾患におけるさまざまなタイプの細胞(血管および脳細胞)とこれらの細胞から分泌される炎症メディエータとの関連を示す図。
【図２９】多発性硬化症治療剤としてのシンバスタチンの効能。データは臨床スコアの平均で表した: 0=正常、1=立毛、2=尾の緊張の消失、3=後肢麻痺、4=対麻痺、5=瀕死。
【図３０】（図３０Ａ〜３０Ｆ）ロバスタチンはEAEの臨床症状を阻害する。罹患動物の臨床スコアの平均を(A)、(C)および(E)に示し、体重測定結果を(B)、(D)および(F)に記述した。(A)能動性EAEは、SJL/J系マウスにおいて、CFAのミエリンPLP139-151ペプチドの免疫化により誘導された。(C)および(E)。受動性EAEは、ミエリン-PLP139-151感作T細胞のレシピエントSJL/J系マウスへの養子移植によって誘導された。(A)および(C)。マウス(1群当たり6匹)には、EAE誘導後0〜60日目から毎日、tまたは5 mg/kgのロバスタチンを腹腔内(i.p.)投与した; (E) 10日目からロバスタチン投与を開始した。(A)、(C)および(E) ロバスタチン投与マウスにおいては重症例の発生が有意に少なかった(p＜0.001)。(B)、(D)および(F)能動性および受動性EAE投与マウスの体重を隔週で測定した。データは一貫性のある結果を持った3つの独立した実験を代表するものである。
【図３１】（図３１Ａ〜３１Ｂ）養子移植によるEAEおよびロバスタチン処置を行ったSJL/J系マウス由来の脊髄組織切片の組織病理学。組織は腰部から採取し(1匹当たり6箇所)、10%緩衝ホルマリン液で固定した。組織をパラフィンに包埋し、厚さ5-μmで切片を作製した。(A)組織をH&Eで染色した。倍率×100で示している。(B)脊髄から採取した細胞を分離し、CD4+およびMHCクラスII細胞用に染色し、FACSで捕らえてCellQuestを用いて解析した。
【図３２】DAPI用の染色を施した浸潤細胞の統計解析。浸潤細胞の定量化により、EAE動物の脊髄において、対照およびロバスタチン投与(LN)動物のいずれよりも、有意に多数の単球/マクロファージならびにグリア細胞および炎症性細胞が存在することが示された。
【図３３】（図３３Ａ〜３３Ｉ）ラット腰部脊髄におけるED1およびIL-1β(A-C)、LFA-1(D-F)およびCD3(G-I)検出のための免疫蛍光画像。IL-1βおよびED1発現検出用のLewis系ラット脊髄切片(腰部)の二重免疫蛍光染色では、EAE動物において(B)、対照(A)または処置動物(C)に比べて、発現が増加していることが示された。EAE動物(B)のみにおいて、IL-1βおよびED1の共局在が黄色/オレンジ色として示されている。対照(A)および投与動物(C)の脊髄切片は共局在性を示していなかった。
【図３４】（図３４Ａ〜３４Ｉ）スタチンはマウスのCNSにおけるTNF-α、IFN-γおよびiNOS発現を阻害する。
【図３５】（図３５Ａ〜３５Ｊ）ロバスタチンによるTh2サイトカインの誘導。(A)、(C)、(E)、(G)、および(I) PLP139-151免疫化したSJL/J系マウスから10日目にDNL細胞を単離し、インビトロで、PLP139-151(5 μg/ml)およびロバスタチン(10および20 μM)存在下、細胞5×106 個/mlで培養した。(B)、(D)、(F)、(H)および(J) リンパ節から単離した未処置T細胞(98%精製)を抗-CD3および抗CD-28-プレコートプレートで細胞1×106 個/mlでロバスタチン(10および20 μM)とともに培養した。サイトカイン測定用に、上清を、48時間(IFN-γおよびTNF-αの場合)および120時間(IL-4、IL-5およびIL-10の場合)で採取した。(A-D) IFN-γおよびTNF-αは、PLP-刺激細胞および未処置T細胞のいずれにおいても有意に減少した(p＜0.0001)。(E-J) IL-10、IL-5およびIL-4は有意に増加した(p＜0.0001)。値は各ポイントでの3通りの方法の平均であり、エラーバーは+/-SDを表している。データは一貫性のある結果を持った4つの独立した実験結果の代表である。
【図３６】（図３６Ａ〜３６Ｆ）Th1およびTh2細胞におけるGATA-3およびT-bet発現にロバスタチンが及ぼす影響。GATA-3およびT-betは、インビボで、PLP139-151特異性細胞および未処置細胞において解析した。DLNは、10日目に、免疫化してロバスタチン処置したマウスから採取し、ウエスタンブロットでT-bet(A)およびGATA3(B)を解析した。PLP139-151特異性細胞はロバスタチン(10および20μM)で48時間培養した。(C)および(D) T-betおよびGATA3をウエスタンブロットで解析し、バンドを濃度計でスキャンニングして、任意単位をプロットした。未処置T細胞は、rmIL-12またはrmIL-4(10 ng/ml) およびロバスタチン(10および20 μM)存在下で抗-CD3およびCD-28を用いて48時間刺激した。細胞を回収して溶解し、タンパク質50 μgを分離し、膜上にブロットして、抗T-bet(E)および抗GATA3(F)で検出した。データは一貫性のある結果を持った3つの独立した実験結果の代表である。
【図３７】（図３７Ａ〜３７Ｄ）ロバスタチンは刺激を受けたT細胞内におけるNF-κβの核移行を阻害する。未処置T細胞(98%精製)を異なる濃度のロバスタチンで2時間前処理し、プレート結合性抗-CD3およびCD28(2 μg/ml)で4時間(NF-κβの場合)および30分(Iκβαの場合)刺激した。(A) NF-κβ発現をゲルシフトで解析した。(B)用量依存的なさらなる阻害が観察された(5μM〜50μM)。(C)核抽出物を作製し、TranSignalアレイを用いてNF-κβの核移行を解析した。(D)pIκβαおよびIκβαを決定するために、上述の方法で刺激したT細胞を回収し、pIκβαおよびIκβαの検出のために細胞質分画を用いた。バンドは濃度計でスキャンニングして、pIκβα/Iκβαの比をプロットした。データは一貫性のある結果を持った2つの独立した実験結果の代表である。
【図３８】（図３８Ａ〜３８Ｆ）Th1およびTh2細胞におけるGATA-3およびT-bet発現にロバスタチンが及ぼす影響。GATA-3およびT-betは、PLP139-151免疫化(100 μg/マウス)およびロバスタチン処理(2および5 mg/kg)したマウスにおいてインビボで、また、PLP139-151特異性細胞および未処置細胞においてインビトロで解析した。DLNは、免疫化およびロバスタチン処理したマウスから10日目に回収し、ウエスタンブロットでT-bet(A)およびGATA3(B)を解析した。PLP139-151特異性T細胞は、10および20 μMロバスタチンで48時間培養した。(C)および(D) T-betおよびGATA3をウエスタンブロットで解析し、バンドをデンシトメーターでスキャンニングして、任意単位をプロットした。未処置T細胞を、rmIL-12または rmIL-4(10 ng/ml)およびロバスタチン(10および20 μM)存在下で、抗-CD3およびCD28を用いて48時間刺激した。細胞を回収して溶解し、タンパク質50 μgを分離し、膜上にブロットして、抗T-bet(E)および抗GATA3(F)で検出した。データは一貫性のある結果を持った3つの独立した実験結果の代表である。
【図３９】脊髄損傷(SCI)動物の血液脳関門(BBB)運動スコアと挫傷後の日数との関連。表示は+/- SD (21は正常な運動を示している。動きが観察されなかったのは0である)。
【図４０】損傷脊髄に入る血管からの単球の浸潤をみるための免疫蛍光染色。
【図４１】反応性神経膠症検出のための免疫蛍光染色。
【図４２】シャム対照、未処置対照および処置モデルにおける希突起膠細胞のアポトーシスの結果。
【図４３】脳卒中モデル動物(大脳中央部の動脈閉塞)における抗酸化剤および抗炎症剤の治療的効果。
【図４４】脳卒中モデル動物(大脳中央部の動脈閉塞)における抗酸化剤および抗炎症剤の治療的効果。
【図４５】キナ酸誘導発作(てんかんモデル)に対する治療剤としてのスタチン使用に関する実験デザイン。
【図４６】ラット海馬におけるKA誘導ニューロン細胞死に対するアトルバスタチンの効果(クレシルバイオレット染色)。スタチンは海馬においてKAによって引き起こされる海馬細胞死を阻害した。ラットには、KA (10 mg/kg、i.p.)に先立って、アトルバスタチン(LP; 10 mg/kg)を経口的に前投与した(7日前)。KA注射の3日後、クレシルバイオレット染色を用いて海馬におけるニューロン細胞死を調べた。
【図４７】CA3領域におけるKA誘導ED-1発現に対するアトルバスタチンの効果。アトルバスタチンは海馬においてKAによって引き起こされるマクロファージの浸潤を阻害した。ラットには、KA (10 mg/kg、i.p.)に先立って、アトルバスタチン(LP; 10 mg/kg)を経口的に前投与した(7日前)。KA注射の3日後、海馬のCA1およびCA3領域におけるマクロファージの浸潤を、単核細胞のマーカーとして、ED-1に対する免疫蛍光標識を用いて調べた。
【図４８】（図４８Ａ〜４８Ｂ）ラット海馬におけるKA誘導CA1ニューロン細胞死に対するアトルバスタチンの効果(トンネル染色)。アトルバスタチンは海馬においてKA誘導によるアポトーシスを阻害した。ラットには、KA (10 mg/kg、i.p.)に先立って、アトルバスタチン(LP; 10 mg/kg)を経口的に前投与した(7日前)。KA注射の3日後、TUNNELアッセイを用いて、海馬のCA1(A)およびCA3(B)領域におけるニューロン細胞死を調べた。
【図４９】ラット海馬におけるKA誘導ニューロン細胞死に対するロバスタチンの効果(クレシルバイオレット染色)。ロバスタチンは海馬におけるニューロン細胞死を阻害した。ラットには、KA (10 mg/kg、i.p.)に先立って、ロバスタチン(Lov; 10 mg/kg)を経口的に前投与した(7日前)。KA注射の3日後、クレシルバイオレット染色を用いて海馬におけるニューロン細胞死を調べた。
【図５０】（図５０Ａ〜５０Ｃ）ラット海馬におけるKA誘導TNF-α、IL-1βおよびiNOS発現に対するアトルバスタチンの効果。アトルバスタチンは海馬においてKAによって引き起こされる炎症性遺伝子の発現を阻害した。ラットには、KA (10 mg/kg、i.p.)に先立って、アトルバスタチン(LP; 10 mg/kg)を経口的に前投与した(7日前)。KA注射の3日後、海馬における炎症性遺伝子(TNF-α、IL-1βおよびiNOS)の発現をリアルタイムPCRにより調べた。各遺伝子の発現はGAPDH発現を用いて正規化した。
【図５１】（図５１Ａ〜５１Ｃ）ラット海馬におけるKA誘導TNF-α、IL-1βおよびiNOS発現に対するロバスタチンの効果。ロバスタチンは海馬においてKAによって引き起こされる炎症性遺伝子の発現を阻害した。ラットには、KA (10 mg/kg、i.p.)に先立って、ロバスタチン(Lov; 10 mg/kg)を経口的に前投与した(7日前)。KA注射の3日後、海馬における炎症性遺伝子(TNF-α、IL-1βおよびiNOS)の発現をリアルタイムPCRにより調べた。各遺伝子の発現はGAPDH発現を用いて正規化した。
【図５２】（図５２Ａ〜５２Ｄ）ラットにおけるKA誘導発作に対するアトルバスタチン(LP)およびロバスタチン(lov)の効果。発作の指標: ステージ1、顔面クローヌス、; ステージ2、点頭発作; ステージ3、前肢クローヌス、; ステージ4、起立を伴う前肢クローヌス、; ステージ5、起立、ジャンピング、および転倒。ラットには、KA (10 mg/kg、i.p.)に先立って、ロバスタチンまたはアトルバスタチン(Lovまたは LP; 10 mg/kg)を経口的に前投与した(7日前)。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２１Ｆ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３０Ｅ】
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【図３０Ｆ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３５Ｅ】
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【図３５Ｆ】
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【図３５Ｇ】
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【図３５Ｈ】
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【図３５Ｉ】
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【図３５Ｊ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３６Ｆ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５２Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月24日(2006.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) グルタチオン供与体; および
(b) 5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A (HMG-CoA)還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)、またはそれらの誘導体
の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法。
【請求項２】
患者が予防または治療の必要があることを判定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
予防または治療の必要がある患者を判定する段階が、患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階を含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
患者が炎症性の疾患または症状を発症する危険性があるかどうかを判定する段階が家族歴または患者歴を取得する段階を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
グルタチオン供与体が薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項1〜4いずれか一項記載の方法。
【請求項６】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項1〜5いずれか一項記載の方法。
【請求項７】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する前に、投与する間に、または投与した後に、グルタチオン供与体を患者に投与する、請求項1〜6いずれか一項記載の方法。
【請求項８】
グルタチオン供与体を患者に投与する前に、投与する間に、または投与した後に、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する、請求項1〜6いずれか一項記載の方法。
【請求項９】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する前に、投与する間に、および投与した後に、グルタチオン供与体を患者に投与する、請求項1〜6いずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
グルタチオン供与体を患者に投与する前に、投与する間に、および投与した後に、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットを患者に投与する、請求項1〜6いずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
グルタチオン供与体がグルタチオンを含む分子である、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
グルタチオン供与体がグルタチオンの前駆体分子である、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
グルタチオン供与体およびAICARを患者に投与する、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
グルタチオン供与体およびHMG-CoA還元酵素阻害剤を患者に投与する、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
HMG-CoA還元酵素阻害剤がスタチンである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
グルタチオン供与体およびD-PDMPを患者に投与する、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
グルタチオン供与体およびミグラスタットを患者に投与する、請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
グルタチオン供与体、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、およびミグラスタットを患者に投与する、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
炎症性の疾患または症状が脳卒中、X-副腎白質ジストロフィー(X-ALD)、がん、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群、心筋炎、関節炎、自己免疫疾患、炎症性腸疾患、炎症性神経系疾患、炎症性肺疾患、炎症性眼疾患、慢性炎症性歯肉疾患、慢性炎症性関節疾患、皮膚疾患、骨疾患、心疾患、腎不全、慢性脱髄疾患、内皮細胞疾患、心臓血管疾患、肥満症、風邪、狼瘡、鎌状赤血球貧血、糖尿病、または神経変性疾患である、請求項1〜22いずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
炎症性の疾患または症状が糖尿病である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
炎症性の疾患または症状が脳卒中または神経変性疾患である、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ランドリーギランバレーストロール症候群、多発性硬化症、ウイルス性脳炎、後天性免疫不全症候群(AIDS)関連認知症、筋萎縮性側索硬化症、脳損傷、または脊髄疾患である、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
炎症性の疾患または症状を治療または予防するために使われる第二療法を施す段階をさらに含む、請求項1〜26いずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
グルタチオン供与体が薬学的に許容される組成物中に含まれる、請求項1〜27いずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される組成物中に含まれる、請求項1〜28いずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが別個の組成物中に含まれる、請求項1〜21および23〜29いずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが同じ組成物中に含まれる、請求項1〜21および23〜29いずれか一項記載の方法。
【請求項３２】
グルタチオン供与体がGSNOではない、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
(a) グルタチオン供与体; および
(b) 5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A (HMG-CoA)還元酵素阻害剤、D-トレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノールHCl (D-PDMP)、もしくは1,5-(ブチルイミノ)-1,5-ジデオキシ-D-グルシトール(ミグラスタット)、またはそれらの誘導体
を含む組成物。
【請求項３４】
薬学的に許容される組成物とさらに定義される、請求項33記載の組成物。
【請求項３５】
グルタチオン供与体およびAICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、またはミグラスタットが薬学的に許容される賦形剤中に製剤化される、請求項33または34いずれか一項記載の組成物。
【請求項３６】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項33〜35いずれか一項記載の組成物。
【請求項３７】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項36記載の組成物。
【請求項３８】
グルタチオン供与体およびAICARを含む、請求項33または34記載の組成物。
【請求項３９】
グルタチオン供与体およびHMG-CoA還元酵素阻害剤を含む、請求項33または34記載の組成物。
【請求項４０】
HMG-CoA還元酵素阻害剤がスタチンである、請求項39記載の組成物。
【請求項４１】
スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項41記載の組成物。
【請求項４３】
グルタチオン供与体およびD-PDMPを含む、請求項33または34記載の組成物。
【請求項４４】
グルタチオン供与体およびミグラスタットを含む、請求項33または34記載の組成物。
【請求項４５】
グルタチオン供与体、AICAR、HMG-CoA還元酵素阻害剤、D-PDMP、およびミグラスタットを含む、請求項33または34記載の組成物。
【請求項４６】
グルタチオン供与体がGSNOではない、請求項33記載の組成物。
【請求項４７】
グルタチオン供与体、5-アミノ4-イミダゾールカルボキサミドリボチド(AICAR)、スタチン、D-PDMP、もしくはミグラスタット、またはそれらの誘導体
の治療的有効量を患者に投与する段階を含む、患者において炎症性の疾患または症状を予防または治療する方法。
【請求項４８】
グルタチオン供与体およびスタチン、またはその誘導体を含む、薬学的に許容される組成物。
【請求項４９】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)、L-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項48記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５０】
グルタチオン供与体がS-ニトログルタチオン(GSNO)である、請求項49記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５１】
スタチンがアトルバスタチン、ロバスタチン、ロスバスタチン、フルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、またはセリバスタチンである、請求項50記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５２】
スタチンがアトルバスタチンである、請求項51記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５３】
グルタチオン供与体がL-2-オキソ-チアゾリジン4-カルボキシレート(プロシステイン)、N-アセチルシステイン(NAC)、またはN-アセチルグルタチオンである、請求項48記載の薬学的に許容される組成物。
【請求項５４】
グルタチオン供与体がGSNOではない、薬学的に許容される組成物。
【請求項５５】
請求項33〜46いずれか一項記載の組成物を患者に投与する段階を含む、患者において糖尿病を予防または治療する方法。
【請求項５６】
糖尿病が1型糖尿病である、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
請求項48〜54いずれか一項記載の組成物を患者に投与する段階を含む、患者において糖尿病を予防または治療する方法。
【請求項５８】
糖尿病が1型糖尿病である、請求項57記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007516294000001.app
【国際調査報告】
2007516294.tif 000169