(57)【要約】本発明は、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の、植物における発現を調節すること、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の植物における活性および／またはレベルを調節することによって、植物の成長特性を改変するための方法に関する。本発明はさらに、新規なＧＲＵＢＸタンパク質、およびこのようなタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、核酸をコードするＧＲＵＢＸを含む構築物、および、改変された成長特性を有するトランスジェニック植物であって、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の、改変された発現を有する植物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物の成長特性を改善するための方法であって、該方法は、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の、植物内における発現を増加する工程を包含し、そして／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の植物内における活性を増加する工程、および／またはレベルを増加する工程を包含し、そして必要に応じて、改善された成長特性を有する植物を選択する、方法。
【請求項２】
前記増加が、好ましくは、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子座における、遺伝的改変の導入により達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝的改変が、位置指定突然変異誘発、相同組換え、ＴＩＬＬＩＮＧ、およびＴ−ＤＮＡアクティベーションの内の１つによって達成される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
植物の成長特性を改善するための方法であって、該方法は、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする、単離された核酸配列を、植物内に導入する工程、および植物内で発現させる工程を包含する、方法。
【請求項５】
前記ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸が、植物内で過剰発現される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸が真核生物に由来する、好ましくは植物に由来する、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が双子葉植物に由来する、好ましくはナス科に由来する、より好ましくは、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が単子葉植物に由来する、好ましくはイネ科に由来する、より好ましくは、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａに由来する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記核酸は、配列番号１によって表されるか、または配列番号１の一部分であるか、またはそれとハイブリダイズし得る配列であるか、またはＧＲＵＢＸタンパク質をコードし、ここで、該ＧＲＵＢＸタンパク質は、配列番号２で表されるか、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントである、方法。
【請求項１０】
請求項４〜請求項９のいずれかに記載の方法であって、前記核酸配列および前記タンパク質が、以下：
（ｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体、またはスプライシング改変体によってコードされる、該ＧＲＵＢＸタンパク質；
（ｉｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の対立遺伝子改変体、または対立遺伝子改変体によってコードされる、該ＧＲＵＢＸタンパク質；
（ｉｉｉ）人工染色体の少なくとも一部分上に含まれる核酸配列であって、該人工染色体はまた、好ましくは、１つ以上の関連する遺伝子ファミリーのメンバーを含む、核酸配列；
（ｉｖ）ＧＲＵＢＸをコードする核酸の機能的部分；
（ｖ）ＧＲＵＢＸをコードする核酸にハイブリダイズし得る配列；
（ｖｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質のホモログ、誘導体、および活性なフラグメント
から選択される改変体を含む、方法。
【請求項１１】
請求項４〜請求項１０のいずれかに記載の方法であって、前記ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の発現が、種子優先プロモーター、好ましくはプロラミンプロモーターによって駆動される、方法。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれかに記載の方法であって、前記改善された成長特性は、それぞれ対応する野生型植物と比較して、増加した収量、および／または、改変された植物構造である、方法。
【請求項１３】
請求項１〜請求項１２のいずれかに記載の方法であって、前記増加した収量は、増加した種子の収量である、方法。
【請求項１４】
請求項１〜請求項１３のいずれかに記載の方法であって、前記増加した収量、および前記改変された植物構造は、対応する野生型植物と比較して、以下：
（ｉ）増加した、種子の生物体量、
（ｉｉ）増加した、種子の総数、
（ｉｉｉ）増加した、詰まった種子の数、
（ｉｖ）増加した、種子の大きさ、
（ｖ）増加した、種子の体積、
（ｖｉ）増加した、収穫指数、および
（ｖｉｉ）増加した千粒重
の１つ以上を含む、方法。
【請求項１５】
植物の収量を増加させるための方法であって、該方法は、ＧＲＵＢＸをコードする核酸の植物における発現を増加させる工程、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の植物内における活性、および／またはレベルを増加させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
改善された成長特性を有するトランスジェニック植物を産生するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．植物または植物細胞に、ＧＲＵＢＸタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする、核酸配列、該核酸配列とハイブリダイズし得る核酸配列またはその一部分を導入する工程；
ｂ．植物の成長を促進する条件下で、該植物細胞を培養する工程
を包含する、方法。
【請求項１７】
改善された成長特性を有する植物を選択するための方法であって、該方法は、ＧＲＵＢＸをコードする配列の、優れた対立遺伝子改変体の選択に基づき、そして該対立遺伝子は、植物において改善された成長特性を生じる、方法。
【請求項１８】
請求項１〜請求項１７のいずれかに記載の方法により得られる植物であって、ただし、前記ＧＲＵＢＸタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ９２７１４０によって表される核酸配列によってコードされるものではない、植物。
【請求項１９】
単離された核酸配列であって、該単離された核酸配列は、以下：
（ｉ）配列番号６によって表される核酸配列、またはその相補鎖；
（ｉｉ）配列番号７によって表されるアミノ酸配列、あるいは、そのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）上記の（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列と、（好ましくはストリンジェントな条件下において）ハイブリダイズし得る核酸配列であって、該ハイブリダイズする配列が、好ましくはＧＲＵＢＸ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列；
（ｉｖ）遺伝暗号の結果として縮重している、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載の核酸配列；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の核酸配列の、対立遺伝子改変体である核酸；
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）に記載の核酸配列の、選択的スプライシング改変体である核酸；
（ｖｉｉ）（ｉ）〜（ｖｉ）に定義される配列の内の任意の１つ以上と、７５．００％の配列同一性、８０．００％の配列同一性、８５．００％の配列同一性、９０．００％の配列同一性、９５．００％の配列同一性、９６．００％の配列同一性、９７．００％の配列同一性、９８．００％の配列同一性、または９９．００％の配列同一性を有する、核酸配列；
（ｖｉｉｉ）上記の（ｉ）〜（ｖｉｉ）の内の任意のものに記載の核酸配列の一部分であって、該一部分は、好ましくはＧＲＵＢＸ活性を有するタンパク質をコードする、一部分
を含む、単離された核酸配列。
【請求項２０】
単離されたタンパク質であって、該単離されたタンパク質は、以下：
（ｉ）配列番号４において与えられるポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号７において与えられるポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号４または配列番号７において与えられるアミノ酸配列と、少なくとも４０．００％の配列同一性、好ましくは５０．００％の配列同一性、６０．００％の配列同一性、７０．００％の配列同一性、より好ましくは８０％の配列同一性、９０％の配列同一性、最も好ましくは９５．００％の配列同一性、９６．００％の配列同一性、９７．００％の配列同一性、９８．００％の配列同一性、または９９．００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｖ）少なくともＵＢＸドメインを、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを、そして必要に応じてジンクフィンガードメインを含むポリペプチド；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の内の任意のものにおいて定義されるタンパク質のホモログ、誘導体、免疫学的に活性な、かつ／または機能的なフラグメント
からなる群より選択されるポリペプチドの１つの、少なくとも部分を含み、
ただし、該タンパク質配列は、配列番号２によって表される配列でも、データベースの見出し項目Ｑ９ＺＵ９３、ＡＡＲ０１７４４、Ｑ９Ｄ７Ｌ９、Ｑ９ＢＺＶ１、Ｑ９９ＰＬ６、ＥＮＳＡＮＧＰ００００００２０４４２、Ｑ７ＳＸＡ８、Ｑ９Ｖ８Ｋ８、Ｑ９６ＩＫ９、ＥＮＳＲＮＯＰ００００００３７２２８、またはＡＡＨ０７４１４でもない、単離されたタンパク質。
【請求項２１】
構築物であって、該構築物は、以下：
（ｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列の、植物における発現を駆動し得る、１つ以上の調節配列；および、必要に応じて、
（ｉｉｉ）転写終止配列
を含み、
ただし、該ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ９２７１４０において表される核酸ではない、構築物。
【請求項２２】
請求項２１に記載の構築物であって、前記ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸は、配列番号２によって表されるタンパク質、または請求項２０の（ｉ）〜（ｖ）の内の任意のものに記載のタンパク質をコードする核酸配列である、構築物。
【請求項２３】
請求項２１または請求項２２に記載の構築物であって、前記調節配列が、少なくとも種子優先プロモーター、好ましくはプロラミンプロモーターを含む、構築物。
【請求項２４】
配列番号５と本質的に類似する発現カセットを含む構築物。
【請求項２５】
トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞であって、該植物または植物細胞が、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の増加された発現、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の増加された活性および／またはレベルを有することで特徴付けられる、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞。
【請求項２６】
改善された成長特性を有する、請求項２５に記載のトランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞。
【請求項２７】
請求項２５または請求項２６に記載のトランスジェニック植物であって、該植物は、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、菜種、または綿を含む作物植物、好ましくは単子葉植物（例えば、サトウキビ）、最も好ましくは穀類（例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、キビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ、またはカラスムギ）である、トランスジェニック植物。
【請求項２８】
請求項１８、請求項２５、請求項２６、または請求項２７の内の任意のものに記載の植物の、植物細胞、収穫可能な部分および／または該収穫可能な部分に直接的に由来する生産物を含む植物の部分、零余子、または子孫。
【請求項２９】
植物の成長特性を改善する工程における、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列、その部分、またはそれにハイブリダイズする核酸の使用。
【請求項３０】
植物の成長特性を改善する工程の置ける、ＧＲＵＢＸタンパク質、そのホモログ、その誘導体、およびその活性なフラグメントの使用。
【請求項３１】
植物の成長特性を改善する工程における、請求項２０に記載のＧＲＵＢＸタンパク質の使用。
【請求項３２】
植物の成長特性を改善する工程における使用のための、ＧＲＵＢＸタンパク質を含有する組成物。
【請求項３３】
植物の成長特性を改善する工程における使用のための、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸を含有する組成物。
【請求項３４】
育種計画における、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の成長特性を改善するための方法に関する。より具体的には、本発明は、植物において、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の発現を調節することによって、ならびに／あるいは、植物におけるＧＲＵＢＸタンパク質の活性および／またはレベルを調節することによって、植物の成長特性を改善するための方法に関する。本発明はさらに、新たなＧＲＵＢＸタンパク質、およびこのようなタンパク質をコードする核酸を提供する。本発明はまた、ＧＲＵＢＸをコードする核酸を含む構築物、そして、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の、調節された発現、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の、調節された活性および／またはレベルを有する植物に関し、ここで、この植物は、対応する野生型植物と比較して、改善された成長特性を有する。
【背景技術】
【０００２】
世界人口が常に増加し、そして農業のために利用可能な土地の面積が縮小するならば、農業の効率を改善し、そして園芸における植物の多様性を増大させることは、農学研究の主要な目的であり続ける。作物および園芸の改良のための従来の手段は、所望の特性を有する植物を同定するための、選択的な育種技術を利用する。しかし、このような選択的な育種技術は、いくつかの欠点を有し、その欠点とはすなわち、これらの技術は代表的には労働集約的であり、そして多くの場合、親の植物から伝えられる所望の特性を常には生じ得ない、異質な遺伝的構成成分を含む植物を生じることである。さらに、所望の特性を提供するための、適切なドナー種は、まれであり得る。分子生物学における進歩は、人類が、動物および植物の生殖質（ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）を操作することを可能にした。植物の遺伝工学は、遺伝物質（代表的には、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態における）の単離および操作、ならびに、この遺伝物質の植物への引き続く導入を必要とする。このような技術は、種々の改善された経済的特性、農学的特性、または園芸学的特性を有する植物の開発につながった。特定の経済的な目的の特性は、例えば高収量のような成長特性である。収量は通常、作物からの経済的価値の、測定可能な結果として定義される。これは、量および／または質によって定義され得る。作物の収量は、植物または作物が受ける代表的なストレスによって、不利に影響を受ける。このようなストレスとしては、非生物的なストレス（例えば、異常な高温または低温に起因する温度ストレス）；栄養不足に起因するストレス；水の欠乏または過剰な水（干ばつ、氾濫）に起因するストレス、化学物質（例えば、肥料または殺虫剤）に起因するストレスが挙げられる。代表的なストレスとしてはまた、生物的なストレスが挙げられ、これは、他の植物（雑草、または高密度の植え付けの影響）、動物の疫病（放牧に起因するストレスを含む）、および病原体によって、植物に負わせられ得る。作物の収量は、その作物または植物が受ける、１つ以上のストレスに抗することによってのみ増加し得るのではなく、植物の生来の成長機構を改変することによっても増加し得る。植物の生来の成長機構は、いくつかのレベルにおいて、かつ種々の代謝プロセスによって制御される。このようなプロセスの１つは、ユビキチン媒介性タンパク質分解による、細胞内のタンパク質レベルの制御である。
【０００３】
ユビキチン化は、ユビキチン分子の結合体化による、タンパク質の改変をいう。ユビキチン化という用語は、多くの場合、ユビキチンタンパク質、またはユビキチンの機能を模倣するタンパク質の結合を媒介するプロセスに拡大される。ユビキチン化は、真核生物細胞が、タンパク質の安定性、機能、および細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在性を制御するための、用途の広い手段である。この機構は、タンパク質分解、細胞周期制御、ストレス応答、ＤＮＡ修復、シグナル伝達、転写調節、および小胞輸送において、中心的な役割を担う。ユビキチン媒介性タンパク質分解は、多くの細胞性プロセスの基本にあるので、高度に制御され、そして高い基質特異性、および下流のエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）における十分な多様性を必要とする。いくつかのユビキチン結合タンパク質が公知である。これらのタンパク質は、多くの場合、モジュール式のドメイン構造を有する。例えば、ユビキチン結合タンパク質は、代表的には、可変性のエフェクタードメインを有するユビキチン結合ドメインと結合する。その場合、ユビキチン結合ドメインを含まないが、ユビキチンと類似する三次構造を有し、従ってユビキチン化の特定の局面を模倣し得る他の物（ユビキチン様ドメイン）が存在する。
【０００４】
ユビキチンおよびユビキチン様タンパク質に存在する、ユビキチン関連モチーフおよびドメインの数は、より多くのゲノム配列の情報が利用可能になるにつれ、増えつつある。それらのドメインのいくつかのプロトタイプは、例えば、ＵＢＡ、ＵＢＤ、ＵＩＭ、およびＵＢＸである（例えば、Ｐｆａｍデータベース；非特許文献１を参照のこと）。ＵＢＸドメインは、長さが約８０アミノ酸残基の配列で、機能未知であり、そして種々の生物体のタンパク質に存在する。これらのタンパク質のほとんどは、ヒトＦＡＦ１タンパク質、ヒトｐ４７タンパク質、ヒトＹ３３Ｋタンパク質、ヒトＲＥＰ８タンパク質、およびヒトＵＢＸＤ１タンパク質によって例示される、５つの進化的に保存されたファミリーの１つに属する（非特許文献２；非特許文献３）。代表的には、ＵＢＸドメインは、タンパク質のＣ末端に位置する。
【０００５】
構造的な証拠が、ＵＢＸドメインの、ユビキチン関連プロセスにおける機能を示唆する；特に、ＵＢＸドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用に関与し得る。ＵＢＸドメインを含むタンパク質は、普通、主に細胞質内に存在することが予測されるが、他の細胞内局在性もまた報告されている。例えば、多くのタンパク質の活性を調節するために用いられる、特定のタンパク質改変であるリン酸化が、ＦＡＦ−１の核内への輸送にも影響することが示された（非特許文献４）。
【０００６】
要約すると、動物のＵＢＸを含むタンパク質は、アポトーシス、細胞周期、または分解のためのタンパク質のターゲティングに関連する遺伝子の発現の増強に関与し得ることが、提唱されている。
【０００７】
アラビドプシス（この植物のゲノムは完全に配列決定された）においては、少なくとも１５個のＵＢＸ含有タンパク質が存在する。これらは、配列類似性に従って、ＦＡＦ１群、ｐ４７群、Ｙ３３Ｋ群、およびＵＢＸＤ１群に分類され得るが、ＲＥＰ８に対応する群だけは、植物において存在しないようである（図１を参照のこと）。動物界におけるように、植物のタンパク質におけるＵＢＸドメインは、他のドメイン（例えば、ＳＥＰ、Ｇ６ＰＤ、ＰＵＧ、またはジンクフィンガーのような）と組み合わせて存在する。ＵＢＸ含有タンパク質、およびこれらのタンパク質のドメイン構造は記載され（非特許文献５を参照のこと）、そして専門化されたデータベース（例えばＳＭＡＲＴ）を用いた検索によって同定され得る（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００８】
ＰＵＧドメイン（ペプチド：Ｎ−グリカナーゼ、および他の推定核ＵＢＸドメイン含有タンパク質内；非特許文献８）は、ＵＢＸドメイン（哺乳動物および植物において）、ＵＢＡドメイン（植物において）、およびＵＢＣドメイン（プラスモディウム属において）を含む、ユビキチン媒介性タンパク質分解に中心的であるドメインを有するタンパク質内に、同時に存在する。ＰＵＧ含有タンパク質（例えば、ＰＮＧａｓｅ）は、折り畳まれていないタンパク質の応答、異常なタンパク質を、正常に折り畳まれたタンパク質と区別する、小胞体（ＥＲ）の品質管理監視システムにおいて、役割を担うと考えられる。いくつかの場合において、これらの誤って折り畳まれたタンパク質、および／または折り畳まれていないタンパク質は、いわゆるＥＲ関連分解機構によって分解されることが示されており、ＥＲ関連分解機構は、ユビキチン−プロテアソーム系に関与する（非特許文献９）。ＰＵＧドメインの互いに異なる形態はまた、折り畳まれていないタンパク質の応答の初期段階に機能することが公知である、ＩＲＥ１ｐ型のキナーゼにも存在する（非特許文献１０）。
【０００９】
ＵＢＸドメインを含む、最近特徴付けられたアラビドプシスのタンパク質が、ＰＵＸ１である（非特許文献１１）。ＰＵＸ１はアラビドプシス内の単一の遺伝子であって、そして恐らくは植物内で遍在的に発現される。このタンパク質は、ＡＡＡ型ＡＴＰａｓｅであるＣＤＣ４８の、非競合的インヒビターであることが示された。ＰＵＸ１は、そのＵＢＸドメインを介して、ＣＤＣ４８の非六量体形態と会合するが、六量体ＣＤＣ４８とは会合しない。ＰＵＸ１が、活性な六量体ＣＤＣ４８の分解を促進し、そしてこのタンパク質のＮ末端ドメインが、このプロセスに必要であることが、推定される。ｐｕｘ１ノックアウト植物は、成熟までのより早い発生を示したが、全体的な形態学的異常は有さなかった。ＰＵＸ１の他に、他の２つのＵＢＸドメイン含有タンパク質である、ＰＵＸ２およびＰＵＸ３が、ＣＤＣ４８と相互作用することが示された（非特許文献１１）。ＰＵＸ２（Ａｔ２ｇ０１６５０）は、過去に特許文献１において開示された（配列番号１および配列番号２として、それぞれ遺伝子配列およびタンパク質配列が記載される）。
【特許文献１】国際公開第０３／０８５１１５号パンフレット
【非特許文献１】Ｂａｔｅｍａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）３０（１）：２７６−２８０
【非特許文献２】Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３０７、１７−２４
【非特許文献３】Ｃａｒｉｍ−Ｔｏｄｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（２００１）１５１７、２９８−３０１
【非特許文献４】Ｏｌｓｅｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（２００３）５４６、２１８−２２２
【非特許文献５】Ｂｕｃｈｂｅｒｇｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２００２）１２、２１６−２２１
【非特許文献６】Ｓｃｈｕｌｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５、５８５７−５８６４
【非特許文献７】Ｌｅｔｕｎｉｃら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（２００２）３０、２４２−２４４
【非特許文献８】Ｄｏｅｒｋｓら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００２）１２、４７−５６
【非特許文献９】Ｓｕｚｕｋｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（２０００）１４９、１０３９−１０５２
【非特許文献１０】ＳｈａｍｕおよびＷａｌｔｅｒ、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９９６）１５、３０２８−３０３９
【非特許文献１１】Ｒａｎｃｏｕｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）オンライン公開１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ４０５４９８２００
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
ここで、ＧＲＵＢＸタンパク質（成長関連ＵＢＸドメイン含有タンパク質）をコードする核酸、特に配列番号２によって例示されるＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の、植物内における調節された発現が、改善された成長特性を有する植物を与えることが見出された。従って、本発明の第一の実施形態において、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の、植物内における発現を調節する工程、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の植物内における活性および／またはレベルを調節する工程を包含する、植物の成長特性を改善するための方法が、ここで提供される。本発明の好ましい局面に従って、この調節された発現は、増加された発現であり、調節された活性および／またはレベルは、増加された活性および／またはレベルである。必要に応じて、改善された成長特性を有する植物が選択され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の調節された発現（増強または減少）、あるいはＧＲＵＢＸタンパク質自身の活性および／またはレベルの調節は、特定の細胞または組織における、遺伝子の変化された発現、ならびに／あるいは遺伝子産物（すなわちポリペプチド）の変化された活性および／またはレベルから生じ得る。この調節された発現は、内因性のＧＲＵＢＸ遺伝子の変化された発現レベルに起因してもよく、および／または、植物に過去に導入された、ＧＲＵＢＸをコードする核酸の変化された発現に起因してもよい。同様に、ＧＲＵＢＸタンパク質の調節されたレベルおよび／または活性は、内因性のＧＲＵＢＸ遺伝子の変化された発現レベルの結果であってもよく、そして／あるいは、植物に過去に導入された、ＧＲＵＢＸをコードする核酸の変化された発現に起因してもよい。ＧＲＵＢＸタンパク質のレベルに変化がない場合において、またはＧＲＵＢＸタンパク質のレベルが減少する場合においてさえ、活性は増加され得る。このことは、内因性の性質を変化させることで（例えば、野生型よりも活性な突然変異体を作製することによって）達成され得る。また、調節配列の阻害または刺激、あるいは、ＧＲＵＢＸをコードする天然の遺伝子、またはＧＲＵＢＸをコードする導入遺伝子の発現を駆動する、新たな調節配列の準備も、包含される。このような調節配列は、植物に導入され得る。例えば、植物に導入される調節配列は、内因性のＧＲＵＢＸ遺伝子の発現を駆動し得るプロモーターであり得る。
【００１２】
遺伝子の発現、ならびにタンパク質の活性および／またはレベルは、遺伝的改変の導入（好ましくは、ＧＲＵＢＸ遺伝子の遺伝子座への）によって調節され得る。本明細書中で定義される遺伝子の遺伝子座は、目的の遺伝子、およびコード領域より１０ｋｂ上流または１０ｋｂ下流を含む遺伝的領域を意味するようになる。
【００１３】
遺伝的改変は、例えば、以下の方法の任意の１つ（またはそれ以上）によって導入され得る；ＴＤＮＡアクティベーション、ＴＩＬＬＩＮＧ、位置指定突然変異誘発、相同組換え、あるいは、ＧＲＵＢＸポリペプチドまたはそのホモログをコードする核酸の、植物内への導入および発現。遺伝的改変の導入に続いて、ＧＲＵＢＸポリペプチドの増加された活性について選択する工程が続き、ここで活性の増加は、植物に改善された成長特性を有させる。
【００１４】
Ｔ−ＤＮＡアクティベーションタギング（Ｈａｙａｓｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  （１９９２）１３５０−１３５３）は、通常はプロモーターを含むＴ−ＤＮＡ（翻訳エンハンサーまたはイントロンでもあり得る）を、このようなプロモーターが標的遺伝子の発現を支配するような配置で、目的の遺伝子の遺伝的領域、あるいは遺伝子のコード領域の１０ｋＢ上流または１０ｋＢ下流に挿入することに関連する。代表的には、標的遺伝子の発現の、その遺伝子の天然のプロモーターによる調節が破壊され、そしてその遺伝子は、新たに導入されたプロモーターに制御されるようになる。このプロモーターは、代表的にはＴ−ＤＮＡ内に埋め込まれる。このＴ−ＤＮＡは、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染を介して、植物のゲノム中にランダムに挿入され、そして挿入されたＴ−ＤＮＡの近傍の遺伝子の過剰発現を導く。生じるトランスジェニック植物は、導入されたプロモーターに近接する遺伝子の過剰発現に起因して、優性の表現型を示す。導入されるべきプロモーターは、所望の生物（この場合は植物）において遺伝子の発現を支配し得る任意のプロモーターであり得る。例えば、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導性プロモーターは、全て、Ｔ−ＤＮＡアクティベーションにおける使用に適している。
【００１５】
遺伝的改変はまた、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノム内標的化誘導性局所領域（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｌｏｃａｌ  Ｌｅｓｉｏｎｓ  ＩＮ  Ｇｅｎｏｍｅｓ））の技術を用いて、ＧＲＵＢＸ遺伝子の遺伝子座に導入され得る。これは、ＧＲＵＢＸ活性を示し得る、ＧＲＵＢＸ核酸の突然変異改変体を産生および／または同定、ならびに最終的には単離するために有用な、突然変異誘発技術である。ＴＩＬＬＩＮＧはまた、このような突然変異改変体を持つ植物の選抜を可能とする。これらの突然変異改変体はなお、その天然の形態の遺伝子によって示されるよりも、高いＧＲＵＢＸ活性を示し得る。ＴＩＬＬＩＮＧは、高密度な突然変異誘発を、ハイスループットなスクリーニング方法と組み合わせる。ＴＩＬＬＩＮＧに続く工程は、代表的には：
（ａ）ＥＭＳ突然変異誘発（Ｃ  Ｋｏｎｃｚ、Ｎ−Ｈ  Ｃｈｕａ、Ｊ  Ｓｃｈｅｌｌ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｗｏｒｌｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ、ｐｐ  １６−８２における、ＲｅｄｅｉおよびＫｏｎｃｚ（１９９２）；ＥＭ  Ｍｅｙｅｒｏｗｉｔｚ、ＣＲ  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ編、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ｐｐ  １３７−１７２における、Ｆｅｌｄｍａｎｎら（１９９４）；Ｊ  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｚａｐａｔｅｒ、Ｊ  Ｓａｌｉｎａｓ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８２巻、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、ｐｐ  ９１−１０４における、ＬｉｇｈｔｎｅｒおよびＣａｓｐａｒ（１９９８））；
（ｂ）個体のＤＮＡ調製およびプール；
（ｃ）目的の領域のＰＣＲ増幅；
（ｄ）ヘテロ二重鎖の形成を可能にする、変性およびアニーリング；
（ｅ）プールにおけるヘテロ二重鎖の存在が、クロマトグラムの追加のピークとして検出される、ＤＨＰＬＣ；
（ｆ）変異個体の同定；ならびに
（ｇ）変異ＰＣＲ産物の配列決定
である。ＴＩＬＬＩＮＧの方法は、当該分野で周知である（ＭｃＣａｌｌｕｍ、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００年４月；１８（４）；４５５−７、Ｓｔｅｍｐｌｅ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．５、１４５−１５０、２００４）。
【００１６】
位置指定突然変異誘発は、ＧＲＵＢＸ活性（例えば、陽イオン輸送活性）を保持する、ＧＲＵＢＸ核酸またはその部分の改変体を産生するために用いられ得る。位置指定突然変異誘発を達成するためのいくつかの方法が使用可能であり、最も一般的なのはＰＣＲに基づく方法である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ編、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．４ｕｌｒ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｕｒｒｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌを参照のこと）。
【００１７】
ＴＤＮＡアクティベーション、ＴＩＬＬＩＮＧ、および位置指定突然変異誘発は、ＧＲＵＢＸの機能を保持する、ＧＲＵＢＸの新規な対立遺伝子およびＧＲＵＢＸの改変体を産生し得、それゆえ、本発明の方法において有用である技術の例である。
【００１８】
相同組換えは、選択された核酸を、ゲノム中に、明確に選択された位置に導入することを可能にする。相同組換えは、下等生物（例えば、酵母、およびコケであるＰｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ）についての生物科学において通常用いられる標準的な技術である。植物において相同組換えを行うための方法は、モデル植物について（Ｏｆｆｒｉｎｇａら（１９９０）ＥＭＢＯ  Ｊ．９、３０７７−３０８４）だけでなく、作物植物（例えば、イネ（Ｔｅｒａｄａら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、１０３０−１０３４；または、ＩｉｄａおよびＴｅｒａｄａ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、１３２−１３８））についても記載されている。標的とされるべき核酸（本明細書中で前に定義したように、ＧＲＵＢＸ核酸分子でもその改変体でもよい）は、ＧＲＵＢＸ遺伝子の遺伝子座を標的とされる必要は無いが、例えば、高発現領域に導入され得る。標的とされるべき核酸は、内因性の遺伝子を置き換えるために用いられる、改善された対立遺伝子であっても、内因性の遺伝子に加えて導入されてもよい。
【００１９】
ＧＲＵＢＸ遺伝子の発現を調節するために、あるいはＧＲＵＢＸタンパク質の活性および／またはレベルを調節するために好ましいアプローチは、ＧＲＵＢＸタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする、単離された核酸配列を植物中に導入する工程を包含する。この核酸は、例えば形質転換によって、植物中に導入され得る。従って、本発明の好ましい局面に従って、ＧＲＵＢＸコード核酸の植物中への導入、および発現を包含する、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。
【００２０】
用語ＧＲＵＢＸタンパク質は、本明細書中で定義される場合、少なくともＵＢＸドメインを、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを、そして必要に応じてジンクフィンガードメインも含むタンパク質をいう。好ましくは、このＧＲＵＢＸタンパク質は、構造的にヒトＵＢＸＤ１タンパク質（ＳＰＴｒＥＭＢＬ  ＡＡＨ０７４１４）と関連される。好ましくは、このＧＲＵＢＸタンパク質は植物由来である。さらに好ましくは、このＧＲＵＢＸタンパク質はナス科由来であり、より好ましくは、このＧＲＵＢＸはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ由来のタンパク質であり、最も好ましくは、このＧＲＵＢＸは、配列番号２で表されるタンパク質であるか、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントであり、ここで、これらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントは、配列番号２の生物学的活性と類似した生物学的活性を有する。しかし、Ｚｅａ  ｍａｙｓ由来のＧＲＵＢＸタンパク質、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ由来のＧＲＵＢＸタンパク質（配列番号４）、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来のＧＲＵＢＸタンパク質（配列番号７）、パンコムギ種由来のＧＲＵＢＸタンパク質、オオムギ種由来のＧＲＵＢＸタンパク質、およびモロコシ種由来のＧＲＵＢＸタンパク質を含む、単子葉植物に由来するＧＲＵＢＸタンパク質が、これらの配列は配列番号２に関連されるので（図１ｂを参照のこと）、本発明の方法において同様に良好に用いられ得ることが理解されるべきである。
【００２１】
このようなＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸が、本発明で用いられるようにプロラミンプロモーターの制御下で、イネにおいて発現される場合、ＧＲＵＢＸタンパク質の活性の１つは、種子収量を増加させることであり、特に収穫指数を増加させることである。都合の良いことに、ＧＲＵＢＸタンパク質は、Ｒａｎｃｏｕｒら（２００４）において記載された条件下において、植物のＣＤＣ４８タンパク質と相互作用し得る。
【００２２】
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍのＧＲＵＢＸタンパク質が、ＳＭＡＲＴツールによって分析され、そしてＰｆａｍ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １１．０、２００３年１１月；Ｂａｔｅｍａｎら（２００２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３０、２７６−２８０）およびＩｎｔｅｒＰｒｏデータベース（Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、２００３年７月２２日；Ｍｕｌｄｅｒら（２００３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３１、３１５−３１８）をスクリーニングするために用いられた。ＧＲＵＢＸタンパク質は、ＵＢＸドメイン（ＰＦ００７８９、ＳＭ００１６６、ＩＰＲ００１０１２）およびＰＵＧドメイン（ＳＭ００５８０、ＩＰＲ００６５６７）を含む。ＩｎｔｅｒＰｒｏにおいて定義される場合、ＵＢＸドメインはユビキチン調節タンパク質において見い出され、このユビキチン制御タンパク質は、ＦＡＦ−１（ＦＡＳ−関連因子１）、ヒトＲｅｐ−８再生（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）タンパク質、および酵母に由来するいくつかの仮想タンパク質を含む、多数の他のタンパク質とならんで、ユビキチン化経路のメンバーである。アラビドプシスにおいては、このドメインを含むことが予測される、約２０個のタンパク質が存在する。ＰＵＧドメインは、タンパク質キナーゼ、Ｎ−グリカナーゼ、および真核生物における他の核タンパク質において見い出され、そしてタンパク質−タンパク質相互作用に（総説として、ＳｕｚｕｋｉおよびＬｅｎｎａｒｚ（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０２、１−５、およびＢｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．３０３、７３２を参照のこと）、およびＲＮＡ結合に（Ｄｏｅｒｋｓら、２００２）関与すると推定される。ＰＵＧドメインは、アラビドプシスのタンパク質において、多くの場合ＵＢＡドメインまたはＵＢＸドメインと共に見出される（Ｄｏｅｒｋｓら、２００２）。ＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０、２００３年９月１５日に配列データベースをアップデート）において定義されるように、ＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインについてのコンセンサスな配列を、図２ａに示す；図２ｂは、配列番号２およびＳＰＴｒＥＭＢＬ  Ｑ９ＺＵ９３の、それぞれＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを示す；図２ｃはこれらの２つのタンパク質のＢＬＡＳＴアラインメントを示す；そして、図２ｄおよび図２ｅは、それぞれ、配列番号２と配列番号４との間のアラインメント、および、配列番号４と配列番号７との間のアラインメントを示す。ＰＵＧドメインとＵＢＸドメインが示される。
【００２３】
必要に応じて、ＧＲＵＢＸタンパク質にジンクフィンガードメインが存在し得る。ＩｎｔｅｒＰｒｏに定義されるように、ジンクフィンガードメインは、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ転写因子ＴＦＩＩＩＡにおいて最初に同定された、核酸結合タンパク質構造である。これらのドメインは、それ以来、多くの核酸結合タンパク質において見出されている。ジンクフィンガードメインは、Ｃ−２−Ｃ−１２−Ｈ−３−Ｈ型モチーフ内に、２つの保存されたＣｙｓ残基、および２つの保存されたＨｉｓ残基を含む、２５〜３０アミノ酸残基から構成される。第２のＣｙｓと第１のＨｉｓを分ける１２残基は、主に極性かつ塩基性であり、このことは、この領域が核酸結合に関与することを示す。ジンクフィンガーモチーフは、異常に短く、自己フォールディングするドメインであって、その三次構造にはＺｎが重大な構成要素である。ジンクフィンガードメインは、四面体アレイ内のＺｎ原子に結合し、その結果、核酸の主溝においてヌクレオチドと相互作用し得る、指のような突起を形成する。Ｚｎは、保存されたＣｙｓ残基およびＨｉｓ残基と結合する。指は、核酸を含む、グアニン残基の短いひと続きの、約５塩基対に結合することが見出され、そしてＲＮＡおよびＤＮＡの両方に結合する能力を有する。従って、ジンクフィンガーは、新奇な核酸結合タンパク質を表し得る。Ｚｎを中心に持つドメインが、タンパク質相互作用（例えば、タンパク質キナーゼＣ）に用いられ得ることもまた示唆された。ジンクフィンガーの多くのクラスは、亜鉛原子の空間的な配置に関与するヒスチジン残基およびシステイン残基の数および位置に従って、特徴付けられる。特徴付けられた第一のクラス（Ｃ２Ｈ２（ＩＰＲ００７０８７）と呼ばれる）において、亜鉛を配位する残基の最初の対は、システインからなり、一方で第二の対はヒスチジンからなる。別のジンクフィンガードメイン（ＩＰＲ００６６４２）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質であるＲａｄ１８において見出される型のものであり得る。ここでも、ジンクフィンガードメインは、推定核酸結合配列である。しかしながら、本明細書中で定義される場合のＧＲＵＢＸタンパク質における任意のジンクフィンガードメインは、Ｃ２Ｈ２型にもＲａｄ１８型にも限定されず、ジンクフィンガードメインの任意の型であり得る。
【００２４】
本明細書中で定義される場合、用語ＧＲＵＢＸ核酸／遺伝子は、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする任意の核酸、またはその相補体をいう。この核酸は、この核酸が植物で発現される場合、ＧＲＵＢＸ核酸／遺伝子の調節された発現、あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の調節された活性および／またはレベルにつながるとの条件で、任意の天然の供給源または人工的な供給源に、（直接的または間接的（引き続いて改変される場合）のいずれかで）由来し得る。この核酸は、微生物的な供給源（例えば、細菌、酵母、または真菌）から単離されても、植物、藻類、または動物（ヒトを含む）の供給源から単離されてもよい。好ましくは、この核酸は真核生物に由来する。好ましくは、このＧＲＵＢＸ核酸は植物起源であり、さらに好ましくは、単子葉植物起源または双子葉植物起源であり、より好ましくは、このＧＲＵＢＸ核酸は、ナス科に由来するＧＲＵＢＸタンパク質をコードし、さらにより好ましくは、このＧＲＵＢＸ核酸は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ由来の核酸配列であり、最も好ましくは、このＧＲＵＢＸ核酸は、配列番号１によって表されるような核酸配列、またはその機能的部分、あるいはそれとハイブリダイズし得る核酸配列であり、このハイブリダイズする配列は、ＧＲＵＢＸタンパク質活性（すなわち、配列番号１の生物学的活性と類似する生物学的活性）を有するタンパク質をコードし、そしてまた、配列番号２によって表されるアミノ酸配列、あるいは、そのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸も包含する。あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸は、イネ科、好ましくはＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａに由来し得る。この核酸は、その天然の形態から、慎重なヒトの操作を介して、組成物および／または遺伝的環境に、実質的に改変され得る。この核酸配列は、好ましくは、相同な核酸配列（すなわち、構造的に、および／または機能的に関連した核酸配列）であり、好ましくは、同じ植物種に由来するか、または異なる植物種に由来して、植物から得られる。
【００２５】
用語「機能的部分」とは、ＧＲＵＢＸタンパク質と同じ生物学的活性を保持し、そしてＵＢＸドメインを有し、そして好ましくはさらにＰＵＧドメインを有し、そして必要に応じてジンクフィンガードメインを有するポリペプチドをコードする、ＧＲＵＢＸ遺伝子の一部分をいう。用語「ＧＲＵＢＸ核酸／遺伝子」はまた、遺伝暗号の縮重に起因する、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の改変体、ＧＲＵＢＸをコードする核酸の対立遺伝子改変体、ＧＲＵＢＸをコードする核酸の種々のスプライシング改変体、および、１つ以上の介在性配列によって中断された改変体を包含する。
【００２６】
都合の良いことに、本発明の方法はまた、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列（例えば、配列番号１によって表される配列）の部分を用いて、あるいは、好ましくはストリンジェントな条件下において、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする配列（このハイブリダイズする配列は、ＧＲＵＢＸ活性を有するタンパク質をコードする）を用いて、あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質（例えば、配列番号２に記載の配列）のホモログ、誘導体、または活性なフラグメントを用いて、あるいは、これらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸を用いて、実行され得る。
【００２７】
ＧＲＵＢＸタンパク質（例えば、配列番号２に表されるもの）のホモログは、種々の真核生物において見出され得る。最も近縁のホモログは、一般に植物界において見出される。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａゲノムは、少なくとも１５個のＧＲＵＢＸタンパク質を有するようであり、ここで、ＳＰＴｒＥＭＢＬ  Ｑ９ＺＵ９３およびＱ８ＬＧＥ５に寄託された配列（ＭＩＰＳ番号Ａｔ２Ｇ０１６５０、またはＧｅｎＢａｎｋ  ＡＹ０８４３１７およびＡＡＭ６０９０４）のホモログが、配列番号２に最も近いホモログであり、配列番号２の、他の適切なホモログとしては、配列番号３に表される核酸にコードされる、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ  ｏｆｆｉｃｉｎａｒｕｍ由来の配列番号４、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ由来の配列番号７（配列番号６に表される核酸配列によってコードされる）、および、Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａに由来する、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＱ１９８３４７およびＢＦ７７８９２２が挙げられる。
【００２８】
ＧＲＵＢＸホモログを検索し、そして同定するための方法は、十分に当業者の範囲内である。このような方法は、配列のアラインメントまたは比較のための分野において周知であるアルゴリズム（例えば、ＧＡＰ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８、４４３−４５３（１９７０））、ＢＥＳＴＦＩＴ（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２、４８２−４８９（１９８１））を用いる）、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．、Ｇｉｓｈ，Ｗ．、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗ．、Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、２４４４−２４４８（１９９８）））を用いた、コンピューターで読み取り可能な形式の、配列番号１または配列番号２によって表される配列の、公共データベース（例えば、ＭＩＰＳ（Ｍｕｎｉｃｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｐｓ．ｇｓｆ．ｄｅ／）、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、またはＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ））において利用可能な配列との比較を包含する。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国生物工学情報センターを介して、公共に利用可能である。上記のホモログは、ｂｌａｓｔのデフォルトのパラメーター（例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラムの高度な選択肢：Ｇ−Ｃｏｓｔ（ギャップを開くため）＝５；Ｅ−Ｃｏｓｔ（ギャップを拡張するため）＝２；ｑ−Ｐｅｎａｌｔｙ（不一致のため）＝−３；ｒ−Ｒｅｗａｒｄ（一致のため）＝１；ｅ−期待値（Ｅ）＝１０．０；Ｗ−ワードサイズ＝１１；ＴＢＬＡＳＴＮプログラムの高度な選択肢：Ｇ−Ｃｏｓｔ（ギャップを開くため）＝１１；Ｅ−Ｃｏｓｔ（ギャップを拡張するため）＝１；ｅ−期待値（Ｅ）＝１０．０；Ｗ−ワードサイズ＝３）を用いて同定された。より多くのゲノムが配列決定されつつあるので、さらに多くのＧＲＵＢＸホモログが同定可能になることが期待される。
【００２９】
配列番号６によって表される配列は、これまでは未知であった。従って、本発明の二番目の実施形態において、以下：
（ａ）配列番号６によって表される核酸配列、またはその相補鎖；
（ｂ）配列番号７によって表されるアミノ酸配列、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列；
（ｃ）上記の（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列と（好ましくはストリンジェントな条件下において）ハイブリダイズし得る核酸配列であって、このハイブリダイズする配列は、好ましくはＧＲＵＢＸ活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列；
（ｄ）遺伝暗号の結果として縮重された、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載の核酸配列；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）に記載の核酸配列の対立遺伝子改変体である核酸；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）に記載の核酸配列の選択的スプライシング改変体である核酸；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）に定義された配列のうちの任意の１つ以上と、７５．００％、８０．００％、８５．００％、９０．００％、９５．００％、９６．００％、９７．００％、９８．００％、または９９．００％の配列同一性を有する核酸配列；
（ｈ）上記の（ａ）〜（ｇ）のうちの任意の１つに記載の核酸配列の一部分であって、この一部分は好ましくはＧＲＵＢＸ活性を有するタンパク質をコードする、一部分
を含む単離された核酸配列が提供される。
【００３０】
配列番号４によって表される配列は、４つのＥＳＴ配列（ＣＡ１５４２７０、ＣＡ１４４０２８、ＢＱ５３５５１１、およびＣＡ１８４７４２）から組み立てられ、そしてこれまでは未知であった。従って、以下：
（ｉ）配列番号４において与えられるポリペプチド；
（ｉｉ）配列番号７において与えられるポリペプチド；
（ｉｉｉ）配列番号４または配列番号７において与えられるアミノ酸配列と、少なくとも４０．００％の配列同一性を、好ましくは５０．００％の配列同一性、６０．００％の配列同一性、７０．００％の配列同一性を、より好ましくは８０％の配列同一性または９０％の配列同一性を、最も好ましくは９５．００％の配列同一性。９６．００％の配列同一性、９７．００％の配列同一性、９８．００％の配列同一性、または９９．００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｉｖ）少なくともＵＢＸドメインを、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを、および必要に応じてジンクフィンガードメインを含むポリペプチド；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の内の任意のものに定義されるタンパク質のホモログ、誘導体、免疫学的に活性な、および／または機能的なフラグメント
からなる群より選択される、単離されたＧＲＵＢＸタンパク質が提供され、ただし、このポリペプチド配列は、配列番号２によって表される配列でも、データベースの見出し項目であるＱ９ＺＵ９３、ＡＡＲ０１７４４、Ｑ９Ｄ７Ｌ９、Ｑ９ＢＺＶ１、Ｑ９９ＰＬ６、ＥＮＳＡＮＧＰ００００００２０４４２、Ｑ７ＳＸＡ８、Ｑ９Ｖ８Ｋ８、Ｑ９６ＩＫ９、ＥＮＳＲＮＯＰ００００００３７２２８、またはＡＡＨ０７４１４でもない。
【００３１】
用語ＧＲＵＢＸは、配列番号２において示される、ＧＲＵＢＸと相同なタンパク質を含む。従って、本発明の方法において用いられるのに好ましいホモログは、少なくともＵＢＸドメインを含み、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを含む。ＧＲＵＢＸタンパク質の「ホモログ」は、改変されていない当該タンパク質と比較して、アミノ酸置換、アミノ酸欠失、および／またはアミノ酸挿入を有し、そして、由来する改変されていないタンパク質と類似した生物学的活性および機能的活性を有する、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を包含する。このようなホモログを産生するためには、タンパク質のアミノ酸は、類似した性質（例えば、類似した、疎水性、親水性、抗原性、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成または破壊する性質）を有する他のアミノ酸で置換され得る。保存的置換の表は、当該分野で周知である（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと）。
【００３２】
本発明の方法において有用なホモログは、改変されていないタンパク質と、少なくとも４０．００％の配列同一性または類似性（機能的な同一性）を有し、あるいは、改変されていないタンパク質と、少なくとも５０．００％の配列同一性または類似性を有し、あるいは、改変されていないタンパク質と、少なくとも６０．００％の配列同一性または類似性を有し、あるいは、改変されていないタンパク質と、少なくとも７０．００％の配列同一性または類似性を有する。代表的には、このホモログは、改変されていないタンパク質と、少なくとも８０％の配列同一性または類似性を有し、改変されていないタンパク質と、好ましくは少なくとも８５．００％の配列同一性または類似性を、さらに好ましくは少なくとも９０．００％の配列同一性または類似性を、最も好ましくは、改変されていないタンパク質と、少なくとも９５．００％の配列同一性または類似性、少なくとも９６．００％の配列同一性または類似性、少なくとも９７．００％の配列同一性または類似性、少なくとも９８．００％の配列同一性または類似性、または少なくとも９９．００％の配列同一性または類似性を有する。同一性の割合は、アラインメントプログラム（例えばＧＡＰ）を用いて計算され得る。比較的低い配列相同性（約４０．００％程度の低さ）であるように見受けられ得ても、少なくともＵＢＸドメインを有する、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを有する、そしてさらに必要に応じてジンクフィンガードメインを有する、全ての全長タンパク質を有するＧＲＵＢＸタンパク質は、構造上、高度に保存される。従って、他の植物種におけるＧＲＵＢＸタンパク質は、容易に発見され得る（イネおよびサトウキビの、上記の新規な配列によって証拠付けられるように）。
【００３３】
相同なタンパク質は、「タンパク質ファミリー」に分類され得る。タンパク質ファミリーは、機能的類似性分析および配列類似性分析（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）によって定義され得る。ＧＲＵＢＸと相同なタンパク質の近接結合法系統樹がＣｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムによって生成され得、そしてその構造的な関係および祖先関係の良い概観を与える（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ５．５、Ｉｎｆｏｒｍａｘで作製した、図１ａおよび図１ｂを参照のこと）。本発明の特定の実施形態において、ＧＲＵＢＸのホモログは、配列番号２に対応するタンパク質と同じタンパク質ファミリーに属する。
【００３４】
アラビドプシスのゲノムにおいて、ＧＲＵＢＸタンパク質の好ましいファミリーのメンバーが同定された（Ｑ９ＺＵ９３、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆｓｅｑ  ＮＭ＿１２６２２６）。他の植物（例えば、イネ、サトウキビ、または他の単子葉植物）においてもまた、ＧＲＵＢＸタンパク質のファミリーのメンバーが、上記に示したように同定された。都合の良いことに、これらのファミリーのメンバーもまた、本発明の方法において有用である。
【００３５】
相同性の２つの特別な形態である、オーソロガスおよびパラロガスは、遺伝子の祖先関係を記載するために用いられる、進化的な概念である。用語「パラロガス」は、ある種のゲノムに含まれる、１つ以上の遺伝子重複の結果として生じる相同な遺伝子をいう。用語「オーソロガス」は、これらの遺伝子の祖先関係に起因する異なる生物における相同な遺伝子をいう。本明細書中で用いられる場合、用語「ホモログ」はまた、本発明の方法において有用なタンパク質のパラログおよびオーソログを包含する。オーソロガスな遺伝子は、例えばＢＬＡＳＴプログラムを用いて、目的の照会遺伝子で、１つ以上の遺伝子データベースを照会することで同定され得る。次いで、この検索の結果から生じる最も順位の高い対象遺伝子を、再びＢＬＡＳＴ分析にかけて、照会遺伝子と再び一致する対象遺伝子のみが、真のオーソロガスな遺伝子として保持される。例えば、イネにおけるオーソログが検索される場合、目的の配列は、ＮＣＢＩにおいて利用可能な、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ由来の２８，４６９個の全長ｃＤＮＡクローンに対してｂｌａｓｔ検索される。ヌクレオチドから始める場合には、ＢＬＡＳＴｎまたはｔＢＬＡＳＴＸが、あるいは、タンパク質から始める場合には、ＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮが、標準のデフォルト値で使用され得る。ｂｌａｓｔの結果は、フィルター処理され得る。次いで、フィルター処理された結果またはフィルター処理されていない結果のいずれかの全長配列が、目的の配列が由来する生物（この場合、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）の配列に対してブラストバック（ｂｌａｓｔ  ｂａｃｋ）（第二のｂｌａｓｔ検索）される。次いで、第一のｂｌａｓｔ検索および第二のｂｌａｓｔ検索の結果が比較される。第二のｂｌａｓｔ検索の結果が、最も類似性の高いヒットとして、照会ＧＲＵＢＸ核酸またはＧＲＵＢＸポリペプチドを与える場合、オーソログが見つけられる。特定の照会配列について、ＧＲＵＢＸのパラログと最も高いヒットが見つけられる場合、このような照会配列もまた、ＧＲＵＢＸ活性を有し、そして少なくともＵＢＸドメインを、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを、ならびに必要に応じてジンクフィンガードメインも含むとき、ＧＲＵＢＸのホモログと見なされる。生じた配列がＣｌｕｓｔａｌＷで分析され、そして近接結合法系統樹として可視化される場合、この結果はさらに精密にされる。この方法は、多くの異なる種におけるオーソログを同定する際に使用され得る。
【００３６】
関連するタンパク質の群に含まれる、機能的なオーソログを同定するためのさらなる方法は、このタンパク質ファミリーのメンバーの発現パターンおよび組織分布を決定することであり、それによって、同じ組織に存在し、そして類似した発現パターンを有する配列は、関連する機能を遂行することが予測される。タンパク質の機能的なホモログを同定するためのさらなる方法は、類似する保存的ドメイン構造を有する配列を同定することによる。同じドメインを保持し、そして特に、そのドメインの分布が保存される場合、そのタンパク質は、類似した機能を遂行することが予測される。従って、化学的構造および調節（発現パターン、組織特異性）における類似性は、ＧＲＵＢＸの機能的なホモログを同定するために有用であり得る。
【００３７】
ＧＲＵＢＸの「ホモログ」は、改変されていないタンパク質と比較して、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、および／またはアミノ酸欠失を有するタンパク質を包含する。
【００３８】
タンパク質の「置換改変体」は、アミノ酸配列の少なくとも１残基が除かれ、そして異なる残基がその場所に挿入されるタンパク質である。アミノ酸置換は、代表的には単一の残基のものであるが、そのポリペプチド上におかれる機能的な制約に依存して密集され得；挿入は、通常約１アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基程度であり、そして欠失は、約１残基〜２０残基の範囲である。好ましくは、アミノ残置換は保存的アミノ酸置換を含む。
【００３９】
タンパク質の「挿入改変体」は、タンパク質の予め決められた部位に、１つ以上のアミノ酸残基が導入されるタンパク質である。挿入は、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸の、アミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合、ならびに配列内挿入を含み得る。一般的に、アミノ酸配列内の挿入は、アミノ末端融合またはカルボキシ末端融合よりも小さく、ほぼ１残基〜１０残基程度である。アミノ末端融合タンパク質またはペプチド、あるいはカルボキシ末端融合タンパク質またはペプチドの例としては、酵母ツーハイブリッド系にて用いられる転写活性化因子の結合ドメインまたは活性化ドメイン、ファージコートタンパク質、（ヒスチジン）６−タグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−タグ、プロテインＡ、マルトース結合タンパク質、ジヒドロ葉酸還元酵素、Ｔａｇ−１００エピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ、プロテインＣエピトープ、およびＶＳＶエピトープが挙げられる。
【００４０】
タンパク質の「欠失改変体」は、タンパク質からの１つ以上のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。タンパク質のアミノ酸改変体は、当該分野で周知のペプチド合成技術（例えば、固相ペプチド合成など）を用いて、または組換えＤＮＡ操作によって、容易に作製され得る。タンパク質の置換改変体、挿入改変体、または欠失改変体を産生するための、ＤＮＡ配列を操作するための方法は、当該分野で周知である。例えば、ＤＮＡ内の予め決められた部位に置換突然変異を作製するための技術は、当業者にとって周知であり、Ｍ１３突然変異誘発、Ｔ７−Ｇｅｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＣＲ媒介性位置指定突然変異誘発、または他の位置指定突然変異誘発プロトコルが挙げられる。
【００４１】
用語「誘導体」とは、タンパク質の天然に存在する形態のアミノ酸配列（例えば、配列番号２または配列番号４に示されるような）と比較して、置換、欠失、または天然に存在するアミノ酸残基および天然には存在しないアミノ酸残基の付加を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素をいう。ＧＲＵＢＸの「改変体」は、そのポリペプチドの天然に存在する形態のアミノ酸配列と比較して、天然に存在する変化したアミノ酸残基、グリコシル化したアミノ酸残基、アシル化したアミノ酸残基、または天然に存在しないアミノ酸残基を含み得る、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、および酵素を包含する。改変体はまた、由来するアミノ酸配列と比較して、１つ以上の非アミノ酸置換（例えば、レポーター分子または他のリガンドであって、結合したレポーター分子がアミノ酸配列の検出を促進するように、そのアミノ酸配列に共有結合的に、または非共有結合的に結合する、レポーター分子または他のリガンド、および、天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と比較して、天然には存在しないアミノ酸残基）を含み得る。
【００４２】
ＧＲＵＢＸタンパク質の「活性なフラグメント」は、タンパク質の、少なくとも８０個の連続するアミノ酸残基を包含し、この残基は、天然に存在するタンパク質と類似した生物学的活性および／または機能的活性を保持する。この活性なフラグメントは、少なくともＵＢＸドメインを含み、好ましくはこの活性なフラグメントはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを含む。
【００４３】
都合の良いことに、本発明の方法はまた、ＧＲＵＢＸ活性を保持するポリペプチドをコードする、ＤＮＡまたは核酸配列の部分を用いて実行され得る。ＤＮＡ配列の部分とは、本来の（より大きな）ＤＮＡ分子に由来する、またはこれから調製されるＤＮＡの一片をいい、このＤＮＡ部分は、植物内で発現される場合、改善された成長特性を有する植物を生じる。この部分は少なくとも２００ヌクレオチドを含み、そして少なくともＵＢＸドメインをコードする配列を含み、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインをコードする配列を含み、そして必要に応じてジンクフィンガードメインをコードする配列を含む。一部分は、例えば、ＧＲＵＢＸ核酸分子に１つ以上の欠失を作製することで、調製され得る。この部分は、付加的な制御エレメントを有する、または付加的な制御エレメントを有さない多くの遺伝子を含んでもよく、単にスペーサー配列などのみを含んでもよい。この部分は、単離された形態であってもよく、あるいは、例えば、いくつかの活性（その内の１つは、植物内でプロラミンプロモーターの制御下で発現される場合、種子の収量を増加させる）を併せるタンパク質を産生するために、他のコード配列（または非コード配列）と融合されてもよい。好ましくは、この部分は、配列番号１、配列番号３、または配列番号６のうちの任意の１つである。
【００４４】
本発明はまた、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし得る核酸配列を包含し、この核酸配列もまた、本発明の方法の実行に有用であり得る。本明細書中で定義される場合、用語「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が互いにアニールするプロセスである。このハイブリダイゼーションのプロセスは、全体として溶液中で起こり得る（すなわち、両方の相補的な核酸が溶液中にある）。このようなプロセスに依存する分子生物学における手段としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；およびこれに基づく全ての方法）差引きハイブリダイゼーション、ランダムプライマー伸長法、ヌクレアーゼＳ１マッピング、プライマー伸長法、逆転写法、ｃＤＮＡ合成、ＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ、およびＤＮＡ配列決定が挙げられる。このハイブリダイゼーションプロセスはまた、マトリックス（例えば、磁性ビーズ、セファロースビーズ、または他の任意の樹脂）に固定される相補的な核酸の１つと共に起き得る。このようなプロセスに依存する分子生物学における手段としては、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡの単離が挙げられる。このハイブリダイゼーションプロセスはさらに、固体支持体に固定される（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜、あるいは、例えば写真平板によって、例えば珪質ガラス（ｓｉｌｉｃｅｏｕｓ  ｇｌａｓｓ）支持体に固定される（後者は、核酸アレイまたはマイクロアレイとして、あるいは核酸チップとして公知である））相補的な核酸の１つと共に起き得る。このようなプロセスに依存する分子生物学における手段としては、ＲＮＡおよびＤＮＡのゲルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーションが起こるためには、核酸分子は一般的に、二本鎖が２つの単鎖に融解し、そして／または、短鎖の核酸からヘアピンまたは他の二次構造を除くために、温度的にまたは化学的に変性される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、条件（例えば、温度、塩濃度、およびハイブリダイゼーション緩衝液の組成）によって影響される。
【００４５】
高い選択性を必要とする適用のために、当業者は、代表的には、ハイブリッドを形成するために、比較的ストリンジェントな条件を用いることを望み、例えば、比較的低量の塩および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度にて、約０．０２Ｍ〜約０．１５ＭのＮａＣｌによって提供されるような）を選択する。従って、ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシーな条件は、高温および／または低塩濃度（塩としては、ＮａＣｌおよびＮａ３−クエン酸が挙げられる）を含むが、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドの含有、および／または、ハイブリダイゼーション緩衝液中の化合物（例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム））濃度の低下、および／または、ハイブリダイゼーション緩衝液からの化合物（例えば、硫酸デキストラン、またはポリエチレングリコール（分子の集合を促進する））の排除によっても影響を受け得る。十分に低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、前出の、本発明のＤＮＡ配列に相同な核酸の単離に、特に好ましい。相同性に寄与する要素としては、対立性、遺伝暗号の縮重、および好ましいコドン使用頻度の相違が挙げられる。
【００４６】
核酸ハイブリダイゼーション実験（例えば、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーション）の文脈における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存的であり、そして異なる環境パラメーターのもとで異なる。例えば、配列が長いほど、高い温度で特異的にハイブリダイズする。Ｔｍは、完全に一致するプローブに対して、標的配列の５０％がハイブリダイズする、定義されたイオン強度およびｐＨのもとでの温度である。特異性は、代表的には、ハイブリダイゼーション洗浄後の機能である。このような洗浄の重要な因子としては、最後の洗浄溶液のイオン強度および温度が挙げられる。
【００４７】
一般的に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度およびｐＨのもとでの、特異的な配列についての温度融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）よりも約５０℃低いように選択される。Ｔｍは、完全に一致するプローブに対して、標的配列の５０％がハイブリダイズする、定義されたイオン強度およびｐＨのもとでの温度である。Ｔｍは、溶液の条件およびプローブの塩基組成に依存し、そして以下の式：
Ｔｍ＝７９．８℃＋（１８．５×ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋（５８．４℃×％［Ｇ＋Ｃ］）−（８２０×（二重鎖内の＃ｂｐ）−１）−（０．５×％ホルムアミド）
を用いて計算され得る。
【００４８】
より好ましいストリンジェントな条件は、温度がＴｍより２０℃低い場合であり、最も好ましいストリンジェントな条件は、温度がＴｍより１０℃低い場合である。また、非特異的な結合は、多数の公知の技術（例えば、タンパク質含有溶液による膜のブロッキング、ハイブリダイゼーション緩衝液への異質なＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＳＤＳの添加、および、ＲＮａｓｅによる処理）のうちの任意の１つを用いて制御され得る。
【００４９】
洗浄条件は、代表的には、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーにおいて、またはそれ以下で行われる。一般的には、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、または遺伝子増幅検出手順に適切な、ストリンジェントな条件は、上記に示したとおりである。よりストリンジェントな、またはよりストリンジェントでない条件もまた選択され得る。
【００５０】
ストリンジェンシーのレベルを定義する目的で、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＣＳＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に、参照が都合よく作製され得る。低いストリンジェンシー条件の例は、３７℃〜４５℃にて、２〜３時間、４〜６×ＳＳＣ／０．１〜０．５％ｗ／ｖのＳＤＳである。ハイブリダイゼーションに関与する核酸の供給源および濃度に依存して、異なるストリンジェンシーの条件（例えば、中間のストリンジェント条件）が用いられ得る。中間のストリンジェント条件の例としては、４５℃以上にて、２〜３時間、１〜４×ＳＳＣ／０．２５％ｗ／ｖのＳＤＳが挙げられる。高ストリンジェンシー条件の例としては、６０℃にて、１〜３時間、０．１〜１×ＳＳＣ／０．１％ｗ／ｖのＳＤＳが挙げられる。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の間に変化され得、ストリンジェンシー条件を維持するか変えるかのどちらかである、種々のパラメーターを知っている。例えば、別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６５℃にて４×ＳＳＣでのハイブリダイゼーション、続いて６５℃にて約１時間、０．１×ＳＳＣ内での洗浄である。あるいは、別のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃にて、５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣである。なお別の、ストリンジェントな条件の例としては、６×ＳＳＣ、０．０５×ＢＬＯＴＴＯ内で６２℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ｗ／ｖのＳＤＳで、６２℃での洗浄が挙げられる。
【００５１】
本発明の方法はまた、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体を用いて行われ得る。本明細書中で用いられる場合、用語「選択的スプライシング改変体」は、選択されたイントロンおよび／またはエキソンが切除、置換、または付加された、核酸配列の改変体を包含する。このような改変体は、タンパク質の生物学的活性が影響を受けないままであるものであり、このことは、そのタンパク質の機能的なセグメントを選択的に保持することで達成され得る。このようなスプライシング改変体は、天然で見つかっても、合成であってもよい。このようなスプライシング改変体を作製する方法は、当該分野で周知である。従って、本発明の別の局面において、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体の、植物内における発現を調節する工程、ならびに／あるいは、この選択的スプライシング改変体によってコードされるＧＲＵＢＸタンパク質の活性および／またはレベルを調節する工程を包含する、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。好ましくは、このスプライシング改変体は、配列番号１によって表される配列のスプライシング改変体である。
【００５２】
都合の良いことに、本発明の方法はまた、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の対立遺伝子改変体、好ましくは配列番号１によって表される配列の対立遺伝子改変体を用いて行われ得る。対立遺伝子改変体は天然に存在し、そして本発明の方法に包含されるのは、これらの天然の対立遺伝子の使用である。対立遺伝子改変体は、一塩基多型（ＳＮＰ）、および小挿入／欠失多型（Ｓｍａｌｌ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＩＮＤＥＬ）を包含する。ＩＮＤＥＬの大きさは、通常１００ｂｐ未満である。ＳＮＰおよびＩＮＤＥＬは、ほとんどの生物の、天然に存在する多型株における、配列改変体の最大のセットを形成する。
【００５３】
特定の従来の育種計画における（例えば、マーカーに補助される育種における）これらの対立遺伝子改変体の使用もまた、本発明に包含され；このことは、本発明の方法における対立遺伝子改変体の使用に加えてであり得る。このような育種計画は、時々、植物の突然変異誘発性処理による、植物における対立遺伝子改変体の導入を必要とする。１つの適切な突然変異誘発方法は、ＥＭＳ突然変異誘発である。次いで、対立遺伝子改変体の同定が、例えばＰＣＲによって行われ得る。このことに、該当するＧＲＵＢＸ配列の優れた対立遺伝子改変体の選抜のための選抜工程が続き、そしてこの対立遺伝子改変体は、植物における改善された成長特性を引き起こす。選抜は、代表的には、該当する配列の異なる対立遺伝子改変体（例えば、配列番号１の、異なる対立遺伝子改変体）を含む植物の成長能力をモニターすることで行われる。成長能力のモニターは、温室で行われても、圃場で行われてよい。さらなる必要に応じた工程としては、優れた対立遺伝子改変体が同定された植物を、別の植物と交配させる工程が挙げられる。このことは、例えば、興味のある表現型特性の組み合わせを作製するために用いられ得る。このように、ＧＲＵＢＸ遺伝子の突然変異は天然に起こり得るので、これらは、より高い収量を示す植物の選抜のための基本を形成し得る。従って、本発明の別の局面において、改善された成長特性を有する植物を選抜するための方法であって、植物における改善された成長特性を生じさせる、ＧＲＵＢＸ配列の優れた対立遺伝子改変体の選抜に基づく方法が提供される。
【００５４】
本発明の方法はまた、（天然の、または人工の）染色体（例えば、細菌人工染色体（ＢＡＣ））の少なくとも一部分を植物に導入することによって行われ得て、この染色体は、少なくとも、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする遺伝子／核酸配列（例えば、配列番号１または配列番号３）を、好ましくは、１つ以上の関連する遺伝子ファミリーのメンバー、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸの発現および／または活性の調節タンパク質をコードする核酸配列と共に含む。従って、本発明のさらなる局面において、少なくともＧＲＵＢＸタンパク質をコードする少なくとも遺伝子／核酸を含む染色体の、少なくとも一部分を植物中に導入することによって、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。
【００５５】
本発明の別の局面において、育種計画内で、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸による優位性が得られ得る。この核酸配列は、少なくともＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列、および好ましくは１つ以上の関連するファミリーのメンバーも含む、染色体またはその一部分上に存在し得る。このような育種計画の例において、植物内においてＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の発現の調節を可能とする遺伝子であって、ＧＲＵＢＸタンパク質自身をコードする遺伝子であっても、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする遺伝子の発現、および／またはＧＲＵＢＸタンパク質自身の活性に、直接的にまたは間接的に影響を与え得る、他の任意の遺伝子であってもよい遺伝子と、遺伝的に連鎖し得るＤＮＡマーカーが同定される。次いで、このＤＮＡマーカーは、改善された成長特性を有する植物を選抜するために、育種計画において用いられ得る。
【００５６】
従って、本発明は、育種計画における、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の使用にわたる。
【００５７】
ＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体、あるいはＧＲＵＢＸポリペプチドまたはそのホモログは、ＧＲＵＢＸ遺伝子またはその改変体と遺伝的に連鎖し得るＤＮＡマーカー、所望の形質、または量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）が同定される育種計画において、用途を見出し得る。この所望形質またはＱＴＬは、所望の形質に影響を与える単一の遺伝子、または連鎖した遺伝子の集団を含み得る。ＧＲＵＢＸまたはその改変体、あるいはＧＲＵＢＸまたはそのホモログは、分子マーカーを定義するために用いられ得る。次いで、このＤＮＡマーカーまたはタンパク質マーカーは、改善された成長特性を有する植物を選抜するために、育種計画において用いられ得る。ＧＲＵＢＸ遺伝子またはその改変体は、例えば、配列番号１によって表される核酸であっても、上記で言及したホモログのうちの任意のものをコードする核酸であってもよい。
【００５８】
また、ＧＲＵＢＸの対立遺伝子改変体は、マーカーで補助される育種計画において用途を見出し得る。このような育種計画は、時々、例えばＥＭＳ突然変異誘発を用いる植物の突然変異誘発性処理によって、対立遺伝子変化の導入を必要とし；あるいは、この計画は、いわゆる「天然の」起源（故意のものでない原因の）の対立遺伝子変化の収集から始め得る。次いで、対立遺伝子改変体の同定が、例えばＰＣＲによって行われる。このことに、該当する配列の優れた対立遺伝子改変体の選抜のための選抜工程が続き、この対立遺伝子改変体は、植物における改善された成長特性（例えば増加した収穫指数）を引き起こす。選抜は、代表的には、該当する配列の異なる対立遺伝子改変体（例えば、配列番号１の、または、上記で言及した植物ホモログのうちの任意のものをコードする核酸の、異なる対立遺伝子改変体）を含む植物の成長能力をモニタリングすることで行われる。成長能力は、温室または圃場でもモニタリングされる。さらなる必要に応じた工程としては、増加したＧＲＵＢＸ活性を生じる、優れた対立遺伝子改変体が同定された植物を、別の植物と交配させる工程が挙げられる。このことは、例えば、興味のある表現型特性の組み合わせを作製するために用いられ得る。
【００５９】
また、ＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体は、このＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体が一部分である遺伝子を、遺伝的におよび物理的にマッピングするためのプローブとして、ならびに、これらの遺伝子と連鎖する形質についてのマーカーとして使用され得る。このような情報は、所望の表現型を有する株を開発するために、植物育種において有用であり得る。ＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体のこのような使用は、長さが少なくとも１０ヌクレオチドの核酸配列のみを必要とする。ＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカーとして使用され得る。制限酵素消化した植物のゲノムＤＮＡのサザンブロットは、ＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体によってプローブされ得る。次いで、生じるバンドパターンが、遺伝地図を作製するために、コンピュータープログラム（例えば、ＭａｐＭａｋｅｒ（Ｌａｎｄｅｒら（１９８７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １、１７４−１８１））を用いて遺伝的分析に供され得る。さらに、この核酸は、定義された遺伝的交配の親および子孫を代表する個体のセットの、制限エンドヌクレアーゼ処理したゲノムＤＮＡを含むサザンブロットをプローブするために用いられ得る。この集団を用いて過去に得られた遺伝地図（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３２、３１４−３３１）における、ＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体の位置を計算するために、ＤＮＡ多型の分離が記述され、そして用いられる。
【００６０】
遺伝的マッピングにおける使用のための、植物遺伝子由来のプローブの生成および使用は、ＢｅｍａｔｚｋｙおよびＴａｎｋｓｌｅｙ（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ４、３７−４１、１９８６）に記載される。多くの刊行物が、上記に概説した方法論またはその改変を用いた、特定のｃＤＮＡクローンの遺伝的マッピングを記載する。例えば、Ｆ２交雑集団、戻し交配集団、ランダムに交配した集団、近隣同質遺伝子系統（ｎｅａｒ  ｉｓｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｎｅ）、および個体の他のセットが、マッピングに用いられ得る。このような方法論は、当業者にとって周知である。
【００６１】
また、核酸プローブが、物理的マッピング（すなわち、物理的地図上への配列の配置；Ｎｏｎ−ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ＧｕｉｄｅにおけるＨｏｈｅｉｓｅｌら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ、１９９６、ｐｐ．３１９−３４６、およびそこに引用される参考文献を参照のこと）のために用いられ得る。
【００６２】
別の実施形態において、この核酸プローブは、直接的な蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）マッピングにおいて用いられ得る（Ｔｒａｓｋ（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．７、１４９−１５４）。ＦＩＳＨマッピングの現在の方法は、大きなクローン（数ｋｂ〜数百ｋｂ；Ｌａａｎら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．５、１３−２０を参照のこと）の使用に好都合であるが、感度における改善が、より短いプローブを用いるＦＩＳＨマッピングの実行を可能とし得る。
【００６３】
遺伝的マッピングおよび物理的マッピングの、種々の核酸増幅に基づいた方法が、この核酸を用いて行われ得る。例としては、対立遺伝子特異的増幅（Ｋａｚａｚｉａｎ（１９８９）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１、９５−９６）、ＰＣＲ増幅フラグメントの多型（ＣＡＰＳ；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １６、３２５−３３２）、対立遺伝子特異的ライゲーション（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１、１０７７−１０８０）、ヌクレオチド伸長反応（Ｓｏｋｏｌｏｖ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８、３６７１）、放射線ハイブリッドマッピング（Ｗａｌｔｅｒら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７、２２−２８）、およびハッピーマッピング（Ｈａｐｐｙ  Ｍａｐｐｉｎｇ）（ＤｅａｒおよびＣｏｏｋ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７、６７９５−６８０７）が挙げられる。これらの方法について、増幅反応またはプライマー伸長反応における使用のためのプライマー対を設計し、そして生成するために、この核酸配列が用いられる。このようなプライマーの設計は、当業者にとって周知である。ＰＣＲに基づく遺伝的マッピングを用いる方法において、マッピング交配の親の間の、即時の核酸配列に対応する領域におけるＤＮＡ配列の相違を同定することが必要であり得る。しかしながら、このことは一般的には、マッピング方法に不要である。
【００６４】
このようにして、変化されたＧＲＵＢＸ活性を有し、改善された成長特性を示す、改善された植物の生成、同定、および／または単離が行われ得る。
【００６５】
本発明の別の特長に従って、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の、植物内における発現を調節する工程、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質のレベルおよび／または活性を調節する工程を包含し、ここで、上記核酸配列および上記タンパク質は、以下：
（ｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の選択的スプライシング改変体であるか、またはスプライシング改変体によってコードされる、上記のＧＲＵＢＸタンパク質；
（ｉｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の対立遺伝子改変体であるか、または対立遺伝子改変体によってコードされる、上記のＧＲＵＢＸタンパク質；
（ｉｉｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質をコードし、そして人工染色体の少なくとも一部分上に含まれる核酸配列であって、この人工染色体はまた、好ましくは、１つ以上の関連する遺伝子ファミリーのメンバーを含む、核酸配列；
（ｉｖ）ＧＲＵＢＸをコードする核酸の機能的部分；
（ｖ）ＧＲＵＢＸをコードする核酸にハイブリダイズし得る配列；
（ｖｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質のホモログ、誘導体、および活性なフラグメント
から選択される改変体を含む、植物の成長特性を改善するための方法が提供される。
【００６６】
本発明の好ましい局面に従って、核酸の増強された発現または増加された発現が構想される。遺伝子または遺伝子産物の増強された発現または増加された発現を得るための方法は、当該分野で良く記述されており、そして、例えば、（強力な）プロモーターに駆動される過剰発現、転写エンハンサーまたは翻訳エンハンサーの使用が挙げられる。プロモーターまたはエンハンサーエレメントとして役立つ単離された核酸は、ＧＲＵＢＸ核酸またはその改変体の発現を上方制御するように、ポリヌクレオチドの非相同的ｎａ形態の、適切な部位（代表的には上流）に導入され得る。例えば、内因性のプロモーターが、突然変異、欠失、および／または置換によってインビボで変化させられても（Ｋｍｉｅｃ、米国特許第５，５６５，３５０号；Ｚａｒｌｉｎｇら、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３８６８号を参照のこと）、単離されたプロモーターが、本発明の遺伝子の発現を制御するように、本発明の遺伝子と適切な配向および距離で、植物細胞に導入されてもよい。好ましくは、本発明に有用な核酸は、植物または植物細胞内で過剰発現される。本明細書中で用いられる場合、用語過剰発現とは、本来の野生型の発現レベルに付加的である発現の任意の形態を意味する。好ましくは、植物に導入されるべき核酸、および／または、植物内で過剰発現されるべき核酸は、作動可能に連結されるプロモーターに関してセンス方向である。好ましくは、過剰発現されるべき核酸はＧＲＵＢＸタンパク質をコードし、さらに好ましくは、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列は双子葉植物から単離され、好ましくはナス科から単離され、さらに好ましくは、ここでこの配列はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍから単離され、最も好ましくは、この核酸配列は配列番号１またはその一部分によって表されるか、あるいは、配列番号２によって表されるアミノ酸配列、または、そのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする。あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列は、ＭＩＰＳ番号Ａｔ２ｇ０１６５０、配列番号３もしくは配列番号６によって表されるか、またはそれらの一部分であるか、あるいは、Ｑ９ＺＵ９３、配列番号４もしくは配列番号７によって表されるアミノ酸配列をコードするか、またはそれらのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする。本発明の適用性は、配列番号１によって表される核酸の使用にも、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列に基づくものでもないが、配列番号２のホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする他の核酸配列、または配列番号１の部分、または配列番号１とハイブリダイズする配列が、本発明の方法において用いられ得ることが、注意されるべきである。特に、本発明の方法に有用な核酸は、少なくともＵＢＸドメインを、好ましくはＵＢＸドメインおよびＰＵＧドメインを、そして必要に応じてジンクフィンガードメインも含むタンパク質をコードする。
【００６７】
本発明のさらなる実施形態に従って、本発明に従った方法において有用なヌクレオチド配列の導入および／または発現を促進する遺伝子構築物およびベクターが提供される。従って、本発明の第三の実施形態に従って、以下：
（ｉ）ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列の発現を調節し得る、１つ以上の調節配列；および、必要に応じて、
（ｉｉｉ）転写終結配列
を含む遺伝子構築物が、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする上記の核酸が、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ９２７１４０において表される核酸でない場合に、提供される。
【００６８】
本発明に従った方法において有用な構築物は、当業者に周知である組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る。この遺伝子構築物は、市販され得る、植物形質転換に適切でかつ目的の遺伝子の形質転換細胞における発現に適切なベクターに挿入され得る。この遺伝子構築物は、原核生物宿主細胞および／または真核生物宿主細胞における発現を可能にする、１つ以上の調節配列に、核酸配列が作動可能に連結された発現ベクターであり得る。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態に従って、この遺伝子構築物は、核酸配列を過剰発現するように設計された発現ベクターである。この核酸配列は、ＧＲＵＢＸタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列（例えば、本明細書中で前に記載された核酸配列のうちの任意のもの）であり得る。好ましい核酸配列は、配列番号１によって表される配列、もしくはその一部分、もしくはそれにハイブリダイズし得る配列、または配列番号２によって表される配列をコードする核酸配列、もしくはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表される配列をコードする核酸配列である。好ましくは、この核酸は、作動可能に連結される調節配列に関してセンス方向にクローン化される。
【００７０】
植物は、目的の配列（すなわち、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の発現を調節し得る核酸配列）を含むベクターを形質転換され、この配列は、１つ以上の調節配列（少なくともプロモーター）に作動可能に連結される。用語「調節エレメント」「調節配列」および「プロモーター」は、全て本明細書中で交換可能に用いられ、そして、連結される配列の発現に影響し得る、調節核酸配列をいうように、広い文脈の中で解釈されるべきである。上述の用語によって包含されるのは、古典的な真核生物ゲノム遺伝子に由来する転写調節配列（正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックスを、ＣＣＡＡＴボックス配列と共に、または含まずに、含む）、ならびに、発達的な刺激および／または外部的な刺激に応答して、あるいは組織特異的な様式で、遺伝子発現を変化させる、付加的な調節エレメント（すなわち、上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）である。古典的な原核生物遺伝子の転写調節配列もまた、この用語の範囲内に含まれ、この場合、−３５ボックス配列、および／または−１０ボックス転写調節配列を含み得る。用語「調節エレメント」はまた、細胞、組織、または器官における核酸分子の発現を与える、活性化する、または増強する、合成的な融合分子または誘導体を包含する。本明細書中で用いられる場合、用語「作動可能に連結された」とは、プロモーター配列が、目的の遺伝子の転写を開始し得るような、プロモーター配列と目的の遺伝子との間の機能的な連結をいう。
【００７１】
都合の良いことに、任意の型のプロモーターが、所望の結果に依存する核酸配列の発現を駆動するために用いられ得る。適切なプロモーターとしては、単子葉植物（例えば、イネまたはトウモロコシ）において活性であるプロモーターが挙げられる。
【００７２】
好ましくは、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする遺伝子の発現を調節し得る核酸配列は、種子優先プロモーターに作動可能に連結される。本明細書中で定義される場合、用語「種子優先」とは、種子組織において主に発現されるプロモーターをいうが、この組織に排他的である必要は無い。用語「種子優先」は、種子において活性である全てのプロモーターを包含する。種子組織は、胚乳、アリューロン、または胚を含む、種子の任意の部分を包含する。好ましくは、この種子優先プロモーターはプロラミンプロモーター、あるいは、類似した強さのプロモーターおよび／または類似した発現パターンを有するプロモーターである。最も好ましくは、プロラミンプロモーターは、配列番号５の発現カセットにおけるヌクレオチド１〜６５４によって表される。プロモーターの強さおよび／または発現パターンは、例えば、プロモーターをレポーター遺伝子と結合すること、および植物の種々の組織における、このレポーター遺伝子の発現をアッセイすることによって分析され得る。当業者に周知である１つの適切なレポーター遺伝子は、細菌性のβ−グルクロニダーゼである。他の種子優先プロモーターの例を表１に示し、そしてこれらのプロモーターは、本発明の方法にとって有用である。
【００７３】
（表１：本発明の実行において用いるための種子優先プロモーターの例）
【００７４】
【表１−１】
2007514431.tif 000002
【００７５】
【表１−２】
2007514431.tif 000003
【００７６】
【表１−３】
2007514431.tif 000004
また、細胞質に蓄積する、成熟したメッセージの量を増加させるために、部分的コード配列の５’非翻訳領域またはコード配列に、イントロン配列が付加され得る。植物発現構築物および動物発現構築物の両方における、転写単位内へのスプライシング可能なイントロンの封入が、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方において、遺伝子発現を１０００倍まで増加させることが示されている（ＢｕｃｈｍａｎおよびＢｅｒｇ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８、４３９５−４４０５（１９８８）；Ｃａｌｌｉｓら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１、１１８３−１２００（１９８７））。このようなイントロンの遺伝子発現の増強は、代表的には、転写単位の５’末端付近に位置される場合に最も大きくなる。トウモロコシのイントロンであるＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２、および６、Ｂｒｏｎｚｅ−１イントロンの使用が、当該分野で公知である。一般的には、Ｍａｉｚｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１１６章、ＦｒｅｅｌｉｎｇおよびＷａｌｂｏｔ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。
【００７７】
また、必要に応じて、１つ以上の終結配列が、植物に導入される構築物内において用いられ得る。用語「終結」は、一次転写物の３’プロセシングおよびポリアデニル化、ならびに転写の終止を合図する、転写単位の末端におけるＤＮＡ配列である調節配列を包含する。付加的な調節エレメントとしては、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーが挙げられ得る。当業者は、本発明の実行において用いるために適切であり得る終結配列およびエンハンサー配列に気付く。このような配列は公知であるか、当業者によって容易に得られ得る。
【００７８】
本発明の遺伝子構築物はさらに、特定の細胞型における維持および／または複製に必要な、複製起点の配列を含み得る。１つの例は、遺伝子構築物が、エピソーム様遺伝的エレメント（例えば、プラスミド分子またはコスミド分子）として細菌細胞内で維持されるために必要な場合である。好ましい複製起点としては、ｆ１−ｏｒｉおよびｃｏｌＥ１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
この遺伝子構築物は、必要に応じて、選択的マーカー遺伝子を含み得る。本明細書中で用いられる場合、用語「選択的マーカー遺伝子」は、本発明の核酸構築物をトランスフェクトまたは形質転換された細胞の同定および／または選別を促進するために、発現される細胞に表現型を与える任意の遺伝子を含む。適切なマーカーは、抗生物質耐性または除草剤耐性を与えるか、新規の代謝特性を導入するか、または視覚的な選択を可能にするマーカーから選択され得る。選択的マーカー遺伝子の例としては、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子（例えば、ネオマイシンおよびカナマイシンをリン酸化するｎｐｔＩＩ、またはハイグロマイシンをリン酸化するｈｐｔ）、除草剤に対する耐性を与える遺伝子（例えば、Ｂａｓｔａに対する耐性を提供するｂａｒ；グリフォセートに対する耐性を提供するａｒｏＡまたはｇｏｘ）、または代謝特性を提供する遺伝子（例えば、マンノースを単独の炭素源として植物に利用させるｍａｎＡ）が挙げられる。視覚的なマーカー遺伝子は、色（例えば、β−グルクロニダーゼ、ＧＵＳ）、発光（例えばルシフェラーゼ）、または蛍光（緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰおよびその誘導体）の形成を生じる。
【００８０】
好ましい実施形態において、上記で言及したような遺伝子構築物は、好ましくは種子優先プロモーター（例えば、イネプロラミンプロモーター）であるプロモーターと結合されたＧＲＵＢＸをセンス方向に含む。従って、本発明の別の局面は、プロラミンプロモーター、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ＧＲＵＢＸ遺伝子、およびＴ−ｚｅｉｎ＋Ｔ−ｒｕｂｉｓｃｏδＧＡ転写終結配列を含む、配列番号５と本質的に類似した発現カセットを含むベクター構築物である。配列番号５と本質的に類似する配列は、配列番号２と相同なタンパク質をコードするか、または配列番号１にハイブリダイズする第一の核酸配列を包含し、この第一の核酸配列は、プロラミンプロモーターまたは類似した発現パターンを有するプロモーターと作動可能に連結され、加えて、または代わりに、この第一の核酸は転写終結配列と連結される。
【００８１】
従って、本発明の別の局面に従って、以下：
（ｉ）配列番号１によって表される核酸配列、またはその相補鎖；
（ｉｉ）配列番号２によって表されるアミノ酸配列、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントをコードする核酸配列；
（ｉｉｉ）上記の（ｉ）または（ｉｉ）の核酸配列と（好ましくはストリンジェントな条件下において）ハイブリダイズし得る核酸配列であって、このハイブリダイズする配列は好ましくは、ＧＲＵＢＸタンパク質活性を有するタンパク質をコードする、核酸配列；
（ｉｖ）遺伝暗号の結果として縮重される、上記の（ｉ）〜（ｉｉｉ）に記載の核酸配列；
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）に記載の核酸配列の対立遺伝子改変体である核酸配列；
（ｖｉ）（ｉ）〜（ｖ）に記載の核酸配列の選択的スプライシング改変体である核酸配列
を含む群から選択される、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列が配置される発現カセットを含む、核酸構築物が提供される。
【００８２】
また、本発明は、本発明に従った方法によって獲得可能な植物を包含する。従って、本発明は、本発明に従った方法によって獲得可能な植物を提供し、この植物は改善された成長特性を有し、そしてこの植物は、変化されたＧＲＵＢＸタンパク質活性および／またはレベル、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の変化された発現を有するが、このＧＲＵＢＸタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＸ９２７１４０によって表される核酸配列によってはコードされない。
【００８３】
従って、本発明の第四の実施形態に従って、本発明の核酸分子の植物内への導入および発現を包含する、改善された成長特性を有するトランスジェニック植物の産生のための方法が提供される。
【００８４】
より具体的には、本発明は、改善された成長特性を有するトランスジェニック植物の産生方法を提供し、この方法は：
（ａ）植物または植物細胞に、ＧＲＵＢＸタンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする核酸配列、それとハイブリダイズし得る核酸配列、またはその一部分を導入する工程；
（ｂ）植物の成長を促進する条件下において上記の植物細胞を培養する工程
を包含する。
【００８５】
ＧＲＵＢＸタンパク質自身、および／またはＧＲＵＢＸ核酸自身は、植物細胞に直接導入されても、植物自身に直接導入されても（組織、器官、または植物の他の任意の部分への導入を含む）よい。本発明の好ましい特徴に従って、この核酸は好ましくは形質転換によって植物に導入される。好ましくは、この核酸は配列番号１によって表されるか、またはその一部分またはそれとハイブリダイズし得る配列であるか、あるいは、配列番号２またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表されるアミノ酸配列をコードする核酸である。あるいは、この核酸配列は、ＭＩＰＳ番号Ａｔ２ｇ０１６５０、配列番号３、配列番号６のいずれかによって、またはその一部分によって、または上述の配列のうちの任意のものにハイブリダイズし得る配列によって表される。あるいは、このアミノ酸配列は、ＳＰＴｒＥＭＢＬ  Ｑ９ＺＵ９３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＲ０１７４４、配列番号４、配列番号７のうちの任意のものによって、あるいは、それらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントによって表される配列であり得る。
【００８６】
本明細書中でいわれる場合、用語「形質転換」は、外因性のポリヌクレオチドの宿主細胞への移行を、移行のために用いられる方法に無関係に、包含する。器官形成によってであれ、胚形成によってであれ、引き続くクローン増殖の可能な植物組織は、本発明の遺伝子構築物を形質転換され得、そしてそこから植物全体が再生される。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種にとって利用可能な、かつ最も適したクローン増殖系に依存して変化する。例示的な組織標的としては、葉、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存の分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、および根端分裂組織）、および誘導性分裂組織（例えば、子葉分裂組織、および胚軸分裂組織）が挙げられる。ポリヌクレオチドは、宿主細胞に一過性に導入されても、安定的に導入されてもよく、そして非組み込み的に（例えば、プラスミドとして）維持されてもよい。あるいは、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。次いで、生じるトランスジェニック植物細胞は、当業者に公知の様式で、トランスジェニック植物を再生するために用いられ得る。
【００８７】
植物種の形質転換は、現在ではかなり慣例的な技術である。都合の良いことに、いくつかの形質転換方法のうちの任意のものが、目的の遺伝子を適切な祖先細胞に導入するために用いられ得る。形質転換方法としては、リポソームの使用、エレクトロポレーションの使用、遊離のＤＮＡの取り込みを増加させる化学物質、ＤＮＡの植物への直接的な注入、パーティクルガンボンバードメントの使用、ウイルスまたは花粉を用いる形質転換、およびマイクロプロジェクション（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）の使用が挙げられる。方法は、プロトプラストのためのカルシウム／ポリエチレングリコール法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ら、１８８２、Ｎａｔｕｒｅ、２９６、７２−７４；Ｎｅｇｒｕｔｉｕ  Ｉ．ら、１９８７年６月、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８、３６３−３７３）；プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｓｈｉｌｌｉｔｏ  Ｒ．Ｄ．ら、１９８５、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ、３、１０９９−１１０２）；植物材料へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ  Ａ．ら、１９８６、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ、２０２、１７９−１８５）；ＤＮＡまたはＲＮＡ被覆粒子ボンバードメント（Ｋｌｅｉｎ  Ｔ．Ｍ．ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２７、７０）（非組み込み的な）ウイルスによる感染などから選択され得る。ＧＲＵＢＸ遺伝子を発現する形質転換イネ植物は、好ましくは、イネの形質転換のための周知の方法（例えば以下のうちの任意のものに記載される：公開された欧州特許出願ＥＰ  １１９８９８５  Ａ１、ＡｌｄｅｍｉｔａおよびＨｏｄｇｅｓ（Ｐｌａｎｔａ、１９９、６１２−６１７、１９９６）；Ｃｈａｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（３）４９１−５０６、１９９３）、Ｈｉｅｉら（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６（２）２７１−２８２、１９９４）、これらの開示は、その全体が示されるかのように、本明細書中で参考として援用される）のうちの任意のものを用いる、アグロバクテリウム媒介性形質転換を介して産生される。トウモロコシの形質転換の場合、好ましい方法は、Ｉｓｈｉｄａら（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９６年６月；１４（６）：７４５−５０）またはＦｒａｍｅら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００２年５月；１２９（１）：１３−２２）のいずれかに記載されるようなものであり、これらの開示は、その全体が示されるかのように、本明細書中で参考として援用される。
【００８８】
一般的には、形質転換の後、植物細胞または細胞分類が、目的の遺伝子と共に同時に移行された、植物が発現できる遺伝子によってコードされる、１つ以上のマーカーの存在について選択され、続いて形質転換された材料が植物全体に再生される。
【００８９】
ＤＮＡ移行および再生に続いて、形質転換されたことが推定される植物は、例えばサザンブロット分析を用いて、目的の遺伝子の存在、コピー数、および／またはゲノムの組織化（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ）について評価され得る。あるいは、または加えて、新たに導入されたＤＮＡの発現レベルが、ノーザン分析および／またはウエスタン分析を用いてモニタリングされ得、両方の技術は、当業者にとって周知である。
【００９０】
作製された形質転換植物は、種々の手段（例えば、クローン増殖または古典的な育種技術）によって増殖され得る。例えば、第一世代（すなわちＴ１）のトランスジェニック植物は、自家受粉して同型接合の第二世代（すなわちＴ２）形質転換体を生じ、そしてこのＴ２植物はさらに、古典的な育種技術を通して増殖され得る。
【００９１】
作製された形質転換生物は、種々の形態をとり得る。例えば、これらは、形質転換された細胞と形質転換されていない細胞とのキメラ；クローンの形質転換体（例えば、全ての細胞が発現カセットを含むように形質転換される）；形質転換された組織と形質転換されていない組織との接木（例えば、植物において、形質転換された台木が形質転換されていない接ぎ穂に接木される）であり得る。
【００９２】
本発明は明白に、本明細書中で記載された方法のうちの任意のものによって作製された、任意の植物細胞または植物、ならびに、全ての植物の部分、その零余子、および子孫に広がる。本発明はさらに、上述の方法のうちの任意のものによって作製された、一次的な、形質転換された、またはトランスフェクトされた細胞、組織、器官、または植物全体の子孫を包含する範囲に及び、唯一の必要条件は、その子孫が、本発明に従った方法による親によって提供される遺伝子型特性および／または表現型特性と同じ遺伝子型特性および／または表現型特性を示すことである。また、本発明は、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする、単離された核酸分子を含む宿主細胞を含む。本発明に従った好ましい宿主細胞は植物細胞である。従って、本発明はまた、改善された成長特性を有する宿主細胞、トランスジェニック植物細胞、またはトランスジェニック植物を包含し、これらの成長特性は、この宿主細胞、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物細胞が、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の増加した発現、ならびに／あるいは、ＧＲＵＢＸタンパク質の増加した活性および／またはレベルを有するという点で特徴付けられる。
【００９３】
本発明はまた、植物の収穫可能な部分（例えば、種子、葉、果実、花、茎または茎培養物、根茎、根、塊茎、および鱗茎）、ならびに、それに直接的に由来する生産物（例えば、乾燥ペレットまたは乾燥粉末、油、脂質および脂肪酸、デンプン、またはタンパク質）に及ぶが、これらに限定されない。
【００９４】
本明細書中で用いられる場合、用語「植物」は、植物全体、植物の祖先および子孫、植物の部分、植物細胞、植物組織、および植物器官を包含する。従って、用語「植物」はまた、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、花、果実、種子、根（根茎および塊茎を含む）、苗条、鱗茎、茎、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子を包含する。本発明の方法に特に有用な植物としては、藻類、シダ類、Ｖｉｒｉｄｉｐｌａｎｔａｅ上科に属する全ての植物が挙げられ、特に、Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ亜種、Ａｃｅｒ亜種、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ亜種、Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ亜種、Ａｌｌｉｕｍ亜種、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ亜種、Ａｎａｎａｓ  ｃｏｍｏｓｕｓ、Ａｎｎｏｎａ亜種、Ａｐｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒａｃｈｉｓ亜種、Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ亜種、Ａｓｐａｒａｇｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ａｖｅｒｒｈｏａ  ｃａｒａｍｂｏｌａ、Ｂｅｎｉｎｃａｓａ  ｈｉｓｐｉｄａ、Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ  ｅｘｃｅｌｓｅａ、Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ亜種、Ｃａｄａｂａ  ｆａｒｉｎｏｓａ、Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｎａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｃａｐｓｉｃｕｍ亜種、Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ、Ｃａｒｉｓｓａ  ｍａｃｒｏｃａｒｐａ、Ｃａｒｔｈａｍｕｓ  ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、Ｃａｒｙａ亜種、Ｃａｓｔａｎｅａ亜種、Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ  ｅｎｄｉｖｉａ、Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ亜種、Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ  ｌａｎａｔｕｓ、Ｃｉｔｒｕｓ亜種、Ｃｏｃｏｓ亜種、Ｃｏｆｆｅａ亜種、Ｃｏｌａ亜種、Ｃｏｌｏｃａｓｉａ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｃｏｒｙｌｕｓ亜種、Ｃｒａｔａｅｇｕｓ亜種、Ｃｕｃｕｍｉｓ亜種、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ亜種、Ｃｙｎａｒａ亜種、Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ亜種、Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ亜種、Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ  ｌｏｎｇａｎ、Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ亜種、Ｄｉｏｓｐｙｒｏｓ亜種、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ亜種、Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ、Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｅｕｇｅｎｉａ  ｕｎｉｆｌｏｒａ、Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ亜種、Ｆａｇｕｓ亜種、Ｆｉｃｕｓ  ｃａｒｉｃａ、Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ亜種、Ｆｒａｇａｒｉａ亜種、Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ、Ｇｌｙｃｉｎｅ亜種、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ亜種、Ｈｉｂｉｓｃｕｓ亜種、Ｈｏｒｄｅｕｍ亜種、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｂａｔａｔａｓ、Ｊｕｇｌａｎｓ亜種、Ｌａｃｔｕｃａ  ｓａｔｉｖａ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ亜種、Ｌｅｍｎａ亜種、Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ、Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ、Ｌｉｔｃｈｉ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｌｏｔｕｓ亜種、Ｌｕｆｆａ  ａｃｕｔａｎｇｕｌａ、Ｌｕｐｉｎｕｓ亜種、Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ亜種、Ｍａｌｐｉｇｈｉａ  ｅｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｍａｌｕｓ亜種、Ｍａｍｍｅａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ、Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ、Ｍａｎｉｈｏｔ亜種、Ｍａｎｉｌｋａｒａ  ｚａｐｏｔａ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖａ、Ｍｅｌｉｌｏｔｕｓ亜種、Ｍｅｎｔｈａ亜種、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ亜種、Ｍｏｒｕｓ  ｎｉｇｒａ、Ｍｕｓａ亜種、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ亜種、��ｌｅａ亜種、Ｏｐｕｎｔｉａ亜種、Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ亜種，Ｏｒｙｚａ亜種、Ｐａｎｉｃｕｍ  ｍｉｌｉａｃｅｕｍ、Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａ  ｅｄｕｌｉｓ、Ｐａｓｔｉｎａｃａ  ｓａｔｉｖａ、Ｐｅｒｓｅａ亜種、Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ亜種、Ｐｈｏｅｎｉｘ亜種、Ｐｈｙｓａｌｉｓ亜種、Ｐｉｎｕｓ亜種、Ｐｉｓｔａｃｉａ  ｖｅｒａ、Ｐｉｓｕｍ亜種、Ｐｏａ亜種、Ｐｏｐｕｌｕｓ亜種、Ｐｒｏｓｏｐｉｓ亜種、Ｐｒｕｎｕｓ亜種、Ｐｓｉｄｉｕｍ亜種、Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ、Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ、Ｑｕｅｒｃｕｓ亜種、Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、Ｒｈｅｕｍ  ｒｈａｂａｒｂａｒｕｍ、Ｒｉｂｅｓ亜種、Ｒｕｂｕｓ亜種、Ｓａｃｃｈａｒｕｍ亜種、Ｓａｍｂｕｃｕｓ亜種、Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ、Ｓｅｓａｍｕｍ亜種、Ｓｏｌａｎｕｍ亜種、Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｓｐｉｎａｃｉａ亜種、Ｓｙｚｙｇｉｕｍ亜種、Ｔａｍａｒｉｎｄｕｓ  ｉｎｄｉｃａ、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ亜種、Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ  ｒｉｍｐａｕｉ、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ亜種、Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ亜種、Ｖｉｃｉａ亜種、Ｖｉｇｎａ亜種、Ｖｉｔｉｓ亜種、Ｚｅａ  ｍａｙｓ、Ｚｉｚａｎｉａ  ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ亜種、他を含む一覧から選択される、飼料（ｆｏｄｄｅｒ）または飼料（ｆｏｒａｇｅ）のマメ科植物、観賞用植物、食用作物、木、または低木を含む、単子葉植物および双子葉植物が挙げられる。
【００９５】
本発明の好ましい特徴に従って、上記の植物は、ダイズ、ヒマワリ、キャノーラ、アルファルファ、菜種、または綿を含む作物植物である。さらに好ましくは、本発明に従った植物は単子葉植物（例えば、サトウキビ）であり、最も好ましくは、穀類（例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、キビ、オオムギ、ライムギ、モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）またはカラスムギ）である。しかし、公知の真核生物のＧＲＵＢＸホモログの内のドメイン保存性は、細胞の代謝において、等しく保存された機能を示唆するので、本発明の方法が広範囲の植物に適用され得ると考えられる。
【００９６】
都合の良いことに、本発明に従った方法の実行は、種々の改善された成長特性を有する植物を生じ、このような改善された成長特性としては、それぞれ対応する野生型の植物と比較して、改善された成長、改善された収量および／または改善された生物体量、改変された構造、および改変された細胞分裂が挙げられる。
【００９７】
本発明は、植物の成長特性を改善する方法、または改善された成長特性を有する植物を作製する方法に関連し、ここで上記の成長特性は、以下：増加した収量、増加した生物体量、増加した総地上部分（ａｂｏｖｅ  ｇｒｏｕｎｄ  ａｒｅａ）、増加した植物の高さ、増加した腋芽数、増加した第一円錐花序の数、増加した第二円錐花序の数、増加した総種子数、増加した詰まった種子数、植物あたりの増加した総種子収量、増加した種子生物体量、増加した種子の大きさ、増加した種子の体積、増加した収穫指数、増加した千粒重（ＴＫＷ）、変化された生活環時間（ｃｙｃｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）および／または変化した成長曲線から選択される任意の１つ以上を含む。本発明はまた、上記で言及した成長特性の１つを、他の成長特性の１つに対する不利を引き起こすことなく、変化する方法（例えば、同じ数の詰まった種子および同じ種子収量を保持する一方での、地上の緑色組織部分の増加）を提供する。
【００９８】
用語「増加した収量」は、対応する野生型の植物の生物体量と比較して、植物の１つ以上の部分における生物体量の増加を包含する。この用語はまた種子収量の増加を包含し、種子収量の増加は、それぞれ、対応する野生型植物と比較して、種子の生物体量（種子重量）の増加、および／または（詰まった）種子の数の増加、および／または種子の大きさの増加、および／または種子の体積の増加を包含する。トウモロコシについては、種子収量の増加は、穂あたりの（種子の）列の増加、および／または列あたりの穀粒の数の増加に反映され得る。稲を例に取る場合、収量の増加は、以下：ヘクタールまたはエーカーあたりの植物の数、植物あたりの円錐花序の数、円錐花序あたりの小穂の数、円錐花序あたりの花の数の１つ以上における増加、特に、詰まった種子の割合の増加によって明らかにされ得る。種子の大きさおよび／または体積の増加はまた、種子の組成に影響し得る。種子収量の増加は、花の数および／または大きさの増加に起因し得る。収量の増加はまた、総生物体量を収穫可能な部分（例えば種子）の収量で割った割合として表される収穫指数；または千粒重を増加させうる。増加した収量はまた、高密度での植栽の能力（ヘクタールまたはエーカーあたりの植物の数）を包含する。
【００９９】
用語「改変された細胞分裂」は、細胞分裂の増加または減少、あるいは異常な細胞の分裂／細胞質分裂、変化した分裂面、変化した細胞極性、変化した細胞分化を包含する。この用語はまた、核内分裂、母性効果変異（ａｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ）、倍数性、多糸性、および核内倍加のような現象を包含する。
【０１００】
増加した生物体量および高さを有する植物は、対応する野生型の植物と比較される場合、改変された成長速度を示すと考えられ得る。本明細書中で用いられる場合、用語「改変された成長速度」は、植物の生活環における１つ以上のステージにおいて、植物の１つ以上の部分（緑色生物体量を包含し、そして種子を包含する）における、より速い成長の速度を包含するが、これに限定されない。用語「改変された成長」は、増強された活力、より早い開花、改変された生活環時間を包含する。成長速度が十分に増加される場合、結果として生じる、より短い生活環時間が、一度の通常の成長期間内でのさらなる収穫を可能にし得る。いくつかの植物の場合、同じ根茎からの収穫のさらなる回数も、可能となり得る。植物の収穫周期の改善は、（任意の特定の植物が成長され得、そして収穫され得る回数（約一年）の数の増加に起因して）エーカーあたりの一年間の生物体量生産の増加につながり得る。作物の生長のための土地の制限は、植栽の時点（早い時期）または収穫の時点（遅い時期）のいずれかにおいて、多くの場合、有害な環境条件によって決定されるので、成長速度の増加はまた、野生型の対照よりも、より広範囲の地理的地域における、改変された植物の栽培を可能にし得る。このような有害な条件は、収穫周期が短くされる場合、回避され得る。改変された成長を有する植物は、改変された成長曲線を示し得、そして改変されたＴｍｉｄ値またはＴ９０値（それぞれ、対応する野生型の植物と比較して、最大面積の半分に達するのに必要な時間、またはその面積の９０％に達するのに必要な時間）を有し得る。
【０１０１】
本発明の好ましい特徴に従って、本発明に従った方法の実行は、増加した収量を有する植物を生じる。好ましくは、増加した収量は、コントロールの植物と比較して、少なくとも収穫指数の増加を含む。従って、本発明に従って、植物の収量、特に収穫指数を増加させる方法が提供され、この方法は、植物における、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列の発現を増加させる工程、および／またはＧＲＵＢＸタンパク質自体の活性を増加させる工程を包含し、ここで好ましくは、このＧＲＵＢＸタンパク質は、配列番号１によって表される核酸配列もしくはその一部分によって、または、それらとハイブリダイズし得る配列によってコードされるか、あるいは、このＧＲＵＢＸタンパク質は、配列番号２によって表されるか、またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表される。あるいは、このＧＲＵＢＸは、ＭＩＰＳ番号Ａｔ２ｇ０１６５０、配列番号３のうちの任意のものによって表される核酸配列、またはそれらの一部分、またはそれらとハイブリダイズし得る配列によって表される核酸配列によってコードされ得るか、あるいはここで、このＧＲＵＢＸは、ＳＰＴｒＥＭＢＬ  Ｑ９ＺＵ９３、配列番号４のうちの任意のものによって表されるか、またはこれらの任意のもののホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントによって表される。
【０１０２】
本発明の方法は、植物の収穫指数を増加させるために用いられるので、本発明の方法は、作物植物に適用されることが好ましい。従って、本発明の方法は、特に、種子のために栽培される作物植物（例えば穀類）にとって有用である。従って、本発明の特定の実施形態は、穀類の収穫指数を増加させる方法に関連する。
【０１０３】
植物がストレスのない条件下にあろうと、または植物がコントロールの植物と比較して種々のストレスに曝されていようと、収量および／または成長の増加は生じる。植物は、代表的には、よりゆっくりと成長することで、ストレスへの曝露に応答する。重度のストレスの状態において、植物は完全に成長を止めすらし得る。一方で、穏やかなストレスは、成長を再開し得ることなく完全に成長を中止する植物を生じない、植物が曝される任意のストレスであると、本明細書中で定義される。農業の実施（灌漑、施肥、農薬処理）における発達に起因して、重度のストレスは、栽培される作物植物において多くの場合遭遇するものではない。結果として、穏やかなストレスによって誘導される損なわれた成長が、多くの場合、農業にとって望ましくない特徴である。穏やかなストレスは、植物が曝され得る代表的なストレスである。これらのストレスは、植物が曝される、毎日の生物的なストレス、および／または非生物的な（環境の）ストレスであり得る。代表的な非生物的すなわち環境のストレスとしては、異常な高温または低温／凍結に起因する温度ストレス、塩ストレス、水ストレス（乾燥または過剰な水）が挙げられる。非生物的ストレスはまた、化学物質によって引き起こされ得る。生物的ストレスは、代表的には、病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、または昆虫）によって引き起こされるストレスである。
【０１０４】
「改変された構造」は、細胞分裂における変化に起因し得る。本明細書中で用いられる場合、用語「構造」は植物の構造的特徴または構造的特徴の組み合わせの、任意の１つ以上を含む、植物の外観または形態学を包含する。このような構造的特徴としては、任意の細胞、組織、または器官、あるいは、植物の細胞、組織、または器官の群（特に、根、葉、苗条、茎または腋芽、葉柄、トリコーム、花、花序（単子葉植物および双子葉植物について）、円錐花序、花弁、柱頭、花柱、雄ずい、花粉、胚珠、種子、胚、内胚乳、種皮、アリューロン、繊維、形成層、木部、心材、柔組織、通気組織、篩要素、師部、または維管束組織が挙げられる）の、形、大きさ、数、位置、質感、配置、およびパターンが挙げられる。従って、改変された構造は、植物の改変された成長の全ての局面を含む。
【０１０５】
本発明はまた、植物の成長特性を改善する上での、好ましくは、植物の収量および／または生物体量を増加させる上での、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸の使用、およびその部分またはそれとハイブリダイズする核酸の使用に関連する。本発明はまた、植物の成長特性を改善する上での、ＧＲＵＢＸタンパク質の使用、ならびに、そのホモログ、誘導体、および活性なフラグメントの使用に関連する。この核酸配列は、好ましくは、配列番号１、配列番号６によって表されるか、またはその部分、またはそれとハイブリダイズし得る配列であるか、あるいは、配列番号２、配列番号４、配列番号７によって表されるアミノ酸配列、またはそのホモログ、誘導体、もしくは活性なフラグメントをコードする。
【０１０６】
本発明はまた、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸配列およびその改変体の、そして、ＧＲＵＢＸタンパク質自体、ならびにそのホモログ、誘導体、および活性なフラグメントの、成長調節因子としての使用に関連する。本明細書中で以前に記載した核酸配列（ならびに、その部分、および、それにハイブリダイズし得る配列）、および本明細書中で以前に記載したアミノ酸配列（ならびにそのホモログ、誘導体、および活性なフラグメント）が、本明細書中で以前に記載したように、植物の成長特性の改善において有用である。従って、これらの配列は、植物の成長を刺激または阻害するための、成長調節因子としての用途を見出す。従って、本発明は、植物の成長特性を改善する上での使用のための、ＧＲＵＢＸタンパク質、または配列番号２によって表されるタンパク質、あるいはそれらのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントを含有する組成物を提供する。本発明はさらに、植物の成長特性を改善する上での使用のための、ＧＲＵＢＸタンパク質をコードする核酸、または配列番号１によって表される核酸、あるいは、それらの一部分、またはそれらとハイブリダイズする配列を含有する組成物を提供する。本発明はまた、成長調節因子としての使用のための、上述のアミノ酸配列の内の任意のものによって表されるタンパク質、あるいはそのホモログ、誘導体、または活性なフラグメントを含有する組成物を提供する。
【実施例】
【０１０７】
ここで、本発明は以下の実施例に関して記載され、これらは例示のみのためのものである。
【０１０８】
ＤＮＡ操作：他に述べない限り、組換えＤＮＡ技術は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  （２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＣＳＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）またはＡｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９８）の第１巻および第２巻に記載される標準のプロトコルに従って行われる。植物分子研究のための標準の材料および方法は、Ｒ．Ｄ．Ｄ．Ｃｒｏｙによる、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ（ＵＫ）およびＢｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＵＫ）から刊行される、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ（１９９３）に記載される。
【０１０９】
（実施例１：ＣＤＳ０６６９配列のクローニング）
（タバコからのＧＲＵＢＸ遺伝子フラグメントのクローニング）
同調させたタバコＢＹ２細胞培養物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２）に対し、ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ実験を行い、そしてさらなるクローニングのために、細胞周期を調節した、配列タグを発現したＢＹ２を選抜した。この発現した配列タグを、タバコｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、そして目的の全長ｃＤＮＡ（すなわち、ＧＲＵＢＸ遺伝子をコードするもの（ＣＤＳ０６６９））を単離するために用いた。
【０１１０】
（ＢＹ２細胞の同調）
タバコＢＹ２（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２）培養細胞懸濁液を、以下のように、アフィディコリンをもちいて早期Ｓ期で細胞を止めることにより同調した。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２の細胞懸濁液を、記載された（Ｎａｇａｔａら、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．１３２、１−３０、１９９２）ように維持した。同調のために、７日目の定常培養物を、ＤＮＡポリメラーゼα阻害薬剤であるアフィディコリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；５ｍｇ／ｌ）を補充された新鮮な培地に、１０倍まで希釈した。２４時間後、新鮮な培地で何度か洗浄することによって、細胞を停止から解放し、その後に、これらの細胞周期の進行が再開した。
【０１１１】
（ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成）
総ＲＮＡを、ＬｉＣｌ沈降（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１）をもちいて調製し、そしてポリ（Ａ＋）ＲＮＡを、Ｏｌｉｇｏｔｅｘカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を製造業者の使用説明書に従って用いて、５００μｇの総ＲＮＡから抽出した。１μｇのポリ（Ａ＋）ＲＮＡから始めて、ビオチン化オリゴ−ｄＴ２５プライマー（Ｇｅｎｓｅｔ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いた逆転写によって、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉリガーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＵＳＢ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）、およびＲＮＡｓｅ−Ｈ（ＵＳＢ）を用いた鎖の置換（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）によって、二本鎖合成を行った。
【０１１２】
（ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ分析）
５００ｎｇの二本鎖ｃＤＮＡを、記載された（Ｖｏｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３（２１）４４０７−４４１４．１９９５；Ｂａｃｈｅｍら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．９（５）７４５−５３、１９９６）ＡＦＬＰ分析に改変を加えたＡＦＬＰ分析のために用いた。用いた制限酵素はＢｓｔＹＩおよびＭｓｅＩ（Ｂｉｏｌａｂｓ）であり、そして２つの別個の工程において消化を行った。１つの酵素による最初の制限消化の後、３’末端フラグメントをＤｙｎａビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）に、そのビオチン化した尾部によって捕捉し、一方で他のフラグメントを洗い流した。第二の酵素による消化の後、遊離した制限フラグメントを収集し、引き続くＡＦＬＰ工程におけるテンプレートとして用いた。前増幅のために、選択的ヌクレオチドを有さないＭｓｅＩプライマーを、３’のほとんどのヌクレオチドとしてＴまたはＣのいずれかを含むＢｓｔＹＩプライマーと合わせた。ＰＣＲ条件は記載された（Ｖｏｓら、１９９５）とおりであった。得られた増幅混合物を６００倍に希釈し、そして５μｌを、Ｐ３３標識されたＢｓｔＹＩプライマーおよびＡｍｐｌｉｔａｑ−Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いた選択的増幅のために用いた。増幅産物を、Ｓｅｑｕｉｇｅｌシステム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、５％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。乾燥したゲルをＫｏｄａｋ  Ｂｉｏｍａｘフィルムに曝し、そしてＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）においてスキャニングした。
【０１１３】
（ＡＦＬＰフラグメントの特徴付け）
異なって発現した転写物（その中で、（部分的な）転写物が配列番号１（すなわちＣＤＳ０６６９）に対応する）に対するバンドをゲルから単離し、そして溶出したＤＮＡを、選択的増幅と同じ条件下で再増幅した。選択的ＢｓｔＹＩプライマーを用いる、再増幅したポリメラーゼ連鎖反応産物の直接的な配列決定か、またはフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローン化した後の、個々のクローンの配列決定のいずれかによって、配列情報を得た。得られた配列を、ＢＬＡＳＴ配列アラインメント（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）３３８９−３４０２  １９９７）によって、公共的に利用可能なデータベースに存在するヌクレオチド配列およびタンパク質配列に対して比較した。利用可能な場合、有意な相同性を見出す機会を増やすために、タグ配列を、より長いＥＳＴまたは単離されたｃＤＮＡ配列と置換した。引き続いて、配列番号１（ＣＤＳ０６６９）に対応する物理的なｃＤＮＡクローンを、以下のように、市販のタバコｃＤＮＡライブラリーから増幅した。
【０１１４】
（ＧＲＵＢＸ遺伝子（ＣＤ０６６９）のクローン化）
挿入物の平均的な大きさが１，４００ｂｐであるｃＤＮＡライブラリーを、活性に分裂する、同調させていないＢＹ２タバコ細胞から単離したポリ（Ａ＋）ＲＮＡから調製した。これらのライブラリーの挿入物を、ａｔｔＢ  Ｇａｔｅｗａｙカセット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６．０内にクローン化した。このライブラリーから、４６，０００クローンを選抜し、３８４ウェルのマイクロタイタープレートに配列し、引き続いてナイロンフィルター上に二連でスポットした。配列したクローンを、プローブとして数百の放射標識されたタグのプール（配列ＣＤＳ０６６９、配列番号１に対応するＢＹ２−タグを含む）を用いてスクリーニングした。陽性のクローンを単離し（その中で、クローンがＣＤＳ０６６９、配列番号１に対応する）、配列決定し、そしてタグ配列と整列させた。タグとのハイブリダイゼーションが失敗した場合、タグに対応する全長ｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅によって選抜した：タグ特異的プライマーは、ｐｒｉｍｅｒ３プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｇｅｎｏｍｅ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｏｔｈｅｒ／ｐｒｉｍｅｒ３．ｈｔｍｌ）を用いて設計し、そして部分的ｃＤＮＡ挿入物を増幅するために、共通のベクタープライマーと組み合わせて用いた。５０，０００ｃＤＮＡクローン、１００，０００ｃＤＮＡクローン、１５０，０００ｃＤＮＡクローン、および３００，０００ｃＤＮＡクローンに由来するＤＮＡのプールを、ＰＣＲ増幅におけるテンプレートとして用いた。次いで、増幅産物をアガロースゲルから単離し、クローン化し、配列決定し、そしてこれらの配列をそのタグの配列と整列させた。次に、配列番号１のヌクレオチド配列に対応する全長ｃＤＮＡを、ＬＲ反応を介して、ｐＣＭＶｓｐｏｒｔ６．０ライブラリーベクターから、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）ドナーベクターであるｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）にクローン化し、結果としてエントリークローンｐ７７を生じた（図３）。
【０１１５】
（実施例２：ベクター構築）
引き続いて、エントリークローンｐ７７を、ｐ０８３０（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ形質転換に用いるデスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ））を用いるＬＲ反応に用いた。このベクターは、以下のものをＴ−ＤＮＡ境界内に機能的要素として含む：植物の選択的マーカー；視覚的マーカー発現カセット；および、エントリークローンに既にクローン化された目的の配列との、ＬＲインビボ組換えを意図するＧａｔｅｗａｙカセット。種子優先発現のためのプロラミンプロモーター（ＰＲＯ００９０）が、このＧａｔｅｗａｙカセットの上流にあった。ＬＲ組換え工程の後、結果として生じる発現ベクターｐ７２（図４）を、アグロバクテリウム  ＬＢＡ４４０４株に形質転換し、引き続いてＯｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ植物に形質転換した。
【０１１６】
（実施例３：ＰＲＯ００９０−ＣＤＳ０６６９構築物を用いた、イネの形質転換）
Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ｎｉｐｐｏｎｂａｒｅ品種の、成熟した乾燥種子から穀を取った（ｄｅｈｕｓｋ）。この種子を７０％エタノール中で１分間インキュベートし、次いで０．２％のＨｇＣｌ２内で３０分間処理し、そして滅菌した蒸留水による１５分間の洗浄を６回行うことで、滅菌を行った。次いで、この滅菌種子を、２，４−Ｄを含む培地（カルス誘導培地）上で発芽させた。暗黒化での４週間のインキュベートの後、胚形成性の胚盤由来のカルスを切除し、そして同じ培地上で増殖させた。２週間後、このカルスを、同じ培地上でさらに２週間継代培養することで、増加または増殖させた。共培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）の３日前に、胚形成性カルス片を、細胞分裂活性を促進するために、新鮮な培地上で継代培養した。共培養には、バイナリーベクターであるｐ７２を持つアグロバクテリウム  ＬＢＡ４４１４株を用いた。このアグロバクテリウム株を、適切な抗生物質を含むＡＢ培地上で、２８℃にて３日間培養した。次いで、この細菌を収集し、そして液体共培養培地に、約１のＯＤ６００で懸濁した。この懸濁物をペトリ皿に移し、そしてこのカルスを懸濁物に１５分間浸した。次に、このカルス組織をフィルター紙上にブロット乾燥し、固化した共培養培地に移して、そして暗黒化、２５℃で３日間インキュベートした。その後、共培養したカルスを、適切な濃度で選択因子が存在する、２，４−Ｄ含有培地上で、暗黒化、２８℃で４週間増殖させた。この期間の間、早く成長する耐性カルスの島が発生した。この物質の、再生培地への移行、および明所でのインキュベートに際して、胚形成能力が開放され、そして次の４〜５週間で苗条が発生した。カルスから苗条を切除し、そしてオーキシン含有培地上で２〜３週間インキュベートし、そこから土壌に移した。硬化した苗条を、温室内で、短い日数、高湿度下で成長させた。最終的に、移植から３〜５ヶ月後に、種子を収穫した。この方法は、単一遺伝子座形質転換体を、５０％を越える割合で産生した（ＡｌｄｅｍｉｔａおよびＨｏｄｇｅｓ、Ｐｌａｎｔａ  １９９、６１２−６１７、１９９６；Ｃｈａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２（３）、４９１−５０６、１９９３；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．６（２）、２７１−２８２、１９９４）。
【０１１７】
（実施例４：ＰＲＯ００９０−ＣＤＳ０６６９構築物を形質転換されたトランスジェニックイネの評価）
約１５〜２０個の、独立したＴ０イネ形質転換体を産生した。この一次形質転換体を、成長させ、そしてＴ１種子を収穫するために、組織培養チャンバーから温室へ移した。Ｔ１子孫が、導入遺伝子の存在／非存在について３：１に分離する、６つの事象を保持した。これらの事象のそれぞれについて、視覚的なマーカーの発現をモニタリングすることによって、導入遺伝子を含む約１０個のＴ１実生（ヘテロ接合体およびホモ接合体）、および導入遺伝子を欠失している約１０個のＴ１実生（ヌル接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｔｅ））を選択した。栄養成長および種子生産量に関する多くのパラメーターを評価し、そして全てのデータを以下に概説するように、統計学的に分析した：
（統計学的分析：ｔ検定およびＦ検定）
植物の表現型特性の全体的な評価に関する統計学的モデルとして、二元ＡＮＯＶＡ（改変体の分析）を用いた。本発明の遺伝子を形質転換された、全ての事象の全ての植物の、測定された全てのパラメーターについて、Ｆ検定を行った。このＦ検定は、全ての形質転換事象にわたるこの遺伝子の効果を調べるために、そしてこの遺伝子の全体的な影響（本明細書中で「全体的遺伝子効果」ともいわれる）を確認するために行われる。Ｆ検定の値が、このデータが有意であることを示す場合、「遺伝子の」効果が存在すると結論されるが、このことは、この遺伝子の存在または位置だけが、表現型の相違の原因となることを意味するものではない。真の全体的遺伝子効果についての有意性の閾値は、このＦ検定について、５％の確率水準に設定される。
【０１１８】
（４．１  栄養成長の測定：）
選択されたＴ１植物（導入遺伝子を有する約１０個、および導入遺伝子を含まない約１０個）を温室に移した。それぞれの植物は、表現型のデータを、対応する植物に明らかに結びつけるために、独自のバーコード標識を受けた。この選択されたＴ１植物を、以下の環境設定：明期＝１１．５時間、日光強度＝３０，０００ｌｕｘ以上、日中温度＝２８℃以上、夜間温度＝２２℃、相対湿度＝６０〜７０％、のもと、直径１０ｃｍの鉢の中で、土壌上で成長させた。トランスジェニック植物、および対応するヌル接合体を、無作為の位置で、隣り合わせて成長させた。播種の段階から、成熟の段階まで、それぞれの植物を、何度かデジタル画像化キャビネットを通し、画像化した。それぞれの時点で、少なくとも６つの異なる角度から、それぞれの植物のデジタル画像（２０４８×１５３６ピクセル、１６００万色）を得た。画像分析ソフトウェアを用いて、全ての植物の全てのデジタル画像から、自動化された方法にて、いくつかのパラメーターを引き出すことが出来た。
【０１１９】
（４．２  種子関連パラメーターの測定：）
成熟した一次円錐花序を収穫し、袋につめ、バーコードで標識し、次いで３７℃の乾燥器内で３日間乾燥させた。次いで、この円錐花序を脱穀し、全ての種子を収集して計数した。送風デバイスを用いて、詰まった穀を空の穀から分離した。空の穀を捨て、残った画分を再び計数した。詰まった穀の重量を、化学天秤で測った。この手順により、種子関連パラメーターのセットを引き出すことが出来る。
【０１２０】
（植物の収穫指数）
本発明の収穫指数を、総種子収量と地上部分（ｍｍ２）との間の比に係数１０６を掛けたものとして定義する。植物あたりの総種子収量を、上記に記載したように、植物から収穫した、全ての詰まった穀の重量を測ることで測定した。植物の地上部分は、背景から識別した地上の植物部分から、デジタル画像のピクセルの総数を計数することで決定した。この値を、異なる角度から同じ時点で撮った写真について平均化し、そして較正によって、ｍｍ２で表される物理的な面積値に変換した。実験から、この方法で測定された地上の植物部分は、植物の地上部の生物体量と相関することが示された。
【０１２１】
第一の実験で得たデータを、Ｔ２植物を用いる第二の実験において確認した。正しい発現パターンを有する３つの系統を、さらなる解析のために選抜した。Ｔ１における陽性の植物（ヘテロ接合体およびホモ接合体の両方）からの種子バッチを、マーカー発現をモニタリングすることでスクリーニングした。次いで、それぞれの選抜事象について、ヘテロ接合体の種子バッチを、Ｔ２評価のために保持した。それぞれの種子バッチの中で、同数の陽性の植物および陰性の植物を、評価のために、温室内で成長させた。
【０１２２】
総数１２０のＧＲＵＢＸトランスジェニック植物を、Ｔ２世代、すなわち事象あたり、導入遺伝子について２０の陽性の植物体および２０の陰性の植物体の、４０の植物体において評価した。
【０１２３】
重複する事象を含む２つの実験を行ったので、分析の結合を行った。このことは、２つの実験にわたる事象の一貫性を確かめるために有用であり、そして、このことが問題になる場合、結果の信頼性を増すために、両方の実験から得られる証拠を蓄積するために有用である。用いられた方法は、データの多層構造（すなわち、実験−事象−分離個体）を斟酌する、混合モデルアプローチであった。Ｐ値は、尤度比検定をχ二乗分布と比較することで得られる。
【０１２４】
第一の実験において、Ｔ１世代の６系統を評価した。収穫指数の平均的な増加があり、そして２系統は、ヌル接合体系統と比較して、５０％以上の有意な増加を有した（表２）。
【０１２５】
（表２：最高の成果を挙げる２つのＴ１事象の評価）
【０１２６】
【表２】
2007514431.tif 000005
Ｔ１世代におけるトランスジェニック系統（ＴＲ）およびコントロール植物（ヌル）についての収穫指数の測定の平均絶対値を、第２列および第３列に示し、第４列に絶対差、第５列に％における差、第６列に、ｔ検定において得られたｐ値として表される有意性を示す。
【０１２７】
Ｔ１世代について得られた結果を、Ｔ２世代において確認し；収穫指数の平均増加は１３％であり、そしてＦ検定は、この増加が有意であること（ｐ値が０．０４４７）を示した。さらに、これらのＴ２のデータを、Ｔ１世代についての結果と合わせた分析で再評価し、そして、Ｆ検定から得られたｐ値は、観察された効果が有意であること（ｐ値が０．０１８１）を、再度示した。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
ここで、本発明は、添付の図に関して記載される：
【図１Ａ】ＳＭＡＲＴツールによって認識される、ＵＢＸドメインを含む、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａタンパク質および動物の参照タンパク質を表す系統樹。ヒトのタンパク質は、そのＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０７９５１７（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ＵＢＸ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  １（ＵＢＸＤ１））、ＡＡＰ９７２６３（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  Ｆａｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＦＡＦ１  ｍＲＮＡ）、ＮＰ＿００５６６２（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ８（Ｄ８Ｓ２２９８Ｅ）、ＲＥＰ８）によって表され、そして、ラットのタンパク質は、ＮＰ＿１１４１８７（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ  ｐ４７  ｐｒｏｔｅｉｎ）によって表される。他の識別名（配列番号２、配列番号４、および配列番号７は除く）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａタンパク質のＧｅｎＢａｎｋまたはＳＰＴｒＥＭＢＬの登録番号である。
【図１Ｂ】ＳＭＡＲＴツールによって認識される、ＰＵＧドメインを含む植物タンパク質を表す系統樹。配列番号２および配列番号４が、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａのタンパク質（ＳＰＴｒＥＭＢＬ登録番号Ｑ９ＺＵ９３（発現されたタンパク質）、Ｑ９ＦＫＩ１（亜鉛メタロプロテイナーゼに類似）、Ｑ９ＭＡＴ３（Ｆ１３Ｍ７．１６タンパク質）、Ｑ９ＦＫＣ７（ゲノムＤＮＡ、第５染色体、ＴＡＣクローン：Ｋ２４Ｇ６）、Ｑ９ＳＦ１２（仮想タンパク質）、Ｑ９Ｃ５Ｓ２（エンドリボヌクレアーゼ／タンパク質キナーゼ  ＩＲＥ１）、Ｑ８ＲＸ７５（ＡＴ５ｇ２４３６０／Ｋ１６Ｈ１７＿７）、Ｑ９４ＩＧ５（Ｉｒｅ１ホモログ−１））と、およびイネのタンパク質であるＳＰＴｒＥＭＢＬ  Ｑ７ＸＩＴ１（ＯｓＩｒｅ１ｐ）と比較される。
【図２Ａ】コンセンサス配列による、ＵＢＸ１ドメインおよびＰＵＧドメインの定義（ＳＭＡＲＴデータベース）。コンセンサス／５０％、それぞれ／６５％、および／８０％は、ＵＢＸ１ドメインまたはＰＵＧドメインを含む参照配列の、最大５０％、最大６５％、および最大８０％についてコンセンサスな配列である。大文字は、種々のアミノ酸についての、標準の一文字ＩＵＰＡＣコードであり、他の文字は、以下：
【表３】
2007514431.tif 000006
に概説するような、アミノ酸の性質を記号で表す。
【図２Ｂ】配列番号２およびＱ９ＺＵ９３に示される、ＵＢＸドメイン配列およびＰＵＧドメイン配列。
【図２Ｃ】Ｑ９ＺＵ９３および配列番号２のアラインメント、ＰＵＧドメインに下線を引き、ＵＢＸドメインは太字にする。
【図２Ｄ】配列番号２および配列番号４のアラインメント、ＰＵＧドメインに下線を引き、ＵＢＸドメインは太字にする。
【図２Ｅ】配列番号４および配列番号７のアラインメント、ＰＵＧドメインに下線を引き、ＵＢＸドメインは太字にする。
【図３】エントリークローンｐ７７の概略表示であって、ｐＤＯＮＲ２０１骨格へのＧａｔｅｗａｙ（登録商標）クローニングのためのＡｔｔＬ１部位およびＡｔｔＬ２部位内に、ＣＤＳ０６６９を含む。ＣＤＳ０６６９は、タバコＧＲＵＢＸコード配列についての、内部コードである。このベクターはまた、細菌性カナマイシン耐性カセット、および細菌性複製開始点を含む。
【図４】プロラミンプロモーター（ＰＲＯ００９０）の制御下で、タバコＧＲＵＢＸ遺伝子（ＣＤＳ０６６９）を、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ内で発現するためのバイナリーベクター。このベクターは、左端境界（ＬＢリピート、ＬＢ  Ｔｉ  Ｃ５８）および右端境界（ＲＢリピート、ＲＢ  Ｔｉ  Ｃ５８）によって限定される、Ｔｉプラスミド由来のＴ−ＤＮＡを含む。左端境界から右端境界までに、このＴ−ＤＮＡは：トランスジェニック植物の抗生物質選抜のためのカセット；トランスジェニック植物の視覚的なスクリーニングのためのカセット；タバコＧＲＵＢＸ遺伝子の発現のための、ＰＲＯ００９０−ＣＤＳ０６６９−ゼインおよびｒｂｃＳ−δＧＡ二重ターミネーターのカセットを含む。このベクターはまた、細菌性複製のための、ｐＢＲ３２２由来の複製起点、ならびに、スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンによる細菌性選抜のための選抜可能マーカー（Ｓｐｅ／ＳｍｅＲ）を含む。
【図５−１】本発明に有用な配列の例。配列番号１および配列番号２は、実施例において用いた、それぞれＧＲＵＢＸ核酸およびＧＲＵＢＸタンパク質の配列である。配列番号３および配列番号４は、サトウキビＧＲＵＢＸオーソログのコード配列およびタンパク質配列を表し、配列番号５は、形質転換イネ植物において用いられた発現カセットの配列であり、配列番号６および配列番号７は、イネＧＲＵＢＸオーソログの、それぞれコード配列およびタンパク質配列を表す。
【図５−２】本発明に有用な配列の例。配列番号１および配列番号２は、実施例において用いた、それぞれＧＲＵＢＸ核酸およびＧＲＵＢＸタンパク質の配列である。配列番号３および配列番号４は、サトウキビＧＲＵＢＸオーソログのコード配列およびタンパク質配列を表し、配列番号５は、形質転換イネ植物において用いられた発現カセットの配列であり、配列番号６および配列番号７は、イネＧＲＵＢＸオーソログの、それぞれコード配列およびタンパク質配列を表す。
【図５−３】本発明に有用な配列の例。配列番号１および配列番号２は、実施例において用いた、それぞれＧＲＵＢＸ核酸およびＧＲＵＢＸタンパク質の配列である。配列番号３および配列番号４は、サトウキビＧＲＵＢＸオーソログのコード配列およびタンパク質配列を表し、配列番号５は、形質転換イネ植物において用いられた発現カセットの配列であり、配列番号６および配列番号７は、イネＧＲＵＢＸオーソログの、それぞれコード配列およびタンパク質配列を表す。
【図１Ａ】
2007514431.tif 000007
【図１Ｂ】
2007514431.tif 000008
【図２Ａ】
2007514431.tif 000009
【図２Ｂ】
2007514431.tif 000010
【図２Ｃ】
2007514431.tif 000011
【図２Ｄ】
2007514431.tif 000012
【図２Ｅ】
2007514431.tif 000013
【図３】
2007514431.tif 000014
【図４】
2007514431.tif 000015
【図５−１】
2007514431.tif 000016
【図５−２】
2007514431.tif 000017
【図５−３】
2007514431.tif 000018
【配列表】
2007514431000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月10日(2007.1.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007514431000001.app
【国際調査報告】
2007514431.tif 000027
2007514431.tif 000028
2007514431.tif 000029
2007514431.tif 000030
2007514431.tif 000031