(57)【要約】  本発明は、人参の主要な代謝産物であるジンセノサイド（Ginsenoside）Ｆ１（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオール；以下、「ジンセノサイドＦ１」という）または化合物Ｋ（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサダイオール；以下、「化合物Ｋ」という）を有効成分とするゼラチナーゼの生合成抑制剤；及びこれを含有する優れた表皮真皮境界部の分解抑制及び生成促進効果と保護効果を有する皮膚老化防止用化粧料及び医薬料組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋのうち１種以上を有効成分として含有するゼラチナーゼの生合成抑制剤。
【請求項２】
前記ゼラチナーゼは、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９であることを特徴とする請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載のゼラチナーゼの生合成抑制剤を含有する皮膚外用剤組成物。
【請求項４】
前記皮膚外用剤は、表皮真皮境界部の分解抑制または生成促進用であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記皮膚外用剤は、皮膚シワ改善または皮膚弾力改善用であることを特徴とする請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人参の主要な代謝産物であるジンセノサイド（Ginsenoside）Ｆ１（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオール）または化合物Ｋ（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサジオール）を主要な有効成分とするゼラチナーゼ生合成抑制剤；及びこれを含む表皮と真皮の境界部（以下、「表皮真皮境界部」という）の分解抑制及び生成促進効果に優れた皮膚老化防止用化粧料及び医薬料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、人体の一次防御膜であって、体内の諸器官を温度及び湿度変化や紫外線、公害物質など外部環境の刺激から保護し、且つ、体温調節などの生体恒常性の維持に重要な役割をしている。しかし、外部から受ける過度な物理的・化学的刺激、紫外線、ストレス及び栄養欠乏などは、皮膚の正常機能を低下させ、弾力損失、角質化、シワ生成などの皮膚老化現象を促進させるようになるが、特に、表皮真皮境界部は、紫外線により激しく損傷を受ける。
【０００３】
人間の皮膚において、老化による変化に関して検討した結果によれば、紫外線露出部皮膚では、境界部が分解され、多重となる多重化、又は断たれる断裂などの表皮真皮境界部の構造変化が２０代後半から既に発生すると言われている。また、紫外線Ｂの長期照射により誘導されたマウスシワモデルを使用した研究では、紫外線Ｂの照射により表皮で生成されたゼラチナーゼが表皮真皮境界部の損傷、真皮の損傷、そしてシワの形成を引き起こす可能性があることが明らかにされた。但し、紫外線を多く受けない非露出部皮膚では、高齢者の場合にも、このような変化がほとんど観察されないと報告されている。したがって、このような既存の検討結果によって、人間の紫外線露出部皮膚の表皮では、ゼラチナーゼ （gelatinase、ＭＭＰ−２、−９）の生成が誘導され、表皮真皮境界部の傷害に関与されるものと予測することができる。
【０００４】
ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２、−９）は、表皮真皮境界部の構成成分である４型コラーゲン、７型コラーゲン及びその他の細胞外基質成分を分解する酵素である。ゼラチンザイモグラフィ法（Gelatin zymography）及び酵素免疫法（ＥＬＩＳＡ）を用いた既存の分析結果によれば、ＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の両方が紫外線露出部表皮で検出されたと言われる。また、前記分析で、額の凍結皮膚では、皮膚中のゼラチナーゼ活性が表皮基底層及び有棘層の付近に存在し、顔面などの紫外線露出部皮膚の表皮でも、ゼラチナーゼが存在することが明らかにされた。したがって、紫外線が表皮基底細胞でのゼラチナーゼ生成を誘導し、その一部が真皮境界部の破壊に作用し、残りが表皮まで到達するという事実を予想できる。
【０００５】
マウスに紫外線を長期照射して製作したシワモデルにおいてシワ形成機作に関して検討した結果をみれば、紫外線Ｂを長期照射した皮膚では、ゼラチナーゼ活性が表皮全層で検出された。表皮真皮境界部の傷害は、紫外線Ｂを照射してから５週目で観察され始め、７週目、１０週目でその程度が高くなった。特に、１０週目には、真皮境界部の断裂と一部での多重化が観察された。また、真皮乳頭部のコラーゲン繊維では、紫外線Ｂの長期照射により繊維密度の低下が観察された。したがって、誘導されたゼラチナーゼが表皮真皮境界部の傷害と乳頭真皮のコラーゲン分解に関与する可能性が示唆された（第９６回ＦＪセミナー集１２−１５、２００２）。
【０００６】
表皮真皮境界部が損傷される場合、境界部の扁平化、多重化、断裂などが生じ、シワが生成され、皮膚が垂れ、容易に傷が生じる可能性が高くなり、障壁（barrier）としての本然の機能が喪失されれば、外部環境の汚染物質を表皮真皮境界部で濾すことができないため、有害物質が真皮まで侵入する可能性が高くなり、皮膚が容易に損傷され得る。損傷された表皮真皮境界部を回復させたり、健康な状態に維持するためには、まず、その構成成分が正しく維持され得るようにしなければならない。年齢が増加するにつれて、生合成が減少すると知られた成分は、４型コラーゲン、７型コラーゲン、ラミニン１０／１１であり、変化がないものは、ラミニン５、生合成が増加するものは、分解に関連した酵素であるゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）である（LavkerなどJ. Invest. Derm. 1979, 73:59-65, PouliotなどExp. Dermatol. 2002, 11:387-397）。
【０００７】
このような紫外線や外部ストレスによる皮膚老化現象を防止し、健康で且つ弾力ある皮膚を維持するために、従来、各種動物、植物、微生物などから得た生理活性物質が強化された化粧品を使用することによって、皮膚の固有機能を維持させ、皮膚細胞を活性化させて、皮膚老化を効果的に抑制するための努力がなされてきた。
【０００８】
化粧品の原料には、皮膚への副作用を誘発することなく、皮膚老化防止効果を有するものが適当であり、これらのうち人参抽出物に対する関心が非常に高くて、継続的な研究が進行されている。今までの人参抽出物に対する研究方向をみれば、人参抽出物（ginseng extract）から人参サポニン（ginseng saponin）の抽出、人参アグリコン（ginseng aglycon）の製造及び人参サポニンの精製を通じて人体内部での主要な代謝産物であるジンセノサイドＦ１または化合物Ｋを製造、分離、精製する方向に展開された。
【０００９】
人参サポニンは、ダマラン（dammaran）タイプのトリテルペン（triterpene）である非糖部のＲ１、Ｒ２、Ｒ３位置のアルコール性ＯＨ基にグルコース（glucose）、ラムノース（rhamnose）、キシロース（xylose）及びアラビノース（arabinose）のような糖類がエーテル結合された構造を有し、現在まで人参で合計２９種が明らかにされた。前記人参サポニンの各成分は、１９６４年Ｓｈｉｂａｔａが人参に含有された配糖体という意味でジンセノサイド（ginsenoside）と命名し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により分離された移動距離の順にオレアナン（oleanane）系サポニンであるジンセノサイド−Ｒｏとジンセノサイド−Ｒａ、−Ｒｂ１、−Ｒｂ２、−Ｒｃ、−Ｒｄ、−Ｒｅ、−Ｒｆ、−Ｒｇ１、−Ｒｇ２、−Ｒｇ３及びＲｈなどと命名した。
【００１０】
このような人参サポニンは、７５０余種の植物に含有された他の植物のサポニンとは化学構造が異なるだけでなく、薬理効能も異なるものであることが判明された。特に、人参サポニンは、薬性が非常に温和であり、過量投与による毒性がないだけでなく、溶血作用もほとんどないことが明らかにされた。また、人参サポニンを老化抑制剤の原料として応用するために、人参サポニンの効能を維持し、特に皮膚透過性を増加させた生物切換（bioconversion）された人参アグリコン（aglycon）の皮膚での効能が確認された。
【００１１】
前述したような人参抽出物及び人参サポニンを利用した事例として、化粧料（米国特許第５，５６５，２０７号、第５，５６７，４１９号、第５，５７８，３１２号、第５，６６３，１６０号、第５，６２６，８６８号、第５，７５３，２４２号、第５，７４７，３００号、第５，８５３，７０５号、第６，０２７，７２８号、第６，０６３，３６６号、第６，２２１，３７２号、及び第６，２２８，３７８号）、医薬原料（米国特許第５，５６９，４５９号、第５，５７１，５１６号、第５，５８７，１６７号、第５，６７４，４８８号、第５，６６５，３９３号、第５，６２９，３１６号、第５，７７６，４６０号、第５，７３９，１６５号、第５，９１６，５５５号、第６，０７１，５２１号、第６，０８３，５１２号、及び第６，２５５，３１３号）及び分離、精製技術（米国特許第５，５９１，６１１号、第５，５９１，６１２号、第５，７３６，３８０号、第５，７８９，３９２号、第５，７８０，６２０号、第５，９２２，５８０号、第５，９３５，６３６号、第６，１３２，７２６号、第６，１５６，８１７号、及び第６，２０７，１６４号）などに関する多くの研究結果が報告された。
【００１２】
しかし、人参サポニンは、ダマランタイプにＲ１、Ｒ２及びＲ３位置のアルコール性ＯＨ基に糖類がエーテル結合で連結された構造を有していて、親水性が大きく、分子量が大きくなるにしたがって、皮膚透過性及び吸水性が低くなり、人参サポニン自体の親水性性質に起因して皮膚の角質層を通過せず、人参サポニンが皮膚の内部に流入しがたいという問題点があった。一方、最近、サポニンの代謝物に関する研究が進行されつつ、サポニン自体よりは、サポニンが腸内細菌により分解された腸内細菌代謝物が人参サポニンの効能を示す活性本体であることが示唆されていて、また、人参のサポニン成分のうちアグリコンに糖（グルコース）が１つ付いた構造よりなるジンセノサイドＲｈ１、Ｒｈ２及びＦ１と化合物Ｋなどが癌細胞増殖抑制作用、腫よう増殖抑制作用、抗ガン剤の抗癌活性増大作用などの薬理作用があるものと知られている。
【００１３】
したがって、人参サポニンから糖の一部を除去することによって得られたジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋを皮膚に効果的に導入させるための剤型化についての研究が行われ、それによる細胞増殖効果、コラーゲン生合成効果などの皮膚老化防止効果が証明された（韓国公開特許第２００３−００６００１７号、第２００３−００６００１８号）。
【００１４】
一方、表皮真皮境界部に対する特許をみれば、“老化防止用化粧料組成物（韓国公開特許第２００３−００６６９１２号）”においてヌスビトハギ抽出物、“皮膚基底膜形成促進剤、人工皮膚形成促進剤及び人工皮膚の製造方法（韓国公開特許第２００２−００１９９２０号）”、“ラミニン−５生成促進剤及びインテグリン−α６β４生成促進剤を含有する組成物（日本公開特許第２００３−２２６６５５号）”、“皮膚基底膜部活用組成物（日本国特許公開第２００３−１８３１２１号、第２００２−３３８４６０号）”、“皮膚基底膜形成促進剤、人工皮膚形成促進剤及び人工皮膚の製造方法（日本国特許公開第２００１−２６９３９８号）”、“ラミニン−５及び基底膜構造の形成（日本国特許公開第２０００−５１３２２０号）”などが公開されている。すなわちヌスビトハギ抽出物、米糠油、フェニルプロパノイドなどを表皮真皮境界部の再生用に使用した。しかし、人参成分に対しては、表皮真皮境界部に対する分解抑制及び生成促進効能と、皮膚シワ及び弾力の改善の用途として全然知られていない。
【非特許文献１】LavkerなどJ. Invest. Derm. 1979, 73:59-65, PouliotなどExp. Dermatol. 2002, 11:387-397
【特許文献１】米国特許第５，５６５，２０７号
【特許文献２】米国特許第５，５６７，４１９号
【特許文献３】米国特許第５，５７８，３１２号
【特許文献４】米国特許第５，６６３，１６０号
【特許文献５】米国特許第５，６２６，８６８号
【特許文献６】米国特許第５，７５３，２４２号
【特許文献７】米国特許第５，７４７，３００号
【特許文献８】米国特許第５，８５３，７０５号
【特許文献９】米国特許第６，０２７，７２８号
【特許文献１０】米国特許第６，０６３，３６６号
【特許文献１１】米国特許第６，２２１，３７２号
【特許文献１２】米国特許第６，２２８，３７８号
【特許文献１３】米国特許第５，５６９，４５９号
【特許文献１４】米国特許第５，５７１，５１６号
【特許文献１５】米国特許第５，５８７，１６７号
【特許文献１６】米国特許第５，６７４，４８８号
【特許文献１７】米国特許第５，６６５，３９３号
【特許文献１８】米国特許第５，６２９，３１６号
【特許文献１９】米国特許第５，７７６，４６０号
【特許文献２０】米国特許第５，７３９，１６５号
【特許文献２１】米国特許第５，９１６，５５５号
【特許文献２２】米国特許第６，０７１，５２１号
【特許文献２３】米国特許第６，０８３，５１２号
【特許文献２４】米国特許第６，２５５，３１３号
【特許文献２５】米国特許第５，５９１，６１１号
【特許文献２６】米国特許第５，５９１，６１２号
【特許文献２７】米国特許第５，７３６，３８０号
【特許文献２８】米国特許第５，７８９，３９２号
【特許文献２９】米国特許第５，７８０，６２０号
【特許文献３０】米国特許第５，９２２，５８０号
【特許文献３１】米国特許第５，９３５，６３６号
【特許文献３２】米国特許第６，１３２，７２６号
【特許文献３３】米国特許第６，１５６，８１７号
【特許文献３４】米国特許第６，２０７，１６４号
【特許文献３５】韓国公開特許第２００３−００６００１７号
【特許文献３６】韓国公開特許第２００３−００６００１８号
【特許文献３７】韓国公開特許第２００３−００６６９１２号
【特許文献３８】韓国公開特許第２００２−００１９９２０号
【特許文献３９】日本公開特許第２００３−２２６６５５号
【特許文献４０】日本公開特許第２００３−１８３１２１号
【特許文献４１】日本公開特許第２００２−３３８４６０号
【特許文献４２】日本公開特許第２００１−２６９３９８号
【特許文献４３】日本公開特許第２０００−５１３２２０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このような状況下で、本発明者らは、皮膚老化に影響を及ぼすいろいろな要因を効果的にコントロールする方法を研究し、人参ジンセノサイドＦ１または化合物Ｋを含有する外用剤を使用する場合、自然老化と光老化により発生する表皮真皮境界部の変性、断裂、多重化などの変化を防止したり、回復させることができることを発見した。すなわち、ジンセノサイドＦ１と化合物Ｋによる表皮真皮境界部の分解抑制及び生成促進作用は、表皮と真皮の結合力を強化させることができるので、このような成分を含むことによって、皮膚老化防止用化粧料及び医薬料を提供できることを知見し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明は、ジンセノサイドＦ１と化合物Ｋを含有する皮膚老化防止用外用剤を提供する。また、本発明は、前記ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋを用いて皮膚の表皮真皮境界部の分解を抑制し、表皮と真皮の結合力を強化させることによって、皮膚老化を防止できる方法を提供する。
【００１７】
具体的に、本発明は、人参の主要な代謝産物であるジンセノサイド（Ginsenoside）Ｆ１（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサトリオール；以下、「ジンセノサイドＦ１」という）または化合物Ｋ（２０−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−２０（Ｓ）−プロトパナキサダイオール；以下、「化合物Ｋ」という）を有効成分として含有するゼラチナーゼの生合成抑制剤；及びこれを含有する優れた表皮真皮境界部分解抑制及び生成促進効果と保護効果を有する皮膚老化防止用化粧料及び医薬料組成物を提供する。
【００１８】
本発明は、ジンセノサイドＦ１、化合物Ｋ、またはこれらの混合物を含有する外用剤組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋのうち少なくとも１種以上を含有するゼラチナーゼ生合成抑制剤を提供する。前記ゼラチナーゼは、好ましくは、ＭＭＰ−２またはＭＭＰ−９である。
【００２０】
本発明に係る前記ゼラチナーゼ抑制剤を含有する外用剤は、皮膚に使用する場合、皮膚の表皮真皮境界部を保護することができる。前記皮膚の表皮真皮境界部の保護効果によって皮膚老化防止及びシワ改善の効果を得ることができ、皮膚弾力の増進を図ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、ジンセノサイドＦ１または化合物Ｋは、抑制剤または組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％が含有されることができる。好ましくは、０．０１〜５重量％の量で含有される。
【００２２】
本発明に使われたジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋの構造は、下記化学式１及び化学式２で表現される。
【００２３】
【化１】
2007518795.tif 000002
【００２４】
【化２】
2007518795.tif 000003
【００２５】
本発明で使われたジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋは、人参精製サポニンを酸、アルカリまたは酵素などで加水分解し、人参サポニンから糖を除去した後、反応液をシリカコラムに通過して製造することができる。ここで、使用可能な酵素には、サポニンの糖結合を分解するβ−グルコース分解酵素（β−glucosidase）、α、β−アラビノース分解酵素（α、β−arabinosidase）、α、β−ラムノース分解酵素（α、β−rhamnosidase）などエキソ糖結合分解酵素及びこれらを含有している複合酵素剤などを挙げることができる。
【００２６】
本発明では、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋを用いて表皮真皮境界部を保護することによって、皮膚シワ、弾力など皮膚の老化につれて発生する諸症状を効果的に改善することができる。ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋの使用量は、in vitro実験及びin vivo実験を根拠にして、組成物の総重量に対して０．００１〜１０重量％、好ましくは、０．０１〜５重量％が適当である。
【００２７】
本発明の外用剤組成物は、シワ及び弾力を改善させる目的で使われるもので、その剤型において特に限定されるものではなく、例えば、柔軟化粧水、栄養化粧水、マッサージクリーム、栄養クリーム、パック、ジェルまたは皮膚粘着タイプ化粧料の剤型を有する化粧料組成物であることができ、また、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチまたは噴霧剤のような経皮投与型剤型であることができる。
【００２８】
また、各剤型の外用剤組成物において、前述のような必須成分以外の他の成分は、その他の外用剤の剤型または使用目的などに応じて当業者が困難性無しに適宜選定して配合することができる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例及び試験例により本発明の構成及び作用効果を具体的に説明する。しかし、本発明がこれらの例に限定されるわけではない。
【００３０】
［参考例１］人参精製サポニンの調製
紅参（ＫＴ＆Ｇ；韓国タバコ人参公社−６年根紅参）２Ｋｇに、水を含むエタノール４Ｌを入れ、７７℃で３回還流抽出した後、１５℃で６日間沈積させた。その後、濾過布を用いた濾過と遠心分離を通じて残渣と濾液を分離し、分離された濾液を減圧濃縮して得られたエキスを水に懸濁した後、エーテル１Ｌで５回抽出して色素を除去し、水層を１−ブタノール５００ｍｌで３回抽出した。得られた１−ブタノール層を５％ＫＯＨで処理した後、蒸留水で洗浄し、減圧濃縮して１−ブタノールエキスを得、これを少量のメタノールに溶解した後、大量のエチルアセテートに追加して、生成された沈殿物を乾燥することによって、人参精製サポニン１００ｇ（収率：５％）を得、同一操作を１０回繰り返して１Ｋｇの人参精製サポニンを準備した。
【００３１】
下記実施例のジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋの抽出及び確認は、韓国特許出願第２００１−６７９６４号（公開番号10-2003-0037005）を参考にした。
【００３２】
［実施例１］酸加水分解方法によるジンセノサイドＦ１の調製
参考例１で得た人参精製サポニン１００ｇに２０倍（v/w）の硫酸／５０％エタノール溶液（v/w）を加え、１００℃水浴槽で６時間加熱還流させて、人参サポニンに結合された糖結合を加水分解させた。反応液を減圧濃縮して溶媒を除去し、残渣に蒸留水（1,000ml）を加えて懸濁させた後、同量のエーテルで３回抽出した。得られたエーテル層を蒸留水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウム（MgSO4）で脱水、濾過、濃縮して、粗生成物を得た。得られた粗生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノールの比率を９：１から４：１に変化させる方法で極性を増加させながら分離）により分離し、各分画に対して薄膜クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水＝６５／３５／１０、Ｒｆ＝０．６５）を用いてジンセノサイドＦ１の分画を分離、回収し、最終的に、ジンセノサイドＦ１２４００ｍｇ（収率２．４％）を得た。
【００３３】
［実施例２］酵素分解方法を用いた化合物Ｋの調製
参考例１で得られた人参精製サポニン１００ｇを１，０００ｍｌのシトレート緩衝溶液（ｐＨ５．５）に溶解させ、これにペニシリウム属から分離したナリンジナーゼ酵素１ｇを添加し、４０℃水浴上で４８時間攪拌させながら反応させた。薄層クロマトグラフィーにより周期的に確認し、基質が完全に消失されれば、熱水中で１０分間加熱して反応を終了させた後、反応液は、同量のエーテルで３回抽出、濃縮した。得られた生成物をシリカゲルコラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノールの比率を９：１から４：１に変化させる方法で極性を増加させながら分離）により分離し、各分画に対して薄膜クロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール／水＝６５／３５／１０、Ｒｆ＝０．７３）を用いて化合物Ｋの分画を分離、回収し、最終的に、化合物Ｋ４４００ｍｇ（収率４．４％）を得た。
【００３４】
［試験例１］紫外線によるゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−９）とゼラチナーゼＢ（MMP-2）の生合成抑制効能測定
人体の角質形成細胞を１０4／ｗｅｌｌの濃度で２４孔平板培養器に培養し、２４時間後に紫外線Ｂを３０ｍＪ／ｃｍ2で照射した後、実施例１及び実施例２で分離した化合物を各々０．１ｐｐｍ、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ含む培地に交替した。培養２日目、上澄み液を収穫し、ゼラチンゼルを利用したザイモグラフィ（zymography）を行った後、生成されたＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の量をデンシトメータで測定し定量した。その結果は、実施例１及び実施例２で分離した化合物を含まない対照群培地（以下、「対照群」という）でのＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の量を１００にして比較値を表１に示した。
【００３５】
【表１】
2007518795.tif 000004
【００３６】
表１から、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋを含有する本発明の組成物は、皮膚基質である４型コラーゲンと７型コラーゲンを分解する酵素であるＭＭＰ−２とＭＭＰ−９の生合成を減少させることができ、表皮真皮境界部の分解を防止できる成分であることが分かる。
【００３７】
［試験例２］皮膚細胞の４型コラーゲン生合成効能測定
人体の角質形成細胞を５Ｘ１０4／ｗｅｌｌの濃度で２４孔平板培養器に培養した後、実施例１及び実施例２で分離した化合物を各々０．１ｐｐ、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ含む培地に交替した。培養２４時間後、上澄み液を収穫（harvest）し、ドットブロット（Dot Blot）方法を用いて生成された４型コラーゲンの量を定量した。その結果は、対照群を１００にして比較値を表２に示した。
【００３８】
【表２】
2007518795.tif 000005
【００３９】
表２から、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋを含有する本発明の組成物は、４型コラーゲン生合成を濃度依存的に増加させることが分かる。
【００４０】
［試験例３］皮膚細胞の７型コラーゲン生合成効能測定
人体の繊維芽細胞を１０4／ｗｅｌｌの濃度で２４孔平板培養器に培養した後、実施例１及び実施例２で分離した化合物を各々０．１ｐｐ、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ含む培地に交替した。培養２４時間後、上澄み液を収穫（harvest）し、ドットブロット（Dot Blot）方法を用いて生成された７型コラーゲンの量を定量した。その結果は、対照群を１００にして比較値を表３に示した。
【００４１】
【表３】
2007518795.tif 000006
【００４２】
［試験例４］皮膚細胞のラミニン１０／１１生合成効能測定
人体の角質形成細胞を５Ｘ１０4／ｗｅｌｌの濃度で２４孔平板培養器に培養した後、実施例１及び実施例２で分離した化合物を各々０．１ｐｐ、１ｐｐｍ、１０ｐｐｍ含む培地に交替した。培養２４時間後、上澄み液を収穫（harvest）し、ウェスタンブロット（Western Blot）方法を用いて生成されたラミニン１０／１１の量を定量した。その結果は、対照群を１００にして比較値を表４に示した。
【００４３】
【表４】
2007518795.tif 000007
【００４４】
［試験例５］無毛マウスで表皮真皮境界部の変化測定
本発明の組成物により紫外線による表皮真皮境界部の変化を確認するために、下記表５の組成比に基づいて外用剤を栄養クリームの剤型で製造し、各々剤型例１〜３と命名した。
【００４５】
【表５】
2007518795.tif 000008
【００４６】
試験のために、無毛マウスの背中部位に前記剤型例１〜３及び比較剤型例１を２週間に亘って１週間に５回塗布し、その後、１２週間は、１週間に紫外線を３回照射しながら、剤型例１〜３及び比較剤型例１を５回塗布した後、生検し、皮膚真皮境界部の変化を電子顕微鏡を用いて測定した。
その結果、紫外線を照射しながら、ジンセノサイドＦ１とＫを塗布した場合、比較剤型例１に比べて表皮真皮境界部の変形、分裂、単離、多重化症状がほとんど生じないことを観察することができるので、ジンセノサイドＦ１と化合物Ｋが皮膚のシワを減少させ、弾力を強化させることができたことを確認することができ、その結果を下記表６に示した。
【００４７】
【表６】
2007518795.tif 000009
【００４８】
［試験例６］人間でのシワ改善効果（画像分析）
前記表５の比較剤型例１と剤型例１〜３に対してシワ改善効果を確認するために、次のように評価した。３０代女性８０人を各々比較剤型例１及び剤型例１、２及び３群として２０人ずつ４組みに分けて毎日１回８週間塗布するようにした後、シリコンを用いてレプリカを取ってシワの状態をvisiometer（SV600, Courage and Khazaka Electronic GmbH, Germany）で測定して画像分析し、表７に塗布８週後の各々のパラメータ値から塗布前パラメータ値を引き抜いたものの平均を示した。
【００４９】
【表７】
2007518795.tif 000010
【００５０】
前記表６に示されるように、剤型例１〜３の外用剤組成物は、皮膚シワ改善効果に非常に優れていることが分かり、特に剤型例３の場合、その効果が最も優れていた。
【００５１】
［試験例７］人体で皮膚弾力改善測定
前記表５に基づいて製造した栄養クリームの皮膚弾力改善効果を測定した。温度２４−２６℃、湿度７５％条件で３０才以上の健康な女性４０人を４組みに分け、各組みに比較剤型例１と剤型例１〜３の栄養クリームを毎日２回ずつ１２週間顔面に塗布した後、皮膚弾力測定機（Cutometer SEM 575, Courage and Khazaka Electronic GmbH, Germany)を用いて皮膚弾力を測定し、その結果を表８に示した。表８の結果は、Cutometer SEM 575のΔＲ８（Ｒ８（左側）−Ｒ８（右側））値に記載したが、Ｒ８値は、皮膚粘弾性（viscoelasticity）の性質を示す。これと別途に試験を終了した時点に、試験対象者にとってアンケート用紙を作成するようにし、機器的な評価と同時に、主観的な効能評価をも実施した。
【００５２】
【表８】
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【００５３】
表８のように、ジンセノサイドＦ１及び化合物Ｋが含有された剤型例１、２及び３の物質を塗布した群では、比較剤型例１を塗布した群に比べて皮膚弾力性がさらに増加し、特に、剤型例３の場合、優れた弾力増加を示した。
【００５４】
これと同時に、アンケート調査を通じて、剤型例１〜３を塗布した場合、皮膚弾力性が改善されることを確認することができ、特に、剤型例３の場合、アンケートでも優れた結果を示した。結果を下記表９に示した。
【００５５】
【表９】
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【００５６】
以下、本発明の他の剤型例を説明するが、本発明に係るジンセノサイドＦ１、化合物Ｋを含有する外用剤の剤型がこれらの例に限定されるものではなく、これらは、いずれもゼラチナーゼ の生合成を抑制する効能を有する。
【００５７】
【表１０】
2007518795.tif 000013
【００５８】
【表１１】
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【００５９】
【表１２】
2007518795.tif 000015
【００６０】
【表１３】
2007518795.tif 000016
【００６１】
【表１４】
2007518795.tif 000017
【００６２】
以上、説明したように、ジンセノサイドＦ１と化合物Ｋのうち１種以上を含有することによって、ゼラチナーゼ （ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９）の生合成を減少させ、４型コラーゲン、７型コラーゲン、ラミニン１０／１１の生合成を増加させ、表皮真皮境界部の分解を抑制し、生成を促進させ、皮膚老化の諸症状であるシワ及び弾力を改善する抗老化効能を有する皮膚外用剤組成物として使用することができる。
【国際調査報告】
2007518795.tif 000018