(57)【要約】  虚血性と非虚血性の心筋症を区別するための遺伝子発現予想プロファイルを作成する方法であって、虚血性又は非虚血性の心筋症に罹患している患者から臨床検査試料を得る工程、少なくとも複数の前記検査試料から核酸配列を分離する工程、遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列の各個体に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、虚血性検査試料の遺伝子発現レベルを非虚血性検査試料の遺伝子発現レベルと比較することによって遺伝子発現の差を有する遺伝子を同定する工程、及び遺伝子発現の差があると同定された遺伝子を含む遺伝子発現予想プロファイルを同定し、前記予想プロファイルが虚血性と非虚血性の心筋症を区別する工程を含む、前記方法。
2007514441.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血性と非虚血性の心筋症を区別するための遺伝子発現予想プロファイルを作成する方法であって、
虚血性又は非虚血性の心筋症に罹患している患者から臨床検査試料を得る工程、
少なくとも複数の前記患者からの核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列の各個体に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
虚血性検査試料の遺伝子発現レベルを非虚血性検査試料の遺伝子発現レベルと比較することによって遺伝子発現の差を有する遺伝子を同定する工程、及び
遺伝子を含む遺伝子発現予想プロファイルを同定し、遺伝子発現の差があると同定された前記予想プロファイルが虚血性と非虚血性の心筋症を区別する工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約90％の感受性と約89％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約89％の感受性と約80％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の感受性と約90％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約90％の感受性と約80％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の感受性及び/又は約83％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、89％の感受性及び/又は約60％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の感受性及び/又は約100％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約100％の特異性を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、表3に挙げられた90の遺伝子を含んでいる、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
前記遺伝子発現レベルが、DNAマイクロアレイに前記分離された核酸配列をハイブリッドすることによって同定される、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
虚血性検査試料における遺伝子発現レベルを非虚血性検査試料における遺伝子発現と比較することによる前記遺伝子発現の差が、マイクロアレイ有意分析(SAM)を行うことによって求められる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
虚血性と非虚血性の心筋症を区別する前記遺伝子発現予想プロファイルがマイクロアレイ予想分析(PAM)を行うことによって同定される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
表3に挙げられた90の遺伝子を含む、虚血性と非虚血性の心筋症を区別するための遺伝子発現予想プロファイル。
【請求項１６】
虚血性と非虚血性の心筋症を区別するための診断方法であって、
心筋症を有する患者から臨床検査試料を得る工程、
前記検査試料から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
前記検査試料の遺伝子発現レベルを請求項1記載の方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイルと比較して、予想分析を行うことによって虚血性又は非虚血性の心筋症を求める工程
を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記遺伝子発現プロファイリング法が、DNAマイクロアレイである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記臨床検査試料が、LVADの取付け前の心筋組識から得られる、請求項16記載の診断方法。
【請求項１９】
前記臨床検査試料が、LVADの除去後の心筋組識から得られる、請求項16記載の診断方法。
【請求項２０】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、表3に挙げられた90の遺伝子を含んでいる、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
虚血性又は非虚血性の心筋症に罹患している患者から臨床検査試料を得る工程、
少なくとも複数の前記患者から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列の各個体に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
虚血性検査試料の遺伝子発現レベルを非虚血性検査試料の遺伝子発現レベルと比較することによって遺伝子発現の差を有する遺伝子を同定する工程、及び
遺伝子発現の差があると同定された遺伝子を含む遺伝子発現予想プロファイルを同定し、前記予想プロファイルが虚血性と非虚血性の心筋症を区別する工程
を含む方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイル。
【請求項２２】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約90％の感受性と約89％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約89％の感受性と約80％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の感受性と約90％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約90％の感受性と約80％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の感受性及び/又は約83％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、89％の感受性及び/又は約60％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、100％の感受性及び/又は約100％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、約100％の特異性を有する、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、表3に挙げられた90の遺伝子を含んでいる、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子発現レベルが、DNAマイクロアレイに前記分離された核酸配列をハイブリッドすることによって同定される、請求項21記載の方法。
【請求項３３】
虚血性と非虚血性の心筋症を区別するための遺伝子発現予想プロファイルを作成する方法であって、
虚血性又は非虚血性の心筋症に罹患している患者から臨床検査試料を得る工程、
少なくとも複数の前記患者からの核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列の各個体に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
虚血性検査試料の遺伝子発現レベルを非虚血性検査試料の遺伝子発現レベルと比較することによって遺伝子発現の統計学的に有意な差を有する遺伝子を同定する工程、及び
遺伝子発現の統計学的に有意な差があると同定された遺伝子を含む遺伝子発現予想プロファイルを同定し、前記予想プロファイルが虚血性と非虚血性の心筋症を区別する工程
を含む、前記方法。
【請求項３４】
虚血性又は非虚血性の心筋症に罹患している患者から臨床検査試料を得る工程、
少なくとも複数の前記患者から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列の各個体に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
虚血性検査試料の遺伝子発現レベルを非虚血性検査試料の遺伝子発現レベルと比較することによって遺伝子発現の統計学的に有意な差を有する遺伝子を同定する工程、及び
遺伝子発現の有意差があると同定された遺伝子を含む遺伝子発現予想プロファイルを同定し、前記予想プロファイルが虚血性と非虚血性の心筋症を区別する工程
を含む方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイル。
【請求項３５】
虚血性と非虚血性の心筋症を区別するために診断する段階を含む、虚血性又は非虚血性の心筋症の治療方法であって、前記診断が、
心筋症をもつ患者から臨床検査試料を得る工程、
前記検査試料から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
前記検査試料の遺伝子発現レベルを請求項1記載の方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイルと比較して、予想分析を行うことによって虚血性又は非虚血性の心筋症を求める工程
を含む、前記方法。
【請求項３６】
前記遺伝子発現プロファイリング法が、DNAマイクロアレイである、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
前記臨床検査試料が、LVADの取付け前の心筋組識から得られる、請求項35記載の診断方法。
【請求項３８】
前記臨床検査試料が、LVADの除去後の心筋組識から得られる、請求項35記載の診断方法。
【請求項３９】
前記遺伝子発現予想プロファイルが、表3に挙げられた90の遺伝子を含んでいる、請求項35記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔背景技術〕
関連出願
本出願は、2003年12月18日出願の米国仮特許出願第60/524,834号の優先権を主張し、この明細書の内容は本願明細書に含まれるものとする。
【０００２】
〔技術分野〕
本発明は、心筋症、特に、虚血性と非虚血性の心筋症の診断と予後に関する。特に、本発明は、評価される心臓組織の遺伝子発現プロファイルに基づいて虚血性心筋症と非虚血性心筋症を区別する診断法に関する。本発明は、また、遺伝子プロファイリング方法、及び前記方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイルに関する。
【０００３】
遺伝子発現プロファイリングは、種々の疾患における診断と予後の正確さを高めるツールとして非常に有望なものである。この技術は、固形悪性腫瘍や血液悪性腫瘍において広範囲にわたる成功を得、まもなく臨床試験に使うことができる。(Alizadeh AA et al., Nature (2000);Lapointe J., et al., Proc Natl Acad Sci. (2004); Tibshirani R., et al., Proc Natl Acad Sci. (2002); Dhanasekaran SM, et al., Nature (2001); Pomeroy, et al., Nature (2002); Van de Vijver MJ, et al., N Engl J Med. (2002); Golub TR, et al., Science (1999); Rosenwald A., et al., N Engl J M. (2002); http://www.agilent.com/about/newsroom/presrel/2003/2laug 2003a.html (2004)). 対照的に、診断、特に虚血性の病因に関する診断を高めるとともに心筋症において患者の驚くべき重要な患者の結果を予想する能力で、このための遺伝子発現プロファイリングの適用はその最も初期の段階にある。現在まで、わずかな研究から、遺伝子発現が心不全と非心不全(Barrans J D., et al., Am J Pathol. (2002); Tan FL., et al., Proc Natl Acad Sci. (2002); Yung CK., et al., Genomics; Steenman M., et a1., Physiol Genomics (2004))、拡張型心筋症と肥大性心筋症(Hwang JJ, Al1en PD, Tseng GC et af.,Physiol Genomics (2002))、補助人工心臓の配置の前後(Chen Y., et al., Physiol Genomics (2003); Hall JL., et al., Physiol Genomics (2003); Chen MM.' et al., Circulation; Blaxal BC, et al., L7 AM C oll Cardiol (2003)で異なることが示されている。これらの研究は、新規な遺伝子経路の同定に集中した。臨床的に関連した心筋症亜型を区別する遺伝子発現の応用は、以前は行われてなく、腫瘍と異なり、心筋症の進行の病因から独立している最終共通路があるという主張のために、議論の余地があると考えられる。
【０００４】
虚血性心筋症は、移植された心臓の組織学上の心筋梗塞の証拠として定義される。遺伝子発現プロファイリングは、虚血性心筋症の診断において画像診断や代謝ツールの有効な補助的手段として役に立つ。類似した所見にもかかわらず、虚血性と非虚血性の心筋症は異なった疾患である。虚血性心筋症患者は、非虚血性対応患者と比較して生存が少なく(Felker GM, et al., N Engl J Med. (2000); Felker GM, et al., J AM Coll Cardiol. (2003); Dries DL, et al., J Am Coll Cardiol. (2001))治療に対して異なって応答する。(Kittleson M, et al, J Am Coll Cardiol. (2003); Doval HC, et al., Lancet (1994); Singh SN, et al., N Engl J Med. (1995); Reynolds MR, et al., Circulation (2003)).虚血性遺伝子発現プロファイルは、特にそれらの冠状動脈疾患と不釣合いな心不全患者において診断の洞察を与える。このような患者の割合は、1つの観察的研究において最高11％であると推定される(Eelker GM, et al., J Am Coll cardiol. (2002))。最も利益を得る人々を同定することによって個々の患者に治療を合わせる能力は、心臓不全患者において極めて重要である。(Reynolds MR, Circluration(2003))
【０００５】
以前の研究では、LVAD(左心補助人工心臓)支持後の虚血性と非虚血性の心筋症試料における遺伝子発現の差が指摘された。しかしながら、その研究は、予測原則をを確立せず、将来を見通して有効ともしなかった。(Blaxall BC, et al., J Am Coll Cardioll. (2003)) 他の研究では、虚血性と非虚血性の心筋症試料の遺伝子発現プロファイルが比較されたが、区別して発現された遺伝子は見いだされなかった(Steenman M, et al., Physiol Genomics. (2003))。その研究は2人の虚血性心筋症患者と2人の非虚血性心筋症患者だけからプールした試料を用い、この研究は遺伝子発現の変化を検出するために十分な能力をもたなかったようである(Mukherjee S, et al., J Comput Biol. (2003))。他の研究には、心不全と非心不全間の差別的遺伝子発現は、年齢と性差によることが示されている(Boheler KR, et al., Proc NatL Acad Sci USA. (2003))。しかしながら、この分析は、虚血性と非虚血性の心筋症には広げられていない。他の研究にも、心不全がLVAD(左心補助人工心臓)支持後に遺伝子発現の変化を示すことが示された。(Chen Y., et al., Physiol Genomics (2003 ); Hall JL., et al., Physiol Genomics (2004); Chen MM., et al., Circulation (2003); Blaxal BC, et al., J AM Coll Cardiol. (2003)). 更に、他の技術によって有効とされるまで、遺伝子発現分析は仮説とみなされた。(Cook SA, et al., Circ Res. (2002))
【０００６】
我々の主要な新規の知見は、遺伝子発現に基づく署名(gene expression-based signature)が心筋症の虚血性と非虚血性の病因を正確に区別するということである。遺伝子発現プロファイルは、腫瘍学における病因又は臨床成果とうまく相関した(Alizadeh AA et al., Nature (2000); Lapointe J., et al., Proc Natl Acad Sci. (2004); Tibshirani R., et al., Proc Natl Acad Sci. (2002); Dhanasekaran SM, et al., Nature (2001); Pomeroy, et al., Nature (2002); Van de Vijver MJ, et al., N Engl J Med. (2002); Golub TR, et al., Science (1999); Rosenwafd A., et al., N Engl J Med. (2002); Hastie T, et al., Genome Biol. (2000) and renal allograft rejection, (Sarwal M, et al., N Engl J Med. (2003)). 発現プロファイルに基づく予後ツールは、腫瘍学における臨床試験である。(http://www.agilent.com/about/newsroom/presrel/2003/21aug2003a.html (2004)) 心筋症における診断と予後の技術を高めることが等しく求められている。我々の知見は、遺伝子発現プロファイリングが疾患病因を正確に同定ことができることを示すものである。このことは、実質的に臨床的な意味を有し、予後と治療に対する応答を決定する際に発現プロファイリングに基づくバイオマーカを組み込む継続中の努力を強く支持するものである。
【０００７】
〔発明の開示〕
本発明の目的は、末期心筋症患者において心不全の一般的な原因を識別することができる遺伝子発現プロファイルを提供することである。この目的を達成する方法が異なる研究室において得られるデータを高度に一般化できることを我々は確立した。
本発明の他の目的は、分子署名を心不全の診断評価と治療技術を高めるために用いることができ、疾患病因に基づいて治療と予後の決定が変わることができることを確立することである。(Felker GM, et al., N Engl J Med. (2000); Felker GM, et a1., J Am Coll Cardiol (2003); Dries DL, et al. , J Am Coll Cardiol. (2001); Kittleson M, et al., J Am Coll Cardiol. (2003); Doval HC, et al., Lancet (1994); Singh SN, et al., N Engl J Med. (1995); Follath F, et al., J Am Coll Cardiol. (1998))
【０００８】
より詳しくは、本発明は、虚血性と非虚血性の心筋症を区別するための遺伝子発現予測プロファイルを作成する方法であって、
虚血性又は非虚血性心筋症に罹患している患者から臨床検査試料を得る工程、
少なくとも複数の前記患者から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列の各個体に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
虚血性試料の遺伝子発現レベルを非虚血性試料の遺伝子発現レベルと比較することによって遺伝子発現の統計学的に有意な差を有する遺伝子を同定する工程、及び
虚血性と非虚血性心筋症を区別する遺伝子発現予測プロファイルを同定する工程
を含む、前記方法に関する。
【０００９】
本発明は、また、虚血性と非虚血性の心筋症を区別するための診断方法であって、
心筋症を有する患者から臨床検査試料を得る工程、
前記検査試料から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
前記試料の遺伝子発現レベルを上記方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイルと比較して、予想分析を行うことによって虚血性又は非虚血性心筋症を求める工程
を含む、前記方法に関する。
【００１０】
本発明は、更に、
虚血性又は非虚血性心筋症を罹患している患者から臨床検査試料を得る工程、
少なくとも複数の前記患者から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列の各個体に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
虚血性試料の遺伝子発現レベルを非虚血性試料の遺伝子発現レベルと比較することによって遺伝子発現の差、好ましくは統計学的に有意な差を有する遺伝子を同定する工程、及び
虚血性と非虚血性の心筋症を区別する遺伝子を含む遺伝子発現予想プロファイルを同定する工程
を含む方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイルに関する。
【００１１】
本発明は、更に、虚血性又は非虚血性心筋症を治療する方法であって、虚血性と非虚血性心筋症を区別するために診断する段階を含む、前記方法に関する。診断法は、
心筋症をもつ患者から臨床検査試料を得る工程、
前記検査試料から核酸配列を分離する工程、
遺伝子発現プロファイリング法によって前記核酸配列に対応する遺伝子発現レベルを得る工程、
前記試料の遺伝子発現レベルを請求項1の方法に従って作成された遺伝子発現予想プロファイルと比較して、予想分析を行うことにより虚血性又は非虚血性心筋症を決定する工程
を含んでいる。
【００１２】
他の目的及び本発明の特徴は、添付図面と共に考えられる以下の詳細な説明から明らかになる。しかしながら、図面が単に説明だけのために設計され、本発明の限度の定義として設計されてなく、添付の請求の範囲を参照すべきであることは理解されなければならない。更に、図面は、必ずしも一定の比率で描かれてなく、特に明記しない限り、本明細書に記載される構造と手順を単に概念的に示しているものであることも理解されなければならない。
【００１３】
図1は、末期心筋症試料のトレーニングセット(遺伝子発現予想プロファイルを同定するために用いられる)、試験セット(予想プロファイルの正確さを評価するために用いられる)、リモデリング(remodeling)後試料への分離を示す図である。全体の予想の正確さを、トレーニングセット試料と試験セット試料の210の組合せを調べることによって評価した。
図2は、機能的グループによって分類された虚血心と非虚血心におけるアップレギュレートした遺伝子とダウンレギュレートした遺伝子の数を示す棒グラフである(www. geneontology - org)。
図3は、遺伝子発現の類似性と試料の相関性に基づく48の試料における90の遺伝子の階層的なクラスター形成である。各横列は遺伝子記号によって分類された遺伝子であり、各縦列は試料である。各々の細胞の色は、試料のセット全体における発現の平均レベルと相対した、対応する試料における対応する遺伝子の発現レベルを反映している。平均より高い発現レベルは青で濃淡がつけられ、平均より下のものは、赤で濃淡がつけられている。試料は、病因に基づいて2つの異なったクラスタを形成する。矢印は、それらの病因クラスタに現れない試料を示している。ICMは虚血性心筋症を示し、NICMは非虚血性心筋症を示す。
【００１４】
〔発明を実施するための最良の形態〕
本明細書に用いられる遺伝子発現予想プロファイル又は分子署名又は遺伝子発現に基づく署名という用語は、新規の遺伝子セットの不明な遺伝子発現プロファイルが比較又は評価され得る遺伝子セットの既知の発現プロファイルを意味する。
臨床検査試料という用語は、種々の方法におけるヒト心筋から得られた試料を意味する。
【００１５】
本明細書に用いられる“核酸”という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、適切な場合には、リボ核酸(RNA)のようなポリヌクレオチドを意味する。用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作成されたRNA又はDNAの類似体、また、記載されている実施態様に適用できるものとして、一本鎖(センス又はアンチセンス)と二本鎖のポリヌクレオチドを含むことも理解されなければならない。EST、染色体、cDNA、mRNA、rRNAは、核酸と呼ぶことができる分子の代表例である。
【００１６】
本明細書に用いられる発現プロファイリング法という用語は、DNA マイクロアレイ、スポットアレイ、cDNAアレイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)のような技術に基づいて遺伝子発現レベルを検出する方法である。
本明細書に用いられる臨床検査試料又は試料のランダム分割という用語は、グルーピングとマッチングから得られた全ての可能な成果を得る試料のグルーピングとマッチング方法を意味する。
【００１７】
予想分析という用語は、一般的には、遺伝子発現予想プロファイルを同定するための分析法を意味する。特には、用語は、新規で不明な試料から遺伝子セット(“分子署名”としても記載される)を得、新規の試料におけるこのセットの遺伝子の発現レベルを既知の遺伝子発現予想プロファイルの遺伝子発現と比較することによって、新規で不明な試料が属するグループを決定することを可能にすることを意味する。セットにおける遺伝子の発現レベルは、グループ内で十分に且つ一貫して異なり、新規の試料が属するグループについて区別することを可能にする。
【００１８】
本発明は、遺伝子発現プロファイルの確立と共に種々の方法が使われる。本発明に使われる方法、例えば、臨床的な試料収集、核酸サンプル調製、DNAマイクロアレイ技術、遺伝子プロファイル解析と関連している統計的分析は一般に利用できるが、遺伝子発現プロファイリングに基づく虚血性又は非虚血性心筋症の診断と治療は、一群の遺伝子が分離・同定されて、虚血性心不全を非虚血性心不全から正確に区別するまで実行可能であると考えられなかった。
本発明は一般的には以下に記載される工程を含む。
【００１９】
患者及び臨床検査試料
全般的な想定、診断法、及び/又は予後、及びこのような診断に基づく治療を与えることができる遺伝子発現想定プロファイルを作成するために、非虚血性心筋症に罹っている患者の心筋組識から臨床検査試料が集められる。
好適実施態様においては、虚血性心筋症をもつ心筋組識が得られた全ての患者は、重篤な冠状動脈疾患(左の前下行動脈と少なくとも1つの他の心外膜冠状動脈の>75％の狭窄)及び/又は実証した心筋梗塞の病歴を示した。(Hare JM, et al., J Am Coll Cardiol. (1992); Felker GM, et al., J Am Coll Cardiol. (2003)) 非虚血性の患者は、心筋梗塞、血管再生又は冠状動脈疾患の病歴を有しなかった。
好ましくは手術からの心筋組識を液体窒素で直ちに凍結し、-80℃で保存する。組織は、他の方法によって保存することもできる。
【００２０】
発現プロファイリング法
心筋遺伝子の発現プロファイルを確立するために、DNAマイクロアレイを用いることができる。トリゾル試薬とキアゲンRNeasyカラムを用いて心筋RNAを冷凍試料からの分離することができる。SuperScript Choice系(Invitrogen Corp、カールズバッド、カリフォルニア)を用いて5μg RNAから二本鎖cDNAを合成することができる。続いてビオチン標識cRNAを作成するために鋳型として各二本鎖cDNAを用いることができる。各試料からの15μgの断片化ビオチン標識cRNAを、Affymetrix U133A マイクロアレイ(Affymetrix、サンタクララ、カリフォルニア)にハイブリダイズした。Affymetrixチップ処理を行った。U133Aマイクロアレイは、21,722転写物(15,713全長、4,534非発現配列標識(EST)、1,475 EST)の検出を可能にする。アレイハイブリダイゼーションの品質は、GAPDHとβ-アクチンの3'→5'プローブシグナル比によって評価することができる。1-1.2の比率は、許容しうるRNA調製物を示す。
【００２１】
遺伝子発現プロファイルを得るためにDNAマイクロアレイが好ましいが、当業者に既知の他の発現法、例えば、スポットアレイcDNAアレイやRT-PCRもまた、ほぼ同じ結果を得るために用いることができる。
【００２２】
データ正規化
データ正規化の目的は、プローブ・セットデータをマイクロアレイハイブリダイゼーション(マイクロアレイから得られた生データ)から遺伝子発現値に変換することである。マイクロアレイは、各々の一定の転写物に複数のプローブを含有し、各転写物の発現のためにこれらのプローブの各々に対するハイブリダイゼーションの強度を合わせて単一の定量値を作成しなければならない。更に、正規化は、チップ内や試料全体の変化の修正を可能にするので異なるチップからのデータを同時に分析することができる。参考文献(Irizarry RA, et al., Biostatistics (2003)and Irizarry RA, et al., Nucleic Acids Res. (2003))に記載される強力なマルチアレイ分析(RMA)アルゴリズムは、Affymetrixプローブセットデータを全試料の遺伝子発現レベルへ前処理するために用いることができる。Irizarry RA, et al., Biostatistics (2003); Irizarry RA, et al., Nucleic Acids Res. (2003)の内容は、全体で引用されるものとする。Affymetrixのデフォルト前処理アルゴリズム(MAS 5.0)を用いるように他の方法を用いて、データを標準化することができるが、RMAが好ましく、予想能力がより良好な識別器に結果としてなる。(Irizarry RA, et al., Nucleic Acids Res. (2003))
【００２３】
ろ過
虚血性試料と非虚血性試料で区別して発現される遺伝子を用いて遺伝子発現予想プロファイルを作成するために、虚血性と非虚血性の試料間での遺伝子発現の変化、好ましくは遺伝子発現の統計学的に有意な変化を示す遺伝子を同定するための統計的分析を行った。このためには、マイクロアレイ有意分析(SAM)が好ましい。参考文献(Tusher VG, et al., Proc NatI. Acad Sci USA.(2001))はSAM分析の詳細を提供し、その内容は全体で引用されている。SAMは、我々がSAM統計と呼ぶ一連の遺伝子特異的試験(ｔ検定と同様)を同化することによって変化、好ましくは発現の統計的に有意な変化を有する遺伝子を同定する。あらゆる一定の閾値のために、再サンプリング手順は、遺伝子のリストの棄却された仮説のうちで第一種の過誤が起こる確率(FDR)を推定するために用いられ、SAM統計はこの閾値より大きい。0.1％のFDRで、虚血心と非虚血心との間に3332の区別して発現された遺伝子があった。これらの3332の遺伝子は、次に、更に分析を受けた。当業者に既知の他の統計的方法は、同じ目的を達成するために用いられることもできる。
【００２４】
予想分析
虚血性又は非虚血性心筋症に相対する発現プロファイル間の一貫性を試験するために、マイクロアレイ予想分析ソフトウェアPAM (Tibshirani R, et al., Proc Natl Acad Sci USA. (2002))によって用いられる方法に基づく分類アルゴリズムを使った。そうすることによって、虚血性心筋症試料を非虚血性心筋症試料から区別する遺伝子発現プロファイルが同定される。このために他の既知の方法を用いることができるが、PAMが好ましい。PAMは、予想能力に対するその寄与を代表する各遺伝子の評点を定義することを指図した分類法である。遺伝子セットを与えれば、PAMは、トレーニングセットの分類に基づいて、予想原則を特定し、次に、試験セットに適用する。PAMについての詳細は、参考文献Tibshirani R, et al., Proc Natl. Acad Sci USA. (2002)に示され、この内容は全体で引用されるものである。
【００２５】
統計的分析
病因予想プロファイルの正確さがベースラインの臨床的共変量(年齢、性、心収縮期機能、薬剤使用を含む)や病因の差によって影響されるかを判断するために、臨床検査試料が得られる個体がこれらの共変量に基づいて層化され、予想の正確さを評価した。
連続変数は中央値によって纏めることができ、四分位数とグループをwilcoxon順位和検定を用いて比較することができる。分類変数は、割合で纏めることができ、Fisherの正確な試験を用いて比較することができる。
【００２６】
予想の正確さは予想の感受性と特異性に基づいて求められ、感受性は試料が遺伝子発現プロファイリングによって正しく分類した虚血性心筋症の割合であり、特異性は、正しく分類した非虚血性心筋症試料の割合である。
本発明は、異なる研究室からの試料を一般化することができる予想ツールを与え、虚血性と非虚血性の心筋症の場合、予想ツールは疾患の重篤度から独立している。
病因予想プロファイルが虚血性と非虚血性の心筋症患者間の臨床的な特徴の差によって影響されたかを求めるために、我々は、下記の表1に挙げた臨床的共変量に基づいて我々の分析を層化し、我々の分析の感受性と特異性が影響されなかったことがわかった。このことは、我々の方法の優れた予想の正確さがベースラインの特徴の差の人為産物でないという考えを支持している。
【００２７】
我々は、末期心筋症試料における遺伝子発現プロファイルを作成し、匹敵する段階の試料におけるプロファイルを試験した。我々は、また、非虚血心のLVAD後試料のプロファイルを試験し、予想プロファイルによって虚血性又は非虚血性心筋症を分類するのに完全に行われたが、3つの虚血性LVAD後試料の1つだけが正しく分類された。このことは、虚血心が、非虚血心よりLVAD支持後に遺伝子発現の変化が更に多いことを示している。このことは、非虚血性心筋症患者が遺伝子発現のより大きな変化を示すことを求めた最近の研究とは対照的であるように見える(Blaxall BC, et al., J Am Coll Cardiol. (2003))が、その研究におけるLVAD支持の持続期間が、我々の本研究(190±151日)と比較して比較的短かく(平均(±SD)57±15日)、このことは遺伝子発現の変化に影響したものである。
【００２８】
マイクロアレイ分析が新規な遺伝子の経路の発見に集中している心臓病学における大多数の研究と異なり、我々の分析は臨床的な予想に集中するものである。従って、我々の有効性の確認は独立試料を分類するために同定された遺伝子発現予想プロファイルの適用を必要とした。がん文献において充分に有効とされた(Tibshirani R, et al., Proc Natl Acad Sci USA (2002); Van de Vijver MJ, et al., N Engl J Med. (2002); Golub TR, et al., Science. (l999))、この方法を用いて、我々は試験セット試料の広範囲の組合せについて優れた正確さで独立試料の病因を求めた。
【００２９】
本発明者の知識の及ぶ限りでは、この研究は、マイクロアレイ分析が心臓組織における遺伝子発現プロファイリングに基づいて改善する臨床診断と最適化する治療に実質的に関与することができる最初の証明である。本研究は、また、予後と治療に対する応答を含む、臨床的に関連したパラメータによって心不全を区別するために分子プロファイリングを用いる将来の研究の根拠をなしている。
以下の実施例によって本発明を更に具体的に説明することができるが、それらは本発明を制限しない。
【実施例】
【００３０】
実施例1
患者及び臨床検査試料
研究試料は、27人の心筋症患者からの41試料から構成した。心筋組識を、異なる段階をもつ患者から得た。1)左心補助人工心臓(LVAD)配置又は心臓移植の時間に得られた25の末期組織、2) 16の逆リモデリング後: LVAD支持体除去後(平均日数：190±151日)。試料の28を対にした。即ち、LVAD移植と移植の間のLVAD除去で1人の患者から得た。試料は、2つの機関からのものとした。1)ボルチモア、メリーランドのジョンズホプキンス病院(n= 20患者、n=27試料)と2)ミネアポリス、ミネソタのミネソタ大学(n= 7患者（n=l4試料)。後者の機関からの試料を集め、独立して調製し(Chen Y, et al., Physiol. Genomics. (2003))、遺伝子発現データファイルが恵与された。その後の説明は、ジョンズホプキンス病院で患者から集めた試料27にあてはまる。
【００３１】
全ての患者は、重い低駆出分画、左心室の拡張、高肺動脈楔形圧、低心係数による虚血性の(n= 11)又は非虚血性(n= 16)末期心筋症であった(表1)。重要なことに、これらの血液動態とリモデリング基準はグループ間で似ていた。虚血性の心筋症患者は、年配の全て男性で、アンギオテンシン転換酵素阻害剤(ACEI)に基づき、静脈内変力治療に基づかないようであった。
【００３２】
表1. 患者の臨床の特徴*
2007514441.tif 000003
【００３３】
実施例2
試料配分とランダム分割
41試料のうち25を、遺伝子発現予想プロファイルの同定と有効性確認に用いた。25試料全てを、LVAD移植又は心臓移植時に患者から得た。我々はトレーニングセットとして16試料を用いた。次に、ミネソタ大学でマイクロアレイ分析から得られた7を含む、異なる患者からの9試料において遺伝子プロファイルを試験した。また、16LVAD後試料においてプロファイルを試験した。
遺伝子発現の全体予想能力に対する洞察を得るために、我々は、ランダム分配原理に基づいて遺伝子発現予想プロファイルを試験し有効とした。我々は、無作為抽出によって得られる全210の可能な再分割を考え、それぞれ、ランダムに分割することによって、6トレーニング試料と4試験試料に分割される10虚血性試料と、ｌ0トレーニング試料と5試験試料に分割される15非虚血性試料を含んでいる。(図1)
【００３４】
実施例3
診断の正確さ
PAMは、アレイ上で全ての遺伝子発現測定と同じだけを用いるように設計されている。しかしながら、我々は遺伝子の小さなサブセットを含有する遺伝子プロファイリングを求めたいので、我々はSAMによって選ばれる3332遺伝子に集中した。全3332の区別して発現された遺伝子に対して5を含有する遺伝子発現プロファイルの予想の正確さを全ての210ランダム分割にわたって評価した。我々の仮説作成セット(n=16)についてPAMを用いて、我々は、虚血性試料を非虚血性試料から正確に区別した遺伝子発現プロファイルを同定した。異なる研究室において作成された独立試料に適用したとき、この署名は虚血性心筋症と非虚血性心筋症のについて100％の感受性と100％の特異性を有した。技術の予想の正確さに対する信頼範囲を確立するために、我々は、トレーニングセットと試験セットのランダムな210の組合せを用い、89％ (95％ CI 75-100％)の感受性と89 (95％ CI 60 - 100％)の特異性を示した。
【００３５】
完全な結合を有するユークリッド距離を用いて階層的クラスター形成(www.bioconduclor.org)と加熱マップ(Eisen MB, et al., Proc Natl. Acad Sci. (1998))によって予想プロファイルの遺伝子を視覚化した。
虚血性試料と非極性試料間の臨床パラメータの有意差がプロファイルの正確さに関与したかを評価するために、我々は、各々の臨床的な共変量に基づいて、層における予想の正確さを調べた(表2)。層の中で、感受性と特異性は似ており、全て全体の感受性と特異性に匹敵した(表2)。
【００３６】
表2.臨床的共変量によって定義される層における90遺伝子プロファイルの感受性と特異性
2007514441.tif 000004
ACEIは、アンギオテンシン転換酵素阻害剤を示す
【００３７】
実施例4
LVAD後分析
発現に基づく予想プロファイルが心不全の段階によって影響されたかを評価するために、我々は、16のLVAD後試料において正確さを評価した。遺伝子発現プロファイルは、全ての非虚血性試料を正しく分類した(特異性100％)が、1つの虚血性試料(感受性33％)を正しく分類しただけであった。
【００３８】
実施例5
遺伝子分子署名の評価
トレーニング試料と試験セット試料の全210の組合せについて、最高の正確さは90遺伝子を含むプロファイルと、30％の時間によって達成され、90遺伝子発現プロファイルは完全な正確さを示した(表3)。210の組合せの正確さの平均を表3に示す。大多数の遺伝子は、シグナル伝達、代謝、及び細胞増殖/維持の機能的グループ(www-geneontology.org)に分類された(図2)。大多数の遺伝子は、fold changeの平均1.9 ± 0.9を有する非虚血心と比較して、虚血心におけるアップレギュレートした発現を有した。
【００３９】
表3.遺伝子発現予想プロファイル
2007514441.tif 000005
【００４０】
表3つづき
2007514441.tif 000006
【００４１】
表3つづき
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【００４２】
表3つづき
2007514441.tif 000008
*Fold changeは、非虚血性試料に相対する虚血性試料の平均遺伝子発現を記載した。
【００４３】
90遺伝子発現予想プロファイルの階層的クラスター形成アルゴリズムにおいて、虚血性の試料の全てであるが3つは異なったクラスタを形成し、非虚血性試料の全てであるが1つは異なったクラスタを形成する(図3)。重要なことに、試料は、LVAD装着前又はLVAD装着後状態によって又は由来の機関によって集まらなかった。
本発明は、例として示されているだけであり、添えられた特許請求の範囲によって定義される保護範囲内の種々の方法で変更することができる、上記実施態様によって制限されない。
【００４４】
このように、我々は、その好ましい実施態様に適用された本発明の基本的な新規特徴を図示し、説明し、指摘してきたが、例示されたデバイスの形と詳細において、またそれらの動作において種々の省略や置換や変更が本発明の真意から逸脱することなく当業者によってなされてもよいことは理解される。例えば、同じ結果を達成する実質的に同一方法における実質的に同じ機能を行う要素及び/又は方法工程の全ての組合せが本発明の範囲内であることを明白に意図する。その上、本発明のあらゆる開示された形又は実施態様と共に図示及び/又は説明された構造及び/又は要素及び/又は方法工程が、設計選択の全般的な内容としてあらゆる他の開示され又は説明され又は示唆された形又は実施態様に組込まれてもよいことは認識されなければならない。それ故、これに添えられた特許請求の範囲によって示されるように制限されるだけであることが意図される。
以下は関連する刊行物のリストであり、その内容は全体で引用されるものである。
【００４５】
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【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】末期心筋症試料のトレーニングセット(遺伝子発現予想プロファイルを同定するために用いられる)、試験セット(予想プロファイルの正確さを評価するために用いられる)、リモデリング後試料への分離を示す図である。
【図２】機能的グループによって分類された虚血心と非虚血心におけるアップレギュレートした遺伝子とダウンレギュレートした遺伝子の数を示す棒グラフである(www. geneontology - org)。
【図３】遺伝子発現の類似性と試料の相関性に基づく48の試料における90の遺伝子の階層的なクラスター形成である。
【図１】
2007514441.tif 000009
【図２】
2007514441.tif 000010
【図３】
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【国際調査報告】
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