(57)【要約】  触媒抗体および共有結合抗体の産生、選択、および阻害のための改良された方法を開示する。【選択図】図２
2007524601.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物において、下記の式(1)の共有結合反応性ポリペプチド抗原アナログ(pCRA)に対する抗体を産生させることを含む、共有結合抗体または触媒抗体を調製する方法:
【化１】
2007524601.tif 000043
［式中、L1...Lx...Lmは抗原決定基を規定する構成要素であり、
Lxは、アミノ酸残基、糖残基、脂肪酸残基およびヌクレオチドからなる群から選択される抗原決定基の構成要素ユニットであり、
L'はLxの官能基であり、
Y"は原子、共有結合またはリンカーであり、
Y'は場合によっては荷電した基または中性基であり、
Yは前記抗原決定基に結合する抗体と特異的に反応する共有結合反応性求電子基であり、
場合によっては、Y"、Y'またはYは末端構成要素または内部構成要素として水結合基を含み、
nは1から1000の整数であり、かつ
mは4から30である］。
【請求項２】
下記の式(1)の水結合性、共有結合反応性ポリペプチド抗原アナログ(pCRAW):
【化２】
2007524601.tif 000044
［式中、L1...Lx...Lmは抗原決定基を規定する構成要素であり、
Lxは、アミノ酸残基、糖残基、脂肪酸残基およびヌクレオチドからなる群から選択される抗原決定基の構成要素ユニットであり、
L'はLxの官能基であり、
Y"は原子、共有結合またはリンカーであり、
Y'は場合によっては荷電した基または中性基であり、
Yは前記抗原決定基に結合する抗体と特異的に反応する共有結合反応性求電子基であり、
Y"、Y'またはYは末端構成要素または内部構成要素として水結合基を含み、
nは1から1000の整数であり、かつ
mは4から30である］。
【請求項３】
前記水結合基が、1つまたは複数の水分子をキレート結合する金属イオンと結合する部位から構成される、請求項2に記載のpCRAW。
【請求項４】
前記金属が亜鉛、銅、ニッケル、コバルト、カルシウムまたはマグネシウムである、請求項3に記載のpCRAW。
【請求項５】
前記金属結合基が(His)n-(ここでn=2以上)、-Cys-X-Cys-Cys-または-Cys-X-Cys-（ここでXはアミノ酸残基、エチレンジアミン四酢酸またはジアミノメチルピリジンである）から選択される、請求項2に記載のpCRAW。
【請求項６】
ポリペプチド抗原に対する前記抗体の結合が非共有結合性抗原結合を破壊する変性剤による解離に耐性である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチド抗原に対する前記抗体の結合が2%ドデシル硫酸ナトリウムによる解離に耐性である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド抗原がHIV-1 gp120である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がポリペプチド抗原におけるペプチド結合の開裂を触媒する、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチド抗原がHIV-1 gp120である、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、
a)共有結合する抗体についてのスクリーニングおよび選択、ならびに
b)触媒活性についてのスクリーニングおよび選択
によって、前記生物の血清において同定されるポリクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、
a)ハイブリドーマ細胞系、ウイルス形質転換細胞系、またはベクターから発現される免疫グロブリンフラグメント遺伝子、のライブラリーを調製すること、
b)抗原pCRAまたはポリペプチドに対する抗体または抗体フラグメントの結合によって、それらの共有結合活性についてスクリーニングすること、
c)ステップa)およびステップb)の抗体または抗体フラグメントによるポリペプチドの触媒的加水分解についてスクリーニングすること、ならびに
d)前記抗体または抗体フラグメントを精製すること
を含むステップにより前記生物のリンパ球から得られるモノクローナル抗体または抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原性pCRAがgp120、VIP、第VIII因子、上皮増殖因子レセプター、CD4、βアミロイドペプチド1-40またはβアミロイドペプチド1-42のCRA誘導体である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドがgp120、VIP、第VIII因子、上皮増殖因子レセプター、CD4、βアミロイドペプチド1-40またはβアミロイドペプチド1-42である、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物がヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスである、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記生物がマウスである、請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターがファージディスプレイベクター、レトロウイルスディスプレイベクター、酵母ディスプレイベクター、細菌ディスプレイベクターおよび哺乳動物ディスプレイベクターからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体フラグメントが、
a)逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応による免疫グロブリンVLおよびVHのcDNAの調製、
b)ディスプレイベクターの表面に発現される単鎖FvフラグメントとしてVLおよびVHのcDNAの発現を可能にする形のベクターにそれらcDNAをクローニングすること、
c)前記ベクターの粒子を請求項1に記載の固定化pCRAと接触させること、洗浄による未結合ベクター粒子の除去、および原核細胞または真核細胞においてpCRA結合ベクター粒子から可溶型としてFv遺伝子を発現させること、
d)共有結合抗原結合活性について可溶性Fv構築体をスクリーニングすること、
e)触媒活性について可溶性Fv構築体をスクリーニングすること
を含むステップによって単離される、共有結合活性または触媒活性を発現する単鎖Fvフラグメントである、請求項12に記載の方法。
【請求項１９】
リンパ球が、
a)前記リンパ球をpCRAと接触させること、
b)前記pCRAに結合していないリンパ球から前記pCRAに結合しているリンパ球を分離すること
を含むステップによって得られる、請求項12に記載の方法。
【請求項２０】
前記pCRAが蛍光基を含むかまたは蛍光プローブを用いて検出され、かつpCRA結合リンパ球がフローサイトメトリーにより分離される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がIgG、IgM、IgD、IgAまたはIgEクラスに属する、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体がIgG、IgM、IgD、IgAまたはIgEのフラグメントである、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
[L1...Lx...Lm]が微生物タンパク質の抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
[L1...Lx...Lm]がHIV-1タンパク質gp12Oの抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
[L1...Lx...Lm]がヒト、動物または植物タンパク質の抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
[L1...Lx...Lm]が血管作用性腸管ペプチドの抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
[L1...Lx...Lm]が癌細胞上に過剰発現している抗原の抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
[L1...Lx...Lm]が上皮増殖因子レセプターの抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項２９】
nが1から23である、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
前記pCRAがLys側鎖アミノ基を23mol/molタンパク質の密度で
【化３】
2007524601.tif 000045
で誘導体化されたgp120である、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】
前記pCRAが下記のgp120ペプチジル誘導体である、請求項1に記載の方法。
【化４】
2007524601.tif 000046
【請求項３２】
前記pCRAがLys20側鎖を
【化５】
2007524601.tif 000047
で誘導体化された血管作用性腸管ペプチドである、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫原性決定基がそれぞれLys側鎖を
【化６】
2007524601.tif 000048
で誘導体化された、上皮増殖因子レセプターの可溶性細胞外ドメイン、CD4の可溶性細胞外ドメイン、第VIII因子、βアミロイドペプチド1-40またはβアミロイドペプチド1-42に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項３４】
gp120の開裂を触媒するモノクローナルIgG抗体クローンYZ-18、YZ-20またはYZ-24。
【請求項３５】
請求項30に記載のgp120-CRAと結合し、前記結合が2%SDSを用いた解離に耐性であるモノクローナルIgG抗体クローンYZ-18、YZ-19、YZ-20、YZ-21、YZ-22、YZ-23またはYZ-24。
【請求項３６】
gp120と結合し、前記結合が2%SDSを用いた解離に耐性であるモノクローナルIgG抗体クローンYZ-18、YZ-19、YZ-20、YZ-21、YZ-22、YZ-23またはYZ-24。
【請求項３７】
請求項12に記載の抗体フラグメントから調製される全長IgG、IgMおよびIgA抗体であって、
a)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターに含まれるIg定常ドメイン5'側へのVLおよびVHドメインcDNAの挿入、
b)原核または真核宿主細胞における前記ベクターの増殖、培地または細胞内容物からの全長抗体の抽出、および前記抗体の精製
を含むステップによって調製される抗体。
【請求項３８】
自己免疫疾患を有する生物、同種免疫病を有する生物、公知の疾患を有さない生物またはヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスのリンパ球からモノクローナル共有結合抗体、触媒抗体、共有結合抗体フラグメントまたは触媒抗体フラグメントを得る方法であって、
a)ハイブリドーマ細胞系、ウイルス形質転換細胞系、またはベクターにクローニングされそのベクターから発現する免疫グロブリンフラグメント遺伝子のライブラリーを調製するステップ、
b)請求項1に記載の抗原性pCRAまたはポリペプチドに対する結合によって抗体または抗体フラグメントの共有結合活性についてスクリーニングおよび選択するステップ、
c)前記抗体または抗体フラグメントによるポリペプチドの触媒加水分解についてスクリーニングおよび選択するステップ、ならびに
d)前記抗体または抗体フラグメントを精製するステップ
を含む方法。
【請求項３９】
前記抗体がペプチド結合を加水分解する、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体がスーパー抗原ポリペプチドにおけるペプチド結合を加水分解する、請求項38に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体がgp120を加水分解する、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体がCD4を加水分解する、請求項38に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗体がβアミロイドペプチドを加水分解する、請求項38に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗体がβアミロイドペプチド1-40および1-42を加水分解する、請求項38に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己免疫疾患が全身性エリテマートーデスである、請求項38に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫グロブリンフラグメントがペプチドリンカーにより連結されるVLおよびVHドメインである、請求項38に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫グロブリンフラグメントが軽鎖サブユニットである、請求項38に記載の方法。
【請求項４８】
前記ベクターがファージディスプレイベクター、レトロウイルスディスプレイベクター、酵母ディスプレイベクター、細菌ディスプレイベクターおよび哺乳動物ディスプレイベクターからなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４９】
前記ディスプレイベクターがM13ファージミドベクターpHEN2またはpCANTAB5his6である、請求項38に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体フラグメントが、
a)リンパ球からのRNAをテンプレートとして用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によって免疫グロブリンVL cDNA、VH cDNAおよび軽鎖cDNAを調製すること、
b)ディスプレイベクターの表面に発現した単鎖Fvフラグメントとして、VLおよびVH cDNAの発現を可能にする形でそれらのcDNAをクローニングすること、
c)ディスプレイベクターの表面上に発現した軽鎖として軽鎖cDNAの発現を可能にする形でベクターにそれらのcDNAをクローニングすること、
d)前記ベクターの粒子を請求項1に記載の固定化pCRAと接触させること、洗浄による未結合のベクター粒子の除去、およびpCRA結合ベクター粒子から原核細胞または真核細胞において可溶型としてFv cDNAまたは軽鎖cDNAを発現させること、
e)共有結合抗原結合活性について前記可溶性Fv構築体または軽鎖構築体をスクリーニングすること、
f)触媒活性について前記可溶性Fv構築体または軽鎖構築体をスクリーニングすること
を含むステップによって単離される、共有結合活性または触媒活性を発現する単鎖Fvフラグメントまたは軽鎖である、請求項38に記載の方法。
【請求項５１】
請求項38に記載のFvフラグメントから調製される全長IgG、IgMおよびIgA抗体であって、
a)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターに含まれるIg定常ドメイン5'側へのVHおよびVLドメインcDNAの挿入、
b)原核または真核宿主細胞における前記ベクターの増殖、培地または細胞内容物からの全長抗体の抽出および前記抗体の精製
を含むステップによって調製される抗体。
【請求項５２】
請求項38に記載の軽鎖フラグメントから調製される全長IgG、IgMおよびIgA抗体であって、
a)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターへの軽鎖cDNAの挿入、
b)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターに含まれるIgG重鎖定常ドメイン5'側へのgp120結合抗体のVHドメインの挿入、
c)原核または真核宿主細胞における前記ベクターの増殖、培地または細胞内容物からの全長抗体の抽出および前記抗体の精製
を含むステップにより調製される抗体。
【請求項５３】
リンパ球が、
a)前記リンパ球をpCRAと接触させること、
b)前記pCARに結合していないリンパ球から前記pCRAに結合しているリンパ球を分離すること
を含むステップによって得られる、請求項38に記載の方法。
【請求項５４】
前記pCRAが蛍光基を含むかまたは蛍光プローブを用いて検出され、pCRA結合リンパ球がフローサイトメトリーによって分離される、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体がIgG、IgM、IgD、IgAまたはIgEクラスに属する、請求項38に記載の方法。
【請求項５６】
pCRAの[L1...Lx...Lm]が微生物タンパク質の抗原決定基を表す、請求項38に記載の方法。
【請求項５７】
pCRAの[L1...Lx...Lm]がHIV-1タンパク質gp12Oの抗原決定基を表す、請求項38に記載の方法。
【請求項５８】
pCRAの[L1...Lx...Lm]がヒト、動物または植物タンパク質の抗原決定基を表す、請求項38に記載の方法。
【請求項５９】
pCRAの[L1...Lx...Lm]が血管作用性腸管ペプチドの抗原決定基を表す、請求項38に記載の方法。
【請求項６０】
pCRAの[L1...Lx...Lm]が癌細胞上で過剰発現している抗原の抗原決定基を表す、請求項38に記載の方法。
【請求項６１】
pCRAの[L1...Lx...Lm]が上皮増殖因子レセプターの抗原決定基を表す、請求項38に記載の方法。
【請求項６２】
nが1から23である、請求項38に記載の方法。
【請求項６３】
前記pCRAがLys側鎖アミノ基を23mol/molタンパク質の密度で
【化７】
2007524601.tif 000049
で誘導体化されたgp120である、請求項38に記載の方法。
【請求項６４】
前記pCRAが下記のgp120ペプチジル誘導体である、請求項38に記載の方法。
【化８】
2007524601.tif 000050
【請求項６５】
前記pCRAがLys20側鎖を
【化９】
2007524601.tif 000051
で誘導体化された血管作用性腸管ペプチドである、請求項38に記載の方法。
【請求項６６】
前記免疫原性決定基が、それぞれLys側鎖を
【化１０】
2007524601.tif 000052
で誘導体化された、上皮増殖因子レセプターの可溶性細胞外ドメイン、CD4の可溶性細胞外ドメイン、第VIII因子、βアミロイドペプチド1-40またはβアミロイドペプチド1-42に由来する、請求項38に記載の方法。
【請求項６７】
a)VLおよびVHドメインに突然変異を導入するステップ、
b)その結果として生じる抗体フラグメントをディスプレイベクターの表面に提示させるステップ、
c)前記ベクターの粒子を前記pCRAWと接触させ、未結合のベクター粒子を除去するステップ、
d)原核または真核細胞に可溶型の前記抗体フラグメントを発現させるステップ、
e)共有結合性抗原結合活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ、
f)触媒活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ
を含む、請求項12に記載の抗体フラグメントの共有結合活性または触媒活性を改良する方法。
【請求項６８】
a)VLおよびVHドメインに突然変異を導入するステップ、
b)その結果として生じる抗体フラグメントをディスプレイベクターの表面に提示させるステップ、
c)前記ベクターの粒子を前記pCRAWと接触させ、未結合のベクター粒子を除去するステップ、
d)原核または真核細胞に可溶型の前記抗体フラグメントを発現させるステップ、
e)共有結合性抗原結合活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ、
f)触媒活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ
を含む、請求項38に記載の抗体フラグメントの共有結合活性または触媒活性を改良する方法。
【請求項６９】
a)患者における医学障害に関連する抗原に特異的な共有結合活性または触媒活性を有する抗体を治療有効量投与すること、および
b)維持治療のために、必要に応じステップa)を繰り返すこと、
を含む、疾患の受動免疫治療のための方法であって、前記抗体が請求項1に記載の方法によって産生されたものである、方法。
【請求項７０】
a)患者における医学障害に関連する抗原に特異的な共有結合活性または触媒活性を有する治療有効量の抗体を投与すること、および
b)維持治療のために、必要に応じてステップa)を繰り返すこと
を含む、疾患の受動免疫治療のための方法であって、前記抗体が請求項38に記載の方法によって産生されたものである、方法。
【請求項７１】
前記抗体がHIV-1感染の免疫治療のためにgp120に対するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗体が肝炎感染の免疫治療のためにC型肝炎ウイルスタンパク質gp120に対するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗体がアルツハイマー病の免疫治療のためにβアミロイドペプチドに対するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体が癌の免疫治療のために上皮増殖因子レセプターに対するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗体が血液凝固障害の免疫治療のための第VIII因子に対するものである、請求項1に記載の方法。
【請求項７６】
生物における予防抗体の産生を刺激するための方法であって、前記抗体が前記生物における医学的状態に関連する抗原に特異的な共有結合活性または触媒活性を有し、前記方法が、
a)前記抗原から請求項1に記載の通り調製された免疫原性量のpCRAを含むワクチンを生物に投与するステップ、
b)効果的な抗体産生を確実にするために、必要に応じてステップa)を繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項７７】
前記医学障害が微生物疾患であって、前記pCRAが前記微生物の構成タンパク質から調製される、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
前記医学障害がHIV-1感染であって、前記pCRAがgp120から調製される、請求項77に記載の方法。
【請求項７９】
触媒抗体の作用を阻害することによって患者における医学障害を治療する方法であって、前記方法が、
a)抗原決定基が前記触媒抗体によって不可逆的に結合されたエピトープに由来するpCRAを治療量前記患者に投与するステップ、
b)前記触媒抗体の不活性化について前記患者を評価するステップ、および
c)前記触媒抗体の前記作用の阻害を維持するために、必要に応じてステップa)を繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項８０】
前記疾患状態が自己免疫疾患である、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
前記自己免疫疾患が自己免疫性甲状腺炎、全身性エリテマートーデス、全身性硬化症、喘息、慢性関節リウマチ、混合性結合病、ライター症候群、シェーグレン症候群、血管炎および散弾網膜症からなる群から選択される、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
前記医学障害がリンパ増殖性障害である、請求項79に記載の方法。
【請求項８３】
前記リンパ増殖性障害が多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、リンパ芽球性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、リンパ形質細胞リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、濾胞中心リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、ヘアリーセル白血病、びまん性大B細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、および節性単球様リンパ腫からなる群から選択される、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
前記生物がB細胞において欠損したB細胞レセプター仲介膜貫通シグナル伝達を生ずる遺伝子欠損を発現する、請求項12に記載の方法。
【請求項８５】
前記欠損したB細胞レセプター仲介膜貫通シグナル伝達がCD19、CD22またはLynの発現の改変によって引き起こされる、請求項84に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
米国特許法第202条(c)項によって、本明細書において記載されている本発明に米国政府がある一定の権利を有することが承認される。本発明は、国立衛生研究所助成金番号HL59746、AI31268、CA80312、AI46029およびAI058865からの資金を用いて一部なされた。
【０００２】
本出願は、2003年3月26日に出願された米国仮出願第60/458,063号および2004年1月8日に出願された第60/534,689号の優先権も主張し、前記出願のそれぞれの開示全体は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００３】
発明の分野
本発明は免疫学、分子生物学および医学の分野に関する。さらに詳細には、本発明は新規な共有結合抗体(covalent antibodies)、触媒抗体(catalytic antibodies)およびそれらの阻害剤の産生を刺激するための新規な方法および組成物を提供する。触媒抗体を発現するファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするための改良された方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
本発明が属する技術分野の現状をさらに十分に記載するために、いくつかの刊行物および特許書類が本出願において参照される。これらの刊行物のそれぞれの開示は参照により本明細書に組み込まれている。
【０００５】
いくつかの研究グループは、負荷電の遷移状態アナログ(TSA)で免疫することによってエステラーゼ活性を有する抗体(Ab)の合成がもたらされることを報告した(1、2)。トランスアシラーゼAbを調製するこれらの試みは、抗体(Ab)遺伝子の体細胞多様化の過程の間に触媒部位をde novoで作り出すことに依存している。この戦略では、Abの結合部位と四面体TSAの負荷電した酸素原子との間の非共有結合的形状相補性の誘導が触媒活性を達成するのに十分であると提案された(表1)。しかし、負荷電したTSAに対して作製されたAbによるペプチド結合加水分解を請求する特許が授与されたものの(例えば米国特許第5,952,462号)、論文審査のある学術専門誌にはこの戦略により同定されたタンパク質分解Abの例は存在しない。ある報告はTSAに対して作製された抗体におけるエステラーゼ活性およびタンパク質分解活性の並行検査について記載している(3)。前者の活性は容易に検出されたが、ペプチド結合開裂活性は観察されなかった。この取り組みによるタンパク質分解Abの調製に失敗したことは、一般にペプチド結合の加水分解の方がエネルギー要求性が高いこと、および多数の遷移状態の形成を含めてこの反応に対する反応経路の方が複雑であることが原因とされる。これらの遷移状態では反応が完了に進むのに触媒がペプチド基質と一過性共有結合複合体を形成しなければならない。
【０００６】
天然Abがタンパク質分解活性を発現できるという観察から突破口が開かれた。血管作用性腸管ペプチド(VIP；vasoactive intestinal peptide)が喘息患者のAbによって開裂するという観察は、Abがペプチダーゼ活性を有し得るという初期の根拠をもたらした(4)。この観察の一般性は、橋本甲状腺炎における自己抗体によるチログロブリンの開裂を示す追加の報告により立証されている(5)。自己免疫疾患において触媒Abが合成される傾向があることのさらなる証拠は、ループス患者(6)のAbおよび自己免疫疾患の遺伝素質を有するマウス系統(7)のAbにDNアーゼ活性が存在するという観察に裏付けられている。最近では、ある血友病患者から単離された抗体が、血液凝固の補因子である第VIII因子を加水分解することが観察された(8)。HIVタンパク質gp41に対するある抗体フラグメントもこのタンパク質を加水分解することが記載されている(9)。
【０００７】
共有結合触媒メカニズムによりペプチド結合を開裂する潜在性が大部分の天然Abに広く分布することを示すデータが本発明に開示されている。非Ab性セリンプロテアーゼにより利用されるメカニズムを想起させる共有結合触媒メカニズムは、天然タンパク質分解Abの顕著な特徴である(10)。比較として、TSAに対して作製されたAbは遷移状態の非共有結合を利用し、共有結合触媒経路の出現は予測されず、偶発である。
【０００８】
本発明の一態様は、天然Abの共有結合反応性を強化することである。これは、(a)共有結合反応性の増加は、結合反応の共有結合性によって、ポリペプチドとの安定結合を形成できるAbの出現を可能にし、(b)水分子がAbの活性部位に適当に収容されると、共有結合Ab-ポリペプチド複合体は加水分解されて反応サイクルを完了できるという2つの結果をもたらす。後者の結果に有利なように、結合した水分子を含むポリペプチドアナログを用いて免疫を行い、望みの水分子を収容するのに十分な空間を有するAb活性部位を誘導できるようにする。
【０００９】
ポリペプチドの触媒開裂は安定なAb-抗原複合体の形成を可能にしないことから、タンパク質分解Abは従来の結合アッセイを用いて同定できない。以前に触媒Abを同定するために使用された抗原アナログは、そのアナログの化学反応中心が触媒Abにより開裂されるポリペプチド抗原における結合の位置を正確にシミュレートするにちがいないと仮定している。タンパク質分解Abにおける共有結合反応基であるセリンプロテアーゼ様求核体は個別のポリペプチドエピトープに対するAb特異性の原因である非共有結合力に比べてかなりコンホメーションの柔軟性が高いというデータが、本発明に開示されている。
【００１０】
この発見は、本発明の別の主要な態様、すなわち共有結合反応性求電子体がポリペプチド主鎖の代わりにアミノ酸の側鎖に容易に局在できるようなポリペプチドアナログの開発をもたらした。ポリペプチドにより発現される線状エピトープおよび不連続エピトープに対する特異性とAb求核反応性を協調させ、Abと抗原との間のエピトープ特異的求核反応の発生を可能にするためにこれらのアナログを使用する方法を本発明に開示する。これらの方法は、共有結合Abおよび触媒Abの開発における大きなネックを取り除く。それは、高分子量ポリペプチドに対するこれらの抗体の調製が今のところ通常法では不可能だからである。主鎖に組み込まれた求電子体を用いた高分子量ポリペプチドの合成は現在の化学合成技術の範囲外であるが、一方でタンパク質の天然抗原構造をあまり乱すことなく求電子体を化学結合によりアミノ酸側鎖に容易に配置できる。主鎖内に求電子ポリペプチドを調製する代替的な取り組みは、自然の合成法によるタンパク質合成に非天然求電子アミノ酸アナログを利用することであって、例えばポリリボソーム複合体でmRNAが翻訳される間に適当なtRNA種により求電子アミノ酸アナログが正しく認識されることによる。
【００１１】
発明の開示
天然Abのタンパク質分解活性はセリンプロテアーゼ様求核部位をコードする遺伝性生殖細胞系列を受け継いでいると報告されている(11)。個別の抗原エピトープに対する特異的Abを合成する細胞に分化する過程でB細胞により作られる最初の抗体はIgMクラスに属し、後の段階でIgG Abへのクラススイッチが起こり、同時にAb可変ドメインの体細胞多様化が継続する。IgM AbがIgG Abに比べて優れた触媒であることを示す観察が本発明に開示されている。タンパク質分解活性を有するIgMである抗原特異的Abの合成を同定し誘導する方法も開示されている。
【００１２】
参考文献
2007524601.tif 000003
2007524601.tif 000004
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は、特異的共有結合Abおよび触媒Abおよびそれらのフラグメントの産生を刺激するための新規な組成物および方法を提供する。感染症、自己免疫疾患および腫瘍疾患を含めるがそれらに限定されない多様な医学疾患および医学障害の治療のためにこれらのAbを同定、単離、精製および阻害するための改良された方法が本明細書に提供されている。これらのAbは人体医学、獣医学、工業化学処理、基礎科学研究および生物医学研究の分野にも用途を有する。
【００１４】
本発明の一態様によると、発病過程および腫瘍過程に関与する抗原を含めるがそれらに限定されない所定の標的抗原に対する特異的共有結合Abおよび触媒Abの産生を刺激するための方法および組成物が本明細書に提供される。自己免疫疾患、微生物病、リンパ増殖性疾患、癌、敗血症性ショック、全身炎症性疾患、および急性呼吸窮迫症候群を含めた多様な医学的状態の治療に治療的価値を有する共有結合Abおよび触媒Abの産生を刺激する共有結合反応性ポリペプチドアナログ(pCRA)および水結合性pCRA(pCRAW)が記載されている。これらの医学障害の発生を防止するために本発明のAbを予防的に使用してもよい。
【００１５】
本発明の一態様において、pCRAまたはpCRAWが特異的共有結合抗体および触媒抗体の産生を刺激する条件でこれらの化合物は生物に投与される。次に、これらの抗体はクローニングされ、精製され、そのような治療を必要とする患者に所定の医学障害に関連する抗原を不活性化するのに十分な量が投与される。
【００１６】
代替的な実施形態において、望ましくない副作用をその患者が経験した場合に、前記患者に免疫pCRAを投与することによって、注入された触媒抗体の活性を不可逆的に不活性化することができる。
【００１７】
本発明のなお別の態様において、アジュバントとの複合体としてpCRAまたはpCRAWを免疫対象の患者に投与することによって、ヒトまたは動物へのワクチン接種(能動免疫)が達成される。pCRA-アジュバント複合体のブースター注射は随時投与される。この方法は疾患過程に対する能動的な共有結合免疫及び触媒免疫、すなわち疾患過程の開始および継続に重要な抗原に対する防御的な共有結合Abおよび触媒Abの産生を誘導する。
【００１８】
本発明の別の態様によれば、内因性発現した病原触媒Abの存在に関係する病的状態を治療するための方法が提供される。そのような異常な病的状態の例は、ある種の自己免疫障害およびリンパ増殖性障害である。この方法はそのような病的状態を有する患者に、内因性産生された触媒Abと不可逆結合できるpCRAを含む製剤を、その触媒Abに不可逆的に結合しそれを不活性化するのに十分な量投与し、それによってその病的状態を軽減することを含む。本実施形態において、pCRAは最小のBエピトープを含み、T細胞エピトープはpCRAの免疫原性を最小にするために可能ならば削除される。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、B細胞表面に提示されたAbおよびそれらのフラグメント、または共有結合Abおよび触媒Abの発現のためのファージディスプレイベクターなどの適当なベクターに提示されたAbおよびそれらのフラグメントをスクリーニングするための方法を含む。本実施形態において、pCRAと結合するファージまたはB細胞が単離される。そのように単離されたファージまたはB細胞から共有結合Abおよび触媒AbをコードするDNAを単離し、クローニングするための方法も本発明の範囲内に属する。
【００２０】
本発明の方法は、現在入手できる化合物ならびに所定の標的抗原に特異的な共有結合Abおよび触媒Abを同定、単離および阻害するための方法に比べて顕著な利点を提供する。したがって、本発明に開示された方法は疾患の治療のための価値ある臨床試薬を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
1. セリンプロテアーゼ様Ab。  求核反応性はAb性タンパク質分解の基本である(図1)。求核性はある種のアミノ酸側鎖の活性化に由来する。セリンプロテアーゼではSer-His-Asp三連構造の精密な空間配置がSerの酸素に求核反応性を付与する水素結合ネットワークの形成を可能にする。ベンスジョーンズタンパク質のCDR1とセリンプロテアーゼの活性部位Ser残基周囲のペプチド領域との間の配列ホモロジーに基づいて、Abはタンパク質分解活性を発現すると1973年に予測された(1)。Ser27a-His93-Asp1からなる触媒的同族三連構造が部位特異的突然変異形成によりVIPに対するAbの軽鎖(L鎖)に同定された(2)。非Ab性セリンプロテアーゼと同様に、His93との水素結合はSer残基に求核反応性を付与すると思われ、Asp1は正しく配置されて三連構造の第三構成要素として働く。
【００２２】
最近の研究は全てではないが大部分のAbが通常の酵素よりも大きなレベルでセリンプロテアーゼ様求核反応性を発現することを示している(3)。これらのAbは共有結合反応性ハプテンであるホスホン酸エステル(4、5)を用いて同定された。そのハプテンの求電子リン原子は活性化した求核体と安定共有結合を形成する。以前の突然変異形成研究と一緒に行った触媒のスクリーニングから、求核活性およびタンパク質分解活性は生殖細胞Vドメインにコードされる遺伝形質であることが示された(6)。[約50個のVHおよび50個のVL遺伝子、ならびに少数のD遺伝子(diversity gene)およびJ遺伝子(joining gene)が、遺伝Abレパートリーを構成している]。触媒活性が生殖細胞によりコードされることから、原則として免疫系は任意のポリペプチド抗原に対する触媒Ab応答を備えることができるはずである。よって、触媒Abを産生できるかどうかは、生殖細胞V遺伝子を動員してポリペプチドを認識および開裂するためにV遺伝子の適応分化(adaptive specialization)を誘導することに成功するかどうかにかかっている。
【００２３】
共有結合反応性は触媒の必要条件であるが、十分条件ではないことに注目することが重要である。これは触媒サイクルの完了が共有結合アシル-酵素中間体の形成後に起こる事象の促進、すなわち中間体の加水分解および産生したペプチドの放出を必要とするからである。この能力を欠く求核タンパク質は触媒活性を発現しない。したがって、求核Abの一部のみが触媒活性を発現すると予想される。
【００２４】
2. 内因性の求核活性及び触媒活性。  前項に引用されたVIPアーゼL鎖のSer27a-His93-Asp1部位は生殖細胞のVL対応物にも存在する(7)。しかし、適応成熟したL鎖では(生殖細胞タンパク質に比べて)4つの置換突然変異が同定された。これらの突然変異を突然変異形成により生殖細胞の配置に復帰させても触媒活性の消失はなく(6)、活性が生殖細胞起源であることが確認された。これは免疫されていないヒトおよび動物におけるAbおよびL鎖が雑多なペプチド結合開裂活性を発現するという発見と一致する(8〜10)。
【００２５】
免疫的にナイーブなマウスおよび健康なヒトのIgM Abは、IgG Abを超える求核活性およびタンパク質分解活性を示すことが本発明に開示されている。さらに、脾臓B細胞上に発現したμ鎖含有B細胞レセプター(BCR)はハプテンCRAによる細胞の求核性染色の大部分を説明する。いくつかの以前の研究でB細胞発生に果たすセリンプロテアーゼ活性の重要な役割が示唆されたが、活性を有する分子は同定されなかった。セリンプロテアーゼ阻害剤であるジイソプロピルフルオロリン酸(DFP)およびα-1アンチトリプシンはマイトジェンに応答してB細胞の分裂を阻害する(11、12)。DFP-感受性酵素は細胞結合性であり、Arg含有基質を好む(13)。BCRにより活性化されるシグナル伝達に及ぼす抗μ Abの刺激作用はセリンプロテアーゼ阻害剤により阻害され(14)、抗μ Abが介在するB細胞活性化は細胞表面でのセリンプロテアーゼ活性の出現を誘導する(15)。CRAはセリンプロテアーゼ阻害剤である。B細胞表面での主要なCRA反応性構成成分はBCR自体であることから、内因性共有結合反応性リガンドは求核部位に結合しB細胞発生に影響すると仮定される。
【００２６】
3. 抗原特異的求核活性および触媒活性。  成熟Abの抗原特異的な認識の原因である従来の非共有結合力とAbの求核部位との間の機能的協調をポリペプチドCRAを用いて検査した。これらのCRAはペプチド主鎖内またはタンパク質の側鎖基内に求電子基を含む(図2)。ポリペプチド性CRA(pCRA)に組み込まれたペプチドエピトープに特異的なAbは関連性のないAbを超えるレベルで不可逆結合を示した(3)。これは検査したどのAbについてもいえることであった。pCRAを用いた結果は、別個のアミノ酸が求核反応性および非共有結合相互作用の原因であるという活性部位のスプリットサイトモデル(split-site model)を支持するものであった(16)。
【００２７】
優れた抗原特異的求核反応性にもかかわらず、大部分のIgG Abは抗原特異的触媒活性を発現しない。抗原特異的タンパク質分解Ab応答を誘導することの主なハードルは、免疫応答が経過する間に触媒機能の適応改善を制限する生理調節過程が存在することであった(図3)。生理条件下での触媒の合成に対して障壁が存在することを仮定することによりこれを説明できる。抗原によるBCR(Igα/Igβと会合した表面Ab)の占有はB細胞の増殖を推進する。効率的なBCR触媒は生成物放出速度が細胞分裂を誘導するのに必要なBCR膜貫通シグナル伝達よりも速いならばクローン増殖を中断する。したがって、生成物放出速度が膜貫通シグナル伝達速度よりも遅い範囲でのみ触媒合成が許容されうる。比較として、抗原がBCRの占有を延長するならばAb求核性の改善への障害は存在しない。極端な場合には求核性の増大は抗原との完全な共有結合の形成を招きうる。共鳴電子共有メカニズムによる部分共有結合の形成の方が出現が少ない(図1参照;部分共有結合性を有する弱結合のよく知られている例は水素結合である)。求核Abは抗原と安定な行き止まりの共有結合複合体も形成する可能性があり、そのような例の2つが刊行され(17、18)、我々の研究室の未発表の研究では、ある種のAbとアルブミンとの安定結合を観察し、その結合はSDS処理に耐性であった。
【００２８】
HIV-1コートタンパク質gp120由来pCRAの免疫により、本明細書に開示されているように前節に引用したハードルを乗り越えた。gp120-CRAはgp120特異性触媒Abの産生を誘導した(19)。この戦略は、ペプチドエピトープの非共有結合性認識のためのAb Vドメインの適応成熟を誘導し、同時に生殖細胞Ab求核体の化学反応性を強化するように計画されている。非共有結合は、個別の抗原に対するAb特異性を保証する。図1に抗原およびそれらのCRAアナログとの触媒Abの反応スキームを示す。増大した求核性を有するAbの合成はペプチドエピトープ内に、求核性残基の選択的共有結合が可能な四面体ホスホン酸ジエステルを組み込むことにより促される(4、5、20)。正に荷電したアミジノ基はホスホン酸基に近接して組み込まれる。(全てではないが)多くのタンパク質分解Abが正荷電した残基のC末端側のペプチド結合を開裂することからこのホスホン酸基はpCRAに導入されたLys/Arg残基の模倣体である(4、8、10)。タンパク質分解Abは中性基、負荷電した基、芳香族基およびかさ高い基を含む結合を含めた他の種類の結合も(切断されやすい結合のN末端側およびC末端側隣接アミノ酸に対応する;参照24)P1およびP1'位置で開裂できる。最近、我々はβアミロイド1〜40ペプチドにおけるHis-Gln結合を開裂するあるAbを同定した(Paulおよび共同研究者、未発表)。
【００２９】
pCRAにおける脱離基の強度は共有結合反応性のもう1つの決定因子である。p-ニトロフェノール基およびフェノール基などの強力な脱離基の使用は弱い求核体の共有結合を可能にする。ペプチジル-CRAおよびタンパク質-CRAの設計は活性部位のスプリットサイトモデルに基づき、そのモデルでは別個のアミノ酸が求核反応性および非共有結合相互作用の原因になっている。このモデルでは、求核体はその後の非共有結合が完了するまでAgとほとんどまたは全く接触しない。活性部位が柔軟であることから、いったん最初の結合が生じると求核体がAgと接触し化学反応を開始するのが可能となる。
【００３０】
天然タンパク質分解Abの構造特性を活用することは、触媒合成に対する生理的制限を回避できる免疫原の基礎をなす設計原理の不可欠な要素である。ホスホン酸エステル化合物よりも半減期が長い炭素系pCRAの使用およびAb活性部位の反応中心近辺への水の収容を促進するモチーフの包含を含めて、免疫原の構造および免疫方式の追加的な改良は容易に考え出される。ホスホン酸基が適当にエステル化されている場合に、単に共有反応性を発現できることからリン原子は重要である。炭素はリンに類似した化学反応性を発現することができ、ホウ素およびバナジウムなどの元素も適当な求電子反応性を与えたリン原子の代替として働く。Abの求核性を増大させる以外に、遷移状態反応中心の非共有結合性安定化は誘発された触媒応答の質を高めるために理想的である。我々のグループによる最近の研究は、負荷電したホスホン酸モノエステルが十分な求電子性を発現してセリンプロテアーゼにみられる求核体と共有結合を形成することを示している。これは、迅速な触媒に関係するペプチド結合遷移状態の両方の特性、すなわち負に荷電した酸素原子での静電相互作用および炭素原子の共有結合反応性を兼ね備えたpCRAの設計を可能にする(4、5)。
【００３１】
以前に言及されたように、負荷電した(オキシアニオン)ハプテンTSAによる免疫はタンパク質分解AbではなくエステラーゼAbの誘導を可能にする(21、22)。比較として、本出願に開示されている化合物によるタンパク質分解Abの誘導における成功は、Abと抗原との相互作用においてAbによって利用される固有の力の動員、すなわち反応中心から離れたエピトープ構成成分での非共有結合と協調した求核反応性から理解することができる。
【００３２】
3. 自己免疫疾患における適応調節過程。  上に言及したように、抗原特異的なタンパク質分解Ab応答を日常的に発生させることの主な障壁は、免疫応答の経過時に触媒機能の適応改良を制限する生理調節過程の存在である。自己免疫疾患は比較的高いターンオーバーの触媒Abと関連する(23〜27)。例えば、健康なヒトはVIPと結合する低親和性VIP結合性自己抗体を発現するが(28)、自己免疫疾患にのみVIP特異的触媒Abがみられる(29)。CDR/フレームワーク突然変異パターン(30)および自己抗原に対する高親和性(23)から判断されるように、触媒自己抗体Vドメインは適応成熟する。これは、触媒が受ける生理的制限の回避を可能にする病態生理メカニズムの存在を示唆している。自己免疫疾患における固有に加速されたBCRシグナル伝達速度はBCR触媒活性が生理条件下で不可能とされるレベルに適応改善することを説明していると思われる(図3)。いくつかの報告が自己免疫とB細胞膜貫通シグナル伝達の機能不全とを結びつけている。BCRと会合する膜タンパク質であるCD19は(31)、B細胞の抗原刺激の閾値を低下させ(32、33)、別の膜タンパク質であるCD22はその閾値を増加させる(34)。SrcプロテインチロシンキナーゼであるLynも抗原が刺激するBCRシグナルを伝達する(35)。これらのタンパク質の機能不全は自己抗体の産生と関連している。
【００３３】
自己免疫疾患におけるタンパク質分解Abの産生増大の代替的な説明は、BCR求核部位に共有結合する内因性化合物が存在するという仮説である。ポリペプチドCRAの免疫はAbタンパク質分解活性の適応改善に対する生理学的障壁を克服することが示された(19)。天然セリンプロテアーゼ阻害剤および以前に求核部位に共有結合することが示された反応性カルボニル化合物を潜在的内因性CRAとして考えることができる。例えばピルビン酸エステルのアミジノ誘導体はトリプシンおよびトロンビンのSer求核体と共有結合反応することが示された(36、37;アミジノ基は共有結合反応に参加せずにP1サブサイトを占有する)。追加の候補CRAは自己免疫疾患で高レベル起こる過程である脂質過酸化およびタンパク質グリケーション(メイラード反応)の結果として産生する求電子体である(38〜40)。よく知られている例は、4-ヒドロキシ-2-ノネナールおよびマロンジアルデヒド(脂質過酸化の生成物;参考文献41、42)ならびにグリオキサール、メチルグリオキサールおよびペントシジン(糖代謝の間に生じる反応性カルボニル化合物;参考文献43)である。これらの化合物は酵素の活性部位求核体(44)と共有結合反応でき、低速でArgおよびLys残基と共有結合反応できる(41)。
【００３４】
CRAの構造設計原理は自己免疫レパートリーからの触媒Abの単離に重要である。例えば、自己免疫疾患である全身性エリテマートーデスを有する患者によって発現されるAbレパートリーのうち触媒Abはgp120の認識に特異性を示す。これらのAbの同定は、Abの求核残基と共有結合できる四面体リン酸ジエステルに並列する適当なgp120ペプチドエピトープを含むpCRAによって可能になる(図45および46参照)。ループス患者のAbが比較的保存性の高いエピトープに対するもので、それらのAbが組織培養におけるウイルス感染を中和することから、これは重要である(45)。臨床文献のいくつかの報告がループス患者にAIDSがまれであることについて論じている(46〜48)。gp120-CRAに結合することによりループスのファージディスプレイライブラリーからの触媒Abフラグメントが本発明に開示されている。
【００３５】
4. pCRA。  pCRAの構造は抗体パラトープおよび求核領域が2つの別個のサブサイトとして扱われる共有/触媒抗体のスプリットサイトモデルに基づいている。pCRAは、1つまたは複数のアミノ酸側鎖が求電子基(E)と連結しているタンパク質およびポリペプチドの誘導体である(図2)。アミノ酸側鎖に対するEの連結は直接、またはアダプター官能基の使用を介して成し遂げることができ、そこでそのアダプター官能基は図4に示されるpCRAの一般式においてEの構成要素とみなされている。LxはEが結合している任意のアミノ酸に対応する。Lxの典型的な例はLys、Asp、Glu、Cys、Ser、ThrおよびTyrである。これらのアミノ酸に対するEの連結部位の例には-NH2、-COOH、-SHおよび-OH基がある。Lは付着した求電子体Eと空間的に近接し、抗体によって認識される線状または不連続抗原エピトープ[L1 ....Lm]に対応する。L1〜Lmをつなぐ点線は抗原エピトープの構成要素として働かない、短いかまたは長いリガンド領域を表す。タンパク質は1つまたは複数の抗原エピトープを発現できるため、pCRAは[L1....Lm]、LxおよびEからなるそれぞれの反応ユニットの1つまたは複数のセットのを含みうる。X線結晶研究は、ポリペプチド抗原の場合に[L1....Lm]がわずか4個のアミノ酸および30個ものアミノ酸からなりうることを示した。
【００３６】
Eは分泌されたAbおよび細胞表面に発現したAbにより発現される求核体と共有結合を形成できる任意の求電子体でありうる。適当な求電子体の例は、ホスホン酸エステルにおけるリン原子;カルボニルエステル、カルボニルアミド、炭酸塩、アルデヒド、ケトン、脂肪族カルボニル化合物および芳香族カルボニル化合物における炭素原子;ボロネートにおけるホウ素原子;ならびにバナデートにおけるバナジウム原子である。場合によっては、Yは例えばホスホン酸モノエステルにおける求電子リン原子近くの負荷電酸素原子である、求電子性原子に付着した部分的または完全に負荷電した原子を含みうる。電子吸引基および電子供与基は求電子性原子に直接、またはスペーサー基を介して連結し、誘起効果のためAbにおける求核体との共有結合反応性を増加および減少させる。そのような基の例が、図5に提供されている。置換基1〜18は多様な電子吸引能を有する基を表す。理想的な置換基は求核性共有結合メカニズムを利用する他の触媒と結合することなしに望みの触媒の活性部位に対する選択的結合を可能にする置換基である。例えばリン原子の共有原子価を非常に高いレベルに増加させることは望ましくない。それは、これがリン原子をアセチルコリンエステラーゼなどの生命に不可欠な酵素と結合できるようにするからである。リン原子の共有原子価の減少は置換基19〜35を用いて達成される。
【００３７】
場合によっては正荷電または負荷電は、共有結合Abおよび触媒Abのそれぞれ塩基性残基および酸性残基特異性を模倣するために求電子性原子付近に配置される。同様に、求電子性原子付近の基のかさ、疎水性および水素結合傾向はAbの隣接基の特異性を最適化するために変動しうる。Eがアミノ酸側鎖にアダプター基を介して連結するとき、そのアダプター基の柔軟性は、求核反応と協調して非共有結合エピトープの結合が起こることを確実にするように変動する。
【００３８】
共有結合Ab-抗原複合体の加水分解は触媒反応における制限要因でありうる。加水分解反応が容易に起こる効果的なタンパク質分解抗体の合成を促進するために、pCRA免疫原のE付近に水結合部位を配置できる。水結合部位の例を図6に示す。そのような水結合性pCRAをpCRAWと称す。pCRAWの例を図6に示す。β-アミロイドペプチドの完全に集合したpCRAWアナログを図48に示す。これらの例において、水結合基はpCRA構造内にキレートした金属イオンである。求電子基としてホスホン酸モノエステルを含有するpCRAWの場合、リン原子自体が金属イオンキレート能をもたらし、そのキレート能は結合した水を求電子反応中心にさらに近づけることができる。pCRAWの免疫は、活性部位に十分な余地を有する抗体の合成を可能にし、水が反応中心に拡散できるようになる。Abは金属と結合しなければならないとか、金属に結合した活性化水分子を含まなければならないという必要性はない。もっとも、そのようなことが起こるのは本発明の範囲内に属する。本質的に、pCRAWに対するAbは、特異的な、高ターンオーバーのタンパク質分解に必要な3つの協調した活性、すなわち抗原エピトープの特異的非共有結合性認識、求電子体との共有結合および加水分解反応を促進することのできる水分子を収容するのに十分な空間を発現する。
【００３９】
目的はAbの求核体に対するpCRAおよびpCRAWの共有結合をAbパラトープとの非共有結合と組み合せることであるから、これらの化合物の求電子および非共有結合基は空間的に位置が合わなければならない。pCRAおよびpCRAW調製物中の種々のアミノ酸の側鎖上に求電子体を配置することによって、抗体の求核体への共有結合および抗体パラトープへの抗原エピトープの結合が同時に起こることが可能になる。求電子体はポリペプチド主鎖に局在しないが、抗体とpCRAまたはpCRAWとの柔軟性が反応の進行を可能にする。これはpCRAまたはpCRAWの免疫後に抗体の多様なドメインの親和性成熟を可能にし、求核性の増加およびパラトープ結合親和性の増加をもたらす。pCRAまたはpCRAWの抗原決定基は標的タンパク質抗原にみられる抗原決定基と構造的に類似している。pCRAまたはpCRAWにおける求電子体は標的タンパク質における共有結合性求核攻撃に感受性の求電子基、例えばペプチド結合またはGlnおよびAsn側鎖におけるアミド結合のカルボニル基に対応する。このように高い、非共有結合親和性およびpCRAとの迅速な共有結合反応を示す抗体は標的天然タンパク質とも高い親和性および共有結合反応性を示す。天然タンパク質と共有結合する抗体は天然タンパク質分子を永久に不活性化する。比較として、通常の非共有結合抗体は抗原-抗体複合体から解離し、生物学的に有効な抗原が再生する。
【００４０】
本発明に開示された実施例I〜XIは以下の目的に有用な様々な方法を表す:(a)標的ポリペプチド抗原と特異的に共有結合できるAbの合成の誘導、(b)種々の標的ポリペプチド抗原の加水分解を特異的に触媒できるAbの合成誘導、(c)自己免疫疾患を有する患者において発現される天然Abレパートリーからの特異的共有結合Abおよび触媒Abの単離、 (d)自己免疫疾患を有する患者によって発現される病原触媒Abの永久不活性化、(e)触媒Abを作製するための宿主として機能不全B細胞膜貫通を有するトランスジェニックマウスの使用、および(f)ヒト共有結合Abおよび触媒Abを作製するためのヒトAb遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの使用。
【００４１】
共有結合反応性抗原アナログ(CRAA)は米国特許第6,235,714号に記載されている。これらのアナログを本発明に記載された方法によって共有結合Abおよび触媒Abを作製するために使用できる。同様に、共有結合反応性遷移状態アナログ(CRTSA)は米国特許出願第10/114,716号(出願日04/01/2002)に開示され、これらのアナログを本発明に記載される方法によって共有結合Abおよび触媒Abを作製するために使用できる。
【００４２】
本発明の一態様において、pCRAおよびpCRAWはそれらが抗原特異的タンパク質分解Abの産生を刺激する条件で免疫アジュバントと共に生物に投与される。免疫原の用量、免疫スケジュールおよびアジュバントは、微生物および癌細胞などの病原体に曝露されたときにタンパク質分解免疫応答を迅速に開始することができる記憶T細胞およびB細胞を含め、長期持続免疫の誘発を可能にするように調整される。本発明の本態様において、pCRAおよびpCRAWは予防ワクチンとして働く。ワクチンの構成は精製されたタンパク質およびペプチドに限らない。多様な表面発現抗原に対する広範囲の共有結合および触媒免疫を誘導するために微生物全体のpCRAおよびpCRAW版を調製できる。
【００４３】
本発明の別の態様において、例えば、(a)ヒトAbレパートリーを発現する通常のマウスおよびトランスジェニックマウスからモノクローナルAbを調製すること、(b)自己免疫ファージディスプレイライブラリーからの望みの抗体の化学選択、および(c)in vitroでのAbの定方向進化（directed evolution）により、pCRAおよびpCRAWは治療Abの単離に適用される。それぞれの場合でスクリーニングおよび選択のための効率的な方法が望みの活性を有する珍しいAbの単離を可能にするために適用される。このように生じた共有結合Abおよび触媒Abを次に標的抗原部分を不活性化するために患者に投与する。このシナリオにおいて、患者が有害副作用を経験した場合に、触媒抗体を不可逆的に不活性化するために免疫性pCRAまたはpCRAWを投与することができる。
【００４４】
最後に、自己免疫疾患または多発性骨髄腫などの医学障害と関連して触媒抗体を現在発現している患者に本発明のpCRAを投与してもよい。存在する抗体と特異的に反応するようにpCRAは設計される。触媒機能の阻害は疾患状態の軽減をもたらすはずである。これらのpCRAは免疫原性が最小のB細胞エピトープを含むように設計され、Abの合成を誘導しないようにアジュバント非存在下で投与される。
【００４５】
以下の詳細な説明に本発明を実施するための好ましい方法を記載する。免疫系による所定の特異性の触媒Abおよび共有結合抗体の合成を刺激するための方法を開示する。本発明の一実施形態において、選択したポリペプチド抗原に対する触媒抗体の生成のための組成物および方法を提供する。別の実施形態において、HIV-1感染症、癌および他の医学的状態の治療のための受動免疫治療の様式に有用な組成物および方法が提供される。
【００４６】
本発明の別の実施形態において、所定のウイルス性抗原および病原性抗原に対する触媒Abおよび共有結合Abの産生を誘発するワクチン接種プロトコルを記載する。
【００４７】
5. 適当なpCRAおよびpCRAWの同定および調製。  pCRAおよびpCRAWの構造は標的ポリペプチドの構造に基づいている。適当なポリペプチドの例を表2に示す。VIPおよびβアミロイドペプチドなどの合成ペプチド;gp120、EGFR、IgEおよび第VIII因子などの全長タンパク質;純粋なペプチドとタンパク質との混合物;HIV-1などのウイルス全体;ならびに原生動物および細菌全体を用いてpCRAおよびpCRAWを調製できる。
【００４８】
適当な標的の例には、治療用モノクローナルAbの標的としてすでに検証されたペプチドおよびタンパク質、例えばEGFR、VEGFおよびTNF-α;ならびに微生物由来ペプチドおよびタンパク質と微生物自体とがある。標的とされるヒト内因性ポリペプチドには可溶性リガンドおよびこれらのリガンドに対する膜結合型レセプターがある。炎症伝達物質も触媒のための標的に適している。この群の例示的な分子には、TNF、IL-1ベータ、IL-4およびそれらの同種のレセプターがある。本発明の抗体による触媒について微生物タンパク質も標的とすることができる。これらにはgp12O、gp160、Lex1リプレッサー、gag、pol、B型肝炎表面抗原、細菌外毒素(ジフテリア毒素、破傷風菌(C. tetani)毒素、ボツリヌス菌(C. botulinum)毒素、百日咳毒素)があるが、それらに限定されない。標的とされる癌関連抗原にはEGF、TGFα、p53生成物、前立腺特異抗原、癌胎児性抗原、プロラクチン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、c-myc、c-fos、c-jun、P糖蛋白質、多剤耐性関連タンパク質、メタロプロテイナーゼ、血管新生因子、EGFR、EGFR突然変異体、HER-2、プロラクチンレセプター、およびステロイドレセプターがあるがそれらに限定されない。
【００４９】
タンパク質における生物学的に重要な決定基を同定することは、pCRAおよびpCRAWのための出発物質に適した合成ペプチドを同定するための指針となる。例えば、宿主細胞レセプターに対するHIV gp120の結合はそのタンパク質のCD4領域に局在する残基を含む不連続決定基によって仲介される。この領域に対応するペプチド(例えば残基421〜436)はpCRAおよびpCRAWのための適当な出発物質となりうる。ウイルス関連タンパク質および癌関連タンパク質における重要な決定基の多くは通常のモノクローナルAbに基づく方法を用いてマッピングされた。この知識は、所定のエピトープに対して特異性を有する触媒抗体阻害剤および触媒抗体の誘導剤として有用なpCRAおよびpCRAWの設計を促進する。
【００５０】
自己免疫疾患およびリンパ増殖性障害では先在する触媒抗体が見出されている。これらの触媒抗体の有害作用は患者にpCRAを投与することにより抑制されるであろう。pCRAは免疫原性を有さないか、または免疫原性が小さいように設計される。pCRAにより不活性化される触媒Abの例は、VIP、第VIII因子、フィブリリン1、DNA、Arg-バソプレシン、チログロブリン、サイロイドペルオキシダーゼ、IL-1、IL-2、インターフェロン、プロテイナーゼ3、グルタミン酸デカルボキシラーゼに対するものである。
【００５１】
実施例IはHIV-1 gp120に対する共有結合触媒Abおよび触媒Abを作製するためのpCRAおよびpCRAWの調製に適している、gp120のCD4結合部位に由来する例示的なペプチドを記載する。このペプチドはgp120の残基421〜433の模倣体である。
【００５２】
B細胞による効率的なAb合成はTヘルパー細胞の動員に一部依存し、Tヘルパー細胞は一旦感作されると必要な刺激性サイトカインを分泌し、Tヘルパー細胞上のCD4およびB細胞上のB7などのアクセサリー分子によって仲介される直接接触によりB細胞を活性化する。Ag特異的T細胞の動員は、T細胞レセプター(TCR)がMHCクラスII分子に結合したプロセシング済みのAgエピトープ複合体を認識することにより起こる。
【００５３】
Ab合成のためのT細胞ヘルプはMHC多型性が原因で種々の個体における制限を潜在的に受けやすい。pCRAおよびpCRAWは、ユニバーサルTエピトープ源として働く破傷風トキソイドまたはキーホールリンペットヘモシアニンなどの適当な担体タンパク質と複合される。代わりにユニバーサルT細胞エピトープとして働くことが知られているペプチドを免疫原に組み込むこともできる(49)。
【００５４】
pCRAおよびpCRAWの構造の設計に重大であるとみなされる経験的な実験基準には、
・  触媒活性の阻害効力およびAbに対する共有結合の効力(Ki)。最良のpCRAおよびpCRAWは非Ab性セリンプロテアーゼおよびAb性セリンプロテアーゼを阻害する能力についてのこれらの化合物の一連のスクリーニングにより同定される。
【００５５】
・  提示された抗体ライブラリーからpCRAおよびpCRAWが高ターンオーバーの特異的触媒を選択する能力(ファージディスプレイ法については参考文献4を参照のこと。細菌および酵母ディスプレイなどの他のディスプレイ法も適している)。
【００５６】
・  実験動物にpCRAおよびpCRAWを免疫後に、免疫された動物からの血清中ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の、望みの共有結合活性および触媒活性についての分析。
【００５７】
6. pCRAおよびpCRAWの投与
本明細書において記載されるpCRAおよびpCRAWは製剤として患者に投与されることが意図される。本明細書において使用される用語「患者」は、ヒトまたは動物の対象を指す。本発明のpCRAおよびpCRAWを含む製剤は、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、油、界面活性剤、懸濁化剤またはそれらの適当な混合物などの許容可能な媒質と共に投与するために都合よく製剤される。選択された媒質中のpCRAおよびpCRAWの濃度は媒質の疎水性および親水性に依存する。当業者は溶解限度を容易に決定できる。
【００５８】
本明細書において使用する「生物学的に許容可能な媒質」は、前節に例示されるような製剤の望みの投与経路に適当でありうる任意および全ての溶媒、分散媒などを含む。薬学的有効物質のためのそのような媒質の使用は当技術分野で公知である。任意の通常の媒質または薬剤が、投与されるpCRAおよびpCRAWに不適合性である場合を除いて、製剤における媒質または薬剤の使用が考えられる。
【００５９】
通常の免疫法が触媒Ab合成を誘導するために適用される。Ab合成を誘導するために免疫原の注射が数回(それぞれペプチド約100μg)行われる。動物実験にはRIBIが使用される。ヒトへの使用にはアジュバントとしてアラムが使用される。アラム(Alum)はヒトへの使用が承認されている。RIBIはフロイント完全アジュバントの低毒性代替物であり、多様なAgに対する良好なAb応答を再現性をもって促進する。血流への静脈内注射により、または皮下、筋肉内または腹腔内注射により免疫原を非経口的に投与できる。非経口注射のための製剤は当技術分野で一般に公知である。
【００６０】
製剤は投与が容易な単位剤形で、均一な投薬量で製剤される。本明細書において使用される単位剤形は、治療を受けている患者に適した製剤の物理的に別々の単位を指す。各投薬は望みの効果をもたらすと計算された量の有効成分と、選択された医薬担体とを含むはずである。適当な投薬単位を決定するための方法は当業者に十分公知である。
【００６１】
触媒Abを阻害することを意図される製剤を適当な間隔で、例えば病気の症状が減少または軽減するまで1日1回投与でき、その後投薬量を維持レベルに下げることができる。特定の場合において適当な間隔は、普通は患者において治療に努める状態および病原状態に普通は依存する。
【００６２】
7. 共有結合抗体および触媒抗体の投与
本明細書において記載される共有結合抗体および触媒Abは一般に製剤として患者に投与される。
【００６３】
本発明の製剤は、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、油、界面活性剤、懸濁化剤またはそれらの適当な混合物などの許容可能な媒質と共に投与するために都合よく製剤される。選択された媒質中のAbの濃度は媒質の疎水性および親水性、ならびに触媒抗体のその他の性質に依存する。当業者は溶解限度を容易に決定できる。
【００６４】
本明細書において使用される「生物学的に許容可能な媒質」は、前節に例示されるような製剤の望みの投与経路に適当でありうる任意および全ての溶媒、分散媒などを含む。薬学的有効物質のためのそのような媒質の使用は当技術分野で公知である。任意の通常の媒質または薬剤が、投与される触媒抗体に不適合性である場合を除いて、製剤における媒質または薬剤の使用が考えられる。
【００６５】
Abを投与する場合に通常の受動免疫法が使用される。好ましい実施形態において、Abは患者の静脈内に点滴される。ある種の医学障害の治療のために、十分な量の分子が標的細胞に達して生物学的作用を発揮することを確実にするためのステップを踏まなければならない。
【００６６】
分子の親油性またはそれらの分子を送達する製剤を大きくして分子が標的位置に到達できるようにしなければならない。さらに、本発明のAbは細胞を標的とする担体中に存在する形で送達され、十分な数の分子が標的細胞に達するようにしなければならない。親油性の増加および治療分子のターゲッティングのための方法は、本発明のAbを抗体が散在するリポソームに被包することを含み、当技術分野で公知である。
【００６７】
本発明の主題である共有結合触媒をAbフラグメントまたはAb全体として使用でき、またそれらを組換え分子に組み込むか、またはポリエチレングリコールなどの担体に複合させることもできる。さらに、任意のそのようなフラグメントAbまたはAb全体を上に言及したように細胞膜を通過して輸送させることができる担体に、前記Abまたはフラグメントを結合させることができる。この種の担体には記載されたものがあるが、それらに限定されない(50)。
【００６８】
製剤は投与が容易な単位剤形で、均一な投薬量で製剤される。本明細書において使用される単位剤形は、治療を受けている患者に適した製剤の物理的に別々の単位を指す。各投薬は、選択された医薬担体と組み合わせて、望みの効果をもたらすように計算された量の有効成分を含むはずである。適当な投薬単位を決定するための方法は当業者に十分公知である。例えばヒトにおける同遺伝子型IgGの半減期は約20日である。この期間に60480個のAg分子が抗体1分子により2.1個/分のターンオーバーで開裂する(51)。したがって、ペプチダーゼ抗体は化学量論的可逆結合分子よりもかなり強力な抗原中和活性を発現することができる。
【００６９】
触媒Abを含む製剤を適当な間隔で、例えば病気の症状が縮小または軽減するまで1週間に2回投与でき、その後投薬量を維持レベルに下げることができる。特定の場合において適当な間隔は、患者において治療に努める状態および病原状態に普通は依存する。
【００７０】
許容可能な予防剤または治療剤に対する標準的な基準を満たす受動免疫または能動免疫治療に適したAbを生成するpCRAおよびpCRAWが選択される:(1)Abによる標的ペプチド抗原の共有結合または開裂は標的ペプチド抗原を機能的に活性化するか機能的に不活性化するかのどちらかにより病理学的過程の有益な変化をもたらし、(2)前記Abの投与またはpCRAおよびpCRAWを免疫することによる体内でのそれらの産生の誘導は、臨床有益性が任意の副作用に関連する罹患に勝るような好都合の治療指数をもたらす。そのような基準をいかにして予防剤または治療剤のアクセプタビリティについて定めるかの議論は当技術分野によくあるものであり、Bert Spilkerによる「Guide to Clinical Trials」、Raven Press、ニューヨーク、1991などの文章にみられる。効力の実証のための許容可能な基準には、例えば腫瘍治療の場合には、腫瘍容積の減少、進行までの時間および生存率の改善がある。HIV免疫治療の場合、血中の感染ウイルス数、CD4+T細胞数および日和見感染の発症率を測定することにより効力が決定される。
【００７１】
特定の標的分子の機能を阻害するように作用する通常のモノクローナルAbは、バイオテクノロジー会社および製薬会社によって臨床利用のために開発中である最もよくある種類の治療剤のうちである。これらの一部は実質的に臨床的に有望であることが示された。例えば、臓器移植の分野ではT細胞レセプターと結合するMoAb(OKT3)がin vivoでT細胞を枯渇させるために使用されている。さらに、MoAbが移植片対宿主病の治療に使用されある程度の成功を収めつつある。多発性硬化症の治療において抗CD4moABがT細胞サブセットを枯渇する能力を評価する臨床試験が定められた。したがって、モノクローナル抗体の投与法は当業者の臨床家に十分に公知である。
【００７２】
通常のモノクローナルAbに適していることが知られている、露出した任意のペプチド性標的抗原は、本発明の主題である共有結合Abおよび触媒Abに特に適した標的候補である。本発明に考えられているAbは、それらの優れた効力が原因で通常のモノクローナルAbを超える大きな改良となり、治療コストを劇的に減らす。臨床有望性を示す通常のモノクローナルAbが標的とする一部の抗原と、対応する医学適応の一覧を表2に示す。
【００７３】
本発明の実施のための予防または治療用標的ペプチド抗原の適当な部門には、サイトカイン、増殖因子、サイトカインレセプターおよび増殖因子レセプター、増殖因子レセプターにより開始される刺激の伝達に関与するタンパク質、凝固因子、インテグリン、抗原レセプター、酵素、詳細には細胞プログラム(分化、増殖およびプログラム細胞死)の制御に関与する転写調節因子、これらの細胞プログラムの他の誘導因子、抗癌剤を排出できる細胞ポンプ、微生物抗原およびウイルスペプチド抗原があるが、それらに限定されない。
【００７４】
以前に開発された方法を用いて望みの抗原に対する防御抗体応答を誘発するように設計されたワクチンを用いて能動免疫が行われる。例えば、アラムなどの適当なアジュバント製剤と混合されたpCRAおよびpCRAWを、抗体の合成が最大となるように最適化された用量で筋肉内投与でき、血清中の触媒抗体濃度が定常レベルに達するまで4週間隔で2または3回のブースター注射を投与できる。ワクチン接種が原因生物または癌細胞の曝露に応答して刺激されAbを産生することができる特異的長寿命記憶細胞の形成をもたらすことから、そのように生じた防御免疫は数年間持続すると期待される。触媒Abを測定するための記載および方法は実施例で解説される。大部分の抗原に対するAb合成応答はT細胞依存性であるため、適当なT細胞エピトープをペプチド合成によって免疫原に組み込むことができる。代わりに、キーホールリンペットヘモシアニンなどの担体をlysの側鎖アミノ基またはCys側鎖スルフヒドリル基を介して結合させることによってpCRAおよびpCRAWと複合させ、必要ならば抗体応答を最大にすることができる。
【００７５】
本発明の好ましい実施形態の若干が上に記載され、具体的に例示されたが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されない。本発明の範囲および思想から逸脱せずにそれらに様々な修正を施すことができる。以下の実施例は本発明の理解を容易にするために提供される。
【００７６】
参考文献
2007524601.tif 000005
2007524601.tif 000006
2007524601.tif 000007
2007524601.tif 000008
2007524601.tif 000009
【実施例１】
【００７７】
特異的抗原結合活性と協調して発現した天然抗体の広範に分布する化学的反応性
多くの酵素は、基質との共有結合的な相互作用を利用して化学的変換を触媒する。一方、Ab触媒に関するほとんどの研究は、反応物と生成物との間のエネルギー障壁を下げる機構としての非共有的結合力、例えば、エステル加水分解の負に荷電したオキシアニオン遷移状態を安定化する静電力に注目してきた(1、2の総説)。元となる仮説は、Abは専ら非共有的手段によってリガンドと相互作用するということである。天然のAbは酵素とは見分けのつかない化学反応性を表すという当初の指摘は、自己抗体のタンパク質分解活性およびヌクレアーゼ活性の報告(3、4)から得られた。同様の活性が後に多発骨髄腫の患者のAb軽鎖(5)、輸血によって誘発された血友病の患者の同種異系抗体(6)、ポリペプチドによる通常免疫で生じたAb(7、8)および抗酵素Abに対する抗イディオタイプAb(9)で発見された。変異誘発および阻害剤の研究から、天然Abのタンパク質分解活性は、従来のセリンプロテアーゼで使用されるものと同様の求核機構によって生じることが明らかになった(10、11)。天然Abの触媒活性は、B細胞クローン選択理論の原理に反するものと解釈することができた。V領域をコードする生殖細胞系遺伝子の配列多様化、その後の最も親和性の高いB細胞レセプターによる選択的な抗原結合、それによるAbのクローン増殖の刺激という免疫過程の中で抗原特異的Abが生成される。触媒には、抗原の化学的変換およびB細胞選択の中断を引き起こすことが予測される生成物(IgαおよびIgβサブユニットに関連した表面イムノグロブリン)の遊離が必要である。したがって、Ab触媒活性の適応選択は、敬遠される現象である。この理由のため、天然に生じるAbによる触媒作用は、機能と密接な関係のある一般的現象とは対照的に、V領域の配列多様性によって生じる分子的な偶発的出来事(molecular accident)であると考えられることが多い。
【００７８】
前記の制限は、セリンプロテアーゼ触媒の触媒過程の最初の段階には適用されない。従来の酵素と同様に、タンパク質分解性Abに属する求核体(図7AのNu)は、非共有結合の基底状態複合体が形成された後に抗原に対する求核攻撃を開始すると考えられる。B細胞レセプターが占有されたままなので、もし結果が共有結合アシル-Ab複合体の形成であるならば、Abの求核性の適応発生はB細胞クローン選択性と完全に合致する。触媒過程が完了するかどうかは、アシル-Ab複合体の加水分解および生成物の遊離の効率に左右される。最近、ハプテンホスホン酸エステルは、セリンプロテアーゼおよびセリンエステラーゼ活性を示すAbの活性部位求核体に共有結合するためのプローブとして開発された(11、12)(CRAと称される、共有結合反応性抗原アナログ)。これらの化合物は、触媒の実現のために必要な他の活性とは独立したAb化学的活性の直接的な研究に適用することができる。さらに、ホスホネートは、Ab求核反応性と個々のポリペプチドの特異的認識を可能にする非共有結合力との間の相互作用を研究するために、ペプチドおよびタンパク質内部に配置することができる(図7Bおよび7C)。
【００７９】
IgGおよび組換えFv調製物には、従来のセリンプロテアーゼトリプシンの程度を上回る求核反応性が広い範囲で分布することを示唆する所見を本明細書で説明する。触媒Abのプローブとして元々調製されたので、EGFRおよびHIV gp120合成ペプチドのCRAアナログは、ホスホネート基を持たない抗原で免疫することによって生じる通常のAbと共に共有結合アダクトを形成することが認められ、適応変異過程は求核反応性の発現に有利であることが示唆される。これらの所見は、抗体求核性は発現したAbレパートリーの形成に関与する力であることを明らかにしており、Abの永久的な不活性化に対する新しい経路を示唆する。
【００８０】
方法
Ab。  ヒトポリクローナルIgGは、6人の健常人対象の血清(研究室認識番号、1086、1087、1088、1091、1092、1518)からプロテインG-セファロース(Amersham Pharmacia)のアフィニティークロマトグラフィーによって調製した。8匹のBALB/cマウス(4〜5週齢)から収集した血清のIgGも同様に得た。KLHに結合させた合成Cys-gp120(421〜436)(KQIINMWQEVGKAMYA;gp120 HIV SF2種の421〜436残基)で過免疫することによるポリクローナルAbの調製は、(13)に説明されている。雌BALB/cマウス(5〜6週齢)は、0日目、27日目および41日目にRIBIアジュバントに入れてexEGFR(10μg/注射)を、14日目にはA431腫瘍細胞(生理食塩水に溶かした107個の細胞)を注射して免疫することによって、exEGFRに対するポリクローナルAbを得た。exEGFRに対するモノクローナルAb(クローンC225、H11およびC111.6)は、Labvision(Fremont、CA)から購入した。対照の抗BSAモノクローナルIgG(クローンBGN/H8)は、Biogenesis(Kingston、NH)から入手した。単鎖Fv構造物(N=15)は、(11)に記載された狼瘡患者から得られたヒトFvライブラリーから無作為に選択した。(MM系クローン、12、14、18、20、24、F1、F2、F4、F5、F6、F7、F11、F12、F14、F17、F18)。scFVタンパク質は、Ni-NTAカラムの金属アフィニティークロマトグラフィーによって電気泳動的に均一(27kDaのバンド)になるまで精製した(11)。発現濃度は、細菌培養液1リットル当り0.3〜5.7mgであった。該ライブラリーには、ヌクレオチド配列決定によって決定された異なるscFvクローンが含まれており(11)、多様なAbのV領域を確実にサンプリングすることが可能である。この研究で調べたscFvクローンの1つ、MM-F4の配列決定を行い(GenBank番号AF522073)、そのVLおよびVH領域がそれぞれXおよびIファミリーに属することが決定され、生殖細胞系遺伝子相対物はそれぞれ、V1-13およびVH1-2であった。SDS電気泳動ゲルにおけるscFvバンドの確認は、c-mycに対するモノクローナルAbを使用したイムノブロッティングによって行った(10)。
【００８１】
求核体用プローブ。  ハプテンCRA Iの合成(図7)および天然に生じるタンパク質分解性Abとの共有結合反応性は、既に記載されている(11、14)。求核ホスホン酸ジエステルはペプチド結合に似ており、正に荷電したアミジノ基は天然に生じるタンパク質分解性AbのLys/Arg P1選択性に似ており(11)、ビオチン基によってAbホスホネートアダクトを高感度で検出することが可能である。IIは、Iで説明したように、ジフェニルアミノ(フェニル)メタンホスホネート(化合物a)および6-ビオチンアミドヘキサン酸N-ヒドロキシスクシニミドエステル(Sigma)を縮合することによって調製した。IIIを調製するために、化合物a(160mg、0.34mmol)を30% HBr/CH3COOH(5ml)で処理した。得られたジフェニルアミノ(フェニル)メタンホスホネート臭化水素酸塩(100mg、0.24mmol)は、メタノールに溶かしたナトリウムメトキシド0.5M溶液(9.5ml)に溶解し、該溶液はN2下で撹拌した(室温、2h)。減圧下で溶媒を除去した後、残渣をCH2Cl2(50ml)で抽出して、該抽出物を水(5mlx3)で洗浄して、Na2SO4で乾燥して、乾燥するまで留去した。黄色味を帯びた油状残渣をジエチルエーテル(30ml)に溶解した。ジエチルエーテルに溶かしたHCl(1M)(0.25ml)を添加し、沈殿物は濾過によって収集し、ジエチルエーテルで洗浄して得られた、収量35mg、68%、tR 11.8分(純度>97%、C18カラム、0.1%トリフルオロ酢酸に溶かした5〜80%アセトニトリル、50分、1.0ml/分)、エレクトロスプレイイオン化質量分析によるm/z 216(MH+)。この化合物のビオチン化は、通常通り(14)実施した。IVを調製するために、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.11ml、0.63mmol)およびビス(スルホスクシニミジル)スベリン酸二ナトリウム塩(150mg、0.26mmol、Pierce)を含有するDMF(2ml)に溶かしたジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(0.13mmol)を2時間混合することによって、ジフェニルN-[O-(3-スルホスクシニミジル)スベロイル]アミノ(4アミジノフェニル)メタンホスホネート(化合物b)をまず合成した。bは、逆相HPLCによって精製し、凍結乾燥して無色粉末を得た。収率54%、50mg、m/z 715 (MH+)。電気泳動的に純粋なexEGFR(0.5mg、O'Connor-McCourt博士から恵与、文献15)をHEPES 10mM、NaCl 150mM、CHAPS 0.1mM、pH7.5緩衝液0.53ml中で6-ビオチンアミドヘキサン酸N-ヒドロキシスクシニミドエステル(59nmol、Sigma)と反応させた(50分、25℃)。未反応のビオチン化試薬をゲル濾過によって除去した(Micro BioSpin 6カラム、BioRad)。次に、ビオチン化exEGFR(0.33mg)を緩衝液3.3ml中で化合物b(136nmol)と2時間反応させた。Tris-HCl 50mM、グリシン100mM、CHAPS 0.1mM、pH7.8でゲル濾過することによって過剰なbを除去した後、最初のタンパク質およびCRA-誘導体化タンパク質の遊離アミンの濃度をフルオレスカミンを使用して測定した(16)。2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸(17)を使用して測定したビオチン含量は、1.1mol/mol exEGFRであった。ホスホン酸ジエステル標識の密度は19mol/mol exEGFRであった。総タンパク質量は、BCA(Pierce)を使用して測定した。実験の中にはexEGFR CRA IVaを使用して実施されたものもあった。この化合物は、リンカーにジスルフィド結合が存在することを別にすればIVと同一である。IVaを調製するために、前駆体ジフェニルN-((3-スルホスクシニミジル)-3,3'-ジチオビスプロピオニル)アミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(化合物c)は、3,3'-ジチオビス(スルホスクシニミジルプロピオネート)(Pierce)を使用して化��物bで説明したように得られた。収量6.0mg、21.4%、tR24.49分、純度>98、0.1% TFAに溶かした20〜50%アセトニトリル、60分)、m/z 751 (MH+)。ビオチンおよびcの標識は、IVで説明した通りである(IVaのビオチンおよびホスホン酸ジエステルの含量はそれぞれ、2.3molおよび18.3mol/mol exEGFR)であった。ペプチジル-CRA VおよびVaの合成およびそれらの化学的特徴付けは、(18)に記載されている。Vは、(13)のようにγ-マレイミド酪酸N-ヒドロキシスクシニミドエステルを使用してBSAと結合させた。BSAは、潜在的V結合部位を遮断するために、ジフェニルN-(ベンジルオキシカルボニル)アミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネートで予備処理した(BSA、21.3μM、ホスホネート、0.5mM、溶媒、5% DMSOを含有するPBS 10mM、15.5時間)。V/BSAモル比は、エルマン試薬を使用して-SH基の消費から3.9であることが測定された。I〜IIIの保存は、N,N-ジメチルホルムアミドに溶かした10mM溶液として-70℃で行った。IVおよびIVaは、50mM Tris-HCl、pH8.0、グリシン0.1M、CHAPS 0.1mM中で-70℃で保存した。VおよびVaは、N,N-ジメチルホルムアミドに溶かした10mM溶液として-70℃で保存した。
【００８２】
ELISA。  Maxisorp96ウェルマイクロタイタープレート(Nunc)を、100mM 重炭酸ナトリウム緩衝液(pH8.6)に溶かしたBSA結合gp120(421〜436)(20ngペプチド相当量/ウェル、ペプチドの結合法については文献13を参照すること)、BSA結合V(20ngペプチド-CRA相当量/ウェル)、exEGFR(200ng/ウェル)またはexEGFR-CRA(200ngタンパク質相当量/ウェル)でコーティングした(2時間)。ELISAの方法は本質的に(13)に記載された通りであった。結合したマウスIgGは、ヤギ抗マウスIgG-HRP複合体(Fc特異的、Sigma、Saint-Louis、MO、1:1000)で検出した。
【００８３】
不可逆的CRA結合。  50mM Tris、HCl、グリシン100mM、CHAPS 0.1mM、pH7.7中でビオチン化CRAをAbまたはトリプシン(ブタ、IX型、Sigma)と共に37℃でインキュベートした後、該反応混合物を2% SDSで煮沸して(5分間)、SDS-PAGE(4〜20%、Bioradまたは8〜25% Phastゲル、Amersham)で泳動した。電気ブロッティングならびにストレプトアビジン-HRPおよび化学発光基質(Supersignal、Pierce)を使用したビオチン検出方法は(11)に記載されている。画像処理および定量は、Unscan-itソフトウェア(Silk scientific、Orem、Utah)またはFluoro-STM MultiImager(Biorad)を使用してX線フィルム(Kodak)上で行った。バンドの強度はarbitrary area unit(AAU)で表した。曝露および現像時間は一定ではないので、異なる実験のバンド強度の確実な比較は不可能である。フルオロリン酸ジイソプロピル(Sigma)は、使用するまで4℃で維持した。いくつかの実験では、ビオチン化BSA(Pierce、8molビオチン/モルタンパク質)は試料と平行していくつかの濃度で電気泳動し、CRAアダクトのビオチン含量を測定した。疑似一次反応速度定数(Kobs)は、式Bt=Bmax(1-exp(-kobst)(式中、Btは様々な時点でのアダクトの濃度を表し、Bmaxは初期Ab濃度を表す)にあてはめて反応進行曲線から算出した。ヤギ抗マウスIgG Abによるイムノブロットは(7)の通りであった。
【００８４】
タンパク質分解測定法。  触媒活性は、短いペプチド-MCA基質のC末端アミノ酸にアミノメチルクマリンを結合するアミド結合の切断を蛍光計で測定することによって測定した(λex360nm、λem470nm、Varian Cary Eclipse)(10)。触媒は、96ウェルプレートにおいて50mM Tris HCl、グリシン0.1M、0.025% Tween-20、pH8.0中でペプチド-MCA基質(Pro-Phe-Arg-MCA、Boc-Glu-Ala-Arg-MCA、Boc-Ile-Glu-Ala-Arg-MCA、200μM、Peptide International)と共に37℃でインキュベートした。いくつかの測定では、IgGおよびトリプシンのタンパク質分解活性の比較は10mM リン酸ナトリウム、pH7.4、NaCl 0.137M、KCl 2.7mM、CHAPS 0.1mMにおいて実施した。標準アミノメチルクマリン(Peptide International)を使用して、生成物遊離をモル値で算出する標準曲線を作成した。
【００８５】
結果
ハプテンCRAで確認したAb求核性。  ホスホネートハプテンCRA I〜III(図7)は、セリンプロテアーゼの公知の活性部位特異的阻害剤のアナログである(19)。セリンプロテアーゼトリプシンのように、健常人対象から得られたIgGは煮沸した変性SDSに耐性があるCRA Iアダクトを形成した(図8、IgG、150kDアダクト、トリプシン、21KDアダクト)。免疫学的に操作されていないBALB/cマウスから得られた収集IgGは同様のIアダクトを形成した。CRA I内の正に荷電したアミジノ基は元来、化合物に取り込まれて、P1部位の塩基性残基に対する選択性を示すトリプシンの選択的認識を可能にした(該残基はペプチド基質の切断部位のすぐ側にある、文献20)。CRA IIは、共有結合反応性リン原子に隣接した正に荷電したアミジノ基を持たない。IgGは、IよりもIIに対する反応性が240倍少なかったので、Abのトリプシン様P1特異性が示唆される。Iよりも弱い遊離基を含有するIIIは、IgGとは検出可能なアダクトを形成しなかった(メトキシ遊離基が存在すると、リン原子の求核性が減少する、メトキシ含有ホスホン酸ジエステルはある種のセリンプロテアーゼと弱く結合することが報告されている、文献21)。IgGおよびトリプシンとの共有結合Iアダクトの形成増加は、反応時間の関数であることが明白であった(図8B)。IgGの反応速度は、同一条件下で測定したトリプシンよりも14.5倍速かった(それぞれ、172.7±14.2および11.9±0.6 AAU/分、図8Bデータの直線回帰より)。ホスホニル化されたタンパク質複合体の加水分解は同等であると推定されたので(図7の反応スキームを参照すること)、IgGの求核効果はトリプシンよりも優れていると結論づけることが可能である。
【００８６】
健常人および免疫学的に操作されていないマウスのIgG調製物は、塩基性残基のC末端側の小さなモデルペプチド基質を切断することが報告され、該切断活性は、試験したいくつかのIgG調製物それぞれに認められ、該活性は変性ゲル濾過実験においては完全な150kD IgGと一緒に移動し、該活性はパパイン消化によって調製されたFab調製物によって示された(22)。この研究において、トリプシンと健常人対象由来のIgG(図8の求核性研究と同じ調製物)のタンパク質分解活性を比較した。IgGによるタンパク質分解の初期速度は、Glu-Ala-Arg-MCAではトリプシンよりも1.8x105倍、Pro-Phe-Arg-MCA基質では、6.8x105倍少なかった(図9AおよびB、進行曲線の勾配から決定)。Glu-Ala-Arg-MCAはトリプシンの好ましい基質である。Glu-Ala-Arg-MCAおよびPro-Phe-Arg-MCA基質は、以前にペプチド-MCA基質のパネルのスクリーニングで決定されたヒトIgGの好ましい基質である(22)。このIgG調製物によるタンパク質分解の強さは、その他のヒトIgG調製物で既に報告された範囲内に入る。該IgGの求核反応性は優れているが、明らかにトリプシンと比較して不十分な触媒である。
【００８７】
CRA IおよびDFP(セリンプロテアーゼの他の活性部位特異的阻害剤)は、IgG触媒ペプチドMCA切断の触媒活性を阻害し(図9C)、DFPはIgGによるCRA Iの不可逆的な結合を阻害した(95%)。これらの結果から、CRA IはIgGの触媒部位に結合することが確実になった。DFPはセリンプロテアーゼの活性部位に結合するので、その阻害効果によってIgGのI結合部位のセリンプロテアーゼ特性が裏付けられた。還元条件下でI-IgGアダクトを電気泳動することによって、ハプテンCRAによって両サブユニットが標識されることが明らかになり、ビオチン含有バンドが50kD重鎖バンドおよび25kD軽鎖バンドにあることがはっきりした(図9D)。IgGの不可逆的なI結合活性は、タンパク質を60℃で10分間予備加熱することによって失われるので、求核反応性が天然タンパク質構造に左右されることが示された。
【００８８】
健常人から得られた5種類のポリクローナルIgG調製物それぞれは、Iに不可逆的な結合を示した(表3)。ヒトライブラリーから無作為に抽出された16個のscFvクローンはそれぞれ、Iアダクトを形成し(図10Aの例を参照すること)、結合部位にVドメインが位置することが示され、求核反応性は異なるAbに共通の特性であることが示唆された。図10A(GenBank #AF522073)で示されたFv MM-F4で利用できる総タンパク質の91%は、求核反応性を示した[ビオチン モル/27kD IアダクトバンドのFvタンパク質 モルとして算出、Fv結合価1、図10の反応条件]。非還元条件下で電気泳動して分析すると、いくつかのscFv反応混合物は、27kDaのモノマーscFvアダクトに加えて55〜90kDのCRA Iアダクトを含有した。CRAアダクトバンドの全てはまた、c-mycに対するAbで染色可能で、アダクト中にscFvが存在することが裏付けられた(組換えタンパク質は10残基c-mycペプチドを含有する、文献10)。scFvが凝集物を形成する傾向があることは既に報告されている(23)。scFvクローンをI処理する前にDFPで処理するとき、Iアダクトの濃度減少が検出された(72%)。異なるFvクローンによる共有結合アダクト形成の速度は、34倍の範囲にわたって変化し(表3)、Abが異なると求核反応性の程度が異なることを示している。異なるAbの混合物を表す5種類のポリクローナルIgG試料の反応性は変化が少なかった(5.4倍)。ペプチド-MCA切断活性(Glu-Ala-Arg-MCA基質)とscFvクローンによる不可逆的I結合とを比較すると、強い相関性が示され(p<0.005、r2=0.77、図10B)、優れた求核反応性には官能基が重要であることが裏付けられた。
【００８９】
ペプチジルおよびタンパク質CRAの特異的な共有結合。  タンパク質CRA IVおよびペプチドCRA Vaについて、抗原特異的Abが抗原の非共有結合認識と協調して求核反応性を表すことができるかどうかを評価するために分析した。CRA IVは、腫瘍関連タンパク質、exEGFRの細胞外ドメインで、アダクトの検出を可能にする少量のビオチンと共にホスホン酸ジエステル(19mol/mol)を有するLys側鎖を誘導体化した様々な抗原エピトープを提示する。CRA IVのSDS電気泳動によって、名目質量90kDa(exEGFRの質量 85kDa、ハプテンホスホネート基の質量、714Da)の主要な銀染色およびビオチン含有バンドが明らかになった。CRA Vは、Lys432のアミジノ代用物およびC末端に位置する共有結合反応ホスホン酸ジエステル基と共にHIVコートタンパク質gp120の421〜431残基に対応する。このペプチジルCRAの純度および化学特性は、既に報告されている(18)。exEGFRおよびgp120の421〜436残基に対応する合成ペプチドで通常に免疫することによって生じたAbは、最初はこれらのCRAの抗原強度を保証するために使用された。ELISA研究によって、exEGFRおよび合成gp120(421〜436)に対するポリクローナルAbによる(BSAに結合させた)IVおよびVaへの結合はそれぞれ、ホスホン酸ジエステル基を持たない対照抗原、すなわちexEGFRおよびgp120(421〜436)への結合よりもわずかに低いだけであることが示された(図11)。Lys側鎖(IV)およびC末端(Va)にホスホン酸ジエステルを導入しても、この2種類の抗原のエピトープ構造は明らかに保存されている。抗exEGFRまたは抗gp120(421〜436)Abは、固定化カルモジュリンおよびアルブミンに対して結合しないことが検出され(1:1000に希釈した抗血清ではA490<0.05)、非特異的タンパク質結合効果がないことが裏付けられた。固定化(BSAに結合した)CRA IVおよびCRA Vaは、ELISA用の対照として使用した非免疫Abに異常な結合を示さず、ホスホン酸ジエステル基は無差別な共有結合効果を生じないことが示唆された。
【００９０】
Abによる共有結合は、ハプテンCRAで説明したように変性電気泳動を使用して研究した。exEGFRに対するAbでビオチン含有IVアダクトが飽和形成されることは明らかであった(名目上の質量250kDa)。非免疫IgGのIVアダクトは検出されなかった(図12)。IV濃度が低いので(図12では0.2μM)、ハプテンCRA Iを使用して認められたものと同様のアダクト形成は予測されない(図8;100μMI)。exEGFR(1μM)が存在するとアダクトの形成は少量であるか、または全く形成されないが、アダクト形成は同濃度のカルモジュリンによっては妨害されないので、共有結合反応はAbの抗原結合部位またはその近隣にあることが示唆される。250kD IVアダクトは抗IgGで染色可能であった(データは示さず)。exEGFRに対する市販の3種類のモノクローナルAbはそれぞれ、IVaと共有結合アダクトを形成し(供給業者によれば、Ab C225はEGFRの細胞外ドメインの351〜364残基に結合し、Ab H11およびC111.6によって認識される線状ペプチド決定基は未知であるが、両Abは該タンパク質の細胞外ドメインに結合する)、無関係なモノクローナルAbはアダクトを形成せず、該モノクローナルAbによるアダクトの形成はホスホン酸ジエステル基を持たないexEGFRによって阻害されたが、無関係なタンパク質、カルモジュリンでは阻害されなかった。本質的に同様の結果が、CRA Vaを使用して得られた(図13)。ビオチン含有152kDアダクトの形成は、時間の関数で飽和し(Vaの質量、2.2kD)、アダクトの形成はgp120(421〜436)-BSA複合体(3μM)によって阻害されるが、同濃度のBSAでは阻害されず、非免疫Abとの反応は、特異的Abと比較してゆっくり進行した。
【００９１】
exEGFRに対するポリクローナルIgGのIVアダクトの蓄積についての疑似一次反応速度定数は、1.0±0.1h-1であった。非免疫IgGでは反応が検出されなかったので、kobsの正確な推定は不可能である。図12における観察期間中のアダクト蓄積の上限として画像システムの検出感度を使用すると(133AAU)、kobsの上限は7.2x10-3h-1であった。同様に、Vaの抗ペプチドIgGアダクト蓄積のkobsは非免疫IgGアダクトよりも496倍高かった(それぞれ、17.8±3.3h-1および0.4x10-1±10-1h-1、図13のデータ)。
【００９２】
考察
従来のセリンプロテアーゼの活性化された求核残基は、ホスホン酸ジエステルプローブ、例えばセリンプロテアーゼの触媒性Ser-His-Asp三連構造の水素結合によって活性化されたSer残基と共有結合的に反応する。タンパク質分解性およびエステル分解性のAbにおけるこのような求核体の存在は、変異誘発およびホスホネート共有結合の研究から推理されてきた(10〜12)。基質への求核攻撃は、ある種の酵素による触媒における速度制限段階である(24)。Abで報告されている触媒速度定数(kcat)の大きさは一般的に酵素よりも小さいので、一般的にAbの求核反応性には不完全性が存在すると思われる。本明細書で報告した研究は他の場合を示す。ハプテンホスホン酸ジエステルとの共有結合アダクトの形成速度から測定したところ、タンパク質分解活性が低いにもかかわらず、IgG調製物はトリプシンよりも強力な求核反応性を示した。ポリクローナルIgGおよび個々のscFvクローンの研究は、見かけ上共通の求核活性を示した。対照実験では、この反応性は熱変性で失われたので、求核体の活性化はタンパク質の天然構造に左右されるという予測と一致する。ホスホン酸ジエステルに結合する共有結合Abは、確立されたセリンプロテアーゼ反応試薬DFPによって阻害された。さらに、Abのタンパク質分解活性は、ホスホネートならびにDFPによって阻害されたので、ホスホネートと反応する求核体はセリンプロテアーゼ様の特性であることが裏付けられた。これらの研究によって、Abに本来備わっている特性としての求核反応性は、免疫応答中に生じた非共有型抗原結合力と独立して発現したことが示唆される。この結論は、タンパク質分解性Ab軽鎖の触媒的三連構造は生殖細胞系V遺伝子によってコードされるという以前の我々の報告と一致する(25)。
【００９３】
IgGの両Abサブユニットはハプテンホスホン酸ジエスエルIの共有結合を表すので、軽鎖(8、10)および重鎖(12、26)で触媒的Ser求核体が同定された研究と一致した。組換えscFvクローンの研究によって、V領域に求核部位が存在することが確かめられた。タンパク質CRA IVおよびペプチジルCRA Vaに対する抗原特異的Abでは共有結合の改善が認められることによって示唆されるように、求核体は抗原結合部位内またはすぐ側に位置する。本研究はV領域に起因する触媒活性に関して実施したので、定常領域の求核部位の存在は調べなかった。V領域および定常領域をコードする遺伝子はある種の配列同一性(27)を示すので、定常領域求核体の存在を否定することはできない。求核反応性が印象深いにもかかわらず、Abによる触媒速度は制限される。おそらく、これは脱アシル化および生成物遊離段階に関連したエネルギー障壁のためであろう(図7)。アシル化反応中間体の蓄積増大は、反応過程のその後の段階が類似しているにもかかわらず、質量作用の法則にしたがってタンパク質分解を加速するので、この説は、scFvクローンのタンパク質分解と求核性の相関性の所見と矛盾しない。プロテアーゼに加えて、脂質、炭化水素および核酸の化学的変換に関与する様々な酵素の触媒力は共有結合機構に起因する(28〜30)。これらの酵素の中には、ホスホネートプローブとの反応が報告されているものもある(例、31)。アルドラーゼAbは、ホスホン酸ジエステルハプテンで免疫することによって生じたが(32)、固有のAb求核性との関係ははっきりしない。プロテアーゼおよびエステラーゼ活性に加えて、Abはヌクレアーゼ(4)、ペルオキシダーゼ(33)およびキナーゼ(34)活性を発現する。本明細書で説明した求核性Ab反応は、おそらくこれらの反応で役割を担っているのであろう。
【００９４】
EGFRおよび合成gp120(421〜436)ペプチドに対する特異的ポリクローナルAbおよびモノクローナルAbは、非免疫IgGよりも実質的に高い程度でこれらの抗原のCRAアナログ(それぞれ、IVおよびVa)に対する共有結合を示したので、該求核体は非共有型抗原結合相互作用と協調してそれらの反応性を発現することが示唆された。したがって、非共有型Ab-抗原結合は、求電子体(ホスホン酸基)をAb求核体へより効果的に輸送することを可能にする機構として解釈することができる。ホスホン酸ジエステル基を持たない同族抗原は共有結合反応を阻害するので、求核体と非共有的結合が生じる残基との間は空間的に近接していることが示唆された。CRAアダクトの実験的に観察された抗原特異的形成を説明するために、以下の条件を揃えなければならない、(a)生殖細胞系によってコードされる求核体は、Ab結合部位に保持されるか、または新規求核体は適応Ab特殊化の最中に生成されなければならない、(b)ホスホネートプローブの共有結合距離内にAb求核体がさらに接近するのを可能にするための機構を利用しなければならない。該Abはこれらの基を含有しないポリペプチドで免疫することによって生じるので、IVおよびVa内のホスホネート基で見当を合わせてAb求核体を空間的に正確に配列させることは成功しそうにない。逆に、Abの非共有結合部位と求核結合部位との間の部分的関係を予知しなくても、ホスホネート求電子体はタンパク質IVの側鎖Lys残基およびペプチドVaのC末端に配置された。これらの考察から、求核体は抗原エピトープ内に不正確に位置するホスホネート求電子体と接触させるために十分な立体的自由度を持っていることが示唆される。抗原に結合した後のAbの個々のアミノ酸の移動度は、他のグループによって報告されている(35、36)。以前に行われたエピトープマッピングおよび変異誘発研究によって、タンパク質分解性Abの触媒残基はAb抗原基準状態複合体の安定化に最低限関与することが示されたので(11、37)、求核体の移動度は非共有結合相互作用によって制限されないことが示唆された。おそらく、空間的に隣接したペプチド結合への攻撃を開始するために、求核体が自由なもう1つの遷移状態が形成されることによって、VIP(38)およびgp41(8)に対するMAbはこれらの抗原における複数のペプチド結合を切断できるという所見によって、このモデルはさらに支持される。
【００９５】
Abによる触媒速度を適応改善することは、B細胞のクローン選択に関与する機構によって制限される。生成物放出が細胞分裂を刺激するために必要なBCRによる膜貫通情報伝達の速度を超過すると、細胞増殖は停止する。一方、本研究の結果によって示唆されるように、Ab求核性を適用改善するために制約はない。本明細書で説明した抗原特異的Abの改善された求核反応性は、ポリペプチドによる通常免疫から生じる。該反応性は2種類の異なる抗原を対象とするポリクローナルAbおよび3種類の異なるモノクローナルAbで認められるので、該反応性を偶発的な免疫学的現象によるものと見なすのは困難である。IVおよびVaのホスホネート基に当たる天然の部分、例えば、ペプチド主鎖および側鎖アミドの求電子カルボニル基への求核攻撃は、共有結合アシル-Ab複合体の形成を引き起こすことが予測され(図7)、BCRの長期占有を可能にし、反応性の高まったAbの出現に有利である。明らかに、CRAのホスホン酸ジエステル基は、タンパク質抗原のカルボニル基よりも求電子性が高いが、Ab求核性はトリプシンに匹敵するか、またはトリプシンより優れており、タンパク質抗原に対して求核性Abによる攻撃が起こり得ることが示唆される。ハプテン抗原と不可逆的な共有結合複合体を形成する能力を備えたAbの2例が報告されており(39、40)、あるAbはアルブミンに対してSDS耐性結合を示す(Paulおよび共同研究者、別の場所で報告される予定である)。Ab求核反応性は、安定な共有結合を形成せずにAb抗原結合に関与することができると考えられた。例えば、該求核反応は、プロトンを遊離基(図7のC末端ペプチドフラグメント、攻撃が側鎖アミド基に生じる場合はアンモニア)の窒素原子に与えるために利用できる機構がないために、アシル-Ab複合体には推移しない部分的な共有結合特性を備えた構造を導くことができる。
【００９６】
重要な生物学的影響は、自己免疫、同種免疫およびリンパ球増殖性疾患(41)で見いだされるAbのタンパク質分解活性、例えば、免疫制御の妨害(42)および神経ペプチドVIPの平滑筋弛緩作用(43)が原因であると考えられてきた。非共有結合相互作用によってホスホン酸ジエステル基のAb共有結合が促進されることを考慮すると、ペプチジルおよびタンパク質CRAは触媒活性の永久的および選択的遮断を可能にするという仮説を立てることができる。さらに、非共有結合抗原結合と協調した求核性の発現が一般的なAb特性である限り、CRA阻害は一般的に、触媒活性に関わりなく、Abの生物学的影響を阻害する有用な手段とすることができる。例えば、CRA IVおよびVaを使用して、EGFR(44)および合成gp120(421〜436)(45)に結合することがそれぞれ報告されている全身性硬化症および狼瘡の患者のAbの機能的役割を研究することができる。
【００９７】
実施例１の参考文献
2007524601.tif 000010
2007524601.tif 000011
2007524601.tif 000012
1略語:Ab、抗体、AMC、7-アミノ-4-メチルクマリン、BSA、ウシ血清アルブミン、CRA、共有結合反応性抗原アナログ、DFP、フルオロリン酸ジイソプロピル、exEGFR、ヒト上皮増殖因子受容体の細胞外ドメイン、KLH、キーホールリンペットヘモシアニン、MCA、メチルクマリンアミド、V領域、可変領域、VIP、血管作用性小腸ペプチド
【実施例２】
【００９８】
gpl20の共有結合反応性アナログによって誘導される特異的なHIVgp120切断抗体
小さなペプチド基質の乱雑な切断は、生殖細胞系遺伝子Vドメインによってコードされる抗体Iの遺伝性の機能である(1で総説)。個々のポリペプチドに関する特異性を有するペプチド結合切断抗体は、自己免疫疾患(1)および同種免疫疾患(2)を有する患者において同定されている。タンパク質分解活性を示す特異的モノクローナル抗体および抗体L鎖サブユニットは、ポリペプチドを用いた通常の免疫によって産生することができる(3、4)。しかしながら通常の環境下では、触媒活性の適応性のある成熟は、好ましい事象ではない可能性がある。B細胞クローン選択は、抗体のVドメインをコードする遺伝子の配列の多様化、次にB細胞の増殖を促進する(5)、最大親和性での細胞表面抗体と抗原の選択的結合によって起こる。触媒反応は抗原の化学変換および抗体からの生成物の放出を伴い、これによって触媒速度が細胞増殖を刺激するのに必要な膜貫通シグナルの速度を超えるときは、B細胞増殖の停止が引き起こされる可能性がある。
【００９９】
ハプテンホスホン酸エステルは、従来型のセリンプロテアーゼの不可逆的阻害剤として本来開発されたので、天然のタンパク質分解抗体の求核性部位と共有結合することが報告されている(6、7)。ハプテンホスホン酸エステルは、改善された求核性を有する抗体の合成を誘導するために、共有結合反応性アナログ(CRA)として働く可能性があると思われる。抗体の求核性がタンパク質分解の律速である程度では、すなわち、触媒反応サイクルの後のステップ (アシル-抗体複合体の加水分解、および生成物の放出)が重大なエネルギー障害となることはない(図14)場合、その増大がより迅速なペプチド結合の切断を可能にする可能性がある。抗体の求核反応性の本来の特徴はこの手法の主な要素であり、Vドメインの配列多様化の過程における化学的反応性がある部位のde novo形成の必要性は存在しない。抗体中の触媒部位の構造をプログラムするための大部分の以前の試みは、対照的に、オキシアニオン遷移状態の非共有結合安定化に頼っている(すなわち、遷移状態のアナログを用いた免疫による;8、9)。エステラーゼ活性を有する抗体(10)、およびアルドラーゼ活性を有する他の抗体(11)は、共有結合の触媒機構を利用するが、本来の抗体の求核性とのこれらの活性の関係は明らかではない。
【０１００】
理想的な抗原特異的タンパク質分解抗体は、抗体-抗原複合体の基底状態における伝統的な非共有結合の相互作用と、ペプチド主鎖上の求核攻撃を組み合わせていると考えることができる。基底状態の相互作用は、個々のポリペプチド抗原に関する特異性を得るのに望ましい。安定した基底状態の複合体によって、触媒反応に関する障害が示されることはない。ただし、非共有結合の相互作用は遷移状態の複合体に行われ、反応中心における求核攻撃と適切に協調するものとする。理論では、抗原特異的タンパク質分解抗体の合成は、非共有結合の相互作用に利用可能な古典的な抗原エピトープとの関連で化学反応中心の模倣体である、アナログによって誘導され得ると思われる。反応が錠と鍵の関係の立体化学的機構によって進行する場合、模倣体はポリペプチド抗原の主鎖中の目的の切断性結合の位置に正確に位置しなければならない。大きなタンパク質の場合、タンパク質主鎖内に模倣体を配置させることは、現代の合成技術の範囲外である。考えられる解決法は、化学的連結技法を使用して、模倣体の基をアミノ酸側鎖に配置させることである。側鎖の模倣体を認識する抗体の求核体は、それが基質のポリペプチド主鎖に接近しアシル-抗体複合体を形成するのに充分な立体配座の自由を享受する場合、タンパク質分解を容易にすると思われる(図14)。
【０１０１】
タンパク質のLys側鎖に位置するホスホン酸ジエステル基からなる、HIV-1コートタンパク質gp120(gp120-CRA)の共有結合反応性アナログ(CRA)によって誘導される抗体の特徴を我々はここで記載する。これらの抗体の増大したセリンプロテアーゼ様求核反応性を観察した。1つのモノクローナル抗体がgp120をゆっくりと特異的に切断し、それはLys/Arg残基のC末端側での切断に関する優先性を示し、この触媒反応はCRA阻害の影響を受けやすかった。これらの発見は、個々のタンパク質に特異的なタンパク質分解活性を有する抗体を、需要に応じて産生することができることを初めて示した。
【０１０２】
材料および方法
ハプテン、gp120-CRAおよびビオチン化タンパク質。  ハプテンCRA IおよびIIの合成(図14)、ならびにESI-質量分光法および元素分析によるそれらの特徴付けは、以前に記載されている(12)。gp120-CRA IIIを調製するために、前駆体ジフェニルN-[O-(3-スルホスクシンイミジル)スベロイル]アミノ(4アミジノフェニル)メタンホスホン酸(IV)は、ジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホン酸(79mg、0.13mmol)を、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.11ml、0.63mmol)を含むDMF(2ml)に溶かした溶液と、ビス(スルホスクシンイミジル)スベリン酸二ナトリウム塩(150mg、0.26mmol;Pierce)を2時間混合させることによって合成した。逆相HPLCによってIVを精製し(12)、凍結乾燥させて無色の粉末を得た;収率54%、50mg;m/z715(MH+)、電子衝撃イオン化質量分析による)。IV(1.1mg)は、電気泳動によって純粋な状態にしたgp120(0.5mg;Immunodiagnostic Inc、MN菌株、バキュロウイルス発現系から精製したもの)と、5mlの10mM HEPES、25mMのNaCl、0.1mMのCHAPS、pH7.5バッファー中において反応させた(2時間、25℃)。ゲル濾過(Micro Bio-Spin 6使い捨てカラム、BioRad)によって過剰なIVを除去し、最初のタンパク質およびCRA誘導型タンパク質中の遊離アミンの濃度を、フルオレスカミン(13)を使用して測定した。標識の濃度は、IVの濃度を変えることによって4.0〜32.6mol CRA/mol gp120まで必要に応じて変えた。Lys残基においてビオチンで標識されたgp120(Bt-gp120)の調製は、6-ビオチンアミドヘキサン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Sigma)を使用する同様の手段によるものであった。反応時間および反応物の濃度を調節して、ビオチン/gp120モル比0.8〜1.9を得た。未反応ビオチン化試薬は、50mMのTris-HCl、100mMのグリシン、0.1mMのCHAPS、pH7.8中において使い捨てゲル濾過カラムを使用して除去した。ビオチン含量は、2-(4'-ヒドロキシアゾベンゼン)安息香酸(14)を使用して測定した。全タンパク質はBCA法(Pierceキット)を使用して測定した。ビオチン化IIIは、IIIに関して記載したのと同様にBt-gp120から調製した。ハプテン基の取り込みが増大すると、ビオチン化IIIは、約240kDおよび380kD(モノマーgp120の外見上の質量、120kD)のバンドとしてSDS電気泳動ゲル中で明らかな、ダイマーおよびトリマーを形成する傾向があった。免疫原として使用した非ビオチン化IIIと同等のハプテン濃度(23mol/molgp120)でのビオチン化IIIは、それぞれ50%、21%および29%の比率でモノマー、ダイマーおよびトリマー種を含んでいた。タンパク質-CRAを凍結乾燥させ、使用するまで-20℃で保存した。Bt-gp120は50mMのTris-HCl、pH8.0、0.1Mのグリシン、0.1mMのCHAPS中に-70℃で保存した。N,N-ジメチルホルムアミドに溶かした10mM溶液と同様にIおよびIIの保存は-70℃であった。Dr.Maureen O'Connor(15)から得たEGFRの細胞外ドメイン(exEGFR)を、gp120(0.9molビオチン/mol exEGFR)に関して記載したのと同様にビオチン化させた。
【０１０３】
抗体。  gp120-CRA III(23molホスホン酸ジエステル/mol gp120)で免疫したメスのMRL/MpJ-Faslprマウス(Jackson Laboratory、Bar Harbor、Maine;4〜5週齢)からモノクローナル抗体を調製した。gp120-CRA III(11μg)をRibiアジュバント(MPL+TDMエマルジョン;Sigma)に溶かしたものを第0、14および28日にマウスに腹腔内注射し、次に第55日にアジュバントなしで第4回目の静脈内追加抗原刺激を行った。免疫スケジュールの過程中に眼後方の網状組織から血液を得た。最後の注射後第3日で、脾臓細胞と骨髄腫細胞系(NS-1;3)を融合させることによってハイブリドーマを作製した。ELISAによって所望の抗体を分泌するウェルを同定した後、モノクローナル細胞系を、希釈を制限することによって2ラウンドのクローニングによって調製した。モノクローナルIgGは、固定タンパク質Gの親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体(200ml)を含む組織培養物上清から調製した(3)。対照モノクローナル抗体(抗VIPクローンc23.5および抗黄熱病ウイルス抗原クローンCRL1689;ATCC)および血清IgGを同様に精製した。過剰なIgGの銀染色およびマウスIgGに特異的な抗体を用いるイムノブロッティングによって測定して(3)、IgG調製物は電気泳動によって均質であった。gp120またはgp120-CRAを用いたメスのBALB/cマウス(Jackson;4〜5週齢)の追加の免疫を同様に行った。モノクローナル抗体重鎖および軽鎖アイソタイプは、(3)に記載したのと同様にELISAによって測定した。
【０１０４】
ELISA。  Maxisorp96-ウェルマイクロプレート(Nunc)を、100mM重炭酸バッファー、pH8.6に溶かしたgp120またはgp120-CRA(40〜100ng/ウェル)でコーティングした。通常のELISAを、(16)に記載したのと同様に行った。不可逆的結合のアッセイ用に、抗体をプレートに結合させ、2%SDS、10mMリン酸ナトリウム中、137mMのNaCl、2.7mMのKCl、0.05%のTween-20、pH7.4(PBS-Tween)、またはSDSを含まないPBS-Tween(全体の結合を測定するための対照ウェル)で30分間、ウェルを処理した。次いでウェルをPBS-Tweenで3回洗浄し、ヤギ抗マウスIgGのペルオキシダーゼ結合体(Fc特異的;Sigma、Saint-Louis、MO)を使用して、結合したIgGを通常どおり測定した。観察した結合値は、非免疫IgGまたは非免疫マウス血清を含むウェル中の非特異的結合に補正した(A490<0.03)。SDS処理したウェル中の残基結合の割合は、(A490,SDS 処理ウェル)×100/(A490,PBS-Tween 処理ウェル)として計算した。
【０１０５】
抗体-CRA複合体の電気泳動。  精製IgGによるビオチン化CRAの不可逆的結合は、変性電気泳動によって測定した(6)。簡潔には、反応混合物を50mMのTris-HCl、0.1MのグリシンpH8.0中において37℃でインキュベートした。SDSを2%まで加え、混合物を煮沸し(5分間)、次いでSDS-PAGEを施した(4〜20%、Biorad、Hercules、CA;または8〜25%Phastゲル、Amersham)。ニトロセルロース膜(0.22μm、Biorad)上でのエレクトロブロッティングの後、膜をPBS-Tweenに溶かした5%のスキムミルクでブロックし、それぞれペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgG(Sigma)またはペルオキシダーゼストレプトアビジンを使用する、IgGまたはビオチンの検出用に処理した。画像化および定量は、X線フィルム(Kodak)およびUnscan-itソフトウェア(Silk scientific、Orem、Utah)またはFluoro-STM Multilmager(Biorad)を使用して行った。ビオチン化BSA(11molビオチン/1mol BSA;Sigma)を使用して、標準曲線を構築した(0.06〜1.5pmolビオチン/レーン)。
【０１０６】
加水分解アッセイ。  ビオチン化タンパク質を、50mMのTris-HCl、0.1Mのグリシン、0.1mMのCHAPS、pH8中において37℃でIgGと共にインキュベートし、2%までのSDSを加えることによって反応を停止させ、サンプルを煮沸し(5分間)、次いで還元SDSゲル電気泳動(4〜20%、BioRad)によって分析した。ゲルのブロット中のビオチン含有タンパク質バンドを、前項と同様に同定し定量した。いくつかのブロットでは、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗gp120抗体(Fitzgerald、Concord、MA;カタログ番号60-H14)を使用するイムノブロッティングによって反応生成物を同定した(16)。電気泳動ゲル由来のタンパク質バンドのN末端塩基配列決定は、前に記載したのと同様に行った(17)。ペプチド-MCA基質(Peptide Intn、Louisville、KYまたはBachem Biosci、King of Prussia、PA)の加水分解は、標準として真正アミノメチルクマリンを用いる、アミノメチルクマリンの蛍光検出(Varian Cary Eclipse;λex360nm、λem470nm)によって96ウェルプレート中において測定した(6)。モノクローナル抗体c23.5による(Tyr10-125I)VIPの切断は、トリクロロ酢酸で説明できる放射能として測定した(17)。高濃度のペプチド-MCA基質の切断に関する運動パラメーターは、ミカエリス-メンテンの式:v=(Vmax[S])/(Km+[S])から測定した。高濃度のタンパク質におけるgp120の切断の研究に費やしたために、この反応に関するKd(ほぼKm)およびkcatを、一般的な二次方程式から得た(17):[Ct]と[St]が触媒と基質の合計濃度であり、[CS]が触媒基質濃度である、[CS]2-[CS]([Ct]+[St]+Kd)+[Ct][St]=0。この方法は、一連の推定Kd値における[CS]を計算することからなる。(線形回帰により)観察した反応速度と[CS]の間の最適性をもたらす推定Kd値が、実験で測定したKdとなる。kcatは観察した速度と[CS]プロットの勾配として計算する。
【０１０７】
結果
gpl20-CRAの設計および確認。  ハプテンCRA IおよびIIの合成(図14)およびそれらの天然に存在するタンパク質分解抗体との共有結合反応性は前に記載されている(6、7)。求核性のホスホン酸基は、求核攻撃を受けやすいペプチド結合カルボニル基と似ており、ホスホン酸ジエステルに隣接する正に荷電したアミジノ基は、Lys/ArgP1残基の模倣体として働き、そこでは生殖細胞系遺伝子にコードされたタンパク質分解抗体による切断が観察され(6)、I中のビオチン基は抗体-ホスホン酸アダクトの感度の良い検出を可能にする。gp120-CRA IIIは、タンパク質によって提示される抗原エピトープと空間的に近いホスホン酸ジエステル基を含む。多数のホスホン酸ジエステル基がgp120の1分子当たりで利用可能であり、多様な抗原エピトープと共に求核性ハプテンの提示を可能にした。
【０１０８】
IIIで免疫したMRL/lprおよびBALB/cマウスでは強いポリクローナル抗体の応答が、通常のELISAによって観察された。IIIに対して産生した抗体は、ホスホン酸ジエステル基を欠く対照gp120より幾分高いレベルで固定されたIIIの近くに結合した(図15)。逆に、gp120に対して産生した抗体は固定されたIIIを認識したが、その結合は固定されたgp120の3〜4分の1であった (例えば、1:1000の血清希釈で、A490は固定されたIIIに関して0.44±0.03、および固定されたgp120に関して1.40±0.03)。非免疫抗体によるIIIの結合は無視できる程度のものであり、ハプテン基における無差別な共有結合は問題ではなかったことが示された。観察したgp120とIIIの抗原反応性の違いは、さらなる抗体試験を続けるのに充分なほど小さく保たれた。高スループットスクリーニングを容易にするために、抗体による不可逆的なIIIの結合を測定する可能性を、ELISAによって試験した。ポリクローナル抗体抗III抗体と固定抗原の結合の後に、ELISAプレートを変性SDSで処理して、不可逆的に結合した抗体を除去した。SDS処理によって、ハプテンホスホン酸基を欠く対照gp120の近くに結合した抗III抗体を、ほぼ完全に除去することができた。対照的に、3回の反復実験での SDS処理の後に固定されたIIIと結合した、全体の抗III抗体の結合活性の13〜40%は一貫して保たれた。マウスIgGに対する抗体を用いたSDS電気泳動およびイムノブロッティングによって、煮沸反応混合物中の不可逆的な抗体-III複合体の形成を確認した(図15の挿入図、レーン3、分子質量標準の外挿標準曲線からの推定質量、約400kD;III中での多数の抗体とハプテン基の結合によって、大きな複合体を形成することができる)。
【０１０９】
触媒活性。  gp120-CRA IIIで免疫したMRL/lprマウスから、モノクローナル抗体を調製した。このマウス系統は、機能障害のあるFas-受容体遺伝子に起因するループス様自己免疫疾患を発症する。タンパク質分解抗体の自然発生(18)、およびホスホン酸モノエステルハプテンによる免疫に応答したエステラーゼ抗体の合成の増大(19、20)が、このマウス系統において報告されてきている。712のハイブリドーマのウェル(2つの脾臓細胞-骨髄腫細胞融合体)からの上清を、IIIとのSDS耐性結合に関してスクリーニングした。7つのウェル由来のIgGは、この活性に関して陽性であった。限界希釈による細胞のクローニングの後、7つの細胞系の上清由来のモノクローナルIgGを精製し、結合アッセイを繰り返した(図16;クローンYZ18、IgG2a、k;YZ19、IgG2b、k;YZ20、IgG2a、k;YZ21、IgG2a、k;YZ22、IgG2a、k;YZ23、IgG2a、kおよびYZ24、IgG1、k)。ELISAプレートのSDS処理なしで観察した全体の結合の中で、界面活性剤処理後の残基の結合は、4回の反復アッセイにおいて43〜83%であった。SDS処理なしで通常のELISAによって測定して、7つ全てのモノクローナル抗体がハプテンCRA基を欠くgp120によっても結合し、IIIの調製用に使用した化学的修飾手順によって作製したネオエピトープを、これらのモノクローナル抗体が対象としないことが示された。無関係なモノクローナル抗体(クローンCRL1689)は、IIIまたはgp120の検出可能な結合は示さなかった。
【０１１０】
SDS電気泳動ゲル中のタンパク質のビオチン含有フラグメントの出現によって測定すると、不可逆的なIIIの結合活性を有する7つのモノクローナル抗体の中で、3つのモノクローナル抗体によるBt-gp120のゆっくりとした切断が検出された(YZ18、YZ20、YZ24)。モノクローナル抗体YZ18およびYZ24によって切断されたBt-gp120の電気泳動パターンは、図17においてモノクローナル抗体YZ20に関して示されたものと類似していた。モノクローナル抗体YZ20をさらに試験した。何故なら、それは、Bt-gp120を他の2つのモノクローナル抗体より約5倍速く切断したからである。gp120の消費は時間依存性であった(図17A)。見た目の質量55kDおよび50kDを有する主要なビオチン含有切断生成物、および27kDおよび15kDでのさらに弱く染色されたバンドが観察された。35kDでのバンドは過剰露出したゲルでは目に見える状態であったが、これがモノクローナル抗体による切断の生成物を表すわけではない。何故ならそれは、希釈液中でのBt-gp120の対照インキュベーションにおいて、同じ濃度で存在したからである。対照の無関係なモノクローナル抗体(クローンCRL1689)は、Bt-gp120を切断しなかった。ポリクローナル抗gp120抗体を使用するイムノブロッティングによって、非ビオチン化gp120もモノクローナル抗体によって切断されやすいことを確認した(55kDの切断生成物、図17B)。両方の検出法が、完全なgp120の減少を測定することによって、gp120の切断を定量することができる。いずれの方法も、完全な生成物の概略または生成物濃度についての指針を与えることはできない。何故ならBt-gp120は、最小量のビオチン(約1mol/molgp120)を含み、イムノブロッティングに使用したポリクローナル抗体は、切断生成物と等しく反応しないからである。
【０１１１】
モノクローナル抗体YZ20は、ビオチン化BSAまたは上皮増殖因子の細胞外ドメイン(exEGFR)を切断せず、gp120に関する選択性が示された(図18A)。モノクローナル抗体YZ20によって切断される結合を同定するための試みは成功しなかった。55kDおよび50kDのバンドのN末端塩基配列決定によって、gp120のN末端残基に対応する同一の配列(TEKLWVTVYY)を得た。YZ20の反応混合物由来の15kDバンドの塩基配列決定によって、おそらく固定されたN末端のために、検出可能なアミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体は得られなかった。27kDのgp120フラグメントの同定は、それが還元ゲル中で抗体軽鎖と共に移動するために複雑である。モノクローナル抗体によって切断されるgp120中の正確な結合の同定が、この試験の中心ではなかったので、我々は切断性結合の優先性を決定するためのモデルペプチド基質の使用に移った。蛍光測定アッセイを使用して、アミノメチルクマリンと一群のペプチド-MCA基質中のC末端アミノ酸を連結させるアミド結合の、モノクローナル抗体触媒の切断を測定した(図18B)。ペプチド-MCA基質は過剰な濃度(200μM)で使用して、さらに弱い交差反応性の触媒抗体の検出を可能にする。Arg-MCAおよびLys-MCAにおける選択的切断を観察し、中性または酸性残基のC末端側での明らかな切断は観察されなかった。この割合の違いは(離れた残基とは反対に)切断部位における塩基性残基の認識によるものであることを確認するために、切断性結合部のN末端残基以外配列が同一である2つのトリペプチド基質、Gly-Gly-Arg-MCAおよびGly-Gly-Leu-MCAを我々は試験した。前者の基質は抗体YZ20によって検出可能なレベルで切断され[0.31±0.01(標準偏差)μMのAMC/19h/IgG 1μM]、一方、後者の基質と抗体の反応混合物の蛍光強度は、アッセイ希釈液で観察したバックグラウンド値とは統計上識別不能であった[0.02±0.04μMのAMC/19h/IgG 1μM;P>0.05;スチューデントのt検定、非対;図18C]。塩基性残基の優先性は、免疫原(III)中のホスホン酸基に隣接する正に荷電したアミジノ基の存在、および前に観察した生殖細胞系遺伝子にコードされたタンパク質
分解抗体によるArg/Lys残基のC末端側での選択的切断と一致する(21、22)。
【０１１２】
望ましい触媒性、すなわち個々の抗原に関する高い親和性と迅速な代謝回転を組み合わせた能力の達成は、Kmおよびkcatパラメーター(切断された抗原のモル数/抗体のモル数/単位時間)から判断することができる。Bt-gp120のモノクローナル抗体YZ20のKmは、その好ましいペプチド-MCA基質(E-A-R-MCA;表4;アミノ酸の一文字コード)の約200分の1であり、IIIを用いた免疫によるgp120に関する特異性の増大と一致した。12モルのE-A-R-MCAが、反応(22時間)の過程中1モルのモノクローナル抗体YZ20当たりで切断され、このモノクローナル抗体は、触媒の明確な特徴である代謝回転が可能であることが示された。Bt-gp120の代謝回転は、E-A-R-MCAの約10分の1であった。以前に、従来の非抗体セリンプロテアーゼは、大きなタンパク質より迅速に短いペプチドを切断することが報告され(23)、これはおそらく、前者の基質が触媒部位により容易に接近可能であるためである。
【０１１３】
求核反応性。  モノクローナル抗体YZ20によるgp120の加水分解はハプテンCRA IIによって阻害され(図19)、このモノクローナル抗体のセリンプロテアーゼ様の性質が確認された。gp120のモノクローナル抗体YZ20切断によるIIの阻害は、VIPのモノクローナル抗体c23.5による切断の阻害より90倍強力であった(IC50、それぞれ0.4μMおよび36.0μM)。後者のモノクローナル抗体は、ホスホン酸ジエステル基を欠くVIPを用いた免疫によって得た(3)。ハプテンCRAとモノクローナル抗体YZ20の優れた反応性は、gp120-CRA免疫原中に存在するホスホン酸基を用いた免疫に応じて強化された抗体の求核性という結論と一致する。
【０１１４】
求核性の誘導を確認するために、ポリクローナルIgGによる不可逆的なハプテンCRA Iの結合を測定した。ハプテンCRAはgp120に属する抗原エピトープを含まず、非共有結合の相互作用が、抗体によるその不可逆的結合に貢献するとは予想されない。IIIで免疫した全4匹のマウス由来のIgGサンプルが、対照gp120で免疫したマウス由来のIgG(平均値、0.31および0.01pmolのI;P<0.02、スチューデントのt検定、非対観察値)、および集めた非免疫IgGと比較して、優れたIの結合を示した(図19)。BALB/cマウスをこの免疫において試験した。IIIを用いた免疫に応じた求核性抗体の合成は、自己免疫宿主に限られないと結論付けることができる(gp120-CRA IIIに対するモノクローナル抗体は、MRL/lprマウスから調製した)。
【０１１５】
考察
この試験の目的は、抗体の固有のセリンプロテアーゼ様反応性を強めること、およびgp120の切断に対する反応性を対象とすることであった。gp120-CRA IIIを用いた免疫後の、抗体によるハプテンCRAの改善された不可逆的結合は明らかであり、ハプテンCRAはモノクローナル抗体によるgp120切断の強力な阻害剤であった。これらの観察によって、ホスホン酸ジエステル基によって誘導される抗体の求核性の適応性のある改善が示唆される。gp120に関する抗体の特異性は、伝統的な非共有結合機構、すなわちホスホン酸ジエステル基の近くに位置するgp120エピトープの認識によって得た。gp120切断モノクローナル抗体による無関係なタンパク質の切断は観察されず、モデルペプチドの切断のKm値はgp120切断のそれより200倍大きく、無差別なタンパク質分解はなかったことが示された。
【０１１６】
タンパク質分解はgp120の主鎖における抗体攻撃を伴い、一方ホスホン酸求核体は免疫原のLys側鎖に位置する。gp120-CRAに対して産生したモノクローナル抗体はタンパク質分解活性を示したので、側鎖の求核体を認識するために生じた求核体は、ポリペプチド主鎖を攻撃するのに充分な立体配座の自由を享受しているに違いない。抗原と結合した後の抗体結合部位中の個々のアミノ酸の移動は、報告されてきている(24、25)。いくつかのタンパク質分解抗体のエピトープのマッピングおよび突然変異誘発試験は、これらの触媒残基は抗体-抗原基底状態複合体の安定化に関与していないことを示してきており(26、27)、求核体の移動性が最初の非共有結合抗体-抗原相互作用によって制限される可能性はないことが示唆される。VIP(17)およびgp41(4)に対する天然に存在するモノクローナル抗体は、これらの抗原中の多数のペプチド結合を切断し、このことは、求核体が空間的に近いペプチド結合における求核攻撃を自由に開始する、他の遷移状態の形成を仮定することによって説明することができる(28中に総説)。抗体の求核体の立体配座の自由の程度を理解することは重要である。何故なら、大きなタンパク質を使用して触媒抗体の合成を誘導しなければならないときに、側鎖中にペプチド結合模倣体を配置するための実行可能な代替法は存在しないからである。利用可能な触媒抗体における求核体の動きの構造分析を対象とすること以外に、側鎖にホスホン酸基を結合させるために使用するリンカーの長さおよび柔軟性を他の試験において変化させて、触媒部位の柔軟性を評価することができる。合成ペプチド免疫原の場合、ホスホン酸基をペプチド主鎖内に取り込ませて、目的の切断性結合をより良くことができる(7)。しかしながら合成ペプチドは、全長タンパク質においてそれらの同族の抗原決定基と類似した立体配座をとることができないことが多く、この場合、抗ペプチド抗体は親タンパク質を認識しない。
【０１１７】
現代の非抗体セリンプロテアーゼにおいて見られる充分有効である触媒機構は、触媒サイクル中のそれぞれの律速ステップを最適化した淘汰圧力に応じて、おそらく進化してきている。対照的に、CRA免疫原はせいぜい、最大の共有結合攻撃能力を有する抗体を選択することができる。アシル-抗体複合体の加水分解または後の生成物放出ステップに関する選択は予想されず、これによって限られた抗体の代謝回転の観察結果を説明することができる。エステラーゼ抗体を産生するための2つの以前の試みによって、抗体による不可逆的な基質の結合の形成が示され(29、30)、抗体による求核攻撃後に起こる事象を最適化する必要性が示唆された。さらに、免疫原の構造的改良、例えば水分子と結合する要素の封入を実施して、抗体-抗原複合体の触媒経路への誘導、およびアシル-タンパク質複合体の加水分解の促進を手助けすることができると思われる。この弱点にもかかわらず、ここで報告する結果は、抗原特異的なタンパク質分解抗体の開発に関する相当な進展となる。以前に、ハプテンエステル加水分解活性を有するいくつかの抗体が、オキシアニオン遷移状態を非共有結合により安定化することができる触媒部位が、抗体Vドメインの適応性のある配列多様化の過程中に新たに(de novo)形成される可能性があるという前提に基づいて産生された(8、9)。この手法は、タンパク質分解抗体の開発に関しては成功していない。PollackおよびSchultzは、Phe-Leu-Alaのホスホン酸モノエステルアナログはタンパク質分解抗体の合成を誘導することができないを記載した(31)。プロテアーゼ合成の目的で本来の抗体の固有の性質、すなわちそれらの求核性および切断部位に隣接する塩基性残基の選択的認識を取り入れるための試みは、この試験ではなされていない。近年、ホスホン酸モノエステルが、セリンプロテアーゼ中の求核体と共有結合を形成することが発見されたが、それらの反応性はこの試験で使用したジエステルより弱く、隣接する正電荷が存在しない限り、検出可能な反応は起こらなかった(6、12)。
【０１１８】
触媒機能により増大した有効性の証拠が、VIP、28-アミノ酸神経ペプチドの生物学的影響の抗体アンタゴニズムに関して、近年発表されてきている(32、33)。gp120に関しては、主な障害は、ウイルス体中に含まれる抗原決定基、すなわち宿主CD4およびケモカイン受容体の結合部位を、認識する抗体の合成を誘導することとなっている。モノマーgp120に対して産生した大部分の抗体は、その可変領域のエピトープを対象とし、それらの抗体は、異なる地理的な位置で見られる多様なHIV-1菌株は中和しない(34)。可逆的に結合する抗体は、gp120の受容体結合部位またはその近くに結合して、宿主細胞へのHIVの進入を立体的に妨害するに違いない。タンパク質分解抗体は、それ自体が宿主細胞との結合に関与しない部位で切断が起こる場合でも、gp120の不活性化という潜在的な利点を与える。gp120-CRA IIIに対するモノクローナル抗体の免疫療法の可能性の考察はこの試験の範囲外であるが、最初のHIV-1中和試験によって、gp120-CRA IIIに対するいくつかのモノクローナル抗体は、HIV-1の主要単離体ZA009を中和する(末梢血単核細胞培養物、p24抗原の濃度を測定することによって感染を測定した;Paulおよび同僚、他の場所で発表された)ことが示唆される。考えられる落とし穴は、モノマーgp120-CRAに対するタンパク質分解抗体は、タンパク質と可逆的に結合する抗体に関して観察したのと同様に(35)、HIV-1の表面上のトリマーgp120を認識しない可能性があることである。この試験中に記載するCRA免疫原の技法は、近年開発されたトリマーgp120の組換え模倣体(36)、および完全なHIV-1粒子に容易に適用される。
【０１１９】
実施例２の参考文献
2007524601.tif 000013
2007524601.tif 000014
1略語:Ab、抗体、BSA、ウシ血清アルブミン、Bt、ビオチン、CRA、共有結合反応性抗原アナログ、L鎖、軽鎖、MAb、モノクローナル抗体、MCA、メチルクマリンアミド、TSA、遷移状態アナログ、V領域、可変領域、VIP、血管作用性小腸ペプチド
【実施例３】
【０１２０】
選択的な共有結合による病原性抗体の不活性化に関して:触媒性自己抗体を不活性化する血管作用性腸管ペプチドのホスホン酸ジエステルアナログ
自己免疫、アレルギーおよび移植拒絶反応の結果として産生されるある種のAbの病原性効果の元となるのは、可変領域による特異的抗原認識である。例えば、重症筋無力症(文献1の概説)および血友病(文献2の概説)に見いだされるAbは、アセチルコリンレセプターおよび第VIII因子それぞれの重要なエピトープに結合し、立体的な妨害機構によってこれらのタンパク質の生物学的活性を妨害する。その他のAbは、Fc領域を利用して病原作用を媒介するが、Ab可変領域による抗原認識はこれらの効果を開始する刺激であり、例えば、赤血球抗原のAb認識は、自己免疫溶血性貧血および不適合輸血におけるFc領域による補体活性化を刺激する。同様に、肥満細胞表面のFcレセプターに結合したIgEによるアレルゲン認識は脱顆粒を刺激する。他の疾患では、Ab病原性の機構ははっきりしない。例えば、狼瘡(文献3の概説)および橋本甲状腺炎(文献4の概説)では核酸に対するAbは明白に疾患関連性があるが、他の免疫異常もまた、これらの疾患で明白で、Abの正確な機能的効果には議論の余地が残されている。最近、Ab病原性の基礎となる新規可変領域機構、すなわち抗原の触媒的切断が明らかになった。ポリペプチド(5〜8)および核酸(9)に対するAbなどの加水分解触媒は、永久的に抗原を不活性化する能力を備えていた。さらに、触媒は代謝能力を備えており、すなわち、1個のAb分子が複数の抗原分子を加水分解することができるので、このようなAbは化学量論的な抗原認識に左右されるAbよりも能力が高い機能的効果を発揮できることが示唆される。
【０１２１】
VIPの切断を触媒するAbは、自己免疫疾患の患者で同定された(10)。VIPは、Tリンパ球に対する作用による免疫制御(文献11の概説)、並びに平滑筋に対する作用による血流および空気流の制御(文献12の概説)を含めた重要な生物学的作用をするアミノ酸28個のペプチドである。モデルのタンパク質分解Abは、培養T細胞によるサイトカイン合成を妨害すると同時に細胞性VIPを減少させ(13)、該Abをマウスに投与すると気道平滑筋の弛緩を妨害する(14)。VIPに対するタンパク質分解性Abは、セリンプロテアーゼを連想させる共有結合触媒機構を利用するようである。これは、活性部位Ser残基の置換によって触媒活性の消失が生じる研究(15)およびハプテンホスホン酸ジエステルによる触媒の阻害(10)によって示唆される。これらの化合物は、求電子的リン原子の共有結合反応性によって酵素の求核体が活性化したアダクトを形成し(文献16の概説)、最近、セリンプロテアーゼおよびセリンエステラーゼ活性を表すAbの活性部位求核体のためのプローブとして開発された(17、18)[共有結合反応性抗原アナログ(CRA)と称する]。
【０１２２】
通常のAbの場合のように、伝統的な非共有結合抗原認識は、VIPのタンパク質分解性Abの特異性の基礎となるとの仮説が立てられる。したがって、VIP配列のCRAは、Ab活性部位に対する共有結合と隣接するペプチドエピトープでの非共有結合とを併せ持つ反応表面を提供することによって、Abを標的化する潜在的に特異的な手段となる。本明細書で、モノクローナルAbおよびポリクローナルAbの合成VIP-CRA化合物との抗原特異的共有結合反応を説明する。単一部位、Lys20にホスホネート基を配置するにもかかわらず、共有結合反応によって、残基7と22との間に位置するいくつかのペプチド結合でVIPを切断するポリクローナルAbの不可逆的な阻害がもたらされる。これらの結果から、個々のAb集団の特異的不活性化の実現可能性は、抗原特異性に基づくことが示唆される。
【０１２３】
材料および方法
CRA。  ジフェニルN-(6-ビオチンアミドヘキサノイル)アミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(1)は、PyBOP(Novabiochem、San Diego、CA)を使用してジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネート(19、20)および6-ビオチンアミドヘキサン酸(Anaspec、San Jose、CA)から調製した。HPLC精製物質[保持時間20.76分、純度95%(220nm)、YMC ODS-AMカラム(4.6x250mm)、TFA 0.05% 水溶液(A)、アセトニトリルによるTFA 0.05%溶液(B)、90:10から20:80で45分(1.0ml/min)]は、ESI-MSによって特徴付けし[測定m/z 721.3(MH+、C36H45N6O6PSの算出MH+、721.3)]、DMFに溶かした10mM溶液として-70℃で保存した。活性化エステル2は、同前駆体アミンをスベリン酸ジスクシンイミジル(Pierce、Rockford、IL)でアシル化することによって調製し、同様の方法で特徴付けした[測定m/z、635.3(MH+、C32H35N4O8Pの算出MH+、635.2)]。VIP-CRA (3)は以下の通りに合成した。N末端にビオチンを有するVIP配列は、4-メチルトリチル(22)をLys20の側鎖保護として使用すること以外は、標準的9-フルオレニルメトキシカルボニル方法(21)によってRinkアミドMBHA樹脂(0.72nmol/g、Novabiochem)で作製した。該ペプチド樹脂は、ジクロロメタンに溶かした1%TFA溶液(5分x10)で処理して、4-メチルトリチル基を除去し、Lys20の脱保護したアミノ基はN,N-ジイソプロピルエチルアミン0.1mMを含有する1-メチル-2-ピロリジノンに溶かした2でアシル化した。ペプチド樹脂は、TFA-エタンジチオール-チオアニソール-フェノール(90:1:1:8)で室温で2時間処理した。濾過によって樹脂を除去した後、ジエチルエーテルを溶液に添加して沈殿を生成し、遠心によって収集してジエチルエーテルで洗浄した。HPLC精製物質[保持時間50.25分、純度96%(220nm)、Vydac 214TP C4カラム(4.6x250mm)、A:B、90:10から60:40で60分(1.0ml/min)]は、ESI-MSによって特徴付けし[測定m/z 4071.4(MH+、C185H282NO49O49PS2の算出MH+  4072.0)]、DMSOに溶かした10mM溶液として-70℃で保存した。
【０１２４】
Ab。  抗VIPモノクローナルIgGクローンc23.5および対照のアイソタイプが一致したIgGクローンUPC10(IgG2a、κ;Sigma、St.Louis、MO)は、プロテインG-セファロースを固定したアフィニティークロマトグラフィーによって覆水から精製した(23)。慢性閉塞性肺疾患のヒト患者の血清から得られたポリクローナルIgG(文献24ではHS2と称される)はまた、プロテインG-セファロースクロマトグラフィーによって精製した。抗VIP Abクローンc23.5(GenBank#L34775)の組換え軽鎖は、細菌の周辺質抽出物で発現し、Ni-アフィニティーカラムにhis6タグを結合させることによって精製した(15)。Abは全て、塩基泳動的に均一であった。タンパク質濃度は、Micro BCAタンパク質測定キット(Pierce)で測定した。
【０１２５】
CRAアダクト。  共有結合の測定は、既に説明したように実施した(17、20)。簡単に説明すると、IgG(1μM)を1mM CHAPS及び0.1％DMSO（3-結合実験）又は0.1％DMF（1-結合実験）を含有するリン酸ナトリウム10mM、NaCl 0.137M、KCl 2.7mM(PBS、pH7.4)中で化合物1または3(10μM)と共に37℃でインキュベートした。いくつかの実験では、該反応はEDTAに収集したヒト血漿(8人の健康な血液提供者から収集、1%v/v)の存在下で実施した。反応混合物の一定量を10分、20分、40分、60分、90分および120分の時点で水浴中において3.3% 2-メルカプトエタノールを含有する2% SDSで煮沸し(5分)、次に電気泳動を行った(ポリアクリルアミドゲル4〜20%、Bio-Rad、Hercules、CA)。ニトロセルロース膜(TransBlot、Bio-Rad)にエレクトロブロットした後、ビオチン含有アダクトをストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ複合体および化学ルミネセンス基質キット(Supersignal、Pierce)で染色した。バンドの濃度は、Fluoro-STM MultiImager(Bio-Rad)を使用して測定したarbitrary area unit(AAU)で表し、濃度が直線応答範囲内であるように気をつけた。
【０１２６】
触媒活性測定法。  Pro-Phe-Arg-AMC(0.2mM、Peptides International、Louisville、KY)は、96ウェルプレートで、0.6% DMSOおよび0.025% Tween 20を含有する50mM Tris・HCl-0.1M グリシン(pH8.0)中でAb(0.8μM)と37℃でインキュベートして、AMCの遊離を蛍光計によって測定した(λem470nm、λex360nm、Cary Eclipse分光計、Varian、Palo Alto、CA)。[Tyr10-125I]-VIPの切断の調製および測定は、既に記載されている(24)。CRAがABを不可逆的に阻害するかどうかを決定するために、IgG(2μM)を1または3と共に2.5% DMSOおよび0.025% Tween 20を含有する50mM Tris・HCl-0.1M Gly(pH8.0)中で16時間インキュベート(37℃)した。次に、文献35のように、未反応の1または3は反応混合物(0.2ml)をプロテインGカラムでクロマトグラフィーを行うことによって除去した(降下ゲル50μl、50mM Tris・HCl、pH7.4、0.8mlで洗浄し、0.1M Gly・HCl、pH2.7、0.2mlで溶出し、1M Tris・HCl、pH9で中和した)。回収されたIgG(およびIgG-CAL複合体)の一定量50μlを[Tyr10-125I]-VIP(86,000c.p.m)で18時間インキュベートし、ペプチド切断はトリクロロ酢酸に溶解した放射活性を測定することによって測定した。対照IgG試料は、CRA無しでインキュベートし、同様にクロマトグラフィーを行いVIP切断活性を分析した。
【０１２７】
結果
VIP-CRA。  VIP-CAL(化合物3、図20A)の設計における重要な点は、(a)セリンプロテアーゼで見いだされるような活性化求核体と選択的に反応することができる求電子ホスホン酸ジエステル基が含まれていること(16)、(b)塩基性アミノ酸のC末端側鎖のペプチド結合(Arg/Lys)を選択的に切断するタンパク質分解性IgGモデルクローンc23.5による認識を可能にするために、ホスホネートの近隣に正に荷電したアミジノ基が配置されていること(23、25)、および(c)VIP配列のLys20の側鎖にこれらの基を取り込むことである。ハプテンCRA 1は、ホスホン酸ジエステル基およびアミジノ基を含有するが、VIP配列を持たない。Lys20に共有結合性反応部分が位置するという根拠は、Lys20-Lys21ペプチド結合はモノクローナルAbクローンc23.5(23)およびVIPに対するAbを含有するヒトポリクローナルIgG調製物(24)によって切断される結合の1つであることが観察されたことである。プロテアーゼのペプチド阻害剤は、ペプチド主鎖内またはペプチド末端に位置する共有結合性反応基を常に含有する(例えば、26、27)。本研究では、異なるAb活性部位に含まれる求核体の共有結合距離内にホスホネート基が接近する機会を最大限にすることが目的である。この理由のため、(該ホスホネートをペプチド主鎖に含めると、この基の接近しやすさにより立体的な制限をもたらし得るのとは対照的に)該ホスホネート基は、いくつかのC-C結合での回転を可能にさせる柔軟なリンカーを使用してLys20の側鎖に配置された。
【０１２８】
図20Bに概略を示したように、VIP-CRA 3は、領域選択的な樹脂上でのアシル化によって合成した。該VIP配列は、4-メチルトリチル基を20位のLysの側鎖保護として使用すること以外は、標準的9-フルオレニルメトキシカルボニル化学物質で固相ペプチド合成することによって作製した(4a)。4-メチルトリチルを選択的に除去した後、ペプチド樹脂4bを、ジフェニルアミノ(4-アミジノフェニル)メタンホスホネートおよびスベリン酸ジスクシンイミジルから調製した2でアシル化した。得られたペプチド樹脂4cを無水TFAで処理して3を得て、HPLCで精製して、予測質量を有する単一種を得た(m/z、4071.4、計算値、4072.0)。
【０１２９】
共有結合によるAb標識。  モノクローナルAb c23.5は、VIPで過免疫することによって生じた。これは、伝統的な非共有結合Abパラトープ-エピトープ相互作用によって可能となった基底状態VIPの認識の高いことが特徴である(Kd 1.9nM、Km 0.34nM)(23)。該Abの触媒部位は、軽鎖サブユニットに位置し、セリンプロテアーゼ様触媒三連構造から構成される(15)。本明細書で、このAbとVIP-CRA 3およびハプテンCRA 1との共有結合を比較した。アイソタイプが合致したAb UPC10(IgG2a、κ)は、VIPの非共有結合的認識とは独立したAb求核反応のバックグラウンドを測定する対照として使用した。共有結合反応は、反応混合物を煮沸し、その後SDS電気泳動で変性し、ビオチン含有アダクトを検出することによって視覚化した(図21A、挿入図)。抗VIP Abとの共有結合VIP-CRA 3アダクトの蓄積は、アダクトの大部分を占める軽鎖サブユニット(分子量標準物と比較することによって決定した名目上質量29kD)と共に時間2の関数として直線的に増加した。対照AbとのVIP-CRA 3のアダクトは、低濃度で形成された。同様に、ハプテンCRA 1の抗VIPおよび対照Abとの反応はVIP-CRAと比較してゆっくりで、軽鎖サブユニットのハプテンCRAの共有結合への選択性はなかった。見かけ上の反応速度(Vapp)は、最小二乗法分析による経過データの一次回帰曲線の勾配から得られた([Ab-CRA]=Vapp・t、式中、[Ab-CRA]はAb-CRAアダクトの強度をAAUで表したもので、tは反応時間を表す]。Vapp値を表5にまとめて示す。抗VIP Abでは、VIP-CRA 3と軽鎖との反応のVappは重鎖の6.6倍であった。このAbの2個のサブユニットに対するハプテンCRA 1のVapp値は、ほとんど等しかった。VIP-CRAと抗VIP軽鎖との反応のVappは、対照Ab軽鎖との対応する反応の66倍であった。これらの所見によって、抗VIP軽鎖の求核反応性は選択的であることが示唆される。該反応混合物にホスホネート基を持たないVIPを含めると、抗VIP軽鎖とのVIP-CRA 3アダクトの形成が阻害された(図21B、3回反復した実験における阻害、41.0±7%)。抗VIP AbによるVIP-CRA 3の選択的共有結合は、VIP配列が存在するために生じる非共有型相互作用によって可能となると結論づけることができる。
【０１３０】
VIP-CRAの選択性をさらに調べるために、健常人から収集した血漿をVIPアーゼc23.5と共に反応に含めた。予測通り、VIPアーゼAbの軽鎖サブユニットの位置にVIP-CRA 3アダクトが優勢に出現した(図21C)。VIP-CRAは、血漿タンパク質および対照IgGとはほとんど、または全く反応しないことが観察された。同様に、ハプテンCRA 1の反応混合物は、血漿タンパク質または外部から添加されたモノクローナルAbとはほとんど、または全くアダクト形成を生じなかった。図21Cに示した各レーンにおいて、長時間曝露すると不鮮明なビオチンバンドが質量67〜70kDに認められた。これらのバンドは、ハプテンCRAおよびVIP-CRAと、血漿中に存在する主要タンパク質であるアルブミンとの低濃度のアダクト形成を反映しているのであろう(図21Cの銀染色電気泳動列を参照すること)。アルブミンと有機リン酸化合物との共有結合反応は、既に報告されている(28、29)。
【０１３１】
よく確立されているセリン加水分解酵素阻害剤、フルオロリン酸ジイソプロピル(DFP)は、抗VIP軽鎖c23.5による触媒を阻害することが既に報告されている(15)。本研究では、DFPはVIP-CRAと軽鎖との共有結合を阻害し(図21D)、セリンプロテアーゼ様部位の存在と一致した。
【０１３２】
触媒活性の阻害。  抗VIP Ab c23.5の組換え軽鎖によってペプチド基質モデルPro-Phe-Arg-AMCが切断されることは既に報告されている(15)。部位特異的変異誘発研究によって、軽鎖はセリンプロテアーゼの活性部位と同様の触媒性三連構造(catalytic triad)を含有することが示唆された(15)。本明細書で、軽鎖によるPro-Phe-Arg-AMC切断の進行は、Arg-AMCアミド結合の切断によって生じるAMCを蛍光計で測定することによって測定した。予測通り、AMC蛍光の直線的増加が明らかとなった(図22A)。反応混合物にVIP-CRA 3を含めると、時間に依存した様式で反応を阻害した。VIP-CRAが存在すると進行曲線が直線から逸脱するので、阻害様式が不可逆的であることが示唆される(30)。VIP-CRA 3およびハプテンCRA1を使用して阻害能力を比較すると、前者の化合物の能力が優れていることが示された(それぞれのIC50は1.5μMおよび27μMである、図22B)。VIP-CRA 3の優れた潜在能力は、前項で報告した共有結合アダクトのデータと矛盾せず、VIP-CRA 3のペプチジル成分の改善された非共有結合認識に起因する可能性がある。該阻害の化学量論は、制限された量のVIP-CRA 3で力価測定することによって測定した([3]/[軽鎖]比:0.0375〜3.75、図22C)。残存活性(%)のx切片対[VIP-CRA 3]/[軽鎖]プロットは0.89で、化学量論的には1:1であると示唆される。これは、軽鎖の測定分子量と矛盾しない。VIP-CRAアダクト、すなわち、29kD(軽鎖、25kD、VIP-CRA、4kD)。
【０１３３】
次に、気道疾患の患者から単離されたヒトポリクローナルIgG調製物(文献24でHS-2と称された)について取り組んだ。Fabフラグメントに活性が保持されていること、IgG結合試薬によって活性が吸着されること、および対照、すなわち、同様に精製されたヒトIgG調製物によってVIP切断が起こらないことに基づいて考えると、この調製物によるVIPの切断はIgG自己抗体に起因した。このIgGによって生じるVIPフラグメントのN末端の配列決定によって、以下の切断しやすい結合、Thr7-Asp8、Argl4-Lysl5、G1n16-Metl7、Met17-A1a18、Ala18-Vall9、Lys20-Lys2lおよびLys21-Tyr22が確認された(24)。本明細書で、VIPの複数のペプチド結合を切断するポリクローナルIgG調製物の能力を最初に確認した。IgGで処理することによって、[Tyr10-125I]-VIPから3個の新しい放射活性ピークが出現した(図23A)。前述のペプチド結合での切断によって生じるVIPフラグメントは、HPLCから同様の保持時間で溶出することが既に示されているので(24)、図23Aで観察された放射活性生成物ピークは、ペプチドフラグメントの混合物を表すものと思われる。
【０１３４】
VIP-CRA 3が不可逆的な阻害剤であるかどうかを決定するために、様々な濃度(10、20、40、80μM)のこの化合物で処理したIgGの一定量についてプロテインGのアフィニティークロマトグラフィーを行って未反応の阻害剤を除去して、その後[Tyr10-125I]-VIPの切断を測定した(図24B)。対照IgGは、VIP-CRA無しで同様のインキュベーションを行い、その後クロマトグラフィー操作を行った。触媒活性が用量依存阻害であることは明らかで、触媒のほとんど完全な阻害がVIP-CRA濃度>20μMで認められた。不可逆的な阻害が認められたことから、前項で調べたモノクローナルAbによる作用と同様に、VIP-CRAはポリクローナルAbとの共有結合アダクトを形成することが示唆される。VIP-CRA阻害効果の選択性は、ハプテンCRA 1と比較することによって確かめられた。予測通り、VIP-CRAは、ハプテンCALよりもVIPの切断を阻害する能力が高かった(それぞれのIC50:7μMおよび36μM)。
【０１３５】
考察
これらのデータから以下の結論が導かれる。(a)非共有結合および共有結合相互作用を機能的に協調させることによって、求核性抗VIP AbがVIP-CRAと特異的かつ共有的なアダクトを形成することが可能になり、(b)VIP-CRAは、いくつかのペプチド結合でVIPの切断に関与する反応それぞれを阻害し、様々な抗VIP触媒Abの汎用阻害剤としての能力が示唆される。VIP-CALがAb求核体を導くために非共有結合Abパラトープ-抗原エピトープ結合が重要であることは、以下の観察、VIP配列を持たないハプテンCRAとの抗VIPモノクローナルAbの反応性は低いこと、関係のないアイソタイプの一致したAbとVIP-CRAを有する血漿タンパク質との反応は限られていること、およびCRA部分のないVIPによってVIP-CRAと抗VIP Abとの共有結合反応が阻害されることから明らかである。最近、その他のポリペプチド抗原(HIV gp120および上皮増殖因子レセプター)のCRA誘導体はまた、これらの抗原に特異的な特異的Abと共有結合アダクトを形成することが報告されているが、関係のないAbに特異的なAbでは反応がほんわずかな程度であることが明らかであった(31、32)。これらをもとにすると、これらの考察によって、抗原特異性に基づいて個々のAb亜集団が永久的阻害を行う過程が明らかにされる。
【０１３６】
軽鎖サブユニットは、VIP-CRAを有する抗VIPモノクローナルAbの共有結合反応性のほとんどの割合を占めた。ハプテンCRAとの反応性は、Ab-抗原複合体化を担う伝統的な非共有結合力から独立したAb求核性の指標として役立つ。抗VIP重鎖および軽鎖サブユニットのハプテンCRA反応性は似ており、本来の求核反応性の差によって、軽鎖とVIP-CRAとのアダクトの迅速な形成を説明することはできない。軽鎖求核体はAbの非共有結合部位のすぐ側にあり、非共有結合相互反応は共有結合を促進すると結論づけることができる。この意見は、このAbの精製された軽鎖はVIPの切断を特異的に触媒することができる(25)という観察と矛盾しない。以前に、非共有結合Ab-抗原複合体について従来の測定によって測定したところ(軽鎖、重鎖およびIgG全体のKdはそれぞれ、10.1、6.8および1.9nMである、文献33)、該Abの精製軽鎖および重鎖サブユニットは、VIPに独立して結合することが報告された。軽鎖に加えて、重鎖サブユニットは、VIPとのAb複合体化の非共有結合エネルギーに関与するものと思われるが、重鎖は共有結合反応に関与するVIP-CRAのホスホネート基とは十分にはかみ合わないようである。
【０１３７】
VIP-CRAによって付加逆的かつ特異的にAb認識されることの他の証拠は、触媒測定から得ることができる。未反応VIPを除去した後に得られたAbのVIP-CRAアダクトは、触媒活性を示さなかった。モノクローナルAbの組換え軽鎖によるPro-Phe-Arg-AMCの触媒的切断は既に報告されている(15)。この反応は、軽鎖によるVIPの切断よりもKmが57.5倍高いことが特徴で、親和性の高い非共有結合に関与することができる抗原エピトープを持たないペプチド基質と触媒部位との交差反応性に起因すると考えられる。軽鎖によるPro-Phe-Arg-AMC切断は、ハプテンCRAよりもVIP-CRAによってより強く阻害された。同様に、VIPに対するポリクローナルヒト自己抗体によるVIPの切断は、ハプテン-CRAよりもVIP-CRAによってより強く阻害された。
【０１３８】
Abの多様性は、病原性Abの抗原特異的共有結合不活性化を実現するときの興味深い問題を提起する。様々なドメインの構造的差異が個々の抗原エピトープに対するAb特異性の根底にあり、小分子に対するAbを提示する限定された表面領域であっても構造的に異なる結合部位を含有することができる(例えば、34、35)。自己免疫疾患の患者の触媒性IgG調製物は、ポリペプチド(7、24)およびオリゴヌクレオチド(9)抗原のいくつかの主鎖結合を切断する。これは、ポリクローナルIgG調製物に複数のAb種が存在し、それぞれが異なる易切断結合特異性を備えていることに依る可能性がある。Abと抗原との非共有結合が生じるとき、求核体は制限を受けないAb活性部位内でいくらかの移動度が許されることを既に示唆した(31、32)。この仮説が妥当である限り、ホスホネート基が抗原エピトープ内でいくらか不正確に位置していても、異なるペプチド結合特異性を備えたAbはVIP-CRAと共有結合的に反応することができた。本発明では、(ペプチド主鎖とは対照的に)Lys20側鎖のホスホネートを配置し、柔軟なリンカーを含めることは、共有結合反応に使用できる構造空間をさらに拡大するための取り組みである。VIP残基7と22との間のいくつかの結合を切断するポリクローナルAbによるVIPの触媒的加水分解が、VIP-CRAによって競合阻害されることは明らかであった。したがって、異なるAbの抗原特異的共有結合を阻害するために有望な手段には、Ab触媒部位に本来備わっている構造特性を利用し、リンカー構造を操作することによってホスホネート基への接近しやすさを高めることが含まれる。これに対して、Ab-抗原結合が柔軟性のない表面接触に関与する剛体相互作用と考えるならば、共有結合阻害剤の設計には、それぞれの易切断性結合の遷移状態に形状的に近いシミュレーションが必要で、個々の阻害剤は異なる触媒Abを効率的に阻害するように開発しなければならない。阻害剤設計において構造的要素を評価することの重要性は、非共有結合サブサイトでの抗原結合が触媒サブサイトをほとんど、または全く構造的に束縛せず、遷移状態が形成されるときに該触媒残基が他のペプチド結合とかみ合うような位置になるのを可能にする触媒の分割部位モデル(31、32)を提案した以前の報告によって支持される。
【０１３９】
既に述べたように、Abは自己免疫疾患の病理発生に関与するように企図される。特異的な共有結合阻害剤は、Abの正確な機能的効果の限定を助ける新規手段である。このような阻害剤は、有害なAb作用を改善することができる治療薬を開発するための試作品として役立ち得る。分泌型Abの不活性化に加えて、VIP-CRAなどの試薬は、抗原特異的B細胞を標的とするために有用であり得る。この目的が実現可能であることは、B細胞レセプター3の成分としてB細胞の表面上に発現するAbにCALが共有結合するという証拠によって示される。Ab求核性は、共有結合触媒の第1段階、すなわち、アシル-Ab反応中間体の形成を完了させる能力の表れとして見なすことができる。これは、Ab求核反応性の大きさがタンパク質分解活性に相関するという観察によって支持される(31)。最近の研究によって、非触媒Abはまた、求核体を含有するが、抗原に対する共有結合攻撃、すなわち、アシル-Ab中間体に対する水攻撃および生成物遊離の後の触媒過程における段階を促進することができないことが示唆された(31)。非触媒Abによって発現した求核体の生理学的機能にかかわらず、それらが存在することによって、確立された病原的役割を備えたAb集団、例えば、血友病における抗第VIII因子AbをCRAで標的化することが可能である。
【０１４０】
謝辞。我々は技術的支援に関してRobert Dannenbring氏に感謝致します。
【０１４１】
実施例３の参考文献
2007524601.tif 000015
2007524601.tif 000016
2007524601.tif 000017
脚注
1使用した略語:AAU、任意面積単位、Ab、抗体、AMC、7-アミノ-4-メチルクマリン、CHAPS、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸、CRA、共有結合反応性アナログ、DMF、N,N-ジメチルホルムアミド、DMSO、ジメチルスルホキシド、ESI-MS、電子衝撃イオン化質量分析、Fc、フラグメント定常部、PyBOP、(ベンゾトリアゾール-1-イル)オキシトリス(ピロリジノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、SDS、ドデシル硫酸ナトリウム、TFA、トリフルオロ酢酸、Vapp、見かけ上の反応速度、VIP、血管作用性小腸ペプチド。
【０１４２】
2CRA-Ab反応は、二次反応速度法にしたがって予測されるが、反応の初期段階ではアダクトの直線的な蓄積が生じる。
【０１４３】
3S.Paulおよび共同研究者、未発表データ。
【実施例４】
【０１４４】
タンパク質分解免疫性の個体発生論:IgMセリンプロテアーゼ
自己免疫疾患および同種免疫疾患において抗原特異的IgG抗体が、化学反応を触媒することは記載されている(1〜3)。一般的な抗原を用いる通常の実験の免疫によって産生した触媒抗体の例も公開している(4〜7)。しかしながら、天然に存在する触媒抗体が、適応性のある配列多様化プロセスから生じた稀なアクシデントであるか、あるいは重要な機能的役割を有する真性の酵素であるかどうかのコンセンサスは発展していない。その主な理由は、抗原特異的IgG抗体の代謝回転(kcat)が悪いことである。いくつかの触媒抗体は従来の酵素に匹敵する触媒効率(kcat/Km)を示すが、これは抗原基底状態の高親和性認識によるものである(8中に概説)。
【０１４５】
いくつかの酵素は、基質の一時的な共有結合中間体の形成を含む機構、および活性部位に存在する求核性残基によってペプチド結合を切断する。求核体は、分子間の活性化機構、例えばHis残基との水素結合によるSer/Thr側鎖ヒドロキシル基の活性化によって生じ、求電子性ホスホン酸ジエステルとの共有結合によって検出することができる(9、10)。抗原の共有結合反応性アナログ(CRA)としてこれらの化合物を使用して、我々はIgG抗体がトリプシンに匹敵する求核反応性を示すことを観察した(11)。それらの求核能力にもかかわらず、おそらくはアシル-抗体中間体の形成後に起こるステップ、すなわち中間体の水分子攻撃および生成物の放出の欠陥のために、IgG抗体は低効率のタンパク質分解を示す。抗原によるB細胞受容体(BCR、表面Igはαおよびβサブユニットならびにシグナル変換タンパク質と複合体形成する)の占有は、B細胞クローン選択を引き起こす。したがってBCRによるタンパク質分解は、抗原フラグメントの切り離しが、細胞分裂を誘導するのに必要な抗原誘導型の膜貫通シグナルの速度より遅い程度までのみ、クローン選択と適合性がある。遷移状態の電荷特性を模倣したハプテンによる免疫(12)は、触媒速度定数の適応性のある改善に対する障害を乗り越えるための方法として示唆されている。しかしながら、これらの手段によって得た「デザイナー」IgG抗体による触媒反応も、非常にゆっくりと進行する。
【０１４６】
マウスおよびヒトでは、最初の抗体レパートリーは、100個までの遺伝性VLおよびVH遺伝子からなる。適応性のある成熟プロセスは、このレパートリーを数桁拡大する。前B細胞表面上の最初のBCR複合体は、代理L鎖との複合体としてV-(D)-J再編成Igμ鎖を含む(13中に概説)。細胞分裂が抗原依存性になるB細胞の分化段階の、正確な割り当ては幾分曖昧であるが、前BCRとの非共有結合による抗原結合は初期の細胞増殖には必要とされないと一般的に考えられている。k/λ鎖は抗原誘導型B細胞分化の後期段階で代理L鎖を置換し、これは体細胞の過剰突然変異プロセスによる多様化および連続した遺伝子再編成を伴う(14、15)。V-(D)-J遺伝子再編成は、IgMによって個々の抗原に関する特異性を増大させることができるが(16)、抗原結合親和性はIgG抗体と比較して低い傾向がある。IgGへのアイソタイプ変換の後にVドメイン中に蓄積する体細胞突然変異によって、高親和性の抗原認識が助長される。いくつかの構造位置では、IgMモノクローナル抗体が広範囲で突然変異する可能性があり、高親和性の抗原結合を示す可能性がある(17)。H鎖のC末端における膜結合ペプチドの消失は、分泌IgMおよびIgG抗体の生成をもたらす。
【０１４７】
抗体触媒の発生学的側面については、非常にわずかな情報が入手可能である。ここで我々は、B細胞の表面上で発現された分泌IgMおよびIgサブユニットの求核反応性を報告する。細胞表面のμおよびk/λ鎖は、ハプテンCRAとB細胞の共有結合反応の主要部位であり、分泌IgM抗体の求核およびタンパク質分解活性の程度はIgG抗体より一貫して優れていた。
【０１４８】
実験手順
脾臓細胞-CRA結合。  化合物I〜IVの合成およびそれらの化学的同一性の確認は発表されている(11、18)。化合物I、IIIおよびIVは、求核部位(9、10、18)と反応性があるジフェニルホスホン酸エステルである。これらの化合物中に取り込まれたビオチンによって、抗体-CRAアダクトを目に見える状態にすることができた。フルオロリン酸ジイソプロピル(DFP)はSigmaからのものであった。BALB/cマウス(5〜6週齢、メス、Jackson Laboratories、Maine)は頚椎脱臼によって安楽死させ、脾臓細胞は、脾臓を細かく裂き非解離組織を除去することによって(単位重力沈降)RPMI-1640(Gibco)中で調製した。赤血球を低張塩化アンモニウム液(5分間;ACK溶解バッファー、Cambrex、Walkersville、MD)に溶かし、細胞は10mMのリン酸ナトリウム、pH7.5、137mMのNaCl、2.7mMのKCl(PBS)で二回洗浄した。製造者の教示書に従いB細胞陰性選択単離キット(Miltenyi、Auburn、CA)を使用して、B細胞を脾臓細胞から単離し、以下に記載するフローサイトメトリーによって>95%CD19+であることを確認した。0.05%トリパンブルー(90〜95%)を使用して生存を測定した。細胞(2〜5×106個の細胞)をハプテンCRA Iまたは化合物II(37℃;最小DMSO濃度1%)と共に0.5mlのPBS中でインキュベートし、三回洗浄し100μlの抗CD16/32抗体で処理して(10μg/ml;BD Pharmingen、サンディエゴ、CA;5分間、4℃)、Fc受容体との抗体の結合を阻害した。染色は、FITC結合ストレプトアビジン(1μg/mlあるいは記載したのと同様に;Molecular Probes、Eugene、Oregon)、およびCD19に対するPE結合ラットモノクローナル抗体(10μg/ml;Caltag、Burlingame、CA)を用いて、100μl中で20分間4℃において行った。PBSで(2回)さらに洗浄した後、細胞は2%パラホルムアルデヒドで固定し(1時間、4℃)、一回洗浄しPBS中に再懸濁させた。対照インキュベーションでは、等しい濃度の無関係な抗原(Pharmingen)に対するPE結合アイソタイプ適合ラット抗体を、抗CD19抗体の代わりとした。デコンボルーション顕微鏡測定を、Olympus IX-70倒立顕微鏡およびApplied Precision Deltaワークステーション(SoftWoRx(商標)ソフトウェア;参照19)を使用して行った。染色した細胞は0.25μmの厚さで他数回の捕捉を施して、画像を重ねた。これらの画像に、それぞれのプローブに関してデコンボルーションを施した(5回繰り返し)(FITC;λex488nm、λem525nm;DAPI;λex350nm、λem470mn;フィコエリスリン;λex565nm、λem578nm)。フローサイトメトリーは、Baylor Medical College Core Facility(EPICS XL-MCL Beckman-Coulterフローサイトメーター、EXPO32ソフトウェア)中で行った。PEとFITCの交差検出を最小限にするための装置による測定は、これらのフルオロクロムで個々に染色した細胞を使用して行った。前方および側方測定によって、集めた細胞群から死細胞を排除することができた。CRA染色性細胞は、化合物IIの染色に関して観察したレベルを超える染色を示す群として同定した。CRA染色性CD19+細胞は、アイソタイプ適合抗体を使用して観察したバックグラウンド値を差し引くことによって評価した。細胞の抽出は、界面活性剤CHAPSを用いた処理によるものであった(12mM、4℃において2時間)。抽出物を遠心分離にかけ(10,000g、30分間)、上清はPBSを用いて1mMのCHAPSに希釈し、次いでタンパク質G-Sepharoseカラム(100μl固定ゲル;0.6×5cmカラム;Phannacia、Piscataway、NJ)に固定したマウスμ、γ、δ、λおよびk鎖(Caltag)に対するヤギポリクローナル抗体(IgG)を使用する、親和性クロマトグラフィーに施した。この目��用に、抗体(50μg)をカラム中(15分間、4℃)、1mMのCHAPSを含むPBS(PBS-CHAPS)中でタンパク質Gゲルと混合させ、ゲルを固定させ、非結合分画を回収し、カラムはPBS-CHAPSで洗浄した。細胞抽出物(1.4ml;1mM CHAPSに希釈;3×106個の由来)をカラムに通し、カラムはPBS-CHAPSで洗浄し(9倍体積)、結合タンパク質は100mMのグリシン-HCl、pH2.7(8カラム体積)を用いて溶出させ、還元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(4〜20%、Bio-Rad)に施した。タンパク質-CRAアダクトは、(11)中と同様にストレプトアビジン-ペルオキシダーゼでゲルのニトロセルロースエレクトロブロットを染色することによって目に見える状態にした。イムノブロッティング用に、これらのブロットを、(11)中と同様にマウスμ、γ、δ、λおよびk鎖に対するヤギポリクローナル抗体(IgG)、次にペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギIgG(Fc特異的、1:1000;Pierce)で染色した。外見上の質量値は、標準タンパク質(14kD〜220kD;Pharmacia)との比較によって計算した。
【０１４９】
分泌抗体-CRA結合。  ヒト血清抗体は、感染の形跡または免疫疾患がない対象由来のものであった(2人女性、3人男性、年齢23〜45才)。マウス血清モノクローナル抗体は、BALB/cマウス(Harlan、Indianapolis、INから購入;150匹のマウスから集めたもの;8〜12週齢)由来のものであった。ここで使用したマウスモノクローナルIgM抗体は、主要組織適合性抗原(カタログ番号8702、8704、9008、9010、9020に対応するクローン;無細胞腹水;Cedarlane、Ontario、カナダ)を対象とする。モノクローナルIgMYvoは、ワルデンストレームのマクログロブリン血症を有する患者に由来する(20)。全てのモノクローナルIgMはk鎖を含む。ここで使用した4つのマウスモノクローナルIgG抗体は:クローンc23.4(抗VIP;参照6)、クローンc39.1(抗グルカゴン;S.Paulおよび同僚、未発表);ATCCクローンHP6045(抗体Fab2、γ)およびATCCクローンHP6054(抗Igλ鎖)であった。全てのモノクローナルIgM抗体は、γ2a重鎖およびk軽鎖を含む。血清または腹水液(1ml)を、それぞれIgM結合用量0.8および3mgを有する、1mlのSepharose 4B結合ラット抗マウスIgG抗体(固定ゲル;Zymed、サンフランシスコ、CA)、またはアガロース結合ヤギ抗ヒトIgM抗体(Sigma、St.Louis、MO)と、50mMのTris-HCl、pH7.5、0.1mMのCHAPS(バッファーA)中で1時間混合させた。非結合分画を回収し、溶出液中のタンパク質が溶出前の検出不能なレベルに戻らないように注意しながら、ゲルを20倍のバッファーA体積で洗浄した(A280<0.001)。溶出は100mMグリシンpH2.7(25μlの1M Tris-HCl中に0.5ml/分画、pH9.0)によるものであった。さらなる精製は、Superose-6 FPLCゲル濾過カラム(1×30cm;0.25ml/分;Pharmacia)上、2つの異なる溶媒:50mMのTris-HCl、pH7.7、0.1Mのグリシン、0.15MのNaCl、0.025%のTween-20(バッファーB)または6Mのグアニジン塩酸塩を溶かしたバッファーB、HClでpH6.5に調整したもの(バッファーC)中で行った。カラムによる分画化の前に、親和性精製したIgMをバッファーCに対して透析した。カラムによる測定は、チログロブリン(660kD)、IgG(150kD)、およびアルブミン(67kD)を用いて行った。分子量900kDを有するIgMは、カラムの空体積付近まで溶出させた。バッファーCのクロマトグラフィー後、バッファーBに対する透析によって、IgMを復元させた(21)。IgMYvo、クリオグロブリンは、繰り返しの加熱(37℃)および冷却(4℃;3サイクル;参照20)、次に抗ヒトIgMカラム上での親和性クロマトグラフィーによって血清から精製した。抗IgMカラムまたは無細胞腹水由来の非結合分画を出発物質として使用して、タンパク質G-Sepharoseカラム上でIgGを精製した(21)。IgGのFPLCゲル濾過は、IgMに関して記載したのと同様であった。ただし、Superose12カラムを使用した。製造者(Pierce)によって推奨されたように、アガロース結合ペプシンでIgM(300μl、1mg/ml)を分解消化することによって(0.6mlゲル、30分間、37℃)、100mMの酢酸ナトリウム、pH4.5、150mMのNaCl、0.05%のNaN3、0.1mMのCHAPS中)、Fabフラグメントを調製した。非結合分画はバッファーBに対して透析し、Superose12カラム上でのFPLCゲル濾過によって精製し、50mMのTris-HCl、pH7.7、0.1Mのグリシン、0.1mMのCHAPSに対して透析した。タンパク質は全て、ビシンコニン酸(bicinchoninic acid)法(Pierce)によって測定した。マウス抗体を含むSDSゲルのイムノブロッティングは前項と同様であった。ヒト抗体ゲルは、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトμ、抗ヒトkおよび抗ヒトλ抗体(Sigma、St Louis、MO)を使用してイムノブロッティングした。
【０１５０】
精製した抗体は、50mMのTris、HCl、100mMのグリシン、0.1mMのCHAPS、pH7.7中において37℃でビオチン化CRAを用いて処理した。抗体-CRAアダクトの形成は、前項と同様にSDS電気泳動によって測定した。バンド強度は、濃度測定によって測定した任意の領域単位(AAU)で表す(11)。時間の関数(最初は60分)としてプロットした進行曲線の勾配として、初速を計算した。
【０１５１】
タンパク質分解アッセイ。ペプチド-AMC基質(Peptide International、Louisville、KYまたはBachem、King ofPrussia、PA)中で、アミノメチルクマリンをC末端アミノ酸に連結させるアミド結合の切断を、50mMのTrisHCl、pH7.7、0.1Mのグリシン、0.025%のTween-20中、96ウェルプレート中において蛍光測定法によって測定した(λex360nm、λem470nm;Varian Cary Eclipse)(21)。真正アミノメチルクマリンを使用して標準曲線を構築した。高濃度のペプチド-AMC基質において得た速度データをミカエリス-メンテン-ヘンリの式:v=(Vmax[S])/(Km+[S])に適合させることによって、運動パラメーターを得た。阻害剤の存在下での進行曲線は、[AMC]maxが阻害剤の不在下でのAMC濃度である、式:[AMC]/[AMC]max=1-e-kobs・tに適合させた。IC50(50%阻害をもたらす濃度)は、曲線にOを通過させる式:阻害率=100/(1+10logIC50-log[Inhibitor])から得た。
【０１５２】
結果
不可逆的なCRA-B細胞の結合。  化合物I(図24)などのハプテンCRAは、従来型のセリンプロテアーゼおよび抗体中の求核部位と不可逆的に反応する(9〜11、18)。免疫前レパートリー(すなわち、意図的な免疫攻撃なしで自然に発生したレパートリー)のB細胞の表面上で示される求核反応性を評価するために、BALB/cマウス由来の生命力のある脾臓細胞を、ハプテンCRA Iで処理した。対照化合物IIは、ハプテンCRA Iと構造が同一である。ただし、ホスホン酸基はエステル化されておらず、これが求核性残基との共有結合反応性の消失をもたらす(11、18)。ハプテンCRA Iを用いた処理によって、化合物IIより高いレベルで大部分の細胞の染色がもたらされ、少数の細胞が強い染色を示す(11±2、N3実験;UV顕微鏡を使用して400個のリンパ球を計数することによって測定した)。CRA I染色細胞は全てリンパ球の形状を示し、単球が染色された証拠はなく、あるいは好塩基球もわずかに染色された。トリパンブルー除外により測定して、CRA Iまたは化合物IIとのインキュベーション後に、細胞の生命力が失われることはなかった。フローサイトメトリーによって、顕微鏡の結果を確認した。少数の亜群が非常に高い蛍光強度を有していたことを含めて(14%;亜群2、図25A中)、79パーセントのCRA I処理細胞が、化合物IIで処理した細胞を超える蛍光強度を示した。3回の反復実験において、B細胞マーカーCD19に陽性であったCRA I染色細胞の比率は82±4%であった(図25B)。デコンボルーション顕微鏡測定によって、ハプテンCRA Iの結合による蛍光パターンは、抗CD19抗体の蛍光パターンとほぼ一致したことが示された(図25C〜E)。CRA蛍光の大部分は、B細胞の表面に限られていた(図25F)。
【０１５３】
細胞表面上の求核性分子を同定するために、精製したB細胞をCRA Iで標識し、細胞の界面活性剤抽出物を煮沸し、次いでSDS電気泳動によって分析した。ごく限られたCRA含有タンパク質が明らかであった(図26A)。予想通り、銀染色によって異種の存在が明らかになり、細胞の複合的なタンパク質構成が示された。主要なCRAアダクトバンドの質量は70kDであり、このバンドは抗μ鎖抗体によって染色可能であった(図26B)。少量のCRA含有バンドが、25kD、40kD、50kD、55〜60kD、90〜135kDおよび140kDにおいて明らかであった。55〜60kDおよび140kDにおけるバンドは、抗μ抗体によって染色可能であり、25kDおよび50kDにおけるバンドは、抗k/λ抗体で染色可能であった。全長モノマータンパク質と異なる質量範囲の類似したμおよびk/λバンドは、分泌抗体およびB細胞抽出物の前の試験でも観察したように、非還元状態のオリゴマー、分解産物および切断型B細胞Ig産物をおそらく表す(22〜24)。μ、γ、k/λ(図26B)およびδ鎖(示さず)に対する抗体で染色不能であった、40kDおよび90〜135kDにおける少量のバンドは、非Igタンパク質をおそらく表す。Igγ鎖に対応するCRA含有アダクトは、検出されなかった。B細胞抽出物のイムノブロッティングによって、抗k/γ抗体で染色可能であった50kDにおけるバンドを同定したが、このバンドは充分に過剰露光したゲルにおいてのみ目に見える状態であり、ごく少量のγ鎖が抽出物中に存在したことが示唆された。
【０１５４】
CRA IアダクトがIgサブユニットを含むことの確認は、μ、δ、γおよびk/λ鎖に対する抗体を固定したカラム上での親和性クロマトグラフィー、次にSDS電気泳動によるものであった(図26C)。CRA含有μおよびk/λバンドは、抗μおよび抗k/λカラムからの溶出液中で明らかであった。抗k/λカラムからの溶出液中のCRA含有μ鎖の回収は、細胞表面上のジスルフィド結合した軽鎖と重鎖の複合体の存在によって説明することができる。抗γおよび抗δカラムからの溶出液中のCRA含有バンドは明らかではなかったが(示さず)、これが欠陥のあるγ/δ鎖の求核反応性を表すと解釈することはできない。何故なら、これらのタンパク質は、免疫学的にナイーブなマウス由来のB細胞中では低レベルでのみ発現されるからである。Igサブユニットとの複合体形成に起因する全体的な細胞CRA染色の比率を測定するために、μおよびk/λ鎖に対する固定抗体から構成される1つの親和性カラム上で、B細胞抽出物を分画化した。カラムに充填した非結合分画および抽出物中のビオチン含有バンドの濃度測定によって測定して、細胞の全CRA含量の80パーセントがカラムに吸着した(示さず)。合わせて考えると、これらの観察結果は、完全なB細胞のCRA染色の大部分は表面Igとの不可逆的結合に起因し、μ鎖が共有結合反応性の大部分の原因であることを示す。
【０１５５】
分泌IgMの求核反応性。  免疫学的にナイーブなBALB/cマウスの集めた血清から精製したIgMによるハプテンCRA Iアダクトの形成に関する初速は、IgGより40倍大きかった(図27A;値は、完全な抗体の単位濃度当たりで表した、2つの抗体サブユニットで起こった反応速度の合計である)。単位結合部位濃度の二乗当たりで表すと(それぞれ10および2の結合部位、IgMおよびIgG中)、速度の違いは8倍である。IgM反応混合物の還元SDSゲル中、70、50および25kDaにおいて、3つのCRA含有バンドを観察した(図27B)。70kDaおよび25kDaのバンドは、それぞれ抗μ抗体および抗k/λ抗体で染色可能であった。50kDaのバンドは抗μ抗体で染色可能であり、μの分解産物をおそらく表す。γおよびk/λ鎖に対応する2つのCRA含有バンドを、IgG反応混合物の還元ゲル中で観察した。一群の6つのランダムに選択したモノクローナルIgM抗体(5つはマウス、および1つはヒト)、ならびに4つのモノクローナルIgG抗体(全てマウス)に関して、同様の結果を得た。モノクローナルIgM抗体は、IgG抗体と比較して不可逆的なCPAI結合の優れた速度を均一に示した(図27C;それぞれ、平均±SEM:62.6±24.4×104個および1.9±0.4×104AAU/μM/時間; P<0.01、マン-ホイットニーのU検定、2つの罫下)。ポリクローナル抗体の実験と一致して、μ鎖はポリクローナルおよびモノクローナルIgMにおける共有結合の大部分の原因であったが、k/λ鎖サブユニットにおける低レベルの結合も、それぞれの抗体調製物に関して観察した(簡潔性のため、個々のIgM調製物由来のμ鎖と対応するk/λ鎖のデータ地点を、図27C中で結ぶ;データはμMサブユニット濃度当たりで表して、容易な比較を可能にする)。4つのモノクローナルIgG抗体はγ2a重鎖を含み、全てのモノクローナルIgM/IgG抗体はk鎖を含む。様々なγ鎖アイソタイプの求核反応性を測定するための試みは行わなかった。しかしながら、ポリクローナル抗体のデータは、血液中のIgGアイソタイプ混合物の平均的な求核反応性は、IgMの反応性より低いことを示す。抗原特異性に関して同様の議論を示すことができる。5つのマウスIgモノクローナル抗体および4つのIgG抗体を
実験的免疫によって産生し、異なる抗原(MHC抗原、VIP、グルカゴン、Igサブユニット;参照6、25、および製造者によって与えられた仕様書)と結合させた。第六のモノクローナルIgMは、抗原特異性が知られていないワルデンストレームのマクログロブリン血症を有する患者に由来するものであった(20)。モノクローナルIgM抗体はIgG抗体に対する優れた反応性を均一に示し、互いに異なる抗原特異性が反応性の違いの原因ではないことが示唆された。
【０１５６】
モノクローナルIgM抗体の1つである、Yvoを使用すると、ハプテンCRAの共有結合に好ましい構造要件の定義が容易になった。非エステル化状態のホスホン酸を含む化合物IIは、3時間までのインキュベーション時間ではIgMとのアダクトは形成しなかった(反応条件は図26Bと同じ)。同様に、アミジノ基を欠く中和ハプテンCRA III、および弱性の脱離基(フェニル基ではなくメチル基)を有するハプテンCRA IVは、このIgM抗体との検出可能なアダクトを形成することができなかった。これらの反応特性は、前に報告したIgG抗体の反応特性と類似している(11)。
【０１５７】
分泌IgMの触媒活性。  プールしたマウス血清から調製したポリクローナルIgMおよびIgGの触媒活性は、最初に基質としてGlu-Ala-Arg-AMCを使用して測定した(図28A)。AMCとこのペプチドのC末端Arg残基を連結するアミド結合の切断は、IgG抗体によるペプチド結合加水分解の代わりとして確認した(21)。ポリクローナルマウスおよびヒトIgM分画によるGlu-Ala-Arg-AMCの切断は、同じ血清由来のIgG分画より、それぞれ344倍および237倍大きい速度で進行した(初速データから計算した;単位完全抗体濃度当たりで表した)。全部で10のIgM結合価2および2つのIgG結合価が満たされる場合、マウスおよびヒトIgMの個々の結合部位に関する速度は、対応するIgGの速度より69倍および47倍大きい。前項の不可逆的結合データと一致して、マウスポリクローナルIgMによるGlu-Ala-Arg-AMC切断は、ハプテンCRA I(図28B)、およびセリンプロテアーゼ阻害剤フルオロリン酸ジイソプロピル(示さず;30μMおよび100μMのDFPで63%および93%の阻害、それぞれ12時間後)によって阻害された。CRA Iの存在下での直線からの進行曲線の逸脱は、不可逆的な阻害形式を示唆する(26)。増大するハプテンCRA I濃度(10〜300μM)において、累進的に増大するマウスIgM活性の阻害(9〜100%)が明らかであった(IC50、42μM;示さず)。触媒としてヒトポリクローナルIgMを使用して、同様の結果を得た(ハプテンCRA I阻害に関するIC50値、111μM)。
【０１５８】
従来のプロテアーゼによるIgMの汚染を、以前に使用した方法によって試験して、IgGおよび抗体軽鎖の酵素活性(21、27)を確認した。抗μカラム上での親和性クロマトグラフィーによって得たIgMは、FPLCゲル濾過によるさらなる精製によって得た900kDのIgM分画と、ほぼ同じレベルの触媒活性を示した(図29A)。このことは、IgMに対する酵素活性の割り当てに必要な特異的活性を、一定にするための精製の基準を満たす。次に我々は、6Mのグアニジン塩酸塩で処理したIgMを調べて、任意の非共有結合汚染物を解離させた。この目的のために、親和性によって精製したIgMに、6Mのグアニジン塩酸塩中で3サイクルのゲル濾過を施し(図29B)、最終ゲル濾過サイクルからの900kDの分画は、透析によって復元した。これらの手順を施したIgMによる、時間依存性のGlu-Ala-Arg-AMCの切断を観察した(図29C)。
【０１５９】
ポリクローナルIgM調製物および6個のモノクローナルIgM抗体の基質選択性を、一群の10個のペプチド-AMC結合体を使用して試験した。表6に示す速度は、進行曲線の勾配として計算した。切断部位に塩基性残基を含む基質のみが、IgM抗体によって加水分解された。切断部位に酸性および中性残基を含む基質に関しては、加水分解は検出されなかった。6個のモノクローナルIgM抗体はいずれも触媒活性を示したが、異なる抗体に関する活性レベルは同一ではなかった(例えば24倍を超える範囲で基質としてのGlu-Ala-Arg-AMCと共に変わった)。抗体は異なる基質選択性の概略を示した。例えば、Glu-Ala-Arg-AMCとIle-Glu-Gly-Arg-AMCの切断率の割合は、5つのマウスモノクローナルIgMに関しては0.9〜30.0で変わり、ヒトモノクローナルIgMは、後者の基質を検出可能なほど切断せずに一定の割合で前者の基質を切断した(図30)。IgM9020によるGly-Gly-Arg-AMCおよびGly-Gly-Leu-AMCの加水分解を比較して、切断部位における塩基性残基の必要性を確認した。これらの基質はArg-AMC/Leu-AMC連結以外は同一であり、別の残基の影響を混同する可能性は除外される。Gly-Gly-Arg-AMCの切断は検出可能であったが、Gly-Gly-Leu-AMCの切断は検出不能であった(それぞれ、12.6±0.6および<0.13μMのAMC/抗体1μM/1時間)。
【０１６０】
5つのマウスモノクローナルIgM抗体中の、定常ドメインの主鎖は同一である。互いに異なる触媒活性レベルおよび基質選択性の観察によって、触媒部位はVドメイン中に位置することが示唆された。これを確認するために、IgMYvoを固定ペプシンで分解消化し、55kDタンパク質のピーク時に、Fabフラグメントをゲル濾過によって精製した(図31A)。FabフラグメントによるGlu-Ala-Arg-AMCの濃度依存性の切断を確認した(図31B)。次に我々は、カラムから放出されるペプシンが確認したFab活性の原因であった可能性を考えた。ペプシンのpHの最適値は、基質に応じて1.5〜2.7である(28)。触媒アッセイは、0.1Mのグリシン、pH2.7、1mMのCHAPS中で繰り返した。中性pHにおいて容易に検出可能な触媒活性を与えるFab濃度では(図31B)、FabによるGlu-Ala-Arg-AMCの検出可能な切断は、pH2.7において明らかではなかった。ペプシンの切断部位優先性(芳香族および疎水性残基のC末端側での加水分解)は、IgM抗体の塩基性残基の優先性とは異なる。精製ペプシンは、Fabによる容易に検出可能な触媒反応をもたらす条件下において、Glu-Ala-Arg-AMCを切断しなかった(675nMペプシン;他の反応条件は図31Bと同じ)。これらのデータによって、ペプシン汚染は観察したFab活性の要因ではないことが示される。
【０１６１】
増大したGlu-Ala-Arg-AMC濃度における4つのIgM調製物に関する反応速度の測定によって、典型的な酵素動態が示された(ポリクローナルマウスおよびヒトIgM、モノクローナルIgM9020およびIgM9008)。過剰な基質濃度で速度は飽和状態になり、これはミカエリス-メンテン-ヘンリの動態と一致する(表7)。観察したKm値は、従来のプロテアーゼの認識性を暗示する広いマイクロモル範囲内にあった。適切に分化して個々の抗原を認識する触媒抗体は、他方でナノモル〜狭いマイクロモル範囲のKm値を示し、例えば、表7に示すIgGc23.5は、Km0.4nMで自己抗原VIPを切断する(参照6より)。IgMに関する見かけのKcat値は、IgGに関して以前に報告された値を超える(21)。
【０１６２】
考察
B細胞によって産生される第一クラスの抗体であるIgM抗体は、IgG抗体と比較して優れた求核反応性および触媒反応性を示した。これは抗体の非共有抗原結合機能とは対照的であり、免疫応答の行程中に適切に向上する。求核活性および触媒IgM活性は、非免疫マウスおよび健常人において同定した。ハプテンCRAのホスホン酸基と隣接する正に荷電した基の優先的なIgM認識、およびペプチド基質中の切断性結合は、免疫前抗体レパートリーの固有の性質をおそらく表す。この非共有結合認識モチーフは、ペプチド基質との低親和性の相互作用を可能にし、一方で伝統的な非共有結合エピトープ-パラトープ結合は、高親和性の抗原認識(ナノモル範囲のKd)によって特徴付けられる。
【０１６３】
ハプテンCRA Iは、IgG抗体を含めたセリンプロテアーゼによって発現される求核反応性に関するプローブとして、以前に確認されている(11、28)。不可逆的CRA結合活性の程度は、触媒活性とほぼ関係している(11、29)。この試験では、ハプテンCRA Iアダクトは、B細胞の表面上のCD19の非常に近くに位置していた。後者のタンパク質は、B細胞の分化中にBCRの要素として、シグナル変換の役割を果たす(30)。免疫化学および親和性クロマトグラフィー試験によって、B細胞表面の染色の大部分はIgサブユニットによる共有結合に起因し、μ鎖が主に貢献し、k/λ鎖はわずかに貢献することが示唆された。これは、分泌IgMのμ鎖サブユニットの優れた求核反応性と一致する。細胞をあまり染色しなかった対照ホスホン酸ハプテンは、リン原子の乏しい求核性ために求核体とは反応しない(11、18)。モノクローナルBCRはここでは含まれなかったが、調べた全6個のモノクローナルIgM抗体が求核反応性を示し、大部分のBCRによってこの反応性が示される可能性もあることが示唆された。少数のB細胞がCRAによって強く染色された。これらの細胞は、将来の研究において可能性のある触媒源として興味深い。両方のIgサブユニットが求核体を発現するという観察結果は、それらのパートナーサブユニットの不在下においてペプチド結合の切断を別々に触媒する軽鎖と重鎖の能力と一致する(31)。部位特異的突然変異誘発試験によって、IgG抗体の軽鎖中のセリンプロテアーゼ様の触媒三連構造が示されており(32)、他のIgG抗体の重鎖は求核性のSer残基を含むことが報告されている(例えば33)。
【０１６４】
セリンプロテアーゼ活性の機能的役割は、B細胞の分化プロセスにおいて推定されているが、この活性を担う分子は我々の知る限りでは同定されていない。セリンプロテアーゼ阻害剤DFPおよびα-1抗トリプシンは、マイトジェン誘導型B細胞分裂を阻害し(34、35)、培養B細胞によるいくつかの抗体アイソタイプの合成を上方制御する(35)。DFP感受性酵素はB細胞と結合し、Arg含有基質を好む(36)。セリンプロテアーゼ阻害剤は、抗IgM誘導型のBCRシグナル変換を阻害することが報告されており(37)、抗IgM仲介型のB細胞活性化は、細胞表面上のセリンプロテアーゼ活性の出現と関係がある(38)。明らかに、従来のセリンプロテアーゼはB細胞の制御に貢献する可能性があるが、この試験で明らかなB細胞表面上の主要なCRA結合要素が、BCRそのものであるかは依然として分からない。したがって、BCR求核部位を刺激することによって、B細胞の分化に影響を与える可能性があると仮定することは理にかなっている。このような化合物は、天然に存在するセリンプロテアーゼ阻害剤、および求核性アミノ酸と不可逆的に結合することができる反応性カルボニル化合物を含む(39)。
【０１６５】
モノクローナルIgM抗体の互いに異なるレベルの触媒活性、それらの異なる基質優先性、およびFabフラグメント中での活性の保持の観察結果によって、触媒部位がVドメイン中に位置することが示唆される。触媒アッセイを溶液相中、過剰濃度の小ペプチド基質で行った。これらの条件が、1または複数の抗体価による1つのペプチド分子の結合を助長することはないであろう。個々の結合部位に可逆的に結合した抗原の解離は、隣接部位への抗原の利用を増大させる可能性がある。しかしながら、このような影響は、最初の抗原濃度が制限されるときのみ触媒反応の速度に影響を与え、観察されるVmaxの変化はないであろう。したがって、非相互作用部位による多価結合(親和力の影響)は、二価IgGと比較した十価IgMの優れた活性に関しては考えられない説明である。優れたIgM活性に関しては、以下の説明を示すことができる。第一に触媒活性の消失は、IgMからIgGへのアイソタイプ変更後のVドメインの体細胞多様化に付随する可能性がある。第二に、特徴的なIgM定常ドメインの特性は、触媒部位の完全性の維持において重要である可能性があり、その場合アイソタイプ変更そのものが、低い触媒活性をもたらす可能性がある。これらの説明は、互いに相容れないものではない。2つの説明は、(有効なBCR触媒反応は低いBCR占有率をもたらすので)B細胞分化の進んだ段階において、触媒反応は好ましくない現象であるという議論と一致する。この試験において実験によってこれらのポイントに取り込むことを、我々は試みなかった。しかしながら、一価Fab試験によって、IgMの定常ドメイン構造の破壊は、触媒反応に有害であることが示唆された。Fab調製物は、ペンタマーIgMの個々の結合部位に関して計算した活性より、10倍まで低い活性を示した。Fabを調製するために使用したペプシンは、その立体配座の柔軟性によって区別される(41)、CH2ドメインのC末端側のμ鎖を切断する(40)。同じVドメインが異なるアイソタイプに属する全長IgG抗体として発現されるときの、抗原結合活性の変化は記載しているが(例えば42)、文献中のIgM-IgGのVドメインの交換実験を我々は知らない。個々の抗体価を実現することによるアロステリック結合部位の活性化は、二価IgG調製物の場合以前から考えられている(43)。個々のIgM結合部位が抗原と結合するときの、一時的な一連の事象は解明されていない。過剰な抗原では、10個のIgM結合部位の5個のみが実現すると考えられ(例えば44)、抗原結合に対する好ましいアロステリック効果は、存在する場合、限定的な抗原濃度の条件に限られるに違いないことが示唆される。
【０１６６】
我々のスクリーニング実験は、数個のIgMおよび数個の市販の基質に限られた。さらなる試験が、IgM抗体の生理的基質および触媒反応速度の上限を定義するために必要である。しかしながら、入手可能なデータからいくつかの結論に達することができる。IgM調製物に関する見た目の代謝回転数(kcat)は、2.8/分ほど高かった。血清IgM濃度(1.5〜2.0mg/ml;〜2μM)は、従来の酵素より3〜4桁まで大きく(例えば、抗トロンビンIIIとの複合体として、血清中においてng〜μg/mlで見られるトロンビン;参照45)、IgMのkcat値は、従来のセリンプロテアーゼより2桁まで小さい。触媒反応がin vitroで観察される速度で進行する場合、代謝回転数2.8/分を有する2μMのヒトIgMは、過剰濃度(>>Km)で存在する24,000μMまでの抗原を3日間で切断する(血中でのIgMのおよその半減期に対応)。高濃度で存在する抗原、例えば血中アルブミンおよびIgG;それらの合成部位に近い位置に蓄積するポリペプチド、甲状腺小胞の内腔中のチログロブリンなど;ならびに重度に感染した位置の細菌およびウイルス抗原の場合、最大速度の条件に近づく可能性がある。阻害剤は、血液凝固を担う酵素などのin vivoの従来のプロテアーゼの活性を制御する。非制御型の触媒反応は、ホメオスタシスの破壊をもたらす可能性がある。従来の酵素を制御する阻害機構は、IgMタンパク質分解に関しては考えられる。
【０１６７】
免疫前レパートリー中の無差別なIgMタンパク質分解活性の同定によって、抗原特異的触媒IgM抗体の存在に関する重要な問題が持ち出される。限定的な抗原濃度の条件下では、触媒能力はKcat/Kmパラメーター(KmはKdにほぼ等しい3)として測定する。表7中に抗VIPIgGに関して示したように、触媒能力の多大な増大は、高い抗原結合親和性(低いKm)のために起こる。いくつかのポリペプチドは、高い親和性で免疫前レパートリー中に存在するIgM抗体によって認識される、例えばスーパー抗原Staphylococcalタンパク質AおよびHIVgp1204は、ナノモル範囲のKdを有するVH3ファミリーのドメインを含むIgM抗体によって認識される(46、47)。さらに、個々の抗原に関して改善された親和性を有する特異的なIgM抗体が、適応性のあるVドメイン成熟プロセスによって出現する(16、48)。同様に、個々の自己抗原を認識するように分化した触媒IgMの将来の研究が興味深い。自己免疫疾患を有する患者由来のIgM抗体は、グリコシダーゼ活性を示す(49)。自己免疫性のヒトおよびマウスは、高レベルで触媒抗体を合成する傾向があり(50〜53)、VIPに対するタンパク質分解IgG調製物は、VIPの生理的な平滑筋弛緩効果を害することが示されている(54)。
【０１６８】
実施例４の参考文献
2007524601.tif 000018
2007524601.tif 000019
2007524601.tif 000020
脚注
1使用した略語:AAU、任意面積単位、Ab、抗体、AMC、7-アミノ-4-メチルクマリン、BCR、B細胞レセプター、CDR、相補性決定領域、CHAPS、3-[(3-コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸、CRA、共有結合反応性アナログ、DFP、ジイソプロピルフルオロリン酸、EAR-MCA、Boc-Glu(OBzl)-Ala-Arg-MCA、IEGR-MCA、Boc-Ile-Glu-Gly-Arg-MCA、Fab、抗原結合フラグメント、FITC、フルオレセインイソチオシアネート、FR、フレームワーク領域、Ig、免疫グロブリン、PE、フィコエリトリン、SDS、ドデシル硫酸ナトリウム、VLおよびVH、軽鎖および重鎖可変ドメイン、VIP、血管作用性小腸ペプチド。
【０１６９】
2しかし、通常、IgMの10の結合価が全て埋まっているわけではない(例えば、ref44)。
【０１７０】
3抗体-抗原非共有結合複合体の解離の速度定数であるk2が非共有結合複合体の化学的変換の速度定数であるkcatより非常に大きい場合。
【０１７１】
4あるIgM抗体は他のポリペプチドより速い速度でgp120を切断する(S. Karle, S. PlanqueおよびS. Paul、未公表の観察)。
【実施例５】
【０１７２】
選択的にIgMにより触媒されるHIV gp120の加水分解:gpl2Oに対する先天的防御？
求電子性ホスホン酸ジエステル基を含む、ハプテン様共有結合反応性抗原アナログ(CRA)は、不可逆的にIgG抗体(Ab)の可変(V)ドメインと結合することが報告されており、酵素様求核部位(Planqueら、2003)の存在が示唆されている。非共有結合性の抗体-抗原相互作用は、ポリペプチド成分に対するAbを伴う、ポリペプチドCRAの比反応性から判断されるように、個々のポリペプチド抗原に対して、求核反応性を導く(Planqueら、2003)。これらの性質にもかかわらずIgG Abは、低レベルのタンパク質分解活性を表すだけである。この点は、抗体触媒作用とB細胞分化の後期段階で生じる相反する出来事から生じる、生理的障壁を知る手がかりになる可能性がある。抗原によりB細胞レセプター複合体(BCR;細胞膜と結合したIgサブユニットと共に非共有結合的に結合するシグナル伝達タンパク質)が占有され、細胞分裂が促進される。一方では、効率的な触媒作用は、抗原によるクローン選択の停止を生じる恐れがある抗原フラグメントの迅速な放出を伴う。
【０１７３】
ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)コートタンパク質gp120が、宿主細胞のCD4レセプターと結合することにより、ウイルス感染が始まる。さらに、モノマーgp120はウイルスから脱落し、可溶した状態で細胞表面に感染する。遊離のgp120は、AIDSの病理発生に重要である。感染したCD+細胞に対するタンパク質の結合は、T細胞の減少に関連づけられており(Siliciano, 1996)、遊離したgp120はニューロンの損傷も引き起こす。(KaulおよびLipton, 1999).現在、HIV感染症または可溶性gp120に対して効果的な利用できる免疫療法または予防接種方策はない。HIV感染に対する体液性IgGの応答は、通常、gp120の変異を生じやすい領域に対するAbによって支配されている。これらのAbは、感染経過で出現するウイルスの逃げ延びた変異体に対しては効果がない。実験的に免疫して生成した、gp120がCD4レセプター結合部位に対するAb(Heら、2002)、およびファージライブラリープロトコルが、免疫療法の候補として提案された(Burtonら、1994)。最近、gp120のCRA誘導体を使う免疫が、gp120を切断する特異的なIgGAb産生を誘導することが示された(Paulら、2003)。適切なgp120認識特異性を有するタンパク質分解性のAbは、タンパク質の永続的な不活性化に有利である。さらに、反応サイクルを繰り返すと、単一の触媒分子で、多数のgp120分子が切断される結果となる。通常のAbは、化学量論的にgp120と結合し、この抗体-抗原複合体の解離により、生物学的に活性タンパク質が放出される。
【０１７４】
健常人および免疫されていないマウスのIgGAbは、無差別に短いペプチド基質を切断することが報告されている(Kalagaら、1995)。エステル分解と過酸化水素合成などの反応も、Vドメインの適応性の成熟状態に関係なく、特定のAbにより触媒される(Wentworthら、2000; Pattenら、1996)。B細胞の発生中に産生される最初のクラスのAbとして、IgM抗体は通常、分化したB細胞で産生されるIgG Vドメインより低次に多様化した可変配列を持つVドメインを含んでいる。抗体に触媒されるgp120の切断に関する研究過程で(Paulら、2003)、我々は、免疫前のレパートリーに存在するIgMによる、選択的で効果的なgp120の切断現象を発見した。IgMAbは、ペプチド決定基を認識して、CD4に接触部位(すなわち、gp120残基421-433)を提供すると報告されている(Goodglickら、1995; KarrayとZouali, 1997)。この決定基は、特定のAbの保存されたVドメイン領域により、gp120に存在するスーパー抗原として認識されることにも関係している(Neshatら、2000; Karrayら、1998)。
【０１７５】
結果
ポリクローナルIgMAbの触媒活性。
【０１７６】
ビオチン化gp120(Bt-gp120)を、全5人のヒト血清からのIgMにより切断し(図32A)、ゲル電気泳動で、元のgp120バンドの減少と、小さい質量をもつフラグメントの出現に基づいて評価した(図32B;おそらくはバキュロウイルス発現系での不完全な糖鎖形成のため、組換え型のタンパク質は、Mr約94kD移動する)。
【０１７７】
5人のヒト血清からのいずれのIgGサンプルも、gp120を検出可能な程度に切断しなかった。図32Aのデータは、IgMとIgGの等価な結合部について表されている(それぞれ10および2;しかし、全て10個のIgM結合価が通常占められるというわけではない点に留意すること(ChavinおよびFranklin, 1969)。したがって、優れたIgM触媒作用は数の多いIgM結合部に起因させることができない。本質的には同一の結果が、免疫学的に刺激されていないBALB/cマウスのプールされた血清から調製したIgMとIgGAbを用いて得られた(87.9%切断/20時間/150nM IgM結合部;等価なIgG結合部濃度では検出不可能なgp120切断;図32Aと同様な反応条件)。
【０１７８】
アフィニティー精製したIgMを、変性溶媒、6Mの塩酸グアニジンで、2サイクルのゲル濾過にかけた(図33)。この操作で回収されたAbを、透析で再生し、触媒活性を測定した。変性ゲル濾過にかけたIgMは、出発IgM分画とほとんど等しいBt-gp120切断活性を示し(それぞれ、82.2±9.2および78.8±1.0%の切断)、非共有結合した混入プロテアーゼが存在しないことを示している。
【０１７９】
モノクローナルIgM Abの触媒活性。
【０１８０】
調べた6つのモノクローナルIgM Ab(マウス5;ヒト1)のおのおのが、gp120切断活性を示した(図34A)。加温と冷却を反復して精製したIgM Yvoを、さらに抗IgMカラムでアフィニティークロマトグラフィーを実施する前後に、触媒活性について分析した。最終的な精製ステップ前後のgp120切断レベルは、本質的には同一であった(それぞれ46.4±0.6%(s.d.)および44.3±4.9% Bt-gp120切断/50nM IgM/6時間;図32Bと同様な反応)。これは、IgMに酵素活性という付与するのに必要な、一定の比活性に対する精製基準を満たしている。
【０１８１】
同様に精製したマウスのIgM Abは、27.5倍の範囲まで変化する異なるレベルの触媒活性を発現した(図34A)。Abの定常ドメイン構造が同一なので、この結果は、触媒活性がVドメインの特性であることを示唆している。この点は、固定したペプシンによる消化とゲル濾過により調製された、IgM YvoのFabフラグメントでの、gp120の切断活性の観察により裏付けられている(図34B)。使用した中性のpH状態下で、ペプシンは不可逆的に失活する(Cornish-Bowdenら、1969)。精製ペプシン(1.2μM)によるBt-gp120の処理では、タンパク質は検出可能な程度で切断されず(図示せず;図34Cと同様な反応条件)、観察されたFabのgp120切断活性は、ペプシン混入が原因ではないことが確認された。
【０１８２】
IgM YvoでBt-gp120を処理すると、80kDのビオチンを含むフラグメントが生じ、その生じる程度は反応の全過程にわたりわずかに変化し、元のバンドはだんだんと消失した(図35A)。これは、80kDのバンドはアダクト的な切断反応に影響されやすいことを示唆している。複数の弱いビオチン含有バンドが、過剰に露出したゲル中に小さいMr値で出現した。(43と、31、25、17kD;図示せず)。gp120はビオチン含有量が少ないため(1.4モル/モル)、ビオチンの存在は、フラグメントの相対的な存在割合の正確な予測ではない。ビオチンを含有しないgp120をIgM Yvoと共にインキュベートすると、クーマシーブルーで染まる15.4〜18.8kDのバンドが複数生じた(図35B;25kDと70kDのバンドは、IgM YvoのL鎖とH鎖にそれぞれ対応する)。フラグメントのN末端のアミノ酸配列の決定を行った(表8)。80kDのゲル領域に、gp120のN末端に対応する配列が得られた。gp120ペプチドの内部配列が検出されないので、切断部位は同定出来なかったが、そのフラグメントは、gp120の半分のC末端に位置する部位で切断されて生じたと結論された。15.4〜16.4kDと17.6kDのゲル領域に対応するフラグメント中に、gp120残基433〜442に対応するペプチド配列が同定され、一つの切断部位として432〜433のペプチド結合を明らかにすることができた。gp120の残基1〜10に対応する2つのペプチド配列が、15.4〜16.4kDと18.8kDゲル領域にみられた。これらのgp120フラグメントは、タンパク質の半分のN末端に位置するさらに2つの切断部位の存在を示している。
【０１８３】
速度論および選択性。
【０１８４】
ビオチン化ウシ血清アルブミン(Bt-BSA)、ビオチン化可溶性CD4(Bt-sCD4)、またはビオチン化可溶性上皮増殖因子レセプター(Bt-sEGFR)をポリクローナルヒトIgMで処理しても、これらのタンパク質の全長に対応する電気泳動法バンドの顕著な減少は生じなかった(図36)。これらの条件下では、容易に検出できるBt-gp120切断が認められた。同様に、IgM YvoおよびポリクローナルマウスIgMで処理した、全長Bt-sCD4、Bt-sEGFRおよびBt BSAバンドに、検出可能な減少がみられなかった。(反応条件は図36と同様;これらのAbによるBt-gp120の切断は、それぞれ69.1%および97.4%)。
【０１８５】
漸増gp120濃度で観察された初速度を一般的な二次方程式にあてはめて、3つのIgM標品に関する速度論的パラメーターを決定し、触媒-基質複合体濃度を予測した(表9)。gp120濃度がKdより小さい場合は、この方法は反応速度論の研究に適用できる。見かけ上のKdは、観察された速度と[IgM-gp120]の間で、最高の適合を与える値であり、そして見掛け上のKcatは、速度対[IgM-gp120]プロットの勾配である。表9で記録さたデータに対応している3つのプロットに関する相関係数は>0.9であった。ポリクローナルヒトIgM、モノクローナルヒトIgM YvoおよびモノクローナルマウスIgM 8704で観察されたKcat値は、52.5倍の範囲にわたって変化し、Kd値は23.8倍の範囲にわたって変化した。
【０１８６】
求核反応性。
【０１８７】
gp120残基421〜432のホスホネートジエステル含有アナログ(gp120pep-CRA;図37A)が、求核性の抗gp120 Abの共有結合プローブとして作成された。不可逆的に結合したペプチド成分で免疫することによりAbが上がり、gp120pep-CRAを用いると急速に上昇する。これは非共有結合性の抗原-抗体結合相互作用の促進効果のためである。(Planqueら、2003)。本研究で、IgM Yvoによる、Bt-gp120の切断の漸進的阻害がgp120pep-CRA濃度を増加させることにより観察された(図37B)。電気泳動ゲルで、タンパク質アダクトバンド中のビオチン含有量を推定することにより、共有結合性のgp120pep-CRA結合が測定された。調べた全て5つのIgM抗体調製物(3つのモノクローナルIgM、マウスポリクローナルIgMおよびヒトポリクローナルIgM)は、ハプテンCRA Iのアダクト形成を上回る割合で、gp120pep-CRAと共有結合アダクトを形成する(図38A;平均の割合、前者の化合物より41倍多い;P<0.002、スチューデントt検定、両側検定)。モノクローナルIgM Yvoの場合以外は、μ鎖サブユニットが、大部分の共有結合性のgp120pep-CRA結合を占めていた(図38B;任意の領域単位における割合(AAU)/h/μM Abサブユニット:H鎖、41.5〜257.5;L鎖、22.3〜247.7)。CRAアダクトは、時間の関数として直線的に蓄積した(例えば、図38Cに示したIgM Yvo L鎖アダクト)。反応混合物(500μM)中の、過剰量の合成gp120の混在物(421-436)が、反応が生じたサブユニットとは無関係に、それぞれ5つのIgM標品によって、gpl20pep-CRAアダクトの形成を≧68%阻害した(例えば、図38D)。
【０１８８】
考察
本研究は、HIVのコートタンパク質gp120の切断を触媒するIgM抗体の選択的能力を示唆している。Abは、感染していないヒトおよび免疫していないマウスからのものであった。より分化の進んだB細胞の生成物であるIgGAbは、評価しうるほどにはgp120を切断しなかった。したがって、gp120加水分解を触媒したIgMの観察された選択性は、免疫前の抗体のレパートリー固有の特質を反映しているにちがいない。IgM Vドメインに対する触媒活性の割当は、これらの観察に基づいて支持される:(a)Vドメインのみが異なるIgM Abは、互いに異なる触媒活性レベルを示した;(b)Fab フラグメントが、活性を発現した; (c) gp120 pep-CRAプローブを有する共有結合性のIgMアダクトの形成は、ハプテンCRA形成より急速に進行した;異なるAbは、様々なレベルでアダクトを形成した;異なるAbに対する反応では、異なるサブユニットが選択されることを示した;反応は、gp120 pep-CRA中のペプチド決定基に及ぶ合成ペプチドにより阻害された。活性化されたセリン求核基に共有結合することにより、CRAホスホン酸ジエステル基は、セリンプロテアーゼを阻害する(OleksyszynとPowers、1994;Sampson と Barton、1991)。L鎖の生殖細胞系での構成は、セリンプロテアーゼ様タンパク質分解活性を発現することが示されている。(Gololobovら、1999)そして、免疫していないマウスおよびヒトのレパートリーに存在するIgG Abもまた、タンパク質分解活性を発現することが報告されている(Kalagaら、(1995);Matsuuraら、1998)。ここで示されたタンパク質分解性IgMの反応性は、触媒活性が生殖細胞系由来であることと一致している。
【０１８９】
IgMの10結合価特性による結合活性効果により、たとえ個々の結合部位固有の親和力が小さくても、反複エピトープをもつ抗原との結合を強化することができる。しかしながら、gpl20は、反複エピトープを持たないため、IgGと比較しIgMの優れた触媒作用は、この要素によると考えることは出来ない。さらにまた、モノクローナルAbを用いて、溶液中での触媒作用の測定では、同じgp120分子に多価のIgMが結合することを支持していない。以下の説明は、IgM Abの優れた触媒活性に関して示されている。まず、触媒活性の減少は、IgMからIgGへのアイソタイプの転換後の、体細胞でのVドメインの多様化に付随している可能性がある。次に、特有のIgM不変領域特性が、触媒的部位を完全な形で維持するために重要である可能性がある。その場合には、アイソタイプの転換それ自体が、触媒活性の減少に結びつく可能性がある。これらの説明は、両立しないものではない。両方の説明は、効率的なBCR触媒作用は、BCR占有率の減少に結びつくと予測されるので、触媒作用はB細胞の発生が進行した段階では歓迎されない現象であるという議論と一致している。本研究では我々は実験的に、これらの点について言及することは試みていない。しかしながら、IgMの不変領域構造が崩壊すると、触媒作用に有害であることが一価のFabの研究により示唆されている。複数のFabの標品は、五量体のIgM個々の結合部から計算した活性より、約100分の1の活性を示した。ペプシンを用いて、μ鎖CH2領域のC末端側で切断したFabを調製した(MacKenzieら、1978)、このFab は高次構造上の柔軟性に基づき識別される(Rouxら、1998)。同じVドメインが、別のアイソタイプに属する完全長を持つIgG Abとして発現するとき、抗原結合活性が変わることが示された(例えば、Morelockら、1994)。しかし、我々は文献でIgM-IgG Vドメインを交換している実験については知らない。例えば2つのIgG結合部位による抗原結合に関して示される、正の協調作用効果(van Erpら、1991)が、触媒作用に理論的には有利に寄与することができている。個々のIgM結合部位が抗原を結合する事象の順序は解明されなかったが、抗原が過剰な濃度で存在するとき、10個のIgM結合部位のうちの5個のみが抗原に占められていることが見つかり、正の協調作用仮説は支持されていない(例えば、ChavinとFranklin、1969)。
【０１９０】
IgMプロテアーゼによる選択的なgp120認識は、ジペプチド切断部位の認識に限定される局所的な化学的相互作用からは理解できない。これは、同じジペプチドの単位が、他の十分に切断されていないタンパク質中に存在しているからである。選択性は、おそらくAbによる非共有結合性のgp120認識に起因する。このことは、おそらくgp120の触媒的IgMの認識に関する比較的小さいKd値(1.3〜30.0μM)から推論される。これらの値は、IgM Ab(S. PlanqueとS. Paul、未発表の観察)および免疫前のマウスと健康なヒト血清から分離されるIgG Ab(Kalagaら、1995)により触媒される、無差別のタンパク質分解反応に対する見掛け上のKdより約2桁小さい。非共有結合性の相互作用の重要性に関するさらなるサポートは、IgM Abとgp120pep-CRAの共有結合性の反応は、そのペプチド成分の非共有結合性の認識により導かれるという観察から引き出すことができる。非共有結合性の認識に由来するAb触媒的選択性に関する先例が利用できる。切れやすい結合への求核攻撃と協調する、非共有結合性のパラトープ-エピトープ結合は、実験的な免疫で得られた適応的に成熟したタンパク質分解性のAbによる、個々のポリペプチド抗原を選択的に切断するための基礎である(Paulら、2003; Sunら、1997)。
【０１９１】
HIVに感染していない対象のIgMによるgp120の選択的な切断は、gp120のスーパー抗原性の形質に由来する可能性がある(Berberianら、1993)。IgM Abは、保存されたAb Vドメイン領域で接触して(Neshatら、2000;Karrayら、1998)、スーパー抗原としてgp120と結合すると記載されている(Townsley-Fuchsら、1996;Juompanら1998)。gp120のスーパー抗原性部位は、不連続なペプチドセグメントから構成されており、その一つは、残基421-433にわたっている(Goodglickら、1995;KarrayとZouali、1997)。ここで調べられたIgM Abは、残基432と433をつなぐペプチド結合を切断した。触媒的IgM Abの全ては、残基421-431と残基432および433を模倣するアミジノホスホネートを含むgp120pep-CRAの選択的な共有結合を示した。これは、触媒的部位の求核反応性と機能的に調和している、非共有結合性のgp120結合を伴っているモデルを支持している。提案されたメカニズムは、非共有結合が、適応的に成熟した超可変ループでなく、保存されたVドメイン領域で起こること以外は、実験的な免疫により誘導される触媒的IgG Abにより利用されるメカニズムと同一である(Paulら、2003;Sunら、1997)。しかし、モデルのある側面は、探究する必要がある。例えば、共有結合性のgp120pep-CRAデータは、求核反応性が非共有結合性のペプチドエピトープ認識と調和する程度を示唆しているが、そのデータは触媒的求核基のサブユニットの部位を確定していない。gp120pep-CRAのアダクトは、主に4つのIgM標品のH鎖および1つのIgM標品のL鎖によって作成された。以前の報告では、L鎖とH鎖は、それぞれ触媒的求核基を発現することができることを示している(Gaoら、1995;MatsuuraとSinohara、1996;Hatiuchiら、2003)。別の興味深い側面は、gp l20中の複数のペプチド結合の切断である。これは、モノクローナルAbのL鎖に触媒されるgp41(Hifumiら、2002)および、血管作用性小腸ペプチド(VIP)(Sunら、1997)の切断に関して報告されている、複合切断プロフィールに類似している。切断プロフィールは、求核性残基に一致して配置する、別のペプチド結合と、交互になったAb-gp120基底状態複合体形成により、説明できる(Paulら、2003)。Abが立体配置的なエピトープを認識する場合、交互の切断部位は、空間的に隣接していなければならないが、直線的な配列では離れていても良く、複合切断パターンを生じる。
【０１９２】
以前報告した非共有結合性のIgM-gp120複合体には、VH3ファミリーに属するVHドメインをもつAbが含まれる(Goodglickら、1995;KarrayとZouali、1997;Berberianら、1993)。IgM YvoのVHドメインは、VH2ファミリーに属している(VH2-5生殖細胞系遺伝子;Shawらから推論される、2002;ここで研究されたIgM Abの残りのVHシークエンスは利用できない)。この矛盾は、以下のように説明できる。まず第一に、gp120のタンパク質分解は、生成物の迅速な放出を伴う。安定な免疫複合体の濃度が少ないため、効果的な触媒は、結合実験によっては十分に検出されないであろう。第二に、ターンオーバー機能により、非触媒的Abよりも、感度の高い触媒の検出が可能になる。図32Aで、IgM(15nM)およびgp120濃度(100nM)で、Kd 31μMを有する非触媒的Abは、平衡状態でgp120と0.5nMだけ結合する。平衡状態は次の方程式から計算される[[Ab-Ag]2-[Ab-Ag]([Ab0]+[Ag0]+Kd)+[Ab0][Ag0]=0、ここで[Ab0]と[Ag0]は、時間0におけるAbおよび抗原の濃度]。一方、非触媒的Abと同様なKcat 2.1/minおよびKdをもつ触媒的IgM標品により、同様の状態下で、70nMのgp120が20時間で切断される(Pt = Ag0[1-e(-k[Ab0]t)]として計算した。ここでPtは、時間tにおける生産物濃度であり、kはkcat/Kmである;Marangoni、2003)。
【０１９３】
免疫系により自然発生的に作り出される触媒的Abは、主として病原性エフェクター分子として、これまで見られてきており、例えば、VIP (Paulら、1989)、核酸(Shusterら、1992)およびFactor VIII(Lacroix-Desmazesら、1999) に対する自己抗体である。本研究は、IgM触媒作用はHIV感染症の病理発生に、関連する可能性があることを示唆している。HIVから脱落した遊離のgp120は、いくつかの細胞型に有害な影響を及ぼすと考えられる。遊離したgp120の神経毒性作用は、エイズ痴呆に関連づけられている(KaulとLipton、1999)。そして、細胞の感染の有無とは無関係に、gp120のアポトーシスを誘導する能力が、CD4+T細胞減少の原因となっている可能性がある(Siliciano、1996)。IgM Abの機能上の効力の評価での注意点は、HIV感染症に関連する血中および他の解剖学的な部位で、天然のセリンプロテアーゼ阻害剤による阻害の可能性である。阻害剤がない場合、血中を2mg/mlで循環するヒトIgMにより、濃度<<Kdで、存在するgp120の50%および90%を、それぞれ、4.6分および15.5分間で加水分解すると計算できる(Kd31μM、Kcat 2.1/minと仮定する、表9)。同様に、ウイルス表面で3量体のgp120の切断が、遊離のタンパク質に関して観察される速度で進行する場合、大半のウイルスgp120の加水分解に要する時間はごく短い(感染gp l20濃度<<観察されたKd、の状態にとどまる;例えば、100gp120分子/ビリオンを有する106 HIVコピー/mlは、約2x10-13Mのgp120に対応する;Richieriら、1998)。IgM Abの保護的な役割に対する支持は、gp120の421〜433残基を認識するAbの能力から得られる。これらの残基は、宿主細胞CD4レセプターがgp120との結合の際の接触部位となる(Olsheveskyら、1990;Kwongら、1998)。IgM感受性のLys432-A1a433結合で切断されて生じるフラグメントは、CD4結合活性を欠いていると報告されている(Pollardら、1991)。非共有結合的にgp120のスーパー抗原性部位に結合するIgG AbはHIV感染症の進行では抵抗因子として記載されている(Townsley-Fuchsら、1996;Juompanら、1998)。最初の研究は、Karleらと同様に実施された。ポリクローナルヒトIgMは、低血清状態下で、初期のHIV-1分離株により、末梢血単核細胞の感染を中和することができることが、出版物では示唆されている(Hanson、KarleおよびPaul、発表予定)。Berberianら(1993)は、gp120スーパー抗原性の部位に結合するIgM抗体による血清不在下でのHIVの中和を示唆する、彼らの未発表のデータをすでに引用している(Berberianらの引用11、1993)。
【０１９４】
これらの研究は、HIVワクチン設計に役立つ可能性もある。gp120残基421〜433を含む合成ペプチドが、ワクチン候補として提出されている(Morrowら、1992;Karleら、2003)。これらの残基は、種々のHIV株で比較的変化しにくいのが理由の一部である。ここで記載されたgp120ペプチジルCRAは、gp120スーパー抗原性部位の強化された認識をもつAbを誘導するための潜在的な免疫原である。全長のgp120のCRA誘導体は、触媒的Abの合成を誘導する(Paulら、2003)、しかし、不適切なエピトープに対するAbが、この免疫原に対する応答で優位を占めるであろう。
【０１９５】
実験手順
抗体
ヒト血清Abは、感染または免疫学的疾患の徴候のない対象から分離された(女性2人、男性3人;23〜45歳)。マウスの血清Abは、BALB/cマウスからのものである(Harlan、Indianapolis、IN;150匹のマウスからプールされた;年齢8〜12週)。ここで用いられたマウスのモノクローナルIgM Abは、特定の主要組織適合抗原に対するものである(クローンはカタログ番号、8702、8704、9008、9010および9020に対応;無細胞の腹水;Cedarlane、Ontario、Canada)。モノクローナルIgM Yvoは、ワルデンストレームマクログロブリン血症患者の血漿交換により得た(Shawら、2002)。全てのモノクローナルIgM Abには、κ鎖が含まれている。血清または腹水(1ml)を、1mlのラット抗マウスIgM Ab結合セファロース4B(沈殿ゲル;Zymed、San Francisco、CA)またはヤギ抗ヒトIgM Ab結合アガロース(Sigma、St. Louis、MO)と1時間混合した（それぞれのIgM結合能は0.8および3mg、50mMトリス-HC1、pH 7.5、0.1mM CHAPS(3[(3-コルアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸)中(バッファーA)。結合していない画分を回収し、ゲルを20(体積)倍量のバッファーAで洗浄した。溶出液中のタンパク質は、溶出前には検出不可能なレベルに戻っていることに注意(A280<0.001)。溶出は、100mMのグリシンpH 2.7で行った(0.5ml/画分を、25のμlの1Mトリス-HCI、pH 9.0中へ)。さらに精製を、Superose-6 FPLCゲル濾過カラム(1x30cm; 0.25ml/min; Pharmacia)を用いて、2つの異なる溶媒中で実施した:50mMトリス-HCI、pH 7.7、0.1Mグリシン、0.15M NaCl、0.025%ツイーン-20(バッファーB)、または塩酸でpH 6.5に調整したバッファーB中で6M塩酸グアニジン(バッファーC)。カラム分画に先立ち、アフィニティー精製したIgMを、バッファーCで透析した。カラム較正には、チログロブリン(660KD)、IgG(150kD)およびアルブミン(67kD)を用いた。IgMは、外見上Mr 900kDのボイドボリュームの付近で溶出した。IgMを、バッファーCを用いたクロマトグラフィー後、バッファーBに対して透析して再生した(Kalagaら、1995)。IgM Yvo(クリオグロブリン)は、反復加温(37℃)により血清から精製し、冷却(4℃;3サイクル;Shawら、2002)後、抗ヒトのIgMカラムでアフィニティークロマトグラフィーを行った。抗IgMカラムまたは無細胞腹水からの非結合分画を出発物質に用いて、IgGをタンパク質G-セファロースカラム(Kalagaら、1995)で精製した。Fabフラグメントは、100mMの酢酸ナトリウム、pH 4.5、150mM NaCl、0.05%アジ化ナトリウム、0.1mM CHAPS中で、アガロース結合ペプシン(ゲル0.6ml、30分、37℃)でIgM(300μl, 1mg/ml)を消化して調製した(製造業者(Pierce)推奨に基づく)。非結合画分を、バッファーBに対して透析し、Superose 12カラム上でFPLCゲル濾過により精製した。そして、50mMのトリス-HC1、pH 7.7、0.1Mグリシン、0.1mM CHAPSに対して透析した。総タンパク質量は、ビシンコニン酸法に基づいて測定した(Pierce)。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(4〜20%ゲル)は、還元状態下で実施した(2‐メルカプトエタノール)。ゲルブロットを、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトμ、γ、κおよびλAb(1:1000;Sigma)または、ヤギ抗マウスμ、γ、κおよびλAbで染色後、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヤギIgGで処理した(Fc特異的、1:1000;Pierce;Kalagaら、1995)。名目Mr値を、標準タンパク質との比較により計算した(14kDa〜94kDa;Pharmacia)。
【０１９６】
タンパク質分解のアッセイ
gp120および上皮増殖因子レセプター(sEGFR)の可溶性細胞外ドメインおよびウシ血清アルブミンは、リジン残基でビオチン(Bt)でラベルされることが記載されている(1〜2モルBt/モルタンパク質)、これはPlanqueら、2003と同じ方法である。可溶性CD4(sCD4;残基1〜183;NIH AIDS 試薬プログラム[NIH AIDS Reagent Program])はビオチン化されて、同様の方法で精製された(1.3モル Bt/モル sCD4)。gp120(MN系統)は、バキュロウイルス系で発現される組換え型のタンパク質である(Immunodiagnostics、Woburn、MA)。gp120pep-CRA(C末端にアミジノホスホン酸ジエステル基をもつBt-KQIINMWQEVGN)の合成は、Taguchiら、2002により述べられている。触媒作用測定(ポールら、2003)を、Btタンパク質とAbを、50mMのトリス-HC1、100mMのグリシン、pH7.7、1m MCHAPS中、37℃でインキュベートして実行した。試料を、SDSと2‐メルカプトエタノールを含むバッファー中で煮沸し、SDS-ゲル電気泳動を行った。切断は、ストレプトアビジンペルオキシダーゼで染色されるエレクトロブロットの濃度測定に基づいて定量した。gp120pep-CRAによる、触媒作用阻害の測定は、6%のエタノール中で行った。Fab切断研究で、コントロールとして用いられた精製ブタペプシンは、電気泳動ゲルから、エレクトロブロットされたgp120フラグメントのシグマN末端配列決定からのものであり、Sunら、1997の方法により実行された (Applied Biosystems Model 492 Precise cLC sequencer)。変化させたBt-gp120濃度で、速度データを二次方程式に適合させることにより、速度論的パラメーターが決定された(Sunら、1997):[CS]2-[CS]([Ct]+[St]+Kd)+[Ct][St]=0、ここで[Ct]と[St]は、触媒と基質の総濃度であり、[CS]は触媒-基質複合体の濃度である。
【０１９７】
不可逆的CRA結合
ビオチン-含有ハプテンホスホネートCRAの合成およびそのプロテアーゼとAbの不可逆反応、並びにgp120残基421-436から成る合成ペプチドに対する特異的なAbとgp120pep-CRAの不可逆的結合が示された(Planqueら、2003; Taguchiら、2002; Nishiyamaら、2002)。CRA-IgMアダクトの形成は、還元性SDS-電気泳動法および、エレクトロブロッティング、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼコンジュゲートを用いるデンシトメトリーに基づいて測定された(Planqueら、2003)。バンドの強度は、任意の領域単位で表した。初速度は、進行曲線の勾配として計算された(20、40、60、120および220分間インキュベーション; ここで報告される全部のデータ関してr2>0.9)。
【０１９８】
参考文献
2007524601.tif 000021
2007524601.tif 000022
2007524601.tif 000023
2007524601.tif 000024
【実施例６】
【０１９９】
pCRA免疫により誘導される、特異的な共有結合性で触媒的抗体応答に関する追加的証拠と方法
実施例2において、自己免疫性のマウス(MRL/1pr系統)をgp120-CRA免疫原で免疫して上昇するIgG Abに関するデータが開示されている。gp120-CRAは、非自己免疫BALB/cマウスの免疫原としても用いられた。この実施例で、後者の免疫によるAbは、実施例2の場合と本質的には同様に生成した。ホスホン酸ジエステル基を欠くgp120が、コントロール免疫原として用いられた。免疫は、標準アジュバントにプロテインA(Protein A)を同時に共同免疫するか、またはしないで実施した。B細胞スーパー抗原は、VH3+ファミリーAbの利用で、レパートリーをゆがめると考えられた(1)。IgG Abに加えて、IgM Abもこの実施例で検討された。免疫過程で得られたマウスからの血清中のgp120に対する特異的なAbの測定では、gp120-CRAに反応するIgMクラスの抗gp120 Abの蓄積は、コントロールgp120への反応よりは大きいことが示唆された(図39)。プロテインAとの共同免疫は、さらに抗gp120 IgM Abの蓄積を増強した。
【０２００】
gp120-CRAで免疫したマウスのうちの1匹からのモノクローナルIgMおよびIgG Abは、実施例2の場合と同様に調製した。Bt-gp120の切断に関するモノクローナルIgMを分泌しているハイブリドーマのスクリーニングを、基本的には実施例2で示したように実施した。この目的のために、ハイブリドーマ培養液上清について、セファロース不固定抗マウスIgM Abを用いて、96ウェルプレート中で、高率のスループットアフィニティー精製を行った(アフィニティーゲルの詳細については実施例Vを参照)。免疫していないマウスからのIgM Abよりかなり高いレベルでBt-gp120切断する、いくつかのIgMクローンが同定された(例えば、クローンF223-3E7およびF223-6H1、図40に示す)。
【０２０１】
前節で述べた、ハイブリドーマがIgGを分泌しているウェルを、還元性SDSゲルでの変性電気泳動法を用いて、Bt-gp120に対する共有結合についてスクリーニングした(N = 117)。このスクリーニングの抗原は、ホスホン酸基を欠いている。SDS-ゲルで検出される何らかの結合は、共有結合性の特性を有する結合を含む、異常に安定した相互作用を反映していると解釈される。見掛けの質量154kDを有するBt-gp120バンドが、4クローンを用いて実施したインキュベーションで観察された、一例を図41に示す。このバンドは、また免疫ブロットでマウスIgGに対するAbにより染色可能であり、バンドは、IgGのサブユニットとgp120の安定な複合体を示していることをを確認した。(SDS-電気泳動は還元状態下で実施されるので、IgGのS-S結合構造は壊され、そして共有結合性のgp l20-IgG複合体は、gp120-H鎖複合体およびgp120-L鎖複合体の特性をもって移動する)。
【０２０２】
これらの結果は、実施例2で述べられている、YZシリーズIgG Abについて実行された、引き続く研究と一致している。そこで述べられたように、gp120-CRAで免疫したマウスからの7つのモノクローナルIgGは、共有結合で固定されたgp120-CRAと結合することが確認され、我々の共有結合ELISAプロトコルで、2%SDS処理に対する複合体の抵抗性により評価された。もっと最近の研究で、我々は、全て7つのこれらモノクローナルIgGは、ホスホネート部分を欠くgp120に対して、SDS耐性結合をも示すことを観察した(MAbの3つに関するデータを図42に示す)。組織培養上清と同様に、精製したIgG(タンパク質G-セファロースクロマトグラフィーによる)を用いて、SDS耐性結合が観察された。同じSDS処理により、不固定gp120に結合した通常の抗gp120 Abは、ほぼ完全に除去される結果になった(gp120 V3ドメインに対する、クローン1121、257-D IVおよび268-D IV;NIH AIDS調査および参照対象プログラム(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)およびDr.S. Zolla-Paznerの厚意による、参考文献 2-3)。これらの結果は、gp120-CRAに対して上げられたAbによる、異常に安定したgp120結合を示している。我々は、共有結合免疫は、抗HIVAbの共有結合反応性を強化するために、実行可能な手段であると結論した。
【０２０３】
我々はまた、実施例3で述べたように、VIP-CRAを用いてマウスを免疫することを含む、新しい研究をも実施した。VIP-CRAによる免疫では、免疫の期間中、ポリクローナルIgGの求核反応性レベルが段階的に増加する結果となり、これは変性電気泳動ゲルで、CRAアダクトの出現に基づき判定した(図43)。VIP-CRA共有結合のレベルは、VIP配列を欠いた、ハプテンCRAのレベルより優れており、特異的求核性抗体応答を示唆している。この研究でpCRAを用いた免疫により、特異性の原因となる通常の非共有結合性の結合力と協調する、強化された求核反応性を有するAb合成を誘導したことを確認した。
【０２０４】
参考文献
2007524601.tif 000025
【実施例７】
【０２０５】
抗gp120-CRA抗体によるHIV中和の証拠
HIV-1一次分離株による健常供血者の末梢血単核細胞感染が、p24酵素免疫検定法を用いて測定された(方法論の詳細は参考文献1)。研究されたHIV-1分離株に、R5-およびX4-依存性の株が入っていた(strains ZA009、BR004およびSF-162株)。対照には、適切な無関係なAbが含まれていた(アイソタイプ適合モノクローナルIgG)。陽性対照は、gp120のCD4bsに対するモノクローナルAb b12を含んでいた(2)。試験Ab標本は、HIVなしでAbをインキュベーション後、細胞生存率の減少が観察されなかったので、PBMCに細胞毒性を及ぼさなかった(アクリジンオレンジ/臭化エチジウムで細胞を染色して判定した;Sigma;希釈液およびAb標品で処理された細胞で生存率約80〜85%)。結果は以下の通りである:gp120-CRAで免疫して上げられたモノクローナルIgG YZ18、YZ22およびYZ23は、再現性をもって、用量に依存してR5依存性のGlade C株ZA009を中和した(図44)。陽性対照(クローンb12、Dr. Dennis Burton提供)は、このHIV-1株の中和に限定した能力を示した。同程度に精製した無関係なモノクローナルIgG、クローンCRL169の存在下では、HIV-1の中和は観察されなかった。gp120-CRAにより上昇するAbは、HIV-I表面で発現した本来のgp120を認識し、HIV-1感染の能動免疫療法に有用である可能性があると結論できる。
【０２０６】
参考文献
2007524601.tif 000026
【実施例８】
【０２０７】
狼瘡ライブラリーからの触媒的抗HIV Abフラグメントの分離
狼瘡患者は、このタンパク質の残基421〜436から成るHIV gp120決定基に結合するAbを合成する(1)。前述のように、狼瘡患者では、亢進したレベルで触媒的Ab合成が生じる(2)。そこで我々は、gp120に特異的な触媒的Abを同定するためにCRAに着目した。ハプテンCRAは、求電子性のリンと活性化された求核基の間での共有結合形成により、非特異的な触媒を分離するのに役立つことを我々はすでに報告している(3)。基本的には、狼瘡Abレパートリーをその表面に発現しているファージをCRAに結合させる。そして共有結合で接着したファージから回収したAbcDNAを水溶液中で発現させ、金属アフィニティークロマトグラフィーを用いて、組換え型Abのhis6標識を用いて精製後、抗原との結合および切断活性に関して分析した。参考文献3に、狼瘡患者からの単鎖Fv(scFv)とL鎖サブユニット(L鎖)を発現するファージライブラリーの調製と特性を記載する。scFv構造は、短くて可動性のペプチドリンカーにより連結されたAbの、VLおよびVHドメインから構成されている。L鎖のVLドメインは、H鎖サブユニットのVHドメインに依存しない触媒活性を発現することをすでに示している(4、5)。非触媒的Abのように、ペプチダーゼAbは、VLとVHドメインからの残基での接触によって媒介される高特異性をもって抗原に結合できる(6)。2つのVドメインの詳細な寄与は、個々のAb抗原複合体で変化する。しかし、VHドメインは、いくらかより高いレベルで寄与する可能性がある。それは、CDRH3がCDRL3と比較してシークエンスが、より長くより可変的である傾向があるためである。それにもかかわらず、VHドメインは「リモートコントロール」でペプチダーゼ活性に影響を及ぼすことができる。そのVHドメインに結合した、触媒的抗VIP VLドメインで構成される、Fv構造のペプチダーゼ活性で示されたように、VHドメインは、切断部位からかけ離れたVIPに対して結合して、結合部位の高次構造に影響することができるからである。VIP結合能および触媒的効率で評価されたように、触媒活性に、抗VIP VHドメインは有益な効果を及ぼし、無関係なVHドメインは有害な効果を及ぼした(6)。
【０２０８】
gp120の特異的な触媒を分離するために、我々は、ペプチジル-CRAおよびgp120-CRA全長を用いた。それぞれ、図7Cと図14に示す。これらのCRAは、エピトープ-パラトープインタフェースのところで生じる、通常の非共有結合性の結合と共有結合形成反応とを併用することにより、特異的な触媒を捕捉する。gp120(421-431)-CRAを用いて、我々は、狼瘡ファージライブラリーから特異的なgp120切断L鎖を分離した(図45)。ファージ-CRA複合体を、ストレプトアビジンカラムでトラップし、ビオチンとホスホネート部分間のジスルフィド結合を切断して溶出した。高度に精製されたL鎖標品が、金属-アフィニティークロマトグラフィーで得られた。触媒作用測定には、基質gp120(421-432)-メチルクマリンアミドを用いた[MCA;標的結合は、gp120(421-431)-CRAのホスホネート部分に位置するLys432-MCAである]。アミノメチルクマリン放出を、蛍光定量的に測定した(7)。1つのL鎖が触媒活性を発現した。ビオチン化gp120を用いた電気泳動による触媒作用測定で、このL鎖も、gp120全長を切断したことが示された(図45)。特異性は、同時に調べた無関係なポリペプチドの切断の欠如により示された(アルブミン(EGFRの細胞外ドメイン)。予期されたように、L鎖は、共有結合でgp120-(421-431)-CRA結合する能力を示した。CRA部分を欠いた合成gp120(421-436)がペプチジルCRAの共有結合を阻害したことは、その活性化された求核基が、非共有結合認識を担っている部位の近くに位置していることを示唆している。
【０２０９】
タンパク質分解性の活性をL鎖に帰することは(微量の混入物に由来するためではなく)、非特異性のタンパク質分解性の活性の欠如および、ファージ選択に用いるCRA構造から予測される正しいエピトープ特異性の発現並びに、gp120(421-431)-CRAに対する特異的な共有結合の発現によって支持される。すでに、我々は、突然変異誘発および、免疫化学的試験によって、別の抗原(VIP)に対する、同様に精製された触媒的scFvおよびL鎖クローンの触媒活性を確認している(9)。
【０２１０】
同様の研究を、ファージ選択方法で、多少変異した狼瘡scFvフラグメントを分離するために、全長gp120-CRAを用いて実施した。すなわち、gp120-CRAと結合したファージを捕捉するための不固定抗ビオチンAbを使用し、それに続くファージを溶出する低pH溶出ステップである。結合したファージ画分から得られた24個の精製されたscFvフラグメントを、電気泳動にかけてビオチン化されたgp120の切断についてスクリーニングした。触媒的scFv8クローンが確認された(図46に、2scFvクローンでのgp120切断を示す)。同時にスクリーニングした、複数の同様に調製したscFvクローンは、gp120切断活性を欠いていた。これらのscFvとL鎖クローンは、HIV-1感染の免疫療法のための潜在的試薬である。
【０２１１】
参考文献
2007524601.tif 000027
【実施例９】
【０２１２】
改善した抗HIV-1の構築
望みの触媒活性をもつ抗HIV Abフラグメントが得られたなら、標準抗体工学法に基づいて改善されることができる。治療グレードのAb構築物の可能性は、ワクチン接種を受けていない対象から調製したファージライブラリーを用いて、腫瘍壊死因子に対するヒトscFv構築物の開発よって裏付けられる。IgG全長として再クローンした、この構築物は、関節リウマチの治療薬として最近承認された(1)。
【０２１３】
先に述べたように、gpl20切断のレベルをモニターすることは、操作した抗体フラグメント活性に関して、改善の判定に役立つ方法である。さらに、HIV中和試験が、クローンの活性が改善されたことを確認するために実行された。
【０２１４】
ドメイン連鎖と増大:効力の増進が、1価のscFvクローンを2価のIgGとして再クローニングすることにより認められた。1価のFabのIgGバージョンは、亢進した結合アビディティにより、400倍高い中和力を示すことがすでに報告されている(2)。IgM Abとして1価のscFvが、10価で発現すればHIV-1 結合アビディティを、さらに増加させることになる。一つの重要な要素は、抗体全長に対するscFvおよびFabフラグメントの薬物動態である。scFv構築物の半減期は、通常は時間のオーダーであるが、IgGおよびIgM Abの半減期は、それぞれ、数週間から数日間まで延びる。したがって、抗原の持続的な中和を達成するために、好ましい試剤は全長のAbである。他方、より小さいscFv構築物が、全長のAbより優れた組織浸透機能を現わす可能性がある。例えば、HIV免疫療法を意図したscFv構築物は、全長の抗体より効率的に、組織のウイルス供給源に浸透する。
【０２１５】
不変領域は、Abに特定のエフェクター機能をもたらす。例えば、補体結合能および、Ab依存性細胞障害活性媒介能並びに、抗原提示細胞上で発現するFcレセプターとの結合能があげられる。そのうえ、IgA抗体としてscFvを再クローニングすると、IgA抗体は上皮表面を通過することができるので、粘膜液中でHIV-1に対して防御を可能にする。
【０２１６】
哺乳動物細胞発現ベクターへの再クローニングにより、全長の抗体がscFv構築物から得られる。ベクターは、望む抗体クラスおよび、サブクラスの不変領域をコードするcDNAを含んでいる(3)。IgGlおよびIgM構築物としてのscFvの再クローニングは、標準方法論より達成される(4)。ベクターは、Lonza等から市販されている。ベクターは、異種Vドメイン挿入用の制限酵素認識部位が側面に位置するヒトAb不変領域を含んでいる。VLとVHドメインcDNAは、ベクター中に存在する適切な制限酵素認識部位を持つバック/フォワードプライマーを用いて、pHEN2プラスミドDNAから増幅される。scFvのVLドメインは、ベクターのκ不変領域の5'側に、そしてVHドメインは適切なH鎖ドメインの5'側にクローニングされた(例えば、γ1、αおよびμ不変領域)。ベクターは、選択するために抗生物質耐性遺伝子を含んでいる。安定なトランスフェクタントが、CHO細胞または別の哺乳類の培養細胞株で調製される(Ab収率、5〜30のμg/ml))。不固定タンパク質G、抗IgAおよび抗IgM Abを用いて、IgG、IgAおよびIgMが精製される。
【０２１７】
scFvの多量体形成により、HIV-I認識の高まった結合活性も得られる。例えば、scFv構築物のC末端に、GNC4タンパク質由来の33-アミノ酸自動集合性ペプチドを配置することにより、四価の抗体フラグメントが生成される(5)。このペプチドは、非共有結合的に4-ヘリックス束状構造に会合し、このホモテトラマーによって多数の結合価を発現できるようになる。多価の結合(結合アビディティ)の総合的結合力は、個々の結合部位に関する結合力の合計よりかなり大きいので、事実上不可逆的な結合が、これらの手段より得られる。リンカー法が、二重特異性抗体、すなわち、異なる抗原特異性をもつ2つのscFv成分から成る抗体を生成するためにも適用できる。この場合、目標は2つの異なる抗原を標的にすることである。例えば、トランスフェリンレセプターおよびCD3に向けられた二重特異性の構築物は、トランスフェリンレセプターを発現するCD3+T細胞の細胞溶解を導くことが明らかになった。
【０２１８】
in vitroでの親和性亢進。
【０２１９】
改善された触媒活性をもつAbフラグメントを得るために、突然変異誘発性プライマーを用いて、突然変異をCDRに導入する。実施例VIIIで示すように、ファージの表面で変異体分子を発現させて、ファージを共有結合でCRAに結合させるようにした。各サイクルで、さらに突然変異を導入後、抗原結合によりファージを分離する過程が数回繰り返される。ワクチン接種を受けていないヒト提供者で発現するscFvレパートリーを出発物質として、1010〜1011M-1(Ka)の強度の結合能をもつ抗原特異性のscFvクローンが得られた。VLとVHドメインの6つのCDRは、約100個のアミノ酸を含んでいる。20個の天然アミノ酸それぞれの残基で広範囲に変異した抗体の研究は、結果として大きな変異体ライブラリーを生じるため実際的でない(約10020クローン)。CDRH3での抗原接触面は、抗原-抗体相互作用で特異性を与えると考えられるため、VHドメインのCDR3が、突然変異を導入するために多くの場合選択される。VH CDR3の構造を最適化すると、抗原結合特性が改善することを、いくつかのグループが報告している(6-9)。この戦略に基づく改善されたH1V-1認識の実例が続く。
【０２２０】
他のグループがすでに記載しているように、望みのCDRで変異体を作成するために、CDRウォーキング突然変異誘発方法(walking mutagenesis procedures)が使用される(6,7)。
【０２２１】
約108クローンより大きいファージライブラリーを用いることは実際的でない(ファージ溶解度とトランスフェクションよりもたらされる制約のため)ので、突然変異誘発は、段階的な様式で実施される。例えば、CDR残基の5つのN末端が、最初にランダム化されそして、先に述べたように、生じたファージライブラリー(ライブラリー1)が、gp120(または全HIV)に対する結合に関して選ばれる。それから、次の5つの残基をランダム化し(ライブラリー2)、そして抗原結合選択を再び続ける。完全なCDRに及ぶまで、この過程は繰り返される。この過程で、gp120切断とHIV-l中和特性の最適化が成し遂げられる。生じたscFv構築物のVLと VHドメイン配列を決定し、操作したクローンの改善された生物活性をもつVドメインの突然変異を同定するために、この配列を元のscFvクローンと比較した。
【０２２２】
上述の戦略に加えて、結合能を改善するために合理的根拠に基づき、好ましい突然変異を、Vドメインに導入することもできる(最近の例、参考文献10)。特に抗原抗体複合体に関する構造情報が利用できる場合には可能である。例えば、突然変異誘発にふさわしい候補アミノ酸を、分子モデリングまたはX線結晶学情報により同定できる。抗体Vドメインの分子モデリングを、組み合わせた相同性と最初からアルゴリズムを用いて実施した。ペプチド骨格トポグラフィー追跡用の、高い適中率をもつコンピュータープログラムが作成されたが、側鎖の位置は予測するのがより困難である。モデリングは、最大の配列相同性をもつデータベースのFab/Fv構造の同定から開始した。FRs、VL CDR1-3およびVH CDR1-2に関する極限構造が利用できる。最大の変動性の領域(特にVH CDR3ループ構造)は、適切な力場下で反復的にエネルギーが最小化される。有利な変異誘発に適した候補残基を同定するために、リガンドを仮定の結合部位に配置することができる。例えば、アダクト的な静電気的安定化相互作用を導入する手段として、小型中性アミノ酸と類似した大きさの荷電残基との置換を試すことができる。
【０２２３】
VL-VHハイブリッド形成
scFvクローンに加え、触媒活性を示す狼瘡ライブラリーからのL鎖クローンを、工学方法により改善に利用できる。VLおよびVHドメインで形成される本来の結合部位と比べ、結合能の減少にもかかわらず、Ab Vドメインは、互いに独立して抗原を認識することができる。適切なVHライブラリーから適合性のVHドメインを探索して、抗HIV L鎖で構成される個々のVLドメインの結合活性が改善される。このアプローチの可能性が、以下の考察により示唆される:(a)VLおよびVHドメインは独立して抗原と結合でき(11、12)、VHドメインは抗原結合特異性の全体に大きく貢献している(13)。これの例は、L鎖を認識しているVIPと、その相手方VHドメインの組合せによる、抗原VIPの認識の改善である(14)。
【０２２４】
既定のgp120認識活性をもつAbからの個々のVHドメイン、例えば抗体クローンS 1-1 (15)またはb12(16)は、狼瘡VLドメインの相手として利用できる。あるいは、適合性のVL-VH分子境界面(すなわち、機能的触媒部位を形成するために充分に空間的に近接したCDRを持つ境界面)を形成可能な、適切なVHドメインを見いだす確率を増加させるために、VHドメインのライブラリーが利用される。それから、最も有利な対になるVL-VHドメインが、ファージが全組合せの少数であってもファージ選択法で同定される。適切なVHドメイン供与源は、大量の特異的抗gp120抗体を産生するHIV-1感染者である。VHドメインの別の都合のよい供与源は、ヒト抗体を発現するgp120または、合成gp120(421-436)で免疫されたトランスジェニックマウスである。例えば、Abgenix社作成のXenomouseTMマウスがある。担体タンパク質抱合gp120または、合成gp120(421-436)の投与による、これらマウスの免疫方法をすでに我々は示している(17)。HIV感染者由来のscFvライブラリーの標品および、トランスジェニックマウスは基本的には以前に示したとおりである(18)。scFvを発現しているファージを従来通り、gp120または合成gp120(421-436)で選択し、VHドメインの供与源としてscFvクローンを回収する。これらのscFvクローン由来のかなりのVHドメインは、それぞれgp120を認識すると予想できる。これは非共有結合性の抗原認識に、VHドメインは、大きく寄与するという研究で示唆されている。このようなVHドメインは狼瘡患者から分離される抗HIV L鎖の相手として適している。
【０２２５】
ハイブリッドscFvを作成する方法は、我々の研究室で実施されている(18)。基本的には、scFv構築物を含むpHEN2ベクターへのクローニングに必要な適切な制限酵素認識部位を持つプライマーを用いて、VL cDNAのcDNAはベクターから増幅される。リンカー配列は、ベクター中に含まれている。制限消化法で内在のVLドメインcDNAを除去した後、望みのVLドメインをベクターに結合した。前述のパラグラフのように、選ばれたファージDNA由来のVHドメイン(HIV-1感染者およびトランスジェニックマウス由来)がベクターに結合され、ハイブリッドscFvファージはパッケージされる。ハイブリッドscFvを発現しているハイブリッドファージを、CRAで選択し、適切なgp120抗原標品の切断をスクリーニングした。この戦略の成功は、増強したgp120切断活性および、元のL鎖と比較したscFvクローンのHIV-I中和活性に反映される。
【０２２６】
VL-VH配向性:
必要ならば、scFvでVドメインの配向性を変える。scFv結合を検討している一部のグループは、いずれの配向(VH-VLまたはVL-VH)でも、scFvの抗原結合能力に有意差を見いだしていない[19、20]。簡潔には、5'位置で結合可能なSfi IおよびXho I制限酵素認識部位をもつVHを、PCRで増幅するために、オリゴヌクレオチドプライマを合成する。同様に、リンカーの3'をApa LIおよびNot I部位に連結用のVLを増幅するために合成する。その配向の両方で、scFvが精製されて、gp120切断とHIV中和に関して調べられた。
【０２２７】
リンカー効果:
以前に述べたように、scFv構築物は、分子間の会合を起こすことができる(21-23)。このような効果を測定するために、scFvをゲル濾過カラムで解析する。それぞれの多量体種に対応するピークを、標準タンパク質の保持時間との比較で同定し、モノマーで凝集状態で存在するscFvの比率を算出する。ELISA検査を、可溶性scFv濃度の関数として実施し、そしてこの結果を凝集現象の濃度依存性と比較した。リンカーペプチドの長さと構成が重要な効果を及ぼし得る。リンカーの最適化は、例えば、リンカー配列をランダム化して実行でき、続いて望む挙動を示す変異体の同定を行う。この目的に対する好ましい戦略の一例が以下に実施される。リンカーの柔軟性を保つことが必要なため、リンカーにグリシンを維持し、リンカー位置2、7、12および15のセリンを、Tangらのランダム化方法の変法を用いて全20アミノ酸で置換する(24)。これは、種々のVL-VH界面相互作用を与える効果があり、そのいくつかは凝集効果を減し、機能的挙動を改善する。簡潔に述べると、オリゴ5'末端にNco I制限酵素認識部位および、3'末端にXho I部位をもつオリゴヌクレオチドを、セリン2、7、12および15に対応するコドンがランダム化され全20アミノ酸が取込めるように合成する。このリンカーライブラリーの多様性は、3.2x 106である。Xho I部位をもつプライマーの3'末端とハイブリダイズする相補的なアンチセンス15マー(15-mer)を、二重鎖リンカーを作成するために用いた。この突然変異を誘発したリンカーライブラリーを、Sl-1 VLおよびVHを持つpHEN2に結合し、ファージ生成後、TG-1細胞を形質転換するために用いる。適切なgp120または合成gp120 CRAの共有結合に関して、リンカーライブラリーの選択を行い、従来通り、HIV中和に関するスクリーニングを実施して、最良の変異株を同定する。
【０２２８】
参考文献
2007524601.tif 000028
2007524601.tif 000029
【実施例１０】
【０２２９】
共有結合および触媒的生産に関するβ-アミロイド-CRAおよびβ-アミロイド-CRAWs
我々は、最近アミロイド-βペプチド1-40を切断する、はっきりと特徴付けられた触媒的なAb L鎖(IgL)を記述する研究を発表した(Aβ1〜40;参考文献1)。これらのIgLのうちの1つ(マウスのクローンc23.5)は、単一ペプチド結合Lysl6-Leul7でAβI-40を切断する。これは、前述した塩基性残基のC末端側で最も選択される切断と一致している(2)。別のIgL(ヒトクローンhkl4)は、Aβ1〜40の凝集状態に明らかに依存するさらに複雑な切断パターンを示した。高濃度のAβ1〜40で(1mM)、1残基だけ長さが異なるいくつかのペプチド断片が作成された。これはいくつかのペプチド結合で切断に結びつく、一連のエキソペプチダーゼ様反応を示唆している。遥かに低いAβ1〜40濃度で(100μM)、IgL hk14は単一のペプチド結合、His 14-Gln15結合を切断した(図47)。これは残基1〜14および15〜40に対応する、2つのペプチド断片が検出され明白である(ESI-質量分析で測定した)。IgLが存在しない場合、バックグラウンドのAβ1〜40切断は検出されなかった。切断特異性の違いは、種々の濃度下において、種々の立体配置状態でペプチドが採用する異なる高次構造に起因している。
【０２３０】
Aβ1〜42はAβ1〜40より速やかに凝集し、毒性が増大する。Aβ1〜42(100μM)をIgL hkl4とインキュベーション(24時間)後、HPLCでの分析で、図47のようなAβ1〜42ペプチドの切断を示唆するAβ1〜14フラグメント(11.8min)の出現が認められた。
【０２３１】
IgLは、セリンプロテアーゼのメカニズムを基礎にしたプローブであるハプテンCRAと、共有結合した(3)。これらの観察は自然免疫レパートリー中に、Aβペプチドを無差別に切断するAbが見出されることを示している。特異的Aβペプチド切断Abは、アルツハイマー病の免疫療法に対する候補試薬である。Aβ1〜42-CRAの免疫により特異性が改善したAbおよび、共有結合反応性増進並びに、触媒活性の向上が得られる。この目的に役立つCRAおよびCRAWsの実施例を、図48に示す(Aβ1〜42-CRA 1〜3、Aβ1〜42-CRAW 4)。Aβ1〜42-CRA 1〜3を用いる免疫の理論的根拠は、発明の詳細な説明に記載している。我々の以前の研究において、求核反応性の強さはタンパク質分解活性と相関するが、速度-限界も、抗原への求核攻撃より形成されるアシル-Ab中間体の遅い処理に起因することが示された。したがって、アシル-Ab中間体への水の攻撃を容易にするよう設計したAβ1〜42-CRAW 4に、新機能が組み込まれている。このCRAは、金属-水錯体を含み、その目的は、求核性部位の近傍へ水分子を収容できるAb活性部位を誘導することである。[Abの求核基が反応に利用できるため、メタロプロテアーゼのメカニズムに類似した水分子の求核性の活性化の必要がないことに注目すべきである。むしろ、我々の目的は、水を活性部位に拡散させるセリンプロテアーゼAbを誘導することである]。以前の結晶学的研究は、Ab活性部位で水分子が不足していることを示唆し、水を含むAbの意図した設計を正当化している。Aβ1〜42-CRAW 4による水の結合は、金属入りの溶液中で、すなわち、Cu2+およびNi2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+、Ca2+等の塩類液中での最初の処理で完了した。CRAのHis4は、水の結合にまだ利用できる特定の配位結合価をもつ金属イオンをキレート化するように設計されている[参考文献4に記載されている]。Aβ1〜42-CRAW 4による金属結合は、原子吸光分析で実験的に測定し、複合体の含水量は、元素分析で測定した。X線結晶構造解析は、含水量を測定するための他の方法である。免疫応答を最大にするため、CRA/CRAWをN末端のCys残基で担体タンパク質(KLH)に結合させた(これは、T細胞エピトープの供与源となる)。標準免疫法を、Ab合成誘導に使用した。CRA/CRAWで過剰免疫したマウスから血液を集め、抗AβAb応答を測定した。MAbを調製するために脾臓を得た。IgGおよびIgMをそれぞれ、タンパク質G-セファロースおよび抗IgMセファロースを用いて、血清から電気泳動的に均質になるまで精製した。以下の測定を実施した:
(a)免疫原の全結合および共有結合(Aβ1〜42-CRA 1-3)それぞれELISAおよびSDS-電気泳動法による;
(b)RP-HPLCによるAβ1〜42の切断;および
(c)N2a細胞培養に対するAβ1〜42毒性の中和。
【０２３２】
共有結合研究の目的は、特異的求核性のAb応答の誘導を確定することである(ハプテンCRAと比較してAβ1〜42-CRAの優れた共有結合で示される)。触媒作用の研究で、Aβ1〜42に対する求核性の活性および特異性だけでなく、反応の次ステップすなわち、アシル-Ab中間体の加水分解と生成物の放出をも容易にする、Abを同定する。最初の研究を、免疫したマウスからのプールしたIgGを用いて実施した。活性レベルが分かれば、応答の再現性の確認のため、反復実験を、個々のマウス由来のIgGを用いて実施する。100μlの血清からのIgG/IgMの収量は、0.2μM Abで約100回の反応を実施するのに充分な量である。対照には、免疫前のIgG;無関係なペプチド-CRA(例えばVIP-CRA)に基づく共有結合の測定;ホスホネートグループを欠くAβ1〜42によるAβ1〜42-CRA結合の阻害;Aβ1〜42-CRAによるAβ1〜42切断の阻害が含まれる。Abタンパク質分解活性は、Fab活性の測定および免疫吸着Abで確認した。さらに、Ab:Aβ1〜42-CRA反応混合物を透析して遊離のCRAを除去後、N2A細胞に対する、Aβ1〜42媒介毒性の中和能力を検討した。これは、Ab中和活性がAb結合部位により媒介されることを示すのに役立つ。
【０２３３】
Abの求核性の改善は、非共有結合性のAb応答の成熟について観察される同じ速度論に従わない。これは、共有結合したBCR-免疫原結合またはT細胞応答での変化に起因する、接種スケジュール後期での、B細胞のダウンレギュレーションに起因しうる。したがって、接種スケジュールにわたり時間の関数として、触媒的なAbの出現を注意深く測定することが重要である。したがって、免疫原投与のタイミングはAb応答を最適化するため変える(例えば2週間の代わりに4週間)ことができる。また、Aβ1〜42-CRAを、求電子性のグループを欠く通常のAβ1〜42と、交互に投与するかまたは、まず最初にAβ1〜42に対する通常の免疫応答を確立後、求核基の適応性成熟の誘導のために、Aβ1〜42-CRAを投与できる。
【０２３４】
標準的方法で、我々は以前の研究と同様にハイブリドーマを作製した(5,6)。ハイブリドーマ上清の一次スクリーニングは、Aβ1〜42切断の測定である。タンパク質分解を直接スクリーニングすることが、タンパク質分解性のAbを検出するために重要である。高親和性と高回転率でAβと結合する、そのようなタンパク質分解性の抗体の精製は見つからないであろう。それは、これらが不固定基質Aβ1〜42を破壊するからである。触媒作用の直接的スクリーニングを可能にするため、我々は、96ウェルプレート中のハイブリドーマ上清に存在するIgGおよびIgM Abの、迅速な捕捉と溶出を行う高速大量処理法を開発した。それぞれ、タンパク質Gおよび抗IgMビーズを用いてIgGとIgMを捕捉した。そして低pH溶出液を96ウェルアッセイに捕集し、次に基質と共にインキュベートした。オートサンプラー附き高速液体クロマトグラフィーで、約50試料/日のAβ1〜42切断がスクリーニング可能である。二次的なスクリーニングを、電気泳動後のAβ1〜42の共有結合について実施する。ここでもまた、比較的に高速大量処理が実施されている(12 gels/run; 24 wells/gelを収容する電気泳動装置を使用)。このスクリーニングで、触媒活性予測因子である最大の求核性をもつAbを同定する。しかし、数種の普通の酵素に関して報告されているように、一部のAbは、ホスホナターゼ(phosphonatase)活性を発現する可能性がある(7)。その場合は、共有結合型錯体は加水分解され、結合は見つけられないであろう。したがって、Aβ1〜42切断分析に頼るのが、一次スクリーニングとして望ましい。Aβに対して最強のタンパク質分解性活性を示す抗AβAbを、N2Aで、そのAβ1-41の毒性阻害能力を試験する。これらの分析の対照には、非交差反応の抗VIPハイブリドーマ培養液上清が含まれる。
【０２３５】
実験的に測定されるAbの重要な特質は:
(a)HPLCで測定される切断サイト特異性、および、質量分析/N末端配列決定;
(b)一連の無関係なポリペプチド基質と共に、Aβオリゴマー、モノマーおよび、フィブリルの加水分解を調べて測定される抗原特異性;
(c)様々な反応物濃度で測定される速度論的パラメーター(Kcat; Km);
(d)野生型N2A細胞および、トランスフェクタントで発現するアミロイド前駆体タンパク質を用いて測定される、タンパク質分解性および、対照の非タンパク質分解性AbのAβペプチド中和活性。
【０２３６】
CRA免疫原は、タンパク質分解性Ab合成における生理的拘束を回避するように設計されている。このアプローチで、求核性と特異性の特性は、CRAの構造成分によりAb活性部位にプログラムされている。普通のセリンプロテアーゼの活性部位には、十分な水が存在するがしかし、Ab結合部位では抗原が密充填され、水の排除が生じ、アシル-Ab中間体の強制的加水分解が生じる(脱アシルステップ)。したがって我々は、水1分子を収容することができるAbを誘導するために、CRA中に水結合部位を入れた。必要に応じて、リンカー長と柔軟性を変更して、そしてオキシ陰イオン(oxyanion)(ジエステルの代わりにホスホネートモノエステル、詳細は参考文献48参照)を含めて、CRA構造をさらに最適化できる。これにより、さらにAb接触反応速度定数を改善できる。種々の置換基に起因するAβ1〜42抗原構造の混乱は、その位置の変更、例えばリジンNH2基の代わりに酸性側鎖、で緩和できる。
【０２３７】
我々の以前の研究では、CRA-免疫マウスの死亡率または罹患率の顕著な増加は無く、また投与部位に見られる所性反応の徴候もなかった。セリンプロテアーゼおよびセリンエステラーゼの全身性のCRA阻害は有害な可能性があるが、必要なペプチドCRAはごく少量なので、この懸念の大部分は緩和される。通常の酵素より4〜6ログオーダー低い濃度のAbが、ペプチドCRAと結合することが示されたことがその理由である。
【０２３８】
Aβ毒性作用の中和は、Abの期待した特質であった。切断反応がペプチドのC末端領域に向かって生じるかまたは、Aβ1〜42が多数のペプチド結合で切断された場合、この可能性はありそうである。例えば、エキソペプチダーゼ様の反応が、IgLクローンhk14を用いて観察された。以前に、我々もMAbにより、多数のペプチド結合でgp120およびVIPが切断されることを観察した(5、8)。切断反応により、それ自体神経毒でないフラグメントが放出される場合には、たとえAbエピトープ特異性が通常のMAbのものと異なっていても、タンパク質分解性Abに媒介される、Aβ毒性に対する防御が達成される場合がある。抗原特異性が維持される限り、中和反応は触媒反応に基づくので、結合性はタンパク質分解性Abに関してあまり問題でない。過剰なAβ濃度(濃度>>Km)で、代謝回転1.0/分のタンパク質分解性IgG分子の中和能力は、化学量論的にAβに結合するIgG分子で、28,800倍大きく算出される可能性がある(生体内でt1/220日と仮定;1×60×24×20)。IgM Abでは、循環でのt1/2は約3日である。しかし、我々の予備的研究では、IgM Abの不変領域構造が、IgGより優れた接触反応に寄与することを示唆している(9)。このAbクラスは、特異的な抗原認識に導く親和性成熟を受けるので、特異的なIgM Abの産生は問題ではない。IgMは、IgGより分子量が大きいが、周辺のAβが減少すると脳からAβが出て行く可能性があるため、CNS中へのAbの流入は、脳中のAβ量を減らすことには必ずしも必要ではない。
【０２３９】
高い代謝回転触媒を同定する他の方法は、Aβ-CRAでラベルした求核性のB細胞をフローサイトメトリーで選別後、ハイブリドーマ法を適用するものである。
【０２４０】
マウスMAbは、受動免疫療法に理想的なものではない(抗Ab反応が生じる恐れがあるため)。
【０２４１】
しかし、現在の目的で開発された方法は、ヒトAb遺伝子座を発現しているトランスジェニックマウスからヒトAbを得るために容易に適用できる(10)。これらのマウスは、種々の抗原に対して強力で高い親和性をもつヒトAb応答を引き起こすことが示されている。同様に、ヒトリンパ球で再構成したSCIDマウスは、ヒトのAb応答を行うことができる。最後に、分子工学技術をヒト化マウスAbに利用でき、これは、ヒトAb不変領域の骨格にマウスのVドメインをつなぎ合わせたのち、ヒト抗マウスIg応答を低減するマウスのVドメインでの置換からなる。分子モデリングまたは結晶構造に従うと、抗原が接触する残基は保守されている。したがって、Aβペプチドにヒトおよび、ヒト化タンパク質分解性Abを得る上での克服しがたい困難はない。
【０２４２】
参考文献
2007524601.tif 000030
2007524601.tif 000031
【実施例１１】
【０２４３】
触媒抗体産生に関する変異体VIP-CRA構造およびB細胞欠損宿主の使用
VIP-CRA構造
VIP-CRAの合成および特性は、実施例3に記載されている。図49に示したホスホネートエステルVIP-CRAに加えて、カルボニルpCRAも有益である。その理由は、カルボニルpCRAのより長い半減期およびAbによるペプチド結合切断におけるカルボニル反応中心を巧みにシミュレーションすることによる。カルボニルVIP-CRAの例を図49に示す。この化合物の構造は、アミジノフェニルピルベートは、ホスホネートCRAのものと類似のセリンプロテアーゼ(1、2)と共有結合複合体を作るという報告に基づいている。アミジノ成分は、Lys/Argを模倣するもので、多くの触媒的Abの切断特異性に対応している。
【０２４４】
ホスホネートVIP-CRAの重要な要素は:(a)Abパラトープへの非共有結合を可能にするペプチド性構造、;(b)リンの化学反応性のレベルを決定し、そしてモノエステルの場合は、非エステル型酸素の負電荷の発現を可能にする1つの(モノエステル)または2つの脱離基(ジエステル);そして(c)正荷電のアミジノ基である。担体タンパク質への抱合に関する、ビオチンおよびアミノ酸がN末端で組み込まれている。速度定数k3(図7)は、リン原子の共有結合的反応性に依存する。異なるk3数値をもつCRAは、異なる目的に有用である。Abの急速で完全な阻害が、反応性の高い大きいk3値をもつCRAで達成できる。共有結合性の弱いCRA(低いk3)は、弱い求核基で反応せずに、強いAb求核基と反応する。弱い共有結合性は、永続的なBCR関与によりB細胞免疫寛容化の可能性を制限するため、触媒的Ab合成を促進する可能性もある。図7の反応スキームで、AbとVIPの可逆的結合を完全に模倣するVIP-CRAは、VIPのKdに相当する平衡定数Ki(k2/kl)をもつ。さらに、負に荷電するモノエステルCRAが、遷移状態の非共有結合的反応性を模倣するため、Kiは、遷移状態の結合エネルギーのある種の成分を反映する。
【０２４５】
VIP-CRA 4は、抗VIP Abと選択的に結合することが観察された(実施例3を参照)。VIP-CRA 3および5の合成は、基本的には4と同様に実施した。VIP-CRAB 1を合成するために、C末端にホスホネートジエステル残基をもつ保護されたペプチドVIP 1-19を、水性炭酸水素ナトリウムで処理してモノエステルを与えた。このペプチジルホスホネートモノエステルを、N末端グリコール酸残基をもつC末端ペプチド断片に結合し(3)、生成物を無水TFAで処理した。VIP-CRA 2は、C末端ホスホネートモノメチルエステルをもつペプチド断片を用いて、類似した戦略に基づいて作成した。生成物をHPLCで精製し、質量分析で特性を決定した。VIP-CRA 1および2に類似したペプチジルCRAの調製とAb反応性が、我々のグループにより記録された(4)。VIP-CRA 3-5には、VIPの3つのリジン残基NH2側鎖に位置するホスホネートジエステルがある。ピルボイルVIP-CRAは、3と構造的に類似している。VIP-CRA 1-3の構造は、その共有結合的反応性グループが、ペプチド骨格とは見当はずれな方向を向いているという点で従来の戦略から逸脱している。合成での主要な陥穽は、予想外のグループでの副反応である。この点は、適切な保護基を用いたことにより最小化される。ピルボイルVIP-CRAの調製は難しい。それはピルビン酸のカルボキシルとリジン側鎖アミン間での必要な反応が、VIP-CRA4の類似反応とよく似て進行するためである。
【０２４６】
これらのpCRAの研究で、Ab求核基によって享受される柔軟性の検討が可能になる。VIP-CRA1および2は、Lys20の骨格中に位置するホスホネートグループをもつVIPの全配列を含んでいる。共有結合性の反応位置から離れた構造要素が関与する場合,ホスホネートの両側面にペプチドが存在することは、非共有結合的パラトープ-エピトープ相互作用を捕捉し、延びた遷移状態を模倣するのに望ましい(5;遷移状態で遠隔性の構造変化は可能である。それは遷移状態で、一重結合特性が生じたとき、C-N結合の回りの自由回転が、遠隔構造要素の移動を可能にするためである)。ホスホネートのC末端側のVIP領域(残基22-28)が、Ab-VIP認識で重要なエネルギーに貢献することが示唆されている(6)。
【０２４７】
利用可能なVIP特異的Abを用いて、VIP-CRAがAb認識可能エピトープを発現していることを確認する。ペプチジルエピトープでの非共有結合によって、他のタンパク質(非特異的なAb、セリンプロテアーゼ、セリンエステラーゼ)と比べ、特異的Abによる優れたVIP-CRA結合が可能となる。全てのVIP-CRAを、共有結合に対して検討した:(a)特異的なVIPアーゼ活性をもつ触媒的なAbのパネル(MAb c23.5とc23.4 IgG;狼瘡単鎖FvクローンDM506;ポリクローナル血清IgGコード39、80および5960;参考文献7);(b)非免疫Ab、可能な場合は適合したアイソタイプ(MAb UPC 10、RPC5;狼瘡FvクローンDM302;VIPアーゼまたはVIP結合活性のないポリクローナルヒトIgG);および(c)市販のセリンプロテアーゼ(トリプシン、トロンビン、サブチリシン)。アッセイは、適切な濃度の精製AbをVIP-CRAとインキュベートした後、SDS-電気泳動、ゲルのブロッティング、そしてストレプトアビジンペルオキシダーゼおよび化学発光の基質を用いて、ビオチンを含むバンドの視覚化(IgGに関しては約153kD;Fvに関しては約30kD)から構成されている。対照には、過剰DFP(求核基への結合での競合)または過剰VIP(非共有結合性の競争物)の存在下での反応が含まれる。
【０２４８】
触媒的なAb産生
機能障害を起こしたB細胞シグナル伝達が、自己免疫性疾患において、増幅された触媒的Ab生産の根底にひそむ理由のようである。したがって、B細胞膜貫通シグナル伝達で、特定の欠陥を発現するトランスジェニックマウスが、回転率の高い触媒的Abを産生するであろう。特に、増進したシグナル伝達を発現するマウスは、このために役立つ、例えばCD19トランスジェニックマウスである。CD19は、チロシンキナーゼ媒介経路を通してBCRシグナル伝達する。CD19-過剰発現および、CD19ノックアウトマウスでの、加速および減速されたBCRシグナルが報告されている(8)。これらのマウスはそれぞれ、抗原刺激に減衰された、および増幅された応答を示す。そして、自己抗体レベルの変動が明らかでもある(8)。適切な遺伝的背景をもつマウスが、対照となる(CD95-欠損マウスおよびC3H/++対照、Jackson Labs)。破壊したCD19遺伝子をもつホモ接合性マウスからのB細胞は、通常、免疫応答性である。しかし、B-1細胞数は減少して、T依存性抗原への反応はいくぶん可変的である(9)。これは、T-B細胞相互作用の欠陥というよりは,むしろBCRシグナル伝達の内因性欠陥に起因する(10)。必要に応じてLynおよびCD22欠損マウスが利用できる。例えば[Lyn:抗IgMAbと架橋したBCRにより活性化されたSrcチロシンキナーゼ;CD22、シグナル伝達のアダプタタンパク質]。
【０２４９】
VIP-CRAによる過剰免疫後、CD19を過剰発現しているマウス、CD19欠損マウス[C57B1/6背景]および実施例3で示したこれらの野生型対照(それぞれn=10)由来のポリクローナルAbのタンパク質分解活性を調べた。これには、方程式[v = Kcat[Ag]/Km+[Ag]; v、速度; KmほぼKd; kcat、最大速度] およびVIP-CRAに対する共有結合に適合した速度データからの速度論的パラメーターの決定も含まれる。これらのマウスの応答は非常に用量依存性であるため、種々の免疫原投与量で反複して免疫する必要がある(9)。前述したようにMAbは、野生型対照と較べ、VIP切断Ab反応で大きな違いを示すマウス系統から作成される。
【０２５０】
VIP-CRAによる免疫は、低Km、高Kcat Abを産生すると期待される。モノエステルVLP-CRAでの免疫は、このペプチドがオキシ陰イオン安定化と求核反応性を組み合わせたAb産生を促進する可能性があるため興味深い。モノエステルの、より弱い共有結合反応性は、細胞のアポトーシスを促進することもある、永続的なBCRの関わりを回避するのに有益な場合がある。VIP-CRA 1および2に対するAbは、Lys20-Lys21でVIPを切断する。VIP-CRA 3-5のホスホネート部分は、ペプチドの骨格ではなくリジン側鎖に位置する。このようなCRAを用いた免疫実験は、活性部位の柔軟性の試験として役に立つ。なぜなら側鎖基を認識するために作成された柔軟性を欠くAb求核基は、ペプチド骨格と一致して入り込むことができないからである。カルボニルVIP-CRAは、高Kcatで特異的なAbを誘発するはずであり、内因性のCRAが、自己免疫疾患における、タンパク質分解性Ab生産の刺激免疫原になるという仮説を支持している。[自己免疫疾患では、反応性のカルボニル化合物が高濃度で生じる(タンパク質グリケーション産物、脂質過酸化産物)]。CD19を過剰発現するB細胞が抗原刺激されたBCRシグナルを、正常B細胞より効率的に伝達するので、これらはクローン消失の危険を冒すことなく、優れた触媒活性をもつAbを発現するはずである。
【０２５１】
参考文献
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【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【０２５２】
なお、図面において、図７〜13は実施例１に関わる図、図14〜19は実施例2に関わる図、図20〜23は実施例3に関わる図、図24〜31は実施例4に関わる図、図32〜38は実施例5に関わる図、図39〜43は実施例6に関わる図、図44は実施例7に関わる図、図45〜46は実施例8に関わる図、図47〜48は実施例10に関わる図、図49は実施例11に関わる図である。
【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１】セリンプロテアーゼ抗体の反応機構の図である。左側。抗体は、非共有結合状態で基底状態 (ΔGAg)にある抗原を安定化させる。活性Ser残基などの求核体はペプチド結合を攻撃し、不安定な共鳴遷移状態(TS1)を形成する。この反応が終了することによって、共有アシル-抗体中間体が形成され、C末端ペプチドフラグメントが切り離される。第二の反応では、第二のテトラヘドラル遷移状態(TS2)を介して、水分子が共有結合中間体を加水分解する。右側。この反応は前述のように進行する、ただし、部分的な共有結合を含む共鳴状態の抗原-抗体複合体(前述のTS1)は、抗原-抗体複合体の基底状態より安定している。ΔG*uncatおよびΔG*catは、無触媒反応および触媒反応の活性化エネルギーにそれぞれ対応する。Kmは基底状態の安定化の程度の関数である(ΔGS)。Kcat/Kmは、触媒-基質基底状態の複合体と比べた、遷移状態の安定化の関数である。
【図２】ポリペプチド共有結合反応性アナログ(pCRA)の図である。pCRAは、1つまたは複数のアミノ酸側鎖が求電子基(E、例えばホスホン酸エステル)と結合した、タンパク質およびポリペプチドの誘導体である。Lは、結合した求電子体Eと空間的に近接し抗体によって認識される、直鎖状または不連続な抗原エピトープ[L1-Lm]に対応する。[L1-Lm]を結ぶ点線は、抗原エピトープとして働かない、リガンド領域の短い長さまたは長い長さを表す。Eとアミノ酸側鎖の結合は直接、あるいはアダプター官能基を使用することによって実施することができ、したがってこれは、ここで示す一般的なpCRAの式中のEの要素であると考えられる。LxはEが結合するアミノ酸に対応する。Lxの典型的な例は、Lys、Asp、Glu、Cys、Ser、ThrおよびTyrである。Eとこれらのアミノ酸の結合部位の例には、-NH2、-COOH、-SHおよび-OH基がある。タンパク質は1つまたは複数の抗原エピトープを発現することができるので、pCRAは、[L1-Lm]およびEから構成される、1組または複数組の反応単位を含むことができる。
【図３】触媒抗体合成の誘導の図である。その表面上で触媒抗体を発現するB細胞を刺激することによって、クローンの発育不全がもたらされる。何故なら、生成物の放出によって、増殖を誘導するのに必要な必須の抗原刺激が細胞から奪われるからである(上部)。共有結合反応性抗原アナログは対照的に、表面の抗体と安定した方式で結合し、クローンの増殖および触媒合成細胞の成熟を刺激する。
【図４】pCRAおよびpCRAWの一般的表示の図である。これらの化合物は、求電子体を含む1つまたは複数の抗原エピトープから構成される。エピトープは、連続的または不連続なリガンド要素[L1...Lx...Lm]から構成される。L'は、求電子体を含むY-Y'-Y''単位が結合する、リガンド要素Lxの官能基である。Yは、抗体の求核基(Nu)と完全または部分的な共有結合を形成することができる、求電子原子または基である。Y'およびY''はそれぞれ、任意選択のP1亜部位および任意選択のアダプター官能基である。Y'は原子、結合または化学基であり、これはYおよびL'またはY''と結合し、Yの求電子性とは無関係にpCRAおよびpCRAWの反応性を調節する、追加的な効果を与えることができる。Y''は原子、結合または化学基であり、これはY'およびLx'と結合し、Yとエピトープの間の距離およびこれらの基の空間的位置を調節することができる。水の結合部位がY-Y'-Y''内の任意の場所に存在するとき、pCRAをpCRAWと呼ぶ。実施例1:Yはホスホン酸モノフェニルエステル基であり、抗体のNuと共有結合を形成する。Y'はエチレンアミン基であり、これはアミド結合(Y'')を介してYおよびAsp(Lx)のβ-カルボキシル基(L')と結合し、メチル側鎖を表し、Nu近くに小さな疎水性ポケットを有する抗体との共有結合を容易にすることができる。実施例2:Yはホスホン酸ジフェニルエステル基であり、抗体のNuと共有結合を形成する。Y'は(4-アミジノフェニル)メチルアミン基であり、これはYおよびスベリン酸基(Y'')と結合する。Y'の4-アミジノフェニル側鎖は、受容体とNu近くの負に荷電したポケットの共有結合を容易にすることができる。Y''の他の官能基は、Lys(Lx)のε-アミノ酸(L')と結合する。実施例3:Yはホウ酸基であり、Nuと共有結合を形成する。Y'は1-アミノ-4-グアニジノブチルアミン基であり、これはYおよびγ-マレイミドブチリル基(Y'')と結合する。Y'のグアニジノプロピル側鎖は、Nu近くの負に荷電したポケットを有する抗体との共有結合を容易にすることができる。Y''のマレイミド基は、Cys(Lx)のスルフヒドリル基(L')と結合する。
【図５Ａ】(A)Yの変形の図である。求電子基Yは電子欠損原子(Z)から構成され、これはNuと共有結合を形成し、1つ(実施例2)または複数の(実施例1)置換基(-R1および-R2)はZと結合する。R1およびR2は、ZとNuの間の共有結合を可能にする、任意の原子または基であってよい。R1およびR2の典型例にはアルキル基、アルコキシ基、アリール基、アリールオキシ基、水素、およびヒドロキシル基がある。R1およびR2は、同じまたは異なる置換基の対であってよい。
【図５Ｂ】(B)Yの共有結合反応性を増大させるR1およびR2の例。R1およびR2の電子的性質が、Yの求電子的反応性を調節することを示す図である。
【図５Ｃ】(C)Yの共有結合反応性を低下させるR1およびR2の例の図である。
【図５Ｄ】(D)ペプチド伸長部を有するR1およびR2の例の図である。
【図６】pCRAW中に取り込ませるのに適した、水-金属結合モチーフの例の図である。
【図７】図AおよびB、セリンプロテアーゼ様抗体と、それぞれ抗原、およびホスホン酸ジエステル含有抗原アナログの反応の図である。図C、CRA構造の図である。図Aでは、Nuは求核体を示し;Ag'およびAg''は、抗体との非共有的接触が起こる抗原エピトープの要素であり;Ag'-Lys-OHはN末端抗原フラグメントであり;かつNH2-Ag''はC末端抗原フラグメントである。活性部位の求核体は、抗原(基質)中の切断性結合のカルボニル炭素を攻撃して、テトラヒドラル遷移状態複合体を形成する。C末端抗原フラグメントは切り離され、アシル-抗体複合体が形成される。アシル-抗体複合体の加水分解によって、N末端抗原フラグメントの切り離しおよび触媒抗体の再生がもたらされる。触媒速度定数kcatはk3'とk3''の合計である。図Bでは、抗体の求核体は求電子性ホスホン酸ジエステルを攻撃し(カルボニル基の代わりに)、ホスホン酸含有抗原(CRA)は、基底状態および遷移状態の抗体-Ag複合体における残りの相互作用を再現するが(ペプチドエピトープにおける非共有結合)、アシル-抗体中間体とは異なり、ホスホニル-抗体アダクトが安定した生成物である。図CにおいてIは、トリプシン様酵素の活性部位を対象とする阻害剤である。IIおよびIIIは、それぞれ側鎖アミジノ官能基を欠き弱性の脱離基を含む、Iの誘導体である。IVおよびVはそれぞれ、exEGFRおよびgp120の残基421〜432に対して特異的な抗体中の、求核体を検出することができると考えられる。ビオチンおよびホスホン酸ジエステル基は、IV中のLys側鎖に取り込まれた。VaはN末端にビオチンを含み、C末端にホスホン酸ジエステルを含む。
【図８】IgGおよびトリプシンによるハプテンCRAの結合の図である。A、Iのヒト(#1518)とマウス(BALB/c)血清IgG(1μM)とのアダクトを示す、SDS-ポリアクリルアミドゲルの例示的なストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。IgGとIIの弱い反応を、ゲルを長時間(4時間)暴露させることによって観察し、IIIとの反応は明らかではなかった。ハプテンCRA、10μM、60分。B、三連で測定したIgG-Iおよびトリプシン-I結合の時間行程。Y軸の値は、任意の領域単位(AAU)で表した、150kD(IgG)または23kD(トリプシン)のアダクトのバンドの強度である。CRA1、100μM。挿入図、ビオチン含有アダクトを示す、SDS-ポリアクリルアミドゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット(上部、IgG;底部、トリプシン)。
【図９】ヒトIgG(#1518)およびトリプシンの、触媒およびハプテンCRAの結合特性の図である。A、Pro-Phe-Arg-MCA(200μM、IgG500nM、トリプシン0.1nM)の切断の時間行程。B、Glu-Ala-Arg-MCA(200μM、IgG500nM、トリプシン0.1nM)の切断の時間行程。C、IgG(375nM)およびトリプシン(1nM)による、ペプチド-MCA(Glu-Ala-Arg-MCA、Pro-Phe-Arg-MCAおよびIle-Glu-Gly-Arg-MACの混合物;それぞれ67μM)の、DFP(5mM)およびCRA I(0.1μM)切断の阻害剤;それぞれ21時間および1.5時間の反応。D、DFP(5mM)および10分間のタンパク質予備加熱によるI(10μM)アダクト形成の阻害を示す、還元SDS-ポリアクリルアミドゲルの例示的なストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。IgG 1μM;トリプトシン1μM。1時間反応。Iとのインキュベーション前に30分間DFPで処理。A〜C中の値は、3つの反復値の平均±標準偏差である。
【図１０】ハプテンCRA Iとの単鎖Fvの反応性(A、B)、およびタンパク質分解との相関関係(B)の図である。A、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ(レーン2)、抗-c-myc抗体(レーン3)および銀(レーン4)で染色した、CRA Iを有するFv(クローンMMF-4)アダクトを示す還元SDS-電気泳動ゲル。レーン1、ゲル測定用に使用した標準タンパク質。レーン2の反応用には、CRA I(200μM;60分反応)で処理したFv(0.45μM)。レーン2の微量のc-myc含有バンドは、ニッケルカラムで全長Fvと同時精製した分解生成物である。何故ならそれは、his6タグを含むからである。B、示すのは、8個のクローン(MM18、20、24、F4、F5、F6、F11、F14)から精製したFvによる、Glu-Ala-Arg-MCA(Y軸;200μM;17時間の反応時間)の切断およびCRA Iの結合(200μM;60分)に関する値である。線形回帰によって評価した相関関係。点線、95%の信頼限界。FU、蛍光単位。183FU、1μMのアミノメチルクマリン。
【図１１】従来のELISA手順により測定した、ホスホン酸ジエステル含有タンパク質CRA IVおよびペプチドCRA Vによる抗体結合の図である。A、exEGFRに対する抗血清によって固定したIV(黒四角)と対照の非免疫血清(白抜き四角)の結合の比較。(黒丸は、抗exEGFR抗血清によって固定したexEGFRの結合を示す。B、gp120(421〜436)-KLH複合体に対する抗血清によって固定したVa(黒四角)と対照の非免疫血清(白抜き四角)の結合の比較。(黒丸)は、抗gp120(421〜436)抗血清によって固定したgp120(421〜436)-BSA複合体の結合を示す。対照の非免疫血清によって固定したexEGFRまたはgp120(421〜436)-BSA複合体の結合は、明らかではなかった(示さず)。示すのは吸光値(490nm)±標準偏差である。
【図１２】EGFRに対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体による、exEGFRタンパク質CRA IVの特異的不可逆結合の図である。A、増大する長さの時間(0.05、1、2、3、4、6、および8時間;レーン1〜8それぞれ)、IV(0.2μM)をポリクローナル抗EGFRIgG(0.7μM)で処理することによって形成された250kDのアダクトを示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色したブロット。レーン9は、8時間対照の非免疫IgG(0.7μM)と共にインキュベートした、IV(0.2μM)の反応混合物である。B、図Aからの250kDのバンドの強度(任意の領域単位)。C、時間の関数としての、EGFRに対するモノクローナル抗体(0.5μM;クローンC225、H11、111.6)を含むIV(0.2μM)の250kDのビオチン含有アダクトの蓄積。均等に処理した対照モノクローナル抗体(BGN/H8)によって、アダクトが形成されることはなかった。D、exEGFRの不在下(レーン1)およびexEGFRの存在下(1μM;レーン2)あるいはカルモジュリンの存在下(1μM;レーン3)で、IV(0.2μM)をexEGFRに対するポリクローナルIgG(0.5μM)で2時間処理することによって形成された、ビオチン含有250kDアダクト。対照反応では、IV(0.2μM)を、非免疫IgG(0.5μM;レーン4)およびexEGFRに対する煮沸ポリクローナルIgG(100℃で10分間;0.5μM;レーン5)で2時間処理した。exEGFRの不在下において、モノクローナルIgGC225(0.5μM)で2時間処理したIVa(0.2μM)はレーン6に示し、exEGFRの存在下(1μM)あるいはカルモジュリンの存在下(1μM)のそれはレーン7および8にそれぞれ示す。IVまたはIVaを加える前に30分間競合タンパク質で処理した抗体。
【図１３】gp120(421〜436)との、抗体によるペプチジルCRA Vaの特異的不可逆結合の図である。A、gp120(421〜436)に対するIgG(1μM)と共にインキュベートした、Va(10μM)のアダクトの形成の時間行程。挿入図、抗gp120(421〜436)IgG(上部)および均等な濃度の非免疫IgG(底部)形成された、非還元SDS-ポリアクリルアミドゲル中のストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色された152kDのアダクト。B、競合タンパク質の不在下(レーン1)およびアルブミンの存在下(3μM)あるいはgp120(421〜436)-BSAの存在下(3μMのBSA均等;30μMのペプチド均等)で、抗gp120(421〜436)IgG(1μM;1時間)を用いた処理によって形成されたVa(10μM)のアダクトを示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色された非還元SDS電気泳動ゲル。
【図１４】CRA構造(A)および抗体とのそれらの反応(B)の図である。IIIは、Lys残基におけるgp120とR3置換基の概略図である。IIIの左側は、4mol(レーン1)および14mol(レーン2)のホスホン酸ジエステル基/mol gp120を含むビオチン化したIIIを示す、SDS電気泳動ゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットである。Bでは、Nu、求核体;Ag'-Lys-OH、N末端抗原フラグメント;NH2-Ag''、C末端抗原フラグメント;kcat=k3'+k3''。触媒抗体は、従来のエピトープ-パラトープ相互作用によって最初の非共有結合複合体を形成する。活性部位の求核体は、抗原(基質)中の切断性結合のカルボニル炭素を攻撃して、テトラヒドラル遷移状態複合体を形成する。C末端抗原フラグメントは切り離され、アシル-抗体複合体が形成される。アシル-抗体複合体の加水分解によって、N末端抗原フラグメントの切り離しおよび触媒抗体の再生がもたらされる。ホスホン酸含有抗原との反応は、基底状態および遷移状態の抗体-抗原複合体における相互作用を再現するが(ペプチドエピトープにおける非共有結合および抗体による求核攻撃)、アシル-抗体中間体とは異なり、ホスホニル-抗体アダクトが安定した生成物である。考えられる弱点は、免疫原IIIが、アシル-抗体中間体の迅速な加水分解および生成物の切り離しが可能な抗体の合成に好ましい、構造的特徴を含まないことである(底部の反応スキーム)。
【図１５】ポリクローナル抗体による不可逆的なIIIの結合の図である。A、固定したgp120。B、固定したIII。示すのは、IIIで過剰免疫したマウス血清中の(集めた血清、N=4匹のマウス)、ポリクローナル抗体の結合に関するELISA値である。非免疫マウス血清の結合は、わずかであった(Aでは1:100非免疫血清のA490、0.001;Bでは0.002)。残存結合および全体の結合は、それぞれSDSで処理したウェルおよびSDSなしで処理したウェル中のA490値を表す。挿入図、非免疫IgG(レーン2;0.1μM)および抗III IgG(レーン3;0.1μM)で48時間処理したIII(0.3μM)を示す、SDS電気泳動ゲルの抗IgG染色ブロット。大きな抗体含有アダクトは、レーン3では〜400kDで明らかである。レーン1は、過剰露出させたレーン2および3中の不鮮明な位置の明確に定義された150kDのバンドを示す、レーン2の暴露が短いものである。
【図１６】モノクローナル抗体による不可逆的なIIIの結合の図である。モノクローナル抗体(YZ系)(A)およびgp120-CRA IIIを用いた免疫によって産生したクローンYZ18から精製したモノクローナルIgG(B)を含む組織培養上清による、SDS耐性であるIIIの結合を示すELISA。モノクローナル抗体CRL1689は、モノクローナル抗体YZ21およびYZ23と同じアイソタイプを有する無関係なモノクローナルIgGである。固定した抗原、gp120およびIII。III+SDSと示した棒線および曲線によって示される、SDS耐性であるIIIの結合。
【図１７】モノクローナル抗体YZ20によるBt-gp120の切断の図である。A、モノクローナル抗体YZ20による時間依存性のBt-gp120の切断、およびモノクローナル抗体YZ19(22時間のインキュベーション)による切断の欠如を示す、SDS電気泳動ゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。IgG、1μM;Bt-gp120、0.2μM。OE、YZ20IgG(1μM)と共に希釈液中で22時間インキュベートしたBt-gp120を示す過剰暴露レーン。27kDaおよび15kDaにおける生成物のバンドが、主要な50〜55kDaのバンド以外に眼に見える状態である。B、希釈液またはYZ20IgGと共にインキュベートした(1μM、24時間)gp120(1μM)を示す、SDS電気泳動ゲルの抗gp120ペルオキシダーゼ染色ブロット。
【図１８】モノクローナル抗体YZ20によるBt-BSAおよびBt-exEGFRの切断の欠如(A)、および塩基性残基における優先的切断(B、C)を示す図である。A、モノクローナル抗体YZ20と共にインキュベートした(1μM、24時間)ビオチン化タンパク質(0.2μM)の、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。B、ペプチド-MCA基質(200μM、22時間)のモノクローナル抗体YZ20(0.5μM)触媒切断の蛍光測定。C、モノクローナル抗体YZ20(0.5μM)によるGGR-MCAおよびGGL-MCAの切断。Gly-Gly-Leu-MCAの限られた溶解度のために、2つの基質の濃度は12.5μMに保った。基質のN末端のブロック基は、スクシニル-AE-MCA、AAA-MCA、AAPF-MCA、IIW-MCA、t-ブチルオキシカルボニル-EKK-MCA、VLK-MCA、IEGR-MCA、EAR-MCA;ベンジルオキシカルボニル-GGR-MCA、GGL-MCAであった。値は3つの反復値の平均±標準偏差である。
【図１９】IIIで免疫したマウス由来のポリクローナルIgGによる増大したハプテンCRA Iの共有結合(A)、およびハプテンCRA IIによるBt-gp120のモノクローナル抗体YZ20切断の強力な阻害(B)の図である。A、III(Ms9〜12)で免疫したBALB/cマウス由来のIgG(0.4μM)、または対照gp120(Ms1〜4)との60分間のインキュベーションによって測定した、ハプテンCRA I(10μM)の結合、SDS電気泳動および150kDaのビオチン含有バンドの定量。NI、非免疫IgG(20匹のマウスから集めたもの)。挿入図、III(Ms11)で免疫したマウス、gp120(Ms3)で免疫したマウス由来のIgG、および非免疫IgG(NI)によるハプテンCRA Iの結合を示す例示的なSDS電気泳動レーン。B、モノクローナル抗体YZ20(1μM、4時間)によるBt-gp120(0.1μM)の切断、およびモノクローナル抗体c23.5(20nM、18時間)による(Tyr10-125I)VIP(〜100pM、45K c.p.m.)の切断を、高濃度のIIの存在下で測定した。IIの不在下では、利用可能なBt-gp120およびVIPの15%および40%がそれぞれ切断された。
【図２０】(A)ハプテンCRA1、VIP-CRA3および合成中間体2の構造の図である。(B)VIP-CRA3の合成に関するスキームである。図B中のステップi〜viに関する試薬および条件:(i)9-フルオレニルメトキシカルボニル化学物質による固相ペプチド合成[脱保護、20%ピペリジンDMF中(3分×2、20分×1);カップリング、N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)アミノ酸(2.5当量)、PyBOP(2.5当量)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(2.5当量)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.5当量)DMF中(60分)];(ii)20%ピペリジンDMF中(3分×2、20分×1);(iii)D-ビオチン(2.5当量)、PyBOP(2.5当量)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(2.5当量)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.5当量)DMF中(60分)];(iv)1%TFA、CH2Cl2中(5分×10);(v)2(3当量)、0.1mMのN,N-ジイソプロピルエチルアミンDMF中(一晩);(vi)TFA-エタンジチオール-チオアニソール-フェノール(90:1:1:8、2時間)。全てのステップは室温。保護基:Boc、tert-ブトキシカルボニル;tBu、tert-ブチル;Pmc、2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル;Trt、トリチル;Mtt、4-メチルトリチル。
【図２１】モノクローナル抗VIPIgG(クローンc23.5)による特異的な共有VIP-CRA結合。図A:電気泳動および濃度測定によって測定した、アダクトバンドの任意の領域単位(AAU)で示すVIP-CRA3またはハプテンCRA1アダクトの蓄積。反応条件:1μMのIgG、10μMのCRA、37℃。データは、非常に一致する二連の平均値である。線形回帰によって進行曲線と適合する曲線の相関係数は0.9以上であった。全ての反応は、抗VIP L鎖に関して示すように6箇所の時間地点で分析した。説明用に、120分の最終データ地点のみ、抗VIP H鎖および対照抗体のH鎖およびL鎖(UPC10IgG)に関して示す。挿入図、c23.5軽鎖(29kD)および重鎖(58kD)の3つのアダクトを示す、SDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。レーン1〜6は、グラフ中に示す反応時間に対応する(10、20、40、60、90、および120分)。図B:VIP-CRA3との抗VIP軽鎖アダクトの形成のVIP(10μM)による阻害を示す例示的なプロット。+VIPおよび-VIPがそれぞれVIPの存在および不在を指す、100-100(Vapp,+VIP)/(Vapp,-VIP)として阻害率を決定した。挿入図、VIPの不在下および存在下で形成された軽鎖アダクトを示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色した電気泳動フラグメント。見出し1〜6は、グラフ中に示す累進的に増大する反応時間に対応する。図C:ヒト血漿(1%体積/体積;1時間;CRA、それぞれ10μM;外から加えた抗体、10μM)の存在下での抗VIP抗体とのCRAの結合を示す、SDS電気泳動ゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。使用した外来性の抗体およびCRAは:抗VIPc23.5IgG+VIP-CRA3(レーン1);対照UPC10IgG+VIP-CRA3(レーン2);VIP-CRA3のみ(レーン3);抗VIPc23.5+ハプテン1(レーン4)、UPC10IgG+ハプテン1(レーン5);およびハプテン1のみ(レーン6)である。レーン1〜6中のビオチン含有バンドは図Aと同様に検出した。レーン7および8は、それぞれヒト血漿(1%体積/体積)の銀染色ブロットおよび分子量標準である。図D:DFPによる抗VIPc23.5軽鎖とのVIP-CRAの結合の阻害を示す、還元SDS電気泳動ゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。抗VIPIgGc23.5(1μM)を、DFP(5mM)有りまたは無しで5分間インキュベートし、次いでVIP-CRA3(2μM)と60分間反応させた。
【図２２】VIP-CRA3による抗VIP軽鎖c23.5触媒Pro-Phe-Arg-AMC加水分解の阻害の図である。図A:VIP-CRA3(3μM)の不在下(白丸)および存在下(黒丸)での、軽鎖(0.8μM)によるPro-Phe-Arg-AMC(0.2mM)切断の進行曲線。曲線は、VがAMC切り離しの速度であり;[AMC]maxがAMC切り離しの外挿最大値であり、kobsが観察した一次速度定数である、式[AMC]=V.t(r20.99)(白丸)または[AMC]/[AMC]max=1-e-kobs・t(r20.89)(黒丸)に適合する最小二乗法のものである。データは3つの反復値の平均±標準偏差である。真正AMCを使用して構築した標準曲線と比較して、切り離されたAMCとして表した蛍光値。触媒不在下でのバックグラウンド蛍光は、0.05±0.03μMのAMCに対応する。図B:VIP-CRA3(黒丸)およびハプテンCRA1(白丸)阻害の軽鎖触媒Pro-Phe-Arg-AMC加水分解の比較。曲線は、EC50が50%の阻害をもたらす濃度である(r20.98)、式:阻害率=100/(1+10logEC50-log[CRA])に適合する。図Aと同様の反応条件。ただし、様々なCRA濃度を使用した(1、3、10、30μM)。阻害率は、V13が13時間のインキュベーション後の残存活性を表す、100(V-V13)/Vとして計算した(図Aと同様に得た最小二乗法に適合する進行曲線の接線)。値は3つの反復値の平均±標準偏差である。CRAの不在下では、反応速度は22nM AMC h-1であった。図C:VIP-CRA3との抗体軽鎖(c23.5)の反応の化学両論。示すのは、様々なVIP-CRA3濃度の存在下での(図Bと同じ反応条件、ただし、VIP-CRA濃度は0.03、0.1、0.3、1.0および3.0μMであり、反応時間は36時間であった)、軽鎖の残基の触媒活性(Pro-Phe-Arg-AMC加水分解)のプロットである。残存活性は、Vが阻害剤の不在下での速度でありViが完全に阻害剤が消費される条件下での速度の計算値である、100Vi/Vとして決定した。Aおよびkobsがそれぞれ、阻害剤の消費が行われているときの段階で計算したAMC切り離しの値、および観察した一次速度定数をそれぞれ表す、式[AMC]=Vit+A(1-e-kobs・t)に適合する最小二乗法から、Vi値を得た(個々の進行曲線のr2、>0.97)。この式は、最初の第一次期および次のゼロ次期を有する反応に関して有効である。プロット中に示すX軸の遮断物は、[VIP-CRA3]/[軽鎖]比<1のデータ地点に関して最小二乗法の適合から測定した。挿入図、Vi値をそこから計算した進行曲線の例。VIP-CRA3、0.03μM。
【図２３】VIP-CRA3およびハプテンCRA1によるポリクローナル抗体触媒VIP切断の阻害の図である。図A:ヒトIgG HS-2による多数の部位での[Tyr10-125I]-VIPの切断を示す逆相HPLCの概略。[Tyr10-125I]-VIPは、HS-2IgG(2μM)の存在下(黒丸)または不在下(白丸)で16時間インキュベートし、HPLC[Nova-pak C18 3.9×150mm;0.1%TFA、水中:0.1%TFA、80%アセトニトリル中、95:5、10分間、95:5〜30:70、55分間、30:70〜0:100、5分間、0:100、5分間(0.5ml/分)]に施した。示すのは、HPLC分画(0.5ml)中で回収した125Iの放射活性の値である。図B:VIP-CRA3およびハプテンCRA1によるHS-2IgG触媒の[Tyr10-125I]-VIP切断の不可逆的阻害。IgG(2μM)を、高濃度のVIP-CRA3(黒丸)またはハプテンCRA1(白丸)の不在下または存在下で、16時間プレインキュベートした。固定タンパク質Gでのクロマトグラフィーによって未反応CRAを除去した後、IgGの残基の触媒活性を、基質として[Tyr10-125I]-VIPを使用して測定した。データは平均±標準偏差である。対照のHS-2IgGは、CRA切断2791c.p.m.[Tyr10-125I]-VIPの不在下でインキュベートした。
【図２４】化合物I〜IV、ジイソプロピルフルオロリン酸(DFP)およびGlu-Ala-Arg-AMCの図である。ハプテンCRA Iは、トリプシン様酵素の活性部位特異的阻害剤である。化合物IIは、共有結合反応性を欠くIの非エステル化ホスホン酸アナログである。IIIおよびIVはそれぞれ、側鎖アミジノ官能基を欠き弱性の脱離基を含むIの誘導体である。これらの構造体は、不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤DFPのアナログである。Boo-Glu(OBzl)-Ala-Arg-AMCは、Argとメチルクマリンアミド基の間のアミド結合の切断によって蛍光性の7-アミノ-4-メチルクマリンが放出される、市販の合成基質の一例である。
【図２５】脾臓細胞とのハプテンCRA Iの反応性の図である。A、ビオチン化ハプテンCRA I(グレー線)および化合物II(黒線;両方の化合物100μM、4時間;ストレプトアビジン-FITC(50μg/ml)で染色した、マウス脾臓細胞(ナイーブBALB/cマウス)のフローサイトメトリー。25000の細胞を計数した。B、抗CD19抗体染色(グレー線;ハプテンCRA I標識細胞のフィコエリスリン結合体);ストレプトアビジン-FITC、1μg/ml)。(黒線)はアイソタイプが合致する対照抗体のフィコエリスリン結合体による染色を示す。C〜F、CRA I(ストレプトアビジン-FITC、1μg/ml、図C)およびフィコエリスリン結合抗CD19抗体(図D)で標識した2つのB細胞を示す、デコンボルーションによる蛍光性の獲得(5回繰り返し)。EはFITCとフィコエリスリンプローブの併せた解釈を示す。Fは、30の個体群から集め次いで分離スクリーニングによる抽出を施した、FITC発光パターンの3Dのワイヤーフレームモデルである。青色の対比染色液、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。
【図２６】B細胞抽出物中のハプテンCRA I標識Igサブユニットの、免疫化学的同定の図である。A、銀(レーン1)およびペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(レーン2)で染色した後、ハプテンCRA I(100μM、4時間)で標識したB細胞の抽出物を示す、SDSゲル電気泳動レーン。マーカータンパク質の移動を左側に示す。B、μ(レーン3)、λ(レーン4)、k(レーン5)およびγ(レーン6)鎖に対する抗体で染色した、ハプテンCRA I標識B細胞抽出物のSDSゲルイムノブロット。C、固定抗μ(レーン7)、抗k/λ(レーン8)および抗γ抗体(レーン9)により脾臓細胞抽出物の親和性クロマトグラフィーによって回収した、ハプテンCRA I標識タンパク質を示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色SDSゲル。
【図２７】IgMおよびIgG抗体との不可逆的なハプテンCRA Iの結合の図である。A、ポリクローナルマウス抗体-CRAアダクト形成に関する進行曲線。AAU、任意の領域単位。反応条件:IgM、0.2μMまたはIgG、1μM(均等な組合せ濃度);ハプテンCRA I、0.1mM。値は、IgM(黒丸)およびIgG(白丸;非常に一致する二連の平均)の、H鎖-CRAおよびL鎖-CRAバンドの強度の合計である。B、2時間でのCRA-抗体サブユニットアダクトを示す、還元SDSゲルレーンの例。それぞれIgMサブユニットおよびIgGサブユニットのアダクトを示す、レーン4および5:ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。クーマシーブルー、抗μ鎖抗体および抗k/λ鎖抗体で染色したIgGサブユニットは、それぞれレーン1、2および3に示す。C、IgMおよびIgGのサブユニットにおける、ハプテンCRA Iアダクト形成の比較用の初速。それぞれの地点が異なる抗体を表す。比較用に、個々のIgM抗体のμ鎖およびk/λ鎖に対応するデータ地点を結びつける。試験した抗体:ポリクローナルヒトIgM、ポリクローナルマウスIgM、5モノクローナルマウスIgM抗体(クローン8702、8704、9008、9010、9020)、モノクローナルヒトIgMYvo、ポリクローナルヒトIgG、ポリクローナルマウスIgGおよび4つのモノクローナルIgG抗体(クローンc23.4、c39.1、HP6045、HP6054)。それぞれの場合μ鎖群に対して*P<0.05(スチューデントのt検定、2つの罫下)。
【図２８】IgMおよびIgG抗体のタンパク質分解活性の図である。A、ポリクローナルマウスIgM(黒丸)、ヒトIgM(黒四角)、ポリクローナルマウスIgG(白丸)およびポリクローナルヒトIgG(白抜き四角)によるGlu-Ala-Arg-AMC(400μM)の切断。IgM、5nM;IgG、160nM。B、ハプテンCRA I(黒四角、30μM; 白抜き四角、100μM)による、ポリクローナルマウスIgM(5nM)触媒のGlu-Ala-Arg-AMC(400μM)切断の阻害。黒丸、阻害剤なしの進行曲線。値は3つの反復値の平均±標準偏差である。
【図２９】IgM純度の図である。A、特異的活性を一定にするための、ポリクローナルマウスIgMの精製。白丸、抗μの親和性クロマトグラフィーによって精製したIgM;黒丸、FPLCゲル濾過によるさらなる分画化に施した、親和性によって精製したIgM。IgM、5nM;Glu-Ala-Arg-AMC、200μM。B、6Mのグアニジン塩酸塩で行った、ポリクローナルマウスIgMの変性ゲル濾過の概略(Superose12カラム)。変性クロマトグラフィーの第一サイクル由来の棒線(- - - -)の下のIgM分画を集め、変性ゲル濾過の2回の追加的サイクルに施した。第三のクロマトグラフィーサイクル(―)から回収したIgMは、図Cで触媒活性に関して分析した。C、図B中の3サイクルの変性ゲル濾過によって精製したIgM(2.5nM)による、Glu-Ala-Arg-AMC(200μM)の切断に関する進行曲線。
【図３０】モノクローナルIgM抗体の互いに異なる基質の選択性の図である。データは、Viが進行曲線から計算した初速を表す、Vi,Glu-Ala-Arg-AMC/Vi,Ile-Glu-Gly-Arg-AMCとして表す。基質、200μM。名称8702、8704、9008、9010、9020およびYvoは、個々のIgM抗体(5nM)を示す。*、IgM Yvoが、Ile-Glu-Gly-Arg-AMCを検出可能なほど切断することはなかった(<0.0125μM AMC)。
【図３１】IgMFabフラグメントによるGlu-Ala-Arg-AMCの切断の図である。A、固定ペプシンによる分解消化なし(- - -)および分解消化あり(―)のIgMYvoのゲル濾過概略(Superose12)。挿入図、55kDのFabフラグメントの銀染色した非還元(レーン1)および還元(レーン2)SDSゲル。還元レーン中の高および低Mrフラグメントは、Fab重鎖フラグメントおよび軽鎖要素に対応する。B、1.2μM(黒丸)、0.4μM(白抜き三角)および0.12μM(黒四角)のFabで切断された、Glu-Ala-Arg-AMC(400μM)の進行曲線。
【図３２】ポリクローナルヒトIgMおよびIgG調製物による、ビオチン化gp120(Bt-gp120)の切断の図である。A、5人の健常人由来のIgMおよびIgG抗体画分の、gp120の切断活性の分散プロット。抗体結合部位濃度150nM(十価のIgM、15nM;二価のIgG、75nM)。反応条件:20時間、37℃、100nMのBt-gp120。実線は平均値である[IgM、53.3±25.4%;IgGによる切断は検出限界未満である(<5%)]。挿入図、固定抗IgM抗体の親和性クロマトグラフィーによって精製し、クーマシーブルー(レーン1)およびヒトμ鎖(レーン2)、k鎖(レーン3)およびλ鎖(レーン4)に対するペルオキシダーゼ結合抗体で染色したヒト血清IgMを示す、典型的な還元SDS電気泳動(4〜20%ゲル)の結果。B、抗体の不在下で23時間インキュベートした、集めたポリクローナルヒトIgM.BC、Bt-gp120によるBt-gp120の時間依存性の切断を示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色還元SDSゲルレーン。IgM、50nM;Bt-gp120、100nM。
【図３３】変性ゲル濾過を施したIgMによるgp120の切断の図である。固定抗μ抗体の親和性クロマトグラフィーによって精製した、集めたヒト血清IgMを、変性ゲル濾過のサイクル(サイクル1- - -;サイクル2―;Superose12カラム)、6Mグアニジン塩酸塩に施した。挿入図、変性ゲル濾過によって得たIgM(50nM)(レーン3)、および変性なしで分析した対照IgM(レーン3)によるBt-gp120(0.1μM)の切断を示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色SDSゲルレーン。反応時間、16時間。レーン1、IgMではなく希釈液と共に16時間インキュベートしたBt-gp120。
【図３４】モノクローナルIgM抗体によるgp120の切断の図である。A、ヒトモノクローナルIgM;マウスIgMクローン8702、8704、9008、9010および9020、ならびに集めたヒト血清およびマウス血清から精製したポリクローナルIgMの互いに異なる触媒活性。ビオチン化gp120、0.1μM;IgM、17nM。ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色還元SDSゲルの濃度測定によって得たデータ。挿入図、クーマシーブルー(レーン1)、抗ヒトμ鎖抗体(レーン2)および抗k鎖抗体(レーン3)で染色したIgMYvoを示すSDSゲル。B、固定ペプシンによる分解消化なし(- - -)および分解消化あり(―)のIgMYvoのゲル濾過概略(Superose12)。挿入図、55kDのFabフラグメントの銀染色した非還元(レーン1)および還元(レーン2)SDSゲル。還元レーン中の高および低Mrフラグメントは、Fab重鎖フラグメントおよび軽鎖要素に対応する。C、高濃度のFabYvoと共に48時間インキュベートしたビオチン化gp120(0.1μM)の切断を示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色SDSゲル。
【図３５】モノクローナルIgMYvo抗体によるgp120の切断の図である。A、IgMYvo(50nM)によるビオチン化gp120(0.1μM)切断の時間行程。示すのは、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色還元SDSゲル電気泳動レーンである。BC、IgMなしで16時間インキュベートしたBt-gp120を示す対照レーン。主要なビオチン化生成物は、80kDのバンドである。B、46時間インキュベートした、gp120(8.5μM)とIgMYvo(50nM)の反応混合物(レーン1)、IgMYvo単独(レーン2)およびgp120単独(レーン3)を示す、クーマシーブルー染色したSDSゲルレーン。70kDおよび25kDのバンドは、それぞれIgM重鎖および軽鎖に対応する。15.4〜16.4kD、17.6kD、18kDおよび80kDに対応するブロット領域を、表8のN末端塩基配列決定に施した。
【図３６】gp120の切断の選択性の図である。希釈液中で22時間インキュベートした、Bt-gp120、Bt-sEGFR、Bt-BSAおよびBt-sCD4、またはポリクローナルヒトIgM(50nM)を示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色還元SDSポリアクリルアミドゲル。Bt-タンパク質、0.1μM。
【図３７】Yvo IgM gp120ase活性のgp120(421〜431)-CRAによる阻害の図である。A、gp120残基421〜433(gp120pep-CRA)のホスホン酸ジエステルアナログ、およびgp120ペプチド配列を欠くハプテンホスホン酸ジエステル(ハプテンCRA)。B、gp120pep-CRAによるIgMYvo(50nM)触媒Bt-gp120(0.1μM)の阻害。15時間のインキュベーション。挿入図、gp20pep-CRAの不在下(レーン2)および存在下(10μM、レーン2)でIgMYvoと共にインキュベートしたBt-gp120を示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色SDSゲル。レーン1、希釈液中でインキュベートした対照Bt-gp120。
【図３８】IgMによる不可逆的なgp120(421〜431)-CRAの結合の図である。A、モノクローナルIgMYvo、8704および9020(黒丸)、集めたヒト血清由来のIgM(黒菱形)、および集めたマウス血清由来のIgM(黒四角)による、ハプテンCRAアダクトおよびgp120pep-CRAアダクトの形成に関する比較用の初速。二連で測定した抗体による不可逆的なCRA結合に関する進行曲線から初速を計算し、H鎖CRAおよびL鎖CRAバンドの強度の合計を表した。AAU、任意の領域単位。反応条件:IgM、150nM;ハプテンCRAまたはgp120pep-CRA、10μM。挿入図、ポリクローナルマウスIgMによって形成されたgp120pep-CRA(レーン1)およびハプテンCRA(レーン2)のアダクトを示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色還元ゲル。B、モノクローナルIgMYvo、8704および9020(黒丸)、集めたヒト血清由来のIgM(黒菱形)、および集めたマウス血清由来のIgM(黒四角)のμ鎖およびk/λ鎖によるgp120pep-CRAアダクトの形成に関する比較用の初速。図Aからの反応混合物。C、進行曲線のデータの例。示すのは、IgM YvoのL鎖を有するgp120pep-CRAアダクトおよびハプテンCRAアダクトの蓄積である。反応は図Aと同様である。挿入図、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色SDSゲル由来の示した時間地点における、L鎖アダクトのバンドのフラグメント。D、合成gp20(421〜436)の不在下(レーン1)および存在下(500μM、レーン2)でポリクローナルヒトIgMによって、および合成gp20(421〜436)の不在下(レーン3)および存在下(500μM、レーン4)でIgM Yvoによって形成されたgp120pep-CRAのアダクトを示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色還元SDSゲル。反応条件は図Aと同様である。4.5時間のインキュベーション。
【図３９】示した抗原で免疫したBALB/cマウス由来の血清中での、IgM抗体によるgp120-CRAの結合を示すELISAの図である。黒矢印は、抗原(10μgのタンパク質)の投与を示す。グレーの矢印は、タンパク質A(1000μg)の投与を示す。血清は1:100に希釈した。抗ペルオキシダーゼ結合抗マウスIgM抗体を使用して、結合を目に見える状態にした。
【図４０】共有免疫により増大したIgM触媒gp120切断の図である。示すのは、gp120-CRA(黒いバー;スクリーニングしたIgM分泌ハイブリドーマの数、96)で免疫したマウスから得た、3つのモノクローナルIgM抗体によるビオチン化gp120の切断の値である。これらの条件下では、免疫しなかったマウス由来のIgMによる切断は検出不能であった(白いバーはスクリーニングした137IgMクローンの3つを示す)。固定抗μ鎖抗体のクロマトグラフィーによって培養物上清から精製したIgM。IgM、〜5nM;Bt-gp120、100nM;15時間。SDSゲル電気泳動によって測定した切断。
【図４１】抗gp120-CRA IgG抗体による不可逆的なgp120の結合の図である。示すのは、IgGクローンF223-3(レーン2)および対照IgGクローン(レーン1、クローンF223-1)と共にインキュベートしたビオチン化gp120のSDS電気泳動ゲルの、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロットである。レーン2および4は、それぞれクローンF223-3およびF-223-1との反応混合物の抗IgG染色ゲルを示す。154kDのバンドは、不可逆的gpl20-IgGサブユニット複合体を表す。IgG、0.1μM;ビオチン化gp120、0.1μM、反応時間15時間。
【図４２】モノクローナル抗体による不可逆的なgp120の結合の図である。gp120-CRA(クローンYZI8、YZ22_およびYZ23)を用いた免疫によって産生した精製モノクローナル抗体による、SDS耐性gp120の結合を示すELISA。試験した対照抗gpl20モノクローナル抗体は、マウスIgG#1121(Immunodiagnostics Inc.)、ならびにNIH AIDS Reagent Repositoryからのヒトモノクローナル抗体257-Dおよび268-D(いずれもgp120のV3ループを対象とする)であった。黒いバー:固定gp120との抗gpl20の結合の後に、PBS、pH7.4で洗浄したELISAプレート。白いバー:固定gp120との抗gpl20の結合の後に、PBSに溶かした2%SDSで洗浄したプレート。SDSで処理した後の残りのgp120結合の割合は、SDS耐性のバーの上に示す。40ngのgp120/ウェル;IgG、0.5μM。
【図４３】VIP-CRAに対する特異的なマウスの求核性の抗体応答の図である。データは、SDS電気泳動によって同定したVIP-CRA4の共有結合IgGアダクトの強度(代表的なマウスからの任意の領域単位(AAU)の重鎖および軽鎖アダクトの合計)を表す。矢印は、RIBIアジュバントに溶かしたVIP-CRA(84μg)を用いた、マウス(BALB/c)N=5)の腹腔内免疫を示す。タンパク質G-Sepharoseクロマトグラフィーによって精製したIgG(100nM)を、Bt-VIP-CRA4(黒丸)またはハプテン-CRA1(白丸)と共にインキュベートした(10μM、4時間)。
【図４４】gp120-CRAを用いた免疫によって産生した2つのモノクローナルIgG抗体による、濃度依存性のHIV-1中和の図である。一次HIV-1単離体ZA009(クレードC、R5-依存性)で感染させたPBMC。均等に精製した無関係な対照抗体CRL1689を、平行して試験した。p24レベル(本文参照)を測定することによって決定した中和。
【図４５】gp120(421〜431)-CRAとのファージ結合によって単離した、ループスL鎖クローンSKL6の特徴の図である。A、gp120(421〜431)-CRAを使用した選択したL鎖による合成gp120(421〜432)-メチルクマリンアミド(MCA)の切断の図である。蛍光測定法(C末端のMCA基の切り離し)によって調べた切断反応。金属親和性クロマトグラフィーによって精製した、分析したL鎖クローン、N=28。基質、5μM。B、L鎖SKL6によるビオチン化gp120(Bt-gp120)の切断(矢印)、および無関係なタンパク質(ビオチン化BSAおよびEGFRの細胞外ドメイン)の切断の欠如を示す、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼSDSゲル。レーン1、3および5は、SKL6-gp120反応混合物を示し;レーン2、4および6は、対照の非触媒性L鎖-gp120反応混合物を示す。基質タンパク質、0.3μM(それぞれのタンパク質Lys残基においてビオチン化されている)。0.3molビオチン/gp120 1mol。L鎖、0.03μM、24時間のインキュベーション。C、時間の関数としての、Bt-gp120(421〜431)-CRAの共有L鎖SKl6結合の図である。L鎖、1μM、CRA、10μM。挿入図、グラフ中の時間地点に対応する、SDSゲルのストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色ブロット。D、gp120(421〜436)による活性部位の保護の図である。示すのは、gp120(421〜436)の不在下(レーン1)および存在下(10μM;レーン2)、ならびに無関係なペプチド[EGFR(351〜364)、10μM;レーン3]の存在下で、L鎖(1μM)と共に形成された共有Bt-gp120(421〜436)(10μM)アダクトの、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ染色SDSゲルである。E、L鎖活性部位とのペプチジルCRAの相互作用のモデルの図である。
【図４６】精製したループス単鎖FvクローンGL2およびGL59による、Bt-gp120(0.1μM)の切断の図である。Fv、55nM、24時間インキュベーション。平行して分析したFvGL46は、切断活性を欠いている(希釈液で処理したBt-gp120と区別不能)。
【図４７】低い凝集の条件下(100μM)での、IgLhk14によるAβ1-40の切断の図である。Aβ1-40は、2.5μMのIgLと共に24時間インキュベートした。HPLCおよびオンラインESI質量分析によって、等分試料を分析した。条件:C18カラム、溶媒:A=0.2%ギ酸、水中、B=0.2%ギ酸、アセトニトリル中。勾配:A:B、97:3、5分間;97:3〜40:60、20分間;40:60〜0:100、1分間。ESI質量分析、ポジティブモード、0〜2000amu範囲。AはHPLCカラムからのA220トレースである。Aのピークの同定値は、質量スペクトルによってB(Aβ1-14)およびC(Aβ15-40)に示した。Bで観察したイオン系(m/z425.9、567.3、850.1)は、多様に荷電したAβ1-14種[(M+4H)4+、(M+3H)3+、(M+2H)2+]の正確な質量値に対応する。Cで観察したイオン系(m/z884.0、1324.9)は、Aβ15-40(M+3H)3+および1324.9(M+2H)2+イオンの正確な質量値に対応する。
【図４８】Aβ-CRAおよびAβ-CRAWの構造の図である。担体タンパク質と結合させるために、CysをN末端で置換した。共有結合アダクトの形成は、N末端にビオチンを有するCRAを使用して調べることができる。CRAW4では、R1中のHis4配列がZn+2およびCu+2などの金属(M)の結合を可能にし、これによってヘキサキス(hexakis)複合体を形成する水分子を配位結合させることができる。ハプテンCRAは、Aβ非共有結合の認識とは無関係な共有結合反応性の検出を可能にする。
【図４９】VIP-CRAおよびピルビルVIP-CRA、R、Hまたはビオチンの図である。
【図１】
2007524601.tif 000053
【図２】
2007524601.tif 000054
【図３】
2007524601.tif 000055
【図４】
2007524601.tif 000056
2007524601.tif 000057
2007524601.tif 000058
2007524601.tif 000059
2007524601.tif 000060
【図６】
2007524601.tif 000061
【図７】
2007524601.tif 000062
【図８】
2007524601.tif 000063
【図９】
2007524601.tif 000064
【図１０】
2007524601.tif 000065
【図１１】
2007524601.tif 000066
【図１２】
2007524601.tif 000067
【図１３】
2007524601.tif 000068
【図１４】
2007524601.tif 000069
【図１５】
2007524601.tif 000070
【図１６】
2007524601.tif 000071
【図１７】
2007524601.tif 000072
【図１８】
2007524601.tif 000073
【図１９】
2007524601.tif 000074
【図２０】
2007524601.tif 000075
【図２１】
2007524601.tif 000076
【図２２】
2007524601.tif 000077
【図２３】
2007524601.tif 000078
【図２４】
2007524601.tif 000079
【図２５】
2007524601.tif 000080
【図２６】
2007524601.tif 000081
【図２７】
2007524601.tif 000082
【図２８】
2007524601.tif 000083
【図２９】
2007524601.tif 000084
【図３０】
2007524601.tif 000085
【図３１】
2007524601.tif 000086
【図３２】
2007524601.tif 000087
【図３３】
2007524601.tif 000088
【図３４】
2007524601.tif 000089
【図３５】
2007524601.tif 000090
【図３６】
2007524601.tif 000091
【図３７】
2007524601.tif 000092
【図３８】
2007524601.tif 000093
【図３９】
2007524601.tif 000094
【図４０】
2007524601.tif 000095
【図４１】
2007524601.tif 000096
【図４２】
2007524601.tif 000097
【図４３】
2007524601.tif 000098
【図４４】
2007524601.tif 000099
【図４５】
2007524601.tif 000100
【図４６】
2007524601.tif 000101
【図４７】
2007524601.tif 000102
【図４８】
2007524601.tif 000103
【図４９】
2007524601.tif 000104
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月29日(2005.11.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物において、下記の式(1)の共有結合反応性ポリペプチド抗原アナログ(pCRA)に対する抗体を産生させることを含む、共有結合抗体または触媒抗体を調製する方法:
【化１】
2007524601.tif 000105
［式中、L1...Lx...Lmは抗原決定基を規定する構成要素であり、
Lxは、アミノ酸残基、糖残基、脂肪酸残基およびヌクレオチドからなる群から選択される抗原決定基の構成要素ユニットであり、
L'はLxの官能基であり、
Y"は原子、共有結合またはリンカーであり、
Y'は場合によっては荷電した基または中性基であり、
Yは前記抗原決定基に結合する抗体と特異的に反応する共有結合反応性求電子基であり、
場合によっては、Y"、Y'またはYは末端構成要素または内部構成要素として水結合基を含み、
nは1から1000の整数であり、かつ
mは4から30である］。
【請求項２】
下記の式(1)の水結合性、共有結合反応性ポリペプチド抗原アナログ(pCRAW):
【化２】
2007524601.tif 000106
［式中、L1...Lx...Lmは抗原決定基を規定する構成要素であり、
Lxは、アミノ酸残基、糖残基、脂肪酸残基およびヌクレオチドからなる群から選択される抗原決定基の構成要素ユニットであり、
L'はLxの官能基であり、
Y"は原子、共有結合またはリンカーであり、
Y'は場合によっては荷電した基または中性基であり、
Yは前記抗原決定基に結合する抗体と特異的に反応する共有結合反応性求電子基であり、
Y"、Y'またはYは末端構成要素または内部構成要素として水結合基を含み、
nは1から1000の整数であり、かつ
mは4から30である］。
【請求項３】
前記水結合基が、1つまたは複数の水分子をキレート結合する金属イオンと結合する部位から構成される、請求項2に記載のpCRAW。
【請求項４】
前記金属結合基が(His)n-(ここでn=2以上)、-Cys-X-Cys-Cys-または-Cys-X-Cys-（ここでXはアミノ酸残基、エチレンジアミン四酢酸またはジアミノメチルピリジンである）から選択される、請求項2に記載のpCRAW。
【請求項５】
ポリペプチド抗原に対する前記抗体の結合が非共有結合性抗原結合を破壊する変性剤による解離に耐性である、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリペプチド抗原がHIV-1 gp120である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がポリペプチド抗原におけるペプチド結合の開裂を触媒する、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリペプチド抗原がHIV-1 gp120である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、
a)共有結合する抗体についてのスクリーニングおよび選択、ならびに
b)触媒活性についてのスクリーニングおよび選択
によって、前記生物の血清において同定されるポリクローナル抗体である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、
a)ハイブリドーマ細胞系、ウイルス形質転換細胞系、またはベクターから発現される免疫グロブリンフラグメント遺伝子、のライブラリーを調製すること、
b)抗原pCRAまたはポリペプチドに対する抗体または抗体フラグメントの結合によって、それらの共有結合活性についてスクリーニングすること、
c)ステップa)およびステップb)の抗体または抗体フラグメントによるポリペプチドの触媒的加水分解についてスクリーニングすること、ならびに
d)前記抗体または抗体フラグメントを精製すること
を含むステップにより前記生物のリンパ球から得られるモノクローナル抗体または抗体フラグメントである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原性pCRAがgp120、VIP、第VIII因子、上皮増殖因子レセプター、CD4、βアミロイドペプチド1-40またはβアミロイドペプチド1-42のCRA誘導体である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体フラグメントが、
a)逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応による免疫グロブリンVLおよびVHのcDNAの調製、
b)ディスプレイベクターの表面に発現される単鎖FvフラグメントとしてVLおよびVHのcDNAの発現を可能にする形のベクターにそれらcDNAをクローニングすること、
c)前記ベクターの粒子を請求項1に記載の固定化pCRAと接触させること、洗浄による未結合ベクター粒子の除去、および原核細胞または真核細胞においてpCRA結合ベクター粒子から可溶型としてFv遺伝子を発現させること、
d)共有結合抗原結合活性について可溶性Fv構築体をスクリーニングすること、
e)触媒活性について可溶性Fv構築体をスクリーニングすること
を含むステップによって単離される、共有結合活性または触媒活性を発現する単鎖Fvフラグメントである、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
リンパ球が、
a)前記リンパ球をpCRAと接触させること、
b)前記pCRAに結合していないリンパ球から前記pCRAに結合しているリンパ球を分離すること
を含むステップによって得られる、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がIgG、IgM、IgD、IgAまたはIgEクラスに属する、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
[L1...Lx...Lm]が微生物タンパク質の抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
[L1...Lx...Lm]がHIV-1タンパク質gp12Oの抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
[L1...Lx...Lm]がヒト、動物または植物タンパク質の抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
[L1...Lx...Lm]が癌細胞上に過剰発現している抗原の抗原決定基を表す、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
前記pCRAがLys側鎖アミノ基を23mol/molタンパク質の密度で
【化３】
2007524601.tif 000107
で誘導体化されたgp120である、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
前記pCRAが下記のgp120ペプチジル誘導体である、請求項1に記載の方法。
【化４】
2007524601.tif 000108
【請求項２１】
前記免疫原性決定基がそれぞれLys側鎖を
【化５】
2007524601.tif 000109
で誘導体化された、上皮増殖因子レセプターの可溶性細胞外ドメイン、CD4の可溶性細胞外ドメイン、第VIII因子、βアミロイドペプチド1-40またはβアミロイドペプチド1-42に由来する、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
gp120の開裂を触媒するモノクローナルIgG抗体クローンYZ-18、YZ-20またはYZ-24。
【請求項２３】
gp120と結合し、前記結合が2%SDSを用いた解離に耐性であるモノクローナルIgG抗体クローンYZ-18、YZ-19、YZ-20、YZ-21、YZ-22、YZ-23またはYZ-24。
【請求項２４】
請求項10に記載の抗体フラグメントから調製される全長IgG、IgMおよびIgA抗体であって、
a)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターに含まれるIg定常ドメイン5'側へのVLおよびVHドメインcDNAの挿入、
b)原核または真核宿主細胞における前記ベクターの増殖、培地または細胞内容物からの全長抗体の抽出、および前記抗体の精製
を含むステップによって調製される抗体。
【請求項２５】
自己免疫疾患を有する生物、同種免疫病を有する生物、公知の疾患を有さない生物またはヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックマウスのリンパ球からモノクローナル共有結合抗体、触媒抗体、共有結合抗体フラグメントまたは触媒抗体フラグメントを得る方法であって、
a)ハイブリドーマ細胞系、ウイルス形質転換細胞系、またはベクターにクローニングされそのベクターから発現する免疫グロブリンフラグメント遺伝子のライブラリーを調製するステップ、
b)請求項1に記載の抗原性pCRAまたはポリペプチドに対する結合によって抗体または抗体フラグメントの共有結合活性についてスクリーニングおよび選択するステップ、
c)前記抗体または抗体フラグメントによるポリペプチドの触媒加水分解についてスクリーニングおよび選択するステップ、ならびに
d)前記抗体または抗体フラグメントを精製するステップ
を含む方法。
【請求項２６】
前記抗体がペプチド結合を加水分解する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がgp120を加水分解する、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫グロブリンフラグメントがペプチドリンカーにより連結されるVLおよびVHドメインである、請求項25に記載の方法。
【請求項２９】
前記ベクターがファージディスプレイベクター、レトロウイルスディスプレイベクター、酵母ディスプレイベクター、細菌ディスプレイベクターおよび哺乳動物ディスプレイベクターからなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
【請求項３０】
請求項25に記載のFvフラグメントから調製される全長IgG、IgMおよびIgA抗体であって、
a)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターに含まれるIg定常ドメイン5'側へのVHおよびVLドメインcDNAの挿入、
b)原核または真核宿主細胞における前記ベクターの増殖、培地または細胞内容物からの全長抗体の抽出および前記抗体の精製
を含むステップによって調製される抗体。
【請求項３１】
請求項25に記載の軽鎖フラグメントから調製される全長IgG、IgMおよびIgA抗体であって、
a)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターへの軽鎖cDNAの挿入、
b)核酸分解消化および連結手順による、発現ベクターに含まれるIgG重鎖定常ドメイン5'側へのgp120結合抗体のVHドメインの挿入、
c)原核または真核宿主細胞における前記ベクターの増殖、培地または細胞内容物からの全長抗体の抽出および前記抗体の精製
を含むステップにより調製される抗体。
【請求項３２】
リンパ球が、
a)前記リンパ球をpCRAと接触させること、
b)前記pCARに結合していないリンパ球から前記pCRAに結合しているリンパ球を分離すること
を含むステップによって得られる、請求項25に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体がIgG、IgM、IgD、IgAまたはIgEクラスに属する、請求項25に記載の方法。
【請求項３４】
pCRAの[L1...Lx...Lm]がHIV-1タンパク質gp12Oの抗原決定基を表す、請求項25に記載の方法。
【請求項３５】
pCRAの[L1...Lx...Lm]がヒト、動物または植物タンパク質の抗原決定基を表す、請求項25に記載の方法。
【請求項３６】
pCRAの[L1...Lx...Lm]が癌細胞上で過剰発現している抗原の抗原決定基を表す、請求項25に記載の方法。
【請求項３７】
前記pCRAがLys側鎖アミノ基を23mol/molタンパク質の密度で
【化６】
2007524601.tif 000110
で誘導体化されたgp120である、請求項25に記載の方法。
【請求項３８】
前記pCRAが下記のgp120ペプチジル誘導体である、請求項25に記載の方法。
【化７】
2007524601.tif 000111
【請求項３９】
前記免疫原性決定基が、それぞれLys側鎖を
【化８】
2007524601.tif 000112
で誘導体化された、上皮増殖因子レセプターの可溶性細胞外ドメイン、CD4の可溶性細胞外ドメイン、第VIII因子、βアミロイドペプチド1-40またはβアミロイドペプチド1-42に由来する、請求項25に記載の方法。
【請求項４０】
a)VLおよびVHドメインに突然変異を導入するステップ、
b)その結果として生じる抗体フラグメントをディスプレイベクターの表面に提示させるステップ、
c)前記ベクターの粒子を前記pCRAWと接触させ、未結合のベクター粒子を除去するステップ、
d)原核または真核細胞に可溶型の前記抗体フラグメントを発現させるステップ、
e)共有結合性抗原結合活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ、
f)触媒活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ
を含む、請求項10に記載の抗体フラグメントの共有結合活性または触媒活性を改良する方法。
【請求項４１】
a)VLおよびVHドメインに突然変異を導入するステップ、
b)その結果として生じる抗体フラグメントをディスプレイベクターの表面に提示させるステップ、
c)前記ベクターの粒子を前記pCRAWと接触させ、未結合のベクター粒子を除去するステップ、
d)原核または真核細胞に可溶型の前記抗体フラグメントを発現させるステップ、
e)共有結合性抗原結合活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ、
f)触媒活性について前記抗体フラグメントをスクリーニングするステップ
を含む、請求項25に記載の抗体フラグメントの共有結合活性または触媒活性を改良する方法。
【請求項４２】
a)患者における医学障害に関連する抗原に特異的な共有結合活性または触媒活性を有する抗体を治療有効量投与すること、および
b)維持治療のために、必要に応じステップa)を繰り返すこと、
を含む、疾患の受動免疫治療のための方法であって、前記抗体が請求項1に記載の方法によって産生されたものである、方法。
【請求項４３】
生物における予防抗体の産生を刺激するための方法であって、前記抗体が前記生物における医学的状態に関連する抗原に特異的な共有結合活性または触媒活性を有し、前記方法が、
a)前記抗原から請求項1に記載の通り調製された免疫原性量のpCRAを含むワクチンを生物に投与するステップ、
b)効果的な抗体産生を確実にするために、必要に応じてステップa)を繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項４４】
触媒抗体の作用を阻害することによって患者における医学障害を治療する方法であって、前記方法が、
a)抗原決定基が前記触媒抗体によって不可逆的に結合されたエピトープに由来するpCRAを治療量前記患者に投与するステップ、
b)前記触媒抗体の不活性化について前記患者を評価するステップ、および
c)前記触媒抗体の前記作用の阻害を維持するために、必要に応じてステップa)を繰り返すステップ
を含む方法。
【請求項４５】
前記生物がB細胞において欠損したB細胞レセプター仲介膜貫通シグナル伝達を生ずる遺伝子欠損を発現する、請求項10に記載の方法。