(57)【要約】  白血球を含む分画細胞計数を実施する方法および装置、およびかかる細胞計数を行う光バイオディスクの使用。バイオディスクは、中心と外縁（outer edge）を有する、実質的に円形の基板；基板に付随する活性層；中心と外縁の間に配置された標的領域；および抗体が標的領域の活性層上で固定化されるように、活性層に結合した、複数の捕捉抗体を含む。
2007501407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
様々なタイプの細胞から所望の細胞タイプを検出および定量する方法であって、
第１の表面マーカを有する第１の細胞タイプおよび第２の表面マーカを有する第２の細胞タイプを含む、共通の表面マーカを有する、標的細胞を有する試験サンプルを用意し、；
中心および外縁を有する実質的に円形の基板、該中心と該外縁の間に配置された標的領域、並びに、前記標的領域内の前記実質的に円形の基板に結合し、固定化された複数の捕捉抗体であって、前記標的細胞上の共通の表面マーカに対する親和性を有する複数の捕捉抗体を含む、バイオディスクを用意し、；
前記標的領域上に前記試験サンプルを保持させ；
前記試験サンプル中に存在する、前記第１および第２のタイプの細胞を含む前記標的細胞を、前記共通の表面マーカを通じて前記複数の捕捉抗体と結合させ；
非結合細胞を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；
前記第１の表面マーカに対する特異的親和性を有する、シグナル抗体が結合したレポータ因子を用意し、；
前記標的領域上に前記レポータ因子を保持させ；
前記標的領域内の前記第１の細胞タイプ上の第１の表面マーカを、前記シグナル抗体と結合させ、それにより前記第１の細胞タイプをタグ付けし；
非結合レポータ因子を除去するために、標的領域を洗浄し；そして
前記標的領域上で電磁放射ビームを走査させ、それによりタグ付けされた第１の細胞タイプ細胞およびタグ付けされてない第２の細胞タイプ細胞の数を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記レポータ因子が、検出可能な物理的特性を有するビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出可能な物理的特性が、色、大きさ、質感、反射率、吸光度、質量、蛍光、リン光および磁気特性から成る群より選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記レポータ因子が酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的領域上に、前記酵素と反応する酵素基質を保持し、それにより検出可能なシグナルを生成することをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記酵素は、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼから成る群より選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酵素基質は、ＴＭＢ（３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジン）、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＣＮ／ＤＡＢ（４−クロロナフトール／３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）および４−ＣＮ（４−クロロ−１−ナフトール）から成る群より選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記検出可能なシグナルが、前記第１の細胞タイプに接着する沈殿である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプル中の様々なタイプの細胞を検出する光バイオディスクを作成する方法であって：
中心および外縁を有する基板を用意し；
前記基板に付随する情報層上に、前記ディスクの回転を制御するための、ディスクドライブアセンブリにより読み取り可能である情報をコードし、；
前記基板上の前記中心と前記外縁の間に、標的領域を形成し；
前記標的領域に活性層を設け；そして
該捕捉抗体の少なくとも一部が前記活性層に付着し、前記標的領域内に固定化されるように、前記標的領域内に、複数の捕捉抗体を保持すること
を含む、方法。
【請求項１０】
前記標的領域と流体連通している流体流路を形成することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記複数の捕捉抗体は、前記様々なタイプの細胞の、共通の表面抗原に対する親和性を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
流体流路と流体連通しているチャンバを形成することをさらに含む方法であって、該チャンバは注入ポートを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１２に従って作成された光バイオディスクを用い、１つ以上のタイプの細胞を検出および定量する方法であって、：
前記共通の表面抗原を有する様々なタイプの細胞を有する試験サンプルを、前記注入ポートを通して前記流体流路内に充填し、それにより前記試験サンプルを、前記標的領域内の前記複数の捕捉抗体と接触させ、；
前記標的領域内に前記様々なタイプの細胞を固定化するために、前記複数の捕捉抗体を前記共通の表面抗原と結合させ；
光バイオディスクを所定の速度および時間にて回転させ、非結合細胞を標的領域から除去し；
各抗体は群に固有なレポータ因子が付着しており、シグナル抗体の各群は、前記標的領域内の様々なタイプの細胞のうち１つの細胞タイプに対する親和性を有する、少なくとも１群のシグナル抗体を用意し；
前記シグナル抗体を、前記標的領域内の前記複数の捕捉抗体と接触させるために、前記少なくとも１群のシグナル抗体を、前記注入ポートを通して前記流体流路内に充填し、；
それぞれ対応する細胞タイプをタグ付けするために、前記少なくとも１群のシグナル抗体を、それぞれ対応する細胞タイプと結合させ、；
非結合シグナル抗体を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；
前記標的領域上で電磁放射ビームを走査させ；そして
タグ付けされてない細胞および前記少なくとも１群のシグナル抗体によりタグ付けされた細胞の数を決定するために、前記標的領域からの帰還ビームを分析すること
を含む、方法。
【請求項１４】
様々なタイプの細胞を有する試験サンプル中の細胞タイプを検出するおよび定量する方法であって、：
中心および外縁を有する実質的に円形の基板、該中心と該外縁の間に配置された標的領域、前記標的領域内の前記実質的に円形の基板に結合し、固定化された様々なタイプの細胞のうち共通の抗原に対する親和性を有する、前記複数の捕捉抗体を含むバイオディスクを用意し；
前記標的領域上に前記試験サンプルを保持させ；
前記標的領域内に前記様々なタイプの細胞を固定化するために、前記複数の捕捉抗体を前記共通の抗原と結合させ、；
非結合細胞を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；
各シグナル抗体は群に固有なレポータ因子が付着しており、シグナル抗体の各群は、前記標的領域内に固定された様々なタイプの細胞のうちの１細胞タイプに対する親和性を有する、少なくとも１群のシグナル抗体を用意し、；
前記少なくとも１群のシグナル抗体を、それぞれ対応する細胞タイプと結合させ、それにより前記それぞれ対応する細胞タイプをタグ付けし；
非結合シグナル抗体を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；そして
タグ付けされてない細胞および前記少なくとも１群のシグナル抗体によりタグ付けされた細胞の数を決定するために、前記標的領域上で電磁放射ビームを走査させること、
を含む、方法。
【請求項１５】
サンプル中の様々な細胞タイプから細胞タイプを検出する光バイオディスクであって、：
中心および外縁を有する実質的に円形の基板；
前記基板に付随する活性層；
前記中心と前記外縁の間に配置された標的領域；および
前記活性層と結合し、前記標的領域内の前記活性層上に固定化された複数の捕捉抗体
を有する、光バイオディスク。
【請求項１６】
前記活性層は、ニトロセルロース、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン無水マレイン酸共重合体および金から成る群より選ばれる、請求項１５に記載の光バイオディスク。
【請求項１７】
前記基板はそこに付随するコードされた情報を含み、前記コードされた情報がディスクドライブアセンブリにより読み取り可能であり、それにより前記バイオディスクの回転を制御する、請求項１６に記載の光バイオディスク。
【請求項１８】
前記基板の表面に形成された反射層をさらに有する、請求項１７に記載の光バイオディスク。
【請求項１９】
前記標的領域と流体連通しているフロー流路および前記フロー流路と流体連通している入口部位をさらに有する、請求項１８に記載の光バイオディスク。
【請求項２０】
酵素をさらに有する光バイオディスクであって、前記酵素は、酵素基質にさらされたとき、入射電磁放射ビームにより検出可能なシグナルを生成する、請求項１９に記載の光バイオディスク。
【請求項２１】
前記複数の捕捉抗体が、細胞上の共通の表面マーカに対する親和性を有する、請求項１９に記載の光バイオディスク。
【請求項２２】
請求項２１の光バイオディスクを用いる、所望の細胞タイプを区別および定量するための方法であって、：
共通の表面マーカを有する、所望の細胞タイプおよび非標的細胞タイプを含有するサンプルであって、前記非標的細胞タイプが固有な表面マーカを有するサンプルを用意し；
前記非標的細胞タイプ上の前記固有な表面マーカに対する親和性を有する抗体に付着したタグ付け因子を用意し；
前記タグ付け因子と前記サンプルを混合し；
前記タグ付け因子を、前記非標的細胞タイプ上の前記固有な表面マーカと結合させ、それにより前記非標的細胞タイプ上の前記共通の表面マーカをブロックし、前記非標的細胞タイプが前記標的領域内の前記複数の捕捉抗体と結合するのを防止し；
前記サンプルを前記標的領域内の前記捕捉抗体と接触させるために、前記サンプルを、
前記入口部位を通して前記フロー流路内に充填し、；
前記捕捉抗体を、前記所望の細胞タイプ上の前記共通の表面マーカと結合させ；
標的領域から非結合非標的細胞を除去するために、前記光バイオディスクを所定の速度および期間にて回転させ；および
前記標的領域内の前記目的細胞タイプの数を決定するために、前記標的領域上で電磁放射ビームを走査させること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記サンプルが、リンパ球および単球を含む単核細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記共通の表面マーカがＣＤ４抗原である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固有な表面マーカがＣＤ１４抗原である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１２に従って作成された光バイオディスクを用いる、様々な細胞タイプを同定および定量する方法であって、：
第１の表面マーカを有する第１の細胞タイプ、第２の表面マーカを有する第２の細胞タイプおよび第３の表面マーカを有する第３の細胞タイプを含む、共通の表面抗原を有する様々な細胞タイプを含有するサンプルを用意し；
前記サンプルを前記標的領域内の前記複数の捕捉抗体と接触させるために、前記サンプルを、前記注入ポートを通して前記フロー流路内に充填し、；
前記標的領域内の前記様々な細胞タイプを固定化するために、前記複数の捕捉抗体を、前記共通の表面抗原と結合させ、；
標的領域から非結合細胞を除去するために、前記光バイオディスクを所定の速度および時間にて回転させ、；
前記第１の表面マーカに対する親和性を有する第一のシグナル抗体が付着した第１のレポータ因子、前記第２の表面マーカに対する親和性を有する第２のシグナル抗体が結合した第２のレポータ因子および第３の表面マーカに対する親和性を有する第３のシグナル抗体が結合した第３のレポータ因子を含む、種々のタイプのレポータ因子を含有する標識溶液を用意し；
前記レポータ因子を前記標的領域内に固定化された前記細胞と接触させるために、前記標識溶液を、前記注入ポートを通して前記フロー流路内に充填し、；
前記第１の細胞タイプを前記第１のレポータ因子で標識するために、前記第１のシグナル抗体を、前記標的領域内の前記第１の細胞タイプ上の前記第１の表面マーカと結合させ、；
前記第２の細胞タイプを前記第２のレポータ因子で標識するために、前記第２のシグナル抗体を、前記標的領域内の前記第２の細胞タイプ上の前記第２の表面マーカと結合させ、；
前記第３の細胞タイプを前記第３のレポータ因子で標識するために、前記第３のシグナル抗体を、前記標的領域内の前記第３の細胞タイプ上の前記第３の表面マーカと結合させ、；
標的領域から非結合レポータ因子を除去するために、前記光バイオディスクを所定の速度および時間にて回転させ；そして
前記標的領域上で電磁放射ビームを走査させ、前記第１のレポータ因子でタグ付けされた細胞の数、前記第２のレポータ因子でタグ付けされた細胞の数および前記第３のレポータ因子でタグ付けされた細胞の数を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２７】
前記サンプルが単核細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記共通の表面抗原がＣＤ４５抗原である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の捕捉抗体が抗ＣＤ４５抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の細胞タイプがリンパ球である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の細胞タイプ上の前記第１の表面マーカが、ＣＤ３抗原、ＣＤ１９抗原およびＣＤ５６抗原から成る群より選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のシグナル抗体が、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ５６抗体から成る群より選ばれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の細胞タイプが単球である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の細胞タイプ上の前記第２の表面マーカが、ＣＤ１４抗原である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２のシグナル抗体が抗ＣＤ１４抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第３の細胞タイプが好酸球である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記第３の細胞タイプ上の第３の表面マーカが、ＣＤ１１６抗原である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第３のシグナル抗体が抗ＣＤ１１６抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試験サンプルから標的細胞を検出および定量する方法であって、：
中心および外縁を有する実質的に円形の基板、前記基板に付随する活性層、前記中心と前記外縁の間に配置された標的領域を含み、前記標的細胞に対する親和性を有し、少なくとも１つの捕捉抗体が前記標的領域内の前記活性層に結合し、固定化した、バイオディスクを用意し；
前記標的領域上に前記試験サンプルを保持させ；
前記試験サンプル中に存在する標的細胞を、前記捕捉抗体と結合させ；
非結合細胞を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；
結合因子と結合する親和因子を有する、複数のシグナル抗体を用意し；
標的細胞をタグ付けするために、前記シグナル抗体を、前記シグナル抗体により認識される抗原を有する標的細胞と結合させ、；
非結合シグナル抗体を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；
各レポータ因子が１つ以上の結合因子を有する、複数のレポータ因子を用意し；
前記レポータ因子を、前記標的領域内の標的細胞と結合したシグナル抗体と結合させ；
非結合レポータ因子を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；そして
タグ付けされた細胞およびタグ付けされてない細胞の数を決定するために、前記標的領域上で電磁放射ビームを走査させ、そして帰還ビームを分析すること
を含む、方法。
【請求項４０】
前記レポータ因子が、光ディスク読み取り装置を用いて検出可能な物理的特性を有するビーズである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記物理的特性が、色、大きさ、質感、反射率、吸光度、質量、蛍光、リン光および磁
気特性から成る群より選ばれる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記レポータ因子が酵素である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記標的領域上に、前記酵素と反応し、それにより検出可能なシグナルを生成する酵素基質を保持することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記親和因子がビオチンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記酵素が、前記親和因子と結合する結合因子と接合される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記結合因子が、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンから成る群より選ばれる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記酵素が、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼから成る群より選ばれる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記酵素基質は、ＴＭＢ（３，３’，５，５’，−テトラメチルベンジジン）、ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＣＮ／ＤＡＢ（４−クロロナフトール／３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩）および４−ＣＮ（４−クロロ−１−ナフトール）から成る群より選ばれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記検出可能なシグナルが、標的細胞に接着する沈殿である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的細胞が、白血球細胞、腫瘍細胞、細菌、ウィルス、単細胞生物、組織由来の細胞および器官由来の細胞から成る群より選ばれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項５１】
標的細胞を検出および定量する方法であって、：
中心および外縁を有する実質的に円形の基板、中心と外縁の間に配置された標的領域および、前記基板の前記標的領域内に結合し、固定化された前記親和因子を含む、バイオディスクを用意し；
表面マーカを有する、前記標的細胞を含有するサンプルを用意し；
前記表面マーカに対する親和性を有する捕捉抗体および前記親和因子に対する親和性を有する結合因子が付着している、レポータ因子を前記サンプルと混合し；
前記レポータ因子で前記標的細胞をタグ付けするために、前記捕捉抗体を、前記標的細胞上の前期表面マーカと結合させ、；
前記標的領域上に、前記タグ付けされた細胞を有する前記サンプルを保持させ；
前記標的領域内の前記標的細胞を固定化するために、前記レポータ因子に付着した前記結合因子を、前記親和因子と結合させ、；
非結合細胞を除去するために、前記標的領域を洗浄し、；そして
前記レポータ因子でタグ付けされた細胞の数を決定するために、前記標的領域上で電磁放射ビームを走査させること
を含む、方法。
【請求項５２】
前記標的細胞が、白血球細胞、腫瘍細胞、細菌、ウィルス、単細胞生物、組織由来の細胞および器官由来の細胞から成る群より選ばれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記親和因子がビオチンである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記結合因子が、ストレプトアビジンおよびニュートラアビジンから成る群より選ばれる、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、包括的には細胞検定、特に光バイオディスクにより実施される細胞検定に関する。より具体的には、本発明は、白血球を含む分画細胞計数を実施する方法および装置並びにかかる細胞計数を行うための光ディスクの使用に関するが、本発明は、実施の最良の形態に記載される本明細書中の特定の実施形態に制限されない。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００３年３月３日付けで出願された米国仮出願第６０／４５１，５８７号（参照により本明細書中に完全に援用される）の利点を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
［関連技術の考察］
多数の研究および診断場面において、細胞の混合物から特異的な細胞を単離して、分析することが必要とされている。特に、原因が、血液、髄液、骨髄、腫瘍ホモジェネート、リンパ系組織などの可能性がある場合には、必要とされる。
【０００４】
血球計数は、診断、処置、および患者の健康を判断するための追跡調査の期間中に使用される。全血球計数（ＣＢＣ（complete blood count））は、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度、平均赤血球容積、血小板計数、および白血球計数を含む試験の集合体である。血球計数は、１立方ｍｍの全血あたりの赤血球および白血球を数えあげることである。
【０００５】
白血球計数（ＷＢＣ（white blood cell count）、白血球）は、血液の標準サンプルの白血球の総数である。正常な健康人では、通常、ＷＢＣ計数は、１マイクロリットル（μｌ）あたり４，０００〜１０，８００個の細胞である。例えば運動、ストレス、および病気といった要因により、これらの値は影響を受ける可能性がある。ＷＢＣが高いということは、感染症、白血病、又は組織の損傷を示すことがある。ＷＢＣ計数が１マイクロリットルあたり１，０００細胞未満になると、感染症の危険が増加する。
【０００６】
分画白血球計数試験（leukocyte differential testing）は、白血球計数自体から得ることができる情報を以上の情報を収集するのに不可欠である。分画白血球計数は、疑わしい新たな感染症又は熱（ＣＢＣが正常な場合であっても）、異常に関連した疾患の疑い、異常な白血球計数、疑いのある白血病、および例えば好酸球増加症、単球増加症、又は好塩基球増加症といった他の異常を見極めるのに使用される。重度の白血球減少症がある場合（例えば薬物治療の副次的なものとして）には、白血球又は分画白血球計数の試験が、繰り返し実行されることがある。処置の間、例えば化学治療又は放射線治療の間、その処置が、癌細胞に加えて健康な血球を欠乏させているかどうかを判断するのに、血球計数は非常に重要である。
【０００７】
分画白血球計数は、コンピュータ化された細胞計数計測装置によって求めることができる。このような装置は、５つの主要な白血球のタイプの総計数および割合を求める。正常な個人では、大多数の好中球（５０〜６０％）、それに次ぐリンパ球（２０〜４０％）、次いで単球（２〜９％）が、わずかな好酸球（１〜４％）および好塩基球（０．５％〜２％）と共に存在する。
【０００８】
リンパ球のカテゴリ内では、さらなるリンパ球およびさらなる細胞のサブタイプが存在する。例えば、リンパ球は、大きくは、Ｔ細胞（胸腺由来リンパ球）およびＢ細胞（ファブリキウス嚢リンパ球（bursal-equivalent lymphocyte））に分けることができ、それぞれ主として細胞媒介性免疫および体液性免疫を担っている。白血球内の群を分類するのに、形態学的特徴が使用されてきたが、形態だけでは、リンパ球のサブタイプの多くの機能を区別するのに不十分であることが分かってきた。様々な機能を有するリンパ球を区別するために、ロゼット（rosetting）による分析、免疫蛍光顕微鏡検査による分析、酵素組織化学による分析、および最近のモノクローナル抗体による分析を含む技法が開発された。Ｔ細胞は、表面上の２つの糖タンパク質（ＣＤ４およびＣＤ８）を含む表面マーカの存在により識別される（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞）。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、抗体媒介性免疫にかかわる。ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞により提示される抗体と結合する。その結果、抗原性物質に対する抗原を分泌する、形質細胞のクローンが発生する。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫にも不可欠である。ＣＤ４＋細胞は、貪食マクロファージおよび樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）により提示される抗原と結合する。次にＴ細胞は、その場所に他の細胞をひきつけるリンフォカインを放出する。結果として炎症、すなわち抗原物質を囲み破壊しようとする、細胞および分子の集積が起こる。
【０００９】
ＣＤ８＋、すなわち細胞障害性／サプレッサータイプ細胞は、結合した細胞を破壊する分子を分泌する。標的細胞がウィルスに感染した場合、他の細胞に感染することができる新規なウィルス群が放出される前に通常その細胞は破壊されるため、この機能は非常に有用である。
【００１０】
［ＨＩＶおよびエイズ］
ヒト免疫不全ウイルスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対する高い親和性を有するレトロウィルスであり、したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、このウィルスの有力な標的である。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、免疫におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性の鮮明で悲劇的な実例を提供する。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ＣＤ４分子に結合し、ＣＤ４＋Ｔ細胞に侵入および感染する。この病気が進行すると、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、その正常な範囲である１マイクロリットル（μｌ）あたり約１，０００個よりも少なくなる。１つの説明は、患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が感染したＣＤ４＋細胞を絶え間なく破壊しようとすることであり得る。
【００１１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が１マイクロリットルあたり４００個よりも少なくなると、免疫応答を高める患者の能力が劇的に低下する。患者は、身体に侵入する病原体だけではなく、通常は我々に危害を加えることなく我々の組織に存在する微生物、特に細菌に過敏になる。最終的には、患者は、カンジダ症、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューモシスティス・カリニ肺炎、トキソプラズマ症、結核その他のような日和見感染症で死亡する。
【００１２】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞比の推定は、免疫低下症のヒト患者における免疫健康を評価するのに有用である。例えば、エイズを有する個人は、免疫におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の重要性を示す。この病気が進行するに従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、正常範囲である約１，０００細胞／μｌを下回る。患者のＣＤ８＋Ｔ細胞が感染ＣＤ４＋Ｔ細胞を破壊するに従って、非感染ＣＤ４＋細胞はアポトーシスを被る。したがって、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の比は、病気の進行に対する診断マーカを提供する。米国公衆衛生局は、全ての感染者において、３〜６月ごとにＣＤ４＋レベルをモニターすることを推奨している（米国においては、毎年４０，０００，０００試験が６００の試験研究所で行われている）。
【００１３】
ＣＤ４およびＣＤ８に加えて、リンパ球のサブタイプの識別に使用できる他の多くの細
胞表面抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ４５、およびＣＤ５６）が存在する。抗体技法によってこれらの細胞表面抗原を検出できることにより、診断病理学には新しい局面が加えられ、様々な技法を、ヘマトリンパ球（hematolymphoid）疾患（例えば、ＡＩＤＳ、白血病、およびリンパ腫）の免疫表現型（immunophenotype）の研究に利用することができる。例えば放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）といった従来のマイクロ免疫検定法（microimmuno-assay）は、対応した分析物（analyte）の存否を検出するために、同位体、酵素、又は蛍光物質をそれぞれ使用する。
【００１４】
［白血病免疫表現型］
白血病における表面マーカは、診断および予後目的のため、腫瘍系統（lineage）を同定するのを助ける。総合的白血病表現型の検査は、病歴および形態の再検討に始まり、各症例に関して一団のマーカが選ばれる。ほとんどの場合、系統はＴ細胞、Ｂ細胞又はミエロイドと同定され得、診断（すなわち鑑別診断）がされ得る。
【００１５】
白血病表現型検査の狙いは、腫瘍過程における細胞タイプの同定である。この表現型同定は、白血病又はリンパ腫の分類の手助けとして、細胞系統および成熟レベルの概要を示す。さらに、この表現型同定は、細胞集団が正常か異常かの同定および病気の緩和、発達および再発をモニターするため、試料中の予め特徴付けられた細胞集団の検出を支援する。
【００１６】
白血病免疫表現型検査は、血液又は骨髄標本で行われるが、他の体液又は組織で試験されてもよい。ＲＢＣ溶解方法又は密度勾配単離（例えば、フィコール・ハイパック）を用いて得られた白血球が使用され得る。可能であれば、総白血球計数および分画を処理前に行い、細胞濃度をそれに従って調節する。
【００１７】
［リンパ腫免疫表現検定］
リンパ腫における表面マーカは、診断および予後目的のため、腫瘍系統を同定するのを助ける。総合的白血病／リンパ腫表現型の検査は、病歴および形態の再検討に始まり、各場合に関して一団のマーカが選ばれる。ほとんどの場合、系統はＴ細胞、Ｂ細胞又はミエロイドと同定され得、診断（すなわち分画診断）がされ得る。
【００１８】
リンパ腫表現型検査の狙いは、腫瘍過程における細胞タイプの同定である。この表現型同定は、リンパ腫の分類の手助けとして、細胞系統および成熟レベルの概要をしめす。さらに、この表現型同定は、細胞集団が正常か異常かの同定および病気の緩和、発達および再発をモニターするため、試料中の予め特徴付けられた細胞集団の検出を支援する。
【００１９】
全血球計数（白血球計数を含む）を行う。血球計数は、治療に対する病気の反応の重要な指標である。これらの計数はまた、薬剤治療又は放射線療法の効果を知るために重要である。白血球計数は、通常血液中で約４，０００〜１１，０００ｃｍ3である。総ＷＢＣ計数が１１，０００細胞／ｍｍ3を超える場合、身体の感染に対する普通の反応である、白血球増加症と見なされる。血液計数は、薬剤が作用しているかを決定するのを助ける。伝統的には、細胞計数は、ＦＡＣＳスキャナのような高価な電子カウンタにより行われ、試験を行うには技術的専門知識が必要とされた。各細胞タイプのパターンは、リンパ腫が存在するか否かおよびリンパ腫のタイプを示唆する。
【００２０】
［モノクローナル抗体パネル］
いくつかの場合では単色免疫蛍光が適切であるにもかかわらず、多くの実験室では多色免疫蛍光を使用する。決まって含まれる抗体は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ４５、
ＣＤ１０３、ＦＭＣ７、重鎖、κおよびλである。臨床的又は形態的特徴が「Ｔ」又は「ＮＫ」リンパ球障害を示す時は、以下の付加的な抗体組み合わせも行われる：ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８、ＣＤ７／ＣＤ５／ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ２５／ＣＤ２／ＣＤ３、ＣＤ１６／ＣＤ５６／ＣＤ１９、ＣＤ５７／ＣＤ８／ＣＤ３、ＴＣＲα−β／δ−γ／ＣＤ３。
【００２１】
抗体技法によって細胞関連抗原を検出できることにより、診断病理学には新しい局面が加えられた。様々な技法を、ヘマトリンパ球疾患の免疫表現型の研究に利用することができる。しかし、様々な癌に加え、後天性免疫不全症候群およびＴ細胞白血病等のウイルスによる病気を含む、数々の病気を広く検出する方法において、抗体抗原反応を利用した免疫検定法のさらなる開発が必要とされる。当業者には明確であるように、現発明の検定法および光バイオディスクシステムは、かかる免疫検定を行うのに用いられてもよい。
【００２２】
放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）のような従来のマイクロ免疫検定法は、同位体、酵素、又は蛍光物質と特異的にそれぞれ反応する、対応した抗体又は抗原の存否を検出するために、当該同位体、酵素、又は蛍光物質をそれぞれ使用する。しかしながら、上記の方法には限界および欠点がある。ＲＩＡは、特別な設備、予備対策、半減期の制限、および種々の他の要因を必要とする。着色又は発光により標識を測定する際に酵素又は蛍光物質を用いる方法は、過剰な未結合且つ未反応の試薬を除去するために幾つかの洗浄工程を必要とすることに加えて、比色又は蛍光反応を検出するために高精度で複雑な機器を必要とする。さらに、細胞（特にリンパ球および癌細胞）および同様の試料を検出する上記の方法の適用には、高性能な調製、検出、および分析の技術の改良が必要である。
【００２３】
細胞表面抗原に特異的な蛍光抗体の使用に関して開発された強力な手段は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）の技法である。これは、非常に信頼性が高く、高速且つ高精度の方法である。フローサイトメトリは、自動化されたおよび定量的な、最も実用的な方法である。フローサイトメトリ分析のためのサンプルの主要な要件は、サンプルが単分散性の懸濁液中にあり、所望の細胞が蛍光マーカで標識されることである。しかし、これは非常に高価な試験であり、システム全体が、臨床分析実験室および高価な機器において、訓練された技術者により扱われる必要がある。モノクローナル抗体は、多数の細胞を客観的に定量するフローサイトメトリにおいて、別々のプローブとして用いられる。
【００２４】
さらに、フローサイトメトリの基礎的な欠点は、一度分析された細胞を、繰り返し分析又はさらなる調査（例えば希少細胞（rare event cell）の顕微鏡検査）に用いることができなくなることである。フローサイトメトリに関する利点および欠点を有する多くの代替的技術が開発されたが、全て、それぞれに特異的な問題へと導いた。
【００２５】
表面マーカ分析は非常に有用な実験手段であり、特に、白血病、リンパ腫、および免疫不全症の研究において非常に有用である。抗体ベースのマイクロアレイ技術は、確かに、特に臨床診断における、血液サンプルおよび組織サンプルを含む、サンプル中の特異的抗原の識別に関する最新技術である。ほとんどの診断試験は、限られたサンプル集団（癌、白血病、リンパ腫、甲状腺疾患など）のみの判定を必要とする。したがって、１回の試験において臨床的に関連するすべてのパラメータを同時に測定するにあたり、技術の小型化によりごく少量の血液サンプルしか必要でないこと、および実験室職員の時間および費用が節約されることは、その費用効率、労働効率、および簡単さにより、病院の実験室およびポイントオブケア設備にとって極めて魅力的である可能性が高い。
【００２６】
従来技術のシステムおよび細胞計数方法に対する代替として、本発明者等は、細胞（特に、血液およびＣＳＦのような他の体液に感染する寄生生物および病原体を含む、血球）の分析、検出および定量をする簡便且つ安価なシステムを開発した。様々な血球、寄生生
物および病原体を同定するため、関連する情報並びにシグナル処理方法およびソフトウェアが開発された。
【００２７】
従来の方法およびシステムと比較して、本発明者等は、簡便、小型、超高感度および安価な、細胞分析をするシステムを開発した。このシステムは、情報およびシグナル処理方法およびソフトウェアに加えて、光バイオディスク、関連検出アセンブリを使用する。
【発明の開示】
【００２８】
［発明の概要］
マイクロテクノロジーは、特に細胞タイプ、寄生生物、病原体および他の生物学的物質を同定する診療的診断において、大変重要である。本発明は、光バイオディスク上で全血球中の分画白血球計数を行うために、マイクロテクノロジーを用いる。さらに、本発明は、血球の画像化、分画白血球計数を行うことおよび関連した処理方法およびソフトウェアを対象とする。
【００２９】
本試験および検定は、２通りで行われ得る。第一の方法は、光バイオディスク上に位置する特殊なチャネル中の血球の光学的画像化の原理に基づく。約７μｌの全血が、ディスク上の特殊に設計されたチャネル内に注入される。これらの様々な白血球サブタイプを同定し且つ白血球分画計数を生じる細胞認識ソフトウェアで、画像を分析する。第二の方法は、特異的な細胞に対する細胞特異的抗体を用いた特異的細胞捕捉に基づく。この特定の場合では、抗体はリンパ球（ＣＤ４、ＣＤ２、ＣＤ１９）、単球（ＣＤ１４）、好酸球（ＣＤ１５）等を対象とする。これらの白血球サブタイプ特異的抗体は、フローチャンバを含むバイオディスク内の固相表面に、集合／接着する。
【００３０】
細胞タイプの同定および定量の特異性を増大するために、捕捉された細胞は、微粒子又は所望の細胞タイプ若しくは不要な細胞若しくは汚染細胞を対象とする特異的抗体で被覆されたビーズによりタグ付けされ、ビーズ−細胞複合体を形成してもよい。この方法は、捕捉領域における、特異的標的細胞と汚染細胞の区別を可能にする。細胞の同定におけるビーズの使用に関するさらなる詳細を、図１８〜図２４と共に以下に検討する。
【００３１】
バイオディスクドライブアセンブリは、ディスクの回転、ディスク上に記憶された任意の符号化情報の読み出しおよび処理、並びにバイオディスクのフローチャンバの細胞捕捉領域の分析に使用される。バイオディスクドライブには、バイオディスクを回転させるモータと、ディスクの回転速度を制御するコントローラと、ディスクからの帰還信号（return signal）を処理するプロセッサと、処理されたシグナルを分析する分析装置とが設けられる。回転速度は、可変であり、回転の速さと時間の双方に応じて厳密に回転速度を制御することができる。また、バイオディスクは、フローチャンバおよび標的領域の試験物質が、ドライブの読み取りビームによって呼びかけ（interrogated）を受け、分析装置によって分析される前又はその後において、当該バイオディスクに情報を書き込むことに利用することもできる。バイオディスクは、ディスクの回転を制御する符号化情報と、行われる細胞免疫型検定の型に特有の情報の処理を提供する符号化情報と、その結果をバイオドライブに関連したモニタに表示する符号化情報とを含むことができる。
【００３２】
全体として分画細胞計数プロトコルは、また特に分画白血球計数プロトコルは、ＣＤフォーマット、ＣＤ−Ｒフォーマット、ＤＶＤフォーマット又はＤＶＤ−Ｒフォーマット、これらのフォーマットの変更版およびそれらの代替物に対して開発される。ドライブの読み取りビーム又は呼びかけビーム（interrogation beam）は、分析サンプル内の様々な細胞を検出し、分画細胞計数ソフトウェアにより分析を受けることができる画像を生成する。
【００３３】
これらの単調で根気のいる細胞計数検定を行うには、微視的方法又は高機能な細胞計数器が不可欠である。本方法は、光バイオディスクおよび関連するアセンブリを使用する。様々な細胞タイプの光画像および分析チャンバ内で結合されていない（free）ビーズ−細胞複合体、又は、特異的抗体方法によって捕捉されたそれらの光画像が、細胞認識ソフトウェアプログラムによって生成され分析され、この細胞認識ソフトウェアプログラムは、血液又は他の体液内の様々な細胞要素をそれらの光散乱特性により識別する。本方法は、分析の前に、細胞染色、ＲＢＣ削除、又は他の根気のいるプロトコルといったサンプルの処理をなんら要しないようにできる。これらの方法は、以下に図面と共に詳細に述べる、上部検出器、底部検出器、イベント計数器、若しくは細胞計数器を使用する光ディスク読み取り装置を用いる微視的分析又は細胞検出を含む。
【００３４】
本発明の分画細胞計数法の正確度および精密度をさらに増大するために、種々の細胞集団をタグ付け又は標識してもよい。これらのタグは、例えばミクロスフェア、蛍光標識抗体および酵素結合抗体を含んでよい。サンプルおよび／又はレポータ分子のタグ付け又は標識を伴う他の態様に関するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲渡人に譲渡されて同時係属中である、２００２年４月１１日付けで出願された「Multi-Parameter Assays Including Analysis Discs and Methods Relating Thereto」と題する米国出願番号１０／１２１，２８１号（参照により本明細書中に完全に援用される）中に開示されている。
【００３５】
本発明又はその様々な態様は、以下の同一の譲受人に譲渡された同時係属中の特許出願に開示されるディスク、検定、およびシステムにおいて容易に実施されるか、それに適応されることができる。１９９９年８月２３日付けで出願された「Methods and Apparatus for Analyzing Operational and Non-operational Data Acquired from Optical Discs」と題する米国特許出願第０９／３７８，８７８号、１９９９年８月２３日付けで出願された「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する米国仮特許出願第６０／１５０，２８８号、１９９９年１０月２６日付けで出願された「Trackable Optical Discs with Concurrently Readable
Analyte Material」と題する米国特許出願第０９／４２１，８７０号、２０００年８月２１日付けで出願された「Methods and Apparatus for Optical Disc Data Acquisition Using Physical Synchronization Markers」と題する米国特許出願第０９／６４３，１０６号、２００１年１１月１５日付けで出願された「Optical Biodiscs with Reflective Layers」と題する米国特許出願第０９／９９９，２７４号、２００１年１１月１６日付けで出願された「Methods and Apparatus for Detecting and Quantifying Lymphocytes with Optical Biodiscs」と題する米国特許出願第０９／９８８，７２８号、２００１年１１月１９日付けで出願された「Methods and Apparatus for Blood Typing with Optical Bio-discs」と題する米国特許出願第０９／９８８，８５０号、２００１年１１月２０日付けで出願された「Apparatus and Methods for Separating Agglutinants and Disperse
Particles」と題する米国特許出願第０９／９８９，６８４号、２００１年１１月２７日付けで出願された「Dual Bead Assays Including Optical Biodiscs and Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第０９／９９７，７４１号、２００１年１１月３０日付けで出願された「Apparatus and Methods for Separating Components of Particulate
Suspension」と題する米国特許出願第０９／９９７，８９５号、２００１年１２月７日付けで出願された「Optical Discs for Measuring Analytes」と題する米国特許出願第１０／００５，３１３号、２００１年１２月１０日付けで出願された「Methods for Detecting Analytes Using Optical Discs and Optical Disc Readers」と題する米国特許出願第１０／００６，３７１号、２００１年１２月１０日付けで出願された「Multiple Data Layer Optical Discs for Detecting Analytes」と題する米国特許出願第１０／００６，６２０号、２００１年１２月１０日付けで出願された「Optical Disc Assemblies for Performing Assays」と題する米国特許出願第１０／００６，６１９号、２００１年１２月１４日付けで出願された「Detection System For Disk-Based Laboratory and Improved 
Optical Bio-Disc Including Same」と題する米国特許出願第１０／０２０，１４０号、２００１年１２月２１日付けで出願された「Surface Assembly for Immobilizing DNA Capture Probes and Bead-Based Assay Including Optical Bio-Discs and Methods Relating Thereto」と題する米国特許出願第１０／０３５，８３６号、２００２年１月４日付けで出願された「Dual Bead Assays Including Covalent Linkages for Improved Specificity and Related Optical Analysis Discs」と題する米国特許出願第１０／０３８，２９７号、２００２年１月１０日付けで出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Methods for Biological and Medical Imaging」と題する米国特許出願第１０／０４３，６８８号、２００２年１月１４日付けで出願された「Optical Disc Analysis System Including Related Signal Processing Methods and Software」と題する米国仮特許出願第６０／３４８，７６７号、２００２年２月２６日付けで出願された「Methods for DNA Conjugation Onto Solid Phase Including Related Optical Biodiscs and Disc Drive Systems」と題する米国特許出願第１０／０８６，９４１号、２００２年２月２８日付けで出願された「Methods for Decreasing Non-Specific Binding of Beads in Dual Bead Assays Including Related Optical Biodiscs and Disc Drive Systems」と題する米国特許出願第１０／０８７，５４９号および２００２年３月１４日付けで出願された「Dual Bead Assays Using Cleavable Spacers and/or Ligation to Improve Specificity and Sensitivity Including Related Methods and Apparatus」と題する米国特許出願第１０／０９９，２５６号。
【００３６】
これら全ての出願は、参照により本明細書中に完全に援用される。したがってこれらは、本明細書中でその全体が繰り返されるのと同様に、本発明を支持する背景および関連開示を提供する。
【００３７】
本発明のさらに別の目的は、当該目的に寄与する別の特徴および当該目的から生じる利点と共に、以下の本発明の好ましい実施形態の説明から明らかになる。この好ましい実施形態は、添付図面に示される。添付図面では、全体を通して、同じ参照番号は同じ構成要素を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
［発明の説明］
本発明は、ディスクドライブシステム、光バイオディスク、細胞検定および定量検定を対象とする。より具体的には、本発明は、例えば白血球を含む、細胞定量のための生物学的サンプル中にある様々な細胞集団を分画する方法およびかかる細胞定量を行うための光ディスクの使用に関するが、本発明は、実施の最良の形態に記載される本明細書中の特定の実施形態に制限されない。本発明の各態様は、さらに詳細に以下に検討される。
【００３９】
ドライブシステムおよび関連したディスク
図１は、本明細書で開示される分画細胞計数を行うために実施される本発明による光バイオディスク１１０の斜視図である。本光バイオディスク１１０は、光ディスクドライブ１１２および表示モニタ１１４と共に示される。
【００４０】
図２は、光バイオディスク１１０の一実施形態の主要な構造上の要素の分解斜視図である。図２は、本発明で使用することができる反射領域の光バイオディスク１１０（以下「反射型ディスク」という）の例である。主要な構造上の要素には、キャップ部１１６、接着部材１１８および基板１２０が含まれる。キャップ部１１６は、１つ以上の注入ポート１２２および１つ以上の排出ポート１２４を備える。キャップ部１１６は、ポリカーボネートから形成することができ、図２の斜視図から見られるように、その底部は、反射面１４６（図４により良好に図示される）で被覆されることが好ましい。好ましい形態では、トリガーマーキング１２６は反射層１４２（図４により好適に図示される）の表面に含ま
れる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、又は反射区域若しくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、又は反射区域若しくは半反射区域は、情報により符号化される。この情報は、図１０に示すように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すように、呼びかけビーム又は入射ビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。図２に示す第２の要素は、流体回路１２８、すなわちＵ字型流路が形成された接着部材１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、又は、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路１３０および帰還流路１３２を備える。図２に示す流体回路１２８の幾つかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路１３０に対して対称的に形成される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路１３０の一方の側に形成される。図２に示す第３の要素は、標的領域又は捕捉領域１４０を備えた基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図４に示すように、その最上部には反射層１４２が保持されている。標的領域１４０は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状に反射層１４２を除去することにより形成される。あるいは、標的領域１４０は、反射層１４２を施す前に標的領域１４０区域をマスクすることを含むマスク技法によって形成することもできる。反射層１４２は、例えばアルミニウム又は金といった金属から形成することができる。
【００４１】
図３は、図２に示す光バイオディスク１１０の平面図であり、ディスク内に位置する流体回路１２８、標的領域１４０、およびトリガマーキング１２６が見えるように、キャップ部上の反射層１４２が、透明で示されたキャップ部１１６上に示されている。
【００４２】
図４は、本発明の一実施形態による反射領域型の光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。この図は、光バイオディスク１１０の様々な層の一部を含み、この一部は、それぞれの主要な層、基板、コーティング、又は膜の部分断面図を示すために切り取られている。図４は、反射層１４２で被覆された基板１２０を示す。反射層１４２上には、活性層１４４が施される。好ましい実施形態では、活性層１４４は、ポリスチレンから形成することができる。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス（activated glass）、変性ガラス（modified glass）、又は変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸共重合体（polystyrene-co-maleic anhydride）を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することができる。あるいは、別にこの実施形態に示すように、活性層１４４上には、プラスチック接着部材１１８を施す。プラスチック接着部材１１８の露出部分は、切り取られたか、又は、刻印されたＵ字型を示し、このＵ字型が流体回路１２８を生成する。本バイオディスクのこの反射領域の実施形態の最後の主要な構造上の層は、キャップ部１１６である。キャップ部１１６は、その底部に反射面１４６を備える。反射面１４６は、アルミニウム又は金といった金属から作成することができる。
【００４３】
図５は、本発明による透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造上の要素の分解斜視図である。この透過型の光バイオディスク１１０の主要な構造上の要素も、同様に、キャップ部１１６、接着部材１１８および基板１２０の層を備える。キャップ部１１６は、１つ以上の注入ポート１２２および１つ以上の排出ポート１２４を備える。キャップ部１１６は、ポリカーボネート層から形成することができる。図６および図９に最もよく示すように、オプションのトリガマーキング１２６を、薄い半反射層１４３の表面に備えることができる。トリガマーキング１２６には、バイオディスクの３つの層すべての透明窓、不透明区域、又は反射区域若しくは半反射区域が含まれ得る。これらの透明窓、不透明区域、又は反射区域若しくは半反射区域は、情報により符号化される。この情報は、図１０に示すように、プロセッサ１６６にデータを送信し、次に、図６および図１０に示すよう
に、呼びかけビーム１５２の操作機能とやり取りを行う。
【００４４】
図５に示す第２の要素は、流体回路１２８、すなわちＵ字型流路が形成された接着部材１１８である。この流体回路１２８は、膜に刻印するか、又は、膜を切り取ってプラスチック薄膜を除去し、図示するような形状を形成することにより形成される。流体回路１２８のそれぞれは、フロー流路１３０および帰還流路１３２を備える。図５に示す流体回路１２８の幾つかは、混合チャンバ１３４を備える。２つの異なる型の混合チャンバ１３４が示されている。第１のものは、フロー流路１３０に対して対称的に形成される対称混合チャンバ１３６である。第２のものは、オフセット混合チャンバ１３８である。このオフセット混合チャンバ１３８は、図示するように、フロー流路１３０の一方の側に形成される。
【００４５】
図５に示す第３の要素は、標的領域又は捕捉領域１４０を備えることができる基板１２０である。基板１２０は、ポリカーボネート製であることが好ましく、図６に示すように、その最上部には薄い半反射層１４３が保持されている。図５および図６に示すディスク１１０の基板１２０に関連した半反射層１４３は、図２、図３、および図４に示す反射型ディスク１１０の基板１２０上の反射層１４２よりもかなり薄くなっている。この薄い半反射層１４３により、呼びかけビーム１５２の一部は、図１２に示すように、透過型ディスクの構造上の層を透過することができる。薄い半反射層１４３は、例えばアルミニウム又は金といった金属から形成することができる。
【００４６】
図６は、図５に示す光バイオディスク１１０の透過型の実施形態の基板１２０および半反射層１４３の拡大斜視図である。薄い半反射層１４３は、例えばアルミニウム又は金といった金属から作成することができる。好ましい実施形態では、図５および図６に示す透過型ディスクの薄い半反射層１４３は、約１００〜３００Åの厚さであり、４００Åを越えない。この薄い半反射層１４３により、入射ビーム又は呼びかけビーム１５２の一部は、半反射層１４３を貫通して、通過することが可能になり、それによって、図１０に示す上部検出器１５８によって検出される。一方、その光の一部が反射されて、すなわち入射経路に沿って戻される。以下に示すように、表１は、金の薄膜の厚さに対する反射特性および透過特性を示している。金の薄膜層は、８００Åよりも厚くなると、完全反射となる。一方、光が金の薄膜を透過する閾値不透明度は、約４００Åである。
【００４７】
【表１】
2007501407.tif 000003
【００４８】
表１に加えて、図７は、金の厚さに基づく薄い半反射層１４３の反射特性および透過特性の逆の関係のグラフ表示を提供する。図７に示すグラフで使用される反射値および透過値は、絶対値である。
【００４９】
図８は、図５および図６に示す透過型光バイオディスク１１０の平面図である。透明なキャップ部１１６は、ディスク内に位置する流体流路、トリガマーキング１２６、および標的領域１４０を見せている。
【００５０】
図９は、本発明の透過型ディスクの実施形態による光バイオディスク１１０の拡大斜視図である。このディスク１１０は、その様々な層の一部が、それぞれの主要な層、基板、コーティング、又は膜の部分断面図を示すために切り取られて示されている。図９は、透明なキャップ部１１６と、基板１２０上の薄い半反射層１４３と、トリガマーキング１２６とを有する透過型ディスクフォーマットを示している。トリガマーキング１２６は、キャップの上部に配置された不透明材を備える。あるいは、トリガマーキング１２６は、ディスクの薄い反射層１４３にエッチングされた透明な非反射窓、又は、図１０に示すトリガ検出器１６０から到来するシグナルを吸収する、すなわち反射しない任意のマークによって形成することができる。また、図９は、図示した形状、あるいは、任意の所望の形状で、指定した区域をマーキングすることにより形成される標的領域１４０も示している。標的領域１４０を示すマーキングは、基板１２０上の薄い半反射層１４３又は（ディスクの下の）基板１２０の底部に作成することができる。あるいは、標的領域１４０は、標的領域１４０を除く薄い半反射層１４３全体をマスクすることを含むマスク技法によって形成することもできる。この実施形態では、標的領域１４０は、薄い半反射層１４３上のシルクスクリーンインクによって作成することができる。活性層１４４は、薄い半反射層１４３上に施される。好ましい実施形態では、活性層１４４は、２％のポリスチレンからなる４０〜２００μｍの厚さの層である。あるいは、ポリカーボネート、金、活性ガラス、変性ガラス、又は変性ポリスチレン、例えばポリスチレン無水マレイン酸共重合体を使用することができる。さらに、ヒドロゲルを使用することができる。この実施形態に示すように、活性層１４４上には、プラスチック接着部材１１８が施される。プラスチック接着
部材１１８の露出部分は、切り取られたか、又は、刻印されたＵ字型を示し、このＵ字型が流体回路１２８を生成する。本バイオディスク１１０のこの透過型の実施形態の最後の主要な構造上の層は、透明なキャップ部１１６である。このキャップ部１１６は、注入ポート１２２および排出ポート１２４を備える。
【００５１】
図１０は、光コンポーネント１４８と、入射ビーム又は呼びかけビーム１５２を生成する光源１５０と、帰還ビーム１５４と、透過ビーム１５６とを示すブロック斜視図である。図４に示す反射バイオディスクの場合、帰還ビーム１５４は、光バイオディスク１１０のキャップ部１１６の反射面１４６から反射される。本光バイオディスク１１０のこの反射型の実施形態では、帰還ビーム１５４は、底部検出器１５７によって検出され、シグナル要素が存在する場合には分析される。他方、透過バイオディスクフォーマットでは、透過ビーム１５６が、上部検出器１５８によって検出され、シグナル要素が存在する場合には分析も行われる。透過型の実施形態では、上部検出器１５８として、光検出器を使用することができる。
【００５２】
また、図１０は、ディスク上のトリガマーキング１２６とトリガ検出器１６０とを含むハードウェアトリガメカニズムも示している。このハードウェアトリガメカニズムは、反射バイオディスク（図４）および透過バイオディスク（図９）の双方で使用される。トリガメカニズムにより、プロセッサ１６６は、呼びかけビーム１５２がそれぞれの標的領域１４０にある場合にのみデータを収集することが可能になる。さらに、透過バイオディスクシステムでは、ソフトウェアトリガも使用することができる。このソフトウェアトリガは、呼びかけビーム１５２が、それぞれの標的領域１４０の端部に当たるとすぐに、底部検出器を使用して、プロセッサ１６６にシグナルを送り、データを収集する。さらに、図１０は、駆動モータ１６２と、光バイオディスク１１０の回転を制御するコントローラ１６４とを示している。また、図１０は、別の場合に実施されるプロセッサ１６６および分析装置１６８を示しており、これらは、帰還ビーム１５４と、透過型光バイオディスクに関連した透過ビーム１５６とを処理する。
【００５３】
図１１は、本発明による光バイオディスク１１０の反射型ディスクの実施形態の部分断面図である。図１１は、基板１２０および反射層１４２を示している。上述したように、反射層１４２は、例えば、アルミニウム、金、又は他の適切な反射材といった材料から作成することができる。この実施形態では、基板１２０の上面は滑らかになっている。また、図１１は、反射層１４２上に施される活性層１４４も示している。また、図１１に示すように、標的領域１４０は、所望の場所の反射層１４２の区域又は一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を施す前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図１１にさらに示すように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に施される。また、図１１は、キャップ部１１６、および、当該キャップ部１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、キャップ部１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路１３０が形成される。図１１に示す矢印により図示するように、入射ビーム１５２の経路は、最初、ディスク１１０の下から基板１２０の方向に向けられている。次いで、この入射ビームは、反射層１４２の近くの一点にフォーカスする。このフォーカスは、反射層１４２が存在しない場所では、標的領域１４０で起こるので、入射は、活性層１４４を通ってフロー流路１３０内に入る経路に沿って進み続ける。その後、入射ビーム１５２は、上方に進み続けてフロー流路を横切り、最終的には反射面１４６に入射する。この時点で、入射ビーム１５２は、入射経路に沿って戻され、すなわち反射されて帰還し、それによって帰還ビーム１５４を形成する。
【００５４】
図１２は、本発明によるバイオディスク１１０の透過型の実施形態の部分断面図である。図１２は、透明キャップ部１１６と、基板１２０上の薄い半反射層１４３とを有する透
過型ディスクフォーマットを示している。また、図１２は、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４も示している。好ましい実施形態では、この透過型ディスクは、約１００〜３００オングストロームの厚さの例えばアルミニウム又は金といった金属から作成された薄い半反射層１４３を有し、４００オングストロームを越えることはない。この薄い半反射層１４３により、図１０に示す光源１５０からの入射ビーム又は呼びかけビーム１５２の一部は、ディスクを貫通して上方に通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部は、反射され、入射ビームと同じ経路に沿って逆方向に戻る。この配置では、帰還ビーム又は反射ビーム１５４は、半反射層１４３から反射される。したがって、このようにして、帰還ビーム１５４はフロー流路１３０に入ることはない。反射光又は帰還ビーム１５４は、図１３および図１４と共に、より詳細に説明するように、半反射層１４３内又は半反射層１４３上に形成される事前に記録された情報トラック上の入射ビーム１５２を追跡するために使用することができる。図１２に示すディスクの実施形態では、画定された標的領域１４０が存在してもよいし、存在しなくてもよい。標的領域１４０は、基板１２０上の薄い半反射層１４３上に作成される直接マーキングによって生成することができる。これらのマーキングは、シルクスクリーニング又は任意の同等の方法を使用して形成することができる。標的領域を画定するのに物理的な印が使用されない実施形態では、フロー流路１３０は、実際には、検査特徴（investigational feature）の検査が行われる限られた標的区域として使用されてもよい。
【００５５】
図１３は、本発明によるバイオディスク１１０の反射型ディスクの実施形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１３は、基板１２０および反射層１４２を含む。この実施形態では、基板１２０は一連の溝１７０を備える。これらの溝１７０は、ディスクの中心近くから外側端部に向かって伸びる螺旋形状である。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がディスクの螺旋溝１７０に沿って追従できるように実施される。この型の溝１７０は、「ウォブル溝」として知られている。波状の、又は、波打つ側壁を有する底部は、溝１７０を形成する一方、高くなった、又は、立ち上がった部分は、隣接する溝１７０を螺旋状に分離する。この実施形態で溝１７０上に施された反射層１４２は、図示するように、性質上等角である。また、図１３は、反射層１４２上に施された活性層１４４も示している。図１３に示すように、標的領域１４０は、所望の場所の反射層１４２の区域又は一部を除去することによるか、あるいは、反射層１４２を施す前に所望の区域をマスクすることにより形成される。図１３にさらに示すように、プラスチック接着部材１１８が活性層１４４上に施される。また、図１３は、キャップ部１１６および当該キャップ部１１６に関連した反射面１４６も示している。したがって、キャップ部１１６が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路１３０が形成される。
【００５６】
図１４は、図１２に示す本発明によるバイオディスク１１０の透過型ディスクの実施形態のトラックを横切った断面図である。この図は、ディスクの半径およびフロー流路に沿って縦方向に描かれている。図１４は、基板１２０および薄い半反射層１４３を示している。この薄い半反射層１４３により、光源１５０からの入射ビーム又は呼びかけビーム１５２は、ディスクを貫通して通過することが可能になり、上部検出器１５８によって検出される。一方、光の一部が反射され、帰還ビーム１５４の形で戻る。薄い半反射層１４３の厚さは、ディスク読み取り装置がその追跡能力を維持するのに必要とされる反射光の最小量によって決定される。この実施形態の基板１２０は、図１３で論考した基板と同様に、一連の溝１７０を備える。この実施形態の溝１７０も、ディスクの中心近くから外側端部に向かって伸びる螺旋形状であることが好ましい。溝１７０は、呼びかけビーム１５２がこの螺旋に沿って追従できるように実施される。また、図１４は、薄い半反射層１４３上に施された活性層１４４も示している。図１４にさらに示すように、プラスチック接着部材１１８が、活性層１４４上に施される。また、図１４は、反射面１４６を有さないキ
ャップ部１１６も示している。したがって、キャップ部が、所望の切り取り形状を備えたプラスチック接着部材１１８に貼付されると、それによって、フロー流路１３０が形成され、入射ビーム１５２の一部は、ほぼ反射されることなく、フロー流路１３０を通過することができる。
【００５７】
図１５は、反射型ディスクの全層と、反射型ディスクの最初の反射特性とを示す図１１と同様の図である。図１６は、透過型ディスクの全層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１２と同様の図である。これらの切断面は、溝１７０に沿って切断されたものであるので、図１５および図１６には、溝１７０は見えない。図１５および図１６は、これらの実施形態の溝１７０に垂直に位置する狭いフロー流路１３０が存在することを示している。図１３、図１４、図１５、および図１６は、それぞれの反射型ディスクおよび透過型ディスクの全層を示している。これらの図では、入射ビーム１５２が、最初に、基板１２０と相互作用することが示されている。基板１２０は、入射ビームの経路を図示するように変更して、反射層１４２又は薄い半反射層１４３上でビーム１５２のフォーカスを提供する屈折特性を有する。
【００５８】
全血液からの所望の細胞の単離
図１７は、上記で説明した光バイオディスクシステムを用いた、クラスタ分化（ＣＤ:cluster marker）マーカ検定のための血液サンプルの調整分析を示す、画像的フローチャートである。工程１において、血液（４〜８ｍｌ）を直接４又は８ｍｌのＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）に回収し、ＥＤＴＡ、クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）又はヘパリンのような抗凝血剤を加える。本発明の別の実施形態における相当する工程では、抗凝血剤中の３ｍｌの血液を、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Sigma Diagnostics, St. Louis, MO）のような分離勾配１７６を含有するチューブ１７２中にかぶせる。いかなる場合でも、回収から２時間以内で血液サンプル１７４を使用することが好ましい。分離勾配１７６とそこにかぶさった血液サンプル１７４を含有するチューブ１７２を、水平ロータおよび回転バケツを有するバイオハザード遠心分器中で、１，５００〜１，８００ＲＣＦ（２，８００ｒｐｍ）室温で２５分間遠心分離する。遠心分離後、単球細胞（ＭＮＣ）分画１８０上約２ｍｍの血漿を残して、血漿層１７８を除去する（工程２）。ＭＮＣ層１８０を回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄する。細胞を３００ＲＣＦ（１，２００ｒｐｍ）で１０分間、室温で遠心分離によりペレットにし、残っていた血小板を除去する。上清を除去し、チューブを軽く叩くことにより、ＭＮＣペレット１８０をＰＢＳ中に再懸濁する。最終ペレット１８０を再懸濁し（工程３）、バイオディスク１１０のフロー流路１３０の厚さに応じて、１０，０００〜３０，０００細胞／μｌの細胞計数になるまでＰＢＳで希釈する。代替的には、不要な細胞の凝集および沈殿を生じる生理活性試薬を用いて、全血液からＴ−リンパ球を単離してもよい。生理活性試薬の非限定的な例は、ＰｒｅｐａＣｙｔｅ（BioE, St. Paul, MN）である。ＰｒｅｐａＣｙｔｅは、顆粒球、血小板、単球、Ｂ細胞（８０％まで）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（８０％まで）を選択的に除去することで、全血液からＴ−リンパ球を単離することを可能にする。光ディスクベースの細胞検定において用いられる、Ｔ−リンパ球を単離する方法に伴う他の態様に関連するさらなる詳細は、２００２年５月２２日付けで出願された「Method for Isolation of Lymphocytes for Use in Differential Cell Counting and Use of Optical Bio-disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３８２，３２７号（本明細書中に完全に援用される）において開示されている。
【００５９】
細胞の区別、検出および定量
１種の抗体で被覆された表面を用いた細胞捕捉は、特定のマーカを有する（ほとんど）すべての細胞を捕捉する。特異的な細胞タイプ、例えばヘルパーＴ細胞を捕捉することを目的とすると、１つのマーカを用いるだけでは不十分なことがある。多重マーカを用いるフローサイトメトリのような技術では、すべての選択されたマーカを有する細胞のみ計数
する。従ってヘルパーＴ細胞と単球細胞（両者はＣＤ４抗体を運搬する）は、ＣＤ３（ＣＤ４細胞についてのみ）又はＣＤ１９（単球細胞についてのみ）のような２次マーカによって識別される。このことは、単球も一緒に捕捉するのを避けられないため、１つの抗体による表面捕捉方法において特有の問題を生じる。
【００６０】
２次細胞集団が、表面を被覆された抗体に結合するのを避けることは困難であるが、２次抗体に結合するシグナル因子で印をつけることにより、それらを識別することが可能である。例えば、このシグナル因子は、所定の波長で光を吸収するビーズ又は色素である。所定の波長は、光ディスク読み取り装置１１２の入射ビーム１５２又はその近辺であることが好ましい。従って、両方の細胞集団はバイオディスクの表面で捕捉されるが、細胞は図１０と共に上記する測定システムによって識別できるであろう。
【００６１】
一例として、ＣＤ４抗体をディスク１１０の表面に保持する。ＣＤ４抗体は、通常ＣＤ４＋単球の副集団とＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の両方を捕捉する。しかしながら、サンプルの調製中に、ＣＤ１９抗体で被覆されたＩＲ吸収ビーズが導入され、単球はＣＤ１９＋であるがヘルパーＴ細胞はＣＤ１９＋ではないため、単球がこれらのビーズで被覆されることになる。これには２つの効果がある。１つ目は、立体障害のため、単球がＣＤ４捕捉区域に結合する可能性が減少する。２つ目は、ディスクの捕捉区域上に結合する残存単球は、ＩＲレーザビームに対してＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞よりも暗いので、単球とヘルパーＴ細胞との識別を可能にする。
【００６２】
詳細には、ハードウェア計数（閾値を用いるＳ曲線認識(S-curve recognition)に基づく）を用いた本発明のバイオディスクシステムによって計数が行われた場合は、単球の吸収はＳ曲線振幅を閾値より低くするのに十分な結果となる。同様に、単球がＩＲ色素によって識別された場合は、単球は暗くなり別々に計数することができる。ハードウェア計数ソフトウェアとＳ曲線認識に関するさらなる詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中であり、且つ関連する、それぞれ２００２年２月１３日、２００２年４月１１日および２００２年９月４日付けで出願された、全て「Bio-Disc and Bio-Drive Analyser System Including Methods Relating Thereto」と題する米国仮出願第６０／３５６，９８２号、米国仮出願第６０／３７２，００７号および米国仮出願第６０／４０８，２２７号に開示されている。これらの出願は、本明細書中でその全体が繰り返されるのと同様にその内容のすべてが、参照により本明細書に援用される。
【００６３】
二重マーカを、同定可能な対象若しくは物質を細胞表面上に付着させる又は上記したように細胞表面を被覆して結合の可能性を減少させるのに用いられ得る方法は、細胞検定システムの多くのタイプで用いることができる。例えば、ＣＤ８抗体はＮＫ細胞を捕捉するが、これは（この場合は非特異的に）ＣＤ５６によって印を付けられ得る。又、顆粒球は特異的に印を付けられ得、ＣＤ４５抗体で被覆された捕捉又は標的領域１４０上の白血球と識別できる。色素は関連する細胞のみを覆うのに使う必要はない。色素はまた、核のような細胞の内部構造中に非特異的に吸収され得る。このような細胞は、既知の濃度でサンプル中に固定若しくは予め混合することによって安定化している場合は、捕捉領域上でキャリブレータ因子として用いることができる。
【００６４】
基本的に、多重マーカも使用できる。例えば、あるシグナル因子は、細胞上のマーカに結合する特異的な抗体上の色素であってよい。第２のシグナル因子は、別のマーカに結合する別の特異的な抗体上の微粒子又はビーズであってよい。第２のマーカが存在すると、ビーズは細胞に結合して、細胞が捕捉領域にある捕捉因子に結合するのを防ぐ。第１のマーカしかない場合、細胞は結合するが細胞上のシングルマーカと識別できる。
【００６５】
陽性同定もまた可能である。例えば、ＩＲビーズが付着した細胞又はＩＲ色素を用いて
染色された細胞は、他の細胞に比べて暗くなり、本発明の光ディスク読み取り装置を用いて画像化する場合は直接計数できる。例えば、リアルタイム細胞計数に使用されるスプリット検出器配置では、差異シグナル（Ａ-Ｂ）よりも合計シグナル（Ａ＋Ｂ）を用いる方が暗い細胞を検出できる。実時間細胞計数およびＳ曲線認識に使用されるスプリット検出器配置に関する詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年１０月２４日付けで出願された「Segmented Area Detector for Biodrive and Methods Relating Thereto」と題する米国出願第１０／２７９，６７７号に開示されている。この出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。様々な細胞タイプを含有するサンプルから、１つ以上の細胞を同定する多重マーカの使用に関するさらなる詳細を以下に検討する。
【００６６】
標的細胞を区別且つ単離する微粒子の使用
上記光ディスクシステムを用いた画像分析による白血球サブセットの免疫表現型分類と定量は、細胞区別の精度を上げるために２次ゲート又はパラメータを必要とすることがある。本発明は、官能化された表面を有する若しくは有さない、種々の物理的特性を有する微粒子又はビーズのようなレポータ因子又はシグナル因子の使用に関する。これらは標的細胞又は不要な細胞に特異的に結合する少なくとも１つの抗体と接合して、光ディスク読み取り装置に検出され得るビーズ−細胞複合体を形成する。シグナル抗体はレポータ又はシグナル因子とクロスリンカーによって接合する。クロスリンカーは、受容体−リガンド相互反応又は結合因子−親和因子相互反応を含む。結合因子は、例えばストレプトアビジン又はニュートラアビジンである。親和因子は、例えばビオチンである。代替的に、当業者は、修飾されて官能化された表面を有するビーズは、共有結合的にビーズ表面上のシグナル抗体と接合し且つ所望の細胞へのビーズ又はレポータ因子の堅固な固定を促進するのに用いられえることについて既知である。大きさ、色、質感（Texture）、反射率、吸光度、質量、蛍光、リン光および／又は磁気特性など種々の物理的特性を有するビーズを用いて、標的細胞を単離および／又は区別することがまた可能である。このプロセスは、図２０Ａおよび図２０Ｂと共に以下に検討する、少なくとも１つのタイプのレポータ因子又は細胞表面に付着したビーズである独特な特徴によって、標的細胞の識別をより容易にする。
【００６７】
２つ以上の特異的な細胞タイプが、他のサブセットや細胞タイプ（例えば、ＣＤ４抗原を細胞膜上に有するＴ細胞や単球、ＣＤ３抗原を細胞膜上に有する全ての成熟Ｔ細胞およびＣＤ４５抗原を細胞膜上に有する全ての白血球）と共に、細胞膜上で同一の抗原エピトープを共有すると、不正確が生じる。この結果、タグ又は標識を用いずに、抗ＣＤ４又は抗ＣＤ４５のような共通の捕捉抗原を用いて細胞タイプを区別すること並びに細胞の形態および大きさを測る可能性が困難になる。
【００６８】
以下に述べるように、ビーズを、細胞を標識するレポータ因子として用いることによって、例えば、抗ＣＤ４抗原捕捉因子を用いて捕捉した標的ＣＤ４＋Ｔ細胞を、不要なＣＤ４＋単球から区別することができる。これは、単球上で、ＣＤ４エピトープ以外の抗原エピトープを標識又はタグ付けすることによって達成される。例えば、単球は、単球に対して特異的であるＣＤ１４抗体に結合するビーズでタグ付けされる。一旦単球が抗ＣＤ１４ビースでタグ付けされると、ＣＤ１４表面抗原（以下図２３に述べる）に結合した１つ以上のビーズを有するＣＤ４＋単球と、表面にＣＤ１４抗原が存在しないためビーズを有さないＣＤ４＋Ｔ細胞とを識別する光ディスクシステムを用いた画像分析が実行される。このようにして、図１８に描くように、ＭＮＣ又は血液サンプル中のＣＤ４Ｔ細胞と単球の区別を可能にする。
【００６９】
引き続いて、共に表面にＣＤ４抗原を有するリンパ球２００および単球２０２を図１８に図示する。単球はまた表面にＣＤ１４抗原を有するが、リンパ球は有さない。従って単
球は、シグナル抗体２０６（この場合、抗ＣＤ１４抗体）が付着したビーズ２０４でリンパ球をタグ付けすることによって区別できる。ビーズは、ディスク読み取り装置１１２の呼びかけビーム１５２（図１０）によって検出できる程度に十分大きく、タグ付けされる細胞よりは小さいことが好ましい。ビーズの好ましい大きさは、直径約０．５〜５μｍである。従ってレポータ複合体２０８は、図示するようにＣＤ４＋リンパ球２００およびＣＤ４＋単球２０２を含有する細胞懸濁液中に存在すると、単球２０２のみに結合する。これらのＣＤ４＋細胞を、抗ＣＤ４捕捉抗体が付着した捕捉点１４０で捕捉し、光ディスク読み取り装置１１２（図１）を用いて分析すると、細胞は以下図２３Ａと図２３Ｂと共に述べるシグネチャトレース(signature trace)の結果、区別できる。
【００７０】
次に、血液サンプルから不要な細胞を単離又は除去するビーズの使い方を描いた、本発明の実施形態を図１９に図示する。不要な又は汚染細胞は、ビーズを用いて不要な細胞の表面上の抗原をブロックし、これらのブロックされた細胞がディスク上の捕捉プローブに結合するのを防ぐことによって除去される。図１９に示す実施例では、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む様々なタイプの細胞２１２を含有するサンプル２１０は分析に付される。細胞２１２の全ては表面にＣＤ３マーカを有する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞は所望の標的細胞２１６であり、一方ＮＫ細胞２１４は不要な細胞である。共通の抗体、抗ＣＤ３は、標的細胞を捕捉するために用いられる。ＮＫ細胞は表面にＣＤ５６抗原を含有するが、サンプル中の他の細胞は含有しない。示すように、抗原で被覆されたビーズ２０８をサンプル２１０と一緒に混合する。ビーズ２０８は抗ＣＤ５６抗体で被覆される。ビーズ２０８は次に、ロゼットを形成する（rosetting）又はＮＫ細胞を取り囲む、ＮＫ細胞２１４の表面上のＣＤ５６抗原に結合する。ＣＤ４＋、ＣＤ８＋およびロゼット形成ＮＫ細胞２１４を含有する検定溶液を、次に、描かれているようにバイオディスク１１０の流体チャンバ１３０の中に充填する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋標的細胞２１６は、次にディスクの表面上で抗ＣＤ３捕捉因子２１７と結合する。ＮＫ細胞２１４の表面上のビーズは、ＮＫ細胞上でＣＤ３抗原エピトープをブロックすることによって、ＮＫ細胞２１４が抗ＣＤ３捕捉抗体２１７に結合するのを防ぐ。非結合ＮＫ細胞を次に図示するように、洗浄又は遠心分離によって除去する。続いて捕捉細胞を、標的領域を通って捕捉細胞と相互反応する入射ビーム１５２（図１０）を走査し、且つサンプル中の標的細胞の相対量を決定する帰還ビーム１５４を分析する光ディスクシステムを使用することによって分析する。代替的には、透過型光ディスクを使用する場合には、透過ビーム１５６（図１０）を捕捉細胞の数を決定するために分析することができる。図１９に図示する光ディスクは、図２〜図９と共に上記されたフロー経路１３０、キャップ部位１１６、反射表面１５６、接着部材１１８、活性層１４４、反射層１４２および基板１２０等のディスク構成要素を含む。上述したように、透過型光バイオディスク（図８および図９）は、反射層１４６が除去されて層１４２が半反射的になると入射ビーム１５２がディスクを通過し、図１０、図１２および図１６と共に上記するように上部検出器１５８を用いた透過ビーム１５６の検出と分析を可能にすることに使用する。
【００７１】
図１９と共に上記する方法および方法に対する代替の実施形態では、より大きい、より重いおよび／又は磁性のビーズが不要な細胞に付着する。標的細胞は例えばＣＤ４＋Ｔ細胞であり、不要な細胞はＣＤ４＋単球である。本実施例で用いられる捕捉抗体は、抗ＣＤ４抗原であり得る。両方の細胞タイプは細胞表面にＣＤ４抗原を有し、単球は固有のＣＤ１４表面マーカを有するため、抗ＣＤ１４抗体で被覆された、同じ大きさの非磁気ビーズよりはるかに大きい質量を有する磁気ビーズを用いて、単球をサンプルから除去する。大きい質量のため、不要な細胞を遠心分離により容易に除去できる。サンプルをディスクに充填する前又は後に、ビーズをサンプル溶液と混合してよい。ビーズを次に単球の表面ＣＤ１４抗原に結合させる。磁気粒子は比較的重いので、バイオディスクドライブ１１２を用いた遠心分離により又は磁気分離装置若しくは磁気光学式ディスクシステムと併せてビーズの磁気特性を利用することにより、所望の細胞から単球を分けることができる。磁気
光学式ディスクシステムに関わる他の態様に関連するさらなる詳細は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年３月１４日付けで出願された「Dual Bead Assays Using Cleavable Spacers and/or Ligation to Improve Specificity and Sensitivity Including Related Methods and Apparatus」と題する米国出願第１０／０９９，２５６号、２００２年３月１４日付けで出願された「Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets」と題する米国出願１０／０９９,２６６号および２００２年１１月２７日付けで出願された「Magneto-Optical Bio-Discs and Systems Including Related Methods」と題する米国出願第１０／３０７，２６３号に開示されている。これらのすべての出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００７２】
次に図２０Ａと図２０Ｂでは、図１９と共に述べる、本発明の代替の実施形態における非限定的な実施例を示す。この実施形態では、種々の物理特性を有するビーズを、１つ以上の標的又は捕捉領域で共通の表面マーカによって捕捉された様々な細胞タイプを同定するのに用いる。図２０Ａに示すように、所望の細胞２１６を含有するサンプル２１０を、ピペット２１８を用いてバイオディスク１１０の中に充填する。本実施形態において、白血球は、ディスクの表面で抗ＣＤ４５捕捉抗体によって捕捉される所望の細胞である。捕捉抗体２１７は、共通のＣＤ４５白血球表面抗原に結合する。次に図２０Ｂを参照すると、ビーズ２２０の種々の群を、ピペット２１８を用いてディスク１１０の中に充填する。ビーズの各群は、好ましくはディスク読み取り装置１１２を用いて識別できる異なる物理的特性と、そこに付着した異なる抗体を有する。ビーズの各群に付着した抗体は、所望の細胞上の特異的抗原に親和性を有する。例えば、透過型ビーズ２２１の群は、白血球２２４をタグ付けする、ＣＤ３、ＣＤ１９又はＣＤ５６のうちのどれかに対する抗体を有し、不透過型ビーズ２２３の群は、単球２２２をタグ付けする、ビーズに付着したＣＤ１４に対する抗体を有し、半透過型ビーズ２２５の群は、好酸球２２６をタグ付けする、ＣＤ１１６に対する抗体を有する。ビーズをそれぞれの標的に十分な時間結合させた後、非結合ビーズ２２７を遠心分離又は洗浄によって除去する。種々の細胞タイプを、光ディスク読み取り装置を用いて、細胞に結合したビーズの物理的特性に基づいて定量する。図示するように、この実施例では透過型ディスクを使用するため、ビーズ−細胞複合体を光ディスクシステム（図１０）を用いて以下に述べる操作を通して分析する。すなわち操作とは、標的領域を通過してビーズ−細胞複合体と相互反応する入射ビーム１５２（図１０）を走査し、光検出器を用いて透過ビーム１５６を検出し、検出したビームを分析してサンプル中のそれぞれの標的細胞タイプの相対量を決定することである。上記の通り反射型ディスクもまたこの分析に使用してよい。
【００７３】
代替的に、１つ以上のビーズの群又はレポータは、同じ細胞タイプの異なる表面抗原に結合できる。次に、この細胞タイプは、１種類以上のレポータが結合しているかしていないかを決めることで、他の細胞タイプと識別し定量することができる。多重のパラメータが、単独の細胞タイプとして同定するのに用いられるため、検定に特異性を寄与する。光ディスクを用いた様々な細胞タイプの検出と定量の方法に関する他の態様に関する詳細は、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００２年５月２４日付けで出願された「Methods and Apparatus for Use in Detection and Quantitation of Cell Populations and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same」と題する米国仮出願第６０／３８２，９４４号に開示されている。この出願は、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【００７４】
微粒子又はビーズは、組織並びにウイルスおよび細菌等の微生物からの細胞を標識又はタグ付けするのに用いられ、同定、区別および定量を容易にする。少なくとも１つ以上のビオチン２３２を有する捕捉ビーズ２０４と、そこに接合した捕捉抗体２０６とでタグ付
けされるＥ．ｃｏｌｉ２３４の例を図２１に示す。抗体２０６はＥ．ｃｏｌｉの抗原に特異的な親和性を有する。図示するように、ビーズがＥ．ｃｏｌｉを含有するサンプルと一緒に混合されると、ビーズ−細菌複合体２３７が形成する。複合体２３７と非結合ビーズ２０４は、ストレプトアビジン２３６を用いてディスクの捕捉領域上に捕捉される。次に、上記のように、ディスクをビーズ−細菌複合体の有無と量について分析する。
【００７５】
次の図２２は、不要な細胞上の抗原に親和性を示す抗体を有するビーズを用いて、不要な細胞をタグ付けするイラストである。標的細胞はこのようにタグ付けされず、上記のように光ディスクバイオシステムを用いて単離又は定量される。
【００７６】
図２３Ａは、本発明による光バイオディスクのトラックＡ−Ｅの近傍に位置するビーズ−細胞複合体中で共に結合した、１ミクロンのレポータビーズと５ミクロンの細胞のグラフ表示である。
【００７７】
本発明による光ドライブから検出されたシグナルを利用して、図２３Ａ中のビーズと細胞から発生した、トラックＡ−Ｅからの一連のシグネチャトレースを図２３Ｂに図示する。これらの図は検出された透過ビーム１５６を表している。示すように、１ミクロンのレポータビーズ１９０のシグネチャは、５ミクロンの細胞１９２とのシグネチャと十分に異なるので、ビーズ−細胞複合体を単独の細胞の中から検出し見分けることができる。帰還ビームがビーズ又は細胞を通過するときに検出されるトレースシグナルの十分な偏向を、イベントとする。レポータおよび細胞からのイベントの相対的な近接は、ビーズ−細胞複合体の有無を表す。示すように、レポータおよび細胞のトレースはお互いがすぐ隣にあり、それらが複合体になっていることを表している。
【００７８】
代替的に、細胞懸濁液中の様々な細胞タイプを同定および定量するために、他の検出方法が用いられ得る。例えば、レポータビーズは蛍光性又はリン光性であり得る。このようなレポータの検出は、蛍光又はリン光型光ディスク読み取り装置で実行できる。他のシグナル検出方法は、例えば、本発明の譲受人に譲渡されて同時係属中である、２００１年１１月９日付けで出願された「Disc Drive System and Methods for Use with Bio-Discs」と題する米国出願第１０／００８，１５６号（参照により明確に援用される）、２００１年２月２０日付けで出願された米国仮出願第６０／２７０，０９５号および２００１年５月１８日付けで出願された米国仮出願第６０／２９２，１０８号並びに２００２年１月１０日付けで出願された上記参照の「Optical Disc Analysis System Including Related Methods For Biological and Medical Imaging」と題する米国出願第１０／０４３，６８８号に開示されている。
【００７９】
図２４は非付着ビーズ２３８、単独細胞２４０およびビーズ−細胞複合体２４２を示す顕微鏡写真である。この実験で使われたビーズは、抗ＣＤ２抗体で被覆された４．５μｍの磁気ビーズであった。示すように、ＣＤ２抗原を有する細胞はこのように、ビーズ−細胞複合体を形成するビーズによって標識又はタグ付けされ、非ＣＤ２＋細胞は単独のままである。この実験に関する詳細を実施例８と共に以下に述べる。
【００８０】
不溶性酵素産物を用いた標的細胞の区別
次に参照する図２５Ａと２５Ｂは、酵素反応で生じた検出可能な沈殿物を用いて不要な細胞を標的細胞から区別する、本発明中の方法における別の実施形態を図示したイラスト表示である。流体回路１３０内の標的領域１４０の拡大図を図２５に図示する。本開示に関わる当業者には明らかであるように、反射又は透過型ディスクのどちらも分析に用いることができる。図２５Ａおよび図２５Ｂに描かれている実施例では、ＣＤ４抗体２４４を光バイオディスク１１０上の標的又は捕捉領域１４０に保持させる（工程１）。次の工程、工程２では、単核細胞（ＭＮＣ）を含有するサンプルを標的領域の中に導入する。ＣＤ
４表面抗原を有する細胞は、次に標的領域上のＣＤ４捕捉抗体２４４に結合する。これらの細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および単球を含む。図１９〜図２１と共に上記するように、続いて非結合細胞を標的領域から洗い流すかスピンする。非結合細胞を除去した後、ＣＤ１４抗体２４６（レポータ因子）に接合した酵素２４８を含有する溶液を、工程３に示すように標的領域に導入する。単球のみがＣＤ１４抗原を含有するため、抗体と接合した酵素は、図示するように標的領域に結合した単球にのみ結合する。標的領域を続いて非結合酵素又はレポータ因子を除去するために洗浄し、工程４で標的領域に酵素基質を導入する。一旦基質が酵素と接触すると、酵素−基質反応２５０が起こって、工程５に示す検出可能な産物２５２を産生する。検出可能な産物２５２は好ましくは、工程６に図示するように、細胞表面で沈殿物２５４を形成する不溶性産物である。電磁気放射線２５６の呼びかけ信号を続いて標的領域を通過して走査し、帰還ビーム又は透過ビーム（使用するディスクのタイプに応じる）を、沈殿物で標識された細胞の有無について分析する。標識又はタグ付けされたおよび標識されていない又はタグ付けされていない（untagged）細胞を次に定量する。その結果、図２５Ｂに示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞および単球の特異的な検出、分類および定量が可能である。この実施形態で使用され得る酵素は、これらに限定されないが、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を挙げることができる。これらの酵素と併せて用いられる基質は、例えば、ＴＭＢ（３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン）、ＤＡＢ（３，３'−ジアミノベンジジン）、ＡＢＴＳ（２，２'−アジノービス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））、ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）、ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）、ＣＮ／ＤＡＢ（４−クロロナフトール／３，３'−ジアミノベンジジン四塩酸塩）、（４−ＣＮ）４−クロロ−１−ナフトールおよび光ディスク読み取り装置で検出できる産物を生じる反応を酵素に触媒させる他の適合する基質から成る群より選ばれる。
【００８１】
［実験の詳細］
本発明を図面を参照して詳細に説明してきたが、本発明の一定の例およびさらなる例示を以下に提供する。
【実施例】
【００８２】
＜実施例１＞
【００８３】
図１７は、サンプルの調製、バイオディスクの使用、および結果の提供を示す画像的フローチャートを示す。個々の処理工程の時間分、回転速度や他の詳細等の、以下の実施例の詳細は、図１７を参照した上記のものより詳細である。それにも関わらず、本実施例の基本的な工程は上記のものと類似である。
【００８４】
Ａ．基板調製および化学保持を含むディスク製造
この実施例において、反射型ディスク又は透過型ディスク基板１２０（それぞれ、図２および図５）を、エアガンを用いて清浄にしてすべての塵粒を除去する。このディスクを、スピンコータを用いてイソプロパノールで２回洗い流す。２％ポリスチレンをディスク上にスピンコートし、全体を極めて厚くコーティングする。
【００８５】
その後、化学保持を行う。一実施形態は、以下の３工程の保持プロトコルを含む：ストレプトアビジンを３０分間培養；ビオチン化した第１の抗体を６０分間培養；および第２の捕捉抗体を３０分間培養。第１の抗体は、第２の種（例えば、マウス）のイムノグロブリンのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）に対して、第１の種（例えば、羊）において作成することができる。第２の捕捉抗体は、特異的な細胞表面抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８）に対して、第２の種において作成される。これらの工程は、恒湿チャンバ中において室温で、保持の間の洗浄および乾燥工程を用いて行われる。
【００８６】
リン酸緩衝生理食塩水中の１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン１μｌずつを各窓上に積層し、３０分間培養する。過剰のストレプトアビジンを蒸留水を用いて洗い流し、ディスクを乾燥させる。等容量のビオチン化抗マウスＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）および活性化デキストランアルデヒド（２００μｇ／ｍｌ）を混合する。デキストランアルデヒド（ＤＣＨＯ）−ビオチン化抗マウスＩｇＧを、各捕捉窓中のストレプトアビジン上に積層し、冷蔵庫中で６０分間又は一晩培養する。過剰の試薬を洗い流し、ディスクをスピン乾燥する。
【００８７】
Ｂ．ディスクアセンブリ
流体流路を作製するＵ型又は「ｅ−ｒａｄ」流路等のスタンプアウト（stamped out）部分を有する、例えば、２５、５０又は１００ミクロン厚であり得る接着層（図２および図５の流路層１１８）、および透明なキャップ１１６（図５、上部検出器を用いた透過型ディスクとの使用のため）又は捕捉領域全体にある反射層１４２を有するキャップ１１６（図２、底部検出器を用いた反射型ディスクとの使用のため）を用いて、ディスクを組み立てる。
【００８８】
一実施形態において、このディスクは、符号化情報層として３００ｎｍの金で被覆された、フォワードＷｏｂｂｌｅ  Ｓｅｔ  ＦＤＬ２１：１３７０７又はＦＤＬ２１：１２７０  ＣＤ−Ｒディスクである。反射型ディスク上には、既知のリソグラフィー技術によって、２×１ｍｍの大きさの楕円の観察窓が反射層からエッチングされている。透過型ディスクの幾つかのデザインにおいては、分かれた観察窓はエッチングされておらず、ディスク全体を使用可能である。この特殊な例においては、流路層は、Ｆｒａｙｌｏｃｋ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ＤＢＬ２０１  Ｒｅｖ  Ｃ  ３Ｍ９４６６１から形成される。カバーは、半径２６ｍｍで等距離にある、直径０．０４０インチの４８個のサンプル注入口を有するクリアディスクである。ＣＤ４／ＣＤ８計数ソフトウェアを用いて、ソフトウェアを４倍速且つサンプル率２．６７ＭＨｚで、データディスクを走査して読み取る。
【００８９】
Ｃ．ディスク漏れチェック
血液を分析しているため、ディスクの漏れをチェックし、ｉｎ  ｓｉｔｕでサンプルを有するディスクをスピンする間にチャンバ漏れがないことを初めに確認することが可能である。ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄおよびＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ等の遮断剤を、各流路に充填する。ブロックは少なくとも１時間である。ディスクを５，０００ｒｐｍで５分間スピンさせて漏れ試験を行い、ディスクの安定性をチェックする。漏れをチェックした後、ディスクを真空チャンバに２４時間入れる。２４時間真空化後、ディスクを真空パウチに入れ、使用まで冷蔵庫中に保管する。
【００９０】
Ｄ．サンプルの回収、調製およびディスクへの塗布
以下の項は、概して図１７Ａに示されるサンプル処理工程に関する。単核細胞（ＭＮＣ）を、例えばＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒを用いて、密度勾配遠心法により精製する。血液（４〜８ｍｌ）を、４又は８ｍｌのＥＤＴＡ含有ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ中に直接回収する。水平ローターおよび回転バケツを有するバイオハザード遠心機中で、１，５００〜１，８００×ｇで２５分間、室温で管を遠心分離する。血液は、回収の２時間以内に使用されることが好ましい。遠心分離後、ＭＮＣ層上の約２ｍｍの血漿は残し、単核細胞画分上の血漿を除去する。ＭＮＣを回収し、ＰＢＳで洗浄する。３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離することにより、細胞をペレット化する。上清を除去し、管を軽く叩くことによりＭＮＣを含有するペレットをＰＢＳに再懸濁する。３００×ｇで各１０分間、室温でもう一度洗浄を行い、血小板を除去する。最終的なペレットを、１０，０００細胞／μｌの細胞数に再懸濁する。１８μｌ容量のＭＮＣを、１以上の分析チャンバ又は流路へ導入し、ディスクを固定して１５分間室温で培
養する。流路を密閉する。その後、ディスクドライブを用いて３，０００ｒｐｍで３〜４分間ディスクをスピンさせる。４倍速且つサンプル率２．６７ＭＨｚでソフトウェアを用い、ディスクを走査して読み取ることが好ましい。
【００９１】
血液サンプルを直ちに処理できない場合、ＣＰＴ管を数回穏やかに反転させることによって最初の遠心分離後の単核細胞を血漿に再懸濁し、室温で２４時間まで保管することができる。２４時間以内に、上記のように血漿中の細胞を回収し、洗浄することができる。
【００９２】
Ｅ．ＣＤ４／ＣＤ８検定フォーマット
この実施例における検定は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球集団の絶対数および血液サンプル中のＣＤ４＋／ＣＤ８＋リンパ球の比を迅速に測定するための、一般的な均質固相細胞捕捉検定法である。この試験はＣＤ−ＲＯＭに組み込まれた小さなチャンバ内で実施されるが、全血液から単離された単核細胞（ＭＮＣ）７μｌ中の、捕捉領域上の特異的な抗体によって捕捉される、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋細胞の数を測定する。この試験は、ディスク上の特異的な位置の局在細胞を捕捉するという原理に基づく。特定の血液細胞表面抗原に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体に基づく捕捉化学物質を局在塗布することにより、幾つかの特異的な細胞捕捉領域をディスク上に作製する。チャンバをＭＮＣ血液（３０，０００細胞／μｌ）で溢れさせると、抗原ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ４５を発現する細胞は、ディスク上の捕捉領域で捕捉される。また、画定された陰性対照領域もバーコードに組み込まれる。
【００９３】
Ｆ．オンディスク分析
上記工程Ｄで調製されたＭＮＣ細胞（ＰＢＳ中、１８μｌ）をディスクチャンバに注入し、チャンバの注入ポートおよび排出ポートを密閉する。ディスクを１５分間室温で培養した後、上部検出器を有する光学ドライブ中で７８０ｎｍのレーザを用いて走査し、上記のように捕捉領域を画像化する。
【００９４】
ソフトウェアをディスク上に符号化して、ドライブに以下の動作を自動的に行うように指示を与える：（ａ）１以上の段階でディスクを遠心分離し、過剰の非結合細胞をスピン除去する、（ｂ）特異的な捕捉窓を画像化する、および（ｃ）それぞれの捕捉領域中の特異的に捕捉された細胞を計数すること並びにＣＤ４／ＣＤ８の比（又は比がプログラムされ、測定される）を得ることを含み、データを処理する。
【００９５】
処理工程の間、ソフトウェアによってそれぞれの捕捉領域画像全体を読み込み、細胞に接近すると細胞に印を付ける。例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の数の評価に続いて、ソフトウェアによってＣＤ４＋／ＣＤ８＋細胞の比を算出し、全血液１μｌ当たりの、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ３＋およびＣＤ４５＋捕捉領域中の細胞の絶対数、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋比の双方を示す。光学ドライブへディスクを挿入してから数および比を得るまでの全処理は、約１２分かかる。
【００９６】
Ｇ．使用試薬
ストレプトアビジン（Sigma, cat. # S-4762）：脱イオン水を添加して５ｍｇ／ｍｌ溶液とし、等分して−３０℃で保管する。使用の際は、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるようにＴｒｉｓ緩衝液を添加する。
陽性対照：ＣＤ４５（Sigma, Lot # 038H4892, cat # C7556）。２〜８℃で保管する。
二次捕捉抗体：ビオチン化抗マウスＩｇＧ（ヒツジ由来、Vector laboratories, lot #
L0602, Catalog # BA-9200）。保存溶液（１．５ｍｇ／ｍｌ）は蒸留水で作製される。使用ｂ−ＩｇＧ溶液：０．１ＭのＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ。２〜８℃で保管する。長期保管の場合は−３０℃で保持してもよい。
アルデヒド活性化デキストラン（Pierce, lot # 97111761, cat # 1856167）。保存溶
液：ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍｌ、２〜８℃で保管する。
一次捕捉抗体：ＣＤ４（DAKO, cat # M0716）、ＣＤ８（DAKO, cat # M0707）、ＣＤ２（DAKO, cat # M720）、ＣＤ４５（DAKO, cat # M0701）、ＣＤ１４（DAKO, cat # M825）およびＣＤ３（DAKO, cat # M7193）。２〜８℃で保管する。
陰性対照：マウスＩｇＧ１（DAKO, cat # X0931）。２〜８℃で保管する。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４（Life Technologies/GIBCO BRL, cat. # 10010-023）又は等価物。室温で保管する。
イソプロピルアルコール、９０〜１００％。
【００９７】
Ｈ．ＲＢＣ溶解プロトコル
塩化アンモニウム溶解緩衝液
１倍保存の塩化アンモニウム溶解緩衝液は、２〜８℃で保管されるべきである。０．１５５ＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ3および０．１ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムを含有する；ｐＨ７．３〜７．４、２〜８℃で保管する。使用前に室温に戻す。
【００９８】
手順
１．各１００μｌの血液に対して２ｍｌの溶解緩衝液を添加する（この手順はバイオハザードフード中で行うのが好ましい）。
２．ボルテックスして室温で１５分間培養する。
３．バイオハザードフード中の遠心機を用いて、５００×ｇで５分間、室温で血液を遠心分離する。
４．上清を除去し、ＰＢＳ中の２％ＦＣＳ又はＦＢＳで細胞を洗浄する。細胞を遠心分離する。
５．ＷＢＣの全量を算出し、サンプル注入のためにＷＢＣの最終濃度を１０，０００細胞／μｌとする。
＜実施例２＞
【００９９】
単核細胞分離手順
クエン酸ナトリウムを有するＢｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＣＰＴ（BD catalog # 362760（４ｍｌの場合）、# 362761（８ｍｌの場合））細胞調製管を使用する。手順は、すべてのバイオハザード対策に従い、バイオハザードフード中で行う。工程：
１．血液を、４又は８ｍｌのＥＤＴＡ含有ＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ中に直接回収する。血液が既に抗凝固物質中にある場合、初めにＥＤＴＡをＶａｃｕｔａｉｎｅｒへ添加した後、血液サンプル６〜８ｍｌをＣＰＴ管へ添加する。
２．水平ローターおよび回転バケツを有するバイオハザード遠心機中で、１，５００〜１，８００×ｇ、２５分間室温で管を遠心分離する。最も良い結果のためには、回収の２時間以内に血液を遠心分離すべきである。２時間より古い血液を遠心分離すると、ＭＮＣ数が減少し、且つＲＢＣ汚染が増加し得る。
３．遠心分離後、ＭＮＣ層上の約２ｍｍの血漿を残し、血漿を除去する。白色の単核層を回収し、１５ｍｌの円錐形遠心分離管へ移す。
４．ＭＮＣ層へ１０〜１５ｍｌのＰＢＳを添加し、遠心分離管を数回反転させることによって細胞を穏やかに混合する。
５．バイオハザード遠心機中で２００×ｇで１０分間、室温で遠心分離することによって細胞を洗浄する。
６．上清を除去する。管を軽く叩くことによって細胞を再懸濁する。
７．１０ｍｌのＰＢＳ中でもう一度洗浄する。２００〜３００×ｇで１０分間、室温で遠心分離して血小板を除去する。
８．上清を除去して、５０μｌのＰＢＳにペレットを再懸濁する。
９．サンプル中の細胞数を推定する。ＣＢＣを実施する、又は２μｌの細胞を１８μｌ
のトリパンブルーに希釈し、穏やかに混合して細胞を血球計算器で計数する。分析のために、サンプルを最終細胞数１０，０００細胞／μｌとする。
１０．細胞を直ちに処理することができない場合、最初の遠心分離(上記工程２)の後にＣＰＴ管を数回穏やかに反転させることによって、分離された血漿中へ単核細胞を再懸濁し、室温で２４時間までの間保管する。２４時間以内に血漿中の細胞を回収し、上記のような洗浄を続ける。
【０１００】
１μｌ当たりの全細胞数＝２５ｍ2中の細胞数×（倍）１００。
＜実施例３＞
【０１０１】
Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を用いた全血液からのＭＮＣの単離
１ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７を１５ｍｌの遠心分離管に入れ、１ｍｌの全血液をその上に穏やかに積層した。その後、４００×ｇで３０分間、室温で遠心分離した。混合物をパスツールピペットで慎重に吸引し、不透明な界面を遠心分離した管へ移した。その後、１０ｍｌのＰＢＳを遠心分離管へ添加した。その後、溶液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、細胞ペレットを１０．０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２５０×ｇで１０分間スピンさせた。その後、ペレットを１０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、２５０×ｇでスピンさせることによって、細胞をもう一度洗浄した。最終的な細胞ペレットを０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。
＜実施例４＞
【０１０２】
Ｄｙｎａｌビーズを用いたＣＤ４＋細胞の単離
Ａ．材料
１．冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳ、ｐＨ７．４
２．ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ、ｐＨ７．４
３．ＣＤ４陽性Ｄｙｎａｌ単離キット
４．ＤｙｎａｌＭＰＣ、Ｄｙｎａｌ混合機、遠心機、ポリプロピレン管
【０１０３】
Ｂ．手順
ＣＢＣを実施し、必要な細胞ごとのビーズの数を決定する（４〜１０ビーズ／細胞）。１ｍｌの冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳを、所望量のビーズ（１×１０7ビーズ／７２μｌ）に添加し、再懸濁する。管をＤｙｎａｌＭＰＣ中に３０秒間置き、上清をピペットで除去する。洗浄したビーズを最初の容量に再懸濁する。所望量のビーズを細胞に添加する。１１に設定したＤｙｎａｌ混合機にて２〜８℃で２０分間培養する。ロゼット形成細胞をＤｙｎａｌ  ＭＰＣ中で２分間単離する。上清をピペットで除去する。ロゼット形成細胞を４×ＰＢＳ／２％ＦＢＳで洗浄する。ロゼットを２００〜４００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳに再懸濁する。１００μｌ細胞懸濁液あたり１０μｌのＤｅｔａｃｈ−ａ−Ｂｅａｄを添加する。１１に設定したＤｙｎａｌ混合機にて室温で６０分間培養する。ビーズをＤｙａｎａｌ  ＭＰＣ中で２分間単離する。上清を移して保存する。ビーズを５００μｌのＰＢＳ／２％ＦＢＳ中で２〜３回洗浄し、細胞残渣を得る。回収した細胞を４００μｌのＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで洗浄する。
【０１０４】
ＣＢＣを実施し、単離した細胞濃度を求める。
＜実施例５＞
【０１０５】
ディスク調製および化学保持（ストレプトアビジンによる）
Ａ．基板調製および化学保持を含むディスク製造
この実施例では、透過型ディスク基板をエアガンで清浄にして塵を除去した。その後、このディスクをスピンコータに載せ、イソプロパノールの一定流で２回洗い流した。次いで、３１０ｍｌのトルエンおよび６５ｍｌのイソプロパノールに溶解させた２％ポリスチ
レンを有するポリスチレン溶液を、ディスク上に均一にコーティングした。
【０１０６】
ストレプトアビジン保持のために、ストレプトアビジン保存溶液をＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌとなるように希釈した。手動のピン保持を用いて、約１μｌのストレプトアビジンをディスク上のそれぞれの捕捉領域に保持させた。ディスクを恒湿チャンバ中で３０分間培養した。その後、過剰の非結合ストレプトアビジンを脱イオン水で洗い流して捕捉領域から除去し、ディスクをスピン乾燥した。
【０１０７】
二次抗体保持のために、活性化デキストランアルデヒドの新たな溶液（ＰＢＳ中に２００μｇ／ｍｌ）を、等容量のＶｅｃｔｏｒ  ＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）と混合した。手動のピン保持を用いて、ディスク上のそれぞれの捕捉領域に、約１μｌのＩｇＧ＋ＤＣＨＯ複合体を保持（ストレプトアビジン層の上に積層）した。ディスクを恒湿チャンバ中で６０分間培養した。過剰の抗体は脱イオン水で洗い流して除去し、ディスクをスピン乾燥した。
【０１０８】
一次抗体のために、ＤＡＫＯ  ＣＤ４を希釈してＰＢＳ中に５０μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ  ＣＤ８を希釈してＰＢＳ中に２５μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ  ＣＤ４５を希釈してＰＢＳ中に１４５μｇ／ｍｌとした。手動のピンアプリケーターを用いて、約１μｌの各一次抗体を、結合させた二次抗体の上に保持させた。その後、ディスクを恒湿チャンバ中で３０分間培養した。捕捉領域をＰＢＳで洗浄することにより過剰の非結合抗体を除去し、ディスクをスピン乾燥した。
【０１０９】
Ｂ．ディスクアセンブリ
使用したカバーディスクは、Ｆｒａｙｌｏｃｋ接着流路層が取り付けられた透明のディスクであった。流体回路を作製する４つのＵ型流路を接着剤へ刻印した。カバーを透過型ディスク基板上に置いて、流体流路が捕捉領域全体にわたるようにした。次いで、ディスクを共に固定するために、ディスクプレスを８回通過させた。
【０１１０】
Ｃ．ディスク漏れチェック、ブロッキング
各流体流路にＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄを充填し、１時間培養した。培養の間、ディスクをスピンコータ中で５分間５，０００ｒｐｍでスピンさせた。スピン後、ディスク流路の漏れをチェックした。次いで、ＳｔａｂｌｅＧｕａｒｄを流路から吸引し、ディスクを真空チャンバ中、真空下で一晩置いた。翌朝、ディスクを真空パウチに入れ、４℃で保管した。
＜実施例６＞
【０１１１】
光バイオディスクによるＣＤ４／ＣＤ８の比とＦＡＣＳによるＣＤ４／ＣＤ８の比との比較
Ａ．ＣＰＴ管を用いた臨床血液サンプルの調製
３ｍｌの臨床ＥＤＴＡ血液サンプル（番号２９、３０、３１、３２、３３、３４および３５）を、クエン酸ナトリウムを除去した個別のＣＰＴ管に添加した。管を１，５００×ｇで室温にて、２５分間遠心分離した。遠心分離後、０．５ｃｍの不透明ＭＮＣ層内の上部血漿を吸引により除去した。残りの不透明ＭＮＣ層を清浄な１５ｍｌ管に移し、１２ｍｌのＰＢＳをそれぞれの管に添加した。
【０１１２】
洗浄
続いて、細胞懸濁液を２５０×ｇで１０分間遠心分離した。続いて、上清を吸引により除去し、細胞を１４ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。懸濁液を、２５０×ｇで１０分間、再び遠心分離した。上清を吸引により除去し、各細胞ペレットを２００〜１７５μｌのＰＢＳを用いて再懸濁した。各サンプルの細胞濃度を、血球計算機で細胞を計数することにより
決定した。最終細胞濃度を各サンプルにつき３０，０００細胞／μｌに調整した。
【０１１３】
Ｂ．光バイオディスクによるＣＤ４／ＣＤ８の比とＦＡＣＳによるＣＤ４／ＣＤ８の比との比較
ディスク（番号２７ａ、２７ｂ、２７ｃ、２７ｄ、２７ｅ、２７ｆおよび２８）を、２５μｍの接着流路を用いて、実施例５と同様に調製した。
【０１１４】
各サンプルを、以下の表２に示すように対応する各ディスクに注入した。３０分後、ディスクを３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。続いて、化学領域で捕捉された細胞の光顕微鏡写真を撮影し、細胞を計数した。各臨床サンプルに対して、ＦＡＣＳ分析も行った。この実験の結果を以下の表２に示す。
【０１１５】
【表２】
2007501407.tif 000004
＜実施例７＞
【０１１６】
ディスク調製および化学保持
この実施例では、透過型ディスク基板をエアガンで清浄にして塵を除去した。その後、このディスクをスピンコータに載せ、イソプロパノールの一定流で２回洗い流した。次いで、３１０ｍｌのトルエンおよび６５ｍｌのイソプロパノールに溶解させた２％ポリスチレンを有するポリスチレン溶液を、ディスク上に均一にコーティングした。
【０１１７】
二次抗体保持のために、活性化デキストランアルデヒドの新たな溶液（ＰＢＳ中に２００μｇ／ｍｌ）を、等容量のＶｅｃｔｏｒ  ＩｇＧ（ＰＢＳ中に１２５μｇ／ｍｌ）と混合した。手動のピン保持を用いて、ディスク上のそれぞれの捕捉領域に、約１μｌのＩｇＧ＋ＤＣＨＯ複合体を保持した。ディスクを恒湿チャンバ中で６０分間培養した。過剰の抗体は脱イオン水で洗い流して除去し、ディスクをスピン乾燥した。
【０１１８】
一次抗体のために、ＤＡＫＯ  ＣＤ４を希釈してＰＢＳ中に５０μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ  ＣＤ８を希釈してＰＢＳ中に２５μｇ／ｍｌとし、ＤＡＫＯ  ＣＤ４５を希釈してＰＢＳ中に１４５μｇ／ｍｌとした。手動のピンアプリケーターを用いて、約１μｌの各一次抗体を、吸着させた二次抗体の上に保持させた。恒湿チャンバ中で３０分間培養した。過剰の抗体をＰＢＳで洗い流して除去し、ディスクをスピン乾燥した。
＜実施例８＞
【０１１９】
抗体被覆ビーズを用いた標的細胞と不要な細胞の区別
この実施例では、実施例３に上記するように透過型ディスクを調製した。
Ａ．アンモニウム溶解緩衝液を用いた臨床サンプルの調製
２０ｍｌの１×塩化アンモニウム溶解緩衝液を、１ｍｌのＡＣＤ血液サンプルに添加した。サンプルをボルテックスし、室温で１５分間培養した。次に、サンプルを５００×ｇで室温にて５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞をＰＢＳ中２％のＦＢＳ３ｍｌで洗
浄した。洗浄した細胞を、５００×ｇで５分間、遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、細胞をＰＢＳ中２％のＢＳＡ１ｍｌに再懸濁した。懸濁溶液中の最終細胞濃度は５，５００細胞／μｌであった。
【０１２０】
Ｂ．細胞のタグ付けおよび分析
Ｄｙｎａｌ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  抗ＣＤ２［Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ２（Ｐｒｏｄ  Ｎｏ．１１１．０２）］ビーズを、ビーズの保存溶液をＰＢＳ中０．１％ＢＳＡで３回洗浄することにより調製した。７２μｌのビーズ懸濁溶液を上記Ａ節で調製した細胞と一緒に混合した。細胞／ビーズ懸濁溶液を続いて室温で２０分間培養して、ビーズをサンプル中の不要なＣＤ２＋ＮＫ細胞と結合させた。培養後、懸濁溶液を上記で調製したディスク上に充填した。懸濁溶液を含有するディスクを続いて室温で１５分間培養して、サンプル中のＣＤ４＋細胞（Ｔ−リンパ球およびＮＫ細胞）を、ディスク上の捕捉領域内で抗ＣＤ４＋捕捉因子と結合させた。ディスクを続いて１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、非結合細胞を除去した。次に捕捉領域の顕微鏡写真を撮影した。これらの顕微鏡写真を図２４に示した。図２４に示すように、ＮＫ細胞２４２はビーズでタグ付けされているがＴ−リンパ球２４０はされておらず、ＮＫ細胞のみが表面上にＣＤ２マーカを有するため、ＮＫ細胞２４２は捕捉領域内でＴ−リンパ球と識別できる。
【０１２１】
［概要の結び］
多くのディスク、検定およびシステムに容易に提供又は適応される、本発明又はその種々の態様は、以下の本発明の譲渡人に譲渡されて同時係属中である特許出願にも提供されている。すなわち、２００２年３月１４日付けで出願された「Use of Restriction Enzymes and Other Chemical Methods to Decrease Non-Specific Binding in Dual Bead Assays and Related Bio-Discs, Methods, and System Apparatus for Detecting Medical Targets」と題する米国出願第１０／０９９，２６６号、２００２年４月１１日付けで出願された「Multi-Parameter Assays Including Analysis Discs and Methods Relating Thereto」と題する米国出願第１０／１２１，２８１号、２００２年５月１６日付けで出願された「Variable Sampling Control for Rendering Pixelization of Analysis Results in a Bio-Disc Assembly and Apparatus Relating Thereto」と題する米国出願第１０／１５０，５７５号、２００２年５月１６日付けで出願された「Surface Assembly For Immobilizing DNA Capture Probes in Genetic Assays Using Enzymatic Reactions to Generate Signals in Optical Bio-Discs and Methods Relating Thereto」と題する米国出願第１０／１５０，７０２号、２００２年７月１２日付けで出願された「Optical Disc System and Related Detecting and Decoding Methods for Analysis of Microscopic Structures 」と題する米国出願第１０／１９４，４１８号、同じく２００２年７月１２日付けで出願された「Multi-Purpose Optical Analysis Disc for Conducting Assays and Various Reporting Agents for Use Therewith」と題する米国出願第１０／１９４，３９６号、２００２年７月１９日付けで出願された「Transmissive Optical Disc Assemblies for Performing Physical Measurements and Methods Relating Thereto」と題する米国出願第１０／１９９，９７３号、２００２年７月２２日付けで出願された「Optical Analysis Disc and Related Drive Assembly for Performing Interactive Centrifugation」と題する米国出願第１０／２０１，５９１号、２００２年７月２４日付けで出願された「Method
and Apparatus for Bonded Fluidic Circuit for Optical Bio-Disc」と題する米国出願第１０／２０５，０１１号、同じく２００２年７月２４日付けで出願された「Magnetic Assisted Detection of Megnetic Beads Using Optical Disc Drives」と題する米国出願第１０／２０５，００５号、２００２年８月２９日付けで出願された「Methods for Qualitative and Quantitative Analysis of Cells and Related Optical Bio-Disc Systems」と題する米国出願第１０／２３０，９５９号、２００２年８月３０日付けで出願された「Capture Layer Assemblies for Cellular Assays Including Related Optical Analysis DIscs and Methods」と題する米国出願第１０／２３３，３２２号、２００２年９月６
日付けで出願された「Nuclear Morphology Based Identification and Quantification of White Blood Cell Types Using Optical Bio-Disc Systems」と題する米国出願第１０／２３６，８５７号、２００２年９月１１日付けで出願された「Methods for Differential Cell Counts Including Related Apparatus and Software for Performing Same」と題する米国出願第１０／２４１，５１２号、２００２年１０月２４日付けで出願された「Segmented Area Detector for Biodrive and Methods Relating Thereto」と題する米国出願第１０／２７９，６７７号、２００２年１１月１３日付けで出願された「Optical Bio-Discs and Fluidic Circuits for Analysis of Cells and Methods Relating Thereto」と題する米国出願第１０／２９３，２１４号、２００２年１１月１５日付けで出願された「Methods and Apparatus for Blood Typing with Optical Bio-Discs」と題する米国出願第１０／２９８，２６３号、２００３年１月１３日付けで出願された「Method and Apparatus for Visualizing Data」と題する米国出願第１０／３４１，３２６号、２００３年１月１４日付けで出願された「Methods and Apparatus for Extracting Data From an Optical Analysis Disc」と題する米国出願第１０／３４５，１２２号、２００３年１月１５日付けで出願された「Optical Discs Including Equi-Radial and/or Spiral Analysis Zones and Related Disc Drive Systems and Methods」と題する米国出願第１０／３４７，１５５号、２００３年１月１７日付けで出願された「Bio-Safe Dispenser and Optical Analysis Disc Assembly」と題する米国出願第１０／３４７，１１９号、２００３年１月２１日付けで出願された「Multi-Purpose Optical Analysis Disc for Conducting Assays and Related Methods for Attaching Capture Agents」と題する米国出願第１０／３４８，０４９号、２００３年１月２１日付けで出願された「Processes for Manufacturing Optical Analysis Discs with Molded Microfluidic Structures and Discs Made According Thereto」と題する米国出願第１０／３４８，１９６号、２００３年１月２３日付けで出願された「Methods for Triggering Through Disc Grooves and Related Optical Analysis Discs and System」と題する米国出願第１０／３５１，６０４号、２００３年１月２３日付けで出願された「Bio-Safety Features for Optical Analysis Discs
and Disc System Including Same」と題する米国出願第１０／３５１，２８０号、２００３年１月２４日付けで出願された「Manufacturing Processes for Making Optical Analysis Discs Including Successive Patterning Operations and Optical Discs Thereby
Manufactured」と題する米国出願第１０／３５１，２４４号、２００３年１月２７日付けで出願された「Processes for Manufacturing Optical Analysis Discs with Molded Microfluidic Structures and Discs Made According Thereto」と題する米国出願第１０／３５３，７７７号、２００３年１月２８日付けで出願された「Method and Apparatus for Logical Triggering」と題する米国出願第１０／３５３，８３９号、２００３年１月３０日付けで出願された「Methods For Synthesis of Bio-Active Nanoparticles and Nanocapsules For Use in Optical Bio-Disc Assays and Disc Assembly Including Same」と題する米国出願第１０／３５６，６６６号、２００３年２月１９日付けで出願された「Methods and an Apparatus for Multi-Use Mapping of an Optical Bio-Disc」と題する米国出願第１０／３７０，２７２号および２００３年１月１９日付けで出願された「Fluidic Circuits for Sample Preparation Including Bio-Discs and Methods Relating Thereto」と題する米国仮出願第６０／６０／４７９，８０３号に提供されている。
【０１２２】
本明細書で言及したすべての特許、特許出願およびそれ以外の出版物は、本明細書でその全体が繰り返されるのと同様に、その内容のすべてが参照により本明細書に援用される。
【０１２３】
一定の好ましい実施形態を参照して、本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、それらの正確な実施形態に限定されるものでないことが理解されるべきである。例えば、上記の方法は血液細胞以外の標的を区別するのに用いることができる。他の標的には、これらに限定されないが、ウィルス、組織細胞、細菌、植物細胞および微生物を挙げることがで
きる。逆に、本発明を実践する現在の最良の形態を説明する本開示を考慮すると、当業者には、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多くの変更および変形が提示されるであろう。したがって、本発明の範囲は、上記説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の意味するものおよび均等物の範囲内に入るすべての改変、変更、および変形は、特許請求の範囲の範囲内にあるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明によるバイオディスクシステムのイラスト表示である。
【図２】本発明と共に利用される反射型バイオディスクの分解斜視図である。
【図３】図２に示すディスクの平面図である。
【図４】切り取り部分がディスクの様々な層を示す、図２に示すディスクの斜視図である。
【図５】本発明と共に使用される透過型バイオディスクの分解斜視図である。
【図６】切り取り部分がディスクの半反射層の機能的態様を示す、図５に示すディスクを表す斜視図である。
【図７】薄い金薄膜の厚さと透過との関係を示すグラフ表示である。
【図８】図５に示すディスクの平面図である。
【図９】切り取り部分が、図６に示す半反射層のタイプを含むディスクの様々な層を示す、図５に示すディスクの斜視図である。
【図１０】図１のシステムをより詳細に示すブロック斜視図表示である。
【図１１】図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたフロー流路を示す、当該反射型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。
【図１２】図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたフロー流路および上部検出器を示す、当該透過型光バイオディスクの半径に対して垂直な部分断面図である。
【図１３】図２、図３、および図４に示す反射型光バイオディスクに形成されたウォブル溝を示す当該反射型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。
【図１４】図５、図８、および図９に示す透過型光バイオディスクに形成されたウォブル溝および上部検出器を示す当該透過型光バイオディスクの縦方向の部分断面図である。
【図１５】反射型ディスクの全層と、反射型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１１と同様の図である。
【図１６】透過型ディスクの全層と、透過型ディスクの最初の屈折特性とを示す図１２と同様の図である。
【図１７】本発明の方法を使用する血液サンプルの分析、および勾配細胞分離方法を使用する白血球細胞の単離を示す、イラストで表したフローチャートである。
【図１８】ビーズによる、細胞の標識化のイラスト図（pictorial illustration）である。
【図１９】バイオディスク上で不要な細胞の結合を防止するためのビーズの使用を描く、本発明の実施形態のイラスト表示である。
【図２０Ａ】バイオディスク上に固定化された標的細胞を特異的にタグ付けする又は標識する様々なビーズを用いた、サンプル中の様々なタイプの細胞を同定する方法の工程を説明する、本発明の別の実施形態のグラフィック図を示す。
【図２０Ｂ】バイオディスク上に固定化された標的細胞を特異的にタグ付けする又は標識する様々なビーズを用いた、サンプル中の様々なタイプの細胞を同定する方法の工程を説明する、本発明の別の実施形態のグラフィック図を示す。
【図２１】光バイオディスクを用いた、当該微生物を捕捉する、且つその存在を検出するビーズの使用のイラスト表示である。
【図２２】ビーズを用いた、不要な細胞のタグ付けのイラストである。
【図２３】Ａは、本発明による光バイオディスクのトラックの近くに位置する、１ミクロンレポータビーズと５ミクロン細胞が共に結合した複合体のグラフ表示である。      Ｂは、本発明による光ドライブから検出されたシグナルを用いた、図２３Ａの複合体に由来する一連のシグネチャトレース（signature trace）である。
【図２４】非付着ビーズ、非標識細胞およびビーズ−細胞複合体又は標識細胞の顕微鏡写真を示す。
【図２５Ａ】不必要な細胞を同定するために、酵素を用いて標的細胞から不要な細胞を分画する方法の工程を示す、本発明の別の実施形態のイラスト表示である。
【図２５Ｂ】不必要な細胞を同定するために、酵素を用いて標的細胞から不必要な細胞を分画する方法の工程を示す、本発明の別の実施形態のイラスト表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【国際調査報告】
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