(57)【要約】  哺乳類の四肢の血管外細胞に対してポリヌクレオチドの送達が可能な静脈送達方法が記載される。本方法は、一時的に閉塞された遠位の静脈に対するポリヌクレオチドの注射を含む。ポリヌクレオチドの送達は、周囲組織に溶液の管外溢出を可能にするために、充分量の迅速な注射によって容易になる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の肢で血管外細胞にポリヌクレオチドを送達する方法であって、
ａ）前記肢の静脈への注射装置の挿入と、
ｂ）前記ポリヌクレオチドの注射の目的とする部位の近位の静脈に対する閉塞の形成と、
ｃ）前記静脈に対して溶液中のポリヌクレオチドを注射し、それによって前記閉塞と遠位の前記肢の前記血管外細胞に対する前記ポリヌクレオチドの送達と、
よりなる方法。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドが順行方向で前記静脈に注射されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閉塞の形成は、前記肢の皮膚の表面への血流を妨害するための装置を適用し、前記肢へ流れ込む血流及び前記肢からの血流を妨害するために前記装置で前記肢に対して十分な圧力を適用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記血管外細胞は、骨格の筋細胞、筋繊維、筋細胞、関節細胞、滑液細胞、軟骨細胞、結合組織細胞、線維芽細胞、線維細胞、軟骨細胞、間充織細胞、マスト細胞、大食細胞、組織球、腱細胞、カプセル状の細胞、骨細胞、骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞、骨髄細胞、血液生成細胞、皮膚細胞、リンパ節細胞およびストロマ細胞からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドは、裸のポリヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドは、ウィルス関連のポリヌクレオチドから構成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウィルスは、アデノ伴生ウィルス及びアデノウィルスから構成される群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドは、トランスフェクション剤と関連することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドは、発現可能な遺伝子で構成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子は、分泌タンパク質、内分泌因子、非分泌タンパク質、抗原及び治療ポリペプチドからなるリストから選択されるポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、前記細胞の遺伝子の発現を変化することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ポリヌクレオチドを誘発するＲＮＡｉ、及びｓｉＲＮＡ又はアンチセンスポリヌクレオチドをコードする遺伝子からなる群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのスプライシングを変えることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
静脈の透過性を高めるために一つ以上の化合物を前記肢の血管に対する注射をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
麻酔薬および鎮痛薬からなるリストから選択される一つ以上の化合物の前記哺乳類に対する投与をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳類は疾病を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾病は、代謝性疾患、筋疾患、筋肉損傷、筋収縮症、癌、伝染病、血管病、循環障害、内分泌の障害、免疫不全からなるリストから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳類の肢で血管外細胞に分子を送達する方法であって、
ａ）前記肢の静脈への注射装置の挿入と、
ｂ）前記ポリヌクレオチドの注射の目的とする部位の近位の静脈に対する閉塞の形成と、
ｃ）前記静脈に対して溶液中の分子を注射し、それによって前記閉塞と遠位の前記肢の前記血管外細胞に対する前記ポリヌクレオチドの送達と、
よりなる方法。
【請求項１９】
前記分子は、生物的に活性な化合物から構成されることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
霊長類の血管外細胞にｓｉＲＮＡポリヌクレオチド又はｓｉＲＮＡ発現ポリヌクレオチドを送達する方法であって、
ａ）前記静脈への注射装置の挿入と、
ｂ）前記静脈に対して溶液中の分子を注射し、それによって前記血管外細胞に対する前記ポリヌクレオチドの送達と、
よりなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で哺乳類の血管外の実質細胞に対するポリヌクレオチドの静脈内送達のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療は、疾患または生医学的調査および研究を扱うために遺伝物質の細胞に対する意図的な送達である。遺伝子治療は、外生のヌクレオチド配列を発現するか、内因性ヌクレオチド配列の発現を禁止するか、除去するか、増やすかまたは変えるか、あるいは、自然に細胞と関係していない特定の生理的特徴を生じるために、ポリヌクレオチドの細胞への送達を含む。場合によっては、細胞に送達される際に、ポリヌクレオチド自体は細胞の遺伝子の発現を変えることができる。遺伝子治療の基本的な挑戦は、効率的で安全である方法においてインビボで遺伝情報を細胞に届ける方法を開発することである。遺伝物質が適切に届けられる場合、それらは潜在的に患者の健康を強化することができて、ある場合には、治療に至ることができる。また、遺伝物質のインビボにおける細胞への送達は、薬剤開発と従来の小さい分子薬剤のためのターゲットの確証と同様に、遺伝子機能に対する基礎研究において有益である。
【０００３】
骨格の筋肉は、疾患（例えば筋ジストロフィーまたは末梢性肢虚血）を治療することを意図する遺伝子治療介入のための魅力的な目標組織である。また、代謝および遺伝子の筋肉状況の他の先天的な過失、筋肉疾患、筋収縮症、筋肉損傷（スポーツ損傷を含む）および筋ジストロフィーの二次症状は、遺伝子治療を使用する処置における候補である。筋肉に関連した疾患に加えて、他の非筋肉状況は、また、骨格の筋肉に対する遺伝子送達によって治療されることができる。遺伝物質を骨格の筋細胞に届けることによって、筋組織は、改変された内分泌組織になることができ得る。届けられた遺伝子が筋細胞から分泌されるタンパク質をコード化する場合、血友病、糖尿病、高コレステロール血症、腎臓間質性線維症、高血圧、異リポ蛋白血症、慢性腎臓線維症、肝硬変、高血糖およびアテローム性動脈硬化症のような疾患は治療されることができる。筋細胞に対する遺伝子送達は、また、免疫反応を調節するかまたは誘発して、骨疾患を治療するかまたは骨の治癒を促進するか、または、成長プレート損傷を治療するために用いてもよい。治療的な見込みが高い候補遺伝子が識別される一方、現行の送達方法は関連した問題を有する。
【０００４】
インビボでプラスミドＤＮＡの筋肉への直接的な注射が筋肉で外来遺伝子の発現を可能にすることが最初に分かった（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０）。近年、肢骨格の筋肉に対するポリヌクレオチドの動脈内送達は、効果的なことを示した。（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｂｕｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６，  ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｂｕｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｈｏｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００３，  Ｅａｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００２）この方法は、肢の全体にわたって筋細胞にポリヌクレオチドの送達に影響を及ぼす際の直接の筋肉注射における改善を提供した。肢の多数の筋肉群の１０％以上の筋繊維のトランスフェクション効率は、動脈部位への単一の注射に続いて得られた（Ｂｕｄｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。肢骨格の筋細胞に対するポリヌクレオチドの動脈内送達が効果的であると証明される一方、手順は直ちに臨床的に実行可能でない。動脈の注射は、動脈にアクセスするように侵襲的技法を必要とし、繰り返し送達が臨床的に実際的であるかどうか、疑問となる。また、効果的な送達のために必要とされるかなりの注射量および高い注射率が、懸念の原因である。肢静脈の多数の弁の存在のため、静注がインビボでポリヌクレオチドを肢の筋肉に届けるための実行可能なオプションでないと考えられていた。動脈の注射において行なわれているように、多分岐の静脈に向かう注射は、これらの弁によって妨害されて、弁に潜在的に損害を与える。
【０００５】
我々は、現在、弁によって提示される障害を克服して、哺乳類の肢の筋肉の全体にわたって骨格の筋繊維にポリヌクレオチドの効果的で、反復可能で、安全な送達のための肢静脈を使用するインビボで効果的な送達方法を記載する。静脈システムは魅力的な投与ルートである。その理由は、動脈の様に、静脈システムは肢の多数の筋肉群に対する直接的な導管のためである。動脈とは異なり、静脈は皮膚によるアクセスに非常により容易であり、注射において血管に関して、潜在的に害になる結果が少ない。加えて、静脈方法は後毛細管細静脈付近により直接的な導管を提供し、そして、それは筋肉の微小血管系の他の一部よりも、高分子に浸透する（Ｐａｌａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  １９７８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、インビボで哺乳類の血管外の実質細胞に対するポリヌクレオチドの静脈内送達のための方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一つの実施態様において、哺乳類の四肢の細胞へポリヌクレオチドを送達するための処理が記載され、その処理は、肢に流れ込む血流及び／又は肢から流れ出る血流を妨害することと、閉塞に対して末端部位の肢の静脈の経路に溶液中のポリヌクレオチドを挿入することからなる。ポリヌクレオチドは、閉塞に対して末端の肢細胞に送達される。注射の前、注射の間、及び注射後に、静脈は閉塞されてよい。好ましい実施態様において、当該細胞は、哺乳類の肢の血管外細胞である。
【０００８】
好ましい実施態様において、我々は、インビボで哺乳類の肢の実質細胞へのポリヌクレオチドの送達のための処理を記載し、当該処理は、静脈内に溶液中のポリヌクレオチドを注射することからなり、注射量及び注射率の量が、静脈及び小静脈の透過性を増大して、目標となる組織の血管外流体量を増やすことに結果としてなる。静脈透過性及び目標となる組織の血管外流体量を増やすことは、目標組織若しくは領域に流れ込むおよび／または目標組織若しくは領域から流れ出る一つ以上の血管による流体の流れを妨げることをさらに含むことができる。溶液は、ポリヌクレオチドと結合してもしなくてもよい化合物を追加的に含んでもよく、送達を支援し得る。
【０００９】
好ましい実施態様において、処理は、さらに、少なくとも一つの麻酔薬または鎮痛薬または佐剤の投与から成る。麻酔薬または鎮痛薬の投与は、処理中若しくは処理後に、哺乳類によって経験される潜在的な不快または痛みを緩和する。この種の薬剤の例は、リドカリン（ｌｉｄｏｃａｒｉｎｅ）、ＮＳＡＩＤ、クロニジン、ケタミン、神経筋遮断薬及び免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔｓ）である。
【００１０】
好ましい実施態様において、インビボで哺乳類の血管から周囲組織にポリヌクレオチドの輸送を増やすための方法が記載され、当該方法は、ポリヌクレオチドを含有する注射溶液の量を目標とする組織の静脈に注射することからなり、それによって、静脈から流体を血管外領域に流出させる。目標となる組織は、静脈が血液を排出する組織である。さらに、この注射溶液は、送達を支援してもよく、かつポリヌクレオチドと結合してもしなくてもよい化合物を含む。
【００１１】
好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドを哺乳類の細胞に送達するためのインビボ処理が記載され、当該処理は、注射ポイント及び目的とする組織に近接した一つ以上の血管による流体の流れを妨げるか、閉塞する間に、溶液中のポリヌクレオチドを静脈に挿入することからなる。閉塞は哺乳類に存在する、例えば凝血塊などの閉塞であってよく、または、閉塞は適用されてよい。処理は、哺乳類の皮膚に対して外部の圧縮を適用することによって静脈による流体の流れまたは目標とする組織の動脈を妨げることを含む。この圧縮は、例えば血圧計（またはふくらんでいるよりもブラダーを備える装置）または止血バンドなどのカフの皮膚上に適用することを含む。血管による流体の流れはまた、血管をクランプすることによって防ぐか、または血管内に位置したバルーンカテーテルによって防がれてよい。血管は、組織に対して虚血性の損傷を引き起こさずにポリヌクレオチドを送達するために必要な時間において閉塞される。溶液は、閉塞に対して末端の肢の静脈に注射される。溶液は、カテーテル、注射器針、カニューレ、スタイレット、バルーンカテーテル、多数のバルーンカテーテル、単一穴カテーテルおよびマルチ・ルーメン・カテーテルからなる群から選択される注射装置を使用して注射される。
【００１２】
細胞は、骨格の筋細胞（筋繊維、筋細胞）骨細胞（骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、骨髄細胞、ストロマ細胞、共同の細胞（滑液および軟骨電池）、結合組織細胞（線維芽細胞、線維細胞、軟骨細胞、間充織細胞、マスト細胞、大食細胞、組織球）、皮膚の腱細胞の細胞およびリンパ節の細胞で構成される群から選択されてよい。
【００１３】
記載されている方法は、細胞の内在性特性を変えるために、例えば、治療的な目的のため、機能を増やすため、薬剤の発見を促進するため、薬剤の目標確証を容易にするため、または遺伝子機能を調査（すなわち、研究）するために、ポリヌクレオチドを哺乳類の細胞に送達するために用いることができる。
【００１４】
本発明のさらなる目的、特徴及び利点は、添付図と共に下記の詳細な記載から明白である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１Ａ乃至１Ｃは、哺乳類の肢への核酸のカテーテルによって媒介される静注の概略図であり、Ａはラットの末梢後肢に対する静脈内送達、Ｂは霊長類の末梢後肢に対する静脈内送達、Ｃはヒトの末梢後肢に対する静脈内送達を示す。各々の左パネルは、肢の主要静脈を例示する。図に示される閉塞部位および注射部位は、図示する目的のためである。本記載および実施例において示されるように、異なる閉塞および注射部位が可能である。
【００１６】
図２Ａ乃至２Ｂで、（Ａ）は注射量の効果を例示し、（Ｂ）は雌のスピローグ−ドーリー・ラット（１２０−１５０ｇ）の後肢に、ｐＤＮＡ（ｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）の静脈内送達の結果による、ルシフェラーゼ発現の注射率を示すグラフである。各データポイントにおいて、２乃至７の肢に注射されて解析された。Ｔバーは標準偏差を示す。
【００１７】
図３は、５００μｇのｐＤＮＡ（ｐＣＩ−ＬａｃＺ）の単一の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたラット肢腓腹筋の筋肉の顕微鏡写真である。
【００１８】
図４は、５００μｇのｐＤＮＡ（ｐＣＩ−ＬａｃＺ）の反復した（複数の）静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたラット肢腓腹筋（Ａ）及び肢むこうずね（Ｂ）の筋肉の顕微鏡写真である。
【００１９】
図５は、治療遺伝子の哺乳類の四肢への血管内注射である。１２０乃至１５０ｇの雌のスピローグ−ドーリー・ラット（ｎ  ＝  ３）の末端肢の大伏在静脈に、ラット・エリトロポイエチンをコード化している５００μｇ  ｐＤＮＡ（３ｍｌのＮＳＳ／２０ｓにおいて）の注射後のエリトロポイエチン発現の時間の経過を示すグラフである。
【００２０】
図６は、治療遺伝子の哺乳類の四肢への血管内注射である。０．６ｍｌのＮＳＳ（７．５秒の注射）のｐＤＮＡヒトジストロフィン発現ベクターの３００μｇの静注の一週間後のｍｄｘ４ｃｖマウス腓腹筋の筋肉（左パネル）のヒトのジストロフィン発現における免疫組織化学的染色を示す。ｐＣＩ−Ｌｕｃネガティブコントロールベクターを注射されるｍｄｘ４ｃｖマウスの染色は、右パネルに示される。
【００２１】
図７Ａ乃至７Ｆは、４０ｍｇのｐＤＮＡ（ｐＣＩ−ＬａｃＺ）の大伏在静脈（Ａ−Ｂ）の末端部位への一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色された３つの異なる下肢筋肉群からの顕微鏡写真である。ＡＢは腓腹筋、ＣＤはヒラメ筋、ＥＦは短母指伸筋を示す。個々のパネルは、各々の筋肉群の２つの異なる位置の代表的な高発現領域を示す。
【００２２】
図８は、ｓｉＲＮＡｓおよびｐＤＮＡ発現ベクターの静脈内共同送達後のラットおよび霊長類の肢の筋肉のＲＮＡ干渉を示す。目標とされたｓｉＲＮＡを使用する肢の筋肉のホタル・ルシフェラーゼノックダウンは、１まで正常化されたコントロールｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）を使用するホタル・ルシフェラーゼノックダウンに対してプロットされた。（Ａ）はラット、（Ｂ）はモンキーである。
【００２３】
図９は、ビーグル（Ａ）およびアカゲザル・マカーク（Ｂ）の２つの静注後のクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）値の時間の経過を示すグラフである。
【００２４】
図１０は、静脈内遺伝子の免疫化：Ａ）マウス及びＢ）ウサギの抗ルシフェラーゼ抗体発現の時間の経過を示す。動物は、ルシフェラーゼ遺伝子をコード化している発現ベクターで静脈内注射された。
【００２５】
図１１は、毎分３ｍｌの率で、０．８ｍｌ食塩水のアデノ伴生ウイルスの０．１９のｘ  １０９の変換ユニットの一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたマウス後肢腓腹筋の筋肉の顕微鏡写真である。
【００２６】
図１２は、β−ガラクトシダーゼ・トランス遺伝子の静脈内送達後の骨のＬａｃＺ染色の顕微鏡写真である。左パネルは、骨および関節の断面図を示す。右側パネルは、ＬａｃＺによって染色された同じ断面を示す。
【００２７】
図１３は、止血バンドから末端の伏在静脈へローダミン標識の７０ｋＤａのデキストランの静脈内注射の後、マウスの肢の骨格筋の顕微鏡写真である。左上のパネルは、ローダミン標識のデキストランを示す。右上のパネルは、筋細胞の位置を示す。左下のパネルは、核の位置を示す。右下のパネルは、合成画像を示す。
【００２８】
本明細書に記載の発明は、哺乳類の四肢の血管外細胞に対するポリヌクレオチドの送達方法を提供する。より詳細には、本発明は、脈管系外の細胞に対して、ポリヌクレオチドを届ける静脈系の用途に関し、それによって、ポリヌクレオチドは順行方向（通常の血流方向）で肢の静脈に注射される。ポリヌクレオチドの静脈内送達は、多くの効果を提供する。静脈注射は、動脈の注射よりも危険性が少ない。若干の静脈は、動脈より表面に近く位置して、このように、動脈よりもアクセス可能である。したがって、静脈システムは、初回（一回の）及び繰り返し送達に対して、より容易にアクセス可能である。加えて、血流を妨げるためのカフの使用を伴う静脈注射は、非外科的方法をポリヌクレオチド送達に提供する。処理の間、静脈が損傷される場合、その損傷は動脈の場合よりも問題とはならない。静脈システムの血管は、相当する動脈の血管と比較して血管壁厚が薄く、動脈のシステムよりも浸透することができ、血管外場所へのさらに配達させる。特定の臨床徴候において、動脈のシステムが脈管病理（動脈硬化、アテローム性動脈硬化症および単一であるか多数の部分的であるか完全閉塞）を示す所で、静脈システムは、ポリヌクレオチドを骨格の筋細胞を含む、関心のある血管外領域に届ける、より魅力的な送達導管を表す。
【００２９】
静脈内送達方法は、目標の肢から血流を妨げ、閉塞から末端で肢の静脈に注射装置を挿入して、順行方向の静脈にポリヌクレオチドを含む溶液を注射することからなる。注射量と、注射率は、動物のサイズ、溶液が注射される静脈のサイズ、並びに目標の細胞のサイズ及び／又は量に依存する。多量の注射及び／又は高い注射率は、より大きな目標又は肢のサイズに依存する。大型動物への送達において、多量の注射が予期される。肢のサイズを決定する一つの方法は、容量置換測定によるか、またはＭＲＩ走査により、それは筋肉質量を決定するために用いることができる。与えられた哺乳類の種の特定の目標組織に送達するために特定の静脈に注射する正確な容量及び率は、経験的に決定されることができる。閉塞から末端に位置する細胞は、閉塞と、心臓から離れた肢の端との間に位置する細胞である。手、足、又は関節の静脈に対する注射において、溶液は、逆行方向に注射してよい。肢の分離した部分への送達において、肢部への血流は、目標とする領域の近接部と末端部の両部で閉塞してよい。記載されている方法は、肢または目標組織の全体にわたる細胞に対して、直接の筋内注射によって可能であるよりも均一なポリヌクレオチドの分配を提供する。
【００３０】
針、カニューレ、カテーテルまたは他の注射装置は、静脈にポリヌクレオチドを注射するために用いてもよい。単一、またはマルチ・バルーンカテーテル並びに単一およびマルチ・ルーメン注射装置と同様に、単一およびマルチポート注射器が用いられてよい。目標組織内または目標組織の近くに位置するために、カテーテルは遠部位に挿入されることができて、静脈の内腔に通されることができる。また、注射は、皮膚を横断して、静脈の内腔に入る針を使用して実行されることができる。血管の閉塞は、バルーンカテーテルによって、クランプするか、または、カフは目標領域を制限することができるかまたは定めることができる。記載されている静脈内処理は、血流が虚血によって組織損害を与えるのに必要とする時間よりも、実質的に少ない時間において、妨げられることが必要である。
【００３１】
流体の流れを閉塞する一つの方法は、外部カフの適用である。用語としてカフは、哺乳類の四肢への流れ及び四肢からの流れを妨げるための外部に適用された装置である。カフの真下の領域で静脈のような四肢周辺でカフが圧力をかけることは、通常の流率で静脈から流れ出る流体を妨げるのに十分な量を閉塞させる。カフの一例は、血圧計であり、それは血圧を測定するために通常用いる。別の例は、止血バンドである。第三の例は、静脈内の局所麻酔のために使用されるような、２つのエアーブラダーを含む修正された血圧計カフである（すなわちＢｉｅｒ  Ｂｌｏｃｋ）。さらに、二重止血バンド、二重カフ止血バンド、オシロ・トノメータ、オシロ・メートルおよびヘモ・トノメータは、カフの実施例である。血圧計は、収縮期の血圧を５００ｍｍ  Ｈｇを超えるか、または７００ｍｍ  Ｈｇを超過する圧力に高めることができるか、または注射によって発生する血管内圧力より高くすることができる。
【００３２】
肢の血管の近位の閉塞と共に、適当な率で注射溶液の適当量を周辺の肢静脈に挿入することは、注射溶液およびその中のポリヌクレオチドに対する肢の脈管構造の透過性を高める。透過性は、高分子が血管から移動して、血管外領域に入る傾向である。血流を閉塞することは、全ての肢への血流および全ての肢からの血流を妨げることによってなされるか、または特定の血管を妨げることによってなされることができる。全ての肢を閉塞することにおいて、カフが使用できる。注射溶液に存在するポリヌクレオチドを送達させるのに十分な時間において、血管は部分的または全体的に閉塞される。閉塞は、注射の直後に開放されることができるか、または虚血による組織損害に結果としてならないと決められた時間を経た後、開放されることができる。ポリヌクレオチドは裸のポリヌクレオチドであってもよいし、非ウィルス性のトランスフェクション剤などの送達を支援する組成と関連したものであってもよい。さらに、タンパク質またはウィルス性ベクターなど他の高分子を血管外細胞に送達することが可能である。
【００３３】
脈管構造は個々の間で同一ではないので、方法は適当な注射量および注射率を予測するかまたは制御するように使用されることができる。蛍光透視法によって検出されるヨード化されたコントラスト染料の注射は、血管床サイズを決定するのを助けることができる。ＭＲＩは、また、ベッドサイズを決定するために用いることができる。また、注射溶液が予め設定された圧力または率で送達されるように、自動注射システムが用いられることができる。このようなシステムにおいて、圧力は、注射装置において、溶液が注射される血管で、目標組織の範囲内の分岐血管、または目標組織の範囲内の静脈若しくは動脈の範囲内で測定されることができる。
【００３４】
薬剤または化学品および高緊張溶液を含む、公知である他の薬剤は、さらなる血管の浸透性を高めるように使用されてよい。薬剤または化学製品は、血管壁内で細胞の機能、活性または形状の変化を引き起こすことによって、血管の透過性を高めることができ、概して、脈管細胞の特定のレセプタ、酵素またはタンパク質と相互に作用する。他の薬剤は、細胞外で結合する物質を変えることによって、透過性を高めることができる。血管透過性を高めるために用いてもよい薬剤または化学製品の例は、ヒスタミン、脈管透過性因子（ＶＰＦ（また、脈管内皮成長因子として公知であるＶＥＧＦ）、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、ベラパミル、ニカルジピン、ジルチアゼム）、ベータ遮断薬（例えば、リシノプリル）、ホルボールエステル（例えば、ＰＫＣ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、アデノシン、パパベリン、アトロピンおよびニフェジピンを含む。透過性を強化する薬剤または化学製品は、ポリヌクレオチドを含有する注射溶液に存在してもよい。流出促進溶液（透過性を強化する薬剤または化学製品を含んでいる溶液）は、また、ポリヌクレオチドを含んでいる溶液の注射前に、静脈に注射されることができる。高緊張の溶液は、このように浸透圧を高め、細胞を縮ませて、血液の浸透性と比較して、浸透性を高める。概して、塩化ナトリウムのような塩類または糖若しくはマンニトールのような多価アルコールを含んでいる高緊張の溶液が用いられる。送達は、また、血管収縮または血管拡張が生じる薬理的な薬剤（例えば、カテコールアミン、エピネフリン、ノレピンプリン（ｎｏｒｅｐｉｎｅｐｒｈｉｎｅ）、ドーパミン、ドブタミン、アドレナリン作用遮断剤（例えば、Ｃａｌｄｕｒａ（ファイザー）、ｄｉｂｅｎｓｙｌｉｎｅ（Ｗｅｌｌｓｐｒｉｎｇ）、Ｈｙｔｒｉｎ（アボット）およびＭｉｎｉｐｒｅｓｓ（ファイザー））、アドレナリン刺激剤（ａｌｄｏｃｌｏｒ（メルク）、ｃａｔａｐｒｅｓ（ｏｅｒｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＣｌｏｒｐｒｅｓ（Ｂｅｒｔｅｋ））、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）抑制剤、利尿剤、アンギオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、βアドレナリン作用遮断剤）によって強化されてよい。ヘパリン、血栓溶解剤（ウロキナーゼ、Ａｂｂｏｋｉｎａｓｅ）、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子（Ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ、ＴＮＫアーゼ、Ａｌｔｅｐｌａｓｅ、Ａｃｔｉｖａｓｅ  Ｉ．Ｖ．）、ナトリウム利尿ペプチド、昇圧剤およびエンドセリン受容体アンタゴニスト（ボセンタン（ｂｏｓｅｎｔａｎ））のような血液凝固（または消化凝血）を妨げるか、または予防する薬剤はまた、血管に注射されてよい。コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼおよびヘパリナーゼ（ｈｅｐａｒｉｎａｓｅｓ）のような酵素は、また、送達を改善するために用いてもよい。寒さ、熱、電磁放射、電流、電圧および超音波の物理的な適用はまた、送達を改善するために用いられ得る。
【００３５】
また、物理的な力は、ポリヌクレオチドの送達を援助するために、肢に対して適用されることができる。これらの物理的な力は、熱、寒さ、電磁放射（例えば、マイクロ波または赤外線）、超音波、電流および電圧を含む。
【００３６】
ポリヌクレオチドは、薬学的に許容可能な溶液に注射される。薬学的に許容可能は、薬理学的／毒物的な見地から哺乳類が許容できる特質及び／又は物質を意味する。薬学的に許容可能なフレーズは、哺乳類に投与される際に、生理的に許容できて、概してアレルギー、他の問題となるもの、または中毒反応をもたらさない、分子体、組成物および特性に関連する。望ましくは、本願明細書において使われるように、用語項薬学的に許容可能な手段は、動物での使用、特に人間における使用において、連邦政府または州政府の調整機関の承認を得るか、または米国のファルマコピア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）若しくは他の一般的に認められたファルマコピア（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）に一覧される。
【００３７】
記載されている方法は、ポリヌクレオチドをマウス、ラット、ウサギ、イヌおよび人間以外の霊長類の肢筋細胞に届けるために効果的なことを示す。また、関節の細胞（滑液、軟骨細胞およびカプセル状の細胞を含む）並びに骨の細胞および骨髄（血液生成で血液生成幹細胞および骨髄間質細胞を含む）を含む肢の他の細胞への送達が可能である。注射されるポリヌクレオチドの量および注射量を増やすことによって、ラットのような小さい哺乳類の肢の細胞に対するポリヌクレオチドの静脈内送達のために記載された方法は、より大型動物で使用するために容易に適する。また、注射率は、より大型の哺乳類に対する送達のために高めてもよい。逆にいえば、より小さい動物に対する注射量および／または注射率は減じられる。例えば、ラットの後肢（総量１５０ｇの動物）に対する送達において、伏在静脈に対する２５ｍｌ／分の率で０．２乃至３ｍｌの注射溶液の注射は、結果として、肢の全体にわたって多数の筋細胞へのポリヌクレオチドの送達になる。ビーグル犬（総量９．５ｋｇまで）前肢に対する送達において、肢静脈に対する２ｍｌ／秒の送達率の４０ｍｌの注射溶液は、結果として、肢の全体にわたって多数の筋細胞にポリヌクレオチドの送達になる。アカゲザルの肢に対する送達において、肢静脈に対する１．７乃至２ｍｌ／秒の送達率の４０乃至１００ｍｌの注射溶液は、結果として、肢の全体にわたって多数の筋細胞にポリヌクレオチドの送達になる。この量は、アカゲザルの取って代わった目標の肢の１ｍｌにつき、約０．２乃至０．６ｍｌの注射量に対応する。目標の肢の量は、肢の量であるか、静脈閉塞に対して末端の肢の部分であるか、あるいは血管閉塞によって分離される肢の部分である。静注方法は、単一の注射にしたがって、閉塞に対して末端の肢のほとんど全ての筋肉群において、結果として、非常に効果的な遺伝子送達となる。この手法がより大型の哺乳類に拡大されるにつれて、この手法を用いて達成できるトランス遺伝子発現のレベルが減少しないことは、特に注目に値する。対照的に、プラスミドＤＮＡの直接の筋内注射は、げっ歯動物の筋肉の１グラムにつき高い発現レベルとなるが、しかし、霊長類の筋肉の１グラムにつき非常に低い発現レベルとなる（Ｊｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．  １９９２）。この方法がラット、犬、及びヒト以外の霊長類に対して容易に適用されるので、ヒトを含む他の哺乳類での使用においても容易に適用されることが予測される。
【００３８】
また、記載されている方法が、単一の哺乳類において反復して用いられてよい。複数の注射は追加的な組織への送達を提供するため、単一組織への送達を高めるために使用されてよいか、あるいは複数の処理が示される場合である。複数の注射は、同じ動物の異なる肢、その動物の同じ肢内、その動物の同じ静脈内、その動物の（同一または異なる肢）異なる静脈内で実行されてよい。また、血管閉塞の部位は、同じ動物の複数の注射において、同一でも異なってもよい。
【００３９】
ヌクレオチドは、閉塞部位に対する肢末端に存在する任意の静脈に挿入してよい。好ましい静脈は、表面の静脈を含む。肢の静脈は、橈側皮静脈、正中静脈、橈側正中皮静脈、尺側正中皮静脈、上腕静脈、尺側皮静脈、骨間静脈、橈骨静脈、尺骨静脈（前部、後部、総）、深部の手掌静脈、大型の伏在静脈（内側伏在静脈、大伏在静脈、内部伏在静脈、長伏在静脈）、より小さい伏在静脈、小型の伏在静脈（支伏在静脈、外側伏在静脈、小伏在静脈、短伏在静脈）、前脛骨静脈、後方脛骨静脈、腓骨静脈、膝窩静脈、足底静脈（内側及び支脈）、背面の静脈アーチ、背面指静脈、背面の中手静脈および背側指静脈からなるリストから選択されてよい。
【００４０】
記載された方法が、他の送達賦形剤若しくはベクター又は他の送達を強化する群と組み合わせてもよいと予測される。そのような送達賦形剤および群は、トランスフェクション試薬、ウィルス・ベクター、非ウィルス・ベクター、脂質、ポリマー、ポリカチオン、両親媒性化合物、ターゲティングシグナル、核のターゲティングシグナルおよび膜活性化合物を含む。注射溶液の組成は、送達される分子又は複合体の性質に依存できる。ある複合体は、低い塩の注射溶液を使用して、より効率的に送達されてよい。さらに、高緊張であるか低浸透の注射溶液の使用又は注射溶液での血管拡張薬の使用は送達を強化する。
【００４１】
遺伝子の哺乳類において以前に発現されないタンパク質を発現する細胞への送達は、新しく発現されたタンパク質に対して導かれる免疫反応の誘発となることができる。さらに、ポリヌクレオチド自体、または注射溶液の他の潜在的な化合物は、正常でない免疫反応を引き起こす。したがって、哺乳類に免疫抑制剤を提供することは、有益である。発現された遺伝子に対する免疫反応の抑制は、遺伝子の発現を延長することができる。免疫抑制薬は、ポリヌクレオチドの注射の前、注射の間、または注射の後に与えられることができる。免疫抑制は短期間（三ヶ月以内）であるか、長期間となる。
【００４２】
ポリヌクレオチドは、遺伝子機能を研究するために、肢細胞に届けられることができる。肢細胞に対するポリヌクレオチドの送達はまた、潜在的な臨床応用を有することができる。臨床応用は、筋肉のジストロフィー、循環障害、内分泌の障害、免疫変調および予防接種および代謝性障害の治療を含む（Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｂｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．  １９９５，  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６，  Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８，  Ｖａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ｓｉｍｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１）。効果的に遺伝子を遠位肢の筋肉に届ける能力は、この方法を筋ジストロフィー患者の手または足機能を保つことにおいて、または末梢血管疾患患者の末梢部の血流を増やすことにおいて、臨床的に魅力的にさせる。
【００４３】
好ましい実施態様において、本方法は、治療的なポリヌクレオチドを血管病または閉塞の処理のための筋細胞に届けるために用いてもよい。届けられたポリヌクレオチドは、組織に対する血流を改善するように、血管形成、脈管形成、動脈起源または吻合を刺激するタンパク質またはペプチドを発現することができる。遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ  ＩＩ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１３８、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ  １α）、内皮ＮＯ合成酵素（ｅＮＯＳ）、ｉＮＯＳ、ＶＥＦＧＲ−１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）、ニューロピリン−１（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−１）、ＩＣＡＭ−１、なめらかな筋細胞、単球または白血球遊走、反アポトーシスのペプチドおよびタンパク質を促進する因子（ケモカインおよびサイトカイン）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−１ｂ、ＦＧＦ−１ｃ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−２ｂ、ＦＧＦ−２ｃ、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−３ｂ、ＦＧＦ−３ｃ、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−９、酸性のＦＧＦ、塩基性のＦＧＦ、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、アンジオポイエチン−１（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  １）（Ａｎｇ−１）、アンジオポイエチン−２（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ  ２）（Ａｎｇ−２）、ＣＴＧＦ−２（結合組織成長因子）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ派生の成長因子（ＰＤＦＧｓ）ＰＤＧＦ−ＢＢ、単球走化性タンパク質−１、顆粒白血球大食細胞−コロニー刺激因子、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、ＩＧＦ−２、初期の成長反応因子−１（ＥＧＲ−１）、ＥＴＳ−１、ヒトの組織カリクレイン（ＨＫ）、マトリックス・メタロプロテイナーゼ、キマーゼ、ウロキナーゼ−タイプ・プラスミノゲン活性剤およびヘパリナーゼからなるリストから選択されてよい。分泌されるタンパク質及びペプチドにおいて、遺伝子はシグナルペプチドをコードするシークエンスを含んでよい。また、送達されたポリヌクレオチドは、内因性遺伝子の発現または血管形成、脈管形成、動脈起源若しくはアナストモーシス形成を阻害する遺伝子産物の発現を抑制するか、阻害できる。複数のポリヌクレオチドまたは一つ以上の治療遺伝子を含むポリヌクレオチドは、記載された処理を使用して送達されてよい。遺伝子は、血管形成を促進するか、副次的な血管形成を促進するか、末梢の脈管形成を促進するか、または筋組織での血流を改善するように、送達できる。また遺伝子は、末梢性循環障害、肢虚血、動脈の閉鎖的な疾患、末梢性動脈の閉鎖的な疾患、脈管不足、脈管障害、閉塞性動脈硬化、閉塞性血栓性血管炎、アテローム性動脈硬化症、大動脈炎症候群、ベーチェット病、膠原症ｓ、糖尿病に関する虚血症、跛行、間欠性跛行、レイノー病、心筋症または心肥大を処置するように送達できる。ポリヌクレオチドは、虚血症状の筋細胞または通常の筋細胞に届けられることができる。ポリヌクレオチドはまた、虚血または血管病または障害の危険にさらされている組織の細胞に届けられることができる。
【００４４】
好ましい実施態様において、本方法は、筋ジストロフィー（ＭＤ）の治療のための、筋ジストロフィーの二次症状のための、または他の筋萎縮若しくは損傷のための肢筋細胞に、ポリヌクレオチドの送達のために用いられることができる。ＭＤが生じる不完全な遺伝子は、疾患の多くの型に知られている。これらの不完全な遺伝子も、タンパク質産物を生成することに失敗するか、適切に機能することに失敗するタンパク質産物を生成するか、または、細胞の適当な機能に干渉する機能不全のタンパク質産物を生成する。ポリヌクレオチドは、機能不全のタンパク質の生成または活性を阻害する治療的な機能性タンパク質またはポリヌクレオチドをコード化することができる。そのような遺伝子は、ジストロフィン（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ  ＭＤ）；ジストロフィン関連のグリコプロテイン（β−筋肉グリカン、及びδ−筋肉グリカン、肢帯  ＭＤ  ２Ｅ  ａｎｄ  ２Ｆ；α−筋肉グリカン及びγ−筋肉グリカン、肢帯  ＭＤ  ２Ｄ  ａｎｄ  ２Ｃ）、ウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）、カルパイン（常染色体退行の肢帯ＭＤタイプ２Ａ）、カベオリン−３（ｃａｖｅｏｌｉｎ−３）（常染色体有力な肢帯  ＭＤ）、ラミニンアルファ２（メロシン（ｍｅｒｏｓｉｎ）欠損の先天的なＭＤ）、フクチン（ｆｕｋｕｔｉｎ）（福山タイプの先天的なＭＤ）、並びにエメリン（ｅｍｅｒｉｎ）（エメリー−ドライフスＭＤ）またはこれらのタンパク質の治療的なバリエーションからなるリストから選択されてよい。また、筋疾患または損傷を患っている患者に有益なタンパク質を発現するポリヌクレオチドまたは筋肉疾患を緩和する二次障害を狙うブースタ遺伝子は、患者の筋細胞に届けられることができる。そのような遺伝子は、ミニ・アグリン（基底膜形成を促進）、ウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）、ラミニンα２、α７インテグリン、ＧａｌＮａｃ転移酵素およびＡＤＡＭ１２（細胞粘着力および筋肉安定性を促進する）カルパスタチン（筋肉壊死から守る）、一酸化窒素シンターゼ（炎症を容易にする）、ＡＤＡＭ１２、ＩＧＦ−Ｉ、優位な負のマイオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）およびマイオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）阻害剤（筋肉再生を促進して、線維症を減らす）、ＴＧＦ−β（筋肉質量を調整する）、一酸化窒素シンターゼ（炎症を減じる）、アクチン、チチン（ｔｉｔｉｎ）、筋肉クレアチンキナーゼ、トロポニン、成長因子（ヒト成長因子およびヒト成長ホルモンを放出するホルモンおよび脈管内皮成長因子（ＶＥＧＦ））、インスリンおよび抗炎症性遺伝子からなるリストから選択されてよい。また、ｓｉＲＮＡｓおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドのようなポリヌクレオチドは、マイオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）封鎖をつくるかまたはマイオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）合成（筋肉の発達を促進する）を阻害、マイオゲニン（ｍｙｏｇｅｎｉｎ）産物を阻害する（筋肉サイズを増やす）か、若しくは不完全な内因性遺伝子のスプライシングを修正するために届けられることができる。
【００４５】
好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは、分泌されたタンパク質の発現のために提供する肢骨格の筋細胞および他の血管外か実質細胞に届けられてよい。一般に、筋肉は分泌組織と考えられないが、筋細胞に届けられる遺伝子からの産物は体循環に入ることができる。したがって、エンドクリンおよびパラクリン要因および他の治療的なタンパク質のレベルを変えるためにこの方法を使用することで可能性が存在する。このような方法で、筋肉がトランス遺伝子生成のためのバイオリアクタとして使用され、全身効果のために分泌されるタンパク質を生成する。治療手法として、この方法はペプチド／タンパク質の投与において有利であり、それは比較的短い半減期を有して、反復注射を必要とする。（Ｇｏｌｄｓｐｉｎｋ  ２００３）。成長ホルモン欠乏、貧血症その他のような内分泌物、糖尿病性神経障害および末梢性神経障害を含む神経組織栄養障害、循環障害および代謝性障害は筋肉への遺伝子移動を使用して治療されることができる疾患の実施例である。潜在的に治療的なタンパク質をコード化する遺伝子は、関節炎の治療のためのＩＬ−１０、可溶なｐ７５腫瘍壊死要因レセプタ−Ｆｃ融合タンパク質、インターロイキン１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−ＲＡ）およびＴＮＦα拮抗剤；  糖尿病の治療のための修正されたインスリン、プレプロインシュリンおよび修正されたプレプロインシュリン遺伝子；  コレステロール関連の疾患（例えば高コレステロール血症およびアテローム硬化（ａｔｈｅｒｏｓｃｈｌｅｒｏｓｉｓ）の治療または予防のためのアポリポタンパク質Ｅおよびアデポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）；  高血糖症の治療のためのグルコキナーゼまたはブドウ糖輸送体；間質性腎臓病、腎臓間質性線維症および慢性腎臓線維症のための肝細胞増殖因子およびアンギオテンシンＩＩブロッカー；  肝硬変、筋肉疾患および筋肉損傷、神経障害などのためのＩＧＦ１；血友病のための第ＩＸ因子を含む凝固因子；  癌または肝炎を治療するインターフェロンα、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ１２；  骨疾患を治療して、破断治癒を改善される骨形態形成タンパク質−２のような骨帰納的な因子および成長因子；  自己免疫不全を治療するかまたは免疫反応を修正するサイトカインおよびサイトカイン抑制剤；  貧血症の治療のための血液生成要因およびエリトロポイエチン（Ｅｐｏ）；  筋肉成長／肥大を誘発して、筋肉質量を増やす成長ホルモンおよびメカノ（ｍｅｃｈａｎｏ）成長因子；  ファブリー病の治療のためのα−ガラクトシダーゼ；  成長プレート損傷の処置のためのＩＧＦ１および骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）；  気腫を治療するかまたは肺疾患を予防するα−反トリプシン；  癌の処置のための顆粒白血球大食細胞コロニー刺激因子および他の神経成長因子、オートクリン因子、成長因子および分泌促進物質からなるリストから選ばれることができる。
【００４６】
また、筋肉への遺伝子転移は、代謝性疾患（例えば、肥満および糖尿病）を治療するために用いることができる。例えば、肥満はレプチンの遺伝子を送達することによって治療されることができ、または、糖尿病はインスリン遺伝子とフリン（ｆｕｒｉｎ）裂開及び調節された発現における修飾を有するインスリン遺伝子を送達することによって治療されることができる。筋肉に分泌されたタンパク質をコード化している遺伝子を届けることによって治療されることができる代謝の他の先天性不全は、以下を含み、それらは、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、チロシン血症、尿素サイクル欠陥、アミノ酸代謝（例えばプロピオン酸尿症、メチルマロン酸尿症）の障害、脂肪の障害および脂肪酸代謝（炭水化物代謝（ｇａｌａｃｔｏｓｅｍａ）グリコーゲン記憶障害（ポンぺ病およびマカードル病を含む）、リソソーム記憶障害、ミトコンドリア障害、呼吸鎖欠陥およびビリルビン代謝性障害（Ｃｒｉｇｌｅｒ−Ｎａｊｊａｒ  ＳｙｎｄｒｏｍｅＩおよびＩＩ、ギルバート症候群、デュービン−ジョンソン症候群、Ｒｏｔｏｒ症候群）の障害）である。リポタンパク質レベルは、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプタ、アポリポタンパク質Ａ、アポリポタンパク質Ｅまたはこれらの遺伝子の発現を調節するか、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベルを高める転写因子の遺伝子を送達することによって変更される。
【００４７】
疾病状態を弱めるか又は予防する際のタンパク質の治療的な効果は、細胞内に留まるか、膜の細胞に付加されるままであるか、または、分泌されており、タンパク質が大循環及び血液に入ることができる細胞から分離するタンパク質によって達成できる。膜上のタンパク質は、タンパク質またはリポタンパク質を吸収するためにレセプタを細胞に提供することによって、治療的な効果を有することができる。例えば、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプタは、肝細胞において発現されることができ、血液コレステロール濃度を低下させることができて、これによって、脳卒中または心筋梗塞を引き起こす可能性があるアテローム硬化性病変を予防し得る。細胞内にとどまる治療的なタンパク質は、フェニルケトン尿症におけるように循環する有毒な代謝物質を消去する酵素となる。また、それらのタンパク質は、癌細胞を増殖的にさせないか、またはガンにさせなくする（例えば、より転移でない）ことができる。また、細胞中のタンパク質は、ウィルスの複製に干渉し得る。
【００４８】
我々は、特定の組織のレポーター遺伝子から達成される遺伝子の発現を開示した。レポーター（マーカー）遺伝子の産物を含む遺伝子産物のレベルは測定され、次いで、他のポリヌクレオチドをトランスフェクションすることによる遺伝子発現の同様の量の合理的な予測を示す。例えば、当業者によって有益であるとみなされる処置のレベルは、疾病ごとに異なり、例えば、血友病ＡおよびＢは、それぞれ、Ｘにリンクされた凝固因子ＶＩＩＩおよびＩＸの不足によって生じる。それらの臨床経過は、ＶＩＩＩまたはＩＸ因子の通常の血清濃度のパーセンテージによってかなり影響されて、２％未満であると厳しい状態であり、２乃至５％だと緩和状態であり、５乃至３０％だと穏やかな状態である。したがって、重篤な患者における循環因子の通常レベルの１％から２％への増大は、有益であると考えることができる。６％よりも高いレベルは、手術または損傷に対して２次的なブリード（ｂｌｅｅｄｓ）でなく自然発生的なブリードを防ぐ。遺伝子治療の当業者は、マーカー遺伝子の結果の充分なレベルに基づく疾病に特定の遺伝子の発現の有益なレベルを合理的に予測し得る。血友病実施例において、マーカー遺伝子が第８因子の正常レベルの２％までの量に相当するレベルでタンパク質を産生するために発現される場合、第８因子をコードする遺伝子は、類似したレベルで発現されることを合理的に予測できる。したがって、ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼの遺伝子などのレポーター又はマーカー遺伝子は、一般に細胞内タンパク質の発現のための有用な例として役立つ。同様に、レポーター又はマーカー遺伝子の分泌されたアルカリフォスファターゼ（ＳＥＡＰ）は、一般に分泌されたタンパク質における有用な例として役立つ。
【００４９】
好ましい実施態様において、ポリヌクレオチドは、ペプチド又はタンパク質の抗原の発現を提供するために、肢の骨格筋細胞に送達されてよい。我々は、ポリヌクレオチドを含有する溶液の静脈内投与が、ポリヌクレオチドの非脈管実質細胞への送達、細胞のポリヌクレオチドによってコード化される遺伝子の発現および哺乳類の免疫反応の誘発に結果としてなることを示す。ポリヌクレオチドは、動物の免疫反応を生じるために、ペプチドまたはタンパク質抗原をコード化することができる。ワクチンを提供するか、または、癌または感染のような、治療的な反応を提供するために、記載されている方法が哺乳類の抗体の生産のために用いられることができる。
【００５０】
また、送達方法は、例えば、筋芽細胞および血液生成幹細胞などの細胞を届けるために用いることができる。細胞は、治療的なタンパク質を生産するために遺伝子組換えできる。
【００５１】
定義：
ポリヌクレオチド
用語ポリヌクレオチド又は核酸あるいはポリ核酸は、少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリマーを意味する技術用語である。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドポリマーの単量ユニット（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｕｎｉｔｓ）である。頻繁に、１２０の単量ユニットより少ないポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと呼ばれる。天然の核酸は、デオキシリボース又はリボースのリン酸のバックボーンを有する。人工又は合成のポリヌクレオチドは、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又は細胞が存在しないシステムで重合されて、同一若しくは同様の塩基を含むが、天然のリボースとリン酸のバックボーン以外のタイプのバックボーンを含む、任意のポリヌクレオチドである。それらのバックボーンは、ＰＮＡｓ（ペプチド核酸）、ホスホロチオネート、ホスホロジアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄａｔｅｓ）、モルホリノおよび天然の核酸のリン酸のバックボーンの他の異型を含む。塩基は、プリンとピリミジンを含み、さらにそれらは、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン及び天然のアナログを含む。プリンとピリミジンの合成の派生物は、下記に限定されないが、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート及びアルカリハライドなどの新たな反応基に置き換える修飾基を含む。用語としての塩基は、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の任意の塩基アナログを包含する。用語としてのポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせ、並びに他の天然及び合成のヌクレオチドを含む。
【００５２】
ポリヌクレオチドは、外来のヌクレオチドシークエンスを発現し、内因性ヌクレオチドシークエンスの発現を禁止、除去、増殖又は変更するか、あるいは、自然に細胞と関係していない特定の生理的特徴に影響を及ぼすために、細胞に送達できる。遺伝子の発現を変更することは、ＲＮＡのスプライシングを変更すること、ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすこと、及び転写因子への結合による遺伝子発現を変更することを含んでよい。また、ポリヌクレオチドは、細胞内のポリヌクレオチドのシークエンスを変更できる。これは、染色体ＤＮＡ、細胞ＲＮＡ、ウィルスＤＮＡ、ウィルスＲＮＡのシークエンスを変えるポリヌクレオチドを含み得る。細胞のポリヌクレオチドのシークエンスを変えることは、遺伝子変換または組換えによるシーケンスを変えることを含む。キメロプラスト（Ｃｈｉｍｅｒｏｐｌａｓｔｓ）（ＲＮＡとＤＮＡの複合型分子）および一本鎖ポリヌクレオチドは、染色体ＤＮＡのシークエンスを変えるために用いられている。
【００５３】
ポリヌクレオチドに基づく遺伝子発現の阻害剤は、シークエンスに特異的な分解又は遺伝子の機能、転写若しくは翻訳の阻害を引き起こす、細胞内で存在または転写する、任意のポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに基づく遺伝子発現の阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、干渉ＲＮＡ又はＲＮＡｉ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスポリヌクレオチド、及びｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸をコード化するＤＮＡ発現カセットからなる群から選択されてよい。ＳｉＲＮＡは、典型的には１５乃至５０塩基対、好ましくは１９乃至２５塩基対を含み、発現されるターゲット遺伝子又は細胞内のＲＮＡに同等であるか殆ど同等であるヌクレオチドシークエンスを有する、二本鎖構造を含む。ＳｉＲＮＡは、２つのアニールしたポリヌクレオチド又はヘアピン構造を形成する一本鎖ポリヌクレオチドから構成されてよい。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は小型で非コードのポリヌクレオチドであり、約２２ヌクレオチドの長さを有し、それらのｍＲＮＡターゲットの直接的な破壊又は翻訳抑制する。アンチセンスポリヌクレオチドは、遺伝子又はｍＲＮＡに対して相補的なシークエンスを含む。アンチセンスポリヌクレオチドは、下記に限定されないが、モルホリノ、２’−Ｏ−メチルポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ等を含む。ポリヌクレオチドに基づく遺伝子発現の阻害剤は、インビトロで重合されるか、組み換えられてよく、キメラシークエンス又はそれらの群の派生物を含んでよい。ポリヌクレオチドに基づく遺伝子発現の阻害剤は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、合成ヌクレオチド、又はターゲットとなるＲＮＡ及び／若しくは遺伝子が阻害されるような任意の適切な組み合わせを含んでよい。
【００５４】
発現カセット：
用語として発現カセットは、細胞内で遺伝子又は遺伝子的なシークエンスを発現できる、天然又は組み換えて生成した核酸分子を意味する。典型的には、発現カセットは、プロモーター（転写を開始させる）と、一つ以上のタンパク質又はＲＮＡをコード化するシークエンスを含む。オプションとして、発現カセットは、翻訳エンハンサー、非コードシークエンス、スプライシング信号、転写停止シグナル及びポリアデニレーションシグナルを含んでよい。概して、ＲＮＡ発現カセットは、翻訳開始コドン（翻訳を開始させる）と、一つ以上のタンパク質をコード化するシークエンスを含む。オプションとして、発現カセットは、翻訳停止シグナル、ポリアデノシンシークエンス、インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（ＩＲＥＳ）、及び非コードシークエンスを含んでよい。オプションで、発現カセットは、タンパク質に翻訳されない遺伝子又は部分的な遺伝子のシークエンスを含んでよい。核酸は、ターゲット細胞のＤＮＡ又はＲＮＡの変化に影響を及ぼすことができる。これは、ハイブリダイゼーション、多鎖の核酸形成、相同性の組み換え体、遺伝子コンバージョン、ＲＮＡ干渉又はさらにその他の記載されるメカニズムによって達成できる。
【００５５】
用語としての遺伝子は、一般的に、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）又はポリヌクレオチドあるいはプレカーサーの生成のために必要なコードシークエンスを含む、核酸シークエンスを意味する。完全長のポリペプチドまたは断片の所望の活性または機能的特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル形質導入）が保持される限り、ポリヌクレオチドは、完全長のコードシークエンスによるか、又はコードシークエンスの任意の部分によってエンコードできる。また、遺伝子としての用語は、遺伝子のコード領域を包含し、いずれかの末端が約１ｋｂかそれ以上の長さにおける５’及び３’末端の両端で遺伝子が完全長のｍＲＮＡの長さと一致するようなコード領域に隣接して位置するシークエンスを含む。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡに存在するシークエンスは、５’未翻訳シークエンスと呼ばれる。コード領域の３’又は下流に位置し、ｍＲＮＡに存在するシークエンスは、３’未翻訳シークエンスと呼ばれる。用語としての遺伝子は、合成、組み換え、ｃＤＮＡ及びゲノム形態の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、イントロン、介在領域あるいは介在シークエンスと呼ばれる非コードシークエンスで妨害されるコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡに転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサーのような調節因子を含んでよい。イントロンは、核または一次転写産物から取り除かれるか、若しくはスプライスされる。したがって、イントロンは成熟したＲＮＡの転写産物では欠損している。遺伝子の構成要素は、下記に限定されないが、プロモーター、エンハンサー、転写因子の結合部位、ポリアデニレーションシグナル、インターナル・リボソーム・エントリー部位、サイレンサー、絶縁シークエンス（ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、マトリックス・アタッチメント領域を含む。非コード領域は、遺伝子の転写及び／又は翻訳のレベルあるいは比率に影響する。遺伝子の共有結合的修飾は、転写の比率（例えば、ゲノムＤＮＡのメチル化）、ｍＲＮＡの安定（例えば、３’ポリアデノシン尾部の長さ）、翻訳の比率（例えば、５’キャップ）、核酸の修復、核酸の転送及び免疫原性に影響し得る。遺伝子発現は、プロセスにおける多くの段階で調節できる。アップレギュレーション又は活性化は、遺伝子発現産物（つまり、ＲＮＡやタンパク質）の生成を高める調節を意味し、一方で、ダウンレギュレーション又は抑制は、生成を減じる調節を意味する。アップレギュレーション又はダウンレギュレーションに含まれる分子（例えば、転写因子）は、それぞれ活性化因子とリプレッサーと呼ばれる。
【００５６】
調節されたプロモーターを用いて送達されたポリヌクレオチドの発現を調節することは望ましい。調節されたプロモーターは、誘発するか、抑制してよい。調節された遺伝子発現システムは、薬剤依存の遺伝子調節、テトラサイクリン／ドキシサイクリン誘発、テトラサイクリン／ドキシサイクリン抑制、ラパマイシン誘発、β−ガラクトシド、ストレプトグラミン調節、細菌の抑制タンパク質、アンチプロゲスチン誘発型ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）（Ｖａｌｅｎｔｉｓ，  Ｉｎｃ．，  ミフェプリストーンによって誘発）、核ホルモンレセプターリガンド結合領域（アンチプロゲスチン、抗エストロゲン、エクジステロイド、グルココルチコイド反応性）、ヘテロ・ジメリックタンパク質、代謝的で調節、低酸素反応性、及び、ブドウ糖反応性システムからなるリストから選択されてよい。それらのシステムのうちのいくつかは、哺乳類の細胞で自然に生じるタンパク質によって調節され、一方で、その他のものは、転写活性化因子またはリプレッサーをコードする遺伝子の共同送達を必要とする。
【００５７】
また、送達されたポリヌクレオチドが筋肉の特定のプロモーターから発現されることが望ましい。筋肉の特定のプロモーターは、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン軽鎖３Ｆミオシン軽鎖、デスミン（ｄｅｓｍｉｎ）、α−アクチン、エノラーゼ、ウトロフィン（ｕｔｒｏｐｈｉｎ）、ジストロフィン、筋肉グリカンおよび他のジストロフィン関連のグリコプロテイン・プロモーターからなるリストから選択されてよい。また、筋肉で機能する他の転写因子は、アクチンおよびβ−アクチン・プロモータ、Ｅボックス因子、ＭＥＦ−２因子、ＴＥＦ−１因子、ＳＲＥ部位、筋ゲニン・エンハンサシークエンスおよびウィルスのプロモーター（例えば、ＣＭＶおよびＳＶ４０）を含む。
【００５８】
生物学的に活性な化合物は、生物学的な化合物と反応する潜在性を有する化合物である。より詳細には、本明細書で活用される生物学的に活性な化合物は、生きた細胞に関した自然な処理を変化するように設計される。本明細書の目的において、細胞の自然な処理は、生物学的に活性な化合物の送達前に細胞と関連する処理である。生物学的に活性な化合物は、医薬、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、ホルモン類、サイトカイン、抗原、ウィルス、オリゴヌクレオチド、核酸およびポリパイロール（ｐｏｌｙｐｙｒｏｌｅｓ）が送達し得るような合成ポリマーからなる群から選択されてよい。
【００５９】
トランスフェクション
一般的に、細胞に対してポリヌクレオチドを送達するプロセスはトランスフェクションと呼ばれるか、トランスフェクティングプロセスと呼ばれ、さらに形質転換と呼ばれる。ここで使用される用語としてのトランスフェクティングは、細胞に対するポリヌクレオチド又は他の生物学的に活性な化合物の導入を意味する。ポリヌクレオチドは、研究目的で使用されてよいし、治療可能な細胞に変化を生じるように使用されてよい。治療目的のポリヌクレオチドの送達は、一般的に、遺伝子治療と呼ばれる。用語としての安定なトランスフェクション又は安定してトランスフェクションするは、一般的に、トランスフェクションした細胞のゲノムに対する外来性ポリヌクレオチドの導入及び組込みを意味する。用語としての安定なトランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）は、ポリヌクレオチドをゲノムＤＮＡに安定して組み込んだ細胞を意味する。安定したトランスフェクションは、また、真核生物細胞分裂（例えば、複製の乳頭腫ウィルスオリジンを含んでいるプラスミドＤＮＡベクター、人工染色体）の間に複製されるエピソーマル・ベクターを用いて得られることができる。用語としての一時的なトランスフェクションまたは一過性にトランスフェクションさせるは、ポリヌクレオチドがトランスフェクションする細胞のゲノムに統合されない細胞へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ポリヌクレオチドが発現可能な遺伝子を含む場合、発現カセットは、染色体で外来性遺伝子の発現を支配する調節的な制御を受ける。用語としての一時的なトランスフェクタントは、ポリヌクレオチドを取り込み始めたが、ポリヌクレオチドをそのゲノムＤＮＡに組み込まなかった細胞を意味する。
【００６０】
トランスフェクション剤
トランスフェクション剤、若しくはトランスフェクション試薬あるいは送達賦形剤は、細胞に結合する化合物であるか、またはオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドとの複合体で、かつ細胞への入り込みを高める。トランスフェクション試薬の例は、下記に限定されないが、陽イオン・リポソームおよび脂質、ポリアミン、リン酸カルシウム沈殿物、ヒストン・タンパク質、ポリエチルエミニン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）、ポリリシンおよびポリ両性電解質複合体を含む。ヒストンおよびプロタミンのような陽イオン・タンパク質、またはポリリシン、ポリ・アルギニン、ポリオルニチン、ＤＥＡＥデキストラン、ポリブレン及びポリエチルエミニンのような合成ポリマーは、効果的な細胞内のインビトロ送達剤であってよい。概して、トランスフェクション試薬は、オリゴヌクレオチドのまたはポリヌクレオチドの負電荷と結合する正味の陽電荷を有する構成要素を有する。インビボ送達において、陽イオンのトランスフェクション剤のサブ中和量でなる複合体が好まれる。非ウィルスベクターは、タンパク質およびポリマー複合体（ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ）、脂質およびリポソーム（ｌｉｐｏｐｌｅｘｅｓ）、ポリマーおよび脂質（ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ）の組合せ、および多層化された再充電された粒子を含む。トランスフェクション剤はまた、核酸を縮合してよい。また、トランスフェクション剤は、ポリヌクレオチドを有する関連する官能基に用いられてよい。官能基は、細胞ターゲットシグナル、核ローカライゼーションシグナル、エンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ）から内容の放出を強化する合成物または他の細胞内小嚢（例えば、膜活性化合物のような）、および化合物またはそれらが付加される（相互作用修飾子）複合体の性質若しくは相互作用を変える他の合成物を含む。
【００６１】
細胞ターゲットシグナルは、細胞受容体リガンド（例えば、タンパク質、ペプチド、糖、ステロイド、および、例えば、脂質、脂肪酸、コレステロール、ダンシル合成物など細胞膜と相互作用する群と同様の合成リガンド、および、アンホテリシン誘導剤であり得る。シグナルは、細胞表面に対する化合物の結合および／または細胞内コンパートメントとのその関連を高めることができる。他のターゲット群は、細胞の特定の一部（例えば、核ローカライゼーションシグナル）に対するポリヌクレオチドの送達を高めるために用いることができる。
【実施例】
【００６２】
実施例１．レポーターポリヌクレオチド
ｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ発現ベクターは、ホタル・ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ｐＳＰ−ｌｕｃ＋発現ベクター−プロメガ）の表現カセットにＣＭＶエンハンサー／プロモーター（ｐＣＩ哺乳類の発現ベクター−プロメガ、マディソン、ＷＩ）をライゲーションして、アンピシリン抗生物質耐性遺伝子をカナマイシン抗生物質耐性遺伝子と置換することによって生成した。ｐＣＩ−ＬａｃＺは、ｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋに対する類似物であって、サイトメガロウイルス・エンハンサー／プロモーターの制御下のガラクトシダーゼ・リポーター遺伝子を含む。ｐＣＭＶ−ｈＳＥＡＰは、ヒトの分泌アルカリホスファターゼ、サイトメガロウイルス・エンハンサー／プロモーターからのｈＳＥＡＰを発現する。ｐＭＩＲ５９は、筋肉クレアチンキナーゼ・エンハンサー／プロモータの制御下のラット・エリトロポイエチン遺伝子を含む。ｐＭＩＲ４８は、サイトメガロウイルス・エンハンサー／プロモーターの制御下のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含む。ｐＭＩＲ６８は、ユビキチンＣ（ｕｂｑｕｉｔｉｎ  Ｃ）プロモーターの抑制下のホタル・ルシフェラーゼ遺伝子および長期発現を促進するための肝臓の制御領域を含む。ｐＭＩＲ１５２は、サイトメガロウイルス・プロモーターの制御下のラット・インターロイキン２を含む。リポーターまたは標識遺伝子（例えば、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼのための遺伝子）は、一般に、細胞内タンパク質の発現のための有用な方法として役立つ。同様に、リポーターまたは標識遺伝子は、分泌されたアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）のような、一般に、分泌されたタンパク質のための有用な方法として役立つ。また、リポーター遺伝子発現の抑制（例えば、ｓｉＲＮＡの送達後）は、適当なｓｉＲＮＡを分配することによって他の遺伝子を阻害する合理的な確率を示す。
【００６３】
実施例２．
小（外側の）伏在静脈への静注は、肢骨格の筋肉にポリヌクレオチドの効果的な送達を提供する。１２０乃至１４０ｇの成熟したスピローグ−ドーリー・ラットは８０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび４０ｍｇ／ｋｇのキシロ・アジンによって麻酔されて、外科的な領域は剃られて、消毒されて準備された。動物は、外科的な処置の間、体温の損失を予防するために、電気座布団に配置された。４ｃｍ長の腹部正中線の開腹がなされ、その後、皮膚フラップが開かれて、ターゲット領域を露出させるためにクランプで保持された。湿ったガーゼは、内部臓器の過剰な乾燥を防ぐために塗布された。腸は、腸骨の静脈および動脈を視覚化するように移動された。微小血管挿弾子は、肢からの血液の流出および肢への血液の流入を妨害するために、分岐近くの下大静脈と同様に、外部腸骨の、尾部上腹部の、内部腸骨の、輸送導管並びに臀筋の動脈及び静脈に配置された。２７ｇの針により、流出促進溶液（例えば、３ｍｌ食塩水の０．５ｍｇパパベリン）は小伏在静脈に注射された。１乃至１０分後に、２７Ｇの蝶針は同じ部位に嵌入され、ホタル・ルシフェラーゼをコードしている５００μｇのｐＭＩＲ４８プラスミドＤＮＡを含有する１０．５ｍｌの通常の食塩水は、０．５８３ｍｌ／秒の率で注射された。流体は、通常の血流方向に注射された。微小血管挿弾子は注射の２分後に取り外され、血流の流れは、圧力およびゲル泡によって制御された。腹筋および皮膚は、４乃至０デクソン（４−０  ｄｅｘｏｎ）縫合によって閉じた。ラットは、注射後５日で安楽死させ、肢の筋肉は収集されて、６つの群（四頭筋、二頭筋、膝窩筋、腓腹筋、脛肉および足）に分けられた。各々の筋肉群からのルシフェラーゼ活性は前述したように決定されて（チャン等、２００１）、筋組織のグラム当たりのルシフェラーゼ発現の総レベルが決定された。筋肉の詳細は、後肢の以下の筋肉群を示す：四角筋−上部脚の前筋肉；二頭筋−上部脚の中間の筋肉；膝窩筋−上部脚の後方筋肉；腓腹筋−下腿の後方筋肉；脛肉−下腿の前筋肉；足−足の背面の筋肉を示す。ルシフェラーゼ発現は、閉塞から遠位の肢の全体にわたって、筋肉において観察された。最も発現したレベルは、注射部位の近くで観察された。
【００６４】
表１．プラスミドＤＮＡの静注による肢の筋肉への遺伝子送達
【００６５】
【表１】
2007501282.tif 000002
実施例３．
内側伏在静脈への静注は、肢骨格の筋肉にポリヌクレオチドの効果的な送達を提供する。この実施例において、我々は、内側伏在静脈への順行注射を実行した。この注射のために、開腹および切開は、伏在静脈を露出させるために、後肢の内部に沿ってなされた。微小血管挿弾子は、脚からの血液の流出および肢への血液の流入を妨害する分岐の近くの下静脈と同様に、外部の腸骨の、尾部上腹部の、内部腸骨の、上膀胱の、臀筋動脈および静脈に配置された。パパベリン（３．０ｍｌ）の前処理は、手で伏在静脈（順行で）に噴射された。５分後、２７のゲージ蝶カテーテルは、伏在静脈に嵌入されて、シリンジポンプに接続された。５００μｇプラスミドＤＮＡ（ｐＭＩＲ４８）を含有する１０ｍｌの溶液は、２０ｍｌ／分の流速で送達された。肢の全体にわたる膨張が、注射の後に観察された。ラットは注射の５日後に安楽死させ、肢の筋肉は収集されて、６つの群（四頭筋、二頭筋、膝窩筋、腓腹筋、脛肉および足）に分けられた。各々の筋肉群からのルシフェラーゼ活性は前述したように決定されて（チャン等、２００１）、筋組織のグラム当たりのルシフェラーゼ発現の総レベルが決定された。ルシフェラーゼ発現は、閉塞から遠位の肢の全体にわたって、筋肉において観察された。最も発現したレベルは、血管の閉塞の近く又は遠位で観察された。この手順において、クランプは二頭筋の近くに配置された。
【００６６】
表２．プラスミドＤＮＡの静注による肢の筋肉への遺伝子送達
【００６７】
【表２】
2007501282.tif 000003
実施例４．
大（内側）伏在静脈への静注は、肢骨格の筋肉にポリヌクレオチドの効果的送達を提供する。切開は、鼠径部から足関節まで及んでなされた。遠位内側の伏在静脈の部分は自由に切り裂かれた、そして、クランプは遠位静脈に配置された。近位大腿動脈および動脈は、また、自由に解剖されて、上腹部動脈および静脈と同様に固定された。パパベリン（２．０乃至２．５ｍｌ）の前処理は、手で伏在静脈へ順行注射された。５分後、２７のゲージ蝶針カテーテルは、伏在静脈に嵌入されて、シリンジポンプに接続された。次いで、５．０ｍｌのプラスミドＤＮＡ（２５０μｇ）は、１０ｍｌ／分の流速で注射された。下肢の筋肉はふくらみ、注射が進行するにつれて、若干の漏れが注射部位から生じた。２分後にクランプが取り外され、静脈がレパーフューズ（ｒｅｐｅｒｆｕｓｅ）された。数分以内で、筋肉はピンクの色を回復し、静脈は標準に戻った。ラットは、注射後５日で安楽死されて、肢の筋肉は収集されて、６つの群（四頭筋、二頭筋、膝窩筋、腓腹筋、脛肉および足）に分けられた。各々の筋肉群からのルシフェラーゼ活性は前述したように決定され（チャン等、２００１）、筋組織１グラムにつきルシフェラーゼ発現の総レベルが決定された。ルシフェラーゼ発現は、閉塞から遠位の肢の全体にわたって、筋肉において観察された。最も高い発現レベルは、腓腹筋と脛肉において観察された。これらの筋肉は、血管閉塞の部位に近かったうえに、注射部位に近かった。
【００６８】
表３．プラスミドＤＮＡの静注による肢の筋肉への遺伝子送達
【００６９】
【表３】
2007501282.tif 000004
実施例５．静脈注射を経たラット肢筋細胞に対するルシフェラーゼＤＮＡベクターの送達
３ｍｌの規定食塩液（ＮＳＳ）のｐＤＮＡ（ｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）の５００μｇが、１５０ｇまでのスピローグ−ドーリー・ラット（ハーランラボラトリーズ、インディアナポリス、ＩＮ）への全ての血管内及び筋肉内ＤＮＡ注射のために用いられた。肢へ流れ及び肢から流れる血流は、注射のちょうど前と注射の間に制限され、かつ、上部脚（四頭筋筋肉群のちょうど上または部分的に近位）周辺に止血バンドを配置することによって、注射後２分間において制限された。その後、パパベリン溶液の１．５ｍｌは、大伏在静脈の末梢部位に、注射された（１．５ｍｌＮＳＳの２５０μｇパパベリン）。パパベリンは、血管拡張を刺激し、脈管透過性を増やすために、予め注射された（Ｂｕｄｋｅｒ等１９９８、リー等１９７８）。パパベリン注射の２分後に、ｐＤＮＡ（規定食塩液のｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ  ）は、２０秒までにおいて３ｍｌの比率で、遠位後肢の大伏在静脈に注射した（１０ｍｌ／分；図１）。静注は、プログラム可能なハーバードＰＨＤ  ２０００シリンジポンプ（ハーバードインストルメンツ）に接続している針カテーテルを経て、前方に動く方向（すなわち、血流によって）において実行された。ラットは、注射後５日で安楽死されて、肢の筋肉は収集されて、６つの群（四頭筋、二頭筋、膝窩筋、腓腹筋、脛肉および足）に分けられた。各々の筋肉群からのルシフェラーゼ活性は前述したように決定されて（チャン等２００１）、筋組織１グラムにつきルシフェラーゼ発現の総レベルが決定された。
【００７０】
結果−静脈手順は、血管閉塞から遠位のほとんど全ての肢筋肉群に、高水準での遺伝子送達を容易にした（下部の肢の筋肉１ｇにつき５００ｎｇを越えるルシフェラーゼ）（図２及び表４）。送達の最効率は、注射３ｍｌ量（ｐＤＮＡの５００μｇを使用する場合）および毎分６乃至１２ｍｌの注射率を使用して観察された。発現は投与に依存して、ルシフェラーゼのより高いレベル（筋肉１ｇにつき１０００ｎｇまで）は、注射されるｐＤＮＡ量を単に高めることによって達成された。
【００７１】
表４．個々の筋肉群におけるルシフェラーゼ発現（ルシフェラーゼｎｇ／筋肉ｇ）
【００７２】
【表４】
2007501282.tif 000005
データは、異なる日にちに実行された２つの異なる実験の結果を表す（実験１、ｎ＝３；実験２、ｎ＝４）。筋肉の説明は、後肢の以下の筋肉群を示す：四角形−上部脚の前筋肉；二頭筋−上部脚の中間の筋肉；膝窩筋−上部脚の後方筋肉；  腓腹筋−下腿の後方筋肉；脛肉−下腿の前筋肉；足−足の背面の筋肉。
【００７３】
実施例６．様々な遺伝子送達方法の効果の比較
インビトロ送達手段およびベクターを一般に用いる他のレベルと、静脈送達手段により肢細胞のインビトロ遺伝子表現のレベルを比較するために、我々は、ＣＭＶ−ルシフェラーゼアデノウィルスベクター及び他の投与ルート（表５）を用いる裸のｐＤＮＡの投与によるトランス遺伝子の発現レベル（ルシフェラーゼ）をアッセイした。
【００７４】
静脈内アデノウィルス注射
アデノウィルスベクターの注射において、２×１０９伝染性の粒子（Ａｄ５ＣＭＶルシフェラーゼ、アイオワ大学、ベクターコアファシリティ）は、１２．５ｍｌ／分の率で、５ｍｌのＮＳＳにおいて注射された。ｐＤＮＡに関しては記載されるように、アデノウィルス注射は大伏在静脈に実行された。
【００７５】
ｐＤＮＡの動脈内注射−動脈内の（腸骨の）注射は、以下の変更態様によって前述したように実行され（Ｂｕｄｋｅｒ等１９９８）、その変更は、５００μｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋを含む１０ｍｌの総量が２０秒で注射された。動脈内注射において、総量は、ハーバードＰＨＤ  ２０００シリンジポンプに接続しているカテーテルを介して分配された。
【００７６】
筋内注射−直接の筋内注射において、３ｍｌ（ＮＳＳの２×１０９伝染性の粒子のアデノウィルスまたはＮＳＳの５００μｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ  ｐＤＮＡ）の総量は、血管内注射後の肢の量の増加を模倣するために用いた。３ｍｌ量は分割されて、腓腹筋、四頭筋、二頭筋、膝窩筋およびむこうずね筋肉群に均一に（手で）噴射された。全ての筋肉は、注射の５日後に収集されて、ルシフェラーゼ活性のために検定された。
【００７７】
表５．ラット（ｎ＝２乃至７）の後肢の筋肉に、ｐＤＮＡまたはアデノウィルスベクターの送達による筋肉発現の比較
【００７８】
【表５】
2007501282.tif 000006
裸のｐＤＮＡの静注は、アデノウィルスベクターの静注より、ほぼ８０倍多くのルシフェラーゼ発現を可能にした。また、ｐＤＮＡの静脈内送達は、ｐＤＮＡの直接の筋内注射より効率的で（トランス遺伝子の発現よりも３０倍以上高い）、動脈内送達での達成可能な発現レベルと同等だった（表５）。動脈処理を使用する遺伝子送達（ｐＤＮＡ）の類似したレベルを得るために、相当に高い容量および注射の率が必要だった（表５）。また、相当な関心において、裸のＤＮＡ送達において使用されたのと同様の注射量と注射率を使用するアデノウィルスの静脈内注射は、アデノウィルスの直接の注射よりも、筋細胞へのかなり高い（７０倍）効果的な遺伝子送達に帰着した。
【００７９】
実施例７．トランスフェクションした筋繊維のパーセンテージの決定：
ｐＣＩ−ＬａｃＺプラスミドＤＮＡの静注は、ラットの遠位四肢（大伏在静脈）に実行された。β−ガラクトシダーゼ染色において、サンプルは各筋肉群から取り出され、冷イソペンタンで凍結され、−８０℃で保存された。１０μｍ厚の低温保持部分は、各々の筋肉群の近位、中間、及び末梢部の位置の部分から切断された。その部分は固定され、３７°Ｃで１時間のＸ−ｇａｌ染色溶液（Ｍｉｒｕｓ社、マディソン、ＷＩ）においてインキュベーションされた。青色に染まった細胞（つまり、β−ガラクトシダーゼ陽性）の視覚を最大にするために、腓腹筋部（Ａ）は、対比染色剤で着色されなかった。全てのむこうずねの筋肉断片は、ヘマトキシリン（Ｂ）で、対比染色された。区分するために使用しない筋組織は計量されて、β−ガラクトシダーゼにおける化学発光分析によって分析された（Ｇａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ）。外来タンパク質（β−ガラクトシダーゼ）の発現に関する免疫効果を最小限にするために、すべてのラットは免疫抑制された。動物は、ＦＫ−５０６  （２．５  ｍｇ／ｋｇ．  ＰＯ）及びデキサメタソン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）  （１  ｍｇ／ｋｇ，  ＩＭ）の両者を注射の１日前、注射の１時間前、注射の１日後に受けた。次いで、動物は、研究の期間を通して、ＦＫ−５０６  （２．５  ｍｇ／ｋｇ．  ＰＯ）を毎日受けるように続けられた。
【００８０】
５００μｇのｐＣＩ−ＬａｃＺの単一な静注（２０秒間にわたる３ｍｌのＮＳＳ）の後、β−ガラクトシダーゼの発現は、止血バンドから遠位の下肢の全ての筋肉群（３乃至４５％のβ−ガラクトシダーゼの陽性細胞の範囲）において検出された（図３）。最も発現が高い筋肉群の一つは腓腹筋であり、筋肉の高い発現領域のトランス遺伝子が陽性に染色された細胞のほぼ３０乃至４５％である（図３）。β−ガラクトシダーゼ発現の化学ルミネセンスの決定は、腓腹筋の筋肉の２０，９１７，９００のＲＬＵｓ及びむこうずねの筋肉の１，１５８，２００のＲＬＵｓを与えた。
【００８１】
実施例８．複数（反復）注射：スピローグ−ドーリー・ラットは、５００μｇのｐＣＩ−ＬａｃＺで０日目、４日目及び８日目において、３回にわたって静脈注射されて、筋肉が１０日目に収集された。横方向の足底静脈、小さい伏在、および大伏在のそれぞれ異なる部位で、０日目、４日目及び８日目に、カテーテルを介して注射が実行された。各注射において、注射された総体積及び総量は上述したものである。β−ガラクトシダーゼ染色は、上述のように実行された。追加的な注射は、トランス遺伝子を発現する細胞の相当高いパーセンテージとなった（図４）。３度注射されたラットの肢の腓腹筋において、β−ガラクトシダーゼの発現は、高い発現領域の細胞の約６０乃至８０％において観察された（図４）。個々の筋肉群におけるβ−ガラクトシダーゼ酵素分析は、組織化学的分析（腓腹筋の筋肉の５２，９５９，５００のＲＬＵｓと、むこうずねの筋肉の１１，８９４，７００のＲＬＵｓ）を相関させた。
【００８２】
実施例９：分泌されたタンパク質をコード化している遺伝子の静脈内送達：筋肉に対する静脈内遺伝子送達が血流に分泌されたタンパク質を送達するために用いることがありえたかどうか決定するために、ｐＣＭＶ−ｈＳＥＡＰの一回の反復静注は、分泌されたリポーター遺伝子発現の構成を用いて実行された。８日後の注射において、一度だけ注射されたラット（上述したように０日目で行なった）は、３７４ｎｇ／ｍｌの平均血清ｈＳＥＡＰ濃度（±２６４、ｎ＝３）を有し、一方で、２回の注射を受けたラット（０日目と５日目）は、６３１．６ｎｇ／ｍｌの平均濃度（±１５６、ｎ＝５）を有する。
【００８３】
治療的に適切なエリトロポイエチンをコード化しているポリヌクレオチドを注射されたラット（上記の通りのｐＭＩＲ５９を注射）は、最初の２９日以内で、基線の４７％から７５％まで連続的にそれらのヘマトクリット増加を有した。
【００８４】
実施例１０．マウスの肢筋細胞に対する治療的に適切なジストロフィン遺伝子の静脈内送達。臨床的に適切な例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ジストロフィン陰性圧力Ｂ６Ｒｏｓ．Ｃｇ−ＤＭＤｍｄｘ−４Ｃｖ（ジャクソン研究所））のためのｍｄｘ４ｃｖマウスモデルに、人間のジストロフィン遺伝子の静脈内送達によって提供される。各々の注射において、０．６ｍｌのＮＳＳ（７．５秒の注射）の３００μｇのｐＤＮＡヒトジストロフィン発現ベクター（Ａｃｓａｄｉ等１９９１）は、マウス後肢の大伏在静脈の末梢部位に噴射された。脚に流れ込み、脚から流れ出る血流は、止血バンドによってふさがれた。血流は、注射の前と、注射後の２分間ふさがれた。ｍｄｘ４ｃｖマウス筋肉（腓腹筋から）のヒトジストロフィン発現のための免疫組織化学的染色は、マウスの反ジストロフィンポリクローナルの主要な抗体およびＦＩＴＣ結合のヤギの抗マウスＩｇＧ（ＦＡＢ特性；  Ｓｉｇｍａ）の２次抗体を使用して、注射後１週間実行された。ジストロフィン陽性の筋繊維の類似したパーセンテージは、ヒトジストロフィン（ＮＣＬ−ＤＹＳ３、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に特有のモノクローナル抗体を使用して検出された。画像は、１０倍の対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２蛍光顕微鏡）を使用して撮像された。
【００８５】
完全長のヒトジストロフィンをコード化しているプラスミド発現ベクターを静脈内に一度注射される４匹のｍｄｘ４ｃｖマウスにおいて、さまざまな後肢の筋肉の筋繊維の３乃至１５％は、筋繊維膜な（ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ）ジストロフィン発現を呈した（図６）。この特定のｍｄｘ菌株のジストロフィン陽性の復帰突然変異体は、０．５％以下である（図６）。マウスモデルの静脈内処置を実行する能力は、リサーチツールとしてその有用性を強化する。
【００８６】
実施例１１．イヌの肢筋細胞に対するポリヌクレオチドの静脈内送達：９．５ｋｇのビーグルは、チオペンタール（１０乃至１５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）による１０乃至２０分後にアセプトマジン（ａｃｅｐｒｏｍａｚｉｎｅ）（０．１ｍｇ／ｋｇ、ＳＱ）及びモルヒネ（１．５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）で誘発された。次いで、動物に挿管されて、麻酔機械に接続されて、１乃至２％のイソフルランによって維持された。注射される前肢は剃られ、改造された小児用血圧カフは肘のちょうど上に取り付けられた。２０ゲージ静脈内カテーテル（長さが１．８インチ）は、遠位の橈側皮静脈に嵌入されて、テープで固定された。血液サンプルは、完全血球測定（ＣＢＣ）および化学的パネルのために集められた。次いで、カテーテルは、スリーウェイ・ストップコックに接続されて、カテーテルの血液を取り出すために、２ｍｌまでの食塩水によってフラッシュされた。肢への血流及び肢からの血流の流れを妨げるために３００ｍｍＨｇより高い圧力まで血圧カフをふくらました後に、４．２ｍｇのパパベリン（シグマ、セントルイス、ミズーリ）および１５０ユニットのヘパリンを含有する２５ｍｌのＮＳＳが、１０秒以上にわたり、手で注射された。ｐＤＮＡの注射において、スリーウェイ・ストップコックが単一のシリンジで各々ロードされる２つのＰＨＤ２０００シリンジポンプに接続された。パパベリン注射の５分後、３６乃至４０ｍｌのＮＳＳの２０ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋが、秒速２ｍｌの率で注射された。ポリヌクレオチドを注射した２分後、血圧カフは開放されて、カテーテルが取り外された。動物は、注射時に一度、及び、処置の後に再度、鎮痛薬（ブプレノルフィン、０．０１乃至０．０２ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）が与えられた。左の前肢は０日目に注射され、右の前肢は３日目に注射された。血液サンプルはそれぞれの注射直前、注射の一日後、７日目に犠牲となる直前に採血された。麻酔から回復した後に、動物は、注射された肢を使用して、自由に動き回ることが可能だった。注射後の２４時間は、注射された肢において膨張する兆候はなかった。
【００８７】
表６．ルシフェラーゼ遺伝子をコード化するプラスミドのインビボ静脈内送達によるイヌ（ビーグル犬）の前肢筋細胞でのルシフェラーゼ発現
【００８８】
【表６】
2007501282.tif 000007
表７．ルシフェラーゼ遺伝子をコード化するプラスミドのインビボ静脈内送達によるイヌの前肢筋細胞でのルシフェラーゼ活性
【００８９】
【表７】
2007501282.tif 000008
加重平均は、分析される肢の筋肉の合計量（グラム）によって発現された全ルシフェラーゼ（ナノグラム）を分割することによって算出された。
【００９０】
実施例１２．霊長類（アカゲザル）へのポリヌクレオチドの静脈内送達。３匹の成熟したアカゲザル霊長類が、この研究において使われた。霊長類＃１は８．８ｋｇの男性で、霊長類＃２は６．０ｋｇの女性で、霊長類＃３は４．２ｋｇの男性であった。動物は、ケタミン（１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）によって誘発された、挿管されて、１乃至２％のイソフルランで麻酔維持された。注射される肢は剃られて、改造された小児用血圧カフ（血圧計）は、近い肘（または膝）と最も近いところに取り付けた。２２ゲージの静脈内カテーテル（長さは１．０インチ）は、選択された静脈（大伏在、小伏在、橈側皮静脈又は正中静脈）に嵌入されて、テープで固定された。血液サンプルは、完全血球測定（ＣＢＣ）および化学的パネルのために集められた。次いで、カテーテルは、スリーウェイ・ストップコックに接続されて、食塩水によってフラッシュされた。末端肢（図１Ｂ）への血流及び肢からの血流の流れを妨げるために３００ｍｍＨｇより高い圧力まで血圧カフをふくらました後に、５ｍｇのパパベリンと１５０ユニットのヘパリンとを含有する２０乃至３０ｍｌの食塩水が、１０秒以上にわたり、手で注射された。ｐＤＮＡの注射において、スリーウェイ・ストップコックが単一のシリンジで各々ロードされる２つのシリンジポンプに接続された。パパベリン注射の５分後、ｐＤＮＡ（４０乃至１００ｍｌのＮＳＳの１５．５乃至２５．７ｍｇ）が、秒速１．７または２ｍｌの率で注射された。ｐＤＮＡを注射した２分後、血圧カフは開放されて、カテーテルが取り外された。動物は、注射時に一度、及び、処置の後に再度、鎮痛薬（ブプレノルフィン、０．０１ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）が与えられた。
【００９１】
霊長類＃１は、０日目で注射された左の前腕（１６．５ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ）と右の後肢（２１．３ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ）、３日目に注射された右の前腕（１５．５ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ）と左の後肢（２５．７ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ）を有した。霊長類＃２は、０日目で注射された左の前腕（２０ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）と右の後肢（２０ｍｇのｐＣＩ−ＬａｃＺ）、３日目に注射された右の前腕（２０ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）と左の後肢（２０ｍｇのｐＣＩ−ＬａｃＺ）を有した。霊長類＃３は、０日目で注射された左の前腕（２０ｍｇのｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）と右の後肢（４０ｍｇのｐＣＩ−ＬａｃＺ）、３日目に注射された右の前腕（プラスミドとｓｉＲＮＡ）と左の後肢（プラスミドとｓｉＲＮＡ）を有した。血液サンプルはそれぞれの注射直前、注射の一日後、７日目に犠牲となる直前に採血された。麻酔から回復した後に、動物は、注射された肢を使用して、自由に動き回ることが可能だった。注射後２４時間は、軽微に膨張するだけで、注射された肢の挫傷の小さい領域があるだけであった。
【００９２】
動物は、示された日に安楽死されて、ルシフェラーゼ分析、筋肉セクショニング、ヘモトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）の対比染色、β−ガラクトシダーゼ染色が、ラット研究で記載されたように実行された。顕微鏡写真は、１０Ｘまたは２０Ｘの対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２の顕微鏡）を使用して撮像された。β−ガラクトシダーゼの陽性細胞は、所与の断面上の筋繊維の総数によって、かつ１００倍することによって、青く染色された総細胞数を分割することにより数量化された。
【００９３】
表８．ルシフェラーゼ遺伝子をコード化するプラスミドのインビボ静脈内送達によるアカゲザルの肢筋細胞でのルシフェラーゼ発現
【００９４】
【表８】
2007501282.tif 000009
表９．ルシフェラーゼ遺伝子をコード化するプラスミドのインビボ静脈内送達によるアカゲザルの腕筋細胞でのルシフェラーゼ発現
【００９５】
【表９】
2007501282.tif 000010
表１０．アカゲザル・マカークの肢筋肉でのルシフェラーゼ発現（ｎｇ／ｇ筋肉）
【００９６】
【表１０】
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加重平均は、分析される肢の筋肉の合計量（グラム）によって発現された全ルシフェラーゼ（ナノグラム）を分割することによって算出された。
【００９７】
ｐＣＩ−ＬａｃＺ及び続くβ−ガラクトシダーゼ組織化学的分析での静注は、ラットにおけるように、筋繊維が霊長類においてトランスフェクションしたことを示す。β−ガラクトシダーゼをコード化するｐＤＮＡで注射される霊長類＃２の後肢において、発現は、下肢の全ての筋肉群において観察された。３つの目標とされた筋肉群（腓腹筋、ヒラメ筋、短母指伸筋）の高い発現領域でトランスフェクションした筋繊維のパーセンテージは、１１％から４９％まで変動した（図７）。目標とされた遠位の肢筋肉群（ヒラメ筋、足の小筋肉）のうちの２つにおいて、より多くの定量分析は、筋肉群の全体にわたってランダムに選択される多数のセクションから、β−ガラクトシダーゼの陽性細胞をカウントすることによって実行された。この分析技術を使用して、足の小さい筋肉が７．３％の全体のトランスフェクション効率を示す（２０５のｌａｃＺ陽性細胞／計数した２８０５の総細胞数）一方で、ヒラメ筋は２５．４％の全体のトランスフェクション効率を示した（２４５３のｌａｃＺ陽性細胞／計数した９６５０の総細胞数）。
【００９８】
実施例１３．ラットおよび霊長類肢筋細胞へのｓｉＲＮＡｓの静脈内送達：静注はまた、筋組織に他の高分子を送達するために用いられることができる。ＲＮＡ干渉は、標的遺伝子の発現（哺乳動物細胞において）が、細胞に対する二本鎖ＲＮＡの導入によって、選択的に禁止されることができるという最近認識された現象である（Ｅｌｂａｓｈｉｒその他２００１）。しかしながら、インビボで（ＲＮＡ干渉を経て）効果的な遺伝子のノックダウンを成し遂げることは、標的細胞に対するポリヌクレオチド（２１乃至２３ｂｐの二本鎖ＲＮＡ；  ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡと呼ばれる）の効果的な送達を必要とする。インビボでＲＮＡ干渉を筋繊維において成し遂げるために無管肢細胞に対してｓｉＲＮＡを送達することは、ｓｉＲＮＡｓ（ホタル・ルシフェラーゼに対して目標とされた）は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、スピローグ−ドーリー・ラットおよびアカゲザル・マカークの大伏在静脈に対して、ホタル・ルシフェラーゼをコード化するｐＤＮＡ（ｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）で共に注射された。注射の２日後、目標とされた遺伝子の９５％を超える抑制は、３種のすべての種で、ホタル・ルシフェラーゼをコード化しているｓｉＲＮＡを受ける四肢において成し遂げられた（図８）。
【００９９】
ラット肢筋細胞に対するｓｉＲＮＡの送達において、１５０ｇのスピローグ・ドーリー・ラットは、ホタル・ルシフェラーゼをコード化している２５０μｇのｐＤＮＡ（ｐＳＰ−ｌｕｃ＋、プロメガ）およびレニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（和名：ウミシイタケ）のルシフェラーゼをコード化している２５μｇのｐＤＮＡ（ｐＲＬ−ＳＶ４０、プロメガ）を大伏在静脈に対して共に注射した。上述したように、注射は、３ｍｌの注射量で実行された。動物（ｎ  ＝  ５）の１つの群は単独でプラスミドを受け、１つのグループ（ｎ＝５）はホタル・ルシフェラーゼ（ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋）に対して目標とされたｓｉＲＮＡの１２．５μｇを加えたプラスミドを受け、対照群（ｎ＝５）は増強された緑色蛍光タンパク質（ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に対して目標とされたｓｉＲＮＡの１２．５μｇを加えたプラスミドを受けた。筋肉は注射の７２時間後に収集された。
【０１００】
【表１１】
2007501282.tif 000012
発現レベルは、ホモジェネートを調製し、二重のルシフェラーゼ分析キット（プロメガ）を使用して、ホタル・ルシフェラーゼとレニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼの活性を測定することで測定された。ホタル・ルシフェラーゼに対して目標とされたｓｉＲＮＡを受ける動物の平均発現レベル（全ての収集された筋肉群から）は、対照のｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）を受けるそれらの動物に正常化された。ホタル・ルシフェラーゼに対してｓｉＲＮＡを受ける動物は、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ発現と関連して、ホタル・ルシフェラーゼ発現で６０倍までの減少を示した。
【０１０１】
霊長類肢筋細胞に対するｓｉＲＮＡ送達において、注射パラメータが、プラスミド送達研究のために上記の通りに用いられた。アカゲザル・マカークの１つの前肢は、ホタル・ルシフェラーゼをコード化するｐＤＮＡ（ｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）の１０ｍｇを含有する４０ｍｌの食塩水と、レニラ・レニホルミス（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（シーパンジー）ルシフェラーゼをコード化するｐＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａの２．２ｍｇと、ホタル・ルシフェラーゼに対して目標とされたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−ｌｕｃ＋）の７５０μｇとで橈側皮静脈を経て注射された。反対の下部の後肢は、増幅された緑色蛍光タンパク質に対して目標とされたｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ）の７５０μｇに加えて同じプラスミドを含有する５０ｍｌの食塩水で大伏在静脈を経て、同じ日に注射された。注射の９６時間後、動物に麻酔されて、筋肉が収集された。発現レベルはラット研究に記載したのと同じ技術で測定された。データは、対照ｓｉＲＮＡ（ＥＧＦＰ）において得られた値に対して標準化された。発現可能なレポーター遺伝子を含有するプラスミドの共同送達は、定量的にｓｉＲＮＡの送達を検定するために、便利な手法として用いられた。本発明は、ｓｉＲＮＡ送達におけるプラスミドの共同送達を必要とせず、注射溶液内でのプラスミドＤＮＡの欠如は、ｓｉＲＮＡ送達の効果を及ぼさない。前腕（長掌筋、円回内筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、浅指屈筋、深指屈筋、方形回内筋、腕橈骨筋、長橈側手根屈筋、短橈側手根屈筋、指伸筋、肘筋、尺側手根屈筋、回外筋、長母指外転筋、ｅｘｔ．  ｄｉｇｉｔｉ  ｓｅｃｕｎｄ  ｅｔ  ｔｅｒｉｔｉ、ｅｘｔｅｎｓｏｒ  ｄｉｇｉｔｉ  ｑｕａｒｔ  ｅｔ  ｍｉｎｉｍｉ、親指の筋肉、骨間筋、その他、手の筋肉）の全ての筋肉群において、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの発現に対するホタル・ルシフェラーゼの発現の比率は、０．０１９±０．０１５であった。下部の後肢（内側腓腹筋、横側の腓腹筋、ひらめ筋、膝窩筋、長指屈筋、長母指屈筋、後腓骨筋、前脛骨筋、長母指屈筋、長指伸筋、長母指外転筋、長腓骨筋、短腓骨筋、短指伸筋、短母指伸筋、他の足の筋肉）の全ての筋肉群において、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼの発現に対するホタル・ルシフェラーゼ発現の比率は、０．４４８±０．１５５であった。ホタル特定のｓｉＲＮＡを受ける筋肉は、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼと関連してホタル・ルシフェラーゼの２３．６倍より低い発現を示した。
【０１０２】
実施例１４．ポリヌクレオチドの静脈内送達後の毒性評価：麻酔から回復するとすぐに、全てのマウス、ラット、イヌおよび霊長類は処理をよく受け入れ、注射された四肢を使い始めた。注射された霊長類上の血清化学のパネルは、電解質、血清ミネラル、血清脂質、血清タンパク質（ビリルビン、総タンパク質）が注射によって悪影響を受けていなかったことを示した。血清肝臓酵素（アラニン・アミノトランスフェラーゼ−ＡＬＴおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ−ＡＳＴ）は注射の１日後にわずかに上昇し（正常範囲より少し上に）、全てのケースで、それらは注射後４８時間で正常範囲に戻った。３匹の注射された霊長類上の完全血球測定（ＣＢＣ）で、赤血球（ＲＢＣｓ）と白血球（ＷＢＣｓ）の全体のレベルが注射により正常範囲のままであることが分かった。２匹のアカゲザル・マカークにおいて、血小板のわずかな上昇は、注射後７日で観察された。
【０１０３】
手順に関連した筋肉損傷を評価するために、筋たんぱく質クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の血清濃度は、注射の後、さまざまな時間で各々の種において測定された。最適状況（２０秒にわたる３ｍｌの通常の食塩水において）の下で、５００μｇのｐＣＩ−Ｌｕｃを注射されたラットにおいて、ＣＰＫ値は、注射による実質的な変化を示さなかった。イヌにおいて、別々の脚で２つの経時的な静注が実行され（０日目および３日目；脚への注射につき４０ｍｌ）、ＣＰＫ値も注射による実質的な変化を示さなかった（図９）。イヌおよび霊長類の通常の基線ＣＰＫ価値の範囲は、それぞれ１６乃至４１３Ｕ／血液Ｌと、０乃至６１１のＵ／血液Ｌである。同じ日に２つの異なる肢（腕および脚）に注射を受けたアカゲザルにおいて、血清ＣＰＫ値は、一時的な上昇を示したが、数日以内で、基線レベルに戻った（図９）。サルにおいて、静注は各々の動物になされ、０日目で１本の腕および脚に注射され、３日目に反対側の腕と脚になされた（つまり、０日目の２注射と３日目の２注射）。３日目に、両種の血液サンプル（ＣＰＫ分析のために）が、２回目の静注に先立って収集された。２回目の注射後の低いＣＰＫ値は、減少した注射量（７０乃至９０ｍｌの注射）を反映し得る。サルのＣＰＫレベルのこれらの一時的な上昇が筋肉損傷の最小量を表す点に注意することは、重要である。この大きさのＣＰＫレベルは、通常の対象のさまざまな偏心の運動療法を伴う（ノックス等１９８７、ノサカ等１９９６）。ヒト及びヒト以外の霊長類の研究は、原形質膜透過性の一時的な増加が、四肢への止血バンド配置後に生じ、脈管系への溶液の迅速な注射後に発生できることを証明した（チウ等１９７６、Ｃｈｅｔｖｅｒｉｋｏｖａ  １９７７、Ｍｏｄｉｇ等１９７８、Ｒｕｐｉｎｓｋｉ等１９８９、チャン等２００４）。
【０１０４】
ＣＰＫデータと整合して、筋肉組織学（Ｈ＆Ｅ染色）は、最小の壊死（０．２％より少ない筋繊維）が静注後のラットまたはアカゲザル筋肉に発生し、筋組織が注射の７日後に非注射された筋肉から見分けがつかなかったことを示した。おそらく最も重要なことに、静脈組織学（Ｈ＆Ｅ染色）および放射線学的静脈造影図（造影剤の排水）は、静脈への注射による検出可能な脈管損傷がないことを示した。
【０１０５】
実施例１５．ポリヌクレオチドの静脈内送達後のマウスの免疫反応の誘発：４匹のマウスは、サイトメガロウィルスプロモーター（ｐＭＩＲ４８）の制御下で、ホタル・ルシフェラーゼをコード化するプラスミドで０日目、１４日目及び２１日目に注射された。各注射において、プラスミドを含有する溶液は、以下の通りに伏在静脈動物のルーメンに嵌入された：ラテックス止血バンドは、脚への血流と脚から血流を妨げるために、四頭筋上のちょうど上の後肢に巻かれて、止血鉗子を有する場所にしっかりと固定された。小さい切開は、大きな（または中間の）伏在静脈の末端部分を露出させるために実行された。針の先端を順行方向で膝のちょうど上に配置するように、３０ゲージの針カテーテルは遠位静脈に嵌入されて、進められた。シリンジポンプは、４．５ｍｌ／分の流速で５０μｇのｐＤＮＡを含有する１．０ｍｌの食塩水の注射による１乃至５分後に４．５ｍｌ／分の流速で、流出促進溶液（０．２５ｍｌの食塩水の４２μｇパパベリン）を注射するために用いた。溶液は、静脈による通常の血流の方向に注射された。注射の２分後に、止血バンドは取り外されて、血流は圧力と止血スポンジによって制御された。切開は、４乃至０のビクリル（Ｖｉｃｒｙｌ）縫合によって閉じた。処置は、１０分ほどで完了された。
【０１０６】
対照として、２匹のマウスは、尾部静脈注射を使用して、肝臓へのプラスミド送達を介して予防接種をされた。マウスは、上述のように同じ日に注射を受けた。尾部静脈注射において、２．５ｍｌのリンガー溶液での５０μｇのプラスミドＤＮＡは、２７本のゲージ針を使用して、尾部静脈に注射された。全ての容量は、１０秒以内で分配された（米国特許第６，６２７，６１６号）。
【０１０７】
ルシフェラーゼに対する免疫反応の誘導をモニタするために、動物は、１、７、２０および３４日目に採血された。血液は凝固されて、サンプルは血清を回収するために遠心分離機で分離された。以下の通りに、血清は、ＥＬＩＳＡを使用してルシフェラーゼに対する抗体の存在において分析された：９６穴プレートは、ウェルごとに０．１Ｍの炭酸バッファーの１００μｌの２μｇ／ｍｌのタンパク質でインキュベーションすることによって、組換え体のルシフェラーゼタンパク質（プロメガ、マジソン、ウィスコンシン）でコーティングされた。プレートは４℃でオーバーナイトにわたってインキュベーションされ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳで３回洗浄された。ウェルは室温で１時間半にわたって２００μｌＰＢＳと１％の非脂肪ドライミルクでブロックされて、上述のように３回洗浄された。マウスの血清は、ＰＢＳと１％ミルクで希釈された。１００μｌの希釈した血清は、二重でウェルに添加されて、室温で１時間半にわたってインキュベーションされた。上述のように、プレートは３回洗浄された。ＰＢＳと１％ミルクで２万倍に希釈された西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ（シグマ、セントルイス、ＭＯ）に接合した１００μｌの抗マウス多価抗体が各ウェルに添加された。上述のように、プレートは５回洗浄された。１００μｌのテトラメチル・ベンジジン（シグマ）は各ウェルに加えられて、サンプルを成長させた。反応はウェルにつき１００μｌの１．０ＭのＨ２ＳＯ４の添加によって停止されて、吸収度は４５０ナノメートルで読まれた。標準線は、ヤギ由来の抗ルシフェラーゼ西洋ワサビ・ペルオキシダーゼのコンジュゲート（シグマ）を使用して生成された。結果は図１０Ａに示される。マウス血清に存在する抗ルシフェラーゼ抗体の存在は、免疫反応の成功した誘導を示す。
【０１０８】
実施例１６．ウサギでの遺伝子工学的な免疫操作：４匹のウサギは、０、１４、２１及び２８日目に、サイトメガロウイルス・プロモータ（ｐＭＩＲ４８）と、ユビキチンＣ（ｕｂｑｕｉｔｉｎ  Ｃ）プロモータと、長期発現（ｐＭＩＲ６８）の促進のための肝臓のコントロール領域の制御下で、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子をコード化するプラスミドで注射した。また、２匹の動物は、サイトメガロウイルス・プロモータ（ｐＭＩＲ１５２）の制御下でラット・インターロイキン２をコード化しているプラスミドを受けた。各注射において、プラスミドを含んでいる溶液は、以下の通りに伏在静脈のルーメンに嵌入された：ラテックス止血バンドは、脚への血流と、脚からの血流を妨げるために、後肢の上部に巻かれて、止血鉗子を有する場所に固定された。注射は、大きいか、又は小さい伏在静脈にされた。静脈のルーメンに、順行方位で、２３のゲージ・カテーテルが嵌入された。シリンジポンプは、４乃至５ｍｌ／分の流速で流出促進溶液（６ｍｌの食塩水の１．０ｍｇパパベリン）を注射するために用いた。１乃至５分後、プラスミドＤＮＡを含有する溶液は、カテーテルにより注射された（１８乃至４４ｍｌ食塩水の１ｍｇ／ｋｇのｐＭＩＲ４８又はｐＭＩＲ６８、２ｍｇ／ｋｇのｐＭＩＲ１５２、動物の体重ｋｇ当たり１４ｍｌ）。溶液は、１８乃至３０秒（１乃至２ｍｌ／秒）で注射された。溶液量と注射率は、ウサギの体重に依存して変化した。溶液は、静脈による通常の血流の方向に注射された。注射の２分後に、止血バンドは取り外された。切開および静脈穿刺からの出血は、圧力と止血スポンジによって制御された。切開は、４−０のブラウナミド（Ｂｒａｕｎａｍｉｄ）縫合によって閉じた。処置は、２０分ほどで完了された。
【０１０９】
動物においてルシフェラーゼに対する免疫反応の誘導をモニタするために、動物は、３、１４、２１、２８および３５日目に採血された。免疫反応の誘発を示す、血清中の抗体の存在は、上述したように決定された。結果は図１０Ｂに示される。ウサギ血清に存在する抗ルシフェラーゼ抗体の存在は、免疫反応の成功した誘導を示す。
【０１１０】
実施例１７．足の筋肉に対するポリヌクレオチドの静脈内送達：この実施例は、下記の違いにしたがって、実施例５のように実行された。止血バンドは、足関節のちょうど上に配置され、１ｍｌの食塩水中のルシフェラーゼをコード化している、１００μｇのプラスミドＤＮＡを３０のゲージ針カテーテルを使用して、横方向の足底静脈に１０ｍｌ／分の率で逆行的な方向で注射された。パパベリンの前注射は、実行されなかった。２匹の動物において、足の筋肉の平均的なルシフェラーゼ発現は、筋組織の１グラムにつき５８４±５８．６ｎｇのルシフェラーゼであった。ルシフェラーゼ発現は、同じ動物の腓腹筋の筋肉（止血バンドに近位の筋肉）において最小限だった。
【０１１１】
実施例１８．血管拡張薬は、肢筋細胞に対するポリヌクレオチドの静脈内送達に必要でない：これらの実験は、下記の違いでもって実施例５に記載したように実行された。２５０μｇのｐＭＩＲ４８プラスミドが注射され、何匹かの動物において、血管拡張パパベリンは前注射溶液に含まれなかった。ルシフェラーゼの発現は、パパベリンを受けていない動物と比較してパパベリンを受けている動物において、統計学的に違いはなかった。表の数は、パパベリンが用いられた９匹の動物の１２の肢と、パパベリンが注射されなかった７匹の動物の７の肢における平均に加えたＳＥＭを示した。４匹の動物は、１つの後肢にパパベリンを受け、他の後肢にはパパベリンを受けなかった。
【０１１２】
表１１．注射前の血管拡張薬に関係なく、静脈注射を介してラットの後肢にわたる筋肉へのポリヌクレオチド送達
【０１１３】
【表１２】
2007501282.tif 000013
実施例１９．ポリヌクレオチド注射後の血管閉塞の時間の効果：これらの実験は、以下の違いで実施例５にて説明したように実行された。２５０μｇのｐＭＩＲ４８プラスミドが注射されて、注射された脚への血流及び注射された脚からの血流は、ポリヌクレオチドを含有する溶液の静脈に対する注射を終えた後、０分、２分又は５分間ブロックされた。血流は、止血バンドの解放によって、示された時間に回復された。パパベリン前注射はなく、４．５ｍｌの食塩液中のＤＮＡは３０秒で注射された。結果は、注射後の長いか、又は短い期間の血流の制限が肢の細胞へのポリヌクレオチド送達を除去しないことを示す。
【０１１４】
表１２．静注を介するラット後肢の全体にわたる筋肉に対するポリヌクレオチドの送達；注射後の血管閉塞の維持の効果。
【０１１５】
【表１３】
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実施例２０．関節および骨に対するポリヌクレオチド送達、ならびに静脈内注射を経た骨髄細胞。ＩＣＲマウスは、各手順を通して、１乃至２％のイソフルランによって麻酔された。小さいラテックス止血バンドは、後肢（上記の四頭筋）上にしっかりと巻かれて、止血鉗子で保持された。小さい切り傷（１ｃｍまでの）は、遠位の大伏在静脈の部分を露出させるために、皮膚においてなされた。３０のゲージ針カテーテルは、遠位の大伏在静脈に嵌入されて、約０．５ｃｍを血管内に前進させて、注射の間、保持された。次いで、カテーテルは、ハーバードＰＨＤ  ２０００のシリンジポンプに接続されて、ＤＮＡ（１００μｇ、１４７μｇ  ＭＣＫ、２８０μｇ  Ｄｅｓｍｉｎ）の食塩液（１．０ｍｌ）が、８ｍｌ／分の率で注射された（順行）。プラスミドＤＮＡは、ルシフェラーゼ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子でコード化される。注射の２分後に止血バンドは取り外されて、皮膚が５乃至０の縫合によって閉じた。注射の一日後、組織は、０．５ｍｌの溶解緩衝液において均質にされて収集され、ルシフェラーゼ発現のために検定された。骨髄細胞は、大腿骨を開いて、鉗子で骨髄を掘り出すことによって収集された。残りの大腿骨は、骨の発現のために検定された。関節の組織は、関節のカプセルから滑液ライニング、腱、軟骨および結合組織を含んだ。
【０１１６】
表１３．静脈内注射を経た大腿骨の骨細胞に対するポリヌクレオチド送達
【０１１７】
【表１４】
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表１４．静脈内注射を経た骨髄細胞へのポリヌクレオチド送達。
【０１１８】
【表１５】
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表１５．静脈内注射を経た関節細胞へのポリヌクレオチド送達。
【０１１９】
【表１６】
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図１２は、ＬａｃＺ染色によって示されたようにβ−ガラクトシダーゼのトランス遺伝子でトランスフェクションされた骨の細胞の存在を示す。左のパネルは、骨と関節の断面図を示す。顕微鏡写真の中間部の近くの暗から明への移行は、骨および軟骨からの移行を示す。右側パネルは、ＬａｃＺによって染色される同じ部分を示して、トランスフェクションした骨細胞（暗い点）の存在を示す。
【０１２０】
ラットでの関節細胞への送達において、２ｍｇのＤＮＡ（ＣＭＶ−ルシフェラーゼ）が注射される以外は、実施例＃５と同じ手順であった。注射の２４時間後、ラットは安楽死されて、完全な関節（脛骨、大腿骨、膝蓋骨および全ての関節の小型の組織の上部）は収集されて、５．０ｍｌの溶解緩衝液において均質にされて、ルシフェラーゼ発現のために検定された。
【０１２１】
表１６．静脈内注射を経た関節細胞へのポリヌクレオチド送達。
【０１２２】
【表１７】
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実施例２１．ラットおよびマウスの肢骨格の筋細胞に対するポリヌクレオチドの静脈内送達における注射溶液量および注射率の効果。注射溶液は率を変化させることで注射された注射溶液が率を変化させることで注射された以外は、実施例５のように、ラットへの静脈内注射が実行された。
【０１２３】
表１７．さまざまな注射率を使用して、ラット肢筋細胞に対するポリヌクレオチド送達。
【０１２４】
【表１８】
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注射溶液量と注射率が多様だったこと以外、実施例１０のように、Ｃ５７マウスへの静脈内注射は実行された。
【０１２５】
表１８．さまざまな注射率を使用して、ラット肢筋細胞に対するポリヌクレオチド送達。
【０１２６】
【表１９】
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実施例２２．伏在静脈への静注は、肢骨格の筋肉にポリヌクレオチドの効果的な送達を提供する。１２０乃至１４０ｇの成熟したスピローグ−ドーリー・ラットは８０ｍｇ／ｋｇのケタミンおよび４０ｍｇ／ｋｇのキシラジンによって麻酔されて、外科的な分野は剃られて、殺菌剤によって殺菌消毒された。動物は、外科的処置の間、体温の損失を予防するために、電気座布団に配置された。４ｃｍ長の腹部正中線に切開がなされて、その後、皮膚フラップが広げられて、目的領域を露出させるためにクランプで保持された。湿ったガーゼは、内部臓器の過剰な乾燥を防ぐために塗布された。腸は、腸骨の静脈および動脈を視覚化するように動かされた。微小血管クリップは、大腿動脈および上腹部静脈に配置された。２７ｇの針により、流出促進溶液（例えば１．５ｍｌの食塩水の０．５ｍｇのパパベリン）は小伏在静脈に注射された。１乃至１０分後に、２７Ｇの蝶針は同じ部位に嵌入され、ホタル・ルシフェラーゼをコード化している５００μｇのｐＭＩＲ４８プラスミドＤＮＡを含んでいる７．５ｍｌの通常の食塩水が、２５ｍｌ／分の率で注射された。流体は、通常の血流の方向に注射された。微小血管挿弾子は注射の２分後に取り外されて、血流は圧力およびゲル泡によって制御された。腹筋および皮膚は、４乃至０のデキソン（ｄｅｘｏｎ）縫合によって閉じられた。ラットは注射後５日目で安楽死されて、肢の筋肉は収集されて、６つの群（四頭筋、二頭筋、膝窩筋、腓腹筋、脛肉および足）に分けられた。各々の筋肉群からのルシフェラーゼ活性は前述したように決定されて（チャン等２００１）、筋組織のグラムにつきルシフェラーゼ発現の総レベルは決定された。筋肉説明は、後肢の以下の筋肉群を示す：四角筋−上部脚の前筋肉；二頭筋−上部脚の内側筋肉；膝窩筋−上部脚の後方筋肉；  腓腹筋−下腿の後方筋肉；脛肉−下腿の前筋肉；足−足の背面の筋肉。ルシフェラーゼ発現は、閉塞から遠位の肢の全体にわたって、筋肉において観察された。最も高い発現レベルは、注射部位の近くで観察された。結果は、１つか２つのだけ静脈の閉塞が、静注による無管肢細胞へのポリヌクレオチド送達を提供するのに十分であることを示す。
【０１２７】
表１９．個々の筋肉群でのルシフェラーゼ発現
【０１２８】
【表２０】
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実施例２３．さらなる圧力静脈内注射を経た肢筋細胞に対するアデノウィルス伴生ウィルス（ＡＡＶ）の送達。マウスは、各手順の全体にわたって１乃至２％のイソフルランによって麻酔された。小さいラテックス止血バンドは、上部の後肢（上記の四頭筋）のまわりにしっかりと巻かれて、止血鉗子で保持された。小さい切開（１ｃｍまで）は、遠位の大伏在静脈の部分を露出させるために、皮膚においてなされた。３０のゲージ針カテーテルは、遠位の大伏在静脈に嵌入されて、約０．５ｃｍを静脈内に前進させて、注射の間、保持された。カテーテルは、ハーバードＰＨＤ  ２０００シリンジポンプに接続されて、ＡＡＶ（０．１９ｘ  １０９導入ユニット、（ＣＭＶ−ＬａｃＺ）の食塩液（０．８ｍｌ）が３ｍｌ／分の率で注射された（順行）。注射の２分後に、止血バンドは取り外されて、皮膚が５−０の縫合によって閉じられた。注射の２週後に、肢の筋肉は収集されて、冷却したイソペンタンにおいて−８０℃で保存された。１０μｍ厚の低温部分が製作されて、１．２５％のグルタルアルデヒド（ｇｌｕｔｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ）に固定された。次いで、その部分は、３７°Ｃで１時間のＸ−ｇａｌ染色溶液（Ｍｉｒｕｓ社）においてインキュベーションされた。図１１は、β−ガラクトシダーゼにおいて染色されるマウス後肢腓腹筋の筋肉の顕微鏡写真を示し、ＡＡＶが筋細胞に対して効率的に分配されたことを示す。
【０１２９】
実施例２４．無管肢細胞への高分子の静脈内送達。この研究は、マウスにおいてなされた。ＩＣＲマウスが準備された。食塩水の１００μｇのローダミン標識の７０ｋＤａのデキストランポリマー高分子を注射したことを除いては、実施例２０にて説明したように注射された。筋組織は注射の１時間後に収集され、蛍光顕微鏡検査のために調製された。図１３に示されるように、標識されたデキストランは、肢の骨格の筋細胞に、効果的に送達された。図１３の左上のパネルは、ローダミン標識のデキストランを示す。右上のパネルは、筋細胞の位置を示す。左下のパネルは、核の位置を示す。右下のパネルは、合成画像を示す。
【０１３０】
実施例２５．マウス肢の細胞へのポリヌクレオチド送達、発現カセットの比較。ＩＣＲマウスは、各手順の全体にわたって１乃至２％のイソフルランによって麻酔された。小さいラテックス止血バンドは、上部の後肢（上記の四頭筋）のまわりにしっかりと巻かれて、止血鉗子で保持された。小さい切開（１ｃｍまで）は、遠位の大伏在静脈の部分を露出させるために、皮膚においてなされた。３０のゲージ針カテーテルは、遠位の大伏在静脈に嵌入されて、約０．５ｃｍを静脈内に前進させて、注射の間、保持された。次いで、カテーテルは、ハーバードＰＨＤ  ２０００シリンジポンプに接続されて、ＤＮＡ（５０μｇ）の食塩液（１．０ｍｌ）が、８ｍｌ／分の率で注射された（順行）。プラスミドＤＮＡは、ルシフェラーゼ遺伝子またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子でコード化される。注射の２分後に止血バンドは取り外されて、皮膚が５−０の縫合によって閉じた。注射の２または７日後に、肢筋組織は収集されて、０．５ｍｌの溶解液において均質にされて、ルシフェラーゼ発現のために検定された。異なるプロモーターの４つの異なる発現カセットが送達された。それらは、ＣＭＶプロモータを含んでいるｐＭＩＲ０４８、耐ＫａｎバックボーンのＭＣＫプロモータを含んでいるｐＭＩＲ０５７、耐ＡｍｐバックボーンのＭＣＫプロモータを含んでいるｐＭＣＫ−ＬｕｃおよびＨＣＲ−Ｕｂプロモータを含んでいるｐＭＩＲ０６８である。各時間ポイントで各ベクターにおいて、４乃至５匹のマウスが検定された。
【０１３１】
表２０．骨格の筋細胞に対するプラスミドＤＮＡの静脈内送達後の異なる発現カセットからの骨格の筋細胞のルシフェラーゼ発現
【０１３２】
【表２１】
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実施例２６．静脈注射を経たラット肢筋細胞に対するルシフェラーゼＤＮＡベクターの送達：５００μｇのｐＤＮＡ（ｐＣＩ−Ｌｕｃ−Ｋ）の規定食塩液（ＮＳＳ）が、１５０ｇまでのスピローグ−ドーリー・ラットに対する全ての静注において用いられた。肢へ流れ込む血流及び肢から流れ出る血流は、注射の直前と注射の間に抑制されて、脚の上部（四頭筋筋肉群のちょうど上の近く又は部分的に近く）周辺に止血バンドを配置することによって注射後２分間において制限された。何匹かのラットにおいて、１．５ｍｌのパパベリン溶液は、大伏在静脈の末梢部位に注射された（２５０μｇパパベリンの１．５ｍｌ  ＮＳＳ溶液）。パパベリンの前注射を受けているラットにおいて、１分または５分後に、ｐＤＮＡは、２０秒間まで３ｍｌの率（１０ｍｌ／分；図１）で、遠位の後肢の大伏在静脈に注射された。パパベリン注射を受けていないラットにおいて、ｐＤＮＡの４．５ｍｌ食塩水（注射される同じ総量）は、３０秒間で注射された。静注は、プログラム可能なハーバードＰＨＤ  ２０００シリンジポンプ（ハーバードインストルメンツ）に接続している針カテーテルを介して、前方に動く方向（すなわち、血流によって）において実行された。ラットは注射の５日後に安楽死されて、肢の筋肉は収集されて、６つの群（四頭筋、二頭筋、膝窩筋、腓腹筋、脛肉および足）に分けられた。各々の筋肉群からのルシフェラーゼ活性は前述したように決定されて（チャン等２００１）、筋組織のグラム当りのルシフェラーゼ発現の総レベルが決定された。３匹のラットは、各々の状態において注射された。血管拡張薬の前注射の有無に関わらず、ルシフェラーゼ発現によって証明されたように、結果は、ポリヌクレオチドが肢骨格の筋細胞に効果的に送達されることを示す。
【０１３３】
表２１．血管拡張前注射の有無に関係ない、肢筋細胞に対する核酸の送達。
【０１３４】
【表２２】
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前述は、本発明の原則だけを例示するように考慮される。さらに、当業者にとって、多数の変更態様と修正が容易になされ得るので、本発明を図と共に記載される正確な構造および作動に制限することを要求されない。したがって、全ての適切な変更態様および同等な物は、本発明の範囲内となる。
【０１３５】
関連出願の相互参照
本願は、先願の米国仮特許出願第６０／４７３，６５４号（２００３年５月２８日出願）及び第６０／５００，２１１号（２００３年９月４日）の利益を主張する。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１Ａ】哺乳類の肢への核酸のカテーテルによって媒介される静注の概略図であり、ラットの末梢後肢に対する静脈内送達を示し、右パネルは、肢の主要静脈を例示する。
【図１Ｂ】哺乳類の肢への核酸のカテーテルによって媒介される静注の概略図であり、イヌの末梢後肢に対する静脈内送達を示し、右パネルは、肢の主要静脈を例示する。
【図１Ｃ】哺乳類の肢への核酸のカテーテルによって媒介される静注の概略図であり、霊長類の末梢後肢に対する静脈内送達を示し、右パネルは、肢の主要静脈を例示する。
【図１Ｄ】哺乳類の肢への核酸のカテーテルによって媒介される静注の概略図であり、ヒトの末梢後肢に対する静脈内送達を示し、右パネルは、肢の主要静脈を例示する。
【図２Ａ】雌のスピローグ-ドーリー・ラット（１２０−１５０ｇ）の後肢に対するpDNA（pCI−Luc-K）の静脈内送達の注射量の効果を示すグラフである。
【図２Ｂ】雌のスピローグ-ドーリー・ラット（１２０−１５０ｇ）の後肢に対するpDNA（pCI−Luc-K）の静脈内送達による、ルシフェラーゼ発現の注射率を示すグラフである。
【図３】５００μｇのpDNA（pCI-LacZ）の単一の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたラット肢腓腹筋の筋肉の顕微鏡写真である。
【図４】５００μｇのpDNA（pCI-LacZ）の反復した（複数の）静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたラット肢腓腹筋（Ａ）及び肢むこうずね（Ｂ）の筋肉の顕微鏡写真である。
【図５】治療遺伝子の哺乳類の四肢への血管内注射後のエリトロポイエチン発現の時間の経過を示すグラフである。
【図６】治療遺伝子の哺乳類の四肢への血管内注射後の免疫組織化学染色図である。
【図７Ａ】40mgのpDNA（pCI-LacZ）の大伏在静脈の末端部位への一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色された腓腹筋筋肉の顕微鏡写真を示す。
【図７Ｂ】40mgのpDNA（pCI-LacZ）の大伏在静脈の末端部位への一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色された腓腹筋筋肉の顕微鏡写真を示す。
【図７Ｃ】40mgのpDNA（pCI-LacZ）の大伏在静脈の末端部位への一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたヒラメ筋の顕微鏡写真を示す。
【図７Ｄ】40mgのpDNA（pCI-LacZ）の大伏在静脈の末端部位への一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたヒラメ筋の顕微鏡写真を示す。
【図７Ｅ】40mgのpDNA（pCI-LacZ）の大伏在静脈の末端部位への一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色された短母指伸筋の顕微鏡写真を示す。
【図７Ｆ】40mgのpDNA（pCI-LacZ）の大伏在静脈の末端部位への一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色された短母指伸筋の顕微鏡写真を示す。
【図８】siRNAsおよびpDNA発現ベクターの静脈内共同送達後のラットおよび霊長類の肢の筋肉のRNA干渉を示すグラフであり、Ａはラット、Ｂはモンキーを示す。
【図９】ビーグル犬(A)およびアカゲザル・マカーク（B）の2つの静注後のクレアチンホスホキナーゼ（CPK）値の時間の経過を示すグラフである。
【図１０】静脈内遺伝子の免疫化において、Aはマウス、Bはウサギの抗ルシフェラーゼ抗体発現の時間の経過を示すグラフである。
【図１１】毎分3mlの率で、0.8ml食塩水のアデノ伴生ウィルスの0.19のx 109の変換ユニットの一回の静注後のβガラクトシダーゼにおいて染色されたマウス後肢腓腹筋の筋肉の顕微鏡写真である。
【図１２】β-ガラクトシダーゼ・トランス遺伝子の静脈内送達後の骨のLacZ染色の顕微鏡写真であり、左パネルは、骨および関節の断面図を示し、右側パネルは、LacZによって染色された同じ断面を示す。
【図１３】止血バンドから末端の伏在静脈へローダミン標識の70kDaのデキストランの静脈内注射の後、マウスの肢の骨格筋の顕微鏡写真であり、左上のパネルは、ローダミン標識のデキストランを示し、右上のパネルは、筋細胞の位置を示し、左下のパネルは、核の位置を示し、右下のパネルは、合成画像を示す。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ−１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2007501282.tif 000034
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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