(57)【要約】一つまたは複数の敗血症または炎症誘導物質によって調節され、ペプチドによって阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを同定する方法を記述する。炎症または敗血症反応を阻害するためにポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法。方法には、陽イオンペプチドの存在下または非存在下で細胞をLPS、LTA、CpG DNAおよび／または無傷の微生物または微生物成分に接触させる段階；ペプチドの存在下および非存在下で細胞に関するポリヌクレオチド発現パターンを検出して、ペプチドの存在下でのパターンによって炎症または敗血症反応の阻害が表される段階、が含まれる。同様に、本発明の方法によって同定された化合物および方法も含まれる。もう一つの局面において、本発明は、被験者における先天性免疫を増強する方法および化合物を提供する。2007505048.tif 000178
2007505048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1〜4、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチドの治療的有効量を被験者に投与して、それによって免疫応答を刺激することを含む、被験者における先天性免疫を刺激する方法。
【請求項２】
先天性免疫が、宿主免疫細胞の活性化、増殖、分化、またはMAPキナーゼ経路活性化によって証明される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
MAPキナーゼがMEKおよび／またはERKである、請求項2記載の方法。
【請求項４】
被験者にGM-CSFを投与することをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
SEQ ID NO:1〜4、7、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチドと併用して抗生物質を被験者に投与する段階を含む、感染症を有するかまたは感染症を有する危険性のある被験者における先天性免疫を刺激する方法。
【請求項６】
ペプチドがD-エナンチオマーである少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
ペプチドが環状である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
ペプチドの配列が逆転している、請求項1記載の方法。
【請求項９】
抗生物質を被験者に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
抗生物質が、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、クロラムフェニコール、グリシルサイクリン（glycylcycline）、リコサミド（licosamide）、アミノシクリトール、陽イオン抗菌ペプチド、リポペプチド、ポリミキシン、ストレプトグラミン、オキサゾラジノン、リンコサミド（lincosamide）、フルオロキノロン、カルバペネム、テトラサイクリン、マクロライド、βラクタム、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、またはグリコペプチドから選択される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ペプチドが抗炎症活性を有する、請求項5記載の方法。
【請求項１２】
ペプチドが抗敗血症活性を有する、請求項5記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドがD-エナンチオマーである少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項5記載の方法。
【請求項１４】
ペプチドが環状である、請求項5記載の方法。
【請求項１５】
ペプチドの配列が逆転している、請求項5記載の方法。
【請求項１６】
抗生物質が、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、クロラムフェニコール、グリシルサイクリン、リコサミド、アミノシクリトール、陽イオン抗菌ペプチド、リポペプチド、ポリミキシン、ストレプトグラミン、オキサゾラジノン、リンコサミド、フルオロキノロン、カルバペネム、テトラサイクリン、マクロライド、βラクタム、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、またはグリコペプチドから選択される、請求項5記載の方法。
【請求項１７】
SEQ ID NO:1〜4、7、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチドと併用してGM-CSFを被験者に投与する段階を含む、感染症を有するかまたは感染症を有する危険性のある被験者における先天性免疫を刺激する方法。
【請求項１８】
ペプチドが抗炎症活性を有する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドが抗敗血症活性を有する、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
ペプチドがD-エナンチオマーである少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項17記載の方法。
【請求項２１】
ペプチドが環状である、請求項17記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドの配列が逆転している、請求項17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に、ペプチド、詳しくは治療物質として有効な、ならびに微生物感染症に起因する病態に関連する新薬を発見するためおよび先天性免疫または抗炎症活性を調節するために有効なペプチドに関する。
【０００２】
関連出願データ
本出願は、その全内容物が参照により本明細書に組み入れられる、35 USC 120によって2002年12月2日に提出された米国特許出願第10/308,905号に対する優先権を、そして35 USC 119（e）によって2001年12月3日に提出された米国特許出願第60/336,632号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
感染疾患は、全世界での死因の第一位である。1999年の世界保健機構の調査によれば、毎年1300万人を超える人が感染疾患のために死亡する。感染疾患は北米では死因の第三位であり、年間死亡数の20％を占め、1980年代以降50％増加している。多くの内科的および外科的治療の成否も、感染疾患の制御次第で決まる。抗生物質の発見および使用は、近代医学の偉大な業績の一つであった。抗生物質がなければ、医師は、複雑な手術、化学療法、またはカテーテル挿入のようなほとんどの医学的介入を行うことができないであろう。
【０００４】
抗生物質の現在の売上高は全世界で260億アメリカドルである。しかし、抗生物質の過剰使用および時に正しいと認められていない使用の結果、新たな抗生物質耐性菌の進化が起こった。抗生物質耐性は、医学ではごく当たり前の光景の一部となった。バンコマイシン耐性腸球菌（Enterococcus）、VREおよびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、MRSAのような細菌は、抗生物質によって治療することができず、そのような細菌の感染症を有する患者はしばしば死亡する。抗生物質の発見は、新薬の開発に関する最も難しい領域の一つであることが判明し、多くの製薬大企業は自社の抗生物質開発プログラムを削減または完全に停止した。しかし、難治性感染症の出現を含む抗生物質耐性の劇的な増加により、新しいタイプの抗菌療法に対する明確な満たされていない要求が存在し、先天性免疫に影響を及ぼす物質は、そのような一つのクラスの物質となるであろう。
【０００５】
先天性の免疫系は非常に有効であり、全身性の防御系を進化させた。先天性免疫の要素は常に低レベルで存在し、刺激されると非常に迅速に活性化される。刺激には、細菌のシグナル伝達分子と生体の細胞表面上のパターン認識受容体との相互作用または疾患の他のメカニズムが含まれうる。ヒトは毎日、摂取する食物および水を通して、呼吸する空気を通して、ならびに触れる表面、ペット、および人々を通して、可能性がある何万もの病原性微生物に曝露されている。先天性の免疫系は、これらの病原体が疾患を引き起こさないように作用する。先天性免疫系は、それが常に存在し、即座に有効であり、如何なる所定の病原体に対しても比較的非特異的であることから、いわゆる適応免疫（抗体ならびに抗原特異的BおよびTリンパ球が含まれる）とは異なる。適応免疫系は、特異的認識要素の増幅を必要とし、このように反応するまでに数日から数週間を要する。適応免疫がワクチン接種によって予め刺激されている場合であっても、病原体に対して反応するためには3日またはそれ以上を要するが、先天性免疫は直ちにまたは迅速に（数時間以内）利用できる。先天性免疫は、貪食細胞、補体系を含む多様なエフェクター機能を含むが、一般的に完全には理解されていない。一般的に言って、多くの先天性免疫応答は、細菌のシグナル伝達分子と、宿主細胞表面上のToll様受容体と呼ばれるパターン認識受容体との結合によって「誘発」される。これらのエフェクター機能の多くは炎症反応においてひとまとめにされている。しかし、炎症反応があまりに重度であれば、生体にとって有害となる反応が起こりえて、極端な場合では敗血症およびおそらく死亡が起こりうる。
【０００６】
感染症の際に感染因子から構造成分が放出されると、炎症反応を引き起こし、これはチェックされないままであると、おそらく致死性の病態である敗血症が起こりうる。敗血症は北米において毎年患者約780,000人に起こっている。敗血症は、肺炎のような、地域で獲得された感染症の結果として発症する可能性があり、または外傷、癌、もしくは大手術の治療の合併症である可能性がある。重度の敗血症は、体が炎症反応によって圧倒されて、体の臓器が機能不全となり始める場合に起こる。米国では、敗血症のために毎年120,000例もの死亡が認められる。敗血症はまた、血液中の病原性微生物または毒素（例えば、毒血症）を伴う可能性があり、これはヒトの死因の第一位である。グラム陰性菌は、そのような疾患に最も一般的に関連する生物である。しかし、グラム陽性菌は、感染症の原因となりつつある。グラム陰性およびグラム陽性菌ならびにそれらの成分は全て、敗血症を引き起こしうる。
【０００７】
微生物成分が存在すると、前炎症性サイトカインの放出を誘導し、中でも腫瘍壊死因子-α（TNF-α）は極めて重要である。TNF-αおよび他の前炎症性サイトカインは次に、他の前炎症性メディエータの放出を引き起こし、炎症カスケードが起こりうる。グラム陰性敗血症は通常、細菌の外膜成分であるリポ多糖類（LPS；エンドトキシンとも呼ばれる）の放出によって引き起こされる。エンドトキシン血症と呼ばれる血液中のエンドトキシンは、主に細菌感染症に由来し、抗生物質による治療の際に放出される可能性がある。グラム陽性敗血症は、リポテイコ酸、ペプチドグリカン（PG）、連鎖球菌（Streptococci）によって産生されるラムノース-グルコースポリマー、またはブドウ球菌（Staphylococci）によって産生される莢膜多糖類のような細菌の細胞壁成分の放出によって引き起こされうる。哺乳類DNAとは異なり、非メチル化シトシン-グアノシン二量体（CpG DNA）をしばしば含む細菌または他の非哺乳類DNAも同様に、TNF-αの産生を含む敗血症状態を誘導することが示されている。哺乳類のDNAは、かなり低い頻度でCpGジヌクレオチドを含み、しばしばメチル化型である。細菌感染症の際に本来放出されることの他に、抗生物質治療によっても、細菌の細胞壁成分であるLPSおよびLTS、そしておそらく細菌DNAの放出が引き起こされうる。次に、これは感染症からの回復を妨害して、さらには敗血症を引き起こしうる。
【０００８】
陽イオンペプチドは、感染症に対する防御の一つの形としての認識が高まっているが、科学および特許文献において認識されている主要な効果は抗菌作用である（Hancock, R.E.W., and R. Lehrer, 1998.「Cationic peptides : a new source of antibiotics.」、Trends in Biotechnology 16：82〜88）。抗菌活性を有する陽イオンペプチドは、広範囲の生物から単離されている。自然界において、そのようなペプチドは、細菌および酵母のような微生物に対する防御メカニズムを提供する。一般的に、これらの陽イオンペプチドは細胞質膜との相互作用によって、そして多くの場合チャンネルまたは病変を形成することによって、細菌上でその抗菌活性を発揮すると考えられている。グラム陰性菌では、それらはLPSと相互作用して外膜を可溶化し、外膜を超えての自己促進取り込みが起こり、細胞質膜への通路が形成される。陽イオン抗菌ペプチドの例には、インドリシジン（indolicidin）、デフェンシン、セクロピン、およびマガイニンが含まれる。
【０００９】
最近、そのようなペプチドは、先天性免疫の他の局面におけるエフェクターであるとますます認識されている（Hancock, R.E.W. and G. Diamond, 2000.「The role of cationic peptides in innate host defenses.」、Trends in Microbiology 8：402〜410；Hancock, R.E.W. 2001.「Cationic peptides : effectors in innate immunity and novel antimicrobials.」、Lancet Infectious Diseases 1：156〜164）が、抗菌機能およびエフェクター機能が独立していることは知られていない。
【００１０】
いくつかの陽イオンペプチドは、LPSおよびLTAのような細菌産物の結合に対して親和性を有する。そのような陽イオンペプチドは、LPSに反応してサイトカイン産生を抑制することができ、様々な程度に致死性ショックを防止することができる。しかし、そのような作用がLPSおよびLTAに対するペプチドの結合によるか否か、またはペプチドと宿主細胞との直接相互作用によるか否かに関しては証明されていない。陽イオンペプチドは、哺乳類の免疫系によって用いられるものと類似の調節経路（Toll受容体および転写因子NFκBを含む）によって、微生物またはLPSのような微生物シグナル伝達分子によるチャレンジに反応して誘導される。したがって、陽イオンペプチドは、先天性免疫において重要な役割を有するように思われる。抗菌ペプチドの誘導に影響を及ぼす変異は、細菌のチャレンジに反応して生存を減少させることができる。同様に、ショウジョウバエのToll経路の変異では抗真菌ペプチド発現の減少が起こり、それによって致死性の真菌感染症に対する感受性が増加する。ヒトにおいて、α-デフェンシンを完全に欠損する特異的顆粒欠乏症候群の患者は、しばしばそして重度の細菌感染症を有する。他の証拠には、感染因子によるいくつかのペプチドの誘導能、および炎症部位で記録された非常に高濃度が含まれる。陽イオンペプチドはまた、細胞の遊走を調節して、白血球が細菌感染症と闘う能力を促進する可能性がある。例えば、二つのヒトα-デフェンシンペプチドであるHNP-1およびHNP-2は、マウスおよびヒトのT細胞および単球の直接走化性活性を有することが示されており、ヒトβ-デフェンシンは、CCR6との相互作用を通して、未成熟な樹状細胞およびメモリーT細胞の化学走化性物質として機能するように思われる。同様に、ブタ陽イオンペプチドであるPR-39は、好中球に対して化学走化性であることが判明した。しかし、異なる構造および組成のペプチドがこれらの特性を共有する理由に関してはわかっていない。
【００１１】
ヒトからの単一の既知のカテリシジンLL-37は、炎症障害の際に骨髄前駆細胞、精巣、ヒトケラチノサイト、および気道上皮によって産生される。カテリシジンペプチドの特徴は、カテリンドメインと呼ばれるN-末端プレプロ領域での高レベル配列同一性である。カテリシジンペプチドは、不活性なプロペプチド前駆体として保存されるが、刺激されると、活性なペプチドへと処理される。
【発明の開示】
【００１２】
発明の概要
本発明は、エンドトキシンリポ多糖類、リポテイコ酸、CpG DNA、または他の細胞成分（例えば、微生物もしくはその細胞成分）によって調節され、陽イオンペプチドによって影響を受けるポリヌクレオチド発現パターンに基づいて、被験者における敗血症および／または炎症を遮断または減少する新規化合物をスクリーニングすることができるという独創性に富んだ発見に基づいている。さらに、ツールとして陽イオンペプチドを用いることに基づいて、敗血症反応を誘発せずに、ならびに炎症および／または敗血症反応を遮断／低下させることができる先天性免疫の選択的増強物質を同定することができる。
【００１３】
このように、一つの態様において、一つまたは複数の敗血症または炎症誘導物質によって調節され、陽イオンペプチドによって阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドパターンを同定する方法を提供する。本発明の方法には、ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを、一つまたは複数の敗血症または炎症誘導物質に接触させる段階、およびポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを陽イオンペプチドと同時または直後に接触させる段階が含まれる。発現の差が、陽イオンのペプチドの存在下および非存在下で検出され、発現の差は、それがアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであれ、敗血症または炎症誘導物質によって調節され、陽イオンペプチドによって阻害されるポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのパターンを示している。もう一つの局面において、本発明は、上記の方法によって同定されたポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを提供する。敗血症または炎症誘導物質の例には、LPS、LTA、もしくはCpG DNA、微生物成分（またはその任意の組み合わせ）または関連物質が含まれる。
【００１４】
もう一つの態様において、本発明は、上記の方法によって同定されたポリヌクレオチドを物質と混合することを含む、敗血症または炎症を遮断する物質を同定する方法であって、物質の存在下でポリヌクレオチドの発現が物質の非存在下での発現と比較して調節され、発現の調節が炎症または敗血症反応に影響を及ぼす方法を提供する。
【００１５】
もう一つの態様において、本発明は、1）陽イオンペプチドの存在下または非存在下で細胞をLPS、LTA、および／またはCpG DNAに接触させる段階、ならびに2）ペプチドの存在下および非存在下で細胞に関するポリヌクレオチド発現パターンを検出する段階、によって、炎症または敗血症反応の阻害に関するポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を提供する。ペプチドの存在下で得られたパターンは、炎症または敗血症反応の阻害を表す。もう一つの局面において、ペプチドの存在下で得られたパターンを、類似のパターンを提供する化合物を同定するために、試験化合物のパターンと比較する。もう一つの局面において、本発明は、前述の方法によって同定された化合物を提供する。
【００１６】
もう一つの態様において、本発明は、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを、対象物質に接触させて、物質の存在下でのポリヌクレオチドの発現が、物質の非存在下でのポリヌクレオチドの発現と比較して調節され、調節された発現によって先天性免疫の増強が起こることによって、先天性免疫を増強する物質を同定する方法を提供する。好ましくは、物質の用量は、被験者における敗血症反応を刺激しない。一つの局面において、物質は、抗炎症ポリヌクレオチドの発現を増加させる。例としての、しかし非制限的な抗炎症性ポリヌクレオチドは、IL-1 Rアンタゴニスト相同体1（AI167887）、IL-10 Rβ（AA486393）、IL-10 Rα（U00672）、TNF受容体メンバー1B（AA150416）、TNF受容体メンバー5（H98636）、TNF受容体メンバー11b（AA194983）、HLA IIのIKサイトカインダウンレギュレーター（R39227）、TGF-B誘導型初期増殖反応2（AI473938）、CD2（AA927710）、IL-19（NM_013371）、またはIL-10（M57627）のようなタンパク質をコードする。一つの局面において、物質は、プロテアソームサブユニット26S（NM_013371）のようなNF-κB活性化に関与するプロテアソームサブユニットをコードするポリヌクレオチドの発現を減少させる。一つの局面において、物質はタンパク質キナーゼのアンタゴニストとして作用する可能性がある。一つの局面において、物質は、SEQ ID NO:4〜54から選択されるペプチドである。
【００１７】
もう一つの態様において、本発明は、先天性免疫を選択的に増強する化合物を同定するためにポリヌクレオチド発現パターンを同定する方法を提供する。本発明には、ペプチドの存在下でのパターンが先天性免疫の刺激を表す、陽イオンペプチドの存在下および非存在下で接触させた細胞に関するポリヌクレオチドの発現パターンを検出する段階；陽イオンペプチドの存在下で認められたパターンと類似の試験化合物によるパターンが先天性免疫を増強する化合物を示している、試験化合物の存在下で接触させた細胞のポリヌクレオチド発現パターンを検出する段階が含まれる。化合物の用量は、被験者における敗血症反応を刺激しないことが好ましい。
【００１８】
もう一つの態様において、本発明は、非感染被験者と比較して表50、51、および／または52における少なくとも二つのポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の増加によって例示されるポリヌクレオチド発現パターンを核酸試料において同定することによって、被験者の核酸試料からの哺乳類被験者における感染状態を推論する方法を提供する。同様に、上記の任意の方法によって得られたポリヌクレオチド発現パターンも含まれる。
【００１９】
もう一つの局面において、CXCR-4のアンタゴニストである陽イオンペプチドが提供される。さらにもう一つの局面において、試験ペプチドの存在下または非存在下においてT細胞をSDF-1に接触させる段階および走化性を測定する段階によって、CXCR-4のアンタゴニストである陽イオンペプチドを同定する方法を提供する。試験ペプチドの存在下において走化性が減少すれば、CXCR-4のアンタゴニストであるペプチドであることが示される。陽イオンペプチドはまた、SDF-1受容体ポリヌクレオチド（NM_013371）の発現を減少させるように作用する。
【００２０】
上記の方法の全てにおいて、本発明の化合物または物質には、ペプチド、陽イオンペプチド、ペプチド模倣体、化学化合物、ポリペプチド、核酸分子等が含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
さらにもう一つの局面において、本発明は、単離された陽イオンペプチドを提供する。本発明の単離陽イオンペプチドは、以下の一般式の一つおよび一文字アミノ酸コードによって表される：
X1がR、L、またはKの一つまたは二つであって、X2がC、S、またはAの一つであって、X3がRまたはPの一つであって、X4がAまたはVの一つであって、およびX5がVまたはWの一つである、
2007505048.tif 000003
；
X1がD、E、S、TまたはNの一つまたは二つであって、X2がP、G、またはDの一つまたは二つであって、X3がG、A、V、L、I、またはYの一つであって、X4がR、K、またはHの一つであって、およびX5がS、T、C、M、またはRの一つである、
2007505048.tif 000004
；
X1がA、P、またはRから選択される一つから四つであって、X2が一つまたは二つの芳香族アミノ酸（F、Y、およびW）であって、X3がPまたはKの一つであって、X4がA、P、Y、またはWから選択される一つ、二つ、またはなしであて、およびX5がRまたはPから選択される一つから三つである、
2007505048.tif 000005
；
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸（S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH）であって、X3がC、S、M、D、またはAであって、およびX4がF、I、V、M、またはRである、
2007505048.tif 000006
；
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸（S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH）であって、X3がC、S、M、D、またはAの一つであって、X4がF、I、V、M、またはRの一つであって、およびX5がA、I、S、M、D、またはRの一つである、
2007505048.tif 000007
；
X1が極性アミノ酸（C、S、T、M、N、およびQ）であって、X2がA、L、S、またはKの一つであって、およびX3がG、A、V、L、I、P、F、S、T、K、およびHから選択される1〜17個のアミノ酸である、
2007505048.tif 000008
；
X1が疎水性アミノ酸であって、およびX2が親水性アミノ酸である、
2007505048.tif 000009
。
【００２２】
さらに、もう一つの局面において、本発明は単離陽イオンペプチド
2007505048.tif 000010
を提供する。
【００２３】
本発明の陽イオンペプチドをコードする核酸配列、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、およびベクターを含む宿主細胞も同様に提供される。
【００２４】
もう一つの態様において、本発明は、本発明のペプチド、例えばSEQ ID NO:1〜4、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチドを被験者に投与する段階を含む、被験者における先天性免疫を刺激または増強する方法を提供する。本明細書の実施例において示されるように、先天性免疫は、単なる例として、単球の活性化、増殖、分化、またはMAPキナーゼ経路の活性化によって証明されうる。一つの局面において、方法にはさらに、被験者にGM-CSFのような血清因子を投与することが含まれる。被験者は好ましくな任意の哺乳類であって、より好ましくはヒト被験者である。
【００２５】
もう一つの態様において、本発明は、最適下濃度の抗生物質を本発明のペプチドと併用して被験者に投与する段階を含む、感染症を有するかまたは感染症を有する危険性のある被験者における先天性免疫を刺激する方法を提供する。一つの局面において、ペプチドはSEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:7である。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ポリヌクレオチド発現の調節能（例えば、アップおよび／またはダウンレギュレート能）を有し、それによって敗血症および炎症反応および／または先天性免疫を調節する一群の一般式を特徴とする新規陽イオンペプチドを提供する。
【００２７】
本明細書において用いられる「先天性免疫」は、病原体による浸潤に対する生物の本来の自己防衛能を指す。本明細書において用いられる病原体または微生物には、細菌、真菌、寄生虫、およびウイルスが含まれてもよいがこれらに限定されない。先天性免疫は、生物が、特異性、増幅可能性、および自己対非自己識別を特徴とする、抗体および／または免疫リンパ球に実質的に基づいて防御メカニズムを発達させる後天性／適応免疫とは対比をなす。先天性免疫によって、広く非特異的な免疫が提供され、曝露前に免疫学的記憶はない。先天性免疫の顕著な特徴は、病原体に対する前回の曝露とは無関係な、可能性がある広範な病原体に対する有効性、および即時有効性（誘発されるために数日から数週間を要する特異的免疫応答とは対照的に）である。さらに、先天性免疫には、癌、炎症疾患、多発性硬化症、様々なウイルス感染症等のような他の疾患に影響を及ぼす免疫応答が含まれる。
【００２８】
本明細書において用いられるように、「陽イオンペプチド」という用語は、長さがアミノ酸約5〜約50個の一連のアミノ酸を指す。一つの局面において、本発明の陽イオンペプチドは、長さがアミノ酸約10〜約35個である。ペプチドは、9.0より大きいpKaを有するために十分な陽性荷電アミノ酸を有する場合に、「陽イオン性」である。典型的に、陽イオンペプチドの少なくとも二つのアミノ酸残基、例えばリジンまたはアルギニンが陽性荷電であろう。「陽性荷電」とは、pH 7.0で真の陽電荷を有するアミノ酸残基の側鎖を指す。本発明に従って組換えによって産生されうる天然に存在する陽イオン抗菌ペプチドの例には、デフェンシン、カテリシジン、マガイニン、メリチン、およびセクロピン、バクテネシン、インドリシジン、ポリフェムシン、タキプレシン、およびその類似体が含まれる。多様な生物が微生物に対する非特異的防御メカニズムの一部として用いられる分子である陽イオンペプチドを産生する。単離された場合に、これらのペプチドは、細菌、真菌、および特定のエンベロープを有するウイルスを含む広範な微生物に対して毒性である。陽イオンペプチドは多くの病原体に対して作用するが、顕著な例外および多様な程度の毒性が存在する。しかし、本特許は、微生物に対して毒性を示さないが先天性免疫の刺激を通して感染症に対する保護能を有するさらなる陽イオンペプチドを明らかにし、本発明は抗菌活性を有する陽イオンペプチドに限定されない。実際に、本発明において有用な多くのペプチドが抗菌活性を有しない。
【００２９】
当技術分野で公知の陽イオンペプチドには、例えばヒトカテリシジンLL-37およびウシ好中球ペプチドのインドリシジン、ならびにウシバクテネシン変種Bac2Aが含まれる。
2007505048.tif 000011
【００３０】
先天性免疫において、免疫応答は抗原に依存しない。先天性免疫のプロセスには、上記のように分泌分子および細胞成分の産生が含まれてもよい。先天性免疫において、病原体は、生殖系列においてコードされる受容体によって認識される。これらのToll様受容体は、広い特異性を有し、多くの病原体を認識することができる。陽イオンペプチドが免疫応答に存在する場合、それらは病原体に対する宿主反応において役立つ。免疫応答におけるこの変化は、感染部位で免疫細胞の動員を促進するケモカインの放出を誘導する。
【００３１】
ケモカインまたは走化性サイトカインは、走化性および他の前炎症性現象を媒介する免疫因子の亜群である（Schall, 1991, Cytokine 3:165〜183を参照されたい）。ケモカインは、長さが約70〜80残基の低分子であり、一般的に二つのサブグループに分類され、αは一つのアミノ酸によって隔てられた二つのN-末端システインを有し（CxC）、βはN末端で隣接する二つのシステインを有する（CC）。RANTES、MIP-1α、およびMIP-1βは、βサブグループのメンバーである（Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci, 15:159〜165；Murphy, P,M., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12:593〜633によって論評）。βケモカインRANTES、MCP-1、およびMCP-3のアミノ末端は、これらのケモカインによって誘導される細胞遊走および炎症の媒介に関係している。この関与は、MCP-1のアミノ末端の8残基、MCP-3のアミノ末端の9残基、およびRANTESのアミノ末端の8残基の欠失、ならびにRANTESのアミノ末端のメチオニンの付加によって、その天然の相対物によって刺激された走化性、カルシウム動員、および／または酵素放出が拮抗されるという知見によって示唆される（Gongら、1996, J. Biol. Chem. 271:10521〜10527；Proudfootら、1996, J. Biol. Chem. 271:2599〜2603）。さらに、αケモカイン様走化性活性は、Tyr 28およびArg30のそれぞれロイシンおよびバリンへの二重変異によってMCP-1に導入されており、このタンパク質の内部領域もまた、走化性活性の調節において役割を有することを示している（Beallら、1992, J. Biol. Chem. 267:3455〜3459）。
【００３２】
これまで特徴付けされた全てのケモカインの単量体型は有意な構造的相同性を有するが、αおよびβ群の四次構造は異なる。βおよびαケモカインの単量体構造は非常に類似であるが、二つの群の二量体構造は完全に異なる。N末端システイン1個のみを有するさらなるケモカインであるリンフォタクチンも同様に同定されており、さらなるサブグループ（γ）のケモカインを表す可能性がある（Yoshidaら、1995, FEBS Lett. 360:155〜159；およびKelnerら、1994, Science 266:1395〜1399）。
【００３３】
ケモカインの受容体は大きいG-タンパク質共役7回膜貫通ドメイン受容体ファミリー（GCR's）に属する（Horuk, R., 1994, Trends Pharmacol. Sci, 15:159〜165；およびMurphy, P.M., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12:593〜633の論評を参照されたい）。競合的結合および交叉脱感作試験から、ケモカイン受容体がリガンド結合にかなりの乱雑性を示すことが示された。βケモカイン受容体における乱雑性を示す例には：RANTESおよびMIP-1αに結合するCC CKR-1（Neoteら、1993, Cell 72:415〜425）、RANTES、MIP-1α、およびMCP-1に結合するCC CKR-4（Powerら、1995, J. Biol. Chem. 270:19495〜19500）、ならびにRANTES、MIP-1α、およびMIP-1βに結合するCC CKR-5（Alkhatibら、1996, Science印刷中、およびDragicら、1996, Nature 381:667〜674）。赤血球は、αおよびβケモカインの双方に結合する受容体（Duffy抗原として知られる）を有する（Horukら、1994, J. Biol. Chem. 269:17730〜17733；Neoteら、1994, Blood 84:44〜52；およびNeoteら、1993, J. Biol. Chem. 268:12247〜12249）。このように、ケモカインおよびその受容体において明白な配列および構造的相同性により、受容体-リガンド相互作用において何らかのオーバーラップが許容される。
【００３４】
一つの局面において、本発明は、宿主細胞上で直接作用することによって敗血症および炎症反応を減少させるために本発明のペプチドを含む化合物を用いることを提供する。この局面において、調節が陽イオンペプチドによって変化する、一つまたは複数の敗血症または炎症誘導物質によって調節されるポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドの同定法が提供される。そのような敗血症または炎症誘導物質には、エンドトキシンリポ多糖類（LPS）、リポテイコ酸（LTA）、および／またはCpG DNAまたは無傷の細菌もしくは他の細菌成分が含まれるがこれらに限定されない。同定は、ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを敗血症または炎症誘導物質に接触させる段階、およびさらに陽イオンペプチドを同時または直後に接触させる段階によって行われる。陽イオンペプチドの存在下および非存在下におけるポリヌクレオチドの発現を観察して、発現が変化すれば、ポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドのパターンが、敗血症または炎症誘導物質によって調節され、陽イオンペプチドによって阻害されることを示している。もう一つの局面において、本発明は、方法によって同定されたポリヌクレオチドを提供する。
【００３５】
同定されると、そのようなポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼすことによって敗血症または炎症を遮断することができる化合物のスクリーニング法において有用となるであろう。そのような発現に及ぼす作用は、発現のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションであってもよい。敗血症反応を誘発しない、および炎症または敗血症反応を遮断または低下させることができる化合物を同定することによって、本発明はまた、先天性免疫の増強物質を同定する方法も紹介する。さらに、本発明は、上記の方法において用いられたまたは同定された化合物を提供する。
【００３６】
候補化合物は、合成または天然化合物のライブラリを含む多様な起源から得られる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、広範な有機化合物および生体分子のランダムおよび方向性合成のために多数の手段が利用可能である。または、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形での天然の化合物のライブラリが利用可能であり、容易に産生される。さらに、天然または合成によって産生されたライブラリおよび化合物は、通常の化学、物理、および生化学手段によって容易に改変され、組み合わせライブラリを産生するために用いてもよい。公知の薬理学的物質に、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の方向性またはランダム化学改変を行って、構造類似体を作製してもよい。候補物質はまた、ペプチド、ペプチド模倣体、糖質、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、化学化合物、誘導体、構造類似体またはその組み合わせが含まれるがこれらに限定されない生体分子においても認められる。
【００３７】
スクリーニングアッセイの成分をインキュベートする段階には、試験化合物と対象ポリヌクレオチドとを接触させる条件が含まれる。接触させる段階には、溶液および固相、または細胞内が含まれる。試験化合物は任意で、複数の化合物をスクリーニングするための組み合わせライブラリであてもよい。本発明の方法において同定された化合物はさらに、溶液中で、または固相支持体に結合させた後に、化合物の検出に通常適用される任意の方法によって、評価、検出、クローニング、シークエンシング等を行うことができる。
【００３８】
一般的に、本発明の方法において、陽イオンペプチドは、敗血症または炎症のプロセスにおいて必須であるポリヌクレオチドを検出および位置を特定するために利用される。同定されれば、陽イオンペプチドの存在下および非存在下での発現を観察することによって、ポリヌクレオチド発現パターンを得てもよい。陽イオンペプチドの存在下で得られたパターンは、ポリヌクレオチドの発現を阻害して、それによって敗血症または炎症を阻害することができるさらなる化合物を同定するために有用である。非ペプチド化学物質およびペプチド模倣体は、受容体および酵素結合部位に対するペプチドの結合能を模倣して、このように生体反応を遮断または刺激するために用いることができることは、当業者に周知である。さらなる対象化合物が陽イオンペプチドの存在下での発現のパターンと類似のポリヌクレオチド発現パターンを提供する場合、その化合物はまた、敗血症または先天性免疫応答の調節においても有用である。このように、公知の敗血症および炎症の阻害剤であって、先天性免疫の増強物質である本発明の陽イオンペプチドは、敗血症および炎症を阻害して、先天性免疫を増強するさらなる化合物を同定するためのツールとして有用である。
【００３９】
下記の実施例において認められうるように、本発明のペプチドは、LPSによって調節されるポリヌクレオチドの発現を広く減少させることができる。血液中の高レベルのエンドトキシンは、発熱および白血球数の増加のような重篤な感染症または炎症の際に認められる多くの症状に関与している。エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁成分であり、敗血症の病理生理学の強力な誘発物質である。炎症および敗血症の基礎となるメカニズムは関連している。実施例1において、ポリヌクレオチドアレイを利用して、上皮細胞の転写反応に及ぼす陽イオンペプチドの影響を決定した。詳しく述べると、LPSによって誘導された異なる特異的ポリヌクレオチドプローブ14,000個以上に対する作用を観察した。表は、対照細胞と比較してペプチドによって処置した細胞に関して認められた変化を示す。得られたデータは、ペプチドが、LPSによって誘導されたポリヌクレオチドの発現の減少能を有することを示した。
【００４０】
実施例2は同様に、本発明のペプチドがグラム陽性およびグラム陰性菌産物による免疫細胞の刺激を中和できることを示している。さらに、TLR1（AI339155）、TLR2（T57791）、TLR5（N41021）、TNF受容体関連因子2（T55353）、TNF受容体関連因子3（AA504259）、TNF受容体スーパーファミリーメンバー12（W71984）、TNF受容体スーパーファミリーメンバー17（AA987627）、低分子誘導型サイトカインサブファミリーBメンバー6（AI889554）、IL-12Rβ2（AA977194）、IL-18受容体1（AA482489）のような、表24に記載されるような特定の前炎症性ポリヌクレオチドが、陽イオンペプチドによってダウンレギュレートされるが、IL-1 Rアンタゴニスト相同体1（AI167887）、IL-10 Rβ（AA486393）、TNF受容体メンバー1B（AA150416）、TNF受容体メンバー5（H98636）、TNF受容体メンバー11b（AA194983）、HLA IIのIKサイトカインダウンレギュレーター（R39227）、TGF-B誘導型初期増殖反応2（AI473938）、またはCD2（AA927710）のような表25において認められる抗炎症性ポリヌクレオチドは、陽イオンペプチドによってアップレギュレートされることが認められる。これらの結果の関係および応用は、マウスにインビボで適用することによって確認される。
【００４１】
もう一つの局面において、本発明は、先天性免疫を増強する物質を同定する方法を提供する。方法において、先天性免疫に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを対象物質に接触させる。ポリヌクレオチドの発現を、物質の存在下および非存在下の双方において決定する。発現を比較して、発現が特異的に調節されれば、先天性免疫の増強が示された。もう一つの局面において、物質は、前炎症性サイトカインTNF-αのアップレギュレーションの欠如によって示されるように敗血症反応を刺激しない。さらにもう一つの局面において、物質は、炎症または敗血症反応を減少または遮断する。さらにもう一つの局面において、物質は、TNF-αおよび／またはIL-1β、IL-6、IL-12 p40、IL-12 p70、およびIL-8が含まれるがこれらに限定されないインターロイキンの発現を減少させる。
【００４２】
もう一つの局面において、本発明は、陽イオンペプチドによる直接のポリヌクレオチドの調節法、および先天性免疫の要素を刺激するために陽イオンペプチドを含む化合物を用いることを提供する。この局面において、本発明は、先天性免疫を増強する化合物を同定するためにポリヌクレオチド発現パターンの同定法を提供する。本発明の方法において、陽イオンペプチドの存在下および非存在下で接触させた細胞に関してポリヌクレオチド発現パターンの初回検出を行う。ペプチドの存在下でポリヌクレオチド発現に起因するパターンが得られれば、先天性免疫が刺激されたことを表す。ポリヌクレオチド発現パターンを、試験化合物の存在下で検出し、試験化合物によって得られたパターンが陽イオンペプチドの存在下で認められたパターンと類似であれば、先天性免疫を増強する化合物であることが示される。もう一つの局面において、本発明は、上記の方法によって同定された化合物を提供する。もう一つの局面において、本発明の化合物は、ケモカインまたはケモカイン受容体発現を刺激する。ケモカインまたはケモカイン受容体には、CXCR4、CXCR1、CXCR2、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、MIP-1α、MDC、MIP-3α、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5およびRANTESが含まれてもよいがこれらに限定されない。さらにもう一つの局面において、化合物はペプチド、ペプチド模倣体、化学化合物、または核酸分子である。
【００４３】
さらにもう一つの局面において、ポリヌクレオチド発現パターンには、前炎症性ポリヌクレオチドの発現が含まれる。そのような前炎症性ポリヌクレオチドには、リングフィンガータンパク質10（D87451）、セリン／トレオニンタンパク質キナーゼMASK（AB040057）、KIAA0912タンパク質（AB020719）、KIAA0239タンパク質（D87076）、RAP1、GTPアーゼ活性化タンパク質1（M64788）、FEM-1様デスレセプター結合タンパク質（AB007856）、カテプシンS（M90696）、仮説上のタンパク質FLJ20308（AK000315）、pim-1腫瘍遺伝子（M549195）、プロテアソームサブユニットβ5型（D29011）、KIAA0239タンパク質（D87076）、ムチン5サブタイプB気管気管支（AJ001403）、cAMP反応要素結合タンパク質CREBPa、インテグリンαM（J03925）、Rho-関連キナーゼ2（NM_004850）、PTD017タンパク質（AL050361）、未知遺伝子（AK001143、AK034348、AL049250、AL16199、AL031983）、およびその任意の組み合わせが含まれてもよいがこれらに限定されない。さらにもう一つの局面において、ポリヌクレオチド発現パターンには、レチン酸受容体（X06614）、G-タンパク質共役受容体（Z94155、X81892、U52219、U22491、AF015257、U66579）、ケモカイン（C-Cモチーフ）受容体7（L31584）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17（Z29575）、インターフェロンγ受容体-2（U05875）、サイトカイン受容体様因子1（AF059293）、クラスIサイトカイン受容体（AF053004）、凝固因子II（トロンビン）受容体様2（U92971）、白血病阻害因子受容体（NM_002310）、インターフェロンγ受容体1（AL050337）が含まれてもよいがこれらに限定されない細胞表面受容体の発現が含まれる。
【００４４】
実施例4において、本発明の陽イオンペプチドは、マクロファージおよび上皮細胞におけるポリヌクレオチド発現を変化させることが認められうる。本実施例の結果は、前炎症性ポリヌクレオチドは陽イオンペプチドによってダウンレギュレートされるが（表24）、抗炎症性ポリヌクレオチドは陽イオンペプチドによってアップレギュレートされること（表25）を示している。
【００４５】
例えば、陽イオンペプチドは、主に前炎症性反応をダウンレギュレートすることによって、および／または抗炎症反応をアップレギュレートすることによって、感染因子のシグナル伝達分子に対する宿主細胞を中和することができることが下記の表1〜15に示される。実施例5は、陽イオンペプチドが、感染部位への免疫細胞の動員を促進するケモカインの放出を誘導することによって、病原体に対する宿主反応において役立ちうることを示している。結果はマウスへのインビボ応用によって確認される。
【００４６】
下記の実施例から、陽イオンペプチドは、例えば感染部位への免疫細胞の動員を促進するがおそらく有害な前炎症性サイトカインを誘導しない選択的前炎症反応を誘導することによって、宿主免疫応答の調節を補助するという点において、病原体に対する宿主反応に実質的な影響を及ぼすことが認められる。敗血症は、感染因子に対する圧倒的な前炎症性反応によって一部引き起こされるように思われる。陽イオンペプチドは、抗炎症反応を誘導して、そしておそらく有害な特定の前炎症性反応を抑制することによって、病原体に対して「バランスのとれた」反応をするように宿主を助ける。
【００４７】
実施例7において、陽イオンペプチドと細胞との相互作用の影響の背後にある基礎的メカニズムを調べるために、選択したMAPキナーゼの活性化を調べた。マクロファージは、細菌感染症に反応してMEK/ERKキナーゼを活性化する。MEKは、活性化されると下流のキナーゼERK（細胞外調節キナーゼ）をリン酸化して、次にこれが二量体を形成して核に転移し、そこでElk-1のような転写因子を活性化して、ポリヌクレオチド発現を改変するMAPキナーゼキナーゼである。MEK/ERKキナーゼは、マクロファージにおいて、サルモネラ（Salmonella）の複製を障害することが示されている。MEKキナーゼおよびNADPHオキシダーゼによるシグナル伝達は、細胞内病原体に対する先天性の宿主防御において重要な役割を有する可能性がある。下記に示すように、MAPキナーゼに影響を及ぼすことによって、陽イオンペプチドは細菌感染症に対して効果を有する。陽イオンペプチドは、キナーゼに直接影響を及ぼしうる。表21は、ペプチドに反応したMAPキナーゼポリヌクレオチド発現の変化を示すが、これに限定されない。キナーゼには、MAPキナーゼキナーゼ6（H070920）、MAPキナーゼキナーゼ5（W69649）、MAPキナーゼ7（H39192）、MAPキナーゼ12（AI936909）、およびMAPキナーゼ活性化タンパク質キナーゼ3（W68281）が含まれる。
【００４８】
もう一つの方法において、本発明の方法は、多数の特徴を有する物質を同定するために、すなわち抗炎症活性／抗敗血症活性を有する、および部分的にインビボでケモカインを誘導することによって先天性免疫の増強能を有するペプチドを同定するために、併用して用いてもよい。
【００４９】
もう一つの局面において、本発明は、非感染被験者と比較して表55における少なくとも二つのポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現の増加によって示されるポリヌクレオチド発現パターンを核酸試料において同定することによって、被験者の核酸試料から哺乳類被験者における感染状態を推論する方法を提供する。もう一つの局面において、本発明は、非感染被験者と比較して表56または表57における少なくとも二つのポリヌクレオチドのポリヌクレオチド発現によって例示されるポリヌクレオチド発現パターンを核酸試料において同定することによって、被験者の核酸試料から哺乳類被験者における感染状態を推論する方法を提供する。本発明の一つの局面において、感染状態は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌、ウイルス、真菌、または寄生因子のような、しかしこれらに限定されない感染因子またはそれに由来するシグナル伝達分子が原因である。さらにもう一つの局面において、本発明は、上記の方法によって同定された感染状態を有する被験者のポリヌクレオチド発現パターンを提供する。同定されると、そのようなポリヌクレオチドは、そのような感染因子またはシグナル伝達分子の活性または存在に関連した疾患の診断法において有用となるであろう。
【００５０】
下記の実施例10は、本発明のこの局面を証明する。詳しく述べると、表61は、MEKおよびNADPHオキシダーゼ阻害剤がいずれも、細菌の複製を制限できることを証明している（IFN-γプライミングマクロファージをネズミチフス菌（S. typhimurium）に感染させるとMEKキナーゼを誘発する）。これは、宿主細胞シグナル伝達分子を変化させることによって、細菌の生存がどのように影響を受けうるかの例である。
【００５１】
本発明のなおもう一つの局面において、間質由来因子-1（SDF-1）によるT細胞の走化性を阻害する化合物が示される。SDF-1受容体の発現を減少させる化合物も同様に示される。そのような化合物はまた、CXCR-4のアンタゴニストまたは阻害剤として作用する可能性がある。一つの局面において、本発明は、CXCR-4のアンタゴニストである陽イオンペプチドを提供する。もう一つの局面において、本発明は、CXCR-4のアンタゴニストである陽イオンペプチドを同定する方法を提供する。方法には、試験ペプチドの存在下または非存在下においてT細胞をSDF-1に接触させる段階、および走化性を測定する段階が含まれる。試験ペプチドの存在下で走化性が減少すれば、ペプチドがCXCR-4のアンタゴニストであることを示している。そのような化合物および方法は、HIV患者における治療応用において有用である。これらのタイプの化合物およびその利用は、例えば実施例11において示される（表62、63も同様に参照されたい）。その実施例において、陽イオンペプチドは、細胞の遊走を阻害してそれによって抗ウイルス活性を示すことが示される。
【００５２】
一つの態様において、本発明は、以下の一般式（式A）のアミノ酸配列を有する単離陽イオンペプチドを提供する：
X1がR、L、またはKの一つまたは二つであって、X2がC、S、またはAの一つであって、X3がRまたはPの一つであって、X4がAまたはVの一つであって、およびX5がVまたはWの一つである、
2007505048.tif 000012
。本発明のペプチドの例には、
2007505048.tif 000013
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５３】
もう一つの態様において、本発明は、以下の一般式（式B）のアミノ酸配列を有する単離直線状陽イオンペプチドを提供する：
X1がD、E、S、TまたはNの一つまたは二つであって、X2がP、G、またはDの一つまたは二つであって、X3がG、A、V、L、I、またはYの一つであって、X4がR、K、またはHの一つであって、およびX5がS、T、C、M、またはRの一つである、
2007505048.tif 000014
。本発明のペプチドの例には、
2007505048.tif 000015
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５４】
もう一つの態様において、本発明は、以下の一般式（式C）のアミノ酸配列を有する単離直線状陽イオンペプチドを提供する：
X1がA、P、またはRから選択される一つから四つであって、X2が一つまたは二つの芳香族アミノ酸（F、Y、およびW）であって、X3がPまたはKの一つであって、X4がA、P、Y、またはWから選択される一つ、二つ、またはなしであて、およびX5がRまたはPから選択される一つから三つである、
2007505048.tif 000016
。本発明のペプチドの例には、
2007505048.tif 000017
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５５】
もう一つの態様において、本発明は、以下の一般式（式D）のアミノ酸配列を有する単離十六量体陽イオンペプチドを提供する：
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸（S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH）であって、X3がC、S、M、D、またはAであって、およびX4がF、I、V、M、またはRである、
2007505048.tif 000018
。本発明のペプチドの例には、
2007505048.tif 000019
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５６】
さらにもう一つの態様において、本発明は、以下の一般式（式E）のアミノ酸配列を有する単離十六量体陽イオンペプチドを提供する：
X1がRまたはKの一つまたは二つであって、X2が極性または荷電アミノ酸（S、T、M、N、Q、D、E、K、R、およびH）であって、X3がC、S、M、D、またはAの一つであって、X4がF、I、V、M、またはRの一つであって、およびX5がA、I、S、M、D、またはRの一つである、
2007505048.tif 000020
。本発明のペプチドの例には、
2007505048.tif 000021
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５７】
もう一つの態様において、本発明は、以下の一般式（式F）のアミノ酸配列を有する単離されたより長い陽イオンペプチドを提供する：
X1が極性アミノ酸（C、S、T、M、N、およびQ）であって、X2がA、L、S、またはKの一つであって、およびX3がG、A、V、L、I、P、F、S、T、K、およびHから選択される1〜17個のアミノ酸である、
2007505048.tif 000022
。本発明のペプチドの例には、
2007505048.tif 000023
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５８】
さらにもう一つの態様において、本発明は、以下の一般式（式G）のアミノ酸配列を有する単離されたより長い陽イオンペプチドを提供する：
X1が疎水性アミノ酸であって、X2が親水性アミノ酸である、
2007505048.tif 000024
。本発明のペプチドの例には、
2007505048.tif 000025
が含まれるがこれらに限定されない。
【００５９】
さらに、もう一つの態様において、本発明は以下の式のアミノ酸配列を有する単離陽イオンペプチドを提供する：
2007505048.tif 000026
【００６０】
本明細書において用いられるように「単離された」という用語は、他のタンパク質、脂質、および核酸（例えば、インビボで産生されたペプチドが本来関連するであろう細胞成分）を実質的に含まないペプチドを指す。好ましくは、ペプチドは重量で少なくとも70％、80％、または最も好ましくは90％純粋である。
【００６１】
本発明にはまた、類似体、誘導体、保存的変種、または変異体が、それが先天性免疫を増強する検出可能な活性を有する、または抗炎症活性を有する限り、列挙されたポリペプチドの類似体、誘導体、保存的変種、および陽イオンペプチド変異体が含まれる。類似体、誘導体、変種、または変異体は、必ずしも類似体、誘導体、保存的変種、または変異体が由来するペプチドの活性と同一な活性を有する必要はない。
【００６２】
陽イオンペプチド「変異体」は、参照される陽イオンペプチドの変化形であるペプチドである。例えば、「変異体」という用語には、参照ペプチドの少なくとも一つのアミノ酸が発現ライブラリにおいて置換されている陽イオンペプチドが含まれる。「参照」ペプチドという用語は、そこから変異体、誘導体、類似体、または保存的変種が由来する本発明の任意の陽イオンペプチド（例えば、上記の式において定義される）を意味する。二つの陽イオンペプチドのそれぞれの少なくとも一部（例えば、二つの陽イオンペプチドのそれぞれの30〜80％）を含むハイブリッドペプチドは、「誘導体」という用語に含まれる。同様に、誘導体が先天性免疫を増強する活性を有する、または抗炎症活性を有する限り、本明細書において列挙したペプチドの配列から一つまたは複数のアミノ酸が欠失しているペプチドも含まれる。これによって、同様に有用性を有するであろうより小さい活性分子を開発することができる。例えば、先天性免疫またはペプチドの抗炎症活性を増強するために必要ではない可能性があるアミノまたはカルボキシ末端アミノ酸を、除去することができる。同様に、ペプチドの活性を完全に阻害することなく、一つまたは少数（例えば、5個未満）のアミノ酸を陽イオンペプチドに付加することによって、さらなる誘導体を産生することができる。さらに、C-末端誘導体、例えばC-末端メチルエステルおよびN-末端誘導体を産生することができ、これらも本発明に含まれる。本発明のペプチドには、本明細書に記述の生物活性が残っている限り、本発明において開示されたペプチドの任意の類似体、相同体、変異体、異性体、または誘導体が含まれる。同様に、上記の一般式によって含まれるペプチドの逆配列もまた含まれる。さらに、「D」コンフィギュレーションのアミノ酸を、「L」コンフィギュレーションのアミノ酸の代わりに用いてもよく、その逆でもよい。または、ペプチドは化学的に環状化してもよく、または配列内での二つまたはそれ以上のシステイン残基の付加、および酸化によってジスルフィド結合を形成してもよい。
【００６３】
本発明にはまた、本明細書に例示のペプチドの保存的変種であるペプチドが含まれる。本明細書において用いられる「保存的変種」という用語は、少なくとも一つのアミノ酸がもう一つの生物学的に類似の残基に置換されるポリペプチドを指す。保存的変種の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン、またはメチオニンのような一つの疎水性残基をもう一つの疎水性残基の代わりに用いること、またはリジンをアルギニンに置換、アスパラギン酸をグルタミン酸に、またはアスパラギンをグルタミンに置換することのような、一つの極性残基をもう一つの残基に置換することが含まれる。互いに置換することができる中性疎水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、およびトレオニンが含まれる。「保存的変種」という用語はまた、非置換の親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を有するペプチドを含む。そのような置換アミノ酸には、メチル化またはアミド化されているアミノ酸が含まれてもよい。他の置換は、当業者に公知であろう。一つの局面において、置換されたポリペプチドに対する抗体はまた、非置換ポリペプチドに特異的に結合するであろう。
【００６４】
本発明のペプチドは、αアミノ基のt-BOCまたはFMOC保護を含む方法のような、一般的に用いられる方法によって合成することができる。いずれの方法も、ペプチドのC-末端から始めてアミノ酸1個が各段階で付加される段階的合成を含む（Coliganら、「Current Protocols in Immunology」, Wiley Interscience,1991, Unit 9を参照されたい）。本発明のペプチドはまた、0.1〜1.0 mMアミン/gポリマーを含むコポリ(スチレン-ジビニルベンゼン)を用いて、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1962およびStewart and Young, 「Solid Phase Peptides Synthesis」, Freeman, SanFrancisco, 1969, pp.27〜62に記載される方法のような、周知の固相ペプチド合成法によって合成することができる。化学合成の終了時、ペプチドを脱保護して、液体HF-10％アニソールによる0℃で約1/4〜1時間の処置によってポリマーから切断することができる。試薬を蒸発させた後、ペプチドを1％酢酸溶液によってポリマーから抽出して、その後凍結乾燥すると粗材料が得られる。ペプチドは、溶媒として5％酢酸を用いて、セファデックスG-15でのゲル濾過のような技術によって精製することができる。カラム溶出液の適当な分画を凍結乾燥すると、均一なペプチドが得られ、これを、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収分光法、モル旋光度、または溶解度の測定のような標準的な技術によって特徴を調べることができる。望ましければ、ペプチドは固相エドマン分解によって定量することができる。
【００６５】
本発明にはまた、本発明のペプチドをコードする単離された核酸（例えば、DNA、cDNA、またはRNA）が含まれる。本明細書に記述のペプチドの類似体、変異体、保存的変種、および変異体をコードする核酸が含まれる。本明細書において用いられる「単離された」という用語は、インビボで産生された核酸が本来会合するタンパク質、脂質、および他の核酸を実質的に含まない核酸を指す。好ましくは、核酸は、重量で少なくとも70％、80％、または好ましくは90％純粋であり、インビトロで核酸を合成する通常の方法を、インビボ法の代わりに用いることができる。本明細書において用いられるように、「核酸」は、異なる断片の形で、またはより大きい遺伝子構築物の成分としてのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す（例えば、本発明のペプチドをコードする核酸にプロモーターを機能的に連結させることによって）。多数の遺伝子構築物（例えば、プラスミドおよび他の発現ベクター）が当技術分野で公知であって、無細胞系または原核細胞もしくは真核細胞（例えば、酵母、昆虫、または哺乳類）細胞において本発明のペプチドを産生するために用いることができる。遺伝子コードの縮重を考慮に入れることによって、当業者は本発明のポリペプチドをコードする核酸を容易に合成することができる。本発明の核酸は、本発明のペプチドを産生するために、通常の分子生物学的方法において容易に用いることができる。
【００６６】
本発明の陽イオンペプチドをコードするDNAを、「発現ベクター」に挿入することができる。「発現ベクター」という用語は、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含むように操作することができる当技術分野で公知のプラスミド、ウイルス、または他の媒体のような遺伝子構築物を指す。そのような発現ベクターは、好ましくは宿主細胞において挿入された遺伝子配列の転写を促進するプロモーター配列を含むプラスミドである。発現ベクターは典型的に、複製開始点、およびプロモーターと共に、形質転換細胞の表現型選択を可能にするポリヌクレオチド（例えば、抗生物質耐性ポリヌクレオチド）を含む。誘導型および構成的プロモーターを含む様々なプロモーターを本発明において利用することができる。典型的に、発現ベクターは、レプリコン部位および宿主細胞と適合する種に由来する制御配列を含む。
【００６７】
本発明の核酸によるレシピエントの形質転換またはトランスフェクションは、当業者に周知の通常の技術を用いて行うことができる。例えば、宿主細胞が大腸菌である場合、当技術分野で公知のCaCl2、MgCl2、またはRbCl法を用いて、DNA取り込みを行うことができるコンピテント細胞を調製することができる。または、電気穿孔またはマイクロインジェクションのような物理的手段を用いることができる。電気穿孔は高圧の電気的衝撃によって細胞に核酸を移入させる。さらに、当技術分野で周知の方法を用いて、核酸をプロトプラスト融合によって宿主細胞に導入することができる。電気穿孔およびリポフェクションのような真核細胞を形質転換するために適した方法も同様に公知である。
【００６８】
本発明に含まれる「宿主細胞」または「レシピエント細胞」は、本発明の核酸を用いて本発明のポリペプチドを発現させることができる任意の細胞である。この用語にはまた、レシピエントまたは宿主細胞の任意の子孫が含まれる。本発明の好ましいレシピエントまたは宿主細胞には、大腸菌、黄色ブドウ球菌、および緑膿菌（P. aeruginosa）が含まれるが、発現ベクターが宿主における発現を許容する複製開始点を含む限り、他のグラム陰性およびグラム陽性菌、真菌および哺乳類細胞ならびに当技術分野で公知の生物を利用することができる。
【００６９】
本発明の方法に従って用いられる陽イオンペプチドポリヌクレオチド配列は、生物から単離する、または研究室において合成することができる。対象陽イオンペプチドをコードする特異的DNA配列は、1）ゲノムDNAからの二本鎖DNA配列の単離；2）対象陽イオンペプチドにとって必要なコドンを提供するためのDNA配列の化学合成；および3）ドナー細胞から単離したmRNAの逆転写による二本鎖DNA配列のインビトロ合成、によって得ることができる。後者の場合、一般的にcDNAと呼ばれるmRNAの二本鎖DNA相補体が最終的に形成される。
【００７０】
DNA配列の合成は、所望のペプチド産物のアミノ酸残基の完全な配列が公知である場合にしばしば選択される方法である。本発明において、DNA配列の合成は、細菌宿主によってより認識される可能性が高いコドンを組み入れることができ、それによって翻訳の際に楽々と高レベル発現を得ることができるという長所を有する。さらに、天然の陽イオンペプチド、その変異体、または合成ペプチドをコードするものを含む、実質的に如何なるペプチドも合成することができる。
【００７１】
所望のペプチドの完全な配列がわかっていない場合、DNA配列の直接合成は可能ではなく、選択される方法は、cDNA配列の形成である。対象cDNA配列を単離するための標準的な技法は、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞において豊富に存在するmRNAの逆転写に由来するcDNAライブラリを含むプラスミドまたはファージの形成である。ポリメラーゼ連鎖反応技術と併用して用いると、非常にまれな発現産物でさえもクローニングすることができる。陽イオンペプチドのアミノ酸配列の有意な部分が公知である場合、標的cDNAにおいて仮に存在する配列を複製する標識された一本鎖または二本鎖DNAまたはRNAプローブ配列の産生を、一本鎖型に変性されているcDNAのクローニングされたコピーに関して行われるDNA/DNAハイブリダイゼーション技法において用いてもよい（Jayら、Nuc. Acid Res. 11:2325, 1983）。
【００７２】
本発明のペプチドは、注射または時間をかけて注入によって非経口投与することができる。好ましくは、ペプチドは、先天性免疫応答を増強または刺激するために治療的に有効量で投与される。先天性免疫は本明細書において記述されているが、先天性免疫の刺激の指標の例には、単球の活性化、増殖、分化、またはMAPキナーゼ経路の活性化が含まれるがこれらに限定されない。
【００７３】
ペプチドは静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮投与することができる。好ましいペプチドの送達法には、ミクロスフェアまたはプロテノイドへの封入、肺へのエアロゾル送達による経口送達、またはイオントフォレシスもしくは経皮電気穿孔による経皮送達が含まれる。他の投与法は当業者に公知であろう。
【００７４】
本発明のペプチドの非経口投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳剤が含まれる。非水性溶媒の例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩液および緩衝培地を含む、水、アルコール／水溶液、乳液、または懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内溶媒には、液体および栄養補給液、電解質補給液（リンゲルデキストロースに基づく液のような）等が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等のような保存剤および他の添加剤も同様に存在してもよい。
【００７５】
一つの態様において、本発明は、相乗的治療法を提供する。例えば、本明細書に記述のペプチドは、抗生物質の阻害下濃度との相乗的併用において用いることができる。本発明のペプチドによる相乗治療にとって有用な特定のクラスの抗生物質の例には、アミノグリコシド（例えば、トブラマイシン）、ペニシリン（例えば、ピペラシリン）、セファロスポリン（例えば、セフタジジム）、フルオロキノロン（例えば、シプロフロキサシン）、カルバペネム（例えば、イミペネム）、テトラサイクリンおよびマクロライド（例えば、エリスロマイシンおよびクラリスロマイシン）が含まれる。先に記述した抗生物質の他に、典型的な抗生物質には、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルマイシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート／エチルスクシネート／グルセプテート／ラクトバイオネート／ステアレート）、ペニシリンのようなβ-ラクタム（例えば、ペニリシンG、ペニシリンV、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリンおよびピペラシリン）、またはセファロスポリン（例えば、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメット、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキシム、およびセフスロジン）が含まれる。他のクラスの抗生物質には、例えば、カルバペネム（例えば、イミペネム）、モノバクタム（例えば、アズトレオナム）、キノロン（例えば、フレロキサシン、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシンおよびシノキサシン）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン）、およびグリコペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン）が含まれる。他の抗生物質には、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、ムピロシン、および陽イオンペプチドが含まれる。
【００７６】
ペプチドの有効性は、感染モデルにおいて、単独でおよび最適下濃度の抗生物質と併用して評価した。黄色ブドウ球菌は重要なグラム陽性病原体であり、抗生物質耐性感染症の主な原因である。簡単に説明すると、ペプチドを、それらを単独および最適下用量の抗生物質と併用して感染発症後6時間目に注射することによって、黄色ブドウ球菌感染モデルにおいて治療有効性に関して試験した。これは、耐性菌のMICは治療が成功するためには高すぎるように（すなわち、適用した抗生物質の用量は最適下であった）、感染の際に起こる抗生物質耐性の状況を模倣するであろう。抗生物質およびペプチドの併用は有効性の改善を示すことが証明され、併用治療の可能性を示唆している（実施例12を参照されたい）。
【００７７】
本発明は、以下の非制限的な実施例を参照してより詳細に記述する。本発明は、その特定の好ましい態様を参照して詳細に記述してきたが、改変および変更は、記述され、請求される本発明の趣旨および範囲に含まれると理解されるであろう。
【００７８】
実施例1
抗敗血症／抗炎症活性
ポリヌクレオチドアレイを利用して、上皮細胞の転写反応に及ぼす陽イオンペプチドの影響を決定した。A549ヒト上皮細胞株を、10％ウシ胎児血清（FBS、Medicorp）を添加したDMEM（Gibco）において維持した。A549細胞を100 mm組織培養皿に2.5×106個/皿で播種して、一晩培養した後、50 μg/mlペプチドの存在下または非存在下で100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPS（Sigma）と共に、または培地単独で4時間インキュベートした。刺激後、細胞をジエチルピロカーボネート処置リン酸緩衝生理食塩液（PBS）によって1回洗浄して、セルスクレイパーを用いて皿から剥離させた。RNAqueous（Ambion, Austin, TX）を用いて総RNAを単離した。RNA沈降物を、Superase-In（RNアーゼ阻害剤；Ambion）を含むRNアーゼを含まない水に浮遊させた。DNAの混入は、DNA-freeキット（Ambion）によって除去した。RNAの質を1％アガロースゲルにおけるゲル電気泳動によって評価した。
【００７９】
用いたポリヌクレオチドアレイは、Human Operonアレイ（ゲノムの識別番号はPRHU04-S1である）であり、これは1試料あたり2個ずつスポットしたヒトオリゴ約14,000個からなる。総RNA 10 μgからプローブを調製して、Cy3またはCy5標識dUTPによって標識した。プローブを精製して、押印されたスライドガラスに42℃で一晩ハイブリダイズさせて、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナを用いて画像を獲得した。画像処理ソフトウェア（Imapolynucleotide 5.0, Marina Del Rey, CA）は、スポットの平均強度、強度の中間値、およびバックグラウンド強度を決定する。「施設内」プログラムを用いてバックグラウンドを除去した。プログラムは各サブグリッドに関して最低の10％強度を計算し、各グリッドに関してこれを差し引く。分析は、Genespringソフトウェア（Redwood City, CA）によって行った。各スポットの強度は、スライドガラス内のスポット値の集団から、中央値スポット強度を得て、この値を実験における全てのスライドガラスの値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較して、ペプチドを処置した細胞において認められた相対的変化は、表1および2において認められうる。これらの表2は、発現の変化に関して試験したポリヌクレオチド14,000個の発現に有意な変化を示したポリヌクレオチドのみを反映している。データはペプチドが、LPSによって誘導されたポリヌクレオチドの発現の広範な減少能を有することを示している。
【００８０】
表1において、ペプチド、SEQ ID NO:27は、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べると、大腸菌O111:B4 LPSによってアップレギュレートされたポリヌクレオチドの多くの発現を強力に減少させることが示される。ペプチド（50 μg/ml）およびLPS（0.1μg/ml）、またはLPS単独をA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製して、Human Operonアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。非刺激細胞の強度を、表1の第三の列に示す。「比：LPS/対照」は、非刺激細胞の強度によって除したLPS刺激細胞のポリヌクレオチド発現強度を指す。「比：LPS＋ID 27/対照」の列は、非刺激細胞によって除した、LPSおよびペプチドによって刺激した細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
【００８１】
（表１）大腸菌O111:B4 LPSによってアップレギュレートされたA549ヒト上皮細胞ポリヌクレオチド発現のペプチドSEQ ID NO:27による減少
2007505048.tif 000027
2007505048.tif 000028
2007505048.tif 000029
2007505048.tif 000030
2007505048.tif 000031
2007505048.tif 000032
2007505048.tif 000033
2007505048.tif 000034
2007505048.tif 000035
a表1〜表64までのアクセッション番号は、全てGenBankアクセッション番号を指す。
【００８２】
表2において、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べたところ、濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSによってアップレギュレートされたポリヌクレオチドの多くの発現を強力に減少させることが示された。ペプチドおよびLPSまたはLPS単独をA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製して、Human Operonアレイ（RRHU04）にハイブリダイズした。非刺激細胞の強度を表2の三番目の列に示す。「比：LPS/対照」列は、非刺激細胞の強度で除したLPS刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現の強度を指す。他の列は、非刺激細胞によって除したLPSおよびペプチドによって刺激した細胞におけるポリヌクレオチド発現の強度を指す。
【００８３】
（表２）大腸菌O111:B4 LPSによってアップレギュレートされ、陽イオンペプチドによって減少するヒトA549上皮細胞ポリヌクレオチド発現
2007505048.tif 000036
2007505048.tif 000037
2007505048.tif 000038
【００８４】
実施例2
免疫細胞の刺激の中和
化合物が、グラム陰性およびグラム陽性菌双方の産物による免疫細胞の刺激を中和できるか否かを調べた。細菌産物は、免疫系の細胞を刺激して、炎症性サイトカインを産生し、これが抑制されなければ敗血症が起こりうる。最初の実験は、American Type Culture Collection（Manassas, VA）から得たマウスマクロファージ細胞株RAW 264.7、ヒト上皮細胞株A549、およびBALB/cマウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）の骨髄に由来する骨髄初代培養マクロファージを利用した。マウス骨髄からの細胞を、20％FBS（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）およびM-CSF源として20％L-細胞条件培地を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM；Life Technologies, Burlington, ON）において150 mmプレートにおいて培養した。マクロファージが60〜80％コンフルエントとなった後、それらをL細胞条件培地を14〜16時間枯渇して、細胞を静止期に入らせて、100 ng/ml LPSまたは100 ng/ml LPS＋20 μg/mlペプチドによって24時間処置した。培養上清へのサイトカインの放出を、ELISA（R&D Systems, Minneapolis, MN）によって決定した。細胞株RAW 264.7およびA549は、10％仔ウシ胎児血清を添加したDMEMにおいて維持した。RAW264.7細胞を24ウェルプレートにDMEMにおいて106個/ウェルの密度で播種して、A549細胞を24ウェルプレートにおいてDMEMにおいて105個/ウェルの密度で播種して、いずれも5％CO2において37℃で一晩インキュベートした。一晩増殖させた細胞からDMEMを吸引して、新鮮な培地を加えた。いくつかの実験において、ボランティアヒトドナーからの血液を静脈穿刺によって14.3 USP単位ヘパリン/ml血液を含むチューブ（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）に採取した（UBC 臨床研究倫理委員会、証明書C00-0537によって承認された手順に従って）。血液を、ポリプロピレンチューブにおいてペプチドの存在下または非存在下でLPSと37℃で6時間混合した。試料を2000×gで5分間遠心して、血漿を採取した後、ELISA（R&D Systems）によってIL-8に関して分析するまで-20℃で保存した。細胞を用いる実験では、LPSまたは他の細菌産物を37℃、5％CO2において細胞と共に6〜24時間インキュベートした。ネズミチフス菌LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSをSigmaから購入した。黄色ブドウ球菌からのリポテイコ酸（LTA）（Sigma）を無エンドトキシン水（Sigma）に浮遊させた。LTA調製物に関してリムラス・アメーバ溶解物アッセイ（Sigma）を行って、ロットがエンドトキシンによって有意に汚染されていないことを確認した。エンドトキシンの混入は1 ng/ml未満であり、この濃度はRAW 264.7細胞において有意なサイトカイン産生を引き起こさなかった。非キャップリポアラビノマンナン（AraLAM）はJohn T博士、Belisle of Colorado State Universityからの寄贈であった。マイコバクテリウムからのAraLAMを濾過滅菌して、エンドトキシンの混入は、リムラス・アメーバアッセイによって決定したところ、LAM 1.0 mgあたり3.75 ngであることが判明した。LPSの添加と同時に（または特に記述されている場合には後に）陽イオンペプチドを濃度範囲で加えた。上清を回収してELISA（R&D Systems）によってサイトカイン産生に関して試験した。アッセイは全て、少なくとも3回行い、類似の結果を得た。抗敗血症活性をインビボで確認するために、ガラクトサミンによって感作した8〜10週齢の雌性CD-1またはBALB/cマウスに、リン酸緩衝生理食塩液（PBS；pH 7.2）において大腸菌O111:B4 LPS 2または3μgを腹腔内���射することによって敗血症を誘導した。ペプチドを含む実験において、滅菌水100 μl中に200μgを、LPS注射の10分以内に異なる腹腔部位に注射した。他の実験において、CD-1マウスに大腸菌O111:B4 LPS 400 μgを注射して、10分後にペプチド（200 μg）を腹腔内注射によって導入した。生存を注射後48時間モニターした。
【００８５】
TNF-αの過剰産生は、古典的に敗血症の発生に関連している。本実施例において用いた三つのタイプのLPS、LTA、またはAraLAMは、グラム陰性およびグラム陽性菌の双方によって放出された産物を示した。SEQ ID NO:1のペプチドは、ネズミチフス菌、B.セパシア（B. cepacia）および大腸菌O111:B4 LPSによって刺激されたTNF-αの産生を有意に減少させることができたが、前者はいくぶん罹患の程度は弱かった（表3）。後者の二例では、1 μg/mlもの低い濃度のペプチド（0.25 nM）で、TNF-α産生の実質的な減少が認められた。異なるペプチド、SEQ ID NO:3は、RAWマクロファージ細胞においてLPSによるTNF-αの産生を減少させず、これは陽イオンペプチドに関して均一で予測可能な特性ではないことを示している。それぞれの式の代表的なペプチドを同様に、大腸菌O111:B4 LPSによって刺激されたTNF-αの産生に影響を及ぼすことができるか否かに関して調べた（表4）。ペプチドは多様にTNF-αの産生を減少させることができたが、それらの多くはTNF-αの産生を少なくとも60％低下させた。
【００８６】
SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:2は、特定の濃度では上皮細胞株による細菌産物のIL-8産生の刺激能を低下させることができるであろう。LPSは、上皮細胞によるIL-8産生の公知の強力な刺激である。低濃度（1〜20 μg/ml）のペプチドは、LPSに対する上皮細胞のIL-8誘導反応を中和した（表5〜7）。ペプチドSEQ ID NO:2も同様に、ヒト全血におけるIL-8のLPSによる産生を阻害した（表4）。逆に、高濃度のペプチドSEQ ID NO:1（50〜100 μg/ml）によって実際に、IL-8レベルの増加が得られた（表5）。このことは、ペプチドが、濃度が異なれば異なる作用を有することを示唆している。
【００８７】
炎症性の刺激に対するペプチドの作用も同様に、初代培養マウス細胞において証明され、この場合ペプチドSEQ ID NO:1は、100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSによって刺激したBALB/cマウスの骨髄由来マクロファージによるTNF-α産生を有意に（＞90％）低下させた（表8）。これらの実験は、LPSのCD14に対する迅速な結合を媒介することができるタンパク質であるLPS結合タンパク質（LBP）を含む血清の存在下で行った。SEQ ID NO:1をマクロファージの上清に、100 ng/ml大腸菌LPSによる刺激後1時間遅れて添加してもなお、TNF-α産生の実質的な減少（70％）が起こった（表9）。
【００８８】
SEQ ID NO:1がインビトロでLPSによるTNF-αの産生を防止できることと一致して、特定のペプチドは同様に、高濃度のLPSによって誘導される致死性ショックに対してマウスを保護した。いくつかの実験において、CD-1マウスに、先にガラクトサミンを注射してからLPSに感作させた。大腸菌O111:B4 LPS 3μgを注射したガラクトサミン感作マウスは全て、4〜6時間以内に死亡した。SEQ ID NO:1 200 μgをLPSの15分後に注射すると、マウスの50％が生存した（表10）。他の実験において、D-ガラクトサミンを感作しないでより高濃度のLPSをBALB/cマウスに注射すると、ペプチドは、生存を認めなかった対照群と比較して100％保護した（表13）。選択した他のペプチドも同様に、これらのモデルにおいて保護的であることが判明した（表11、12）。
【００８９】
陽イオンペプチドはまた、マイコバクテリウムの非キャップリポアラビノマンナン（AraLAM）および黄色ブドウ球菌LTAのようなグラム陽性菌産物によってマクロファージの刺激を低下させることができた。例えば、SEQ ID NO:1は、RAW 264.7細胞において、グラム陽性菌産物、LTA（表14）によるTNF-αの産生を阻害し、およびAraLAM（表15）によるTNF-αの産生をより弱い程度に阻害した。もう一つのペプチド、SEQ ID NO:2も同様に、RAW 264.7細胞によるLTA誘導TNF-α産生を減少させることが判明した。SEQ ID NO:1は濃度1μg/mlで、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTAによるTNF-αの産生の誘導を実質的に減少（＞75％）させることができた。20 μg/ml SEQ ID NO:1では、AraLAM誘導TNF-α産生は＞60％阻害された。混入するエンドトキシンが、SEQ ID NO:1によるAraLAM誘導TNF-αの阻害において重要な要因ではないことを証明するために、ポリミキシンB（PMB）を対照として含めた。これらの結果は、陽イオンペプチドが細菌産物に対する免疫系の前炎症性サイトカイン反応を減少させることができることを証明している。
【００９０】
（表３）RAW 264.7細胞におけるSEQ ID NO:1によるLPS誘導TNF-α産生の減少
RAW 264.7マウスマクロファージ細胞を、SEQ ID NO:1の表記の濃度の存在下で100 ng/mlネズミチフス菌LPS、100 ng/ml B.セパシアLPS、および100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSによって6時間刺激した。培養上清に放出されたTNF-αの濃度を、ELISAによって決定した。100％はLPS単独と共に6時間インキュベートしたRAW 264.7細胞に起因するTNF-αの量を表す（ネズミチフス菌LPS＝34.5±3.2 ng/ml、B.セパシアLPS＝11.6±2.9 ng/mlおよび大腸菌O111:B4 LPS＝30.8±2.4 ng/ml）。刺激を与えないで6時間培養したRAW 264.7細胞によるTNF-αの産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αレベルが0.037〜0.192 ng/mlの範囲であった。データは1試料あたり2個ずつから得て、3回の実験の平均値＋標準誤差として表す。
2007505048.tif 000039
【００９１】
（表４）RAW 264.7細胞における大腸菌LPS誘導TNF-α産生の陽イオンペプチドによる減少
RAW264.7マウスマクロファージ細胞を、表記の濃度の陽イオンペプチドの存在下で100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSによって6時間刺激した。培養上清に放出されたTNF-αの濃度をELISAによって決定した。刺激を与えないで6時間培養したRAW 264.7細胞によるTNF-αの産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αのレベルが0.037〜0.192 ng/mlであった。データは1試料あたり2個ずつの試料から得て、3回の実験の平均値＋標準偏差として表す。
2007505048.tif 000040
2007505048.tif 000041
【００９２】
（表５）A549細胞におけるSEQ ID NO:1によるLPS誘導IL-8産生の減少
A549細胞を、LPS（100 ng/ml大腸菌O111:B4）の存在下で増加濃度のSEQ ID NO:1によって24時間刺激した。培養上清におけるIL-8の濃度を、ELISAによって決定した。細胞単独からのIL-8のバックグラウンドレベルは0.172±0.029 ng/mlであった。データは3回の実験の平均値＋標準誤差として表す。
2007505048.tif 000042
【００９３】
（表６）A549細胞におけるSEQ ID NO:2による大腸菌LPS誘導IL-8産生の減少
ヒトA549上皮細胞をLPS（100 ng/ml大腸菌O111:B4）の存在下で増加濃度のSEQ ID NO:2によって24時間刺激した。培養上清におけるIL-8の濃度は、ELISAによって決定した。データは3回の実験の平均値＋標準誤差として表す。
2007505048.tif 000043
【００９４】
（表７）ヒト血液におけるSEQ ID NO:2による大腸菌LPS誘導IL-8の減少
ヒト全血を増加濃度のペプチドおよび大腸菌O111:B4 LPSによって4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して血清を採取し、ELISAによってIL-8に関して試験した。データはドナー2人の平均値として表す。
2007505048.tif 000044
【００９５】
（表８）マウス骨髄マクロファージにおけるSEQ ID NO:1による大腸菌LPS誘導TNF-α産生の減少
BALB/cマウス骨髄由来マクロファージを、20 μg/mlペプチドの存在下または非存在下で、100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSと共に6時間または24時間のいずれか培養した。上清を回収してELISAによってTNF-αレベルに関して試験した。データは、LPS単独と共に6時間（1.1±0.09 ng/ml）または24時間（1.7±0.2 ng/ml）インキュベートした骨髄由来マクロファージの1試料あたりウェル2個から得られたTNF-αの量を表す。TNF-αのバックグラウンドレベルは、6時間の場合0.038±0.008 ng/mlおよび24時間の場合0.06±0.012 ng/mlであった。
2007505048.tif 000045
【００９６】
（表９）A549細胞に対するSEQ ID NO:1の遅れた添加による大腸菌LPS誘導TNF-α産生の阻害
ペプチド（20 μg/ml）を、A549ヒト上皮細胞および100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSを含むウェルに時間をずらして加えた。上清を6時間後に回収して、ELISAによってTNF-αレベルを調べた。データは3回の実験の平均値＋標準誤差として表す。
2007505048.tif 000046
【００９７】
（表１０）ガラクトサミン感作CD-1マウスにおける致死性エンドトキシン血症のSEQ ID NO:1による保護
CD-1マウス（9週齢）を、ガラクトサミンの腹腔内注射（0.1 ml滅菌PBSにおいて20 mg）を3回行うことによってエンドトキシンに対して感作した。次に、大腸菌O111:B4 LPS（0.1 ml PBSにおいて3μg）の腹腔内注射によってエンドトキシンショックを誘導した。ペプチドSEQ ID NO:1（200 μg/マウス＝8 mg/kg）をLPSの注射後15分に異なる腹腔内部位に注射した。マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
2007505048.tif 000047
【００９８】
（表１１）ガラクトサミン感作CD-1マウスにおける致死性エンドトキシン血症に対する陽イオンペプチドによる保護
CD-1マウス（9週齢）を、ガラクトサミンの腹腔内注射（0.1 ml滅菌PBSにおいて20 mg）によってエンドトキシンに対して感作した。次に、大腸菌O111:B4 LPS（0.1 ml PBSにおいて2μg）の腹腔内注射によってエンドトキシンショックを誘導した。ペプチド（200 μg/マウス＝8 mg/kg）をLPSの注射後15分に異なる腹腔内部位に注射した。マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
2007505048.tif 000048
【００９９】
（表１２）ガラクトサミン感作BALB/cマウスにおける致死性エンドトキシン血症に対する陽イオンペプチドによる保護
BALB/cマウス（8週齢）を、ガラクトサミンの腹腔内注射（0.1 ml滅菌PBSにおいて20 mg）によってエンドトキシンに対して感作した。次に、大腸菌O111:B4 LPS（0.1 ml PBSにおいて2μg）の腹腔内注射によってエンドトキシンショックを誘導した。ペプチド（200 μg/マウス＝8 mg/kg）をLPSの注射後15分に異なる腹腔内部位に注射した。マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
2007505048.tif 000049
【０１００】
（表１３）BALB/cマウスにおける致死性エンドトキシン血症に対するSEQ ID NO:1による保護
BALB/cマウスに大腸菌O111:B4 LPS 400 μgを腹腔内注射した。ペプチド（200 μg/マウス＝8 mg/kg）を異なる腹腔内部位に注射して、マウスを48時間モニターして、結果を記録した。
2007505048.tif 000050
【０１０１】
（表１４）黄色ブドウ球菌LTAによって誘導されるTNF-α産生のペプチドによる阻害
RAW 264.7マウスマクロファージ細胞をペプチドの増加濃度の非存在下および存在下で1μg/ml黄色ブドウ球菌LTAによって刺激した。上清を回収してELISAによってTNF-αレベルに関して調べた。刺激を行わずに6時間培養したRAW 264.7細胞によるTNF-α産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αレベルが0.037〜0.192 ng/mlの範囲であった。データは3回またはそれ以上の実験の平均値＋標準誤差として表す。
2007505048.tif 000051
【０１０２】
（表１５）マイコバクテリウム非キャップリポアラビノマンナンによって誘導されるTNF-α産生のペプチドによる阻害
RAW 264.7マウスマクロファージ細胞を、20 μg/mlペプチドまたはポリミキシンBの非存在下および存在下で1μg/ml AraLAMによって刺激した。上清を回収して、ELISAによってTNF-αレベルに関して試験した。刺激しないで6時間培養したRAW264.7細胞によるTNF-α産生のバックグラウンドレベルは、TNF-αレベルが0.037〜0.192 ng/mlの範囲であった。データは、3回またはそれ以上の実験の阻害の平均値＋標準誤差として表す。
2007505048.tif 000052
【０１０３】
実施例3
陽イオンペプチドの毒性の評価
ペプチドに関して可能性がある毒性を二つの方法で測定した。第一に、細胞障害性検出キット（Roche）（乳酸デヒドロゲナーゼ-LDH）アッセイを用いた。これは、損傷された細胞のサイトソルから上清に放出されたLDH活性の測定に基づく、細胞死および細胞溶解を定量するための比色アッセイである。LDHは全ての細胞に存在する安定な細胞質酵素であり、細胞質膜の損傷に基づいて細胞培養上清に放出される。死細胞または細胞膜損傷細胞の量が増加すれば、ELISAプレートリーダーによってOD490 nmで測定した場合に培養上清におけるLDH酵素活性の増加が起こる（アッセイにおいて形成された色素量は、溶解された細胞数に比例する）。このアッセイにおいて、ヒト気管支上皮細胞（16HBEo14、HBE）をペプチド100 μgと共に24時間インキュベートして、上清を採取してLDHに関して試験した。陽イオンペプチドの毒性を測定するために用いた他のアッセイはWST-1アッセイ（Roche）であった。このアッセイは生存細胞におけるミトコンドリアデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩WST-1の切断に基づく、細胞増殖および細胞生存率の定量のための比色アッセイである（[3H]-チミジン取り込みアッセイに対する非放射活性代用法）。このアッセイにおいて、HBE細胞をペプチド100 μgと共にインキュベートした後、10μl/ウェル細胞増殖試薬WST-1を加えた。細胞を試薬と共にインキュベートして、プレートをELISAプレートリーダーによってOD490 nmで測定する。
【０１０４】
下記の表16および17に示す結果は、ほとんどのペプチドが調べた細胞に対して毒性ではないことを証明している。しかし、式Fの四つのペプチド（SEQ ID NO:40、41、42、および43）は、いずれのアッセイによって測定しても膜の損傷を誘導した。
【０１０５】
（表１６）LDH放出アッセイによって測定した陽イオンペプチドの毒性
ヒトHBE気管支上皮細胞を100 μg/mlペプチドまたはポリミキシンBと共に24時間インキュベートした。LDH活性は細胞培養上清においてアッセイした。100％LDH放出の対照として、トライトンX-100を加えた。データは平均値±標準偏差として示す。ペプチドSEQ ID NO:40、41、42、および43のみが有意な毒性を示した。
2007505048.tif 000053
2007505048.tif 000054
【０１０６】
（表１７）WST-1アッセイによって測定した陽イオンペプチドの毒性
HBE細胞を100 μg/mlペプチドまたはポリミキシンBと共に24時間インキュベートして、細胞生存率を調べた。データは平均値±標準偏差として表す。100％LDH放出の対照として、トライトンX-100を加えた。ペプチドSEQ ID NO:40、41、42、および43のみが有意な毒性を示した。
2007505048.tif 000055
2007505048.tif 000056
【０１０７】
実施例4
陽イオンペプチドによるポリヌクレオチド調節
ポリヌクレオチドアレイを利用して、マクロファージおよび上皮細胞の転写反応に及ぼす陽イオンペプチド自身の影響を決定した。マウスマクロファージRAW 264.7、ヒト気管支細胞（HBE）、またはA549ヒト上皮細胞を150 mm組織培養皿において5.6×106個/皿で播種して、一晩培養した後、50 μg/mlペプチドまたは培地単独と共に4時間インキュベートした。刺激後、細胞をジエチルピロカーボネート処置PBSによって1回洗浄して、セルスクレイパーを用いて皿から剥離させた。総RNAトリゾル（Gibco Life Technologies）を用いて単離した。RNA沈降物を、RNアーゼ阻害剤（Ambion, Austin, TX）を含むRNアーゼを含まない水に浮遊させた。RNAをDNアーゼI（Clontech, Palo Alto, CA）によって37℃で1時間処置した。終止ミクス（0.1 M EDTA[pH 8.0]、1 mg/mlグリコーゲン）を加えた後、試料をフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）によって1回抽出し、クロロホルムによって1回洗浄した。次に、100％エタノールの2.5倍量および酢酸ナトリウム、pH 5.2の1/10倍量を加えることによって、RNAを沈殿させた。RNAを、RNアーゼ阻害剤（Ambion）を含むRNアーゼを含まない水に浮遊させて、-70℃で保存した。RNAの質は、1％アガロースゲルにおけるゲル電気泳動によって評価した。ゲノムDNA混入がないことは、β-アクチン特異的プライマー
2007505048.tif 000057
によるPCR増幅の鋳型として単離RNAを用いることによって評価した。アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色は、35サイクル後にアンプリコンが存在しないことを確認した。
【０１０８】
陽性荷電メンブレンにおいて1試料あたり2個ずつスポットした選択されたマウスcDNA 588個からなるAtlas cDNA発現アレイ（Clontech, Palo Alto, CA）を、初期ポリヌクレオチドアレイ試験のために用いた（表18、19）。5μg総RNAから調製した32P放射標識cDNAプローブを、アレイと共に71℃で一晩インキュベートした。フィルターを十分に洗浄した後、ホスホイメージャースクリーン（Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA）に4℃で3日間露出した。画像をMolecular Dynamics PSIホスホイメージャーを用いて獲得した。ハイブリダイゼーションシグナルは、AtlasImage 1.0画像分析ソフトウェア（Clontech）およびエクセル（Microsoft, Redmond, WA）を用いて分析した。各スポットの強度をバックグラウンドレベルに関して補正して、刺激条件によってほとんど変化しないことが認められたポリヌクレオチド5個：β-アクチン、ユビキチン、リボソームタンパク質S29、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、およびCa2+結合タンパク質の平均値を用いてプローブの標識の差に関して標準化した。所定のcDNAに関して標準化されたハイブリダイゼーション強度が20未満である場合、比および相対的発現を計算するために20の値を割付した。
【０１０９】
用いた次のポリヌクレオチドアレイ（表21〜26）は、ResgenヒトcDNAアレイ（ゲノムの識別番号はPRHU03-S3である）であったが、これは1試料あたり2個ずつスポットしたヒトcDNA 7,458個からなる。総RNA 15〜20μgからプローブを調製して、Cy3標識dUTPによって標識した。プローブを精製して、押印したスライドガラスに42℃で一晩ハイブリダイズさせて、洗浄した。洗浄後、Virtekスライドリーダーを用いて画像を獲得した。画像処理ソフトウェア（Imagene 4.1, Marina Del Rey, CA）は、スポットの平均強度、強度の中央値、およびバックグラウンド強度を決定する。Genespringソフトウェア（Redwood City, CA）によって標準化および分析を行った。強度の値は、Imageneによって決定した平均強度の値からバックグラウンド強度の平均値を差し引くことによって計算した。スライドガラス内でスポット値の集団からスポットの強度の値の中央値を得て、この値を実験における全てのスライドガラスの値と比較することによって、各スポットの強度を標準化した。対照細胞と比較してペプチドによって処置した細胞に関して認められた相対的変化を、下記の表に認めることができる。
【０１１０】
用いた他のポリヌクレオチドアレイ（表27〜35）はヒトオペロンアレイ（ゲノムの識別番号はPRHU04-S1である）であったが、これは1試料あたり2個ずつスポットされたヒトオリゴ約14,000個からなる。総RNA 10μgからプローブを調製して、Cy3またはCy5標識dUTPによって標識した。これらの実験において、A549上皮細胞を100 mm組織培養皿において2.5×106個/皿で播種した。RNAqueous（Ambion）を用いて総RNAを単離した。DNAの混入はDNA-freeキット（Ambion）によって除去した。総RNAから調製したプローブを精製して、押印されたスライドガラスに42℃で一晩ハイブリダイズさせて洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナを用いて画像を獲得した。画像処理ソフトウェア（Imagene 5.0, Marina Del Rey, CA）は、スポットの平均強度、強度の中央値、およびバックグラウンド強度を決定する。「施設内」プログラムを用いてバックグラウンドを除去した。プログラムは各サブグリッドに関して最低の10％強度を計算して、各グリッドに関してこれを差し引く。Genespringソフトウェア（Redwood City, CA）によって分析を行った。スライドガラス内でスポット値の集団からスポットの強度の値の中央値を得て、この値を実験における全てのスライドガラスの値と比較することによって、各スポットの強度を標準化した。対照細胞と比較してペプチドによって処置した細胞に関して認められた相対的変化を、下記の表に認めることができる。
【０１１１】
半定量的RT-PCRを行って、ポリペプチドアレイの結果を確認した。RNA試料1μgを、DEPC処置水の容量12μlにおいて、サーモサイクラーにおいてオリゴT（500 μg/ml）1 μlおよび1 mM混合dNTP保存液1 μlと共に65℃で5分間インキュベートした。5×一本鎖緩衝液4 μl、0.1 M DTT 2μl、およびRNアーゼOUT組換え型リボヌクレアーゼ阻害剤（40単位/μl）1μlを加えて、42℃で2分間インキュベートした後、Superscript II（Invitrogen, Burlington, ON）1μl（200単位）を加えた。Superscript IIの非存在下での平行な反応を用いて、各RNA源の陰性対照を作製した。cDNAを、5'および3'プライマー（1.0 μM）、0.2 mM dNTP混合物、1.5 mM MgCl、1 U Taq DNAポリメラーゼ（New England Biolabs, Missisauga, ON）、および1×PCR緩衝液の存在下で増幅した。各PCRをサーマルサイクラーにおいて、94℃で30秒の変性、52℃または55℃のいずれかでの30秒のアニーリング、および72℃で40秒の伸長からなる30〜40サイクルによって行った。PCRのサイクル数は、各プライマーおよびRNA試料の組に関して反応の直線相に入るように最適にした。ハウスキーピングポリヌクレオチドβ-アクチンを各実験において増幅して、抽出技法を評価して、RNAの量を推定した。電気泳動によって反応産物を可視化して、密度測定によって分析し、β-アクチン増幅を参照して相対的開始RNA濃度を計算した。
【０１１２】
表18は、RAW 264.7細胞のSEQ ID NO:1の処置によって、選択された公知のポリヌクレオチドを有する小さいAtlasマイクロアレイにおいて、30個より多い異なるポリヌクレオチドの発現がアップレギュレートされたことを示している。ペプチドSEQ ID NO:1によってアップレギュレートされたポリヌクレオチドは、主に二つのカテゴリーに由来し、一つには受容体（増殖、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン、神経伝達物質）、細胞表面抗原、および細胞接着が含まれ、ならびにもう一つには、細胞-細胞伝達（増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、インターフェロン、ホルモン）、細胞骨格、運動性、およびタンパク質代謝回転が含まれる。アップレギュレートされた特異的ポリヌクレオチドには、ケモカインMCP-3、抗炎症性サイトカインIL-10、マクロファージコロニー刺激因子、ならびにIL-1R-2（IL-1R1に対する生産的IL-1結合の推定のアンタゴニスト）、PDGF受容体B、NOTCH4、LIF受容体、LFA-1、TGFβ受容体1、G-CSF受容体、およびIFNγ受容体のような受容体をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ペプチドはまた、いくつかの骨形態形成タンパク質BMP-1、BMP-2、BMP-8a、TIMP2およびTIMP3を含む、いくつかのメタロプロテナーゼおよびその阻害剤をコードするポリヌクレオチドをアップレギュレートした。同様に、ペプチドは、JunD、ならびにYYおよびLIM-1転写因子を含む特異的転写因子、ならびにEtk1およびCskのようなキナーゼをアップレギュレートして、その広範な作用を証明した。同様に、ポリヌクレオチドアレイの研究から、SEQ ID NO:1がRAW 264.7マクロファージ細胞において少なくとも20個のポリヌクレオチドをダウンレギュレートすることが発見された（表19）。ペプチドによってダウンレギュレートされたポリヌクレオチドには、DNA修復タンパク質ならびにMIP-1α、オンコスタチンM、およびIL-12のようないくつかの炎症性メディエータが含まれた。ポリヌクレオチド発現に及ぼすペプチドの多くの作用をRT-PCRによって確認した（表20）。ペプチドSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:19、およびSEQ ID NO:1、ならびに式のそれぞれの代表的なペプチドも同様に、中等度の大きさのマイクロアレイ（ポリヌクレオチド7835個）を用いてヒト上皮細胞株における転写反応を変化させた。ポリヌクレオチド発現に及ぼすSEQ ID NO:1の影響を二つのヒト上皮細胞株、A549およびHBEにおいて比較した。非刺激細胞より2倍より大きい比でペプチド2個またはそれ以上によってアップアレギュレートされた、宿主免疫応答に関連したポリヌクレオチドを、表21に記述する。非刺激細胞より2倍より大きい比でペプチド2個またはそれ以上によってダウンレギュレートされたポリヌクレオチドを表22に記述する。表23および24においてそれぞれ、アップおよびダウンレギュレートされたヒト上皮前炎症性ポリヌクレオチドを示す。表25および表26において、陽イオンペプチドによって影響を受けた抗炎症性ポリヌクレオチドを示す。陽イオンペプチドが抗炎症反応をアップレギュレートして、前炎症性反応をダウンレギュレートする傾向は明確である。ダウンレギュレートされた抗炎症反応関連ポリヌクレオチドを発見することは非常に難しかった（表26）。陽イオンペプチドによってアップレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチドは、主に遊走およ��接着に関連したポリヌクレオチドであった。ダウンレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチドの中で、全ての陽イオンペプチドが、感染因子に対する宿主反応のシグナル伝達において非常に重要であるいくつかのtoll様受容体（TLR）ポリヌクレオチドに影響を及ぼしたことは注目すべきである。全てのペプチドによってアップレギュレートされた重要な抗炎症性ポリヌクレオチドは、IL-10受容体である。IL-10は前炎症性サイトカインの調節に関与する重要なサイトカインである。これらのポリヌクレオチド発現作用も同様に、表27および28においてペプチドSEQ ID NO:6に関して認められたように、初代培養ヒトマクロファージを用いて認められた。選択したポリヌクレオチド（調べた14,000個のうち）のヒト上皮細胞発現に及ぼすそれぞれの式の代表的なペプチドの影響を下記の表31〜37に示す。各式の少なくとも6個のペプチドを、ヒト上皮ポリヌクレオチド発現を変化させることができるか否かに関して調べたところ、実際にそれらは広範囲の刺激作用を有した。式のそれぞれにおいて、群においてペプチドのそれぞれによって一般的にアップレギュレートされたポリヌクレオチド少なくとも50個が存在した。
【０１１３】
（表１８）RAWマクロファージ細胞のペプチドSEQ ID NO:1による処置によってアップレギュレートされたポリヌクレオチドa
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を強力に誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートした後、RNAを単離して、標識したcDNAプローブに変換してAtlasアッセイにハイブリダイズした。非刺激細胞の強度を第三の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現の強度を指す。
【０１１４】
ハウスキーピングポリヌクレオチドの標準化された強度の変化は0.8〜1.2倍の範囲であり、標準化のためにこれらのポリヌクレオチドを用いることを確認した。所定のcDNAの標準化されたハイブリダイゼーション強度が20未満である場合、比および相対的発現を計算するために、20の値を割付した。アレイ実験を異なるRNA調製物に関して3回繰り返して、変化倍率の平均値を上記に示す。相対的発現レベルの2倍またはそれより大きい変化を示すポリヌクレオチドを示す。
2007505048.tif 000058
2007505048.tif 000059
2007505048.tif 000060
2007505048.tif 000061
【０１１５】
（表１９）RAWマクロファージ細胞のペプチドSEQ ID NO:1による処置によってダウンレギュレートされたポリヌクレオチドa
濃度50 μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を減少させることが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識されたcDNAプローブに変換して、Atlasアッセイにハイブリダイズさせた。非刺激細胞の強度を第三の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現の強度を指す。アレイの実験を異なる細胞について3回繰り返して変化倍率の平均値を下記に示す。相対的発現レベルにおいて約2倍またはそれより大きい変化を示すポリヌクレオチドを示す。
2007505048.tif 000062
2007505048.tif 000063
【０１１６】
（表２０）ペプチドSEQ ID NO:1に反応したポリヌクレオチド発現の変化はRT-PCRによって確認することができる
RAW264.7マクロファージ細胞を、50 μg/mlペプチドまたは培地単独と共に4時間インキュベートして、総RNAを抽出し、半定量的PCRを行った。各ポリヌクレオチドに関する特異的プライマー組をRNAの増幅のために用いた。β-アクチンの増幅を陽性対照としておよび標準化のために用いた。RT-PCR産物の密度測定分析を用いた。結果は、培地単独と共にインキュベートした細胞と比較したペプチド処置細胞のポリヌクレオチド発現の相対的変化倍率を示す。データは実験3回の平均値±標準誤差として示す。
2007505048.tif 000064
【０１１７】
（表２１）A549上皮細胞のペプチド処置によってアップレギュレートされたポリヌクレオチドa
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000065
2007505048.tif 000066
2007505048.tif 000067
2007505048.tif 000068
2007505048.tif 000069
2007505048.tif 000070
2007505048.tif 000071
【０１１８】
（表２２）A549上皮細胞のペプチド処置によってダウンレギュレートされたポリヌクレオチドa
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000072
2007505048.tif 000073
2007505048.tif 000074
2007505048.tif 000075
2007505048.tif 000076
【０１１９】
（表２３）A549細胞のペプチド処置によってアップレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかの前炎症性ポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された（データは表21のサブセットである）。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000077
【０１２０】
（表２４）A549細胞のペプチド処置によってダウンレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、いくつかの前炎症性ポリヌクレオチドの発現を減少させることが示された（データは表22のサブセットである）。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000078
2007505048.tif 000079
【０１２１】
（表２５）A549細胞のペプチド処置によってアップレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、特定の抗炎症性のポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された（データは表21のサブセットである）。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000080
【０１２２】
（表２６）A549細胞のペプチド処置によってダウンレギュレートされた前炎症性ポリヌクレオチド
濃度50μg/mlの陽イオンペプチドは、特定の抗炎症性ポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された（データは表21のサブセットである）。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトcDNAアレイID#PRHU03-S3にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：非刺激の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000081
【０１２３】
（表２７）初代培養ヒトマクロファージにおいてSEQ ID NO:6によってアップレギュレートされたポリヌクレオチド
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:6は、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド処置：対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000082
2007505048.tif 000083
2007505048.tif 000084
【０１２４】
（表２８）初代培養ヒトマクロファージにおいてSEQ ID NO:6によってダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:6は、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトマクロファージと共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000085
2007505048.tif 000086
【０１２５】
（表２９）HBE細胞におけるSEQ ID NO:1によってアップレギュレートされたポリヌクレオチド
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:1は、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトHBE細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第二の列に示す。「ペプチド：対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000087
2007505048.tif 000088
2007505048.tif 000089
2007505048.tif 000090
【０１２６】
（表３０）HBE細胞においてペプチド（50 μg/ml）、SEQ ID NO:1によってダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
濃度50μg/mlのペプチドSEQ ID NO:1は、多くのポリヌクレオチドの発現を減少させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を第三の列に示す。「ペプチド：対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000091
2007505048.tif 000092
2007505048.tif 000093
2007505048.tif 000094
2007505048.tif 000095
【０１２７】
（表３１）式Aのペプチドによって誘導されたA549細胞におけるポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号：対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000096
2007505048.tif 000097
2007505048.tif 000098
2007505048.tif 000099
2007505048.tif 000100
2007505048.tif 000101
【０１２８】
（表３２）式Bのペプチドによって誘導されるA549細胞におけるポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号：対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000102
2007505048.tif 000103
2007505048.tif 000104
2007505048.tif 000105
2007505048.tif 000106
【０１２９】
（表３３）式Cのペプチドによって誘導されたA549細胞におけるポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号：対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000107
2007505048.tif 000108
2007505048.tif 000109
2007505048.tif 000110
2007505048.tif 000111
【０１３０】
（表３４）式Dのペプチドによって誘導されたA549細胞におけるポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号：対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000112
2007505048.tif 000113
2007505048.tif 000114
2007505048.tif 000115
2007505048.tif 000116
2007505048.tif 000117
2007505048.tif 000118
2007505048.tif 000119
【０１３１】
（表３５）式Eのペプチドによって誘導されたA549細胞におけるポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号：対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000120
2007505048.tif 000121
2007505048.tif 000122
2007505048.tif 000123
2007505048.tif 000124
2007505048.tif 000125
【０１３２】
（表３６）式Fのペプチドによって誘導されたA549細胞におけるポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識したcDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関して第二の列および第三の列に示す。「ID番号：対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000126
2007505048.tif 000127
2007505048.tif 000128
2007505048.tif 000129
2007505048.tif 000130
2007505048.tif 000131
2007505048.tif 000132
【０１３３】
（表３７）式Gおよびさらなるペプチドによって誘導されたA549細胞におけるポリヌクレオチド発現のアップレギュレーション
濃度50μg/mlのペプチドは、多くのポリヌクレオチドの発現を増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離し、標識cDNAプローブに変換してヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を色素Cy3およびCy5によるcDNAの標識に関してそれぞれ、第二の列および第三の列に示す。「ID番号：対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。アクセッション番号および遺伝子の名称はU00115、ジンクフィンガータンパク質；M91036、ヘモグロビンγG；K000070、仮説上のタンパク質；AF055899、溶質担体ファミリー27；AK001490、仮説上のタンパク質；X97674、核受容体共活性化因子2；AB022847、未知；AJ275986、転写因子；D10495、タンパク質キナーゼC、δ；L36642、EphA7；M31166、ペンタキシン関連遺伝子；AF176012、未知；AF072756、キナーゼアンカータンパク質4；NM_014439、IL-1スーパーファミリーz；AJ271351、推定の転写調節因子；AK000576、仮説上のタンパク質；AJ272265、分泌型燐蛋白質2；AL122038、仮説上のタンパク質；AK000307、仮説上のタンパク質；AB029001、KIAA1078タンパク質；U62437、コリン作動性受容体；AF064854、未知；AL031588、仮説上のタンパク質；X89399、RAS p21タンパク質活性化因子；D45399、ホスホジエステラーゼ；AB037716、仮説上のタンパク質；X79981、カドヘリン5；AF034208、RIG-様7-1；AL133355、第21染色体オープンリーディングフレーム53；NM_016281、SEE20様キナーゼ；AF023614、膜貫通活性化因子およびCAML相互作用因子；AF056717、ash2-様；AB029039、KIAA1116タンパク質；J03634、インヒビン、βA；U80764、未知；AB032963、未知；X82835、ナトリウムチャンネル、電位により開く、IX型。
2007505048.tif 000133
2007505048.tif 000134
【０１３４】
実施例5
細胞株、ヒト全血、およびマウスにおけるペプチドによるケモカインの誘導
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7、THP-1細胞（ヒト単球）、ヒト上皮細胞株（A549）、ヒト気管支上皮細胞（16HBEo14）、およびヒト全血を用いた。HBE細胞をアール塩を含むMEMにおいて増殖させた。THP-1細胞を増殖させて、RPMI1640培地において維持した。RAWおよびA549細胞株を、10％仔ウシ胎児血清を添加したDMEMにおいて維持した。細胞を24ウェルプレートにおいてDMEM（上記参照）において106個/ウェルの密度で播種し、A549細胞を24ウェルプレートにおいてDMEM（上記）において105個/ウェルの密度で播種し、双方を5％CO2において37℃で一晩インキュベートした。一晩増殖させた細胞からDMEMを吸引して、新鮮な培地に交換した。細胞をペプチドと共にインキュベートした後、培養上清へのケモカインの放出をELISA（R&D Systems, Minneapolis, MN）によって決定した。
【０１３５】
動物試験はUBC動物飼育委員会（UBC ACC #A01-0008）によって承認された。BALB/cマウスをCharles River Laboratoriesから購入して、標準的な動物施設に収容した。年齢、性別、および体重をマッチさせた成体マウスを、アベルチン（4.4 mM 2-2-2-トリブロモエタノール、2.5％2-メチル-2-ブタノールの蒸留水溶液）200 μl/10 g体重を用いて腹腔内注射によって麻酔した。点滴注入は、HoおよびFurst 1973から適合させた非外科的気管内注入法を用いて行った。簡単に説明すると、麻酔したマウスを、その顎を開いた状態でその前歯を支持フレームの上部の針金の上に引っかけて、バネで胸部を前方に押して、咽頭、喉頭、および気管を垂直の直線状に配置した。気道を外部から照射して、明白に照らした気管腔に挿管カテーテルを挿入した。ペプチド懸濁液または滅菌水20 μlをカテーテルの近位末端のウェルに入れて、空気200 μlと共に気管に徐々に注入した。動物を注入後直立位で2分間維持して呼吸器に液体を排水させた。4時間後、300 mg/kgペントバルビタールの腹腔内注射によってマウスを安楽死させた。気管を露出して、静脈内カテーテルを近位気管に通して、縫合糸によってその場で結んだ。気管カテーテルを通して肺に滅菌PBS 0.75 mlを導入して、数秒後に液を回収することによって洗浄を行った。これをPBSの同じ試料について3回繰り返した。洗浄液を氷中の試験管に入れて、マウスあたりの総回収容積は約0.5 mlであった。気管支肺胞洗浄（BAL）液を1200 rpmで10分間遠心して、透明な上清を採取して、ELISAによってTNF-αおよびMCP-1に関して試験した。
【０１３６】
陽イオンペプチドによるケモカインのアップレギュレーションは、いくつかの異なる系において確認された。ヒトMCP-1の相同体であるマウスMCP-1は、β（C-C）ケモカインファミリーのメンバーである。MCP-1は、単球、NK細胞、およびいくつかのT-リンパ球を動員することが示されている。RAW264.7マクロファージ細胞およびドナー3人からのヒト全血を、ペプチドSEQ ID NO:1の増加濃度によって刺激した場合、それらはELISAによって判断するとその上清に有意なレベルのMCP-1を産生した（表36）。ペプチド濃度20〜50 μg/mlによって24時間刺激したRAW264.7細胞は、有意なレベルのMCP-1を産生した（バックグラウンドより200〜400 pg/ml高い）。細胞（24時間）および全血（4時間）を100 μg/ml LL-37によって刺激すると、高レベルのMCP-1が産生された。
【０１３７】
ケモカイン誘導に及ぼす陽イオンペプチドの影響はまた、完全に分化した細胞系、A549ヒト上皮細胞においても調べた。興味深いことに、これらの細胞はLPSに反応してMCP-1を産生するが、この反応はペプチドによって拮抗することができ、ペプチドSEQ ID NO:1に対して直接反応したA549細胞によるMCP-1の産生を認めなかった。しかし、高濃度のペプチドSEQ ID NO:1は、好中球の特異的ケモカインであるIL-8の産生を誘導した（表37）。このように、SEQ ID NO:1は、異なる細胞タイプからの反応の異なるスペクトルを異なる濃度で誘導することができる。式の群のそれぞれからの多くのペプチドをA549細胞におけるIL-8の誘導能に関して試験した（表38）。これらのペプチドの多くは低濃度、すなわち10 μg/mlでバックグラウンドより高いIL-8を誘導した。高濃度（100 μg/ml）のSEQ ID NO:13はまた、ヒト全血においてIL-8を誘導することが判明した（表39）。ペプチドSEQ ID NO:2も同様に、HBE細胞（表40）および未分化のTHP-1細胞（表41）においてIL-8を有意に誘導した。
【０１３８】
BALB/cマウスにSEQ ID NO:1または無エンドトキシン水を気管内注入によって投与して、3〜4時間後に気管支肺胞洗浄液におけるMCP-1およびTNF-αレベルを調べた。50 μg/mlのペプチドSEQ ID NO:1を処置したマウスは、水を与えたまたは麻酔のみを行ったマウスと比較してMCP-1レベルが有意に増加することが判明した（表42）。ペプチドは水を与えたまたは麻酔のみを行ったマウスより有意なTNF-αを産生しなかったことから、これはペプチドSEQ ID NO:1に対する前炎症性反応ではなかった。ペプチドSEQ ID NO:1はまた、ペプチドSEQ ID NO:1（100 μg/mlまで）を処置したRAW264.7細胞および骨髄由来マクロファージによるTNF-α産生を有意に誘導しないことが判明した（表43）。このように、ペプチドSEQ ID NO:1は、感染症を除去することができる貪食細胞の動員を助けながら細菌産物による炎症を遮断することができる要因としてペプチドSEQ ID NO:1の二重の役割を示す。
【０１３９】
（表３８）RAW264.7細胞およびヒト全血におけるMCP-1の誘導
RAW264.7マウスマクロファージ細胞またはヒト全血をLL-37の増加濃度によって4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して、血清を採取し、RAW264.7細胞からの上清と共にELISAによってMCP-1に関して試験した。示したRAW細胞データは、3回またはそれ以上の実験の平均値±標準誤差であり、ヒト血液データは異なるドナーからの平均値±標準誤差を表す。
2007505048.tif 000135
【０１４０】
（表３９）A549細胞およびヒト全血におけるIL-8の誘導
A549細胞またはヒト全血をペプチドの増加濃度によってそれぞれ、24時間および4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して、血清を採取し、A549細胞からの上清と共にELISAによってIL-8に関して試験した。示したA549細胞データは、3回またはそれ以上の実験の平均値±標準誤差であり、ヒト血液データは異なるドナーからの平均値±標準誤差を表す。
2007505048.tif 000136
【０１４１】
（表４０）陽イオンペプチドによるA549細胞におけるIL-8の誘導
A549ヒト上皮細胞をペプチド10 μgによって24時間刺激した。上清を採取してELISAによってIL-8に関して試験した。
2007505048.tif 000137
2007505048.tif 000138
【０１４２】
（表４１）ヒト血液におけるペプチドによるIL-8の誘導
ヒト全血をペプチドの増加濃度によって4時間刺激した。ヒト血液試料を遠心して、血清を採取してELISAによってIL-8に関して試験した。示したデータはドナー2人の平均である。
2007505048.tif 000139
【０１４３】
（表４２）HBE細胞におけるIL-8の誘導
ペプチドの増加濃度をHBE細胞と共に8時間インキュベートして、上清を採取して、IL-8に関して試験した。データは、3回またはそれ以上の実験の平均値±標準誤差として表す。
2007505048.tif 000140
【０１４４】
（表４３）未分化THP-1細胞におけるIL-8の誘導
ヒト単球THP-1細胞を表記の濃度のペプチドと共に8時間インキュベートした。上清を採取して、ELISAによってIL-8に関して試験した。
2007505048.tif 000141
【０１４５】
（表４４）マウス気道におけるペプチドSEQ ID NO:1によるMCP-1の誘導
BALB/cマウスをアベルチンによって麻酔して、ペプチドもしくは水の気管内注入を行うか、または注入を行わなかった（無処置）。マウスを4時間モニターして麻酔し、BAL液を単離してELISAによってMCP-1およびTNF-α濃度に関して分析した。示したデータは各条件に関してマウス4または5匹の平均値±標準誤差である。
2007505048.tif 000142
【０１４６】
（表４５）陽イオンペプチドによる有意なTNF-α誘導の欠損
RAW264.7マクロファージ細胞を、表記のペプチド（40 μg/ml）と共に6時間インキュベートした。上清を採取して、ELISAによってTNF-αレベルに関して試験した。データは3回またはそれ以上の実験の平均値＋標準誤差として表す。
2007505048.tif 000143
2007505048.tif 000144
【０１４７】
実施例6
陽イオンペプチドはケモカイン受容体の表面発現を増加させる
IL-8RB、CXCR-4、CCR2、およびLFA-1の細胞表面発現を分析するために、RAWマクロファージ細胞を10 μg/mlの適当な一次抗体（Santa Cruz Biotechnology）によって染色した後、FITC結合ヤギ抗ウサギIgG[IL-8RBおよびCXCR-4（Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA）]またはFITC結合ロバ抗ヤギIgG（Santa Cruz）によって染色した。FACscanを用いて細胞を分析し、事象10,000個を計数して、前方および側方散乱にゲートを設定して細胞の破片を除去した。
【０１４８】
ポリペプチドアレイデータから、いくつかのペプチドがケモカイン受容体IL-8RB、CXCR-4、およびCCR2の発現を非刺激細胞よりそれぞれ10、4、および1.4倍アップレギュレートすることが示唆された。ポリペプチドアレイデータを確認するために、ペプチドによって4時間刺激したRAW細胞上のこれらの受容体の表面発現をフローサイトメトリーによって調べた。50 μg/mlペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートすると、IL-8RBは、非刺激細胞より平均で2.4倍アップレギュレートされ、CXCR-4は、非刺激細胞より平均で1.6倍アップレギュレートされ、そしてCCR2は非刺激細胞より1.8倍アップレギュレートされた（表46）。対照として、CEMAは、類似のアップレギュレーションを引き起こすことが示された。Bac2Aは、LFA-1の有意なアップレギュレーションを示す唯一のペプチドであった（対照細胞より3.8倍高い）。
【０１４９】
（表４６）ペプチドに反応したCXCR-4、IL-8RB、およびCCR2の表面発現の増加
RAWマクロファージ細胞をペプチドによって4時間刺激した。細胞を洗浄して、適当な一次抗体およびFITC標識二次抗体によって染色した。示したデータは、平均値（ペプチドによって刺激したRAW細胞の培地に対する変化倍率）±標準誤差を表す。
2007505048.tif 000145
【０１５０】
実施例7
陽イオンペプチドによるMAPキナーゼのリン酸化
細胞を2.5×105個〜5×105個/mlで播種して一晩放置した。それらを培地において1回洗浄し、朝のあいだ血清を枯渇した（無血清培地−4時間）。培地を除去してPBSに交換して37℃で15分間放置した後、室温で15分間放置した。ペプチド（濃度0.1μg/ml〜50 μg/ml）またはH2Oを加えて、10分間インキュベートした。PBSを非常に速やかに除去して、阻害剤（NaF、B-グリセロホスフェート、MOL、バナジン酸塩、PMSF、ロイペプチン、アプロチニン）を含む氷冷ラジオイムノ沈殿（RIPA）緩衝液に交換した。プレートを氷中で10〜15分間または細胞が溶解するまで振とうさせて、溶解物を採取した。THP-1細胞の場合の技法はわずかに異なり、より多くの細胞（2×106個）を用いた。それらを一晩血清を枯渇させて、氷冷PBS 1 mlを加えた後、氷中に5〜10分間放置して遠心した後、RIPAに浮遊させた。タンパク質濃度は、タンパク質アッセイ（Pierce, Rockford, IL）を用いて決定した。細胞溶解物（タンパク質20 μg）をSDS-PAGEによって分離して、ニトロセルロースフィルターに転写した。フィルターを10 mMトリス-HCl、pH 7.5、150 mM NaCl（TBS）/5％スキムミルク粉末によって1時間ブロックした後、TBS/0.05％ツイーン20において一次抗体と共に低温で一晩インキュベートした。TBS/0.05％ツイーン20によって30分間洗浄した後、フィルターを1μg/ml二次抗体のTBS溶液と共に室温で1時間インキュベートした。フィルターをTBS/0.05％ツイーン20によって30分間洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIgG（TBS/0.05％ツイーン20において1：10,000希釈）と共に室温で1時間インキュベートした。フィルターをTBS/0.1％ツイーン20によって30分間洗浄した後、免疫反応性バンドを増強化学発光（ECL）検出によって可視化した。末梢血単核球による実験に関して、末梢血（50〜100 ml）を全ての被験者から単離した。単核球をFicoll-Hypaque上での密度勾配遠心によって末梢血から単離した。分裂間期細胞（単核球）を採取して、洗浄し、10％仔ウシ胎児血清（FCS）および1％グルタミンを含む推奨される初代培養細胞培養培地に浮遊させた。細胞を6ウェル培養プレートに4×106個/ウェルで播種して、5％CO2大気中で37℃で1時間接着させた。上清の培地および非接着細胞を洗浄して除去し、ペプチドを含む適当な培地を添加した。新たに採取した細胞は、そのトリパンブルー排除能によって評価したところ、一貫して生存細胞＞99％であった。ペプチドによる刺激後、様々なホスファターゼおよびキナーゼ阻害剤の存在下でRIPA緩衝液において細胞を溶解することによって、溶解物を採取した。タンパク質含有量を分析して、各試料約30 μgを12％SDS-PAGEゲルにローディングした。ゲルをニトロセルロースにブロットして、1％トライトンX 100を含むトリス緩衝生理食塩液（TBS）において5％スキムミルク粉末によって1時間ブロックした。リン酸化は、リン酸化特異的抗体によって検出した。
【０１５１】
ペプチド誘導リン酸化の結果を表46に概要する。SEQ ID NO:2は、マウスマクロファージRAW細胞株およびHBE細胞において、p38およびERK1/2の用量依存的なリン酸化を引き起こすことが判明した。SEQ ID NO:3は、THP-1ヒト単球細胞株においてMAPキナーゼのリン酸化を引き起こし、マウスRAW細胞株においてERK1/2のリン酸化を引き起こした。
【０１５２】
（表４７）ペプチドに反応したMAPキナーゼのリン酸化
2007505048.tif 000146
【０１５３】
（表４８）ヒト血液単球におけるMAPキナーゼのペプチドリン酸化
50 μg/mlのSEQ ID NO:1を用いてリン酸化を促進した。
2007505048.tif 000147
【０１５４】
実施例8
陽イオンペプチドは免疫応答を増強することによって細菌感染症に対して保護する
BALB/cマウスにサルモネラ1×105個および陽イオンペプチド（200 μg）を腹腔内注射によって投与した。マウスを24時間モニターして、その時点でマウスを安楽死させて、脾臓を摘出し、ホモジナイズしてPBSに浮遊させて、カナマイシン（50 μg/ml）を含むLuriaブロス寒天プレートに播種した。プレートを37℃で一晩インキュベートして、生存細菌に関して計数した（表49および50）。CD-1マウスに、5％ブタムチンにおいて黄色ブドウ球菌1×108個および陽イオンペプチド（200 μg）を腹腔内注射によって投与した（表51）。マウスを3日間モニターしてその時点で屠殺して血液を採取し、生存細胞数を調べるために播種した。CD-1雄性マウスにEHEC細菌5.8×106 CFUおよび陽イオンペプチド（200 μg）を腹腔内注射（IP）によって投与して、3日間モニターした（表52）。これらの動物モデルのそれぞれにおいて、ペプチドのサブセットは感染症に対する保護を示した。サルモネラモデルにおいて最も保護的なペプチドは、表50および51における保護アッセイの結果を表31〜37における遺伝子発現の結果と比較した場合に、上皮細胞において遺伝子の共通のサブセットの誘導能を示した（表53）。これは明らかに、ペプチドの保護を示す能力と一貫した遺伝子発現パターンが存在することを示している。陽イオンペプチドの多くは、最小生育阻止濃度（MIC）アッセイによって調べた場合に、直接の抗菌剤ではないことが示された（表54）。このことは、ペプチドの感染症保護能は、直接の抗菌活性よりむしろ、ペプチドの宿主先天性免疫の刺激能に依存することを証明している。
【０１５５】
（表４９）BALB/cマウスにおけるサルモネラ感染症に及ぼす陽イオンペプチドの作用
BALB/cマウスにサルモネラおよびペプチドを腹腔内注射して、24時間後に動物を安楽死させて、脾臓を摘出してホモジナイズし、PBSにおいて希釈して、細菌の生存率を決定するために、プレートの計数を行った。
2007505048.tif 000148
【０１５６】
（表５０）BALB/cマウスにおけるサルモネラ感染症に及ぼす陽イオンペプチドの作用
BALB/cマウスにサルモネラおよびペプチドを腹腔内注射して、24時間後に動物を安楽死させて、脾臓を摘出してホモジナイズし、PBSにおいて希釈して、細菌の生存率を決定するために、プレートの計数を行った。
2007505048.tif 000149
【０１５７】
（表５１）マウス黄色ブドウ球菌感染症モデルにおける陽イオンペプチドの作用
CD-1マウスに、5％ブタムチンにおいて細菌1×108個を腹腔内注射（IP）によって接種した。陽イオンペプチド（200 μg）を異なるIP注射によって投与した。マウスを3日間モニターして、その時点で安楽死させて、採血して生存細胞数を調べるために播種した。以下のペプチドは、黄色ブドウ球菌感染症の制御において有効ではなかった：SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:26。
2007505048.tif 000150
【０１５８】
（表５２）マウスEHEC感染症モデルにおけるペプチドの作用
CD-1雄性マウス（5週齢）にEHEC細菌5.8×106 CFUを腹腔内注射（IP）によって接種した。陽イオンペプチド（200 μg）を異なるIP注射によって投与した。マウスを3日間モニターした。
2007505048.tif 000151
【０１５９】
（表５３）インビボで活性であるペプチドによって誘導されたA549上皮細胞における遺伝子発現パターンのアップレギュレーション
ペプチドSEQ ID NO:30、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:13は、濃度50 μg/mlでそれぞれ4時間処置後に遺伝子発現パターンを増加させることが示された。ペプチドをヒトA549上皮細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離して、標識cDNAプローブに変換して、ヒトオペロンアレイ（PRHU04）とハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞におけるポリヌクレオチドの強度を、cDNAの標識に関して第二の列に示す（Cy3およびCy5の平均値）。アップレギュレーション倍率は、非刺激細胞の強度で除したペプチド刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。SEQ ID NO:37のペプチドは、マウス感染症モデルにおいて活性ではない陰性対照として含めた。
2007505048.tif 000152
【０１６０】
（表５４）
本明細書において調べたほとんどの陽イオンペプチド、および特に感染症モデルにおいて有効である陽イオンペプチドは、有意に抗菌的ではない。ペプチドの連続希釈液を表記の細菌と共に96ウェルにおいて一晩インキュベートした。細菌を殺すペプチドの最低濃度をMICとして用いた。記号＞は、MICが大きすぎて測定できないことを示す。MIC 8μg/mlまたはそれ未満は、臨床的に意味のある活性であると見なされた。省略語：E.coli、大腸菌；S.aureus、黄色ブドウ球菌；P.aerug、緑膿菌；S. typhim、腸炎菌亜種ネズミチフス菌；C. rhod、シトロバクター・ロデンシス；EHEC、腸管出血性大腸菌。
2007505048.tif 000153
2007505048.tif 000154
2007505048.tif 000155
【０１６１】
実施例9
診断／スクリーニングにおける細菌シグナル伝達分子によって誘導されたポリヌクレオチドの使用
ネズミチフス菌LPSおよび大腸菌O111:B4 LPSは、Sigma Chemical Co.（St. Louis、MO）から購入した。黄色ブドウ球菌のLTA（Sigma）を無エンドトキシン水（Sigma）に浮遊させた。LTA調製物に関してリムラス・アメーバ溶解物試験（Sigma）を行って、ロットがエンドトキシンによって有意に汚染されていないこと（すなわち、＜1 ng/ml、RAW細胞アッセイにおいて有意なサイトカイン産生を引き起こさない濃度）を確認した。CpGオリゴデオキシヌクレオチドを、Applied Biosystems Inc.モデル392 DNA/RNAシンセサイザー、Missisauga, ONによって合成した後、精製して無エンドトキシン水（Sigma）に浮遊させた。以下の配列を用いた：
2007505048.tif 000156
。非CpGオリゴは、そのサイトカイン産生刺激能に関して調べたところ、TNF-αまたはIL-6の有意な産生を引き起こさないことが判明し、したがって陰性対照として見なされた。培地単独、100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、または1μM CpG（RAW細胞において腫瘍壊死因子（TNF-α）の最適な誘導を引き起こす濃度）によって4時間インキュベートしたRAW 264.7細胞から、RNAを単離した。RNAを用いて上記のようにClontech AtlasポリヌクレオチドアレイフィルターにハイブリダイズさせたcDNAプローブをポリヌクレオチド化させた。cDNAプローブのそれぞれの固定DNAに対するハイブリダイゼーションは、オートラジオグラフィーによって可視化して、ホスホイメージャーを用いて定量した。少なくとも2または3回の独立した実験からの結果を表55〜59に要約する。RAW 264.7細胞のLPS処置によってIL-1β、誘導型酸化窒素シンターゼ（iNOS）、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α、CD40および多様な転写因子のような炎症性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む60個より多いポリヌクレオチドの発現の増加が起こることが判明した。LPS、LTA、およびCpG DNAによって誘導されたポリヌクレオチド発現の変化を比較したところ、これらの細菌産物は、三つ全てがiNOS、MIP-1α、MNP-2α、IL-1β、IL-15、TNFR1およびNF-κBのような前炎症性ポリヌクレオチドの発現を同程度に増加させることが判明した（表57）。表57は、その刺激比の差が三つの細菌産物のあいだで1.5倍未満であるという点において、同程度に細菌産物によってアップレギュレートされたポリヌクレオチド19個について記述している。同様に、LPS、LTA、およびCpGによって同程度にダウンレギュレートされたいくつかのポリペプチドが存在した。同様に、三つの細菌産物に反応して異なるように調節される多くのポリヌクレオチドが存在することが判明し（表58）、これには、一つまたは複数の細菌産物のあいだでの発現レベルの差が1.5倍より大きいこれらのポリヌクレオチドの多くが含まれた。LTA処置は、Jun-D、Jun-B、Elk-1ならびにサイクリンG2およびA1の発現の過剰刺激を含む、LPSまたはCpGと比較してポリヌクレオチドの最大のサブセットの発現に異なるように影響を及ぼした。その発現がLPSまたはCpG処置によってより大きく変化したポリヌクレオチドはごく少数であった。LTAまたはCpG処置と比較してLPS処置によって発現を選択的に増加させたポリヌクレオチドには、cAMP反応エレメントDNA結合タンパク質（CRE-BPI）、インターフェロン誘導型蛋白質1、およびCACCCボックス結合タンパク質BKLFが含まれた。LPSまたはLTA処置と比較してCpG処置後に発現が選択的に増加したポリヌクレオチドには、白血病阻害因子（LIF）およびプロテアーゼネキシン1（PN-1）が含まれた。これらの結果は、LPS、LTA、およびCpG DNAが大きく重なり合うポリヌクレオチド発現反応を刺激するが、同様に特定のサブセットのポリヌクレオチドの異なる調節能を示すことを示している。
【０１６２】
用いた他のポリヌクレオチドアレイは、ヒトオペロンアレイ（ゲノムの識別番号はPRHU04-S1）であり、これは1試料あたり2個ずつスポットしたヒトオリゴ約14,000個からなった。プローブを総RNA 5μgから調製して、Cy3またはCy5標識dUTPによって標識した。これらの実験において、A549上皮細胞を100 mm組織培養皿において2.5×106個/皿で播種して、一晩インキュベートした後、100 ng/ml大腸菌O111:B4 LPSによって4時間刺激した。RNAqueous（Ambion）を用いて総RNAを単離した。DNAの混入は、DNA-freeキット（Ambion）によって除去した。総RNAから調製したプローブを精製して、押印したスライドガラスに42℃で一晩ハイブリダイズさせて、洗浄した。洗浄後、Perkin Elmerアレイスキャナを用いて画像を獲得した。画像処理ソフトウェア（Imapolynucleotide 5.0、Marina Del Rey, CA）は、スポットの平均強度、強度の中央値、およびバックグラウンド強度を決定する。「施設内」プログラムを用いてバックグラウンドを除去した。プログラムは、各サブグリッドに関して最低の10％強度を計算して各グリッドに関してこれを差し引いた。分析はPolynucleotidespringソフトウェア（Redwood City, CA）によって行った。各スポットの強度は、スライドガラス内でのスポット値の集団からスポット強度の値の中央値を得て、この値を実験における全てのスライドガラスの値と比較することによって標準化した。対照細胞と比較してLPSによって処置した細胞において認められた相対的変化は、下記の表に認められうる。感染症の診断において有用であろうまだ報告されていない変化の多くを表60に記述する。
【０１６３】
これらの変化の機能的重要性を確認および評価するために、選択したmRNAおよびタンパク質のレベルを評価して、密度測定法によって定量した。CD14、ビメンチン、およびトリステトラプロリン特異的プローブを用いたノザンブロットにより、三つ全ての細菌産物による刺激後の発現が類似であることを確認した（表60）。炎症メディエータであるNOレベルを評価するために、グリース試薬を用いた酸化窒素シンターゼ、iNOSの酵素活性を同様に測定したところ、iNOS発現の類似のアップレギュレーションと一致して、24時間後に同等のNOレベルが産生されることが証明された（表59）。ウェスタンブロット分析から、CpGによって白血球阻害因子（LIF、IL-6サイトカインファミリーのメンバー）が選択的に刺激されることが確認された（表59）。他の確認実験により、LPSがELISAによって評価した場合にTNF-αおよびIL-6の発現をアップレギュレートすること、ならびにノザンブロット分析によって評価した場合にMIP-2αおよびIL-1βmRNAの発現をアップレギュレートすること、DP-1およびサイクリンD mRNAをダウンレギュレートすることが示された。細菌要素がヒト全血における前炎症性サイトカイン産生を刺激できるか否かを調べるために、分析を、より臨床的に関連するエクスビボ系に拡大した。大腸菌LPS、ネズミチフス菌LPS、および黄色ブドウ球菌LTAは全て、血清中のTNF-α、およびIL-1βの類似の量を刺激することが判明した。CpGはまた、かなり低いレベルではあるがこれらのサイトカインの産生を刺激し、細胞株データを部分的に確認した。
【０１６４】
（表５５）A549上皮細胞において大腸菌O111:B4 LPSによってアップレギュレートされたポリヌクレオチド
大腸菌O111:B4 LPS（100 ng/ml）は、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べた場合、A549細胞における多くのポリヌクレオチドの発現を増加させた。LPSを、A549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いて、Cy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。非刺激細胞の強度を表55の第二の列に示す。「比：LPS/対照」の列は、非刺激細胞の強度によって除したLPS刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000157
2007505048.tif 000158
2007505048.tif 000159
2007505048.tif 000160
2007505048.tif 000161
2007505048.tif 000162
【０１６５】
（表５６）A549上皮細胞において大腸菌O111:B4 LPSによってダウンレギュレートされたポリヌクレオチド
大腸菌O111:B4 LPS（100 ng/ml）は、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べた場合に、A549細胞における多くのポリヌクレオチドの発現を減少させた。LPSをA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。非刺激細胞の強度を、表の第二の列に示す。「比：LPS/対照」の列は、非刺激細胞の強度で除したLPS刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現強度を指す。
2007505048.tif 000163
2007505048.tif 000164
2007505048.tif 000165
2007505048.tif 000166
【０１６６】
（表５７）細菌産物LPS、LTA、およびCpG DNAによって刺激後に類似の程度に発現されたポリヌクレオチド
細菌産物（100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、または1μM CpG）は、いくつかのポリヌクレオチドの発現を強力に誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離して、標識cDNAプローブに変換して、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞の強度を第二の列に示す。「LPS/LTA/CpG：対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除した細菌産物刺激細胞のポリヌクレオチド発現の強度を指す。
2007505048.tif 000167
【０１６７】
（表５８）細菌産物LPS、LTA、およびCpG DNAによって異なるように調節されたポリヌクレオチド
細菌産物（100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、または1μM CpG）は、いくつかのポリヌクレオチドの発現を強力に誘導することが示された。ペプチドをRAW細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離して、標識cDNAプローブに変換して、Atlasアレイにハイブリダイズさせた。対照の非刺激細胞の強度を第二の列に示す。「LPS/LTA/CpG：対照の比」の列は、非刺激細胞の強度によって除した細菌産物刺激細胞のポリヌクレオチド発現の強度を指す。
2007505048.tif 000168
【０１６８】
（表５９）表57および58のアレイデータの確認
a）非刺激RAWマクロファージ細胞および100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNA、または培地単独によって4時間処置した細胞から総RNAを単離して、ノザンブロットを行い、メンブレンをGAPDH、CD14、ビメンチン、およびトリステトラプロリンに関して既に記述されたようにプロービングした[Scottら]。ノザンブロットのハイブリダイゼーション強度を、ローディングの際の不一致を調べるためにGAPDHと比較した。これらの実験を少なくとも3回繰り返して、示したデータは培地と比較した各条件の相対的レベルの平均値（密度測定によって測定）±標準誤差である。
b）RAW 264.7細胞を100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNA、または培地単独によって24時間刺激した。タンパク質溶解物を調製して、SDS PAGEゲルにおいて泳動させ、ウェスタンブロットを行ってLIF（R&D Systems）を検出した。これらの実験を少なくとも3回繰り返して、示したデータは培地と比較したLIFの相対レベル（密度測定によって測定）±標準誤差である。
c）100 ng/mlネズミチフス菌LPS、1μg/ml黄色ブドウ球菌LTA、1μM CpG DNAまたは培地単独によって24時間処置したRAWマクロファージ細胞から上清を回収して、既に記述されたように[Scottら]、グリース試薬によって安定なNO代謝物である窒素化物の蓄積から推定して、上清において形成されたNOの量を調べた。示したデータは、3回の実験の平均値±標準誤差である。
2007505048.tif 000169
【０１６９】
（表６０）細菌のシグナル伝達分子（LPS）によってアップレギュレートされたA549ヒト上皮細胞における遺伝子発現パターン
大腸菌O111:B4 LPS（100 ng/ml）は、ポリヌクレオチドマイクロアレイによって調べたところ、A549細胞において多くのポリヌクレオチドの発現を増加させた。LPSをA549細胞と共に4時間インキュベートして、RNAを単離した。総RNA 5μgを用いてCy3/Cy5標識cDNAプローブを作製し、ヒトオペロンアレイ（PRHU04）にハイブリダイズさせた。LPS刺激細胞におけるポリヌクレオチド発現の変化の例は、無処置細胞に対するLPS処置細胞の2倍より大きい強度レベルの変化を表す。
2007505048.tif 000170
2007505048.tif 000171
【０１７０】
実施例10
細菌感染症に対して保護するためのシグナル伝達の変化
ネズミチフス菌SL1344をAmerican Type Culture Collection（ATCC；Manassas, VA）から得て、ルリア-ベルタニ（LB）ブロスにおいて増殖させた。マクロファージ感染に関して、125 mlフラスコにおいてLB 10 mlを凍結したグリセロール保存液から接種して、37℃で振とうさせながら静止相まで一晩培養した。RAW 264.7細胞（1×105個/ウェル）を24ウェルプレートに播種した。細菌を培養培地において、名目上の感染多重度が100となるように希釈して、細菌を単層上で1000 rpmで10分間遠心して、感染を同期させて、感染を37℃、5％CO2インキュベータにおいて20分間進行させた。細胞をPBSによって3回洗浄して、細胞外細菌を除去した後、残存している如何なる細胞外細菌も殺し、再感染を防止するために、100 μg/mlゲンタマイシン（Sigma, St. Louis, MO）を含むDMEM＋10％FBSにおいてインキュベートした。2時間後、ゲンタマイシン濃度を10 μg/mlに低下させて、アッセイを通して維持した。細胞を、以下の濃度の阻害剤によって感染前に30分間前処置した：50 μM PD 98059（Calbiochem）、50 μM U0126（Promega）、2 mMジフェニルヨードニウム（DPI）、250 μMアセトバニロン（アポシニン、Aldrich）、1 mMアスコルビン酸（Sigma）、30 mM N-アセチルシステイン（Sigma）、および2 mM NG-L-モノメチルアルギニン（L-NMMA、Molecular Probes）、または2 mM NG-D-モノメチルアルギニン（D-NMMA、Molecular Probes）。確実に有効性が得られるように、調製したばかりの阻害剤を感染直後、感染後2時間、および6〜8時間に加えた。対照細胞を、培地1 mlあたり同等の容量のジメチルスルホキシド（DMSO）によって処置した。ネズミチフス菌SL1344の細胞内生存／複製は、既に記述されているように、ゲンタマイシン耐性アッセイを用いて決定した。簡単に説明すると、細胞をPBSによって2回洗浄して、ゲンタマイシンを除去し、1％トライトンX-100/0.1％SDSのPBS溶液によって感染後2時間および24時間目に溶解して、細胞内細菌数をLB寒天プレート上でのコロニー数から計算した。これらの感染条件において、マクロファージを標準的なプレート計数によって評価したところ、平均で細菌1個/細胞を含み、これによって感染後24時間でのマクロファージの分析を行うことができた。細菌の糸状化は細菌のストレスに関連する。NADPHオキシダーゼおよびiNOSは、MEK/ERKシグナル伝達によって活性化することができる。結果（表61）は、細胞のシグナル伝達の変化が、それによって細胞内サルモネラ感染症を寛解できる方法であることを明らかに証明している。このように、細菌は、ヒト細胞において多数の遺伝子をアップレギュレートすることから、シグナル伝達を遮断するこの戦略は、感染症に対する一般的治療法である。
【０１７１】
（表６１）IFN-γプライミングRAW細胞における細胞内細菌に及ぼすシグナル伝達分子MEKの影響
2007505048.tif 000172
【０１７２】
実施例11
抗ウイルス活性
SDF-1、C-X-Cケモカインは、HIV-1共受容体-CXCR4の天然のリガンドである。ケモカイン受容体CXCR4およびCCR5は、HIV-1複製阻害の標的となる可能性がある。SDF-1の結晶構造は、逆平行β-シート、およびCXCR4の陰性荷電細胞外ループに結合する際に肝要である陽性荷電表面を示す。これらの知見は、ケモカイン誘導体、低分子CXCR4アンタゴニスト、またはケモカインの構造もしくはイオン特性を模倣するアゴニストが、X4 HIV-1感染症を治療するために有用な物質となる可能性があることを示唆している。陽イオンペプチドはSDF-1誘導T-細胞遊走を阻害することが判明し、ペプチドがCXCR4アンタゴニストとして作用する可能性があることを示唆している。遊走アッセイは以下のように実施した。ヒトJurkat T細胞を化学走化性培地（RPMI 1640/10 mM Hepes/0.5％BSA）において5×106個/mlで浮遊させた。遊走アッセイを5μmポリカーボネートトランスウェルインサート（Costar）を用いて24ウェルプレートにおいて行った。簡単に説明すると、ペプチドまたは対照を化学走化性培地において希釈し、下室に入れて、細胞（5×106個/ml）0.1 mlを上室に加えた。37℃で3時間後、下室に遊走した細胞数をフローサイトメトリーを用いて決定した。下室からの培地をFACscanの中に30秒間通過させて、前方および側方散乱にゲートを設定して細胞の破片を除外した。細胞5×105個/mlを下室に直接ピペッティングした「100％遊走対照」と比較して、生存細胞数をFACscanにおいて30秒間計数した。結果は、ペプチドの添加によっておそらくCXCR4発現に影響を及ぼすことによって（表63および64）、ヒトJurkat T細胞（表62）の遊走阻害が起こることを証明している。
【０１７３】
（表６２）ペプチドはヒトJurkat T細胞の遊走を阻害する
2007505048.tif 000173
【０１７４】
（表６３）表56に対応するポリヌクレオチドアレイデータ
2007505048.tif 000174
【０１７５】
（表６４）表62および63に対応するFACsデータ
2007505048.tif 000175
【０１７６】
実施例12
相乗的併用
材料および方法
黄色ブドウ球菌をリン酸緩衝生理食塩液（PBS）および5％ブタムチン（Sigma）において、最終期待濃度が1〜4×107 CFU/mlとなるように調製した。黄色ブドウ球菌（5％ブタムチンと混合）100 μlを各CD-1マウス（体重20〜25 gの6〜8週齢雌性マウス（Charles River））に腹腔内注射した。感染開始6時間後、ペプチド100 μlを0.1 mg/kgセフェピムと共にIP注射した（50〜200 μg）。24時間後、動物を屠殺して、心穿刺を行って血液100 μlを得た。血液をヘパリンを含むPBS 1 mlにおいて希釈した。これをさらに希釈して、ミュラー-ヒントン寒天プレート（10-1、10-2、10-3、および10-4）において生存コロニー数を調べるためにに播種した。生存コロニー、コロニー形成単位（CFU）を24時間後に計数した。各実験は、少なくとも3回行った。データはCFUの平均値±標準誤差／治療群（マウス8〜10匹/群）として表す。
【０１７７】
全身性黄色ブドウ球菌感染の開始後6時間目に投与したペプチドおよび最適下セフェピムに関して実験を行った（図1）。図1のデータは、感染開始後24時間でのマウスから採取した血液からの生存細胞数の平均値±標準誤差として表す。最適下抗生物質（セフェピム）の投与とSEQ ID NO:7との併用によって、治療効率の改善が得られた。マウス感染症モデルにおいてペプチドが最適下濃度の抗生物質と併用して作用できることは重要な知見である。このことは、臨床における抗生物質の保存期間を延長させるおよび抗生物質耐性の発生率を減少させる可能性を示唆している。
【０１７８】
一例としてSEQ ID NO:1は、ヒト末梢血由来単球およびヒト気管支上皮細胞におけるマイトゲン活性化タンパク質キナーゼERK1/2およびp38のリン酸化および活性化を誘導したが、BまたはTリンパ球では誘導しなかった。リン酸化は、ヒト単球およびT細胞におけるSEQ ID NO:1誘導走化性の受容体であるとこれまでに提案されていたG-タンパク質共役受容体EPRL-1に依存しなかった。ERK1/2およびp38の活性化は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）の存在下で顕著に増加したが、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）の存在下では増加しなかった。SEQ ID NO:1に対する曝露によってまた、下流の転写因子であってリン酸化ERK1/2によって活性化されるElk-1の活性化が起こるのみならず、様々なElk-1制御遺伝子のアップレギュレーションが起こった。SEQ ID NO:1がこれらの経路を通してシグナルを伝達できることは、免疫、単球の活性化、増殖、および分化において広い意味を有する。
【０１７９】
材料および方法
SEQ ID NO:1（配列
2007505048.tif 000176
）は、UBCの核酸タンパク質合成（NAPS）部門においてFmoc[(N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル)]化学によって合成した。ヒト組換え型顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターロイキン-4（IL-4）、およびマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）は、Research Diagnostics Inc.（Flanders, NJ. USA）から購入した。百日咳毒素はList Biological Laboratories Inc.（Campbell, CA, USA）によって提供された。
【０１８０】
血液の単球は標準的な技術を用いて調製した。簡単に説明すると、新鮮なヒト血液100 mlを、UBC臨床試験倫理委員会プロトコールC02-0091に従ってボランティアからヘパリンナトリウムVacutainer採血管（Becton Dickinson, Mississauga, ON, Canada）に採取した。血液を、E-toxa-clean（Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada）洗浄無エンドトキシンボトルにおいて、RPMI 1640培地[10％v/v仔ウシ胎児血清（FBS）、1％L-グルタミン、1 nMピルビン酸ナトリウムを添加]と1：1比で混合した。Ficoll-Paque Plus（Amersham Pharmacia Biotech, Baie D'Urfe, PQ, Canada）を用いて室温でPBMCを分離して、リン酸緩衝生理食塩液（PBS）によって洗浄した。ビブリオコレラ（Vibrio cholerae）ノイラミニダーゼ（Calbiochem Biosciences Inc., La Jolla, CA, USA）によって前処置した新鮮なヒツジ赤血球（UBC動物飼育室）とのロゼット形成によってT-細胞を除去することによって単球を濃縮した。濃縮した単球をPBSによって洗浄し、37℃で1時間培養（約2〜3×106個/ウェル）して、非接着細胞を除去した。単球はフローサイトメトリーによって決定したところ、＞95％純粋であった（データは示していない）。Bリンパ球は、非接着細胞を除去して、それらを新しいプレートに37℃で1時間加えることによって単離した。これを全体で3回繰り返した。残っている如何なる単球もプレートに接着し、残留非接着細胞は主にB細胞であった。細胞をFalcon組織培養6ウェルプレート（Becton Dickinson, Mississauga, ON, Canada）において培養した。接着単球を、培地1 mlにおいて37℃で培養し、この培地に無エンドトキシン水（Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada）に溶解したSEQ ID NO:1および／またはサイトカインを加えた。無エンドトキシン水を溶媒対照として加えた。百日咳毒素を用いる試験の場合、毒素100 ng/mlを含む新鮮な培地に培地を交換して、37℃で60分間インキュベートした。SEQ ID NO:1およびサイトカインを、百日咳毒素を含む培地に直接加えた。Tリンパ球を単離する場合、ロゼット形成したT細胞およびヒツジ赤血球をPBS 20 mlに浮遊させて、蒸留水10 mlを加えて赤血球を溶解した。細胞を1000 rpmで5分間遠心後、上清を捨てた。沈降したT細胞をPBSによって速やかに洗浄して、全てのヒツジ赤血球が溶解するまで水の量を増加させて加えた。残っているT細胞をもう一度PBSによって洗浄して、生存率を0.4％トリパンブルー溶液を用いて確認した。初代培養ヒト血球およびT細胞を、10％v/v熱不活化FBS、1％v/v L-グルタミン、1 nMピルビン酸ナトリウム（GIBCO Invitrogen Corporation, Burlington, ON, Canada）を添加したRPMI 1640において培養した。それぞれの実験に関してドナー2人〜8人を用いた。
【０１８１】
シミアンウイルス-40形質転換不死化16HBE4o-気管支上皮細胞株はD. Gruenert博士（University of Calfornia, San Francisco, CA）の寄贈であった。細胞は、日常的に湿度100％および5％CO2において37℃でコンフルエンスとなるまで培養した。細胞を、10％FBS（Hyclone）、2 mM L-グルタミンを含むアール塩（GIBCO Invitrogen Corporation, Burlington, ON, Canada）を含む最小基本培地において増殖させた。実験に関して、細胞を24ウェルプレートにおいてCostar Transwellインサート（口径3μm、Fischer Scientific）上で増殖させた。細胞を培地0.25 mlあたり5×104個でインサートの上部で播種して、培地0.95 mlをウェルの下部に加え、37℃および5％CO2で培養した。膜通過抵抗性は、ミリポア電圧抵抗計によって毎日測定し、インサートを典型的に、抵抗が500〜700オームである8〜10日後に実験に用いた。細胞は継代8〜20代のあいだで用いた。
【０１８２】
ウェスタンイムノブロッティング
刺激後、細胞を1 mMバナジン酸塩（Sigma）を含む氷冷PBSによって洗浄した。次に、RIPA緩衝液（50 mMトリス-HCl、pH 7.4、1％NP-40、0.25％デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF、各1μg/mlのアプロチニン、ロイペプチン、ペプスタチン、1 mMオルトバナジン酸ナトリウム、1 mM NaF）125 μlを加えて、肉眼的に評価して細胞が完全に溶解するまで、細胞を氷中でインキュベートした。溶解物をBCAアッセイ（Pierce）を用いて定量した。溶解物30 μlを厚さ1.5 mmのゲルにローディングして、これを100ボルトで約2時間泳動した。タンパク質をニトロセルロースフィルターに70 Vで75分間転写した。フィルターを5％スキムミルクのTBST（10 mMトリス-HCl、pH 8、150 mM NaCl、0.1％ツイーン-20）溶液によって室温で2時間ブロックした。次に、フィルターを抗ERK1/2-Pまたは抗-p38-P（Cell Signaling, Technology, Ma）モノクローナル抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。免疫反応性バンドを西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスIgG抗体（Amersham Pharmacia, New Jersey）および化学発光検出（Sigma, MO）を用いて検出した。バンドを定量するために、フィルムをスキャンして、ソフトウェアプログラムImageJを用いて密度測定によって定量した。ブロットをβ-アクチン抗体（ICN Biomedical Incorporated, Ohio）によって再プロービングして、密度測定を行ってタンパク質のローディングを補正した。
【０１８３】
キナーゼアッセイ
ERK1/2活性アッセイは非放射活性キット（Cell Signaling, Technology）を用いて行った。簡単に説明すると、細胞を15分間処置して、溶解緩衝液において溶解した。等量のタンパク質を、ERK1/2のリン酸化（すなわち活性化）型に限って反応する固定ホスホERK1/2抗体によって免疫沈殿した。固定された沈殿した酵素を、Elk-1を用いるキナーゼアッセイに用いた後、リン酸化基質を検出および定量することができる抗体によるウェスタンブロット分析を行った。
【０１８４】
IL-8の定量
16HBE40細胞の上清からのヒトIL-8は、製造元の説明書に従って市販の酵素結合イムノソルベントアッセイキット（Biosource）を用いて測定した。
【０１８５】
半定量的RT-PCR
二つの独立した実験からの総RNAを、製造元によって記述されたRNAqueous（Ambion）16HBE40細胞から単離した。試料をDNアーゼによって処置した後、第一鎖cDNA合成キット（Gibco）を用いてcDNA合成を行った。得られたcDNAを様々なサイトカイン遺伝子
2007505048.tif 000177
のPCRにおける鋳型として用いた。各RT-PCR反応を少なくとも1試料あたり2個ずつ行った。結果を増幅の直線相において分析し、ハウスキーピング対照であるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼに対して標準化した。逆転写酵素を用いない対象を含めることによって、反応をRNA増幅に関して確認した。
【０１８６】
結果
A．ペプチドは末梢血由来単球においてERK1/2およびp38のリン酸化を誘導する
ペプチドがMAPキナーゼ、ERK1/2、および／またはp38の活性化を誘導するか否かを決定するために、末梢血由来単球を50 μg/ml SEQ ID NO:1または水（溶媒対照として）によって15分間処置した。キナーゼの活性化（リン酸化）型を可視化するために、キナーゼの二重リン酸化型（ERK1/2およびp38に関してそれぞれ、Thr202＋Tyr204およびThr180＋Tyr182でのリン酸化）に対して特異的な抗体によるウェスタンブロットを行った。ゲルをβ-アクチンに対する抗体によって再プロービングして、ローディングの差を標準化した。全てにおいて、ERK1/2（n＝8）およびp38（n＝4）のリン酸化の増加がSEQ ID NO:1の処置に反応して認められた（図2）。
【０１８７】
図2は、SEQ ID NO:1に対する曝露によって、ERK1/2およびp38のリン酸化が誘導されることを示している。ヒト末梢血由来単球からの溶解物を50 μg/ml SEQ ID NO:1に15分間露出した。A）ERKおよびp38のリン酸化型に対して特異的な抗体を用いて、ERK1/2およびp38の活性化を検出した。調べたドナーは全て、SEQ ID NO:1の処置に反応してERK1/2およびp38のリン酸化の増加を示した。ドナー8人中代表的なドナー1人。ERK（B）およびp38（C）のリン酸化の相対量は、材料および方法に記述されるように、対応する対照バンドの強度によってリン酸化バンドの強度を除することによって決定した。
【０１８８】
B．ペプチドによるERK1/2の活性化はウシ胎児血清よりヒト血清において大きい
本発明者らは、LL-37によるERK1/2のリン酸化が血清の非存在下では起こらないこと、およびリン酸化の程度が、ERK1/2の活性化がウシ胎児血清（FBS）よりヒト血清（HS）においてかなり優れているように、存在する血清のタイプに依存することをを証明することができた。
【０１８９】
図3は、LL-37によるERK1/2のリン酸化が血清の非存在下では起こらないこと、およびリン酸化の程度が、存在する血清のタイプに依存することを示している。ヒト血液由来単球を50 μg/ml LL-37によって15分間処置した。溶解物を12％アクリルアミドゲルにおいて泳動した後、ニトロセルロースメンブレンに転写して、キナーゼのリン酸化（活性）型に対して特異的な抗体によってプロービングした。タンパク質のローディングを標準化するために、ブロットをβ-アクチンによって再プロービングした。定量はImageJソフトウェアによって行った。図3の挿入図は、LL-37が無血清条件ではヒト単球においてMAPK活性化を誘導することができないことを証明している。細胞を50 mg/ml LL-37（+）または溶媒対照として無エンドトキシン水（-）に15分間曝露した。（A）10％仔ウシ胎児血清を含む培地においてLL-37に曝露した後、リン酸化ERK1/2は検出可能であったが、ERK1/2のリン酸化は血清の非存在下では検出されなかった（n＝3）。（B）ERK1/2の下流の転写因子であるElk-1は、10％仔ウシ胎児血清を含む培地において50 μg/ml LL-37の曝露によって活性化（リン酸化）されたが、血清の非存在下では活性化されなかった（n＝2）。
【０１９０】
C．ペプチドによるERK1/2およびp38の活性化は用量依存的であり、GM-CSFとの相乗作用を示す
GM-CSF、IL-4、またはM-CSF（それぞれ、100 ng/ml）をSEQ ID NO:1と同時に加えて、新たに単離したヒト血液単球においてERK1/2のリン酸化を測定した。細胞を50 μg/ml SEQ ID NO:1によって処置した場合、ERK1/2リン酸化は明白であった（無処置に対して8.3倍増加、n＝9）が、より低い濃度（n＝2）では明白ではなかった。100 ng/ml GM-CSFの存在下では、SEQ ID NO:1によるERK1/2リン酸化は、顕著に増加した（無処置より58倍増加、n＝5）。さらに、GM-CSFの存在下では、ERK1/2の活性化は、調べたドナー2人においてそれぞれ、5および10 μg/ml SEQ ID NO:1の濃度に反応して起こった（図4）。このことは、SEQ ID NO:1が、炎症部位で局所的に認められるサイトカインであるGM-CSFの存在下では、より低い閾値でERK1/2の活性化を誘導したことを証明する。
【０１９１】
図4は、LL-37がERK1/2の活性化をより低い濃度で誘導して、特定のサイトカインの存在下で増幅されることを示している。新たに単離した単球を、GM-CSF（100 ng/ml）およびIL-4（100 ng/ml）の双方を含む培地において刺激した場合、LL-37によるERK1/2のリン酸化は、5μg/mlもの低い濃度で明らかであった。ERK1/2のこの相乗的活性化は、主にGM-CSFによるものであるように思われる。
【０１９２】
D．ERK1/2の活性化によって、Elk-1制御遺伝子の転写およびIL-8の分泌が起こる
IL-8は少なくとも部分的にERK1/2およびp38キナーゼの活性化によって支配される。ペプチドがIL-8分泌を誘導できるか否かを調べるために、ヒト気管支細胞株16HBE4o-をTranswellフィルターにおいてコンフルエンシーまで増殖させ、これによって細胞の分極が起こり、明瞭な先端および基底表面が作製される。細胞を先端表面において50 μg/ml SEQ ID NO:1によって4時間刺激した場合、先端上清に放出されたIL-8の統計学的に有意な増加が検出された（図5）。ペプチドによるMAPキナーゼ活性化の下流の転写効果を決定するために、ERK1/2またはp38によって調節されることが公知である遺伝子の発現を、RT-PCRによって評価した。RT-PCRは、2回の独立した実験から、16HBE4o-細胞から単離され、血清の存在下で50 μg/ml SEQ ID NO:1を4時間処置されたRNAについて行った。MCP-1およびIL-8はERK1/2およびp38の双方の転写制御下にあることが証明されており、これと一致してそれらはそれぞれ、2.4および4.3倍アップレギュレートされる。MCP-3の転写はこれまで、マイトゲン活性化タンパク質キナーゼの活性化によって影響を受けないことが証明されており、これと一致して発現はペプチド処置によって影響を受けない（図5）。これらのデータは、ERK1/2およびp38シグナル伝達経路の活性化が、免疫調節機能を有するサイトカイン遺伝子の転写に対して機能的影響を及ぼすという仮説と一致する。図3Bの挿入図はまた、ペプチドが血清依存的に転写因子Elk-1のリン酸化を誘導したことを証明している。
【０１９３】
図5は、ペプチドが、16HBE4o-ヒト気管支上皮細胞株において様々なサイトカイン遺伝子の転写およびIL-8の放出の双方に影響を及ぼすことを示している。細胞を、半透過性膜においてコンフルエンシーまで増殖させ、50 μg/ml SEQ ID NO:1によって先端表面で4時間刺激した。A）SEQ ID NO:1処置細胞は、先端上面から採取した上清においてELISAによって検出したところ、対照より有意に多いIL-8を産生したが、基底側方表面からは産生されなかった。独立した3回の実験の平均値±SEを示し、星印はp＝0.002を示す。B）RNAを上記の実験から採取して、RT-PCRを行った。ERK1/2またはp38のいずれかによって調節されることが知られたサイトカイン遺伝子の数は、ペプチドによる刺激の際にアップレギュレートされた。独立した2回の実験の平均値を示す。
【０１９４】
本発明は、現在好ましい態様を参照して記述してきたが、様々な改変を行うことができ、それらも本発明の趣旨に含まれると理解すべきである。したがって、本発明は以下の請求の範囲に限って制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
【図１】黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染症を治癒するためにセフェピムとSEQ ID NO:7の相乗作用を示す。CD-1マウス（1群8匹）に黄色ブドウ球菌1×107個を5％ブタムチンにおいてIP注射によって接種した。試験化合物（50μg〜2.5 mg/kg）を、黄色ブドウ球菌の6時間後に異なるIP注射によって投与した。この時点でセフェピムも0.1 mg/kgの用量で投与した。マウスを24時間後に安楽死させて、血液を採取して、生存細胞数を計数するために播種した。平均値±標準誤差を示す。本実験は、2回繰り返した。
【図２】SEQ ID NO:1に対する曝露がERK1/2およびp38のリン酸化を誘導することを示す。ヒト末梢血由来単球の溶解物を50 μg/ml SEQ ID NO:1に15分間曝露した。A）ERKおよびp38のリン酸化型に対して特異的な抗体を用いて、ERK1/2およびp38の活性化を検出した。調べたドナーは全て、SEQ ID NO:1の処置に反応してERK1/2およびp38のリン酸化の増加を示した。8匹中の代表的なドナー1匹。ERK（B）およびp38（C）の相対的リン酸化量は、リン酸化バンドの強度を、材料および方法に記述される対応する対照バンドの強度によって除することによって決定した。
【図３】LL-37誘導ERK1/2のリン酸化は、血清の非存在下では起こらないこと、およびリン酸化の程度が存在する血清のタイプに依存することを示す。ヒト血液由来単球を、50μg/ml LL-37によって15分間処置した。溶解物を12％アクリルアミドゲルにおいて泳動させた後、ニトロセルロースメンブレンに転写して、キナーゼのリン酸化（活性化）型に対して特異的な抗体によってプロービングした。タンパク質のローディングを標準化するために、ブロットをβ-アクチンによって再プロービングした。定量はImageJソフトウェアを用いて行った。図3の挿入図は、LL-37が無血清条件でヒト単球においてMAPK活性化を誘導できないことを示している。細胞を50 mg/ml LL-37 （+）または溶媒対照として無エンドトキシン水（-）に15分間曝露した。（A）10％仔ウシ胎児血清を含む培地においてLL-37に曝露した後、リン酸化ERK1/2は検出可能であったが、ERK1/2のリン酸化は血清の非存在下では検出されなかった（n＝3）。（B）ERK1/2の下流の転写因子であるElk-1は、10％仔ウシ胎児血清を含む培地において50μg/ml LL-37に曝露した後活性化（リン酸化）されたが、血清の非存在下では活性化されなかった（n＝2）。
【図４】ERK1/2のLL-37による活性化はより低い濃度で起こること、および特定のサイトカインの存在下で増幅されることを示している。単離したばかりの単球を、GM-CSF（100 ng/ml）およびIL-4（100 ng/ml）の双方を含む培地において刺激したところ、LL-37によるERK1/2のリン酸化は、5μg/mlもの低い濃度で存在した。ERK1/2のこの相乗的活性化は、主にGM-CSFによるものであると思われる。
【図５】ペプチドが、16HBE4o-ヒト気管支上皮細胞株における様々なサイトカイン遺伝子の転写およびIL-8の放出の双方に影響を及ぼすことを示す。細胞を半透過性メンブレンにおいてコンフルエンシーまで増殖させて、先端表面を50μg/ml SEQ ID NO:1によって4時間刺激した。A）SEQ ID NO:1処置細胞は、先端表面から回収した上清においてELISAによって検出したところ、対照より有意に多いIL-8を産生したが、基底側方表面からは産生しなかった。3回の独立した実験の平均値±SEを示し、星印は、p＝0.002を示す。B）上記の実験からRNAを回収して、RT-PCRを行った。ERK1/2またはp38のいずれかによって調節されることが知られている多くのサイトカイン遺伝子が、ペプチドによる刺激によってアップレギュレートされた。独立した二つの実験の平均値を示す。
【図１】
2007505048.tif 000179
【図２】
2007505048.tif 000180
【図３】
2007505048.tif 000181
【図４】
2007505048.tif 000182
【図５】
2007505048.tif 000183
【配列表】
2007505048000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月17日(2006.5.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における先天性免疫を刺激するための、SEQ ID NO：1〜4、11、18、25、32、39、46、53、または54に記載のペプチド。
【請求項２】
被験者が感染症を有するかまたは感染症を有する危険性のある、請求項1記載の使用のためのペプチド。
【請求項３】
ペプチドと併用して抗生物質をさらに含む、請求項1または2記載の使用のためのペプチド。
【請求項４】
先天性免疫が、宿主免疫細胞の活性化、増殖、分化、またはMAPキナーゼ経路活性化によって証明される、請求項1から3のいずれか一項記載の使用のためのペプチド。
【請求項５】
MAPキナーゼがMEKおよび／またはERKである、請求項4記載の使用のためのペプチド。
【請求項６】
GM-CSFをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項記載の使用のためのペプチド。
【請求項７】
ペプチドがD-エナンチオマーである少なくとも一つのアミノ酸を含む、請求項1から6のいずれか一項記載の使用のためのペプチド。
【請求項８】
ペプチドが環状である、請求項1から7のいずれか一項記載の使用のためのペプチド。
【請求項９】
ペプチドの配列が逆転している、請求項1から8のいずれか一項記載の使用のためのペプチド。
【請求項１０】
抗生物質が、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、カルバセフェム、セファマイシン、クロラムフェニコール、グリシルサイクリン（glycylcycline）、リコサミド（licosamide）、アミノシクリトール、陽イオン抗菌ペプチド、リポペプチド、ポリミキシン、ストレプトグラミン、オキサゾラジノン、リンコサミド（lincosamide）、フルオロキノロン、カルバペネム、テトラサイクリン、マクロライド、βラクタム、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、またはグリコペプチドから選択される、請求項3記載の使用のためのペプチド。
【請求項１１】
ペプチドが抗炎症活性を有する、請求項１から10のいずれか一項記載の使用のためのペプチド。
【請求項１２】
ペプチドが抗敗血症活性を有する、請求項1から10のいずれかの一項記載の使用のためのペプチド。
【請求項１３】
被験者における先天性免疫を刺激するための薬物の製造における、SEQ ID NO : 1〜4、11、18、25、32、39、46、53、または54で示したペプチドの使用。
【国際調査報告】
2007505048.tif 000184
2007505048.tif 000185
2007505048.tif 000186
2007505048.tif 000187