(57)【要約】  配列番号１〜８０のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１０以上の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記ヌクレオチド配列の１０１位のヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断若しくは治療用ポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜８０のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１０以上の連続したヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチド配列の２０１位のヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断若しくは治療用ポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする、二型糖尿病の診断または治療用ポリヌクレオチド。
【請求項３】
長さが１０ないし１００ヌクレオチドである、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
プライマーまたはプローブである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断用マイクロアレイ。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断用キット。
【請求項７】
（ａ）個体から核酸試料を単離する段階と；
（ｂ）配列番号１〜８０のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドのうちの１以上の多型部位（１０１位）のヌクレオチドを決定する段階と、
を含む、前記個体における二型糖尿病の診断方法。
【請求項８】
前記１以上の多型部位のヌクレオチドを決定する段階は、
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイ上に前記核酸試料をハイブリダイズさせる段階と；
ハイブリダイゼーションの結果を検出する段階と、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リスク対立遺伝子を含む、配列番号２、４、５、８、９、１１、１３、１６、１８、２０、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３３、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６２、６３、６５、６７、６９、７１、７５、７７、及び８０から選択される１以上のヌクレオチド配列が検出される場合に、前記個体は二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性が高いと決定する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、二型糖尿病に関与するポリヌクレオチド、それを含むマイクロアレイ及び診断キット、並びに二型糖尿病に関与するポリヌクレオチドの分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
あらゆる生物のゲノムは、永続的な進化の過程で自然突然変異を経るため、先祖の核酸配列の変異形態を生じる（Ｇｕｓｅｌｌａ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５５，８３１−８５４（１９８６））。変異形態は、先祖の形態に比べて進化上利益若しくは不利益を与えるか、またはその中間の場合もある。ある場合には、変異形態が致死の不利益を与えて、当該生物の次世代に伝達されることはない。他の場合には、変異形態が種に進化上の利益を与え、結局、その種のほとんどの個体のＤＮＡに組み込まれることとなり、効果的に先祖形態となる。多くの場合、先祖形態及び変異形態は共に生き残り、種集団中に共存するようになる。配列の複数形態の共存により、多型が発生する。
【０００３】
多型としていくつかのタイプが知られており、ＲＦＬＰ（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：制限断片長多型）、ＳＴＲ（ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ：短縦列反復配列）、ＶＮＴＲ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ：数の様々な縦列反復配列）、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）などが含まれる。このうち、ＳＮＰは同じ種の個体間の単一ヌクレオチド変異の形態を取る。ＳＮＰは、タンパク質のコーディング配列内に発生すると、多型形態のうちいずれであっても欠陥タンパク質、または変異タンパク質が発現する場合がある。他方、ＳＮＰが非コーディング配列内に発生すると、それらの多型のうちの一部が、欠陥タンパク質若しくは変異タンパク質の発現を招くことがある（例えば、欠陥のあるスプライシングの結果として）。その他のＳＮＰは、表現型に何らの影響も及ぼさない。
【０００４】
ヒトのＳＮＰは、約１，０００ｂｐごとに一回の頻度で発生することが知られている。それらＳＮＰが疾病のような表現型の発現を誘導する場合、前記ＳＮＰを含むポリヌクレオチドは、かかる疾病の診断用のプライマーまたはプローブとして使用することができる。前記ＳＮＰと特異的に結合するモノクローナル抗体もまた疾病の診断に使用することができる。現在、多くの研究機関でＳＮＰのヌクレオチド配列及び機能に関する研究が行われている。同定されたヒトＳＮＰのヌクレオチド配列や他の実験結果はデータベース化され、容易に利用可能となってきている。
【０００５】
現在までに利用可能となっている知見がたとえ、特定のＳＮＰがヒトゲノム若しくはｃＤＮＡ上に存在することを示していても、かかるＳＮＰの表現型に及ぼす影響が明らかにされているわけではない。一部のＳＮＰを除く、大半のＳＮＰの機能はまだ明らかにされていない。
【０００６】
二型糖尿病（ＴｙｐｅＩＩ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ）は、糖尿病患者全体のうち９０〜９５％に該当すると知られている。二型糖尿病は、体内でインシュリンを異常に生産するか、またはインシュリン感受性が低い人間がかかる病気であり、これにより、血液中の血糖値が大きく変化してしまう。インシュリン分泌の異常によって二型糖尿病の状態となる場合、血中のグルコースを体細胞に運ぶことができず、食物をエネルギーに変換するのが困難になる。二型糖尿病の発病には、遺伝的要因があると知られている。二型糖尿病に関する、それ以外のリスク要因としては、４５才以上の年齢、糖尿病に対する家族歴、肥満、高血圧、及び高コレステロール値がある。現在、糖尿病の診断は主に、病理学的な表現型の変化、すなわち空腹時血糖（ＦＳＢ：ｆａｓｔｉｎｇ  ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｇａｒ）試験、グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ：ｏｒａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｅｓｔ）などを用いて血中グルコース値を評価することによって行われている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｄｄｋ．ｎｉｈ．ｇｏｖ，２００３）。二型糖尿病の診断がなされる場合、運動、特別な食餌療法、体重調節、薬物療法などを介して二型糖尿病の予防が可能となるか、またはその発症を遅らせることが可能となる。この点において、二型糖尿病は早期診断が非常に望まれている疾病であると言える。ミレニアム・ファーマシューティカルズ社（Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）から、ＨＮＦ１遺伝子上に存在する遺伝子型変異に基づいて、二型糖尿病の診断と予測とが可能であるという発表がなされた（ＰＲ  ｎｅｗｓｗｉｒｅ，Ｓｅｐｔ１，１９９８）。また、シーケノム社（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  Ｉｎｃ．）からは、ＦＯＸＡ２（ＨＮＦ３β）遺伝子が二型糖尿病に高度に関与しているという発表がなされた（ＰＲ  Ｎｅｗｓｗｉｒｅ，Ｏｃｔ２８，２００３）。二型糖尿病に関与するいくつかの遺伝子について報告されているが、二型糖尿病の発病に関する研究は、特定の集団における数本の染色体の特定遺伝子上に集中している。これにより、人種によって異なる研究結果が示される可能性がある。更に、二型糖尿病の原因遺伝子は全て、未だ同定されていない。かかる分子生物学的方法による二型糖尿病の診断はまだ一般的ではない。更に、二型糖尿病の発病前の早期診断は現在利用できない。このため、ヒトゲノム全体を対象に、二型糖尿病に高度に関与している新しいＳＮＰ及び関連遺伝子を探し出し、当該ＳＮＰ及び関連遺伝子を用いて二型糖尿病の早期診断を行わなければならないという必要性が高まっている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の詳細な説明
発明の技術目的
本発明は、二型糖尿病に関与する一塩基多型を含むポリヌクレオチドを提供する。
【０００８】
本発明はまた、各々、二型糖尿病に関与する一塩基多型を含むポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ及び二型糖尿病診断キットを提供する。
【０００９】
本発明はまた、二型糖尿病に関与するポリヌクレオチドの分析方法を提供することである。
【００１０】
発明の開示
本発明は、配列番号１〜８０のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１０以上の連続したヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチド配列のうちの多型部位（１０１位）のヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断若しくは治療用ポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチドを提供する。
【００１１】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１〜８０のヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列の多型部位を含む１０ヌクレオチド以上の連続した範囲を含むものである。前記ポリヌクレオチドの長さは、１０ないし４００ヌクレオチド、好ましくは１０ないし１００ヌクレオチド、さらに好ましくは１０ないし５０ヌクレオチドである。ここで、配列番号１〜８０の各ヌクレオチド配列の多型部位は、１０１位である。
【００１２】
前記配列番号１〜８０のヌクレオチド配列はそれぞれ多型配列である。多型配列とは、一塩基多型（ＳＮＰ）が生じる多型部位を含むヌクレオチド配列をいう。多型部位とは、ＳＮＰの起こる多型配列の部位をいう。前記ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらであってもよい。
【００１３】
本発明において、前記配列番号１〜８０の多型配列の多型部位（１０１位）は、二型糖尿病に関与する。これは、二型糖尿病患者と正常者とからそれぞれ得られた血液試料のＤＮＡ配列を分析することにより確認されている。表１−１、１−２、２−１、及び２−２は、二型糖尿病を伴った前記配列番号１〜８０の多型配列と二型糖尿病との関係、及び前記多型配列の特性をまとめたものである。
【００１４】
【表１】
2007516719.tif 000002
【００１５】
【表２】
2007516719.tif 000003
【００１６】
【表３】
2007516719.tif 000004
【００１７】
【表４】
2007516719.tif 000005
【００１８】
【表５】
2007516719.tif 000006
【００１９】
【表６】
2007516719.tif 000007
【００２０】
【表７】
2007516719.tif 000008
【００２１】
【表８】
2007516719.tif 000009
【００２２】
表１−１及び１−２において、各欄の内容が意味するところは次の通りである。
【００２３】
Ａｓｓａｙ＿ＩＤは、マーカーの名称を表す。
【００２４】
ＳＮＰは、ＳＮＰ多型部位の多型塩基を示す。ここで、Ａ１及びＡ２はそれぞれ、シーケノム社の均質的ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ：ｈＭＥ）法による配列分析の結果として、質量の小さな対立遺伝子をＡ１、及び質量の大きい対立遺伝子をＡ２と表し、任意的に実験の便宜上命名したものである。
【００２５】
ＳＮＰ配列は、ＳＮＰ部位を含む配列、すなわち、１０１位に対立遺伝子Ａ１若しくはＡ２を含む配列を示す。
【００２６】
対立遺伝子頻度（ａｌｌｅｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）欄で、ｃａｓ＿Ａ２、ｃｏｎ＿Ａ２、及びＤｅｌｔａは、それぞれ疾病群（ｃａｓｅ  ｇｒｏｕｐ）の対立遺伝子Ａ２の頻度、正常群（ｎｏｒｍａｌ  ｇｒｏｕｐ）の対立遺伝子Ａ２の頻度、及び前記ｃａｓ−Ａ２とｃｏｎ＿Ａ２との間の差の絶対値を表す。ここで、ｃａｓ＿Ａ２は前記疾病群における、（遺伝子型Ａ２Ａ２の頻度×２＋遺伝子型Ａ１Ａ２の頻度）／（試料数×２）であり、ｃｏｎ＿Ａ２は前記正常群における、（遺伝子型Ａ２Ａ２の頻度×２＋遺伝子型Ａ１Ａ２の頻度）／（試料数×２）である。
【００２７】
遺伝子型頻度（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）は、各遺伝子型の頻度を示す。ここで、前記疾病群においてｃａｓ＿Ａ１Ａ１、ｃａｓ＿Ａ１Ａ２、及びｃａｓ＿Ａ２Ａ２はそれぞれ遺伝子型Ａ１Ａ１、Ａ１Ａ２、及びＡ２Ａ２を有する人の数を示し、前記正常群においてｃｏｎ＿Ａ１Ａ１、ｃｏｎ＿Ａ１Ａ２、及びｃｏｎ＿Ａ２Ａ２は、それぞれ遺伝子型Ａ１Ａ１、Ａ１Ａ２、及びＡ２Ａ２を有する人の数を示す。
【００２８】
ｄｆ＝２は、自由度が２であるカイ二乗値を示す。ｃｈｉ−ｖａｌｕｅはカイ二乗値を示し、ｐ−ｖａｌｕｅは前記ｃｈｉ−ｖａｌｕｅに基づいて決定される。ｃｈｉ＿ｅｘａｃｔ＿ｐ−ｖａｌｕｅは、カイ二乗検定に対するフィッシャーの正確確率検定のｐ−ｖａｌｕｅ（ｐ値）を示す。遺伝子型数が５未満の場合、カイ二乗検定の結果は不正確となりうる。そのため、フィッシャーの正確確率検定による、さらに正確な統計的有意性（ｐ−ｖａｌｕｅ）の決定が求められる。ｃｈｉ＿ｅｘａｃｔ＿ｐ−ｖａｌｕｅは、フィッシャーの正確確率検定に用いられる変数である。本発明では、ｐ−ｖａｌｕｅ≦０．０５である場合、前記疾病群と前記正常群との遺伝子型が同じではない、すなわち、両者の間に有意差があると考えられる。
【００２９】
リスク対立遺伝子（ｒｉｓｋ  ａｌｌｅｌｅ）の欄では、基準対立遺伝子をＡ２とし、前記疾病群での前記対立遺伝子Ａ２の頻度が前記正常群での前記対立遺伝子Ａ２の頻度より大きい（すなわち、ｃａｓ＿Ａ２＞ｃｏｎ＿Ａ２である）場合には、前記対立遺伝子Ａ２をリスク対立遺伝子とする。その反対の場合には、対立遺伝子Ａ１をリスク対立遺伝子とする。
【００３０】
オッズ比は、前記正常群中でのリスク対立遺伝子を有する確率に対する、前記疾病群中でのリスク対立遺伝子を有する確率の比を表す。本発明では、マンテルヘンツェル（Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌ）オッズ比法を使用した。ＣＩは、オッズ比に対する９５％信頼区間を示し、（下限信頼区間、上限信頼区間）で表される。１が前記信頼区間に該当すると、リスク対立遺伝子の疾病への関与はほとんどないと考えられる。
【００３１】
ＨＷＥは、ハーディーワインバーグ平衡（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）を示す。ここで、ｃｏｎ＿ＨＷＥ及びｃａｓ＿ＨＷＥは、それぞれ前記正常群及び前記疾病群におけるハーディーワインバーグ平衡からの偏位度を表す。カイ二乗（ｄｆ＝１）検定におけるｃｈｉ＿ｖａｌｕｅ＝６．６３（ｐ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｄｆ＝１）を基準に、６．６３より大きい値はハーディーワインバーグ非平衡（ＨＷＤ：Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）と判断し、６．６３より小さな値はハーディーワインバーグ平衡（ＨＷＥ：Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）と判断した。
【００３２】
ｃａｌｌ＿ｒａｔｅ（コール率）は、実験に使用された試料総数に対する遺伝子型の説明が可能な試料数を示す。ここで、ｃａｓ＿ｃａｌｌ＿ｒａｔｅ及びｃｏｎ＿ｃａｌｌ＿ｒａｔｅは、それぞれ前記疾病群及び前記正常群に使用された総試料数（３００人）に対する、遺伝子型の説明が可能な試料数の比を表す。
【００３３】
表２−１及び２−２は、ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  １２３を基準とする、ＳＮＰマーカーの特性を示す。
【００３４】
表１−１、１−２、２−１、及び２−２に示すように、本発明の配列番号１〜８０の多型マーカーについてのカイ二乗検定によれば、ｃｈｉ＿ｅｘａｃｔ＿ｐ−ｖａｌｕｅが９５％の信頼区間で４．５４×１０−４〜０．０１０４の範囲をとる。このことは、配列番号１〜８０の多型マーカーでの対立遺伝子の発生頻度において、予想値と測定値との間に有意差があるということを示している。オッズ比の範囲は１．３４〜２．４３であり、このことは、配列番号１〜８０の多型マーカーは二型糖尿病に関与しないということを示している。
【００３５】
本発明の配列番号１〜８０のＳＮＰは、二型糖尿病患者群及び正常群において有意な頻度で出現する。よって、本発明のポリヌクレオチドは、二型糖尿病の診断、フィンガープリント分析、または治療において効果的に利用可能である。具体的には、本発明のポリヌクレオチドは二型糖尿病の診断のためのプライマーまたはプローブとして使用可能である。更に、本発明のポリヌクレオチドは二型糖尿病治療のためのアンチセンスＤＮＡまたは組成物として使用することも可能である。
【００３６】
本発明はまた、配列番号１〜８０のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の多型部位のヌクレオチドを含む１０ヌクレオチド以上の連続した範囲を含むポリヌクレオチドとハイブリダイズする、二型糖尿病の診断用の対立遺伝子特異的ポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチドを提供する。
【００３７】
対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドとは、各対立遺伝子と特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドをいう。すなわち、前記対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、配列番号１〜８０の多型配列のうちの多型部位のヌクレオチドを識別し、前記ヌクレオチドの各々と特異的にハイブリダイズできる。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件、例えば、１Ｍ以下の塩濃度及び２５℃以上の温度という条件下で実行される。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）及び２５〜３０℃の条件が対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。
【００３８】
本発明において、前記対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、プライマーであってもよい。本明細書で用いられる場合、「プライマー」という用語は、適当な条件下、例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸塩、及びＤＮＡポリメラーゼ若しくはＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素などのポリメラーゼを含むバッファー中で、及び適当な温度下で、テンプレート方向のＤＮＡ合成の開始点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。前記プライマーの適当な長さは、使用目的によって変わりうるが、通常は１５ないし３０ヌクレオチドである。通常、プライマー分子が短いほど、テンプレートと安定なハイブリッドを形成するために、より低い温度を必要とする。プライマー配列は、必ずしもテンプレートと完全に相補的である必要はないが、前記テンプレートとハイブリダイズ可能な程度に相補的でなければならない。前記プライマーの３’末端が配列番号１〜８０の各多型部位（１０１位）のヌクレオチドと整列することが好ましい。前記プライマーは、多型部位を含む標的ＤＮＡにハイブリダイズし、前記プライマーが前記標的ＤＮＡと完全な相同性を示す対立遺伝子の増幅を開始する。前記プライマーは、反対鎖とハイブリダイズする第２プライマーと対をなして使われる。前記２つのプライマーを用いた増幅によって増幅産物が得られ、これは、特定の対立遺伝子形態が存在するということを意味する。本発明のプライマーは、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ）で使われるポリヌクレオチド断片を含む。
【００３９】
本発明において、前記対立遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、プローブであってもよい。本明細書で用いられる場合、「プローブ」という用語は、ハイブリダイゼーションプローブ、すなわち核酸の相補的な鎖と配列特異的に結合できるオリゴヌクレオチドを意味する。かかるプローブは、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７−１５００（１９９１）（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されているような、ペプチド核酸であってもよい。本発明のプローブは、対立遺伝子特異的プローブである。従って、同種のうちの２個体から得られる核酸断片中に多型部位が存在する場合、前記プローブは１個体から得られるＤＮＡ断片にはハイブリダイズするが、もう１つの個体から得られるＤＮＡ断片にはハイブリダイズしない。この場合、ハイブリダイズ条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における有意な差により、１つの対立遺伝子とだけハイブリダイズする程度にストリンジェントでなければならない。前記プローブの中心位置、すなわち、１５ヌクレオチドからなるプローブであるなら７位が、１６ヌクレオチドからなるプローブであるなら８位または９位が、配列番号１〜８０のヌクレオチド配列の各多型部位と整列することが好ましい。このようにして、対立遺伝子間のハイブリダイゼーションにおける有意な差を誘発できる。本発明のプローブは、対立遺伝子検出用の診断方法に使用できる。前記診断方法には、サザンブロットなどの、核酸のハイブリダイゼーションに基づく検出方法が含まれる。核酸のハイブリダイゼーションに基づく検出方法にＤＮＡチップを利用する場合、前記プローブはＤＮＡチップの基板上に固定された形態で提供されうる。
【００４０】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む二型糖尿病の診断用マイクロアレイを提供する。前記マイクロアレイのポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらであってもよい。前記マイクロアレイは、本発明のポリヌクレオチドを含むことを除いては、一般的なマイクロアレイと同じである。
【００４１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む二型糖尿病の診断用キットを提供する。前記二型糖尿病の診断用キットには、本発明のポリヌクレオチドだけではなく、重合に必要な試薬、例えば、ｄＮＴＰ、各種のポリメラーゼ及び発色剤などを含んでもよい。
【００４２】
また、本発明は個体における二型糖尿病の診断方法を提供し、本法は、前記個体から核酸試料を単離する段階と；配列番号１〜８０のポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチドのうちの１以上の多型部位（１０１位）のヌクレオチドを決定する段階と、を含む。ここで、前記核酸試料のうちの１以上の多型部位のヌクレオチドが、前記表１−１、１−２、２−１、２−２、３、４、及び５に示されている１以上のリスク対立遺伝子と同じである場合、前記個体は、二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性が高いと決定されうる。
【００４３】
前記個体から前記核酸試料を単離する段階は、通常のＤＮＡ単離方法によって行われうる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により標的核酸を増幅し、その後精製することにより、前記核酸試料を得ることができる。ＰＣＲ以外に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４、５６０（１９８９）、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１、１０７７（１９８８））、転写増幅（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６、１１７３（１９８９））、自家維持的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７、１８７４（１９９０））、または核酸配列に基づく増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＢＡ）を用いることも可能である。最後に挙げた２つの方法は、等温転写に基づく等温反応と関連するものであり、増幅産物として、３０または１００倍の一本鎖ＲＮＡ及び二重鎖ＤＮＡを生産する。
【００４４】
本発明の一実施形態によると、多型部位のヌクレオチドを決定する前記段階は、本発明の配列番号１〜８０のヌクレオチド配列からなる群から得られる１０以上の連続したヌクレオチドを含み、多型部位（１０１位）のヌクレオチドを含む二型糖尿病の診断または治療用ポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイ上に、前記核酸試料をハイブリダイズさせる段階と；前記ハイブリダイゼーション結果を検出する段階と、を含む。
【００４５】
マイクロアレイ、及びプローブポリヌクレオチドを基板上に固定化することによりマイクロアレイを調製する方法は、当業界において周知である。本発明の二型糖尿病に関与するプローブポリヌクレオチドを基板上に固定化する過程は、従来技術を使用して容易に実行可能である。マイクロアレイ上での核酸のハイブリダイゼーション及び前記ハイブリダイゼーション結果の検出もまた、当業界において周知である。例えば、前記ハイブリダイゼーション結果の検出は、核酸試料を蛍光物質（例えば、Ｃｙ３及びＣｙ５）などの検出可能な信号を発生させる標識物質で標識し、標識された核酸試料をマイクロアレイ上にハイブリダイズし、前記標識物質から発生する信号を検出することによって実行可能である。
【００４６】
本発明の他の実施形態によると、多型部位のヌクレオチド配列を決定した結果、リスク対立遺伝子を含む配列番号２、４、５、８、９、１１、１３、１６、１８、２０、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３３、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６２、６３、６５、６７、６９、７１、７５、７７、及び８０から選択される１以上のヌクレオチド配列が検出される場合、前記個体は二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性が高いと決定されうる。前記リスク対立遺伝子を含むヌクレオチド配列が１つの個体から多く検出されればされるほど、前記個体は二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性がさらに高いと決定されうる。
【００４７】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれら実施例に限定されるものではない。
【００４８】
発明の効果
本発明のポリヌクレオチドは、二型糖尿病の診断、治療、またはフィンガープリント分析に使用することができる。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ及び診断キットは、二型糖尿病の効果的な診断用に使用することができる。
【００５０】
本発明の二型糖尿病に関与するポリヌクレオチドを分析する方法は、二型糖尿病の存在または危険性を効果的に検出することができる。
【実施例】
【００５１】
発明を実施するための最良の形態
実施例
実施例１
本実施例では、二型糖尿病患者と診断され治療中であった、３００人の韓国人からなる患者群、及び二型糖尿病の症状がなく前記患者群と同一の年齢層に該当する、３００人からなる正常者群の血流からＤＮＡ試料を抽出し、特定のＳＮＰの発生頻度を評価した。前記ＳＮＰは、公知のデータベース（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）または（シーケノム：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｅａｌｓｎｐ．ｃｏｍ／）から選択した。選択されたＳＮＰ周辺の配列にハイブリダイズするプライマーを利用し、前記ＤＮＡ試料中のＳＮＰのヌクレオチド配列を分析した。
【００５２】
１．ＤＮＡ試料の調製
二型糖尿病患者及び正常者の血流からＤＮＡ試料を抽出した。ＤＮＡ抽出は、公知の抽出方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｐ３９２、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９）とＣｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍが製造している市販のキットの説明書とによって行われた。抽出されたＤＮＡ試料の中から、１．７以上の純度（Ａ２６０／Ａ２８０ｎｍ）を有するＤＮＡ試料だけを使用した。
【００５３】
２．標的ＤＮＡの増幅
分析しようとするＳＮＰを含む所定のＤＮＡ領域である標的ＤＮＡを、ＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲは、一般的な方法で行い、その条件は、次の通りである。まず、標的ゲノムＤＮＡを２．５ｎｇ／ｍｌで調製した。次に、下記のようなＰＣＲ反応液を調製した。
【００５４】
水（ＨＰＬＣグレード）  ２．２４μｌ
１０×バッファー（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）  ０．５μｌ
ｄＮＴＰミックス（ＧＩＢＣＯ）（各２５ｍＭ）  ０．０４μｌ
Ｔａｑ  ｐｏｌ（ＨｏｔＳｔａｒ）（５Ｕ／μｌ）  ０．０２μｌ
フォワード／リバース  プライマーミックス（各１μＭ）  ０．０２μｌ
ＤＮＡ  １．００μｌ
総体積  ５．００μｌ
ここで、前記フォワード及びリバースプライマーは、公知のデータベースにあるＳＮＰの上流及び下流配列に基づいて設計した。前記プライマーを下記の表３に列記する。
【００５５】
ＰＣＲの熱サイクルは次の通りである：９５℃で１５分間インキュベートし；９５℃で３０秒間、続いて５６℃で３０秒間、続いて７２℃で１分間を４５サイクル反復し；７２℃で３分間インキュベートした後、４℃で保管した。その結果、２００ヌクレオチド以下の長さを有する増幅ＤＮＡ断片を得た。
【００５６】
３．増幅された標的ＤＮＡ断片中のＳＮＰの分析
前記増幅ＤＮＡ断片中のＳＮＰの分析は、シーケノム社の均質的ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｈＭＥ）法を利用して行った。前記ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ法の原理は、次の通りである。まず、前記標的ＤＮＡ断片中のＳＮＰの直前で終了するプライマー（「伸長プライマー」とも呼ばれる）を設計した。次に、前記プライマーを前記標的ＤＮＡ断片にハイブリダイズさせ、ＤＮＡ重合を行った。このとき重合反応液は、第１対立遺伝子ヌクレオチド（例えば、Ａ対立遺伝子）に相補的なヌクレオチドの取り込み後ただちに重合を止める試薬（例えば、ｄｄＴＴＰ）を含んでいた。その結果、前記標的ＤＮＡ断片中に前記第１対立遺伝子（例えば、Ａ対立遺伝子）が存在する場合には、前記第１対立遺伝子に相補的な１つのヌクレオチド（例えば、Ｔヌクレオチド）だけが前記プライマーから伸長した産物が得られることとなる。一方、前記標的ＤＮＡ断片中に第２対立遺伝子（例えば、Ｇ対立遺伝子）が存在する場合には、前記第２対立遺伝子に相補的な１つのヌクレオチド（例えば、Ｃヌクレオチド）が前記プライマーの３’末端に付加され、その後、最も近接した前記第１対立遺伝子に相補的なヌクレオチド（例えば、Ｔヌクレオチド）が付加されるまで、前記プライマーは伸長する。前記プライマーから伸長された産物の長さを質量分析により決定した。このようにして、標的ＤＮＡ断片中に存在する対立遺伝子を同定することができた。具体的な実験条件は、次の通りである。
【００５７】
まず、未反応のｄＮＴＰを前記ＰＣＲ産物から除去した。かかる除去用に、脱イオン水１．５３μｌ、ＨＭＥバッファー０．１７μｌ、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ：ｓｈｒｉｍｐ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）０．３０μｌを１．５ｍｌ容チューブに入れて混合し、ＳＡＰ酵素溶液を調製した。前記チューブを５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。その後、前記ＰＣＲ産物を前記ＳＡＰ溶液チューブに加え、密封し、３７℃で２０分間、続いて８５℃で５分間インキュベートし、その後４℃で保管した。
【００５８】
次に、増幅された標的ＤＮＡ断片をテンプレートとして用いて、均質的伸長反応を行った。伸長用反応液の組成は、次の通りであった。
【００５９】
水（ナノスケールの脱イオン水）  １．７２８μｌ
ｈＭＥ伸長ミックス（２．２５ｍＭ  ｄ／ｄｄＮＴＰを含む１０×バッファー）  ０．２００μｌ
伸長プライマー（各１００μＭ）  ０．０５４μｌ
Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（３２Ｕ／μｌ）  ０．０１８μｌ
総体積  ２．００μｌ
前記反応液を前述の調製した標的ＤＮＡ溶液に十分に混合した後、スピンダウン遠心分離した。前記反応液を含むチューブまたはプレートを密封し、９４℃で２分間インキュベートした後、９４℃で５秒間、続いて５２℃で５秒間、続いて７２℃で５秒間の条件を４０サイクル反復し、その後４℃に保管した。このようにして得られた均質的伸長反応産物を樹脂（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ）を用いて洗浄した。伸長反応に使われた伸長プライマーを下記の表３に列記する。
【００６０】
【表９】
2007516719.tif 000010
【００６１】
【表１０】
2007516719.tif 000011
【００６２】
前記伸長反応産物中の多型部位のヌクレオチドを、質量分析法であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）を利用して分析した。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは以下の原理に従って行われる。検体がレーザビームを受けると、イオン化されたマトリックスと共に、真空状態の中を反対側にある検出器まで飛んで行く。このとき、前記検体が前記検出器に到達するまでの所要時間を計算する。質量の小さな物質ほど、前記検出器に早く達する。前記標的ＤＮＡ断片中のＳＮＰのヌクレオチドは、前記ＤＮＡ断片間の質量の差と、前記ＳＮＰの既知のヌクレオチド配列とに基づいて決定できるのである。
【００６３】
前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いて標的ＤＮＡの多型部位のヌクレオチドを決定した結果を、表１−１、１−２、２−１、及び２−２に示す。各対立遺伝子は、各個体においてホモ接合体（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）またはヘテロ接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）の形態で存在しうる。しかし、所定の集団における、ヘテロ接合体の頻度とホモ接合体の頻度との分布は、統計的に有意な水準を超えることはない。メンデルの遺伝法則及びハーディーワインバーグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）の法則によれば、集団を構成する対立遺伝子の遺伝的構成は、一定の頻度に維持される。前記遺伝的構成が統計的に有意な場合、生物学的に意義深いものと考えられる。本発明のＳＮＰは、表１−１、１−２、２−１、及び２−２に示すように、二型糖尿病患者においては、統計的に有意な水準で現れており、従って二型糖尿病の診断に効果的に使用可能である。
【配列表】
2007516719000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月8日(2006.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜８０のヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の１０以上の連続したヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチド配列の１０１位のヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断若しくは治療用ポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドとハイブリダイズする、二型糖尿病の診断または治療用ポリヌクレオチド。
【請求項３】
長さが１０ないし１００ヌクレオチドである、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
プライマーまたはプローブである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断用マイクロアレイ。
【請求項６】
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドを含む、二型糖尿病の診断用キット。
【請求項７】
（ａ）個体から核酸試料を単離する段階と；
（ｂ）配列番号１〜８０のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドのうちの１以上の多型部位（１０１位）のヌクレオチドを決定する段階と、
を含む、前記個体における二型糖尿病の診断方法。
【請求項８】
前記１以上の多型部位のヌクレオチドを決定する段階は、
請求項１に記載のポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドが固定化されているマイクロアレイ上に前記核酸試料をハイブリダイズさせる段階と；
ハイブリダイゼーションの結果を検出する段階と、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リスク対立遺伝子を含む、配列番号２、４、５、８、９、１１、１３、１６、１８、２０、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３３、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６２、６３、６５、６７、６９、７１、７４、７５、７７、及び８０から選択される１以上のヌクレオチド配列が検出される場合に、前記個体は二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性が高いと決定する、請求項７に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
また、本発明は個体における二型糖尿病の診断方法を提供し、本法は、前記個体から核酸試料を単離する段階と；配列番号１〜８０のポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチドのうちの１以上の多型部位（１０１位）のヌクレオチドを決定する段階と、を含む。ここで、前記核酸試料のうちの１以上の多型部位のヌクレオチドが、前記表１−１、１−２、２−１、２−２、及び３に示されている１以上のリスク対立遺伝子と同じである場合、前記個体は、二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性が高いと決定されうる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
本発明の他の実施形態によると、多型部位のヌクレオチド配列を決定した結果、リスク対立遺伝子を含む配列番号２、４、５、８、９、１１、１３、１６、１８、２０、２１、２３、２５、２７、３０、３２、３３、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６２、６３、６５、６７、６９、７１、７４、７５、７７、及び８０から選択される１以上のヌクレオチド配列が検出される場合、前記個体は二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性が高いと決定されうる。前記リスク対立遺伝子を含むヌクレオチド配列が１つの個体から多く検出されればされるほど、前記個体は二型糖尿病を発症する危険性があると診断される可能性がさらに高いと決定されうる。
【国際調査報告】
2007516719.tif 000012
2007516719.tif 000013
2007516719.tif 000014
2007516719.tif 000015