(57)【要約】  開示するものは、野生型細胞核由来コケ発現促進領域(ＭＥＰＲ)をコードしている単離核酸分子、およびかかるＭＥＰＲを用いて組換えポリペプチドを産生するための方法である。
2007501619.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型細胞核由来コケ発現促進領域(ＭＥＰＲ)をコードしている単離核酸分子。
【請求項２】
ＭＥＰＲが、ツリガネゴケ属（Physcomitrella）、ヒョウタンゴケ科（Funaria）、ミズゴケ科（Sphagnum）、キンシゴケ科（Ceratodon）、ゼニゴケ科（Marchantia） および ダンゴコケ科（Sphaerocarpos）、好ましくは、ヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）、ヒョウタンゴケ（Funaria hygrometrica） および ゼニゴケ（Marchantia polymorpha）のＭＥＰＲから選択されることを特徴とする、請求項１の単離核酸分子。
【請求項３】
ＭＥＰＲが、配列番号１〜２７またはそれらの発現促進フラグメントから選択されることを特徴とする、請求項１または２の単離核酸分子。
【請求項４】
コケ・プロモーターおよび、好ましくは５'-ＵＴＲ領域および／または５'-イントロンおよび／または３'-ＵＴＲを含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項５】
ＭＥＰＲが、カリフラワー・モザイク・ウイルス(ＣaＭＶ)３５Ｓプロモーターの発現促進活性と少なくとも同等な発現促進活性を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項６】
ＭＥＰＲが、カリフラワー・モザイク・ウイルス (ＣaＭＶ) ３５Ｓプロモーターの発現促進活性の少なくとも２００％、好ましくは少なくとも５００％、特に少なくとも１０００％である発現促進活性を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項７】
組換えポリペプチド産物のためのコード領域をさらに含み、該コード領域がＭＥＰＲの制御下にあることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項８】
選択マーカーをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項９】
形質転換されるべき種のゲノム配列に相同な配列をさらに含み、それによりこの種において標的組込みが可能となることを特徴とする、請求項１〜７のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
アンチセンスまたはリボザイム分子として提供されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
次のステップ:
−請求項１〜１０のいずれかに記載のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子と所望により該組換えポリペプチド産物についてのコード領域を含み、該コード配列が宿主中の該核酸分子のＭＥＰＲの制御下にある、組換えＤＮＡクローニングビヒクルを提供すること、
-該コード配列を天然には担持していない上記真核生物宿主細胞を、該ＭＥＰＲの制御下にあるように、該コード配列で形質転換すること、
−形質転換された真核生物宿主細胞を適当な培養培地中で培養すること、
−該組換えポリペプチドの発現を可能にすること、そして
−発現した組換えポリペプチドを単離すること、
を含む真核生物宿主細胞における組換えポリペプチド産物を発現するための方法。
【請求項１２】
真核生物宿主細胞が、植物細胞、好ましくはコケ細胞、特にPhyscomitrella patens 細胞から選択されることを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
宿主細胞が、原糸体コケ組織細胞であることを特徴とする、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
培養培地が、それらに追加の植物ホルモンを含まないことを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
細胞が、Physcomitrella、Funaria、Sphagnum、Ceratodon、Marchantia および Sphaerocarpos 群のコケ細胞群から選択されることを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞が、該組換えポリペプチド産物を一過的に発現することを特徴とする、請求項１１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドを工業的に産生するため、特に該ポリペプチドを産生する組換え細胞を提供するための請求項１〜１０のいずれかに記載のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用。
【請求項１８】
コケ・ポリペプチド発現のための、該ＭＥＰＲによって天然には制御されていない該コケ・ポリペプチド発現のための、特に該ポリペプチドを発現する組換えコケ細胞を提供するための請求項１〜１０のいずれかに記載のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用。
【請求項１９】
発現促進領域についてのコンセンサス配列をスクリーニングおよび明示するための請求項１〜１０のいずれかに記載のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用。
【請求項２０】
翻訳後修飾タンパク質の組換え発現のための、特に翻訳後に修飾されたタンパク質の産生のための請求項１〜１０のいずれかに記載のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用。
【請求項２１】
組換えタンパク質のイン・ビトロ発現のための請求項１〜１０のいずれかに記載のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用。
【請求項２２】
代謝修飾タンパク質の組換え発現のための請求項１〜１０のいずれかに記載のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、遺伝子修飾された真核生物宿主細胞中でポリペプチドの発現を促進する単離核酸分子に関する。
【０００２】
遺伝子修飾された細胞中で、タンパク質様物質(タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、そのフラグメント、さらにこれら分子の翻訳後に修飾された形態）の発現は、本明細書中で「ポリペプチド」(例えば実施例部分において、「タンパク質」と一緒に同義的に用いられる）の発現は、多くの場合、稀にみる貴重な物質の調製物を提供するための主な源である。遺伝子修飾された宿主細胞中でかかるポリペプチドを発現するためには、この発現を正に制御する(「活性化する」「促進する」) ＤＮＡ領域の存在が必要である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを、ｍＲＮＡ(Watson et al.," Recombinant DNA"(1992), Chapter I.1 and 2)で転写を開始するためにＤＮＡへ結合させ得るような領域に対する重要な例である。
【０００３】
それらの単純な性質（コケは、高等植物の進化の出発点に位置している）から、高等植物の複雑な生態への洞察力が提供されるので、コケ類は植物生理学および進化について探索するための有用な対象として注目を集めてきた。コケ類の単純な形態および有利な培養実現性により、植物生理学の実験および発生生物学の研究のために人気のあるモデル生物となった：コケ種は、無菌培養を含むイン・ビトロ技術を用いて、ペトリ皿だけでなく、液体培養、例えばバイオリアクターを用いても、制御された条件下で問題なく培養され得る。半数体配偶体は、滅菌培養において光合成無機栄養で生育され、細胞レベルで容易に観察される。
【０００４】
コケ類の別の主な利点は、それらの形質転換能である：多くの試験にも拘わらず、植物において起こる標的組込み比率は、１０-４に達成することはほとんどなく、このことは植物の機能的ゲノムに対する遺伝子標的法の一般的な使用を妨げるものである。これまで試験されてきた他の全ての植物とは異なって、コケ(特に、確立されたコケのモデル生物、例えばヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)(その分子遺伝学の概説については:Reski, 1999)のゲノムにおける相同的なＤＮＡ配列の組込みは、相同組換えによって、標的位置で優先的に発生する。コケの形質転換体は、プロトプラストによるプラスミドＤＮＡのＰＥＧ媒介取込み、ミクロプロジェクション爆弾、エレクトロポーレーションおよびミクロインジェクションによる  ＤＮＡ移入を介して一般的かつ容易に実施される(Cove et al., 1997)。形質転換構築体の設計によって、ランダムまたは標的組込みが優先的に起こる。
【０００５】
有効な産生方法が利用できる(例えば、EP 1 206 561 Aに記載の原糸体コケ類組織を培養すること)ようになってきたにもかかわらず、植物生理学的研究用の科学的ツールとしてのコケ類の使用、コケ細胞における組換え異種ポリペプチドを産生するためのコケ類の使用はむしろ制限されている。
【０００６】
真核生物宿主細胞、特に動物細胞または高等植物細胞における形質転換技術に関する主な制限は、かかる形質導入宿主細胞において、外来遺伝子の高い構成的発現のために有効なプロモーターが存在しないことである。カリフラワー・モザイク・ウイルス(ＣaＭＶ)３５Ｓプロモーターは、数多くの植物形質転換系(例えば、WO 01/25456 Aを参照されたい)において、広くこの目的に使用されてきたが、しかし該ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、いくつかの植物種（特に単子葉植物、例えばコメ(McElroy et al., 1991,))では低い活性を示していた。単子葉植物の形質転換のために、コメのアクチン１ ５'領域は、異種タンパク質の発現に使用されてきた（McElroy et al., 1991,)。しかしながら、遺伝子修飾された真核生物宿主細胞における組換え（外来）ポリペプチドの発現については、新規発現促進手段を提供するという永続的な必要性が未だ存在している。 
【０００７】
コケ類、特にPhyscomitrella patensについては、現在までに、同種の(この場合において、同種とは；コケ由来であると定義される）適当な細胞核由来発現プロモーターまたは他の細胞核由来発現促進配列は、今までに発表されていなかった(Holtdorf et al., 2002)。それ故、研究者は、選択マーカー遺伝子および重要な他の遺伝子の発現のために、異種の(異種とは、コケ類由来でないと定義される)プロモーターを使用してきた。しかし、いくつかのこのようなプロモーターだけが、特定のコケ類において確実に機能すると報告されてきた（例えば、ＣａＭＶ３５Ｓ−プロモーター；Holtdorf et al., 2002に要約されている; ＣａＭＶ ３５Ｓ−プロモーターは、ある他の種では機能しない(Zeidler et al., 1999);ＴＥＴ-プロモーター(Reski (1998)で概説される)。そのために、コケ類を遺伝子的に操作するための他の手段が、この分野、例えばジーン・トラップおよびエンハンサー・トラップ系で開発されてきた(Hiwatashi et al.,2001;しかし、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター(ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの短くしたバージョンも)も;著者は３５Ｓプロモーターの短くしたバージョンも、弱いプロモーターとして機能する一時的な発現実験を示した; 実際、この文献は、エンハンサー-トラップ株においてレポーター遺伝子の発現に関するが、コケ類のあらゆる調節要素に対してこの発現のいずれの相関関係を明らかにするものでもない。
【０００８】
相同組換えを用いるコケ類における上記研究にもかかわらず、異種プロモーターの使用は必要であり(それ故に、同種プロモーターは必要とされておらず、さらにそれらは、ほとんどの場合有用でない)、組換えポリペプチド産生または相同ポリペプチドの過剰発現にコケ類を工業的に使用するための、適当なコケ由来発現促進手段に対する必要性が存在しており、いまだ解決されていない。かかる発現促進手段は、適用される培養条件下で安定かつ構成的な発現を可能にし、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと同等か、それよりも高い発現の再現性を可能にすべきである。
【０００９】
それ故に、本発明は、コケ発現促進領域(ＭＥＰＲ)、すなわち野生型コケ由来の発現促進領域をコードする単離核酸分子を提供する。本発明によって、遺伝子修飾された宿主細胞、特にコケ類における構成的発現を可能にするコケ由来発現領域(すなわち、野生型コケ由来の細胞核由来領域)を提供し、それにより、先行技術(Holtdorf et al., 2002; Schaefer et al., 2002)で生じたかかるツールについての必要性を解決するものである。
【００１０】
本発明のＭＥＰＲの基本的特徴は、ＭＥＰＲの発現促進活性が、特異的宿主細胞において機能する異種プロモーター(例えば、Physcomitrella patensにおける組換えポリペプチドの発現のためのＣａＭＶ３５Ｓ)の発現促進活性の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％であって、このような発現促進活性を示さないコケ・プロモーターは本発明の目的を解決するために使用できないので、それ故ＭＥＲＰとしてみなされない。
【００１１】
それ故、本発明のＭＥＰＲは、野生型コケ、すなわちコケ以外の種由来のプロモーター［例えば、高等植物または（植物）病原体のプロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、またはＴＥＴプロモーター］の導入によって遺伝子的に修飾されていないコケ、の細胞核から単離される。また、例えば自然株配列変動によるかまたはＭＥＰＲ単離中のイベントにより起こり得る少数の配列の差違（例えば、発現促進活性が負に影響（消失）しない領域での１、２、３、４または５個の塩基交換）を有するＭＥＰＲは、本発明のＭＥＰＲとして見なされる。発現促進活性の分析方法、またはこの活性に対するかかる少数の配列差違の効果の分析方法は、当業者に利用し得るし（例えば、既知のＣａＭＶ３５Ｓ構築体との比較によって)、またこれ以降の実施例においても説明される。
【００１２】
本発明によれば、胞子体（sphorophyte）に特異的でない発現を促進するＭＥＰＲは、構成的ＭＥＰＲ、好ましくは配偶体由来細胞において発現を促進するＭＥＰＲ、より好ましくは原糸体細胞において発現を促進するＭＥＰＲとして定義される。
【００１３】
本発明によれば、構成的発現は、光合成無機栄養的に増殖したコケ類について一般的に使用される液体培養条件下、例えば、次に説明される一過的発現系に使用されるフラスコ培養、バイオリアクター培養(EP 1 206 561 A)条件下で、このタンパク質を検出し得る量を生じる発現として定義されるのが好ましい。それ故に、構成的発現は、好ましくは特定の培養添加物の必要性もなく、好ましくは培養培地に添加される糖、植物ホルモンまたはこのような物質混合物の必要性もなく、本発明のＭＥＲＰに与えられるべきである。構成的発現は、定常モードで実施されるべきである；しかし一過的であってもよい。
【００１４】
明細書に示される「コケ」または「コケ類」は、全ての蘚苔類(コケまたは苔綱類、マツモ類およびコケ類)を包含する。コケ類の特徴は、それらの異型世代交代、即ち、細胞核ＤＮＡ量および形態学に関して互いに異なる２世代の交代である。二倍体の胞子体は、その初期にのみ光合成活性であり、優勢で緑色の半数体の配偶体からの補給を必要とする。配偶体は、２つの形態学的に異なる形で存在する：原糸体と呼ばれる初生配偶体そして茎葉体と呼ばれる成体配偶体である。原糸体に対して、成体配偶体(茎葉体)は生殖器を有する。
【００１５】
本発明に関して、一過的な発現は、下記のように、エピソーマル核酸を基にした構築体（例えば、ＭＥＰＲおよび目的の遺伝子）を、コケのプロトプラスト中への導入すること、好ましくは、培地中への細胞外タンパク質の分泌を生じさせるベクターからの一過的な発現をひきおこすか、可能にすることとして定義されている。プロトプラストは、コケ細胞、好ましくは配偶体細胞、より好ましくは原糸体細胞から得られる。
【００１６】
本発明のＭＥＰＲは、あらゆるコケ類から採取され得るが、ＭＥＰＲは、共通したモデルのコケ種類から単離されるのが好ましい。そのため、好ましくは、ＭＥＰＲは、ツリガネゴケ属（Physcomitrella）、ヒョウタンゴケ科（Funaria）、ミズゴケ科（Sphagnum）、キンシゴケ科（Ceratodon）、ゼニゴケ科（Marchantia） および ダンゴコケ科（Sphaerocarpos）、特にヒメツリガネゴケ（Physcomitrella patens）、ヒョウタンゴケ（Funaria hygrometrica） および ゼニゴケ（Marchantia polymorpha）から単離される。
【００１７】
本発明の適当なＭＥＰＲは、配列番号１〜２７またはそれらの発現促進フラグメントから選択される。"発現促進フラグメント"は、特異的宿主細胞において機能する異種プロモーター（例えば、Physcomitrella patensにおける組換えポリペプチドの発現にはＣａＭＶ ３５Ｓ）の発現促進活性の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％のＭＥＰＲの発現促進活性を有するＭＥＰＲのフラグメントである。
【００１８】
本発明のＭＥＰＲは、特異的領域、例えばプロモーター領域("プロモーター")、５'非翻訳領域("５'-ＵＴＲ")、５'-イントロンまたは３'-ＵＴＲを含む。いくつかのＭＥＰＲについては、５'-イントロンだけを含有する発現促進フラグメントが存在する。通常、プロモーターは、常に発現促進フラグメントとして単独で活性である。そのために、本発明のＭＥＰＲは、コケ・プロモーターを含むのが好ましく、５'-ＵＴＲ領域および／または５'-イントロンおよび／または３'-ＵＴＲを含むのが好ましい。
【００１９】
特定の構成的発現が達成されるなら、それで十分であることは多いが、多くの場合において、高い発現割合を達成することは、特に組換えポリペプチドの工業的産生には好ましい。大部分の本発明のＭＥＰＲは、特に同種の系（例えば、Physcomitrellaにおけるポリペプチドの発現には Physcomitrella ＭＥＰＲ)において、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターよりも、得られる組換えポリペプチドに対して発現速度が顕著に高くなり得ることが証明されてきた。それ故に、本発明の好ましいＭＥＰＲは、ＭＥＰＲが単離されたコケの種類において、特にこれに限定するものではないが、少なくともカリフラワー・モザイク・ウイルス (ＣaＭＶ)３５Ｓプロモーターの発現促進活性と同等な発現促進活性を有する。さらに好ましいＭＥＰＲは、特にそのＭＥＰＲが単離されたコケの種類において、特にこれに限定するものではないが、カリフラワー・モザイク・ウイルス (ＣaＭＶ)３５Ｓプロモーターの発現促進活性の少なくとも２００％、好ましくは少なくとも５００％、特に少なくとも１０００％である発現促進活性を有する。
【００２０】
本発明の単離核酸分子は、好ましくは組換え形質導入ポリペプチドを産生するために、特異的宿主細胞を形質転換するために使用され、好ましくはこれに限定するものではないが工業的スケールで使用されるのが好ましい。そのために、核酸分子は、宿主細胞中で形質転換およびトランスジーンの発現を可能にする適当なベクターとして提供される。本発明のＭＥＰＲは、コケにおける天然のプロモーターを置換し、これにより野生型株では通常存在しないコケのゲノム中の場所に位置づけられているＭＥＰＲの制御下で、同種コケ・ポリペプチドの発現をもたらすために使用されるという可能性の１つには、本願ＭＥＰＲの有力な工業的利用性は、産生宿主細胞、特異的植物細胞、特にコケ細胞中での異種（"外来"）遺伝子発現の制御である。従って、本発明の核酸分子は、さらに組換えポリペプチド産物のコード領域を含み、該コード領域はＭＥＰＲの制御下にある。
【００２１】
本発明の単離核酸分子が、選択マーカーおよび／または選択された形質転換方法（例えば、Cove et al., 1997; Schaefer, 2002を参照されたい）を適切にするのに必要な別の領域をさらに含むならば、それもまた有利である。例えば、標的組込みが好まれるならば、本発明の核酸分子は、形質転換されるべき種のゲノム配列と相同な配列をさらに含むべきである。このようにして、形質転換されるべき種のゲノム中へ、相同組換えによる単離核酸分子の標的組込みが可能となる。
【００２２】
さらに、本発明の単離核酸分子は、発現促進領域に対するコンセンサス配列のスクリーニングおよび明示に使用され得る。発現促進活性に重要および／または必須であるかかるコンセンサス配列（領域、四角）についての発見およびスクリーニングは、組換えＤＮＡ技術、特にコケを使用した工業的生物工学に関して貴重な財産である。
【００２３】
別の態様によれば、本発明は、真核生物宿主細胞における組換えポリペプチド産物の発現のための方法にも関し、次のステップ：
−本発明のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子、および所望により該組換えポリペプチド産物についてのコード領域を含む組換えＤＮＡクローニングビヒクルを提供することであり、該コード配列は該宿主において該核酸分子のＭＥＰＲの制御下にある、
−該コード配列を天然には担持しない上記真核生物宿主細胞を、該ＭＥＰＲの制御にあるように、該コード配列で形質転換すること、
−形質転換された真核生物宿主細胞を適当な培養培地中で培養すること、
−該組換えポリペプチドの発現を可能にすること、そして
−発現した組換えポリペプチドを単離すること、を含む。
【００２４】
上記のとおり、本発明のＭＥＰＲは、基本的に、様々な細胞タイプにおいて構成的発現を達成する能力を有し、該真核生物宿主細胞は、植物細胞、好ましくはコケ細胞、特にPhyscomitrella patens細胞から選択されるのが好ましい。
【００２５】
本発明に特に好ましい系は、コケ原糸体培養物（原糸体コケ組織）における培養系である。その際、EP 1 206 561 Aに記載の方法およびそれらの好ましい実施態様は、出典明示により本明細書の一部とし、直ちに本発明に用いうる。
【００２６】
本発明の手段を用いるポリペプチドの構成的発現は、培養培地において様々な添加物、特に特異的分化または分化組織の成長を促進するための添加物を必要とせずに行い得る。それ故に、電解質、選択剤および培地安定化剤以外には、その培養培地は、好ましくは、細胞供給物のためのあらゆる他の添加物を含有しない。安定に形質転換された植物のための培養培地は、追加の糖、植物ホルモンまたはそれらの混合物を含まないのが好ましい。一過的に形質転換されたプロトプラストのための培養培地は、追加の植物ホルモンを含まないのが好ましい。
【００２７】
好ましいコケ細胞は、Physcomitrella、Funaria、Sphagnum、Ceratodon、MarchantiaおよびSphaerocarpos、特に原糸体培養物一群のコケ細胞である。
【００２８】
別の態様に従って、本発明は、ポリペプチドを工業的に産生するための、特に該ポリペプチドを産生する組換え細胞を提供するためのＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用も提供する。工業的産生により、バイオリアクターにおいて目的とする特定のポリペプチドの大量産生、例えばｇ量またはそれ以上（市販用産量）を産生し得る。これは、該産生と比べて、研究用途（mg 量）または分析目的(μg量)には十分であり、これも当然、本発明によって実施され得る。一過的発現系において、このような分析目的のための十分なタンパク質量は、本願ＤＮＡ分子を用いて容易に得られ得る。
【００２９】
従って、本発明は、コケ・ポリペプチドの発現のため、該ＭＥＰＲによって天然の制御されていない該コケ・ポリペプチドの発現のために、特に該ポリペプチドを発現する組換えコケ細胞を提供するためにＭＥＰＲをコードする単離核酸分子を使用することを含む。この使用は、コケ・ポリペプチドに関する研究目的および工業規模の産生の両方を実施するために修飾され得る。
【００３０】
別の態様によれば、本発明は、特異的な翻訳後修飾（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ）に関連のあるタンパク質の発現のための、特に、通常は存在しないか、または通常、非形質転換コケ細胞において別の比率で存在する翻訳後修飾を有するポリペプチドを発現する組換えコケ細胞を提供するための、ＭＥＰＲをコードする単離核酸分子の使用を提供する。
【００３１】
別の態様によれば、本発明は、代謝経路に関連のあるタンパク質の発現のために、特に代謝物、例えば二次的代謝物のその含量が変化した組換えコケ細胞を提供するために、ＭＥＰＲをコードする単離核酸分子を使用することを提供する。
【００３２】
別の態様によれば、本発明は、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子またはリボザイムの発現のため、特に、変化した表現型、例えば形態学的、生物化学的変化をもたらす特異的タンパク質量の低下を伴う組換えコケ細胞を提供するために、ＭＥＰＲをコードする単離核酸分子の使用を提供する。
【００３３】
別の好ましい態様によれば、本発明は、翻訳後修飾タンパク質の組換え発現のための、特に翻訳後に修飾されたタンパク質の産生のための本発明のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の使用にも関する。かかる技術を用いて、翻訳後に（ネイティブ宿主細胞とは違って）特異的に修飾されるタンパク質を産生することが可能となり、それにより、例えば植物細胞またはコケ培養により、例えば哺乳動物またはヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質の産生が可能となる。かかる技術が特異的グリコシルトランスフェラーゼを用いて適用される例は、例えばWO 00/49153 A および WO 01/64901 Aにおいて記載されている。
【００３４】
本発明のＭＥＰＲをコードしている単離核酸分子の別の好ましい使用は、組換えタンパク質のイン・ビトロ発現に関する。イン・ビトロ翻訳の技術は、宿主細胞に関連する不確実性を許容する必要性なく、より制御された組換え産物の産生を可能にする。
【００３５】
本発明の核酸分子の別の好ましい使用は、代謝修飾タンパク質、例えば翻訳されたアミノ酸鎖の(翻訳後の)修飾を修飾するタンパク質(Berlin et al, 1994を参照されたい)、の組換え発現のためのそれらの使用である。
【００３６】
本発明は、次の実施例および図によってさらに説明されるが、それらに制限するものではない。
【００３７】
材料および方法
植物材料
Physcomitrella patens (Hedw.)B.S.G.は、以前から特徴分析されてきた(Reski et al. 1994))。それは、H.L.K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire, UK によって収集され、Engel (1968; Am J Bot 55, 438-446)によって増殖された株16/14の二次培養物である。
【００３８】
標準的な培養条件
植物を、単純無機液体修飾化 Knop 培地［１０００mg/l Ｃa(ＮＯ３)２ x ４Ｈ２Ｏ、２５０mg/l ＫＣｌ、２５０mg/l ＫＨ２ＰＯ４、２５０mg/l ＭｇＳＯ４ x ７Ｈ２Ｏ および１２.５mg/l ＦｅＳＯ４ x ７Ｈ２Ｏ；ｐＨ５.８ (Reski and Abel (1985) Planta 165, 354-358)］中で、滅菌条件下に無菌的に培養した。植物を、培養培地（２００ml）を含有するエーレンマイヤーフラスコ（５００ml）または固形性 Knop培地（１０g/l 寒天)を有する９cmのペトリ皿で培養した。フラスコを、１２０rpmに設定したCertomat R shaker (B.Braun Biotech International, Germany)上で振とうした。増殖チャンバー内の条件は、２５＋／−３℃および１６：８時間の明暗期間であった。培養物を、３５micromol/m-2s-1を提供する２本の蛍光管(Osram L 58 W/25)を用いて上方から照射した。Ultra-Turrax ホモゲナイザー(IKA, Staufen, Germany)を用いる分散および新しいKnop培地（１００ml）を含有する２つの新規エーレンマイヤーフラスコ（５００ml）への接種により、液体培養の二次培養を１週間に１回行った。さらに、培養物を、分散３または４日後に濾過し、新しい Knop 培地に移した。
【００３９】
バイオリアクター培養物を、５リットルの作業容量を有する攪拌タンクガラスバイオリアクター(Aplikon, Schiedam, The Netherlands)内で Knop 培地または１／１０Knop培地で各々増殖させた（Hohe and Reski, Plant Sci. 2002, 163, 69-74に記載されているとおり）。攪拌を、５００rpmのスピードで回転するマリンインペラーにより行い、該培養物を、０.３vvm [(通気容量)/(培地容量)/分]の空気で通気した。容器中、２５℃の培養温度を、二重ジャケット冷却システムによって制御した。光強度は蛍光管(Osram L 8W/25)によって提供された５０micromol/m-2s-1であり、１６/８時間の光/暗リズムを有する。培養物中のｐＨ値(ｐＨ６.５−７.０)は調整しなかった。
【００４０】
プロトプラスト単離
プロトプラスト単離のための異なるプロトコール(Grimsley et al.1977; Schaefer et al. 1991; Rother et al. 1994; Zeidler et al. 1999; Hohe and Reski 2002; Schaefer 2001)が、Physcomitrella patensについて説明されてきた。本明細書中で示した試験に対しては、以前に開示された方法の修飾/組合せを用いた：
コケ組織物を、７日間、Ｃａ(ＮＯ３)２含量が低い（１０％）Knop培地で培養した。培養物を、分散後３または４日で濾過し、Ｃａ(ＮＯ３)２含量が低い（１０％）新しいKnop培地に移した。濾過後、コケ原子体を、０.５Ｍマンニトール中でプレインキュベートした。３０分後、４％の Driselase (Sigma, Deisenhofen, Germany)を懸濁液に添加した。Driselaseを、０.５Ｍ マンニトール(ｐＨ ５.６-５.８)に溶解し、３６００rpm、１０分間で遠心分離し、０.２２μmフィルター（Millex GP, Millipore Corporation, USA）を通して滅菌した。１％ Driselase（終濃度）を含有する該懸濁液を、室温暗所でインキュベートし、静かに攪拌した(プロトプラストの最良収率を、インキュベーション２時間後に達成した)。該懸濁液を、孔サイズが１００ミクロメーターおよび５０ミクロメーターのシーブに通した(Wilson, CLF, Germany)。該懸濁液を、滅菌遠心分離チューブ中で遠心分離し、プロトプラストを室温で１０分間、５５ gで（加速３；減速３；で； Multifuge 3 S-R, Kendro, Germany)で沈降させた。プロトプラストを、Ｗ５培地(１２５mM ＣａＣｌ２ x ２Ｈ２Ｏ；１３７mM ＮａＣｌ； ５.５mM グルコース；１０mM ＫＣｌ；ｐＨ ５.６; ６６０-６８０ mOsm; 濾過滅菌； Menczel et al.1981)に穏やかに再懸濁した。該懸濁液を、再び室温で１０分間、５５ gで（加速３；減速３；；Multifuge 3 S-R, Kendro, Germany）遠心分離した。プロトプラストを、Ｗ５培地中に穏やかに再懸濁した。プロトプラストを計測するために、少量の懸濁液をFuchs-Rosenthal-chamberに移した。
【００４１】
一過的な形質転換
形質転換のための様々なプロトコール（Schaefer et al. 1991; Reutter and Reski 1996, Schaefer 2001）が、Physcomitrella patensについて記載されてきた。以前に開示された業は、以前から説明されている方法の修飾/組合せを用いた:
【００４２】
形質転換のために、プロトプラストを、暗所３０分間氷上でインキュベートした。次に、プロトプラストを、室温１０分間、５５ ｇ（加速３；減速３；； Multifuge 3 S-R, Kendro）で遠心分離によって沈降させた。プロトプラストを、３Ｍ培地（１５mM ＣａＣｌ２ x ２ Ｈ２Ｏ；０.１％ ＭＥＳ；０.４８Ｍ マンニトール；ｐＨ５.６；５４０mOsm;滅菌濾過, Schaefer et al. (1991) Mol Gen Genet 226, 418-424)中、１.２ x １０６プロトプラスト/mlの濃度で再懸濁した。このプロトプラスト懸濁液（２５０ microliter）を、新しい滅菌した遠心分離用チューブに分配し、ＤＮＡ溶液（５０microliter）(Ｈ２Ｏにおいてカラム精製したＤＮＡ(Qiagen, Hilden, Germany, Hilden, Germany);１０-１００microliterの至適ＤＮＡ量（６０microgram）を添加し、最終的に２５０ microliterのＰＥＧ−溶液(４０％ ＰＥＧ ４０００;０.４Ｍ マンニトール;０.１Ｍ Ｃａ(ＮＯ３)２;オートクレーブ後にｐＨ６)を添加した。該懸濁液を、ただちに、しかしゆっくりと混合し、次いで６分間室温で時々混合しながらインキュベートした。該懸濁液を、１、２、３および４mlの３Ｍ培地を添加して希釈した。該懸濁液を、２０℃１０分間５５gで（加速３；減速３；; Multifuge 3 S-R, Kendro）遠心分離した。該ペレットを、３Ｍ培地（４００microliters）に再懸濁した。形質転換したプロトプラストの培養を、４８ウェルプレート(Cellstar, greiner bio-one, Frickenhausen, Germany)で行った。
【００４３】
一過的な形質転換を、弱い光(４.６ micromols-1m-2)において、２５℃でインキュベートした。サンプルを、２４時間および４８時間後に採取し、各々半分の培地(２００ microliters)を新しい培地に注意深く置換した。プロトプラストは液体中に保持しなければならないため、該培地は、完全には置換しなかった。取出した培地（組換えタンパク質を包含する）を−２０℃で貯蔵した。４８時間のサンプルを、ＥＬＩＳＡで測定した。
【００４４】
安定な形質転換
形質転換のための異なるプロトコール (Schaefer et al. 1991; Reutter and Reski 1996, Protocol Schaefer 2001)が、Physcomitrella patensについて説明されてきた。本明細書中で示した試験に対しては、以前に開示された方法の修飾/組合せを用いた:
【００４５】
形質転換のために、プロトプラストを、暗所で３０分間氷上でインキュベートした。次いで、プロトプラストを、室温で１０分間５５ｇ（加速３；減速３； Multifuge 3 S-R, Kendro）で遠心分離により沈降させた。プロトプラストを、３Ｍ培地（１５mM ＣａＣｌ２ x ２Ｈ２Ｏ；０.１％ ＭＥＳ；０.４８Ｍマンニトール;ｐＨ５.６;５４０ msm；滅菌濾過、Schaefer et al. (1991) Mol Gen Genet 226, 418-424）中に１.２ x １０６プロトプラスト/mlの濃度で再懸濁した。このプロトプラスト懸濁液（２５０ microliter）を、新しい滅菌遠心分離チューブに分配した。ＤＮＡ溶液(Ｈ２Ｏ中でカラム精製したＤＮＡ(Qiagen, Hilden, Germany, Hilden, Germany)（５０ microliter）;至適ＤＮＡ量（６０microgram）（１０-１００ microliter）を添加し、最終的にＰＥＧ溶液(４０％ ＰＥＧ ４０００;０.４Ｍ マンニトール;０.１Ｍ Ｃａ(ＮＯ３)２（２５０ microliter）;オートクレーブ後にｐＨ６）を添加した。該懸濁液を、直ちに、しかし穏やかに混合し、次いで６分間室温で、時折ゆっくりと混合しながらインキュベートした。該懸濁液を、１、２、３および４mlの３Ｍ培地を添加して段階希釈した。該懸濁液を、２０℃で１０分間５５g（加速３；減速３；Multifuge 3 S-R, Kendro)で遠心分離した。該ペレットを、再生培地（３ml）中に再懸濁した。選択方法は、Strepp et al.(1998)に記載のとおりに行った。
【００４６】
ＥＬＩＳＡ
一過的に形質転換したコケプロトプラストによって発現した組換えＶＥＧＦ１２１を、ＥＬＩＳＡ(R&D Systems, Wiesbaden, Germany)によって定量化した。ＥＬＩＳＡを、製造者の指示書に従って実施した。サンプルを定量化のために希釈した。
【００４７】
細菌株およびクローニングベクター
全てのクローニグおよび増殖実験のために、Escherichia coli 株 Top10 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を用いた。ＤＮＡフラグメントのクローニングのために、ｐＣＲ2.1-TOPO (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)、ｐＣＲ4-TOPO (Invitrogen, Karlsruhe, Germany), pZErO-2 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)またはｐＲＴ101 (Toepfet et al. (1987), NAR, 15, p5890)を、ベクターとして使用した。
【００４８】
ゲノムＤＮＡ：調製、消化、ライゲーション
Physcomitrella patens ゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢプロトコール(Schlink and Reski, 2002)に従って１３日目の原子体から単離した。
【００４９】
ゲノムＤＮＡ(３-５ micrograms)を、消化あたり１つのエンドヌクレアーゼを用いて、全量３０microliters中３０ユニットの様々な制限エンドヌクレアーゼ(例えば、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＰａｅＩ、ＰａｇＩ、ＸｂａＩ；全てのMBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いて、２時間３７℃で消化した。消化したＤＮＡを、製造者マニュアルに従ってＰＣＲ精製カラム(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて精製した［消化物（３０ microliters）＋緩衝液PB（２００ microliters）］。溶出を、溶出緩衝液（ＥＢ； Qiagen, Hilden, Germany)(５０ microliters）中で行った。次処理の前に、溶出液(１０microliters)をアガロースゲル(０.５％)上で分析した。
【００５０】
残っているＤＮＡを、５ユニットのＴ４リガーゼ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いて、全量３００ microliters中、室温で２時間、さらに４℃で２日間再結合させた。酵素添加前に、ライゲーション混合物を、頑強な末端の塩基対形成を溶解するために５０℃で５分間、次いで氷上に置いた。０.３Ｍ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４.８)を用いるエタノール沈殿および７０％のエタノールで２回洗浄の後、再結合したＤＮＡを、ＥＢ（２００microliters）中に再懸濁した。この再結合したゲノムＤＮＡの１／３を、Ｉ−ＰＣＲに使用した。
【００５１】
ＲＮＡ調製
Physcomitrella patensの全ＲＮＡを、液体窒素下で組織を磨りつぶし、E.Z.N.A. Ｐlant ＲＮＡ Ｋｉｔ（PeqLab）またはＲＮｅａｓｙ Ｐlant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) の取扱方法を製造者マニュアルに従って調製した。全ＲＮＡをゲル分析し、定量し(OD260)、各々−２０℃または−８０℃で貯蔵した。
【００５２】
ＤＮａｓｅ処置および第一鎖cＤＮＡ合成
全ＲＮＡ(１microgram)を、製造者マニュアルに従って全量でＤＮａｓｅ(GIBCO BRL) （１１ microliters）消化した。このＤＮａｓｅ（４.５ microliters）処理全ＲＮＡ(〜４００ng)を、製造者マニュアルに従って、Oligo dT(１２-１８)プライマーおよびSUPERSCRIPT II RNase H 逆転写酵素(GIBCO BRL)を用いて、第一鎖ｃＤＮＡを調製した。得られたcＤＮＡを、滅菌ｄｄＨ２Ｏで１０倍希釈し、−２０℃で貯蔵した。
【００５３】
一般的なＰＣＲ
特に指示がなければ、ＰＣＲは、cＤＮＡポリメラーゼ混合物(BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Germany)を用いて行われる。他の全ＰＣＲ法について、次のＤＮＡポリメラーゼ：Ｔaq リコンビナント・ポリメラーゼ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)、Ｐfu ネイティブ・ポリメラーゼ (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)、プラチナ Ｐfx ＤＮＡポリメラーゼ(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)またはTripleMaster PCR System (EppendＯＲＦ, Hamburg, Germany)を使用した。認可されたサーモサイクラーは Mastercycler gradient であった(EppendＯＲＦ, Hamburg, Germany)。全てのプライマーを、MWG Biotech AG, Ebersberg, Germanyによって合成した。ＰＣＲ産物について、精製またはゲル溶出 ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡおよびＧｅｌ Ｂａｎｄ 精製キット(Amersham Bioscience, Freiburg, Germany)を、製造者マニュアルに従って使用した。
【００５４】
組換えプラスミドの構築およびクローニング
従来の分子生物学的プロトコールは、基本的にはSambrook et al.(1989), Molecular クローニング: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Pressによって説明されている。
【００５５】
インバースＰＣＲ(Ｉ−ＰＣＲ)＆ネスティッドＰＣＲ
Ｉ−ＰＣＲを、Advantage cＤＮＡポリメラーゼ混合物（０.２５ microliters）および緩衝液［(３.５ｍＭ Ｍｇ(ＯＡｃ)２を含む、両方BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Germany)］、０.２ｍＭ各プライマー、０.２ｍＭ ｄＮＴＰおよびゲノム再結合物（１〜３ microliters）(上記参照)を、全量２５microliters中で行った。サイクル条件：９６℃で２分の開始ステップ、次いで９６℃で２０秒、最初に−６７℃で１０秒(タッチダウン：-０.１５℃/サイクル)および第二ステップとして６８℃で１０分、３５〜４０回反復して、続く６８℃で２０分の停止ステップ、そしてプログラム終了時４℃での冷却。ＰＣＲ産物を、アガロースゲルから溶出した。溶出を３０microliters中で行った。溶出したＰＣＲ産物を、TOPO TA ベクター(pCR4-TOPO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)において直接クローニングするか、ネスティッドＰＣＲで再確認のためのテンプレートとして使用する。後者の場合、ゲル溶出したネスティッドＰＣＲ産物をTOPO TA ベクター(pCR4-TOPO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)においてクローニングした。ネスティッドＰＣＲのためのサイクル条件：１分９６℃の開始ステップ、次いで９４℃２０秒、５６℃１０秒および６８℃４分を第二ステップとして、２５反復し、続いて６８℃で１０分の停止ステップ。
【００５６】
増幅したプロモーターフラグメントのクローニング用pRT101newの生成
pRT101p21(Gorr 1999)を、プライマー３２０および３２１（これと全ての連続プライマーについては、表１を参照されたい)を用いて、Ｐfuネイティブ・ポリメラーゼ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いて再増幅した。プライマー３２０(フォワード)は、ＶＥＧＦシグナルペプチドの第二コドン(５'-(atg)aac...)で開始する。プライマー３２１(リバース)は、３５Ｓプロモーター(５'-gac...)の前のマルチ・クローイング・サイト内のＨｉｎｃＩＩ部位中央で開始する。さらにＸｈｏＩ部位を、プライマー３２１を用いて導入した。ＰＣＲ産物の再結合により、３５Ｓプロモーターの欠失およびＨｉｎｃＩＩ部位の再構築をもたらした。ＶＥＧＦ遺伝子の配列を、配列決定によって確認した。この新規ベクターを、ｐＲＴ１０１newと呼び、レポーター遺伝子の前方部分で、各々ＸｈｏＩまたはＨｉｎｃＩＩ部位を介して発現促進領域のクローニングのために使用した。
【００５７】
配列決定
全ての配列決定反応をＳＥＱＬＡＢ Sequence Laboratories, Goettingen, Germanyによって行った。
【００５８】
ソフトウェア
Sci Ed Central, Clone Manager Suiteを、プラマー設計、ペアワイズおよびマルチプル配列アラインメントに使用した。Lasergene,DNASTAR (Version 5) Megalign and SeqManを、配列データの分析に用いた。ホモロジー検索を、ＢＬＡＳＴ２(Altschul et al., 1997)で実施した。
【００５９】
実施例
本発明は、コケ発現促進領域について４つの例によって説明される:第一の例に、Physcomitrella patensのチューブリン発現促進領域のファミリーの様々なメンバーに関する単離および分析。第二の例に、様々な異なるコケ由来のアクチン遺伝子ファミリーについて発現促進領域を提供する。第三および第四の例は、ユビキチン発現促進領域およびＲＢＣＳ発現促進領域に関する。
【００６０】
実施例１： Physcomitrella patens β-チューブリン遺伝子およびそれらの発現促進領域のクローニングおよび分析
概略
第一ステップにおいてPhyscomitrella patens (Pp)由来のβ-チューブリン(tub)調節/プロモーター配列を得るために、β-チューブリン相同物のコード配列を、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって単離した。そのために、Arabidopsis thaliana (Ａttub １-９）由来の全て９つの公開されたβ-チューブリンゲノム配列のアラインメントを使用して、高度に保存されたコード領域(８Ｆ、９Ｆおよび１０Ｒ；これと全ての二次プライマーは表１を参照されたい）内にプライマーを設計した。さらに、Physcomitrella patens由来の公開ＥＳＴデータの配列情報を使用したが、３つのみがβ−チューブリンとのホモロジーを示しただけであった。そのうちの１つは、予測されたたコード領域の遺伝子特異的プライマー（Ｆ７)上流を設計するために使用した。上記したプライマーによって生じた全てのクローン化ＰＣＲ産物とＥＳＴデータの配列比較により、限定しないが、主にイントロン内の相違による群間での相違だけで、同一のＤＮＡを有する３群のクローンを導いた。このβ-チューブリンオルトログを、各々Ｐｐｔｕｂ１、Ｐｐｔｕｂ２およびＰｐｔｕｂ３と呼ぶ。
【００６１】
さらに、プロジェクトが進行中で、さらなるＥＳＴデータが利用できる（2002の開始と共にＮＣＢＩ／ｄｂＥＳＴにおいて５００００以上が新規に登録された)ので、β-チューブリンに対して高い類似性を有する全１２１のPhyscomitrella patens ＥＳＴの詳細な分析により、群内では同一であるがその他の群またはＰｐｔｕｂ１-３のいずれに対しても同一でないＥＳＴの３つの別の新規の上流および３つの下流群を導いた。新しい各群由来の予測された非コード化上流および下流領域(下記を参照されたい)から誘導されたプライマー、および並べかえた全てのプライマーの組合せを用いるＰＣＲは、特定の座、各々Ｐｐｔｕｂ４、Ｐｐｔｕｂ５およびＰｐｔｕｂ６に対して、対応する上流および下流群との相関を算定するのに役立った。３つ全ての新規の座のゲノムおよびcＤＮＡ増幅物の両方をクローニングし、配列決定をし、Physcomitrella patensにおけるβ-チューブリンオルトグの数を６に増やした。
【００６２】
Ｐｐｔｕｂ１〜４（Ｐｐｔｕｂ５および６と対比し）は、ＥＳＴデータベースにおいては非常に頻繁に提示される。対応するcＤＮＡライブラリィーを、主に原糸体および初生茎葉体（gametophore）由来のＲＮＡを用いて産生した。そのため、フランキングゲノム領域中で移動するため、得られた配列データを基にしてこの４つの遺伝子についてのみ、インバースＰＣＲ法(Ｉ−ＰＣＲ)を実施した。
【００６３】
Ｐｐｔｕｂ１
第一ステップで既に記載したように、プライマー８Ｆおよび１０Ｒを用いて Physcomitrella patens ゲノムＤＮＡを基にした２つの独立したＰＣＲ由来のＴａｑ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)ＰＣＲフラグメントを、クローニングした。各ＰＣＲからの１つのクローン(２-１)および２つのクローン(８-１、８-２)各々を、部分的に配列決定し、同一であることを明らかにした。対応する座をＰｐｔｕｂ１と呼ぶ。再結合されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩゲノム消化物（プライマー３５、３６）に対してＩ−ＰＣＲ法を用いて、Ｐｐｔｕｂ１のフランキング領域内でのゲノムウォークを行うために、この予備的な配列情報を用いてプライマーを設計した。産物の再確認を、ネスティッドＰＣＲ(プライマー４０、３８)によって行った。ネスティッドＰＣＲ産物(Ｅ＃１およびＨ１.７)によって生じた２つのクローンを完全に配列決定した。
【００６４】
Ｈind ＩＩＩクローンＨ １.７は、おそらく酵素のスター活性またはランダムds遮断物のライゲーションのため、内部のＨｉｎｄ ＩＩＩ部位を持たなかった。しかし、第一ＥｃｏＲＩ部位の配列上流を、ゲノムＤＮＡ(プライマー１１３、６７および１１３、９０)に対して２つの独立したＰＣＲによって確認した。さらに、別のcＤＮＡ(８９、９１；Ｐｆｕネイティブ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany))ＰＣＲ産物をクローニングした。
【００６５】
全ての記載したクローンは、配列データの生成および再確認に役立てた。全体で、スタートコドンの〜１５００bp上流およびストップコドンの〜１５００bp下流を得た。
【００６６】
Ｐｐｔｕｂ２
すでに記載したとおりに、Physcomitrella patens由来の公開されたＥＳＴの配列情報を使用して、予言されたコード領域について遺伝子-特異的プライマー（Ｆ７）上流を設計した。Physcomitrella patensゲノムＤＮＡ(プライマーＦ７、１０Ｒ)に対するＰＣＲ、続くＰＣＲ産物のクローニングと配列決定により、公開されたＰｐｔｕｂ ＥＳＴ(Ｐｐｔｕｂ ＥＳＴ１-３)に関して３つ全てと一緒に、それが、Ｐｐｔｕｂ２と呼ばれる１つの座に属することが証明された。イントロンの位置は、ＥＳＴをゲノム配列と比較することによって確認できる。
【００６７】
この予備的配列情報を用いて、Ｐｐｔｕｂ２の隣接したゲノム領域中でゲノムウォークを行うために、再結合ＰａｇＩ、ＢａｍＨ ＩおよびＮｄｅＩゲノム消化物に対するＩ−ＰＣＲ法を用いて、イントロン(プライマー９５および７１)内に遺伝子-特異的プライマーを設計する。ＰＣＲ産物を、ネスティッドＰＣＲ(プライマー３８、３５)によって再確認した。ネスティッドＰＣＲ産物(Ｃ＃２ＰａｇおよびＤ＃２Ｎｄｅ)によって生成した２つのクローンを、完全に配列決定した。ＮｄｅＩクローンＤ＃２は、おそらくは酵素のスター活性またはランダム ds 破損箇所のライゲーションにより、内部ＮｄｅＩ部位を担持しなかった。しかしながら、配列データを、Ｃ＃２Ｐａｇおよび第３のＩ−ＰＣＲクローン(９５＃８ＢａｍＨＩ；プライマー１４９および７１)によって確認した。さらに、ゲノムＤＮＡ(プライマー２０５、１４９；Ｔａｑ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany) およびプライマー２０５、２０６)に対して２つの独立したＰＣＲにより産物の長さを確認した。２０５-２０６ＰＣＲ産物および追加のゲノムの下流ＰＣＲ産物(プライマー７１、２０６；Ｐｆｕネイティブ (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany))をクローニングし、配列データの確認に役立てた。
【００６８】
全ての記載したクローンを、配列データを生成するため、および再確認するために役立てた。合計で、スタートコドンの〜１４００bp上流およびストップコドンの〜１４００bp下流を得た。
【００６９】
Ｐｐｔｕｂ３
最初のステップですでに記載したとおりに、プライマー９Ｆおよび１０Ｒを用いる、Physcomitrella patensゲノムおよびcＤＮＡに対する２つの独立したＰＣＲから、Ｔａｑ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)ＰＣＲフラグメントをクローニングした。各ＰＣＲ(＃３−３ゲノム、＃４-３ｃＤＮＡ)からのクローンを、部分的に配列決定して、同一であることが判った。対応する座をＰｐｔｕｂ３と呼ぶ。
【００７０】
この予備的配列情報を使用して、Ｐｐｔｕｂ３の隣接領域中にゲノムウォークを行うために、再結合したＰａｇＩおよびＮｃｏＩゲノム消化物に対するＩ−ＰＣＲ法を用いて、イントロン(プライマー６９、７０)内で遺伝子-特異的プライマーを設計した。ＰＣＲ産物の再確認を、ネスティッドＰＣＲ（プライマー３８、３５)にて行った。２つのクローン(Ａ＃１Ｎｃｏおよび＃４-１Ｐａｇ)を完全に配列決定した。Ａ＃１Ｎｃｏは、＃４-１ＰａｇＩは元来のＩ−ＰＣＲ産物（６９、７０)によって生成されたにもかかわらず、ネスティッドＰＣＲ産物(３８、３５)によって生成したクローン遺伝子である。さらに、ゲノムＰＣＲ産物(プライマー２０３、２０４)をクローニングし、配列データを評価するのに役立てた。
【００７１】
全て記載したクローンは、配列データを生成し、再確認するために役立てた。合計して、スタートコドンの〜１９００bp 上流およびストップコドンの〜１１００bp下流を得た。
【００７２】
Ｐｐｔｕｂ４
すでに記載したとおりに、Ｐｐｔｕｂ４の場合、ＥＳＴデータを用いて、ゲノムおよびcＤＮＡクローンを生成するために、遺伝子-特異的下流および上流プライマー(２９７、２９９)を設計した。ネイティブＰｆｕポリメラーゼ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いる別のゲノムクローンを、配列データを評価するのに役立てた。
【００７３】
プライマー２９７および２９９を逆転させ(３３７、３８３)、再結合したＮｄｅＩおよびＮｃｏＩゲノム消化物に対してＩ−ＰＣＲ法を用いて、Ｐｐｔｕｂ４の隣接ゲノム領域へのウォーキングを行うために使用した。２つのクローン(４８＃２ＮｃｏおよびＡ０２＃３Ｎｄｅ)および追加のゲノムクローン(プライマー５４７および３７４；Advantage cＤＮＡポリメラーゼ混合物(BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Germany)およびTriple Master (EppendＯＲＦ, Hamburg, Germany))を生成した。
【００７４】
全て記載したクローンは、配列データを作成および再確認するために役立てた。合計で、スタートコドンの〜２３００bp上流およびストップコドンの〜１１００bp下流を得た。
【００７５】
Ｐｐｔｕｂ５および６
すでに記載したように、Ｐｐｔｕｂ５および６の場合、各遺伝子のゲノムおよびcＤＮＡクローンを生成するために、ＥＳＴデータを用いて遺伝子-特異的下流および上流プライマー(Ｐｐｔｕｂ５：２９８、３００およびＰｐｔｕｂ６：２９６、３３６)を設計した。ネイティブＰｆｕポリメラーゼ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いて、Ｐｐｔｕｂ５、追加のゲノムクローンを、配列データを評価するために役立てた。
【００７６】
全て記載したクローンは、配列データを生成し、再確認するために役立てた。合計では、Ｐｐｔｕｂ５については２０３１bpゲノム配列およびＰｐｔｕｂ６については３１６１bpゲノム配列を得た。
【００７７】
クローニングストラテジー
予備的Ｐｐｔｕｂ１(２−１、８−１、８−１；全てのゲノム)およびＰｐｔｕｂ３（３−３ゲノム、４−３ｃＤＮＡ)クローンを、Ｔａｑリコンビナントポリメラーゼを用いて生成した。ＰＣＲ産物を、TOPO TA ベクター(pCR4-TOPO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)中に結合させた。ＰＣＲ条件：全量２５microlitersにおいて、２.５ユニット Ｔａｑリコンビナントポリメラーゼ、酵素緩衝液、３.３ｍＭ ＭｇＣｌ２(全て、MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)、０.４ｍＭ各プライマー、テンプレートとして１００ nanogramsのcＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ。サイクル条件:９５℃５分の初期ステップ、次いで９５℃４５秒、６０℃１０秒（プライマー８Ｆ）または６５℃（プライマー９Ｆ）および７２℃１分間を第二ステップとして、３０〜３５回反復し、次いで７２℃５分の停止ステップ、プログラムの終了時４℃に冷却する。
【００７８】
その他全てのゲノムおよびcＤＮＡクローンは下記のとおりであった：
Ｐｐｔｕｂ １:  １１３-６７、１１３-９０、８９-９０、８９-９１ｃＤＮＡ
Ｐｐｔｕｂ ２:  Ｆ７/Ｒ１０、２０５-２０６、７１-２０６
Ｐｐｔｕｂ ３:  ２０３-２０４
Ｐｐｔｕｂ ４:  ５４７-３７４(＋Tripple Master)、２９７-２９９cＤＮＡ＋ゲノム(＋Ｐｆｕ)
Ｐｐｔｕｂ ５:  ２９８-３００ cＤＮＡ＋ゲノム(＋Ｐｆｕ)
Ｐｐｔｕｂ ６:  ２９６-３３６ cＤＮＡ＋ゲノム
【００７９】
上記の下線を引いたクローンを、２０microliterのＰＣＲあたり、酵素混合物（０.２５ microliters）、緩衝液(３.５ ｍＭ Ｍｇ(ＯＡｃ)２を包含し、両方、BD Biosciences Clontech, Heidelberg, Germany)、０.２５ｍＭ 各々プライマー、０.２５ｍＭ ｄＮＴＰおよびテンプレート（１０-２０nanograms）を用いて、Advantage cＤＮＡポリメラーゼ混合物によって生成した。サイクル条件：９６℃２分での開始ステップ、次いで９６℃２０秒、６０℃１０秒および６８℃２分/ｋｂを第二ステップとして、３５〜４０反復し、次いで６８℃１５分の停止ステップ、プログラムの終了時４℃に冷却する。適切な長さのＰＣＲ産物を、アガロースゲルから溶出した。溶出を、増幅した量によって、３０-５０microlitersで行った。溶出されたＰＣＲ産物を、ＴＯＰＯ ＴＡベクター(pCR4-TOPO,Invitrogen, Karlsruhe, Germany)においてクローニングした。
【００８０】
他の全てのクローンを、２つの別のゲノムクローン２９７-２９９および２９８-３００であった場合、Ｐｆｕネイティブ・ポリメラーゼと共に、２０ microliters ＰＣＲあたり、ポリメラーゼ(＝０.７５ユニット)（０.３ microliters）、緩衝液、２-４ｍＭ ＭｇＳＯ４(全て、MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)、０.２５ｍＭ 各々プライマー、０.２ ｍＭ ｄＮＴＰおよびテンプレート（１０-２０nanograms）を用いて生成した。サイクル条件：９６℃２分の開始ステップ、次いで９６℃２０秒、６０℃１０秒および７２℃で２分/ｋｂを第二ステップとして、３５〜４０反復し、次いで７２℃１０分の停止ステップおよびプログラム終了時に４℃に冷却する。適切な長さのＰＣＲ産物を、アガロースゲルから溶出した。溶出を、増幅した量によって、３０-５０microlitersで行った。溶出されたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶを用いて直線化したｐＺＥｒＯ−２(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)においてクローニングした。
【００８１】
５４７-３７４の別のクローンを、２０microliterのＰＣＲあたり、ポリメラーゼ混合物(＝１.２５ユニット)（０.２５ microliters）、チューニング緩衝液(２.５ｍＭ Ｍｇ２＋を包含する、両方EppendＯＲＦ, Hamburg, Germany)、０.２ ｍＭ 各プライマー、０.２ ｍＭ ｄＮＴＰｓおよびテンプレート（１０-２０nanograms）を用いて、TripleMaster PCR Systemにより生成させた。サイクル条件：２分９６℃開始ステップ、次いで２０秒９６℃、２０秒６０℃および３分７２℃を第二ステップとして、４０反復で、次いで１０分７２℃の停止ステップおよびプログラムの終了時に４℃まで冷却する。適切な長さのＰＣＲ産物を、アガロースゲルから溶出した。溶出を、増幅物の量によって、３０-５０microlitersで行った。溶出したＰＣＲ産物を、TOPO TA ベクター(pCR4-TOPO, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)においてクローニングした。
【００８２】
要約すると、Physcomitrella patensのゲノムＤＮＡに対するＰＣＲおよびＰＣＲ産物のクローニングから、６つの転写されたPhyscomitrella patens β-チューブリン遺伝子の配列情報を導いた。さらに、ＥＳＴおよびcＤＮＡデータを使用して、ゲノム配列データおよびイントロン/エキソン境界を確認した。Ｐｐｔｕｂ １〜４の場合では、インバースＰＣＲから、非転写フランキング５’および３’ゲノム配列を導いた。全ての６つのゲノム領域の全概要を図１に示した。
【００８３】
遺伝子構造＆保存
すでに強調したように、Ｐｐｔｕｂ１〜４は、ＥＳＴデータベースにおいて最も多く示される。さらに、それらの対応する大多数のＥＳＴを、完全長cＤＮＡライブラリィーから生じた。この２つの事実は、インシリコ（in silico）でＰｐｔｕｂ１〜４の転写開始部位(ＴＳＳ)を決定するために役立てた。対応する上流ゲノム領域に対して５'ＥＳＴの複数アラインメントは、Ｐｐｔｕｂ１〜３が正確な転写開始を有することを示した：Ｐｐｔｕｂ１については５'ＥＳＴの２７のうち２０が、Ｐｐｔｕｂ２については５'ＥＳＴの２０のうち１６およびＰｐｔｕｂ３については５'ＥＳＴの１４のうち９は、＋１(図３-６)でマークした最も上流の位置で、同時に開始する。さらに、全ての３つのＴＳＳは、コンセンサス配列によって囲まれる(下記を参照)。Ｐｐｔｕｂ４の場合では、２３の５'ＥＳＴは、１００bp内で複数のＴＳＳを示した。最も上流の５'ＥＳＴの開始部位を、＋１として定義した。
【００８４】
対応する下流ゲノム領域に対する３'ＥＳＴの相同な複数アラインメントから、植物遺伝子がほとんど２以上のポリ(Ａ)部位を有し、コンセンサス配列が哺乳類遺伝子よりも明確には定義されない、例えばこの配列ＡＡＵＡＡＡがほとんど偏在している(Rothnie et al., 1996を参照されたい）ことを確認した。
【００８５】
Physcomitrella patensの６つのクローニングした座は、いかなる非センスストップコドンも示さず、既知のβチューブリンと高い類似性を有する適当なタンパク質が予測された。コード領域以外では、一般的に、類似性は直ちにかつ有意に低下する。５'推定調節要素に関して、４つの全ての上流領域の詳細な比較から、遺伝子ファミリー内または他の既知植物のβ-チューブリン遺伝子の５'領域に全体的に保存されていないことが明らかになった。しかし、遺伝子ファミリー内の保存についていくつかの興味ある一致が検出できた：
ａ）３つ全ての場合において、Ｐｐｔｕｂ １〜３の決定されたＴＳＳは、コンセンサス配列Ｔ／Ｃ ＣＡ(＋１) Ｇ／Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ 内で生じ、Ｃ／Ｔ−リッチに富む領域(１７１ 非関連ＴＡＴＡ植物プロモーターのコンセンサスを比較する：http://mendel.cs.rhul.ac.uk/mendel.php?topic=plantpromでのplantProm データベースにおいてＴ／Ｃ Ｃ Ａ(＋１) Ｎ Ｍ Ｎ)に挿入される。
ｂ)ＴＳＳの２２-２４bp上流−植物ＴＡＴＡプロモーター(plantProm DBを参照されたい)に対して典型的な距離内である−２０-２５bpの保存された範囲に挿入されていた弱い８bpのＴＡＴＡボックスはＰｐｔｕｂ １〜３で見出され得る。１７１非関連植物プロモーター由来のＴＡＴＡボックスのコンセンサスは次のとおりである：Ｔ９６ Ａ９５ Ｔ９６ Ａ１００ Ａ６２/Ｔ３８ Ａ９７ Ｔ６１/Ａ３８ Ａ７３(plantProm DBを参照されたい)およびＰｐｔｕｂ １-３については次のとおりである：Ｔ ｔ Ｔ Ａ Ｔ ｃ Ｔ ｃ／ｔ／Ａ、大文字はコンセンサスとの相関関係示す。
ｃ）全ての４つの遺伝子は、それらの５'ＵＴＲにおいて非常に低い程度のアデノシン(９-１６％)を有する。
ｄ）Ｐｐｔｕｂ ４の５'ＵＴＲは、全体的なＣ／Ｔ含量の７４％であり、さらに、Ｃ／Ｔ範囲(〜５０bp)を、最も短く、最も下流の５'ＥＳＴの開始部分の直後に担持する。
ｅ）Ｐｐｔｕｂ２は、ＴＳＳ(−４５０−４８９まで)の約４５０bpの上流付近に、４０bpポリＡ範囲を担持する。
ｆ）Ｐｐｔｕｂ １および４上流において、約−４２０位置の長く非常にＡ／Ｔ−に富む領域(Ｐｐｔｕｂ１は約９００bpに対してＡ／Ｔが８０％を超え、Ｐｐｔｕｂ４は、１７５０bpに対してＡ／Ｔが７５％である）がはじまり、位置スキャッホルド/マトリックス結合領域［S/MARs;(Liebich et al., 2002)、この遺伝子の上流］についての可能性をひらくものである。
【００８６】
β-チューブリンプロモーターの機能分析＆定量化 
最高のプロモーター活性を示す最小プロモーター−フラグメントの定義を、発現系として非再生化Physcomitrella patensプロトプラストを使用して、一過的な発現系においてＰｐｔｕｂ １〜４の推定５'調節配列の機能的定量化によって行った。各プロモーターに対して、上流領域および５'ＵＴＲを包含する様々な長さのいくつかの構築体は、レポーター遺伝子のスタートコドンの前に正確にもたらされる。レポーター遺伝子として、ヒトタンパク質(組換えヒト血管内皮増殖因子１２１:ｒｈＶＥＧＦ １２１；Gorr 1999)を、それ自身のシグナルペプチドを介した培地中に分泌した。コケ培養の上清中のｒｈＶＥＧＦ １２１の量は、ＥＬＩＳＡによって定量化され、該系においてプロモーターまたはプロモーターフラグメントの強度を表した。この値を、３５Ｓプロモーターによって得た値と関連した。各構築体を、最小６回の２〜３つの異なる形質転換実験において形質転換した。サンプルを、２４時間と４８時間後に各々採取し、４８時間のサンプルを、ＥＬＩＳＡで適当な釈希釈で２回測定した。該結果の概略を図２に示した。
【００８７】
Ｐｐｔｕｂ１〜４の発現促進領域を、配列番号１〜８として開示した。
【００８８】
pRT101newへのＰｐｔｕｂ １および４の増幅したプロモーターフラグメントのクローニング
【表１】
2007501619.tif 000003
【００８９】
上記プロモーターフラグメントを、Ｐｆｕネイティブポリメラーゼ(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)と共に、ＡＴＧスタートコドン(cat...)の逆相補配列および部分的な、ＸｈｏＩ部位を含有するフォワードプライマーと共に開始する逆プライマーを用いて、ゲノムＤＮＡで増幅させた。ＰＣＲ産物を、各々、ＸｈｏＩで切除し、ＸｈｏＩ／ＨｉｎｃＩＩで結合するか、または全く切除せずに、開環したpRT101newのＨｉｎｃＩＩに結合させる。生じたクローンを、配列決定によって確認した。クローン１-２(ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ)、２-１（ＢｇｌＩＩ)、２−２（ＳａｌＩ）、２−３(ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ)、２-４(ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ)、３−２(ＳａｌＩ)、３−３(Ｅｃｏ１４７Ｉ／ＨｉｎｃＩＩ)、３−４(ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ)を、より長いクローンの内部削除によって生じさせる。残存するベクターを、ゲル溶出し、再結合させた。１本鎖オーバーハングが一致しなかった場合には、製造者マニュアルに従って、クレノーフラグメント(MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)を用いて中断した３'-末端を埋めた後にライゲーションを行った。
【００９０】
Ｐｐｔｕｂ １
６つの異なるプロモーター長を、レポーター遺伝子の前に、形質転換ベクターpRT101p21中でクローニングした。全ての構築体のデータを、図３(＋２２６まで５'ＵＴＲ＝＋１(ＴＳＳ、＋２２７＝ＡＴＧ)に示した。
【００９１】
【表２】
2007501619.tif 000004
【００９２】
プロモーターフラグメント１-２を、高発現割合を与える最も短いプロモーターフラグメントとして定義し得る。該割合は、１００％として設定した３５Ｓプロモーターを用いて生じた値と比べると、約１５０％である。最小プロモーターフラグメント１−２の長さの上流、非常にＡ／Ｔリッチな領域が開始することに注目されたい(ほぼ９００bpに対して８０％Ａ／Ｔを超える)。
【００９３】
Ｐｐｔｕｂ ２
５つの異なるプロモーター長を、形質転換ベクターpRT101p21中、このレポーター遺伝子の前でクローニングした。全ての構築体のデータを、図４(＋１２２まで５'ＵＴＲ＝＋１（ＴＳＳ）、＋１２３＝ＡＴＧ)に示した。
【００９４】
【表３】
2007501619.tif 000005
【００９５】
プロモーターフラグメント２−２を、高発現割合を与える最短プロモーターフラグメントとして定義し得る。該割合は、３５Ｓプロモーターを用いて生成した値に匹敵する(１００％)。
【００９６】
Ｐｐｔｕｂ ３
異なるプロモーター長を、形質転換ベクターpRT101p21中、このレポーター遺伝子の前にクローニングした。４つの構築体のデータを図５(＋１１２まで５'ＵＴＲ＝＋１（ＴＳＳ）、＋１１３＝ＡＴＧ)に示した。
【００９７】
【表４】
2007501619.tif 000006
【００９８】
プロモーターフラグメント３−２を、高発現割合を与える最短プロモーターフラグメントとして定義し得る。該割合は、１００％として設定した３５Ｓプロモーターを用いて生じた値と比べて約３００％である。
【００９９】
Ｐｐｔｕｂ ４
２つの異なるプロモーター長を、形質転換ベクターpRT101p21中、このレポーター遺伝子の前にクローニングした。該データを図６に示した。(５'ＵＴＲ＝ＴＳＳ(＋１から＋１０３まで)＋２０５まで、＋２０６＝ＡＴＧ)
【０１００】
【表５】
2007501619.tif 000007
【０１０１】
プロモーターフラグメント４−１は、１００％として設定した３５Ｓプロモーターを用いて生じた値と比べて約２５０％である発現速度を示した。この最小プロモーターフラグメント(４−０)の上流で、長く、非常にＡ／Ｔに富んだ領域が始まる(１７５０ bpに対して７５％Ａ／Ｔ)ことに注目されたい。
【０１０２】
要約すると、Ｐｐｔｕｂ １〜４ゲノム上流領域の一過的プロモーター活性を特徴分析した。最高のプロモーター活性を与える最小プロモーターフラグメントが定義され、３倍までの３５Ｓプロモーター活性を与える。
【０１０３】
Ｐｐｔｕｂ-構築体の一覧(配列表も参照されたい)
【表６】
2007501619.tif 000008
【０１０４】
【表７】
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【０１０５】
【表８】
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【０１０６】
【表９】
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【０１０７】
【表１０】
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【０１０８】
【表１１】
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【０１０９】
【表１２】
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【０１１０】
【表１３】
2007501619.tif 000015
【０１１１】
実施例２： 様々な種およびそれらの発現促進領域由来のアクチン遺伝子のクローニングおよび分析
２．１． Physcomitrella patens アクチン遺伝子のゲノム構造
発現ベクターを構築するために、４つのアクチン遺伝子およびコケ植物 Physcomitrella patensのプロモーター領域およびFunaria hygrometricaおよび苔網類 Marchantia polymorphaから３つ、コケにおいてそれらを使用するために単離した。
【０１１２】
公開されたデータベースに存在する Physcomitrella ＥＳＴ配列から設計した特異的オリゴを用いて、４つのアクチン遺伝子(Ｐｐａｃｔ１、Ｐｐａｃｔ３、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７)を、ゲノムＤＮＡから数回のＩ−ＰＣＲにおいて単離し、配列決定した。
【０１１３】
Physcomitrellaにおいて、単離された遺伝子の構造は、ある１つのケース(Ｐｐａｃｔ１)では高等植物のアクチン遺伝子の保存された構造的組織体に類似する。非翻訳リーダーは、１４nt上流のイニシエーターＡＴＧに位置する相対的に長い(９５５bp)イントロンによって分断されている。コード領域は、他の植物種のアクチン遺伝子のイントロンと同じ場所に位置する３つの小さなイントロンを示す。一番目のものは、コドン２０（ｌｙｓ）および２１（ａｌａ）の間に位置し、二番目のものはコドン１５２（ｇｌｙ）の間で、三番目はコドン３５６(ｇｌｎ)と３５７（ｍｅｔ）の間である。この遺伝子的構造は、単離した（Ｐｐａｃｔ３、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７）３つの他のPhyscomitrellaアクチン遺伝子とは異なっていることが判る。それらの場合において、５'ＵＴＲイントロン（４３４bp、１００６bpおよび１０５５bp各々）もまた、ＡＴＧの前の１４ntに位置するが、該コード領域は、コドン２１（ｌｙｓ）および２２（ａｌａ）（図７）の間に位置する１つのイントロンによって分断される。
【０１１４】
２．２．アクチン遺伝子の発現促進領域の活性試験
様々なPhyscomitrellaアクチン発現促進領域（配列番号５〜８）の活性に加えて、様々な遺伝子の５'ＵＴＲの効果を試験するために、様々なベクターを試験中５'領域の制御の下で、hＶＥＧＦタンパク質の発現のために構築した。
【０１１５】
転写開始部位の上流約２kbゲノム領域が、ゲノムＤＮＡからのiＰＣＲによって単離し、配列決定し、プロモーターによって駆動されるヒトＶＥＧＦのcＤＮＡを含有し、５'イントロンを包含する正確なリーダー配列を含有するベクターを、コケプロトプラストの一過的なトランスフェクションのために構築した。完全な５'促進発現領域を、Ｐｐａｃｔ１についてはプライマー３９５および３３２、Ｐｐａｃｔ３については４０８および３３３、Ｐｐａｃｔ５については５１１および３３４およびＰｐａｃｔ７については４１３および３３５を用いる、プルーフリーディングＰＣＲによって増幅させた。
【０１１６】
プロトプラストの形質転換を、試験すべき各構築体、および平行して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下でｈＶＥＧＦcＤＮＡを担持する構築体と同じ数の分子を用いて実施した。ｈＶＥＧＦタンパク質は、培地に組換えタンパク質を分泌させる２６aaシグナルペプチドをＮ末端部分で含有する。形質転換体の分析を、このプロトプラストを形質転換４８時間後にインキュベートした培地の種々の希釈物を用いてＥＬＩＳＡによって実施した。
【０１１７】
様々な Physcomitrella ５'アクチン領域の発現を駆動するための能力を、構成的３５Ｓプロモーターの活性と比較した。
【０１１８】
分析した全ての場合で、アクチン遺伝子の５'領域は、３５Ｓプロモーターよりも高い活性に達した。しかし、発現レベルは、様々なアクチン調節配列に対して変化した。すなわち、Ｐｐａｃｔ３の５'配列は、３５Ｓプロモーターよりも２倍近くもＶＥＧＦの高い発現を促進した。Ｐｐａｃｔ１およびＰｐａｃｔ７の５'領域を含有するベクターを形質転換に使用した場合、ＶＥＧＦのさらに高いレベルを測定した。それら場合において、４〜８倍の３５Ｓ値を得た。５'Ｐｐａｃｔ５遺伝子の場合、最も劇的な相違が観察され、３５Ｓと比べて１１倍までの高い発現値が、いくつかの場合で得られた(図８)。
【０１１９】
Physcomitrella アクチン遺伝子の５'ＵＴＲ領域の高活性の役割について、さらに試験するために、５'ＵＴＲイントロンの欠失、組合せおよび置換を含有するベクターを作製し、コケプロトプラストでの一過的アッセイに使用した。
【０１２０】
Ｐｐａｃｔ１ ５'イントロンの欠失は、Ｐｐａｃｔ１のインタクトな５'領域を使用した場合に得られたものと比べて、一過的な発現レベルを劇的に低下させた。この場合に、プロトプラスト培地中で検出され得る分泌ＶＥＧＦタンパク質の量は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって得られたものと非常に類似していた。これは、Ｐｐａｃｔ１の５'イントロンが、Ｐｐａｃｔ１プロモーター由来の有効な遺伝子発現に重要であることを示すものである。このリーダーイントロンを包含する５'ＵＴＲが、下流の３５Ｓプロモーターと融合された場合に、同じ結果を得た。この構築体は、インタクトな３５Ｓプロモーターと同量の分泌タンパク質を産生し、５'ＵＴＲ領域がＰｐａｃｔ１プロモーター以外のプロモーターの活性に対してそのような劇的な影響も示さないことを示している。重要なことは、５'ＵＴＲ Ｐｐａｃｔ１領域を担持する構築体が、３５Ｓプロモーター単独よりも３０％低い量でタンパク質産生のみを促進し得ることである。このことから、遺伝子のこの領域でプロモーター活性が低いか、ベクターのバックボーン配列に存在するプロモーター活性が休止していると考えられ得る（図９）。
【０１２１】
同じ方法を用いて、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７遺伝子中に含有された５'ＵＴＲイントロンのプロモーター活性に対する影響を調べた。欠失された５'イントロンの構築体を分析し、Ｐｐａｃｔ１の場合と同様の結果を得た、即ち、達成されたタンパク質量は、Ｐｐａｃｔ５の場合の３５Ｓプロモーターの場合とほぼ同じで、Ｐｐａｃｔ７の場合ではわずかに低く、５'ＵＴＲ中のイントロンの存在が、プロモーターの有効な活性に重要であることを示す。また、形質転換がＡＴＧまでの５'転写領域のみを含有する構築体によって実施された場合に、いくつか残っている促進活性を観察した。さらに、これらの２つの遺伝子の場合では、５’ＵＴＲ下流３５Ｓプロモーターの融合により、３５Ｓプロモーター単独(図１０、１１)と比較した場合、ＶＥＧＦタンパク質の発現が高効率（２〜７倍)となった。同様の結果がＰｐａｃｔ３の場合に観察され、５'ＵＴＲ単独または融合された下流ＣａＭＶ３５Ｓは、３５Ｓと比較して(図１２) 各々約２および３倍産生した。これらの指標により、それらが様々なプロモーター下に位置づけられる場合であっても、これら３つの遺伝子についての５'転写領域において増強された活性の存在を示唆した。
【０１２２】
Ｐｐａｃｔ１、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７遺伝子に存在する５'イントロンの役割をさらに調べるために、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７の５'イントロンによるＰｐａｃｔ１遺伝子のリーダーイントロンの置換を、一過的な形質転換のためにベクター中で設計した。平行して、遺伝子のコード領域に存在するＰｐａｃｔ１イントロンによるＰｐａｃｔ１の５'イントロンの置換を行った。
【０１２３】
Ｐｐａｃｔ１ ５'イントロンの、コード領域イントロン１および３のＰｐａｃｔ１の置換より、発現レベルが約２５％低下した。検出したタンパク質の量は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより得られたものよりも約２〜３倍高かった。５'イントロンのコード領域のイントロン２による置換から、プロモーター活性がなくなるという驚くべき結果を得た(図１３)。しかし、構築体を調べると、該配列はイントロンに対するスプライシング部位が正しくなかったことを示した。正しいスプライシング配列を担持する新しい構築体を作製し、コケ植物の形質転換の後に得られた結果は、イントロン２の効果が他の置換と同じであることを示した。
【０１２４】
該置換をＰｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７遺伝子に対応する５'イントロンを用いて行った場合、タンパク質発現の低下も観察されたが、この場合では、該低下は若干少なかった。
【０１２５】
２.３．アクチン遺伝子の発現促進領域の欠失構築体
様々なアクチン遺伝子プロモーターのさらなる特性分析を、５'非転写領域の欠失構築体を作製すること、そしてコケプロトプラストの一過的な形質転換を介して分析することによって行った。
【０１２６】
すなわち、Ｐｐａｃｔ１について、転写（＋１）開始の上流の様々なゲノム領域長(−１８２３bp、−９９２bp、-７９０bp、−５６９bp、−３８３bp、−２３７bpおよび−８２bp)を担持する構築体を作製した。基本的には、−８２bpを除く全ての構築体は、完全なプロモーター活性を持ち得た。しかし、−３８３bpの構築体は、活性の低下を示し、−８２bp構築体（図１４）と同様のレベルに達する。
【０１２７】
Ｐｐａｃｔ３のプロモーター領域の欠失構築体の分析から、いくつかの興味深い特徴を明らかになった。記載したとおりに、このプロモーターは、他のアクチン遺伝子プロモーターと比べて低い活性を示し、ＣａＭＶ ３５Ｓと関連するが、それはわずかに活性が高かった。この場合に、次の５'非転写領域について試験した：−２２１０bp、−９９５bp、−８２１bp、−５２３bp、−３２３bp、−１８２bpおよび−８１bp。驚くべきことに、プロモーターの活性は、プロモーター領域の−８２１bpまでを含有する構築体についてはＣａＭＶ ３５Ｓとほぼ同じであった。しかし、bp−５２３および転写開始に対してより短い領域を含有する構築体は、組換えタンパク質の２倍以上の量を産生した。これは、一過的形質転換アッセイ(図１５)中にこの遺伝子の転写を下方調節する−５２３bp領域上流に位置づけられるcis-アクチン領域を示しているのであろう。
【０１２８】
Ｐｐａｃｔ５の場合に、遺伝子転写開始上流−１８７２bp、−７５８bp、−５４４bp、−３５５bpおよび−１２１bpフラグメントを含有する構築体を生成した。一過的アッセイから得た結果は、プロモーターの完全な活性が、転写開始（＋１）(図１６)から−７５８から−１２１の間の領域に存する。
【０１２９】
Ｐｐａｃｔ７の５'非転写領域について次の欠失構築体を分析した：−１７９０bp、−１０７０bp、−８５４bp、−６５９bp、−４８４bp、−２９９bpおよび−６６bp。得られた結果は、−４８４bpおよび−２９９bpの間に含まれる領域が、一過的な実験アッセイ中にプロモーターの完全な活性に重要である（図１７）ことを示した。
【０１３０】
Physcomitrella アクチン遺伝子の一組の異種プロモーターを得るために、他の２種、コケ植物 Funaria hygrometrica および 苔網類 Marchantia polymorpha を使用して、アクチン遺伝子を含有するゲノムＤＮＡフラグメントを単離した。このために、様々な程度の縮重を有するオリゴ（oligos）を設計し、２つの種から単離したゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、ＰＣＲ反応を行った。
【０１３１】
２．４．様々なコケ種Physcomitrella patens、Funaria hygrometrica および Marchantia polymorphaからの様々なアクチン遺伝子の比較
Physcomitrella patens
Physcomitrella patens から単離した４つの異なるゲノムアクチン配列は、５'プロモーター配列５'ＵＴＲ＋５'イントロン、ＯＲＦ＋内部イントロンおよび３'ＵＴＲおよび別の３'下流配列を包含する遺伝子の全機能的配列を示すようである。全体では、ゲノム配列のＰｐａｃｔ１ ５８０９ bp、Ｐｐａｃｔ３ ５６３３ bp、Ｐｐａｃｔ５ ８６５３ bpおよびＰｐａｃｔ７ ６３５１ bpを単離した(図１８Ａ)。単離した Physcomitrella アクチンｃＤＮＡのコード領域は、１１３４ bpのＯＲＦを持つＰｐａｃｔ１を除いて、ほとんど１１３７ bp 長さであった。対応するタンパク質は、３７７アミノ酸を持つＰｐａｃｔ１を除いて、３７８アミノ酸長である。ヌクレオチドレベルに対しては、コード配列は、８６.６〜９８.９％のホモロジーを共有する。該タンパク質配列は、９７.１〜９９.７％の同一性を有する(DNA STAR，MegAlign Program, Clustal V (weighted) sequence alignment)。
【０１３２】
４つのPhyscomitrella アクチン遺伝子全てに対して、伸張したＡＴＧスタートコドンのゲノムＤＮＡ配列の５'を、Ｉ−ＰＣＲによって単離し、配列決定した：Ｐｐａｃｔ１については２９７３ nt、Ｐｐａｃｔ３については３０９１nt、Ｐｐａｃｔ５については３０９５ ntおよびＰｐａｃｔ７については３０６９nt。Ｐｐａｃｔ１、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７について、完全長ｃＤＮＡのみ増幅できる５'レース（race）をthe Gene Racer Kit (Invitrogen)を用いて行い、遺伝子の５'ＵＴＲを決定した。Ｐｐａｃｔ３について、５'ＵＴＲを、データベースから様々なＥＳＴの長さによって決定した。ゲノムＩ−ＰＣＲフラグメントとｃＤＮＡの比較によって、大きな５'イントロンの存在が示され得る。−１４からＡＴＧスタートコドンに全て位置する５'イントロンの長さは、Ｐｐａｃｔ１、Ｐｐａｃｔ３、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７各々に対して、９５５ bp、４３４ bp、１００６ bpおよび１０５５ bpであった（図１８Ａ）。ＯＲＦ内部イントロンの位置を、ゲノム配列、cＤＮＡ配列に対して得られたタンパク質配列およびArabidopsis thaliana由来のアクチン遺伝子のタンパク質配列を比較することによって決定した。利用可能なPhyscomitrella アクチン遺伝子に対する５'プロモーター配列は、Ｐｐａｃｔ１については１８２４ nt、Ｐｐａｃｔ３については２２７０ nt、Ｐｐａｃｔ５については１９０９ bp およびＰｐａｃｔ７については１８０５ bp（図１８Ａ）である。
【０１３３】
全体として、Funaria hygrometrica（発現促進領域：配列番号９〜１２）由来の４つの異なるアクチン遺伝子および Marchantia polymorpha（発現促進領域：配列番号１３〜１５）由来の３つの異なる遺伝子を、ゲノムＤＮＡに対して縮重ＰＣＲによって同定し得る。この目的は、様々なコケ種由来の推定される異なるアクチン遺伝子ホモログの５'プロモーター領域を単離することを優先したので、配列大部分は現在まで３'末端では不完全である（図１８Ｂ／Ｃ）。
【０１３４】
Funaria hygrometrica
Funariaについて、同定したアクチン遺伝子を、Ｆｈａｃｔ１、Ｆｈａｃｔ４．４、Ｆｈａｃｔ５およびＦｈａｃｔ５ｂと呼ぶ。ゲノム 配列のＦｈａｃｔ１の３９５１ bp、Ｆｈａｃｔ４．４の２４１７ bp、Ｆｈａｃｔ５の４４３２ bpおよびＦｈａｃｔ５ｂの７２２ bpを、様々なアクチン遺伝子についてＩ−ＰＣＲによって単離した。完全なコード化ｃＤＮＡ配列を、１１３４ヌクレオチドのコード配列を有するＦｈａｃｔ１遺伝子について単離した。他の Funaria アクチン遺伝子について、３'末端を欠失しているが、部分配列は利用できる：Ｆｈａｃｔ４.４については９０６ bp、Ｆｈａｃｔ５については９６５bp およびＦｈａｃｔ５ｂについては７２２ bp（図１８Ｂ）。単離されたコード配列は、ヌクレオチドレベルで８７.４〜９９.２％の範囲のホモロジーを共有する。誘導されたタンパク質配列は、９０.８〜９９.２％同一である(DNA STAR，MegAlign Program, Clustal V (weighted) sequence alignment)。
【０１３５】
Ｆｈａｃｔ５b 以外について、ＡＴＧスタートコドンの５'配列上流を、Ｉ−ＰＣＲによって単離し、配列決定した。Ｆｈａｃｔ１ １８２４ bpの場合には、Ｆｈａｃｔ４.４ １３３３ bpおよびＦｈａｃｔ５ ３２８９ bp が利用できる。様々な５'ＵＴＲの長さを、Gene Racer Kit (Invitrogen)を用いる５'レースによって決定した。イントロン−エキソン構造を、cＤＮＡ配列とiＰＣＲによって得られたゲノム配列との比較によって、そしてPhyscomitrella 遺伝子と比較することによって決定した。Physcomitrellaアクチン遺伝子の場合では、同定したFunariaアクチン遺伝子は、ｃＤＮＡの位置−１４に位置する大きな５'イントロン、Ｆｈａｃｔ１、Ｆｈａｃｔ４.４ および Ｆｈａｃｔ５各々に対して、９２８ bp、１０１５ bp および６５６ bpの長さを含有する。現在までにＦｈａｃｔ１について ７００ bp、Ｆｈａｃｔ４.４について１４５ bp および５'プロモーター配列のＦｈａｃｔ５ ２５１５ bpを単離し、配列決定した。Ｆｈａｃｔ１について、３'領域の４１９ bpを単離した。Funaria アクチン遺伝子の５'領域または３'領域を、Funaria hygrometrica 由来のゲノムＤＮＡに対するＰＣＲによって、Ｆｈａｃｔ１の５'領域についてはプライマー９０８および９０９を用いることによって、Ｆｈａｃｔ１の３'領域については９８３および９８４、Ｆｈａｃｔ４.４の５'領域については１０００および１００１および、Ｆｈａｃｔ５の５'領域については６１１および６１２を用いて、増幅した。
【０１３６】
Marchantia polymorpha
Marchantia について、同定されたアクチン遺伝子を、Ｍｐａｃｔ１、Ｍｐａｃｔ４およびＭｐａｃｔ１５と呼ぶ。３つの配列全てに対して、３'末端は欠失している。これまで、ゲノム配列のＭｐａｃｔ１ については２２２９ bp、Ｍｐａｃｔ４については３９８７ bp および Ｍｐａｃｔ１５については２１７４ bp に関しては、単離し、配列決定した。単離したコード化cＤＮＡ配列の長さは、Ｍｐａｃｔ１、Ｍｐａｃｔ４およびＭｐａｃｔ１５については各々９９７nt、９６２ ntおよび９９５ ntである（図１８Ｃ)。Marchantia アクチン遺伝子内の配列のホモロジーは、ヌクレオチドレベルでは７８.３〜８５.５ ％の範囲、アミノ酸レベルでは９４.７〜９６.１％の範囲において別の２つのコケ種と比べたものよりも非常に低い（DNA STAR， MegAlign Program, Clustal V (weighted) sequence alignment)。同定された３つの異なるMarchantiaアクチン遺伝子全てに対してＡＴＧの５'上流配列をiＰＣＲにて単離し、配列決定した：Ｍｐａｃｔ１に対しては９３７bp、Ｍｐａｃｔ４に対しては３０２５ bp およびＭｐａｃｔ１５に対しては９１０ bp。Marchantia アクチン遺伝子相同な５'領域は、Marchantia polymorpha 由来のゲノムＤＮＡを、５'Ｍｐａｃｔ１については９５０および９５１、Ｍｐａｃｔ４ については９６０および９６１およびＭｐａｃｔ１５については９７０および９７１のプライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＯＲＦのイントロン−エキソン構造を、異なるコケ種からの様々なアクチン遺伝子配列を比較することによって得た。Ｍｐａｃｔ１の単離５'配列は、別のPhyscomitrellaおよびFunaria 遺伝子の場合と同様に、５'イントロンの存在を示す位置−１４でイントロンスプライス部位（aggt）に対するコンセンサス配列を示す。Ｍｐａｃｔ４およびＭｐａｃｔ１５の５'上流配列内では、イントロンスプライス部位コンセンサス配列が全く存在しておらず、そのことから５'イントロンの欠失が考えられる（図１８Ｃ)。
【０１３７】
P.patens、F.hygrometrica および M.polymorpha アクチン遺伝子の比較
上記の通りに、一般的に、ある種内で様々な単離アクチン遺伝子に対するヌクレオチドおよびタンパク質配列のホモロジーは、特にタンパク質レベルで非常高い。密接に関係するコケ種の Physcomitrella patens および Funaria hygrometrica 間のホモロジーは、非常に高いことがわかった。アクチン遺伝子は、ヌクレオチドレベルでは、８６.９〜９６.３ ％同一性のホモロジーを示し、アミノ酸レベルでは、ホモロジーの範囲は９５.５〜９９.７％である。
【０１３８】
これに対して、他の両種に対してコケ類 Marchantia polymorpha のより遠い関係が、ヌクレオチドレベルに対する遺伝子の最も低いホモロジーをもたらす。Physcomitrella および Marchantia アクチン遺伝子間のホモロジーは、ただ７５．２％〜７８．８％の範囲であり、Funaria および Marchantia 間のホモロジーは、７５.５％〜８０.４％の範囲である。アミノ酸レベルでは、Marchantiaアクチン遺伝子のホモロジーは、Physcomitrellaに比較すると９３.０％〜９６.１％の間で変化し、Funariaと比較すると９３.４％〜９６.７％の間で変化する。
【０１３９】
イントロン−エキソン構造（図１８Ａ／Ｂ／Ｃ）
前記したとおり、一定の範囲に対して Physcomitrella アクチン遺伝子のイントロン−エキソン構造は、高等植物のものと類似しているが、明らかな相違も有している。全ての単離 Physcomitrella アクチン遺伝子は、５'非翻訳領域内で大きな５'イントロンを含有し、調査した大部分の高等植物アクチンがそうである。唯一Ｐｐａｃｔ１は、Arabidopsis thaliana由来の全ての単離アクチン遺伝子について実施態様に対する条件に影響を及ぼすＯＲＦ内に３つの内部イントロンを含有する。また、Ｐｐａｃｔ１のＯＲＦ内部イントロン位置は、高等植物アクチン遺伝子と比べて保存される。反対に、Ｐｐａｃｔ３、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７は、ＯＲＦ内の１つの内部イントロンのみ含有する。
【０１４０】
同じゲノム構造を、５'ＵＴＲ内で１つの伸張した５'イントロンを有する単離したFunariaアクチン遺伝子において見出し得る。Ｆｈａｃｔ１は、Ｆｈａｃｔ４.４およびＦｈａｃｔ５がＯＲＦ配列内で１つの内部イントロンのみを含有するにもかかわらず、Ｐｐａｃｔ１と同じ保存されたイントロン−エキソン構造を持つ。Ｆｈａｃｔ５ｂの単離した配列は、イントロン−エキソン構造についていくらかはっきりと言うには、あまりに短いが、少なくともＦｈａｃｔ１またはＰｐａｃｔ１と比べて内部イントロン２を含有しない。
【０１４１】
Marchantiaにおいて、単離したアクチン遺伝子のゲノム構造は、さらに異なっていると考えられる。３つの異なるコケ種における異なるアクチン遺伝子の数が知られていないことを示すことは重要ではあるが、それは、Marchantia由来の３つの単離したアクチン遺伝子は、個々の機能的相同遺伝子を示さないであろう。Marchantiaに存在する３つ以上のアクチン遺伝子およびPhyscomitrellaおよびFunariaにおいて４つ以上のアクチン遺伝子が存在するようである。 
【０１４２】
しかし、Ｍｐａｃｔ１のイントロン−エキソン構造は、５'ＵＴＲ内に５'イントロンおよびＯＲＦ内部イントロン１および２の保存位置を有するＰｐａｃｔ１およびＦｈａｃｔ１の場合と同じであると考えられる。Ｍｐａｃｔ１５は、保存されたＯＲＦ内部イントロン１およびイントロン２を含有するが、それは、５'ＵＴＲ内の位置−１４で、またはPhyscomitrella またはいくつかのArabidopsis各々のアクチン５'イントロンで見出されるように、位置−１０で保存イントロンスプライス部位を持たず、そのことは５イントロンの欠失についても一致する。同じ状況が、おそらく５'イントロンを欠失するＭｐａｃｔ４についても見出された。さらに、Ｍｐａｃｔ４は、ＯＲＦ内でイントロン１またはイントロン２を持たず、全ての単離したコケアクチン遺伝子とは大きく異なる。
【０１４３】
推定の相同的コケアクチン遺伝子
Physcomitrella および Funaria 由来の種々な単離されたアクチン遺伝子のイントロン−エキソン構造から、２種間の相同な遺伝子についての結論を提案するが、ゲノム構造からこのことを結論づけることはできない。例えば、Ｐｐａｃｔ１およびＦｈａｃｔ１は、同様の保存されたイントロン−エキソン構造を共有するが、同じゲノム構造を持つ両植物のゲノム中に存在するより多くの遺伝子があるかどうかは前に示したように明白ではない。相同な遺伝子について説明するためには、機能的ホモロジーを提案する発現データも必要であろう。また、タンパク質の配列ホモロジーまたはコード化cＤＮＡ配列から、それらが一般的にあまりに類似しているので、種間の対応する相同な遺伝子についてどのような仮定をたてることも不可能である。
【０１４４】
PhyscomitrellaおよびFunariaの場合には、ＵＴＲ配列、イントロン配列およびプロモーター配列に関して非コード配列内で非常に高い配列ホモロジーを見出されることは興味深い。そのため、高いホモロジーを、Ｐｐａｃｔ１とＦｈａｃｔ１の間、Ｐｐａｃｔ３とＦｈａｃｔ５の間で見出した。両ケースにおいて、該イントロン配列は、普通でない高い保存性を示した。Ｐｐａｃｔ１とＦｈａｃｔ１の場合には、ホモロジーは次のとおりである：５イントロン：５８％；イントロン１：６４％、イントロン２：５２％およびイントロン３：５５％。Ｐｐａｃｔ３とＦｈａｃｔ５の場合には、ホモロジーは、５'イントロンについて５１％であり、イントロン１については４８％の同一性を示す。
【０１４５】
両ケースに対して、単離した５'プロモーター配列は、高いホモロジーを示した。図１９Ａは、Ｐｐａｃｔ１およびＦｈａｃｔ１の単離したプロモーター領域の概略図の比較を示す。転写開始は、位置１であるといわれ、５'プロモーター領域の最初のntは−１である。Ｆｈａｃｔ１の５'プロモーター領域の単離した２６７は、５８％のＰｐａｃｔ１ ５'プロモーター領域の最初の２６７ bpに対する全てのホモロジーを示す。この配列内では、種々な観察し得る相同なブロックがある。−２６７と−１２９の間の配列が、５１％のホモロジーを示す。次の２９bpは、６２％ 同一性を示し、位置−１００および−１内のホモロジーは、ほぼ７０％であった。Ｐｐａｃｔ１からＦｈａｃｔ１ イントロンおよびプロモーター配列間のこれらの高い配列同一性に関して、これらの２つのコケ植物における相同な遺伝子としてこれらの２つの遺伝子を推定することは妥当である。別の興味深い態様は、様々なＰｐａｃｔ１:ｖｅｇｆ欠失構築体間で観察された発現低下である(図１５)。発現の劇的な低下は、−２３７〜−８２欠失構築体に存在することが判った。これは、Ｐｐａｃｔ１のプロモーター領域の配列として、-１２９〜−１の間の５'プロモーター領域の重要な機能について論じるものであり、Ｆｈａｃｔ１は、説明したとおりに、高度に保存されており、−２３７欠失構築体であるが、−８２欠失構築体は高度に保存された配列の全てを含有しない。
【０１４６】
Ｐｐａｃｔ３およびＦｈａｃｔ５のプロモーター内で高度に保存された領域も見られ得る。この場合では、単離された両遺伝子についてプロモーター領域は、より長いものである。それ故に、さらに多くのホモロジーの領域が、２つの５'プロモーター領域(図１９Ｂ)間で見出される。この場合において、−１〜−２２７０のＰｐａｃｔ３および−６４〜−２３２５のＦｈａｃｔ５のプロモーター領域は、幾つかの興味深い相同的特徴を示す。ＴＳ位置における相違は、Ｆｈａｃｔ５の５'ＵＴＲが実験的に決定され、Ｐｐａｃｔ３の１つがデータベースからのＥＳＴを分析することによって決定されるという事実によるものであろう。
【０１４７】
−２２７０〜−１８７６の間のＰｐａｃｔ３の配列は、−２３２５〜−１９４８の間に位置付けられたＦｈａｃｔ５の同じ配列領域に対して、２９％の低いホモロジーを示すのみでる。次いで、約１１００ ntの伸張領域は、８２％の非常に高いホモロジーを示す。次のＰｐａｃｔ３の１４０ nt およびＦｈａｃｔ５プロモーターの１５２ ntは、「ただ」５３％のホモロジーを示す。−６４１〜−４６３に位置づけられるＰｐａｃｔ３の配列は、Ｆｈａｃｔ５の−７０５および−５２８の間の領域に対して７６％の再び高い保存性を示す。次の約１８０ ntは、５３％の低いホモロジーを再び示す。次いで、Ｐｐａｃｔ３プロモーター配列の最終の２８８ bpは、またＦｈａｃｔ５の次の２８０bpに対して７３％と相同である。２つの相同な遺伝子間のホモロジーの様々な程度のこれらの領域は、５'プロモーター領域内の調節性活性要素の存在を示す。
【０１４８】
Ｐｐａｃｔ１およびＦｈａｃｔ１の場合に関して、ここでも様々なＰｐａｃｔ３：ｖｅｇｆ欠失構築体の発現分析は、この関連から興味深い（図１７)。ここで、−５２３欠失構築体と比べて−２２１０、−９９５、−８２１欠失構築体のｖｅｇｆ発現レベルが有意に増加することが、観察された。Ｐｐａｃｔ３およびＦｈａｃｔ５で見出された−１８７６から−７７９の間の伸張したホモロジー領域の少なくとも一部分を含有するこの３つの欠失構築体は、３５Ｓプロモーターまたは長い欠失構築体と比べて−５２３欠失構築体が発現の２１／２倍の増加を示すにもかかわらず、ほぼ３５Ｓプロモーターのレベルに達した。これは、Ｐｐａｃｔ３とＦｈａｃｔ５とのホモロジーが８２％であるこの領域内で負のレギュレーターの存在を示すものである。
【０１４９】
Marchantiaの場合において、PhyscomitrellaおよびFunaria由来の異なるアクチン遺伝子間で比較し得る配列ホモロジーは全く見出され得なかった。
【０１５０】
Ｆｈａｃｔ５遺伝子について、ｈＶＥＧＦcＤＮＡと融合された５'非転写領域の１１５７bpを含有する構築体を構築され、Physcomitrella プロトプラストに対して一過的な形質転換実験に使用した。この場合では検出したタンパク質の量は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターと比べてわずかに高い(２倍まで)が同じ範囲内であった。Ｆｈａｃｔ５遺伝子は、Ｐｐａｃｔ３遺伝子に対して最も高いホモロジーを示し、興味深いことには両プロモーターは、一過的なアッセイにおいてPhyscomitrella プロトプラストで同様の活性を示した。
【０１５１】
２．５．安定な形質導入系
ＶＥＧＦcＤＮＡの発現を駆動するＰｐａｃｔ１、Ｐｐａｃｔ５およびＰｐａｃｔ７の５'ＭＥＰＲを含有するカセットを、Physcomitrella植物のゲノムに導入した。各ＭＥＰＲについて、安定に形質転換された植物１０のうち５つを取り出し、rｈＶＥＧＦの発現を試験した。試験されたこれら３つのＭＥＰＲについて、発現および分泌されたコケ由来rｈＶＥＧＦが、該植物の成長中の(標準的Knop 培地)培養物の上清中で検出された。このことは、ＭＥＰＲが、それらがゲノムの他の部分で組込みされる場合、非誘導条件(標準的条件)下でタンパク質発現を促進するということを示す。それらの系において測定され得るタンパク質の量は、構築体および安定な系によって、７ｎｇＶＥＧＦ／ｍｇコケ乾燥重量から５３ｎｇＶＥＧＦ／ｍｇコケ乾燥重量までの範囲である。
【０１５２】
Ｐｐａｃｔ５の制御下でＶＥＧＦｃＤＮＡを含有する１つの形質導入コケ株を使用して、バイオリアクターの培養を行った。ＥＬＩＳＡで測定したバイオリアクターの培養物中でコケ誘導組換えＶＥＧＦの量は、４０-５０ｎｇＶＥＧＦ／ｍｇコケ乾燥重量であった。
【０１５３】
実施例３： Physcomitrella patens およびFunaria hygrometrica ユビキチン遺伝子のクローニングおよび分析、およびそれらの発現促進領域
Physcomitrellaのポリユビキチン遺伝子、特異的なオリゴに対応するいくつかのＥＳＴ配列の存在に関する利点を、データベースにおけるユビキチン遺伝子相同配列の最も豊富に存在するＥＳＴの対応するゲノム配列を単離するために設計し、Ｐｐｕｂｑ１と呼ぶ。Ｐｐｕｂｑ１の５'領域の２１４６bpはＩ−ＰＣＲによって同定され得る。１２９bpの転写された５'リーダーは、ＯＲＦの開始前に存在し、５'レースによって決定した。Ｐｐｕｂｑ１の５’領域は、プライマー７７７および６０２を用いて、Physcomitrella patens由来のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲによって増幅した。 
【０１５４】
プロモーターの様々な部分およびｈＶＥＧＦｃＤＮＡの発現を誘導する５'ＵＴＲ領域を担持するベクターを、Physcomitrella プロトプラストの一過的形質転換中、プロモーターの活性を分析するために構築した。
【０１５５】
この結果は、このプロモーターについて、Ｐｐａｃｔ５プロモーターと同様の活性(または、さらに高い)を示した。試験した構築体、１.６Ｋｂおよび１.３Ｋｂプロモーターフラグメントは、ＣａＭＶ ３５Ｓよりも４倍から７倍も高い発現レベルに達した。
【０１５６】
Funaria 由来のユビキチン遺伝子、Ｆｈｕｂｑ１を、Ｐｐｕｂｑ１コード配列から誘導されたプライマーを用いて、Funaria 全ＲＮＡに対して、５'レースＰＣＲを行って同定した。単離した５'ＵＴＲ配列および部分的コード配列を使用して、Funaria hygrometricaのゲノムライゲーションに対してＩ−ＰＣＲのためのプライマーを設計した。この方法で、５'ＵＴＲの配列の５'上流を同定した。５'領域を、プライマー９４３および９４４を用いてFunaria hygrometrica由来のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲによって増幅した。
【０１５７】
実施例４：Physcomitrella patens ＲＢＣＳ発現促進領域のクローニングおよび分析
アクチン、チューブリンおよびユビキチン遺伝子に隣接する推定候補体として、リブロース-１,５-ビスホスフェートカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ・スモール・サブユニット(ｒｂｃＳ)遺伝子を考察した。様々なｒｂｃＳ遺伝子を、核ゲノム上でコードした。ｒｂｃＳ遺伝子は、遺伝子ファミリーのメンバーである。基本的には全ての植物の葉部分で発現したｒｂｃＳ遺伝子は、ＣＯ２を固定できる。それ故にこの遺伝子ファミリーは、様々なコケの異なるｒｂｃ遺伝子の発現促進領域の５'および３'フランキングを得ることを目的とする。第一ステップとして、Physcomitrella ＥＳＴデータベースを分析した。Physcomitrella patens 由来のｒｂｃＳ遺伝子が、１２遺伝子を含む遺伝子ファミリーにおいて組織化されるということがわかった。ＰｐｒｂｃＳ１２と呼ばれる最も豊富に存在するｒｂｃＳ遺伝子のＥＳＴを、その５'および３'発現促進配列を見出すための候補として考えた。ＥＳＴ配列データにより開始して、この遺伝子の５'および３'フランキング領域を、Ｉ−ＰＣＲによって同定し、このクローン５'および３’領域を配列決定した。５'領域を、プライマー８３９および８５８を用いて、Physcomitrella patens由来のゲノムＤＮＡに対してＰＣＲによって増幅した。３'領域を、プライマー９０４および９０１を用いて、ＰＣＲによって増幅した。
【０１５８】
添付した配列表において、次の配列を示した(配列番号/配列の名前/ 相対的なタンパク質コード領域に対する５'または３’領域):
１      Ｐｐｔｕｂ１ ５'
２      Ｐｐｔｕｂ１ ３'
３      Ｐｐｔｕｂ２ ５'
４      Ｐｐｔｕｂ２ ３'
５      Ｐｐｔｕｂ３ ５'
６      Ｐｐｔｕｂ３ ３'
７      Ｐｐｔｕｂ４ ５'
８      Ｐｐｔｕｂ４ ３'
９      Ｐｐａｃｔ１ ５’
１０      Ｐｐａｃｔ１ ３'
１１      Ｐｐａｃｔ３ ５'
１２      Ｐｐａｃｔ３ ３'
１３      Ｐｐａｃｔ５ ５'
１４      Ｐｐａｃｔ５ ３'
１５      Ｐｐａｃｔ７ ５'
１６      Ｐｐａｃｔ７ ３’
１７      Ｆｈａｃｔ１ ５'
１８      Ｆｈａｃｔ１ ３'
１９      Ｆｈａｃｔ４.４ ５’
２０      Ｆｈａｃｔ５ ５'
２１      Ｍｐａｃｔ１ ５'
２２      Ｍｐａｃｔ４ ５'
２３      Ｍｐａｃｔ１ ５ ５'
２４      Ｐｐｕｂｑ１ ５'
２５      Ｆｈｕｂｑ1 ５'
２６      ＰｐｒｂｃＳ１２ ５'
２７      ＰｐｒｂｃＳ１２ ３'
【０１５９】
【表１４】
2007501619.tif 000016
【０１６０】
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】図１は、Physcomitrella patensにおけるβ-チューブリン遺伝子である。
【図２】図２は、Physcomitrella patensにおけるβ−チューブリンの発現促進領域の分析である。
【図３】図３は、rｈＶＥＧＦ構築体の一過的な形質転換によるＰｐｔｕｂ１の発現促進領域の分析である。
【図４】図４は、rｈＶＥＧＦ構築体の一過的な形質転換によるＰｐｔｕｂ２の発現促進領域の分析である。
【図５】図５は、rｈＶＥＧＦ構築体の一過的な形質転換によるＰｐｔｕｂ３の発現促進領域の分析である。
【図６】図６は、rｈＶＥＧＦ構築体の一過的な形質転換によるＰｐｔｕｂ４の発現促進領域の分析である。
【図７】図７は、Physcomitrella patensアクチン遺伝子のゲノム構造である。
【図８】図８は、様々な５'アクチン領域の発現活性の比較である。
【図９】図９は、Ｐｐａｃｔ１構築体である。
【図１０】図１０は、Ｐｐａｃｔ５ 構築体である。
【図１１】図１１は、Ｐｐａｃｔ７構築体である。
【図１２】図１２は、Ｐｐａｃｔ３：ｖｅｇｆ構築体である。
【図１３】図１３は、Ｐｐａｃｔ１ プロモーター：５'イントロン置換体である。
【図１４】図１４は、Ｐｐａｃｔ１ プロモーター：ｖｅｇｆ欠失構築体である。
【図１５】図１５は、Ｐｐａｃｔ３プロモーター：ｖｅｇｆ欠失構築体である。
【図１６】図１６は、Ｐｐａｃｔ５プロモーター:ｖｅｇｆ欠失構築体である。
【図１７】図１７は、Ｐｐａｃｔ７プロモーター:ｖｅｇｆ欠失構築体である。
【図１８】図１８は、様々なコケ種のアクチン遺伝子である。
【図１９】図１９は、Physcomitrella patens および Funaria hygrometrica由来の相同なアクチン遺伝子のプロモーター配列の比較である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月10日(2006.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2007501619.tif 000067
2007501619.tif 000068
2007501619.tif 000069
2007501619.tif 000070