(57)【要約】  送達システムとして遺伝子的に解毒されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ＣｙａＡを使用する診断試験及び免疫モニタリングは、例えば、感染性及び非感染性疾患又はワクチン接種により発生した免疫応答の如きいかなる免疫応答も追跡するのに有効である。与えられた抗原により以前に刺激されたＴ細胞は、ＣｙａＡ又はその断片に融合された若しくは化学的にカップリングされた同じ抗原によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激されうる。本発明は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫優勢タンパク質ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０を、ヒト細胞及び非ヒト動物細胞、例えばウシの細胞、に送達することができる送達システムを提供することによる結核の診断試験又は免疫モニタリングを含む。更に、ＣｙａＡとがん抗原との融合タンパク質は、がん、例えば、メラノーマのための診断試験及び免疫モニタリングシステムとしても提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の疾患をｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断又は免疫モニタリングする方法又はいかなる他のＴ細胞応答も免疫モニタリングする方法であって、
（Ａ）
（１）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ又はその断片、及び
（２）前記哺乳動物のＴ細胞を以前に刺激した疑いのある抗原のペプチド、
を含む組換えタンパク質に前記動物のＴ細胞を曝露し、そして
（Ｂ）Ｔ細胞の活性化の変化を検出する、
ことを含む方法。
【請求項２】
組換えタンパク質が１種以上のペプチドを含む、請求項１に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項３】
組換えタンパク質が１種以上の抗原を含む、請求項１に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項４】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡが、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項５】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ又はその断片が解毒されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項６】
ＣｙａＡ及び組換えタンパク質のペプチドが遺伝子的に融合されているか又は化学的に結合している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項７】
疾患が非ヒト動物の疾患である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項８】
非ヒト動物が雌ウシである、請求項７に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項９】
疾患がヒトの疾患である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１０】
疾患が結核である、請求項９に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１１】
組換えタンパク質が融合タンパク質である、請求項１０に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１２】
融合タンパク質がＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６又はＣｙａＡ−ＣＦＰ１０である、請求項１１に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１３】
疾患がメラノーマである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１４】
抗原が、感染性物質、アレルゲン又はがん細胞からの抗原である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１５】
ワクチン接種された個体又は動物の免疫モニタリングのために使用する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
組換えタンパク質がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡの断片を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１７】
組換えタンパク質が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡにおける任意の許容的部位に局在する、以前に前記細胞を刺激したことがありうる抗原のペプチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞の活性化の変化が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５又はＩＦＮ−γ産生の変化である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項１９】
試験サンプルが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血又は全血の画分である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項２０】
Ｔ細胞活性化の変化の検出が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、ＥＬＩＳＡ又はＴ細胞活性化を検出するための他のアッセイにより達成される、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の診断又は免疫モニタリング方法。
【請求項２１】
哺乳動物における疾患の診断試験用又は、疾患により生じたＴ細胞応答を含む、哺乳動物におけるＴ細胞応答を免疫モニタリングするためのキットであって、
（Ａ）
（１）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ又はその断片、及び
（２）前記哺乳動物のＴ細胞を以前に刺激した疑いのある抗原のペプチド、
を含む組換えタンパク質、及び
（Ｂ）Ｔ細胞の活性化の変化を検出するための試薬、
を含むキット。
【請求項２２】
組換えタンパク質が１種以上のペプチドを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
組換えタンパク質が１種以上の抗原を含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡが、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａに由来する、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２５】
抗原のペプチドがＣｙａＡに遺伝子的に融合されているか又は化学的に結合している、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ又はその断片が解毒されている、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
疾患が非ヒト動物の疾患である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２８】
非ヒト動物が雌ウシである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
疾患がヒトの疾患である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３０】
疾患が結核である、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
組換えタンパク質が融合タンパク質である、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
融合タンパク質がＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６又はＣｙａＡ−ＣＦＰ１０である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
疾患がメラノーマである、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３４】
抗原が、感染性物質抗原、アレルゲン又はがん細胞からの抗原である、請求項２１〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３５】
融合タンパク質が、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ＣｙａＡにおける任意の許容的部位に局在する、以前に前記細胞を刺激したことがありうる抗原のペプチドを含む、請求項２１〜３４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３６】
組換えタンパク質がＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ  ＣｙａＡの断片を含む、請求項２１〜３５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３７】
Ｔ細胞の活性化の変化が、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５又はＩＦＮ−γ産生である、請求項２１〜３６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３８】
試験サンプルが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血又は全血の画分である、請求項２１〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３９】
Ｔ細胞の活性化の変化の検出方法が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、ＥＬＩＳＡ又はＴ細胞活性化を検出するための他のアッセイである、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項４０】
ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ１０のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質。
【請求項４１】
組換えタンパク質ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ１０をコードするＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項４２】
受託番号Ｉ−３１３６でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託されたプラスミドｐＴ７ＣＡＣＴ３３６／ＥＳＡＴ−６。
【請求項４３】
受託番号Ｉ−３１３５でＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．に寄託されたプラスミドｐＴ７ＣＡＣＴ３３６／ＣＦＰ−１０。
【請求項４４】
請求項３７又は４３に記載のプラスミドのインサートを含むヌクレオチド配列。
【請求項４５】
請求項４２又は４３に記載のプラスミド又は請求項４３に記載のヌクレオチド配列を含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断及び免疫モニタリング（immunomonitoring）のためのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．の組換えアデニル酸シクラーゼに関する。
【０００２】
本発明は、抗原によるＴ細胞の刺激の後の、診断試験及び疾患の免疫モニタリング並びにいかなるＴ細胞応答の免疫モニタリングにも関する。
【０００３】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓにより引起されるウシ（cattle）における結核（ＴＢ）の発生率は、英国の国営牧場ではこの１０年間にわたり劇的に増加している。この増加は、重要な動物健康問題、経済問題及び潜在的公衆衛生の問題を構成する（krebs et al.,1997）。人畜共通感染症疾患を制御するために、より良好でより特異的な診断試薬並びに有効なワクチンが緊急に必要とされる。英国政府は、このような試薬及びワクチンを開発するための研究プログラムに着手した。
【０００４】
ウシ（cattle）のウシ結核（bovine tubercrosis）の診断は、殆どツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）による皮膚試験でのみ行われる。この試験の特異性は、ＰＰＤの不明確で交差反応性の性質の故に限定される。ツベルクリンで誘発されたＩＦＮ−γの産生を測定する血液に基づく試験も、現在限定的に現場で使用されている（Wood et al.,1994）。しかし、ツベルクリンをベースとする試薬の特異性は、ヒトＴＢワクチンＭ．ｂｏｖｉｓＢＣＧによるワクチン接種の後弱められる（Budde et al., 2003に概説されている）。故に、ウシ用の有効なＴＢワクチンを開発することができる前に、Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染及びワクチン接種された動物の鑑別診断（differential diagnosis）を可能とする診断試薬が必要とされる。
【０００５】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、ヒトの健康に対しても大きな脅威であり、いかなる他のバクテリアよりも世界的なより多くの死亡の原因である。ＴＢに対するワクチン及びＴＢの免疫学的診断は完全に満足できるものではない。例えば、活性な結核及び潜在的結核の両方の診断を助けるのに使用される皮膚試験試薬、ＰＰＤは、特異性及び感度に欠けている。Bacille Calmette Guerin（ＢＣＧ）ワクチンは、ＴＢを防止するのに非常に広く使用されているが、成体におけるその保護有効性はやはり限定される。
【０００６】
ワクチン接種の他に、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによる潜伏感染（ＬＴＢ１）の臨床ＴＢへの進行を防止するための別の制御ストラテジーは、予防的抗結核薬物治療（ＰＴ）の使用による。この制御ストラテジーの一つの観点は、診断試験であるが、潜伏感染を有する健康な個体を識別するのに使用されるツベルクリンク皮膚試験（ＴＳＴ）は、いくつかの操作上の欠点を有する。第一に、ＴＳＴ試薬、ＰＰＤは、それが多くのｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａに見出されるエピトープを含有するので、交差反応性である。ＴＳＴ反応性は、環境のｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａによる感作により又はＢＣＧワクチンから生じうる。第二に、ＴＳＴの感度は、ＨＩＶ感染により減少させられる（Johnson, J.L et al, 1998）。第三に、ＴＳＴは、１つは投与のため、１つは判断（reading）のため、２回の来診を必要とする。この試験もオペレーターに依存する。これらの制限は、ＬＴＢ１の識別を害し、それ故、ＰＴのより広い適用を害する。ＢＣＧより大きい有効性のＴＢワクチン候補に対する当該技術分野における要求があるが、ＴＳＴ皮膚試験よりも高い感度、特異性及び実施可能性の免疫診断方法の開発に対する要求もある。
【０００７】
これまでに、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  又はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにより高度に発現されるが、ＢＣＧのゲノムからは欠失している抗原を使用することにより、診断試薬の特異性が改良されうることが示された。このような抗原は、感染した動物又はヒト及びＢＣＧワクチン接種された動物又はヒトの鑑別診断を可能とするのみならず、ワクチン接種の不存在下においてツベルクリン自体の特異性も改良する。
【０００８】
結核の研究における大きな進歩は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ複合体の病原性メンバー中に存在するが、すべての弱毒化されたＢＣＧ株には存在しないゲノムセグメント（欠失領域１−ＲＤ１と命名された）の同定であった（Gorden, S.V., et al. 1999; Behr,M.A., et al. 1999 and Mahairas, G.G., 1999）。このセグメントにコードされた分子は、病原性の一因となり（Pym, A.S., et al. 2003）又は防御潜在力の種特異的Ｔ細胞応答を刺激することができる（Weinrich Olsen, A., et al.,:2001; Pym et al., 2003）。更に、多くの興味が、ＴＢの免疫診断を改良するためにＲＤ１にコードされた抗原の可能性に集中した（Arend, S.M., et al, 2000; Ewer, K., et al.2003）。しかしながら、タンパク質サブユニットは、Ｔ細胞応答を効率悪く刺激する傾向がありそして、最も有望な実験的なワクチン製剤すら、ヒトにおける使用が認可されていない強力なアジュバントを必要とする。同様に、既知の最善の免疫診断方法は、医療施設の不足した環境において使用するにはあまりにも複雑そうなペプチド混合物及びＥＬＩＳＰＯＴ分析に頼る（Arend, S.M., et al. 2002）。Ｍ．ｂｏｖｉｓ／  Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＲＤ１領域、ＢＣＧのすべての株において欠如している領域、にコードされている抗原ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０は、ＩＦＮ−γ試験において組換えタンパク質又は合成ペプチドとして使用される場合に、診断試薬として特に有望であることを示したが（Budde et al. 1999, Vordermeier et al., 1999 and 2001）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原に対するＴ細胞応答を高めることができる簡単な方法に対する要求が当該技術分野には依然としてある（Wilkinson, K.A., et al. 2000; Wilkinson, K.A., et al., 1999）。
【０００９】
抗原（Ａｇ）提示の古典的経路の下では、病原体の外因性及び内因性抗原は、一般に２つの異なる経路によりＡｇ提示細胞（ＡＰＣｓ）においてプロセッシングされて、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）拘束性提示（major histocompatibility complex(MHC)-restricted presentation）のためのペプチドを生じる（Germain, R.N. 1994）。外因性Ａｇｓは、エンドサイトーシス経路（endocytic pathway）に沿ってプロテアーゼにより取り込まれそして分解される。これらのプロセッシングされたペプチドは、次いで新生ＭＨＣクラスＩＩ分子（nascent MHC class II molecules）に結合しそしてＡＰＣ細胞膜においてＣＤ４+Ｔ細胞に提示される（Villadangos, J. 2001）。この特異的認識及び共刺激分子（co-stimulatory molecules）との相互作用の後に、活性化されたＣＤ４+Ｔ細胞は、サイトカインを分泌することによりＢ細胞又はＣＤ８+Ｔ細胞に助力を与えることができる。内因性タンパク質は、ＡＰＣ細胞質中のプロテアソームにより分解されて、ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチド（MHC class I-restricted peptides）を生じ、このペプチドは、小胞体に輸送され、そこでそれらは新生初期ＭＨＣクラスＩ分子に結合する。次いで、ＭＨＣ１−ペプチド複合体が送り出されそしてＡＰＣ細胞膜においてＣＤ８+Ｔ細胞に提示される（Rock, K.. L., and A. L. Goldberg. 1999）。
【００１０】
Ａｇ提示のこれらの古典的経路に加えて、ある外因性細胞関連Ａｇ又は粒状Ａｇ（exogenous cell-associated or particulate Ag）は別のプロセッシングの経路を介してＭＨＣクラスＩ分子上に交差提示され（cross-presented）うることが今やよく実証されている（Jondal, M., et al., 1996; Heath, E. R., and F.R.carbone. 2001; Reimann, J., and R. Schirmbeck. 1999; Moron, G., et al. 2002）。外因性Ａｇに対するＣＴＬ応答を誘発するための一つの特定のアプローチは、ある種のタンパク質、主としてバクテリア毒素が、ＡＰＣの細胞質ゾルに入り、ＭＨＣクラスＩ提示経路に沿ってプロセッシングされ、次いでＣＤ８+Ｔ細胞に提示される能力を利用する。かくして、組換えバクテリア毒素を使用するいくつかのワクチンストラテジーが、外因性Ａｇに対するＣＴＬ応答を発生させるためにさまざまな研究室でデザインされた（Ballard, J. D., et al. 1996; Bona, C. A. et al., 1998; Goletz, T.J., et al. 1997; Haicheur, N., et al. 2000）。
【００１１】
ワクチンデザインへの魅力的なアプローチは、非複製性タンパク質ベクター（non-replicating protein vectors）、例えば、バクテリア毒素又はトキソイドによるタンパク質の送達である。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓは、カルモジュリンで活性化されるアデニル酸シクラーゼ毒素、ＣｙａＡを分泌するが、これは、αMβ2インテグリン受容体（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を発現する骨髄性食細胞（myeloid phagocytic cells）を主標的とし、そしてこの骨髄性食細胞は専門的抗原提示細胞、例えば、好中球、マクロファージ、ＮＫ細胞及び樹状細胞を含む（Guermonprez, P., et al., 2000）。ＣｙａＡは、そのＮ末端触媒アデニル酸シクラーゼドメイン（４００アミノ酸残基）を、直接細胞質膜（cytoplasmic membrane）を通して真核標的細胞の細胞質ゾル中に送達することができる（Guermonprez, P., et al., 2000; Sebo, P., et al., 1995）。
【００１２】
ＣｙａＡは、マウスモデルにおいて有望であることを示したベクター系である。ペプチド及び小タンパク質は、ＣｙａＡとの融合タンパク質として挿入されそして発現されうるか又はＣｙａＡに化学的に結合させることができる。ＣｙａＡは、標的細胞の形質膜を横切る直接のトランスロケーションを促進する。重要なことに、ＣｙａＡによるワクチン接種は、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８+Ｔ細胞応答（MHC class I restricted CD8+T cell response）を誘発することができることが示された（例えば、Gueromonprez et al., 1999）。
【００１３】
遺伝子的に解毒された（genetically detoxified）ＣｙａＡは、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞エピトープが最初の６００アミノ酸内のＣｙａＡトキソイドのアデニル酸シクラーゼ活性ドメイン（ＡＣ）内に挿入されるとき、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの両方を抗原提示細胞に送達するためのビークルとして使用することができる。次いで抗原提示細胞は特異的Ｔ細胞応答をトリガーする（Dadaglio,G., et al., 2000; Saron, M.F., et al., 1997; Osicka, R., et al., 2000; Loucka, J., et al., 2002; Fayolle, C., et al., 1996）。ＣｙａＡはそのＮ末端触媒ドメイン（ＡＣドメイン）をαｍβ2  インテグリン（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）を有する真核細胞の細胞質ゾルに送達する。遺伝子的に解毒されたＣｙａＡ  ＡＣドメインに挿入されたＣＤ８+Ｔ細胞エピトープは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方でＣＤ１１ｃ+ＣＤ１１ｂhighＤＣ細胞質に送達される（Guermonprez, P., et al. 2002）。このＭＨＣクラスＩ経路へのＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの標的化された送達の機構は、効率的な提示、それに続く強固で防御的なＣＴＬ応答をもたらす（Fayolle, C., et al, 1996, 1999, and 2001）。更に、この送達システムによりｉｎ  ｖｉｖｏで発生したＴ細胞応答は、Ｔｈ１に向けて強く分極化され（Polarized）（Dadaglio, G., et al., 2000）、そしてＣＤ８+Ｔ細胞活性化は、ＣＤ４+Ｔ細胞の助力又はＣＤ４０シグナリングを必要としない（Guermonprez, P., et al., 2002）。ゆえに、ＣｙａＡは、ＣＤ８+Ｔ細胞プライミングをもたらす、ＣＤ１１ｂｈｉｇｈＤＣｓへのｉｎ  ｖｉｖｏ標的化されたＡｇ送達のための安全で強力なビークルであると思われる（El Azami El ldrissi, M., et al., 2002）。抗腫瘍予防及び治療免疫において及びある感染性病原体に対して最適のＣＤ８+Ｔ細胞応答の発生は、ＣＤ４+Ｔ細胞応答の同時的活性化に依存しうるということを、いくつかの研究が証明した（Kern, D.E., et al., 1986; Toes, R.E., et al., 1999; Schnell, S., et al., 2000; Pardoll, D.M., et al., 1998; Wong,P., et al., 2003; Zajac, A.J. et al., 1998）。最適のワクチンストラテジーは、Ｔ細胞プライミングのためのＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの両方の同時送達を必要としうる。
【００１４】
これまでに、ＣｙａＡの最初の６００アミノ酸の範囲内に挿入されたＭａｌＥＣＤ４+Ｔ細胞エピトープは、ＡＰＣｓのＭＨＣクラスＩＩ提示経路に有効に標的化されそして特異的Ｔ細胞ハイブリドーマに提示されることが示された（Louca, J., et al., 2002）。それぞれ、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性提示経路へのＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの共送達（co-delivery）は、ＭａｌＥＣＤ４+Ｔ細胞エピトープ及びＯＶＡＣＤ８+Ｔ細胞エピトープをそのＡＣドメインに有する組換え解毒ＣｙａＡにより証明されうる。両エピトープを送達してＭＨＣ−ペプチド複合体を形成するためのこのタンパク質の能力も重要である。
【００１５】
ウシは、結核の実際の標的種においてＣｙａＡをベースとする構築物を試験するのに理想的なモデルである。マイコバクテリア抗原とのＣｙａＡ融合タンパク質は、特にそれらが慣用の組換えタンパク質より有効にウシにおいて認識される場合には、ウシにおけるサブユニットワクチンの候補のみならず、診断抗原の候補でもある。
【００１６】
これらの融合タンパク質の増加した有効性は、高められた感度から生じる。何故ならばこれらの融合タンパク質はより低いタンパク質濃度で認識されるからである。後者の考察は、大きなコスト利益を与えることができる。何故ならば、それは、潜在的に数百万試験／年の試験を実施するのに産生されなければならない抗原の量を有意に減少させることができるからである。
【００１７】
一般に、動物及びヒトにおけるＴＢの検出用の診断試薬に対する当該技術分野での要求がある。Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染された動物及びワクチン接種された動物の鑑別診断（differential diagnosis)をすることができそして有効なＴＢワクチンを開発することができるように、この要求は存在する。ヒトでは、ＴＳＴ皮膚試験より高い感度、特異性及び実用性の免疫診断方法の開発に対する要求がある。このような免疫診断方法はＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する高められたＴ細胞応答を可能とする方法から生じるであろう。
【００１８】
本発明の簡単な要約
本発明は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する高められたＴ細胞応答を可能とする免疫診断方法、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる免疫診断方法を提供することにより当該技術分野での要求を達成するのを助け、更に詳しくは、本発明は、送達システムとして遺伝子的に解毒されたＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．のＣｙａＡ（Bordetella sp. CyaA）を使用する診断試験及び免疫モニタリングのための新規なシステムを提供する。
【００１９】
本発明は、ＣｙａＡに遺伝子的に融合され又は化学的に結合されたペプチドによる診断試験及び免疫モニタリングの方法を提供する。組換えＣｙａＡによる試験の結果は定量的であり、ゆえに、免疫モニタリング及び簡単な診断試験を提供することができる。
【００２０】
１つの態様では、本発明は、動物における抗原によるＴ細胞刺激の後で、疾患を診断若しくは免疫モニタリングするか又はいかなるＴ細胞応答も免疫モニタリングする方法であって、（Ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ又はその断片及び前記哺乳動物のＴ細胞を以前に刺激した疑いのある抗原に相当するペプチドを含む組換えタンパク質を前記動物のＴ細胞に曝露し、そして（Ｂ）Ｔ細胞の活性化の変化を検出することを含む方法である。
【００２１】
他の態様では、本発明は、動物における抗原によるＴ細胞刺激の後の、疾患の診断若しくは免疫モニタリング試験又はＴ細胞応答の免疫モニタリングのためのキットであって、（Ａ）Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ又はその断片及び前記動物のＴ細胞を以前に刺激した疑いのある抗原に相当するペプチドを含む組換えタンパク質並びに（Ｂ）Ｔ細胞の活性化の変化を検出するための試薬を含むキットである。
【００２２】
本発明の態様では、組換えタンパク質は、１種以上の抗原に相当する１種以上のペプチドを含む。
【００２３】
本発明の態様では、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉａからのものである。
【００２４】
本発明の態様では、診断試験及び免疫モニタリングストラテジーは、ヒト又は動物の疾患、例えばウシの疾患であることができるが、それらに限定はされない。
【００２５】
本発明の特定の態様では、疾患は、感染性疾患、例えば、結核であるか又はがん、例えばメラノーマである。
【００２６】
本発明の態様では、組換えタンパク質は、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６又はＣｙａＡ−ＣＦＰ１０である。
【００２７】
本発明の態様では、試験に使用される抗原は、感染性物質（infectious agent）、アレルゲン又はがん細胞、例えばメラノーマからの抗原を含むことができるが、それらに限定はされない。
【００２８】
好ましい態様の詳しい説明
実施例に示されたとおり、与えられた抗原により予め刺激されたＴ細胞は、ＣｙａＡに含まれた同じ抗原によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激されうる。この発見に基づいて、本発明は、ＣｙａＡを含むタンパク質として、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ免疫優勢タンパク質（immunodominant proteins）ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０並びに他のタンパク質を送達することができる送達システムを提供することによるＴＢに対する診断試験及び免疫モニタリングを含む。
【００２９】
本発明は、ＣＦＰ−１０に対するポジティブ応答の頻度がＣｙａＡ送達により増加する（ｐ＝０．０２１）結核感染を検出するための簡単化された全血モデルも提供する。ポジティブ応答のこの増加した頻度は、危険にさらされている集団（ａｔ  ｒｉｓｋ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）における潜伏感染を識別するのを助けることができ、かくして活性な結核のより良好な阻止を促進することができる重要な特性である。
【００３０】
本発明は、動物、例えば、ウシ及びヒトにおける改良された診断試験及び免疫モニタリングに有効であることが示された。特に、ウシＴ細胞は、ＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ−１０とのＣｙａＡ融合タンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで認識する。
【００３１】
更に、本発明は、ＴＢ以外の疾患の診断試験及び免疫モニタリングを提供する。ＣｙａＡのＡＣドメインは、ＣＤ８+Ｔ細胞エピトープ、ＯＶＡ及びＣＤ４+Ｔ細胞エピトープ、ＭａｌＥを、それぞれ、ＢＭＤＣｓＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ提示経路に共送達することができる。これらのエピトープはＴＢからのものではないので、それらは、本発明の非ＴＢ態様の有用性を証明する。ＣｙａＡが送達されると、ＭａｌＥタンパク質と比較してＣＤ４+Ｔ細胞エピトープ提示の強い増強があるが、これは、抗ＣＤ１１ｂｍＡｂｓによりＣｙａＡのその受容体との相互作用をブロックすることにより抑制される（abrogated）。ＡＣドメインは、そのインターナリゼーションの後に、従来のエンドサイトーシス経路又は細胞質経路に沿ってプロセッシングされて、それぞれ、ＭａｌＥ及びＯＶＡペプチドを発生させる。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＣｙａＡはＭａｌＥ及びＯＶＡエピトープに対する特異的Ｔｈ１ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘発する。
【００３２】
ゆえに、ＣｙａＡ送達システムは新規な診断試験のために有用である。何故ならば、それはＤＣｓを標的化し、有効な提示のためのＭＨＣＩ及びＩＩ拘束性Ｔ細胞エピトープを送達し、そしてＴｈ１分極化された（Th1 polarized）ＣＤ４+Ｔ細胞及び強固な（robust）ＣＴＬ応答をｉｎ  ｖｉｖｏで誘発するからである。
【００３３】
本明細書で使用した、「免疫モニタリング」という用語は、免疫学的アッセイにより疾患の進行を追跡すること又は疾患からの回復を追跡することを指す。それは、抗原による刺激後に免疫応答、特に哺乳動物のＴ細胞応答を試験することを指す。例えば、免疫モニタリングは、例えば、臨床試験においてワクチン接種された個体のＴ細胞応答を試験することを指す。本発明に従う免疫応答の試験は、生物学的サンプルで、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。本発明は、特に、Ｔ細胞応答の免疫モニタリングの結果として、ヒト患者又は動物における腫瘍クリアランスを含む腫瘍進展の診断及び免疫モニタリングを指向する。Ｔ細胞応答モニタリングは、ある場合には、Ｂ細胞応答のモニタリングよりも適当な腫瘍免疫モニタリングであることが特に示される。
【００３４】
本明細書で使用された、「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することができる異種ペプチドを指す。特定の態様では、興味ある抗原又は分子は異種抗原である。本明細書で使用された、「異種」（"heterologous"）という用語は、ベクターにおいて使用されるＣｙａＡ以外の種の抗原由来の抗原を指すか、又は、ベクターにおいて使用されるＣｙａＡと同じ種の抗原に由来する抗原であるが、しかしそれが天然には存在しない位置においてＣｙａＡ内に位置した抗原を指す。
【００３５】
本明細書で使用された、「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発することができる抗原の最小ペプチド配列を指す。
【００３６】
本明細書で使用された「抗原に相当するペプチド又は抗原のペプチド」という用語は、ペプチド、エピトープ、あるいは、例えば、特に抗原提示細胞による抗原／エピトーププロセッシングを高める天然に若しくは非天然に存在するフランキング領域によりフランキングされた抗原又はペプチドを包含する。
【００３７】
「再刺激された」という用語は、感染、ワクチン接種又は特にｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原への他の暴露により抗原によって最初に刺激されそして本発明の方法において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで再び刺激された、特許請求の範囲に記載の方法のＴ細胞を指す。本発明に従う「再刺激」試験は、試験される生物学的サンプルにおいて、決定された抗原と接触させられるＴ細胞は、サンプルを提供する患者が該抗原を有する作用物質（感染性、腫瘍又は他の病原性作用物質を含む）と以前に接触していた場合にのみ、この抗原に応答することができる（例えば、サイトカイン、例えばインターフェロンを有意に産生することによって）ということに基づいている。
【００３８】
アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）又はその断片を含む使用される組換えタンパク質は、本発明の「再刺激」試験に対する感度の有意な増加を誘発することが本発明で示された。
【００３９】
本明細書で使用された、「免疫原性」という用語は、免疫応答を誘発することができるものとしてのタンパク質の特徴を示す。
【００４０】
「Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．のＣｙａＡ」又は「Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ」という用語は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．の病原体のアデニル酸シクラーゼトキソイドを指す。このようなＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ又はＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のものであることができる。
【００４１】
「Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡ」又は「Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａアデニル酸シクラーゼ」という用語は、修飾されているか又は修飾されていないが、しかしＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体への特異的結合及び触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスが影響を受けていない、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡタンパク質又はその断片を包含する。例えば、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ＣｙａＡは、解毒されるために修飾されうる。
【００４２】
「ペプチド」という用語は、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは６個より多くのアミノ酸わを含むアミド結合により連結された一連のアミノ酸を示す。
【００４３】
「腫瘍抗原」という用語は、免疫応答を誘発しそして抗体又はＴ細胞と特異的に反応する腫瘍からの物質を指す。
【００４４】
本発明の試験で使用される組換えタンパク質の抗原部分は、ＣｙａＡアデニル酸シクラーゼトキソイドのいかなる許容される部位（permissive sites）にも局在することができる（ＷＯ９３／２１３２４）。更に、本発明は、組換えタンパク質におけるＣｙａＡアデニル酸シクラーゼの断片のみを使用する試験を包含する（ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．５，５０３，８２９、５，６７９，７８４及び５，９３５，５８０に対応するＥＰＯ０３／２９１，４８６．３；El-Azami-El-Idrissi, et al., 2003, Interaction of Bordetella pertussis Adenylate Cyclase with CD11b/CD18, J. Biol. Chem.., vol. 278,pp. 38514-21参照）。
【００４５】
本発明の抗原はＣｙａＡに融合しているか又は化学的に結合していることができる（ＰＣＴ／ＥＰ０１／１１３１５）。
【００４６】
本明細書で使用された「ＣｙａＡアデニル酸シクラーゼの断片」という用語は、末端部ではない１つ以上のアミノ酸が欠失しておりそしてアデニル酸シクラーゼ毒素の所望の機能的性質が実質的に影響を受けていない、即ち、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体に対する特異的結合に必要なドメイン及び触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスが影響を受けていない、ＣｙａＡタンパク質を含む前記タンパク質の断片に関する。例えば、アミノ酸２２４〜２４０が欠失しているＣｙａＡ。
【００４７】
本明細書で使用された、「許容される部位」という用語は、アデニル酸シクラーゼ毒素の所望の機能的性質に実質的に影響を与えることなく、即ち、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体への特異的結合のために必要なドメインに影響を与えることなく、そして触媒ドメインのトランスロケーションのプロセスに影響を与えることなく有利に、異種ペプチドを挿入することができる部位に関する。
【００４８】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニル酸シクラーゼの許容される部位は、残基１３７〜１３８（Ｖａｌ〜Ａｌａ）、残基２２４〜２２５（Ａｒｇ〜Ａｌａ）、残基２２８〜２２９（Ｇｌｕ〜Ａｌａ）、残基２３５〜２３６（Ａｒｇ〜Ｇｌｕ）及び残基３１７〜３１８（Ｓｅｒ〜Ａｌａ）を含むが、それらに限定はされない（Ｓｅｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５参照）。下記の追加の許容される部位も本発明の態様に含まれる：残基１０７〜１０８（Ｇｌｙ〜Ｈｉｓ）、残基１３２〜１３３（Ｍｅｔ〜Ａｌａ）、残基２３２〜２３３（Ｇｌｙ〜Ｌｅｕ）、及び３３５〜３３６（Ｇｌｙ〜Ｇｌｎ）。（一般に、Glaser et al., 1988 Bordetella pertussis adenylate cyclase: the gene and the protein, Tokai j. Exp. Clin. Med., 13 Suppl.: 239 -52参照）。
【００４９】
本発明は、Ｔリンパ球の活性化により引起されるいかなる変化も検出する診断試験及び免疫モニタリングシステムを包含する。これらの変化は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５又はＩＦＮ−γ産生の変化を含むが、それらに限定はされない。
【００５０】
本発明は、試験サンプルが、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血又は全血の画分であることができる診断試験及び免疫モニタリングシステムも包含する。
【００５１】
本発明の診断試験及び免疫モニタリングシステムは、検出方法、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びＥＬＩＳＡ又は抗体を使用する他のアッセイ、テトラマーを使用するアッセイ及びＴ細胞活性化を検出するためのいかなる他のアッセイも含むが、それらに限定はされない。
【００５２】
本発明の更に他の態様は、プラスミドｐＴ７ＣＡＣＴ３３６／ＥＳＡＴ−６及びｐＴ７ＣＡＣＴ３３６／ＣＦＰ−１０のインサートのヌクレオチド配列を含む。これらのプラスミドは、下記のようにして調製される：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７４ｖ遺伝子ｅｓａｔ−６及びｃｆｐ−１０のオープンリーディングフレームを、表１に示されたプライマーを使用しそしてテンプレートとしてＲＤ１領域のｐＹＵＢ４１２コスミドクローン（Gorden, et al.1999）を使用するＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーに組み込まれた部位でＢｓｒＧＩにより消化し、そして抗原をコードする精製された断片を、ｐＴ７ＣＡＣＴ３３６−ＢｓｒＧＩ発現ベクターのｃｙａＡのコドン３３５と３３６との間にインフレームで挿入した（Osicka, et al. 2000）。クローニングされたインサートの正確な配列は、ＤＮＡ配列決定により確証された。組換えＤＮＡ構築のため及びＣｙａＡに挿入された抗原の発現のためにこの研究全体にわたり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene）を使用した。ｐＴ７ＣＡＣＴ１に由来する適切なプラスミドで形質転換されたバクテリア（Gordon et al.1999）を１５０μgアンピシリン／mlを補充されたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で３７℃で成育させた。
【００５３】
【表１】
2007514415.tif 000002
【００５４】
プラスミドｐＴ７ＣＡＣＴ３３６／ＣＦＰ−１０は、受託番号Ｉ−３１３５の下にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに２００３年１１月１８日に寄託された。プラスミドｐＴ７ＣＡＣＴ３３６／ＥＳＡＴ−６も、受託番号Ｉ−３１３６の下にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅに２００３年１１月１８日に寄託された。
【００５５】
更に、ＣｙａＡ−Ｔｙｒを発現するプラスミドＸＬ１／ｐＴＲＡＣＥＳ５−Ｔｙｒｏｓ３６９は、受託番号Ｉ−２６７９の下にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍに２００３年５月３１日に寄託された。プラスミドｐＴＲＡＣＥ５−Ｔｙｒｏｓ３６９は、λファージＰｒプロモーターの制御下にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからのｃｙａＣ及びｃｙａＡ遺伝子を発現する発現ベクターｐＴＲＡＣＧの誘導体である（ｐＴＲＣＡＧもアンピシリン耐性選択マーカー及び感熱性λリプレッサーＣｌ857を有する）。ｐＴＲＡＣＥ５−Ｔｙｒｏｓ３６９においては、ｃｙａＡ遺伝子は、野生型ＣｙａＡのコドン１８８と１８９との間にジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎの挿入により（アデニル酸シクラーゼ活性の不活性化をもたらす）及び、ＣｙａＡのコドン２２４と２４０との間に挿入された下記のペプチド配列ＰＡＳＹＭＤＧＴＭＳＱＶＧＴＲＡＲＬＫをコードするＤＮＡ配列の挿入により修飾される。下線を施したペプチド（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）はチロシナーゼのアミノ酸配列３６９〜３７７に相当する。ＣｙａＡ−ＧｎＴＶを発現するプラスミドＸＬ１／ｐＴＲＡＣＥＳ−ＧｎＴＶは受託番号Ｉ−３１１１の下にＣ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅに２００３年１０月１６日に寄託された。プラスミドｐＴＲＡＣＥ５−ＧｎＴＶ  は、λファージＰｒプロモーターの制御下にＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからのｃｙａＣ及びｃｙａＡ遺伝子を発現する発現ベクターｐＴＲＡＣＧの誘導体である（ｐＴＲＣＡＧも、アンピシリン耐性選択マーカー及び感熱性λリプレッサーＣｌ857を有する）。ｐＴＲＡＣＥ５−ＧｎＴＶにおいて、ｃｙａＡ遺伝子は、野生型ＣｙａＡのコドン１８８と１８９との間にジペプチドＬｅｕ−Ｇｌｎの挿入（アデニル酸シクラーゼ活性の不活性化をもたらす）により、及びＣｙａＡのコドン２２４と２４０との間に挿入された下記のペプチド配列ＰＡＳＶＬＰＤＶＦＩＲＣＧＴをコードするＤＮＡ配列の挿入により修飾される。下線を施したペプチド（ＶＬＰＤＶＦＩＲＣ）は、Ｎ−アセチルグルコサミニル−トランスフェラーゼＶ遺伝子に由来するＨＬＡ−Ａ２拘束性メラノーマエピトープＮＡ−１７Ａに相当する。（G.Dadaglio, et al.(2003) Recombinant adenylate cyclase of Bodetella pertussis induces CTL responses against HLA-A2-restricted melanoma epitope. Int. Immuno）。
【００５６】
腫瘍抗原に対するＴ細胞応答の誘発に関する結果は、刊行物Dadaglio G. et al（International Immunology, 2003,vol.15,No.12,pp.1423-1430）に説明されている。
【００５７】
本明細書に示されたデータは、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０融合タンパク質は、より高い最大値及び同等な刺激を達成するのに必要な減少した抗原濃度の両方に関して、ＣＦＰ−１０単独よりも有効にウシＴ細胞によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで認識されることを示す。この認識は、ＣＤ１１ｂで媒介される。ＣｙａＡをベースとする融合タンパク質は、全血ＩＦＮ−γ試験に適用することができる。ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０をベースするＣｙａＡ融合タンパク質の両方共、それらの非融合タンパク質対応物よりも強く認識される。ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０は、特により低い試験濃度でＣＦＰ−１０単独により創り出された感度より高い増加した感度を与えた。与えられた実施例は、マイコバクテリア抗原ＣＦＰ−１０及びＥＳＡＴ−６に融合されたＣｙａＡ融合タンパク質がウシＴ細胞により認識されること及びこの認識はＣＤ１１ｂで媒介されることを証明する。これらのＣｙａＡをベースとする組換え融合タンパク質は、対応する融合タンパク質よりも有効にウシＴ細胞により認識され、これは減少した試験濃度を可能とする。本発明の診断試験のＣｙａＡをベースとする融合タンパク質は全血ＩＦＮ−γ試験に適用することができ、そしてこれらの試験フォーマットは現場（ｆｉｅｌｄ）で使用することができる。実施例は、これらのＣｙａＡをベースとする試薬がウシにおける有用な診断試薬でありそしてウシにおけるサブユニットワクチン候補であることを示す。
【００５８】
実施例３〜５は、マウス系（murine system）で以前に記載されたとおり、ＣｙａＡ融合タンパク質は、ＣＤ１１ｂで媒介される機構を介してウシにおいて認識されることを示す。ウシＤＣを標的化するこれらのＣｙａＡ融合タンパク質は、マウスにおいて記載されたとおり、同様な方法でｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫応答を誘発するためのサブユニットワクチンとして使用することもできる。しかしながら、免疫診断試薬としてのＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０の独特な感度及び特異性は、もしそれらがサブユニットワクチン接種のために使用されるべき場合には考慮されなければならない。
【００５９】
実施例３〜５に示されたデータにより証明されるとおり、ＣｙａＡをベースとする融合タンパク質はウシにおけるウシ結核を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断試薬である。それらの使用の実用性は、現場において、それぞれ、それらの感度及び特異性を決定するために、農場から集められたウシ結核を有する多数のウシ（現場リアクター（ｆｉｅｌｄ  ｒｅａｃｔｏｒｓ）及びウシ結核のない牧場からのウシにおいて決定することができる。大規模な現場の適用におけるこれらの試薬の実用性の他の決定は、それらを大量に産生できる容易さ及び慣用の組換えタンパク質又は合成ペプチドに比較したそれらの生産コストである。
【００６０】
ＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ−１０を有するＣｙａＡトキソイドは、ＴＢ患者及び健常な感作されたドナーの９１．１％以上からのＴ細胞を再刺激することができた。ＣｙａＡによる抗原の送達は、Ｔ細胞を再刺激するのに必要なＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０の量を１０倍減少させ、そして低い応答者では、検出されたＩＦＮ−γ産生細胞の全体の頻度は増加した。ＣｙａＡによるこれらの抗原の送達は、ＣＤ４+Ｔ及びＣＤ８+Ｔ細胞の両方の応答を高めそして、この応答は、それぞれ、阻害ＭＨＣクラスＩＩ又は古典的ＭＨＣクラスＩ抗原プロセッシング（inhibition MHC Class II or classical MHC Class I antigen processing）によりブロックされうる。ＣｙａＡ担体とＥＳＡＴ−６の単純な混合物は応答を高めなかったことからトキソイドの抗原プロセッシングは必要である。更に、トキソイドのＣＤ４認識は、クロロキンによる阻害に感受性であった。ＣＦＰ−１０に対するポジティブ応答の頻度は  ＬＴＢ１を検出するための単純化された全血モデルでは、危険にさらされている集団においてＬＴＢ１を同定するのを助けることができる潜在的に重要な特質である、ＣｙａＡ送達により増加し、かくして活性な感染性ＴＢのより良好な予防を促進する。
【００６１】
実施例で与えられたデータは、ＣｙａＡによる抗原送達が、プロセッシングされたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のペプチドの新生ＭＨＣ分子へのアベイラビリティーを増加させるという解釈と合致している。ＣｙａＡトキソイドは、ＣｙａＡがＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８を介して特異的に取り込まれることから、細胞質プロセッシングにおいてプロテオソーム開裂を受けやすくなることが知られている（Guermonprez, P., et al. 2001）。ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＣｙａＡは、樹状細胞の細胞質ゾルに有効に送達されることが証明された（Guermonprez, P., et al. 2001）。かくして、可溶性組換え抗原は典型的にはエンドソームにおいてプロセッシングされ、かくしてＭＨＣクラスＩにはアクセスし難いことから、ＣＤ８応答は、可溶性組換え抗原に対する応答に比べて、より容易に検出される。ＣＤ８+Ｔ細胞は、結核に対するヒト保護応答に潜在的に貢献するが（Pathan, A.A.., et al.2000; Lalvani, A., et al., 1998）、抗原特異的応答の検出は、ペプチドプール対象の興味ある抗原を発現する組換えＶａｃｃｉｎｉａウイルスを使用する必要によりこれまで制限されてきた（Pathan, A.A.., et al.2000; Lalvani, A., et al., 1998; Wilkinson, R.J., et al., 1998）。ＣｙａＡによる抗原の送達は、全Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質に対するＣＤ８+Ｔ細胞の応答をアッセイすることができる新規な方法を提示する。
【００６２】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞の応答もまた高められ、これは以前の所見と合致している（Loucka, J., et al., 2002）。ＣｙａＡに融合された抗原に対する応答の増強は、遊離抗原（free antigen）に対する低い応答を有するドナーにおいて特に顕著であった。これは、抗原提示細胞のＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリン受容体に特異的に結合し（Guermonprez, P., et al. 2001）、その後急速にエンドサイトーシスされる（Loucka, J., et al., 2001）巨大分子ＣｙａＡ抗原コンジュゲートよりも、可溶性組換え抗原はピノサイトーシスによってより少なく有効に取り込まれ（かくしてエンドソームプロセッシングにはより少なく利用可能性である）からでありうる。これは、モル基準で１０〜２０倍少ないトキソイド抗原がなぜ同じ応答を再刺激するか（図５）そして組換え抗原に対するネガティブ応答を有するいくらかのドナーがなぜＣｙａＡに融合された抗原に対する応答を示すか（図６）も説明するであろう。
【００６３】
数年前、限定されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに応答してＴ細胞により産生されたＩＦＮ−γのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生をアッセイする試験によりＴＳＴを代替することが討論された（Jurcevic,S., et al., 1996）。このアプローチは、高度に免疫原性のＲＤ１にコードされた抗原ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０の組み込みにより改良されそして改善された（Sorensen, A.L., et al., 1995; Berthet, F.X., et al., 1998）。いくつかの研究は、ＲＤ１にコードされた抗原に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答は、病原性マイコバクテリアによる感染からのＢＣＧによる免疫感作を鑑別する（differentiate）ことを示した（Arend,S.M., et al., 2000; Cockle, P.J., 2002; Lalvani, A., et al., 2001）。ＥＳＡＴ−６の複数のペプチドに対するＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答は、９６％の感度及び９２％の特異性で潜在的及び明白な結核感染を検出するのに利用することができる（lalvani, A., et al., 2001）。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ感作された対象において観察されるＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０抗原トキソイドの認識の非常に高い頻度は、これらの評価とぴったり一致する。抗原刺激された全血培養物を使用するより実際的なアプローチは、都合の悪いことに感度の７２％への低下と関連している（Brock, L., et al., 2001）。しかしながら、データは、送達システムとしてのＣｙａＡトキソイドの使用はこの欠陥を克服することができることを示唆する。更に、ＣｙａＡによる送達は、低応答対象におけるＩＦＮ−γの検出、ＨＩＶのセッティングにおける明白な利点でありうる特質、を最善に高めた。
【００６４】
研究の結果は、ＣｙａＡのＡＣドメインがＢＭＤＣｓのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ拘束性提示経路の両方へｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達されることを証明する。ＭａｌＥタンパク質又はＭａｌＥペプチドの提示と比較して、ＣｙａＡ−ＭａｉＥによるクラスＩＩ提示の高い増強が観察された。この増強は、ＣＤ１１ｂ−ＣｙａＡ相互作用に依存する。何故ならばそれは抗ＣＤ１１ｂｍＡｂｓによりブロックされるからである。提示アッセイにおいて薬物及びＴＡＰ１欠失ＢＭＤＣｓを使用すると、受容体媒介エンドサイトーシス後に、ＣｙａＡのＡＣドメインは、ＢＭＤＣｓの細胞質ゾルにトランスロケーションされて従来のＭＨＣクラスＩプロセッシング経路に沿ってプロセッシングされるか又はプロセッシングのエンドサイトーシス経路にしたがって分解されることは明らかである。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＣｙａＡは、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞プライミングのためのＭａｌＥ及びＯＶＡペプチドを同時に送達し、そしてＯＶＡペプチドに対するＣＴＬを誘発しそしてＭａｌＥ及びＯＶＡエピトープの両方に特異的なＴｈ−１サイトカイン産生を誘発する。
【００６５】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓの遺伝子的に解毒されたアデニル酸シクラーゼのＡＣドメインに挿入されたＭａｌＥＣＤ４+Ｔ細胞エピトープは、ＢＭＤＣｓにより、ＣＲＭＣ３、ＭａｌＥ−特異的ＣＤ４+Ｔ細胞ハイブリドーマに、非常に有効に提示される。得られるＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示は、同等な濃度の精製されたＭａｌＥタンパク質で観察された提示より１００倍も多く有効である。ＡＰＣｓが高濃度の外因性Ａｇとインキュベーションされる場合すら、少数のＭＨＣクラスＩＩ分子のみがそのＡｇに由来するペプチドを提示することが十分に証明される（Lich,J.D., et al., 2000）。ここでは、エンドサイトーシス経路へのＣｙａＡによるＭＨＣクラスＩＩエピトープ送達の増強は、ＣｙａＡのその細胞受容体ＣＤ１１ｂとの相互作用が抗ＣＤ１１ｂｍＡｂｓによりブロックされるとき妨害される。これらの結果は、ＣｙａＡのＣＤ１１ｂとの相互作用は、Ｔ細胞ハイブリドーマに対する提示のためのＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドの発生を促進することを示す。ＭＨＣクラスＩＩ提示の増強は、ＭａｌＥ及びＯＶＡＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの両方を有するＣｙａＡで依然として観察される。この場合に、ＣｙａＡは、ＯＶＡ及びＭａｌＥエピトープを、それらのそれぞれの提示経路へ、これらのエピトープの１つのみを有するＣｙａＡｓと同じく有効に同時に送達する。
【００６６】
ＣｙａＡは、そのＮ末端ＡＣドメインを、直接であり、次いで従来の細胞質ゾル経路に沿ったＡＣドメインプロセッシングが続くと考えられるトランスロケーションにより標的細胞細胞質ゾル内に送達することが、繰り返し示された（Ladant, D., and A. Ulmann. 1999）。ＣｙａＡ  ＡＣドメインはまたＭＨＣクラスＩＩ提示経路に非常に有効に送達されるので、このような二重送達に関係したプロセッシング機構が分析された。細胞質ゾルＡｇｓに由来するペプチドのＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示は、別のプロセッシング経路により発生させることができることを、いくつかの研究が報告している（Rudensky, A., et al., 1991; Mukherjee, P., et al., 2001）。しかしながら、ＣｙａＡ  ＡＣドメインのＭＨＣクラスＩＩプロセッシングはプロテアソーム活性もＴＡＰ輸送体も必要としないで、小胞酸性化後に活性化されるエンドサイトーシスプロテアーゼにより行われる。これらの結果もまた、ＭａｌＥペプチド提示がＭＨＣクラスＩＩ分子ネオ合成を必要とすることを確認する。ゆえに、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示のためのＡＣドメインプロセッシングは従来のエンドサイトーシス経路に従って起こる。
【００６７】
この結果及びＣｙａＡ提示のためのＣＤ１１ｂ要求は、この毒素が受容体媒介エンドサイトーシスによっても細胞に入ることができ、その後小胞から標的細胞細胞質ゾルへのＡＣドメインの急速なトランスロケーション、又はエンドサイトーシス小胞に沿ったこのドメインの分解が続くことを示唆する。あるいは、ＡＣドメインは、細胞膜から細胞質ゾルに直接トランスロケーションされるか、又は取り込まれてエンドサイトーシス経路の小胞に入る。ＣｙａＡ取り込みは、ファゴサイトーシスも、マクロピノサイトーシスも、カベオラ媒介エンドサイトーシスも必要としない。しかしながら、結果は、ＣｙａＡのＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示は受容体媒介エンドサイトーシスによるＣｙａＡインターナリゼーションに依存することを示す。これは、ＣＤ１１ｂ媒介エンドサイトーシスは、標的細胞へのＣｙａＡエントリーの機構の１つであることを示唆する。次いで、ＣｙａＡＡＣドメインは、ＭＨＣクラスＩ提示経路に沿って更にプロセッシングされるために細胞質ゾルにトランスロケーションされうる。
【００６８】
ＣｙａＡは、ＣＤ１１ｂポジティブ細胞を標的化し（Guermonprez,P., et al., 2001 and 2002）；そしてペプチドをＭＨＣクラスＩ提示経路に送達する非常に有効なベクターである。この標的化された送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの防御ＣＴＬを誘発することが示された（Fayolle,C., et al., 2001）。この研究では、ＣｙａＡはｉｎ  ｖｉｖｏでＯＶＡ及びＭａｌＥＴ細胞エピトープをそれらのそれぞれの提示経路に共送達し、そしてＣＤ８+及びＣＤ４+Ｔ細胞応答を誘発する。アジュバントなしで静脈内経路によるＣｙａＡ５０μgの１回の注射は、Ｔｈ１に向けて分極化されるＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答を誘発した。ＣＤ１１ｂ+細胞の中でも、ＣＤ１１ｂＣＤ８−ＤＣサブセットは、ＣｙａＡのｉｎ  ｖｉｖｏ提示をもたらす（Guermonprez,P., et al., 2002）。このマウスＤＣ亜集団（murine DC subpopulation）は、ＣＴＬ誘発において最も有効であるが（Schlecht, G., et al., 2001; Ruedl, C., et al., 1999）、主にＴｈ−２に向けてＣＤ４+Ｔ細胞応答をバイアスさせることも報告された。しかしながら、ある種の微生物化合物による活性化後に、このＤＣサブセットは、Ｔｈ−１Ｔ細胞応答を誘発する能力を獲得する（Manickasingham, S.P., et al., 2003; Boonstra, A., et al., 2003）。実施例で示されたとおり、誘発されたＴ細胞応答はＴｈ−１に向けて強く分極化され、これはＣｙａＡが、挿入されたエピトープを送達することに加えてＤＣ成熟を促進することができることを示唆する。追加の研究は、ＣｙａＡがＴｈ−１応答を発生することを可能とするシグナルの性質を説明することができる。
【００６９】
強固なＴｈ−１ＣＤ４+及びＣＴＬＣＤ８+Ｔ細胞応答の同時誘発は、ワクチン接種の１つの目標である。実際に、現在使用されるサブユニットワクチンの大部分は、Ｔｈ−２分極化されたＣＤ４+Ｔ細胞応答を発生させる。ウイルス又は細胞内病原体により誘発された疾患又は抗腫瘍免疫においては、ＣＤ８+Ｔ細胞及びＴｈ−１ＣＤ４+Ｔ細胞型の応答が必要である。ＣｙａＡは、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答を非常に有効に発生させることができる。ゆえに、ＭＨＣクラスＩ提示経路へのクラスＩエピトープ送達におけるＣｙａＡの高い有効性と組み合わさった観察されたＭＨＣクラスＩＩ提示の増強は、このベクターを新規な診断試験及び免疫モニタリングのために非常に有用なものとし、そしてワクチンデザインのために非常に有望なものとする。
【００７０】
本発明を下記の実施例でより詳細に説明する。
【００７１】
実施例１
ウシの研究のための物質及び方法
ウシツベルクリン（ＰＰＤ−Ｂ）及びトリツベルクリン（ＰＰＤ−Ａ）は、Veterinary Laboratories Agency-WeybridgeにおけるTuberculin Production Unitから得られそして１０μg/mlで培養において使用された。組換えＥＳＡＴ−６は、Dr.A.Whelen(VLAWeybridge）により供給され、組換えＣＦＰ−１０は、Lionex Ltd., Braunschweig, Germanyから得られた。ＣｙａＡ、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０及びＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６は、Dr.C.Leclerc, Institute Pasteur, Parisにより提供された。タンパク質の同一バッチを全体にわたり使用した。
【００７２】
Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染したウシ（Vordemeier et al., 1999）の仔ウシを、５×１０3〜５×１０4ＣＦＵの気管内点滴によりＧＢからのＭ．ｂｏｖｉｓフィールド株（M.bovis field strain）（ＡＦ２１２２／９７）で感染させた。感染は、これらの動物の肺及びリンパ節における結核性病巣（tuberculous lesions）の存在並びに感染の約２０週間後に行われた死後に集められた組織からのＭ．ｂｏｖｉｓの培養により確かめられた。ヘパリンを加えた血液サンプルは、強くそして持続したｉｎ  ｖｉｔｒｏツベルクリン応答が観察された、感染の少なくとも６週間後に得られた。
【００７３】
インターフェロン−ガンマＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（Vordermeier et al., 2002）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ヘパリンを加えた血液からＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Sigma）勾配遠心により単離し、そして組織培養培地（５％ＣＰＳＲ−１（制御されたプロセス血清代替物−１型、Sigma Aldrich, Poole,UK）、非必須アミノ酸（Sigma Aldrich）、５×１０-5Ｍ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンサルフェート）を補充されたＲＰＭＩ  １６４０）（Life Technologies, Paisley, Scotland, U.K.)）中で培養した。直接ＥＬＩＳＰＯＴｓを以前に記載されたとおりに数えた。簡単に言えば、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ−Ｐポリフッ化ビニリデン膜、Millipore, Molsheim, France）を、ウシＩＦＮ−γ特異的モノクローナル抗体２．２．１で４℃にて一晩コーティングした。結合しなかった抗体を洗浄により除去し、そしてウエルをＲＰＭＩ１６４０培地中の１０％ＦＣＳでブロックした。次いで、組織培養培地（５％ＣＰＳＲ−１を補充されたＲＰＭＩ１６４０）中に懸濁させたＰＢＭＣ（２〜５×１０5／ウエル））を加えそして加湿したインキュベーター中で３７℃及び５％ＣＯ2で２４時間培養した。ＩＦＮ−γに対して特異的なウサギ血清でスポットを発生させ、次いでウサギＩｇＧに対して特異的なアルカリホスファターゼ−コンジュゲーテッドモノクローナル抗体（Sigma Aldrich）とインキュベーションさせた。モノクローナル抗体２．２．１は、親切にも、Dr.D.Godson、（Veterinary infectious Disease Organization, Saskatoon, SK, Canada）により提供された。スポットをＢＣＩＰ−ＮＢＴ基質（Sigma Aldrich）により可視化した。
【００７４】
ＣＤ１１ｂの関与は、１００μｌ中に分配した２×１０5ＰＢＭＣに、マウスｍＡｂＣＣ９４及びＩＬＡ１５（両ＩｇＧ１、親切にも、DrC.Howard,IAH,Compton,UK）により提供された）の添加（５０μｌ／ウエルのＥＬＩＳＰＯＴプレート）により決定された。３７℃で３０分の予備インキュベーションの後に、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０の段階希釈物を加え、そして培養物を上記したとおりに２４時間インキュベーションし、次いでＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。
【００７５】
前記したとおり（Vordermeier et al., 2001）ＭＡＣＳシステム（ヤギ抗マウスＩｇＧコーテッドビーズ、ＬＳ分離カラム、Miltenyi Biotec Ltd, Bergisch-Gladbach, Germany）と協同して抗ウシＣＤ４又はＣＤ８特異的ｍＡｂＣＣ３０及びＣＣ５８（C. Howard, IAH）を使用する磁性ネガティブ選択により、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞亜集団を枯渇させた（depleted）。
【００７６】
インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）アッセイ（Wood et al., 1994; Vordermeier et al., 1999）。ヘパリンを加えた血液０．１mlを等容積の抗原含有溶液と混合することにより、９６ウエルプレート中で０．２ml／ウエルアリクォートにおいて、全血培養を行った。上清を培養の２４時間後に回収し、Ｂｏｖｉｇａｍ  ＥＩＡキット（CSL, Merbourne, Australia）を使用してインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を決定した（Vordermeier et al., 2002）。データをＯＤ４５０単位（ＯＤ４５０×１０００）として表す。ＣｙａＡバックグラウンドレベルをＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ１０の値から減じた。
【００７７】
統計的分析。ｉＭａｃパーソナルコンピューターでＩｎｓｔａｔ  ｖ３．０ａ（GraphPad, San Diego, CA, USA）を使用して統計的分析を行った。片側又は両側ウイルコクスン符号付順位マッチドペアー検定（one- or two-tailed Wilcoxon signed rank matched pairs test）を使用して、データを分析した。
【００７８】
実施例２
完全な（entire）マイコバクテリア抗原Ｃｆｐ１０又はＥｓａｔ−６を有する組換えＣｙａＡの構築及び精製
組換えＤＮＡ構築のため及びＣｙａＡに挿入された抗原の発現のために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Stratagene）を使用した。ｐＴ７ＣＡＣＴ１（Osicka et al., 2000）に由来する適切なプラスミドで形質転換されたバクテリアを、アンピシリン１５０μg/mlを補充されたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で３７℃にて成育させた。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖ遺伝子ｅｓａｔ−６及びｃｆｐ−１０のオープンリーディングフレームを、下記のプライマー：
【００７９】
【表２】
2007514415.tif 000003
【００８０】
を使用してＲＤ１領域（Gordon et al., 1999）のｐＹＵＢ４１２コスミドクローンからのＰＣＲにより増幅させた。
【００８１】
ＰＣＲ産物を、ＰＣＲプライマーに組み込まれた部位でＢｓｒＧＩにより消化し、そして抗原をコードする精製した断片を、ｐＴ７ＣＡＣＴ−３３６−ＢｓｒＧＩ発現ベクター（Ｏｓｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）上に保持されたＣｙａＡ遺伝子オープンリーディングフレームのコドン３３５と３３６との間にインフレーム内で挿入された。クローニングされたインサートの正確な配列は、ＤＮＡ配列決定により確認された。
【００８２】
それぞれ、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０抗原を有するコントロール解毒モックＣｙａＡ（control detoxified mock CyaA）及び組換えＣｙａＡタンパク質を、前記したとおり（karimova et al., 1998）、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生させ、ＤＥＡＥ−セファロースでのイオン交換クロマトグラフィー及びフェニル−セファロースでの疎水性クロマトグラフィーの組み合わせにより封入体から精製した。最終段階で、タンパク質を８Ｍ尿素、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、２mMＥＤＴＡで溶離し、そして以前に記載されたとおりにして特徴付けた（karimova et al., 1998）。得られたタンパク質は、如何なる検出可能なアデニル酸シクラーゼ酵素活性も含んでいなかった。
【００８３】
実施例３
実験的に感染したウシのＩＦＮ−γ応答
実験的に感染させたウシからＰＢＭＣを調製し、そして抗原（組換えＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０及びＣｙａＡコントロール）の段階希釈物とインキュベーションさせた。抗原で誘発されたＩＦＮ−γ応答を、鋭敏なＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して２４時間の培養の後に決定した。抗原を加えないで（培地コントロール）見出されたスポット形成性細胞（ＳＦＣ）の数を、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０刺激後に誘発されたＳＦＣの数から減じた。データがその後いかに表されそして比較されたかを説明するために、１頭の仔ウシで試験したＣＦＰ−１０についての代表的結果を図１に示す。この仔ウシでは、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０は、組換えＣＦＰ−１０より高いピーク応答を誘発し（水平線ａとｂにより示された値の比較により示されたとおり）、そして、組換えタンパク質で誘発された「半最大」（half maximum）（ピーク応答の５０％）応答（線ｃ）に必要な濃度を示す垂線ｄ及びｅにより示されるとおりより有効に認識された。
【００８４】
次いで、６頭の実験的にＭ．ｂｏｖｉｓ感染させた仔ウシの更なるバッチを試験し、そして結果を同じく解釈した。ＣＦＰ−１０又はＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０により誘発されたピーク応答の比較及び５０％最大応答に必要な減少した濃度により証明されるとおり、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０融合タンパク質は、その非融合同等物より優れており（図２）：ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０ピーク応答はＣＦＰ−１０で観察されたピーク応答よりも約二倍高かった（メディアン応答（median response）；ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０：１５７ＳＦＣ；ＣＦＰ−１０：７５ＳＦＣ；ｐ＝０．０３）。５０％最大応答に必要な濃度により判定されるとおり、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０は、ＣＦＰ−１０より約２０倍有効に認識された（５０％最大濃度；ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０：０．３nMＣＦＰ−１０：６．２５nM、ｐ＝０．０１７）。
【００８５】
ＥＳＡＴ−６又はＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６融合タンパク質により誘導されたＩＦＮ−γ応答は、お互いに有意には異ならなかった（図２）。興味深いことに、組換えＥＳＡＴ−６はＣＦＰ−１０より約７０倍有効に認識された（５０％最大濃度のメディアン（median of 50% maximum concentrations）：ＣＦＰ−１０による６．２５に比較してＥＳＡＴ−６での０．０９）。これらの２つのタンパク質間の有効性のこの差は、ＣｙａＡ融合タンパク質としてＥＳＡＴ−６を呈示することの追加の利益が何故これらの実験で実現されなかったかを説明することができよう。
【００８６】
実施例４
ＣｙａＡ−ＣＦＰ１０の認識はＣＤ１１ｂにより媒介される
ＣｙａＡ−ＣＦＰ１０の認識がＣＤ１１ｂ依存性機構（マウスで最近示されたとおりの）を介して媒介されるかどうかを決定するために、感染した仔ウシからのＰＢＭＣを、ウシＣＤ１１ｂに対して特異的な同じアイソタイプ（ＩｇＧ１）の２つのｍＡｂ（親切にも、Dr C.Howard,IAH,Compton,UKにより提供された）の存在下にＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０で刺激した。これらのｍＡｂの１つ、（ＩＬＡ１５）は、ＳＦＣの数が有意に減少したので、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０のＣＤ１１ｂとの相互作用を妨害したが、これに対して、非ブロッキングアイソタイプコントロールｍＡｂ（ＣＣ９４）は妨害しなかった（図３、一側ウイルコクスンマッチドペアー検定one-tailed Wilcoxon matched pairs test）により決定して、試験された各濃度についてｐ＜０．０２）。これらの結果は、マウス系における如く、ＣｙａＡはウシのＡＰＣ上のＣＤ１１ｂと相互作用するという証拠を与える。
【００８７】
ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方により認識されることも示された。これは、磁性ビーズにより両方の亜集団を枯渇させることにより分析された。ウシ結核の早期段階のウシは、弱い又は検出できないＣＤ８＋Ｔ細胞応答しか示さない（Pollock et al., 1996, Vordermeier, 公表されていない観察）。その結果として、この研究のために入手可能な実験的に感染させた動物のすべてを、感染後相対的に早期に（即ち、感染後約４〜６ヶ月）試験し、そして有意なＰＰＤ−Ｂ及びＣＦＰ−１０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が試験された４頭の乳牛（cows）の１頭のみにおいて観察された。それにもかかわらず、数年前に感染した成体乳牛（adult cows）から得られた結果は、組換えタンパク質のように、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞により認識されることを示した。しかしながら、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０は、その差は統計的に有意ではないとしても、組換えタンパク質と比較してより高いｉｎ  ｖｉｔｒｏＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発した（応答する細胞のＣＤ８／ＣＤ４比：ＣＦＰ−１０：０．８、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０：１．０５、データは示されていない）。
【００８８】
実施例５
全血ＩＦＮ−γ試験におけるＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０の成績（ＢＯＶＩＧＡＭアッセイ）
全血アッセイ（ＢＯＶＩＧＡＭ試験）のフォーマットにおいて現場での診断アッセイとしてＩＦＮ−γ試験を適用した。このフォーマットにおいて、農場で集められた血液にヘパリンを加え、それをツベルクリン又は特異的抗原とインキュベーションした。２４時間のインキュベーション期間の後に、血漿上清中の抗原で誘発されたＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡにより決定した。ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０とのＣｙａＡ融合タンパク質の性能を決定するために、第２バッチの８頭の実験的にＭ．ｂｏｖｉｓに感染した仔ウシから血液を得た。これらの血液サンプルを４及び２０nMのＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０で刺激した。２４時間後に行ったＥＬＩＳＡアッセイの結果を図４に示す。ＥＬＩＳＰＯＴにより測定されたＰＢＭＣ応答について上記に示されたとおり、組換えＣＦＰ−１０タンパク質と比較して有意により強いＩＦＮ−γ応答が、両試験濃度でＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０で観察された（両濃度でｐ＝０．０７８）。この増加した応答は、血液を４nM濃度の抗原で刺激したとき、特に明白であった（メディアンＯＤ４５０単位、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０：３１３、ＣＦＰ−１０：１０５）。ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＥＳＡＴ−６の応答は、２０nMでは有意に異ならなかったが、４nMでのＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６による刺激後に有意に高められた応答が観察された（ｐ＝０．０１５、メディアンＯＤ４５０単位、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６：４８６；ＥＳＡＴ−６：２６０）。
【００８９】
１００  ＯＤ４５０単位の普通に適用されるカットオフを使用して診断結果を評価したとき、８頭の試験された動物のうち６頭は、両試験濃度で適用されたＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６を使用するウシＴＢについてはポジティブであると思われる（図４）。対照的に、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０の使用は、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０による２０及び４nM試験濃度で試験した動物の８頭の内７及び８頭の内６頭はポジティブであり、これに対して、対応する試験濃度で組換えＣＦＰ−１０による刺激後に、８頭のうち６頭及び８頭のうち４頭がポジティブと分類された（図４）ので、抗原としてのＣＦＰ−１０の感度を改良した。
【００９０】
８頭のうちの１頭の試験ネガティブ動物は、Ｍ．ｂｏｖｉｓは採取されたいかなる組織サンプルからも培養されうるとしても、この実験が行われた数ヵ月後に行われた死後の結核病巣なしと呈示された。この動物は、ツベルクリン皮膚試験もネガティブであった。合わせて考えると、これは、この動物における実験的感染は封じ込められ（cotained）そして疾患は生じなかったことを示唆する。予想されたとおり、ＰＰＤ−Ｂ、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０、ＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ−１０による刺激後のこの仔ウシの血中にＩＦＮ−γは誘発されず、かくしてこれらの試薬の特異性を明らかにする（図４）。
【００９１】
実施例６
ヒトの研究のための材料及び方法
ヒトの研究は、Harrow Local Research Ethics Committee (Harrow LREC 1645 and 2414）からの倫理的承認を伴って行われた。結核を有する患者及びそれらの健常な接触者は、Northwick Park Hospital, Harrow (North West London Hospitals NHS Trust）から動員された。異なる臨床表現型を有する３グループの人々が選ばれた。第１グループは、明白な（即ち、培養又は生検ポジティブ）結核を有する成人であった（ｎ＝２１、１４Ｍ、７Ｆ、平均年齢３５．１歳）。第２グループは、正常な胸部Ｘ線写真を有するがそれにもかかわらず強くポジティブなＴＳＴ反応（Heaf Grade ３以上）を示し、かくしてＬＴＢ１を有していそうだと思われる無症候成人からなっていた（ｎ＝４４、２６Ｍ、１８Ｆ、平均年齢３４．７歳）。第３のコントロールグループは、ＴＢへの証明された暴露（documented exposure）を持たず、その皮膚試験反応はネガティブである健常な成人からなっていた（ｎ＝７、３Ｍ、４Ｆ、平均年齢３７．６歳）。最初の２つのグループは、M.tuberculosis特異的抗原に対するＴ細胞反応性の機会を最大にし、かくして組換えトキソイド及びＣｙａＡトキソイドに対する応答の比較を可能とするように選ばれた。すべての対象は、次いでBritish Thoratic Societyガイドラインに従ってアドバイスされそして、必要であれば、処置された（Thorax 55:887-901, 2000）。
【００９２】
細胞。Ficoll-Paque Plus（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上での遠心により血液２０mlからＰＢＭＣを分離し、そして２mMＬ−グルタミン、ペニシリン１００Ｕ／ml、ゲンタマイシン５μg/ml及び１０％熱不活性化されたウシ胎児血清（Sigma, St. Louis, MO）を補充されたＲＰＭＩ中に懸濁させた。製造者の指示に従って、鉄含有ビーズ（Dynabeads M-450, Dynal, Oslo, Norway）にコンジュゲートした抗ＣＤ４又は抗ＣＤ８ｍＡｂを使用してＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞を枯渇させた。これらの枯渇は９７〜９９％純度を有する細胞集団を一貫して生じさせた。抗ＭＨＣクラスＩＩブロッキング抗体（Ｌ２４３、Lenico Technologies）、抗ＭＨＣクラスＩブロッキング抗体（Ｗ６／３２、Leinco）及びアイソタイプコントロール抗体（mouse IgG2a, Leinco）を、抗原の添加の３０分後に５μg/mlで使用した。１０μg/mlのクロロキン（Sigma）を抗原のすぐ前に培養物に加えた。
【００９３】
単一細胞ＩＦＮ−γ放出についてのｅｘ  ｖｉｖｏ酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ。抗ＩＦＮ−γｍＡｂ１−Ｄ１Ｋ（MAIPS45, Nacka, Sweden）１５μg/mlで予備コーティングされた９６ウエルのＰＶＤＦ裏打ちされたプレート（MAIPS45, Millipore, Bedford, MA）を、Ｒ１０で２時間ブロックした。３×１０5ＰＢＭＣを１００μｌＲ１０／ウエル中に加えた。ＣｙａＡトキソイド及び組換えＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０の二重ウエル（duplicate wells）を図５に由来する最適濃度で使用した、１００Ｕ／mlのＰＰＤ（Rvans Medical, Liverpool, UK）及び５μg/mlのフィトヘマグルチニン（ICN Biomedicals, Aurora, OH）をポジティブコントロールウエルに加えた。ネガティブコントロールウエルには抗原を加えなかった。５％ＣＯ2中で３７℃での１４時間のインキュベーションの後に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した。１μg/mlのビオチニル化された抗ＩＦＮ−γｍＡｂ、７−Ｂ６−１−ビオチン（Mabtech）、５０μｌを２時間加えた。プレートを洗浄しそしてストレプトアビジン−アルカリホスファターゼトキソイド（Mabtech）を１：１０００希釈で加えた。１時間及び更なる洗浄の後に、脱イオン水で１：２５に希釈された発色原性アルカリホスファターゼ基質（Biorad, Hercules, CA, USA）５０μｌを加えた。１０分後に、プレートを洗浄し、乾燥させ、そしてスポット形成性細胞（ＳＦＣ）を拡大鏡で数えた。
【００９４】
組換え抗原及びＣｙａＡトキソイド構築。組換えネイティブＥＳＡＴ−６は、前記のようにして調製されそしてVeterinary Laboratories Agency, Weybridge, Surrey KT15, UKからの贈り物であった。組換えＣＦＰ−１０はＬｉｏｎｅｘから商業的に得られた（Brawnschweig, Germany）。Ｎ末端配列決定は、クローニングされた抗原の同一性を確証した。組換えＤＮＡ構築のため及びＣｙａＡに挿入された抗原の発現のためのこの研究全体にわたり、Escherichia coliXL1-Blue (Stratagene）を使用した。ｐＴ７ＣＡＣＴ１（Osicka, R., 2000）に由来する適切なプラスミドで形質転換されたバクテリアを、アンピシリン１５０μg/mlを補充されたＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地中で３７℃で成育させた。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨ３７Ｒｖ遺伝子ｅｓａｔ−６及びｃｆｐ−１０のオープンリーディングフレームを、下記のプライマー：
【００９５】
【表３】
2007514415.tif 000004
【００９６】
を使用してＲＤ１領域のｐＹＵＢ４１２コスミドクローン（Gordon, S.V., et al., 1999）からＰＣＲにより増幅させた。
【００９７】
ＰＣＲ産生物を、ＰＣＲプライマーに組み込まれた部位でＢｓｒＧＩにより消化し、そして抗原をコードする精製した断片を、ｐＴ７ＣＡＣＴ−３３６−ＢｓｒＧＩ発現ベクター（Osicka, et al., 2000）上のＣｙａＡのコドン３３５と３３６の間にインフレームで挿入した。クローニングされたインサートの正確な配列はＤＮＡ配列決定により立証された。
【００９８】
コントロール解毒モックＣｙａＡ並びに、それぞれ、ＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０表現を有する組換えＣｙａＡタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生させ、８Ｍ尿素、５０mMＴｒｉｓ−ＣｌｐＨ８．２、２mMＥＤＴＡ中で封入体から精製し、そして以前に記載の如くして特徴付けた（Sebo, et al., 1999）。得られるタンパク質は、いかなる検出可能なアデニル酸シクラーゼ酵素活性も含んでいなかった。
【００９９】
全血アッセイ及びインターフェロン−γＥＬＩＳＡ。静脈血液を集め（BD Na Heparin vacutainer, Cat368480）そしてサンプリングの４時間以内にプロセッシングした。全血をＲＰＭＩ（グルタミン及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充された）中で１：１０に希釈した。希釈した血液１８０μｌを、二重ウエル中で刺激性抗原で９６ウエルの丸底プレート中で平板培養した。抗原の最終濃度は、２５０nM（ｒＥＳＡＴ−６）、５０nM（ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６）、５００nM（ｒＣＦＰ−１０）、５０nM（ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０）、５０nM（モックＣｙａＡトキソイド）、５μg/ml（ＰＨＡ：ポジティブコントロール）及び２０μｌ/ｍ（ＲＰＭＩ：ネガティブコントロール）であった。刺激された全血をＣＯ2インキュベーター中で３７℃で培養した。二重ウエルからの上清を培養の６０〜７２時間後に回収し、そして直ちにＥＬＩＳＡによる後のＩＦＮ−γ測定のために凍結させた。刺激剤の最適濃度及び回収のタイミングを用量応答及び時間経過実験により予め決定した。ＥＬＩＳＡ反応を抗体製造者の指示に従って行った。簡単に言えば、９６ウエル平底プレートを精製されたマウス抗ヒトＩＦＮ−γ（BD Pharmigen 554548）により４℃で一晩コーティングした。ブロッキング及び洗浄後に、ウエルを、上清（二重に１：２希釈）及び標準（１５pg/ml〜１００００pg/mlの標準曲線希釈、二重の測定）で平板培養し、その後プレートを再び４℃で一晩インキュベーションした。洗浄した後に、ウエルをビオチニル化されたマウス抗ヒトＩＦＮ−γ（BD Pharmingen, 554550）と室温で１．５時間インキュベーションし、再び洗浄しそしてストレプトアビジン（Sigma Cat no A3151）と３０分間インキュベーションした。検出のための基質としてＯＰＤを使用しそしてカラー発色を停止させるための２ＮＨ2ＳＯ4を使用した。光学濃度をプレートリーダーで４９０nmで読み取り、そしてＩＦＮ−γ濃度を標準曲線から計算した。独立変数間のSpearman順位相関係数（Spearman rank correlation coefficients）を、ＳＰＳＳ−１０を使用して計算した。
【０１００】
実施例７
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的Ｔ細胞を再刺激するのに必要なＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ−１０の用量はＣｙａＡ送達により１０〜２０倍減少する
ＣｙａＡトキソイドとして組換え分子中に挿入された抗原の同等な用量（即ち、同じモル量のタンパク質）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０及びそれぞれのＣｙａＡトキソイドの最適刺激用量を決定した。次いでオーバナイトＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＩＦＮ−γＳＦＣの数を数えた。ＣｙａＡトキソイドによるこれらの実権は、抗原性刺激が挿入されていない同じ量のＣｙａＡトキソイド（モックトキソイド）を含有するウエルにおけるＩＦＮ−γＳＦＣの数を減じることによりコントロールされた。ＥＳＡＴ−６に対応する９人の健常なＴＳＴ＋ｖｅドナーにおいて、この分子の最適認識が５００nMの用量で観察された。抗原がＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６として提示される場合は、１０倍少ないＥＳＡＴ−６（５０nM）が必要であった（図５Ａ）。
【０１０１】
興味深いことに、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６の用量を５００nMに増加させると、ＣｙａＡベクターによる送達は、検出されたＩＦＮ−γＳＦＣの全体の増加をもたらすことができることが示された。しかしながら、ＣｙａＡトキソイドの用量の更なる増加は、ＣｙａＡトキソイドを可溶化するのに必要な溶液の高い尿素含有率によるものであるＳＦＣの減少と関連していた（データは示されていない）。ＣＦＰ−１０に対応する１０人の同様なドナーでは、ＣｙａＡ融合は、同様に用量応答曲線を左にシフトさせた。ＣｙａＡトキソイドとして表された約１０〜２０倍少ないＣＦＰ−１０がネイティブ抗原と同じ応答を引き起こした（図５Ｂ）。かくして、ＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ−１０の量の１０倍減少したＣｙａＡ融合体がＴ細胞を再刺激するのに必要であった。更に、特にＥＳＡＴ−６について、検出されたＩＦＮ−γＳＦＣの全体の数を増加させる潜在力があった。
【０１０２】
実施例８
低く応答する対象におけるＩＦＮ−γＳＦＣの検出はＣｙａＡ送達により高められる
図５に示された結果に基づいて、５００nMｒＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６では５０nM、及び２５０nMＣＦＰ−１０及び２５nMＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０を、同等な効力に基づいて、更なる実験のために選んだ。ＣｙａＡによる送達がＩＦＮ−γＳＦＣの数を増強させるかどうかを決定するために、より大きいグループの患者及び健常な感作された対象を研究した。患者と健常な感作された対象との間にいかなる刺激に対する応答の頻度又は大きさにも差はなく、それゆえ結果を分析のために組み合わせた。６８人のドナーのうち６３人はｒＥＳＡＴ−６に応答し（＞１０ＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣ）（平均ＩＦＮ−γＳＦＣ／百万ＰＢＭＣは１０７．７±１６．２であった）、そして６４人はＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６に応答し（１０７．５±１２．９）；５２人はｒＣＦＰ−１０に応答し（１０４．４±１４．３）そして６２人はＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０に応答した（９４．９±１１．３）。かくして、組換え体又はトキソイドによるＰＢＭＣの刺激の後のＩＦＮ−γＳＦＣの頻度間の全体の差は明白ではなかった。しかしながら、ＣＦＰ−１０に応答する対象の割合は７６．４から９１．１％に増加した。
【０１０３】
対象の応答が、組換え抗原に対するそれらの応答に従って、低い（＜５０ＩＦＮ−γＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣ）、中間（＞５０＜１００ＩＦＮ−γＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣ）又は高い応答者（＞１００ＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣ）に分析されたとき、低い応答者のグループにおける明らかな増強が見られた。かくして、検出されたＩＦＮ−γＳＦＣ／百万の平均数は、ＥＳＡＴ−６では２６．１±２．７から４８．２±７．３（ｎ＝２７、ｐ＝０．００９）に増加し、ＣＦＰ−１０の場合には１７．５±２．６から３６．８±４．３（ｎ＝３４、ｐ＝０．０００２）に増加した（図６）。興味深いことに、ｒＣＦＰ−１０に応答しなかった１０人のドナーのＰＢＭＣはＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０による刺激の後にＩＦＮ−γを産生した（平均ＩＦＮ−γＳＦＣ／百万３７．８±８．２）。これは、検出されたＣＦＰ−１０特異的ＩＦＮ−γＳＦＣの全体の数も、ＥＳＡＴ−６について最初に見られていたとおり（図５）増加させることができたことを示す。
【０１０４】
実施例９
ＣＤ４+及びＣＤ８+応答はＣｙａＡ送達により高めることができる
ＣｙａＡトキソイドを認識したＴ細胞サブセットを規定するために、ＰＢＭＣからのＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞を先に免疫磁性枯渇を行うことにより集団を濃縮した（enriched）。残りの細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてセットアップし、そしてＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ−１０及び同じ抗原を組み込む解毒したＣｙａＡで一晩刺激した。８人のドナーをＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６について試験し、５人のドナーをＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０について試験し、そして対応する組換え抗原について試験した。ＣＤ４+及びＣＤ８+応答の両方共組換え抗原に対して見られ、ＣＤ４+が優勢であった（図７）。組換え抗原に対する応答と比較すると、ＣｙａＡトキソイドに対する応答は、３つの例でＣＤ４に向けてシフトし、２つの例でＣＤ８に向けてシフトしていた（図７）。残りの８つの場合には正味の変化はなかった。
【０１０５】
実施例１０
ＩＦＮ−γＳＦＣの高められた検出は、ＭＨＣを経由する提示のためにプロセッシングされなければならないＣｙａＡへの抗原の共有結合会合（covalent associrtion）を必要とする
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質がＣｙａＡに共有結合で連結されなければかどうかを決定するために、ＥＳＡＴ−６をモックＣｙａＡトキソイドと混合することの効果を試験した。４人の対象からのＰＢＭＣをＥＳＡＴ−６（５００nM）、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６（５０nM）又はｒＥＳＡＴ−６（５００nM）とＣｙａＡ（５０nM）の混合物でセットアップした。これらの刺激剤についてのメディアンＩＦＮ−γＳＦＣ／百万は、それぞれ、１１３、１４７及び５８であり、これは増強が起こるためには、抗原と担体との共有結合連結が必要である（データは示されていない）ということを示している。事実、ｒＥＳＡＴ−６のＣｙａＡとの単純な混合物は、ｒＥＳＡＴ−６に対する応答を実際には減少させたかも知れないと思われる。
【０１０６】
次に、ＣｙａＡトキソイドを認識したＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩ又はクラスＩＩ拘束性であるかどうかを決定した。ＣＤ４又はＣＤ８を欠乏させた細胞をＥＬＩＳＰＯＴプレート上にセットアップし、そしてＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６（５人のドナー）又はＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０（４人のドナー）で刺激した。抗ＭＨＣクラスＩブロッキング抗体、抗ＭＨＣクラスＩＩブロッキング抗体、又はアイソタイプコントロール（すべて５μg/mlで）を選ばれたウエルに加えそしてプレートを一晩インキュベーションした。ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡＣＦＰ−１０に応答するＣＤ４枯渇した（ＣＤ８と解釈される）Ｔ細胞のＩＦＮ−γ応答はそれぞれ抗ＭＨＣクラスＩ抗体により４８％及び８３％阻害された（図８Ａ及びＣ）。ＣＤ８枯渇した（ＣＤ４と解釈される）Ｔ細胞応答は、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体により６２％及び８８％阻害された（図８Ｂ及びＤ）。アイソタイプコントロール抗体は認識に対する効果を持たなかった（データは示されていない）。更に、クロロキンは、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０トキソイドに対するＣＤ４応答をそれぞれ７７％及び８４％阻害した（図８Ｂ及びＤ）。これらのデータは、一緒になって、ＣｙａＡトキソイドとして送達されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原に対する応答は抗原プロセッシングを必要とすること、及び挿入されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ分子のＭＨＣ認識は古典的拘束性である（classically restricted）ことを示す。
【０１０７】
実施例１１
ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０に対する応答は、簡単な全血ＩＦＮ−γ産生アッセイにおいても高められる
全血培養物の上清中に分泌されたＩＦＮ−γの検出は、より少ない血液を必要とし、そしてｅｘ−ｖｉｖｏＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイよりも現場条件に潜在的により多く適用可能である。しかしながら、このような全血アッセイは、特異性を保持しているが、ＥＬＩＳＰＯＴ検出よりも感度が低いと思われる。ゆえに、ＥＳＡＴ−６又はＣＦＰ−１０を有するＣｙａＡトキソイドに対する高められた応答がこの欠陥を補償することができるかどうかを検査した。３３人の患者及び健常な感作された対象を、ＩＦＮ−γ産生について２つのリードアウトアッセイ（read-out assay）を使用して並行して試験した。すべての３３人のドナーはｒＥＳＡＴ−６に応答し、そして３１人のドナーは、ｒＣＦＰ−１０に応答した。ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６及びＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０に対するＥＬＩＳＰＯＴ及び全血ＩＦＮ−γ応答は正の相関があった（ｒ＝それぞれ、０．５８及び０．６４、両場合にｐ＜０．００１、図９Ａ）。ドナーは、全血アッセイにおいて、遊離抗原に対するそれらの応答に従って、低い（＜２５０pg/mlＩＦＮ−γ）、中間（２５０〜１０００pg/mlＩＦＮ−γ）又は高い応答者（＞１０００pg/mlＩＦＮ−γ）に層別化される。結果は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより見出されたとおり抗原認識に対するＣｙａＡ送達の同様な効果を示した。かくして、低く応答する対象では、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０の存在下に産生されるＩＦＮ−γの量は、遊離ｒＣＦＰ−１０の存在下におけるよりは平均して２７．７±９．５倍高かった（ｐ＝０．０２１、図９Ｂ）。ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６に対する応答は同じ一般的傾向を示したが（平均５．６±３．２倍）、この効果は統計的有意には達しなかった。
【０１０８】
実施例１２
マイコバクテリアでプライミングされたＴ細胞のｒ−ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６による特異的及び有効なｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのＲＤ１染色体領域を安定に補充された、１×１０6又は１×１０7ＣＦＵのＢＣＧ株（ＢＣＧ：：ＲＤ１と呼ばれる）（Ｐｙｍ，２００２；Ｐｙｍ，２００３）で感染させた（皮下又は静脈内）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞は、ＥＳＡＴ−６：１〜２０ペプチド又はｒＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６構築物によりｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激すると十分なレベルのＩＦＮ−γを産生した（図１０）。産生されたこれらのＩＦＮ−γレベルはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの精製されたタンパク質誘導体（ＰＰＤ）による刺激後に産生されたＩＦＮ−γレベルに匹敵していたことは注目する価値がある。このＴ細胞応答の特異性は、（ｉ）無関係のＭａｌ−Ｅ：４０〜５４ペプチド又はｒ−ＣｙａＡ−ＯＶＡ：２５７〜２６４ネガティブコントロールによるこれらの細胞の刺激はＩＦＮ−γの放出を誘発しなかった及び（ｉｉ）コントロールＢＣＧで感染したマウスの脾臓細胞（ＢＣＧ：：ｐＹＵＢ４１２）はＥＳＡＴ−６：１〜２０又はｒ−ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後に検出可能なＩＦＮ−γを産生しなかったという観察により確立された（図１０）。
【０１０９】
マウス、感染、免役感作。雌の、特異的病原体を含まないＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）又はＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウス（Iffa Credo, L’Arbresle,France）を６〜１２週齢で使用した。マウスを１×１０6又は１×１０7ＣＦＵ／マウスのＢＣＧ：：ＲＤ１で感染させ、そしてPasteur Instituteの動物施設におけるＡＢＬ−３バイオハザード条件においてアイソレーターにおいて維持した。Ｔ細胞応答を感染の３〜４週間後に調べた。ｒ−ＣｙａＡによるマウス免疫感作は、ＰＢＳ中の適切なｒ−ＣｙａＡ１０又は５０μgによる１回又は２回静脈内注射により行われた。Ｔ細胞応答を免疫感作の１０〜１２週間後に調べた。
【０１１０】
Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生アッセイ。脾臓細胞又はリンパ節細胞の単一細胞懸濁液を、種々の濃度の合成ペプチド（Neosystems, Strasbourg, France）又は１〜１０μg/mlのｒ−ＣｙａＡの存在下に、２mMＬ−グルタミン、１００ＩＵペニシリン／ml及び１００μgストレプトマイシン／mlを補充された合成ＨＬ−１培地（BioWhittaker, Walkersville, MD）中で９６ウエル平底プレート上にプレートした（１×１０6細胞／ウエル）。リンパ増殖アッセイ（lymphoproliferation assays）のために、培養物を１μＣｉ［メチル−3Ｈ］−チミジン（ICN,Orsay, France）で１６時間パルスしそして細胞をｃｐｍ計数のために回収した。
【０１１１】
サイトカインアッセイのために、培養上清を、ＩＬ検出のため４８時間に集めそして他のサイトカインのために７２時間に集めた。標準ＣＴＬＬ−２バイオアッセイを使用してＩＬ−２を定量した。捕捉モノクローナル抗体として、それぞれ、ＢＶＤ４−１Ｄ１１、ＴＲＦＫ５及びＲ４−６Ａ２並びにビオチン−コンジュゲーテッドＢＶＤ６−２４Ｇ２、ＴＲＦＫ４及びＸＭＧ１．２モノクローナル抗体（BD Pharmingen,san Diego,CA）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＦＮ−γを定量した。組換えマウスサイトカイン（BD PharMingen）により標準曲線を得た。
【０１１２】
実施例１３
本発明の使用の範囲を証明するための物質及び方法
マウス。Iffa CREDO (L'Arbresle, France）からの雌のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２b）マウスを６〜１０週齢で使用した。Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドへの雌のＴＡＰ１ノックアウトマウス（Van kaer, L., et al., 1992）はA.Bandeira(Institut Pasteur, paris, France）からの寄贈品でありそして我々の動物施設において繁殖させた。
【０１１３】
ペプチド及びタンパク質。それぞれ、オボアルブミン残基２５７〜２６４（Bevan,M.J., 1976）を包含するＣＤ８+Ｔ細胞エピトープ及びＥ．ｃｏｌｉＭａｌＥタンパク質残基１００〜１１４（ＲＥＦ）に相当するＣＤ４+Ｔ細胞エピトープに相当する、合成ペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ及びＮＧＫＬＩＡＹＰＩＡＶＥＡＬＳをＮｅｏｓｙｓｔｅｍ（Strabourg, France）から購入した。ＭａｌＥタンパク質は、親切にも、J.M.Clement（Institut Pasteur）により提供され、そしてオボアルブミンはSigma（Saint-Quentin Fallavier, France）から購入した。両者を１mg/mlでＰＢＳ中に溶解した。
【０１１４】
挿入されたＣＤ４+ＭａｌＥ及びＣＤ８+ＯＶＡエピトープを有する組換えＣｙａＡ毒素の構築、産生及び精製
ＭａｌＥ及びＯＶＡエピトープを同時に有するＣｙａＡタンパク質をコードするハイブリッドＣｙａＡ対立遺伝子を構築するために、ｐＴ７ＣＡＣＴ１由来のプラスミドの組にコードされそしてそれぞれＣＤ４+ＭａｌＥエピトープ（Loucka,J., et al）又はＣＤ８+ＯＶＡエピトープ（Osicka, R.,et al., 2000）をコードするオリゴヌクレオチドインサートを有するＣｙａＡ対立遺伝子の組換えのために、ＣｙａＡ対立遺伝子に沿った適切な独特の制限部位を使用した。ＣｙａＡ遺伝子における両オリゴヌクレオチドの挿入及び配向（orientation）は、プラスミドの制限分析により立証され、対応する発現されたＣｙａＡタンパク質の長さは、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより立証された。この研究で使用された組換えＣｙａＡは、アミノ酸１０８と１０９の間にＮＧＫＬＩＡＹＰＩＡＶＥＡＬＳ配列を有し（ＣｙａＡ−ＭａｌＥ）、アミノ酸３３６と３３７の間にＳＩＩＮＦＥＫＬ配列を有し（ＣｙａＡ−ＯＶＡ）を、又はそれらのそれぞれの挿入部位に両配列を有する（ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ）。すべての構築物を残基１８８と１８９の間にジペプチド配列の挿入により遺伝子的に解毒された。
【０１１５】
Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ−１Ｂｌｕｅ株（Stratagene）を、ｐＴ７ＣＡＣＴ１に由来しそしてＡＣＴ（Osicka,R., et al.,2000）翻訳後のアシル化のために必要なアクセサリー遺伝子ｃｙａＣを含有する構築されたプラスミドにより形質転換した。細胞を先に記載されたようにして成育させ（Osicka,R., et al.,2000）、そして組換えタンパク質の発現を、１mMＩＰＴＧの添加により誘発した。ＣｙａＡタンパク質を８Ｍ尿素で抽出し（Sebo, P., et al., 1991）、そしてＤＥＡＥ−セファロース及びフェニルセファロースクロマトグラフィーにより精製した（Karimova,G., et al., 1998）。精製された毒素の均一性は、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより証明された。精製された組換えＣｙａＡタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法により決定された。
【０１１６】
ＣｙａＡＥ５、インサートなしの遺伝子的に解毒されたＣｙａＡは、親切にもD.Ladant（Institut Pasteur）により提供され、そしてネガティブコントロールとして使用された。
【０１１７】
培養培地。完全培地は、１０％ウシ胎児血清（Valbiotech, Paris, France）、２−ＭＥ５×１０-5Ｍ及び抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ml、ストレプトマイシン１００μg/ml）を補充されたＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含有するＲＰＭＩ１６４０からなっていた。
【０１１８】
細胞系。Ｅ．ｃｏｌｉからのＭａｌＥタンパク質の１００〜１１４配列に特異的な、Ｈ−２b拘束性ハイブリドーマＣＲＭＣ３を、先に記載されたとおりに（Lo-Man, et al., 2000）我々の実験室で発生させ、そしてＣＭ地に維持した。Ｂ３Ｚ（karttunen, J.., et al., 1992）、Ｋb拘束性ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドに特異的なＣＤ８+Ｔ細胞ハイブリドーマは、N.Shastri（University of California, Berkeley, CA）からの寛大な贈与物であり、そしてＣＭにＧ４１８、１mg/ml及びヒグロマイシンＢ４００μg/mlを加えることにより維持された。ＥＬ−４５ｔｈｙｍｏｍａは、American Type Culture Collection（Manassas, Va）から得られそしてＣＭ中に維持された。
【０１１９】
ＢＭＤＣ発生。ＢＭＤＣｓを先に記載されたとおりに（Inaba, K., et al., 1992）骨髄前駆体から発生させた。簡単に言えば、Ｃ５７ＢＬ／６又はＴＡＰ１ノックアウトマウスからの骨髄細胞を、回収し、洗浄しそして、ＧＭＣＳＦ含有上清１％を有するＣＭ中で２．１０5細胞／mlで平板培養した。７％ＣＯ2、３７℃で３日間の培養後に、培地をブレートに加えた。非接着性及び半接着性細胞を、ＰＢＳ  ＥＤＴＡ（５mM）でプレートをフラッシュすることにより７日目又は８日目に回収し、そして使用前に洗浄した。回収された細胞は、通常、すべてＣＤ１１ｂを発現したＣＤ１１ｃポジティブ細胞６０〜７０％を含有していた。これらのＢＭＤＣｓはＣＤ４０lo及びＣＤ８６loであった。
【０１２０】
抗原提示アッセイ。ＣＲＭＣ３又はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ（１０5細胞／ウエル）の刺激を、９６ウエル培養プレートにおいてＢＭＤＣｓ（１０5細胞／ウエル）の存在下に１８時間細胞培養物の上清中のＩＬ−２放出をモニタリングした。大抵の実験において、ＢＭＤＣｓは種々の濃度のタンパク質又はペプチドで４〜５時間パルスされ（pulsed）（図の説明参照）、そして洗浄した後にＣＭ０．２ml中の１０5Ｔ細胞ハイブリドーマを加えた。薬物阻害アッセイでは、ＢＭＤＣｓを、バルスされた後に０．０５％グルタルアルデヒド（Sigma）で固定し、洗浄し、次いでハイブリドーマを加えた。１８時間後に、培養上清を−８０℃で少なくとも２時間凍結させた。次いで、ＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ細胞系１０4細胞／ウエルをこれらの上清１００μｌで培養した。４８時間後に、［3-Ｈ］チミジン（５０μCi/ml，ICN, Orsay, France）をウエルに加えそして細胞を自動化細胞回収器（automated cell harvester）（Skatron, lier, Norway）で６時間後に回収した。組み込まれたチミジンをシンチレーション計数により検出した。すべての実験で、各点は二重に（in duplicate）行われた。
【０１２１】
阻害剤及び抗体。シクロヘキシミド（ＣＨＸ、５μg/mlで使用した）、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、５μg/ml）、サイトカラシンＢ（ＣＣＢ、５μg/ml）、ロイペプチン（５０μg/ml）、ペプスタチン（５０μg/ml）、クロロキン（５０及び１５０μM）、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−ノルロイシナル（ＬＬｎＬ、１２μg/ml）及びＮ−アセチル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−メチオニナール（ＬＬｍＬ、１２μg/ml）は、すべてSigma−Ａｌｄｒｉｃｈ（Saint-Louis, MO）からのものであり、そして製造者の助言に従って適切な溶媒中に溶解した。ラクタシスチン（Biomol, research Labs., Inc., Plymouth Meeting PA）を１mg/mlで水に溶解しそして１０μＭ最終で使用した。マウスＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０、ｒａｔＩｇＧ２ｂ、Ｋ）に対して特異的な精製したｍＡｂｓ及び対応するアイソタイプコントロールは、Pharmingen（Le Pont de Claix, France）から購入しそして１０μg/mlで使用した。
【０１２２】
阻害の研究。阻害の研究のために、ＢＭＤＣｓを、最初に、７％ＣＯ2、３７℃でＣＭ０．１ml中で１時間薬物又は抗体とインキュベーションした。次いでＡｇｓを阻害剤の連続的存在下に、図の説明に示された最終濃度でＣＭ０．１ml中に加えた。抗ＣＤ１１ｂ又はアイソタイプコントロール抗体を使用するアッセイにおいて、差細胞をＡｇｓ及び抗体の両方との５時間のインキュベーションの後に３回洗浄し、そして１０5Ｔ細胞ハイブリドーマを加えた。薬物を使用するアッセイでは、細胞を５時間のインキュベーションの後に洗浄し、そして３７℃で２分間グルタルアルデヒド００５％（Sigma）及びリシン０．２Ｍ（Sigma）を使用して固定した。３回洗浄した後、Ｔ細胞ハイブリドーマを０．２mlＣＭ中にウエルに加えた。
【０１２３】
低張性ショック（hypotonic shock）の後のＫ+欠乏によるクラスリン媒介エンドサイトーシスの阻害のために、ＤＣ（１０5／ウエル）を、５．１０-5Ｍ２−ＭＥ、１００Ｕ／mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンを補充された血清を含まない合成ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Life Technologies）中で３０分間インキュベーションした。次いで、ＤＣｓを、低張性培地（ＯｐｔｉＭＥＭ培地及び超純粋Ｈ2Ｏ、５０／５０）中で５分間、そして最後に、Ｋ+不含有（１４０mMＮａＣｌ、２０mMＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１mMＣａＣｌ2、１mMＭｇＣｌ2、１mg/mlグルコース及び０．５％ＢＳＡ）又はＫ+含有（１０mMＫＣｌ、１３０mMＮａＣｌ、２０mMＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、１mMＣａＣｌ2、１mMＭｇＣｌ2、及び０．５％ＢＳＡ）において３０分間インキュベーションした。Ａｇｓを図の説明に指示された濃度でウエルに加え、１時間後に、ＤＣｓをＰＢＳ中で洗浄し、そしてＣＭを４時間加えてＡｇプロセッシングを可能とした。ＤＣｓを洗浄し、先に記載されたようにして固定し、そしてＴ細胞ハイブリドーマを１８時間ウエルに加えた。
【０１２４】
マウス免疫感作。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＰＢＳ０．１ml中に希釈されたＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＣｙａＡＥ５、５０μgを静脈内注射した。
【０１２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害性アッセイ
免疫感作されたマウスからの脾臓細胞を、ＣｙａＡ注射の７日後に単離し、そして同系の照射されたナイーブ脾臓細胞の存在下に、ＯＶＡ257-264ペプチド（１μg/ml）により５日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激した。細胞傷害性活性を、先に記載されたように（Fayolle, C., et al., 1996）５時間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ［51Ｃｒ］−放出アッセイにおいて決定した。簡単に言えば、ＯＶＡ257-264ペプチド５０μＭをロードされたＥＬ４（Ｈ−２b）腫瘍細胞をＨ−２bエフェクター細胞のための標的細胞として使用した。種々のエフェクター対標的比を使用しそしてすべてのアッセイを二重に行った。各アッセイにおいて、ペプチドの不存在下にインキュベーションされたＥＬ−４細胞を、非特異的溶解のためのコントロールとして使用した。各ウエルにおける［51Ｃｒ］−放出を、マイクロベータートリラックス液体シンチレーションカウンター（MicroBeta Trilux liquid scintillation Counter）（Wallac, Turku, Finland）を使用して計数した。特異的溶解の百分率は、１００×（実験での放出−自然に起こる放出）／（最大放出−自然に起こる放出）として計算された。最大放出は、標的細胞に１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−４０５を加えることにより得られ、そして自然に起こる放出はＣＭ中でインキュベーションされた標的細胞により決定された。
【０１２６】
サイトカインＥＬＩＳＡアッセイ。免疫感作されたマウスからの脾臓細胞を、ＭａｌＥ100-114又はＯＶＡ257-264ペプチド１μg/mlの存在下又は不存在下にｉｎ  ｖｉｔｒｏで再刺激し、そして培養上清を７２時間後に回収した。次いで、ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＦＮ−δ濃度を、標準サンドイッチＥＬＩＳＡによりこれらの上清において測定した。マキシソーププレート（Maxisorp plates）（Nunc, Roskilde, Demark）を、コンジュゲート化されていない（unconjugated）抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、又は抗ＩＦＮ−δ捕捉抗体（それぞれ、ＢＶＤ４−１Ｄ１１、ＴＲＦＫ５、Ｒ４−６Ａ２クローン、Pharmingen）でコーティングし、そして対応するビオチニル化ｍＡｂ（ＢＶＤ６−２４Ｇ２、ＴＲＦＫ４、ＸＭＧ１．２クローン、Pharmingen）を使用して検出を行った。プレートをストレプトアビジン−ＨＲＰ（Pharmingen）及び基質としてｏ−フェニレンジアミン（Sigma-Aldrich）を使用して展開した。すべての投与量を二重に行った。アッセイを組換えマウスサイトカイン（Pharmingen）で標準化し、そして結果をpg/mlで表す。
【０１２７】
実施例１４
ＣｙａＡ−ＭａｌＥは、ＭＨＣクラスＩＩ提示経路へのＣＤ４+Ｔ細胞エピトープ送達においてＭａｌＥタンパク質より有効である
レポーターとしてＭａｌＥＣＤ４+Ｔ細胞エピトープを使用して、組換えＣｙａＡ−ＭａｌＥは、脾臓細胞のＭＨＣクラスＩＩ提示経路にＮＧＫＬＩＡＹＰＩＡＶＥＡＬＳ  ＭａｌＥ100-114ペプチドを送達することが以前に示された（Loucka, J., et al., 2000）。ＭａｌＥタンパク質に比べてこの送達の有効性を次に評価した。ＣＤ１１ｂポジティブである（データは示されていない）ＢＭＤＣｓを使用して、位置１０８にＭａｌＥ  ＮＧＫＬＩＡＹＰＩＡＶＥＡＬＳ  ＣＤ４+Ｔ細胞エピトープを有するＣｙａＡの提示をＭａｌＥタンパク質と比較した。ＡＰＣｓを各タンパク質の段階希釈物とインキュベーションし、そしてそれらの表面におけるＩ−Ａb−ＮＧＫＬＩＡＹＰＩＡＶＥＡＬＳ複合体の出現を、ＣＲＭＣ３、このＭＨＣ−ペプチド複合体に対して特異的なＣＤ４+Ｔ細胞ハイブリドーマ、によりモニタリングした（Lo-Man, R., et al., 2000）。予想されるとおり（図１１Ａ）、ＣｙａＡ−ＭａｌＥとインキュベーションされたＢＭＤＣｓは、ＣＲＭＣ３によるＩＬ−２分泌を有効に刺激した。更に、ＣｙａＡ−ＭａｌＥと同じレベルのＴ細胞ハイブリドーマ刺激に達するためには、１００倍高い濃度のＭａｌＥタンパク質が必要であった。脾臓細胞で先に示されたとおり（Loucka, J., et al.,2002）、ＣｙａＡ−ＭａｌＥとインキュベーションされたＢＭＤＣｓはまた、ＣＲＭＣ３を刺激することにおいて、遊離ＭａｌＥ100-114ペプチドをロードされたＢＭＤＣｓよりも１０倍有効でもあった。
【０１２８】
この増強は、ＣｙａＡ又はＣｙａＡ組成物中のある成分の非特異的刺激効果によるものであることを排除するために、ＢＭＤＣｓを、一定濃度のＣｙａＡＥ５又はＣｙａＡ−ＯＶＡ及び種々の濃度のＭａｌＥ100-114ペプチド又はＭａｌＥタンパク質とインキュベーションした。次いでＣＲＭＣ３へのＩ−Ａb−ＮＧＫＬＩＡＹＰＩＡＶＥＡＬＳ複合体提示の有効性をモニタリングした。図１Ｂに示されたとおり、ＭａｌＥ１００−１１４ペプチド又はＭａｌＥタンパク質提示の増強は、ＣｙａＡＥ５又はＣｙａＡ−ＯＶＡの存在下では観察されなかった。これらの結果は、ＣｙａＡにより送達されたＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩＩ拘束された提示の増強は、ＣｙａＡ又は汚染物によるＢＭＤＣ活性化よるものではないことを確証する。
【０１２９】
実施例１５
ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡは、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ提示のためのモデルＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞エピトープを同時に送達する
先のレポートにおいて、３つの異なるＣＤ８+Ｔ細胞エピトープを有するＣｙａＡは、これらのエピトープに対してｉｎ  ｖｉｖｏ保護ＣＴＬ応答を同時に誘発することが示された（Fayolle, C., et al., 2001）。ゆえに、ＣｙａＡは、ＢＭＤＣｓにＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの両方を送達して、特異的Ｔ細胞ハイブリドーマにＡｇ提示することができるかどうかを決定した。ゆえに、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ、即ち、ＭａｌＥ（クラスＩＩ拘束性）及びＯＶＡ（クラスＩ拘束性）エピトープの両方を有する組換えＣｙａＡを、提示アッセイにおいてＣｙａＡ−ＭａｌＥ及びＣｙａＡ−ＯＶＡと比較した。この比較を可能とするために、ＭａｌＥＣＤ４+Ｔ細胞エピトープを、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ及びＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡのアミノ酸１０８と１０９の間に挿入した。ＯＶＡＣＤ８+Ｔ細胞エピトープを、ＣｙａＡ−ＯＶＡ及びＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡのアミノ酸３３６と３３７の間に挿入した。ＢＭＤＣｓ上のＫb−ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の存在を検出するために、Ｂ３Ｚ、ＯＶＡ257-267ペプチドに対して特異的なＣＤ８+Ｔ細胞ハイブリドーマ（Karttunen., J., et al., 2002）を使用した。図１１Ａ及び１１Ｃに示されたとおり、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡとインキュベーションされたＢＭＤＣｓは、ＣＲＭＣ３及びＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマの両方を刺激した。更に、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡは、ＭＨＣクラスＩＩ提示経路へのＭａｌＥ100-114ペプチド送達においてＣｙａＡ−ＭａｌＥと同じく有効であった。ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＣｙａＡ−ＯＶＡのＢＭＤＣｓとのインキュベーションの後の、Ｂ３Ｚへの同等なＫb−ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体提示も観察された。これらの結果は、ＣｙａＡは、そのＡＣドメインに挿入されたエピトープをＭＨＣＩ及びＩＩ分子に同時に送達すること、及び１つのエピトープの送達の有効性がＣｙａＡのＡＣドメインへの他のエピトープの挿入により影響されないことを確証する。特に、ＭＨＣクラスＩＩ提示の増強は、ＯＶＡ及びＭａｌＥエピトープの両方を有するＣｙａＡで依然として観察された。
【０１３０】
実施例１６
ＣｙａＡとＢＭＤＣｓ上のＣＤ１１ｂとの相互作用は、レポーターＣＤ４+Ｔ細胞エピトープの送達の増強のために必要である
ＣｙａＡ送達におけるＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示の増強は、このタンパク質と、ＢＭＤＣｓ上に発現されているそのＣＤ１１ｂ受容体（Guermonprez, P., et al., 2001）との特異的相互作用により説明することができる。この仮説を検定するために、ＢＭＤＣｓを最初に１０μg/ml抗ＣＤ１１ｂｍＡｂｓ又は同じ濃度のアイソタイプコントロールｍＡｂｓとインキュベーションした。図２Ａに示されたとおり、ＡＰＣｓと抗ＣＤ１１ｂｍＡｂｓとの予備インキュベーションは、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達の後のＣＲＭＣ３へのＭａｌＥ100-114ペプチドの提示を完全に且つ特異的に妨害した。予想されるとおり、ＢＭＤＣｓとｍＡｂｓとの予備インキュベーションは、ハイブリドーマへのＭａｌＥタンパク質の提示に影響を与えなかった。抗ＣＤ１１ｂとのＢＭＤＣｓインキュベーションは、Ｂ３Ｚへの遊離ＯＶＡ257-264ペプチド提示に影響を与えることなく、ＣｙａＡ−ＯＶＡ−ＭａｌＥからのＫb−ＳＩＩＮＦＥＫＬ複合体の発生を阻止することも確証された（図１２Ｂ）。これらの結果は、ＣｙａＡがＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ経路の両方に送達される高い有効性がＣｙａＡ−ＣＤ１１ｂ特異的相互作用に依存していることを示す。
【０１３１】
実施例１７
ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによるＭＨＣクラスＩＩ提示経路へのＭａｌＥペプチド送達は、プロテアソーム活性もＴＡＰトランスポーターも必要としない
先の研究は、ＣＤ１１ｂとのＣｙａＡの相互作用は、標的細胞の細胞質ゾルへの直接のＡＣドメイントランスロケーションをもたらすことを証明した。このドメインをその後にプロセッシングしてＭＨＣクラスＩ拘束性提示のためのペプチドを発生させることは、プロテアソームを必要としそしてＴＡＰトランスポーターに依存する（Guermonprez, P., et al., 1999）。ある内因性Ａｇｓは、プロテアソーム及びカルパインを必要とする別の経路によるＭＨＣクラスＩＩ提示のために細胞質ゾルにおいてプロセッシングされることが報告された（lich., J.D., et al., 2000）。次いで、細胞質ゾル中に放出されたペプチドは、あまり理解されていない機構に沿ってエンドサイトーシス区画に輸送される。ゆえに、ＣＲＭＣ３へのＭＨＣクラスＩＩ拘束性ＭａｌＥ100-114ペプチド提示のためのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡのプロテアソーム要求を試験した。ＢＭＤＣｓを、ラクタシスチン、２０Ｓプロテアソーム阻害剤（fenteany, G.,et al., 1995; Craiu, A., et al., 1997）と１時間インキュベーションし、次いでＡｇｓを加えた。
【０１３２】
図１３Ａに示されたとおり、プロテアソーム活性の阻害は、Ｉ−Ａb−ＭａｌＥ100-114複合体形成及びＣＲＭＣ３への提示を妨げなかった。予測されるとおり、遊離ペプチド及びＭａｌＥタンパク質は、ラクタシスチンで処理されたＢＭＤＣｓにより依然として提示された。対照的に、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達によるＯＶＡ257-264ペプチド提示は、ラクタシスチンにより完全に妨げられた（図１３Ｂ）。
【０１３３】
次いで、ＢＭＤＣｓによるＣＲＭＣ３へのＭａｌＥ100-114ペプチド提示に対するＬＬｎＬ（カテプシン及びプロテアソーム阻害剤）及びＬＬｍＬ（カテプシン阻害剤）に対する効果を比較した。図１３に示されたとおり、両阻害剤は、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達によるＭａｌＥ100-114ペプチド提示を阻止した。これは、このプロセッシング経路におけるカテプシンＬ又はＢに対する要求を証明した。コントロールとして、ＬＬｎＬはＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達の後にＢ３ＺへのＯＶＡペプチド提示を阻止したが、ＬＬｍＬは阻止しなかった。かくして、ＢＭＤＣへのそのエントリー後に、ＣｙａＡＡＣドメインは、プロテアソーム活性を必要としないが、エンドサイトーシス経路の２つのシステインプロテアーゼであるカテプシンＬ又はＢに依存する機構により、プロセッシングされてＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示のためのペプチドを発生する。
【０１３４】
ＡＣドメインからのクラスＩ及びＩＩエピトープのプロセッシングが、ＡＰＣｓへのＡＣドメイン送達後に異なる経路をたどることを更に確証するために、ＭＨＣクラスＩＩ分子によるＣｙａＡ提示のためのＴＡＰ要求を試験した。ＢＭＤＣｓをＴＡＰ１ノックアウトマウスから発生させそしてＣＲＭＣ３への提示アッセイに使用した。図１３Ｃに示されたとおり、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡは、ＷＴ及びＴＡＰ１ノックアウトＢＭＤＣｓのＭＨＣクラスＩＩ提示経路にＭａｌＥ100-114ペプチドを有効に送達した（Van kaer, L., et al）。予測されるとおり、ＭＨＣクラスＩＩ分子へのＭａｌＥ100-114ペプチド送達もまた、ＭａｌＥタンパク質又はＭａｌＥ100-114ペプチドがＡｇｓとして使用されるとき、ＴＡＰトランスポーターに依存しなかった。先に公表されたとおり（Guermonprez,P., et al）、ＢＭＤＣｓＭＨＣクラスＩ提示経路へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達は、ＡＰＣｓにおいてＴＡＰ１トランスポーターの存在を必要とすることが示された（図１３Ｄ）。これらの結果は、ＣｙａＡＡＣドメインからのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩペプチドの発生は、２つの異なる経路をたどることを更に確証する。更に、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達に対するＭａｌＥ100-114ペプチド提示のためのカテプシン活性の要求は、プロセッシングのエンドサイトーシス経路がＣｙａＡ分解及びＭＨＣクラスＩＩ提示経路へのエントリーの責任を有するかも知れないことを示唆する。
【０１３５】
実施例１８
ＭＨＣＩＩ提示のためのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡプロセッシングは、エンドソームプロテアーゼ及び液胞酸性化を必要とする
外因性可溶性Ａｇのインターナリゼーション後に、ＭＨＣクラスＩＩ提示のためのペプチドリガンドは、逐次に活性化されるプロテアーゼの組によるタンパク質のタンパク質分解によりエンドソーム及びリソソームにおいて発生される（Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ，  Ｊ．  ２００１）。ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達後にＭａｌＥ100-114ペプチド提示を発生させるのにカテプシン活性が必要であるので、他のエンドサイトーシスプロテアーゼがＩ−Ａb−ＭａｌＥ100-114複合体形成のために必要であるかどうかを試験した。ロイペプチン（Umezawa, H. 1976）、セリン及びシステインプロテアーゼの阻害剤は、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡがＡｇとして使用されるとき、ＣＲＭＣ３へのＭａｌＥ100-114ペプチド提示を完全にブロックしたが、遊離ペプチドの提示に影響を与えなかった（図１４Ａ）。セリンプロテアーゼはＭａｌＥエピトープのＮ−末端を発生させるのに実際に必要でありうることが言及されるべきである。ペプスタチン（Umezawa, H. 1976; Mizuochi, T., et al., 1994）、アスパラギン酸プロテアーゼの阻害剤、も、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達後のＭａｌＥ100-114ペプチド提示を部分的に阻害した。遊離ＭａｌＥ100-114ペプチド提示は、薬物の存在下に影響を受けないままであった。これらの結果は、エンドサイトーシスプロテアーゼがＭＨＣクラスＩＩペプチド発生のためのＡＣドメイン分解に関与していることを示す。ゆえに、これらの結果は、ＣｙａＡＡＣドメインが古典的エンドサイトーシス経路に達してプロテアーゼによりプロセッシングされることを示す。
【０１３６】
液胞酸性化は、エンドサイトーシスプロテアーゼの逐次的活性化を制御する重要なファクターである。ゆえに、クロロキン、エンドサイトーシス小胞酸性化の阻害剤、を使用して、ＣｙａＡ送達によるＭａｌＥ100-114ペプチド提示がエンドサイトーシスプロセッシング後に起こることを確証した。図１４Ａに示されたとおり、クロロキンは、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ及びＭａｌＥタンパク質送達後のＭａｌＥ100-114ペプチドの提示を強く減少させるが、これに対して遊離ペプチド提示は影響を受けないままである。しかしながら、ＯＶＡ257-264ペプチド提示は、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡがＡｇとして使用されるとき、液胞酸性化に依存しないことが確証される（Guermonprez, P., et al., 2000a, b）。これらの結果は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドを発生させるためのＢＭＤＣｓへのＡＣドメインプロセッシングは、液胞酸性化及びエンドサイトーシスプロテアーゼに依存していることを証明する。それらはまた、ＣｙａＡＡＣドメインが、ＢＭＤＣｓ細胞質ゾルに同時にトランスロケーションされることができて、プロテアソームにより更にプロセッシングされ、そして、小胞に捕捉されることができ、小胞はプロセッシングのエンドサイトーシス経路たどることも示唆する。あるいは、ＣＤ１１ｂに結合した後に、ＣｙａＡはエンドサイトーシスされ、次いで細胞質ゾルにトランスロケーションされることが可能である。
【０１３７】
実施例１９
ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによるＭａｌＥエピトープ送達は、ブレフェルジンＡによるゴルジ障害及びシクロヘキシミドによるタンパク質合成阻害に対して感受性である
ＡＰＣ表面におけるＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体の提示は、外因性Ａｇの分解を必要とし、しかも発生したペプチドのＭＨＣクラスＩＩ分子との会合も必要とする（Gordon, S.V., et al., 1999）。古典的エンドサイトーシス経路では、新たに合成されたＭＨＣクラスＩＩ分子が必要である。これらの分子は、ゴルジをとおってＥＲを去りそしてトランスゴルジ網（ＴＧＮ）に達し、それによりそれらはエンドサイトーシス経路に向けて送られる。
【０１３８】
ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達後のＩ−Ａb−ＭａｌＥ100-114ペプチド複合体発生が新生ＭＨＣクラスＩＩ分子を必要とするかどうかを決定するために、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）、タンパク質合成の阻害剤、を使用した。図１５Ａに示されたとおり、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＭａｌＥタンパク質の添加前にＣＨＸと予備インキュベーションされたＢＭＤＣｓは、ＣＲＭＣ３によるＩＬ−２分泌を刺激しなかった。予測されるとおり、ＣＨＸは、Ｔ細胞ハイブリドーマへの遊離ペプチドの提示を阻害しなかった。更に、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達に続くＢ３ＺへのＯＶＡ257-264ペプチド提示もまたＣＨＸにより完全に妨害された（図１５Ｂ）。かくして、新規に合成されたタンパク質が、ＣｙａＡＡＣドメインに挿入されたＭａｌＥレポーターＴ細胞エピトープのＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示のために必要である。
【０１３９】
ＭａｌＥ100-114ペプチドを提示するＭＨＣクラスＩＩ分子がゴルジに向けてエンドソームより先に及び後で達するかどうかを決定するために、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）、ゴルジ輸送の阻害剤（Doms, R.W., et al., 1989; Pelham, H.R. 1991）を使用した。ここでも、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＭａｌＥタンパク質によるＢＭＤＣｓへのその送達後のＭａｌＥ100-114ペプチドの提示は、ＡＰＣｓがＢＦＡで処理されたとき完全に妨害された（図１５Ａ）。遊離ペプチドの提示は影響を受けなかった。これらの実験から、ＭＨＣクラスＩＩ分子の新規合成は、ＢＭＤＣｓがＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡにより送達されたＭａｌＥエピトープを提示するために必要であること及びゴルジを通ってＴＧＮに向けてのトラフィッキングは、これらの新規に合成された分子がエンドサイトーシス経路に達することを可能とすることは明らかである。
【０１４０】
実施例２０
ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによるＭａｌＥエピトープ送達は、アクチンフィラメント重合に依存しないがクラスリン被覆小孔を必要とする
ＣｙａＡのインターナリゼーション及びそのＡＣドメインに挿入されたＯＶＡペプチドのその後のＭＨＣクラスＩ拘束性提示は、ファゴサイトーシスに依存しないことが既に示されている（Guermonprez,P., et al., 2000a, b）。しかしながら、ＣｙａＡのいくらかの分子は、他の分子が古典的外因性Ａｇとして捕捉されそしてプロセッシングされてＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドを生じようと、そのＡＣドメインをＡＰＣｓ細胞質中にトランスロケーションさせることは排除できない。アクチン依存性捕捉が、有効なＭＨＣクラスＩＩ拘束性提示のためのＭａｌＥエピトープ送達に関係しているかどうかを最初に試験した。この実験では、サイトカラシンＢ（ＣＣＢ）、アクチンフィラメント重合を阻止しそしてマクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス及びカベオレ媒介エンドサイトーシスを害する薬物（Gottlieb, T.A.., et al., 1993）、を使用した。図１６に示されたとおり、ＣＣＢは、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達後のＭａｌＥ又はＯＶＡ257-264ペプチドのそれぞれの特異的Ｔ細胞ハイブリドーマへのＭａｌＥの提示もＯＶＡ257-264ペプチドの提示も阻害しなかった。予測されるとおり、ＭａｌＥタンパク質の提示は阻害剤により完全に妨害されたが、これに対して遊離ＭａｌＥ100-114ペプチドは依然としてＣＲＭＣ３に提示された。これらの結果は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子へのＡＣドメイン送達が、ＢＭＤＣｓによるＣｙａＡファゴサイトーシス、マクロピノサイトーシス又はカベオレ媒介エンドサイトーシスを必要としないことを示す。
【０１４１】
ＣｙａＡはＡＰＣ細胞表面のＣＤ１１ｂと相互作用するので、ＣｙａＡがクラスリン依存性プロセスによりエンドサイトーシスされるかどうかを試験した。低張性ショック後のＫ+枯渇（Larkin, J. M.., et al., 1983; Madshus, I.H.., et al., 1987; Bayer, N., et al., 200１）を使用して、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡのＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ提示のためにクラスリン被覆小孔が必用であるかどうかを試験した。低張性ショック後のＫ+枯渇を低張性媒体へのＢＭＤＣｓ暴露により行い、次いで細胞外カリウムの不存在下にインキュベーションした。この処理は、形質膜からのクラスリン被覆の解離及び細胞質中のクラスリンケージ（clathrin cages）の非生産性センブリー（nonproductive assembly）をもたらす。ゆえに、細胞質アミノ酸配列を介してＡＰ２クラスリンアダプター複合体と相互作用する膜タンパク質のインターナリゼーションは損なわれる。図１６に示されたとおり、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達後のＭａｌＥ１００−１１４及びＯＶＡ２５７−２６４ペプチドのそれぞれのＴ細胞ハイブリドーマへの提示の両方ともＫ+枯渇により完全に妨害されたが、ＭａｌＥタンパク質又は遊離ペプチド提示は阻害されなかった。
【０１４２】
これらの結果は、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡクラスリン媒介エンドサイトーシスは、クラスＩ及びクラスＩＩ拘束性提示の両方のために必用であることを証明する。これは、驚くべきことである。何故ならば、ＣｙａＡは、エンドサイトーシスされることなく、そのＡＣドメインを形質細胞膜から細胞質ゾルに直接トランスロケーションさせると考えられたからである。その代わりに、これらの結果は、ＣｙａＡＡＣドメインがクラスリン被覆小胞から、そのエンドサイトーシス後にトランスロケーションされることを示唆する。
【０１４３】
実施例２１
ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＯＶＡ特異的ＣＤ８+Ｔ細胞応答及びＭａｌＥ特異的ＣＤ４+Ｔ細胞応答を誘発する
種々のＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープに対するＣＴＬ応答（Fayolle, C., et al. 2001）及びＭａｌＥＣＤ４+Ｔ細胞エピトープに対する増殖応答（Loucka, J., et al., 2002）を誘発するためのＣｙａＡの高い有効性は既に証明されている。ＣｙａＡがＡｇ提示のためにＢＭＤＣｓにＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞エピトープの両方を送達するための効力のあるビークルであることを証明するｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究の後、これらのエピトープの同時のｉｎ  ｖｉｖｏ送達におけるＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡの有効性を試験した。マウスを、アジュバントなしで、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ、又はＣｙａＡＥ５、５０μgにより静脈内経路により免疫感作させた。Ｔ細胞応答を注射の７日後にモニタリングした。
【０１４４】
ＣＤ８+Ｔ細胞応答のリードアウトとして、ＯＶＡ257-264ペプチドをロードされた標的細胞に対する免疫感作されたマウスからの脾臓細胞の細胞傷害性活性を試験した。図１７Ａに示されたとおり、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ及びＣｙａＡ−ＯＶＡの両方ともＯＶＡエピトープに対する特異的ＣＴＬ応答を誘発した。予測されるとおり、マウスがＣｙａＡ−ＭａｌＥ又はＣｙａＡＥ５を受け取ったとき応答は検出されなかった。ＣｙａＡでプライミングされたＴ細胞によるサイトカイン分泌も分析した。免疫感作されたマウスからの脾臓細胞を対応するペプチドで再刺激するか又は対応するペプチドなしで再刺激し、そして７２時間培養上清中のＩＦＮ−γ及びＩＬ−５特異的分泌をＥＬＩＳＡによりモニタリングした。ＬＣＭＶエピトープについて先に報告されたとおり（Dadaglio, G., et al., 2000）、ＣｙａＡ−ＯＶＡは、強いＩＦＮ−γ産生により特徴付けられた、ＩＬ−５分泌のない、Ｔｈ−１様分極化されたＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答（Th1-like polarized OVA-specific T cell response）を誘発した（図１７Ｃ）。ＩＬ−４及びＩＬ−１０はこれらの培養上清中で検出されなかった。これらの結果は、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡは、Ｔｈ−１分極化されたＣＤ８+Ｔ細胞応答のｉｎ  ｖｉｖｏ誘発のためにＣｙａＡ−ＯＶＡと同じく免疫原性であることを示す。
【０１４５】
ＣｙａＡ−ＯＶＡと比較してＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡにより誘発されたＣＤ４+Ｔ細胞応答も分析した。リードアウトとして、ＭａｌＥ100-114ペプチドでｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激された脾臓細胞のサイトカイン分泌をモニタリングした。図１７Ｂに示されたとおり、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＣｙａＡ−ＭａｌＥの両方共免疫脾臓細胞による特異的ＩＦＮ−γ分泌を誘発した。ＩＬ−５分泌も、４つの実験のうち３つの実験で検出されたが、そのレベルは非常に低く（図１７Ｂ参照）、これは、ＣｙａＡにより誘発されたＣＤ４+Ｔ細胞応答は、主としてＣＤ８+Ｔ細胞応答と同様にＴｈ−１分極化されていることを示す。ここでも、ＩＬ−１０又はＩＬ−４は上清中に検出できなかった。
【０１４６】
これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏＴ細胞プライミングのためのクラスＩ及びクラスＩＩエピトープの両方を同時に送達するためのＣｙａＡの能力を更に確証する。更に、このような同時送達の有効性は単一エピトープ送達と同様であり、そしてＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方共、Ｔｈ１分極化されていると思われる。
【０１４７】
更に、ＥＳＡＴ−６（Ｒｖ３８７５、９５アミノ酸）又はＣＦＰ−１０（Ｒｖ３８７４、１００アミノ酸）Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノム配列は、ＣｙａＡにより送達されることができ、そしてＣｙａＡはＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的ＩＦＮ−γ産生細胞の用量−応答又は検出頻度に影響を与え、これはＴＢの免疫診断を高める。
【０１４８】
参考文献
下記の参考文献を本明細書で引用する。各参考文献の全体の開示は、本明細書で頼りとされ、そして本明細書に引用により組み込まれる。
【０１４９】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】ＣＦＰ１０（四角形）及びＣｙａＡ−ＣＦＰ１０（三角形）による刺激の後のｉｎ  ｖｉｔｒｏＩＦＮ−γ産生の用量応答関係を示す。リードアウトシステムはＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイであった。培地のみを有する培養物からのスポット形成細胞（ＳＦＣ）数をすべての値から減じ、そしてＣｙａＡのみとのインキュベーションの後のスポットの数を、ＣｙａＡ−ＣＦＰ１０刺激により誘発されたＳＦＣから減じた。Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染した仔ウシから単離された２×１０5ＰＢＭＣ／ウエルにより二重に（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）試験を行った。水平線は、ＣｙａＡ−ＣＦＰ１０（ａ）及びＣＦＰ１０（ｂ）による刺激の後に誘発された最大ＳＦＣ数（ピーク値）を示す。線ｃはＣＦＰ−１０刺激後に誘発された半最大ＳＦＣ（５０％最大値）を示す。垂線は、ＣＦＰ−１０で誘発されたピーク応答の５０％を誘発するのに必要なＣｙａＡ−ＣＦＰ１０（ｄ）及びＣＦＰ−１０（ｅ）濃度（５０％最大濃度）を示す。
【図２】Ｍ．ｂｏｖｉｓ感染ウシからのＰＢＭＣによるｉｎ  ｖｉｔｒｏＩＦＮ−γ産生を刺激するためのＣｙａＡ融合タンパク質及び組換えタンパク質の有効性の比較を示す。パネルＡ：図１に示されたとおりに決定された５０％最大濃度。パネルＢ：図１に示されたとおりに決定されたピーク値を示す。リードアウトシステム：ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。培地のみを有する培養物からのＳＦＣ数をすべての値から減じた。更に、ＣｙａＡのみとのインキュベーションの後のスポットの数を、ＣｙａＡ−ＣＦＰ１０刺激により誘発されたＳＦＣから減じた。試験を、２×１０5ＰＢＭＣ／ウエルにより二重に行った。＊は、ｐ＜０．０５を示す（両側ウイルコクスン符号付順位マッチドペアー検定（two-tailed Wilcoxon signed rank matched pairs test）
【図３】ＣｙａＡ−ＣＦＰ１０の認識におけるＣＤ１１ｂの関与を示す。培養は、２つのＣＤ１１ｂ特異的ＩｇＧ１ｍＡｂ（ＩＬＡ１５及びＣＣ９４）の存在下に行った。リードアウトシステムは、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイであった。培地のみを有する培養物からのＳＦＣ数をすべての値から減じた。試験を、１頭の感染した仔ウシから単離された２×１０5ＰＢＭＣ／ウエルにより二重に行った。応答は、一側ウイルコクスン順位マッチドペアー検定（one-tailed Wilcoxon rank matched pairs test）により決定して、最も低い濃度を除いて試験した各濃度について有意差があった（ｐ０．０２）。
【図４】全血ＢＯＶＩＧＡＭ  ＩＦＮ−γアッセイにおけるＣｙａＡ融合タンパク質及び組換えＥＳＡＴ−６及びＣＦＰ−１０の性能を示す。８頭のＭ．ｂｏｖｉｓ感染仔ウシからのヘパリンを加えた血液を、４nM、「（４）」と命名された、及び２０nM、「（２０）」と命名された、試験濃度で抗原とインキュベーションした。血漿培養上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより決定した。結果をＯＤ４５０単位（ＯＤ４５０×１０００）として表す。水平線は、ポジティビティー（positivity）についてのカットオフ（１００  ＯＤ４５０単位）を示す。培養を９６ウエル平底プレート中で二重に行った。両側ウイルコクスン符号付順位マッチドペアー検定により決定して、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示す。  ＴＢ感染を有するヒト個体
【図５Ａ】Ｔ細胞を再刺激するのに必要な抗原の投与量がＣｙａＡ送達により１０〜２０倍減少されることを示す。ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数は、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０又はそれらのＣｙａＡトキソイド同等物の存在下にオーバナイトＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて数えた。示された濃度は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の濃度を表す。パネルＡ：９頭の健常なＴＳＴ＋ｖｅ応答性ドナーにおいて、組換えＥＳＡＴ−６の認識は５００nMで最適であったが、これに対して同様な認識が１０倍少ないＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６の存在下に起こった。パネルＢ：ネイティブなＣＦＰ−１０に応答した１０頭の同様なドナーにおいて、ＣｙａＡ送達は、やはり投与量応答曲線を左にシフトさせた。ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０トキソイドとして発現された約１０〜２０倍少ないＣＦＰ−１０が同じ応答を誘発した。
【図５Ｂ】Ｔ細胞を再刺激するのに必要な抗原の投与量がＣｙａＡ送達により１０〜２０倍減少されることを示す。ＩＦＮ−γスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数は、ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ−１０又はそれらのＣｙａＡトキソイド同等物の存在下にオーバナイトＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて数えた。示された濃度は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原の濃度を表す。パネルＡ：９頭の健常なＴＳＴ＋ｖｅ応答性ドナーにおいて、組換えＥＳＡＴ−６の認識は５００nMで最適であったが、これに対して同様な認識が１０倍少ないＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６の存在下に起こった。パネルＢ：ネイティブなＣＦＰ−１０に応答した１０頭の同様なドナーにおいて、ＣｙａＡ送達は、やはり投与量応答曲線を左にシフトさせた。ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０トキソイドとして発現された約１０〜２０倍少ないＣＦＰ−１０が同じ応答を誘発した。
【図６Ａ】低応答対象におけるＩＦＮ−γＳＦＣの検出がＣｙａＡ送達により高められることを示す。ネイティブＥＳＡＴ−６（パネルＡ）及び／又はＣＦＰ−１０（パネルＢ）に応答した対象は、組換え抗原に対するそれらの応答の大きさにより低（＜５０ＩＦＮ−γＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣ）、中間（５０〜１００）及び高（＞１００）応答者に層別化された。ＣｙａＡ送達は、特に低応答対象のＩＦＮ−γＳＦＣ検出を有意に増加させた。
【図６Ｂ】低応答対象におけるＩＦＮ−γＳＦＣの検出がＣｙａＡ送達により高められることを示す。ネイティブＥＳＡＴ−６（パネルＡ）及び／又はＣＦＰ−１０（パネルＢ）に応答した対象は、組換え抗原に対するそれらの応答の大きさにより低（＜５０ＩＦＮ−γＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣ）、中間（５０〜１００）及び高（＞１００）応答者に層別化された。ＣｙａＡ送達は、特に低応答対象のＩＦＮ−γＳＦＣ検出を有意に増加させた。
【図７】ＣＤ４+及びＣＤ８+応答は、ＣｙａＡ送達により高めることができることを証明する。ＰＢＭＣからのＣＤ４+又はＣＤ８+Ｔ細胞の免疫磁気的枯渇化（immunomagnetic depletion）を行いそしてＣｙａＡトキソイドに対する残りの細胞の応答をアッセイした。ＣＤ４+枯渇ＰＢＭＣの応答はＣＤ８として解釈されそしてその逆も成り立つ。次いでＣＤ８枯渇したＰＢＭＣの抗原刺激されたＩＦＮ−γＳＦＣ（ＣＤ４）をＣＤ４枯渇したＰＢＭＣのＩＦＮ−γＳＦＣ（ＣＤ８）で割って、ＣＤ４／ＣＤ８比を得た。個々のドナーの応答は線により連結して示されている。組換え抗原に対する優勢な応答はＣＤ４であり、そしてＣｙａＡ送達はＣＤ４又はＣＤ８応答のいずれも高めることができた。
【図８】ＣｙａＡトキソイドに対するＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答は、ＭＨＣクラスＩＩ及びクラスＩ分子により拘束されることを示す。ＣＤ４又はＣＤ８枯渇したＰＢＭＣのＣｙａＡトキソイドに対する応答を、阻害剤の存在下又は不存在下にアッセイした。パネルＡ及びＣ：ＣＤ８+Ｔ細胞応答はＭＨＣクラスＩに対する抗体により部分的にブロックされうる。パネルＢ及びＤ：ＣＤ４+Ｔ細胞は、抗ＭＨＣクラスＩＩ又はクロロキン（１０mM）による阻害に対して感受性であった。
【図９Ａ】パネルＡにおいてＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴと全血アッセイとの相関を示す。ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０で一晩刺激されたＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を、３１人の結核感作したドナーにおいて１／１０に希釈した全血中のＩＦＮ−γの７２時間の産生と比較した。１０ＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣのＥＬＩＳＰＯＴカットオフ及び１０pg/mlのＥＬＩＳＡカットオフを使用して、８１％応答は合致した。応答はまた、スピアマン相関係数（Spearman correlation coefficient）（ここで、ｒ＝０．６４、ｐ＝０．０００２である）を使用して、有意に相関付けられた。パネルＢは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＣＦＰ−１０を有するＣｙａＡにより刺激された全血中のＩＦＮ−γ分泌の増強を示す。７２時間全血アッセイにおいてこれらの抗原を取り込むＥＳＡＴ−６（△）、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６（▲）、ＣＦＰ−１０（○）、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０（●）トキソイドにより誘発されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ａｇ特異的ＩＦＮ−γを決定した。次いで、ドナーを、ネイティブ抗原に対するそれらの応答により、高い（＞１０００ＩＦＮ−γ  pg/ml）、中（２５０〜１０００ＩＦＮ−γ  pg/ml）及び低い（＜２５０ＩＦＮ−γ  pg/ml）応答者に層別化した。低く応答するドナーの応答のみを示す。ＣＦＰ−１０のＣｙａＡ送達によるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的全血応答の増強は、白円（open circles）と黒円（closed circles）の分布の差により証明されるとおり、ＣＦＰ−１０に対して低い応答者として分類された対象において有意であった（ｐ＝０．０２１）。
【図９Ｂ】パネルＡにおいてＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴと全血アッセイとの相関を示す。ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０で一晩刺激されたＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ応答を、３１人の結核感作したドナーにおいて１／１０に希釈した全血中のＩＦＮ−γの７２時間の産生と比較した。１０ＳＦＣ／１０6ＰＢＭＣのＥＬＩＳＰＯＴカットオフ及び１０pg/mlのＥＬＩＳＡカットオフを使用して、８１％応答は合致した。応答はまた、スピアマン相関係数（Spearman correlation coefficient）（ここで、ｒ＝０．６４、ｐ＝０．０００２である）を使用して、有意に相関付けられた。パネルＢは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＣＦＰ−１０を有するＣｙａＡにより刺激された全血中のＩＦＮ−γ分泌の増強を示す。７２時間全血アッセイにおいてこれらの抗原を取り込むＥＳＡＴ−６（△）、ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６（▲）、ＣＦＰ−１０（○）、ＣｙａＡ−ＣＦＰ−１０（●）トキソイドにより誘発されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ａｇ特異的ＩＦＮ−γを決定した。次いで、ドナーを、ネイティブ抗原に対するそれらの応答により、高い（＞１０００ＩＦＮ−γ  pg/ml）、中（２５０〜１０００ＩＦＮ−γ  pg/ml）及び低い（＜２５０ＩＦＮ−γ  pg/ml）応答者に層別化した。低く応答するドナーの応答のみを示す。ＣＦＰ−１０のＣｙａＡ送達によるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ特異的全血応答の増強は、白円（open circles）と黒円（closed circles）の分布の差により証明されるとおり、ＣＦＰ−１０に対して低い応答者として分類された対象において有意であった（ｐ＝０．０２１）。
【図１０】ｒ−ＣｙａＡ−ＥＳＡＴ−６は、ＥＳＡＴ−６を発現しているマイコバクテリアで感染させたマウスからのＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的に且つ有効に刺激することができることを示す。種々のペプチド１０μg/ml、ＰＰＤ１０μg/ml又はｒ−ＣｙａＡ２．５μg/mlによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に応答して１×１０6又は１×１０7ＣＦＵのＢＣＧ：：ＲＤ１又はＢＣＧ：：ｐＹＵＢ４１２コントロールで皮下で免疫感作されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞により産生されたＩＦＮ−γの濃度。結果を二重培養ウエル（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｗｅｌｌｓ）の平均及び標準偏差として示す。ラベル「ＥＳＡＴ−６（１−２０）」は、ＥＳＡＴ−６のアミノ酸１〜２０に対応するペプチド（免疫優勢ＣＤ４+Ｔ細胞エピトープ）を示す。ラベル「ＭａｌＥ（１０−５４）」は、Ｅ．ｃｏｌｉからのＭａｌＥタンパク質のアミノ酸１０〜５４に対応するペプチドを示す。ラベル「ｒＣｙａＡ−ＯＶＡ／：２５７」はＯＶＡ  ＣＴＬエピトープを有するＣｙａＡを示す。
【図１１Ａ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡの送達は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ経路の両方によるものであることを証明する。パネルＡ及びＢにおいて証明されるとおり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＢＭＤＣｓを、種々の濃度のＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ、ＣｙａＡＥ５、ＭａｌＥタンパク質、ＭａｌＥ100-114又はＯＶＡ257-264ペプチドと５時間インキュベーションした。インキュベーションの後に、ＢＭＤＣｓを洗浄しそしてＣＲＭＣ３（パネルＡ及びＢ）又はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ（パネルＣ）をウエルに加えた。パネルＢでは、ＢＭＤＣｓを、７．５nMのＣｙａＡＥ５又はＣｙａＡ−ＯＶＡ及び種々の濃度のＭａｌＥ100-114ペプチド又はタンパク質と同時にインキュベーションした。５時間後に、細胞を洗浄しそして１０5ＣＲＭＣ３Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加えた。培養上清を回収し、そして１８時間後に凍結させた。培養期間中ＣＲＭＣ３又はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマにより分泌されたＩＬ−２の量を、実施例１４に記載のとおりにＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ細胞系でモニタリングした。結果をｃｐｍで表す。各パネルは少なくとも２つの実験の結果を表す。
【図１１Ｂ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡの送達は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ経路の両方によるものであることを証明する。パネルＡ及びＢにおいて証明されるとおり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＢＭＤＣｓを、種々の濃度のＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ、ＣｙａＡＥ５、ＭａｌＥタンパク質、ＭａｌＥ100-114又はＯＶＡ257-264ペプチドと５時間インキュベーションした。インキュベーションの後に、ＢＭＤＣｓを洗浄しそしてＣＲＭＣ３（パネルＡ及びＢ）又はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ（パネルＣ）をウエルに加えた。パネルＢでは、ＢＭＤＣｓを、７．５nMのＣｙａＡＥ５又はＣｙａＡ−ＯＶＡ及び種々の濃度のＭａｌＥ100-114ペプチド又はタンパク質と同時にインキュベーションした。５時間後に、細胞を洗浄しそして１０5ＣＲＭＣ３Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加えた。培養上清を回収し、そして１８時間後に凍結させた。培養期間中ＣＲＭＣ３又はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマにより分泌されたＩＬ−２の量を、実施例１４に記載のとおりにＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ細胞系でモニタリングした。結果をｃｐｍで表す。各パネルは少なくとも２つの実験の結果を表す。
【図１１Ｃ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡの送達は、ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ経路の両方によるものであることを証明する。パネルＡ及びＢにおいて証明されるとおり、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＢＭＤＣｓを、種々の濃度のＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ、ＣｙａＡＥ５、ＭａｌＥタンパク質、ＭａｌＥ100-114又はＯＶＡ257-264ペプチドと５時間インキュベーションした。インキュベーションの後に、ＢＭＤＣｓを洗浄しそしてＣＲＭＣ３（パネルＡ及びＢ）又はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマ（パネルＣ）をウエルに加えた。パネルＢでは、ＢＭＤＣｓを、７．５nMのＣｙａＡＥ５又はＣｙａＡ−ＯＶＡ及び種々の濃度のＭａｌＥ100-114ペプチド又はタンパク質と同時にインキュベーションした。５時間後に、細胞を洗浄しそして１０5ＣＲＭＣ３Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加えた。培養上清を回収し、そして１８時間後に凍結させた。培養期間中ＣＲＭＣ３又はＢ３ＺＴ細胞ハイブリドーマにより分泌されたＩＬ−２の量を、実施例１４に記載のとおりにＩＬ−２依存性ＣＴＬ−Ｌ細胞系でモニタリングした。結果をｃｐｍで表す。各パネルは少なくとも２つの実験の結果を表す。
【図１２】抗ＣＤ１１ｂｍＡｂｓはＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡの送達をブロックすることを証明する。ＢＭＤＣｓを、１０μg/ml抗ＣＤ１１ｂｍＡｂｓ又は同じ濃度のアイソタイプコントロールｍＡｂｓと１時間インキュベーションした。次いでタンパク質又はペプチド（７．５nMのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ及びＯＶＡｐ２５７−２６４ペプチド及び７５０nMのＭａｌＥタンパク質）をｍＡｂｓの常に存在下にＢＭＤＣｓに加えた。ＡＰＣｓをＡｇｓとの４〜５時間のインキュベーションの後に洗浄し、そしてＣＲＭＣ３（パネルＡ）又はＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマを１８時間加えた。上清を、ＣＴＬ−Ｌ細胞系によりＩＬ−２含有率について試験した。結果は、ｃｐｍで表しそして４つの実験を表す。
【図１３Ａ】ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はプロテアソーム活性もＴＡＰ輸送体も必要としないことを証明する。パネルＡ及びＢ：ＢＭＤＣｓを、３μg/mlのラクタシスチン又は１２μg/mlのＬＬｎＬ又はＬＬｍＬと１時間インキュベーションした。次いで、Ａｇｓを加え、そして５時間後に、ＢＭＤＣｓを洗浄しそして固定した。次いで、１０5ＣＲＭＣ３（パネルＡ）及びＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加え、そして培養を１８時間後に停止した。培養上清地のＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌ細胞で決定した。結果を、阻害剤なしで得られた応答と比較して阻害剤の存在下に残留Ｔ細胞活性化の百分率として表し、そして２つの実験を表す。パネルＣ及びＤ。ＴＡＰ輸送体に対する要求を、ＴＡＰ１ノックアウトマウスから発生したＢＭＤＣｓで決定した。ＢＭＤＣｓを種々の濃度のＡｇｓとインキュベーションしそしてＣＲＭＣ３（パネルＣ）又はＢ３Ｚ（パネルＤ）Ｔ細胞ハイブリドーマと培養した。ＣＲＭＣ３によるＩＬ−２産生を先に所望されたとおりに決定した。結果をｃｐｍで表しそして２つの実験を表す。
【図１３Ｂ】ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はプロテアソーム活性もＴＡＰ輸送体も必要としないことを証明する。パネルＡ及びＢ：ＢＭＤＣｓを、３μg/mlのラクタシスチン又は１２μg/mlのＬＬｎＬ又はＬＬｍＬと１時間インキュベーションした。次いで、Ａｇｓを加え、そして５時間後に、ＢＭＤＣｓを洗浄しそして固定した。次いで、１０5ＣＲＭＣ３（パネルＡ）及びＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加え、そして培養を１８時間後に停止した。培養上清地のＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌ細胞で決定した。結果を、阻害剤なしで得られた応答と比較して阻害剤の存在下に残留Ｔ細胞活性化の百分率として表し、そして２つの実験を表す。パネルＣ及びＤ。ＴＡＰ輸送体に対する要求を、ＴＡＰ１ノックアウトマウスから発生したＢＭＤＣｓで決定した。ＢＭＤＣｓを種々の濃度のＡｇｓとインキュベーションしそしてＣＲＭＣ３（パネルＣ）又はＢ３Ｚ（パネルＤ）Ｔ細胞ハイブリドーマと培養した。ＣＲＭＣ３によるＩＬ−２産生を先に所望されたとおりに決定した。結果をｃｐｍで表しそして２つの実験を表す。
【図１３Ｃ】ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はプロテアソーム活性もＴＡＰ輸送体も必要としないことを証明する。パネルＡ及びＢ：ＢＭＤＣｓを、３μg/mlのラクタシスチン又は１２μg/mlのＬＬｎＬ又はＬＬｍＬと１時間インキュベーションした。次いで、Ａｇｓを加え、そして５時間後に、ＢＭＤＣｓを洗浄しそして固定した。次いで、１０5ＣＲＭＣ３（パネルＡ）及びＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加え、そして培養を１８時間後に停止した。培養上清地のＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌ細胞で決定した。結果を、阻害剤なしで得られた応答と比較して阻害剤の存在下に残留Ｔ細胞活性化の百分率として表し、そして２つの実験を表す。パネルＣ及びＤ。ＴＡＰ輸送体に対する要求を、ＴＡＰ１ノックアウトマウスから発生したＢＭＤＣｓで決定した。ＢＭＤＣｓを種々の濃度のＡｇｓとインキュベーションしそしてＣＲＭＣ３（パネルＣ）又はＢ３Ｚ（パネルＤ）Ｔ細胞ハイブリドーマと培養した。ＣＲＭＣ３によるＩＬ−２産生を先に所望されたとおりに決定した。結果をｃｐｍで表しそして２つの実験を表す。
【図１３Ｄ】ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はプロテアソーム活性もＴＡＰ輸送体も必要としないことを証明する。パネルＡ及びＢ：ＢＭＤＣｓを、３μg/mlのラクタシスチン又は１２μg/mlのＬＬｎＬ又はＬＬｍＬと１時間インキュベーションした。次いで、Ａｇｓを加え、そして５時間後に、ＢＭＤＣｓを洗浄しそして固定した。次いで、１０5ＣＲＭＣ３（パネルＡ）及びＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加え、そして培養を１８時間後に停止した。培養上清地のＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌ細胞で決定した。結果を、阻害剤なしで得られた応答と比較して阻害剤の存在下に残留Ｔ細胞活性化の百分率として表し、そして２つの実験を表す。パネルＣ及びＤ。ＴＡＰ輸送体に対する要求を、ＴＡＰ１ノックアウトマウスから発生したＢＭＤＣｓで決定した。ＢＭＤＣｓを種々の濃度のＡｇｓとインキュベーションしそしてＣＲＭＣ３（パネルＣ）又はＢ３Ｚ（パネルＤ）Ｔ細胞ハイブリドーマと培養した。ＣＲＭＣ３によるＩＬ−２産生を先に所望されたとおりに決定した。結果をｃｐｍで表しそして２つの実験を表す。
【図１４Ａ】ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はエンドサイトーシスプロテアーゼ活性及び液胞酸性化を必要とすることを証明する。ＢＭＤＣｓを、ロイペプチン、ペプスタチン、又は等級を付けた濃度のクロロキン（ＣＣＱ）と１時間インキュベーションし、次いでＡｇｓを最適濃度（ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡについて７．５nM、ＭａｌＥ100-114ペプチド及びタンパク質について７５０nM、ＯＶＡ257-264ペプチドについて７５０nM）でウエルに加えた。ＢＭＤＣｓの洗浄及び固定化後に、ＣＲＭＣ３（パネルＡ）又はＢ３Ｚ（バネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマを加えた。培養上清を１８時間後に回収しそしてそれらのＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌで決定した。結果を、阻害剤の不存在下に行われた培養と比べて残留Ｔ細胞活性化の百分率として表す。それらは２〜５の実験を表す。
【図１４Ｂ】ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はエンドサイトーシスプロテアーゼ活性及び液胞酸性化を必要とすることを証明する。ＢＭＤＣｓを、ロイペプチン、ペプスタチン、又は等級を付けた濃度のクロロキン（ＣＣＱ）と１時間インキュベーションし、次いでＡｇｓを最適濃度（ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡについて７．５nM、ＭａｌＥ100-114ペプチド及びタンパク質について７５０nM、ＯＶＡ257-264ペプチドについて７５０nM）でウエルに加えた。ＢＭＤＣｓの洗浄及び固定化後に、ＣＲＭＣ３（パネルＡ）又はＢ３Ｚ（バネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマを加えた。培養上清を１８時間後に回収しそしてそれらのＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌで決定した。結果を、阻害剤の不存在下に行われた培養と比べて残留Ｔ細胞活性化の百分率として表す。それらは２〜５の実験を表す。
【図１５Ａ】ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩへのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はタンパク質新規合成及びゴルジ輸送を必要とすることを証明する。ＢＭＤＣｓを、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）又はブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）と１時間インキュベーションした。次いで、Ａｇｓを加えた（ＭａｌＥタンパク質及びペプチドについて７５０nM又はＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡについて７．５nM）。５時間後に、細胞を洗浄しそして実施例１８に記載のとおりに固定した。ＣＲＭＣ３（パネルＡ）又はＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加えそして１８時間培養上清中のＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌ細胞系でモニタリングした。結果は、阻害剤なしに行われた培養に比較して阻害剤の存在下に残留Ｔ細胞活性化の％で表し、そして４つの実験を代表する。
【図１５Ｂ】ＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩへのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ送達はタンパク質新規合成及びゴルジ輸送を必要とすることを証明する。ＢＭＤＣｓを、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）又はブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）と１時間インキュベーションした。次いで、Ａｇｓを加えた（ＭａｌＥタンパク質及びペプチドについて７５０nM又はＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡについて７．５nM）。５時間後に、細胞を洗浄しそして実施例１８に記載のとおりに固定した。ＣＲＭＣ３（パネルＡ）又はＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマをウエルに加えそして１８時間培養上清中のＩＬ−２含有率をＣＴＬ−Ｌ細胞系でモニタリングした。結果は、阻害剤なしに行われた培養に比較して阻害剤の存在下に残留Ｔ細胞活性化の％で表し、そして４つの実験を代表する。
【図１６Ａ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによるＭＨＣクラスＩＩエピトープ送達は、ファゴサイトーシスを必要としないが液胞酸性化に依存することを証明する。アクチン依存性機構阻害について、ＢＭＤＣｓを１０μg/mlサイトカラシンと３７℃で１時間インキュベーションし、そしてＡｇｓを最適濃度（７．５nMのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ、ＯＶＡ257-264及びＭａｌＥ100-114ペプチド、７５０nMのＭａｌＥタンパク質）で加えた。５時間のインキュベーション後に、ＢＭＤＣｓを３回洗浄しそして実施例２０に詳説されたとおりグルタルアルデヒドで固定した。カリウム枯渇について、血清を含まない培地中で細胞をインキュベーションし、低張性ショツクを受けさせ、次いで実施例２０に詳説されたとおりＫ+イオンの不存在下に４５分間Ａｇｓとインキュベーションし、次いでＡｇｓを洗浄しそして細胞をＣＭ中で更に４時間インキュベーションしそして固定した。３回の洗浄後に、ＣＲＭＣ３（パネルＡ）又はＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマを、１０5細胞／ウエルで１８時間加えた。上清をＣＴＬ−Ｌ細胞系でＩＬ−２について試験した。各Ａｇｓについて、阻害剤の不存在下のＣＴＬ−Ｌ増殖のレベルは、Ｔ細胞活性化１００％とみなした。結果は、薬物の存在下に残留Ｔ細胞活性化の百分率を示す。結果は２〜４実験を代表する。
【図１６Ｂ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによるＭＨＣクラスＩＩエピトープ送達は、ファゴサイトーシスを必要としないが液胞酸性化に依存することを証明する。アクチン依存性機構阻害について、ＢＭＤＣｓを１０μg/mlサイトカラシンと３７℃で１時間インキュベーションし、そしてＡｇｓを最適濃度（７．５nMのＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ、ＯＶＡ257-264及びＭａｌＥ100-114ペプチド、７５０nMのＭａｌＥタンパク質）で加えた。５時間のインキュベーション後に、ＢＭＤＣｓを３回洗浄しそして実施例２０に詳説されたとおりグルタルアルデヒドで固定した。カリウム枯渇について、血清を含まない培地中で細胞をインキュベーションし、低張性ショツクを受けさせ、次いで実施例２０に詳説されたとおりＫ+イオンの不存在下に４５分間Ａｇｓとインキュベーションし、次いでＡｇｓを洗浄しそして細胞をＣＭ中で更に４時間インキュベーションしそして固定した。３回の洗浄後に、ＣＲＭＣ３（パネルＡ）又はＢ３Ｚ（パネルＢ）Ｔ細胞ハイブリドーマを、１０5細胞／ウエルで１８時間加えた。上清をＣＴＬ−Ｌ細胞系でＩＬ−２について試験した。各Ａｇｓについて、阻害剤の不存在下のＣＴＬ−Ｌ増殖のレベルは、Ｔ細胞活性化１００％とみなした。結果は、薬物の存在下に残留Ｔ細胞活性化の百分率を示す。結果は２〜４実験を一晩ＥＬＩＳＰＯＴ。
【図１７Ａ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによる免疫感作はＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方を誘発することを証明する。５０μgのＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＣｙａＡＥ５を静脈内注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を免疫感作の１週間後に回収した。（Ａ）免疫マウスからの脾臓細胞をＯＶＡ257-264ペプチド１μg/mlの存在下に５日間刺激し、そして同じペプチドと共に又は同じペプチドなしでインキュベーションされた51Ｃｒ標識されたＥＬ−４標的細胞に対するＣＴＬ活性について試験した。自然に起こる細胞51Ｃｒ放出は、培地のみの中でインキュベーションされたＥＬ−４で得られた。各曲線は、４つの異なる実験において試験された４（ＣｙａＡＥ５）〜８マウス（ＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ）を代表する単一のマウスについて得られたＣＴＬ応答を表す。（Ｂ、Ｃ）免疫マウスからの脾臓細胞をＭａｌＥ100-114ペプチド（Ｂ）１０μg/ml又はＯＶＡ257-264ペプチド（Ｃ）１μg/mlの存在下又は不存在下に７２時間刺激した。培養上清をＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩＬ−５及びＩＦＮ−δ含有率について試験した。結果は、pg/mlで表しそしてペプチドの存在下及び不存在下にサイトカイン濃度間の差を表す。結果は４実験を代表する。
【図１７Ｂ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによる免疫感作はＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方を誘発することを証明する。５０μgのＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＣｙａＡＥ５を静脈内注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を免疫感作の１週間後に回収した。（Ａ）免疫マウスからの脾臓細胞をＯＶＡ257-264ペプチド１μg/mlの存在下に５日間刺激し、そして同じペプチドと共に又は同じペプチドなしでインキュベーションされた51Ｃｒ標識されたＥＬ−４標的細胞に対するＣＴＬ活性について試験した。自然に起こる細胞51Ｃｒ放出は、培地のみの中でインキュベーションされたＥＬ−４で得られた。各曲線は、４つの異なる実験において試験された４（ＣｙａＡＥ５）〜８マウス（ＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ）を代表する単一のマウスについて得られたＣＴＬ応答を表す。（Ｂ、Ｃ）免疫マウスからの脾臓細胞をＭａｌＥ100-114ペプチド（Ｂ）１０μg/ml又はＯＶＡ257-264ペプチド（Ｃ）１μg/mlの存在下又は不存在下に７２時間刺激した。培養上清をＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩＬ−５及びＩＦＮ−δ含有率について試験した。結果は、pg/mlで表しそしてペプチドの存在下及び不存在下にサイトカイン濃度間の差を表す。結果は４実験を代表する。
【図１７Ｃ】ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡによる免疫感作はＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答の両方を誘発することを証明する。５０μgのＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ又はＣｙａＡＥ５を静脈内注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓細胞を免疫感作の１週間後に回収した。（Ａ）免疫マウスからの脾臓細胞をＯＶＡ257-264ペプチド１μg/mlの存在下に５日間刺激し、そして同じペプチドと共に又は同じペプチドなしでインキュベーションされた51Ｃｒ標識されたＥＬ−４標的細胞に対するＣＴＬ活性について試験した。自然に起こる細胞51Ｃｒ放出は、培地のみの中でインキュベーションされたＥＬ−４で得られた。各曲線は、４つの異なる実験において試験された４（ＣｙａＡＥ５）〜８マウス（ＣｙａＡ−ＭａｌＥ、ＣｙａＡ−ＯＶＡ、ＣｙａＡ−ＭａｌＥ−ＯＶＡ）を代表する単一のマウスについて得られたＣＴＬ応答を表す。（Ｂ、Ｃ）免疫マウスからの脾臓細胞をＭａｌＥ100-114ペプチド（Ｂ）１０μg/ml又はＯＶＡ257-264ペプチド（Ｃ）１μg/mlの存在下又は不存在下に７２時間刺激した。培養上清をＥＬＩＳＡアッセイにおいてＩＬ−５及びＩＦＮ−δ含有率について試験した。結果は、pg/mlで表しそしてペプチドの存在下及び不存在下にサイトカイン濃度間の差を表す。結果は４実験を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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