(57)【要約】本発明は、一般に、ＲＳＶ感染を治療または予防する方法、特に、免疫病理学的応答を誘発せずに、または減少した免疫病理学的応答を誘発して、防御免疫を誘発することができる１つまたはそれ以上のＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントを含む組成物およびその使用に関する。１つの局面において、本発明は、ＲＳＶ感染を治療または予防する方法を提供し、該方法は、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントおよび変異体に特異的な免疫反応を誘発するのに充分な用量で、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する。
2007505033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
呼吸器合胞体ウイルス感染を治療または予防する方法であって、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント（該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、または減少した免疫病理学的応答を誘発して、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する）、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントに特異的な免疫反応を誘発するのに充分な用量で、それを必要とする被験体に投与することを包含する、方法。
【請求項２】
該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号２から成るアミノ酸配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号６、配列番号５６または配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該Ｇタンパク質免疫原が、疎水性成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該疎水性成分がアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該疎水性部分が脂質である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該疎水性成分が、融合タンパク質のアミノ末端に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該疎水性成分が、融合タンパク質のカルボキシ末端に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤がリポソームである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
該組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
該アジュバントが、ミョウバン、プロトリンまたはプロテオソームである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該組成物が、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質免疫原またはＭタンパク質免疫原をさらに含み、該Ｆタンパク質免疫原および該Ｍタンパク質免疫原がそれぞれ、免疫病理学的応答を誘発せずに、または減少した免疫病理学的応答を誘発して、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
該組成物が、少なくとも２つのＧタンパク質免疫原を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントが、融合タンパク質を形成するための第二アミノ酸配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
該第二アミノ酸配列が、標識または酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
該第二アミノ酸配列が、チオレドキシン、ポリヒスチジンまたはそれらの組合せである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
該融合タンパク質が疎水性成分をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
該疎水性成分が、融合タンパク質のアミノ末端に存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
該疎水性成分が、融合タンパク質のカルボキシ末端に存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
該融合タンパク質が、疎水性成分をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
該免疫病理学的応答が、好酸球増加症または喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
該好酸球増加症が肺好酸球増加症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
感染がサブグループＡ呼吸器合胞体ウイルスによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
感染がサブグループＢ呼吸器合胞体ウイルスによるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
感染がサブグループＡおよびサブグループＢの呼吸器合胞体ウイルスの両方によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
該組成物を、経腸、非経口、経皮、経粘膜、経鼻および吸入からなる群より選択される経路によって投与する、請求項１〜４、１１および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
該組成物を経鼻投与する、請求項１〜４、１１および１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜４、１１および１２のいずれか１項に記載の方法によって製造される、複数の抗体。
【請求項３０】
呼吸器合胞体ウイルス感染を治療または予防する方法であって、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤、および請求項２９に記載の複数の抗体を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
プロテオソームまたはプロトリンと配合された呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原を含む組成物であって、該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号２に示す配列に少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、該Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントが、免疫病理学的応答を誘発せずに、または減少した免疫病理学的応答を伴って、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する、組成物。
【請求項３２】
該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号２から成るアミノ酸配列である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号６、配列番号５６または配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
該Ｇタンパク質免疫原が、疎水性成分をさらに含む、請求項３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３６】
該疎水性成分がアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
該疎水性部分が脂質である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
該疎水性成分が、融合タンパク質のアミノ末端に存在する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
該疎水性成分が、融合タンパク質のカルボキシ末端に存在する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項４０】
該Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントが、融合タンパク質を形成するための第二アミノ酸配列をさらに含む、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
該第二アミノ酸配列が、標識または酵素である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
該第二アミノ酸配列が、チオレドキシン、ポリヒスチジンまたはそれらの組合せである、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
該融合タンパク質が疎水性成分をさらに含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４４】
該疎水性成分が、融合タンパク質のアミノ末端に存在する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
該疎水性成分が、融合タンパク質のカルボキシ末端に存在する、請求項４３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／５，６７５，８７号（２００４年５月３日出願）、および米国仮特許出願第６０／４８７，８０４号（２００３年７月１５日出願）の優先権を主張し、これらの仮出願は全体として、本明細書に参照として組み入れられる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般に感染の予防、より詳しくは、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて（例えば、関連した肺疾患を減少させる）、防御免疫を誘発することができる１つまたはそれ以上の呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫抗原およびそのフラグメントまたは変異体を含む組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、早期新生児期における下気道感染症（急性細気管支炎および肺炎）の主要な原因である（非特許文献１〜３）。実際に、全ての子供は、２歳までにＲＳＶに感染し、全感染小児の１〜２％は入院を必要とする（非特許文献１、４）。乳児および年少小児におけるＲＳＶ感染の大発生および下気道感染死は、強い相関関係を示し（非特許文献５）、入院した小児の死亡率は、米国およびカナダにおいて０．１〜１％である（非特許文献２、４、６〜８）。乳児期におけるＲＳＶ感染の結果は、細気管支炎または肺炎から小児喘息リスクの増加に及ぶ。
【０００４】
過去４０年にわたる熱心な努力にもかかわらず、ＲＳＶに対する安全かつ有効なワクチンは得られていない。ホルマリン不活性化および弱毒化生ウイルスを包含する初期のＲＳＶワクチン（非特許文献９に概説されている）は、残念なことに、非防御的であることが明らかになり、実際には、その後に自然ＲＳＶ感染を受けたワクチン接種小児においてより重篤な肺疾患を生じた。炎症性細胞浸潤を特に包含する免疫病理学的応答は、肺組織へのＲＳＶ媒介損傷の基礎になり得ると考えられる。ホルマリン不活化ＲＳＶワクチンを接種された小児は、高レベルのウイルス特異性抗体を生じたが、抗体は低レベルの中和活性を有し（非特許文献１０）、ＲＳＶによる感染に対して防御することができなかった（非特許文献１１〜１３）。
【０００５】
ＲＳＶワクチン開発に関する最近の努力は、サブユニットおよび組換え法に焦点を当てている。ＲＳＶは２つの主要な表面糖タンパク質（ＦおよびＧと称される）を有し、それらは潜在的ワクチンにおける使用が調査されている。Ｆタンパク質は、ウイルスと標的細胞との膜融合に関与し（非特許文献１５）、Ｇタンパク質は、細胞受容体へのウイルスの結合を媒介していると考えられる（非特許文献１６）。ＲＳＶ  ＦおよびＧタンパク質の両方は、強い血清および粘膜免疫を誘発し、これらはＲＳＶ感染に対する防御に重要である（非特許文献１、２、１７〜１９）。マウスを用いた研究は、ホルマリン不活化ＲＳＶおよびいくつかのＧタンパク質コード化ワクシニア組換え体が有害な肺炎症反応（その反応において、好酸球が顕著な関与物質である）を生じることを示している（非特許文献２０〜２５）。
【０００６】
好酸球および好酸球誘引サイトカインＩＬ−５は、いわゆる２型免疫反応の特徴であると考えられ、これは、ＲＳＶ抗原での免疫化が、特定のウイルス免疫原の種類およびそれらの提示経路（ｒｏｕｔｅ  ｏｆ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）のような要素に依存して２型反応を誘発する可能性を有するという考えを助長している（非特許文献２５〜２７）。最近の研究は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の保存領域の一部が、ＲＳＶに対する防御免疫、および好酸球増加の誘発を含む炎症反応の発生に関与していることを示している（非特許文献２８〜３２）。
【非特許文献１】Ｇｌｅｚｅｎら，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．，１９８６，１４０：５４３
【非特許文献２】Ｈｏｌｂｇｅｒｇら，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１９９１，１３３：１１３５
【非特許文献３】Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら，「Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９６，特に、第４４章，ｐ．１３１３−１３５１，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．，ＭｃＩｎｔｏｓｈ，Ｋ．およびＣｈａｎｏｃｋ，Ｒ．Ｍ．，「Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ」
【非特許文献４】Ｐａｒｒｏｔｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，１９７３，９８：２８９
【非特許文献５】Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９９０，１６１：６４０
【非特許文献６】Ｎａｖａｓら，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１９９２，１２１：３４８
【非特許文献７】Ｌａｗら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．，１９９３，１２：６５９
【非特許文献８】ＲｕｕｓｋａｎｅｎおよびＯｇｒａ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１９９３，２３：５０
【非特許文献９】Ｍｕｒｐｈｙら，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．，１９９４，３２：１３
【非特許文献１０】Ｍｕｒｐｈｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８６，２４：１９７
【非特許文献１１】Ｋｉｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１９６９，８９：４２２
【非特許文献１２】Ｋａｐｉｋｉａｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１９６９，８９：４０５
【非特許文献１３】Ｆｕｌｇｉｎｉｔｉら，Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．，１９６９，８９：４３５
【非特許文献１４】Ｃｈｉｎら，Ｖｉｒｏｌ．，１９６９，１：１
【非特許文献１５】ＷａｌｓｈおよびＨｒｕｓｋａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８３，４７：１７１
【非特許文献１６】Ｌｅｖｉｎｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９８７，６８：２５２１
【非特許文献１７】Ｇｌｅｚｅｎら，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．，１９８１，９８：７０８
【非特許文献１８】Ｌａｍｐｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９７６，１３４：２１１
【非特許文献１９】Ｈｅｍｍｉｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９５，８：２２
【非特許文献２０】Ｃｏｎｎｏｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９４，６８：５３２１
【非特許文献２１】Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９４，２：１４８
【非特許文献２２】Ｗａｒｉｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９６，７０：２８５２
【非特許文献２３】Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３，１５１：２０３２
【非特許文献２４】Ｂｅａｓｌｅｙら，Ｔｈｏｒａｘ，１９８８，４３：６７９
【非特許文献２５】Ｏｐｅｎｓｈａｗら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９２，４：４９３
【非特許文献２６】Ｋａｋｕｋら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９９３，１６７：５５３
【非特許文献２７】ＯｐｅｎｓｈａｗおよびＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｔｈｏｒａｘ，１９９４，４９：１０１
【非特許文献２８】Ｓｐａｒｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐｔ’ｌ．Ｍｅｄ．，１９９８，１８７：１９２１
【非特許文献２９】Ｔｅｂｂｅｙら，Ｊ．Ｅｘｐｔ’ｌ．Ｍｅｄ．，１９９８，１８８：１９６７
【非特許文献３０】Ｓｒｉｋｉａｔｃｈａｃｈｏｒｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，７３：６５９０
【非特許文献３１】Ｖａｒｇａら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，１６５：６４８７
【非特許文献３２】ＨｕａｎｇおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ，２００３，２１：２５００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、ＲＳＶ感染に対して治療的に有効な組成物、特に、関連した有害な肺炎症を伴わずに、またはそれを減少させて、防御免疫を誘発することによってワクチンとして作用し得る組成物を、同定し開発することが必要とされている。さらに、種々のＲＳＶ免疫原性サブタイプおよびサブグループ（ｓｕｂｇｒｏｕｐ）によって感染に対して防御するかまたは治療するために変化させることができるワクチン配合物も必要とされている。本発明は、そのような要求を満たし、関連した他の利益も与える。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（開示の要旨）
本発明は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するのに有用な、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫原、特にＧタンパク質免疫原の治療配合物の発見を開示する。
【０００９】
１つの局面において、本発明は、ＲＳＶ感染を治療または予防する方法を提供し、該方法は、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント（該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する）、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントおよび変異体に特異的な免疫反応を誘発するのに充分な用量で、それを必要とする被験体に投与することを含む方法である。関連した態様において、Ｇタンパク質免疫原は、配列番号２を含むかまたはそれから成るアミノ酸配列である。他の態様において、本発明は、Ｇタンパク質免疫原が配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０から選択されるアミノ酸配列を有する、呼吸器合胞体ウイルス感染の治療または予防法を提供する。さらに他の態様において、本発明は、該組成物が、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＦタンパク質免疫原またはＭタンパク質免疫原（該Ｆタンパク質およびＭタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する）をさらに含むかまたは少なくとも２つのＧタンパク質免疫原を含有する方法を提供する。
【００１０】
他の態様において、任意の前記Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体が、特にプロテオソームアジュバント送達賦形剤（ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅ）を使用して配合する場合に、疎水性部分または成分（例えば、膜またはプロテオソームまたはリポソームのような脂質環境においてアンカー（ａｎｃｈｏｒ）またはフット（ｆｏｏｔ）として機能する）をさらに含む。さらに他の態様において、疎水性成分が、アミノ酸配列または脂質を含む。ある態様において、キャリアはリポソームであり、他の態様において、リポソームはＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ脂質またはα−ガラクトシルホスホチジルグリセロールアルキルアミンを含有する。他の態様において、任意の前記組成物は、アジュバント、例えば、ミョウバン、フロイントアジュバント、またはプロテオソームに基づく配合物（例えば、プロテオソームアジュバント送達システム）をさらに含む。アジュバントは、ヒトにおける使用に適しているのが好ましい。他の態様において、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントおよび変異体は、融合タンパク質を形成するための第二アミノ酸配列をさらに含み、該第二アミノ酸配列は、標識（ｔａｇ）、酵素またはそれらの組合せ、例えば、ポリヒスチジン、チオレドキシンまたはそれらの両方であってよい。ある態様において、そのような融合タンパク質は、疎水性成分をさらに含んでよい。さらに他の態様において、任意の前記方法を、ＲＳＶ感染から生じたまたはそれに関連した免疫病理学的応答が好酸球増加症（例えば、肺好酸球増加症）または喘息である場合に使用する。さらに他の態様において、本発明は、感染がサブグループＡ、サブグループＢ、またはサブグループＡとサブグループＢの両方のＲＳＶによる場合に、任意の前記方法を使用する。関連した態様において、任意の開示組成物を、経腸、非経口、経皮、経粘膜、経鼻または吸入から選択される経路によって、任意の前記方法で投与し得る。
【００１１】
他の局面において、本発明は、前記の方法のいずれか１つの方法によって製造される複数の抗体、Ｔｈ細胞またはそれらの両方を提供する。１つの態様において、ＲＳＶ感染を治療または予防する方法を提供し、該方法は、それを必要とする被験体に、薬学的に受容可能なキャリアまたはプロテオソームアジュバント送達賦形剤および前記の複数の抗体を含む組成物を投与することを含む。
【００１２】
さらに他の局面において、プロテオソームアジュバント送達賦形剤と共に配合した呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントを含む組成物であって、該Ｇタンパク質免疫原が、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、該Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントが、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する組成物を提供する。他の態様において、組成物は、任意の前記Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体、融合タンパク質、多価融合体（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎｓ）、カクテル組成物またはそれらの任意の組合せ、および他の添加剤、たとえばアジュバントを含有する。いくつかの態様において、アジュバントは、ミョウバン、プロテオソームまたはプロトリンである。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の局面は、下記の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかである。
【００１４】
（詳細な説明）
前記のように、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス感染を治療または予防するために、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｇタンパク質免疫原を使用し製造する組成物および方法を提供する。ＲＳＶ再感染（即ち、攻撃）に対する防御は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質の種々の形態および免疫化法から成る以前のワクチンによって得られたが、これは、顕著な好酸球増加を特徴とする好ましくない有害な肺炎症を伴う場合が多かった。それに加えて、重篤なＲＳＶ疾患にかかりやすい被験者（例えば、月齢２〜７ヶ月のヒト被験者）の免疫化は、母系由来血清ＲＳＶ−中和抗体の推定される免疫抑制作用によるか、または被験者の免疫学的未熟により、困難である。従って、本発明は一般に、特定のＲＳＶ  Ｇタンパク質フラグメントを修飾して、ＲＳＶに対する防御免疫を誘発または惹起することができ、後のＲＳＶでの感染時に例えば肺炎症および重篤疾患を生じる不随免疫病理学的事象を誘発しないかまたはそれを減少させることができるという意外な発見に関する。特に、これらのＧタンパク質免疫原は、ＲＳＶに関わる感染を治療または予防するのに有用である。本発明の使用に好適なＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントおよび変異体、ならびに代表的組成物および治療的使用について、以下に詳しく記載する。
【００１５】
本発明の開示において、あらゆる濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲または整数範囲は、特に指定しなければ、記載されている範囲内の任意の整数値、および適切な場合にその分数（例えば、整数の１／１０および１／１００）を包含するものと理解される。本明細書に使用される「約」または「から基本的に成る」という語句は、±１５％を意味する。選択肢（例えば「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方またはそれらの任意組合せを意味するものと理解すべきである。さらに、本明細書に記載されている配列、構造および置換基の種々の組合せから誘導される個々の化合物または化合物群は、各化合物または化合物群が個々に開示されているのと同じ程度に、本出願によって開示されているものと理解すべきである。従って、特定の配列、構造または置換基の選択は、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
（ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原）
本発明は一般に、他のポリペプチド（例えば、標識、他のタンパク質、疎水性アミノ酸配列、またはそれらの任意組合せ）への融合または他の修飾（例えば、脂質の付加、またはグリコシル化）を含む、Ｇタンパク質またはそのフラグメントおよび変異体の免疫原性ＲＳＶポリペプチド免疫原に関する。免疫原性Ｇポリペプチドは、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて、ＲＳＶ感染に対する防御免疫応答を誘発することができるエピトープを有するＧタンパク質の、任意の部分またはフラグメントを含んでよい。本発明の免疫原性ポリペプチドは、線形に配列または結合してよく、各免疫原は反復してもしなくてもよく、該反復は１回または複数回存在してよい。さらに、複数の種々のＲＳＶ免疫原性ポリペプチド（例えば、種々のＧタンパク質、Ｆタンパク質またはＭタンパク質変異体およびそのフラグメントまたはその変異体）を選択し、混合するかまたは組み合わせてカクテル組成物にするか、または融合、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）または連結させて、有害な不随免疫反応を生じずに防御免疫応答を誘発するのに使用される多価ワクチンを提供することができる。
【００１７】
本明細書に使用される「Ｇタンパク質免疫原」または「ＲＳＶ免疫原」は、本明細書に記載されるように、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて、ＲＳＶ感染に対する防御免疫応答を誘発することができる、全ての全長ポリペプチド、全長変異体、フラグメントおよびその変異体、多価融合体、カクテル組成物、融合タンパク質、またはそれらの任意組合せを意味する。
【００１８】
本発明はさらに、融合タンパク質を包含する合成または組換え多価ＲＳＶポリペプチド免疫原を製造する方法も提供する。例えば、Ｇタンパク質免疫原コード化核酸発現構造物を含有する宿主細胞を培養して、組換えＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体を製造し得る。さらに、Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体、またはポリペプチドの組合せ（融合タンパク質を包含する）を使用して、ＲＳＶ感染を治療または予防するか、または免疫反応を誘発する方法も意図する。
【００１９】
本明細書に使用される「免疫病理学的応答」という語句は、検出可能な臨床症候を有するかまたは有さない、免疫反応から生じる症状または疾患を意味する。例示的免疫病理学的応答は、過敏症または喘息を包含する。他の例示的免疫病理学的応答は、アレルギー状態または微生物感染（例えば、寄生虫感染または呼吸器合胞体ウイルス感染）の特徴である、血液好酸球増加または肺浸潤性好酸球増加に見られるような、２型サイトカインに応答した顆粒球の非定型誘発である。
【００２０】
理論に縛られるものではないが、背景として、ＲＳＶは、少なくとも１０のウイルスタンパク質（Ｇ、Ｆ、ＳＨ、Ｍ、Ｍ２、Ｎ、Ｐ、Ｌ、ＮＳ１およびＮＳ２）をコードする、負の向きの（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｓｅ）、非セグメント化、一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ＲＳＶは２つの主要な表面糖タンパク質（ＦおよびＧと称される）有し、これらは潜在的ワクチンにおける使用に関して調査されている。Ｆタンパク質は、ウイルスと標的細胞との膜融合に関与し（ＷａｌｓｈおよびＨｒｕｓｋａ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４７：１７１，１９８３）、Ｇタンパク質は、細胞受容体へのウイルスの結合を媒介していると考えられる（Ｌｅｖｉｎｅら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：２５２１，１９８７）。ＲＳＶ  ＦおよびＧタンパク質の両方は、強い血清および粘膜免疫を誘発し、これらはＲＳＶ感染に対する防御に重要である（Ｇｌｅｚｅｎら，１９８６；Ｈｏｌｂｅｒｇら；Ｇｌｅｚｅｎら，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．９８：７０８，１９８１；Ｌａｍｐｒｅｃｈｔら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１３４：２１１，１９７６；Ｈｅｍｍｉｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．８：２２，１９９５）。マウスを用いた研究は、ホルマリン不活化ＲＳＶおよびいくつかのＧタンパク質コード化ワクシニア組換え体が有害な肺炎症反応（その反応において、好酸球が顕著な関与物質である）を生じることを示している（Ｃｏｎｎｏｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：５３２１，１９９４；Ｄｏｈｅｒｔｙ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：１４８，１９９４；Ｗａｒｉｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２８５２，１９９６；Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２０３２，１９９３；Ｂｅａｓｌｅｙら，Ｔｈｏｒａｘ  ４３：６７９，１９８８；Ｏｐｅｎｓｈａｗら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：４９３，１９９２）。本発明の意外な結果は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するＧタンパク質免疫原（例えば、野生型Ｇタンパク質の変異体または突然変異体；例示的野生型Ｇタンパク質は配列番号４に示され、それは、配列番号３に示すような核酸配列によってコードすることができる）の同定である。従って、本発明の特定の態様において、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントを使用して、ＲＳＶ感染を治療または予防するのに有用な組成物を製造する。
【００２１】
特定の態様において、ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原は、配列番号２（ＲＳＶ  Ａ群、Ｌｏｎｇ株；配列番号１は、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列である）に示す全長Ｇタンパク質突然変異体、または配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０に示すそのフラグメントの、アミノ酸配列に、少なくとも５０％〜１００％のアミノ酸同一性、好ましくは６０％〜９９％の同一性、より好ましくは７０％〜９７％の同一性、最も好ましくは８０％〜９５％の同一性を有し、Ｇタンパク質免疫原変異体は、免疫病理学的応答（例えば、好酸球増加）を誘発せずに、またはそれを減少させて、ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを保持している。本明細書に使用される「パーセント同一性」または「％同一性」は、一般にデフォルトパラメーターと共に（ｗｉｔｈ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）、コンピューター実行アルゴリズム（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、対象ポリペプチド、ペプチドまたはその変異体の配列の全てを、試験配列と比較することによって求められるパーセント値である。
【００２２】
好ましい態様において、Ｇタンパク質免疫原は、点突然変異を有する野性型Ｇタンパク質の変異体であり、それにおいて、例えば位置１９１（Ａｓｎ）における、アミノ酸が、Ａｌａに変化し（配列番号２および図３参照；Ｇタンパク質Ｎ１９１Ａとも称される）、より好ましい態様において、Ｇタンパク質免疫原変異体は、全長Ｇタンパク質のフラグメントである。例えば、そのようなＧタンパク質フラグメントは、アミノ酸約１２８〜アミノ酸約２２９を含み、該フラグメントはＮ１９１Ａ突然変異を有する（配列番号６）。他の態様において、Ｇタンパク質変異体はアミノ酸１２８〜２２９にわたり、該変異体は、Ｐ１９０ＡおよびＮ１９１Ａ（配列番号５６）またはＲ１８８ＡおよびＮ１９１Ａ（配列番号５８）のような二点突然変異を有する。本発明に使用される他の点突然変異は、位置１７８（配列番号６０）および１７９（配列番号６２）におけるＡｓｎ、および位置１９６（配列番号６４）、１９７（配列番号６６）、２０４（配列番号６８）または２０５（配列番号７０）におけるＬｙｓの点突然変異を包含する。
【００２３】
本明細書に記載する代表的なＧタンパク質免疫原変異体はＡｌａ置換を有するが、本発明はそれに限定されず、当業者は、他のアミノ酸を置換に使用し得ることを理解する。さらに、本発明の変異体免疫原は、１つまたはそれ以上の種々の突然変異、例えば、点突然変異、フレームシフト突然変異、ミスセンス突然変異、付加、欠失などを有するように製造することができ、または変異体は、例えば、グリコシル化、アルキル化等を包含する特定の化学置換による、修飾の結果であってもよい。本発明の各変異体は、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答（例えば、好酸球増加）を減少させて、ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘発できることが好ましい。
【００２４】
本明細書に記載するように、ＲＳＶ  Ａ群またはＢ群に由来するＧタンパク質の好ましいフラグメントは、ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘発し、減少した免疫病理学的応答を誘発するか、または免疫病理学的応答を誘発できない少なくとも１つのエピトープを保持している免疫原である。特定の態様において、免疫原フラグメントまたはその変異体（例えば、Ｎ１９１Ａ突然変異）は、配列番号２のアミノ酸約１２０〜アミノ酸約３００、好ましくはアミノ酸約１２５〜アミノ酸約２５０、より好ましくはアミノ酸約１５０〜アミノ酸約２２５、最も好ましくはアミノ酸約１６５〜アミノ酸約１９５にわたるアミノ酸配列において、野生型Ｇタンパク質からの突然変異または変異を有する。１つの態様において、Ｇタンパク質免疫原フラグメントがアミノ酸１２８〜２２９を有し、突然変異は、Ｇタンパク質のアミノ酸約１７８〜約２０５の範囲に見出すことができる。
【００２５】
配列比較は、任意の標準ソフトウエアプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ｔＢＬＡＳＴ、ｐＢＬＡＳＴまたはＭａｇＡｌｉｇｎを使用して行うことができる。その他には、ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって製造されているＬａｓｅｒｇｅｎｅバイオインフォーマティックスコンピューティングスイートにおいて提供されるソフトウエアプログラムを包含する。ＡＬＩＧＮまたはＢＬＡＳＴのようなアルゴリズムについての記載は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５−５６５，１９９１；またはＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２  に見出される。ＢＬＡＳＴはＮＣＢＩウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）で利用できる。至適配列を決定することによって多数のヌクレオチドまたはアミノ酸配列を比較する他の方法は、当業者に既知である（参照：例えば、ＰｅｒｕｓｋｉおよびＰｅｒｕｓｋｉ，Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；Ｗｕら編，「Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｕｐｅｒｈｉｇｈｗａｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｍｅｔｈｏｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐ．１２３−１５１（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９７）；および、Ｂｉｓｈｏｐ編，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９９８）。
【００２６】
本明細書に使用される２つのペプチドまたはポリペプチドの「類似度」は、１つのペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列を、第二ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存アミノ酸置換基と比較することによって、一般に決定される。本発明のＧタンパク質免疫原またはその変異体のフラグメントまたは部分は、ペプチド合成によって対応する全長Ｇタンパク質免疫原を製造するのに使用でき；従って、フラグメントは、全長Ｇタンパク質免疫原を製造するための中間体として使用し得る。同様に、本発明の核酸のフラグメントまたは部分を使用して、本発明の全長核酸を合成し得る。
【００２７】
本明細書に記載されるように、本発明のＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する。フラグメントおよび変異体は、当分野で既知の生体内および生体外アッセイ、例えば、動物免疫化試験（例えば、マウスまたはウサギモデルを使用）およびウエスタンイムノブロット分析およびそれらの組合せを使用して、同定し得る。他の例は、本発明のＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体が、免疫反応、特に防御（中和）免疫反応を誘発し得るかを評価するプラーク減少アッセイ（ｐｌａｑｕｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ）である。簡単に言えば、皮下投与によって、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原またはその組成物で動物を免疫化し、血清を免疫化動物から収集し、次に、細胞培養単層のＲＳＶ感染を阻害する能力について、血清を試験する（感染は、形成されたプラークの数として測定される；即ち、細胞を溶解させるＲＳＶによって生じる単層における「穴」）（例えば、実施例８参照）。さらに、変化した（減少または強化した）免疫病理学的応答は、例えば、本発明のＧタンパク質免疫原で免疫化した後にＲＳＶで攻撃した動物におけるサイトカイン発現パターンを調査することによって、直接的に同定できる。例えば、本発明のＧタンパク質免疫原での免疫化およびその後のＲＳＶでの攻撃後に１型または２型反応が優勢であるかを推定するリボヌクレアーゼ防御アッセイ（ＲＰＡ）を使用して、特定のサイトカインレベルを関心のある組織において測定できる（実施例９参照）。これらおよび当業者に既知の他のアッセイを使用して、本発明に記載するような、免疫病理学的応答を誘発せずにまたは免疫病理学的応答を減少させて防御免疫応答を誘発する少なくともエピトープを有するＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体を同定することができる。
【００２８】
本発明のＲＳＶ  Ｇタンパク質ポリペプチド、そのフラグメント、およびその融合タンパク質、ならびに対応する核酸は、好ましくは分離形態で提供され、特定の好ましい態様においては、精製して均質にされる。本明細書に使用される「分離された」という用語は、物質をその原環境または自然環境から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物または細胞に存在する天然核酸分子またはポリペプチドは分離されていないが、自然系におけるいくつかのまたは全ての共存物質から分離されている場合に、同じ核酸分子またはポリペプチドは分離されている。核酸分子は、例えば、ベクターの一部であってよく、そして／または、そのような核酸またはポリペプチドは組成物の一部であってよく、そして、そのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部でないという点で、やはり分離されている。
【００２９】
本発明は、合成的にまたは組換え的に、好ましくは組換え的に製造されたＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体にも関する。免疫原の免疫原性ポリペプチド成分は、自動化手順による合成を包含する標準合成法によって合成し得る。一般に、免疫原性ペプチドは、ＨＡＴＵをカップリング剤として使用して、固相Ｆｍｏｃ保護法に基づいて合成される。免疫原性ペプチドは、側鎖官能基も脱保護する適切なスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸を使用して、固相樹脂から開裂される。分取逆相クロマトグラフィーによって、粗免疫原ペプチドをさらに精製する。他の精製法、例えば、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動法、またはイオン交換クロマトグラフィーを使用し得る。ｔＢｏｃ保護法、種々のカップリング試薬の使用等のような、当分野で既知の他の合成法を使用して、同様の免疫原性ペプチドを製造し得る。さらに、Ｄ−またはＬ−アミノ酸およびそれらの組合せを包含する任意の天然アミノ酸またはその誘導体も使用し得る。特に好ましい態様において、本発明の合成Ｇタンパク質免疫原は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。
【００３０】
本明細書に記載するように、特定の態様のＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体を組換えてもよく、それにおいて、核酸発現構造物中の発現制御配列（例えば、プロモータ）に操作可能に連結されたポリヌクレオチドから、所望のＧタンパク質免疫原を発現させる。特に好ましい態様において、組換えＧタンパク質免疫原は、配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの好ましい組換えＧタンパク質免疫原は、配列番号２のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２に示されるアミノ酸配列だけから成る。より好ましくは、組換えＧタンパク質免疫原およびその変異体は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０に示すアミノ酸配列を含み、より好ましくは、配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、組換えＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体は、免疫生理学的反応を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する。
【００３１】
「核酸」または「核酸分子」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生じるフラグメント、およびライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかによって生じるフラグメントのいずれかを意味する。核酸は、天然ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）、天然ヌクレオチドの類似体（例えば、天然ヌクレオチドのα−鏡像異性形）、またはそれら両方の組合せであるモノマーから成ってよい。修飾ヌクレオチドは、糖成分および／またはピリミジンまたはプリン塩基成分において、修飾を有することができる。糖修飾は、例えば、１つまたはそれ以上のヒドロキシル基の、ハロゲン、アルキル基、アミンおよびアジド基での置換を包含し、または糖をエーテルまたはエステルとして官能化することができる。さらに、糖成分全体を、立体的および電子的に類似した構造物、例えばアザ糖および炭素環式糖類似体で置換してよい。塩基成分における修飾の例は、アルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンおよびピリミジン、および他のよく知られた複素環式置換基を包含する。核酸モノマーを、ホスホジエステル結合またはそのような結合の類似物によって連鎖させることができる。ホスホジエステル結合の類似物は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデート等を包含する。「核酸」という用語は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、それは、ポリアミド主鎖に結合した天然または修飾核酸塩基を有する。核酸は一重基準あるいは二重基準になることができる。
【００３２】
さらに、「分離核酸分子」は、その起源細胞（それが通常存在する染色体を包含する）から、少なくとも一度、実質的に純粋な形態で分離された、分離フラグメントの形態の、またはより大きい核酸構造物の成分としての、ポリヌクレオチド分子を意味する。例えば、ＲＳＶ粒子から、またはＲＳＶで感染されたかまたはそれを含んでいる宿主細胞から分離された、ＲＳＶポリペプチド、ペプチドまたはその変異体をコードするＤＮＡ分子は、分離ＤＮＡ分子である。分離核酸分子の他の例は、化学的に合成された核酸分子である。核酸分子は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド類似体またはそれらのある組合せを包含する種々のヌクレオチドから成ってよい。１つの態様において、分離核酸分子は、配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントをコードする配列を含み；該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する。他の態様において、分離核酸分子は、配列番号２を含むかまたはそれから成るアミノ酸配列を有するＧタンパク質免疫原をコードする配列を含む。他の態様において、分離核酸分子は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０に示すアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を含むＧタンパク質免疫原フラグメントをコードする配列を含む。
【００３３】
特定の局面において、本発明は、本発明の核酸配列を含有する核酸ベクターおよび構造物、特に、前記のＲＳＶポリペプチドおよびそのフラグメントまたは変異体をコードする任意ポリヌクレオチドを含有する「核酸発現構造物」に関する。他の局面において、本発明は、本発明のベクターまたは構造物で遺伝子操作した宿主細胞、およびその製造、およびＲＳＶ感染を治療または予防するかまたは免疫反応を誘発する方法におけるその使用に関する。ＲＳＶペプチドおよびそのフラグメントまたは変異体は、適切な発現制御配列の制御下に、哺乳動物細胞、酵母、細菌または他の細胞において発現し得る。無細胞トランスレーションシステムによって、本発明の核酸発現構造物から誘導されたＲＮＡを使用して、そのようなタンパク質を製造してもよい。原核生物および真核生物宿主と共に使用される適切なクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）  に記載されており、プラスミド、コスミド、シャトルベクター、ウイルスベクター、および本明細書に開示される複製の染色体源を含むベクターを包含する。
【００３４】
１つの態様において、核酸発現構造物は、配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有するＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した発現制御配列を有し；該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する。特定の態様において、核酸発現構造物は、配列番号２を含むかまたはそれから成るアミノ酸配列を有するＧタンパク質免疫原をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した発現制御配列を有する。他の態様において、核酸発現構造物は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０に示すアミノ酸配列、より好ましくは、配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を含むＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した発現制御配列を有する。
【００３５】
他の態様において、本明細書に記載する核酸発現構造物は、誘発性プロモータを有し、それは、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｔｒｐ、λファージ、Ｔ７ファージおよびＴ５ファージプロモータであってよく、より好ましくは、米国特許出願公開第２００３／０１４３６８５号に開示されているＴ５ファージプロモータ／ｌａｃ  オペレータ発現制御配列（プラスミドｐＴ５）である。「発現制御配列」は、宿主細胞において、関心のあるタンパク質の発現を可能にするのに充分なあらゆる配列を意味し、１つまたはそれ以上のプロモータ配列、エンハンサー配列、オペレータ配列（例えば、ｌａｃＯ）等を含有する。特定の態様において、ＲＳＶポリペプチドをコードする核酸が、プラスミド、好ましくはプラスミドｐＴ５中にあり、宿主細胞は細菌、好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである。
【００３６】
種々の病原体の抗原をコードする遺伝子輸送媒介物（ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｈｉｃｌｅｓ）（例えば裸ＤＮＡ）のヒトへの注入は、防御免疫応答を生じることが示されている（Ｕｌｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−９，１９９３；Ｂｏｕｒｎｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７３：８００−７，１９９６；Ｈｏｆｆｍａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１５２９−３３，１９９４）。筋肉組織に注射された裸ＤＮＡからの異種タンパク質の生体内発現が最初に記載されてから（Ｗｏｌｆｆら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−８，１９９０）、ワクチン接種のためのＤＮＡの設計および輸送においていくらか進歩が見られる。
【００３７】
抗体が最終的に防御免疫を確立するので、本明細書に記載するＲＳＶワクチンは、裸ＤＮＡによる輸送に適しているのが理想的である。例えば、１つの態様において、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞発現用に特に操作されたプラスミドに連結させる（参照：例えば、Ｈｏｒｔｉｋｋａら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：１２０５−１７，１９９６；これは、サイトメガロイルス初期遺伝子からのプロモータ／エンハンサー成分、ヒト組織プラスミノゲン活性化因子からのシグナルペプチド、およびウシ成長ホルモン遺伝子からのテーミネター成分を含有する）。ＲＳＶポリペプチドをプラスミドにクローン化し、これを使用してヒト細胞系をトランスフェクションして、組換えタンパク質発現を確実にする。プラスミドをＥ．Ｃｏｌｉのような細菌中で増殖させ、免疫化試験に充分な量で塩化セシウム勾配遠心分離によって精製し得る。マウスのような動物を、例えば、生理食塩水５０μＬ中の分離組換えプラスミド５０μｇで、筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫化することができる。初期注射から３週間および６週間の間隔で、同じ用量のブースター注射をさらに行ってよい。
【００３８】
他の種々の遺伝子輸送媒介物も本発明に使用することができ、それは、ウイルス、レトロトランスポソンおよびコスミドを包含する。代表的な例は、下記のものを包含する：アデノウイルスベクター（例えば、ＷＯ  ９４／２９１４、ＷＯ  ９３／９１９１；Ｙｅｉら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１９２−２００，１９９４；Ｋｏｌｌｓら，ＰＮＡＳ  ９１（１）：２１５−２１９，１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら，ＰＮＡＳ  ９０（２４）：１１４９８−５０２，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８（６）：２８３８−４８，１９９３；Ｇｕｚｍａｎら，Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３（６）：１２０２−１２０７，１９９３；Ｚａｂｎｅｒら，Ｃｅｌｌ  ７５（２）：２０７−２１６，１９９３；Ｌｉら，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４（４）：４０３−４０９，１９９３；Ｃａｉｌｌａｕｄら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（１０）：１２８７−１２９１，１９９３）、アデノ関連１型（「ＡＡＶ−１」）またはアデノ関連２型（「ＡＡＶ−２」）ベクター（ＷＯ  ９５／１３３６５；Ｆｌｏｔｔｅら，ＰＮＡＳ  ９０（２２）：１０６１３−１０６１７，１９９３参照）、デルタ肝炎ベクター、生、弱毒化デルタウイルスワクシニアベクターおよびヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，２８８，６４１号）ならびに米国特許第５，１６６，３２０号に開示されているベクター。他の代表的なベクターは、レトロウイルスベクター（例えば、ＥＰ  ０４１５７３１；ＷＯ  ９０／０７９３６；ＷＯ  ９１／０２８０５：ＷＯ  ９４／０３６２２；ＷＯ  ９３／２５６９８；ＷＯ  ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ  ９３／１１２３０；ＷＯ  ９３／１０２１８）を包含する。遺伝子治療におけるそのようなベクターの使用法は、当分野でよく知られている（参照：例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．およびＢｕｒｃｋ，Ｋ．Ｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＫｒｅｉｇｌｅｒ，Ｍ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）。
【００３９】
遺伝子輸送媒介物は、媒介物を使用するか、または種々の物理的方法によって、宿主細胞に導入し得る。そのような方法の代表的な例は、下記の方法である：燐酸カルシウム沈降を使用するトランスフォーメーション（Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、ＰＮＡＳ  ８１：７５２９−７５３３，１９８４）、そのような核酸分子の無処置標的細胞への直接マイクロインジェクション（Ａｃｓａｄｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１５−８１８，１９９１）、およびエレクトロポレーション（それにより、導電溶液に懸濁した細胞を、強電場に暴露して膜を過渡的に分極して、核酸分子の侵入を可能にする）。他の方法は、下記のものを使用する方法を包含する：不活性アデノウイルスに結合した核酸分子（Ｃｏｔｔｏｎら，ＰＮＡＳ  ８９：６０９４，１９９０）、リポフェクション（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７，１９８９）、微粒子銃（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，ＰＮＡＳ  ８８：２７２６−２７３０，１９９１）、ポリカチオン化合物（例えばポリリシン）、受容体特異性リガンド、核酸分子を包括しているリポソーム、スフェロプラスト融合（それにより、核酸分子を含有するＥ．ｃｏｌｉから外細胞壁を剥離し、ポリエチレングリコールを使用して動物細胞に融合させる）、ウイルストランスダクション（Ｃｌｉｎｅら，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９，１９８５；およびＦｒｉｅｄｍａｎｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５，１９８９）、およびＤＮＡリガンド（Ｗｕら，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）、ならびにセンダイまたはアデノウイルスのようなソラレン不活性化ウイルス。
【００４０】
ＲＳＶポリペプチド免疫原およびそのフラグメントまたは変異体、およびその融合体を含有する遺伝子輸送媒介物で免疫化した被験体からの血清を、天然ＰＳＶポリペプチドを抗原として使用するＥＬＩＳＡによって、全抗体滴定量について分析することができる。血清防御抗原は、本明細書に記載のように、または当分野で既知であるように、分析し得る。ＤＮＡ  ＲＳＶポリペプチドワクチンの防御効力は、例えば、医薬組成物またはワクチンにおいて示されるＲＳＶ血清型を使用する（即ち、攻撃感染試験）直接的動物防御アッセイ（即ち、攻撃感染試験）によって、測定することができる。
【００４１】
当業者によって理解されるように、ＲＳＶポリペプチドをコードする核酸は、例えば遺伝暗号の縮重による、自然配列の変異体であってよい（相同形または株（ｓｔｒａｉｎ）変異体または他の変異体を包含する）。簡単に言えば、「変異体」は、自然多型性から生じ得るか、または組換え法（例えば、特定宿主における発現のために、コドン至適化を得るため）または化学合成によって合成でき、１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、欠失等により、野生型ポリペプチドと異なってよい。保存的アミノ酸置換を含む変異体は、例えば、１つの脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸への置換（例えば、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）または１つの極性残基の別の極性残基への置換（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、またはＧｌｎとＡｓｎ）を包含する。そのような置換は、類似した物理的性質、構造的特性および機能的活性、例えば、類似抗体（例えば、野生型Ｇタンパク質に特異的に結合する抗体）を誘発しそれと交差反応を有する能力、を有する変異体を生じることは当分野でよく知られている。他の変異体は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０に対して少なくとも５０％〜１００％のアミノ酸同一性を有するＧタンパク質免疫原フラグメントをコードする核酸配列を有する。好ましい態様は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０のアミノ酸配列との９０％または９５％より以上の同一性を有する変異体である。
【００４２】
特定の態様において、本発明は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０に示すアミノ酸配列を有するＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体をコードし、機能的活性を保持している（例えば、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する）、任意の前記縮重核酸分子を含む。他の局面において、ＲＳＶポリペプチド変異体が１つまたはそれ以上のＲＳＶ株に特異的な抗体を誘発し得る少なくとも１つのエピトープを保持する（野生型から）かまたは有するような、保存的アミノ酸置換または欠失または置換を有するＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体をコードする核酸分子を意図する。
【００４３】
特定の局面において、核酸配列を修飾して、核酸配列の特定コドンが特定宿主に好ましいコドンに変化され、高レベルの発現を生じることができるＲＳＶ免疫原またはその機能変異体をコードし得る（例えば、Ｈａａｓら，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：３１５，１９９６；Ｙａｎｇら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４５９２，１９９６参照）。例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおける発現増加のために、ペプチドの一次配列を変化させずに、免疫原性ペプチドの特定コドンを至適化することができる。例示するものであって、限定するものはないが、ＡＧＧ／ＡＧＡのアルギニン（Ａｒｇ）コドンを、ＣＧＴ／ＣＧＣのＡｒｇコドンに変化させることができる。同様に、ＡＧＧ／ＡＧＡ  Ａｒｇコドンを、ＣＧＴ／ＣＧＣコドンに至適化することができる。当分野で知られているように、Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体が発現される宿主（細菌、真菌、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞を包含する）のために、コドンを至適化し得る。さらに、種々のアミノ酸をコードするコドンを変化させてもよく、その場合、特定宿主に最も適合するように、種々のアミノ酸をコードする１つまたはそれ以上のコドンを同時に変化させてよい（例えば、アルギニン、グリシン、ロイシンおよびセリンのコドンを全て至適化するか、またはそれらの任意組合せを至適化してよい）。細菌における発現のために至適化したコドンを有する例示的核酸配列は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１および配列番号３３に示す配列を有する。これらの核酸配列は、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４にそれぞれ示す、Ｇタンパク質免疫原フラグメント融合タンパク質（即ち、チオレドキシンまたはヘキサヒスチジン標識に融合している）をコードする。または、コドン至適化は、一次アミノ酸配列における１つまたはそれ以上の変化、例えば、保存的アミノ酸置換、付加、欠失およびそれらの組合せを生じ得る。
【００４４】
ＲＳＶ免疫原をコードする分離核酸の特定の態様を配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７または配列番号６９に示すが、本発明の開示において、１つまたはそれ以上の分離核酸についての記載は、これらの配列の変異体を包含し、該変異体は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０のＲＳＶポリペプチドに含有される少なくとも１つのＧタンパク質エピトープに類似した構造を有し、それに対する特異的抗体を誘発する類似した機能的能力を有する天然または非天然ＲＳＶポリペプチドをコードするという点で実質的に類似している。本明細書に使用されるヌクレオチド配列は、下記の場合に「実質的に類似している」と考えられる：（ａ）ヌクレオチド配列が、ＲＳＶ  Ｇタンパク質遺伝子（例えば、本明細書に記載する配列の部分または配列の相同異形を包含する）のコード領域から誘導され、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発する実質的に同じ能力を有するＧタンパク質エピトープを含有する場合；（ｂ）ヌクレオチド配列が、中度または高度厳密条件下に、本発明のヌクレオチド配列にハイブリダイゼーションすることができる場合；（ｃ）遺伝暗号の結果として、ヌクレオチド配列が縮重して（即ち、異なるコドン配列を使用して同じアミノ酸をコードする配列）、（ａ）または（ｂ）に定義されるヌクレオチド配列に生じる場合；または（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に定義されるいずれかの配列に相補的である場合。
【００４５】
本明細書に使用されるように、実質的に相補的な核酸配列間に安定なハイブリッドが形成される場合、２つのヌクレオチド配列は、特定厳密条件下に「バブリダイズしている」と考えられる。ハイブリダイゼーションの厳密性は、ハイブリッドをアニールし洗浄する際の環境（即ち、アニールしたハイブリッドが、ハイブリダイズした状態またはアニールした状態を維持する条件）を説明するものであり、変化するイオン強度および温度を一般に包含する。ハイブリダイゼーションに作用し得る他の要因は、ハイブリッドを形成させるプローブの大きさおよび時間を包含する。例えば、「高度」、「中度」、「低度」厳密性は、下記の条件またはそれと同等の条件を包含する：高度厳密性は０．１×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり；中度厳密性は０．２×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃であり；低度厳密性は１．０×ＳＳＰＥまたはＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、５０℃である。本明細書に使用される「高度厳密条件」は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみ、１つまたはそれ以上の配列がハイブリダイズされた状態を維持することを意味する。好ましい態様において、Ｇタンパク質免疫原をコードする核酸分子にバイブリダイズした状態を維持する核酸配列は、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０のいずれか１つのＧタンパク質免疫原の少なくとも１つのエピトープを保持し、免疫病理学的応答を示さずに、または免疫病理学的応答を減少させて、防御免疫応答を誘発する実質的に同じ能力を有するエピトープを有する。
【００４６】
本発明のＲＳＶポリペプチドを製造する方法も提供し、該方法において、本明細書に記載する任意の核酸分子および宿主細胞を使用し得る。好ましい態様において、Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体（免疫病理学的応答を示さずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを有する）を製造する方法は、ＲＳＶポリペプチド、例えば、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０のいずれか１つに示すＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体をコードする核酸分子に操作可能に連結された少なくとも１つの発現制御配列を含む核酸発現ベクターを含有する縮主細胞を、ポリペプチドの発現に充分な条件および時間において、培養することを含む。１つの態様において、ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体をこの方法で製造し、より好ましくは、製造されたＲＳＶポリペプチドが、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０に示すアミノ酸配列を含み、さらに好ましくは、製造されたＲＳＶポリペプチドが、配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を含む。
【００４７】
特定の態様において、多価ワクチンが考えられる。例えば、そのような多価組成物は、２つまたはそれ以上の種々のＧタンパク質免疫原の組合せ、または１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原と１つまたはそれ以上の他のＲＳＶ免疫原（例えば、Ｆタンパク質またはＭタンパク質免疫原）との組合せを含んでよい。抗原の組合せは、カクテル（即ち、複数の異なる免疫原の混合物）として配合するか、またはその組合せは、接合、連結または融合させた（化学的または組換え的に）複数の異なる免疫原であってもよい。さらに、融合免疫原は、多価融合タンパク質内で少なくとも１回反復している１つまたはそれ以上の免疫原を有してよく、該反復は、選択された多価免疫原ポリペプチドのアミノ末端、カルボキシ末端、内部位置、多位置、またはそれらの任意組合せに存在してよい。例えば、そのような多価ハイブリッドＲＳＶ免疫原は、Ｇタンパク質の１つまたはそれ以上のペプチドフラグメント、およびＲＳＶのＦタンパク質またはＭタンパク質の１つまたはそれ以上のペプチドフラグメント、およびそれらの任意組合せを含んでよい。特定の態様において、そのような多価ハイブリッドＲＳＶ免疫原ワクチン組成物は、種々のＲＳＶ抗原群からの免疫原性エピトープ、例えば、サブグループＡウイルス（例えば、ＬｏｎｇおよびＡ２）またはサブグループＢウイルス（例えば、ＣＨ−１８５３７および８／６０）からの免疫原、またはサブグループＡおよびＢウイルスの両方からの免疫原（または、例えばヒトに感染すること見出されている他のあらゆるＲＳＶサブグループ）を組み合わしてよい。
【００４８】
いくつかの態様において、ＲＳＶ免疫原を、例えば、制限酵素認識部位である核酸配列によってコードされる少なくとも２つのアミノ酸によって連結してよく、該制限部位は、ＢａｍＨＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩ等のいずれか１つまたはそれ以上であってよい。当分野において既知であり、本明細書に記載するように、付加的アミノ酸リンカーも合成的に付加してよい。好ましくは、付加的アミノ酸は、ヒトタンパク質の５アミノ酸ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む配列においていかなる同一性も形成せず、それによって、ヒト組織交差反応抗体を誘発する可能性を最小限にする。さらに、本発明のハイブリッドポリペプチドは、少なくとも１つの付加的カルボキシ末端アミノ酸をさらに含んでよく、該付加的アミノ酸はＤ−またはＬ−アミノ酸である。２０の天然アミノ酸またはその誘導体のずれか、例えば、システイン、ヒスチジン、ロイシンおよびグルタミン酸を添加し得る。例えば、システインの添加は、脂質、キャリアタンパク質、標識、酵素等のような他の成分を結合させる（例えば、酵素的に、または化学架橋よる）のに有用な場合がある。
【００４９】
本明細書に記載するように、本発明は、ＲＳＶ免疫原融合タンパク質も提供し、該融合タンパク質は、例えば、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質の検出、分離および精製を可能にする、付加的な機能性または非機能性ポリペプチド配列に融合した、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントを含む。例えば、付加的な機能性ポリペプチド配列は標識配列であってよく、それは、特定の態様において、タンパク質−タンパク質親和（例えば、受容体−リガンド）、金属親和または電荷（ｃｈａｒｇｅ）親和法によって検出、分離または精製される融合タンパク質を包含する。他の特定の態様において、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質を、プロテアーゼ認識配列を含む配列を有する融合タンパク質の特異的プロテアーゼ開裂によって検出でき、それによって、ハイブリッドポリペプチドを付加的ポリペプチド配列から分離し得る。さらに、融合タンパク質のアミノ末端、カルボキシ末端または内部位置（非末端）に存在し得る付加的アミノ酸、キャリアタンパク質、疎水性部分または成分（例えば脂質）または標的配列を含むハイブリッドポリペプチドを、合成的に製造し得る。特に好ましい態様において、例えば、組換えＲＳＶ免疫原を標識にインフレーム融合させ、該タグは、アルカリホスファテーゼ、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、β−ガラクトシダーゼ、ヘキサヒスチジン（６×−Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ標識（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号７１）、ＧＳＴ等のいずれか１つ、およびそれらの任意組合せであってよい。
【００５０】
好ましい態様は、ハイブリッドポリペプチドの親和検出および分離を促進し、例えば、ポリ−Ｈｉｓまたは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら（１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４）に記載されている規定（ｄｅｆｉｎｅｄ）抗原ペプチドエピトープ、またはＸＰＲＥＳＳＴＭエピトープ標識（ＤＬＹＤＤＤＤＫ、配列番号７２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）またはチオレドキシンを含んでよい、ハイブリッドポリペプチド融合タンパク質を包含する。親和配列は、ベクターによって供給されるヘキサ−ヒスチジン標識であってよい。例えば、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）は、ニッケル親和カラムを使用して、細菌のような特定の宿主から成熟タンパク質融合体の精製するためのポリヒスチジン標識を提供することができる。または、ＲＳＶの免疫原ペプチドをコードする核酸配列を組換え的に生成する（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用）のに使用されるプライマーに、親和配列を合成的にまたは遺伝子工学的に付加し得る。任意の前記Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体、およびその融合タンパク質は、アミノ末端またはカルボキシ末端に接合、連結または融合された（化学的または組換え的に）疎水性部分（アンカーまたはフット）も任意に有してよい。代表的な疎水性成分は、少なくとも５個のアミノ酸のアミノ酸配列、例えば、ＭＦＬＬＡＶＦＹＧＧ（配列番号３５）またはＧＧＹＦＶＡＬＬＦ（配列番号３６）、または脂質を包含する。
【００５１】
特定の態様において、ＲＳＶ免疫原をチオレドキシンまたはポリヒスチジン標識に融合させ、それは、そのような融合タンパク質をコードする組換え核酸配列によってコードされる。好ましい態様において、ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原フラグメントをチオレドキシンおよびポリヒスチジンに融合させ、それは、配列番号２３または２５に示す核酸配列によってコードされる。チオレドキシンおよびポリヒスチジン標識に融合させたＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原フラグメントの例示的アミノ酸配列は、配列番号２４および２６に示されている。関連した態様において、配列番号２７、２９、３１または３３に示す配列に見られるような、Ｇ免疫原融合タンパク質に連結または融合した疎水性成分またはフットをコードする核酸配列をさらに含むＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。チオレドキシンおよびポリヒスチジン標識に融合し、疎水性部分またはフットをさらに含む、ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原グラグメントの例示的アミノ酸配列を、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２および配列番号３４に示す。好ましい態様において、疎水性成分は、融合タンパク質のアミノ末端に融合したＭＦＬＬＡＶＦＹＧＧ（配列番号３５）、または融合タンパク質のカルボキシ末端に融合したＧＧＹＦＶＡＬＬＦ（配列番号３６）のアミノ酸配列である。
【００５２】
融合タンパク質は、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合した疎水性成分を含んでよい。または、融合タンパク質は、リンカー（例えば、１個またはそれ以上、好ましくは２個または４個のアミノ酸）に融合した疎水性部分を含んでもよく、次に、これが、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合される。さらに他の態様において、融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のアミノ酸配列（例えば、チオレドキシンまたはポリヒスチジンのような標識）に融合した疎水性成分を含んでもよく、次に、これが、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントのアミノ末端に融合されるか；または、融合タンパク質は、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントのアミノ末端に融合した１つまたはそれ以上のアミノ酸配列（例えば、チオレドキシンまたはポリヒスチジンのような標識）を含んでもよく、次に、これが、疎水性部分に融合される。当業者に理解されるように、本発明の融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントおよび変異体、１つまたはそれ以上のリンカー、１つまたはそれ以上の付加的アミノ酸標識配列、１つまたはそれ以上の疎水性部分、またはそれらの任意組合せを含有するように構成し得る。
【００５３】
（治療配合物および使用法）
本発明は、１つまたはそれ以上のＲＳＶ免疫原を含有する医薬組成物にも関し、該組成物を使用して、免疫病理学的応答を伴わずに、または免疫病理学的応答を少なくとも減少させて、免疫反応を誘発し得る。本発明は、ＲＳＶ感染を治療および予防する方法にも関し、該方法は、本明細書に記載するＲＳＶに特異的な抗体を誘発するのに充分な用量で、Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントおよび変異体、融合タンパク質、多価免疫原、またはそのような免疫原の混合物を、被験体に投与することによって行われる。Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントおよび変異体、またはそのような免疫原のカクテルは、本発明の方法に使用される場合に、薬学的に受容可能な組成物の一部であるのが好ましい。
【００５４】
背景として、動物またはヒト被験体の自然または実験感染は、Ｇタンパク質を認識するＣＤ８＋  ＣＴＬ免疫反応を誘発しないと考えられ、これに対して、Ｆタンパク質はＣＤ８＋  ＣＴＬ免疫反応を誘発する。従って、本明細書に記載するＧおよびＦ複合ＲＳＶ抗原ワクチンは、有害なまたは好ましくない病理学的増殖性リンパ球反応を誘発せずに、またはそれを減少させて、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋防御免疫応答の両方を誘発すると考えられる。さらに、ＲＳＶ抗原と組み合わしたプロテオソーム技術に基づく成分の使用は、ＲＳＶ抗原に対して生じる免疫反応における、主要２型反応から選択的１型反応へのシフト（当業者に既知のサイトカインプロフィールによって決定）に影響を与え、それによって、本発明のワクチンまたは医薬組成物での免疫化後に、望ましくない好酸球性反応、望ましくないＩｇＥ反応またはそれらの両方を統計的有意に除去または減少させる。例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の１つまたはそれ以上のＭＨＣクラスＩ  ＣＤ８＋免疫原性エピトープと、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に含有される１つまたはそれ以上のＣＤ４＋ＭＨＣクラスＩＩ免疫原性エピトープとを組み合わせる。
【００５５】
当分野で知られているように、ＲＳＶ免疫原への最初の暴露時におけるサイトカイン発現およびＣＤ４＋リンパ球活性化のパターンは、後の暴露に対する免疫反応のパターンに影響を与える。従って、本発明の免疫原性組成物は、呼吸器疾患および好酸球増加症に対する防御と共に、ＲＳＶ感染に関連した小児喘息に対する防御に有効であると考えられる。１つの好ましい態様において、例えば、本発明のワクチンは、ＲＳＶ感染の病理学的結果に対して防御するかまたはそれを緩和する免疫反応を誘発することができ、それと同時に、共通のアレルゲンに対する後のＩｇＥ抗体反応を除去するかまたは減少させる。
【００５６】
特定の態様において、本発明は、プロテオソームまたはリポソームと共に配合した呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原を含む組成物を提供し、該Ｇタンパク質免疫原は、配列番号２に少なくとも８０％同一のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含み、該Ｇタンパク質免疫原またはそのグラグメントは、病理学的反応を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する。１つの態様は、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むか、または配列番号２から成る、Ｇタンパク質免疫原である。他の好ましい態様は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０、より好ましくは、配列番号６、配列番号５６または配列番号５８から選択されるアミノ酸配列を含むＧタンパク質免疫原である。好ましくは、１つまたはそれ以上のＲＳＶ免疫原を含有するように配合したリポソームが、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ脂質またはα−ガラクトシルホスホチジルグリセロアルキルアミンをさらに含む。リポソームにおけるそのような脂質の付加は、防御免疫性を増加させ有害な好酸球増加を抑制することによって、ＲＳＶワクチン組成物の有効性を増強させることができる（例えば、ＨｕａｎｇおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１５８６，２００２参照）。
【００５７】
本発明の呼吸器合胞体ウイルス免疫原は、共有結合疎水性成分をさらに含有し得る。疎水性成分は、例えば、米国特許第５，７２６，２９２号に開示されているように、アミノ酸配列または脂質であってよい。特定の態様において、疎水性成分は、免疫原のアミノ末端に融合したＭＦＬＬＡＶＦＹＧＧ（配列番号３５）、または免疫原のカルボキシ末端に融合したＧＧＹＦＶＡＬＬＦ（配列番号３６）のアミノ酸配列である。天然ＲＳＶ  Ｇタンパク質は、疎水性膜内外アミノ酸配列を含有し、該配列は、本発明の疎水性成分として機能し得る。１つの態様において、本発明のＲＳＶ組成物（例えば、ワクチン組成物）は、プロテオソームまたはプロトリンと共に配合された、本明細書に記載するようなＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原またはそのフラグメントを含む。プロテオソームまたはプロトリンと共に配合する場合、Ｇタンパク質免疫原は疎水性成分をさらに含むのが好ましく、該疎水性成分は、疎水性アミノ酸配列または脂質（本明細書に使用される脂質は、溶解特性を意味し、従って、アルキル、アリールアルキル、アリール、脂肪酸、グリセリドおよびグリセリルエーテル、ホスホリピド、スフィンゴリピド、長鎖アルコール、ステロイド、ビタミン等を包含する）から成ってよい。特定の態様において、疎水性成分を含有するかまたは含有しないＧタンパク質免疫原は、第二アミノ酸配列をさらに含有して融合体を形成してもよく、該第二アミノ酸配列は、本明細書に記載するように、標識、キャリア、酵素またはそれらの組合せである。本発明の１つの好ましいＲＳＶワクチンは、高免疫原性でありウイルス増殖を免疫中和することができる非感染性ＲＳＶポリペプチドまたはそのフラグメントを含むことができる。本発明の好ましい態様において、そのようなＲＳＶサブユニットワクチンは、ワクチン接種した被験体、例えばヒトまたは動物における好ましくない免疫病理学的副作用（例えば、好酸球増加症または喘息）を減少させるか有さない。
【００５８】
医薬組成物は、１つまたはそれ以上のＲＳＶ免疫原またはその融合タンパク質および任意に他の成分に加えて、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリア、希釈剤または添加剤の少なくとも１つを含有するのが好ましい。例えば、Ｇタンパク質免疫原またはその融合タンパク質、または２つまたはそれ以上のＧタンパク質のカクテルまたはその融合タンパク質、またはＧ、ＦおよびＭ免疫原のカクテルまたはその融合タンパク質の組成物に使用するのに好適な薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、粘稠化剤、緩衝剤、溶剤、保湿剤、防腐剤、キレート剤、アジュバント等およびそれらの混合物を包含する。
【００５９】
例示的アジュバントは、ミョウバン（水酸化アルミニウム、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標）、燐酸アルミニウム、ＬＰＳ（プロトリン）を含有するかまたはＬＰＳを含有しないプロテオソームアジュバント（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号および第５，９８５，２８４号、および米国特許出願公開第２００１／００５３３６８号および第２００３／００４４４２５号参照）、ビロゾーム、Ｌｉｐｉｄ  Ａ含有および非含有リポソーム、Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ／Ｃｏｒｉｘａ）、ＭＦ５９、または他の油性および水性エマルジョン型アジュバント、例えばナノエマルジョン（例えば、米国特許第５，７１６，６３７号参照）およびサブミクロンエマルジョン（例えば、米国特許第５，９６１，９７０号参照）、およびフロインド完全および不完全アジュバントを包含する。治療用途の薬学的に受容可能なキャリアは、製薬分野でよく知られており、本明細書、および、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏら，第１８版，１９９０）およびＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ，Ｄｒｕｇ，ａｎｄ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＬＣ（Ｓ．Ｃ．Ｓｍｏｌｉｎｓｋｉ編，１９９２）に記載されている。
【００６０】
特定の態様において、Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントおよび変異体（融合タンパク質および多価組成物を包含する）を、プロテオソームを使用して配合する。本明細書に使用される「プロテオソーム」または「プロジュバント」は、ナイセリア種のようなグラム陰性細菌からの外膜タンパク質（ＯＭＰ、ポーリンとしても既知）の調製物を意味し（参照：例えば、Ｌｏｗｅｌｌら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈら，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ，「Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」第２版，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，ｐ．１９３，１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第４，７０７，５４３号）、これらは、細菌またはウイルス抗原のような免疫原用のキャリアまたはアジュバントとして有用である。プロテオソームは、疎水性であり、ヒトへの使用に安全であり、ある種のウイルスに比較し得る大きさである。プロテオソームは、２０〜８０ｎｍの小胞または小胞状ＯＭＰクラスターに自己集合し、タンパク質抗原（Ａｇｓ）、特に疎水性成分を有する抗原に、非共有結合的に、組み込まれるか、配位結合するか、会合するか（例えば、静電気的または疎水的）または共同する興味深い能力を有する。小胞形態または小胞状形態の外膜タンパク質成分（多分子膜状構造物、または１つまたはそれ以上のＯＭＰの溶融球状ＯＭＰ組成物を包含する）を生じるあらゆる製造法が、プロテオソームの定義に含まれる。プロテオソームは、例えば、文献に記載されているように製造し得る（米国特許第５，７２６，９２９号または第５，９８５，２８４号参照）。
【００６１】
特定の態様において、Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体（融合タンパク質および多価組成物を包含する）を、プロトリンを使用して配合する。本明細書に使用される「プロテオソーム：ＬＰＳ」または「プロトリン」（「ＩＶＸ−９０８」としても既知）は、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（免疫刺激組成物として機能し得る）を得るために、少なくとも１種類のリポサッカリドと本明細書に記載のように混合したプロジュバントの調製物を意味する。従って、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントは、プロトリンの２つの基本成分から構成することができ、それは（１）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのようなグラム陰性細菌から調製されるプロテオソーム（即ち、プロジュバント）の外膜タンパク質調製物、および（２）１つまたはそれ以上のリポサッカリドの調製物、を包含する。プロトリンの成分は、脂質、糖脂質、糖タンパク質、小分子等であってよいか、またはそれらを含有してよいとも考えられる。プロトリンは、例えば、米国特許出願公開第２００３／００４４４２５号に記載のように製造し得る。
【００６２】
プロジュバントは一般に、天然、修飾または補足的疎水性成分または部分（「フット」または「アンカー」とも称される）を有する抗原（天然または修飾）と共に使用される。プロトリン（外因的に付加されたＬＰＳ含有）を、疎水性フットドメインを含有せず、性質上ほぼ親水性の抗原と共に使用することもできる。プロトリンは、疎水性フットを含有する抗原、疎水フットを含有しない抗原、または疎水性部分またはフットを含有する抗原と含有しない抗原との組合せと、混合するかまたは組み合わせることができる。
【００６３】
本明細書に使用される「リポサッカリド」（例えば、プロトリンの製造に使用されリポサッカリド）は、下記の細菌に由来する天然（分離、または天然構造物を使用して合成的に製造）または修飾リポポリサッカリドまたはリポオリゴ糖（集合名詞的に、「ＬＰＳ」とも称される）を意味する：グラム陰性細菌、例えばＳｈｉｇｅｌｌａ  ＦｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、または他のグラム陰性細菌、例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ、Ｅｈｒｌｉｃｈａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓを包含）、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、他のＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓを包含）、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、他のＳｈｉｇｅｌｌａ、Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ、ＶｉｂｒｉｏまたはＹｅｒｓｉｎｉａ種。リポサッカリドは無毒化形態（即ち、脂質Ａ核が除去されている）であってもよく、または無毒化していない形態であってもよい。本発明において、リポサッカリドは無毒化する必要はなく、無毒化しないのが好ましい。
【００６４】
ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントの２つの成分を特定の初期比率で配合して、成分間の相互作用を至適化し、それによって、本発明の免疫原性組成物の製造に使用される成分の安定な会合および配合を生じ得る。該方法は、透析、好ましくはダイアフィルトレーション／限外濾過法によって界面活性剤の量を所定の好ましい濃度に減少させながら、選択した界面活性剤溶液（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、またはＭｅｇａ−１０）中で成分を混合し、次に、ＯＭＰおよびＬＰＳ成分の錯化を行うことを一般に含む。２つの成分の混合、共沈または凍結乾燥を使用して、適切かつ安定な会合または配合を得ることもできる。好ましい態様において、免疫原性組成物は、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原、およびアジュバントを含んでよく、該アジュバントは、プロジュバント（即ち、プロテオソーム）およびリポサッカリドを含む。
【００６５】
特定の態様において、全プロテオソームタンパク質の重量％として示すリポサッカリド最終含有量は、約１％〜約５００％、より好ましくは約１０％〜約２００％、または約３０％〜約１５０％である。他の態様は、プロテオソームをＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓから製造し、リポサッカリドをＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓから製造し、最終リポサッカリド含有量が全プロテオソームタンパク質の５０ｗｔ％〜１５０ｗｔ％であるアジュバントを含有する。他の態様において、全ＯＭＰの約０．５％〜約５％の内因性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）含有量を有するプロテオソームを製造する。本発明の他の態様は、全ＯＭＰの約１２％〜約２５％、好ましい態様においては約１５％〜約２０％の内因性リポサッカリドを含有するプロテオソームを提供する。本発明は、プロテオソームの由来源と同じグラム陰性細菌種であるかまたは異なる細菌種である任意のグラム陰性細菌種に由来するリポサッカリドを含有する組成物も提供する。
【００６６】
特定の態様において、免疫原性組成物における、（プロテオソームまたはプロトリン）／（Ｇタンパク質免疫原）の比率は、１：１より大、２：１より大、３：１より大、または４：１より大である。この比率は、８：１またはそれ以上であってもよい。他の態様において、免疫原性組成物の（プロテオソームまたはプロトリン）／（コロナウイルス抗原）の比率は、約１：１〜約１：５００、好ましくは、その比率は少なくとも１：５、少なくとも１：１０、少なくとも１：２０、少なくとも１：５０、または少なくとも１：１００である。（プロトリン）／（Ｇタンパク質免疫原）比率１：２〜１：２００の利点は、免疫反応を誘発するＧタンパク質免疫原の能力に有意な影響を与えずに、プロテオソームに基づくアジュバントの量を顕著に減少し得ることである。
【００６７】
本明細書に記載される「薬学的に受容可能な塩」は、本発明化合物と、有機または無機酸（酸付加塩）または有機または無機塩基（塩基付加塩）との組合せから誘導される本発明化合物の塩を意味する。本発明化合物は、遊離塩基または塩の形態で使用してよく、両形態は、本発明の範囲に含まれるものとする。
【００６８】
さらに、本発明の医薬組成物は、希釈剤または賦形剤、例えば水または燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をさらに含有し得る。好ましくは、希釈剤または賦形剤は、最終燐酸濃度約０．１ｍＭ〜約１Ｍ、より好ましくは約０．５ｍＭ〜約５００ｍＭ、さらに好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、最も好ましくは約２．５ｍＭ〜約１０ｍＭを有するＰＢＳであり；最終塩濃度は、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、最も好ましくは約１２５ｍＭ〜約１７５ｍＭである。好ましくは、最終ＰＢＳ濃度は、約５ｍＭ燐酸および約１５０ｍＭ塩（例えばＮａＣｌ）である。特定の態様において、本明細書に記載するいずれかのＲＳＶ免疫原またはＲＳＶ免疫原カクテルを含む本発明の医薬組成物は、滅菌されている。
【００６９】
組成物は、それらを無菌環境下で製造することによって滅菌することができ、または当分野で使用される方法によってそれらを定期に滅菌することができる。多くの医薬は滅菌状態に製造され、この基準はＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞によって規定されている。この態様における滅菌は、工業において承認されＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞に示されている多くの方法（ガス滅菌、電離放射または濾過を包含する）によって行われる。滅菌は、これもＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞に規定されている無菌処理と称される方法によって維持し得る。ガス滅菌に使用するのに許容されるガスは、エチレンオキシドを包含する。電離放射に使用するのに許容される放射線種は、例えばコバルト６０源からのγ線、および電子線を包含する。γ線の一般的な線量は、２．５ＭＲａｄである。適切であれば、好適な孔径、例えば０．２２μｍ、および好適な材料、例えばＴｅｆｌｏｎ（登録商標）のフィルターを使用して濾過を行ってよい。「ＵＳＰ」という用語は、米国薬局方を意味する（ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ参照）。
【００７０】
本発明は、ＲＳＶ感染を治療または予防する方法にも関し、該方法は、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント（該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する）、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントに特異的な免疫反応を誘発するのに充分な用量で、それを必要とする被験体に投与することを含む方法である。特定の態様において、感染が、ＲＳＶのサブグループＡ、サブグループＢ、またはサブグループＡおよびＢの両方による。特定の好ましい態様において、本明細書に記載する任意の組成物および方法に使用されるＧタンパク質免疫原は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０、より好ましくは配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を有する。
【００７１】
本発明は、ＲＳＶ感染に関連した免疫病理学的応答のリスクを減少させる方法にも関し、該方法は、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント（該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、または免疫病理学的応答を減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する）、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を、１つまたはそれ以上のＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントに特異的な免疫反応を誘発するのに充分な用量で、それを必要とする被験体に投与することを含む方法である。特定の態様において、感染が、ＲＳＶのサブグループＡ、サブグループＢ、またはサブグループＡおよびＢの両方による。特定の好ましい態様において、本明細書に記載する任意の組成物および方法に使用されるＧタンパク質免疫原は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０、配列番号より好ましくは配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を有する。
【００７２】
ＲＳＶ免疫原配合物での治療に適した被験体は、疾患を発症するリスクの充分に確立した指標によるか、または存在する疾患の充分に確立した特徴によって同定し得る。例えば、感染の指標は、発熱、膿、微生物陽性培養物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、炎症等を包含する。本発明のＲＳＶ免疫原ワクチンで治療または予防し得る感染は、その感染が一次、二次、日和見などにかかわらず、ＲＳＶによって生じたまたはそれに起因する感染を包含する。ＲＳＶの例は、これらのウイルスのあらゆるサブタイプ、株、抗原変異体などを包含する。予防目的のために、例えば、ＲＳＶに感染するいくつかの既知の危険因子は、早産、慢性肺疾患を有する小児、デイケアに通っている小児、家庭における学童期兄弟姉妹の存在、家庭における受動煙への暴露、および免疫無防備状態の被験体（成人および小児）を包含する。
【００７３】
本発明の１つまたはそれ以上のＲＳＶ免疫原を含有する医薬組成物は、組成物を被験体、例えばヒトまたは動物に、投与することを可能にするどのような形態であってもよい。例えば、本発明のＧタンパク質免疫原、融合タンパク質および多価組成物を、液体溶液として製造し投与してもよく、または固体形態（例えば、凍結乾燥）として製造し、これを固体形態で投与するか、または投与に関して液体に再懸濁してもよい。ハイブリッドポリペプチド組成物を、それに含有される活性成分が被験体または患者への組成物の投与時に生物学的に利用可能であるように、または徐放出によって生物学的に利用可能であるように、配合し得る。被験体または患者に投与される組成物は１つまたはそれ以上の投与単位の形態を取り、その場合、例えば、錠剤が単一投与単位であってよく、エーロゾル形態の１つまたはそれ以上の本発明化合物の容器が複数の投与単位を含有してよい。特定の好ましい態様において、本発明のＲＳＶ免疫原または免疫原カクテルを含む本発明の任意医薬組成物を、容器、好ましくは滅菌容器に入れる。
【００７４】
１つの態様において、治療組成物を経鼻投与し、その場合、細胞、例えば、鼻に関連したリンパ組織に存在する細胞が、本発明のＲＳＶ免疫原またはカクテル組成物を受け取ることができる。他の一般的な投与経路は、経腸、非経口、経皮／経粘膜、経鼻および吸入を包含するがそれらに限定されない。本明細書に使用される「経腸」という用語は、免疫原性組成物が胃腸管または口腔粘膜から吸収される投与経路であり、経口、直腸および舌下投与を包含する。本明細書に使用される「非経口」という用語は、胃腸管を通らない投与経路を意味し、動脈内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜下および膣内注射または注入法を包含する。本明細書に使用される「経皮／経粘膜」という用語は、免疫原性組成物が皮膚を介してまたは通って投与される投与経路であり、局所投与を包含する。「経鼻」および「吸入」という用語は、免疫原性組成物が呼吸樹に導入される投与法を意味し、肺内または経肺投与を包含する。好ましくは、本発明の組成物は経鼻投与される。
【００７５】
他の態様において、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメントを含む本発明組成物を、予防法に使用できる。例えば、本発明のＲＳＶ免疫原またはカクテル組成物を、妊娠中の母親に投与して、母親のＲＳＶ感染を防止し、胎児または新生児に受動免疫を与え得る。予防法は、第一被験体に、ＲＳＶ免疫原および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含む組成物を投与し、次に、第二被験体に、少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルス免疫原を含む第二組成物を投与することを含んでよく；該第一組成物は、第二被験体に投与されるのと異なるＲＳＶ免疫原を含み、該第二組成物は、配列番号２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント、および薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤を含み；該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する。特定の態様において、予防に使用されるＧタンパク質免疫原は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０、より好ましくは配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を有することができる。
【００７６】
代表的な第一被験体は、妊娠中の母親であり、代表的な第二被験体はその母親の新生児である。各組成物は、１つまたはそれ以上のＲＳＶ免疫原（例えば、本明細書に開示するＧタンパク質免疫原）に特異的な免疫反応を誘発するのに充分な用量で投与される。理論に縛られるものではないが、例えば、ＲＳＶへの暴露により母親が既に有している抗体と同様のＩｇＧ抗体を誘発し得るＧタンパク質免疫原およびその組成物を、母親に全身的に（例えば、静脈内）投与することができる。次に、粘膜を介して（例えば、鼻腔内）、新生児を免疫化することができ、これは分泌型ＩｇＡ抗体を誘発し、従って、ＩｇＧ抗体が粘膜境界面に存在しないので、粘膜を介して投与されたＧタンパク質免疫原は、新生児が受け継いだ全身性母系（ＩｇＧ）抗体によって検出されない。即ち、母系的に受け継がれた抗体は、新生児の鼻腔内免疫化によって誘発されるＩｇＡ反応に不利な影響を与えない。特定の態様において、投与された組成物は、ＲＳＶのサブグループＡ、サブグループＢ、またはサブグループＡおよびＢの両方による感染を予防し得る。ＲＳＶ免疫原配合物での処置に適した被験体は、本明細書に記載し当分野で既知であるような、疾患を発症するリスクの充分に確立した指標によるか、または存在する疾患の充分に確立した特徴によって同定し得る。本発明のＲＳＶ免疫原で治療し得る感染は、ＲＳＶによって生じたまたはそれに起因する感染を包含する。ＲＳＶの例は、これらのウイルスのあらゆる株、サブタイプ、抗原変異体などを包含する。
【００７７】
本発明は、ＲＳＶ感染の予防法によって生じる複数の抗体も提供し、該方法は、１つまたはそれ以上のＲＳＶ免疫原に特異性の抗体を誘発するのに充分な用量で、本発明の組成物を被験体に投与することを含み、該Ｇタンパク質免疫原は、免疫病理学的応答を誘発せずに、またはそれを減少させて、防御免疫応答を誘発するエピトープを有する。１つの態様において、抗体は、サブグループＡ  ＲＳＶ、またはサブグループＢ  ＲＳＶ、またはサブグループＡおよびＢ  ＲＳＶの両方に特異性の、少なくとも１つの抗体を含む。他の態様において、ＲＳＶ感染を治療または予防する方法が、アジュバンドを含有するかまたは含有しない薬学的に受容可能なキャリア、および複数の本発明の抗体を含む組成物を、被験体に投与することを含む。
【００７８】
さらに、ＲＳＶ感染のリスクを有する被験体は、配列番号２と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する少なくとも１つの異なる呼吸器合胞体ウイルスＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント、および医薬的にされるキャリア、希釈剤または賦形剤を含む本発明組成物の投与前、投与と同時または投与後に投与された、複数の本発明の抗体を有し得る。特定の好ましい態様において、本明細書に記載する任意の組成物および方法に使用されるＧタンパク質免疫原は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６８または配列番号７０、より好ましくは配列番号６、配列番号５６または配列番号５８に示すアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、１つまたはそれ以上のＲＳＶ抗原に特異性の抗体を受動的に得ることができる一方で、被験体がワクチン接種を受けて、１つまたはそれ以上の異なるＲＳＶ免疫原に対する抗体を能動的に誘発する。
【００７９】
他の局面において、本発明のＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体を使用して、本発明のＧタンパク質免疫原およびそのフラグメントまたは変異体に存在する少なくとも１つのエピトープに特異性の抗体を誘発する。従って、本発明は、そのような抗体も提供する。好ましい態様において、抗体が、ＲＳＶ  Ｇタンパク質に存在する特定の防御エピトープに結合する。本発明に関して、「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、モノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂフラグメントのようなフラグメント、および組換え的または合成的に製造された抗体を包含する。そのような抗体は、モノクローナル抗体が特異的に結合し得るようにする可変領域を組み込んでおり、これは、抗体が、サブタイプＡまたはＢのＲＳＶ  Ｇタンパク質からのペプチドまたはポリペプチドに選択的に結合できることを意味する。「〜に特異性」とは、本発明のサブタイプＡまたはＢからのＲＳＶ  Ｇタンパク質、またはサブタイプＡまたはＢからの合成ＲＳＶ  Ｇタンパク質をコードする核酸配列によってコードされるポリペプチドまたはペプチドに選択的に結合する、タンパク質（例えば抗体）の能力を意味する。特定の抗原への抗体の会合または「結合」は、静電的相互作用、水素結合、ファンデルワース相互作用および疎水性相互作用を一般に包含する。これらのいずれか１つまたはそれらの任意組合せが、抗体とその抗原との結合において役割を果たすことができる。そのような抗体は、抗原、例えば、少なくとも１０４、好ましくは少なくとも１０５、より好ましくは少なくとも１０６、さらに好ましくは少なくとも１０７、最も好ましくは少なくとも１０８の親和力定数（Ｋａ）を有するＧタンパク質免疫原と、一般に会合する。親和力定数は、よく知られている方法を使用して当業者によって求められる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９参照）。モノクローナル抗体または抗体の親和力は、当業者によって容易に求められる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０−６７２，１９４９参照）。
【００８０】
さらに、本明細書に使用される「抗体」という用語は、天然抗体ならびに非天然抗体を包含し、例えば、単鎖抗体、キメラ、二官能性およびヒト化抗体、完全ヒト抗体、ならびにそれらの抗原結合フラグメントである。そのような非天然抗体は、固相ペプチド合成を使用して構成するか、組換え的に製造するか、または、例えば、可変重鎖および可変軽鎖から成る組合せライブラリーをスクリーニングすることによって得られる（Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９））。例えば、キメラ、ヒト化、ＣＤＲグラフト、単鎖、および二官能性抗体を製造するこれらおよび他の方法は、当分野でよく知られている（ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １４：２４３，１９９３；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４，１９８９；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２；Ｂｏｒｒａｂｅｃｋ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｈｉｌｙａｒｄら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９２）。
【００８１】
ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウサギ、マウスまたはラットを包含する種々の温血動物から、当業者によって容易に得ることができる。簡単に言えば、所望のＧタンパク質免疫原またはそのフラグメント、またはＲＳＶ免疫原の混合物、またはそれらの変異体を、非経口、腹腔内、筋肉内、眼内または皮下注射によって動物に投与して免疫化する。関心のあるハイブリットポリペプチドの免疫原性を、アジュバント、例えば、ミョウバンおよびフロイント完全アジュバントまたは不完全アジュバントの使用によって増加し得る。数週間にわたる数回の追加免疫化後に、血清の少量試料を収集し、所望の免疫原への反応性について試験した。動物の滴定量が、本発明のＧタンパク質免疫原への反応性においてプラトーに達したら、毎週の放血によるか、または動物の全採血によって、より多い量のポリクローナル免疫血清を容易に得ることができる。
【００８２】
当分野で既知であり本明細書に記載する生体外および生体内アッセイを使用して、本発明のＲＳＶ免疫原を容易に同定することができる。代表的なアッセイを実施例に示す。同様に、本明細書に記載するように、いくつかのアッセイを使用して、本発明のＲＳＶ免疫原によって誘発される抗体の活性を調査することもできる。
【００８３】
本明細書および出願データシートに記載されている全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許刊行物は全体として、本明細書に参照として組み入れられる。記載した本発明および下記の実施例は、本発明を限定するものではなく例示するものである。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
（プロテオソームの調製）
本発明の免疫原を、非共有結合的相互作用によってプロテオソームと共に配合して、免疫化したヒトまたは動物被験体において防御免疫応答を誘発させることができるワクチン組成物を形成し得る。本発明のプロテオソームは、例えばグループＢ２型Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓから精製した外膜タンパク質を含む粘膜アジュバント輸送賦形剤である。ワクチン配合におけるプロテオソームの使用は、Ｌｏｗｅｌｌ，Ｇ．Ｈ．，「Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」第２版，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ（１９７７）ｐ．１９３−２０６に概説されている。本発明のプロテオソームは、下記のようにして製造し得る：１Ｍ塩化カルシウム中の６％Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ（ＥＢＢ）（ＡｌｂｒｉｇｈｔおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｗｈｉｔｈａｖｅｎ，ＵＫ）の溶液でのフェノール殺菌細菌ペーストの抽出、次に、エタノールでの沈殿、１％ＥＢＢ−Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ−生理食塩水中での可溶化、次に、硫酸アンモニウムでの沈殿。沈殿物を１％ＥＢＢ緩衝液に再溶解し、透析し、０．１％ＥＢＢ中において−７０℃で保存する。代替法をプロテオソームの製造に使用してよく、例えば、工程を短縮するために硫酸アンモニウム沈殿を省いて製造してもよい。プロテオソームの製造は、米国特許出願公開第２００１／００５３３６８号および米国特許第６，４７６，２０１  Ｂ１号に開示されている。
【００８５】
（実施例２）
（リポソームの調製）
免疫化したヒトまたは動物被験体において防御免疫応答を誘発させることができるワクチン組成物として、本発明の免疫原をリポソームに非共有結合的に結合させ得る。当業者に既知の方法によって、例えば、脱水と組み合わした再構成法（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（ＫｉｒｂｙおよびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：９７９，１９８４）を使用して、免疫原を多層リポソームで封入し得る。簡単に言えば、リポソームを下記のようにして製造し得る：ＰＢＳ中の最終脂質濃度３０ｍｇ／ｍＬのジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ／コレステロール、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；５：１，Ｗ／Ｗ）の音波処理；または、抗原の存在または不存在下に、ＨｕａｎｇおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１５８６，２００２に記載されているＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ脂質またはα−ガラクトシルホスホチジルグリセロアルキルアミンを使用するリポソームの生成。１つまたはそれ以上の免疫原を含有するかまたは含有しないリポソームを、凍結乾燥し、滅菌水に再懸濁させる。リポソームに組み込まれていない免疫原は、燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でリポソームを繰り返し洗浄し遠心分離（例えば、１３，２００ｒｐｍで１分間の微細遠心分離）にかけることよって除去し得る。免疫原含有および不含有の洗浄リポソームのタンパク質含有量を、例えば、血清アルブミンのような校正量既知タンパク質標準を使用して定量的銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定する。リポソームのタンパク質含有量を測定し、所望のように調節し、例えば、タンパク質含有量を０．３ｍｇ／ｍｇ脂質（リポソームとして）／ｍＬに調節し得る。
【００８６】
ある場合には、タンパク質抗原がリポソームと相互作用する仕方を評価するために、Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメント（野生型または突然変異体）のアリコートを含有するリポソームを、ＰＢＳ中３７℃で１時間、プロテイナーゼＫ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して１．０、０．１および０．０１μｇ／ｍＬで培養し得る。いくつかの培養は、リポソームを崩壊させる１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００も含有し、それによって、プロテイナーゼＫの、タンパク質、融合タンパク質またはそれらのポリペプチドフラグメントへの完全な接近を可能にし得る。培養を終了し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析する。そのような手順を使用して、免疫原（例えば、１つまたはそれ以上のウイルスタンパク質）調製物のリポソーム封入の程度を測定し得る。
【００８７】
（実施例３）
（Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントをコードする核酸および発現構造物の調製）
アミノ酸１２８−２２９、ならびに、例えば、突然変異１２８−２２９配列に対応するＲＳＶ（Ｌｏｎｇ株）からのＧタンパク質コード化核酸配列を、ＲＴ−ＰＣＲによってウイルスＲＮＡから増殖し、得られたＰＣＲ生成物を、ｐＥＴ−３２−ＬＩＣ細菌発現プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化した。ＲＳＶ  Ｇ１２８−２２９タンパク質配列の部位特異的突然変異を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異プロトコルによって行った。簡単に言えば、ＰＣＲを、テンプレートｐＥＴ−３２−ＬＩＣ−Ｇ１２８−２２９ＤＮＡで行った（Ｇ１２８−２２９配列をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位にクローン化）。
【００８８】
これらの実験において、プライマー対は、下記の通りであった：
【００８９】
【化１】
2007505033.tif 000003
【００９０】
【化２】
2007505033.tif 000004
。
【００９１】
野生型、および前記突然変異ＲＳＶ  Ｇタンパク質フラグメントを含有するチオレドキシン（Ｔｒｘ）−融合タンパク質を、実施例４に記載するように製造した。
【００９２】
（実施例４）
（Ｇタンパク質免疫原およびそのフラグメントの調製）
薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤と混合することによって、ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原を医薬組成物として製造することができる。例えば、本明細書に記載し、修飾ｐＥＴ−３２−ＬＩＣプラスミドに含有される核酸によってコードされる、ＲＳＶ  Ｇタンパク質配列を、ＩＰＴＧでの誘発後に、形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１／ＤＥ３細胞中にチオレドキシン（Ｔｒｘ）−融合タンパク質として発現させた。８Ｍ尿素での抽出、次に、ＴＡＬＯＮ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用する親和精製およびＰＢＳに対する透析によって、全てのＴｒｘ−融合タンパク質を、形質転換細胞ペレットから回収した。ポリミキシンＢビーズ（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）での処理によって、精製Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９ポリペプチドを、汚染エンドトキシンから遊離させた。この手順の詳細および改変は、当業者によく知られている。免疫化に使用する際に、免疫原を、アジュバント、例えば、ミョウバンまたはプロテオソームに基づくジュバントと、さらに組み合わすかまたは混合することができる。
【００９３】
（実施例５）
（ＲＳＶの調製）
ＲＳＶ（Ｌｏｎｇ株）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、ペリシンＧ（１００Ｕ／ｍＬ）および硫酸ストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）を含有し、１％血清（ウシ胎児血清／ウシ血清、１：３）を補足したイーグル最少必須培地（ＭＥＭ）で培養したＨＥｐ−２細胞において増殖させた。細胞およびウイルスは、ＰＣＲアッセイによってマイコプラズマ汚染が陰性であることが確認された（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）。この実施例に記載するＨＥｐ−２細胞の集密的単層培養物に、ＲＳＶ（Ｌｏｎｇ株）を感染多重度（ＭＯＩ）１で接種し、４℃で９０分間吸着させ、洗浄し、１％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）において３７℃で培養した。培養細胞を２４〜３０時間後に収集し、その際、細胞単層はほぼ完全に融合しており；ウイルスを、手持ち型テフロン（登録商標）スクレーパ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）での崩壊によって細胞から剥離し、細胞片を、１３，０００×ｇで５分間の微細遠心分離によって除去した。上澄みを、マウス攻撃試験用のウイルス源として使用した（実施例６参照）。
【００９４】
（実施例６）
（マウス免疫化）
全ての免疫化を、ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｓｔｅ．Ｃｏｎｓｔａｎｃｅ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）を使用して行い、該マウスにケタミン（２．３ｍｇ／マウス；Ｂｉｍｅｄａ−ＭＴＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）およびキシラジン（０．５ｍｇ／マウス；Ｂａｙｅｒ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）で麻酔をかけた。ワクチン／攻撃試験において、７〜９匹のＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）のグループを、１４日間隔で２回、ＰＢＳ／ミョウバン、ＰＢＳ／ミョウバン中のＴｒｘ−Ｇ１２８−２２９または突然変異Ｔｒｘ―Ｇ１２８−２２９タンパク質（５０μＬ容量中１０μｇタンパク質）で皮下的に免疫化した。第二投与から１４日後に、マウスをＲＳＶ（５０μＬ中２ｘ１０６ｐｆｕ）で鼻腔内攻撃した。４日後、ペントバルビタールナトリウムを使用してマウスを犠牲にし、当業者によく知られている方法によって、肺ウイルス滴定量および気管支肺胞液における白血球浸潤を分析した。
【００９５】
免疫ブロット分析は、ＲＳＶ  Ｇタンパク質のアミノ酸１２８−２２９に対して生じた血清抗体が、野生型または突然変異Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質で免疫化したマウスにおけるＲＳＶ  Ｇタンパク質を特異的に認識できることを示した（図１参照）。ＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞の抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、膜（例えば、ポリ弗化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜）に移した。移したタンパク質を含有する膜を、室温で一晩の培養によって、ＴＢＳＴ（０．８％ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６）中の４％脱脂乳および０．５％カゼイン（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ銘柄）を使用して、ブロックした（非特異性相互作用を防止するため）。次に、ブロックした膜を血清試料と共に培養し、ＴＢＳＴで洗浄し、次に、ヒツジ抗マウス抗体共役ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共に１時間培養し、次に、当分野で既知の手順によって、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ；１ｍｇ／ｍＬ、０．０３％ＮｉＣｌ２および０．１％Ｈ２Ｏ２）を使用して、シグナルを検出した。強いＧタンパク質特異性抗体（ＩｇＧ）反応が、野生型およびＮ１９１Ａ突然変異タンパク質で観測された。極めて少ないＲＳＶ  Ｇタンパク質抗体特異性シグナルが、Ｉ１８５ＡまたはＫ１８７Ａ突然変異ＲＳＶ  Ｇポリペプチド融合タンパク質から得た血清において観測された。残るＴｒｘ−Ｇ１２８−２２９突然変異タンパク質は、中間レベルのＲＳＶ  Ｇ特異性抗体を誘発した（図１）。
【００９６】
（実施例７）
（免疫化マウスのＲＳＶ攻撃）
これらの実験において、野生型Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９または９つの突然変異体の１つでマウスを免疫化し（実施例６に記載のように免疫化）、次に、ＲＳＶで攻撃した。好酸球増加症の誘発を、Ｍａｄｅｒら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１１１０，２０００に記載の手順によって測定した。図２Ａに示すように、野生型Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９および種々の単一突然変異体は、ＲＳＶ攻撃からマウスを種々の程度に防御した。比較すると、Ｎ１９１Ａ突然変異Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９は、突然変異Ｐ１９０Ａ、Ｒ１８８ＡおよびＩ１８９Ａより優れた防御を与えた。残るＴｒｘ−Ｇ１２８−２２９突然変異タンパク質は、中間レベルの防御を与えた。さらに比較すると、Ｒ１８８ＡおよびＮ１９１Ａ突然変異体は、最も高いレベルの防御を示した。この意外な結果は、Ｇタンパク質における単一点突然変異が、かなり減少した免疫病理学的応答（例えば、肺好酸球増加症）を伴って、防御免疫応答を誘発できるポリペプチドを生じ得ることを示す。
【００９７】
（実施例８）
（ＲＳＶ中和アッセイ）
これらの実験において、滴定前ＲＳＶのアリコートを、各マウス血清の連続希釈試料と混合し、室温で１時間培養した。各マウスからの血清を、実施例６に記載したミョウバン中の免疫原の２回の皮下投与の第二投与から１４日後に、収集した。プラーク減少アッセイによって、ＲＳＶ中和抗体について血清を分析した。混合物を、ＨＥｐ−２細胞の６０〜８０％集密的単層を含有する２４穴平板に二重に適用し、４℃で９０分間吸着させ、次に、洗浄し、１％ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ培地１ｍＬ中で３７℃で４０時間にわたってその平板を培養した。培養後、単層を１５％ホルムアルデヒドで固定し、ウイルスプラークの可視化のために０．０１％クリスタルバイオレットで染色した。プラーク減少を、プラーク減少中和滴定量５０（ＰＲＮＴ５０）として計算し、これは、ＨＥｐ−２細胞の半集密的（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）単層においてＲＳＶプラークの５０％を中和するのに必要とされる血清のレシプロカル（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）希釈である。
【００９８】
ＲＳＶプラーク減少アッセイの結果を表１に示す。免疫化マウスからの血清におけるＲＳＶ中和滴定量は、免疫化に使用したＴｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質の１８５−１９３領域内のアミノ酸配列への、中和抗体反応の強い依存性を示した（実施例６の免疫化の結果と同様）。
【００９９】
【表１】
2007505033.tif 000005
。
【０１００】
（実施例９）
（ＲＳＶ  Ｇタンパク質変異体へのサイトカインｍＲＮＡの反応）
種々のＲＳＶ  Ｇタンパク質変異体で免疫化したマウスの肺におけるサイトカインｍＲＮＡレベルを、リボヌクレアーゼ保護アッセイによって測定した（該アッセイは、有害な好酸球性反応が生じるかどうかの指標になり得る）。各マウス肺からの１つの葉（ｌｏｂｅ）を、ＲＮＡｌａｔｅｒＴＭ溶液（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）中において−２０℃で保存し、次に、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用してＲＮＡ抽出のために処理した。ＲＮＡを定量化し、サイトカイン（ＭＣＫ−１）テンプレート（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）からプローブを合成する転写キット（ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）を使用してリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）に付し、α−３２Ｐ［ＵＴＰ］を使用して放射性標識し、次に、ハイブリダイゼーションし、ＲＰＡＩＩＩキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用してＲＮａｓｅ消化に付した。反応混合物を、製造会社の指示に従って５％ポリアクリルアミド８Ｍ尿素ゲル上で分解し、次に、乾燥し、増感紙を使用して−７０℃でオートラジオグラフィーに付した。
【０１０１】
ＲＰＡ結果は、野生型または突然変異Ｔｒｘ−Ｇタンパク質で免疫化し、次に、ＲＳＶで攻撃したマウス間に顕著な差異があることを示した（図４）。図４に示すように、アップレギュレーションを最も受けやすいＴｈ２型サイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３であり、より低い程度に受けるのはＩＬ−５であった。Ｇタンパク質変異体Ｋ１９３Ａ、Ｐ１９０ＡおよびＩ１８９Ａは、顕著なＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３反応を誘発することが見出された。弱いＩＬ−４、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３反応が、他のＧタンパク質変異体、例えば、Ｎ１９２Ａ、Ｎ１９１Ａ、Ｒ１８８Ａ、Ｋ１８７ＡおよびＣ１８６Ａで観測された。この試験の結果は、ＩＬ−１３の明白な重要性を示し、ＩＬ−１３は、最近、喘息（Ｇｒｕｎｉｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２６１，１９９８）ならびにＲＳＶワクチン誘発疾患（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８４８５，１９９９）と関連づけられている。高レベルのＩＬ−１３およびＩＬ−１０は、野生型または突然変異体Ｉ１８９Ａ、Ｐ１９０Ａ、Ｋ１９２ＡおよびＫ１９３Ａで免疫化したＲＳＶ攻撃マウスにおいて観測された高レベルの好酸球増加とよく相関していた。これに対して、Ｎ１９１Ａ、Ｋ１８７ＡおよびＲ１８８Ａのような突然変異体は、ＩＬ−４の中程度の誘発物質であったが、ＩＬ−１３、ＩＬ−１０および好酸球増加の低誘発物質であった。
【０１０２】
比較すると、原型Ｔｈ１サイトカイン、ＩＦＮ−γは、全ての実験マウス群において増加した。理論に縛られるものではないが、例として、これは、ＮＫ細胞ならびにＴｈ１細胞からのＩＦＮ−γの発現（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：１８７，１９８９）、ＲＳＶ感染時のＩＦＮ−γの急速誘発（ＨｕｓｓｅｌｌおよびＯｐｅｎｓｈａｗ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：２５９３，１９９８）および／またはＴｈ２反応が優勢であると考えられる免疫過程におけるＩＦＮ−γ発現の支配的性質（Ｗａｒｉｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：２８５２，１９９６；Ｓｐｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７９：１７５１，１９９８；ＳｒｉｋｉａｔｋｈａｃｈｏｒｎおよびＢｒａｃｉａｌｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６７８，１９９７）を反映していると考えられる。
【０１０３】
（実施例１０）
（ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原を含有するプロテオソームの調製）
保存ＲＳＶ  Ｇタンパク質生成物免疫原（例えば、野生型または突然変異ペプチド）の一部を、例えば、ダイアフィルトレーション／限外濾過法を使用するかまたは透析を使用することによって、プロテオソームと配合し得る。いずれの方法においても、ＲＳＶ  Ｇタンパク質生成物を、例えば、所望の界面活性剤（例えば、１％のＥｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ（ＥＢＢ）、または０．１％〜２％のＥＢＢ、または使用される界面活性剤の種類に依存する他の好適な界面活性剤）を含有する生理食塩水緩衝溶液に溶解させ、次に、生理食塩水緩衝１％Ｅｍｐｉｇｅｎ溶液（または、適切な濃度の他の適切な界面活性剤）中のプロテオソームと、１：４〜８：１（１：４、１：１、２：１、４：１および８：１を含む）の種々のプロテオソーム：ＲＳＶ  Ｇ（ｗｔ／ｗｔ）比率で混合する。Ｅｍｐｉｇｅｎを除去するために、その混合物を、次に、限外濾過／ダイアフィルトレーション法に付すか、または、例えば１０，０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する透析膜、またはＭＷＣＯ範囲１，０００〜３０，０００を有する機能的に類似した膜を使用して、緩衝生理食塩水に対して、４℃で１〜２週間、毎日少なくとも５００部緩衝液を交換して、完全に透析する。種々の段階で、ＥＬＩＳＡおよび一元放射状免疫拡散法（ＳＲＩＤ）のような免疫学的アッセイを使用して、有効性を測定し得る。ハロ免疫拡散法を使用して、種々の比率におけるＲＳＶ  Ｇ抗原とプロテオソームとの配合物の含有量を測定する（プロテオソームの調製についての詳細は、例えば、米国特許出願公開第２００１／００５３３６８号参照）。
【０１０４】
多価ワクチンは、個々の一価プロテオソームワクチンを製造し、次に、最終配合および充填の前に、必要とされる比率でそれらを合わすことによって製造し得る。多価調製物は、個々のＲＳＶ  Ｇ抗原を所望の比率で合わし、その混合物をプロテオソームと配合することによって製造し得る。多価ワクチン調製物は、１つまたはそれ以上のＲＳＶ  Ｆタンパク質免疫原および／または１つまたはそれ以上のＭタンパク質免疫原を、１つまたはそれ以上のＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原と組み合わせて含有し得る。次に、ワクチン組成物を、０．８μｍ孔径の薄膜フィルターに通し、免疫化前および免疫化中に４℃で保存する。
【０１０５】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原（例えば、野生型または前記のいずれかの形態の突然変異ペプチド）を、例えば米国特許第６４７６２０１  Ｂ１、および本明細書に開示されているようなプロテオソーム−ＬＰＳアジュバントの種々の量と配合してもよい。
【０１０６】
（実施例１１）
（プロトリン配合ＲＳＶ  Ｇタンパク質免疫原での免疫化）
プロトリンと配合したＲＳＶ  Ｇ野生型（アミノ酸１２８−２２９）または突然変異（Ｎ１９１Ａ）タンパク質で、マウスを鼻腔内免疫化して、ＲＳＶ−特異性の全身および粘膜滴定量を誘発されるかを判定した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、用量６μｇまたは２μｇのＴｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）融合タンパク質だけか、またはプロトリンまたはミョウバンで増強したもので、３回免疫化した。プロトリンだけかまたはプロトリンと配合した融合タンパク質を鼻腔内投与し、ミョウバンだけまたはミョウバンと配合した融合タンパク質を皮下投与した。第二投与後（第３５日）に、伏在静脈から採血し、第三投与から２週間後（第６２日）に、全採血によって血清を得た。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料も第６２日に収集した。
【０１０７】
ＲＳＶ  Ｇ特異性血清ＩｇＧおよびＢＡＬ  ＩｇＡ滴定量を、ＥＬＩＳＡによって測定した。６および２μｇの両用量でＴｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）だけで免疫化したマウスと比較して、プロトリンと配合したＴｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）で鼻腔内免疫化したマウスにおいて、血清ＩｇＧ滴定量の１０倍の増加が観測された（図５）。プロトリン配合物で鼻腔内に、またはミョウバン配合物で皮下的に免疫化したグループの間に、血清ＩｇＧ滴定量における有意な差異はなかった。いずれかのアジュバントを使用して与えたＧ（１２８−２２９）野生型およびＧ（１２８−２２９）突然変異Ｎ１９１Ａの両方に関して、比較し得る滴定量が得られた。ＲＳＶ  Ｇ（１２８−２２９）−特異性ＢＡＬ  ＩｇＡ滴定量は、プロトリンと配合したＧ（１２８−２２９）免疫原（野生型または突然変異体）を与えたグループにおいて、免疫原だけで免疫化したグループと比較して顕著に高かった（図６）。この場合も、比較し得る滴定量が、野生型および突然変異Ｇ（１２８−２２９）免疫原の両方に関して得られた。予想されるように、ミョウバンと配合したＧ（１２８−２２９）免疫原で皮下的に免疫化したグループにおいて、ＩｇＡが検出されなかった。これらの結果は、プロトリン配合Ｇ（１２８−２２９）免疫原（野生型または突然変異体）ワクチンが、鼻腔内投与された場合に、充分に許容されるものであり、免疫原性であることを示す。
【０１０８】
本発明の特定の態様を例示目的で本明細書に記載したが、本発明の意図および範囲を逸脱せずに種々の変更を加え得ることは、前記の記載から明らかである。従って、本発明は、請求の範囲による以外は限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、ミョウバン中の野生型または突然変異Ｔｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）タンパク質で免疫化したマウスにおける血清抗体の誘発、野生型ＲＳＶ  Ｇタンパク質を認識するそれらの能力、およびそのような誘発におけるＧタンパク質突然変異の作用を示す。ＲＳＶ感染ＨＥｐ−２−細胞の抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、膜に移し、各グループのマウスからのプール血清で探査した（マウスを、１４日間隔で２回、ＰＢＳ／ミョウバン、またはミョウバン−アジュバンド野生型または突然変異Ｔｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）タンパク質で免疫化した）。ＲＳＶ  Ｇタンパク質へのマウス血清（１：１００希釈）の特異性を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの免疫ブロットを示す。
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、Ｇタンパク質変異体が、ＲＳＶで攻撃された免疫化マウスにおける防除免疫（Ａ）および気管支肺胞液における好酸球浸潤（Ｂ）において、どのように作用するかを示す。マウスを、１４日間隔で２回、ＰＢＳ／ミョウバン、またはミョウバン中の野生型または突然変異Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質で皮下的に免疫化し、次に、ＲＳＶで攻撃した。ＲＳＶ攻撃から４日後に、肺ホモジネートにおけるＲＳＶ滴定量、ならびに気管支肺胞液洗浄好酸球（全細胞の％として）を測定した。結果を平均±ＳＤとして示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、Ｇタンパク質変異体が、ＲＳＶで攻撃された免疫化マウスにおける防除免疫（Ａ）および気管支肺胞液における好酸球浸潤（Ｂ）において、どのように作用するかを示す。マウスを、１４日間隔で２回、ＰＢＳ／ミョウバン、またはミョウバン中の野生型または突然変異Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質で皮下的に免疫化し、次に、ＲＳＶで攻撃した。ＲＳＶ攻撃から４日後に、肺ホモジネートにおけるＲＳＶ滴定量、ならびに気管支肺胞液洗浄好酸球（全細胞の％として）を測定した。結果を平均±ＳＤとして示す。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、ＲＳＶ  Ａ群、Ｌｏｎｇ株Ｇタンパク質の、核酸配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。太字で示されているのは、本発明のＧタンパク質免疫原を生じるアミノ酸の例示的突然変異（Ｎ１９１Ａ、コドンＡＡＣからＧＣＣへ）であり、そのフラグメントおよび変異体を本明細書に記載のように使用できる。
【図４Ａ】図４Ａおよび図４Ｂは、肺組織におけるサイトカインｍＲＮＡのリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）のポリアクリルアミドゲルオートラジオグラムを示す。結果は、１４日間隔で２回、ＰＢＳ／ミョウバンだけ、ミョウバンをアジュバントとする野生型Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質または変異体Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質で皮下的に事前に免疫化したマウスの肺における、ＲＳＶ攻撃から４日後に分析したサイトカインｍＲＮＡの相対レベルを示す。パネルＡおよびＢは、３日間（Ａ）または１時間（Ｂ）、放射線用フイルムを露光したポリアクリルアミドゲルの種々の領域を示す。
【図４Ｂ】図４Ａおよび図４Ｂは、肺組織におけるサイトカインｍＲＮＡのリボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）のポリアクリルアミドゲルオートラジオグラムを示す。結果は、１４日間隔で２回、ＰＢＳ／ミョウバンだけ、ミョウバンをアジュバントとする野生型Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質または変異体Ｔｒｘ−Ｇ１２８−２２９タンパク質で皮下的に事前に免疫化したマウスの肺における、ＲＳＶ攻撃から４日後に分析したサイトカインｍＲＮＡの相対レベルを示す。パネルＡおよびＢは、３日間（Ａ）または１時間（Ｂ）、放射線用フイルムを露光したポリアクリルアミドゲルの種々の領域を示す。
【図５】図５は、野生型または変異体Ｔｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）融合タンパク質だけか、またはプロトリンまたはミョウバンをアジュバントとするもので免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスからの、特異性血清ＩｇＧ抗体のＥＬＩＳＡによる検出を示す。マウスを、６μｇまたは２μｇ用量のＴｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）融合タンパク質で３回免疫化した。プロトリンだけか、またはプロトリンと共に配合した融合タンパク質を鼻腔内投与し、ミョウバンだけか、またはミョウバンと共に配合した融合タンパク質を皮下投与した。第二免疫化後（第３５日）、および第三免疫化から２週間後（第６２日）に、血清試料を得た。
【図６】図６は、野生型または変異体Ｔｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）融合タンパク質だけか、またはプロトリンまたはミョウバンをアジュバントとするもので免疫化したＢＡＬＢ／ｃマウスからの、特異性気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）ＩｇＡ抗体のＥＬＩＳＡによる検出を示す。マウスを、６μｇまたは２μｇ用量のＴｒｘ−（ｐｏｌｙＨｉｓ）−Ｇ（１２８−２２９）融合タンパク質で３回免疫化した。プロトリンだけか、またはプロトリンと共に配合した融合タンパク質を鼻腔内投与し、ミョウバンだけか、またはミョウバンと共に配合した融合タンパク質を皮下投与した。ＢＡＬ試料を、第６２日（第三免疫化から２週間後）に収集した。
【図１】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
2007505033000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月23日(2006.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2007505033.tif 000048
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