(57)【要約】  エオタキシンおよび少なくとも１つの他のＴｈ−２関連サイトカインをダウンレギュレートすることにより好酸球増加症を処置する方法、ならびにエオタキシン−１、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、およびＩＬ−１３に対する抗体を含み、被験体において能動免疫応答を生じさせる多価免疫性組成物およびこのような組成物を用いる処置方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸球の蓄積から起こる炎症症状に対して被験体を処置する方法であって、エオタキシンおよびＩＬ−５に対する自己抗体を含む患者において能動免疫応答を生じさせることを含む、方法。
【請求項２】
喘息、アレルギーまたはアレルギー性疾患から起こる症状に対して被験体を処置する方法であって、被験体においてエオタキシンおよびＩＬ−５に対する免疫応答を生じさせることを含む、方法。
【請求項３】
免疫タンパク質担体に結合されたエオタキシンまたはそのペプチド断片およびＩＬ−５またはそのペプチド断片を含む、免疫性組成物。
【請求項４】
Ｔ細胞エピトープ、ＩＬ−５由来のエピトープおよびエオタキシン由来のエピトープを含む、免疫性組成物。
【請求項５】
免疫担体に結合されたエオタキシンまたはその一部およびＩＬ−５またはその一部を含む、喘息、アレルギーまたはアレルギー性疾患の処置のための免疫性組成物。
【請求項６】
エオタキシンまたはその一部およびＩＬ−５またはその一部と免疫担体とを結合させることを含む、請求項３、４または５の組成物の製造方法。
【請求項７】
複数のサイトカインを含む免疫調節経路に関連する疾患を処置する方法であって、被験体をその経路の２種以上のサイトカインに対して能動免疫し、被験体において、それらサイトカインと結合してその活性を調節し得る自己抗体を惹起することを含む、方法。
【請求項８】
前記経路がＴｈ−２経路である、請求項７の方法。
【請求項９】
前記被験体がＩＬ−５およびエオタキシンに対して能動免疫される、請求項８の方法。
【請求項１０】
エオタキシンにより媒介される症状に対して被験体を処置する方法であって、被験体において、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９またはＩＬ−１３からなる群から選択される、エオタキシンおよび少なくとも１種のサイトカインに対する能動免疫応答を生じさせることを含む、方法。
【請求項１１】
エオタキシンにより媒介される症状が喘息、アレルギーまたはアレルギー性疾患である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
配列番号１〜３８、４２〜６１および１１７〜１２１および１３０〜１３２で示されるペプチド配列から選択される少なくとも１つのペプチド配列と、配列番号６２〜１１６および１２２〜１２３で示されるペプチド配列から選択される少なくとも１つのペプチド配列とを含む、請求項５の免疫性組成物。
【請求項１３】
ヒト被験体において好酸球増加症を改善する方法であって、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、またはＩＬ−１３からなる群から選択される、エオタキシンをダウンレギュレートすると同時にサイトカインをダウンレギュレートすることを含む、方法。
【請求項１４】
Ｔｈ−２免疫疾患を処置するために被験体を能動免疫するための多価免疫性組成物であって、２種以上のＴｈ−２サイトカインに由来する複数のペプチドエピトープに結合された免疫担体を含む、組成物。
【請求項１５】
前記Ｔｈ−２サイトカインが、エオタキシン−１、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９またはＩＬ−１３からなる群から選択される、請求項１４の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の背景］
サイトカインは免疫系の細胞によって産生され、免疫系の細胞に作用するペプチドメッセンジャー分子である。それらは特徴としてはパラ分泌または自己分泌であり、細胞と結合せず、リンパ液または血漿を介して全身循環に溢出した場合には全身に作用し得る。サイトカインは免疫系の化学メッセンジャーとして重要な役割を果たし、正常な免疫機能に不可欠なものであるが、特定の免疫系疾患では、特定のサイトカインのレベルが異常となり、病態が促される。
【０００２】
アトピー性症状、特に喘息などの免疫系疾患、および自己免疫疾患では、ケモカイン、特定種のサイトカイン、およびそれらのサブクラスであるインターロイキンが重要な役割を果たす。組織におけるこれらのケモカインの存在およびレベルは生理学的変化を誘導し、特定の疾病に罹患している個体では、これが増幅および恒常化して、病態として認識される表現型を生じる。ケモカインは炎症の誘導および維持のメディエーターである。このケモカイン−受容体の相互作用を中和抗ケモカイン抗体またはケモカイン受容体アンタゴニストで妨げると、炎症性応答が弱まるか、または抑制される。ケモカインに対する自己抗体は、ケモカイン、ならびに免疫系に対するそれらのシグナル伝達および調節作用、さらには疾病を効果的に中和する。ケモカインレベルの異常に関連する疾病の、標的ケモカインに対する患者の自己抗体レベルの調節による治療概念は、実際、身体固有の病因論または疾病の調節を模倣したものであると言える。
【０００３】
疾病におけるケモカインの重要な調節的役割は、開発中のいくつかの製品をもたらしており、その作用様式はケモカインとそれらの受容体との結合を遮断することである。いくつかは臨床試験下にあるが、これらの製品の大部分はヒト化モノクローナル 抗体（「ｍＡｂ」）、非抗原性受容体アンタゴニストまたは可溶性受容体分子または類似体に基づくものであり、これらはいずれも何回も反復投与が必要で、長期の治療処置または予防処置とするには理想的とは言えない。例えば、慢性関節リウマチおよび炎症性腸疾患のためのヒト化抗ＴＮＦα  ｍＡｂ、ならびに喘息の処置のためのいくつかのヒト化抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−８および抗ＩＬ−９  ｍＡｂが開発中である。これらのヒト化ｍＡｂ処置は急性の病態の短期処置に効力を持ち得るが、長期の管理療法を満たすに理想的とは言えない。結果として、目下臨床試験中の製品の多くの欠点を克服する手段として、ポリクローナル自己抗体に基づいた標的ケモカインレベルの制御を付与するために患者固有の免疫系を有効に活用できるようにする治療が示唆されたのである（例えば、ＷＯ００／６５０５８および米国特許第６，０９３，４０５号参照）。
【０００４】
サイトカインの中和
開発中のサイトカイン中和の最も一般的な方法は、サイトカイン受容体アンタゴニストの投与によるもの、サイトカインまたはサイトカイン受容体に対するヒト化モノクローナル抗体の投与によるもの、またはサイトカインと結合し、それを中和する、末端切断型の受容体の投与にものがある。例えば、米国特許第５，９１２，１３６号；同第５，９１４，１１０号；同第５，９５９，０８５号；同第６，１６８，７９１Ｂ１号；および同第６，１７１，５９０Ｂ１号はいずれもこのような方法を開示している。サイトカインの中和の方法としてもう１つ報告されているものとして、サイトカイン遺伝子のコード配列に相補的なアンチセンス分子の使用によるものがあり、その目的はその遺伝子の発現を阻害することである。
【０００５】
今や、能動免疫により生成された自己抗体によるサイトカインの中和は、病的症状を処置する有望な方法であると考えられている(Zagury et al., “Toward a new generation of vaccines: The anti-cytokine therapeutic vaccines”, PNAS, July 3, 2001, Vol. 98, No. 14, 8024-8029, Svenson et al., Journal of Immunological Methods 236 (2000) 1-8, Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772. Dalum et al., Nature Biotechnology, Vol. 17, July 1999, 666-669)。サイトカインの中和に有用なワクチンは、サイトカイン分子を不活性化し、それを免疫原性とすることにより作製できる。例えば、Ciapponi et al., (“Induction of interleukin-6 (IL-6) autoantibodies through vaccination with an engineered IL-6 receptor antagonist.” Nature Biotechnology, Vol. 15, October 1997, pgs. 997-1001)参照、この筆者は、高循環レベルのヒトＩＬ−６を有するトランスジェニックマウスで、抗原性がある非生活性操作型ＩＬ−６受容体アンタゴニストを接種した後のＩＬ−６の中和を首尾良く実証している。Ciapponi et alは、継続的な非経口送達が必要なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）または受容体アンタゴニストによる治療に優る、免疫疾患または新生物性疾患の、このようなワクチン処置の優位性を想定している。あるいは、サイトカインは、それを免疫原性とするために免疫担体と結合させることができる（例えば、Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772, 米国特許第６，４８２，４０３号、同第６，４７１，９５７号、同第６，４５５，５０４号、同第６，４２０，１４１号、ＷＯ０１／４３７７１およびＷＯ００／６４３９７参照）。この抗サイトカインワクチンアプローチは、喘息およびアレルギー性疾患に関与するインターロイキンのレベル制御することにより、これらの病態を処置するために提案されたものである（ＷＯ００／６５０５８、ＷＯ０１／６２２８７および米国特許第６，０９３，４０５号参照）。
【０００６】
アトピー性症状：喘息、アレルギーおよびアレルギー性疾患
喘息は最も重要な医学的問題となってきており、米国だけで約千五百万人の喘息患者が存在する。喘息患者の数はここ十年で５０％を超える増加を示し、米国では７００，０００人の罹患者が現れ、そのほとんどが小児である。
【０００７】
人は誰でも肺に入ってきたアレルゲンに対して防御免疫応答を起こすが、ケモカインをはじめとする物質を放出するアレルギー性の免疫抗体ＩｇＥを産生する細胞の過剰応答を起こすことにより反応する人もあり、これが免疫発作を起こす。喘息症状が少なくとも週に２回現れる慢性喘息は、現在のところ、（１）コルチコステロイドなどの炎症を鎮静する薬物、および（２）発作が起こった際に収縮した気道を開き、呼吸を容易にする救済薬の２つのタイプの薬物で処置されている。流通している現行の薬物は喘息の症状を緩和する助けをするだけで、そのアレルギー、その後の喘息を引き起こす免疫応答を排除または抑制するものではない。さらに、現行の薬物の大部分は頻繁に服用しなければならない丸剤であるか、あるいは、頻繁に、または発作の際に吸入器で投与しなければならない。主としてステロイドに基づく治療法として、それらは望ましくない副作用をもたらし、使用が増えると、または長期の使用では効力が低下することがある。数ヶ月ごとに投与するだけの、喘息発作をもたらすアレルギー様応答を抑制または除去するワクチンタイプの投与のほうが、極めて望ましい。
【０００８】
Ｔヘルパー細胞は免疫応答の鍵となる機能を果たし得る。一般に、Ｔヘルパー前駆体（Ｔｈ−ｐ）細胞は免疫応答の一部として、いずれも重要な生物学的役割を持つＴヘルパー１（Ｔｈ−１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ−２）エフェクター細胞のいずれかへと分化する。肺に入ってくる抗原に応答すると、個体は防御的Ｔｈ−１反応かまたはアレルギー性のＴｈ−２応答のいずれかを起こし得る。Ｔｈ−２応答はＩｇＥ抗体の産生とアレルギー症状を生じる。アレルギーおよび喘息個体は、ＩｇＥレベルの上昇を伴って、吸入したアレルゲンに対する過剰なＴｈ−２応答を示す。
【０００９】
喘息における気道の炎症は、Ｔｈ２細胞、好酸球および肥満細胞による気道壁の炎症を特徴とする。これらの細胞は各々、喘息の特徴である生理学的変化に関与し、これらの細胞種は各々、ある限定されたサイトカイン群を産生し、それに対して反応性を有する。
【００１０】
Ｔｈ−ｐ細胞の、Ｔｈ−１またはＴｈ−２細胞のいずれかへの分化は、多くの場合インターロイキンとケモカインの異なる組合せからなる異なるホルモンシグナル伝達経路を媒介とする。Ｔｈ−２経路は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を含むサイトカインを媒介とする。これらのインターロイキンはＴｈ−２およびその他の免疫系細胞によって産生され、抗体の産生およびアレルギー性の免疫応答に関与する他の細胞へのシグナル伝達に重要である。エオタキシンは、Ｔｈ−２シグナル伝達カスケードにおける別種のケモカインであり、好酸球を調節する。エオタキシンはＩｇＥ抗体の産生に影響を及ぼし、アレルギー応答において重要な役割を果たす。
【００１１】
新たな喘息治療においては、これまでに実質的な研究開発努力がなされている。これらとして、主としてエオタキシン、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３に関するケモカイン中和療法、およびヒト化抗ＩｇＥ  ｍＡｂまたは可能性としてはＩｇＥに対して免疫化するワクチンのいずれかを用いた直接的遮断によりＩｇＥ抗体を中和することをねらいとした他の戦略が挙げられる。他の、もっと従来的なアレルギーワクチン戦略は、例えばネコのふけまたはブタクサ花粉などの特定のペプチドアレルゲンによる免疫化または脱感作を中心としている。新たな送達方法およびアレルゲンのワクチン接種のためのＤＮＡワクチン技術の適用に注力した研究も続いているが、アレルゲン特異的な戦略は喘息の全般的な療法を提供するものではない。
【００１２】
また、Ｔｈ−１免疫応答をもたらす既知のＴｈ−１抗原またはＤＮＡワクチンで免疫することにより、非特異的Ｔｈ−１免疫応答を生じるか、または患者のＴｈ−２応答をＴｈ−１応答へシフトさせることに焦点を当てた汎用喘息ワクチンに対する多大な研究努力もある（例えば、米国特許第６，０８６，８９８号参照）。アレルギーおよび自己免疫疾患の治療法として提案されている能動免疫アプローチは、インターロイキンＩＬ−４およびＩＬ−５のレベルの制御に焦点が当てられてきた。米国特許第６，０９３，４０５号は、アレルギーまたは自己免疫疾患を処置するためにそれぞれ、免疫原性ＩＬ−４またはＩＬ−５サイトカイン組成物で能動免疫することによってＩＬ−４またはＩＬ−５に対する免疫応答を誘導することを開示している。ＷＯ００／６５０５８は、抗ＩＬ−５免疫原の構築、ならびに喘息およびその他の慢性アレルギー性疾患の管理に関して提案される方法において、ＩＬ−５をダウンレギュレートする方法におけるそれらの使用を開示している。
【００１３】
アレルギー性疾患に関連づけられている好酸球増加症の発症に関する分野の現状では、Ｔｈ−２ケモカインの各々の主な機能は、その経路の他のケモカインの機能に複雑かつ統合的に関連していると考えられている。例えば、エオタキシンは組織における好酸球蓄積を促進し、ＩＬ−５は血中の好酸球増加を誘導すると考えられている。そして、エオタキシンの産生はＩＬ−１３によって調節され、ＩＬ−１３は、ＩＬ−５とは無関係に好酸球の移動を調節することができる。マウスでは、ＩＬ−５、エオタキシンまたはその両者の産生の欠乏がマウスにＴ細胞の内因的欠乏の素因をつくり、これにより次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＬ−１３産生能が損なわれるということが報告されている（Mattes, et al., J. Exp. Med., Vol. 195, No. 11, June 3, 2002, 1433-1444参照）。
【００１４】
エオタキシン
エオタキシンは、好酸球蓄積を刺激する、または好酸球を誘引する好酸球特異的ケモカインである。エオタキシンは好酸球の走化性を誘導するが、好中球、単球またはＴ細胞の走化性は有意には誘導しない。エオタキシンはケモカインのＣＣサブファミリーのメンバーであり、このクラスはまた、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ）およびマクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ）も誘導する、Van Coillie et al., Cytokine & Growth Factor Reviews, 10 (1999) 61-86; Garcia-Zepeda, et al. (1996) Nat. Med., 2: 449-456参照。
【００１５】
現在のところ、エオタキシンとして分類されるものには少なくとも３つに分子があり、最初に確認されたものが、エオタキシン−１であり、これはなおエオタキシンと呼ばれており（Kitaura, M. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271; 7725-30およびPonath et al., J. Clin. Invest. 1996, 97: 604-12参照）、その後発見されたエオタキシン−２とエオタキシン−３がある（Conroy et al. Respir Res 2001, 2: 150-156; Guiterrez-Ramos et al. Immunology Today, November 1999, Vol. 20, No. 11, 500-504参照）。エオタキシンはケモカイン受容体３、すなわちＣＣＲ３と比較的高い親和性で結合し、それを介して好酸球補充を誘導する働きをする。その構造およびペプチド配列およびエオタキシンをコードする遺伝子は既知であり、受容体結合が研究、同定されている（Garcia-Zepeda et al. Nature Medicine, Vol. 2, No. 4, April 1996, 449-456; Ye et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 35, September 1, 2000 27250- 27257; Mayer and Stone, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 17, April 27 2001, 13911-13916参照）。
【００１６】
好酸球は蠕虫寄生感染に対する身体のＴｈ−２型免疫防御の主要成分の１つであり、感染個体の血液および組織中に蓄積する。好酸球は陽イオンタンパク質の顆粒を含み、  脱顆粒時にこれが細胞環境へ放出され、侵入してくる蠕虫に傷害を与える。喘息および慢性アレルギー性疾患などのアトピー性症状はアレルギー性の非蠕虫刺激に対する著しいＴｈ−２型免疫応答を特徴とする。喘息および慢性アレルギー性疾患患者の肺の炎症は、肺および特に気管支粘膜における好酸球の浸潤および蓄積を特徴とする。蠕虫感染が存在しない場合のこれらの症状では、脱顆粒時の好酸球の陽イオンタンパク質の放出が周囲の細胞に傷害を与える。その結果、エオタキシンはアトピー性症状の処置および予防、特に喘息およびアレルギー性疾患の治療の可能性のある標的として認識されるようになった。米国特許第５，９９３，８１４号および同第６，０３１，０８０号ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９８５、ＷＯ９７／００９６０、ＷＯ９７／１２９１４、およびＷＯ９９／１０５３４は、治療におけるエオタキシンに対する抗体をはじめ種々のエオタキシンアゴニストおよびアンタゴニストの使用を示唆している。ＷＯ０１／６６７５４は、受動免疫法におけるエオタキシン介在症状の処置のための、抗エオタキシンヒト抗体ＣＡＴ２１２および２１３ならびにそのフラグメントの作製および使用を開示している。
【００１７】
エオタキシンが作用する受容体ＣＣ、ＣＫＲ３またはＣＸＣＲ３受容体が同定されており（ＷＯ９７／４１１５４および米国特許第６，１７１，５９０Ｂ１号参照）、また、治療のためにこの受容体のアゴニストおよびアンタゴニストも示唆されている（米国特許第６，２７１，３４７号参照）。米国特許第６，１７１，５９０Ｂ１号は、この受容体に由来する免疫オリゴペプチドを治療効果のため、この受容体に対する能動免疫において使用できることを示唆している。しかしながら、上記で挙げた刊行物および特許の中には、治療法としてのエオタキシンに対する能動免疫を示唆するもの、またはこのような能動免疫療法に有用な免疫性組成物を開示するものはない。
【００１８】
本発明は、好酸球蓄積を特徴とする症状の処置に有用な組成物を提供する。喘息および慢性アレルギー性疾患が最も一般的であるが、これらのアトピー性症状には、乾癬などのアトピー性皮膚症状、および好酸球性潰瘍性大腸炎などの他の症状が含まれる。これらの各症状では、エオタキシンが誘導する好酸球補充により、罹患組織に著しく好酸球が蓄積する。罹患組織に高レベルの好酸球が慢性的に存在すると著しい組織損傷が起こり、これが経時的に進行し、不可逆的なものとなることがある。他の大多数により行われているサイトカイン中和療法は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３またはエオタキシンなどのケモカインの１つだけの作用、またはＣＣＲ３受容体に対するケモカイン、エオタキシンなど、その受容体に対するケモカインの作用を遮断することに向けられる。これらの療法では、小分子アンタゴニスト、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体による受動免疫、１つのサイトカインに対する能動免疫、またはその受容体自体に対する受動もしくは能動免疫を利用する。小分子および受動免疫アプローチは反復投与を必要とし、患者の応諾の点から問題がある。さらに、反復療法の結果として投与されるｍＡｂに対する中和抗体の誘導は、慢性疾患の長期処置では、ｍＡｂによる受動免疫の有効性を著しく損なう(Adair, F., Drug Discovery World, Summer 2002 pp 53-59)。他方、受容体自体に対する能動免疫は、その受容体への他のケモカインの結合を妨げ、予測できない、また、意図しない生物学的結果をもたらすことがある。
【００１９】
［発明の概要］
本発明は１種以上のサイトカインの免疫調節経路を含む、サイトカイン媒介疾患の処置のための方法および組成物を提供する。このような疾患としては、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカイン経路を含む、自己免疫疾患ならびに喘息およびアレルギー症状などのアトピー性症状が挙げられる。本発明の方法は、その機能がこの経路に関連する２種以上のサイトカインの活性の遮断を提供する。サイトカイン遮断の全体的な効果はサイトカインの全レベルおよび関連する免疫応答をダウンレギュレートし、処置する症状を改善することである。
【００２０】
本発明の方法は、被験体において、対象とするサイトカイン経路における２種以上のサイトカインに対する自己抗体の免疫応答を生じさせるように被験体を免疫することを意図する。本発明の免疫性組成物は、免疫された被験体において標的サイトカインに特異的な有効免疫応答を生じさせるために使用できる。これらの方法は、各々ただ１つのサイトカイン標的に対して免疫応答を生じさせるように向けられた免疫原を個別投与すること、または、２以上のサイトカイン標的に対して免疫応答を生じ得る多価免疫原を投与することを含む。
【００２１】
本発明によれば、Ｔｈ−２免疫応答関連疾患が、Ｔｈ−２ケモカインレベルを調節し、被験体におけるケモカインの作用を遮断することにより処置または予防できる。これは、１つの方法では、その疾病に対して作用を持ち得る１種以上のＴｈ−２ケモカインに対して被験体を能動免疫することにより達成できる。例えば、被験体はエオタキシンに対して能動免疫すると同時に、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９またはＩＬ−１３など、Ｔｈ−２経路における少なくとも１つの他のサイトカインを遮断することができる。この同時遮断は、標的サイトカインに対する能動免疫；抗体を用いた受動免疫；標的サイトカインとそれらの受容体との結合を妨げるアンタゴニストの投与；自由に循環し、それらの活性を中和する、受容体断片などのサイトカイン捕捉剤の投与をはじめとするいずれかの方法、またはこれらの方法または構成要素のいずれかの組合せにより達成することができる。例えば、好酸球増加症の処置は、エオタキシンとＩＬ−５；エオタキシンとＩＬ−１３；エオタキシン、ＩＬ−５とＩＬ−１３；エオタキシンとＩＬ−９；またはエオタキシンとＩＬ−４の同時遮断により達成できる。本発明の他の実施形態では、エオタキシンの遮断に加え、エオタキシン２および／またはエオタキシン３も遮断し得る。種々の標的サイトカインは、ヒトをはじめとする動物被験体の、抗サイトカイン免疫原での能動免疫により効果的に遮断することができる。
【００２２】
本発明の特定の実施形態では、エオタキシンの遮断はエオタキシンに対する能動免疫により達成される。さらなるサイトカインの遮断は、能動免疫を含むいずれの手段によって達成してもよい。能動免疫は、各々１つの標的サイトカインに向けられた個々の治療用ワクチン製品を投与することにより、あるいは標的サイトカインの全てに対して能動免疫応答を誘発し得る１つの多価治療用ワクチン製品を投与することにより達成できる。能動免疫は、抗原性ペプチド免疫タンパク質複合体またはＤＮＡワクチンをはじめ、いずれのワクチン法によって達成してもよい。
【００２３】
本発明の特定の実施形態は、Ｔｈ−２免疫応答に関与する２種以上のサイトカインを標的とする多価ワクチン製品に関する。例えば、本発明の一実施形態では、Ｔｈ−２経路に関与する２種のサイトカイン、ＩＬ−５とエオタキシンに対して患者を能動免疫することによる、アレルギー性疾患および喘息の処置方法を提供する。関連の実施形態では、本発明は、被験体においてサイトカイン、ＩＬ−５とエオタキシンに対する自己抗体を惹起し得る多価免疫原、ならびに喘息およびアレルギー性疾患およびその他のアトピー性症状など、好酸球蓄積を含む炎症症状を処置するための、このような多価免疫原の使用を提供する。これらの多価ワクチンまたは免疫製品は種々の形態の免疫原および当技術分野で公知の送達方法を利用でき、単独で使用することもできるし、あるいは他の治療薬と併用することもできる。
【００２４】
免疫性組成物は、患者において、ＩＬ−５およびエオタキシンを免疫調節または免疫中和し、さらにそれらの活性をダウンレギュレートし、炎症症状を改善するように好酸球蓄積の軽減をもたらすに十分なレベルで、これらのサイトカインに対してよう自己抗体応答を生じさせるために使用できる。これらの免疫原としては、エオタキシンおよびＩＬ−５配列の一部を含む組合せペプチド免疫原、または免疫担体に結合されたミメティクス、またはこのような組合せペプチド免疫原をコードするＤＮＡワクチンが挙げられる。
【００２５】
本発明はまた、好酸球増加症または好酸球蓄積に関連する症状の処置方法であって、本発明の免疫性組成物で、エオタキシンおよびＩＬ−５に対して被験体を能動免疫することを含む方法に関する。本発明の処置方法は、多価抗エオタキシンおよび抗ＩＬ−５ワクチンを用いる能動免疫に加え、他の医薬剤で被験体を処置することを含む療法を含む。
【００２６】
本発明のある態様は、ヒトをはじめとする動物被験体においてＴｈ−２サイトカインをダウンレギュレートするワクチン組成物に関する。これらのワクチン組成物は、エオタキシン−１、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＬ−４などの２種以上のＴｈ−２ケモカインに対する自己抗体含む被験体において能動免疫応答を生じさせるのに用いられる。これらの多価ワクチン製品は、喘息およびアレルギー性疾患およびその他のアトピー性症状など、エオタキシンを媒介とする好酸球蓄積から起こる炎症症状の処置に使用できる。これらのワクチンまたは免疫製品は種々の免疫原種および送達方法を利用でき、単独で使用することもできるし、あるいは他の治療薬と併用することもできる。さらに、これらの多価免疫原は種々の標的ケモカインの各々について複数の異なるペプチドエピトープを含み得る。
【００２７】
これら抗原ペプチドに基づく製品は、改変ケモカイン、すなわち不活性かつ免疫原性とされているものを用いて処方することができる。ある実施形態では、これらの免疫原は、免疫担体に結合された少なくとも１つのケモカイン受容体アンタゴニストもしくはアゴニスト、またはケモカイン由来エピトープを含む。標的ケモカインまたはケモカインミメティクスに由来する免疫原は当技術分野で公知の方法を用いて構築することができ、マウスまたはウサギなどの実験動物において免疫応答を惹起するために使用できる。得られた抗体を、臨床開発に最も適当なエピトープを選択する前段階として、標的ケモカインとその受容体との結合を中和するそれらの能力に関してin vitroおよび／またはin vivoでスクリーニングすればよい。これらＤＮＡに基づく製品は、抗原ペプチドをコードし、処置した被験体において抗原ペプチド産物の産生をもたらすＤＮＡワクチン製品を含み、これらは免疫した被験体において標的ケモカインに対する免疫応答を惹起する。特定の製品のデザインは、一次免疫応答が求められる標的組織および主として生じる免疫応答のタイプによって異なる。
【００２８】
本発明の免疫原を構築するには、特定のペプチドエピトープ配列を免疫担体と結合させる。得られた免疫原は、動物被験体に投与されると、体液性の免疫応答を惹起し、被験体において自己抗原を産生し、これが標的ケモカイン、例えばＩＬ−５またはエオタキシンと結合し、その生物学的作用を中和することができる。免疫応答は免疫原の追加投与により長期にわたって維持することができる。好適な免疫担体は、ジフテリア毒（ＤＴ）または破傷風毒（ＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、インフルエンザウイルスヘマグルチニンなどのタンパク質またはタンパク質毒素を含み得る。特定のペプチド配列は、二官能性架橋剤を用いた結合を介して免疫担体と結合させる。あるいは、特定のペプチドを、それを免疫原性とするためにコロイド金属と結合させてもよく、または、所望のケモカイン、例えばエオタキシンおよびＩＬ−５標的断片に対して持続的な免疫応答を惹起するために、特定のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを有する合成ヘテロ官能性免疫ペプチドとして好適なＴ細胞エピトープ配列とタンデムで合成することもできる。
【００２９】
本発明はまた、エオタキシン媒介好酸球蓄積に関連する症状の処置方法であって、本発明の免疫性組成物で、Ｔｈ−２ケモカインに対して被験体を能動免疫することを含む方法に関する。本処置方法は、抗ケモカインワクチンを用いた能動免疫に加えて、他の医薬剤での被験体の処置も含む療法を含む。
【００３０】
［発明の詳細な説明］
本発明は、哺乳類およびヒトをはじめとする動物被験体においてサイトカイン媒介疾患を処置するための方法および組成物を提供する。本発明の特に中心となるものは、Ｔｈ−１およびＴｈ−２、Ｔ細胞経路など、複数のサイトカインからなる免疫調節経路を含む疾患の処置である。本発明によれば、治療を必要とする被験体は、処置する疾患に関連づけられている経路における２種以上のサイトカインに対して能動免疫される。被験体は各々単一のサイトカインに対する、複数の個々の一価組成物で免疫してもよいし、あるいは、２種以上のサイトカインに対する自己抗体を含み、被験体で免疫応答を惹起し得る多価免疫性組成物で免疫してもよい。
【００３１】
本発明の特定の実施形態は、Ｔｈ−２免疫調節経路を含む疾患、特にアレルギー性疾患および喘息の処置のための方法および組成物を提供する。これらの疾患のいくつかは、肺組織などの特定の組織への好酸球補充およびその結果起こる組織炎症を特徴とする。本発明の方法は、好酸球の産生および補充を制御するため、および組織炎症の軽減をもたらすために、Ｔｈ−２免疫応答に関与する複数のサイトカインに対する、また特定の実施形態では、Ｔｈ−２免疫応答に関与する２種のサイトカインであるＩＬ−５とエオタキシンに対する被験体の能動免疫を提供する。
【００３２】
本発明は、能動免疫に有用であり、かつ、疾患に関連づけられている免疫調節経路に関与する複数のサイトカインに対して持続的な免疫応答を誘導するようにデザインされている免疫性組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、動物およびヒトにおけるアレルギー性疾患および喘息と関連づけられているＴｈ−２経路および好酸球蓄積に関与するエオタキシンおよびＩＬ−５に対して特異的免疫応答を誘導するにデザインされている免疫原を提供する。本発明の種々の免疫原は、特定の症状の処置に最適な特定の免疫原を選択するために、対象とする疾病または炎症症状に好適な動物モデルにおいて生産および分析することができる。喘息およびその他のアレルギー性疾患に好適な動物モデルは当技術分野で周知のものである（Humbles et al., J. Exp. Med., Vol. 186, No. 4, August 18, 1997, 601-612, Corry et al., J. Exp. Med., Vol. 183, January 1996, 109-117, Foster et al., J. Exp. Med., Vol. 183, January 1996, 195-201, Lukacs, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Bio., Vol. 10, 526-532, 1994参照）。
【００３３】
本発明の免疫原は、標的サイトカインの生物活性を中和または調節可能とするのに十分高い、標的サイトカインに対する特異性および結合親和性の抗体を含む被験体で免疫応答を誘導しなければならない。高レベルの好酸球に関連する疾患を処置するために用いられる治療組成物では、誘導される抗サイトカイン抗体の力価が、被験体において高レベルのエオタキシンの低下をもたらし、アトピー性症状により影響を受けた組織への好酸球の補充の低下をもたらすに十分なものでなければならない。被験体または患者を本発明の免疫性組成物で能動免疫することにより、エオタキシンと反応する種々の自己抗体の全体のレベル、およびＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＩＬ−４など、エオタキシンレベルまたはＴｈ−２媒介アレルギー応答に影響を及ぼす少なくとも１つの他のサイトカインは被験体内で維持され、アレルギー反応中の好酸球の補充は妨げられ、改善されている。この抗サイトカイン自己抗体レベルは本発明の免疫性組成物の追加投与で維持することができるので、小分子ケモカインアンタゴニストによって与えられるもの、すなわち、治療薬のレベルに著しい変動を示し、好ましい患者の応諾を得にくいという問題がある受動抗ケモカイン免疫に比べて、慢性疾病状態の管理に関してより優れた防御を与えるはずである。さらに、ｍＡｂの受動免疫では、反復投与した際に標的化されるｍＡｂに対する中和抗体が発達してしまい、長期処置ではそれらの有効性が限定される。
【００３４】
エオタキシンまたはその断片など、通常の非免疫原性のケモカインはまた、周知の方法（例えば、米国特許第６，２１７，８８１号；同第６，１３２，７２０号；同第５，８９１，９９２号；同第５，６０９，８７０号；同第５，６０７，６７６号；同第５，４６８，４９４号；同第５，０２３，０７７号；および同第４，２０１，７７０号、ならびにRichard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772; Svenson et al., Journal of Immunological Methods, 236 (2000), 1-8; Dalum et al., Nature Biotechnology, Vol. 17, July 1999, 666-669; Gonzalez et al., Annals of Oncology, 9: 431-435,1998; およびDalum et al., The Journal of Immunology, 1996, 157: 4796-4804参照）により、そのペプチドまたは断片を免疫担体タンパク質、またはジフテリア毒（ＤＴ）、破傷風毒（ＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＢＣＧ、ＯＶＡまたはその他などのタンパク質毒素と結合させることによって免疫原性、またそうでなければ生物学的に不活性とすることができる。あるいは、これらのケモカインはコロイド金属と結合させてそれらを免疫原性とすることもできるし（米国特許第５，１１２，６０６号、同第６，２７４，５５２号、および同第６，５２８，０５１号参照）、またはＷＯ００／６５０５８およびＷＯ９５／０５８４９で開示されている方法を用い、エオタキシン配列にタンデムでＴヘルパーエピトープを導入することにより、不活性であるが、免疫原性である改変されたケモカイン変異体または形態を作出することもできる。
【００３５】
標的ケモカインまたはその断片の、不活性であるが、免疫原性である形態を作出するのに有用であり得る化学的、物理的および免疫学的処理がいくつか知られている（例えば、米国特許第６，０９３，４０５号； Zagury et al., PNAS, July 3, 2001, Vol. 98, No. 14, 8024-8029; Gringeri et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human Retrovirology, Vol. 20, No. 4, April 1, 1999; Ciapponi et al., Nature Biotechnology, October 1997, Vol. 15, 997-1001; Raaberg et al., Pediatric Research, Vol. 37, No.2, 1995, 169-174; Raaberg et al., Pediatric Research, Vol. 37, No. 2, 1995, 175-181; Gringeri et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, Vol. 7, No. 7, 1994, 978-988; Zagury et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, Vol. 5, No. 7, 1992, 676-681参照）。
【００３６】
本発明の一実施形態は、ＤＴまたはＴＴなどの免疫タンパク質担体に結合されたケモカイン分子上の所望のエピトープに対応する同じ標的ケモカイン由来の複数の異なるペプチド断片を含み、それにより無差別のＴ細胞エピトープを提供し、長期の抗体応答の間、免疫記憶を可能とする複合免疫原に関する。このような免疫原は、ケモカインに対する能動体液性免疫応答を生じさせるためにヒトまたは動物被験体に投与することができる。本発明の一実施形態は、それを免疫原性とするためにＤＴなどの免疫担体タンパク質に結合されたヒトエオタキシン分子などの完全ケモカインを含む。本発明のその他の実施形態は、免疫担体タンパク質に結合された、種々の、もっと短いケモカインペプチド断片を含む。
【００３７】
これらの複合体はエピトープを含む約４〜５０個のアミノ酸残基のペプチドを用いて構築することができ、被験体に存在しているケモカイン分子上にあるエピトープと交差反応する抗体を被験体に誘導する。これらのエピトープを含むこれらのペプチドを、次に、一定範囲のペプチド／担体タンパク質モル比でタンパク質担体と結合させる。このペプチドは免疫タンパク質と直接結合させてもよいし、あるいは抗原提示細胞に対する提示、およびそれにより所望のエピトープの免疫原性を増強するために、担体分子から所望のエピトープを延長すべく、ペプチドスペーサー配列を組み込んでもよい。このペプチドスペーサーはペプチド断片のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれの末端に付着させてもよく、次に、このスペーサーを免疫担体と結合させる。ペプチドと担体の結合は、所望のエピトープを含むペプチドと担体タンパク質とを付着させるための架橋剤（ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のいずれか）を用いて達成される。二官能性架橋剤の選択は、そのペプチド上の官能部分の利用度によって異なる。これらの結合法の化合物は当技術分野で周知のものであり、米国特許第６，１３２，７２０号；同第５，６０９，８７０号；および同第５，４６８，４９４号、ならびにChemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, S.S. Wong (1991) CRC Press, Inc.の開示に示されている。
【００３８】
あるいは、免疫ケモカインペプチドは、選択されたケモカインエピトープ断片を、Ｔ細胞エピトープとタンデムで産生し、それにより無差別のＴ細胞エピトープとともに、選択されたＢ細胞エピトープ（ケモカインに由来する）を提示し、免疫された被験体で持続的な免疫応答をもたらすように、合成ペプチド化学により構築してもよい。
【００３９】
本発明の複合体免疫原は、当技術分野で周知の成分および方法を用いて、医薬上許容されるビヒクル中、アジュバントまたはその他の免疫刺激剤とともに処方すればよい（Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, (1995) Powell and Newman Eds., Plenum Press (New York), Aucouturier et al., Vaccine 19 (2001) 2666-2672）。
【００４０】
免疫ケモカインペプチドは、また、ケモカイン断片、または同じもしくは異なるケモカイン由来の複数の断片の所望のＤＮＡ配列が、Ｔ細胞エピトープの、必要なＤＮＡ配列とタンデムでコードされており、それによりＴ細胞エピトープとともに、選択されたＢ細胞エピトープ（ケモカインに由来する）を含む融合タンパク質を産生するようなプラスミドベクターを作出するよう、組換えＤＮＡ技術により構築することもできる。この融合タンパク質は細胞培養／発酵技術を用いてin vitroで発現させることができ、培養物から精製することができるか、またはプラスミド表面で発現させることができるか、またはそのプラスミドＤＮＡ構築物をＤＮＡワクチンとして使用することができる。これらの方法はいずれも、個々の調製物で免疫した被験体においてケモカイン特異的、かつ、持続的免疫応答を惹起するのに好適な調製物を提供することができる。
【実施例】
【００４１】
実施例１：抗エオタキシン免疫原
成熟ヒトエオタキシン−１は、２３アミノ酸の親水性アミノ末端配列を含む９７アミノ酸の前駆体タンパクに由来するものであり、これが切断されると７４アミノ酸、分子量約８．４ｋＤａの成熟タンパク質となる（米国特許第６，４０３，７８２号、ＷＯ９９／１０５３４；ＷＯ９７／００９６０； Ye et al., Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 35, Sept. 1, 2000, 27250-27257; Garcia-Zepeda et al., Nature Medicine, Vol. 2, N0. 4, April 1996, 449-45; Ponath et al., J. Clin. Invest., Vol. 97, No. 3, February 1996, 604-612; Mayer et al., Journal Biological Chemistry, Vol. 278, No. 17, April 27, 2001, 13911-13916参照）。成熟ヒトエオタキシンのアミノ酸配列（配列番号１）は次の通りである（各アミノ酸残基の一文字コードを用いている）。
【表１】
2007525436.tif 000002
【００４２】
エオタキシンは通常、免疫原性でない。このペプチドそれ自体、または対象とするエピトープに相当するそのペプチドの断片は、当技術分野で周知の方法により免疫原性とすることができる。使用できる１つの方法として、エオタキシンの生物活性は失っているが、免疫原の形態であって、動物またはヒト被験体において抗エオタキシン中和抗体を惹起し得る不活性なエオタキシンまたは不活性なエオタキシン断片を作出するものがある。不活性であるが、免疫原性であるエオタキシンまたはその断片を作出するのに有用な化学的、物理的および免疫学的処理はいくつか知られている（例えば、米国特許第６，０９３，４０５号； Zagury et al., PNAS, July 3, 2001, Vol. 98, No. 14, 8024-8029; Gringeri et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndrome and Human Retrovirology, Vol. 20, No. 4, April 1, 1999; Ciapponi et al., Nature Biotechnology, October 1997, Vol. 15, 997-1001; Raaberg et al., Pediatric Research, Vol. 37, No.2, 1995, 169-174; Raaberg et al., Pediatric Research, Vol. 37, No. 2, 1995, 175-181; Gringeri et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, Vol. 7, No. 7, 1994, 978-988; Zagury et al., Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes, Vol. 5, No. 7, 1992, 676-681参照）。
【００４３】
成熟ヒトエオタキシン配列を参照すれば、本発明の特定の実施形態では、この分子のアミノ末端に由来するアミノ酸残基１〜４５のペプチド断片およびカルボキシル末端を構成している残渣５４〜７４の断片が、本発明の免疫複合体の構築に有用である。この免疫複合体は、同じ免疫担体に結合された、同じペプチド断片または異なるペプチド断片に存在し得る１以上の異なるエオタキシンエピトープを含み得る。本発明の免疫原の構築に有用ないくつかのエオタキシンペプチド断片は次の通りである：
【表２】
2007525436.tif 000003
【表３】
2007525436.tif 000004
【表４】
2007525436.tif 000005
【表５】
2007525436.tif 000006
これらのペプチドは当技術分野で周知の合成または組換え手段により作製できる。また、当業者ならば、どんなペプチド断片であれ、そのアミノ酸配列を、その免疫原性を高めるために、あるいは例えば電荷、電荷密度、疎水性など、その断片の他の何らかの特性を付与もしくは高めるために、溶解度を変化させるために、または被験体においてエオタキシンに対する免疫応答の誘導に寄与するその能力を維持しながら、ジスルフィドによるオリゴマー化を排除するためのシステイン残基の置換をはじめとする、オリゴマー化および凝集の可能性を低減するために、改変することができる。このような改変は例えばアミノ酸残基を誘導体化することにより、または特定のアミノ酸は別のアミノ酸に置換することにより、または当技術分野で公知の他の何らかの方法により行うことができる。
【００４４】
また、特定の動物被験体においてエオタキシンの生物活性を示さないミミックまたはイムノミミックを用いて複合免疫原を構築することもできる。ミミックはそれ自体で免疫原性とはなり得ないが、免疫ペプチドと結合させることにより免疫原性となり得る。ある実施形態では、これらのミミックはマウスまたはモルモットエオタキシンなどのその他の哺乳類エオタキシン分子に由来するものであってもよい（米国特許第６，０３１，０８０号および同第５，９９３，８１４号）。
【００４５】
エオタキシンペプチド断片またはイムノミミックスは免疫タンパク質担体と直接結合させてもよいし、あるいは抗原提示細胞に対する提示、およびそれにより所望のエピトープの免疫原性を増強するために、担体分子から所望のエピトープを延長すべく、ペプチドスペーサー配列を組み込んでもよい。多様なペプチドスペーサーが使用できる。米国特許第５，６０９，８７０号および同第５，４６８，４９４号は、ペプチドスペーサー、およびそれらのスペーサーを目的のペプチドと、そしてさらに本発明の複合免疫原を構築するのに有用であり得るＤＴまたはＴＴなどの免疫タンパク質担体と結合させる方法を開示している。これらのペプチドスペーサー：
【表６】
2007525436.tif 000007
は、本発明のエオタキシンペプチド断片に使用可能である。これらのスペーサーペプチドをエオタキシンペプチド断片のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに組み込むと、例えば、
【表７】
2007525436.tif 000008
などの免疫タンパク質と結合したペプチドが作出できる。
【００４６】
一般に、これらのスペーサー配列は、エピトープを含むペプチド断片の作出の際の合成ペプチド化学によって特定のエオタキシン配列に組み込む。特に、いくつかの親水性配列を有する配列を含み、その分子の表面に提供される可能性が高いエオタキシン断片が本発明に特に有用である。これらのものとして、例えば、
【表８】
2007525436.tif 000009
が挙げられる。
【００４７】
一実施形態では、架橋剤を用いて特定のエオタキシン断片とＤＴおよびＴＴなどの担体タンパク質との結合を補助するには、トレオニン、セリンまたはアラニン残基での置換により、天然配列からシステイン残基を除去するのが望ましい。ペプチド断片のシステイン残基を除去するための、このアミノ酸の置換は、本発明のいずれの免疫原にも、また、いずれの標的ケモカインにも適用される。これにより、ペプチド断片の流体力学的品質は、架橋工程の際に潜在的に有害な副反応を排除しつつ、保持される。例としては、
【表９】
2007525436.tif 000010
が挙げられる。
【００４８】
抗エオタキシン免疫原は、免疫担体に結合された１つのペプチド断片、例えば、ＤＴに結合された配列ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ（配列番号１６）のペプチド断片１以上のコピーを含み得る。他の実施形態では、エオタキシン上の２以上のエピトープに対する抗体を用いて被験体において能動免疫応答を誘導するために、２以上の異なるペプチド断片を同じ免疫担体に結合させてもよい。このような免疫原は、例えば、ＤＴに結合されたペプチド配列ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ（配列番号１６）およびＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ（配列番号２３）の各々の複数コピーを含み得る。
【００４９】
もう１つの実施形態では、エオタキシン上の２以上のエピトープに対する抗体を用いて被験体において能動免疫応答を誘導するために、２以上の異なるペプチド免疫担体複合体を用いて製剤を調製してもよい。例えば、投与する組成物は、１つは担体に結合された１つの特定のエピトープを含む第一の構築物と、他の担体分子に結合された第二の異なるエピトープを含む第二の構築物の、２つの異なる免疫原構築物の同時配合混合物である。このような免疫原製剤は、例えば、ペプチド配列ＤＴ複合体、すなわち、ＤＴに結合されたＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ（配列番号１６）、およびＤＴに結合されたＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ（配列番号２３）の各々の複数コピーを含む。
【００５０】
エオタキシン−毒素複合体は、個別処方に、または最終製剤において２以上のエピトープ特異的複合体を提供するための混合に好適な単独物として調製することができる。あるいは、２以上のエオタキシン特異的ペプチドの結合は、それらの末端スルフヒドリル基を介して単一のマレイミジル−毒素調製物と結合させることもできる。これはマレイミジル−毒素を、活性化毒素の利用可能なマレイミジル部分より１．１モル過剰の混合ペプチドと混合したエオタキシン−特異的ペプチドの１：１混合物と反応させることにより達成される。これにより、複数のエオタキシン特異的エピトープを含む単一毒素複合体が形成される。
【００５１】
ある実施形態では、エオタキシン上の複数のエピトープに対する免疫応答を免疫された被験体に導入すると、相乗作用的である可能性のある、標的エオタキシンの結合および中和が起こり得る。適当なエピトープ配列は、それらの特異的エオタキシンエピトープに対する抗体間の結合の妨害の可能性を低減するよう、標的分子上の互いから十分除去された配列から選択される。このようなエオタキシンエピトープの組合せの一例として、次のエオタキシンおよびエオタキシン類似体配列が挙げられる：
【表１０】
2007525436.tif 000011
【００５２】
実施例２：抗ＩＬ−５免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−５に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。ＷＯ００／６５０５８は、抗ＩＬ−５免疫性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している。ＷＯ００／６５０５８  に開示されている抗ＩＬ−５免疫原は本発明の方法に有用であり、ＷＯ００／６５０５８の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【００５３】
本発明の免疫原を構築するのに有用なＩＬ−５ペプチド断片は、
【表１１】
2007525436.tif 000012
である。
【００５４】
実施例３：抗ＩＬ−９免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−９に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772は、抗ＩＬ−９免疫性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している（米国特許第６，６４５，４８６も参照）。Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772に開示されている抗ＩＬ−９免疫原は本発明の方法に有用であり、Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【００５５】
実施例４：抗ＩＬ−１３免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−１３に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。ＷＯ０２／０７０７１１は、抗ＩＬ−１３免疫性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している。ＷＯ０２／０７０７１１に開示されている抗ＩＬ−１３免疫原は本発明の方法に有用であり、ＷＯ０２／０７０７１１の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【００５６】
実施例５：抗ＩＬ−４免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−４に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。ＷＯ０２／０７０７１１は、抗ＩＬ−４免疫性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している。ＷＯ０２／０７０７１１に開示されている抗ＩＬ−４免疫原は本発明の方法に有用であり、ＷＯ０２／０７０７１１の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【００５７】
実施例６：抗エオタキシン−２免疫原
エオタキシン−２のアミノ酸配列は既知である、Grzegorewski et al., (2001) Cytokine 13; 209-219:およびMayer and Stone (2000) Biochemistry, 39, 8382-8395参照。
ペプチド断片
【表１２】
2007525436.tif 000013
は、本発明の抗エオタキシン−２免疫原を構築するために使用できる。
【００５８】
実施例７：抗エオタキシン−３免疫原
エオタキシン−３のアミノ酸配列はMayer and Stone, (2003) Proteins 50: 184-191に開示されている。ペプチド断片
【表１３】
2007525436.tif 000014
は、本発明の抗エオタキシン−３免疫原を構築するために使用できる。
【００５９】
実施例８：二価抗エオタキシンおよび抗ＩＬ−５免疫原
エオタキシンおよびＩＬ−５の両者に対する能動免疫応答を惹起する免疫原も本発明の方法に従って構築でき、免疫治療用ワクチン組成物の投与は好酸球増加症を処置するために使用できる。本発明のある特定の実施形態では、この二価免疫性組成物は、同じ免疫タンパク質担体分子に結合されたハプテンとしてのエオタキシンエピトープおよびＩＬ−５エピトープに特異的な抗原ペプチド決定基を含む。
【００６０】
エオタキシン特異的エピトープとして用いるための抗原ペプチド決定基は、配列番号１〜３８、１１７〜１１９および４２〜６１またはその任意の組合せから選択できる。
【００６１】
ＩＬ−５エピトープハプテンとして有用であり得る抗原ペプチド決定基としては、
【表１４】
2007525436.tif 000015
【表１５】
2007525436.tif 000016
【表１６】
2007525436.tif 000017
【表１７】
2007525436.tif 000018
【表１８】
2007525436.tif 000019
および配列番号１２２〜１２３が挙げられる。
【００６２】
配列番号６２〜１０９の抗原決定基はそれらのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて配列番号３９〜４１のものなどのスペーサーペプチド配列と結合させ、さらに、そのスペーサーペプチドリンカーによってＤＴまたはＴＴなどの免疫担体と結合させてもよい。また、抗ＩＬ−５免疫エピトープの構築に有用なイムノミミックを作出するために、この抗原ペプチド決定基に対応するＩＬ−５断片の天然配列を改変または変更してもよい。本発明の特定の実施形態では、システイン残基をトレオニンに変換するが、トレオニンの代わりにセリンまたはアラニンによってシステイン置換を用いることもできる。このような改変ペプチド配列の例としては、
【表１９】
2007525436.tif 000020
がある。
【００６３】
二価免疫原は毒素ペプチドなどの免疫担体に結合されたエオタキシンおよびＩＬ−５エピトープの任意の組合せにおいて複数の抗原ペプチド決定基を含み得る。例えば、ヒト被験体においてエオタキシンおよびＩＬ−５に対する能動免疫応答を惹起するのに有用な二価免疫原は、配列番号５６〜６１および１１４〜１１６、１１８、１１９、１２２および１２３の複数の抗原ペプチド決定基と、ＤＴなどの免疫担体とを結合させることにより構築することができる。
【００６４】
実施例９：ペプチド抗原決定基と免疫担体との結合
ペプチドと免疫タンパク質担体を結合させる方法は当技術分野で周知のものである（例えば、ＷＯ０２／０６６０５６参照）。例えば、トレオニン置換エオタキシンエピトープ断片：
【表２０】
2007525436.tif 000021
を、ヘテロ二官能性架橋剤を介してＤＴまたはＴＴ担体タンパク質と結合させてもよい。これらのエオタキシン断片の１以上は、Ｎ−（エピシロン−マレイミドカプロイルオキシ）−スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）またはその水溶性類似体スルホ−ＥＭＣＳなどのヘテロ二官能性架橋剤と反応させることで、ＤＴまたはＴＴと架橋させる。本実施形態では、ＤＴまたはＴＴをまず、毒素上のアミノ基においてスクシンイミジルエステルを介してヘテロ二官能性架橋剤と反応させる。この反応は好ましくは、６．５±０．３、約１〜３時間、室温で行う。マレイミジル基と担体タンパク質の比、例えば、５：１、１０：１、１５：１は、毒素（ＤＴまたはその他の担体タンパク質）と適当過剰の架橋剤とを反応させることにより達成される。架橋剤の実際のモル過剰量は滴定により決定する。滴定の際に毒素１モル当たりに組み込まれるマレイミドのモル数は、次に、マレイミジル−毒素をシステインまたはβ−メルカプトエタノールなどのスルフヒドリル化合物と反応させることにより決定できる。マレイミジル−毒素と反応させるスルフヒドリル化合物の量は、最も容易には、残存しているスルフヒドリル化合物をビス−ジチオ−ニトロベンゾエートと反応させることで直接測定することができる。ダイアフィルトレーションかゲル濾過のいずれかによって過剰な架橋剤を除去した後、マレイミジル−毒素をその末端スルフヒドリル基を介し、活性化毒素のマレイミジル部分の１：１モル過剰のエオタキシン−スペーサーペプチドと反応させる。このペプチドと毒素との結合は好ましくは、ｐＨ６．０±０．３、約３〜６時間、室温で行う。あるいは、このペプチドとマレイミジル−毒素との結合反応は室温で一晩反応させることにより達成することができる。容器内で、マレイミド基を含む架橋剤との結合反応を行うのが好ましい。ペプチドと反応させた後、過剰量のペプチドをリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２±０．２に対してダイアフィルトレーションまたはゲル浸透クロマトグラフィーを行うことにより除去する。
【００６５】
実施例１０：多価抗ケモカイン免疫原
本発明の免疫原は、実施例９の結合方法または当技術分野で公知のその他の方法を用い、種々の異なる組合せで、上記実施例１〜８配列番号１〜１２９で示したような任意数の種々のペプチドエピトープを結合させることにより構築することができる。この方法では、標的ケモカイン、特に、エオタキシン−１、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、またはＩＬ−１３およびその組合せからなる群から選択されるＴｈ−２ケモカインのいずれかの組合せを標的化する免疫原を構築することができる。例えば、ａ）エオタキシン−１、エオタキシン−２、エオタキシン−３またはｂ）エオタキシン、ＩＬ−５、ＩＬ−１３もしくはＴｈ−２ケモカインの他のいずれかの組合せに対して多価免疫原を構築することができる。免疫原の構築のために選択される特異的標的ケモカインを処置する免疫疾患のタイプおよびその関連のサイトカイン特性によって異なる。
【００６６】
実施例１１：免疫ワクチン組成物の処方
抗原決定基毒素複合体の免疫原性の提供に好適な処方としては、限定されるものではないが、アルミニウムまたはアルヒドロゲルへの吸着、リポソーム、リソソームまたは類似のマイクロスフェア（マイクロ粒子およびナノ粒子を含む）内への封入、水中油または油中水エマルション（多相エマルション、およびマイクロエマルション（例えば、ＷＯ０２／０６６０５６参照）が挙げられる。その他の好適であり得る処方としては、含まれている抗原（この場合、好ましいエオタキシン特異的毒素複合体）に対する免疫応答を刺激し得るアジュバント特性を有するブロックコポリマーとの調製物が挙げられる。本発明の複合免疫原はアジュバントまたはその他の免疫刺激剤を用い、医薬上許容されるビヒクル中に、当技術分野で周知の成分および方法を用いて処方することができる（Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, (1995) Powell and Newman Eds., Plenum Press (New York), Aucouturier et al., Vaccine 19 (2001) 2666-2672参照）。
【００６７】
本発明の特定の実施形態は、抗原決定基ペプチド毒素複合体の油中水エマルションの水相への処方を含む。濾過除菌（０．１〜０．２μｍ）したペプチド毒素複合体水溶液を、水油混合物をホモジナイズした際に安定な油中水エマルションが得られるに十分な乳化剤を含有する好適な濾過除菌（０．２μｍ）油混合物と合わせる。この乳化工程は、最終的な濾過、加熱滅菌または照射によって滅菌できない医薬製剤（無菌エマルションを含む）無菌調剤の無菌調剤および充填の実施に有用な層流フードまたは好適な無菌アイソレーター内で無菌的手段として実施する。
【００６８】
油中水混合物は５０：５０〜１０：９０の範囲で様々であってよいが、より好ましくは４０：６０〜２０：８０油中水の範囲である。好ましい油中水エマルションを作製するというこの目的のために好適な油／乳化剤混合物はSEPPIC, SA, Paris, Franceから入手できるＭｏｎｔａｎｉｄｅ製品系から得られる。さらに、乳化工程中、最終の乳化の水相に水溶性アジュバントをさらに配合することが望ましい(Adams, A. Synthetic Adjuvants. 1985 John Wiley & Sons, New York)。好適なアジュバントの例としては、Ｑｕｉｌｌ  Ａ，  ＱＳ２１、またはムラミルジペプチド（ｎｏｒ−ＭＤＰ）が挙げられる。
【００６９】
炎症症状の処置方法
本発明の免疫原はまた、他の医薬または抗炎症薬を伴う処置計画で投与してもよい。例えば、喘息またはアトピー性慢性アレルギー性疾患の場合には、罹患組織におけるエオタキシンレベルおよび好酸球蓄積を制御またはダウンレギュレートするために本発明の抗エオタキシンワクチンで患者を能動免疫し、同時に、例えば過剰なアレルギー刺激によってもたらされる急性発作に対応して、救済薬または抗喘息または抗アレルギー薬を投与する。組合せ処置に有用なこのような付加的薬剤としては、コルチコステロイド、クロモグリエート、抗炎症薬、ＣＯＸ−２阻害剤、ロイコトリエン（受容体）アンタゴニスト、キサンチン、抗ヒスタミン薬および気管支拡張薬が挙げられる。
【００７０】
ＤＮＡワクチン
本発明のもう１つの実施形態では、エオタキシンペプチド断片または上記の他のサイトカイン抗原決定基をコードする核酸配列を含み、さらにＴヘルパー細胞エピトープをコードする核酸配列を含むＤＮＡ構築物をＤＮＡワクチンとして用いる。このようなＤＮＡワクチンを構築、処方および投与する方法は当技術分野で公知のものであり、本発明のケモカインペプチドエピトープに採用されるＷＯ００／６５０５８、ＷＯ９８／３１３９８、Donnelly et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 and Donnelly et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172参照。
【００７１】
参照文献の組み込み
本願には、種々の刊行物および特許文書が引用されている。これら引用、刊行物および特許の各々の開示は、それら刊行物および特許の開示がそこに引用されているのと同様、出典明示により、そのまま本願の記載の一部とされる。
【配列表】
2007525436000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007525436000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好酸球の蓄積から起こる炎症症状に対して被験体を処置する方法であって、エオタキシンおよびＩＬ−５に対する自己抗体を含む患者において能動免疫応答を生じさせることを含む、方法。
【請求項２】
喘息、アレルギーまたはアレルギー性疾患から起こる症状に対して被験体を処置する方法であって、被験体においてエオタキシンおよびＩＬ−５に対する免疫応答を生じさせることを含む、方法。
【請求項３】
免疫原性タンパク質担体に結合されたエオタキシンまたはそのペプチド断片およびＩＬ−５またはそのペプチド断片を含む、免疫原性組成物。
【請求項４】
Ｔ細胞エピトープ、ＩＬ−５由来のエピトープおよびエオタキシン由来のエピトープを含む、免疫原性組成物。
【請求項５】
免疫原性担体に結合されたエオタキシンまたはその一部およびＩＬ−５またはその一部を含む、喘息、アレルギーまたはアレルギー性疾患の処置のための免疫原性組成物。
【請求項６】
エオタキシンまたはその一部およびＩＬ−５またはその一部と免疫原性担体とを結合させることを含む、請求項３、４または５の組成物の製造方法。
【請求項７】
複数のサイトカインを含む免疫調節経路に関連する疾患を処置する方法であって、被験体をその経路の２種以上のサイトカインに対して能動免疫し、被験体において、それらサイトカインと結合してその活性を調節し得る自己抗体を惹起することを含む、方法。
【請求項８】
前記経路がＴｈ−２経路である、請求項７の方法。
【請求項９】
前記被験体がＩＬ−５およびエオタキシンに対して能動免疫される、請求項８の方法。
【請求項１０】
エオタキシンにより媒介される症状に対して被験体を処置する方法であって、被験体において、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９またはＩＬ−１３からなる群から選択される、エオタキシンおよび少なくとも１種のサイトカインに対する能動免疫応答を生じさせることを含む、方法。
【請求項１１】
エオタキシンにより媒介される症状が喘息、アレルギーまたはアレルギー性疾患である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
配列番号１〜３８、４２〜６１および１１７〜１２１および１３０〜１３２で示されるペプチド配列から選択される少なくとも１つのペプチド配列と、配列番号６２〜１１６および１２２〜１２３で示されるペプチド配列から選択される少なくとも１つのペプチド配列とを含む、請求項５の免疫原性組成物。
【請求項１３】
ヒト被験体において好酸球増加症を改善する方法であって、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、またはＩＬ−１３からなる群から選択される、エオタキシンをダウンレギュレートすると同時にサイトカインをダウンレギュレートすることを含む、方法。
【請求項１４】
Ｔｈ−２免疫疾患を処置するために被験体を能動免疫するための多価免疫原性組成物であって、２種以上のＴｈ−２サイトカインに由来する複数のペプチドエピトープに結合された免疫原性担体を含む、組成物。
【請求項１５】
前記Ｔｈ−２サイトカインが、エオタキシン−１、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９またはＩＬ−１３からなる群から選択される、請求項１４の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
サイトカインの中和
開発中のサイトカイン中和の最も一般的な方法は、サイトカイン受容体アンタゴニストの投与によるもの、サイトカインまたはサイトカイン受容体に対するヒト化モノクローナル抗体の投与によるもの、またはサイトカインと結合し、それを中和する、末端切断型の受容体の投与によるものがある。例えば、米国特許第５，９１２，１３６号；同第５，９１４，１１０号；同第５，９５９，０８５号；同第６，１６８，７９１Ｂ１号；および同第６，１７１，５９０Ｂ１号はいずれもこのような方法を開示している。サイトカインの中和の方法としてもう１つ報告されているものとして、サイトカイン遺伝子のコード配列に相補的なアンチセンス分子の使用によるものがあり、その目的はその遺伝子の発現を阻害することである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
今や、能動免疫により生成された自己抗体によるサイトカインの中和は、病的症状を処置する有望な方法であると考えられている(Zagury et al., “Toward a new generation of vaccines: The anti-cytokine therapeutic vaccines”, PNAS, July 3, 2001, Vol. 98, No. 14, 8024-8029, Svenson et al., Journal of Immunological Methods 236 (2000) 1-8, Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772. Dalum et al., Nature Biotechnology, Vol. 17, July 1999, 666-669)。サイトカインの中和に有用なワクチンは、サイトカイン分子を不活性化し、それを免疫原性とすることにより作製できる。例えば、Ciapponi et al., (“Induction of interleukin-6 (IL-6) autoantibodies through vaccination with an engineered IL-6 receptor antagonist.” Nature Biotechnology, Vol. 15, October 1997, pgs. 997-1001)参照、この筆者は、高循環レベルのヒトＩＬ−６を有するトランスジェニックマウスで、抗原性がある非生物活性操作型ＩＬ−６受容体アンタゴニストをワクチン接種した後のＩＬ−６の中和を首尾良く実証している。Ciapponi et alは、継続的な非経口送達が必要なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）または受容体アンタゴニストによる治療に優る、免疫疾患または新生物疾患の、このようなワクチン処置の優位性を想定している。あるいは、サイトカインは、それを免疫原性とするために免疫原性担体と結合させることができる（例えば、Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772, 米国特許第６，４８２，４０３号、同第６，４７１，９５７号、同第６，４５５，５０４号、同第６，４２０，１４１号、ＷＯ０１／４３７７１およびＷＯ００／６４３９７参照）。この抗サイトカインワクチンアプローチは、喘息およびアレルギー性疾患に関与するインターロイキンのレベルを制御することにより、これらの病態を処置するために提案されたものである（ＷＯ００／６５０５８、ＷＯ０１／６２２８７および米国特許第６，０９３，４０５号参照）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
現在のところ、エオタキシンとして分類されるものには少なくとも３つの分子があり、最初に確認されたものが、エオタキシン−１であり、これはなおエオタキシンと呼ばれており（Kitaura, M. et al., J. Biol. Chem., 1996, 271; 7725-30およびPonath et al., J. Clin. Invest. 1996, 97: 604-12参照）、その後発見されたエオタキシン−２とエオタキシン−３がある（Conroy et al. Respir Res 2001, 2: 150-156; Guiterrez-Ramos et al. Immunology Today, November 1999, Vol. 20, No. 11, 500-504参照）。エオタキシンはケモカイン受容体３、すなわちＣＣＲ３と比較的高い親和性で結合し、それを介して好酸球補充を誘導する働きをする。その構造およびペプチド配列およびエオタキシンをコードする遺伝子は既知であり、受容体結合が研究、同定されている（Garcia-Zepeda et al. Nature Medicine, Vol. 2, No. 4, April 1996, 449-456; Ye et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 35, September 1, 2000 27250- 27257; Mayer and Stone, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 17, April 27 2001, 13911-13916参照）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
エオタキシンが作用する受容体ＣＣ、ＣＫＲ３またはＣＸＣＲ３受容体が同定されており（ＷＯ９７／４１１５４および米国特許第６，１７１，５９０Ｂ１号参照）、また、治療のためにこの受容体のアゴニストおよびアンタゴニストも示唆されている（米国特許第６，２７１，３４７号参照）。米国特許第６，１７１，５９０Ｂ１号は、この受容体に由来する免疫原性オリゴペプチドを治療効果のため、この受容体に対する能動免疫において使用できることを示唆している。しかしながら、上記で挙げた刊行物または特許の中には、治療法としてのエオタキシンに対する能動免疫を示唆するもの、またはこのような能動免疫療法に有用な免疫原性組成物を開示するものはない。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
［発明の概要］
本発明は２種以上のサイトカインの免疫調節経路を含む、サイトカイン媒介疾患の処置のための方法および組成物を提供する。このような疾患としては、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカイン経路を含む、自己免疫疾患ならびに喘息およびアレルギー症状などのアトピー性症状が挙げられる。本発明の方法は、その機能がこの経路に関連する２種以上のサイトカインの活性の遮断を提供する。サイトカイン遮断の全体的な効果はサイトカインの全レベルおよび関連する免疫応答をダウンレギュレートし、処置する症状を改善することである。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
本発明の方法は、被験体において、対象とするサイトカイン経路における２種以上のサイトカインに対する自己抗体の免疫応答を生じさせるように被験体を免疫することを意図する。本発明の免疫原性組成物は、免疫された被験体において標的サイトカインに特異的な有効免疫応答を生じさせるために使用できる。これらの方法は、各々ただ１つのサイトカイン標的に対して免疫応答を生じさせるように向けられた免疫原を個別投与すること、または、２以上のサイトカイン標的に対して免疫応答を生じ得る多価免疫原を投与することを含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明によれば、Ｔｈ−２免疫応答関連疾患が、Ｔｈ−２ケモカインレベルを調節し、被験体におけるケモカインの作用を遮断することにより処置または予防できる。これは、１つの方法では、その疾病に対して作用を持ち得る１種以上のＴｈ−２ケモカインに対して被験体を能動免疫することにより達成できる。例えば、被験体はエオタキシンに対して能動免疫すると同時に、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９またはＩＬ−１３など、Ｔｈ−２経路における少なくとも１つの他のサイトカインを遮断することができる。この同時遮断は、標的サイトカインに対する能動免疫；抗体を用いた受動免疫；標的サイトカインとそれらの受容体との結合を妨げるアンタゴニストの投与；自由に循環するサイトカインに結合し、それらの活性を中和する、受容体断片などのサイトカイン捕捉剤の投与をはじめとするいずれかの方法、またはこれらの方法または構成要素のいずれかの組合せにより達成することができる。例えば、好酸球増加症の処置は、エオタキシンとＩＬ−５；エオタキシンとＩＬ−１３；エオタキシン、ＩＬ−５とＩＬ−１３；エオタキシンとＩＬ−９；またはエオタキシンとＩＬ−４の同時遮断により達成できる。本発明の他の実施形態では、エオタキシンの遮断に加え、エオタキシン２および／またはエオタキシン３も遮断し得る。種々の標的サイトカインは、ヒトをはじめとする動物被験体の、抗サイトカイン免疫原での能動免疫により効果的に遮断することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
本発明の特定の実施形態では、エオタキシンの遮断はエオタキシンに対する能動免疫により達成される。さらなるサイトカインの遮断は、能動免疫を含むいずれの手段によって達成してもよい。能動免疫は、各々１つの標的サイトカインに向けられた個々の治療用ワクチン製品を投与することにより、あるいは標的サイトカインの全てに対して能動免疫応答を誘発し得る１つの多価治療用ワクチン製品を投与することにより達成できる。能動免疫は、抗原性ペプチド免疫原性タンパク質複合体またはＤＮＡワクチンをはじめ、いずれのワクチン法によって達成してもよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の特定の実施形態は、Ｔｈ−２免疫応答に関与する２種以上のサイトカインを標的とする多価ワクチン製品に関する。例えば、本発明の一実施形態では、Ｔｈ−２経路に関与する２種のサイトカイン、ＩＬ−５とエオタキシンに対して患者を能動免疫することによる、アレルギー性疾患および喘息の処置方法を提供する。関連の実施形態では、本発明は、被験体においてサイトカイン、ＩＬ−５とエオタキシンに対する自己抗体を惹起し得る多価免疫原、ならびに喘息およびアレルギー性疾患およびその他のアトピー性症状など、好酸球蓄積を含む炎症症状を処置するための、このような多価免疫原の使用を提供する。これらの多価ワクチンまたは免疫原性製品は種々の形態の免疫原および当技術分野で公知の送達方法を利用でき、単独で使用することもできるし、あるいは他の治療薬と併用することもできる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
免疫原性組成物は、患者において、ＩＬ−５およびエオタキシンを免疫調節または免疫中和し、それによりそれらの活性をダウンレギュレートし、炎症症状を改善するように好酸球蓄積の軽減をもたらすに十分なレベルで、これらのサイトカインに対して自己抗体応答を生じさせるために使用できる。これらの免疫原としては、エオタキシンおよびＩＬ−５配列の一部を含む組合せペプチド免疫原、または免疫原性担体に結合されたミメティクス、またはこのような組合せペプチド免疫原をコードするＤＮＡワクチンが挙げられる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明はまた、好酸球増加症または好酸球蓄積に関連する症状の処置方法であって、本発明の免疫原性組成物で、エオタキシンおよびＩＬ−５に対して被験体を能動免疫することを含む方法に関する。本発明の処置方法は、多価抗エオタキシンおよび抗ＩＬ−５ワクチンを用いる能動免疫に加え、他の医薬剤で被験体を処置することを含む療法を含む。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
本発明のある態様は、ヒトをはじめとする動物被験体においてＴｈ−２サイトカインをダウンレギュレートするワクチン組成物に関する。これらのワクチン組成物は、エオタキシン−１、エオタキシン−２、エオタキシン−３、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３およびＩＬ−４などの２種以上のＴｈ−２ケモカインに対する自己抗体含む被験体において能動免疫応答を生じさせるのに用いられる。これらの多価ワクチン製品は、喘息およびアレルギー性疾患およびその他のアトピー性症状など、エオタキシンを媒介とする好酸球蓄積から起こる炎症症状の処置に使用できる。これらのワクチンまたは免疫原性製品は種々の免疫原種および送達方法を利用でき、単独で使用することもできるし、あるいは他の治療薬と併用することもできる。さらに、これらの多価免疫原は種々の標的ケモカインの各々について複数の異なるペプチドエピトープを含み得る。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
これら抗原ペプチドに基づく製品は、改変ケモカイン、すなわち不活性かつ免疫原性とされているものを用いて処方することができる。ある実施形態では、これらの免疫原は、免疫原性担体に結合された少なくとも１つのケモカイン受容体アンタゴニストもしくはアゴニスト、またはケモカイン由来エピトープを含む。標的ケモカインまたはケモカインミメティクスに由来する免疫原は当技術分野で公知の方法を用いて構築することができ、マウスまたはウサギなどの実験動物において免疫応答を惹起するために使用できる。得られた抗体を、臨床開発に最も適当なエピトープを選択する前段階として、標的ケモカインとその受容体との結合を中和するそれらの能力に関してin vitroおよび／またはin vivoでスクリーニングすればよい。これらＤＮＡに基づく製品は、抗原ペプチドをコードし、処置した被験体において抗原ペプチド産物の産生をもたらすＤＮＡワクチン製品を含み、これらは免疫した被験体において標的ケモカインに対する免疫応答を惹起する。特定の製品のデザインは、一次免疫応答が求められる標的組織および主として生じる免疫応答のタイプによって異なる。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明の免疫原を構築するには、特定のペプチドエピトープ配列を免疫原性担体と結合させる。得られた免疫原は、動物被験体に投与されると、体液性の免疫応答を惹起し、被験体において自己抗原を産生し、これが標的ケモカイン、例えばＩＬ−５またはエオタキシンと結合し、その生物学的作用を中和することができる。免疫応答は免疫原の追加投与により長期にわたって維持することができる。好適な免疫原性担体は、ジフテリア毒（ＤＴ）または破傷風毒（ＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、インフルエンザウイルスヘマグルチニンなどのタンパク質またはタンパク質毒素を含み得る。特定のペプチド配列を、二官能性架橋剤を用いた結合を介して免疫原性担体と結合させる。あるいは、特定のペプチドを、それを免疫原性とするためにコロイド金属と結合させてもよく、または、所望のケモカイン、例えばエオタキシンおよびＩＬ−５標的断片に対して持続的な免疫応答を惹起するために、特定のＢ細胞エピトープおよびＴ細胞エピトープを有する合成ヘテロ官能性免疫原性ペプチドとして好適なＴ細胞エピトープ配列とタンデムで合成することもできる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
本発明はまた、エオタキシン媒介好酸球蓄積に関連する症状の処置方法であって、本発明の免疫原性組成物で、Ｔｈ−２ケモカインに対して被験体を能動免疫することを含む方法に関する。本処置方法は、抗ケモカインワクチンを用いた能動免疫に加えて、他の医薬剤での被験体の処置も含む療法を含む。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
［発明の詳細な説明］
本発明は、哺乳類およびヒトをはじめとする動物被験体においてサイトカイン媒介疾患を処置するための方法および組成物を提供する。本発明の特に中心となるものは、Ｔｈ−１およびＴｈ−２、Ｔ細胞経路など、複数のサイトカインからなる免疫調節経路を含む疾患の処置である。本発明によれば、治療を必要とする被験体は、処置する疾患に関連づけられている経路における２種以上のサイトカインに対して能動免疫される。被験体は各々単一のサイトカインに対する、複数の個々の一価組成物で免疫してもよいし、あるいは、２種以上のサイトカインに対する自己抗体を含み、被験体で免疫応答を惹起し得る多価免疫原性組成物で免疫してもよい。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明は、能動免疫に有用であり、かつ、疾患に関連づけられている免疫調節経路に関与する複数のサイトカインに対して持続的な免疫応答を誘導するようにデザインされている免疫原性組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、動物およびヒトにおけるアレルギー性疾患および喘息と関連づけられているＴｈ−２経路および好酸球蓄積に関与するエオタキシンおよびＩＬ−５に対して特異的免疫応答を誘導するようにデザインされている免疫原を提供する。本発明の種々の免疫原は、特定の症状の処置に最適な特定の免疫原を選択するために、対象とする疾病または炎症症状に好適な動物モデルにおいて生産および分析することができる。喘息およびその他のアレルギー性疾患に好適な動物モデルは当技術分野で周知のものである（Humbles et al., J. Exp. Med., Vol. 186, No. 4, August 18, 1997, 601-612, Corry et al., J. Exp. Med., Vol. 183, January 1996, 109-117, Foster et al., J. Exp. Med., Vol. 183, January 1996, 195-201, Lukacs, et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Bio., Vol. 10, 526-532, 1994参照）。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本発明の免疫原は、標的サイトカインの生物活性を中和または調節可能とするのに十分高い、標的サイトカインに対する特異性および結合親和性の抗体を含む被験体で免疫応答を誘導しなければならない。高レベルの好酸球に関連する疾患を処置するために用いられる治療組成物では、誘導される抗サイトカイン抗体の力価が、被験体において高レベルのエオタキシンの低下をもたらし、アトピー性症状により影響を受けた組織への好酸球の補充の低下をもたらすに十分なものでなければならない。被験体または患者を本発明の免疫原性組成物で能動免疫することにより、エオタキシンと反応する種々の自己抗体の全体のレベル、およびＩＬ−５、ＩＬ−１３またはＩＬ−４など、エオタキシンレベルまたはＴｈ−２媒介アレルギー応答に影響を及ぼす少なくとも１つの他のサイトカインは被験体内で維持され、アレルギー反応中の好酸球の補充は妨げられ、改善されている。この抗サイトカイン自己抗体レベルは本発明の免疫原性組成物の追加投与で維持することができるので、小分子ケモカインアンタゴニスト、または治療薬のレベルに著しい変動を示し、好ましい患者の応諾を得にくいという問題がある受動抗ケモカイン免疫により与えられる防御に比べて、慢性疾病状態の管理に関してより優れた防御を与えるはずである。さらに、ｍＡｂの受動免疫では、反復投与した際に標的化されるｍＡｂに対する中和抗体が発達してしまい、長期処置ではそれらの有効性が限定される。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３４】
エオタキシンまたはその断片など、通常の非免疫原性のケモカインはまた、周知の方法（例えば、米国特許第６，２１７，８８１号；同第６，１３２，７２０号；同第５，８９１，９９２号；同第５，６０９，８７０号；同第５，６０７，６７６号；同第５，４６８，４９４号；同第５，０２３，０７７号；および同第４，２０１，７７０号、ならびにRichard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772; Svenson et al., Journal of Immunological Methods, 236 (2000), 1-8; Dalum et al., Nature Biotechnology, Vol. 17, July 1999, 666-669; Gonzalez et al., Annals of Oncology, 9: 431-435,1998; およびDalum et al., The Journal of Immunology, 1996, 157: 4796-4804参照）により、そのペプチドまたは断片を免疫原性担体タンパク質、またはジフテリア毒（ＤＴ）、破傷風毒（ＴＴ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ＢＣＧ、ＯＶＡまたはその他などのタンパク質毒素と結合させることによって免疫原性、またそうでなければ生物学的に不活性とすることができる。あるいは、これらのケモカインはコロイド金属と結合させてそれらを免疫原性とすることもできるし（米国特許第５，１１２，６０６号、同第６，２７４，５５２号、および同第６，５２８，０５１号参照）、またはＷＯ００／６５０５８およびＷＯ９５／０５８４９で開示されている方法を用い、エオタキシン配列にタンデムでＴヘルパーエピトープを導入することにより、不活性であるが、免疫原性である改変されたケモカイン変異体または形態を作出することもできる。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
本発明の一実施形態は、ＤＴまたはＴＴなどの免疫原性タンパク質担体に結合されたケモカイン分子上の所望のエピトープに対応する同じ標的ケモカイン由来の複数の異なるペプチド断片を含み、それにより無差別のＴ細胞エピトープを提供し、長期の抗体応答の間、免疫記憶を可能とする複合免疫原に関する。このような免疫原は、ケモカインに対する能動体液性免疫応答を生じさせるためにヒトまたは動物被験体に投与することができる。本発明の一実施形態は、それを免疫原性とするためにＤＴなどの免疫原性担体タンパク質に結合されたヒトエオタキシン分子などの完全ケモカインを含む。本発明のその他の実施形態は、免疫原性担体タンパク質に結合された、種々の、もっと短いケモカインペプチド断片を含む。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
これらの複合体はエピトープを含む約４〜５０個のアミノ酸残基のペプチドを用いて構築することができ、被験体に存在しているケモカイン分子上にあるエピトープと交差反応する抗体を被験体に誘導する。これらのエピトープを含むこれらのペプチドを、次に、一定範囲のペプチド／担体タンパク質モル比でタンパク質担体と結合させる。このペプチドは免疫原性タンパク質と直接結合させてもよいし、あるいは抗原提示細胞に対する提示、およびそれにより所望のエピトープの免疫原性を増強するために、担体分子から所望のエピトープを延長すべく、ペプチドスペーサー配列を組み込んでもよい。このペプチドスペーサーはペプチド断片のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれの末端に付着させてもよく、次に、このスペーサーを免疫原性担体と結合させる。ペプチドと担体の結合は、所望のエピトープを含むペプチドと担体タンパク質とを付着させるための架橋剤（ホモ二官能性またはヘテロ二官能性のいずれか）を用いて達成される。二官能性架橋剤の選択は、そのペプチド上の官能部分の利用度によって異なる。これらの結合法の化学は当技術分野で周知のものであり、米国特許第６，１３２，７２０号；同第５，６０９，８７０号；および同第５，４６８，４９４号、ならびにChemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, S.S. Wong (1991) CRC Press, Inc.の開示に示されている。
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
あるいは、免疫原性ケモカインペプチドは、選択されたケモカインエピトープ断片を、Ｔ細胞エピトープとタンデムで産生し、それにより無差別のＴ細胞エピトープとともに、選択されたＢ細胞エピトープ（ケモカインに由来する）を提示し、免疫された被験体で持続的な免疫応答をもたらすように、合成ペプチド化学により構築してもよい。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
免疫原性ケモカインペプチドは、また、ケモカイン断片、または同じもしくは異なるケモカイン由来の複数の断片の所望のＤＮＡ配列が、Ｔ細胞エピトープの、必要なＤＮＡ配列とタンデムでコードされており、それによりＴ細胞エピトープとともに、選択されたＢ細胞エピトープ（ケモカインに由来する）を含む融合タンパク質を産生するようなプラスミドベクターを作出するよう、組換えＤＮＡ技術により構築することもできる。この融合タンパク質は細胞培養／発酵技術を用いてin vitroで発現させることができ、培養物から精製することができるか、またはプラスミド表面で発現させることができるか、またはそのプラスミドＤＮＡ構築物をＤＮＡワクチンとして使用することができる。これらの方法はいずれも、個々の調製物で免疫した被験体においてケモカイン特異的、かつ、持続的免疫応答を惹起するのに好適な調製物を提供することができる。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
成熟ヒトエオタキシン配列を参照すれば、本発明の特定の実施形態では、この分子のアミノ末端に由来するアミノ酸残基１〜４５のペプチド断片およびカルボキシル末端を構成している残基５４〜７４の断片が、本発明の免疫原性複合体の構築に有用である。この免疫原性複合体は、同じ免疫原性担体に結合された、同じペプチド断片または異なるペプチド断片に存在し得る１以上の異なるエオタキシンエピトープを含み得る。本発明の免疫原の構築に有用ないくつかのエオタキシンペプチド断片は次の通りである：
【表２】
2007525436.tif 000045
【表３】
2007525436.tif 000046
【表４】
2007525436.tif 000047
【表５】
2007525436.tif 000048
これらのペプチドは当技術分野で周知の合成または組換え手段により作製できる。また、当業者ならば、どんなペプチド断片であれ、そのアミノ酸配列を、その免疫原性を高めるために、あるいは例えば電荷、電荷密度、疎水性など、その断片の他の何らかの特性を付与もしくは高めるために、溶解度を変化させるために、または被験体においてエオタキシンに対する免疫応答の誘導に寄与するその能力を維持しながら、ジスルフィドによるオリゴマー化を排除するためのシステイン残基の置換をはじめとする、オリゴマー化および凝集の可能性を低減するために、改変することができることを理解し得る。このような改変は例えばアミノ酸残基を誘導体化することにより、または特定のアミノ酸は別のアミノ酸に置換することにより、または当技術分野で公知の他の何らかの方法により行うことができる。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
また、特定の動物被験体においてエオタキシンの生物活性を示さないペプチドミメティクスまたはイムノミミックを用いて複合免疫原を構築することもできる。ペプチドミメティクスはそれ自体で免疫原性とはなり得ないが、免疫原性ペプチドと結合させることにより免疫原性となり得る。ある実施形態では、これらのペプチドミメティクスはマウスまたはモルモットエオタキシンなどのその他の哺乳類エオタキシン分子に由来するものであってもよい（米国特許第６，０３１，０８０号および同第５，９９３，８１４号）。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
エオタキシンペプチド断片またはイムノミミックは免疫原性タンパク質担体と直接結合されてもよいし、あるいは抗原提示細胞に対する提示、およびそれにより所望のエピトープの免疫原性を増強するために、担体分子から所望のエピトープを延長すべく、ペプチドスペーサー配列を組み込んでもよい。多様なペプチドスペーサーが使用できる。米国特許第５，６０９，８７０号および同第５，４６８，４９４号は、ペプチドスペーサー、およびそれらのスペーサーを目的のペプチドと、そしてさらに本発明の複合免疫原を構築するのに有用であり得るＤＴまたはＴＴなどの免疫原性タンパク質担体と結合させる方法を開示している。これらのペプチドスペーサー：
【表６】
2007525436.tif 000049
は、本発明のエオタキシンペプチド断片に使用可能である。これらのスペーサーペプチドをエオタキシンペプチド断片のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかに組み込むと、例えば、
【表７】
2007525436.tif 000050
などの免疫原性タンパク質と結合したペプチドが作出できる。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
典型的に、これらのスペーサー配列を、エピトープを含むペプチド断片の作出の際の合成ペプチド化学によって特定のエオタキシン配列に組み込む。特に、いくつかの親水性配列を有する配列を含み、その分子の表面に提示される可能性が高いエオタキシン断片が本発明に特に有用である。これらのものとして、例えば、
【表８】
2007525436.tif 000051
が挙げられる。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
抗エオタキシン免疫原は、免疫原性担体に結合された１つのペプチド断片、例えば、ＤＴに結合された配列ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ（配列番号１６）のペプチド断片の１以上のコピーを含み得る。他の実施形態では、エオタキシン上の２以上のエピトープに対する抗体を用いて被験体において能動免疫応答を誘導するために、２以上の異なるペプチド断片を同じ免疫原性担体に結合させてもよい。このような免疫原は、例えば、ＤＴに結合されたペプチド配列ＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ（配列番号１６）およびＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ（配列番号２３）の各々の複数コピーを含み得る。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
もう１つの実施形態では、エオタキシン上の２以上のエピトープに対する抗体を用いて被験体において能動免疫応答を誘導するために、２以上の異なるペプチド免疫原性担体複合体を用いて製剤を調製してもよい。例えば、投与する組成物は、１つは担体に結合された１つの特定のエピトープを含む第一の構築物と、他の担体分子に結合された第二の異なるエピトープを含む第二の構築物の、２つの異なる免疫原構築物の同時配合混合物である。このような免疫原製剤は、例えば、ペプチド配列ＤＴ複合体、すなわち、ＤＴに結合されたＧＰＡＳＶＰＴＴＣＣＦＮＬＡＮＲＫＩＰＬ（配列番号１６）、およびＤＴに結合されたＫＫＫＷＶＱＤＳＭＫＹＬＤＱＫＳＰＴＰＫＰ（配列番号２３）の各々の複数コピーを含む。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
実施例２：抗ＩＬ−５免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−５に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。ＷＯ００／６５０５８は、抗ＩＬ−５免疫原性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している。ＷＯ００／６５０５８  に開示されている抗ＩＬ−５免疫原は本発明の方法に有用であり、ＷＯ００／６５０５８の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
実施例３：抗ＩＬ−９免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−９に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772は、抗ＩＬ−９免疫原性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している（米国特許第６，６４５，４８６も参照）。Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772に開示されている抗ＩＬ−９免疫原は本発明の方法に有用であり、Richard et al., PNAS, January 18, 2000, Vol. 97, No. 2, 767-772の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
実施例４：抗ＩＬ−１３免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−１３に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。ＷＯ０２／０７０７１１は、抗ＩＬ−１３免疫原性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している。ＷＯ０２／０７０７１１に開示されている抗ＩＬ−１３免疫原は本発明の方法に有用であり、ＷＯ０２／０７０７１１の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実施例５：抗ＩＬ−４免疫原
哺乳類およびヒトにおいてＩＬ−４に対する能動免疫応答を惹起する免疫原は当技術分野で公知のものである。ＷＯ０２／０７０７１１は、抗ＩＬ−４免疫原性組成物、ならびにそれらを作製および投与するための方法を開示している。ＷＯ０２／０７０７１１に開示されている抗ＩＬ−４免疫原は本発明の方法に有用であり、ＷＯ０２／０７０７１１の開示は出典明示によりそのまま本明細書の一部とされる。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
実施例８：二価抗エオタキシンおよび抗ＩＬ−５免疫原
エオタキシンおよびＩＬ−５の両者に対する能動免疫応答を惹起する免疫原も本発明の方法に従って構築でき、免疫原性治療用ワクチン組成物の投与は好酸球増加症を処置するために使用できる。本発明のある特定の実施形態では、この二価免疫原性組成物は、同じ免疫原性タンパク質担体分子に結合されたハプテンとしてのエオタキシンエピトープおよびＩＬ−５エピトープに特異的な抗原ペプチド決定基を含む。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
配列番号６２〜１０９の抗原決定基はそれらのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて配列番号３９〜４１のものなどのスペーサーペプチド配列と結合させ、さらに、そのスペーサーペプチドリンカーによってＤＴまたはＴＴなどの免疫原性担体と結合させてもよい。また、抗ＩＬ−５免疫原性エピトープの構築に有用なイムノミミックを作出するために、この抗原ペプチド決定基に対応するＩＬ−５断片の天然配列を改変または変更してもよい。本発明の特定の実施形態では、システイン残基をトレオニンに変換するが、トレオニンの代わりにセリンまたはアラニンによるシステイン置換を用いることもできる。このような改変ペプチド配列の例としては、
【表１９】
2007525436.tif 000052
がある。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
二価免疫原は毒素ペプチドなどの免疫原性担体に結合されたエオタキシンおよびＩＬ−５エピトープの任意の組合せにおいて複数の抗原ペプチド決定基を含み得る。例えば、ヒト被験体においてエオタキシンおよびＩＬ−５に対する能動免疫応答を惹起するのに有用な二価免疫原は、配列番号５６〜６１および１１４〜１１６、１１８、１１９、１２２および１２３の複数の抗原ペプチド決定基と、ＤＴなどの免疫原性担体とを結合させることにより構築することができる。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
実施例９：ペプチド抗原決定基と免疫担体との結合
ペプチドと免疫原性タンパク質担体を結合させる方法は当技術分野で周知のものである（例えば、ＷＯ０２／０６６０５６参照）。例えば、トレオニン置換エオタキシンエピトープ断片：
【表２０】
2007525436.tif 000053
を、ヘテロ二官能性架橋剤を介してＤＴまたはＴＴ担体タンパク質と結合させてもよい。これらのエオタキシン断片の１以上は、Ｎ−（イプシロン−マレイミドカプロイルオキシ）−スクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）またはその水溶性類似体スルホ−ＥＭＣＳなどのヘテロ二官能性架橋剤と反応させることで、ＤＴまたはＴＴと架橋させる。本実施形態では、ＤＴまたはＴＴをまず、毒素上のアミノ基においてスクシンイミジルエステルを介してヘテロ二官能性架橋剤と反応させる。この反応は好ましくは、６．５±０．３、約１〜３時間、室温で行う。マレイミジル基と担体タンパク質の比、例えば、５：１、１０：１、１５：１は、毒素（ＤＴまたはその他の担体タンパク質）と適当な過剰の架橋剤とを反応させることにより達成される。架橋剤の実際のモル過剰量は滴定により決定する。滴定の際に毒素１モル当たりに組み込まれるマレイミドのモル数は、次に、マレイミジル−毒素をシステインまたはβ−メルカプトエタノールなどのスルフヒドリル化合物と反応させることにより決定できる。マレイミジル−毒素と反応させるスルフヒドリル化合物の量は、最も容易には、残存しているスルフヒドリル化合物をビス−ジチオ−ニトロベンゾエートと反応させることで直接測定することができる。ダイアフィルトレーションかゲル濾過のいずれかによって過剰な架橋剤を除去した後、マレイミジル−毒素をその末端スルフヒドリル基を介し、活性化毒素のマレイミジル部分の１：１モル過剰のエオタキシン−スペーサーペプチドと反応させる。このペプチドと毒素との結合は好ましくは、ｐＨ６．０±０．３、約３〜６時間、室温で行う。あるいは、このペプチドとマレイミジル−毒素との結合反応は室温で一晩反応させることにより達成することができる。容器内で、マレイミド基を含む架橋剤との結合反応を行うのが好ましい。ペプチドと反応させた後、過剰量のペプチドをリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２±０．２に対してダイアフィルトレーションまたはゲル浸透クロマトグラフィーを行うことにより除去する。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
実施例１１：免疫ワクチン組成物の処方
抗原決定基毒素複合体の免疫原性の提示に好適な処方としては、限定されるものではないが、アルミニウムまたはアルヒドロゲルへの吸着、リポソーム、ミクロソームまたは類似のマイクロスフェア（マイクロ粒子およびナノ粒子を含む）内への封入、水中油または油中水エマルション（多相エマルション、およびマイクロエマルション（例えば、ＷＯ０２／０６６０５６参照）が挙げられる。その他の好適であり得る処方としては、含まれている抗原（この場合、好ましいエオタキシン特異的毒素複合体）に対する免疫応答を刺激し得るアジュバント特性を有するブロックコポリマーとの調製物が挙げられる。本発明の複合免疫原はアジュバントまたはその他の免疫刺激剤を用い、医薬上許容されるビヒクル中に、当技術分野で周知の成分および方法を用いて処方することができる（Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, (1995) Powell and Newman Eds., Plenum Press (New York), Aucouturier et al., Vaccine 19 (2001) 2666-2672参照）。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
本発明の特定の実施形態は、抗原決定基ペプチド毒素複合体の油中水エマルションの水相への処方を含む。濾過除菌（０．１〜０．２μｍ）したペプチド毒素複合体水溶液を、水油混合物をホモジナイズした際に安定な油中水エマルションが得られるに十分な乳化剤を含有する好適な濾過除菌（０．２μｍ）油混合物と合わせる。この乳化工程は、最終的な濾過、加熱滅菌または照射によって滅菌できない医薬製剤（無菌エマルションを含む）の無菌調剤および充填の実施に有用な層流フードまたは好適な無菌アイソレーター内で無菌的手段として実施する。