(57)【要約】  本発明は、標的分子の少なくとも４つのコピーと、標的分子に対して特異的な少なくとも２つの結合分子とを有する粒子を含む親和性結合アッセイであって、第１の結合分子が第１のラベルに関連付けられ、第２の結合分子が第２のラベルに関連付けられ、第１のラベルを有する粒子と第２のラベルを有する粒子とが、第１および第２のラベルの両方を有する分子から区別可能であり、第１の結合分子と第２の結合分子とがそれぞれ、標的分子に対して特異的な少なくとも２つの結合領域を含む、親和性結合アッセイを開示する。本発明はまた、第１のラベルに関連付けられた第１の結合分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の結合分子とを含み、第１のラベルおよび第２のラベルから得られるシグナルが、第１および第２のラベルの組合せシグナルから区別可能である組成物であって、第１および第２の結合分子がそれぞれ、本質的に同一の標的分子に対して、好ましくは、標的分子上の本質的に同一のエピトープに対して、特異的な少なくとも２つの結合領域を有することを特徴とする組成物を開示し、本開示の組成物および方法を用いることを含む、少なくとも３つの抗原のコレクションから合成抗原を選択する方法を開示する。本発明はさらに、上述の方法によって得られ、初期免疫応答を含み得る抗原、前記方法を実行するための部品キット、ワクチンとしての使用のために前記方法によって選択される抗原の使用、および、抗原および抗体の治療薬としての使用を開示する。
2007527000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
親和性結合ペアのメンバーであって、たんぱく様分子のエピトープに特異的なメンバーを含む、細胞を検出するための方法において、
たんぱく様分子の少なくとも一部に由来する合成ペプチドを生成することと、
ヒト以外の動物を合成ペプチドで免疫化して、動物から得たサンプル中の、たんぱく様分子に特異的な親和性結合ペアのメンバーを含む細胞を検出することと、を含むことを特徴とする細胞を検出するための方法。
【請求項２】
サンプルを、たんぱく様分子またはその等価物からのエピトープの少なくとも２つのコピーを含み、第１のラベルを含む第１の分子、および、たんぱく様分子またはその等価物からのエピトープの少なくとも２つのコピーを含み、第２のラベルを含む第２の分子と共に培養して、サンプル中の、第１のラベルおよび第２のラベルを含む細胞を検出する、ことを特徴とする請求項１記載の細胞を検出するための方法。
【請求項３】
修飾ペプチドがたんぱく様分子のどのペプチドとも免疫学的に異なるように合成ペプチドを修飾する、ことを特徴とする請求項１または２記載の細胞を検出するための方法。
【請求項４】
合成および／または修飾ペプチドに、二量体および／またはタンデム二量体ペプチド、ミモトープ、置換網マップしたペプチド、および／または、ペプチドの２０アミノ酸当たり１〜６個のアミノ酸置換を含むアミノ酸置換ペプチドが含まれる、ことを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項５】
合成および／または修飾ペプチドがＧｎＲＨに由来する、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項６】
合成および／または修飾ペプチドがガストリンに由来する、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項７】
合成および／または修飾ペプチドがｈＣＧに由来する、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項８】
合成および／または修飾ペプチドがＰＴＨｒＰに由来する、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項９】
細胞が免疫細胞である、ことを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項１０】
細胞がＢ細胞である、ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項１１】
第１の分子および第２の分子に、エピトープの四量体またはたんぱく様分子の四量体が含まれる、ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞を検出するための方法。
【請求項１２】
第１のラベルに関連付けられた第１の分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の分子とを含む組成物において、
第１のラベルおよび第２のラベルから得られるシグナルが、第１のラベルと第２のラベルとの組合せシグナルから区別可能であり、各分子がエピトープの四量体またはたんぱく様分子の四量体を含む、ことを特徴とする組成物。
【請求項１３】
抗原を選択するための方法において、
抗原のコレクションを準備することと、
ヒト以外の少なくとも１匹の動物をコレクションで免疫化することと、
たんぱく様分子に特異的なＢ細胞系統の細胞のクローン性増殖が生じた抗原を選択することと、を含むことを特徴とする抗原を選択するための方法。
【請求項１４】
抗原に、たんぱく様分子の少なくとも一部に由来する修飾ペプチドであって、たんぱく様分子のどのペプチドとも免疫学的に異なる修飾ペプチドが含まれる、ことを特徴とする請求項１３記載の抗原を選択するための方法。
【請求項１５】
抗原特異的細胞のクローン性増殖が、コレクション中の他の抗原でのクローン性増殖よりも広範な抗原を選択すること、をさらに含むことを特徴とする請求項１３または１４記載の抗原を選択するための方法。
【請求項１６】
Ｂ細胞系統の細胞のクローン性増殖を、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法によって検出する、ことを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の抗原を選択するための方法。
【請求項１７】
天然たんぱくとの交差反応性免疫応答を含むことが可能で、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法で得られる、ことを特徴とする合成および／または修飾ペプチド。
【請求項１８】
ＧｎＲＨに由来する、ことを特徴とする請求項１７記載の合成および／または修飾ペプチド。
【請求項１９】
ガストリンに由来する、ことを特徴とする請求項１７記載の合成および／または修飾ペプチド。
【請求項２０】
ｈＣＧに由来する、ことを特徴とする請求項１７記載の合成および／または修飾ペプチド。
【請求項２１】
ＰＴＨｒＰに由来する、ことを特徴とする請求項１７記載の合成および／または修飾ペプチド。
【請求項２２】
ワクチンの調製のための、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項２３】
薬剤の調製のための、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項２４】
前立腺癌および女性のＧｎＲＨ関連の癌の治療用薬剤の調製のための、請求項１８記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項２５】
避妊用薬剤の調製のための、請求項１８記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項２６】
ガストリン関連の結腸直腸癌、および／または、胃癌、および／または、膵臓癌の治療用薬剤の調製のための、請求項１９記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項２７】
ｈＣＧ関連の婦人科、結腸直腸、睾丸精上皮腫、膀胱、肝臓、胃、膵臓、肺、脳および腎臓の各癌の治療用薬剤の調製のための、請求項２０記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項２８】
ｈＣＧ関連の潰瘍、ジュークス病および肝硬変の治療用薬剤の調製のための、請求項２０記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項２９】
ＰＴＨｒＰ関連の癌の治療用薬剤の調製のための、請求項２１記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項３０】
ＰＴＨｒＰ関連の溶骨性骨疾患の治療用薬剤の調製のための、請求項２１記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項３１】
ＰＴＨｒＰ関連の高カルシウム血症の治療用薬剤の調製のための、請求項２１記載の合成および／または修飾ペプチドの使用。
【請求項３２】
免疫細胞のコレクションに、たんぱく様分子のエピトープに特異的な特異的結合ペアのメンバーの、少なくとも２つのコピーを有する細胞が含まれるか否かを判定する方法において、
特的結合ペアのメンバーに特異的な少なくとも２つの分子であって、第１の分子が第１のラベルに関連付けられ、第２の分子が第２のラベルに関連付けられた２つの分子を、コレクションに供給することと、
両方のラベルによって染色された細胞がコレクションに含まれるか否かを判定することと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
たんぱく様分子のエピトープに特異的な特異的結合ペアのメンバーの、少なくとも２つのコピーを有する細胞が、Ｂ細胞である、ことを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
請求項３３記載のＢ細胞に由来するハイブリドーマ細胞系。
【請求項３５】
抗体の調製のための、請求項３２記載の単離Ｂ細胞および／または請求項３４のハイブリドーマの使用。
【請求項３６】
請求項３２記載のＢ細胞または請求項３３記載のハイブリドーマによって産生された単離抗体。
【請求項３７】
薬剤の調製のための、請求項３６記載の単離抗体の使用。
【請求項３８】
少なくとも、第１のラベルに関連付けられた第１の分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の分子とを含み、第１の分子と第２の分子とが、たんぱく様分子のエピトープに特異的な親和性結合ペアの、同一メンバーに対する少なくとも２つの結合領域を含む、ことを特徴とする部品キット
【請求項３９】
抗原を選択するための、請求項３８記載の部品キットの使用。
【請求項４０】
細胞コレクション中の細胞を検出するための方法において、
前記細胞に特異的に結合することが可能な第１および第２の分子であって、互いに異なるラベルを含み、前記細胞に対する少なくとも４つの結合領域を含む第１および第２の分子を、細胞コレクションに提供することと、
両方のラベルを含む細胞を検出することと、を含むことを特徴とする方法。
【請求項４１】
前記細胞が両方のラベルを略等モル量含む、ことを特徴とする請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞が免疫細胞である、ことを特徴とする請求項４０または４１記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞を、前記結合領域を含む分子またはその機能的誘導で免疫化した動物から得る、ことを特徴とする請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
動物を、天然たんぱくまたは天然ペプチドの一部に類似するが同一ではない機能的誘導体で免疫化し、結合が天然たんぱくまたは天然ペプチドの前記一部と同一である、ことを特徴とする請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
機能的誘導体に二量体ペプチドが含まれる、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
機能的誘導体にタンデム二量体ペプチドが含まれる、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４７】
機能的誘導体に抗原のミモトープが含まれる、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
機能的誘導体に、２０アミノ酸当たり１〜６個の、Ｄアミノ酸および／またはＬアラニンによって置換されたアミノ酸が含まれる、ことを特徴とする請求項４４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫の分野およびワクチン開発に関する。本発明はさらに、特異的抗体による免疫化後の初期Ｂ細胞応答の検出に関する。
【０００２】
ワクチンは、公衆衛生を改善する非常に有効な手段であることが判明している（Ｊａｃｋｓｏｎら、２００２年）。しかし、従来のワクチン開発は、高コストであるだけでなく、病原体不活性化における技術的問題によって妨害され得る。
【０００３】
さらに、多くの抗原が免疫系によって直ちに異種として認識されず、したがって、それらの抗原は適切な免疫応答を引き起こさない。これらの場合、ペプチド系合成ワクチンが有効な代替物となる（Ｊａｃｋｓｏｎら、２００２年）。ペプチドワクチンは、感染症の予防に（Ｍｏｎｚａｖｉ−Ｋａｒｂａｓｓｉら、２００２年）、ならびに、腫瘍（Ｒｉｂａｓら、２００３年；Ｎｏｇｕｃｈｉら、２００３年）、アミロイドーシス（Ｎｉｃｏｌｌら、２００３年）および自己免疫疾患（Ｌｉｕら、２００２年）の治療に、成功裏に使用されてきた。
【０００４】
人体によって異種と認識されない抗原に対するワクチンの調製における１つの困難は、耐性現象に起因する。通常、免疫応答は異種として認識された抗原に対して発現するが、自己抗原に対しては発現しない。ワクチンが奏功するためには、ワクチンは充分に異種でなければならない。ワクチンが充分に異種すなわち充分に免疫原性であるときのみ、免疫系がワクチンに対して反応し、免疫応答が誘発される。しかしながら、逆に、免疫細胞および／または抗体は、依然として自己物質または耐性抗原を認識し得なければならず、よって、ワクチンはあまりに「異種」であることはできない。このため、その抗原のペプチドが作られ、このペプチドは、その抗原の免疫原性を高めるように修飾される。このペプチドまたは修飾ペプチドはペプチドワクチンとして使用される。
【０００５】
ペプチドワクチンの開発は、多大な労力を要し、時間のかかる手続きである。ペプチドワクチン候補は、免疫応答を発現しなければならず、特異的Ｔ細胞および／またはＢ細胞のクローン性増殖を引き起こさなければならない。この免疫応答は、Ｔ細胞および／またはＢ細胞によって認識され、抗原特異的Ｔ細胞およびＢ細胞の増殖反応を開始するエピトープによって発現される。増殖反応すなわち「クローン性増殖」は、抗原と免疫系の最初の接触の後、たとえばワクチン接種後、数時間以内に始まる。特異的免疫Ｂ細胞の数は、クローン性増殖によって、ワクチン接種後３、４週間後にエフェクター細胞が高レベルに達するまで増加する。クローン性増殖後のこれらのエフェクター細胞のレベルは、エフェクター細胞を従来の方法で検出するに足る高さである。ペプチドがＢまたはＴ細胞エピトープを曝すか否かを検出するためには、ペプチドの多数のセットの動物免疫化処理でのスクリーニングが必要である。Ｂ細胞およびＴ細胞特異性の免疫レパートリは非常に多様であり（ＤａｖｉｓおよびＢｊｏｒｋｍａｎｎ、１９８８年）、抗体応答に関与する抗原特異的Ｂ細胞の頻度は非常に低いので、Ｂ細胞の検出が、Ｂ細胞の機能的および分子的特徴付けにおいて主たる困難となり（Ｎｅｗｍａｎら、２００３年）、Ｂ細胞反応の研究者に大きな問題を課す。クローン性増殖の後、活性化されたＢ細胞が抗原特異的抗体を産生する（Ａｄａｍｓら、２００３年）。したがって、抗原に対するＢ細胞応答は、通常、循環血液における抗原特異的抗体のレベルを測定することによって、測定される。その結果、通常の免疫化処理の後、抗原に対して向けられた抗体が、比較し解釈し得るレベルに達するまでに、少なくとも４〜５週間はかかるので、多数の実験動物をかなりの期間にわたって飼育しなければならない。実際、これが、迅速かつ系統的な合成ペプチドワクチンの開発にとって、主たる障害になっている。
【０００６】
Ｂ細胞は、通常、抗原または抗体をシグナリング分子に結合させることによって行われる直接染色法または間接染色法によって、特異的に検出することが可能であり、シグナリング分子には、たとえば、蛍光染色剤（フルオレセインイソチオシアナート、ＦＩＴＣ、またはローダミン）、または、化学的な、放射性の、もしくは酵素的なシグナル源、または、他のマーカー物質であって、マーカー物質のＢ細胞への結合を熟練者が検出することを可能にするものなどがある。Ｂ細胞検出の感度を向上させる多くの方法が開発されており、大きな細胞コレクション内たとえば脾臓細胞内の少数の抗原特異的Ｂ細胞が検出可能な程度にまでなっている。現在までのところ、クローン性増殖の前の抗原特異的Ｂ細胞の数は、既存の検出方法によって検出するには少なすぎる。クローン性増殖の過程は、Ｂ細胞またはＢ細胞によって産生される抗体のいずれかが検出され得るレベルにまで、Ｂ細胞の数を増大させる。蛍光染色技術に基づいて、フローサイトメトリが開発されて、抗原特異的Ｂ細胞に適用されるまでになっている（ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９３年）。歴史的には、研究者は、抗原特異的Ｂ細胞の研究に２つの異なる研究手法を組み合わせて用いてきた。一方の手法は、免疫反応性Ｂ細胞を捕捉するハイブリドーマ技術であり、他方の手法は、増強された数の抗原特異的Ｂ細胞によって遺伝子的に操作された動物を研究することである。両方法ともに、ワクチン接種後かつクローン性増殖が完了する前に出現する、低レベルの抗原特異的Ｂ細胞を検出するには感度が低すぎる。
【０００７】
Ｂ細胞の検出のために開発された１つの方法は、Ｔ細胞の染色を適用したものである。Ｔ細胞検出の感度は、四量体ペプチド−ＭＨＣ分子であってそのペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞受容体に結合するものと共に、細胞を培養することによって、高められている（Ａｌｔｍａｎら、１９９６年；Ｓｔｅｔｓｏｎら、２００２年）。上述の方法は、抗原特異的Ｂ細胞の検出に適用されてきたが（Ｎｅｗｍａｎら、２００３年）、通常の処理の感度は１０倍増大したにすぎない。これは未だ、ワクチン接種後すぐに出現する低頻度の抗原特異的Ｂ細胞を効果的に検出するには、あまりに低感度である。
【０００８】
低頻度の標的細胞の検出レベルを高めるための他の方法が、Ｔｏｗｎｓｅｎｄらによって２００１年に記載されており、同氏らは、Ｂ細胞を、そのＢ細胞受容体であって異なる２つのラベルにコンジュゲートさせておいたものに特異的な、２種類の試薬で染色することによって、検出閾値を低下させることに成功している（「単一エピトープ多重染色」とも呼ばれる）。この順次染色処理（第１の試薬は飽和濃度以下で使用される）の原理は、偽陽性細胞が両試薬に結合する可能性は、偽陽性細胞が一方の試薬のみに結合する可能性よりもはるかに小さいことである。しかしながら、Ｔｏｗｎｓｅｎｄらは、適合移植されたＢＣＲ−トランスジェニック細胞の特徴付けを行ったのみで、彼らの方法が、ワクチンによって誘発される反応を含む真の免疫応答の解析にまで外挿し得るか否かの問いに、解答を与えていない。
【０００９】
この「単一エピトープ多重染色処理」は、背景の染色を低減し、これによって、フローサイトメトリの感度が１〜２オーダ向上し、高親和性抗原特異的Ｂ細胞の生体内での検出が可能になっている。感度のこのような向上は、トランスジェニックＢ細胞またはクローン性増殖が完了した後のＢ細胞の検出を可能にするかもしれないが、免疫化後７日以内の低頻度の初期Ｂ細胞の検出には、やはり低感度すぎる。しかも、この方法は複雑であり、著者は、フローサイトメトリの感度を向上させることにおいてこの方法が有効になるには、いくつかの必要条件が満たされなければならないことに注意することが決定的に重要であると、人々に警告している。上述のＴｏｗｎｓｅｎｄらの方法は、マウスにとって異種の抗原、すなわちニワトリの卵白リゾチームを、抗原として使用している。ＧｎＲＨのような自己抗原に対する特異的Ｂ細胞の検出に適用したとき、この方法は、特異的Ｂ細胞を背景染色から識別することができなかった（本出願の実施例１参照）。したがって、Ｔｏｗｎｓｅｎｄらの方法は自己抗原に対する低頻度のＢ細胞の検出には適さなかった。
【００１０】
本発明者らは、免疫応答の非常に初期の段階におけるクローン性増殖の間の出現Ｂ細胞の特異的染色に基づいて、ペプチドワクチン候補を選択するための高感度で再現性のある親和性結合アッセイ（affinity-binding assay）を開発した。親和性結合アッセイは、互いに対してある程度の親和性を有する２以上の物質の結合を、検出または測定する試験である。これは、たとえば、抗体と抗原との、酵素とその基質との、あるいは、ホルモンとそのホルモン受容体との結合であり得る。本出願において、本発明者らは、例として、抗原特異的Ｂ細胞受容体と抗原との親和性結合を記載する。当然、この親和性結合は種々の方法で検出し、または測定することができる。例として、本発明者らは、適応フローサイトメトリ法（adapted flow cytometry method）による親和性結合の検出を開示する。
【００１１】
本出願は、結合アッセイおよびこの結合アッセイを用いた試験方法を開示するが、この結合アッセイでは、少なくとも４つの標的分子から成る粒子または細胞、たとえば、細胞膜に結合した抗体、受容体、または抗原特異的Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）を、その粒子または細胞を異なるラベルを有する少なくとも２つの結合分子に接触させることによって、検出することが可能である。粒子または細胞をフローサイトメトリによって検出することは、その粒子または細胞を蛍光ラベルで染色し、蛍光検出器を用いて蛍光シグナルを記録することによって、ラベルをつけた粒子または細胞を検出することに基づいている。各蛍光ラベルは、強度および背景染色のレベルに関して固有の特性を有する。本出願は、抗原の多重形から成り、本質的に同一の抗原の少なくとも２または３の、好ましくは４以上の結合エピトープが存在し露出している分子で染色することが、染色の強度を向上させることを開示する。強度のさらなる向上は、上述の抗原の多重形の染色と、異なる２つの蛍光ラベルとを組み合わせることで達成される。この目的のために、本質的に同一の多重抗原分子の２つの量が、異なる２つのラベルに関連付けられる。この場合、たとえば、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）でラベルしたニュートラアビジン、および、ストレプトアビジンに結合させたアロフィコシアニン（ＡＰＣ）などの、蛍光シグナルの点で異なるラベルが選択される。異なるラベルを付したこれらの抗原分子の両方に細胞を接触させることで、細胞は両分子に結合し、異なる２つの蛍光ラベルを表面上で結集させる。この接触は、たとえば連続したステップで行うことが可能であり、たとえば、細胞を、まず、飽和濃度未満の量の第１の蛍光ラベル抗原分子と共に培養し、次いで、より飽和濃度に近いまたは飽和濃度の量の第２の蛍光ラベル抗原と共に培養する。粒子または細胞を両方の蛍光ラベル抗原分子で染色する方法の他の例は、２つの異なるラベル抗原分子を略等モル量で混合し、粒子または細胞をその混合物と共に培養することである。分離した２つの分子の同一粒子への特異的結合の可能性は非常に低いので、この方法の特異性は向上する。この向上した特異性は、多重抗原分子との結合のより高い親和性と相まって、感度を驚くほど向上させて、１００万個の細胞中における僅か２０〜３０個の細胞の特異的検出を可能にする。本出願では、抗体分子または免疫細胞の表面に存在する抗原特異的Ｂ細胞受容体は、標的分子または親和性結合ペアのメンバーと呼ばれ、このメンバーは、たんぱく様分子のエピトープに特異的である。標的分子に結合する抗原分子は、本出願では、結合分子または分子と名付けられる。この（結合）分子は、１以上のペプチド、またはたんぱく質もしくはそのフラグメントを含んでもよい。さらに、この（結合）分子は、染色する分子を含んでもよい。本出願における粒子は、ウィルス、微生物、または細胞もしくは酵母の一部であり得る。この粒子の大きさは、好ましくは、最小では、ウィルスの大きさ程度であり、最大では、１０００細胞の大きさ程度、より好ましくは、１００細胞の大きさ程度、さらに好ましくは、１０細胞の大きさ程度、さらに好ましくは１細胞の大きさ程度である。本特許出願において、好ましくはフローサイトメトリの結果を解釈することによって、二重に染色された粒子または細胞が、ラベルを１つのみ有する、またはラベルを全く有さない粒子または細胞から、区別できることについて、「区別可能」という語を使用する。好ましくは、この区別は、第１および第２のラベルからのシグナルの差異を通じてなされる。本明細書において、ラベルとは、好ましくは蛍光染色ラベルを意味するが、磁気ラベルまたは他のどのような種類の染色ラベルであってもよい。
【００１２】
したがって、本発明は、標的分子の少なくとも２つのコピーと、標的分子に特異的に結合する少なくとも２つの結合分子とを有する粒子を含み、第１の結合分子が第１のラベルに関連付けられ、第２の結合分子が第２のラベルに関連付けられ、第１のラベルを有する粒子と第２のラベルを有する粒子が、第１のラベルと第２のラベルの両方を有する粒子から区別可能であり、第１の結合分子および第２の結合分子が、それぞれ、標的分子に特異的な少なくとも２つの結合領域を有する、親和性結合アッセイを開示する。粒子は細胞であってもよく、したがって、本発明は、上述のアッセイであって、粒子が細胞であるアッセイも開示する。細胞は生きている細胞でよいし、または、細胞は、たとえば、ホルマリン、アセトン、アルコールまたはグルタルアルデヒドなどの、フローサイトメトリで通常使用される固定剤のような、固定剤で処理してもよい。
【００１３】
本発明の方法は非常に感度が高いので、このような方法が、たとえば非常に初期の免疫Ｂ細胞のような、非常に低頻度の抗原特異的Ｂ細胞を検出し得ることは、これが初めてである。これらの非常に初期の免疫細胞は、完全なクローン性増殖過程を終えていないので、非常に低い頻度でのみ存在する。したがって、本発明は、上述の親和性結合アッセイであって、前記細胞に、１次免疫応答のクローン性増殖相における活性化された免疫細胞が含まれる、アッセイを開示する。たとえばマウスにおいては、この活性化は、抗原との最初のまたは２回目の接触の後、数時間以内に起こり、３〜４週間以内に末梢血に抗体が現れる結果となる。
【００１４】
本方法は、非常に低頻度のＢ細胞の検出に特に適しており、抗体応答が進むのをもはや待つ必要がないため、多くの時間を節約する。これよって、少なくとも３〜４週間を要していた各ペプチドについての動物相が、１〜２週間に短縮される。さらに、非常に低頻度のＢ細胞の検出は、記憶Ｂ細胞の検出にも非常に適している。このことは、ある種の疾患に対する免疫状態を評価するために重要であるかもしれない。本出願において、Ｂ細胞とは、活性化または分化のあらゆる段階におけるＢ細胞を意味し、たとえば、抗原特異的前駆Ｂ細胞、抗体分泌細胞、形質細胞、および記憶Ｂ細胞を含む。したがって、本発明は、好ましい実施形態において、上述のアッセイであって、前記細胞にＢ細胞が含まれるアッセイを開示する。本出願に開示されるように、Ｂ細胞を計数し表現型に関して特徴付けを行うことが可能であることによって、当業者は、免疫化または感染に対する初期免疫応答、たとえば、原始Ｂ細胞の抗体分泌細胞、記憶Ｂ細胞および形質細胞への増殖および分化の検出ができるようになる。
【００１５】
多重抗原分子と多重染色技術との組み合わせによって、感度が驚くほど大きく向上するから、本発明は、上述の親和性結合アッセイであって、第１および第２のラベルを有する粒子が親和性結合アッセイの感度を向上させる親和性結合アッセイを開示する。
【００１６】
多重抗原分子の結合特性は、分子上の露出した抗原部位の数と共に向上する。本出願においては、たとえば、４つの抗原部位を含む四量体分子を試験している。当然、同一分子内で繰返す抗原の数を他の数にしても、所望の効果が得られるであろう。したがって、本発明は、上述の親和性結合アッセイであって、第１および第２の結合分子がそれぞれ、標的分子に特異的な結合領域を少なくとも２つ含むアッセイを開示する。好ましくは、結合領域の数は４である。
【００１７】
標的分子の抗原部位またはエピトープが本質的に同一のエピトープである場合、結合はさらに高まるかもしれない。したがって、本発明は、上述の親和性結合アッセイであって、少なくとも２つの結合領域が本質的に同一であるアッセイを開示する。このアッセイの大きな利点は、検出アッセイの結合分子が天然たんぱくのエピトープを表現してもよいことであり、なぜならば、これによって、その天然たんぱくの変化抗原による免疫化を、その天然たんぱくに対する交差特異性で監視できるからである。本出願において、天然たんぱくとは天然に存在するたんぱくである。したがって、本発明は、上述の親和性結合アッセイであって、結合分子が天然たんぱくのエピトープを表現するアッセイを開示する。本発明は、低頻度のＢ細胞の検出に非常に適している。Ｂ細胞は、抗原との接触によって活性化されたとき、クローン性増殖の間に、抗原特異的Ｂ細胞受容体すなわちＢＣＲをそれらの細胞表面上に露出する。好適なＢ細胞受容体は、たとえば、ＦｃフラグメントによってＢ細胞の壁に入り込み、可変部によって抗原を特異的に認識する、周知の細胞結合した抗体様分子であり、その抗原はＢ細胞を活性化するのに用いた抗原である（Ｋｏｕｓｋｏｆｆら、２０００年）。本アッセイにおいて、ＢＣＲは結合分子が結合する標的分子である。したがって、本発明は、上述の親和性結合アッセイであって、標的分子にＢＣＲが含まれるアッセイを開示する。
【００１８】
さらに好ましくは、アッセイはＢＣＲの抗原特異的部位への結合を検出する。したがって、本発明は、上述の親和性結合アッセイであって、標的分子にＢＣＲの可変部が含まれるアッセイを開示する。
【００１９】
アッセイは、標的分子を検出する結合分子の組によって行われる。結合分子は、好ましくは、四量体分子から成る。したがって、他の実施形態における本発明は、第１のラベルに関連付けられた第１の多重結合分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の多重結合分子とを含み、第１のラベルおよび第２のラベルから得られるシグナルが、第１および第２のラベルの組合せシグナルから区別可能であり、各結合分子が、本質的に同一の標的分子に、好ましくは、その標的分子の本質的に同一のエピトープに特異的な、少なくとも４つの結合領域を含む、構成を開示する。
【００２０】
クローン性増殖の間の非常に初期の段階におけるＢ細胞を検出し選択するためのアッセイおよび構成が存在するようになった現在、ワクチン目的のために抗原が評価できるようになるまで、抗体レベルの増大を３〜４週間以上も待つ必要はもはやない。これによって、熟練者が、迅速かつ信頼できる方法で、多くの抗原のコレクションの中から抗原を選択することが可能になる。他の実施形態では、たとえば腫瘍抗原およびホルモンなどを含む治療的ワクチン接種処理に関して、個々の応答が監視可能であり、非応答性個体をより迅速に特定することができる。
【００２１】
ある種の抗原に対する免疫系の耐性を克服するために、たとえば合成ペプチドの産生によって、種々の修飾抗原を産生することが可能である。ペプチドにおける変化は、免疫原性を向上させるかもしれず、本発明のアッセイと方法によってそのペプチドを試験することによって、新しい改良された抗原が検出され選択されるかもしれない。ペプチドの抗原性を変化させるためにペプチドに種々の変更を加えることで、そのペプチドの様々な形態が得られ、これはペプチドコレクションとも呼ばれる。本出願に開示する抗原特異的Ｂ細胞の検出は、ワクチン免疫原性の評価を促進し、応答の細かな特異性の解析を可能にする。たとえば、多価コンジュゲートワクチンの新規な産生の正確な（サブ）抗原型特異性を、これまでになく詳細に解析することが今や可能である。したがって、本発明は、少なく２つの抗原を含むコレクションの中から合成抗原を選択する方法であって、その合成抗原に特異的な免疫細胞のための親和性結合アッセイにおいて、その抗原コレクションの抗原によって免疫化した哺乳動物から得た細胞サンプル中の抗原特異的免疫細胞のクローン性増殖の検出に、上述の構成を用いることと、そのクローン性増殖を、そのコレクションからの別の抗原によって免疫化した別の哺乳動物のクローン性増殖と比較することと、そのコレクションの中の少なくとも１つの他の抗原について観察されるクローン性増殖よりも、クローン性増殖が広範である抗原をそのコレクションの中から選択することとを含む方法を開示する。より広範なクローン性増殖とは、本出願において、特定のＢ細胞の数が、他の抗原に対する反応としてのクローン性増殖と比較して、より速やかにより高いレベルに向上することを意味する。たとえばマウスでは、第７日における向上したクローン性増殖は、第１４日におけるクローン性増殖、および、免疫応答におけるさらに後の高レベルの抗体の、指標となる。ラットまたは他の動物においては、この向上は、より遅くあるいはより早く現れるかもしれないが、その抗原コレクションの別の抗原で免疫化した他のラットまたは他の動物のクローン性増殖と比較した場合、より広範なクローン性増殖の強い指標となる。
【００２２】
当然、上述の方法では、上述した親和性結合アッセイのいずれを使用してもよい。したがって、本発明は、上述の合成抗原を選択する方法であって、本開示に記載したあらゆるアッセイが親和性結合アッセイに含まれる方法を開示する。
【００２３】
当然、合成ペプチドが天然たんぱくに対する良好なワクチンであるためには、それらの合成ペプチド抗原に対して向けられた抗体の、それらのペプチドが由来する天然たんぱくとの交差反応を、充分に考慮しなければならない。したがって、上述の方法は、好ましくは、少なくとも２つの結合分子が、標的分子に対する結合部位として、抗原コレクションの合成抗原、または、天然抗原もしくはその抗原の相同物を、含むように使用される。天然抗原とは、本出願において、天然のたんぱくに存在するままの抗原である。抗原の相同物とは、量においては必須ではないが、質において同一の抗原的特徴を示す物質である。相同物は、天然のペプチドもしくはたんぱく、または合成ペプチドもしくはその一部から成ることもある。したがって、直接Ｂ細胞染色処理によって、ペプチドワクチンとそれらが由来する天然抗原との、特異的Ｂ細胞受容体交差反応性の評価が可能になる。
【００２４】
本発明は、上述の方法であって、抗原特異的免疫細胞のクローン性増殖が少なくとも他の抗原のクローン性増殖よりも広範である抗原を選択することを、さらに含む方法も開示する。
【００２５】
上述のアッセイおよび方法によって、ある抗原に特異的なＢ細胞が選択され単離される。単離されたＢ細胞は、さらに、天然抗原またはその抗原の相同物とも呼ばれる天然たんぱくへの結合の特異性と親和性を試験してもよい。したがって、本発明は、上述の方法であって、さらに抗原特異的免疫細胞が天然抗原またはその抗原の相同物に特異的であるか否かを評価することを、含む方法を教示する。
【００２６】
上述の方法およびアッセイによって、当業者は、抗原特異的細胞を選択し単離することが可能になる。したがって、本発明は、抗原特異的免疫細胞の選択のための親和性結合アッセイであって、（ａ）標的分子のコピーを少なくとも４つの有する細胞を、標的分子に特異的な少なくとも２つの結合分子、好ましくは四量体結合分子に接触させること（第１の結合分子が第１のラベルに対応付けられ、第２の結合分子が第２のラベルに対応付けられる）と、（ｂ）各ラベルで染色される細胞を検出することと、（ｃ）両方のラベルと結合する細胞を選択することとを含むアッセイを開示する。
【００２７】
本発明は、上述の方法と共に、抗原コレクションの中から合成抗原を試験し選択するための、天然たんぱくとの交差反応性免疫応答を含む新しい方法を教示する。これは、この分野における技術的可能性の重要な進歩であり、選択のための新たな方法の可能性、したがって、他の製品への可能性を開く。したがって、本発明は、天然たんぱくとの交差免疫応答を含み、上述の方法と共にワクチンとしての使用に選択可能な合成抗原を、開示する。当然、たんぱく様分子に由来する単離したペプチドは、たんぱく様分子への免疫応答を誘起することが可能である。
【００２８】
ペプチドの抗原性を向上させるために、そのペプチドモチーフは、２、３またはそれ以上のペプチドが相互に直接またはスペーサ分子を介して連結した、二量体、三量体または多量体ペプチドにすることができる。同一の２つのペプチドを結合して二量体とすることは、そのペプチドの免疫特性をさらに向上させる。したがって、本発明は、上述の方法で得ることが可能な、免疫原性ペプチドであって、二量体ペプチドを含むペプチドを開示する。
【００２９】
この二量体ペプチドにおいて、各々のペプチドは、イオウ架橋または他の連結分子によって連結することができる。ペプチドの免疫原性を向上させる他の方法は、ペプチドを結合して、タンデムペプチドおよび／またはタンデム二量体ペプチドにすることである。国際公開第９６／４０７５５号パンフレットから、タンデム二量体原理のＧｎＲＨ−Ｉ分子の変異形への適用が、緩和な補助剤との併用によって低用量で高い有効性を示したことが、知られている。したがって、本発明は、抗原由来の免疫原性ペプチドを選択する方法であって、上述の抗原特異的免疫細胞のクローン性増殖を検出することを含み、ペプチドにタンデム二量体が含まれる方法を開示する。
【００３０】
本発明で提供するペプチドの抗原特性は、改善された特性を有するペプチドの検出を可能にする、置換網マッピングなどの様々な技術を用いることによって、さらに最適化される。たとえば、そのようなペプチドの１つは、エピトープに対して向けられた抗体に結合して、これによってそのエピトープの免疫特性を模倣するペプチドでよい。そのようなペプチドは、ミモトープと呼ばれる。この方法は、特許出願国際公開第００／２９８５１号パンフレットに開示されている。したがって、本発明は、たんぱく由来の免疫原性ペプチドであって、そのたんぱくのミモトープを含むペプチドも開示する。
【００３１】
少なくとも１つのアミノ酸のＤアミノ酸および／またはＬアラニンによるアミノ酸置換も、国際公開第０２／２２６５９号パンフレットに記載されているように、ペプチドの免疫原性を向上させる。したがって、本発明は、たんぱく由来の免疫原性ペプチドであって、少なくとも１つのアミノ酸がＤアミノ酸および／またはＬアラニンによって置換されたペプチドを開示する。
【００３２】
ペプチドがホルモンの配列に従って調製され、上述の方法によって試験されたペプチドホルモンの１つの例は、ゴナドトロピン放出ホルモンすなわちＧｎＲＨである。したがって、本出願は、上述の方法であって、抗原に、ＧｎＲＨペプチドホルモンおよび／またはその一部、またはＧｎＲＨ由来のペプチドを含む方法を開示する。ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）は、視床下部によって産生されるデカペプチドである。ＧｎＲＨは、門脈循環を通って下垂体に達して、ゴナドトロピンＦＳＨおよびＬＨの放出を刺激する（Ｔａｌｗａｒ、１９９９年）。抗ＧｎＲＨ免疫は、雌雄両動物の生殖能力を妨害し（Ｍｅｌｏｅｎら、２００１年）、ＧｎＲＨワクチンは、前立腺および女性の癌への適用がある（Ｔａｌｗａｒ、１９９９年；Ｆｕｅｒｓｔら、１９９７年）。異なる方法の有用性を比較するために、オボアルブミン（ＯＶＡ）にコンジュゲートさせたＧｎＲＨ様ペプチドで、マウスを免疫化した。異なる３つのペプチド、すなわち、ＧｎＲＨ単量体（ｐＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧＣ）、ＧｎＲＨタンデム体（ｐＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧＣ）、およびＧｎＲＨタンデム二量体（ＴＤＫ、ｐＥＨＷＳＹｋＬＲＰＧＱＨＷＳＹｋＬＲＰＧＣの二量化体であり、「ｋ」はＤリジン残基を表す）が産生された。キャリアたんぱくにコンジュゲートさせたＧｎＲＨタンデム体およびＴＤＫペプチドは、高い免疫原性を示し、ＧｎＲＨ中和抗体となり、全ての処理動物において完全な生物学的作用を発現した（Ｍｅｌｏｅｎら、１９９４年；Ｏｏｎｋら、１９９８年）。したがって、本出願は、上述の方法で得られる免疫原性ペプチドであって、ＧｎＲＨ由来のペプチドを開示する。
【００３３】
たんぱくの配列に従って調製され、上述の方法で試験されたペプチドホルモンの他の例は、ガストリンである。したがって、本出願は、ペプチドホルモンに由来し、上述の方法で得られる免疫原性ペプチドであって、ガストリンに由来するペプチドを開示する。ガストリンは、酸分泌、ならびに、正常および悪性の両方の消化管上皮の成長の調節に重要な、ペプチドホルモンである（Ｊｅｎｓｅｎら、２００２年）。腫瘍細胞は、循環内分泌性ガストリン（Ｗａｔｓｏｎら、１９８９年）、および自己分泌または傍分泌の形式で作用する局所産生ガストリン（Ｈｏｏｓｅｉｎら、１９９０年）の双方に、応答する。ガストリンの効果的な阻害は、結腸直腸癌、胃癌および膵臓癌の治療に有益であるかもしれない。なぜなら、ガストリンはこれらの腫瘍の成長因子として作用するからである。ガストリン受容体アンタゴニストは、いくつかの受容体サブタイプがガストリンの作用に関与し、ガストリンを追放するためには大量が必要であるため、完全には有効でない。ガストリンの中和によって、この問題は回避できるかもしれない。
【００３４】
ガストリン由来のペプチドは、ガストリン（アミノ酸配列ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ）に対するワクチンに使用することができる。ワクチンのための好適なペプチドは、アミノ酸１〜Ｘ（Ｘは５〜１２）を含む。コンジュゲートのために、システインがＮ端またはＣ端に含まれる。これらのペプチドは、タンデムまたはタンデム二量体の形態で、Ｎ端またはＣ端にシステインを加えて、あるいは、ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＣＱＧＰＷＬＥＥＥＥのように、２つのガストリン配列の間にシステインをタンデムに加えて、適用することもできる。ＬリジンまたはＤリジンをタンデム形態に導入して、これらのペプチドが、以下の２式に示すように、システインを介して二量化し、ＬリジンまたはＤリジンを介してコンジュゲートし得るようにする。
【００３５】
【化１】
2007527000.tif 000003
【００３６】
【化２】
2007527000.tif 000004
【００３７】
ここで、「ｋ」はＤリジンを表す。
これらのペプチドをワクチンとしてマウスにおいて試験し、免疫化後第７日または第１４日に、四量体ガストリンペプチド分子を用いる本発明の方法によって、特異的Ｂ細胞を検出した。四量体を形成するために、ペプチドｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＫ（＄）＃を使用した。ここで、＃はアミドであり、ｐＥはピログルタミンであり、Ｋ（＄）はビオチン化リジンである。
【００３８】
したがって、本発明は、上述のいずれかの方法で得られる免疫原性ペプチドであって、ガストリンに由来するペプチドを開示する。
【００３９】
ペプチドを調製したホルモンのさらなる例は、通常、妊娠中に胎盤によって産生される（Ｍｅｙｅｒら、２００１年）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン−ベータ（ｈＣＧ−β）である。このたんぱくは、血清中または尿中で検出することができる。ｈＣＧベータは、妊娠の第１期において上昇し、しばしば妊娠の指標として用いられる。ｈＣＧ−βは、種々のタイプの癌に存在する腫瘍関連抗原でもある。最も一般的には、ｈＣＧベータは、婦人科癌（Ｇａｕｃｈｉら、１９８１年；Ｈｉｇａｓｈｉｄａら、２００１年；Ｋｉｎｕｇａｓａら、１９９２年）において、また、結腸直腸（Ｌｕｎｄｉｎら、２０００年）、睾丸精上皮腫（Ｈａｒａら、２００２年）、膀胱（Ｈｏｔａｋａｉｎｅｎら、２００２年）、肝臓（Ｓｚａｖａｙら、２０００年）、胃（Ｂａｔｅｍａｎら、１９９５年）、膵臓（Ｓｙｒｉｇｏｓら、１９９８年）、肺（Ｕｃｋａｙａら、１９９８年）、脳（Ｆｕｊｉｍａｋｉら、２０００年）、および腎臓（Ｈｏｔａｋａｉｎｅｎら、２００２年）の癌において、１０ｍＩＵ／ｍｌを超えて上昇する（Ｇａｕｃｈｉら、１９８１年）。悪性ではない上昇が、妊娠（Ｍｅｙｅｒら、２００１年）、潰瘍（Ｍａｎａｂｅら、１９８５年）、ジュークス病（Ｃａｒｐｅｌａｎ−Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍら、１９９６年）、および肝硬変（Ｈｏｅｒｍａｎｎら、１９９２年）において観察されることもある。ｈＣＧ−βのレベルは、腫瘍進行に対する化学療法などの治療の有効性の監視に有用である。ｈＣＧ−βが高レベルの癌患者は、中央値レベルよりも低いレベルの患者よりも、有意に短い生存可能期間を有する。ｈＣＧ-βの効果的阻害は、したがって、婦人科、結腸直腸、睾丸精上皮腫、膀胱、肝臓、胃、膵臓、肺、脳、および腎臓の各癌における治療法として、疾患の防止と疾患末期の両方において有益である。ｈＣＧ−βの効果的阻害は、したがって、潰瘍、ジュークス病、および肝硬変における治療法としても、有益である。ｈＣＧ−β配列の受託番号はＰ０１２３３である。スイスたんぱく（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔｅｉｎ）エントリ名は、ＣＧＨＢ＿ＨＵＭＡＮである。このホルモンは１６５のアミノ酸から成り、アミノ酸１〜２０がシグナルペプチドを構成する。
【００４０】
キャリアたんぱくへのコンジュゲートのためのＮ端システインを有する重複した２０量体ペプチドが、免疫化に用いられた。これには、２１〜４０，３１〜５０，４１〜６０，５１〜７０，６１〜８０，７１〜９０，８１〜１００，９１〜１１０，１０１〜１２０，１１１〜１３０，１２１〜１４０，１２９〜１６５および１４１〜１６５のペプチドが含まれる。実施例４において、ｈＣＧのアミノ酸位置１０９〜１４５に対応する配列から成るＣ端ペプチド（ＣＴＰ）を用いた。
【００４１】
ペプチドを調製したさらに別のホルモンは、ヒト副甲状腺ホルモン関連たんぱく（ＰＴＨｒＰ）である。
【００４２】
高カルシウム血症は、癌を有する患者において最も普通に見られる代謝性合併症である。高カルシウム血症は、末期上皮癌の大多数で発生し、腫瘍のＰＴＨｒＰ分泌によって引き起こされる。健常人においては、ＰＴＨｒＰは検出し得ないレベルである。腫瘍によって分泌されたＰＴＨｒＰは、普通のＰＴＨ受容体に作用するため、高いカルシウムレベルを引き起こす。
【００４３】
ＰＴＨｒＰは、乳癌において、重要な役割を果たす。一次腫瘍の約５０％がＰＴＨｒＰを分泌する。この性質は骨転移の進行と関連する。骨転移において、ＰＴＨｒＰは溶骨性骨疾患を誘発し、組織の破壊の原因となる。この溶骨性骨疾患は骨組織からのＴＧＦ−Ｂの放出を招き、これが今度はＰＴＨｒＰのさらなる産生を刺激する。
【００４４】
癌における高カルシウム血症には２つのタイプがある。１つは体液性高カルシウム血症であり、体液性高カルシウム血症においては、一次腫瘍がＰＴＨｒＰを産生し、ＰＴＨｒＰがホルモンとして作用し、血流中に分泌された後、骨と腎臓とに作用してカルシウムレベルを上昇させる。
【００４５】
もう１つは、局所的溶骨性高カルシウム血症であり、これにおいても、ＰＴＨｒＰが骨転移に役割を果たす。ＰＴＨｒＰは、骨転移近傍に局所的骨溶解を誘発し、腫瘍転移を骨組織内にまで成長させる。乳癌においてはほとんど全ての転移が高レベルのＰＴＨｒＰを含むのに対し、非骨転移の１７％のみがＰＴＨｒＰを発現する。ＰＴＨｒＰは、これらの患者において、骨破砕と骨痛の原因となる。高カルシウム血症の現在の治療法は、ビスフォスフォネートの投与であり、ビスフォスフォネートはカルシウムレベルを下げる。しかし、この治療法はＰＴＨｒＰレベルに影響を及ぼさない。
【００４６】
癌においてＰＴＨｒＰに対するワクチン接種によってＰＴＨｒＰを中和することは、末期癌を退行させて、患者の人生の質を向上させることに寄与するかもしれない。スイスたんぱくエントリ名はＰＴＨＲ＿ＨＵＭＡＮである。配列の受託番号はＰ１２２７２である。ヒトＰＴＨｒＰの長さは１７７アミノ酸１〜１７７であり、アミノ酸１〜３６がリーダー配列を成す。
【００４７】
有効なペプチドは、ＰＴＨｒＰフラグメント３７〜７０のＮ端ペプチドであり、３７〜Ｘ（Ｘは４７〜５６）を含む。Ｃ端システインが、コンジュゲートのために加えられる。これらのペプチドは、タンデム体およびタンデム二量体の形態で使用することができる。
【００４８】
本発明は、薬剤の調製のために上述の方法によって選択することが可能な、免疫原性たんぱくおよび／またはその一部および／または免疫原性ペプチドの使用を開示する。
【００４９】
本発明の他の実施形態においては、特異的出現Ｂ細胞を、たとえば細胞分類および／または磁気ビーズ分離によって、分類および単離することが可能である。
【００５０】
これらの単離されたＢ細胞は、この分野において一般に知られているハイブリドーマ産生に従って不死化することが可能であり、よって、モノクローナル抗体を産生する不死化Ｂ細胞となる。したがって、本発明は、抗体の調製のために上述の方法によって選択されるＢ細胞、およびハイブリドーマ産生のためのそのようなＢ細胞の使用も開示する。
【００５１】
このＢ細胞ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体は、診断目的、または、たとえば、血液循環中のＧｎＲＨの不活性化のため、または、病原体の複製阻害のための、薬剤の調製に特に有用である。したがって、本発明は、上述のＢ細胞によって産生された単離抗体、および、薬剤調製のためのその抗体の使用も開示する。
【００５２】
本特許出願に記載される技術は、免疫応答誘起のための適切な抗原を選択するために、使用することができる。抗原が一旦判れば、本出願が、その抗原の多重コピーから成る結合分子を作ることによって、いかにしてラベル感度を向上させるか、結合分子をいかにしてラベルするか、および、ラベルした結合分子を抗原の選択にいかに用いるか、を示す。したがって、本出願は、少なくとも、第１のラベルに関連付けられた第１の結合分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の結合分子とを含み、各結合分子が同一の標的分子に対する少なくとも２つの結合領域を含む、部品キットを開示する。このようなキットは、ペプチドライブラリからペプチドを選択するために非常に有用である。したがって、本発明は、そのキットを抗原の選択のために使用することを開示する。
【００５３】
本発明は、標的分子の少なくとも４つのコピーを有する粒子と、その標的分子に対して特異的な少なくとも２つの結合分子とを含む親和性結合アッセイであって、第１の結合分子が第１のラベルに対応付けられ、第２の結合分子が第２のラベルに対応付けられ、第１のラベルを有する粒子と第２のラベルを有する粒子が、第１のラベルと第２のラベルとの両方を有する粒子から区別可能であり、第１および第２の結合分子が、それぞれ、標的分子に対して特異的な結合領域を少なくとも２つ含む、親和性結合アッセイを提供する。
【００５４】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、粒子に細胞が含まれる親和性結合アッセイを開示する。
【００５５】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、細胞に一次免疫応答のクローン性増殖相における活性免疫細胞が含まれる親和性結合アッセイを開示する。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、細胞にＢ細胞が含まれる親和性結合アッセイを開示する。
【００５７】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、第１および第２のラベルを有する粒子が親和性結合アッセイの感度を向上させる、親和性結合アッセイを開示する。
【００５８】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、第１および第２の結合分子が、それぞれ、標的分子に対して特異的な少なくとも４つの結合領域を含む、親和性結合アッセイを開示する。
【００５９】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、少なくとも４つの結合領域が本質的に同一である親和性結合アッセイを開示する。
【００６０】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、結合分子が天然たんぱくのエピトープを表現する親和性結合アッセイを開示する。
【００６１】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、標的分子にＢ細胞受容体が含まれる親和性結合アッセイを開示する。
【００６２】
本発明はさらに、本発明の親和性結合アッセイであって、標的分子にＢ細胞受容体の可変部が含まれる親和性結合アッセイを開示する。
【００６３】
本発明はさらに、第１のラベルに関連付けられた第１の多重結合分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の多重結合分子とを含む組成物であって、第１のラベルおよび第２のラベルから得られるシグナルが、第１および第２のラベルの組合せシグナルから区別可能であり、結合分子が、それぞれ、本質的に同一の標的分子に対して、好ましくは、標的分子の本質的に同一のエピトープに対して特異的な少なくとも４つの結合領域を含む、組成物を開示する。
【００６４】
本発明はさらに、少なくとも２つの抗原を含むコレクションから合成抗原を選択する方法であって、合成抗原に特異的な免疫細胞の親和性結合アッセイにおいて、抗原コレクションの抗原によって免疫化した哺乳動物から得られる細胞サンプル中の抗原特異的免疫細胞のクローン性増殖の検出に、本発明の組成物を使用し、クローン性増殖を、そのコレクションの別の抗原によって免疫化した別の哺乳動物のクローン性増殖と比較して、そのコレクションからの少なくとも１つの別の抗原について観察されるクローン性増殖よりも、クローン性増殖が広範である抗原をそのコレクションの中から選択し、抗原コレクションに本発明のあらゆる抗原が含まれる、方法を開示する。
【００６５】
本発明はさらに、本発明の方法であって、親和性結合アッセイに本発明のアッセイまたは本発明の方法が含まれる方法を開示する。
【００６６】
本発明はさらに、本発明の方法であって、少なくとも２つの結合分子に、標的分子に対する結合部位として、抗原コレクションの合成抗原、または、天然抗原もしくはその抗原の相同物が含まれる、方法を開示する。
【００６７】
本発明はさらに、本発明の方法であって、抗原特異的免疫細胞のクローン性増殖が、他の少なくとも２つの抗原によるクローン性増殖よりも広範な抗原を選択することを、さらに含む方法を開示する。
【００６８】
本発明はさらに、本発明の方法であって、抗原特異的免疫細胞が天然抗原またはその抗原の相同物に対して特異的であるか否かを評価することを、さらに含む方法を開示する。
【００６９】
本発明はさらに、抗原特異的免疫細胞を選択する親和性結合アッセイのための方法であって、標的分子の少なくとも４つのコピーを有する細胞を、標的分子に対して特異的な少なくとも２つの結合分子（第１の結合分子は第１のラベルに関連付けられ、第２の結合分子は第２のラベルに関連付けられる）に接触させること、各ラベルで染色された細胞を検出すること、両ラベルに結合する細胞を選択すること、を含む方法を開示する。
【００７０】
本発明はさらに、天然たんぱくとの交差反応性免疫応答を含み、ワクチンとしての使用のために本発明の方法によって選択可能な、合成抗原を開示する。
【００７１】
本発明はさらに、本発明の抗原であって、二量体ペプチドを含む抗原を開示する。
本発明はさらに、本発明の抗原であって、タンデム二量体ペプチドを含む抗原を開示する。
【００７２】
本発明はさらに、本発明の抗原であって、抗原のミモトープを含む抗原を開示する。
本発明はさらに、本発明の抗原であって、少なくとも１つのアミノ酸が、Ｄアミノ酸および／またはＬアラニンで置換された抗原を開示する。
【００７３】
本発明はさらに、本発明の抗原であって、ペプチドがＧｎＲＨに由来する抗原を開示する。
【００７４】
本発明はさらに、本発明の抗原であって、ペプチドがガストリンに由来する抗原を開示する。
【００７５】
本発明はさらに、本発明の抗原であって、ペプチドがｈＣＧに由来する抗原を開示する。
【００７６】
本発明はさらに、本発明の抗原であって、ペプチドがＰＴＨｒＰに由来する抗原を開示する。
【００７７】
本発明はさらに、本発明の抗原を薬剤の調製に使用することを開示する。
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原を、前立腺癌および女性のＧｎＲＨ関連の癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００７８】
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原を避妊用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００７９】
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原を、ガストリン関連の結腸直腸癌および／または胃癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００８０】
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原を、ｈＣＧ関連の婦人科、結腸直腸、睾丸精上皮腫、膀胱、肝臓、胃、膵臓、肺、脳および腎臓の各癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００８１】
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原を、ｈＣＧ関連の潰瘍、ジュークス病および肝硬変の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００８２】
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原をＰＴＨｒＰ関連の癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００８３】
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原をＰＴＨｒＰ関連の溶骨性骨疾患の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００８４】
本発明はさらに、本発明の抗原の使用であって、本発明の抗原をＰＴＨｒＰ関連の高カルシウム血症の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【００８５】
本発明はさらに、本発明の方法によって検出された、抗体調製のための単離Ｂ細胞を開示する。
【００８６】
本発明はさらに、本発明のＢ細胞に基づくハイブリドーマを開示する。
本発明はさらに、本発明のＢ細胞または本発明のハイブリドーマによって産生された単離抗体を開示する。
【００８７】
本発明はさらに、本発明の単離抗体であって、薬剤の調製のための単離抗体を開示する。
【００８８】
本発明はさらに、少なくとも、第１のラベルに関連付けられた第１の結合分子と第２のラベルに関連付けられた第２の結合分子とを含み、結合分子が同一の標的分子に対する少なくとも２つの結合領域を含む、部品キットを開示する。
【００８９】
本発明はさらに、本発明の部品キットを抗原の選択に使用することを開示する。
本発明はさらに、標的分子の少なくとも４つのコピーを有する粒子を検出する方法であって、その粒子を、標的分子に対する少なくとも２つの結合部位を有する第１および第２の結合分子（第１の結合分子は第１のラベルに連結され、第２の結合分子は第２のラベルに連結される）に接触させること、および、両方のラベルを有する粒子を検出することを含む方法を開示する。
【００９０】
本発明はさらに、本発明の粒子の検出方法であって、第１および第２の結合分子からの組合せシグナルを検出することを含む、方法を開示する。
【００９１】
本発明はさらに、本発明の粒子の検出方法であって、天然抗原またはその抗原の相同物によるワクチン接種から１４日以内の哺乳動物に由来する粒子を、検出する方法を開示する。
【００９２】
本発明はさらに、本発明の粒子の検出方法であって、第１の結合分子と第２の結合分子が略等モル量で存在する方法を開示する。
【００９３】
本発明の他の実施形態において、本出願は、親和性結合ペアのメンバーであって、たんぱく様分子のエピトープに特異的なメンバーを含む細胞を検出する方法であって、たんぱく様分子の少なくとも一部分に由来する合成ペプチドを産生することを含み、さらに、ヒト以外の動物を合成ペプチドで免疫化して、その動物から得られるサンプル中の、たんぱく様分子に特異的な親和性結合ペアのメンバーを含む細胞を検出することを、含む方法を開示する。
【００９４】
他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、合成ペプチドを修飾して、修飾ペプチドがたんぱく様分子のいずれとも免疫的に相違するようにすることを含み、さらに、ヒト以外の動物を修飾ペプチドで免疫化して、その動物から得られるサンプル中の、たんぱく様分子に特異的な親和性結合ペアのメンバーを含む細胞を検出することを、含む方法を開示する。
【００９５】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、たんぱく様分子またはその分子の等価物からのエピトープの少なくとも２つのコピーを含み、第１のラベルを含む第１の分子と、たんぱく様分子またはその分子の等価物からのエピトープの少なくとも２つのコピーを含み、第２のラベルを含む第２の分子と共に、サンプルを培養することと、サンプル中の第１のラベルと第２のラベルとを含む細胞を検出することとを含む方法を開示する。
【００９６】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、修飾ペプチドに、二量体および／またはタンデム二量体ペプチド、ミモトープ、置換網マップペプチド、および／または、そのペプチドの２０アミノ酸当り１〜４個のアミノ酸置換を含むアミノ酸置換ペプチド、が含まれる方法を開示する。
【００９７】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、合成および／または修飾ペプチドがＧｎＲＨに由来する方法を開示する。
【００９８】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、合成および／または修飾ペプチドがガストリンに由来する方法を開示する。
【００９９】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、合成および／または修飾ペプチドがｈＣＧに由来する方法を開示する。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、合成および／または修飾ペプチドがＰＴＨｒＰに由来する方法を開示する。
【０１０１】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、細胞が免疫細胞である方法を開示する。
【０１０２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、細胞がＢ細胞である方法を開示する。
【０１０３】
他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、第１および第２の分子に、エピトープの四量体またはたんぱく様分子の四量体が含まれる方法を開示する。
【０１０４】
さらに他の実施形態において、本発明は、第１のラベルに関連付けられた第１の分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の分子とを含む組成物であって、第１のラベルおよび第２のラベルから得られるシグナルが、第１のラベルと第２のラベルの組合せシグナルから区別可能であり、それぞれの分子が、たんぱく様分子上の本質的に同一のエピトープに対して特異的な、少なくとも４つの結合領域を含む、組成物を開示する。
【０１０５】
さらに他の実施形態において、本発明は、抗原を選択する方法であって、抗原コレクションを用意し、ヒト以外の少なくとも１匹の動物をコレクションで免疫化し、たんぱく様分子に特異的なＢ細胞系統の細胞のクローン性増殖が生じた抗原を、選択する方法を開示する。
【０１０６】
他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、抗原に、たんぱく様分子の少なくとも一部分に由来し、そのたんぱく様分子のいずれのペプチドとも免疫的に相違する修飾ペプチドが含まれる、方法を開示する。
【０１０７】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、抗原特異的免疫細胞のクローン性増殖がコレクションの他の抗原によるクローン性増殖よりも広範な抗原を選択することを、さらに含む方法を開示する。
【０１０８】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、Ｂ細胞系統の細胞のクローン性増殖を本発明の方法によって検出する方法を開示する。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明は、本発明の方法によって得られ、天然たんぱくとの交差反応性免疫応答を誘起し得る合成および／または修飾ペプチドを開示する。
【０１１０】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドであって、ＧｎＲＨに由来するペプチドを開示する。
【０１１１】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドであって、ガストリンに由来するペプチドを開示する。
【０１１２】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドであって、ｈＣＧに由来するペプチドを開示する。
【０１１３】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドであって、ＰＴＨｒＰに由来するペプチドを開示する。
【０１１４】
さらに好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、ワクチンの調製に使用することを開示する。
【０１１５】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１１６】
一実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、前立腺癌および女性のＧｎＲＨ関連の癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１１７】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、避妊用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１１８】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、ガストリン関連の結腸直腸癌および／または胃癌および／または膵臓癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１１９】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、ｈＣＧ関連の婦人科、結腸直腸、睾丸精上皮腫、膀胱、肝臓、胃、膵臓、肺、脳および腎臓の各癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１２０】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、ｈＣＧ関連の潰瘍、ジュークス病および肝硬変の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１２１】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、ＰＴＨｒＰ関連の癌の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１２２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、ＰＴＨｒＰ関連の溶骨性骨疾患の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１２３】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の合成および／または修飾ペプチドを、ＰＴＨｒＰ関連の高カルシウム血症の治療用薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１２４】
他の実施形態において、本発明は、免疫細胞コレクションが、特異的結合ペアのメンバーの少なくとも２つのコピーを有し、たんぱく様分子のエピトープに特異的な細胞を、含むか否かを判定する方法であって、特異的結合ペアのメンバーに特異的な少なくとも２つの分子（第１の分子は第１のラベルに関連付けられ、第２の分子は第２のラベルに関連付けられる）をコレクションに提供することと、両方のラベルによって染色された細胞がコレクションに含まれるか否かを判定すること、を含む方法を開示する。
【０１２５】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、特異的結合ペアのメンバーの少なくとも２つのコピーを有し、たんぱく様分子のエピトープに特異的な細胞が、Ｂ細胞である方法を開示する。
【０１２６】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明のＢ細胞に由来するハイブリドーマ細胞系を開示する。
【０１２７】
他の好ましい実施形態において、本発明は、本発明の単離Ｂ細胞および／または本発明のハイブリドーマを、抗体の調製に使用することを開示する。
【０１２８】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の単離Ｂ細胞および／または本発明のハイブリドーマによって産生される、単離抗体を開示する。
【０１２９】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の単離抗体を薬剤の調製に使用することを開示する。
【０１３０】
他の好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも、第１のラベルに関連付けられた第１の分子と、第２のラベルに関連付けられた第２の分子とを含む部品キットであって、それぞれの分子が、たんぱく様分子のエピトープに特異的な親和性結合ペアの同一メンバーに対して、特異的な少なくとも２つの結合部位を含む、キットを開示する。
【０１３１】
さらに他の実施形態において、本発明は本発明の部品キットを抗原の選択に使用することを開示する。
【０１３２】
さらに他の実施形態において、本発明は、細胞コレクション中の細胞を検出する方法であって、その細胞に特異的に結合することが可能で、互いに異なるラベルを含み、それぞれその細胞に対する少なくとも４つの結合部位を含む、第１および第２の分子を、細胞コレクションに提供することと、さらに、両方のラベルを含む細胞を検出することとを、含む方法を開示する。
【０１３３】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、細胞が両方のラベルを略等モル量で含む方法を開示する。
【０１３４】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、細胞が免疫細胞である方法を開示する。
【０１３５】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、細胞が前記結合部位を含む分子またはその機能性誘導体によって免疫化した動物から得られる方法を、開示する。
【０１３６】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、動物が、天然たんぱくの一部分またはペプチドに類似するが同一ではない、機能性誘導体によって免疫化され、結合が、天然たんぱくの一部分またはペプチドと同一である、方法を開示する。
【０１３７】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、機能性誘導体に二量体ペプチドが含まれる方法を開示する。
【０１３８】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、機能性誘導体にタンデム二量体ペプチドが含まれる方法を開示する。
【０１３９】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、機能性誘導体に抗原のミモトープが含まれる方法を開示する。
【０１４０】
さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の方法であって、機能性誘導体に、２０アミノ酸当たり１〜６個の、Ｄアミノ酸および／またはＬアラニンによって置換されたアミノ酸が含まれる、方法を開示する。
【０１４１】
本発明を実施例によってさらに説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【０１４２】
実施例１
低頻度初期Ｂ細胞の検出
材料および方法
動物
６〜８週齢のマウスを用い、本発明者らの機関の倫理指針に従って、処理を施した。マウスを第０日に、完全フロイントアジュバント中の、オボアルブミン（１００μｇ）と結合させたＧｎＲＨ−ＴＤＫ、またはジフテリアトキソイドと結合させたガストリン−ＴＤＫ１（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）によって、腹腔内で免疫化した。対照マウスは免疫化しなかった。第７日に、各グループのマウスの半分を不完全フロイントアジュバントを用いて増強し、動物の半分を犠牲にして脾臓を得た。第１４日に、残余のマウスから脾臓を得た。全ての動物実験は、地方倫理委員会（ＤＥＣ）の許可を得て行った。
【０１４３】
四量体合成
四量体分子は、２００μＭのＣ端ビオチン化、中央ビオチン化、またはＮ端ビオチン化ＧｎＲＨ（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）でラベルした３．３μＭのニュートラアビジン（ＰＥ−ＮＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、 Ｅｕｇｅｎｅ、 ＯＲ）、または、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）でラベルした６．１μＭのストレプトアビジン（ＡＰＣ−ＳＡ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とを、同体積混合することによって、作成した。各混合物を４℃にて少なくとも１２時間培養した。次いで、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−３０スピンカラム（Ｂｉｏ− Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いたゲルろ過によって、四量体を非複合化ペプチドから分離した。
【０１４４】
ビオチン化ガストリンペプチドｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＫ（＄）＃を、四量体の形成に用いた。ここで、＃はアミド、ｐＥはピログルタミン、Ｋ（＄）は ビオチン化リジンである。
最適濃度の決定のために、各四量体を滴定した。
【０１４５】
フローサイトメトリ
脾臓を機械的に破砕して脾細胞の細胞懸濁液を得て、０．１６Ｍの塩化アンモニウム溶液ｐＨ７．４中で、赤血球を溶解させた。得られた単一細胞懸濁液を、蛍光色素でラベルした抗体とＧｎＲＨ四量体との組合せによって、最適希釈にて染色した。染色は４℃にて２段階で行った。まず、細胞を、ＰＥでラベルした四量体で、実験的に決定した最適濃度にて、１時間染色した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、細胞を、ＡＰＣまたはＦＩＴＣでラベルした四量体と、ＰｅｒＣＰでラベルした抗ＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ１９抗体（クローン１Ｄ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰＥでラベルした抗ＣＤ２７抗体（クローンＬＧ．３Ａ１０、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、およびＰＥでラベルしたＣＤ１３８抗体（クローン２８１−２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の組合せとによって、染色した。直接ラベルしたリガンドを含む染色実験には、ＦＩＦＴおよびビオチンでラベルしたＧｎＲＨ（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。
【０１４６】
データは、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータ、および、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて取得した。１サンプルあたり１・１０6の事象が得られた。ＦＡＣＳ解析のために、リンパ球に、その前方および側方散乱特性に基づいて、正のゲートをかけ（生リンパ球ゲート）、無関係のＴ細胞および自己蛍光細胞を、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰへの負のゲートによって除去した。
【０１４７】
ＥＬＩｓｐｏｔアッセイ  ニトロセルロースをつけた９６−ウェルＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ＨＡろ過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、２０μｇ／ｍｌの抗原またはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＢＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ １０３１−０１）でコートし、４℃にて終夜培養した。ウェルをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ５％ＦＣＳで３０分間ブロックした。ブロッキング培地を１００μｌのＲＭＰＩ培地１０％ＦＣＳと細胞培養液からの再懸濁細胞とで置き換えた。プレートを、３７℃にて２４時間、６％ＣＯ2の培養器中で培養した。ウェルをＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＡＰコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＢＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ １０３０−０４）を加え、室温にて２〜４時間培養した。ウェルをＰＢＡ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質を加えた。スポット展開の後、プレートを水道水中で洗浄した。スポットの数をＡ．ＥＬ．ＶＩＳソフトウェアを用いて測定した。
【０１４８】
Ｅｌｉｓａ試験  ９６ウェル多重ウェルプレートを、２０μｇ／ｍｌの抗原またはヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＳＢＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ １０３１−０１）でコートし、４℃にて終夜培養した。ウェルをＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄し、ＰＢＳ５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）で３０分間ブロックした。ウェルをＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。各ウェルにサンプルを加え、１時間培養した。ウェルをＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＰＯコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧを加え、室温にて１時間培養した。ウェルをＰＢＡ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。１００μｌ／ウェルのＡＳＢＴ基質を加えた。３分間の培養後、プレートをＥｌｉｓａリーダ（Ｂｉｏ Ｒａｄ）によって読み取った。
【０１４９】
抗ペプチド血清抗体レベル：放射線自己免疫アッセイ
ＧｎＲＨに対する抗体力価を、Ｍｅｌｏｅｎら（１９９４）が記載しているように、放射線免疫アッセイ（ＲＩＡ）によって測定した。０．４％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を有するＰＢＳ中に１：１０００の割合で希釈した５０μｌ量の抗血清を、０．４％ＢＳＡを有する５０μｌＰＢＳ中のヨウ化ＧｎＲＨ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）と結合させた。４℃での２日間の培養の後、抗体に結合したヨウ化ＧｎＲＨを、デキストランでコートした活性炭を用いて、未結合物から分離した。上清を計数して、１：２０００に希釈した血清中の、抗体が結合したヨウ化ＧｎＲＨの割合を求めた。
【０１５０】
結果
本発明者らは、四量体分子を使用して、１００万リンパ球中の２０〜３０個の特異的細胞にまで識別レベルを下げることが可能な、新規なＢ細胞検出方法を開発した。この方法は、異なる２つの蛍光ラベルされた分子を各ペプチドに用い、これにより、信号対ノイズ比が向上し、したがって、非常に高感度である。超低頻度のＢ細胞を検出する本発明者らの方法の有用性を示すために、２つのモデルワクチン処方、すなわち、ＧｎＲＨ様ペプチドおよびガストリン様ペプチドを使用した。フローサイトメトリを用いて抗原特異的Ｂ細胞を検出するいくつかの方法が、図１に系統的に示すように、これまでに開示されている（ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９３年；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、２００１年；Ｎｅｗｍａｎら、２００３年）。
【０１５１】
ＧｎＲＨ特異的Ｂ細胞を検出するために、直接ラベルした天然ＧｎＲＨ、または、天然ＧｎＲＨを有するラベルした四量体を、一重および二重染色手順の両方で使用した。ＧｎＲＨ四量体は、ビオチン化ＧｎＲＨを、蛍光ラベルしたストレプトアビジンまたはニュートラアビジンと共に培養することによって、生成した。Ｂ細胞マーカーＣＤ１９およびＴ細胞マーカーＣＤ３に対するモノクローナル抗体を、染色手順に含めた。自己蛍光細胞はもとより（無関係な）Ｔ細胞を否定的に選択するために、抗ＣＤ３染色を使用した。図１に示すように、本発明者らの結果は、四量体二重染色のみが識別可能な結果を与え（図１Ｄ）、他のいずれの染色方法も識別可能な結果を与えない（図１Ａ〜図１Ｃ）ことを示した。ラベルＧｎＲＨ（図１Ａ、図１Ｂ）またはＮｅｗｍａｎらの方法による単一四量体（図１Ｃ）での直接染色では、高い背景ノイズのみが生じ、Ｔｏｗｎｓｅｎｄらに従ったラベルＧｎＲＨでの二重染色の場合（図１Ｂ）は、非常に小さな特異的シグナルが生じた。本発明者らは、本出願に開示された四量体二重染色が、一度の免疫化後の第７日において、１０6脾細胞当たり２０〜３０個の頻度で、特異的Ｂ細胞を検出することを見出した（図１Ｄ）。
【０１５２】
リンパ球を、ペプチド四量体とＣＤ１９およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体とで染色した。特異的Ｂ細胞の数が非常に少ないと予想していたので、ライブゲート（前方および側方散乱）で破片を除去し、ＣＤ３ｅへの負のゲートでＴ細胞を除去した。ペプチド特異的細胞を検出するために、ビオチン化ＧｎＲＨ四量体分子またはビオチン化ガストリン四量体分子を二重染色法で使用した（図２Ａ）。この方法を採用することで、免疫化後第７日の１００万リンパ球中の、２０〜３０個の特異的ペプチド四量体二重陽性細胞、および、免疫化後第１４日の１００個の特異的細胞を、検出することができた（図２Ａ）。
【０１５３】
ペプチド四量体二重陽性細胞の識別の後、これらの細胞の表現型特性を調べた。成熟Ｂ細胞の特徴付けに数人が異なるマーカーを使用してきたが（ＭｃＨｅｙｚｅｒ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、１９９３年）、本発明者らは、汎Ｂ細胞マーカーとしてＣＤ１９を使用することに決めた。全ての二重陽性細胞はＣＤ１９陽性であり、これらの細胞をＢ細胞として分類させる。興味深いことに、非免疫化マウスに見られる稀な二重陽性細胞も、ＣＤ１９陽性であり（図２Ｂ）、これらの細胞が、天然マウスの１００万リンパ球当たり約３〜４個の細胞から成る、特異的抗原に対するＢ細胞前駆群であることを示している。
【０１５４】
四量体結合の特異性を、ラベルしていないＧｎＲＨ（図３Ａ参照）またはガストリン（データ不図示）での阻害試験によって示した。リンパ球を、ラベルしていないペプチドと共に前培養し、次いで、ラベルした四量体、ＣＤ１９およびＣＤ３ｅ抗体と共に培養した。図３Ａに示すように、四量体染色は、ラベルしていないペプチドを含むことによって、用量依存的に阻害された。
【０１５５】
さらなる特異性試験として、Ｎ端、中央、またはＣ端をラベルしたペプチドを用いて四量体を生成した。図３Ｂに示すように、Ｃ端をビオチン化したＧｎＲＨ四量体のみが特異的Ｂ細胞を検出し得ることが判った。
【０１５６】
脾臓サンプルから赤血球を除去した後、ガストリンで免疫化したマウスからの脾細胞を、ＩＬ−２およびパンソルビン刺激下で５日間培養した。この期間の終わりにおいて、ＥＬＩＳＡ試験を行うために上清を使用し、細胞をＥＬＩｓｐｏｔアッセイに用いた。図４Ａに示すように、免疫化したマウスの細胞のみが、ＥＬＩｓｐｏｔウェル上でスポットを産生することができた。これらの結果は、ＥＬＩＳＡ試験で確認され（図４Ｂ）、また、ＦＡＣＳ解析の結果と整合しており、Ｂ細胞検出が、ペプチドワクチンの選択のために信頼できる方法であることを証明している。
【０１５７】
したがって、本研究において、本発明者らは、非常に低頻度の抗原特異的Ｂ細胞を可視化する新規な方法を開示する。本発明者らの実験では、二重四量体染色手順は、前述の方法（たとえば、ラベルしたペプチドリガンド、単一四量体）よりも、高感度で再現性が高かった。本発明者らのペプチド四量体は、極めて特異的なＢ細胞染色試薬であることが判った。
【０１５８】
実施例２
ＧｎＲＨ由来ペプチドの免疫原性の比較
材料および方法
動物
６〜８週齢のマウスを用い、ユトレヒト大学の倫理指針に従って処理した。第０日に、マウスを、オボアルブミン（ＯＶＡ）にコンジュゲートさせたＧｎＲＨ様ペプチドで、腹腔内にて免疫化した。異なる３つのペプチド、すなわち、ＧｎＲＨ単量体（ｐＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧＣ）、ＧｎＲＨタンデム体（ｐＥＨＷＳＹＧＬＲＰＧＱＨＷＳＹＧＬＲＰＧＣ）およびＧｎＲＨタンデム二量体（ＴＤＫ、ｐＥＨＷＳＹｋＬＲＰＧＱＨＷＳＹｋＬＲＰＧＣの二量体であり、「ｋ」はＤリジンを表す）（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）を、完全フロイントアジュバント内に調製した。対照マウスは、免疫化しなかった。第７日に、各グループのマウスの半分を、不完全フロイントアジュバントを用いて増強し、動物の半分を犠牲にして脾臓を得た。第１４日に、残余のマウスから脾臓を得た。全ての動物実験は、地方倫理委員会（ＤＥＣ）の許可を得て行った。
【０１５９】
細胞培養  脾細胞の細胞懸濁液から赤血球を除いて、細胞を、Ｔ７５フラスコ内で、パンソルビン（ＳＡＣ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａｔ． Ｎｏ ５０７８５８）および組み換えヒトＩＬ−２（ＣＥＴＵＳ）の存在下、５日間、３７℃、５％ＣＯ2の培養器中で、培養した。細胞を培養して、ＲＭＰＩ１０％ＦＣＳ中２・１０6／ｍｌの濃度で、５〜１０・１０7個の脾臓細胞とした。培養後、細胞をチューブに入れて、１２００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。上清をＥｌｉｓａ試験に用いた。
【０１６０】
四量体合成  Ｃ端をビオチン化した２００μＭのペプチド（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｂ．Ｖ．）と、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）でラベルした３．３μＭのニュートラアビジン（ＰＥ−ＮＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）またはアロフィコシアニン（ＡＰＣ）でラベルした６．１μＭのストレプトアビジン（ＡＰＣ−ＳＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とを、同量混合して、四量体分子を生成した。各混合物を、４℃にて最低１２時間培養した。次いで、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ−３０スピンカラム（Ｂｉｏ− Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いたゲルろ過によって、四量体を非複合化ペプチドから分離した。用いたペプチドは、ＧｎＲＨに由来する（Ｐｅｐｓｃａｎ Ｂ．Ｖ．）。
【０１６１】
フローサイトメトリ  脾臓を機械的に破砕して脾細胞の細胞懸濁液を得て、０．１６Ｍの塩化アンモニウム溶液ｐＨ７．４中で、赤血球を溶解させた。得られた細胞懸濁液を、蛍光色素でラベルした抗体とペプチドの四量体分子との組合せによって、最適希釈にて染色した。染色は常法どおり４℃にて２段階で行った。まず、ＰＥでラベルしたペプチドの四量体分子で１時間染色した。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、ＡＰＣまたはＦＩＴＣでラベルした四量体と、ＰｅｒＣＰでラベルした抗ＣＤ３抗体（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、ＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ１９抗体（クローン１Ｄ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との組合せを用いて、細胞に、第２段階の染色を施した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、データを取得した。１サンプルあたり１・１０6の事象が得られた。全データは、少なくとも３匹の実験マウスと３匹の対照マウスを分析する、少なくとも３つの独立実験から得られる典型的なプロットであった。
【０１６２】
結果
ＧｎＲＨ特異的Ｂ細胞を検出するために、二重染色手順によって天然ＧｎＲＨでラベルした四量体を使用した。Ｂ細胞マーカーＣＤ１９に対するモノクローナル抗体およびＴ細胞マーカーＣＤ３に対するモノクローナル抗体を、染色手順に含めた。抗ＣＤ３染色は、自己蛍光細胞はもとより（無関係な）Ｔ細胞を否定的に選択するために、使用した。
【０１６３】
上述の方法によって、マウスにワクチン接種するためのＧｎＲＨの異なる３処方を比較した。二重四量体染色アッセイの結果を図５Ａおよび図５Ｂに示す。これらの結果は、ＧｎＲＨ ＴＤＫ−ＯＶＡが、免疫化後第７日および第１４日の両方の測定において、最も広範なＢ細胞増殖を生じさせることを示す。
【０１６４】
実施例３
ガストリン由来ペプチドの免疫原性の比較
上述の方法を用いて、マウスにワクチン接種するためのＧｎＲＨの異なる４処方を比較した。
【０１６５】
【化３】
2007527000.tif 000005
【０１６６】
これらのペプチドをマウスにおいてワクチンとして試験し、免疫化後第７日および第１４日に、四量体ガストリンペプチドを用いる本発明の方法によって、特異的Ｂ細胞を検出した。四量体の形成に、ビオチン化ガストリンペプチドｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＫ（＄）＃を使用した。ここで、＃はアミド、ｐＥはピログルタミン、Ｋ（＄）はビオチン化リジンである。
【０１６７】
二重四量体染色アッセイの結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。この結果は、ガストリン ＴＤＫ２−ＯＶＡが、免疫化後第１４日の測定において、最も広範なＢ細胞増殖を生じさせることを示す。
【０１６８】
実施例４
ｈＣＧのＣ端ペプチドで免疫化したラットにおける低頻度初期Ｂ細胞の検出
材料および方法
動物
８週齢のラット（１番、２番および３番）を用い、本発明者らの機関の倫理指針に従って、処理を施した。ラットを第０日に、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の、３００μｇのＫＬＨと結合させた、ｈＣＧの１０９〜１４５位のアミノ酸から成る１００μｇのＣ端ペプチド（ＣＴＰ）で、腹腔内にて免疫化した。ｈＣＧの受託番号はＰ０１２３３であり、スイスたんぱくエントリ名は、ＣＧＨＢ＿ＨＵＭＡＮである。
【０１６９】
ＣＦＡ中のＫＬＨで対照ラット（４番、５番および６番）を免疫化した。第１０〜１２日に、動物を犠牲にして脾臓を得た。全ての動物実験は、地方倫理委員会（ＤＥＣ）の許可を得て行った。
【０１７０】
フローサイトメトリ
脾臓を機械的に破砕して脾細胞の細胞懸濁液を得た。フィコール勾配を用いてリンパ球を収集した。得られた単一細胞懸濁液を、ｈＣＧ四量体で最適希釈にて染色した。染色は、４℃で２段階で行った。まず、細胞を、ＰＥでラベルしたｈＣＧの四量体で、実験的に決定した最適濃度にて１時間染色した。そして、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。次いで、細胞を、ＡＰＣでラベルしたｈＣＧの四量体で染色し、再度洗浄した。
【０１７１】
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメータおよびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、データを取得した。１サンプル当たり１・１０6事象が得られた。ＦＡＣＳ解析のために、リンパ球に、その前方および側方散乱特性に基づいて、正のゲートをかけた（ライブリンパ球ゲート）。
【０１７２】
結果
本発明の方法によって、１回のみ免疫化した動物において１２日以内に、四量体分子を用いて、１・１０6個の脾細胞中に合計１３６個の特異的細胞を検出した。この方法は、ｈＣＧ用に異なる２つの蛍光ラベル分子を採用し、これによって、信号対ノイズ比が向上し、したがって、非常に高感度であった。
【０１７３】
ｈＣＧ特異的Ｂ細胞を検出するために、二重染色手順において、天然ｈＣＧでラベルした四量体を用いた。
【０１７４】
【表１】
2007527000.tif 000006
【０１７５】
ｈＣＧ四量体でリンパ球を染色した。特異的Ｂ細胞の数が非常に少ないと予想していたので、ライブゲート（前方および側方散乱）で破片を除去した。ｈＣＧ特異的Ｂ細胞を同定するために、二重染色法において、ｈＣＧ四量体分子を使用した（表１）。この方法によって、免疫化後第１２日に、１００万脾細胞中に１３６個の二重陽性の特異的ｈＣＧ四量体を検出することができた。３匹のラットのうちの１匹のみが、特異的Ｂ細胞応答に基づく免疫化に対して応答することが検出された。
【０１７６】
したがって、この実施例で、本発明者らは、非常に低頻度の抗原特異的Ｂ細胞がたんぱく四量体に対しても機能することを視覚化する新規な方法を開示した。本発明者らのたんぱく四量体は極めて特異的なＢ細胞染色試薬であることが判った。
【０１７７】
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【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】抗原特異的Ｂ細胞を示す図である。特異的Ｂ細胞を検出するために、いくつかのフローサイトメトリ法が開発されており、それらの有効性を比較した。  図１Ａ：単一蛍光ラベルペプチドでの染色である。免疫化マウスおよび非免疫化マウスからの脾細胞であって、Ｃ端ビオチン化ＧｎＲＨおよびＦＩＦＴでラベルした抗ＣＤ１９での染色に続いて、ＡＰＣでラベルしたストレプトアビジンで染色した脾細胞である。  図１Ｂ：、免疫化マウス（Ｉ）および非免疫化マウス（Ｎ）からの脾細胞を、Ｃ端ビオチン化およびＦＩＴＣでラベルしたＧｎＲＨで染色し、次いで、ＡＰＣでラベルしたストレプトアビジンで染色した（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、２００１年、に従った）。  図１Ｃ：単一蛍光ラベル四量体での染色である（Ｎｅｗｍａｎら、２００３年、に従った）。免疫化マウス（Ｉ）および非免疫化マウス（Ｎ）からの脾細胞を、ＰＥでラベルしたＧｎＲＨ四量体およびＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ１９で染色した。  図１Ｄ：本発明の単一エピトープ多重染色原理を用いた、２蛍光ラベル四量体での染色である。免疫化マウス（Ｉ）および非免疫化マウス（Ｎ）からの脾細胞を、ＰＥでラベルした、およびＡＰＣでラベルしたＧｎＲＨ、ならびに、ＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ１９で染色した。
【０１７９】
【図２】ＧＮＲＨ特異的Ｂ細胞およびガストリン特異的Ｂ細胞の同定を示す図である。  図２Ａ：特異的Ｂ細胞四量体二重染色である。ＧｎＲＨ−ＴＤＫまたはガストリン−ＴＤＫで免疫化したマウスからの脾細胞を、ペプチド四量体分子、抗マウスＣＤ３ｅ、抗マウスＣＤ１９で染色し、ＦＡＣＳによって解析した。四量体反応性のリンパ球の同定のためのゲート法は、ライブゲート（前方および側方散乱）、および、Ｔ細胞を除去するためのＣＤ３ｅへの負のゲートを含む。ＰＥまたはＡＰＣに結合させた異なる２つのペプチド四量体分子を用いることによって、免疫化後第７日および第１４日に、特異的ＧｎＲＨ細胞を検出することができた。全点プロットは、少なくとも５匹の実験マウスと５匹の対照マウスを分析した最小でも３つの独立した実験に由来する。  図２Ｂ：特異的四量体二重陽性細胞は、ＣＤ１９陽性である。四量体二重陽性細胞の同定の後、これらの細胞のみを可視化するためにゲート（Ｒ３）をかけた。次いで、これらの細胞上のＣＤ１９の表現型発現を観察した。全ての特異的細胞はＣＤ１９陽性である。密度プロットは全リンパ球集団の典型を表しており、これらを、ＣＤ１９陽性細胞の識別のための四分区画の適切な大きさの選択に用いた。
【０１８０】
【図３】Ｂ細胞検出の特異性を示す図である。  図３Ａ：ラベルしていないＧｎＲＨまたはガストリンは、特異的Ｂ細胞を染色するペプチド四量体分子を阻害することができる。四量体結合の特異性を、阻害実験によって示した。脾細胞を、ラベルしていないＧｎＲＨまたはガストリンと共に前培養し、次いで、ラベルした四量体ならびに抗ＣＤ１９抗体および抗ＣＤ３抗体と共に培養した。ラベルしていない抗原の３用量、すなわち、２ｍＭ、２０μＭおよび０．２μＭを用いた。その高用量で四量体染色はほぼ終了した。  図３Ｂ：特異的Ｂ細胞は、Ｃ端四量体によってのみ認識される。ビオチン化した異なるＧｎＲＨと用いて、ペプチド四量体分子、すなわち、Ｃ端、Ｎ端および中央ビオチン化ペプチドを作成した。Ｃ端ペプチドのみが特異的細胞を識別することができた。
【０１８１】
【図４】ＥＬＩｓｐｏｔアッセイおよびＥｌｉｓａ試験による抗原特異的Ｂ細胞の検出を示す図である。  図４Ａ：ＥＬＩｓｐｏｔアッセイである。赤血球を溶解した後、非免疫化マウスおよび免疫化後１４日のマウスからの脾細胞を、パンソルビンおよびＩＬ−２刺激下で、５日間培養した。この培養の後、細胞を、ペプチド四量体、ジフテリアトキソイドおよび抗マウスＩｇＧでコートしたＥＬＩｓｐｏｔウェルに加えた。抗マウスＩｇＧでコートしたウェルでは、脾臓の全てのＢ細胞応答を評価することができる。他のウェルでは、抗原に対する特異的Ｂ細胞応答を評価することができる。免疫化したマウスからの細胞のみが、特異的抗原上にスポットを生成し得る。  図４Ｂ：Ｅｌｉｓａ試験である。培養５日後の細胞から収集した上清を、Ｅｌｉｓａ試験を行うために用いた。全Ｂ細胞応答のレベルは、免疫化したマウスと免疫化していないマウスとで等しい。免疫化したマウスからの血清のみが、ガストリンおよびジフテリアトキソイドに対する抗体を含有する。特異的抗体のレベルは、免疫化後１４日の方が、７日後よりも高い。これらの結果はＦＡＣＳ解析に合致する。
【０１８２】
【図５】３つのＧｎＲＨワクチンによる免疫化後のＧｎＲＨ特異的Ｂ細胞の計数を示す図である。  図５Ａ：特異的Ｂ細胞四量体二重染色である。ＧｎＲＨモノ、ＧｎＲＨタンデムおよびＴＤＫタンデム二量体で免疫化したマウスからの脾細胞を、ＧｎＲＨ四量体（ＰＥおよびＡＰＣ）、ＰｅｒＣＰでラベルした抗ＣＤ３、ＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ１９によって染色し、フローサイトメトリによって解析した。四量体結合性のリンパ球を、ライブゲート（前方および側方散乱）、および、（無関係な）Ｔ細胞および自己蛍光細胞の除去のためのＦＬ３＋への負のゲートを用いて同定した。各密度プロットについて、１×１０6事象を取得した。右上の区画に二重陽性Ｂ細胞を示す。示したプロットは、少なくとも３匹の実験マウスと３匹の対照マウスを分析した最小でも３つの独立した実験からの典型である。  図５Ｂ：各ワクチンについて、少なくとも９つのサンプルを免疫化後第７日および第１４日に解析した。グラフに、各グループで見出された二重陽性細胞の数の平均値を示す。
【０１８３】
【図６】４つのガストリンワクチンで免疫化した後のガストリン特異的Ｂ細胞の計数を示す図である。  図６Ａ：特異的Ｂ細胞四量体二重染色である。ガストリンモノ、ガストリンタンデム、ＴＤＫ１タンデム二量体およびＴＤＫ２タンデム二量体で免疫化したマウスからの脾細胞を、ガストリン四量体（ＰＥおよびＡＰＣ）、ＰｅｒＣＰでラベルした抗ＣＤ３、ＦＩＴＣでラベルした抗ＣＤ１９で染色し、フローサイトメトリによって解析した。四量体結合性のリンパ球を、ライブゲート（前方および側方散乱）、および、（無関係な）Ｔ細胞および自己蛍光細胞の除去のためのＦＬ３＋への負のゲートを用いて同定した。各密度プロットについて、１×１０6事象を取得した。右上の区画に二重陽性Ｂ細胞を示す。示したプロットは、少なくとも３匹の実験マウスと３匹の対照マウスを分析した最小でも３つの独立した実験からの典型である。  図６Ｂ：各ワクチンについて、少なくとも９つのサンプルを免疫化後第７日および第１４日に解析した。グラフに、各グループで見出された二重陽性細胞の数の平均値を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｂ−２】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｄ−２】
2007527000.tif 000014
【図２Ａ−１】
2007527000.tif 000015
【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ｂ−１】
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【図２Ｂ−２】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ−１】
2007527000.tif 000026
【図５Ａ−２】
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【図５Ａ−３】
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【図５Ａ−４】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−１】
2007527000.tif 000031
【図６Ａ−２】
2007527000.tif 000032
【図６Ａ−３】
2007527000.tif 000033
【図６Ａ−４】
2007527000.tif 000034
【図６Ａ−５】
2007527000.tif 000035
【図６Ａ−６】
2007527000.tif 000036
【図６Ｂ】
2007527000.tif 000037
【国際調査報告】
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