(57)【要約】  脆弱Ｘ症候群などの短鎖縦列反復配列多型（ＳＴＲＰ）を検出するための方法であり、ＰＣＲを用いて、対象の全てのＳＴＲ、およびそのＳＴＲに隣接する核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡにおける染色体上の核酸を増幅させる。次いで、１本鎖の産物を得て、（ｉ）ＳＴＲ、および（ｉｉ）近接ＤＮＡセグメントを標的とする比色標識したオリゴヌクレオチドを、この１本鎖の産物とハイブリダイズし、次いで１本鎖の産物を固相に結合させ、標的材料の残部から分離する。この標識したオリゴヌクレオチドの標的材料を塩基で処理することにより回収し、次いでそれに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定して個々の値を得、その値を既知の対照サンプルからの結果と比較して、分析したＤＮＡの対象の領域におけるＳＴＲの数を正確に定量する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）試験するゲノムＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）ＰＣＲを用いて、ＦＲＡＸＡ遺伝子の非翻訳部分の全てのＣＧＧ反復、および前記ＣＧＧ反復に隣接する、核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡにおけるＸ染色体上の核酸を増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅した核酸から１本鎖の産物を得るステップと、
（ｄ）（ｉ）（ＣＧＧ）反復、および（ｉｉ）前記近接核酸セグメントを標的にする比色標識したオリゴヌクレオチドを、ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記１本鎖産物を固相に結合するステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を、標的材料の残部から分離するステップと、
（ｇ）標識標的材料を、ステップ（ｆ）の分離した産物から回収するステップと、
（ｈ）次いで、ステップ（ｇ）の回収した標識標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、
（ｉ）マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定してそれに対する個々の値を得るステップと、
（ｊ）ステップ（ｉ）の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたゲノムＤＮＡのＦＲＡＸＡ遺伝子におけるＣＧＧ反復の数を正確に定量するステップと
を含むことを特徴とする、脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するための方法。
【請求項２】
ＣＧＧ反復の数が、以下の式：
Ｎ＝３０＋（Ａ−１．０３）６６．４
を用いて求められる、請求項１に記載の方法であって、
式中、Ｎは反復の数であり、Ａは、近接する核セグメントに対するプローブにハイブリダイズした標的のＣＩに対するＣＧＧプローブとハイブリダイズした標的のＣＩの比であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
増幅された前記核酸は、Ｘ染色体上のＣＧＧ反復切片、および少なくともＦＲＡＸＡ遺伝子の３’の翻訳されたセグメントの実質的な部分を含むことを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記の、ＣＧＧ反復に対してハイブリダイズする標的は３個と７個の間のトリプレットを含み、ＣＧＧ反復プローブは６個と２０個の間のトリプレット、および前記反復ターゲットの少なくとも２倍のトリプレットを含むことを特徴とする、請求項１、２、および３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
標識された標的は、その５’末端に蛍光色素を有することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）は、ＤＮＡ領域の３’ボーダーに相補的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーの対を使用し、ＤＮＡの３’ボーダーがＣＧＧ反復切片全体を含み、核酸の前記近接セグメントが少なくとも３０ヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記近接セグメントはＣＧＧ反復切片の３’であり、ＦＲＡＸＡ遺伝子の翻訳セグメントの少なくとも実質的な部分を含むことを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ領域のアンチセンス鎖の３’ボーダーに相補的である、ステップ（ｂ）で用いられるフォワードプライマーは、その５’末端にアンカー部分を有することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
リバースプライマーの５’末端にリン酸塩があり、ステップ（ｃ）で得られた前記１本鎖の産物はエキソヌクレアーゼで２本鎖のＰＣＲ産物のアンチセンス鎖を消化することによって得られることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アンカー部分はビオチンであり、ステップ（ｅ）および（ｆ）はステップ（ｄ）の後に行われ、かつ前記ハイブリダイズした産物を、固相に付着しているアビジンに結合させ洗浄することにより分離することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）でハイブリダイズした前記標識標的材料は、前記鎖を変性させるためにステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を処理し、上清を回収することによりステップ（ｇ）で回収されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）の後で、エキソヌクレアーゼで処理して１本鎖の標的材料を得る前に、非結合のプライマーを除去するために増幅された核酸の産物を精製することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記フォワードプライマーは配列番号１を含み、前記リバースプライマーは配列番号２を含むことを特徴とする、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）試験するゲノムＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）ＰＣＲ、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、全てのＣＧＧ反復、および翻訳されたＦＲＡＸＡ遺伝子の近接部分を含むゲノムＤＮＡにおけるＸ染色体上の核酸を増幅し、前記フォワードプライマーがその５’末端にアンカー部分を有するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の２本鎖の産物を精製するステップと、
（ｄ）エキソヌクレアーゼでそのアンチセンス鎖を消化することによりステップ（ｃ）から１本鎖の産物を得るステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の産物を、（ＣＧＧ）反復に対する、およびＦＲＡＸＡ遺伝子の近接部分に対する蛍光標識したアンチセンス標的とハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を、前記フォワードプライマーの５’末端の前記アンカー部分により固相と結合させることにより非ハイブリダイズの標的の残部から分離するステップと、
（ｇ）ステップ（ｇ）の産物を、適切なプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズし、前記マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、存在する蛍光標識標的材料の蛍光強度を測定してその個々の値を得るステップと、
（ｈ）得られたＤＮＡのＦＲＡＸＡ遺伝子におけるＣＧＧ反復の数を正確に定量するために、ステップ（ｇ）の結果を以下の式：
Ｎ＝３０＋（Ａ−１．０３）６６．４
を用いて既知の対照サンプルからの結果と比較するステップであり、式中、Ｎは反復の数であり、Ａは、近接セグメントに対するプローブにハイブリダイズした標的のＦＩに対するＣＧＧプローブとハイブリダイズした標的のＦＩの比である、既知の対照サンプルの結果と比較するステップと
を含むことを特徴とする、脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するための方法。
【請求項１５】
（ａ）試験するゲノムＤＮＡを得るステップと、
（ｂ）ＰＣＲを用いて、対象の全てのＳＴＲ、および前記ＳＴＲに隣接する、核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡにおける染色体上の核酸を増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の増幅したＤＮＡからの１本鎖の産物を得るステップと、
（ｄ）（ｉ）ＳＴＲ、および（ｉｉ）前記近接核酸セグメントを標的とする、比色標識したオリゴヌクレオチドを、ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、
（ｅ）ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物を固相に結合させるステップと、
（ｆ）ステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を、標識標的材料の残部から分離するステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の産物から標識標的材料を回収するステップと、
（ｈ）次いで、回収されたステップ（ｇ）の標識された標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、
（ｉ）マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイの特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定してそれに対する個々の値を得るステップと、
（ｊ）ステップ（ｉ）の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたＤＮＡの対象の領域におけるＳＴＲの数を正確に定量するステップと
を含むことを特徴とする、短鎖縦列反復配列多型（ＳＴＲＰ）を検出するための方法。
【請求項１６】
前記の、ＳＴＲに対してハイブリダイズする標的は３個と７個の間の反復を含み、ＳＴＲプローブは６個と２０個の間の反復、および前記ＳＴＲ標的の少なくとも２倍の反復を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）は、ＤＮＡ領域の３’ボーダーに相補的な１対のフォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用し、ＤＮＡ領域がＳＴＲ切片全体を含み、核酸の前記近接セグメントは少なくとも３０ヌクレオチドを含み、ステップ（ｂ）で使用するフォワードプライマーはＤＮＡ領域のアンチセンス鎖の３’ボーダーに相補的であり、その５’末端にアンカー部分を有し、リバースプライマーの５’末端はリン酸塩であり、前記標識標的材料はその５’末端に蛍光色素を有し、１本鎖の産物は２本鎖のＰＣＲ産物のアンチセンス鎖をエキソヌクレアーゼで消化することによりステップ（ｃ）で得られることを特徴とする、請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）哺乳動物のゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーはＦＲＡＸＡ遺伝子の非翻訳領域の５’の位置で、Ｘ染色体のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーはＦＲＡＸＡ遺伝子またはその３’内の位置に相補的であり、
前記フォワードプライマーは、その５’末端に共有結合したアンカー部分を有し、
前記リバースプライマーは、その５’末端にリン酸塩を有し、
前記プライマーのオリゴヌクレオチドの対は、全てのＣＧＧ反復、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するのに特異的である、
１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記ＣＧＧ反復領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、
（ｃ）（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）アンチセンス鎖の消化、（ｉｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、（ｉｖ）ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および（ｖ）比色定量、を行うためのバッファーおよび酵素と、
（ｄ）スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の１つに相補的なＤＮＡプローブに付着している、複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイと、
（ｅ）前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルから前に生成されたデータを用いてＣＧＧ反復の数の診断を行うための手段と
を含むことを特徴とする、脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するためのキット。
【請求項１９】
前記ハイブリダイズする標的は３個と７個の間のＣＣＧ反復を含み、ＣＧＧプローブは６個と２０個の間の反復、および前記相補的な標的の少なくとも２倍の反復を含み、前記フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ＣＧＧ反復切片全体、およびその３’であり少なくとも３０ヌクレオチドを含む核酸の前記近接セグメントを含むＤＮＡ領域の３’ボーダーに相補的であり、フォワードプライマーはアンチセンス鎖の３’ボーダーに相補的でありその５’末端にビオチンを有し、リバースプライマーはその５’末端にリン酸塩を有し、前記標識した標的のオリゴヌクレオチドはその５’末端に蛍光色素を有し、内部対照領域の標的の少なくとも約１０倍の量のＳＴＲ領域の標的の量が提供され、２本鎖のＰＣＲ産物のアンチセンス鎖を消化して１本鎖のＰＣＲ産物を得るためにエキソヌクレアーゼを提供することを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
（ａ）哺乳動物のゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの対は、全てのＳＴＲ、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡの選択された領域を増幅するのに特異的であり、フォワードプライマーは染色体の選択された領域のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーは選択された領域のセンス鎖の３’末端に相補的であり、
前記フォワードプライマーは、その５’末端に共有結合しているアンカー部分を有し、前記リバースプライマーは、その５’末端の伸長が阻止されている、１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドと、
（ｂ）前記ＳＴＲ領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、
（ｃ）（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）アンチセンス鎖の消化、（ｉｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、（ｉｖ）ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および（ｖ）比色定量を行うためのバッファーおよび酵素と、
（ｄ）スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の１つに相補的なＤＮＡプローブにそこで付着している、複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイと、
（ｅ）前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルから前に生成されたデータを用いてＳＴＲの数の診断を行うための手段と
を含むことを特徴とする、ＳＴＲＰを示す突然変異を検出するためのキット。
【請求項２１】
前記アンカー部分に相補的なカップリング剤を有する固相材料を含むことを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、遺伝性または散発性の遺伝的欠損のための診断アッセイに関し、より詳しくは短鎖縦列反復配列（ＳＴＲ）により引き起こされる疾患または欠損のためのアッセイに関し、さらにより詳しくはヒト、胎児、および胚で脆弱Ｘ症候群を引き起こす遺伝的欠損に対するアッセイに関する。これらのＳＴＲＰのアッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し、その後マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、および分析を行う。
【背景技術】
【０００２】
真核生物のＤＮＡには、短鎖縦列反復配列多型（ＳＴＲＰ）と呼ばれる非常に短い単純な配列の縦列反復を有する。反復多型には、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、およびテトラヌクレオチドの反復が含まれる。トリヌクレオチドおよびテトラヌクレオチドの反復は、３および４ヌクレオチドの反復である。ますます多くの疾患が、トリヌクレオチドのＳＴＲの伸長と関連していることが知られている（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３参照）。これらの疾患では、反復ブロックのサイズは一般に、疾患の重症度および発症の年齢と相互関連があり、その結果これらを示す。いくつかの疾患、例えば、ハンチントン病、脊髄小脳失調症Ｉ型、球脊髄性筋萎縮症、マシャドジョセフ病、および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症は、反復ブロックのサイズのわずかな増加と相互関連している。Ａ型脆弱Ｘ、Ｅ型脆弱Ｘ、および筋緊張性ジストロフィーなどの他の疾患は、通常のＳＴＲの最高１００倍の伸長を伴うことがある。
【０００３】
例えば、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７など、ヒトゲノムに存在する高度に多型のクラスまたは反復のＤＮＡの増幅および検出に基づく、ある種の診断アッセイおよび法医学的アッセイが提案されている。通常、反復配列を含むＤＮＡのセグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅され、次いで変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりサイズで分けられる。
【０００４】
この手法は、そのサイズおよびゲノム分布により診断上のおよびマッピングの応用で特に関心が高い、いわゆる「短鎖縦列反復配列」すなわち「ＳＴＲ」反復のＤＮＡを標的としている。このクラスのＤＮＡにおける反復ユニットの長さは通常２から６ヌクレオチドであり、ＰＣＲ増幅および電気泳動分離に好都合な標的となっている。特許文献１は、１つまたは複数の染色体特異的ＳＴＲを同時に増幅するための、増幅されたＳＴＲを電気泳動でサイズにより分離するための、および存在する増幅されたＳＴＲＤＮＡのそれぞれの量を求めるための方法を開示しており、この方法を用いて選択された染色体の異数性を判定する。特許文献２は、非特許文献８を引用し、これらの反復のフランキング領域に対応するオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡの小サンプル上のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーとして使用してもよいことを示唆している。放射能または蛍光などで標識したヌクレオチドを有するＤＮＡを増幅することにより、サンプルを配列ゲル上で分離し、オートラジオグラフィーまたは蛍光検出などの周知の方法により可視化してもよい。これらの多型は、長さが数塩基ペアしか異ならないことがある対立遺伝子からなるので、これらは、一般に、伝統的なＲＦＬＰ分析で用いられるような従来のサザンブロッティングにより検出されないことがあると指摘されている。特許文献３は、少なくとも３ヌクレオチドの増幅されたＳＴＲを用いて、異数性を検出することができると述べている。増幅されたＤＮＡを電気泳動でサイズにより分離し、スペクトルに分解できる蛍光標識の使用により相対的濃度を求める。
【０００５】
ＳＴＲＰのカテゴリーに入る遺伝性疾患はかなりの数が存在する。これらの中には、筋緊張性ジストロフィー−ＣＴＧ反復、ハンチントン病および脊髄小脳失調症−ＣＡＧ反復、および脆弱Ｘ−ＣＧＧ反復が含まれる。脆弱Ｘ症候群は、浸透度が減少するＸ連鎖優性疾患であり、遺伝性精神遅滞の最も一般的な形態の１つである。この病状は、およそ１２５０人に１人の男性、およそ２０００人に１人の女性が罹患する。認知の、行動の、および身体の表現型は性別により異なり、突然変異がＸ連鎖遺伝であるので、男性の方が重度に罹患する。
【０００６】
その名称が含意するように、脆弱Ｘは、Ｘ染色体に連鎖した病状である。脆弱Ｘの表現型はＸ染色体の末端近くの遺伝子座ｑ２７．３における肉眼で見える狭窄を特徴とし、組織培養では、ある条件下でＸ染色体の先端が折れる傾向がある。研究者らは、この病状に関連するゲノムの領域を同定し、脆弱Ｘ症候群に関連するＤＮＡ配列（ＦＲＡＸＡ遺伝子）を特許文献４で述べている。障害を引き起こす突然変異は、Ｘｑ２７．３に位置するＦＲＡＸＡの５’の非翻訳領域でＣＧＧ反復の増幅をもたらす。脆弱Ｘ−ＣＧＧ反復には、４つの形態：通常（６〜４０反復）、中間（４１〜６０反復）、前変異（６１〜２００反復）、および全変異（＞２３０反復）がある。最終的に脆弱Ｘの表現型をもたらす突然変異は一般的に、段階的に生じる。初期の段階では、遺伝子は完全に欠損しておらず、むしろ「前変異」が存在し、前変異の保有者は正常の表現型を有することがある。しかし、女性の保有者に突然変異が生じる可能性があり、その女性はその子孫に表現型を産することがある。ＣＧＧ反復の数の増加の結果は、異常行動から精神遅滞までの範囲である。正常な範囲（６から４０）を超えたＣＧＧ反復の数により、症候群の重症度が判定される。
【０００７】
長年、脆弱Ｘ症候群を診断する唯一の方法は、組織培養で細胞を増殖し処理を行った後、罹患している個体の染色体を顕微鏡で検査することによるものだった。このような検査では、検査室で、Ｘ染色体の先端が破れたことを確認するために検査していた。ゲノムのレベルでＣＧＧ反復配列を直接同定するためのＰＣＲベースの方法を開発する初期の試みの中には、不成功もあった（例えば、非特許文献９を参照されたい）。
【０００８】
より最近の診断方法は、ＰＣＲおよびゲル電気泳動分離を用いて、分子量に基づいた同定を実現している。例えば、Ｂｕｎｎらの特許文献５は、競合的な方法による定量ＰＣＲの方法を開示しており、ＤＮＡ増幅に影響を及ぼすパラメーター、およびテンプレートの（試験および対照両方の）比率およびコピー数の差を区別する機構を論じている。体細胞の突然変異を検出するのにこれを用いてもよいことが述べられている。Ｂｕｎｎらは、ＤＮＡプライマーおよびそれらのそれぞれのプライマーの結合部位の性質から大部分が生じる増幅プロセスに対する様々なパラメーターの影響を述べている。しかし、このシステムは、標的に十分に近いスタンダードを使用するように制限されており、標的とサンプルはＰＣＲにより同じ比率で増幅される。さらに、スタンダードの長さは酵素の作用により後で変更されうるから、したがってスタンダードおよび標的が分離でき電気泳動により定量できるように、スタンダードは、標的とは異ならなければならない。
【０００９】
Ｃａｓｋｅｙの特許文献６は、正常および罹患していない個体におけるＦＭＲ−１遺伝子の発現を測定して比較する方法を記載しており、正常な個体における発現の変異と比べた罹患した個体における発現の変異は、脆弱Ｘ症候群に対する突然変異を示すものである。この方法は、しばしば不正確な診断をもたらすことがある、安定なゲノムＤＮＡではなく、不安定なｍＲＮＡの定量を試みるものである。Ｄａｓの特許文献７は、脆弱Ｘ症候群を有する男性を同定するためにメチル化特異的ＰＣＲを用いている。しかし、この方法は、２００反復を超える全変異を診断するのに、実際、制限されている。Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄの特許文献８は、ヒト脆弱Ｘ遺伝子座を含む精製され単離されたＤＮＡ分子を記載しており、ゲノムＤＮＡを特徴付けるのに用いられる増幅産物に相補的なプローブでハイブリダイズさせることにより、ＣＧＧ反復のＰＣＲ増幅産物を検出することを教示している。しかし、これは、続く十分な診断を実現するのに必要な方法で反復の数を特異的に定量する方法を教示しておらず、適当なストリンジェンシーのもとで異常な配列にハイブリダイズするプローブを使用することを示唆しているにすぎない。特許文献９および特許文献１０は、ｄＧＴＰの類似体を使用したＰＣＲを用いた後に最終的にゲル電気泳動を行う、脆弱Ｘ症候群を検出するための方法を開示している。
【００１０】
しかし、これらの方法は、ＣＧＧ反復の数を求め、したがって正確な診断を提供するのに限られた能力しかない。これは、一般的に、ＰＣＲがＣＧＧ反復の領域を増幅するのが困難であるからであり、検出に著しい量を必要とする正確なゲル電気泳動分析を可能にするのに十分なＰＣＲ産物が産生されないことが多い。
【００１１】
【特許文献１】国際公開第９４／０３６３８号パンフレット
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０２２４３８０号明細書
【特許文献３】国際公開第９４／０３６３８号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，１９７，５００号明細書
【特許文献５】米国特許第５，２１３，９６１号明細書
【特許文献６】米国特許第６，１８０，３３７号明細書
【特許文献７】米国特許第６，１４３，５０４号明細書
【特許文献８】米国特許第６，１９７，５００号明細書
【特許文献９】米国特許第５，６５８，７６４号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，２００，７４７号明細書
【特許文献１１】米国特許第４，６８３，２０２号明細書
【特許文献１２】米国特許第４，６８３，１９５号明細書
【特許文献１３】米国特許第４，８００，１５９号明細書
【特許文献１４】米国特許第４，９６５，１８８号明細書
【特許文献１５】米国特許第６，１７４，６８３号明細書
【特許文献１６】国際公開第０２／０５９３７２号パンフレット
【非特許文献１】Trottier, Y. et al, Current Biology 3: 783-786 (1993)
【非特許文献２】Bates, G. et al., Bioassays 16:277-284 (1994)
【非特許文献３】Kawaguchi, Y. et al., Nature Genetics 8:221-227 (1994)
【非特許文献４】Craig et al., J. Forensic Sci., Vol.33, pgs.1111-1126 (1988)
【非特許文献５】Edwards et al., Genomics, Vol. 12, pgs.241-253 (1992)
【非特許文献６】Boerwinkle et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.86, pgs.212-216 (1989)
【非特許文献７】Tautz, Nucleic Acids Research, Vol.17, pgs.6463-6471 (1989)
【非特許文献８】Saiki, Science 239:484-491 (1988)
【非特許文献９】E. J. Kremer, "Mapping of DNA Instability at the Fragile X to a Trinucelotide Repeat Sequence p(CGG)n", Science, vol.252, Jun.21, 1991, pp.1711-1714
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、ＳＴＲＰに起因する疾患および欠損のための、特に脆弱Ｘ症候群のための、簡単で信頼できる正確なアッセイを求めて探索が続いている。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
ＦＲＡＸＡ遺伝子の５’非翻訳領域におけるＣＧＧ反復など、ゲノムＤＮＡに存在するＳＴＲのコピー数を正確に推定することができる、高感度の比色検出を用いた方法が現在開発されている。ＳＴＲ、および内部対照として働く近接領域またはセグメントを含むＤＮＡ領域が選択され、したがってこれらはＰＣＲを用いてゲノムＤＮＡのサンプルから共増幅される。脆弱Ｘ症候群に対し、内部対照をコードするＤＮＡ領域がＣＧＧ反復領域の５’または３’のいずれかのＸ染色体上に位置するように選択され、ＣＧＧ反復領域およびこの内部スタンダードセグメントが近接する限り、これらは常に共増幅される。サンプルをＰＣＲ増幅した後、１本鎖の産物を得るための適当な手段がとられる。次いで、標識されたＣＣＧ標的および標識された内部スタンダードの標的の両方が提供され、これらの標識された標的は１本鎖のＰＣＲ増幅産物とハイブリダイズする。洗浄して非ハイブリダイズの標的を除去した後、ＰＣＲ産物とハイブリダイズした、残りの標識されたオリゴヌクレオチド標的が得られ、これらはＣＧＧプローブおよび内部対照プローブを含むマイクロアレイと引き続きハイブリダイズさせることにより定量される。次いでこのような未知サンプルのＣＧＧ反復のコピー数を、ＣＧＧ反復領域プローブにおけるシグナル強度の、内部対照プローブのシグナル強度に対する比を求め、この比を、既知の対照サンプルから前に生成された値と比較することにより正確に推定する。内部対照として用いるための妥当な染色体の近接セグメントを適切に選択し、それとＳＴＲ領域とを共増幅することにより、他のＳＴＲＰに対し同様の分析を行う。
【００１４】
特定の一態様では、本発明は、脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）；試験するゲノムＤＮＡを得るステップと、（ｂ）；ＰＣＲを用いて、ＦＲＡＸＡ遺伝子の非翻訳部分の全てのＣＧＧ反復、および前記ＣＧＧ反復に隣接する核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡにおけるＸ染色体上の核酸を増幅するステップと、（ｃ）；ステップ（ｂ）の増幅した核酸から１本鎖の産物を得るステップと、（ｄ）；（ｉ）（ＣＧＧ）反復、および（ｉｉ）前記近接核酸セグメント、を標的にする比色標識したオリゴヌクレオチドをステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、（ｅ）；ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物を固相に結合するステップと、（ｆ）；ステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を、標的材料の残部から分離するステップと、（ｇ）；ステップ（ｆ）の分離した産物から標識標的材料を回収するステップと、（ｈ）；次いで、ステップ（ｇ）の回収した標識標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、（ｉ）；マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識標的材料の比色強度を測定してそれに対する個々の値を得るステップと、（ｊ）；ステップ（ｉ）の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたゲノムＤＮＡのＦＲＡＸＡ遺伝子におけるＣＧＧ反復の数を正確に定量するステップとを含む。
【００１５】
特定の別の態様では、本発明は脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）；試験するゲノムＤＮＡを得るステップと、（ｂ）；ＰＣＲ、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、全てのＣＧＧ反復、および翻訳されたＦＲＡＸＡ遺伝子の近接部分を含むゲノムＤＮＡにおけるＸ染色体上の核酸を増幅させるステップであって、前記フォワードプライマーがその５’末端にアンカー部分を有するステップと、（ｃ）；ステップ（ｂ）の２本鎖の産物を精製するステップと、（ｄ）：エキソヌクレアーゼでそのアンチセンス鎖を消化することによりステップ（ｃ）から１本鎖の産物を得るステップと、（ｅ）；ステップ（ｄ）の産物を、（ＣＧＧ）反復に対する、およびＦＲＡＸＡ遺伝子の近接部分に対する蛍光標識したアンチセンス標的とハイブリダイズさせるステップと、（ｆ）；ステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を、前記フォワードプライマーの５’末端の前記アンカー部分により固相と結合させることにより非ハイブリダイズの標的の残部から分離するステップと、（ｇ）；ステップ（ｇ）の産物を、適切なプローブを含むマイクロアレイとハイブリダイズし、前記マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、蛍光標識した存在する標的の材料の蛍光強度を測定して、その個々の値を得るステップと、（ｈ）；得られたＤＮＡのＦＲＡＸＡ遺伝子におけるＣＧＧ反復の数を正確に定量するために、ステップ（ｇ）の結果を以下の式：Ｎ＝３０＋（Ａ−１．０３）６６．４を用いて既知の対照サンプルからの結果と比較するステップであり、式中、Ｎは反復の数であり、Ａは、近接セグメントに対するプローブとハイブリダイズした標的のＦＩに対するＣＧＧプローブとハイブリダイズした標的のＦＩの比率である、既知の対照サンプルの結果と比較するステップとを含む。  さらなる特定の一態様では、本発明は、短鎖縦列反復配列多型（ＳＴＲＰ）を検出するための方法を提供し、この方法は、（ａ）；試験するゲノムＤＮＡを得るステップと、（ｂ）；ＰＣＲを用いて、対象の全てのＳＴＲ、および前記ＳＴＲに隣接する核酸の実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡにおける染色体上の核酸を増幅するステップと、（ｃ）；ステップ（ｂ）の増幅したＤＮＡから１本鎖の産物を得るステップと、（ｄ）；（ｉ）ＳＴＲおよび（ｉｉ）前記近接核酸セグメントを標的とする比色標識したオリゴヌクレオチドを、ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物とハイブリダイズさせるステップと、（ｅ）；ステップ（ｃ）の前記１本鎖の産物を固相に結合させるステップと、（ｆ）；ステップ（ｄ）の前記ハイブリダイズした産物を、標識標的材料の残部から分離するステップと、（ｇ）；ステップ（ｆ）の産物から標識標的材料を回収するステップと、（ｈ）；次いで、回収されたステップ（ｇ）の標識された標的材料を、それに相補的な適切なオリゴヌクレオチドプローブを含む複数のスポットを有するマイクロアレイにハイブリダイズさせるステップと、（ｉ）；マイクロアレイへのハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイ上の特定のスポットに存在するハイブリダイズした標識された標的材料の比色強度を測定して、それに対する個���の値を得るステップと、（ｊ）；ステップ（ｉ）の結果を既知の対照サンプルからの結果と比較して、得られたＤＮＡの対象の領域におけるＳＴＲの数を正確に定量するステップとを含む。
【００１６】
またさらなる特定の一態様では、本発明は、脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するためのキットを提供し、このキットは、（ａ）；哺乳動物のゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーは、ＦＲＡＸＡ遺伝子の非翻訳領域の５’であるそれらの位置上で、Ｘ染色体のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーがＦＲＡＸＡ遺伝子またはそれらの３’内の位置に相補的であり、前記フォワードプライマーは、その５’末端に共有結合したアンカー部分を有し、前記リバースプライマーは、その５’末端にリン酸塩を有し、前記プライマーオリゴヌクレオチドの対は、全てのＣＧＧ反復、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するのに特異的である、１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドと、（ｂ）；前記ＣＧＧ反復領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、（ｃ）；（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）アンチセンス鎖の消化、（ｉｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、（ｉｖ）ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および（ｖ）比色定量を行うためのバッファーおよび酵素、（ｄ）；スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の１つに相補的なＤＮＡプローブに付着している、複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイと、（ｅ）；前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルからの前に生成されたデータを用いてＣＧＧ反復の数の診断を行うための手段とを含む。
【００１７】
またさらなる特定の一態様では、本発明は、ＳＴＲＰを示す突然変異を検出するためのキットを提供し、このキットは、（ａ）；哺乳動物のゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、前記プライマーのオリゴヌクレオチドの対は、全てのＳＴＲ、および内部対照として働く実質的な近接セグメントを含むゲノムＤＮＡの選択された領域を増幅するのに特異的であり、フォワードプライマーは染色体の選択された領域のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーは選択された領域のセンス鎖の３’末端に相補的であり、前記フォワードプライマーは、その５’末端に共有結合しているアンカー部分を有し、前記リバースプライマーの５’末端の伸長が阻止されている、１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドと、（ｂ）；前記ＳＴＲ領域および前記内部対照セグメントを別々に標的とする標識されたオリゴヌクレオチドと、（ｃ）；（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）アンチセンス鎖の消化、（ｉｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、（ｉｖ）ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および（ｖ）比色定量を行うためのバッファーおよび酵素と、（ｄ）；スポットが、それぞれ前記標識されたオリゴヌクレオチド標的の１つに相補的なＤＮＡプローブにそこで付着している、複数のスポットを有する少なくとも１つのマイクロアレイと、（ｅ）；前記マイクロアレイの比色スキャニングの結果、および対照サンプルからの前に生成されたデータを用いてＳＴＲの数の診断を行うための手段とを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に述べる詳細な説明をよりよく理解するために、以下の用語および略称語の定義を定める。
【００１９】
ハイブリダイゼーションは、溶液中または固相のいずれかで行われるＤＮＡの相補鎖間での２重構造の形成を示すのに用いられ、２本鎖のうち１本が固体表面またはマトリックス上に固定されている。
【００２０】
アニーリングは、本明細書では、ゆっくり低下する温度または単一の温度の、プローブまたはプライマーが分析物の核酸内のその相補配列と結合できるようにしたハイブリダイゼーション条件下で、１本鎖のまたは熱変性した２本鎖の核酸の分析物を、オリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーとインキュベートすることを意味するのに用いられる。
【００２１】
分析物または分析物の核酸は、分析の対象であるＤＮＡサンプルにおける化合物を表すために用いられる。
【００２２】
標識または検出可能の標識（または「タグ」）は、ある核酸配列に付着することができ、その検出および／または定量を可能にする置換基を意味する。例として、３２Ｐ、３３Ｐ、および３５Ｓなどの放射標識；蛍光、化学発光または着色化合物などの比色指示薬；ビオチンなどのリガンド；ならびに質量または他の分光器の性質により識別可能な化学基が含まれる。適切な標識のより詳しい例には、キサンチン色素、ローダミン色素、ナフチルアミン、ベンズオキサジアゾール、スチルベン、ピレン、アクリジン、シアニン３、およびシアニン５が含まれる。標識は、化学反応、酵素反応（ポリメラーゼ、キナーゼ、もしくはリガーゼを含む）による標識されたヌクレオチドの組込み、または分析物の核酸と標識されたプローブのハイブリダイゼーションまたはアニーリングを含む様々な手段により、分析物の核酸中に導入してよい。
【００２３】
プローブは、ハイブリダイゼーション反応により分析物の核酸によって決定された、その相補配列に結合するための試薬として用いられる核酸配列を意味する。
【００２４】
配列は、特定の順序および鎖長で相互に結合している、ＤＮＡにおけるＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ残基を含む核酸中の一連の塩基を意味する。
【００２５】
相補的、または相補配列は、２本鎖（２重）の構造を形成することができる２つの配列を意味する。
【００２６】
標識されたプローブは、本明細書では、核酸分析物中のその相補配列に結合することができ、その検出および／または定量を可能にする、１つまたは複数の検出可能な標識またはタグを有するオリゴヌクレオチドを意味するのに用いられる。
【００２７】
キャプチャープローブは、本明細書では、一端が固体表面に結合しており（すなわち、係留しており）、ハイブリダイゼーション反応において相補配列を含む核酸またはオリゴヌクレオチドの、固体表面上への捕獲を可能にする特定の配列のオリゴヌクレオチドを意味するのに用いられる。
【００２８】
標的、標的とする配列、標的とする鎖、または標的とする核酸は、本明細書では、例えば、特定のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより、その存在が検出の対象となる核酸配列を意味するのに用いられる。「標的とする配列」は、広義には、ＤＮＡプローブにより結合している核酸分子またはフラグメントを意味するのに用いられることがあり、あるいは、限定的な意味では、相補的な塩基対によりＤＮＡプローブに結合している標的とする核酸に由来する特定のヌクレオチド配列を意味するのに用いられる。
【００２９】
係留されている、または表面が係留されているは、本明細書では、表面上の官能基とＤＮＡプローブの一端の官能基との間に形成されている共有結合または他の方法の強力な結合により、一端である表面に結合しているオリゴヌクレオチドＤＮＡプローブを意味するのに用いられる。
【００３０】
固相ハイブリダイゼーションは、２重構造の形成に関与する２本の「反応を受ける鎖」のうちの１本が固体の支持体上に固体されているところで行われるハイブリダイゼーション反応を意味する。
【００３１】
ボーダー配列またはフランキング配列は、選択されたＤＮＡ配列および染色体の末端に近く、隣接し、かつ／またはそれを含む核酸セグメントを意味するのに用いられる。
【００３２】
オリゴヌクレオチドは、通常約１００ヌクレオチドまでの長さの、化学合成することができる短いＤＮＡ鎖を意味する。
【００３３】
遺伝子は、タンパク質、遺伝子内に散在するイントロン（非コード）配列、および遺伝子の調節で機能するさらなる配列をコードする配列を含む、遺伝機能の単位を意味する。
【００３４】
ゲノムは、遺伝子、遺伝子間配列、および生物体または自律複製物質を含む他の遺伝子エレメントの相補体全体を意味する。マイクロアレイまたはＤＮＡチップは、表面上に形成されている表面が係留されているＤＮＡプローブの２次元のアレイを意味し、通常、小型化したフォーマットで、１ミリメートル未満の中心から中心の間隙に配列されている個々のＤＮＡプローブとの多くのハイブリダイゼーション反応の同時分析を可能にしている。
【００３５】
プライマーは、遊離の３’−ＯＨ終末を有するオリゴヌクレオチドを意味し、「テンプレート鎖」と塩基対を成し、したがってポリメラーゼ酵素により伸長することができる。例えば、ＤＮＡテンプレートとアニールしたオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの基質として（デオキシヌクレオシド５’−三リン酸と共に）働くことができ、ＰＣＲ反応におけるように「プライマーの伸長」をもたらす。プライマー対は、核酸セグメントの反対側の鎖に結合する２個のプライマーを意味する。
【００３６】
ＰＣＲフラグメントは、ポリメラーゼ連鎖反応によって形成された、規定された長さ（テンプレート上の開始部分の間の間隙によって規定される）のＤＮＡのフラグメントを意味する。
【００３７】
変性、または変性しているは、２重らせんを不安定にする条件下で、最も一般的には高温の条件下での（「熱変性」）、２重の核酸分子の２本鎖の分離（解離）を意味する。反復、または反復配列は、短鎖反復配列の配列、特に、ＣＧＧＣＧＧＣＧＧを意味する。
【００３８】
５’末端／終末は、そのデオキシリボース上の非エステル化炭素−５を有するヌクレオチドを含む核酸の鎖の末端を意味する。
【００３９】
３’末端／終末は、そのデオキシリボース上の非エステル化炭素−３を有するヌクレオチドを含む核酸の鎖の末端を意味する。
【００４０】
ＣＣＤ−電荷結合素子
ＣＩ−比色強度
ＦＩ−蛍光強度
ＰＣＲ−ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＳＣ−標準クエン酸食塩水、塩化ナトリウム１５０ｍＭおよびクエン酸ナトリウム１５０ｍＭを含む溶液
ＳＴＲ−短鎖縦列反復配列
ＳＴＲＰ−短鎖縦列反復配列多型
【００４１】
出願者の診断方法は、ＰＣＲを利用して、全ゲノムＤＮＡに比べて少ない量で存在する特定のＤＮＡ配列を最初に増幅する。ＰＣＲを用いることにより、特定のＤＮＡ配列を１０万倍以上に増幅して、出発のＤＮＡに存在する場合にはその検出を容易にすることができる。
【００４２】
その開示が本明細書に参照として組み入れられる特許文献１１、特許文献１２、特許文献３、および特許文献１４は、本発明が利用している、現在よく知られているＰＣＲプロセスの詳細を提供するものである。ＰＣＲは、対象の特別な領域に隣接する配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、数時間でＤＮＡ配列を数オーダー増幅して、反対方向および重複方向にプライマーが誘導するＤＮＡ合成をもたらす。高温のテンプレート変性、オリゴヌクレオチドプライマーの再アニーリング、およびポリメラーゼが介在する伸長の反復サイクルを用いることにより、ＤＮＡ配列を数１０万倍正確に増幅することができる。一般的に、ＰＣＲは、１つはセンス鎖を生成するためのフォワードプライマー、１つはアンチセンス鎖を生成するためのリバースプライマーという、各テンプレートに対する２つの異なるプライマーをデザインできるように、増幅されるテンプレートの５’末端および３’末端両方の配列を知る必要がある。
【００４３】
本発明におけるＰＣＲプロセスは、望ましいＤＮＡ合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む、単一の対のプライマーを用いることが好ましい。オリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ核酸テンプレートにハイブリダイズする際に望ましいテンプレートの３’末端に対して陥没しており、したがって核酸ポリマーの重合の合成の開始部位として働く、遊離の３’ＯＨ基を有しており、その配列は（ａ）デオキシリボヌクレオチド基質、（ｂ）ＤＮＡ複製を行うことができる適切な酵素、ならびに（ｃ）適切な温度、および望ましいｐＨを提供するバッファーの存在下でテンプレート鎖に相補的である。プライマーは、便宜上、合成で製造されることが好ましい。ＰＣＲは、選択された核酸テンプレートに結合する２つのプライマーを使用するが、２つのプライマーのそれぞれは増幅する２重のセグメントの２つの３’末端のうちの１つまたはボーダーに相補的である。これらは、通常、フォワードプライマーおよびリバースプライマーと呼ばれる。これらのプライマーは、プライマーの伸長を引き起こす条件下で他のＰＣＲ試薬と、すなわち、４つの異なるヌクレオシド三リン酸（またはその類似物質）、適切なポリメラーゼ、および適切なバッファー（「バッファー」は、ｐＨおよびイオン強度を求める物質、補助因子などを含む）と適切な温度で結合する。ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼであるＰＣＲ法では、バッファーは、マグネシウム塩、好ましくはＭｇＣｌ２を１．５〜２ｍＭ、各ヌクレオシド三リン酸を１５〜２００μＭ、各プライマーを１μＭ、ならびに、例えばＫＣｌ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．４のＴｒｉｓバッファー１０ｍＭ、およびゼラチン１００μｇ／ｍｌを含んでもよい。ＰＣＲ増幅を行うためのこのようなキットは、多くの業者から市販されている。
【００４４】
各プライマーは、適切なポリメラーゼ、および上記に記載したものなどの他の試薬の存在下で、伸長ＤＮＡ産物の合成を始め、または開始するのに十分長くなければならない。適切なプライマーの長さは、よく知られているように多くの要因に依存し、通常、出願者の方法で実行するには１５〜３０ヌクレオチド残基を含むプライマーが用いられる。プライマー分子が短いと、鎖の伸長反応を支持するプライマー−テンプレート複合体を形成し維持するために、一般に、より低い反応温度が必要とされる。
【００４５】
用いたプライマーは、増幅すべき選択された配列を含む核酸に実質的に相補的である必要があり、すなわち、プライマーは選択された配列（またはその相補体）を含む核酸と結合し、すなわちハイブリダイズしなければならない。プライマー配列は、テンプレートの完全に正確な相補体である必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチドフラグメントまたは他の部分は、プライマーの５’末端に付着していてもよく、プライマー配列の残部が選択された核酸配列に相補的である。選択された核酸配列に完全に相補的であるプライマーが好ましく、通常用いられる。
【００４６】
一般的に、配列の両末端の十分な数の塩基が十分詳しく知られている限り、任意の特定の核酸配列をＰＣＲプロセスにより増幅することができ、その結果、核酸配列上の望ましい相対的な位置に位置する望ましい配列の様々な鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができる。その結果、１つのプライマーから合成された伸長産物が、そのテンプレート（相補体）から分離された後、次のサイクルで他のプライマーが規定された長さの核酸に伸長するためのテンプレートとして働く。
【００４７】
ＳＴＲＰを診断するための本発明の好ましい一実施形態では、１対のプライマーが用いられる。一方のプライマー、すなわちフォワードプライマーは、選択されたＤＮＡ領域のアンチセンスの３’末端に近く、隣接し、かつ／またはそれを含む配列に相補的である。他方のプライマー、すなわちリバースプライマーは、選択されたＤＮＡ領域の３’末端の配列の相補体に近く、隣接し、かつ／またはそれを含む配列の相補体を含む。
【００４８】
アッセイが方向付けられるＳＴＲＰに応じて、増幅すべき、関連する染色体上の核酸の長さに関する決定を最初に行う。ヒトゲノムのシークエンシングが完結した結果、これらのＳＴＲＰの部位は現在知られており、したがって、その部位が表れる遺伝子座に注意が向けられている。次いで、全てのＳＴＲセグメント、および内部対照として働くＳＴＲセグメントの３’または５’のいずれかの近接セグメントを全て含むフランキング配列を選択する上で判断がなされる。脆弱Ｘ症候群では、ＳＴＲ領域の３’にある近接配列をこのようにして選ぶことが好ましいが、代替のその５’領域も使用してもよい。増幅すべき核酸セグメントの長さを選択した後、ＳＴＲ領域全て、および内部対照として用いる選択された近接セグメントの共増幅を行う適切なオリゴヌクレオチドプライマー対をデザインする。プライマーは、その領域が、選択された核酸セグメントの特定の末端に近く、隣接し、かつ／またはそれを含む核酸のそれぞれの鎖の３’領域に相補的であるようにデザインされる。
【００４９】
一般的に、プライマーは、約１５ヌクレオチドと約３０ヌクレオチドの間の長さであり、好ましくは約１８ヌクレオチドと約２７ヌクレオチドの間の長さである。プライマーは、生じるであろう望ましい位置のハイブリダイゼーションを最大にするように、ゲノムにおける独特のＤＮＡ配列にハイブリダイズするように選択されることが好ましい。
【００５０】
ＳＴＲ領域はアッセイが目指す長さにおける変異であるので、増幅される問題の染色体上の核酸の長さは、もちろんＳＴＲ領域の長さによって決まる。一般的に、通常のヒトの染色体では約３５０ヌクレオチドと２０００ヌクレオチドの間の核酸の長さが選択され、より好ましくは約５００ヌクレオチドと１０００ヌクレオチドの間の核酸の長さが選択される。
【００５１】
アッセイを速やかに進めるために、必要な道具を全て含むキットが提供される。例えば、脆弱Ｘ症候群を示す突然変異を検出するためのキットは、哺乳動物のゲノムＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして機能する１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドを含まなければならず、フォワードプライマーは、ＣＧＧ反復が位置するＦＲＡＸＡ遺伝子の非翻訳領域の５’上の位置でＸ染色体のアンチセンス鎖の３’ヌクレオチド配列に相補的であり、リバースプライマーはＦＲＡＸＡ遺伝子内の、すなわち反復領域の３’内の位置に相補的である。フォワードプライマーは、その５’末端に共有結合しているアンカー部分を有さなければならず、この場合リバースプライマーは、その５’末端にリン酸塩を有する。この配列は、所望により逆転してもよい。このような対のオリゴヌクレオチドは、したがって、ＣＧＧ反復全て、および内部対照として働く実質的に近接セグメントを含むゲノムＤＮＡの領域を増幅するのに特異的である。ＣＧＧ反復領域および内部対照領域を別々に標的にする標識されたオリゴヌクレオチドが、（ｉ）ＰＣＲ、（ｉｉ）アンチセンス鎖の消化、（ｉｉｉ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄、（ｉｖ）ハイブリダイズされた標識されたオリゴヌクレオチド標的の解離、および（ｖ）比色定量を行うためのバッファーおよび酵素と共に提供される。このキットは、複数のスポットを有するマイクロアレイを含み、これらのスポットはそれぞれ、標識されたオリゴヌクレオチド標的の１つに相補的なＤＮＡプローブに付着している。マイクロアレイの、例えば比色の、スキャニングの結果を用いて、ＣＧＧ反復の数の診断を行うための手段をさらに含むが、その診断は、前に対照サンプルから生成されたデータに基づく。
【００５２】
好ましく用いられる対のプライマーのフォワードプライマーには、各プライマーの５’末端に共有結合しているアンカー部分がある。リバースプライマーは、５’末端のリン酸塩で誘導体化されている。以下に説明するアッセイにおける分離のステップでは、このアンカー部分を利用する。一般的に、オリゴヌクレオチドを固体の表面または固相に結合する働きをするあらゆるアンカー部分を用いることができる。
【００５３】
当技術分野ではよく知られているが、様々な固相材料を用いることができる。例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＲａｄ、およびＳｉｇｍａから市販されているもののような一般的に使用されている任意の広範な材料から、固体支持材料を選択することができる。これは、粒子、プレート、マトリックス、繊維などの形態であることができ、シリカ、セルロース、アガロースビーズ、多孔質ガラス、ポリマービーズ、ゲルビーズ、または磁気ビーズでできていてもよい。磁気ビーズが好ましいが、これは磁気ビーズのようなものを使用すると、磁場を直接適用することにより上清からの引き続いての分離を促進するからである。これは、フローチャンバーを用いて、または単純なピペット操作により行うことができる。このような磁気ビーズ、例えば、Ｄｙｎａｌビーズとして販売されているもの、またはＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓより販売されているものなどを使用して、生物学的サンプルおよびＰＣＲ材料の残部、ならびに反応生成物から、洗浄により増幅したＤＮＡを分離することができる。この同じ性質をやはり用いて、アッセイ手順のより後の段階で、減結合した標的材料を分離するのに利用する。ビーズ形態の粒子は、能力および取扱いのために好まれるが、他の形をした粒子または基質を代わりに使用してもよい。このような市販の磁気ビーズは、一般的に、望ましい磁気特性を提供するために磁鉄鉱の層でコーティングされ、次いで外部コーティングでコーティングされている無孔性の小球である。これらの目的で市販されている磁気ビーズは、様々な方法で製造され、金属酸化物などの常磁性の金属を、ポリマーまたはケイ酸塩などの適切なコーティング材料と共にカプセル化して、直径約１μｍ〜１００μｍの被覆されたビーズを製造することが多い。
【００５４】
相補的であり互いに結合するアンカー部分およびカップリング剤は、このような固体の支持体に増幅されたＤＮＡを付着させるための連結法として用いられる。多くの種類の結合対が、当技術分野ではよく知られており、適切に使用することができる。アンカー部分は、固相に、より一般的には、固相により運搬される相補的なカップリング剤に直接つながることができる。好ましい結合システムは、アビジンまたはストレプトアビジン、およびビオチンを使用するものである。例えば、ストレプトアビジンは、固体の支持体、例えば磁気ビーズの外部表面に共有結合し、次に、ビオチン化したＤＮＡに強力に結合する。対象の応用に適するこのような磁気ビーズは、数々の業者から市販されている。ビーズ表面に結合しているストレプトアビジンを有するビーズは、直径約１ミクロンの公称寸法を有し、カリフォルニアのＡｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  Ｃａｒｌｓｂａｄにより販売されている。他の結合対、例えば、抗体−抗原などを、このような中間連結法として代わりに用いてもよい。このような誘導体化したビーズを、上記の品目（ｉｉｉ）で述べたように洗浄を促進するためのバッファーと共に、キットの任意の部分として供給してもよい。
【００５５】
分類されたキットの部分の一部として供給される他の品目は、市販され、あらゆるＰＣＲキットの部分として一般的に含まれる、よく知られた品目である。これらは、現在よく知られているＰＣＲプロセスの詳細を提供する４つの米国参考文献の群に、詳しく記載されている。
【００５６】
キットの重要な品目は、ＣＧＧ反復領域、および内部対照として選択された領域を別々に標的にするようにデザインされた、標識されたオリゴヌクレオチドのセットである。用いられる標識は、指示色素、放射性核種、抗体、酵素などを含めた、核酸を標識するために市販されている広範な材料から選択された、一般的に用いられている品目のあらゆるものであることができる。標識が比色指示薬であるのが好ましく、最終のアッセイを単純化するための蛍光色素であるのがより好ましいが、アルカリ性のリン酸塩、過酸化水素水、β−ガラクトシダーゼ（ベータ−ガラクトシダーゼ）、ならびにジゴキシンおよびジゴキシゲニンなどのハプテン、ならびに化学発光成分などの品目も用いてもよい。当技術分野でよく知られているように標識が標的のハイブリダイゼーションを妨害しないように短いリンカーを用いてもよいが、一般に標識は標的に直接連結している。好ましい比色指示薬は、Ｃｙ−３蛍光色素である。
【００５７】
２つの分離し標識されたオリゴヌクレオチド標的のうち、１つの標的はＳＴＲ切片にハイブリダイズするようにデザインされている。これらのオリゴヌクレオチドは、約３個および７個のトリプレットを含み、好ましくは約４個と約６個の間のトリプレットを含み、すなわち、約１２ヌクレオチドと約１８ヌクレオチドの間の長さであるべきである。内部対照用の標識された標的材料は、一般的に２１ヌクレオチドと５４ヌクレオチドの間の長さであり、好ましくは、約３０ヌクレオチドと約４５ヌクレオチドの間の長さである。これは、選択された近接核酸セグメント、例えば翻訳されたＦＲＡＸＡ遺伝子のセグメントのセンス鎖に相補的であるように選択されているにすぎない。標識されたＳＴＲ標的の量は、内部対照の標的の量の少なくとも約５倍であることが好ましく、少なくとも約１０倍の量であることがより好ましく、少なくとも約２０倍であることが最も好ましい。
【００５８】
キットには、選択されたＤＮＡプローブをそれに付着させる複数のマイクロスポットを有するマイクロアレイも含まれ、プローブは標識された標的の１つに相補的である。標的に対するプローブが平面の基質に、またはマイクロタイタープレートのウェルで直接結合する２次元のアッセイのものを含めた、標識されたＤＮＡ標的に対する開発された無数のアレイの任意のものを用いることができるが、特許文献１５に記載され、および「３次元フォーマットのバイオチップ（Three Dimensional Format Biotips）」のタイトルで特許文献１６で公表されたものなどの、３次元のバイオチップを提供することが好ましい。このような３次元のアレイでは、プローブはプレートにおけるウェルの固体表面、またはスライドガラスもしくは他のプレートに連結していないが、その代わりに、重合したヒドロゲルのマイクロスポットに付着することにより３次元のアレイに提示される。このように配置することによりプローブが固体の基質から分離され、この配置は、プローブを提示し、標識された標的の分子を最終的に捕獲するために、拡張された表面領域を提示する。アッセイで使用する異なる標的のそれぞれに対して、このような複数の３−Ｄのマイクロスポットを各スライドガラス上、またはマイクロウェルプレートの各ウェル中に提供することが好ましい。
【００５９】
アンカー部分がフォワードプライマーに共有結合し、次いでフォワードプライマーがセンス鎖に組み込まれる好ましい実施形態では、プローブは最初に選択された核酸のセンス鎖の切片にすぎず、これらは、マイクロアレイプレートに、または好ましい配置においてはマイクロアレイプレートに接着しているヒドロゲルスポットに、共役しまたは結合するように誘導体化されている。あらゆる適切なリンカーを用いることができ、好ましくは、当技術分野で一般的に知られているようにＣ−６アミノリンカーを使用する。ＳＴＲ切片のプローブは、複数のＣＧＧトリプレット、好ましくは約６個と約２０個の間のトリプレット、より好ましくは約８個と約１５個の間のトリプレットを含まなければならず、プローブには標的材料に存在する少なくとも約２倍のトリプレットが存在することが好ましい。内部対照の標的材料に対するオリゴヌクレオチドプローブは同様に、単に適切な長さの選択された近接領域由来の核酸のセンス鎖のセグメントである。これは、標的材料と少なくとも同じ長さであることが好ましく、本明細書で内部対照標的材料に示したものとおよそ同じ長さであることが好ましい。
【００６０】
上記で述べたように、キットはハイブリダイゼーション反応を促進するのに適当な化学物質を含む。ハイブリダイゼーション溶液をスライドガラスまたはウェルでインキュベートした後、非結合の標識標的材料を除去するために洗浄を行う。得られたスライドを、蛍光色素を用いた場合は蛍光検出器を用いるなどにより、あらゆる適切な方法で観察することができる。他の適切な検出器を、もちろん、標的に付着するために選択した特殊な標識の性質に応じて代わりに使用する。次いで、キットに備えられている適当な演算式または他の手段を用いて、マイクロアレイの比色スキャニングの結果を解明する。これらは対照サンプルから前に生成されたデータを発展させ、それをもとにしているものである。
【００６１】
ＳＴＲＰの存在を検出するためのアッセイ手順の例として、少量の未知のゲノムＤＮＡを最初に得る。例えば、約１０ｎｇで十分であるとみなされる。この未知のサンプルを、５０マイクロリットルの容積を有する反応チャンバーでＰＣＲにかける。ＳＴＲ切片を含む選択された核酸セグメントに対するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを約１μＭずつ、および選択された核酸の近接セグメントを、適当なデオキシリボヌクレオシド基質、適当な酵素、およびバッファーを含む市販のＰＣＲシステムの成分と共に加える。一般的に、約５サイクルと約４０サイクルの間の温度サイクルのＰＣＲ複製プロセスを行って、望ましい量の増幅された選択された核酸配列を生成する。ＰＣＲ増幅が完了したら、標準の手段を用いて２本鎖の産物を精製して、未反応のプライマーおよびヌクレオチド基質などを除去する。このような精製キットは市販されており、次いで適当量のＤＩ水で溶出を行う。
【００６２】
次いで、精製したＤＮＡのアンチセンス鎖を、ラムダエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）などの適切なヌクレアーゼで消化する。このような消化の後に、最初に選択した核酸のセンス鎖のヌクレオチド配列を有するビオチン化した１本鎖のＤＮＡが残る。次いで、これを、ＳＴＲ切片および内部対照セグメントの両方に対して標識標的材料と混合する。ＳＴＲ切片に対する標識した標的のオリゴヌクレオチドを約２００ｎＭ、および内部対照切片を約１０ｎＭ、ならびに適切な市販のバッファー系を使用する。混合物を約９５℃の変性温度に約１０分間さらし、次いで適当な時間、例えば、ハイブリダイゼーションを促進するために連続振とうなどを用いて約２から５時間、約３５℃から４０℃の温度でインキュベートする。
【００６３】
インキュベートの後、増幅したＤＮＡ鎖のビオチンアンカー部分により、ハイブリダイズしたサンプル材料をストレプトアビジンビーズまたは他の適切な固体基質に固定化する。室温で約１５分間、適切なバッファー中で振とうするなどしてインキュベートすることにより固定化を行う。ビーズとビオチン化ＤＮＡの間の付着が完了する時間を提供した後、ビーズを洗浄して、特異的にハイブリダイズされなかった標識された標的を含む他の成分を全て除去する。一般的に、場合により厳密さを増して、複数回の洗浄を使用する。
【００６４】
これらの洗浄の後、０．１Ｍ  ＮａＯＨまたは匹敵する塩基で処理し室温で約５分間インキュベートすることにより、標識した標的を、固体の支持体に結合している鎖から溶出する。溶出後、液体の上清を磁気引力により固定化されているビーズから分離し、それを回収し、中性化する。次いで、標識された標的を含む液体の溶液を、適切なマイクロアレイに直接かける。
【００６５】
マイクロアレイへのハイブリダイゼーションは、適当な温度、例えば４０℃から５０℃で、通常少なくとも約１２時間の間、適切なバッファーを含む溶液中で行う。ハイブリダイゼーションの後、適切なバッファーを含む溶液を用いてマイクロアレイを複数回洗浄し、次いで比色分析にかける。好ましいように標識が蛍光である場合には、増幅された核酸にハイブリダイズする異なる標的材料に特異的であるプローブから発せられる蛍光シグナルの強度が記録される。以下に詳しく説明するように、これらの値を増幅されたＰＣＲ産物で共増幅されたことが見出された内部対照の量と比べることにより、特定のＳＴＲセグメントの相対的な長さの定量的な指標が提供される。
【００６６】
アッセイの最初の部分におけるいくつかのステップは、所望の通り様々な配列で行うことができる。例えば、ビオチン化した、増幅した２本鎖ＤＮＡは、アンチセンス鎖が消化される前にストレプトアビジンを担持する磁気ビーズと最初に結合してもよく、または代わりに、標識された標的を混合物に加える前にそのように連結してもよい。しかし、アッセイを行う好ましい方法は上記に示した通りであるが、２本鎖の産物を最初に処理してアンチセンス鎖を消化してから、標識した標的すなわち蛍光標識を担時するＤＮＡオリゴヌクレオチドを加え、次いで、１本鎖のＤＮＡ標的が、増幅されたＤＮＡの相補配列にハイブリダイズしてからストレプトアビジンを担持する磁気ビーズなどに付着させるような、ハイブリダイゼーションを行える条件下に混合物を維持する。ビーズを洗浄した後、水酸化ナトリウム溶液などのアルカリで室温で処理して蛍光標識した合成の標的を遊離させてもよい。次いで、増幅したＤＮＡサンプルとハイブリダイズしたが、そのようなアルカリ処理の結果現在は遊離されている２つの標的に対する適切なアッセイで、得られた水溶液を直接用いることができるが、最初に中性化することが好ましい。
【００６７】
本発明の明細書を、今度は、脆弱Ｘ症候群と呼ばれるＳＴＲＰの検出に焦点を当てるようにデザインされた分析の実施例の観点から記載する。脆弱Ｘ症候群に関して分析される未知のサンプルからの結果を解釈する手段を提供するために、上記に記載した方法を最初に用いて、それぞれ３０個のＣＧＧ反復および１１７個のＣＧＧ反復を有することがわかっている２つの対照サンプルを試験する。用いた標識は蛍光であり、したがってマイクロアレイ上のそれぞれの各プローブで測定される比色強度は蛍光強度（ＦＩ）である。以下の結果が得られた。
【００６８】
１．  ３０反復を有することがわかっている対照サンプルでは、
ＣＧＧプローブのＦＩ＝１７，５９８
内部対照プローブのＦＩ＝１７，００８
（ＣＧＧのＦＩ）／（内部対照のＦＩ）＝１．０３
２．  １１７反復を有することがわかっている対照サンプルでは、
ＣＧＧプローブのＦＩ＝１１，００５
内部対照プローブのＦＩ＝４，７０８
（ＣＧＧのＦＩ）／（内部対照のＦＩ）＝２．３４
【００６９】
これらの対照サンプルから得られた結果は比例しており、これらの結果から引き出された等式を用いてあらゆる未知サンプルにおける反復数を求めるのに用いることができる手段が提供される。より詳しくは、このような２つの対照サンプルからの結果を用いて、このような未知のサンプルにおける反復数を計算するために未知のサンプルから後で得られる、ＦＩまたは他の比較できる比色の値をその時使用できるようにする演算式を作り出すことができることが見出されている。
【００７０】
脆弱Ｘ（ＦＲＡＸＡ）遺伝子などの特定の遺伝子におけるＳＴＲに対する試験データに基づき、以下の演算式が開発され、次いでこれから単純化された等式が、この特定のＳＴＲＰに対して引き出される：
Ｎ＝Ｋ＋（Ａ−Ｂ）×Ｑ／（Ｃ−Ｂ）
Ｎ＝未知サンプルにおけるＳＴＲの計算された数
Ｋ＝反復数が少ない対照サンプルにおけるＳＴＲの数
ＣＩ＝比色強度
Ａ＝未知サンプルの、ＳＴＲプローブのＣＩを内部対照プローブのＣＩで割った比
Ｂ＝Ｋ反復を有する対照サンプルに対するＣＩの比
Ｑ＝反復数の多い対照サンプルと、反復数の少ない対照サンプルとの間の反復数の差
Ｃ＝反復数の多い対照サンプルの、ＳＴＲプローブのＣＩを内部対照プローブのＣＩで割った比
【００７１】
次いで、この演算式を用いて、疑わしい脆弱Ｘ症候群の分析に対する特定の等式を引き出す。３０反復および１１７反復を有する２つの対照サンプルを試験した結果、Ｋ、Ｂ、Ｃ、およびＱの値が現在わかっている。したがって、演算式を脆弱Ｘに対する以下の等式に単純化することができる：
Ｎ＝３０＋（Ａ−１．０３）６６．４
【００７２】
この分析の妥当性を試験するために、次に、未知サンプルで実施する。このような未知のアッセイの詳細を、以下の実施例でこれ以降に述べる。しかし、これらは例示的なものであり、本発明を限定するものではないとみなすべきであり、本発明の範囲はここに添付する特許請求の範囲で規定される。
【実施例】
【００７３】
ゲノムＤＮＡを１０ｎｇ、およびＦＲＡＸＡ遺伝子配列の遺伝子座におけるＸ染色体の選択された核酸セグメントに対する各プライマーを１μＭ含む、全容積５０μｌでＰＣＲを行った。選択されたセグメントはＣＧＧ反復切片全体、およびそれに近接する３’内部対照セグメントを含む。ＲｏｃｈｅからのＧＣリッチのＰＣＲシステムを用いる。用いるＦＲＡＸＡのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ヌクレオチド塩基配列配列番号１および２（表を参照）を有するオリゴヌクレオチドである。フォワードプライマーの長さは２１ヌクレオチドであり、リバースプライマーは長さ２７ヌクレオチドである。これらは、「正常の」Ｘ−染色体において少なくとも長さ２５４ヌクレオチドの全ての遺伝子セグメントに及ぶ。フォワードＰＣＲプライマーは、５’ビオチン化し、リバースプライマーは５’リン酸化した。使用したＰＣＲ温度サイクル条件は、９５℃で２分間、その後９５℃で１．５分間、５６℃で１分間、７２℃で２分間を２５サイクルであった。最終の伸長を７２℃で７分間行った。
【００７４】
増幅したＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、次いで、ＤＩ水５０μｌで溶出した。精製したＤＮＡのアンチセンス鎖を、次いで、ラムダエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）で消化した。
【００７５】
残りの、ビオチン化した１本鎖ＤＮＡを、２つの異なる５’−Ｃｙ３−で標識した標的のオリゴヌクレオチド：（ＣＣＧ）ｎを含むＢｉｏｃｅｐｔ＃３５８４（配列番号３）、および選択された３’ＦＲＡＸＡ内部対照に相補的なＢｉｏｃｅｐｔ＃３５９５（配列番号４）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、１×Ｂ＆Ｗバッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ）中で行った。サンプルを９５℃で１０分間変性させ、その後、振とう機中３７℃で３時間インキュベートした。
【００７６】
ハイブリダイズした標的材料を、次いで、１×Ｂ＆Ｗバッファー中、室温で１５分間、振とう機上でインキュベートすることにより、ビオチン化したセンス鎖とカップリングさせてストレプトアビジンビーズ（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）に固定化した。ＤＮＡ／ビーズ複合体を、１×Ｂ＆Ｗで３回洗浄し、次いで、０．１Ｍ  ＮａＯＨを加え室温で５分間インキュベートすることにより、結合した１本鎖ＤＮＡから標識した標的のオリゴヌクレオチドを分離した。放出された、標識された標的のオリゴヌクレオチドを含む上清を回収し、中性化した。
【００７７】
次いで、標識された標的のオリゴヌクレオチドを、２つのプローブ：Ｂｉｏｃｅｐｔ＃３５９４（配列番号５）およびＢｉｏｃｅｐｔ＃３６８６（配列番号６）を含むＨｙｄｒｏ  Ａｒｒａｙマイクロアレイにハイブリダイズさせた。これらのプローブは、それぞれ、ＦＲＡＸＡ内部対照、およびＣＧＧ反復に対する標識された標的に相補的であった（表を参照）。マイクロアレイでのハイブリダイゼーションは、３×ＳＳＣおよび０．１％ＴｒｉｏｔｎＸ−１００を含む溶液中、４５℃で約１４時間行った。アレイを、２×ＳＳＣおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む溶液中、３７℃で各１５分間３回洗浄した。比色標識はここでは蛍光標識であり、したがって蛍光画像がレーザースキャナーで得られた（ＳｃａｎＡｒｒａｙ（登録商標）Ｌｉｔｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）。
【００７８】
【表１】
2007525998.tif 000002
【００７９】
ＦＲＡＸＡプローブ（＃３５９４）における比色強度、ここでは蛍光強度（ＦＩ）は、共増幅された内部対照として働き、ＰＣＲの効果の指標も提供する。プローブ＃３５８６および＃３５９４における蛍光強度を比較して、所望の比が得られた。ＦＩの比、すなわちＳＴＲプローブのＦＩを内部対照プローブのＦＩで割った比は、１．７８であることがわかった。前述の導き出された等式に１．７８を代入すると、ＳＴＲの数の以下の計算がもたらされる：
反復数＝３０＋（１．７８−１．０３）６６．４＝８０
したがって、未知サンプルにおけるＣＧＧ反復数の結果は８０という計算値になる。
【００８０】
試験を実証するために、ＰＣＲおよび配列分析を用いて、冗長にＣＧＧ反復の数を直接求め、結果は約８０から８５であることが見出された。試験手順は、したがって、完全に正確であると思われる。
【００８１】
現時点で本発明者に知られている、本発明を実施するための最良の形態を構成するいくつかの好ましい実施形態に関して本発明を記載したが、ここに添付する特許請求の範囲で述べる本発明の範囲から逸脱することなしに、様々な変更および修正を行ってもよいことを理解されたい。
【配列表】
2007525998000001.app
【国際調査報告】
2007525998.tif 000003
2007525998.tif 000004
2007525998.tif 000005
2007525998.tif 000006
2007525998.tif 000007