(57)【要約】  本発明は、試料中の対象検体を検出するためのアッセイキットを提供する。該キットは、ａ）レポーター種、ｂ）対象検体に結合できる第１の結合領域と、レポーター種に結合できる第２の結合領域とを有する標識種、ｃ）標識種の第１の結合領域に結合できる固定化種、およびｄ）レポーター種に結合できる固定化捕捉試薬を含む。試料を標識種と接触させ、次いで固定化種と接触させ、その後固定化捕捉試薬と接触させるが、試料を固定化捕捉試薬と接触させる前に、レポーター種を添加する手順を取る。試料中に検体が存在しない場合、標識種は固定化種と結合し、そのため固定化捕捉試薬と結合できない。試料中に検体が存在する場合、検体が標識種と結合することにより、標識種は固定化種と結合できないが、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合でき、したがって検体の存在が、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合する標識種の存在によって判定される。
2007514157.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）レポーター種、
ｂ）対象検体に結合できる第１の結合領域と、レポーター種に結合できる第２の結合領域とを有する標識種、
ｃ）標識種の第１の結合領域に結合できる固定化種、および
ｄ）レポーター種に結合できる固定化捕捉試薬
を含み、試料を標識種と接触させ、次いで固定化種と接触させ、その後固定化捕捉試薬と接触させるが、試料を固定化捕捉試薬と接触させる前にレポーター種を添加するような手順を取り、
試料中に検体が存在しない場合、標識種は固定化種と結合し、そのため固定化捕捉試薬と結合できず、試料中に検体が存在する場合、検体が標識種と結合することにより、標識種は固定化種と結合できないが、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合でき、したがって検体の存在が、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合する標識種の存在によって判定される
試料中の対象検体を検出するアッセイキット。
【請求項２】
固定化種を捕獲帯に供給し、固定化捕捉試薬を離れた検出帯に供給し、試料が捕獲帯から検出帯へ移動する、請求項１に記載のアッセイキット。
【請求項３】
標識種を捕獲帯の上流にある試薬帯に供給し、使用時に試料を試薬帯に接触させると、標識種は、試料中を移動し、試料中の対象検体（存在する場合）と結合でき、更に捕獲帯に移動し、その後検出帯に移動できる、請求項２に記載のアッセイキット。
【請求項４】
レポーター種が捕獲帯またはその上流に供給される、請求項２または請求項３に記載のアッセイキット。
【請求項５】
ａ）可動性レポーター種、
ｂ）対象検体に特異的な第１の結合領域と、レポーター種に特異的な第２の結合領域とを有する可動性標識種を有する試薬帯、
ｃ）試薬帯にまたはその下流にあり、固定化対象検体を含む捕獲帯、および
ｄ）捕獲帯の下流にあり、レポーター種に特異的な固定化捕捉試薬を含む検出帯
を含み、可動性レポーター種が検出帯より上流にある
試料中の対象検体を検出するための側方流動担体イムノアッセイ用具。
【請求項６】
検出帯の上流にある可動性対照マーカー、および
検出帯の下流にあって、対照マーカーと結合できる固定化捕捉試薬を含む対照帯
を更に含む、請求項２から５のいずれか一項に記載のアッセイキットまたは用具。
【請求項７】
検体がハプテンである、請求項１から６のいずれかに記載のアッセイキットまたは用具。
【請求項８】
試料を、対象検体に結合できる第１の結合領域とレポーター種に結合できる第２の結合領域とを有する標識種とに接触させ、
試料を、標識種の第１の結合領域に結合できる固定化種に接触させ、
その後、試料を、レポーター種に結合できる固定化捕捉試薬に接触させる
ことを含み、試料を固定化捕捉試薬と接触させる前にレポーター種を添加し、試料中に検体が存在しない場合、標識種は固定化種と結合し、そのためレポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合できず、試料中に検体が存在する場合、検体が標識種と結合することにより、標識種は固定化種と結合できないが、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合でき、したがって検体の存在が、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合する標識種の存在によって判定される
試料中の対象検体の存在を検出する方法。
【請求項９】
試料を、基材上に存在し、固定化対象検体を有する捕獲帯と接触させ、その後、基材上の固定化捕捉試薬を有する検出帯に接触させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試料を、基材上に存在し、標識種を有する試薬帯と接触させ、次いで標識種が試料中を移動する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料中の検体の検出における、請求項１から７のいずれか一項に記載のアッセイキットまたは用具の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイ用具、それだけではないが特に側方流動アッセイ用具、および試料中の検体、それだけではないが特にハプテンの有無を検出する際のこの用具の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中のハプテンの有無および／または量を検出する側方流動イムノアッセイ用具は、欧州特許第２９１１９４号により開示されているように知られている。ハプテン種の大きさが小さいために、捕捉試薬がこの検体の２個の異なるエピトープに特異的に結合するサンドイッチ捕捉試薬式結合反応は、不可能である。代わりに、試料中の検体が、標識捕捉試薬を求めて、他の種、通常は同一の検体と競合する競合反応が採用される。通常、側方流動担体は、粒子状標識試薬を含む試薬帯と、試薬帯より下流にある固定化種を含む検出帯とを含んでいる。検体がない場合、標識試薬は検出帯に結合し、検出可能なシグナルを生じる。試薬帯より上流に通常添加される試料中に、検体がある場合、標識試薬は検体と選択的に結合することができ、したがって検出帯に結合できない。即ち、検出帯に生じるシグナルは、検体の濃度が増加するにつれて減少する。半定量的な○×式肉眼読み取り試験では、このような結果の表示は使用者に混乱や不確実さを生む恐れがある。この不確実さを避けるために、このようなイムノアッセイの製造業者は、結果の正負を示す像を各用具上で印刷することにより、使用者による結果の解釈を補助するまでになっている。例えば、ある種の誤用薬物を検出するためのこのようなアッセイの使用者は、通常は検査技師であろう。しかし、誤用薬物の使用が増加したために、訓練を受けていない個人によるこのような試験の使用が増加するに至っている。したがって、結果を容易に解釈できることが非常に重要である。
【０００３】
米国特許第５４５１５０４号および第５８７４２１６号は、検体の濃度が増加するにつれて検出帯に生じるシグナルが増加する、ハプテン検出のためのイムノアッセイ試験を開示している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
検体の濃度の増加と共に生成するシグナルが増加する、試料中の検体の存在を検出する代替／改良法を提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の態様によれば、本発明は、試料中の対象検体を検出するアッセイキットであり、
ａ）レポーター種、
ｂ）対象検体に結合できる第１の結合領域と、レポーター種に結合できる第２の結合領域とを有する標識種、
ｃ）標識種の第１の結合領域に結合できる固定化種、および
ｄ）レポーター種に結合できる固定化捕捉試薬
を含み、試料を標識種と接触させ、次いで固定化種と接触させ、その後固定化捕捉試薬と接触させるが、試料を固定化捕捉試薬と接触させる前にレポーター種を添加するような手順を取り、
試料中に検体が存在しない場合、標識種は固定化種と結合し、そのため固定化捕捉試薬と結合できず、試料中に検体が存在する場合、検体が標識種と結合することにより、標識種は固定化種と結合できないが、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合でき、したがって検体の存在が、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合する標識種の存在によって判定される、アッセイキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
固定化種は捕獲帯に供給してよく、固定化捕捉試薬は離れた検出帯に供給してよく、試料は捕獲帯から検出帯へ移動する。
【０００７】
標識種は、捕獲帯の上流にある試薬帯に供給してよい。試料を試薬帯に適用した後、標識種は、試料中を移動し、試料中の対象検体（存在する場合）と結合でき、更に捕獲帯に移動し、その後検出帯に移動できる。レポーター種、標識種、固定化種および固定化捕捉試薬は、基材上および／または基材中に供給してよく、この基材は側方流動担体であってよい。
【０００８】
レポーター種は可動性でよく、基材上の検出帯の上流に存在してよい。一実施形態では、レポーター種は試薬帯またはその上流に供給される。別の実施形態では、レポーター種は捕獲帯に供給される。
【０００９】
標識種の第１および第２の結合領域は、それぞれ対象検体およびレポーター種に特異的に結合できてよく、固定化種は標識種の第１の結合領域に特異的に結合できてよく、固定化捕捉試薬はレポーター種に特異的に結合できてよい。
【００１０】
第２の態様によれば、本発明は、
ａ）対象検体に特異的な第１の結合領域と、レポーター種に特異的な第２の結合領域とを有する可動性標識種を有する試薬帯、
ｂ）試薬帯にまたはその下流にあり、検出すべき固定化対象検体を含む捕獲帯、
ｃ）捕獲帯の下流にあり、レポーター種に特異的な固定化捕捉試薬を含む検出帯、および
ｄ）検出帯より上流にある可動性レポーター種
を含む側方流動担体イムノアッセイ用具を提供する。
【００１１】
第３の態様によれば、本発明は、試料中の対象検体の存在を検出する方法であり、
試料を、対象検体に結合できる第１の結合領域とレポーター種に結合できる第２の結合領域とを有する標識種とに接触させ、
試料を、標識種の第１の結合領域に結合できる固定化種に接触させ、
その後、試料を、レポーター種に結合できる固定化捕捉試薬に接触させる
ことを含み、試料を固定化捕捉試薬と接触させる前にレポーター種を添加し、試料中に検体が存在しない場合、標識種は固定化種と結合し、そのためレポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合できず、試料中に検体が存在する場合、検体が標識種と結合することにより、標識種は固定化種と結合できないが、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合でき、したがって検体の存在が、レポーター種を介して固定化捕捉試薬と結合する標識種の存在によって判定される、方法を提供する。
【００１２】
試料は、基材上に存在し、固定化種を有する捕獲帯と接触させ、その後、基材上の固定化捕捉試薬を有する検出帯に接触させてよい。
【００１３】
本発明の第３の態様の方法は、基材上の標識種を有する試薬帯に試料を接触させてもよい。標識種は、試料が試薬帯に接触するとき試料中を移動してよく、次いで、移動する標識種は、試料中の対象検体（存在する場合）と結合することができる。
【００１４】
本発明の第３の態様の方法は、対象検体を含んでいると疑われる試料を、可動性レポーター種、可動性標識種、固定化種および固定化捕捉試薬を含む基材に添加する１ステップを含んでよい。あるいは、レポーター種および／または標識種を試料に添加した後、基材に適用してもよい。
【００１５】
更なる態様によれば、本発明は、流体試料を側方流動担体に添加し、その際検体が存在すれば、可動性標識種と第１の結合複合体を形成する場合に、ハプテンを陽性に検出する方法を提供する。可動性標識種は、検体との複合体を形成する前または後に、レポーター種と特異的に結合反応し、その後レポーター種は検出帯中に浸透し、そこでレポーター種に特異的な固定化捕捉試薬によって捕捉される。次いで、検出帯中に存在する標識試薬を定量または可視化することにより、検体の存在を指示し得る。
【００１６】
検体が存在しない場合、可動性標識種はレポーター種と結合複合体を形成する。この複合体は、その後捕獲帯に捕捉され、そのため検出帯中に浸透することができない。
【００１７】
更なる態様によれば、本発明は、試料中の検体の検出において、本発明のアッセイキットまたは用具を使用する。
【００１８】
本発明は、生成するシグナルが試料中の検体濃度の増加に比例して増加する、試料中の検体を検出するアッセイキットまたは用具を提供する。試料は、流体、例えば被験体から採取した体液などの液体、または、固体から誘導した液体であってもよい。アッセイ用または他の試薬を用いて、固体から液体試料を誘導してもよい。
【００１９】
アッセイキットまたは用具は、試料の流動方向が、試薬帯（存在するならば）から捕獲帯へ、更に検出帯となるように、各帯を材料上に適当に配置した単一の連続的材料細片を含み得る。あるいは、アッセイ用具は、試薬帯、捕獲帯および検出帯の各々の確定した機能を実施するように設計された個々の区画、および各区画の生成物を次の区画に移動させる手段を含み得る。この各帯は、同一または異なる材料の個々の区分を指し得る。各区分は、試料が１つの区分から他の区分へ通過できるように、相互に一部または全部が重複してよい。可動性試薬は、放出特性が良好な（即ち、試薬が試料中に再懸濁され、材料沿いまたはその中を透過することを可能とする。）材料の１つまたは複数の区分に供給されてよいし、固定化試薬が、結合特性の良好な１つまたは複数の区分に供給されてよい。各区分は、使用前の処理により、結合および／または放出特性を増強または低減させてもよい。放出特性が良好な材料の一例はガラス繊維であり、結合特性の良好な材料の一例はニトロセルロースである。このような処理および材料は、欧州特許第２９１１９４号および欧州特許第３８３６１９号に記載されている。
【００２０】
本発明のある種の実施形態の側方流動担体は、ニトロセルロースなどの適当な多孔性担体から選択してよい。あるいは、試料が捕獲帯および検出帯を移動できるようにする、任意の適当な材料を使用してよい。その上、側方流動担体材料を強化用中実裏地材料で支持することにより、用具の取扱い強度を高めてもよい。また、担体は、複数の材料からなり、相互に流体で接触するように配置してもよい。
【００２１】
あるいは、側方流動担体は、１つまたは複数の毛管経路を有する微小流体担体でもよい。
【００２２】
あるいは、本発明のアッセイキットの基材は、固定化試薬と場合により可動性試薬とを含む、１つまたは一連の層またはカラムであってもよい。一実施形態では、固定化種および固定化捕捉試薬は、試料および標識種を固定化種と接触させた後、固定化捕捉試薬と接触させるように配置し、その場合レポーター種は、固定化捕捉試薬と接触させる前に添加する。
【００２３】
本発明のアッセイキットは、流体シンクおよび／または試料受容部材、更に、米国特許第６３５２８６２号で開示されているような、検出帯より下流にある対照帯も含み得る。したがって、本発明のアッセイキットの更なる実施形態では、このアッセイキットは、可動性で、固定化検体の上流にあってもよい対照マーカーと、固定化捕捉試薬の下流にあって、対照マーカーと結合できる固定化捕捉試薬を含む対照帯とを含んでいる。対照マーカーは試料と共に、捕獲帯および検出帯を透過して対照帯に到達でき得、この場合この対照マーカーは固定化捕捉試薬により結合される。対照帯における対照マーカーの検出によって、試料はアッセイキットを首尾よく透過し終えたことが確認され、したがって、試験が首尾よく完了したとの陽性シグナルを使用者に与える。標識種が対照マーカーとして機能してもよい。シグナルが、対照帯において任意の適切な方法で生成され得る。一実施形態では、対照帯は、対照マーカーの検出が検体の検出と識別できる限り、アッセイ用具の対照帯の上流の任意地点に存在し得る可動性対照マーカーの固定化受容体を含み得る。試料が、アッセイ用具に沿って捕獲帯および検出帯の中を移動するとき、可動性対照マーカーが一緒に搬送される。あるいは、対照帯は、流体試料が対照帯に到達したときに変色するように誘発される、固定化無水物質を含み得る。対照帯において陽性シグナルを与える更に別の方法を、本発明のアッセイ用具に含めてもよい。
【００２４】
本発明のアッセイキットまたは用具は、欧州特許第２９１１９４号で開示されているような、流体不透過性とし得る筐体を更に取り込み得る。
【００２５】
一実施形態では、通常用具の一端で試料と接触する側方流動イムノアッセイ用具が提供される。試料は、毛管作用により多孔性流動担体材料中を先ず試薬帯（存在する場合）へ、次いで捕獲帯へ、更に検出帯へと流動する。あるいは、試料は、重力、遠心力、撹拌などの他の力により、本発明のアッセイ用具の連続的各帯中を移動するように推進してもよい。
【００２６】
本発明のある種の実施形態の試薬帯は、対象検体に特異的な第１の結合領域と、レポーター種に特異的な第２の結合領域とを有する可動性標識種を含む。可動性標識種は、当業者に知られている幾つもの方法によって基材上の試薬帯に沈着させることにより、当該種を試料の添加前に試薬帯に固定した状態にし得る。試料を添加すると、この可動性種は移動性となり、基材のその他の各帯を通るように試料によって搬送される。可動性標識種は、試料内を自由に移動でき、レポーター種および検体（試料中に存在する場合）の両者と相互作用し、結合することができる。
【００２７】
可動性レポーター種は、試薬帯内に存在してもよい。当業者に知られている方法によって、知られている濃度のレポーター種を本発明の基材に適用し得る。ある種の実施形態では、レポーター種は、それ故に、試料の適用前に基材中または基材上に存在し、試料を基材に適用することにより移動する。レポーター種は、対象試料中に未だ存在していないと思われる種から選択し得る。一実施形態では、レポーター種は、対象検体の結合事象を妨害しないように選択される。同様に、対象検体は、検出帯における結合事象を妨害し得ない。本発明の一実施形態では、レポーター種は卵白アルブミン−ＦＩＴＣコンジュゲートである。
【００２８】
標識種の第１および第２の結合領域は、対象検体およびレポーター種にそれぞれ特異的であるが、他の検体に対してはわずかしかまたは全く特異性を示さない（バックグランドを超える程に検出できないように）。これらの結合領域は、意図する標的分子とは特異的に結合でき、その他の分子とは検出できる程度に結合できない任意の分子を含んでよい。レポーター種がハプテンなどの単一エピトープ部位を有する種である場合、レポーター種は、それ自体はアッセイを妨害しないＢＳＡや卵白アルブミンなどの担体とコンジュゲート形成し得る。レポーター種は、当業者に知られている標準的なコンジュゲート法を用いて、適当な担体分子とコンジュゲート形成し得る。
【００２９】
レポーター種がより大きく、同種または異種の異なるエピトープ部位で結合反応を起こすことができる場合、レポーター種は、必ずしも担体にコンジュゲート形成させずに使用し得る。
【００３０】
標識種の各結合領域は、対象種と特異的に結合し、特異的な結合対を形成できる、特異的な結合領域であってよい。特異的な結合対の例には、抗原がペプチド配列、ヌクレオチドまたはペプチドの相補配列であり得る抗体および抗原、ポリマー性の酸および塩基、色素およびタンパク質結合剤、ペプチドおよび特異的タンパク質結合剤、酵素および補因子、ならびにエフェクターおよび受容体分子が挙げられ、ここで、受容体という用語は、ある分子の特定配向または極性配向、即ちエピトープ部位または決定基部位を認識できる任意の化合物または組成物を指す。
【００３１】
抗体を指し示すものには、これらに限らないが、ポリクローナル、モノクローナル、二重特異性、ヒト化およびキメラの各抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片およびＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生する断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記いずれかのエピトープ結合性断片が挙げられる。抗体の部分にはＦｖおよびＦｖ’の部分が含まれる。Ｆｖ部分は修飾して、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）として知られている合成構築体を生成することができる。これには、Ｖｈ領域およびＶｌ領域を共有結合し、分子の安定性に寄与するペプチドリンカーが含まれる。抗体は、天然の抗体、例えば、ＫｏｅｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの方法で得られるモノクローナル抗体、および例えば抗原の動物中への注入により得られるポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、一部または完全にヒト化することもできる。使用できる他の合成構築体には、相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。これらは、抗原結合性決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド模倣物質も使用し得る。これらの分子は、普通、ＣＤＲループの構造を模倣し、抗原相互作用性の側鎖を含んだ、立体配座上制約のある有機の環である。
【００３２】
対象検体およびレポーター種の双方に結合できる標識種は、例えば、検体または検体類縁体に特異性を示す第１の特異的結合剤と、レポーター種に特異性を示す第２の特異的結合剤で共感作される、粒子状の直接標識の場合がある。共感作種の例は、欧州特許第８３３１５７号に開示されている。あるいは、可動性標識種は、検体およびレポーター種に特異的な２つの結合領域を有する、標識された二重特異性捕捉種の場合もある。二重特異性捕捉試薬の例は、欧州特許第９６２７７１号に示されている。
【００３３】
この標識は、適切ななんらかの物質でよく、金属ゾル、例えば金ゾルなどの粒子状の直接標識、または、蛍光色素を含む適切な色素を担持した、例えばポリウレタンもしくはラテックスなどの有機粒子であり得る。この標識は、検出し、定量できる任意の適切な標識であり得る。適切な標識の追加例には、カーボンブラックなどの粒子、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの反応して着色反応生成物を生成できる酵素、生物発光、化学発光、燐光、蛍光などの検出光を生成できる分子、または当業者に知られている他の任意の標識が含まれる。
【００３４】
試薬帯を含むような実施形態において、本発明の捕獲帯は、試料の流動方向に対して試薬帯の下流にあってよい。捕獲帯は、アッセイ用具の基材に固定的に結合していてよい固定化種を含み、この固定化種は、試料中の対象検体に未だ結合していない第１の結合領域を有する任意の標識種に結合する。こうして、捕獲帯は、試料中の対象検体に結合していない任意の標識種が検出帯に進行するのを防止し、したがって疑陽性の結果が発生するのを防止する（流体試料中に対象検体が実際には存在しないときの、検出帯におけるシグナルの生成）。試料中の対象検体に結合した（しかも、レポーター種にも結合すると思われる。）任意の標識種は、捕獲帯を通過し、検出帯に進行するであろう。したがって、捕獲帯における結合部位を争う、検体と標識種との競合反応は起こらずに、試料中に存在する任意の検体は、標識種の検出帯への進行を直接起こすであろう。
【００３５】
固定化種は、対象検体またはこの類縁体であり得る。対象検体の類縁体には、関連種の動物が存在する場合、このような動物由来の類縁分子、または検体の構造を模倣するように合成した分子、あるいは検体の特定の結合領域が含まれる。
【００３６】
固定化種は、基材の捕獲帯に、当業者に知られている任意の手段によって結合させ得る。固定化種は、直接結合していてよいし、または捕獲帯に分子自体が固定化している支持分子に結合していてよい。あるいは、固定化種は、流動担体材料と流体接触を保っている、中実プラスチックシートなどの支持材料上に固定化していてよい。あるいは、固定化種は、用具中を移動するときの試料と接触しているアッセイ材料の表面に結合していてよい。例えば、イムノアッセイ用具が微小流体用具のとき、固定化種は、用具内を通して試料を搬送する毛管経路の内表面に結合していてよい。
【００３７】
実際上は、捕獲帯の捕捉効率は１００％に満たないから、したがって、流体試料中に検体が存在しない場合でも、レポーター種−標識試薬結合複合体は全てが捕獲帯に必ずしも捕捉されず、そのために検出帯中に透過するであろう。しかし、疑陽性の出現を避けるために、アッセイ用具中に存在するレポーター種の量を、検体を含まない試料を用具に添加したときは標識試薬が検出帯で認められないような程度に選択し得る。レポーター種の添加量は、側方流動担体の種類およびその処理法に応じて変更してよい。最適量は、ごく普通の実験によって極めて容易に決定される。検出帯は、試料の流動方向に関して捕獲帯より下流にあってよく、レポーター種を結合できる固定化捕捉試薬を含んでよい。固定化捕捉試薬をレポーター種に結合し、したがってレポーター種が標識種に結合しているときだけ、標識種を固定化し得る。したがって、試料中に存在する検体が標識種に結合し、標識種がレポーター種も結合し、次いでレポーター種が検出帯に結合する場合だけ、陽性シグナルが検出帯に生成する。試料中に検体が存在しない場合、レポーター種はやはり検出帯へ進行し、そこで固定化捕捉試薬と結合するが、検出帯からの標識種が存在しないためにシグナルは生成しない。
【００３８】
本発明の一実施形態では、アッセイ用具は捕獲帯および検出帯を含む。用具に試料を添加する前に、対象検体に結合できる第１の結合領域とレポーター種に結合できる第２の結合領域とを有する標識種、および場合によりレポーター種を含む適切な緩衝液と共に、試料を混合し得る。この溶液は、検体、標識種、およびレポーター種の間で起こり得る結合性相互作用に対する妨害を防止するために、適当に緩衝させ得る。試料を緩衝液と適当な時間混合することにより、試料中の検体（存在する場合）、標識種およびレポーター種の間で何らかの結合反応が起こり得る。混合後、捕獲帯の上流にある一点で試料をアッセイ用具に添加してもよい。その後、試料は、前記した任意の手段によって先ず捕獲帯、次いで検出帯を通過する。したがって、検体、標識種およびレポーター種の間の初期結合性相互作用は、試料をアッセイ用具に添加する前に起こり得る。
【００３９】
対象検体は、標識種の第１の結合領域との結合事象を受けることのできる任意の種から選択され得る。本発明によるアッセイ用具は、ハプテンなどの低分子を含む検体の検出に適している。ハプテンは、担体と結合して初めて免疫応答を誘発できる低分子抗原決定基と定義してよい。ハプテンは抗体と結合し得るが、例えばハプテンを動物体内に注入することによって、それ自体は抗体の応答を誘発することはできない。ハプテンの非限定的な例には、ＭＤＡ（３，４−メチレンジオキシアンフェタミン）、「エクスタシー」の名でも知られているＭＤＭＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−メチルアンフェタミン）、ＭＤＥＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−エチルアンフェタミン）、ＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−２−ブタナミン）、ＭＢＤＢ（３，４−メチレンジオキシフェニル−Ｎ−メチルブタナミン）、ＭＤＰＡ（３，４−メチレンジオキシ−Ｎ−プロピルアンフェタミン）などのアンフェタミン系誤用薬物；モルヒネ、コデインなどのアヘン剤、ならびにヘロイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、オキシコドン、オキシモルフォンを含む合成類縁体；リセルグ酸ジエチルアミド（ＬＳＤ）ならびにその代謝産物；テトラヒドロカンナビノールおよびコカイン；ジアゼパム、ニコチン、アセトアミノフェン、カフェイン、リスペリドン、フェノバルビタールなどの毒性薬物；プロゲステロン、エストラジオールとその代謝産物、テストステロンなどのホルモン；農薬；フルオレッセインイソチオシアネート、テキサスレッドなどの色素などが含まれる。
【００４０】
本発明において、「体液」という用語は、例えば血液、血漿、尿、リンパ液、胃液、胆汁、血清、唾液、汗、間質液、ならびに髄液および脳液を含めた、哺乳動物体から得ることのできる全ての液体を含む。対象検体に応じて、工業、環境または農業が起源のものなどの他の流体および液体試料も想定し得る。更に、体液は処理したもの（例えば、血清）、未処理のもののいずれでもよい。対象検体を得るため、および／または放出させるために、必要なら試料を予備処理してよく、対象検体を含む液体試料を産生するための処理法に固体試料の処理を含み得る。被験体から体液試料を得る方法は、当業者に知られている。
【００４１】
本発明の各態様の好ましい特徴は、必要な変更を加えれば他の態様の各々にも当てはまる。本明細書に述べた先行技術の文書は、法律の許す限り完全に組み込まれる。
【実施例】
【００４２】
本発明の特徴および利点は、次の実施例を参照することによってより十分に理解し得、次の実施例は本発明の特定の一実施形態に過ぎず、本発明は以下に記載の特定の実施形態の特定の特徴に限られると見なすべきでないことを認識されたい。添付の図面を参照する。
【００４３】
実施例では、抗精神病薬リスペリドンに対する陽性読み取りハプテンアッセイについて記載する。この実施例では、レポーター種は卵白アルブミン担体とコンジュゲート形成したＦＩＴＣ（フルオレッセイン−５−イソチオシアネート、異性体１）である。様々な実験を行って、抗ＦＩＴＣ抗体がリスペリドンに結合せず、抗リスペリドン抗体がＦＩＴＣに有意な結合をしないことを確認した。図１には、陽性試料および陰性試料を試験したときの結果を含む、例示したハプテンアッセイの概略図を示す。
【００４４】
抗ＦＩＴＣ抗体
Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｃ．Ｃｏｎｃｏｒｄ  ＭＡ，ＵＳＡ（クローンＭ２５２８５、Ｍ２５２８６、Ｍ４９２０９）の供給品。予備スクリーニング後、クローンＭ２５２８６をこれらの実験に使用するために選択した。
【００４５】
卵白アルブミン−ＦＩＴＣコンジュゲートの調製
ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ）１０ｍｇをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）１ｍｌと混合した。卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）をｐＨ９．３の５０ｍＭ炭酸塩緩衝液中５ｍｇ／ｍｌに調製した。一連の反応比の卵白アルブミン対ＦＩＴＣを調製した（１：１０から１：４０までの範囲）。反応混合物をホイルに包んで室温で終夜放置し、翌朝ゲルろ過により精製した（リン酸緩衝塩水ＰＢＳＡで平衡化したＰＤ１０カラム）。コンジュゲートは全てＰＢＳＡ中１：１００に希釈し、ＵＶ／可視走査により特性を決定した。卵白アルブミン対ＦＩＴＣの導入比、１：２．５、１：３．９、１：３．８および１：２．６が生成した。導入比１：３．９のコンジュゲートＯＢＢ０２をこれらの実験に使用するために選択した。
【００４６】
卵白アルブミン−リスペリドンコンジュゲートの調製
リスペリドン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｇｍａ）および１−エチル−３（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ）のストック溶液を乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（ＲＯＭＩＬ）中で調製した。卵白アルブミン（Ｓｉｇｍａ）の溶液をｐＨ７の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中で調製した。
【００４７】
リスペリドン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび１−エチル−３（３ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドＨＣｌの活性化混合物（１：１：１の比）を装飾ガラス容器中で調製し、室温で約２時間振とうした。上記活性化混合物を卵白アルブミン溶液に滴下して加え、磁気撹拌器上で室温、終夜撹拌した。上記各試薬の量は、反応比２５：１（リスペリドン対卵白アルブミン）となるように選択した。この比は、コンジュゲート化効率を高めながら沈殿する可能性を下げるために選択した。
【００４８】
翌朝、コンジュゲートをＰＤ１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。カラムに入れた後、コンジュゲートをｐＨ７のリン酸緩衝塩水（＋ナトリウムアジド）（Ｓｉｇｍａ）中で溶出した。ＨＰＬＣでコンジュゲートの特性を決定した結果、導入比は６．８：１（リスペリドン対卵白アルブミン）であった。
【００４９】
側方流動担体の調製
欧州特許第２９１１９４号により開示された方法に従って、計量ポンプに繋いだペンおよびシリンジを用いて、各試薬をＭｙｌａｒ裏張りニトロセルロース膜（８μｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、コードＣ１０８８８−１）上に投与した。卵白アルブミン−リスペリドンコンジュゲート（リスペリドン００９、２．３９ｍｇ／ｍｌ）の３帯域をその膜に調製した。第１帯域は試験細片の基部から８．５ｍｍの位置にとり、その後の帯域はこの位置から下流に１．５ｍｍ離した。抗ＦＩＴＣクローンＭ２５２８６（２．５ｍｇ／ｍｌ）を細片基部から１６ｍｍに単一帯域（観察帯域）として付着させた。付着させた後、膜を５５℃で５分乾燥し、１％（ｗ／ｖ）ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）（Ａｉｒｖｏｌ  ９Ｋ  １８０３４００４）＋３％（ｗ／ｖ）蔗糖（ＢＤＨ  Ａｎａｌａｒ  Ｋ３０１３９０８６２３６）中でブロックした。膜が飽和するまで、膜を通してブロッキング溶液をクロマトグラフィーで展開した。飽和した後、膜を７５℃で５分乾燥した。
【００５０】
抗リスペリドンおよび抗ＦＩＴＣ中でコーティングしたラテックス粒子の調製
Ｄｕｋｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの青色ラテックス（ＣＢ１６１５）（直径４００ｎｍ）を、抗リスペリドン（１００μｇ／ｍｌ、クローン６３５２：１）および抗ＦＩＴＣ（２５μｇ／ｍｌ、クローンＭ２５２８６）を含む混合物中、固形分０．５％（ｗ／ｖ）でコーティングした。室温で６０分インキュベーションした後、ラテックス粒子を２０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｔｙｐｅ  Ｈ７  Ｎ２１２０７）中、室温で３０分ブロックした。調製した後、粒子を洗浄し、乾燥用緩衝液中に交換した（６．５％ＢＳＡおよび２０％蔗糖（ｗ／ｖ）を含むｐＨ８．５の１００ｍＭホウ酸塩）。
【００５１】
Ｗｈａｔｍａｎガラス繊維材料上への試薬の付着
抗リスペリドンおよび抗ＦＩＴＣ中でコーティングした上記のラテックス粒子をＷｈａｔｍａｎガラス繊維担体材料上に単一線として付着させた（乾燥用緩衝液中）。担体上に線としてラテックスを付着させるために、Ｘ−Ｙプロッターに繋いだＨａｍｉｌｔｏｎ製シリンジおよびポンプを使用した（０．２３μｌ／ｍｍ）。更に、卵白アルブミン−ＦＩＴＣコンジュゲートＯＢＢＯ２を乾燥用緩衝液中で１：２０の希釈率で調製し、Ｈａｍｉｌｔｏｎ製ポンプおよびシリンジによって、同じガラス繊維材料上に別の線として付着させた（０．２３μｌ／ｍｍ）。卵白アルブミン−リスペリドンコンジュゲートならびに抗ＦＩＴＣ検出帯を含んだニトロセルロース膜に、Ｗｈａｔｍａｎガラス繊維材料を積層によって結合し、図２に示すようなアッセイ用具を作製した。
【００５２】
用具の試験
リスペリドン陰性の貯留尿中に希釈することによって、１．１８ｍｇ／ｍｌのリスペリドンストック液からリスペリドン各標準液を調製した。形成したアッセイ用具は、Ｗｈａｔｍａｎガラス繊維の約３ｍｍが貯留リスペリドン標準液中に保持できるように、プラスチック容器中に配置した。該用具は、上記に調製したリスペリドン標準液の各３００μｌ分量中に室温で５分間垂直に保持した。
【００５３】
５分経過後、該用具を室温で乾燥した。検出帯のシグナル強度は、Ｐｅｒｓｏｎａ（商標）モニター（Ｕｎｉｐａｔｈ  Ｌｔｄ．から販売）を用いて光学的に定量した。
【００５４】
様々な患者試料を試験して、その結果を図３に示す。
【００５５】
図４は、尿リスペリドン各標準液を用いた試験後の様々なアッセイ用具細片を示す。これらの試験細片は、尿中のリスペリドン濃度が増加するにつれて、卵白アルブミン−リスペリドンコンジュゲートの帯域上でシグナルが減殺する様子を明確に示している。それとは反対に、検出帯のシグナル強度は、リスペリドン濃度が増加するにつれて増加し、陽性応答を起こす。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】陰性試料および陽性試料を試験したときのアッセイ結果の図示を含む、リスペリドンの検出のために設計した本発明による一アッセイを示す図である。
【図２】ニトロセルロース膜の細片に積層して結合したＷｈａｔｍａｎガラス繊維材料の薄片を含む、本発明のアッセイ用具を示す図である。
【図３】リスペリドン標準液の測定値と比較した、リスペリドンの存在を試験する患者試料の結果を示す図である。
【図４】リスペリドン標準液で試験した後の本発明による様々なアッセイ用具を示す図である。
【図１】
2007514157.tif 000003
【図２】
2007514157.tif 000004
【図３】
2007514157.tif 000005
【図４】
2007514157.tif 000006
【国際調査報告】
2007514157.tif 000007
2007514157.tif 000008