(57)【要約】  リファレンスコントロール組成物、及び使用方法が、有核赤血球の測定のために開示され、これは、水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する合成球状粒子の１つのセットを含む。当該合成球状粒子は、光学測定により測定される場合有核摂家急の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。当該リファレンスコントロール組成物は、更に、白血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する合成球状粒子の第二セットを含んでよい。更なる開示は、それぞれ、特定の細胞成熟度を有する有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する１種類の合成球状粒子量を有する一連のリファレンスコントロール組成物を含む、リファレンスコントロールシステムである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの範囲の平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する、１種類の合成球状粒子量を含んで成る有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロール組成物であって、ここで上記合成球状粒子が、光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有するリファレンスコントロール組成物。
【請求項２】
更に、白血球成分を含んで成る、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項３】
更に、赤血球成分及び血小板成分を含んで成る、請求項２に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項４】
更に、網状赤血球成分を含んで成る、請求項３に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項５】
前記合成球状粒子が、特定の細胞成熟度を有する有核赤血球の前記光学特性をシミュレートとする、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項６】
前記合成球状粒子が、約１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子である、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項７】
前記光学測定が、低角度光散乱測定及び軸上光損失測定、又は２つの低角度光散乱測定である、請求項１に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項８】
一連のリファレンスコントロール組成物を含んで成る有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロールシステムであって、各リファレンスコントロール組成物が、水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの範囲の平均粒径、及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する、１種類の合成球状粒子量を含んで成り；各種の合成粒子が、光学測定により測定される場合、特定の細胞成熟度を有する有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する、リファレンスコントロールシステム。
【請求項９】
前記各一連のリファレンスコントロール組成物が、更に、白血球成分を含んで成る、請求項８に記載のリファレンスコントロールシステム。
【請求項１０】
前記各一連のリファレンスコントロール組成物が、更に、赤血球成分及び血小板成分を含んで成る、請求項９に記載のリファレンスコントロールシステム。
【請求項１１】
前記各一連のリファレンスコントロール組成物が、更に、網状赤血球成分を含んで成る、請求項１０に記載のリファレンスコントロールシステム。
【請求項１２】
前記合成球状粒子が、約１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子である、請求項８に記載のリファレンスコントロールシステム。
【請求項１３】
前記光学測定が、低角度光散乱測定及び軸上光損失測定、又は２つの低角度光散乱測定である、請求項８に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項１４】
水性懸濁培地中で単分散される、約６μｍ〜約１２μｍの範囲の平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する合成球状粒子の少なくとも２つのセットを含んで成る有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロール組成物であって、ここで上記合成球状粒子の第一のセットが、光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有し、そして上記合成球状粒子の第二のセットが、上記光学測定により測定される場合、白血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する、リファレンスコントロール組成物。
【請求項１５】
更に、赤血球成分及び血小板成分を含んで成る、請求項１４に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項１６】
前記第一セットの合成球状粒子が、１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子である、請求項１４に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項１７】
前記第二セットの合成球状粒子が、ポリスチレン粒子、又はカルボキシル化ポリスチレン粒子である、請求項１４に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項１８】
前記光学測定が、低角度光散乱測定及び軸上光損失測定、又は２つの低角度光散乱測定である、請求項１４に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項１９】
水性懸濁培地中で単分散される、約６μｍ〜約１２μｍの範囲の平均粒径、及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する合成球状粒子の複数のセットを含んで成る有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロール組成物であって、ここで上記合成球状粒子の第一のセットが、光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有し、そして合成球状粒子の少なくとも２つのセットが、上記光学測定により測定される場合、少なくとも２つの白血球の亜集団の光学特性をシミュレートする光学特性を有する、リファレンスコントロール組成物。
【請求項２０】
更に、赤血球成分及び血小板成分を含んで成る、請求項１９に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項２１】
前記光学測定が、低角度光散乱測定及び軸上光損失測定、又は２つの低角度光散乱測定である、請求項１９に記載のリファレンスコントロール組成物。
【請求項２２】
（ａ）リファレンスコントロール組成物を、光学測定により有核赤血球を測定することができるフローサイトメトリー機器に供する工程であって、上記リファレンスコントロール組成物が、水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの範囲の平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する、一種類の合成球状粒子量を含んで成り、ここで上記合成球状粒子が光学測定により測定される有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する工程；
（ｂ）上記光学測定によりフォーカスされたフローセル中のリファレンスコントロール組成物を分析する工程；及び、
（ｃ）上記リファレンスコントロール組成物の有核赤血球の数をレポートする工程、
を含んで成る、有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロール組成物を使用する方法。
【請求項２３】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中に白血球成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、上記リファレンスコントロール組成物の白血球を分析し、そしてレポートすることを含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中で分散される赤血球成分及び血小板成分を含んで成り、そして、前記方法が、更に、前記リファレンスコントロール組成物の赤血球及び血小板を分析すること、そしてレポートすることを含んで成る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記光学測定が、低角度光散乱測定及び軸上光損失分析である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記光学測定が２つの低角度光散乱測定である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）リファレンスコントロール組成物を、光学測定により有核赤血球を測定することができるフローサイトメトリー機器に供する工程であって、上記リファレンスコントロール組成物が、水性懸濁培地中で単分散される、約６μｍ〜約１２μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する複数の合成球状粒子量を含んで成り、ここで上記合成球状粒子の第一セットが光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有し、そして上記合成球状粒子の第二セットが上記光学測定により測定される場合白血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する工程；
（ｂ）上記光学測定によりフォーカスされたフローセル中のリファレンスコントロール組成物を分析する工程；及び、
（ｃ）上記合成球状粒子の上記第一セットと上記第二セットを区別し、そして上記リファレンスコントロール組成物の有核赤血球の数及び白血球の数をレポートする工程、
を含んで成る、有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロール組成物を使用する方法。
【請求項２８】
前記リファレンスコントロール組成物が、更に、前記懸濁培地中で分散される赤血球成分及び血小板成分を含んで成り、そして前記方法が、更に、前記リファレンスコントロール組成物の赤血球及び血小板を分析し、そしてレポートすることを含んで成る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記光学測定が、低角度光散乱測定及び軸上光損失測定である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記光学測定が、２つの低角度光散乱測定である、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液サンプルの有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロール組成物に関する。より具体的には、当該リファレンスコントロール組成物は、光学測定により測定される場合有核赤血球をシミュレートする光学特性を有する合成球状粒子を含んで成る。
【０００２】
本願は、その全体における参考例として本明細書に組み入れられている、２００３年１０月２日に出願された仮特許出願第６０／５０８，１６１号の３５  ＵＳＣ  １１９（ｅ）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００３】
フローサイトメトリー機器は、一般的に、フォーカスされたフローセルを通過する粒子の分析のための光学シグナルに依存する。通常、較正、及び／又は機器の操作状態を確認するためのリファレンスコントロール製品の分析は、正確且つ信頼のあるアッセイ結果を保証するために、粒子の分析を行う前に必要とされる。
【０００４】
クオリティーコントロールは、臨床的な血液学において、長い間必要とされ、そして慣習的な手順であった。多様な種類の血球の計数における精度は、部分的に、適当なコントロール製品の使用、及び当該コントロール製品の使用方法に依存する。機器の誤動作の可能性が存在することから、現在入手可能な多くの種類の粒子計数用の機器でコントロール製品の使用のために、クオリティーコントロールが必要とされる。
【０００５】
自動粒子計数機器のためのクオリティーコントロールプログラムを維持する伝統的な方法は、全血液スタンダードとして新鮮なヒトの血液を供することから成っている。しかしながら、当該新鮮な血液は１日しか使用可能ではなく、このため製品のより長い有効期間を有する、多様な製造されたコントロール製品が開発されてきた。
【０００６】
コントロール製品において一般的に使用される粒子は、分析を行うことが意図される粒子又は細胞の種類をシミュレート又は近似する。結果的に、これらの粒子は類似粒子として、しばしば適用されてきた。これらの類似粒子は、機器において分析されるこれらの粒子又は細胞に類似する特定の特性を有するように選択又は作製されるべきである。代表的な特性及びパラメーターは、大きさ、容積、表面特性、粒度特性、光散乱特性、及び蛍光特性における類似性を含む。
【０００７】
現在、ヒト血液細胞の類似物として多様な処理又は固定されたヒト又は動物血液細胞を使用する多様な商業的リファレンスコントロール製品が入手可能である。米国特許第５，５１２，４８５号（Young, et al)は、処理及び固定された動物赤血球から作製された、いくつかの白血球類似体を含んで成る血液学的なコントロールを教示する。米国特許第６，１８７，５９０号及び第５，８５８，７９０号（Kim, et al)は、溶解及び固定されたトリ又はサカナ赤血球から作製された有核赤血球（ＮＲＢＣ）類似体を含んで成る血液学的なコントロールを教示する。米国特許第６，４０６，９１５号、第６，４０３，３７７号、第６，３９９，３８８号、第６，２２１，６６８号、及び６，２００，５００号（Ryan, et al)は、トリ血液細胞由来のＮＲＢＣ類似体を含んで成る血液学的なコントロールを教示する。米国特許第６，４４８，０８５号（Wang, et al)は、ニワトリ血液由来の有核赤血球（ＮＲＢＣ）類似体及び有核赤血球を伴う固定ヒト血液を含んで成る血液学的なコントロールを教示する。これらの先行技術は、有核赤血球のステージングの測定を促進するためのコントロール物質の細胞サイズ、及び蛍光強度の測定を教示する。米国特許第６，６５３，１３７号、及び第６，７２３，５６３号（Ryan)は、爬虫類又はサカナ血球から細胞質を溶解させ、そして除去することにより作製される有核赤血球成分を含む血液学的なリファレンスコントロールの作製及び使用方法を教示する。
【０００８】
コントロール目的のための血球類似体の使用に加えて、合成微粒子もまた、フローサイトメトリーのコントロール製品において使用されてきた。より具体的には、米国特許第６，０７４，８７９号（Zelmanovic, et al)は、粒子分析のためのフローサイトメトリー機器を較正及び標準化するための合成球状粒子を使用する方法を教示する。当該先行技術は、具体的に、アッセイされる粒子又は細胞の、本質的に再生産可能な平均粒径及び屈折率を有する粒子の使用を教示する。米国特許第６，５２１，７２９号(Zelmanovic, et al)は、更に、血液学的な較正、並びに約５〜５．５μｍの平均粒径及び約１．４の屈折率の有するフッ素含有球状粒子を含んで成るリファレンスコントロールを開示する。
【０００９】
一方、フローサイトメトリー機器における血液サンプル中の有核赤血球を測定するためのいくつかの検出方法が報告されている。米国特許第５，８７９，９００号(Kim, et al)は、溶解条件下において血液サンプルの散乱光の２つの低角度及び蛍光シグナルを測定することによる有核赤血球を区別する方法を教示する。米国特許第５，８７４，３１０号及び第５，９１７，５８４号(Li, et al)は、溶解条件下において血液サンプルの光散乱シグナルの２つの角度を測定することによる有核赤血球を区別する方法を教示する。
【００１０】
現在、先行技術により教示された有核赤血球のためのリファレンスコントロールは、有核赤血球類似粒子として、安定化された、処理された、又は固定された血球の使用に制限されている。コントロール製品のためのこれらの血球を製造するためのプロセスは、複雑で高価であることが知られており、類似粒子は、安定性が制限され、そしてロット間の多様性に影響される。
【００１１】
このため、リファレンスコントロール組成物において、有核赤血球類似体として合成粒子を使用することが所望され、ここで当該合成粒子は、特定の反応及び検出条件下における有核赤血球個体群の特性をシミュレートする。
【発明の開示】
【００１２】
ある態様において、本発明は、水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する１種類の合成球状粒子量を含んで成る有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロール組成物に関する。当該合成球状粒子は、光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。より具体的には、当該合成球状粒子は、約１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子である。当該光学測定は、低角度光散乱測定（low angle light scatter measurement) 及び軸上光損失測定（axial light loss measurement）、又は２つの低角度光散乱測定である。
【００１３】
リファレンスコントロール組成物は、更に、白血球成分、赤血球成分、血小板成分、及び網状赤血球成分を含んで成ってよい。
【００１４】
更なる態様において、本発明は、有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロールシステムに関する。当該リファレンスコントロールシステムは、一連のリファレンスコントロール組成物を含んで成り、そのそれぞれは、水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する１種類の合成球状粒子量を含んで成る。各種類の合成球状粒子は、特定の細胞成熟度を有する有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。
【００１５】
他の態様において、本発明は、水性懸濁培地中で単分散される、約６μｍ〜約１２μｍの範囲の平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する合成球状粒子の２つのセットを含んで成るリファレンスコントロール組成物に関する。当該合成球状粒子の第一のセットは光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。当該合成球状粒子の第二のセットは、同じ条件下で白血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。当該合成球状粒子の第一のセットは約１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子であり、そして当該合成球状粒子の第二のセットは、ポリスチレン粒子、又はカルボキシル化ポリスチレン粒子であってよい。
【００１６】
より更なる態様において、上記リファレンスコントロール組成物は、少なくとも２つの白血球亜集団の光学特性をシミュレートする光学特性を有する合成球状粒子の２つのセットを含んでよい。当該リファレンスコントロール組成物は、有核赤血球の測定、及び白血球亜集団の区別のために使用することができる。
【００１７】
更なる観点において、本発明は、有核血液細胞の測定のためのリファレンスコントロールを使用する方法に関する。当該方法は：リファレンスコントロール組成物を、光学測定により有核赤血球を測定することができるフローサイトメトリー機器に供する工程であって、当該リファレンスコントロール組成物が、水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する１種類の合成球状粒子量を含んで成り；ここで当該合成球状粒子が光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する工程；光学分析によりフォーカスされたフローセル中のリファレンスコントロール組成物を分析する工程：及び当該リファレンスコントロール組成物の有核赤血球の数をレポートする工程を含んで成る。
【００１８】
更に、上記リファレンスコントロール組成物は、白血球成分、赤血球成分、血小板成分、及び網状赤血球成分を含んで成ってよく；そして当該方法は更に、白血球、赤血球、血小板、及び網状赤血球を分析し、そしてレポートすることを含んで成ってよい。
【００１９】
他の態様において、上記方法は、水性懸濁培地中で単分散される、約６μｍ〜約１２μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する合成球状粒子の複数のセットを含んで成るリファレンスコントロール組成物であって、ここで当該合成球状粒子の第一のセットが光学測定により測定される場合、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有し、そして合成球状粒子の第二のセットが白血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する、リファレンスコントロール組成物を供する工程；当該光学測定によりフォーカスされたフローセル中のリファレンスコントロール組成物を分析する工程；及び当該リファレンスコントロール組成物の有核赤血球の数及び白血球の数をレポートする工程を含んで成る。
【００２０】
発明の詳細な説明
ある態様において、本発明は、フローサイトメトリー機器において有核赤血球を測定するためのリファレンスコントロール組成物を供する。当該リファレンスコントロール組成物は、水性懸濁培地中で単分散される、約６．２μｍ〜約６．８μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する１種類の合成球状粒子量を含んで成る。当該合成球状粒子は、光学測定により測定される場合、有核赤血球（ＮＲＢＣ）の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。当該リファレンスコントロール組成物は、光学測定による有核赤血球の測定のためのコントロールとして使用することができる。本明細書において、「１種類の合成球状粒子」のフレーズは、個々の粒子が同じ物質から作成され、そして、誤差範囲内において、同じ粒径及び屈折率を有することを意味する。
【００２１】
更なる態様において、上記リファレンスコントロール組成物は、水性懸濁培地中で単分散される、約６μｍ〜約１２μｍの平均粒径及び約１．５８〜約１．６２の屈折率を有する合成球状粒子の複数のセットを含んで成る。当該合成球状の第一のセットは、光学測定により測定される場合、血液溶解条件下において、有核赤血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。当該合成球状粒子の第二のセットは、同じ条件下で白血球の光学特性をシミュレートする光学特性を有する。本明細書において、「合成球状粒子のセット」のフレーズは１種類の合成球状粒子量を意味し、ここで個々の粒子は誤差範囲内において、同じ粒径及び屈折率を有する。
【００２２】
本発明の目的のための有核赤血球の測定のための光学測定は、（ａ）低角度光散乱測定及び軸上光損失測定、又は（ｂ）２つの低角度光散乱測定であってよい。本明細書において使用される「低角度光散乱測定」のフレーズは、入射光から１０°未満の角度における光散乱シグナルの測定を意味する。軸上光損失（Axial light loss)（ＡＬＬ、前方吸光（forward extinction)としても知られる）は、一般的に、レーザー光線の前方に通過する粒子又は細胞により光エネルギーが損失することであり、光ダイオードにより検出される。当該光損失は、一般的に、散乱及び吸収が原因であり、そして光ビームを通して（一般的に、ＡＬＬは、約０°〜約１°の角度において検出される）粒子又は細胞の通過により光ビームの進路における検出器に達する光エネルギーが損失するものとして定義される。好ましい態様において、ＡＬＬシグナルは、入射光軸から約０．５°未満のサーキュラーエリアにおいて得られる。ＡＬＬは粒子サイズに強く影響される。
【００２３】
血液サンプル中の有核赤血球の測定に使用される機器は、改変Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬTM  フローサイトメーターとした。当該実験のフローサイトメトリー機は、低角散乱光、例えば、１．９°、３．０°、３．７°、及び軸上光損失を含む、多様な角度において光散乱測定を可能にする光学検出器を装備した。フローセルの開口の寸法は２５０μｍ又は５０μｍとすることができる。血液サンプルを希釈し、そして赤血球を溶解するために等張性血液希釈液及び溶解試薬を使用した。
【００２４】
実施例１は、記載された実験的なフローサイトメトリー機器を使用する、光学測定による血液溶解条件下における有核赤血球の測定例を示す。血液溶解条件下において、当該赤血球は溶解され、白血球及び有核赤血球の両方は、部分的に溶解し、これらの細胞容積は実質的に低下する。有核赤血球のサイズは、だいたいこれらの核の容積にまで低下する。
【００２５】
図１Ａは、１００個の白血球あたり約５個のＮＲＢＣを含む臨床的な全ての血液サンプルから実施例１に記載の条件下で得られた４つの散乱ダイアグラムを示す。当該４つの散乱ダイアグラムは、それぞれ、ＡＬＬ対１．９°、ＡＬＬ対３．０°、ＡＬＬ対３．７°、及び３．７°対３．０°の散乱ダイアグラムである。示されるように、有核赤血球は、対応する散乱ダイアグラムの特定の領域において、別々のクラスターとして現れた。このため散乱ダイアグラムの特定の領域は、ＮＲＢＣ領域と称される。異なる散乱ダイアグラムにおいて、当該ＮＲＢＣ領域は異なっていてよいことに注意する。図１Ｂは、通常の全ての血液サンプルから得られた対応する散乱ダイアグラムを示す。示されるように、対応するＮＲＢＣ領域中に細胞群は見られない。
【００２６】
ある代表的な態様において、６．４４μｍの平均粒径及び１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子は、上述の溶解条件下においてヒト有核赤血球の光学特性をシミュレートするために使用された。図２は、実施例２に記載された条件下において得られたポリスチレン粒子の散乱ダイアグラムを示す。示されるように、６．４４μｍのポリスチレン粒子は、上述の条件下において、ヒト有核赤血球のＮＲＢＣ領域中に位置した。このため有核赤血球の光学特性をシミュレートする当該合成粒子はまた、今後、ＮＲＢＣ類似体と称される。本明細書で言及される合成粒子の特定のサイズは、平均粒径であることに注意する。
【００２７】
他の例として、６．４４μｍの平均粒径及び１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子は、反応条件下及び上述の測定において、白血球（ＷＢＣ）をシミュレートするために使用された。図３は、実施例２に記載の条件下において得られた７．２２μｍのポリスチレン粒子の散乱ダイアグラムを示す。示されるように、７．２２μｍのポリスチレン粒子は、ＮＲＢＣ領域の外に位置したが、上述の条件下においてヒト白血球と同じ領域に現れた。
【００２８】
更なる例において、１０．９μｍの平均粒径及び１．６０の屈折率を有する濃青色のカルボキシル化ポリスチレン粒子もまた、上述の条件下において白血球をシミュレートするために使用された。
【００２９】
白血球の光学特性をシミュレートするために、又は言い換えれば白血球類似体として機能するために、上記合成粒子が定められたＮＲＢＣ領域とオーバーラップしない限り、合成粒子は散乱ダイアグラムの広範な範囲に局在してよい。好ましくは、白血球類似体は、１つの主な白血球亜集団、例えば、顆粒球又はリンパ球に類似する光学特性を有する。
【００３０】
より更なる態様において、リファレンスコントロール組成物は更に、上記条件下にいて２つの異なる白血球亜集団、例えば、リンパ球及び顆粒急の光学特性をシミュレートする合成球状粒子の２つのセットを含んで成ってよい。当該リファレンスコントロール組成物は有核赤血球のシミュレーション測定、及び白血球亜集団の区別のために使用することができる。
【００３１】
あるいは、また、ＷＢＣ類似体は、溶解条件下において白血球の光学特性をシミュレートする細胞粒子から作製してもよい。細胞粒子から作成されるＷＢＣ類似体の適当な例は、当業界において既知な安定化哺乳類白血球、及び処理及び／又は固定されたヒト及び動物赤血球を含む。
【００３２】
他の態様において、本発明は、有核赤血球及び白血球、並びに水性懸濁培地中で分散される赤血球成分及び血小板成分の光学特性をシミュレートする上述の合成球状粒子を含んで成るリファレンスコントロール組成物を供する。
【００３３】
上記赤血球成分は、安定化哺乳類赤血球、好ましくは安定化ヒト赤血球であってよい。当該赤血球成分の作製プロセスは、米国特許第４，７０４，３６４号に詳細に記載されており、本明細書においてその全体における参考例として組み入れられている。上記血小板成分は、安定化ヒト又は動物血小板、又は他の細胞種類から作製された血小板類似体であってよい。１つの適当な例は、米国特許第４，７０４，３６４号に記載されている血小板類似体としての処理ヤギ赤血球であり、その全体において参考例として本明細書に組み入れられている。
【００３４】
血液サンプルの赤血球、及びリファレンスコントロール組成物中の安定化ヒト赤血球は、溶解条件下において溶解され、そして有核赤血球及び白血球の測定において検出されるべきではない。溶解条件下において、血液サンプルの血小板は、実質的にサイズが減少し、そしてこれらは有核赤血球の測定の検出限界以下である。上述の血小板類似体は、溶解条件下において血小板応答をシミュレートする。このため、リファレンスコントロール組成物中の赤血球及び血小板の存在は、溶解試薬に対するコントロール組成物の応答、並びに機器における反応条件に影響する。このため、赤血球及び血小板成分を含むリファレンスコントロール組成物は、機器の作動状態に関する更なる情報を供することができる。
【００３５】
実施例３は、赤血球及び血小板成分と一緒に、上述の合成球状粒子のリファレンスコントロール組成物への組み込みを説明する。図４は、上述の６．４４μｍのポリスチレン及び１０．９μｍのカルボキシル化ポリスチレン粒子を含んで成るリファレンスコントロール組成物が、水性懸濁培地中の安定化ヒト赤血球及びヤギ赤血球から作製された血小板類似体と一緒に懸濁されたことを示す。合成粒子が安定化赤血球及び血小板類似体の存在下における懸濁培地中で懸濁された場合、類似体粒子の凝集は観察されなかった。更に、散乱ダイアグラム中の位置において僅かなシフトが認められたが、個々の合成粒子の光学特性の有意な変化は観察されなかった。
【００３６】
ＮＲＢＣ類似体と白血球類似体間で得られた割合は、１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数をレポートするために使用することができ、これは臨床実験室における血液サンプル中の有核赤血球をレポートするために使用されるものと同じ単位である。図５は、０％〜約５０％のＮＲＢＣの範囲における機器及び理論値によりレポートされた１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの相関を示す。本明細書において使用されるＮＲＢＣのパーセンテージは１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数を意味することに注意する。示されるように、当該機器から得られた結果は、理論値に対して直線的な相関を有した。
【００３７】
上述のリファレンスコントロール組成物が、有核赤血球の光学測定を行う血液学的アナライザーにおいて慣習的に使用される場合、特定の散乱ダイアグラムにおけるこれらの予定された位置におけるＮＲＢＣ及び／又はＷＢＣ類似体の偏差、又は既知のリファレンス値に対するカウント比の変化は、不適当な機器の作動状態を指摘することができる。
【００３８】
更なる態様において、本発明は、異なる成熟度を有する有核赤血球をシミュレートするリファレンスコントロールシステムを供する。ヒト有核赤血球はこれらの成熟状態に依存して異なるサイズを有することが知られている。一般的に、有核赤血球の核がより大きければ、当該細胞はより成熟している。更に、同じ臨床的な血液サンプル中で、異なる成熟度を有する有核赤血球を観察することができる。これにより、有核赤血球の成熟状態を更に刺激するリファレンスコントロールシステムを有することが望ましい。
【００３９】
ある態様において、リファレンスコントロールシステムは、一連のリファレンスコントロール組成物を供し、それぞれは、一定の成熟度を伴うヒト有核赤血球の光学特性をシミュレートする僅かに異なる有核赤血球類似体のセットを含む。ある態様において、僅かに異なる粒子サイズであるが、１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子は、リファレンスコントロールシステムのＮＲＢＣ類似体として使用することができる。当該リファレンスコントロールシステムは、キット形態においてパッケージングされていてよく、ここで各組成物は、分離バイアル中にパッケージングされている。
【００４０】
本発明は、光学測定により測定される場合、有核赤血球をシミュレートするために合成粒子を利用する第一のリファレンスコントロール組成物を供する。赤血球類似体として合成球状粒子を使用することは、いくつかの利点を有する。当該製造プロセスは、複雑なＮＲＢＣ類似体の調製プロセス、例えば、血球が類似体の製造のために使用される場合に必要とされるようなプロセスを必要としないためにより簡単とすることができる。その化学的不活性により、合成球状粒子は細胞作製型類似体よりも安定性を有する。
【００４１】
先行技術と異なる上述の合成粒子、ＮＲＢＣ類似体、又はＷＢＣ類似体は、溶解条件下において、実質的に対応するヒト有核赤血球又は白血球と異なるサイズを有することが発見された。より具体的には、ＮＲＢＣ類似体粒子の平均粒径は６．２μｍ〜約６．８μｍであり、一方上述の溶解条件下におけるヒト赤血球の細胞の粒径は、わずかに約３．９μｍ〜約４．７μｍの範囲である。溶解条件下におけるヒト有核赤血球のサイズ測定は、その全体における参考例により本明細書に組み入れられている米国特許第６，４１０，３３０号に記載されているように、実験的な血液学的機器において、ＤＣインピーダンス測定により独立に行われた。更に、白血球の屈折率は典型的には、約１．３７〜約１．４０である。本発明においてＷＢＣ類似体として使用されるポリスチレン及びカルボキシル化ポリスチレン粒子は、実質的にシミュレートされる天然の白血球のものよりも高い屈折率を有する。
【００４２】
当該発見された特性は、合成粒子の選択に関して考慮すべき柔軟性を供し、そして実質的に先行技術が教示するような特定の検出条件下において血球特性をシミュレートするための粒子サイズにおける制限を減少させることから、極めて重要である。
【００４３】
以下の実施例は、本発明の例示であり、如何なる場合も、特許請求の範囲に定義されるような本発明の範囲を制限するものとして解釈されない。
【実施例】
【００４４】
実施例１
赤血球の溶解及び有核赤血球の分析のための活性成分を含む水溶液である、実験の溶解試薬を調製した：２５．０ｇ／Ｌのテトラデシルトリメチルアンモニウム・ブロミド、１５．０ｇ／ＬのＩｇｅｐａｌ  ＳＳ−８３７(エトキシル化フェノール、Rhone-Poulenc, Cranbury, New Jersey 由来)、及び４．０ｇ／ＬのＰｌｕｒｏｆａｃ  Ａ３８  ｐｒｉｌｌ  界面活性剤活性剤(エトキシル化アルコール, BASF Corp., Florham Park, New Jersey 由来)。
【００４５】
３４μｌの全血液サンプルを８５０μＬの等張性血液希釈剤のイソトン（Isotone）（登録商標） III (Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida)で希釈し、それから１４５μｌの上述の溶解試薬組成物と混合させた。当該サンプル混合物を、１．９°±０．５°、３．０°±０．５°、及び３．７°±０．５°、並びに軸上光損失（０°±０．５°）を含む多様な角度において散乱光シグナルの検出を可能にする光学検出器を装備した改変Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＸＬ  フローサイトメーター(Beckman Coulter, Inc., Miami, Florida)である実験的なフローサイトメトリー機器により吸引した。当該サンプル混合物は５０μｍのフォーカスされたフローセルを通して吸引された。光学検出器により、フローセルを通る各血球を測定した。
【００４６】
図１Ａは、１００個の白血球あたり約５個のＮＲＢＣを含む臨床的な全血液サンプルの、得られた多様な散乱ダイアグラムを示す。示されるように、有核赤血球は、それぞれ、ＡＬＬ対１．９°、ＡＬＬ対３．０°、ＡＬＬ対３．７°、及び３．７°対３．０°の散乱ダイアグラムの特定の領域に別々のクラスターとして現れた。
【００４７】
図１Ｂは、同じ条件下において得られる正常な血液サンプルの対応する散乱ダイアグラムを示す。対応するＮＲＢＣ領域に個体群は見られなかった。
【００４８】
実施例２
１．５９の屈折率、それぞれ６．４４μｍ及び７．２２μｍの平均直径を有するポリスチレンの２つのセットは、それぞれ非イオン性の界面活性剤であるツイーン（Tween)（登録商標）２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、JT Baker, Phillipsburg, New Jersey）の水性溶液中に懸濁させた。各粒子懸濁液は、約３．０×１０3／μｌ〜６．０×１０3／μｌの粒子濃度を有する。ポリスチレン粒子の両セットは、Bangs Laboratories, Inc., Fishers, Indiana の製品である。これらの粒子は、約０．０７μｍの直径の標準偏差を伴う狭いサイズ分布を有した。
【００４９】
３４μｌの粒子懸濁溶液は、８５０μｌのイソトン（Iston)（登録商標）III で希釈し、それから１４５μｌの溶解性の実施例１の試薬組成物と混合させた。当該サンプル混合物を吸引し、そして実施例１に記載された実験的なフローサイトメトリー機器により測定した。
【００５０】
図２は、６．４４μｍのポリスチレン粒子の散乱ダイアグラムを示す。当該粒子は、ヒト血液サンプルの対応するＮＲＢＣ領域に位置した。
【００５１】
図３は、７．２２μｍのポリスチレン粒子の散乱ダイアグラムを示す。当該粒子は、ヒト白血球が局在した対応する領域に位置した。
【００５２】
示されるように、上記６．４４μｍのポリスチレン粒子は、ヒト有核赤血球をシミュレートし、そして７．２２μｍのポリスチレン粒子は、上述の反応及び検出条件下で、それぞれ、ヒト白血球をシミュレートした。
【００５３】
実施例３
合成粒子の２つのセットは、２つの粒子懸濁液を形成するために非イオン性界面活性剤ツイーン（登録商標）２０の水溶液にそれぞれ懸濁させた。第一の粒子セットは、６．４４μｍの平均直径、及び１．５９の屈折率を有するポリスチレン粒子とした。第二の粒子セットは、１０．９μｍの平均直径、及び１．６０の屈折率を有するカルボキシル化ポリスチレン粒子とした。当該１０．９μｍの粒子は、濃青色であった。粒子の両セットは、Bangs Laboratories, Inc., Fishers, Indiana の製品である。
【００５４】
リファレンスコントロール組成物は、予定した量の各粒子懸濁液を、安定化ヒト赤血球とヤギ赤血球から作製した血小板類似体の混合物を含む水性細胞懸濁培地（以下に供する組成物）に添加することにより調製した。当該安定化ヒト赤血球及び血小板類似体は使用前に類似体懸濁培地中で別々に懸濁させた。リファレンスコントロール組成物中の類似体濃度は、約１．９×１０6／μｌの安定化ヒト赤血球、約２３×１０3／μｌの血小板類似体、約０．５×１０3／μｌのＮＲＢＣ類似体（６．４４μｍの粒子）、及び約５×１０3／μｌのＷＢＣ類似体（１０．９μｍの粒子）とした。他の適当な細胞懸濁培地は、米国特許第４，７０４，３６４号、第５，３２０，９６４号、及び第５，５１２，４８５号に記載されており、これらの全体における参考例により本発明に組み入れられている。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
３４μｌのリファレンスコントロール組成物を８５０μｌのイソトン（Isoton)（登録商標）III で希釈し、それから安定化ヒト赤血球を溶解するために１４５μｌの実験１の溶解剤組成物で混合した。当該サンプル混合物を吸引し、そして実施例１に記載される実験的なフローサイトメトリー機器により測定した。
【００５７】
図４はリファレンスコントロール組成物の散乱ダイアグラムを示す。示されるように、ＮＲＢＣ類似体は、ヒト血液サンプルの対応するＮＲＢＣ領域に見られた６．４４μｍの粒子から作製し、そしてＷＢＣ類似体は、ヒト血液サンプルの対応するＮＲＢＣ領域に見られた１０．９μｍの粒子からそれぞれ作製した。当該赤血球及び血小板類似体は、反応条件下においてヒト血液サンプルの対応する細胞に予測されたとおり、散乱ダイアグラム中に示されなかった。
【００５８】
実施例４
一連のリファレンスコントロール組成物は、実施例３に記載されるとおり調製され、それぞれ、上述の６．４４μｍのポリスチレン粒子から作製されたＮＲＢＣ類似体、及び１０．９μｍのカルボキシル化ポリスチレン粒子から作製されたＷＢＣ類似体を含んだ。当該ＷＢＣ類似体の濃度は一定を保ち、そしてＮＲＢＣ類似体の濃度は、０％〜約５０％ＮＲＢＣのＷＢＣ類似体に対するＮＲＢＣ類似体の割合を産出するような範囲において変化した。各リファレンスコントロール組成物は、約１．９×１０6／μｌの安定化ヒト赤血球及び約２３×１０3／μｌの血小板類似体を含んだ。
【００５９】
各リファレンスコントロール組成物を吸引し、そして実施例３に記載される手順に従い実施例１に記載される実験的なフローサイトメトリー機器において測定した。
【００６０】
上記散乱ダイアグラムの分析から得られた１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数は、ＮＲＢＣ類似体濃度の理論値に対してプロットされた。図５は、得られた相関曲線を示す。示されるように、リファレンスコントロールの測定されたＮＲＢＣ濃度（１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数中）は、測定された濃度範囲中の理論値に対して直線的に相関する。
【００６１】
一方、本発明は、付随する図において詳細に且つ写真的に示され、これらは、本発明の範囲を制限するものとして考慮すべきではなく、好ましい態様の例証として考慮すべきである。しかしながら、上述の明細書に記載され、並びに付属の特許請求の範囲及びこれらの合法的な相当物において規定されるように、本発明の精神及び範囲において、多様な修正及び変更を行うことができることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】１００個のＷＢＣあたり約５個のＮＲＢＣを含む臨床的な全血液サンプルの多様な散乱ダイアグラムを示す。
【図１Ｂ】正常な血液サンプルの多様な散乱ダイアグラムを示す。
【図２】６．４４μｍのポリスチレン粒子の多様な散乱ダイアグラムを示す。
【図３】７．２２μｍのポリスチレン粒子の多様な散乱ダイアグラムを示す。
【図４】安定化赤血球及び血小板を含む培地中で懸濁された、６．４４μｍのポリスチレン粒子、及び１０．９μｍのカルボキシル化ポリスチレン粒子を含んで成る、リファレンスコントロール組成物の散乱ダイアグラムを示す。
【図５】０〜５０％のＮＲＢＣの範囲におけるフローサイトメトリー機器及び理論値によりレポートされる１００個のＷＢＣあたりのＮＲＢＣの数の相関関係を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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