(57)【要約】  本発明は、変異型の成熟ポリペプチドが下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる、グループ1ダニポリペプチドの変異型に関する: 配列番号1のA10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、99、100、101、104、105、106、109、110、111、112、113、132、144、145、146、148、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208。【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型の成熟ポリペプチドが親ポリペプチド中の下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる、親グループ1ダニポリペプチドの変異型: 配列番号1のA10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、99、100、101、104、105、106、109、110、111、112、113、132、144、145、146、148、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208。
【請求項２】
親ポリペプチド中の下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる請求項1に記載の変異型: 配列番号1のA10、A12、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、I158、I159、Q160、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、29、30、32、46、47、54、55、64、66、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、100、101、104、105、106、110、111、112、113、132、144、145、146、158、159、160、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208。
【請求項３】
親ポリペプチド中の下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる請求項1に記載の変異型: 配列番号1のA10、A12、G29、G30、G32、A46、S54、L55、D64、A66、G73、T75、Q84、N86、G87、S92、Y96、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、I113、A132、I144、K145、D146、D162、N163、G164、Y165、N179、A180、G182、V183、D184およびA205または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、29、30、32、46、54、55、64、66、73、75、84、86、87、92、96、100、101、104、105、106、110、113、132、144、145、146、162、163、164、165、179、180、182、183、184および205。
【請求項４】
親グループ1ダニポリペプチドに比較して、前記変異型が変更されたIgE抗原性を有する、請求項1〜3のいずれかに記載の変異型。
【請求項５】
親グループ1ダニポリペプチドに比較して、前記変異型が少なくとも同一のT細胞刺激作用を有する、請求項4に記載の変異型。
【請求項６】
親グループ1ダニポリペプチドに比較して、前記変異型がヒトを包含する暴露された動物において変更された免疫原性応答を誘導する、請求項1〜5のいずれかに記載の変異型。
【請求項７】
親グループ1ダニポリペプチドに比較して、前記変異型がヒトにおいて変更された免疫原性応答を誘導する、請求項1〜6のいずれかに記載の変異型。
【請求項８】
下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる請求項1に記載の変異型: 配列番号1のA10、A12、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G87、S92、A98、R99、E100、Q101、R105、R110、F111、G112、I113、I144、K145、D146、D148、R151、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、30、32、46、47、54、55、64、66、67、87、92、98、99、100、101、105、110、111、112、113、144、145、146、148、151、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208。
【請求項９】
下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる請求項1に記載の変異型: 配列番号1のA10、A12、G32、S54、L55、A66、S67、G87、A98、R99、F111、G112、I113、I144、D146、D148、I159、R161、G164、Q166、A180、D184、A205およびI208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、32、54、55、66、67、87、98、99、111、112、113、144、146、148、159、161、164、166、180、184、205および208。
【請求項１０】
下記の突然変異から成る群から選択される突然変異を含んでなる請求項1〜9に記載の変異型:
V、Y、Q、N、EおよびDから成る群から選択される残基で置換された10;
V、Y、Q、NおよびFから成る群から選択される残基で置換された12;
V、Y、E、D、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された32;
N、A、T、VおよびQから成る群から選択される残基で置換された54;
V、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された55;
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された66;
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された67;
V、Y、DおよびEから成る群から選択される残基で置換された87;
V、N、Q、DまたはEから成る群から選択される残基で置換された98;
H、Y、V、N、Q、EおよびDから成る群から選択される残基で置換された99;
V、H、IおよびWから成る群から選択される残基で置換された111;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換された112;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換された113;
A、G、Y、N、QまたはVから成る群から選択される残基で置換された144;
Y、H、V、I、L、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された146;
Y、V、IおよびLから成る群から選択される残基で置換された148;
V、Y、AおよびGから成る群から選択される残基で置換された159;
A、G、VおよびYから成る群から選択される残基で置換された161;
V、HおよびWから成る群から選択される残基で置換された164;
S、W、YおよびFから成る群から選択される残基で置換された166;
V、N、QおよびYから成る群から選択される残基で置換された180;
V、MおよびYから成る群から選択される残基で置換された184;
V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換された205;
A、G、V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換された208；
前記ナンバリングは成熟Der p 1ポリペプチドの位置であるか、あるいは前記位置に対応する。
【請求項１１】
下記の突然変異から成る群から選択される突然変異を含んでなる請求項10に記載の変異型:
V、Y、Q、N、EおよびDから成る群から選択される残基で置換されたA10;
V、Y、Q、NおよびFから成る群から選択される残基で置換されたA12;
V、Y、E、D、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたG32;
V、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたL55;
N、A、T、VおよびQから成る群から選択される残基で置換されたS54;
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたA66;
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたS67;
V、Y、DおよびEから成る群から選択される残基で置換されたG87;
V、N、Q、DまたはEから成る群から選択される残基で置換されたA98;
H、Y、V、N、Q、EおよびDから成る群から選択される残基で置換されたR99;
V、H、IおよびWから成る群から選択される残基で置換されたF111;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換されたG112;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換されたI113;
A、G、Y、N、QまたはVから成る群から選択される残基で置換されたI144;
Y、H、V、I、L、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたD146;
Y、V、IおよびLから成る群から選択される残基で置換されたD148;
V、Y、AおよびGから成る群から選択される残基で置換されたI159;
A、G、VおよびYから成る群から選択される残基で置換されたR161;
V、HおよびWから成る群から選択される残基で置換されたG164;
S、W、YおよびFから成る群から選択される残基で置換されたQ166;
V、N、QおよびYから成る群から選択される残基で置換されたA180;
V、MおよびYから成る群から選択される残基で置換されたD184;
V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換されたA205;
A、G、V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換されたI208；
前記ナンバリングは配列番号1の位置であるか、あるいは前記位置に対応する。
【請求項１２】
前記親グループ1ダニポリペプチドがその成熟形態で配列番号1に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜11のいずれかに記載の変異型。
【請求項１３】
前記親グループ1ダニポリペプチドがその成熟形態で配列番号2に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜11のいずれかに記載の変異型。
【請求項１４】
前記親グループ1ダニポリペプチドがその成熟形態で配列番号3に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜11のいずれかに記載の変異型。
【請求項１５】
前記親グループ1ダニポリペプチドがその成熟形態でDer m 1に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜11のいずれかに記載の変異型。
【請求項１６】
前記親グループ1ダニポリペプチドがその成熟形態で配列番号5に対して少なくとも80%の同一性を有する配列を有する、請求項1〜11のいずれかに記載の変異型。
【請求項１７】
親グループ1ダニポリペプチドの突然変異が、1つの大きさを有するアミノ酸の異なる大きさを有するアミノ酸への置換、1つの親水性を有するアミノ酸の異なる親水性を有するアミノ酸への置換、1つの極性を有するアミノ酸の異なる極性を有するアミノ酸への置換、または1つの酸性度を有するアミノ酸の異なる酸性度を有するアミノ酸への置換を含んでなる、請求項1〜16のいずれかに記載の変異型。
【請求項１８】
親グループ1ダニポリペプチド中の突然変異がポリマーを複合化する1または2以上の結合基の挿入を含んでなる、請求項1〜17のいずれかに記載の変異型。
【請求項１９】
親グループ1ダニポリペプチド中の突然変異がポリマーを複合化する1または2以上の追加のグリコシル化部位の挿入を含んでなる、請求項1〜17のいずれかに記載の変異型。
【請求項２０】
親グループ1ダニポリペプチドが天然親グループ1ダニポリペプチドである、請求項1〜19のいずれかに記載の変異型。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれかに記載の変異型をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２２】
宿主細胞における変異型の産生を指令する1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖されている、請求項21に記載のヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド構築物。
【請求項２３】
請求項22に記載のヌクレオチド構築物を含んでなる組換え発現ベクター。
【請求項２４】
請求項22に記載のヌクレオチド構築物を含んでなる組換え宿主細胞。
【請求項２５】
下記工程を含んでなる請求項1〜20のいずれかに記載の変異型を製造する方法：
(a)  変異型の産生を促す条件下に請求項24に記載の組換え宿主細胞を培養し、そして
(b)  変異型を回収する。
【請求項２６】
請求項1〜20のいずれかに記載の変異型と、薬学上許容される担体またはアジュバントまたはそれらの組成物とを含んでなる組成物。
【請求項２７】
担体またはアジュバントが生理的食塩水、グリセロール、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サポニン、スクアレンに基づく乳濁液、モノホスホリルリピドA、モノホスホリルリピドAの合成模倣物、ポリアクチドコ-グリコリド (PLG) 粒子、ISCOMS、リポソーム、キトサン、細菌のDNAから選択される、請求項26に記載の組成物。
【請求項２８】
請求項1〜20のいずれかに記載の変異型を薬学上許容される担体またはアジュバントまたはそれらの混合物と混合することを含んでなる、請求項26に記載の組成物を製造する方法。
【請求項２９】
薬剤として使用するための請求項1〜20のいずれかに記載の変異型または請求項26に記載の組成物。
【請求項３０】
免疫学的障害を治療する薬剤を製造するための請求項1〜20のいずれかに記載の変異型または請求項26に記載の組成物の使用。
【請求項３１】
疾患を治療するための請求項1〜20のいずれかに記載の変異型または請求項26に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
免疫学的障害を治療するための請求項1〜20のいずれかに記載の変異型または請求項26に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
免疫学的障害がヒトにおけるアレルギーである、請求項30または32に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、親グループ1ダニ (mite) ポリペプチド抗原アレルゲンに比較して、変更された抗原性プロファイルを有するグループ1ダニポリペプチド抗原アレルゲンの変異型、このような変異型を作る方法、前記変異型を含んでなる組成物、および免疫療法、例えば、アレルギーワクチン接種および/または脱感作における変異型の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒトおよび動物に対して異質の抗原ポリペプチド (例えば、グループ1ダニポリペプチドのアレルゲンは、例えば、ほこりダニ (dust mite) デルマトファゴイデス・プテロニシヌス (Dermatophagoides pteronyssinus) (Der p 1) またはデルマトファゴイデス・ファリナエ (Dermatophagoides farinae) (Der f 1) の排泄物中に存在する) は、ヒトおよび動物の感受性個体において免疫学的応答、例えば、アトピー性アレルギー応答を誘発することがある。アレルギー応答は、枯草熱、鼻結膜炎、鼻炎、および喘息から、感作された個体が、例えば、ハチに刺されるか、あるいは昆虫に咬まれた場合における、全身的アナフィラキシーおよび死亡までの範囲であることがある。
【０００３】
個体は、吸入、皮膚または眼との直接的接触、摂取または注射により、このようなポリペプチド (アレルゲンと命名される) に対して感作されるようになることがある。アレルギー応答の背後の一般的メカニズムは感作期および症候期に分割される。感作期はアレルゲンに対する個体の最初の暴露を含む。この事象は特異的TおよびBリンパ球を活性化し、アレルゲン特異的抗体、例えば、免疫グロブリンE (IgE) の産生に導く。特異的IgE抗体は、なかでも、マスト細胞および好塩基球上のIgEレセプターに結合し、そして症候期は同一または同種のアレルゲンに対する第2暴露で開始する。アレルゲンは細胞結合IgEに結合し、そして抗体のポリクローナル特質はIgEレセプターの架橋および集団化を生じ、引き続いてマスト細胞および好塩基球を活性化させる。この活性化は種々の化学的メディエイター、例えば、ヒスタミン、ヘパリン、プロテアーゼ、プロスタグランジンD2およびロイコトリエンを放出し、これらはアレルギーの病徴期の初期ならびに後期の反応に関係する。
【０００４】
IgE仲介アレルギーのある種の形態について、特異的アレルギーワクチン接種 (SAV) または免疫療法 (IT) と呼ばれる療法が存在し、これはワクチンとして処方されたアレルゲン製剤の反復した非経口的または経粘膜 (例えば、舌下) 投与を含んでなる (Int. Arch. Allergy Immunol. 1999、Vol. 119、pp. 1-5)。これにより、アレルギー症候は減少し、これは主として保護的な、IgEに基づかない、免疫応答の誘導のためであり、多分存在するTh2応答のモジュレーションおよび/または免疫保護的 (Th1) 経路に向かう再方向づけによる (Int. Arch. Allergy Immunol. 1999、Vol. 119、pp. 1-5)。
【０００５】
他の型のワクチン接種に比較して、アレルギーワクチン接種はアレルギー患者における現存しかつ進行する免疫応答の存在により複雑化する。影響を受けた組織中のエフェクター細胞、例えば、マスト細胞および好塩基球上のアレルゲン特異的IgE抗体の存在は、抗原に対して暴露したときアレルギー病徴を生ずることがある。こうして、悪い事象または副作用の固有の危険は抗原の投与可能な投与量を制限し、そして送達される投与量を経時的にゆっくり増加させる、延長した (12〜36ヶ月) 厄介な処理養生法を必要とする。
【０００６】
こうして、悪い事象の固有の危険を低下し、特定のアレルギーワクチン接種に使用できる、変更されたアレルゲンを提供することが必要とされている。これらの変更されたアレルゲンは、抗原特異的IgE分子を結合する、特に架橋する能力が減少されているべきである。同時に、変更されたアレルゲンは、患者において保護的 (IgGに基づく) 免疫応答を誘発するために、親アレルゲンの三次構造を保持し、ある程度まで、その免疫原性を保持することが重要である。
【０００７】
このような変更されたタンパク質を製造するために、まず分子上の最小B細胞エピトープを同定することが望ましい。エピトープは抗体と結合できる複合抗原上の構造領域であるが、最小エピトープは抗体結合に直接関係するアミノ酸を含有する。
【０００８】
B細胞エピトープは事実連続的、不連続的またはそれらの組み合わせであることがあるが、抗体応答を誘発するために約10個のアミノ酸を含有しなくてはならない。エピトープと最小エピトープとを含んでなる分子の大きい領域または区域を同定することができるが、この分子中に突然変異を導入することによってポリペプチドの免疫原性を変更しようとするとき、まず最小エピトープを同定することの重要性を認識するであろう。なぜなら、潜在的に突然変異させるべきアミノ酸の数が5〜10を超える場合、アミノ酸の突然変異化により変更されたポリペプチドを製造することは非常に困難であるからである。可能な変異型の数は突然変異法に関係するアミノ酸の数とともに急激に増加し (より多くの置換が可能である)、そしてエピトープの一部分ではないアミノ酸を変更することは有効性に劣るからである。
【０００９】
グループ1ほこりダニのアレルゲン中のエピトープを同定するために、いくつかの研究がなされてきている:
Der p 1の抗体結合性フラグメントは下記の文献に開示されている: Green 他、Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. Vol. 92、pp. 30-38、1990; Green 他、J. Immunol. Vol. 147、pp. 3768-3773、1991およびGreenおよびThomas、Molecular Immunol. Vol. 29(2)、pp. 257-262、1992。開示されている抗体結合性領域は非常に大きく (11〜56アミノ酸残基)、そして一緒になって分子のほとんどすべてのアミノ酸をカバーする。
【００１０】
Lombardero 他、J. Immunol. Vol. 144(4)、pp. 1353-1360、1990には、Der p 1上のB細胞のエピトープがコンフォメーション的であること、すなわち、エピトープが分子の非連続的部分から構成されており、こうして正しい三次構造に高度に依存すること、そして抗体結合がタンパク質の変性に対して感受性であることが開示されている。
Collins 他、Clin. Exp. Allergy Vol. 26(1)、pp. 36-42、1996において、Der p 1およびDer f 1のIgE結合性エピトープが事実不連続であることが結論されている。
【００１１】
Jeannin 他、Molecular Immunol. Vol. 29(6)、pp. 739-749、1992において、4つの推定上の抗体結合性ペプチドを同定するために疎水性およびアミノ酸残基に対する溶媒のアクセス可能性の予測が使用されている: N52-C71、C117-Q133、G176-I187およびV188-Y199。4つのエピトープは、ほこりダニアレルギー患者のパネルの40〜60%において、好塩基球において低レベルのヒスタミン放出を誘導することができた。ヒスタミン放出は少なくとも2つのIgE分子の架橋を必要とし、そしてペプチドは非特異的に血清成分に結合し、こうしてハプテンとして作用したに違いないと著者らは推測している。
【００１２】
Furmonaviciene 他、Clin. Exp. Allergy 29、pp. 1563-1571、1999において、Der p 1のL147-Q160がモノクローナルマウス抗Der p 1抗体により認識される潜在的エピトープであることが示唆されている。
Plerson-Mullany 他、Molecular Immunol. 37、pp. 613-620、2000において、Der p 1の残基T1-T21、E59-Y93、Y155-W187およびI209-I221を表すペプチドがDer p 1に対するヒト血清の結合を部分的に阻害できることが報告されている。
WO 99/47680 (ALK-ABELLQ) には、アレルゲンを修飾してこれらのポリペプチドのアレルゲン性を低下できることが開示されている。この開示は主としてカンバの花粉タンパク質、Bet v 1および毒液アレルゲンVes V 5の修飾に関する。
【００１３】
WO 02/40676 (ALK-ABELLQ) には、修飾されたアレルゲンが開示されており、前記修飾はアレルゲンのアレルゲン性を減少させると主張されている。この開示において、修飾に適当なアミノ酸は溶媒アクセス可能性により、すなわち、それらがアレルゲン表面上に存在する場合、選択されるか、あるいは同一分類学上の基の同種アレルゲンに比較してそれらが保存されされている場合、選択される。
【００１４】
WO 01/29078 (HESKA) には、グループ1ダニポリペプチドの組換え発現、これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列およびある種の微生物中で前記タンパク質を発現できるように修飾されたヌクレオチド配列が記載されている。この開示のグループ1ダニポリペプチドは、天然グループ1ダニポリペプチドにまた結合するIgEに結合すると述べられている。
EP-A 1 219 300には、アレルギーワクチンを投与する方法が記載されている。
【００１５】
この分野において、グループ1ダニポリペプチド、例えば、Der p 1の抗体結合性エピトープに関して種々の示唆がなされている。しかしながら、この技術は下記に関する: (1) 線状エピトープ、それらの大部分はアレルギーに対して低い関連性を有する、(2) 抗体認識に関係する特異的アミノ酸の情報を含有するためには大き過ぎる領域、(3) エピトープが抗体結合性に事実関係するであるかどうかを考慮しないで、より高い溶媒アクセス可能性を有する区域を選択することによって選択されたエピトープ、(4) 非ヒトエピトープまたは (5) (1) 〜 (4) の1または2以上の組み合わせ。
【００１６】
例えば、Der p 1におけるエピトープ同定の不適切さは、例えば、Der p 1上の非常に異なる潜在的エピトープが異なる文献において報告されている理由による。例えば、WO 02/40676において、残基E13、P24、R20、Y50、S67、R78、R99、Q109、R128、R156、R161、P167およびW192はDer p 1のアレルゲン性のために重要であるとして選択されているが、Pierson-Mullany 他において、エピトープは残基T1-T21、E59-Y93、Y155-W187およびI209-I221であると考えられており、Furmonaviciene 他において、主要なエピトープはL147-Q160であると決定されており、そしてJeannin 他 (ここでWO 02/40676におけるのとほとんど同一のアプローチが利用されている) において、N52-C71、C117-Q133、G176-I187およびV188-Y199が同定されている。
【００１７】
さらに、2件の研究が活性部位、成熟部位、またはシステイン架橋形成部位の残基中の突然変異により、活性または 「アレルゲン活性」 を減少することを目的としている。
WO 99/25823 (Smith Kline Beecham) には、a) C34が突然変異されており、b) プロペプチドが、例えば、NAET配列の欠失による、修飾されているか、あるいはc) H170が突然変異されている、Der p 1の変異型が開示されている。
WO 03/016340 (Smith Kline Beecham) には、6つのシステイン (C4、C31、C65、C71、C103、またはC117) が突然変異されているエピトープ、例えば、Der p 1のエピトープが開示されている。
【００１８】
例えば、Der p 1のエピトープに関する技術の不明確さは、現在決定的なかつ信頼性あるデータが、グループ1ダニポリペプチドのエピトープについて入手不可能であり、そしてこれらのポリペプチドの抗原性を減少する目的で突然変異に適当な前記エピトープ中に構成されたアミノ酸について非常に少ないことを意味する。
【発明の開示】
【００１９】
発明の要約
ポリペプチドのアレルゲンのアレルゲン性を減少させる試みがなされてきた。エピトープにおける小さい変化が抗体に対する結合に影響を与えることがあることが発見された。これは、例えば、このようなエピトープを抗体に対する高い親和性から低い親和性のエピトープに変換することによって、エピトープの性質を変化させることができるか、あるいはエピトープの喪失を生ずる、すなわち、エピトープが抗体に十分に結合して抗原応答を誘発できないことさえある。
【００２０】
ワクチン因子として改良された性質をもつ修飾されたグループ1ダニポリペプチドを製造するために、分子上の最小B細胞エピトープを最初に同定することが好都合である。エピトープは、抗体に結合できる、複合抗原上の最小構造区域である。B細胞エピトープは事実連続的または不連続的であることができる。最小エピトープは、抗体結合性に直接関係する特異的アミノ酸から成る。
本発明は、最小エピトープ中に突然変異を含んでなり、こうしてヒトを包含する、暴露された動物において変更された免疫原性プロファイルを有する、Der p 1を包含する、グループ1ダニポリペプチド抗原の変異型に関する。
【００２１】
出願人はグループ1ダニポリペプチド中のアミノ酸を同定し、これらのアミノ酸は抗体結合性エピトープに関係し、その突然変異はポリペプチドの抗体結合性、特にIgE結合性を変更する作用、好ましくは減少する作用を有する。それゆえ、第1の面において、本発明は、グループ1ダニポリペプチドの変異型を提供し、ここで変異型の成熟ポリペプチドは下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる: 配列番号1のA10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98-Q101、R104-P106、Q109-I113、A132-D146、D148、R151、I158-Q166、N179、A180、G182-D184、A205、I208または選択的に成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98-101、104-106、109-113、132、144-146、148、151、158-166、179-180、182-184、205、208。
【００２２】
特に、前記変異型はIgE結合性を減少しており、より詳細には保護的応答を誘導する保存された免疫原性を組み合わせて有する (上を見よ)。なおより好ましくは、変異型は、天然グループ1ダニポリペプチドに比較して、ヒトを包含する、暴露され動物において変更された免疫原性プロファイルを有する。
それ以上の面において、本発明は、本発明の変異型をコードするヌクレオチド配列; 宿主細胞における変異型の産生を指令する1または2以上の制御配列に作用可能に連鎖された、変異型をコードするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオチド構築物; 本発明のヌクレオチド構築物を含んでなる組換え発現ベクター; および本発明のヌクレオチド構築物を含んでなる組換え宿主細胞を提供する。
【００２３】
なお他の面において、本発明は、本発明の変異型を製造する方法を提供する:
(a)  変異型の産生を促す条件下に本発明の組換え宿主細胞を培養し、そして
(b)  変異型を回収する。
なお他の面において、本発明は、本発明の変異型と、薬学上許容される担体とを含んでなる組成物、および本発明の変異型を薬学上許容される担体と混合することを含んでなるこのような医薬組成物を製造する方法を提供する。
なお他の面において、本発明は、薬剤として使用する本発明の変異型または組成物を提供する。
【００２４】
なお他の面において、本発明は、免疫学的障害を治療する薬剤を製造するための本発明の変異型または組成物の使用を提供する。
なお他の面において、本発明は、疾患を治療するための本発明の変異型または組成物の使用を提供する。
なお他の面において、本発明は、免疫学的疾患を治療するための本発明の変異型または組成物の使用を提供する。
なお他の面において、本発明は、固体支持体上に固定化された本発明の変異型を含んでなるキットを提供する。
【００２５】
配列表
この出願は配列表の形態で情報を含有し、この配列表は出願に添付され、また、この出願とともにデータキャリアで提出された。データキャリアの内容は完全に引用することによって本明細書の一部とされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な説明
定義
用語 「天然ポリペプチド」 は、本明細書において使用するとき、本質的に天然に存在する形態のポリペプチドとして理解すべきである。天然ポリペプチドは、例えば、野生型ポリペプチド、すなわち、天然源から単離されたポリペプチド、天然源と異なる宿主生物における発現によりまたはポリペプチド合成により遺伝子操作を介して得られた天然に存在する形態のポリペプチドであることができる。
【００２７】
「エピトープ」または 「B細胞エピトープ」 は、この関係において使用するとき、抗体と組み合わせるか、あるいは抗体と結合できる複合抗原上の抗原決定基または構造区域である。それは実際に不連続であることができるが、一般に1 kD以下 (約10アミノ酸以下) の大きさを有する。この大きさは、エピトープおよびポリペプチドに依存して、3〜10アミノ酸または5〜10アミノ酸またはさらに7〜10アミノ酸であることができる。
【００２８】
「エピトープパターン」は、本明細書において使用するとき、抗体結合性ペプチドのコンセンサス配列として理解すべきである。例はパターンA R R * Rである。記号中の符号「*」は、整列された抗体結合性ペプチドが第2アルギニンと第3アルギニンとの間に非コンセンサス部分を含むことを示す。その部分は任意のアミノ酸またはわずかのアミノ酸または非アミノ酸であることができる。エピトープパターンは、複合抗原上のエピトープおよび最小エピトープを同定するために使用される。
【００２９】
用語 「アンカーアミノ酸」 は、本明細書において使用するとき、エピトープパターンを規定するために使用される単一特異的抗体により結合されたすべてのペプチド中に存在するエピトープパターンの保存された個々のアミノ酸として理解すべきである。通常、また、アンカーアミノ酸は完全なポリペプチド上の最小エピトープのアミノ酸であろう。
ポリペプチドの「抗原性」は、この関係において、抗体、例えば、IgEおよび/またはIgGおよび/または他の免疫グロブリンクラスの抗体に結合するその能力を示す。ポリペプチド 「IgE抗原性」 は、本明細書において使用するとき、IgE抗体に結合するその能力を示す。
【００３０】
ポリペプチドの「免疫原性」は、ヒトを包含する、暴露された動物における抗体産生および免疫学的反応を刺激するその能力を示す。
ポリペプチドの「アレルゲン性」は、ヒトを包含する、暴露された動物におけるIgE抗体産生およびアレルギー感作を刺激するその能力を示す。
用語 「親」 または 「親グループ1ダニポリペプチド」 は、本発明による突然変異の導入前のグループ1ダニポリペプチド (また、グループ1ダニアレルゲンと呼ぶ) として理解すべきである。特に、親グループ1ダニポリペプチドは天然グループ1ダニポリペプチドである。
【００３１】
グループ1ダニポリペプチド
この分野、例えば、WO 01/29078において記載されているように、ダニはいくつかのクラスまたはグループのアレルゲンを産生し、それらの1つはグループ1アレルゲンとして知られている。グループ1アレルゲンは、かなりの交差反応性を示し、下記において見出される: デルマトファゴイデス・プテロニッシヌス (Dermatophagoides pteronyssinus)、デルマトファゴイデス・ファリネ (Dermatophagoides farinae)、デルマトファゴイデス・シボネイ (Dermatophagoides siboney)、デルマトファゴイデス・ミクロセウス (Dermatophagoides microceaus)、ブロミア・トロピカリス (Blomia tropicalis) およびエウログリフス・マイネイ (Euroglyphus maynei)、例えば、下記の文献を参照のこと：Thomas 他、1998、Allergy 53、821-832。
【００３２】
グループ1ダニアレルゲンは、アクチニジン、パパイン、カテプシンHおよびカテプシンBを包含するシステインプロテアーゼの科と有意な相同性を有し、これはそれらがグループ1ダニシステインプロテアーゼと呼ばれる理由である。グループ1ダニアレルゲンはダニの糞中に見出され、そしてダニ腸管中で消化酵素として機能すると考えられる。
【００３３】
異なるダニからのグループ1アレルゲンは高度に相同性の、ほぼ25キロダルトン (kD) の分泌糖タンパク質であり、これらは成熟形態にプロセシングされるプレプロタンパク質として細胞により合成される。デルマトファゴイデス・ファリネ (D. farinae)、デルマトファゴイデス・プテロニッシヌス (D. pteronyssinus)、およびエウログリフス・マイネイ (E. maynei) のグループ1タンパク質は、例えば、約80%の同一性を共有する。特に、デルマトファゴイデス・ファリネ (D. farinae) およびデルマトファゴイデス・プテロニッシヌス (D. pteronyssinus) からのグループ1アレルゲン (また、それぞれDer f 1およびDer p 1タンパク質と呼ぶ) は、IgEおよびIgGの結合において広範な交差反応性を示す。ダニアレルギーである患者において、個体のほぼ80%〜90%はグループ1アレルゲンに対して反応性であるIgEを有する (Thomas、Adv. Exp. Med. Biol. 409、pp. 85-93、1996)。
【００３４】
こうして、グループ1ダニアレルゲンは下記のこの分野において知られている下記の天然ポリペプチドを包含する: デルマトファゴイデス・プテロニッシヌス (Dermatophagoides pteronyssinus) から得られるDer p 1 (NCBI受け入れ番号: P08176、配列番号1)、デルマトファゴイデス・ファリネ (D. farinae) から得られるDer f 1 (NCBI受け入れ番号: P16311、配列番号2)、デルマトファゴイデス・ミクロセウス (Dermatophagoides microceaus) から得られるEur m 1 (NCBI受け入れ番号: P25780、配列番号3)、デルマトファゴイデス・ミクロセウス (Dermatophagoides microceaus) から得られるDer m 1 (NCBI受け入れ番号: P16312、配列番号4)、およびブロミア・トロピカリス (Blomia tropicalis) から得られるBlo t 1 (NCBI受け入れ番号: Q95PJ4、配列番号5)。
【００３５】
こうして、この特許の関係において、用語 「グループ1ダニアレルゲン」 は、特に天然グループ1ダニアレルゲンを包含するが、また天然グループ1アレルゲンに対する相同体、例えば、N-グリコシル化モチーフが崩壊されている組換え変異型、および前述のダニアレルゲンのハイブリッド、例えば、この分野において記載されているようにファミリーシャフリングにより作られたハイブリッドを包含する (J. E. Ness、Nature Biotechnology Vol. 17、pp. 893-896、1999)。
【００３６】
グループ1ダニポリペプチドにおけるエピトープパターンおよびエピトープのシリコ同定
グループ1ダニポリペプチドは、WO 00/26230およびをWO 01/83559に詳細に開示されている登録シリコ (silico) エピトープマッピングツールを使用してエピトープマッピングすることができる。簡単に述べると、このツールはエピトープパターンのデータベース (抗タンパク質抗体に特異的に結合することが知られている、ペプチド配列の入力から決定される) と、エピトープパターンのデータベースに対して所定のタンパク質の三次元構造を解析するアルゴリズムとを含んでなる。これにより、そのタンパク質上の可能なエピトープ、およびエピトープの部分であるべきタンパク質配列中の各アミノ酸の優先性が決定される。
【００３７】
抗体結合性ペプチドの同定
抗体結合性ペプチドは多数の異なる方法により同定することができる。1つは既知の配列をもつ多数のペプチドを合成し、そして、例えば、ELISAまたは他の免疫化学的アッセイにおいて、抗体に結合するそれらの能力を試験することである。このようなデータは文献中に非常に豊富に入手可能である。
特定の有効な方法は、多数の異なるランダムペプチドのライブラリーを調製し、そして抗体に十分にかつ特異的に結合するもののみを実験的に選択することである (すなわち、抗体を発生させたタンパク質と対抗させることができる)。ファージ展示技術は、この抗体結合性ペプチドを見出す方法に十分に適する。
【００３８】
ファージ展示系において、必要なアミノ酸配列をコードする配列をファージ表面上に展示されたタンパク質をコードするファージ遺伝子の中に組込む。こうして、ファージはハイブリッドタンパク質を作り、その表面上に展示し、ここでそれは特異的ターゲット因子と相互作用することができる。各ファージが決定された長さをもつ1つの特異的配列のためのコドンを含有するとすると、平均ファージ展示ライブラリーは108〜1012の異なるランダム配列を発現することができる。展示された配列があるエピトープに類似する場合、そのファージはエピトープ特異的抗体により選択されることができる。こうして、各々がそれらの1つのハイブリッドタンパク質を発現する、多数のファージの集団から特異的ファージを選択することが可能である。
【００３９】
ファージ展示系により提示された (オリゴ)ペプチドのアミノ酸配列は、同定すべきエピトープの有意な部分を提示するために十分な長さを有することが重要である。オリゴペプチドは5〜25アミノ酸、好ましくは少なくとも8アミノ酸、例えば、9アミノ酸を有することができる。
【００４０】
オリゴペプチドとの反応に使用する抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであることができる。特に、同定されるエピトープがIgEエピトープ、すなわち、IgEを誘導しかつ結合するエピトープであることを保証するために、抗体はIgE抗体であることができる。また、抗体は単一特異的であることができ、これはある種のタンパク質に対するそれらの特異性に従い、抗体を単離できることを意味する。ポリペプチドのエピトープに関するより広い知識を得るために、シリコマッピングツールにおいて使用すべき抗体結合性ペプチドに関するデータを構成するために、ポリクローナル抗体は好ましい。
これらの反応性ペプチドは、抗体に対する反応性を有するために、完全なポリペプチド上のエピトープの外観にある程度まで類似する。
【００４１】
反応性ペプチドからのエピトープパターンの同定
例えば、ファージディスプレイにより、同定された反応性(オリゴ)ペプチドを比較し、整列させて、共通のエピトープパターンを同定し、次いでこれらを三次元ポリペプチド上の抗体結合性エピトープの同定に使用することができる。
整列において、アミノ酸に対する保存的代替物、例えば、アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩、リシンおよびアルギニン、セリンおよびトレオニンは1つとしてまたは等しいとして考慮する。こうして、整列は多数のパターンを生じ、これらはペプチドの選択した数の残基に依存する。例えば、7マーのペプチドを使用すると、パターンは下記の形態を有することができる:
【００４２】
X X * * X X X、
ここで記号中の符号「*」は、任意のアミノ酸またはアミノ酸のグループまたは非アミノ酸であることができる非コンセンサス部分を示すが、Xは下記の13残基型の1つである: AG、C、DE、FY、H、IL、KR、M、NQ、P、ST、V、およびWであり、ここで対AG、DE、FY、IL、KR、NQ、STは保存的代替物であり、等しいとして考慮する。したがって、3ペプチド、例えば、
A K S N N K R
A K S M N K R
A K T P N K K
【００４３】
は[AG] [KR] [ST] * [NQ] [KR] [KR] のパターンをつくり、ここでAG KR STおよびNQ KR KRは3ペプチドが共有するコンセンサス残基であり、こうしてエピトープパターンはAG KR ST *  NQ KR KRである。これらのパターンは、最も少ない可能なパターンにより、反応性(オリゴ)ペプチドの完全な組 (例えば、ファージ展示および抗体反応により、得られた) を記載するために選択される。
【００４４】
エピトープパターンは反応性ペプチドから直接決定ことができる。例えば、７マーの反応性ペプチドのライブラリーを作る場合、保存的代替物を考慮して、後述するようにエピトープマッピングアプローチにおけるエピトープパターンとして、各異なる7マーの反応性ペプチドを使用できる。
また、重複パターンを除去しおよび/またはこの分野において知られている実験デザインを使用することによって、エピトープマッピングにおいて検査すべきエピトープパターンの数を減少することができる (実施例1参照)。
同定されたエピトープパターン内で、いくつかのアミノ酸は保存的であり、アンカーアミノ酸と呼ばれる。アンカーアミノ酸は反応性ペプチドのすべてまたは大部分において再発する。
【００４５】
エピトープマッピングのアルゴリズム
エピトープパターンが同定されたとき、それらを引き続いて問題のポリペプチドのアミノ酸配列の三次元座標と比較して、1または2以上のコンセンサス配列または1または2以上のエピトープパターンに対応する、ポリペプチド表面上の残基の組み合わせを同定する。このようにして、抗体結合のために重要である、アミノ酸残基を同定することができる。
いったん1または2以上のエピトープパターンが同定されると、三次元構造が既知であるポリペプチドをエピトープパターンに合致するエピトープについて解析することができる。下記の方法においてポリペプチド表面をサーチすることによって、ポリペプチド上のエピトープの発見は達成される:
【００４６】
(1)  ポリペプチド中のすべてのアミノ酸について、(a) アミノ酸の型がエピトープパターンの最初のアミノ酸に合致するかどうかおよび (b) アミノ酸を免疫学的に相互作用性とするために、表面のアクセス可能性が選択した閾値より大きいか、あるいはそれに等しいかどうか検査する。1 (a) および1 (b) を満足するアミノ酸を選択する。
(2)  工程1において選択されたアミノ酸の選択した距離 (例えば、10オングストローム) の範囲内のすべてのアミノ酸について、(a) アミノ酸の型がパターンの第2のアミノ酸に合致するかどうかおよび (b) アミノ酸を免疫学的に相互作用性とするために、表面のアクセス可能性が選択した閾値より大きいか、あるいはそれに等しいかどうか検査する。
【００４７】
2 (a) および2 (b) を満足するアミノ酸を選択する。
(3)  工程2において選択されたアミノ酸の選択した距離 (例えば、10オングストローム) の範囲内のすべてのアミノ酸について、(a) アミノ酸の型がパターンの第3のアミノ酸に合致するかどうかおよび (b) アミノ酸を免疫学的に相互作用性とするために、表面のアクセス可能性が選択した閾値より大きいか、あるいはそれに等しいかどうか検査する。3 (a) および3 (b) を満足するアミノ酸を選択する。
手順 (工程3) をエピトープパターンのコンセンサス配列中のすべてのアミノ酸について反復する。C-アルファ原子の座標はアミノ酸の空間的ポジショニングを規定する。表面の溶媒アクセス可能性は、特定の残基型について平均の百分率で記載される (実施例2参照)。
【００４８】
エピトープパターン中のすべてのアミノ酸について合致するアミノ酸がポリペプチドの構造中に見出される場合、エピトープが発見されたことが非常に強く示される。
しかしながら、また、エピトープの大きさが満足すべき大きさであること、すなわち、2つの残基が所定の閾値、通常25Å以下であることをチェックする。
発見されたエピトープをそれらのアクセス可能な表面区域に従い等級づけかつ秤量して、ツールの予測可能性をさらに改良することができる。
【００４９】
最後に、すべての可能なエピトープが問題のタンパク質についてマッピングされたとき、エピトープパターン中にタンパク質の各アミノ酸が出現する回数を加算することによって、そのアミノ酸についてスコアを与えることができる。このスコアは、そのアミノ酸の修飾 (置換、挿入、欠失、グリコシル化または化学的複合化) がより低い抗原性をもつ変異型を生ずる確度の指示である。次いで、このスコアに従いタンパク質のすべてのアミノ酸を等級づけ、そして最高のスコアをもつものを突然変異誘発のために選択することができる。
【００５０】
既知の反応性ペプチドのサブセットがエピトープパターンの構築し、こうしてエピトープのマッピングを実施するためのデータの組として含まれるように、エピトープマッピングツールを調節することができる。例えば、IgE抗体 (IgGまたは他の抗体よりむしろ) に対して反応性であるペプチドを含めるように選択するだけでよいか、あるいはヒト抗体およびその他に対して反応性であるペプチドのみを含めることができる。目標とするタンパク質に対して反応性であるペプチドのみを含めるように選択して、いっそう特異的な応答を得ることができる; しかしながら、一般に、引き続いて任意のタンパク質に対して発生させた抗体に対して反応性であるペプチドを含める。
【００５１】
問題のタンパク質について三次元構造の座標が入手できない場合、問題のタンパク質の主要な配列に対して直接エピトープパターンをマッピングすることができる。
すべての上記情報から、このエピトープマッピングツールを使用してエピトープは好都合に決定されることが明らかである。
さらに、シリコエピトープマッピングツールを使用して、1つのアミノ酸残基の突然変異により、全体的によりわずかのエピトープを有する新しい変異型が生ずるかどうかを予測することができる。こうして、19の可能な置換のいくつかまたはすべてを所定の位置において試験することができ、これらの提案された変異型の各々のモデル構造についてエピトープマッピング手順を反復し、1または2以上の最良の変異型を突然変異により構築し、そして実験的に試験することができる。
【００５２】
グループ1ダニポリペプチドの同定されたエピトープ
エピトープマッピングツールを使用して、本発明者らは、驚くべきことには、下記から成る位置に対応するアミノ酸は天然グループ1ダニポリペプチドのエピトープ中に含まれることを発見した: 配列番号1のA10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98-Q101、R104-P106、Q109-I113、A132、I144-D146、D148、R151、I158-Q166、N179、A180、G182-D184、A205、I208または選択的に成熟Der p 1ポリペプチド、特に配列番号1のそれの10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、80、84、86、87、92、93、96、98-101、104-106、109-113、132、144-146、148、151、158-166、179-180、182-184、205、208。グループ1ダニポリペプチドは前述したように高度に相同的であり、そして種々の源のグループ1ダニポリペプチド中の対応する位置はこのような位置を配列番号1と整列させることによって容易に発見することができる。
【００５３】
グループ1ダニポリペプチド変異型
突然変異のための位置の選択
いったんポリペプチドのエピトープが決定されると、エピトープ中に含まれる1または2以上のアミノ酸を突然変異させることによって、修飾された抗原性をもつポリペプチドの変異型を作ることができる。この関係において、突然変異はアミノ酸残基の欠失および/または置換および/またはその残基前後の1または2以上のアミノ酸の挿入を含む。
【００５４】
アレルギーの治療のために、ワクチンとして適当なポリペプチド変異型を提供するとき、IgEエピトープを変更してIgEの結合を減少させると同時に、ヒトおよび動物における免疫応答を引き起こす変異型の能力を維持することが特に望ましく、それゆえポリペプチドは親ポリペプチドの三次元のコンフォメーションを保持することが望ましい。さらに、変異型はT細胞を十分に、好ましくは親ポリペプチドのレベルでまたはよりよく刺激できることが特に望ましい。なおさらに、変異型はヒトおよび動物においてIgG応答を引き起こすことができることが望ましい。
【００５５】
同定されたエピトープは、そのエピトープの少なくとも1つのアミノ酸を置換することによって、突然変異させことができる。特定の態様において、少なくとも1つのアンカーアミノ酸を突然変異させる。突然変異はしばしば異なる大きさ、親水性、極性および/または酸性度をもつアミノ酸との置換、例えば、大きいアミノ酸の交換における小さいアミノ酸、疎水性アミノ酸の交換における親水性アミノ酸、非極性アミノ酸の交換における極性アミノ酸および酸性アミノ酸の交換における塩基性アミノ酸であろう。
【００５６】
他の突然変異はエピトープの少なくとも1つのアミノ酸の挿入または欠失、特にアンカーアミノ酸の欠失であることができる。さらに、エピトープはいくつかのアミノ酸の置換、および他のアミノ酸の欠失および/または挿入により突然変異させことができる。
実施される1または2以上の突然変異は当業者によく知られている標準技術により実施することができる (例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、NY)。
【００５７】
突然変異誘発はスパイクド突然変異誘発であることができ、これは部位特異的突然変異誘発の形態であり、ここで1または2以上の位置においてオリゴヌクレオチドの混合物を使用して、使用するプライマーが合成されている。
ヌクレオチド置換は下記の文献に一般的に説明されている: Ford 他、1991、Protein Expression and Purification 2、pp. 95-107。
【００５８】
本発明のポリペプチド変異型は、親ポリペプチド中の下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる、親グループ1ダニポリペプチドの変異型に関する: 配列番号1のA10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、13、29、30、32、46、47、54、55、64、66、67、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、99、100、101、104、105、106、109、110、111、112、113、132、144、145、146、148、151、158、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208。
【００５９】
上記の特定の態様において、本発明の変異型ポリペプチドは、下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる: 配列番号1のA10、A12、G29、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、F111、G112、I113、A132、I144、K145、D146、I158、I159、Q160、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、29、30、32、46、47、54、55、64、66、73、75、I80、84、86、87、92、Y93、96、98、100、101、104、105、106、110、111、112、113、132、144、145、146、158、159、160、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208。
【００６０】
なお特定の態様において、本発明の変異型ポリペプチドは、下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる: 配列番号1のA10、A12、G29、G30、G32、A46、S54、L55、D64、A66、G73、T75、Q84、N86、G87、S92、Y96、E100、Q101、R104、R105、P106、R110、I113、A132、I144、K145、D146、D162、N163、G164、Y165、N179、A180、G182、V183、D184およびA205または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、29、30、32、46、55、64、66、73、75、84、86、87、92、96、100、101、104、105、106、110、113、132、144、145、146、162、163、164、165、179、180、182、183、184および205。
【００６１】
特に、変異型は親グループ1ダニポリペプチドに比較して変更された抗体結合性プロファイルを有し、より詳細には変異型は減少したIgE結合性を有し、より詳細には保護的応答を誘導する保存された免疫原性を併有する (上を見よ)。なおより好ましくは、変異型は、親グループ1ダニポリペプチドに比較して、ヒトを包含する、暴露された動物において変更された免疫原性プロファイルを有する。
さらに、変異型は、親グループ1ダニポリペプチドに比較して、特に変更されたIgE抗原性を有する。
【００６２】
なおさらに、変異型は、親グループ1ダニポリペプチドに比較して、実施例5における手順により測定して、特に少なくとも同一のT細胞刺激作用を有する。
なおさらに、変異型は、親グループ1ダニポリペプチドに比較して、ヒトを包含する暴露された動物において変更された免疫原性応答を誘導する。
なおさらに、変異型は、親グループ1ダニポリペプチドに比較して、ヒトにおいて変更された免疫原性応答を誘導する。
【００６３】
なお他の特定の態様において、本発明の変異型ポリペプチドは、下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる: 配列番号1のA10、A12、G30、G32、A46、Y47、S54、L55、D64、A66、S67、G87、S92、A98、R99、E100、Q101、R105、R110、F111、G112、I113、I144、K145、D146、D148、R151、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、G182、V183、D184、A205、I208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、30、32、46、47、54、55、64、66、67、87、92、98、99、100、101、105、110、111、112、113、144、145、146、148、151、159、160、161、162、163、164、165、166、179、180、182、183、184、205、208。
【００６４】
上記のなお他の特定の態様において、本発明の変異型ポリペプチドは、下記から成る位置または前記位置に対応する1または2以上の突然変異を含んでなる: 配列番号1のA10、A12、G32、S54、L55、A66、S67、G87、A98、R99、F111、G112、I113、I144、D146、D148、I159、R161、G164、Q166、A180、D184、A205およびI208または成熟Der p 1ポリペプチドの10、12、32、54、55、66、67、87、98、99、111、112、113、144、146、148、159、161、164、166、180、184、205および208。
【００６５】
減少した抗原性を直接提供する突然変異
減少した抗原性を有する突然変異体を提供するとき、親グループ1ダニポリペプチドのエピトープ中のアミノ酸を異なる性質を有するアミノ酸で置換することは特に興味あることであろう。それゆえ、特定の態様において、本発明の変異型ポリペプチドは下記の突然変異から成る群から選択される突然変異を含んでなる:
V、Y、Q、N、EおよびDから成る群から選択される残基で置換された10;
V、Y、Q、NおよびFから成る群から選択される残基で置換された12;
V、Y、E、D、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された32;
N、A、T、VおよびQから成る群から選択される残基で置換された54;
V、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された55;
【００６６】
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された66;
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された67;
V、Y、DおよびEから成る群から選択される残基で置換された87;
V、N、Q、DまたはEから成る群から選択される残基で置換された98;
H、Y、V、N、Q、EおよびDから成る群から選択される残基で置換された99;
V、HおよびWから成る群から選択される残基で置換された111;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換された112;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換された113;
A、G、Y、N、QまたはVから成る群から選択される残基で置換された144;
Y、H、V、I、L、NおよびQから成る群から選択される残基で置換された146;
Y、V、IおよびLから成る群から選択される残基で置換された148;
【００６７】
V、Y、AおよびGから成る群から選択される残基で置換された159;
A、G、VおよびYから成る群から選択される残基で置換された161;
V、HおよびWから成る群から選択される残基で置換された164;
S、W、YおよびFから成る群から選択される残基で置換された166;
V、N、QおよびYから成る群から選択される残基で置換された180;
V、MおよびYから成る群から選択される残基で置換された184;
V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換された205;
A、G、V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換された208；
【００６８】
前記ナンバリングは成熟Der p 1ポリペプチドの位置であるか、あるいは前記位置に対応する。
なお他の特定の態様において、本発明の変異型ポリペプチドは、下記の突然変異から成る群から選択される突然変異を含んでなる:
【００６９】
V、Y、Q、N、EおよびDから成る群から選択される残基で置換されたA10;
V、Y、Q、NおよびFから成る群から選択される残基で置換されたA12;
V、Y、E、D、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたG32;
N、A、T、VおよびQから成る群から選択される残基で置換されたS54;
V、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたL55;
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたA66;
V、H、Y、D、E、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたS67;
V、Y、DおよびEから成る群から選択される残基で置換されたG87;
V、N、Q、DまたはEから成る群から選択される残基で置換されたA98;
H、Y、V、N、Q、EおよびDから成る群から選択される残基で置換されたR99;
V、HおよびWから成る群から選択される残基で置換されたF111;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換されたG112;
V、H、N、Q、E、DおよびYから成る群から選択される残基で置換されたI113;
【００７０】
A、G、Y、N、QまたはVから成る群から選択される残基で置換されたI144;
Y、H、V、I、L、NおよびQから成る群から選択される残基で置換されたD146;
Y、V、IおよびLから成る群から選択される残基で置換されたD148;
V、Y、AおよびGから成る群から選択される残基で置換されたI159;
A、G、VおよびYから成る群から選択される残基で置換されたR161;
V、HおよびWから成る群から選択される残基で置換されたG164;
S、W、YおよびFから成る群から選択される残基で置換されたQ166;
V、N、QおよびYから成る群から選択される残基で置換されたA180;
V、MおよびYから成る群から選択される残基で置換されたD184;
V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換されたA205;
A、G、V、WおよびHから成る群から選択される残基で置換されたI208；
【００７１】
前記ナンバリングは配列番号1の位置であるか、あるいは前記位置に対応する。
それ以上の態様において、親グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号1に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはDer p 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
それ以上の態様において、変異型グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号1に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはDer p 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
【００７２】
それ以上の態様において、親グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号2に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはEur m 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
それ以上の態様において、変異型グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号2に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはEur m 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
【００７３】
それ以上の態様において、親グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号3に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはDer f 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
それ以上の態様において、変異型グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号3に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはDer f 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
【００７４】
それ以上の態様において、親グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態でDer m 1に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細にはDer m 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
それ以上の態様において、変異型グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態でDer m 1に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細にはDer m 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
【００７５】
それ以上の態様において、親グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号5に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはBlo t 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
それ以上の態様において、変異型グループ1ダニポリペプチドはその成熟形態で配列番号5に対して少なくとも80%の同一性、特に少なくとも90%の同一性、特に95%の同一性、より詳細には98%の同一性、より詳細には配列番号1に対して100%の同一性またはBlo t 1に対して100%の同一性を表示する配列を有する。
【００７６】
新しいエピトープを作るか、あるいは現存するエピトープが重複されるエピトープを排除するためにタンパク質操作に関する危険は、問題のタンパク質の三次元構造中の所定位置における計画した突然変異を発見されたエピトープパターンに対して試験し、これによりポリペプチドの必要な性質を得ることが可能である突然変異を各位置について同定することによって減少される。
【００７７】
本発明の特定の態様において、各々が導入された1または2以上の交換されたアミノ酸を有する種々の突然変異体のライブラリーを確立し、そしてワクチンとして最良の作用を示すと同時に副作用が最小である変異型を選択することは有利であろう。種々のライブラリーはこの分野において知られているある範囲の技術により確立することができる (Reetz MT、Jaeger KE、Biocatalysis - from Discovery to Application、編者Fressner WD、Vol. 200、pp. 31-57 (1999); Stemmer、Nature Vol. 370、pp. 389-391、1994; ZhaoおよびArnold、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 94、pp. 7997-8000、1997; またはYano 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 95、pp. 5511-5515、1998)。
【００７８】
より好ましい態様において、置換は下記の工程を含んでなる方法により発見される: 1) ある範囲の置換、付加、および/または欠失をいくつかのエピトープを含めて列挙する、2) アミノ酸配列中のこれらは変化のランダム化サブセットをターゲット遺伝子の中に、例えば、スパイクド突然変異誘発により導入するライブラリーを設計する、3) ライブラリーを発現させ、好ましい変異型を選択する。最も好ましい態様において、この方法にスクリーニングの第1ラウンドからのヒットのスクリーニングおよび/またはファミリーシャフリングの追加のラウンドを補助する (J. E. Ness 他、Nature Biotechnology Vol. 17、pp. 893-896、1999)。
【００７９】
エピトープ区域中のアミノ酸に増加したグリコシル化を提供する突然変異
他のアプローチにおいて、翻訳後の認識部位がエピトープ区域中に導入され、そして対応する翻訳後の修飾を可能とする適当な宿主生物中でタンパク質変異型が発現されるように、突然変異をデザインする。これらの翻訳後の修飾はエピトープをシールドし、それゆえタンパク質主鎖に関してポリペプチド変異型の免疫原性を低下する働きすることができる。翻訳後の修飾は、グリコシル化、リン酸化、N-末端のプロセシング、アシル化、リボシル化および硫酸化を包含する。すぐれた例はN-グリコシル化である。N-グリコシル化はAsn-Xaa-Ser、Asn-Xaa-Thr、またはAsn-Xaa-Cysの部位に見出され、ここでXaa残基およびトリ-ペプチドコンセンサス配列後のアミノ酸はプロリンではない (T. E. Creighton、“Proteins - Structures and Molecular Properties”、第2版、W. H. Freeman and Co. 、New York、1993、pp. 91-93)。
【００８０】
こうして、主鎖タンパク質の配列中にこのような認識部位を導入することが望ましい。グリコシル化されたポリペプチド変異型のグリコシル鎖の特異的特質は、タンパク質および宿主細胞に依存して直鎖状または分枝鎖状であることができる。他の例はリン酸化である: 認識配列arg - arg - (xaa)n - ser (ここでn = 0、1、または2)(これはcAMP依存性キナーゼによりリン酸化できる) をもつセリンリン酸化部位、または認識配列 - lys/arg - (xaa)3 -asp / glu - (xaa)3 - tyr (これは通常チロシン特異的キナーゼによりリン酸化できる) をもつチロシンリン酸化部位を導入するように、タンパク質配列を修飾することができる (T. E. Creighton、“Proteins - Structures and Molecular Properties”、第2版、W. H. Freeman、New York、1993)。
【００８１】
エピトープ区域中のアミノ酸にポリマーの共有結合複合化を提供する突然変異
ポリペプチドの抗原性を変化させる突然変異を作る他の方法は、エピトープ中またはその付近のアミノ酸にポリマーを反応または結合させ、こうしてアンカーアミノ酸に対するアクセスをブロックまたは遮断し、こうして抗体またはレセプターをそれらのアミノ酸に結合させることである。ポリマーとの複合化に適当なアミノ酸が親ポリペプチド中に存在しない場合、適当な突然変異は1または2以上のアミノ酸の挿入であり、前記アミノ酸はポリマー接合のための取り付け部位および/または基および/またはアミノ酸である。
【００８２】
どのアミノ酸が置換または挿入されるかは、原理的に、適用すべき結合化学に依存する。共有結合の生物複合体を製造する化学は下記文献中に見出される: “Bioconjugate Techniques”、Hermanson G. T. (1996)、Academic Press Inc. 、これは引用することによって本明細書の一部とされる。
特定の態様において、活性化されたポリマーをエピトープ区域中またはその付近のアミノ酸に複合化させる。
保存的置換はポリペプチドに対する置換の衝撃を制限することを保証するので、ポリペプチドを複合化すべきとき、ポリペプチド中に保存的置換を作ることが好ましい。
【００８３】
追加のアミノ基を提供する場合、これはアルギニンのリシンへの置換により実施することができ、ここで両方の残基は正に帯電しているが、遊離アミノ基を有するリシンのみが取り付け基として適当である。
追加のカルボン酸基を提供する場合、保存的置換は、例えば、アスパラギンからアスパラギン酸またはグルタミンからグルタミン酸への置換である。これらの残基は、酸性残基上に存在するカルボキシル基を除外して、大きさおよび形状が互いに類似する。
SH基を提供する場合、保存的置換はトレオニンまたはセリンのシステインへの置換により実施することができる。
【００８４】
変更された抗原性を有する変異型の検証
エピトープのシリコ決定により予測されるように、エピトープ中に含まれるアミノ酸の突然変異はポリペプチドの抗原性を変化させるであろう。しかしながら、変異型の抗原性、すなわち、抗体結合性および免疫原性に対する突然変異の定量的作用は、in vivo またはin vitro モデル系を使用して適当に決定される。それを使用するために、問題のポリペプチド変異型は慣用技術によりより大きい規模で発現させ、精製することができる。次いで、システインプロテアーゼ活性アッセイにより、機能性および特異的活性を試験して、変異型が三次元構造を保持していることを保証することができる。
【００８５】
In vitro 系は、ほこりダニアレルギー患者または暴露された動物からの血清中のIgEに対する結合性、ほこりダニアレルギー患者からの一次T細胞またはほこりダニアレルギー患者 (Current Protocols in Immunology、chapter 7および9) または暴露された動物から発生したT細胞クローンまたはT細胞系統のサイトカイン発現のプロファイルまたは増殖応答、およびほこりダニアレルギー患者の好塩基球からのヒスタミン放出を測定するアッセイを包含する。
【００８６】
IgE抗体結合性は下記のアッセイにより詳細に検査することができる: 例えば、直接的または競合的ELISA (C-ELISA)、ほこりダニアレルギー患者の好塩基球、またはほこりダニアレルギー患者からのIgE含有血清とインキュベートした全血からのIgE除去好塩基球についてのヒスタミン放出アッセイ、あるいは他の固相イムノアッセイまたは細胞アッセイ (実施例9参照)。全血からストリッピングした好塩基球の使用は下記の文献に記載されている: Knol EF、Kuijpers TW、Mul FP、Roos D; ヒト好塩基球の刺激は溶血性凝集を生ずる。脱顆粒に対して独立の応答。Stimulation of human basophils results in homotypic aggregation. A response independent of degranulation. J. Immunol. 1993 Nov. 1; 151(9): 4926-33; およびBudde IK、Aalbers M、Aalberse RC、van der Zee JS、Knol EF; IgE依存性ヒスタミン放出因子に対する反応性はモノマーIgEのためである。Allergy 2000 Jul; 55(7): 653-7。
【００８７】
特定の態様において、IgEに結合するポリペプチド変異型の能力は、もとのまたは親グループ1ダニポリペプチドの結合能力に比較して、少なくとも3倍減少し、好ましくは5倍減少し、より好ましくは10倍減少し、またはより好ましくは50倍減少する。
それ以上の態様において、ほこりダニに対してアレルギー性の被検体からの好塩基球中のヒスタミン放出を誘導するポリペプチド変異型の能力は、親グループ1ダニポリペプチドのそれに比較して、少なくとも3倍減少し、好ましくは10倍減少し、より好ましくは50倍減少する。
【００８８】
それ以上の態様において、もとのまたは親グループ1ダニポリペプチドに対して以前に暴露されたヒトを包含する動物からのリンパ球中で再生T細胞応答を引き起こすポリペプチド変異型の能力を測定する。応答の強さは親グループ1ダニポリペプチドのそれに匹敵するか、あるいはそれより大きいことが好ましい。
特定の態様において、 in vivo 検証は皮膚乱刺法 (SPT) を含んでなり、ここでほこりダニアレルギー被検体/個体をグループ1ダニポリペプチドの皮内または皮下注射に暴露し、本発明のポリペプチド変異型に応答する、膨疹および発赤反応の直径として測定した、IgE反応性を、親グループ1ダニポリペプチドのそれと比較する (Kronquist 他、Clin. Exp. Allergy 2000、Vol. 30、pp. 670-676)。
【００８９】
アレルギーおよびSITの動物モデル - 組成物の各々を使用する動物の実験的免疫化
本発明のポリペプチド変異型の in vivo 免疫原性は動物試験において適当に測定され、ここで試験動物をワクチン接種のアレルゲンポリペプチドに暴露し、応答を測定し、ターゲットアレルゲンまたは他の適当な参照の応答と比較する。免疫応答の測定は、試験動物からの血清IgG、IgEまたはT細胞のターゲットポリペプチドおよびポリペプチド変異型に対する反応性を比較することを含む。動物の免疫化は少なくとも2つの明確な方法で実施することができる: 自然動物および前感作動物 (ワクチン環境をよりよく刺激するために) について。本発明の関係において、ターゲット抗原に対する免疫グロブリンの親和性を試験する。
【００９０】
特定の態様において、変異型分子の投与後における動物のIgGおよび/またはIgG1および/またはIgG4の親和性を試験する。
本発明による方法において、試験動物は自然動物または前感作動物である。
モデル系の数は自然動物の使用に基づく。
特定の態様において、 in vivo 検証はマウスを鼻内経路により親ターゲットアレルゲンに暴露することを含んでなる。有効なin vivo 動物モデルはマウス鼻内試験 (MINT) モデルを包含する (Robinson 他、Fund. Appl. Toxicol. 34、pp. 15-24、1996)。
【００９１】
それ以上の特定の態様において、in vivo 検証は試験動物を気管内経路によりポリペプチド変異型に暴露することを含んでなる。有効な動物モデルはモルモット気管内 (GPIT) モデル(Ritz 他、Fund. Appl. Toxicol. 21、pp. 31-37、1993) およびラット気管内 (rat-IT) モデル (WO 96/17929、Novo Nordisk) を包含する。
それ以上の特定の態様において、in vivo 検証は試験動物を皮下的にターゲットアレルゲンおよびワクチン接種アレルゲン変異型に暴露することを含んでなる。適当なモデルはマウス皮下 (マウス-SC) モデル (WO 98/30682、Novo Nordisk) を包含する。
【００９２】
それ以上の特定の態様において、この方法は試験動物を腹腔内的に暴露することを含んでなる。ALK-Abellq (WO 02/40676) には、下記の方法が開示されている: マウスを免疫化したときIgG抗体を誘導するアレルゲン変異型 (カンバ花粉アレルゲンbet v 1の) の能力を評価する: BALB/Cマウスを関係するアレルギー変異型または対照で、14日の投与間隔で4回、腹腔内的に免疫化した。タンパク質を1.25 mg/mLのal-ヒドロゲル (AlOHゲル、1.3%、pH 8-8.4、Superfos Biosector) に対して複合化した。マウスを1または10 μgのタンパク質/投与で免疫化した。血液試料を第0日、14日、21日、35日、49日、および63日に抜き出し、rBet v 1被覆マイクロタイタープレートおよび検出抗体としてビオチニル化ウサギ抗マウスIgGを使用する直接ELISAにより分析した。
【００９３】
なお他の態様において、この方法は試験動物としてドナー特異的免疫性の産生を促進できるトランスジェニックマウスを使用することを含んでなる。このようなマウスはWO 01/15521 (Genencor International) に開示されている。
また、多数の研究において、動物モデルにおいてアレルギーワクチン接種組成物の効果が評価されてきており、ここで関係するアレルゲンに対して動物を感作し、次いでワクチン接種組成物に対して暴露した。
【００９４】
マウス: Li 他 (J. Allerg. Clin. Immunol. Vol. 112、pp. 159-167、2003) は、アレルギーワクチンの効能を評価するマウスに基づく系を開示している。マウスを食物アレルゲンで胃内感作し、処置を直腸内注射として導入する。別のアレルギーワクチン接種系において、Hardy 他 (AM J. Respir. Crit. Care Med. Vol. 167、pp. 1393-1399、2003) は、マウスを腹腔内注射により感作できること、および動物を麻酔してアレルギーワクチン化合物を気管内に投与できることを示している。Sudowe 他 (Gene Therapy Vol. 9、147-156、2002) は、マウスにおける腹腔内注射によりTH1またはTH2応答を産生できることを示している。
【００９５】
ラット: Wheeler 他 (Int. Arch. Allergy Immunol. Vol. 126、pp. 135-139、2001) は、ラットにアジュバントと一緒に皮下注射する、ラットのアレルギーモデルを開示している。次いで、これらの「アレルギー」ラットは、引き続いて実験ワクチン組成物を注射すると、アレルギーワクチン様応答を行うようにすることができる。
モルモット: Nakamoto 他 (Clin. Exp. Allergy Vol. 27、pp. 1103-1108、1997) は、モルモットをSITのモデル系として使用することを証明している。モルモットに腹腔内注射し、2回ブースター投与し、次いでそれらをワクチン化合物に対して暴露して、化合物、配合物、または適用モードの関数として抗体力価を測定することによって、アレルゲン性の減少を記録する。
【００９６】
複合化のためのヌクレオチド構築物、ベクター、宿主細胞、タンパク質変異型および複合化用ポリマーの製造
本発明によれば、当業者によく知られている慣用の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を使用することができる。このような技術は文献において完全に説明されている。例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook、Fritsch、およびManiatis、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New York (本明細書において「Sambrook 他、1989」) DNA Cloning : A Practical Approach Vol. IおよびII (D. N. Glover 編 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Galt 編 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. HamesおよびS. J. Higgins 編 (1985)); Transcription And Translation (B. D. HamesおよびS. J. Higgins 編 (1985)); Animal Cell Culture (R. I. Freshney 編 (1986)); Immobilized Cell And Enzymes (IRL Press (1986)); B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)。
【００９７】
特定の態様において、この方法は、WO 01/29078 (HESKA) に記載されているように、大腸菌 (E. coli) 中の封入体としてまたはメチロトローフ酵母、例えば、ピキア・パストリス (Pichia pastoris) 中に可溶性形態でグループ1ほこりダニに対して暴露するように実施しする。WO 01/29078 (HESKA) には、微生物中でポリペプチドを発現できるように修飾されたヌクレオチド配列を包含するグループ1ダニタンパク質の組換え発現が記載されている。
【００９８】
好ましい方法は、下記の文献に記載されているように、サッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) 中でグループ1ダニタンパク質を発現させることである: Chua 他、J. Allerg. Clin. Immunol. 1992、Vol. 89、pp. 95-102)。
他の好ましい方法は、昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ (Drosophila) (Jacquet 他、Clin. Exp. Allergy 2000、Vol. 30、pp. 677-84) またはバキュロウイルス系で感染させたスポドプテラ・フルギペルダ (Spodoptera frugiperda) Sf9細胞 (Shoji 他、Biosci. Biotech. Biochem. 1996、Vol. 60、pp. 621-25) 中でグループ1ダニタンパク質を発現させることである。
【００９９】
ヌクレオチド配列
本発明は、また、本発明のポリペプチド変異型をコードするヌクレオチド配列を包含する。説明したように、ヌクレオチド置換によりポリペプチド変異型をコードするヌクレオチド配列の標準的突然変異は、例えば、下記の文献に記載されている: Ford 他、1991、Protein Expression and Purification 2、pp. 95-107。他の標準的方法、例えば、位置指定突然変異誘発は、例えば、下記の文献に記載されている: Sambrook 他 (1989)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、NY。
【０１００】
「ヌクレオチド配列」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの一本鎖または二本鎖のポリマーである。ヌクレオチド配列はRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離し、in vitro で合成し、または自然分子と合成分子との組み合わせから製造することができる。
【０１０１】
ヌクレオチド配列ならびにポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を単離またはクローニングする技術はこの分野において知られており、そして ゲノムDNAからの単離、cDNAからの製造、またはそれらの組み合わせを包含する。このようなゲノムDNAからの本発明のヌクレオチド配列のクローニングは、例えば、よく知られているポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) または共有構造的特徴をもつクローニングされたDNAフラグメントを検出する発現ライブラリーの抗体スクリーニングを使用することによって実施することができる。例えば、下記の文献を参照のこと: Innis 他、1990、A Guide to Methods and Application、Academic Press、New York。他のヌクレオチド増幅法、例えば、リガーゼ連鎖反応 (LCR)、結合活性化転写 (LAT) および核酸配列決定に基づく増幅 (NASBA) を使用することができる。ヌクレオチド配列をポリペプチド産生株から、または他の関係する生物からクローニングすることができ、こうして、ヌクレオチド配列は、例えば、ヌクレオチド配列のポリペプチドエンコーディング領域のアレレまたは種変異型であることができる。
【０１０２】
用語 「単離された」 ヌクレオチド配列は、本明細書において使用するとき、他のヌクレオチド配列を本質的に含まず、アガロースゲル電気泳動により測定して、例えば、少なくとも約20%の純度、好ましくは少なくとも約40%の純度、より好ましくは約60%の純度、なおより好ましくは約80%の純度、最も好ましくは約90%の純度、なお最も好ましくは約95%の純度である。例えば、ヌクレオチド配列をその自然の位置からそれが複製される異なる部位に再配置するために、遺伝子操作において使用される標準的クローニング法により、単離されたヌクレオチド配列を得ることができる。
【０１０３】
クローニング法は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる必要なヌクレオチドフラグメントの切除および単離、変異型分子中へのそのフラグメントの挿入、およびヌクレオチド配列の多重コピーまたはクローンが複製される宿主細胞の中への組換えベクターの組込みを含む。ヌクレオチド配列はゲノム、cDNA、RNA、半合成、合成由来、またはそれらの任意の組み合わせのヌクレオチド配列であることができる。このような単離された分子はそれらの自然環境から分離されるものであり、そしてcDNAおよびゲノムのクローンを包含する。本発明の単離されたDNA分子はそれらが本来関連する他の遺伝子を含まず、そして天然に存在する5’および3’非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびターミネーターを含むことができる。関連する領域の同定は当業者にとって明らかであろう (例えば、下記の文献を参照のこと: DynanおよびTijan、Nature 316: 774-78、1985)。
【０１０４】
ヌクレオチド構築物
本明細書において使用するとき、用語 「ヌクレオチド構築物」 は、cDNA、ゲノムDNA、合成DNAまたはRNA由来の任意のヌクレオチド分子を示すことを意図する。用語 「構築物」 は、一本鎖または二本鎖であることができ、かつ問題のポリペプチドをコードする完全なまたは部分的に天然に存在するヌクレオチド配列に基づくことができるヌクレオチドセグメントを示すことを意図する。この構築物は必要に応じて他のヌクレオチドセグメントを含有することができる。
【０１０５】
問題のDNAは適当にはゲノムまたはcDNA由来であり、例えば、標準技術に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションにより、ゲノムまたはcDNAライブラリーを製造し、ポリペプチドのすべてまたは一部分をコードするDNA配列についてスクリーニングすることによって得ることができる (Sambrook 他、前掲参照)。
ヌクレオチド構築物は、また、確立された標準的方法、例えば、BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Letters 22 (1981)、1859-1869に記載されているホスホアミダイト法、またはMatthes 他、EMBO Journal 3 (1984)、801-805に記載されている方法により合成的に製造することができる。ホスホアミダイト法に従い、オリゴヌクレオチドは、例えば、自動化DNA合成装置中で合成し、精製し、アニリーングし、結合し、そして適当なベクター中でクローニングする。
【０１０６】
さらに、ヌクレオチド構築物は、標準技術に従い、合成、ゲノムまたはcDNA由来 (適当なものとして) のフラグメントを結合することによって製造された混合合成およびゲノム、混合合成およびcDNAまたは混合ゲノムおよびcDNA由来であることができ、フラグメントは全体のヌクレオチド構築物の種々の部分に対応する。
また、ヌクレオチド構築物は、例えば、下記の文献に記載されているように、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により製造することができる: 米国特許第4,683,202号またはSaiki 他、Science 239 (1988)、487-491。
【０１０７】
用語 「ヌクレオチド構築物」 は、ヌクレオチド構築物が本発明のコーディング配列の発現に必要なすべての制御配列を含有するとき、用語 「発現カセット」 と同義である。
用語 「コーディング配列」 は、本明細書に定義するとき、前述の制御配列の制御下に配置するとき、mRNAに転写され、本発明のポリペプチドに翻訳される配列である。コーディング配列の境界は、一般に、5’末端における翻訳開始コドンおよび3’末端における翻訳停止コドンにより決定される。コーディング配列は、DNA、cDNA、および組換えヌクレオチド配列を包含するが、これらに限定されない。
【０１０８】
用語 「制御配列」 は、ヌクレオチド配列のコーディング配列の発現に必要なまたは好都合な、すべての成分を包含すると定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して自然であるか、あるいは外来であることができる。このような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列、および転写ターミネーターを包含するが、これらに限定されない。最小において、制御配列はプロモーター、および転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング領域との制御配列の結合を促進する特異的制限部位を導入する目的で、リンカーを有することができる。
【０１０９】
転写および翻訳制御配列は、DNA制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびその他であり、これらは宿主細胞においてコーディング配列を発現させる。真核細胞において、ポリアデニル化シグナルは制御配列である。
また、本発明のヌクレオチド構築物は、ポリペプチドの発現において好都合である1または2以上の因子、例えば、アクチベーター (例えば、トランス作用性因子)、シャペロン、およびプロセシングプロテアーゼをコードする、1または2以上のヌクレオチド配列を含んでなることができる。選択した宿主細胞において機能的である任意の因子を本発明において使用することができる。これらの因子の1または2以上をコードするヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と縦列において不必要である。
【０１１０】
プロペプチド
制御配列は、また、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードする、プロペプチドコーディング領域であることができる。生ずるポリペプチドはプロ酵素またはプロポリペプチド (またはある場合においてチモーゲン) として知られている。
【０１１１】
プロポリペプチドは一般に不活性であり、そしてプロポリペプチドからの触媒的または自己触媒的切断により、成熟した活性なポリペプチドに変換させことができる。本発明において、スブチリシン様セリンプロテアーゼのファミリーのプロテアーゼはプロポリペプチドの活性化に有効であることが証明された。スブチリシンを粗製細胞上清に添加し、濾過濃縮上清に添加し、またはカラムクロマトグラフィーにより精製された物質に添加することができる。スブチリシンは余分のクロマトグラフィー工程により除去するか、あるいはオオムギキモトリプシンインヒビター (cl-2A) で不活性化することができる。インキュベーション時間は1〜21または24時間である。変異型のpro-der p 1または対応するプロペプチドを自然プロセシング部位で切断して (エドマン分解法およびN-末端配列決定により確認される)、N-末端配列TNACSINを生成した。
【０１１２】
好ましいスブチリシンは次の通りである: SavinaseTM (バシラス・クラウシイ (Bacillus clausii) からのスブチリシン、Novozymesの商品)、BPN’ (バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) からのスブチリシンNovo、SwissProt:SUBT_BACAM、Siezen 他、Protein Engng. 4 (1991) 719-737参照)、PD498 (バシラス (Bacillus) 種からのスブチリシン、GeneSeqP:AAW24071; WO 9324623A1) およびB34 (バシラス・アルカロフィルス (Bacillus alcalophilus) からのスブチリシン、特許WO 0158275)。BPN’ (BASBPN) (Siezen 他、Protein Engng. 4 (1991) 719-737)) は最も好ましく、0.25〜165 μg/ml、好ましくは16.5〜165 μg/mlの範囲の最終濃度で投与される。
【０１１３】
プロペプチドコーディング領域は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子 (aprE)、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 中性プロテアーゼ遺伝子 (nprE)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) アルファ-因子遺伝子、またはミセリオフトラ・サーモフィリウム (Myceliophthora themophilium) ラッカーゼ遺伝子 (WO 95/33836) から得ることができる。
【０１１４】
アクチベーター
アクチベーターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の転写を活性化するタンパク質である (Kudla 他、EMBO Journal 9: 1355-1364; JaraiおよびBuxton、1994、Current Genetics 26: 2238-244; Verier、1990、Yeast 6: 271-297)。アクチベーターをコードするヌクレオチド配列は、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) NprAをコードする遺伝子 (nprA)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) ヘメアクチベータータンパク質1をコードする遺伝子 (hap 1)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) ガラクトース代謝タンパク質4をコードする遺伝子 (gal4)、およびアスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アンモニア調節タンパク質をコードする遺伝子 (areA) から得ることができる。それ以上の例については、下記の文献を参照のこと: Verdier、1990、前掲およびMacKenzie 他、1993、Journal of General Microbiology 139: 2295-2307。
【０１１５】
シャペロン
シャペロンはフォールディングにおいて他のポリペプチドを適切に補助するタンパク質である (Harti 他、1994、TIBS 19: 20-25; Bergeron 他、1994、TIBS 19: 124-128; Demolder 他、1994、Journal of Biotechnologies 32: 179-189; Craig、1993、Science 260: 1902-1903; GethingおよびSambrook、1992、Nature 355: 33-45; PulgおよびGilbert、1994、Journal of Biological Chemistry 269: 7764-7771; WangおよびTsou、1993、The FASEB Journal 7: 1515-11157; Robinson 他、1994、Bio/Technology 1: 381-384)。
【０１１６】
シャペロンをコードするヌクレオチド配列は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) GroEタンパク質、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) タンパク質ジサルファイドイソメラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) カルネキシン、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) BIP/GRP78、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) Hsp70をコードする遺伝子から得ることができる。それ以上の例については、下記の文献を参照のこと: ; GethingおよびSambrook、1992、前掲、およびHarti 他、1994、前掲。
【０１１７】
プロセシングプロテアーゼ
プロセシングプロテアーゼは、プロペプチドを切断して成熟した生化学的に活性なポリペプチドを発生させるプロテアーゼである (EnderlinおよびOgrydziak、1994、Yeast 10: 67-79; Fuller 他、1989、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 86: 1434-1438; Jullus 他、1984、Cell 37: 1075-1089; Julius 他、1993、Cell 32: 839-852)。プロセシングプロテアーゼは、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) Kex2、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) ジペプチジルアミノペプチダーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) Kex2、およびヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) 二塩基性プロセシングエンドペプチダーゼ (xpr6) から得ることができる。
【０１１８】
プロモーター
制御配列は、適当なプロモーター配列、すなわち、ヌクレオチド配列の発現のために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であることができる。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写および翻訳制御配列を含有する。 プロモーターは選択した宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であり、そして宿主細胞に対して同種または異種である細胞外または細胞内のポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１１９】
用語 「プロモーター」 は、RNAポリメラーゼ結合および転写開始を提供するDNA配列を含有する遺伝子の部分を意味するために、この分野において認識されている意味で本明細書において使用される。プロモーター配列は遺伝子の5’ 非コーディング領域において、常にではないが、普通に見出される。
【０１２０】
特に細菌宿主細胞において、本発明のヌクレオチド構築物の転写を指令する適当なプロモーターの例は下記から得られるプロモーターである: 大腸菌 (E. coli) lacオペロン、ストレプトマイセス・ケリコロル (Streptomyces coelicolor) アガロース遺伝子 (dagA)、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) レバンスクラーゼ遺伝子 (sacB)、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) アルカリ性プロテアーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) アルファ-アミラーゼ遺伝子 (amyL)、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) マルトジェニックアミラーゼ遺伝子 (amyM)、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) アルファ-アミラーゼ遺伝子 (amyQ)、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) BANアミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis) ペニシラーゼ遺伝子 (penP)、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) xylAおよびxylB遺伝子、および原核生物ベータ-ラクタマーゼ遺伝子 (Villa-Kamaroff 他、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731)、ならびにtacプロモーター (DeBoer 他、1983、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25)、またはバシラス・ピュミルス (Bacillus pumilus) キシロシダーゼ遺伝子、またはファージラムダPRまたはPLプロモーターまたは大腸菌 (E. coli) lac、trpまたはtacプロモーター。それ以上のプロモーターは下記の文献に記載されている: “Useful proteins from recombinant bacteria”、Scientific American、1980、242: 74-94; およびSambrook 他、1989、前掲。
【０１２１】
糸状真菌宿主細胞において、本発明のヌクレオチド構築物の転写を指令する適当なプロモーターの例は下記をコードする遺伝子から得られるプロモーターである: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アルファ-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 酸安定性アルファ-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) またはアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) グルコアミラーゼ (glaA)、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アセトアミダーゼ、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ (米国特許第4,288,627号に記載されているような、これは引用することによって本明細書の一部とされる)、およびそれらのハイブリッド。
【０１２２】
糸状真菌宿主細胞において使用するために特に好ましいプロモーターは、TAKAアミラーゼ、NA2-tpi (アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アルファ-アミラーゼおよびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) トリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子からのプロモーターのハイブリッド)、およびglaAプロモーターである。糸状真菌宿主細胞において使用するために適当なそれ以上のプロモーターは、ADH3プロモーター (McKnight 他、The EMBO J. 4 (1985)、2093-2099) またはtpiAプロモーターである。
【０１２３】
酵母宿主細胞において使用するために適当なプロモーターの例は次の通りである: 酵母グリコール酸遺伝子 (Hitzman 他、J. Biol. Chem. 255 (1980)、12073-12080; AlberおよびKawasaki、J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982)、419-434) またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子 (Young 他、Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals、編者 Hollaender 他、Plenum Press、New York、1982) からのプロモーター、またはTPI1 (米国特許第4,599,311号) またはADH2-4c (Russell 他、Nature 304 (1983)、652-654) プロモーター。
【０１２４】
それ以上の有効なプロモーターは下記から得られる: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ (ENO-1) 遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) ガラクトキナーゼ遺伝子 (GAL1)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) アルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド‐3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子 (ADH2/GAP)、およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 3-ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子。酵母宿主細胞のために他の有効なプロモーターは下記の文献に記載されている: Romanos 他、Yeast 8: 423-488。哺乳動物宿主細胞において、有効なプロモーターはウイルスプロモーター、例えば、シミアンウイルス40 (SV40)、ラウス肉腫ウイルス (RSV)、アデノウイルス、およびウシ乳頭腫ウイルス (BPV) からのプロモーターを包含する。
【０１２５】
哺乳動物細胞において本発明のポリペプチドをコードするDNAの転写を指令するために適当なプロモーターの例は次の通りである: SV40プロモーター (Subramani 他、Mol. Cell. Biol. 1 (1981)、854-864)、MT-1 (メタロチオネイン遺伝子) プロモーター (Palmiter 他、Science 222 (1983)、809-814) またはアデノウイルス2主要後期プロモーターである。
【０１２６】
昆虫細胞において使用するために適当なプロモーターの例は次の通りである: ポリヘドリンプロモーター (米国特許第4,745,051号; Vasuvedan 他、FEBS Lett. 311 (1992) 7-11)、P10プロモーター (J. M. Vlak 他、J. Gen. Virology 69、1989、pp. 765-776)、オートグラファ・カリフォルニカ (Autographa californica) ポリヘドロシスウイルス塩基性タンパク質プロモーター (EP 397 485)、バキュロウイルス前初期遺伝子1プロモーター (米国特許第5,155,037号、米国特許第5,162,222号) またはバキュロウイルス39K後初期遺伝子プロモーター (米国特許第5,155,037号、米国特許第5,162,222号)。
【０１２７】
ターミネーター
また、制御配列は適当な転写ターミネーター配列、すなわち、宿主細胞により認識されて転写を停止させる配列であることができる。ターミネーター配列はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3’末端に作用可能に連鎖されている。選択した宿主細胞において機能的である任意のターミネーターを、本発明において使用することができる。
【０１２８】
糸状菌宿主細胞に好ましいターミネーターは、アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) アルファ-グリコシダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) トリプシン様プロテアーゼ (真菌宿主) をコードする遺伝子から得られるか、あるいはおよびTPI1 (AlberおよびKawasaki、前掲) またはADH3 (McKnight 他、前掲) ターミネーターである。
【０１２９】
酵母宿主細胞に好ましいターミネーターは下記をコードする遺伝子から得られる: サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) エノラーゼ、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) シトクロムC (CYC1)、またはサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) グリセルアルデヒド‐3-リン酸デヒドロゲナーゼ。酵母宿主細胞に有効なターミネーターは下記の文献に記載されている: Romanos 他、1992、前掲。
【０１３０】
ポリアデニル化シグナル
また、制御配列はポリアデニル化配列であることができる。この配列はヌクレオチド配列の3’末端に作用可能に連鎖されており、そして、転写されるとき、ポリアデノシン残基を転写されたmRNAに付加されるシグナルとして宿主細胞により認識される配列である。選択した宿主細胞において機能的である任意のポリアデニル化配列を本発明において使用することができる。
【０１３１】
糸状菌宿主細胞に好ましいポリアデニル化配列は下記をコードする遺伝子から得られる: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) アントラニレートシンターゼ、およびアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) アルファ-グリコシダーゼ。酵母宿主細胞に有効なポリアデニル化配列は下記の文献に記載されている: GuoおよびSherman、1995、Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990。ポリアデニル化配列は哺乳動物宿主細胞、例えば、SV40またはアデノウイルス5Elb領域についてこの分野においてよく知られている。
【０１３２】
シグナル配列
また、制御配列はシリカゲルペプチドコーディング領域であることができ、これの領域はポリペプチドのアミノ末端に作用可能に連鎖されており、発現されたポリペプチドを宿主細胞の細胞分泌経路の中へ向けることができるアミノ酸配列をコードする。ヌクレオチド配列のコーディング配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントと翻訳リーデイングフレームで自然に結合されたシグナルペプチドコーディング領域を固有に含有することができる。選択的に、コーディング配列の5’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコーディング配列の部分に対して外来であるシグナルペプチドコーディング領域を含有することができる。コーディング配列が通常シグナルペプチドコーディング領域を含有しない場合、外来シグナルペプチドコーディング領域を必要とすることがある。
【０１３３】
選択的に、外来シグナルペプチドコーディング領域を単に自然シグナルペプチドコーディング領域と置換して、通常コーディング配列に関連する自然シグナルペプチドコーディング領域に関して分泌を増強することができる。シグナルペプチドコーディング領域は下記から得ることができる: アスペルギルス (Aspergillus) 種からのグルコアミラーゼまたはアミラーゼ遺伝子、リゾムコル (Rhizomucor) 種からのリパーゼまたはプロテイナーゼ遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) からのアルファ-因子の遺伝子、バシラス (Bacillus) 種からのアミラーゼまたはプロテアーゼ遺伝子、またはプレプロキモシン遺伝子。しかしながら、発現されたポリペプチドを選択した宿主細胞の分泌経路の中に向けることができる、任意のシグナルペプチドコーディング領域を本発明において使用することができる。
【０１３４】
用語 「分泌シグナル配列」 は、ポリペプチド (より大きいポリペプチドの1成分として、より大きいポリペプチドをそれが合成される細胞の分泌経路に通して向ける「分泌ペプチド」) をコードするDNA配列である。より大きいポリペプチドは、分泌経路を通して移行する間、普通に切断されて分泌ペプチドを除去する。
【０１３５】
細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコーディング領域は、下記遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である: バシラス (Bacillus) NCIB 11837からのマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) アルファ-アミラーゼ遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) スブチリシン遺伝子、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) ベータ-ラクタマーゼ遺伝子、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) 中性プロテアーゼ遺伝子 (nprT、nprS、nprM)、およびバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) PrsA遺伝子。それ以上のシグナルペプチドは下記の文献に記載されている: SimonenおよびPalva、1993、Microbiological Reviews 57: 109-137。
【０１３６】
糸状菌宿主細胞のために有効なシグナルペプチドコーディング領域は、下記遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域である: アスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) TAKAアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) 中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、フミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) セルラーゼまたはリパーゼ遺伝子、またはリゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼまたはプロテアーゼ遺伝子、アスペルギルス (Aspergillus) 種アミラーゼまたはグルコアミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) リパーゼまたはプロテアーゼをコードする遺伝子。好ましくは、シグナルペプチドは下記をコードする遺伝子に由来する: アスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) TAKAアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 中性アルファ-アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー (A. niger) 酸安定性アミラーゼ、またはアスペルギルス・ニガー (A. niger) グルコアミラーゼ。
【０１３７】
酵母宿主細胞に有効なシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) α-因子およびサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) インベルターゼの遺伝子から得られる。他の有効なシグナルペプチドコーディング領域は、Romanos 他、1992、前掲に記載されている。
【０１３８】
酵母細胞からの分泌のために、分泌シグナル配列は、細胞の分泌経路の中への発現されたポリペプチドの効率よい方向づけを保証する、任意のシグナルペプチドをコードすることができる。シグナルペプチドは天然に存在するシグナルペプチド、またはその機能的部分であることができるか、あるいはそれは合成ペプチドであることができる。適当なシグナルペプチドは、α-因子のシグナルペプチド (米国特許第4,870,008号参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド (O. Hagenbuchle 他、Nature 289、pp. 643-646参照)、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド (L.A. Valls 他、Cell 48、pp. 887-897参照)、酵母BAR1シグナルペプチド (WO 87/02670参照)、または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3 (YAP3) シグナルペプチド (M. Egel-Mitani 他、Yeast 6、1990、pp. 127-137) であることが発見された。
【０１３９】
酵母における効率よい分泌のために、リーダーペプチドをコードする配列は、また、シグナル配列の下流におよびポリペプチドをコードするDNA配列の上流に挿入することができる。リーダーペプチドの機能は発現されたポリペプチドを内質小網からゴルジ装置に向けさせ、さらに分泌小胞に向けさせて媒質の中に分泌させることである (すなわち、細胞壁を横切ってまたは細胞膜を通して酵母細胞の周辺質空間の中にポリペプチドを輸出する)。リーダーペプチドは酵母α-因子リーダーであることができる (その使用は米国特許第4,546,082号、EP 16 201、EP 123 294、EP 123 544およびEP 163 529)。選択的に、リーダーペプチドは合成リーダーペプチド、すなわち、天然に存在しないリーダーペプチドであることができる。合成リーダーペプチドは、例えば、WO 89/02463またはWO 92/11378に記載されているように構築することができる。
【０１４０】
昆虫細胞において使用するために、シグナルペプチドは好都合に昆虫遺伝子 (WO 90/05783参照)、例えば、鱗翅類マンヅカ・セクスタ (Manduca sexta) 脂肪速度論的ホルモン前駆体シグナルペプチドから誘導することができる (米国特許第5,023,328号参照)。
昆虫細胞において使用するために、シグナルペプチドは好都合に昆虫遺伝子 (WO 90/05783参照)、例えば、鱗翅類マンヅカ・セクスタ (Manduca sexta) 脂肪速度論的ホルモン前駆体シグナルペプチドから誘導することができる (米国特許第5,023,328号参照)。
【０１４１】
他の調節配列
また、宿主細胞増殖に関してポリペプチド発現の調節を可能とする調節配列付加することが望ましいことがある。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的または物理的刺激因子に応答して遺伝子の発現をターンオンまたはターンオフさせる調節システムである。原核生物における調節システムはlac、tac、およびtrpオペレーター系を包含するであろう。酵母において、ADH2系またはGAL1系を使用することができる。
【０１４２】
糸状真菌において、TAKAアルファ-アミラーゼプロモーター、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger) グルコアミラーゼプロモーター、およびアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) グルコアミラーゼプロモーターを調節配列として使用することができる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能とする配列である。真核生物において、これらはメトトレキセートの存在下に増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属を使用して増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。これらの場合において、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は調節配列と縦列で配置されるであろう。
【０１４３】
ヌクレオチド構築物を含んでなる組換え発現ベクター
本発明は、また、本発明のヌクレオチド配列、プロモーター、および転写および翻訳停止シグナルを含んでなる組換え発現ベクターに関する。前述の種々のヌクレオチド配列および制御配列を一緒に結合して組換え発現ベクターを生成することができ、このベクターは1または2以上の慣用の制限部位を含み、このような部位におけるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入または置換を可能とすることができる。選択的に、ヌクレオチド配列または前記配列を含んでなるヌクレオチド構築物を適当な発現ベクターの中に挿入することによって、本発明のヌクレオチド配列を発現させことができる。発現ベクターをつくるとき、発現のために、可能ならば分泌のために、適当な制御配列に作用可能に連鎖されるように、コーディング配列を位置決定する。
【０１４４】
「作用可能に連鎖される」は、DNAセグメントについて言及するとき、セグメントがそれらの意図する目的のために共同して機能するように、例えば、転写がプロモーター中で開始し、コーディングセグメントに通してターミネーターに進行するように、セグメントが配置されていることを示す。
【０１４５】
「発現ベクター」は、線状または環状のDNA分子であり、これはその転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連鎖されている問題のポリペプチドをコードするセグメントを含んでなる。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列および必要に応じて1または2以上の複製起点、1または2以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他を含むことができる。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスDNAに由来するか、あるいは両方の因子を含有することができる。
【０１４６】
組換え発現ベクターは、好都合に組換えDNA手法に付すことができ、かつヌクレオチド配列の発現を発生させることができる、任意のベクター (例えば、プラスミドまたはウイルス) であることができる。典型的には、ベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞とのベクターの適合性に依存するであろう。ベクターは線状であるか、あるいは閉じた円のプラスミドであることができる。
【０１４７】
ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外実在物として存在するベクターであることができ、その複製は染色体の複製に対して独立であり、例えば、プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、または人工的染色体である。ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含有することができる。選択的に、ベクターは、宿主細胞中に導入したとき、ゲノム中に組込まれ、それが組込まれている1または2以上の染色体と一緒に複製するものであることができる。ベクター系は単一のベクターまたはプラスミドであるか、あるいは宿主細胞のゲノムの中に導入すべき全DNAを一緒に含有する2またはそれ以上のベクターまたはプラスミド、またはトランスポゾンであることができる。
【０１４８】
本発明のベクターは、形質転換された細胞の選択を容易とする、1または2以上の選択可能なマーカーを含有することが好ましい。選択可能なマーカーはある遺伝子であり、その遺伝子の産物は殺生物剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性株に対するプロトトロフィー、およびその他を提供する遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例は、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis) またはバシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis) からのdal遺伝子、または抗生物質に対する耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を付与するマーカーである。
【０１４９】
酵母宿主細胞に適当なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、およびURA3である。糸状菌宿主細胞において使用する選択可能なマーカーは、amdS (アセトアミダーゼ)、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hygB (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD (硝酸レダクターゼ)、pyrG (オロチジン-5’-リン酸デカルボキシラーゼ)、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、trpC (アントラニル酸シンターゼ)、およびグルフォシネート耐性マーカー、ならびに他の種からの同等マーカーを包含するが、これらに限定されない群から選択することができる。
【０１５０】
アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) またはアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) のamdBおよびpyrGマーカー、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス (Streptomyces hygroscopicus) のbarマーカーは、アスペルギルス (Aspergillus) 細胞において使用するために好ましい。さらに、選択は、例えば、下記の文献に記載されているように、共形質転換により達成することができる: WO 91/17243、ここで選択可能なマーカーは別のベクター上に存在する。
【０１５１】
本発明のベクターは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定な組込みまたは細胞のゲノムに対して独立に細胞中のベクターの自律的複製を可能とする1または2以上の因子を含有することが好ましい。
【０１５２】
本発明のベクターは、宿主細胞中に導入するとき、宿主細胞ゲノム中に組込ませることができる。組込みのために、ベクターはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に頼るか、あるいは相同的または非相同的組換えによりゲノム中にベクターを安定に組込ませるベクターの任意の他の因子に頼ることができる。選択的に、ベクターは宿主細胞ゲノム中への相同的組換えによる組込みを指令する追加のヌクレオチド配列を含有することができる。追加のヌクレオチド配列は、1または2以上の染色体中の1または2以上の精確な位置において宿主細胞ゲノム中にベクターを組込ませることができる。
【０１５３】
精確な位置における組込みの確度を増加させるために、組込み因子は十分な数のヌクレオチド、例えば、100〜1,500塩基対、好ましくは400〜1,500塩基対、最も好ましくは800〜1,500塩基対を含有することが好ましく、これらは相同的組換えの確率を増強するために相応してターゲット配列と高度に相同的である。組込み因子は、宿主細胞ゲノム中のターゲット配列と相同的である、任意の配列であることができる。さらに、組込み因子は非エンコーディングまたはエンコーディングヌクレオチド配列であることができる。他方において、ベクターは非相同的組換えにより宿主細胞ゲノム中に組込ませることができる。これらのヌクレオチド配列は、宿主細胞ゲノム中のターゲット配列と相同的である任意の配列であることができ、そして、さらに非エンコーディングまたはエンコーディング配列であることができる。
【０１５４】
自律的複製のために、ベクターは問題の宿主細胞中で自律的にベクターを複製させる複製起点をさらに含んでなることができる。細菌の複製起点の例は、プラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUB110、pE194、pTA1060、およびpAMβ1の複製起点である。酵母宿主細胞において使用する複製起点の例は、CEN6とARS4との組み合わせ、およびCEN3とARS1との組み合わせである。複製起点は、宿主細胞においてその機能を温度感受性とする突然変異を有するものであることができる (例えば、下記の文献を参照のこと: Ehrlich、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1433)。
【０１５５】
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の2以上のコピーを宿主細胞中に挿入して、ヌクレオチド配列の発現を増幅することができる。この分野においてよく知られている方法を使用して宿主細胞ゲノム中にヌクレオチド配列の少なくとも1つの追加のコピーを組込ませ、形質転換体を選択することによって、ヌクレオチド配列を安定に増幅させることができる。
前述の因子を結合して本発明の組換え発現ベクターを構築する手順は当業者によく知られている (例えば、下記の文献を参照のこと: Sambrook 他、1989、前掲)。
【０１５６】
ヌクレオチド構築物を含んでなる宿主細胞
本発明は、また、本発明のヌクレオチド配列またはヌクレオチド構築物または組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞に関し、これらは本発明のポリペプチド変異型の組換え産生において好都合に使用される。用語 「宿主細胞」 は、親宿主細胞およびそれらの任意の子孫を包含し、ここで子孫は複製間に起こる突然変異のために親宿主細胞と同一ではない。
【０１５７】
本発明のヌクレオチド配列を含んでなるベクターで細胞を形質転換し、次いでこのベクターを宿主染色体中に組込ませることが好ましい。 「形質転換」 は、本発明のヌクレオチド配列を含んでなるベクターを宿主細胞中に導入して、ベクターが染色体の組込み体としてまたは自己複製する染色体外ベクターとして維持されるようにすることを意味する。組込みは、ヌクレオチド配列が細胞中で安定に維持される可能性が大きいので、有利であると考えられる。宿主染色体中へのベクターの組込みは、前述したように、相同的または非相同的組換えにより発生させることができる。
【０１５８】
宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子に大きい程度に依存するであろう。宿主細胞は単細胞微生物、例えば、原核生物、または非単細胞微生物、例えば、真核生物であることができる。有効な単細胞の細胞は細菌細胞、例えば、下記のものを包含するが、これらに限定されない: グラム陽性菌、バシラス (Bacillus) 細胞、例えば、バシラス・アルカロフィルス (Bacillus alkalophilus)、バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・ブレビス (Bacillus brevis)、バシラス・サーキュラン (Bacillus circulans)、バシラス・コアギュランス (Bacillus coagulans)、バシラス・ラウツス (Bacillus lautus)、バシラス・レンツス (Bacillus lentus)、バシラス・リヘニフォルミス (B. licheniformis)、バシラス・メガテリウム (Bacillus megaterium)、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus)、バシラス・サチリス (Bacillus subtilis)、およびバシラス・スリンジェンシス (Bacillus thuringiensis); またはストレプトマイセス (Streptomyces) 細胞、例えば、ストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) またはストレプトマイセス・ムリヌス (Streptomyces murinus); またはグラム陰性菌、例えば、大腸菌 (E. coli) およびシュードモナス (Pseudomonas) 種。
【０１５９】
好ましい態様において、細菌宿主細胞はバシラス・レンツス (Bacillus lentus)、バシラス・リヘニフォルミス (Bacillus licheniformis)、バシラス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) またはバシラス・サチリス (Bacillus subtilis) 細胞である。
【０１６０】
細菌宿主細胞の形質転換は、例えば、下記により実施することができる: プロトプラスト形質転換 (例えば、下記の文献を参照のこと: ChangおよびCohen、1979、Molecular General Genetics 168: 111-115)、コンピテント細胞の使用 (例えば、下記の文献を参照のこと: YoungおよびSpizizin、1961、Journal of Bacteriology 81: 823-829、またはDubnarおよびDavidoff-Abelson、1971、Journal of Molecular Biology 56: 209-221)、エレクトロポレーション (例えば、下記の文献を参照のこと: ShigekawaおよびDower、1988、Biotechniques 6: 742-751)、または複合化 (例えば、下記の文献を参照のこと: KoehlerおよびThorne、1987、Journal of Bacteriology 169: 5771-5278)。
【０１６１】
宿主細胞は真核生物、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞または真菌細胞であることができる。
有効な哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞、HeLa細胞、ベイビーハムスター腎 (BHK) 細胞、COS細胞、または、例えば、下記から入手可能である任意の数の他の永久分裂能化細胞系統: アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション (American Type Culture Collection)。
【０１６２】
適当な哺乳動物細胞の例は次の通りである: COS (ATCC CRL 1650および1651)、BHK (ATCC CRL 1632、10314および1573、ATCC CCL 10)、CHL (ATCC CCL 39) またはCHO (ATCC CCL 61) 細胞系統。哺乳動物細胞をトランスフェクトしかつ導入されたDNA配列を発現させる方法は、例えば、下記の文献に開示されている: KaufmanおよびSharp、J. Mol. Biol. 159 (1982)、601-621; SouthernおよびBerg、J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982)、327-341; Loyter 他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982)、422-426; Wigler 他、Cell 14 (1978)、725; CorsaroおよびPearson、Somatic Cell Genetics 7 (1981)、603; Ausubel 他、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, Inc.、N.Y.、1987; Hawley-Nelson 他、Focus 15 (1993)、73; Ciccarone 他、Focus 15 (1993)、80; Grahamおよびvan der Eb、Virology 52 (1973)、456; およびNeumann 他、ENBO J. 1 (1982)、841-845。
【０１６３】
好ましい態様において、宿主細胞は真菌細胞である。 「真菌」 は、本明細書において使用するとき、下記を包含する: 子嚢菌門 (Ascomycota)、担子菌門 (Basidiomycota)、ツボカビ門 (Chytridiomycota)、および接合菌門 (Zygomycota) (下記により規定されている: Hawksworth 他、Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi、第8版、1995、CAB International, University Press、英国ケンブリッジ) ならびに卵菌門 (Oomycota) (下記の文献に記載されている: Hawksworth 他、1995、前掲、p. 171) およびすべての栄養胞子真菌 (Hawksworth 他、1995、前掲)。
【０１６４】
子嚢菌門 (Ascomycota) の代表的グループは、例えば、下記を包含する: アカバンカビ (Neurospora)、エウペニシリウム (Eupenicillium) (=ペニシリウム (Penicillium))、エメリセラ (Emericella) (=アスペルギルス (Aspergillus))、コウジカビ (Eurotium) (=アスペルギルス (Aspergillus))、および上に列挙した真正酵母。担子菌門 (Basidiomycota) の例は、キノコ、サビ病、およびクロホ病菌である。
【０１６５】
ツボカビ門 (Chytridiomycota) の代表的グループは、例えば、アロマイセス (Allomyces)、ブラストクラジエラ (Blastocladiella)、ケロモミセス (Coelomomyces)、および水生真菌を包含する。卵菌門 (Oomycota) の代表的グループは、例えば、サプロレグニオミセタス (Saprolegniomucetous) 水生真菌 (水性菌類) 例えば、アキリア (Achlya) を包含する。栄養胞子真菌の例は、アスペルギルス (Aspergillus)、ペニシリウム (Penicillium)、カンジダ (Candida)、およびアルテルナリア (Alternaria) である。接合菌門 (Zygomycota) の代表的グループは、例えば、リゾプス (Rhizopus) およびケカビ (Mucor) を包含する。
【０１６６】
好ましい態様において、真菌宿主細胞は酵母細胞である。 「酵母」 は、本明細書において使用するとき、子嚢胞子発生酵母 (エンドミケス目 (Endomycetales))、担子胞子発生酵母、および不完全菌類 (Fungi Imperfecti) (ブラストミセテス (Blastomycetes)) に属する酵母を包含する。子嚢胞子発生酵母は科スペルモフトラセエ (Spermophthoraceae) およびサッカロミセタセエ (Saccharomycetaceae) に分割される。後者は4つの亜科、シゾサッカロマイコイデアエ (Schizosaccharomycoideae) (例えば、属シゾサッカロマイセス (Scizosaccharomyces))、ナドソニオイデア (Nadsonioideae)、リポミコイデア (Lipomycoideae)、およびサッカロミコイデア (Saccharomycoideae) (例えば、属ピキア (Pichia)、クライベロマイセス (Kluyveromyces) およびサッカロマイセス (Saccharomyces)) から構成される。
【０１６７】
担子胞子発生酵母は、属レイコスポリジム (Leucosporidim)、ロドスポリジウム (Rhodosporidium)、スポリジオボラス (Sporidiobolus)、フィロバシヂウム (Filobasidium)、およびフィロバシジエラ (Filobasidiella) を包含する。不完全菌類 (Fungi Imperfecti) に属する酵母は、2つの科、スポロボロミセタセタセアエ (Sporobolomycetacetaceae) (例えば、属ソロボロマイセス (Sorobolomyces) およびブルレラ (Bullera)) およびクリプトコッカセエ (Cryptococcaceae) (例えば、属カンジダ (Candida)) に分割される。
【０１６８】
酵母の分類は将来変更されることがあるので、本発明の目的に対して、酵母は下記の文献に記載されているように定義される: Biology and Activities of Yeast (Skinner F. A.、Passmore S. M. およびDavenport R. R. 編、Soc. App. Bactriol. Symposium Series No. 9、1980)。酵母の生物学および酵母遺伝学の操作はこの分野においてよく知られている (例えば、下記の文献を参照のこと: Biochemistry and Genetics of Yeast、Bacil M.、Horecker B. J. およびStopani A. O. M. 編者、第2版、1987; The Yeasts、Rose A. H. およびHarrison J. S. 編者、第2版、1987; およびThe Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces、Strathern 他、編者、1981)。
【０１６９】
酵母宿主細胞は下記種の細胞から選択することができる: カンジダ (Candida)、クライベロマイセス (Kluyveromyces)、サッカロマイセス (Saccharomyces)、シゾサッカロマイセス (Scizosaccharomyces)、カンジダ (Candida)、ピキア (Pichia)、ハンゼヌラ (Hansenula)、またはヤロウィア (Yarrowia)。好ましい態様において、酵母宿主細胞は、サッカロマイセス・カリスベルゲンシス (Saccharomyces carisbergensis)、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、サッカロマイセス・ジアスタチカス (Saccharomyces diastaticus)、サッカロマイセス・ドウグレシイ (Saccharomyces douglesii)、サッカロマイセス・クルイベリ (Saccharomyces kluyveri)、サッカロマイセス・ノルベンシス (Saccharomyces norbensis) またはサッカロマイセス・オビフォルミス (Saccharomyces oviformis) 細胞である。
【０１７０】
他の有効な酵母宿主細胞は次の通りである: クライベロマイセス・ラクチス (Kluyveromyces lactis)、クライベロマイセス・フラギリス (Kluyveromyces fragilis)、ハンゼヌラ・ポリモルファ (Hansenula polymorpha)、ピキア・パストリス (Pichia pastoris)、ヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica)、シゾサッカロマイセス・ポンベ (Schzosaccharomyces pombe)、ウスチラゴ・マイリス (Ustilago maylis)、カンジダ・マルトセ (Candida maltose)、ピキア・グイレスモディイ (Pichia gullermondii) およびピキア・メタノリオ (Pichia metanolio) 細胞 (Gleeson 他、J. Gen. Microbiol. 132、1986、pp. 3459-3465; 米国特許第4,882,279号および米国特許第4,879,231号参照)。
【０１７１】
好ましい態様において、真菌宿主細胞は糸状菌細胞である。「糸状菌」は、亜門真菌門 (Eumycota) および卵菌門 (Oomycota) のすべての糸状形態である (Hawksworth 他、1995、前掲に規定されている)。糸状真菌はキチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖から構成された栄養菌糸体により特徴づけられる。栄養成長は菌糸伸長により、そして炭素異化作用は無条件的好気性である。対照的に、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) による栄養成長は単細胞葉状体の発芽により、そして炭素異化作用は発酵的である。
【０１７２】
より好ましい態様において、糸状菌宿主細胞は下記を包含するが、これらに限定されない種の細胞である: アクレモニウム (Acremonium)、アスペルギルス (Aspergillus)、フザリウム (Fusarium)、フミコラ (Humicola)、ケカビ (Mucor)、ミセリオフトラ (Myceliopthora)、アカバンカビ (Neurospora)、ペニシリウム (Penicillium)、チエラビア (Thielavia)、トリポクラジウム (Tolypocladium)、およびトリコデルマ (Trichoderma) またはそれらのテレオモルフまたは同義。なおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス (Aspergillus) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアクレモニウム (Acremonium) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はフザリウム (Fusarium) 細胞である。
【０１７３】
他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はフミコラ (Humicola) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はケカビ (Mucor) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はミセリオフトラ (Myceliopthora) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアカバンカビ (Neurospora) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム (Penicillium) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はチエラビア (Thielavia) 細胞である。他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はトリポクラジウム (Tolypocladium) 細胞である。
【０１７４】
他のなおより好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はトリコデルマ (Trichoderma) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はアスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フェチヅス (Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニカス (Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、アスペルギルス・ニヅランス (Aspergillus nidulans) またはアスペルギルス・オリゼ (Aspergillus oryzae) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞は節ディスカラー (Discolor) (また、節フザリウム (Fusarium) として知られている) のフザリウム (Fusarium) 細胞である。例えば、糸状真菌親細胞は下記の細胞であることができる: フザリウム・バクトリジオイデス (Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス (Fusarium cerealis)、フザリウム・クロックウェレンセ (Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム (Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアラム (Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム (Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム (Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンジ (Fusarium negundi)、フザリウム・レチクラツム (Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロセウム (Fusarium roseum)、フザリウム・サムブシヌム (Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム (Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スルフリウム (Fusarium sulphureum)、またはフザリウム・トリコテキオイデス (Fusarium trichothecioides) 細胞。
【０１７５】
他の好ましい態様において、糸状真菌親細胞は節エレガンス (Elegans) のフザリウム (Fusarium) 株、例えば、フザリウム・オキシスポラム (Fusarium oxysporum) である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はフミコラ・インソレンス (Humicola insolens) またはフミコラ・ラヌギノサ (Humicola lanuginosa) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はムコール・ミエヘイ (Mucor miehei) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はミセリオフトラ・サーモフィリウム (Myceliophthora themophilium) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa) 細胞である。他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はペニシリウム・パープロゲナム (Penicillium purpurogenum) 細胞である。
【０１７６】
他の最も好ましい態様において、糸状菌宿主細胞はチエラビア・テレストリス (Thielavia terrestris) またはアクレモニウム・クリソゲヌム (Acremonium chrysogenum) 細胞である。他の最も好ましい態様において、トリコデルマ (Trichoderma) 細胞はトリコデルマ・ハルジアナム (Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギイ (Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアツム (Tricoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーセイ (Trichoderma reesei) またはトリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) 細胞である。タンパク質の発現におけるアスペルギルス (Aspergillus) 種の使用は、例えば、EP 272 277、EP 230 023に記載されている。
【０１７７】
本発明のヌクレオチド配列、DNAは、それを発現させる好ましい特定の宿主生物についてのコドンの使用を最適化するように修飾することができる。この例は下記について発表されている: 酵母 (Woo JH 他、Protein Expression and Purification Vol. 25 (2)、pp. 270-282、2002)、真菌 (Te’o 他、FEMS  Microbiologylogy Letters Vol. 190 (1) pp. 13-19 (2000))、および他の微生物、ならびに哺乳動物細胞中で発現されたDer p 1(Massaer M 他、International Archives of Allergy and Immunology Vol. 125 (1)、pp. 32-43、2001)。
【０１７８】
特定の態様において、宿主細胞は昆虫細胞および/または昆虫細胞系統である。宿主として使用する昆虫細胞系統は燐翅目 (Lepidoptera) 細胞系統、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ (Spodoptera frugiperda) 細胞またはトリコデルマ・ニ (Trichoderma ni) 細胞 (米国特許第5,077,214号参照)。例えば、WO 89/01029またはWO 89/01028、または前述の参考文献中に記載されている培養条件は適当であろう。
【０１７９】
植物
本発明は、また、回収可能な量でポリペプチドを発現し、産生するように、本発明のポリペプチド (すなわち、変異型) をコードするヌクレオチド配列で形質転換された、トランスジェニック植物、植物部分、または植物細胞に関する。ポリペプチドは植物または植物部分から回収できる。選択的に、組換えポリペプチドを含有する植物または植物部分は、それ自体ワクチンの目的で使用できる。
【０１８０】
特定の態様において、ポリペプチドは種子中の内乳貯蔵小胞に対してターゲッティングされる。これは適当なシグナルペプチドをもつ前駆体としてそれを合成することによって得ることができる、下記の文献を参照のこと: Horvath 他、PNAS、Feb. 15、2000、Vol. 97、No. 4、pp. 1914-1919。
【０１８１】
トランスジェニック植物は、双子葉植物 (a dicot) または単子葉植物 (a monocot) またはそれらの操作された変種であることができる。単子葉植物の例は、イネ科植物、例えば、ナカハグサ (イチゴツナギ、イネ科、イチゴツナギ科)、飼料の草、例えば、フェスツカ (festuca)、ロリウム (lolium)、温帯イネ科植物、例えば、アグロスチス (Agrostis)、および穀物、例えば、コムギ、カラスムギ、ライムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、およびトウモロコシ (コーン) である。双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、例えば、ハウチワマメ、ジャガイモ、テンサイ、エンドウマメ、ソラマメ・インゲン・ササゲの類およびダイズ、およびアブラナ科植物 (アブラナ科 (Brassicaceae))、例えば、カリフラワー、ナタネ、および密接に関係するモデル生物アラビドプシス・タリアナ (Arabidopsis thaliana) である。例えば、下記の文献に記載されている低フィチン酸塩植物は操作された植物の例である: 米国特許第5,689,054号および米国特許第6,111,168号。
【０１８２】
植物部分の例は、幹、カルス、葉、根、果実、種子、および塊茎である。また、特定の植物組織、例えば、葉緑体、アポプラスト、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、および細胞質は植物部分であると考えられる。さらに、任意の植物細胞は、組織由来が何であっても、植物部分であると考えられる。
また、このような植物、植物部分および植物細胞の子孫は本発明の範囲内に含まれる。
【０１８３】
この分野において知られている方法に従い、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または植物細胞を構築することができる。簡単に述べると、本発明のポリペプチドをコードする1または2以上の発現構築物を植物宿主ゲノム中に組込み、そして生ずる修飾された植物または植物細胞をトランスジェニック植物または植物細胞に増殖させることによって、植物または植物細胞を構築する。
【０１８４】
好都合には、発現構築物は核酸構築物であり、これは本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含んでなり、この核酸配列は選択した植物または植物部分中の核酸配列の発現に必要な適当な調節配列に作用可能に連鎖されている。さらに、発現構築物はそれが組込まれている宿主細胞を同定するために有効な選択可能なマーカーと、問題の植物中に構築物を導入するために必要なDNA配列とを含んでなる (後者は使用すべきDNA導入法に依存する)。
【０１８５】
調節配列、例えば、プロモーターおよびターミネーター配列および必要に応じてシグナルまたはトラシット配列の選択は、例えば、ポリペプチドを発現しようとする時間、場所、および方法に依存して決定される。例えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は構成的または誘導可能であるか、あるいは発育、段階または組織特異的であり、そして遺伝子産物を特定の組織または植物部分、例えば、種子または葉にターゲッティングすることができる。調節配列は、例えば、下記の文献に記載されている: Tague 他、1988、Plant Physiology 86: 506。
【０１８６】
構成的発現のために、35S-CaMVプロモーターを使用することができる (Franck 他、1980、Cell 21: 285-294)。器官特異的プロモーターは、例えば、次の通りである: 貯蔵シンク組織、例えば、種子、ジャガイモ塊茎、および果実からのプロモーター (EdwardsおよびCoruzzi、1990、Ann. Rev. Genet. 24: 275-303)、または代謝シンク組織、例えば、分裂組織からのプロモーター (Ito 他、1994、1994、Plant Mol. Biol. 24: 863-878) 、種子特異的プロモーター、例えば、イネからのグルテリン、プロラミン、グロブリン、またはアルブミンのプロモーター (Wu 他、1998、Plant and Cell Physiology 39: 885-889)、ソラマメ・ナンテンハギ (Vicia faba) からのレグミンB4および未知の種子タンパク質遺伝子からのソラマメ・ナンテンハギ (Vicia faba) プロモーター (Conrad 他、1998、Journal of Plant Physiology 152: 708-711)、種子油ボディタンパク質からのプロモーター (Chen 他、1998、Plant and Cell Physiology 39: 935-941)、ブラシカ・ナプス (Brassica napus) からの貯蔵タンパク質napAプロモーター、またはこの分野において知られている、例えば、WO 91/14772に記載されている、任意の他の種子特異的プロモーター。
【０１８７】
さらに、プロモーターは次のものであることができる: 葉特異的プロモーター、例えば、イネまたはトマトからのrbcsプロモーター (Kyozuka 他、1993、Plant Physiology 102: 991-1000)、クロレラウイルスアデニンメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター (MitraおよびHiggins、1994、Plant Molecular Biology 26: 85-93)、またはイネからのaldP遺伝子プロモーター(Kagaya 他、1995、Molecular and General Genetics 248: 668-674)、または傷誘導性プロモーター、例えば、ジャガイモpin2プロモーター (Xu 他、1993、Plant Molecular Biology 22: 573-588)。
【０１８８】
また、プロモーターエンハンサー因子を使用して、植物中の本発明の変異型のより高い発現を達成することができる。例えば、プロモーターエンハンサー因子はプロモーターと、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に配置されたイントロンであることができる。例えば、Xu 他、1993、前掲には、発現を増強するためにイネアクチン1遺伝子の第1イントロンを使用することが開示されている。
なおさらに、コドン使用頻度を問題の植物種のために最適化して、発現を改良することができる (前述のHorvath 他、参照)。
【０１８９】
選択可能なマーカーおよび発現構築物の任意の他の部分を、この分野において入手可能なものから選択することができる。
核酸構築物をこの分野において知られている慣用技術、例えば、下記の技術に従い植物ゲノム中に組込む: アグロバクテリウム (Agrobacterium) 仲介形質転換、ウイルス仲介形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、およびエレクトロポレーション (Gasser 他、Science 244: 1293; Potrykus、1990、Bio/Technology 8: 535; Shimamoto 他、1989、Nature 338: 274)。
【０１９０】
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens) 仲介遺伝子転移は、トランスジェニック双子葉植物を発生させるために選択する方法である (概観については下記の文献を参照のこと：HooykasおよびSchilpercort、1992、Plant Molecular Biology 19: 15-38)。しかしながら、それは単子葉植物の形質転換に使用することもできるが、他の形質転換法は一般にこれらの植物のために好ましい。現在、トランスジェニック単子葉植物を発生させるために選択する方法は、胚カルスまたは発育する胚の粒子衝撃 (形質転換性DNAで被覆した微視的金またはタングステン粒子) である (Christou、1992、Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto、1994、Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil 他、1992、Bio/Technology 10: 667-674)。単子葉植物の別の形質転換法は、下記の文献に記載されているようにプロトプラスト形質転換に基づく: Omirulleh 他、1993、Plant Molecular Biology 21: 415-428。
【０１９１】
形質転換後、当業者によく知られている方法に従い、その中に発現構築物を組込んで有する形質転換体を選択し、全植物に再生させる。
本発明は、また、下記工程を含んでなる本発明のポリペプチドを製造する方法に関する：(a) 変異型の産生を促す条件下に本発明の変異型をコードする核酸配列を含んでなるトランスジェニック植物または植物細胞を培養し、そして (b) 変異型を回収する。
【０１９２】
グループ1ダニポリペプチド変異型を製造する方法
本発明のポリペプチド変異型は、(a) 適当な宿主細胞を本発明のヌクレオチド構築物で形質転換し、(b) 本発明の変異型の産生を促す条件下に本発明のヌクレオチド構築物を含んでなる本発明の組換え宿主細胞を培養し、そして (c) 変異型を回収することによって製造することができる。この方法はWO 01/29078 (HESKA) に記載されているように実施することができ、前記文献には、微生物中でポリペプチドを発現できるように修飾されたヌクレオチド配列を含むグループ1ダニタンパク質を組換え発現させることが記載されている。
【０１９３】
形質転換
真菌細胞は、それ自体知られている方法においてプロトプラストを形成し、プロトプラストを形質転換し、そして細胞壁を再生することを含むプロセスにより形質転換することができる。アスペルギルス (Aspergillus) 宿主細胞を形質転換する適当な手順は下記の文献に記載されている: EP 238 023およびYelton 他、1984、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474。フザリウム (Fusarium) 種を形質転換する適当な手順は下記の文献に記載されている: Malardier 他、1989、Gene 78: 147-156または同時係属米国特許出願No. 08/269,449。
【０１９４】
他の真菌細胞の例は、糸状真菌、例えば、アスペルギルス (Aspergillus) 種、アカバンカビ (Neurospora) 種、フザリウム (Fusarium) 種またはトリコデルマ (Trichoderma) 種、特にアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 、アスペルギルス・ニヅランス (A. nidulans) またはアスペルギルス・ニガー (A. niger) の株の細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス (Aspergillus) 種の使用は、例えば、下記の文献に記載されている: EP 272 277およびEP 230 023。フザリウム・オキシスポラム (F. oxysporum) の形質転換は、例えば、下記の文献に記載されているように実施することができる: Malardier 他、1989、Gene 78: 147-156。
【０１９５】
酵母は下記の文献に記載されている手順を使用して形質転換することができる: BeckerおよびGuarente、編者 Abelson J. N. およびSimon M. I.、Guide to Yeast Genetics and Molecular  Biology、Methods in Enzymology Vol. 194、pp. 182-187、Academic Press, Inc.、New York; Ito 他、1983、Journal of Bacteriology 153: 163; およびHinnen 他、1978、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920。哺乳動物細胞は、GrahamおよびVan der Eb (1978、Virology 52: 546) のリン酸カルシウム沈殿法を使用する直接的吸収により形質転換することができる。
【０１９６】
昆虫細胞の形質転換およびその中の異種ポリペプチドの産生は下記の文献に記載されているように実施することができる: 米国特許第4,745,051号、米国特許第4,775,624号、米国特許第4,879,236号、米国特許第5,155,037号、米国特許第5,162,222号およびEP 397,485、それらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる。
【０１９７】
培養
前述の形質転換されたまたはトレンスフェクトされた宿主細胞は、必要な分子の産生を可能とする条件下に適当な栄養培地中で培養し、次いでこれらを細胞または培養ブロスから回収する。
【０１９８】
細胞培養に使用する培地は宿主細胞の増殖に適当な任意の慣用培地、例えば、適当な補助物質を含有する最小または複合培地であることができる。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された調製法に従い調製することができる (例えば、American Type Culture Collectionのカタログ)。培地はこの分野において知られている手順を使用して調製する (例えば、下記の細菌および酵母の文献を参照のこと: Bennett J. W. およびLaSure L. 編者、More Gene Manipulations in Fungi、Academic Press、カリフォルニア州)。
【０１９９】
回収
特定の態様において、本発明のポリペプチド変異型は単離され、精製された形態である。こうして、本発明のポリペプチド変異型は20% w/wより高い純度、特に50% w/wより高い純度、より詳細には75% w/wより高い純度、より詳細には90% w/wより高い純度、なおより詳細には95% w/wより高い純度の調製物で提供される。この関係において純度は、調製において全ポリペプチド物質の調製物中に存在する本発明のポリペプチドの量として理解すべきである。
【０２００】
ポリペプチドに適用するとき、用語 「単離された」 は、ポリペプチドがその自然環境以外の状態で、例えば、血液および動物組織を別として、見出されることを示す。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のタンパク質、特に動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない。ポリペプチドは高度に精製された形態、すなわち、95%より高い純度、より好ましくは99%より高い純度であることが好ましい。
【０２０１】
分子が栄養培地中に分泌される場合、分子は培地から直接回収可能である。分子が分泌される場合、分子は細胞ライゼイトから回収できる。分子は培地から慣用手順により回収され、ここで慣用手順は宿主細胞を培地から遠心または濾過により分離し、塩、例えば、硫酸アンモニウムにより上清または濾液のタンパク質成分を沈殿させることを含む。タンパク質はin vitro で、例えば、自己触媒的プロセシングを誘導する酸性化により成熟させることができ (Jacquet 他、Clin. Exp. Allergy 2002、Vol. 32、pp. 1048-53)、そしてタンパク質は、問題の分子の型に依存して、種々のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはその他により精製することができる (例えば、下記の文献を参照のこと: Protein Purification、J-C JansonおよびLars Ryden 編者、VCH Publishers、New York、1989)。
【０２０２】
ポリマーの活性化
本発明の変異型を1または2以上のポリマーに対して複合化すべき場合、そして問題のポリペプチドと複合化すべきポリマー分子が活性ではない場合、それを適当な技術により活性化しなくてはならない。また、本発明によれば、リンカーを通してポリマー分子をポリペプチドに結合させることが考えられる。適当なリンカーは当業者によく知られている。
【０２０３】
ポリマー分子の活性化ならびにポリペプチドの複合化の方法および化学は文献に集中的に記載されている。不溶性ポリマーの活性化に普通に使用されている方法は、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カーボジイミド、スルホニルハライド、トリクロロトリアジンおよびその他を使用する官能基の活性化を包含する (参照：R. F. Taylor (1991)、“Protein Immobilisation, Fundamental and applications”、Marcel Dekkar、N.Y.; S. S. Wong (1992)、“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”、CRC Press、Boca Raton; G. T. Hermanson 他、(1993)、“Immobilized Affinity Ligand Techniques”、Academic Press、N.Y.)。
【０２０４】
方法のいくつかは不溶性ポリマーの活性化に関するが、また、可溶性ポリマーの活性化に適用できる、例えば、過ヨウ素酸塩、トリクロロトリアジン、スルホニルハライド、ジビニルスルホン、カーボジイミド、およびその他。ポリマー上のアミノ、ヒドロキシル、チオール、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフヒドリルである官能基およびタンパク質上の選択した取り付け基は、下記から成る活性化および複合化化学を選択するとき考慮しなくてはならない: i) ポリマーの活性化、ii) 複合化、およびiii) 残留活性基のブロッキング。
下記において、多数の適当なポリマー活性化法を簡単に説明する。しかしながら、他の方法を使用することもできることを理解すべきである。
【０２０５】
ポリペプチドの遊離酸基に対するポリマー分子の結合は、ジイミド、例えば、アミノ-PEGまたはヒドラジノ-PEG (Pollak 他、(1976)、J. Am. Chem. Soc. 98、289-291) またはジアゾアセテート/アミド (Wong 他、(1992)、“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”、CRC Press) の助けにより実施することができる。
ヒドロキシ基に対するポリマー分子の結合は水中で実施しなくてはならないので、一般に非常に困難である。通常、加水分解がヒドロキシル基との反応を超えて優勢である。
【０２０６】
遊離スルフヒドリル基に結合するポリマー分子は、特別の基、例えば、マレイミドまたはオルト-ピリジルジサルファイドと反応させることができる。また、ビニルスルホン (米国特許第5,414,135号、(1995)、Snow 他) はスルフヒドリル基より好ましいが、記載した他のものように選択的ではない。
ポリペプチド鎖中のアクセス可能なアルギニン残基は、2つのビシナルカルボニル基を含んでなる基でターゲッティングすることができる。
【０２０７】
求電子的に活性化したPEG類をリシンのアミノ基に結合することを含む技術を使用することもできる。アルコールに通常の脱離基の多数はアミン結合を生ずる。例えば、下記の基を使用することができる: アルキルスルホネート、例えば、トレシレート (Nilsson 他、(1984)、Methods in Enzymology Vol. 104、Jacoby W. B. 編、Academic Press: Orland、pp. 56-66; Nilsson 他、(1987)、Methods in Enzymology Vol. 135、Mosbach K. 編、Academic Press: Orland、pp. 65-79; Scouten 他、(1987)、Methods in Enzymology Vol. 135、Mosbach K. 編、Academic Press: Orland、1987、pp. 79-84; Crossland 他、(1971)、J. Am. Chem. Soc. 1971、93、pp. 4217-4219)、メシレート (Harris、(1985)、前掲; Harris 他、(1984)、J. Poym. Sci. Polym. Chem. 編、pp. 341-352)、アリールスルホネート、例えば、トレシレート、およびパラ-ニトロベンゼンスルホネート。
【０２０８】
有機スルホニルクロライド、例えば、トレシルクロライドは多数のポリマー、例えば、PEG中のヒドロキシ基をすぐれた脱離基 (スルホネート) に変換し、これらの脱離基は、ポリペプチド中の求核基、例えば、アミノ基と反応するとき、ポリマーとポリペプチドとの間に安定な結合の形成を可能とする。高い複合化収率に加えて、反応条件は一般に温和 (中性またはわずかにアルカリ性pH、変性を回避しかつ活性の崩壊はわずかであるか、あるいは全くない) であり、そしてポリペプチドに対する非破壊的必要条件を満足する。
【０２０９】
トレシレートはメシレートよりもいっそう反応性であるが、またいっそう不安定性であって、PEG、ジオキサン、およびスルホン酸に分解する (Zalipsky、(1995)、Bioconjugate Chem. 6、150-165)。また、エポキシドがアミン結合の形成に使用されてきているが、前述の基よりも反応性が非常に低い。
【０２１０】
PEGをホスゲンでクロロホルメートに変換すると、リシンに対するカルバメート結合が生ずる。この主題は多数の変異型において塩素を下記の基で置換する働きをすることできる: N-ヒドロキシスクシンイミド (米国特許第5,122,614号、(1992); Zalipsky 他、(1992)、Biotechnol. Applied Biochem. 15、pp. 100-114; Monfardini 他、(1995)、Bioconjugate Chem. 6、62-69)、イミダゾール (Allen 他、(1991)、Carbohydr. Res. 213、pp. 309-319)、パラ-ニトロフェノール、DMAP (EP 632 082 A1、(1993)、Looze Y.) およびその他。誘導体は通常クロロホルメートを必要な脱離基と反応させることによって作られる。すべてのこれらの基はペプチドに対するカルバメート結合を生ずる。
【０２１１】
さらに、イソシアネートおよびイソチオシアネートは、それぞれ、尿素およびチオ尿素を生成するとき使用できる。
アミドは前述と同一の脱離基および環状イミドトロンを使用してPEG酸から得ることができる (米国特許第5,349,001号、(1994)、Greenwald 他)。これらの化合物の反応性は非常に高いが、加水分解を速くさせることがある。
また、無水コハク酸との反応から作られたPEGスクシネートを使用することができる。ここで構成されたエステル基は複合体を加水分解物に対して非常に感受性とする (米国特許第5,122,614号、(1992)、Zalipsky)。この基はN-ヒドロキシスクシンイミドで活性化することができる。
【０２１２】
さらに、特別のリンカーを導入することができる。最も古いものは塩化シアヌル酸である (Abuchowski 他、(1977)、J. Biol. Chem. 252、3578-3581; 米国特許第4, 179,337号、(1979)、Davis 他; Shafer 他、(1986)、J. Polymer Sci. Poly. Chem. 編、24、375-378。
芳香族アミンに対するPEGの結合および引き続くジアゾ化は非常に反応性のジアゾニウム塩を生じ、これはその場でペプチドと反応することができる。また、アミド結合はPEGのアズラクトン誘導体を反応させ (米国特許第5,321,095号、(1994)、Greenwald R. B.)、こうして追加のアミド結合を導入することができる。
【０２１３】
いくつかポリペプチドは多数のリシンを含まいので、2以上のPEGを同一リシンに結合させることは好都合であることがある。これは、例えば、1,3-ジアミノ-2-プロパノールを使用することによって実施できる。
また、PEG類をカルバメート結合でポリペプチドのアミノ基に取り付けることができる (WO 95/11924、Greenwald 他)。また、リシン残基を主鎖として使用することができる。
これらの例において使用される結合技術は、WO 90/13590 (Enzon) に記載されているN-スクシニミジルカーボネート複合化技術である。
【０２１４】
組成物
本発明は、また、本発明の変異型と、必要に応じて薬学上許容される担体および/またはアジュバントとを含んでなる組成物、および本発明の変異型を薬学上許容される担体および/またはアジュバントと混合することを含んでなる前記組成物を製造する方法に関する。特定の態様において、組成物は免疫学的障害、例えば、動物またはヒトにおけるアレルギーを治療するために適当であり、例えば、ワクチンである。
【０２１５】
薬学上の担体および/またはアジュバントは下記を包含する: 生理的食塩水、グリセロール、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、サポニン (例えば、Q21およびQuill A)、スクアレンに基づく乳濁液 (例えば、MF59)、モノホスホリルリピドA (および合成模倣物)、ポリアクチドコ-グリコリド (PLG) 粒子、ISCOMS、リポソーム、キトサン、細菌のDNA (例えば、非メチル化CpG含有配列) を包含する。適当な担体は、また、薬学上許容される溶媒および/または錠剤化助剤/補助剤を包含する。
【０２１６】
ワクチン接種抗原ポリペプチド変異型およびそれらを含有する組成物の使用
それ以上の面において、本発明は、本発明の変異型または組成物を、薬剤として、特に免疫学的障害、例えば、動物およびヒトにおけるアレルギーの治療に、および/またはこのような免疫学的障害を治療する薬剤の製造に使用することに関する。
伝統的に、アレルギーワクチン接種は、非経口、鼻内、または舌下投与により、かなり長い期間にわたって投与量を増加して実施され、そして、いわゆる、患者の脱感作を生ずる。正確な免疫学的機構は知られていないが、アレルゲン特異的TおよびB細胞の表現型の誘導された差は特に重要であると考えられる。
【０２１７】
慣用のワクチン接種の型に比較して、アレルギーワクチン接種はアレルギー患者における進行する免疫応答の存在により複雑化している。この免疫応答はアレルゲン特異的IgEの存在により特徴づけられ、このIgEはアレルギーメディエイターの放出を仲介し、これによりアレルゲンに対する暴露時にアレルギー症候を誘導する。こうして、天然および/または天然に存在するアレルゲンを使用するアレルギーワクチン接種は、究極的に患者の生命を脅かす、固有の副作用の危険を有する。
【０２１８】
この問題を回避するアプローチは3つのカテゴリーに分割できる。実際には、2以上のカテゴリーからの手段がしばしば組み合わされる。手段の第1カテゴリーは長い期間にわたっていくつかの小さい、増加する投与量の投与を含み、この量は実質的に蓄積した投与量に到達する。この理論は、潜在的にアナフィラキシーの投与量のアレルゲンが投与される前に、保護的免疫応答をゆっくり開始させることである。手段の第2カテゴリーは、アレルゲンを、例えば、ゲル処方物、例えば、水酸化アルミニウムに混入することによる、アレルゲンの物理的変更を含む。水酸化アルミニウムはアジュバント作用および遅いアレルゲン放出の蓄積作用を有し、こうして組織中のアレルゲン濃縮を減少する。手段の第3カテゴリーは、本明細書に記載するように、アレルゲン性を減少する目的でアレルゲンを修飾することを含む。
【０２１９】
アレルギーワクチンの免疫治療的効果は多数の異なる方法で評価することができる。1つは特異的IgE結合性を測定することであり、その減少はよりすぐれた安全性のプロファイルを示す (しかしながら、必ずしもよりすぐれたワクチンの可能性を示さない) (WO 99/47680、ALK-ABELLQ)。また、いくつかの細胞アッセイを使用して、すぐれたアレルギーワクチンの可能性を示す変更された免疫応答を示すことができるであろう、これはいくつかの刊行物に示されており、これらのすべては引用することによって本明細書の一部とされる (van Neerven 他、“T Lymphocyte responses to allergens: Epitope-spcecificity and clinical relevance”、Immunology Today、1996、Vol. 17、pp. 526-532; Hoffmann 他、Allergy、1999、Vol. 54、pp. 446-454、WO 99/07880)。好塩基球ヒスタミン放出: 例えば、Swoboba 他、Eur. J. Immunol. Vol. 32、pp. 270-280、2002。また、皮膚乱刺法を、例えば、下記の文献に記載されているように使用できるであろう: Kronqvist 他、Clin. Exp. Allergy 2000 Vol. 30、pp. 670-676。
【０２２０】
究極的に、アレルゲン患者の臨床実験は細胞または臨床的終点測定により使用できるであろう (Ebner 他、Clin. Exp. All. 1997、Vol. 27、pp. 107-1015; Int. Arch. Allergy Immunol. 1999、Vol. 119、pp. 1-5)。
【実施例】
【０２２１】
方法
サンドイッチELISA
イムノプレート (Nunc Maxisorb; Nunc-Nalgene) を、一夜4℃において適当な投与量のポリクローナルウサギ抗Der p 1抗体で被覆する。次いでプレートを0.05%のツイーン20を含有する0.15 Mのリン酸塩緩衝液 (PBS)(PBST) で十分に洗浄し、そして残りの結合部位を2%のスキムミルク粉末を含むPBSで室温において1時間ブロックする。試料は精製された、半精製された組換えグループ1ダニポリペプチド変異型アレルゲンまたは問題のタンパク質を含有する粗製培養ブロスであることでき、これを適当な投与量または投与量範囲で添加する。
【０２２２】
次いでプレートを0.15 MのPBSTで十分に洗浄した後、ビオチニル化モノクローナル抗Der p 1抗体 (INDOOR) と室温において1時間インキュベートすることによって、アレルゲンを検出する。再び0.15 MのPBST中で洗浄する。ストレプトアビジン: 西洋ワサビペルオキシダーゼ (KierkegaardおよびPerry) の複合体と室温において1時間複合化する。洗浄工程を反復し、3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン過酸化水素 (TMB Plus、Kem-En-Tec) の添加により現像し、0.2 MのH2SO4の添加により反応を停止させる。OD450は免疫グロブリンへのアレルゲンの結合を反映し、こうして既知濃度で自然Der p 1 (Indoor Biotechnologies から入手可能である、製造番号: NA-DP1) をある投与量範囲で添加した場合、結合したアレルゲンを検出し、定量することができる。
【０２２３】
実施例１．抗体反応性をもつオリゴペプチド内のエピトープパターンの発見
それらの表面タンパク質の一部分としてランダムオリゴマーペプチド (ヘキサ、ヘプタ、オクタ、ノナおよび/またはドデカペプチド) を発現するファージの高い多様性のライブラリーを、抗体に結合する能力についてスクリーニングした。ファージライブラリーはSchafer-N (デンマーク国コペンハーゲン) から入手した。
【０２２４】
動物 (ラット、ウサギまたはマウス) において、下に列挙するタンパク質の各々を非経口的にまたは経粘膜的に投与することによって、抗体試料を発生させた。抗体をリン酸塩緩衝液 (PBS) 中に溶解した。ある場合において、カプリン酸沈降 (全IgG) または下記抗体の1つを負荷した常磁性免疫ビーズ (Dynal AS) を使用するアフィニティークロマトグラフィーにより、特定のサブクラスの抗体を免疫化動物の血清から精製した: マウス抗ラットIgGおよびラット抗マウスIgE。
【０２２５】
1)   バシラス (Bacillus) 種DSM 12649からのアミラーゼAA860、(ラットIgG)、
2)   バシラス・ハルマパルス (Bacillus halmapalus) からのα‐アミラーゼ (WO 96/23873)、これはまたアミラーゼSP722と呼ばれる、(ラットIgG)、
3)   残基183および184が欠失されたSP722の変異型、JE-1と呼ぶ (WO 96/23873)、(ラットIgGおよびウサギIgG)、
4)   ミセリオプトラ・サーモプラ (Mycelioptora thermoplla) ラッカーゼ (WO 95/33836) (ウサギIgG)、
5)   サーモミセス・ラヌギノスス (T. lanuginosus) リパーゼ (LipolaseTM) (ラットIgGおよびウサギIgG)、
6)   フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) からのファミリー45セルラーゼ (CarezymeTM) (ウサギIgG) 
【０２２６】
7)   バシラス・レンツス (Bacillus lentus) プロテアーゼ (SavinaseTM) (ラットIgG、マウスIgG、マウスIgE、およびウサギIgG)
8)   バシラス・アミロリクファシエンス (B. amyloliquefaciens) からのスブチリシンNovo (BPN’) (ラットIgG)、
9)   スブチリシンNovoのY217L変異型 (ラットIgG)、
10)  スブチリシン・カールスバーグ (AlcalaseTM) (ラットIgG)、
11)  TY145プロテアーゼ (ラットIgG)、
12)  CDJ31プロテアーゼ、
13)  スブチリシン147 (EsperaseTM) (ラットIgG)、
14)  バシラス・アミロリクファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) からのバシロリシン(NeutraseTM) (ラトIgGおよびラットIgG1)、および
15)  スブチリシンPD498 (WO 93/24623) (ラットIgGおよびウサギIgG)。
【０２２７】
ファージライブラリーを抗体被覆ビーズとインキュベートした。例えば、マウスIgE抗体に対する親和性をもつオリゴペプチドを発現するファージをラット抗マウスIgE被覆ビーズ上に捕捉し、これらの常磁性ビーズを磁場に暴露することによって収集した。温和な酸処理により、またはそれぞれの抗体試料に対して特異的な完全なタンパク質抗原 (例えば、抗Savinase抗体に対するSavinase) で溶離することによって、収集したファージを固定化抗体から溶離した。この分野において知られている方法を使用して、単離されたファージを増幅した。選択的に、固定化されたファージを感染のために大腸菌 (E. coli) と直接インキュベートした。
【０２２８】
簡単に述べると、F-因子陽性大腸菌 (E. coli) (例えば、XL-1 Blue、JM101、TG1) をヘルパーファージ (例えば、M13K07) の存在下にM13由来ベクターで感染させ、典型的には、グルコースまたはIPTG、および選択のために適当な抗体を含有する2×YT中でインキュベートした。最後に、細胞を遠心により除去した。このサイクルの事象をそれぞれの細胞上清について、最小2回および最大5回反復した。選択ラウンド2、3、4および5後、感染した大腸菌 (E. coli) の画分を選択2×YT寒天プレート上に接種し、そして出現するファージの特異性を免疫学的に評価した: ファージをニトロセルロース (NC) 膜に移した。各プレートについて、2つのNCレプリカを作った。一方のレプリカを選択抗体とインキュベートし、他方のレプリカを選択抗体、およびコンペティターとして抗体を得るために使用した免疫原とインキュベートした。免疫原が存在しないプラークを特異的と考慮し、そして前述の手順に従い増幅した。
【０２２９】
ポリエチレングリコールの存在下に遠心により細胞上清から、特異的ファージ-クローンを単離した。DNAを単離し、オリゴペプチドをコードするDNA配列をPCRにより増幅し、そしてそのDNA配列を決定し、ここですべてはこの分野において知られている標準的手順に従った。対応するオリゴペプチドのアミノ酸配列をDNA配列から推定した。
【０２３０】
これらの256の実験的に決定された反応性ペプチドに、文献に発表された402の反応性ペプチドに関する情報を補充した:
Allergy 38 (1983) 449-459;
Allergy 56 (2001) 118-125;
Allergy 56 s67 (2001) 48-51;
Allergy 54 (1999) 1048-1057;
Appl. Biochem. Biophys. 342 (1997) 244-253;
B. B. Res. Com. 219 (1996) 290-293;
Biochem. J. 293 (1993) 625-632;
Bioinformatics 18 (2002) 1358-1364;
Clin. Exp. Allergy 24 (1994) 100-108;
Clin. Exp. Allergy 24 (1994) 250-256;
【０２３１】
Clin. Exp. Allergy 31 (2001) 331-341;
Clin. Exp. Med. 24 (1994) 100-108;
Eur. J. Biochem. 245 (1997) 334-339;
Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89 (1989) 342-348;
Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 89 (1989) 410-415;
Int. Arch. Appl. Immunol. 103 (1994) 357-364;
Int. Arch. Appl. Immunol. 92 (1990) 30-38;
J. Allergy Clin. Immunol. 106 (2000) 150-158;
J. Allergy Clin. Immunol. 107 (2001) 1069-1076; 
J. Allergy Clin. Immunol. 93 (1994) 34-43;
【０２３２】
J. Biol. Chem. 271 (1996) 29915-29921;
J. Clin. Invest. 103 (1999) 535-542;
J. Immunol. 121 (1989) 275-280;
J. Immunol. 133 (1984) 2668-2673;
J. Immunol. 140 (1988) 611-616;
J. Immunol. 147 (1991) 205-211;
J. Immunol. 151 (1993) 5354-5363;
J. Immunol. 151 (1993) 7206-7213;
J. Immunol. Methods 213 (1998) 1-17;
Mol. Immunol. 25 (1988) 355-365;
【０２３３】
Mol. Immunol. 28 (1991) 1225-1232;
Mol. Immunol. 29 (1992) 1383-1389;
Mol. Immunol. 29 (1992) 257-262;
Mol. Immunol. 30 (1993) 183-189;
Mol. Immunol. 35 (1998) 293-305;
Mol. Immunol. 37 (2000) 789-798;
Peptides 21 (2000) 589-599;
Protein Science 8 (1999) 760-770;
Scand. J. Immunol. 27 (1988) 587-591;
Science 233 (1986) 747-753;
【０２３４】
WO 90/11293;
WO 99/38978;
WO 01/34186;
WO 01/39799;
WO 01/39799;
WO 01/49834;
www.csl.qov.uk/allergen
【０２３５】
こうして、前述のタンパク質特異的抗体に対する特異性をもつ、合計658ペプチド配列が得られた。これらの配列をデータベース中に集め、配列整列により解析して、エピトープパターンを同定して、保存的代替物が等しいと考えられることを観測された (前述したように)。
【０２３６】
エピトープパターンの同定
原理的には、658の反応性 (オリゴ)ペプチド配列の各々はエピトープパターンを表した。しかしながら、658の反応性 (オリゴ)ペプチド配列中で、いくつかのエピトープパターンは重複し、そしてエピトープパターン中の重複性を除去するために、反応性 (オリゴ)ペプチド配列をコンピュータ化データ解析に付した。
【０２３７】
まず、保存的代替物を考慮して132の異なる組み合わせに対応する、すべての可能なジペプチドを発生させた。658の反応性 (オリゴ)ペプチド配列中の各ジペプチドの存在および頻度を列挙した。次に、133の異なる組み合わせに対応する、すべての可能なトリペプチドを発生させ、再び658の反応性 (オリゴ)ペプチド配列中の各トリペプチドの存在および頻度を列挙した。次いで列挙したジペプチドおよびトリペプチドのすべての可能な組み合わせをを発生させ、これらはジペプチドとトリペプチドとの間に挿入された1、2、3または4残基を含有するものを包含し、これらの残基は13の可能な残基型の中から選択した。この手順により、各々が最初のリストからの少なくとも1つのジペプチドおよび少なくとも1つのトリペプチドならびにそれらの間に0〜4残基を含有する、5〜9アミノ酸の異なるペプチドの組み合わせのリストが発生した。
【０２３８】
反応性を等級づける手順により、658の反応性 (オリゴ)ペプチド配列における各ペプチドの組み合わせの頻度を選択し、そしてまず最も頻度が高い組み合わせによりカバーされる反応性ペプチドを選択し、658の反応性ペプチドのグループから分離する手順により、関係するエピトープパターンを選択した。次いで第2の最も頻度が高い組み合わせによりカバーされる反応性ペプチドを選択し、残りのグループから分離した。次いで第3の最も頻度が高い組み合わせによりカバーされる反応性ペプチドを選択し、残りのグループから分離した。658の反応性ペプチドをカバーする組み合わせが見出されるまで、この手順を反復した。このようにして、357の組み合わせ (エピトープパターン) がすべての658の反応性ペプチドをカバーすることが発見された。
【０２３９】
実施例２．エピトープの予測
鋳型として下記の三次元構造を使用して、Der p 1を構築した:
【０２４０】
【表１】
2007525155.tif 000002
【０２４１】
下記の文献に記載されているClustalW 1.7を使用して、3つの鋳型および成熟Der p 1の配列を整列させた: Higgins 他、Methods Enzymology、Vol. 266、pp. 383-402、1996、およびThomson 他、Nucleic Acids Research、Vol. 22、pp. 4673-4680、1994。この整列を下に示す。成熟Der p 1の第1の残基は鋳型のいずれにおいても対応する残基をもたないので、これらの残基の信頼性あるモデリングは不可能であり、それゆえ、9つのN-末端残基はDer p 1モデルに含まれていない。
【０２４２】
「モデラー (Modeler) 5.0」 プログラム (Accelrys Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、Der p 1の三次元モデルを構成した。下記のパラメーターを使用して 「インサイト (Insight) II」 分子モデリングソフトウェア (Accelry Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) から 「モデラー5.0」 を開始した: 1、最適化レベル: なし、より多くのオプション: あり、最適化ループ: あり、ループモデルの数: 2、ループ最適化レベル: 低、構成水素: なし。
「インサイトII」 を使用して、水素を付加し、そしてCHARMmポテンシャルおよび部分的チャージをモデルに割り当てた。 「CHARMm」 (Accelrys Software、米国カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、100ステップのABNR最小化を適用してモデルを緩和した。
【０２４３】
【表２】
2007525155.tif 000003
【０２４４】
【表３】
2007525155.tif 000004
【０２４５】
DSSPプログラム (参照：W. KabschおよびC. Sander、Biopolymers 22 (1983) 2577-2637) を使用して、表面アクセス可能性を配列番号1中の各アミノ酸について測定した (そのアミノ酸についての標準値の百分率)。確立された方法に従いDSSPプログラムを使用してヘリックス形成において20マーの均質なペプチド中のアミノ酸の平均表面アクセス可能性を解析することによって、標準値を発生させた。20の異なる残基の各々について、平均表面アクセス可能性は次の通りであった:
【０２４６】
【表４】
2007525155.tif 000005
【０２４７】
次のように実施例1において見出したエピトープパターンを使用することによってDer p 1 (配列番号1) の三次元モデルについてコンピュータプログラムにより、エピトープを予測した:
(1)  配列番号1中のすべてのアミノ酸について、(a) アミノ酸の型がエピトープパターンの最初のアミノ酸に合致するかどうか、および (b) 溶媒表面アクセス可能性が前もって規定した値、例えば、20%より大きいか、あるいはそれに等しいかどうかを検査した。1 (a) および1 (b) を満足するアミノ酸を選択する。
【０２４８】
(2)  工程1において選択されたアミノ酸から直径10Åの範囲内のすべてアミノ酸について、(a) アミノ酸の型がエピトープパターンの第2のアミノ酸に合致するかどうか、および (b) 溶媒表面アクセス可能性が前もって規定した値、例えば、20%より大きいか、あるいはそれに等しいかどうかを検査する。2 (a) および2 (b) を満足するアミノ酸を選択する。
【０２４９】
(3)  工程2において選択されたアミノ酸から直径10Åの範囲内のすべてアミノ酸について、(a) アミノ酸の型がエピトープパターンの第3のアミノ酸に合致するかどうか、および (b) 溶媒表面アクセス可能性が前もって規定した値、例えば、20%より大きいか、あるいはそれに等しいかどうかを検査する。3 (a) および3 (b) を満足するアミノ酸を選択する。
(4)  エピトープパターン中のすべてのアミノ酸について工程3を反復する。
【０２５０】
さらに、25Åの限界を任意の2つのエピトープ残基間の最大距離として設定した。
表面アクセス可能性のカットオフの下記の設定の各々について、すべての357エピトープパターンについて、この手順を実施した: 30、40、50、60、70および80%。この手順に従い配列番号1の三次元構造と合致するエピトープパターンを、エピトープとして予測する。
【０２５１】
最後に、溶媒アクセス可能性の7設定の各々について、すべてのDer p 1アミノ酸の表を作製し、ここで各アミノ酸残基がエピトープの1つのにおいて出現した回数を加算することによって、そのアミノ酸残基にスコアを与えた (その溶媒の設定において)。このスコアはそのアミノ酸の修飾 (置換、挿入、欠失、グリコシル化または化学的複合化) がより低い抗原性の変異型を生ずる可能性の指示であろう。次いでタンパク質のすべてのアミノ酸をこのスコアに従い順位付け、そして最高のスコアをもつものを突然変異誘発のために選択することができる。
【０２５２】
各溶媒アクセス可能性の設定において、10%の最高スコアのアミノ酸 (すなわち、22の最高スコアのアミノ酸) を下記表に示す (しかしながら70および80%の溶媒アクセス可能性の設定について、22より少ない残基がスコアを付されたので、それらの2つの場合において、スコアを付けたすべての残基が列挙されている)。システインは三次元構造の維持においてしばしば関係するので、それらは省略されている。
【０２５３】
【表５】
2007525155.tif 000006
【０２５４】
この手順から、配列番号1の残基A10、A12、E13、G29、G30、G32、A46、Y47、L55、D64、A66、S67、G73、T75、I80、Q84、N86、G87、S92、Y93、Y96、A98、R99、E100、Q101、R104、R105、P106、Q109、R110、F111、G112、I113、A132、I114、K145、D146、D148、R151、I158、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166、N179、A180、Q182、V183、D184、A205、I208の各々は、少なくとも1つの溶媒アクセス可能性の設定において上部10%の最高の順位付け残基に属することが発見された。
【０２５５】
配列番号1の残基A10、A12、G30、G32、A46、Y47、L55、D64、A66、S67、G87、S92、Y96、A98、R99、E100、Q101、R105、R110、F111、G112、I113、I114、K145、D146、D148、R151、I159、Q160、R161、D162、N163、G164、Y165、Q166の各々は、少なくとも1つの溶媒アクセス可能性の設定において上部5%の最高の順位付け残基に属した。
Der p 1の三次元モデル上における上部10%スコアリングのアミノ酸の位置を研究することによって、分子上の5エピトープ含有領域を規定することができる。次いで、各領域内の50%の最高スコアリングのアミノ酸を突然変異の最良の候補として選択する: 配列番号1の残基A10、A12、G32、L55、A66、S67、G87、A98、R99、F111、G112、I113、I114、D146、D148、I159、R161、G164、Q166、A180、D184、A205およびI208。
【０２５６】
実施例３．グループ1ダニポリペプチドの整列
5つの異なる天然グループ1ダニプレプロ-ポリペプチドを整列させた:
【表６】
2007525155.tif 000007
【０２５７】
【表７】
2007525155.tif 000008
【０２５８】
【表８】
2007525155.tif 000009
【０２５９】
Der p 1は18アミノ酸のシグナルペプチドおよび80アミノ酸のプロペプチドを保持するが、天然Der p 1は222アミノ酸の分子である。整列において、ギャップがDer p 1の位置8において作られている。なぜなら、それは他のグループ1ダニポリペプチドに比較してここにおいてアミノ酸を欠如するからである。同様な説明がEur m 1についてなされるが、Der f 1についてのみ成熟ポリペプチドが示され、そしてDer m 1について配列の画分のみが同定された。
【０２６０】
この整列により、グループ1ダニポリペプチド間の高い相同性およびエピトープ中に含まれるとして同定されたアミノ酸における例外的に高い相同性または保存性が確認される。こうして、Der p 1について示唆されたエピトープ、こうして突然変異もまたグループ1ダニポリペプチドの残部メンバーのために適当であると言うことは安全であるように思われる。
【０２６１】
実施例４．酵素変異型の構築および発現
特異的置換を含んでなる本発明のDer p 1変異型をDNAフラグメントのクローニングにより作った (Sambrook 他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor、1989)。ここでDNAフラグメントは必要な突然変異を含有するオリゴを使用するPCRにより製造された。
【０２６２】
組換えDer p 1およびすべての変異型はDer p 1ポリペプチドとともに発現され、そしてそれらのすべては成熟配列内のN-グリコシル化モチーフのみを崩壊する突然変異S54Nを有した。
鋳型プラスミドDNAはpSteD212であるか、あるいはDer p 1またはDer p 1の変異型を含有するこのアナローグであることができる。オリゴ指定突然変異誘発により、突然変異を変異型の構築に導入した。Der p 1プラスミド構築物を、下記の文献に記載されているように、サッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) 中に形質転換させた: BeckerおよびGuarente、1991、Methods Enzymology 194: 182-187。
【０２６３】
システインプロテアーゼまたは本発明のその変異型はベクターpSteD212中に位置した。このベクターは発現ベクターpYES 2.0から誘導される (Kofod 他、1994、J. Biol. Chem. 269: 29182-29189およびChristgau 他、1994、Biochem. Mol. Biol. Int. 33: 917-925)。
このプラスミドは大腸菌 (E. coli) およびサッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) の両方の中で複製した。サッカロマイセス・セレビシエ (S. cerevisiae) において、Der p 1または本発明によるその変異型はこのプラスミドから発現された。
【０２６４】
実施例５．発酵
100 mlのSC培地を含有する500 mlのバッフルドエルレンマイヤーフラス中で30℃において回転震蘯テーブル (250 rpm) 上において、Der p 1酵素/Der p 1変異型を産生するための発酵を30℃において5日間実施した。
結局、例えば、2リットルのブロスを作るために、20個のエルレンマイヤーフラスを同時に発酵させた。
【０２６５】
SC培地 (1リットルにつき):
アミノ酸を含まない酵母窒素基剤       7.5 g
コハク酸                             11.3 g
ビタミンを含まないカザミノ酸         5.6 g
トリプトファン                       0.1 g
水を添加した。オートクレーブ処理し、冷却した後、グルコースおよびL-トレオニンをそれぞれ4%および0.02%の最終濃度に添加した。
寒天プレートについて、20 gのバクト寒天をオートクレーブ処理前に培地に添加した。
【０２６６】
実施例６．Der p 1変異型についてのスクリーニング
Der p 1またはDer p 1変異型を発現する酵母形質転換体をスクリーニングするために、形質転換溶液をSC寒天プレート上にプレートして、30℃において3日間コロニー形成させた。コロニーを96マイクロウェルのプレート中に接種し、各ウェルは200 μlのSC培地を含有した。プレートを30℃、250 rpmにおいて5日間発酵させた。
【０２６７】
50 μlの培養ブロスを0.15 Mのリン酸塩緩衝液 (PBS) 中で1:1に希釈した後、サンドイッチELISAでOD450を測定した。Der p 1遺伝子を含まないプラスミドで形質転換した培養ブロスを、0.55の平均OD450のバックグラウンドとして使用した。OD450 > 0.55のサンドイッチELISAで試験した変異型を配列決定し、正しくフォールディングされ、酵母発現されたDer p 1変異型として承認された。
【０２６８】
標準として天然Der p 1を使用してサンドイッチELISAにより、変異型の一部分を培養ブロス中で直接濃度決定した。
OD450 > 0.55および定量的サンドイッチELISA (μg/mLとして記載した濃度) の両方により同定され、決定されたDer p 1変異型を下記表に示す。
【０２６９】
【表９】
2007525155.tif 000010
【０２７０】
【表１０】
2007525155.tif 000011
【０２７１】
実施例７．Der P 1抗原のPro形態および成熟形態の精製法
Der P 1およびPro-Der P 1を検出するアッセイ
Der P 1およびPro-Der P 1を検出する定量的ELISA (酵素結合免疫収着アッセイ)。
ウサギにおいて天然Der P 1 (Indoor Technologiesから購入した) に対して、ポリクローナル抗体を発生させた。ポリクローナル抗体を文献に記載されているように硫酸アンモニウム沈降法およびタンパク質カラムにより精製し、最後に50 mMのホウ酸塩pH 8緩衝液に対して透析した。
【０２７２】
製品シート (Pierce Chemicals、米国イリノイ州61105ロックフォード、N. メリジアンロード3747、郵便私書箱117) に記載されているようにNHS-ビオチンを使用して、精製したDer P 1に対する抗体を標識化し、そして標識化された抗体を検出抗体として使用した。
【０２７３】
Der P 1またはPro-Der P 1の高速検出法は次の通りであった: 
免疫収着マイクロタイタープレートをNUNCから購入し、そして10 μlの10 μg/mlのDer P 1に対する非標識化ポリクローナル抗体で、マイクロタイターウェルを4℃において一夜被覆した。次いで、文献に記載されているように、マイクロタイターウェルをPBSツイーン緩衝液で洗浄した。次いで、200 μlの10 mg/mlのBSAおよび0.05%のツイーン20を含有するPBS緩衝液でマイクロタイターウェルを飽和させ、室温において30分間インキュベートした。
【０２７４】
次いで、0.05%のツイーン20を含有するPBS緩衝液でマイクロタイターウェルを2回洗浄した。
次いで100 μlのDer P 1またはPro-Der P 1を含有する画分でマイクロタイターウェルを被覆し、おだやかに震蘯しながら20分間インキュベートした。次いで0.05%のツイーン20を含有するPBS緩衝液でマイクロタイターウェルを3回洗浄した。次いで0.05%のツイーン20を含有するPBS緩衝液中で約1 μg/mlに希釈した100 μlのビオチン標識化ポリクローナル抗体でマイクロタイターウェルを被覆し、室温においておだやかに震蘯しながら20分間インキュベートした。
【０２７５】
次いでマイクロタイターウェルをPBS緩衝液で3回洗浄し、100 μlの適切に希釈した免疫純粋アビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体 (これはPierce Chemicalsから購入した) で被覆した。室温において20分間インキュベートした後、0.05%のツイーン20を含有するPBS緩衝液でウェルを洗浄した。
次いで100 μlの西洋ワサビペルオキシダーゼ基質TMB  One (Kem EN Tecから購入した) をマイクロタイターウェルに添加し、数分間インキュベートし、KEN EN TECに記載されているようにリン酸の添加により反応を停止させた。ブランクについて、正確に同一の手順を実施したが、抗原をウェルに添加しなかった。
この方法をDer P 1またはPro Der P 1を検出する定量的アッセイとして使用した。
【０２７６】
Der P 1およびPro Der P 1の精製法
酵母またはアスペルギルス・オリゼ (A. oryzae) 中で発現したDer P 1抗原 (デルマトファゴイデス・プテロニッシヌス (Dermatophagoides pteronyssinus)) のPro形態の1リットルの発酵上清を遠心し、細胞破片を含有する沈殿を廃棄した。次いで細胞上清を0.22 μの無菌Seitz-EKS (Pall Corporationから入手した) (Pall Seitz Schenk Filter sysem GmbH、ドイツ国カド・クレンツナーハ、ピアニゲルStr. 137D) に通して圧力下に滅菌濾過した。
【０２７７】
次いで10 kDaのカットオフの膜 (Millipore Corporation、米国マサチューセッツ州01730ベッドフォード、から購入した) を使用する限外濾過技術により、滅菌濾過した必要なタンパク質を含有する細胞上清を濃縮した。緩衝液として50 mMのホウ酸塩pH 8を使用する透析濾過により、10 kDaより小さい分子を除去した。
濃縮し、透析濾過した必要なタンパク質を含有する上清に、おだやかに攪拌しながら固体状硫酸アンモニウムを1 Mの硫酸アンモニウムの最終濃度に徐々に添加し、pHを8に調節した。
【０２７８】
Toypearl Phenyl-650マトリックス (TOSOH Bioscience GmbH、ドイツ国シュツットガルト70567、ゼッタックリング6、から購入した) を詰めた50 mlのXK26カラム (Amersham-Pharmaciaから購入した) 上で、疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。
カラムを50 mMのホウ酸塩pH 8中に溶解した1 Mの硫酸アンモニウムを洗浄し、次いでそれと平衡化させた。
【０２７９】
次いで、濃縮した発酵上清を20 mL/分の流れでカラム上に適用した。次いで、ホウ酸塩pH 8緩衝液中に溶解した1 Mの硫酸アンモニウム (緩衝液A) を使用して、非結合物質を洗浄除去した。分画コレクター (Amersham Pharmaciaから購入した) に取り付けたUV検出器を使用して、すべての非結合物質が洗浄除去されたことをモニターした。
次いで他の塩を含有しない50 mMのホウ酸塩pH 8を含有する緩衝液Bで結合したタンパク質を溶離し、10 mlの画分を集めた。必要なタンパク質を含有する画分をSDS-PAGEによりチェックした。次いで、33 kDa〜22 kDaの分子量を有しかつ前述したように定量的に免疫反応性であることが見出されたタンパク質を含有する画分をプールし、さらにアニオン交換クロマトグラフィーにより精製した。
【０２８０】
Der P 1およびPro Der P 1のアニオン交換クロマトグラフィー
アニオン交換体高速流Qセファローズ50 mlカラムXK26 (前もって充填された、Amersham Pharmacia) を50 mMのホウ酸塩pH 8緩衝液で洗浄し、それと平衡化させた。
次いで、疎水性クロマトグラフィーからのDer P 1および/またはPro Der P 1を含有するプールを希釈して4 mSI以下のイオン強度に調節し、pHを8に調節した。次いで希釈したプールを高速流Qセファローズカラム上に20 ml/分の流速で適用し、非結合物質を緩衝液Aとしてホウ酸塩緩衝液pH 8で洗浄した。
【０２８１】
次いで、塩化ナトリウムとして1 Mの塩とともに50 mMのホウ酸塩pH 8を含有する緩衝液Bを使用する線形勾配で、結合した物質を溶離した。使用した全緩衝液は20カラム体積であった。
次いで、SDS‐PAGEおよび定量的ELISAアッセイにより、すべての画分を分析した。
次いで約30 kDaの分子量をもつタンパク質をPro-Der P 1としてプールし、そして成熟Der P 1はわずかにプロセシングされたために20 kDaのタンパク質として観察された。次いで、SDS‐PAGEおよびApplied Biosystemsの装置を使用するPVDF膜上のブロッティング後に、精製したタンパク質をN-末端について分析した。
【０２８２】
実施例８．酵素変異型のアレルゲン性のin vivo 評価 (MINTアッセイ)
グループ1ダニポリペプチド変異型のアレルゲン性を検証するために、マウス鼻内 (MINT) モデル (Robinson 他、Fund. Appl. Toxicol. Vol. 34、pp. 15-24、1996) を使用することができる。
実験の第1および第3日およびその後6週の期間に毎週、マウスにグループ1ダニポリペプチド変異型を鼻内に投与する。研究開始後15、31および45日に、血液試料を採り、引き続いて血清をIgEレベルについて分析することができる。
【０２８３】
ELISAによるマウス血清中の特異的IgE濃度の測定:
マウスからの血清試料中の特異的IgE抗体の相対濃度を、下記の手順に従い3層サンドイッチELISAにより測定する:
1)   100 μl/ウェルのラット抗マウスIgE重鎖 (0.05 Mの炭酸塩緩衝液pH 9.6中で1:100に希釈したHD-212-85-IgE3) でELISAプレート (Nunc Maxisorp) を被覆する。一夜インキュベートする。
2)   ウェルを空にし、0.15 MのPBS緩衝液pH 7.5中の200 μl/ウェルの2%スキムミルクで4℃において1時間ブロックする。プレートを前述したように洗浄する。
【０２８４】
3)   0.5%のスキムミルクおよび0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中の8倍希釈から開始して2倍希釈において、マウス血清 (100 μl/ウェル) の希釈物と、プレートをインキュベートする。陽性および陰性の対照血清試料の適当な希釈物 + 緩衝液対照を含める。室温において1時間インキュベートする。おだやかに震蘯する。0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中で、プレートを3回洗浄する。
【０２８５】
4)   0.5%のスキムミルクおよび0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中で1 μgのタンパク質/mlに希釈したグループ1ダニポリペプチド変異型の100 μl/ウェルを、プレートに添加する。プレートを4℃において1時間インキュベートする。プレートを前述したように洗浄する。
5)   結合した抗原を検出するために、0.15%のスキムミルクおよび0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中で、特異的ポリクローナル抗グループ1ダニポリペプチド変異型抗血清の血清 (plg) を希釈する。100 μl/ウェルを4℃において1時間インキュベートする。プレートを前述したように洗浄する。
【０２８６】
6)   0.15%のスキムミルクおよび0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中で1:1000に希釈したペルオキシダーゼと複合化したplg抗ウサギIgの100 μl/ウェルを、プレートに添加する。4℃において1時間インキュベートする。プレートを前述したように洗浄する。
7)   100 μl/ウェルのTMB (Plus (Ready-to-go基質; Kem-En-Tec、カタログNo. 4390A) を添加し、10分間反応させる。
8)   100 μl/ウェルのH2SO4の添加により、反応を停止させる。
9)   参照として620 nmを使用して、プレートを450 nmにおいて読む。
投与量応答曲線をグラフにし、非線形回帰を使用してS字形曲線に対して適合させ、そしてグループ1ダニポリペプチド変異型についてEC50を計算する。
【０２８７】
ELISAによるマウス血清中の特異的IgG1濃度の測定:
マウスからの血清試料中の特異的IgG1抗体の相対濃度を、下記の手順に従い3層サンドイッチELISAにより測定する:
1)   PBS中で10 μg/mlに希釈したグループ1ダニポリペプチド変異型の100 μl/ウェルでELISAプレート (Nunc Maxisorp) を被覆する。一夜インキュベートする。
2)   ウェルを空にし、0.15 MのPBS緩衝液pH 7.5中の2%スキムミルクの200 μl/ウェルで4℃において1時間ブロックする。0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液でプレートを3回洗浄する。
【０２８８】
3)   0.5%のスキムミルクおよび0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中の20倍希釈から開始して3倍希釈において、マウス血清 (100 μl/ウェル) の希釈物と、プレートをインキュベートする。陽性および陰性の対照血清試料の適当な希釈物 + 緩衝液対照を含める。室温において1時間インキュベートする。おだやかに震蘯する。プレートを前述したように洗浄する。
4)   0.5%のスキムミルクおよび0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中で2000×に希釈した、ビオチニル化ラット抗マウスIgG1 (Serotec、カタログNo. MCA 336B) の100 μl/ウェルをプレートに添加する。プレートを4℃において1時間インキュベートする。プレートを前述したように洗浄する。
【０２８９】
5)   0.15%のスキムミルクおよび0.05%のツイーン20を含む0.15 MのPBS緩衝液中で1000×に希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジン (kierkegaard & Perry、カタログNo. 14-30-00) の100 μl/ウェルをプレートに添加する。4℃において1時間インキュベートする。プレートを前述したように洗浄する。
6)   100 μl/ウェルのTMB (Plus (Ready-to-go基質; Kem-En-Tec、カタログNo. 4390A) を添加し、10分間反応させる。
【０２９０】
7)   100 μl/ウェルのH2SO4の添加により、反応を停止させる。
8)   参照として620 nmを使用して、プレートを450 nmにおいて読む。
投与量応答曲線をプロットし、非線形回帰を使用してS字形曲線に対して適合させ、そしてグループ1ダニポリペプチド変異型についてEC50を計算する。
【０２９１】
実施例９．酵素変異型のIgE抗原性のin vitro 評価
直接的および競合的ELISAおよび好塩基球ヒスタミン放出により、IgE結合性の減少を検証した。次いでIgE抗原性が減少したグループ1ダニポリペプチド変異型を、皮膚乱刺法により、さらに試験することができる。
【０２９２】
直接的ELISA
適当な投与量、または投与量範囲のグループ1ダニポリペプチドアレルゲン、または組換えグループ1ダニポリペプチド変異型アレルゲンで、イムノプレート (Nunc Maxisorp; Nunc-Nalgene) を4℃において一夜被覆した。次いで0.05%のツイーン20を含有するリン酸塩緩衝液 (PBS) (PBST) でプレートを十分に洗浄し、そして2%のスキムミルク粉末を含有するPBS (SMP) で残りの結合部位をブロックした。次いでほこりダニに対してアレルギーの患者からの血清 (ほこりダニアレルギーは病歴、皮膚乱刺法およびほこりダニ抽出物に対する特異的IgEの定量 (CAP-RAST測定) に基づいて診断した) をPBST中で1/4に希釈し、プレートに添加し、室温 (RT) において1時間または4℃において一夜インキュベートした。
【０２９３】
PBSTで十分に洗浄した後、アレルゲン-IgE複合体をウサギ抗ヒトIgE抗体 (DakoCytomation) および西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したブタ抗ウサギIgとのインキュベーションにより検出した。TMB (Kem-En-Tecから) の添加により酵素活性を測定し、等しい体積の0.2 MのH2SO4の添加により反応を停止させ、そしてELISAリーダー中で450 nmにおける光学密度 (OD450) を測定することによって、発色を定量した。OD450はアレルゲンに対するIgEの結合を反映する。
【０２９４】
第1に、競合的ELISAに適当なドナーを次のようにして同定した: ほこりダニのアレルゲンに対してアレルギーの23人の患者から単離した血清中のnDer p 1特異的IgE結合性を、直接的ELISAにおいてnDer p 1に対する投与量応答曲線により解析した。500 ng/ウェルのアレルゲンの被覆濃度を得るOD450値を決定し、そして0.5に等しいか、あるいはそれより高いOD450に到達しない血清を競合的ELISAにおけるそれ以上の分析から排除した。ドナー1、3、6、7、9、13、14、22および23からの血清を競合的ELISAにおける分析のために選択した。
【０２９５】
表11に、ほこりダニに対してアレルギーの23人の患者から単離した血清において、500 ng/ウェルのグループ1ダニ野生型ポリペプチドの被覆濃度を得るOD450力価を決定し、下記表に示す。
【０２９６】
【表１１】
2007525155.tif 000012
【０２９７】
ほこりダニのアレルゲンに対してアレルギーの23人の患者から単離した血清中のnDer p 1特異的IgE結合性を、直接的ELISAにおけるnDer p 1に対する投与量応答曲線により解析した。500 ng/ウェルのアレルゲンの被覆濃度に対応するOD450値を決定し、そして0.5に等しいか、あるいはそれより高いOD450に到達しない血清を競合的ELISAにおけるそれ以上の分析から排除した。表11に示すデータに基づいて、ドナー1、3、6、7、9、13、14、22および23からの血清を競合的ELISAによる個々の変異型の解析のために選択した。異なる変異型濃度についての完全な投与量応答曲線からのデータにより、この選択が確証された (データは示されてない)。
【０２９８】
競合的ELISA
2つを除外して、競合的ELISAを直接的ELISAと同様に実施した: イムノプレートを固定した濃度 (500 ng/ウェル) の野生型ポリペプチドで被覆し、そしてアレルギー患者からの希釈した血清をある投与量範囲のグループ1ダニ野生型ポリペプチド、組換えグループ1ダニポリペプチド野生型またはグループ1ダニポリペプチド変異型のアレルゲンと前インキュベートした。IgEが溶液中のポリペプチドに結合するとき、プレート結合野生型ポリペプチドに対する結合は減少し、こうしてOD450は減少する。
【０２９９】
Graph-Pad Prismソフトウェアを使用して、減少したIgE結合性を解釈した: OD450を変異型アレルゲン投与量の対数に対してプロットし、これによりS字形投与量応答曲線-適合をつくった。Prismにおける4パラメーターロジック (下部、上部、log ED50およびヒル勾配) S字形曲線適合のモデルを使用することによって、グループ1ダニ野生型ポリペプチドおよび変異型アレルゲンとのインキュベーションにより見出されたEC50を比較した。グループ1ダニ野生型ポリペプチドに対するIgE結合性を50%阻害するために要求される変異型の量のX倍増加または減少として、結合親和性の差を表す。
表12に、9人のほこりダニアレルギー患者から単離したnDer p 1特異的IgE血清における投与量応答曲線をプロットし、S字形曲線に対して適合させ、そしてグループ1ダニポリペプチド変異型についてEC50を計算した。
【表１２】
2007525155.tif 000013
【０３００】
表13に、6人のほこりダニアレルギー患者から単離したnDer p 1特異的IgE血清における投与量応答曲線をプロットし、S字形曲線に対して適合させ、そしてグループ1ダニポリペプチド変異型についてEC50を計算した。
【表１３】
2007525155.tif 000014
【０３０１】
表12および表13中に開示されているデータは、3つの変異型DP024、DP026、およびDP070が、グループ1ダニポリペプチドに比較して、高度に減少したIgE結合性を有することを示す。nDer p 1の応答に比較して、DP024変異型中に導入された突然変異は特異的血清IgEに対する親和性を約8〜22倍だけ低下させ、DP026中に導入された突然変異は特異的血清IgEに対する親和性を約3〜39倍だけ低下させ、そしてDP070中に導入された突然変異は特異的血清IgEに対する親和性を約23〜46倍だけ低下させる。さらに、データは、nDer p 1の応答に比較して、変異型DP065およびDP071が減少したIgE結合性を有することを示す。
【０３０２】
好塩基球ヒスタミン放出
好塩基性白血球からのヒスタミン放出は次のように実施した。ヘパリン化血液 (40 mL) を各ほこりダニアレルギー患者から抜き出し、室温において貯蔵し、そして24時間以内に使用した。25 μlのヘパリン化血液をガラス繊維被覆マイクロタイターウェル (Reference Laboratory、デンマーク国コペンハーゲン) に適用し、25 μlの投与量範囲の野生型ポリペプチド、組換え野生型、変異型アレルゲン、イエほこりダニ (House dust mite) (HDM) 抽出物または抗IgEと37℃において1時間インキュベートした。すべての連続希釈物をPIPES緩衝液 (Reference Laboratory、デンマーク国) 中で調製した。その後、プレートを水ですすぎ、妨害物質を除去した。最後に、微小繊維に結合したヒスタミンを分光蛍光測定により測定した。下記式を使用して結果を解釈する:
【０３０３】
アレルゲン誘導ヒスタミン放出% =〔 (アレルゲン刺激上清中のヒスタミン - 基底値) / (全ヒスタミン放出 - 基底値) 〕× 100
ここで
基底値 = アレルゲン刺激を含まない上清中の自発的ヒスタミン放出、そして
全ヒスタミン放出 = 過塩素酸2%で処置後に測定した血液試料中の全ヒスタミン含有率。
10%より大きい比ヒスタミン放出は陽性として考慮した。
【０３０４】
上記手順をある数のグループ1ダニポリペプチド変異型アレルゲンに適用した。ヒスタミン放出%をアレルゲン濃度の関数としてプロットし (第1図参照)、そしてED50を決定した。ヒスタミン放出の誘導において反映する差として、より高い濃度へのEC50のシフトに基づいて、好塩基球ヒスタミン放出が減少した変異型アレルゲンを選択した。
【０３０５】
23人のほこりダニに対してアレルギーの患者および3人の陰性患者 (イエほこりダニ (HDM) 抽出物 (ALK-Abello) を使用する刺激に対するヒスタミン放出に対して陰性) からの好塩基性細胞を、グループ1ダニポリペプチドおよびグループ1ダニポリペプチド変異型を使用する刺激に対するヒスタミン放出アッセイにおいて分析した。23人のほこりダニアレルギー患者のうちで、14人のみがnDer p 1を使用する刺激に応答してヒスタミン放出を誘導することが見出され、ほこりダニに対してアレルギーの患者のほぼ61%がnDer p 1特異的IgE抗体を有することが証明された (データは示されてない)。
【０３０６】
第1図に開示されているデータは、1人のほこりダニアレルギー患者からのヒト好塩基性細胞アッセイにおいて、rec-proDer p 1、rec-Der p 1およびDP070変異型がヒスタミン放出を誘導する効力を示す。DP070変異型の放出曲線は、nDer p 1、rec-proDer p 1およびrec-Der p 1の放出曲線に比較して、明らかに右にシフトしていることが理解される。このシフトは、ヒスタミン放出を誘導するDP070の効力がnDer p 1に関して約22倍だけ減少していることを示す。DP070の放出曲線の右へのシフトは、nDer p 1特異的IgE仲介応答を有するすべての14人の患者において見出され、対応する効力の減少は2〜22倍の範囲であった。
【０３０７】
9人の残りのほこりダニアレルギー患者からの好塩基性細胞は、1.67 μg/mlまでの濃度のグループ1ダニポリペプチドを使用する刺激に対して応答しなかった (データは示されてない)。しかしながら、グループ1ダニポリペプチドの最高濃度 (22 μg/ml) において、ヒスタミン放出はこれらの患者からの好塩基性細胞から観測された。このnDer p 1の高い濃度におけるヒスタミン放出の誘導は、商業的nDer p 1中に低レベルの不純物、こうして他のほこりダニアレルゲンが存在するためであろう。グループ1ダニポリペプチド変異型を使用する刺激に対する応答において、これらの9人の患者からの好塩基性細胞中で、ヒスタミン放出は観測されなかった (データは示されてない)。
【０３０８】
3人の陰性のドナーからの好塩基性細胞は、グループ1ダニポリペプチドまたはグループ1ダニポリペプチド変異型を使用する刺激に対して応答せず、粗製抽出物の非特異的刺激を証明した。
【０３０９】
第2図に開示されているデータは、ヒスタミン放出アッセイにより測定した、IgE抗原性の全体の減少を証明する。各変異型について、9人の患者の各々において、変異型のEC50値/nDer p 1のEC50値の比を計算した。こうして、対照として使用したnDer p 1試料について、すべてのドナーは1の正規化した値を示す (左欄)。nDer p 1試料の対照シリーズを含め、正常試料として処理した。このシリーズについての結果を一番右の欄に示し、そして比較的低い変動性を証明し、これはむしろ感受性の生物学的応答アッセイであると考えられる。変異型DP024およびDP070は、それぞれ、約5および約6、7の平均改良ファクターを示す。さらに、変異型DP071、DP065、DP033、およびDP026は、EC50値の増加により測定して、ドナーの大部分においてIgEに基づく抗原性の改良を示す。
【０３１０】
好塩基球ヒスタミン放出の使用は、下記の文献に記載されている: Nolte H、Schlotz O、Skov PS; 子供におけるアレルギー試験のための新しいガラス微小繊維に基づくヒスタミン分析; 結果を慣用の白血球ヒスタミン放出アッセイ、皮膚乱刺法、気管支誘発試験およびRASTで比較した; Allergy 1987 July; 42 (5): 336-73; およびWinther L、Moseholm L、Relmet CM、Stahl Skov P、Kaergaard Poulsen L; 好塩基球ヒスタミン放出、IgE、好酸球の計数、ECPおよびEPXは季節的アレルギー性鼻炎の重症度に関係する; Allergy 1999 May; 54 (5): 436-45。
【０３１１】
皮膚乱刺法
皮膚乱刺法をグループ1ダニポリペプチドに対してアレルギーの患者について実施し、そしてこの技術はこの分野においてよく知られており、例えば、下記の文献に記載されている: Kronquist 他、Clin. Exp. Allergy 2000、Vol. 30、pp. 670-376。
簡単に述べると、15 μlの組換え野生型または変異型アレルゲンを含有する溶液を患者の前腕上に配置する。その後、皮膚を乱刺ランセット (Prick-Lancette) (ALK) で乱刺する。試験部位を3 cm離して配置して偽陽性結果を回避する。組換えアレルゲンの最初の溶液 (例えば、1 mgのタンパク質/mL) から、適当な連続希釈物 (例えば、100 μg〜0.1 μg/mL) を無菌の生理的食塩水中で調製する。
【０３１２】
感作した好塩基球により有意なヒスタミン放出を誘発したアレルゲン濃度に従い、これらの希釈物を選択する。ヒスタミン放出試験および皮内反応に対する陽性の閾値は同一範囲であることが示された; そして、乱刺法の感度は皮内試験のそれよりも102〜103倍低いことが仮定される。生理的食塩水を使用して陰性対照試験実施し、そしてヒスタミンを、例えば、1 mg/mLで使用して陽性対照試験を実施する。膨疹の直径をその変異型に向かうアレルギー反応の測度として使用し、これにより、変異型アレルゲンを親または天然型アレルゲンと比較することができる。
【０３１３】
実施例１０．T細胞を刺激する保持された能力のアッセイ
グループ1ダニポリペプチドに対してアレルギーの患者からのヘパリン化血液のリンパ球画分をLymphoprep (Axix-Shield PoC、ノールウェー) 上の密度勾配遠心により精製し、AIM-V (Invitrogene) 中に再懸濁させ、96無菌組織培養プレート (Nuclon Delta) 中に2.5×105細胞/ウェルの細胞密度でプレートした。野生型グループ1ダニポリペプチドおよびグループ1ダニポリペプチド変異型のアレルゲンの連続希釈物を増殖培地中で作り、培地のみの対照と一緒に、細胞に添加した。次いで、プレートを37℃、5%CO2、100%湿度において7日間インキュベートした。
【０３１４】
インキュベーションの終わりにおいて、T細胞増殖を3[H]-チミジンの組込みにより測定し、収集20時間前に、3[H]-チミジン (0.5 μCi/ウェル) を添加した。細胞をガラス繊維フィルター上に収集し、3[H]-チミジンの組込みをシンチレーションカウンター中で測定した。三重または二重反復実験のウェルの3[H]-チミジンの組込みの平均計数/分 (cpm) として、増殖を表した。アレルゲン刺激および非刺激対照 (培地のみの対照) により得られたcpmの商として、刺激指数 (SI) を計算した。
SIを各ドナーおよびグループ1ダニポリペプチド変異型の選択について表4に示す。ドナー1〜23は23人のほこりダニアレルギー患者を表すが、ドナー24〜26は3人の陰性ドナーを表す。
【０３１５】
表14に、グループ1ダニポリペプチドおよびグループ1ダニポリペプチド変異型を使用する刺激に応答するT細胞増殖についての刺激指数。この表中に特記しない限り、T細胞増殖の分析は1.0 μg/mlのグループ1ダニポリペプチドまたはグループ1ダニポリペプチド変異型を使用する刺激について実施した。
【０３１６】
【表１４】
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【０３１７】
上記表に開示されているデータは、グループ1ダニポリペプチド変異型がほこりダニアレルギー患者からの一次T細胞において増殖を誘導することができたことを示す。これにより、変異型は抗体産生に必要な細胞の免疫応答を開始できることが示唆される。
【０３１８】
実施例１１．ヒト抗Der p 1抗血清に基づくエピトープマッピング
選択実験においてターゲッティングするためのDer p 1に対する特異性をもつヒトIgEビーズの製造 (抗Der p 1ビーズ):
ウサギ抗ヒトIgE (抗hIgE) 抗体を、商業的に入手可能なトシル活性化常磁性ビーズに共有結合させた。製造業者の規格書に従い残りの結合部位を不活性化し、ビーズを洗浄した後、抗hIgEビーズをDer p 1に対して感作した患者からプールした血清 (血清を希釈緩衝液 (PBS pH 6.6) 中で3×希釈した) と4℃において一夜インキュベートした。200 μlのビーズを40 mlの洗浄緩衝液 (PBS pH 6.6 + 0.05%のツイーン20) で3回洗浄し、次いで2%のスキムミルクを補充したPBSと室温において1時間インキュベートし、前述したように3回洗浄した。
【０３１９】
商業的に入手可能なファージ展示ペプチドライブラリーからのエピトープ模倣物の選択: 7マーまたは12マーのペプチドライブラリーに拘束された、いずれかの7マーの商業的に入手可能なファージ展示ライブラリー (New England Biolabs) から、エピトープを模倣するペプチドを単離した。抗Der p 1ビーズを2×1011ライブラリーファージと室温において4において時間インキュベートし、次いで非結合ファージを徹底的な洗浄により除去した。普通のビーズまたは抗hIgE抗体に結合したペプチドの濃縮を回避するために、特別の溶離手順を実行した: 洗浄後、まず0.5%のスキムミルクを補充したPBSとビーズを室温において1時間インキュベートした。
【０３２０】
この追加の洗浄工程後、0.5%のスキムミルクを補充したPBS中で25 μMの精製したDer p 1と、再び室温において1時間インキュベートすることによって、ファージをビーズから溶離した。この溶離の上清中のファージのみをさらに増殖させた。ER2738細胞を使用する選択の第1ラウンド後、ライブラリー製造業者のガイドライン (NEBユーザーマニュアル) に従い、選択したファージを増幅した。第2ラウンド後、細胞を感染させ、ファージ単離のために拡大し、引き続いて結合について試験し、配列決定した。
【０３２１】
血清IgEに対する結合を試験するためのファージELISA
100 μlの被覆緩衝液 (50 mMの炭酸ナトリウム、pH 9.0) 中の100 ngの抗hIgE抗体を96ウェルのプレート上に4℃において一夜被覆した。洗浄緩衝液 (PBS pH 6.6 + 0.05%のツイーン20) 中において、非占有結合部位をスキムミルク (2 w/v%) で室温において2時間ブロックした。次いで希釈緩衝液 (PBS pH 6.6) 中で100 μlに50×希釈した血清試料からヒトIgEを選択的に固定化し、室温において2時間インキュベートした。第2ラウンドの溶離で感染させた、単離した細胞からのファージ調製物は推定上のエピトープ模倣物を展示するファージを含有し、結合のために、それらを変化する希釈物中に採取した。ファージ調製物の非存在下に血清に対する交差反応性が検出された時、マウス抗M13-ファージ抗体-西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) 複合体を使用するか、あるいはマウス抗pIII抗体、ヒツジ抗マウスIgG抗体-HRPサンドイッチを使用して、結合したファージを検出した。
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】図1は、グループ1ダニポリペプチド (nDr p 1) およびグループ1ダニポリペプチド変異型、rec-proDer p 1、rec-Der p 1およびDP070を使用する刺激に応答した1人の代表的ドナー、ドナー1におけるヒスタミン放出を示す。
【図２】図2は、正規化したヒスタミン放出を示し、EC50をグループ1ダニポリペプチド変異型について計算した。ほこりダニのアレルギーを有する14人の患者から単離したnDr p 1特異的IgE血清における投与量応答曲線をプロットし、S字曲線に適合させ、そしてEC50をグループ1ダニポリペプチド変異型について計算し、グループ1ダニポリペプチド (nDr p 1) に対して正規化した。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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