(57)【要約】  炭疽の感染防御抗原０３５に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体を開示する。ヒト抗体は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチングを受けることによりヒトモノクローナル抗体の複数のアイソタイプを生産することができる非ヒトトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスで生産させることができる。またヒト抗体の誘導体（例えば二重特異性抗体および免疫複合体）、ヒト抗体を含んでなる製薬学的組成物、非ヒトトランスジェニック動物およびヒト抗体を生産するハイブリドーマ、およびヒト抗体を使用した治療および診断法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１０７Ｍ−１の見掛け親和性を有する炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に結合し、そして毒素中和アッセイにおいて５μｇ／ｍｌ以下のＥＤ５０で炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素を中和する、単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
ＥＤ５０が１μｇ／ｍｌ以下である請求項１に記載のヒト抗体。
【請求項３】
ＥＤ５０が０．１μｇ／ｍｌ以下である請求項１に記載のヒト抗体。
【請求項４】
ＥＤ５０が０．０５μｇ／ｍｌ以下である請求項１に記載のヒト抗体
【請求項５】
毒素中和アッセイにおいて炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の致死因子を中和する、前記請求項のいずれかに記載のヒト抗体。
【請求項６】
毒素中和アッセイが神経、心臓、肺および骨髄から選択される組織に由来する細胞を使用する、前記請求項のいずれかに記載のヒト抗体。
【請求項７】
細胞がマクロファージである、請求項６に記載のヒト抗体。
【請求項８】
ヒトＩｇＧ重鎖およびヒトカッパ軽鎖を含んでなる前記請求項のいずれかに記載のヒト抗体。
【請求項９】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ３重鎖を含んでなる前記請求項のいずれかに記載のヒト抗体。
【請求項１０】
ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含んでなる単離されたヒトモノクローナル抗体であって、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域の配列が、それぞれ配列番号２および４、配列番号２および６、配列番号８および１０、配列番号１２および１４または配列番号１６および１８から選択される配列を含んでなり、そしてそれらの保存的な配列改変体を含む上記の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１１】
炭疽の感染防御抗原に対する結合について、請求項１０に記載のヒトモノクローナル抗体と競合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１２】
ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４配列を含んでなるヒト重鎖可変領域、ならびにＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４配列を含んでなるヒト軽鎖可変領域を含んでなる単離されたヒトモノクローナル抗体であって：
（ａ）ヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が配列番号２０、３８、５０および６２およびそれらの保存的改変体からなる群から選択され；そして
（ｂ）ヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が配列番号２６、３２、４４、５６および６８およびそれらの保存的改変体からなる群から選択され；
抗体が少なくとも１０７Ｍ−１の見掛け親和性で炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に結合し、そして毒素中和アッセイにおいて５μｇ／ｍｌ以下のＥＤ５０で炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素を中和する、上記の単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ヒト重鎖可変領域ＣＤＲ２配列が配列番号２２、４０、５２および６４およびそれらの保存的改変体からなる群から選択され、そしてヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ２配列が配列番号
２８、３４、４６、５８および７０およびそれらの保存的改変体からなる群から選択される、請求項１２に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項１４】
ヒト重鎖可変領域ＣＤＲ１配列が配列番号２４、４２、５４および６６およびそれらの保存的改変体からなる群から選択され；そしてヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ１配列が配列番号３０、３６、４８、６０および７２およびそれらの保存的改変体からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の単離されたヒト抗体。
【請求項１５】
配列がヒト重鎖ＶＨ３−３３またはＶＨ３−７生殖細胞系配列に由来するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列を有するヒト重鎖可変領域を含んでなる、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１６】
配列がヒト軽鎖Ｌ１５、Ｌ１８またはＡ２７生殖細胞系配列に由来するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列を有するヒト軽鎖可変領域を含んでなる、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１７】
図１〜９に示すヒト重鎖および軽鎖から選択されるＣＤ１、ＣＤ２およびＣＤ３領域のアミノ酸配列に少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含んでなる、ヒト重鎖および軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖および軽鎖ＣＤＲ２領域ならびにヒト重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域を含んでなる、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体。
【請求項１８】
ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を含んでなる、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体であって：
（ａ）ヒト重鎖可変領域が、配列番号２、８、１２および１６、および配列番号２、８、１２および１６に少なくとも８０％相同な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなり；そして
（ｂ）ヒト軽鎖可変領域が、配列番号４、６、１０、１４および１８、および配列番号４、６、１０、１４および１８に少なくとも８０％相同な配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、上記の単離されたヒトモノクローナル抗体
【請求項１９】
抗体がＦａｂフラグメントまたは単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、前記請求項のいずれかに記載のヒト抗体。
【請求項２０】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６および１８から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸。
【請求項２１】
配列番号２０、３８、５０および６２から選択されるアミノ酸配列を含んでなる重鎖可変領域ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列、ならびに  配列番号２６、３２、４４、５６および６８から選択されるアミノ酸配列を含んでなる軽鎖可変領域ＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列を含んでなる請求項１に記載のヒト抗体をコードする単離された核酸。
【請求項２２】
請求項１０ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体をコードする単離された核酸分子。
【請求項２３】
請求項２０ないし２１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含んでなる発現ベクター。
【請求項２４】
請求項２３に記載の発現ベクターを含んでなるトランスフェクトーマ。
【請求項２５】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体を発現するトランスジェニック非ヒト動物であって、トランスジェニック非ヒト動物がヒト重鎖導入遺伝子または導入染色体およびヒト軽鎖導入遺伝子または導入染色体を有する、上記のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項２６】
ハイブリドーマにより生産される請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の単離されたヒト抗体であって、ハイブリドーマが、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子または導入染色体およびヒト軽鎖導入遺伝子または導入染色体を含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物から得たＢ細胞から調製される、上記の単離されたヒト抗体。
【請求項２７】
治療薬に連結された請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体を含んでなる免疫複合体。
【請求項２８】
治療薬がサイトトキシンまたは放射性同位体である請求項２６に記載の免疫複合体。
【請求項２９】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３０】
さらに追加の治療薬を含んでなる請求項２９に記載の製薬学的組成物。
【請求項３１】
追加の治療薬が、感染防御抗原ワクチン、または炭疽菌、胞子、感染防御抗原、致死因子もしくは浮腫因子に対する第２の抗体、または該第２の抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは単鎖Ｆｖフラグメントから選択される、請求項３０に記載の製薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項２７に記載の免疫複合体および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３３】
検出可能な量の請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の抗体を生産するハイブリドーマ。
【請求項３４】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体を生産する方法であって、抗体が動物のＢ細胞により生産されるように、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原または炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原を発現する細胞で免疫感作し、動物からＢ細胞を単離し、そしてＢ細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体を産生する不死化ハイブリドーマ細胞を形成することを含んでなる上記生産方法。
【請求項３５】
炭疽による感染が疑われる細胞における炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原の生理学的活性を阻害する方法であって、感染防御抗原の生理学的活性が阻害されるように、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原を細胞の存在下で有効量の請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の抗体と接触させることを含んでなる上記阻害方法。
【請求項３６】
炭疽による感染が疑われる細胞中の炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素を中和する方法であって、毒素が中和されるように、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原を細胞の存在下で有効量の請求項１ないし１９のいずれかに記載の抗体と接触させることを含んでなる上記中和方法。
【請求項３７】
炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に感染した宿主の炭疽感染を処置または防止する方法であって、宿主に炭疽感染を処置または防止するために有効な量の請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体を投与することを含んでなる上記処置または防止方法。
【請求項３８】
さらに追加の治療薬を投与することを含んでなる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
追加の治療薬が抗生物質およびワクチンから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
サンプル中の炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原の存在を検出する方法であって：
サンプルを請求項１ないし１９、１２ないし１４、１７または１８のいずれかに記載の抗体と、抗体および感染防御抗原を含んでなる複合体が形成できる条件下で接触させ；そして
複合体の形成を検出する、
ことを含んでなる、上記検出法。
【請求項４１】
抗体の毒素を中和する能力がＦｃ受容体への結合を要する、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項４２】
標準的ＥＬＩＳＡに従い、抗体がＰＡ８３よりもＰＡ６３に高い親和性を現す、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項４３】
（１）標準的ＥＬＩＳＡに従い１μｇ／ｍｌではＰＡ８３に結合せず、０．２以下のＯＤ４０５ｎｍであり；
（２）ＰＡに結合する炭疽致死因子または浮腫因子を遮断しない、
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項４４】
ＰＡ６３に対する結合において、マウス１Ｇ３、マウス２Ｄ５およびマウス１４Ｂ７から選択される抗−ＰＡ抗体とは競合しない、請求項１ないし１９のいずれか１項に記載のヒト抗体。
【請求項４５】
（１）中和活性のためにＦｃ受容体への結合を要し；
（２）ＰＡ８３よりもＰＡ６３に高い親和性を現し；
（３）（ａ）標準的ＥＬＩＳＡに従い１μｇ／ｍｌではＰＡ８３に結合せず、０．２以下のＯＤ４０５ｎｍであり、
（ｂ）炭疽致死因子または浮腫因子の感染防御抗原への結合を遮断しない、
から選択される１もしくは複数の特性を現し、
（４）ＰＡ６３に対する結合において、マウスＩＧ３、マウス２Ｄ５およびマウス１４Ｂ７から選択される抗−ＰＡ抗体と競合しない、
特徴を含んでなる、炭疽感染防御抗原に対する中和抗体。
【請求項４６】
請求項４１ないし４５のいずれかに１項に記載の抗体および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項４７】
請求項４５に記載の抗体を０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬用量で投与する工程を含んでなる、処置が必要な患者の炭疽の処置または防止方法。
【請求項４８】
請求項４５に記載の抗体を０．３ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇの投薬用量で投与する工程を含んでなる、処置が必要な患者の炭疽の処置または防止方法。
【請求項４９】
請求項４５に記載の抗体を１ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇの投薬用量で投与する工程を含んでなる、処置が必要な患者の炭疽の処置または防止方法。
【請求項５０】
患者が炭疽に感染している、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
患者が好中球減少症を現す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
患者が炭疽感染の１もしくは複数の兆候および／または症状を現す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
患者が炭疽に感染していない請求項４７に記載の方法。
【請求項５４】
投薬用量が皮下または静脈内に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５５】
１もしくは複数の追加の投薬用量が投与される請求項４７に記載の方法。
【請求項５６】
炭疽感染防御抗原に対する抗体をスクリーニングする方法であって；
（１）毒素中和アッセイにおいて炭疽毒素を中和する１もしくは複数の抗体を選択し；そして
（２）０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＤ５０を有する抗体を選択する、連続工程を含んでなり、選択基準として、抗原−抗体結合親和性アッセイが工程（１）または（２）の前に使用されない上記方法。
【請求項５７】
スクリーニングが炭疽毒素を中和するためにＦｃ受容体結合を要する抗体を選択することをさらに含んでなる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項５６に記載の方法により選択される抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）は主に家畜および野生動物、特にウシ、ヒツジ、ウマ、ラバおよびヤギのような草食動物の疾患である。ヒトにおける自然な炭疽感染は稀であるが（疾患のある動物との接触を介する感染の危険性は、約１／１００，０００）、バイオテロの正に現実的脅威を引き起こす。このバクテリアは耐熱性の頑丈な胞子を形成し、そして粗雑な条件下で何十年も生存することができる。皮膚炭疽は、より迅速に処置することができるが、肺炭疽の多くは２〜４日の致死率が８０％より高い突然の破滅的疾病をもたらす。胞子の安定性により疾患が容易に広がり得ることは、２００２年に米国で起こった５例の死亡により明らかである。炭疽菌の胞子がテロの行為により広がれば、大勢の人が治療を求め、または死ぬまでこの出来事は発見することができないだろう。抗生物質およびワクチンを含む現在の治療では、これら大多数の犠牲者を助けることはできない。
【０００２】
炭疽感染の現行モデルは、胞子の双生後、活発に増殖するバクテリアの細胞が、血清および食細胞の殺バクテリア成分および食細胞の飲食作用に対してバクテリアを保護するポリ−Ｄ−グルタメートポリペプチドを含有する筴膜を生産することを教示する。この筴膜は疾患の末期よりも炭疽毒素により媒介される感染の樹立中に重要である。病因論の原因となる毒素は、感染防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）からなる。ＥＦは炭疽感染に付随する浮腫を引き起こし、そして免疫細胞がバクテリアを摂取し、そして分解することを妨げると考えられているカルシウム−カルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼである。ＬＦは、マイトジェンが活性化するプロテインキナーゼ−キナーゼおよび数種のペプチドホルモンを分解する細胞型特異的メタロプロテアーゼである。これはマクロファージ細胞死および毒素物質の放出を引き起こす（例えばＴＮＦ−αおよびＩＬ−１のような敗血症ショックに関連するような）。ＬＦは炭疽の毒性に関連する主なビルレンスであり、そして全身性ショックおよび死亡の原因となる。
【０００３】
いずれの毒素成分も単独で病原性ではなく、そしてＥＦおよびＬＦはそれらの毒性効果を宿主細胞の内側で発揮するためにＰＡを必要とする。感染中、急速に増殖している炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）から分泌される８３ｋＤａの感染防御抗原ＰＡ８３タンパク質は、炭疽毒素受容体（ＡＴＲ）を介して宿主の細胞表面に結合する（非特許文献１）。膜結合フリンおよび／またはフリン様プロテアーゼによるＰＡ８３の分解は、アミノ−末端の２０ｋＤａのＰＡフラグメントを放出し、受容体に結合する６３ｋＤａのＰＡを生じる。ＰＡ６３の７環へのオリゴマー化は、ＬＦおよびＥＦの両方のアミノ末端により認識される高親和性結合部位を形成する。受容体−毒素複合体の酸性エンドソームへの飲食作用はＰＡ６３に立体的変化を誘導し、これによりＬＦまたはＥＦがエンドソームへ放出される。リソソームの酸性化および続いて受容体の放出は、オリゴマー性のＰＡ６３孔の不可逆的な膜挿入を促進する。ＰＡ６３により形成される孔は、ＬＦおよびＥＦのそれぞれの毒性を現すことができる細胞質への輸送を可能とする。
【０００４】
ＰＡ機能の解釈の幾つかの様式が炭疽に対する処置を開発するために調査されてきた。ＡＴＲを持つ細胞（例えばマクロファージ）を含有する培地に導入された可溶性ＡＴＲ（ｓＡＴＲ）は、細胞表面上の受容体の代わりにｓＡＴＲへの結合を引き起こし（非特許文献２）、ＡＴＲが炭疽の処置の設計に有用となり得ることを示唆する。優性ネガティブインヒビター（ＤＮＩ）と呼ばれるＰＡの変異体は、天然のＰＡと混合した時に７量体の複合体の形成を可能とすることも示され、これは細胞培養および齧歯類モデルの両方でＥＦおよびＬＰを細胞に注入できなかった（非特許文献３）。ＰＡに対して生成したモノクローナル抗体は、感染の症状を弱め、ならびに予防を提供することができる。抗体はＰＡが細胞表面上のその受容体への結合を遮断し、かつ／またはＥＦもしくはＬＦのＰＡへの結合を遮断することができる。これらの方法のいずれも毒素が細胞に入り、そして傷害を引き起こすことを防止することができた。抗生物質単独でバクテリアの増殖を制御することができるが、それらは毒素の効果を中和することには役に立たない。さらにバクテリア中の耐性を作り変え、これにより抗生物質を無益にする可能性があるかもしれない。
【０００５】
主要な免疫原性成分としてＰＡを含有する炭疽ワクチン（ＡＶＡ）は、疾患に対する防御を与えることができる。しかしＡＶＡを使用することに対しては幾つかの欠点がある。免疫感作スケジュール（例えば６回の初期投与に続いて毎年の追加免疫感作）は、強力な免疫学的記憶を生成しない。また抗原レベルの標準化の欠如により、ロット毎の効力に高度な変動性が生じる。さらにワクチンは数種の細胞成分を含有する無細胞培養基の濾液であるので、局所および全身反応の高い発生の一因となり得る。ワクチンに対応して生成されたポリクローナル抗体の予防的使用では、ＰＡに対する抗体が炭疽に暴露された後に疾患を予防することが示された。ＰＡに結合する抗体について、ナイーブな単鎖ＦｖファジェミドライブラリーからスクリーニングされたヒトｓｃＦｖの開発が記載された（非特許文献４）。これらのＰＡ結合剤は、受容体が媒介する細胞へのＰＡの結合を阻害するそれらの能力に基づき、精製したＰＡ８３に対して選択された。しかしこれらの免疫剤は完全な抗体ではないので、処置におけるそれらの使用は低下した半減期または低い親和性により制限され、これはさらに高い投薬用量を必要とし、特に予防的処置ではそうである。
【０００６】
モノクローナル抗体は抗生物質よりも利点があり、また抗体の効力を増すために使用することができる。活発な肺疾患の処置に関して、抗生物質は前もって形成されそして放出された、病因である毒素を中和しないが、抗体はさらなる毒素が炎症カスケードの一因となる前に毒素を中和することができる。予防的処置については、必要とされる抗生物質の予防期間が６０日であり、これに従うことは難しい。さらにこの期間は１回の抗体の注射に代えることができる。さらに真の暴露では、抗生物質が防御免疫応答を妨害し得るので、投与が終了した後の防御免疫は獲得されない。
【０００７】
したがって、炭疽感染を処置するための改善された治療、特に免疫系に十分に寛容され、しかも予防的、暴露後の予防的および治療的使用が可能な炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に対する抗体が必要である。
【参考文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１４：２２５−２２９
【非特許文献２】Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：３０９−３１４
【非特許文献３】Ｓｅｌｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：６９５−６９７
【非特許文献４】Ｃｉｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（６７：２９５７−２９６３）
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
本発明は、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（炭疽：ａｎｔｈｒａｘ）の感染防御抗原に結合する単離されたヒトモノクローナル抗体、これにより炭疽菌の生物学的活性を阻害すること、ならびに誘導体（例えば免疫複合体（ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、二重特異性分子および単鎖フラグメント（ＳｃＦｖ）およびそのような抗
体を単独で、または追加の治療薬と組み合わせて含有する他の治療的組成物を提供する。また本発明の抗体を使用して炭疽感染を処置し、そして防止するための方法および組成物も提供する。
【００１０】
本発明の抗体は、一部は抗体が感染防御抗原活性を効果的に中和するその能力により、および抗体の完全なヒト組成物により炭疽感染を処置および防止するための改善された手段を提供し、これはヒト患者に投与した時にこれまでに生成された他の感染防御抗原抗体（例えばマウスおよびヒト化抗体）よりも抗体の免疫原性を有意に低くし、しかもさらに治療に効果的かつ有用とする。
【００１１】
このように１つの観点では、本発明は少なくとも１０７Ｍ−１の見掛け親和性（ａｐｐａｒｅｎｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有する炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に結合し、そして毒素中和アッセイにおいて５μｇ／ｍｌ以下のＥＤ５０で炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の毒素を中和する、完全なヒト抗体を提供する。
【００１２】
別の観点では、本発明は炭疽感染防御抗原に対して中和するヒトモノクローナル抗体を提供し、これは以下の特徴：
（１）中和活性のためにＦｃ受容体への結合を要し；
（２）ＰＡ８３よりもＰＡ６３に高い親和性を現し；
（３）（ａ）標準的ＥＬＩＳＡに従い１μｇ／ｍｌではＰＡ８３に結合せず、０．２以下のＯＤ４０５ｎｍであり、
（ｂ）競合的結合アッセイで炭疽致死因子または浮腫因子が感染防御抗原へ結合することを遮断しない、
から選択される１もしくは複数の特性を現し、
（４）ＰＡ６３に対する結合において、マウスＩＧ３、マウス２Ｄ５およびマウス１４Ｂ７から選択される抗−ＰＡ抗体と競合しない、
の１もしくは複数を有する。
【００１３】
特定の態様では、抗体はヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域の配列が、それぞれ配列番号２および４、配列番号２および６、配列番号８および１０、配列番号１２および１４または配列番号１６および１８から選択される配列を含んでなり、そしてそれらの保存的な配列改変体を含むヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を有する。
【００１４】
別の態様では、抗体はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４配列を含むヒト重鎖可変領域、ならびにＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４配列を含んでなるヒト軽鎖可変領域を有し、ここでヒト重鎖可変領域ＣＤＲ３配列が配列番号２０、３８、５０および６２およびそれらの保存的改変体からなる群から選択され；そしてヒト軽鎖可変領域ＣＤＲ３配列が配列番号２６、３２、４４、５６および６８およびそれらの保存的改変体からなる群から選択される。
【００１５】
さらに別の態様では、本発明の特定のヒト抗体はヒト重鎖および軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖および軽鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖および軽鎖ＣＤＲ３領域を有するＣＤＲドメインを含んでなるものを含み、これらは図１−９に示すＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同、好ましくは８５％相同、より好ましくは９０％、９５％、９８％または９９％相同なアミノ酸配列を含んでなる。
【００１６】
さらに別の態様では、抗体はヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域を有し、ここでヒト重鎖可変領域が、配列番号２、８、１２および１６、および配列番号２、８、１２および１６に少なくとも８０％相同な配列から選択されるアミノ酸配列を含み、そしてヒト
軽鎖可変領域が、配列番号４、６、１０、１４および１８、および配列番号４、６、１０、１４および１８に少なくとも８０％相同な配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明の特定の治療用抗体は、ヒトモノクローナル抗体（ＨｕＭａｂ）５Ｅ８および機能的に同等な抗体を含み、これは（ａ）配列番号１および配列番号３にそれぞれ説明する可変領域中のヌクレオチド配列を含んでなるヒト重鎖およびヒト軽鎖核酸、およびそれらの保存的配列改変体によりコードされるか、あるいは（ｂ）配列番号２および配列番号４にそれぞれ示すアミノ酸配列を含んでなる重鎖および軽鎖可変領域、およびそれらの保存的な配列改変体を含む。別の態様では、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８の軽鎖可変領域は、配列番号５および６にそれぞれ説明するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含んでなり、それらの保存的配列を含む。
【００１８】
本発明の別の特定の治療用抗体は、ヒトモノクローナル抗体２Ｄ５および機能的に均等な抗体を含み、これは（ａ）配列番号７および配列番号９にそれぞれ説明する可変領域中のヌクレオチド配列を含んでなるヒト重鎖およびヒト軽鎖核酸、およびそれらの保存的な配列改変体によりコードされ、あるいは（ｂ）配列番号８および配列番号１０にそれぞれ示すアミノ酸配列を含んでなる重鎖および軽鎖可変領域、およびそれらの保存的な配列改変体を含む。
【００１９】
さらに本発明の別の特定の治療用抗体は、ヒトモノクローナル抗体２Ｈ４および機能的に均等な抗体を含み、これは（ａ）配列番号１１および配列番号１３にそれぞれ説明する可変領域中のヌクレオチド配列を含んでなるヒト重鎖およびヒト軽鎖核酸、およびそれらの保存的な配列改変体によりコードされ、あるいは（ｂ）配列番号１２および配列番号１４にそれぞれ示すアミノ酸配列を含んでなる重鎖および軽鎖可変領域、およびそれらの保存的な配列改変体を含む。
【００２０】
さらに本発明の別の特定の治療用抗体は、ヒトモノクローナル抗体５Ｄ５および機能的に均等な抗体を含み、これは（ａ）配列番号１５および配列番号１７にそれぞれ説明する可変領域中のヌクレオチド配列を含んでなるヒト重鎖およびヒト軽鎖核酸、およびそれらの保存的な配列改変体によりコードされ、あるいは（ｂ）配列番号１６および配列番号１８にそれぞれ示すアミノ酸配列を含んでなる重鎖および軽鎖可変領域、およびそれらの保存的な配列改変体を含む。
【００２１】
さらに本発明は、抗体５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４もしくは５Ｄ５により定められる炭疽の感染防御抗原上のエピトープに結合し、かつ／または抗体５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４もしくは５Ｄ５と感染防御抗原への結合を競合し、または抗体５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４もしくは５Ｄ５により現される他の機能的結合特性を有する抗体を包含する。そのような抗体には感染防御抗原に特異的に結合し（例えば細胞表面抗原とは交差反応性がない）、そして毒素中和活性を現すものを含む。
【００２２】
さらに別の観点では、本発明はヒト抗−ＰＡ抗体およびその部分（例えばその可変領域）をコードする核酸分子、ならびに本発明の本発明の核酸を含む組換え発現ベクター、およびそのようなベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。これらの宿主細胞を培養することにより抗体を生産する方法も、本発明に包含される。本発明の抗体をコードする特定の核酸には、抗体５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４および５Ｄ５のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
別の観点では、本発明は感染防御抗原に結合するヒトモノクローナル抗体を発現する、ヒト重鎖導入遺伝子または導入染色体（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）およびヒト軽鎖導入遺伝子または導入染色体を含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動
物を提供する。特定の態様では、トランスジェニック非ヒト動物はトランスジェニックマウスである（本明細書では”ＨｕＭＡｂ”マウス（商標）とも呼ぶ）。
【００２４】
さらに別の観点では、本発明は記載するようなトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスに由来する、ヒト抗−ＰＡ抗体を発現する単離されたＢ細胞を提供する。次いで単離されたＢ細胞は不死化細胞と融合することにより不死化して、ヒト抗−ＰＡ抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供することができる。そのようなハイブリドーマ（すなわちヒト抗−感染防御抗原抗体を産生する）も、本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
本明細書に例示するように、本発明のヒト抗体は抗体を発現するハイブリドーマから直接得ることができ、あるいは宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞またはリンパ球）でクローン化し、そして組換え的に発現させることができる。したがって別の観点では本発明は、炭疽の感染防御抗原に結合するヒトモノクローナル抗体の生産法を提供し、この方法は抗体が動物のＢ細胞により生産されるように、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原または炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原を発現する細胞で、ヒト重鎖導入遺伝子およびヒト軽鎖導入遺伝子を含有するゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物を免疫感作し、Ｂ細胞を単離し、そしてＢ細胞をミエローマ細胞と融合して抗体を分泌する不死化ハイブリドーマ細胞を形成することによる。１つの態様では、この方法はＨｕＭａｂ  Ｍｏｕｓｅ（商標）を、精製または濃縮した炭疽の感染防御抗原調製物で、かつ／または炭疽の感染防御抗原を発現する細胞で免疫感作することを含む。
【００２６】
さらに別の観点では、本発明のヒト抗−ＰＡ抗体は誘導体化され、他の機能的分子、例えば他のペプチドもしくはタンパク質（例えばＦａｂ’フラグメント）に連結され、またはそれと同時に発現される。例えば本発明の抗体もしくは抗原結合部分は、別の抗体のような１もしくは複数の他の分子的実体に機能的に連結され（例えば化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合もしくはその他）、二重特異性または多重特異性抗体を生産することができる。したがって本発明は多種類の抗体結合体、二重および多重特異性分子、および融合タンパク質を包含し、そのすべてが炭疽の感染防御抗原に結合し、そして炭疽の感染防御抗原を特定の細胞に標的するために使用することができる。
【００２７】
さらに別の観点では、本発明はサンプル中の炭疽の感染防御抗原の存在をインビトロまたはインビボで検出する方法、例えば炭疽感染の診断法を提供する。１つの態様では、これは試験するサンプルを場合により対照サンプルと一緒に本発明のヒトモノクローナル抗体（またはその抗原結合部分）に、抗体と感染防御抗原との間に複合体が形成され、続いて形成された複合体が検出できる（例えばＥＬＩＳＡを使用して）条件下で接触させることにより行う。試験サンプルと一緒に対照サンプルを使用する場合、複合体は両サンプル中で検出され、そしてサンプル間の複合体形成における任意の統計的な有意差は、試験サンプル中に感染防御抗原が存在することの指標となる。
【００２８】
別の観点では、本発明は毒素中和アッセイにおいて炭疽毒素を中和する１もしくは複数の抗体を選択し、続いて０．１μｇ／ｍｌ未満のＥＤ５０を有する抗体を選択する連続工程により、炭疽の感染防御抗原に対する抗体をスクリーニングする方法を提供し、ここで抗原−抗体結合親和性アッセイはいずれの工程前にも選択基準として使用されない。
【００２９】
別の観点では、本発明は１もしくは複数のヒト抗−ＰＡ抗体を担体と一緒に含んでなる治療用および診断用組成物を提供する。特定の態様では、組成物はさらに感染防御抗原ワクチンまたは炭疽菌、胞子、感染防御抗原、致死因子もしくは浮腫因子に対する第２の抗体、あるいは第２抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは単鎖Ｆｖフラグメントのような１もしくは複数の追加の治療薬を含む。
【００３０】
別の観点では本発明は、本発明のヒト抗体を治療に有効な投薬用量で、抗体に基づく臨床的生成物について当該技術分野で知られている適切な投与経路、例えばＳＣ注射および静脈内注射を使用して、患者（例えばヒト個体）に投与することによる炭疽のインビボ処置および防止法を提供する。
【００３１】
特定の態様では、本発明は：
（１）中和活性のためにＦｃ受容体への結合を要し；
（２）ＰＡ８３よりもＰＡ６３に高い親和性を現し；
（３）（ａ）標準的ＥＬＩＳＡに従い１μｇ／ｍｌではＰＡ８３に結合せず、０．２以下のＯＤ４０５ｎｍであり、
（ｂ）競合的結合アッセイで炭疽致死因子または浮腫因子が感染防御抗原へ結合することを遮断しない（Ｌｉｔｔｌｅ，１９９６を参照にされたい）、
から選択される１もしくは複数の特性を現し、
（４）ＰＡ６３に対する結合において、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬用量でマウスＩＧ３、マウス２Ｄ５およびマウス１４Ｂ７から選択される抗−ＰＡ抗体と競合しない、
特徴を有する、炭疽の感染防御抗原に対する中和抗体を投与することにより、炭疽の処置が必要な患者を処置し、または防止する方法を提供する。本発明の別の特定の態様では、炭疽に感染し、そして炭疽疾患の兆候および／または症状を現している患者を本発明の抗体により処置することができる。
【００３２】
特定の態様では、本発明のヒト抗体は１もしくは複数の追加の治療薬、例えば抗生物質、感染防御抗原ワクチン、または炭疽菌、胞子、感染防御抗原、致死因子もしくは浮腫因子に対する抗体と併用投与される（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｅｄ）。そのような追加の作用物質は本発明の抗体と同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）（例えば１つの組成物で、または別々に併用時投与されるか、または抗−ＰＡ抗体の投与前もしくは後に投与される。
【００３３】
本発明の別の特徴および利点は、限定するとは解釈されるべきではない以下の詳細な説明および実施例から明白になるだろう。本明細書中に引用するすべての参考文献、特許および公開された特許出願は、参考により本明細書に編入する。
発明の詳細な説明
本発明は、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）を処置および診断するための新規な抗−ＰＡ抗体、ならびに改善された抗体に基づく治療を提供する。本発明の方法は炭疽の感染防御抗原に結合し、そして炭疽の感染防御抗原、浮腫因子および／または致死因子の機能を阻害する単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を使用し、この方法はヒトの治療に有用である。
【００３４】
本発明の抗体は、完全長（例えばＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３抗体）であることができ、または抗原結合部分（例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖフラグメント）のみを含むことができる。１つの態様では、ヒト抗体はたとえばＶ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチングを経ることにより炭疽ＰＡに対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ）を産生することが可能なトランスジェニックマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物で生産される。従って、本発明の特定の観点は、抗体、抗体フラグメント、およびそれらの薬学的組成物だけではなく、モノクローナル抗体を生産する非ヒトトランスジェニック動物、Ｂ細胞およびハイブリドーマも含む。生物学的サンプル中の炭疽ＰＡを検出するために本発明の抗体を使用する方法も、本発明に包含する。炭疽ＰＡが誘導する生物学、例えば毒素に関連する機能を遮断または阻害するための本発明の抗体の使用法も提供され、そして炭疽感染
の処置または防止に有用である。
【００３５】
本発明をさらに容易に理解できるようにするために、最初にいくつかの用語を以下に定義し、さらなる定義については発明の詳細な説明全体に記載する。
【００３６】
本明細書で使用する「感染防御抗原」および「ＰＡ」という用語は、炭疽菌（Ｂａｃｈｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）（炭疽）により生産される感染防御抗原タンパク質を指し、そしてバクテリアにより自然に発現され得る、または組換え的に発現され得る炭疽の感染防御抗原の任意のバリアント、アイソフォームおよび種相同体を含む［Ｗｅｌｋｏｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ６９：２８７−３００（１９８８）を参照にされたい］。用語「感染防御抗原」および「ＰＡ」は、この用語が１つの形またはその他を具体的に限定しない限り、炭疽の感染防御抗原の８３ｋＤ（ＰＡ８３）および６３ｋＤ（ＡＰ６３）の両方を指す。
【００３７】
１つの態様では、本発明の抗−ＰＡ抗体は炭疽毒素（すなわち致死因子または浮腫因子）を「中和する」。本明細書で使用するように、「中和する」およびその文法的変形は、本発明の抗体の活性を指し、この活性は抗体の炭疽ＰＡへの結合で炭疽感染に感受性の細胞へのＥＦまたはＬＦの侵入（ｅｎｔｒｙ）またはトランスロケーションを防止する。特定の作用機作に限定されることを意図しないが、本発明の抗体の炭疽ＰＡへの結合は、感染プロセスの間（例えば（１）炭疽ＰＡの細胞上のＡＴＲへの結合、（２）ＰＡ８３のＰＡ６３形への分解、（３）７つのＰＡ６３単位を含んでなる７量体の形成、および（４）毒素の７量体への結合そうでなければ会合）、多数の異なる点で細胞の細胞質への毒素のトランスロケーションの防止をもたらすことができる。本発明の抗体は炭疽ＰＡへの結合を介して感染プロセス中に１もしくは複数の異なる点を阻害または遮断することにより炭疽毒素を中和することができる。
【００３８】
本発明のヒト抗体のような治療用化合物が炭疽毒素を中和できるかどうかを測定するインビトロアッセイは、当該技術分野では周知である。本発明の抗体のそのような活性は、例えば毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）（例えばＬｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５８：１６０６−１６１３を参照にされたい。これは抗−ＰＡ抗体の存在下で炭疽ＬＦおよびＰＡの混合物に暴露された毒素感受性マクロファージ細胞株Ｊ７７Ａ．１の使用を記載し、ここで抗体が媒介する毒素の中和は、マクロファージの生存の増加をもたらす；Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．１９９：６７６−８２；およびＬｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：７０７−７１５）により測定することができる。本発明の抗体の効力を測定するためのＴＮＡの実施において、５０％（ＥＤ５０）細胞生存能を達成することができる抗体の有効用量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ：ＥＤ）を測定する。本発明に有用な抗−ＰＡ抗体は５μｇ／ｍｌ未満で、より好ましくは１μｇ／ｍｌ未満、そして最も好ましくは０．１μｇ／ｍｌ未満の濃度で炭疽毒素を中和する。すなわち本発明の抗体は、ＴＮＡにより測定した時、約０．００１〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下、そして最も好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＤ５０を有する。
【００３９】
本明細書で「抗体」という用語には、抗体全体および抗原結合フラグメント（すなわち抗原結合部分）またはその１本鎖が含まれる。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互に結合した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖か、またはその抗原結合部分を含む糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと省略）および重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬと省略）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域はＣＬという１つのドメインからなる。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（
ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、その中に散在するフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域とに分けることができる。ＶＨとＶＬはそれぞれ３つのＣＤＲと４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端に向けてＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序に並んでいる。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合領域が含まれる。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、宿主組織または免疫系の各種細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一の構成要素（Ｃｌｑ）を含む因子の結合を媒介することができる。
【００４０】
本明細書で使用する抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）という用語は、抗原（たとえば炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）感染防御抗原）に結合する能力を保持する抗体の１もしくは複数のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、全長の抗体のフラグメントによって発揮されることが示された。抗体の「抗原結合部分」という用語が包含する「結合フラグメント」には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価の断片、（ｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結している２つのＦａｂフラグメントを含む２価のフラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬおよびＶＨ領域からなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）、および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２ドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子でコードされているが、組換え法を用い、それらを１本のタンパク鎖にしてＶＬおよびＶＨ領域をつなげて１価の分子を形成させることが可能な合成リンカーにより結合させることができる（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３を参照にされたい）。そのような１本鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることを意図する。このような抗体フラグメントは当業者に既知の従来技術を用いて得られ、フラグメントは用途について完全な抗体と同様の様式でスクリーニングされる。
【００４１】
「エピトープ」という用語は、抗体に特異的に結合することができるタンパク質決定基を意味する。エピトープは通常、化学的に活性な表面にある、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団からなり、そして通常、特異的な３次元構造特性ならびに特異的な電荷特性を有する。変性溶媒の存在下では高次構造のエピトープへの結合は失われるが非高次構造のエピトープは失われない点で前者と後者は区別される。
【００４２】
「二重特異性分子」という用語は、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチドの複合体など、２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質が含まれることを意図する。たとえば、分子は、（ａ）細胞表面抗原、および（ｂ）別の抗−ＰＡ抗体と結合または相互作用することができる。「多重特異性分子」または「ヘテロ特異性分子」には、たとえばタンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチドの複合体など、２より多くの異なる結合特異性を有する任意の作用物質が含まれることを意図する。たとえば、分子は、（ａ）細胞表面抗原、（ｂ）別の抗−ＰＡ抗体、および（ｃ）少なくとも一つの別の構成要素と結合または相互作用することができる。したがって、本発明には、限定するわけではないが炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）感染防御抗原のような細胞表面抗原、および抗−ＰＡ抗体のような他の標的に向けられた二重特異性、三重特異性、四重特異性、およびその他の多重特異性分子を含む。
【００４３】
「二重特異性抗体」という用語にはディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）も含む。ディアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上に発現している２価の二重特異性抗体だが、同一の鎖上でこの２領域を対にするには短すぎるリンカーを用いているた
めに、これらのドメインは別の鎖の相補領域と対になり、そして２つの抗原結合部位を作り出している（たとえばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８；  Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）にされたい）。本明細書で使用する「ヘテロ抗体」は、一緒に連結された少なくとも２つが異なる特異性を有する２以上の抗体、抗体結合フラグメント（例えばＦａｂ）、それらの誘導体または抗原結合領域を指す。これら異なる特異性には別の炭疽抗原に対する結合特異性を含む。
【００４４】
本明細書に使用する「ヒト抗体」という用語には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれることを意図する。本発明のヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えばインビトロにでのランダムなまたは位置指定な変異誘発、またはインビボの体細胞性の突然変異によって導入された突然変異）も含まれる。しかし、本明細書で使用する「ヒト抗体」という用語には、マウスのような別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図していない。
【００４５】
本明細書に使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特性および特定のエピトープへの親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特性を示す抗体を意味する。１つの態様では、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得たＢ細胞を含む、ハイブリドーマによって産生される。
【００４６】
本明細書で使用する「組換えヒト抗体」という用語には、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子に組換えた動物（例えばマウス）から単離した抗体（以下のセクションＩに詳述する）、（ｂ）宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、（ｃ）組換え体、組み合わせ抗体ライブラリーから単離した抗体、および（ｃ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングが関与する他の手段によって、調製、発現、作製、または単離した抗体のような、組換え手段によって調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体を含むことを意図する。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし特定の態様では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発（またはヒトＩｇ配列を導入したトランスジェニック動物を用いた場合、インビボ体細胞突然変異誘発）にかけることができ、したがって組換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し関連している一方で、インビボではヒト抗体生殖系列レパートリーに天然に存在しないかもしれない。
【００４７】
本明細書で使用する「異種抗体」は、そのような抗体を生産するトランスジェニック非ヒト生物に関連して定義される。この用語は、トランスジェニック非ヒト動物から構成されない生物であって、一般にトランスジェニック非ヒト動物以外の種に見いだされるものに対応する、アミノ酸配列またはコード核酸配列を有する抗体を意味する。
【００４８】
本明細書で使用する「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物に由来する軽鎖および重鎖を有する抗体を指す。たとえば、マウス軽鎖を伴うヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。ヘテロハイブリッド抗体の例には、上述のキメラ抗体、およびヒト化抗体を含む。
【００４９】
本明細書で使用する「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図する（例えば、感染防御抗原に結合する単離された抗体は、感染防御抗原以外の抗原に結合する抗体を実質的に含まない）。しかし炭疽感染防御抗原のエピトープ、アイソフォーム、またはバリアントに結合する単離した抗体は、たとえば他のバクテリア種（例えば感染防御抗原の種相同体）、他に関連する抗原と交差反応性を有することができる。さらに単離した抗体は他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくても良い。本発明の１つの態様では、異なる特異性を有する「単離された」モノクローナル抗体の組み合わせを、明確な組成物中で混合する。
【００５０】
本明細書で使用する「特異的な結合」とは、炭疽感染防御抗原に結合する本発明の抗−ＰＡ抗体を指す。典型的には抗体は、少なくとも約１ｘ１０７Ｍ−１の親和性で結合し、そして感染防御抗原には、感染防御抗原または関係性の近い抗原以外の非特異的な抗原（たとえばＢＳＡ、カゼイン）への結合性に対する親和性の少なくとも２倍大きい親和性で結合する。「感染防御抗原を認識する抗体」および「感染防御抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書では「感染防御抗原に特異的に結合する抗体」という文言と互換的に用いられる。
【００５１】
本明細書で使用するＩｇＧ抗体への「高親和性」とは、少なくとも約１０７Ｍ−１の結合親和性を指し、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、さらに好ましくは例えば最高１０１３Ｍ−１以上など、少なくとも約１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、または１０１１Ｍ−１以上の結合親和性を指す。しかし、「高親和性」結合は、他の抗体アイソタイプでは変化することがある。たとえば、ＩｇＭアイソタイプへの「高親和性」結合とは、少なくとも約１０７Ｍ−１の結合親和性を指す。
【００５２】
本明細書で使用する“Ｋａｓｓｏｃ”または“Ｋａ”という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の会合定数を意味を指すことを意図する。
【００５３】
本明細書で使用する“Ｋｄｉｓ”または“Ｋｄ”という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指すことを意図する。
【００５４】
本明細書で使用する「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によリコードされる抗体クラス（たとえばＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。本発明の単離されたヒト抗体は、任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤおよびＩｇＥであることができる。
【００５５】
本明細書で使用する「アイソタイプスイッチング」とは、抗体のクラスまたはアイソタイプがあるＩｇクラスから別のＩｇクラスに変化する現象を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する「非スイッチ型アイソタイプ」は、アイソタイプスイッチングが生じない場合に生産される重鎖のアイソタイプクラスを意味し、非スイッチ型アイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は典型的には、機能的に再構成されたＶＤＪ遺伝子の直下流の第１のＣＨ遺伝子である。アイソタイプスイッチングは古典的または非古典的なアイソタイプスイッチングに分類されてきた。古典的なアイソタイプスイッチングは、導入遺伝子の少なくとも１つのスイッチ配列領域に関与する組換えイベントによって生じる。非古典的アイソタイプスイッチングは、たとえばヒトσμおよびヒトΣμ間の相同的組換え（δ関連欠失）などによって生じることがある。導入遺伝子間および／または染色体間組換えなどの代替的な非古典的スイッチングメカニズムが、とりわけアイソタイプスイッチングを生じて起こることがある。
【００５７】
本明細書で使用する用語「スイッチ配列」とは、スイッチ組換えの原因となるＤＮＡ配
列を意味する。「スイッチドナー」配列は典型的にはμスイッチ領域で、スイッチ組換えの間に消去される構成領域（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｒｅｇｉｏｎ）の５’（すなわち上流）側であろう。「スイッチアクセプター」領域は、消去される構成領域と置換定常領域（たとえばγ、εなど）の間にある。組換えが常に生じる特異的な部位はないため、最終遺伝子配列は構成から予測することは一般にはできないだろう。
【００５８】
本明細書で使用する「グリコシル化パターン」とは、タンパク質、さらに具体的には免疫グロブリンタンパク質に共有結合した炭化水素単位のパターンとして定義される。異種抗体のグリコシル化パターンは、当業者が導入遺伝子のＣＨ遺伝子が由来する種よりも非ヒトトランスジェニック動物種に生じた該グリコシル化パターンに類似していると認識する場合、非ヒトトランスジェニック動物種によって生産される抗体上で天然に存在するグリコシル化パターンに実質的に類似していると特徴付けられる。
【００５９】
本明細書で使用する、物体に適用される「天然に存在する」という用語は、ある物体を天然に発見することができるという事実を意味する。例えば天然の供給源から単離することができ、研究室で人為的に改変されたものではない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在するものである。
【００６０】
本明細書で使用する「再構成（ｒｅａｒｒａｎｇｅｄ）」という用語は、重鎖または軽鎖免疫グロブリン座位の配置を意味し、ここでＶセグメントは、完全なＶＨまたはＶＬドメインを基本的にコードする配置において、それぞれＤ−ＪまたはＪセグメントに隣接して位置する。再構成した免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較によって同定することができ、再構成した座位は少なくとも１つの組換え７量体／９量体相同性要素を有するだろう。
【００６１】
Ｖセグメントに関して本明細書で使用する「非再構成」または「生殖系配置」という用語は、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントに隣接するように組換えされていない配置を指す。
【００６２】
本細書で使用する「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は１本鎖または２本鎖であってよいが、好ましくは２本鎖ＤＮＡである。
【００６３】
感染防御抗原に結合する抗体または抗体部分（例えばＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸に関して、本明細書で使用する「単離された核酸分子」という用語は、抗体および抗体部分をコードするヌクレオチド配列が感染防御抗原以外の抗原と結合する抗体または抗体部分をコードするその他のヌクレオチド配列を含まない核酸分子を指し、その他の配列はヒトゲノムＤＮＡにおける核酸を天然に挟む。１つの態様では、ヒト抗−ＰＡ抗体またはその部分は、５Ｅ８（および５Ｅ８’）、２Ｄ５、２Ｈ５、５Ｄ５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、または配列番号１および２、７および８、１１および１２、および１５および１６にそれぞれ示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する重鎖（ＶＨ）可変領域、あるいは配列番号３および４、５および６、９および１０、１３および１４、および１７および１８にそれぞれ示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する軽鎖（ＶＬ）可変領域を有する。当業者は抗体５Ｅ８および５Ｅ’８が同じ重鎖を有するが、それらの軽鎖が異なることを理解するはずであり、ここで５Ｅ８は配列番号３および４にそれぞれ示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する軽鎖（ＶＬ ｍａｊｏｒ）可変領域を有し、そして５Ｅ’８は配列番号５および６にそれぞれ示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する軽鎖（ＶＬ ｍｉｎｏｒ）可変領域を有する。５Ｅ８ハイブリドーマに由来するこれら抗体の両方が炭疽の感染防御抗原に結合し、そしてＴＮＡで炭疽毒素を中和する。
【００６４】
本明細書に開示され、そして特許請求されるように、配列番号１〜７２に説明する配列には「保存的配列改変体」、すなわちヌクレオチド配列によってコードされる抗体、またはアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響を及ぼすことがない、または変化させることがないヌクレオチドおよびアミノ酸配列改変体が含まれる。そのような保存的配列改変体には、ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、付加、および欠失が含まれる。位置指定突然変異誘発およびＰＣＲを媒介とする突然変異誘発などの当該技術分野で知られている標準技術により、配列番号１〜７２に改変体を導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換したものが含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。このファミリーには、塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐鎖側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。このようにヒト抗−ＰＡ抗体における予測された非必須アミノ酸残基は、同一の側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基に置換されることが好ましい。
【００６５】
あるいは、別の態様では、突然変異は、飽和突然変異などによって抗−ＰＡ抗体コード配列の全体または部分にランダムに導入することができ、そして得られた改変体抗−ＰＡ抗体は結合活性についてスクリーニングされ得る。
【００６６】
したがって本明細書に開示する（重鎖および軽鎖可変領域の）ヌクレオチド配列によりコードされる抗体、および／または本明細書に開示する（重鎖および軽鎖可変領域の）アミノ酸配列を含む抗体には、保存的に改変体された類似の配列によってコードされる、または含有する実質的に類似の抗体が含まれる。そのような実質的に類似の抗体を、配列番号１〜１８としてここに開示した部分的な（すなわち重鎖および軽鎖可変領域）配列に基づいてどのように生成できるかについて、さらに後述する。
【００６７】
核酸について「実質的な相同性」という用語は、２つの核酸、またはその指定の配列が適切に整列され、そして比較された時、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は少なくとも約９０％〜９５％、そしてさらに好ましくはヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９．５％において同一である適切なヌクレオチドの挿入または欠失を有することを示す。あるいは実質的な相同性は、セグメントが選択的なハイブリダイゼーション条件下において鎖の相補鎖にハイブリダイズする場合に存在する。
【００６８】
２つの配列の同一性の割合は、配列が共有する同一の位置の数の関数（すなわち、相同性の％＝同一位置の＃／位置＃の合計  ｘ  １００）であり、２つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップ数および各ギャップ長を考慮したものである。配列の比較および２つの配列間の同一性の割合の決定は、以下の非限定的例に記載するように数学的アルゴリズムを用いて実行することができる。
【００６９】
２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０もしくは８０のギャップ加重、および１、２、３、４、５、または６の長さ加重を用いて定めることができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の割合は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．  Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．  Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズ
ムを用いて、ＰＡＭ１２０加重残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いても定めることができる。さらに、２つのアミノ酸残基間の同一性の割合は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムを用いて、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを用い、１６、１４、１２、１０、８、６、もしくは４のギャップ加重、および１、２、３、４、５もしくは６の長さ加重を用いて定めることもできる。
【００７０】
本発明の核酸またはタンパク質配列はさらに、例えば関連した配列を同定するために公的なデータベースに対する検索を実行するための「クエリ配列」として使用することもできる。このような検索はＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて行い、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行い、本発明のアミノ酸配列に相同なタンパク質分子を得ることができる。比較のためのギャップのあるアラインメントを得るには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載の通り使用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照にされたい。
【００７１】
核酸は、全細胞、細胞ライセート中、または部分的に精製したまたは実質的に純粋な形状で存在することができる。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動、およびそのほかの当該技術分野で周知な方法を含む標準技術により、例えば他の細胞性核酸またはタンパク質などのその他の細胞成分またはそのほかの夾雑物を除去して精製した場合に、「単離された状態」または「実質的に純粋な状態」になる。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，編集  分子生物学の現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーネ出版およびウィリー  インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（１９８７）を参照にされたい。
【００７２】
ｃＤＮＡ、ゲノム、または混合物のいずれかから得られる本発明の核酸組成物は、野生型配列に存在することが多いが（改変体された制限酵素認識部位等を除く）、遺伝子配列を提供するために標準技術に従って変異を導入することができる。コード配列の場合、この変異の導入は所望のようにアミノ酸配列に影響を与えることができる。特に本明細書に記載の天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常、スイッチおよびその他のこのような配列に実質的に相同な、または由来するＤＮＡ配列が考慮される（ここで「由来する」とは、ある配列が別の配列と同一であるかまたは改変体されていることを示す）。
【００７３】
核酸が別の核酸配列と機能的な関係におかれている場合に、核酸は「操作可能に連結されて」いる。例えばプロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に作用する場合は、コード配列に操作可能に連結されている。転写調節配列に関して、操作可能に連結されたとは、結合したＤＮＡ配列が隣接しており、必要な場合には２つのタンパク質コード領域を連結し、隣接させ、そしててリーディングフレーム内にすることを意味する。スイッチ配列の場合、操作可能に連結されたとは、その配列がスイッチ組換えに作用することがで
きることを示す。
【００７４】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、結合している別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことを意図する。ベクターの１種が「プラスミド」で、それは別のＤＮＡセグメントが中にライゲート（ｌｉｇａｔｅｄ）されていてもよい円形の２本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターで、ここで別のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされていてもよい。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自律複製することができる（例えば細菌の複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると宿主細胞ゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムとともに複製され得る。さらにある種のベクターはそれが連結された遺伝子の発現を駆動することもできる。このようなベクターは、本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術に用いられる発現ベクターは、プラスミドの形状をしていることが多い。プラスミドは最も一般的に用いられる形状のベクターであるため、本明細書では「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられてよい。しかし、本発明では、均等な機能を提供するウイルスベクター（例えば複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような他の形状の発現ベクターも含むことを意図する。
【００７５】
本明細書で使用する「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターを導入した細胞を指すことを意図する。そのような用語は特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も指すことを意図すると理解すべきである。突然変異または環境的な影響によって、後代に特定の改変体が生じるかもしれないため、そのような子孫は事実上親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用する「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞には、例えばＣＨＯ細胞およびリンパ球細胞を含む。
【００７６】
本発明の様々な観点を、以下の小章でさらに詳述する。
Ｉ．炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の感染防御抗原に対するヒト抗体の生産
本発明のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、たとえばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５に記載の標準体細胞ハイブリダイゼーション技術など、従来のモノクローナル抗体の方法を含む各種技術によって生産することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手法が好ましいが、原理的にはモノクローナル抗体を生産するためのその他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス性または発癌性トランスフォーメーションを用いることもできる。
【００７７】
ハイブリドーマを調製する好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマ生産は、非常に確立した方法である。融合用の免疫感作した脾細胞の単離のための免疫感作プロトコールおよび技術は当該技術分野では公知である。融合パートナー（例えばマウスミエローマ細胞）および融合手順も既知である。
【００７８】
好適な態様では、感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体はマウス系よりはむしろくヒト免疫系の部分を有するトランスジェニックマウスを用いて作製することができる。これらのトランスジェニックマウスは本明細書では「ＨｕＭａｂ」と呼び、非再構成ヒト重鎖（μおよびγ）ならびにκ軽鎖免疫グロブリン配列とともに、内因性μおよびκ鎖座を不活化する標的突然変異をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小座（ｍｉｎｉｌｏｃｉ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９）。したがってマウスはマウスＩｇＭまたはκの低発現が見られ、免疫感作に応答して、導入したヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子にクラススイッチおよび体細胞突然変異が生じ、高親和性ヒトＩｇＧκモノクローナルを生じる（Ｌｏｎｂｅｒ
ｇ，  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４），同上；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３、およびＨａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂマウスの調製は、後述の第ＩＩ章および引用により全部、その全内容を本明細書に編入するＴａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：３７２０−３７２４；Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１１７−１２３；Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８２１−８３０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９４）  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．ｅｔ
ａｌ．（１９９４）  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｄ．（１９９５）  Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．（１９９５）  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に記載されている。さらに引用により全部、その全内容を本明細書に編入するＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｋａｙ、およびジェンファーム  インターナショナル（ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）への米国特許第５，５４５，８０６号、５，５６９，８２５号、５，６２５，１２６号、５，６３３，４２５号、５，７８９，６５０号、５，８７７，３９７号、５，６６１，０１６号、５，８１４，３１８号、５，８７４，２９９号、および５，７７０，４２９号明細書、Ｓｕｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，５４５，８０７号明細書、１９９８年６月１１日公開の国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、１９９４年１１月１０日公開の国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、１９９３年６月２４日公開の国際公開第９３／１２２７号パンフレット、１９９２年１２月２３日公開の国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、１９９２年３月１９日公開の国際公開第９２／０３９１８号をパンフレットを参照にされたい。あるいは実施例１、小章ＩＩに記載のＨＣＯ１２トランスジェニックマウスを用いてヒト抗−ＰＡ抗体を作製することができる。
ＨｕＭａｂ免疫感作
感染防御抗原に対する完全なヒトモノクローナル抗体を作製するために、ＨｕＭａｂマウスをＬｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８（６４７４）：８５６−８５９；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１および国際公開第９８／２４８８４号パンフレットに記載されるように、炭疽ＰＡ８３またはＰＡ６３または両方および／または感染防御抗原発現細胞の精製もしくは濃縮調製物で免疫感作することができる。好ましくは、マウスに最初の注射を行うのは６〜１６週齢である。例えば感染防御抗原の精製または濃縮調製物（５〜２０μｇ）（米国陸軍の感染症研究所のＳｔｅｐｈｅｎ  Ｌｉｔｔｌｅによる好意により得た）を用いてＨｕＭａｂマウスの腹腔内において免疫することができる。マウスは免疫応答を促進するために、感染防御抗原を発現するトランスフェクト細胞で免疫感作することもできる。
【００７９】
各種抗原を用いた経験の積み重ねから、ＨｕＭａｂトランスジェニックマウスは、最初に完全フロイントアジュバントに入れた抗原で腹腔内に（ＩＰ）免疫感作に、その後、隔
週に不完全フロイントアジュバントに入れた抗原で腹腔内に免疫感作する（最高で合計６回）場合に、最良の応答が得られることが示されている。免疫応答は、後眼窩からの採血によって得られた血漿サンプルを用いた免疫感作プロトコールの経過について監視することができる。血漿は、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができ（後述）、そして抗−ＰＡヒト免疫グロブリンの力価が十分なマウスを融合に用いることができる。マウスは屠殺および脾臓の摘出の３日前に静脈内に抗原を追加免疫することができる。各抗原につき２〜３回の融合を行う必要があるかもしれない。各抗原を数匹のマウスに免疫する。例えばＨＣ０７およびＨＣ０１２系のＨｕＭａｂマウス、合計１２匹を免疫感作することができる。
感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの作製
マウス脾細胞は標準プロトコールに基づき単離して、ＰＥＧとともにマウスミエローマ細胞株と融合することができる。次いで得られたハイブリドーマを、抗原特異性抗体の産生についてスクリーニングする。例えば免疫感作マウスから得られた脾リンパ細胞の単一細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧを用いて、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３非分泌マウスミエローマ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８０）の数の１／６と融合する。平底マイクロタイタープレートに約２  ｘ  １０５個の細胞をプレーティングし、２０％  ウシクローン血清、１８％  ”６５３”調整培地、５％  ｏｒｉｇｅｎ（ＩＧＥＮ社）、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、  １ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０ユニット／ｍｌ  ペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン、５０ｍｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン、および１Ｘ  ＨＡＴ（シグマ社（ｓｉｇｍａ）：融合から２４時間後にＨＡＴを加える）を含有する選択培地中で２週間インキュベーションする。２週間後、ＨＡＴをＨＴに交換した培地中で細胞を培養する。次いで各ウェルをヒト抗−ＰＡモノクローナルＩｇＭおよびＩｇＧ抗体について、ＥＬＩＳＡでスクリーニングする。大規模なハイブリドーマ成長が生じたら、通常１０〜１４日後に培地を観察する。ハイブリドーマを分泌する抗体を再びプレーティングし、再スクリーニングし、そしてヒトＩｇＧについてまだ陽性であれば、抗−ＰＡモノクローナル抗体を限界希釈によって少なくとも２倍にサブクローニングすることができる。その後、安定したサブクローンをインビトロで培養し、特性決定のための抗体を組織培養培地中で少量産生する。
炭疽の感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体を生産するトランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）の生成
本発明のヒト抗体は、当該技術分野で周知であるように（例えばＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ、（１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）、例えば組換えＤＮＡ技術および遺伝子トランスフェクション法の組み合わせを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマ中に生産させることができる。
【００８０】
例えば抗体またはその抗体フラグメントを発現させるために、部分または完全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを標準的な分子生物学的技術により得ることができ（例えばＰＣＲ増幅、位置指定突然変異誘発法）、そして遺伝子が転写および翻訳制御配列に操作可能に連結されるように発現ベクター中に挿入することができる。この内容において、用語「操作可能に連結された」とは、ベクター中の転写および翻訳制御発現が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する目的機能を果たすように、抗体遺伝子がベクター中に連結されることを意味するものとする。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は別個のベクターに挿入することができ、あるいはさらに典型的には両遺伝子を同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準的技術（例えば抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が無ければ平滑末端のライゲーション）により発現ベクターに挿入される。ＶＨセグメントがベクター中のＣＨセグメント（１もしくは複数）に操作可能に連結され、そしてＶＬセグメントがベクター中のＣＬセグメントに操作可能に連結されるように、本明細書に記載する抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、それらを、すでに所望するアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域がコードされた発現ベクターに挿入することにより、任意の抗体アイタイプの完全長抗体遺伝子を作成するために使用するとができる。さらに、あるいは代替的に、組換え発現ベクターは宿主細胞から抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクター中にクローン化することができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種のシグナルペプチド（すなわち非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であることができる。
【００８１】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞中での抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を持つ。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または発現を制御する他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。そのような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデッミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）に記載されている。当業者は、調節配列の選択を含め発現ベクターの設計が形質転換させる宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベル等のような因子に依存し得ると考えるだろう。哺乳動物の宿主細胞の発現に好適な調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シンドビスウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））およびポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサーのような哺乳動物細胞中で高レベルのタンパク質発現を支配するウイルス要素を含む。あるいはユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターのような非ウイルス性の調節配列を使用してもよい。
【００８２】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞中でベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子のようなさらなる配列を含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えばすべてＡｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６５５号および同第５，１７９，０１７号明細書を参照にされたい）。例えば典型的には選択可能なマーカー遺伝子はベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートのような薬剤に対する耐性を付与する。好適な選択可能なマーカー遺伝子にはジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅でｄｈｆｒ−宿主細胞中にて使用する）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）がある。
【００８３】
軽鎖および重鎖の発現には、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（１もしくは複数）を、標準技術により宿主細胞にトランスフェクトする。用語「トランスフェクション」の様々な語形は、外因性ＤＮＡを原核または真核宿主細胞に導入するために通常使用される広範な技術、例えば電気穿孔、カルシウム−リン酸沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等を包含することを意図する。理論的には本発明の抗体は原核または真核宿主細胞のいずれでも発現することが可能であるが、真核宿主細胞での抗体の発現、そして最も好ましくは哺乳動物宿主細胞中での発現は、そのような真核細胞そして特に哺乳動物細胞が原核細胞よりも正しくフォールドされ、そして免疫学的に活性な抗体を集成および分泌する可能性があるので最も好適である。抗体遺伝子の原核発現は、高収量で活性な抗体を生産するには非効率的であることが報告された（Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｗｏｏｄ，Ｃ．Ｒ．（１９８５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ６：１２−１３）。
【００８４】
本発明の組換え抗体を発現するために好適な哺乳動物宿主細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、例えばＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１に記載されているようなＤＨＦＲ選択可能マーカーと使用する）、ＮＳ０ミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞を含む。特にＮＳＯミエローマ細胞と使用するために、別の好適な発現系は国際公開第８７／０４４６２号、同第８９／０１０３６号パンフレットおよび欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードするＧＳ発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物の宿主細胞に導入される場合、抗体は宿主細胞中での抗体の発現、さらに好ましくは宿主細胞が増殖する培養基への抗体の分泌が可能となる十分な期間、宿主細胞を培養することにより生産される。抗体は標準的なタンパク質精製法を使用して培養基から回収することができる。
完全な抗体を発現するための部分的抗体配列の使用
抗体は、主に６つの重鎖および軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外の配列よりも、個々の抗体間で多様性に富んでいる。ＣＤＲ配列はほとんどの抗体−抗原相互作用を引き起こしているため、天然に存在する特異的な抗体の特性を模倣する組換え抗体は、異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列に移植した天然に存在する特異的抗体から得たＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって発現させることが可能である（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ
３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；およびＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｅｅ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３を参照にされたい）。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから得ることができる。これらの生殖系列配列は、Ｂ細胞成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）中にＶ（Ｄ）Ｊ結合によって形成された、完全に集成された可変遺伝子を含まないため、成熟した抗体遺伝子配列とは異なるだろう。生殖系列遺伝子配列は、可変領域全体に均一に、個々の高親和性二次レパートリ抗体の配列とも異なるだろう。例えば体細胞突然変異はフレームームワーク領域のアミノ末端部分では比較的頻度が低い。たとえば、体細胞突然変異はフレームームワーク領域１のアミノ末端部分、およびフレームワーク領域４のカルボキシ末端では比較的頻度が低い。さらに、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性を有意に変化させない。このため、もとの抗体と同様の結合特性を有する完全な組換え抗体を再生するために、特定の抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（すべての目的のために引用により本明細書に編入する、１９９９年３月１２日出願のＰＣＴ／ＵＳ９９／０５５３５号明細書を参照にされたい）。ＣＤＲ領域全体の部分的な重鎖および軽鎖は、典型的にはこの目的には十分である。この部分的配列を用いて、どの生殖系列可変および結合遺伝子セグメントが組換え抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。その後、生殖系列配列を用いて、可変領域の欠損部分を埋める。重鎖および軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の特性には寄与しない。このため、発現構築物に相当する生殖系列リーダー配列を用いる必要がある。欠損配列を付け加えるために、クローン化したｃＤＮＡ配列を、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。あるいは可変領域全体を、短く、重複しているオリゴヌクレオチドのセットとして合成し、ＰＣＲ増幅で組み合わせて全体を合成した可変領域クローンを作製することもできる。このプロセスには、特定の制限酵素認識部位の消去もしくは包含、または特定のコドンの最適化などの利点がある。
【００８５】
ハイブリドーマから得た重鎖および軽鎖転写物のヌクレオチド配列を用いて、合成オリゴヌクレオチドの重複セットを設計し、天然の配列と同一のアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を作製する。合成重鎖およびカッパ鎖配列は、３つの点において天然の配列と異なる可能性がある。繰り返しているヌクレオチド塩基のストリングが遮られてオリゴヌクレオチド合成およびＰＣＲ増幅が容易になる。最適な翻訳開始部位がコザックの規則に
従って組み入れられている（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６；１９８６７−１９８７０）。およびＨｉｎｄＩＩＩ部位が翻訳開始部位の上流に作られている。
【００８６】
重鎖および軽鎖可変領域の両方のために、最適化したコード鎖配列、および対応する非コード鎖配列を、対応する非コードオリゴヌクレオチドのおよその中間点である３０〜５０ヌクレオチドの大きさに切断する。すなわち各鎖について、オリゴヌクレオチドは１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントに広がり重複した２本鎖セットに組み立てることができる。その後、そのプールを１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を産生するためのテンプレートとして用いる。典型的には、単一可変領域オリゴヌクレオチドセットを２つのプールに分割し、別々に増幅して２つの重複ＰＣＶ産物を作製するだろう。これらの重複産物をＰＣＴ増幅で組み合わせ、完全な可変領域を作製する。ＰＣＲ増幅において、発現ベクター構築物に容易にクローニングすることができるフラグメントを作製するための、重鎖および軽鎖定常領域の重複フラグメント（カッパ軽鎖のＢｂｓＩ部位、またはガンマ重鎖であればＡｇｅＩ部位を含む）を含むことも望ましい。
【００８７】
次に、再構築された重鎖および軽鎖可変領域を、クローン化したプロモーター、翻訳開始、定常領域、３’非翻訳、ポリアデニル化、および転写終結配列と組み合わせて、発現ベクター構築物を作製する。重鎖および軽鎖の発現構築物を単一のベクターに挿入し、同時に、または連続して、または別々に宿主細胞にトランスフェクトし、その後融合して両方の鎖を発現する宿主細胞を形成することができる。
【００８８】
ヒトＩｇＧκの発現ベクターの構築に用いるプラスミドについて、以下に説明する。ＰＣＲで増幅したＶ重鎖およびＶカッパ軽鎖ｃＤＮＡ配列を用いて完全な重鎖および軽鎖小遺伝子を再構築することができるようにプラスミドを作製した。これらのプラスミドを用いて、完全なヒトまたはキメラＩｇＧ１κまたはＩｇＧ４κ抗体を発現することができる。同様のプラスミドを、そのほかの重鎖アイソタイプの発現用、またはラムダ軽鎖を含んでなる抗体の発現用に作製することができる。
【００８９】
したがって本発明の別の観点では、本発明のヒト抗−ＰＡ抗体、例えば５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の構造的な特徴を用いて、感染防御抗原への結合のような本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する構造的に関連したヒト抗−ＰＡ抗体を作製する。さらに具体的には、５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の１つ以上のＣＤＲを、既知のヒトフレームワーク領域およびＣＤＲと組換え的に組み合わせ、組換え的に工作されたさらなる本発明のヒト抗−ＰＡ抗体を作製することができる。
【００９０】
したがって別の態様では、本発明は：
（１）ヒト重鎖フレームワーク領域およびヒト重鎖ＣＤＲ（ここで少なくとも１つのヒト重鎖ＣＤＲが図１、４、６または８に示したＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２０、２２、２４、３８、４０、４２、５０、５２、５４、６２、６４および６６）から選択されるアミノ酸配列を含んでなる）、および（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域およびヒト軽鎖ＣＤＲ（少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲが図２、３、５、７または９に示したＣＤＲのアミノ酸配列（配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、４４、４６、４８、５６、５８、６０、６８、７０および７２）から選択されたアミノ酸配列を含んでなる）、
を含んでなる抗体を調製することを含んでなる抗−ＰＡ抗体を調製する方法を提供し、ここで抗体は感染防御抗原に結合する能力を保持する。
【００９１】
感染防御抗原に結合する抗体の能力は、実施例に説明する方法（たとえばＥＬＩＳＡ）など、標準結合アッセイを用いて測定することができる。
【００９２】
抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３ドメインが、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性に特に重要な役割を果たしているということは当該技術分野では周知であるため、上述の本発明の組換え抗体は、５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の重鎖および軽鎖ＣＤＲ３を含んでなることが好ましい。抗体はさらに、５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５のＣＤＲ２を含んでなることができる。本発明はさらに、５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５のＣＤＲ１を含んでなることができる。本発明の抗体はさらにＣＤＲの任意を組み合わせを含んでなることができる。
【００９３】
したがって別の態様では、本発明はさらに、（１）ヒト重鎖フレームワーク領域、ヒト重鎖ＣＤＲ１領域、ヒト重鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト重鎖ＣＤＲ３領域（ここでヒト重鎖ＣＤＲ３領域が図１、４、６または８に示す５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の重鎖ＣＤＲ３であり（配列番号２０、３８、５０および６２））、および（２）ヒト軽鎖フレームワーク領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ１領域、ヒト軽鎖ＣＤＲ２領域、およびヒト軽鎖ＣＤＲ３領域（ここでヒト軽鎖ＣＤＲ３領域が図２、３、５、７または９に示す５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の軽鎖ＣＤＲ３であり（配列番号２６、３２、４４、５６および６８））を含んでなる抗−ＰＡ抗体を提供し、ここで抗体は感染防御抗原に結合する。抗体はさらに５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の重鎖ＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ２を含んでもよい。抗体はさらに、５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の重鎖ＣＤＲ１および／または軽鎖ＣＤＲ１を含んでもよい。
【００９４】
本発明の抗体の上記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３領域は、本明細書に開示する５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５のアミノ酸配列と厳密に同一であるアミノ酸配列を含むことができる。しかし当業者は、５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５と厳密に同一であるＣＤＲ配列からいくらかの相異は、感染防御抗原への抗体の効果的な結合能力が維持されていれば可能であることを理解するだろう。したがって別の態様では、本発明の抗体は５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４または５Ｄ５の１つ以上のＣＤＲと例えば９５％、９８％または９９．５％同一である１もしくは複数のＣＤＲを含むことができる。
ヒトモノクローナル抗体の感染防御抗原への結合の特性決定
本発明のヒトモノクローナル抗−ＰＡ抗体の結合を特徴づけるために、免疫感作したマウスから採取した血清を例えばＥＬＩＳＡなどによって試験することができる。ＥＬＩＳＡプロトコルの一般的な（しかしこれに限定されない）例では、マイクロタイタープレートを２０μｇ／ｍｌの精製した感染防御抗原のＰＢＳ溶液でコートし、次いで５％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ溶液でブロックする。抗−ＰＡ抗原を含有する血漿の希釈物を各ウエルに加え、３７℃で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄し、次いでアルカリホスファターゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ特異性ポリクロナール試薬とともに、３７℃で１時間インキュベートする。プレートを洗浄後、ｐＮＰＰ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で発色し、ＯＤ４０５−６５０で解析する。好ましくは、最高の力価を生じるマウスを融合に使用するであろう。
【００９５】
上記のＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＰＡ免疫原で陽性反応を示すハイブリドーマをスクリーニングすることもできる。感染防御抗原に高アビディティで結合するハイブリドーマをサブクローンし、さらに特性決定する。親細胞の反応性（ＥＬＩＳＡによる）を維持する各ハイブリドーマから得たクローンを、−１４０℃で保存した５〜１０バイアル細胞バンクを作製するため、および抗体を精製するために選択することができる。
【００９６】
ヒト抗−ＰＡ抗体を精製するために、選択したハイブリドーマを２リットルのスピナーフラスコで成長させてモノクローナル抗体を精製することができる。上清を濾過し、濃縮してからプロテインＡセファロース（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ）のアフィニティクロマトグラフィにかけることができる。溶出したＩｇＧは、ゲル電気泳動でチェックし、高性能液体クロマトグラフィで純度を確認
することができる。バッファー溶液をＰＢＳに交換することができ、濃度を吸光係数１．４３を用いてＯＤ２８０によって測定することができる。モノクローナル抗体をアリコートに分割して、−８０℃で保存することができる。
【００９７】
選択したヒト抗−ＰＡモノクローナル抗体が固有のエピトープに結合するかどうかを決定するために、市販の試薬（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ）、ロックフォード、イリノイ州）を使用して各抗体をビオチン化することができる。非標識のモノクローナル抗体およびビオチン化したモノクローナル抗体を用いた競合研究を、感染防御抗原でコートしたＥＬＩＳＡプレートを用いて上記の通り行うことができる。ビオチン化ＭＡｂ結合は、ストレップ−アビジン−アルカリホスファターゼプローブを用いて検出することができる。
【００９８】
精製した抗体のアイソタイプを決定するために、アイソタイプＥＬＩＳＡを行うことができる。例えばマイクロタイタープレートのウェルを１０μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇで、４℃で一晩かけてコートすることができる。５％  ＢＳＡでブロックした後、プレートを１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体または精製アイソタイプ対照と、室温で２時間反応させる。次いでウェルをヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＭ特異性アルカリホスファターゼ結合プローブと反応させることができる。プレートを発色させ、上記の通り解析する。
【００９９】
抗−ＰＡヒトＩｇＧは、さらに感染防御抗原との反応性をウエスタンブロッティングにより試験することもできる。例えばＰＡをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることができる。電気泳動後、分離した抗原をニトロセルロース膜に移し、２０％マウス血清でブロックし、試験するモノクローナル抗体でプローブする。ヒトＩｇＧ結合は、抗ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼを用いて検出し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質錠（シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、セントルイス、ミズーリ州）で発色させることができる。
ＩＩ．ヒトモノクローナル抗−ＰＡ抗体を生産するトランスジェニック非ヒト動物の作出
さらに別の観点では、本発明は感染防御抗原に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を発現することができる、トランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル（ｔｒｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）マウスのようなトランスジェニックおよびトランスクロモゾーマル非ヒト動物を提供する。特定の態様では、本発明はマウスが炭疽の感染防御抗原および／または感染防御抗原を発現する細胞で免疫感作された時に、ヒト抗−ＰＡ抗体を生産するように、ヒト重鎖導入遺伝子を含んでなるゲノムを有するトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマルマウスを提供する。ヒト重鎖導入遺伝子は、トランスジェニック、例えばＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（商標）の場合のように、本明細書に詳細に記載し、そして例示するようにマウスの染色体ＤＮＡに組み込まれることができる。あるいはヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開第０２／４３４７８号パンフレットに記載されているように、トランスクロモゾーマル（例えばＫＭ−Ｍｏｕｓｅ（商標））の場合のように、染色体外に維持され得る。そのようなトランスジェニックおよびトランスクロモゾーマル動物は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えおよびアイソタイプスイッチングを経て、感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体の複数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＥ）を生産することができる。イソタイプスイッチングは、例えば古典的または非古典的アイソタイプスイッチングにより生じることができる。
【０１００】
異種抗体レパートリによる外来性の抗原刺激に応答するトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル非ヒト動物の設計には、異種免疫グロブリン導入遺伝子が、Ｂ細胞の発達の経路全体を通してトランスジェニック動物の機能に正しく収容される必要がある。これは例えば異種重鎖導入遺伝子のアイソタイプスイッチングを含む。したがって導入遺伝子は、アイソタイプスイッチング、ならびに（１）高レベルで細胞型に特異的な発現、（２）機能的遺伝子再構成、（３）対立遺伝子排除の活性化およびそれに対する応答、（４）十分な一次レパートリの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞超突然変異、およ
び（７）免疫応答中の導入遺伝子抗体座の支配、のうちの１つ以上を生じるように構築する。
【０１０１】
上記の要件すべてを満たす必要はない。例えばトランスジェニック動物の内因性免疫グロブリン座が機能的に破壊されている態様では、導入遺伝子は対立遺伝子排除を活性化する必要はない。さらに、導入遺伝子が機能的に再構成された重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン遺伝子を含む態様では、機能的遺伝子の再構成の２番目の要件は、少なくともすでに再構成されている導入遺伝子の場合には不必要である。分子免疫学の背景については、引用により本明細書に編入する免疫学の基礎（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第２班、（１９８９）、Ｐａｕｌ  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．，編集、ラベン出版（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークを参照のこと。
【０１０２】
特定の態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体を生産するために用いることができるトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル非ヒト動物は、トランスジェニック動物の生殖系列に再構成された、再構成されてない異種の免疫グロブリン重鎖および軽鎖導入遺伝子、またはそれらの組み合わせを含む。重鎖導入遺伝子はそれぞれ、少なくとも１つのＣＨ遺伝子を含む。さらに重鎖導入遺伝子は機能的アイソタイプスイッチ配列を含んでもよく、その配列はトランスジェニック動物のＢ細胞の中にある複数のＣＨ遺伝子をコードする異種導入遺伝子のアイソタイプスイッチングを支持することができる。そのようなスイッチ配列は、導入遺伝子ＣＨ遺伝子の供給源となる種に由来する生殖系列免疫グロブリン座の中に天然に存在する配列であることができ、またはそのようなスイッチ配列は導入遺伝子構築物（トランスジェニック動物）を受け取る種の中に生じる配列に由来してもよい。例えばトランスジェニックマウスを作製するために用いるヒト導入遺伝子構築物は、マウス重鎖座に天然に存在するスイッチ配列と同様の配列が組み込まれている場合、アイソタイプスイッチング発生頻度が高くなることがある。これは恐らくマウススイッチ配列がマウススイッチリコンビナーゼ酵素系とともに機能するために最適化されているのに対し、ヒトスイッチ配列はそうではないからであろう。スイッチ配列は単離して従来のクローニング方法でクローン化してもよく、または免疫グロブリンスイッチ領域配列に関連する公開配列情報をもとに設計された重複合成オリゴヌクレオチドから、デノボ合成してもよい（Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：７３０５−７３１６（１９９１）；Ｓｉｄｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １：６３１−６４２  （１９８９））。前期の各トランスジェニック動物について、機能的に再構成された異種重鎖および軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子は、かなりの割合のトランスジェニック動物のＢ細胞に見い出される（少なくとも１０％）。
【０１０３】
本発明のヒトモノクローナル抗体を生産するために使用するトランスジェニック非ヒト動物を作出するために使用する導入遺伝子には、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの多様性遺伝子セグメント、１つの結合遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んでなる重鎖導入遺伝子が含まれる。免疫グロブリン軽鎖導入遺伝子は、少なくとも１つの可変遺伝子セグメント、１つの結合遺伝子セグメント、および少なくとも１つの定常領域遺伝子セグメントをコードするＤＮＡを含んでなる。軽鎖および重鎖遺伝子セグメントをコードする遺伝子セグメントは、トランスジェニック非ヒト動物から構成されていない種に由来する免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子セグメントをコードするＤＮＡに由来するか、またはそれに相当する点でトランスジェニックヒト動物に対して異種性である。本発明のある１つの観点では、導入遺伝子は、個々の遺伝子セグメントが非再構成であるように、すなわち機能的免疫グロブリン軽鎖または重鎖をコードするように再構成されることがないように構築される。そのような非再構成の導入遺伝子はＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子セグメントの組換え（機能的再構成）を支持し、そして好ましくは、Ｄ領域遺伝子セグメントの全体または部分を、感染防御抗原に暴露された場合にトランスジェニック動物の中で得られる再構成免疫グロブリ
ン重鎖に組み込むことを支持する。
【０１０４】
あるいは別の態様では、導入遺伝子は非再構成の「小座位（ｍｉｎｉ−ｌｏｃｕｓ）」を含んでなる。そのような導入遺伝子は典型的には、Ｃ、Ｄ、およびＪセグメントの実質的な部分ならびにＶ遺伝子セグメントのサブセットを含んでなる。そのような導入遺伝子構築物の場合、例えばプロモーター、エンハンサー、クラススイッチ領域、ＲＮＡプロセッシングのためのスプライスドナーおよびスプライスアクセプター配列、組換えシグナルなどの種々の調節配列は、異種ＤＮＡに由来する対応する配列を含んでなる。そのような調節配列は本発明で使用する非ヒト動物と同じ種、またはそれに関連する種に由来する導入遺伝子に組み込まれることができる。例えばヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントは、トランスジェニックマウスに用いるための齧歯類免疫グロブリンエンハンサー配列を有する導入遺伝子と組み合わせることができる。代替的には、合成した調節配列を導入遺伝子に組み込むこともでき、ここでそのような合成した調節配列は、哺乳動物のゲノムに天然に存在することが知られている機能的ＤＮＡ配列と相同ではない。合成した調節配列は、例えばスプライスアクセプター部位またはプロモーター／エンハンサーモチーフの許容され得る配列を特定するなどのコンセンサスルールにしたがって設計する。例えば小座位は、天然に存在する生殖系列のＩｇ座と比較して、非必須ＤＮＡ部分（たとえば介入配列、イントロンまたはその部分）の少なくとも１つの内部（すなわちその部分の終端においてではない）欠損を有するゲノム免疫グロブリン座の部分を含んでなる。
【０１０５】
本発明の好適な態様では、感染防御抗原に対するヒト抗体を生成するために用いるトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル動物は、国際公開第９８／２４８８４パンフレットの実施例５、６、８、もしくは１４に記載の軽鎖導入遺伝子の単一のコピーを含有する動物、および国際公開第９８／２４８８４パンフレットの実施例１０に記載のＪＨを欠失した動物と交配させたその仔と交配させた国際公開第９８／２４８８４パンフレット実施例１２に記載の導入遺伝子の、少なくとも１つ、典型的には２〜１０個、そして時には２５〜５０個以上のコピーを含む。動物はこれら３つの形質のそれぞれについてホモ接合性になるように交配する。そのような動物は以下の遺伝子型を有する：ヒト重鎖非再構成小座（国際公開第９８／２４８８４号パンフレットの実施例１２に記載）の単一のコピー（染色体のハプロイド１組あたり）、編成したヒトＫ軽鎖構築物（国際公開第９８／２４８８４号パンフレットにの実施例１４に記載）の単一のコピー（染色体のハプロイド１組あたり）、および機能的ＪＨセグメント（国際公開第９８／２４８８４パンフレットにの実施例１０に記載）のすべてを除去する内因性マウス重鎖座のそれぞれにおける欠失、。そのような動物は、ＪＨセグメントの欠失（国際公開第９８／２４８８４号パンフレットにの実施例１０に記載）についてホモ接合性のマウスと配合して、ＪＨ欠失についてホモ接合性であり、ヒト重鎖および軽鎖構築物についてはヘミ接合性である仔を生む。得られた動物に抗原を注射し、そしてこれらの抗原に対するヒトモノクローナル抗体生産のために使用する。
【０１０６】
そのような動物から単離したＢ細胞は、それらが各遺伝子の単一のコピーしか含まないので、ヒト重鎖および軽鎖に関して単一特異的である。さらにそれらは内因性マウス重鎖遺伝子のコピーが両方とも、国際公開第９８／２４８８４号パンフレットの実施例９および１２に記載の通り導入されたＪＨ領域全体にわたる欠失のために非機能的であるので、ヒトまたはマウス重鎖に関して単一特異的であろう。さらに再構成ヒトκ軽鎖遺伝子の単一コピーの発現が、かなりの割合のＢ細胞における内因性マウスκおよびラムダ鎖遺伝子の再構成を、対立遺伝子的およびアイソタイプ的に排除するので、実質的割合のＢ細胞はヒトまたはマウス軽鎖に関して単一特異的であろう。
【０１０７】
好適なトランスジェニックおよびトランスクロモゾーマル非ヒト動物、例えばマウスは、重要なレパートリー、理想的には天然のマウスのレパートリに実質的に類似のレパート
リの免疫グロブリンの生産を現すだろう。したがって例えば内因性Ｉｇ遺伝子が不活化されている態様では、総免疫グロブリンレベルが血清中約０．１〜１０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌであり、理想的には少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌである。ＩｇＭからＩｇＧへのスイッチを行うことができる導入遺伝子がトランスジェニックマウスに導入された場合、成熟マウスにおける血清ＩｇＧ対ＩｇＭの比は、好ましくは約１０：１である。ＩｇＧ対ＩｇＭの比は、未成熟マウスにおいてははるかに小さいだろう。一般に、約１０％超、好ましくは４０〜８０％の脾およびリンパ節Ｂ細胞は、ヒトＩｇＧタンパク質のみを発現する。
【０１０８】
このレパートリは理想的には天然のマウスに見られるレパートリである、通常は少なくとも約１０％もの、好ましくは２５〜５０％以上に近いだろう。一般に、主にマウスゲノムに導入された異なるＶ、ＪおよびＤ領域の数によって、少なくとも約１０００種類、好ましくは１０４〜１０６種類以上の異なる免疫グロブリン（理想的にはＩｇＧ）が生産される。これらの免疫グロブリンは典型的には、例えばスタフィロコッカス  プロテインＡなどの高度に抗原性のタンパク質の約半分以上を認識するだろう。一般に免疫グロブリンは、１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍさらにそれ以下のようなも約１０−７Ｍ未満のあらかじめ選択した抗原に対する親和性（ＫＤ）を現す。幾つかの態様では、予め定めたレパートリーを有する非ヒト動物を作出して、予め定めた抗原のタイプに応答して抗体に表れるＶ遺伝子の選択を制限することが好ましい。予め定めたレパートリーを有する重鎖導入遺伝子は、例えばヒトにおいて予め定めた抗原タイプに対する抗体応答に優先的に用いられるヒトＶＨ遺伝子を含んでもよい。あるいはＶＨ遺伝子の中には、様々な理由（例えば予め定めた抗原にについて高度な親和性Ｖ領域をコードする可能性が低いか、体細胞突然変異および親和性シャープニングを経る傾向が低いか、または特定のヒトに免疫原性である、など）から、所定のレパートリから排除されてもよい。このように各種重鎖または軽鎖遺伝子セグメントを含む導入遺伝子の再構成の前に、そのような遺伝子セグメントは、例えばハイブリダイゼーションまたはＤＮＡシークエンシングにより、トランスジェニック動物以外の生物種に由来することを容易に同定することもできる。
【０１０９】
上記のトランスジェニックおよびトランスクロモゾーマル非ヒト動物、例えばマウスは、例えば精製された感染防御抗原もしくはその組換え調製物および／または感染防御抗原を発現する細胞で免疫感作することができる。あるいはトランスジェニック動物は、ヒト感染防御抗原をコードするＤＮＡで免疫感作することができる。次いで動物は導入遺伝子内スイッチ組換え（ｃｉｓスイッチング）によってクラススイッチを起こすＢ細胞を生産し、感染防御抗原と反応する免疫グロブリンを発現する。この免疫グロブリンはヒト配列でることができ（「ヒト配列抗体」とも呼ばれる）、ここで重鎖および軽鎖ポリペプチドはヒト導入遺伝子配列によってコードされ、この配列には体細胞突然変異およびＶ領域組換え結合ならびに生殖系列コード配列によって誘導された配列を含んでよく、これらのヒト抗体はたとえ他の非生殖系列配列が体細胞突然変異および特異な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）なＶ−ＪおよびＶ−Ｊ−Ｄ組換え結合の結果として存在していても、ヒトＶＬまたはＶＨ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬまたはＤＨおよびＪＨセグメントによってコードされるポリペプチド配列と実質的に同一であるといってよい。各抗体配列の鎖の可変領域は一般に、少なくとも８０％がヒト生殖系列Ｖ、Ｊ、および重鎖の場合はＤ遺伝子セグメントによってコードされており、高頻度で可変領域の少なくとも８５％が導入遺伝子上に存在するヒト生殖系列配列によってコードされており、しばしば可変領域配列の９０または９５％以上が導入遺伝子上にて存在するヒト生殖系列配列によってコードされている。しかし、非生殖系列配列は体細胞突然変異ならびにＶＪおよびＶＤＪ結合によって導入されているため、ヒト配列抗体は、マウスの生殖系列中のヒト導入遺伝子（１もしくは複数）に見られるようなヒトＶ、Ｄ、またはＪ遺伝子セグメントによってコードされていない可変領域配列のいくつかを高頻度に有するだろう（そして定常領域配列の場合は頻度が低い）。典型的には、そのような非生殖系列配列（または個々のヌクレオチドの位置）は
ＣＤＲ内もしくは近傍、または体細胞突然変異がクラスターを形成することが知られている領域中においてクラスターを形成するだろう。
【０１１０】
予め定めた抗原に結合するヒト配列抗体はアイソタイプスイッチングから生じることができるので、ヒト配列γ鎖（γ１、γ２ａ、γ２Ｂまたはγ３のような）およびヒト配列軽鎖（カッパのような）を含んでなるヒト抗体を生産する。そのようなアイソタイプスイッチされたヒト配列抗体は、特に２次（または後続）抗原の刺激の後に、抗原によるＢ細胞の親和性の成熟および選択の結果、典型的には可変領域において、およびしばしばＣＤＲの約１０残基中またはそれ以内において、１もしくは複数の体細胞突然変異を含むことが多い。これら高親和性ヒト配列抗体は、１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満、またはそれ以下のような１０−７Ｍ未満の結合親和性（ＫＤ）を有することがある。
【０１１１】
本発明の別の観点は、本明細書に記載するようなトランスジェニックまたはトランスクロモゾーマル非ヒト動物に由来するＢ細胞を含む。Ｂ細胞は高親和性（例えば１０−７Ｍ未満）で感染防御抗原に結合するヒトモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマを作出するために用いることができる。したがって本発明の別の態様では、被検体として組換えヒト感染防御抗原を、そしてヒト感染防御抗原に結合するリガンドとして抗体を使用して、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００装置で表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技術により測定した時、１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満、またはそれ以下のような１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）を有するヒト抗体を生産するハイブリドーマを提供し、ここで抗体が：
（１）ヒトＶＬ遺伝子セグメントおよびヒトＪＬセグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する軽鎖可変領域、および（２）ヒトＣＬ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する軽鎖定常領域、からなるヒト配列軽鎖；ならびに
（１）ヒトＶＨ遺伝子セグメント、場合によりそのＤ領域、およびヒトＪＨセグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する重鎖可変領域、および（２）ヒトＣＨ遺伝子セグメントによりコードされるポリペプチド配列と実質的に同一のポリペプチド配列を有する定常領域、からなるヒト配列重鎖、
を含んでなる。
【０１１２】
感染防御抗原に対する高親和性ヒトモノクローナル抗体の生成は、組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子を含んでなるゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物のヒト可変領域遺伝子セグメントのレパートリーを拡大する方法により実施可能となり、この方法は該組み込まれたヒト免疫グロブリン導入遺伝子中に存在しないＶ領域遺伝子セグメントを含んでなるＶ領域遺伝子セグメントを含んでなるＶ遺伝子導入遺伝子をゲノムに導入する工程を含んでなる。しばしばＶ領域導入遺伝子は、ヒトゲノムに天然に存在するかもしれず、または組換え法によって別々に共にスプライスされているかもしれず、異常または除外Ｖ遺伝子セグメントを含むかもしれない、ヒトＶＨまたはＶＬ（ＶＫ）遺伝子セグメントアレイの一部分を含んでなる酵母人工染色体である。少なくとも５つ以上の機能的Ｖ遺伝子セグメントがＹＡＣ上に含まれていることが多い。この変形の場合、Ｖレパートリー拡大方法によりトランスジェニック動物を作出することが可能であり、ここで動物はＶ領域導入遺伝子上に存在するＶ領域遺伝子セグメントおよびヒトＩｇ導入遺伝子上にコードされているＣ領域によりコードされる可変領域配列を含んでなる免疫グロブリン鎖を発現する。Ｖレパートリー拡大方法により、少なくとも５つの別個のＶ遺伝子を有するトランスジェニック動物を作出することができ、同様に少なくとも約２４個以上のＶ遺伝子を含む動物を作出することもできる。いくつかのＶ遺伝子セグメントは、非機能的（たとえば偽遺伝子など）であってよく、これらのセグメントは、所望により当業者が実行できる組換え方法によって、維持または選択的に削除することもできる。
【０１１３】
いったんマウスの生殖系列を、拡大Ｖセグメントレパートリーを有する機能的ＹＡＣを含み、ＪおよびＣ遺伝子セグメントを含むヒトＩｇ導入遺伝子に実質的に存在しないように操作すると、その形質が増殖し、そして拡大したＶセグメントレパートリーを有する機能的ＹＡＣを異なるヒトＩｇ導入遺伝子を有する非ヒト動物生殖系列に組み込むなどのバックグラウンドを含め、その他の遺伝的バックグラウンドに組み込むことができる。拡大したＶセグメントレパートリーを有する複数の機能的ＹＡＣを、ヒトＩｇ導入遺伝子（または複数のヒトＩｇ導入遺伝子）とともに働かせるために、生殖系列に組み込んでもよい。本明細書ではＹＡＣ導入遺伝子と呼んでいるが、そのような遺伝子はゲノムに組み込まれると、酵母菌の自律複製に必要な配列のような酵母配列を実質的に失うことがあり、そのような配列は場合により、酵母菌の複製の必要がもはや無くなった後（すなわち、マウスＥＳ細胞またはマウスプロ接合体への導入前）に遺伝子工学（たとえば制限消化、およびパルスフィールドゲル電気泳動、またはその他の適切な方法）によって除去することができる。ヒト配列免疫グロブリン発現の形質の拡大方法には、ヒトＩｇ導入遺伝子（１もしくは複数）を有する、および場合により拡大したＶセグメントレパートリーを有する機能的ＹＡＣも有するトランスジェニックマウスの交配を含む。ＶＨおよびＶＬ遺伝子セグメントの両方がＹＡＣ上に存在してもよい。トランスジェニック動物は、ヒトＩｇ導入遺伝子および／またはその他のヒトリンパ球タンパク質をコードする導入遺伝子を含め、その他のヒト導入遺伝子を有するバックグラウンドを含む、実施者が望むいずれのバックグラウンドと交配してもよい。本発明はまた、拡大したＶ領域レパートリーのＹＡＣ導入遺伝子を有するトランスジェニックマウスにより生産された高親和性ヒト配列免疫グロブリンも提供する。前述の記載は本発明のトランスジェニック動物の好ましい態様を説明しているが、４つのカテゴリーに分類したその他の態様も意図する：
Ｉ．再構成していない重鎖および再構成した軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子と含むトランスジェニック動物；
ＩＩ．再構成していない重鎖および再構成していない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物；
ＩＩＩ．再構成した重鎖および再構成していない軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物；ならびに
ＩＶ．再構成した重鎖および再構成した軽鎖免疫グロブリン導入遺伝子を含むトランスジェニック動物。
【０１１４】
トランスジェニック動物のこれらのカテゴリーのうち、内因性軽鎖遺伝子（または少なくともＫ遺伝子）が相同な組換え（またはそのほかの方法）によってノックアウトされている場合の好ましい選好順序はＩＩ＞Ｉ＞ＩＩＩ＞ＩＶであり、そして内因性軽鎖遺伝子がノックアウトされず、そして対立遺伝子排除によって支配されなければならない場合にはＩ＞ＩＩ＞ＩＩＩ＞ＩＶである。
ＩＩＩ．感染防御抗原に結合する二重特異性／多重特異性分子
本発明のさらに別の実施態様では、感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分は、誘導体化されるか、たとえば別のペプチドまたはタンパク質（たとえばＦａｂ’フラグメント）などの別の機能的な分子へ結合し、複数の結合部位または標的エピトープに結合する二重特異性または多重特異性分子を生じる。例えば本発明の抗体または抗原結合部分は、別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物のような１もしくは複数の別の結合分子に機能的に結合することができる（たとえば化学カップリング、遺伝子融合、または非共有会合などにより）。
【０１１５】
したがって本発明には、感染防御抗原への少なくとも１つの第１の結合特異性、および第２の標的エピトープに関する第２の結合特異性を含んでなる二重特異性および多重特異性分子を含む。
【０１１６】
１つの態様では、本発明の二重特異性および多重特異性分子は、結合特異性として少なくとも１つの抗体または例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖもしくは１本鎖Ｆｖを含む抗体のフラグメントを含む。また抗体は軽鎖もしくは重鎖の二量体、またはその引用により内容を本明細書に編入する１９９０年８月７日に発効されたＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，９４６，７７８明細書に記載のＦｖまたは１本鎖作製物のような、その任意の最小フラグメントであってもよい。
【０１１７】
ヒトモノクローナル抗体が好ましいが、本発明の二重特異性または多重特異性分子に用いることができる他の抗体は、マウス、キメラ、およびヒト化モノクローナル抗体である。
【０１１８】
キメラマウス−ヒトモノクローナル抗体（すなわちキメラ抗体）は、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えばマウス（またはその他の種の）モノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を制限酵素で切断し、マウスＦｃをコードする領域を除去し、そしてヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の等価の部分に置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号パンフレット；Ａｋｉｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願公開第１８４，１８７号明細書；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願公開第１７１，４９６号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願公開第１７３，４９４号明細書：Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許出願公開第１２５，０２３号明細書；Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＰＮＡＳ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｎａｔｌ
Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９参照を参照にされたい）。
【０１１９】
キメラ抗体は、さらにヒトＦｖ可変領域と等価の配列に結合する抗原に直接関与しないＦｖ可変領域の配列に交換することによってヒト化することができる。ヒト化キメラ抗体の一般的な総説は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７およびＯｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
４：２１４に提供されている。それらの方法には少なくとも１つの重鎖または軽鎖に由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全体または一部をコードする核酸配列を分離、操作、および発現する工程を含む。そのような核酸の供給源は当業者に周知であり、例えば抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ抗体生産ハイブリドーマである７Ｅ３から得ることもできる。次にキメラ抗体またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローン化することができる。あるいは適切なヒト化抗体をＣＤＲ置換によって生成することもできる。米国特許第５，２２５，５３９号明細書、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８６  Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４、およびＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８８
Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０。
【０１２０】
特定のヒト抗体のＣＤＲすべてを、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分と交換してもよく、またはＣＤＲの幾つかだけを非ヒトＣＤＲと交換してもよい。ただしＣＤＲは、ヒト化抗体をＦｃ受容体に結合させるのに必要な数だけ交換する必要がある。
【０１２１】
抗体は、ヒト抗体のＣＤＲの少なくとも一部分を非ヒト抗体に由来するＣＤＲと交換することができる、任意の方法によってもヒト化することができる。Ｗｉｎｔｅｒは、本発明のヒト化抗体を調製するために使用できる方法を記載し（１９８７年３月２６日に出願
された英国特許出願第２１８８６３８Ａ号明細書）、その内容は引用することにより本明細書に編入する。ヒトＣＤＲは、ヒト単核食細胞に関する免疫グロブリンＧのＦｃ受容体に対するヒト化抗体（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ）という表題の国際公開第９４／１０３３２号パンフレットに記載のとおり、オリゴヌクレオチド位置指定突然変異誘発を用いて非ヒトＣＤＲと交換することができる。
【０１２２】
特定のアミノ酸が置換、欠失、または付加されているキメラまたはヒト化抗体も本発明の範囲内である。特に好ましいヒト化抗体は、抗原への結合性が向上するように、フレームワーク領域においてアミノ酸が置換されている。例えばマウスＣＤＲを有するヒト化抗体では、ヒトフレームワーク領域に位置するアミノ酸をマウス抗体の対応する位置にあるアミノ酸と交換することができる。このような置換は場合により、ヒト化抗体の抗原への結合性を向上する場合があるということが知られている。アミノ酸を付加、欠失、または置換した抗体を、本願明細書では改変体抗体または改変抗体と呼ぶ。
【０１２３】
改変体抗体という用語は、抗体の部分を欠失、付加、または置換するなどによって改変体されたモノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体のような抗体も含むことを意図する。例えば抗体は定常領域を欠失させ、たとえば血清半減期などの半減期、抗体の安定性または親和性を増加させるために定常領域と交換することによって、抗体を改変体することができる。どのような改変体も、二重特異性および多重特異性分子がＦｃγＲに特異的な少なくとも１つの抗原結合領域を有し、そして少なくとも１つのエフェクター機能を誘導する限り、本発明の範囲内である。
【０１２４】
本発明の二重特異性および多重特異性分子は、化学的な技術（例えばＤ．Ｍ．Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５８０７参照）、「ポリドーマ」技術（Ｒｅａｄｉｎｇへの米国特許第４，４７４，８９３号明細書）、または組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができる。
【０１２５】
特に本発明の二重特異性および多重特異性分子は、当該技術分野で既知の方法および本明細書に提供する実施例に記載の方法を使用して、構成要素の結合特異性、例えば抗−ＦｃＲおよび抗−ＰＡ結合特異性を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させることによって調製することができる。例えば二重特異性および多重特異性分子の各結合特異性を別々に作り出し、次いで互いに結合させることができる。結合特異性がタンパク質またはペプチドである場合、様々なカップリング剤または架橋剤を使用して共有結合を作り出すことができる。架橋剤の例にはプロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロハキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）が含まれる（例えばＫａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８））。その他の方法には、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．（１９８５）  Ｎｏ．７８，１１８−１３２）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：８１−８３）、およびＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：２３６７−２３７５）により記載された方法が含まれる。好ましい結合剤は、ＳＡＴＡおよびスルホ−ＳＭＣＣで、どちらもピアスケミカル社（ロックフォード、イリノイ州）から入手することができる。
【０１２６】
結合特異性が抗体（例えば２つのヒト化抗体）である場合、それらは２つの重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフィド結合を介して結合させることができる。特に好ましい態様では、ヒンジ領域を、奇数の、好ましくは１つのスルフィド残基を結合前に含むように改変体する。
【０１２７】
あるいは両方の結合特異性とも、同じベクターにコードされ、そして同じ宿主細胞に発現させ、そして組み立てることができる。この方法は、二重特異性および多重特異性分子がＭＡｂ  ｘ  ＭＡｂ、ＭＡｂ  ｘ  Ｆａｂ、Ｆａｂ  ｘ  Ｆ（ａｂ’）２またはリガンドｘ  Ｆａｂ  融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性および多重特異性分子、例えば二重特異性分子は、１本鎖二重特異性抗体、１つの１本鎖抗体および結合決定基を含む１本鎖二重特異性分子、または２つの結合決定基を含む１本鎖二重特異性分子のような１本鎖分子であることができる。また二重特異性および多重特異性分子は、１本鎖分子であってもよく、または少なくとも２つの１本鎖分子を含んでなるものでもよい。二重および多重特異性分子の調製方法は、たとえば米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号、同第  ５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号、同第５，２５８，４９８号；および同第５，４８２，８５８号明細書に記載されている。
【０１２８】
二重特異性および多重特異性分子の特異的標的への結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ法、生物検定法（たとえば毒素中和アッセイ）、またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。一般にこれらの各アッセイは目的の複合体に特異的な標識した試薬（たとえば抗体）を用いて、目的のタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えばＦｃＲ抗体複合体は、例えば抗体−ＦｃＲ複合体を認識し、そして特異的に結合する酵素結合抗体または抗体フラグメントを用いて検出することができる。あるいは複合体は様々な他のイムノアッセイのいずれかを使用して検出することができる。例えば抗体を放射標識し、そしてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に用いることができる（例えば引用により本明細書に編入するＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，ラジオイムノアッセイの原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）、第７回、ラジオリガンドアッセイ技術に関するトレーニングコース（Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、内分泌学会（Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）、１９８６年３月を参照にされたい）。放射性同位体は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターなどの使用により、またはオートラジオグラフィーにより検出することができる。
Ｖ．製薬学的組成物
別の観点では、本発明は例えば製薬学的に許容され得る担体とともに配合したヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分（１もしくは複数）を単独で、または組み合わせて含有する製薬学的組成物などの組成物を提供する。すなわち１つの態様では、組成物には本発明の複数（たとえば２つ以上）の単離されたヒト抗−ＰＡ抗体または抗原結合部分の組み合わせを含む。好ましくは組成物の抗体またはその抗原結合部分のそれぞれは、感染防御抗原の予め選択された別のエピトープに結合する。
【０１２９】
本明細書で使用する「薬学的に許容され得る担体」には、ありとあらゆる溶媒、懸濁媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに生理学的に適合するものが含まれる。好ましくは担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または皮内投与（例えば注射または注入による）に適する。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性および多重特異性分子は、酸および化合物を不活化する可能性がある他の自然条件の作用から化合物を保護するための物質でコーティングしてもよい。
【０１３０】
「薬学的に許容され得る塩」は、元の化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そして望ましくない毒物学的作用はない塩を指す（例えばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。そのような塩の例には、酸付加塩および塩基付加塩がある。酸付加塩には、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸などの無毒性無機酸、リンなどから、ならびに脂肪族系モノカルボン酸およびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等の無毒性有機酸から誘導される塩を含む。塩基付加塩には、ナトリウム、カリウム、マグネシウムおよびカルシウムなどのアルカリ土類金属から、ならびにＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、およびプロカイン等の無毒性有機アミンから誘導される塩を含む。
【０１３１】
本発明の組成物は、当該技術分野で既知の種々の方法により投与することができる。当業者に理解されるとおり、投与経路および／または様式は、望まれる結果によって変動する。活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達システムを含む放出制御製剤のような急速な放出から化合物を保護する担体とともに調製することができる。酢酸ビニルエチレン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生分解性の生物適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製方法の多くは特許が認可されているか、または当該技術分野で一般的に知られている。例えば徐放性および放出制御薬剤送達システム（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｊ．Ｒ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、編集、マルセルデッカー社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９７８を参照されたい。
【０１３２】
本発明の化合物を特定の投与経路で投与するために、不活性化を防止する物質で化合物をコートするかまたは化合物と併用投与する必要があるかもしれない。例えば化合物は、例えばリポソームまたは希釈剤などの適切な担体に入れて個体に投与することができる。製薬学的に許容され得る希釈剤には、塩水および緩衝化水溶液が含まれる。リポソームには、水中油中水型ＣＧＦエマルションならびに従来のリポソームが含まれる（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０１３３】
製薬学的に許容され得る担体には、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の即時調合用滅菌粉末が含まれる。製薬学的に活性な物質用のそのような媒質および薬剤は、当該技術分野では既知である。従来の溶媒または薬剤が活性化合物と適合性がない場合を除き、本発明の製薬学的組成物にそれらを使用することが企意される。補助的な活性化合物もまた、前記組成物に組み込むことができる。
【０１３４】
一般に治療用組成物は、滅菌されており製造および保存条件下で安定でなければならない。組成物は溶液、マイクロエマルション、リポソームまたは高薬物濃度に適切なその他の指示通りの（ｏｒｄｅｒｅｄ）構造物として調剤することができる。担体は例えば水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒質であっることができる。例えばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持により、そして表面活性剤の使用により適切な流動性を維持することができる。多くの場合、例えば糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、または塩化ナトリウムなどの等張剤が組成物に含まれることが好ましいだろう。注射用組成物は、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンなどの吸収遅延剤を前記組成物に含むことによって、吸収を持続させることができる。
【０１３５】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて上記の成分１つまたは組み合わせを含む適切な溶媒中に活性化合物必要量で包含し、続いて滅菌マイクロ濾過を行うことにより調製できる。一般に、分散液は活性化合物を、塩基性分散媒質および上記の成分からの必要な他の成分を含む滅菌賦形剤に包含することにより調製する。滅菌注射用溶液の調製用滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、この方法により活性成分に予め滅菌濾過したその溶液から得たさらなる望ましい成分を加えた粉末を得る。
【０１３６】
投与計画は最適な望ましい応答（たとえば治療応答）が得られるように調整する。例えば、単回のボーラス投与でもよく、時間をかけて数回に分割して投与してもよく、または治療状況の緊急度により示されるように投与量を漸減もしくは漸増させてもよい。非経口組成物を、投与の容易さおよび投与量の均一化のために単位剤形に配合することが特に有利である。本明細書で使用する単位剤形とは、処置する個体への単回投与量として適する物理的に別れた単位を意味し、各単位には、望ましい治療効果を得るために計算した予め定めた量の活性化合物を必要な製薬学的担体と併せて含有する。本発明の単位剤形の詳細は、（ａ）活性化合物の固有の特性および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個人の処置の感受性に対して、そのような活性化合物を製剤する技術に固有の限界にて支配され、そしてこれらに直接依存する。
【０１３７】
製薬学的に許容され得る抗酸化剤の例には（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、二硫酸ナトリウム、メタ二硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル，アルファトコフェロール等の油溶性抗酸化剤；および（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＴＤＡ）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸等の金属キレート剤を含む。
【０１３８】
治療用組成物には、本発明の製剤は経口、経鼻、局所（口腔内および舌下を含む）、直腸、経膣、および／または非経口投与に適したものを含む。製剤は都合の良く単位剤形であることができ、製薬業の分野で既知のいずれの方法で調製してもよい。担体物質と混合して単回投与剤形を形成することができる活性成分の量は、処置する個体および投与の特定の様式によって変動するだろう。担体物質と合わせて単回投与剤形を製造することができる活性成分の量は、一般に組成物が治療効果を生じる量である。一般に１００％のうち、この量は活性成分が約０．０１％〜約９９％の範囲内であり、好ましくは約０．１％〜約７０％であり、最も好ましくは約１％〜約３０％である。
【０１３９】
膣投与に適切な本発明の製剤には、当該技術分野で適切であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤も含まれる。本発明の組成物の局所または経皮投与のための剤形には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性化合物は滅菌条件下で製薬学的に許容され得る担体、および必要であれば保存剤、緩衝剤または推進剤と混合することができる。
【０１４０】
本明細書で使用する「非経口投与」および「非経口的に投与する」という句は、経腸および局所投与ではない投与形態であり、通常、注射による投与形態を意味し、限定するわけではないが静脈内、筋肉内、動脈内、クモ膜下内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管穿刺、皮下、皮内、関節内、皮膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射ならびに注入を含む。
【０１４１】
本発明の製薬学的組成物に使用することができる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチル
などの注射用有機エステルが含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および表面活性剤の使用により維持することができる。
【０１４２】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤などの補助剤を含んでもよい。微生物の存在の防止は、上述の滅菌手順および例えばパラベン、クロロブタノール、およびソルビン酸フェノール等の各種抗菌剤および抗真菌剤の含有によって、確実に防止することもできる。また糖、塩化ナトリウム等の等張剤を組成物に含むことが望ましい場合もある。さらに、注射用の製薬学的剤形の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を包含することによりもたらされ得る。
【０１４３】
本発明の化合物がヒトおよび動物に医薬品として投与される場合、それらは単独で、または例えば０．０１％〜９９．５％（さらに好ましくは０．１〜９０％）の有効成分を製薬学的に許容され得る担体と組み合わせて含有する製薬学的組成物として投与することができる。
【０１４４】
選択した投与経路にかかわらず、適切に水和した形態で使用され得る本発明の化合物および／または本発明の製薬学的組成物は、当該技術分野で既知の従来の方法により、製薬学的に許容される剤形に製剤される。
【０１４５】
本発明の製薬学的組成物中の有効成分の実際の投薬用量レベルは、患者に対して毒性とならずに特定の患者に対して望ましい治療応答、組成物および投与様式が達成されるために効果的な有効成分の量が得られるように変動させてもよい。選択された投薬用量レベルは、本発明で使用する特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用する特定の化合物の排出速度、処置期間、使用する特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質の、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態、および既往歴等の医学業界で周知の同様の因子を含む、種々の薬物動態学的因子に依存するだろう。
【０１４６】
当該技術分野の通常の技術を有する医師または獣医師は、必要な製薬学的組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば医師または獣医師は、望ましい治療効果を達成するために必要な薬学的組成物中の本発明の化合物の用量を必要量よりも少量から開始し、望ましい効果が達成されるまで投与量を漸増することができる。一般に本発明の組成物の適切な一日用量は、治療効果を生じるために有効な最低用量である化合物の量であろう。そのような有効用量は、一般に上記の因子に依存する。
【０１４７】
任意の非経口投与様式が本発明で使用するために適している。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下であることが好ましく、好ましくは標的部位に最も近い部分に投与する。望ましい場合には、治療用組成物の有効な一日用量を２回、３回、４回、５回、６回またはそれ以上に分けて、一日のうちに適切な間隔を置き、場合により単位投与剤形にして投与してもよい。本発明の化合物を単独で投与することも可能だが、化合物を製薬学的製剤（組成物）として投与することが好ましい。
【０１４８】
治療用組成物は当該技術分野で知られる医療デバイスで投与することができる。例えば好適な態様では、本発明の治療用組成物は米国特許第５，３９９，１６３号、同第５，３８３，８５１号、同第５，３１２，３３５号、同第５，０６４，４１３号、同第４，９４１，８８０号、同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号明細書に開示されるデバイスのような無針皮下注射器で投与することができる。本発明に有用な周知のインプラントおよびモジュールの例には、制御された速度で医薬品を分配するための埋込可能なマイクロ注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号明細書；皮膚を通
して医薬品を投与するための治療用デバイスを開示する米国特許第４，４８６，１９４号明細書；正確な注入速度で医薬品を送達するための医薬品注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号明細書；連続薬物送達のための可変フロー埋込可能注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号明細書；マルチチャンバー区画を有する浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号明細書；浸透圧薬物送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号明細書が含まれる。これらの特許は引用により本明細書に編入する。このようなインプラント、送達システムおよびモジュールは、他にも数多く当該技術分野で知られている。
【０１４９】
特定の態様では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、インビボて適切に分布するように調製することができる。例えば血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高度に疎水性の化合物を通過させない。本発明の治療用化合物を確実にＢＢＢを通過させるために（望ましい場合に）、例えばリポソーム内などに配合することができる。リポソームの作製方法は、例えば米国特許第４，５２２，８１１号、同第５，３７４，５４８号および同第５，３９９，３３１号明細書を参照にされたい。リポソームは特異的細胞または臓器へ効果的に輸送される１もしくは複数の部分を含んでなることができ、すなわち標的化された薬剤の送達を強化する（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的なターゲッティング部分には、葉酸またはビオチン（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，４１６，０１６号明細書を参照にされたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ
ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；界面活性プロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）、本発明の製剤を含んでもよい異なる種、ならびに本発明の分子の成分；ｐ１２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）を含む。Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｊ．Ｊ．Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｉ．Ｊ．  Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照のこと。本発明の１つの態様では、本発明の治療用化合物をリポソーム中に調製し、さらに好ましい態様では、リポソームはターゲッティング部分を含む。最も好ましい態様では、リポソーム中の治療用化合物は、所望する領域、例えば炎症または感染部位に最も近い部位にボーラス注射することにより送達される。組成物は注射器に入れやすいようにある程度流動的でなければならない。組成物は製造および保存状況下において安定でなければならず、そして細菌および真菌などの微生物の夾雑物の活動が防止されなければならない。
【０１５０】
本発明の抗体の用量に関連して、「治療に有効な」とは、炭疽感染に伴う症状を少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、さらに一層好ましくは少なくとも約８０％まで減少させ、そして最も好ましくは未処置個体に比べて完全に減少させる抗体の量を意味する。好ましくは治療に有効な量の本発明の抗体は、炭疽に暴露された個体の死を防止するために十分な量である。炭疽感染に伴う死の防止を含む兆候および／または症状を減少するための本発明の抗体の能力は、ヒトの炭疽感染の処置において抗体の効力を予測する動物モデルシステムにおいて評価することができる。そのようなモデルの例は、以下の実施例６〜８に記載し、これは動物が炭疽に感染し、次いで本発明を抗体で処置されるウサギの実験を提供する。
【０１５１】
あるいは本発明の抗体の治療に有効な量は、当該技術分野で周知であり、そしてこれまでに記載したような毒素中和アッセイでインビトロにて炭疽毒素を中和する抗体の能力を調査することにより評価することができる。当業者は、個体のサイズ、兆候および／また
は個体の症状の重篤度、および選択した特定の組成物もしくは投与経路などの因子に基づいて、このような量を決定することができる。
【０１５２】
治療的用途の本発明の抗体を含有する組成物は、滅菌されており、そして注射器により送達できる程度に流動性がなければならない。担体は水に加えて等張緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコール等）、およびそれらの適切な混合物であることができる。例えばレシチンのようなコーティング剤の使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、および表面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、例えば糖、マンニトールもしくはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを組成物に含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンなどの吸収遅延剤を組成物に含むことによりもたらすことができる。
【０１５３】
活性化合物が上記のように適切に保護される場合、化合物は例えば不活性希釈剤または吸収性の食用担体とともに経口投与してもよい。
ＶＩ．本発明の用途および方法
本発明の抗体、抗体組成物および方法には、炭疽感染の診断、防止および処置が関与するインビトロおよびインビボでの診断用および治療用の多数の用途がある。例えばこれらの抗体は炭疽感染を処置および／または防止するためにヒト個体に投与することができる。加えて、個体の炭疽感染を診断するために、血液または組織サンプルを個体から採取し、そしてサンプル中の炭疽ＰＡの検出が可能となる条件下で本発明の抗体と接触させることができる。本明細書で使用する「個体」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むことを意図する。
【０１５４】
特定の態様では、抗体（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、炭疽感染をインビボで処置し、防止し、または診断するために使用される。１つの予防的用途では、個体は炭疽に暴露され、したがって炭疽による感染を防止するために、本発明のヒト抗体で予防的な暴露前の処置を受けることができる。別の予防的用途において、炭疽に暴露されたことが分かっているが、疾患の兆候または症状を現さない個体は、炭疽疾患の進行に伴う病状を防ぐために暴露後の処置を受けることができる。治療的処置では、炭疽に暴露された個体は感染し、そして疾患の兆候および／または症状を現している。本発明の抗体は炭疽の予防的設定および治療的処置の両方で使用することができる。
【０１５５】
例えば本発明のヒト抗体、抗体組成物および方法は、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）に感染し（または感染したと疑われている）、かつ／または炭疽感染の兆候および／または症状を現す個体を処置するために使用することができる。炭疽に感染したか、または感染した可能性がある個体の兆候および／または症状は測定可能である。例えば兆候には低ｐＯ２（血中酸素）、高体温（体温測定）、肺検査での外因性の音（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ  ｓｏｕｎｄ）、低血圧（またはショックの他の兆候）、胸部Ｘ線での広がった縦隔（例えば肺に排出したリンパ節の溶解による）、あるいは典型的に制御されていない肺炭疽感染および毒素放出に伴うことが知られている他の兆候を含むことができ；症状には呼吸の短さ、咳、悪寒、熱っぽさ、虚弱、深呼吸に伴う疼痛、または肺炭疽に一般的に伴う他の症状を含むことができる。皮膚炭疽は拡大し、そして侵食する（１〜２日）そう痒および小水疱から始まり、後に中央の黒い焼痂を形成する壊死潰瘍を残す。胃腸炭疽は、糜爛した喉の咽頭損傷、嚥下困難が際立つ首の膨張および局部的リンパ節症を生じるか、または熱、重度の腹痛、大量の腹水、吐血および下血を特徴する腸感染を生じる可能性がある。どのような状態の炭疽でも、出血性の髄膜炎が１次部位から生物の血流の広がりで生じる可能性がある。
【０１５６】
１つの態様では、本発明の抗体（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、生物学的サンプル中（例えば炭疽感染個体に由来する血液中）の感染防御抗原をレベルを検出するために使用することができ、このレベルを特定の病状と関連させることができる。これは当該技術分野で既知の通常の検出アッセイを使用して、例えば抗体と感染防御抗原との間に複合体を形成することができる条件下で、サンプルおよび対照サンプルを抗−ＰＡ抗体と接触させることにより行うことができる。抗体と感染防御抗原との間に形成されたいずれの複合体も検出し、そしてサンプルと対照間を比較する。
【０１５７】
別の態様では、本発明の抗体（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、最初にインビトロでの治療または診断的用途に関係する結合活性について試験することができる。例えば本発明の組成物は、以下の実施例に記載するＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーアッセイを使用して試験することができる。
【０１５８】
本発明の抗体（例えばヒト抗体、多重特異性および二重特異性分子および組成物）は、炭疽の治療および診断においてさらなる用途を有する。例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性または二重特異性分子は、インビボまたはインビトロで１もしくは複数の以下の生物学的活性を誘導するために使用することができる：（１）炭疽毒素の細胞への侵入またはトランスロケーションの防止；（２）感染防御抗原の、ＡＴＲを発現する細胞上のＡＴＲへの結合の防止；（３）ＰＡ８３からＰＡ６３への分解の阻害；（４）ＰＡ７量体の形成の防止；（５）毒素（浮腫因子または致死因子）の７量体への結合の遮断または減少；（６）毒素が細胞に生理学的な傷害を引き起こすことができないように、致死因子または浮腫因子の中和；および／または（７）毒素の致死効果に対して細胞のその他の保護。
【０１５９】
インビボおよびインビトロで、本発明の抗体組成物（例えばヒトモノクローナル抗体、多重特異性および二重特異性分子および免疫複合体）の適切な投与経路は当該技術分野では周知であり、そして当業者により選択され得る。例えば抗体組成物は上記のように注射（例えば静脈内または皮下）により投与することができる。使用する分子の適当な投薬用量は、個体の年齢および体重、ならびに抗体組成物の濃度および／または配合に依存する。（ｉ）処置（すなわち炭疽に感染し、そして臨床的兆候および／または症状を示している）、（ｉｉ）予防的処置（例えば好中球減少症のような炭疽の臨床的発現、炭疽に暴露されたと疑われる患者、または炭疽に感染したが臨床的兆候または症状を示さない患者の臨床的兆候および／または臨床的症状の防止）、あるいは（ｉｉｉ）予防（例えば炭疽による暴露もしくは感染前の疾患の予防、抗生物質に対してアレルギー性の個体、または炭疽が抗生物質耐性の場合、またはワクチン効力のために１８カ月以上の摂取する場合のワクチン療法と組み合わせて）が必要な患者に投与するための、炭疽感染に対する本発明の治療に有効な用量の抗体には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの投薬用量を含む。特定の態様では、当業者は０．３ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜１２ｍｇ／ｋｇ投与することができる。投薬用量は、炭疽による感染が存在していしなくても、炭疽疾患の兆候もしくは症状が存在してもしなくても、そして投与が予防のためであってもなくても、とりわけ患者の健康に依存する。当業者は本発明を抗体の投薬用量がこれらの因子により変更され得ると考えるだろう。
【０１６０】
したがって以下の投薬計画は、限定と解釈すべきではない。例えば患者が炭疽に感染していると診断され、そして炭疽感染の兆候を現しているならば、患者の生命を救うために実質的に高い用量、例えば少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇまたはさらに１００ｍｇ／ｋｇを投与することができる。あるいは感染したと考えられるが、兆候もしくは症状を現していない患者は、比較的低い投薬用量、例えば１２〜１５ｍｇ／ｋｇ未
満、またはさらに１〜３ｍｇ／ｋｇから利益を得ることができる。したがって炭疽ワクチンを受けている患者では、ワクチンから患者自身の抗体の適切な血漿レベルになる前に、炭疽感染に対して即時の防御を提供するために治療用抗体を提供することが望ましく、熟練者は例えば１２〜５０ｍｇ／ｋｇの即時投薬用量範囲を使用することができる。
【０１６１】
本発明のヒト抗−ＰＡ抗体は、１もしくは複数の治療薬または免疫刺激薬と併用投与され得る。抗体はその薬剤の前、後もしくは併用投与されることができ、あるいは炭疽ワクチン、ＬＦ、ＥＦ、ＰＡに対する抗体、および炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）抗生物質、例えばシプロフロキサシン、ドキシサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、テトラサイクリン、リファンピンおよびバンコマイシンを含む他の既知の治療薬と併用投与することができる。
【０１６２】
特定の態様では、本発明はサンプル中の感染防御抗原の存在を検出する方法、または感染防御抗原の量を測定する方法を提供し、この方法には抗体またはその部分と感染防御抗原との間に複合体が形成できる条件下で、サンプルおよび対照サンプルを、本発明のヒトモノクローナル抗体または感染防御抗原に特異的に結合するその抗原結合部分と接触させることを含んでなる。その後、複合体の形成を検出し、ここで対照サンプルに比べてサンプルの複合体形成間の差異が、サンプル中の感染防御抗原の存在の指標となる。
【０１６３】
また本発明の範囲内には、本発明の抗体組成物（例えばヒト抗体および免疫複合体）および使用説明書を含んでなるキットがある。このキットはさらに１もしくは複数の上記の追加の診断用、治療用または免疫刺激剤を含むことができる。
【０１６４】
本発明をさらに限定するとは解釈されない以下の実施例によりさらに具体的に説明する。
【０１６５】
また本発明は処置法に有用となる特性を有する新規抗体を同定するスクリーニング法も提供する。処置法に特に有用である抗体は、上記および以下の実施例での中和活性を有することに加えて、１もしくは複数の以下の特性を有する抗体を含む；中和活性のためにＦｃ受容体に結合する（例えば２．４Ｇ２のようなＦｃ受容体ブロッキング抗体の使用、または活性において少なくとも５倍、より好ましくは１０倍低下したＴＮＡにおけるＦａｂ’２もしくＳｃＦｖの使用により測定した時）；ＰＡ８３よりもＰＡ６３に高い親和性を現し（例えば１μｇ／ｍｌ抗体を使用して標準的ＥＬＩＳＡにより測定した時）、１μｇ／ｍｌでＰＡ８３には結合せず、標準的ＥＬＩＳＡに従いＯＤ４０５ｎｍが０．２以下であり、Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：７０７−７１５に記載されている競合結合アッセイに従い炭疽致死因子／浮腫因子を遮断せず、あるいはＰＡ６３への結合において、マウスＩＧ３、マウス２Ｄ５およびマウス１４Ｂ７から選択される抗−ＰＡ抗体とは競合しない（例えば標準的ＥＬＩＳＡ競合アッセイにより測定した時）。これらの多くまたはすべての特性を有する抗体は、インビボでの使用に望ましい。特に有用な抗体は、ＰＡ６３に対する結合において、マウス１４Ｂ７から選択される抗−ＰＡ抗体と競合せず（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：７０７−７１５を参照にされたい）、すなわちＡＴＲへのＰＡ結合を遮断する抗体であり、これはインビボ治療に望ましい。
【０１６６】
本発明の特定のスクリーニング法では、抗体は（１）最初に毒素中和アッセイで炭疽毒素を中和する１もしくは複数の抗体を選択し、そして（２）次いでＴＮＡで０．１μｇ／ｍｌ以下のＥＤ５０を有する抗体を選択する、ことに基づき選択される。この方法では、抗原−抗体結合親和性アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）はＴＮＡ工程の前には使用されない。これはスクリーニングの第１および主要方法として抗原−抗体結合親和性アッセイに依存する従来技術で通常使用される方法とは対照的である。そのような工程を含むことによ
り、他に優れた毒素中和活性を示すＨｕＭＡｂ  ５Ｅ８のような多くの抗体が、さらなる開発から除外される。本発明者は、ＰＡに対する結合親和性が有用な基準ではないことを見いだし、故に本発明の選択法から省略する。記載する特性を有する抗体を得るために、上記の２つの工程に加えてさらなる選択工程を実施することができる。
【実施例】
【０１６７】
実施例１：完全なヒト抗体を発現するトランスジェニック動物の作出
Ｉ．トランスジェニック（Ｃｍｕ標的）マウスの作出
ＣＭＤターゲッティングベクターの構築
プラスミドｐＩＣＥｍｕは、Ｂａｌｂ／Ｃゲノムラムダファージライブラリから得た、ｍｕ遺伝子全般に広がるマウスＩｇ重鎖座位のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩフラグメントを含有する（Ｍａｒｃｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２２：１８７，１９８０）。このゲノムフラグメントをプラスミドｐＩＣＥＭＩ９ＨのＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした（Ｍａｒｓｈ  ｅｔ  ａｌ；Ｇｅｎｅ  ３２，４８１−４８５，１９８４）。ｐＩＣＥｍｕに含まれる重鎖配列は、ｍｕイントロンエンハンサーの３’側にちょうど位置するＥｃｏＲＩ部位の下流から、ｍｕ遺伝子の最後の膜貫通エキソンの約１ｋｂ下流に位置するＸｈｏＩ部位まで及ぶが、ｍｕスイッチ反復領域のほとんどが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の継代によりすでに消えた。
【０１６８】
ターゲッティングベクターは、以下の通り構築した。１．３ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩフラグメントをｐＩＣＥｍｕから切り出し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。このｐＩＣＥｍｕフラグメントは、Ｃｍｕ１の５’側から約１ｋｂのところに位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＣｍｕ１内に位置するＳｍａＩ部位まで及ぶ。得られたプラスミドは、ＳｍａＩ／ＳｐｅＩで消化し、そしてＣｍｕ１  ３’側にあるＳｍａＩ部位から最後のＣｍｕエキソンのちょうど下流に位置するＸｂａＩ部位まで及ぶｐＩＣＥｍｕから得た約４ｋｂのＳｍａＩ／ＸｂａＩ断片を挿入した。得られたプラスミドｐＴＡＲ１をＳｍａＩ部位で直線化し、ｎｅｏ発現カセットを挿入した。このカセットは、マウスホスホグリセレートキナーゼ（ｐｇｋ）プロモーターの転写制御下にあるｎｅｏ遺伝子からなり（ＸｂａＩ／ＴａｑＩフラグメント；Ａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｇｅｎｅ  ６０：６５−７４）、そしてｐｇｋポリアデニル化部位を含む（ＰｖｕＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２８：２９９−３０８）。このカセットはプラスミドｐＫＪ１から得たもので（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６５：１１５３−１１６３に記載）、ここからｎｅｏカセットをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとして切り出し、そしてＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＧＥＭ−７Ｚｆ（＋）にサブクローニングしてｐＧＥＭ−７（ＫＪ１）を生成した。ｎｅｏカセットは、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化によりｐＧＥＭ−７（ＫＪ１）から切り出し、末端を平滑化し、そしてゲノムＣｍｕ配列とは反対側に位置するプラスミドｐＴＡＲ１のＳｍａＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドをＮｏｔＩで直線化し、そして単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）カセットを挿入して、Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８−３５２に記載されるように相同性組換え体を有するＥＳクローンを濃縮した。このカセットは、Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｃｅｌｌ  ６５：１１５３−１１６３に記載されているように、マウスｐｇｋプロモーターおよびポリアデニル化部位によって囲まれたｔｋ遺伝子のコード配列からなる。得られたＣＭＤ標的ベクターは、重鎖座位と相同な合計約５．３ｋｂを含み、そして突然変異ｍｕ遺伝子を生成するように設計されており、この遺伝子に、第１のＣｍｕエキソンの固有のＳｍａＩ部位にあるｎｅｏ発現カセットを挿入した。ターゲッティングベクターをＰｖｕＩで直線化し、これをプラスミド配列内で切断した後、ＥＳ細胞に電気穿孔した。
標的ＥＳ細胞の作製および分析
ＡＢ−１  ＥＳ  細胞（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ．Ｐ．ａｎｄ  Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．，（１９９０）  Ｃｅｌｌ  ６２：１０７３−１０８５）は、基本的に（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．（１９８７）  ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．）オックスフォード：ＩＲＬ出版、ｐ．７１−１１２）に記載の分裂不活性ＳＮＬ７６／７  支持細胞層（ｉｂｉｄ．）上で増殖させた。直線化したＣＤＭターゲッティングベクターをＨａｓｔｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｈａｓｔｙ，Ｐ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：２４３−２４６）が記載した方法によってＡＢ−１細胞に電気穿孔で挿入した。電気穿孔した細胞を、１００ｍｍの皿に１〜２ｘ１０６細胞／皿の濃度で播種した。２４時間後、Ｇ４１８（活性成分の２００μｇ／ｍｌ）およびＦＩＡＵ（５ｘ１０−７Ｍ）を培地に加え、そして８〜９日間かけて薬物耐性クローンを成長させた。クローンを収集し、トリプシン処理して２分割し、そしてさらに増殖させた。その後、各クローンに由来する細胞の半分を冷凍し、そしてもう半分をベクターと標的配列との間の相同組換えについて分析した。
【０１６９】
ＤＮＡ解析はサザンブロットハイブリダイゼーションにより行った。ＤＮＡはＬａｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｌａｉｒｄ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４２９３）が記載した通り、クローンから単離した。単離したゲノムＤＮＡをＳｐｅＩで消化し、そして９１５ｂｐのＳａｃＩフラグメント、プローブＡ（図１参照）でプローブしてｍｕイントロンエンハンサーとｍｕスイッチ領域との間の配列とハイブリダイズした。プローブＡは、野生種座位から得た９．９ｋｂのＳｐｅＩフラグメント、およびＣＭＤターゲッティングベクターと相同に組換わったｍｕ座位から得た診断用７．６  ｋｂバンドを検出する（ｎｅｏ発現カセットはＳｐｅＩ部位を含む）。サザンブロット分析でスクリーニングした１１３２  Ｇ４１８およびＦＩＡＵ耐性クローンのうち、３つがｍｕ座位での相同組換えを示唆する７．６ｋｂのＳｐｅＩバンドを示した。これら３つのクローンをさらにＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩおよびＥｃｏＲＩ酵素で消化して、ベクターがｍｕ遺伝子に相同性を導入したことを確認した。プローブＡでハイブリダイズした場合、ＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩおよびＥｃｏＲＩで切断した野生型ＤＮＡのサザンブロットは、それぞれ１５．７、７．３および１２．５  ｋｂのフラグメントを生成し、その一方で、標的ｍｕ対立遺伝子の存在は７．７、６．６、および１４．３  ｋｂの断片により示唆される。ＳｐｅＩ消化により検出された３つの陽性クローンはすべて、ｎｅｏカセットがＣｍｕ１エキソンに挿入されたことを示す、予想どおりのＢｇｌＩ、ＢｓｔＸＩおよびＥｃｏＲＩ制限フラグメントを示した。
突然変異したｍｕ遺伝子を有するマウスの作出
２６４、２７２および４０８番と命名した３つの標的ＥＳクローンを解凍し、そしてＢｒａｄｌｅｙ（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９８７）ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ）オックスフォード：ＩＲＬ出版、ｐ．１１３−１５１）に記載の通りＣ５７ＢＬ／６Ｊ胚盤胞に注入した。注入した胚盤胞を偽妊娠したメスの子宮に移し、挿入したＥＳ細胞に由来する細胞および宿主胚盤胞の混合物を提示するキメラマウスを作出した。ＥＳ細胞のキメラへの寄与の程度は、黒色Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ背景に対するＥＳ細胞株由来のアグーチコート呈色の量によって視覚的に見積もることができる。クローン２７２および４０８はキメラの発生率が低かった（すなわちアグーチ色素沈着の割合が低かった）が、クローン２６４のオスキメラの発生率は高かった。これらのキメラをＣ５７ＢＬ／６Ｊメスと交配し、そしてＥＳ細胞ゲノムの生殖系列の伝達を示すアグーチの仔を作出した。標的ｍｕ遺伝子のスクリーニングは、尾部の生検で採取したＢｇｌＩ消化ＤＮＡのサザンブロット分析によって行った（ＥＳ細胞ＤＮＡの分析について上記の通り）。約５０％のアグーチ仔が、ハイブリダイズしている７．７ｋｂのＢｇｌＩバンドとともに１５．７ｋｂの野生型バンドを示し、標的ｍｕ遺伝子の生殖系列伝達を示した。
ｍｕ遺伝子の機能的不活化のためのトランスジェニックマウスの分析
Ｃｕｍ１へのｎｅｏカセットの挿入がＩｇ重鎖遺伝子を不活化したかどうかを調べるために、クローン２６４キメラを、ＪＨ遺伝子セグメントの欠失を生じる重鎖の発現が不活化されるＪＨＤ突然変異についてホモ接合性のマウスと交配させた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：６４７−６５６）。４匹のアグーチ仔が生まれた。１ヶ月齢のこれらの動物から血清を採取し、そしてＥＬＩＳＡでマウスＩｇＭの存在についてアッセイした。４匹の仔のうち２匹はＩｇＭが完全に欠損していた（表１を参照されたい）。尾部生検で採取したＤＮＡを、ＢｇｌＩで消化し、そしてプローブＡとハイブリダイゼーションしたもの（図１の参照されたい）、およびＳｔｕＩで消化し、そして４７５ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩフラグメント（同上）でハイブリダイゼーションしたものを、サザンブロットで分析して４匹の仔マウスの遺伝子型を特定したところ、血清ＩｇＭを発現できない動物は、重鎖座位の１つの対立遺伝子がＪＨＤ突然変異を有し、もう１つの対立遺伝子がＣｍｕ１突然変異を有する動物であることが証明された。ＪＨＤ突然変異についてヘテロ接合のマウスは、野生型の血清Ｉｇレベルを示す。これらのデータは、Ｃｍｕ１突然変異がｍｕ遺伝子の発現を不活化することを示す。
【０１７０】
【表１】
2007525191.tif 000002
【０１７１】
表１は、ＣＭＤ及びＪＨＤ突然変異を両方とも有するマウス（ＣＭＤ／ＪＨＤ）、ＪＨＤ突然変異についてヘテロ接合のマウス（＋／ＪＨＤ）、野生型（１２９Ｓｖ  ｘ  Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）Ｆ１マウス（＋／＋）、およびＪＨＤ突然変異についてホモ接合のＢ細胞欠失マウスについて、ＥＬＩＳＡにより検出された血清ＩｇＭレベルを示す。
ＩＩ．  ＨＣＯ１２トランスジェニックマウスの作出
ＨＣＯ１２ヒト重導入遺伝子は、ｐＨＣ２の８０ｋｂ挿入物（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５７９−５９１）、およびｐＶｘ６の２５ｋｂ挿入物を同時に注入して生成した。プラスミドｐＶｘ６は以下のように構築した。
【０１７２】
生殖系列ヒトＶＨ１−１８（ＤＰ−１４）遺伝子とともに約２．５ｋｂの５’フランキング、および５ｋｂの３’フランキングゲノム配列を含んでなる８．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ  ＤＮＡフラグメントを、プラスミドベクターｐＳＰ７２（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、マジソン、ウイスコンシン州）にサブクローニングし、プラスミドｐ３４３．７．１６を生成した。生殖系列ヒトＶＨ５−５１（ＤＰ−７３）遺伝子とともに約５ｋｂの５’フランキング、および１ｋｂの３’フランキングゲノム配列を含んでなる７ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＤＮＡフラグメントを、ｐＢＲ３２２を基礎にしたプラスミドクローニングベクターｐＧＰ１ｆ（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５）にクローニングして、ｐ２５１ｆを生成した。ｐＧＰ１ｆ、ｐＧＰ１ｋに由来する新規のクローニングベクタ
ーをＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩで消化し、そして生殖系列ヒトＶＨ３−２３（ＤＰ４７）遺伝子とともに約４ｋｂの５’フランキングおよび１ｋｂの３’フランキングゲノム配列を含んでなる１０ｋｂのＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩ  ＤＮＡフラグメントにライゲートした。得られたプラスミドｐ１１２．２ＲＲ．７をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、そしてｐ２５１ｆの７ｋｂの精製ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ挿入物フラグメントにライゲートした。得られたプラスミドｐＶｘ４をＸｈｏＩで消化し、そしてｐ３４３．７．１６の８．５ｋｂのＸｈｏＩ／ＳａｌＩ挿入物とライゲートした。
【０１７３】
ＶＨ１−１８遺伝子をそのほかの２つのＶ遺伝子と同一方向にしたクローンを得た。ｐＶｘ６と命名したこのクローンをＮｏｔＩで消化し、そしてＨｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂ．Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，マウス胚の操作（Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ）、ア  ラボラトリーマニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）、第２版、１９９４，コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、プレインビュー、ニューヨーーク）に記載されている通り、精製した２６ｋｂ挿入物をモル比１：１のｐＨＣ２の精製した８０ｋｂのＮｏｔＩ挿入物とともに１日半のＦ２胚の前核  （Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  ｘ  ＤＢＡ／２Ｊ）に同時に注入した。Ｖｘ６およびＨＣ２の両方から得た配列を含んでなるトランスジェニックマウスの３つの独立した株を、注入した胚から成長させたマウスから確立した。これらの株は（ＨＣＯ１２）１４８８１、（ＨＣＯ１２）１５０８３、および（ＨＣＯ１２）１５０８７と命名する。この３つの各株を、実施例１に記載のＣＭＤ突然変異、ＪＫＤ突然変異（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：８１１−８２０）、および（ＫＣｏ５）９２７２導入遺伝子（Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１）を含んでなるマウスと交配させた。得られたマウスは、内因性マウス重鎖およびカッパ軽鎖座位の破壊についてホモ接合のバックグラウンドを持つヒト免疫グロブリン重鎖およびカッパ軽鎖導入遺伝子を発現する。
実施例２：炭疽の感染防御抗原に対する完全なヒト抗体の生産
炭疽の感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体は、上記のように作出したトランスジェニックマウスで以下に記載のように生産された。
ヒト抗−ＰＡモノクローナル抗体の生成
４つの異なる遺伝的改変体を有するトランスジェニックＨｕＭＡｂ  Ｍｏｕｓｅ（商標）、ＨＣ２／ＫＣｏ７株を免疫感作に使用した。これらのトランスジェニックマウスは未編成ヒト重鎖（μおよびγ）およびκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小座を、内因性μおよびκ鎖座を不活性にする標的突然変異と一緒に含む。したがってマウスはマウスＩｇＭまたはκを発現せず、そして免疫感作に応答して、導入されたヒト重鎖および軽鎖導入遺伝子はクラススイッチングおよび体性突然変異を受けて高親和性のヒトＩｇＧκモノクローナル抗体を生じる。
【０１７４】
マウスをフィルターケージに収容し、そして免疫感作、採血および融合の日に良好な健康状態であることを評価した。１５０μＬのＰＢＳ中の１５マイクログラムの組換え完全長炭疽ＰＡ８３を、完全フロインドアジュバント（シグマＦ５８８１）またはＭＰＬ＋ＴＤＭ（ＲＩＢＩ）アジュバント（シグマＭ６５３６）１：１と、乳化針を使用して混合した。マウスに０．３ｃｃの調製抗原を注射し、そして続いて１４日の間隔で２〜４回、完全長ＰＡ８３不完全フロインド（シグマＦ５５０６）またはＲＩＢＩ（シグマＭ６５３６）を追加免疫感作したが、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８はＰＡ６３を用いて追加免疫感作することにより調製した。マウスでの抗体応答は、ＰＡを使用してＥＬＩＳＡにより監視した。感染防御抗原に対する抗−ＰＡ力価を生じた動物は、融合前７２時間に、組換え感染防御抗原のｉ．ｖ．注射を与えた。個々のマウスに由来する力価は１：２００と１：１００，０００の間で変動した。マウス脾細胞を回収し、精製し、そして融合させた。
【０１７５】
免疫感作した動物に由来する脾細胞リンパ球の単一細胞懸濁液を、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（アメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックヴィル  メリーランド州；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０、ロットＦ−１５１８３）と、ポリエチレングリコールの存在下で融合させた。元のＡＴＣＣバイアルを解凍し、そして培養で増殖させた。凍結バイアルのシードストックをこの増殖物から調製した。細胞は培養で３〜６カ月間維持し、１週間に２回継代した。Ｐ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−６３  ＦＬ）を２００ｍＬに増殖させ、そして消耗させた。上清を遠心し、そして濾過し、そしてコンディション培地として知られている培地添加物（ｍｅｄｉａ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）として使用した。この細胞株を３〜６カ月間継代し、そして新たなバイアルを解凍した。
【０１７６】
５％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレパチエントマイシン（Ｓｔｒｅｐａｔｉｅｎｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ＃３００４０３０）を含有する高グルコースＤＭＥＭ（メディアテック（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１００１３２４５）を使用して、ミエローマおよびＰ３８８Ｄ１細胞を培養した。５％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレパチエントマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ＃３００４０３０）を含有する高グルコースＤＭＥＭ（メディアテック、Ｃｅｌｌｇｒｏ＃１００１３２４５）を使用して、ミエローマおよびＰ３８８Ｄ１細胞を培養した。追加の培地補給物をハリブリドーマ成長培地に加え、これには３％オリジン−ハイブリドーマクローニング因子（Ｏｒｉｇｅｎ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）（イゲン（Ｉｇｅｎ）、３６３３５）、１０％  Ｐ３８８Ｄ１コンディション培地（８／１０／９９ＤＨ）、１０％ＦＢＳ（ハイクローン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＳＨ３００７１ロット＃ＡＧＨ６８４３）、Ｌ−グルタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）＃１０１６４８３）、０．１％ゲンタマイシン（ギブコ＃１０２００７０）、２−メルカプトエタノール（ギブコ＃１０１９０９１）ＨＡＴ（シグマ、Ｈ０２６２）１．０×１０４Ｍ  ヒポキサンチン、４．０×１０−７Ｍアミノパチエンテリン（Ａｍｉｎｏｐａｔｉｅｎｔｅｒｉｎ）、１．６×１０−５Ｍチミジン）。
【０１７７】
ハイブリドーマは融合から２４時間後、ＨＡＴの添加により選択した。ハイブリドーマは最初にヒトＩｇＧ生産体についてサンドイッチＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。簡単に説明すると、ハイブリドーマ上清をヤギ抗−ヒトカッパ（サザンバイオテック（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ブリミンハム、アリゾナ州）で捕捉し、次いでアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（ガンマ鎖特異的）（ジャクソン  イムノリサーチラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ウエスト  グローブ、ペンシルベニア州）と反応させた。
【０１７８】
次いでハイブリドーマが生産する特異的ヒトＩｇＧを生産するハイブリドーマは、インビトロ毒素中和アッセイを使用してスクリーニングした（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：５１７１−５１７５；実施例３を参照にされたい）。最初にｍＡｂは、完全長ＰＡ８３を使用してＥＬＩＳＡにより炭疽の防御抗原に対する結合について試験した。しかし良好な毒素中和活性（ＴＮＡ）を示した数個のｍＡｂは、ＥＬＩＳＡによる結合が悪かった。これら抗体のほとんどが分解したＰＡ６３とよく反応した。この知見の結果、ＴＮＡを最初のスクリーニングとして使用し、続いてＥＬＩＳＡを使用した特性決定を行った。このプロトコールは少なくとも４種の目的抗体、例えば５Ｅ８、２Ｄ５、２Ｈ４および５Ｄ５の単離を導いた。選択した抗−ＰＡ  ＨｕＭａｂのＶＨおよびＶＬ領域はハイブリドーマに由来するＲＮＡから単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、そしてＶ領域をＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物を実施例４に示すようにシークエンシングした。
【０１７９】
次いでＨｕＭａｂは以下の手順を使用してプロテインＡカラムクロマトグラフィーにより精製した：（１）添加条件：上清はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラムに乗せた；（２）洗浄：ＰＢＳバッファー；（３）溶出：１５
０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．９。溶出液を１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー（各２ｍｌの画分に３０ｕｌ）で中和した。各溶出画分はプールする前にゲルに流した。クマーシーブルー染色による純度を確認したら、画分をプールし、そして１５０ｍＭ  ＮａＣｌ２を含有する１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．３に対して透析した。
実施例３Ａ：抗−ＰＡヒトモノクローナル抗体による致死毒素のインビトロ中和
ＴＮＡ実験はＬｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０、同上に従い行った。簡単に説明すると、毒素感受性のマウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ．１は、抗−ＰＡｍＡｂが濃度を変えて存在するか、またはしないＰＡおよびＬＦ（１０：１）の混合物に暴露した。３時間のインキュベーション後、幾らかのマクロファージを生存能色素（ＭＴＴ）を使用して測定した。結果（図１０）は、ヒト抗−ＰＡ抗体がインビトロで致死毒素を中和する活性を示す。以下の表２は、ＴＮＡにおいてマクロファージの５０％生存能（ＥＤ５０）を維持するために必要な抗体の有効用量を示す。
【０１８０】
【表２】
2007525191.tif 000003
【０１８１】
炭疽の感染防御抗原への直接結合について試験するために、ＥＬＩＳＡプレートをＰＡ８３またはＰＡ６３でコートした。ｍＡｂサンプルを適切な希釈で加え、そして結合した抗体を抗−ヒトＩｇＧアルカリホスファターゼ結合プローブで検出した。プレートはｐ−ＮＰＰ基質で発色させ、そしてＯＤ４０５をＳｏｆｔｍａｘプレートリーダーで測定した。結合速度定数は、プラスモン共鳴技術を使用してＢＩＡｃｏｒｅ装置で決定した。
【０１８２】
予備的結合データでは、ＨｕＭａｂに関する解離定数がナノモル範囲であることが明らかとなった。結合活性の結果は（図１１）、ｒＰＡ−８３に対して生成したヒト抗体が、感染防御抗原の完全長（８３ｋＤ）および分解（６３ｋＤ）形の両方に結合することが示された。ＨｕＭａｂである５Ｄ５、２Ｈ４および５Ｅ８は、ＰＡ８３よりもＰＡ６３に対してより大きな反応性を現し、恐らくこれは抗原の分解後に結合エピトープがより露出するからであろう。
【０１８３】
炭疽毒素の抗体中和に必要な活性を測定するために、さらなる毒素中和アッセイを記載のようにＨｕＭａｂ  ５Ｅ８およびマウス１４Ｂ７を使用して行ったが、抗体は毒素の添加前（−３０分）、毒素の添加時と同時（０分）、毒素の添加から１５分後（＋１５分）、または毒素の添加から３０分後（＋３０分）のいずれかに加えた（図１２を参照されたい）。
【０１８４】
データは、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８が細胞が毒素に暴露された後、細胞を炭疽毒素から保護することを示す。ＰＡ８３が受容体に結合することを防ぐマウス抗体とは対照的に（マウスｍＡｂ  １４Ｂ７を１０×高用量で使用した）、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８はＰＡ８３およびＬＦの添加後１５分に加えて時でも炭疽毒素から細胞死を防ぎ続けた。これらのデータは細胞に結合したＰＡ６３に優先的に結合するＨｕＭａｂ  ５Ｅ８が、暴露後でも炭疽毒素による死から細胞の救済に効果的となり得ることを示す。したがって、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８およびこれと類似の特性を有する抗体は、受容体結合を遮断する抗体よりも大きな治療的活性を有すると期待される。
実施例３Ｂ：Ｈｕｍａｂ５Ｅ８によるインビトロ中和には、Ｆｃ受容体結合が必要である
毒素中和アッセイを前記のように行ったが、５Ｅ８抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび完全な５Ｅ８ｍＡｂを、Ｆｃ受容体および抗体のＦｃ相互作用を特異的に遮断する抗−マウスＦｃＲＩＩ／ＩＩＩモノクローナル抗体２．４Ｇ２の不存在または存在下で使用した（ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ファミンゲン、サンディエゴ、カリフォルニア州）。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはｍＡｂ  ５Ｅ８のペプシン消化、続いてプロテインＡおよびプロテインＬカラムクロマトグラフィーを使用したＦ（ａｂ’）２の精製により調製した。
【０１８５】
結果はＨｕＭａｂ  ５Ｅ８が活性にＦｃ受容体の結合を要することを示す（図１３を参照にされたい）。ＰＡ６３への完全な結合活を保持するが、Ｆｃ受容体と結合する能力が無い性ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８のＦ（ａｂ’）２フラグメントは、マクロファージ様細胞の死を防ぐことができない。さらにＦｃ受容体および抗体のＦｃ相互作用を特異的に遮断する２．４Ｇ２抗体は、ｈｕＭａｂ  ５Ｅ８の抗毒素活性を大きく減少させた。
実施例４：抗体のシークエンシング
４種のＨｕＭａｂのＶＨおよびＶＬ領域をハイブリドーマＲＮＡから単離し、ｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲにより増幅し、そしてシークエンシングした。これらＨｕＭａｂのＶＨおよびＶＬ領域の核酸およびアミノ酸配列は以下に、そして図１−９に提供する。５Ｅ８ハイブリドーマは２つの軽鎖（ＶＬ ｍａｊｏｒまたはＶＬ ｍｉｎｏｒ）の１つと対合する重鎖を有する抗体を生産することに注目されたい。両抗体（すなわち５Ｅ８ＶＨ／ＶＬ ｍａｊｏｒおよび５Ｅ８’ＶＨ／ＶＬ ｍｉｎｏｒ）は、炭疽ＰＸに結合し、そしてＴＮＡに従い炭疽毒素を中和することができる。
【０１８６】
これら抗体の重鎖を生産するヒト生殖細胞系配列は、図１−９に記するようにＶＨ３−３３およびＶＨ３−７を含むが、軽鎖を生産するヒト生殖細胞系配列はＡ２７、Ｌ１８およびＬ１５を含む。これらの生殖細胞系配列は当該技術分野では周知であり、そして免疫学の参考書および容易にアクセスできる無料のインターネットウェッブサイトに見いだすことができ、例えばＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、アメリカ保健社会福祉省、ＮＩＨ、ＮＩＨ出版第９１−３２４２（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕおよびｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ）およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ−ｏｋ．ｐｈｐ？ｍｅｎｕ＝９０１で更新可能）を参照にされたい。
５Ｅ８  ＶＨ核酸配列
【０１８７】
【表３】
2007525191.tif 000004
【０１８８】
５Ｅ８  ＶＨアミノ酸配列
【０１８９】
【表４】
2007525191.tif 000005
【０１９０】
５Ｅ８  ＶＬ（ｍａｊｏｒ）核酸配列
【０１９１】
【表５】
2007525191.tif 000006
【０１９２】
５Ｅ８  ＶＬ（ｍａｊｏｒ）アミノ酸配列
【０１９３】
【表６】
2007525191.tif 000007
【０１９４】
５Ｅ８’ＶＬ（ｍｉｎｏｒ）核酸配列
【０１９５】
【表７】
2007525191.tif 000008
【０１９６】
５Ｅ８’ＶＬ（ｍｉｎｏｒ）アミノ酸配列
【０１９７】
【表８】
2007525191.tif 000009
【０１９８】
２Ｄ５  ＶＨ核酸配列
【０１９９】
【表９】
2007525191.tif 000010
【０２００】
２Ｄ５  ＶＨアミノ酸配列
【０２０１】
【表１０】
2007525191.tif 000011
【０２０２】
２Ｄ５  ＶＬ核酸配列
【０２０３】
【表１１】
2007525191.tif 000012
【０２０４】
２Ｄ５  ＶＬアミノ酸配列
【０２０５】
【表１２】
2007525191.tif 000013
【０２０６】
２Ｈ４  ＶＨ核酸配列
【０２０７】
【表１３】
2007525191.tif 000014
【０２０８】
２Ｈ４  ＶＨアミノ酸配列
【０２０９】
【表１４】
2007525191.tif 000015
【０２１０】
２Ｈ４  ＶＬ核酸配列
【０２１１】
【表１５】
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【０２１２】
２Ｈ４  ＶＬアミノ酸配列
【０２１３】
【表１６】
2007525191.tif 000017
【０２１４】
５Ｄ５  ＶＨ核酸配列
【０２１５】
【表１７】
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【０２１６】
５Ｄ５  ＶＨアミノ酸配列
【０２１７】
【表１８】
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【０２１８】
５Ｄ５  ＶＬ核酸配列
【０２１９】
【表１９】
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【０２２０】
５Ｄ５  ＶＬアミノ酸配列
【０２２１】
【表２０】
2007525191.tif 000021
【０２２２】
実施例５Ａ：炭疽の感染防御抗原に関するＨｕＭａｂ  ５Ｅ８結合特性を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
標準的ＥＬＩＳＡアッセイは、感染防御抗原へのヒトモノクローナル抗体の結合特性決定の章に記載した通りに行った。プレートをＰＡ８３またはＰＡ６３のいずれかでコートし、そして結合した抗体をアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（ジャクソンイムノリサーチ  ラボラトリーズ、ウエスト  グローブ、ペンシルベニア州）を使用して検出した。ＥＬＩＳＡの結合曲線は、完全長ＰＡ８３およびＰＡの活性フラグメント（すなわちＰＡ６３）に対してＨｕＭａｂ  ５Ｅ８について作成した。
【０２２３】
結果は、ＥＬＩＳＡアッセイでＨｕＭａｂ  ５Ｅ８がＰＡ６３には結合するが、ＰＡ８３への測定できる結合が示されなかったことを示す（図１４を参照にされたい）。したがってＰＡ８３へのＥＬＩＳＡ結合が主要なスクリーニングとして使用されれば、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８はさらなる展開に選択しなかった。この抗体−抗原結合親和性アッセイ法はこれまで感染防御抗原に対する抗体をスクリーニングするために使用されてきた（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、５６：１８０７−１８１３）。
実施例５Ｂ：炭疽の感染防御抗原に関するＨｕＭａｂ  ５Ｅ８結合特性を測定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
標準的ＥＬＩＳＡアッセイは、感染防御抗原へのヒトモノクローナル抗体の結合特性決定の章に記載した通りに行った。ヒト抗体５Ｅ８は、マウスの各抗体１４Ｂ７、２Ｄ５および１Ｇ３（Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４２：７０７−７１５）と一緒に、ＰＡ６３をコートしたプレートでインキュベーションした。マウス抗体のＰＡへの結合は、ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）アルカリホスファターゼ結合体（ジャクソンイムノリサーチ  ラボラトリーズ、ウエスト  グローブ、ペンシルベニア州）を使用して検出する。
【０２２４】
結果はいずれのマウスＭＡｂも、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８のＰＡ６３への結合の結果としてＰＡ６３への結合を遮断されなかったことを示す（図１５を参照にされたい）。これはこれらのマウス抗体のいずれもＰＡ６３への結合に関して５Ｅ８と直接競合しないことを示し、５Ｅ８抗体がＰＡ６３上の異なるエピトープに結合することを示唆している。
実施例６：ウサギへの静脈内および皮下投与後のヒトＩｇＧの薬物動態学
この実施例では、ウサギを対象としたヒトモノクローナル抗体の静脈内および皮下注射後にヒトＩｇＧの薬物動態を評価する。データはウサギを対象とした致死的肺炭疽モデルにおいて、炭疽の感染防御抗原に対するヒトモノクローナル抗体の効力を評価するための実験について、投与計画の選択を支持するために作成した。
【０２２５】
ヒトＩｇＧは静脈内（２匹のウサギ）または皮下（４匹のウサギ）のいずれかに投与して、ウサギにおけるヒトモノクローナル抗体の薬物動を測定した。１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量を２匹のウサギに投与し、そして１０ｍｇ／ｋｇの皮下用量は４匹のウサギに投与した。Ｃｍａｘ（最大濃度）は静脈内および皮下投与後にそれぞれ３８９μｇ／ｍＬおよび１５５μｇ／ｍＬであった。静脈内注射後のＴｍａｘ（最大濃度までの時間）は２時間であった。皮下投与後のＴｍａｘは４８時間であった。１００μｇ／ｍＬより高い血清濃度は、静脈内および皮下投与後の両方で４日後に観察され、そして２０μｇ／ｍＬより高いレベルが１４日後に観察された。十分な血清レベルが皮下および静脈内投与後の両方で
達成され、そしていずれの投与経路も効力実験に適切である。そのような十分な血清レベルを長期間維持するために、抗体の負荷用量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｄｏｓｅ）を最初に投与し、続いて低い第２用量の抗体を初期投与からおよそ４日後に投与することができる。しかし治療的モデルで皮下注射を行う場合、最大濃度までの延びた時間を考慮すべきである。実施例７Ａ：ウサギの吸入モデルにおける炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）（エームズ（ａｍｅｓ）株）の致死的エーロゾル攻撃に対するヒトモノクローナル抗体の効力および治療的処置
この実験は本発明の抗−ＰＡ抗体の効力を、ウサギの致死的肺炭疽モデルで示す。抗体５Ｄ５または５Ｅ８で処置した３０匹のウサギのうち２６匹が、炭疽に暴露してから１４日後に生存していた。すなわち本発明の抗体は、炭疽への暴露に関して効果的な新規処置を提供する。
【０２２６】
４群のニュージーランドホワイトラビットは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）でエーロゾル攻撃した直後、および９６時間後に２つのモノクローナル抗−ＰＡ抗体（ＰＡｍＡｂ  ５Ｅ８または５Ｄ５）の１つを投与した。エーロゾル化した胞子は、約１００倍のＬＤ５０の用量で、吸入によってのみ鼻口部を介して送達された。動物は暴露後１４日間、死亡率について観察された。炭疽感染に対する抗体による防御は、死亡に対して延びた時間と、または攻撃から２週間後の生存と定めた。以下の表３は実験群のウサギの数、暴露から１時間後に投与した抗体の投薬用量レベル、暴露から９６時間後の投薬用量レベルおよびこの実験を生き抜いたウサギの数を含むヒトモノクローナル抗体の効力の評価を提供する。
【０２２７】
【表２１】
2007525191.tif 000022
【０２２８】
図１６に示すこの実験結果は、ウサギを対象とした本発明の完全なヒト抗体の効力を証明する。対称群の動物は炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）への暴露から５日以内に死亡した。延びた生存時間（１４日）は、ｍＡｂ  ５Ｅ８で処置した動物の８５％で見られた。６ｍｇ／ｋｇの５Ｅ８を受けた１匹のウサギが１４日に死亡し、１２ｍｇ／ｋｇの５Ｅ８を受けた１匹のウサギが１３日に死亡し、そして１２ｍｇ／ｋｇを受けた１匹のウサギが１４日に死亡した。３ｍｇ／ｋｇの５Ｄ５で処置した１匹のウサギは暴露から５日以内に死亡した。ウサギに由来する血清サンプルの薬物動態学的分析は、抗体の血漿レベルが投与から最初の２４時間中に７０μｇ／ｍＬよりも高いことを示す。６ｍｇ／ｋｇで処置した群の血漿レベルは、３ｍｇ／ｋｇの追加投与前に５０から１１７μｇ／ｍＬの間に下降し、そして実験の終わりには３０μｇ／ｍＬ未満であった。これは５０μｇ／ｍＬより高い抗−ＰＡ抗体の血漿レベルが、このモデルにおいてウサギを防御するために十分であることを示す。この実験では投与された最低用量が効力的であったので、より低い血漿濃度でも効果があるかもしれない。
実施例７Ｂ：ウサギの吸入モデルにおける炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）（エームズ（ａｍｅｓ）株）の致死的エーロゾル攻撃に対するヒトモノクローナル抗体（５Ｅ８）の効力
この実験は、より低用量レベルの本発明の抗−ＰＡ抗体の効力を、ウサギの致死的肺炭疽モデルで示す。抗体５Ｅ８で処置した２０匹のウサギのうち１７匹が、炭疽に暴露して
から１４日後に生存していた。すなわち本発明の抗体は、炭疽の暴露に関して効果的な処置を提供する。
【０２２９】
２群のニュージーランドホワイトラビットは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）でエーロゾル攻撃した直後、および９６時間後にモノクローナル抗−ＰＡ抗体（ＰＡ  ｍＡｂ  ５Ｅ８）を投与した。エーロゾル化した胞子は、約１００倍のＬＤ５０の用量で、吸入によってのみ鼻口部を介して送達された。動物は暴露後１４日間、死亡率について観察された。炭疽感染に対する抗体による防御は、死亡に対して延びた時間と、または攻撃から２週間後の生存と定めた。以下の表４は実験群のウサギの数、暴露から１時間後に投与した抗体の投薬用量レベル、暴露から９６時間後の投薬用量レベルおよびこの実験を生き抜いたウサギの数を含むヒトモノクローナル抗体の効力の評価を提供する。
【０２３０】
【表２２】
2007525191.tif 000023
【０２３１】
図１７に示すこの実験結果は、ウサギを対象とした本発明の完全なヒト抗体の効力を証明する。対称群の動物は炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）への暴露から５日以内に死亡した。延びた生存時間（１４日）は、ｍＡｂ  ５Ｅ８で処置した動物の８５％で見られた。１ｍｇ／ｋｇの５Ｅ８を受けた１匹のウサギが、暴露から８日以内に死亡した。３ｍｇ／ｋｇで処置した１匹のウサギが５日に死亡し、そして１匹は６日に死亡した。この実験での上昇した生存率は、わずか１ｍｇ／ｋｇの用量レベルがこの動物モデルで死亡数を防止するのに効力的であることを示した。
実施例７Ｃ：ウサギの吸入モデルにおける炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）（エームズ（ａｍｅｓ）株）の致死的エーロゾル攻撃に対するヒトモノクローナル抗体（５Ｅ８）の治療的処置
この実施例は、暴露の臨床的兆候がウサギの致死的肺炭疽モデルで始まった後、死亡数の防止における本発明の抗−ＰＡ抗体の効力を証明する。炭疽に暴露してから２４時間後に抗体５Ｅ８で処置した１０匹のウサギのうち９匹が、１４日間生存した。暴露から４８時間後に抗体５Ｅ８で処置した５匹のウサギのうち３匹が、１４日間生存した。これらの動物は処置前に感染のかなりの兆候があった。すなわち本発明を抗体は、炭疽に対する暴露に関し効果的な処置を提供する。
【０２３２】
１０匹のニュージーランドホワイトラビットは、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）でエーロゾル攻撃してから２４時間後にモノクローナル抗−ＰＡ抗体（ＰＡｍＡｂ  ５Ｅ８）を投与され、そして１０匹のウサギはエーロゾル攻撃から４８時間後にモノクローナル抗−ＰＡ抗体（ＰＡ  ｍＡｂ  ５Ｅ８）を投与された。エーロゾル化した胞子は、約１００倍のＬＤ５０の用量で、吸入によってのみ鼻口部を介して送達された。動物は暴露後１４日間、死亡率について観察された。炭疽感染に対する抗体による防御は、死亡に対して延びた時間と、または攻撃から２週間後の生存と定めた。以下の表５は実験群のウサギの数、抗体の投薬用量レベル、炭疽攻撃に関して投与した時期、およびこの実験を生き抜いたウサギの数を含むヒトモノクローナル抗体の効力の評価を提供する。
【０２３３】
【表２３】
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【０２３４】
この実験結果は、ウサギを対象として炭疽の兆候を発症した後に本発明の完全なヒト抗体の効力を証明する（図１８を参照にされたい）。好中球の循環レベルにおける低下（好中球の絶対数および相対的割合）は、炭疽への暴露から２４時間後の対照動物の大部分で観察された。これらのパラメーターは、炭疽への暴露から２４時間後に５Ｅ８で処置した動物においてもこの時点で評価し、そしてすべての動物で減少した。炭疽への暴露から４８時間後にモノクローナル抗体で処置した５匹の動物の中で、４匹の動物の食欲が低下し、そして他の動物は処置前の活動が低下した。この実験では、対照群の動物が炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｅａｃｉｓ）への暴露から５日以内に死亡し、２４時間で処置した９匹の動物の８匹が生存し、そして４８時間で処置した症状を示す５匹の動物のうち３匹が生存した。合わせると、このデータはモノクローナル抗体が疾患の臨床的過程が始まった後の動物の処置に効果的である証拠と提供する。
等価物
当業者は、日常的な実験を行うだけで本明細書に記載した本発明の特定の態様の多くの等価物を認識し、あるいは確認できるであろう。そのような等価物は特許請求の範囲の包含することを意図する。
【０２３５】
参考文献の編入
本明細書で引用するすべての特許、係属特許出願および他の公報は、全部、引用により本明細書に編入する。
【図面の簡単な説明】
【０２３６】
【図１】ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８のＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１）および対応するアミノ酸配列（配列番号２）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図２】ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８（ｍａｊｏｒ）のＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号３）および対応するアミノ酸配列（配列番号４）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図３】ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８（ｍｉｎｏｒ）のＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号５）および対応するアミノ酸配列（配列番号６）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図４】ＨｕＭａｂ  ２Ｄ５のＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号９）および対応するアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図５】ＨｕＭａｂ  ２Ｄ５のＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１１）および対応するアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図６】ＨｕＭａｂ  ２Ｈ４のＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１３）および対応するアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図７】ＨｕＭａｂ  ２Ｈ４のＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１５）および対応するアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図８】ＨｕＭａｂ  ５Ｄ５−２Ｅ１０のＶＨ領域のヌクレオチド配列（配列番号１７）および対応するアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図９】ＨｕＭａｂ  ５Ｄ５−２Ｅ１０のＶＬ領域のヌクレオチド配列（配列番号１９）および対応するアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。ＣＤＲ領域も示す。
【図１０】４種のヒト抗−ＰＡ抗体による炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｅａｃｉｓ）致死毒素の中和を示すグラフである。
【図１１】完全長の感染防御抗原（８３ｋＤ；白色棒）および分解した感染防御抗原（６３ｋＤ；あや目付き棒）に対するＥＬＩＳＡによる抗−ＰＡ抗体結合を示すグラフである。
【図１２】ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８およびマウスｍＡｂ  １４Ｂ７による炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｅａｃｉｓ）致死毒素の中和の動力学的分析を示すグラフである。
【図１３】抗−マウスＦｃＲＩＩ／ＩＩＩモノクローナル抗体２．４Ｇ２の不存在または存在下、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント、および完全な５Ｅ８ｍＡｂを使用した炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｅａｃｉｓ）致死毒素の中和の比較を示すグラフである。
【図１４】標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用したＨｕＭａｂ  ５Ｅ８のＰＡ６３およびＰＡ８３への結合の比較を示すグラフである。
【図１５】ＰＡ６３標準的ＥＬＩＳＡを使用して、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８と３種のマウスｍＡｂとの間の競合的結合アッセイを示すグラフである。
【図１６】ウサギの吸入モデルを対象として、ＨｕＭａｂ  ５Ｅ８および５Ｄ５の効力を示すグラフである。
【図１７】ウサギの吸入モデルを対象として、低用量のＨｕＭａｂ  ５Ｅ８の効力を示すグラフである。
【図１８】ウサギの吸入モデルを対象として、暴露後に投与したＨｕＭａｂ  ５Ｅ８の効力を示すグラフである。（Ａ）動物は暴露から２４時間および５日後に処置した。（Ｂ）動物は暴露から４８時間および６日後に処置した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007525191.tif 000029
【図６】
2007525191.tif 000030
【図７】
2007525191.tif 000031
【図８】
2007525191.tif 000032
【図９】
2007525191.tif 000033
【図１０】
2007525191.tif 000034
【図１１】
2007525191.tif 000035
【図１２】
2007525191.tif 000036
【図１３】
2007525191.tif 000037
【図１４】
2007525191.tif 000038
【図１５】
2007525191.tif 000039
【図１６】
2007525191.tif 000040
【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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