(57)【要約】  本発明は、細胞表面膜などの膜に対して又は膜を通して、細胞内のポリペプチドを標的化するためのアミノ酸配列モチーフ（例えば、生体分子パーティションモチーフ）を提供するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然ポリペプチドには存在しない生体分子パーティションモチーフを含む、細胞表面ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
ポリヌクレオチドがＤＮＡ分子である、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
ポリヌクレオチドがＲＮＡ分子である、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のＲＮＡ分子に相補的であるＲＮＡ分子を含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項６】
生体分子パーティションモチーフが配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項１に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項２に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項８】
天然ポリペプチドには存在しない生体分子パーティションモチーフを含む細胞表面ポリペプチドをコードする、組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
生体分子パーティションモチーフが配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
組換えポリヌクレオチドがエンハンサー及び／又はプロモーターに動作可能なように連結されている、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１に記載の組換えポリヌクレオチドを含む形質転換細胞。
【請求項１２】
組換えポリヌクレオチドが、細胞のトランスフェクション、エレクトロポレーション又はトランスフォーメーションによって細胞に導入される、請求項１１に記載の形質転換細胞。
【請求項１３】
請求項８に記載の発現ベクターを含む形質転換細胞。
【請求項１４】
発現ベクターが、細胞のトランスフェクション、エレクトロポレーション又はトランスフォーメーションによって細胞に導入される、請求項１３に記載の形質転換細胞。
【請求項１５】
細胞が組換えポリヌクレオチドを発現し、それによって細胞表面にポリペプチドを産生する、請求項１１又は１３に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
ａ）天然ポリペプチドには存在しない生体分子パーティションモチーフを含む細胞表面ポリペプチドをコードする、組換えポリヌクレオチドをトランスフェクティング、エレクトロポレーティング又はトランスフォーミングし、そして
ｂ）ステップａ）のポリペプチドの発現に充分な条件下にステップａ）の細胞を保持する、
ステップを含む、形質転換細胞を調製する方法。
【請求項１７】
組換え細胞表面ポリペプチドが天然のポリペプチドには存在しない生体分子パーティションモチーフを含む、組換え細胞表面ポリペプチドを含む形質転換細胞。
【請求項１８】
ポリペプチドを細胞表面に供給するのに充分な条件下で、少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドを発現し、そして
ポリペプチドを単離し、それによって細胞表面からポリペプチドを得る、
ことを含む、細胞の表面からポリペプチドを得る方法。
【請求項１９】
生体分子パーティションモチーフが配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドの翻訳後修飾が天然のポリペプチドの翻訳後修飾に較べて修飾されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドのグリコシル化パターンが天然のポリペプチドのグリコシル化パターンに較べて減少している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
グリコシル化パターンがＯ−結合グリコシル化パターンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリペプチドが、抗体、Ｇタンパク質共役型受容体、サイトカイン受容体、膜内輸送タンパク質及び膜結合酵素から成る群から選択されるいずれかのメンバーをコードするポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
ポリペプチドが治療用の生体物質をコードする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
治療用の生体物質が、抗体、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン−１から２９、ＴＮＦα、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン及びそれらの断片から成る群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ポリペプチドをコードする核酸配列のＣ末端に生体分子パーティションモチーフを接着し、そして
細胞に核酸配列を導入し、
ここで、ポリペプチドがその核酸配列から発現し、小胞体においてプロセシングを受け、そこから分泌され、細胞外膜に挿入され、
それによってポリペプチドを細胞表面に供給する、
ことを含む、細胞の表面にポリペプチドを供給する方法。
【請求項２９】
生体分子パーティションモチーフが配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ポリペプチドの翻訳後修飾が天然のポリペプチドの翻訳後修飾に較べて修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ポリペプチドのグリコシル化パターンが天然のポリペプチドのグリコシル化パターンに較べて減少している、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
グリコシル化パターンがＯ−結合グリコシル化パターンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ポリペプチドが、抗体、Ｇタンパク質共役型受容体、サイトカイン受容体、膜内輸送タンパク質及び膜結合酵素から成る群から選択されるいずれかのメンバーをコードするポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
ポリペプチド又はその一部が免疫原性決定因子をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
ポリペプチドが治療用の生体物質をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
治療用の生体物質が、抗体、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン−１から２９、ＴＮＦα、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン及びそれらの断片から成る群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ポリペプチド又はその一部がカリウムチャンネルのサブユニットをコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
カリウムチャンネルがｈＥＲＧカリウムチャンネルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ポリペプチド又はその一部がβアミロイドタンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
ポリペプチド又はその一部が嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
ポリペプチド又はその一部がｐ−糖タンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
ポリペプチド又はその一部がインスリン受容体をコードする、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
ポリペプチド又はその一部が水チャンネル、アクアポリン２をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
ポリペプチド又はその一部が多剤耐性タンパク質をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
ポリペプチド又はその一部がロドプシンをコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
ポリペプチドを細胞表面に供給するのに充分な条件下の細胞内で、少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドを発現させ、
ここで、細胞の表面におけるポリペプチドの量が、非天然の生体分子パーティションモチーフを一つも有していないポリペプチドを発現している細胞の表面でのポリペプチドの量に較べて増加しているものである、
ことを含む、細胞の表面でポリペプチドの発現を増加させる方法。
【請求項４９】
生体分子パーティションモチーフが、配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ポリペプチドの翻訳後修飾が天然のポリペプチドの翻訳後修飾に較べて修飾されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ポリペプチドのグリコシル化パターンが天然のポリペプチドのグリコシル化パターンに較べて減少している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
グリコシル化パターンがＯ−結合グリコシル化パターンである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドが、非天然の生体分子パーティションモチーフを一つも含むことなく、細胞内凝集体を形成する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
ポリペプチドが一つ又はそれ以上の抗体をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
ポリペプチド又はその一部が一つ又はそれ以上の免疫原性決定因子をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
ポリペプチドが一つ又はそれ以上の治療用の生体物質をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
治療用の生体物質が、抗体、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン−１から２９、ＴＮＦα、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン及びそれらの断片から成る群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ポリペプチド又はその一部がカリウムチャンネルの一つ又はそれ以上のサブユニットをコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
カリウムチャンネルがｈＥＲＧカリウムチャンネルである、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
ポリペプチド又はその一部が一つ又はそれ以上のβアミロイドタンパク質をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
ポリペプチド又はその一部が一つ又はそれ以上の嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６４】
ポリペプチド又はその一部が一つ又はそれ以上のｐ−糖タンパク質をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６５】
ポリペプチド又はその一部が一つ又はそれ以上のインスリン受容体をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６６】
ポリペプチド又はその一部が水チャンネル、アクアポリン２、をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６７】
ポリペプチド又はその一部が一つ又はそれ以上の多剤耐性タンパク質をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６８】
ポリペプチド又はその一部がロドプシンをコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６９】
検査薬の薬理活性を定量するためのアッセイにおいて、少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドを発現している細胞を採用することを更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項７０】
細胞の表面にポリペプチドを供給するのに充分な条件下で、免疫原決定因子をコードするポリペプチド及び少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを発現させ、それによって細胞の表面に免疫原を産生する、
ことを含む、細胞の表面で免疫原を産生する方法。
【請求項７１】
生体分子パーティションモチーフが、配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
免疫原がウイルスポリペプチドに由来する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
免疫原が細菌ポリペプチドに由来する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
免疫原が真菌ポリペプチドに由来する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
生体分子パーティションモチーフを、細胞表面ポリペプチドをコードする遺伝子のコード領域に導入し、そして
細胞の表面にポリペプチドを供給するのに充分な条件下でポリペプチドを発現させ、それによって患者の障害を治療する、
ことを含む、ポリペプチドの細胞内保有によって特徴づけられる患者の障害を治療する方法。
【請求項７８】
生体分子パーティションモチーフが配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ポリペプチド又はその一部がカリウムチャンネルのサブユニットをコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
カリウムチャンネルがｈＥＲＧカリウムチャンネルである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
障害が急性冠不全症候群である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
ポリペプチド又はその一部がβアミロイドタンパク質をコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
障害がアルツハイマー病である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ポリペプチド又はその一部が嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質をコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項８７】
障害が嚢胞性繊維症である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
ポリペプチド又はその一部がｐ−糖タンパク質をコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項８９】
ポリペプチド又はその一部がインスリン受容体をコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項９０】
障害が糖尿病である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ポリペプチド又はその一部が水チャンネル、アクアポリン２、をコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項９２】
障害が腎性糖尿病である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
ポリペプチド又はその一部が多剤耐性タンパク質をコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項９４】
障害がデュービン・ジョンソン症候群である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
ポリペプチド又はその一部がロドプシンをコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項９６】
障害が常染色体優性網膜色素変性症である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
生体分子パーティションモチーフをポリペプチドに付着させ、そして
ポリペプチドを細胞の表面に供給し、
それによって患者の障害を治療する、
ことを含む、ポリペプチドの細胞内保有によって特徴づけられる患者の障害を治療する方法。
【請求項９８】
生体分子パーティションモチーフが、配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
ポリペプチド又はその一部がカリウムチャンネルのサブユニットをコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
カリウムチャンネルがｈＥＲＧカリウムチャンネルである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
障害が急性冠不全症候群である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ポリペプチド又はその一部がβアミロイドタンパク質をコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０５】
障害がアルツハイマー病である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
ポリペプチド又はその一部が嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質をコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０７】
障害が嚢胞性繊維症である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
ポリペプチド又はその一部がｐ−糖タンパク質をコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０９】
ポリペプチド又はその一部がインスリン受容体をコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１０】
障害が糖尿病である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ポリペプチド又はその一部が水チャンネル、アクアポリン２、をコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１２】
障害が腎性糖尿病である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
ポリペプチド又はその一部が多剤耐性タンパク質をコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１４】
障害がデュービン・ジョンソン症候群である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
ポリペプチド又はその一部がロドプシンをコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１１６】
障害が常染色体優性網膜色素変性症である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
生体分子パーティションモチーフが天然の免疫原性ポリペプチド中に存在しないものであり、免疫原性ポリペプチド及び一つ又はそれ以上の生体分子パーティションモチーフをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び好適な医薬賦形剤を含む、ＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１１８】
生体分子パーティションモチーフが、配列番号１から配列番号２４８より成る群から選択される、請求項１１７に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１１９】
生体分子パーティションモチーフがＳＷＴＹモチーフである、請求項１１８に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１２０】
ＳＷＴＹモチーフが配列番号１から配列番号１８より成る群から選択される、請求項１１９に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１２１】
組換えポリヌクレオチドがエンハンサー及び／又はプロモーターに動作可能なように連結されている、請求項１１７に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項１２２】
免疫原性ポリペプチドがウイルスポリペプチド又はその断片である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
免疫原性ポリペプチドが細菌ポリペプチド又はその断片である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
免疫原性ポリペプチドが真菌ポリペプチド又はその断片である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
少なくとも一つの生体分子パーティションモチーフをポリペプチドに接着させ、そして
細胞の表面におけるポリペプチドの量が、接着している生体分子パーティションモチーフを一つも有していないポリペプチドを発現している細胞表面のポリペプチドの量に較べて増加するように、ポリペプチドを細胞の表面に供給する、
ことを含む、細胞の表面でポリペプチド発現を増加させる方法。
【請求項１２６】
生体分子パーティションモチーフが、ポリペプチドに親和性を有するタグによってポリペプチドに接着されている、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
生体分子パーティションモチーフが、生体分子パーティションモチーフを有する別のポリペプチドと複合体を形成してポリペプチドに接着されている、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
ａ）Ｋｉｒ２．１及び公知のＥＲ局在化シグナルを含むプラスミドを調製し、ここで、前記ＥＲ局在化シグナルは、Ｋｉｒ２．１のＥＲコンパートメントへの再配置を生じさせるものであり、
ｂ）ランダムペプチド配列を各々更に含むステップａの複数のプラスミドのライブラリーを生成させ、ここで、各ランダムペプチド配列は、ステップａのプラスミドにおいてＥＲ局在化シグナルの下流に位置しており、
ｃ）ステップｂに由来するプラスミドのライブラリーで酵母を形質転換し、
ｄ）４ｍＭのカリウムプレート上で増殖させるプラスミドを選択し、そして
ｅ）ステップｄの選択されたプラスミド内でポリペプチド配列を単離する、
ステップを含む、細胞表面発現を誘導することができるアミノ酸配列モチーフを同定するための遺伝子スクリーニング。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願、特許及び参照による取り込み）
本出願は、２００３年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６０／５２４，３８０号の優先権を主張し、その内容を参照して本明細書に取り込む。
【０００２】
本明細書に引用されている各々の出願及び特許は、各々の出願及び特許（各発行済み特許の審査中のものを包含する）に引用された各文献又は参考資料（「出願引用文献」）と共に、及びこれらの出願及び特許のいずれかに対応する及び／又は優先権を主張するＰＣＴ及び外国出願並びに特許の各々、及び出願引用文献の各々に引用された又は参照された文献の各々は、ここに、参照して本明細書に取り込むものである。より一般的には、文献又は参考資料は、明細書末尾の参考文献リスト、又は明細書のいずれかにおいて、引用されており、そしてこれらの文献又は参考資料（「本明細書引用資料」）の各々、及び本明細書引用資料の各々に引用されている各文献又は資料（製造者の仕様書、指示書のいずれも包含する）は、ここに、参照して本明細書に取り込むものである。
【背景技術】
【０００３】
膜タンパク質は、原核生物及び真核生物の両方においてプロテオームの約３０％を占めている（Wallin and von Heijne, 1998）。膜タンパク質キネシスにおける重要なステップの一つは、正確に作用部位へ選択的に輸送（trafficking）することである。タンパク質の異常な折りたたみ及び選択輸送は、ますます多くの疾患に関わるものとなっている（Thomasら,1995, Dobson, 2001, Radford ら,1999）。生物発生の重要なステップは、２つの輸送事象：順行性輸送（anterograde transport）と逆行性輸送（retrograde transport）、を含んでいる。前者は、細胞表面へ向かう小胞体の前方への進行であり、後者は、逆のプロセス、即ち、選択的にマークされたタンパク質をＥＲ（小胞体）へ回収する小胞輸送である（Bonifacino and Glick, 2004）。
【０００４】
連続的な折りたたみステップ及び「品質」チェックにより、タンパク質の構造又はオリゴマー状態におけるわずかな変化をも検出し、作用部位への選択輸送を回避する。タンパク質が適切に組み立てられると、ＥＲから細胞表面へ放出される。細胞表面タンパク質は、細胞表面に発現させるための特別なタグである「ジップコード（宛先の書かれた荷札）」を含有している。折りたたみが不適切であったり又はサブユニットの組立てが不完全であれば、分子の特性（構造又は配列）に悪影響を及ぼし、それが保持／回収機構によって認識されるのである。細胞表面に発現させるための「ジップコード」については、そのシグナルモチーフに於いても、分子機構に於いても殆んど知られていないので、膜タンパク質の発現を介在する、「ＥＲ局在」に対して「細胞表面局在」、というそれら二つの相反する作用については更なる探求が必要である。
【０００５】
細胞表面における膜受容体の発現は、高度に制御されている。シグナルモチーフは、新しく合成されたタンパク質をその最終目的のためにＥＲへと、又は、別のタンパク質と組み合わせて、細胞表面に選択輸送される前に一過性のコンパートメントへと、空間的な局在を付与するように設計されているものとして同定されている（Mellman and Warren, 2000）。ＫＫＸＸ及びＲＸＲモチーフのような特異的な配列が、膜タンパク質のＥＲへの局在を付与する役割を果たすものとして同定されている（Nilsson ら, , 1989; Zerangue ら, , 1999）。ＤＸＥ（Nishimura and Balch, 1997）及びＦＣＹＥＮＥ（Maら,2001）等の、膜タンパク質の細胞表面発現を促進するシグナルモチーフも同定されている。これらのモチーフは、ＥＲから放出されるステップで機能すると考えられる。
【０００６】
ＥＲからの放出（細胞表面発現を誘導する）と回収（ＥＲへの局在化を付与する）といった拮抗する作用は、２つの連鎖的な生物発生的なステップで機能する、というのが従来から支持されている例証である。この考え方と一致して、ＥＲから放出されるステップに次ぐ後者のステップである逆行性の輸送は、自然界に於いては優位である。タンパク質を細胞表面に進行させる、逆行性輸送から（逆行性輸送により取り入れられたもの）の選択的な放出は、少なくとも三つのメカニズムによるものとされる。第一は、二塩基性及びＲＫＲモチーフのようなＥＲ局在化シグナルが、マルチサブユニットの高分子複合体の会合によりマスクされることである。第二は、物理的なマスキングに加えて、ＥＲ局在化シグナルは、膜の細胞質小葉の近傍では敏感となり、タンパク質間の相互作用又は折りたたみの結果として異なったゾーンにシグナルが再配置されて、ＥＲ局在化能が修飾を受け変化することがある。第三のメカニズムは、逆行性輸送機構であるＣＯＰＩと競合的に結合するモジュラータンパク質をリクルートすることである。
【０００７】
逆行性輸送からの放出に関与するシグナルモチーフ及び制御経路を探索するために、ＥＲ局在化に打ち勝って細胞表面への発現を誘導する能力について、ランダムペプチド配列を評価する遺伝子スクリーニングを設計した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アミノ酸配列モチーフ（本明細書では生体分子パーティションモチーフと称する）が、細胞表面膜を含む膜に対して、また、膜を通して、細胞内ポリペプチドの標的化を誘導するものであるということは確定している。生体分子パーティションモチーフを付加することにより、ポリペプチドの発現レベル及び細胞局在を変更することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様において、本発明は、天然ポリペプチドには存在しない生体分子パーティションモチーフを含む、細胞表面ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを提供する。
細胞表面ポリペプチドは、抗体、Ｇタンパク質共役型受容体、サイトカイン受容体、膜結合輸送タンパク質及び膜結合酵素を包含するがこれらに限定されるものではない。
【００１０】
特定の態様において、生体分子パーティションモチーフはＳＷＴＹモチーフであってもよい。
【００１１】
別の態様において、本発明は、生体分子パーティションモチーフが天然のポリペプチド中には存在しない、細胞表面ポリペプチド及び生体分子パーティションモチーフをコードする組換えポリヌクレオチドを含む形質転換細胞を提供する。
【００１２】
なお別の態様において、本発明は、ポリペプチドを細胞表面に供給するのに充分な条件下で、少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドを発現させ、ポリペプチドを単離し、それによって細胞表面からポリペプチドを得る、細胞の表面からポリペプチドを得る方法を提供する。
【００１３】
特定の態様においては、ポリペプチドの翻訳後修飾は、天然のポリペプチドの翻訳後修飾に較べて、修飾により変更されている。
【００１４】
特定の一態様において、ポリペプチドのグリコシル化パターンは、天然のポリペプチドのグリコシル化パターンに較べて減少している。グリコシル化パターンは、Ｏ−結合グリコシル化パターンであってもよい。
【００１５】
一態様において、ポリペプチドは治療用の生体物質（biologic）をコードする。治療用の生体物質は、抗体、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキンの１から２９まで、ＴＮＦα、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、インスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポイエチン及びこれらの断片であってもよいがこれらに限定されるものではない。
【００１６】
なお別の態様において、本発明は、ポリペプチドをコードする核酸配列のＣ末端に生体分子パーティションモチーフを接着し、細胞に核酸配列を導入し、ここに於いて、ポリペプチドが核酸配列から発現し、小胞体においてプロセシングを受け、そこから分泌され、細胞外膜に挿入され、それによってポリペプチドを細胞表面に供給することを含む、細胞の表面にポリペプチドを供給する方法を提供する。
【００１７】
なお別の態様において、本発明は、ポリペプチドを細胞表面に供給するのに充分な条件下（細胞の表面におけるポリペプチドの量が、非天然の生体分子パーティションモチーフを一つも有していないポリペプチドを発現している細胞表面でのポリペプチドの量に比較して増加している）で、  少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドを細胞内で発現させることを含む、細胞の表面にポリペプチド発現を増加させる方法を提供する。
【００１８】
更に別の態様において、本発明は、少なくとも一つの生体分子パーティションモチーフをポリペプチドに接着させ、そして細胞の表面におけるポリペプチドの量が、接着している生体分子パーティションモチーフを一つも有していないポリペプチドを発現している細胞表面のポリペプチドの量に比べて増加するように、ポリペプチドを細胞の表面に供給することを含む、細胞の表面でポリペプチド発現を増加させる方法を提供する。
【００１９】
特定の態様において、生体分子パーティションモチーフは、ポリペプチドに親和性を有するタグによってポリペプチドに接着されている。
【００２０】
別の態様において、生体分子パーティションモチーフは、生体分子パーティションモチーフを有する別のポリペプチドと複合体を形成してポリペプチドに接着されている。
【００２１】
更に別の態様において、本発明のポリペプチドは、非天然の生体分子パーティションモチーフを含まないで細胞内凝集体を形成してもよい。
【００２２】
更に別の態様において、本発明は、細胞の表面にポリペプチドを供給するのに充分な条件下で、免疫原決定因子をコードするポリペプチド及び少なくとも一つの非天然の生体分子パーティションモチーフを発現させ、それによって細胞の表面に免疫原を産生することを含む、細胞の表面で免疫原を産生する方法を提供する。
【００２３】
特定の態様において、免疫原は、ウイルスポリペプチド、細菌ポリペプチド、真菌ポリペプチド及びこれらの断片から誘導することができる。
【００２４】
更に別の態様において、本発明は、生体分子パーティションモチーフが天然の免疫原性ポリペプチド中に存在しない、免疫原性ポリペプチド及び一つ又はそれ以上の生体分子パーティションモチーフをコードする組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び好適な医薬賦形剤を含む、ＤＮＡワクチン組成物を提供する。
【００２５】
特定の態様において、免疫原は、ウイルスポリペプチド、細菌ポリペプチド、真菌ポリペプチド、又はこれらの断片であってもよい。
【００２６】
更に別の態様において、本発明は、生体分子パーティションモチーフを、細胞表面ポリペプチドをコードする遺伝子のコード領域に導入し、そして細胞の表面にポリペプチドを供給するのに充分な条件下でポリペプチドを発現させ、それによって患者の障害を治療することを含む、ポリペプチドの細胞内保有によって特徴づけられる患者の障害を治療する方法を提供する。
【００２７】
更に別の態様において、本発明は、ポリペプチドの細胞内保有によって特徴づけられる患者の障害を治療する方法であって、生体分子パーティションモチーフをポリペプチドのC末端に付着させ、そして、ポリペプチドを細胞の表面に供給し、それによって患者の障害を治療することを含む方法を提供する。
【００２８】
障害は、冠不全症候群、嚢胞性繊維症、アルツハイマー病、糖尿病、腎性糖尿病、デュービン・ジョンソン症候群及び常染色体優性網膜色素変性症であってもよいがこれらに限定されるものではない。
【００２９】
ポリペプチドは、カリウムチャンネル（例えば、ｈＥＲＧカリウムチャンネル）、βアミロイドタンパク質、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質、ｐ−糖タンパク質、インスリン受容体、水チャンネルアクアポリン−２、多剤耐性タンパク質及びロドプシンであってもよいがこれらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の他の態様は、以下の開示に記載され又は開示から明らかであり、本発明の範囲内である。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義
「生体分子パーティションモチーフ」は、１４−３−３タンパク質に結合し、膜標的ポリペプチドの脂肪質部分に位置している約５〜約２０の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列モチーフである。膜標的ポリペプチドは、膜に又は膜を通して送達されるポリペプチドである。
【００３２】
「ＳＷＴＹモチーフ」は、生体分子パーティションモチーフの一種である。ＳＷＴＹモチーフは、カルボキシ末端に対して２位にあるセリン残基又はスレオニン残基のいずれかを有し、カルボキシ末端に対して３位から１０位で、好ましくは２位でリン酸化されるアミノ酸残基を有する、約５〜約１０の連続したアミノ酸を含むアミノ酸配列モチーフである。特別な態様において、ＳＷＴＹモチーフは、カルボキシ末端（例えば、Ｒ（−７）、Ｇ（−６）、Ｒ（−５）、Ｓ（−４）、Ｗ（−３）、Ｔ（−２）Ｙ（−１）−ＣＯＯＨ）に対して、それぞれ、位置−７、−６、−５、−４、−３、−２及び−１において、配列ＲＧＲＳＷＴＹ（配列番号１）の少なくとも２つのアミノ酸残基を含有する。別の特定の態様において、ＳＷＴＹモチーフは、カルボキシ末端に対して、それぞれ、８位ないし１位において、配列ＦＲＧＲＳＷＴＹ（配列番号２）の少なくとも二つのアミノ酸残基を含有し、（例えば、Ｆ（−８）、Ａ（−７），Ｇ（−６），Ｒ（−５），Ｓ（−４），Ｗ（−３）、Ｔ（−２）Ｙ（−１）−ＣＯＯＨ；Ｆ（−８）、Ｒ（−７）、Ｒ（−６）、Ｒ（−５）、Ｓ（−４）、Ｗ（−３）、Ａ（−２）Ｙ（−１）−ＣＯＯＨ又はＦ（−８）、Ｒ（−７）、Ｇ（−６）Ａ（−５）、Ｓ（−４）、Ｗ（−３）、Ｔ（−２）Ｙ（−１）−ＣＯＯＨ）のいずれかの一つ位置に、アラニン置換を有していてもよい。
【００３３】
「小胞体」は、真核細胞の細胞質内の膜結合コンパートメントであり、そこでは脂質が合成され、膜結合タンパク質が作られる。
【００３４】
「細胞表面ポリペプチド」は、ポリペプチドのいくつかの部分、又はポリペプチドに接着した修飾体（例えば、脂質）、が外部に（即ち、細胞外膜に対して外部に）位置している、細胞外膜に接触しているいずれかのポリペプチドである。細胞表面のポリペプチドの外部に位置している部分は、「細胞外」と云われている。細胞外膜との接触は、直接的であっても間接的（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用、脂質結合、その他によって）であってもよい。細胞表面ポリペプチドは、例えば、細胞間ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質を包含する。本発明の細胞表面ポリペプチドは、生体分子パーティションモチーフを有する又は有さない他のポリペプチドと会合、又は複合体を形成することができる。
【００３５】
「細胞外膜」は、脂質分子の二重層（即ち、脂質二重層）であり、全ての細胞を取り囲んでいる会合タンパク質である。
【００３６】
本明細書で使用される「天然の」という用語は、組換え又は親和性を基にした技術によって操作されていない、天然に存在するポリペプチド、又はそのアミノ酸配列、を云う。従って、本発明の天然のポリペプチド及びアミノ酸配列は、ＳＷＴＹモチーフをコードする配列のような付加的配列を包含するように変更されていないものである。
【００３７】
「非天然の生体分子パーティションモチーフ」は、組換え技術によって天然に存在するポリペプチドに、直接的又は間接的に加えられた生体分子パーティションモチーフを云う。
【００３８】
「非天然のＳＷＴＹ」は、組換え技術によって天然に存在するポリペプチドに直接的又は間接的に加えられたＳＷＴＹモチーフを云う。
【００３９】
本明細書で使用される「組換え体」という用語は、遺伝子組換え（例えば、酵素的又は化学的プロセス）によって別の核酸配列に結合された核酸配列（又はそれによってコード化されたアミノ酸配列）を云うのに使用される。
【００４０】
本明細書で使用される「融合ポリペプチド」は、ペプチド結合形成又は親和性に基づく技術によって、別のポリペプチド又はアミノ酸配列（例えば、生体分子パーティションモチーフ）に結合したポリペプチドである。
【００４１】
「コード領域」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写される核酸配列を含有する遺伝子の領域を表す。
【００４２】
「コードする」という用語は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、最終的にポリペプチドを形成するアミノ酸配列を生じる核酸配列を云う。
【００４３】
「翻訳後修飾」は、翻訳が開始された後に生じるポリペプチドの何れの酵素的修飾であってもよい。翻訳後修飾は、グリコシル化、アミノ酸修飾又は置換、結合の切断又は形成（例えば、スルフィド結合）及び連結形成（例えば、ファルネシル化、アセチル化）を包含するが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
「Ｏ−結合グリコシル化パターン」は、ゴルジ装置内で選択されたセリン又はスレオニンの側鎖水酸基に、糖が結合することによって生じる。
【００４５】
「免疫原」は、免疫応答を引き起こす分子である。
【００４６】
「免疫原決定基」は、抗体又はＴ細胞受容体に結合する免疫原性分子の特異的領域である。
【００４７】
本明細書で使用される「検査薬」とは、細胞表面ポリペプチドに結合する何れの実験化合物であってもよい。
【００４８】
「診断薬を得る」における「得る」という用語は、診断薬（又は示唆された物質又は材料）を購入する、合成する又はそうでなければ獲得することを含むものである。
【００４９】
本発明の開示において、「含む（comprises）」「含んでいる（conprising）」、「含有している（containing）」及び「有する（having）」等は、米国特許法に基づいて付与された意味を有するものであり、「包含する（includes）」、「包含している（including）」等を意味する。同様に「実質的に〜から成る（consisting essentially of ）」又は「実質的に〜より成る（consists essentially）」といった表現も米国特許法に基づく意味を有する。そして、オープンエンド形式であり、先行技術の実施形態は除外されるが、クレームされた基本的な又は新規な特徴がクレーム以外の要素によって変更されない（影響されない）限り、クレーム以外の要素も権利範囲に含むものである。
【００５０】
更なる定義は、本明細書における全開示に亘り提供される。
【００５１】
ＩＩ．本発明の方法及び組成物
本発明は、細胞外膜、核膜又はオルガネラ膜のような、膜内へ、又は膜を通して、ポリペプチドの送達を媒介する能力を有する、生体分子パーティションモチーフの発見を前提としている。本発明の生体分子パーティションモチーフに関する利点は、細胞に基づく技術及び治療の広い範囲に応用される。
【００５２】
細胞外膜へのポリペプチドの供給は、例えば、細胞表面の発現のレベルを増加させることができる。細胞表面の発現レベルが増加すれば、細胞から単離することによりポリペプチドの収量を増やすことができる。細胞表面の発現レベルの増加は、又、ポリペプチドへのアクセスの増加させることができる。そのような改善は、薬剤スクリーニング、抗体生成及びワクチン製造を包含する生物医学への応用において有用である。
【００５３】
本発明の生体分子パーティションモチーフは、又、治療用の生体物質の開発においても有用である。モチーフを付加することにより、ポリペプチドの翻訳後修飾を変更することができるが、それは包括的な臨床効果をもたらすものである。例えば、生体分子パーティションモチーフは、グリコシル化を減少させるか又はグリコシル化に変更を加えて、不都合な炎症反応を減少させる。
【００５４】
本発明の生体分子パーティションモチーフは、又、別に小胞体に保持されている変異した又は欠損したポリペプチドを膜に供給して機能を回復させるのに有用である。臨床応用において、標的化の不具合に関連した遺伝的欠陥の原因となる変異ポリペプチドが、生体分子パーティションモチーフの付加によって適切に標的化され、それによってインビボで機能を回復し、そのような障害に関連した症状を緩和する。
【００５５】
生体分子パーティションモチーフは、１４−３−３タンパク質に結合する約５〜約２０の連続するアミノ酸を含むアミノ酸配列モチーフであり、膜標的ポリペプチドの細胞質部分に位置している。タンパク質の１４−３−３ファミリーは、２つの構造ドメインとして組織化された９つの逆平行αヘリックスのモノマーを含有している（詳細な総説として、H. Fu ら,  (2000), Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40: 617-47及びYaffe, M. B., (2002), FEBS Letters, 513 (2002), 53-57を参照、これらの内容は、参照して本明細書に取り込む）。ダイマー形態において、長さ３５オングストローム、巾３５オングストローム、深さ２０オングストロームの、大きな負に荷電したチャンネルが創成される。１４−３−３タンパク質は、状況に応じてリン酸化結合部位で特異的標的タンパク質に結合することによって作用する。特別な態様において、生体分子パーティションモチーフは、ＲＫＲシグナルを無効にすることができる。ＲＫＲシグナルは、ポリペプチドを小胞体に留まらせるアミノ酸配列である（Shikano and Li, 2003）。ＲＫＲシグナルは、当該技術分野公知の小胞体局在化シグナルのうちの一つである。
【００５６】
本発明の生体分子パーティションモチーフには、以下の：
ＲＧＲＳＷＴＹ（配列番号：１）ＦＲＧＲＳＷＴＹ（配列番号：２）
ＦＡＧＲＳＷＴＹ（配列番号：３）ＦＲＧＲＳＷＡＹ（配列番号：４）
ＦＲＧＡＳＷＴＹ（配列番号：５）ＲＬＲＲＧＷＴＶ（配列番号：６）
ＧＨＧＲＲＨＳＷ（配列番号：７）ＲＲＫＴＶ（配列番号：８）
ＬＶＲＲＳＩＴＦ（配列番号：９）ＳＲＤＲＲＫＴＹ（配列番号：１０）
ＬＭＫＲＲＳＳＶ（配列番号：１１）ＬＭＫＲＲＫＳＶ（配列番号：１２）
ＬＲＡＲＲＫＳＩ（配列番号：１３）ＲＲＫＲＳＶＳＬ（配列番号：１４）
ＥＲＨＲＲＷＳＳ（配列番号：１５）ＥＨＲＳＲＮＴＬ（配列番号：１６）
ＫＬＲＲＲＫＴＬ（配列番号：１７）ＧＱＲＫＬＡＳＴ（配列番号：１８）
ＱＲＳＩＷＧＫＫＳＱ（配列番号：１９）ＦＬＧＫＫＫＴＫＴＤ（配列番号：２０）
ＫＡＭＰＫＡＫＳＡ（配列番号：２１）ＩＢＣＫＮＤＬＫＫＳＮ（配列番号：２２）
ＮＩＤＡＬＬＫＫＴＥ（配列番号：２３）ＮＩＤＡＬＬＫＫＴＥ（配列番号：２４）
ＫＫＮＫＫＲＫＦＴＫ（配列番号：２５）ＬＰＷＫＲＫＫＴＴＩ（配列番号：２６）
ＫＶＶＥＫＡＫＹＳＬ（配列番号：２７）ＲＲＬＱＰＡＫＳＴＦ（配列番号：２８）
ＲＲＬＱＰＡＫＳＴＦ（配列番号：２９）ＩＫＫＬＷＣＫＴＳＡ（配列番号：３０）
ＩＫＫＬＷＣＫＴＳＡ（配列番号：３１）ＰＹＶＣＫＣＫＬＴＮ（配列番号：３２）
ＴＹＶＣＫＣＫＦＴＮ（配列番号：３３）ＩＫＬＬＮＥＫＫＴＳ（配列番号：３４）
ＧＲＲＲＧＧＫＡＴＴ（配列番号：３５）ＫＫＩＬＧＧＫＣＳＱ（配列番号：３６）
ＥＴＬＣＲＫＫＬＳＧ（配列番号：３７）ＦＧＫＧＴＫＫＴＳＨ（配列番号：３８）
ＦＫＫＭＶＫＫＳＴＬ（配列番号：３９）ＩＫＫＣＴＫＤＴＳＫ（配列番号：４０）
ＩＫＫＣＴＫＤＴＳＫ（配列番号：４１）ＩＫＫＣＴＫＤＴＳＫ（配列番号：４２）
ＩＫＫＣＴＫＤＴＳＫ（配列番号：４３）ＩＫＶＬＩＫＫＩＳＬ（配列番号：４４）
ＩＫＶＬＩＫＫＩＳＬ（配列番号：４５）ＫＫＬＷＳＫＴＬＴＫ（配列番号：４６）
ＫＫＬＷＳＫＴＬＴＫ（配列番号：４７）ＲＩＬＹＫＫＫＩＳＬ（配列番号：４８）
ＲＭＩＫＲＫＩＬＳＱ（配列番号：４９）ＲＶＩＣＴＫＫＩＳＬ（配列番号：５０）
ＲＶＩＣＴＫＫＩＳＬ（配列番号：５１）ＲＶＬＣＫＫＫＩＴＭ（配列番号：５２）
ＲＶＬＣＫＫＮＩＳＬ（配列番号：５３）ＲＶＬＣＫＫＱＩＳＬ（配列番号：５４）
ＲＶＬＦＫＫＫＩＳＬ（配列番号：５５）ＲＶＬＩＫＫＫＩＳＬ（配列番号：５６）
ＲＶＬＩＫＫＫＩＳＬ（配列番号：５７）ＲＶＬＹＫＫＫＩＳＬ（配列番号：５８）
ＲＶＬＹＫＫＫＩＳＬ（配列番号：５９）ＴＬＬＣＲＫＫＳＳＬ（配列番号：６０）
ＴＬＬＣＲＫＫＳＳＬ（配列番号：６１）ＶＫＫＴＬＫＲＩＴＳ（配列番号：６２）
ＶＫＫＴＬＫＲＩＴＳ（配列番号：６３）ＶＫＫＴＬＫＲＩＴＳ（配列番号：６４）
ＶＫＫＴＬＫＲＩＴＳ（配列番号：６５）ＶＫＫＴＭＫＲＩＴＳ（配列番号：６６）
ＶＫＫＴＭＫＲＩＴＳ（配列番号：６７）ＶＭＡＭＶＫＲＫＳＳ（配列番号：６８）
ＳＡＫＫＭＬＫＩＳＶ（配列番号：６９）ＳＡＫＫＭＬＫＩＳＶ（配列番号：７０）
ＳＬＫＫＭＬＫＩＴＩ（配列番号：７１）ＳＬＫＫＭＬＫＩＴＩ（配列番号：７２）
ＫＫＳＬＲＮＲＩＳＩ（配列番号：７３）ＫＫＳＬＲＮＩＲＩＳＩ（配列番号：７４）
ＲＮＲＰＷＰＫＤＳＹ（配列番号：７５）ＤＫＮＬＲＱＲＮＴＮ（配列番号：７６）
ＬＫＲＳＲＱＲＦＳＳ（配列番号：７７）ＡＣＥＲＫＲＤＩＴＹ（配列番号：７８）
ＡＶＱＳＫＲＲＫＳＫ（配列番号：７９）ＤＩＳＲＲＲＫＬＴＫ（配列番号：８０）
ＤＩＳＲＲＲＫＬＴＫ（配列番号：８１）ＤＲＬＲＡＲＲＫＳＩ（配列番号：８２）
ＥＦＳＲＧＲＫＬＴＫ（配列番号：８３）ＥＲＲＬＱＲＱＱＴＴ（配列番号：８４）
ＨＩＬＲＲＲＬＦＳＱ（配列番号：８５）ＨＲＬＨＩＲＲＫＳＩ（配列番号：８６）
ＫＧＡＬＲＲＩＭＳＲ（配列番号：８７）ＫＧＡＬＲＲＩＭＳＲ（配列番号：８８）
ＫＧＡＬＲＲＩＴＴＫ（配列番号：８９）ＫＧＡＬＲＲＩＴＴＫ（配列番号：９０）
ＫＫＬＩＣＲＶＡＳＬ（配列番号：９１）ＬＬＦＨＲＲＩＬＳＳ（配列番号：９２）
ＬＬＳＨＲＲＩＬＳＳ（配列番号：９３）ＬＬＳＨＲＲＩＬＳＳ（配列番号：９４）
ＭＫＫＬＷＲＫＣＳＳ（配列番号：９５）ＭＫＫＬＷＲＫＣＳＳ（配列番号：９６）
ＮＩＦＳＲＲＬＣＳＱ（配列番号：９７）ＮＩＬＳＲＲＬＣＳＱ（配列番号：９８）
ＮＩＬＳＲＲＬＣＳＱ（配列番号：９９）ＮＩＬＳＲＲＬＣＳＱ（配列番号：１００）
ＮＴＬＳＲＲＬＣＳＨ（配列番号：１０１）ＱＤＹＴＲＲＣＧＴＴ（配列番号：１０２）
ＲＧＬＭＫＲＲＳＳＶ（配列番号：１０３）ＶＫＬＩＲＲＫＩＳＳ（配列番号：１０４）
ＶＫＲＲＫＲＳＶＳＬ（配列番号：１０５）ＶＫＲＴＭＲＲＩＴＭ（配列番号：１０６）
ＶＫＲＴＭＲＲＩＴＭ（配列番号：１０７）ＧＲＲＧＧＳＲＬＴＥ（配列番号：１０８）
ＨＲＷＲＫＳＲＲＴＩ（配列番号：１０９）ＲＹＫＫＳＴＲＶＴＦ（配列番号：１１０）
ＳＫＶＱＫＴＫＮＴＴ（配列番号：１１１）ＳＫＶＱＫＴＫＮＴＴ（配列番号：１１２）
ＫＦＣＫＧＫＴＰＳＣ（配列番号：１１３）ＳＴＰＧＲＳＲＮＳＬ（配列番号：１１４）
ＦＬＶＦＲＤＲＶＳＬ（配列番号：１１５）ＫＦＩＧＲＥＲＲＴＳ（配列番号：１１６）
ＮＭＶＮＫＨＫＦＳＨ（配列番号：１１７）ＤＬＶＲＲＫＬＡＳＫ（配列番号：１１８）
ＤＬＶＲＲＫＬＡＳＫ（配列番号：１１９）ＧＶＬＧＫＫＫＩＳＬ（配列番号：１２０）
ＨＲＡＬＱＫＫＲＳＶ（配列番号：１２１）ＫＫＬＷＣＫＴＬＴＴ（配列番号：１２２）
ＫＲＱＬＧＫＫＭＳＣ（配列番号：１２３）ＫＲＱＬＧＫＫＭＳＣ（配列番号：１２４）
ＫＶＩＡＫＫＦＬＴＫ（配列番号：１２５）ＭＫＫＳＷＫＲＩＴＳ（配列番号：１２６）
ＭＫＫＳＷＫＲＩＴＳ（配列番号：１２７）ＮＡＬＴＩＫＫＥＳＥ（配列番号：１２８）
ＮＬＦＳＣＫＫＧＳＩ（配列番号：１２９）ＮＳＴＧＫＫＩＬＳＲ（配列番号：１３０）
ＰＱＫＳＫＫＤＲＴＱ（配列番号：１３１）ＲＩＩＧＳＫＫＩＳＬ（配列番号：１３２）
ＲＲＳＬＬＫＥＲＳＭ（配列番号：１３３）ＲＲＳＬＬＫＥＲＳＭ（配列番号：１３４）
ＲＲＶＬＷＫＱＲＳＬ（配列番号：１３５）ＲＶＩＣＳＫＫＩＳＬ（配列番号：１３６）
ＲＶＩＣＳＫＫＩＳＬ（配列番号：１３７）ＲＶＩＦＳＫＫＩＳＬ（配列番号：１３８）
ＲＶＩＳＳＫＫＩＳＬ（配列番号：１３９）ＲＶＬＣＫＫＥＩＳＬ（配列番号：１４０）
ＳＰＲＮＲＫＥＫＳＳ（配列番号：１４１）ＳＳＲＴＫＫＬＫＳＰ（配列番号：１４２）
ＳＳＲＴＫＫＬＫＳＰ（配列番号：１４３）ＳＳＴＧＫＫＩＬＳＲ（配列番号：１４４）
ＳＳＴＧＫＫＩＬＳＲ（配列番号：１４５）ＳＳＴＧＫＫＩＬＳＲ（配列番号：１４６）
ＶＫＫＴＩＫＲＩＴＳ（配列番号：１４７）ＶＫＫＴＷＫＲＩＴＳ（配列番号：１４８）
ＶＫＫＴＷＫＲＬＴＣ（配列番号：１４９）ＶＫＫＴＷＫＲＬＴＣ（配列番号：１５０）
ＶＲＶＬＩＫＫＩＳＬ（配列番号：１５１）ＮＦＳＳＲＬＲＩＴＨ（配列番号：１５２）
ＮＦＳＳＲＬＲＩＴＨ（配列番号：１５３）ＲＮＲＰＷＰＫＤＳＹ（配列番号：１５４）
ＤＫＮＬＲＱＲＮＴＮ（配列番号：１５５）ＡＡＫＬＲＲＲＫＴＬ（配列番号：１５６）
ＡＶＱＳＫＲＲＫＳＫ（配列番号：１５７）ＤＲＰＲＡＲＲＫＳＩ（配列番号：１５８）
ＥＲＲＬＱＲＱＲＴＴ（配列番号：１５９）ＨＲＬＨＬＲＲＫＳＩ（配列番号：１６０）
ＩＲＲＲＫＲＳＶＳＬ（配列番号：１６１）ＩＲＲＲＫＲＳＶＳＬ（配列番号：１６２）
ＫＫＫＬＦＲＦＤＴＱ（配列番号：１６３）ＫＴＬＮＲＲＩＦＳＳ（配列番号：１６４）
ＫＴＬＳＲＲＬＣＳＨ（配列番号：１６５）ＬＬＣＨＲＲＫＦＳＰ（配列番号：１６６）
ＮＶＬＳＲＲＬＣＳＱ（配列番号：１６７）ＱＤＹＴＲＲＣＧＴＴ（配列番号：１６８）
ＲＧＬＭＫＲＲＳＳＶ（配列番号：１６９）ＶＣＥＫＲＲＮＩＴＨ（配列番号：１７０）
ＶＫＬＶＲＲＫＩＳＳ（配列番号：１７１）ＤＩＲＥＫＳＫＣＳＧ（配列番号：１７２）
ＨＲＷＲＫＳＲＲＴＩ（配列番号：１７３）ＫＫＤＫＤＶＲＶＴＷ（配列番号：１７４）
ＲＲＲＡＤＶＲＩＴＧ（配列番号：１７５）ＫＲＲＣＬＣＫＬＳＳ（配列番号：１７６）
ＥＥＫＫＤＥＲＫＴＤ（配列番号：１７７）ＫＧＫＳＧＥＲＶＴＳ（配列番号：１７８）
ＦＫＫＬＩＧＫＫＳＱ（配列番号：１７９）ＫＫＭＴＲＧＲＱＳＳ（配列番号：１８０）
ＫＶＬＷＲＧＲＤＳＧ（配列番号：１８１）ＩＬＬＫＫＨＫＳＳＨ（配列番号：１８２）
ＣＰＰＫＲＫＥＫＳＳ（配列番号：１８３）ＥＲＲＬＱＫＱＱＴＳ（配列番号：１８４）
ＦＧＫＧＡＫＫＴＳＨ（配列番号：１８５）ＩＲＲＹＱＫＫＡＴＡ（配列番号：１８６）
ＫＫＹＧＬＫＰＰＴＬ（配列番号：１８７）ＫＲＭＬＥＫＫＲＴＳ（配列番号：１８８）
ＫＲＭＬＥＫＫＲＴＳ（配列番号：１８９）ＬＩＥＮＬＫＫＡＳＱ（配列番号：１９０）
ＳＰＲＮＫＫＥＫＳＳ（配列番号：１９１）ＳＶＬＴＩＫＫＥＳＥ（配列番号：１９２）
ＹＲＡＬＱＫＫＲＴＭ（配列番号：１９３）ＹＳＩＣＥＫＫＦＳＭ（配列番号：１９４）
ＹＳＩＣＥＫＫＦＳＭ（配列番号：１９５）ＹＳＩＣＥＫＫＦＳＭ（配列番号：１９６）
ＲＮＲＰＷＰＫＤＳＹ（配列番号：１９７）ＤＫＮＬＲＱＲＮＴＮ（配列番号：１９８）
ＤＫＮＬＲＱＲＮＴＮ（配列番号：１９９）ＨＬＶＫＲＱＲＰＳＰ（配列番号：２００）
ＡＲＲＲＫＲＳＶＳＬ（配列番号：２０１）ＡＶＱＳＫＲＲＫＳＫ（配列番号：２０２）
ＨＬＬＮＲＲＰＦＳＫ（配列番号：２０３）ＨＬＰＮＲＲＦＦＳＫ（配列番号：２０４）
ＬＱＶＲＱＲＬＧＳＬ（配列番号：２０５）ＱＤＹＴＲＲＣＧＳＴ（配列番号：２０６）
ＱＲＬＭＫＲＲＫＳＶ（配列番号：２０７）ＲＧＬＭＫＲＲＳＳＶ（配列番号：２０８）
ＲＶＭＱＲＲＱＤＳＲ（配列番号：２０９）ＲＶＭＱＲＲＱＤＳＲ（配列番号：２１０）
ＲＶＭＱＲＲＱＤＳＲ（配列番号：２１１）ＳＲＲＳＳＲＣＧＴＰ（配列番号：２１２）
ＴＬＰＲＫＲＭＳＳＩ（配列番号：２１３）ＫＶＷＧＲＳＲＡＳＲ（配列番号：２１４）
ＲＲＱＲＫＳＲＲＴＩ（配列番号：２１５）ＫＡＫＡＡＡＫＫＳＤ（配列番号：２１６）
ＬＥＮＰＡＡＫＫＴＶ（配列番号：２１７）ＶＤＮＦＤＡＫＫＴＥ（配列番号：２１８）
ＥＨＡＫＥＤＫＫＴＫ（配列番号：２１９）ＫＫＳＥＤＥＫＩＳＮ（配列番号：２２０）
ＫＫＭＱＮＦＲＶＳＴ（配列番号：２２１）ＦＥＶＥＥＫＬＫＴＣ（配列番号：２２２）
ＦＰＮＶＩＫＫＫＳＴ（配列番号：２２３）ＫＬＳＫＩＫＬＶＳＣ（配列番号：２２４）
ＭＶＧＳＳＫＡＫＳＥ（配列番号：２２５）ＮＡＰＳＫＫＳＩＳＹ（配列番号：２２６）
ＲＫＴＬＫＫＱＬＳＲ（配列番号：２２７）ＲＲＳＥＱＫＡＱＴＥ（配列番号：２２８）
ＳＩＬＶＶＫＫＶＴＳ（配列番号：２２９）ＳＳＳＮＧＫＫＮＳＲ（配列番号：２３０）
ＥＶＲＰＴＱＫＫＴＫ（配列番号：２３１）ＥＮＳＲＳＲＮＫＳＥ（配列番号：２３２）
ＥＹＮＱＲＲＩＬＳＬ（配列番号：２３３）ＳＧＫＲＥＲＫＫＳＥ（配列番号：２３４）
ＷＰＥＲＨＲＲＷＳＳ（配列番号：２３５）ＹＳＡＳＲＲＡＳＳＡ（配列番号：２３６）
ＱＫＮＴＥＳＫＫＴＫ（配列番号：２３７）ＳＬＥＨＲＳＲＮＴＬ（配列番号：２３８）
ＮＮＧＫＥＴＫＫＴＫ（配列番号：２３９）及び
ＩＫＲＫＮＶＲＨＴＮ（配列番号：２４０）
ＨＣＶＰＲＤＬＳＷＬＤＬＥＡＮＭＣＬ（配列番号：２４１）
ＥＣＤＡＡＥＧＡＥＮ（配列番号：２４２）ＥＡＥＡＧＥＧＧＥＮ（配列番号：２４３）
ＱＱＤＥＥＡＧＥＧＮ（配列番号：２４４）ＱＤＤＤＧＧＥＧＮＮ（配列番号：２４５）
ＡＬＱＤＶＥＤＥＮＱ（配列番号：２４６）ＤＥＧＤＡＧＥＧＥＮ（配列番号：２４７）
ＧＧＥＡＰＱＥＰＱＳ（配列番号：２４８）
が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５７】
本発明の核酸分子及びポリペプチドは、先ず単離され、次いで一つ又はそれ以上の所望の生体分子パーティションモチーフを加えるために、組換え技術又は他のプロセスによって修飾される。核酸分子に関して本明細書で使用されている「単離される」という用語は、次のことを意味する。（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅される；（ｉｉ）クローニングによって組み換えにより製造される；（ｉｉｉ）開裂及びゲル分離によって精製され；又は（ｉｖ）例えば、化学合成によって合成される。単離された核酸分子は、当該技術分野でよく知られた組換えＤＮＡ技術によって容易に操作することができる。本発明の実施では、特に指示しない限り、当該技術分野の範囲内である、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の通常の技術を採用する。そのような技術は、”Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); “Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); “Method in Enzymology", “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)のような文献に充分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの製造に応用することができ、それにより、本発明を完成し、実施するものである。特別な態様にとって特に有用な技術は、以下の各項目に於いて考察される。
【００５８】
一態様において、本発明の核酸分子は、真核細胞又は原核細胞内で核酸分子の発現を目的としている遺伝子発現配列に動作可能なように連結されている。「遺伝子発現配列」は、動作可能なように連結している核酸分子の効率的な転写及び翻訳を容易にする、プロモーター配列又はプロモーターエンハンサー組み合わせのような、何れかの制御核酸配列である。遺伝子発現配列は、例えば、構成又は誘導プロモーターのような、哺乳動物又はウイルスプロモーターであってもよい。哺乳動物の構成プロモーターは、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＴＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、βアクチンに対するプロモーター、及びその他の構成プロモーターを包含するがそれらに限定されるものではない。真核細胞で構成的に機能するウイルスプロモーターの例としては、例えば、シミアン・ウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）及び他のレトロウイルスからのプロモーター、及び単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが挙げられる。他の構成プロモーターは、当業者に公知である。本発明の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導プロモーターを包含する。誘導プロモーターは、誘導剤の存在で発現する。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある種の金属イオンの存在で転写及び翻訳を促進するよう誘導される。他の誘導プロモーターは当業者に公知である。
【００５９】
一般的に、遺伝子発現配列は、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ、転写及び翻訳の開始に関連する５’非転写及び５’非翻訳配列を包含しなければならない。特に、５’非転写配列のような配列は、動作可能なように連結結合した核酸の転写を調節するプロモーター配列を包含するプロモーター領域を含むものである。遺伝子発現配列は、任意に、エンハンサー配列又は上流活性化配列を包含していてもよい。
【００６０】
核酸配列及び遺伝子発現配列が共有結合しており、遺伝子発現配列の影響下又は制御下にコード配列の転写及び／又は翻訳が進められる場合に、「動作可能に連結されている」と云われる。配列が機能的タンパク質に翻訳されることが望まれ、５’遺伝子発現配列におけるプロモーターの誘導が核酸配列の転写をもたらすものであり、そして、２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の誘導をもたらすことがなく、（２）配列の転写を指向するプロモーター領域の能力を妨害しないなら、又は（３）タンパク質に翻訳されるものに相当するＲＮＡ転写能が妨害されないなら、２つのＤＮＡ配列は動作可能なように連結されていると云われる。このように、遺伝子発現配列が、転写物が望ましいタンパク質又はポリペプチドに翻訳されるように核酸配列の転写を達成することがでれば、遺伝子発現配列は核酸配列に動作可能なように連結されたと云える。
【００６１】
真核細胞又は原核細胞に核酸分子を単独で又はベクターと共に送達することができる。その最も広い概念において、「ベクター」は、（１）核酸分子又はポリペプチドの標的細胞への送達、（２）標的細胞による核酸分子又はポリペプチドの取り込み、又は（３）標的細胞における核酸分子又はポリペプチドの発現、を促進することができるいずれかの輸送手段である。ベクターは、当該技術分野公知の形質導入又はトランスフェクション技術によって細胞に供給することができる。好ましくは、ベクターは、核酸又はポリペプチドを、ベクターを用いない場合にもたらされるより損傷が少ない状態で、標的細胞に輸送する。細胞の表面においてターゲッティングリガンドに対してコグネイト受容体（例えば、受容体、抗体によって認識される抗原）を発現する細胞に選択的にベクターを送達するように、ベクターに「ターゲッティングリガンド」を接着してもよい。（核酸を含有する）ベクターはこのようにして、特異的細胞に選択的に送達される。一般的に、本発明において有用なベクターは、２つのクラスに分けられる、即ち、生物学的ベクター及び化学的／物理的ベクターである。生物学的ベクターは、通常、核酸の送達及び／又は取り込みにより有用である。化学的／物理的ベクターは、通常、核酸の送達及び／又は取り込みにより有用である。
【００６２】
生物学的ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、本発明の核酸配列、及び本発明の核酸配列に連結することができる遊離の核酸断片の挿入又は取り込みによって操作されたウイルス又は細菌由来のその他の媒体を包含するが、これらに限定はされない。ウイルスベクターは、生物学的ベクターの好ましい型であり、モロニーマウス白血病ウイルスのようなレトロウイルス、ハーベイネズミ肉腫ウイルス、ネズミ乳癌ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチニアウイルス、及びポリオウイルスからの核酸配列を包含するが、これらに限定はされない。命名されていないが、当該技術分野公知のその他のベクターも、容易に採用することができる。
【００６３】
選択されたウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子と置換されている非細胞変性真核ウイルスに基づいている。非細胞変性ウイルスは、レトロウイルスを包含し、そのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写、次いで宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの一体化である。一般的に、レトロウイルスは、複製欠損である（即ち、所望のタンパク質の合成を指向することができるが、感染粒子を産生することができない）。そのような遺伝的に変化したレトロウイルス発現ベクターは、一般的に、インビボでの遺伝子の効率のよい形質導入に於いて有用性がある。複製欠損レトロウイルスを産生する標準プロトコール（外来性の遺伝物質のプラスミドへの取り込み、プラスミドを有するパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からウイルス粒子の収集、及びウイルス粒子を有する標的細胞の感染、のステップを包含する）は、Kriegler, M., ■Gene Transfer and Expression, A Laboratory Mannual", W. H. Freeman Co. New York (1990) and Murry, E. J. Ed. ■Methods in Molecular Biology", vol. 7, Humana Press, Inc., Clifton, New Jersey (1991) に提供されている。
【００６４】
いくつかの応用のための別のウイルスは、アデノ随伴ウイルス、二重らせんＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作することができ、広範な細胞型及び種に感染させることができる。それは、熱及び脂質溶媒安定性、様々な系統の細胞における高い形質導入頻度、及び多くの連続した形質導入が可能となる重複感染阻害の欠如、のような更なる利点を有している。報告されているところによれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことができ、それによって挿入突然変異及び挿入遺伝子発現のばらつきの可能性を最小化する。更に、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧がなくても１００継代を超えて組織培養を続けられ、アデノ随伴ウイルスゲノム組込は比較的安定していることを暗示している。アデノ随伴ウイルスは、染色体外の様式でも機能することができる。
【００６５】
発現のための全ての必要な要素を含有する発現ベクターは、市販のものを入手可能であり、当業者に公知である。例えば、Sambrook ら,  Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,  1989を参照。細胞は、ポリペプチド又はその断片をコードする異種のＤＮＡの細胞に導入することにより、遺伝子工学処理される。異種ＤＮＡは、宿主細胞で異種ＤＮＡの発現を可能にする転写要素の動作可能な制御下におかれる。
【００６６】
哺乳動物の細胞に於けるｍＲＮＡ発現系は、Ｇ４１８耐性（安定してトランスフェクトされる細胞系の選択を容易にする）を付与する遺伝子のような選択可能なマーカー及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含有するｐＲｃ／ＣＭＶ又はｐｃＤＮＡ１（Invitrogene, Carlsbad, CAから入手可能）といったものを包含する。更に、霊長類又はイヌの細胞系における発現に適したものは、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）複製起源を含有した、ｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogene, Carlsbad, CA）であり、多コピー染色体外要素としてプラスミドの保持を容易にする。別の発現ベクターは、インビトロで転写を効果的に促進する、ポリペプチド伸張因子１αのプロモーターを含有するｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドである。プラスミドはＭｉｓｈｉｚｕｍａ及びＮａｇａｔａ（Nuc. Acids Res. 18: 5322, 1990）により記載されており、トランスフェクションの実験におけるその使用は、例えば、Demoulin (Mol. Cell. Biol. 16: 4710-4716, 1996)によって開示されている。なお、別の好ましい発現ベクターは、Stratford-Perricaudetによって記載された、Ｅ１及びＥ３タンパク質が欠損している、アデノウイルスである（J. Clin. Invest. 90:  626-630, 1992）。
【００６７】
核酸を細胞に導入するために種々の手法が採用される。そのような手法は、核酸−ＣａＰＯ４沈殿トランスフェクション法、ＤＥＡＥに関連した核酸のトランスフェクション法、目的の核酸を包含するレトロウイルスのトランスフェクション法、リポソーム媒介トランスフェクション法等である。いくつかの使用のためには、核酸が特定の細胞を標的とすることが好ましい。そのような例において、本発明による核酸の細胞への送達に使用される媒体（例えば、レトロウイルス、又は別のウイルス、リポソーム）は、それに付着した標的分子を有することができる。例えば、標的細胞における表面膜タンパク質、又は標的細胞における受容体に対するリガンドに特異的な抗体のような分子は、核酸送達媒体に結合させる、又はその中に取り込むことができる。例えば、リポソームが本発明の核酸を送達するために採用されると、エンドサイトーシスに関連した表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、標的及び／又は取り込みを容易にするためのリポソーム処方に取り入れられる。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に影響を及ぼすタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内在化を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的にし、細胞内半減期を増強するタンパク質等を包含している。重合体の送達系も、又、当業者に知られているように、細胞内に核酸をうまく送達するために使用されている。そのような系は、核酸の経口送達も可能である。
【００６８】
生物ベクターに加えて、化学／物理的ベクターを、核酸分子又はポリペプチドを標的細胞に送達し、それによって取り込みを容易にするのに使用することができる。本発明で使用されるように、「化学／物理的ベクター」は、単離された核酸分子又はポリペプチドを細胞に送達することができる、細菌又はウイルス起源由来のもの以外の天然又は合成分子を表す。
【００６９】
そのような本発明の化学／物理的ベクターの一つに、コロイド分散系がある。コロイド分散系は、水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを包含する脂質を基本にした系を包含する。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、インビボ又はインビトロでの送達ベクターとして有用な人工膜小胞である。０．２〜４．０μのサイズ範囲である、大きな単層の小胞（ＬＵＶ）は、大きな高分子を封入することができることが示されている。ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び無傷（intact）のビリオンは、水性の内層内に封入することができ、生物学的活性な形態で細胞に送達することができる（Fraley ら,  Trends Biochem. Sci. v.6, p. 77 (1981)）。リポソームが効率的な核酸運搬ベクターであるためには、（１）目的の核酸の封入が生物活性の保有とともに高い効率であること、（２）非標的細胞に比較して標的細胞に優先的且つ実質的に結合すること、（３）小胞の水性内容物の、標的細胞の細胞質への送達が高い効率であること、及び（４）遺伝情報の正確で効果的な発現であること、のうち一つ又はそれ以上が必要とされる。
【００７０】
リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質又はタンパク質のような特異的リガンドへ結合することによって、リポソームは特定の組織を標的とすることができる。特定の細胞に対しリポソームが標的とするのに有用なリガンドは、特定の細胞又は組織型に依存している。更に、ベクターが核酸を封入する場合、ベクターは、宿主細胞の核に核酸分子を導く核標的ペプチドに結合することができる。
【００７１】
リポソームは、例えば、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のような陽イオン脂質の形状をなしている、LIPOFECTIN（登録商標）及びLIPOFECTACE（登録商標）として、Gibco BRL, Carlsbad, CAから入手可能である。リポソームの作成方法は、当該技術分野公知であり、多くの刊行物に記載されている。
【００７２】
核酸分子の標的細胞による取り込みを容易にするために使用することができる別の例示的組成物は、リン酸カルシウム及びその他の細胞内輸送を介在する化学的物質、微量注入組成物、電気穿孔法及びそれと同等の組換え組成物（例えば、核酸分子を、標的細胞染色体内の前もって選定された位置に組み込む）を包含する。
【００７３】
本発明は、当業者が望ましい発現ベクター又は複数のベクターを調製することができる、いわゆる発現キットを包含する。そのような発現キットは、前に考察したコード配列の少なくとも別の部分を包含している。所望により、その他の成分も、必要とされる前記の配列が包含される限り、加えてもよい。
【００７４】
本発明は、原核生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、又は真核生物（例えば、ＣＯＳ細胞、酵母発現系及び昆虫細胞中での組換えバキュロウイルス発現）である、宿主細胞及び細胞株をトランスフェクトするための発現ベクター中のｃＤＮＡ配列の使用を包含する。特に有用なのは、ヒト、ブタ、ヤギ、霊長類等のような哺乳動物の細胞である。細胞は、種々の組織型のものであってもよく、初代細胞及び細胞株であってもよい。発現ベクターは関連ある配列、即ち、上に記載した核酸、がプロモーターに動作可能なように連結されていることが必要である。
【００７５】
本発明の核酸及びポリペプチドを含有する細胞は、標準的な細胞培養技術に従って培養することができる。小スケールの細胞培養では、培養物は、培養プレート、培養フラスコ、及び培養皿に入れられる。大スケールの細胞培養では、培養物は、ローラーボトル、スピナーフラスコ及びファーメンターのような他の大スケール培養容器中に入れられる。三次元、多孔性、固体マトリックスにおける培養も使用可能である。
【００７６】
当業者に周知の種々の方法論が、本発明の単離されたポリペプチドを細胞から得るのに利用することができる。ポリペプチドは、クロマトグラフィー法又は免疫認識によって細胞から精製することができる。当業者であれば、ポリペプチドを単離するための公知の方法に従って容易に行うことができる。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、細胞表面膜のような膜から直接単離することができる。ポリペプチドに関して本明細書で使用されている「単離する」とは、その天然の環境から分離され、それを同定又は使用するのに充分な量で存在することを意味する。単離は、例えば、クロマトグラフィー又は電気泳動によって精製することにより達成することができる。単離されたタンパク質又はポリペプチドは、必ずしも必要というわけではないが、実質的に純粋である。「実質的に純粋」という用語は、実用上、また、使用目的に適切な程度に、天然又はインビボ系で見出されるような、他の物質がタンパク質又はポリペプチドに実質的に含まれていないことを意味する。実質的に純粋なポリペプチドは、当該技術分野で周知の技術によって製造可能である。
【００７８】
本発明のポリペプチドは、細胞又は組織の層をばらばらに分解した細胞ホモジネートから得られた細胞懸濁液のような不均質はタンパク質の溶液から単離することができる。培養物全体をホモジナイズし、単離するために下記のステップを行う。培養物は、細胞及び細胞の残屑を除去するために濾過する。集めた上清は、望ましいポリペプチドを単離するめに、標準のクロマトグラフィー処理によって分画する。当業者であれば、限定はされないが、サイズ排除クロマトグラフィー、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー等を包含する手順には精通している。
【００７９】
単離されたポリペプチドが、改変された翻訳後修飾を有する治療用ポリペプチドである場合は、溶解性、安定性、有効性、免疫原性等について修飾の効果を評価するのに、各ポリペプチドに関連する当該技術分野公知のアッセイを用いることができる。これまでに、インターフェロンα２ａ（ロフェロン−Ａ（登録商標）、Hoffmann-La Roche, Inc.）、ペグインターフェロンαａ（ペガシス（登録商標）、Hoffmann-La Roche,Inc.）、インターフェロンα２ｂ（イントロンＡ（登録商標）、Schering-Plough Corporation）、ＰＥＧ化インターフェロンα２ｂ(PEG-Intron（登録商標）、Schering-Plough Corporation)、インターフェロンαｎ１（Wellferon（登録商標）、GlaxoSmithKline）、インターフェロンαｎ３（アルフェロン Ｎ（登録商標）、Interferon Sciences, Inc.）、インターフェロンβ１ａ（アボネックス（登録商標）、Biogen, Inc.; レビフ（登録商標）、Serono, Inc.）、インターフェロンβ１ｂ（ベータセロン（登録商標）、Chiron Corp.; Berlex Laboratories）、インターフェロンγ１ｂ（アクトイムン（登録商標）、Intermune Pharmaceuticals, Inc.）等のインターフェロン類を含むいくつかの治療用の生体物質がＦＤＡに認可されている。更に、ＧＭ−ＣＳＦが、商品名ロイキン（登録商標）（Berlex Laboratories）でＦＤＡにより認可され、ＩＬ−２が商品名プロロイキン（登録商標）（Chiron Corp(登録商標)）で使用が認可された。認可された、また、前臨床の治療薬の両方は、望ましからぬ翻訳後修飾を改変させる生体分子パーティションモチーフを添加することにより、有益なものとなる。
【００８０】
特定の態様において、治療用ポリペプチドは免疫原性であり、本明細書で別に記載するように、ワクチン組成物における、又は抗体生成における使用に適している。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、生体分子パーティションモチーフを有するか又は有さないその他のポリペプチドと会合、又は複合体を形成することができる。生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドが、有さないポリペプチドと複合体を形成する場合には、生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドは、複合体全体を膜に又は膜を通して輸送するよう指令を出すことができる。
【００８２】
本発明は、選択的に細胞表面ポリペプチドに結合する試薬（例えば、検査薬）を同定する又は特徴付ける方法を包含する。本発明の細胞は、試薬をスクリーニングする、又は選択された試薬（例えば、検査薬）の結合特性を評価するのに有利な増加したレベルの細胞の表面での発現を有する。試薬のいくつかは、特定の機能を有する阻害剤である。アッセイにより、阻害剤が細胞の機能的活性を阻害する能力を有するか否かをスクリーニング、及び／又は、決定し、また、阻害が選択的であるか否かを決定する。
【００８３】
検査薬が本発明の細胞表面ポリペプチドに結合するか否かを決定するためにいずれかの公知の結合アッセイを用いる。例えば、推定の結合剤を細胞表面に固定し、次いで標識した細胞表面ポリペプチドに接触させる。推定の結合剤が細胞表面ポリペプチドに結合するか否かを決定するために、推定の結合剤と相互作用する細胞表面ポリペプチドの量又は推定の結合剤に結合しない量を定量する。
【００８４】
検査薬の細胞表面ポリペプチドへの結合を測定するために、検査薬（又は、対照試薬）を含有するアッセイ混合物を細胞表面ポリペプチドに結合する条件下でインキュベートする。化合物の添加順序、インキュベーション温度、インキュベーション時間、及びアッセイのその他のパラメーターは、容易に決定できる。そのような実験をすることは、単に、アッセイパラメーターの至適化であり、アッセイの基本的な構成ではない。インキュベーション温度は通常、４℃〜４０℃である。インキュベーション時間は、迅速かつ高度なスループットスクリーニングを促進するために最小化することができ、通常、１分〜１０時間である。
【００８５】
インキュベーション後、細胞表面ポリペプチドと検査薬の特異的な結合レベルは、使用者に利用可能な従来のいずれの方法によっても検出される。分離ステップは、多くの場合、非結合成分から結合物を分離するのに使用される。分離ステップは、種々の方法で達成することができる。ある種の態様においては、少なくとも成分の一つを固体の基質に固定化すると、そこから結合しなかった成分が容易に分離される。固体基質は、多様な材料及び形状からなり、例えば、ミクロタイタープレート、ミクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子等が挙げられる。基質は好ましくは、シグナル対ノイズ比を最大にするように選択され、主として、バックグランド結合を最小にすると共に分離の容易さとコストを最小にする。
【００８６】
分離は、例えば、容器からビーズ又はディップスティックを除去し、ミクロタイタープレートウエルのような容器を空にし又は希釈し、ビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラム又はフィルターを洗浄溶液又は溶媒でリンスすることによって達成される。分離ステップは、好ましくは、複数回のリンスと洗浄を包含する。例えば、固体基質がミクロタイタープレートの場合、ウエルは洗浄溶液で数回洗浄され、この際、洗浄液は、典型的には、特異的結合に関与しない、例えば塩、バッファー、洗剤（detergents）、非特異的タンパク質等の、インキュベーション混合物の成分を含んでいる。固体基質が磁性ビーズである場合は、ビーズは洗浄溶液で１回又はそれ以上洗浄され、磁石を使用して単離される。
【００８７】
検査薬は、種々の原料に由来するものである。例えば、検査薬は、溶液中で、固定化された形態で、又はファージディスプレーライブラリーとして容易に調製できる変性ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより誘導することができる。コンビナトリアルライブラリーも、一つ又はそれ以上のアミノ酸を含有するペプチドとして合成することができる。ライブラリーは、更に、ペプチド及び非ペプチド合成部分として合成することができる。また、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形態での天然化合物のライブラリーが入手可能であるか、又は容易に作ることができる。更に、天然及び合成されたライブラリー及び化合物は、通常の化学的、物理的、及び生化学的手段により容易に改変することができる。更に、公知の薬物は、試験される試薬の構造類縁体を製造するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等のような、指令又はランダム化学修飾に処してもよい。
【００８８】
一般的に、複数のアッセイが、種々の濃度に対する異なった応答を得るために異なった試薬濃度で平行して行われる。通常、これらの濃度の一つを陰性対照として用いるが、それは即ち、試薬をゼロ濃度又は試薬濃度を測定で検出できる限界以下にする。検査薬は、通常は、有機化合物ではあるが、多数の化学的分類を包含する。特定の態様において、検査薬は、小分子の有機化合物、即ち分子量が５０超で、約２，５００未満のものである。検査薬は、本発明のポリペプチドと構造的に相互作用するのに必要な化学的官能基を含み、通常は、少なくとも、アミン、カルボニル、ヒドロキシ又はカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つの化学的官能基、より好ましくは、少なくとも３つの化学的官能基を含む。検査薬は、上記で同定された一つ又はそれ以上の官能基で置換された炭素環又はヘテロ環式構造及び／又は芳香族又は多環芳香族構造を含む。検査薬は、又、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体又は構造類縁体、又はこれらの組み合わせ等のような生体分子であってよい。試薬が核酸である場合、試薬は通常、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子であるが、非天然の結合又はサブユニットを有する修飾核酸も考慮される。
【００８９】
種々の他の試薬もアッセイ混合物中に包含することができる。これらは塩、バッファー、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、洗剤等を包含し、それらは至適なタンパク質−タンパク質及び／又はタンパク質−核酸結合を容易にするために使用される。そのような試薬は、又、反応成分の非特異的な相互作用又はバックグランドの相互作用を減少するものである。
【００９０】
本発明のポリペプチドは、抗体又は機能的に活性な免疫原結合抗体断片の生成において使用することもできる。本発明の方法は、生体分子パーティションモチーフを包含することで、当該技術分野公知の従来の方法により多様な抗体を得ることができる如何なる望ましい免疫原をも細胞表面に発現させるので、抗体の生成には理想的である。
【００９１】
抗体は、免疫科学に携わる当業者には周知のものである。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、損傷を受けていない抗体分子のみならず免疫原結合能を保持している抗体分子の断片も意味している。そのような断片は、当該技術分野で周知であり、インビトロ及びインビボの両方で通常採用されている。従って、本明細書で用いられる「抗体」という用語は、損傷を受けていない免疫グロブリン分子ばかりでなく、周知の活性断片Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂも意味している。損傷を受けていない抗体のＦｃ断片を欠いている、Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ断片は、循環からより急速に除去され、損傷を受けていない抗体のより少ない非特異的な組織結合を有する（Wahl ら,  J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)）。本発明の抗体は、全て天然の抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、一本鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）及び融合ポリペプチドを含む。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナルである。抗体は、また、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の調製及び使用も、当業者には公知である。本発明は、重鎖及び軽鎖の一対が第１の抗体から得られ、重鎖及び軽鎖の他の一対が異なった第２の抗体から得られたものである、ハイブリッド抗体も包含する。そのようなハイブリッドは、又、ヒト化された重鎖及び軽鎖を使用して形成される。そのような抗体は、しばしば「キメラ」抗体と称される。
【００９２】
一般的に、損傷を受けていない抗体は「Ｆｃ」及び「Ｆａｂ」領域を含有すると云われている。Ｆｃ領域は、補体の活性化に関与し、抗原結合に関与しない。Ｆｃ’領域が酵素的に開裂された、又はＦｃ’領域なしに製造された抗体は、「Ｆ（ａｂ’）２」断片と称され、両方の損傷を受けていない抗体の抗原結合部位を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に開裂された、又はＦｃ領域なしに製造された抗体は、「Ｆａｂ’」断片と称され、損傷を受けていない抗体の抗原結合部位の一つを保持している。Ｆａｂ’断片は、「Ｆｄ」と表示される、共有結合している抗体軽鎖及び抗体重鎖の部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要な決定基である（単一のＦｄ断片は、抗体特異性を変えることなく１０の異なった軽鎖まで関連することができる）。単離されたＦｄ断片は、免疫原性エピトープに特異的に結合する能力を保持している。
【００９３】
抗体は、免疫原として、本発明の細胞表面ポリペプチド、又はその断片、を利用して当該技術分野公知の何れかの方法によって作ることができる。抗体を得る一つの方法は、好適な宿主動物を免得源で免役し、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体製造の標準的手順に従うことである。免疫原は、例えば、ウイルス性、細菌性又は他の病原性生物に由来するものであり、細胞表面に免疫原性の提示を促進する生体分子パーティションモチーフを含有している。本発明の方法は、細胞表面に免疫原の発現レベルを増加させ、それによって免疫原性反応を増強する。本発明の方法は、又、小胞体で別に捕捉されそして分解される免疫原を提供することができ、それによってユニークな免疫原、それ故、ユニークな抗体を提供することができる。
【００９４】
好適な宿主の免疫化は、多くの方法で実行することができる。本発明の細胞表面ポリペプチドをコードする核酸配列は、宿主の免疫細胞によって取り込まれる送達媒体により宿主に提供することができる。細胞は、生体分子パーティションモチーフによって媒介されるように、順繰りに、細胞表面にポリペプチドを発現し、宿主に免疫原性反応を発生させる。本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、また、インビトロで細胞に発現でき、次いで、ポリペプチドが単離され、ポリペプチドを、抗体を産生するのに好適な宿主に投与する。特別な態様において、ポリペプチドは、ワクチンとして（例えば、ＤＮＡ又はポリペプチドワクチン）提供され、宿主に於ける免疫原性の応答は、感染病原体を防御するに充分なものとなっている。
【００９５】
いずれかの手段を使って、抗体は、宿主から精製することができる。抗体精製法は、塩沈殿法（例えば、硫安で）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン又は陰イオン交換カラムで、好ましくは中性ｐＨで行い、増加するイオン強度の勾配で溶出する）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル濾過ＨＰＬＣを含む）、及びプロテインＡ、プロテインＧ、ヒドロキシアパタイト、及び抗免疫グロブリン等の親和性樹脂を用いたクロマトグラフィーを包含する。
【００９６】
抗体は、抗体を発現するように工学処理したハイブリドーマ細胞から、好都合に得ることができる。そのような抗体は、前記したように、先ず、本発明のポリペプチドから得ることができる。ハイブリドーマを作る方法は、当該技術分野で周知である。ハイブリドーマ細胞は、好適な培地で培養することができ、使用済みの培地は、抗体源として使用することができる。抗体をコードするポリヌクレオチドは、抗体を産生するハイブリドーマから順に得ることができ、次いで抗体はそれらＤＮＡ配列から合成により、又は組換えにより得ることができる。大量の抗体を製造するためには、一般的に腹水液を得るのがより便利である。腹水を増やす方法は、一般的にハイブリドーマ細胞を免疫的に実験未使用な組織適合性又は免疫寛容な哺乳動物、特にマウスに注射することを含む。哺乳動物は、好適な組成物、例えば、プリスタンを前投与してから腹水生産を開始してもよい。
【００９７】
本発明の方法により製造されたモノクローナル抗体（Ｍａｂｓ）は、当該技術分野公知の方法で「ヒト化する」ことができる。「ヒト化」抗体は、少なくとも配列の一部が、よりヒトの免疫グロブリンに似ているように当初の形態から変更した抗体である。ヒト化抗体の技術は、非ヒト動物（例えば、ネズミ）抗体が生成される場合に特に有用である。ネズミ抗体をヒト化する方法の例としては、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５，５３０，１０１号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５８５，０８９号、同第５，６９３，７６２号及び同第５，８５９，２０５号に提供されている。一変形において、重鎖及び軽鎖Ｃ領域が、ヒト配列で置換されている。もう一つの変形においては、ＣＤＲ領域に目的の抗原を認識するためのアミノ酸配列を含み、可変フレームワーク領域もまたヒト配列に変換されている。例えば、欧州特許第０３２９４００号を参照のこと。哺乳動物の抗体の非ＣＤＲ領域が、非特異的又は異種特異的抗体の相当する領域で置換され、元の抗体のエピトープ特異性は保持されていることは定説になっている。この技術は、非ヒトＣＤＲが、機能的抗体を製造するために、ヒトＦＲ及び／又はＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合している、ヒト化抗体の開発及び使用に有用である。三つ目の変形において、可変領域が、ヒト及びマウス可変領域のコンセンサス配列を設計し、コンセンサス配列間で異なっているＣＤＲの外側の残余部分を変換することによってヒト化される。
【００９８】
抗体発現用のファージディスプレーライブラリーの構築、特に抗体のＦａｂ又はｓｃＦｖ部分、は当該技術分野で周知である（Heitner, 2001）。抗体を発現するファージディスプレー抗体ライブラリーは、参照して本明細書に取り込まれている米国特許第５，２２３，４０９号に記載されている方法に従って作成することができる。一般的方法論の手順は、本発明の抗体を製造するための本明細書の開示を適応することができる。ヒトモノクローナル抗体を製造する方法は、一般的に以下を包含する：（１）ライブラリーの起源としてヒト免疫グロブリン遺伝子を用いてクローニングベクターに重鎖及び軽鎖を別々にコードする遺伝子ライブラリーを作り、（２）重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子ライブラリーを、ヘテロ二量体の抗体分子を発現し、組み立てることができる単一のジシストロニック発現ベクターに組み込み、（３）組み立てたヘテロ二量体の抗体分子をフィラメント状のファージ粒子の表面で発現させ、（４）前もって選択した免疫原に対してファージ粒子をパンニングするような免疫親和性技術を用いて、表面に発現したファージ粒子を単離し、それによって特定の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子及び前もって選択した免疫原と免疫反応する抗体分子を含有する一つ又はそれ以上のファージミドの種を単離する。前もって選択した免疫原は、細胞表面又は他の細胞膜に、生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドを発現する、本発明の細胞によって提供することができ、又は細胞から得ることができる。
【００９９】
一本鎖可変領域断片は、短い連結ペプチドを用いることによって軽鎖及び重鎖可変領域と連結することにより作成される。充分なフレキシビリティと長さを有するペプチドであれば、いずれもｓｃＦｖでのリンカーとして使用することができる。通常リンカーは、免疫原性をほんの少し有するか又は全く有さないものが選択される。連結されたペプチドの例としては、（ＧＧＧＧＳ）３が挙げられ、一方の可変領域のカルボキシ末端と、もう一方の可変領域のアミノ末端のおよそ３．５ｎｍの間を架橋する。他のリンカー配列も使用することができる。重鎖又は軽鎖の全て又は一部を、いかなる組み合わせで使用してもよい。通常は、全ての可変領域がｓｃＦｖに包含される。例えば、軽鎖可変領域は、重鎖可変領域に連結することができる。また、軽鎖可変領域の一部は、重鎖可変領域又はその部分に連結することができる。二相性ｓｃＦｖを含む組成物が、一成分は免疫原を認識するポリペプチドであり、他の成分は、Ｔ細胞エピトープのような異なった抗原を認識する、異なったペプチドであるように構築することができる。
【０１００】
ＳｃＦＶは、組換え法又は合成法のいずれかで製造することができる。ｓｃＦｖの合成には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する好適なプラスミドを、酵母、植物、昆虫又は哺乳動物の細胞のような真核生物、又はＥ．ｃｏｌｉのような原核生物のいずれかの好適な宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチドによって発現させられたタンパク質を、標準的なタンパク質生成技術を用いて単離する。
【０１０１】
ｓｃＦｖｓの製造に特に有用な系は、Ｅ．ｃｏｌｉのプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Novagen, Madison, Wis.）である。ｐＥＴ−２２ｂ（＋）は、６連続ヒスチジン残基からなるニッケルイオン結合領域を含有しており、発現したタンパク質を好適な親和性樹脂上で精製することが可能となる。ｓｃＦｖｓの製造用の好適なベクターの別の例としては、上に記載した、哺乳動物の細胞におけるｐｃＤＮＡ３（Invitrogen, San Diego, Calif.）が挙げられる。
【０１０２】
発現条件は、ｓｃＦｖが機能性であること、及び好ましくは、最適な三次構造であることが確実でなければならない。使用されるプラスミド（特に、プロモーターの活性）及び宿主細胞に依存して、産生速度を調節することが必要又は有益であろう。例えば、弱いプロモーターの使用、又は低温での発現が、真核生物の系で適切に折りたたまれたｓｃＦｖの製造を最適化するのに必要又は有用であろう。或いは、真核細胞でｓｃＦｖを発現することは好ましいであろう。
【０１０３】
別の態様において、本発明は、ワクチン組成物又はその製造及び使用方法を提供する。ワクチン組成物は、生体分子パーティションモチーフを有し（即ち、「ＤＮＡワクチン」）病原性ポリペプチド又はその断片をコードする本発明の核酸を含むことができる。好適な宿主の免疫化は、例えば、核酸を、宿主の免経細胞により取り込まれる、送達媒体により宿主に提供することによって実施することができる。細胞は、生体分子パーティションモチーフによって媒介されるように、順繰りに、細胞表面でポリペプチドを発現し、宿主に於いて望ましい免疫原性応答を発生させ、それによって宿主を病原生物に対して免疫する。
【０１０４】
本発明のＤＮＡワクチン組成物は通常、好適な医薬賦形剤と共に処方される。本発明のＤＮＡワクチン組成物は、アジュバントを包含することができるが、しかし、組成物の免疫原性が増強されたことにより、追加の免疫促進の必要性がなくなる。
【０１０５】
本発明のワクチン組成物はまた、ポリペプチドの細胞表面発現を増強するために、単離及びワクチン組成物へ取り込まれる前に含有していた生体分子パーティションモチーフを含んだ本発明のポリペプチド又はその断片を、含むことができる。生体分子パーティションモチーフは、ワクチン組成物への取り込みの前に免疫原性ポリペプチドからとり除いてもよい。
【０１０６】
本発明のワクチン組成物は、限定はされないが、哺乳動物、動物（例えば、家畜及び農業動物）及び全ての年齢のヒトを包含する、種々の宿主に投与するのに適している。
【０１０７】
ワクチン組成物に使用するための本発明の核酸及びポリペプチド配列は、感染性の病原体に由来する免疫原性ポリペプチド、又はその断片をコードすることができる。感染性ウイルスの例としては、レトロウイルス科（例えば、ＨＩＶ−１のような、ヒト免疫不全ウイルス、別にＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩ、及びＨＩＶ−ＬＰのような、その他の分離株）、ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、腸内ウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）、カリシウイルス科（例えば、胃腸炎の原因となる菌株）、トガウイルス科（例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）、フラビウイルス科（例えば、デングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱ウイルス）コロナウイルス科（例えば、コロナウイルス）、ラブドウイルス科（例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、フィロウイルス科（例えば、エボラウイルス）、パラミクソウイルス科（例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、ＲＳウイルス）、オルトミクソウイルス科（例えば、インフルエンザウイルス）、ブニヤウイルス科（例えば、ハンタンウイルス、ブニヤウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス）、アレナウイルス科（例えば、出血熱ウイルス）、レオウイルス科（レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス）、ビルナウイルス科、ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）、パルボウイルス科（パルボウイルス）、パポーバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）、アデノウイルス科（殆んどのアデノウイルス）、ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型及び２型、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス科（痘瘡ウイルス、ワクチニアウイルス、ポックスウイルス）、及びイリドウイルス科（例えば、アフリカブタコレラウイルス）、及び未分類ウイルス（例えば、海綿様脳症の病原体、デルタ型肝炎の作用因子（Ｂ型肝炎ウイルスの欠損サテライトと考えられている）、非Ａ非Ｂ肝炎の作用因子（クラス１：内因性に伝播する；クラス２：非経口的に伝播（即ち、Ｃ型肝炎）、ノーウォーク及び関連ウイルス、及びアストロウイルス）を包含する。
【０１０８】
感染性細菌の例としては、ヘリコバクター・ピロリ、ボレリア・バーグドオルフェリー、レジオネラ・ニューモフィラ、マイコバクテリア種（例えば、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイ、マイコバクテリウム・ゴルドネー）、スタフィロコッカス・アウレウス、ナイセリア・ゴノロエ、ナイセリア・メニンギイティディス、リステリア・モノサイトゲネス、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｂ群連鎖球菌）、ストレプトコッカス（ビリダンス群連鎖球菌）、ストレプトコッカス・フェカーリス、ストレプトコッカス・ボビス、ストレプトコッカス（嫌気性種）、ストレプトコッカス・ニューモニエ、病原性カンピロバクター種、エンテロコッカス種、ヘモフィルス・インフルエンザ、バシラス・アントラシス、コリネバクテリウム・ジフテリア、コリネバクテリウム種、エリシペロトリックス・ルシオパティエ、クロストリジウム・パーフィリンジェンス、クロストリジウム・テタニー、エンテロバクター・アエロゲネス、クレブシエラ・ニューモニエ、パスツレラ・マルトシダ、バクテロイデス種、フゾバクテリウム・ヌクレアツム、ストレプトバチラス・モニリフォーミス、トレポネーマ・パリダム、トレポネーマ・パーテヌエ、レプトスピラ、及びアクチノマイセス・イスラエリイを包含する。
【０１０９】
感染性真菌の例としてはクリプトコックス・ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、コクシディオイデス・イミチス、ブラストミセス・デルマチチジス、クラミジア・トラコマティス、カンジダ・アルビカンス。その他の感染性生物（即ち、原生生物）は以下を包含する：熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）及びトキソプラズマ（Toxoplasma gondii）を包含する。
【０１１０】
本発明のワクチン組成物は、本明細書に記載されたもを含む、いずれかの感染性病原体に由来する核酸及び免疫原性ポリペプチドをコードするポリペプチド配列、又はこれらの断片を含む。生体分子パーティションモチーフに包含されるものは、免疫原の細胞表面発現を増加し、それによって宿主への投与の前に免疫原性ポリペプチドの選択及び単離を増強し、又は、ＤＮＡワクチンとして投与されたとき、インビボで免疫原性応答を増強する。
【０１１１】
ワクチン組成物の有効量は、感染性病原体に曝露された宿主を防御できる程度に、ワクチンに対する充分な免疫応答を増加させる量である。好ましくは、予防されるべき有害な生理的症状又は病気の悪影響の一つから全てが、顕著に減少するのが見出される程度に宿主が防御されることである。
【０１１２】
ワクチン組成物は、単回投与で、又は繰り返しの投与で投与することができる。投与量は、例えば、１から１，０００ミリグラムの免疫原を含むものであるが、副作用又は感染の生理的症状をもたらす程の免疫原の量であってはならない。有効な免疫原性薬剤の好適な投与量を決定するための方法は、当該技術分野公知である。
【０１１３】
本発明のワクチンを含有する組成物は、宿主の免疫応答を延長する又は持続するアジュバント、又は許容される担体と併せて投与してもよい。アジュバントは、組み合わされた場合本発明のワクチンに対して免疫応答を増加する物質である。アジュバントは、ワクチンと同時に、及び同じ部位に、又は異なった時間に、例えば、ブースターとして投与してもよい。アジュバントは、ワクチンが投与される様式、部位又は位置から異なった様式で又は部位又は位置の宿主に有利に投与することもできる。アジュバントは、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、Ｅ．ｃｏｌｉから単離された熱不安定な又は熱安定なエンテロトキシン、コレラトキシン又はそのＢサブユニット、ジフテリアトキシン、破傷風トキシン、百日咳トキシン、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント等を包含する。ジフテリアトキシン、破傷風トキシン及び百日咳トキシンのような、トキシンを元にしたアジュバントは、例えばホルムアルデヒド処理によって使用前に不活化してもよい。
【０１１４】
ワクチン組成物は、理想的には、関連のある病原体に曝露されていない宿主に直接投与される。ワクチン組成物は経口又は非経口で投与することができる。非経口投与経路の例としては、皮膚内、筋肉内、静脈内、腹腔内、皮下及び鼻腔内投与経路である。溶液として投与する場合、ワクチン組成物は、水性溶液、シロップ、エリキシル、又はチンキ剤の形態で調製することができる。そのような処方は、当該技術分野公知であり、好適な溶媒系に抗原及びその他の好適な添加物の溶解によって調製される。そのような溶媒は、水、生理食塩水、エタノール、エチレングリコール、グリセリン、Ａｌ液等を包含する。当該技術分野公知の好適な添加物は、公認の色素、香料、甘味料、及びチメロサール（エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム）のような抗微生物保存剤を包含する。そのような溶液は、例えば、部分加水分解ゼラチン、ソルビトール、又は細胞培養培地の添加によって安定化され、及びリン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素カリウム及び／又はリン酸二水素カリウムのような、当該技術分野公知の試薬を使用して、当該技術分野公知の方法により緩衝化される。
【０１１５】
液性処方は、懸濁液及びエマルジョンを包含する。例えばコロイド・ミルを使用した懸濁液、及び例えばホモジナイザーを使用したエマルジョンの製造は、当該技術分野公知である。
【０１１６】
体液系に注射するために設計された、非経口剤形は、宿主の体液のレベルに相当する好適な等張性及びｐＨ緩衝性を必要とする。非経口処方は、使用前に滅菌されなければならない。等張性は、必要とする塩化ナトリウム及びその他の塩類で調節することができる。エタノール又はプロピレングリコールのような、その他の溶媒は、組成物の成分の溶解性及び溶液の安定性を増すために使用することができる。本発明の処方に使用することができる更なる添加物は、Ｄ型グルコース、通常の抗酸化剤及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような通常のキレート剤を包含する。
【０１１７】
特定の宿主について望ましい結果を達成するために、投与経路、投与量及び処方を調節することは、当業者のレベル範囲内に充分はいるものである。
別の態様において、本発明の生体分子パーティションモチーフは、膜に到達不可能な変異した、又はさもなければ欠損ポリペプチドを救援するために有用である。タンパク質の異常な折れ曲がり及び選択輸送はますます多くの疾患に関わるものとなっている。アルツハイマー病及びプリオン関連病（クロイツフェルト・ヤコブ病又はスクレピーのような）のような疾患は、脳組織内における高濃度の不溶性タンパク質凝集の存在によって特徴づけられる。これらのプラークは、異常な折り畳み構造のβアミロイド又はプリオンタンパク質の凝集のようにみえる。、嚢胞性線維症の発症は、患者の７０％に於いて、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）における一つのアミノ酸（ΔＦ５０８）の欠失に起因するものである。この変異により、ＣＦＴＲタンパク質がＥＲに留まる原因となり、細胞表面の作用部位に輸送することができないのである。心筋活動電位に於けるＱＴ間隔の延長は、心臓突然死に至る可能性のあるトルサード・ド・ポワント（Torsade de Pointes）の原因となる。カリウムチャンネルの増孔サブユニット（pore-forming subunit）をコードするヒトのエーテル・ア・ゴー・ゴー（ether-a-go-go）関連遺伝子（ｈＥＲＧ）において同定された多くの突然変異がある。これらの突然変異のサブセットは、ｈＥＲＧタンパク質がＥＲに残留するの原因となり、カリウム電流密度を減少させ、それによってＱＴ間隔の延長を引き起こす。加えて、薬物の５０％超が、ＱＴ間隔延長をもたらすという副作用の故に市場から取り下げられた。これらの薬物の殆んどは、ｈＥＲＧカリウムチャンネル電流の阻害を示し、数知れない程の薬物が、ｈＥＲＧカリウムチャンネルの細胞表面輸送に影響している。生体分子パーティションモチーフの添加によるこれらポリペプチドの好適なターゲッティングが、機能を回復し、これらの障害に関連する症状を緩和することができる。
【０１１８】
宿主細胞の遺伝子変化は、外来性の遺伝物質の添加によって創成される細胞の遺伝物質の、全ての一過性及び安定な変化を包含している。遺伝子変化の例としては、変異した又は欠失した配列を置換するために機能的核酸配列の導入、又は一つ又はそれ以上の生体分子パーティションモチーフを有する治療遺伝子産物をコードする核酸配列の導入のような、いかなる遺伝子導入も包含している。それ故、本発明の方法によれば、一つ又はそれ以上の生体分子パーティションモチーフを、相同的組換え又はウイルス融合によって欠失遺伝子の遺伝子座に取り込むことができる。それ故、目的の遺伝子をコードする核酸配列及び一つ又はそれ以上の生体分子パーティションモチーフを、細胞に安定的に又は染色体外に発現することができ、それによって細胞における機能を回復し又は獲得する。
【０１１９】
それ故、当業者に明らかであるように、種々の好適な方法が、矯正遺伝物質を含んでいる本発明の核酸を細胞に転送するために利用できる。例えば、遺伝子置換療法に従う特定の条件用の治療剤を送達するための好適なベクターの選択、及び選択された発現ベクターの細胞への挿入条件の最適化は、過度の実験を要さず、当業者の技術の範囲内で可能である。
【０１２０】
送達ベクターに特徴的に関連するプロモーターは、転写開始に必要な特異的ヌクレオチド配列を有している。状況に応じて、外部遺伝物質は、更に、望ましい遺伝子転写活性を得るための付加的配列（即ち、エンハンサー）を更に包含する。この考察の目的のために、「エンハンサー」は、単に、プロモーターによって指示された基礎的な転写レベルを変化するように（シスで）コード配列に接触して作用する、いずれの非翻訳ＤＮＡ配列であってもよい。好ましくは、外部遺伝物質は、プロモーターから直ぐ下流の細胞ゲノムに導入され、プロモーター及びコード配列が動作可能に連結されてコード配列の転写が可能となる。好ましいレトロウイルス発現ベクターは、挿入された外部配列の転写を制御するための外部プロモーター要素を包含する。そのような外部プロモーターは、構成プロモーター及び誘導プロモーターの両方を包含する。
【０１２１】
天然に存在する構成プロモーターは、必須の細胞機能の発現を制御する。結果として、構成プロモーターの制御下にある配列は、細胞増殖の全ての条件下で発現する。具体的な構成プロモーターは、ある種の構成的又は「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のプロモーターを包含する：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Scharfmann ら,  1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 4626-4630）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター（Laiら, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10006-10010）、及び当業者に公知のその他の構成プロモーター。更に、多くのウイルスプロモーターが真核細胞で構成的に機能している。それらは以下を包含する：ＳＶ４０の初期及び後期プロモーター、モロニー白血病ウイルス及びその他のレトロウイルスの長末端反復（ＬＴＲＳ）、及び単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、その他多数。従って、上記に参照した構成プロモーターのいずれも、異種核酸配列の転写を調節するために使用することができる。
【０１２２】
誘導プロモーターの制御下にある本発明の核酸配列は、誘導剤の存在下のみ、又はより大きな程度に発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にある転写は、ある種の金属イオンの存在で大きく増加する）。誘導プロモーターは、誘導因子が結合する場合、転写を促進する応答配列（ＲＥ）を包含する。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸及びサイクリックＡＭＰのＲＥがある。特定のＲＥを含有するプロモーターは、誘導応答を得るために選択することができ、ある場合には、ＲＥそれ自体が異なったプロモーターに接着し、それによって組換え遺伝子に誘導性を付与する。この様に、好適なプロモーターを選択することによって（構成対誘導、強対弱）、遺伝子修飾細胞での治療ポリペプチドの発現の存在及びレベルの両方を制御することが可能である。特定の治療剤の治療有効量を送達するためのこれら因子の選択及び最適化は、上記に開示した因子及び患者の臨床上の特徴を考慮に入れることにより、過度の実験を要さず、当業者の技術の範囲内であると見なされる。
【０１２３】
本発明の少なくとも一つのプロモーター及び少なくとも一つの異種核酸に加えて、発現ベクターは、好ましくは、発現ベクターと共にトランスフェクトされた又は形質導入された細胞の選択を容易にするために、選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を包含する。代わりに、細胞は、治療剤をコードする遺伝子を含有する少なくとも一つのベクター、選択遺伝子を含有する別のベクターである、２つ又はそれ以上の発現ベクターでトランスフェクトされる。好適なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子及び／又はシグナル配列（以下に記載する）の選択は、過度の実験を要さず、当業者の技術の範囲内であると見なされる。
【０１２４】
単離された細胞において核酸配列を発現するための特定の発現ベクターの選択及び最適化は、好ましくは一つ又はそれ以上の好適な制御領域（例えば、プロモーター、挿入配列）を有する配列を得、配列が挿入されるベクターを含むベクター構造を作り、培養細胞をインビトロでベクター構造と共にトランスフェクト又は形質導入し、そして発現産物が培養細胞中に存在するか否かを決定することによって達成される。
【０１２５】
本発明において、外部の遺伝物質を細胞に導入する好ましい方法は、複製欠損レトロウイルスを使用してマトリックス上でin situで細胞に形質導入することによる。複製欠損レトロウイルスは、全てのビリオンタンパク質の合成を指向することができるが、しかし感染粒子を作ることはできない。従って、これらの遺伝子的に変換されたレトロウイルスベクターは、培養細胞において遺伝子の効率の良い形質導入への有用性、及び本発明の方法における使用につき特別の有用性を一般的に有している。レトロウイルスは、遺伝物質を細胞に運搬するために広範囲に使用されている。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的プロトコール（外部遺伝物質のプラスミドへの取り込み、プラスミドを有するパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の採集、及びウイルス粒子を有する標的細胞の感染の各ステップを包含する）は、当該技術分野に於いて提供されるものである。
【０１２６】
レトロウイルスを使用する主要な利点は、ウイルスが、治療薬物をコードする遺伝子の単一コピーを効率的に宿主細胞ゲノムに挿入し、それによって、細胞が分裂するとき、細胞の子孫に外部遺伝物質が伝わるのを可能にする。更に、ＬＴＲ領域の遺伝子プロモーター配列は、種々の細胞型において挿入されたコードした配列の発現を増強することが報告されている。レトロウイルス発現ベクターを使用する主な欠点は、（１）挿入変異、即ち、核酸配列の、例えば制御されない細胞増殖を導く標的細胞ゲノムの望ましからぬ位置への挿入、及び（２）ベクターにより運ばれた治療遺伝子が標的ゲノムに組み込まれるための標的細胞の増殖の必要性、である。これらの明らかな制限にもかかわらず、レトロウイルスを経由する核酸配列の送達は、もし形質導入の効率が高く及び／又は形質導入によって得られる標的細胞の数が高ければ、有効であり得る。
【０１２７】
細胞の形質転換用発現ベクターとして有用な、更なる別のウイルス候補は、二重鎖ＤＮＡウイルスのアデノウイルスである。レトロウイルスと同様に、アデノウイルスゲノムは、遺伝子形質導入の発現ベクターとしての使用に、即ちウイルス自体の生産を制御する遺伝情報を除くことによって、適応可能である。アデノウイルスは、通常、染色体外の様式で機能するので、組換えアデノウイルスは、挿入変異の理論的問題を有さない。一方において、標的細胞のアデノウイルスの形質転換は、安定な形質導入をもたらさない可能性がある。しかし、最近、ある種のアデノウイルス配列は、キャリアー配列に染色体内集積特異性を付与し、外部の遺伝物質の安定な形質導入をもたらすことが報告されている。
【０１２８】
それ故、当業者には明らかなように、種々の好適な方法が、目的の遺伝物質を細胞に転移することができる。遺伝子置換療法に従う特定の条件のために、生体分子パーティションモチーフを有するポリペプチドをコードする核酸配列を送達する好適なベクターの選択、及び選択された発現ベクターの細胞への挿入のための条件の最適化は、過度の実験を要さず、当業者の技術の範囲内である。
【０１２９】
別の態様において、生体分子パーティションモチーフの付加は、タグが目的のポリペプチドに親和性を有している（例えば、ヒトの疾患に関連した選択輸送に於いて欠損を有するタンパク質）場合には、タグに連結された生体分子パーティションモチーフを有する細胞を提供することによって達成することができる。この方法論は、当該技術分野では周知である。例えば、Gestwickiら, (2004) Science, 29: 306, 865-9を参照のこと。この内容を参照して本明細書に取り込む。そのような二連分子の送達は、受動的な拡散又は促進された形質導入によって達成されるものである。
本発明の特別な態様は、以下の実施例によって更に記載されるがそれらに限定されるものではない。
（実施例）
【実施例１】
【０１３０】
トラフィッキングモチーフの遺伝子スクリーニング
ペプチド配列のランダムなプール内で、各々がある程度の表面発現ポテンシャル（ＳＥＰ）を有することが予測され、それらに任意に番号をつけることができた。ランダムなアミノ酸配列の多様なスペース内で、大多数の配列は、前進トラフィッキング（即ち、表面発現を促進する能力）又は保持（即ち、ＥＲ又はゴルジ体内で細胞内局在を付与する能力）のいずれかにおいて、効果を有さないことが予測された。それで、ＳＥＰ値に対する配列の数をプロットすると、多数の配列がゼロの近くに集まることが提示された（図１Ａ）。＋１の値に近いもの、例えば、ＤＸＥ又はＦＣＹＥＮＥ（Ma ら,  2001; Nishimura and Balch, 1997）は、強い前進トラフィッキングポテンシャルを有しているであろう。逆に、−１の値に近いもの、例えばＲＫＲモチーフ、は強い保持／回復ポテンシャルを有しているであろう(図１Ａ)。細胞表面で発現するタンパク質の能力は、これら２つの相反する力の正味の量であり、それらは接近可能性（Schwappachら,  2000）及びシグナルモチーフのゾーニング（Shikano and Li, 2003）を包含する別の制御因子に従うものである。存在する前進輸送配列は退行性であるので、ＤＸＥモチーフもＦＣＹＥＮＥモチーフも、ＲＫＲの負のポテンシャルに取って代わるのに充分な正のＳＥＰ値を有しておらず、それ故細胞内局在化が起こることになる。
【０１３１】
膜タンパク質の前進トラフィッキングを媒介する可能性のある配列モチーフを単離し、ＤＸＥ又はＦＣＹＥＮＥの値よりも大きなＳＥＰ値を有するために、遺伝子スクリーニングを、レポータータンパク質としてＫｉｒ２．１内向き整流カリウムチャンネルを用いて開発した。この系は、酵母細胞が正常なカリウム培地（〜４ｍＭ）で生存するためにＴＲＫ１及びＴＲＫ２を必要とするという事実を利用している。二重ノックアウト（ＳＧＹ１５２８）の突然変異表現型は、Ｋｉｒ２．１を包含する多くの哺乳動物のカリウムチャンネルを補完する（Tangら,1995）。Ｋｉｒ６．２カリウムチャンネルからのＲＫＲモチーフのようなＥＲ局在化シグナルを有する融合Ｋｉｒ２．１は、哺乳動物の細胞において効果的な細胞内局在化を導く（Shikano and Li, 2003）。従って、Ｋｉｒ２．１がＫｉｒ６．２カリウムチャンネルからのＲＫＲモチーフと融合された。
【０１３２】
Ａ．分子生物学：
マウスＫｉｒ２．１ｃＤＮＡを、ｐＡＤＮＳベクターのＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位にクローニングすることにより、哺乳動物Ｋｉｒ２．１のための酵母発現ベクターを構築した。最後の残基（Ｉ）をＰｓｔＩ配列（ＬＱ）に置換することによってＫｉｒ２．１のＣ末端に人工的にＰｓｔＩ部位を挿入した。マウスＫｉｒ６．２のＣ末端３６アミノ酸をコードするＤＮＡ断片（ＬＬＤＡＬＴＬＡＳＳＲＧＰＬＲＫＲＳＶＡＶＡＫＡＫＰＫＦＳＩＳＰＤＳＬＳ）を、ＰｓｔＩ及びＮｏｔＩ突出部を有する相補的オリゴヌクレオチドをアニーリング及び伸張することによって生成させ、次いでＫｉｒ２．１に結合した。
【０１３３】
Ｂ．融合タンパク質の増殖試験：
４ｍＭのカリウム濃度にてＳＧＹ１５２８の補体増殖に対する融合ＲＫＲモチーフの能力を試験した。ＲＫＲは、次いで、効果を逆転する能力を試験し、新たな表面発現を起こす能力を試験するために特異的にＲＡＡに変異させた(図１Ｂ)。
【０１３４】
ＲＫＲモチーフのＫｉｒ２．１への融合は、Ｋｉｒ２．１の天然の前進輸送配列モチーフ、ＦＣＹＥＮＥによって付与された前進輸送効果と入れ替わり、優先的にタンパク質をＥＲコンパートメントに移動させた。このレポーター系を使用して、ＲＫＲのＥＲ局在シグナルに起因する保持効果を無効にすることによって表面発現を付与する能力を有する配列モチーフの存在を確認した。
【０１３５】
Ｋｉｒ２．１は、細胞表面に定常状態の発現の増加を付与することが示された、天然の前進輸送配列モチーフ、ＦＣＹＥＮＥ、を有している(図１Ｃ、左パネル)（Maら, 2001）。ＲＫＲモチーフのＫｉｒ２．１への融合は、前進輸送効果に取って代わり、タンパク質を顕著にＥＲコンパートメントに移転させ、ＥＲ局在化シグナルが前進輸送シグナルよりも優位であるという現時点の信念に完全に一致している。このレポーター系を使用して、ＲＫＲのＥＲ局在シグナルに起因する保持効果を無効にすることによって表面発現を付与する能力を有する配列モチーフの存在を試験した。
【０１３６】
Ｃ．ライブラリー選択：
生物学的閾値とレポータータンパク質のクローン発現下に活性の陽性選択の利点を組み合わせて、ランダムペプチドライブラリーを酵母増殖選択に対して構築した。８つのアミノ酸ランダムペプチドを２つの考えを踏まえて選択した：第一に、エピトープは、相互作用するタンパク質によって特異的に認識されるために充分に多様性のある空間をコードするのに充分な長さを有することが必要とされた（Chungら,2003）；第二に、構造的な情報に基づいて、殆んどのタンパク質はＣ末端が露出しており、多くの空間位置確認シグナルがＣ末端に見出される（Chungら,2002）。
【０１３７】
ＲＫＲシグナルの９ａａ下流に、Ｘ８ランダムペプチドライブラリーをコードするＤＮＡ断片でＳＩＳＰＤＳＬＳ配列を置換するためにＳａｃｌ部位を構築した（これでＰＫがＥＬに変異する）。ＳａｃｌとＮｏｔＩ突出部位を有し、Ｐｈｅによって先行される８アミノ酸をランダムにコードするように合成された、センス鎖（５’−ＧＡＧＣＴＣＴＴＴ（ＮＮＫ）８ＴＡ０００ＧＧＣＣＧＣＴＡＣＡＴＡＣＡ、式中ＮはＡのいずれか、Ｔ、Ｃ、Ｇ及びＫはＧ又はＴのいずれかを示す）及びアンチセンス鎖（５’−ＴＧＴＡＴＧＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡ）オリゴヌクレトチドをアニーリング及び伸張することによってＸ８ライブラリーＤＮＡ断片を生成した。Ｅ．ｃｏｌｉをエレクトロポーレーション法によってＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−Ｘ８ライブラリープラスミドで形質転換し、プラスミドを単離するために１０，０００コロニー／プレートで播種した。
【０１３８】
Ｄ．表面Ｋｉｒ２．１発現クローンの酵母スクリーニング：
ＳＧＹ１５２８（ＭＡＴａ；ａｄｅ２−１；ｃａｎｔ−１００；ｈｉｓ３−１１，１５；ｌｅｕ２−３，１１２；ｔｒｐｌ−１；ｕｒａ３−１；ｔｒｋｌ；ＨＩＳ３；ｔｒｋ２；ＴＲＰ１）は、低カリウム培地では増殖しないが、Ｋｉｒ２．１の異種発現によって救出することができる。酵母をｐＡＤＮＳプラスミドで形質転換し、ロイシンを欠き、１００ｍＭＫＣｌを補充したドロップアウト培地で増殖した。形質転換体を相補性検定のために４ｍＭのＫＣｌ培地に播いた。
【実施例２】
【０１３９】
優性な表面発現シグナルの特徴付け
Ａ．Ｘ８ライブラリーのスクリーニング：
Ｘ８ライブラリーのスクリーニングのために、酵母をＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−Ｘ８ライブラリープラスミド３００μｇで形質転換し、形質転換体約２×１０６クローン（１００ｍＭのＫＣｌに増殖させて見積もった）を、４ｍＭ／ＫＣｌプレートに直接播いた。培養５日後、レスキューコロニーを取り上げ、更にプレート単離用の別のプレートで増殖させた。プラスミドの増殖依存性を確認するために、単離したプラスミドをＳＧＹ１５２８に再形質転換し、４ｍＭ／ＫＣｌプレートでの増殖を試験した。４ｍＭのカリウムで増殖が認められたものを再形質転換に処した。再形質転換で増殖が確認された約２００クローンから、Ｘ８配列を分析した。６７の顕著な配列が単離された。哺乳動物の細胞における活性で同定するため、配列を哺乳動物の細胞発現ベクターに移し、ＨＥＫ２９３細胞での一過性トランスフェクションを経て個々に発現させた。哺乳動物の細胞発現ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位で、キメラＫｉｒ２．１ｃＤＮＡｓをｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）に移すことによって構成した。表面発現を検出するため、ＨＡエピトープ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）をＫｉｒ２．１の１１７位に挿入した。このＨＡは、チャンネルの性質に顕著な効果は及ぼさないことが報告されている（Zerangueら,1999）。
【０１４０】
Ｂ．ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＡタグを付けたＫｉｒ２．１チャンネルのフローサイトメトリー分析：
別のＥＲ局在化ＨＡタグを付けたＫｉｒ２．１−ＲＫＲタンパク質の表面発現を、抗ＨＡ抗体により評価し、フローサイトメトリーで定量化した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１０分間、３７℃で、０．５ｍＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳでインキュベーションすることによって収穫し、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及び２％のＦＢＳ（染色培地）を補充したＨａｎｋのバランス塩溶液で洗浄した。全てのＡｂインキュベーション及び洗浄は、染色培地で４℃にて実施された。表面Ｋｉｒ２．１チャンネルについて、細胞をラットモノクローナル高親和性抗ＨＡ（Roche Applied Sciences, IN）、次いで、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ（Vector, Burlingame, CA）で染色した。染色した細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences, San Jose, CA）で、表面発現を試験した。
【０１４１】
Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲの表面発現を付与する効果に基づいて、これらの配列を３つの群に分けた（図２，Ａ及びＢ）。第１群は、検出し得る表面発現はなく、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲのレポーター融合のそれと類似していた。この群は、酵母に特異的な活性を有するモチーフ、又は酵母増殖を助ける異なった機構を表しているのであろう。第２群配列は、野生型Ｋｉｒ２．１又はＫｉｒ２．１−ＲＡＡ対照のそれに類似したレベルで表面発現を指向することができるものである。第３群は、野生型よりも高い表面発現レベルを付与するモチーフを含む。これは、チャンネルタンパク質の表面発現を増強することによる機能の獲得を示している。
【０１４２】
電気生理学的記録とルビジウムフラックスアッセイの両方を、野生型Ｋｉｒ２．１チャンネルを有するＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹ（クローン＃４）の電圧活性化及び他の生物物理学的性質を比較するために実施した。ＲＧＲＳＷＴＹ（＃４）モチーフ（ＳＷＴＹと称する）を、表面発現を増強する力価があるので更なる分析のために選択した。ＳＷＴＹ効果がＲＫＲ依存性であるか否かを試験するため、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの発現をＫｉｒ２．１−ＲＡＡ−ＳＷＴＹのそれと、フローサイトメトリーで比較した。
【０１４３】
フローサイトメトリーデータは、発現レベルは実質的に同等であることを示した（図２Ｃ、右パネル）。より重要なことは、ＲＫＲ又はＲＡＡにかかわらず、両構築物は、野生型よりも比較的高い表面発現レベルを提示したことである。これらの結果は、ＲＧＲＳＷＴＹは、機能の獲得を付与し、野生型Ｋｉｒ２．１に類似した表面発現レベルをもたらすであろう、ＲＫＲ活性を単にマスクすることによって効果を発揮するものではないことを支持している。
【０１４４】
Ｃ．ＳＷＴＹモチーフ特異性：
ＳＷＴＹモチーフはレポーター特異的であるか否かを評価するため、強固な表面発現を有するＩ型膜タンパク質であるＣＤ４をＲＫＲ又はＲＡＡモチーフと融合し、表面発現をＳＷＴＹモチーフの存在下及び非存在下で測定した。３つのＨＡ反復が付いたヒトＣＤ４細胞外及び膜貫通ドメインをコードするＣＤ４（ＨＡ）３ベクターを、記載されているようにして生成した（Shikano and Li,2003）。Ｋｉｒ６．２の３６ａａ配列をＣＤ４（ＨＡ）３のＣ末端のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ部位にクローンニングした。
【０１４５】
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳ、１０分、３７℃でインキュベーションして収穫し、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及び２％のＰＢＳ（染色培地）を加えた、Ｈａｎｋのバランス塩溶液で洗浄した。全ての抗体インキュベーション及び洗浄は、４℃で染色培地中で実施された。表面ＣＤ４には、ＦＩＴＣ共役抗ヒトＣＤ４ｍＡｂ（DAKO, Carpinteria, CA）を使用した。染色した細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences, San Jose, CA）で、表面発現を試験した。
【０１４６】
ＣＤ４のＲＫＲモチーフとの融合は、表面発現をバックグランドレベルまで劇的に減少させた。Ｋｉｒ２．１に類似して、ＲＫＲ又はＲＡＡの変異は、表面発現を回復した。ＳＷＴＹモチーフの存在で、ＣＤ４表面発現は、ＲＫＲの影響をもはや示さず、ＳＷＴＹは再び有効であり、ＲＫＲの効果より優位であることを示している（図２Ｄ）。ＣＤ４−ＲＫＲ−ＳＷＴＹ又はＣＤ４−ＲＡＡ−ＳＷＴＹにおける表面発現は、ＣＤ４−ＲＡＡのそれよりもわずかに高いが、Ｋｉｒ２．１に比較するとあまり顕著でなく、ＣＤ４及びＫｉｒ２．１の異なったオリゴマー状態が表面発現の増加に影響することは無視することができないにしても、既に強固なＣＤ４の発現があるためではないかと思われる。総合して、結果は、ＳＷＴＹモチーフが、４量体のＫｉｒ２．１チャンネル及び単量体のＣＤ４表面抗原の両方で、ＲＫＲが媒介するＥＲ局在化より優位であることを示している。
【実施例３】
【０１４７】
リン酸化ＳＷＴＹ及び１４−３−３タンパク質間の相互作用
Ａ．免疫沈降：
ＳＷＴＹモチーフは、膜タンパク質の表面発現を活発に媒介するタンパク質装置を助けることによって機能しているのか否かを試験するため、ＨＥＫ２９３細胞を対照ベクター、ＨＡ−タグを付したＫｉｒ２．１−ＲＫＲ及びＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹで、それぞれトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を収穫し、溶解し、抗ＨＡ抗体で免疫沈降した。免疫沈降のために、トランスフェクトした細胞をＰＢＳで１回洗浄し、溶解バッファー（１％のＮＰ４０、２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）で、プロテアーゼカクテルと共に、２０分間、４℃で溶解した。２０分間、１１，０００×ｇで遠心分離した後、上清を、前もって１μｇの抗ＨＡ又は抗１４−３−３ＲＡｂ(Santa Cruz)でインキュベートした、プロテインＡ共役アガロースビーズと混合した。５時間のインキュベーションの後、ビーズを５回溶解バッファーで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に試料バッファーで２回煮沸した。
【０１４８】
免疫沈降した材料を分画し、銀染色で可視化した（図３Ａ）。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）を組み合わせたスケールアップ免疫沈降を実施した。ＳＷＴＹ及び対照配列に対してビオチン共役ペプチドを合成し（Abgent, San Diego, CA）、ストレプトアビジン−セファロースビーズで固定化した。ＨＥＫ２９３の細胞溶解物をペプチド−固定化ビーズで、５時間インキュベートし、溶解バッファーで５回洗浄した。ビーズを煮沸し、溶出液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで銀染色により１４−３−３を分析した。２つのＳＷＴＹ特異的バンドとして同定されたＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹ及び１４−３−３イソ型の間の特異的相互作用を、細胞及び生成した形態で、組換え発現した１４−３−３イソ型を用いて更に確認した。
【０１４９】
Ｃ．１４−３−３結合及び表面発現分析：
表面発現と１４−３−３結合とのリンクの可能性を試験するため、ＦＲＧＲＳＷＴＹモチーフをスキャンする一連のＡｌａ置換を、効果に対して重要である残基を決定するために構築した。個々のＡｌａ置換変異体の表面発現を、フローサイトメトリーで試験した。図３Ｂは、個々のＡｌａ置換変異体の表面発現を試験する一連のフローサイトメトリー実験を示している。８つの変異体で、ＦＡＧＲＳＷＴＹ及びＦＲＧＲＳＷＡＹが最も有効であり、表面発現を完全に止めていた(図３Ｂ)。ＦＲＧＡＳＷＴＹも又、野生型Ｋｉｒ２．１又はＫｉｒ２．１−ＲＡＡのレベルと比較できるくらい、表面発現の顕著な減少を提示した。それ故、−２Ｔｈｒ及び上流のＡｒｇ残基は、表面発現の増加には重要である。
【０１５０】
免疫沈降を、対照ベクター及びＡｌａ置換を有するＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹ変異体でトランスフェクトした細胞を用いて実行した。免疫沈降のために、トランスフェクトした細胞をＰＢＳで１回洗浄し、溶解バッファー（１％のＮＰ４０、２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）で、プロテアーゼカクテルと共に、２０分間、４℃で溶解した。２０分間、１１，０００×ｇで遠心分離した後、上清を、前もって、１μｇの抗ＨＡ又は抗１４−３−３ＲＡｂ(Santa Cruz)でインキュベートした、プロテインＡ共役アガロースビーズと混合した。５時間のインキュベーションの後、ビーズを５回溶解バッファーで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に試料バッファーで２回煮沸した。
【０１５１】
得られた免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、銀染色で可視化した(図３Ｃ、上のパネル)。免疫沈降物をＫｉｒ２．１及び１４−３−３に対する抗体と共に瓶詰めした(図３Ｃ、下のパネル)。表面分画のＫｉｒ２．１タンパク質のブロッティングのために、細胞をＥＤＴＡ−ＰＢＳで収穫し、対応する抗体と２０分間４℃、染色培地でインキュベートし、充分に洗浄し、１％ＮのＰ４０バッファーで溶解した。遠心後の上清をプロテインＡ共役ビーズと、５時間、４℃でインキュベートし、結合タンパク質を、ビーズを煮沸することによって溶出した。
【０１５２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割した試料をニトロセルロースに移し、相当する一次抗体、続いてＨＲＰ共役二次抗体でブロットした。ウサギポリクローナル抗Ｋｉｒ２．１抗体は、アミノ酸１８８−４２８に相当するＣ末端細胞質領域に対するものであった。免疫ブロットをＥＣＬシステム（Amersham-Pharmacia, Piscateway, New Jersey）で展開した。
【０１５３】
野生型、ＲＡＡ、ＲＫＲ及びＲＫＲ−ＳＷＴＹを含有する異なったＫｉｒ２．１発現ベクターでトランスフェクトした細胞の銀染色パターンを比較した。表面発現を止めるのに最も効果があった８つの変異株の内、２つの１４−３−３結合を測定した。観察された１４−３−３の減少を、１４−３−３に対する免疫ブロットにより更に実証した。
【０１５４】
表面分画でのＫｉｒ２．１タンパク質のブロッティングのために、細胞をＥＤＴＡ−ＰＢＳで収穫し、相当する抗体で、染色培地中、２０分間、４℃でインキュベートし、頻繁に洗浄し、１％ＮのＰ４０バッファに溶解した。遠心後の上清をプロテインＡ共役ビーズと、５時間、４℃でインキュベートし、結合タンパク質を、ビーズを煮沸することによって溶出した。
【０１５５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割した試料をニトロセルロースに移し、相当する一次抗体、続いてＨＲＰ共役二次抗体でブロットした。ウサギポリクローナル抗Ｋｉｒ２．１抗体は、アミノ酸１８８−４２８に相当するＣ末端細胞質領域に対するものであった。免疫ブロットをＥＣＬシステム（Amersham-Pharmacia, Piscateway, New Jersey）で展開した。
【０１５６】
野生型、ＲＡＡ、ＲＫＲ及びＲＫＲ−ＳＷＴＹを包含する異なったＫｉｒ２．１発現ベクターでトランスフェクトした細胞の銀染色パターンを比較したとき、１４−３−３種のみがＳＷＴＹトランスフェクト細胞において検出された（図３Ｃ、レーン１−５）。Ａｌａスキャンニング変異株の銀染色パターンは、１４−３−３イソ型に結合する変異株の能力と相関する差異のある１４−３−３強度を示した。特に、ＦＡＧＲＳＷＴＹ及びＦＲＧＲＳＷＡＹの両方が、１４−３−３結合の顕著な減少を提示した(図３Ｃ、レーン７及び１２)。１４−３−３の減少を、１４−３−３に対する免疫ブロットによって更に実証し、減少（レーン７）及びシグナルのロス（レーン１２）を示した。Ｋｉｒ２．１の発現レベルは抗ＨＡを使用した免疫ブロットによって示したように比較的矛盾がなく残存しており、このことは、Ｋｉｒ２．１タンパク質の変動のいずれもが、差異のある表面発現及び１４−３−３への結合に関与しているという可能性と相反している。この結果は、サイトメトリーのデータと一致しており、従って、表面発現レベルと１４−３−３結合の効率の繋がりが証明された（図３Ｂ）。
【０１５７】
Ｄ．１４−３−３とＳＷＴＹ関連モチーフの相互作用：
第２群及び第３群（４ｍＭのカリウムで増殖することが以前に見出され、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲの表面発現が幾分付与されているクローンの３つの群の内の２つ）で種々の単離されたクローンに対して、１４−３−３結合において共通の性質の可能性を探るため、一過性トランスフェクションを、これら２群から選択された１９クローンの発現をするため、実施した（図４Ａ）。抗ＨＡ沈降物質を分画し、抗Ｋｉｒ２．１抗体（上のパネル）又は抗１４−３−３抗体（下のパネル）のいずれかで検出した。
【０１５８】
１４−３−３と相互作用することが見出されたクローン(図４Ａ)は、２位にＳｅｒ又はＴｈｒを含む明らかに共通の特徴を有している。Ｓｅｒ又はＴｈｒに対する位置２の位置付けの優先の可能性を決めるため、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹのＣ末端に融合された３つの付加的なアラニンを有する変異型を構築し、発現させた。フローサイトメトリー分析をＳＷＴＹ媒介表面発現に対する変異の効果を決定するために実施した(図４Ｃ)。２位のＴｈｒ又はＳｅｒのリン酸化が役割を果たしているか否かを決定するため、アフィニティ・プルダウン実験を、対照配列（ＳＩＳＰＤＳＬＳ）に相当する合成ペプチド、及びＳＷＴＹ配列の３つの形、ＲＧＲＳＷＴＹ、ＲＧＲＳＷｐＴＹ及びＲＧＲＳＷｐＴＹＡＡＡを用いて実施した。ＨＥＫ２９３細胞溶解物との親和性結合において、充分に洗浄した後の得られた物質をＳＤＳゲルで分離し、銀染色で検出した。
【０１５９】
フローサイトメトリー分析では、ＡＡＡをＳＷＴＹのＣ末端に加えると、ＳＷＴＹが媒介する表面発現が止まることが示された(図４Ｃ)。２位のＴｈｒ又はＳｅｒのリン酸化が役割を果たしているか否かを決定するため、アフィニティ・プルダウン実験を対照配列（ＳＩＳＰＤＳＬＳ）に相当する合成ペプチド、及びＳＷＴＹ配列の３つの形、ＲＧＲＳＷＴＹ、ＲＧＲＳＷｐＴＹ及びＲＧＲＳＷｐＴＹＡＡＡを用いて実施した。ＨＥＫ２９３細胞溶解物との親和性結合において、充分に洗浄した後の得られた物質をＳＤＳゲルで分離し、銀染色で検出した。結果は、ＲＧＲＳＷｐＴＹが、１４−３−３を沈殿させる可能性が最も高いことを示した（図４Ｄ、レーン４）。それ故、ＳＷＴＹモチーフの２位のリン酸化は１４−３−３の相互作用にとって重要である。
【実施例４】
【０１６０】
ＳＷＴＹモチーフによるグリコシル化の調節
Ａ．ＣＤ８タンパク質の表面発現：
グリコシル化と表面発現レベルの相関関係を試験するため、ＳＷＴＹモチーフをＣＤ８抗原と融合し、タンパク質発現の分布とＣＤ８グリコシル化の程度をフローサイトメトリーにて決定するために実験を行った。ＣＤ８ＨＡベクターを、ＣＤ４（ＨＡ）のＣＤ４配列を全長ヒトＣＤ８ａ配列で置換することによって構築した。クローン＃４のＦＲＧＲＳＷＴＹ配列の突然変異誘発を、個々の変異を含んだ相補的オリゴヌクレオチドをアニーリング及び伸張するによって実行した。天然のＸ８配列をＳｆｉＩとＸｈｏＩ部位の間に挿入することによってＣＤ８ベクターにクローニングし、次いでＫｌｅｎｏｗ酵素によってオリゴ伸張を行った。
【０１６１】
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、１０分間、３７℃で、０．５ｍＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳでインキュベーションすることによって収穫し、５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及び２％のＦＢＳ（染色培地）を補充したＨａｎｋのバランス塩溶液で洗浄した。全てのＡｂインキュベーション及び洗浄は、染色培地で４℃にて実施された。ＣＤ８については、マウス抗ヒトＣＤ８ｍＡｂ（Santa Cruz, Santa Cruz, CA）を、ＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ（Vector Laboratories, Burlingame, CA）によって続けた。染色した細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences, San Jose, CA）で、表面発現を試験した。
【０１６２】
フローサイトメトリー分析は、野生型ＣＤ８の強固な表面発現を示したが、ＲＫＲ融合は表面発現を実質的に止めた（図５Ａ）。ＲＫＲ特異的効果を再度、ＲＡＡの点突然変異によって明らかにしたが、表面発現を検出できる程度には減少させなかった。ＳＷＴＹによる野生型に比べて表面発現の更なる増加の欠如は、ＣＤ４(図２Ｄ)の場合に類似して、既にＣＤ８の強固な表面発現があったためであろう。
【０１６３】
Ｂ．ＣＤ８タンパク質の免疫ブロット検出：
タンパク質発現及びポテンシャルモビリティシフトを、全細胞溶解物と、細胞外エピトープに特異的な抗ＣＤ８によって免疫沈降した表面局在受容体の両方の免疫ブロット分析によって決定した。
【０１６４】
表面分画でのＣＤ８タンパク質のブロッティングのために、細胞をＥＤＴＡ−ＰＢＳで収穫し、相当する抗体で、染色培地中、２０分間、４℃でインキュベートし、頻繁に洗浄し、１％ＮのＰ４０バッファーに溶解した。遠心後の上清をプロテインＡ共役ビーズと、５時間、４℃でインキュベートし、結合タンパク質を、ビーズを煮沸することによって溶出した。
【０１６５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割した試料をニトロセルロースに移し、相当する一次抗体、続いてＨＲＰ共役二次抗体でブロットした。免疫ブロットをＥＣＬシステム（Amersham-Pharmacia, Piscataway, New Jersey）で展開した。
【０１６６】
どのような形のＣＤ８−ＲＫＲ及びＣＤ８−ＲＡＡが、総細胞溶解物中に見出されるかを決定するために、ＣＤ８タンパク質を、ＲＫＲ又はＲＡＡのいずれかと比較した。同様な分析を、融合したＳＷＴＹモチーフとＣＤ８−ＲＫＲ（又はＲＡＡ）で実施した。付与されたＣＤ８表面発現を、ＳＷＴＹ（図７）のＣ末端配列に相同的である天然のＫＣＮＫ１５、ＫＣＮＫ３及びＧＰＣＲ１５のＣ末端配列、及び他の１４−３−３結合陽性配列（データは示さない）について試験した。
【０１６７】
ＣＤ８タンパク質とＲＫＲ又はＲＡＡとの比較は、ＣＤ８−ＲＫＲが未成熟型においては総溶解物の中にのみ見出すことができることを明らかにした。対照的に、ＣＤ８−ＲＡＡの大部分がグリコシル化を示す成熟形で存在した。常に、成熟型が、表面免疫沈降によって検出された(図５Ｂ、レーン１〜４)。細胞表面免疫沈降からのＣＤ８−ＲＫＲに検出される成熟シグナルの欠如は、抗体による表面受容体の特異的認識を示している。融合ＳＷＴＹモチーフとのＣＤ８−ＲＫＲ（又はＲＡＡ）の同様な分析を実施した結果、総溶解物中に成熟型の実質的な減少及び未成熟形の増加が明らかになり、ＳＷＴＹモチーフを欠くＣＤ８−ＲＡＡに比較してバンディング強度の逆の比率の上昇を示した（図５Ｂ、レーン３及び５）。更に、表面免疫沈降は、殆んど同じ量の成熟及び未成熟形が沈降したことを明らかにした。２つの形の同程度の比率がＣＤ８−ＲＡＡ−ＳＷＴＹ構築から得られた（図５Ｂ、レーン７及び８）。ＣＤ８−ＲＡＡ、ＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹ、及びＣＤ８−ＲＡＡ−ＳＷＴＹの表面発現レベルが実質的に同じであるならば（図５Ａ）、事実は、全くないかかなり減少したＯ−結合グリコシル化を有するＣＤ８のＳＷＴＹ依存表面発現を支持している。更に、ＳＷＴＹに相同的である(図７)、ＫＣＮＫ１５，ＫＣＮＫ３及びＧＰＣＲ１５の天然のＣ末端配列は、Ｏ−グリコシル化の実質的な減少を有するＣＤ８の表面発現も付与している(図５Ｂ、レーン９〜１４)。同様に、図４Ｂの別の１４−３−３結合陽性配列は、ＣＤ８グリコシル化に同じ効果を有する（データは示さない）。
【０１６８】
Ｃ．１４−３−３とＣＤ８タンパク質の共免疫沈降：
未成熟形の表面発現と１４−３−３結合の間の潜在的な因果関係を決定するために、種々のＣＤ８構築でトランスフェクトされた細胞を、抗１４−３−３抗体と免疫沈降させた。免疫沈降のために、トランスフェクトした細胞をＰＢＳで１回洗浄し、溶解バッファー（１％ＮのＰ４０、２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５０）で、プロテアーゼカクテルと共に、２０分間、４℃で溶解した。２０分間、１１，０００×ｇで遠心分離した後、上清を、前もって、１μｇの抗ＨＡ又は抗１４−３−３ＲＡｂ(Santa Cruz)でインキュベートした、プロテインＡ共役アガロースビーズと混合した。５時間のインキュベーションの後、ビーズを５回溶解バッファーで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に試料バッファーで２回煮沸した。沈降した物質は、指示したようにして、全てのＣＤ８融合に反応性である抗ＨＡ抗体で検出された。図５Ｃは、抗１４−３−３抗体は、ＳＷＴＹ融合構築のみ共沈殿することを示している。更に、共沈殿形の移動性は、未成熟形のそれと同じであり（図５Ｃ、レーン４，５）、ＣＤ８−ＳＷＴＹ融合の未成熟形と１４−３−３タンパク質の選択的会合を示している。
【０１６９】
Ｄ．ＳＷＴＹモチーフとＣＤ８及びＫｉｒ２．１タンパク質のパルス・チェイス：
１４−３−３がＳＷＴＹを持った受容体と関わりを持つ生物発生の段階を評価するため、パルス・チェイス分析を実施した。ＣＤ８構築物とのトランスフェクション後２４時間に、ＨＥＫ２９３細胞を、５％透析ＦＢＳを補充したメチオニン／システイン不含培地で、１時間、３７℃にて、飢餓培養した。ＣＤ８−ＲＡＡ、ＣＤ８−ＲＫＲ及びＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹでトランスフェクトした細胞をＳ３５標識Ｍｅｔ及びＣｙｓで、１０分間パルスし、０時間、１時間及び３時間追跡した。冷ＰＢＳで４回洗浄後、細胞を２ｍＭのメチオニン及びシステインを補充した完全培地中、３７℃にて、指示した時間追跡した。次いで、細胞を、上に記載したようにして、抗ＨＡ抗体と共に免疫沈降のために溶解した。総溶解物の沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、オートラジオグラフィーで記録した。
【０１７０】
ＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの別の一過性成熟形である可能性がある、２つの強いバンドが、パルス後直ぐにＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹについて検出可能であり、１４−３−３に等しい移動性を有していた。同等性を決定するため、類似のパルス・チェイス実験を、Ｋｉｒ２．１又はＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹを安定して発現する細胞を使用して、実施した。Ｋｉｒ２．１タンパク質のパルス・チェイスのために、野生型及びＲＫＲ−ＳＷＴＹの安定したＫｉｒ２．１クローンを、５ｍＭの酪酸ナトリウムと一晩培養した。３７℃、１０分間パルス及び３７℃で指示した時間追跡の後、細胞１セットを、先ず、抗ＨＡ抗体とインキュベートし、次いでプロテインＡビーズによる沈降によって、表面発現したＫｉｒ２．１タンパク質の定量を行った。細胞の別のセットを直接溶解し、抗ＨＡ抗体と前もって結合したプロテインＡビーズによって沈降させた。溶出した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割し、ニトロセルロースに移転し、ホスフォイメージング  システム（Phosphoimaging System：Fujifilm, Stamford, CT）を使用してオートラジオグラフィーによって分析した。
【０１７１】
図６Ａは、パルス直後にはＣＤ８−ＲＡＡの未成熟形が検出されるが、相当する成熟形は１時間後に検出することができることを示している。ＣＤ８−ＲＡＡは、３時間には完全に成熟した（図６Ａ、レーン１，４及び７）。一方、ＣＤ８−ＲＫＲは、細胞内局在化及び表面発現の不成功に一致して、全く成熟しなかった（図６Ａ、レーン２，５，８）。ＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹに独特なものとして、パルス直後に２つの強いバンドが検出された。３時間の追跡の全てにわたって、ＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの未成熟形の移動度に相当する、低いバンドが広がった（図６Ａ、矢印＃３でマークしたバンド）。しかし、ＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの成熟形３時間の追跡後わずかに見ることができた（図６Ａ、レーン３，６，９、矢印＃１でマークした）。ＣＤ８−ＲＡＡ及びＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの表面発現レベルは実質的に同じであるから(図５Ａ)、この事実は、ＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの成熟形は細胞表面で発現することができるという意見に対して更なる支持を提供している。ＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの異なった一過性の成熟形であり得る、２つの強いバンドが１４−３−３のそれと同じ移動性を有している。同等性を決めるため、同じパルス・チェイス実験を、安定的にＫｉｒ２．１又はＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹを発現する細胞を使用して行った。ＣＤ８実験から得られた結果（図６Ａ、例えば、レーン３）に類似して、２つのバンドがパルス直後に再び観察され、それらの存在は、３時間の追跡にわたって持続した（図６Ｂ、レーン７〜１２）。対照的に、２つのバンドは、Ｋｉｒ２．１トランスフェクトした細胞では欠けていて、ＳＷＴＹ依存性であることを立証していた。バンドの強度／比率（考察も参照のこと）及び図３Ａに示した免疫沈降の結果を考慮すると、これら２つのバンドは、１４−３−３イソ型であるようである。１４−３−３が既にＣＤ８−ＲＫＲ−ＳＷＴＹに結合した場合、０時間でＣＤ８の成熟形が検出されないので（図６Ａ、レーン１，３）、１４−３−３とＳＷＴＹを持った受容体の会合は、ゴルジ体に転送する前に起こっているようである。
【０１７２】
表面にあるＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹが１４−３−３と会合するか否かを決定するため、表面にあるＫｉｒ２．１及びＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹを、パルス追跡条件下で選択的に沈降させた。表面にあるＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹトランスフェクト細胞（レーン４〜６）から対Ｋｉｒ２．１トランスフェクト細胞（レーン１〜３）からの１４−３−３の特異的共免疫沈降を調べた。表面受容体の比率を総受容体と比較した。
【０１７３】
図６Ｃは、表面にあるＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹトランスフェクト細胞（レーン４〜６）からのみで、Ｋｉｒ２．１トランスフェクト細胞（レーン１〜３）ではない、１４−３−３の特異的共免疫沈降を示している。これらの結果は、生物発生の初期に確立されたＳＷＴＹモチーフと１４−３−３間の相互作用は、表面にあるＫｉｒ２．１チャンネルにおいても検出されることを示している。表面受容体対総受容体の比率の比較は、ＳＷＴＹモチーフによって４倍を超える改善が付与されることを示している(図６Ｄ)。細胞表面に到達する比率は同程度であるから、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹのシグナルは、Ｋｉｒ２．１のそれよりも、延長された追跡期間内で大幅に強かった。これらのデータ及び定常状態発現分析は、ＳＷＴＹが、細胞表面でタンパク質の半減期を延長することができることを支持している。
【実施例５】
【０１７４】
天然のタンパク質におけるＳＷＴＹモチーフ
Ａ．天然のＳＷＴＹ様配列：
配列情報、突然変異誘発及び１４−３−３タンパク質との会合の組合せは、天然のＳＷＴＹ様配列を有する天然のタンパク質の試験を可能とする。ヒト（Homo sapiens）、マウス（Mus musculus）、ラット（Rattus norvegicus）、虫（Caenorhabditis elegans）、及び酵母（Saccharomyces cerevisiae）について、NCBI RefSeqタンパク質データベース（既知の遺伝子及び遺伝子モデルについてのｍＲＮＡ及びタンパク質を含む、管理された非重複セット）をダウンロードし、所望の性質についてＰＥＲＬで書かれたプログラムで検索した。タンパク質の名前が以下のキーワード：受容体、トランスポーター、膜貫通、膜、チャンネル又は孔、のうちの一つを含むことを要求することによって、膜タンパク質を選択した。バイオインフォマティクス解析を実施して、以下の基準：（１）膜結合、（２）２位のＳｅｒ又はＴｈｒ、及び（３）４位及び５位における正に荷電した残基、に合致するＣ末端を有するタンパク質を検索した。ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）プロテオームについて、Flybase（http://flybase.bio.indiana.  Edu/annot/fbannquery.hform）によって場所を突き止められた原形質膜として注釈をつけられたタンパク質を、他の生物で使われた基準につき手作業で検索した（膜のキーワード基準を除く）。
【０１７５】
ＥＲ局在化シグナルを無効にする天然の配列の活性を、実験的に明らかにし、それによって細胞表面に到達するために、ＣＤ８抗原を、ＨＡタグ及びＲＫＲ・ＥＲ局在化モチーフと融合したレポータータンパク質として選択した（図７Ｂ）。示された天然の配列のリストを、フローサイトメトリーによってＣＤ８の表面発現、及び共免疫沈降によって１４−３−３結合について試験した。いくつかの群は、３つのカリウムチャンネル（ＫＣＮＫ３、ＫＣＮＫ９及びＫＣＮＫ１５）（ヒト）、膜関連細胞質内タンパク質（マウスのＢＡＳＰ様タンパク質）、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）（ヒト）、新規テトラスパンタンパク質（C. elegans）、及び酵母タンパク質、Ａｎｔ１ｐを含む、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ及び酵母タンパク質を包含していた。これらの配列を持ったＣＤ８融合タンパク質を発現させた。フローサイトメトリー分析を、ＥＲ局在化に打ち勝つ能力を定量するために使用した。
【０１７６】
Ｂ．作用におけるＳＷＴＹ様配列：
天然の状態でＳＷＴＹ様配列の活性を試験するため、２つの顕著な異なったタンパク質：膜ポテンシャルを調節するのに重要なカリウムチャンネルであるＫＣＮＫ３（Lopes ら, 2000）及び、ＨＩＶの共受容体であるＧタンパク質結合受容体（Marescaら,2003；Wade-Evansら,2001）を選択した。ＰＣＲにより、２１３位にＨＡエピトープが挿入されているラットＫＣＮＫ３を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位でｐｃＤＮＡ３（＋）にクローン化した。ＰＣＲにより、ヒトＧＰＲ１５をＮ末端のＨＡエピトープと共に、ＳａＩＩ及びＮｏｔＩ部位でｐＥＭＶベクターにクローン化した。
【０１７７】
抗体結合の後にフローサイトメトリーを、野生型ＫＣＮＫ３及び培養したＨＥＫ２９３細胞のＧＲＰ１５の一過性発現に起因する表面発現を検出するのに使用した。トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳで、１０分間、３７℃にてインキュベーションにより収穫し、次いで５ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）及び２％ＦＢＳ（染色培地）を補足したＨａｎｋのバランス塩溶液で洗浄した。全ての抗体インキュベーション及び洗浄は、洗浄培地で、４℃にて実施した。ＨＡ−ＫＣＮＫ３及びＨＡ−ＧＰＲ１５について、マウス抗ＨＡ抗体（Santa Cruz, Santa Cruz, CA）結合を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Moleculer Probes, Eugene, OR）によって検出した。染色した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（BD Biosciences, San Jose, CA）で表面発現を試験した。同様の分析を、Ｃ末端、ＫＣＮＫ３についてＳ４１０Ａ、及びＳ２５９ＡをＧＰＲ１５に、点変異の導入により実行した。ＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５タンパク質の局在化を更に共焦点顕微鏡により試験した。
【０１７８】
これらの２つのタンパク質は、ＳＷＴＹ様配列（図７Ｂ）を有しており、培養ＨＥＫ２９３細胞での野生型ＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５の一過性発現は、抗体結合の後にフローサイトメトリーによって容易に検出される表面発現をもたらした。点突然変異をＣ末端、ＫＣＮＫ３に対してはＳ４１０Ａ、及びＧＰＲ１５に対してはＳ２５９Ａ、に導入した場合、表面発現におけるかなりの減少がフローサイトメトリーによって検出された（図８Ａ、上のパネル）。ＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５タンパク質の局在化を共焦点顕微鏡によって更に試験した。野生型タンパク質の局在化が、細胞表面に見出された。対照的に、突然変異タンパク質は、細胞内コンパートメントに顕著な蓄積を表示した。ＫＣＮＫ３−Ｓ４１０Ａ又はＧＰＲ１５−Ｓ２５６Ａの表面発現は検出されなかった（図８Ａ、下のパネル）。
【０１７９】
Ｃ．ＳＷＴＹ機能の保存：
ＳＷＴＹは、ＫＮＫ３及びＧＰＲ１５タンパク質で同等に機能するか否かを決定するために、Ｃ末端をＲＧＲＳＷＴＹ又はＲＧＲＳＷＴＹのいずれかで置換することによって構築されたキメラＫＣＮＫ３又はＧＰＲ１５タンパク質を試験した。野生型及びキメラタンパク質に対して結合する１４−３−３の比較を、タグ付けしたＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５に特異的な抗ＨＡ抗体で共免疫沈降を使用して実行した。ＫＣＮＫ３とＧＰＲ１５両方の表面発現を補助する能力を、ＳＷＴＹ及びＳＷＡＹについて試験した。
【０１８０】
１４−３−３タンパク質の特異的会合を、野生型ＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５と共に、しかしＣ末端で突然変異した形ではなく、検出した（図８Ｂ，レーン４及び５）。キメラチャンネル及び受容体タンパク質を、表面発現について試験した。図８Ｃは、ＳＷＡＹでなく、ＳＷＴＹがＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５の両方の表面発現を補充する能力があったことを示している。これらの結果は、新たに単離したＲＧＲＳＷＴＹは、ＫＣＮ３（ＬＭＫＫＲＲＳＳＶ）及びＧＰＲ１５（ＲＲＫＲＳＶＳＬ）の２つのＣ末端配列に機械論的に同等であることを示している。更に、これらの実験は、２つの顕著に異なった天然タンパク質を使用して、リン酸化に繋がる配列、１４−３−３結合に繋がる配列、及び表面発現に繋がる配列の直接の証拠を提供している。
【０１８１】
上記の発明について、明確さと理解のために説明及び例示を目的として詳しく述べてきたが、ある種の変更及び変形を実施することができることは、当業者には明らかである。よって、当該記載及び実施例は、番号を付された添付の請求項によって示されている本発明の範囲を何ら限定するものではないものと理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
以下の詳細な説明は、例示目的のためのものであり、何ら、本発明を記載された特定の態様に限定するものではないが、参照して本明細書に取り込む添付の図面と併せて理解されよう。本発明の種々の好ましい特徴及び態様を、限定はされないが、上記実施例及び以下の添付図面にて示すものである。
【図１Ａ】図１Ａは、細胞表面発現ポテンシャル（ＳＥＰ）の仮説を描いたものである。プロットは、表面発現又は細胞内保存（横軸）のいずれかを付与する能力の関数としてランダムペプチドライブラリーからの配列の仮説的分布（縦軸）を表示している。グラフの形及び対称性は、図式化したものであることは云うまでもない。２つの点線は、（ＲＫＲのような）ＥＲ局在性シグナル及び（ＤＸＥ及びＦＣＹＥＮＥのような）前進輸送シグナルに対するＳＥＰ値の仮説的閾値を表す。矢印は、閾値に対するそれらのＳＥＰ値を表す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、４ｍＭ又は１００ｍＭのカリウムの存在下、異なった融合ペプチド、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ及びＫｉｒ２．１−ＲＡＡと共に、Ｋｉｒ２．１内向き整流カリウムチャンネルの酵母増殖試験を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃ、左側は、天然の前進輸送配列モチーフ、ＦＣＹＥＮＥ、とＫｉｒ２．１レポーター、及び、右側は、図に示したように４ｍＭ又は１００ｍＭカリウムを含有する培地中で〜１０，０００ライブラリー形質転換体の増殖比較を示す。円で囲んだ領域は、選択プレートで増殖したコロニーを図示する。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｘ８ランダムペプチドスクリーニングから推定されるアミノ酸配列を列挙したものである。配列は、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲの表面発現を付与する能力に従ってグループ化してあり、第１群は実質的に検出される表面発現がないことを示し、第２群は野生型Ｋｉｒ２．１又はＫｉｒ２．１−ＲＡＡ対照の表面発現に類似したレベルでの表面発現を方向付けることができ、そして第３群は野生型よりも高い表面発現レベルを付与している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＨＥＫ２９３細胞のＨＡタグを付けたＫｉｒ２．１チャンネルのフローサイトメトリー分析を示す。一番上の３つのパネルは、図に示したようにＫｉｒ２．１、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ及びＫｉｒ２．１−ＲＡＡ発現を示す。グレーの領域は、染色シグナルである。１次及び２次抗体で染色されたトランスフェクション試薬だけを与えた細胞をバックグランドとした（空の領域）。下の３つのパネルは、第１、２及び３群の選択されたクローンからのフローサイトメトリーシグナルである。推測したアミノ酸配列は、図示した通りである。
【図２Ｃ】図２Ｃ、左側は、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの概略図、及び、右側は、ＳＷＴＹ−タグ付けＫｉｒ２．１の表面発現とＲＫＲ又はＲＡＡモチーフを比較したフローサイトメトリー分析を図示したものである。
【図２Ｄ】図２Ｄ、左側は、ＣＤ４−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの概略図、及び右側は、ＳＷＴＹ−タグ付けＣＤ４の表面発現とＲＫＲ又はＲＡＡモチーフを比較したフローサイトメトリー分析を図示したものである。
【図３Ａ】図３Ａは、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の免疫沈降から単離したタンパク質の銀染色ゲルのイメージを示す。レーン１は、プロテインＡ単独、レーン２は、プロテインＡ＋抗ＨＡ抗体、レーン３〜５は、偽のベクター（レーン３）、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ構造体（レーン３〜５）又はＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＲＧＲＳＷＴＹ構造体（レーン５）、でトランスフェクトした細胞の溶解物からの抗ＨＡ沈降を示す。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって確認されたタンパク質は、右に同定されており、ＫＤａで表した分子量標準品は左に示してある。
【図３Ｂ】図３Ｂは、抗ＨＡ抗体を使用してＨＡタグを付けたＫｉｒ２．１の表面発現を測定したフローサイトメトリー分析からのヒストグラムを示す。左の４つのパネルは、Ｋｉｒ２．１、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ、Ｋｉｒ２．１−ＲＡＡ及びＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＲＧＲＳＷＴＹの対照構成体を示す。残り８つのパネルは下線の位置によって図示されたＡｌａ置換変異体の発現を表示したものである。
【図３Ｃ】図３Ｃは、抗ＨＡ抗体との免疫沈降を示す。レーン１〜５は、対照ベクター、Ｋｉｒ２．１、Ｋｉｒ２．１−ＲＡＡ、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ及びＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＲＧＲＳＷＴＹからのトランスフェクトした細胞溶解物の免疫沈降に相当する。一番上のパネルは、銀染色ゲルのイメージを構成する。１４−３−３タンパク質ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって同定されたもので、右側に示してあり、ｋＤａでの分子量標準品は左に示してある。中央のパネルは、抗Ｋｉｒ２．１抗体でプローブした同じ物質の免疫ブロットを構成する。一番下のパネルは、全ての７つのイソ型に交差反応する抗１４−３−３抗体を使用する免疫ブロットである。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｋｉｒ２．１及び１４−３−３の免疫ブロット検出を構成する。ＨＥＫ２９３細胞を示されたクローンで一過性にトランスフェクトし、相当する溶解物を抗ＨＡ抗体を使用して免疫沈降に処した。Ｋｉｒ２．１は、抗Ｋｉｒ２．１抗体（上のパネル）により検出された。同じ材料を抗１４−３−３抗体（下のパネル）でプローブした。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＳＷＴＹ様モチーフとのＫｉｒ２．１融合の表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。塗りつぶした領域は、抗ＨＡによって検出されたシグナルであり、空白の領域はバックグランドを表す。相当するクローンは、図示した通りである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｋｉｒ２．１−ＳＷＴＹ及びＫｉｒ２．１−ＳＷＴＹ−ＡＡＡの表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。塗りつぶした領域は、抗ＨＡによって検出されたシグナルであり、空白の領域はバックグランドを表す。相当するクローンは、図示した通りである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、対照配列（ＳＩＳＰＤＳＬＳ）及びＳＷＴＹ配列の３つの型（ＲＧＲＳＷＴＹ、ＲＧＲＳＷｐＴＹ、及びＲＧＲＳＷｐＴＹＡＡＡ）に相当する合成ペプチドを使用した、ＨＥＫ２９３細胞からの１４−３−３タンパク質の親和性沈降を示す。結合したビオチンペプチドとのストレプトアビジン共役ビーズを、相互作用タンパク質を結合及び沈殿するのに使用した。引き下ろされた材料を銀染色によって可視化した。使用したペプチド配列は、一番上に示した。分子量標準（ｋＤａ）は左側に示した。
【図５Ａ】図５Ａは、野生型形態及びＲＫＲ、ＲＡＡ、ＲＫＲ−ＳＷＴＹ及びＲＡＡ−ＳＷＴＹとの融合体の一部として、ＣＤ８タンパク質の表面発現のフローサイトメトリー分析からのヒストグラムを示す。塗りつぶした領域はＣＤ８シグナルを表し、空白の領域は偽のトランスフェクトした細胞からのシグナルを表す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、全細胞融合又は表面分画のＣＤ８及びＣＤ８融合タンパク質の免疫ブロット検出を描写したものである。全（Ｔ）及び表面（Ｓ）分画は、図示したクローンとトランスフェクトし、抗ＨＡ抗体とブロットしたＨＥＫ２９３細胞から調製したものである。Ｏ−結合グリコシル化の異なった程度のＣＤ８タンパク質は、それぞれ成熟及び未成熟として図示されている。およそ５０ｋＤａのシグナルは、ＩｇＧ重鎖である。レーン９〜１４は、総細胞溶解物対ＫＣＮ１５、ＫＣＮＫ３及びＧＰＣＲ１５の天然のＣ末端配列とのＣＤ８の表面発現を示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、１４−３−３とのＣＤ８タンパク質の共免疫沈降の結果を示す。図示された種々のＣＤ８構成物でトランスフェクトされた細胞からの全溶解物を抗１４−３−３Ａｂ（レーン１−５）によって免疫沈降し、次いで溶出物を抗ＨＡＡｂと瓶詰めした。全溶解物のブロットを、レーン６〜１０に示す。分子量標準（ｋＤａ）は左側に示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＣＤ８及びＫｉｒ２．１タンパク質とＳＷＴＹモチーフで実施したパルス・チェイス分析のオートラジオグラフィーの結果を示す。細胞溶解物は、抗ＣＤ８抗体と免疫沈降された。矢印１及び３は、それぞれＣＤ８の成熟及び未成熟形態を示し、矢印２及び４は、１４−３−３イソフォームを示す。分子量標準（ｋＤａ）は左側に示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、安定して発現する野生型Ｋｉｒ２．１及びＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹの細胞株を使用したパルス・チェイス分析のオートラジオグラフィーの結果を示す。細胞は３７℃、１０分間パルスされ、示された時間、３７℃で経時的に追跡され、細胞溶解物は抗ＨＡ抗体で免疫沈降された。２５ｋＤａと３７ｋＤａ（強い上と下のバンド）間のシグナルは、Ｋｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹと共免疫沈降した１４−３−３イソフォームを表す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、Ｋｉｒ２．１及びＫｉｒ２．１−ＲＫＲ−ＳＷＴＹ安定細胞株の表面分画のパルス・チェイス実験の結果を示す。図示されたパルスの後のチェイス時間で安定なトランスフェクトされた細胞を、先ず、抗ＨＡＡｂでインキュベートし、溶解し、そしてＫｉｒ２．１タンパク質をプロテインＡビーズにより沈殿させた。野生型（ｗｔ）及びＳＷＴＹ融合Ｋｉｒ２．１チャンネルペプチドは矢印で示した通りである。
【図６Ｄ】図６Ｄは、放射活性標識Ｋｉｒ２．１の棒グラフでの数量化を構成する。表面免疫沈降物質対総免疫沈降物質の放射活性シグナルの比率を数量化した。パルス後１２０分でのｗｔとＳＷＴＹの比をヒストグラムで表した。
【図７Ａ】図７Ａは、選別基準（選別した天然のＳＷＴＹ様Ｃ末端配列、即ち、ＲＧＲＳＷＴＹに類似する）及び選別基準を逐次適用して、異なった種からヒットしたものを要約したものである。６つの生物の全ての非重複タンパク質の広範囲な組み合わせをＲＧＲＳＷＴＹに類似のＣ末端配列につきスクリーニングした。スクリーニング基準は、フローサイトメトリー及び共免疫沈降からのデータに基づく。用いた特別な基準は、左に列挙してある。各逐次選別基準に合った遺伝子の数を列挙した。１遺伝子の重複スプライス変異を１ヒットとして登録した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、上部のパネルにおいて、ＨＡエピトープ、ＲＫＲモチーフ、及び融合ＳＷＴＹ又はＳＷＴＹ様配列を包含するＣＤ８構築物の概念図を示す。下は、ランダムペプチドライブラリー、又はバイオインフォーマティック探索により同定されたものから選択された遺伝子、の何れかからの配列をＣ末端の位置に従って整列させ、クローン数又はタンパク質名、ＩＤ、及び種によって同定したものである。１４−３−３に結合する能力、及びＲＫＲシグナルを無効にする能力は、共免疫沈降及びフローサイトメトリー分析によって決定された。共ＩＰ及びフローサイトメトリーの結果は図示したように要約される。
【図８Ａ】図８Ａは、Ｃ末端−２位（４つの図の上及び下の各セットの上部２パネル）でのセリンからアラニンの変異あり及びなしに、ＨＡタグを付けたＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５の表面発現のフローサイトメトリー分析からのヒストグラムを示す。塗りつぶした領域はＫＣＮＫ３又はＧＰＲ１５シグナルを表し、空白領域は偽トランスフェクト細胞からのシグナルを表す。ヒストグラムの右側の棒グラフは、表面発現の定量化を示す。野生型及び変異（Ｓ４１０Ａ又はＳ２５９Ａ）タンパク質の平均蛍光強度はＦＣＭ分析によって測定され、偽トランスフェクト細胞のそれと共に差し引いた。亜局在化は、共焦点顕微鏡によって分析された（４つの図の上及び下の各セットの下部２パネル）。トランスフェクトされた細胞を、抗ＨＡ抗体によってＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５に対して透過及び可視化した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、１４−３−３とＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５との共免疫沈降の結果を示す。図示したトランスフェクトした細胞からの総溶解物を抗ＨＡ抗体によって免疫沈降し、溶出物を抗１４−３−３抗体とブロットした。
【図８Ｃ】図８Ｃは、ＲＧＲＳＷＴＹ又はＲＧＲＳＷＡＹで置換したＣ末端配列（ＲＲＳＳＶ又はＲＲＫＲＳＶＳＬ）を有するＫＣＮＫ３及びＧＰＲ１５の、表面発現のフローサイトメトリー分析からのヒストグラムを示す。又、それぞれについて測定した表面蛍光の定量化した棒グラフも示した。
【図９】図９は、修飾生体分子パーティションモチーフとの相互作用により誘導されたタンパク質再分配の概略図を示す。膜貫通タンパク質は、先ず、細胞内コンパートメントに局在して示される。ＳＷＴＹモチーフと関連するタグと相互作用すると、複合体は再分配され、その結果細胞表面での発現が上昇する。
【０１８３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2007525207.tif 000003
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2007525207.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2007525207.tif 000008
【図３Ａ】
2007525207.tif 000009
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
2007525207.tif 000012
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
2007525207.tif 000016
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
2007525207.tif 000019
【図６Ｂ】
2007525207.tif 000020
【図６Ｃ】
2007525207.tif 000021
【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
2007525207.tif 000023
【図７Ｂ】
2007525207.tif 000024
【図８Ａ】
2007525207.tif 000025
【図８Ｂ】
2007525207.tif 000026
【図８Ｃ】
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【図９】
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【配列表】
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