(57)【要約】  本発明は、高速複製及び高いヒト死亡率が関わる新種のペプチド及び、疾病の診断、予防及び治療におけるその使用を提供している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）第２のリジン残基から６〜１０残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基、
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む単離された又は合成されたコロナウイルスペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドアミノ酸配列が７〜２５個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の単離又は合成ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドアミノ酸配列が７〜１６個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の単離又は合成ペプチド。
【請求項４】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１２のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号７１２のアミノ酸配列を有するコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項６】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１７のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号７１７のアミノ酸配列を有するコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項８】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１８のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号７１８のアミノ酸配列を有するコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項１０】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１９のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号７１９のアミノ酸配列を有するコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項１２】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７２０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号７２０のアミノ酸配列を有するコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項１４】
ヌクレオカプシド中に存在する少なくとも１つの単離レプリキン又はスパイク又は外被タンパク質又はコロナウイルスの新興株のその他のタンパク質及び薬学的に受容可能な担体を含んで成るコロナウイルスワクチン。
【請求項１５】
ワクチンが単離レプリキンを複数含む、請求項１４に記載のコロナウイルス。
【請求項１６】
少なくとも１つの単離レプリキンが配列番号７１２のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１７】
少なくとも１つの単離レプリキンが配列番号７１７のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１８】
少なくとも１つの単離レプリキンが配列番号７１８のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１９】
少なくとも１つの単離レプリキンが配列番号７１９のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項２０】
少なくとも１つの単離レプリキンが配列番号７２０のアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項２１】
ヌクレオカプシド中に存在する少なくとも１つの単離レプリキン又はスパイク又は外被タンパク質又はコロナウイルスの新興株のその他のタンパク質及び薬学的に受容可能な担体を含んで成るコロナウイルスワクチンを患者に投与する段階を含んで成る、ＳＡＲＳの予防又は治療方法。
【請求項２２】
前記コロナウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスである、請求項１に記載の単離又は合成ペプチド。
【請求項２３】
（１）１つのヒスチジンを除く全てのリジン；
（２）第２のリジン残基から７〜１０残基のところにある少なくとも１つのリジン；
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（４）少なくとも６％のリジン残基
を含む、約７〜１０アミノ酸という長さの合成レプリキンペプチド。
【請求項２４】
汎用合成エピトープ（ＵＴＯＰＥ）及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物を投与する段階を含んで成る、受動免疫を提供する方法。
【請求項２５】
汎用合成エピトープ（ＵＴＯＰＥ）、アジュバント及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物を投与する段階を含んで成る、受動免疫を提供する方法。
【請求項２６】
ＵＴＯＰＥを投与する段階を含むＳＡＲＳに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の合成レプリキンペプチドを投与する段階を含むＳＡＲＳに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項２８】
請求項１４に記載のワクチンを投与する段階を含むＳＡＲＳに対する免疫応答の誘発方法。
【請求項２９】
ＵＴＯＰＥを投与する段階を含んで成る、ＳＡＲＳの治療方法。
【請求項３０】
ＵＴＯＰＥをコードする合成ペプチド。
【請求項３１】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０、配列番号７４１又は配列番号７４２から成るグループの中から選択された配列の１つによってコードされている、請求項３０に記載のＵＴＯＰＥをコードする合成ペプチド。
【請求項３２】
少なくとも１つの請求項３１に記載のＵＴＯＰＥ及び薬学的に受容可能な担体を含む抗−レプリキンワクチン（ＵＶＡＸ）。
【請求項３３】
前記ＵＴＯＰＥが、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０、配列番号７４１又は配列番号７４２から成るグループの中から選択された配列の１つによりコードされている、ＵＴＯＰＥに特異的な抗ＵＴＯＰＥ抗体。
【請求項３４】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３２によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３５】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３３によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３６】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３４によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３７】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３５によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３８】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３６によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３９】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３７によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４０】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３８によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４１】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４０によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４２】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４１によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４３】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４２によりコードされる、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４４】
該ＵＴＯＰＥが配列番号７３２のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３３のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４６】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３４のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４７】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３５のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４８】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３６のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４９】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３７のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５０】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３８のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３９のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５２】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４０のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５３】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４１のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５４】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４２のアミノ酸配列を有する請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５５】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度（アミノ酸１００個あたりのレプリキン配列数）について分析する段階；
（３）該ウイルスの個々のタンパク質の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期にその個々のタンパク質の各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間にレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項５６】
前記ウイルスの新興株が、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ及びコロナウイルスから成るグループの中から選択されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間の個々のタンパク質のレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項５８】
前記ウイルスの新興株が、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ及びコロナウイルスから成るグループの中から選択されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
診断、予防又は治療を目的としてインフルエンザウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素の個々のタンパク質のいずれかのものの少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列をレプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列中のウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素の個々のタンパク質のいずれかのもののレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に株の同じタンパク質の各々のものの血球凝集素アミノ酸配列内で観察された同じ個々のタンパク質のいずれかのもののレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間の個々のタンパク質のうちのいずれかのもののレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株及びタンパク質を同定する段階；
を含んで成る方法。
【請求項６０】
診断、予防又は治療を目的としてインフルエンザウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素のタンパク質の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列をレプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各菌の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列中のウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株の血球凝集素アミノ酸配列内で観察された血球凝集素タンパク質のレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間の血液凝集素タンパク質のレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株を同定する段階；
を含んで成る方法。
【請求項６１】
新規レプリキンの数の比較を含み、これによって新規レプリキン、すなわち前年にはその正確な構造が存在していなかったものの数が計数され、この新規レプリキンの数はウイルス新興に先立って及びその間に増大する、請求項５５〜６０に記載の方法。
【請求項６２】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの非新興株又は休眠状態のウイルス株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間にレプリキン配列の濃度が最低の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項６３】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）レプリキン計数つまり１００アミノ酸長の配列あたりのレプリキンの数を決定する段階；
（４）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内のレプリキン計数を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン計数と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの計数を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（５）該少なくとも２つの時期の間にレプリキン計数が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
レプリキンは、構造的特徴を共有する新たに発見された種類のペプチドである。レプリキンは、ウイルス、細菌、真菌、癌関連タンパク質、植物及び単核寄生虫の中に発見されており、疾病を治療又は予防する方法の開発における標的として使用されている。レプリキンはこれらの疾病の検出において有用である。同様に本発明は、食用に用いられる植物の成長を刺激するためのレプリキンの使用にも関する。
【０００２】
高速複製は、或る種の細菌、ウイルス及び悪性腫瘍における病原性の特徴であるが、これまで、異なる生体における高速複製に共通の化学反応が記述されたことは全く無い。本出願は、出願人らが発見した高速複製に関係する新しい種類のタンパク質構造について記述している。レプリキンと命名された高速複製に関係する保存された小タンパク質のこの新しいファミリーは、多数の生体及び疾病において高速複製を予見し制御するため及び植物及び動物の生態において高速複製を誘発させるために使用可能である。
【０００３】
我々は、レプリキンを探索するためのアルゴリズムを構築した。このアルゴリズムを応用する中で、エピトープの機能（高速複製）が明らかにされたのみならず、高速複製に関係する機能をもつ相同体ファミリー全体が発見され、我々はこれをレプリキンと命名した。
【０００４】
該アルゴリズムは以下のことに基づいている。すなわち、１）免疫系は認識においてタンパク質全体ではなく一部分に目を向けるという証拠。タンパク質鎖は、免疫系が免疫防御を開始できる対象である外来性構造についてのその認識プロセスの一部として、長さが往々にして６〜１０アミノ酸であるより小さい細片へと免疫系によりまず加水分解される。一例を挙げると、免疫系は、疾病作用物質のタンパク質をより小さいペプチド配列へと切り刻みそれらを読取ることにより疾病の存在を認識する。この原理では、エピトープの構造がひとたびわかった時点でマリグニン癌エピトープの相同体について探索するのに用いられるアルゴリズムの基礎として用いられる。２）３つのリジン（Ｋ）のうち２つが８残基離隔しているマリグニンエピトープの特異的構造は、以上で言及された認識のために免疫系により用いられる明白な「法則」（長さ６〜１０アミノ酸）と合致している。３）マリグニン癌エピトープが非常に強い抗原、すなわち強い免疫応答の発生物質であることが示されたという事実。１０量体ペプチド神経膠腫レプリキン内に３つのリジン（Ｋ）が存在するという事実及びＫがウイルス進入のための潜在的な標的であるＤＮＡ及びＲＮＡに頻繁に結合するものとして知られているという事実。そして、４）マリグニンエピトープの配列内に、８残基離れた２つのＫの間に１つのヒスチジン（Ｈ）が内含され、このことは、複製のためのエネルギーを提供するのに必要とされる酸化還元系の金属に対する連結を示唆している。
【０００５】
適切に位置づけされた官能基を伴う必要に応じた結合ポケットを有する工学処理された酵素及び触媒抗体が、数多くの化学的変換の触媒として作用する上で成功し、時として目覚しい効率を示してきた。特異的なかつきわめて異なる機能をもつ２つ以上の別々のタンパク質が現在往々にして生体により一緒に合成され次に「それらの別々の機能に専念する」べく別々に分割されるのとちょうど同じように、レプリキン構造は、免疫系により別々に認識されると思われる独特の機能をもつ独特のタンパク質であり、現在合理的に工学処理（例えば合成）されて機能的単位を生成することができる。
【０００６】
プロテオミクスの観点から見ると、新たに決定された神経膠腫ペプチド配列に基づくこの鋳型は、関連する保存された構造及びこの場合は複製である特殊な機能をもつ広範なタンパク質の種類の発見を導いた。１つの疾病の病原性に伴うレプリキン濃度の増加の例は、インフルエンザ、ＨＩＶ、癌及びトマト縮葉病ウイルスを含めた疾病において現われる。この種の構造は、酵母、藻類、植物、ジェミニトマト縮葉病ウイルス、ＨＩＶ及び癌といったさまざまな生体内の高速複製の現象に関係している。
【０００７】
高速複製する生体内のレプリキンの存在の検出に加えて、我々は、１）レプリキン濃度（アミノ酸１００個あたりのレプリキン数）、及び２）高速複製に応じた特定の機能的状態におけるレプリキンの組成が、レプリキンの常在する生体の複製速度に量的にも質的にもレプリキンが関係しているという発見事実のための根拠を提供する、ということを発見した。これらの機能的証拠の例としては、グリア芽種細胞内の病原性と高速複製の間、インフルエンザウイルス中のレプリキンとインフルエンザの世界的流行及び地域的流行の予見の間、そしてレプリキン濃度とＨＩＶの高速複製の間に見られる関係がある。
【０００８】
高速複製におけるレプリキンの役割についての第１の機能的根拠は、２５０ＫＤの細胞タンパク質である多形性脳グリア芽腫（神経膠腫）におけるマリグニンと呼ばれる１０ＫＤのペプチドである神経膠腫レプリキンの特性の中に発見された。抗マリグニン抗体は、現在ほとんどの又は全ての細胞型について用いられている早期癌診断試験によって測定された場合に、血清中で濃度が増加した（ＡＭＡＳ）。マリグニンは、組織培養中で、このペプチドの発現及びその抽出可能な膜タンパク質１ミリグラムあたりの濃度が、単位時間あたりの細胞分裂の速度の増加に伴って増大したために、このように命名された。細胞数の増加に正比例したマリグニン量の増加が存在するのみならず、マリグニンの量は富化されている−すなわち細胞数が５倍しか増加していないのに対し１０倍増加した。
【０００９】
マリグニンタンパク質の構造は加水分解と分光分析を通して決定され、これらは、新規１６量体ペプチド配列であることが判明したものを明らかに示してくれた。我々は、我々が健康なヒトゲノムのためのデータベース内で神経膠腫レプリキンタンパク質と命名した１６量体のペプチド配列について探索し、それがこれらのデータベース内に存在しないことを発見した。
【００１０】
従って、神経膠腫レプリキンタンパク質又はその相同体についてその他の生体内で探索するために、固定必要条件アルゴリズムが使用された。「Pub Med」データベース内の４０００以上のタンパク質配列が探索され、高速複製と特定的に結びつけられたウイルス及び植物形態中に相同体が発見された。かかるレプリキンタンパク質の相同体は、その研究者から「複製タンパク質」と呼ばれているタンパク質内で頻繁に発生した。
【００１１】
レプリキン配列の相同体は、全ての腫瘍ウイルス（つまり癌をひき起こすウイルス）及び藻類、植物、真菌、ウイルス及び細菌の「複製タンパク質」内で発見された。
【００１２】
神経膠腫細胞の高速複製における細胞数及び膜タンパク質濃度の５倍の増加に比べマリグニンでは１０倍富化されるという事実は、複製に対するレプリキンの不可欠な関係を示唆している。神経膠腫レプリキンとインビトロで合成しウサギに合成ワクチンとして投与した場合、豊富な抗マリグニン抗体が産生され、血清中抗マリグニン抗体（ＡＭＡＳ）試験の抗原性の根拠を厳正に立証し、初めての潜在的合成癌ワクチン及びその他の生体内でのレプリキンワクチン用プロトタイプを提供した。
【００１３】
癌レプリキンが共有している特異性に基づく（細胞型に優先する）癌レプリキンに対する自然免疫応答及び複製に対するレプリキンの関係の実証により、抗マリグニン抗体での免疫の受動的増加及び合成レプリキンワクチンでの能動的増加が可能となる。
【００１４】
癌患者及び対照由来の８，０９０件の血清標本の研究により、集団内の癌の発生率が増大するのと同様、健康な個体内では抗マリグニン抗体の濃度が年齢と共に増大し、細胞型の如何に関わらず早期悪性腫瘍においてさらに２〜３倍増大することが実証された。インビトロでは、この抗体は癌細胞１個あたりのピコグラム（フェムトモル）で癌に対し細胞毒性をもち、インビボで抗マリグニン抗体の濃度は数量的に癌患者の生存率と関係する。神経膠腫細胞内で示されているように、今や、細胞が死に致らない悪性状態までしか形質転換されておらず、鎮静期又は休眠期にとどまっている癌病期を、レプリキンの濃度増加を特徴とするより活性の高い生命を脅かす複製状態と区別することが可能である。さらに、神経膠腫糖タンパク質１０Ｂが正常な１０Ｂと比べた場合に炭水化物残基の５０％の減少を示すという事実に、癌のウイルス病因論への糸口を見い出せるかもしれない。この減少は、その他のケースでウイルスの進入に結びつけられており、従って、悪性状態への形質転換における１つのステップとしてのグリア細胞の１０Ｂに対するウイルスレプリキンの送達のためのウイルスの付着の証拠であり得る。
【００１５】
神経膠腫及び関連する癌レプリキンについて抗マリグニン抗体で実証された通り、該種類のさまざまな成員により免疫学的特異性が共有されているという事実は、Ｂ細胞及びその産物抗体が類似の認識「言語」を用いてレプリキンを認識しうるということを示唆している。レプリキンの発見で、この共有された免疫学的特異性は、以前理解し難かったことすなわち何故、抗マリグニン抗体が全ての癌で高くなり癌細胞に対し細胞毒性を有し、大部分又は全ての細胞型において癌患者の生存率に関係しているのか、を説明することができる。かくして、免疫学的特異性を共有し細胞型ではなく高速複製の現象に関連づけられる癌レプリキンに対して抗マリグニン抗体が産生される。
【００１６】
癌をひき起こすものとして知られているウイルス内のもの又は形質転換するタンパク質内のもの又は癌細胞タンパク質内で単離されたもの（表２、癌レプリキンについての項を参照のこと）のいずれであれ、癌レプリキンの認識は、充分に全般的なものであることから血清中の抗マリグニン抗体試験（ＡＭＡＳ試験）は１つの有効な一般的癌試験である。それでもなお、癌レプリキンの各々のものの細かい構造（一次アミノ酸配列）には充分に個性及び差異が存在することから、これらを質量分析法といった当該技術分野において一般的な診断方法により組織及び流体内で特異的に検定することが可能である。発見されここで記述されている方法によって、癌タンパク質の配列内で特定のレプリキンがひとたび同定されると、該レプリキンは合成され、同じ構造についての組織及び流体内の検定のための標準として作用する。例えば、１つのこのような癌タンパク質つまり最初に画定された癌細胞レプリキン、神経膠腫レプリキン「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」についての最も確実できわめて特異的な質量分析は表１に示されている。癌レプリキンのこの特異的測定は、癌に罹患した組織又は器官のタイプの診断的特定及びその特異的治療を可能にする。かくして、例えば神経膠腫レプリキンは、有効な治療法が全くない死亡率が９０％以上である全ての腫瘍のうちの最も悪性のものの１つである悪性脳腫瘍、多形性グリア芽腫でのみ発生する。その神経膠腫レプリキンが血清中で測定された場合、脳の悪性腫瘍の存在が検出される。現在では、化学、放射線及びその他の治療で特異的に神経膠腫レプリキンをターゲティングすることも又可能である。同じ新規の診断及び治療的方法は、今や、例えば表２でのみ列挙されている卵巣癌レプリキン及びその他の癌レプリキンについても利用可能である。
【００１７】
高速複製におけるレプリキンの役割についての第２の機能的根拠は、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列及びインフルエンザの地域的流行及び世界的流行の疫学についての過去１００年間からのデータの研究にある。これまでのところ、血清学的血球凝集素及び抗体分類のみがインフルエンザにおいて記述されているが株特異的な保存されたペプチド配列はこれまで全く記述されておらず、疫学的に立証された地域的流行又は高速複製と相関関係をもついずれかの株特異的ペプチド配列の濃度及び組成の変化については全く記述されてきていない。
【００１８】
４つの主要な株すなわちインフルエンザＢ型、（Ａ）Ｈ１Ｈ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２及び（Ａ）Ｈ３Ｎ２型の各々のうちの１つにおける株特異的インフルエンザレプリキンの濃度の４倍〜１０倍の増加が発見され、レプリキン濃度のこのような増加は１９０２年から２００１年まで各株によって特異的にひき起こされたインフルエンザの地域的流行に関連づけされた。その後これらの濃度増加は、その消滅から１年〜最高６４年後の少なくとも１つの特異的レプリキン組成の再出現に加えて新しい株特異的なレプリキン組成の新興に起因するものであることが示された。以前は、来たるインフルエンザの流行期においてどの株が優位を占めるかを予想できるようにする、又はワクチンのための全ウイルス株の年間混合物を考案できるようにする株特異的化学構造は全く知られていなかった。Ｈ３Ｎ２の歴史上最大である最近の急激なＨ３Ｎ２レプリキン濃度の増加（１９９７年〜２０００年）及び１９６８年における高死亡率のＨ３Ｎ２の世界的流行及び１９７５年及び１９７７年の２つの高死亡率の世界的流行において最後に見られたものの２０〜２５年間不在であった特異的レプリキン組成の再出現は、共に来たる地域的流行の警告であるかもしれない。
【００１９】
合成レプリキンは新しいワクチンである。同一の構造が１００年間持続し得るか又はこれが１〜６４年の不在の再出現の後に再出現し得るようにするレプリキン構造のこの高い保存率が観察されたことは、インフルエンザタンパク質におけるアミノ酸の無作為置換に起因する病原性の変化であると以前考えられてきたことが、レプリキンの組織立った保存プロセスに起因する変化である確率がより高いということを表わしている。事実、各アミノ酸の無作為置換が発生した場合、（８４は当然のこととして）１年間平均長のインフルエンザレプリキン配列が保存されることに対する確率は、およそ２27対１であると計算される。
【００２０】
レプリキンの有意な保存はインフルエンザウイルスに独特のものではなく、例えばそれは、口蹄病ウイルスＯ型及びＨＩＶ内ならびに小麦内にも存在する。より最近では、レプリキンの有意な保存は、コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質内に存在している。
【００２１】
高速複製におけるレプリキンの役割についての第３の機能的根拠は、ＨＩＶ内の高速複製に関係することが示されたレプリキン濃度の増加である。早期感染において優勢であるＨＩＶの緩慢に成長する低力価株（ＮＳ１、「Ｂｒｕ」）中のレプリキン濃度は、後期ＨＩＶ感染において優勢であるＨＩＶの急速に成長する高力価株（ＳＩ、「Ｌａｉ」）の６分の１であることがわかった。
【００２２】
その他の例が、高速複製に対するレプリキンの関係について示される。例えば、トマトの収穫を壊滅させるトマト縮葉病ジェミニウイルスにおいては、ＤＮＡに結合することが示されてきた「複製タンパク質」の最初の１６１個のアミノ酸は５つのレプリキンを含有している。
【００２３】
高速複製に関し伝説的に有名であるマラリアにおいては、１つのトリパノゾームから何万個の割合で肝臓からトリパノゾームが放出される。その中には１００個のアミノ酸につき最高１１１の重複レプリキンの濃度で、多数の新規でほぼ「火炎状の」レプリキン構造が発見される。
【００２４】
インフルエンザの地域的流行におけるレプリキン濃度の増加は、悪性神経膠腫細胞の高速複製中の神経膠腫レプリキンの濃度増加に機能的に匹敵し、ＨＩＶ内及び多様なその他の生体範囲内の高速複製に匹敵する。かくしてレプリキンは、異なる生体内での高速複製と結びつけられその構造的基礎の一部であると思われる。
【００２５】
従ってレプリキンの濃度及び組成は、各生物学的集団の生存及び優性にとって中枢的なものである複製プロセスを検出し制御する新しい方法を提供する。高速複製に関係づけされるこれらの新しいタンパク質の発見は、１）レプリキンの質的及び量的決定による病原体の検出、２）未変性レプリキンをターゲティングすること及びワクチンとして合成レプリキンを使用することによる、高速複製が主要な要因である広範囲の疾病の制御及び  ３）藻類及び植物食品の成長を助長するためのレプリキンの使用、の新たな機会を提供する。
【００２６】
検出及び治療が困難であることが判明しており、しかもそのための有効なワクチンが全く存在していない著しい数の疾病及び病原体が存在する。かくして、各障害について、これらの疾病及び病原体を検出、治療又は予防する有効な方法を提供することになる標的を開発する必要性が存在している。
【００２７】
発明の要約
本発明は、レプリキン配列を含むヌクレオチド又はアミノ酸配列を同定するための方法を提供している。該方法は、本書では３点認識方法と呼ばれている。「３点認識」方法を用いることにより、新しい種類のペプチドを構成する（１）第２のリジン残基から６〜１０個のアミノ酸残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基、及び（３）少なくとも６％のリジン残基（レプリキン）、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含むペプチドが、複製、形質転換又は酸化還元機能をもつ藻類、酵母、真菌、アメーバ、細菌、植物及びウイルスタンパク質内で明らかにされた。
【００２８】
該発明の１つの態様においては、レプリキン配列を含む単離又は合成されたペプチドが提供されている。該ペプチドは、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む。
【００２９】
本発明は同様に、身体試料又は環境試料中の汚染性生体の存在を検出するための方法において、
（１）該身体試料又は環境試料から核酸を単離する段階；
（２）レプリキン構造の存在について核酸をスクリーニングする段階；及び
（３）汚染性生体の存在とレプリキン構造の存在を相関させる段階、
を含んで成る方法をも提供する。
【００３０】
該発明のもう１つの態様においては、少なくとも１つのレプリキンペプチドを含む組成物の１投薬量を有効量だけ対象に対し投与する段階を含んで成る、レプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激するためのプロセスが提供されている。１つの実施形態は、新規株が新興した場合に生体内の該新興株内に存在する少なくとも１つのペプチドを含んで成る。
【００３１】
本発明は同様に、本書で定義されているような、レプリキンに対し特異的に結合する抗体ならびにレプリキンに特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体カクテルをも提供する。該発明の１実施形態においては、レプリキンに特異的に結合する単数又は複数の抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物が提供されている。
【００３２】
該発明の１つの態様においては、ウイルスレプリキン配列を含む、その他のタンパク質から単離又は分離された状態の組換え型又は合成ペプチド、又はその他の方法が提供されている。該ウイルスレプリキンペプチドは、（１）第２のリジン残基から６〜１０個のアミノ酸残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む（ウイルスレプリキン）。
【００３３】
本発明は同様に、ウイルスレプリキン配列を含むなかんづく、ヌクレオカプシドタンパク質から単離又は分離された状態の、組換え型又は合成ペプチド又はその他の方法をも提供している。該ウイルスヌクレオカプシドレプリキンペプチドは、（１）第２のリジン残基から６〜１０個のアミノ酸残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む。
【００３４】
本発明は同様に、身体試料又は環境試料中の汚染性ウイルスの存在を検出するための方法において、
（１）該身体試料又は環境試料から核酸を単離する段階；
（２）ウイルスレプリキン構造の存在について核酸をスクリーニングする段階；及び
（３）汚染性ウイルスの存在とウイルスレプリキン構造の存在及びその濃度及び組成を相関する段階、
を含んで成る方法をも提供する。
【００３５】
該発明のもう１つの態様においては、少なくとも１つのレプリキンペプチドを含む組成物の１投薬量を有効量だけ対象に対し投与する段階を含んで成る、ウイルスレプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激するためのプロセスが提供されている。１つの実施形態は、新規株が新興した場合にウイルスの該新興株内に存在する少なくとも１つのペプチドを含んで成る。
【００３６】
本発明は同様に、本書で定義されているような、ウイルスレプリキンに対し特異的に結合する抗体ならびにウイルスレプリキンに特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体カクテルをも提供する。該発明の１実施形態においては、ウイルスレプリキンに特異的に結合する単数又は複数の抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物が提供されている。
【００３７】
本発明は同様に、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する単離されたウイルスペプチドを単数又は複数含む治療用組成物をも提供している。
【００３８】
該発明のもう１つの態様においては、ウイルスレプリキンｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス核酸分子において、前記レプリキンｍＲＮＡ配列が；
（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を表わしている、アンチセンス核酸分子が提供されている。
【００３９】
本発明のさらにもう１つの態様においては、ウイルスに対する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激する方法において、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する少なくとも１つのウイルスレプリキンを有効量投与する段階を含んで成る方法、が提供されている。
【００４０】
もう１つの態様においては、予防又は治療用ウイルスワクチンに内含するためのウイルスを選択する方法において、
（１）前記ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階； 
（４）該少なくとも２つの時期の間にレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階；及び
（５）ウイルスワクチン内に内含するためのペプチドとして段階（４）で同定されたウイルスペプチドの株内に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する段階、
を含んで成る方法が提供されている。
【００４１】
本発明は同様に、
（１）新興株として１つのウイルスの株を同定する段階；
（２）ウイルスワクチン製造のためのペプチド鋳型として新興株内に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する段階；
（３）段階（２）の中で選択された少なくとも１つのレプリキン配列のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する段階；及び
（４）薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントと治療上有効な量の段階（３）のペプチドを組合せる段階
を含む予防又は治療用ウイルスワクチンの製造方法をも提供している。
【００４２】
もう1つの態様において、該発明は、診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間にレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法に向けられている。
【００４３】
該発明のさらにもう１つの態様においては、ウイルスの新興株のタンパク質内に存在する少なくとも１つの単離されたレプリキン及び薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントを含む予防用又は治療用ウイルスワクチンが提供されている。
【００４４】
同じく本発明により提供されているのは、ウイルスの新興株のタンパク質内に存在する少なくとも１つの単離されたレプリキン及び薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントを含む予防用又は治療用ウイルスワクチンを、必要としている患者に対し投与する段階を含んで成る、ウイルス感染を予防又は治療する方法である。
【００４５】
インフルエンザ
インフルエンザは、地球規模の重要性をもつ急性呼吸器疾患である。ワクチン接種を通してインフルエンザウイルスの発生を制御しようとする国際的な努力にもかかわらず、インフルエンザ感染は、罹患及び死亡の重要な原因であり続けている。歴史全体を通して、世界中のインフルエンザの地域的流行及び世界的流行が不規則で予測不可能な間隔で発生してきており、将来においてもそれが発生し続けるものと予想されている。世界的流行及び地域的流行の両方のインフルエンザが及ぼす影響は、罹患率、死亡率及び経済的コストに関して実質的なものである。
【００４６】
インフルエンザワクチンは、今なおインフルエンザウイルスに対する最も有効な防御であるが、ウイルスの突然変異能力及び非ヒト宿主レゼルボアの利用可能性を理由として、インフルエンザは新興又は再興感染であり続けるものと予想されている。地球規模でのインフルエンザサーベイランスは、インフルエンザウイルスがインフルエンザの流行期中に１つの国の内部で及び複数の国及び大陸の間で変動する可能性があると指摘している。抗原不連続変異及び抗原連続変異を監視する上で、ウイルス学的サーベイランスが重要である。地域的流行の影響を査定する上では疾病サーベイランスも同様に重要である。両方のタイプの情報が、ワクチン組成及び抗ウイルス薬の適正な使用の根拠を提供している。しかしながら、これまでのところ、増大する数の新興インフルエンザウイルス株の年に一度の事後の血液学的分類しか存在しておらず、近づきつつあるインフルエンザの地域的流行又は世界的流行を標示するものとしてのウイルスの特異的化学構造は全く同定されていない。現在、一定の与えられた年における活性、不活性又は優勢としてのインフルエンザウイルスの年一回の分類のための唯一の根拠は、ウイルス血球凝集素及びノイラミニダーゼタンパク質の活性である。本出願以前には、地域的流行又は世界的流行の量的警告のために又はより有効でかつ安全なワクチンを設計するために使用できるインフルエンザウイルスの化学構造は全く同定されたことがない。
【００４７】
インフルエンザワクチンの年一回の投与及びワクチンを投与できる期間が短かいことを理由として、ワクチン接種率を改善することに向けた戦略は決定的な重要性をもつ。
【００４８】
該発明の１つの態様においては、レプリキン配列を含有する単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドが提供されている。該インフルエンザレプリキンウイルスペプチドは、（１）第２のリジン残基から６〜１０個のアミノ酸残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む（インフルエンザレプリキン）。
【００４９】
該発明のもう１つの態様においては、少なくとも１つのインフルエンザウイルスレプリキンペプチドを含む組成物の１投薬量を有効量だけ対象に対し投与する段階を含んで成る、インフルエンザウイルスレプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激するためのプロセスが提供されている。１つの好ましい実施形態においては、該組成物は、インフルエンザウイルスの新興株内に存在する少なくとも１つのペプチドを含んで成る。
【００５０】
本発明は同様に、本書で定義されているような、インフルエンザウイルスレプリキンに対し特異的に結合する抗体ならびにインフルエンザウイルスレプリキンに特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体カクテルをも提供する。該発明の１実施形態においては、インフルエンザレプリキンに特異的に結合する単数又は複数の抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物が提供されている。
【００５１】
本発明は同様に、
（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する単離されたインフルエンザウイルスペプチドを単数又は複数含む治療用組成物をも提供している。
【００５２】
該発明のもう１つの態様においては、インフルエンザウイルス血球凝集素レプリキンｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス核酸分子において、前記レプリキンｍＲＮＡ配列が（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を表わしている、アンチセンス核酸分子が提供されている。
【００５３】
本発明のさらにもう１つの態様においては、インフルエンザウイルスに対する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激する方法において、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する少なくとも１つのインフルエンザウイルスレプリキンを有効量投与する段階を含んで成る方法、が提供されている。
【００５４】
もう１つの態様においては、予防又は治療用インフルエンザウイルスワクチンに内含するためのインフルエンザウイルスを選択する方法において、
（１）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株の血球凝集素アミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間にレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株を同定する段階、
（５）インフルエンザウイルスワクチン内に内含するためのペプチドとして段階（４）で同定されたインフルエンザウイルスペプチドの株内に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する段階、
を含んで成る方法が提供されている。
【００５５】
本発明は同様に、
（１）新興株として１つのウイルスの株を同定する段階；
（２）ウイルスワクチン製造のためのペプチド鋳型として新興株内に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する段階；
（３）段階（２）の中で選択された少なくとも１つのレプリキン配列のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する段階；及び
（４）薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントと治療上有効な量の段階（３）のペプチドを組合せる段階
を含む予防又は治療用インフルエンザウイルスワクチンの製造方法をも提供している。
【００５６】
もう1つの態様において、該発明は、診断、予防又は治療を目的としてインフルエンザウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度（１００個のアミノ酸あたりのレプリキン配列数）について分析する段階；
（３）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株の血球凝集素アミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間にレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法に向けられている。
【００５７】
該発明のさらにもう１つの態様においては、インフルエンザウイルスの新興株の血球凝集素タンパク質内に存在する少なくとも１つの単離されたレプリキン及び薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントを含む予防用又は治療用インフルエンザウイルスワクチンが提供されている。
【００５８】
同じく本発明により提供されているのは、インフルエンザウイルスの新興株の血球凝集素タンパク質内に存在する少なくとも１つの単離されたレプリキン及び薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントを含む予防用又は治療用インフルエンザウイルスワクチンを、必要としている患者に対し投与する段階を含んで成る、ウイルス感染を予防又は治療する方法である。
トリパノゾーマ
【００５９】
該発明の１つの態様においては、レプリキン配列を含む単離又は合成されたトリパノゾーマペプチドが提供されている。該トリパノゾーマペプチドは、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基及び、（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む。（トリパノゾーマレプリキン）。
【００６０】
マラリア
有効なワクチンが全く存在せず、治療が困難であることがわかっている１つのトリパノゾーマ障害はマラリアである。マラリアは多数の死者を出し、熱帯地方における肉体的かつ経済的な苦難である。マラリアは、主として治療に対し極めて耐性が強いことがわかっている熱帯性マラリア原虫によってひき起こされ、今までのところ、マラリアのためのワクチンは手に入れにくいものであり続けている。従って、有効なマラリアワクチン及び該疾病を治療又は予防する方法に対する必要性が存在している。本出願は、かかるワクチン及び治療及び予防方法のための根拠を提供する。レプリキンウイルスワクチン及びレプリキンインフルエンザウイルスワクチンの生産及びそれによる治療のための上述の方法は全て、レプリキンマラリアワクチンの生産及びそれによる治療に適用可能である。
【００６１】
本発明においては、マラリアを防止又は治療するためのワクチン及び方法が提供されている。該マラリアワクチンは、少なくとも１つの単離された熱帯性マラリア原虫レプリキンを含む。本発明は同様に、少なくとも１つの単離された熱帯性マラリア原虫レプリキンを含む予防又は治療用ワクチンを有効量だけ患者に投与する段階を含む、マラリアを治療又は予防するための方法をも提供している。
【００６２】
同じく本発明により提供されているのは、熱帯性マラリア原虫のマラリア抗原中に存在する単数又は複数のレプリキンに特異的に結合する抗体を含む抗体、抗体カクテル及び組成物である。
【００６３】
マラリアについてそうであったように本発明に基づいて治療され得るトリパノゾーマのもう１つの例、梅毒トレポネーマ（梅毒）のレプリキンは、梅毒の検出、予防、治療のために使用可能である。
【００６４】
細菌
該発明の１つの態様においては、レプリキン配列（細菌レプリキン）を含む単離又は合成された細菌ペプチドが提供されている。該細菌ペプチドは、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基及び、（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む（細菌レプリキン）。細菌配列リスト及び情報を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）２００３年３月２６日付けの米国出願第１０／１０５，２３２号明細書の全体が参考として内含されている。
【００６５】
本発明は同様に、身体試料又は環境試料中の汚染性細菌生体の存在を検出するための方法において、
（１）該身体試料又は環境試料由来の核酸を単離する段階；
（２）レプリキン構造の存在について核酸をスクリーニングする段階；及び
（３）汚染性生体の存在とレプリキン構造の存在を相関させる段階、
を含んで成る方法をも提供する。
【００６６】
該発明のもう１つの態様においては、少なくとも１つの細菌レプリキンペプチドを含む組成物の１投薬量を有効量だけ対象に対し投与する段階を含んで成る、レプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激するためのプロセスが提供されている。１つの実施形態は、新規株が新興した場合に細菌生体内の該新興株内に存在する少なくとも１つの細菌ペプチドを含んで成る。
【００６７】
本発明は同様に、本書で定義されているような、細菌レプリキンに対し特異的に結合する抗体ならびに細菌レプリキンに特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体カクテルをも提供する。該発明の１実施形態においては、細菌レプリキンに特異的に結合する単数又は複数の抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物が提供されている。
【００６８】
本発明は同様に、
（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基； 
（３）少なくとも６％のリジン残基；及び
（４）薬学的に受容可能な担体、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する単離された細菌ペプチドを単数又は複数含む治療用組成物をも提供している。
【００６９】
該発明のもう１つの態様においては、細菌レプリキンｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス核酸分子において、前記レプリキンｍＲＮＡ配列が（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を表わしている、アンチセンス核酸分子が提供されている。
【００７０】
本発明のさらにもう１つの態様においては、細菌に対する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激する方法において、
（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する少なくとも１つの細菌レプリキンを有効量投与する段階を含んで成る方法、が提供されている。
【００７１】
もう１つの態様においては、予防又は治療用細菌ワクチンに内含するための細菌レプリキンを選択する方法において、
（１）該細菌の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）細菌の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、細菌レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階；
（３）該細菌の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内の細菌レプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察された細菌レプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についての細菌レプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内であるか又は急速に突然変異する細菌においてはさらに早いものである段階；
（４）該少なくとも２つの時期の間の細菌レプリキン配列の濃度が最高の増加を示す細菌の株を同定する段階；
（５）細菌ワクチン内に内含するためのペプチドとして段階（４）で同定された細菌ペプチドの株内に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する段階、
を含んで成る方法が提供されている。
【００７２】
本発明は同様に、
（１）新興株として１つの細菌の株を同定する段階；
（２）細菌ワクチン製造のためのペプチド鋳型として新興株内に存在する少なくとも１つの細菌レプリキン配列を選択する段階；
（３）段階（２）の中で選択された少なくとも１つのレプリキン配列のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する段階；及び
（４）薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントと治療上有効な量の段階（３）のペプチドを組合せる段階、
を含む予防又は治療用細菌ワクチンの製造方法をも提供している。
【００７３】
もう1つの態様において、該発明は、診断、予防又は治療を目的として１つの細菌の新興株を同定する方法において、
（１）該細菌の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）細菌の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、細菌レプリキン配列の存在及び濃度（１００個のアミノ酸あたりのレプリキン配列数）について分析する段階；
（３）該細菌の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内の細菌レプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察された細菌レプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についての細菌レプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間の細菌レプリキン配列の濃度が最高の増加を示す細菌の株を同定する段階、
を含んで成る方法に向けられている。
【００７４】
該発明のさらにもう１つの態様においては、細菌の新興株のタンパク質内に存在する少なくとも１つの単離された細菌レプリキン及び薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントを含む予防用又は治療用細菌ワクチンが提供されている。
【００７５】
マイコバクテリウムに分類された細菌の２つの重要な亜種は、その３０−ｓリボソームタンパク質がＣ末端レプリキンをもつライ菌（ハンセン病）及びそのＡＴＰアーゼが３つのレプリキンを有する結核菌（結核）である。
ライ菌（ハンセン病）の３０ｓリボソームタンパク質ｓ６中のレプリキンは；
【化１】
2007526222.tif 000002
結核菌のＡＴＰアーゼ中のレプリキンは：
【化２】
2007526222.tif 000003
大腸菌のＢ−Ｄガラクトシダーゼ中のレプリキン：
【化３】
2007526222.tif 000004
アグロバクテリウム・ツメファシエンス中のレプリキン：
【化４】
2007526222.tif 000005
【００７６】
同じく本発明により提供されているのは、細菌の新興株のタンパク質内に存在する少なくとも１つの単離された細菌レプリキン及び薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントを含む予防用又は治療用ワクチンを、必要としている患者に対し投与する段階を含んで成る、ウイルス感染を予防又は治療する方法である。
【００７７】
真菌
該発明の１つの態様においては、レプリキン配列を含む単離又は合成された真菌ペプチドが提供されている。真菌レプリキンペプチドは、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む（真菌レプリキン）。
【００７８】
細菌レプリキンワクチンの生産及びそれを用いた治療について上述した方法はすべて、真菌レプリキンワクチンの生産及びそれを用いた治療に対しても適用可能である。
【００７９】
該発明のもう１つの態様においては、少なくとも１つの真菌レプリキンペプチドを含む組成物の１投薬量を有効量だけ対象に対し投与する段階を含んで成る、真菌レプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激するためのプロセスが提供されている。
【００８０】
本発明は同様に、本書で定義されているような、真菌レプリキンに対し特異的に結合する抗体ならびに真菌レプリキンに特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体カクテルをも提供する。該発明の１実施形態においては、真菌レプリキンに特異的に結合する単数又は複数の抗体及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物が提供されている。
【００８１】
本発明は同様に、
（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する単離された真菌ペプチドを単数又は複数含む治療用組成物をも提供している。
【００８２】
該発明のもう１つの態様においては、真菌レプリキンｍＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス核酸分子において、前記レプリキンｍＲＮＡ配列が（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を表わしている、アンチセンス核酸分子が提供されている。
【００８３】
該発明のもう１つの態様においては、少なくとも１つのレプリキンペプチドを含む組成物の１投薬量を有効量だけ対象に対し投与する段階を含んで成る、真菌レプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激するためのプロセスが提供されている。
【００８４】
複製の増強
該発明のもう１つの態様においては、少なくとも１つのレプリキン構造を伴う生体内で複製機能をもつ酵素又はその他のタンパク質をコードする遺伝子を形質転換する段階を含む、１つの生体の複製速度を増大させる方法が提供されている。
【００８５】
定義
本書で使用されている通り、「ペプチド」又は「タンパク質」という語は、１つのアミノ酸のカルボキシル基がもう一方のアミノ酸のアミノ基と一体化されている２つ以上のアミノ酸の化合物を意味する。ペプチドという語は同様に、このような化合物をコードするアミノ酸配列を表わすためにも用いられる。本書で使用されている「単離された」又は「合成された」ペプチド又はその生物学的に活性な部分というのは、自ら由来する細胞又は組織供給源からの細胞材料又はその他の汚染性ペプチドを実質的に含まない、又は任意の方法により化学的に合成された時点で化学的前駆物質又はその他の化学物質を実質的に含まない、又は組換え型遺伝子技術によって合成された時点で汚染性ペプチドを実質的に含まないペプチドを意味する。
【００８６】
本書で使用するレプリキンペプチド又はレプリキンタンパク質は、
（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基、
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列である。
同様にして、レプリキン配列はかかるペプチド又はタンパク質をコードするアミノ酸配列である。
【００８７】
本書で使用する通り、本書で用いる「新興株」という語は、かかる生体のその他の株内のレプリキンの濃度に比べてそのタンパク質配列のうちの単数又は複数のものの中のレプリキン配列の増大した漸増的濃度を有するものとして同定されたウイルス、細菌、真菌又はその他の生体の株を意味する。レプリキンの増加又は漸増的濃度は、例えばインフルエンザウイルス内では、少なくとも約６ヵ月の期間にわたって、又好ましくは少なくとも約１年の期間にわたって、最も好ましくは少なくとも約３年以上の期間にわたって、起こるが、細菌及びその他の生体については、はるかに短かい期間であり得る。
【００８８】
本書で使用する「突然変異」という語は、アミノ酸の置換によってひき起こされる生体のこの構造及び特性の変化を意味する。これとは対照的に、本書で使用される「保存」という語は、置換が欠如していることに起因する特定のアミノ酸の保存を意味する。
【００８９】
発明の詳細な説明
本書でレプリキンと呼ばれている高速複製現象に関係する小ペプチドの新しいファミリーの同定は、試料中の病原体の検出及びワクチン開発を含めた療法の開発のための標的を提供する。一般に、このペプチドファミリーの知識及び同定は、レプリキンを抱くあらゆる生体のための有効な療法及びワクチンの開発を可能にする。このペプチドファミリーの同定は同様に、ウイルスの検出及びウイルスワクチン開発をも提供する。
【００９０】
例えば、このペプチドファミリーの同定は、インフルエンザウイルスの検出を提供し、インフルエンザ治療のための新しい標的を提供する。このペプチドファミリーの同定は同様に、例えば、マラリアの検出を提供し、マラリアワクチン開発のための新しい標的を提供する。このペプチドファミリーの同定により提供されるさらなる例としては、感染病レプリキン、癌免疫レプリキン及び構造タンパク質レプリキンの検出が含まれる。
【００９１】
高速複製は、或る種の細菌、ウイルス及び悪性腫瘍における病原性の特徴であるが、これまで、異なる生体における高速複製に共通の化学反応が記述されたことは全く無い。我々は、高速複製に関係する保存された小タンパク質配列ファミリーを発見し、これをレプリキンと命名した。このようなレプリキンは、有効な検出方法及び療法を開発するための新しい標的を提供する。最初に発見されたレプリキンは、マリグニンと呼ばれる多形性脳グリア芽腫（神経膠腫）細胞タンパク質の中で同定された神経膠腫レプリキンであった。
【００９２】
マリグニンの加水分解及び質量分析は、神経膠腫レプリキンを含有する新規１６量体ペプチド配列を明らかにした。このレプリキンは正常な健康なヒトゲノムのためのデータベース内には発見されず、従って体外の何らかの供給源から誘導されるように思われた。
【００９３】
我々は、神経膠腫レプリキン又はその相同体について探索するためのアルゴリズムを考案した。相同体は４０００以上のタンパク質配列内で一般的でなかったが、驚くべきことに、全ての腫瘍ウイルス内及び藻類、植物、真菌、ウイルス及び細菌の複製タンパク質内で発見された。
【００９４】
我々は、１）レプリキン濃度（１００個のアミノ酸あたりのレプリキンの数）及びレプリキン組成の両方が、高速複製の機能的現象と相関関係をもつことを識別した。これらの関係は、レプリキンが複製速度に量的ならびに質的に関係するという決定のための機能的根拠を提供する。
【００９５】
高速複製に対するレプリキンの役割についての最初の機能的根拠は、神経膠腫複製に見られる。神経膠腫マリグニンが神経膠腫細胞の高速複製における細胞数及び膜タンパク質濃度の５倍の増加に比べ１０倍富化されるという事実は、複製に対するレプリキンの不可欠な関係を示唆している。神経膠腫レプリキンとインビトロで合成しウサギに合成ワクチンとして投与した場合、豊富な抗マリグニン抗体が産生される。このことは、血清中抗マリグニン抗体（ＡＭＡＳ）試験の抗原性の根拠を厳正に立証し、初めての潜在的合成癌ワクチン及びその他の生体内でのレプリキンワクチン用プロトタイプを提供する。癌レプリキンと高速複製の共有の特異性に基づく、細胞型に優先する癌レプリキンに対するこの自然免疫応答及び複製に対するレプリキンのこの自然免疫関係の実証により、抗マリグニン抗体での免疫の受動的増加及び合成レプリキンワクチンでの能動的増加がいまや可能である。
【００９６】
患者における抗ＡＧ抗体の存在と生存率の関係は、癌患者由来の８，０９０件の血清標本の研究の中で示された。集団内の癌の発生率が増大するのと同様、抗マリグニン抗体の濃度が年齢と共に増大し、細胞型の如何に関わらず早期悪性腫瘍においてさらに２〜３倍増大することが実証された。インビトロでは、該抗マリグニン抗体は癌細胞１個あたりのピコグラム（フェムトモル）で癌に対し細胞毒性をもち、インビボで抗マリグニン抗体の濃度は数量的に癌患者の生存率と関係する。神経膠腫細胞内で示されているように、今や、細胞が死に致らない悪性状態までしか形質転換されておらず、鎮静期又は休眠期にとどまっている癌病期を、レプリキンの濃度増加を特徴とするより活性の高い生命を脅かす複製状態と区別することが可能である。さらに、神経膠腫糖タンパク質１０Ｂが正常な１０Ｂと比べた場合に炭水化物残基の５０％の減少を示すという事実に、癌のウイルス病因論への糸口を見い出せるかもしれない。この減少は、その他のケースでウイルスの進入に結びつけられており、従って、悪性状態への形質転換における１つのステップとしてのグリア細胞の１０Ｂに対するウイルスレプリキンの送達のためのウイルスの付着の証拠であり得る。
【００９７】
過去１００年にわたるインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列及びインフルエンザ疫学に関する我々の研究は、高速複製に対するレプリキンの関係についての第２の機能的根拠を提供した。これまでのところ、血清学的血球凝集素及び抗体分類のみがインフルエンザにおいて記述されているが株特異的な保存されたペプチド配列はこれまで全く記述されていない。さらに疫学的に立証された地域的流行又は高速複製と相関関係をもついずれかの株特異的ペプチド配列の濃度及び組成の変化については全く記述されてきていない。４つの主要な株すなわちインフルエンザＢ型、（Ａ）Ｈ１Ｈ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２及び（Ａ）Ｈ３Ｎ２型の各々のうちの１つにおける株特異的インフルエンザレプリキンの濃度の４倍〜１０倍の増加が、１９０２年から２００１年まで各株によって特異的にひき起こされたインフルエンザの地域的流行に関係することが示されている。
【００９８】
我々はその後、これらの濃度増加が、その消滅から１年〜最高６４年後の少なくとも１つの特異的レプリキン組成の再出現に加えて新しい株特異的なレプリキン組成の新興に起因するものであることを示した。以前は、来たるインフルエンザの流行期において優位を占めと思われる株を予想できるようにする、又はワクチンのための全ウイルス株の年間混合物を考案できるようにする株特異的化学構造は全く知られていなかった。Ｈ３Ｎ２の歴史上最大である最近の急激なＨ３Ｎ２レプリキン濃度の増加（１９９７年〜２０００年）及び１９６８年の高死亡率のＨ３Ｎ２の世界的流行及び１９７５年及び１９７７年の２つの高死亡率の世界的流行において最後に見られたものの２０〜２５年間不在であった特異的レプリキン組成の再出現は、共に来たる地域的流行の警告であるかもしれない。同一の構造が１００年間持続し得るか又はこれが１〜６４年の不在の後に再出現し得るようにするレプリキン構造のこの高い保存率が観察されたことは、インフルエンザタンパク質におけるアミノ酸の無作為置換に起因する変化であると以前考えられてきたことが、レプリキンの組織立った保存プロセスに起因する変化である確率がより高いということを表わしている。
【００９９】
レプリキンの保存はインフルエンザウイルスに独特のものではなく、例えばそれは、口蹄病ウイルス、Ｏ型及びＨＩＶｔａｔならびに小麦内でも観察された。
【０１００】
高速複製におけるレプリキンの役割についての第３の機能的根拠は、ＨＩＶ内の高速複製の増加に見られる。レプリキン濃度はＨＩＶ内の高速複製に関係することが示された。我々は、早期感染において優勢であるＨＩＶの緩慢に成長する低力価株（ＮＳ１、「Ｂｒｕ」）中のレプリキン濃度が、（後期ＨＩＶ感染において優勢である）ＨＩＶの急速に成長する高力価株（ＳＩ、「Ｌａｉ」）の６分の１であることを発見した。
【０１０１】
さらなる例が、高速複製に対するレプリキンの関係を実証している。例えば、トマトの収穫を壊滅させるトマト縮葉病ジェミニウイルスの「複製タンパク質」においては、ＤＮＡに結合することが示されてきた配列である最初の１６１個のアミノ酸は５つのレプリキンを含有していることが示された。１つのトリパノゾームから何万個の割合で肝臓からトリパノゾームが放出される場合の、高速複製に関し伝説的に有名であるマラリアにおいては、１００個のアミノ酸につき最高３６の重複レプリキンの濃度で、多数の新規でほぼ「火炎状の」レプリキン構造が発見された。
【０１０２】
いずれかの構造の保存は、その構造が、攻撃、破壊するか又は刺激するべき安定した不変の標的を提供するか否かにとってきわめて重要である。構造が何らかの形で生体の基本的生存メカニズムに結びつけられる場合、その構造は保存される傾向にある。変動する構造は、不変の標的を提供し、これは、以前の構造に対して特異的に生成されかくして修飾された形態に対しては効力のない抗体といったようなアタッカーを回避するための優れた戦略である。この戦略は、インフルエンザウイルスなどに用いられ、かくして先行ワクチンが現在発病率の高いウイルスに対し全く効力がなくなる可能性がある。
【０１０３】
治療のための安定した標的としてのレプリキン
細菌及びＨＩＶは両方共、レプリキン及び非レプリキンの両方のアミノ酸を有する。ＨＩＶにおいては、例えば、非レプリキンアミノ酸の突然変異、すなわち置換に起因して薬物耐性が最近９％〜１３％増加した。（本書で論述されているＨＩＶのＴＡＴタンパク質の詳細な分析を参照のこと）。細菌において、「耐性株」の発生は、類似のメカニズムに起因している。しかしながら、我々は、レプリキン構造が非レプリキンアミノ酸と同程度に突然変異又は変化しないことを発見した（同様に、本書で論述されているレプリキンの口蹄病ウイルス保存の論述も参照のこと；さらに、本書で論述されているコロナウイルスレプリキンの保存についての論述も参照のこと）。レプリキン構造は、非レプリキン構造と異なり、保存され、かくして治療のための新しい恒常な標的を提供する。
【０１０４】
生存機能に過度に緊密に関係している或る種の構造は恒常的に変化し得ないように思われる。レプリキン構造の基本的構成要素が複製に必要とされる確率の高いエネルギー源及び酸化還元酵素内の金属基に頻繁に結合するものとして知られているヒスチジン（ｈ）であることを理由として、又、このヒスチジン構造が恒常にとどまることから、この構造はなお一層魅力ある破壊又は刺激用標的であり続けている。
【０１０５】
プロテオミクスの観点から見ると、新たに決定された神経膠腫ペプチド配列に基づいて自ら鋳型を構成したことで、発明人らは、関連する保存された構造及びこの場合は複製である特殊な機能をもつ広範なタンパク質の種類を発見するに至った。１つの疾病の病原性に伴うレプリキン濃度の増加の例としては、インフルエンザ、ＨＩＶ、癌及びトマト縮葉病ウイルスがある。この新たに認められた種の構造は、酵母、藻類、植物、ジェミニトマト縮葉病ウイルス、ＨＩＶ及び癌といったさまざまな生体内の高速複製の現象に関係している。
【０１０６】
レプリキンの濃度及び組成は、各々の生物学的集団の生存率及び優性にとって中枢的なものである複製プロセスを検出し制御する新しい定量的方法を提供する。神経膠腫及び関連する癌レプリキンのための抗マリグニン抗体で実証されたように、該種類の多様な成員による免疫学的特異性の共有は、Ｂ細胞及びその産物抗体が類似の認識言語を用いてレプリキンを認識できるということを示唆している。
【０１０７】
癌レプリキンのペプチド配列又はレプリキンすなわち神経膠腫ペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋの相同体を含有するものとしてのペプチド配列の例は、肺、脳、肝臓、軟組織、唾液腺、鼻咽頭、食道、胃、結腸、直腸、胆のう、乳房、前立腺、子宮、子宮頸管、膀胱、眼、黒色腫形態、リンパ腫、白血病及び腎臓などの癌において発見され得るがただしこれらに制限されるわけではない。
【０１０８】
レプリキンは、１）レプリキンの質的及び量的決定による病原体の検出、２）未変性レプリキンをターゲティングすること及びワクチンとして合成レプリキンを使用することによる、高速複製が主要な要因である広範囲の疾病の治療及び制御；及び３）藻類及び植物食品の増強された成長速度の助長を提供する。
【０１０９】
同定すべき最初のレプリキン配列は、多形性グリア芽腫（神経膠腫）細胞の高速嫌気性複製中に１０倍に富化されることが実証された脳癌タンパク質、マリグニンの中に発見される癌細胞レプリキンであった。（図２）。マリグニンは、多形成グリア芽腫（神経膠腫）細胞の膜からインビボ及びインビトロで単離された２５０ＫＤａの糖タンパク質１０Ｂの１０ＫＤａ部分である。マリグニンの加水分解及び質量分析は、本書で神経膠腫レプリキンと呼ばれ、より短かいペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）を含む１６量体ペプチド配列ｙｋａｇｖａｆｌｈｋｋｎｄｉｄｅ（配列番号４）（両方共正常なヒトゲノム内では見かけ上不在である）を明らかにした。
【表１】
2007526222.tif 000006
【０１１０】
１６量体神経膠腫レプリキンが合成ワクチンとしてウサギの体内に注射された時点で、豊富な抗マリグニン抗体が産生された。（Bogoch et al., 癌の検出と予防。２６（付録１）：４０２（２００２））。インビボでの血清中の抗マリグニン抗体の濃度は癌患者の生存率と量的に関係することが示された（Bogoch et al. 生物学的流体のペプチド、３１：７３９−７４７（１９８４）。インビトロ抗マリグニン抗体は、がん細胞１個あたりピコグラム（フェムトモル）の濃度で癌細胞に対し細胞毒性をもつことが示されてきた（Bogoch et al., 癌の検出と予防。２６（付録１）：４０２（２００２）。
【０１１１】
発明人らにより実施された研究は、神経膠腫レプリキンが正常な健康なヒトゲノム内では表現されないことを示した。その結果、さまざまな生体の公示済み配列の分析によってレプリキン配列の起源及び考えられる相同体についての探索が着手された。
【０１１２】
鋳型として１６量体神経膠腫レプリキン配列を使用し、複数の異なる生体のタンパク質のアミノ酸配列を視覚的に走査するべく認識プロテオーム系を構築することによって、新しい種類のペプチド、レプリキンが同定された。本発明は、レプリキン配列を内含するヌクレオチド又はアミノ酸配列を同定するための方法を提供する。該方法は、本書では３点認識方法と呼ばれている。３点認識方法は、（１）第２のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸のペプチド（レプリキン）を含む。これらのペプチド又はタンパク質は、複製、形質転換又は酸化還元機能を有する藻類、酵母、真菌、アメーバ、細菌、植物、ウイルス及び癌タンパク質を含む種の中で新しい種類のペプチドを構成する。レプリキンペプチドは、より大きい「複製」及び「形質転換」タンパク質（その研究者によりこのように呼称されている、表２参照）及び癌細胞タンパク質の中に集中していることが発見されてきた。マリグニン１６量体ペプチドと同一であることがわかった配列は無い。
さまざまな生体内のレプリキンの例−プロトタイプ：神経膠腫レプリキン*ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）
【表２】
2007526222.tif 000007
【表３】
2007526222.tif 000008
【０１１３】
レプリキンとして又はレプリキンを含有するものすなわち神経膠腫ペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋの相同体としてのアミノ酸配列の同定には、以下の３つの必要条件が満たされる必要性がある。３点認識システムに従うと、配列は、７〜約５０残基のアミノ酸配列の内部に次の３つの要素すなわち、（１）もう１つのリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基の組成物を有している。
【０１１４】
レプリキンを含有するタンパク質配列について国立医学図書館キーワード「PubMed」記述子を用いてデータベースが探索された。４０００以上のタンパク質配列が相同体について視覚的に検査された。PubMed分類されたタンパク質の各グループ内の個々のタンパク質すべての配列が、上述の３つの必要条件を満たすペプチドについて視覚的に走査された。相同体のまれな発生が、「ウイルスペプチド」全体の中（１．５％）（Ｎ＝９５３）及び「脳ペプチド」及び「神経ペプチド」といった悪性形質転換又は複製に関連するものとして指定されていないその他のペプチドの中（合わせて８．５％）（Ｎ＝８４５）で観察された。ただし、驚くべきことに、相同体は、細菌、藻類及びウイルス内での複製における立証済みの機能をもつものとして同定された大きな「複製タンパク質」の中ではるかに高い頻度で同定された。さらに一層驚くべきことは、レプリキン相同体が、「腫瘍ウイルス」の１００％（Ｎ＝２５０）、「癌タンパク質」の９７％（Ｎ＝４０１）、そして「形質転換ウイルス」の８５％（Ｎ＝２４８）の中で発生したという発見事実であった。これらの結果は、細胞型の如何に関わらず癌の病因論には共有の特性が存在することを示唆しており、又、発癌すなわち、休眠中であれ形質転換された状態からより病原性の高い活発に複製している状態までの細胞の転換、におけるウイルスの役割を示唆している。
【０１１５】
３点認識方法によって画定される通りのｋａｇｖａｆｌｈｋｋといったアミノ酸配列の相同体が、アデノウイルス、レンチウイルス、ａ−ウイルス、レトロウイルス、アンデノ関連ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脳炎ウイルス、インフルエンザウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、ヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、口蹄病ウイルス、天然痘ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス腫瘍遺伝子、ポリオーマウイルス、シンドビス、ヒト乳頭腫ウイルス、骨髄単球性腫瘍ウイルス、マウス急性白血病、Ｔ細胞リンパ栄養ウイルス及びトマト縮葉病ウイルスといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）ウイルス又はウイルスペプチドの中で発見された。
【０１１６】
さらに、アミノ酸配列ｋａｇｂａｆｈｋｋの相同体は、宿主細胞の細胞質中で複製する外被ウイルスファミリの成員である既知の種類のコロナウイルスの中に存在する。さらに、アミノ酸配列ｋａｇｖａｔｌｈｋｋの相同体は、重症急性呼吸器症候群つまりＳＡＲＳの原因である最近同定された種類のコロナウイルスの中に存在する。レプリキンは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド全タンパク質配列の中に位置特定される。さらに、レプリキンの場所は、コロナウイルスの種類のその他の成員の中に存在し、より特定的には、これらのコロナウイルス由来のヌクレオカプシドタンパク質配列内にも存在する。
【０１１７】
レプリキンは、Acetobacter、Achromobacter、Actinomyces、Aerobacter、Alcaligenes、Arthrobacter、Azotobacter、Bacillus、Brevibacterium、Chainia、Clostridium、Corynebacterium、Erwinia、Escheria、Lebsiella、Lactobacillus、Haemophilus、Flavobacterium、Methylomonas、Micrococcus、Mycobacterium、Micronomspora、Mycoplasma、Neisseria、Nocardia、Proteus、Pseudomonas、Rhizobium、Salmonella、Serratia、Staphylococcus、Streptocossus、Streptomyces、Streptosporangium、Streptovirticillium、Vibrio peptide及びXanthomasといった細菌（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。
【０１１８】
レプリキンは、Penicillium、Diseula、Ophiostoma novoulim、Mycophycophta、Phytophthora infestans、Absidia、Aspergillus、Candida、Cephalosporium、Fusarium、Hansenula、Mucor、Paecilomyces、Pichia、Rhizopus、Torulopsis、Trichoderma及びErysipheといった真菌（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。
【０１１９】
レプリキンは、Saccharomyces、Cryptococcusneoformasを含むCryptococcus、Schizo saccharomyces、及びOryzaといった酵母（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。
【０１２０】
レプリキンは、Caldophera、Isolepisprolifera、Chondrus、Gracilaria、Gelidium、Caulerpa、Laurencia、Cladophexa、Sargassum、Penicillos、Halimeda、Laminaria、Fucus、Ascophyllum、Undari、Rhodymenia、Macrocystis、Eucheuma、Ahnfeltia及びPteroclasiaといった藻類（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。
【０１２１】
レプリキンは、Entamoeba（Entamoeba invadensを含む)、Amoebidae、Acanthamoeba及びNaegleriaといったアメーバ（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。
【０１２２】
レプリキンは、シロイヌナズナ、小麦、イネ及びトウモロコシといった植物（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。
【０１２３】
補助的明細事項
レプリキンのサブタイプを分類できるようにするため、基本的「３点認識」必要条件に対して（ａ）癌細胞タンパク質（例えば形質転換タンパク質Ｐ２１Ｂ（Ｋ−ＲＡＳ  ２Ｂ）肺、表２、配列番号８９）内の隣接するジ−及びポリリジン及びＴＯＬＬ様レセプタ内のその他の隣接するジアミノ酸の共通の出現といったような構造的根拠に基づく、又は（ｂ）例えば表２に見られるようなＡＴＰアーゼ、チロシンキナーゼ又は酸化還元活性を示す機能的根拠に基づく付加的な又は「補助的明細事項」を付加することができる。
【０１２４】
機能的誘導体
本書で記述されているレプリキンの「機能的誘導体」は、レプリキンに特異的な抗体との免疫学的交叉活性の少なくとも一部分を保持するレプリキンのフラグメント、変異体、類似体又は化学的誘導体である。レプリキンペプチドのフラグメントは、分子のあらゆるサブセットを意味する。変異体ペプチドは、例えば当該技術分野において周知の方法を用いて直接的化学合成によって作ることができる。レプリキンの類似体とは、全タンパク質又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似した非天然タンパク質を意味する。レプリキンの化学的誘導体は、通常ペプチド又はペプチドフラグメントの一部でない付加的な化学的部分を含有している。
【０１２５】
図２に見られるように、細胞複製速度が上昇する嫌気性呼吸の間、マリグニンが富化される。すなわち、マリグニンは、細胞数及び合計膜タンパク質の増大に正比例して増加することがわかっているだけでなく、休止時の３％から始まって合計膜タンパク質の３０％に達して、濃度が１０倍も富化される。神経膠腫  細胞複製に伴うレプリキン濃度の顕著な増加のこの明白な実証は、さまざまな生体内で３点認識法で同定されたレプリキンの存在を提示し、これと一貫性のあるものである。例えば、レプリキンは、「Saccharomyces cerevisiae複製結合タンパク質」（配列番号２）（ｈｓｉｋｒｅｌｇｉｉｆｄｋ）；「トウモロコシ条斑ウイルスの複製関連タンパク質Ａ」（配列番号８）（ｋｙｉｖｃａｒｅａｈｋ）及び（配列番号９）（ｋｅｋｋｐｓｋｄｅｉｍｒｄｉｉｓｈ）；「Staphylococcus aureusの複製関連タンパク質」（配列番号１０）（ｋｋｅｋｔｔｈｎｋ）；「ウシヘルペスウイルス４のＤＮＡ複製タンパク質」（配列番号１１）（ｈｋｉｎｉｔｎｇｑｋ）；及び「Ｍｅａｌｉｇｒｉｄヘルペスウイルス１複製結合タンパク質」（配列番号１２）（ｈｋｄｌｙｒｌｌｍｋ）といったようなタンパク質中で同定された。トマト縮葉病ジェミニウイルスについての先行研究は、ウイルス蓄積の調節には、ウイルス複製中の葉ＤＮＡ及びその他の複製タンパク質分子に対するそのウイルスの「複製タンパク質」のアミノ酸１−１６０の結合が関与するということを示している。この配列の分析は、この「複製タンパク質」のアミノ酸１〜１３５が２０．７といったような高いレプリキン計数（濃度）を含有することを示した（トマト縮葉病ジェミニウイルスについての節を参照のこと）。
【０１２６】
表２は、レプリキン含有タンパク質も同様に頻繁に酸化還元機能及びタンパク質合成又は伸長ならびに細胞複製と関連しているということを示している。金属ベースの酸化還元機能との関連、嫌気性複製中のレプリキン含有神経膠腫マリグニン濃度の富化及び低濃度（ピコグラム／細胞）での抗マリグニンの細胞毒性（図４ｃ−ｆ）は全て、レプリキンが、中枢性呼吸生存率関数に関連づけされ、非レプリキンアミノ酸の特徴である突然変異に付されることが少ないということがわかった、ということを示唆している。
【０１２７】
特に興味深いことに、１００個のアミノ酸につき少なくとも１つのレプリキンが、検査されたインフルエンザウイルスの個々の株のうちのほぼ全ての株の血球凝集素タンパク質の中に存在することがわかるということが観察された。アミノ酸配列データが入手可能である各年について（１９０２〜２００１年）、インフルエンザウイルスの４つの優勢な株、インフルエンザＢ型、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ２Ｎ２型及びＨ３Ｎ２型各々の分離株の血球凝集素タンパク質の中で発生すると観察されたレプリキン配列が、表３、４、５及び６で示されている。
【表４】
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【表５】
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【０１２８】
１．インフルエンザＢ型は、ヒトにおけるいかなる世界的流行の原因でもなかった。
２．年号の略号：例えば「４３」＝１９４３年、「０１」＝２００１年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、そのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．下線の付された、１９７７年の地域的流行の前２年以内の、複数年にわたり不在であったレプリキンの復帰は、合計レプリキン濃度（レプリキン計数＝１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図７参照。
【表６】
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【表７】
2007526222.tif 000012
【表８】
2007526222.tif 000013
【表９】
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【表１０】
2007526222.tif 000015
１．インフルエンザＨ１Ｎ１型は、１９１８年のヒトにおける世界的流行の地球規模の分布の原因であった。
２．年号の略号：例えば「９６」＝１９９６年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、この研究作業においてはそのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．（下線の付された）例えば１９１８年及び１９７７年の地域的流行年に、新しいレプリキン構造の数の増加が起こり、このことは合計レプリキン濃度（１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図７参照。
【表１１】
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【表１２】
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１．インフルエンザＨ２Ｎ２型は、１９５７年のヒトにおける世界的流行（地球規模分布）の原因であった。
２．年号の略号：例えば「５８」＝１９５８年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、この研究作業においてはそのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．（下線の付された）例えば１９５７年及び１９６５年の地域的流行の年に、新しいレプリキン構造の数の増加が起こり、このことは合計レプリキン濃度（１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図８参照。
【表１３】
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【表１４】
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１．インフルエンザＨ３Ｎ２型は、１９６８年のヒトにおける世界的流行（地球規模分布）の原因であった。
２．年号の略号：例えば「７７」＝１９７７年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、そのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．（下線の付された）例えば１９７５年といった年において、新しいレプリキン構造の数の増加が起こり、このことは、合計レプリキン濃度（１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図８参照。
【０１２９】
観察されたレプリキンの濃度とタイプすなわち組成は両方共、インフルエンザの世界的流行及び地域的流行の発生に関係していることがわかった。インフルエンザウイルス中のレプリキンの濃度は、過去１世紀すなわち１９００〜２００１年まで１年毎にヒト及び動物レサバーから世界中で単離されたインフルエンザ株について、国立医学図書館「Pub Med」データベース内で公表された血球凝集素アミノ酸配列を視覚的に走査することによって検査された。次に、各々の株についてこれらのレプリキン濃度（１００個のアミノ酸あたりのレプリキンの数、平均（±ＳＤ）がプロットされた。
【０１３０】
レプリキンの濃度は、インフルエンザの世界的流行及び地域的流行の発生に直接関係することが発見された。インフルエンザＢ型血球凝集素及びインフルエンザＡ型株、Ｈ１Ｎ１、の中に見られるレプリキンの濃度は図７に示され、２つのその他の一般的なインフルエンザウイルスＡ株Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２の中に見られたレプリキンの濃度は図８（Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２）に示されている。図８のデータは同様に、その成分レプリキン（Ｈ３Ｎ２（Ｒ））により画定される通り出現する新しいインフルエンザ株をも実証している。
【０１３１】
各々のインフルエンザＡ株は、それぞれ１９１８、１９５７及び１９６８年の１つの世界的流行の原因であった。図７及び８のデータは、検査された４つの一般的なインフルエンザウイルスの全ての分離株のインフルエンザ血球凝集素タンパク質の各々の中に、１００個のアミノ酸につき少なくとも１つのレプリキンが存在していることを示しており、これは、複製の存続レベルの維持におけるレプリキンの機能を示唆している。１９９０年には、Ｈ３Ｎ２株の衰退の間、Ｈ３Ｎ２の数多くの分離株の中に全くレプリキンが存在しなかったが、新しいレプリキンの高い濃度がＨ３Ｎ２分離株の中に現われており、これらがＨ３Ｎ２（Ｒ）株の新興を定義している。
【０１３２】
図７及び図８では、レプリキン濃度のいくつかの特性が、４つのインフルエンザウイルス株全てに共通であることがわかる。第１に、濃度は何年にもわたり周期的であり、上昇及び下降の単一サイクルが２〜３０年の周期にわたって起こっている。この上昇及び下降は、血球凝集素及びノイラミニダーゼ分類による個々のインフルエンザウイルス株の優位の既知の増強及び減弱と一貫性をもつ。第２に、世界的流行の原因であることがすでに示された各々のインフルエンザウイルス株のピークレプリキン濃度は、世界的流行の３年各年に特定的かつ個別的に関係することが観察された。例えば、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１が原因であることが示された１９１８年の世界的流行については、Ｈ１Ｎ１中のレプリキンのピーク濃度が独立して発生した（Ｐ１）；Ｈ２Ｎ２が新興し原因であることが示された１９５７年の世界的流行については、Ｈ２Ｎ２中のレプリキンのピーク濃度が発生した（Ｐ２）；そしてＨ３Ｎ２が新興しその原因であることが示された１９６８年の世界的流行については、Ｈ３Ｎ２中のレプリキンのピーク濃度が発生した（Ｐ３）。第３に、上述の３つの世界的流行の各々の直後の各年においては、特定のレプリキン濃度が顕著に減少し、これは恐らく各ケースにおいて生成された広く分布した免疫性を反映している。かくして、この世界的流行後の衰退は、自らが原因であった世界的流行（Ｐ１）の直後のＨ１Ｎ１に特異的であり、その時点での全ての株の一般的特性ではない。インフルエンザＢ型の中のレプリキン濃度の増加は、例えば共に最高の死亡率をもつインフルエンザＢ型の世界的流行に結びつけられた１９５１年のＥＢ１及び１９７６年のＥＢ２といったＨ１Ｎ１中のレプリキン濃度の減少と同時にくり返し発生した。（Stuart-Harris et al., Edward Arnold Ltd.（１９８５）。第４に、濃度の１次ピーク増加を超えた２次ピーク濃度が、３つの世界的流行の各々の１５年後に発生しており、この２次ピークには１つの世界的流行が随伴していた。すなわち、Ｈ１Ｎ１「地域的流行」年（Ｅ１）において１９１８年の世界的流行から１５年後；Ｈ２Ｎ２「地域的流行」年（Ｅ２）において１９５７年世界的流行の８年後；及びＨ３Ｎ２「地域的流行」年（Ｅ３）において１９６８年の世界的流行から７年後に起こった。特定のレプリキンのこれらの２次ピーク濃度は、該株の回復を反映し得る。第５に、各々の株の特定的レプリキン濃度のピークは、往々にして、１つ又は両方のその他の株のレプリキン濃度の減衰に付随すると思われ、宿主部位に対する株間の競争を示唆している。第６に、３５年（Ｈ２Ｎ２）から６０年（インフルエンザＢ型）の周期にわたり各株のレプリキン濃度が減衰する明白な全体的傾向が存在する。この減衰は、インフルエンザワクチンの一般的使用に先立つ１９４０年〜１９６４年のインフルエンザＢ型の場合に明らかであったことから、ワクチンの影響のせいにすることはできない。インフルエンザＢ型の場合、減衰からのレプリキンの回復は１９６５年以降に発生していることがわかるが、レプリキン濃度は１９９７年と２０００年の間で再び衰退した（図７）。これは、最近のケースの分離株におけるインフルエンザＢ型の低い発生と相関関係をもつ。Ｈ１Ｎ１株��再出現及び流行と合わせて、Ｈ１Ｎ１レプリキン濃度は１９７８年〜１９７９年にピークに達し、その後、Ｈ１Ｎ１の世界的流行と同時に１９９６年にピークに達した（図７）。Ｈ１Ｎ１レプリキン濃度も同様に１９９７年と２０００年の間で減衰し、Ｈ１Ｎ１株の存在は、これらの年の間に得られた分離株において減少した。Ｈ２Ｎ２レプリキンについては、３５年の減衰からの回復は起こっておらず（図８）、これは、最近の分離株にＨ２Ｎ２が不在であることと相関関係をもつ。Ｈ３Ｎ２については、数多くの分離株のレプリキン濃度は１９９６年〜２０００年の間にゼロまで降下したが、その他のＨ３Ｎ２分離株はレプリキン濃度の有意な鋭い増加を示した。このことは、本書でＨ３Ｎ２（Ｒ）と呼ばれているＨ３Ｎ２の亜株の新興を示している。
【０１３３】
図７及び図８は、レプリキン濃度がピークに達する前に１〜３年の段階的増加が頻繁に観察されることを実証している。この段階的増加は、レプリキンピークと同時に発生する地域的流行の発生に先行する。かくして、特定の株の濃度の段階的増加は、この特定の株が地域的流行又は世界的流行をひき起こす確率の最も高い候補であることのシグナルである。
【０１３４】
現在、インフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２（Ｒ）株のレプリキン濃度は増大している（図８、１９９７〜２０００年）。Ｈ３Ｎ２レプリキン濃度の３つの類似した先行ピーク増加が、該株が最初に新興した１９６８年のＨ３Ｎ２ベースの世界的流行（図８）及び１９７２年と１９７５年のＨ３Ｎ２ベースの地域的流行（図８）において発生したということがわかる。これらの世界的流行及び地域的流行の各々に、過大な死亡率が付随した（Ailing et al., Am. J. Epidemiol., １１３（１）：３０−４３（１９８１））。従って１９９７〜２０００年におけるＨ３Ｎ２レプリキンのＨ３Ｎ２（Ｒ）亜種の濃度の急速な上昇は、近づきつつある重大な地域的流行又は世界的流行の早期警告を統計的に表わしている。Ｈ３Ｎ２の地域的流行は２０００年にロシアで発生し（図８、Ｅ４）、２００１年１２月のＣＤＣ報告書は、現在、Ｈ３Ｎ２が世界中のインフルエンザウイルスの最も高頻度で単離された株であると述べている。（罹患率と死亡率週間報告（ＭＭＷＲ）、病害対策センター；５０（４８）；１０８４−６８（２００１年１２月７日）。
【０１３５】
インフルエンザウイルスの世界的流行又は地域的流行の各ケースにおいて、新しいレプリキンが新興している。一定の与えられた分離株内の一定の与えられた血球凝集素中の同じレプリキンのうちの２つについての観察は全く存在していない。新しいレプリキンの新興が、どのような程度でもう１つの動物又は鳥類のプールからのトランスファ又は突然変異を表わしているかの関係はわかっていない。一部のケースでは、毎年もとのレプリキン構造のうちの単数又は複数のものが保存され、それと同時に新しいレプリキンが新興している。例えばインフルエンザウイルスＢ型血球凝集素の中では、５つのレプリキンが１９１９年と２００１年の間で恒常的に保存されており、一方２６のレプリキンが同じ期間中にやって来ては去っている（一部は数年の不在の後再発した）。特定のレプリキン構造の消滅と何年も後の再興は、レプリキンが新規の突然変異を通してではなくもう１つのウイルス宿主プールから戻るということを示唆している。
【０１３６】
Ｈ１Ｎ１レプリキンの場合、１９１８年の世界的流行に付随するＰ１ピーク内に存在する２つのレプリキンは、１２の新しいレプリキンを含む１９３３年の回復Ｅ１ピークには存在しなかった。従って、恒常的に保存されたレプリキンは、単独又は組合せた形のいずれであれ、ワクチンのための最高の選択肢である。しかしながら、１年の濃度増加に随伴する最近現われたレプリキンでさえ、頻繁に存続しさらに１年以降増加し、結果的に濃度ピーク及び地域的流行となり、かくして合成レプリキンでワクチン接種するための早期警告と時機の両方を提供する（例えば、１９９０年代初頭のＨ１Ｎ１、図７を参照のこと、同様に例えばＨ５Ｎ１、１９９５〜２００２年、図１１も参照のこと。「レプリキン計数」（１００個のアミノ酸あたりのＰＲＫ数）はレプリキン濃度を意味する）。
【０１３７】
図７、８及び１１中のデータは、インフルエンザタンパク質内の特定のレプリキンの存在及び濃度と、インフルエンザの世界的流行及び地域的流行の発生の間の直接的関係を実証している。かくして、レプリキンの存在及び濃度についてのインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列の分析は、インフルエンザの世界的流行及び／又は地域的流行の予測判断材料ならびにインフルエンザワクチン処方のための標的を提供する。このデータを参照すると、再び（段落（０１０９）参照）、以前は来たるインフルエンザの流行期に優勢となると思われる株の予測及びワクチン用の全ウイルス株のその年用混合物の考案を可能にする株特異的化学構造は知られていなかったということが注目に値する。
【０１３８】
株特異的地域的流行の発生の１〜３年前のインフルエンザグループ内の株特異的レプリキン計数の増加という発見事実と同様に、コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質のレプリキン計数の増加も同定されてきた。コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質のレプリキン計数は、以下の通りに増加した。１９９９年に３．１（±１．８）；２０００年に３．９（±１．２）；２００１年に３．９（±１．３）；及び２００２年に５．１（±３．６）。この世界的流行の前の増加は、コロナウイルスが現在の（２００３年）ＳＡＲＳの世界的流行の原因であるという発見事実を裏づけている。（表７参照）。
【０１３９】
かくして、レプリキン構造及びレプリキン計数を監視することで、インフルエンザ及びコロナウイルス株の両方に観察されているような１９１７〜１９１８年のガチョウレプリキン及びその修飾された随伴するレプリキンに対する合成の株特異的な予防的ワクチン接種及び抗体治療の開発手段が提供される。
【０１４０】
図１０は、１９６２年〜２００３年に収集された分離株についてタンパク質配列が入手可能であるヌクレオカプシドコロナウイルスタンパク質の自動化されたレプリキン分析を描いている。各々個々のタンパク質は、受入れ番号によって表わされ、レプリキンの存在について分析されている。レプリキン計数（１００個のアミノ酸あたりのレプリキン数）は、自動化されたレプリキン分析の一部として自動的に計算される。各年について、その年の全てのレプリキン計数に関して、平均（±標準偏差（Ｓ．Ｄ．））レプリキン計数が自動的に計算される。特定のウイルス株（コロナウイルス）中の特定のタンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）の地域的流行以前のこの早期複製増加警報は、インフルエンザの地域的流行及び世界的流行に先立つインフルエンザウイルスの株内に見られる増加に匹敵する（図７、８及び１１）。レプリキン計数が、２００２年の終りに新興し２００３年内まで持続したＳＡＲＳのコロナウイルスペプチドＤと一貫して１９９９〜２００２年まで上昇したということがわかる。図９は、１９１７年から２００２年までのコロナウイルスヌクレオカプシドレプリキンを含め、複数のウイルス株についてのレプリキン計数のグラフを提供している。
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０１４１】
１９１８年の世界的流行のレプリキンにさかのぼったＳＡＲＳ及びＨ３Ｎ２−福建型インフルエンザウイルスレプリキン
ＳＡＲＳウイルスの起源はいまだに不明である。我々は、或る種のＳＡＲＳウイルスペプチドが、２００２年からのインフルエンザウイルス分離株のいくつかの株内の相同なペプチドを通して、２０００万人を超える死亡の原因となった１９１８年のインフルエンザの世界的流行の株内の１つの配列にまでさかのぼることができるものであることの証拠を報告する。
【０１４２】
前世紀を通して記録されたインフルエンザウイルス及びその他の微生物の一次タンパク質配列の定量分析によって、我々は、生体のタイプ（例えば表１）ではなくむしろ高速複製の現象自体及び地域的流行に関連づけされる、リジン及びヒスチジンが豊富な新しい種類のペプチド構造を発見し、それをレプリキンと命名した。我々は、７〜５０個のアミノ酸中の少なくとも２個のリジン６〜１０残基離隔、リジン濃度６％以上、１ヒスチジン、という義務的アルゴリズムをもつ新しい種類のペプチド構造を発見した。これらのペプチドは、高速複製現象及び地域的流行に関係しているため、我々はこれらをレプリキンと命名した。我々は、血球凝集素タンパク質中の株特異的レプリキン濃度（レプリキン計数＝１００個のアミノ酸あたりのレプリキン数）とインフルエンザの地域的流行及び世界的流行の量的相関関係を発見した（図７）。株特異的ウイルスタンパク質の化学的性質とインフルエンザの地域的流行の相関関係はこれまで全く報告されていない。レプリキン構造の保存、縮合及び濃縮は同様に、インフルエンザ（表７ａ中）、ＨＩＶ及びマラリアにおいても発見された。ＳＡＲＳコロナウイルス中のレプリキンの検出は、その考えらえる進化の追跡に加えて、ワクチン用の小さいＳＡＲＳ抗原の合成を可能にした。
【０１４３】
我々は、インフルエンザの地域的流行と、１９１８年、１９５７年及び１９６８年における前世紀の３つの世界的流行とのインフルエンザ血球凝集素タンパク質中の株特異的レプリキン濃度（計数）の量的相関関係を発見した。これら３つの世界的流行の各々について類似の経過が観察された。すなわち、株特異的高レプリキン計数の後、直ちに衰退が続き、その後、地域的流行が随伴する「リバウンド」増加が発生した。同様に、１〜３年の警告的計数増大が大部分の地域的流行に先行していた。
【０１４４】
我々は、１９１７年にガチョウから単離されたインフルエンザウイルスの血球凝集素中のレプリキン（我々はこれをガチョウレプリキンと命名した）が、ｋｋｇ（ｔ／ｓ）ｓｙｐｋｌｓｋｓｙ（ｔ／ｖ）ｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈという２つの置換のみを伴って、１９１８年の世界的流行の原因であるインフルエンザのＨ１Ｎ１株の中に翌年現われていることを発見した。表７ａは、インフルエンザ１９１７ガチョウレプリキン（ＧＲ）がこのとき、多数の小さい置換及びその他のインフルエンザ株への明白な転座にもかかわらず、基本的に８５年間保存されていたことを示している。我々は、１９１７年インフルエンザＧＲが、Ｈ１Ｎ１（１９１８年の世界的流行）、Ｈ２Ｎ２（１９５７〜５８年の世界的流行）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年の世界的流行、２０００年の中国及びロシアでの地域的流行、２００３年の福建型株の地域的流行）及びＨ５Ｎ１（１９９７年の中国での地域的流行）に現われた、複数のインフルエンザ株の間で明白な移動性を示したということを発見した。１９９７年に、その構造は、Ｈ１Ｎ２内で正確にその１９１８年の構造ｋｋｇｓｓｙｐｋｌｓｋｓｙｖｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈまで回復された。
【０１４５】
ＳＡＲＳコロナウイルスはまず最初に２００２〜２００３年のインフルエンザの流行期に出現した。インフルエンザＧＲ及びコロナウイルスレプリキン（又は一部の未知の共有前駆体）からのＳＡＲＳレプリキンの２００２年における２重の起源は、全て２００２年に発生したものである以下の事象により示唆されている：１）８５年間で最初の縮合が、ＧＲ−Ｈ１Ｎ２レプリキン配列内で２９〜２８アミノ酸に見られる（表７ａ）（類似の縮合が、現地域的流行においては、福建型Ｈ３Ｎ２内で２９〜２７アミノ酸に見られた〔表７ａ〕）；２）ＧＲ−Ｈ１Ｈ２のレプリキン計数は、Ｈ１Ｈ２から外に移動するＧＲと一貫した顕著な衰退を示した；３）コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質のレプリキン計数は顕著な増大を示した；そして４）以下のモチーフを含むレプリキンを伴って２００２〜２００３年にＳＡＲＳコロナウイルスが出現した：ＧＲ１９１８及びＧＲ−Ｈ１Ｎ２  ２００１で先に見られた「ｋｋｇ」及び「ｋ−ｋ」；インフルエンザＧＲ−Ｈ１Ｎ２  ２００１に見られた「ｋ−ｋｋ」、「ｋｋ」及び「ｋｌ」；鳥類気管支炎コロナウイルスレプリキンの中に見られる「ｋｋ」；  及びブタ伝染性下痢症のレプリキン内に見られる「ｋｋ−ｋｋ−ｋ」、「ｋ−ｋ」、「ｋｋ」、「ｋｌ」及び「ｋｔ」（表７ａ）（ＳＡＲＳは、糞便汚染という強力な下支えのあった密集共同住宅内で噴出しその後換気扇によって空気で運ばれた伝染性肺炎としてヒトにおいて最初に出現したと考えられている）。
【表１８】
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【０１４６】
近年さらに増大を続けている１９１７年ガチョウレプリキンの高いレプリキン計数ピークは、現在はＨ１Ｎ２（表７ａ）内での１９１７年のレプリキン計数に近づきつつあり、高い死亡率を伴うものとして表７及び７ａ内に示されているガチョウレプリキンの短かいレプリキン誘導体の現在のキャリヤがＳＡＲＳウイルス及びＨ３Ｎ２−福建型ウイルスであることから、すでに始まってしまっている可能性のある来たる世界的流行の警告であり得る。
【０１４７】
ガチョウレプリキンは、インフルエンザ及びＳＡＲＳのＡ株の大部分及び全てが関与する少なくとも８５年間の歴史を有することから、それとその構成成分は、汎株保護のための保存ワクチン候補である。長さ７〜２１アミノ酸で、ガチョウレプリキンに比べてリジン及びヒスチジンの％が富化された縮合短ＳＡＲＳレプリキンが、長さ２９アミノ酸のガチョウレプリキンのもの（２．５％）と比べてさらに高いＳＡＲＳ死亡率（１０〜５５％）と付随して発生した。ここではＳＡＲＳにおいて長いレプリキンと混合された短レプリキンは、高い死亡率の原因でありうる。これは、エボラ及び天然痘ウイルス及び炭疽菌といったその他の生体のレプリキンにもあてはまる（表７ａ）。これらの短かいＳＡＲＳ  レプリキンは、さらに一層高い未治療死亡率が付随する天然痘、炭疽菌及びエボラといったその他の生体の短かいレプリキンと驚くべき相同性を示した。
【０１４８】
短合成ワクチンは、はるかに迅速に産生され（月単位ではなく日単位）かつはるかに安価である以外に、現行の全ウイルスワクチン全般における望まれない何千ものタンパク質の多重エピトープによって生み出される免疫学的干渉及び汚染に付随する副作用が回避されるはずである。インフルエンザについては、あらゆるケースにおいて現行の全ウイルスワクチンは、高齢者の半数以上において有効でない。しかし、短レプリキンは充分な免疫原性をもつのだろうか？  短神経膠腫レプリキン「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」は、合成抗多形性グリア芽腫及び抗気管支原性癌ワクチンを首尾よく入手するための基礎原料であることが証明された。それは、ピコグラム／細胞単位で癌細胞に対する細胞毒性をもち、癌患者の生存率に量的に関係する抗マリグニン抗体を産生した。２００年のコロナウイルスヌクレオカプシドレプリキン計数に見られた急上昇を理由として再発する確率が高いと思われるＳＡＲＳ攻撃に備えるために、我々は、ヌクレオカプシド、スパイク及び外被タンパク質の中に見られる４つのＳＡＲＳ短レプリキンを合成した。我々は、これらの合成短ＳＡＲＳレプリキンがウサギに注射された時点で同じく豊富な特異的抗体を産生することを発見した。例えば、２１アミノ酸のＳＡＲＳヌクレオカプシドレプリキン抗体は、２０４，８００中１より大きい希釈度で結合する。さまざまな小さいペプチドを用いて、天然痘の場合のような何千ものタンパク質又は核酸又は全タンパク質で得られる望ましくない副作用無く強い免疫応答を達成しようとするその他の研究者による以前の試みが失敗してきたため、強い免疫応答を達成する小さい合成レプリキン抗原の能力は、これらのＳＡＲＳワクチンの効力にとって有意である。
【０１４９】
我々は、インフルエンザ及びＳＡＲＳウイルス内のレプリキン構造と死亡率の増加の関係を調査し、表７に示した通りの結果を得た。短かい又は縮合されたレプリキン配列に対する高い死亡率の関係は、インフルエンザとＳＡＲＳ以外のウイルス及び細菌、マラリア及び癌において、表７のセクションＢに示された高死亡率の生体内で見られる。複製が伝播及び病原性にとって重大である広範囲のウイルス、細菌、マラリア及び癌生体の中での基本的レプリキン構造の普及に加えた、いずれかの細胞型又は感染性生体ではなくむしろ高速複製に対するレプリキンの関係とレプリキン構造を統合した概念を裏づけるものとして、以下の相同な配列が観察された。位置１及び２における「ｋ」；取込みのため又は高速複製を刺激するためＤＮＡ、ＲＮＡ又はその他のレセプタ又はリガンドに対して提示されることになる「ｋ」のアラインメント；「２重ｋ」及び「多重ｋ」の頻度；天然痘ウイルス、炭疽菌ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及び多形性グリア芽腫（神経膠腫）といったさまざまな最高死亡率の生体、癌細胞及び遺伝子に結びつけられた最も縮合した短縮レプリキン内のトリプレット「ｋｋｇ」、「ｈｅｋ」、「ｈｄｋ」及び「ｈｋｋ」、結腸及び乳癌内のｃ−ｓｒｃ及び黒色腫及び結腸癌内のｃ−ｙｅｓの発生及び位置３における「ｇ」の頻度に留意のこと。同様にオーストラリア及び東南アジアにおける２つの最近新興している高死亡率のウイルス、Nipab 及びHandrahウイルスのためのほぼ同一のレプリキン構造にも留意されたい。これらの２つのウイルスは、それらに対して形成された類似の又は同一の抗体を有することが報告されているが、今までのところ、この類似の抗体について、その２つのほぼ同一のレプリキンについての我々の発見事実と共に、これについての構造的根拠は全く知られていない。表７は同様に、１９１７年のインフルエンザガチョウレプリキン及び２つのコロナウイルスすなわち鳥類気管支炎コロナウイルス及びブタ伝染性下痢ウイルスの両方に対する、我々が発見した２００３年の５つのＳＡＲＳレプリキンの関係を示している。表７中の最初の２００３年ヒトＳＡＲＳレプリキンは、２００２年におけるインフルエンザＨ１Ｈ２の中間的構造を通して、インフルエンザウイルスガチョウ１９１７とヒト１９１８レプリキンに対するいくつかの配列相同性を示す（例えば、位置１、１８及び１９におけるレプリキン「ｋ」を参照）。１９１７ガチョウレプリキン配列は表７において、１９９９までのレプリキンの画定にとって重要でないアミノ酸における数多くの置換（置換はイタリック体で示されている）にも関わらず、大幅に保存されてきたことがわかる。このとき、もとの２９アミノ酸１９１７レプリキン配列は、２００１Ｈ１Ｎ２レプリキン内でその１９１７−１９１８年の構造までほぼ正確に回復してきたことがわかった。しかしながら、２００２Ｈ１Ｎ２インフルエンザレプリキンは、２９から２８アミノ酸まで短縮されており、アミノ酸ｋｅｖｌ（ｉ／ｖ）ｗｇ（ｖ／ｉ）ｈｈの「左へのシフト」は明白である。２００３年には、我々のレプリキンは、最初に列挙された２００３ヒトＳＡＲＳウイルスの２１アミノ酸のレプリキンまでさらに短縮（又は圧密）された。２００３��ＡＲＳレプリキンのｋの％は現在、ガチョウレプリキン及び１９１８ヒトにおける世界的流行レプリキンの２０．７％に比べ３８．１％（８／２１）である。インフルエンザ２９アミノ酸レプリキンに比較して、３つのＳＡＲＳ  レプリキンは、それぞれ１９、１１及び９アミノ酸長配列までさらに短縮（又は圧密）されていることがわかった。示されたＳＡＲＳ９アミノ酸配列においては、ｋの％は４４．４％（４／９）である。ＳＡＲＳレプリキンの短縮に伴って、ＳＡＲＳのヒトにおける死亡率は、１９１８インフルエンザの世界的流行における２．５％の死亡率に比べ、若者で１０％、高齢者で５５．５％まで上昇した。
【０１５０】
アミノ酸配列は、その証拠が１９１７ガチョウレプリキンにおいて最初に観察されたインフルエンザレプリキンの８５年間（１９１７〜２００２年）にわたる保存及び相同性の度合を強調するように表７に示されている。それまでにこのような保存が観察されたことは全くない。表７は同様に、２００３ヒトＳＡＲＳウイルス内のレプリキンが、１９１７ガチョウレプリキン及び１９１８ヒトにおける世界的流行インフルエンザレプリキンとしてまず最初に現われたインフルエンザレプリキンに対する相同性を有することに加えて、コロナウイルス鳥類気管支炎ウイルスレプリキン（例えば位置１及び２の「ｋ」、「ｈ」で終る）及びコロナウイルス急性下痢ウイルスレプリキン（例えば位置１及び１１の「ｋ」、レプリキンの終りの「ｈ」）の両方に対する或る配列相同性を示すことを例示している。インフルエンザ及びコロナウイルスの両方のレプリキンに対する関係のこの証拠は、ＳＡＲＳの最近のいくつかのインフルエンザの地域的流行及びそれ以前の世界的流行と同様に香港で発生し、ＳＡＲＳウイルスがヌクレオカプシド、スパイク及び外被タンパク質を含め一部にはその構造のために新しいコロナウイルスとして分類されてきたことから、有利なものである。或る種の疫学的証拠も同様に、ＳＡＲＳが糞便汚染という強力な下支えであった密集共同住宅内で噴出し換気扇によって空気で運ばれた伝染性肺炎としてヒトにおいて最初の出現したという点で、関連性がある。
【０１５１】
インフルエンザウイルスＢ型の株内のレプリキンの組成：  この株内で同定された合計２６のレプリキンのうち（表３）、以下の１０のレプリキンが、１９４０〜２００１年に調査された全てのインフルエンザＢ型分離株の中に存在している。重複するレプリキン配列は別途列挙されている。「３点認識」と一貫性ある相同性を実証するため、リジン及びヒスチジンは太字になっている。
【化５】
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【０１５２】
表３及び４は、Ｈ１Ｎ１プリキンと比べ、インフルエンザＢ型血球凝集素にはレプリキン構造のはるかに大きい安定性が存在すると思われるということを示している。インフルエンザＢ型は、いずれかの世界的流行の原因となったことはなく、動物又は鳥類レゼルボアをもたないように思われる（Stuart-Harris et al., Edward Arnold Ltd., London（１９８５））。
【０１５３】
インフルエンザＨ１Ｎレプリキン；  この株が初めて現われその年の世界的流行をひき起こした１９１８年から、２０００年に至るまで配列が入手可能である全てのＨ１Ｎ１分解株の中に、１つのレプリキン「ｈｐ（ｖ/ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ（ｖ/ｋ）（ｓ/ｔ）（ｔ/ａ）のみが存在する（表４）。（「（ｖ/ｉ）」は、アミノ酸ｖ又はｉが異なる年に同じ位置に存在することを表わしている）。Ｈ１Ｎ１は１つの存続するレプリキンしか含有していないものの、Ｈ１Ｎ１はインフルエンザＢ型よりもさらに多産であると思われる。Ｈ１Ｎ１上には８２年間で９５の異なるレプリキン構造が存在するが、一方インフルエンザＢ型分離株の６２年間では３１の異なるレプリキンしか存在しない（表４）。新しいレプリキン構造の数の増加は、地域的流行の年に発生し（表３、４、５及び６）、合計レプリキン濃度の増加と相関関係をもつ（図７及び８）。
【０１５４】
インフルエンザＨ２Ｎ２レプリキン：  インフルエンザＨ２Ｎ２は、１９５７年のヒトにおける世界的流行の原因であった。１９５７年についてその株の中で同定された２０のレプリキンのうち３つが、１９９５年までＰｕｂＭｅｄ上での検査のために利用可能であったＨ２Ｎ２分離株の各々の中に保存されていた（表５）。
【化６】
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【０１５５】
しかしながら、Ｈ１Ｎ１とは対照的に、１９６１年から始まったＨ２Ｎ２の中には、１３の付加的レプリキンしか発見されなかった。新しいレプリキンの出現のこの少なさは、何年にもわたる分離株内のＨ２Ｎ２の出現及びＨ２Ｎ２レプリキンの濃度の衰退と相関関係をもつ（図８）。
【０１５６】
インフルエンザＨ３Ｎ２レプリキン：  インフルエンザＨ３Ｎ２は、１９６８年のヒトにおける世界的流行の原因であった。１９６８年に現われた５つのレプリキンは、１９７７年以降消えたが１９９０年には再び現われた（表６）。２２年間存続した唯一のレプリキン構造は、１９７７年に最初に現われ１９９８年まで存続したｈｃｄ（ｇ/ｑ）ｆ（ｑ/ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ/ｉ）ｅｒ（ｓ/ｔ）であった。１９９０年中葉における１２の新しいＨ３Ｎ２レプリキンの新興（表６）は、同時のレプリキン濃度の増加（図８）及び最近の分離株中のＨ３Ｎ２株の普及とこれらの分離株のいくつかからの全てのレプリキンの同時消滅（図８）と相関関係をもち、このことは、新しい亜株Ｈ３Ｎ２（Ｒ）の新興を示唆している。Ｈ３Ｎ２（福建型）の新しい株の２００３年１１月〜１２月の現在の地域的流行は、２００１年７月９日付けの米国仮出願ＵＳ６０／３０３，３９６号の中で最初になされたこの予測を確認している。
【０１５７】
図１及び２は、インフルエンザの地域的流行及び世界的流行が、その消滅から１〜５９年後の少なくとも１つのレプリキンが再出現に起因するものである。インフルエンザウイルス内のレプリキンの濃度の増大と相関関係をもつことを示している。同様に、Ａ株のみにおいて、新しい株特異的レプリキン組成物の新興が存在する（表４〜６、同様に図１１のＨ５Ｎ１についての地域的流行前の新しいレプリキン数の増加も参照のこと）。単一のタンパク質内の個々のレプリキンの反復によるレプリキン濃度の増加は、インフルエンザウイルスでは発生しないと思われるが、その他の生体では見られる。
【０１５８】
異なるインフルエンザ株の活性の変化は、それ自体、以下の２つのほとんど理解されていないプロセスのうちの１つによりもたらされる置換の産物であるインフルエンザ血球凝集素の配列変化に関係づけられると考えられている。すなわちｉ）血球凝集素分子内の一連の点突然変異の蓄積に起因すると考えられる抗原連続変異、又はｉｉ）変化が非常に大きいため遺伝子の混ぜ合わせがヒト及び非ヒト宿主のウイルスの間で発生することが前提とされている抗原不連続変異、である。まず第１に、当該データは、異なるインフルエンザ株の活性の変化が、非特異的レプリキン濃度の増加に関連づけされるのではなくむしろ、株特異的レプリキンの濃度の増加及び地域的流行に付随する複製の株特異的増大に基づいているか又はそれに関係しているということを示唆している。さらに、該データは、どの配列変化が「連続変異」又は「不連続変異」に起因するか及びどれが保存、レゼルボア内の貯蔵及び再出現に起因するかについての考えられる洞察について検討された。該データは、レプリキン濃度の地域的流行関連増加が、血球凝集素あたりの既存のレプリキンの重複に起因するのではなく、その消滅から１年から最高５９年後の少なくとも１つのレプリキン組成物の再出現そしてＡ株のみにおいて新しい株特異的レプリキン組成物の新興に起因することを示している（表３〜６）。かくして、１９５１年及び１９７７年のインフルエンザＢ型の地域的流行におけるレプリキン濃度の増加は、該地域的流行の年における新しいレプリキン組成物の新興とは結びつけられず、先行する年において現われその後消滅したレプリキン組成物の再出現とのみ結びつけられる（表３）。これとは対照的に、Ａ株においては、以前に消滅したウイルスレプリキンの再出現に加えて、新しい組成物が現われる（例えば、１９９６年の地域的流行の年におけるＨ１Ｎ１では、６つのより早期のレプリキンの再出現に加えて、１０個の新しい組成物が新興した）。インフルエンザＢ型ではなくＡ株のみが非ヒト動物及び鳥類レゼルボアにアクセスできることから、完全に新しい組成物は恐らく、「３点認識」の基本的必要条件以外の新しい組成物と全く類似点が無いと思われる既存のヒトレプリキンの突然変異からではなくむしろ非ヒト宿主レゼルボアに由来する（表２−５）。Ｂ型に比べＨ１Ｎ１がより多産性であることそして世界的流行がＢ型株によってではなく３つのＡ株によってのみ生み出されたという事実は、両方共、非ヒトウイルスレゼルボアから新しいレプリキン組成物を受けとるヒトＡ株の能力の１つの関数でもあり得る。
【０１５９】
一部のレプリキンは、わずか１年間だけ現われ、消滅し、今日まで再出現していない（表３〜６）。その他のレプリキンは、１年から最高８１年間消滅し、その時点で同一のレプリキン配列が再度現われる。主要なレプリキン「ｋ」及び「ｈ」アミノ酸及びそれらの間の空間は、以下の株特異的レプリキンについて表２及び３−６に示されているように、長年にわたる特定のレプリキンの恒常的存在の間保存されている（インフルエンザＢのもの１０、Ｈ１Ｎ１の単一のレプリキン及びＨ３Ｎ２の単一のレプリキンならびに不在後の同一レプリキンの再出現について）。血球凝集素配列の残りのものの中のレプリキン構造の内側及び外側の両方でのその他のアミノ酸の顕著な交換又は置換活性にも関わらず、インフルエンザレプリキンヒスチジン（ｈ）は決して交換されることがないように思われ、リジン（ｋ）はまれにしか交換されない。この保存の例は、１９１８年と２０００年の間で恒常であるＨ１Ｎ１レプリキン「ｈｐ（ｖ/ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ（ｒ/ｋ）（ｓ/ｔ）（ｔ/ａ）ｋ」（配列番号１３５）、１９７５年と１９９８年の間で恒常であるＨ３Ｎ２レプリキン「ｈｃｄ（ｇ/ｑ）ｆ（ｑ、ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ/ｉ）ｅｒ（ｓ/ｔ）ｋ」（配列番号２７７）及び、１９７５年に最初に現われ、２５年間消滅し次に２０００年に再度現われた「ｈｑｎ（ｓ／ｅ）（ｅ／ｑ）ｇ（ｔ／ｓ）ｇ（ｑ／ｙ）ａａｄ（ｌ／ｑ）ｋｓｔｑ（ａ／ｎ）ａ（ｉ／ｌ）ｄ（ｑ／ｇ）Ｉ（ｎ／ｔ）（ｇ／ｎ）ｋ、（ｌ／ｖ）ｎ（ｒ／ｓ）ｖｉ（ｅ／ｃ）ｋ」（配列番号２７６）の中に見られる。数多くのアミノ酸が置換されてきた一方で、約５０アミノ酸以下の６〜１０残基離隔した２つのリジン、１ヒスチジン、最低６％のリジンという基本的なレプリキン構造が保存された。
【０１６０】
完全に無作為な置換は、これらのＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２レプリキンの存続も、１９０２年〜２００１年のインフルエンザＢにおける１０個のレプリキン構造の存続も、７４年間の不在後の１９１９年の１８量体レプリキンの１９９３年における再出現も可能にしないと思われる。無作為なタイプの置換よりもむしろ、恒常性は、秩序立って制御されたプロセスを示唆するか又は、少なくとも、主要なレプリキンが何らかの要領で固定又は結合させられるような形でのそれらの保護を示唆している（おそらくは核酸に結合されるリジン及び恐らくは呼吸器酸化還元酵素に結合されるヒスチジン）。この保存を制御するメカニズムは現在のところわかっていない。
レプリキン構造の保存
【０１６１】
レプリキン構造が保存されているか又は広範な自然突然変異に付されるかも又、そのウイルスのタンパク質における突然変異が何十年にもわたり世界中で充分立証されてきた口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）のさまざまな分離株のタンパク質配列を走査することによって検討された。ＦＭＤＶ分離株のタンパク質配列はレプリキン全体及び特定のレプリキンの中で観察された成分レプリキンアミノ酸残基の各々の両方の存在について目視により検査された。
【０１６２】
近辺のアミノ酸内で発生するように経時的に広範囲の置換が起こるのではなく、レプリキン構造を含むアミノ酸はほとんど又は全く置換されない。すなわちレプリキン構造は保存される。
【０１６３】
例えば、ＦＭＤＶＯ型のタンパク質ＶＰ１の中で、レプリキン（配列番号３）「ｈｋｑｋｉｖａｐｖｋ」は、ＰｕｂＭｅｄ中で報告された２３６の分離株の７８％の中で保存されることが発見され、各アミノ酸は、ｈｉｓ、９５．６％；ｌｙｓ、９１．８％；ｇｌｎ、９２．３％；ｌｙｓ、８４．１％；ｉｌｅ、９０．７％；ｖａｌ、９１．８％；ａｌａ、９７．３％；ｐｒｏ、９６．２％；ａｌａ、７５．４％；及びｌｙｓ、８８．４％といったような個々の分離株内に保存されることがわかった。高い保存率は、レプリキン構造の構造的及び機能的安定性を示唆し、治療のための恒常な標的を提供する。
【０１６４】
同様にして、配列保存は、ＨＩＶＩ型中の（配列番号５）「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」又は（配列番号６）ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ及びＨＩＶ２型中の（配列番号７）「ｋｃｗｎｃｇｋｅｇｈ」といったそのレプリキンについて、ＨＩＶの異なる分離株Ｐで発見された（表２）。配列保存のさらなる例は、主要リジン及びヒスチジンアミノ酸が保存されている（配列番号６１３）ｈｃｌｖｃｋｑｋｋｇｌｇｉｓｙｇｒｋｋ、といったようなＨＩＶｔａｔタンパク質の中に見い出された（表８参照）。
【０１６５】
同様にして、配列保存は、例えば酵素Ｅを活性化させる小麦ユビキチンといったような小麦の中などの植物中に観察された（配列番号６１４−６１６）。小麦中のレプリキンは、中で記述されているように植物の成長の刺激のための信頼性ある標的さえ提供した。その他の保存例は、神経膠腫細胞の組織培養１０年にわたる連続する世代間でのマリグニンの恒常的な存在の中に、そして、米国、英国、欧州及びアジアからの８，０９０件のヒト血清から免疫吸着により単離された抗マリグニン抗体に対する神経膠腫レプリキンの親和力の恒常性に見られる（例えば図５及び米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号）
【０１６６】
同様にして、保存は、ＨＩＶの分離株内のＴａｔ（トランス作用因子）タンパク質中に観察された。Ｔａｔ（トランス作用因子）タンパク質は、レンチウイルス転写を調節する早期ＲＮＡ結合タンパク質である。これらのタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）といったような全ての既知のレンチウイルスのライフサイクルにおける必要な構成要素である。Ｔａｔは、トランス作用性応答配列（ＴＡＲ）ＲＮＡ要素に結合することによって作用しＬＴＲプロモータからの転写の開始及び／又は伸長を活性化する転写調節因子タンパク質である。ＨＩＶは、ｔａｔ無しでは複製できないが、その化学的根拠はわかっていない。８９〜１０２個の残基のＨＩＶｔａｔタンパク質配列の中に、我々は、その他の生体内での高速複製と結びつけられているレプリキンを発見した。このレプリキンのアミノ酸配列は「ｈｃｌｖｃｋｑｋｋｇｌｇｉｓｙｇｒｋｋ」である。実際、我々はこのレプリキンが全てのＨＩＶｔａｔタンパク質の中に存在することを発見した。一部のｔａｔアミノ酸は表９に示されているように交互のアミノ酸により高頻度で置換されている（最も高頻度のアミノ酸の下に並んだ小さいフォント（表８）、優勢なレプリキン「ｈｃｌｖｃｆｑｋｋｇｌｇｉｓｙｇｒｋｋ」についての保存百分率）。これらの置換は、大部分の個々のアミノ酸について現われた。しかしながら、レプリキン構造を画定するレプリキン配列内の主要なリジン及びヒスチジンアミノ酸は、該配列中で１００％保存されている。置換はその他のアミノ酸中の他の場所でレプリキンの内外両方で一般的であるが、これらの主要なヒスチジンアミノ酸上で発生するものは全く無い。
【０１６７】
表８に示されているように、リジンがｔａｔタンパク質アミノ酸配列内で置換されていないとは限らない。表の左側から、レプリキン配列の外側にあるものの直ぐ隣接する配列内のまさに最初のリジン及び、レプリキン形成にとって不可欠でないことから「予備的なもの」であるレプリキン内部にあるが配列内の第２のリジン（ｋ）は、両方共高頻度で置換されている。しかしながら、合わさってレプリキン構造を規定するカッコ内の第３、第４及び第５のリジン、及び１つのヒスチジンは決して置換されていない。かくして、これらの主要アミノ酸配列は１００％保存されている。インフルエンザウイルスレプリキンの場合に観察された通り、この選択的置換及び選択的無置換が無作為置換により偶然発生する可能性はないと思われる。
【表１９】
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【０１６８】
レプリキン構造の保存は、レプリキン構造が、保護及び保存されなくてはならないＨＩＶウイルスのための特異的存続機能を有し、抗体及びその他の「攻撃」を回避するために作り出されるアミノ酸置換のウイルス「防御」操作の犠牲にはなり得ないことを示唆している。これらの「防御」機能は、同様に不可欠であるものの、ＨＩＶ複製のウイルス存続機能と「競合」できない。
【０１６９】
ＨＩＶの異なる分離株において、ＨＩＶ１型におけるｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ（配列番号５）又はｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ（配列番号６）及びＨＩＶ２型におけるｋｃｗｎｃｇｋｅｇｈ（配列番号７）といったようなそのレプリキンについて、さらなる保存が観察された。
【０１７０】
ＦＭＶＤ及びＨＩＶレプリキンにおいて観察された高い保存率は、インフルエンザレプリキンのレプリキン内でも観察された保存がウイルスレプリキンの一般的特性であることを示唆している。この保存によりこれらは、例えば神経膠腫レプリキンについて例示されているようにインフルエンザ、ＦＭＶＤ又はＨＩＶワクチン用といった特異的レプリキンを使用することによる破壊、又は刺激のいずれかのための恒常で信頼性の高い標的となる。
【０１７１】
同様にして、レプリキン内の高い保存率により、保存がウイルスレプリキンの一般的特性でありかくしてレプリキンを破壊又は刺激のための恒常かつ信頼性の高い標的としているということが示唆されている、インフルエンザウイルス、ＦＭＤＶ及びＨＩＶを含むウイルスにおいて発見された例において提供されている通りに、レプリキン構造の保存は植物内で発生する。例えば、小麦植物においては、レプリキンが保存され、刺激のための信頼性の高い標的を提供する。酵素Ｅを活性化する小麦植物ユビキチン内の保存されたレプリキンの例としては、以下のものが含まれる。
【化７】
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【０１７２】
ＨＩＶｔａｔタンパク質内で発見された保存と同様にして、小麦ユビキチン活性化酵素Ｅ内のレプリキンは保存される。ＨＩＶｔａｔタンパク質の場合と同様、小麦ユビキチン活性化酵素Ｅ内のレプリキン変異体形態に隣接するアミノ酸の置換（「*」により指定されている）は一般的である。しかしながらレプリキン構造を形成する主要ｋ及びｈアミノ酸は、わずか５つのアミノ酸（左側の最初のｋから）である「不可欠でない」ｋが置換されているのに対し、変動しない。
【０１７３】
抗レプリキン抗体
抗レプリキン抗体は、レプリキンに対する抗体である。抗レプリキン抗体についてのデータは、同様にレプリキンの種類の一体性を裏づけている。固定化されたマリグニンに対する血清抗マリグニン抗体の免疫吸着により抗−レプリキン抗体応答が定量化されてきた（米国特許第５，８６６，６９０号内の方法を参照のこと）。マリグニン、不在の炭水化物又はその他の基から配列が誘導された１６量体ペプチドの合成バージョンのウサギに対する投与による抗マリグニン抗体の豊富な産生は、このペプチド単独で１つのエピトープであることすなわちこの免疫応答のための充分な根拠を提供することを厳密に実証した（図３）。１６量体ペプチドは、抗体のＩｇＭ及びＩｇＧの両方の形態を産生した。抗マリグニン抗体の血清中濃度は、感染から約１５〜２５年後に発生する肝癌の通常の遵守よりはるかに前の最初の５年間の感染において、早期に、米国及びアジアにおけるＢ型及びＣ型肝炎の７９の症例の３７％で増加することがわかった。感染性肝炎及びＨＩＶ感染の両方に関連して、形質転換された細胞はウイルスにとって安全な隠れ場の１つの形態であり得る。すなわち細胞の寿命を延ばしウイルスの追い立てを回避し、かくしてウイルスは抗ウイルス治療にとってアクセス不可能なものであり続けることになる。
【０１７４】
レプリキンの投与は、免疫系を刺激して、細胞毒性効果をもつ抗体を産生することから、一定の与えられた時期全体にわたり最も濃度が高いことが観察された特定のインフルエンザウイルス又はレプリキングループに基づくペプチドワクチンは、一定の与えられたインフルエンザの流行期において勃発する確率の最も高い特定のインフルエンザ株、例えば新興株又は再興株に対する保護を提供する。例えば、年一回又は二年に一回のペースでインフルエンザウイルス血球凝集素アミノ酸配列を分析することで、その年について特異的にターゲティングされたインフルエンザワクチンを処方する上で有用なデータを提供する。かかる分析は、地域毎に又は任意の望まれる時期に行なうことができ、かくして世界中の異なる部域で新興する株を検出し、各地域のための特異的にターゲティングされたワクチンを処方することができる、ということは言うまでもない。
インフルエンザ
【０１７５】
現在、ワクチン処方は、ＷＨＯ及びＣＤＣの国際的な会合において年２回変更されている。ワクチン処方は、世界の一定の与えられた地域内のインフルエンザウイルス株の最新の優勢性の血清学的証拠に基づいている。しかしながら、本発明以前には、インフルエンザの地域的流行又は世界的流行の発生とインフルエンザウイルス株特異的アミノ酸配列の変化を相関させるものは全く存在しなかった。
【０１７６】
特異的レプリキン及びインフルエンザウイルスタンパク質中のその濃度を観察することにより、インフルエンザの世界的流行及び地域的流行の最初の特異的な量的早期化学的相関要素が提供され、世界の特定の地域内でのインフルエンザウイルスの優勢な新興又は再興株を処理するべく特定的にあつらえたインフルエンザワクチンの生産及び時宜を得た投与が提供される。レプリキンの存在、濃度及び／又は保存について血球凝集素タンパク質配列といったようなインフルエンザウイルスの株の分離株のタンパク質配列を分析することにより、インフルエンザウイルスの世界的流行及び地域的流行を予測することができる。さらに、かかるインフルエンザ勃発の重大性は、例えば約１年から約３年の一定の与えられた時期にわたりウイルス分離株について最も豊富であることがわかった又は上昇中であることが示されたレプリキン配列に基づいてインフルエンザペプチドワクチンを投与することによって著しく小さくすることができる。
【０１７７】
該発明のインフルエンザペプチドワクチンには、単一のレプリキンペプチド配列が含まれていてよく、そうでなければ、インフルエンザウイルス株の中で観察された複数のレプリキン配列が含まれていてよい。好ましくはペプチドワクチンは、一定の与えられた時期全体にわたり濃度を増大させていることが示され、少なくともその時期の間保存されているレプリキン配列（単複）に基づいている。しかしながら、ワクチンは、新しいレプリキン（単複）ペプチドと組合わせた状態で保存されたレプリキンペプチド（単複）を内含でき、そうでなければ、新しいレプリキンペプチド配列に基づいていてもよい。レプリキンペプチドは、化学的合成又は組換え型遺伝子技術を含むあらゆる方法により合成され得、非レプリキン配列を内含できるが、レプリキン配列のみを含有するペプチドに基づくワクチンが好ましい。好ましくは、該発明のワクチン組成物は、薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントも含有している。
【０１７８】
本発明のインフルエンザワクチンは、単独でか又は、ガンシクロビル；インターフェロン；インタロイキン；アマシタジン、リマシタジンといったＭＺ阻害物質；ザナミビル及びオセルタミビルといったようなノイラミニダーゼ阻害物質；などといった抗ウイルス薬ならびに抗ウイルス薬の組合せと組合せた形で投与することができる。
マラリアのおけるレプリキンデコイ
【０１７９】
メロゾイド表面及び寄生菌含有空胞内部にある熱帯マラリア原虫マラリア抗原の一次構造の分析は、この生体がインフルエンザウイルスのように、同様に数多くのレプリキンを含有することを明らかにした（表９）。しかしながら、熱帯マラリア原虫とインフルエンザウイルスの分離株内のレプリキンの観察の間にはいくつかの差異がある。例えば、熱帯マラリア原虫はここで「レプリキンデコイ」と呼ぶいくつかの部分的レプリキンを含有する。これらのデコイ構造はリジン残基を豊富に含有しているが、レプリキン構造に必要とされるヒスチジンが欠如している。特定的には、これらのデコイは、真のマラリアリコグニンと類似しているもののヒスチジン残基の無い重複した形で６〜１０個の残基だけ離隔した数多くのリジンを含有している。デコイ構造は、抗マラリア抗体又はその他の作用物質が、トリパノゾーマの破壊をひき起こし得る呼吸酵素中のレプリキンといったようなレプリキン構造の中に存在するヒスチジンに対し結合するのではなく、リジンを含有する比較的重要度の低い構造すなわちレプリキンデコイに結合することになる確率を最大限にすると考えられている。例えば、レプリキン構造に対する特異性を伴う入来した抗体は、レプリキンデコイ構造に付着し、真のレプリキン構造を手付かずのままに残す可能性がある。
【０１８０】
従って、マラリアの抗レプリキン処置には、次の２つの期が必要である（２重の処置）；ｉ）レプリキンデコイを分割し、特異的抗レプリキン処置の「無害通行」を可能にするタンパク質分解酵素での予備的治療；及びｉｉ）特異的抗体を用いる、又は合成マラリアレプリキンワクチンによって生成される細胞免疫性による又はマラリアレプリキンをターゲティングする有機的手段による、マラリアレプリキンの攻撃。
レプリキン構造の反復及び重複
【０１８１】
熱帯マラリア原虫に見られるもう１つの差異は、インフルエンザウイルスでは観察されなかった、単一タンパク質内の個々のレプリキン構造の頻繁な反復である。反復は、（ａ）レプリキン間でのリジン残基の共有、及び（ｂ）もう１つのレプリキン配列内部でのレプリキン配列の一部分の反復によって発生し得る。
【０１８２】
インフルエンザウイルス分離株及び熱帯マラリア原虫内で観察されるレプリキン構造間の第３の有意な差異は、マラリアタンパク質全体を通してのレプリキン構造の顕著な重複であり、例えば、配列番号３９３の３９個のアミノ酸配列内に９つの重複レプリキン（レプリキン濃度＝２３．１／アミノ酸１００個）及び配列番号４６７の４１個のアミノ酸内に１５個の重複レプリキン（レプリキン濃度＝３６．６／アミノ酸１００個）が存在する。これらの重複するレプリキン構造は両方共、血液ステージのトロフォゾイド及びシゾント中で発生する。これとは対照的に、インフルエンザウイルスレプリキンは、タンパク質全体を通してより散在しており、最大レプリキン濃度はアミノ酸１００個あたり約７．５であり（図７）、トマト縮葉病ジェミニウイルスは、同じく重複するレプリキンを有することが観察された。
トマト縮葉病ジェミニウイルスのレプリキン
【０１８３】
トマト縮葉病ジェミニウイルスは、中国及び世界のその他の数多くの部分でトマトの収穫を壊滅させた。そのレプリキンは、レプリキン計数が２０．７であった日本において単離されたウイルスの中の以下で例示する通りの重複するレプリキンのため、高い計数に達している。
レプリキン分析
【０１８４】
内容説明：  日本におけるトマト（特異的宿主Lycopersicon esculentum Mill.）におけるトマト黄色縮葉病ウイルスの最初の発生
単離されたもの：１９９８年出典：トマト黄色縮葉病ウイルス−［Aichi］
株：  Aichi
タンパク質配列：  アミノ酸位置１〜１３５
【化８】
2007526222.tif 000028
アミノ末端レプリキン
【化９】
2007526222.tif 000029
この配列の分析は、この「複製タンパク質」のアミノ酸１〜１６３が５つのレプリキンを含有しているということを示した；すなわち：
【化１０】
2007526222.tif 000030
【化１１】
2007526222.tif 000031
【化１２】
2007526222.tif 000032
中間分子：ゼロレプリキン
カルボキシ末端：ゼロレプリキン
レプリキン計数＝１００個のアミノ酸あたりのレプリキン数＝２８／１３５＝２０．７。
さらに高いレプリキン計数でさえ、マラリアにおいてレプリキンを重複させることにより達成されることがわかる。
【０１８５】
リジン乗数の機序は、胃癌形質転換タンパク質ｋｔｋｋｇｎｒｖｓｐｔｍｋｖｔｈ（配列番号８８）及び肺の形質転換タンパク質  Ｐ２１Ｂ（Ｋ−ＲＡＳ２Ｂ）ｋｈｋｅｋｍｓｋｄｇｋｋｋｋｋｋｓ（配列番号８９）内といったような癌タンパク質のレプリキン内でも見られる。
【０１８６】
高速複製に対するより高いレプリキン濃度の関係は、同様に、ＨＩＶ分離株の分析によっても確認される。ＨＩＶの低速成長する低力価株（初期ＨＩＶ感染において優勢であるＮＳＩ、「Ｂｒｕ」）が、１００個のアミノ酸あたり１．１（＋／−１．６）レプリキンというレプリキン濃度を有し、一方ＨＩＶの高速成長する高力価株（晩期ＨＩＶ感染において優勢であるＳ１、「Ｌａｉ」）が１００個のアミノ酸残基あたり６．８（＋／−２．７）レプリキンというレプリキン濃度を有するということが発見された。
【０１８７】
マラリア、インフルエンザウイルス及び癌細胞中の重複するレプリキンの高い濃度は、マラリア生体の伝説的に高い高速複製する能力と一貫したものである。マラリアにおいて重複するレプリキンが多いことは、生体がその宿主の免疫系をあふれさせ混乱させ、かくして誤った抗体が作られ永続し主要なマラリア抗原を無害のままに残す確率を最大限にする機会を提供する。
【０１８８】
インフルエンザウイルスの場合のように、例えばマラリア生体内に見られるレプリキン構造（単複）に基づくペプチドワクチンは、マラリアを予防しかつ／又は治療する有効な手段を提供できる。マラリアに対するワクチン接種は、熱帯マラリア原虫内に観察された１つのレプリキン構造又はその混合物を含有する組成物を投与することによって達成できる。さらに、マラリアレプリキンに対する抗体を、受動免疫又はマラリア検出のために生成し投与することができる。
マラリアにおけるレプリキン
【０１８９】
マラリアは、世界中で年間２億件以上の症例を占め年間２００万人以上が死亡し、これまでいかなる有効なワクチンも存在しない疾病である。レプリキンは、マラリアの原因である最も一般的なトリパノゾーマ株である熱帯性マラリア原虫の中に顕著であることがわかっている。
高レプリキン計数
【０１９０】
トリパノゾーマの伝説的に高い複製速度と合致して、あらゆる株の中になおも観察される最高のレプリキン計数は、トリプトゾーマ内で発見された。トリパノゾーマ熱帯性マラリア原虫内で、我々は、最近１９９９年の３Ｄ７マラリア世界的流行年において有効な抗マラリアアルテミシスニンの標的であることが最近見極められたＡＴＰアーゼタンパク質について、全ての分離株のためのＡＴＰアーゼ内の平均レプリキン計数が５７．６であり、１つの分離株においてレプリキンを反復及び重複させることによりレプリキン計数が１１１．８の記録を達成することを発見した。
レプリキン構造の反復及び重複
【０１９１】
インフルエンザレプリキンと比べて高いレプリキンを占める熱帯性マラリア原虫レプリキン内に見られる１つの特徴は、インフルエンザウイルスでは観察されなかった特長である単一タンパク質内部での個々のレプリキン構造の頻繁な反復である。反復は、ａ）単に全レプリキンを反復させることによって、（ｂ）レプリキン間のリジン残基の共有によって、及び（ｃ）もう１つのレプリキン配列と組合わせた又はその内部のレプリキン配列の一部分の反復によって起こり得る。
【０１９２】
レプリキン構造の反復に加えて、インフルエンザウイルスタンパク質内で見られるレプリキン構造と熱帯性マラリア原虫タンパク質内のレプリキン構造の間のもう１つの有意な差異は、マラリアタンパク質全体を通したレプリキンの顕著な重複にある。例えば、重複するレプリキン構造は、以下で見られるように、血液ステージのトロフォゾイド及びシゾント内で発生する。
１）「ｋｓｄｈｎｈｋ」の４つの正確な反復に加えて、配列番号３９３の３９個のアミノ酸配列内に、１４の重複するレプリキンが存在する（レプリキン濃度又はレプリキン計数＝１８／３９＝４６．２／１００アミノ酸）：
【化１３】
2007526222.tif 000033
及び２）配列番号４６７の４１個のアミノ酸内に、１５の重複レプリキンが発生する（レプリキン濃度又はレプリキン計数＝３６．６／１００個のアミノ酸）。
【化１４】
2007526222.tif 000034
【０１９３】
これらの重複するレプリキン構造は両方共、血液ステージのトロフォゾイド及びシゾント内で発生する。これとは対照的に、インフルエンザウイルスレプリキンはタンパク質全体にわたりさらに散乱しており、最大レプリキン計数（１９１７−１８年以外）は約７．５（図７）である。以上で記述した通り、トマト縮葉病ジェミニウイルスも同様に、重複するレプリキンを有しレプリキン計数を２０．７もの高い値に上昇させることが観察された。
【０１９４】
表９
１つの分子、ＡＴＰアーゼ中のレプリキンの反復、重複及び保存
重複レプリキン、レプリキン反復又はレプリキン構造の分子内保存は全て、熱帯性マラリア原虫３Ｄ７  ＡＴＰアーゼの単一の分子内のアミノ酸位置３９９〜９２７までに発見された。以下で示すように、不変的な当初の「ｋ」と末端「ｈｋ」（斜線部分）により各レプリキンの同一のモチーフが保存される一方で、隣接するアミノ酸「ｇ／配列番号」、「ｄ／ｇ／ｅ」、「ｓ／ｃ／ｎ／ｈ」及び「配列番号」は可変的（白）である。各レプリキンについての最後のリジンは、例えばｋ４１１、ｋ４１７といった次のレプリキンにとっての最初のリジンでもある。
【化１５】
2007526222.tif 000035
【化１６】
2007526222.tif 000036
【０１９５】
リジン集合
マラリアにおいて以上の例で見られた高い百分率のリジンを生成するレプリキン内のリジン集合「ｋｋ」、「ｋｋｋ」などの現象は、それが、例えば胃癌形質転換タンパク質「ｋｔｋｋｇｎｒｖｓｐｔｍｋｖｔｈ」（配列８８）内及び肺の形質転換タンパク質Ｐ２１Ｂ（Ｋ−ＲＡＳ２Ｂ）「ｋｈｋｅｋｍｓｋｄｇｋｋｋｋｋｋｓ」（配列番号８９）内といった高死亡率の癌タンパク質のレプリキン内、及びヒトＳＡＲＳヌクレオカプシドタンパク質「ｋｈｌｄａｙｋｔｆｐｐｔｅｐｋｋｄｋｋｋｋ」のように高死亡率のＳＡＲＳ内でも見られるものの、１９１８年のＨ１Ｎ１ヒトインフルエンザ「ｋｋｇｓｓｙｐｋｌｓｋｓｙｖｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈ」内のようにより低い死亡率のインフルエンザ株内ではさほど一般的に見られないことから、病原性の増加及び死亡率の増加に関連づけすることができる。
【０１９６】
マラリア、インフルエンザウイルス及び癌細胞中の重複するレプリキンの高い濃度は、マラリア生体の伝説的に高い高速複製する能力と一貫したものである。マラリアにおいて重複するレプリキンが多いことは、生体がその宿主の免疫系をあふれさせ混乱させ、かくして誤った抗体が作られ永続し主要なマラリア抗原を無害のままに残す確率を最大限にする機会を提供する。
【０１９７】
インフルエンザウイルスの場合のように、例えばマラリア生体内に見られるレプリキン構造（単複）に基づくペプチドワクチンは、マラリアを予防しかつ／又は治療する有効な手段を提供できる。マラリアに対するワクチン接種は、熱帯マラリア原虫内に観察された１つのレプリキン構造又はその混合物を含有する組成物を投与することによって達成できる。さらに、マラリアレプリキンに対する抗体を、受動免疫又はマラリア検出のために生成し投与することができる。
レプリキンデコイ
【０１９８】
インフルエンザウイルスレプリキンとのもう１つの差異においては、熱帯マラリア原虫はここで「レプリキンデコイ」と呼ぶいくつかの部分的レプリキンを含有する。これらのデコイは、真のマラリアリコグニンと類似しているもののヒスチジン残基の無い重複した形で６〜１０個の残基だけ離隔した数多くのリジンを含有している。これらのデコイ構造は、抗マラリア抗体又はその他の作用物質が、トリパノゾーマの破壊をひき起こし得る呼吸酵素中のレプリキンといったようなレプリキン構造の中に存在するヒスチジンを含む結合ではなく、リジンを含有する比較的重要度の低い構造すなわちレプリキンデコイに結合することになる確率を最大限にすると考えられている。例えば、レプリキン構造に対する特異性を伴う入来した抗体は、レプリキンデコイ構造に付着し、真のレプリキン構造を手付かずのままに残す可能性がある。
【０１９９】
従って、マラリアの抗レプリキン処置には、次の２つの期が必要となると思われる（２重の処置）；ｉ）レプリキンデコイを分割し、特異的抗レプリキン処置の「無害通行」を可能にするタンパク質分解酵素での予備的治療；及びｉｉ）特異的抗体を用いる、又は合成マラリアレプリキンワクチンによって生成される細胞免疫性による又はマラリアレプリキンをターゲティングする有機手段による、マラリアレプリキンの攻撃。
【０２００】
表１０は、いくつかの熱帯性マラリア原虫レプリキン配列のリストを提供している。このリストは完全なものとして意図されたものでないという点に留意すべきである。生体の異なる分離株が、その他のレプリキン構造を含有する可能性もある。
表１０
マラリアレプリキン
ａ）メロゾイト表面及び寄生菌含有空胞内に位置特定される熱帯性マラリア原虫マラリア抗原の一次構造。
ｉ）デコイ：
（Ｃ末端）
【化１７】
2007526222.tif 000037
ｉｉ）レプリキン
【化１８】
2007526222.tif 000038
【化１９】
2007526222.tif 000039
ｂ）「肝臓ステージの抗原−３」  遺伝子＝「ＬＳＡ−３」レプリキン
【化２０】
2007526222.tif 000040
【化２１】
2007526222.tif 000041
ｃ）２８ＫＤＡのオーキネート表面抗原前駆体レプリキン
【化２２】
2007526222.tif 000042
ｄ）血液ステージのトロフォゾイド及びシゾントレプリキン：
【化２３】
2007526222.tif 000043
【化２４】
2007526222.tif 000044
【化２５】
2007526222.tif 000045
【化２６】
2007526222.tif 000046
【化２７】
2007526222.tif 000047
構造タンパク質内のレプリキン
【０２０１】
一部の構造タンパク質がレプリキン構造を内含することも決定された。構造タンパク質は、皮ふ及び結合組織内及び膜構造内のコラーゲン例えば脳内のアミロイドＡ４前駆体タンパク質（ＡＰＰ）といったような組織及び器官支持体に関与する分子である。これらのタンパク質の過剰産生は、疾病に結びつけられる。特定的に言うと、皮ふ内のコラーゲンの過剰産生の場合の強皮症（表１１）及び脳内のＡＰＰの過剰産生の場合のアルツハイマー病（表１２）である。
【０２０２】
強皮症と悪性腫瘍の結びつきは、ここ数年にわたり議論の的であった。初期の報告書では、複数の相互関係機序が示唆されていた。最近の長期研究は、強皮症及び悪性腫瘍の連関比の増大を示唆している。しかしながら、根本的な機序はとらえどころのないままである。（Wenzel. J. Eur. J. Dermatol.２０００２ May-Jun；１２（３）：２９６−３００）。
【０２０３】
強皮症におけるタンパク質の過度の産生に関わる複数のタンパク質が、レプリキン構造を含有することがわかっている。かくしてこれらは、過度のコラーゲン産生の阻害又は停止のための未認識標的のさらなる例を提供する。表１１は、強皮症におけるタンパク質及び関連するレプリキンのリストを提供する。
【０２０４】
ＡＰＲタンパク質は、量が過度になると脳内の細胞外空間に斑を形成し、アルツハイマー病において神経細胞喪失に関連して毒性効果を生み出すアミロイドベータＡ４タンパク質の供給源である。これまでの大部分の研究は、Ａ４の過剰な被着を一掃する能力が無いことに焦点をあててきたが、廃棄物クリアランスの問題よりもむしろこれが実際前駆体タンパク質ＡＰＰの過剰産生の問題であり得るということを考慮していなかった。ＡＰＰ内のレプリキンの高い濃度（１００個のアミノ酸あたり３．３のレプリキン）は、過剰産生が充分アルツハイマー病の原因であり得るということを強く示唆している（表１２）。従って、表１２中に含まれているレプリキンは、神経膠腫レプリキンについて詳細に例示されているものと同じ方法により遮断又は阻害され得る。
表１１
強皮症において過剰産生されるタンパク質及び関連するレプリキン
ＰＭ  Ｃ１
【化２８】
2007526222.tif 000048
３４ＫＤの核小体強皮症抗原：
【化２９】
2007526222.tif 000049
フィブリラリン
【化３０】
2007526222.tif 000050
ヒトＳポリペプチド
【化３１】
2007526222.tif 000051
動原体プロテインＣ
【化３２】
2007526222.tif 000052
ＣＴＣＢＦ因子、ＫＵ抗原
【化３３】
2007526222.tif 000053
ＡＴＰシンターゼサブユニット６
【化３４】
2007526222.tif 000054
ＦＢＲＬ核タンパク質
【化３５】
2007526222.tif 000055
ＨＰ１Ｈｓ−アルファタンパク質
【化３６】
2007526222.tif 000056
ＦＭ／Ｓｃｌ核小体タンパク質
【化３７】
2007526222.tif 000057
表１２
アミロイドベータＡ４前駆体タンパク質（ＡＰＰ）レプリキン
【化３８】
2007526222.tif 000058
【０２０５】
受動免疫
該発明のもう１つの実施形態においては、例えば１つの個体内で受動免疫を提供するために使用し得る抗体を生成するべく、単離されたレプリキンペプチドを使用することができる。該発明の方法により来るべきインフルエンザ感染の最も確率の高い原因であると同定されたインフルエンザ株に対する受動免疫は、同定されたインフルエンザウイルス株のレプリキン配列に対する抗体を必要としている患者に対し投与することによって得ることができる。同様にして、熱帯性マラリア原虫レプリキン（単複）に対して抗体を投与することによりマラリアに対する受動免疫を得ることも可能である。
【０２０６】
当該技術分野において既知のさまざまな手順を、レプリキン配列に対する抗体の産生のために使用することができる。かかる抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、１本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリによって産生されたフラグメントが含まれるが、ただしこれらに制限されるわけではない。細胞毒性作用物質に連結されている抗体も同じく生成可能である。抗ウイルス作用物質と組合わせて抗体を投与することも可能である。さらに、異なるレプリキンに対する抗体の組合せを抗体カクテルとして投与することも可能である。
【０２０７】
抗体産生のためには、ウサギ、マウス、ラット、及びそれより大きい哺乳動物を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない）さまざまな宿主動物又は植物をレプリキンペプチド又はその組合せを注射することによって免疫化することができる。
【０２０８】
レプリキンに対するモノクローナル抗体は、抗体分子の産生を提供するあらゆる技術を用いることによって調製可能である。これらには Kohler及びMilsteinによって当初記述されたハイブリドーマ技術（Nature, １９７５，２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., １９８３、Immunology of Tody、４：７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.,pp.７７−９６）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。さらに、キメラ抗体の産生のために開発された技術（Morrison et al., １９８４、Proc. Nat. Acad. Sci USA、 ８１：６８５１−６８５５）又はその他の技術も使用可能である。代替的には、１本鎖抗体の産生のために記述された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、レプリキン特異的１本鎖抗体を産生するべく適合させることも可能である。
【０２０９】
該発明の特に有用な抗体は、インフルエンザウイルスのペプチド及び／又はポリペプチド内に含まれるレプリキン配列に特異的に結合するものである。例えば、インフルエンザウイルスの新興又は再興株の中に存在することが観察されたペプチドのいずれかに対する抗体及びかかる抗体の組合せが、インフルエンザの治療及び／又は予防において有用である。同様にして、マラリア抗原上に存在するいずれかのレプリキンに対する抗体及びかかる抗体の組合せが、マラリアの予防及び治療において有用である。
【０２１０】
レプリキンのための結合部位を含有する抗体フラグメントを、既知の技術により生成することが可能である。例えば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ′）２フラグメント及びＦ（ａｂ′）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成可能であるＦａｂフラグメントが含まれるがこれらに制限されるわけではない。代替的には、Ｆａｂ発現ライブラリを生成して（Huse et al., １９８９，Science, ２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの高速かつ容易な同定を可能にすることもできる。
【０２１１】
癌細胞型の如何に関わらずヒト悪性腫瘍において抗マリグニン抗体の濃度が増大し、かくしてこの抗体が細胞型の如何に関わらず悪性細胞に結合するという事実は、今や、本書で大部分の悪性腫瘍内に存在することが発見されている（図１及び表２）レプリキン構造の存在によって説明することができる。集団研究は、抗マリグニン抗体が年令と共に健康な成人において濃度を増し、ハイリスクファミリーでは癌の頻度が増大するにつれて、それが増すことを示した。早期悪性腫瘍において発生するさらなる２倍以上の抗体増加は、１〜１０mmサイズの乳癌における９７％の感応性によって独立して確認されてきた。in vivoで悪性細胞内に優先的に局在化することが示されてきたものの、組織化学的には、該抗体は正常な細胞には結合せず、インビトロで形質転換した細胞に選択的に結合し（図４ａ、ｂ）、これらの細胞に対し高い細胞毒性を示す（図４ｃ〜ｆ）。これらの例では同じ抗体は複数の細胞型すなわち脳神経膠腫、造血細胞（白血病）及び小細胞肺癌によって結合されていることから、悪性レプリキンの種類の統一性が再び実証されている。
【０２１２】
抗マリグニンは良性増殖と共に増大せず、インビボで乳房内の悪性形質転換及び複製と共にしか特異的に増大せず、悪性細胞の除去の時点で高い値から正常値に戻る（図５）。抗マリグニン抗体濃度は、癌患者の生存率に量的に関係する、つまり抗体が増えれば増えるほど生存率が高くなることが示されてきた。これらの結果を合わせて考えると、抗レプリキン抗体が細胞形質転換及び複製の制御メカニズムの一部であり得るということが示唆されている。この免疫応答の増大は、合成レプリキンをワクチンとして用いて能動的にか、又は抗レプリキン抗体の投与又はレプリキンを特異的にターゲティングするように類似の形で設計されている例えば炭水化物、脂質などといったような非免疫ベースの有機作用物質の導入によって受動的に、複製を制御するのに有用であり得る。
【０２１３】
該発明のもう１つの実施形態においては、単数又は複数のレプリキンに曝露された個体から得られた単数又は複数のレプリキンに対する抗体を含有する免疫血清を、もう１つの個体又は動物において受動免疫を誘発するために使用することができる。免疫血清は、治療を必要とする対象に対し静脈内に投与することができる。受動免疫は同様に、単数又は複数のレプリキンに対する予め形成された抗体をレシピエントに注射することによっても達成可能である。感染性生体に曝露された個体に対し直ちに保護を提供するために、受動免疫を使用することができる。免疫血清又は予め形成された抗体の投与は、日常的なことであり、熟練した開業医ならば、望ましい効果を達成するのに必要とされる血清又は抗体の量を直ちに確認することができる。
合成レプリキンワクチン（活性免疫）
【０２１４】
神経膠腫レプリキン（配列番号１）「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」又はＣ型肝炎レプリキン（配列番号１８）「ｈｙｐｐｋｐｇｃｉｖｐａｋ」又はＨＩＶレプリキン例えば（配列番号５）「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」又は（配列番号６）「ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ」といったレプリキンに基づく合成レプリキンワクチンそして好ましくは一定の与えられた時期にわたり保存された及び／又は新興又は再興するレプリキン（単複）に基づくインフルエンザワクチンは、化学的治療がそのとき有効となりうる細胞外でそれぞれのウイルスに感染した細胞を溶解させウイルスを放出するべく抗体濃度を増大させるために使用可能である。同様にして、マラリアワクチンは、例えばメロゾイト表面上又は寄生虫含有空胞内部で熱帯性マラリア原虫マラリア抗原内に観察されたレプリキンに基づいて、マラリアに対する細胞毒性抗体を生成するために使用することができる。表７は、７個といった少ないアミノ酸に至るまでの、レプリキン配列の短縮又は圧密とこれらのレプリキンを含有する生体によってひき起こされる死亡率との関係を示す。我々は、この相関関係を生体のタイプの如何に関わらない一般的な現象であるということを発見した。我々は同様に、インフルエンザ及びＳＡＲＳウイルスの場合のように、短縮されたレプリキン構造に至るまで経時的な進行が存在し得るということも発見した。各々の感染性生体のつねに増大する「効能」の出現のためにつねに進化的及び競合的圧力が存在するという証拠は豊富に存在する。これらの観察事実に基づき、又、予測により、進化的圧力が、ＥＥＬ白血病の場合のように７０％という高い値までの上昇を続けるリジン（ｋ）濃度と共に、増々短かくなるレプリキンへと向かっているのであれば（図７）、そのとき予測された理論的理想は、可能なかぎり高いｋの％（８３．３％のｋ、５／６及び１つの義務的「ｈ」を含む、演繹されたレプリキン「ｋｋｋｈｋ」における以下の例を参照のこと）で、レプリキンを画定するアルゴリズムにより許される可能なかぎり短かいレプリキンすなわち６つのアミノ酸（６〜１０個のアミノ酸だけ離隔した２つのｋ）となる。従って、我々はいわば、今のところまだ生体自体により見かけ上取られていない次なる進化上の段階であると思われる又はそうなるはずのものを取り上げ、一般的ワクチンとして使用すべき、結果としての演繹されたレプリキンを考案した。我々が演繹したこれらのレプリキンは最大の％の「ｋ」、ひいては最大の潜在的結合能力と定義上レプリキンに必要とされる成分「ｈ」を有し、酸化還元エネルギーシステムに対する「ｈ」接続に対する潜在性を提供している。これらの考案されたレプリキンは、その短かい長さのため生体により分割される確率が最も低く（タンパク質は免疫細胞に対する提示及びそれによる認識のためのプロセッシングにおいて長さ６〜１０アミノ酸まで分割される）、従って、それらが投与される生体内で免疫形成性器官に対して無欠の状態で現れる確率が最も高く、かつその高いｋ含有率のため、短かい相同な高死亡率のレプリキンに対して生成されうる最大限のこのような応答を模倣し増大させうる最大の免疫応答を生成する確率が最も高い。さらに、我々は、ｋの％が高いレプリキンがウサギに投与された場合に最高の抗体応答を生成するということを発見した。我々が設計したこれらの合成ペプチドは、汎用合成エピトープ又は「ＵＴＯＰＥ」と呼称され、これらのＵＴＯＰＥに基づくワクチンは「ＵＶＡＸ」と呼称される。演繹された合成ワクチンであるＵＶＡＸは、唯一のワクチンとしてか又はより特異的なレプリキンワクチン又はその他のワクチンと共に投与された場合にはアジュバントとして使用可能である。以下に記すのは、演繹されたＵＴＯＰＥ及びＵＶＡＸの例である。
【表２０】
2007526222.tif 000059
【０２１５】
抗レプリキン抗体を産生するべく対象の免疫系を誘発するために、対象に対してリコグニン及び／又はレプリキンペプチドを投与することができる。一般に、免疫応答を誘発するために、０．５〜約２mgの投薬量、好ましくは１mgの各ペプチドの投薬量が対象に投与される。望ましい場合には、後続の投薬量を投与することができる。
【０２１６】
レプリキン配列構造は、複製機能と結びつけられる。かくして、例えば本発明のレプリキンが診断的同定の目的でレプリキンを含有する配列をターゲティングするためか、複製を促進するためか又は複製を阻害又は攻撃するためのいずれの目的に使用されるにせよ、レプリキンの構造−機能関係は欠かせない。
【０２１７】
レプリキンフラグメントを認識し、これに付着しかくして細胞の破壊をひき起こすことになる抗体を誘発しようとする場合、特異的レプリキン構造のみを利用することが好ましい。より大きいタンパク質配列が「複製関連機能」をもつものとして当該技術分野において知られているにせよ、より大きいタンパク質を使用するワクチンは往々にして不首尾であるか又は有効でないことが証明されている。
【０２１８】
当該発明人らは単一の理論の縛られることを望んではいないものの、本書中の研究は、先行技術のワクチンがより大きなタンパク質配列の使用に基づいているために効果がないということを示唆している。より大きいタンパク質配列は、不変的に単数又は複数のエピトープ（特異的抗体形成を誘発し得る独立した抗原配列）を有する。レプリキン構造は通常、これらの潜在的エピトープの１つを含んでいる。より大きいタンパク質内のその他のエピトープの存在は、レプリキン抗原を先取りし得る無関係の抗原刺激で免疫系を「溢れさせる」ことにより、レプリキンに対する抗原の適切な形成と干渉し得る。免疫系により提示され認識された第１のペプチドエピトープがその後優勢となり、たとえその他のペプチドエピトープが同時に提示されてもそれに対する抗体が作られるようにする抗原第１主義というこの周知の現象の論述については、Webster, Ｒ.Ｇ., J.Immunol., ９７（２）：１７７−１８３（１９６６）；及びWebster et al., J. Infect. Dis., １３４：４８−５８、１９７６；Klenerman et al., Nature ３９４：４２１−４２２（１９９８）を参照のこと。これは、ワクチン形成において、レプリキンが先取りされず免疫学的メモリ内にとどめられるような形で生体からその他のエピトープを提示する前に、まず最初に免疫系に対し恒常なレプリキンペプチドを提示することが重要であるもう１つの理由である。
【０２１９】
非レプリキンエピトープに対する抗体の形成は、細胞に対する結合を可能にし得るものの、必ずしも細胞の破壊を導くわけではない。マラリアタンパク質のＣ末端上の構造的「デコイ」の存在は、デコイエピトープが数多くのリジン残基を有するもののヒスチジン残基を全くもたないことから、有効な抗レプリキン抗体の結合と干渉するその他のエピトープのこの能力のもう１つの様相である。かくして、デコイエピトープは、抗レプリキン抗体に結合できるが、ヒスチジンに結合した呼吸酵素から離れたところに抗体を保つことができる。従って、治療は、１）デコイを加水分解するためのプロテアーゼと次に２）抗レプリキン抗体又はその他の抗レプリキン作用物質という２つのステージで最も効果的であり得る。
【０２２０】
「外来性」タンパク質に対する抗体産生の過程でタンパク質がまず最初により小さなフラグメントへと加水分解されるということは、当該技術分野において周知である。通常、約６〜１０個のアミノ酸を含有するフラグメントが抗体形成について選択される。かくして、タンパク質の加水分解がレプリキン含有フラグメントを結果としてもたらさない場合、抗レプリキン抗体は産生されないことになる。この点において、リジン残基は膜に結合するものとして知られていることから、レプリキンが、６〜１０個のアミノ酸だけ離隔して位置特定されたリジン残基を含有していることが有利である。
【０２２１】
さらに、レプリキン配列は、少なくとも１つのヒスチジン残基を含有する。ヒスチジンは高頻度で酸化還元中心に対する結合に関与する。かくして、レプリキン配列を特異的に認識する抗体は、細胞１個あたりピコグラム単位で活性であってこれまで記述された中で恐らく最も細胞毒性の高い抗癌抗体である抗マリグニン抗体で見られるように、レプリキンが中に位置設定されている細胞を不活性化する又は破壊する確率がより高いものである。
【０２２２】
疾病をひき起こす作用物質の特定のタンパク質抗原に向けられたワクチンが、（例えばＶＰ１タンパク質又はその大きいセグメントに対して開発された口蹄病ワクチンといったような）該疾病に対する保護を提供する上で充分に効果的でなかったことの１つの理由は、最高の抗体が産生されなかったこと、すなわちレプリキンに対する抗体が産生されなかった確率が高いことにある。レプリキンは産生されなかった。すなわち、より大きなタンパク質フラグメント中に存在するレプリキン以外のいずれかのエピトープが、上述の抗原第１主義という現象に従って、かつ／又は、抗体を産生するためのプロセッシングのためのより小さい配列へのより大きなタンパク質配列の加水分解が、例えばレプリキンが２つに切断される及び／又はヒスチジン残基が加水分解プロセッシングにおいて喪失することなどといったように、存在するあらゆるレプリキン構造の無欠性が喪失することを理由として、干渉する可能性がある。本研究は、有効なワクチンが産生されるためには、レプリキン配列をワクチンとして使用すべきであり、その他のいかなるエピトープも使用すべきでないということを示唆している。例えば、該発明のワクチンは、３点認識システムによって同定されたレプリキンペプチドのいずれか１つを用いて生成可能である。
【０２２３】
例えばインフルエンザワクチンといったような特に好ましいペプチドとしては、単数又は複数年、好ましくは３年以上の期間にわたり保存されることが実証されかつ／又は例えば新興株といったようなその他のインフルエンザウイルス株内のレプリキン濃度との関係におけるレプリキン濃度が最高の増加を示すことが示されたインフルエンザウイルスの株の中に存在するペプチドが含まれる。レプリキンの増加は好ましくは、少なくとも約６ヵ月から１年、好ましくは少なくとも約２年以上そして最も好ましくは約３年以上の期間にわたり発生する。インフルエンザウイルスワクチン内で使用するための好ましいレプリキンペプチドの中には、単数又は複数年にわたる血球凝集素アミノ酸配列からの不在の後に「再興する」ことが観察されたレプリキンである。
【０２２４】
該発明のレプリキンペプチドは好ましくは、ペプチドの抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激する目的で、静脈内又は筋内注射により、単独又はさまざまな組合せの形で、対象に投与される。一般に、ペプチド投薬量は、約０．１μｇ〜約１０mg、好ましくは約１０μｇ〜約１mg及び最も好ましくは約５０μｇ〜約５００μｇの範囲内にある。熟練した医師であれば、有効な免疫応答を生成するのに必要とされる投薬量及び投薬回数を容易に決定することができる。
レプリキンワクチンに対する早期応答の定量的測定
【０２２５】
レプリキンワクチンに対する日数単位の又は数週間以内での早期特異的抗体応答を定量的に測定する能力は、数ヵ月又は数年後にしか臨床的応答を測定できないその他のワクチンに比べ主たる実用的利点である。
アジュバント
【０２２６】
フロインドの（完全又は不完全）アジュバント、ミネラルゲル例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジントロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント例えばＢＣＧ及びコリネバクテリウム・パルヴムを含め（ただしこれらに制限されるわけではない）、宿主種に応じてさまざまなアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。ワクチン自体としての合成ＵＴＯＰＥの使用に加え、ＵＴＯＰＥは、その他のレプリキンワクチン及び非レプリキンワクチンに対するアジュバントとして使用可能である。
レプリキンヌクレオチド配列
【０２２７】
レプリキンＤＮＡ又はＲＮＡは、ウイルス、細菌又はその他のレプリキンコーディング作用物質による感染の結果もたらされる疾病の診断のための数多くの用途を有する可能性がある。例えば、組織試料又は環境試料などの中の特定の生体の存在を診断するため、インサイチュハイブリダイゼーション検定を含め、例えばサザン又はノーザン分析といった生検の行なわれた組織又は血液のハイブリダイゼーション検定において、レプリキンヌクレオチド配列を使用することができる。本発明は同様に、問題の特定の病原体の中に存在する特定のレプリキンに特異的な抗体を収納するか、又は特異的に特定のレプリキンをハイブリッド形成する核酸分子（センス又はアンチセンス）、そして任意には、診断に必要とされるさまざまな緩衝液及び／試薬を収納するキットをも考慮している。
【０２２８】
同じく該発明の範囲内に入るのは、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子を含むオリゴリボヌクレオチド配列及びレプリキン又はリコグニン含有ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように機能するリボザイムである。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びリボザイムの両方共、当該技術分野において既知のあらゆる方法により調製することができる。対象への送達のためにはアンチセンス分子を多種多様なベクター内に取込むことができる。熟練した医師であれば、最良の送達経路を容易に決定することができるが、一般的には、静脈内又は筋内送達が日常的である。投薬量も容易に確認できる。
【０２２９】
特に好ましいアンチセンス核酸分子は、（１）第２のリジン残基から６〜１０残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含む７〜５０個のアミノ酸を含む例えばインフルエンザウイルスポリペプチドをコードするｍＲＮＡの中に含まれるレプリキン配列に相補的なものである。より好ましいのは、遺伝子のコーディングストランド内に存在するレプリキン又はインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質をコードするｍＲＮＡに対し相補的であり、６ヵ月から単数又は複数年の期間にわたり保存されることが実証されているレプリキンをコードするヌクレオチド配列に相補的であり、かつ／又はその他のインフルエンザウイルス株内でのレプリキン濃度に比べてレプリキン濃度が増大したことが示されたインフルエンザウイルスの１つの株内に存在するアンチセンス核酸分子である。レプリキン濃度の増加は、好ましくは少なくとも６ヵ月、好ましくは約１年、最も好ましくは約２年又は３年以上の期間にわたって発生する。
【０２３０】
同様にして、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子は、（１）第２のリジン残基から６〜１０残基のところに位置設定された少なくとも１つのリジン；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含む７〜５０個のアミノ酸のレプリキン配列を含む細菌レプリキンをコードするｍＲＮＡに対し相補的なものである。より好ましいのは、遺伝子のコーディングストランド又は細菌のタンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子である。
診断上の利用分野
【０２３１】
珪藻プランクトン、口蹄病ウイルス、トマト縮葉病ジェミニウイルス、Ｂ型及びＣ型肝炎、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス及び悪性細胞といったような生体のためには、同定された成分レプリキンがワクチンとして有用であり、同様に診断目的で有用にこれを標的することもできる。例えば、輸液のために収集された血液を、汚染生体に特異的であることが示されたレプリキンの存在についてスクリーニングすることによって、ＨＩＶといったような生体の汚染についてスクリーニングすることができる。同様に、特定の病原性生体に特異的なレプリキン構造についてのスクリーニングは、身体組織内又は環境内での生体の診断的検出を導く。
レプリキン成長刺激
【０２３２】
該発明のもう１つの実施形態においては、細胞、組織又は器官の複製速度を増大させるために、レプリキン構造が使用される。複製速度及び収量を増大させるため前記細胞、組織又は器官について当該技術分野で既知の細胞分裂に対する適切な刺激を伴って又は伴わずに、より急速に複製することが望まれているその他の細胞、組織又は器官のための特異的レプリキン構造を付加することによって複製速度を増大させるための方法が利用可能である。これは、例えば当該技術分野において既知の方法により、少なくとも１つのレプリキン構造を伴う生体内の複製機能をもつタンパク質又は酵素についてコードする又はそれと結びつけられた遺伝子を修飾又は形質転換することによって達成可能である。
【０２３３】
該発明のもう１つの態様においては、生体の複製を増大させるためにレプリキン構造が用いられる。本発明は、例えばインフルエンザウイルスにおいて、地域的流行に付随する複製の増大は、レプリキンの濃度増加と結びつけられる。該増加は、１）前年に存在したもののその後１年以上にわたり消滅した特定のレプリキン構造の再出現；及び／又は２）新しいレプリキン組成物の出現に起因する。さらにマラリアレプリキンにおいては、単一のタンパク質内での同じレプリキンの反復が起こる。さらに、生体の成長を刺激するため又は生体の複製を増大させるために、ＵＴＯＰＥを使用することができる。
【０２３４】
かくして本発明は、生体の複製を増大させるための方法及び組成物を提供する。同様にして、任意の生体の複製を阻害するために異なる生体のレプリキンをターゲティングできるような形で、任意の生体の複製を増大させるためにレプリキンを使用することが可能である。例えば、世界の大規模な人口に食料供給をするためにきわめて重要であるイネ、トウモロコシ及び小麦の生産を、例えば任意の特定のイネの株の濃度（１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキンの数）を増大させることによって改善させることができる。
【０２３５】
一例として、イネのオリザ・サティバ株においては、未成熟の種子から単離されたカタラーゼが、タンパク質の４９１のアミノ酸配列内に以下の異なるレプリキンを含有することが観察された：
【０２３６】
【化３９】
2007526222.tif 000060
かくして、当該技術分野において周知の組換え型遺伝子クローング技術を使用することにより、食用作物植物といったような生体内のレプリキン構造の濃度を増大させることができ、これが生体の複製の増加を促進することになる。例えば、当該技術分野において周知の方法によりオリザ・サティバカタラーゼ遺伝子内に以上で同定されたレプリキンのような付加的なレプリキン配列を挿入することのよって、この生体の複製が促進されることになる。
【０２３７】
同様にして、オリザ・サティバ（ジャポニカ品種群）のＮ分離株−Ｌ高速複製タンパク質においては、以下のレプリキンが発見された：
【化４０】
2007526222.tif 000061
【０２３８】
さらに、アスパラギン酸プロテアーゼオリザシン１前駆体タンパク質については、以下のレプリキンが発見された：
【化４１】
2007526222.tif 000062
【０２３９】
同様にして、オリザ・サティバ（インディカ品種群）のＭＡＤＳ−ボックスタンパク質ＦＤＲＭＡＤＳ３においては、以下のレプリキンが発見された。
【化４２】
2007526222.tif 000063
【０２４０】
同様にして、ＬＯＮＩ  ＭＡＩＺＥ（ＡＴＰ−結合酸化還元関連加水分解酵素；セリンプロテアーゼ；多重遺伝子族；ミトコンドリア）内には、以下のレプリキンが発見された：
【化４３】
2007526222.tif 000064
【０２４１】
同様にして、葉緑体前駆体であるグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼＡについては、以下のレプリキンが発見される。
【化４４】
2007526222.tif 000065
【０２４２】
発見されたサビ菌耐性様タンパク質ＲＰ１−４（トウモロコシ（Zea Mays））の例には、以下のレプリキンが含まれている：
【化４５】
2007526222.tif 000066
【０２４３】
以上で論述した通り、小麦ユビキチン活性化酵素Ｅ（配列番号６１４−６１６）内のレプリキンは保存される。このレプリキン構造の保存は、植物の成長の刺激のための信頼性ある標的を提供する。
【０２４４】
酸化還元酵素に対するレプリキンの密な関係は同様に、小麦内のこの構造の中でも明確に示されている。かくして、この小麦ユビキチン活性化酵素Ｅは、まず最初にＡＴＰでそのカルボキシ末端グリシン残基をアデニル化し、その後この残基をＥ１内のシステイン残基の側鎖に連結させて（配列番号６１４）、ユビキチン−Ｅ１チオールエステルと遊離ＡＭＰを生成することによってユビキチンを活性化する。
【０２４５】
小麦レプリキンと酸化還元酵素の関係のさらなる例は、同様に、パン中国春撒き小麦葉緑体Triticum Aestivmから単離したＰＳＡＢ小麦タンパク質、光化学系ＩＰ７００クロロフィルＡアポタンパク質Ａ２（ＰｓａＢ）（ＰＳＩ−Ｂ）の中にも発見された。このタンパク質は以下のように機能する。すなわち、ＰｓａＡ及びＰｓａＢは、光化学系Ｉ（ＰＳＩ）の一次電子供与体ならびに電子受容体Ａ０、Ａ１及びＦＸを結合させる。ＰＳＩはプラストシアニン／シトクロムｃ６−フェレドキシンオキシドシダクターゼとして機能する。共同因子ｐ７００はクロロフィルＡ２量体であり、Ａ０はクロロフィルＡであり、Ａ１はフィロキノンであり、ＦＸは４Ｆｅ−４Ｓ鉄−硫黄中心である。サブユニットＡｐｓアミノ酸／Ｓヘテロ２量体は、Ｐ７００クロロフィル特殊対及びそれ以降の電子受容体を結合させる。より高等な植物及び藻類のＰＳＩ反応中心は、１つの少なくとも１１のサブユニットで構成されている。これは、葉緑体チラコイド膜の膜内在性タンパク質である。「ｈ」が結合する４Ｆｅ−４Ｓ鉄−硫黄「中心」は決定的に重要な意味をもち、従ってレプリキン構造内の「ｈ」に意義が生まれてくる。細菌レプリキンの次に、これらの小麦レプリキン及び植物レプリキンは、複製及び複製に必要とされるエネルギー源の重要性を最も根源的に進化面で例示するものである。この基本的関係は、藻類、ウイルスレプリキン、細菌、癌細胞及び明らかに全ての生体を通して複製に関して伝わる。
【０２４６】
レプリキンのさらなる例は、小麦の成長にとって決定的に重要であるＰＳＡＢ小麦タンパク質の中に発見された。これらには以下のものが含まれる：
【化４６】
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【０２４７】
酸化還元に対する小麦レプリキンの関係のさらな例は、以下のものを含むＰＳＡＡ−ＷＨＥＡＴ光化学系Ｉ９７００クロロフィルＡアポタンパク質Ａ１内で提供される。
【化４７】
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ＲＰＬを同定するためのコンピュータソフトウェア
【０２４８】
本発明は同様に、アミノ酸又は核酸配列内のレプリキン配列を同定するための方法をも提供する。４０００配列以上の視覚的走査が、当該３点認識方法を開発する上で実施された。しかしながら、ヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列を含むデータバンクも同様に、３点認識必要条件を満たす配列の存在についてコンピュータにより走査可能である。
【０２４９】
該発明のもう１つの実施形態に従うと、本書で記述されている３点認識方法をコンピュータによって実施することができる。図６は、本発明の前述の実施形態で使用するために利用可能なコンピュータのブロック図である。コンピュータは、プロセッサ、入出力デバイス及び上述の実施形態の３点認識方法を表わすメモリ記憶用実行可能プログラム命令を内含し得る。メモリはスタティックメモリ、揮発性メモリ及び／又は非揮発性メモリを内含し得る。スタティックメモリは慣習的に、磁気的又は電気的又は光学的記憶媒体上に提供された読取り専用メモリー（「ＲＯＭ」）であり得る。揮発性メモリは、慣習的には、ランダムアクセスメモリー（「ＲＡＭ」）であり得、プロセッサ内部のキャッシュとして組込まれることもできるし、又別の集積回路としてプロセッサから外部的に提供することもできる。非揮発性メモリは電気的、磁気的又は光学的記憶媒体であり得る。
【０２５０】
プロテオミクスの観点から見ると、新しい神経膠腫ペプチド配列に基づく「３点認識」鋳型の構造は、関連する構造及び機能をもつ生物学全体にわたるタンパク質の種類の同定を直接導いた。３点認識方法の作業は、「キーワード」探索の使用による同定に似ているが、標準的な配列相同性探索又はアミノ酸のヌクレオチド仕様の場合のようにキーワード「ｈａｇｖａｆｌｈｋｋ」（配列番号１）の正確なスペリングを使用する代りに、「３点認識」パラメータにより限界決定されたキーワードの抽象化が用いられる。この限界決定された抽象化は、単一の比較的短かいアミノ酸配列から誘導されるものの、同じ仕様により定義される構造をもつタンパク質の１つの種類の同定を導く。この場合では形質転換及び複製である特定の機能は同様に、構造に加えて、露呈された種類の成員が共有するものとなるという事実は、これらの構造及び機能が関連性をもつということを示唆している。かくして、この新たに同定された短かいペプチド配列から、これまで記述されたことのない分子認識「言語」が公式化された。さらに、癌レプリキンについてここで実証されてきたような該種類のさまざまな成員による免疫学的特異性の共有は、Ｂ細胞及びその産物抗体が類似の認識言語を用いてレプリキンを認識するということを示唆している。
３点認識方法のその他の使用
【０２５１】
「３点認識」は特定のタンパク質の種類を特定するプロテオミクス方法であるため、その他のペプチドのために３つ以上の異なる認識点を使用することがその他のタンパク質の種類に関する有用な情報を提供するはずである。さらに、「３点認識」方法はその他のレコグニン例えば生体のリポ多糖類のＴＯＬＬ「生得的」認識に適用可能である。その他の共有結合により連結されたアミノ酸、ヌクレオチド、炭水化物、脂質又はそれらの組合せを内含するその他の有用な共有結合により連結された有機分子の化合物を同定するために、該３点認識方法を修正することも可能である。該発明のこの実施形態においては、３つ以上の所望の構造的特性を含むサブ配列について、配列がスクリーニングされる。共有結合により連結されたアミノ酸、脂質又は炭水化物から成る化合物をスクリーニングする場合、約５０の共有結合によって連結された単位のサブ配列は、（１）第１のアミノ酸、炭水化物又は脂質残基のうちの第２のものから７〜１０残基のところにある少なくとも１つの第１のアミノ酸、炭水化物又は脂質残基；（２）コードする少なくとも１つの第２のアミノ酸、脂質又は炭水化物残基；  及び（３）第１のアミノ酸、炭水化物又は脂質残基の少なくとも６％、を含有すべきである。ヌクレオチド配列をスクリーニングする場合、約２１〜約１５０個のヌクレオチドのサブ配列は、（１）第１のアミノ酸残基をコードする第２のコドンから１８〜３０ヌクレオチド以内のところにある第１のアミノ酸をコードする少なくとも１つのコドン；（２）少なくとも１つの第２のアミノ酸残基を含有すべきであり、（３）前記第１のアミノ酸残基の少なくとも６％をコードする。
【０２５２】
本発明のいくつかの実施形態が本書に特定的に例示され記述される。ただし、本発明の修正及び変形形態が上述の教示により包括され、該発明の精神及び意図された範囲から逸脱することなく添付のクレームの視野の中に入るということがわかるだろう。
例１
レプリキンの抽出、単離及び同定のためのプロセス及びレプリキン含有生体をターゲティング、標識又は破壊するためのレプリキンの使用
ａ）藻類
【０２５３】
以下の藻類を、バミューダ水域サイトから収集し、同日に抽出するか又は−２０℃で冷凍して翌日に抽出した。藻類を低温室（０〜５℃）内でWaringブレンダーの中で１５分間中性緩衝液中、例えばｐＨ７の０．００５Ｍのリン酸緩衝溶液（「リン酸緩衝液」）１００ｃｃ中の１グラムのアリコートの中で均質化させ、３０００ｒｐｍで遠心分離に付し、浸透気化により上清を凝縮させ、低温下でリン酸緩衝液に対し透析して約１５mlの体積を生成した。この抽出物溶液の体積を書きとめ、タンパク質分析のためにアリコートを取り、残りを分留して１〜４のＰＫ範囲をもつタンパク質留分を得た。
【０２５４】
好ましい分留方法は、以下のとおりのクロマトグラフィである。すなわち、抽出物溶液を、０．００５Ｍのリン酸緩衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥセルロース（Cellex−Ｄ）カラム上で、低温室（４℃）内で分留する。以下の溶液を用いて、段階的溶出用溶媒変更を行なう：
溶液１−１〜４．０４ｇのＮａＨ２ＰＯ４及び０．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４を１５リットルの精製水中で溶解させる（０．００５モル、ｐＨ７）；
溶液２−８．５７ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４８０mlの精製水内で溶解させる；
溶液３−１７．１ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４８０mlの精製水中で溶解させる（０．０５モル、ｐＨ４．７）；
溶液４−５９．６５ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４７０mlの精製水中で溶解させる（０．１７５モル）；
溶液５−１０１．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４５５mlの精製水中で溶解させる（ｐＨ４．３；
溶液６−３４０．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４６５mlの精製水中で溶解させる（１．０モル、ｐＸ−ｉ４．１；
溶液７−２８３．６３ｇの８０％リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を２４６０mlの精製水中で作り上げる（１．０モル、ｐＨ１０）
【０２５５】
６〜１０mlの体積中の抽出物溶液を、カラム上に移して、溶液１を上に積層させ、溶液１の３００ml入りタンクをとり付け、カラム上に重力により滴下させた。溶離液の３mlのアリコートを収集し、溶液１で除去されるべきタンパク質全てがカラムから除去されてしまうまでＯＤ２８０でのタンパク質含有量について分析した。次にカラムに溶液２を適用し、各溶液で除去できるタンパク質の全てがカラムから除去されるまで、溶液３、４、５、６及び７が連続して続いた。溶液７からの溶離液を組合せ、リン酸緩衝液に対して透析し、ダイアリザンド（Dialysand）と透析物の両方のタンパク質含有率を決定し、両方をゲル電気泳動によって分析した。溶液７中には、３０００〜２５，０００ダルトンの間の分子量のペプチド又はタンパク質の１本又は２本のバンドが得られる。例えば、上述の通りの抽出及び処置の後、藻類Caulerpa mexicana、 Laurencia obtura、 Cladophexa prolifera、 Sargassum natans、 Caulerpa verticillata、 Halimeda tuna、 及び Penicillos capitatusはすべて、溶液７溶離液中でいかなる汚染物質もないこの分子量領域内で鋭いペプチドバンドを実証した。これらの溶液７のタンパク質又はその溶離されたバンドは加水分解され、アミノ酸組成が決定される。６％以上のリジン組成をもつ、このようにして得られたペプチドはレプリキン前駆体である。これらのレプリキンペプチド前駆体を、その後アミノ酸配列について判定し、米国特許第６．２４２，５７８Ｂ１号に詳述されているように加水分解及び質量分析によりレプリキンを決定する。「３点認識」方法によって定義された基準を満たすものは、レプリキンとして同定される。酵素、細菌、及びあらゆる植物レプリキンを得るためにこの手順を利用することも可能である。
ｂ）ウイルス
【０２５６】
藻類についてａ）で上述されたものと同じ抽出及びカラムクロマトグラフィ分離方法を用いて、ウイルス感染細胞中のレプリキンを単離し同定する。
ｃ）腫瘍細胞インビボ及びインビトロ組織培養
【０２５７】
藻類についてａ）で上述されたものと同じ抽出及びカラムクロマトグラフィ分離方法を用いて、ウイルス感染細胞中のレプリキンを単離し同定する。例えば、各々ａ）で上述した通りに処理された悪性脳腫瘍から単離したアストロシチンのレプリキン前駆体、組織培養中のグリア芽腫腫瘍細胞から単離したマリグニン（Aglyco１０Ｂ）、組織培養中のＭＣＦ７哺乳動物癌細胞及び組織培養中のＰ３Ｊリンパ腫細胞は、それぞれ９．１％、６．７％、６．７％及び６．５％のリジン含有量をもつレプリキン前駆体を生成した。米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号例１０で記述されているようなAglyco１０Ｂの加水分解及び質量分析は、アミノ酸配列、ｙｋａｇｖａｆｌｈｋｋｎｄｉｉｄｅ、１６量体レプリキンを産生した。
例２：
【０２５８】
レプリキンの診断用途の例として、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の図２、３、４及び７に示されているように診断目的で血清中に存在するその対応する抗体を捕捉しその量を定量化するための抗原としてAglyco１０Ｂ又は１６量体レプリキンを使用することができる。
【０２５９】
標識、栄養又は破壊目的でレプリキンに付着させるべき作用物質の産生の一例として、１６量体レプリキンに対する特異的抗体を産生するためのウサギの体内への１６量体レプリキンの注射が、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の例６及び図９Ａ及び９Ｂ内に示されている。
【０２６０】
レプリキンを標識するための作用物質の使用の一例として、このレプリキンを含有する特異的細胞を標識するための１６量体レプリキンに対する抗体の使用は、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の図５及び例６中に示されている。
【０２６１】
レプリキンを破壊するための作用物質の使用の一例として、このレプリキンを含有する特定の細胞を阻害又は破壊するための１６量体レプリキンに対する抗体の使用は、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の図６中に示されている。
例３
【０２６２】
レプリキンの存在及び濃度についてのインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質又はノイラミニダーゼタンパク質の分離株の配列データの分析を、本書で記述する３点認識システムに基づくコンピュータプログラムの使用を通してか又は配列の視覚的走査によって実施する。インフルエンザウイルスの分離株が得られ、インフルエンザ血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼタンパク質のアミノ酸配列は、血球凝集素又はノイラミダーゼ遺伝子を配列決定しそこからタンパク質配列を誘導することといった任意の既知の方法により得られる。各分離株内の新しいレプリキンの存在、レプリキンの経時的保存及びレプリキンの濃度について、配列を走査する。約６ヵ月〜約３年前といったより早い時点で分離株から得たアミノ酸配列に対するレプリキン配列及び濃度の比較は、来たるインフルエンザの流行期においてインフルエンザの原因となる確率が最も高く季節的インフルエンザペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンのための基礎原料を形成する株の新興を予測するために用いられるデータを提供する。約６ヵ月〜約３年以上の期間にわたるインフルエンザウイルスの一定の与えられた株内のレプリキンの濃度の増大とくにその段階的増加は、将来におけるインフルエンザの地域的流行又は世界的流行の確率の高い原因としての株の新興の予測判断材料である。
【０２６３】
新興株内で観察されるレプリキンに基づくペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンが生成される。新興する株は、該時期中に血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼ配列内のレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株として同定される。好ましくは、ペプチド又は核酸ワクチンは、新興株内に保存されていることが観察されているあらゆるレプリキン配列に基づくか又はこれを内含している。保存されたレプリキンは好ましくは、約２年そして好ましくはそれ以上の間血球凝集素又はノイラミニダーゼタンパク質配列内に存在するレプリキン配列である。ワクチンには、新興株内で同定されたレプリキン配列の任意の組合せが内含され得る。
【０２６４】
ワクチン産生のためには、有効なワクチンにとって有用なものとして同定されたレプリキンペプチド（単複）は、クローニング、宿主細胞内での発現及びそれからの精製を含む分子生物学技術及び化学合成を含むあらゆる方法によって合成される。ペプチドは好ましくは、それに対する治療用抗体反応を誘発するように決定された量で薬学的に受容可能な担体と混和される。一般に、投薬量は約０．１μｇ〜約１０mgである。
【０２６５】
インフルエンザワクチンは好ましくは「流行期」の開始より前に、それを必要とする患者に投与される。インフルエンザ流行期は一般に、１０月後半に発生し、４月後半まで続く。しかしながら、該ワクチンは、その年の間いつでも投与可能である。好ましくは、インフルエンザワクチンは一年に一回投与され、インフルエンザウイルスの新興株内に存在することが観察され好ましくは保存されているレプリキン配列に基づいている。インフルエンザワクチン内に内含させるためのもう１つの好ましいレプリキンは、単数又は複数年不在であった後インフルエンザの株内に再興したことが実証されたレプリキンである。
例４
【０２６６】
レプリキンの存在及び濃度についてのコロナウイルスヌクレオカプシド又はスパイク又は外皮又はその他のタンパク質の分離株の配列データの分析を、本書で記述する３点認識システムに基づくコンピュータプログラムの使用を通してか又は配列の視覚的走査によって実施する。コロナウイルスの分離株が得られ、コロナウイルスタンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の遺伝子を配列決定しそこからタンパク質配列を誘導することといった当該技術分野において既知の方法により得られる。各分離株内の新しいレプリキンの存在、レプリキンの経時的保存及びレプリキンの濃度について、配列を走査する。約６ヵ月〜約３年前といったより早い時点で分離株から得たアミノ酸配列に対するレプリキン配列及び濃度の比較は、世界的流行の勃発の原因となる確率が最も高くコロナウイルスペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンのための基礎原料を形成する株の新興を予測するために用いられるデータを提供する。約６ヵ月〜約３年以上の期間にわたるコロナウイルスの一定の与えられた種類又は株内のレプリキンの濃度の増大とくにその段階的増加は、将来におけるＳＡＲＳなどの地域的流行又は世界的流行の確率の高い原因としての株の新興の予測判断材料である。
【０２６７】
コロナウイルスの新興株内で観察されるレプリキンに基づくペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンが生成される。新興する株は、該時期中にヌクレオカプシド配列内のレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すコロナウイルスの株として同定される。好ましくは、ペプチド又は核酸ワクチンは、株内に保存されていることが観察されているあらゆるレプリキン配列に基づくか又はこれを内含している。保存されたレプリキンは好ましくは、約２年そして好ましくはそれ以上の間ヌクレオカプシドタンパク質配列内に存在するレプリキン配列である。ワクチンには、新興株内で同定されたレプリキン配列の任意の組合せが内含され得る。
【０２６８】
ワクチン産生のためには、有効なワクチンにとって有用なものとして同定されたレプリキンペプチド（単複）は、クローニング、宿主細胞内での発現及びそれからの精製を含む分子生物学技術及び化学合成を含むあらゆる方法によって合成される。ペプチドは好ましくは、それに対する治療用抗体反応を誘発するように決定された量で薬学的に受容可能な担体と混和される。一般に、投薬量は約０．１μｇ〜約１０mgである。
【０２６９】
コロナウイルスワクチンは、その年の任意の時点で患者に投与することができる。好ましくは、コロナウイルスワクチンは一度投与され、コロナウイルスの該種類の中に存在することが観察され、かつ好ましくはその中に保存されているレプリキン配列に基づいている。
例５
【０２７０】
レプリキンの存在及び濃度についての熱帯性マラリア原虫抗原の分離株の配列データの分析を、本書で記述する３点認識方法に基づくコンピュータプログラムの使用を通してか又は配列の視覚的走査によって実施する。熱帯性マラリア原虫の分離株が得られ、該タンパク質のアミノ酸配列は、遺伝子を配列決定しそこからタンパク質配列を誘導することといった任意の既知の方法により得られる。各分離株内のレプリキンの存在、レプリキンの経時的保存及びレプリキンの濃度について、配列を走査する。この情報は、抗マラリアワクチン又は核酸ベースのワクチンのための基礎原料を形成するために用いられるデータを提供する。
【０２７１】
マラリアを引き起こす抗体内で観察されるレプリキンに基づくペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンが生成される。好ましくは、ペプチド又は核酸ワクチンは、生体の表面抗原上に存在することが観察されているあらゆるレプリキン配列に基づくか又はこれを内含している。ワクチンには、マラリアを引き起こす株内で同定されたレプリキン配列の任意の組合せが内含され得る。
【０２７２】
ワクチン産生のためには、有効なワクチンにとって有用なものとして同定されたレプリキンペプチド（単複）は、クローニング、宿主細胞内での発現及びそれからの精製を含む分子生物学技術及び化学合成を含むあらゆる方法によって合成される。ペプチドは好ましくは、それに対する治療用抗体反応を誘発するように決定された量で薬学的に受容可能な担体と混和される。一般に、投薬量は約０．１μｇ〜約１０mgである。
【０２７３】
このとき、マラリアワクチンは、その年の間の任意の時点でそれを必要としている患者に対し、特に熱帯環境への旅行の前に投与される。
【０２７４】
もう１つの実施形態は、レプリキン含有生体のヌクレオチド配列に相補的である、ウイルス、トリパノゾーマ、細菌、真菌、藻類、アメーバ及び植物を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）生体内のレプリキンのための生体をコードするｍＲＮＡ又は遺伝子のコーディングストランドと相補的なアンチセンス核酸分子を内含している。
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】さまざまな生体内のレプリキンの発生頻度を描く棒グラフである。
【０２７６】
【図２】グリア芽腫細胞の嫌気性複製中の合計膜タンパク質１ミリグラムあたりのマリグニンの百分率を描いたグラフである。
【０２７７】
【図３】リコグニン１６量体に対する被曝に応答して生成された抗マリグニン抗体の量を示す棒グラフである。
【０２７８】
【図４】図４Ａは、常光及び蛍光灯で撮った血液塗抹標本の写真である。図４Ｂは、２つの白血病細胞の存在を例示する常光及び蛍光灯で撮った血液塗抹標本の写真である。図４Ｃは、抗マリグニン抗体の存在下での神経膠腫細胞のち密層の写真である。図４Ｄ及び図４Ｅは、抗マリグニン抗体の添加から３０分及び４５分の時点で撮った図４Ｃの細胞層の写真である。図４Ｆは、抗マリグニン抗体によるインビトロでの小細胞肺癌腫細胞の成長阻害を示す棒グラフである。
【０２７９】
【図５】外科手術前後の良性又は悪性乳腺疾患を患う患者の血清中に存在する抗マリグニン抗体の量のプロットである。
【０２８０】
【図６】レプリキン配列を同定する３点認識方法を実施するためにコンピュータが使用される本発明の１実施形態を描く箱図表である。
【０２８１】
【図７】１９４０年から２００１年までの年毎のペースでのインフルエンザＢ型及びインフルエンザＡ型株、Ｈ１Ｎ１の血球凝集素中に観察されたレプリキンの濃度を示すグラフである。
【０２８２】
【図８】１９５０年〜２００１年までの年毎のペースでのインフルエンザＡ型株、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２、ならびにその構成要素レプリキンによって画定された新興株の血球凝集素中で観察されたレプリキン濃度のグラフである。
【０２８３】
【図９】特定のレプリキン株についての一年あたりのレプリキン計数を描くグラフである。
【０２８４】
【図１０】ヌクレオカプシドコロナウイルス分離株についての一年あたりの平均レプリキン計数を描いた図表である。
【０２８５】
【図１１】Ｈ５Ｎ１血球凝集素についての一年あたりのレプリキン計数を描いた図表である。
【図１】
2007526222.tif 000069
【図２】
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【図３】
2007526222.tif 000071
【図４】
2007526222.tif 000072
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2007526222.tif 000076
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月7日(2007.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ペプチドのいずれかの末端に位置設定された第１のリジン残基；
（２）前記第１のリジン残基から６〜１０個残基のところに位置づけされた第２のリジン残基；
（３）少なくとも１つのヒスチジン残基及び
（４）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を含む単離された又は合成されたコロナウイルスペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドアミノ酸配列が７〜２５個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の単離又は合成ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドアミノ酸配列が７〜１６個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の単離又は合成ペプチド。
【請求項４】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１２のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号７１２のアミノ酸配列を含むコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項６】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１７のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
配列番号７１７のアミノ酸配列を含むコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項８】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号７１８のアミノ酸配列を含むコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項１０】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７１９のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号７１９のアミノ酸配列を含むコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項１２】
前記コロナウイルスペプチドが配列番号７２０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号７２０のアミノ酸配列を含むコロナウイルスペプチドを認識する抗体。
【請求項１４】
ヌクレオカプシド中に存在する請求項１の少なくとも１つの単離ペプチド又はスパイク又は外被タンパク質又はコロナウイルスの新興株のその他のタンパク質及び薬学的に受容可能な担体を含んで成るコロナウイルスワクチン。
【請求項１５】
ワクチンが請求項１の単離ペプチドを複数含む、請求項１４に記載のコロナウイルスワクチン。
【請求項１６】
少なくとも１つの単離ペプチドが配列番号７１２のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１７】
少なくとも１つの単離ペプチドが配列番号７１７のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１８】
少なくとも１つの単離ペプチドが配列番号７１８のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１９】
少なくとも１つの単離ペプチドが配列番号７１９のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項２０】
少なくとも１つの単離ペプチドが配列番号７２０のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項２１】
ヌクレオカプシド中に存在する請求項１の少なくとも１つの単離ペプチド又はスパイク又は外被タンパク質又はコロナウイルスの新興株のその他のタンパク質及び薬学的に受容可能な担体を含んで成るコロナウイルスワクチンを患者に投与する段階を含んで成る、ＳＡＲＳの予防又は治療方法。
【請求項２２】
前記コロナウイルスがＳＡＲＳコロナウイルスである、請求項１に記載の単離又は合成ペプチド。
【請求項２３】
少なくとも１つのヒスチジンが第２のリジンから６〜１０残基のところ位置設定されている１つのヒスチジンを除いた全てのリジンを含む約７〜１０アミノ酸長のものである合成ペプチド。
【請求項２４】
請求項２３の合成ペプチド及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物を投与する段階を含んで成る、受動免疫を提供する方法。
【請求項２５】
請求項２３の合成ペプチド、アジュバント及び薬学的に受容可能な担体を含む組成物を投与する段階を含んで成る、受動免疫を提供する方法。
【請求項２６】
請求項２３の合成ペプチドを投与する段階を含むＳＡＲＳに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の合成ペプチドを投与する段階を含むＳＡＲＳに対する免疫応答を誘発する方法。
【請求項２８】
請求項１４に記載のワクチンを投与する段階を含むＳＡＲＳに対する免疫応答の誘発方法。
【請求項２９】
請求項２３の合成ペプチドを投与する段階を含んで成る、ＳＡＲＳの治療方法。
【請求項３０】
ＵＴＯＰＥが１つのヒスチジンを除いて全てのリジンを含む長さ６〜約１０アミノ酸の合成ペプチドである、ＵＴＯＰＥのアミノ酸配列からなる合成ペプチド。
【請求項３１】
配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０、配列番号７４１又は配列番号７４２から成るグループの中から選択されている請求項３０のＵＴＯＰＥのアミノ酸配列から成る合成ペプチド。
【請求項３２】
少なくとも１つの請求項３１に記載のＵＴＯＰＥ及び薬学的に受容可能な担体を含む抗−レプリキンワクチン（ＵＶＡＸ）。
【請求項３３】
前記ＵＴＯＰＥが、配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０、配列番号７４１又は配列番号７４２から成るグループの中から選択された配列の１つを含むＵＴＯＰＥに特異的な抗ＵＴＯＰＥ抗体。
【請求項３４】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３２を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３５】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３３を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３６】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３４を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３７】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３５を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３８】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３６を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項３９】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３７を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４０】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３８を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４１】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４０を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４２】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４１を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４３】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４２を含む、ＵＴＯＰＥに特異的な抗体。
【請求項４４】
該ＵＴＯＰＥが配列番号７３２のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４５】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３３のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４６】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３４のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４７】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３５のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４８】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３６のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項４９】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３７のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５０】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３８のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５１】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７３９のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５２】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４０のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５３】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４１のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５４】
前記ＵＴＯＰＥが配列番号７４２のアミノ酸配列を含む請求項３０に記載のペプチド。
【請求項５５】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度（アミノ酸１００個あたりのレプリキン配列数）について分析する段階であって、前記レプリキン配列が；
（ａ）ペプチドのいずれかの末端に位置設定された第１のリジン残基；
（ｂ）前記第１のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置づけされた第２のリジン残基；
（ｃ）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（ｄ）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を含むペプチドとして定義される段階；
（３）該ウイルスの個々のタンパク質の複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期にその個々のタンパク質の各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間でレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項５６】
前記ウイルスの新興株が、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ及びコロナウイルスから成るグループの中から選択されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階であって、前記レプリキン配列が；
（ａ）ペプチドのいずれかの末端に位置設定された第１のリジン残基；
（ｂ）前記第１のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置づけされた第２のリジン残基；
（ｃ）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（ｄ）少なくとも６％のリジン残基、
を含むペプチドとして定義されている段階； 
（３）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の個々のタンパク質のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間で個々のタンパク質のレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項５８】
前記ウイルスの新興株が、インフルエンザウイルス、ＳＡＲＳ及びコロナウイルスから成るグループの中から選択されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
診断、予防又は治療を目的としてインフルエンザウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素の個々のタンパク質のいずれかのものの少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列をレプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階であって、前記レプリキン配列が；
（ａ）ペプチドのいずれかの末端に位置設定された第１のリジン残基；
（ｂ）前記第１のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置づけされた第２のリジン残基；
（ｃ）少なくとも１つのヒスチジン残基及び
（ｄ）少なくとも６％のリジン残基、
を含むペプチドとして定義される段階；
（３）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列中のウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素の個々のタンパク質のいずれかのもののレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に株の同じタンパク質の各々のものの血球凝集素アミノ酸配列内で観察された同じ個々のタンパク質のいずれかのもののレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間で個々のタンパク質のうちのいずれかのもののレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株及びタンパク質を同定する段階；
を含んで成る方法。
【請求項６０】
診断、予防又は治療を目的としてインフルエンザウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素のタンパク質の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列をレプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階であって、前記レプリキン配列が；
（ａ）ペプチドのいずれかの末端に位置設定された第１のリジン残基；
（ｂ）前記第１のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置づけされた第２のリジン残基；
（ｃ）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（ｄ）少なくとも６％のリジン残基、
を含むペプチドとして定義される段階；
（３）インフルエンザウイルスの複数の株のうちの各菌の少なくとも１つの分離株の血球凝集素アミノ酸配列中のウイルスの複数の株のうちの各株の血球凝集素のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株の血球凝集素アミノ酸配列内で観察された血球凝集素タンパク質のレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間で血液凝集素のタンパク質のレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株を同定する段階；
を含んで成る方法。
【請求項６１】
新規レプリキンの数の比較を含み、これによって新規レプリキン、すなわち前年にはその正確な構造が存在していなかったものの数が計数され、この新規レプリキンの数はウイルス新興に先立って及びその間に増大する、請求項５５〜６０に記載の方法。
【請求項６２】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの非新興株又は休眠状態のウイルス株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階であって、前記レプリキン配列が；
（ａ）ペプチドのいずれかの末端に位置設定された第１のリジン残基；
（ｂ）前記第１のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置づけされた第２のリジン残基；
（ｃ）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（ｄ）少なくとも６％のリジン残基、
を含むペプチドとして定義される段階；
（３）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内のレプリキン配列の濃度を、少なくとも１つのより早い時期に各株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン配列の濃度と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの濃度を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（４）該少なくとも２つの時期の間でレプリキン配列の濃度が最低の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【請求項６３】
診断、予防又は治療を目的として１つのウイルスの新興株を同定する方法において、
（１）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株を得る段階；
（２）ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を、レプリキン配列の存在及び濃度について分析する段階であって、前記レプリキン配列が；
（ａ）ペプチドのいずれかの末端に位置設定された第１のリジン残基；
（ｂ）前記第１のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置づけされた第２のリジン残基；
（ｃ）少なくとも１つのヒスチジン残基及び
（ｄ）少なくとも６％のリジン残基、
を含むペプチドとして定義される段階；
（３）レプリキン計数つまり１００アミノ酸長の配列あたりのレプリキンの数を決定する段階；
（４）該ウイルスの複数の株のうちの各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列内のレプリキン計数を、少なくとも１つのより早い時期に各々の株のアミノ酸配列内で観察されたレプリキン計数と比較して、少なくとも２つの時期についてのレプリキンの計数を提供する段階であって、前記少なくとも１つのより早い時期が段階（１）より前約６ヵ月〜約３年以内である段階；及び
（５）該少なくとも２つの時期の間でレプリキン計数が最高の増加を示すウイルスの株を同定する段階、
を含んで成る方法。
【国際調査報告】
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