(57)【要約】  摂動を受ける個体群中のオブジェクトからの反応の多次元分布を特徴付けるためのシステムおよび方法を提供する。この方法は、摂動を受けない参照個体群および摂動を受けた参照個体群から補間された「反応度」スケールの生成を可能にする。この方法は、補間された反応度スケールを使用して、所与のレベルの摂動を受ける試験化合物の反応度の定量を可能にし、試験化合物のための用量反応曲線の生成を可能にする。この方法は、製薬研究で行われているような、細胞検定および化合物のハイコンテンツスクリーニングといった広範囲の用途で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応が個体群の多次元状態の表現である、複数のレベルの摂動を受ける個体群のための反応度スケールを生成する方法であって、
ａ）第１のレベルの摂動を受ける前記個体群の第１の試料のフィンガープリントを決定し、したがって、低反応個体群の前記多次元状態の表現である低反応参照フィンガープリントを取得するステップと、
ｂ）前記第１のレベルの摂動より大きい第２のレベルの摂動を受ける前記個体群の第２の試料のフィンガープリントを決定し、したがって、高反応個体群の前記多次元状態の表現である高反応参照フィンガープリントを取得するステップと、
ｃ）各補間されたフィンガープリントは、多次元状態の前記低反応および高反応個体群の中間の反応度を示す個体群の多次元状態の表現であり、前記低反応参照フィンガープリントおよび前記高反応参照フィンガープリントからの補間されたフィンガープリントの組を決定するステップと
を備え、前記反応度スケールは、前記補間されたフィンガープリントの組、前記低反応参照フィンガープリント、および前記高反応参照フィンガープリントからなり、それぞれは、対応する反応度によって索引付けされることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記個体群は、生物学的個体群であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記個体群は、細胞の個体群であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記各フィンガープリントを決定するステップは、前記細胞の複数のフィーチャを測定するステップを含み、前記フィーチャのうちの少なくとも１つは、長さ、幅、高さ、周囲の長さ、面積、体積、位置づけ、形状、質感、モーメント、平均、分散、ゆがみ、とがり、重心、色、発光、合計発光、平均発光、および光密度からなるフィーチャの組から選択され、各フィーチャは、前記細胞全体または前記細胞の小区域のいずれかから独立して測定されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記摂動は、化学的、生物学的、機械的、熱的、電磁的、重力的、核的、または時間的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記摂動は、生物活性化合物であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
補間されたフィンガープリントの前記組の各補間されたフィンガープリントは、前記低反応参照フィンガープリントおよび前記高反応参照フィンガープリントの線形結合として決定されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
反応が個体群の多次元状態の表現である、参照摂動に関係した既知のレベルの試験摂動を受ける試験個体群の反応を分析する方法であって、
ａ）
ｉ）第１のレベルの前記参照摂動を受ける前記個体群の第１の試料のフィンガープリントを決定し、したがって、低反応個体群の前記多次元状態の表現である低反応参照フィンガープリントを取得することと、
ｉｉ）前記第１のレベルの摂動より大きい第２のレベルの前記参照摂動を受ける前記個体群の第２の試料のフィンガープリントを決定し、したがって、高反応個体群の多次元状態の表現である高反応参照フィンガープリントを取得することと、
ｉｉｉ）補間された各フィンガープリントは多次元状態の前記低反応および高反応個体群の中間の反応度を示す個体群の多次元状態の表現である、前記低反応参照フィンガープリントおよび前記高反応参照フィンガープリントから補間されたフィンガープリントの組を決定することと
によって反応度スケールを決定するステップであって、前記反応度スケールは、補間されたフィンガープリントの前記組、前記低反応参照フィンガープリント、および前記高反応参照フィンガープリントからなり、それぞれは、対応する反応度によって索引付けされるステップと、
ｂ）前記既知のレベルの試験摂動を受ける前記試験個体群のフィンガープリントを決定し、したがって、前記試験個体群の前記多次元状態の表現である試験フィンガープリントを取得するステップと、
ｃ）前記反応度スケールのうちから前記試験フィンガープリントに最も類似のフィンガープリントを決定し、前記最も類似のフィンガープリントに対応する反応度を識別することによって、前記試験個体群の反応度を決定するステップと
を備えたことを特徴とする方法。
【請求項９】
前記参照および試験個体群は、生物学的個体群であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記参照および試験個体群は、細胞の個体群であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各前記フィンガープリントを決定するステップは、前記細胞の複数のフィーチャを測定するステップを含み、前記フィーチャのうちの少なくとも１つは、長さ、幅、高さ、周囲の長さ、面積、体積、位置づけ、形状、質感、モーメント、平均、分散、ゆがみ、とがり、重心、色、発光、合計発光、平均発光、および光密度からなるフィーチャの組から選択され、各フィーチャは、前記細胞全体または前記細胞の小区域から独立して測定されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記摂動は、化学的、生物学的、機械的、熱的、電磁的、重力的、核的、または時間的であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記摂動は、生物活性化合物であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記試験摂動および前記参照摂動は同じであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記試験摂動および前記参照摂動は異なることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記補間されたフィンガープリントの組の各補間されたフィンガープリントは、前記低反応参照フィンガープリントおよび前記高反応参照フィンガープリントの線形結合として決定されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
反応が個体群の多次元状態の表現である、摂動を受ける個体群に対する用量反応関係を生成する方法であって、
ａ）
ｉ）第１のレベルの摂動を受ける前記個体群の第１の試料のフィンガープリントを決定し、したがって、低反応個体群の多次元状態の表現である低反応参照フィンガープリントを取得すること、
ｉｉ）前記第１のレベルの摂動より大きい第２のレベルの摂動を受ける前記個体群の第２の試料のフィンガープリントを決定し、したがって、高反応個体群の多次元状態の表現である高反応参照フィンガープリントを取得すること、
ｉｉｉ）各補間されたフィンガープリントは、多次元状態の前記低反応および高反応個体群の中間の反応度を示す個体群の多次元状態の表現である、前記低反応参照フィンガープリントおよび前記高反応参照フィンガープリントから補間されたフィンガープリントの前記組を決定することと
よって反応度スケールを決定するステップであって、前記反応度スケールは、補間されたフィンガープリントの前記組、前記低反応参照フィンガープリント、前記高反応参照フィンガープリントからなり、それぞれは、対応する反応度によって索引付けされるステップと、
ｂ）異なる既知のレベルの前記試験摂動をそれぞれ受ける、前記個体群の複数の試験試料の複数のフィンガープリントを決定し、したがって、摂動の複数の各レベルに対応する試験フィンガープリントを取得するステップと、
ｃ）前記反応度スケールのうちから前記試験フィンガープリントに最も類似のフィンガープリントを決定し、前記最も類似のフィンガープリントに対応する反応度を識別することによって、各試験フィンガープリントに対する反応度を決定するステップと
を備え、前記用量反応関係は、摂動の前記複数の各レベルに対して取得される前記反応度によって表されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
摂動を受ける個体群のための用量反応曲線を生成する方法であって、前記方法は、請求項１５の前記方法に従って前記個体群に対する用量反応関係を生成するステップと、得られた結果に曲線を適合させるステップとを含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年１月１２日に出願した米国特許出願第６０／５３９３２２号の優先権を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、一部が政府の支援で行われたものである（ＤＨＨＳ認可第１  Ｒ４４  ＮＳ４５３８４−０１号(DHHS Grant No. 1 R44 NS45384-01)）。政府は、本発明のいくつかの権利を有し得る。
【０００３】
本発明は、一般に、画像を特徴付け比較するためのシステムおよび方法に関する。より詳細には、本発明は、生物学的物質、特に細胞の画像を比較し分析するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
摂動による生物学的影響をモニタリングするための検定は、一般に、有効性、毒性、またはその他の生物学的反応を決定するために、創薬、診断、および予防医学で使用される。生物学的反応の複雑な性質により、一般に検定は、試験済みの摂動または類似の摂動のいずれかと関連するとわかっている、１つまたは複数の特定の変化の定量的計測を提供するように設計されている。たとえば、摂動が薬剤への暴露によって生じる場合、通常、試料をある濃度範囲の化合物にさらし、試料への影響の度合いを監視し、既知のタンパク質の発現および／または配置などの、生物学的に意味のある反応の尺度を提供することを先験的に予想される特定の生物学的フィーチャとなるように、測定されるパラメータが選択される。その結果得られるパラメータ値は、図式的にプロットされ、化合物の効果的な用量を推定するのに使用される。その検定は、特定の予想される影響だけをモニタするように設計されているので、化合物の生物学的影響の全範囲に関するデータから取得可能な情報は、本質的に制限されている。そのような検定の例、特には、タンパク質の転座を測定するように設計された検定が、非特許文献１および非特許文献２に記載されている。
【０００５】
パターン認識は、生物学試料の画像を比較し、摂動による類似度または違いを識別するための強力なツールである。この手法は、既知の生物学的な重要性の１つまたは複数のパラメータを測定する特定の検定を知り開発するという制限を取り除き、その代わりに、影響についての最小限の先験的な知識で複数の細胞属性、条件、および変化を監視する。
【０００６】
【特許文献１】同時係属米国特許出願第１０／１１６６４０号明細書（米国特許出願公開第２００２／０１５９６２５号明細書）
【非特許文献１】Ding et al., 1998, Journal of Biological Chemistry 273 (44): 28897-28905
【非特許文献２】Giulano et al., 1997, Journal of Biomolecular Screening 2(4): 249-259
【非特許文献３】Rafael C. Gonzalez and Paul Wintz, ”Digital Image Processing”, second edition, 1987
【非特許文献４】Rubner et al., 2001, Computer Vision and Image Understanding 84: 25-43
【非特許文献５】Rubner et al., 2000, International Journal of Computer Vision 40(2): 99-121
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この手法に関連する大きな課題は、パターン認識に基づいた分析から得られるデータを解釈し表現することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、摂動を受けるオブジェクトの個体群の反応を特徴付け、比較するためのシステムおよび方法を提供する。ここで、反応は、オブジェクトフィーチャの多次元分布を指す。
【０００９】
本発明の方法は、摂動を受けていない参照個体群および摂動を受けた参照個体群をそれぞれ特徴付けるオブジェクトフィーチャの多次元分布に基づいて、中間反応度における一連の個体群に対する多次元統計記述を提供する「反応度」スケールの作成を可能にする。本発明の一態様は、個体群中のオブジェクトの多次元統計記述である反応に対する「反応度」の定義である。本発明の第２の態様は、補間された反応度スケールの生成である。
【００１０】
反応度スケールは、与えられた摂動レベルへの試験個体群の実験的に決定された反応の、定量的反応度の決定を可能にする。さらに、反応度スケールは、試験化合物の用量反応曲線の生成も可能にする。ここで、試験個体群の反応は、複数の摂動レベルで決定される。本発明の別の態様は、補間された反応度スケールから試験個体群の反応度を決定する方法であり、本発明の追加の態様は、試験化合物の用量反応曲線の生成である。
【００１１】
本発明は、特に生物学的用途に適用可能であるが、それに限られない。好ましい実施形態において、本発明は、薬剤、毒素、信号タンパク質、またはその他の生物活性化合物などの摂動にさらされた細胞試料を分析するためのシステムおよび方法を提供する。その場合、試料の画像を分析するために、統計的パターン認識が使用される。本発明は、既知の摂動を受ける細胞試料の反応度の決定を可能にし、また様々なレベルの摂動を受ける細胞試料の反応度を特徴付ける用量反応曲線の決定を可能にする。
【００１２】
好ましい一実施形態では、反応度スケールは、対象となる摂動の範囲の端点での試料反応を表す参照試料から決定される。一般に、細胞検定における摂動は、試料に適用される生物活性化合物を指し、摂動の範囲は、化合物が適用される濃度の範囲を指す。参照試料は、それぞれが少なくとも１つの、しかし好ましくは多くの細胞を含んでおり、対象となる摂動の範囲の端点を定義する条件下で検定される。この方法は、可能な摂動レベルの部分的範囲に同じく適用可能であるが、一般に、一つの試料は、摂動を受けていない状態（すなわち、化合物が適用されていない）を表し、他方の試料は、「最大限に」摂動を受けた状態を表すことになる。各試料中の細胞の多次元統計記述は、試料の「フィンガープリント」と呼ばれ、たとえば、各試料の１つまたは複数の画像のパターン認識分析から取得される。したがって、これらの参照個体群は、摂動の範囲の最小の端点および最大の端点における個体群中の細胞の状態を特徴付けるフィンガープリント（すなわち、個体群の反応）を提供する。
【００１３】
一方は最も小さい摂動での反応を表し、もう一方は最も大きい摂動での反応を表す２つの参照個体群フィンガープリントが与えられた場合、反応の中間レベルによる個体群の反応の推定値（すなわち、フィンガープリント）を表す反応度スケールが生成される。反応度スケールに沿って端点を定義するために、最も小さい摂動での反応（すなわち、フィンガープリント）に等しくなるように最も小さい反応が設定され、最も大きい摂動での反応（すなわち、フィンガープリント）に等しくなるように最も大きい反応が設定される。便宜上、反応度スケールの範囲は適宜、最も小さい反応が０で最も大きい反応が１となるように設定することによって、０から１（０％から１００％と同等）の間隔となるように設定される。
【００１４】
反応度スケールは、反応の変化の数学的モデルを使用して、端点の反応から生成される。細胞反応の生物学についての妥当な仮定に基づいて、細胞検定における中間反応を記述するために、モデルの例示的なクラスが提供される。
【００１５】
本発明は、既知の摂動に対する試験個体群の試験的に決定された反応（フィンガープリント）を定量化するために反応度スケールを使用する方法を提供する。試験的に決定された試験反応は、最も類似する補間値を見つけるために補間された反応と比較され、摂動への試験個体群の反応度は、最も類似する補間値に対応する反応度を割り当てられる。最も類似する補間値を計算する方法を提供する。いくつかの実施形態において、モデルから１組の補間値が生成され、試験フィンガープリントは、生成された補間値と比較される。好ましい諸実施形態では、最も類似する補間値は、補間値モデルから分析的に特定される。
【００１６】
本発明はさらに、個体群の反応と、摂動のレベル、たとえば、試料に施される化合物の濃度レベルとの間の関係を説明する、用量反応曲線を計算する方法を提供する。反応度スケールを使用して、それぞれが化合物の互いに異なる濃度にさらされる一連の試験個体群の反応を定量することにより、用量反応曲線から一連の点が提供される。この一連の点をプロットして、試験化合物のための標準２次元用量反応図を提供することができる。試験的に決定された点を曲線に適合して、用量反応曲線を取得することができる。多次元反応のために定義された用量反応曲線は、標準の単一パラメータの用量反応曲線に類似する方式で使用することができる。
【００１７】
補間された反応度スケールに関連する試験個体群の反応の定量化の方法はさらに、それぞれが様々な種類の摂動を受ける参照個体群から生成される、複数の反応度スケールに関する試験個体群の反応を評価する方法を提供する。たとえば、この方法により、新しい薬剤の候補の影響を、複数の既知の薬剤の影響に関して比較することが可能になる。補間された反応度スケールは、各既知の薬剤に関して生成することができ、候補薬剤にさらされる試験個体群の反応を、各反応度スケールと比較することができる。各補間されたスケールから取得される反応度は、各既知の薬剤に関する、薬剤候補の影響の類似度の尺度を提供する。
【００１８】
複数の反応度スケールに関する試験個体群の反応の測定において、スケールにおける試験個体群から最も類似する（最も近い）補間値までの距離は、試験個体群の反応がそのスケールによってどの位よく特徴付けられるかの尺度を提供する。概念的に、試験反応は、反応度スケールに沿った構成要素反応と、そのスケールから離れた構成要素反応とからなる。スケールに沿った反応の部分が最大化され、スケールから離れた反応の部分が最小化されると、スケール試験反応をうまく特徴付ける。したがって、たとえば、薬剤候補によって誘発された反応をいくつかの既知の薬剤から取得されるスケールと比較すると、薬剤候補は、試験試料の反応を最も特徴付けるスケールに対応する薬剤に最も類似すると見なすことができる。
【００１９】
また、本発明は、本発明の方法を行うためのシステムも提供する。そのようなシステムは一般に、オブジェクトの個体群においてオブジェクトの多次元測定を獲得するための機器と、獲得したデータ上で本発明の方法を行うための命令を機械可読媒体上に含むコンピュータとを提供する。好ましい一実施形態において、本発明のシステムは、試料の自動分析を可能にする要素を備え、そして、自動デジタル顕微鏡などの画像取得モジュールと、本発明の方法を使用して得られる画像データの分析を可能にするコンピューティングモジュールとを備える。
【００２０】
本明細書に記載のシステムおよび方法は、創薬、診断、病理学、および予防医学、ならびに非生物学的分野に広く適用可能であり、その場合に、パターン認識で導かれた画像データを混合することは、中間値の予測推定値を提供することができる。そのような分野には、顔認識、指紋分析、網膜スキャン、および筆跡を含むが、それに限られない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
明確化のため、次のように定義する。他の指示がない限り、すべての用語は、当技術分野で一般語であるとして使用される。ここで引用する上記および下記のすべての参照は、参照によりここに組み込む。
【００２２】
本明細書で使用されているように、「システム」および「計測器」は、（たとえば、機械的および電子的）ハードウェア構成要素、および（たとえば、コンピュータプログラムなどの）関連するソフトウェア構成要素の両方を包含するものとする。
【００２３】
「オブジェクト」は、フィーチャ測定がなされる試料中の個々の要素を指すために本明細書で使用される。オブジェクトの定義は、検定に依存し、本発明の決定的な態様ではない。一般に、器具の測定能力と共に、検定の性質および意図により、どんな試料構成要素をオブジェクトとして選択するかが判定されることになる。たとえば、個々の細胞の測定値が取得される細胞検定において、オブジェクトは、単一の細胞として定義される。
【００２４】
「試料」または「個体群」は、ここで、少なくとも１つの、しかし好ましくは多くのオブジェクトの集まりを指して使用される。
【００２５】
「記述子」、「フィーチャ」、「プリミティグ」、および「統計」という語は、ここでオブジェクトから測定または計算される個々のパラメータを指して使用される。オブジェクトフィーチャは、大きさ、色、または光度などの、オブジェクトから直接得られる測定値でよく、またはオブジェクトの全体またはオブジェクトの下位要素から測定される、面積、モーメント（たとえば、重心、分散、歪度、尖度）、あるいは質感などの、測定値の関数または統計であってよい。適切な記述子の組の選択は用途に依存し、当業者は、ここでの教示に従って適切な組を選択することが可能であろう。オブジェクトを測定するのに使用されるフィーチャの組は、ここでは多次元フィーチャ空間を形成するものとして表され、１つのオブジェクトからのフィーチャの測定は、多次元フィーチャ空間内の点を表す。
【００２６】
Ｉ．フィンガープリント
「フィンガープリント」という語は、本明細書で使用されているようにオブジェクトの多次元記述、または複数のオブジェクトを含む試料、あるいは等価的に、記述子またはフィーチャの組に関するオブジェクトまたは試料の画像を広く指す。
【００２７】
また、細胞などのオブジェクトのフィンガープリントは、本明細書で使用されているようにフィーチャベクトルとも呼び、本明細書では、オブジェクトを特徴付ける記述子（フィーチャ）値のベクトルを指す。概念的に、オブジェクトのフィンガープリントは、多次元フィーチャ空間内の点として表すことができる。
【００２８】
複数のオブジェクトを含む個体群のフィンガープリントは、オブジェクトフィンガープリントの組、またはオブジェクトフィンガープリントの分布の表現を指す。概念的に、個体群のフィンガープリントは、多次元フィーチャ空間内の分布として表すことができる。試料のオブジェクトフィンガープリントの組は、記述子の値ｘｉｊの２次元の配列として便宜上、表すことができ、ここでｘｉｊは、ｉ番目のオブジェクトから測定されたｊ番目の記述子の値、すなわち、各列がオブジェクトの１つに対するフィーチャベクトルである配列である。各フィーチャの分布は、フィーチャベクトルの配列から計算することができる。あるいは、個体群のフィンガープリントは、個々のフィーチャ分布の組またはベクトルとして表すことができる。たとえば、フィンガープリントは、各フィーチャごとに観測された値のヒストグラムによって、あるいは、観測されたデータを分布に適合させることによって一般に得られる分布関数により、表すことができる。いくつかの実施形態では、個体群フィンガープリント分布を推定するのに再サンプリング方法の使用を容易にするので、フィーチャベクトルの配列（すなわち、フィーチャ空間内の点の組）としてのフィンガープリントの表現が好ましい。
【００２９】
「Ｃｙｔｏｐｒｉｎｔ（商標）」（メリーランド州、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、アトーバイオサイエンス社(Atto Bioscience)の商標）という語は、細胞の試料のフィンガープリントを指す。本発明が特に細胞検定に適用可能で、本発明は細胞検定に適用されるものとしてここに詳細に記載されているが、本発明は細胞検定だけには限定されず、一般のオブジェクトの個体群のフィーチャの分析に適用可能であることが、当業者には明らかであろう。
【００３０】
試料のフィンガープリント（または試料の画像）を測定する方法は、同時係属米国出願（特許文献１参照）に記載され、参照によりここに組み込まれる。特定の用途におけるフィンガープリントを構成するフィーチャの選択、およびその用途に適用可能なフィンガープリントを生成する方法の両方は、本発明の決定的な態様ではない。好ましい方法は、ここで例として記載されていて、本発明は例示された方法および用途に限定されないことは、当業者には明らかであろう。
【００３１】
一般に、試料、たとえば細胞の試料のフィンガープリントは、次のステップを使用して取得される。 
１．試料のデジタル画像を取得するステップ。 
２．試料中のオブジェクトを識別する（「画像分割」と呼ぶ）ステップ。 
３．試料に含まれる複数のオブジェクトのそれぞれに、フィーチャベクトルの値を決定するステップ。 
４．フィーチャ値を機械可読形式で格納するステップ。
【００３２】
その結果得られる試料のフィンガープリントは、フィーチャベクトルの集まりである。任意選択で、複数のフィーチャのそれぞれに対するフィーチャ値のヒストグラムまたは分布は、そのフィンガープリントから導くことができる。
【００３３】
試料の画像は、任意の適切な手段を使用して取得することができる。好ましい一実施形態において、細胞の試料の画像は、デジタル画像顕微鏡、好ましくは共焦点顕微鏡を使用して取得される。適切な顕微鏡が、たとえば、ＢＤバイオサイエンス社(BD Biosciences)、バイオイメージングシステム(Bioimaging systems)（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、アマシャムバイオサイエンス社(Amersham Biosciences)（現在、ニュージャージー州ＰｉｓｃａｔａｗａｙのＧＥヘルスケア社(GE Healthcare)の一部）、カールツァイス社(Carl Zeiss Inc.)（ニューヨーク州Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ）、オリンパス社(Olympus)（ニューヨーク州Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）、モレキュラーデバイス社(Molecular Devices)（カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）、セロミクス社(Cellomics)（ペンシルヴェニア州Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ）、エボテックテクノロジーズ社(Evotech Technologies GmbH)（ドイツ、ハンブルク）、およびベックマンコールター社(Beckman Coulter)（カリフォルニア州Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）など、多くのベンダから市販され入手可能である。
【００３４】
試料中のオブジェクトまたはオブジェクトの下位領域に対応する画像内の領域を識別する（「画像分割」）方法は、よく知られている。たとえば、非特許文献３は、分割を含む様々な画像処理技法を記述する教科書であり、その全体を参照によりここに組み込む。当業者には、その文献の網羅的な記述から、特定の用途に適切な方法を選択することが可能であろう。
【００３５】
試料に含まれている複数のオブジェクトのそれぞれに対するフィーチャベクトルの値を決定する方法は、特定の用途のために選択されるフィーチャに依存する。一般に、フィーチャ値は、分割された画像を直接測定することによって、それに続いて適切な統計または関数を計算することによって得られる。たとえば、デジタル画像内のオブジェクトの領域は、一般に、オブジェクトの画像内に含まれる画素（ピクセル）の数を数えることによって、また任意選択で、これをピクセルによって表されている物理的領域に関係付けることによって得られる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、フィンガープリントは、実際に測定されるフィーチャのサブセットに基づいて定義してもよい。特定のフィーチャが、測定はされても特定の用途における対象ではないことが先験的にわかっている場合、あるいは、検定された個体群の一部またはすべてからの特定のフィーチャから得られたデータが異常な場合、これは望ましくなり得る。たとえば、細胞検定において、核領域を位置づけるのに使用される核酸染色法など、下位細胞構成要素の識別を容易にするためだけに使用される蛍光色素の発光は、用途によっては、細胞反応の意味のある測定値を提供しないかもしれない。
【００３７】
ＩＩ．摂動
「摂動」という語は、本明細書で使用されているように、オブジェクトの試料または個体群における観測可能な変化を生じさせる潜在性を有する、任意の測定可能パラメータを指すために使用される。本明細書で使用されているように、摂動は、試料の反応ではなく、試料の処置を指す。摂動の性質は、本発明の決定的な態様ではなく、本方法は広範囲に適用可能である。摂動は、試料に影響を与える条件の幅を含むことができ、化学的、生物学的、力学的、熱的、電磁的、重力、核、および時間的からなるグループから選択された力のうちの任意の１つまたは複数を含むことができるが、それには限られない。
【００３８】
摂動のレベルは、本明細書で使用されているように、試料に適用される摂動の量のスカラー尺度を指す。摂動のレベルの適切な尺度は、摂動の性質に依存する。たとえば、生物学的検定では、摂動は一般に、薬剤、ホルモン、毒素、または作用薬などの生物活性化合物であり、化合物の濃度は、試料に適用される摂動のレベルの適切な尺度である。あるいは、摂動は、様々な長さの時間で試料に適用される単一の濃度でもよく、摂動のレベルの適切な尺度は、その適用時間である。別の実施形態では、摂動は、オブジェクトが反応できるようにするための時間期間がその後に続く離散的事象であってよく、摂動のレベルの尺度は摂動事象に続く時間である。
【００３９】
個体群のフィンガープリントが、摂動の複数のレベルで決定されることになる場合、これは、個体群の複製試料を使用して実施され、それぞれが、摂動のレベルのうちの１つにさらされることは明らかである。
【００４０】
ＩＩＩ．反応
本明細書で使用されているように、ある所与の摂動を受けるオブジェクトまたは個体群の「反応」は、摂動を受けたオブジェクトまたは個体群の状態を指す。反応は、摂動を受けたオブジェクトまたは個体群のフィンガープリントとして測定される。
【００４１】
反応は、摂動を受けていない試料である参照に関して測定される必要はない。反応は、摂動による試料の状態の変化でなく、摂動を受けた試料の状態を指すからである。しかし、ここで記載されるように、フィンガープリントの間の距離の様々な尺度は、異なるように摂動を受けた試料からのフィンガープリントに適用して参照と摂動を受けた試料の間の距離の尺度を提供することができる。
【００４２】
ＩＶ．用量反応
「用量反応曲線」という語は、本明細書で使用されているように、個体群の反応度と個体群に適用されるレベルまたは摂動の間の関係を説明するために使用される。本文脈において、反応は、個体群中のオブジェクトの多次元統計の特徴付け（フィーチャ空間内の多次元分布）を指し、本発明の一態様は、この文脈における「反応度」の定義、および計算である。
【００４３】
「ＥＣ５０」という語は、基準反応と最大反応の中間で反応を引き起こす摂動レベルを指す。
【００４４】
Ｖ．反応度スケール
一態様において、本発明は、中間の反応度における個体群のフィンガープリントを表す「反応度」スケール（本明細書では、単に反応スケールとも呼ぶ）を生成するための方法を提供する。反応度スケールは、それぞれ最小限および最大限に摂動を受けた個体群の反応である、反応端点から補間される。中間反応フィンガープリントは、本明細書で使用されているように、補間値または補間されたフィンガープリントと呼ぶ。反応度スケールとは、実験的に決定された端点に従い、対応する反応度によって索引付けされた、補間の組を指す。
【００４５】
反応度スケールは、参照フィンガープリントを接続するフィーチャ空間における分布の空間内の単位長の曲線を定義し、ここで、摂動を受けていない参照フィンガープリントから曲線に沿った距離は、反応度の尺度であることに留意されたい。
【００４６】
反応度スケールの端点は、参照個体群のフィンガープリントによって定義される。すなわち、最も小さい反応は、摂動の最低レベルでの反応として定義され、最も大きい反応は、摂動の最高レベルでの反応として定義される。一般に、参照個体群は、摂動を受けていない状態および「最大限に」摂動を受けた状態を表すが、この方法は、可能な摂動レベルの部分範囲にも等しく適用可能である。同様に、最も小さい反応は一般に、「ゼロ」反応を表すと仮定され、最も大きい反応は一般に、最大反応を表すと仮定されるが、この方法は、反応の部分的範囲にも等しく適用可能である。便宜上、反応度スケールの範囲は一般に、０から１（０％から１００％の反応と同等）の間隔であるように恣意的に設定されるが、いくつかのケースにおいて（たとえば、拮抗的摂動）、０から−１の間隔など、その他の間隔がより好都合かもしれない。観測された最大の反応は、真に最大の反応を表さない（たとえば、適用された最高レベルの摂動は、試料中のオブジェクトの一部分だけを変化させるという結果になる）ことがわかる実施形態において、それに合わせて、反応範囲の索引を再スケールすることが望ましいかもしれない。
【００４７】
一般に、個体群反応は、連続的方法で変わることができ、反応度は、０（反応なし）から１（フル反応）までの、あるいは等価的に０％から１００％までの連続的な変化できる範囲である。このケースにおいて、反応度スケールは、それぞれが反応度によって索引付けされた無限の組、補間値を含んでいる。いくつかの実施形態において、個体群反応は、可能な離散的状態の有限数に制限され、反応度スケールは、補間の有限個の組を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、反応度スケールは、スケールに沿った反応の組によって近似される。そのような近似は、本発明のいくつかの実施形態において必要とされる演算処理および記憶容量を低減することができ、例えば再サンプリング方法を使用してその補間が生成され記憶される場合であり、実験結果から計算されたパラメータにとって意味のある精密さのレベルに関する生来の限界のために、それは一般に望ましくもなり得る。生成された補間の数は、反応度における所望のステップサイズによって決定され、用途に依存することになる。たとえば、ケースによっては、パーセントの反応（すなわち、０％、１％、２％、．．．．１００％の反応）での整数変化に対応する補間を生成または考慮すれば十分かもしれない。あるいは、正確な結果が得られる本発明の実施形態では、結果を、適切な精度にまるめてもよい。
【００４９】
ＶＩ．補間モデル
各反応度ごとに、対応する補間は、増大する反応のフィーチャベクトル分布における変化のモデルから取得される。適切なモデルは、用途、および特に、適用されるオブジェクトおよび摂動の性質に依存する。当業者は、ここでの教示に従って特定用途のために適切なモデルを選択することが可能であろう。摂動に対するオブジェクトの反応などのプロセスのモデル化では、一般に、実際のプロセスの近似または簡略化を伴い、その機構は、知られていない、あるいは完全には理解されていない場合がある。モデルは、既知の、または仮定の基礎となる機構に基づいていてよく、あるいは、たとえば、実験的に決定された関係を使用して入力から出力が予測される、純粋に現象学的モデルであってもよい。モデルが基礎となる機構を反映し、あるいはそれに基づくかどうかにかかわらず、モデルはその予測値による本発明の方法において、有用であろう。
【００５０】
本発明の好ましい用途は、生物活性化合物などの摂動を受ける細胞の試料の分析である。細胞検定における中間フィンガープリントの好ましいモデルクラスは、細胞が２つの状態、すなわち摂動を受けていない状態および完全に摂動を受けた状態（たとえば、アクティブ化されていない状態およびアクティブ化された状態）のみを有し、細胞が状態を変える（たとえば、アクティブ化される）可能性は、摂動を与える化合物の濃度の関数である、細胞反応の基礎となるモデルを仮定することによって得られる。基礎となる生物学のこのモデルは、薬剤化合物または毒素と共に扱われる広い範囲の細胞検定に適用可能であり得る。たとえば、アポトーシスを誘導する化合物は、細胞の完全な状態変化（すなわち、アポトーシスになる）という結果になる、細胞内の事象のカスケードをトリガすることによって機能するかもしれず、ここでトリガされる細胞の割合は、濃度に依存する。類似の挙動は、細胞内信号カスケードをトリガする、あるいは、より一般に、二極化された細胞反応に影響を与える、広い範囲の化合物から予想され得る。
【００５１】
中間反応試料状態のモデルは、以下のような基礎となる生物学上の仮定から取得される。反応なしの参照試料中の細胞の小さな割合または０は、摂動を受けた状態であり、最大反応の参照試料中の細胞のより大きな割合またはすべてが摂動を受けた状態であると仮定する。中間反応個体群は、摂動を受けた状態中に中間の数の細胞を含む個体群に対応しており、参照個体群の混合として表すことができる。反応なし（反応度スケール上で０）およびフル反応（反応度スケール上で１）の参照個体群の確率密度関数を、それぞれｆ０およびｆ１と表記する。ｆαを、αに等しい中間反応を有する個体群の確率密度関数とし、ここでαは、０〜１の値をとる摂動のレベルの関数である。次に、関数αによって索引付けされ、中間反応を有する個体群の密度関数を記述するモデルクラスは、
ｆα（ｘ）＝αｆ１（ｘ）＋（１−α）ｆ０（ｘ）
として定義される。
αに等しい中間反応を有する個体群のフィンガープリントは、ここでα補間値と呼ぶ。
【００５２】
αの値は、反応度の尺度である。概念的に、フィーチャ空間内の反応度曲線に関して、αは、反応なしからフル反応への参照個体群の曲線に沿った変位を測る。０〜１の値をとる摂動のレベルの関数である以外には、関数αについて何も仮定しない。実際、αは、濃度α関数として、用量反応曲線を表す。本発明は、既知の濃度を受ける試料の実験的に決定された反応を、モデル化された反応度スケールと比較することによって、αの関数の形を決定する方法を提供する。
【００５３】
細胞検定における中間フィンガープリントの代替モデルクラスは、摂動を受けていない状態と完全に摂動を受けた状態（たとえば、アクティブ化されていない状態およびアクティブ化された状態）の間に細胞の状態の連続がある細胞反応の基礎となるモデルを仮定することによって得られ、中間個体群中のすべての細胞は同じ中間状態である。このモデルクラスにおいて、細胞の状態は、摂動を与える化合物の濃度関数である。基礎となる生物学における連続細胞反応のこの仮定は、たとえば、成長因子に応じた細胞サイズなどの、いくつかの細胞プロセスに適用可能である。このモデルクラスの使用は、以下の例に記載されている。
【００５４】
細胞反応の基礎となる２状態モデルに基づく好ましいモデルクラスが、いくつかの細胞検定において有用であることがわかった。いくつかの特定のケースで、測定される細胞フィーチャによって、基礎となる連続的に変化する細胞反応に基づくモデルクラス、または基礎となる生物学的プロセスの様々な仮定に基づく別のモデルクラスが、より利用可能な結果を提供するであろうことが予想される。細胞プロセスの複雑さ、多様さ、一般にあまり理解されていない性質のために、モデルクラスの適性は用途依存であろうことが予想される。さらに、生物学的プロセスの任意のモデルで、表現の正確さは好ましくは、実験的に決定された結果との比較によって決定されるべきであることが理解されよう。
【００５５】
ＶＩＩ．試験試料をスコアリングするための反応度スケールの使用
本発明は、既知の摂動への試験個体群の実験的に決定された反応（フィンガープリント）を定量するために反応度スケールを使用する方法を提供する。以下に詳細に記載されるように、実験的に決定された反応は、「最も類似する」補間値を見つけるために、補間された反応と比べられ、最も類似する補間値に対応する反応度は、試験個体群の反応度として報告される。したがって、反応度スケールは、２つの参照個体群フィンガープリントに基づいて、試験個体群フィンガープリント用の定量的反応度スコアを提供する。
【００５６】
フィンガープリントは、多次元フィーチャ空間内の分布であり、試験化合物フィンガープリントは、これらの次元のいずれかまたはすべてにおいて参照フィンガープリントから外れることができるので、試験化合物のフィンガープリントが、補間値のうちの１つと一致することはほとんどありそうにない。この理由で、試験個体群フィンガープリントの補間値との類似度は、フィーチャ空間内の分布のために定義された距離メトリックを用いて測られる。フィンガープリントと補間値の間の距離の適切なメトリックが与えられると、反応度スケール内の最も類似する補間値は、反応度スケール中の試験フィンガープリントと補間値の間の距離を最小化する補間値を決定することによって取得される。
【００５７】
Ａ．分布のための距離メトリック
フィーチャベクトルの多次元分布間の距離を測定するのに適したいくつかのメトリックが、文献中で知られている。たとえば、多次元フィーチャ空間内の分布として特徴付けられる画像の間の距離を測定するためのコンピュータ画像用途で提案された距離メトリックスであって、本発明において有用となり得る距離メトリックとしては、ミンコフスキー形距離、ヒストグラムインタセクション、および加重平均分散などのヒューリステック測度、コルモゴロフ−スミルノフ距離、クラーメル／ミーゼス（２乗ユークリッド距離）、およびχ２統計などのノンパラメトリック試験統計、カルバック−ライブラー発散およびジェフリー発散などの情報理論発散、ならびに２次形式およびアースムーバ距離などの地上距離測度を含む（たとえば、非特許文献４および非特許文献５参照。いずれも、参照により本明細書に組み込む）。
【００５８】
好ましい一実施形態において、２つのフィンガープリントの間（またはフィンガープリントと補間値の間）の距離は、コルモゴロフ−スミルノフ統計に基づいている。２つの１次元分布（またはヒストグラム）の間のコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離は、累積分布関数（またはヒストグラム）の間の最大の相違である。したがって、２つの累積分布関数Ｆ１およびＦ２の間のＫＳ距離Ｄは、
【００５９】
【数１】
2007526454.tif 000002
【００６０】
によって定義される。
同様に、２つの連続確率密度関数ｆ１およびｆ２の間のＫＳ距離は、
【００６１】
【数２】
2007526454.tif 000003
【００６２】
によって定義される。
コルモゴロフ−スミルノフ距離は、ビンニングされていない(unbinned)分布の尺度であり、したがって、それにより、ビン単位(bin-by-bin)ベースでヒストグラムを比較する距離メトリックを使用すると遭遇するデータビンニングの問題が回避される。
【００６３】
コルモゴロフ−スミルノフ統計は、１次元についてのみ定義される。２つの個体群の多次元フィンガープリントの間の距離を測定するために、各フィーチャに別々に２つの個体群の間の距離を測定するためにＫＳ距離を使用し、フィンガープリントの間のＫＳ距離は、フィーチャからのＫＳ距離の最大として定義される。したがって、フィンガープリントのためにここで定義されるＫＳ距離は、個々のフィーチャのＫＳ距離の最大値である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、フィンガープリントは、フィーチャ空間内の点の組を表すオブジェクトフィーチャベクトルの組として格納され、累積フィーチャ分布またはヒストグラムは、距離が測定される時にデータから計算される。一般に、フィーチャ値の累積ヒストグラムは、フィンガープリント全体に含まれるデータを使用して取得される。しかし、特に大きな個体群の間の距離を推定するのに必要とされる演算を低減するために、ＫＳ距離は、フィンガープリントからのフィーチャ値データのランダムサンプリングを使用して、推定することができる。
【００６５】
Ｂ．試験化合物のスコアリング
既知のレベルの摂動を受ける試験個体群の実験的に決定された反応を定量するために、反応度スケール中の試験フィンガープリントと補間値の間の距離を最小化する補間値が決定され、最も近い補間値の反応度は、反応度スケールに沿った試験フィンガープリントの反応度として報告される。最小距離補間値は、以下に要約し、例の中でより詳細に説明するように、多くの方法で決定することができる。
【００６６】
一実施形態において、適切な数の補間値がモデルから生成され、システム可読メモリに格納される。最小の距離補間値を見つけるために、試験フィンガープリントから各補間値までの距離は、選択された距離メトリック、好ましくはＫＳ距離を使用して測定される。
【００６７】
好ましい実施形態では、補間値は、実際に生成され記憶されず、補間値および端点フィンガープリントの基礎となるモデルを使用して、最も近い補間値がアルゴリズム的に識別される。上述の２つの補間値モデルの下で、最も近い補間値を決定するアルゴリズムについて、例の中で説明する。
【００６８】
好ましい一実施形態では、試験試料の複数の反復が検定され、各反復ごとに別々に反応度が測定され、また平均反応および反応の標準誤差が報告される。
【００６９】
ＶＩＩＩ．用量反応曲線
用量反応曲線は、反応度スケールを使用して、それぞれが化合物の異なる濃度にさらされる一連の試験個体群の反応を定量することによって、実験的に推定される。用量反応曲線からのこの一連の点をプロットして、試験化合物に対する標準２次元用量反応図を提供することができ、実験的に決定された点を曲線に適合して、用量反応曲線を得ることができる。多次元反応のために定義された用量反応曲線は、標準の単一パラメータの用量反応曲線に類似した方法で使用することができる。特に、ＥＣ５０は、ベースライン反応と最大反応の中間で反応を引き起こす摂動レベルを表し、標準的方法を使用して用量反応曲線から取得できる。
【００７０】
実験例
以下の例は、本発明をどのように実施し使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するように提示し、本発明者らが自らの発明であると見なすものの範囲を制限するものではない。例は、細胞検定の本発明への適用について述べている。しかし、以下の例に記述された特定の用途、方法、計測器、およびシステムは例示的なものであり、制限と見なすべきではない。
【００７１】
以下の例は、本発明の実施形態の数学的記述を含む。この方法の実装形態は典型的に、プログラム可能なコンピュータに関するものであろうことが理解されよう。数学的アルゴリズムのプログラミングは当技術分野でよく知られており、そのようなプログラムを書くためのツール、そのようなプログラミング言語、および数学的関数のライブラリは、多くの供給元から商業的に利用可能である。当業者には、一般に使用されるいくつかのプログラミング言語のいずれを使用して、ここに含まれている数学的記述を適切な命令のセットに、変換することが可能であろう。
【００７２】
実験例１
再サンプリングによって反応度スケールを生成
この例は、再サンプリングによって低反応および高反応の参照試料から生成された反応度スケールを使用して、試験試料をスコアリングするための方法について説明する。
【００７３】
ここで使用される中間フィンガープリントのモデルは、細胞反応の基礎となる２状態モデルに基づいている。より具体的には、それぞれｆ０およびｆ１で指定される、反応なし（反応度スケール上で０）およびフル反応（反応度スケール上で１）の分布と、ｆαで指定される、αに等しい中間反応を表す個体群の分布とが与えられた場合、中間反応個体群の分布は、ｆα（ｘ）＝αｆ１（ｘ）＋（１−α）ｆ０（ｘ）となる。
【００７４】
中間反応αを有する個体群の分布は、密度の高い個体群のフィンガープリントから交替で無作為に選ばれたフィーチャベクトルの一部分αと、密度の低い個体群のフィンガープリントから交替で無作為に選ばれたフィーチャベクトルの一部分（１−α）とを含む、仮想個体群を生成することによって推定される。好ましくは、再サンプリングされた中間個体群の合計サイズ（すなわち、フィーチャベクトルの合計数）が、参照個体群のサイズとなるように選ばれる。参照個体群のサイズが等しくない場合、より大きな参照個体群からのフィーチャベクトルのサブセットを、等しいサイズの参照個体群を提供するために、選ぶことができる。αのＮ個以下の離散の等間隔値に対して、補間分布が生成され、ここでＮは、再サンプリングされた個体群の試料サイズである。
【００７５】
試験フィンガープリントに最も近い補間は、各補間への距離が測定され、最小のものが選択されるプルートフォース方法によって、決定することができる。好ましくは、最も近い補間値は、標準二分法など、より効率的なアルゴリズムを使用して決定される。
【００７６】
一実施形態において、そのようにして生成された補間値個体群は、１つまたは複数の試験試料フィンガープリントとの比較に使用するために格納される。このケースでは、記憶要件が高くなり得るが、再サンプリング処理は、αの各レベルに１回だけ実行する必要がある。あるいは、試験個体群までの距離が測定されるごとに、補間個体群を生成し、一時メモリに記憶することができる。これは、メモリ要件を最小限に抑えるために、特に二分法で使用するときに望ましいことがあり、この場合、補間のサブセットだけが典型的に、最も近いものを探すために、試験フィンガープリントと比較される必要がある。
【００７７】
実験例２
「低」反応および「高」反応のヒストグラムからの直接スコアリング
この例は、低反応および高反応の参照試料から試験画像を直接スコアリングするためのアルゴリズムを説明する。
【００７８】
ここで使用される中間フィンガープリントのモデルは、細胞反応の基礎となる２状態モデルに基づいている。より具体的には、それぞれｆ０およびｆ１で指定する反応なし（反応度スケール上で０）およびフル反応（反応度スケール上で１）の分布と、ｆαで指定するαに等しい中間反応を表す個体群の分布とが与えられた場合、中間反応個体群の分布は、ｆα（ｘ）＝αｆ１（ｘ）＋（１−α）ｆ０（ｘ）となる。
【００７９】
ここでのアルゴリズムは、基礎となる分布の離散値の近似を表す試料フィンガープリントからのフィーチャヒストグラムに関して説明することにする。便宜上、試料のフィンガープリントは、試料のオブジェクトフィンガープリントの組であり、記述子値の２次元配列、すなわち、各列がオブジェクトのうちの１つに対するフィーチャベクトルである配列として表される、と仮定する。したがって、たとえば、フィンガープリントは、データ｛ｘｉｊ｝の組として表され、その場合、ｘｉｊは、ｉ番目のオブジェクトから測定されるｊ番目の記述子の値である。反応なしおよびフル反応の参照個体群（低密度の分布および高密度の分布と呼ぶ）からの試料を混合する代わりに、例１の方法のように、本アルゴリズムでは、累積分布（ヒストグラム）を混合する。
【００８０】
｛ｘｉｊ｝、｛ｙｉｊ｝、｛ｚｉｊ｝は、２つの参照画像および試験画像からのデータを表し、｛ｘｉｊ｝は低密度からのデータを表し、｛ｙｉｊ｝は高密度からのデータを表し、｛ｚｉｊ｝は試験画像からのデータを表すとする。
【００８１】
ｊを固定し、ｓｊを、Ｓ＝｛ｘｉｊ｝∪｛ｙｉｊ｝∪｛ｚｉｊ｝の元とする、すなわち、ｓｊは、ｊ番目の統計量の可能な値のうちの１つである。Ｓがソートされると仮定して、各フィーチャの累積ヒストグラムを、
【００８２】
【数３】
2007526454.tif 000004
【００８３】
【数４】
2007526454.tif 000005
【００８４】
と定義する。
【００８５】
ただし、｜・・・｜は、その組のガーディアリティを表し、Ｎ、Ｍ、およびＬは、それぞれの試料中の細胞の合計数である。
【００８６】
試験画像分布Ｈとα補間値分布の間のＫＳ距離は、
【００８７】
【数５】
2007526454.tif 000006
【００８８】
ただし、
ｕ（ｓj）＝Ｈ（ｓj）−Ｇ（ｓj）
ｖ（ｓj）＝Ｆ（ｓj）−Ｇ（ｓj）
となるように定義される。
試験画像から最も近い補間値までの所望の距離は、
【００８９】
【数６】
2007526454.tif 000007
【００９０】
である。
【００９１】
最小のαおよびα補間値を見つける方法
以下の方法において、任意の試験分布とα補間値分布の間の距離Ｄ（α）は、上述のＫＳ距離を使用して、参照フィンガープリントおよび試験フィンガープリントから計算される。
【００９２】
ａ．二分
一実施形態において、最小となる位置および値を、標準二分法を使用して決定することができる。
【００９３】
あるいは、αが離散中間値の有限の組だけをとり、距離Ｄ（α）が、これらの離散間隔でのみ評価されると仮定することによって、反応度スケールは、α補間値の有限のサブセットで近似される。この近似は、二分法アルゴリズムを使用して最小距離を見つけるのに必要とされる計算量を、著しく低減することができる。
【００９４】
ｂ．線形プログラミング
別の実施形態において、最小距離は、線形プログラミングを使用して取得される。
【００９５】
上記に概説した、最も近い補間値を見つける問題は、次のタイプの一般的な問題に帰する。
【００９６】
【数７】
2007526454.tif 000008
【００９７】
ただし、（ｕk，ｖk）のペアは、有限の組に由来する。
この問題は、以下のように線形プログラミングにおける問題として提示し、解決することができる。解Ｄが値α＝α０で得られる場合、すべてのｋに対して次式が成り立つことに留意されたい。  
Ｄ≧｜ｕｋ−α０ｖｋ｜
したがって、（Ｄ，α０）は、次のＬＰ問題に対する解である。  
ｍｉｎＹ（ｙ，α）  ここで以下を条件として、Ｙ（ｙ，α）＝ｙ  
ｙ−ｕｋ＋ｖｋα≧０
ｙ＋ｕｋ−ｖｋα≧０
α≦１
α≧０
特に、（ｕｋ，ｖｋ）ペアがその組の中にあるときはいつでも（−ｕｋ，−ｖｋ）ペアをその組に含めるならば、この問題を次のように書ける。  
ｍｉｎ  Ｙ（ｙ，α）  ただし、Ｙ（ｙ，α）＝ｙ  によって、
ｙ−ｕｋ＋ｖｋα≧０
α≦１
α≧０
下記のシンプレックス法の一種を使用して、この問題を解決することができる。
【００９８】
アルゴリズム
水平軸αおよび垂直軸ｙをもつ２次元の制約領域について考える。この凸領域は、α＝０およびα＝１での垂直線によって境界づけられ、ｙ＝−ｖｋα＋ｕｋのすべての線より上にある。α＝０およびｙ＝ｍａｘ ｕｋにおける制約境界線で開始することにする。この最大値を提供する制約を（ｕ０，ｖ０）と呼ぶと仮定する。α＝０およびｙ＝ｕ０を通る２以上の制約が存在する場合、最小のｖをもつ、それ故に最大の傾きをもつ制約を選ぶ。α＝α０で別の（ｕ，ｖ）に出会うまで、制約（ｕ０，ｖ０）に従う。次に、それらの制約は、α＝α０の前に制約（ｕ，ｖ）に出会わなければならないので、ｕｊ＞ｕであるすべての制約（ｕｊ，ｖｊ）を取り除く。この新しい制約を（ｕ１，ｖ１）と呼ぶと仮定する。α＝１で境界線に当たるか、あるいはＹ（ｙ，α）が増加し始めるまで、残りの制約と共にこの手順を繰り返す。
【００９９】
より具体的には、どの制約が最初に制約（ｕ０，ｖ０）に出会うかを決定するための方法を与える。状況を分析するために、制約（ｕ１，ｖ１）および制約（ｕ０，ｖ０）の交差を求める。これらの２つの制約がα＝α０＞０で出会うとき、
【０１００】
【数８】
2007526454.tif 000009
【０１０１】
となり、（ｕ１，ｖ１）は、この最小値を実現する（ｕ，ｖ）のペアである。  
特に、ｕ０＞ｕ１であるので、ｖ０＞ｖ１を有しなければならない。ｕ０＞ｕかつｖ０＞ｖを満たす任意のその他の制約（ｕ，ｖ）が与えられた場合、
【０１０２】
【数９】
2007526454.tif 000010
【０１０３】
または
【０１０４】
【数１０】
2007526454.tif 000011
【０１０５】
である。
【０１０６】
【数１１】
2007526454.tif 000012
【０１０７】
と書くならば、ｕ０＞ｕかつｖ０＞ｖの場合に限り、求めるペアは、残りの制約の間のあらゆる
【０１０８】
【数１２】
2007526454.tif 000013
【０１０９】
に対してこの行列不等式を満たす唯１つのペアである。
【０１１０】
実験例３
低反応および高反応の分布からの直接スコアリング
この例において、確率密度関数を使用して、既知の高低ウェルの対から未知のウェルをスコアリングする方法を分析する。補間値分布のモデルは、上記の例１および２に記載されているものである。各フィーチャに行われる測定は、連続確率分布をからくると仮定する。スコアリングの基礎となる方法は、未知の試験試料（ウェルとも呼ぶ）から高低の参照試料（ウェル）の間の最も近い補間値までのコルモゴロフ−スミルノフ（ＫＳ）距離を計算する。２つのウェルの間の距離は、各フィーチャからの距離の最大の距離である。臨界フィーチャは、この最大距離を実現するフィーチャである。
【０１１１】
フィーチャが与えられた場合、ρ、ρＡ、ρＢを、そのフィーチャに対する未知の分布、低い分布、高い分布の確率密度関数とする。以下の事実を規定する。
【０１１２】
事実１
各フィーチャと関連して、未知のウェルとは独立していて、高低のウェルにのみ依存する、フィーチャｃに対する（場合によっては一意でない）臨界値が存在する。この臨界値は、ｃ未満の観測の見込みが高低ウェルと同じである特性によって決定される。これは次式によって表される。
【０１１３】
【数１３】
2007526454.tif 000014
【０１１４】
事実２
１つのフィーチャだけの場合、試験ウェルから高低のウェルの間の最も近い補間値までの距離Ｄは、試験ウェルの確率密度関数（「ｐ．ｄ．ｆ」）、低いウェルのｐ．ｄ．ｆ．、およびフィーチャの臨界値を使用してのみ、計算することができる。その距離は、試験ウェル中の観測値がｃ未満である可能性と、ローのウェル中の観測値がｃ未満である可能性との絶対差である。これは次式によって表される。
【０１１５】
【数１４】
2007526454.tif 000015
【０１１６】
事実３
１つのフィーチャだけの場合、試験ウェルまで最も近い補間値（反応）は、フィーチャの臨界値において各ウェルのｐ．ｄ．ｆの値から計算することができる。その値は、次の比によって与えられる。
【０１１７】
【数１５】
2007526454.tif 000016
【０１１８】
計算された反応は、０から１の間隔内に入らない可能性があり、その制約を解に課したいことがある。その場合では、その距離は、試験ウェルから高低のウェルまでのＫＳ距離のうちの最小の距離である。
【０１１９】
事実４
２つ以上のフィーチャの場合、臨界フィーチャは一意ではない。試験ウェルに最も近い補間値は、２つの臨界フィーチャの関数であり、いずれの臨界値でも存在しないことがある。
【０１２０】
事実５
試験ウェルとα補間分布の間の距離Ｄ（α）は、αの凸関数であるが、その最小において微分可能ではないことがある。
【０１２１】
ａ）２つのスカラー分布の間のＫＳ距離
本明細書中の確率分布は、連続的であると仮定する。２つの確率分布ρとρＡの間のＫＳ距離は、次式で定義される。
【０１２２】
【数１６】
2007526454.tif 000017
【０１２３】
ここで、
【０１２４】
【数１７】
2007526454.tif 000018
【０１２５】
および、
Ｆ（ｙ）＝｜Ｇ（ｙ）｜
とした場合、次の表記が得られる。
【０１２６】
【数１８】
2007526454.tif 000019
【０１２７】
最大値は、次式によって与えられる極値で生じる。
【０１２８】
【数１９】
2007526454.tif 000020
【０１２９】
ただし、ｓｇｎは、引数の符号によって、＋１または−１を返す関数として定義する。ρおよびρＡが等しくない場合、最大値はゼロより大きく、また最大値は次式を満たすｙの値で生じなければならない。 
ρ（ｙ）＝ρＡ（ｙ）
Ｆ（ｙ）がその最大値をとるｙの値を、臨界値と呼ぶ。
【０１３０】
ｂ）分布の２つのベクトルの間のＫＳ距離
分布｛ρｊ｝および｛（ρＡ）ｊ｝の２つのベクトルの間の距離を、次式で定義する。
【０１３１】
【数２０】
2007526454.tif 000021
【０１３２】
ただし、
【０１３３】
【数２１】
2007526454.tif 000022
【０１３４】
および
Ｆｊ（ｙ）＝｜Ｇｊ（ｙ）｜
である。
この距離は、分布の２つのベクトルの間の相違を測るものであり、対応するフィーチャの間の最大の差に依存する。
【０１３５】
最大値は、個々のフィーチャのうちの１つの最大で生じるので、最大値は、極値のうちの１つで生じなければならない。最大値を実現するフィーチャを、臨界フィーチャと呼ぶ。前記のように、分布のベクトルが等しくない場合、最大値は、次式が成り立つｙの値で生じなければならない。 
ρｊ（ｙ）＝（ρＡ）ｊ（ｙ）
最大値は、臨界フィーチャの臨界値で生じる。
【０１３６】
ｃ）最も近い補間値までの距離
フィーチャが与えられた場合、ρ、ρＡ、ρＢを、そのフィーチャに対する未知の分布、高低の分布の確率密度関数とする。スコアリングの方法は、未知のウェルから高低のウェルの間の最も近い補間値までのＫＳ距離を計算する。ρＡとρＢの間のα補間分布は、次式で定義される。 
ρα（ｘ）＝αρＢ（ｘ）＋（１−α）ρＡ（ｘ）
補間値は、（この間隔の外側では負の値をとるので）０から１の間隔内のαに対して正規のｐ．ｄ．ｆ．のみであるが、この式は、その間隔の外側でもまだ有効である。α補間分布までの距離は、次式で定義される。
【０１３７】
【数２２】
2007526454.tif 000023
【０１３８】
ここで、
【０１３９】
【数２３】
2007526454.tif 000024
【０１４０】
および
Ｆ（α，ｙ）＝｜Ｇ（α，ｙ）｜
とすると、次式が書ける。
【０１４１】
【数２４】
2007526454.tif 000025
【０１４２】
未知のウェルから高低のウェルの間の最も近い補間値までのＫＳ距離は、次に次式によって得られる。
【０１４３】
【数２５】
2007526454.tif 000026
【０１４４】
次の関数の鞍点（αにおいて最小かつｙにおいて最大）を見つけたい。 
Ｆ（α，ｙ）＝｜Ｇ（α，ｙ）｜
鞍点は、極値で生じる。１つの可能性のある極値は、以下で存在する。
【０１４５】
【数２６】
2007526454.tif 000027
【０１４６】
これは、Ｄ＝０かつ試験ウェルが補間値のうちの１つと等しい分布を有する場合にのみ生じる。さしあたり、そのケースではなく、求める極値は絶対値関数の０から離れていると仮定する。これにより、Ｆの次の２つの偏導関数の０を調べることができる。
【０１４７】
【数２７】
2007526454.tif 000028
【０１４８】
したがって、（αｃ，ｃ）がそれら２つの式に対する解であるとき、次の極値条件が生じる。
【０１４９】
【数２８】
2007526454.tif 000029
【０１５０】
および
【０１５１】
【数２９】
2007526454.tif 000030
【０１５２】
ただし、ρＢ（ｃ）−ρＡ（ｃ）≠０と仮定する。ρＢ（ｃ）−ρＡ（ｃ）＝０の場合、ρ（ｃ）−ρＡ（ｃ）＝０を有する必要もあり、３つの密度はすべて、ｃで等しくなる。このケースでは、あらゆるαが解であり、試験ウェルがすべての補間値から同じ距離で、決定的な反応はない。
【０１５３】
極値条件が満たされるとき、αの係数はＤに対する式から外れ、次式が成り立つことに留意されたい。
【０１５４】
【数３０】
2007526454.tif 000031
【０１５５】
試験ウェルが補間値のうちの１つと等しい分布を有する特別なケースでは、臨界値だけでなくすべてのｘに対して、次式が成り立つ。 
ρ（ｘ）−ρＡ（ｘ）−α０（ρＢ（ｘ）−ρＡ（ｘ））＝０
確かにこのとき、２つの極値式は、やはり臨界値ｃを定義する。
【０１５６】
極値は、最小値で生じるものもあれば、最大値で生じるものもある。未知の分布に最も近い補間値までの距離は、最大値である極値、低い分布までの距離、および高い分布までの距離の間の最小の距離である。
【０１５７】
高低のウェルの固定されたペアをもつ１組の未知のウェルをスコアリングするのに単一のフィーチャを使用する妥当な手法は、まず高低のウェルのみを使用して、各フィーチャの臨界値を計算する。これらの臨界値が与えられると、所与の未知のウェルの分布を使用して、どの臨界値が最大値に対応し、どの臨界値が最小値に対応するかを決定することができる。高低のウェルによってのみ可能な位置が決まるにもかかわらず、この決定は、未知のウェルの分布に大きく依存する。
【０１５８】
関数Ｄ（α）は、その最小においては微分可能ではないことがあることに留意されたい。
【０１５９】
ｄ）距離の凸性
関数Ｄ（α）は、αの凸関数である。この理由は、以下のとおりである。ここで、
【０１６０】
【数３１】
2007526454.tif 000032
【０１６１】
および
【０１６２】
【数３２】
2007526454.tif 000033
【０１６３】
とする。
あらゆるαおよびｙに対してＤ≧｜ｕ（ｙ）−αｖ（ｙ）｜である、（Ｄ，α）の組を考える。固定のｙで、これはＤ−α平面内の２つの半空間の共通部分である。すべてのｙで、組は、これらの半空間のすべての対の共通部分であり、したがって凸である。関数Ｄ（α）は、この凸の組の境界曲線である。最小値は、ｖ（ｙ）＝０のとき、あるいはα＝０またはα＝１のいずれかで生じることを示した。
【０１６４】
ｅ）複数のフィーチャ
２つ以上のフィーチャの場合、距離は、次式のように定義される。
【０１６５】
【数３３】
2007526454.tif 000034
【０１６６】
ただし、整数ｊは、フィーチャ索引を示している。次式が成り立つとする。
【０１６７】
【数３４】
2007526454.tif 000035
【０１６８】
Ｄ（α）はαの凸関数であるが、フィーチャのうちの１つの極値で最小が生じる可能性は低いことを示すことにする。実際、最小は一般に、少なくとも２つのフィーチャと関連している。
前記と同様に、
【０１６９】
【数３５】
2007526454.tif 000036
【０１７０】
および
【０１７１】
【数３６】
2007526454.tif 000037
【０１７２】
とする。
あらゆるαおよびｙについてＤ≧｜ｕｊ（ｙ）−αｖｊ（ｙ）｜である、（Ｄ，α）の組を考える。この組は、半空間の共通部分であり、したがって凸である。
ここで、
Ｇｊ（α，ｙ）＝ｕｊ（ｙ）−αｖｊ（ｙ）
および
Ｆｊ（α，ｙ）＝｜Ｇｊ（α，ｙ）｜
とすると、
【０１７３】
【数３７】
2007526454.tif 000038
【０１７４】
および
【０１７５】
【数３８】
2007526454.tif 000039
【０１７６】
と書ける。
連続凸曲線Ｄ（α）は、個々のＤｊ（α）から得られる有限的に多くの断片からなる。それは凸なので、最小は、その断片のうちの１つの最小部分で、または２つの断片の共通部分で生じなければならない。第１のケースで、最小と関連した１つの臨界フィーチャが存在し、第２のケースで２つが存在する。臨界フィーチャは、最も近い補間値を決定するのに必要な唯一のフィーチャである。
【０１７７】
ｆ）最も近い補間値までのＫＳ距離を計算すること
次式の数値的近似を見つけるためのアルゴリズムを発明した。
【０１７８】
【数３９】
2007526454.tif 000040
【０１７９】
単一のフィーチャに関して、このアルゴリズムを説明することにするが、任意の数のフィーチャに対しても同様に働く。ρＡ、ρＢ、およびρに対応して、次式によって決定される値｛ｘｊ｝、｛ｙｊ｝、および｛ｚｊ｝の３組を生成する。
【０１８０】
【数４０】
2007526454.tif 000041
【０１８１】
ｓｋを、Ｓ＝｛ｘｊ｝∪｛ｙｊ｝∪｛ｚｊ｝の要素とする。ここで、
【０１８２】
【数４１】
2007526454.tif 000042
【０１８３】
Ｇｋ（α）＝ｕｋ−αｖｋ
Ｆｋ（α）＝｜Ｇｋ（α）｜
とする。
【０１８４】
方法
次式でＤを近似する。
【０１８５】
【数４２】
2007526454.tif 000043
【０１８６】
ｉ．線形プログラミングを使用すること
上記で概説した方法は、次のタイプの一般的な問題を解決する。
【０１８７】
【数４３】
2007526454.tif 000044
【０１８８】
ただし、（ｕｋ，ｖｋ）の対は、有限の組からくる。
【０１８９】
このプログラムは、以下の線形プログラミングにおける問題として述べ、解決することができる。解Ｄが値α＝α０で得られるならば、次式が成り立つことに留意されたい。 
あらゆるｋについて、  Ｄ≧｜ｕｋ−α０ｖｋ｜
したがって（Ｄ，α０）は、次式のＬＰ問題に対する解である。 
ｍｉｎ  Ｙ（ｙ，α）
ただし、
ｙ−ｕｋ＋ｖｋα≧０
ｙ＋ｕｋ−ｖｋα≧０
α≦１
α≧０
を条件として、
Ｙ（ｙ，α）＝ｙ
である。
特に、（ｕｋ，ｖｋ）のペアがその組にある場合はいつでも、（−ｕｋ，−ｖｋ）のペアをその組に含めるならば、この問題を次のように書き表すことができる。 
ｍｉｎ  Ｙ（ｙ，α）
ただし、
ｙ−ｕｋ＋ｖｋα≧０
α≦１
α≧０
を条件として、
Ｙ（ｙ，α）＝ｙ
である。
一種のシンプレックス法を使用して、この問題を解くことができる。
【０１９０】
ｉｉ．アルゴリズム
水平軸αおよび垂直軸ｙをもつ２次元の制約領域について考える。この凸領域は、α＝０およびα＝１において垂直線が境界となり、ｙ＝−ｖｋα＋ｕｋのすべての線より上にある。α＝０およびｙ＝ｍａｘ ｕｋでの制約境界上で開始することになる。この最大値をもたらす制約を（ｕ０，ｖ０）と呼ぶと仮定する。α＝０およびｙ＝ｕ０を通る２つ以上の制約が存在する場合、最小のｖをもつ、したがって最大の傾きをもつ制約を選ぶ。α＝α０で別の（ｕ，ｖ）に出会うまで、制約（ｕ０，ｖ０）に従う。次に、ｕｊ＞ｕであるすべての制約（ｕｊ，ｖｊ）を取り除く。それらの制約は、α＝α０の前に制約（ｕ，ｖ）に出会わなければならないからである。この新しい制約を（ｕ１，ｖ１）と呼ぶと仮定する。α＝１で境界に当たるか、あるいはＹ（ｙ，α）が増加し始めるまで、残りの制約でこの手順を繰り返す。
【０１９１】
より具体的には、どの制約が最初に制約（ｕ０，ｖ０）に出会うかを決定するための方法を与える。状況を分析するために、制約（ｕ１，ｖ１）および制約（ｕ０，ｖ０）の交差について解く。これらの２つの制約がα＝α０＞０で出会うとき、
【０１９２】
【数４４】
2007526454.tif 000045
【０１９３】
となり、（ｕ１，ｖ１）はこの最小値を実現する（ｕ，ｖ）の対である。
特に、ｕ０＞ｕ１であるので、ｖ０＞ｖ１を有しなければならない。ｕ０＞ｕおよびｖ０＞ｖを満たす任意のその他の制約（ｕ，ｖ）が与えられた場合、
【０１９４】
【数４５】
2007526454.tif 000046
【０１９５】
が成り立つ。
ここで、
【０１９６】
【数４６】
2007526454.tif 000047
【０１９７】
とする。
ｕ０＞ｕかつｖ０＞ｖの場合にのみ
【０１９８】
【数４７】
2007526454.tif 000048
【０１９９】
と書くならば、求める対は、残りの制約のうちのあらゆる
【０２００】
【数４８】
2007526454.tif 000049
【０２０１】
に対してこの比不等式を満たす唯１つの対である。
【０２０２】
ｉｉｉ．アルゴリズムの正確さ
【０２０３】
【数４９】
2007526454.tif 000050
【０２０４】
【数５０】
2007526454.tif 000051
【０２０５】
であると仮定する。
ｓｉ≦ｙ≦ｓｉ＋１であると仮定する。 
ρα（ｘ）＝αρＢ＋（１−α）ρＡ（ｘ）
とする。
すると、以下が成り立つ。
【０２０６】
【数５１】
2007526454.tif 000052
【０２０７】
ただし、
ｎ＝ｍｉｎ（Ｌ，Ｍ，Ｎ）
である。
したがって、次式が成り立つ。
【０２０８】
【数５２】
2007526454.tif 000053
【０２０９】
さらに、次式が成り立つ。
【０２１０】
すべてのαについて、
【０２１１】
【数５３】
2007526454.tif 000054
【０２１２】
これにより以下の定理が得られる。
【０２１３】
定理１
あらゆるαについて、
【０２１４】
【数５４】
2007526454.tif 000055
【０２１５】
が成り立つ。
この式中でαにβを置き換えた場合、次の系が得られる。
【０２１６】
系１
【０２１７】
【数５５】
2007526454.tif 000056
【０２１８】
さらに、次の系を示すことができる。
【０２１９】
系２
任意のαについて、
【０２２０】
【数５６】
2007526454.tif 000057
【０２２１】
である。
【０２２２】
証明
【０２２３】
【数５７】
2007526454.tif 000058
【０２２４】
明らかに、以下が成り立つ。
【０２２５】
【数５８】
2007526454.tif 000059
【０２２６】
【数５９】
2007526454.tif 000060
【０２２７】
これらの不等式をすべて組み合わせると、次の系が成り立つ。
【０２２８】
系３
【０２２９】
【数６０】
2007526454.tif 000061
【０２３０】
最後に、打切り点ｎの数の関数として、βとαｃの間に誤差を制約したい。αｃにおけるＤ（α）の導関数は、存在することも、存在しないこともある。βとαｃの間の曲線に沿った導関数がいくつか存在すると仮定した場合、導関数がαｃにおいて存在しなくても、誤差のいくらかの推定値を得ることができる。誤差に対する制約は、βとαｃの間およびαｃの近くで、曲線がどの程度、平らであるかに依存する。曲線が平らである程、生じる可能性のある誤差は大きくなる。
【０２３１】
定理２
ｐを正の偶数整数（普通は、ｐ＝２を予想する）とする。Ｄ（α）がβからαｃの開区間内にｐ個の連続導関数を有し、かつαがβからαｃに近付くときのＤ’（α）の限界がＴであると仮定する。さらに、１＜ｊ＜ρであるすべての導関数Ｄ［ｊ］（α）は、αがβからαｃに近付くときに０極限を有し、かつＤ［ｐ］（α）は、βとαｃの間のどこででも何らかの正の値ｐ！Ｍより大きいと仮定する。（Ｄ（α）の凸であることの証明を保証するために、奇数導関数が０となることが望ましい。）したがって、以下が成り立つ。
【０２３２】
【数６１】
2007526454.tif 000062
【０２３３】
証明
βとαｃの間にテイラーの定理を適用する。これにより、次式が得られる。
【０２３４】
【数６２】
2007526454.tif 000063
【０２３５】
αｃは、最小に位置し、Ｄ（α）は凸であるので、Ｄ’（αｃ）およびβ−αｃは反対の符号を有することはできない。この式の右手側の２つの正の項はそれぞれ、１／ｎより大きくなり得ず、結果は容易に得られる。
【０２３６】
Ｇ）試料分布から反応を推定すること
３つの分布、ρＡ、ρＢおよびρから試料｛ｘｉｊ｝、｛ｙｉｊ｝、｛ｚｉｊ｝が与えられたと仮定する。反応αｃおよび距離Ｄを推定したい。ｊを固定し、ｓｊをＳ＝｛ｘｉｊ｝∪｛ｙｉｊ｝∪｛ｚｉｊ｝の要素とする。すなわち、ｓｊは、ｊ番目の統計の可能な値のうちの１つである。Ｓはソートされていると仮定する。以下のように定義する。
【０２３７】
【数６３】
2007526454.tif 000064
【０２３８】
【数６４】
2007526454.tif 000065
【０２３９】
前記のように、線形プログラミングを使用して、次式を計算する。
【０２４０】
【数６５】
2007526454.tif 000066
【０２４１】
ただし、
【０２４２】
【数６６】
2007526454.tif 000067
【０２４３】
【数６７】
2007526454.tif 000068
【０２４４】
である。
【０２４５】
実験例４
複数の負の参照試料
検定によっては、負の制御個体群の２以上のタイプを制御することが望ましい。たとえば、生物活性化合物が緩衝液中の試料に適用される場合、化合物が何もなしで、緩衝溶液単独によって生じる何らかの反応を測定するのが望ましいことがある。その結果、２つの制御個体群を有することになり、一方は何も処理を受けず、もう一方は緩衝液単独での処理を受ける。未処理の負数に関係する合計反応から単に緩衝による反応を分け、したがって、化合物単独の影響を決定することができることが望ましい。この例により、摂動単独による反応を決定する方法が得られる。
【０２４６】
２以上の負数を扱うために、相補的反応β＝（１−α）を扱うのがより容易である。ここで、
【０２４７】
【数６８】
2007526454.tif 000069
【０２４８】
およびρｐを、それぞれｉ番目の負の制御および正の反応の個体群の密度関数とし、ρβを、β補間値の密度関数とする。参照反応の１次結合としての補間値のモデル下では、ｉ番目の負の制御および正の反応の個体群から取得されるβ補間値の密度は、次式のようになる。
【０２４９】
【数６９】
2007526454.tif 000070
【０２５０】
ただし、０≦β≦１である。密度ρβは、密度ρｐから、ρｐから
【０２５１】
【数７０】
2007526454.tif 000071
【０２５２】
までのベクトルに沿った道のりの比率βである密度である。
【０２５３】
補間値のモデルを複数の負の制御の場合に拡張して、ρｐから開始するが、ρｐから各密度関数
【０２５４】
【数７１】
2007526454.tif 000072
【０２５５】
までのベクトルの何らかの正の１次結合で終了するベクトルに沿った補間値密度関数を考慮する必要がある。
これらの密度は、次の形を有する。
【０２５６】
【数７２】
2007526454.tif 000073
【０２５７】
である。
これは、次式のように書くことができる。
【０２５８】
【数７３】
2007526454.tif 000074
【０２５９】
ただし、
【０２６０】
【数７４】
2007526454.tif 000075
【０２６１】
である。この場合、反応は、
【０２６２】
【数７５】
2007526454.tif 000076
【０２６３】
である。
【０２６４】
ρを試験（未知）分布として、ρに最も近い分布
【０２６５】
【数７６】
2007526454.tif 000077
【０２６６】
を見つけたい。この問題は、単一の負の場合に類似の方式で解く。次式によって与えられる関連した線形プログラミング問題を解く。
ｍｉｎ  Ｙ（ｙ，β１，β２，．．．，βｍ）
ただし、
【０２６７】
【数７７】
2007526454.tif 000078
【０２６８】
βｊ≧０
ならば、
Ｙ（ｙ，β１，β２，．．．，βｍ）＝ｙ
である。
最も近い補間値に対応する反応度は、
【０２６９】
【数７８】
2007526454.tif 000079
【０２７０】
となる。
【０２７１】
実験例５
反復個体群
いくつかの実施形態で、所与の摂動レベルでの複数の試料が分析される。その結果、複数の参照フィンガープリント、複数の試験フィンガープリント、あるいはその両方が得られる。こうした状況において本発明を実施する方法について、以下に述べる。
【０２７２】
ａ．複数の試験フィンガープリント
好適な実施形態において、反応の推定値の統計的特徴付けを可能にするために、試験フィンガープリントの複数の反復が検定される。複数の試験試料フィンガープリントはそれぞれ、反応度スケール上で別々にスコアリングされ、したがって、個体群反応の複数の推定値を得る。標準統計的方法を使用して推定値の分布を分析して、たとえば、反応の平均および標準誤差を得ることができる。
【０２７３】
あるいは、複数の試験試料のそれぞれから取得されるオブジェクトフィーチャデータは、すべての試料からすべてのオブジェクトからのデータを含む単一の試験試料を作成するために、プールされる。プールされた試料のフィンガープリントは、試料サイズがより大きいので、真の試験個体群分布のより正確な推定値を提供するものと予想される。
【０２７４】
ｂ．複数の参照フィンガープリント
好適な実施形態において、真の個体群分布の推定値を向上させるために、１つまたは両方の参照個体群からの複数の反復が検定される。単一の参照個体群の各反復試験試料から取得されたオブジェクトフィーチャデータは、すべての反復からのデータを含む単一の試料を作成するためにプールされる。プールされた試料のフィンガープリントは、試料サイズがより大きいので、真の個体群分布のより正確な推定値を提供すると予想される。
【０２７５】
あるいは、各参照試料反復からのフィンガープリントは、別々に扱う。一方は低反応個体群からサンプリングされ、もう一方は高反応参照個体群からサンプリングされた、参照個体群フィンガープリントの各対から補間値スケールを生成することができる。単一の試験フィンガープリントをスコアリングするために、各スケールにおける最も近い補間値が別々に決定され、最も近い補間値を含む反応スケールを使用して、試験フィンガープリントの反応をスコアリングする。あるいは、必要とされる演算量を低減するために、低反応フィンガープリントおよび高反応フィンガープリントの可能な組合せのサブセットを使用する。
【０２７６】
ｃ．複数の試験フィンガープリントおよび参照フィンガープリント
好適な実施形態において、参照個体群からの反復は、真の個体群分布の推定値を改善するためにプールされる。プール後、反復試験試料は、上述のように扱われる。
【０２７７】
実験例６
細胞の段階的な変化に基づく補間
この例において、各細胞は濃度の増加に反応して連続的に反応し、中間−反応個体群中のすべての細胞は同じ状態にあるという、基礎となる生物学に関する仮定に基づいて、中間反応補間値のモデルクラスの一例について説明する。結果は、低い参照分布から高い参照分布へとフィーチャ分布の段階的な偏移である。
【０２７８】
ここでのモデルを、個体群フィーチャの確率密度関数に関して述べる。このモデルでは、固定された百分率でのフィーチャの値は、低分布から高分布へ、線形的に変化すると仮定する。これは、数学的に以下のように表現することができる。
【０２７９】
ｆおよびｇを、何らかのフィーチャのそれぞれ低分布および高分布の密度関数とする。ｔをある百分位数とし、ｘ１をｔに対応する低分布の値、ｘ２を高分布の値とする。つまり、ｘ１未満であるｆの値の何分の１かと、ｘ２未満であるｇの値の何分の１かとが、ｔとなる。これを数学的に次式のように書く。
【０２８０】
【数７９】
2007526454.tif 000080
【０２８１】
このモデルの仮定は、このフィーチャに対して値ｘ１を有する低密度における細胞が、段階的な変化を受けて、高い値ｘ２を有する細胞となることである。したがって、低から高への道のりの割合αでの中間濃度において、百分位数ｔに関連する値が次式で与えられると仮定する。 
ｘ＝（１−α）ｘ１＋αｘ２
Ｈαをαにおける中間濃度の累積分布とすると、次式が書ける。
【０２８２】
【数８０】
2007526454.tif 000081
【０２８３】
スコアリング
累積分布Ｈをもつ試験分布ｈが与えられた場合、どのＨαが最もよく適合するかを知りたい。以下を見つける必要がある。
【０２８４】
【数８１】
2007526454.tif 000082
【０２８５】
ｔ＝Ｈα（ｘ）で置き換えると、次式のようになる。
【０２８６】
【数８２】
2007526454.tif 000083
【０２８７】
最後に、ｔ＝Ｈ（ｚ）とすると、次式が得られる。
【０２８８】
【数８３】
2007526454.tif 000084
【０２８９】
これは、線形目的関数および非線形制約をもつ数学的プログラミング問題である。ここで、
Ｕ（ｚ，α）＝Ｈ［（１−α）Ｆ−１Ｈ（ｚ）＋αＧ−１Ｈ（ｚ）］−Ｈ（ｚ）
とすると、
【０２９０】
【数８４】
2007526454.tif 000085
【０２９１】
である。ただし、すべてのzに対して、以下が成り立つものとする。 
Ｙ≧Ｕ（ｚ，α）
Ｙ≧−Ｕ（ｚ，α）
である。
【０２９２】
離散的問題
上記で既に行ったように、高低、および試験試薬の分布の試料：｛ｘｉ｝、｛ｙｊ｝、｛ｚｋ｝から、Ｕ（ｚ，α）を推定する。ｓを集合Ｃ＝｛ｘｉ｝∪｛ｙｊ｝∪｛ｚｋ｝中のいずれかの値とし、Ｌ、Ｍ、およびＮを、それぞれ各組の試料の数とする。Ｕ（ｓ，α）を以下のように推定する。ｓより小さい試験分布の試料の割合である、
Ｈ（ｓ）＝｜｛ｚｋ：ｚｋ＜ｓ｝｜／Ｎ
を使用する。ここで、ｘ＝Ｆ−１Ｈ（ｓ）は、試験分布がｓより小さいので、それより小さい低い試料の同じ割合を有する低い試料の値である。同様に、ｙ＝Ｇ−１Ｈ（ｓ）は、試験分布がｓより小さいので、それより小さい高い試料の同じ割合を有する高い試料の値である。最終的に、以下が成り立つ。 
Ｈ［（１−α）Ｆ−１Ｈ（ｓ）＋αＧ−１Ｈ（ｓ）］＝｜｛ｚｋ：ｚｋ＜（１−α）ｘ＋αｙ｝｜／Ｎ
したがって、次の非線形プログラミング問題を解かなければならない。
【０２９３】
【数８５】
2007526454.tif 000086
【０２９４】
ただし、Ｃ中のすべてのｓに対して、以下が成り立つものとする。 
Ｙ≧Ｕ（ｓ，α）
Ｙ≧−Ｕ（ｓ，α）
その制約は、次式の非線形関数となる。 
Ｕ（ｓ，α）＝（｜｛ｚｋ：ｚｋ＜（１−α）ｘ＋αｙ｝｜−｜｛ｚｋ：ｚｋ＜ｓ｝｜）／Ｎ
ここで、ｘおよびｙは、ｓによって決定される固定値である。（１−α）ｘ＋αｙの値はｘで開始し、線形的にｙへと変化するので、Ｕ（ｓ，α）は、ｘがｙより小さいかそれともｙより大きいかに依存する、単調増加関数または単調減少関数である。実際に、Ｕ（ｓ，α）は、試験データの値で飛躍（jumps）をもつ区分的な定数関数である。
この問題は、線形プログラミング問題を解くのに使用したのとほぼ同じ方法を使用して解く。