(57)【要約】本発明は、哺乳類、トリ、植物、もしくはその他の真核生物染色体、または人工もしくは操作された染色体コンストラクト内の、関心対象の異種遺伝子またはその他の遺伝的分子を保有かつ発現することが可能である、標的領域を提供する。関心対象の遺伝子または遺伝的分子は、セントロメアもしくはネオセントロメア領域、またはその機能性派生物、またはその潜在型、合成型もしくはハイブリッド型に相当するか、または直接隣接するもしくは近接する染色体領域で発現される。哺乳類、鳥類、もしくは植物、またはその他の高等真核生物における、プロテオミクス治療のためタンパク質産生などの、遺伝子治療もしくは遺伝的改変またはその他の適用を促進する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類、トリ、植物、またはその他の高等真核生物DNAのセントロメアまたはネオセントロメア(neocentromere)領域に相当するヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を保有する細胞または該細胞を含む生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える、異種核酸分子を含む核酸分子。
【請求項２】
核酸分子がDNAである、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
核酸分子が哺乳類由来である、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
哺乳類がヒトである、請求項3記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
核酸分子が植物由来である、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
核酸分子が鳥類由来である、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
セントロメアまたはネオセントロメア領域がqおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメイン(scaffold domain)を含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
哺乳類、トリ、もしくは植物、またはその他の高等真核生物DNAのセントロメアまたはネオセントロメア領域に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含む人工または操作された染色体であって、該核酸分子は該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を保有する細胞または該細胞を含む生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える異種核酸分子を含む、人工または操作された染色体。
【請求項９】
核酸分子がDNAである、請求項8記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
核酸分子が哺乳類由来である、請求項8または9記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
哺乳類がヒトである、請求項10記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
核酸分子が植物由来である、請求項8または9記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
核酸分子が鳥類由来である、請求項8または9記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
セントロメアまたはネオセントロメア領域が、qおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメインを含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項11記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
真核生物における表現型を改変する方法であって、細胞内で染色体または人工もしくは操作された染色体のセントロメアもしくはネオセントロメア領域内、またはその直接隣接するもしくは近接する領域内に発現されると、該細胞のゲノムまたはプロテオームを改変可能である、遺伝子配列を挿入する段階、および人工または操作された染色体の場合は、人工または操作された染色体を細胞に導入する段階を含む方法。
【請求項１６】
セントロメアまたはネオセントロメア領域がqおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメインを含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項8または14記載の人工または操作された染色体を含む、遺伝的に改変された非ヒト動物または植物。
【請求項１８】
請求項15または16記載の改変表現型を含む、遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項１９】
動物における遺伝子治療の方法であって、細胞内で染色体または人工もしくは操作された染色体のセントロメアもしくはネオセントロメア領域内、またはその直接隣接するもしくは近接する領域内に発現されると、該細胞のゲノムまたはプロテオームを改変可能である遺伝子配列を挿入する段階、および人工または操作された染色体の場合は、人工または操作された染色体を細胞に導入する段階を含む方法。
【請求項２０】
動物が哺乳類である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類がヒトである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
セントロメアまたはネオセントロメア領域が、qおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメインを含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して、哺乳類、鳥類、植物およびその他の高等生物における遺伝子治療またはプロテオミクス治療の分野に関する。より具体的には、本発明は、関心対象の異種遺伝子またはその他の遺伝的分子を保有かつ発現することが可能である、哺乳類、鳥類、植物もしくはその他の真核生物染色体、または人工もしくは操作された染色体コンストラクト内の標的領域を提供する。より具体的には、関心対象の遺伝子または遺伝的分子は、セントロメアもしくはネオセントロメア（neocentromeric）領域、またはそれらの機能性派生物、またはそれらの潜在型、合成型もしくはハイブリッド型に相当するか、または直接隣接するもしくは近接する染色体領域内で発現される。標的領域は、細胞の染色体内、または人工もしくは操作された染色体、もしくはミニ染色体（minichromosome）内にあってもよい。本発明はさらに、哺乳類、鳥類、もしくは植物、またはその他の高等真核生物染色体、あるいは人工または操作された染色体コンストラクト内のセントロメアもしくはネオセントロメア領域、またはそこに直接隣接するもしくは近接する領域にDNAを導入することによる、哺乳類、鳥類、もしくは植物、またはその他の高等真核生物におけるプロテオミクス治療のためタンパク質産生を含む、遺伝子治療もしくは遺伝的改変またはその他の適用を促進する方法を意図する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の記載
本明細書において筆者により参照される刊行物の書誌詳細は明細書の末尾に集められている。
【０００３】
本明細書における任意の先行技術への参照は、その先行技術が任意の国で周知の事実に含まれるとの認識、またはいかなる形の示唆でもなく、そのように解釈されるべきでもない。
【０００４】
組換えDNA技術の急速な巧妙化により、医学分野および関連する保健分野における研究開発が大いに促進されている。特に重要な分野は、ヒトを含む哺乳類の遺伝学および遺伝的異常の背後にある分子機構である。セントロメアの転写能についての完全な理解を欠くこと、およびヒトセントロメアを含むクローン化核酸分子が限定的にしか入手できないことにより、この分野の研究における進展が妨げられている。
【０００５】
セントロメアは有糸細胞分裂および減数細胞分裂の間の姉妹染色分体の接着および適切な染色体分離のために必須の構造である。出芽酵母サッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)のセントロメアは大々的に研究され、78bp〜87bpの高度にATに富んだ中央(CDEII)ドメインで分断される、8bp (CDEI)および26bp (CDEIII)のドメインで構成される、125bpの比較的短いDNAセグメント内に含まれることが示されている(Clarke and Carbon, Annu. Rev. Genet. 19: 29-56, 1995)。分裂酵母シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)のセントロメアはかなり大きく、40kb〜100kbの範囲であり、両側に逆方向反復ユニットが隣接する4kb〜7kbの中央のコアDNA要素からなる(Steiner et al., Mol. Cell. Biol. 13: 4578-4587, 1993)。高等真核生物のセントロメアの機能的DNA構成要素は、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)由来のミニ染色体において特徴づけられ、200kbの高度反復配列が片側に隣接する、220kbの必須コアDNAからなることが示されている(Murphy and Karpen, Cell 82: 599-609, 1995)。
【０００６】
今日までに研究されたすべての高等真核生物のセントロメアと同様に、哺乳類のセントロメアには、高度に反復性のヘテロクロマチンDNAがかなり多量に含まれる。例えば、典型的なヒトセントロメアには2Mb〜4Mbにわたる171bpのα-サテライト反復(Wevrick and Willard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9394-9398, 1989; Wevrick and Willard, Nucl. Acids. Res. 19: 2295-2301, 1991; Trowell et al., Hum. Mol. Genet. 2: 1639-1649, 1993)に加え、より小さく、より多様な数の5bpサテライトIII DNAが含まれる(Grady et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1695-1699, 1992; Trowell et al. [1993]前記)。これらのサテライト配列の役割は現在のところ不明である。クローン化された17kbの連続したα-サテライトアレイを培養サル細胞に (Haaf et al., Cell 70: 681-696, 1992)、または120kbのα-サテライトを含むYACをヒトおよびハムスター細胞に(Larin et al., Hum. Mol. Genet. 3: 689-695, 1994)トランスフェクトすると、組込まれた部位にセントロメア機能を付与するように見える。その他の研究者は、再編成されたY染色体を解析したり(Tyler-Smith et al., Nature Genet 5: 368-375, 1993)、またはクローン化されたテロメアDNAを用いてヒトY染色体のセントロメアを分断し(Brown et al., Hum. Mol. Genet. 3: 1227-1237, 1994)、ヒトセントロメア機能には150kb〜200kbのα-サテライトDNAに加えて数百kbの隣接配列が関与していることを示唆した。加えて、テロメア結合染色体断片化により、2.5Mbのαサテライトアレイを保持するヒトX由来ミニ染色体が産生されている(Farr et al., EMBO Journal 14: 5444-5454, 1995)。これら全ての研究において、非α-サテライトDNA配列がセントロメア部位内に埋め込まれているかどうか、およびα-サテライトDNAと独立に、または協調して働いているかどうかは分かっていない。
【０００７】
哺乳類では、4つの構成的セントロメア結合タンパク質、CENP-A、CENP-B、CENP-C、およびCENP-Hが様々な程度まで特徴付けられており、セントロメア機能に直接的な役割をもつ可能性が示唆されている。キネトコアの外側ドメインに局在するタンパク質であるCENP-Aは、ヒストンH3タンパク質に配列相同性を示し、かつクロマチン構造の最も基本的なレベルであるヌクレオソームにおいて、セントロメアと染色体の残りの部分を区別するよう働く、セントロメア特異的コアヒストンである(Choo Dev. Cell 1: 165-177, 2001)。霊長類αサテライトおよびマウスのマイナーサテライトDNAに見いだされるCENP-Bボックスモチーフへの結合によって、セントロメアのヘテロクロマチンに結合するタンパク質であるCENP-Bは、おそらくセントロメアのヘテロクロマチンのパッケージングに関与している。しかし、このタンパク質はY染色体上に検出されず(Pluta et al., Trends Biochem. 15: 181-185, 1990)、二動原体染色体の不活性なセントロメア上に見いだされ(Earnshaw el al., Chromosoma 98: 1-12, 1989)、かつ有糸細胞分裂および減数細胞分裂に対して検出可能な影響なしにその遺伝子をマウスでノックアウトできる(Hudson et al., J. Cell Biol. 141: 309-319, 1998)ことから、CENP-Bの役割は不可欠ではない。CENP-Cはキネトコアのインナープレート(inner kinetochore plate)に位置し、例えば、細胞内への抗CENP-C抗体のマイクロインジェクション後に有糸分裂の進行が阻害されること(Bernet et al., J. Cell. Biol. 111: 1519-1533, 1990; Tomkiel et al., J. Cell. Biol. 125: 531-545, 1994)、二動原体染色体の活性なセントロメアには結合しているが不活性なセントロメアには結合していないこと (Earnshaw et al. [1989]前記; Page et al., Hum. Mol. Genet. 4: 289-294, 1995; Sullivan and Schwartz, Hum. Mol. Genet. 4: 2189-2197, 1995)、およびCenpc遺伝子ノックアウトマウスの胚性致死の表現型(Kalitsis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 1136-1141, 1998)から分かるように、まだ決定されていないものの必須のセントロメア機能を有する。CENP-Hはこれまでに記載された最新の必須な構成的結合セントロメアタンパク質である (Sugata et al., J. Biol. Chem. 274: 27343-27346, 1999; Sugata et al., Hum. Mol. Genet. 9: 2919-2926)。最近、多数の「パッセンジャータンパク質(passenger protein)」（例えば、INCENP、MCAK、CENP-E、CENP-F、3F3/2抗原、および細胞質ダイニン）のための「整列場(marshalling station)」としての、哺乳類のセントロメアの新しい役割が認識されている (Earnshaw and Mackay, FASEB J. 8: 947-956, 1994の総説、およびPluta et al., Science 270: 1591-1594, 1995)。セントロメアへの出現が一時的で、かつ細胞周期により厳密に制御されているこれらのパッセンジャータンパク質は、染色体のモーター移動、スピンドル動態、核構成、細胞間橋構造および機能、姉妹染色分体の接着および解離、ならびに細胞質分裂の調整などの重要な機能を提供する。
【０００８】
米国特許第6,265,211号および国際特許出願WO 98/51790は、通常と異なるヒトマーカー染色体のmardel(10)について記載している。この染色体は単離元のヒト被験体、ならびに樹立された繊維芽細胞培養物および形質転換されたリンパ芽球培養物の双方で、有糸分裂において100%安定である。mardel(10)染色体の領域が、正常なヒト被験体からの相当領域とともにクローン化された。有糸分裂時に安定にもかかわらず、クローン化された核酸分子にはαサテライト反復が含まれていなかった。したがって、この核酸分子は「ネオセントロメア」と呼ばれる新しい型のセントロメアを含んでいた。高等生物のセントロメア領域は従来より転写活性に抑制性であると記載されてきた(Choo Dev. Cell. 1: 165-177, 2001)。セントロメアに見いだされる反復性DNAの大きな区画は、本発明が現れるまで、転写活性の適切な解析を妨げてきた。本発明に従って、セントロメアクロマチンドメインの配置が決定され、かつ発現解析により転写活性が同定された。したがって、本発明は、真核細胞染色体および人工または操作された染色体コンストラクトへ遺伝子およびその他の遺伝物質を挿入する標的を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本明細書を通じて、文脈上特に定めのない限り、「含む(comprise)」または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変化形は、記載された要素または整数値または要素群または整数値群を含むことを意味するが、任意の他の要素または整数値または要素群または整数値群を除外することを意味しないと理解される。
【００１０】
本発明は部分的に、セントロメア構成が高等生物または植物で転写活性に抑制性であるかどうかの解析に基づく。この解析は、人工または操作された染色体の使用を含む遺伝子治療もしくは改良プロトコルの設計に、または染色体遺伝的標的化もしくはプロテオミクス治療のためのタンパク質産生のためのそれらの使用に必要である。本発明に従って、以下の理由から機能的分析が容易に行えるヒトのネオセントロメアが使用される：
(a)縦列反復DNAの大きなアレイを欠くこと；
(b)クロマチンドメインを高解像度で分子マッピングすることができる、完全に配列決定されたマーカーが利用可能であること；および
(c)ネオセントロメア形成の前後に、同じ染色体領域上に多数の天然の遺伝子が存在すること。
【００１１】
図1eに、mardel(10)の10q25ネオセントロメアに定義された種々のドメインの分布がまとめられている。CENP-AおよびHP1ドメインの位置が重複していないのは、コアCENP-A結合DNAがヘテロクロマチンタンパク質を欠くことが示されている、酵母およびハエの場合と同様である(Choo, Dev. Cell. 1: 165-177, 2001)。CENP-AおよびHP1ドメインは、以前10q25ネオセントロメアにマッピングされた1Mbの複製遅延領域の近位および遠位の境界を形成しており(Lo et al., EMBO J. 20: 2087-2096, 2001A)（図le参照）、これらのドメインが複製遅延時間の獲得領域の拡大を阻止する役割を担っていることが示唆される。
【００１２】
ネオセントロメア誘導性のクロマチン再編成領域は、10q25に総計約4Mbの長さで定義されている（図1e）。330kbのCENP-Aおよび100kbのHP1結合ドメインにおける遺伝子サイレンシング(gene silencing)効果が不確定であることを除けば、残りの骨格に富んだ領域上ならびに900kbのCENP-Hドメインおよび1Mbの複製遅延領域内に分布する多数の異なる遺伝子について、通常の転写が許容されていることがデータから明確に示されている（図1e）。これらのデータには、活性なキネトコアの構造的および機能的な決定的性質を与えるクロマチンの実質的な再改変が、基となるセントロメアDNAの大部分の転写能、またはこのDNAへの細胞の転写装置の接近可能性を測定可能なほど損なっていないことも含まれる。
【００１３】
したがって、本発明は細胞の染色体または人工もしくは操作された染色体への遺伝子またはその他の遺伝物質の挿入のための標的を提供する。この標的には、セントロメアもしくはネオセントロメア領域、または近位の遺伝子位置を含む直接隣接する領域が含まれる。
【００１４】
本発明は、哺乳類への遺伝子治療または遺伝的改良プロトコル、ならびにヒト、鳥類、植物、およびその他の高等生物を含むプロテオミクス治療プロトコルの開発を可能にする。特に、遺伝物質を保持する人工または操作された染色体は、セントロメアもしくはネオセントロメア領域内または隣接もしくは近接する領域内に挿入されたプロモーターに機能的に連結される。この遺伝物質は細胞内に導入されると発現可能であり、それゆえ、人工または操作された染色体を用いて、細胞、または細胞を保有する生物もしくは植物に表現型形質の導入もしくは改変を行うか、または大規模抽出のためもしくはプロテオミクス治療で使用するために治療的に有用なタンパク質を産生することができる。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明は部分的に、セントロメアまたはネオセントロメアDNAに相当するDNA領域が転写的に活性であるという判断に基づく。これにより、人工または操作された染色体、および哺乳類、トリ、植物、またはその他の高等真核生物起源などの真核細胞のセントロメアもしくはネオセントロメア領域、または直接隣接するもしくは近接する領域への遺伝物質の部位特異的挿入の開発が可能となる。そのような遺伝物質は意外なほど転写活性を維持し続ける。
【００１６】
したがって、本発明の1つの局面は、哺乳類、トリ、植物、またはその他の高等真核生物DNAのセントロメアまたはネオセントロメア領域に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。該核酸分子は、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を保有する細胞または該細胞を含む生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える、異種核酸分子を含む。
【００１７】
一般的に、対象の核酸分子はDNA分子である。一つの形態ではDNA分子は単離された形態にある。他の形態では、DNAは哺乳類、鳥類、もしくは植物、またはその他の高等真核生物の細胞に内在する。「内在する」という用語には、細胞の染色体に対して自己複製単位として存在するDNA、および細胞の染色体に組込まれたDNAが含まれる。
【００１８】
「哺乳類」という用語には、ヒトもしくはその他の霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、ロバ、ヤギ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ）、または捕獲野生動物が含まれる。鳥類には、家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ガチョウ）、狩猟鳥（例えば、ヤガモ、キジ、クジャク、エミュー、ダチョウ）、または鳥かごもしくは鳥小屋のトリ（例えば、オウム、ハト、フリチェ(friches)）が含まれる。植物は、単子葉もしくは双子葉植物、木質もしくは非木質の植物、農作物、または観賞植物である可能性がある。
【００１９】
しかし、好ましくは、DNAは哺乳類細胞中に、さらに好ましくはヒト細胞中に存在する。
【００２０】
したがって、本発明の他の局面は、哺乳類DNAのセントロメアまたはネオセントロメア領域に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。該核酸分子は、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を保有する細胞または該細胞を含む生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える異種核酸分子を含む。
【００２１】
本明細書において「異種遺伝子」とは、セントロメアもしくはネオセントロメアDNAまたは直接隣接するもしくは近接DNA内に、通常は内在していない遺伝子を意味する。「遺伝子」という用語はそのもっとも広い意味で用いられ、ゲノム遺伝子（エキソンまたはイントロンDNAを含む）およびcDNA（通常エキソンDNAのみ）を含む。しかし、本発明は、転写および任意のスプライシングにおいて、遺伝的ネットワークの構築に関わるイントロンDNAの組込みにも及ぶ。
【００２２】
本発明はさらに、セントロメアもしくはネオセントロメア領域内または直接隣接するもしくは近接する領域内の遺伝子または遺伝子座を不活性化または活性化するための遺伝物質の使用にも及ぶ。一つの態様では、遺伝物質はRNAiまたはアンチセンスRNAを誘導する。
【００２３】
「遺伝子」という用語は、挿入ヌクレオチド配列がタンパク質産物をコードすると限定すると解釈するべきではない。それは、ヌクレオチド配列がRNA分子またはセンス分子をコードするか、あるいはコサプレッション(co-suppression)または転写後もしくは翻訳の遺伝子サイレンシングに関与するRNAi、または遺伝的ネットワークの構築に関わるイントロンを誘導する可能性があるためである。
【００２４】
「遺伝的ネットワークの構築」とは、細胞のゲノムまたはプロテオーム内における、遺伝子発現、プロモーター、調節領域およびペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の調整を意味する。
【００２５】
「セントロメア」または「ネオセントロメア」とは、機能性のネオセントロメア、またはその機能性派生物、またはその潜在型、合成型もしくはハイブリッド型を含み、有糸細胞分裂中の姉妹染色分体の接着および染色体分離の促進が可能であり、かつ／またはCENP-Aおよび／もしくはCENP-Cおよび／もしくはその他の機能的に重要なセントロメアタンパク質に結合可能であり、かつ／または抗CENP-A抗体もしくは抗CENP-C抗体もしくはその他の機能的に重要なセントロメアタンパク質に対する抗体と相互作用可能である。一般的に、かつ好ましくは、ネオセントロメアはCENP-Bタンパク質または抗CENP-B抗体とは相互作用できない。または、ネオセントロメアはエピジェネティック(epigenetic)な機構またはクロマチン再編成などのその他の関連機構により活性化可能な、潜在的なセントロメアであってもよい。ネオセントロメアは、ハイブリッドまたはその他のヒト、哺乳類、植物、酵母、もしくは真核細胞のネオセントロメアであってもよい。例えば、重合技術により提供され正確なコンフォメーションを得た、合成または人工または操作されたネオセントロメアも本発明により意図される。これらすべてのネオセントロメアの型および定義がこの用語の使用に包含される。
【００２６】
特に、セントロメア／ネオセントロメア領域は、少なくともヒトでは、S/MARに包含され、S/MAR、CENP-H、CENP-A、HP1α、およびその他の必須セントロメアタンパク質を含む4Mbの遺伝的領域内に定義されるが、この大きさに限定されない。この領域内で発現される遺伝子の概要を表1に提供する。
【００２７】
したがって、好ましい態様では、本発明は、ヒトDNAのセントロメアまたはネオセントロメア領域に相当するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に向けられ、該核酸分子は、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を保有する細胞または該細胞を含む生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える異種核酸分子を含む。ここでセントロメアまたはネオセントロメア領域はqおよびp腕ドメイン、CENP-H、HP1ドメイン、ならびに骨格ドメインを含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択されるがこれらに限定されない遺伝子を含む（表1参照）。
【００２８】
その他の哺乳類、鳥類、植物、および高等真核生物における同等の領域も本発明によって意図される。
【００２９】
さらに、本発明は、細胞またはそのような細胞を保有する高等生物もしくは植物の遺伝型または表現型の改変に用いるため、および／または遺伝子治療、遺伝的改良、もしくは組換えタンパク質産生に用いるための、異種遺伝子またはその他の遺伝物質を保有する人工または操作された染色体の生成を可能にする。
【００３０】
したがって、本発明の他の局面は、哺乳類、トリ、もしくは植物、または高等真核生物DNAのセントロメアまたはネオセントロメア領域に相当するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含む、人工または操作された染色体を提供し、該核酸分子は、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を保有する細胞または該細胞を含む生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える異種核酸分子を含む。
【００３１】
さらに具体的には、本発明は、哺乳類DNAのセントロメアもしくはネオセントロメア領域またはその直接隣接するもしくは近接する領域に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含む人工または操作された染色体を意図する。該核酸分子は、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内またはその直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を含む細胞または該細胞を保有する生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える、異種核酸分子を含む。
【００３２】
さらに具体的には、本発明は、ヒトDNAのセントロメアもしくはネオセントロメア領域またはその直接隣接するもしくは近接する領域に相当するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含む、人工または操作された染色体に向けられ、該核酸分子は、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、またはその直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入され、発現可能か、または他の方法で異種核酸分子を保有する細胞または該細胞を含む生物もしくは植物に観察可能な表現型効果を与える、異種核酸分子を含む。
【００３３】
さらに、人工または操作された染色体は単離された形態にあるか、または細胞内に存在してもよい。
【００３４】
本発明は、人工もしくは操作された染色体または核酸を含む、単離細胞またはインサイチュー細胞を意図する。
【００３５】
さらに、本発明は、真核細胞において表現型を改変する方法であって、細胞で発現される場合、染色体または人工もしくは操作された染色体のセントロメアもしくはネオセントロメア領域またはその直接隣接するもしくは近接する領域に、該細胞のゲノムまたはプロテオームを改変可能である遺伝子配列を挿入する段階、および人工または操作された染色体の場合は、人工または操作された染色体を細胞に導入する段階を含む方法を意図する。
【００３６】
したがって、本発明は、遺伝子治療、遺伝的改良、または組換えタンパク質産生に用いるためのコンストラクトを提供する。コンストラクトは通常、その内部に、通常プロモーターに機能的に連結され、かつ任意にターミネーターおよび／またはその他の調節配列と機能的に連結される挿入遺伝子配列を有する、セントロメアまたはネオセントロメア領域を含む。
【００３７】
本明細書において、「プロモーター」とは、その最も広い文脈でとらえられ、古典的なゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、任意に上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサーを含む。プロモーターは通常、必ずしもそうではないが、その発現を調節する、構造遺伝子領域の上流または5'側に位置する。さらに、プロモーターを含む調節要素は通常、遺伝子の転写開始部位の2kb以内に位置する。
【００３８】
この文脈において、「プロモーター」という用語は、細胞内で核酸分子の発現を付与、活性化、または増進する、合成もしくは融合分子、または派生物を記載するのにも用いられる。
【００３９】
好ましいプロモーターは、さらにセンス分子の発現を増進するため、ならびに／またはセンス分子の空間的発現および／もしくは時間的発現を変化させるために、1つまたは複数の特異的調節要素の追加コピーを含んでもよい。
【００４０】
プロモーター配列の調節制御下に核酸分子を置くということは、プロモーター配列によって発現を制御されるように分子を配置するということを意味する。上述したように、プロモーターは通常、それらが制御する遺伝子の5'（上流）側に位置する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築にあたり、通常、遺伝子転写開始部位から、天然の状況、つまりプロモーターが由来する遺伝子におけるプロモーターと遺伝子の間の距離とほぼ同じ距離離れて、プロモーターを配置するのが好ましい。当技術分野において公知の通り、プロモーター機能を失わせることなしに、この距離をある程度変化させることも対応可能である。同様に、調節配列要素の、その制御下に置かれる異種遺伝子に対しての好ましい位置は、その要素の天然の状況、つまりそれが由来する遺伝子における位置により定義される。さらに、当技術分野において公知の通り、この距離もある程度変化させることが可能である。
【００４１】
本発明のコンストラクトに用いるのに適したプロモーターの例として、植物、動物、昆虫、菌類、または酵母細胞で機能可能な、哺乳類（例えば、ヒト）ウイルス、菌類、動物、および植物由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは構造遺伝子構成要素の発現を、構成的に、または発現される細胞、組織、または臓器によって区別して調節する可能性がある。
【００４２】
この文脈において、「機能的に連結される」または類似の用語は、構造遺伝子領域または複数の構造遺伝子領域の発現が、細胞内でそれと空間的に接続されたプロモーター配列の制御下にあることを示すと解釈されるべきである。
【００４３】
ある場合または多くの場合で、それらの天然の配置で、2つの分子が機能的に連結されている場合、核酸分子はその内在性プロモーターの制御下にある。
【００４４】
コンストラクトを細胞に導入（つまり、トランスフェクトまたは形質転換）する手段は、当業者に周知である。
【００４５】
本明細書において記載されるコンストラクトは、例えば、検出可能なマーカー酵素、またはその機能性の類似体もしくは派生物をコードする、マーカーヌクレオチド配列を含めることで、それが発現される細胞、組織、または臓器で合成遺伝子の発現の検出を容易にするように、さらに改変可能である。この態様によれば、マーカーヌクレオチド配列は、翻訳可能な様式で存在し、かつ例えば任意の1つまたは複数の構造遺伝子の翻訳産物との融合ポリペプチドとして、または非融合ポリペプチドとして発現される。「構造遺伝子」という用語には、RNA（例えば、mRNA）、またはイントロンもしくはエキソンRNAをコードする遺伝子が含まれる。
【００４６】
遺伝子コンストラクトは、真核細胞を形質転換して、そこに新規の遺伝形質を導入したり、または欠陥遺伝子を修復（つまり、遺伝子治療）するのに特に適している。そのような追加の新規形質は、別個の遺伝子コンストラクトに導入されても、または本明細書において記載される合成遺伝子を含む同一の遺伝子コンストラクト上に導入されてもよい。
【００４７】
本発明は以下の非限定的な実施例によりさらに記載される。
【００４８】
実施例1
材料と方法
細胞培養 
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系統および派生的な体細胞ハイブリッドを以下のように培養した。マウスF9テラトカルシノーマ細胞および派生物は10% v/v FCS、ペニシリン、ストレプトマイシンを補ったDulbeccos Modified Eagles Medium (Trace Biosciences)で培養した。ゼオシン(zeocin)標識されたmardel(l0)染色体(Saffery et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98(10): 5705-5710, 2001)を含むハイブリッド系統の成長培地には、200μg/mlゼオシン(Invitrogen)が補われた。全ての細胞は、サブコンフルエントな状態で維持され、採取時に確実に対数増殖であるようRNA単離の24時間前に1:4に分割された。
【００４９】
体細胞ハイブリッド系統の産生
それぞれmardel(l0)または関係のない正常な第10染色体を含む体細胞ハイブリッド系統5fおよび1fについては、以前に記載されている(du Sart et al., Nat. Genet. 16(2): 144-153, 1997)。4つの新規の単一染色体性体細胞ハイブリッド系統を、微小核細胞融合法(microcell-mediated chromosome transfer, MMCT)法(Saffery et al. [2001]前記)を用いて生成した。それらのうち2つ（それぞれ、CHOM10およびCHON10）は、CHOを基とし、mardel(10)または以前に記載されているようにmardel(10)患者の父親に由来する前駆的な正常第10染色体を含む(Barry et al., Genome Res: 10(6). 832-838, 2000)。これらの細胞系統は、以前に記載されているようにグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ遺伝子についての選択(du Sart et al. [1997]前記)を用いて産生された。残りの2つのハイブリッド系統（F9M10およびF9N10）はマウスF9細胞を基とし、それぞれmardel(10)または正常第10染色体を含む。これらはゼオシン標識mardel(10)を用いてゼオシン選択下で産生された。
【００５０】
RNA抽出およびcDNA合成
RNAは培養細胞からTrizol試薬(Life Technologies, Bethesda, NY)またはQiagen RNeasy midi kitを用い、メーカーの使用説明書に従って単離した。RNAレベルは分光光度法で定量し、RNAの完全性は未変性ゲル電気泳動法(non-denaturing gel electrophoresis)でアッセイした。メーカーの使用説明書に従って、2μgの全RNAをランダムヘキサマープライマーとABI Reverse transcriptase kitを用いたcDNAの産生に用いた。この反応の1/20量を各定量的RT-PCR反応に用いた。
【００５１】
プライマー設計と定量的RT-PCR
PCR増幅のためのプライマーはPrimer express software (ABI)を用いて設計した。いくつかの可能なプライマー対をそれぞれの遺伝子について設計した。混入したゲノムDNAまたは全RNAの増幅を避けるため、少なくとも対の一方がゲノムのエキソン／イントロン境界にまたがるように全てのプライマー対を設計した。各プライマーは合成前にヒトゲノムにおける唯一性について調べられた。各プライマー対について、逆転写の前に、ヒトゲノムDNAまたは全RNAからの増幅がないことを確実にするため、最初の検証実験を行った。定量的RT-PCRはApplied Biosystems SYBR green master mixを用いるSYBR green技術を用いて行い、反応はABI 7700 Sequence Detection System上で行われた。Delta CT解析を用いて18S対照単位複製配列(amplicon)に対する各遺伝子の相対発現量を計算した(Ambion Inc.)。試験プライマー対の増幅効率が18S対照の増幅と同程度であることを確実にするため、さらなる検証実験を行った。この実験では、鋳型の段階的な希釈(2倍希釈から1/256希釈)の後、試験プライマーと18S対照によるPCR増幅が行われた。次に、各希釈物についてのDelta CTを計算したが、増幅効率が同程度ならば、この値は各希釈度で大きく変化しない。いくつかのプライマー対は1つまたは複数の検証実験に落ちたため、最終的な解析には含まれなかった。TAQmanに基づく定量的RT-PCRには、Assay on demand事前最適化プライマーおよびプローブミックスを TAQman master mixおよびTAQman 18S control reagents (Applied Biosystems)とともに用いた。
【００５２】
骨格単離およびアレイ(SIA)解析
細胞核の単離：
2×108個の細胞を500gでペレット化しPBS中で5分間洗浄した。細胞を、3.75mM Tris-HCl、0.05mMスペルミン、0.125mMスペルミジン、1% v/vチオジグリコール、20mM KCl、0.1mM PMSF、0.5mM EDTA/KOHおよび10KIU/ml アプロチニン[pH 7.4]を含む単離緩衝液で3回、500gで5分間、再懸濁および洗浄した。洗浄された細胞は0.1% w/vジギトニンおよび100KIU/mlアプロチニンを含む、12mlの氷冷単離緩衝液に再懸濁し、Dounce型組織ホモジナイザーでB(loose)乳棒の12ストローク(stroke)により破壊した。核は0.1% w/vジギトニンおよび10KIU/mlアプロチニンを含む単離緩衝液で3回、4℃で900g、10分間、洗浄することにより回収した。洗浄されたペレットは、0.1% w/vジギトニンおよび100KIU/mlアプロチニンを含みEDTA/KOHを含まない5mlの単離緩衝液に再懸濁した。核はその後40ミクロンフィルターを通してろ過され、核凝集物が除かれた。
【００５３】
低塩(LIS)骨格抽出：
0.1% w/vジギトニン、100KIU/mlアプロチニンを含みEDTA/KOHを含まない、単離緩衝液100μl中の1×106個の核を37℃で20分間安定化した。その後核を、5mM Hepes/NaOH、0.25mMスペルミジン、2mM EDTA/KOH、2mM KCLおよび50mM 3,5-ジヨードサリチル酸、リチウム塩(SERVA)からなるLIS緩衝液1mlで希釈し、10分間4℃に放置して抽出した。抽出された核は、4℃で2,400g、20分間遠心分離し、その後ペレットを、20mM Tris-HCl、0.05mMスペルミン、0.125mMスペルミジン、20mM KCl、0. 1mM PMSF、0.1% w/vジギトニン、50mM NaCl、5mM MgCl2および100KlU/mlアプロチニンからなる消化緩衝液8mlで4回洗浄した。次に、制限酵素EcoRI、EcoRV、およびBamH1を1000U/mlで添加し、37℃で5時間インキュベートした。4℃で2,400g、10分間遠心分離することにより、消化された環状DNAから、核骨格に付着したDNAをペレット化した。
【００５４】
BACアレイ解析：
100ngのBAC DNAをHybond N+ナイロン膜にドットブロット式に固定した(minifold SAC-96, Schleisher and Schueel, Dassel, Germany)。同一の膜を5μgサケ精子DNAとプレアニールし、1fおよび5f細胞由来の1μgの骨格付着DNAまたは環状DNAプローブ化（probed）し、ランダムプライミングで32P標識し、5μgのヒトCot-1 DNAでプレアニールした。ハイブリダイゼーションおよび洗浄は、高ストリンジェンシーで行われた(0.1×SSC/0.1% w/v SDS、65℃)。結果は、Image QuaNT version 4.2 software (Molecular Dynamics)を用いてphosphorimager system (Storm 860 Gel and Blot Imaging System, Molecular Dynamics)で解析した。骨格付着DNAプローブを用いて得られたシグナルを、環状DNAプローブとハイブリダイズした複製ブロットのシグナルと比較した。各BACスポットへの骨格／基質付着のパーセンテージは、骨格／基質付着シグナルを骨格／基質付着シグナルおよび環状DNAシグナルの和で割ることで計算された。10回の独立した実験の平均値および標準偏差を、コンティグ地図(contig map)上に各BACの中点を用いて図にプロットした。統計的有意性は、異分散のスチューデントの両側t検定を用いて決定した。
【００５５】
骨格-FISH
活発に増殖中の細胞を分裂シェイクオフ(mitotic shake off)により採取し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で洗浄し、0.0075M KClに2×106細胞/mlで10分間、37℃で再懸濁した。次に、細胞を氷冷PA緩衝液（15mM Tris-HCl、0.2mMスペルミン、0.5mMスペルミジン、0.5mM EGTA、2mM EDTA、80mM KCl、20mM NaCl、0.1mM CuSO4 [pH7.2]）に8×106細胞/mlで洗浄した後、1mg/mlジギトニンを含む氷冷PA緩衝液に1×107細胞/mlで再懸濁した。核は4℃、200gで10分間遠心分離され、単離された分裂中期染色体を含む上清を回収した。染色体をスライド上に広げ、16時間乾燥させた。その後、スライドを水平にCIB溶液（10mM Tris、10mM EDTA、0.1% Nonidet P-40、0.1mM CuS04、20μg/ml PMSF [pH 8.0]）中に穏やかに5分間沈め、0.5M NaClを含むCIB溶液中で5分間抽出した。FISHを標準条件を用いて行った。
【００５６】
染色体免疫沈降およびアレイ(CIA)解析
CENP-HおよびHP1についてのCIA解析は本質的に、CENP-Aについて記載されたように(Lo et al., EMBO J. 20(8): 2087-2096, 2001A; Lo et al., Genome Res. 11(3). 448-457, 2001 B)、 アフィニティー精製したラット抗CENP-H抗体 (Sugata et al., [2000]前記)、抗HP1α抗体(Le Douarin et al., EMBO J. 15(23): 6701-6715, 1996)、および抗HP1β抗体(Serotec Ltd. Oxford, UK)を用いて行った。染色体のミクロコッカス・ヌクレアーゼ(micrococcal nuclease)消化を、1mgのクロマチン結合DNAにつき4単位用いて5分〜6分行い、ポリヌクレオソーム(polynucleosome)を得た。
【００５７】
実施例2
ネオセントロメア領域内の遺伝子
ヒトのネオセントロメアの活性化は、通常、特徴づけられた遺伝子または予測遺伝子を含むゲノムの真正染色質領域で起こる(Choo[2001]前記; Amor and Choo, Am. J. Hum. Genet. 71(4): 695-714, 2002)。入手可能なヒトゲノム配列データベースを用いて、mardel(l0)マーカー染色体上の10q25ネオセントロメアの周囲にある推定遺伝子が同定された(du Sart et al. [1997]前記)。公開されているデータベース[Ensembl, UCSC genome browser]での遺伝子予測とCeleraデータベースでのものを直接比較したところ、遺伝子数と順序にいくつか相違があることが明らかとなった。独立のマッピング実験では、10q25でのCeleraの遺伝子順序が支持された。Celeraのアノテーションを遺伝子識別の基礎として用いた。図1aに、以前マッピングされたmardel(10)上のCENP-A結合領域について、予測遺伝子の配置を示す(Lo et al., [2001A]前記)。図1aでは、全部で8MbにわたるBACアレイにより、CIAおよびSIA解析で用いられたクローン（水平のバー）の位置を示した。発現試験で用いられた、10q25に位置する遺伝子の位置と向きを矢印または矢じりで示した。CENP-A結合ドメインの位置は紫色で影付けされて示されている(Lo et al. [2001A]前記)。CENP-A結合ドメインにまたがる単一の推定遺伝子(Celera gene ID: hCG39837)を含め、全部で51個の8Mb領域内の遺伝子を調べた。
【００５８】
mardel(10)または正常な第10染色体のいずれかを含む、同等の遺伝的背景の3組の体細胞ハイブリッドが、セントロメア活性化の前後の遺伝子発現試験のため、SYBR greenを用いる定量的リアルタイムPCRに用いられた（表1）。調べた51個の遺伝子のうち14個の遺伝子が、1つまたは複数の試験された体細胞ハイブリッド系統での発現を示した（図2、表1、図1aの緑色の矢印）。これらのうち、8個についてTAQman定量的RT-PCRを用いて調べ、本質的に類似した結果を得た。驚くべきことに、正常な第10染色体またはmardel(10)を含む、相当するハイブリッドの間で、発現レベルに差が検出されなかったことから、基となるクロマチンの大規模なリモデリングを引き起こしたセントロメア活性化のプロセス（下記参照）は、これらの遺伝子の発現に測定可能な影響を及ぼさなかったことが示唆された。コアCENP-Aドメインから200kbの距離の遺伝子(hCG40949)は不変のレベルで発現されていた。CENP-Aドメインにまたがる唯一の遺伝子、hCG39837の発現は検出できなかったが、この遺伝子が主に脳で発現していることを考慮すれば(Su et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 4465-4470, 2002)、これは驚くには当たらなかった。したがって、CENP-Aのヌクレオソームへの沈着の後の、遺伝子発現への影響を直接測定することは全くできなかった。この発現解析で用いられた第10染色体の遺伝子を表2にまとめてある。
【００５９】
実施例3
10q25ネオセントロメアの骨格付着クロマチンドメインの検出
以前は、機能ドメインの定義が全くないために、セントロメア活性に遺伝子の位置を直接関連づけることができなかった。入手可能な10q25ネオセントロメアの配列により、今や、セントロメアクロマチンドメインの相対位置を定義し、これらのドメインが基となる遺伝子の発現に及ぼす影響を直接アッセイする、無比の機会が提供される。
【００６０】
ネオセントロメア形成前および後での10q25における染色体の骨格／基質付着のパターンを調べた。染色体骨格は、コアヒストン除去後に残る不溶性のクロマチンである(Paulson and Laemmli, Cell 12: 8178-828, 1977)。これは特異的なS/MAR(scaffold/matrix attachment region)配列を通じて直接DNAと相互作用し、かつセントロメア機能に必須であることが示されている、トポイソメラーゼIIα、CENP-C、およびコヒーシンサブユニットなどのタンパク質を含む(Pinsky et al, Dev. Cell. 3(1): 4-6, 2002, Kalitsis, [1998]前記, Saitoh et al., Bioassays 17(9): 2919-2926, 1995)。前記の10q25 BACアレイへのハイブリダイゼーションプローブとして用いるための、骨格付着DNAおよび非骨格付着（または環状）DNAの差次的塩抽出を含む、新規の骨格単離およびアッセイ（SIA）解析法が開発された（実施例1参照）。このアプローチを用いて、正常な第10染色体の相当領域に比較して、有意に高いレベルの染色体骨格／基質付着を示す、10q25ネオセントロメアの約3.5Mbの領域が同定された（図1b）。図1bでは、10q25 BACアレイに沿った骨格／基質付着が、5f（mardel(10)染色体）および1f（正常な第10染色体）ハイブリッド細胞系統から調製されたクロマチンについてのSIA解析で決定された。データポイントは、x軸上ではコンティグ地図の開始点に対する相対的なBAC位置の中点で示され、10回の独立した実験の平均値および平均値の標準偏差として表され、かつ計算され、5fおよび1fの骨格付着／非付着シグナルの比率のパーセンテージの差としてy軸上に示されている。データポイントの有意性はスチューデントのt検定を用いて決定され、アスタリスクで示されている(p<0.01)。S/MARに富む領域は青色で影付けされて示されている。骨格-FISHのデータの概要はグラフの一番上に示されており、骨格付着(+)または骨格非付着(-)BAC DNAを意味し、SIAの結果とよく一致していることが示されている。FISH解析で用いられたグラフ上の、相当するBACは白丸で示されている。
【００６１】
この領域には少なくとも30個の推定遺伝子が含まれ、うち8個は1つまたは複数の体細胞ハイブリッド系統で発現されていることが同定された（実施例2）。SIAの結果を独立して検証するため、関心対象の領域にわたる骨格付着を、10q25アレイ由来のBACクローンをプローブとして用いた分裂中期染色体のFISH解析(Bickmore and Oghene, Cell 84(1): 95-104, 1996)により直接可視化した。結果は、いくつかのBACクローンについて図3に示され、図1b（+/-記号）にまとめられているが、SIA解析を用いて得られた結果と密接に一致していた。塩抽出され、ヒストンが除去された染色体に対するFISHを本質的に前述されたように実施した(Bickmore and Oghene [1996]前記)。図3で、パネルAおよびDは、SIA解析で同定されたS/MARに富んだドメインの外側にマッピングされたBACクローンBA313D6およびBA427L15FISHを用いたFISHを示す。これにより、正常な第10染色体上（上のパネル）およびmardel(10)染色体上（下のパネル）の双方で分散したシグナル（抜き矢印）が生じたことから、プローブ化された領域が主に非骨格付着性であることが示唆される。パネルBおよびCはS/MARドメイン内にマッピングされたBACクローンE8およびBA153G5を用いたFISHを示す。これは第10染色体上（上のパネル）で分散したシグナル（抜き矢印）を生じ、mardel染色体上で密集したシグナル（下のパネル；べた矢印）を生じたことから、mardel(10)上でプローブ化された領域が主に骨格付着性であることが示唆される。かなりの領域にわたるS/MARのこの増加は、mardel(10)の一次狭窄を生じるクロマチンのより緊密なコンパクションを説明しうる。図1bに示されているように、以前同定されたCENP-Aドメインは、増強された染色体のS/MAR-修飾クロマチンの3.5Mbのドメイン内の中心部に位置する。これらの結果は、実質的な骨格付着性のクロマチンドメインが10q25ネオセントロメアに存在することを明確に示し、そのようなドメインおよびそれを構成するタンパク質が、基となる遺伝子の発現に測定可能な影響を及ぼさないことを示す。この実験に用いられたBACのアクセッション番号は表3に示されている。
【００６２】
実施例4
CENP-Hドメインにおける遺伝子発現の検出
CENP-A結合ドメイン内に遺伝子が少なく、検出可能な発現を欠くことを考え合わせ、2つめの必須セントロメア構成タンパク質であるCENP-H(Sugata et al., [1999]前記; Sugata, et al., [2000]前記)が遺伝子発現に及ぼす影響を調べた。ラットのポリクローナル抗ヒトCENP-H抗体が、以前CENP-A結合ドメインを定義するために用いられた(Lo et al., [2001A]前記)、クロマチン免疫沈降およびアレイ(CIA)マッピング法に用いられた。900kbのCENP-H結合ドメインが、骨格に富んだ領域のq腕側の遠位端と最小限重複した部位に同定された（図1bおよび1c）。これらの図は、CIA解析で決定されたCENP-H抗原の分布を10q25 BACコンティグ（x軸）に沿って示す。y軸は、mardel(10)および正常な第10染色体を含む細胞系統の間で、正規化された結合／投入比率が何倍異なるかを示す。各データポイントは独立した4回のCIA実験の平均値である。データポイントの有意性はスチューデントのt検定を用いて決定され、アスタリスクで示されている(p<0.01)。CENP-H結合領域の位置は緑色で影付けして示されている。このCENP-H結合ドメインは、CENP-A結合ドメインから約1Mb離れており、重複を示さなかった（図1C）。CENP-CはCENP-A含有クロマチンを標的としており、CENP-AおよびCENP-Hの両方がCENP-Cの局在化に必要であることを鑑みると、CENP-HとCENP-Aドメインの非重複性は注目に値する(Howman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(3): 1148-1153, 2000; Van Hooser et al., J. Cell. Sci. 114(19): 3529-3542, 2001; Fukagawa et al., EMBO J. 20(16): 144-153, 2001; Ando et al., Mol. Cell. Biol. 22(7): 2229-2241, 2002)。このことは、これらのタンパク質ドメイン間で複雑な高次相互作用が行われていることを示唆する（図1e）。重要なことには、この領域内に、ネオセントロメア形成の前後で同等のレベルで発現されていた6遺伝子が同定されたことから、CENP-Hなどの必須セントロメアタンパク質の、構成的な細胞周期非依存性の結合が、基となる遺伝子の発現に対して阻害性ではないことが示唆される。
【００６３】
実施例5
ヘテロクロマチンタンパク質とセントロメア機能の間の関係
セントロメア／セントロメア周辺領域におけるヘテロクロマチンおよびそれに結合したタンパク質の特異的な役割は不明確なままである。数多くの研究が遺伝子サイレンシングでの役割を示唆しているものの、いくつかの遺伝子は、おそらくヘテロクロマチンタンパク質の浸食から遺伝子を保護するなんらかの遮断作用によりこの抑制を逃れると記載されている(Schulze et al., Mol. Gen. Genet. 264(6): 782-789, 2001)。その他の研究も、ヘテロクロマチンが姉妹染色分体の接着に役割を果たす可能性を示唆している(Vagnarelli et al., Chromsoma 110(6): 393-401, 2001; Bernard et al., Science 294(5551): 2539-2542, 2001; Bernard and Allshire, Trends Cell Biol. 12(9): 419, 2002)。しかし、反復DNAがこれらの研究で用いられたセントロメアおよびその周辺に豊富に存在することで、ヘテロクロマチンがキネトコア活性において持ちうる、任意の直接的な役割の機能的分析が妨げられてきた。セントロメア／セントロメア周辺の反復DNAがないのに、ネオセントロメアにヘテロクロマチンタンパク質のHP1が結合することは(Saffery et al., Hum. Mol. Genet. 9(2): 175-185, 2000)、哺乳類のセントロメア機能におけるヘテロクロマチンの直接的な役割を強く示唆している。
【００６４】
ネオセントロメアにおけるヘテロクロマチン化と転写活性の間の関係を調べるため、ポリクローナル抗HP1α抗体(Le Douarin et al. [1996]前記)を用いてCIA実験を行い、HP1結合の程度と位置を決定した。著しくHP1に富んだ約100kbのドメインが同定された（図1d）。図1dは、CIA解析で決定されたHP1α抗原の分布を10q25 BACコンティグ（x軸）に沿って示す。y軸は、mardel(10)および正常な第10染色体を含む細胞系統の間で正規化された結合／投入比率が何倍異なるかを示す。各データポイントは独立した4回のCIA実験の平均値である。データポイントの有意性はスチューデントのt検定を用いて決定され、アスタリスクで示されている(p<0.01)。HP1α結合領域の位置はオレンジ色で影付けして示されている。類似の結果がβアイソフォームに対する2つ目のHP1抗体を用いて得られた。HP1結合ドメインはmardel(10)のp腕側のコアCENP-A領域から約800kb離れてマッピングされた。HP1およびCENP-Aドメインの間には、ネオセントロメアの活性化後に阻害されない単一の発現された遺伝子（GFRA1;表1）がある。100kbのHP1ドメイン自身には、試験された全ての細胞系統で発現しなかった、単一遺伝子(PNLIP)が含まれる。このことは、この遺伝子が膵臓特異的な発現プロファイルを示すことを鑑みれば、驚くには当たらない(Su et al. [2002]前記)。したがって、CENP-Aドメインについては、HP1の結合後の遺伝子発現への直接的な影響を直接的に決定することはできず、他のより適切な細胞型での将来的な解析が待たれている。
【００６５】
実施例6
NC-MiC解析および遺伝子発現のためのヒト細胞モデル
ヒト線維肉腫HT1080細胞系統におけるmardel(10)の切断は、標的DNA、ヒトテロメア配列、およびハイグロマイシン耐性選択マーカーを含むコンストラクトのトランスフェクションを経て実施された(Saffery et al. [2001]前記)。最近のアプローチには、p腕標的DNAとヒトテロメア配列の間に存在する、ネオマイシン耐性遺伝子(neoR)と隣接loxP部位をもつ、類似のコンストラクトの使用が含まれる。このコンストラクトを16MbのNC-MiC2を保有するHT1080細胞系統にトランスフェクトした(Saffery et al. [2001]前記)。15,000コロニーのスクリーニングにより、NC-MiC2の腕がさらに切断され、かつloxP配列が組込まれたいくつかの第二世代NC-MiCが得られた(Wong et al., Gene Ther 9: 724-726, 2002)。これらのうちの1つ、直鎖状の1.2 MbのNC-MiC6は、パルスフィールドゲル電気泳動、PCR、およびFISH解析から証明されるように、標的切断事象に由来した（図4b）(Wong et al. [2002]前記)。NC-MiC6は完全な有糸分裂安定性、およびセントロメアタンパク質結合性を示し、それにより正常なネオセントロメア機能を示す。重要なことには、それはCRE媒介性の組換えによる、後の遺伝子挿入に用いることができるloxP部位を含む。
【００６６】
NC-MiC6はその他の2つのヒト細胞系統に成功裏に移入された：ヒト結腸直腸HCT116pgrxrおよびヒト胎児腎臓293trex細胞系統（図5-7）。NC-MiC移入は、2つの各細胞系統のクローンにおける、ハイグロマイシンおよびネオマイシン選択を伴うMMCTを用いて成された。これらの細胞系統へのNC-MiC6移入の成功はNC-MiC6上でハイグロマイシンおよびネオマイシンが両方とも発現されていることを示した。
【００６７】
NC-MiC6の融合移入に用いられたHCT116細胞系統は昆虫のエクジソン受容体(pgRXR)を発現し、かつゼオシン耐性遺伝子を保有する。この細胞系統は任意の所望のタンパク質を誘導レベルで発現するのに用いることができる。エクジソン誘導系はエクジソン受容体二量体(VgEcR)、およびエクジソン類似体であるムリステロン(muristerone)の存在下でハイブリッドエクジソン応答要素 (E/GRE)に結合するレチノイドX受容体(RXR)を利用する。エクジソン受容体もショウジョウバエ由来のVP16トランス活性化(transactivation)ドメインを含むよう改変されている。ムリステロンを添加すると、二量体のRXRおよびVgEcRの、天然のエクジソン応答要素およびグルココルチコイド応答要素からなるハイブリッドエクジソン応答要素 (E/GRE)への結合が誘導されることから、関心対象の遺伝子の発現の誘導が引き起こされる。
【００６８】
293T細胞系統はTetリプレッサー(tetR)タンパク質を発現し、かつブラストサイジン(BsdR)に耐性である。この細胞系統も任意の関心対象のタンパク質を誘導レベルで発現するのに用いることができる。テトラサイクリンの非存在下では、Tetリプレッサーは、誘導発現ベクターのTetオペレーター配列と結合するホモ二量体を形成し、遺伝子の転写を抑制する。テトラサイクリンを添加すると、tetはtetRホモ二量体に結合し、これによりtetRはそのコンフォメーション変化によりオペレーターから解離し、そのため、所望の遺伝子の転写が誘導される。
【００６９】
これらの結果は、第一に、抗生物質耐性遺伝子を用いて、選択可能なマーカーを含むNC-MiCを1つの細胞系統から他の細胞系統へ容易に導入できること、第二に、さまざまな細胞系統におけるNC-MiC6の有糸分裂安定性の度合い、および第三に、NC-MiC上の選択マーカーの発現を明示する。これらの結果は、NC-MiCからの遺伝子発現モデルとしてのヒト細胞系統の使用の実現可能性への点、そして、ヒト細胞モデル系における遺伝子欠陥の将来的な修正を結びつけた。
【００７０】
実施例7
マウス胚幹細胞でのNC-MiCの産生および遺伝子発現
上述の研究に加え、ゼオシン耐性遺伝子で標識されたmardel(10)染色体もMMCTを用いてマウス胚幹(ES)細胞に成功裏に導入された。図4aに示されているような切断コンストラクトも、これらの細胞でNC-MiCを産生するのに用いられた。切断コンストラクト（図4a）はB43allおよびB79el6部位（図4b）を特異的に標的とするよう設計された。標的事象は得られなかったが、ランダムな切断の4つのクローンが生成され（図4b）、そのうち3つについてさらに記載されている（図8〜11）。さまざまなプローブによるFISH解析から、NC-MiC53g、NC-MiC8aおよびNC-MiC20fのq腕で切断と欠失が両方とも起こっていることが示されたが、B153g5プローブを用いたFISH解析により示されたように、（機能性セントロメアがその上に会合する）コアCENP-A結合ドメインは元の状態のままである。これらのミニ染色体（図示せず）のFISH特徴づけの結果は図4bにまとめられている。
【００７１】
NC-MiC53g、NC-MiC8aおよびNC-MiC20f上には、メジャーサテライトDNAとマイナーサテライトDNAのいずれも存在していないことが見いだされたことから（図8および9）、これらのMC-MiCは切断後にこれらのサテライトDNAを獲得していないこと、および10q25ネオセントロメアが有糸分裂機能性であることが示された。さらに、マウスcot DNAを用いたFISH解析で示されているように(図10）、マウスDNAはこれらのNC-MiC上に存在せしなかったことから、NC-MiCにはマウスDNAの検出可能な組込みがないことが示唆された。qの遠位領域に存在することが以前示されている、ゼオシン耐性遺伝子の陽性シグナル(Saffery et al. [2001]前記)が、3つのNC-MiC全てについてFISHにより示されている(図11)ことから、切断プロセスの間に、これらのNC-MiCにゼオシン耐性遺伝子が組込まれたことが示唆された。この選択可能マーカーの存在は、その他の哺乳類細胞への将来的なNC-MiCの移入を容易にする。
【００７２】
ES系列におけるNC-MiCからの遺伝子発現解析により、試験された14遺伝子のうちわずかしか発現しないいくつかのNC-MiC細胞系統 (例えば、hCG40964、hCG1818126を発現する20fC94、8aC94、53g43A；表4)、また一方で、多種類の遺伝子を発現するその他のNC-MiC含有細胞系統(例えば、5つの異なる遺伝子を発現する1.931b；表4)を伴う、多様な発現パターンが明らかになった。遺伝子発現の多様性は、ES細胞内のNC-MiCに含まれる、異なるヒト第10染色体領域を反映しており、NC-MiCからの遺伝子発現解析へのマウスES細胞の使用を支持する。
【００７３】
実施例8
NCCおよびNC-MiCからの遺伝子発現についての動物モデルの確立
ヒトのネオセントロメアが、動物個体において、有糸分裂で機能する能力を持つか試験した。これは、マウスで、ヒトのネオセントロメアを含む染色体(NCC)であるmardel(10)の挙動を研究することで行われた。mardel(10)を含むES細胞をマウスの胚盤胞に導入し、里親の雌マウスに再移植した後、高度キメラマウス(例えば、PL、CH、KM、DT) が数多く得られた。成体動物からの組織試料をmardel(10)特異的プライマーを用いたPCRで解析したところ、キメラマウスの骨髄、皮膚、腎臓、脾臓、盲腸、心臓、肺、脳、および精巣など多くの異なる組織でmardel(10)染色体が維持されていることが示された(表5)。mardel(10)プローブのE8およびヒトcot DNAを用いたFISH解析により、3匹のマウスのいくつかの異なる組織にmardel(10)の存在が確認された(PL、CH、KM：例を図12aに示す）。さらに、これらの組織で、mardel(10)上にマウスの着色がなく（図12b）、ヒト第10染色体の着色が陽性であった(図13)ことから、mardel(10)とマウスゲノムの間に検出可能な組込みまたは再編成がなかったことが明らかに示された。これらの結果はmardel(10)ネオセントロメアがマウスで正確に機能することを示し、マウスを個体の動物モデルでNC-MiCを研究するモデル系として考えた時に、種の壁が問題を生じないことを示唆している。
【００７４】
さらに、これらのキメラ動物のいくつかから得られた組織で、本発明者らはいくつかの遺伝子の発現を検出できた(表4参照)。ヒト遺伝子のhCG40949、hCG1811159、hCG1818126、hCG40945、およびhCG40995 (Celera ID番号)が動物のうち2匹の尾部初代線維芽細胞で検出され、hCG40944 (Celera ID番号)の発現もキメラ動物のうち1匹(DT：図14参照）の脳から単離されたRNA中に示された。これは、マウスでのネオセントロメアを含む染色体（ミニ染色体を含む）からの遺伝子発現解析についてのマウスモデル系の実現可能性を示し、動物個体で観察されたNCCの有糸分裂安定性に加え、ヒト疾患のマウスモデルを修正するために治療遺伝子を含むNC-MiCを用いるための道を開く。
【００７５】
（表１）10q25遺伝子発現解析
2007525141.tif 000002
遺伝子番号は図1を参照。Celera遺伝子IDおよび（該当する場合に）相当する遺伝子名が示されている。ドメインは本研究で同定されているクロマチン改変ドメインに関して遺伝子の位置を示す。遺伝子の相対発現レベルは、異なる遺伝的背景をもつ体細胞ハイブリッド系統について示されている(実施例1参照）。相対発現レベルは以下のようにして計算された。特定のRNA試料内での特定の遺伝子増幅についてのCT値は、蛍光が特定の閾値レベルを超えた増幅サイクル数を示す。これは出発試料中の特定のRNAの量に直接関連する。［CT(関心対象の遺伝子) - CT(18s rRNA)］を用いてΔΔCT値が計算される［ΔΔCT = ΔCT(正常な第10染色体を含む細胞系統) -ΔCT(細胞系統)］。相対発現レベル（2-ΔΔCT）は、mardel(10)染色体のネオセントロメア領域からの発現レベルに対する正常な第10染色体からの発現レベルの直接的な比較である。細胞系統間の発現レベルにおける任意の差の統計的有意性はスチューデントのt検定におけるΔCT値を用いて計算された。同一の遺伝的背景をもつハイブリッドの対［mardel(10)対正常第10］が各解析に用いられた。総N10対M10は、組み合わされた3つのハイブリットの対それぞれの各遺伝子についての全てのΔCT値の統合分析を示す。任意の統計的有意差をアスタリスクで示す。
【００７６】
（表２）発現解析に用いられた第10染色体遺伝子
2007525141.tif 000003
2007525141.tif 000004
2007525141.tif 000005
2007525141.tif 000006
【００７７】
（表３）本研究で用いられたBACのアクセッション番号
2007525141.tif 000007
【００７８】
（表４）マウスにおける派生体からの遺伝子発現
2007525141.tif 000008
* hCG40950
& hCG40948
$ hCG40947
W9.5は野生型胚幹(ES)細胞系統である。ES20Aは無傷のmardel(10)染色体を含むES細胞である。20fC94、8aC94、53g43A、および1.931bの説明は図4を参照のこと。キメラマウスDTの脳、ならびにキメラマウスCHおよびKMの繊維芽細胞が解析された。CHO-N10はヒトの正常な第10染色体を含むCHO細胞系統である。
【００７９】
（表５）mardel(10)マーカー染色体に対する特異的なプライマーを用いたPCRによる、キメラマウスPL、CHおよびDTにおけるmardel(10)の存在についてのさまざまな組織のスクリーニング
2007525141.tif 000009
【００８０】
当業者は本明細書において記載されている発明が、具体的に記載されていること以外の、変更および改変が可能であることを認識する。本発明はそのような変更および改変をすべて含むと理解されるべきである。本発明は同様に、本明細書で言及されたか、または示されたすべての段階、特徴、組成物、および化合物を個別にまたは集合的に含み、かつ該段階または特徴の任意の二つまたはそれ以上のあらゆる組み合わせを含む。
【００８１】
参考文献
2007525141.tif 000010
2007525141.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ネオセントロメアドメインの構成の図表示である。(a)CIAおよびSIA解析に用いられたクローンの位置を示す、8MbにわたるBACアレイ。(b)5f（mardel(10)染色体）および1f（正常第10染色体）ハイブリッド細胞系統から調製されたクロマチンのSIA解析で決定された、10q25 BACアレイに沿った骨格／基質付着。(c)CIA解析により決定された、10q25 BACコンティグ（x軸）に沿ったCENP-H抗原の分布。(d)CIA解析により決定された、10q25 BACコンティグ（x軸）に沿ったHP1α抗原の分布。(e)10q25ネオセントロメアにおけるドメイン分布特性の概要。
【図２】10q25ネオセントロメア活性化領域における発現遺伝子のCT解析を示す図である。CTおよびΔCTの説明については表1も参照のこと。1/ΔCT（y軸）は各遺伝子の発現レベルの測定を提供する。ヒト第10染色体を含む体細胞ハイブリッドの結果（灰色のバー）、およびmardel(10)を含むハイブリッドの結果(黒色のバー）の比較から、試験された遺伝子についてハイブリットの対の間に大きな差はないことが示される。ハイブリット間の相対発現レベルおよびスチューデントのt検定値の概要については表1を参照せよ。
【図３】分裂中期染色体への骨格付着を視覚化した図である。(a, d)SIA解析により同定されたS/MARに富むドメインの外側にマッピングされた、BACクローンのBA313D6およびBA427L15を用いたFISHにより、正常な第10染色体上（上のパネル）およびmardel(10)染色体上（下のパネル）の双方で分散したシグナル（抜き矢印）が生じることから、プローブ化された領域が主に非骨格付着性であることが示唆される。(b, c)S/MARドメイン内にマッピングされたBACクローンのE8およびBA153G5を用いたFISHにより、第10染色体上（上のパネル）に分散したシグナル（抜き矢印）が生じ、mardel(10)染色体上に密集したシグナル（下のパネル；べた矢印）が生じることから、mardel(10)上でプローブ化された領域が主に骨格付着性であることが示唆される。
【図４】マウス胚幹細胞におけるmardel(10)の切断を示す図である。(a)mardel(10)の切断のために用いられたTACT(telomere-associated chromosomal truncation)標的コンストラクトの構造。mardel(10)のpおよびq腕由来の標的DNA（B43allおよびB79el6）（4b参照）、ならびに哺乳類の選択可能マーカー（ピューロマイシンか、またはハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン（登録商標）ハイグロマイシン(登録商標））がクローン化されたヒトテロメアDNA(Htel)の小アレイを含むベクターにクローニングされた。コンストラクトはベクターDNAおよびテロメア反復の間の制限部位で直線化され、末端にテロメア配列が露出された。(b)mardel(10)およびmardel(10)の切断体由来のNC-MiCの概略図。抜き矢印はmardel(10)生成時の正常な第10染色体上の切断点を示す。mardel(10)の長腕および短腕はそれぞれ、qおよびpと表記される。NC-MiC53gはmardel(10)のpおよびq腕の両方の切断および欠失の結果形成された。NC-MiC8aおよび20fは、B43all部位を標的とするピューロマイシン耐性遺伝子を有するコンストラクトを用いた切断の後、B79e16sを標的としたハイグロマイシン耐性遺伝子を含むコンストラクトを用いた第二の切断が行われた結果得られた。縦に影付けされた範囲は、セントロメアタンパク質のCENP-A結合ドメインを示す(Lo et al. [2001A]前記)。抜き矢じりは対象の標的とする切断位置を示す。(+)はNC-MiC上でのBACまたはコスミドプローブに対するFISH結果が陽性であることを示し、一方(-)はFISH結果が陰性であることを示す。
【図５】ヒトHCT116pgrxr細胞系統におけるNC-MiC6のFISH解析を示す顕微鏡写真である。NC-MiC6を矢印で、ヒト第10染色体を矢じりで示す。(a)(i)ネオセントロメアプローブのB153g5および(ii)p腕プローブのB326h7(緑色)を用いたFISHであり、MC-MiC6のHCT116pgrxrへの移入を示す。(b)(a)のDAPI染色を分けて示す像。
【図６】ヒト293trex細胞系統におけるNC-MiC6のFISH解析を示す顕微鏡写真である。NC-MiC6を矢印で、ヒト第10染色体を矢じりで示す。(a)(i)ネオセントロメアプローブのB153g5および(ii)p腕プローブのB326h7(緑色)を用いたFISHであり、MC-MiC6の293trexへの移入を示す。(b)(a)のDAPI染色を分けて示す像。
【図７】HCT116pgrxr(a)および293trex(b)におけるNC-MiC6のFISH解析を示す顕微鏡写真である。NC-MiC6を矢印で、第10染色体を矢じりで示す。(i)B153g5 NCプローブ(緑色）およびαサテライトDNA pTRA7(赤色)を用いたFISH。(ii, iii)pTRA7およびDAPIについてそれぞれ分けて示した像であり、NC-MiC上にセントロメア特異的αサテライトDNAがないことを示す。
【図８】NC-MiC 53g、8a、および20fのFISH解析を示す顕微鏡写真である。NC-MiCを矢印で示す。(a)B153g5 NCコスミドプローブ(緑色）およびマウスメジャーサテライトDNAプローブ(赤色）を用いた複合的なFISHの像であり、NC-MiC53g(i)、NC-MiC8a(ii)、およびNC-MiC20f(iii)上にメジャーサテライトがないことを示す。(b)(a)のDAPI染色を分けて示す像。
【図９】NC-MiC 53g、8a、および20fのFISH解析を示す顕微鏡写真である。NC-MiCを矢印で示す。(a)B153g5 NCコスミドプローブ(緑色）およびマウスメジャーサテライトDNAプローブ(赤色）を用いた複合的なFISHの像であり、NC-MiC53g(i)、NC-MiC8a(ii)、およびNC-MiC20f(iii)上にマイナーサテライトがないことを示す。(b)(a)のDAPI染色を分けて示す像。
【図１０】NC-MiC 53g、8a、および20fのFISH解析を示す顕微鏡写真である。NC-MiCを矢印で示す。(a)B153g5 NCコスミドプローブ(緑色）およびマウスcot DNAプローブ(赤色)を用いた複合的なFISHの像であり、NC-MiC53g(i)、NC-MiC8a(ii)、およびNC-MiC20f(iii)上にマウスDNAがないことを示す。(b)(a)のDAPI染色を分けて示す像。
【図１１】NC-MiC 53g、8a、および20fのFISH解析を示す顕微鏡写真である。NC-MiCを矢印で示す。(a)ゼオシン耐性遺伝子(緑色）を用いたFISHであり、NC-MiC53g(i)、NC-MiC8a(ii)、およびNC-MiC20f(iii)上にゼオシン耐性遺伝子が存在することを示す。(b)(a)のDAPI染色を分けて示す像。
【図１２】キメラマウスPL、CH、およびKM由来の組織のFISH解析を示す顕微鏡写真である。mardel(10)を矢印で示す。(a)10q25ネオセントロメア特異的E8プローブ(緑色)およびヒトcot DNA(赤色)を用いたFISHの複合像であり、PLの肺(i)、PLの脾臓(ii)、CHの尾部(iii)、およびKMの尾部(iv)由来の培養細胞にmardel(10)が存在することを示す。(b)E8 NCプローブ(緑色）およびマウスcot DNA(赤色)を用いたFISHであり、PLの肺(i)、PLの脾臓(ii)、CHの皮膚(iii)、およびKMの尾部(iv)から確立された細胞において、mardel(10)上にマウスDNAがないことを示す。
【図１３】キメラマウスPL、CH、およびKM由来の組織のFISH解析を示す顕微鏡写真である。mardel(10)を矢印で示す。(i-iii)E8プローブ(赤色)を用いたFISHおよびヒト第10染色体着色(緑色）の複合像であり、PLの皮膚(i)、CHの尾部(ii)、およびKMの尾部(iii)から確立された培養細胞において、mardel(10)上にのみ陽性の着色を示す。
【図１４】マウス組織におけるhCG40944遺伝子の発現を示す写真である。キメラマウスのDTおよび野生型(WT)の組織から単離されたRNAに対して、F1/R1プライマー対を用いて、SYBR greenを用いた定量的RT-PCRを行った。最終反応混合物のうち15μlを1% w/vアガロースゲル上で泳動した。レーンMはDNAサイズマーカーを含む。mardel(10)を含むキメラマウスDTの脳では遺伝子発現が見られる(肝臓では見られない）が、野生型マウスの脳では見られないことに注意。
【図１】
2007525141.tif 000012
【図２】
2007525141.tif 000013
【図３】
2007525141.tif 000014
【図４】
2007525141.tif 000015
【図５】
2007525141.tif 000016
【図６】
2007525141.tif 000017
【図７】
2007525141.tif 000018
【図８】
2007525141.tif 000019
【図９】
2007525141.tif 000020
【図１０】
2007525141.tif 000021
【図１１】
2007525141.tif 000022
【図１２】
2007525141.tif 000023
【図１３】
2007525141.tif 000024
【図１４】
2007525141.tif 000025
【配列表】
2007525141000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月24日(2006.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類、トリ、植物、またはその他の高等真核生物DNAのセントロメアまたはネオセントロメア(neocentromere)領域に相当するヌクレオチド配列を含み、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入される異種核酸分子を含む核酸分子であって、ここで該セントロメアもしくはネオセントロメア領域には実質的にα-サテライトDNAがなく、異種核酸分子は細胞内で発現される、核酸分子。
【請求項２】
核酸分子がDNAである、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
核酸分子が哺乳類由来である、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
哺乳類がヒトである、請求項3記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
核酸分子が植物由来である、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
核酸分子が鳥類由来である、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
セントロメアまたはネオセントロメア領域がqおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメイン(scaffold domain)を含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項4記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
哺乳類、トリ、もしくは植物、またはその他の高等真核生物DNAのセントロメアまたはネオセントロメア領域に相当するヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を含む人工または操作された染色体であって、該核酸分子は、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域内、または直接隣接するもしくは近接する領域内に挿入され、細胞内で発現される異種核酸分子を含み、該セントロメアもしくはネオセントロメア領域には実質的にα-サテライトDNAがない、人工または操作された染色体。
【請求項９】
核酸分子がDNAである、請求項8記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
核酸分子が哺乳類由来である、請求項8または9記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
哺乳類がヒトである、請求項10記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
核酸分子が植物由来である、請求項8または9記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
核酸分子が鳥類由来である、請求項8または9記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
セントロメアまたはネオセントロメア領域が、qおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメインを含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項11記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
真核生物における表現型を改変する方法であって、細胞内で染色体または人工もしくは操作された染色体の、実質的にα-サテライトDNAがないセントロメアもしくはネオセントロメア領域内、またはその直接隣接するもしくは近接する領域内に発現されると、該細胞のゲノムまたはプロテオームを改変可能である、遺伝子配列を挿入する段階、および人工または操作された染色体の場合は、人工または操作された染色体を細胞に導入する段階を含む方法。
【請求項１６】
セントロメアまたはネオセントロメア領域がqおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメインを含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
請求項8または14記載の人工または操作された染色体を含む、遺伝的に改変された非ヒト動物または植物。
【請求項１８】
請求項15または16記載の改変表現型を含む、遺伝的に改変された非ヒト動物。
【請求項１９】
動物における遺伝子治療の方法であって、細胞内で染色体または人工もしくは操作された染色体の、実質的にα-サテライトDNAがないセントロメアもしくはネオセントロメア領域内、またはその直接隣接するもしくは近接する領域内に発現されると、該細胞のゲノムまたはプロテオームを改変可能である遺伝子配列を挿入する段階、および人工または操作された染色体の場合は、人工または操作された染色体を細胞に導入する段階を含む方法。
【請求項２０】
動物が哺乳類である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
哺乳類がヒトである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
セントロメアまたはネオセントロメア領域が、qおよびp腕ドメイン、ならびに骨格ドメインを含み、hCG41809、hCG40976、hCG1781464、hCG39839、hCG1781461、hCG40945およびhCG1818126より選択される遺伝子を含む、請求項21記載の方法。
【国際調査報告】
2007525141.tif 000034
2007525141.tif 000035
2007525141.tif 000036