(57)【要約】  この発明は、心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法、及び心房の不整頻搏の開始を阻害する方法を提供する。この発明は、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法及び運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の開始を阻害する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法であって、当該被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む方法。
【請求項２】
ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化がＲｙＲ２受容体のからのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を誘導する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む方法。
【請求項５】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法であて、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む方法。
【請求項８】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む物品。
【請求項１０】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項１１】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項１０記載の製造物品。
【請求項１２】
製造物品であて、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項１３】
被験者において心房の不整頻搏の発病（onset）を阻害する方法であって、当該被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む方法。
【請求項１４】
ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化がＲｙＲ２受容体のからのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を誘導する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
被験者において心房の不整頻搏の発病を阻害する方法であて、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む方法。
【請求項１７】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
被験者において心房の不整頻搏の発病を阻害する方法であって、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む方法。
【請求項２０】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項２２】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項２３】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項２２記載の製造物品。
【請求項２４】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項２５】
運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法であって、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む方法。
【請求項２６】
ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化がＲｙＲ２受容体のからのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を誘導する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
被験者がカテコールアミン性の多形性心室性頻脈（ＣＰＶＴ）に罹患している、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む方法。
【請求項３０】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
被験者がカテコールアミン性の多形性心室性頻脈（ＣＰＶＴ）に罹患している、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法であって、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む方法。
【請求項３４】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
被験者がカテコールアミン性の多形性心室性頻脈（ＣＰＶＴ）に罹患している、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む製造物品。
【請求項３７】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項３８】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項３７記載の製造物品。
【請求項３９】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項４０】
運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法であって、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む方法。
【請求項４１】
ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化がＲｙＲ２受容体のからのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を誘導する、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
被験者がカテコールアミン性の多形性心室性頻脈（ＣＰＶＴ）に罹患している、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法であって、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む方法。
【請求項４５】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
被験者がカテコールアミン性の多形性心室性頻脈（ＣＰＶＴ）に罹患している、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項４４記載の方法。
【請求項４８】
運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法であって、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む方法。
【請求項４９】
心房の不整頻搏が心房細動又は心室より上の不整頻搏である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
被験者がカテコールアミン性の多形性心室性頻脈（ＣＰＶＴ）に罹患している、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項５２】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【請求項５３】
薬剤がＪＴＶ−５１９である、請求項５２記載の製造物品。
【請求項５４】
製造物品であって、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
この出願は、２０００年５月１０日に出願された米国連続番号０９／５６８，４７４の継続出願の、２００２年１１月５日に出願された米国連続番号１０／２８８，６０６の一部継続出願であり、今は２００２年１２月３日に発行された米国特許第６，４８９，１２５号  Ｂ１であり、それらのコンテンツは引用により編入される。
【０００２】
本明細書に開示された発明は、国立衛生研究所、ヘルスアンドヒューマンサービスの米国部門から認可番号ＲＯ１  ＨＬ６１５０３及びＲＯ１  ＨＬ５６１８０にて政府のサポートのもとになされた。従って、米国政府はこの発明において一定の権利を有する。
【０００３】
この出願を通して、様々な刊行物が括弧内に著者及び年号により引用される。これらの引用の全文献は請求の範囲の直前の明細書の最後に見いだされる。これらの刊行物の全体の開示は、引用によりこの出願に編入されることにより、この発明が関係する技術分野の状況をより完全に記載する。
【０００４】
発明の背景
溝のある筋肉の収縮は、筋小胞体（ＳＲ）として知られる筋肉細胞内の細管からカルシウム（Ｃａ２＋）が放出されるときに、開始する。溝のある筋肉のＳＲ上のカルシウムの放出チャネル（ライアノジン受容体、ＲｙＲｓ）は、興奮性収縮カップリング（ＥＣ）に必要である。タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）は、心臓筋肉内のＥＣカップリングのために必要な主要のＣａ２＋放出チャネルである。ＥＣカップリングの間、作用ポテンシャルのフェーズゼロにおける心臓筋肉細胞膜の脱分極は、電圧−関門開閉された（gated）Ｃａ２＋チャネルを活性化する。これらのチャネルを通したＣａ２＋の流入が、今度は、Ｃａ２＋−誘導性Ｃａ２＋放出として知られるプロセスにおいて、ＳＲからＲｙＲ２によりＣａ２＋放出を開始する（Ｆａｂｉａｔｏ，１９８３；Ｎａｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｍ１９８９）。ＲｙＲ２−媒介性の、Ｃａ２＋−誘導されたＣａ２＋放出は、心臓筋肉の収縮に必須の、収縮蛋白質を活性化する。
【０００５】
ＲｙＲ２受容体は、４つの５６５，０００ドルトンのＲｙＲ２ポリペプチド及び４つの１２，０００ドルトンＦＫ−５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ１２．６）を含むテトラマーである。ＦＫＢＰ１２．６は、ＲｙＲ２チャネルに、ＲｙＲ２サブユニットあたり一つの分子が結合し、ＲｙＲ２チャネル機能を安定化させ（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、そして隣接するＲｙＲ２チャネルの間のカップリングされた関門開閉を促進させる（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。後者は、Ｃａ２＋の細胞内の貯蔵を放出するＳＲの特化された領域内で密集したアレイにパックされて、筋肉収縮を誘因する。類似のタイプ１ライアノジン受容体（ＲｙＲ１）は、制御サブユニットＦＫＢＰ１２を結合し、骨格筋のＳＲ上に見いだされる。
【０００６】
心不全においては、ＲｙＲ２のｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）によるＲｙＲ２の高リン酸化が、ＲｙＲ２チャネルからの制御性ＦＫＢＰ１２．６サブユニットの解離を誘導する（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これは、ＲｙＲ２チャネルの生物物理的特性における顕著な変化であり、Ｃａ２＋−依存性活性化に対する感度の増加による開確率の増加により証明され（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、当該チャネルの脱分極はサブコンダクタンス状態をもたらし、そして当該チャネルの欠陥をもつカップリング関門開閉が欠陥性ＥＣカップリング及び心臓機能不全をもたらす（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０００７】
心不全の別の共通の特徴は、心臓不整脈の出現である。心臓内の心室の不整脈は急性の致命傷であり、心臓性急死（ＳＣＤ）と呼ばれる現象である。ＳＣＤは普通の心臓病に付随し、もっとも顕著なのは心不全であり、患者の約５０％が致命的な心臓の不整脈により死ぬ。しかしながら、致命的な心室の不整脈は若年でも、その他では構造的な心臓疾患をもたない健康な人でも起こる。構造上正常な心臓において、心室の頻脈の誘導及び保守のためのもっとも共通の機構は、異常な自動能である（automaticity）。異常な自動能の一つの形態は、「誘因された（triggered）不整脈」として知られ、遅延した後脱分極（ＤＡＤｓ）を開始させるＳＲのＣａ２＋の異常な放出に付随する（Ｆｏｚｚａｒｄ，１９９２；Ｗｉｔ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，１９８３）。ＤＡＤｓは、致命的な心室の不整脈を誘因し得て、心臓の作用ポテンシャルの再分極後に起こる心筋内の異常な脱分極である。ＤＡＤｓを引き起こす異常なＳＲのＣａ２＋放出の分子上の基礎は、完全に明らかにされていない。ＤＡＤｓは、しかしながら、ライアノジンによりブロックされていることが知られており、ＲｙＲ２がこの異常なＣａ２＋放出の病理において鍵となる役割を担うかもしれないとの証拠を提供する（Ｍａｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｌａｒｄｉｎｅｌｌｉ，１９９４）。
【０００８】
カテコールアミン性の多形性心室性頻脈（ＣＰＶＴ）として知られる遺伝した不整脈障害の被験者においては、肉体的運動及び感情的なストレスが、検出可能な構造上の心臓の疾患の不在下でＳＣＤを導く二方向性及び／又は多形性の心室頻脈を誘導する（Ｍａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｌｅｅｄｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ＣＰＶＴは常染色体支配的様式において優性遺伝する。罹患した人は幼少期又は青年期に反復性の運動により誘導された失神を伴って発病し（ｐｒｅｓｅｎｔ）、３０歳まで３０−５０％の死亡率である（Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。連鎖の研究及び直接の配列決定は、ＣＰＶＴの人における染色体１ｑ４２−ｑ４３上のヒトＲｙＲ２遺伝子（ｈＲｙＲ２）内の変異を同定した（Ｌａｉｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｓｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。重要なことには、ＣＰＶＴの人は、運動テストに服従させられたときに、心室性不整脈を有するが、休息しているときにはこれらの不整脈を有さない。
【０００９】
運動及び感情的ストレスの間の交感神経系の刺激は、心臓内のβ−アドレナリン受容体（β−ＡＲｓ）を活性化するカテコールアミンの放出を誘導することが知られている。β−ＡＲｓは、Ｇ−プロテインを通して、ｃＡＭＰ濃度を増加させて次にはＰＫＡを活性化するアデニリルシクラーゼの活性化と共役する。
【００１０】
発明の概要
本発明は、心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法を提供するが、当該被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む。
【００１１】
この発明は、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法も提供する。
【００１２】
この発明は、さらに、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法を提供する。
【００１３】
さらに、この発明は、製造物品に向けられ、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む。
【００１４】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。
【００１５】
この発明は、さらに、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００１６】
この発明は、さらに、被験者において心房の不整頻搏の発病（onset）を阻害する方法を提供するが、当該被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む。
【００１７】
この発明は、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む、被験者において心房の不整頻搏の発病を阻害する方法も提供する。
【００１８】
この発明は、さらに、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む、被験者において心房の不整頻搏の発病を阻害する方法を提供する。
【００１９】
さらに、この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００２０】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。
【００２１】
この発明は、さらに、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００２２】
本発明は、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法を提供するが、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む。
【００２３】
この発明は、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法も提供する。
【００２４】
この発明は、さらに、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法を提供する。
【００２５】
さらに、この発明は、製造物品に向けられ、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む。
【００２６】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。
【００２７】
この発明は、さらに、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００２８】
本発明は、さらに、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法を提供するが、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む。
【００２９】
この発明は、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法も提供する。
【００３０】
この発明は、さらに、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法を提供する。
【００３１】
さらに、この発明は、製造物品に向けられ、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む。
【００３２】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。
【００３３】
最後に、この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００３４】
発明の詳細な説明
定義
以下の定義はこの発明を理解する上での助けとなる。
本明細書において使用される「ＲｙＲ２受容体」は、タイプ２ライアノジン受容体を意味し、心臓の筋小胞体（ＳＲ）上のカルシウム（Ｃａ２＋）放出チャネルである。
「ＦＫＢＰ１２．６」は、ＦＫ−５０６結合蛋白質であり、約１２，０００ドルトンの分子量を有し、ＲｙＲ２受容体チャネルに結合してその関門開閉（活性化及び不活性化）を制御する。
【００３５】
「ＰＫＡリン酸化」は、酵素、ｃＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）により触媒される反応においてリン酸基による基質内のヒドロキシル基の置換を意味する。
ＲｙＲ２受容体の「戻しリン酸化（back-phosphorylation）」は、ＲｙＲ２のＰＫＡによるインビトロリン酸化を意味する。
【００３６】
「カテコールアミン性の多形性心室性頻脈」は、「ＣＰＶＴ」とも呼ばれ、アドレナリン（即ち、運動により、及び精神的なストレスにより）誘導された二方向性及び／又は多形性の心室の頻脈及び心筋の著しい構造上の疾患の不在下での心臓性急死により特徴付けされる障害である。「心室頻脈」は、心室（１分あたり１００を超える拍動の少なくとも３つの連続した心室複合体）内の電気インパルスの生成に関連した異常に速い心臓リズムであり、そして広いＱＲＳ複合体を有する心電図により同定される。
【００３７】
「薬学上有効な量」は、薬剤が有効性を示す疾患に罹患した被験者に投与されたときに、当該疾患の減少、軽減又は緩解を引き起こすか又は当該疾患の再発を予防する、薬剤の量を意味する。
【００３８】
「予防上有効な量」は、疾患に罹患した被験者に投与されたときに、当該疾患の発病を阻害する、薬剤の量を意味する。
疾患の発病を「阻害する」は、当該疾患の発病の可能性（likelihood）を減らすか又は当該疾患の発病を完全に妨害することを意味することになる。本薬剤の治療上又は予防上有効な量の決定は、日常のコンピューター方法を用いて動物データを基にして実施され得る。一つの態様において、治療上又は予防上有効な量は、約０．２ｍｇと約１．５ｇの間の薬剤を含む。別の態様においては、有効な量は、約５ｍｇと約５００ｍｇの間の薬剤を含む。さらなる態様においては、有効な量は、約２５ｍｇと約１２５ｍｇの間の薬剤を含む。
【００３９】
「薬学上受容可能な担体」は当業者に知られており、限定ではないが、０．０１−０．１Ｍ、そして好ましくは０．０５Ｍのリン酸バッファー又は０．８％塩溶液を含む。さらに、そのような薬学上受容可能な担体は、水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョンであり得る。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性の担体は、水、アルコール／水性溶液、エマルジョン及び懸濁液を含み、塩溶液及び緩衝媒質を含む。非経口媒体は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル及び固定油を含む。静脈内媒体は、流体及び栄養性の補填剤、電解質補填剤、例えばリンゲルデキストロース等に基づくものを含む。保存剤及び他の付加物を存在させてもよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガス等を含む。
【００４０】
「投与する」は、当業者に知られた様々な方法及び送達系の何れかを用いて果たされるか又は実施される様式における送達を意味する。投与することは、例えば、局所的、静脈内、心膜内（pericardially）、経口、移植物により、経粘膜、経皮、筋肉内、皮下、腹膜内、くも膜下（intrathecally）、リンパ液内（intralymphatically）、外傷内（intralesionally）、又は硬膜外（epidurally）で実施できる。投与することは、例えば、１回、多数回、及び又は１又はそれより多い期間をかけて実施することもできる。
【００４１】
「被験者（subject）」は、あらゆる動物、例えば、哺乳類又は鳥であってよく、限定ではないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えばマウス又はラット、シチメンチョウ、チキン及び霊長類を含む。好ましい態様においては、被験者は人間である。
【００４２】
化学薬剤（chemical agent）の「構造上及び機能上の相同体」は、構造上及び機能上類似の薬剤のシリーズの一つであり、その各々は一定の要素の添加によりその前の一つから形成される（each of which is formed from the one before it by the addition of a constant element）。化学薬剤の「構造上及び機能上の類似体」は、薬剤のそれと類似の構造及び機能を有するが、特定の成分（単数又は複数）に関してそれとは異なる。用語「類似体」は、用語「相同体」よりも広くてそれを包含する。「類似体」は以下の用語も包含する：「アイソマー」、同じ分子式を有するが異なる分子構造又は原子の異なる空間的配置を有する化学化合物；「プロドラッグ」、インビボにおいて要求された化合物に容易に変換可能な化合物の機能性誘導体；及び「代謝物」、生物学上の反応の産物であって化学薬剤の生物又は他の生物学的環境への導入に際して生産される活性な種を含む。
【００４３】
発明の態様
本発明は、心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法を提供するが、当該被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む。一つの態様において、ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を引き起こす。別の態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。
【００４４】
この発明は、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法も提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。別の態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００４５】
この発明は、さらに、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療する方法を提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。
【００４６】
さらに、この発明は、製造物品に向けられ、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む。
【００４７】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。別の態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００４８】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）心房の不整頻搏に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。
【００４９】
本発明は、さらに、被験者において心房の不整頻搏の発病（onset）を阻害する方法を提供するが、当該被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む。一つの態様において、ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を引き起こす。別の態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。
【００５０】
この発明は、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む、被験者において心房の不整頻搏の発病を阻害する方法も提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。別の態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００５１】
この発明は、さらに、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を予防上有効な量にて投与し、それにより被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することを含む、被験者において心房の不整頻搏の発病を阻害する方法を提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。
【００５２】
さらに、この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００５３】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。別の態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００５４】
この発明は、さらに、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者の心房の不整頻搏の発病を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００５５】
この発明は、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法も提供するが、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む。一つの態様において、ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を引き起こす。別の態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。さらなる態様において、被験者は、カテコールアミン性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）に苦しめられている。
【００５６】
この発明は、さらに、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法を提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。別の態様において、被験者は、カテコールアミン性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）に苦しめられている。別の態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００５７】
この発明は、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者を治療することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療する方法も提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。別の態様において、被験者は、カテコールアミン性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）に苦しめられている。
【００５８】
さらに、この発明は、製造物品に向けられ、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む。
【００５９】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。異なる態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００６０】
この発明は、さらに、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈に苦しめられる被験者を治療することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００６１】
この発明は、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法を提供するが、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む。一つの態様において、ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を引き起こす。別の態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。さらなる態様において、被験者は、カテコールアミン性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）に苦しめられている。
【００６２】
この発明は、被験者に、被験者の心臓においてタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法も提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。さらなる態様において、被験者は、カテコールアミン性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）に苦しめられている。異なる態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００６３】
この発明は、被験者に、被験者の心臓のタイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の結合を模倣する薬剤を治療上有効な量にて投与し、それにより被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することを含む、運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害する方法も提供する。一つの態様において、心房の不整頻搏は、心房細動又は心室より上の不整頻搏である。さらなる態様において、被験者は、カテコールアミン性多形性心室頻脈（ＣＰＶＴ）に苦しめられている。
【００６４】
さらに、本発明は、製造物品に向けられ、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）高リン酸化を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む。
【００６５】
この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品にも向けられる。
異なる態様において、上記薬剤は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１としても知られる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラスの中のあらゆる他の化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００６６】
最後に、この発明は、（ｉ）タイプ２のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）へのＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤をその中に有するパッケージング材料及び（ｉｉ）被験者において運動により誘導されたか又はストレスにより誘導された心臓不整脈の発病を阻害することにおける薬剤の使用を示唆するラベルを含む、製造物品に向けられる。
【００６７】
受容体選択性化合物をデザインして合成するアプローチは、よく知られており、薬物化学並びにコンビナトリアルケミストリーのより新しい技術を含み、両者は共にコンピューターにより補助される分子モデリングにより支持される。そのようなアプローチを用いて、化学者及び薬学者は、受容体に結合するか及び／又は受容体の活性化を活性化するか又は阻害するために決定された標的化受容体サブタイプ及び化合物の構造に関する彼らの知見を使用することにより、これらの受容体サブタイプにおいて活性を有する構造をデザインして合成する。
【００６８】
コンビナトリアルケミストリーは、様々な新規化合物の自動化された合成を含み、ケミカルビルディングブロックの異なる組み合わせを用いてそれらを集合させることによる。コンビナトリアルケミストリーの使用は、化合物を生成するプロセスを多大に加速させる。結果の化合物のアレイはライブラリーと呼ばれて、目的の受容体における十分なレベルの活性を証明する化合物（「リード化合物」）をスクリーニングするために使用される。コンビナトリアルケミストリーを用いることにより、目的の受容体標的物に対して大きく偏っていると認識される化合物の「焦点を集めた」ライブラリーを合成することが可能である。
【００６９】
コンビナトリアルケミストリーの使用を通してであろうと慣用の薬物化学の使用を通してであろうとなかろうと、一度化合物が同定されたなら、様々な相同体及び類似体を製造することにより、化学構造と生物学上の活性又は機能活性との間の関係の理解を促進させる。これらの研究は、構造と活性の関係を規定し、そして改善された潜在能力、選択性及び薬力学特性を有するドラッグをデザインするために使用される。コンビナトリアルケミストリーも、リード最適化のための様々な構造を迅速に生成するために使用される。慣用の薬物化学も、一度における複数の化合物の合成を含むが、さらなる精製のため及び自動化された技術により接近不可能な化合物を生成するために使用される。そのようなドラッグが規定されたなら、薬学工業及び化学工業を通じて利用されている標準の化学マニュファクチュアリング方法論を用いて、生産をスケールアップする。
【００７０】
この発明は以下の実験の詳細から良好に理解されることになる。しかしながら、当業者は、その後の特許請求の範囲においてより完全に記載されていることから、特定の方法及び考察された結果が発明の単なる例示であることを容易に認識する。
【００７１】
実験の詳細
実験セットＩ
材料と方法
ＲｙＲ２の免疫沈殿及び戻しリン酸化
ホモジェネート及び筋小胞体（ＳＲ）膜を心臓の心室の組織から、Ｋａｆｔａｎら（１９９６）に記載されるとおりにして調製した。心臓のＳＲ（２００μｇ）又はホモジェネート（５００μｇ）を０．５ｍｌのバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．９％  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  ＮａＦ，０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００，プロテアーゼ阻害剤）に懸濁した。サンプルを一晩４℃において下に示す抗体と共にインキュベートした（各抗体による免疫沈殿に関して、イムノグロブリンのみを陰性対照として使用した、データは示さず）。プロテインＡ−セファロースビーズをサンプルに加え、そして４℃において１時間一定の撹拌と共にインキュベートした。ビーズを１ｘリン酸化バッファー（８ｍＭ  ＮｇＣｌ，１０ｍＭ  エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ），及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸）、ｐＨ６．８）で洗浄し、媒質のみ、ＰＫＡの触媒サブユニット（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ＭＯ）、又はＰＫＡプラスＰＫＡ阻害剤（ＰＫＩ５−２４，５００ｎＭ，カルビオケム、サンディエゴ、ＣＡ）又はｃＡＭＰを示された通りに含む、１０μｌの１．５ｘリン酸化バッファーに再懸濁した。免疫沈殿されたＲｙＲ２の戻しリン酸化は、ＰＫＡ（５ユニット）及びＭｇＡＴＰ（３３μＭ）も添加により開始し、そして５μｌの停止溶液（４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び０．２５Ｍジチオスレイトール（ＤＤＴ））の添加による５分間のインキュベーションの後に終結させた。１）プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）（０．０５ユニット、カルビオケム）によるＲｙＲ２リン酸化を類似の条件下で実施した（１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２をリン酸化バッファーに加えた）；そして２）Ｃａ２＋／カルモジュリン−依存性プロテインキナーゼ（ＣａＭＫＩＩ，０．２μｇ，アップステートバイオテック、レイクプラシッド、ＮＹ）と共に；１．５ｍＭ  ＣａＣｌ２及び５μＭカルモジュリンをリン酸化バッファーに加えた。同じ実験において、アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）溶液は１０％［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ（ＮＥＮライフサイエンス、ボストン、ＭＡ）も含んだ。サンプルを９５℃に加熱して、６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ分画した。ＲｙＲ２に対応する放射性シグナルを、モリキュラーダイナミックスホスホルイメージャー及びイメージクアントソフトウエア（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウエイ、ＮＪ）を用いて定量した。戻しリン酸化をホスホルイメージャーを用いて定量し、非特異的リン酸化（ＰＫＡ阻害剤により阻害されない）を差し引き、そして結果の値を各免疫沈殿物のＲｙＲ２蛋白質の量（イムノブロッティング及び比重計によるか、又は［３Ｈ］ライアノジン結合により測定された）で割って、そしてＰＫＡ−依存性［γ３２Ｐ］−ＡＴＰシグナルの逆数として表した。４℃において１時間インキュベートしてから洗浄することにより、２００μｇの心臓ＳＲから、マイクロシスチン−セファロース（３５μｌ，ＵＢＩ）を用いてＲｙＲ２を単離した。ビーズを６Ｘ  ＳＤＳ負荷バッファーに再懸濁して、沸騰させ、そして上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ分画した。マイクロシスチン−セファロースビーズに結合したホスファターゼＰＰ１及びＰＰ２Ａを、遊離のマイクロシスチン−ＬＲ（カルビオケム）の添加とコンピートオフさせた。
【００７２】
ＰＫＡリン酸化の化学量論
アルカリホスファターゼ（ＡＰ，１：１００酵素：蛋白質、ニューイングランドバイオラブズ）によるＲｙＲ２の２０分間３７℃における前処理により結合したリン酸を除去することにより、最大のＰＫＡ−依存性リン酸化を決定した。５μｌの停止溶液の添加により反応を終結させた。ＮａＦを除き、次に、脱リン酸化の後に加えて反応を終結させた。サンプルを上で記載されたとおりにＰＫＡにより戻しリン酸化した。ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化の化学量論を計算するために、ホスホルイメージャーを用いて公知の比活性（２．０ｘ１．０−４から２．０ｘ１０−３μＣｉ／μｌ）の［γ３２Ｐ］−ＡＴＰ標準により生じたシグナルを換算した。３２Ｐ−リン酸化を、免疫沈殿させたＲｙＲ２蛋白質の各サンプル中の高親和性［３Ｈ］ライアノジン結合により割ることにより、３２Ｐ／ＲｙＲ２のモル比を計算した。
【００７３】
イムノブロット
イムノブロットを記載されたとおりに実施した（Ｍｏｓｃｈｅｌｌａ  ａｎｄ  Ｍａｒｋｓ，１９９３）が、以下の抗体を用いた：抗−ＦＫＢＰ１２（１：１０００）、抗−ＲｙＲ（５０２９、１：３０００）（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、抗−ＰＰ１（１：１０００）、抗−ＰＰ２Ａ（１：１０００）、抗−ＣｎＡ（１：１０００）、抗−ＰＫＡ触媒サブユニット（１：１０００、トランスダクションラブズ、レキシントン、ＫＹ）、抗−ホスホセリン（１μｇ／ｍｌ，ジメド、サンフランシスコ、ＣＡ）、抗−ｍＡＫＡＰ（３μｇ／ｍｌ，アップステートバイオテクノロジー、レイクプラシッド、ＮＹ）、又は精製されたＶＯ５６（抗−ｍＡＫＡＰ抗体）（Ｋａｐｉｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。洗浄後に、膜をペルオキシダーゼコンジュゲートされたヤギ抗−ウサギ又はヤギ抗−マウスＩｇＧ抗血清（１：３０００、ベーリンガーマンハイム）と６０分間室温においてインキュベートし、Ｔｒｉｓ−緩衝バッファー（ＴＢＳ），０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０により３回洗浄し、そして増強されたケミルミネッセンスを用いて発色させた（ＥＣＬ，アマシャム）。
【００７４】
ＦＫＢＰ１２．６結合部位を同定するための酵母２ハイブリッドアッセイ
ヒトＦＫＢＰ１２．６ｃＤＮＡを酵母２ハイブリッドベクターｐＥＧ２０２（オリジーンテクノロジーズ、ロックビル、ＭＤ）にサブクローン化することにより、ｐＥＧＦＫＢＰ１２．６（ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合させたＦＫＢＰ１２．６）を作成した。酵母２ハイブリッドベクターｐＪＧ４−５（オリジーン）にサブクローン化されたヒトＲｙＲ２のｃＤＮＡ断片は、配列決定により確認した。蛋白質−蛋白質相互作用のための酵母２ハイブリッドアッセイを、ＤｕｐＬＥＸ−Ａ酵母系（オリジーン）を用いて、製造者の指示書に従い実施した。ｐＥＧＦＫＢＰ１２．６及びｐＡＤ−ＧＡＬ４ＲｙＲ２／２３６１−２４９６によりラパマイシン−耐性変異酵母株Ｙ６６３を同時形質転換し（Ｌｏｒｅｎｚ  ａｎｄ  Ｈｅｉｔｍａｎ，１９９５）、そして液体β−ガラクトシダーゼアッセイを、ＦＫＢＰ１２．６への結合に関してＲｙＲ２と競合するラパマイシンの不在又は存在下で実施した（０．１，１．０及び１０μＭ）。
【００７５】
部位特異的変異導入、ＧＳＴ−ＲｙＲ２融合蛋白質の発現及びインビトロマッピング
ｐＧＳＴ−ＲｙＲ２構築物をウサギ又はヒトＲｙＲ２のｃＤＮＡを用いて生じさせ、そして融合蛋白質を発現させて、グルタチオンセファロースビーズを用いて精製した。部位特異的変異導入は、５’プライム−３’−プライム部位特異的変異導入キット（アマシャムファルマシアバイオテック）を用いて、製造者の指示書に従い実施した。セファロースビーズに結合させたｐＧＳＴ−ＲｙＲ２融合蛋白質をイヌの心臓ＳＲ（２００μｇ蛋白質）とインキュベートし、沈殿させ、修飾ＲＩＰＡバッファーにより洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ分画し、そして示された抗体によりイムノブロットした。
【００７６】
免疫組織化学
ヒトの心臓の組織を１０％中性緩衝化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィンに埋包した。切片（４μＭ）を一晩３７℃において乾燥し、キシレンにより脱ワックスし、再水和し、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０と５分間インキュベートし、次に、５％ヤギ血清とＰＢＳ中で１時間室温においてインキュベートした。切片を次に、ＰＢＳ中の、前免疫（pre-immune）ウサギ抗体（ＩｇＧ）又は一次抗体［ｍＡＫＡＰ（ＶＯ５６），ＲｙＲ２（モノクローナル、アフィニティーバイオリージェント）；１：５０］、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と一晩４℃においてインキュベートし、そしてＰＢＳにより激しく洗浄した。切片を、次に、ＦＩＴＣ又はローダミン二次抗体（１：１００；ジメッド）の何れかと３％ＢＳＡ−ＰＳＡ中で１時間室温においてインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、そしてヘキスト染料（１０μｇ／ｍｌ）により５分間染色し、そしてＰＢＳで激しく洗浄した。二重免疫染色のため、スライドを連続して２つの個々の一次抗体で染色し、そして二次抗体と同時にインキュベートした。免疫染色されたスライドをニコン顕微鏡を用いて１００Ｘ対物レンズで調査した；アドビーフォトショップを用いて、イメージをＳＰＯＴ  ＲＴカメラで撮った（ダイアグノスティックインスツルメント社）。
【００７７】
ＲｙＲ２の単離及び単一チャネルレコーディング
心筋の重いＳＲを［３Ｈ］ライアノジンとインキュベートし、３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルフォネート（ＣＨＡＰＳ）により可溶化し、そして１４時間かけて１０から３２％の直線蔗糖勾配上で２６，０００ｒｐｍにてソバオールＡＨ−６２９ローター内で遠心分離した（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。単一チャネルレコーディングを、記載されたとおりに実施した（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。単一チャネル特性を、ｐＣＬＡＭＰ６．０２ソフトウエア（アクソンインスツルメンツ）を用いて評価した。最少で３分をかけて、１０秒及び３０秒の間隔でデータを分析することにより、開確率を決定した。各実験の結論において、ライアノジン及び／又はルテニウムレッドを適用することにより、ライアノジン受容体としてのチャネルの同定を確認した。結果は、平均±標準偏差として表す。スチューデントｔ−試験を休止時間分配及び開確率の統計分析に用いた。
【００７８】
ヒト心臓サンプル及び左心室補助装置（ＬＶＡＤ）
この研究のためのヒト組織の使用は、コロンビア長老教会医学センターの制度化評論会議により承認された。正常及び不全のヒト心臓組織、以前に記載されたとおりに、心臓移植を経験した患者から得た（Ｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。左心室補助装置（サーモカルジオシステム社、ウオバーン、ＭＡ）を心臓移植のブリッジとして標準臨床実務に従い患者に移植した（Ｆｒａｚｉｅｒ，１９９４）。
【００７９】
筋肉ストリップ機能
肉柱（trabeculae）（直径＜１ｍｍ、長さ＞３ｍｍ）を、ＬＶＡＤ移植の時に得られたヒト左心室先端コアサンプルから、又は正所性の（orthotopic）心臓移植の時に外植された心臓から得た。肉柱を標準の筋肉バスに入れ、強制変換器（force transducer）に取り付け、そして１Ｈｚにて刺激して、弛緩長において研究する前に１時間平衡に達するように放置し、次に、最大伸長成長（Ｌｍａｘ）の点まで段々引き伸ばした。イソプロテレノール（４μＭ）を含むクレブス−リンゲル溶液を筋肉に注ぐことにより、β−アドレナリン性応答を試験した。
【００８０】
イヌ心不全モデル
イヌの心不全を、２１０心拍／分の速い心臓ペーシングを３週間、続いて２４０心拍／分における追加の週のペーシングにより、前に記載されたとおりに誘導した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。この速いペーシング養生法は、重度の心不全を誘導するが、左心室ｄＰ／ｄｔｍａｘにおける平均４０％の低下（約１８００ｍｍＨｇ／秒まで）、ピークの左心室及び平均大動脈圧の２０％低下（それぞれ１００及び８５ｍｍＨｇまで）、休止心臓速度の５０％増加（１３２心拍／分まで）、及び末期拡張期の圧力の２０ｍｍＨｇを越える上昇により証明された（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。全ての手法は動物保護委員団体により承認された。
【００８１】
細胞をトランスフェクトする方法
ライアノジン受容体が発現される細胞を得るための、ライアノジン受容体をコードする核酸により細胞をトランスフェクトする方法は、当業界でよく知られている（例えば、Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照）。非筋肉細胞においては、ＲｙＲ２受容体が細胞質網状構造（ＥＲ）上に発現される。当該細胞は、ＲｙＲ２受容体とβ−ＡＲの両方が発現される細胞を得るためにβ−ＡＲをコードする核酸によりさらにトランスフェクトされてよい。そのようにトランスフェクトされた細胞は、受容体を結合する薬剤並びにそのような細胞において機能性応答を活性化するか又は活性化を阻害する薬剤を得るために化学薬剤を試験すること及び化学薬剤のライブラリーをスクリーニングするために使用してもよく、よって、インビボでおそらくはそうするであろう。
【００８２】
広い多様な宿主細胞を用いることにより、異種組織で発現された蛋白質を研究することができる。ＨＥＫ２９３細胞に加え、これらの細胞は、限定ではないが、哺乳類細胞系、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＣＯＳ−７；マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ−３７３，ＬＭ（ｔｋ−），マウスＹ１及びヒーラ細胞；昆虫細胞系、例えば、Ｓｆ９，Ｓｆ２１及びイラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）５Ｂ−４細胞；両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞及びアフリカツメガエルメラニン細胞；多彩な酵母株；多彩な細菌細胞株；及びその他を含む。これらの細胞種の各々の培養条件は特別であり、当技術分野を熟知した人には知られている。
【００８３】
研究される蛋白質をコードするＤＮＡを、様々な哺乳類、昆虫、両生類、酵母、細菌及び他の細胞系において、いくつかのトランスフェクション法により一時的に発現させることができ、限定ではないが、リン酸カルシウム媒介性、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介性、リポソーム−媒介性、ウイルス−媒介性、エレクトロポレーション−媒介性、及びマイクロインジェクション送達を含む。これらの方法の各々は、ＤＮＡ、細胞系、及び次に用いられるアッセイの種類に依存して、実験パラメーターの最適化を要求するかもしれない。
【００８４】
異種組織ＤＮＡを安定に宿主細胞に取込むことにより、細胞に、永久に外来蛋白質を発現させることができる。ＤＮＡを細胞に送達する方法は、一時的な発現に関して上で記載されたものと類似であるが、選択可能な表現型、例えば薬剤耐性を標的化宿主細胞に付与するために、補助的に選択可能なマーカー遺伝子の同時トランスフェクションを要求する。ＤＮＡを拾い上げた細胞を選択して保持するために、保証する（ensuring）薬剤耐性、を探索することができる。様々な耐性遺伝子が利用可能であり、限定ではないが、カナマイシン、Ｇ−４１８及びハイグロマイシンを含む。
【００８５】
ＲｙＲ２結合アッセイ
結合アッセイを実施する方法は、当業界でよく知られている。標識された化学薬剤を完全細胞に接触させるか、又はＳＲ又はＥＲを含む細胞抽出物に接触させて、ＲｙＲ２受容体を発現させる。ＳＲ又はＥＲを発現する細胞抽出物を調製する方法は、当業界でよく知られている（Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。薬剤を放射性アイソトープ、例えば、３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ，３５Ｓ，３２Ｐ又は３３Ｐで標識するなら、結合した薬剤は、液体シンチレーションカウンティング、シンチレーション近接又は放射性アイソトープを検出するための他のあらゆる方法を用いて検出してよい。薬剤をフルオロフォアで標識するなら、結合した標識薬剤は、限定ではないが、蛍光強度、時間解析された蛍光、蛍光偏光、蛍光伝達（transfer）、又は蛍光相関分光のような方法により測定してよい。薬剤を染料により標識するなら、結合した標識薬剤は、比色定量又は分光測定を含む様々な方法により測定してよい。薬剤に化学発光標識を付加するなら、結合した標識薬剤は、例えば、光電子倍増管又は電子なだれ（avalanche）光ダイオードにより照度計を用いて測定してよい。ＲｙＲ２受容体に結合した標識薬剤を検出することに加え、非標識の二次薬剤の受容体への結合を、受容体に特異的に結合することが公知の標識された一次薬剤の結合の、その競合的阻害によりアッセイしてよい。
【００８６】
心臓疾患を治療するための化合物に関するアッセイ
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、チャネルの所定の活性化因子に関して細胞の細胞質へのカルシウムのより多い放出をもたらすＲｙＲ２チャネルの活性を増加させる。ＲｙＲ２のＰＫＡ活性化をブロックする化合物は、細胞へのより少ないカルシウムの放出をもたらすＲｙＲ２チャネルの活性化を誘導することが予測されるはずである。ＦＫＢＰ１２．６結合部位においてＲｙＲ２チャネルに結合するがＰＫＡによりチャネルがリン酸化される場合にチャネルにはならない（not come off）化合物も、ＰＫＡ活性化又はＲｙＲ２チャネルを活性化する他のトリガーに応答してチャネルの活性を低下させると予測されるはずである。そのような化合物も細胞への低いカルシウム放出をもたらすはずである。
【００８７】
心臓疾患を治療するのに有効かもしれない化合物に関する一つのアッセイは、ＲｙＲ２チャネルにより、カルシウム−感受性蛍光染料（例えば、Ｆｌｕｏ−３，Ｆｕｒａ−２）を用いて細胞へのカルシウムの放出を測定することを含む。当該アッセイは、蛍光染料による細胞を負荷し（loading）、そして細胞に添加された化合物がカルシウム依存性蛍光シグナルを減少させるか否かを測定することを含む（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｇｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ，１９９３；Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。一つのＲｙＲ２活性化因子は、細胞に添加できるカフェインである。カルシウムが細胞の細胞質に放出されたなら、カルシウム感受性染料により結合されて、次に蛍光シグナルを放射する。カルシウム依存性蛍光シグナルは、光電子倍増管により監視されて、適切なソフトウエアにより分析され、Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓら、１９９４；Ｇｉｌｌｏら、１９９３；及びＪａｙａｒａｍａｎら、１９９６に記載されるとおりである。このアッセイは、マルチウエルディッシュを用いて莫大な数の化合物をスクリーニングするために容易に自動化され得る。当該アッセイは異種発現系、例えば細菌、酵母、昆虫、Ｓｆ９，ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ，ＣＯＳ−７，ＬＭ（ｔｋ−），マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３，２９３ヒト胚性腎臓、又はヒーラ細胞内で組換えＲｙＲ２チャネルを発現させることを含む（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。非筋肉細胞においては、ＲｙＲ２受容体を細胞質網状構造上で発現させる。ＲｙＲ２チャネルを活性化する場合、カルシウムは細胞質網状構造から細胞の細胞質へ放出される。これは、ベータアドレナリン受容体アゴニストの添加に応答してＲｙＲ２受容体活性化における化合物の評価を可能にさせるはずである。
【００８８】
他のアッセイは、心不全の程度に相関するＲｙＲ２のプロテインキナーゼＡリン酸化のレベルを測定することを含み、そしてＲｙＲ２チャネルのプロテインキナーゼＡリン酸化をブロックするようにデザインされた化合物の効率を測定するために使用することができる。このアッセイは、心不全が速い心臓ペーシングにより誘導された動物モデルと関連して使用することができる。当該アッセイはＲｙＲ２チャネル蛋白質に特異的な抗体（抗−ＲｙＲ２抗体）の使用に基づく。このアッセイのためには、ＲｙＲ２チャネル蛋白質を抗−ＲｙＲ２抗体により免疫沈殿させ、そして次に、プロテインキナーゼＡ及び［γ３２Ｐ］−アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）を用いて戻しリン酸化する。ＲｙＲ２受容体蛋白質に移動した放射性３２Ｐ標識の量は、ホスホルイメージャーを用いて測定することができる。当該アッセイの別のバージョンにおいては、抗体がＲｙＲ２受容体のリン酸化された形態に特異的であり、その場合には戻しリン酸化は必要ない。
【００８９】
ＲｙＲ２受容体チャネルの機能に関する別のアッセイは、ＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質とＲｙＲ２受容体の結合（association）の程度、ＲｙＲ２受容体チャネルのサブコンダクタンス状態、ＲｙＲ２受容体チャネルの活性化に関するＣａ２＋感受性、又はＲｙＲ受容体チャネルの開確率（Ｐｏ）を測定することを含む。
【００９０】
結果
プロテインキナーゼＡはＲｙＲ２をリン酸化する
５６５，０００ドルトンのＲｙＲ２ポリペプチドは、インビトロキナージング反応においてＰＫＡリン酸化された（図１Ａ）。ＲｙＲ２としてのＰＫＡリン酸化された高分子量蛋白質の同定を確認するため、リン酸化されたバンドを抗−ＲｙＲ抗体によりイムノブロットした。リン酸化の特異性は、ＰＫＡ阻害剤を用いて証明した（図１Ａ）。ｃＡＭＰを含み外来のＰＫＡを含まないリン酸化バッファーの添加も、ＰＫＩにより阻害されたＲｙＲ２のリン酸化をもたらすことから、内生ＰＫＡがＲｙＲ２と結合することを示す（図１Ａ）。ＰＫＡリン酸化の化学量論は、心筋ＳＲからＲｙＲ２を免疫沈殿させ、ＲｙＲ２をアルカリホスファターゼにより脱リン酸化し、そして次に、ＰＫＡ及び［γ３２Ｐ］−ＡＴＰによりリン酸化することにより測定する。ＰＫＡリン酸化の化学量論は、チャネルのモルあたり３．８±０．１モル（各チャネルは４つのＲｙＲ２サブユニットを含む）又はＲｙＲ２サブユニットあたり１モルのリン酸であったことから、各ＲｙＲ２蛋白質は単一のアミノ酸残基上でＰＫＡリン酸化されることを示す。
【００９１】
ＲｙＲ２マクロ分子複合体はＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡ，ＰＰＩ，ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰを含む
ＲｙＲ２を蔗糖密度勾配遠心分離により［３Ｈ］ライアノジン（図１Ｂ）を用いて記載されたとおりに単離した（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。個々のテトラマーＲｙＲ２チャネルは３０Ｓ複合体として沈降し、そして複数チャネル（２又はそれより多い）は密度の高い複合体として沈降する（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。筋肉のＡキナーゼアンカリング蛋白質（ｍＡＫＡＰ）はＰＫＡを結合してそれを基質に対して標的化するが、心臓ＳＲに集中した（Ｋａｐｉｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。心筋中の主要な蛋白質ホスファターゼはプロテインホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、プロテインホスファターゼ１（ＰＰ１）（ＭａｃＤｏｕｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、及びカルシニューリン（ＣｎＡ）である。蔗糖勾配からのフラクションを抗−ＲｙＲ２抗体によるか又はＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡの触媒サブユニット、ＰＫＡ制御サブユニット（ＲＩＩ）、ＰＰ２Ａ，ＰＰ１，ｍＡＫＡＰ又はＣｎＡ（図１Ｃ）を認識する抗体によりイムノブロットしたがそれら全て（ＣｎＡを除く）はＲｙＲ２を含む全てのフラクションにおいて検出された。これらのデータは、ＲｙＲ２，ＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡ，ＲＩＩ，ＰＰ１，ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰにより構成される高分子量複合体と一致する。
【００９２】
ホスファターゼ阻害剤ミクロシスチンはＰＰ１及びＰＰ２Ａに結合する。ＲｙＲ２はミクロシスチン−セファロースビーズへ結合することにより沈降し、そしてこの相互作用の特異性は遊離のミクロシスチン−ＬＲを用いてＲｙＲ２と競合することにより証明された（図１Ｄ）。同時免疫沈殿を実行したところ、ＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡ，ＲＩＩ，ＰＰ２Ａ，ＰＰ１及びｍＡＫＡＰは全てＲｙＲ２により免疫沈殿したことを示すので、これらの蛋白質とＳＲ  Ｃａ２＋放出チャネルの物理的結合を示す（図１Ｅ）。マクロ分子複合体の存在は、当該複合体をミクロシスチン−セファロースビーズにより最初に沈降させ、次に当該ビーズから離れた複合体（the complex off from the beads）を遊離のミクロシスチン−ＬＲと競合させ、次に複合体の成分の各々を免疫沈殿させることにより個別に示した（図１Ｅ、最後の３つのレーン）。これらのデータを一緒にすると、ＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡ，ＲＩＩ，ＰＰ１，ＰＰ２Ａ及びｍＡＫＡＰはＲｙＲ２とマクロ分子複合体を含むことを示す。
【００９３】
心不全筋肉内のＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化
増加した交感神経の活性は、増加したｃＡＭＰレベルを生じさせてＰＫＡを活性化するアドレナリン性シグナリング経路の活性化をもたらすストレスに対する重要な物理的応答である。心不全においては（心臓に対する損傷の原因に拘わらず）、循環するカテコールアミンのレベルは顕著に増加する。正常心臓及び不全心臓におけるＲｙＲ２の特異的ＰＫＡリン酸化を、［γ３２Ｐ］−ＡＴＰによる戻しリン酸化並びに抗−ホスホセリンイムノブロットの両方を用いて試験した（図２Ａ及びＢ）。
【００９４】
印象的なことに、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、非不全心臓に比較して、ヒト及び動物モデル（ペーシング誘導された心不全のイヌ）からの不全の心臓において顕著に上昇した（図２Ａ及びＢ）。不全心臓からのＲｙＲ２チャネルのＰＫＡリン酸化は、非不全心臓からのＲｙＲ２チャネルに比較して約４倍増加した。不全の心臓から単離されたＲｙＲ２チャネルのＰＫＡの戻しリン酸化の化学量論は、チャネル（ｎ＝８）のモルあたり０．７±０．３モルのリン酸が転移し、対するに、正常な非不全心臓からのチャネルのモルあたり３．１±０．１モルのリン酸が転移した。これらのデータは、不全心臓においては、テトラマーＲｙＲ２チャネル上の４つのＰＫＡ部位のうちの約３つがインビボにおいてリン酸化されて、正常な非不全心臓から単離されたＲｙＲ２上ではインビボにおいてたった一つしかリン酸化されない。
【００９５】
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化のこの増加は、ＲｙＲ２によるＰＫＡの同時免疫沈殿により測定したところによれば、ＲｙＲ２と結合したＰＫＡ蛋白質のレベルの増加によった（図２Ａ）。ＰＫＡ戻しリン酸化を免疫沈殿させたＲｙＲ２を用いて実施することにより、測定されたリン酸化シグナルがＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を特異的に表したことを保証した。ＲｙＲ２レベルは不全心臓において低下する（Ｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を免疫沈殿させたＲｙＲ２蛋白質の量に対して標準化することにより、正常及び不全心臓からのＲｙＲ２分子あたりのＰＫＡリン酸化の量の確実な比較を保証した（図２Ａ及びＢ）。さらに、免疫沈殿させたＲｙＲ２を抗−ホスホセリン抗体によりイムノブロットしたときに同一な結果が得られたことから（例えば、図２Ｂ挿入図を参照）、不全心臓からのＲｙＲ２チャネルは、非不全心臓からのチャネルに比較してＰＫＡ高リン酸化されたことを確証する。
【００９６】
ドナーの心臓が利用可能でないときの移植物に対するブリッジとして、左心室補助装置（ＬＶＡＤｓ）を使用する。研究が示すことは、装置を不全心臓に移植したときに、ＬＶＡＤｓにより提供される左心室の血行力学上の負荷軽減（unloading）が心臓収縮機能における顕著な改善をもたらすことである（Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。ＬＶＡＤ挿入のとき、組織のコアを患者の左心室から取り出し、そして次に、この組織を、移植のときに利用可能になる外植心臓からの組織と比較する。即ち、前（pre-）ＬＶＡＤサンプルは不全心臓由来であり、そして後（post-）ＬＶＡＤサンプルは改善された機能を有する心臓由来である。ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、非不全心臓からのサンプルに比較して、前ＬＶＡＤ心臓において顕著に増加し、ＬＶＡＤ処理後に正常レベルに戻った（図２Ａ及びＢ）。これらのデータを一緒にすると、１）ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化はインビボにおいて生理学的に制御されている；２）心不全はＲｙＲ２の増加したＰＫＡリン酸化と関連する；そして３）心機能がＬＶＡＤ挿入により改善されるとき、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は正常レベルに戻ることを示す。
【００９７】
末期の心不全患者多数を心臓移植の前にβ−アドレナリンアゴニスト（例えば、ドブタミン）で処理したが、数人の患者は、ドナーの心臓が利用可能の時は家から直接入院し、よって病院では静脈投与されたβ−アドレナリンアゴニストを投与されない。ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、正常に比較して、患者からの心臓において顕著に増加したが、β−アドレナリンアゴニスト上では増加しなかった（図２Ａ及びＢ）。ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、心臓移植前にβ−アドレナリンアゴニストで処置された患者からの心臓においてさらに顕著に増加した（図２Ａ及びＢ）。これらのデータは、心不全の患者へのβ−アドレナリンアゴニストの外来（exogenous）投与が、さらに心臓中のＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を増加できることを示す。
【００９８】
不全の心臓において観察されたＲｙＲ２の増加したＰＫＡリン酸化が単にＰＫＡ活性の増加によるのか又はひょっとしたらリン酸基の除去を触媒するホスファターゼの活性の随伴する低下によるのかを決定するため、不全の心臓中のＲｙＲ２に物理的に関連したＰＰ１とＰＰ２Ａの量を、ヒト及びイヌからの正常な心臓のそれらと比較した（図２Ｃ及びＤ）。不全心臓からのＲｙＲ２で同時免疫沈殿させたＰＰ１とＰＰ２Ａのレベルには顕著な低下があった（図２Ｃ及びＤ）。ＲｙＲ２と結合したＰＰ１の量の低下（ＰＰ２Ａではない）は、ＬＶＡＤ処置により正常に回復した（図２Ｃ及びＤ）。これらのデータは、少なくとも一部、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化がＲｙＲチャネルマクロ分子複合体に結合したホスファターゼの低下によることを示唆する。
【００９９】
ＲｙＲ２上のシグナリング複合体結合部位のマッピング
ＲｙＲ２の断片又は完全長のＦＫＢＰ１２．６の何れかをＧａｌ４活性化ドメイン又はＤＮＡ結合ドメインに融合させて含むベクターにより酵母が形質転換されるように、酵母２ハイブリッド蛋白質相互作用スクリーンを用いてＲｙＲ２上のＦＫＢＰ１２．６結合部位を同定した。アミノ酸残基２３６１−２４９６に対応する一つのＲｙＲ２断片（Ｏｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）は、β−ガラクトシダーゼ活性の増加により測定されたところによると、ＦＫＢＰ１２．６との正の相互作用をもたらした（図３Ａ）。ラパマイシン耐性酵母を用いたところ（Ｌｏｒｅｎｚ  ａｎｄ  Ｈｅｉｔｍａｎ，１９９５）、ラパマイシンはＦＫＢＰ１２．６とＲｙＲ２の間の相互作用を酵母において濃度依存性様式にて特異的に阻害することが示されたため（図３Ａ）、ＦＫＢＰ１２．６とＲｙＲ２の間の相互作用は特異的であったことを示唆する。この断片は、ＲｙＲ１，ＩＰ３Ｒ１（Ｃａｍｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、及びＴＲＩ中のＦＫＢＰ１２結合部位に相同であるイソロイシン２４２７及びプロリン２４２８（ズ３Ａ）から構成される疎水性モチーフを含む（図３Ａ）。ＧＳＴ−ＲｙＲ２融合蛋白質をプルダウンアッセイにおいて心臓ＳＲと共に使用することにより、ＲｙＲ２上のＰＰ１（残基５１３−８０８）及びＰＰ２Ａ（残基１４５１−１７６８）のための結合ドメインがマップされた（図３Ｂ）。興味深いことに、ＰＰ１とＰＰ２Ａのための結合ドメインが共にロイシン／イソロイシンジッパーを含む。免疫組織化学は、ｍＡＫＡＰが心臓ＳＲ内に存在するが、ＲｙＲ２と同じ細胞内の位置であり、そしてこの点に関しては正常なヒト心臓と不全ヒト心臓の間に顕著な差異は存在しなかったことを示した（図３Ｃ）。野生型及び変異体ＧＳＴ−ＲｙＲ２融合蛋白質を用いることにより、ＰＰリン酸化の部位を決定した（セリン２８０９、図３Ｄ）。
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化はＦＫＢＰ１２．６結合を阻害する
【０１００】
免疫沈殿したＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化（ＦＫＢＰ１２．６のＰＫＡリン酸化はなかった）は、ＲｙＲ２と同時沈殿するＦＫＢＰ１２．６の量の有意な低下（約９０±９％低下、ｎ＝８，ｐ＜０．００１）をもたらした（図４Ａ）。ＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の解離は、以下の陰性対照において観察されなかった：１）反応物中にＰＫＡ阻害剤を含む反応；２）ＰＫＡを沸騰させる反応；３）ＡＴＰを省いた反応。Ｃａ２＋カルモジュリンキナーゼ（ＣａＭＫＩＩ）もプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）も、共にＲｙＲ２をリン酸化するが、ＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の解離を誘導しなかったことから、ＲｙＲ２からのＰＫＡリン酸化誘導性のＦＫＢＰ１２．６の解離は特異的な効果であることを示す（図４Ａ）。さらに、ヒト（６５±１１％減少、ｎ＝４，ｐ＜０．００５）及びペーシング誘導された心不全のイヌの両方の正常心臓（５０±８％減少、ｎ＝３，ｐ＜０．００５）と比較すると、不全心臓からのＲｙＲにより同時免疫沈殿したＦＫＢＰ１２．６の量に顕著な低下があった（図４Ｂ）。ＦＫＢＰ１２．６の全量は、イムノブロッティングにより測定されたとおり、正常心臓と不全心臓からのホモジェネートにおいて同一であった（データは示さず）。これらのデータは、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化がＲｙＲ２のＦＫＢＰ１２．６結合の生理学的及び病態生理学的な制御の機構を提供する。
【０１０１】
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化はＰｏを増加させてサブコンダクタンス状態を誘導する
ＲｙＲ１又はＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の解離は、以前に、活性化に関するＣａ２＋−依存性を左にシフトすることによりチャネルの開確率（Ｐｏ）を増加させることが示された（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。チャネルからのＦＫＢＰ１２．６の解離の二次的効果は、テトラマーチャネル構造の不安定化に一致してサブコンダクタンス状態を誘導することである（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。平坦な脂質二層中のＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、０．１０±０．０３から０．３５±０．０６への、Ｐｏの顕著な増加をもたらした（ｎ＝４／４，ｐ＜０．００１，例えば、図５Ａ）。ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、ＲｙＲチャネルからのＦＫＢＰ解離後に観察されるのと類似の、サブコンダクタンス状態も誘導した（ｎ＝４，例えば図５Ｂ）（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＲｙＲ２チャネルのＰＫＡリン酸化は、フルコンダクタンス状態の平均開時間を変えなかった（対照チャネルに関してτｏ＝２．１±０．８ｍｓ対２．６±０．６ｍｓＰＫＡ処理後、ｎ＝４，ｐ＝ＮＳ）。しかしながら、長く継続するサブコンダクタンス状態（τｏ＝５０２．１±４０．８ｍｓ）が、二層中のＲｙＲ２チャネルのＰＫＡリン酸化後に観察された（図５Ｂ）。さらに、ホスファターゼ阻害剤オカダ酸（１μＭ）は、ＲｙＲ２のＰｏを０．３±０．１から０．８±０．１に顕著に増加させた（ｎ＝５／６，ｐ＜０．００１）。これらのデータは、ＰＫＡリン酸化がＲｙＲ２チャネルを活性化する機構がＣａ２＋−誘導性活性化に対して増加した感受性をもたらすチャネルからのＦＫＢＰ１２．６の解離を含むことを示唆する。
【０１０２】
心不全及びＰＫＡ高リン酸化は同じＲｙＲ２欠陥を生み出す
ヒト心臓（ｎ＝２１，前ＬＶＡＤ処理心臓サンプルからの３チャネルを含む心不全の３人の患者からの１３チャネル、非不全心臓からの４チャネル、及び後ＬＶＡＤ処理心臓からの４チャネル）及びイヌ心臓（ｎ＝２７，ペーシング誘導された心不全を有する２匹のイヌからの１４チャネル、及び非不全心臓からの１３チャネル）は、不全心臓からのＲｙＲ２チャネルが、ＰＫＡリン酸化されたチャネル（図５Ｂ）と同じ変化を単一チャネル特性中にて呈した（図６Ａ及びＢ）ことを明らかにした。不全心臓からのＲｙＲ２チャネルは、低シス（cis）（細胞質）Ｃａ２＋濃度において増加したＰｏを呈した（５０ｎＭ，０．２４±０．２１対０．００２±０．００１、ｎ＝２７不全心臓、ｎ＝２１非不全心臓及び後ＬＶＡＤ心臓、ｐ＜０．０００１）。５０ｎＭの低シス（cis）（細胞質）［Ｃａ２＋］において、不全心臓からの７０％のＲｙＲ２チャネル（１９／２７）が非不全心臓からの９．５％（２／２１）に比較して、増加したＰｏ（Ｐｏ＞０）を呈した。さらに、５０ｎＭのシス（cis）（細胞質）［Ｃａ２＋］において活性であったＲｙＲ２チャネルにより呈された２種類の挙動があった。不全心臓からの５６％のＲｙＲ２チャネルは、低レベルの活性を呈し（ｎ＝１５／２７，Ｐｏ約０．０３）たが、異常であり、何故ならば、非不全心臓からのチャネルは５０ｎＭのシス（cis）（細胞質）［Ｃａ２＋］においてはほとんどいつも完全に不活性だからである（図６Ｂ）。厳密に言えば、不全心臓からの１５％のＲｙＲ２チャネル（ｎ＝４／２７）は、正常心臓からのチャネルにおいてはけっして観察されなかった第２の種類の挙動を呈した：５０ｎＭのシス（cis）（細胞質）［Ｃａ２＋］においてＰｏ約１．０にて長く継続するサブコンダクタンス状態であり（図６Ｂ）、二層中のＲｙＲ２チャネルのＰＫＡリン酸化後に観察されたものと類似であった（図５Ｂ）。これらのサブコンダクタンス状態は、顕著に増加した開時間（τｏ＝８０２．１±６６．７ｍｓ）を有し、非不全心臓からのＲｙＲ２チャネル（τｏ＝２．２±０．７ｍｓ）と比較される（例えば、図６Ｂ参照）。５０ｎＭのシス（cis）（細胞質）［Ｃａ２＋］において活性なＲｙＲ２チャネルは、心臓周期を通して（収縮期及び拡張期の両方において）開くと予測される。
【０１０３】
不全心臓からのＲｙＲ２チャネルの５２％において、サブコンダクタンス状態が観察され（ｎ＝１４／２７）たが、正常心臓からのチャネルでは５％未満にしか存在しなかった（ｎ＝１／２１，ｐ＜０．００１）（例えば、図６Ａ参照）。当該サブコンダクタンス状態は、ＲｙＲ１チャネルをＦＫＢＰ１２なしで発現させたときに観察されたもの（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）又はＦＫＢＰ１２．６が天然ＲｙＲ２チャネルから解離されたときに観察されたもの（Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）及びＰＫＡリン酸化されたチャネル中で観察されたもの（図５Ａ）と類似である。上記のとおり、不全の心臓からのチャネルも増加したＰＫＡリン酸化（図２Ａ及び２Ｂ）及び減少したＦＫＢＰ１２．６結合（図４Ｂ）を呈した。これらのデータは、不全心臓中のＲｙＲ２の増加したＰＫＡリン酸化がＦＫＢＰ１２．６の解離をもたらし、不安定化されたチャネル及び変化したＣａ２＋感受性に一致して、サブコンダクタンス状態及び増加したＰｏにより特徴付けされる単一チャネル特性の欠陥を引き起こす（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。
【０１０４】
ＬＶＡＤ処理により回復したβ−アドレナリンアゴニスト応答
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化の生理学上のレベルはＳＲ  Ｃａ２＋放出を増加させて、心臓筋肉収縮性を増加させ、少なくとも一部は、β−アドレナリンアゴニストの筋肉収縮支配効果を説明する。不全心臓において心臓収縮性におけるβ−アドレナリンアゴニスト誘導による増加が鈍くなることは、不全心臓においてβ−アドレナリン受容体のダウン制御及び脱感作に帰した（Ｂｒｉｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０１０５】
β−アドレナリンアゴニストに対して鈍くなった応答性は、一部には、不全心筋においてはＲｙＲ２が既に高リン酸化されており（図２Ａ及び２Ｂ）、そしてさらにＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化が起こり得ないという事実により説明されるかもしれない。ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を非不全心臓において観察されたレベルへ戻るまで低下させる介入（intervention）が、心臓収縮性におけるβ−アドレナリンアゴニスト誘導性の増加を回復させるべきである。この仮説を試験するため、我々は、イソプロテレノール−誘導性収縮を測定できるような条件下で、器官バスに入れられた前−及び後−ＬＶＡＤの心臓から単離された筋肉ストリップを使用した。正常心臓に比較して、前−ＬＶＡＤ（不全）筋肉ストリップはイソプロテレノールに対して鈍い応答を呈し（図６Ｃ）、ＬＶＡＤ処理後に顕著に回復した。ＬＶＡＤ処理は、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を正常レベルに回復させ（図２Ａ及び２Ｂ）、そしてＲｙＲ２／Ｃａ２＋放出チャネルの単一チャネル特性における欠陥を逆転させた（データは示さず）。これらのデータは、後−ＬＶＡＤ筋肉において観察されたβ−アドレナリンアゴニストに対する感受性の回復が、一部には、これらのＲｙＲ２チャネルが生理学的にＰＫＡリン酸化される利用可能性の増加により説明されるかもしれないことを示唆する。
【０１０６】
考察
本出願は、ＰＫＡリン酸化がＲｙＲ２へのＦＫＢＰ１２．６結合を制御し、刺激−収縮カップリングに必要な筋小胞体のＣａ２＋放出チャネルを変調させる機構を提供する。不全心臓におけるＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、以下の異常な単一チャネル特性をもたらした：１）活性化のための増加したＣａ２＋感受性；及び２）テトラマーチャネル複合体の不安定化に関連した、上昇したチャネル活性（Ｐｏ）（非不全心臓からのチャネルにはけっして観察されなかった長く継続する部分的開状態を含むサブコンダクタンス状態として明らかにされた）。同時沈降及び同時免疫沈殿研究を用いて、ＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡ，ＲＩＩ，ＰＰ１及びＰＰ２Ａを含むＲｙＲ２チャネルマクロ分子複合体、及びｍＡＫＡＰを規定するために使用されたことから、上記チャネルのリン酸化は局所的に調節される（controlled）ことを示唆する（図７）。
【０１０７】
ＦＫＢＰ１２．６及びＦＫＢＰ１２は、それぞれ、心臓筋肉ＲｙＲ２及び骨格筋ＲｙＲ１のＳＲ  Ｃａ２＋放出チャネルの絶対必要な成分であり（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍａｒｋｓ，１９９６）、そして正常なチャネル関門開閉に必要である（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＦＫＢＰ１２／１２．６のＲｙＲ１又はＲｙＲ２からの解離は、チャネル機能に３つの欠陥をもたらす：１）完全な開チャネルの１／４，１／２及び３／４に等しいコンダクタンスを伴うサブコンダクタンス状態；２）増加したＰｏ；及び３）Ｃａ２＋−依存性活性化に対する増加した感受性（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＦＫＢＰ１２／１２．６除去後のチャネルにおいて呈された増加したＰｏは、Ｃａ２＋−依存性活性化に対する増加した感受性により説明され（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、ＲｙＲチャネルのＣａ２＋−依存性を記載するベル型の曲線の上昇する部分の左へのシフトを表す（Ｂｅｚｐｒｏｚｖａｎｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。低細胞質Ｃａ２＋（例えば、５０ｎＭ［Ｃａ２＋］、図６Ｂを参照）における増加したＰｏは、不適切な活性ＳＲ  Ｃａ２＋放出シグナルをもたらすはずである。これは、心臓の収縮機能を害するかもしれないＳＲ  Ｃａ２＋の枯渇を導くはずである（筋肉収縮を活性化するＣａ２＋シグナルを減じることにより）。低細胞質Ｃａ２＋における不適切なＳＲ  Ｃａ２＋放出チャネル活性化は、致命的な心臓不整脈を誘因し且つ心臓性急死を引き起こす、初期及び遅延した後−脱分極の一因ともなるかもしれない（Ｆｏｚｚａｒｄ，１９９２）。
【０１０８】
ＰＫＡリン酸化により誘導されたＲｙＲ２単一チャネル機能の変化は、ＦＫＢＰ１２．６がチャネルから解離した時に観察されるのに相当する（図５Ａ及び５Ｂ）。我々の発見と一致して、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は上記チャネルの活性を増加させることが報告された（Ｈａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｖａｌｄｉｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。不全心臓から単離されたＲｙＲ２チャネルはＰＫＡ−高リン酸化されており（図２Ａ及び２Ｂ）、そしてインビトロＰＫＡ−リン酸化されたチャネルにおいて観察された機能において同じ変化を呈した（図６Ａ及び６Ｂ）。これらのデータを一緒にすると、不全心臓におけるＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化は制御サブユニットＦＫＢＰ１２．６の解離によりチャネル機能において欠陥を誘導することが示される。心臓機能を改善する機械的装置（ＬＶＡＤ）による心不全の治療は、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化の、正常ヒト心臓において観察されたレベルまでの低下と関連した（図２Ａ及び２Ｂ）。さらに、ＬＶＡＤ処置は、標準化されたＲｙＲ２単一チャネル機能をもたらした（即ち、サブコンダクタンス状態の減少、活性化のためのＣａ２＋感受性の標準化及び低下したＰｏ）。
【０１０９】
ＦＫＢＰ１２のＲｙＲ１からの解離の追加の効果は、隣接するチャネルの関門開閉を分離する（uncouple）ことである（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。我々は、ＦＫＢＰ１２．６がＲｙＲ２チャネル間のカップリングされた関門開閉に必要であることを最近発見した。カップリング関門開閉は均一に活性化され得ることにより、心臓筋肉収縮を誘因するように、最適なＣａ２＋シグナルをもたらす。分離したＲｙＲ２チャネルの一つの意義は、心筋症の心臓において実験上観察された刺激−収縮カップリングの増進の損失のはずである（Ｇｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１１０】
本出願は、心臓のＳＲ並びに核周囲の領域に局在した（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）筋肉Ａキナーゼアンカリング蛋白質（ｍＡＫＡＰ）がＲｙＲ２と共沈降して共に免疫沈殿することを開示する。ｍＡＫＡＰはＲｙＲ２に直接結合することができ、ＮＭＤＡ受容体へ直接結合するｙｏｔｉａに類似しており（Ｗｅｓｔｐｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、あるいはアダプターによる。ＰＫＡ制御性サブユニットＲＩＩはＡＫＡＰｓに直接結合し（Ｆｒａｓｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９９）、そしてＰＫＡ触媒サブユニットを固定する（anchor）。ＰＰ１とＰＰ２Ａは、直接か又はそれら自身の制御／標的化蛋白質により、おそらくは、ＲｙＲ２中に存在するロイシンイソロイシンジッパーに結合することにより、ＲｙＲ２と相互作用するかもしれない。
【０１１１】
β−アドレナリンシグナリングカスケード成分（刺激性Ｇ−プロテインＧｓ及びアデニルシクラーゼ）は、ラットの心室筋細胞中で貫通管状（transverse tubular）ネットワークに局在した（Ｌａｆｌａｍｍｅ  ａｎｄ  Ｂｅｃｋｅｒ，１９９９）。即ち、ＰＫＡ，ＲＩＩ，ＰＰ１及びＰＰ２ＡをＲｙＲ２複合体に固定化してＴ−管−ＳＲ接続へβ−アドレナリンシグナリングカスケードの上流成分を局在化させる一つの重要な意義は、ＲｙＲ２のリン酸化／脱リン酸化が刺激−収縮カップリングの部位において局所的に制御され得ることである。
【０１１２】
不全心臓からのチャネルのＰＫＡ戻しリン酸化の化学量論は０．７であったことから（完全に脱リン酸化されたチャネルに関しては３．８であり、そして非不全心臓からのＲｙＲ２に関しては３．１）、ＲｙＲ２上の４つのＰＫＡ部位の約３つが不全心臓においてはリン酸化されており、対するに、非不全心臓においてはＲｙＲ２上に一つ又は無しであったことを示す。ＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化は、正常心臓からのチャネルに比較して、不全心臓からのＲｙＲ２チャネルへ結合したＦＫＢＰ１２．６の量の約６０％の低下を説明する（図４Ｂ）。ＲｙＲ２チャネルへのＦＫＢＰ１２．６結合のこの低下は、ＦＫＢＰ１２．６をラパマイシン又はＦＫ５０６を用いてチャネルからコンピートオフする時に観察されたものと類似の、偏光された単一チャネル特性を呈した不全心臓からのＲｙＲ２の約７０％を占めるかもしれない（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。さらに、不全心臓からのチャネルの１５％がもっとも重度の欠陥を呈した（５０ｎＭ細胞質［Ｃａ２＋］においてＰｏが約１の長く継続するサブコンダクタンス状態、例えば、図６Ｂ参照）ことから、これらのチャネルは結合したＦＫＢＰ１２．６を一つ有するか又は有さないことを示唆する。
【０１１３】
心不全は合衆国における死亡率及び罹患率のトップの原因であり、年間約４００，０００人の死亡を占め、心臓性急死（ＳＣＤ）と呼ばれる心拍の障害により引き起こされるこれらの死の約５０％である。ヒト心不全と心不全の多数の動物モデルの共通の特徴は、高アドレナリン状態であり、そして及び循環するカテコールアミンのレベルの上昇が、心不全患者における増加した死亡率に関するマーカーである（Ｃｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。
【０１１４】
研究が証明したことは、不全心臓筋肉におけるβ−アドレナリン受容体のダウン制御及びそれらの下流のシグナリング分子であるＧ−プロテインからの分離に寄与しうるこれらの受容体の脱感作である（Ｂｒｉｓｔｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）が、β−アドレナリンブロッカーが心不全のもっとも重要な治療法の一つであることが証明されたため、いくらかの混乱を招いた（ＣＩＢＩＳ−ＩＩ，１９９９；Ｍｅｒｉｔ，１９９９）。いくつかの研究は、ＡＭＰレベル及びＰＫＡ活性が不全のヒト心臓において変化しないこと（Ｋｉｒｃｈｈｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｒｅｇｉｔｚ−Ｚａｇｒｏｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）又はｃＡＭＰレベルは減少するがＰＫＡ活性は変化しないことである（Ｂｏｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。β−アドレナリンブロッカーの使用は、直感に反する物として考察されたが、アドレナリンシステムが不全心臓においてはダウン制御されていると考えられ、そして陰性の筋肉収縮支配特性をもつドラッグが患者に対して危険な可能性があると考えられるためである。よって、心不全の患者においてβ−アドレナリンブロッカーにより提供された治療上の利益の分子上の基礎の機械論的な理解は、この疾患に対するアプローチにおける重要な進歩である。進行中の実験は、β−アドレナリンブロッカーが速い心臓ペーシングにより誘導された心不全を有するイヌにおいてＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化を逆転させることを証明する。
【０１１５】
本研究は、筋小胞体Ｃａ２＋放出チャネルのＲｙＲ２が予測に反して不全心臓においてＰＫＡ−高リン酸化されることを示す。これらのデータは、局所シグナリングが不全心臓からの心筋においてＰＫＡ基質のリン酸化を低下させるよりもむしろ増加させるかもしれないという概念を呼び起こす。
【０１１６】
ＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化の驚くべき発見に関する一つの説明は、ＲｙＲ２に対するホスファターゼの標的化が不全心臓においてはダウン制御されているかもしれないということである。事実、我々は、ＲｙＲ２と結合するＰＰ１とＰＰ２Ａのレベルが不全心臓においては顕著に低下したことを発見した（図２Ｃ及びＤ）。細胞のＰＰ１レベルは不全心臓において増加した（Ｎｅｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）；即ち、ＲｙＲ２−結合ＰＰ１の低下は、心臓内のＰＰ１レベルの標準化された低下により説明できないＲｙＲ２とのＰＰ１結合の特定の低下によるに違いない。
【０１１７】
Ｃａ２＋過度電流（transient）の減少した振幅と遅延した減衰を含む不全心臓内で観察される低下した収縮性を説明できたＣａ２＋制御の欠陥が、記載された（Ｂｅｕｃｋｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍｏｒｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。しかしながら、これらの欠陥に関する分子上の基礎は明らかにされていない。筋小胞体からのＣａ２＋の放出及び取込みが心臓の収縮期における収縮の力を調節している。ＳＲのＣａ２＋放出はＲｙＲ２の活性化により起こり、そしてＣａ２＋の再取込みがＳＲのＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅにより起こり、今度は、ホスホランバンにより制御される。ＰＫＡは心筋において複数の基質を有し、ホスホランバン、筋繊維鞘上のＬ−タイプのＣａ２＋チャネル及び収縮装置の成分を含む。しばらくの間は、β−アドレナリンアゴニストが心臓収縮性を制御することに関与する分子の活性を変調できると理解されてきた。明らかに、心不全と同じくらい複雑な疾患は、多数の分子とＣａ２＋ホメオスタシスの制御に寄与するシグナリング経路の間の相互作用を含む。本研究を区別する一つのキーポイントは、動物モデル（例えばペーシング化イヌモデル）のみならず、ヒトの心不全においても起こるＣａ２＋操縦（handling）分子内の機能上の欠陥の同定であり、そしてヒトにおいては心不全の治療（例えば、ＬＶＡＤ）により逆転される。
【０１１８】
本出願は、ＦＫ−５０６結合蛋白質１２．６（ＦＫＢＰ１２．６）を放出することによりセリン２８０９上の心臓ライアノジン受容体／カルシウム放出チャネル（ＲｙＲ２）のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）リン酸化がチャネルを活性化することを開示する。不全心臓において（心不全のヒト並びに動物モデル）、ＲｙＲ２はＰＫＡ−高リン酸化されており、欠陥のあるチャネルをもたらすが、それらに結合したＦＫＢＰ１２．６の量が低下しており且つカルシウム誘導性活性化に体する感受性が増加している。これらの変化の正味の結果は、ＲｙＲ２チャネルが「漏出性」なことである。これらの「漏出性」なチャネルは、筋肉の収縮のための強い刺激を提供するように筋小胞体内に十分ではないカルシウムが存在するように、カルシウムの細胞内貯蔵の枯渇をもたらし得る。これは、心臓筋肉の弱い収縮をもたらす。「漏出性」なＲｙＲ２チャネルの二次的な重要性は、拡張期として知られる心臓周期の休止期の間にそれらがカルシウムを放出することである。拡張期の間のカルシウムのこの放出は心臓の致命的な不整脈を誘因し得て（例えば、心室頻脈及び心室細動）、心臓性急死を導く。
【０１１９】
出願は、ＰＫＡリン酸化によるＦＫＢＰ１２．６のチャネルへの結合を生理的に調節することにより、ＲｙＲ２チャネルの機能を変調させるための新規な機構を開示する。さらに、不全心臓中で欠陥機能を伴うＰＫＡリン酸化されたチャネルの発見は、心不全における心臓機能不全の機構を提供する。出願は、心臓の筋肉の収縮を制御して心不全を治療するための新規な標的を開示する。さらに、出願は、ＲｙＲ２チャネルへのそれらの効果をアッセイすることにより、心臓疾患に対して治療上の新規なアプローチを試験する方法を開示する。
【０１２０】
実験セットＩＩ
本出願は、偏光されたＲｙＲ２チャネル機能と心室不整脈の間のリンクを証明するデータを提供し、そしてＲｙＲ２複合体からのＦＫＢＰ１２．６の枯渇による欠陥チャネル機能が、ＤＡＤｓを導いて心室不整脈を誘因し得る異常なＳＲ  Ｃａ２＋放出の根底にある一つの分子機構かもしれないことを示唆する。
【０１２１】
以下の実験は、運動の間に、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化がチャネルからＦＫＢＰ１２．６を一部解離させることにより、細胞内Ｃａ２＋放出及び心臓収縮性を増加させる。ＦＫＢＰ１２．６欠損マウス及びＣＰＶＴの患者からのＲｙＲ２チャネルが対照と比較して運動の間はより活性であること、及びＦＫＢＰ１２．６欠損マウスが不整脈を誘因し得て心臓性急死を導く後脱分極を呈することを示すデータが提供される。心臓不整脈を治療する新規な治療上のアプローチは、よって、ＲｙＲ２マクロ分子複合体内のＦＫＢＰ１２．６欠損により誘導される「漏出性」なＲｙ２チャネル致命的な不整脈を誘因し得るとの発見に基づいて提供される。
【０１２２】
材料と方法
ＦＫＢＰ１２．６−欠損マウス
ヒトＦＫ５０６結合蛋白質１２．６（ＦＫＢＰ１２．６）のマウスオルソログのマウスゲノミックλ−ファージクローンを、ＤＢＡ／１ｌａｃＪライブラリーから、完全長のマウスｃＤＮＡプローブを用いてファイザー社のジェーンベネット博士の研究室において単離した。マウスＦＫＢＰ１２．６の全コーディング配列を含むエクソン３及び４を（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、３．５ｋｂのマウスゲノミックＤＮＡをＰＧＫ−ｎｅｏ選択可能マーカーで置換することにより欠失させるように、標的化ベクターをデザインした。５．０ｋｂの５’断片及び１．９ｋｂの３’断片を、ＰＧＫ−ｎｅｏとＰＧＫ−ＴＫカセットを伴うバックボーンベクターであるｐＪＮＳ２にクローン化した。ＤＢＡ／ｌａｃＪ胚性幹（ＥＳ）細胞を生育させ、そして確立されたプロトコルを用いてトランスフェクトした。陽性及び陰性の選択を用いることにより、標的化されたＥＳ細胞系の同定のためのクローンを単離して増殖させた。標的化されたＥＳ細胞を、最初に、サザン分析によりＦＫＢＰ１２．６座の５’末端上でスクリーニングした。ＦＫＢＰ１２．６の５’相同領域から上流のＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｃＩ  ＤＮＡ断片を用いて、ＢｇｌＩＩにより消化されたゲノミックＥＳ細胞ＤＮＡを釣り上げた。この方法は、８．５ｋｂの内因性断片を同定し、そして７．７ｋｂのバンドを標的とする正確な遺伝子が観察される。ゲノミックのサザン分析は、６９の選択されたＥＳ細胞コロニーから、上流プローブを用いて、５つの陽性の標的化クローンを証明した（＃１４，１５，２０，３４，９７）。これらの５つの陽性ＥＳ細胞系をＰＣＲにより分析することにより、３’相同アーム及び標的ＦＫＢＰ１２．６座により相同組換えを確認した。ＰＧＫ−ｎｅｏ１０２３ＦからのＰＣＲプライマー（５’−ｇｇａｔｇａｔｃｔｇｇａｃｇａａｇａｇｃａｔｃ−３’）及びＦＫＢＰ１２．６内の配列３’１．９ｋｂ相同アームの外部、ＦＫＢＰ１２．６  ４４８Ｒ（５’−ｃｔｃｔｃｔｇｃａｇｇｇｇｇｔｇｃａｔｔｇｃ−３’）は、サザン分析により同定された、４／５のＥＳ細胞系（＃１４，１５，２０，９７）内で、予測された２．４ｋｂの断片を増幅した。これら４つの核型分析は、系＃１５が一致した異数性を有し、そして終結したことを標的化ＥＳ細胞系が決定したことを確認した。細胞系＃９７からの標的化ＥＳ細胞を、Ｃ５７ＢＩ／６胚盤胞へ注入した。オスのキメラをＤＢＡ／１ｌａｃＪメスと交配して、生殖細胞子孫がブラウンコート色により同定された。生殖細胞子孫は５’サザン分析を用いて遺伝子型分類された。陽性ＦＫＢＰ１２．６＋／−のオスとメスを交配したところ、子孫は約２５％の頻度でＦＫＢＰ１２．６−／−であった。ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスは稔性であり、そしてオスとメスのＦＫＢＰ１２．６−／−マウスを交配することにより次のコロニーを確立し、よって、同系交配の遺伝子背景を維持した。ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスにより実施した全ての研究は、対照として同じ齢及び性別に適合させたＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスを用いた。以下のバックグラウンド：ＤＢＡ／Ｃ５７ＢＬ６混合、純粋ＤＢＡ及び純粋Ｃ５７ＢＬ６上で出現したＦＫＢＰ１２．６−／−マウス間で��差異は観察されなかった。
【０１２３】
マウス遺伝子型の同定のためにサザンブロット分析を用いた。マウス尾部サンプルから単離されたＤＮＡをＢｇｌＩＩで切断して、Ｐｒｉｍｅ−ａ−Ｇｅｎｅ標識キット（プロメガ）を用いて３２Ｐ−α−ｄＣＴＰにより標識された５’プローブとハイブリダイズさせた。標的化ベクターの５’からすぐ上流に位置するＤＮＡの１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＭｓｃＩ断片を単離することにより、プローブＤＮＡを得た。野生型マウス及び同型接合型変異マウスからのＤＮＡは、それぞれ、８．５ｋｂと７．７ｋｂのバンドを生じた。ＦＫＢＰ１２．６蛋白質の不在は、心臓組織及び特異的には共免疫沈殿によるＲｙＲ２マクロ分子複合体中の両方においてイムノブロッティングにより証明した（図８Ｃ）。
【０１２４】
マウスの心臓エコー図
胸腔を通しての心臓エコー図を齢及び性別適合させたマウスに対して、１５ＭＨｚの変換器を備えたＰｈｉｌｉｐｓ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｏｎｏｓ  ５５００超音波マシンを用いて実施した。体重適合基準にて、２．５％の２−２−２トリブロモエタノールを静脈内投与してマウスを麻酔した。短軸の二次元（２Ｄ）視野を乳頭筋肉のレベルにて得た。次に、腹側と背面を通る２ＤガイドされたＭ−モードのトレースを１００ｍｍ／ｓの前進スピードにて得た。２Ｄ視野を用いることにより、左心室の背面壁の厚さ（ＬＶＰＷＴ）と左心室弛緩末期の寸法（ＥＤＤ）の両方を測定した。Ｍ−モードのトレーシングを用いることにより、拡張期及び収縮期の両方の内部寸法（それぞれ、ＬＶＩＤｄ及びＬＶＩＤｓ）を測定した。フラクションの短縮化（ＦＳ）をＬＶＩＤｄ−ＬＶＩＤｓ／ＬＶＩＤｄとして計算した。
【０１２５】
マウスにおける遠隔測定レコーディング及び運動試験
コロンビア大学の公共団体動物ケア及び活用委員会により承認されたプロトコルに従い、ＦＫＢＰ１２．６＋／＋及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスを維持して、研究した。ケタミン（５０μｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０μｇ／ｋｇ）の静脈内注射を用いて動物を麻酔した。移動性の動物のＥＣＧ無線遠隔操作（radiotelemetry）レコーディングを静脈内移植の＞４８時間に得た（データサイエンスインターナショナル、セントポール、ＭＮ）（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。各マウスに関して連続レコーディングを回収したが、明らかに規定された開始と終結のシグナルを伴うＥＣＧ複合体のみをサンプルした。標準的な基準を用いることにより、ＥＣＧパラメーターを測定した（Ｍｉｔｃｈｅｌｌｅ  ｔ  ａｌ．，１９９８）。ＱＴ間隔を、２相Ｔ波の終わりまで測定した（Ｔｒ  ＋  Ｔｓ；ＱＴｃ＝ＱＴ／（ＲＲ／１００）；Ｍｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照）。ストレス試験に関しては、マウスを疲労困憊するまで傾斜した踏み輪の上で運動させ、そしてエピネフィリン（０．１−０．５ｍｇ／ｋｇ）を静脈注射した（Ｍｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。４時間かけて休止心臓速度を平均化することにより、移動性の動物の心臓速度を測定した。
【０１２６】
組織学分析
ＰＢＳ／２０ｍＭ  ＫＣｌ溶液により拡張期に心臓を止めて、１０％中性緩衝化ホルマリンにより２０ｍｍＨｇにて圧力を固定した。パラフィン埋包組織を切片化し（８μｍ）、そしてヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）により光学顕微鏡のために染色した。パラフィン切片をピクロシリウスレッドによっても染色し、そして心筋のコラーゲンの分布を評価するために偏光光学顕微鏡により分析した。
【０１２７】
マウスからのＳＲの調製
心臓を１．０ｍｌのホモジェナイズ化バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓマレイン酸、ｐＨ６．８，２０ｍＭ  ＮａＦ，及びプロテアーゼ阻害剤）中でホモジェナイズすることにより、心臓ホモジェネートをＦＫＢＰ１２．６＋／＋及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスから調製し、そして３，０００ｇにて１０分間遠心分離した。上清を次に１２，０００ｇにて２０分間遠心分離した。１２０，０００ｇにおいて３０分間の最後の遠心分離からの沈殿物を５０μｌの懸濁バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓマレイン酸、ｐＨ６．８，０．９％  ＮａＣｌ，３００ｍＭ蔗糖）に懸濁して、アリコート化し、そして使用まで−８０℃に保存した。
【０１２８】
ＣＶＴ−結合ＲｙＲ２及びＦＫＢＰ１２．６変異体の生成と発現
シャメロンの部位特異的変異導入キット（ストラタジーン）を用いて変異導入を実施した。ＲｙＲ２に示された変異を導入するように、そして導入された制限部位を用いて変異クローンの選択を可能にするように、以下のプライマーをデザインした：（Ｓ２２４６Ｌ）５’−ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＡ ＣＴＡ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＡＴ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＡ  ＧＣ；（Ｒ２４７４Ｓ）５’−Ｇ  ＧＴＴ  ＴＴＡ  ＣＴＴ  ＧＡＧ  ＡＧＣ  ＧＴＡ  ＴＡＣ  ＧＧＧ  ＡＴＴ  ＧＡＧ  Ｇ；（Ｒ４４９７Ｃ）５’−ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＴＡＴ  ＴＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＴＴＴ  ＴＡＣ  ＡＡＣ  ＡＴＧ。ＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄ変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異導入キット（ストラタジーン、ラホーヤ）を用いて、以下のプライマーを使用して生成した：５’−Ｃ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＣＧＴ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＧＴＴ  ＴＣ，及び５’−ＧＡ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＧ  ＡＧＴ  ＣＣＧ  Ｇ。
【０１２９】
ｐＲＳＥＴ−Ａ−ＦＫＢＰ１２．６内で、リバースプライマー５’−ＣＴＧ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＣＴＡ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＴＧＧを用いて、変異体スクリーニングのためにｂｐ１２１にてＸｍａＩ部位を導入して使用することにより、ＦＫＢＰ１２．６変異Ｄ３７Ｓを生成した。ｐＲＳＥＴ−Ａ−ＦＫＢＰ１２．６（Ｄ３７Ｓ）からのＢｓｍＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＣＭＶ−ＦＫＢＰ１２．６プラスミドにサブクローン化することにより、プラスミドｐＣＭＶ−ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓを生成した。
【０１３０】
Ｃａ２＋リン酸法を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に２０μｇのＲｙＲ２  ＷＴ又は変異体のｃＤＮＡ及び１０μｇのＦＫＢＰ１２．６  ｃＤＮＡを同時トランスフェクトし、そして以前に記載されたとおりに機能性ＲｙＲ２チャネルを含む小胞体を調製した（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１３１】
ＲｙＲ２の免疫沈殿
マウスの心臓のＳＲからのＲｙＲ２の免疫沈殿を以前に記載されたとおりに実施した（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。心臓のＳＲ（２００μｇ蛋白質）を０．５ｍｌのバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．９％  ＮａＣｌ，０．５ｍＭ  ＮａＦ，０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，及びプロテアーゼ阻害剤）に懸濁して、そして一晩４℃において抗−ＲｙＲ−５０２９抗体とインキュベートした（イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）のみを陰性対照として免疫沈殿に用いた、データは示さず）。プロテインＡ−セファロースビーズをサンプルに加え、そして４℃において１時間コンスタントに撹拌しながら加えた。ビーズを１Ｘリン酸化バッファー［５０μＭ  ＭｇＣｌ及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸），ｐＨ６．８］により洗浄し、そして１０μｌの１．５Ｘリン酸化バッファーに懸濁した。
【０１３２】
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化
心臓のＳＲ膜を以前に記載されたとおりに調製した（Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。蛋白質濃度はブラッドフォードアッセイにより測定した。ミクロソーム（５０μｇ蛋白質）を、ＰＫＡの触媒サブユニット（１０ユニット、シグマ、セントルイス、ＭＯ）を含む９０μｌのリン酸化バッファー［５０μＭ  ＭｇＣｌ及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸），ｐＨ６．８］に、特異的ＰＫＡ阻害剤ＰＫＩ５−２４（５００ｎＭ，カルビオケム、サンディエゴ、ＣＡ）の存在又は不在下で懸濁した。リン酸化はＭｇ−ＡＴＰ（５０μＭ）の添加により開始し、そして３０分間室温におけるインキュベーション後にＰＫＩの添加により終結させた。サンプルを１００，０００ｇにて２０分間遠心分離して、４回洗浄し、そして１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び２５０ｍＭ蔗糖を含む２０μｌのバッファーに懸濁した。アリコートを−８０℃に保存した。
【０１３３】
免疫沈殿したＲｙＲ２の標識されたＡＴＰによる戻しリン酸化を使用することにより、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化の程度を測定してよい。戻しリン酸化は、免疫沈殿したＲｙＲ２（１０μｌの１．５Ｘリン酸化バッファーに懸濁された）に、ＰＫＡ（５ユニット）及び１０％の標識されたＡＴＰ、例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（ＮＥＮライフサイエンセズ、ボストン、ＭＡ）を含むＭｇ−ＡＴＰ（３３μＭ）を加えることにより開始する。反応物を５分間室温においてインキュベートし、そして５μｌの停止溶液（４％ＳＤＳ及び０．２５Ｍ  ＤＤＴ）の添加により終結させる。サンプルを９５℃に加熱し、そして６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分画する。戻しリン酸化は、ＲｙＲ２に結合した標識の量を定量すること、例えば、モリキュラーダイナミックスホスホルイメージャー及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウエア（アマシャムファルマシアバイオテック、ピスカタウエイ、ＮＪ）を用いてＲｙＲ２の放射性を定量すること、そしてイムノブロッティング及び密度測定により測定された免疫沈殿物中のＲｙＲ２蛋白質の量により割ることにより測定される。
【０１３４】
イムノブロット
ミクロソーム（５０μｇ蛋白質）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＲｙＲ２に関しては６％、ＦＫＢＰ１２．６に関しては１５％）によりサイズ分画し、そして５０Ｖにて一晩ニトロセルロース膜に転写した。膜は、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％ミルクによりブロックし、そして一次抗体（抗−ＦＫＢＰ１２、１：１，０００希釈）、抗−ＲｙＲ（５０２９，１：３，０００）（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、又は抗−ホスホＲｙＲ２（Ｐ２８０９，１：５，０００）と１時間室温においてインキュベートした。Ｐ２８０９ホスホエピトープ−特異性抗−ＲｙＲ２抗体は、親和精製されたポリクローナルウサギ抗体であり、ＲｙＲ２に相当するＳ２８０９においてＰＫＡ−リン酸化されたペプチドＣＲＴＲＲＩ−（ｐＳ）−ＱＴＳＱを用いて、Ｚｙｍｅｄラボラトリーズ（サンフランシスコ、ＣＡ）によりカスタムメイドされたものであった。洗浄後に、膜をホースラディッシュパーオキシダーゼ−コンジュゲートされた抗−ウサギＩｇＧ（１：５，０００希釈、トランスダクションラボラトリーズ、レキシントン、ＫＹ）と６０分間室温においてインキュベートし、Ｔｒｉｓ−緩衝塩溶液により３回洗浄し、そしてＥＣＬ増強化学発光を用いて発色させた（アマシャムファルマシア、ピスカタウエイ、ＮＪ）。
【０１３５】
細胞トランスフェクション
ヒトの胚腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ギブコ）を含み、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ギブコ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）を追加された最少必須培地（ＭＥＭ）中で生育させ、そしてＣａ２＋リン酸沈殿法を用いて２０μｇのｃＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、ＳＲミクロソームを調製した。
【０１３６】
単一チャネルレコーディング
マウス心臓由来の天然のＲｙＲ２又は組換えＲｙＲ２の単一チャネルレコーディングを、電圧クランプ条件下で０ｍＭにおいて前に記載されたとおりに獲得した（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。チャネルを含む小胞体を、ＫＣｌを用いて、３：１ホスファチジルエタノールアミン／ホスファチジルセリン（アナティポラーリピッズ、バーミンガム、ＡＬ）からなる平坦な脂質２層に融合させた。チャネルレコーディングのために使用された相称性（symmetric）溶液は（ｍｍｏｌ／ｌ）：トランスコンパートメント、ＨＥＰＥＳ  ２５０，Ｂａ（ＯＨ）２５３（いくつかの実験においては、Ｂａ（ＯＨ）２をＣａ（ＯＨ）２に置き換えた），ｐＨ７．３５，及びシス（cis）コンパートメント、ＨＥＰＥＳ  ２５０，Ｔｒｉｓ−ベース１２５，ＥＧＴＡ１．０，及びＣａＣｌ２，ｐＨ７．３５であった。他に示さない限り、単一チャネルレコーディングは、１５０ｎＭ  ［Ｃａ２＋］及び１．０ｍＭ［Ｍｇ２＋］の存在下で、シスコンパートメント中で作成した。各実験の結論においては、ライアノジン（５ｍＭ）をシスコンパートメントに適用することにより、特異的関門開閉ブロックによるチャネルの同定を確認した。関門開閉パラメーター（開確率Ｐｏ，平均の（average）平均（mean）開時間及び閉時間Ｔｏ，Ｔｃ）をデジタル化された電流レコーディングから、Ｆｅｔｃｈａｎソフトウエア（アクソンインスツルメンツ、ユニオンシティ、ＣＡ）、そして代表的な２分レコーディングからの結果を図に示す。ＲｙＲ２の開、閉、及び部分開門開閉状態の確率を、全点振幅ヒストグラムから、代表例に関して示されるとおりに測定した。一連の実験において、１５０ｎＭから１０ｍＭシスコンパートメントの増強増加（incremental increase）により測定されたＣａ２＋感受性を、Ｈｉｌｌ方程式を用いた標準回帰分析により測定したところ、ＣＰＶＴ変異体とＷＴのＲｙＲ２チャネルの間では顕著な差異が見いだされなかった。全てのデータは、平均ＳＥ±として表す。不対スチューデンツｔ試験を実験間の平均値の統計比較に用いた。Ｐ＜０．０５の値が統計上有意であると考えた。
【０１３７】
作用ポテンシャルレコーディング
ＦＫＢＰ１２．６＋／＋又はＦＫＢＰ１２．６−／−マウスの心臓から、Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆの方法（Ｒｅｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）を用いて心筋を単離し、そして（ｍＭにて）：ＮａＣｌ（１４０），ＫＣｌ（５），ＭｇＣｌ２（０．５），ＣａＣｌ２（２．５），ＮａＨ２ＰＯ４（０．３３），グルコース（５．５）、ＮａＦ（０．５），及びＨＥＰＥＳ（５），ｐＨ７．４０を３５−３７℃において注いだ（superfused with）。１μＭのイソプロテレノール又は１μＭのエピネフィリンの注入（superfusion）溶液への添加により、細胞のβ−アドレナリン刺激を生じさせた。ピペット（１−３ＭΩ）充填溶液は（ｍＭにて）：ＮａＣｌ（１０），ＫＣｌ（１３０），ＭｇＣｌ２（１．０），ＭｇＡＴＰ（５），ＨＥＰＥＳ（１９），ＴＥＡ−Ｃｌ（２０），ＫＯＨによりｐＨ７．２０であった。アクソパッチ（Axopatch）２００Ａを電流クランプ様式において使用することにより、作用ポテンシャルを記録した（Ｍｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。電流注入（current injections）は、低速の１２Ｈｚにおいて作用ポテンシャルを誘因した。
【０１３８】
ＦＫＢＰ１２．６結合親和性アッセイ
３５Ｓ−標識されたＦＫＢＰ１２．６を製造者の指示書に従い、プロメガ（マジソン、ＷＩ）からのＴＮＴ登録商標Ｑｕｉｃｋ共役された転写／翻訳システムを用いて作成した。［３Ｈ］−ライアノジン結合を組換えミクロソーム上で６０ｎＭ［３Ｈ］−ライアノジンにて実施することにより、野生型（ＷＴ）及び各変異体に関して等量の組換えＲｙＲ２を上記アッセイにおいて用いた。ミクロソーム（約１００μｇ蛋白質）を１００μｌの１０ｍＭイミダゾールバッファー、ｐＨ６．８中へ希釈し、そして様々な濃度の［３５Ｓ］−標識されたＦＫＢＰ１２．６と３７℃において６０分間インキュベートした。反応は、サンプルを５００μｌの氷冷イミダゾールバッファー中に希釈することにより停止した。サンプルを１００，０００ｇにて１０分間遠心分離し、イミダゾールバッファー中で３回洗浄し、そして結合した［３５Ｓ］−ＦＫＢＰ１２．６の量を沈殿物の液体シンチレーションカウンティングにより測定した。
【０１３９】
ＲｙＲ２とＦＫＢＰ１２．６の結合の程度を測定する別の方法は、２つの蛋白質の共沈降及びイムノブロッティングによる。ミクロソーム（約２００μｇ蛋白質）を、プロテアーゼ阻害剤を含む０．１ｍｌのイミダゾールバッファー（５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４，０．３Ｍ蔗糖）に懸濁し、そして３７℃において１時間ラパマイシン（セルシグナリングテクノロジー、ビバリー，ＭＡ）と共にインキュベートする。サンプルを９５，０００ｇにて１０分間遠心分離し、そして上清を回収する。沈殿物は０．２ｍｌのイミダゾールバッファー中で２回洗浄し、そして９５，０００ｇにて１０分間遠心分離する。最終沈殿物は０．１ｍｌのイミダゾールバッファーに懸濁する。沈殿物と上清の両方の成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、そして以前に記載されたとおりに、ＦＫＢＰ１２．６に関してイムノブロットした（Ｇａｂｕｒｊａｋｏｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１４０】
ＲｙＲ２チャネル機能に対する試験薬剤の効果を監視するためのアッセイ
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化はＲｙＲ２チャネルの活性を増加させ、チャネルの所定の活性因子に関して細胞の細胞質へのより多くのＣａ２＋の放出をもたらす。密閉した状態でチャネルを維持することを助けることによるＲｙＲ２受容体の活性化を抑圧するためのいくつかの機構を予見することができる。例えば、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を阻害する化学試薬は、チャネルの密閉した状態の維持管理を増強すると予測される。同様に、ＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤及びＦＫＢＰ１２．６の結合を模倣する薬剤、即ち、ＦＫＢＰ１２．６結合部位においてＲｙＲ２に結合するがチャネルがＰＫＡによりリン酸化された時にはチャネルにならない（not come off）薬剤も、密閉されたチャネルを維持してＰＫＡ又はＲｙＲ２チャネルの他の薬剤に応答してその活性を低下させることが予測される。これらの薬剤は、全て、細胞へのＣａ２＋の漏出をほとんどもたらさないと予測され、よって、心臓不整脈を誘導し得るＤＡＤｓを妨害する治療上の価値を有するかもしれない。
【０１４１】
ＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害する薬剤の例は、ＪＴＶ−５１９（Ｋ２０１とも呼ばれる）又は１，４−ベンゾチアゼピンの誘導体である化合物のこのクラス内の他の何れかの化合物である（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｋａｎｅｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｈａｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【０１４２】
ＲｙＲ２チャネルの密閉を増強し、即ち、心臓不整脈を治療するのに有効かもしれない薬剤の一つのアッセイは、ＲｙＲ２チャネルにより、カルシウム感受性蛍光染料（例えば、Ｆｌｕｏ−３又はＦｕｒａ−２）を用いて、細胞へのＣａ２＋の放出を測定することに基づく。当該アッセイは、細胞に蛍光染料を負荷すること、細胞をＲｙＲ２活性因子（例えば、ＰＫＡ又はカフェイン）で刺激すること、及び細胞に添加された化学試薬がＣａ２＋−依存性蛍光シグナルを減少させるか否かを測定することを含む（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｇｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。Ｃａ２＋が細胞の細胞質に放出されたとき、Ｃａ２＋−感受性染料により結合されて、次に、蛍光シグナルを発する。Ｃａ２＋−依存性蛍光シグナルは、例えば、光電子倍増管又は電荷結合素子（ＣＣＤ）検出器により監視し、そして適切なソフトウエアにより分析する（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｇｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照）。このアッセイは、マルチウエルディッシュを用いて多数の化学薬剤をスクリーニングするために容易に自動化することができる。当該アッセイは、異種発現系、例えば、細菌、酵母、昆虫、両生類、植物又は哺乳類（ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ，ＣＯＳ−７，ＬＭ（ｔｋ−），マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３，又はヒーラを含む）細胞内でのＲｙＲ２チャネルの発現を必要とする（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）。非筋肉細胞においては、ＲｙＲ２受容体をＥＲ上で発現させ、そしてＲｙＲ２チャネルが活性化されたときに、Ｃａ２＋がＥＲから細胞の細胞質に放出される。
【０１４３】
β−ＡＲｓは、ＲｙＲ２受容体と同時発現させることもできる。これは、β−ＡＲｓ刺激に対する応答における、ＲｙＲ２活性化に対しての異なる化学試薬の効果の評価を可能にさせる。
【０１４４】
別のアッセイは、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化のレベルを測定することを含み、ＲｙＲ２チャネルのＰＫＡリン酸化を阻害するようにデザインされた化合物の効果を決定するのに使用できる。このアッセイは、ＲｙＲ２チャネル蛋白質に特異的な抗体の使用に基づく（抗体−ＲｙＲ２抗体）。このアッセイにおいては、ＲｙＲ２チャネル蛋白質が抗−ＲｙＲ２抗体により免疫沈殿され、そして次にＰＫＡと［γ−３２Ｐ］−アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）により戻しリン酸化される。サンプルを次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でサイズ分画する。ＲｙＲ２受容体蛋白質に転移した放射性３２Ｐ標識の量をホスホルイメージャーを用いて測定できる。別のバージョンのアッセイにおいては、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化された形態には結合するが未リン酸化形態には結合しない抗体を用いる。この場合、戻しリン酸化は必要ない。
【０１４５】
ＲｙＲ２機能のための別のアッセイは、ＦＫＢＰ１２．６とＲｙＲ２受容体の結合の程度、サブコンダクタンス状態の出現、活性化のためのＣａ２＋の感受性、開確率（Ｐｏ）、開休止時間定数（τ）又は沈殿の関門開閉頻度を測定することを含む。
【０１４６】
ＦＫ５０６とラパマイシンは共にＦＫＢＰ１２．６をＲｙＲ２から解離させる。別のアッセイは、ＦＫ５０６−セファロース又はラパマイシン−セファロースカラムを用いることにより、化学薬剤のライブラリーをスクリーニングして、上記カラムに結合するものを同定することを含む。結合は、カラムを結合バッファーで徹底して洗浄し、次に、高塩濃度バッファーにより溶出することにより評価することができる。カラムに結合する薬剤は、それらがＲｙＲ２に結合して（心臓ＳＲ中又は異種細胞ＳＲ膜調製物中）、変異体チャネルに結合したＦＫＢＰ１２．６を置き換える能力に関して試験することができる。この競合アッセイにおいては、ＲｙＲ２チャネルを化学薬剤とインキュベートし、次に遠心分離し、そして沈殿物対上清フラクションをイムノブロットする。チャネルに結合してＦＫＢＰ１２．６をコンピートオフする薬剤は、ＦＫＢＰ１２．６が上清中で検出されることを可能にする。これは、９６ウエルプレートを用いて、ドットブロット装置により、そして抗−ＦＫＢＰ１２．６抗体によりイムノブロッティングすることにより分析できる。
【０１４７】
これらのアッセイにおいて同定された化学薬剤は、イソプロテレノール誘導性の、カルシウム感受性蛍光染料（例えば、Ｆｌｕｏ−３又はＦｕｒａ−２）を負荷した細胞内Ｃａ２＋放出を阻害するそれらの能力に関して試験できる。
【０１４８】
変異体ＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６結合蛋白質の解離を阻害する化学薬剤は、例えば９６ウエルディッシュの中で上清へのＦＫＢＰ１２．６の放出を検出する高処理量酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により検出することができる。変異体ＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の解離の後に、例えば、ラパマイシン又はＦＫ５０６の添加によるか又は変異体ＲｙＲ２のｃＡＭＰ及びＡＴＰによるＰＫＡリン酸化により、抗−ＦＫＢＰ１２．６抗体をＥＬＩＳＡにおいて使用する。ＦＫＢＰ１２．６の上清への放出を阻害する薬剤は、新規治療剤の候補を導き、次に、心臓不整脈の被験者において試験することができる。
【０１４９】
結果
ＦＫＢＰ１２．６−欠損マウスにおける運動誘導性不整脈
心臓中でＦＫＢＰ１２．６蛋白質の不在をもたらす相同組換えにより、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスを生じさせた（図８）。オス及びメスＦＫＢＰ１２．６−／−マウスの心臓は、心臓エコー図及び組織学上（繊維症の不在を含む、データは示さず）に基づくと、構造上正常であった。知覚のある（conscious）ＦＫＢＰ１２．６＋／＋及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスのＥＣＧパラメーターの試験は、ＲＲ（＋／＋，９７．３±５ｍｓｅｃ，−／−，９２．１±４ｍｓｅｃ），ＰＲ（＋／＋，３６．２±２．１ｍｓｅｃ，−／−，３５．４±２．０ｍｓｅｃ），ＱＲＳ（＋／＋．１７．４±１．８ｍｓｅｃ，−／−，１６．４±１．４ｍｓｅｃ），又は速度修正されたＱＴ間隔（ＱＴｃ；＋／＋，５６．７±３．０ｍｓｅｃ，−／−，５５．１±４．０ｍｓｅｃ；ｎ＝１０  ＋／＋；６  −／−，Ｎ．Ｓ．）において有意な差異は示さなかった。即ち、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスは構造上の異常さを示さず休止期においてＥＣＧ異常性又は不整脈を示さなかった（図９Ａ及びＢ）。
【０１５０】
心臓不整脈を試験するため、ＦＫＢＰ１２．６＋／＋及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスを、以前にマウスで用いられた運動プロトコルに供した（Ｍｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。何れのＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスも（０／１０）、プロトコルの間に不整脈又は失神の事象を示さなかったが、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスは８匹のうちの２匹が精力的な運動の２−５秒後に非応答になり、そして全部のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスが運動プラスエピネフィリン注射により死んだ（８／８）。運動後に、エピネフィリンを投与した場合、野生型（ＷＴ）マウスはこのストレスプロトコルにおいて不整脈にならなかったが、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスは１００％（８／８）が致命的な不整脈を有し、洞（sinus）リズム（心臓速度約７００−８５０ｂｐｍ）からの進行（progression）からなり、保持された心室不整脈に対して多形性（polymorphic）心室不整脈（心臓速度＞１，２００ｂｐｍ）を伴った（図９Ｃ）。死ぬ前に、マウスのうちの２匹が有意に延期された多形性の不整脈を呈し（＞６秒）、４匹が心室不整脈の複数の短い（０．５−２秒）ランを呈し、そして２匹のマウスがＥＣＧ監視外で死んだ。別のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスモデルを用いた以前の報告は、オスのマウスが心筋症を有し、そして我々の発見と一致して心臓不整脈は非運動動物において観察されなかったことを示した（Ｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。運動の効果は、その研究では報告されなかった。本研究において報告された我々のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからの心臓を試験したが、心筋症を示唆するような発見はなく、心臓エコー図、組織学（データは示さず）及び心室不整脈に対する罹病性を含む、測定された機能パラメーターの何れに関しても、オスとメスの間に差異はなかった。
【０１５１】
ＦＫＢＰ１２．６−欠損心筋における遅延した後脱分極
ＦＫＢＰ１２．６の欠損が不整脈を誘因し得る遅延した後脱分極（ＤＡＤｓ）の危険の増加と関連するか否かを決定するため、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウス及び対照のＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスから単離した心筋をパッチクランプにより試験した。両遺伝子型の心臓からの心筋において単一の細胞作用ポテンシャル（ＡＰ）に有意な変化はなかった。しかしながら、運動を刺激する条件下で試験された４匹のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＦＫＢＰ１２．６−／−心筋細胞には後脱分極が観察された（即ち、イソプロテレノール（１μＭ）又はエピネフィリン（１μＭ）の適用後、そして致命的な運動誘導性不整脈がＦＫＢＰ１２．６−／−マウスにおいて起こった約７００から７５０ｂｐｍの心臓速度に相当する１２Ｈｚにおける作用ポテンシャルによる刺激）（図９Ｄ及びＥ）。ＦＫＢＰ１２．６＋／＋心臓及びＦＫＢＰ１２．６−／−心臓の両方が、増加したＳＥＲＣＡ２（筋小胞体Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅタイプ２）活性になりやすく（subject to）、そして増加したＬ−タイプのＣａ２＋チャネル活性になりやすく（ＰＫＡ−依存性リン酸化による）、そして両遺伝子型はＰＫＡによるＲｙＲ２リン酸化になりやすく、残りの差異はＦＫＢＰ１２．６−／−マウスの心臓細胞内のＦ１２．６の不在である。
【０１５２】
ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２チャネルは運動の間に欠陥関門開閉を呈する
天然ＲｙＲ２は４つのＲｙＲ２モノマーからなるテトラマーであり、各々は単一のＦＫＢＰ１２．６分子を結合する。ＦＫＢＰ１２．６は密閉された状態においてＲｙＲ２チャネルを安定化してその活性を減少させる（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。運動の間の交換神経系の刺激は、β−ＡＲを活性化するカテコールアミンの放出を誘導して、心臓筋肉中でｃＡＭＰレベルを上昇させてプロテインキナーゼＡを活性化する。ＲｙＲ２−Ｓｅｒ２８０９のＰＫＡリン酸化は、ＦＫＢＰ１２．６をチャネル複合体から解離させ（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、そして［Ｃａ２＋］ｉによる活性化に対するＲｙＲ２の感受性を増加させる（Ｖａｌｄｉｖｉａ，１９９５）。よって、ＰＫＡリン酸化はＦＫＢＰ１２．６のＲｙＲ２からの解離を誘導し、そしてＲｙＲ２の［Ｃａ２＋］ｉに対する増加した感受性（以下を参照）は、ＲｙＲ２活性をアップ制御すること（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）及びＳＲ  Ｃａ２＋の放出を増加させることに関与する生理的機構である。これは運動の代謝要求に合致するように心臓の出力を増加させるシグナリング系（「闘争又は逃避」ストレス応答）の一部として起こる。
【０１５３】
ＲｙＲ２に対する運動の効果を決定するため、チャネルのＰＫＡリン酸化を運動後のＦＫＢＰ１２．６＋／＋及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスにおいて試験した。ＲｙＲ２はＰＫＡ−リン酸化されることがわかり（図１０Ａ）、部分的にＦＫＢＰ１２．６を消耗させた（図１０Ｂ）。ＦＫＢＰ１２．６＋／＋及びＦＫＢＰ１２．６−／−の両方からのＲｙＲ２が運動の間に類似の程度までＰＫＡ−リン酸化された（図１０Ａ）。運動の間、ＲｙＲ２チャネルの開確率が非運動動物のチャネルに比較して増加した（図１０Ｃ−Ｆ）。しかしながら、運動したマウスからのＦＫＢＰ１２．６−／−のＲｙＲ２チャネルは開確率において約１０倍大きな増加を呈し（図１０Ｄと１０Ｆを比較せよ）、同じ程度の運動に供された、齢及び性別を適合されたＦＫＢＰ１２．６＋／＋対照動物に比較される（図１０Ｇ）。ＲｙＲ２チャネルが心臓不整脈を誘因し得る拡張期のＳＲ  Ｃａ２＋漏出を阻害するように極めて低い開確率を有すべきである場合に、拡張期の間の心臓における条件に近似させるため、１５０ｎＭの低いシス（細胞質）［Ｃａ２＋］の条件下でこれらのチャネルを研究した。即ち、運動の間のＦＫＢＰ１２．６−／−のチャネル中のこれらの条件下でのＲｙＲ２開確率の顕著な増加は、マウスが運動しているときはこれらのチャネルが拡張期の間「漏出性」であり得たことを示唆する。
【０１５４】
運動誘導性の心臓性急死は欠陥のあるＲｙＲ２関門開閉にリンクする
ＣＰＶＴの臨床上の表現型は、運動ストレス試験により誘導可能な心室不整脈からなる。運動の間、患者は、単離された未成熟の心室収縮から、心室細動に退化して心臓性急死を引き起こすかもしれない多形性の心室頻脈への典型的な進行を呈するかもしれない（Ｌｅｅｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１５５】
ＣＰＶＴ患者における運動誘導性の不整脈がＳＲのＣａ２＋放出チャネル機能の欠陥に関係するか否かを決定するため、公知のＣＰＶＴミスセンス変異に相当するＲｙＲ２の３つの変異形態（ＲｙＲ２−Ｓ２２４６Ｌ，ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓ，及びＲｙＲ２−Ｒ４４９７Ｃ）（図１１Ａ）を発現させた。ＳＲのＣａ２＋漏出を阻止するために心臓が弛緩してＲｙＲ２チャネルが極めて低い開確率を有するときの拡張期の心臓筋肉の条件に近似させるように、１５０ｎＭの低シス（細胞質）［Ｃａ２＋］にて実験を実施した。ＰＫＡリン酸化の不在下では、ＷＴと全ての３つの変異体ＲｙＲ２が極めて低い活性しか有さない（図１１Ｂの上部トレーシングを参照）。５０ｎＭから５ｍＭの広い範囲のシス（脂肪質）［Ｃａ２＋］にわたり試験されたＷＴ  ＲｙＲ２及び変異体ＲｙＲ２の単一チャネル特性には差異がなかった（図１１Ｂ，上部右のグラフ）。
【０１５６】
基底条件下で３つ全てのＣＰＶＴ−関連変異体ＲｙＲ２がＲｙＲ２−ＷＴチャネルのそれらと識別不可能な正常な単一チャネル特性を呈したという発見は、ＣＰＶＴの患者が休止期に不整脈を有さないとすれば、驚くべきことではなかった（Ｌｅｅｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。しかしながら、ＣＰＶＴの患者は運動により誘導された不整脈を有する（Ｌｅｅｎｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。心筋においてβ−ＡＲシグナリング経路を通してＰＫＡを活性化する運動の効果に近似させるため、ＰＫＡ−リン酸化されたＷＴと変異体ＲｙＲ２のチャネルの単一チャネル特性を平坦脂質２層において比較した。
【０１５７】
ＰＫＡリン酸化はＷＴのＲｙＲ２及びＣＰＶＴ変異体のチャネルの活性（開確率；Ｐｏ）を顕著に増加させた（図１１Ｂの底部トレーシング）。変異体ＲｙＲ２（ＲｙＲ２−Ｓ２２４６Ｌ，ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓ，及びＲｙＲ２−Ｒ４４９７Ｃ）の開確率は、しかしながら、ＷＴのＲｙＲ２のチャネルよりも顕著に高かった（図１１Ｃ，ｎ＝９，Ｐ＜０．０５）。同様に、関門開閉頻度は変異体チャネルにおいて顕著に低かった（ｎ＝９，Ｐ＜０．０５，データは示さず）。変異体チャネルにより呈された増加した開確率及び関門開閉頻度は、それらがＰＫＡによる活性化に対してより感受性であることを示す。ＰＫＡリン酸化の後では、ＷＴとＣＰＶＴ−関連変異体ＲｙＲ２の両方が中度の［Ｃａ２＋］ｉにおいてＣａ２＋−誘導性の活性化に対してより感受性であり（図１１Ｂ，右）、そしてこの効果は変異体チャネルにおいて際立ったことから、それらが増加したＣａ２＋−依存性活性化を呈するために拡張期にはそれらがＷＴチャネルよりも活性であることを示唆する。
【０１５８】
ＲｙＲ２へのＦＫＢＰ１２．６結合に対するＣＰＶＴ変異の効果を決定するため、ＷＴのＲｙＲ２及び３つのＣＰＶＴ変異体（ＲｙＲ２−Ｓ２２４６Ｌ，ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓ，及びＲｙＲ２−Ｒ４４９７Ｃ）を発現するＨＥＫ２９３細胞からミクロソームを調製した。これらのミクロソーム中のＲｙＲ２の量を、［３Ｈ］−ライアノジン結合により測定した。上記ミクロソームを３５Ｓ−標識されたＦＫＢＰ１２．６とインキュベートすることにより、ＦＫＢＰ１２．６結合曲線を得た。チャネルへのＦＫＢＰ１２．６結合の解離定数（Ｋｄ）（ｎ＝３）をスキャッチャード分析から測定した（図４Ｄ）：ＷＴ  ＲｙＲ２に関して１０８．３±９．１ｎＭ、ＲｙＲ２−Ｓ２２４６Ｌに関して１８２．７±８．１ｎＭ、ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓに関して２１５．７±６．０ｎＭ、及びＲｙＲ２−Ｒ４４９７Ｃに関して２０２．２±１１．２ｎＭ。
【０１５９】
Ｋｄの顕著な増加（Ｐ＜０．００１）は、ＣＰＶＴ変異体がＷＴチャネルに比較してＦＫＢＰ１２．６に関して低下した親和性を有したことを示す。
ＣＰＶＴの患者が変異体ＲｙＲ２対立遺伝子に関して異型接合性であるため、ＨＥＫ２９３細胞においてＷＴ  ＲｙＲ２及びＣＰＶＴ−変異体ＲｙＲ２を等量発現させることにより、ヘテロテトラマーチャネルの機能も試験した。２層実験において研究されたあらゆる所定のチャネルの正確な組成は決定できないが、複数のヘテロテトラマーチャネルからのデータをプールした。ホモテトラマーＣＰＶＴ−関連変異体ＲｙＲ２チャネルの場合のように、ヘテロテトラマーＲｙＲ２チャネルも同じ変更された単一チャネル特性を呈し、ＰＫＡリン酸化後の開確率の増加を含んだ（図１１Ｅ及びＦ）。これらのデータを一緒にすると、ＣＰＶＴ−関連変異体ＲｙＲ２チャネルはＷＴのＲｙＲ２チャネルに比較して顕著に変更された単一チャネル特性を呈するが、ＰＫＡリン酸化後のみであることを示す。
【０１６０】
ＦＫＢＰ１２．６は欠陥のあるＲｙＲ２チャネルに対する正常な関門開閉を回復させる
ＦＫＢＰ１２．６はＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２には結合できないことが以前に示された（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。本研究からの結果は、ＦＫＢＰ１２．６は、ＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２を構成的に模倣する変異体ＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄにも結合できないことを示す（図１２Ａ）。変異体ＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２の欠陥のある関門開閉が減少したＦＫＢＰ１２．６によったのか否かを決定するために、そして野生型ＦＫＢＰ１２．６がＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ２に結合できないため、３７位のアスパラギン酸がセリンに置き換わった変異形態のＦＫＢＰ１２．６を生成した（ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓ）。この変異体ＦＫＢＰ１２．６はＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２に対して及びＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄ変異体に対して結合することができる（図１２Ａ）。Ａｓｐ３７上の負の電荷を中和するために選択を行ったのは、ＦＫＢＰ１２がＴＧＦβ受容体Ｉに結合する際にこの残基が疎水性結合ポケットに近く（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、そしてリン酸化後に追加の負の電荷がチャネルに付加されたときにＲｙＲ１又はＲｙＲ２からのそれぞれＦＫＢＰ１２又はＦＫＢＰ１２．６のＰＫＡリン酸化誘導性解離に関与するかもしれないからである。事実、変異体ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓの付加は、ＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄチャネルに対しての正常（低い活性）のチャネル機能を回復させた（図１２Ｂ）。
【０１６１】
さらに、野生型ＦＫＢＰ１２．６とは対照的に、ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓは、運動したＦＫＢＰ１２．６−／−マウスの心臓から単離されたＲｙＲ２チャネルに結合することができたし（図１２Ｃ）、正常なチャネル機能を回復させた（図１２Ｄ）。最後に、ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓは、ＰＫＡ−リン酸化されたＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２変異体チャネルに結合し（図１２Ｅ）、そして正常チャネル機能を回復させた（図１２Ｆ）が、野生型ＦＫＢＰ１２．６はしなかった。即ち、野生型ＦＫＢＰ１２．６とは異なり、ＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２に結合し且つ正常チャネル機能を回復させる変異形態のＦＫＢＰ１２．６を生成した。一緒にすると、これらの結果は、運動中に生理学上起こるＲｙＲ２マクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２．６の部分的な消耗は、増加したＲｙＲ２開確率に関連するが、ＲｙＲ２複合体中のより重度のＦＫＢＰ１２．６の欠損（例えば、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウス又はＣＰＶＴ変異を有する患者）が、正常な心臓からの野生型チャネルにおいては観察されない拡張期の間の顕著に増加した開確率を伴うチャネルをもたらし得ることを示唆する。
【０１６２】
考察
本研究においては、運動により誘導された心臓性急死を呈するＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２、及び患者において運動により誘導された不整脈にリンクしたＣＰＶＴ−関連変異体ＲｙＲ２の両方が、運動中に心臓において拡張期に相当する条件下で顕著に増加した開確率を呈することを示した。これらのデータは、インビボにおいて、ＳＲ  Ｃａ２＋のＰＫＡ−リン酸化されたＦＫＢＰ１２．６枯渇ＲｙＲ２を通した漏出が起こり得ることを示唆する。事実、模擬運動中のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからの心筋細胞において、遅延した後−脱分極（ＤＡＤｓ）が観察された。重要なことに、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２及びＣＰＶＴマウスのＲｙＲ２は基底条件下で正常なチャネル機能を呈し、そして運動誘導性刺激に相当する条件下でそれらが試験された場合に欠陥機能（即ち、増加した開確率）を示すのみである。ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからの心筋細胞において観察されたＤＡＤｓと組み合わされた、運動中のＦＫＢＰ１２．６−／−マウス及びＣＰＶＴ−関連変異体ＲｙＲ２からのチャネルの増加した開確率は、ＲｙＲ２によるＳＲ  Ｃａ２＋漏出が、ＤＡＤが誘因した不整脈を開始できることを示唆する（図１３）。
【０１６３】
ＦＫＢＰ１２．６欠損は運動により誘導された心臓性急死を引き起こす
心臓の心室不整脈は、死亡率の主要な原因であるが、不整脈を開始する誘因の分子基礎が、まだよく理解されていない。本研究において、運動したＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２チャネルが運動したＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスにおいては観察されなかった劇的に増加した開確率を示すことが発見された。これらのデータは、運動したＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスからのＲｙＲ２チャネル複合体中の残りのＦＫＢＰ１２．６（図１２Ｂ）が拡張期の間に閉じたＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ２チャネルを保持するのに十分であることを示唆する。独立に生成したＦＫＢＰ１２．６−／−マウスの表現型を試験した以前の研究は、心筋Ｃａ２＋シグナリングの欠陥を報告したが、運動により誘導された不整脈は研究されなかった（Ｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。本結果は、ＲｙＲ２チャネル複合体中のＦＫＢＰ１２．６の不在がマウスを、運動中並びにβ−ＡＲ経路の刺激の間に、ＤＡＤｓ、心室不整脈及び心臓性急死にしたことを示す。
【０１６４】
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化がチャネル複合体からのＦＫＢＰ１２．６の解離を誘導することが以前に示された（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この発見は、ＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ２を構成的に模倣し、よってＦＫＢＰ１２．６を結合できない、ＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄ変異体チャネルを用いて本研究において確認された（図１２Ａ及びＢ）。変異体ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７ＳがＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２又はＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄを結合できないという発見は、陰性荷電されたリン酸基のＲｙＲ２−Ｓ２８０９への付加に対して二次的な電荷−斥力がＦＫＢＰ１２．６のチャネル複合体からの解離を引き起こすというモデルに一致する。
【０１６５】
ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓが、運動したＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２中の（低い活性）チャネル表現型又はＣＰＶＴ−変異ＲｙＲ２チャネルを救済できたことは、ＰＫＡリン酸化後のＦＫＢＰ１２．６の不在がＲｙＲ２チャネル高活性を導くことを強く示唆する。ＦＫＢＰ１２．６の不在はＦＫＢＰ１２．６−／−マウスにおいて、及びＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２変異を有する患者において不整脈を誘引するかもしれない。さらに、これらの結果は、ＦＫＢＰ１２．６のリン酸化されたＲｙＲ２チャネルへの結合を増加させることが、ＣＰＶＴ及び心不全において誘導された不整脈を阻止するための新規且つ極めて特異的な治療戦略を提供するかもしれないことを示唆する。
【０１６６】
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は闘争又は逃避応答の一部である
ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、「闘争又は逃避」応答として知られる重要な生理学的ストレス経路の一部として起こる（Ｍａｒｋｓ，２０００）。このシグナリング経路は、関連したストレスの代謝要求に合わせるのに必要とされる増強された心臓出力を運動又はストレスに応答した交換神経系の活性化がもたらす機構を提供する。運動の間の交換神経系の刺激は、β−ＡＲを活性化するカテコールアミンの放出を誘導して、細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させ、よって、心臓筋肉中のＰＫＡを活性化する。Ｓｅｒ２８０９におけるＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、ＦＫＢＰ１２．６をチャネル複合体から解離させ、そしてＲｙＲ２活性のアップ制御を含む生理的機構を提供する（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）ことにより、運動又はストレスに応答してＳＲのＣａ２＋放出を増加させる。
【０１６７】
運動誘導性の心臓性急死にリンクしたＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２
ＣＰＶＴ−関連変異と共にＲｙＲ２バリアントはＦＫＢＰ１２．６のＲｙＲ２への結合の減少を呈するが、これらの変異体ＲｙＲ２チャネルは基底条件下ではＦＫＢＰ１２．６を結合することができなかった。この発見は、ＣＰＶＴ患者が休止条件下では不整脈を呈さないという事実に符合する。ＰＫＡ−リン酸化誘導されたＦＫＢＰ１２．６の解離はＲｙＲ２チャネルが運動の間に活性化される機構の一部であるため、低下したＦＫＢＰ１２．６の親和性は、ＰＫＡによる活性化に対しての変異体チャネルの感受性の増加において役割を担う。事実、ＰＫＡリン酸化後は、この研究において試験されたＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２変異が、同じ条件下で試験されたＷＴチャネルに比較して、増加した活性を有するチャネルをもたらした。即ち、運動の間、ＣＰＶＴ−変異体のＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化は、不整脈を誘引する後脱分極の可能性を高める（図１３）。
【０１６８】
基底条件下ではＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２チャネルが正常な活性を呈したことを発見したが、ＲｙＲ２−Ｒ４４７９Ｃ変異体が極めて低い［Ｃａ２＋］において増加した活性を有したという以前の報告とは対照的である（Ｊｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。休止心筋細胞のそれよりも低い５０ｎＭの［Ｃａ２＋］においてさえ、又は心臓筋肉が弛緩している拡張期の間、チャネル機能に差異は観察されなかった。さらに、本研究において変異体ＲｙＲ２がＰＫＡリン酸化後に欠陥を呈したにすぎなかったという事実は、運動の間のチャネルの条件に相当するが、チャネル機能のこれらの特定の変更の、ＣＰＶＴ患者内の運動誘導性不整脈に対する関連性を支持する。さらに、非運動条件下でＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２チャネルにおいて見いだされたあらゆる欠陥が、これらの患者において如何にしてＳＣＤとリンクし得るかを理解するのは困難であるが、何故ならば、休止しているときに不整脈は起こらないからである。
【０１６９】
「漏出性」ライアノジン受容体に関連する遅延した後脱分極
ＤＡＤｓは異常なＳＲ  Ｃａ２＋放出により引き起こされる心臓の作用ポテンシャルの完了後に起こるプラズマ膜ポテンシャル内の振動（oscillations）であり、Ｃａ２＋−活性化された一時的な内部への（脱分極）電流（Ｉｔｉ）をもたらす（Ｆｏｚｚａｒｄ，１９９２；Ｗｉｔ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，１９８３）。以前の薬理学の研究は、ライアノジンが特異的にＤＡＤｓを阻害することを示し、それらが欠陥のあるＳＲ  Ｃａ２＋放出によるのかもしれず、そしてこのプロセスにおいてＲｙＲ２に影響するのかもしれないことを示唆する（Ｍａｒｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｓｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｌａｒｄｉｎｅｌｌｉ，１９９４）。本研究は、誘発された心室不整脈のセッティングにおける、ＲｙＲ２とＤＡＤｓの間のこの機械的なリンクを強くする。
【０１７０】
ＤＡＤ−誘導されて（induced）誘因された（triggered）活性はＣＰＶＴ−関連の運動誘導性不整脈の主な機構として提案された（Ｐｒｉｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＣＰＶＴ−変異体チャネルの生物物理的な欠陥は、チャネルがＰＫＡリン酸化に供されたときにのみ観察され、運動の間にチャネルの条件を模倣する。これは、チャネル機能におけるこれらの欠陥の患者における不整脈に対する関連性を支持するさらなる証拠を提供するが、何故ならば、不整脈は運動の間にも広範囲に観察されて、運動試験により導き出され得るからである。
【０１７１】
この機構の支持として、運動中のＣＰＶＴの患者における未成熟の心室収縮（ＰＶＣｓ）の開始が１分あたり＞１００拍動（１０７±７拍動／分、速度１００−１２０，ｎ＝９）の洞速度において起こることがわかった。心室頻脈が＞１３０ｂｐｍの洞速度において発症した（平均１４８±２２；速度１３５−２０４）。興味を引くのは、心室頻脈のカップリング間隔（３５２±２６ｍｓｅｃ）は、単離された未成熟の拍動ＳＲ  Ｃａ２＋放出のそれよりも短いことであり（ｐ＜０．０００１）、３つのＲｙＲ２変異体のキャリアー中の不整脈の速度依存性がＤＡＤ−媒介性の誘発された活性の基準を満たすことを示す（Ｆｏｚｚａｒｄ，１９９２）。
【０１７２】
誘発された心臓不整脈に関する可能性のある分子機構
ＣＰＶＴは稀な遺伝（inherited）障害であるが、データは、ＲｙＲ２機能の欠陥が広い密接な関係を有するかもしれない心臓性急死にリンクしていることを示す。ＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２における欠陥の解明は、「漏出性」のＳＲ  Ｃａ２＋放出チャネルと心臓不整脈の表現型の間のリンクを提供する。ＲｙＲ２機能における一時的な運動誘導性欠陥は、運動誘導性不整脈に関する機構を提供するらしい（図１３）。
【０１７３】
心不全は開発国における死亡率の一番の原因であり、異常なＳＲ  Ｃａ２＋放出を引き起こすかもしれない、ＰＫＡ高リン酸化及びチャネル複合体からのＦＫＢＰ１２．６の枯渇による、変更されたＲｙＲ２機能に関連する（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。事実、不全心臓からのＲｙＲ２は、運動条件下で試験されたＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２及びＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２と同じ欠陥性の単一チャネル特性を呈する（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。これは、おそらく、心不全がＲｙＲ２チャネルの長期にわたるＰＫＡ高リン酸化及びＲｙＲ２マクロ分子複合体からのＦＫＢＰ１２．６の枯渇をもたらす高アドレナリン状態だからである（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０１７４】
不全ヒト心臓からのＰＫＡリン酸化されたＣＰＶＴ−関連変異体のＲｙＲ２のチャネルとＷＴ  ＲｙＲ２のチャネルは、共に、低細胞質［Ｃａ２＋］において増加した活性を呈し、ＳＲ  Ｃａ２＋漏出を促進させるかもしれない。これら２つの疾患状態の違いは、ＣＰＶＴにおいては、欠陥チャネル機能がＦＫＢＰ１２．６に対する親和性を低下させて拡張期の間にチャネルを閉じさせる能力を損傷させるＲｙＲ２中の遺伝した変異によるのに対して、心不全においては、長期にわたるＰＫＡ高リン酸化のためにＲｙＲ２チャネル複合体がＦＫＢＰ１２．６を枯渇する（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。一緒にすると、これらのデータは、心不全患者において不整脈を誘引する機構が、ＣＰＶＴ及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスにおけるそれらと類似するかもしれないことを示唆する。不全心臓における心臓不整脈は複数の原因によるらしく、そしてＳＲ  Ｃａ２＋漏出により誘発されるそれらがこれらの不整脈のサブセットを代表するらしい。
【０１７５】
本研究は、心臓不整脈に対する治療上のアプローチに関して密接な関係を有する。ＦＫＢＰ１２．６−／−マウス及びＣＰＶＴヒト患者におけるＲｙＲ２によるＣａ２＋の「漏出」の分子機構の解明は、特定のアッセイのデザインが、ＲｙＲ２チャネルの密閉した状態を維持することによりＣａ２＋の漏出を打ち消す化学薬剤を同定することを可能にさせてきた。ＲｙＲ２チャネルの閉鎖を増強する戦略は、限定ではないが、チャネルのＰＫＡリン酸化を減少させること、ＰＫＡリン酸化されたチャネルからのＦＫＢＰ１２．６の解離を阻害すること、及びＰＫＡリン酸化により容易にはほとんど解離されない薬剤によりＦＫＢＰ１２．６のチャネルへの結合を模倣することを含む。当業者は、ＲｙＲ２受容体のＰＫＡリン酸化を減少させる化学薬剤が雑多な機構により作用し得ることを認識するはずであり、とりわけ、ＰＫＡ活性を阻害することか、又は内生ホスファターゼの活性を阻害すること（ＰＰ１とＰＰ２ＡはＲｙＲ２マクロ分子複合体の中に存在することが示された；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、又はｃＡＭＰを加水分解するホスホジエステラーゼの活性を増加させること（ＰＤＥ４Ｄ３，ｃＡＭＰを加水分解するが、ＲｙＲ２マクロ分子複合体中に存在することが示された；Ｄｏｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）を含む。Ｃａ２＋の漏出は、Ｃａ２＋の輸送を、リン酸化されたＲｙＲ２を通して、チャネルに直接結合するか又はチャネルを通して優先的に輸送される化学薬剤により物理的に塞ぐことにより減少させてもよい。少なくとも一つの上記治療戦略の実行可能性は、ＣＰＶＴの患者において不整脈を阻止するために（Ｌｅｅｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を阻害する（Ｒｅｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）β−ＡＲブロッカードラッグの使用により既に証明された。
【０１７６】
結論
一緒にすると、本実験の結果は、マウスにおけるＦＫＢＰ１２．６の欠損及びヒトのＣＰＶＴ−関連の変異がチャネル機能における一時的な運動誘導性欠陥を引き起こすことを示しており、ＲｙＲ２を通したＣａ２＋の漏れが心臓不整脈を誘因し得ることを示唆する。不全心臓においてはＲｙＲ２がＦＫＢＰ１２．６を長期にわたり枯渇することを示す以前のデータセットを組み合わせると（実験セットＩ）、これらの発見は、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウス及び変異体ＲｙＲ２によるＣＰＶＴにおいての心室不整脈の根底にある機構は心不全に共通に関連する心室不整脈を開始する機構に類似しているかもしれないことを示唆する。鍵となる相違は、ＦＫＢＰ１２．６−欠損マウスからのチャネルとＣＰＶＴ−関連ＲｙＲ２のチャネルが一時的に運動中にＰＫＡ−リン酸化されたときに変更された活性を呈したにすぎないのに対して、不全心臓においては、変異をもたないＲｙＲ２チャネルは長期のＰＫＡ高リン酸化に基づいて、変更された機能を呈することである（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。心不全における心室不整脈の根底にあるＣａ２＋「漏出」の可能な分子機構の解明は、ＲｙＲ２受容体を標的化する新規な治療上のアプローチのデザインを可能にさせた。
【０１７７】
実験セットＩＩＩ
材料と方法
ＦＫＢＰ１２．６のＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２に対するＪＴＶ−５１９の効果
イヌの心臓ＳＲ膜を前に記載されたとおりに調製した（Ｋａｆｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。ライアノジン受容体（ＲｙＲ２）をＰＫＡ触媒サブユニット（４０Ｕ；シグマケミカル社、セントルイス、ＭＯ）により、ＰＫＡ阻害剤ＰＫＩ５−２４の存在又は不在下で、リン酸化バッファー（８ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＥＧＴＡ，及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＰＩＰＥＳ，ｐＨ６．８）中でリン酸化した。サンプルを１００，０００ｘｇにて１０分間遠心分離し、イミダゾールバッファー（１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７）中で３回洗浄した。組換え発現されたＦＫＢＰ１２．６（最終濃度２５０ｎＭ）を、異なる濃度のＪＴＶ−５１９の不在及び存在下で、サンプルに加えた。６０分間のインキュベーション後に、サンプルを１００，０００ｘｇにて１０分間遠心分離し、イミダゾールバッファーにより２回洗浄した。サンプルを９５度に加熱し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてサイズ分画した。ＳＲミクロソームのイムノブロッティングを抗−ＦＫＢＰ１２．６抗体（１：１，０００）及び抗−ＲｙＲ２−５０２９抗体（１：３，０００）により実施した（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０１７８】
結果
結果は、ＪＴＶ−５１９がＦＫＢＰ１２．６をＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２に結合させ得ることを示した（１００ｎＭにおいて一部結合、１０００ｎＭにおいて全部結合）。
文献
【０１７９】
【表１】
2007524631.tif 000002
【０１８０】
【表２】
2007524631.tif 000003
【０１８１】
【表３】
2007524631.tif 000004
【０１８２】
【表４】
2007524631.tif 000005
【０１８３】
【表５】
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【０１８４】
【表６】
2007524631.tif 000007
【０１８５】
【表７】
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【０１８６】
【表８】
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【０１８７】
【表９】
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【０１８８】
【表１０】
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【０１８９】
【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１】図１．ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化、マクロ分子シグナリング複合体．ＰＫＡ（５ユニット）又は３，５’−サイクリックアデノシン５’−一リン酸（ｃＡＭＰ）（１０μＭ）の添加により、ＲｙＲ２をリン酸化した；ＰＫＡ阻害剤ＰＫＩ５−２４（５００ｎＭ）がリン酸化を阻害した。ＲｙＲ２を免疫沈殿させて、インビトロキナーゼ反応に供した；等量のＲｙＲ２蛋白質をイムノブロッティングにより示すとおりに各反応において用いた。（Ｂ）ＲｙＲ２チャネルを、Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓら（１９８４）により記載されたとおりに、［３Ｈ］ライアノジンを使用して、蔗糖密度勾配上での遠心分離により単離した。［３Ｈ］ライアノジン結合（白い四角）及び全蛋白質（黒い円）の両方をプロットした。ＲｙＲ１沈降に関して以前に報告されたとおり、個々のＲｙＲ２チャネルは３０Ｓ沈降において沈降し（矢印）、そして２つ又はそれより多い物理的に付着したＲｙＲ２沈降は高蔗糖フラクションにおいて沈降した（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。（Ｃ）特異的抗体によるイムノブロッティング勾配フラクションは、ＦＫＢＰ１２．６、ＰＫＡ触媒サブユニット（ＰＫＡ  ｃａｔ）、ＰＫＡ制御サブユニット（ＲＩＩ）、高蛋白質ホスファターゼ２Ａ（ＰＰ２Ａ）、蛋白質ホスファターゼ１（ＰＰ１）、筋肉Ａ−キナーゼアンカーリング蛋白質がＲｙＲ２を含む全てのフラクションにおいて検出されたが、カルシニューリン（ＣｎＡ）は検出されなかったことを示した。（Ｄ）ミクロシスチン−セファロースビーズへ結合するＲｙＲ２を、フリーミクロシスチン−ＬＲを用いて競合させた。サンプルを沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、抗−ＲｙＲ抗体によりイムノブロッティングを行った。（Ｅ）ＲｙＲ２複合体の成分（ＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡ，ＲＩＩ，ＰＰ２Ａ，ＰＰ１，及びｍＡＫＡＰ）を心臓のＳＲ（２００μｇ蛋白質）により同時に免疫沈殿させた。ＲｙＲ２複合体をミクロシスチン−セファロースを用いて沈降させ、当該複合体をフリーのミクロシスチン−ＬＲとコンピートオフさせ、続いて、抗−ＲｙＲ抗体（αＲｙＲ）で免疫沈殿させてイムノブロッティングを行った。陽性対照（＋Ｃｏｎｔ．）は示されたとおり組換え蛋白質か又は精製された蛋白質であった；陰性対照（−Ｃｏｎｔ．）は各抗体のブロッキングペプチドであるか又は精製された蛋白質又は組換え蛋白質により予め吸着した抗体であった。全てのケースにおいて、示されたデータは３つより多い類似の実験の代表である。
【図２】図２．心不全の間のＲｙＲ２  ＰＫＡリン酸化．（Ａ）示された組織から免疫沈殿されたＲｙＲ２蛋白質のＰＫＡ戻しリン酸化（back-phosphorylation）を上部の列に示す；中部の列は各反応において免疫沈殿したＲｙＲ２の量を示す；そして底部の列は各サンプルからのＲｙＲ２と同時免疫沈殿したＰＫＡの量を示す。正常の不全ヒト心臓；ＩＣＭ，虚血性心筋症の末期の不全ヒト心臓；ＩＤＣＭ，突発性膨張心筋症（idiopathic dilated cardiomyopathy）の末期の不全ヒト心臓；ＩＤＣＭ（−Ｄｂａ）β−アドレナリンアゴニストＤｂａ（ドブタミン）により処置されていないヒト心臓からのサンプル；前−ＬＶＡＤ，左心室補助装置の挿入の間の末期の不全を伴うヒト心臓から採取された左心室サンプル；後−ＬＶＡＤ，ＬＶＡＤ処置後の同じヒト心臓からのサンプル；ＰＫＩ，ＰＫＡリン酸化がＰＫＩにより阻害されたことを示す代表的な陰性対照。（Ｂ）（Ａ）にて示されたＲｙＲ２戻しリン酸化研究の定量．挿入図は、抗−ホスホセリンイムノブロッティングにより確認されたＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化を示す：１）上部の列、ＲｙＲ２イムノブロット（上部のレーン）；２）底部の列、同じサンプルの抗体−ホスホセリンイムノブロッティング。レーン１、正常の非不全ヒト心臓；レーン２、不全ヒト心臓（ＩＣＭ）。各条件に関して、３つの異なる心臓からの組織を用いた３つの実験の最低値が成し遂げられ、エラーバーは平均の標準偏差を表す。（Ｃ）ＰＰ１及びＰＰ２Ａは正常及び心不全においてＲｙＲ２と同時沈殿した。抗−ＲｙＲ抗体による免疫沈殿後に、免疫沈殿物をサイズ分画し、そして抗−ＲｙＲ２（上部パネル）、抗−ＰＰ１（中部パネル）、又は抗−ＰＰ２Ａ抗体によりイムノブロッティングした。示されるデータは、３つの類似の実験の代表である。（Ｄ）ＲｙＲ２と同時免疫沈殿するＰＰ１とＰＰ２Ａの量をイムノブロットの比重定量により測定し、そして同時免疫したＲｙＲ２の量に関して標準化した。全ての心不全サンプルにおいて、ほとんどのＰＰ１及びＰＰ２ＡがＲｙＲ２と対合（associated）しなかった。示されるデータは、３つの類似の実験の代表である。
【図３】図３．ＲｙＲ２上のシグナリング複合体結合部位のマッピング．（Ａ）酵母の２−ハイブリッド相互作用スクリーンを用いて、ＲｙＲ２中のＦＫＢＰ１２．６結合部位を同定した。左の棒グラフは、１）ＦＫＢＰ１２．６／活性化ドメイン融合蛋白質のみ；２）ＲｙＲ２（残基２３６１−２４９６）／ＤＮＡ結合ドメインのみ；３）両者一緒により形質転換された酵母に関してのβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。ＦＫＢＰ１２．６とＲｙＲ２断片（残基２３６１−２４９６、Ｏｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）の間の相互作用は、増加したβ−ガラクトシダーゼ活性をもたらすＧａｌ−４転写を活性化する。当該棒グラフは、ＲｙＲ２からＦＫＢＰ１２．６をコンピートオフするラパマイシンを示された濃度で処理されたＦＫＢＰ１２．６及びＲｙＲ２断片で形質転換されたラパマイシン耐性酵母に関しての標準化されたβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。ＲｙＲ２中のＦＫＢＰ１２／１２．６結合部位は、イソロイシン２４２７とプロリン２４２８（矢印）により規定される。ボックス内に示されるのは、ＲｙＲ１（配列番号：１）（Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、ＲｙＲ２（配列番号：２）（Ｏｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）、ＩＰ３Ｒ１（配列番号：３）（Ｈａｒｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５），ＩＰ３Ｒ２（配列番号：４）（Ｙａｍａｍｏｔｏ−Ｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４），及びＴβＲＩ（配列番号：５）（Ｆｒａｎｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）内のＦＫＢＰ１２結合部位の配列である。（Ｂ）セファロースビーズに結合したグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−ＲｙＲ２融合蛋白質を、心臓ＳＲ（２００μｇ蛋白質）とインキュベートし、沈殿させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分画し、そして示された抗体とイムノブロットした。レーン１、陽性対照（組換え蛋白質）；レーン２、セファロースビーズ（陰性対照）；レーン３、ＧＳＴ（陰性対照）；レーン４、ＧＳＴ−ＲｙＲ２−１−３３４（アミノ酸残基１−３３４）；レーン５、ＧＳＴ−ＲｙＲ２−５１３−８０８；レーン６、ＧＳＴ−ＲｙＲ２−１０２７−１３０４；レーン７、ＧＳＴ−ＲｙＲ２−１２５１−１５００；レーン８、ＧＳＴ−ＲｙＲ２−１４５１−１７６８。（Ｃ）正常及び不全ヒト心臓におけるｍＡＫＡＰ及びＲｙＲ２の心臓ＳＲへの同一局在化を示す免疫組織化学．バー：長い、１．５μｍ；短い、５μｍ。（Ｄ）野生型（ＷＴ）及び変異体（Ｓ２８０９Ａ）ＰＫＡ部位を含むＧＳＴ−ＲｙＲ２融合蛋白質を用いたインビトロキナーゼ反応．ＰＫＡリン酸化を［γ３２Ｐ］−ＡＴＰにより、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのサイズ分画及びオートラジオグラフィーにより実施した。
【図４】図４．ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化はＦＫＢＰ１２．６結合を阻害する．（Ａ）ＦＫＢＰ１２．６を、心臓ＳＲから、抗−ＲｙＲ抗体、続いて抗−ＲｙＲ（上部パネル）又は抗−ＦＫＢＰ（底部パネル）抗体の何れかによるイムノブロッティングにより同時免疫沈殿させた。示された免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズ分画の前にＰＫＡでリン酸化した。ＦＫＢＰ１２．６のＲｙＲ２との同時免疫沈殿は、ＰＫＡリン酸化されたサンプルにおいて顕著に低下したが、Ｃａ２＋−カルモジュリンキナーゼ（ＣａＭＫＩＩ）又はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）リン酸化されたＲｙＲ２サンプルにおいてはしなかった。［γ３２Ｐ］−ＡＴＰを用いて評価したところによると、ＲｙＲ２リン酸化は、ＰＫＡ、ＣａＭＫＩＩ及びＰＫＣに関して均等であった（データは示さず）。（Ｂ）示されたサンプルからのＲｙＲ２とのＦＫＢＰ１２．６同時免疫沈殿の量の定量．正常ヒト心臓；前−ＬＶＡＤ，左心室補助装置の挿入の間の末期の不全を伴うヒト心臓から採取された左心室サンプル；後−ＬＶＡＤ，ＬＶＡＤ処置後の同じヒト心臓からのサンプル；ＩＤＣＭ，突発性膨張心筋症（idiopathic dilated cardiomyopathy）の末期の不全ヒト心臓；正常の非不全イヌ心臓；イヌの早い拍動に誘導された心不全モデル。挿入図は、抗−ＲｙＲ抗体を用いたＲｙＲ２とＦＫＢＰ１２．６の同時免疫沈殿の代表を示す：レーン１、正常の非不全ヒト心臓；レーン２、前−ＬＶＡＤ；レーン３、後−ＬＶＡＤ；レーン４、ヒトＩＤＣＭ；レーン５、正常イヌ心臓；レーン６不全イヌ心臓。正常に比較して心不全の各々において、ＲｙＲ２によるＦＫＢＰ１２．６同時免疫沈殿は顕著に低かった。示されるデータは、３つまたはそれより多い代表である。ＦＫＢＰ１２．６の量を、各実験に関しての単一のイムノブロットに基づいて、特異的ＦＫＢＰ１２．６の比重を用いて定量した。
【図５】図５．ＰＫＡリン酸化はＲｙＲ２を活性化してサブコンダクタンス状態を誘導する．（Ａ）ＭｇＡＴＰ（２ｍＭ）、続くＰＫＡ（２ユニット）の添加の効果を示す時間の関数としてプロットされた単一のＲｙＲ２中チャネルの開確率（Ｐｏ）。（Ｂ）Ａにおいて示された実験に相当する単一チャネルトレーシング。チャネルの開き（openings）は上方への方向であって、これらの条件下での完全な開チャネルに関しての電流の振幅（電流キャリアーとしてのＢａ２＋）は約４ｐＡであった。増加したＰｏ及び複数サブコンダクタンス状態がＰＫＡ処理の前と後のチャネルに関するトレーシングの右に示される。サブコンダクタンス状態は、１、２、又は３ｐＡの電流の振幅を有し、ＦＫＢＰ１２不在下でのチャネルのフルコンダクタンスの１／４，１／２及び３／４に相当する（Ｂｒｉｌｌａｎｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４；Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。底部のトレーシングは、ワンハーフコンダクタンス状態においてＰＫＡリン酸化されたＲｙＲ２チャネルをロックするライアノジン（１μＭ）によりＲｙＲ２チャネルの特徴的な修飾を示す。レコーディングは、脂質二層膜を横切る０ｍＶポテンシャルにおいてであった；破線はチャネルの閉じた状態を示す。示されたデータは、２匹の異なるイヌから単離されたＲｙＲ２を含むＳＲマイクロソームを用いた４つの実験の代表である（各動物に関して２つの別々の単離物）。類似の結果が正常なヒト心臓から単離されたＲｙＲ２チャネルを用いて得られた。
【図６】図６．心不全筋肉内の欠陥ＲｙＲ２チャネル及び収縮性．（Ａ）正常なイヌの心臓（上部の３つのトレーシング）；心不全のイヌ（底部の３つのトレーシング）からのＲｙＲ２の単一チャネルトレーシング．対応する振幅のヒストグラムは右側である。３つの各セットの底部のトレーシングは、１／２コンダクタンス状態にてチャネルをロックするライアノジン（１μＭ）によるＲｙＲ２チャネルの特徴的修飾を示す。レコーディングは０ｍＶにおいてであった；破線はチャネルの閉じた状態を示す。類似の結果がヒト心不全から単離されたＲｙＲ２チャネルを用いて得られた（詳細はテキストを参照）。（Ｂ）イヌの心不全からのＲｙＲ２チャネルは、シス（cis）（細胞質）チャンバー（上部トレーシング）中の≦５０ｎＭの遊離Ｃａ２＋において一般には不活性であった正常心臓からのチャネルと比較して、Ｃａ２＋−依存性活性化に対する増加した感受性を呈した。心不全からのＲｙＲ２チャネルは、≦５０ｎＭの遊離Ｃａ２＋において２種類のＣａ２＋−依存性活性化を呈した。心不全からのいくつかのチャネル（ｎ＝１５）は、≦５０ｎＭの遊離Ｃａ２＋において低いＰｏ（第２のトレーシング）を伴って活性であった；その他（ｎ＝４）は≦５０ｎＭの遊離Ｃａ２＋において極めて活性であり、サブコンダクタンス状態において安定に開いたままであった（底部トレーシング）。類似の結果がヒト心不全から単離されたＲｙＲ２のチャネルを用いて得られた。（Ｃ）イソプロテレノール（４μＭ）への暴露の間のヒトの左心室柱からの連続した力によるトレーシング（continuous force tracings）。正常な心臓サンプルは、イソプロテレノール後の力において３倍を超える増加を示した。鬱血性心不全（ＣＨＦ）の患者からの筋肉は、移植前にβ−アゴニストを受けた患者において応答無しであるか、又は移植前にβ−アゴニストを受けなかった患者において鈍い応答（約２倍増加）を示した。外科手術の前にβ−アゴニストを受けたＬＶＡＤレシピエントの頂点コア組織から得た筋肉は、イソプロテレノールに対してほとんど応答を示さなかった。しかしながら、同じ患者からＬＶＡＤサポートの４８時間後に得られた筋肉は、イソプロテレノールに対する応答において５倍より高い増加を示す（ｎ＝３，ｐ＜０．０１）。
【図７】図７．心臓中のＰＫＡリン酸化の効果のモデル．非不全心臓（左のパネル）において、β−アゴニストは、ヘテロトリマーＧ−プロテイン（Ｇｐｒｏｔ）にカップリングさせた受容体（β１及びβ２アドレナリン受容体、ＡＲｓ）に結合し、今度は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）を活性化してサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）レベルを上昇させ、そしてＰＫＡを活性化する。このモデルにおいては、ＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化が活性化に関するＣａ２＋−依存性を左にシフトさせるチャネルからの一つのＦＫＢＰ１２．６の解離を誘導し、Ｔ−細管（ジヒドロピリジン受容体、ＤＨＰＲ）内の電位差で関門開閉されたカルシウムチャネルによるＣａ２＋−流入による活性化に対するＲｙＲ２の感受性を増加させ、そしてＲｙＲ２チャネル開確率を増加させる。結果は、増加したＳＲ  Ｃａ２＋放出及び心臓収縮性である。テトラマーＲｙＲ２チャネルはマクロ分子シグナリング複合体の一部であり、ＲｙＲ２，ＦＫＢＰ１２．６，ＰＫＡ，プロテインホスファターゼＰＰ１及びＰＰ２Ａ，及びアンカーリング蛋白質ｍＡＫＡＰの各４分子を含む（マクロ分子複合体のＰＫＡ，ＰＰ１，ＰＰ２Ａ，ｍＡＫＡＰ成分を４つのＲｙＲ２サブユニットのたった一つのみに関して示す）。Ｃａ２＋のＳＲへの再取込みは、ＳＲ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）及びその関連する制御性蛋白質ホスホランバン（ＰＬＢ）を通して起こる。
【０１９１】
心不全においては（右のパネル）、ＲｙＲ２のＰＫＡ高リン酸化が心不全筋肉において観察されるβ−アゴニストに対する鈍い応答に寄与するかもしれないのは、当該チャネルがさらにＰＫＡリン酸化され得ないからである。心不全におけるＲｙＲ２チャネルは、それらがサイトゾルのＣａ２＋の休止レベルにおいて活性化されるように、活性化に関してＣａ２＋−依存性におけるシフトを呈する。
【図８】図８．ＦＫＢＰ１２．６けそマウスの生成．（Ａ）マウスＦＫＢＰ１２．６遺伝子（上部）、標的化遺伝子（中部）、及び相同性組換え変異対立遺伝子（底部）の制限マップ。エクソン３及び４を含む３．５キロベース（ｋｂ）のＳｐｅＩ−ＳａｃＩセグメントをネオマイシン耐性（ｎｅｏ）発現カセットで置き換えた。チミジンキナーゼ（ｔｋ）カセットを、ネガティブ選択のために３’末端に連結した。（Ｂ）ＦＫＢＰ１２．６対立遺伝子に関してのマウスヘテロ接合性（＋／−）又はホモ接合性（−／−）、及び野生型マウス（＋／＋）の尾部から抽出されたＤＮＡのサザンブロット分析。ＤＮＡをＮｇｌＩＩにより消化し、そして５’プローブ（パネルＡに示す）にハイブリダイズさせることにより、野生型（＋／＋）及びＦＫＢＰ１２．６−欠損（−／−）マウスに関してそれぞれ８．５ｋｂ及び７．７ｋｂのバンドを生じた。（Ｃ）ＦＫＢＰ１２．６（＋／＋）及び（−／−）マウスからの心臓ホモジェネートのＦＫＢＰ１２／１２．６イムノブロット。
【図９】図９．ＦＫＢＰ１２．６−欠損マウスにおける運動誘導性胎児心室不整脈及び遅延した後脱分極．（Ｂ）ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスに対する（Ａ）知覚のあるＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスのＥＣＧｓを比較するが、顕著な異常性はなかった。（Ｃ）運動及びエピネフィリン後のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスのＥＣＧ。精力的な運動及びエピネフィリン注射（トレースの約８分前）は、ＦＫＢＰ１２．６−／−マウスにおいて多形性心室性頻脈を誘導し、このトレースの記録の４分後に死んだ。このストレス試験はオス（ｎ＝３）及びメス（ｎ＝５）のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスの８／８（１００％）において心室不整脈をもたらしたのに対して、ＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスでは０／６（０％）であった。作用ポテンシャルは、（Ｄ）ＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウス（ｎ＝１９）及び（Ｅ）ＦＫＢＰ１２．６−／−マウス（ｎ＝３８）の心筋において早いペーシングの間に記録された。作用ポテンシャルは電流クランプモードにおいて１２Ｈｚにて簡単な電流注射（brief current injection）により刺激されたパッチクランプされた単一の心筋内で生じた。パネル（Ｄ）及び（Ｅ）の底部の上方の矢印は、誘導された作用ポテンシャルのタイミングを示す。（Ｅ）に示されるもののような後脱分極（after-depolarization）が、４匹のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＦＫＢＰ１２．６−／−心筋（ｎ＝６）において観察された。下方への矢印は、遅延した後分極（ＤＡＤ）を示し、ＦＫＢＰ１２．６−／−心筋において期外収縮を生じた。
【図１０】図１０．運動中のＦＫＢＰ１２．６欠損マウスからのＲｙＲ２の増加した開確率を示す単一チャネル研究．（Ａ）ＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウス及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化が運動中に増加した。「材料と方法」に記載されるとおりにマウスを運動させ、そして運動終了後に心臓を素早く取り出して急速凍結した。ＲｙＲ２を心臓のホモジェネートから免疫沈殿させ、そしてＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化を、ＲｙＲ２−Ｓｅｒ２８０９にてＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２を特異的に認識するホスホエピトープ−特異的抗体（抗−ＲｙＲ２−Ｐ２８０９）を用いて評価した。ＲｙＲ２のカルボキシ末端を認識する抗体である、ＲｙＲ２の抗−ＲｙＲ２−５０２９（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）によるイムノブロットを使用することにより、等量のＲｙＲ２蛋白質が各サンプルにおいて試験されたことを示した。（Ｂ）運動後にＲｙＲ２に結合したＦＫＢＰ１２．６の量はＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウスにおいて低下した（チャネルからＦＫＢＰ１２．６を解離させるＲｙＲ２のＰＫＡリン酸化のため）。ＦＫＢＰ１２．６−／−マウス中では、ＲｙＲ２マクロ分子複合体中にＦＫＢＰ１２．６は検出されなかった。（Ｃ）−（Ｆ）運動後のＦＫＢＰ１２．６＋／＋に比較したＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＲｙＲ２の増加した開確率を示す単一チャネル研究。各条件に関して、チャネルの開きは上方であり、破線は完全な開きのレベルを示し（４ｐＡ）、そして「ｃ」は閉じた状態を示す。チャネルは、圧縮され（５秒、上部トレーシング）そして伸長された（５００ｍｓ，底部トレーシング）時間スケールにて示される；記録は０ｍＶにおいてであった。ＦＫＢＰ１２．６＋／＋及びＦＫＢＰ１２．６−／−チャネルの振幅のヒストグラムは増加した活性を証明し、そして運動したＦＫＢＰ１２．６＋／＋チャネルにおいて部分的又はサブコンダクタンスの開きを証明した。（Ｇ）対照及び運動したＦＫＢＰ１２．６＋／＋マウス及びＦＫＢＰ１２．６−／−マウスの開確率（Ｐｏ）の要約は、心臓内で拡張期を刺激する条件下（低い細胞質［Ｃａ２＋］＝１５０ｎＭ）で、運動後のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスにおける増加したＰｏを明らかにした。
【図１１】図１１．運動誘導性の心臓性急死にリンクしたＲｙＲ２変異はＦＫＢＰ１２．６親和性を減少させてＰＫＡリン酸化によるＲｙＲ２活性化を増加させる．（Ａ）ＣＰＶＴ−関連性ＲｙＲ２変異の位置決定。ＲｙＲ２内の公知のＣＰＶＴ変異を垂直線により示す；この出願において分析された３つのＣＰＶＴ変異を太い垂直線で示し、そして相当するアミノ酸置換により区別する。「ＦＫＢＰ１２．６」結合部位をＲｙＲ２上に示す；「Ｓ２８０９」はＲｙＲ２上のＰＫＡリン酸化部位である。悪性高熱（ＭＨ）及びセントラルコア病（ＣＣＤ）にリンクした骨格筋ＲｙＲ１変異のクラスターを含む３つの領域を太いグレーの線で示す。ＣＰＶＴ及びＭＨ／ＣＣＤ変異はそれぞれＲｙＲ２とＲｙＲ１の高度に相同な領域内に起こることから、ＳＲ  Ｃａ２＋放出における共通の欠陥が、これらの障害において役割を担うかもしれないことを示唆する。（Ｂ）ＣＰＶＴ−変異ＲｙＲ２チャネルは運動を刺激する条件下のみにおいて変更されたチャネル活性を呈する。ＰＫＡプラスＰＫＡ阻害剤ＰＫＩ５−２４で処理されたＨＥＫ２９３細胞内で発現されたＷＴ及びＣＰＶＴ−変異ＲｙＲ２の単一チャネルレコーディング。ＲｙＲ２−ＷＴ及びＣＰＶＴ−関連変異チャネルは、１５０ｎＭのシス（cis）（細胞質）［Ｃａ２＋］を伴う基底条件下では低い活性を呈する。ＰＫＡリン酸化されたＣＰＶＴ−変異ＲｙＲ２は、ＲｙＲ２−ＷＴチャネルに比較して、増加した活性を呈する。少なくとも２つの別々の調製物からの最少の５チャネルをＲｙＲ２−ＷＴに関して記録し、そして示された各条件に関して変異ＲｙＲ２チャネルを記録した。（Ｃ）ＰＫＡリン酸化後のＲｙＲ２−ＷＴ及びＣＰＶＴ−関連変異ＲｙＲ２の平均開確率（Ｐｏ）；＊はＰ＜０．０５を示す。（Ｄ）ＲｙＲ２−ＷＴ及びＣＰＶＴ−関連変異ＲｙＲ２チャネルを含むミクロソームに結合する３５Ｓ−標識されたＦＫＢＰ１２．６はＣＰＶＴ−関連変異ＲｙＲ２チャネルに関しての低下したＦＫＢＰ１２．６親和性を示す。（Ｅ）ＲｙＲ２−ＷＴ及びＣＰＶＴ−関連変異体ＲｙＲ２（ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓ）の一つをホモ−又はヘテロテトラマーチャネルとして表した。ＲｙＲ２−ＷＴ，ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓ，及びヘテロテトラマーＷＴ  ｘ  Ｒ２４７４Ｓチャネルの代表的単一チャネルトレースを示し、ＰＫＡリン酸化後のＷＴ  ｘ  Ｒ２４７４Ｓチャネルの増加した活性を示す。（Ｆ）ＲｙＲ２−ＷＴ，ＷＴ  ｘ  Ｒ２４７４Ｓ，及びＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓチャネルに関する平均開確率を要約する棒グラフ；＊はＰ＜０．０５を示す。
【図１２】図１２．変異ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓは正常な単一チャネル機能を運動したＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのチャネル及びＰＫＡ−リン酸化されたＣＰＶＴ−変異チャネルに戻す．（Ａ）等量のマウス心臓ＳＲ（ＣＳＲ）から免疫沈殿させたＲｙＲ２、及びＨＥＫ２９３細胞内で発現させた組換えＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄの、ＲｙＲのカルボキシ末端を認識する抗−ＲｙＲ−５０２９抗体を用いたイムノブロット（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）．ＰＫＡリン酸化後のＲｙＲ２からのＦＫＢＰ１２．６の解離を示すＦＫＢＰ１２．６のイムノブロット。野生型ＦＫＢＰ１２．６はＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２に結合しない。変異体ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７ＳはＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２チャネルに結合した。ＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄはリン酸化されたＲｙＲ２チャネルを構成的に模倣し、よって、ＦＫＢＰ１２．６を結合しない。（Ｂ）ＦＫＢＰ１２．６（上部）及び変異ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓ（底部）により処理されたＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄチャネルの単一チャネルトレーシングは、ＰＫＡ−リン酸化されたＲｙＲ２チャネルに類似して、ＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄチャネルの増加した開確率を示す（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７ＳのＲｙＲ２−Ｓ２８０９Ｄチャネルへの結合は、正常なチャネル関門開閉を救済し、そして開確率を低下させた（底部）。対応する振幅のヒストグラムを右に示すが、ＦＫＢＰ１２．６−処理されたチャネル中の部分的な開き又はサブコンダクタンス状態の存在を示し、ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓ存在下では示さない。（Ｃ）運動したオス（Ｍ）及びメス（Ｆ）のＦＫＢＰ１２．６−／−マウスからのＣＳＲのＲｙＲ２及びＦＫＢＰ１２．６のイムノブロット。野生型ＦＫＢＰ１２．６は、運動したＦＫＢＰ１２．６−／−マウスマウスの心臓から単離されたＲｙＲ２は結合しないが、ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓは結合する。（Ｄ）ＦＫＢＰ１２．６−／−心臓から単離されたＲｙＲ２チャネルの単一チャネルトレーシングは、高い開確率及びサブコンダクタンス状態を示す（右のヒストグラムを参照）。ＦＫＢＰ１２．６Ｄ３７Ｓの結合はチャネル表現型を完全に救済する；開確率は劇的に低下し、そしてサブコンダクタンス開きは観察されなかった。（Ｅ）ＨＥＫ２９３細胞内で発現された組換えＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓのイムノブロット。ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓは、ＰＫＡ−リン酸化された、ＣＳＲ−関連変異体ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓチャネルにも結合する。（Ｆ）ＰＫＡリン酸化後のＣＳＲ−関連変異体ＲｙＲ２−Ｒ２４７４Ｓチャネルの単一チャネルトレーシングは、高開確率及びサブコンダクタンス状態の存在を示す（振幅のヒストグラムを参照）。ＦＫＢＰ１２．６−Ｄ３７Ｓの結合は、チャネル関門開閉及び開確率を完全に標準化した。各トレーシングに関して、チャネル開きは上方に向かい、破線は完全な開きのレベル（４ｐＡ）を示し、そして「ｃ」は閉じた状態を示す。チャネルは、圧縮され（５秒、上部トレーシング）そして伸長された（５００ｍｓ，底部トレーシング）時間スケールにて示される；記録は０ｍＶにおいてであった。
【図１３】図１３．心臓不整脈を誘因する遅延した後脱分極をＳＲ  Ｃａ２＋漏出が開始するかもしれない機構のモデル．心筋中の興奮性収縮（ＥＣ）カップリングの間、筋小胞体（ＳＲ）上の心臓のライアノジン受容体（ＲｙＲ２）を、横断管（Ｔ−管）上の電位差−関門開閉カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）を通してＣａ２＋の流入により活性化する。交感神経系のストレス／運動により誘導された活性化に応答して、ＲｙＲ２はＰＫＡ−リン酸化され、チャネルからのＦＫＢＰ１２．６の解離を引き起こし、そしてその開確率を増加させる。これは、正常な物理的ストレス応答の一部である（例えば、「闘争又は逃避」）。正常な心臓においては、生理学上ＰＫＡ−リン酸化されたときでさえ、心筋が弛緩して次の収縮のために（心収縮期）血液を再度満たし得る心拡張期の間、野生型ＲｙＲ２がきつく閉じたままであり得る。これは、心臓不整脈を誘因し得る遅延した後脱分極を開始し得る心拡張期の間の、ＳＲ  Ｃａ２＋の漏出を防ぐのに必要である（Ｆｏｚｚａｒｄ，１９９２；Ｗｉｔ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，１９８３）。ＣＳＲ−関連ＲｙＲ２変異体チャネルの場合、それらがＰＫＡ−リン酸化されているとき（ＦＫＢＰ１２．６の結合親和性の低下のため）に、チャネルの増加した活性（増加した開確率）が、内部脱分極電流により、おそらくはナトリウム／カルシウム交換体のためにＤＡＤｓを活性化し得る心拡張期の間の異常なＳＲ  Ｃａ２＋漏出の確率を増加させ、心臓不整脈を誘因する（Ｐｏｇｗｉｚｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。類似の機構は、構造上は正常なＲｙＲ２がＰＫＡ−リン酸化されて欠陥チャネル機能をもたらす心不全における心臓不整脈を経るかもしれず（Ｍａｒｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、不整脈を誘因し得るＳＲ  Ｃａ２＋漏出を促進するかもしれない（Ｐｏｇｗｉｚｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ナトリウム／カルシウム交換体による内部脱分極電流の活性化により誘因された心臓不整脈の起こる可能性は、上記交換体のアップ制御により心不全内でさらに増強される（Ｐｏｇｗｉｚｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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