(57)【要約】【課題】本発明は、ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上に見いだされる抗原に関し、この抗原に対して高い特異性及び選択性を有する抗体、及び主題の抗体を分泌するハイブリドーマを提供する。膵臓癌の診断及び処置のための方法もさらに提供する。【解決手段】膵臓悪性線腫の組織マーカーであるＰａＣａ−Ａｇｌと命名された約４３．５ｋＤの表面膜タンパク質は、通常の膵臓では全く発現しないが、膵臓癌腫細胞中では豊富に発現する。さらに、主題の抗体を用いて、膵臓癌患者の血清及び他の体液中で容易に同定される分子量約３６〜約３８ｋＤａを有するＰａＣａ−Ａｇｌの可溶性形態が存在する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量が約４３．５ｋＤａ；
等電点電気泳動法でのｐＩが約４．５〜約５．０；
グリコシル化されていないか、又は最小限グリコシル化されており；及び
正常な非増殖性細胞においては検出されないが、ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上に主に局在化していることを特徴とする、実質的に精製された形態における膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇ。
【請求項２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量約３６〜約３８ｋＤを有し、膵臓癌患者の血清及び他の体液から単離可能な、膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇ。
【請求項３】
請求項１に記載の膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇの免疫的に活性なフラグメント。
【請求項４】
膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇに対する結合特異性を有し、前記抗原が
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量が約４３．５ｋＤａ；
等電点電気泳動法でのｐＩが約４．５〜約５．０；
グリコシル化されていないか、又は最小限グリコシル化されており；及び
正常な非増殖性細胞においては検出されないが、ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上に主に局在化していることを特徴とする、抗体又はそれらの結合部分。
【請求項５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される分子量約３６〜約３８ｋＤを有し、膵臓癌患者の血清及び他の体液から単離可能な可溶性の膵臓癌腫特異的な抗原にも結合する、請求項４に記載の抗体又はそれらの結合部分。
【請求項６】
ポリクローナル抗体である、請求項４又は５に記載の抗体。
【請求項７】
モノクローナル抗体である、請求項４又は５に記載の抗体。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の３Ｃ４−Ａｇ抗原と特異的に免疫活性なモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系。
【請求項９】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系。
【請求項１０】
請求項９に記載のハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体ｍＡｂ３４Ｃ。
【請求項１１】
ヒト化形態における請求項７又は１０に記載のモノクローナル抗体ｍＡｂ３Ｃ４。
【請求項１２】
前記抗体が、蛍光体、ケミロフォア、化学発光剤、光増感剤、懸濁粒子、同位体元素又は酵素で標識される、請求項４又は５に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、蛍光体、ケミロフォア、化学発光剤、光増感剤、懸濁粒子、同位体元素又は酵素で標識される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が治療薬物又は毒素に接合又は結合する、請求項４又は５に記載の抗体。
【請求項１５】
前記治療薬物又は毒素が、ＳＥＱＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号：１）において記載されるアミノ配列の少なくとも約６連続するアミノ酸配列のペプチド、又はそれらの類似体もしくは誘導体である、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
アミノ酸配列ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号：４）を有するアンテナペディアタンパク質由来のペネトラチン配列が、前記ペプチドのカルボキシ末端に位置する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
前記抗体が治療薬物又は毒素に接合又は結合する、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１８】
動物被検体において膵臓癌を検出する方法であって、
（ａ）前記被検体由来の細胞、組織又は液体サンプルと、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分；モノクローナル抗体ｍＡｂ３４Ｃ；又はモノクローナル抗体ｍＡｂ３４Ｃによって結合されるエピトープに結合する抗体の少なくとも１つとを、前記抗体が前記サンプル中の抗原に特異的に結合可能な条件下で接触させ、抗体−抗原複合体を形成する工程；
（ｂ）前記サンプル中の抗体−抗原複合体を検出する工程；及び
（ｃ）前記サンプル中の抗体−抗原複合体の増加レベルの検出と膵臓癌の存在とを関係付ける工程とを含む、方法。
【請求項１９】
患者由来の細胞、組織又は液体サンプルにおける３Ｃ４−Ａｇを検出するのに好適な診断キットであって、
（ａ）３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分、
（ｂ）前記抗体又はそれらの結合部分のための特異的な結合パートナーの接合体；及び
（ｃ）前記結合した抗体を検出するための標識を含む、キット。
【請求項２０】
膵臓癌を患う患者において膵臓癌を処置する方法であって、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する有効量の抗体又はそれらの結合部分を前記患者に投与する工程を含み、前記抗体又はそれらの結合部分が治療薬物又は毒素に接合又は結合する、方法。
【請求項２１】
前記抗体がｍＡｂ３Ｃ４である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療薬物又は毒素が、ＳＥＱＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号：１）において記載されるアミノ配列の少なくとも約６連続するアミノ酸配列のペプチド、又はそれらの類似体もしくは誘導体である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
薬学的に許容可能なキャリアと混合される、３Ｃ４−Ａｇに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分を含む薬学的組成物。
【請求項２４】
前記３Ｃ４−Ａｇに特異的に結合する抗体またはそれらの結合部分が治療薬物又は毒素に接合又は結合する、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌腫細胞の表面上に見出される特定の抗原の発見、及び高い特異性及び抗原に対する選択性を有するモノクローナル抗体に関する。抗原及びその抗原に対する抗体は、動物、特にヒトにおける膵臓癌の診断及び処置において使用されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
膵臓癌は、疾患を有すると診断された患者の平均生存期間がたった８０〜９０日である、ほぼ常に致命的な疾患である。膵臓癌は、アメリカ合衆国において死亡した多くの患者数にとってより致死率の高い癌の１つである。診断時から５年生存できるのは患者の４％未満であり、約７年後には確実に死に至る。現在では、体液又は分泌物中の膵臓癌に特異的な抗原を同定する膵臓癌に特異的なマーカー、膵臓癌に特異的な抗体、膵臓癌に特異的なアッセイは存在しない。
【０００３】
膵臓癌（ＰａＣａ）がアメリカ合衆国だけで毎年２９，０００人の新しい生命を奪い、それ故に、癌に関連する死亡数において４番目の位置を占める１つの理由は、初期の診断ツールがないからである。効果的な初期の診断ツールは、ＰａＣａに特異的で、治療的介入が首尾よく致死疾患の進行を抑えると同時に同定可能なマーカーを必要とする。
【０００４】
膵臓癌腫を初期の治癒可能な段階で検出するためのコスト的に有効な非侵襲性試験が緊急で必要とされる。患者の８％のみが局所的疾患を有するのに対して、診断時に５１％が遠位の疾患を有する（非特許文献１）；前者の５年生存率は１７〜３０％であるのに対して、後者は２％である（非特許文献２）（非特許文献３）。特に高い死亡率、臨床的症状が現れた時には膵臓損害の８５％が切除不可能であること、効果的な治療法がないこと、及び２ｃｍ以下の損害でさえ（通常は偶然発見される）すでに転移しているか、又はすでに高い死亡率を有している場合があることから、膵臓悪性腫瘍の初期検出のために有用な試験の開発は気力を失わせるほどの挑戦である（非特許文献４）；（非特許文献５）；（非特許文献６）；（非特許文献７）。膵臓悪性線腫のために社会にかかるコストは、処置のみで１年あたり２６億ドルであると概算されている（非特許文献８）；この数字はこの疾患の罹患率及び死亡率によって影響を受ける逸失利益及び他の因子は考慮されていない。
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ  Ａ，  Ｍｕｒｒａｙ  Ｔ，Ｓａｎ２ｕｅｌｓ  Ａ，  Ｇｈａｆｏｏｒ  Ａ，  Ｗａｒｄ  Ｅ，  Ｔｈｕｎ  ＭＪ  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００３．  Ｃａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ，  ５３：５−２６，２００３．
【非特許文献２】Ｊｅｍａｌ  Ａ，  Ｍｕｒｒａｙ  Ｔ，Ｓａｎ２ｕｅｌｓ  Ａ，  Ｇｈａｆｏｏｒ  Ａ，  Ｗａｒｄ  Ｆ，  Ｔｈｕｎ  ＭＪ  Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ２００３．  Ｃａ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｉｎ，  ５３：５−２６，２００３．
【非特許文献３】Ｙｅｏ，  Ｃ．Ｊ．  （１９９５）．  “Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｏｄｕｏｄｅｎｅｃｔｏｎｉｙ．”  ＳｕｒｇＣｌｊｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ７５（５）：  ９１３−２４．
【非特許文献４】Ｂｉｒｋｍｅｙｅｒ  ＪＤ，  Ｗａｒｓｈａｗ  ＡＬ，  Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ  ＳＲＧ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｆｔｅｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｏｄｕｏｄｅｎｅｃｔｏｍｙ．  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２６：  １７８−８３，  １９９９．
【非特許文献５】Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＲＣＧ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ４：８８９−９１６，１９９０．
【非特許文献６】Ｎｉｘ  ＧＡＪＪ，Ｄｕｂｂｅｌｍａｎ  Ｃ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＪＨＰ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉａｍｅｔｅｒ  ｉｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：５２９−５３５，１９９１．
【非特許文献７】Ｔｓｕｃｈｉｙａ  Ｒ，  Ｔｏｍｉｏｋａ  Ｔ，  Ｉｚａｗａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ，  ２０３：７７−８１，１９８６．
【非特許文献８】Ｅｌｉｘｈａｕｓｅｒ  Ａ，  Ｈａｌｐｅｒｎ  ＭＴ．  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏ−ｅｎｔｅｒｏｌ，  ４６：１２０６−１２１３，  １９９９．
【０００６】
現在、膵臓癌腫を診断し、疾患の進行をモニターし、治療に対する応答をモニターするために唯一広く使用されている臨床的な血清試験は、炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）のＥＬＩＳＡアッセイである。直腸癌腫細胞系抗原に対して製造されるモノクローナル抗体によって検出されるＣＡ１９−９（非特許文献９）は、多くの膵臓悪性線腫において高濃度で発現するが、正常な膵臓、胆管及び胃腸管中の細胞にも存在するガングリオシドシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオース（非特許文献１０）である（非特許文献１１）；（非特許文献１２）。従って、これらの組織に対する炎症又は障害は、血液流内にＣＡ１９−９の流出を生じ、膵炎、肝硬変及び閉塞性胆管炎のような通常の非腫瘍性疾患における偽陽性上昇を導く（非特許文献１３）。ＣＡＩ９−９ＥＬＩＳＡの偽陽性は、２〜５４％の範囲で報告されており（非特許文献１４）；（非特許文献１５）、膵臓悪性線腫の初期検出のためのスクリーニングとしてのＣＡ１９−９アッセイを有用性のないものにしている。さらに、ＣＡ１９−９はさらに、胆管癌腫、肝細胞癌腫、胃腸管の癌腫（直腸、胃、食道）及びいくつかの他の癌を含む非膵臓の悪性腫瘍のスペクトルも高める（非特許文献１６）；（非特許文献１７）；（非特許文献１８）。
【０００７】
【非特許文献９】Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ  Ｈ，Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ  Ｚ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｏｍａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：９５７−０７２，１９７９．
【非特許文献１０】Ｍａｇｎａｎｉ  Ｊ，  Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｂｒｏｃｋｌｉａｎｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍｏｎｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ａ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ  ＩＩ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｒｎ  ２５７：１４３６５−１４３６９，１９８２．
【非特許文献１１】Ａｒｅｎｄｓ  ＪＷ．  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ｍｏｎｏｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｔｕｄｙ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：２１９−２２９，１９８２
【非特許文献１２】Ｒｏｌｌｈａｕｓｅｒ，Ｃ，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｗ．Ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｂｅｒ．Ｉｎ：  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｅｄｔ．：Ｈ  Ａ  Ｒｅｂｅｒ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ．ｐｐ１３７−１５６．１９９８．
【非特許文献１３】Ｒｏｌｌｈａｕｓｅｒ，Ｃ，Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｗ．Ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｂｅｒ．  Ｉｎ：  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｅｄｔ．：Ｈ  Ａ  Ｒｅｂｅｒ，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ．ｐｐ１３７−１５６．１９９８．
【非特許文献１４】Ｊａｌａｎｋｏ，Ｈ．，Ｐ．Ｋａｕｓｅｌａ，  ｅｔ  ａｌ（１９８４）．”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｒｋｅｒ，  ＣＡ  １９−９，  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｐｐｅｒ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ３７（２）：  ２１８−２２．
【非特許文献１５】Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ  Ｍ，Ｈａｇｌｕｎｄ  Ｕ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，  ３４：８３３−８４４，  １９９９．
【非特許文献１６】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｗ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡ  １９−９  ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，８５：３５９−３５５，１９９０．
【非特許文献１７】Ｍａｅｓｔｒａｎｚｉ  ｓ，  Ｐｒｚｅｍｉｏｓｌｏ  Ｒ，  Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  Ｈ，  Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  Ｒ．Ａ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ＣＡ  １９−９  ａｎｄ  ＣＥＡ．  Ａｎｎ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｒｎ，３５：９９−１０３，１９９８．
【非特許文献１８】Ｃａｒｐａｌａｎ−Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ  Ｍ，  Ｌｏｕｈ．ｉｍ  Ｊ，  Ｓｔｅｉｒｎａｎ  ＵＨ，  Ａｌｆｔｈａｎ  Ｈ，  Ｈａｇｌｕｎｄ  Ｃ．ＣＥＡ，ＣＡ  １９−９  ａｎｄ  ＣＡ７２−４  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｃｃｕｒａｃｙ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２２：２３１１−２３１６，２００２．
【０００８】
ＣＡ１９−９の感受性は、３７Ｕ／ｍｌの推奨されたカットオフ値を用いて６８〜９３％の範囲であると報告されている（非特許文献１９）；（非特許文献２０）；（非特許文献２１）。感受性は、切除可能な損害対切除可能でない損害の検出のために顕著に低下する；１つの代表的な研究では、後者の感受性は９０％であり、切除可能な損害の検出については７４％に低下する（非特許文献２２）。ＣＡ１９−９オリゴ糖鎖はさらに、Ｌｅｗｉｓａ血液グループ抗原を規定する（非特許文献２３）。集合の約１０〜１５％は、この抗原を発現せず（非特許文献２４）、このサブ集合において初期検出だけではなく、治療に対する応答及びＣＡ１９−９の減少及び増加を介する再発をモニターするためにもＣＡ１９−９を有用でないものにする（例外は、ＣＡ１９−９抗原の膵臓癌発現を有する少数のＬｅｗｉｓａ陰性患者である（非特許文献２５）；（非特許文献２６）；（非特許文献２７）。
【０００９】
【非特許文献１９】Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｗ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＡ  １９−９  ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，  ８５：３５９−３５５，１９９０．
【非特許文献２０】Ｊａｌａｎｋｏ，Ｈ．，Ｐ．Ｋｕｕｓｅｌａ，  ｅｔ  ａｌ  （１９８４）．  “Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍａｒｋｅｒ，  ＣＡ  １９−９，  ｗｉｔｈ  ａｌｐｈａ−ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｐｐｅｒ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．”  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ３７（２）：  ２１８−２２．
【非特許文献２１】Ｅｓｋｅｌｉｎｅｎ  Ｍ，  Ｈａｇｌｕｎｄ  Ｕ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｅｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，３４：８３３−８４４，１９９９．
【非特許文献２２】Ｓａｆｉ  Ｆ，  Ｓｃｈｉｏｓｓｅｒ  Ｗ，  Ｆａｌｋｅｎｒｅｃｋ  Ｓ，  Ｂｅｇｅｒ  ＨＧ．  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ＣＡ  １９−９  ｓｅｒｕｍ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．  ４５：２５３−９，１９９８．
【非特許文献２３】Ｍａｇｎａｎｉ  Ｊ，  Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｂｒｏｃｋｌｉａｎｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍｏｎｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｆｍｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｓ  ａ  ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ｌａｃｔｏ−Ｎ−ｆｕｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ  ＩＩ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｒｍ  ２５７：１４３６５−１４３６９，１９８２．
【非特許文献２４】Ｔｅｍｐｅｒｏ，  Ｍ．Ａ．，Ｅ．  Ｕｃｈｉｄａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）．“Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  １９−９  ａｎｄ  Ｌｅｗｉｓ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  “Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７（２０）：  ５５０１−３．
【非特許文献２５】Ｙａｚａｗａ，Ｓ．，Ｔ．Ａｓａｏ，ｅｔ  ａｌ．  （ｌ９８８）．“Ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＡ１９−９  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｓａｌｉｖａ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｗｉｓ  ｂｌｏｏｄ−ｇｒｏｕｐ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．”  Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７９（４）：  ５３８−４３．
【非特許文献２６】Ｔａｋａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｕｃｈｉｄａ  Ｂ，  Ｔｅｍｐｅｒｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＡ  １９−９  ａｎｄ  ＤＵＰＡＮ−２  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：１４３５−１４３８，  １９８８．
【非特許文献２７】Ｖｏｎ  Ｒｏｓｅｎ  Ａ，  Ｌｉｎｄｅｒ  Ｓ，  Ｈａｒｍｅｎｂｅｒｇ  Ｕ，  Ｐｅｇｅｒｔ  Ｓ．  Ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＣＡ  １９−９  ａｎｄ  ＣＡ  ５０  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌｅｗｉｓ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｔｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｎｄ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐａｎｃｒｅａｓ  ８：１６０−１６５，１９９３．
【００１０】
膵臓癌腫細胞について別のさらに最近開発された、血清マーカーとして臨床的な診断能力を有する分子標識は、ホスファチジルイノシトールに結合した表面タンパク質メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）であり（非特許文献２８）、これは、膵臓悪性線腫の大多数において過剰発現する（非特許文献２９）。メソセリンは、正常な中皮細胞で発現し、中皮腫中の卵巣悪性線腫（卵巣表面上の改質された中皮細胞から誘導される腫瘍）、有意な数の非小細胞肺癌腫、乳癌腫、子宮内膜癌腫、頚部癌腫、子宮内膜癌腫、腸癌腫、及び直腸癌腫の９５％中に存在する（非特許文献３０）；（非特許文献３１）。
【００１１】
【非特許文献２８】Ｃｈａｎｇ  Ｋ，Ｐａｉ  ＬＩ−Ｉ，  Ｂａｔｒａ  ＪＫ，  Ｐａｓｔａｎ  Ｉ，  Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ＭＣ．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  （ＣＡＫ２）  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｋｌ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｏｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｘｉｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｉｎｅｓｏｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２：１８１−１８６，  １９９２．
【非特許文献２９】Ａｒｇａｎｉ  Ｐ，Ｉａｃｏｂｕｚｉｏ−Ｄｏｎａｈｕｅ  Ｃ，  Ｒｙｕ  Ｂ，  Ｈｒｕｂａｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖａｓｔ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｐａａｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｂｙ  ｓｅｒｉａｌ  ａｎａ１ｙｓｉ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｌｉ．ｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７：３８６２−６８，２００１．
【非特許文献３０】Ｃｈａｎｇ  Ｋ，  Ｐａｓｔａｎ  Ｉ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｋｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  （ＯＶＣＡＲ−３）  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｉｎｔ  ＪＣａｎｃｅｒ  ５７：９０−９７，  １９９４．
【非特許文献３１】Ｓｃｈｏｌｌｅｒ  Ｎ，  Ｆｕ  Ｎ，  Ｙｅ  Ｚ，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＧＥ，  Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ＫＥ，  Ｈｅｌｉｓｔｒｏｍ  Ｉ．  Ｓｏｌｕｂｌｅ  ｍｅｍｂｅｒ（ｓ）  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ／ｍｅｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ａｒｅ  ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：１１５３１−１１５３６，１９９９．
【００１２】
膵臓癌腫の初期検出のために提案された１つの技術は、便サンプルからの異常ＤＮＡの検出を含む。この方法は、直腸の悪性線腫の初期検出のために促進され、少数の研究において膵臓悪性線腫において示された（非特許文献３２）。正常な膵臓中では全く発現しないが、他の組織中では見いだされない（又は微量でのみ見出される）膵臓がん細胞に特異的な抗原を検出する血清診断アッセイは、ＣＡ１９−９免疫学的検定法又はメソセリンマーカーよりもかなり有効であることがわかった。
【００１３】
【非特許文献３２】Ｃａｌｄａｓ  Ｃ，  Ｈａｈｎ  ＳＡ，  Ｈｒｕｂａｎ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋ−ｒａｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｔｏｏｌ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５４：３５６８−３５７３，１９９４．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、３Ｃ４−Ａｇ（又はＰａＣａ−Ａｇｌ）と命名される膵臓癌腫に特異的な抗原の発見に関する。この抗原は、ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面に主に局在化し、現在まで試験されるように、通常の卵巣において痕跡量検出される以外は、通常の形質転換されていない細胞において検出されない。従って、本発明は、膵臓癌検出及び処置の領域において切望される改良を表す。ＰａＣａ−Ａｇｌ抗原はさらに、膵臓癌腫患者の血清及び他の体液中にも存在する。それに加えて、本発明はさらに、ＰａＣａ−Ａｇｌ抗原に特異的に結合する抗体に関する。主題の抗原及び抗体は、膵臓癌の診断方法及び処置方法の両方において有用であり、本明細書中で提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に従って、実質的に精製形態での膵臓癌腫に特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇ（ＰａＣａ−Ａｇｌ）が提供される。３Ｃ４−Ａｇは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される、約４３又は４３．５ｋＤａの分子量；等電点電気泳動法でのｐＩが約４．５〜約５．０；及び顕著なグリコシル化の非存在によって特徴付けられてもよい。３Ｃ４−Ａｇは、ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上に主に局在化しており、正常な非増殖性細胞においては検出されない。ＰａＣａ−Ａｇｌ抗原はさらに、膵臓癌患者の血清及び他の体液中に存在するが、健康な固体の血液又は血清中には存在しない。３Ｃ４−Ａｇの免疫的に活性なフラグメントはさらに本発明に包含される。
【００１６】
膵臓癌腫に特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇに対する結合特異性を有する抗体又はそれらの結合部分がさらに提供され、上記抗原はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される、約４３又は４３．５ｋＤａの分子量；等電点電気泳動法でのｐＩが約４．５〜約５．０；及び顕著なグリコシル化の非存在；及びラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上及び膵臓癌患者の血清中に主に局在化しており、正常な非増殖性細胞又は健康な個体の血清においては検出されないことによって特徴付けられる。主題の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、さらにヒト化形態であってもよい。それに加えて、主題の抗体は、蛍光体、ケミロフォア、化学発光剤、光増感剤、懸濁粒子、同位体元素又は酵素で標識されてもよい。別の実施形態では、主題の抗体は、診断薬物、治療薬物又は毒素に接合又は結合してもよい。
【００１７】
本発明はさらに、３Ｃ４−Ａｇに特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を産生する抗原マウスハイブリドーマ細胞系を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様では、動物被検体において膵臓癌を検出する方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：（ａ）前記被検体由来の細胞、組織又は液体サンプルと、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分；モノクローナル抗体ｍＡｂ３４Ｃ；又はモノクローナル抗体ｍＡｂ３４Ｃによって結合されるエピトープに結合する抗体の少なくとも１つとを、前記抗体が前記サンプル中の抗原に特異的に結合可能な条件下で接触させ、抗体−抗原複合体を形成する工程；（ｂ）前記サンプル中の抗体−抗原複合体を検出する工程；及び（ｃ）前記サンプル中の抗体−抗原複合体の増加レベルの検出と膵臓癌の存在を示す対照サンプルとを関係付ける工程とを含む。
【００１９】
本発明のなお別の実施形態では、患者由来の細胞、組織又は液体サンプルにおける３Ｃ４−Ａｇを検出するのに好適な診断キットが提供される。このキットは、：（ａ）３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分、（ｂ）前記抗体又はそれらの結合部分のための特異的な結合パートナーの接合体；及び（ｃ）前記結合した抗体を検出するための標識などの様々な構成要素を備える。
【００２０】
本発明の別の態様では、患者において膵臓癌を処置する方法が提供される。この方法は、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する有効量の抗体又はそれらの結合部分を前記患者に投与する工程を含み、前記抗体又はそれらの結合部分が治療薬物又は毒素に接合又は結合する。
【００２１】
薬学的に許容可能なキャリアと混合される、３Ｃ４−Ａｇに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分を含む薬学的組成物も提供される。３Ｃ４−Ａｇに特異的に結合するこの抗体又はそれらの結合部分は、薬学的組成物中の治療薬物又は毒素に接合又は結合されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明は、膵臓癌腫に特異的な抗原及びそれらに特異的に結合する抗体に関する。膵臓癌腫に特異的な抗原（膵臓癌に関連する抗原）はさらに、本明細書中で以下、３Ｃ４−Ａｇ又はＰａＣａ−Ａｇｌと互換可能に称され、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決定される約４３又は４３．５ｋＤａの分子量を有し、ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上に主に局在化している。３Ｃ４−Ａｇは、正常な非増殖性細胞においては検出されず、腎臓、前立腺及び可能な場合直腸癌腫において非常に低レベルでしか検出されない。
【００２３】
本発明はさらに、膵臓癌患者の血清又は他の体液に存在し、約３５ｋＤａの分子量を有する３Ｃ４−Ａｇ（ＰａＣａ−Ａｇｌ）の可溶性形態、それらから単離可能な形態に関する。
【００２４】
３Ｃ４−Ａｇは、インタクトな生存膵臓癌細胞及びインタクトな固定された膵臓癌細胞（ラット及びヒトの細胞系）で、マウスモノクローナル抗体ｍＡｂＣ４を一次抗体として用いた後、フルオレセイン標識されたヒツジ又はウサギ抗マウスＩｇＧ（ＦＩＴＣ−Ｓ又はＲ抗−Ｍ  ＩｇＧ）及び蛍光顕微鏡による、間接免疫蛍光（ＩＦ）によって最初に細胞表面抗原として同定された。免疫減算−過剰免疫化プロトコル（ＩＳＨＩＰ）を用いてモノクローナル抗体ｍＡｂ３Ｃ４を産生し、このプロトコルは、出願人の仮特許出願、名称「寛容誘発標的化抗体産生（ＴＩＴＡＰ）」、（特許文献１）に完全に記載されており、これらの開示は本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる。ＩＳＨＩＰプロトコルに従って、形質転換されていないラット膵臓細胞（ＢＭＲＰ１細胞）上に存在するマウスにおけるシクロホスファミドで誘発される抗原に対する耐性の後、既知の発癌物質４−（メチル−ニトロソアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノンで新生物的に形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞で続けて過剰免疫化されたもの（以下、ＢＭＲＰ１．ＮＮＫ細胞）は、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞に対する抗体を分泌する血漿細胞のマウスの脾臓内への移動を高める。Ｐ３Ｕ１骨髄腫細胞を用いた免疫化されたマウスからの脾細胞の後に続く融合は、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫの表面上で膵臓癌に関連する抗原（３Ｃ４−Ａｇ）と特異的に反応する抗体を分泌するハイブリドーマを製造するが、形質転換されていない細胞上では製造しない。
【００２５】
【特許文献１】米国出願番号６０／４１３，７０３（２００３年１月２９日出願）
【００２６】
本発明に従って、実質的に精製形態の膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇが提供される。３Ｃ４−Ａｇは以下：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される約４３又は４３．５ｋＤａの分子量；等電点電気泳動法でのｐＩ約４．５〜約５．０；及び顕著なグリコシル化の非存在によって特徴付けられ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬペプスタチン、２ｕｇ／ｍＬアプロチニン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び５ｍＭヨードアセトアミドに可溶性であり；ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上に主に局在化しているが、正常な形質転換されていない細胞においては検出されない。
【００２７】
さらに本発明に従って、膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇに対する結合特異性を有する抗体が提供され、ここで、この抗原は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定される約４３又は４３．５ｋＤａの分子量；等電点電気泳動法でのｐＩ約４．５〜約５．０；及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬペプスタチン、２ｕｇ／ｍＬアプロチニン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び５ｍＭヨードアセトアミドに可溶性であり；ラット及びヒトの膵臓癌細胞の表面上に主に局在化しているが、正常な形質転換されていない細胞においては検出されないことによって特徴付けられる。３Ｃ４−Ａｇに対して特異的に結合する主題の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもよい。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。なおさらに好ましくは、ｍＡｂは３Ｃ４である。
【００２８】
上記の抗体はさらに、膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇに対する結合特異性を有し、ここで、上記抗原は可溶性形態であり、膵臓癌患者の血清又は他の体液から単離可能である。
【００２９】
３Ｃ４−Ａｇに特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞系がさらに提供される。好ましくは、マウスハイブリドーマ細胞系はｍＡｂ３Ｃ４を産生する。
【００３０】
膵臓癌に関連する抗原３Ｃ４−Ａｇは、多くの周知の方法を用いて調製されてもよい。３Ｃ４−Ａｇは同定されてもよく、その遺伝子配列は、免疫減算ハイブリダイゼーション又は差次ＲＮＡディスプレイ方法論を用いて得られる。特定の宿主細胞において機能するプロモーターの制御下で３Ｃ４−Ａｇをコードする遺伝子は、抗原を発現するために、このような宿主細胞をトランスフェクトするために使用されてもよい。あるいは、３Ｃ４−Ａｇは、周知の方法を用いて化学合成されてもよい。
【００３１】
膵臓癌に関連する抗原３Ｃ４−Ａｇは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ；例えば、（非特許文献３３）を参照、及びサイズ排除クロマトグラフィーのような当該技術分野で周知の方法を用いて精製されてもよい。他の精製技術、例えば、３Ｃ４−Ａｇ（例えばｍＡｂ３Ｃ４）に結合する抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーもさらに行われてもよい。このような方法は、実施例８に例示される。ＳＤＳ  ＰＡＧＥの後、約４３ｋＤａの３Ｃ４−Ａｇバンドをゲルから切除し、適切な緩衝液に溶出させた。３Ｃ４−Ａｇのさらなる精製を、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー及び／又は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含んで行ってもよい。ＨＰＬＣは好ましい精製方法である。
【００３２】
【非特許文献３３】Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｇ．（１９９０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：４８８−４９５．
【００３３】
精製された３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントは、３Ｃ４−Ａｇと反応するポリクローナル抗体を産生する目的で、動物に接種するために使用されてもよい。「免疫的に活性なフラグメント」とは、３Ｃ４−Ａｇが膵臓癌細胞の表面上に暴露される際に、３Ｃ４−Ａｇ上で暴露されたエピトープと特異的に反応する抗体の産生、又は膵臓癌患者の血清又は他の体液から単離可能な３Ｃ４−Ａｇの可溶性形態と反応する抗体の産生を刺激するのに十分な約４３又は４３．５ｋＤａの３Ｃ４−Ａｇタンパク質のフラグメントを意味する。従って、ｍＡｂ３Ｃ４に加えて、本発明は、３Ｃ４−Ａｇと特異的に反応する他の抗体、ポリクローナル又はモノクローナル、又はそれらの免疫的に活性なフラグメントを意図し、抗体はｍＡｂ３Ｃ４と同様に、３Ｃ４−Ａｇ上で同じエピトープに結合してもよいし、結合しなくてもよい。
【００３４】
動物、例えば、マウス、ヤギ、ラット、ヒツジ又はウサギなどの哺乳動物、又は他の動物、例えば、ニワトリなどの家禽は、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントを用いて接種され、好ましくは、ポリクローナル抗体を産生する好適なキャリアタンパク質と接合される。このような免疫化は、十分な滴定量の抗体を得るために、数週間までの間隔で必要に応じて繰り返されてもよい。血液は、抗体が産生されるか否かを決定するために動物から集められ、抗血清は３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに対する応答について試験され、必要な場合、再ブーストが行われる。いくつかの場合では、最後の抗原ブーストの後、動物を殺し、脾臓細胞を除去する。免疫グロブリンは、免疫化動物から得られた血清から精製される。次いで、これらの免疫グロブリンは、サンプル中の抗原の存在を検出するために、又は治療的適用において、診断用免疫学的検定法に使用することができる。
【００３５】
好ましくは、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに対して特異的に反応するモノクローナル抗体が調製される。モノクローナル抗体を産生する方法は、例えば、（非特許文献３４）（本明細書中で完全に記載されているものとして組み込まれる）に記載されるように当該技術分野で周知である。例えば、動物は、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントで免疫化されてもよく、免疫化動物から脾臓細胞を得てもよい。次いで、抗体を分泌するリンパ球は、細胞培養物において無制限に複製可能な骨髄腫細胞又は形質転換された細胞と融合される。得られたハイブリドーマを培養してもよく、得られたコロニーは、所望のモノクローナル抗体を産生するためにスクリーニングされてもよい。抗体を産生するコロニーは、多量の抗体を産生する目的で、インビボ又はインビトロのいずれかで増殖されてもよい。
【００３６】
【非特許文献３４】Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７．
【００３７】
ハイブリドーマ細胞系は、インビトロで繁殖させてもよく、高濃度のｍＡｂ（例えばｍＡｂ３Ｃ４）を含有する培地をデカンテーション、ろ過、又は遠心分離によって得てもよい。あるいは、ｍＡｂ３Ｃ４のような主題の抗体のサンプルを、元の融合のための体細胞及び骨髄腫細胞を提供するために組織適合性の種類の動物、例えばマウスを使用して注射してもよい。ｍＡｂを分泌する腫瘍は、注射された動物において成長し、動物の体液、例えば腹水、液、又は血清は高濃度でｍＡｂを産生する。
【００３８】
細胞培養物中で無制限に複製可能な哺乳動物の骨髄腫細胞、又は他の融合パートナーとの融合は、標準的及び周知の技術によって、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は（非特許文献３５）；（非特許文献３６）；（非特許文献３７）及び（非特許文献３８）（これらの開示は本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）に記載されるような他の融合薬剤を用いることによって影響を受ける。このような不死化細胞系は好ましくはマウスであるが、ラット及びヒトのような他の哺乳動物種の細胞から誘導してもよい。好ましくは、細胞系は、特定の栄養の利用のために必要な酵素が欠乏しており、迅速に増殖可能であり、良好な融合能力を有する。このような細胞系は当業者に公知である。
【００３９】
【非特許文献３５】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｋｏｈｌｅｒ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１．
【非特許文献３６】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（２）：５３９−４６．
【非特許文献３７】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５５：４９８０−８３．
【非特許文献３８】Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６（６）：２９２７−３１．
【００４０】
モノクローナル抗体を精製するための方法としては、硫酸アンモニウム沈降、イオン交換クロマトグラフィー、及びＺｏｌａら、（非特許文献３９）（この開示は本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）に記載されるような親和性クロマトグラフィーが挙げられる。本出願の実施例７において記載されるようにマウスに３Ｃ４ハイブリドーマ細胞を注射した後、腹水を集めてもよい。ｍＡｂ３Ｃ４は、Ｇ−タンパク質親和性ビーズを用いて腹水から精製してもよい。ビーズを適切な緩衝液で洗浄した後、結合したｍＡｂ３Ｃ４を溶出緩衝液を用いてビーズから溶出させ、簡単な遠心分離によってビーズから分離してもよい。
【００４１】
【非特許文献３９】Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｕｒｅｌｌ（ｅｄ）ｐｐ．５−５２（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８２）．
【００４２】
抗体全体を利用することに加えて、本発明の方法は、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体の結合部分の使用を含む。このような結合部分としては、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦｃフラグメントが挙げられる。これらの抗体フラグメントは、従来の手順、例えば、（非特許文献４０）（これは本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）に記載されるようなタンパク質分解フラグメント化手順によって製造されてもよい。
【００４３】
【非特許文献４０】Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．９８−１１８，Ｎｅｗ．Ｙｏｒｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）．
【００４４】
本発明はさらに、患者における膵臓癌を検出するための診断方法を提供する。診断用方法は、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する主題の抗体と反応させることによって患者由来のサンプルにおいて膵臓癌腫に特異的な抗原（３Ｃ４−Ａｇ）の存在を検出する免疫学的検定法に基づく。患者サンプル源の例としては、細胞、組織、組織溶解物、組織抽出物、又は血液から誘導されるサンプル（例えば、血液、血清、又は血漿）、尿、又は大便が挙げられる。好ましくは、サンプルは液体である。液体サンプルは、好ましくは血液血清であるが、胸膜液又は腹水液のような他の液体も可能である。サンプル中の３Ｃ４−Ａｇの濃度増加の検出は、患者における膵臓癌の診断と関係付けられる。
【００４５】
本発明の方法において使用されてもよい多くの異なる種類の免疫学的検定法が存在する。患者の血清サンプル又は他のサンプルにおいて、３Ｃ４−Ａｇと特異的に結合する抗体と反応する３Ｃ４−Ａｇの濃度を検出するために任意の周知の免疫学的検定法、例えば、酵素免疫定量アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫定量アッセイ（ＦＩＡ）、化学免疫定量アッセイ（ＣＬＩＡ）、放射能免疫アッセイ（ＲＩＡ）、及びイムノブロッティング法（ＩＢ）を適用してもよい。使用してもよい異なる免疫学的検定法の総説として以下を参照：（非特許文献４１）；（非特許文献４２）。
【００４６】
【非特許文献４１】Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４．
【非特許文献４２】Ｓｉｋｏｒａ et al（ｅｄｓ．），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．３２−５２，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８４）．
【００４７】
例えば、患者において膵臓癌を検出するための免疫学的検定法は、患者由来のサンプルと第１の抗体又はそれらの結合部分（例えば、ｍＡｂ３Ｃ４）を接触させる工程を含み、好ましくは、第１の抗体又はそれらの結合部分は、サンプル中で３Ｃ４−Ａｇと抗体−抗原複合体を形成するために可溶性及び検出可能である。複合体は、第１の抗体の重鎖の一定領域を認識する第２の抗体と接触される。例えば、第２の抗体は、ｍＡｂ３Ｃ４と反応するマウス免疫グロブリン（抗マウス抗体）の重鎖の一定領域を認識する抗体であってもよい。第２の抗体は、蛍光体、ケミロフォア、化学発光剤、光増感剤、懸濁粒子、又は同位体元素で標識される。遊離の標識された第２の抗体は結合した抗体から分離される。次いで、サンプルによって発生する信号は、使用される信号発生系に依存して測定される。増加した光学密度又は放射能活性は、正常患者由来のサンプルと比較した場合、患者における膵臓癌の診断と関係付けられる。
【００４８】
あるいは、例えば、β−ガラクトシダーゼ標識された抗体のような酵素標識された抗体が使用され、酵素標識が反応する適切な基質が添加され、インキュベートされる。酵素は、周知の接合方法を用いて本発明の方法において使用するための３Ｃ４−Ａｇ反応性抗体に共有結合してもよい。例えば、アルカリホスファターゼ及びセイヨウワサビペルオキシダーゼをグルタルアルデヒドを用いて抗体に接合してもよい。セイヨウワサビペルオキシダーゼを過ヨウ素酸塩方法を用いて接合してもよい。酵素を接合する抗体のための市販のキットは広く入手可能である。酵素に接合した抗ヒト及び抗マウス免疫グロブリンに特異的な抗体は、複数の販売元から入手可能である。
【００４９】
酵素標識された抗体は、基質に依存して、異なる信号源を生成する。信号生成は、反応混合物に対する基質の添加を含む。通常のペルオキシダーゼ基質としては、ＡＢＴＳ（登録商標）（２，２’−アジノビス（エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート））、ＯＰＤ（Ｏ−フェニレンジアミン）及びＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラエチルベンジジン）が挙げられる。これらの基質は、過酸化水素の存在を必要とする。ｐ−ニトロフェニルホスフェートは、通常使用されるアルカリホスファターゼ基質である。インキュベーション時間中に、酵素は徐々に基質の一部分をその最終生成物に変換する。インキュベーション時間の終了時に、停止試薬を添加して酵素活性を止める。信号強度は、通常は分光光度計を介して、光学密度を測定することによって決定される。
【００５０】
アルカリホスファターゼ標識された抗体を、蛍光測定法によって測定してもよい。従って、本発明の免疫学的検定法において、基質４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＵＭＰ）を使用してもよい。アルカリホスファターゼは４−ＵＭＰを脱ホスホリル化して蛍光体である４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）を形成する。入射光は３６５ｎｍであり、放射光は４４８ｎｍである。
【００５１】
酵素標識された抗体の代替として、蛍光化合物、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリセリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｅｒｉｎ）、インドシアニン、ビオチン、フィコシアニン、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７、シアニン３、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）、ペリジニンクロロフィル、Ｓｐｅｃｔｒａｌレッド、又はＴｅｘａｓレッドをそれらの結合能力を変えることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を照射することによって活性化される場合、蛍光色素標識された抗体は光エネルギーを吸収し、分子の励起状態を誘発し、特徴的な視覚的に光学顕微鏡で検出可能な光を放射す。ＥＩＡにおける場合、蛍光標識された抗体は、第１の抗体−ハプテン複合体に結合する。結合していない試薬を洗い流した後、残った３元複合体を適切な波長の光に露光する。観察された蛍光は、目的のハプテン、この場合には３Ｃ４−Ａｇの存在を示す。免疫蛍光及びＥＩＡ技術は両方とも当該技術分野で十分に確立されており、本方法のために特に好ましい。しかし、他のリポーター分子、例えば、同位体元素、化学発光分子又は生体発光分子もまた使用されてもよい。必要とされる目的にあわせて手段を変動させる方法は当業者には容易に明らかである。
【００５２】
主題の抗体はさらに、抗体に結合可能な二次標識されたリガンドのグループを用いて検出されてもよい。例えば、従来の技術を用いて、ビオチンを本発明に従って産生された抗体に結合してもよい。次いで、ビオチン化した抗体を３Ｃ４−Ａｇに接触させ、結合させる。次いで、公知の標識で標識されたストレプトアビジン又はアビジンを抗体／３Ｃ４−Ａｇ複合体と接触させ、次いで、ビオチン化抗体のビオチン部分に対する標識されたストレプトアビジン又はアビジンの結合を導く。さらなるビオチンを添加した後、さらに標識されたストレプトアビジン又はアビジンを添加してもよい。各ストレプトアビジン又はアビジン分子が４つのビオチン分子と結合可能なため、従来の蛍光顕微鏡又は放射能写真技術によって検出されてもよい多くの標識を含む比較的大きな三次元ネットワークが作られる。
【００５３】
他の免疫学的検定法技術は、（特許文献２）；（特許文献３）及び（特許文献４）によって示されるように、本発明において利用するために入手可能である。これはもちろん、非競争型のシングルサイト及び２サイト（すなわち「サンドイッチ」）アッセイ、及び上述の従来の競争結合アッセイの両方を含む。サンドイッチアッセイ技術の多くの変形が存在し、全ては本発明によって包含されることが意図される。
【００５４】
【特許文献２】米国特許第４，０１６，０４３号
【特許文献３】米国特許第４，４２４，２７９号
【特許文献４】米国特許第４，０１８，６５３号
【００５５】
典型的な順方向サンドイッチアッセイにおいて、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに対する特異性を有する第１の抗体は、固体表面に共有結合又は受動的に結合する。固体表面は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最もよく使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固体支持体は、管、ビーズ、ディスク又はマイクロプレート、又は免疫学的検定法を行うために好適な任意の他の表面の形態であってもよい。結合プロセスは当該技術分野で周知であり、一般的に、架橋結合、共有結合、又は不溶性のキャリアに分子を物理的に吸着させることからなる。結合後、ポリマー−抗体複合体を試験サンプルのための調製物中で洗浄する。次いで、試験されるサンプルのアリコートを固体相複合体に添加し、抗体に結合させるのに十分な時間インキュベートする。インキュベーション時間は変動するが、一般的に約２〜４０分の範囲である。インキュベーション時間の後、抗体サブユニット固体相を洗浄し、乾燥し、ハプテンの一部分に特異的な第２の抗体とともにインキュベートする。ハプテンに対する第２の抗体の結合を示すために使用されるリポーター分子に第２の抗体を結合する。
【００５６】
順方向アッセイの変形としては、サンプル及び標識された抗体の両方を同時に添加して抗体に結合させる同時アッセイ、又は標識された抗体及び試験されるサンプルを最初に混合し、インキュベートし、次いで標識されていない表面に結合した抗体を添加する逆方向アッセイが挙げられる。これらの技術は当業者に周知であり、小さな変形の可能性は当業者に容易に明らかである。
【００５７】
抗体に対して標識を結合させるために使用するのに好適な架橋剤は周知である。ホモ官能及びヘテロ二官能架橋剤は全て好適である。架橋剤と架橋結合可能な反応基としては、一級アミン、スルホヒドリル、カルボニル、炭水化物及びカルボン酸が挙げられる。架橋剤は、種々の長さのスペーサーアーム又はブリッジを有するものが入手可能である。一級アミンと反応するのに好適な架橋剤としては、ホモ二官能架橋剤、例えば、イミドエステル及びＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルが挙げられる。
【００５８】
２以上の異なる反応基を有するヘテロ二官能架橋剤が本明細書中で使用するのに好適である。例としては、一端でアミン反応性であり、他端でスルホヒドリル反応性である架橋剤が挙げられ、例えば、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−（２−ピリジルジチオ）−トルエン、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート及びマレイミド架橋剤が挙げられる。
【００５９】
本反応において存在する色、蛍光、発光又は放射能活性の量（使用される信号生成システムに依存する）は、ｍＡｂ３Ｃ４のような主題の抗体と反応する患者のサンプルにおける３Ｃ４−Ａｇの量に比例する。光学強度の定量は、分光光度計を用いた方法によって行われてもよい。放射能標識信号の定量は、シンチレーション計測を用いて行われてもよい。ｍＡｂ３Ｃ４のような主題の抗体と反応する３Ｃ４−Ａｇの濃度が正常サンプルの濃度よりも増加していることは、患者における膵臓癌の診断と関係付けられる。
【００６０】
本発明はさらに、上述の方法を行うための診断キットを提供する。１つの実施形態では、この診断キットは以下を含む：（ｉ）３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分、（ｉｉ）抗体のための特異的な結合パートナーの接合体、及び（ｉｉｉ）結合した抗体を検出するための標識。好ましい実施形態では、３Ｃ４−Ａｇに特異的に結合する抗体はｍＡｂ３Ｃ４である。ｍＡｂ３Ｃ４のための特異的な結合パートナーの接合体の例は、ｍＡｂ３Ｃ４に特異的に結合する抗体である。標識が酵素である場合、酵素のための基質を含有する第３の容器が提供されてもよい。
【００６１】
このキットはさらに、緩衝剤及びタンパク質安定化剤、例えば、多糖類等のような他の成分を含んでもよい。それに加えて、主題のキットは、バックグラウンド干渉を減少させるための薬剤、対照薬剤、及び診断試験を行うのに好適な組成物のような信号生成システムの他の薬剤を含んでもよい。このような組成物は、例えば、ガラス又はポリマー、例えば、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンのような固体表面に含まれてもよい。固体支持体は、管、ビーズ、ディスク又はマイクロプレート、又は免疫学的検定法を行うために好適な任意の他の表面の形態であってもよい。
【００６２】
本発明の抗体はさらに、膵臓腫瘍を検出するためのインビボ診断適用、好ましくはヒトへの適用のために有用である。例えば、膵臓腫瘍は、検出可能な信号を発生する適切な撮像薬剤で標識されたｍＡｂ３４Ｃを用いて腫瘍撮像技術によって検出されてもよい。このような試薬を用いて抗体を標識するための撮像薬剤及び手順は周知である。例えば、（非特許文献４３）；（非特許文献４４）を参照。次いで、例えば、（非特許文献４５）；（非特許文献４６）において記載される放射性原子スキャニングによって、標識された抗体を検出してもよい。
【００６３】
【非特許文献４３】Ｗｅｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ，Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）．
【非特許文献４４】Ｃｏｌｃｈｅｒ  at  al ，Ｍｅｕｌａ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６（１９８６）．
【非特許文献４５】Ｂｒａｄｗｅｌｌら  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ
【非特許文献４６】Ｂａｌｄｗｉｎ  ａｔ ａｌ（ｅｄｓ），ｐｐ．６５−８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）．
【００６４】
本発明に従って、膵臓癌を患う患者を処置するための治療方法も提供される。例えば、ｍＡｂ３Ｃ４を単独で使用して腫瘍細胞を標的化するか、又は適切な治療薬剤と組み合わせて膵臓癌を処置してもよい。３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに結合する主題の抗体が単独で使用される場合、このような処置は、相補体で媒介される細胞毒性又は抗体依存性の細胞毒性（ＡＤＣＣ）のような内因性宿主免疫機能を開始することによって行うことができる。ＡＤＣＣは、ヒトリンパ球又はマクロファージの存在下で癌細胞を死滅可能であるか、又はヒト相補体の存在下で腫瘍細胞に対して細胞毒性を有する抗体を伴う。３Ｃ４−Ａｇと特異的に反応する本発明の抗体は、（非特許文献４７）及び（非特許文献４８）に記載されるようなキメラ抗体を産生するために開発された技術を用いて、ＡＤＣＣのために改変されてもよい。
【００６５】
【非特許文献４７】Ｏｉ ｅｔ ａｌ,（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ４（３）：２１４−２２１．
【非特許文献４８】Ｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８５０７−８５１１．
【００６６】
好ましい実施形態では、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する主題の抗体は、癌の部位に治療薬剤を送達するために治療薬物又は毒素に接合又は結合されてもよい。酵素的に活性な毒素及びそれらのフラグメントとしては、限定されないが、以下が挙げられる：例えば、ジフテリア毒素Ａフラグメント、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の外毒素Ａ、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サクリン、特定のＡｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、特定のＤｉａｎｔｈｉｎタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトジリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びタキソールの誘導体（合成品を含む）。（特許文献５）及び（特許文献６）（本明細書中に完全に記載されるものとして組み込まれる）は、このような免疫毒素の酵素的に活性なポリペプチドを調製するための手順を記載する。
【００６７】
【特許文献５】国際特許出願ＷＯ８４／０３５０８
【特許文献６】国際特許出願ＷＯ８５／０３５０８
【００６８】
他の細胞毒性部分としては、限定されないが、アドリアマイシン、クロラムブシル、ダウノマイシン、メトトレキサート、ネオカルジノスタチン、及び白金から誘導されるものが挙げられる。クロラムブシルと抗体とを接合させるための手順は、（非特許文献４９）；（非特許文献５０）及び（非特許文献５１）（これらは本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）に記載される。ダウノマイシンとアドリアマイシンを抗体に接合させるための手順は、（非特許文献５２）及び（非特許文献５３）（これらの開示は本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）に記載される。抗体−リシン接合体を調製するための手順は、例えば、（特許文献７）及び（非特許文献５４）及びそれらに引用される参考文献（これらは本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）中に記載される。（特許文献８）はさらに、カップリング手順を記載し、これは本明細書中に参考として組み込まれる。
【００６９】
【非特許文献４９】Ｆｌｅｃｈｎｅｒ  （１９７３）  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ９：７４１−７４５．
【非特許文献５０】Ｇｈｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ、（１９７２）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊ  ３：  ４９５−４９９．
【非特許文献５１】Ｓｚｅｋｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ，（１９７２）Ｎｅｏｐｌａｓｍｓ  １９：２１１−２１５．
【非特許文献５２】Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ,（１９７５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３５：１１７５−１１８１．
【非特許文献５３】Ａｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ  １：４２９−４４９．
【非特許文献５４】Ｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ，（１９８２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｖｅｙｓ  １：３７３−３８８．
【特許文献７】米国特許第４，４１４，１４８号
【特許文献８】欧州特許出願第８６３０９５１６．２号
【００７０】
あるグループのペプチドは、近年、特に膵臓癌細胞に対して細胞毒性があることが発見された。同時係属中の（特許文献９）及びこれに引用される（特許文献１０）；（特許文献１１）及び（特許文献１２）（これらの開示は本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）を参照。これらの毒素ペプチドは、ｐ５３タンパク質内にアミノ酸配列を含む。ｐ５３タンパク質は、３９３アミノ酸のタンパク質であり、細胞サイクルの生体制御剤である。ｐ５３タンパク質の非存在は細胞の形質転換及び悪性疾患に関連する。（非特許文献５５）。
【００７１】
【特許文献９】米国特許出願番号第１０／３８６，７３７号（２００３年３月１２日出願）
【特許文献１０】米国特許出願番号第６０／３６３，７８５（２００２年３月１２日出願）
【特許文献１１】米国出願番号第０９／８２７，６８３号（２００１年４月５日出願）
【特許文献１２】米国出願番号第６０／１９５，１０２（２０００年４月５日出願）
【非特許文献５５】Ｈａｆｆｎｅｒ，Ｒ  ＆  Ｏｒｅｎ，Ｍ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５：８４−９０．
【００７２】
（特許文献１３）及びこれに引用される特許出願に記載されるように、膵臓癌細胞に毒性のペプチドは、以下のアミノ酸配列を有するペプチドから誘導されてもよい：ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号：１）。好ましくは、このペプチドは、配列番号：１に記載されるアミノ酸配列の少なくとも約６連続するアミノ酸またはそれらの類似体又は誘導体を含む。このようなペプチドの例としては、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号：１）又はそれらの類似体又は誘導体、ＰＰＬＳＱＥＴＦＳ（配列番号：２）又はそれらの類似体又は誘導体、及びＥＴＦＳＤＬＷＫＬＬ（配列番号：３）又はそれらの類似体又は誘導体が挙げられる。
【００７３】
【特許文献１３】米国出願番号第１０／３８６，７３７号
【００７４】
従って、本発明に従って、ＰａＣａ−Ａｇｌに特異的に結合する抗体又はそれらの免疫的に活性なフラグメントが提供される。ここで、この抗体は、上に記載されるペプチド（配列番号：１−３、又はそれらの類似体又は誘導体）のうち少なくとも１つに接合又は結合される。新生物性細胞膜を通る移動を高めるために、リーダー配列は、好ましくは、ペプチド、それらの類似体又は誘導体のカルボキシル末端に位置する。好ましくは、リーダー配列は、優先的に正に帯電したアミノ酸残基を含む。本発明と組み合わせて使用されてもよいリーダー配列の例としては、限定されないが、ペネトラチン、Ａｒｇ８、ＨＩＶ１のＴＡＴ、Ｄ−ＴＡＴ、Ｒ−ＴＡＴ、ＳＶ４０−ＮＬＳ、ヌクレオプラスミン−ＮＬＳ、ＨＩＶ  ＲＥＶ（３４−５０）、ＦＨＶコート（３５−４９）、ＢＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）、ＨＴＬＶ−ＩＩＲＥＸ（４−１６）、ＣＣＭＶ  ＧＡＧ（７−２５）、Ｐ２２Ｎ（１４−３０）、Ｌａｍｂｄａ  Ｎ（１−２２）、Ｄｅｌｔａ  Ｎ（１２−２９）、酵母ＰＲＰ６、ヒトＵ２ＡＦ、ヒトＣ−ＦＯＳ（１３９−１６４）、ヒトＣ−ＪＵＮ（２５２−２７９）、酵母ＧＣＮ４、及びｐ−ｖｅｃが挙げられる。好ましくは、リーダー配列は、アミノ酸配列ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＶＫＶＱＲＧ（配列番号：４）を有するアンテナペディアタンパク質由来のペネトラチン配列である。
【００７５】
好ましい実施形態では、抗体又はそれらの結合部分を含み、上に記載されるような膵臓癌腫特異的な抗原３Ｃ４−Ａｇ（ＰａＣａ−Ａｇｌ）に対する結合特異性を有する、膵臓癌を処置するための治療組成物が提供される。ここで、抗体又はそれらの結合部分は、配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドに接合又は結合され、配列番号：３に記載されるアミノ酸配列を有するペプチドのカルボキシル末端は、配列番号：４に記載されるようなアミノ酸配列を有するペネトラチンリーダー配列に結合される。
【００７６】
３Ｃ４−Ａｇ及びそれらの結合部分に対する抗体はさらに、薬物／プロドラッグ処置法において使用されてもよい。例えば、本発明に従う第１の抗体又はそれらの結合部分は、プロドラッグ活性剤と近接する場合にのみ活性化するプロドラッグと接合される。プロドラッグ活性剤は、第２の抗体又はそれらの結合部分と接合され、好ましくは、膵臓癌細胞又は膵臓癌細胞に関連する他の生物学的物質、例えば、罹患した膵臓細胞によって産生される別のタンパク質に結合するものである。例えば、（非特許文献５６）及び（非特許文献５７）（これらは両方、本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）を参照。
【００７７】
【非特許文献５６】Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５：４８４２−４６．
【非特許文献５７】Ｂｌａｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３２８７−３２９２．
【００７８】
あるいは、抗体又はそれらの結合部分は、高エネルギー照射エミッター、例えば、１３１Ｉのような同位体元素、腫瘍部位に局在化する場合にいくつかの細胞直径を殺すγエミッターに結合してもよい。例えば、（非特許文献５８）を参照。６７Ｃｕもさらに有効であり、抗体に結合する適切な金属キレート剤を介して主題の抗体に結合してもよい。他の好適な同位体元素としては、α−エミッター、例えば、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、及び２１１Ａｔ及びβ−エミッター、例えば、１８６Ｒｅ及び９０Ｙが挙げられる。
【００７９】
【非特許文献５８】Ｏｒｄｅｒ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ  （ｅｄｓ．）ｐｐ．３０３−１６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８５）
【００８０】
治療適用のために、マウス抗体で処置されたヒト被検体は抗マウス抗体を生成する傾向があるため、キメラ（マウス−ヒト）ヒト化モノクローナル抗体がマウス抗体に対して好ましい場合がある。抗体は、ヒト抗体可変領域のフレームワーク領域（ＦＲ）に組み込まれるマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸を含有するコンポジット可変領域を設計及び合成することによって「ヒト化」されてもよい。得られた抗体は元のマウス抗体の特異性及び結合親和性を保持しているが、患者の免疫システムがこの抗体が外来ではないと認識するのに十分ヒト化されている。マウスモノクローナル抗体をヒト化するための技術としては、例えば、（非特許文献５９）及びＳｔｕｄｎｉｃｋａらに対する（特許文献１４）（これらの開示は本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。
【００８１】
【非特許文献５９】Ｖａｓｗａｎｉｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）  Ａｌｌａ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５−１１９．
【特許文献１４】米国特許第５，７６６，８８６号
【００８２】
本発明のなお別の態様では、ヒトコクサッキーアデノウイルスレセプターの血漿外領域及び上述のＰａＣａ−Ａｇｌに特異的な抗体の可変領域を含む真核細胞発現ベクターが提供される。この発現ベクターは、組織特異的な感染を増やすために、Ａｄベクターのようなウイルスベクターを再標的化するために有用である。二重特異性接合の使用に基づく免疫的再標的化法、又はウイルス表面に示される単一鎖抗体の使用に基づく免疫的再標的化法、すなわち、ウイルスの成分に対して指向する抗体と抗体又はリガンドを標的化する抗体との間の接合は当該技術分野で公知である。例えば、（非特許文献６０）；（非特許文献６１）；（非特許文献６２）（これらの開示は本明細書中に完全に記載されているものとして組み込まれる）を参照。
【００８３】
【非特許文献６０】Ｄｏｕｇｌａｓ，  Ｊ．Ｔ．，  Ｒｏｇｅｒｓ，  ＢＥ．，  Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｍｉｃｈａｅｌ，  Ｓ．Ｉ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｃｕｒｉｅｌ，  Ｄ．Ｔ．；  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．ｎｏｌ．  １９９６，  １４：  １５７４−１５７８：  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｂｙ  ｔｒｏｐｉｓｍ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．
【非特許文献６１】Ｗｅｉｔｍａｍｉ，  Ｓ．Ｄ．，  Ｌａｒｋ，  ＲＨ．，  Ｃｏｎｅｙ，  Ｌ．Ｒ．，  Ｆｏｒｔ，  Ｄ．Ｗ．，  Ｆｒａｓｃａ  Ｖ．，  Ｚｕｒａｗｓｋｉ，  Ｖ．Ｒ．，  Ｊｒ．  ａｎｄ  Ｋａｍｅｎ，  Ｂ．Ａ．；  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９２，  ５２：  ３３９６−３４０１：  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＧＰ３８  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ．
【非特許文献６２】Ｈａｍｍｏｎｄ，  ＡＬ，  ＲＫ  Ｐｌｅｍｐｅｒ．  Ｉ  Ｚｈａｎｇ，  Ｕ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ＳJ   Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ｒ  Ｃａｔｔａｎｅｏ．  ２００１．  Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｉｓｐｌａｙｅｄ  ｏｎ  ａ  ｒｅｃｏｉｐｂｉｎａｎｔ  ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｅｎｔｒｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ−Ａｎｔｉｇｅｎ．J．Ｖｉｒｏｌ．，  ７５：２０８７−２０９６．
【００８４】
本発明はさらに、上述の治療方法において使用されてもよい薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントを特異的に認識し、特異的に結合する薬学的に有効量の抗体又はそれらの結合部分と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む。薬学的に許容可能なキャリアの例としては、滅菌液、例えば、水及び油が挙げられ、これらは、界面活性剤及びアジュバント、賦形剤、又は安定剤を含む他の薬学的及び生理学的に受容可能なキャリアを含んでも含んでいなくもよい。例示的な油は、石油由来、動物由来、植物由来、又は合成起源、例えば、ピーナッツ油、大豆油、又は鉱物油である。概して、水、食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、及びグリコール、例えば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールは、特に注射可能な溶液のために好ましい液体キャリアである。ヒト血清アルブミン、イオン交換剤、アルミナ、レシチン、緩衝液基質、例えば、ホスフェート、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、及び塩及び電解質、例えば、プロトアミンサルフェートもまた使用されてもよい。
【００８５】
それ故に、主題の薬学的組成物は、３Ｃ４−Ａｇ又はそれらの免疫的に活性なフラグメントに特異的に結合する抗体又はそれらの結合部分を、改変されていないか、治療薬剤（例えば、薬物、毒素、酵素、又は上述の第２の抗体）に接合した状態、又はキメラＡｂのような組み換え形態のいずれかで含む。薬学的組成物は、膵臓癌を処置するための他の抗体又は接合体、例えば抗体カクテルをさらに含んでもよい。
【００８６】
本発明の抗体又はそれらの結合部分が膵臓癌の処置又はインビボ検出のために使用されるか否かにかかわらず、これらは、経口、非経口、皮下、静脈内、リンパ節内、筋肉内、腹腔内、鼻腔滴下によって、腔内又は膀胱内滴下によって、動脈内、病変内に投与することができるか、又は外科処置において組織表面（腫瘍表面又は直接腫瘍内を含む）に塗布することができる。本発明の抗体は、単独又は上述のような薬学的若しくは生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、又は安定剤と共に投与されてもよい。主題の抗体は、固体又は液体形態、例えば、錠剤、カプセル、粉末、溶液、懸濁物、エマルション、ポリマー性マイクロカプセル又はマイクロベシクル、リポソーム、及び注射可能な溶液又は吸入可能な溶液の形態であってもよい。
【００８７】
本発明の抗体組成物のための効果的な投与法及び投薬量は、患者の年齢、体重、疾患の進行度にほとんど依存する。それ故に、投薬量は個々の患者に合わせて調整される。一般的に言うと、本発明の抗体組成物の有効投与量は、約１〜約５０００ｍｇ／ｍ２の範囲である。
【００８８】
以下の実施例は本発明をさらに説明し、本発明の範囲を限定することを意味するものではない。
【実施例１】
【００８９】
膵臓細胞系ＢＭＲＰＡ．４３０の悪性転換を介する細胞系ＢＭＲＰＡ．４３０．ＮＮＫ（ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ）の発生
物質：
１６４０ＲＰＭＩ培地、ペニシリン−ストレプトマイシンストック溶液（１０，０００Ｕ／１０，０００ｍｇ／ｍＬ）（Ｐ／Ｓ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、２ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（トリプシン−ＥＤＴＡ）を含む０．２％トリプシン、及びトリパンブルーは全てＧＩＢＣＯ（ニューヨーク）から入手した。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）は、Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（アトランタ、ＧＡ）から入手した。Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）、及び完全培地のための全ての微量元素はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（セントルイス、ＭＯ）から購入した。組織培養フラスコ（ＴＣＦ）はＦａｌｃｏｎ−Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（マウンテンビュー、Ｃ．Ａ．）から入手し、組織培養皿（ＴＣＤ）はＣｏｒｎｉｎｇ（コーニング、ＮＹ）から得て、２４−ウェル組織培養プレート（ＴＣＰ）、及び９６−ウェルＴＣＰはＣｏｓｔａｒ（ケンブリッジ、ＭＡ）から入手した。フィルター（０．２２、０．４５μｍ）はＮａｌｇｅｎｅ（ロッチェスター、ＮＹ）から入手した。
【００９０】
複合ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）細胞培地の調製：
ＲＰＭＩ、グルタミン（０．０２Ｍ）、ＨＥＰＥＳ−緩衝液（０．０２Ｍ）、酢酸に溶解したウシインスリン（０．０２ｍｇ／ｍＬ酢酸／培地１Ｌ）、ヒドロコルチゾン（０．１μｇ／ｍＬ）、ＺｎＳＯ４（５×１０−７Ｍ）、ＮｉＳＯ４  ６Ｈ２Ｏ（５×１０−１０Ｍ）、ＣｕＳＯ４（１０−８Ｍ）、ＦｅＳＯ４（１０−６Ｍ）、ＭｎＳＯ４（１０−９Ｍ）、（ＮＨ４）６Ｍｎ７Ｏ２４（１０−７Ｍ）、Ｎａ２ＳｅＯ３（０．５ｍｇ／培地１Ｌ）、ＳｎＣｌ２２Ｈ２Ｏ（５×１０−１０Ｍ）を含む痕跡量の元素及びカルバミルコリン（１０−５Ｍ）を用いてｃＲＰＭＩを調製し、ｐＨを７．３に調整した。培地を滅菌ろ過した。
【００９１】
細胞及び培地：
ＢＭＲＰＡ．４３０（ＢＭＲＰＡ１）は、正常なラット膵臓から確立された自然に不死化された細胞系である（Ｂａｏら，１９９４）。ＴＵＣ３（ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓｖａｌ１２）は、コドン１２（Ｇｌｙ−＞Ｖａｌ）で癌性変異をもつ活性化されたヒトＫ−ｒａｓを含有するプラスミドで形質転換することによって形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞である（Ｄｒ．Ｍ．Ｐｅｒｕｃｈｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）。全ての細胞系は、９５％空気−５％ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、３７℃でｃＲＰＭＩ（１０％ＦＢＳ）中で定常的に維持される。細胞にトリプシン−ＥＤＴＡを通す。５０％使用済培地及び１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含む新鮮なｃＲＰＭＩを含有する５０％凍結培地で作成される混合物中で細胞を凍結して保存する。細胞生存度をトリパンブルー排除法によって評価した。
【００９２】
ＮＮＫ暴露：
発癌物質を含有する培地の全ての調製を、定められた保護測定を用いてＮＣＩ−設計され証明された化学フード内で別個の実験で製造した。４−（Ｎ−ニトロソメチルアミノ）−１−（３−ピリジル）−１−ブタノン（ＮＮＫ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｎ．Ｙ．）を、ＰＢＳ中の１０ｍｇＮＮＫストック溶液として調製し、ＦＢＳを含まないｃＲＰＭＩを添加して最終濃度を１００、５０、１０、５及び１μｇ／ｍｌにした。パッセージ３６（ｐ３６）でＢＭＲＰＡ１細胞を１０５／６０ｍｍＴＣＤに接種し、６日間増殖させた。この時に培地を除去し、細胞をあらかじめ加温した（３７℃）ＦＢＳを含まないｃＲＰＭＩで２回洗浄した後、異なる濃度のＮＮＫを含有するＦＢＳを含まないｃＲＰＭＩ（４ｍＬ／ＴＣＤ）で処理した。ＢＭＲＰＡ１細胞を含有するＴＣＤの６番目のセットを、ＮＮＫを含まないＦＢＳを含まないｃＲＰＭＩ中でインキュベートし、対照として使用した。６セットの異なる培養条件のそれぞれについて８個のＴＣＨを使用して、３７℃の９５％空気−５％ＣＯ２インキュベーターに戻した。１６時間後、ＮＮＫを含有する培地を全てのＴＣＤから除去し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、新鮮なｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ（４ｍｌ／ＴＣＤ）を添加し、インキュベーションを継続した。ＮＮＫを含まない対照培地を並行して処理した。使用済培地の半分を新鮮なｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳと交換することによって細胞を２日ごとに供給した。完全に密集したら、細胞を全てのＴＣＤから収集し、各グループの細胞をプールし、新鮮なＴＣＤ内で２×１０４でパッセージした。
【００９３】
コロニーの単離：
形質転換された細胞の個々のコロニーから細胞を取り出すのを容易にするために、コロニーを含有する細胞培養物を１０５細胞／１００ｍｍＴＣＤで再接種し、７日間増殖させた。滅菌パスツールピペットの細い方の末端を炎であぶり、すぐに伸ばし、最も細い点で壊して、細胞リッチなコロニーのコアのみを取り出すのに十分細い精密に伸ばしたガラス針を作成した。ＮＮＫのみで処理した細胞は細胞リッチな球状のコロニーを含有していた。８個の主要なコロニーの中心コアを取り出し、８０〜２００の密に充填された細胞からなる各コアを２４ウェル皿のそれぞれの別個の皿に入れた。このようにして移した４コロニーの細胞は生存し、拡大した。
【００９４】
細胞増殖アッセイ：
１０％ＦＢＳでの細胞増殖を測定するために、細胞をｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ４ｍｌを含有する５×１０４細胞／６０ｍｍＴＣＤで接種した。３日ごとに、３つ組のＴＣＤを試験中の各細胞系について除去し、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで離し、トリパンブルーの存在下で計測した。減少したＦＢＳ濃度を含有するｃＲＰＭＩの細胞増殖に対する効果を評価するために、同じ数の（１．５×１０４細胞／ｍｌ／ウェル）のＮＮＫで処理されたＢＭＲＰＡ１細胞及び未処理のＢＭＲＰＡ１細胞を２４ウェルＴＣＤの３つ組に接種した。細胞をｃＲＰＭＩ１０％ＦＢＳ中で一晩接着させ、ＰＢＳで洗浄し、指定の％のＦＢＳを含有するｃＲＰＭＩで再インキュベートした。クリスタルバイオレット相対増殖アッセイの改変によって細胞増殖を評価した（Ｓｅｒｒａｎｏ，１９９７）。手短に言えば、細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％緩衝化ホルマリンで固定した後、蒸留水ですすいだ。次いで、細胞を０．１％クリスタルバイオレットで室温（ＲＴ）で３０分間染色し、ｄＨ２Ｏで洗浄し、乾燥した。細胞に関連する染料を１ｍｌの１０％酢酸で抽出し、アリコートをｄＨ２Ｏで１：２に希釈し、ＯＤ６００ｎｍ測定のために９６ウェルマイクロタイタープレートに移した。２４時間でのＯＤ６００ｎｍと比較して細胞増殖を計算した。
【００９５】
ＢｒｄＵ組み込み：
細胞（５×１０４）を６０ｍｍＴＣＤに撒き、ｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ中で増殖させた。３日後、ＢｒｄＵ（１０ｕＭ）を含む新鮮な培地を３時間で添加し、細胞を洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡで離し、製造業者（Ｂｅｃｔｏｍ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって示唆されるようなＦＡＣＳ分析によって、組み込まれたＢｒｄＵをＦＩＴＣに接合された抗−ＢｒｄＵ抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて検出した。手短に言えば、１０６トリプシン−ＥＤＴＡで離された細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで２回洗浄し、７０％エタノールで３０分固定し、ＲＮＡａｓｅＡ（０．１ｍｇ／ｍＬ）中で３７℃で３０分、再懸濁させた。細胞を洗浄した後、それらのＤＮＡを２Ｎ  ＨＣｌ／トリトンＸ−１００で３０分変性させ、０．１Ｍ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７  １０Ｈ２Ｏ、ｐＨ８．５で中和した。次いで、細胞を０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗浄し、ＦＩＴＣ−抗ＢｒｄＵ抗体２０ｕＬを含むＰＢＳ−１％ＢＳＡ溶液中の０．５％Ｔｗｅｅｎ５０ｕＬに再懸濁させた。３７℃で４５分後、細胞を洗浄し、ヨウ化プロピジウム（０．００５ｍｇ／ｍＬ）及びＲＮＡａｓｅ  Ａ（０．１ｍｇ／ｍＬ）を含有するクエン酸Ｎａ緩衝液１ｍＬに再懸濁させた。組み込まれたＢｒｄＵ及びＰＩ染色を検出するための蛍光活性化細胞分類又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を、励起波長４８８ｎｍを用いたアルゴンイオンレーザーを備えるＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＣｏからのＦＡＣＳｃａｎアナライザーを用いて行った。データ分析をＬＹＳＹＳＩＩプログラムを用いて行った。
【００９６】
個々のサンプルのｔ−試験を用いて、ＢｒｄＵを組み込む形質転換されていない細胞と形質転換された細胞の割合の統計的な有意差（ｐ＜０．０５）を示した。形質転換されたＢＭＭＲＰＡ１細胞におけるＧ０／Ｇ１ピークでのＰＩ染色測定値を形質転換されていないＢＭＭＲＰＡ１細胞におけるＧ０／Ｇ１ピークでのＰＩ染色測定値で割った比としてＤＮＡヒストグラムから、ＤＮＡインデックスを以前に記載されているように計算した（Ｂａｒｌｏｇｉｅら，１９８３；Ａｌａｎｅｎら，１９９０）。
【００９７】
足場非依存性増殖：
０．５％寒天−培地混合物（寒天をＨ２Ｏ６４ｍＬ中でオートクレーブにかけ、水浴で５０℃まで冷却し、１５ｍＬ  ５×ｃＲＰＭＩ、１９ｍＬのＦＢＳ及び１ｍＬのＰ／Ｓに添加する）４ｍｌのアリコートを２５ｃｍ２のＴＣＦに注ぎ、４℃で一晩固めた。細胞を撒種する前に、フラスコをＣＯ２−空気インキュベーターに３７℃で５時間入れ、ｐＨ及び温度を平衡化させた。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡによって集め、細胞懸濁物０．１ｍＬ（ｃＲＰＭＩ中に４００００／ｍＬ細胞）を各フラスコの寒天表面上に注意深く広げ、培養物を９５％Ｏ２−５％ＣＯ２の３７℃のインキュベーターに戻した。２４時間後、寒天コーティングされたＴＣＦをひっくり返し過剰の培地を捨てた。Ｚｅｉｓｓ逆顕微鏡を用いてコロニーの増殖について、９日後及び１４日後に培養物を顕微鏡で観察した。
【００９８】
Ｎｕ／Ｎｕマウスにおける腫瘍原性：
Ｎｕ／Ｎｕ  マウス（７週齢）をＨａｒｌｅ’ｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（インディアナポリス，ＩＮ）から得た。注射のために使用される細胞をトリプシン−ＥＤＴＡによって離し、ｃＲＰＭＩ中で洗浄し、１０８細胞／ｍＬでＰＢＳ中に再懸濁させた。試験される各マウスにこの細胞懸濁物０．１ｍＬを用いて皮下（ｓ．ｃ．）注射した。最初の４週間は毎日腫瘍の成長について動物を観察し、その後は１週間ごとに観察した。腫瘍の小片（１〜２ｍｍ３）を腫瘍中心から切断し、４％パラホルムアルデヒド中に４℃で一晩置いた。次いで、組織をＰＢＳ中で洗浄し、３０％ショ糖中にさらに２４時間置いた。Ｌｉｐｓｈａｗで包んだマトリックス中で凍結させた腫瘍組織部分（ピッツバーグ，ＰＡ）をＪｕｎｇ低温保持装置（Ｌｅｉｃａ）を用いて作成し、ゼラチンでコーティングされたスライドの上に置き、−２０℃で保存した。Ｈ＆Ｅ染色を標準的な手順に従って行った。
【００９９】
切除したＮｕ／Ｎｕマウス腫瘍からのＴＵＮＮＫ細胞系の形成：
Ｎｕ／Ｎｕマウスに皮下で移植したＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞から増殖させた腫瘍由来の細胞の単離を、（非特許文献６３）によって記載される方法と類似の、いくつかの手順を変更した方法によって行った。腫瘍を有するＮｕ／ＮｕマウスをＣＯ２窒息によって殺し、氷で冷却した床の上に置き、腫瘍の上の皮膚を開き、腫瘍を迅速に外科的に滅菌して取り出し、すぐに処理するために氷上のＬ−１５培地（ＧＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に置いた。氷冷したＬ−１５培地中に置きながら、組織を小片に刻み、酵素による消化及び機械的破壊を２サイクル行った。Ｌ−１５培地中の消化混合物は、コラゲナーゼ（１．５ｍｇ／ｍｌ）（１３６Ｕ／ｍｇ；ＷｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎＢｉｏｃｈｅｍ．Ｃｏｒｐ．）、大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）（０．２ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｐ．）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；結晶化）（２ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）からなっていた。最初の消化サイクル（２５分、３７℃）の後、細胞及び組織フラグメントを２５０ｇずつにペレット化し、ＳＢＴＩ（０．２ｍｇ／ｍｌ）、ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ（０．００２Ｍ）及びＨＥＰＥＳ（０．０２Ｍ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍ．，インディアナポリス）（Ｓ−緩衝液）を含有する氷冷したＣａ＋＋及びＭｇ＋＋を含まないリン酸緩衝化食塩水（ＰＤ）中で１回洗浄した。細胞を再びペレット化し、消化混合物中に再懸濁させ、第２の消化サイクル（５０分、３７℃）に供した。なお消化混合物中に存在する状態で、細胞懸濁物をピペットを用いて繰り返し取り出し、サイズの小さな針をつけたシリンジで繰り返し取り出すことによって残りの細胞の塊を破壊した。次いで、細胞懸濁物を滅菌２００μ−メッシュ及び２０μ−メッシュのナイロンＮｙｔｅｘ格子（ＴｅｔｋｏＩｎｃ．，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ）を連続的に通してせん断し、Ｓ−緩衝液中で洗浄し、２〜３ｍｌのＬ−１５培地中に再懸濁させ、５０×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。細胞ペレットを集め、ＰＢＳ中で洗浄し、ｃＲＰＭＩ中に再懸濁させた。フラクションのサンプルをトリパンブルー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．）排除（非特許文献６４）によって生菌数計測及び細胞化学的な分析のために処理した。細胞を撒種し、６−ウェルＴＣＤの１０５細胞／３５ｍｍウェルでｃＲＰＭＩ中で増殖させた。
【０１００】
【非特許文献６３】Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ａ．及びＪａｍｉｅｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，１９７４，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６３：１０３７−１０５６．
【非特許文献６４】Ｍｉｃｈｌ  Ｊ．ら，１９７６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４４（６），１４８４−９３）．
【０１０１】
顕微鏡撮影：
フェーズオプティクス（ｐｈａｓｅ  ｏｐｔｉｃｓ）及びＬｅｉｔｚカメラを取り付けたＬｅｉｔｚ  Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅで細胞培養物の全ての観察及び撮影を行った。観察結果をＴＭＸ  ＡＳＡ１００  Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅフィルムで記録した。
【実施例２】
【０１０２】
結果
ＢＭＲＰＡ１形態に対するＮＮＫの影響：ＮＮＫ及び他のニトロソアミンに繰り返し暴露すると、インビトロの膵臓癌実験モデルにおいて、種々のげっ歯類及びヒトにおける細胞毒性及び新生物性形態変化の両方を誘発することが観察された（非特許文献６５）。このような変化が単にＮＮＫの暴露によって誘発されるのか否か、及び比較的低濃度のＮＮＫの暴露によって誘発されるのか否かを決定する目的で、ＢＭＲＰＡ１細胞を１００、５０、１０、５、及び１μｇのＮＮＫ／ｍＬを含有する血清を含まない培地に１６時間暴露した。膵臓細胞を用いた以前の研究で観察されたように、ＮＮＫの濃度が高いと、接着性が低く、変性し、死滅する細胞、及び細胞増殖の低下からなる細胞毒性の変化を生じたが、このような変化は、５及び１μＬのＮＮＫ／ｍＬに暴露した細胞においてはほとんど見られなかった。１００、５０、１０μｇのＮＮＫ／ｍｌを用いた処理の変性変化は、紡錘状の形態及び集中的な過密状態のような悪性転換を含む形質変化の概観によって１週間以内に見られた。１μｇ／ｍｌのＮＮＫで処理したＢＭＲＰＡ１細胞はさらに、悪質変換の形質変化の特徴は示したが、その変化の速度は小さく、数週間かかった。他の突然変異誘発因子について示唆されるように（非特許文献６６）、低用量で観察された変化は、ヒト環境において直面するものに近い用量でＮＮＫで誘発される障害の特異的な優先分子部位を反映しているように思われる。さらに、１μｇ／ｍＬでのこれらの変化のゆっくりとした速度は、ＮＮＫで誘発される形質転換のプロセスにおいて初期事象及び後期事象の両方の経過研究による道を与えることができる。従って、以下に示される結果は、１μｇＮＮＫ／ＦＢＳを含まない培地１ｍＬに対して１６時間暴露したＢＭＲＰＡ１細胞を用いて得た。
【０１０３】
【非特許文献６５】Ｊｏｎｅｓ，１９８１，Ｐａｒｓａ，１９８５，Ｃｕｒｐｈｅｙ，１９８７，Ｂａｓｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ  １９９４）．
【非特許文献６６】Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｐ  Ｋ，  ａｎｄ  Ｌ. J. Ｏｌｄ．  （１９８８）．  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｊｎｉｍｕｎ．  Ｔｏｄａｙ，  ９（３），  ７８−８３．
【０１０４】
３５パッセージについて培地中で連続的に増殖したＢＭＲＰＡ１細胞は、単一層の、形質転換されていない接触阻害された上皮細胞の典型的な丸石状のパターンに組織化した（図１Ａ）。１μｇのＮＮＫ／ｍｌに暴露した２週間後、ＢＭＲＰＡ１細胞は少し形態変化を示した：数個の別個の領域中の細胞は多角形形状を失い始めており、細胞質がほとんどなくさらに暗い色の核を持つ紡錘形状の細胞からなる細胞の島が形成され始めた（図１Ｂ、パッセージ２又はｐ２）。ｐ６の始まりには、丸型の細胞の数が表面上及びさらに高い密度で充填された紡錘細胞の鎖の中に増加していることが観察でき（ｐ６〜８）、これは接触阻害を失っていることを示唆する（図１Ｃ）。
【０１０５】
密集した細胞（病巣）の島状領域はｐ７で顕著となり（図１Ｄ、矢印）、細胞の球状の凝集が始まり、これらの病巣の上部にコロニーとして形成された（ｐ７〜１１）。最初の明確に識別可能なコロニーはｐ８〜９で見られ、これはＮＮＫ暴露から約３ヶ月後であった。初期にはコロニーは小さく（図１Ｄ、矢印）少数であるが、それらのコロニーは、ＮＮＫで処理されたＢＭＲＰＡ１細胞が継代された６ＴＣＦ全てに存在した。コロニーは、コンパクトな塊として水平及び垂直に成長し続けた（図１Ｅ）が、接着性はかなり減少しており、例えば、密集した細胞はトリプシン化及びピペットで吸うことによって容易に分離し、このことは、このような培養物が新生物性細胞を含むであろうことを示す。このようなコロニーのトリプシン化による迅速な破壊は、形質転換されていないＢＭＲＰ４３０（ＢＭＲＰＡ１）細胞と直接的に比較される。ＮＮＫを含まずＦＢＳを含まないｃＲＰＭＩに暴露した１６時間後に並行して連続的に培養した対照ＢＭＲＰＡ１細胞は、なんらの変化を示さず、ＢＭＲＰＡ１細胞のもとの単一層と変わりなかった。
【０１０６】
コロニーを形成する細胞の形質変化特性及び分子特性の研究を容易にするために、微細に伸ばしたガラス針を用いていくつかのコロニーの中心を単離し、各単離物の８０〜２００細胞を「クローン化ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ」と称する細胞系として別個に増殖させた。単離された細胞は、紡錘形〜三角形の形状を示し、１つ以上の顕著な核を含有するしばしば異なるサイズの核を有する多核であった。新しいフラスコに再撒種すると、これらの細胞は病巣及びコロニーを形成する能力を維持していた（図１Ｆ）。興味深いことに、ＮＮＫで形質転換されたＢＭＲＰＡ１において見られるＮＮＫで誘発された形質変化は、ヒト発癌性Ｋ−ｒａｓｖａｌ１２によるＢＭＲＰＡ１の形質転換中に観察されるものと同じとは断言できないが類似していた。Ｈ＆Ｅ染色後に巨視的及び微視的に容易に観察可能なＮＮＫで誘発される好塩基性病巣はさらに、発癌性Ｋ−ｒａｓｖａｌ１２を用いたトランスフェクションによって形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞によって形成される病巣と類似していた。対照的に、未処理のＢＭＲＰＡ１細胞の増殖中には病巣もコロニーも形成されなかった。ＢＭＲＰＡ１細胞中でＮＮＫによって誘発される形態変化はさらに、インビトロで培養された他の形質転換された細胞の十分に確立された特徴と類似していた：低い細胞密度での紡錘形及び三角形の細胞形状、高い細胞密度でのハロ状の外観を有する丸形、及び病巣及び隣接する細胞の上部における増殖によって示されるような接触阻害の喪失（非特許文献６７）。
【０１０７】
【非特許文献６７】Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｅ．，（１９８６） Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ８２３，１６１−１９４．
【０１０８】
ＮＮＫで誘発された過剰増殖：ＢＭＲＰＡ１細胞の増殖に対するＮＮＫの長期的な永久的な効果は、１０％ＦＢＳを追加した複合培地（ｃＲＰＭＩ）中で培養されたＮＮＫで処理された細胞及び未処理の細胞の細胞増殖を比較することによって最初に評価した。ＢＭＲＰＡ１（クローン化されていないＮＮＫで処理されたＢＭＲＰＡ１細胞）、及び「クローン化」ＢＭＲＰＡ．１ＮＮＫ細胞（すなわち、この例では上に記載されるように産生され単離された細胞）を、ＴＣＤ中に同じ密度で撒種した。所定の日数で、ＴＣＤ中の細胞をトリプシン−ＥＤＴＡによって離し、集め、トリパンブルーの存在下で計測した。パッセージ４６（ｐ４６）での未処理のＢＭＲＰＡ１細胞は、ほぼ９日で接触阻害された増殖を含む平衡に達した。対照的に、ＮＮＫ処理の１１パッセージ後に、平衡して増殖させたＮＮＫで処理された細胞は、最初の９日間でより素早い増殖を示し、その後、おそらくＮＮＫによって影響を受けていない形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞の存在下での継続に起因して増殖が遅くなった。ＮＮＫで誘発されたコロニーの中心から単離されたクローン化されたＢＭＲＰＡ．１ＮＮＫ細胞（図１Ｆ）は、非常に密度の濃い過密状態を生じる未処理のＢＭＲＰＡ１細胞よりもかなり早い速度で培養１２日間に増殖し続けた。
【０１０９】
細胞増殖曲線がＮＮＫで処理されたＢＭＲＰＡ１細胞と未処理のＢＭＲＰＡ１細胞との間の顕著な増殖の差を示したことから、高い細胞密度で接触阻害された増殖及び細胞死が観察された細胞増殖に有意に関係するだけでなく、ＮＮＫで処理された細胞が低い細胞密度で増殖する本質的な能力の増加を、これらの細胞がＢｒｄＵを組み込む能力を測定することによってさらに評価した。ＲＮＡａｓｅ処理された細胞においてＢｒｄＵ組み込みの測定は、増殖する細胞のＳ段階の間、ＤＮＡ合成を評価するために通常使用される（非特許文献６８）。形質転換されていないＢＭＲＰＡ．ｐ５８、形質転換されたクローン化されていないＢＭＲＰＡ．ＮＮＫ．ｐ１１、及び形質転換されたクローン化されたＢＭＲＰＡ．ＮＮＫ．ｐ２３細胞におけるＢｒｄＵ組み込みのＦＡＣＳ分析によって得られた結果は、ＮＮＫ処理がＢＭＲＰＡ１における永久的な過剰増殖を生じるというさらなる証拠を与える。これらの観察結果は、接触阻害の局所的喪失及び過剰増殖の両方を誘発することによって、ＢＭＲＰＡ１細胞を形質転換し得るという実験的な証拠を与える。
【０１１０】
【非特許文献６８】Ａｌｂｅｒｔｓ  Ｂ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ａ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｊ．，Ｒａｆｆ，Ｍ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｋ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，２００２，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ，４ｔｈ  ｅｄ．，ＮＹ
【０１１１】
形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞及びＮＮＫ−形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞に対する血清喪失の効果：
形質転換された細胞の１つの頻繁に引用される特性は、低濃度の増殖因子及び血清での選択的な増殖の利点、一次細胞及び形質転換されていない細胞の増殖をほとんど支持しない状態である（非特許文献６９）；（非特許文献７０）；（非特許文献７１）。  形質転換されていないＢＭＲＰＡ１及びＮＮＫ−形質転換されたＢＭＲＰＡ１の血清依存を確立するために、細胞を１％、５％、及び１０％ＦＢＳを追加したｃＲＰＭＩ培地に移し、２４−ウェルＴＣＰのウェル内に同じ数の細胞を撒種し、１２日間増殖させた。クリスタルバイオレットアッセイを使用して相対的な細胞増殖を評価した（非特許文献７１）Ｓｅｒｒａｎｏ，１９９７）。このアッセイは、低濃度の血清でＴＣＤに対する強い細胞接着に起因して生じる細胞の損失（不完全な放出及び細胞死）を排除するため、トリプシン−ＥＤＴＡによって話された細胞の計測について顕著な利点を提供する。
【０１１２】
【非特許文献６９】Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｅ．，（１９８６）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ８２３，  １６１−１９４．
【非特許文献７０】Ｆｒｉｅｓｓ，  Ｈ．，  Ｂｅｒｂｅｒａｔ，  Ｐ．，  Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，  Ｍ．，  Ｋｕｎｚ，  J．，  Ｋｏｒｃ，  Ｍ，  Ｂｕｅｈｌｅｒ，  Ｍ．Ｗ．  （１９９６）．  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．J．Ｍｏl．Ｍｏｄ，７４：３５−４２．
【非特許文献７１】Ｋａｔｚ，  Ｍ．Ｅ．，  ａｎｄ  Ｍｃ  Ｃｏｒｍｉｃｋ，  Ｆ．（１９９７）  Ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒａｓ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｃｕｒｔ  Ｏｐ．  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  ７：  ７５−７９，  １９９７．
【非特許文献７２】Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｍ．，Ａ．Ｗ．Ｌｉｎ，Ｍ．Ｅ．  ＭｃＣｕｒｒａｃｈ，Ｄ．Ｂｅａｃｈ，ａｎｄ  Ｓ．Ｗ．Ｌｏｗｅ．  １９９７．Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｒａｓ  ｐｒｏｖｏｋｅｓ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ａｎｄ  ｐ１６ＩＮＫ４ａ．Ｃｅｌｌ，８８：５：５９３−６０２．
【０１１３】
形質転換されたＢＭＲＰＡ．１ＮＮＫ細胞は、試験された全てのＦＢＳ濃度で、未処理の細胞よりも選択的な増殖の利点を有することがわかった。１％ＦＢＳを含有するｃＲＰＭＩ培地中でさえ、ＮＮＫで形質転換された細胞は、１０％を有するｃＲＰＭＩ中で培養された未処理のＢＭＲＰＡ１細胞よりも良好に増殖した。血清の少ない厳しい条件下でｄＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞が細胞増殖を維持する観察された能力は、ＮＮＫの暴露によるＢＭＲＰＡ１細胞の形質転換をさらに支持する。
【０１１４】
足場非依存性細胞増殖：
多くの細胞の悪性転換は、固定依存条件下で、寒天上で増殖する新規に獲得した能力を生じることが示された（非特許文献７３）。クローン化されたＢＭＲＰＡ．１ＮＮＫ及び未処理のＢＭＲＰＡ１細胞が寒天上で増殖する能力を、軟質寒天上で低密度で細胞を分散させることによって試験した（実施例１を参照）。これらの細胞が１４日間にコロニーを形成する能力は表１に示される。
【０１１５】
【非特許文献７３】Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．Ｅ．，（１９８６）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ８２３，１６１−１９４．
【０１１６】
【表１】
2007525410.tif 000002
【０１１７】
以前の観察（非特許文献７４）を確認すると、ＢＭＲＰＡ１細胞は寒天上で増殖することができず、死滅した。対照的に、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞は、強力な増殖能力及びコロニー形成能力を示した。実際に、撒種した４個のＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の約１個が５０細胞よりも多いコロニーを形成した。寒天上の増殖は悪性転換を示す。
【０１１８】
【非特許文献７４】Ｂａｏ，ＬＹ，ＷＬ  Ｔｈｅｌｍｏ，  Ｓ  Ｓｏｍｎａｙ，Ｃ  Ｍａｄａｈａｒ，Ｊ  Ｍｉｃｈｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｃｉｎａｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ，  ＢＭＪＰＡ．４３Ｏ，  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｐａｎｃｒｅａｓ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８：６４Ａ，１９９４．
【０１１９】
Ｎｕ／Ｎｕマウスにおける腫瘍原性：
寒天上で増殖する細胞は、しばしばＮｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍として増殖する能力を有する（非特許文献７５）；（非特許文献７６）。細胞がＮｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍として増殖する能力は、悪性形質転換の強力な示唆であると考えられている（非特許文献７７）。結果として、Ｎｕ／Ｎｕマウスの後フランク領域において１０７個のクローン化した生存ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）注射した。マウスの別のグループを、形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞を用いて同様の条件下でｓ．ｃ．注射した。Ｎｕ／Ｎｕマウスの第３のグループに陽性対照の目的で、ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓｖａｌ１２細胞を用いて注射した。というのは、これらの細胞はＮｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍を形成することが以前に示されているからである。
【０１２０】
【非特許文献７５】Ｓｈｉｎ，  Ｓ．Ｉ．，  Ｖ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，  Ｒ．  Ｒｉｓｓｅｒ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｐｏｌｌａｃｋ．１９７５．  Ｔｕｉｎｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｎｕ／Ｎｕ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｗｉｔｈ  ａｎｃｈｏｒａｇｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｉ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７２：  １１：４４３５−３９．
【非特許文献７６】Ｃｏｌｂｕｍ，  Ｎ．Ｈ．，  Ｗ．Ｆ．  Ｖｏｒｄｅｒ  Ｂｒｕｅｇｇｅ，，  Ｊ．Ｒ．  Ｂａｔｅｓ，  ＲＨ．  Ｇｒａｙ，  Ｊ．Ｄ．  Ｒｏｓｓｅｎ，  Ｗ．Ｈ．  Ｋｅｌｓｅｙ，  ａｎｄ  Ｔ．  Ｓｈｉｍａｄａ．  １９７８．  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｗｉｔｈ  ｔｕｒｎｏｒｉｇｅｕｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｅｐｉｄｅｎｎａｌ  ｃｅｌｌｓ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ３８：６２４−６３４．
【非特許文献７７】Ｓ．Ｅ．，（１９８６）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ８２３，  １６１−１９４．
【０１２１】
【表２】
2007525410.tif 000003
【０１２２】
ＢＭＲＰＡ１細胞は、注射された５匹のＮｕ／Ｎｕマウスにおいて腫瘍を形成することができなかったが、ＢＭＲＰＡ１．Ｋ−ｒａｓｖａｌ１２細胞は迅速に増殖する結節（＜０．５ｃｍ）を形成し、この結節は接種後４週間以内に腫瘍（＞１ｃｍ）になった。顕著な違いは、クローン化されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を注射したＮｕ／Ｎｕマウスにおける腫瘍形成の過程であった。クローン化されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を注射した後１週間以内に、６匹全てのマウスの注射部位で２〜３ｍｍの結節が形成された。結節は２ヶ月以内に３匹の動物において消失した。それにもかかわらず、４ヶ月までの休止期間後に、残りの３匹の動物における結節は次の１２〜１６週以内に直径１ｃｍを超える腫瘍に成長した。成長した大きな腫瘍の塊を有するこれらのマウスのうち１匹はさらに腹水症を発症し、このことは、転移性の腫瘍細胞の存在を示す。ＴＵＮＮＫと呼ばれる細胞系は、機械的破壊及びコラゲナーゼ消化を組み合わせた方法によってＢＭＰＲＡ１．ＮＮＫを注射したＮｕ／Ｎｕマウスにおいて増殖する腫瘍の１つから確立された。ＴＵＮＮＫは、Ｎｕ／Ｎｕマウスに注射されクローン化されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞と類似の形質転換された形態学的特性を有する。今までのところ、上記２つの間のたった１つの顕著な区別できる形質変化特性は、インビトロで細胞凝集物として浮遊するＴＵＮＮＫの傾向であり、このことは、インビボにおける選択的な増殖プロセスの間に起こる細胞の接着性に顕著な変化を与えることが示唆される。
【実施例３】
【０１２３】
寛容誘発標的化抗体産生（ＴＩＴＡＰ）
物質及び方法：
物質：ＲＰＭＩ１６４０、５．５ｍＭグルコースを含有するＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ−Ｇ＋）、ペニシリン−ストレプトマイシン、ＨＥＰＥＳ緩衝液、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．２％トリプシン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヤギ血清、及びトリパンブルーはＧＩＢＣＯ（ニューヨーク）から入手した。胎児ウシ血清（ＦＢＳ）は、Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（アトランタ、ＧＡ）から入手した。選択的なＨＡＴ及びＨＴ培地のためのヒポキサンチン（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）、及びチミジン（Ｔ）、及びＰＥＧ１５００をＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（ドイツ）から購入した。ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）をＢｉｏＧｅｎｅｘ（ダブリン，ＣＡ）から入手した。ＰＢＳ及びヤギ抗−マウスＩｇＧ［Ｆ（ａｂ’）２ＨＲＰ−ＧαＭ  ＩｇＧ］標識されたセイヨウワサビペルオキシダーゼをＣａｐｐｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｏｃｈｒａｎｖｉｌｌｅ，Ｐａ）から得た。アプロチニン、ペプスタチン、ＰＭＳＦ、デオキシコール酸ナトリウム、ヨードアセトアミド、パラホルムアルデヒド、トリトンＸ−１００、トリズマ塩基、ＯＰＤ、ＨＲＰ−ＧαＭ  ＩｇＧ、及び完全培地のための全ての微量元素をＳｉｇｍａ（セントルイス，ＭＯ）から購入した。過硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、尿素、ＣＨＡＰＳ、低分子量マーカー、及びあらかじめ染色した（Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ）マーカーをＢＩＯＲＡＤ（リッチモンド，ＣＡ）から得た。高められた化学発光（ＥＣＬ）キットをＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）から入手した。メルカプトエタノール（２−ＭＥ）及びフィルムをＥａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ（ロッチェスター，Ｎ．Ｙ．）から入手した。組織培養フラスコ（ＴＣＦ）をＦａｌｃｏｎ（マウンテインビュー，ＣＡ）から入手し、組織培養皿（ＴＣＤ）をＣｏｍｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から入手し、２４−ウェルＴＣプレート（ＴＣＰ）及び９６−ウェルＴＣＰをＣｏｓｔａｒ  （ケンブリッジ，ＭＡ）から入手した。組織培養チャンバー／スライド（各８チャンバー）をＭｉｌｅｓ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）から入手した。
【０１２４】
細胞及び培地：全てのラット膵臓細胞系を１０％ＦＢＳを含有するｃＲＰＭＩ中で培養した。Ｄｒ．Ｍ．ＤｅｌＰｉａｎｏ（Ｍａｘ  Ｐｌａｎｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｏｒｔｍｕｎｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したラット毛細内皮細胞（Ｅ４９）以外の他の細胞系を米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得た。白血球細胞を健康な志願者ドナーから得て、ヒト膵臓組織（マッチしていない移植組織）をＤｏｗｎｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒでＯｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ＤｉｖｉｓｉｏｎからＤｒ．Ｓｏｍｍｅｒｓによって得た。細胞生存度をトリパンブルー排除によって評価した。
【０１２５】
免疫減算過剰免疫化（Ｉｍｍｕｎｏｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ  Ｈｙｐｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）プロトコル（ＩＳＨＩＰ）：ＩＳＨＩＰプロトコルは、係属出願番号第６０／４４３，７０３号（完全に記載されるものとして参考としてこれらの開示が組み込まれる）に詳細に記載される。生存細胞（１０６）及びパラホルムアルデヒド固定し洗浄した（１０６）細胞の混合物をそれぞれ腹腔内（ｉｐ）で固定化するために使用した。６匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（１２週齢）を使用した：２匹のマウスをＢＭＲＰＡ１細胞を用いて標準的に固定化する間４回注射した。他の４匹のマウスにＢＭＲＰＡ１細胞を用いて同様に３回注射し、最後の注射の５時間後に、６０μｇシクロホスファミド／日／体重ｇを用いて次の５日間ｉｐ注射した。これらの免疫抑制されたマウスのうち２匹に、最後のＣｙ注射の後にＢＭＲＰＡ１細胞を用いて再注射した。他の２匹の免疫抑制されたマウスを形質転換されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を用いて週に３回以上注射し、１週間後、７日でさらに５回注射した後に融合してマウスを過剰免疫化した（ＩＳＨＩＰマウス）。所定の免疫化後１週間以内に、血清を全てのマウスから得た。
【０１２６】
ハイブリドーマ及びｍＡｂ精製：最も免疫抑制されたＩＳＨＩＰマウス由来の脾細胞とＰ３Ｕ１骨髄腫細胞を融合することによってハイブリドーマを以前に記載されるように得た（非特許文献７８）；（非特許文献７９）。ハイブリドーマ細胞を２４−ウェルＴＣＰの２８８ウェル中で培養した。ハイブリドーマを最初にＨＡＴ  ＤＭＥＭ−Ｇ＋（２０％ＦＢＳ）培地中で１０日間増殖し、その後、ＨＴを含有する培地で８日間増殖し、次いでＤＭＥＭ−Ｇ＋（２０％ＦＢＳ）中で増殖した。ハイブリドーマ上清を、免疫蛍光顕微鏡観察及び免疫組織化学によるさらなる分析のために特異的なｍＡｂｓの選択を行う前に、Ｃｅｌｌ−ＥＩＡによる特異的な反応性の存在について、融合開始３週間後に細胞−酵素免疫学的検定法（Ｃｅｌｌ−ＥＩＡ）によって３回試験した。
【０１２７】
【非特許文献７８】Ｋｏｈｉｅｒ  Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．  （１９７５）．  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｄｅｓｔｉｉｘｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，  ４９５−４９７．
【非特許文献７９】Ｐｙｔｏｗｓｋｉ  Ｂ．，  Ｂａｓｔｏｎ  Ｔ．Ｇ．，  Ｖａｌｉｎｓｋｉ  Ｊ．Ｅ．，  Ｃａｌｄｅｒｏｎ，  Ｔ．，  Ｓｕｎ，  Ｔ．，  Ｃｈｒｉｓｔｍａｎ，  Ｊ．Ｋ．，  Ｗｒｉｇｈｔ，  Ｓ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｍｉｃｈｉ，  Ｊ．  （１９８８）．  Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６７，  ４２  １−４３９．
【実施例４】
【０１２８】
ＮＮＫで形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞と形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞との間の抗原性の差異の検出：乾燥したＮＮＫで形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞及び形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞と反応するＩｇＧ抗体の存在について、２８８ウェルから集めたハイブリドーマ上清を細胞−酵素免疫学的検定法（Ｃｅｌｌ−ＥＩＡ）によって試験した。ＢＭＰＲＡ１及びＢＭＰＲＡ１．ＮＮＫ細胞を３×１０４／ウェルで０．１ｍＬのｃＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳを用いてＴＣＰ（９６−ウェル）に撒種した。細胞を２４時間接着させ、風乾し、ＲＴ真空下で保存した。次いで、細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで再水和させた後、ハイブリドーマ上清又はマウス血清の２倍連続希釈物のいずれかを各ウェルに室温（ＲＴ）で４５分間添加した。ＰＢＳ−ＢＳＡで洗浄した後、ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧ（ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中１：１００）を各ウェルにＲＴで４５分間添加した。結合していない抗体を洗い流し、ＯＰＤ基質をＲＴで４５分間添加した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ３５５０）を用いて基質の着色をＯＤ４９０ｎｍで評価した。ハイブリドーマ上清について、０．２０（反応性血清を用いて得られた陰性対照のＯＤ４９０ｎｍ値の５倍）より大きいＯＤ４９０ｎｍ値を陽性であるとみなした。融合の１８日〜２１日後の評価は、試験した２８８ウェルの２６５（９２％）が１つ以上の増殖するハイブリドーマを含有することを確立した。Ｃｅｌｌ−ＥＩＡによって、ウェルの７３（すなわち２３．５％）由来の上清は、形質転換されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞と反応する抗体を含有していた。対照的に、４７（すなわち１６．３％）の上清のみがＢＭＲＰＡ１細胞と反応し、これはＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞が形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞によって発現されない抗原を発現することを示す。さらに、ＢＭＲＰＡ１細胞と反応する４７の全てのハイブリドーマ上清が、形質転換されたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞と相互反応性を示した。
【実施例５】
【０１２９】
インタクトな形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞及び形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞と選択されたハイブリドーマ上清との免疫反応性
Ｃｅｌｌ−ＥＩＡ試験が乾燥し破壊された細胞で行われた場合、上清中の抗体は、細胞内及び血漿膜Ａｇの両方に接近し近づく。Ｃｅｌｌ−ＥＩＡによって、これらの上清は一貫してＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞のみ（上清３Ａ２；３Ｃ４；３Ｄ４）と、又はＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ及びＢＭＲＰＡ１細胞の両方（上清４ＡＢ１；２Ｂ５）とのいずれかと強力な反応性を示すため、認識されたＡｇの細胞内位置に関する最初の情報を得るために、インタクトな細胞での間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によるさらなる試験のために５つのハイブリドーマ上清を最初に選択した。Ｃｅｌｌ−ＥＩＡの結果と一致して、上清３Ｃ４、４ＡＢ１、及び２Ｂ５はインタクトな細胞の細胞表面を染色した。
【０１３０】
ＰＢＳ中の０．０２Ｍ  ＥＤＴＡでインキュベーションすることによって細胞を離し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで洗浄し、免疫蛍光分析のために氷冷温度で生きたまま加工した。ハイブリドーマ上清または血清と懸濁させて細胞を１時間インキュベートし、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中で３回洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡで１：４０に希釈したＦＩＴＣ−ＧαＭ  ＩｇＧに暴露した。４５分後、結合していない抗体を洗い流し、細胞を共焦点顕微鏡によって試験した。
【０１３１】
驚くべきことに、３Ｃ４はＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ（図２Ｂ）及び環状パターンにおけるＢＭＲＰＡｌ．Ｋ−ｒａｓＶａｌ１２細胞（同時係属中の仮特許（特許文献１４）を参照）を染色したが、形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞の細胞表面を染色しなかった（図２Ｃ）。このことは、形質転換された細胞の表面膜上にのみ３Ｃ４−Ａｇが存在することを示す。
【０１３２】
【特許文献１４】米国特許出願番号第６０／４４３，７０３号
【実施例６】
【０１３３】
透過性細胞及び組織部分のイムノペルオキシダーゼ染色
細胞及び組織の調製：形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞及び形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞を組織培養チャンバーに１×１０４細胞／ｃＲＰＭＩ０．３ｍＬ／チャンバーで撒種した。２日後、細胞をＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで４℃で一晩固定した。次いで、細胞をＰＢＳ−１％ＢＳＡで２回洗浄し、免疫組織化学染色のために使用した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の４％パラホルムアルデヒドをかん流させて免疫組織化学染色のための膵臓組織を成ラットから調製した。固定した脾臓を固定したラットから取り出し４％緩衝化パラホルムアルデヒド中で４℃で一晩保存した。次いで、脾臓を洗浄し、３０％ショ糖中に一晩置いた。凍結した組織部分（１０μｍ）をＪｕｎｇ低温保持装置（Ｌｅｉｃａ）を用いて作成し、ゼラチンでコーティングされたスライドの上に置き、−２０℃で保存した。細胞系又は組織部分を４％緩衝化パラホルムアルデヒド中で１分間後固定し、Ｔｒｉｓ緩衝液（ＴｒｉｓＢ）（０．１Ｍ，ｐＨ７．６）中で洗浄し、トリトンＸ−１００（ＴｒｉｓＢ中０．２５％）中にＲＴで１５分間置いた。次いで、免疫組織化学を以前に記載されたように行った（Ｇｕｚら，１９９５）。
【０１３４】
生きたげっ歯類及びヒトＰａＣａ細胞のｍＡｂ３Ｃ４を用いた染色は、インタクトな細胞の結晶膜に対して３Ｃ４−Ａｇを局在化させた（図６Ａ〜６Ｊ）。ＩＦＡ及びＦＡＣＳによって検出された３Ｃ４染色（実施例７）は、ＥＤＴＡのみの代わりにトリプシン／ＥＤＴＡが使用され細胞を離す場合完全に阻止され、このことは、３Ｃ４Ａｇが形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞の外側膜上に見られるトリプシン−感受性のタンパク質であることを示す。
【実施例７】
【０１３５】
形質転換された及び形質転換されていないげっ歯類及びヒトの膵臓癌腫細胞の蛍光活性化細胞分類分析（ＦＡＣＳ）
生きた細胞を氷上に置き、ｍＡｂ３Ｃ４及びウサギ−αＭ  ＩｇＧ（ＦＩＴＣ−ＲαＭ  ＩｇＧ）で標識したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ−）と順に反応させ、２％緩衝化パラホルムアルデヒド中で一晩固定し、洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＩＶアナライザーで分析した。
【０１３６】
染色したＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞のＦＡＣＳ分析は、細胞表面上の抗原の存在の半定量的評価を提供し、細胞の９９％超での蛍光を確認し、このことは、ＰａＣａ細胞集合のそれぞれにおける細胞の９９％超が３Ｃ４−Ａｇを発現したことを示す。これらの結果を図７の散布図及び蛍光強度グラフに示す。
【実施例８】
【０１３７】
ｍＡｂ３Ｃ４の精製
マウスに３Ｃ４ハイブリドーマ細胞（１０７／マウス）を注射した。腹水を集め、ｍＡｂ３Ｃ４  ＩｇＧ１をＧタンパク質親和性ビーズを用いて腹水から精製した。ｍＡｂ３Ｃ４を産生するハイブリドーマ細胞を腹腔（ｉ．ｐ．）に注射したマウスから抽出した腹水とともに注射したタンパク質Ｇビーズを一定速度の回転下で４℃で一晩インキュベートした。次いで、タンパク質Ｇビーズを遠心分離し、上清を除去し、ビーズを緩衝液Ａ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．２％トリトンＸ−１００、０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）、及び緩衝液Ｃ（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、０．２５ｍＭ  ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）で順に洗浄して、非特異的に吸着したタンパク質を除去した。ビーズの２倍の体積の溶出緩衝液（０．１Ｍ  グリシン、ｐＨ２．７）を用いて結合したｍＡｂ３Ｃ４をビーズから溶出させ、ビーズから分離したものを簡単に遠心分離した後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０で溶出液を中和した。
【０１３８】
ｍＡｂ３Ｃ４  ＩｇＧの精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法（ＩＢ）によって確認した。
ｍＡｂ３Ｃ４のＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法（ＩＢ）：
タンパク質Ｇビーズカラムから溶出し分離したｍＡｂ３Ｃ４を、還元条件及び非還元条件下でのＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びイムノブロッティング法（ＩＢ）に供した。ｍＡｂ３Ｃ４サンプル及び以下に記載される他のサンプルを非還元性サンプル緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ６．８）及び還元性サンプル緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ６．８）の同体積と混合した。各サンプル（２０μｇ／ウェル）からのタンパク質を以前に記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）、ニトロセルロース膜に電気的に移した。ゲルレーンを以下のようにした：
【０１３９】
レーン          サンプル
１        ＝    ハイブリドーマを注射したマウス腹水
２        ＝    腹水でインキュベートしたタンパク質Ｇビーズからのタンパク質の低ｐＨ緩衝液溶出液
３        ＝    還元後のレーン２のタンパク質
１Ｂ      ＝    レーン１のＩＢ
２Ｂ      ＝    レーン２のＩＢ
【０１４０】
膜をＴＢＳ−Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）乾燥ミルクで１時間インキュベートした後、ＨＲＰ−ＧαＭ  ＩｇＧ抗体を製造業者によって示唆されるように使用した（ＥＣＬキット，Ａｍｅｒｓｈａｍ）。試験した各サンプル中のＥＣＬによるｍＡｂ３Ｃ４タンパク質の存在は、Ｘ−ＯＭＡＴフィルム（Ｋｏｄａｋ）に露光することによって検出した。
【０１４１】
図３のレーン１〜３は、複数からＧタンパク質親和性精製したｍＡｂ３Ｃ４と共にクマシンブルー染色したＳＤＳ−ＰＡゲルの写真である。レーン１は、約１５０〜１６０ｋＤ領域付近に見られるように、かなりの量のｍＡｂ３Ｃ４が腹水内に放出されたことを示す。レーン２：ビーズからＩｇＧが定量的に放出された低ｐＨ溶出液。レーン３は、レーン２を還元した約１６０ｋＤタンパク質（ＩｇＧ）を示す。約１６０ｋＤタンパク質の消失及びＩｇＧに典型的な約５５ｋＤの重鎖及び約２８ｋＤの軽鎖の出現は、抽出した１６０ｋＤタンパク質が実際はＩｇＧであることの証拠である。レーン１Ｂ及び２Ｂは、ＨＲＰ−ＳａＭ  ＩｇＧ及びＥＣＬ反応キットを用いたレーン１及び３におけるＩｇＧのイムノブロット及び放射線写真を示し、これにより約１６０ｋＤタンパク質がＩｇＧであることが確認された。この精製により、腹水中に存在する抗体の約２／３を抽出し、汚染物の９８％超の除去に成功した。アイソタイプ特異性についてのＥＬＩＳＡ分析により、ｍＡｂ３Ｃ４がκ軽鎖を有するマウスＩｇＧのＩｇＧ１サブクラスに属することを同定した。
【実施例９】
【０１４２】
３Ｃ４抗原（ＰａＣａ−Ａｇｌ）の同定
げっ歯類及びヒトの膵臓癌腫細胞由来の細胞溶解タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥの後、ｍＡｂ３Ｃ４を含むＩＢを使用してタンパク質の性質及び３Ｃ４−Ａｇの分子量（ＭＷ）を同定した（図４及び５）。細胞を２５ｃｍ２ＴＣＤ中で増殖して密集させ、氷冷却したＰＢＳで洗浄し、氷上で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％  ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１μｇ／ｍＬペプスタチン、２ｕｇ／ｍＬアプロチニン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び５ｍＭ  ヨードアセトアミドからなる０．５ｍＬ  ＲＩＰＡ溶解緩衝液（ｐＨ８）中でインキュベートした。３０分後、残りの細胞片を溶解溶液内でこすり、細胞溶解物を１１，５００×ｇで１５分間遠心分離して不溶解片を除去した。各溶解液のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄのアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって決定した。細胞抽出物を非還元性緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ６．８）又は還元性緩衝液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、２％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー、２０％ｖ／ｖグリセロール、ｐＨ６．８）の同体積と混合した。各サンプル（２０μｇ／ウェル）からのタンパク質を以前に記載されるようにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し（Ｌａｅｍｍｌｉ，１９７０）、ニトロセルロース膜に電気的に移した。図４におけるゲルレーンを以下のようにした：
【０１４３】
レーン          サンプル
１        ＝    ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ＋ｍＡｂ３Ｃ４；ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを含む
２        ＝    ＢＭＲＰＡ１＋ｍＡｂ３Ｃ４、ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを含む
３        ＝    ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ、ｍＡｂ３Ｃ４なし、ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを含む；
４        ＝    ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３、ｍＡｂ３Ｃ４とＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧとを含む
５        ＝    非還元性ヒトＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ｍＡｂ３ｃ４なし、ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを含む
６        ＝    還元性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ｍＡｂ３Ｃ４なし、ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを含む；
７        ＝    還元性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ｍＡｂ３Ｃ４とＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧとを含む
８        ＝    非還元性ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ｍＡｂ３Ｃ４とＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧとを含む
ＨＲＰ−ＧαＭＩｇＧを含むＥＣＬ増幅
水平線は分離ゲルの上部及び底部を示す。
【０１４４】
膜をＴＢＳ−Ｔ中の５％（ｗ／ｖ）乾燥ミルクで１時間インキュベートした後、ｍＡｂ３Ｃ４（１：２００）及びＨＲＰ−ＧαＭ  ＩｇＧ抗体を製造業者によって示唆されるように使用した（ＥＣＬキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。試験した各サンプル中のＥＣＬによる目的のタンパク質の存在は、Ｘ−ＯＭＡＴフィルム（Ｋｏｄａｋ）に露光することによって検出した。
【０１４５】
図４に示されるイムノブロットにおいて示されるように、ｍＡｂ３Ｃ４は、非還元性条件下（レーン１〜５、８）及び還元性条件下（レーン６及び７）の両方で、３Ｃ４−Ａｇがげっ歯類及びヒトの膵臓癌腫細胞の両方の細胞溶解物中の約４３〜４３．５ｋＤタンパク質であることが明らかに同定された。上記タンパク質は、正常な形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞の溶解物中には存在せず、ＮＮＫ形質転換された細胞及びヒトＰａＣａ細胞系ＭＩＡ−ＰａＣａ−２中に存在する。還元が３Ｃ４−Ａｇの移動パターンを変えないという事実は、抗原がサブユニットを含有しないことを示す。
【０１４６】
図５は、ｍＡｂ３Ｃ４及びタンパク質Ｇ免疫親和性ビーズを含むＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞からの３Ｃ４抗原の免疫沈降を示す。Ａにおいて、タンパク質ゲルの銀染色は、レーン１（タンパク質Ｇのみで処理）には存在するが、レーン２（ｍＡｂ３Ｃ４及びタンパク質Ｇビーズで処理）には存在しない約４３ｋＤａのポリペプチドバンドの除去を示す。抽出されたバンドは、約４３ｋＤａの単一のバンドとしてｍＡｂ３Ｃ４を用いたイムノブロッティング法によって図５Ｂのレーン２において同定された。
【実施例１０】
【０１４７】
２Ｄ等電集束／ＳＤＳ−デュラシルゲル電気泳動ポリペプチド分離
プロテアーゼインヒビターの存在下でＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を系中で溶解させ、それらの核を遠心分離によって除去し、細胞溶解物のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄのアッセイ（ＢｉｏＲａｄ）によって確立した。細胞タンパク質（０．４ｍｇ）を、ｄＨ２Ｏ（１．６５ｍｌ）中の尿素−／ＮＰ−４０−溶液（８．１５ｍｌ）及び２−メルカプトエタノール（０．２ｍｌ）［尿素−／ＮＰ−４０ストック溶液：２４ｇ尿素を０．８４ｍｌのＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ）を含有するｄＨ２Ｏ  １８ｍｌに溶解した］で作成された等電集束サンプル緩衝液に移した。次いで、サンプル緩衝液中の溶解物を、アクリルアミド／ビス−アクリルアミド（０．５ｍｌ）、尿素−／ＮＰ−４０溶液（３．７６ｍｌ）、生物分解物の混合物（０．２５ｍｌ）、硫酸アンモニウム（１０％ｗ／ｖ溶液０．０１５ｍｌ）及びＴＥＭＥＤ（０．００４ｍｌ）からなるＩＥＦキャピラリー管ゲルの上部に置いた。アクリルアミド／ビス−アクリルアミド混合物は、９ｇのアクリルアミド及び０．５４ｇのビス−アクリルアミドを３０ｍｌのｄＨ２Ｏに溶解して調製した。生物分解物（ａｍｐｈｏｌｉｎｅ）混合物は、３〜１０（０．４ｍｌ）及び５〜７（０．１ｍｌ）の範囲をカバーする生物分解物を混合することによって製造した。タンパク質をＩＥＦゲルで２００Ｖで２時間分離した後、５００Ｖで５時間、８００Ｖで１６時間分離した。分離したタンパク質の分子量を規定する第２の寸法は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＢｉｏＲａｄ）中で２０ｍＡ／ゲルで操作した。同一の条件でいくつかのＩＦ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを平衡して操作し、銀染色のために加工し（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）（図１１）、ｍＡｂ３Ｃ４を用いたイムノブロッティング法（図１２）のためにＰＶＤＦ膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｏｌｌ）に電気泳動的に移し、タンパク質配列決定のための３Ｃ４−Ａｇスポットの単離のためのイモビロン膜に移した。あらかじめ染色した分子マーカーを使用して、ＩＦゲルから膜へのタンパク質の適切な移動を照合した。図１１における銀染色は、それらのＰＩ値に従って、ＩＦゲル内で、細胞溶解物中及びそれらの適切な分離物中の大量の個々のタンパク質の存在を示す。図１２に図示されるイムノブロットは、Ｘ線フィルムのＥＣＬ−化学蛍光手順を用いて作られた。ｍＡｂ３Ｃ４ブロットの化学発光分析は、発光の単一のスポット（矢印の先）のみが３Ｃ４−Ａｇが４．６〜４．８のｐＩを有する約４３ｋＤポリペプチドとして同定されることを示す。
【０１４８】
分離したポリペプチドは、半乾燥条件下で１時間、１．２５ｍＡ／ｃｍ２（４８４ｍＡ）でＰＶＤＦ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及びＳｃｈｏｌｌ）膜に迅速に移されるか、又は製造業者（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＭＡ）の指示に従って銀キットで染色されるかのいずれかであった。ＰＶＤＦ膜をウェスタンブロット分析によって３Ｄ４−Ａｇを検出するために使用し、Ｒｅｖ  Ｐｒｏ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，ＭＡ）、又はアミドＢｌａｃｋのいずれかでその後に染色した。最初の寸法におけるｐＨ勾配を以前に記載されるように１．０ｃｍ部分から決定した（非特許文献８０）。２Ｄ分離したポリペプチドの銀染色をゲルのコンピュータースキャンによって記録した。
【０１４９】
【非特許文献８０】Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，ＰＨ．Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｎ，２５０：４００７−４０２１（１９７５）．
【実施例１１】
【０１５０】
３Ｃ４  Ａｇの発現は、膵臓癌細胞に極めて限定され、正常組織には見られない
正常なラット、ヒト組織及び形質転換されたヒト組織内で３Ｃ４−Ａｇの分布を試験するために、ｍＡｂ３Ｃ４を用いた組織抽出物のイムノブロットを行った。種々の組織（甲状腺、卵巣、脳、心臓、肺、肝臓、睾丸、図９を参照）からの組織抽出物由来の減少したタンパク質、及びヒト腺房膵臓細胞、白血球血液細胞、及び腺管膵臓細胞（図９Ｂを参照）を１２％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移し、ｍＡｂ３Ｃ４存在下又は非存在下で処理した後、ＥＣＬ化学発光増幅を行った。ＭＩＡ−ＰａＣａ及びマウスＩｇＧを対照として供した。減少したタンパク質の抽出物（０．０５ｍｇ／レーン）を１２％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移し、ｍＡｂ３Ｃ４存在下又は非存在下で処理した後、ＥＣＬ化学発光増幅を行った（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。それぞれヒト膵臓腺房（ＰＡ）及び腺管組織（ＰＤ）の１０倍及び４倍を超えるタンパク質が、Ａｇの発現の少量の存在をも排除するために追加された。ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞溶解物及びＩｇＧを対照として使用した。図９に記載されるような結果は、３Ｃ４  Ａｇが正常組織には存在しないが膵臓癌細胞には存在することを示す。
【０１５１】
次いで、ｍＡｂ３Ｃ４を用いた種々のヒト癌性組織（神経グリア芽細胞腫、肺癌、表皮癌、結腸ＡＣＡ、乳癌ＡＣＡ、表皮ＡＣＡ、腎臓ＡＣＡ、ＭＩＡ−ＰａＣａ）のイムノブロットを行い、結果を図１０に示した。この結果より、約４３．５ｋＤの抗原についてｍＡｂ３Ｃ４が非常に選択的な反応性を示し、３Ｃ４−ＡｇはヒトＰａＣａ、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞において非常に発現することを示す。この反応性の特異性は、ｍＡｂ３Ｃ４がＩＢ中では除外されるか、又は非特異的なＩｇＧに交換される場合、全ての組織サンプルにおける任意のタンパク質バンドの非存在によってさらに示される。これらのことから、腎臓、前立腺及び可能ならば直腸癌腫において少量の３Ｃ４−Ａｇが存在するが、その量は、ＰａＣａ細胞によって発現される量と比較して十分ではないと考えられ、示されているレーンにおいてたった０．０２ｍｇのタンパク質が分離されたのみである。ひとまとめにして考えると、ＩＢ及びＩＣによって得られた結果は、ラット及びヒトＰａＣａ細胞中で優先的に発現する抗原、３Ｃ４−Ａｇに対するｍＡｂ３Ｃ４の特異性を非常に支持する。
【０１５２】
正常なヒト膵臓組織（ｎ＝２）及び精製したヒト腺房及び導管細胞は、ウェスタンブロットによって、ｍＡｂ３Ｃ４と反応性ではないことがわかった。さらにｍＡｂ３Ｃ４とのウェスタンブロッティングによって、舌、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸、盲腸、直腸、脳、心臓、気管、肺、肝臓、腎臓、乳腺及び前立腺組織及び抹消白血球細胞由来の最適に保存されたヒト組織抽出物（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎから）はｍＡｂ３Ｃ４に対して非反応性であった。しかし、ラット卵巣と同様に、ｍＡｂ３Ｃ４とのウェスタンブロットによって、かすかに陽性の４３．５ｋＤａバンドが正常なヒト卵巣組織で観察された。
【実施例１２】
【０１５３】
ＰａＣａ−Ａｇの特性決定、組織分布、及び相対発現レベルのさらなる試験
パラホルムアルデヒド又はメタノール／アセトンのいずれかで固定された形質転換された細胞の免疫組織化学及び間接的な免疫蛍光（ＩＩＦ）（図１４Ａ、Ｃ〜Ｆ）（形質転換されていない細胞（図１４Ｂ）は除く）は、膜の強調した染色を示した（図１４）。細胞を氷で冷却した後、ｍＡｂ３Ｃ４と反応させ、ＦＩＴＣ−ＧａＭＩｇＧと反応させ、緩衝化２％パラホルムアルデヒドで固定した。Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ×４０オブジェクティブ；Ｅ、Ｆ×６４オブジェクティブ；Ｆｕｊｉ  ４００  ＡＳＡフィルム。
【０１５４】
ＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質の変性を生じさせた細胞全体のトリプシン消化は、血漿膜上の位置と一致した（図１５）。しかし、エキソグリコシダーゼ及びエンドグリコシダーゼ（Ｐｒｏｚｙｍｅ）（非特許文献８１）；（非特許文献８２）；（非特許文献８３）に対する暴露は、抗原性を排除もせず、電気泳動挙動を相当程度変化させもせず（図１６Ｂ）、このことは、ＰａＣａ−Ａｇｌがグリコシル化されていないか、最小限しかグリコシル化されておらず、モノクローナルｍＡｂ３Ｃ４によって認識されるＰａＣａ−Ａｇｌ上のエピトープが炭水化物含有領域ではなくて純粋なペプチドであると考えられることを示す。これにより、ペプチドエピトープと比較して、炭水化物含有エピトープがより影響を受ける交差反応性の可能性を減少させている。
【０１５５】
【非特許文献８１】Ｉｗａｓｅ  Ｈ，  Ｈｏｔｔａ  Ｋ．  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ０−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｇｌｙｃａｎｓ  ｂｙ  ｅｎｄｏ−ａｌｐｈａ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓａ−ｍｉｎｉｄａｓｅ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４：  １５１−１５９，  １９９３
【非特許文献８２】Ａｌｔｍａｎｎ  Ｆ，  Ｓｃｈｗｅｉｓｚｅｒ  Ｓ，  Ｗｅｂｅｒ  Ｃ．  Ｋｉｎｅｔｉｃ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅｓ  Ｆ  ａｎｄ  Ａ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｅｖｅｒａｌ，  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｔｙ．  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  １２：８４−９３，１９９５
【非特許文献８３】Ｌｅｅ，  JＹ，ＴＮ  Ｐａｃｋ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｎ−Ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ３０：７１６−７２０，２００２
【０１５６】
ＰａＣａ−Ａｇｌは、豊富なタンパク質であることがわかった：フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識されたｍＡｂ３Ｃ４及び標準量の蛍光体を有するビーズ存在下でのサイトフルオリメトリー（ＦＡＣＳ）（ＱｕｉｃｋＣａｌ  Ｑｕａｎｔｕｍ−２６，Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂ）（非特許文献８４）；（非特許文献８５）；（非特許文献８６）を用いて、形質転換されたＢＭＲＰＡ１細胞が細胞あたり２〜４．４×１０５のコピーを発現することが決定された。ｍＡｂ３Ｃ４に対するＰａＣａ−Ａｇｌの反応性は、免疫蛍光及びイムノブロットによって形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞においてはゼロであり、イムノブロットによる正常なラット膵臓においてゼロであった（図９及び１０）。さらに、ｍＡｂ３Ｃ４と反応性であるタンパク質は、正常なラット卵巣上皮、食道、胃、小腸、大腸、肝臓（肝細胞及び胆管上皮を含む）、肺、心臓、甲状腺、睾丸、脳及び抹消血液細胞において検出不可であった。
【０１５７】
【非特許文献８４】Ｚａｇｕｒｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，１９９５．
【非特許文献８５】Ｂｏｒｏｗｉｔｚ  ＭＪ，Ｊ  Ｓｈｕｓｔｅｒ，  ＡＪ  Ｃａｒｏｌｌ，  Ｍ  Ｎａｓｈ，  ＡＴ  Ｌｏｏｋ，  Ｂ  Ｃａｍｉｔｔａ，  Ｄ  Ｍａｈｏｎｅｙ，  ＳＪ  Ｌａｕｅｒ，  ＤＩ  Ｐｕｉｌｅｎ．  Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｉｔｙ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｂ−ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ，  Ｂｌｏｏｄ  ８９：３９６０−３９６６，１９９７．
【非特許文献８６】Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ａ，ＧＥ  Ｍａｒｔｉ，Ｒ  Ｐｏｏｎ，ＪＷ  Ｇｒａｔａｍａ，  Ｅ  Ｆｅｍａｎｄｅｚ−Ｒｅｐｏｌｌｅｔ．  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｉｎｇ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｒｎｅｔｒｙ：  Ａ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３３：１０６−１１４，１９９８．
【０１５８】
Ａｂ３Ｃ４との反応性を有する正常なラット組織は、約４３．５ｋＤタンパク質がわずかな反応性を示した成長した卵巣のみであった。
【０１５９】
【表３】
2007525410.tif 000004
【実施例１３】
【０１６０】
ＰａＣａ細胞に対するｍＡｂ３Ｃ４の相補的に媒介される細胞毒性の立証
ｍＡｂ３Ｃ４の細胞毒性を以下のように決定した：ヒトＭＩＡ−ＰａＣａ−２細胞を４℃でｍＡｂ３Ｃ４と共にインキュベートし、相補源（Ｃ）として新鮮なウサギ血清中で３７℃でインキュベートした。結果を図８に示すが、ｍＡｂ３Ｃ４一定濃度で、Ｃの濃度の増加につれて、細胞溶解の数が増えた。対照的に、より高い濃度でさえ、ＨＩ−Ｃ（ＨＩ−Ｃ＝熱不活性化したウサギ血清、５６℃、４５分）は、ｍＡｂ３Ｃ４非存在下でのＣと同様に、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対する細胞毒性を示すのと同程度に有効でなかった。同様の結果がＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ及びＢＭＲＰＡＩについて得られた。Ｔｕｃ３細胞をこのアッセイに使用した。全ての希釈物及び反応物はＣａ＋＋及びＭｇ＋＋を含有するＰＢＳ中で作成した。
【実施例１４】
【０１６１】
インビボでの腫瘍増殖に対するｍＡｂ３Ｃ４の影響
Ｎｕ／Ｎｕマウス（ｎ＝１０）をＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞（５×１０６細胞／マウス）に皮下で異種移植した。腫瘍は、直径１０〜１４ｍｍになるまで成長し、増殖した。この時に、ｍＡｂ３Ｃ４を分泌する３Ｃ４ハイブリドーマ細胞をマウスあたり１０６細胞で腹腔内（ｉｐ）注射し、２日ごとに腫瘍の成長を観察し、腫瘍の直径を測定した。４日以内で腫瘍増殖は抑えられ、１６日以内に腫瘍の大きさが直径４〜６ｍｍまで減少した（すなわち、３Ｃ４ハイブリドーマをＩＰ注射した時に最初に測定した大きさよりも顕著に小さくなっていた）。図１３を参照。腫瘍抑制の有意値は、混合モデル分析を用いて決定される０．０００６６未満である。
【実施例１５】
【０１６２】
３Ｃ４−Ａｇが存在する細胞について高い特異性を有するアデノウイルスベクターの構築
（非特許文献８７）によって公開されたペプチド配列に対応するＤＮＡ配列を用いたＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって２個の一本鎖ＤＮＡフラグメントを合成した。このペプチド配列に加えて、そのフラグメントは、開始コドン、Ｋｏｚａｋモチーフ、停止コドン及びＮｏｔｌ及びＫｐｎ１についての２個の制限部位及びそれぞれの末端に制限酵素が適切に結合可能なさらなる４塩基対を含有していた。
【０１６３】
【非特許文献８７】Ｋａｎｏｖｓｋｙ  Ｍ，  Ｒａｆｆｏ  Ａ，  Ｄｒｅｗ  Ｌ，  Ｒｏｓａｌ  Ｒ，  Ｄｏ  Ｔ，  Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＦＫ，  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  Ｐ，  Ｖｉｓｓｅｒ  Ｊ，  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｒ，  Ｂｒａｎｄｔ−ＲａｕｆＰＷ，  Ｍｉｃｈｌ  Ｊ，  Ｆｉｎｅ  ＲＬ，  Ｐｉｎｃｕｓ  ＭＲ．；  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｉ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳ  Ａ．  ２００１  Ｏｃｔ  ２３；９８（２２）：１２４３８−４３：  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｍｄｍ−２−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｐ５３，  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ａｒｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｔｏ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｃｅｌｌｓ．
【０１６４】
配列を以下に示す：
−５’−ＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＡＡＡＴＧ’ＧＡＧＡＣＣＴＴＴＴＣＴＧＡＣＣ
ＴＣＴＧＧＡＡＡＣＴＣＣＴＣ’ＴＡＧＡＡＧＣＤＤＣＣＤＣＡＣＴＣ−３’
５’酵素：Ｋｐｎ１；３’酵素：Ｎｏｔｌ１
−３’−ＴＡＧＧＣＣＡＴＧＧＴＴＴＡＣ’ＣＴＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＣＴＧ
ＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡＧ’ＡＴＣＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＧ−５’
【０１６５】
３μｇのＧＯＩ−ｆｒｗ及び３μｇのＧＯＩ−ｒｅｖを２．５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）と混合し、０．５μｌのｄＮＴＰ（各１０ｍＭ，Ｑｉａｇｅｎ）、０．５μｌのＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）及び１９．５μｌの滅菌水で全反応体積２５μｌにした。サンプルを９４℃で５分間変性させ、５０℃で１分間アニーリングし、７２℃で１０分間インキュベートした。
【０１６６】
微生物のクローニング及びトランスフェクション；
上述の反応物４ｕｌをＴＡ−クローニング反応のために取り、化学的に有能なＴＯＰ−１０ワンショットＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に添加し、微生物を４２℃で３０秒維持し、ＳＯＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で１時間インキュベートした。微生物をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有する選択的なＬＢ寒天プレートに撒種し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１６７】
微生物クローンの分析：１２コロニーをランダムに選択し、液体培地（５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地）中で一晩増殖させた。３ｍｌ培地から微生物を採取し、ＱｉａｇｅｎのＭｉｎｉｐｒｅｐプラスミド単離キットを用いてプラスミド単離を行った。各単離されたプラスミド１０μｌを１０ユニット（Ｕ）のＥｃｏＲ１制限酵素で３７℃で１時間消化し、それぞれの消化したプラスミドの半分を２％アガロースゲルで分析した。予想された大きさの挿入物を示すプラスミドをＧｅｎｅｗｉｚ  Ｉｎｃ．，ＮＪに対して配列決定するために送った。
【０１６８】
エントリーベクターの構築：
予想された配列を含有するプラスミド４０μｇを５０ｕｌ反応体積中で、４０ＵのＮｏｔ１（ＮＥＢ）を用いて３７℃で１時間消化した。次いで、その半分に、フェノール：クロロホルム＝１：１を添加し、サンプルを攪拌し、最大速度３’で遠心分離した。上層を新しい管に移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液及び１００％エタノールで沈殿させた（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）。プラスミドを再溶出させ、５０ｕｌ反応体積中で４０ＵのＫｐｎ１（ＮＥＢ）で３７℃で１時間消化した。ベクターｐＥＮＴＲ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４０ｇを並行して加工した。両方の反応を２％寒天ゲル上で分析し、次いで、混合物全体を１％アガロースゲル上で処理した。適切なバンドを切断し、ＱｉａｇｅｎからのＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルから抽出した。キット中に含まれる１つのカラムの最大結合能力はＤＮＡ１０ｕｇであるため、消化されたｐＥＮＴＲ１１反応物を３つのフラクションに分け、別個に加工し、次いで再びプールした。サンプルのＯＤを測定し、適切な濃度の５’末端とのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いた結紮反応物を１６℃で４時間インキュベートした（非特許文献８８）。結さつ反応物４ｕｌを使用して上に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉをトランスフェクトした。ＧＯＩの存在について１２コロニーを分析し、陽性クローンを次の実験のために選択した。
【０１６９】
【非特許文献８８】Ｓａｍｂｒｏｏｋ，J．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，  E.Ｆ.  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ  ｅｄ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ．
【０１７０】
ＰＮＣ−２８を含有するアデノウイルスベクターの構築（Ａｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８）：
３００ｎｇのｐＥＮＴＲ１１−ＰＮＣ−２８及び同量のＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５ベクターを製造業者のプロトコルに記載されるようにラムダ組み換え反応において使用し、２５℃で２時間インキュベートした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。
【０１７１】
２９３Ａ細胞における（Ａｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８）の繁殖：
Ａｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８を含有する上記反応混合物１ｕｌをＴＯＰ−１０の化学的に有能なＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、アンピシリンプレート中で増殖させた（１００ｕｇ／ｍｌ）。コロニーを選択し、ＬＢ−クロラムフェニコール（３０ｕｇ／ｍｌ）中で増殖を試みた。増殖がうまくいかない場合、真に陽性のクローンであるため、微生物をＬＢ−アンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）中で繁殖させ、上述のように単離した。１０６個の２９３Ａ細胞をトランスフェクトするために、１トランスフェクションあたり１ウェルあたり、６ウェル皿中の２ｍｌ通常増殖培地に撒種し、ベクター４ｕｇを５０ｕｌ反応体積中で４ＵのＰａｃ１（ＮＥＢ）で３７℃で１時間消化し、フェノールはクロロホルム抽出し、上述のように沈殿させ、１ｕｇ／ｕｌの濃度で溶出させた。撒種１８時間後、細胞培地を抗生物質を含まない通常増殖培地と置換した。撒種２４時間後、細胞をＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５／ＰＮＣ−２８−リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、抗生物質及びＦＢＳを含まないＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）０．５ｍｌ中で、ＤＮＡ：リポフェクタミン２０００比２：５でトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後、培地を抗生物質及びＦＢＳを含有する通常増殖培地で交換した。トランスフェクション４８時間後、細胞を１０ｃｍ２皿に移し、６０％細胞変性効果（ＣＰＥ）が観測されるまで２日ごとに供給し、８０％ＣＰＥに到達したら、ウイルスを製造業者のプロトコルに従って収穫した。
【０１７２】
２９３Ａ及び３Ｃ４−ハイブリドーマ細胞からのｃＤＮＡ合成：
３×１０７細胞を各細胞系で集めた。全ＲＮＡをＲｎｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、ポリ−Ａ＋ｍＲＮＡをＣｌｏｎｔｅｃｈのＮｕｃｌｅｏｔｒａｐ  ｍＲＮＡ精製キットを用いて単離した。各細胞系の精製ｍＲＮＡ１ｕｇを使用し、ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを１％アガロースゲル上で分析し、その整合性を確認した。
【０１７３】
ＣＡＲの外形質領域のＰＣＲ増幅：
ヒトＣＡＲの配列をｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖで検証し、外形質領域及びＳｆｉｌ（５’）及びＮｏｔ１（３’）制限部位に隣接するプライマーを合成した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。配列を以下に示す：
−５’−ａｔｃｃ’ｇｇｃｃｃａｇｃｃｇｇｃｃ’ｇｃｇｃｔｃｃｔｇｃｔｇｔｇｃｔｔｃｇｔｇ−３’  Ｓｆｉｌ  ＣＡＲ−ｆｒｗ
−５’−ａｔｃｃ’ｇｃｇｇｃｃｇｃ’ａｇｃｇｃｇａｔｔｔｇａａｇｇａｇｇｇａｃ−３’  Ｎｏｔ１  ＣＡＲ−ｒｅｖ
【０１７４】
ＰＣＲを以下のように行った。各プライマー１０ｐｍｏｌを１０×ＰＣＲ緩衝液２．５ｕｌ（Ｑｉａｇｅｎ）、ｄＮＴＰ０．５ｕｌ（各１０ｍＭ、Ｑｉａｇｅｎ）、Ｔａｑポリメラーゼ０．５ｕｌ（Ｑｉａｇｅｎ）及び滅菌水１９．５μｌと混合し、全反応体積を２５ｕｌにした（非特許文献８９）Ｓａｉｋｉら，１９８５）。サイクル条件は、９５℃、５分、（９５℃、１分；６０℃、１分；７２℃、２分）×３０、７２℃、１０分であった。ＰＣＲ生成物をＴＡクローニング（ＴＡ  クローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に供し、クローンを分析し、上述のように配列決定した。
ｍＡｂ−３Ｃ４の重鎖（ＶＨ−３Ｃ４）及び軽鎖（ＶＬ−３Ｃ４）の可変領域のＰＣＲ増幅：
【０１７５】
【非特許文献８９】Ｓａｉｋｉ，  Ｒ．  Ｋ．，  Ｓｃｈａｒｆ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｆａｌｏｏｎａ，  Ｆ．，  Ｍｕｌｌｉｓ，  Ｋ．  Ｂ．，  Ｈｏｒｎ，  Ｇ．  Ｔ．，  Ｅｒｌｉｃｈ，  Ｈ．  Ａ．  ａｎｄ  Ａｒｎｈｅｉｍ，  Ｎ．  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１３５０．
【０１７６】
重鎖及び軽鎖の可変領域の一定隣接領域からなるプライマーをＮｏｖａｇｅｎから購入した。Ａｄｖａｎｔａｑポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いる企業によって示唆されるようにＶＨ−３Ｃ４及びＶＬ−３Ｃ４を増幅するためのＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物をＴＡクローニング（ＴＡ  クローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に供し、クローンを分析し、上述のように配列決定した。発現ベクターに適切に挿入可能なさらなる制限部位を含有する得られた配列とマッチする新しいプライマーを設計した。プライマーをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって合成した。プライマー配列を以下に示した：
ＶＨ：
ｆｒｗ：−５’−ａｔｃｃ’ｇｃｇｇｃｃｇｃ’−３’Ｎｏｔ１
ｒｅｖ：−５’−ａｔｃｃ’ｃｃｔａｇｇ’−３’ＢａｍＨ１
ＶＬ：
ｆｒｗ：−５’−ａｔｃｃ’ｇｇａｔｃｃ’ｔ’ｇｇｔ’ａｔｇｇａｇａｃａｇａｃａｃａｃｔｃ−３’ＢａｍＨ１
ｒｅｖ：−５’−ａｔｃｃ’ｃｔｃｇａｇ’ｃ’ｔｔｔｃｃａｇｃｔｔｇｇｔｃｃｃｃｃ−３’Ｘｈｏ１
【０１７７】
ＰＣＲを以下のように行った。各プライマー１０ｐｍｏｌを１０×ＰＣＲ緩衝液２．５μｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｄＮＴＰ０．５ｕｌ（各１０ｍＭ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、Ｔａｑポリメラーゼ０．５ｕｌ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及び滅菌水１９．５μｌと混合し、全反応体積を２５ｕｌにした。サイクル条件は、９５℃、５分、（９５℃、１分；５５℃、１分；７２℃、２分）×３０、７２℃、１０分であった。ＰＣＲ生成物をＴＡクローニング（ＴＡ  クローニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に供し、クローンを分析し、上述のように配列決定した。所望の配列を含有するクローンを発現ベクターの構築のために選択した。
【０１７８】
ＣＡＲ、ＶＨ−３Ｃ４及びＶＬ−３Ｃ４を含有する真核細胞発現ベクターの構築：
ＣＡＲについて予想される配列を含有するプラスミド４０μｇを５０ｕｌ反応体積中で、４０ＵのＮｏｔ１（ＮＥＢ）を用いて３７℃で１時間消化した。次いで、その半分に、フェノール：クロロホルム＝１：１を添加し、サンプルを攪拌し、最大速度３’で遠心分離した。上層を新しい管に移し、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液及び１００％エタノールで沈殿させた。プラスミドを再溶出させ、５０ｕｌ反応体積中で４０ＵのＳｆｉｌ（ＮＥＢ）で５０℃で１時間消化した。選択した真核細胞発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４０μｇを並行して加工した。両方の反応を２％アガロースゲル上で分析し、次いで、混合物全体を１％アガロースゲル上で処理した。適切なバンドを切断し、ＱｉａｇｅｎからのＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてゲルから抽出した。キット中に含まれる１つのカラムの最大結合能力はＤＮＡ１０ｕｇであるため、消化されたｐＥＮＴＲ１１反応物を３つのフラクションに分け、別個に加工し、次いで再びプールした。サンプルのＯＤを測定し、適切な濃度の５’末端とのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いた結紮反応物を１６℃で４時間インキュベートした。結紮反応物４ｕｌを使用して上に記載されるようにＥ．ｃｏｌｉをトランスフェクトし、ここで、抗生物質はアンピシリン（１００ｕｇ／ｍｌ）のみであった。ＰＣＲスクリーニングを介してＣＡＲの存在について２０コロニーを分析した。この実験のために、テンプレートを含有しない以外は上述のＣＡＲのＰＣＲ増幅のために記載されるように、コロニー１個あたり１個の反応管を調製した。サイクル条件は上述のとおりであった。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で分析し、陽性のものは以下ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＣＡＲ２と称され、次の実験のために選択された。
【０１７９】
上に示されるような制限酵素を用いてこの手順をＶＬ−３Ｃ４について繰り返し、プラスミドをｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＶＬ−３Ｃ４と命名した。
【０１８０】
最終構築物を調製するために、ＶＨ−３Ｃ４を含有するＴＯＰＯ−ＴＡベクター４０ｕｇをＢａｍＨｌ及びＮｏｔｌで消化し、各ベクター４０ｕｇ（ｐＳｅｃＴａｇ２−ＣＡＲ２及びｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＶＬ−３Ｃ４）をそれぞれ以前に記載されるようにＮｏｔｌ及びＢａｍＨｌで消化し、ＶＨ−３Ｃ４を２つの遺伝子間に結紮することによって、直鎖化ｐＳｅｃＴａｇ２Ａベクターによって一方の端が隣接された中間体構築物を得た。この構築物をＸｈｏ１で消化し、ゲル精製し、上に記載されるように発現ベクターに結紮し、ｐＳｅｃＴａｇ２Ａ−ＣＡＲ２−Ｖｋ−３Ｃ４−ＶＬ−３Ｃ４と命名した。
【実施例１６】
【０１８１】
げっ歯類及びヒトサンプルにおけるＰａＣａ−Ａｇの可溶性形態の検出
無胸腺マウスにおいてｒａｓ−形質転換された亜系ＢＭＲＡ１．ＴＵＣ３細胞（ｎ＝３）の腹腔内（ｉ．ｐ．）インプラントから集めた腹水、及びこれらの細胞（ｎ＝２）をｓ．ｃ．で移植した無胸腺マウスにおいて形成された腹水は、分子量３６〜３８ｋＤａのＰａＣａ−Ａｇｌ：ｍＡｂ３Ｃ４−反応性タンパク質の可溶性形態を示した。対照的に、Ｐ３Ｕ−１マウス骨髄腫細胞のｉ．ｐ．移植によって誘発される対照腹水は、ｍＡｂ３Ｃ４−反応性タンパク質を含有していなかった。
【０１８２】
同様に、ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３をｓ．ｃ．で異種移植され、腫瘍が２５６〜１２２０ｍｇに成長したマウスからの血清及び腹水は、血清タンパク質が吸着される９６−ウェルプレートのウェルに対するｍＡｂ３Ｃ４の結合についての１−抗体抗原−吸着ＥＬＩＳＡによって陽性であることがわかった（図１７Ｃ）。１−抗体抗原−吸着ＥＬＩＳＡは、ウェル中に存在するＰａＣａ−Ａｇｌを見つけて結合するｍＡｂ３Ｃ４を使用し、第２のＨＲＰ（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）標識されたヒツジ抗マウスＩｇＧ（ＨＲＰ−Ｓ  ＩＭＩｇＧ）に結合した後、ＨＲＰ基質ＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）に結合し、ＯＤ４５０ｎｍで吸収を測定した。
【０１８３】
図１７Ａは、半純粋なＰａＣａ−ＡｇｌのｍＡｂ３Ｃ４濃度の滴定を示す。挿入物は、電気溶出されたＰａＣａ−Ａｇ（ｎ＝２）を示す。図１７Ｂにおいて、ＰａＣａＡｇｌは使用済の（１８時間）膵臓癌細胞（ＢＭＲＰＡ．ＮＮＫ）の細胞培地中に存在する（濃くはない）。赤色の四角は、可溶性のＰａＣａ−Ａｇｌ（ｎ＝２）による、吸着したＰａＣａ−Ａｇｌに対するｍＡｂ３Ｃ４結合の最大の半分の結合での有効な競合を示す。図１７Ｃは、膵臓癌腫ＢＭＲＰＡ．ＴＵＣ３細胞（ｎ＝５）を異種移植されたマウスの腹水におけるＰａＣａ−Ａｇｌの存在を示すが、Ｐ３Ｕ１移植後の対照腹水におけるＰａＣａ−Ａｇｌの存在は示さない（図示せず）（ｎ＝２）。図１７Ｄは、膵臓癌患者（ｎ＝１）の膵臓管汁（ＥＲＣＰ）におけるＰａＣａ−Ａｇｌを示す。対照ウェルのバックグラウンド測定値を引き算した。
【０１８４】
形質転換されたＢＭＲＰＡ１及びヒトＭｉａＰａｃａ−２細胞の組織培養液におけるＰａＣａ−Ａｇｌの測定可能な量の存在は、１−抗体抗原−吸着ＥＬＩＳＡによって示された（図１７Ｂ）。細胞生存度は９８％超であり、ＥＬＩＳＡの陽性が、生存細胞によるＰａＣａ−Ａｇｌ又はそのフラグメントの放出よりも細胞の分解によって生じるという可能性は非常に小さい。
【０１８５】
膵臓悪性線腫をもつ３人の患者由来の血清サンプルをｍＡｂ３Ｃ４に対する反応性についてウェスタンブロットによって試験した。３種全ての血清は、ｍＡｂ３Ｃ４に対する強固な反応性を示し、マウスの腹水において見出されるＰａＣａ−Ａｇｌの可溶性形態と本質的に同じ分子量（ＭＷ）であるＭＷ３６〜３８ｋＤａの単一タンパク質からなる（図１８，レーン２〜４）。健康なヒト対照由来の血清サンプルは、ｍＡｂ３Ｃ４と反応性を示さなかった。既知の膵臓悪性線腫を有する患者における視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）中に得た膵臓管分泌サンプルによってさらに、ｍＡｂ３Ｃ４と反応性のタンパク質の存在が明らかになった。このことは、１−抗体抗原−接着ＥＬＩＳＡを用いて示され：ＰａＣａ−Ａｇｌはウェル中に存在し、ＥＲＣＰ液中のタンパク質を規定の時間で吸着可能にする（図１７Ｄ）。
【実施例１７】
【０１８６】
ＰａＣａ−Ａｇｌの分離及び精製
他の発見と一致して、新生物的に形質転換されたラットＢＭＲＰＡ１細胞及びヒトＭＩＡＰａＣａ−２膵臓癌細胞の細胞フラクションにより、膜／可溶性フラクション中に排他的に見出されるＰａＣａ−Ａｇｌが、粒子状又は核フラクションにはないことがわかった。ＰａＣａ−Ａｇ−１はさらに、非変性電気泳動及び等電点ゲルにおいて、ｍＡｂ３Ｃ４を用いて同定された。電気的に溶出された４３．５ｋＤＰａＣａ−Ａｇｌは、さらに大きな分子サイズのタンパク質でもさらに小さな分子サイズのタンパク質でもなく、膵臓癌腫細胞におけるＰａＣａ−Ａｇｌ及び１−抗体（ｍＡｂ３Ｃ４）抗原（ＰａＣａ−Ａｇｌ）−吸着ＥＬＩＳＡにおける抗原タンパク質に結合するｍＡｂ３Ｃ４と有効に用量依存的に競合することが示された。これらの発見に基づいて、ヒトＭｉａＰａＣａ−２膵臓癌腫から誘導される細胞の血漿膜フラクション由来のＰａＣａ−Ａｇｌを免疫沈降させてもよく、ＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質を任意の汚染物から電気泳動的に分離してもよく、そのアミノ酸（ＡＡ）配列の質量分析的同定のために電気溶出させてもよい。
【０１８７】
方法：ＰａＣａ−Ａｇｌ−特異的なｍＡｂ３Ｃ４が入手可能なことにより、４３．５ｋＤａポリペプチドを単離するための直接的なアプローチとして、細胞溶解物由来のＰａＣＡ−Ａｇｌの免疫親和性抽出が容易になる。Ｍｉａ−ＰａＣａ−２細胞は、ＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質を単離するために使用されてもよい。これらのヒト膵臓癌腫から誘導される細胞は、げっ歯類膵臓癌腫細胞ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ及びＢＭＲＰＡ．ＴＵＣ３によって発現されるものよりも血漿膜において１０倍のＰａＣａ−Ａｇｌを発現する。細胞フラクション及び膜タンパク質の単離のための実際的な親和性アプローチのために、以前に（非特許文献９０）及び（非特許文献９１）によって記載された手順を使用してもよい。
【０１８８】
【非特許文献９０】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｃ，  ＲＡ  Ｎｅｗｍａｎ，  ＤＲ  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｕ  Ａｓｓｅｒ，  ＭＦ  Ｇｒｅａｖｅｓ．  Ａ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｍｕｎｏｍａｔｒｉｘ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２５７：１０７６６−  １０７６９，  １９８２
【非特許文献９１】Ｄｉｓｓｌｅｒ  Ｈ，  Ｆ  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，  ＭＦ  Ｒａｊｅｗｓｉｃｙ．  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｒａｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ  １３０ＲＢ１３−６  ｒｅｖｅａｌｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎ  ＰＣ−ｉ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７０：９８４９−９８５５，１９９５
【０１８９】
可溶化膜フラクション由来のＰａＣａ−Ａｇｌの免疫親和性抽出のための調製において、親和性精製されたｍＡｂ３Ｃ４  ４〜８ｍｇを、ホウ酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．２）中のジメチルピメルイミデート（ＤＭＰ，０．１Ｍ）の存在下でタンパク質Ｇビーズ１ｍｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に架橋してもよい（非特許文献９２）。ｍＡｂ３Ｃ４で誘導体化されたビーズのサンプルを不可逆的に結合する抗体についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析してもよい。使用準備のできたｍＡｂ３Ｃ４−タンパク質Ｇビーズを、使用直前に可溶化緩衝液（以下を参照）中の５０％懸濁物に再懸濁させてもよい。平らなタンパク質Ｇビーズを任意のｍＡｂの非存在下で並行して処理する。
【０１９０】
【非特許文献９２】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｃ，  ＲＡ  Ｎｅｗｍａｎ，  ＤＲ  Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，  Ｕ  Ａｓｓｅｒ，  ＭＦ  Ｇｒｅａｖｅｓ．  Ａ  ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｍｍｕｎｏｍａｔｒｉｘ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２５７：１０７６６−１０７６９，１９８２
【０１９１】
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２（約１０９細胞、３０〜４０の大きな組織培養フラスコ）の大量培養から、８０〜９０％密度での細胞を集め、洗浄し、２５０ｇずつペレット化し、均質化緩衝液［ＮａＰＯ４（０．０２Ｍ）（ｐＨ７．４）、ショ糖（０．２５Ｍ）、プロテアーゼインヒビターカクテル１：１００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中で再懸濁し（１０×細胞体積）、Ｏｍｎｉホモジナイザー（Ｏｍｎｉ）中で氷中３０，０００ｒｐｍで２分間均質化してもよい。均質物を遠心分離（１０００×ｇ）後（沈降物１＝Ｐ１、及び上清１＝Ｓ１）、Ｓ１を集め、可溶性タンパク質（Ｓ２）のフラクションからペレット（Ｐ２）（ＰａＣａ−Ａｇｌを含有する）における不溶性膜フラクションを分離するために１４０，０００×ｇで１時間超遠心分離してもよい。ＰａＣａ−Ａｇｌの免疫親和性抽出のために、ペレットを超遠心分離（３０，０００×ｇ、３０分）によって洗浄し、可溶化緩衝液［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．０４Ｍ）ｐＨ７．５、ＮａＣｌ（０．２Ｍ）、ＣａＣｌ２（０．００１Ｍ）、ＭｇＣｌ２（０．００１Ｍ）、ｎ−オクチル−ｂ−ｄ−グルコシド（０．０５Ｍ、デオキシコレート（０．１４％）、プロテアーゼインヒビターカクテル１：１００］中で直接再懸濁する。細胞均質化中に集めたステップＰ１、Ｓ１、Ｓ２及びＰ２からのタンパク質サンプル（０．０５ｍｇタンパク質）を、効果的な細胞フラクション化を示す異なるタンパク質パターンのために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非特許文献９３）によって試験することができる（非特許文献９４）。
【０１９２】
【非特許文献９３】Ｌａｅｍｍｌｉ，  ＨＵ．  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４．  Ｎａｔｕｒｅ  ２２７：６８０−６８５．１９７０．
【非特許文献９４】Ｂｅａｕｆａｙ  Ｈ，  Ａｍａｒ−Ｃｏｓｔｅｓｅｃ  Ａ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｌ  ６．  Ｅｄ．  Ｋｏｒｎ  ＥＤ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  １９７６．
【０１９３】
タンパク質は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（０．０４Ｍ、ｐＨ７．５）、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２（０．０１Ｍ）、ＭｇＣｌ２（０．００１Ｍ）、デオキシコレート（０．１４％）、及びプロテアーゼインヒビターカクテル中のｎ−オクチル−ｂ−ｄ−グルコシド（０．０５Ｍ）を含有する可溶化緩衝液を頻繁に攪拌しつつ１．５時間インキュベーションすることによって、膜から放出されてもよい。特定のタンパク質可溶化緩衝液の使用を決めるための予備試験により、ｎ−オクチル−ｂ−ｄ−グルコシドが、トリトンＸ−１００による同じ処理時間で放出される腫瘍細胞からのＰａＣａ−Ａｇｌの約２倍量を放出することが示された。１．５時間の放出時間の後、１００，０００×ｇで超遠心分離することによって、可溶化タンパク質を含有する可溶性フラクションを不溶性物質から分離することができる。回収されたタンパク質の量は、ＯＤ２８０ｎｍの読みによって測定するか、又は比色アッセイＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイを用いて測定する。少量の定量がＳＤＳ−ＰＡＧＥのために及びタンパク質含量の確認のためになされてもよく、ウェスタンブロットによるＰａＣａ−Ａｇｌの存在の確認のためになされてもよい。実際の抽出は、タンパク質抽出物０．２ｍｌに対してｍＡｂ−３Ｃ４  ０．０５ｍｌを添加し、１時間までインキュベーションを続けることによって行われてもよい。対照ビーズは、同量の細胞タンパク質とともに処理されてもよい。ビーズを可溶化緩衝液でさらに洗浄した後、結合したタンパク質を低ｐＨ放出緩衝液（グリシン０．０１Ｍ、ｐＨ２．８）でインキュベーションすることによって放出することができる。このとき、集めた各フラクションは正確な量の塩基性ホスフェート緩衝液（Ｎａ３ＨＰＯ４  ０．１Ｍ，ｐＨ１２）を添加することによってすぐに中和する必要がある。各サンプルのタンパク質含量が測定され、ＳＤＳ―ＰＡＧＥによってフラクション分析された後、銀染色及び／又はウェスタンブロットによって測定されてもよい。低ｐＨ放出の代替として、親和性結合したＰａＣａ−ＡｇｌをｐＨ１２で塩基性トリエタノールアミンによって放出することもできる（非特許文献９５）。
【０１９４】
【非特許文献９５】Ｄｉｓｓｌｅｒ  Ｈ，  Ｆ  Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，  ＭＦ  Ｒａｊｅｗｓｉｃｙ．  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｒａｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｇｐ  １３０ＲＢ１３−６  ｒｅｖｅａｌｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｕｒｉｎ  ＰＣ−ｉ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７０：９８４９−９８５５，１９９５．
【０１９５】
一旦ＰａＣａ−Ａｇｌが放出されると、減圧遠心分離によって濃縮することができ、その純度が質量分析によるＡＡ分析のために処理されるのに十分であることを確認するために、濃縮物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験することができる。タンパク質の純度がまだ低い場合、ＰａＣａ−Ａｇｌを２Ｄゲル分離によってさらに精製することができ、ここで、等電点による分離の別の工程が加えられる（非特許文献９６）。ゲル中のＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質スポットの位置は、６ッ組のゲルの１つについてｍＡｂ３Ｃ４を用いたウェスタンブロットによって同定してもよい。
【０１９６】
【非特許文献９６】Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ  ＰＨ．  Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｒｎ，２５０：４００７−４０２１（１９７５）．
【実施例１８】
【０１９７】
サンドイッチＥＬＩＳＡの開発
１−Ａｂ  Ａｇ−吸着アッセイと対照的に、２抗体すなわち「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡは、一度に精密に規定された条件下で、ＰａＣａ−Ａｇｌに特異的な公知の量のＡｂがウェル表面に結合する大量の９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートを可能にする。ウェルあたりの抗−ＰａＣａ−Ａｇｌ  Ａｂ結合量を測定することができるため、膵臓癌腫を有する患者の血清においてピコモル量のＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質の測定を可能にするＰａＣａ−Ａｇｌの反応条件を確立するために、精製されたＰａＣａ−Ａｇｌを用いて抗体ＰａＣａ−Ａｇｌ（捕捉Ａｂ）の最適量を滴定することができる。ＰａＣａ−Ａｇｌの「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡにおける測定を完全にするために、血清からＰａＣａ−Ａｇｌを捕捉するウェル中のＡｂがマウス由来ではなく別の種由来である場合、既存の十分に規定されたｍＡｂ３Ｃ４を第２のＨＲＰ−ＳａＭＩｇＧと組み合わせて使用することができる（非特許文献９７）（非特許文献９８）。
【０１９８】
【非特許文献９７】Ｉｔｏ  Ｏ，  Ｓａｋｏ  Ｙ，  Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｈ，  Ｍａｍｕｔｉ  Ｗ，  Ｎａａｙａ  Ｋ，  Ｎａｋａｏ  Ｍ，  Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｙ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｍｌ８−ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｎｄ  Ｅｍｌ８−ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｏｓｉｓ．  ＡｃｔａＴｒｏｐ  ８５：１７３−１８２，２００３．
【非特許文献９８】Ｐｌｅｓｔｅｄ  JＳ，  Ｃｏｕｌｌ  ＰＡ，  Ｇｉｄｎｅｙ  ＭＡ．（２００３）．ＥＬＩＳＡ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ７１：２４３−２６１．
【０１９９】
ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ及びＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞と反応するが、形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞とは反応しないさらなるハイブリドーマを、ウェスタンブロッティングによって精製されたＰａＣａ−Ａｇｌと反応性のｍＡｂの存在について分析してもよい（上記を参照）。次いで、ＰａＣａ−Ａｇｌと反応性として同定されたものをｍＡｂ３Ｃ４が結合するエピトープに対する可能な結合について試験してもよい。ウェスタンブロットにおけるＰａＣａ−Ａｇｌに対するｍＡｂ３Ｃ４を用いた新規に同定されたｍＡｂの競争アッセイは、ＰａＣａ−Ａｇｌに対するｍＡｂ３Ｃ４の結合を阻害するためにｍＡｂ３Ｃ４エピトープに対して直接又は十分に密接して結合するｍＡｂの同定を可能にする。これらのｍＡｂは、「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡアッセイにおいて有用ではない。ＰａＣａ−Ａｇｌに対するｍＡｂ３Ｃ４の結合と競争しないＭＡｂは、それらがｍＡｂ３Ｃ４とは異なるアイソタイプを有する場合、「サンドイッチ」アッセイのために潜在的に有用である（ＩｇＧｌ，κ）。新規なｍＡｂは、ＩｇＭ又はＩｇＡアイソタイプのいずれかを有するべきである。これは第２の（指示薬）Ａｂ  ＨＲＰ−ＳαＭｉｇＧと補足ｍＡｂ及びｍＡｂ３Ｃ４との交差反応性を避けるために必要である。第２のＨＲＰ−ＳαＭＩｇＧは、Ａｂを捕捉することによってＰａＣａ−Ａｇｌのウェルにおける遅延を示すアッセイの最終ステップにおいて結合したｍＡｂ３Ｃ４、すなわち、新規に同定されたＰａＣａ−Ａｇｌに対するｍＡｂを同定するために使用される。各９６−ウェルプレートは、陽性（精製ＰａＣａ−Ａｇｌ）及び（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）陰性反応及びバックグラウンド結合を同定するためにプレート全体に広がる対照ェルを含有してもよい。１セットの対照ェルを、完全なｍＡｂ３Ｃ４及びＨＲＰ−ＳαＭＩｇＧ及びＴＭＢで処理し、他の対照ェルを第２のＡｂ、ＨＲＰ−ＳαＭＩｇＧのみで処理してバックグラウンド測定を確立してもよい。患者サンプルをＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質保持のために１ウェルあたり０．０５〜０．１ｍｌの血清、腹水、ＥＲＣＰ液、又は尿を用いて３ッ組で試験してもよい。
【０２００】
第２のＨＲＰ−標識されたＡｂをアッセイ中で使用可能にするため、異なるアイソタイプ及びサブタイプのＰａＣａ−Ａｇｌに特異的なｍＡｂが同定できないことがあり得る。この場合には、商業的な企業がｍＡｂ３Ｃ４をＨＲＰに直接的に誘導体化してもよい。この様式では、捕捉されたＰａＣａ−Ａｇｌのウェル中での直接測定においてＨＲＰＡ−ｍＡｂ３Ｃ４を使用することができる。あるいは、ＦＩＴＣ−ｍＡｂ３Ｃ４はＰａＣＡ−Ａｇｌ−陽性の膵臓癌腫細胞の細胞表面に未標識のｍＡｂ３Ｃ４と同様に結合するため、蛍光に基づくアッセイにおけるＦＩＴＣ−ｍＡｂ３Ｃ４を使用してもよい。実際に、ＦＩＴＣ−ｍＡｂ３Ｃ４は、ＦＡＣＳによって確立するＰａＣａ−Ａｇｌ部位の定量に使用された（上記参照）。
【０２０１】
上に引用されるアプローチの代わりに、精製ＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質［キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に誘導体化、又は優先的には、免疫学的に不活性なキャリア、例えば、ＭＷ  Ｆｉｃｏｌｌ  ＭＷ４００，０００に誘導体化（非特許文献９９）を使用して別の動物（ウサギ、ヤギ）中でポリクローナルＰａＣａ−Ａｇｌ−特異的なＡｂｓ（ｐαＰａＣａ−ＡｇＡｂ）を生成してもよい。ｐαＰａＣａ−Ａｇｌ  Ａｂの使用は、ウェルに添加される血清タンパク質の混合物からＰａＣａ−Ａｇｌを保持するために組み合わせてもよい種々〜多くの抗−ＰａＣａ−Ａｇｌ  Ａｂｓにおいて、抗原−捕捉アッセイにおいて有利である場合がある。しかし、異なる動物におけるｐαＰａＣａ−Ａｇｌの調製において、動物のＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質に対する免疫応答によって低から高親和性ｐαＰａＣａ−Ａｇｌ  Ａｂｓへの再分布が生じる場合があることが指摘されるべきである。ｐαＰａＣａ−Ａｇｌ−ＩｇＧの精製は、この状況に影響を与えない。異なる動物から得られたｐαＰａＣａ−Ａｇｌ−ＩｇＧを用いて調製されたＰａＣａ−ＡｇｌのためのＥＬＩＳＡプレートは、同じサンプルについて異なる読みを与える場合がある。従って、ｐαＰａＣａ−Ａｇｌ  ＩｇＧでコーティングされたＥＬＩＳＡプレートの調製は、ｐαＰａＣａ−Ａｇｌ−ＩｇＧにおけるバッチ間の差異を較正するために厳しい質制御が必要となる。このような差異は、この研究のためにＥＬＩＳＡプレートを調整するために大量のｐαＰａＣａ−Ａｇｌ−ＩｇＧプールが生成される場合、減らすことができる。ｐαＰａＣａ−Ａｇｌ  Ａｂを用いた９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにおける陽性対照及び陰性対照の配置は、上述のものとほとんど同じである。ＭＡｂ３Ｃ４後にＨＲＰ−ＳαＭＩｇＧをＡｂとして使用して、陽性血清からＰａＣａ−Ａｇｌの残留を示す。
【０２０２】
【非特許文献９９】Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  ＣＨ，  Ｊ  Ｍｉｃｈｌ，  ＡＬ  ｄｅ  Ｗｅｃｋ．  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｈａｐｔｅｎ−ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  （Ｚｕｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｔａａｅｔ  ｖｏｎ  Ｈａｐｔｅｎ−Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｎ．  Ｅｕｒ  Ｉ  Ｉｎ３ｎｉｕｎｏｌ，１：９８−１０６，１９７１．
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】ＢＭＲＰＡ１細胞におけるＮＮＫによって誘発される形態変化の顕微鏡写真である。図１Ａは、未処理のＢＭＲＰＡ１細胞の正常な外観を示す。図１Ｂ〜１Ｆは、ＮＮＫでＢＭＲＰＡ１を１回１６時間処理した後の連続的な細胞パッセージ（１〜１２）を示す。
【図２】（２Ａ）ＩＳＨＩＰマウス血清を有する、（２Ｂ）３Ｃ４ハイブリドーマ使用済培地を有する、及び（２Ｃ）３Ｃ４ハイブリドーマ使用済培地を含む正常な形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞の、生きたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞を免疫蛍光（ＩＦ）染色した細胞顕微鏡写真である。ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞上での３Ｃ４−Ａｇの表面発現は、線形の環状蛍光画像において図２Ｂに明らかに現れており、ＭＲＰＡ１細胞は染色を完全に消している。
【図３】レーン１〜４は、腹水からＧ−タンパク質親和性精製したｍＡｂ３Ｃ４と共に処理した染色したＳＤＳ−ＰＡゲルの写真である。レーン１：ハイブリドーマを注射したマウスの腹水；レーン２：ＩｇＧがビーズから定量的に放出されている低ｐＨ溶出。レーン３は、レーン２の減少した約１６０ｋＤａタンパク質（ＩｇＧ）を示す。レーン１Ｂ及び２Ｂは、約１６０ｋＤａがＩｇＧであることを確認する、ＨＲＰ−ＳａＭ  ＩｇＧ及びＥＣＬ反応キットを用いた、レーン１及び２におけるＩｇＧのイムノブロット及び放射能写真（化学発光写真）を示す。
【図４】げっ歯類及びヒト膵臓癌腫細胞由来の細胞溶解タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥの後に、ｍＡｂ３Ｃ４でイムノブロットした、放射能写真である。
【図５−Ａ】ｍＡｂ３Ｃ４非存在下（レーン１）及びｍＡｂ３Ｃ４及びタンパク質Ｇビーズ存在下（レーン２）で処理した、ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞の銀染色した溶解物を示すゲル写真である。
【図５−Ｂ】図５Ａ（ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞）における溶解物からの免疫沈降物における３Ｃ４−Ａｇに関するイムノブロットである。（レーン１）ｍＡｂ３Ｃ４非存在下、ｍＡｂ３Ｃ４及びＨＲＰ−ＳａＭ  ＩｇＧを含むＩＢ；（レーン２）ｍＡｂ３Ｃ４存在下、ｍＡｂ３Ｃ４及びＨＲＰ−ＳａＭ  ＩｇＧを含むＩＢ、３Ｃ４−Ａｇを４３ｋＤポリペプチドとして同定；（レーン３）ｍＡｂ３Ｃ４存在下、ｍＡｂ３Ｃ４は含まないがＨＲＰ−ＳｏＭ  ＩｇＧを含むＩＢから得られた免疫沈降物。
【図６】６Ａ、６Ｃ、６Ｅ、６Ｇ、及び６ＩはｍＡｂ３Ｃ４で染色した生きたげっ歯類及びヒト膵臓癌腫細胞のフェーズコントラスト可視光顕微鏡写真である。    ６Ｂ、６Ｄ、６Ｆ、６Ｈ、及び６Ｊは同じものを処理したＵＶ光顕微鏡写真であり、膜蛍光を示す。図６Ａ及び６Ｂ：ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞；図６Ｃ及び６Ｄ：ＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞；図６Ｅ及び６Ｆ：ＣＡＰＡＮ−１細胞；図６Ｇ及び６Ｈ：ＣＡＰＡ２−２細胞；６Ｉ及び６Ｊは、ＢｘＰＣ３細胞である。６Ａ〜６Ｄは、げっ歯類膵臓癌腫細胞である。６Ｅ〜６Ｊはヒト膵臓癌腫細胞である。
【図７】形質転換されたげっ歯類及びヒトＰａＣａ細胞及び形質転換されていないげっ歯類及びヒトＰａＣａ細胞の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を示す。（Ａ）ＢＭＲＰＡｌ．Ｔｕｃ３；（Ｂ）ＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ；（Ｃ）ヒトＭＩＡＰａＣａ。左側のパネルは、ｍＡｂ３Ｃ４の結合について試験した細胞集合を同定する分布図である。右側パネルは、選択された細胞集合の蛍光強度を示す。標識されたピーク（１）は、ＦＩＴＣ−ＲｏＭＩｇＧのみ（一次抗体ではない）で細胞を処理することによるバックグラウンド蛍光を示し（バックグラウンド対照）；（２）は、ｍＡｂ３Ｃ４及びＦＩＴＣ−ＲｏＭＩｇＧと反応した細胞の蛍光を示す。
【図８】活性成分存在下でのＭａＢ３Ｃ４の細胞毒性を模式的に示す。Ｘ軸：ウサギ血清（相補型）希釈率；Ｙ軸：ｍＡｂ３Ｃ４及びウサギ相補体に暴露後の生存細胞の割合。各グループの第１の棒は、新鮮なウサギ血清（活性相補源）のみを用いて３７℃で４５分処理した細胞を示す。各グループの第２の棒はｍＡｂ３Ｃ４及び新鮮なウサギ血清（活性相補源）を用いて３７℃で４５分処理した細胞を示す。各グループの第３の棒は、ｍＡｂ３Ｃ４で処理した後、熱不活性化した（５６℃で３０〜４５分）ウサギ血清（不活性化相補体）で処理した細胞を表す。
【図９】９Ａ及び９ＢはｍＡｂ３Ｃ４を用いた組織抽出物のイムノブロットである；図９Ａ：ラット；図９Ｂ：ヒト。種々の組織（甲状腺、卵巣、脳、心臓、肺、肝臓、睾丸、図９Ａ）からの組織抽出物由来の減少したタンパク質、及びヒト腺房膵臓細胞、白血球血液細胞、及び腺管膵臓細胞を１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分離し、電気泳動的にニトロセルロースに移し、ｍＡｂ３Ｃ４存在下及び非存在下で処理した後、ＥＣＬ化学発光増殖を行った。ＭＩＡ−ＰａＣａ及びマウスＩｇＧを対照として供した。「＋」は、一次ｍＡｂと反応性であることを意味する。「−」は、一次ｍＡｂと反応性でないことを意味する。ＭＩＡ−ＰａＣａ及びマウスＩｇＧを陽性対照として供した。「＊」は、組織抽出物が溶解緩衝液を含有するトリトンＸ−１００の存在下でのＤｏｕｎｚｅ均質化によって得られたことを示す。「＃」は、組織抽出物が溶解緩衝液を含有するトリトンＸ−１００の存在下での高周波パルス音波処理によって得られたことを示す。
【図１０】ｍＡｂ３Ｃ４を用いた種々の癌性ヒト組織のイムノブロットの放射能写真を示す。
【図１１】サイズ及びｐＩに従って二次元ゲル（２Ｄ−ゲル）電気泳動によって分離し、銀染色によって同定したＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞溶解物のタンパク質のゲル写真である。
【図１２】図１１に記載されるような二次元ゲル（２Ｄ−ゲル）電気泳動によって分離し、電気泳動的にＰＶＤＦ膜に移し、ｍＡｂ３Ｃ４でブロットしたＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞溶解物のタンパク質の化学発光写真である。矢印は、３Ｃ４抗原の位置を示す。
【図１３】腫瘍増殖に対するｍＡｂＣ４のインビボ投与の効果を示すグラフである。
【図１４】１４Ａ〜１４ＦはｍＡｂ３４Ｃを用いた直接的な免疫蛍光染色を示すＵＶ光写真である；１４Ａは、げっ歯類の肝臓のＢＭＲＰＡ１．ＮＮＫ細胞であり；１４Ｂは、通常の形質転換されていないＢＭＲＰＡ１細胞であり；１４ＣはＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞であり；１４ＤはＣＡＰＡＮ−１であり；１４ＥはＣＡＰＡＮ−２であり；１４ＦはＢｘＰＣ３細胞であり；１４Ａ〜Ｃ（げっ歯類）及び１４Ｄ〜Ｆ（ヒト）膵臓癌腫細胞。これらの図は、膜に限定されたＰａＣａ−ＡＧＩ−ｍＡｂ３Ｃ４の複合体形成を明らかに示す。Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅは懸濁物中で染色した細胞であり；Ｃ、Ｆは接着性細胞である。
【図１５】１５Ａ及び１５ＢはＢＭＲＰＡ１．ＴＵＣ３細胞上でＰａＣａ−Ａｇｌに結合するｍＡｂ３４ＣのＦＡＣＳ分析である。（Ａ）トリプシン処理あり、及び（Ｂ）トリプシン処理なしのＴＵＣ３細胞。Ａにおける白色のピーク＝非特異的ＩｇＧ染色（バックグラウンド）。
【図１６】１６Ａ及び１６ＢはそれぞれＳＤＳ  ｐａｇｅゲル及びイムノブロットの写真であり、ＰａＣａ−Ａｇｌの酵素的脱グリコシル化によってポリペプチドの分子量が変化しないことを示す（図１６Ｂ）。図１６Ａは、フェチュイン（約５１ｋＤａ）の並行して行った脱グリコシル化により４３〜４５ｋＤａのさらに小さなポリペプチドを生じたことを示す対照であり、インキュベーション条件中のインタクトな酵素活性がＰａＣａ−Ａｇｌタンパク質の脱グリコシル化について並行して使用されたことを示す。
【図１７】１７Ａ〜１７ＤはＰａＣａ−Ａｇｌについての１抗体−抗原吸着ＥＬＩＳＡを示すグラフである。
【図１８】膵臓癌が確認された患者由来及び健康な志願者由来の血清タンパク質のｍＡＢ３Ｃ４を用いたイムノブロットである。レーン２、３、及び４は３人の膵臓癌患者の個々の血清サンプルを用いて行われた。これらのレーン中の矢印は、約３６〜３８ｋＤのポリペプチドとｍＡｂ３Ｃ４との反応生成物を指し示す。レーン５は、健康な志願者由来の血清サンプルを用いて行われた。レーン６は、健康な志願者と等量のレーン３の患者のＰａＣａ−Ａｇｌ陽性血清とを混合して行われた。レーン６中の矢印は、３６〜３８ｋＤの生成物を指し示す。
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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