(57)【要約】本発明は、キャリアおよび治療上有効な量の少なくとも１つの化学療法剤とともに生物治療的な内因性の、オピオイド増殖因子と呼ばれる、ペンタペプチドＭｅｔ−エンケファリンからなる動物またはヒトにおける新生物を処置するための薬学的組成物に関する。また、このような処置の必要な動物またはヒトにおいて新生物形成を処置する方法が提供され、この方法は、キャリアおよび治療上有効な量の少なくとも１つの新生物形成処置因子、例えば、化学療法剤または放射線とともにオピオイド増殖因子からなる治療上有効な量の薬学的組成物の動物またはヒトに対する投与を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療上有効な量の少なくとも１つの新生物形成処置因子、オピオイド増殖因子およびキャリアを含むオピオイド増殖因子レセプターによって特徴付けられる、動物またはヒトにおける新生物形成を処置するための薬学的組成物。
【請求項２】
前記新生物処置因子が、生物療法剤、化学療法剤、放射性医薬品または放射線療法のための薬剤を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記因子が、分裂抑制因子、代謝拮抗剤、ＤＮＡ架橋剤およびアルキル化剤からなる群より選択される、化学療法剤である、請求項１または２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記因子が、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファランカルムスチン（ＢＣＮＵ）ロムスチン（ＣＣＮＵ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン、メトトレキセート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、フルダラビンダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンプレドニゾン、デキサメタゾン、タモキシフェン、フルベストラント、アナストロゾール、レトロゾール、酢酸メゲステロール、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびトレチノインからなる群より選択される化学療法剤である、請求項１〜３のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項５】
静脈内投与のために処方され、かつオピオイド増殖因子を約２０〜１０００μｇ／ｋｇ体重の用量で送達し得る、請求項１〜４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
静脈内投与のために処方され、かつオピオイド増殖因子を約１００〜４００μｇ／ｋｇ体重の用量で送達し得る、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
化学療法剤を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物であって、該組成物は、静脈内投与のために処方され、かつ化学療法剤を約２０〜３０００ｍｇ／ｍ２の用量で送達し得る、薬学的組成物。
【請求項８】
静脈内投与のために処方され、かつ化学療法剤を約１００〜１０００ｍｇ／ｍ２の用量で送達し得る、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記新生物形成が、膵臓癌、扁平上皮細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、骨肉腫、関節の癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、白血病、肺癌、卵巣癌、消化管癌、カポジ肉腫、肝臓癌、咽頭癌および喉頭癌からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
オピオイド増殖因子レセプターによって特徴付けられる新生物形成を、このような処置の必要な動物またはヒトにおいて処置するための方法であって、少なくとも１つの新生物処置因子およびオピオイド増殖因子の治療上有効な量を該動物またはヒトに投与する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
前記新生物形成処置因子が、放射線療法のための因子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記新生物形成処置因子が生物治療的な因子である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記新生物形成処置因子が化学療法剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記新生物形成処置因子が放射性医薬品である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記新生物形成処置因子が、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチンおよび５−フルオロウラシルからなる群より選択される化学療法剤である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記オピオイド増殖因子が、１日あたり約２０〜１０００μｇ／ｋｇ体重で静脈内投与される、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記オピオイド増殖因子が、１日あたり約１００〜４００μｇ／ｋｇ体重で静脈内投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記新生物処置因子が、約１０〜６０分の期間にわたって、約２０〜３０００ｍｇ／ｍ２で静脈内投与される化学療法剤である、請求項１０、１３および１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記化学療法剤が、約１０〜６０分の期間にわたって、約１００〜１０００ｍｇ／ｍ２で静脈内投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記化学療法剤が、少なくとも３週間の期間にわたって、少なくとも週に１回投与される、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記オピオイド増殖因子が、新生物処置因子と同時に投与される、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記オピオイド増殖因子が、新生物処置因子と連続して投与される、請求項１０〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも１つの新生物処置因子またはオピオイド増殖因子が、移植された浸透圧ポンプによって、または経皮パッチによって、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に投与される、請求項１０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記新生物形成が、膵臓癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、骨肉腫または関節の癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、白血病、肺癌、卵巣癌、消化管癌、カポジ肉腫、肝臓癌、咽頭癌および喉頭癌からなる群より選択される、請求項１０〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
パクリタキセルとともに有効量のオピオイド増殖因子とを投与する工程を包含する、該パクリタキセルの毒性を軽減する方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの新生物処置因子の抗新生物効果を増大する方法であって、治療上有効な量のオピオイド増殖因子と組み合わせて該因子を新生物細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２７】
前記新生物処置因子が、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）からなる群より選択される化合物学療法剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組み合わせで観察された前記抗新生物の効果が、前記新生物形成処置因子単独の抗新生物効果よりも大きい、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
オピオイド増殖因子レセプターによって特徴付けられる新生物形成細胞を殺傷する方法であって、このような処置の必要な動物またはヒトにおいて、該動物またはヒトに対して、治療上有効な量の少なくとも１つの新生物形成処置因子およびオピオイド増殖因子を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記新生物細胞が、膵臓細胞または扁平上皮癌細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記新生物処置因子が、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）からなる群より選択される化学療法剤である、請求項２９または３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９条の下、２００４年２月２６日に出願された仮出願番号第６０／５４８／０２１号の優先権を主張し、この出願は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概して、新生物の処置における使用のための治療用処方物に関する。さらに詳細には、本発明は、新生物を処置するための化学療法剤および生物療法剤からなる薬学的処方物に関する。生物療法剤とともに、化学療法および／または放射線のような新生物処置因子を組み合わせた処方を投与することによって新生物を処置するための方法も開示される。
【背景技術】
【０００３】
（関連分野の説明）
癌は、米国における死亡の２番目の主要な原因であり、それを上回るのは心疾患しかない。アメリカ癌学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）によれば、約５５６，０００例のアメリカ人が、毎年癌によって死亡し、平均で毎日１，５００例を超える癌死となる（非特許文献１）。皮膚癌を含まない種々の癌のうち、肺癌が男性および女性の癌死の主要な原因であり；乳癌が女性の癌死の２番目に主要な原因であり；前立腺癌が男性の癌死の２番目に主要な原因であり、そして結腸直腸癌が、癌の３番目に高頻度に診断される形態である。
【０００４】
膵臓癌は、膵臓癌の全ての段階について診断から３〜５ヶ月未満という平均生存期間を有する最も致死的なヒトの癌である。（非特許文献２）。５年生存率は３％未満である。手術、放射線および化学療法の処置努力にかかわらず、生存率は、不変のままであった。（非特許文献２）膵臓癌の頻度は、米国ではわずか０．０１％であるが、膵臓癌は毎年３０，０００例を越える死亡に関連しており、これによって癌の死亡率に関して最も一般的となっている（非特許文献１）。症候性の患者のうち約８５〜９０％が、診断時点での局所浸潤または転移の結果として進行性の疾患を有しており、そしてこれらの個体についての予後は極めて不良である。（非特許文献１）。処置にはある程度の進歩が達成されており、これには、手術、化学療法、放射線療法、免疫療法およびホルモン療法が含まれるが、膵臓癌は、予防、診断、予後診断および治療に関して難解な課題のままである。
【０００５】
診断の時点で、膵臓の腫瘍の約２０％程度までが、外科手術によって取り除かれ得る（非特許文献３）。腫瘍が、膵臓に限定されるが取り除くことができない場合、放射線療法および化学療法の組み合わせが一般に行われる。腫瘍が他の器官、例えば肝臓に転移されている場合、通常は化学療法単独を用いる。標準的な化学療法はゲムシタビンであるが、他の薬物を用いてもよい。ゲムシタビンは本質的に、患者に対症的な改善しかもたらさない。
【０００６】
頭頸部の癌は世界で６番目にランクする癌であり、開発途上国では３番目に最も一般的な新生物である。米国では、気道消化器の癌の頻度は、毎年約４０，０００例の新規な症例に上り、毎年１１，０００を超える死亡者数が記録される（非特許文献１）。頭頸部の癌のうち９０％より多くが扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）であり、口腔および咽頭がＳＣＣＨＮの最も一般的な部位であり、次が喉頭である。外科手術、放射線療法および化学療法、ならびにそれらの組み合わせが、全て処置のために考慮される。不幸にも、２年以内のＳＣＣＨＮの再発の機会は５０％を超え、５年生存率は全ての部位および段階について約５０％である。さらに、ここ２５年間では、ＳＣＣＨＮを有する患者の５年生存率は、感知できるほど変化しなかった（非特許文献１）。
【０００７】
ペプチド増殖因子およびそれらのレセプターは、ＳＣＣＨＮおよび膵臓癌に、ならびに多数の他の癌に関与している（非特許文献４）。膵臓癌およびＳＣＣＨＮにおいて発現されることが見出されたペプチドのうちいくつかとしては、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、およびケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）が挙げられる。
【０００８】
ペプチドの一群である内因性オピオイドは、正常な、新生物の、再生中のおよび治癒中の組織の増殖において、ならびに原核生物および真核生物において重要であると考えられる（非特許文献５）。内因性のオピオイドペプチドであるＭｅｔ−エンケファリンは増殖過程に直接関与し、広範な細胞および組織において負の調節因子として機能する（非特許文献６）。このペプチドの機能（増殖）および分布（神経および非神経）を考慮して、このペプチドは、オピオイド増殖因子（ＯＧＦ）と命名されている。
【０００９】
癌の化学療法剤は、癌細胞への致死的な作用のために用いられる。不幸にも、このような薬物の２〜３しか、癌細胞と他の増殖性細胞との間を識別しない。化学療法は一般には、いくつかの因子の同時、または計画した順序での使用を要する。化学療法処置プロトコールにおいて２つ以上の因子を組み合わせることによって：（１）薬物の最高可能用量；（２）種々の機構によって作用する薬物；（３）種々の毒性を有する薬物；および（４）耐性の発達の軽減；が可能になる。
【００１０】
化学療法剤は主に、分裂またはＤＮＡ合成を受けている細胞に影響し、従って、緩徐に増殖する悪性細胞、例えば、肺癌または結腸直腸癌はしばしば、不応答性である。さらに、ほとんどの化学療法剤は狭い治療指数を有する。化学療法の最も有害な効果としては、嘔吐、口内炎および脱毛症が挙げられる。化学療法剤の毒性はしばしば、骨髄または検出から逃れる細胞（免疫抑制）、消化管（粘膜潰瘍）、皮膚および毛髪（皮膚炎および脱毛症）由来のような、この因子の毒性の影響に対して脆弱である、急速に増殖する細胞に対するその化学療法剤の影響の結果である。
【００１１】
多くの強力な細胞毒性因子が、細胞周期の特定の段階で作用し（細胞周期依存性）、そして分裂の過程の細胞に対してのみ活性を有し、従って、ＤＮＡ合成、転写または紡錘体機能のような過程に特異的に作用する。他の因子は細胞周期非依存性である。従って、細胞毒性処置に対する感受性は、細胞のライフサイクルの種々の段階で変化し得、細胞周期の特定の段階にある細胞のみが殺傷される。この細胞周期の特異性のせいで、細胞毒性因子での処置は、細胞が感受性の段階に入ることを可能にするように延長されるかまたは繰り返される必要がある。細胞周期に特異的でない因子は、細胞周期の任意の段階で作用し得る；しかし、細胞毒性効果はやはり、細胞増殖に依存する。従って、細胞毒性因子は、腫瘍細胞の一定の割合を殺傷し、この割合は、薬物処置の用量に対して比例する。
【００１２】
多数の新生物処置因子が現在使用されており、これには、任意の化学療法剤および生物療法剤、ならびに放射線療法が挙げられる。多くのタイプの化学療法因子があり、これにはアルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質、分裂抑制因子、コルチコステロイドホルモン、性ホルモン、免疫療法、またはその他、例えばＬアスパラギナーゼおよびトレチノインが挙げられる。いくつかを下記に簡略に考察している。
【００１３】
現在広範に用いられる化学療法剤はゲムシタビンである。ゲムシタビンは、代謝拮抗剤として公知の化学療法薬物の一般的な群に属しており、かつ放射線増感因子として機能する、ピリミジンアナログである。ゲムシタビンは、細胞周期特異性を示し、主にＤＮＡ合成を起こしている細胞、すなわちＳ期の細胞を殺傷し、そしてまたＧ１／Ｓ期の境界を通じて細胞の進行をブロックする。
【００１４】
ゲムシタビンは、限定はしないが膵臓および結腸直腸癌を含む、広範な腫瘍について承認された化学療法剤である。しかし、ゲムシタビンの効力は、わずかなものであり、平均余命は、特に膵臓癌患者についてはほとんど延びることはない。ゲムシタビン投与の副作用は、他の化学療法剤に比較して、比較的軽度であり、これは、感染のリスクの増大を伴う骨髄抑制、出血のリスクの増大を伴う血小板数の減少、悪心、嘔吐、肝機能血液検査の上昇および疲労からなる。しかし、ゲムシタビンは一般には、患者に対するその毒性の影響が少なく、従ってより良い生活の質に起因して他の治療に置き換わっている。
【００１５】
プラチンファミリーの化学療法剤は主に、シスプラチンおよびカルボプラチンからなる。シスプラチンは無機の白金錯体であり、鎖内および鎖間の架橋を形成することによってＤＮＡらせんを破壊する。しかし、シスプラチンはまた、他の組織の求核試薬と反応し、腎臓に対して、および第八脳神経（極度の悪心および嘔吐を生じる原因となる）に対して毒性の影響を生じる。他の副作用としては、腎臓毒性、耳鳴りにおよび聴覚喪失よって顕在化する聴器毒性、ならびに軽度から中度の骨髄抑制が挙げられる。カルボプラチンは、主に副作用に関してシスプラチンとは異なる。骨髄抑制は、カルボプラチンの用量依存性の毒性であり、シスプラチンに伴う腎臓、神経性または聴器毒性は極めて小さい。
【００１６】
パクリタキセルは、天然では、かなり毒性であるが、イチイに由来する物質であり、転移性の乳癌、転移性の卵巣癌およびカポジ肉腫の処置に適応される強力な抗微小管化学療法剤を生じるように化学的に変更されている。パクリタキセルはまた、ＳＣＣＨＮ、非小細胞肺癌、小細胞肺癌および膀胱癌を処置するために用いられている。パクリタキセル投与で通常遭遇する副作用としては、悪心および嘔吐、食欲減退、味覚の変化、細いかまたは脆弱な毛髪、２〜３日にわたる腕および脚の関節の疼痛、爪の色の変化および手またはつま先の刺痛が挙げられる。
【００１７】
化学療法剤、５フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、１９６０年代から種々の固形癌において用いられる主要な代謝拮抗剤の１つであった。５−ＦＵは、核酸の合成を妨害することによって細胞がＤＮＡおよびＲＮＡを作成することを防ぎ、これによって癌細胞の増殖を中断する。５−ＦＵは、乳癌、結腸癌、胃腸および頭頸部の癌のアジュバント処置において、単独でまたは併用して用いられる。５−ＦＵはまた、消化管、乳房、肝臓、泌尿生殖器系および膵臓のような、手術不能の悪性の新生物の緩和的な治療として用いられる。５−ＦＵは、多くの共通の副作用を有し、この副作用としては、感染および出血のリスクの増大を伴う骨髄抑制、皮膚および爪床の黒ずみ、悪心、嘔吐、口内または口唇上の痛み、毛髪の希薄化、下痢、もろい爪、日差しおよび乾燥に対する感受性の増大、鱗状の皮膚が挙げられる。
【非特許文献１】Ｊｅｍａｌ，Ａら、ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．，２００５年、５５：ｐ．１０〜３０
【非特許文献２】ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｃｌｉｎ，２００４年、５４：ｐ．８〜２０
【非特許文献３】Ｌａｎｃｅｔ  ２００４年、３６３：ｐ．１０４９〜５７
【非特許文献４】Ｓｕｇｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ら、Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．，１９９５年、１：ｐ．１７２〜１８８
【非特許文献５】Ｚａｇｏｎ，Ｉ．Ｓ．ら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：Ｓｔｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｐｌｏｔｎｉｋｏｆｆ  ＮＰら（編）．１９９９年、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ、ｐ．２４５〜２６０
【非特許文献６】Ｚａｇｏｎ，Ｉ．Ｓ．ら、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ．第１巻、Ｚａｇｏｎ，Ｉ．Ｓ．およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｐ．Ｊ．（編）、１９９３年、Ｃｈａｍｐａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．３９〜６２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
従って、有効性および生存率の向上とともに、化学療法剤が共通して遭遇する、付随する副作用および毒性の軽減を示す、種々のタイプの癌、詳細には膵臓癌およびＳＣＣＨＮを処置するための治療的な処方物が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、キャリアおよび治療上有効な量の少なくとも１つの新生物処置因子、例えば、化学療法剤または放射線療法（因子）、およびオピオイド増殖因子（ＯＧＦ）と呼ばれる、生物治療的な内因性のペンタペプチドであるＭｅｔ−エンケファリンからなる、動物またはヒトにおける新生物を処置するための癌治療の薬学的組成物および／または処置方法を初めて提供する。本明細書において用いる場合、癌治療性組成物とは、限定はしないが真の癌腫だけでなく他の癌、例えば肉腫、黒色腫なども含む全ての新生物の処置のための化学療法剤および生物療法剤の両方を含む組成物をいう。
【００２０】
本明細書において用いる場合、「ＯＧＦまたはＭｅｔ−エンケファリン」という用語は、本明細書において記載されるようにＯＧＦと同様の方式でＯＧＦレセプターと相互作用する能力を保持する、ＯＧＦまたはＭｅｔ−エンケファリンの全ての修飾、置換、短縮または誘導体を含むと解釈されるものとする。これはまた、ＯＧＦレセプターとの相互作用においてＯＧＦの生物学的活性を模倣する合成のまたは任意の他の化合物を包含する。
【００２１】
本発明はまた、新生物の処置の必要な動物またはヒトにおいてこのような処置をする方法を提供し、この方法は、治療上有効な量の各々の、少なくとも１つの新生物処置因子およびＯＧＦの動物またはヒトに対する投与を包含する。広範な種々の新生物処置因子は、代謝拮抗剤、シトシンアナログ、架橋剤などを含むＯＧＦと組み合わせて用いられる場合、有効であることが示されている。ＯＧＦの効果は、ＯＧＦｒを通じて媒介され、従って、任意の化学療法剤、または放射線療法を含む生物療法剤が同様の効果を有することが想定される。本発明に従って用いられ得る化学療法剤のいくつかの例としては、限定はしないが、新生物処置因子が挙げられ、これには、任意の化学療法剤および放射線療法を挙げることができる。多くのタイプの化学療法剤が存在し、そのいずれが、本発明に従って用いられてもよく、これには、限定はしないが、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、分裂抑制因子、コルチコステロイドホルモン、性ホルモン、免疫療法または他に例えば、Ｌ−アスパラギナーゼおよびトレチノインが挙げられる。
【００２２】
生物治療的ＯＧＦおよび新生物処置因子の組み合わせはほとんどの場合、少なくとも相加的であって、処置の毒性を軽減することを可能にする。なぜなら同様の結果をより低用量の新生物処置因子で達成できるからである。これは重要である。なぜならこれらの因子の多くが高度に毒性であって、できるだけ低用量で用いられなければならないからである。少なくとも１つのプロトコールでは、因子の相加的性質に加えて、毒性の軽減がみられた。この組み合わせの結果はしばしば相乗効果であり、すなわち、細胞における軽減は、その因子単独の各々の合計よりも大きい。ＯＧＦの効果は、ナロキソンによってブロックされ、このことは、ＯＧＦの効果がＯＧＦｒによって全体的に媒介されることを示す。
【００２３】
さらに別の実施形態では、ＯＧＦｒは、自殺タイプ（ｓｕｉｃｉｄｅ  ｔｙｐｅ）の処置プロトコールで腫瘍細胞に導入され得、ここで腫瘍または新生物細胞は、細胞へのさらなるＯＧＦｒレセプターの導入によって抗新生物処置に対して感作され、その結果ＯＧＦは、治療の効果を媒介することおよび増強することにおいて、できるだけ多くの細胞と相互作用し得る。
【００２４】
本発明の方法に従って処置され得る新生物としては、ＯＧＦｒを有する任意の新生物細胞が挙げられ、これには限定はしないが、膵臓癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、骨または関節の癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、白血病、肺癌、卵巣癌、消化管癌、カポジ肉腫、肝臓癌、咽頭癌または喉頭癌を挙げることができる。
【００２５】
この組成物によって、静脈内プロトコールで投与され得るＯＧＦの有効な治療量は、例えば、１日あたり約２０〜１０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１００〜４００μｇ／ｋｇ体重である。ＯＧＦは、投与経路に依存して、処置期間全体にわたって、１週に少なくとも１回、そして毎日できるだけ高頻度に複数回、投与されてもよい。ＯＧＦは、非毒性であり、そして本質的に任意の有効量に従って投与され得る。投与の様式、すなわち、静脈内、皮下などはまた、有効用量および薬物投与のタイムテーブルを変更してもよいが、これは慣用的な実験を通じて決定され得る。抗新生物の因子は、ＯＧＦの投与と連続してまたは同時に投与されてもよく、少なくとも１つの新生物処置因子が、動物またはヒトに対して、例えば、約２０〜３０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約１００〜１０００ｍｇ／ｍ２という治療上有効な量で、約１０〜６０分、そして好ましくは約３０分という期間にわたって、約３〜１０週間、好ましくは７週の間に週に少なくとも１回、投与される。１〜３週間、好ましくは１週間の休息後、化学療法剤は、約１０〜６０分、好ましくは約３０分という期間にわたって、約１〜５週間、好ましくは３週間にわたって、投与される。化学療法剤の投与は、２〜８週間ごとに、好ましくは４週間ごとに、疾患の進行または受容できない毒性の非存在下で繰り返されてもよい。皮下またはインプラントの送達も有効である。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、ＯＧＦは、約２０〜１０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１００〜４００μｇ／ｋｇ体重という有効用量で、放射線療法の経過の間、１週に少なくとも３回、好ましくは毎日投与される。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、ＯＧＦは、約２０〜１０００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは約１００〜４００μｇ／ｋｇ体重という有効用量で、放射線療法の経過の間、化学療法とともに、１週に少なくとも３回、好ましくは毎日投与される。
【００２８】
抗新生物因子（単数または複数）およびオピオイド増殖因子の投与経路としては、限定はしないが、非経口投与、すなわち、静脈内、筋肉内または腹腔内、皮下、移植された浸透圧ポンプまたは経皮パッチが挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、キャリアおよび治療上有効な量の少なくとも１つの化学療法剤およびオピオイド増殖因子（ＯＧＦ）と呼ばれる、生物治療的な内因性のペンタペプチドであるＭｅｔ−エンケファリンからなる、動物またはヒトにおける新生物を処置するための癌治療の薬学的組成物および方法を初めて提供する。
【００３０】
本発明はまた、新生物の処置の必要な動物またはヒトにおいてこのような処置をする方法を提供し、この方法は、少なくとも１つの新生物処置因子およびＯＧＦの各々の治療上有効な量の、この動物またはヒトに対する投与を包含する。新生物処置因子としては、任意の生物療法剤、放射性医薬品および化学療法剤、ならびに放射線療法を挙げることができる。多くのタイプの化学療法剤があり、そのいずれが本発明によって用いられてもよい。これらとしては、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、分裂抑制因子、コルチコステロイドホルモン、性ホルモン、免疫療法または他に例えば、Ｌ−アスパラギナーゼおよびトレチノインが挙げられる。生物療法剤の例としては、限定はしないが、インターフェロン、インターロイキン、腫瘍由来活性化細胞が挙げられる。ヨード１２５のような放射性核種も、ガンマ線またはｘ線による放射線療法と同様に妥当である。
【００３１】
化学療法のアルキル化剤は、ＤＮＡ上で直接作用して、癌細胞の増殖を妨げる。薬物のクラスとして、これらの因子は、期間に特異的ではない（言い換えれば、それらは、細胞サイクルの全ての段階で作用する）。これらの薬物は、慢性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、多発性骨髄腫、ならびに肺、乳房および卵巣の特定の癌に対して活性である。アルキル化剤の例としては、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、イホスファミド、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）およびメルファランが挙げられる。
【００３２】
ニトロソ尿素は、アルキル化剤と同様の様式で作用する。それらは、ＤＮＡ修復を補助する酵素を妨害する。これらの因子は、脳に対して移動し得、そのためそれらは、脳腫瘍、ならびに非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫および悪性黒色腫を処置するために用いられる。ニトロソ尿素の例としては、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）が挙げられる。
【００３３】
代謝拮抗剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡの増殖を妨害するクラスの薬物である。これらの因子は、Ｓ期の間に作用して、慢性白血病、ならびに、乳房、卵巣および消化管の腫瘍を処置するために用いられる。代謝拮抗剤の例としては、５−フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセート、ゲムシタビン、シタラビン（ａｒａ−Ｃ）、およびフルダラビンが挙げられる。
【００３４】
抗腫瘍抗生物質は、酵素および有糸分裂を停止すること、または細胞を囲む膜を変更することによってＤＮＡを妨害する。（それらは、感染を処置するために用いられる抗生物質と同じではない）。これらの因子は、細胞周期の全ての段階で作用する。従って、それらは、種々の癌に広範に用いられる。抗腫瘍抗生物質の例としては、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、およびミトキサントロンが挙げられる。
【００３５】
分裂抑制因子は、植物アルカロイドおよび天然の産物に由来する他の化合物である。それらは、有糸分裂を阻害するか、もしくは停止するか、または細胞の再生に必要なタンパク質を作成するための酵素を阻害し得る。これらは、細胞周期のＭ期の間に作用する。分裂抑制因子の例としては、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド（ＶＰ−１６）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられる。
【００３６】
ステロイドは、いくつかのタイプの癌（リンパ腫、白血病、および多発性骨髄腫）および他の疾病を処置するのに有用である天然のホルモンおよびホルモン様薬物である。これらの薬物を用いて癌細胞を殺傷するかまたはその増殖を遅らせる場合、それらは、化学療法薬物とみなされる。それらはしばしば、その有効性を増大するために他のタイプの化学療法薬物と組み合わされる。例としてはプレドニゾンおよびデキサメタゾンが挙げられる。
【００３７】
性ホルモンまたはホルモン様薬物は、雌性または雄性のホルモンの作用または産生を変更する。それらを用いて、身体のホルモンレベルに応答して通常増殖する、乳房、前立腺および子宮内膜（子宮の裏層）の癌の増殖を遅らせる。これらのホルモンは、標準的な化学療法薬物と同じ方法では作用しない。例としては、抗エストロゲン（タモキシフェン、フルベストラント）、アロマターゼインヒビター（アナストロゾール、レトロゾール）、プロゲスチン（酢酸メゲステロール）、抗アンドロゲン（ビカルタミド、フルタミド）、およびＬＨＲＨアゴニスト（ロイプロリド、ゴセレリン）が挙げられる。
【００３８】
いくつかの薬物を、癌を有する人に与えて、さらに効率的に認識して癌細胞を攻撃するようにそれらの免疫系を刺激する。これらの薬物によって、処置の固有の方法が得られ、これらの薬物は、しばしば「化学療法」とは別であるとみなされる。
【００３９】
いくつかの化学療法薬物は、わずかに異なる方法で作用して、他のいずれのカテゴリーにもあてはまらない。例としては、Ｌ−アスパラギナーゼおよびトレチノインのような薬物が挙げられる。
【００４０】
併用療法は、アルキル化剤、カルボプラチン、代謝拮抗剤５−ＦＵおよびゲムシタビン、ならびに分裂抑制因子であるパクリタキセルとともに本明細書において例示されている。
【００４１】
本発明の方法に従って処置され得る新生物形成としては、限定はしないが、膵臓癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌、乳癌、結腸直腸癌、腎臓癌、脳腫瘍、前立腺癌、膀胱癌、骨または関節の癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、多発性骨髄腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、白血病、肺癌、卵巣癌、消化管癌、カポジ肉腫、肝臓癌、咽頭癌および喉頭癌が挙げられる。
【００４２】
静脈内治療のための本発明の組成物および方法によって投与され得るＯＧＦの有効な治療量は、１日あたり体重１ｋｇあたり約２０〜１０００μｇ、好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり約１００〜４００μｇである。ＯＧＦは、処置期間全体にわたって、週に少なくとも３回、そして毎日１回程度の頻度で投与されてもよい。ＯＧＦは安全かつ非毒性であり、そして有効であるために必要な本質的に任意の量で投与されてもよい。投与経路（静脈内、皮下など）は、与えられ得る量に影響し得るが、これは全て慣用的な実験を通じて決定される。ＯＧＦの投与と連続してまたは同時に、少なくとも１つの化学療法剤が、約２０〜３０００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約１００〜１０００ｍｇ／ｍ２という治療上有効な量で、約１０〜６０分、そして好ましくは約３０分という期間にわたって、約３〜１０週間、好ましくは７週の間に週に少なくとも１回、動物またはヒトに投与される。１〜３週間、好ましくは１週間の休息後、化学療法剤は、約１０〜６０分、好ましくは約３０分という期間にわたって、約１〜５週間、好ましくは３週間にわたって、投与される。化学療法剤の投与は、２〜８週間ごとに、好ましくは４週間ごとに、疾患の進行または受容できない毒性の非存在下で繰り返されてもよい。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、ＯＧＦは、体重１ｋｇあたり約２０〜１０００μｇ、好ましくは体重１ｋｇあたり約１００〜４００μｇという有効用量で、放射線療法の経過の間、１週に少なくとも３回、好ましくは毎日投与される。化学療法剤（単数または複数）およびオピオイド増殖因子の投与経路としては、限定はしないが、非経口投与、すなわち、静脈内、筋肉内または腹腔内、皮下、移植された徐放性浸透圧ミニポンプまたは経皮パッチが挙げられる。
【００４４】
ＯＧＦペンタペプチドは、インビボおよびインビトロの両方で、そして正常な状態（例えば、恒常的発生）および異常な状態（例えば、癌、創傷治癒）下で、広範な細胞および組織において構成的に発現される自己分泌阻害性増殖因子である。インビトロでのＯＧＦの作用は、立体特異的、可逆性、非細胞毒性で、血清に非依存性であり、そして生理学的に関連の濃度で生じる。
【００４５】
詳細には、ヒト膵臓癌細胞株を用いて、ＯＧＦおよびゲムシタビンの組み合わせは、４８時間以内に細胞数をコントロールのレベルから２６％〜４６％減少させ、個々の化合物の阻害よりも大きい増殖阻害を生じた。ＯＧＦおよびゲムシタビンの組み合わせはまた、第二の膵臓癌細胞株の増殖を抑制した。インビボでは、ヌードマウスにおけるゲムシタビン治療へのＯＧＦの追加は、いずれかの化合物単独よりも腫瘍容積を減少させる。腫瘍重量および腫瘍容積は、ＯＧＦおよび／またはゲムシタビン群では４５日目にコントロールレベルから３６％〜８５％に低下し、ＯＧＦおよびゲムシタビンの組み合わせに曝露されたマウスの群では、ＯＧＦ単独またはゲムシタビン単独の群から６２％〜７７％という腫瘍サイズの減少があった。
【００４６】
ＯＧＦは、５−フルオロウラシルとの組み合わせでも、膵臓癌細胞株において、いずれかの因子単独より細胞増殖を抑制した。
【００４７】
同様の効果がまた、扁平上皮癌細胞株で観察された。いくつかの株でのパクリタキセルおよびＯＧＦの併用療法は、いずれかの化合物単独での細胞数減少よりも大きい細胞数の減少を生じた。腫瘍の容積および重量におけるインビボでの減少は、相乗作用的であって、ＯＧＦは、パクリタキセルの毒性を軽減して、その結果高い生存率が得られると考えられた。
【００４８】
カルボプラチンはまた、相加的な効果を生じて、扁平上皮癌細胞の数を１４〜２７％減少させた。
【００４９】
理解できるとおり、ＯＧＦと化学療法剤との併用療法によって、いずれかの化合物単独よりも細胞数の減少が大きいという利点は、しばしば相乗作用的であって、また化学療法剤の毒性を減少し得る。これは、多数の細胞株における少なくとも２つの極めて異なるタイプの癌細胞において、種々の化学療法剤でかつ、インビトロおよびインビボの両方でみられた。
【００５０】
いかなる特定の理論にも拘束されないが、ＯＧＦは、パクリタキセルのようないくつかの化学療法剤で遭遇する細胞毒性に対して防御的な効果を付与し得ると考えられる。
【００５１】
ＯＧＦおよびＯＧＦｒの両方は、げっ歯類およびヒトの舌、皮膚、消化管および角膜の上皮で検出されている。ＯＧＦおよびＯＧＦｒの両方は、外科的切除の時点で得られたヒト腫瘍に存在することが示されている。さらに、哺乳動物の舌、表皮、角膜および食道における上皮細胞のＤＮＡ合成は、ＯＧＦによって調節され、レセプター媒介性の様式でそのように調節されることが示されている。
【００５２】
ＯＧＦは、細胞数の減少に関連していることが見出されており、このことはＯＧＦの標的が細胞複製であることを示唆する。組織培養においてヒト膵臓癌細胞を用い、十分な量のＯＧＦを投与して、内因性ＯＧＦで生じるのとおそらく同様の応答を惹起することで、ＯＧＦは細胞蓄積を抑制して、ＯＧＦ曝露後２４時間以内にこの活性をあらわすことが確認されている。いかなる理論にも拘束されないが、ＯＧＦはＤＮＡ合成を有意に減少して、有糸分裂を抑制し、これによって細胞の世代を調節すると考えられる。
【００５３】
細胞周期は、５つの期からなる：前合成すなわちＧ１期；ＤＮＡの合成すなわちＳ期；合成後すなわちＧ２期（この段階は、２つの娘Ｇ１細胞に分裂するＤＮＡの二重の相補体を含む）；および有糸分裂すなわちＭ期。新規に分裂した細胞は、このサイクルに再度入ってもよいし、休止期すなわちＧ０期にいってもよい。ＯＧＦは、細胞周期の段階で細胞の割合を変更して、その結果、約２時間以内にＧ０／Ｇ１で細胞数の顕著な増大、そしてＳおよびＧ２／Ｍ期における細胞の代償性の減少があることが示されている。さらに、ＯＧＦは、Ｇ０／Ｇ１期の長さを劇的に増大させるようであり、これによって、観察される全細胞周期の倍加時間における顕著な増大が説明される。いかなる理論にも拘束されないが、放射線療法の前または間のいずれかにおけるＯＧＦでの処置は、ＯＧＦが細胞周期のＧ０／Ｇ１期（癌細胞が照射に対して最も脆弱である）で癌細胞を蓄積する能力を介して腫瘍細胞に対する照射の効果を感作させると考えられる。
【００５４】
ゲムシタビンは、放射線増感因子としても作用する代謝拮抗剤として公知の化学療法薬物の一般群に属するピリミジンアナログである。ゲムシタビンは、細胞周期特異性を示し、主にＤＮＡ合成を起こしている、すなわちＳ期の細胞を殺傷し、またＧ１／Ｓ期の境界を通じた細胞の進行をブロックする。ゲムシタビンは、活性なゲムシタビン二リン酸（ｄＦｄＣＤＰ）およびゲムシタビン三リン酸（ｄＦｄＣＴＰ）ヌクレオシドに対するヌクレオシドキナーゼによって細胞内で代謝される。ゲムシタビンの細胞毒性効果は、ＤＮＡ合成の阻害をもたらす、二リン酸および三リン酸のヌクレオシドの２つの作用の組み合わせに起因する。第一に、ゲムシタビン二リン酸は、ＤＮＡ合成のためのデオキシヌクレオシド三リン酸を生成する反応を触媒することを担うリボヌクレオチドリダクターゼを阻害する。ヌクレオシド二リン酸によるこの酵素の阻害は、ｄＣＴＰを含むデオキシヌクレオチドの濃度の減少を生じる。第二に、ゲムシタビン三リン酸は、ＤＮＡへの取り込みについてｄＣＴＰと競合する。ｄＣＴＰの細胞内濃度の減少（二リン酸の作用による）は、ＤＮＡへのゲムシタビン三リン酸の取り込みを増強する（自己増強）。ゲムシタビンヌクレオチドがＤＮＡに取り込まれた後、さらなるヌクレオチドが１つだけ、成長しているＤＮＡ鎖に付加される。この付加後、さらなるＤＮＡ合成の阻害が存在する。ＤＮＡポリメラーゼεは、ゲムシタビンヌクレオチドを除去して成長しているＤＮＡ鎖を修復することができない（マスクされた鎖終止）。リンパ芽球様細胞では、ゲムシタビンは、プログラムされた細胞死の特徴の１つである、ヌクレオソーム間のＤＮＡ断片化を誘発する。
【００５５】
パクリタキセルは、Ｔａｘｏｌ（タキソール）としても公知であって、Ｐａｃｉｆｉｃｙｅｗ（太平洋イチイ）の樹皮および葉に由来する（別の供給源は、ヨーロッパイチイの針状葉由来である）。パクリタキセルは、極めて脂溶性であり、調製後直ちに静脈内に投与しなければならない。パクリタキセルは、微小管の二量体のアセンブリを促進して、脱重合を防止することによって微小管を安定化する抗微小管剤である。この安定性によって、生命維持に重要な間期および有糸分裂細胞機能に必須である微小管網目状構造の正常な動的な再構築の阻害が生じる。さらに、パクリタキセルは、細胞周期全体を通じて、微小管の異常なアレイまたは「束（ｂｕｎｄｌｅｓ）」、および有糸分裂の間の微小管の複数の星状体を誘導する。パクリタキセルの副作用としては、一過性の除脈、末梢神経障害、悪心、嘔吐、下痢、好中球減少、血小板増加症、気管支痙攣、蕁麻疹、血管性浮腫、脱毛症および筋肉痛が挙げられる。デキサメタゾン、ジフェンヒドラミンおよびＨ２アンタゴニストの前投薬を用いて、過敏性の反応を軽減する。
【００５６】
カルボプラチンおよびシスプラチンは、鎖間および鎖内の架橋を形成することによってＤＮＡらせんを破壊する無機白金錯体である、化学療法剤のプラチンファミリーに属する。シスプラチンは詳細には、他の組織の求核試薬と反応し、これによって、腎臓、第八脳神経および強度の嘔吐に対して毒性に影響する。
【００５７】
カルボプラチンおよびシスプラチンの両方は、腎臓、肝臓、腸および精巣に濃縮されるが、それらは血液脳関門は越えない。それらは通常、転移した精巣、卵巣癌および進行した膀胱癌で他の因子とともに用いられる。シスプラチン投与には通常、副作用を伴い、これには、腎毒性、耳鳴りにおよび聴覚喪失よって顕在化する聴器毒性、顕著な悪心および嘔吐が挙げられる。さらに、軽度から中度の骨髄抑制が発症し得る。カルボプラチンは、主に副作用に関してシスプラチンとは異なる。なぜなら、骨髄抑制は、カルボプラチンの用量依存性の毒性であり、腎臓、神経性または聴器毒性は極めて小さいからである。
【００５８】
５−ＦＵは、単剤として、結腸および直腸の癌の処置において任意の他の単剤の活性よりも優れた活性を有する。５−ＦＵは主に、緩徐に増殖する固形腫瘍、例えば、乳房および消化管の癌に用いられる。しかし、平均の奏功率は依然として低く、２０％未満である。フルオロウラシルが、チミジル酸を合成するのに必須である酵素を不活性化し得るか、または複雑な経路内で作用する場合、不活性であるとして、フルオロウラシルは、５’−１リン酸ヌクレオチドに変換されなければならない。５−ＦＵは、ＲＮＡに組み込まれて、ＤＮＡ合成を阻害する。５−ＦＵは、種々の異なる代謝経路によって活性な５−フルオロ−デオキシウリジン一リン酸（ＦｄＵＭＰ）に変換される。この薬物は、チミジンの形成を、従ってＤＮＡの形成を減少させる酵素チミジル酸キナーゼを阻害することによって作用する。フルオロウラシルはＦｄＵＭＰとしてもＲＮＡに組み込まれ、ＲＮＡのフッ素化を生じる。
【００５９】
生存している細胞に対する５−ＦＵの効果は、増殖期における効果に主に限定される。しかし、Ｇ２期およびＳ期の細胞が最も影響されるが、任意の段階の細胞周期で影響され得る。５−ＦＵは主に肝臓で代謝され、尿中にそのまま現れる薬物はわずか１０％ある。５−ＦＵは、脳脊髄液に入り得る。細胞が５−ＦＵをその活性型に変換する能力を失うため、５−ＦＵに対する耐性が生じる。一般的な副作用はしばしば遅延型である。潰瘍になる口内炎は、毒性の早期の徴候であり、そして骨髄抑制（白血球減少）が一般に、治療の９日目〜１４日目に生じる。他の副作用としては、脱毛症、皮膚炎、および皮膚の萎縮が挙げられる。
【００６０】
いかなる特定の理論によっても拘束されることはないが、本発明の癌治療的組成物、すなわち、少なくとも１つの化学療法剤と生物療法剤ＯＧＦとの組み合わせは、化学療法剤の細胞毒性効果に対して細胞が脆弱であるＧ０／Ｇ１期においてＯＧＦが細胞を蓄積する能力によって、癌細胞増殖に強力な阻害性の影響を発揮し、これによって、化学療法剤によって殺傷される細胞の数を大きく増強する。従って、ＯＧＦの存在なしに生じる増殖阻害よりも有意に大きい増殖阻害を生じるためには、有効量が少なくなった化学療法剤が必要である。
【００６１】
以下の非限定的な実施例は、ヒト扁平上皮癌細胞株（ＳＣＣ−１細胞株）、およびヒト膵臓癌細胞株（ＭｉａＰａＣａ−２細胞株）に対する、ゲムシタビン、パクリタキセル、カルボプラチンおよび５−ＦＵと組み合わせたＯＧＦ投与の効果を詳細に記載する。
【実施例】
【００６２】
（実施例１−ＳＣＣ−１細胞株に対する併用療法）
（１．ＳＣＣ−１細胞株の増殖曲線）
時間に対してプロットした、細胞増殖アッセイから４５０ｎｍでとった吸光度によって呈示される細胞増殖を、ＳＣＣ−１またはＭｉａＰａＣａ−２細胞に対する種々の薬物の効果を提示するために標準的な形式とした。標準的なＭＴＴアッセイを用いて細胞をカウントした。一般には、各々のデータポイントは、１処置あたり１０ウェルからとった平均の吸光度に相当し；誤差指示線はＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【００６３】
（ａ．パクリタキセル処置）
図１および表１に図示される結果は、ＳＣＣ−１細胞に対するパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）および／またはＯＧＦの添加を試験する。４日の増殖曲線を通じて、統計的分析（ＡＮＯＶＡ）によって、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）単独で、４８時間、７２時間および９６時間で、増殖が阻害されたことが明らかになり、それぞれ細胞数がコントロールのレベルから１１．９％、６．７％および１２．７％減少していた。パクリタキセルは、１０−７Ｍの濃度で、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で、細胞増殖を阻害して、それぞれ細胞数がコントロールから１４．２％、３４．４％、５８％および７０％減少していた。パクリタキセルは、１０−８の濃度でまた、７２時間および９６時間で、増殖を阻害し、それぞれコントロールに対する細胞数の減少は１４．１％および１９．３％であった。パクリタキセル１０−７をＯＧＦの１０−６Ｍと組み合わせた場合、増殖阻害は、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で観察され、それぞれ、１３．５％、５２．６％、６８．４％および７８．４％というコントロールに対する細胞数の減少が生じた。パクリタキセル１０−８ＭをＯＧＦの１０−６Ｍと組み合わせた場合、細胞増殖阻害は、４８時間、７２時間および９６時間で観察され、それぞれ、１３．６％、３０．６％、および３６．３％というコントロールに対する細胞数の減少をともなった。パクリタキセル１０−７Ｍと組み合わせたＯＧＦは、（２４時間でのパクリタキセル１０−７Ｍに加え）全ての時点でいずれかの薬物単独よりも有意に阻害性であって、１０．１〜７５．３％におよぶ細胞数の減少をともなった。パクリタキセル１０−８Ｍと組み合わせたＯＧＦは、４８時間、７２時間および９６時間で、いずれかの薬物単独よりも有意に阻害性であって、１０．４〜２７．１％におよぶ細胞数の減少をともなった。
【００６４】
（ｂ．カルボプラチン処置）
図２および表２に図示される結果は、ＳＣＣ−１細胞に対するカルボプラチンおよび／またはＯＧＦの添加を試験する。４日の増殖曲線を通じて、統計的分析（ＡＮＯＶＡ）によって、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）単独で、４８時間、７２時間および９６時間で、増殖が阻害されたことが明らかになり、ここではそれぞれ８．２％、８．４％および９．７％というコントロールに対する細胞数の減少を伴った。カルボプラチンは、１０−６Ｍの濃度で、４８時間、７２時間および９６時間で、細胞増殖を阻害して、それぞれ細胞数をコントロールに対して５．３％、２１．８％および２４．９％減少させた。カルボプラチンは、１０−７Ｍの濃度でまた、７２時間および９６時間で増殖を阻害し、それぞれコントロールに対して１８．７％および２１％細胞数を減少させた。カルボプラチン１０−６ＭをＯＧＦの１０−６Ｍと組み合わせた場合、増殖阻害は、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で観察され、それぞれ、１０．３％、１７．５％、３２．２％および３３．３％というコントロールに対する細胞数の減少が生じた。カルボプラチン１０−７ＭをＯＧＦの１０−６Ｍと組み合わせた場合、細胞増殖阻害は、４８時間、７２時間および９６時間で観察され、それぞれ、１４．１％、２６．３％、および２７．１％というコントロールに対する細胞数の減少をともなった。カルボプラチン１０−６Ｍと組み合わせたＯＧＦは、４８時間、７２時間および９６時間の時点で、いずれかの薬物単独よりも有意に阻害性であって、３．１〜２３．６％におよぶ細胞数の減少をともなった。カルボプラチン１０−７Ｍと組み合わせたＯＧＦは、４８時間、７２時間および９６時間で、ＯＧＦ単独よりも、４８時間、および７２時間で、カルボプラチン１０−６Ｍよりも、そして４８時間、および７２時間で、カルボプラチン１０−７Ｍよりも有意に阻害性であって、１０．４〜２７．１％におよぶ細胞数の減少をともなった（表２）。
【００６５】
（ｃ．体重、寿命および全体的観察）
トライアルの開始時点で、全てのマウスは約２２〜２４グラムと秤量され、マウスは５日ごとにほぼ２〜４グラム増量した。しかし、実験の２０日目までに、パクリタキセルのマウスは、体重が減少し始め、コントロールよりも１１％の重量減少であった（ｐ＜０．０５）。終了日またはマウスの死亡日まで（図５の生存曲線を参照のこと）、パクリタキセル群内では継続した体重減少が観察され、５０日目にはマウスはコントロール、ＯＧＦおよびパクリタキセル／ＯＧＦ処置マウスよりも２８％（ｐ＜０．００１）体重が減少した（図４を参照のこと）。
【００６６】
パクリタキセル群のマウスは、１９日目に死に始めた（図５を参照のこと）。４０日目までに、パクリタキセル処置マウスのうち７５％が死亡して、パクリタキセル／ＯＧＦ群を含むいずれの他の処置群でも死んだマウスはいなかった。終了日に、１匹のマウスのみ（この群の８％）が依然として生存していた。パクリタキセルマウスの平均寿命は、３４．３±３．１日で、これは全ての他の処置群と有意に（ｐ＜０．００１）異なった。パクリタキセル／ＯＧＦ群の１匹のマウスが４０日目に死んだが、残りの全てのマウスは終了日まで生存していた。
【００６７】
パクリタキセルのマウスが早期に死亡したため、器官を回収して、組織学的分析のためにホルマリン中で固定した。分析の際、早期の死亡は、巨大結腸症に関連する腹部の膨張に起因し得ることが観察された。大腸、盲腸および小腸は全て、硬くなった便で完全に詰まっていた。全ての他の器官系は正常と思われた。
【００６８】
（実施例２−ＳＣＣ−１腫瘍の出現および増殖）
ＳＣＣ−１細胞を注射された全てのマウスが腫瘍を発症した。腫瘍細胞接種後１３日目に、マウスの７５％、パクリタキセル処置マウスの６６％、およびパクリタキセル／ＯＧＦ処置マウスの５８％が腫瘍を有した。可視の腫瘍に対する潜伏期間を試験する場合、コントロールのマウスは、腫瘍細胞の接種の７日以内に、可視であるが、測定不能な腫瘍を発症した。パクリタキセルおよびパクリタキセル／ＯＧＦマウスはまた、同じ１週間の時間枠内に可視の腫瘍を発症したが、ＯＧＦマウスは１１日以内に腫瘍を発症し、このことは、可視の腫瘍発症ではほぼ４日の遅延を示す（ｐ＜０．０５）。測定可能な（６２．５ｍｍ３）腫瘍についての潜伏期間は、可視の腫瘍についての潜伏期間と類似のパターンを示し、このパターンでは、コントロール、パクリタキセルおよびパクリタキセル／ＯＧＦ群は、腫瘍細胞接種の２週間以内に測定可能な腫瘍を有し、一方ＯＧＦ群は、１７日以内に測定可能な腫瘍を発症したが、この相違はコントロール値から有意ではなかった。
【００６９】
腫瘍の寸法は、腫瘍が測定可能であるとみなされた日に開始して毎日記録した。これらを、各々のマウスが３６日の経過にわたって測定可能な腫瘍を有した初日に開始して、測定の２日連続する日ごとにプロットした（図３）。
【００７０】
各々のマウスが３６日の経過にわたって測定可能な腫瘍を有した初日に開始して、２連続日ごとの測定値をプロットしたデータを用いて（図３）、測定可能な腫瘍の出現の第二の時点（測定可能な腫瘍の４日目）、ＯＨＧＦおよびパクリタキセル／ＯＧＦマウスの両方とも、それぞれ、２６％および２９％の減少という、コントロールのマウスよりも有意に（ｐ＜０．０５）小さい腫瘍を有した。３番目の時点では、３つの処置群全てが有した平均腫瘍容積は、コントロールよりも２９％〜３３％有意に小さかった。８〜１０の時点で、パクリタキセル／ＯＧＦマウスは、単独の処置を受けている群の腫瘍サイズより有意に小さい腫瘍を有した。このトライアルの終わりを通じて１１の時点から（図３を参照のこと）、パクリタキセル／ＯＧＦマウスは、コントロールマウスおよびＯＧＦマウスの両方より有意に小さい腫瘍容積を示したが、パクリタキセルのマウスに対する比較では、パクリタキセル群のマウスがほぼこの時点で死に始めたという事実のせいで有意差は明らかでなかった。パクリタキセルマウスの死によって統計学的分析が困難になった。ある場合には、マウスは、化学療法に共通した副作用を示し始め、そして腫瘍サイズはしばしば減少した。従って、パクリタキセルおよびパクリタキセル／ＯＧＦマウスを比較する腫瘍測定値はしばしば、死亡前の腫瘍サイズの減少、およびパクリタキセル群のＮ数の減少の両方に起因して、有意ではなかった。
【００７１】
（実施例３−ＭｉａＰａＣａ−２細胞株に対する併用療法）
図７に例示される結果は、ＭｉａＰａＣａ−２細胞に対する５−ＦＵおよび／またはＯＧＦの添加を試験する。４日の処置期間を通じて、統計的分析（ＡＮＯＶＡ）によって、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）単独で、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で、増殖が有意に阻害されたことが明らかになり、それぞれ７．１％、７．０％、６．９％および１４．２％というコントロールからの細胞数の減少を伴った。５−ＦＵは、１０−５Ｍの濃度で、４８時間、７２時間および９６時間で、細胞増殖を阻害して、コントロールに対してそれぞれ細胞数が２６．０％、３０．１％および３６．４％減少していた。５−ＦＵは、１０−６Ｍの濃度でまた、４８時間、７２時間および９６時間で、増殖を阻害し、それぞれコントロールに対して１２．７％、１０．８％および１５．２％細胞数が減少していた。５−ＦＵ（１０−５Ｍ）をＯＧＦ（１０−６Ｍ）と組み合わせた場合、増殖阻害は、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で観察され、それぞれ、２１．５％、３５．７％、３９．７％および４７．４％という滅菌水処置したコントロールからの細胞数の減少を生じた。５−ＦＵ（１０−６Ｍ）をＯＧＦ（１０−６Ｍ）と組み合わせた場合、細胞増殖阻害は、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で観察され、それぞれ、１３．２％、２２．２％、２３．６％および３０．３％というコントロールからの細胞数の減少をともなった。１０−５Ｍの５−ＦＵと組み合わせたＯＧＦは、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間の時点でいずれかの薬物単独よりも有意に阻害性であって、１５．５〜３８．７％におよぶ細胞数の減少をともなった。
【００７２】
（実施例４−ゲミシタビンおよびＯＧＦの細胞周期分析）
ゲムシタビンおよび／またはＯＧＦが、それらの効果を発揮する正確な細胞周期の相を検討するために、フローサイトメトリーを行った。ＯＧＦは、細胞周期のＧ０／Ｇ１期への有意な増大を示さなかったが、この相では細胞の割合のわずかな増大が、ＯＧＦ曝露後２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２０時間および２４時間で観察された。ゲムシタビンは、Ｇ１／Ｓ期を変更することが公知であり、この補充は、ゲムシタビンまたはゲムシタビン／ＯＧＦのいずれかでの処置後６時間程度の早期に観察され得る。細胞周期のＧ２／Ｍ期における細胞の割合の減少は、ゲムシタビンのみで処置された細胞に比較してゲムシタビン／ＯＧＦで処置した細胞で観察され、これによって、さらに多くの細胞が併用療法を用いてＧ１Ｓ中で行き止ったことが示される。ゲムシタビンでの処置の４８時間および１２０時間には、Ｇ１補充は、強力なままであって、４８時間および１２０時間のゲムシタビン／ＯＧＦ処置でＧ１中にそれぞれ細胞の７３．５０％および６０．７５％が残り、細胞周期のＧ１期には細胞の７４．０３％および６０．１５％が停止した。
【００７３】
（実施例５−ヌードマウスモデルにおけるインビボでのＯＧＦ／ゲムシタビン処置）
インビボにおける併用したＯＧＦ／ゲムシタビン処置の有効性を試験するため、無胸腺ヌードマウスモデルを用いた。ＯＧＦの処置（１０ｍｇ／ｋｇ毎日）、ゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ、３日ごと）、およびゲムシタビン（１２０ｍｇ／ｋｇ、３日ごと）／ＯＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ毎日）を用いて、１×１０６ＭｉａＰａＣａ−２細胞を接種したマウスを処置した。
【００７４】
（ａ．ＭｉａＰａＣａ−２腫瘍の発現および増殖）
ＭｉａＰａＣａ−２細胞を注射された全てのマウスが腫瘍を発症した。腫瘍細胞接種後１６日目に、コントロールの生理食塩水処置群およびＯＧＦ群における全てのマウスが腫瘍を有したが、ゲムシタビン処置したマウスのうち７５％、およびゲムシタビン／ＯＧＦ（ｐ＜０．０００１）処置したマウスのうち０％が腫瘍を有した（図８を参照のこと）。可視の腫瘍に対する潜伏期間を試験する場合、コントロールのマウスは、腫瘍細胞の接種の１０日以内に、可視であるが、測定不能な腫瘍を発症した。ＯＧＦのマウスおよびゲムシタビンのマウスはまた、同じ１０日の時間枠内に腫瘍を発症したが、ゲムシタビン／ＯＧＦマウスは、１６日以内に腫瘍を発症し、このことは、可視の腫瘍発症ではほぼ６日の遅延を示す（ｐ＜０．０５）。測定可能な（６２．５ｍｍ３）腫瘍についての潜伏期間は、可視の腫瘍についての潜伏期間と類似のパターンを示した。コントロール、ＯＧＦおよびゲムシタビン群は、腫瘍細胞接種の２週間以内に測定可能な腫瘍を有し、一方ゲムシタビン／ＯＧＦ群は、２０日以内に測定可能な腫瘍を発症した（ｐ＜０．０５）。腫瘍の寸法は、腫瘍が測定可能であるとみなされた日に開始して毎日記録して、データを、各々のマウスが３１日の経過にわたって測定可能な腫瘍を有した初日に開始して、測定の２日連続する日ごとにプロットした。
【００７５】
測定可能な腫瘍の出現の第６の時点（測定可能な腫瘍の発生の１２日目）から、各々のマウスが３６日の経過にわたって測定可能な腫瘍を有した初日に開始して、２連続日ごとの測定値をプロットしたデータを用いて（図８）、ＯＧＦマウスは、それぞれ、２９．９〜４０．７％の減少という、コントロールのマウスよりも有意に（ｐ＜０．０１、時点７、９、および１６、ｐ＜０．００１、時点８、そしてｐ＜０．０５、残り全て）小さい腫瘍を有した。４番目の時点で開始して、３つの処置群全てで有した腫瘍は、コントロールの腫瘍よりも有意に小さかった。３、９、１０および１１に加えたあらゆる時点で、ゲムシタビン／ＯＧＦマウスは、ＯＧＦ群における腫瘍サイズよりも有意に小さい腫瘍を有した。１、４、１４、１５および１６の時点で、ゲムシタビン／ＯＧＦマウスは、ゲムシタビン単独のマウスよりも有する腫瘍が有意に小さかった。ゲムシタビンのみを投与されているマウスの腫瘍容積は、時点４、５および６で、ＯＧＦを受けているマウスの腫瘍容積とは有意に異なった。ＡＮＯＶＡによって、上述以外には、ゲムシタビン対ゲムシタビン／ＯＧＦの間に多くの有意差は明らかにならなかったが、ゲムシタビン／ＯＧＦ腫瘍の容積は、ＡＮＯＶＡにより有意とみなされた時点で２９．８〜５６．９％小さかった。
【００７６】
（実施例６−ゲムシタビン増殖曲線−細胞カウント）
ＭｉａＰａＣａ−２細胞の増殖に対するゲムシタビンおよび／またはＯＧＦの効果のさらなる検討を、正確な細胞カウントを行うことによって探究した。図９は、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）単独が、４８時間、７２時間および９６時間で増殖を阻害し、それぞれ１５．５％、１７．６％および１６．７％というコントロールからの細胞数の減少を伴っていたことを図示する。ゲムシタビンは、１０−７Ｍの濃度で、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間で、細胞増殖を阻害して、ここでは、コントロールに対してそれぞれ細胞数が３０．１％、４６．４％、４７．４％および６４．２％減少していた。ゲムシタビンは、１０−８Ｍの濃度でまた、４８時間、７２時間および９６時間で、増殖を阻害し、それぞれコントロールに対して細胞数が２１．７％、２１．２％および３２．４％減少していた。ゲムシタビン（１０−８Ｍ）をＯＧＦ（１０−６Ｍ）と組み合わせた場合、増殖阻害は、４８時間、７２時間および９６時間で観察され、それぞれ、２６．３％、４９．２％、および４５．９％という細胞数の減少を生じていた。ＯＧＦ（１０−６Ｍ）と組み合わせた場合のゲムシタビン（１０−８Ｍ）は、ＯＧＦ単独よりも７２時間および９６時間で、そしてゲムシタビン（１０−８Ｍ）単独よりも７２時間および９６時間で有意に阻害性であった（表５を参照のこと）。
【００７７】
表１は、９６時間のトライアルにわたり、パクリタキセルおよび／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ（Ｂ）、パクリタキセル１０−７Ｍ（Ｃ）およびパクリタキセル１０−８Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値を示す。
【００７８】
表２は、９６時間のトライアルにわたり、カルボプラチン（Ｃａｒｂ）および／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ（Ｂ）、カルボプラチン１０−６Ｍ（Ｃ）およびカルボプラチン１０−７Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値を示す。
【００７９】
表３は、９６時間のトライアルにわたり、ゲムシタビンおよび／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、１０−６ＭのＯＧＦ（Ｂ）、ゲムシタビン１０−７Ｍ（Ｃ）およびゲムシタビン１０−８Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値を示す。
【００８０】
表４は、９６時間のトライアルにわたり、５−ＦＵおよび／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ（Ｂ）、１０−５Ｍの５−ＦＵ（Ｃ）または１０−６Ｍの５−ＦＵ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値を示す。
【００８１】
表５は、９６時間のトライアルにわたり、ゲムシタビンおよび／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ（Ｂ）、ゲムシタビン１０−７Ｍ（Ｃ）およびゲムシタビン１０−８Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値を示す。
【００８２】
（表１．９６時間のトライアルにわたり、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ［Ｔａｘ］）および／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ（Ｂ）、パクリタキセル１０−７Ｍ（Ｃ）およびパクリタキセル１０−８Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値）
【００８３】
【表１】
2007525507.tif 000002
コントロールからの有意性、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、そしてｐ＜０．０５（＊）。
ＯＧＦからの有意性、ｐ＜０．００１（＋＋＋）、ｐ＜０．０１（＋＋）、そしてｐ＜０．０５（＋）。
Ｔａｘｏｌ  １０−７Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）、ｐ＜０．０１（ΛΛ）、ｐ＜０．０５（Λ）。
Ｔａｘｏｌ  １０−８Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（＃＃＃）、ｐ＜０．０１（＃＃）、ｐ＜０．０５（＃）。
ａは、Ｔａｘｏｌ  １０−８ＭおよびＴａｘｏｌ  １０−８Ｍ／ＯＧＦが、Ｔａｘｏｌ  １０−７Ｍよりもこれらの時点で阻害性が有意に小さかった（ｐ＜０．００１）ことを示す。
【００８４】
（表２．９６時間のトライアルにわたる、カルボプラチン（Ｃａｒｂ）および／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ（Ｂ）、カルボプラチン１０−６Ｍ（Ｃ）およびカルボプラチン１０−７Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値）
【００８５】
【表２】
2007525507.tif 000003
コントロールからの有意性、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、そしてｐ＜０．０５（＊）。
ＯＧＦからの有意性、ｐ＜０．００１（＋＋＋）、ｐ＜０．０１（＋＋）、そしてｐ＜０．０５（＋）。
カルボプラチン  １０−６Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）、ｐ＜０．０１（ΛΛ）、ｐ＜０．０５（Λ）。
カルボプラチン  １０−７Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（＃＃＃）、ｐ＜０．０１（＃＃）、ｐ＜０．０５（＃）。
ａは、ＯＧＦが、カルボプラチン  １０−７Ｍよりもこの時点で有意に阻害性であった（ｐ＜０．００１）ことを示す。ｂは、カルボプラチン１０−６Ｍが、カルボプラチン１０−７Ｍよりもこれらの時点で有意に阻害性であったことを示す。
【００８６】
（表３．９６時間のトライアルにわたる、ゲムシタビンおよび／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、１０−６ＭのＯＧＦ（Ｂ）、ゲムシタビン１０−７Ｍ（Ｃ）およびゲムシタビン１０−８Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値）
【００８７】
【表３】
2007525507.tif 000004
コントロールからの有意性、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、そしてｐ＜０．０５（＊）。
ＯＧＦからの有意性、ｐ＜０．００１（＋＋＋）、ｐ＜０．０１（＋＋）、そしてｐ＜０．０５（＋）。
Ｇｅｍｚａｒ  １０−７Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）、ｐ＜０．０１（ΛΛ）、ｐ＜０．０５（Λ）。
Ｇｅｍｚａｒ  １０−８Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（＃＃＃）、ｐ＜０．０１（＃＃）、ｐ＜０．０５（＃）。
ａは、Ｇｅｍｚａｒ  １０−８ＭおよびＧｅｍｚａｒ  １０−８Ｍ／ＯＧＦが、Ｇｅｍｚａｒ１０−７Ｍよりもこれらの時点で有意に（ｐ＜０．００１ΛΛΛ、ｐ＜０．０５Λ）阻害性が小さかったことを示す。ｂは、Ｇｅｍｚａｒ  １０−８Ｍが、Ｇｅｍｚａｒの１０−７Ｍよりもこれらの時点で有意に（ｐ＜０．００１）阻害性が小さかったことを示す。
【００８８】
（表４．９６時間のトライアルにわたる、５−ＦＵおよび／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ（Ｂ）、１０−５Ｍの５−ＦＵ（Ｃ）または１０−６Ｍの５−ＦＵ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値）
【００８９】
【表４】
2007525507.tif 000005
コントロールからの有意性、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、そしてｐ＜０．０５（＊）。
ＯＧＦからの有意性、ｐ＜０．００１（＋＋＋）、ｐ＜０．０１（＋＋）、そしてｐ＜０．０５（＋）。
５−ＦＵ  １０−５Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）、ｐ＜０．０１（ΛΛ）、ｐ＜０．０５（Λ）。
５−ＦＵ  １０−６Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（＃＃＃）、ｐ＜０．０１（＃＃）、ｐ＜０．０５（＃）。
ａは、ＯＧＦが、５−ＦＵ  １０−５Ｍおよび５−ＦＵ  １０−６Ｍよりもこれらの時点で有意に（ｐ＜０．００１）阻害性であったことを示す。ｂは、５−ＦＵ  １０−５Ｍが、５−ＦＵの１０−６Ｍおよび５−ＦＵ  １０−６Ｍ／ＯＧＦ  １０−６Ｍよりもこれらの時点で有意に阻害性であったことを示す。
【００９０】
（表５．９６時間のトライアルにわたる、ゲムシタビンおよび／またはＯＧＦ対コントロール（Ａ）、ＯＧＦ１０−６Ｍ（Ｂ）、ゲムシタビン１０−７Ｍ（Ｃ）およびゲムシタビン１０−８Ｍ（Ｄ）についての一元ＡＮＯＶＡから得られた有意値）
【００９１】
【表５】
2007525507.tif 000006
コントロールからの有意性、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、そしてｐ＜０．０５（＊）。
ＯＧＦからの有意性、ｐ＜０．００１（＋＋＋）、ｐ＜０．０１（＋＋）、そしてｐ＜０．０５（＋）。
Ｇｅｍｚａｒ  １０−７Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）、ｐ＜０．０１（ΛΛ）、ｐ＜０．０５（Λ）。
Ｇｅｍｚａｒ  １０−８Ｍからの有意性、ｐ＜０．００１（＃＃＃）、ｐ＜０．０１（＃＃）、ｐ＜０．０５（＃）。
ａは、Ｇｅｍｚａｒ（ゲムシタビン）  １０−８およびＧｅｍｚａｒ  １０−８Ｍ／ＯＧＦが、Ｇｅｍｚａｒ  １０−７Ｍよりもこれらの時点で有意に（ｐ＜０．００１）阻害性が小さかったことを示す。ｂは、Ｇｅｍｚａｒ  １０−８Ｍが、Ｇｅｍｚａｒの１０−７Ｍよりもこれらの時点で有意に（ｐ＜０．００１）阻害性が小さかったことを示す。
【００９２】
（実施例７）
膵臓癌における抗腫瘍因子としての、ＯＧＦ（生物療法）の、およびゲムシタビン（化学療法）の有望な性質を、そしてＯＧＦおよびゲムシタビンの同時の使用に関する前臨床データがないこと考慮して、本研究は、これらの様式の組み合わせの治療能力を探索するために設計した。ヒト膵臓腺癌の組織培養モデルを用いて、ＯＧＦおよびゲムシタビンの両方に対する付随する曝露の効果を、増殖に対して特徴付けた（例えば、可逆性、レセプター媒介、特異性）。膵臓癌に関する別の化学療法処置（例えば、５−ＦＵ）およびＯＧＦの関係、ならびに他の膵臓癌細胞株に対する併用療法の普遍性を評価した。最終的に、本報告は、ＯＧＦおよびゲムシタビンの組み合わせが、インビボにおいてヒト膵臓癌の増殖に影響するか否か、そしてそれによって各々の化合物の有効性を超えるか否かという疑問に取り組む。腫瘍の出現、外見およびサイズ、ならびに転移に対するＯＧＦおよび／またはゲムシタビンの効果を、膵臓癌の異種移植片モデルにおいて試験した。
【００９３】
（材料および方法）
（細胞株）
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＰＮＡＣ−１ヒト膵臓腺癌細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓａｓｓ，ＶＡ）から購入した。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞は、身体に存在する未分化の上皮癌および６５歳齢の男性の膵臓の尾部に由来した［３６］。ＰＮＡＣ−１細胞は、５６歳齢の男性における膵臓の頭部由来の未分化の癌腫に由来した［１８］。ＭＩＡ  ＰａＣａ−２およびＰＡＮＣ−１細胞は、ダルベッコＭＥＭ（改変）培地において増殖させた；培地には１０％ウシ胎仔血清、１．２％重炭酸ナトリウム、および抗生物質（５，０００単位／ｍｌのペニシリン、５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン）を補充し、そして細胞は、７％  ＣＯ２／９３％空気という湿潤雰囲気中で３７℃で維持した。
【００９４】
（増殖アッセイ）
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、等価な量で、７５ｃｍ２フラスコ、６ウェルプレート、または９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）のいずれかの中に播種して、２４時間後にカウントしてプレート効率を測定した。ＰＮＡＣ−１細胞の増殖アッセイは、６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）中で行った。化合物または滅菌水は、播種（＝０時間）の２４時間後に開始して添加して、培地および化合物の両方を、毎日交換した。全ての薬物は、滅菌水中に調製して、希釈は化合物の最終濃度であった。
【００９５】
細胞数は、分裂促進的バイオアッセイ、ＭＴＳアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いること、および４９０ｎｍでのＢｉｏｒａｄ（３５５０モデル）プレートリーダーで４時間後の吸光度を測定すること、または細胞をカウントすることのいずれかによって記録した。手動のカウントのために、細胞は、０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡの溶液で回収して、遠心分離し、血球計でカウントした。細胞の生存度は、トリパンブルー染色によって測定した。１フラスコあたり少なくとも２つのアリコートまたは１処置あたり４〜１０のウェルを各々の時点でカウントした。
【００９６】
（動物および腫瘍細胞の移植）
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した雄性の４週齢のＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕヌードマウスを、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおいて病原体なしのアイソレーター中で飼育した。全ての手順は、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩＡＣＵＣ委員会で承認されて、ＮＩＨによって確立されたガイドラインに適合された。マウスは実験の開始前に４８時間順応させた。
【００９７】
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（１０６細胞／マウス）を、右肩甲骨領域への皮下注射によってヌードマウスに接種した；この手順に関してはマウスは麻酔しなかった。
【００９８】
（薬物処置）
マウスの４つの群（ｎ＝１２）を、毎日１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＦ、３日ごとに１２０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン；毎日１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＦおよび３日目ごとに１２０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン、または毎日０．１ｍｌの滅菌生理食塩水の腹腔内注射を受けるように無作為に割り当てた［２９、３８］。全ての薬物は、生理食塩水に溶解して、毎週調製した。注射は腫瘍細胞接種の１時間以内に与えた。
【００９９】
（腫瘍増殖および転移）
マウスは、この実験全体にわたって毎週秤量して、腫瘍の存在に関して毎日観察した。可視性の腫瘍が出現する潜伏期間、および腫瘍が測定可能（すなわち、６２．５ｍｍ３）になるまでの時間を記録した。腫瘍は、腫瘍出現後、毎日ノギスを用いて測定した。腫瘍容積は、式ｗ２×１×π／６を用いて計算し、ここでは長さは最長の寸法であって、幅は長さに対して垂直の寸法である［３１］。
【０１００】
（終了日の測定）
ＩＡＣＵＣガイドラインに従って、腫瘍が潰瘍化した場合、または腫瘍が直径で２ｃｍに増殖した場合マウスを死亡させた。腫瘍細胞接種の４５日後、全てのマウスを過剰のペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）によって安楽死させ、頸椎脱臼によって殺傷したマウス（腫瘍を有する）を秤量した。腫瘍および脾臓を取り出し秤量して、リンパ節、肝臓および脾臓を転移について試験した。
【０１０１】
（［Ｍｅｔ５］−エンケファリン（ＯＧＦ）の血漿レベル）
終了の時点で、体幹の血液を各々の群の数匹のマウスから収集した。血漿を分離して、ＯＧＦレベルは、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）の［Ｍｅｔ５］−エンケファリンキットを用いて標準的なラジオイムノアッセイ手順によって測定した。
【０１０２】
（化合物）
以下の化合物は、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した：［Ｍｅｔ５］−エンケファリン（ＯＧＦ）、［Ｄ−Ｐｅｎ２，５］−エンケファリン（ＤＰＤＰＥ）、［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙｏｌ５］−エンケファリン（ＤＡＭＧＯ）、β−エンドルフィン、ナルトレキソン（ＮＴＸ）、ナロキソン、ダイノルフィンＡ１−８、［Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｅｕ−エンケファリン］（ＤＡＤＬＥ）、モルフィン、エンドモルフィン−１、およびエンドモルフィン−２。
【０１０３】
（データ分析）
細胞数および／または吸光度を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）（必要に応じて１または２つの因子）を用いて分析し、引き続く比較は、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を用いて行った。腫瘍の発生は、カイ二乗検定によって分析した。腫瘍の出現の潜伏期間および腫瘍容積は、両側ｔ検定またはＡＮＯＶＡのいずれかを用いて分析し、その後の比較はＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を用いて行った。終了データ（すなわち、体重、腫瘍重量、脾臓重量）およびＯＧＦの血漿レベルをＡＮＯＶＡによって比較した。
【０１０４】
（結果）
（ＯＧＦおよび／またはゲムシタビンを用いた増殖アッセイ）
１０−６Ｍ  ＯＧＦ（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の増殖を阻害することが公知の用量、４４）、１０−８Ｍゲムシタビン（予備実験によって１０−７Ｍの用量での対数増殖が明らかにならなかったので選択した用量）、１０−８Ｍのゲムシタビンおよび１０−６ＭのＯＧＦ、または滅菌水（コントロール）で処置したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞培養物の増殖曲線を図１０に示す。ＯＧＦ単独では、コントロールに対して４８時間、７２時間および９６時間で増殖を阻害し、それぞれ、１６％、１８％および１７％という細胞数の減少が注目された。ゲムシタビン単独では、コントロールに対して、４８時間、７２時間および９６時間で、それぞれ細胞数を２２％、２１％および３２％減少させた。ＯＧＦおよびゲムシタビンの併用で処置した細胞は、コントロールに対して、それぞれ４８時間、７２時間および９６時間で２６％、４９％および４６％まで数が減った。７２時間では、ゲムシタビンおよびＯＧＦの併用療法を受けている培養物中の細胞数は、それぞれＯＧＦまたはゲムシタビンにのみ曝露された細胞から３８％および３６％減少した（ｐ＜０．００１）。さらに、９６時間では、ゲムシタビンおよびＯＧＦの併用療法は、それぞれＯＧＦまたはゲムシタビンのみを投与されている培養物からＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の数を３５％および２０％減少させた（ｐ＜０．００１）。
【０１０５】
（５−フルオロウラシルでの増殖アッセイ）
ＯＧＦが、膵臓癌を処置するために一般に用いられる他の化学療法剤の阻害性効果を増強し得るか否かを検討するために、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞培養物を５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に対して１０−６Ｍの濃度で４日間曝露した（図１１）。５−ＦＵ群におけるＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の数は、４８時間、７２時間および９６時間でコントロールのレベルより１１％〜１５％減少した。５−ＦＵ（１０−６Ｍ）およびＯＧＦ（１０−６Ｍ）の併用療法は、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間でコントロールの値より１３％〜３０％細胞数を減少させた。検討した全ての時点で、５−ＦＵおよびＯＧＦの併用療法は、ＯＧＦのみを投与されている培養物より６％〜１９％、そして５−ＦＵのみを投与されている培養物より１０％〜１７％、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の数を減少させた。
【０１０６】
（ＯＧＦおよび／またはゲムシタビンのレセプター媒介性の影響）
ＯＧＦ活性がＯＧＦレセプターによって媒介されるか否かを調査するため、短時間作用性のオピオイドアンタゴニストであるナロキソンを、１０−６ＭのＯＧＦおよび／またはゲムシタビン（１０−８Ｍ）を投与されている培養物中に１０−６Ｍの用量で添加した。９６ウェルプレート中で増殖したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を、１０−６ＭのＯＧＦ、１０−６Ｍのナロキソン、１０−８Ｍのゲムシタビン、または同じ濃度の組み合わせ−ＯＧＦ／ナロキソン、ゲムシタビン／ナロキソン、ゲムシタビン／ＯＧＦ、およびゲムシタビン／ＯＧＦ／ナロキソンで処置した；コントロール培養物には滅菌水を与えた。個々のプレートを薬物添加の９６時間後に読み取った。コントロールのレベルに対して、ＯＧＦ、ゲムシタビン、ゲムシタビン／ＯＧＦおよびゲムシタビン／ＯＧＦ／ナロキソンの添加は、細胞増殖を１３％〜３６％、阻害した（図１２）。ナロキソンの添加はＯＧＦ単独の増殖阻害効果を完全にブロックしたが、ゲムシタビン単独の増殖阻害性作用には影響を有さなかった。さらに、ナロキソンは部分的に、ゲムシタビンおよびＯＧＦの併用の増強された阻害性効果を中和した；ゲムシタビン／ＯＧＦ／ナロキソン群の細胞数は、ゲムシタビンに曝露された細胞に匹敵したが、コントロールのレベルからは有意に減少した。ナロキソン単独では、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の増殖に影響はなかった。
【０１０７】
（ＯＧＦおよび／またはゲムシタビンの阻害性の増殖効果の可逆性）
細胞数に対するＯＧＦおよび／またはゲムシタビンの影響が薬物曝露から細胞を離脱させることによって逆転され得るか否かを確認するために、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の培養物を４８時間にわたって１０−６ＭのＯＧＦおよび／または１０−８Ｍのゲムシタビンに曝した。薬物曝露の４８時間後に、プレートの半分は培地を除いて、ＯＧＦもゲムシタビンも添加しない新鮮な培地を添加した（すなわち、ＯＧＦ−逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）；ゲムシタビン−逆転；ゲムシタビン／ＯＧＦ−逆転群）；いくつかの培養物には、新しい培地および薬物を継続して与えた。９６時間で（すなわち逆転後４８時間で）、ＯＧＦ、ゲムシタビン、ゲムシタビン−逆転、ゲムシタビン／ＯＧＦおよびゲムシタビン／ＯＧＦ−逆転群は、コントロールから２１％〜４６％異なった（図１３Ａ、図１３Ｂ）。ＯＧＦ−逆転群は、ＯＧＦ曝露を継続しているＯＧＦ群よりも１６％多い細胞を有した。しかし、ゲムシタビン−逆転群は、ゲムシタビンでの処置を継続している細胞培養とは異ならなかった。ＯＧＦおよびゲムシタビンの併用に曝された細胞培養物は、ゲムシタビン／ＯＧＦ−逆転群での培養物よりも有する細胞が７％少なかった。
【０１０８】
（膵臓癌細胞増殖に関連するオピオイドペプチド（単数または複数）の特異性）
他のオピオイドペプチド（単数または複数）が増殖に関連するか否かを確認するために、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２培養物（１，０００細胞／ウェル）を１０−６Ｍ濃度の種々の天然および合成のオピオイドリガンドで毎日処置した。ある場合には、これらのリガンドは、他のオピオイドレセプター（例えば、μ、δまたはκのレセプター）に特異的であった。薬物は、ＯＧＦ、ＤＡＭＧＯ、モルフィン、ＤＰＤＰＥ、ＤＡＤＬＥ、ダイノルフィンＡ１−８、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、およびβ−エンドルフィンを含んだ。細胞数は、処置の９６時間後にプレートリーダーで測定した（両方の薬物および培地は毎日交換した）。ＯＧＦは、コントロールに対して細胞数を１６％阻害した；増殖に阻害性または刺激性の影響を有する他の薬物は何も利用しなかった（図１４）。
【０１０９】
（ＯＧＦによる増殖阻害の普遍性）
ゲムシタビンおよびＯＧＦの併用に対して曝した後のＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞で観察された増殖阻害が、細胞株特異的作用ではないかどうかを確認するため、別のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１を試験した。７２時間後、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）、ゲムシタビン（１０−８Ｍ）、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）およびゲムシタビン（１０−８Ｍ）のいずれかに対するＰＮＡＣ−１細胞の曝露によって、コントロールの培養における細胞より、それぞれ、３１％、３１％および５４％、細胞が少ないことが明らかになった（図１５）。ＯＧＦおよび／またはゲムシタビンに対する曝露での細胞増殖のこれらの相違は、コントロールのレベルとは有意に異なり（ｐ＜０．００１）、そしてＯＧＦおよびゲムシタビンの併用は、ＯＧＦ単独およびゲムシタビン単独の培養と異なった（ｐ＜０．０１）。
【０１１０】
（ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍の出現および増殖）
インビボでの膵臓腫瘍の増殖に対するＯＧＦおよび／またはゲムシタビンの効果を検討するために、ヌードマウスにＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞を注射して、薬物で処置した。１０日目に、生理食塩水を注射したコントロール群のマウスのうち８０％が測定可能な腫瘍を有し、ＯＧＦのうち６０％およびゲムシタビン処置動物のうち７５％が、腫瘍を有し、ゲムシタビン／ＯＧＦ群のマウスは測定可能な腫瘍を有さなかった；ゲムシタビンおよびＯＧＦの併用療法を受けている群は、ｐ＜０．００１で他の全ての群と有意に異なった（表６）。１６日目に、測定可能な腫瘍の出現において、群間で相違は検出できず、そして全ての動物が、１７日目までに腫瘍を有した。ゲムシタビン／ＯＧＦ群のマウスにおける可視の腫瘍の出現についての潜伏期間は、コントロール、ＯＧＦおよびゲムシタビン群における動物からほぼ５〜６日遅れた；ゲムシタビン／ＯＧＦ群についてのこの遅延は、ｐ＜０．０５で他の全ての群の遅延と有意に異なった。ゲムシタビン／ＯＧＦ群のマウスにおける測定可能な腫瘍発現についての平均潜伏期間は、コントロール、ＯＧＦおよびゲムシタビン群における動物から約６日遅れた（ｐ＜０．０５）。
【０１１１】
４５日の実験にわたる腫瘍容積の変化を分析した（図１６）。ＯＧＦ、ゲムシタビンおよびゲムシタビン／ＯＧＦ群は全て、１４日目に開始して腫瘍容積においてコントロールとは異なった（少なくともｐ＜０．０５）。併用療法（すなわち、ゲムシタビン／ＯＧＦ）を受けているマウスの腫瘍容積は、１０日目に開始してＯＧＦのみで処置されたマウスと、そして３５日目に開始してゲムシタビン単独で処置されたマウスとは異なった（ｐ＜０．０５）。群間の腫瘍容積の相違は、実験期間の残りにわたって継続した。４５日の期間におよぶ増殖の速度を分析して、図１６Ｂに示した。この結果によって、３つの処置群全てで腫瘍の増殖速度はコントロールのレベルから顕著に減少した（ｐ＜０．００１）ことが実証された。さらに、ゲムシタビンおよびＯＧＦの併用で処置されたマウスにおける腫瘍増殖速度は、ＯＧＦ単独群およびゲムシタビン単独群の両方から有意に低下した（ｐ＜０．００１）。
【０１１２】
終わり（すなわち４５日）の時点で、全ての群のマウスの体重は、統計学的評価で異なることがなかった（表７）。さらに、各々の群における動物の剖検では、転移は明らかにならなかった。しかし、ゲムシタビン単独およびゲムシタビン／ＯＧＦ群におけるマウスについての４５日目の脾臓重量は、コントロールの値から約４０％減少していた；ＯＧＦ群の脾臓重量はコントロールのレベルに比較して変化は認められなかった（表７）。ＯＧＦ単独群、ゲムシタビン単独群、およびゲムシタビン／ＯＧＦ単独群についての終了日での腫瘍の重量は、コントロールのレベルからそれぞれ、３６％、５６％および８５％減少した（表７）。ＯＧＦ単独群、ゲムシタビン単独群およびゲムシタビン／ＯＧＦ群についての４５日目の腫瘍容積は、コントロールの値からそれぞれ、４６％、５６％および８３％減少した（表７）。
【０１１３】
（ＯＧＦの血漿レベル）
ＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍を保有するヌードマウスの血漿中のＯＧＦレベルは、１２９〜２８９ｐｇ／ｍｌにおよんだ。コントロールマウスとＯＧＦ単独、ゲムシタビン単独またはゲムシタビン／ＯＧＦで処置されたマウスとの間に相違は認められなかった。
【０１１４】
（考察）
本研究における結果によって、ＯＧＦおよびゲムシタビンの併用がヒト膵臓癌のインビトロにおける増殖に強力な阻害効果を有することが実証される。ＯＧＦおよびゲムシタビンの併用の抗増殖作用は、個々の薬物よりも常に大きい。多くの場合、薬物の併用の効果は個々の薬物の合計の効果を上回り、ＯＧＦおよびゲムシタビンの併用の作用は、相加を上回った（相乗的であった）（ｓｕｐｒａ−ａｄｄｉｔｉｖｅ）ことが示唆された。ＯＧＦで、およびゲムシタビンで個々に観察された膵臓癌のインビトロでの増殖に対する抑制的な影響は、以前の結果と一致していた［例えば、８、３５、４４］。細胞増殖に対するＯＧＦの作用は、ナロキソン感受性のレセプターによって媒介された。このナロキソン感受性のレセプターは、ＯＧＦｒであると想定される。なぜなら、μ、δおよびκのような古典的なオピオイドレセプターに選択的である合成および天然のオピオイドは、本報告および初期の報告において膵臓癌細胞の増殖に影響しなかったからである［４４］。ＯＧＦはまた、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の複製に対して可逆性の作用を有することが発見され、このことは、この化合物での処置が細胞毒性も細胞死ももたらさないということを示す初期の研究に由来する結果を支持している［３９、４４］。他方では、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対するゲムシタビンの効果は、ナロキソンによってブロックされず、逆転されることもなく、これによって、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対する薬物の影響の特徴が、ＯＧＦのものとは顕著に異なることが示される。従って、これは、ヒトの膵臓癌の増殖を遅らせるために、生物療法剤、ＯＧＦ、および化学療法剤、ゲムシタビンの併用を用いることの有効性についての初めての報告である。
【０１１５】
この報告は、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対するＯＧＦおよびゲムシタビンの効果に集中していたが、ＯＧＦおよびゲムシタビンは、種々のヒト膵臓癌細胞株の増殖に影響することが公知である［８．３５、４４］。本研究によって、個々にではなくＯＧＦおよびゲムシタビンの組み合わせがＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞増殖に対してさらに顕著な影響を有するだけでなく、同様のパターンが、別のヒト膵臓癌細胞株であるＰＡＮＣ−１で見出され得るということが実証される。従って、本明細書で観察されるＯＧＦおよびゲムシタビンの併用療法の効果は、他のヒト膵臓癌細胞株に拡張されると結論することが合理的である。
【０１１６】
ＯＧＦがゲムシタビン以外の化学療法剤と組み合され得るか否かという疑問に取り組むために、ＯＧＦおよび５−ＦＵの併用によって予備的な研究を行なった。これによって、代謝拮抗剤（５−ＦＵ）とシトシンアナログとの間の対比が可能になった［３２］。ピリミジンアナログである５−ＦＵの機構は、活性代謝物５−フルオロ−デオキシウリジン−一リン酸によってチミジル酸シンターゼ（ピリミジンの新規な合成に関与する酵素）を阻害することである。さらに、活性な三リン酸代謝物である５−フルオロ−デオキシウリジン−三リン酸および５−フルオロ−ウリジン−三リン酸が、核酸機能を破壊する［６］。この結果は、５−ＦＵおよびＯＧＦの併用の効果がヒト膵臓癌に対して強力な阻害性の特性を有することを初めて示すものである。ゲムシタビンおよびＯＧＦの場合と同様、膵臓癌細胞に対する５−ＦＵおよびＯＧＦの併用の効果は、各々の薬物よりも顕著に大きく、しばしば事実上、相加的であった。おそらく、これらの結果によって、ＯＧＦが種々の化学療法剤と組み合わせて用いられ得るということが示される。
【０１１７】
本研究の結果、ＯＧＦおよびゲムシタビンの抗増殖特性は、各々の薬物単独の阻害性の効果を上回って増強されるということが示される。これらのデータは、腫瘍の発現、可視または測定可能な腫瘍についての潜伏期間、腫瘍重量および腫瘍容積について最も明らかであった。従って、インビボ研究の結果は、インビボで行われた観察と一致する。腫瘍移植の検討は、１つのヒトの膵臓癌細胞株に集中したが、ＯＧＦまたはゲムシタビンは種々のヒト膵臓癌細胞株の増殖に対してインビボで影響することが公知である［３、２８、３５、３８］。従って、本研究で示されたＯＧＦおよびゲムシタビンの併用療法の効果は、インビボにおける他のヒト膵臓癌細胞株に拡大される。
【０１１８】
ＯＧＦおよびゲムシタビンまたは５−ＦＵのいずれかの併用の増強された抗腫瘍活性の機構は規定される必要がある。ＯＧＦは、細胞周期のＧ０／Ｇ１期を標的としており、膵臓癌細胞の増殖に顕著な遅延を生じる［４１］が、アポトーシスは生じない［３９］。ゲムシタビンおよび５−ＦＵは、細胞毒性であって、かつプログラムされた細胞死を誘導する［９、２７、３０］。従って、ＯＧＦの細胞分裂停止作用は、ゲムシタビンまたは５−ＦＵに関連するアポトーシス経路へと細胞を導くことが想定され得る。
【０１１９】
ゲムシタビンは転移癌の治療に標準的であり［７、１３、１７、２４、４２］、そして局所的に進行した膵臓癌についてのための単剤の化学療法剤として臨床試験中である［１］。ゲムシタビンでの処置は、転移性の疾患には治療的でなく、この因子での処置は、その対症的な利点に関して毒性のような因子に直面して試験されなければならない［１、１７］。膵臓癌の処置における進歩のための差し迫った必要性を考慮すれば、薬物治療の組み合わせは、その多くが新規な薬剤に加えてゲムシタビンであるが、膵臓癌について、注目を集めている［５、７、１７、２４］。本報告は、化学療法および生物療法の組み合わせの刺激的な可能性をヒト膵臓癌のための新規な処置様相へ向けさせる。ＯＧＦは毒性ではなく、薬物耐性に関する問題を回避し、容易な接近性を有し、かつ化学療法剤の慢性使用に組み込まれ得る。さらに、ＯＧＦによって、毒性濃度未満で、および／または生物治療と組み合わせた慢性のレジメンで（メトロノーム様の化学療法）［１０、１６を参照のこと］で化学療法剤を用いるという可能性がもたらされる。単剤として用いられたＯＧＦは、進行した切除不能の膵臓癌腫を有する患者での第Ｉ相の臨床試験で成功している［３３］。Ｓｍｉｔｈおよび共同研究者によるこの研究における長期の実験の間［３３］、診断の時点からの平均生存は、薬物投与の経路次第で、８．７〜９．５ヶ月であり、数例の患者では２３ヶ月程度生存していた。ＯＧＦおよびゲムシタビンの併用が、組織培養および異種移植片において膵臓癌に顕著な影響を有するということを示すこの報告での前臨床の情報、ならびに毒性の欠失を報告しかつ有効性を示唆するＯＧＦでの第Ｉ相臨床試験からのデータによれば、ＯＧＦおよびゲムシタビンでの併用薬物療法を用いる臨床試験の予想は保証されると思われる。
【０１２０】
ＯＧＦとゲムシタビンの組み合わせが、インビトロおよびインビボの両方でヒト膵臓癌に強力な阻害性の作用を有することを示すこの研究での観察は、頭頸部の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）の処置のための化学療法と組み合わせたＯＧＦについての報告と一致している［１４，１９］。組織培養を用いて、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎおよび共同研究者ら［１９］は、ＯＧＦがパクリタキセルまたはカルボプラチンのいずれかと組み合わせて、ＳＣＣＨＮの増殖に顕著な抑制的影響を有することを実証した。Ｊａｇｌｏｗｓｋｉら［１４］は、パクリタキセルと組み合わせたＯＧＦが、ＳＣＣＨＮの異種移植片において腫瘍増殖を顕著に阻害したことを報告した。インビトロおよびインビボの両方の検討で、ＯＧＦおよび化学療法の組み合わせは、個々の化合物についてよりも大きかった。膵臓［３８、４４］およびＳＣＣＨＮ［１９〜２１］に加えて、ＯＧＦは、神経芽細胞腫［２２］、腎臓癌［２］および結腸癌［３７］を含む広範な種々の癌の増殖に影響する（インビトロおよび／またはインビボ）ことが示されている。これらのデータによって、種々の癌のための併用した化学療法（例えば、ゲムシタビン、パクリタキセル）および生物療法（ＯＧＦ）が妥当であることが示される。
【０１２１】
【数１】
2007525507.tif 000007
【０１２２】
【数２】
2007525507.tif 000008
【０１２３】
【数３】
2007525507.tif 000009
【０１２４】
【数４】
2007525507.tif 000010
【０１２５】
【数５】
2007525507.tif 000011
（表６．ＯＧＦおよび／またはゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）で処置したヌードマウスにおけるＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の腫瘍出現の発生率および潜伏期間）
【０１２６】
【表６】
2007525507.tif 000012
値は平均±ＳＥＭである。ａカイ二乗分析によってｐ＜０．００１であらゆる群と有意に異なる。ＡＮＯＶＡを用いてｐ＜０．０５（＊）でコントロールから有意に異なる。
【０１２７】
（表７．ＭＩＡ  ＰａＣａ−２膵臓癌細胞の皮下接種ならびにＯＧＦおよび／またはゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）での処置の４５日後のヌードマウスの特徴）
【０１２８】
【表７】
2007525507.tif 000013
データは平均±ＳＥＭである。ｐ＜０．０５（＊）およびｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから有意に異なる。ｐ＜０．０５（＋）およびｐ＜０．０１（＋＋）でＯＧＦ群から有意に異なる。ｐ＜０．０５（Λ）でＧｅｍｚａｒ処置したマウスから有意に異なる。
【０１２９】
（実施例８）
本研究は、ヒトＳＣＣＨＮの組織培養モデルを用いる頭頸部の扁平上皮細胞癌（ＳＣＣＨＮ）に対するオピオイド増殖因子（ＯＧＦ）およびパクリタキセルの併用の効果を評価した。ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用は、ＳＣＣＨＮ増殖に対して顕著に阻害性であって、４８時間以内にコントロールのレベルから増殖を４８％〜６９％低下させた。カルボプラチンと組み合わせたＯＧＦはまた、細胞増殖を抑制した。ＯＧＦおよびパクリタキセルまたはカルボプラチンの併用のＳＣＣＨＮ増殖に対する効果は相乗的であり、個々の化合物いずれかよりも大きかった。パクリタキセルでは違うが、ＯＧＦの作用は、ナロキソン感受性のレセプターによって媒介されて、完全に可逆性であった。ＯＧＦはＳＣＣＨＮの複製を変更したが、他の内因性または外因性のオピオイドでは変更しなかった。ＯＧＦおよびパクリタキセルは、ＤＮＡ合成を抑制したが、パクリタキセルのみがアポトーシスを誘導した。ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用はまた、別のＳＣＣＨＮであるＣＡＬ−２７の増殖に対して相乗的効果を有し、このことは、併用した薬物活性の普遍性を示した。これらのデータによって、生物療法剤（ＯＧＦ）および化学療法剤（パクリタキセル、カルボプラチン）の併用は、ＳＣＣＨＮに対して増強した抗腫瘍作用を提供し得ることが示唆される。
【０１３０】
ＳＣＣＨＮにおける抗腫瘍因子としてのＯＧＦ（生物治療）およびパクリタキセル（化学療法）の有望な性質、ならびにＯＧＦおよびパクリタキセルの同時の使用に関する前臨床データがないことを考慮して、本研究は、これらの様式の併用の治療的能力を探索するように設計した。口腔底における十分分化した再発性の扁平上皮細胞癌由来のＵＭ−ＳＣＣ−１細胞株（ＳＣＣ−１）の組織培養モデルを用いて、ＯＧＦおよびパクリタキセルの両方に対する同時曝露の効果を、増殖（例えば、可逆性、レセプター媒介、特異性）および作用機序（アポトーシス、壊死、および細胞増殖）に対して特徴付けた。
【０１３１】
（材料および方法）
（細胞株および細胞増殖アッセイ）
ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞株（ＳＣＣ−１）は、７３歳齢の男性の口腔底における十分に分化した再発性の扁平上皮細胞癌に由来した（２５）。この細胞株は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉｃｈｉｇａｎのＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（所長、Ｔｈｏｍａｓ  Ｅ．Ｃａｒｅｙ博士）から入手した。５６歳男性の舌の十分に分化してない癌腫由来のＣＡＬ−２７ヒト扁平上皮細胞癌細胞株（２６）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。両方の細胞株とも、１０％ウシ胎仔血清、１．２％重炭酸ナトリウム、および抗生物質（５，０００単位／ｍｌのペニシリン、５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン）を補充したダルベッコのＭＥＭ（改変）培地中で増殖させた。細胞培養物は、７％ＣＯ２／９３％空気の湿潤雰囲気中で３７℃で維持した。
【０１３２】
細胞を６ウェルまたは９６ウェルのプレート（Ｆａｌｃｏｎ）のいずれかに等量で播種して、２４時間後にカウントして、プレート効率を確認した。ＯＧＦ（１０−６Ｍ）および／またはパクリタキセル（１０−８Ｍ）、または滅菌水を播種（＝０時間）の２４時間後に開始して添加した；培地および化合物は毎日交換した。ＯＧＦは、滅菌水中で調製して、パクリタキセルは、ＤＭＳＯ中に１０−２Ｍの濃度で溶解して、さらに滅菌水中に希釈した；希釈は化合物の最終濃度である。利用したＯＧＦの濃度は、ＳＣＣＨＮの増殖阻害を示す以前の証拠に基づいて選択した（１３）；パクリタキセルの濃度は、パクリタキセルが１０−８Ｍでは細胞増殖を阻害した（ただし１０−７Ｍでは阻害せず）が、５〜６日の期間にわたって全ての細胞を排除はしなかったということを示す本発明者らの実験室での予備的研究から選択した（１５）。
【０１３３】
いくつかの実験によってカルボプラチンおよびＯＧＦの効果を試験した。１０−７Ｍのカルボプラチンおよび／または１０−６ＭのＯＧＦという用量を利用した。選択したカルボプラチンの用量は、以前の報告（２７、２８）に、そして本発明者らの実験室における予備的研究に基づいた。
【０１３４】
細胞数は、ＭＴＳ増殖バイオアッセイ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、および４時間後の吸光度をＢｉｏｒａｄ（３５５０モデル）プレートリーダーで、７５０ｎｍのバックグラウンド吸光度スクリーニングを用いて４９０ｎｍで測定すること、または直接細胞をカウントすることのいずれかによって記録した。ＭＴＳアッセイは、１処置あたり１０ウェルを利用した。手動のカウントのために、細胞は、０．２５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてトリプシン処理によって回収して、遠心分離し、血球計でカウントした。細胞の生存度は、トリパンブルー染色によって測定した。１ウェルあたり少なくとも２つのアリコート、および１処置あたり４〜１０のウェルを、手動のカウントについて各々の時点でカウントした。
【０１３５】
いくつかの実験については、９６時間の期間を超える増殖速度を、線形回帰分析を用いて計算した。直線の勾配（細胞／時間の値）は、分散分析によって比較した。全ての計算は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで行った。
【０１３６】
（ＤＮＡ合成、アポトーシスおよび壊死）
パクリタキセルおよび／またはＯＧＦの作用機序を確認することを始めるために、ＤＮＡ合成（ＢｒｄＵ取り込み）、アポトーシス（カスパーゼ−３活性）および壊死（トリパンブルー陽性）に対するこれらの薬物の効果を評価した。ＤＮＡ合成を検討するために、ＳＣＣ−１細胞は、６ウェルプレート上に置いた２２ｍｍの直径のカバーガラス上に播種した（３×１０３個の細胞／カバーガラス）。細胞をパクリタキセル（１０−８Ｍ）および／またはＯＧＦ（１０−６Ｍ）を用いて２４時間または７２時間処置した；培地および薬物は毎日交換した。細胞固定の３時間前に、培養物に３０μＭのＢｒｄＵを添加した。適切な時点で、細胞をリンスして、１０％の中性に緩衝化したホルマリン中で固定し、ＢｒｄＵに対する抗体で染色した（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。陽性細胞の数は、蛍光顕微鏡を用いて記録した。各々の時点で１処置あたり少なくとも１０００個の細胞をカウントした。
【０１３７】
カスパーゼ−３−ＦＩＴＣ陽性染色を用いて、アポトーシスの早期段階を特徴付けた（２９）。ＳＣＣ−１細胞を６ウェルプレートに播種して、２４時間後に開始する薬物で処置した；薬物および培地は、毎日置き換えた。細胞は薬物処置の１日、３日および６日後に回収して、ＦＡＣＳ分析について製造業者の推奨に従って調製した（４８８ｎｍの１５ｍＷアルゴンイオンレーザーを備えるＦＡＣＳ細胞分取器；Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）。カスパーゼ−３同定のために、ＡＰＯ−ＡＣＴＩＶＥ  ３抗体検出キット（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いた。各々の時点で、各々の処置に由来する３つのサンプルを分析した。フローサイトメトリーによって記録した、ゲートに入った細胞の割合をカスパーゼ陽性とみなした。
【０１３８】
（化合物）
全ての化合物および薬物はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【０１３９】
（統計学的分析）
細胞数および／または吸光度を、分散分析（必要に応じて１因子または２因子）（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、引き続く比較は、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を用いて行った。
【０１４０】
（結果）
（パクリタキセルおよびＯＧＦを用いる増殖アッセイ）
ＳＣＣＨＮの増殖に対するパクリタキセルおよびＯＧＦの併用の効果を達成するため、そしてこれを個々の薬物の効果と比較するために、ＳＣＣ−１細胞の増殖曲線を作成した。ＳＣＣＨＮの増殖に対する実験は、細胞カウントまたはＭＴＳアッセイのいずれかによって評価し、これらの方法は同程度であって、このことは、いずれの技術も分析に適切であったことを示した。増殖曲線は、図１７Ａに示しており、増殖曲線の勾配から得た増殖の速度（細胞／時間の値）を図１７Ｂに示す。薬物処置の４８時間後、ＯＧＦまたはパクリタキセルは、細胞数をコントロールのレベルからそれぞれ、約１０％（有意でない）および３３％（ｐ＜０．０１）減少させた。しかし、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用は、細胞数を４８％減少させ（ｐ＜０．００１）、このことは、これらの薬物の相乗効果を示唆している。培養の７２時間および９６時間で、ＯＧＦはコントロールの値から細胞数をそれぞれ１０％および２３％有意に減少させたが、パクリタキセルは細胞数をそれぞれ２５％および５１％減少させた。両方の薬物に対するＳＣＣ−１細胞の７２時間および９６時間の曝露は、細胞数を正常より少なくさせ、それぞれコントロールのレベルから６３％および６９％という有意な（ｐ＜０．００１）減少が記録された。７２時間後、両方の薬物（ＯＧＦおよびパクリタキセル）の効果は増殖に対して相乗的な効果を示した。ＯＧＦおよびパクリタキセルの両方に対して曝露された細胞は、ＯＧＦまたはパクリタキセル単独のいずれかに７２時間および９６時間曝された培養物に比較して、そしてＯＧＦ群の４８時間から、顕著に細胞数が少なかった。
【０１４１】
４日の期間にわたる増殖速度を分析して、その結果によって、ＯＧＦについておよびパクリタキセルについての細胞増殖は、コントロールの値から顕著に減少した（ｐ＜０．０１）ことが実証された（図１７Ｂ）。さらに、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用によって処置した細胞は、ＯＧＦおよびパクリタキセル群の両方から、増殖速度がそれぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５で有意に減少した。
【０１４２】
（カルボプラチンおよびＯＧＦでの増殖アッセイ）
ＳＣＣＨＮの処置に用いられる他の因子がＯＧＦと組み合わせて高まった応答を有するか否かを調査するために、カルボプラチンおよびＯＧＦを用いた増殖の研究を行なった（図１８）。薬物曝露の４８時間、７２時間および９６時間で、ＯＧＦは、細胞数をコントロールのレベルより８〜１０％減少させたが、カルボプラチンは細胞数を７２時間および９６時間でそれぞれ１９％および２１％減少させた。ＯＧＦおよびカルボプラチンの併用は、細胞数をコントロールの値に対して、４８〜９６時間の期間で１４〜２７％減少させた。ＯＧＦおよびカルボプラチンの両方に対するＳＣＣ−１細胞の曝露は、４８〜９６時間でＯＧＦ群よりも細胞数を、約７〜２０％、そしてカルボプラチン単独で処置した群よりも４８時間および７２時間でそれぞれ約１４％および１２％減少させた。
【０１４３】
（ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルのオピオイドレセプター媒介効果）
ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルの効果がオピオイドレセプターによって媒介されるか否かを決定するため、いくつかの培養物を、短時間作用性のオピオイドアンタゴニストであるナロキソン（１０−６Ｍ）に曝した。細胞は、９６ウェルプレートに播種して、１０−６Ｍ  ＯＧＦ、１０−６Ｍナロキソン、１０−８Ｍパクリタキセル、または同じ濃度の組み合わせ−ＯＧＦ／ナロキソン、パクリタキセル／ナロキソン、パクリタキセル／ＯＧＦ、およびパクリタキセル／ＯＧＦ／ナロキソンで処置した。個々のプレートは薬物添加の２４時間、４８時間、７２時間および９６時間後に読み取った。コントロールのレベルに対して、ＯＧＦ、パクリタキセル、パクリタキセル／ＯＧＦおよびパクリタキセル／ＯＧＦ／ナロキソンの添加は、細胞増殖を８．８％〜２６．０％、阻害した（図１９）。ナロキソンの添加はＯＧＦ単独の増殖阻害効果を完全にブロックしたが、パクリタキセル単独の増殖阻害性作用には影響を有さなかった。さらに、ナロキソンは部分的に、パクリタキセルおよびＯＧＦの併用の増強された阻害性効果を中和した；パクリタキセル／ＯＧＦ／ナロキソン群の細胞数は、パクリタキセルに曝露された細胞に匹敵したが、コントロールのレベルからは有意に減少した。ナロキソン単独では、使用した濃度では、増殖に影響はなかった。
【０１４４】
（ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルの阻害性の増殖効果の可逆性）
増殖に対するＯＧＦおよび／またはパクリタキセルの効果が薬物曝露から細胞を離脱させることによって逆転され得るか否かを確認するために、ＳＣＣ−１細胞の培養物を４８時間にわたって１０−６ＭのＯＧＦ、１０−８Ｍのパクリタキセル、またはパクリタキセル／ＯＧＦに曝した。２日後、プレートの半分は培地を除いて、ＯＧＦもパクリタキセルも添加しない新鮮な培地を添加した（すなわち、ＯＧＦ−逆転群；パクリタキセル−逆転群；パクリタキセル／ＯＧＦ−逆転群）；いくつかの培養物には、新しい培地および薬物を継続して与えた。４８時間以内に、ＯＧＦ−逆転群は、ＯＧＦ曝露を継続しているＯＧＦ群よりも１６％多い細胞を有したが、パクリタキセル−逆転群は、パクリタキセルでの処置を継続している細胞とは異ならなかった（図２０Ａ、図２０Ｂ）。ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用に曝された細胞培養物は、ＯＧＦまたはパクリタキセル単独で処置した培養物よりも、そしてこれらの薬物の併用を４８時間後に離脱した培養物よりも有する細胞が有意に少なかった。パクリタキセル／ＯＧＦ−逆転群は、パクリタキセル単独またはパクリタキセル−逆転群と有意に異ならなかった。
【０１４５】
（頭頸部癌細胞増殖に関連するオピオイドペプチド（単数または複数）の特異性）
他のオピオイドペプチドが、増殖に関連するか否かを決定するために、ＳＣＣ−１培養物（１０００細胞／ウェル）を１０−６Ｍ濃度の種々の天然および合成のオピオイドリガンドで毎日処置した（図２１）。ある場合には、これらのリガンドは、μ、δまたはκのオピオイドレセプターに特異的であった。薬物は、ＯＧＦ、モルフィン、ＤＡＭＧＯ、ＤＰＤＰＥ（ｄ−Ｐｅｎ、ｄ−Ｐｅｎ−エンケファリン）、ＤＡＤＬＥ（ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ｌｅｕ−エンケファリン）、ダイノルフィン１−１３、エンドモルフィン−１、エンドモルフィン−２、およびβ−エンドルフィンを含んだ。吸光度読み取りにおいてコントロールのレベルから１９％低下したＯＧＦを除いて、使用した薬物で増殖に対して阻害性効果または刺激性効果を有するものはなかった。
【０１４６】
（プログラムされた細胞死）
壊死において、コントロール細胞の培養物または上清、ならびにＯＧＦおよび／またはパクリタキセルで処置した培養物または上清中のトリパンブルー陽性細胞の数の分析では壊死に相違は観察されなかった。カスパーゼ−３生成物の測定によってアポトーシスの検討を行った（図２２）。フローサイトメトリーを用いた、ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルでの処置の１日後のカスパーゼ３陽性細胞の割合は無視できた。しかし、パクリタキセルまたはＯＧＦおよびパクリタキセルの組み合わせに対する曝露の３日以内に、コントロール培養よりも３．４倍および５．６倍多いカスパーゼ陽性細胞があった。培養の６日目に、コントロール培養よりも、パクリタキセルまたはＯＧＦおよびパクリタキセルで処置したカスパーゼ反応性細胞はそれぞれ１２．７および１３．９倍多かった。カスパーゼ反応性におけるコントロールレベルからの変化は、３日目または６日目にＯＧＦに曝露された細胞では記録され得なかった。
【０１４７】
（ＳＣＣ−１細胞へのＢｒｄＵ取り込み）
３時間のＳＣＣＨＮ細胞のＢｒｄＵ標識ならびにＯＧＦ、パクリタキセルまたはＯＧＦおよびパクリタキセルでの２４時間の処置は、それぞれコントロールに対する陽性細胞の数の３１％、２４％および３３％の減少を示した（図２３）。薬物処置の３日後、ＢｒｄＵ陽性細胞の数は、ＯＧＦ処置培養物においてコントロールレベルから６１％減少した。ＢｒｄＵ標識細胞の数は、それぞれパクリタキセルまたはパクリタキセル−ＯＧＦ処置培養物においてコントロールのレベルから２４％および１６％減少した。
【０１４８】
（ＳＣＣＨＮの増殖に対するパクリタキセルおよびＯＧＦの効果の普遍性）
ＯＧＦおよびパクリタキセルのいずれかの薬物単独に対する、相乗的な効果の普遍性を確認するために、分化が十分でないＳＣＣＨＮ−ＣＡＬ−２７を検討した（図２４）。ＣＡＬ−２７の対数期培養物を最初に、種々の濃度（１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍ）のパクリタキセルに曝して、この因子に対するこれらの細胞の感度を評価した。培養（薬物および培地は毎日交換）中で４８時間後、１０−７、１０−８、１０−９、および１０−１０Ｍの濃度でのパクリタキセルでの処置は、コントロールのレベルから増殖を６６％、５３％、４４％および２２％減少させた。低レベルの毒性に関してＯＧＦおよびパクリタキセルの併用の大きさを検討するため、さらなる研究のために１０−１０Ｍというパクリタキセルの用量を選択した。４８時間後、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）、パクリタキセル（１０−１０Ｍ）、またはＯＧＦ（１０−６Ｍ）、およびパクリタキセル（１０−１０Ｍ）のいずれかに対するＣＡＬ−２７細胞の曝露は、それぞれコントロールの培養よりも２５％、３５％および６１％少ない細胞を示した。ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルに対する曝露を用いた細胞増殖におけるこれらの相違は、コントロールのレベルとは有意に（ｐ＜０．００１）異なり、そしてＯＧＦおよびパクリタキセルの併用は、それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１で、ＯＧＦおよびパクリタキセルで処置した培養物とは異なった。
【０１４９】
（考察）
本研究で作成したデータによって、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用は、組織培養中のＳＣＣＨＮの２つの細胞株の増殖に強力な阻害性の効果を有することが実証される。ＯＧＦおよびパクリタキセルの抗増殖性作用は、相乗作用的であって、その一部（すなわち、ＯＧＦまたはパクリタキセルの単独）の合計よりも大きい総阻害性活性をともなう。ＯＧＦでおよびパクリタキセルで個々に観察されたＳＣＣＨＮの増殖に対する抑制効果は、以前の結果と一致していた（例えば、１３、３０、３１）。細胞増殖に対するＯＧＦの作用は、ナロキソン感受性レセプターによって媒介された。ナロキソン感受性レセプターは、ＯＧＦｒであることが推定される。なぜなら、μ、δおよびκのような古典的なオピオイドレセプターに対して選択的な合成および天然のオピオイドは、本報告および初期（１３、２２）に実証されたとおり、ＳＣＣ−１の細胞複製に影響しなかったからである。ＯＧＦはまた、ＳＣＣ−１の複製に可逆的な作用を有することが見出されており、このことは、この化合物での処置が細胞毒性および細胞死をもたらさないことを示す初期の研究の結果を支持している（１３，２１）。他方では、ＳＣＣ−１細胞に対するパクリタキセルの効果は、ナロキソンによってブロックされず、逆転もされ得ず、これによってＳＣＣ−１に対するこの薬物の作用の特徴がＯＧＦの特徴とは顕著に異なることが示される。従って、これは、ＳＣＣＨＮの増殖を遅らせる生物療法剤であるＯＧＦ、および化学療法的因子であるパクリタキセルの併用を用いる有効性の最初の報告である。
【０１５０】
この報告は、詳細な研究についてＳＣＣ−１細胞に対するＯＧＦおよびパクリタキセルの効果に集中したが、ＯＧＦおよびパクリタキセルは、種々のＳＣＣＨＮ細胞株の増殖に影響することが公知である（１３，３２）。本研究によって、ＯＧＦおよびパクリタキセルがＳＣＣ−１細胞数に対して相乗的な阻害効果を有するだけでなく、同様の作用が、別のＳＣＣＨＮ細胞株ＣＡＬ−２７で見出され得ることが実証される。従って、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用は、ＳＣＣＨＮ株に対して複数の効果を有するようであり、そして十分に分化した（ＳＣＣ−１）（２５）そして十分に分化していない（ＣＡＬ−２７）（２６）ＳＣＣＨＮの両方の増殖に対して強力な阻害性の作用を有する。従って、本明細書で観察されるＯＧＦおよびパクリタキセルでの併用療法の効果はまた、他のＳＣＣＨＮ細胞株に拡大されると結論することが合理的である。
【０１５１】
パクリタキセルは、細胞周期のＧ２−Ｍ期における細胞増殖の停止を生じて、細胞死をもたらす微小管脱重合を妨げる化学療法剤である（３３、３４）。さらに、パクリタキセルは、細胞のアポトーシスを生じ続いて核の崩壊を生じる多数の細胞内事象を調節する（３５）。ＯＧＦは、アポトーシスに影響せず（２１）、しかし細胞周期のＧ０／Ｇ１期を標的することが公知である（１７）。本発明者らの実験では、パクリタキセルに対して曝露されたＳＣＣＨＮは、薬物処置の開始の３日以内にアポトーシス細胞の数の顕著な増大を生じたことが示された。薬物曝露の６日目までに、ＳＣＣＨＮ細胞の二分の一以上がアポトーシスであった。ＯＧＦは、ＳＣＣＨＮのアポトーシスに影響を有さなかったが、ＤＮＡ合成のＳ期を受けている細胞の数は有意に減少させた。従って、増殖阻害に関するＯＧＦおよびパクリタキセルの併用の効果による増強の機構は、アポトーシス経路への細胞の動員（パクリタキセルの効果）を生じる、細胞周期の遅延（ＯＧＦの効果）に関し得る。
【０１５２】
ＯＧＦが、ＳＣＣＨＮを処置するためにタキソール以外の因子と併用され得るか否かという疑問に取り組むために、ＯＧＦおよび白金アナログ：カルボプラチンの併用で予備的な研究を行なった。カルボプラチンは、インターカレーションによるＤＮＡ鎖の架橋および二機能性の共有結合的架橋の作成を生じ、これが次に細胞周期のＳ期の間のＤＮＡ合成を妨害する（３６〜３８）。この薬物は、アポトーシスの誘導を通じて細胞毒性を示すことが示されている（３９、４０）。この結果は、カルボプラチンおよびＯＧＦの併用の効果が、ＳＣＣＨＮに関して強力な阻害性の特性を有することを最初に示すものである。しかし、ＯＧＦおよびパクリタキセルで相乗作用的な作用を示したタキサンおよびＯＧＦについての場合と異なり、ＯＧＦおよびカルボプラチンは、増殖に対して相加的な効果を有した。おそらく、これらの結果によって、ＯＧＦは、抗腫瘍活性を増強するために化学療法剤（すなわち、タキサン、白金）の２つ以上のファミリーと組み合わせて用いられ得ることが示される。これらの２つの薬物の併用の作用の様式を特徴付けるためには、さらなる研究が必要である。最終の結果は、ＯＧＦが細胞増殖抑制剤であるが、パクリタキセルおよびカルボプラチンは、プログラムされた細胞死を誘導するということ、そしてＯＧＦは、アポトーシス経路へ細胞を導くことによって細胞死に寄与するということであり得る。
【０１５３】
パクリタキセルは、頭頸部の扁平上皮細胞癌の処置において活性であることが報告されており、第ＩＩ相の評価が成功している（６）。ＳＣＣＨＮの単剤治療として用いた場合、この薬物は、シスプラチンおよび５−フルオロウラシル併用療法に比較して、奏功率およびメディアン生存時間を改善した。しかし、パクリタキセルに曝露された患者のうち９１％が好中球減少を経験した。ＯＧＦは、第Ｉ相トライアルにおいて承認されているが（４１）、ＯＧＦは、ＳＣＣＨＮの処置には臨床上用いられていない。しかし、この化合物の有効性は、異種移植片の実験において実証されている（１４、１６）。この報告によって、化学療法および生物治療をＳＣＣＨＮについて新規な処置様式に組み合わせるという刺激的な可能性がもたらされる。
【０１５４】
【数６】
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【０１５５】
【数７】
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【０１５６】
【数８】
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【０１５７】
【数９】
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（実施例９）
本報告は、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用が、インビボにおいてヒトＳＣＣＨＮの増殖に影響するか否か、そして各々の化合物の有効性を超えるか否かという疑問に取り組む。腫瘍の発生率、出現、サイズおよび転移に対する、そしてＯＧＦレセプターの結合特徴に対するＯＧＦおよび／またはパクリタキセルの効果を、ヒトＳＣＣ−１細胞を用いるＳＣＣＨＮの異種移植片モデルで試験した。
【０１５８】
（材料および方法）
（細胞株）
ＵＭ−ＳＣＣ−１細胞株（ＳＣＣ−１）［８］は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉｃｈｉｇａｎのＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（所長、Ｔｈｏｍａｓ  Ｅ．Ｃａｒｅｙ博士）から入手した。細胞は、１０％ウシ胎仔血清、１．２％重炭酸ナトリウム、および抗生物質（５，０００単位／ｍｌのペニシリン、５ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍｌのネオマイシン）を補充したダルベッコのＭＥＭ（改変）培地中で増殖させた。細胞培養物は、７％ＣＯ２／９３％空気の湿潤雰囲気中で３７℃で維持した。細胞は、０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡを用いてトリプシン処理によって回収して、遠心分離し、血球計でカウントした。細胞の生存度は、トリパンブルー染色によって測定した。
【０１５９】
（動物および腫瘍細胞の移植）
Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した雄性の４週齢のｎｕ／ｎｕヌードマウスを、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅにおいて病原体なしのアイソレーター中で飼育した。全ての手順は、Ｐｅｎｎ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＩＡＣＵＣ委員会で承認されて、ＮＩＨによって確立されたガイドラインに適合された。マウスは実験の開始前に４８時間順応させた。
【０１６０】
腫瘍細胞は、右肩甲骨領域への皮下注射によってヌードマウスに接種した。皮下注射は、１マウスあたり少なくとも２×１０６個の細胞で行った；この手順に関してはマウスは麻酔しなかった。
【０１６１】
（化学療法剤の投与）
マウスの４つの群（ｎ＝１２）を、毎日１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＦ、１日おきに８ｍｇ／ｍｌのパクリタキセル；毎日１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＦおよび１日おきに８ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル、または毎日０．１ｍｌの滅菌生理食塩水の腹腔内注射を受けるように無作為に割り当てた。併用治療を受けている群では、ＯＧＦはパクリタキセルの前に注射した。投薬量は、刊行された報告に基づいて選択した［１、１７］。パクリタキセルは、ＤＭＳＯに溶解し、次いで滅菌生理食塩水に希釈した；ＯＧＦは滅菌生理食塩水に溶解した。薬物の注射は、腫瘍細胞接種の１時間後に開始した。０．１ｍｌのＤＭＳＯを毎日マウスに注射することによってＤＭＳＯ単独が腫瘍応答を変更したか否かを確認するために予備的研究を行なった；生理食塩水またはＤＭＳＯの注射の間に腫瘍増殖で相違は見出されず、従ってデータを分析のために組み合わせた。薬物の用量を決定するためにマウスを毎週秤量した。
【０１６２】
（腫瘍の増殖および転移）
マウスを腫瘍の存在について毎日観察した。可視の腫瘍が出現するまでの潜伏期間、および腫瘍が測定可能になる（すなわち、６２．５ｍｍ３）までの時間を記録した。腫瘍は、毎日ノギスを用いて測定した。腫瘍容積は、式ｗ２×１×π／６を用いて計算し、ここでは長さは最長の寸法であって、幅は長さに対して垂直の寸法である［２４］。
【０１６３】
（終了日の測定）
施設の方針およびＩＡＣＵＣガイドラインに従って、腫瘍が潰瘍化した場合、または腫瘍が直径で２ｃｍに増殖した場合、マウスを死亡させた。腫瘍細胞接種の５０日後、そして初めの腫瘍発生の約３５〜４０日後、全てのマウスを過剰のペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ）によって安楽死させ、頸椎脱臼によって殺傷したマウス（腫瘍を有する）を秤量した。腫瘍および脾臓を取り出し秤量して、リンパ節、肝臓および脾臓を転移について試験した。
【０１６４】
（レセプター結合分析）
各々の処置群におけるいくつかのマウス由来の腫瘍組織を、死亡した時点で取り出し、血液および結合組織を洗い流して、液体窒素中で直ちに凍結した。組織を、以前に公開された手順に従ってアッセイした［１６］。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて飽和結合等温線を作成した；結合親和性（Ｋｄ）および容量（Ｂｍａｘ）の値は、コンピューターソフトウェアによって得た。
【０１６５】
（ＯＧＦの血漿レベル）
終了の時点で、体幹の血液を各々の群の数匹のマウスから収集した。血漿を分離して、ＯＧＦレベルは、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ）のキットを用いて標準的なラジオイムノアッセイ手順によって測定した。血漿サンプルは、二重にアッセイした。
【０１６６】
（統計学的分析）
腫瘍の出現は、カイ二乗検定によって分析した。腫瘍出現の潜伏期間および腫瘍容積を、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析し、引き続く比較は、Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定を用いて行った。腫瘍の増殖、終了日のデータ（すなわち、体重、腫瘍重量、脾臓重量）、ＯＧＦの血漿レベル、ならびに腫瘍の結合能力および親和性は、ＡＮＯＶＡおよびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定によって比較した。
【０１６７】
ヌードマウスの生存データは、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロットを用いて分析した。腫瘍増殖は、集積したデータについて非線形性混合効果モデルを用いて分析した。
【０１６８】
（結果）
（ＳＣＣ−１腫瘍の発現および増殖）
１３日目に、生理食塩水注射したコントロール群におけるマウスのうち７５％が測定可能な腫瘍を有した場合、ＯＧＦを投与されているマウスのうち３３％が腫瘍を有した；これらの値はｐ＜０．０５で有意に異なった（表８）。パクリタキセルおよびパクリタキセル／ＯＧＦ群において測定可能な腫瘍を有したマウスはコントロールに比較して少なかった（それぞれ、６６％および７０％）が、これらの相違は、統計学的に有意ではなかった。１７日目に、コントロールマウスの１００％が測定可能な腫瘍を有した場合、ＯＧＦを投与されているマウスのうち６６％のみが腫瘍を有し、それぞれパクリタキセルおよびパクリタキセル／ＯＧＦ群において腫瘍を有したマウスはそれぞれ８３％および９０％であった；しかし、有意な相違は記録されなかった（表９）。ＳＣＣ−１細胞を接種された全てのマウスが腫瘍を発症し（表８）、腫瘍を有するコントロール群のマウスのうち１００％が１７日目までに腫瘍を有し、そして他の群のあらゆる動物が２８日目までに測定可能な腫瘍を有した。ＯＧＦを投与されているマウスが可視の腫瘍を発症するまでの潜伏期間は、７日という平均潜伏期間を有したコントロールに比較して１１日であった；この４日の遅延は、ｐ＜０．０２で有意に異なった（表８）。可視の腫瘍が出現する平均潜伏期間は、コントロール群におけるマウスとパクリタキセルおよびパクリタキセル／ＯＧＦ群におけるマウスとの間で匹敵した。腫瘍が可視になるまでの平均潜伏期間は、１４〜１７日におよび、群間で異なることはなかった。
【０１６９】
５０日の実験にわたる腫瘍容積の変化は、集積したデータについての非線形性混合効果モデルを用いて分析した（図２５）。これらの分析は、２０日目に開始するパクリタキセルマウスの顕著な減少を補償した。３つの処置群におけるマウスの腫瘍容積は、コントロールよりも有意に小さかった。さらに、併用療法を受けているマウスの腫瘍容積は、いずれかの処置単独を受けている群における腫瘍サイズよりも有意に小さかった。
【０１７０】
ＯＧＦおよびパクリタキセル／ＯＧＦ群における終了日（５０日）での腫瘍重量は、コントロールのレベルからそれぞれ２９％および６２％減少していた（表９）。５０日目の腫瘍容積の評価によって、ＯＧＦおよびパクリタキセル／ＯＧＦ群は、コントロールの値からそれぞれ３３％および６９％減少した（表９）ことが明らかになった。パクリタキセル群ではマウスの１匹だけがこの時点で生存していたので、腫瘍の重量または容積の分析を行った。５０日目のパクリタキセル／ＯＧＦ群の腫瘍の重量および容積の測定値によっても、ＯＧＦ群に存在するものからそれぞれ４７％および５３％の減少が明らかになった。
【０１７１】
（生存）
各々の群におけるマウスの生存曲線は図２７に示す。パクリタキセル／ＯＧＦを投与されている１２匹のマウスのうち２匹が、実験の開始の１週間以内に死んだ；これらの死亡原因（単数または複数）は、腫瘍の発達にも注入の過程（例えば、潰瘍形成）にも無関係であると考えられた。パクリタキセルを投与されているマウスは、処置の２０日以内に死に始めた。４０日目までに、パクリタキセルを投与されているマウスのうち７５％が死に、５０日目にはこの群のマウスの１匹しか生きていなかった。パクリタキセル／ＯＧＦ群の１匹のマウスが４２日目に死んだ。ＯＧＦ群またはコントロール群では、実験期間の間に死んだマウスはいなかった。生存曲線の統計的な比較によって、パクリタキセルマウスについての死亡率が他の全ての群から統計学的に信頼できた（ｐ＜０．０００１）ことが明らかになった。パクリタキセルマウスについての平均寿命は、他のマウスの５０日の寿命に比較して３４．３±３．１日であり（５０日＝終了日）、この相違は３つの群全てから統計学的に有意であった（ｐ＜０．００１）。
【０１７２】
（体重および全体的な観察）
全てのマウスが実験の開始時点で約２２〜２３ｇと秤量された（図２６）が、パクリタキセルを投与されているマウスは、研究の５週目に体重の１０％の減少があり、そして６週目および７週目には正常より９〜１０％下であった。終了日（すなわち、５０日）では、パクリタキセルを投与されているマウスはコントロール被験体よりも２８％少ないと秤量され、そしてＯＧＦおよびパクリタキセル／ＯＧＦ群におけるマウスより体重が有意に少なかった（ｐ＜０．００１）（表９）。コントロールの動物の体重とＯＧＦまたはパクリタキセル／ＯＧＦ群における動物の体重との間に相違は記録されなかった。
【０１７３】
パクリタキセル群におけるマウスの全体的観察によって、腹部の膨張、腸の充満および体重の重篤な減少が明らかになった。病理学的な報告によって、結腸の拡張および腹膜炎が示された；他の全ての器官系は正常と考えられた。コントロール、ＯＧＦまたはパクリタキセル／ＯＧＦ群においてマウスについて、病理学的な関連の知見は検出できなかった。
【０１７４】
脾臓重量は、群間で異なることはなかった。さらに、いずれの群においてもマウスの脾臓、肝臓または腋窩リンパ節において転移は認められなかった。
【０１７５】
（ＯＧＦｒ結合の特徴）
結合の１部位モデルを用いて、ＯＧＦｒについての特異的結合および飽和性の結合について、マウスの４つの群全てから収集した腫瘍を記録した。パクリタキセル群由来の腫瘍は、４７日〜５０日で得たが、他の全ての群由来の標本は、実験の最終日（５０日目）に回収した。ＯＧＦｒに対するＯＧＦの結合親和性（Ｋｄ）は、１．０〜２．１ｎＭにおよび、そして群間で異なることはなかった（表１０）。しかし、結合能力についての値（Ｂｍａｘ）はほとんど、コントロールの被験体に対してＯＧＦ群およびパクリタキセル群では２倍高かった（タンパク質１ｍｇあたり約１５ｆｍｏｌ）（表１０）。
【０１７６】
（ＯＧＦの血漿レベル）
ＳＣＣ−１腫瘍を保有するヌードマウスの血漿中のＯＧＦレベルは、２８２〜６１７ｐｇ／ｍｌにおよんだ。腫瘍を有するコントロールマウスと、ＯＧＦ、パクリタキセル、またはパクリタキセル／ＯＧＦで処置されたマウスとの間に相違は認められなかった。
【０１７７】
（考察）
この結果によって、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用が、ＳＣＣＨＭの十分に分化したヒト腫瘍モデルであるヌードマウスにおけるＳＣＣ−１の増殖に強力な阻害性の効果を有することが示される。ＯＧＦおよびパクリタキセルの抗増殖作用は、相乗作用的であって、総阻害活性は、部分（すなわち、ＯＧＦまたはパクリタキセル単独）の合計よりも大きかった。ＯＧＦおよびパクリタキセルの相乗作用的な効果は、腫瘍の重量および容積の測定において最も明らかであった。インビボの条件下で行ったこれらの結果は、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用が細胞数に対して相乗作用的な抑制効果を有した、組織培養中で行った初期の観察に拡大された［１３］。従って、これは、インビボにおけるＳＣＣＨＮの増殖を遅らせるために、生物療法剤であるＯＧＦ、および化学療法剤であるパクリタキセルの併用を用いることの有効性についての初めての報告である。この研究は、ＳＣＣＨＮ細胞モデルであるＳＣＣ−１に集中していたが、ＯＧＦおよびパクリタキセルは、種々のＳＣＣＨＮ細胞株の増殖に影響することが公知である［１０、１４］。従って、本明細書で観察されたＯＧＦおよびパクリタキセルでの併用療法の効果はまた、他のＳＣＣＨＮ細胞株に拡大されると結論することが合理的である。
【０１７８】
本研究で記録した重要な観察は、周知であった［７、２８］体重および生存における有意な減少で明らかになったパクリタキセルに由来する顕著な全身毒性、そして全体的病変および病理的徴候ならびにＯＧＦの同時投与によるこの毒性の軽減。しかし、ＯＧＦによるパクリタキセルの毒性の緩和は、パクリタキセルの抗腫瘍作用の減少は伴わなかった。実際、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用は、パクリタキセル単独（またはＯＧＦ単独）を超える腫瘍増殖への影響（すなわち、重量、容積）を有した。これらの結果によって、パクリタキセルの化学療法レベルは、耐性が優れており、生物療法剤であるＯＧＦと同時に投与された場合の生存と両立したことが示唆される。別の薬物の投与による１因子の毒性の緩和は、無条件ではない［３、９］。タキサンによって生じる副作用からのＯＧＦによって得られる保護という知見は、本来それ自体で、重要である。しかし、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用によって、さらに高い細胞分裂停止用量のパクリタキセルを、この因子の治療有効性を改善するために投与することが可能になり得る。実際、化学療法剤の成功はしばしば、癌細胞の内因性の耐性によって制限され、そして毒性の増大を伴わないパクリタキセルのような薬物の濃度を増大するというアベイラビリティーが有利である。結局、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用の有効性は、動物特異的であるか、そして／またはヌードマウスにおける免疫成分の欠失に起因するか否かに関しては明確でない。骨髄抑制は、化学療法の主要な副作用であるので、薬物機構の理解においてはＯＧＦ／パクリタキセル療法の免疫学的な成り行きを探索することが有用である。
【０１７９】
以前の研究では、ＳＣＣＨＮの外科的な標本が正常な粘膜よりも有意に少ないＯＧＦレセプターを有するということが示されている［１８］。ＯＧＦｒ遺伝子転写における不規則性ではなくＯＧＦｒタンパク質の翻訳／翻訳後は、レセプターのメンバーにおけるこの減少に関与し得る。ＯＧＦレセプターの数は、腫瘍サイズに依存性であり得るということ、ＳＣＣＨＮにおけるＯＧＦレセプターの進行性の減少がＯＧＦの阻害性活性を損ない、それによって加速された細胞増殖に寄与するということがこれらの著者によって想定される。本研究では、ＯＧＦまたはパクリタキセルで処置され、そしてＳＣＣＨＮを接種された動物由来の腫瘍組織は、コントロールの被験体由来の新生物組織よりも２倍以上大きい結合能力を有した。そして、統計学的に有意ではないが、パクリタキセルおよびＯＧＦの併用を受けている動物でさえ結合能力の３８％の増大を有した。ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎおよび共同研究者ら［１７］によって示された仮説が正しい場合、ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルマウスにおけるＳＣＣＨＮ腫瘍が小さいほど、抑制された細胞複製および障害の少ないＯＧＦ−ＯＧＦｒ軸という理由で、コントロールのマウスよりも多い（そしてゆっくり増殖する）ＯＧＦレセプターを有するということが理解可能である。
【０１８０】
パクリタキセルは微小管の脱重合を妨げる化学療法剤であり、細胞死をもたらす細胞周期のＧ２−Ｍ期における細胞の増殖の停止を生じる［３１、３２］。さらに、パクリタキセルは、細胞のアポトーシスを生じ、引き続き核の分解を生じる、多数の細胞内事象を調節する［２７］。ＯＧＦは、アポトーシスに影響しない［３１］が、細胞周期のＧ０／Ｇ１期を標的とする［３２］。組織培養における初期の実験では、パクリタキセルに曝されたＳＣＣＨＮがアポトーシス細胞の数の顕著な増大を生じたことが示された。従って、ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用効果によるインビボの増強された増殖阻害の機構は、アポトーシス経路への細胞の動員（パクリタキセルの効果）を生じる、細胞周期の遅延（ＯＧＦの効果）に関連し得る。
【０１８１】
パクリタキセルは、頭頸部の扁平上皮細胞癌の処置において活性であることが報告されており、第ＩＩ相の評価が成功している［４］。ＳＣＣＨＮの単剤治療として用いた場合、この薬物は、シスプラチンおよび５−フルオロウラシル併用療法に比較して、奏功率およびメディアン生存時間を改善した。しかし、パクリタキセルに曝露された患者のうち９１％が好中球減少を経験した。ＯＧＦは、第Ｉ相トライアルにおいて承認されている［２６］が、ＯＧＦは、ＳＣＣＨＮの処置には臨床上用いられていない。しかし、ＳＣＣＨＮの処置に関するこの化合物の有効性は、異種移植片の実験において実証されている［１６、１７］。この報告によって、化学療法および生物治療をＳＣＣＨＮについて新規な処置様式に組み合わせるという刺激的な可能性がもたらされる。ＯＧＦおよびパクリタキセルの併用は、異種移植片におけるＳＣＣＨＮに相乗作用的な効果を有するという前臨床の情報によって、臨床研究の見通しが考慮されるべきである。
【０１８２】
【数１０】
2007525507.tif 000018
【０１８３】
【数１１】
2007525507.tif 000019
【０１８４】
【数１２】
2007525507.tif 000020
【０１８５】
【数１３】
2007525507.tif 000021
（表８．ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルで処置したヌードマウスにおけるＳＣＣ−１扁平上皮細胞癌の腫瘍出現の発生率および潜伏期間）
【０１８６】
【表８】
2007525507.tif 000022
値は平均±ＳＥＭである。ａカイ二乗分析によってｐ＜０．０５でコントロール群と有意に異なる。ｂＡＮＯＶＡを用いてｐ＜０．０２でコントロールから有意に異なる。
【０１８７】
（表９．ＳＣＣ−１扁平上皮癌の皮下接種ならびにＯＧＦおよび／またはパクリタキセルでの処置（ｉ．ｐ．）の５０日後のヌードマウスの特徴）
【０１８８】
【表９】
2007525507.tif 000023
データは平均±ＳＥＭを意味する。Ｎ．Ａ．＝５０日目に生きていたマウスは１匹だけであったのでデータが利用不能；脾臓および体重はパクリタキセル群でのみ各々のマウスが死んだ日に計算した。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）およびｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから有意に異なる。ｐ＜０．０５（＋）およびｐ＜０．００１（＋＋＋）でＯＧＦから有意に異なる。ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）でパクリタキセル処置したマウスから有意に異なる。
【０１８９】
（表１０．ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルで処置したマウス由来のＳＣＣ−１腫瘍におけるＯＧＦｒのレセプター結合分析）
【０１９０】
【表１０】
2007525507.tif 000024
データは平均±ＳＥＭを意味する。ｐ＜０．０５（＊）でコントロールから有意に異なる。
【０１９１】
本明細書に記載される実施形態は、例示の目的でしかないこと、そしてそれに照らして種々の改変または変化が当業者に示唆され、そして本出願の趣旨および条項内に包含されるべきであるということが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】図１は、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）および／またはＯＧＦで処置されているＳＣＣ−１細胞についての９６時間増殖曲線を示すグラフである。各々のデータポイントは、１０ウェル±Ｓ．Ｅ．Ｍ．の平均吸光度に相当する。各々の時点での有意な値は、表１に見出すことができる。
【図２】図２は、カルボプラチンおよび／またはＯＧＦを補充されているＳＣＣ−１細胞についての９６時間増殖曲線を示すグラフである。各々のデータポイントは、１０ウェル±Ｓ．Ｅ．Ｍ．の平均吸光度に相当する。各々の時点での有意な値は、表２に見出すことができる。
【図３】図３は、無胸腺ヌードマウスにおけるＳＣＣ−１  ＳＣＣＨＮ細胞の増殖を示す。１の時点は、各々の処置群において腫瘍が測定可能になった最初の日を表す。腫瘍の容積は毎日記録しており、２日連続した日の平均がｘ軸上の時点に相当する。
【図４】図４は、ＳＣＣ−１  ＳＣＣＨＮ細胞を接種された無胸腺ヌードマウスの最終終末重量を示す。バーは、終了の時点（５０日）での処置群全体についての重量の平均値を示す。コントロールからの有意性ｐ＜００１（＊＊＊）、ＯＧＦからの有意性ｐ＜０．００１（＋＋＋）、そしてタキソール／ＯＧＦからの有意性、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）。
【図５】図５は、５０日の研究の経過にわたる４つの群の各々での生存しているマウスのパーセントに相当する生存曲線を示す。
【図６】図６は、ゲムシタビンおよび／またはＯＧＦで処置されているＭｉａＰａＣａ−２細胞についての９６時間増殖曲線を示すグラフである。各々のデータポイントは、１０ウェル±Ｓ．Ｅ．Ｍ．の平均吸光度に相当する。各々の時点での有意な値は、表３に見出すことができる。
【図７】図７は、５−ＦＵおよび／またはＯＧＦで処置されているＭｉａＰａＣａ−２細胞についての９６時間増殖曲線を示すグラフである。各々のデータポイントは、１０ウェル±Ｓ．Ｅ．Ｍ．の平均吸光度に相当する。各々の時点での有意な値は、表４に見出すことができる。
【図８】図８は、無胸腺ヌードマウスにおけるＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓癌細胞の増殖を示す。１の時点は、各々の処置群において腫瘍が測定可能になった最初の日を表す。腫瘍の容積は毎日記録しており、２日連続した日の平均がｘ軸上の時点に相当する。グラフは、各々の群で一旦腫瘍が測定可能になれば増殖傾向を示すことを意味する。グラフは、この傾向を示すために、測定可能な腫瘍の発達への潜伏期間を無視している。
【図９】図９は、上記の薬物レジメンの毎日の添加に供されたＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓癌細胞の対時間での増殖を示す。値は、１時点あたり４ウェルからの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．に相当する。有意な値は表５に見出され得る。
【図１０】図１０は、ＯＧＦ（１０−６Ｍ）および／またはゲムシタビン（１０−８）（Ｇｅｍｚａｒ）に９６時間供されたＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の細胞増殖アッセイを示す。薬物または等価容積の滅菌水（コントロール）を、６ウェルプレート中の播種の２４時間後（０時間）に添加した；培地および薬物は毎日交換した。データは、各々の時点での１処置あたり、少なくとも４ウェルについての平均±ＳＥＭに相当する。ｐ＜０．０１（＊＊）、およびｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから有意に相違。ｐ＜０．００１（＋＋＋）でＯＧＦ処置した培養物から有意に相違。ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）でゲムシタビン単独で処置した培養から有意に相違。
【図１１】図１１は、ＭＴＳアッセイ（９６ウェルプレート）によって測定した場合の、５−ＦＵ（１０−６Ｍ）および／またはＯＧＦ（１０−６Ｍ）で処置したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の増殖を示す。値は、各々の時点での１０ウェルについての平均吸光度±ＳＥＭに相当する。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、およびｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから有意に相違。ＯＧＦ処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．００１（＋＋＋）。５−ＦＵ処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．０１（ΛΛ）、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）。
【図１２】図１２は、ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞におけるゲムシタビンおよび／またはＯＧＦの増殖阻害性効果のレセプター媒介を示す。ＯＧＦ（１０−６Ｍ）、オピオイドアンタゴニストナロキソン（１０−６Ｍ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）（１０−８Ｍ）、またはこれらの化合物の組み合わせに供された後、ＭＴＳアッセイによって測定した場合の、９６時間でのＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の数；コントロールは等容積の滅菌水で処置した。化合物および培地を２４時間ごとに交換した。データは、９６時間での１処置あたり１０ウェルについての平均吸光度±ＳＥＭに相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．００１（＊＊＊）。ＮＳ＝有意差なし。
【図１３Ａ】図１３は、ＯＧＦおよび／またはゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）で処置したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞での増殖阻害性効果の可逆性を示す。細胞を９６ウェルプレートに播種して、薬物を用いて４８時間処置した。４８時間で、このプレートのうち半分は、さらに４８時間同じ薬物の投与を続け、このプレートの半分は、滅菌水で４８時間処置した。コントロール培養物には、９６時間にわたって滅菌水を与えた。化合物および培地は毎日交換した。Ａは、可逆性実験における細胞の増殖。Ｂは、処置群における９６時間での細胞数。全てのデータは、１処置あたり１０ウェルについての平均吸光度±ＳＥＭに相当する。薬物で維持した培養の細胞数とビヒクルで置き換えた薬物での培養の細胞数との間の比較（逆転）を示す。ＮＳ＝有意差なし。
【図１３Ｂ】図１３は、ＯＧＦおよび／またはゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）で処置したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞での増殖阻害性効果の可逆性を示す。細胞を９６ウェルプレートに播種して、薬物を用いて４８時間処置した。４８時間で、このプレートのうち半分は、さらに４８時間同じ薬物の投与を続け、このプレートの半分は、滅菌水で４８時間処置した。コントロール培養物には、９６時間にわたって滅菌水を与えた。化合物および培地は毎日交換した。Ａは、可逆性実験における細胞の増殖。Ｂは、処置群における９６時間での細胞数。全てのデータは、１処置あたり１０ウェルについての平均吸光度±ＳＥＭに相当する。薬物で維持した培養の細胞数とビヒクルで置き換えた薬物での培養の細胞数との間の比較（逆転）を示す。ＮＳ＝有意差なし。
【図１４】図１４は、１０−６Ｍという濃度で内因性および外因性の種々のオピオイドで処置した９６ウェルプレートにおいて増殖したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞の増殖を示す。データは、１処置あたり１０ウェルについて平均の吸光度値±ＳＥＭに相当する。ｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから有意に相違。
【図１５】図１５は、６ウェルプレート中で増殖したＰＡＮＣ−１細胞に対するゲムシタビン（１０−８Ｍ）（Ｇｅｍｚａｒ）および／またはＯＧＦ（１０−６Ｍ）の効果を示す。データは、処置の７２時間での４ウェルについての平均±ＳＥＭに相当する。ｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから有意に相違。ｐ＜０．０１（＋＋）でＯＧＦから、そしてｐ＜０．００１（ΛΛΛ）でゲムシタビンのそれぞれの用量から有意に相違。
【図１６Ａ】図１６は、ヌードマウスに対して異種移植したＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍の増殖を示す。動物には、１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＦを毎日、１２０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを３日ごと（Ｇｅｍｚａｒ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＧＦを毎日、および１２０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを３日ごと（Ｇｅｍｚａｒ／ＯＧＦ）、または０．１ｍｌの滅菌生理食塩水を毎日（コントロール）のいずれかを注射した。Ａ．腫瘍容積を実験の４５日間モニターした。値は、この群における全てのマウスについて平均±ＳＥＭに相当する（統計的比較についての結果を参照のこと）。Ｂ．４５日間の実験期間にわたる腫瘍増殖の速度。腫瘍容積は、対数変換して、直線の勾配を計算した。ｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから、ｐ＜０．００１（＋＋＋）でＯＧＦから、そしてｐ＜０．００１（ΛΛΛ）でゲムシタビンから有意に相違。
【図１６Ｂ】図１６は、ヌードマウスに対して異種移植したＭＩＡ  ＰａＣａ−２腫瘍の増殖を示す。動物には、１０ｍｇ／ｋｇのＯＧＦを毎日、１２０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを３日ごと（Ｇｅｍｚａｒ）；１ｍｇ／ｋｇのＯＧＦを毎日、および１２０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを３日ごと（Ｇｅｍｚａｒ／ＯＧＦ）、または０．１ｍｌの滅菌生理食塩水を毎日（コントロール）のいずれかを注射した。Ａ．腫瘍容積を実験の４５日間モニターした。値は、この群における全てのマウスについて平均±ＳＥＭに相当する（統計的比較についての結果を参照のこと）。Ｂ．４５日間の実験期間にわたる腫瘍増殖の速度。腫瘍容積は、対数変換して、直線の勾配を計算した。ｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから、ｐ＜０．００１（＋＋＋）でＯＧＦから、そしてｐ＜０．００１（ΛΛΛ）でゲムシタビンから有意に相違。
【図１７Ａ】図１７は、９６時間の期間にわたってＯＧＦ（１０−６Ｍ）および／またはパクリタキセル（１０−８Ｍ）（＝タキソール）に供されたＳＣＣ−１細胞の増殖（血球計によって測定した細胞数）を示す。６ウェルプレートへの１００，０００個の細胞の播種の２４時間後に、薬物または等容積の滅菌水（コントロール）を添加した；培地および薬物は毎日交換した。Ａ．増殖曲線データは、各々の時点での１処置あたり少なくとも４つのウェルについての平均±ＳＥに相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、およびｐ＜０．００１（＊＊＊）。ＯＧＦ処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．０１（＋＋）およびｐ＜０．００１（＋＋＋）。パクリタキセル処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）。Ｂ．増殖曲線の全体的勾配から計算した増殖の速度。データは、曲線の勾配（１時間あたりの細胞数）±ＳＥに相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）。併用療法で処置した細胞についての増殖速度もまた、ＯＧＦ処置した細胞から、ｐ＜０．０１（＋＋）で、そしてパクリタキセル単独に供された細胞から、ｐ＜０．０５（Λ）で相違した。
【図１７Ｂ】図１７は、９６時間の期間にわたってＯＧＦ（１０−６Ｍ）および／またはパクリタキセル（１０−８Ｍ）（＝タキソール）に供されたＳＣＣ−１細胞の増殖（血球計によって測定した細胞数）を示す。６ウェルプレートへの１００，０００個の細胞の播種の２４時間後に、薬物または等容積の滅菌水（コントロール）を添加した；培地および薬物は毎日交換した。Ａ．増殖曲線データは、各々の時点での１処置あたり少なくとも４つのウェルについての平均±ＳＥに相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、およびｐ＜０．００１（＊＊＊）。ＯＧＦ処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．０１（＋＋）およびｐ＜０．００１（＋＋＋）。パクリタキセル処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）。Ｂ．増殖曲線の全体的勾配から計算した増殖の速度。データは、曲線の勾配（１時間あたりの細胞数）±ＳＥに相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）。併用療法で処置した細胞についての増殖速度もまた、ＯＧＦ処置した細胞から、ｐ＜０．０１（＋＋）で、そしてパクリタキセル単独に供された細胞から、ｐ＜０．０５（Λ）で相違した。
【図１８】図１８は、ＭＴＳアッセイによって測定した場合の、カルボプラチンおよび／またはＯＧＦで処置したＳＣＣ−１細胞の増殖を示す。値は、各々の時点での１０ウェルについての平均吸光度±ＳＥに相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．００１（＊＊＊）。ＯＧＦ処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．００１（＋＋＋）。カルボプラチン処置した培養物から有意に相違、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）。
【図１９】図１９は、ＳＣＣ−１細胞におけるパクリタキセルおよび／またはＯＧＦの増殖阻害性効果のＯＧＦｒ媒介を示す。ＯＧＦ（１０−６Ｍ）、オピオイドアンタゴニストナロキソン（１０−６Ｍ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）（１０−８Ｍ）、またはこれらの化合物の組み合わせに供された後、ＭＴＳアッセイによって測定した場合の、９６時間でのＳＣＣ−１細胞の数；コントロールは等容積の滅菌水で処置した。化合物および培地は２４時間ごとに交換した。データは、１処置あたり１０ウェルについての平均吸光度±ＳＥに相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．００１（＊＊＊）。ＮＳ＝有意差なし。
【図２０】図２０は、ＯＧＦおよび／またはパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）で処置したＳＣＣ−１細胞に対する増殖阻害効果の可逆性を示す。細胞を９６ウェルプレートに播種して、薬物を用いて４８時間処置した。４８時間で、このプレートのうち半分には、さらに４８時間同じ薬物の投与を続け、このプレートの半分は、滅菌水で４８時間処置した。コントロール培養物には、９６時間にわたって滅菌水を与えた。化合物および培地は毎日交換した。Ａは、可逆性の実験における細胞の増殖。Ｂは、処置群における９６時間での細胞数。全てのデータは、１処置あたり１０ウェルについての平均吸光度±ＳＥに相当する。薬物で維持した培養の細胞数とビヒクルで置き換えた薬物での培養の細胞数との間の比較（逆転）を示す。
【図２１】図２１は、種々の内因性および外因性のオピオイドで処置したＳＣＣ−１細胞の増殖を示す。データは、１処置あたり１０ウェルについて平均の吸光度値±ＳＥに相当する。ｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから有意に相違。
【図２２】図２２は、ＯＧＦおよび／またはパクリタキセルを用いて、２４時間、７２時間〜１４４時間処置したＳＣＣ−１細胞におけるアポトーシスの評価を示す。細胞を６つのプレートに播種し、薬物で処置して、適切な時点でカスパーゼ−３を用いて染色した。カスパーゼ−３活性は、１時間あたり１処置あたり１０，０００個の細胞でフローサイトメトリーによって測定した。データは、各々の時点での各々の処置についての３つのサンプルについてのカスパーゼ陽性細胞のパーセント（平均±ＳＥ）に相当する。コントロールから有意に相違ｐ＜０．００１（＊＊＊）、そしてＯＧＦから有意に相違、ｐ＜０．００１（＋＋＋）。併用療法に曝された細胞はまた、ｐ＜０．００１（ΛΛΛ）で、パクリタキセル処置した細胞から異なった。
【図２３】図２３は、２４時間または７２時間にわたってＯＧＦおよび／またはパクリタキセルで処置したＳＣＣ−１細胞においてＢｒｄＵ取り込みをモニタリングすることによるＤＮＡ合成の評価を示す。データは、各々の時点での各々の処置について少なくとも１０００個の細胞の分析からのＢｒｄＵ陽性細胞パーセント（平均±ＳＥ）に相当する。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、およびｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから、そしてｐ＜０．００１（＋＋＋）でＯＧＦから有意に相違。
【図２４】図２４は、分化の十分でないＳＣＣＨＮ細胞株であるＣＡＬ−２７細胞に対するパクリタキセルおよび／またはＯＧＦの効果を示す。データは、処置の４８時間での４つのサンプルについての平均±ＳＥＭに相当する。ｐ＜０．００１（＊＊＊）でコントロールから、そしてｐ＜０．００１（＋＋＋）でＯＧＦから、そしてｐ＜０．０１（ΛΛ）でそれぞれの用量のパクリタキセルから有意に相違。
【図２５】集めたデータについての非直線的な混合効果モデルを用いて分析した実験の５０日にわたる腫瘍容積の変化を示す。これらの分析を行ったところ、２０日目に開始するパクリタキセルのマウスの顕著な死亡に適合した。３つの処置群の全てにおけるマウスの腫瘍容積は、コントロールよりも有意に小さかった（ｐ＜０．００１）。さらに、併用療法を受けたマウスの腫瘍容積は、いずれかの処置単独を受けた群における腫瘍サイズよりも有意に小さかった（ｐ＜０．００１）。動物には、滅菌生理食塩水（０．１ｍｌ；コントロール）毎日、ＯＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ）毎日、パクリタキセル（８ｍｇ／ｋｇ；Ｔａｘｏｌ）１日おき、またはパクリタキセルを１日おき、およびＯＧＦを毎日（Ｔａｘｏｌ／ＯＧＦ）のいずれかの腹腔内注射を与えた。
【図２６】図２６は、ＯＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および／またはパクリタキセル（８ｍｇ／ｋｇ、２日ごと；Ｔａｘｏｌ）のいずれかで処置したマウス；０．１ｍｌの滅菌生理食塩水（コントロール）を与えられたコントロール動物の体重を示す。体重は７日ごとに記録した；値は平均±ＳＥＭである。コントロール、ＯＧＦまたはタキソール群の間の体重に有意な差は記録されなかった。コントロール群からｐ＜０．０５（＊）、およびｐ＜０．００１（＊＊＊）で、そしてＯＧＦからｐ＜０．０１（＋＋）およびｐ＜０．００１（＋＋＋）で、そしてＴａｘｏｌ／ＯＧＦ群からｐ＜０．０５（Λ）、およびｐ＜０．００１（ΛΛΛ）で有意に相違。
【図２７】図２７は、頭頸部の２×１０６ＳＣＣ−１扁平上皮細胞を接種されて、ＯＧＦ（１０ｍｇ／ｋｇ、毎日）および／またはパクリタキセル（８ｍｇ／ｋｇ２日ごと；Ｔａｘｏｌ）のいずれかで処置されたマウス；０．１ｍｌの滅菌生理食塩水（コントロール）を投与されたコントロール動物の生存曲線を示す。カプランマイヤー曲線を分析して、パクリタキセルのみを投与されているマウスの生存は、他の全ての群とはｐ＜０．００１で有意に異なった。
【図１】
2007525507.tif 000025
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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