(57)【要約】  液体中に分散した粒子を、全ての粒子が同一平面内に位置するような形状に集め、集めた粒子をそのような形状のままで処理する。集めた粒子は、例えば同時に電磁放射線に曝露して、粒子に関する情報を含む応答を粒子から引き出すことができる。粒子は、例えば細胞、細胞断片、又は従来は血球計算器中で分析される種類の分析物包含ビーズとすることができる。
2007538259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体中に分散した粒子を含むサンプルの処理方法であって、
（Ａ）粒子受容器を含む処理チャンバ内にサンプルを配置するステップ；
（Ｂ）少なくとも一部の粒子を粒子受容器によって受容することにより、受容された粒子の全てを同一平面内に位置させるステップ；及び
（Ｃ）粒子受容器により受容された粒子の少なくとも一部を処理するスッテプ
を含む方法。
【請求項２】
（１）粒子を含む処理チャンバを、粒子を処理した後で廃棄すること；
（２）サンプルが、１マイクロリットル当り５,０００個ないし２５,０００個、又は１０,０００個ないし２５,０００個、又は１５,０００個ないし２５,０００個の粒子を含むこと；
（３）サンプル中の粒子を、サンプルを処理チャンバに送液する前に洗浄するか、又は改変すること；
（４）障壁部材と、障壁部材に隣接する保持部材であって、それぞれが粒子を１つだけ受容できるポケットを複数有する保持部材との間に粒子を集めること；
（５）液体サンプル自体の流れを使用して、粒子を所望の形状に配向させること；
（６）粒子の処理は、放射線源に曝露された時に粒子が発生する信号を観察することを含むこと、及び信号を処理することにより、放射線源の強度特性を少なくとも部分的に補正すること；
（７）粒子の処理は、粒子が放射線源に曝露された時に発生する信号を観察することを含むこと、及び放射線の軸と観察の軸とが同一であること；
（８）ポンプを使用して液体サンプルを送液し、且つ必要に応じて除去し、更には位置決め液を用いる場合、位置決め液の流れを制御すること、及び１以上のポンプが、作動流体により移動し且つサンプル又は位置決め液と接触する軟質膜を備えること；
（９）複数の処理チャンバを直列に配置するか、又は直列及び並列に配置すること、及び複数の処理チャンバに受容されて同一平面内に並んだ粒子を、同時に又は順次にほぼ同一の方法で試験すること；及び
（１０）処理チャンバは約４０μｍないし約１００μｍの幅及び約１０μｍないし約５０μｍの深さを有し、及び／又は処理チャンバの幅及び深さの各々が粒子サイズの２.５倍以上及び１５倍未満であること；
の内、少なくとも１の特徴を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
障壁部材が堰であり、液体が障壁部材を通過するための唯一の方法は堰を越えることであり、粒子受容器が、堰に隣接して堰と共に鈍角の角を形成し且つそれぞれが粒子を１つだけ受容できるポケットを複数有する細長い保持部材を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（Ｂ）において、液体サンプルの流れにより粒子を粒子受容器の方へ向ける、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＰＲＰが、
（ｉ）その全長に亘って１つの断面を有することにより、１以上の粒子がＥＰＲＰに流入して長軸方向に沿って通過することができ；且つ
（ｉｉ）入口導管の軸に対して３０°ないし６０°の角度を成す軸を有することにより、粒子が導管からＥＰＲＰ内へ移動することができる
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
粒子が放射線源に曝露された時に生成する信号を観察することを含み、放射線の軸と観察の軸とが同一である、請求項２ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
粒子が放射線源に曝露された時に生成する信号を観察することを含み、情報が信号の強度に依存し、フラットフィールド補正を使用して、情報の、放射線源の強度特性に対する依存を低減する、請求項２ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
処理チャンバに配置するサンプルを、原サンプルから粒子を分離し、分離した粒子を液体中に１マイクロリットル当り５ないし２５,０００個の濃度で分散させることにより調製する、請求項２ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法により粒子を含有する液体サンプルを処理するための処理チャンバであって、
（ｉ）サンプル流入口；
（ｉｉ）流入口との間に液体を流通させ、第１端及び第２端を有する細長い粒子保持流路（ＥＰＲＰ）；及び
（ｉｉｉ）ＥＰＲＰの第１端と第２端との間に位置し、液体は通過させるが処理対象の粒子は通過させない細長い障壁部材を備える細長い粒子受容器
を備える処理チャンバ。
【請求項１０】
粒子受容器が細長い保持部材を含み、細長い保持部材は、堰に隣接して堰と共に鈍角の角を形成し且つそれぞれが約２ミクロンないし約２０ミクロンの最大深さ及び約３ミクロンないし約５０ミクロンの幅を有するポケットを複数含む、請求項９に記載の処理チャンバ。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
関連出願との相関関係
本出願は、Arnold, Rakestraw, Paul及びLeungを発明者として２００４年５月１９日に本出願人により出願された同時継続出願である米国特許出願番号１０／８４９７１５号の一部継続出願である。この出願は、米国特許出願番号１０／２９５４８２の優先権を主張しており、且つ本出願人により２００３年１１月１４日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／３６５３３に関連する。米国特許出願番号１０／２９５４８２は、２００４年５月２０日にＵＳ２００４−００９６９７７号として公開され、ＰＣＴ／ＵＳ０３／３６５３３は２００４年６月３日にＷＯ２００４／０４６６９５として公開された（即ち、両方とも本出願の優先日以降に公開された）。これらの出願及び公開の各々の開示内容全体を、参照によりあらゆる目的のために本明細書に包含する。
【０００２】
背景
本発明は粒子の処理に関し、従来細胞数測定により試験される粒子の試験を含むがそれに限定されない。
フローサイトメトリは生命科学研究及び臨床的診断の分野において、細胞及び分析物の付着したビーズを含む粒子の分析に広範に用いられている。細胞数測定の短所は、各粒子を個々に試験しなければならないことである。粒子試験のその他の方法は、例えば、ＷＯ００／１２１２３、ＷＯ０１／３８８６５、ＷＯ０３／０８５３７９、米国特許第６４０６８４８号、及びNature Biotechnology (2000), 18, 630-634, Brenner, S等及びAnal. Chem. (2000), 72, 1144-1147, Kitamori, T.等に開示されている。
【０００３】
発明の概要
ＷＯ２００４／０４６６９５は、液体中に分散した粒子を全ての粒子が同一平面内に位置するような形状に集め、集めた粒子をそのままの形状で処理する方法、装置及びシステムを開示している。例えば、殆ど全ての粒子を同時に電磁放射線に曝露して、粒子に関する情報を含む応答を粒子から引き出す。
本明細書は、ＷＯ２００４／０４６６９５には開示されていないが、ＷＯ２００４／０４６６９５に開示された方法、装置及びシステムを改善するか又は修正するために用いることが可能な多数の新規の特徴を開示する。これら新規の特徴は以下の項目を含むがこれらに限定されない。
（１）粒子を処理した後で粒子を含む処理チャンバを廃棄することにより、処理チャンバの再使用を妨害する残留物質の危険を全て回避する。
（２）サンプルは１マイクロリットル当り、５個ないし約３５,０００個、例えば５,０００個ないし２５,０００個、又は１０,０００個ないし２５,０００個、又は１５,０００個ないし２５,０００個の粒子を含むことができる。
（３）サンプル中の粒子は処理チャンバに送達する前に洗浄するか、そうでない場合は改変する。
（４）障壁部材と障壁部材に隣接する保持部材との間に粒子を集め、保持部材は、個々の粒子の位置決めを補助して所望の形状を形成するような形状に形成される。例えば、保持部材は、各々が１つの粒子を受容できる複数のポケットを備える。
（５）位置決め液を用いる代わりに又は位置決め液を用いることに加えて、液体サンプル自体の流れを使用して粒子を所望の形状に方向付ける。
（６）粒子の処理は、放射線源に曝露された時に粒子が生成する信号を観察することを含み、放射線源の強度特性を少なくとも部分的に補正するステップを実行する。
（７）粒子の処理は、放射線源に曝露された時に粒子が生成する信号を観察することを含み、放射線の軸と観察の軸とは同一である（本明細書では共焦点試験と称する）。
（８）液体サンプルを送液するため、及び必要に応じて除去するため、並びに位置決め液を用いる場合は位置決め液の流れを制御するためにポンプを使用し、ポンプのうちの１又は複数は、作動流体により移動し且つサンプル又は位置決め液と接触する軟質膜（隔膜としても知られる）を備える。
（９）複数の処理チャンバは直列に配置されるか、又は直列と並列とに配置され、異なる処理チャンバのうちの複数、好ましくは全てに受容された粒子は同一平面内に並び、同時に又はほぼ同一の方法で順次試験される。
（１０）処理チャンバは約４０μｍないし約１００μｍの幅及び約１０μｍないし約５０μｍの奥行きを有する及び／又は処理チャンバの幅及び奥行きの各々が粒子サイズの２.５倍以上１５倍未満、例えば４倍以上１０倍未満である。
上記特徴（１）ないし（１０）のうち２つ以上の特徴を組み合わせて用いることができる。
【０００４】
１以上の国内特許出願を行なう際に、ＷＯ２００４／０４６６９５及びこの出願明細書の一方又は両方に基づいて、ＷＯ２００４／０４６６９５に開示された方法及び装置、並びに同出願に開示された新規な特徴の優先権を主張する際の方法に関する各国の法律及び手続き、並びにヨーロッパ特許条約による同様の法律及び手続きは様々に異なっている。本明細書において、本発明は、任意に選択できる特徴である特徴（１）ないし（１０）によって、ＷＯ２００４／０４６６９５に基づいて広義に定義及び特許請求されている。ＷＯ２００４／０４６６９５に基づく国内出願又はヨーロッパ出願に特許付与される開示内容及び／又は特許請求項に関して、これが許可されない国では、本出願人は、本明細書の本発明と同様の方法で、しかしながら上記国内出願又はヨーロッパ出願に適用される法律及び慣例に則って、（１）本発明が、本明細書に開示された新規の特徴の１以上に限定されない限りにおいて、それまでに規定及び特許請求された本発明の「限定修正」、及び／又は（２）ＷＯ２００４／０４６６９５に基づく対応国内出願又はヨーロッパ出願に許可された特許請求項の「限定修正」、及び／又は（３）ＷＯ２００４／０４６６９５中に明示的に開示された主題の「限定修正」、及び／又は（４）最終的「限定修正」に従って、本明細書の本発明を規定及び特許請求する。
【０００５】
第１の好ましい態様において、本発明は粒子処理方法を提供し、本方法は：
（Ａ）液体中に分散した粒子を含むサンプルを、粒子受容器を含む処理チャンバ内へ配置するステップ；
（Ｂ）配置されたサンプル中の粒子の少なくとも一部を粒子受容器によって受容させることにより、受容された粒子の全てが同一平面内に位置させるステップ；及び
（Ｃ）粒子受容器により受容された粒子の少なくとも一部を処理するステップ
を含む。
方法は（Ｄ）処理チャンバから粒子を除去することにより、処理チャンバの再使用を可能にするステップを含むことができる。代替的に、粒子を含む処理チャンバをステップ（Ｃ）の後で廃棄することができる。ステップ（Ｄ）における「粒子の除去」という用語を使用する場合、元の状態又は変化した状態の粒子の除去を含む。
【０００６】
第２の好ましい態様において、本発明は新規の処理チャンバを提供し、本チャンバは：
（ｉ）サンプル流入口；
（ｉｉ）流入口から流体が流れ込む、第１端及び第２端を有する細長い粒子保持流路（ＥＰＲＰ）；及び
（ｉｉｉ）液体は通過させるが、処理粒子、例えば０.１ミクロンないし５０ミクロンの範囲から選択されたサイズより大きいサイズを有する粒子、好ましくは１ミクロンないし２０ミクロンの範囲から選択されたサイズより大きいサイズを有する粒子は通過させない細長い障壁部材を備えた、ＥＰＲＰの第１端と第２端との間の細長い粒子受容器；
を備える。
このような処理チャンバにおいて、粒子を含む液体を障壁部材の方へ向かわせることができ、それによって粒子は粒子受容器に受容され、液体は障壁部材を通過する。
【０００７】
第３の好ましい態様において、本発明は、本発明の第１の態様の方法を実行する装置を提供し、本装置は、本発明の第２の態様による処理チャンバ及び受容器により受容された粒子を処理する手段、好ましくは粒子に関する情報を含む応答を粒子から引き出す電磁放射線源を備える。用語「装置」は広義に使用され、複数の共働する部分を備えるあらゆるシステムを含む。
本発明を添付図面に例示する。これらの図面は、図１１及び図１２を除いて概略図であり、実際の縮尺に対応するものではない。
ＷＯ２００４／０４６６９５の図１ないし図１５及び明細書は本発明をさらに説明する。
【０００８】
本発明の詳細な説明
上記の発明の概要、本発明の詳細な説明、特許請求の範囲、及び添付図面において、例えば構成要素、成分、機器、装置、システム、ステップ、及び実施形態を含む本発明の特定の特徴を参照する。本明細書の本発明の開示には、それら特定の特徴の全ての可能な組み合わせが含まれることを理解されたい。例えば、本発明の１つの特定の態様又は実施形態、１つの特定の図面、或いは１つの特定の特許請求項に関連して１つの特定の特徴が開示される場合、その特徴は、本発明の他の特定の態様及び実施形態と組み合わせて、及び／又はそれらとの関連で、及び本発明に汎用的に、可能な限りの程度まで用いることができる。本明細書において特許請求される本発明には、本明細書中に特に記載されていないけれども、本明細書中に特に記載された特徴と同一、同等又は同様の機能を提供する特徴の使用も含まれる。
本明細書で使用される用語「備える」、「含む」及びそれらの文法的同意語は、用語「備える」、「含む」の後に特に列挙される構成要素、成分、ステップに加えて、場合によっては他の構成要素、成分、ステップ等が存在することを意味する。例えば、構成要素Ａ、Ｂ及びＣを「備える」（又は「含む」）システムは、構成要素Ａ、Ｂ及びＣだけを含むことができるか、又は構成要素Ａ、Ｂ及びＣだけでなく１以上のその他の構成要素を含むことができる。本明細書において２つ以上の規定されたステップを含む方法に言及する場合、文脈上矛盾しない限り、規定されたステップはいかなる順序ででも又は同時に実行することができ、方法は規定されたステップのいずれかの前に、規定されたステップのうちの２つのステップの間に、又は全ての規定されたステップの後に実行される１以上のその他のステップを含むことができる。表現「少なくとも」の後に数字が続く場合、本明細書では、その数字で始まる範囲の始めが示される（この範囲は、規定される変数によって、上限を有しても有さなくてもよい）。例えば、「少なくとも１」は、１又は１を超える数量を意味し、「少なくとも８０％」は８０％又は８０％を超える割合を意味する。「多くとも」の後に数字が続く場合、本明細書では、その数字で終わる範囲の終わりが示される（この範囲は、規定される変数によって、その下限値として１又は０を有する範囲でも下限値を有さない範囲でもよい）。例えば、「多くとも４」は４又は４未満の数量を意味し、「多くとも４０％」は４０％又は４０％未満の割合を意味する。本明細書において、ある範囲が「（第１の数字）ないし（第２の数字）」又は「（第１の数字）〜（第２の数字）」で与えられる場合、これはその範囲の下限が第１の数字であり、上限が第２の数字であることを意味する。本明細書中の数字は、文脈上及び表現上適切な許容範囲を伴うものと解釈されるべきである。本明細書で使用される「複数の」又は「複数」という用語は、２以上を意味する。「細長い」という表現は、本明細書では、１つの寸法（長さ）が、その他の寸法の各々より有意に大きい寸法、好ましくは少なくとも４倍、例えば６倍である寸法を有する物品又は流路を指すために用いる。本明細書で使用される略語「ＥＰＲＰ」は、細長い粒子保持流路を指す。
【０００９】
本明細書において「１つの」又は「その」特徴を指す場合、文脈上矛盾しない限り、そのような特徴は単一である場合も、複数である場合もある。例えば、本明細書で特徴のリストから選択された特徴を指す場合、文脈上矛盾しない限り、特徴は列挙された特徴の内の単一の特徴であるか又は２つ以上の特徴であり得ることを理解されたい。
本明細書において第１の特徴及び／又は第２の特徴に言及する場合、文脈上矛盾しない限り、そのような用語はそれらの特徴を便宜上識別するために用いられているのであり、それらの特徴の一方又は両方が存在し得ることを意味し、両方の特徴が存在する場合、それらは同一であっても異なってもよいことを理解されたい。
本明細書において２つ以上の構成要素（又は部分）に言及する場合、文脈上矛盾しない限り、それらの構成要素は互いに分離しているか、或いは単一の構造又は２つ以上の特定の構成要素として作用する単一の構成要素の一体的部分であり得ることを理解されたい。
【００１０】
粒子
ＷＯ２００４／０４６６９５の３ページ２４行目から４ページ１４行目に、本発明に用いることが可能な粒子が詳細に開示されている。
【００１１】
サンプルの調製、前処理及び希釈又は濃縮
サンプルはサンプル源からいかなる方法によっても調製することができる。例えば、マルチポートロータバルブをサンプル源、ポンプ、サンプルループ、廃液溜め、及び送液導管に接続することができる。バルブの第１位置において、粒子を含む液体をサンプル源からサンプルループ中へポンピングする（液体の量は、サンプルループを確実に満たすため、サンプルループを満たすのに必要な量より大きいことが好ましい）。余剰の液体流は廃液溜めへ流れる。バルブの第２位置において、サンプルは、送液導管内を処理チャンバへ向かってポンピングされる。
場合によっては、サンプルを処理チャンバへ送達する前に、サンプル中の粒子を洗浄する及び／又は修正することが望ましい。このような場合、サンプルは、例えば、液体は通過できるが粒子は保持される前処理チャンバへ送達することができ、この前処理チャンバは、例えば処理チャンバ中に用いられる種類の障壁部材を含む細長い前処理チャンバである。粒子は単一の液体に接触させることができるか、又は２つ以上の液体に連続的に接触させることができる。液体は、単に粒子を洗浄して原サンプル中の望ましくない構成要素、例えば分析用混合物の過剰な構成要素を除去することができる、及び／又は粒子中に何らかの望ましい変化、例えば化学反応を生じさせることができ、この場合、洗浄液は反応が完了するために必要な時間に亘って粒子全体に流される。単一反応又は一連の反応を実行することができる。場合によっては、粒子からの信号を観察することにより反応の進行をモニタリングすることができる（例えば、反応連鎖の一部として適切な蛍光体を添加する場合）。処理された粒子は適切な液体を逆流させることにより前処理チャンバから除去することができる。
【００１２】
場合によっては、サンプルを処理チャンバに送達する前に、サンプル中の粒子の濃度を増減させることが望ましい。このような場合、希釈チャンバにサンプルを送達し、サンプルに追加の液体を添加することができる。粒子を洗浄するか、又は前処理した場合、粒子は、望ましい濃度に対応する容積を有する希釈チャンバへと、前処理チャンバから流し出すことができる。
例えば、ＥＰＲＰが１００ないし５００の粒子滞留部位を含み、４ｎＬないし２０ｎＬの容積を有する場合、好ましいサンプルは１マイクロリットル当り約２５,０００個の粒子を含む。２５マイクロリットルの容積中に約３００個の粒子を含む原サンプルを用いてそのような濃度を達成するため、原サンプル中の粒子を、例えば粒子を保持する堰に原サンプル中の液体を通過させることにより分離し、その後適切な容積（例えば、ＥＰＲＰの設計により、数１０ｎＬの容積）を有する希釈チャンバに流し込む。
【００１３】
細長い粒子保持流路（ＥＰＲＰ）
ＥＰＲＰは直線状であるか、或いは直線部分と曲線部分とを含み、従って例えば蛇行しているか、又は連続的な曲線状とすることができる。ＥＰＲＰの断面は一定であることが好ましいが、部分的に丸いか、又は長方形（正方形を含む）であるなど、いかなる形状であってもよい。流路は、例えば約１０ミクロンないし約１００ミクロンの長さ、例えば約４０ミクロンないし約１００ミクロンの幅及び１０ミクロンないし５０ミクロンの深さを有していてよく、よって粒子を含む液体は流路を自由に流れることができ、その際サンプルの容積を最小化することができる。好ましくは、各ＥＰＲＰの長さは、粒子サイズの少なくとも約２.５倍、特に少なくとも約４倍である。
処理チャンバは単一のＥＰＲＰ又は、同一平面内にあって好ましくは互いに平行な複数のＥＰＲＰを備えることができる。処理チャンバが複数のＥＰＲＰを備える場合、隣接するＥＰＲＰは、それらＥＰＲＰの一方又は両方に細長い粒子受容器を提供する細長い壁を共有することができる。処理チャンバが複数のＥＰＲＰを備える場合、それら全てが単一の流入口との間に液体を流通させることができるか、又は各々が１以上のＥＰＲＰと連絡する複数の異なる流入口を設けることができる。
ＥＰＲＰに関する更なる情報は、ＷＯ２００４／０４６６９５の４ページ１６行目から６ページ２１行目に提供されている。
【００１４】
補助チャンバ
処理チャンバは少なくとも１つの細長い補助チャンバを含むことができ、この補助チャンバはＥＰＲＰと並んで動作し、（ｉ）障壁部材を越えた又は通過した液体を受容するか、又は（ｉｉ）ＥＰＲＰに送達される液体の貯槽として機能する。隣接する細長い壁を共有する複数の平行なＥＰＲＰが存在する場合、補助チャンバは最も外側のＥＰＲＰと並んで動作する。補助チャンバはＥＰＲＰの長さ方向に沿って処理の均一性を改善する。
障壁部材
本発明の好ましい実施形態において、障壁部材は堰であり、堰の上の隙間は保持される粒子のサイズより小さい。粒子は堰に当たると堰の上端の線の位置で受容される。障壁部材に関する更なる情報は、ＷＯ２００４／０４６６９５の４ページ３０行目から５ページ２４行目に提供されている。
【００１５】
粒子受容用のポケット
障壁部材及び／又は保持部材は、任意で個々の粒子を所望の形状に配置するのを補助するような形状にすることができ、例えば複数のポケットを備え、各ポケットに１つのみの粒子を受容することができる。ポケットに関する更なる情報は、ＷＯ２００４／０４６６９５の５ページ１０行目から２０行目に提供されている。
処理チャンバの製造
処理チャンバは、ＷＯ２００４／０４６６９５の６ページ１２行目から２１行目に記載されているように、簡単に製造することができる。
一部の実施形態において、処理チャンバの頂部部材及び底部部材は、互いに封着されているが、分離できる。このとき、多数の異なる頂部部材から選択された１つと、単一の底部部材とを用いることができるか、又は多数の異なる底部部材から選択された１つと、単一の頂部部材とを用いることができる。このようにして、頂部部材及び底部部材のうちの一方のみが粒子の位置決めを行うためのポケットを含む場合、処理される粒子のサイズが変化するとき、粒子の位置決めを行うためのポケットを含む部材を、違うサイズのポケットを有する別の部材で置き換えることができる。加えて、いずれかの部材が汚染されたか又は損傷した場合、それを交換することができる。
【００１６】
受容器による粒子の受容
一部の実施形態では、例えばＷＯ２００４／０４６６９５の６ページ２３行目ないし３０行目に記載されているように、位置決め液を用いて粒子を受容器の方へ向ける。粒子を処理した後、位置決め液の流れの方向を反転させてＥＰＲＰからの粒子の除去を補助することができる。
位置決め液を使用する代わりに又は位置決め液の使用に加えて、ＥＰＲＰ内を通る液体サンプル自体の流れを使用して、粒子受容器へ粒子を方向付けることができる。これは、例えば処理チャンバの流入口から流出口へのサンプルの流れの方向に対してＥＰＲＰを適切に配置することにより及び／又は処理チャンバ内の液体のポンピングを適切に制御することにより、実行することができる。
【００１７】
液体サンプル自体の流れを使用して粒子受容器の方へ粒子を方向付ける一実施形態において、処理チャンバは流入口及び流出口を備え、流入口は同一平面内に位置する平行な複数のＥＰＲＰが接続された入口導管に接続されている。複数のＥＰＲＰの各々は、
（ｉ）その全長に亘って同じ断面を有するので、ＥＰＲＰに流入した１以上の粒子は長軸方向に沿ってＥＰＲＰを通り抜けることができ、且つ
（ｉｉ）入口導管の軸に対して一定の角度を形成する軸を有し、よって粒子が導管からＥＰＲＰ内へ移動することができ、この場合角度は広範囲、例えば３０°〜１５０°の間で変化させることができるが、３０°〜６０°、例えば４５°が便利であることが多いので、粒子は入口導管からＥＰＲＰ中へ流入するとき鈍角の流路を流れる。
各ＥＰＲＰの長さは（この実施形態及び他の一部の実施形態において）、粒子サイズの好ましくは少なくとも約２.５倍、好ましくは少なくとも約４倍、例えば２.５倍ないし１５倍又は４倍ないし１０倍である。ＥＰＲＰの各々に流入する液体は障壁部材を越えて補助チャンバに流入し、全ての補助チャンバは、流出口に接続する出口導管に接続する。流出口は、必要に応じて、望ましい流量の維持を補助し、粒子のＥＰＲＰ内への引き込みを補助するポンプに接続する。同一平面内に位置し、互いに平行なＥＰＲＰの組が２つ以上存在することができる。例えば、それらは、各組のＥＰＲＰが互いに鏡像関係にあり、且つそれらの間に走る出口導管を共有する２組のＥＰＲＰ群とすることができる。補助チャンバの各々がそれに関連するＥＰＲＰとほぼ同一であるが鏡像関係にある場合、システムは逆方向の流れを有するように操作することができ、その場合出口導管が入口導管となり、入口導管が出口導管となり、補助チャンバがＥＰＲＰとなり、ＥＰＲＰが補助チャンバとなる。このような配置を図４ないし図７に示す。
【００１８】
別の実施形態において、処理チャンバは複数のポンプに接続し、各々のポンプは処理チャンバ中の液体に正圧及び／又は負圧をかけて、粒子を粒子受容器の方へ又は粒子受容器とは反対の方向へ動かすことができる。好ましくは、処理チャンバは、（１）サンプルを処理チャンバの流入口へ送達するときの流量の主要な制御を行う送達ポンプ、及び（２）位置決め液がＥＰＲＰを通るときの流量及び方向の主要な制御を行う第１及び第２位置決めポンプに接続される。送達ポンプはまた、処理後の粒子を除去するときの流量の主要な制御を行うことができる。好ましくは、処理チャンバはまた、液体をＥＰＲＰから除去するときの流量の主要な制御を行う抽出ポンプに接続される。操作方法によっては他のポンプも液体流の流量及び方向に影響し得るため、上記の「主要な制御」という表現を使用した。
電空式アクチュエータを用いて複数の異なるポンプを制御することにより、処理チャンバ内の液体流を望ましい順序に並べることができる。正しい構成により、サンプルを供給し、次いで分析チャンバに同時に配置することができる。例えば、サンプルをＥＰＲＰに充填するとき、サンプルの流入口ラインに正の圧力低下がなければならず、流出口ラインに負の圧力低下（即ち、吸引）がなければならない。そうすることによって、サンプル中の粒子を粒子受容器の方へ押すことができる。この過程の間、サンプル流出口ラインを加圧することにより、ＥＰＲＰから液が出て行くのを抑制又は防止することができる。種々のラインにおいて適切な圧力設定を選択することにより、サンプル微粒子の損失を最小限に抑えながらＥＰＲＰから不純物の除去を補助することができる。本発明者らは、特にＥＰＲＰの汚染の低減において、ステップ（Ａ）ないしステップ（Ｃ）の内の１以上のステップの少なくとも一部の間に、ＥＰＲＰから液体サンプルの少量を除去することが有用であることを見出した。除去の速度は、例えばステップ（Ａ）の間のサンプル供給速度の０.０５倍ないし０.２倍とすることができる。
【００１９】
適切に圧力が制御された構成において、多数の電空式アクチュエータを用いることにより、広い操作圧力範囲、一般的に０ｐｓｉないし１００ｐｓｉ（０ｋｇ／ｃｍ２ないし７ｋｇ／ｃｍ２）にわたる圧力水頭を提供することができ、それにより大容積のサンプルの処理及び／又は洗浄に高い流量を用いることが可能となる。例えば、種々のラインで圧力を０ｐｓｉないし６０ｐｓｉ（０ｋｇ／ｃｍ２ないし４.２ｋｇ／ｃｍ２）に設定することにより、サンプル充填のために最大６０ｐｓｉ（４.２ｋｇ／ｃｍ２）の圧力低下が可能となり、且つサンプル排出のための出水量を最大にするために流入口ライン及び位置決め流出口ラインにおいて最大１００ｐｓｉ（７ｋｇ／ｃｍ２）の圧力低下が可能となる。比較的大量（例えば、１０μＬないし２０μＬ）のサンプル液を短時間（例えば、１分未満）で処理することができる。サンプル充填過程及びサンプル排出過程を循環式に繰り返すことにより、多数のサイクルで少量の処理をすることができる。別法では、全ての粒子を１回のサンプル充填過程で捕捉することができる。単一回捕捉モードでは、処理は単純であり、サンプル充填ステップが終了した後に単一の検出ステップのみを必要とする。しかしながら、サンプルの充填時間が長くなると、粒子及び粒子受容器に固着するサンプル中の小さい物質が捕捉される傾向にあり、その結果排出ステップにおける粒子の除去が困難になる場合がある。循環式充填モードにおいては、捕捉される小さな固着性物質の量が少なく、粒子は比較的容易に除去される。多数の充填サイクルに対して多数の検出ステップが必要であり、流体システムに重大な一時的遅延が生じた場合、循環式ステップの制御が複雑化する可能性がある。
一部の実施形態では、ＷＯ２００４／０４６６９５の６ページ３１行目ないし７ページ２行目に記載されているように、粒子は電気的特性を有しており、この電気的特性を使用して粒子を受容器の方へ方向付けることができる。
【００２０】
受容された粒子の処理方法
例えば、ＷＯ２００４／０４６６９５の７ページ４行目ないし８ページ９行目に開示されているように、粒子受容器によって受容された粒子は、あらゆる適切な技術を用いて処理することができる。
粒子の処理に粒子により生成された信号の強度測定を利用する場合、放射線源の強度特性を少なくとも部分的に補正するステップを実行することが望ましい。これは、例えば、別個の正規化手順により行うことができ、この手順では、（ａ）粒子を検査するために用いる（又は既に用いた）光源が、受容した粒子を含む面積と同等の面積、好ましくは受容した粒子を含む面積より幾分大きい面積、例えば２５％大きい面積を照明し、且つ均一な蛍光材料、例えば液体又はゲルから成っており、且つ（ｂ）粒子を検査するとき、使用する（又は既に使用した）検出システムにより、結果として得られる信号が観察される。蛍光領域は、例えば処理チャンバに物理的に取り付けられた別のチャンバにより、又は希釈チャンバのように、粒子処理の間に用いられるが、正規化過程実行のために分離されて蛍光材料で充填されるチャンバにより提供される。この正規化過程の結果は、受容されたサンプル粒子から得られる信号の正規化に用いられる。図１１及び図１２はこのようにして得ることが可能な改善を例示している。
【００２１】
いくつかの種類の試験において、例えばＷＯ２００４／０４６６９５の図１４及び図１５に示されるように、照明の軸とは異なる軸に沿って粒子から蛍光が観察される。そのような試験を本明細書では軸外し試験と称する。他の種類の試験においては、例えば図８に示すように、観察の軸と照明の軸は同一である。そのような試験を本明細書では共焦点試験と称する。
軸外し試験の結果得られる画像では、粒子の一方の側に影ができてしまう。これに対して共焦点試験では影なしの画像が提供される。異なる画像を図９及び図１０に例示する。これらの事実により、（ａ）放射線に対する応答が粒子（例えば、色素注入粒子）全体でほぼ均一であり、従って中心が最も明るいガウス特性を有する強度の画像を生成する粒子、及び（ｂ）放射線に対する応答が粒子（例えば、複合化粒子）の表面だけで起こっており、従って中心より周辺が明るい画像を生成する粒子の識別のために、共焦点試験を用いることが可能となる。このことにより、コード化色素を注入された粒子であって、分析物と反応した場合に信号色素と複合化しており、よってコード化色素と信号色素が放射線に対して異なる応答を行う粒子、例えばレーザに暴露されたときに異なる蛍光信号を発生するような粒子を使用することが可能になる。そのような粒子は、第１フィルタによりコード化色素を識別し、次いで第２フィルタにより信号色素の濃度を同定することにより試験することができる。
【００２２】
例えばＷＯ２００４／０４６６９５の２７ページ２７行目ないし２８ページ５行目に開示されているように、受容された粒子を処理することにより、粒子（例えば、粒子の一部を形成する分析物断片）の一部又は全部を物理的及び／又は化学的に変化させることもできる。
処理チャンバを、サンプルの調製、前濃縮、抽出及び洗浄に用いることもできる。低濃度の標的分析物と、背景濃度の高い分析物との識別は、処理チャンバ内に配置した粒子捕捉にサンプルを通過させることにより達成することができる。
【００２３】
ポンプ
ポンプは、通常、液体サンプルの送達及び除去に用いられ、位置決め液を用いる場合、位置決め液の流れを制御するために用いられる。好ましくは、ポンプは空圧式又は電気浸透式（動電式としても知られる）ポンプである。そのようなポンプは精密に制御することができ、非常に少量の液体、例えば１サイクル当り約１００ピコリットルないし約１００ナノリットルの液体を正確に導入することができる。１以上のポンプがサンプル又は位置決め液に直接作用することができる。代替的に又は追加的に、１以上のポンプは、作動流体により移動し且つサンプル又は位置決め液と接触する軟質膜（隔膜としても知られる）を備えることができる。このことにより、位置決め液として用いるには不十分である作動流体を有するポンプ、或いはサンプル用又は位置決め液用には不十分なポンプを用いることが可能になる。また、ポンプ間にクロストークを生じさせること無くＥＰＲＰ内の流れを直交方向に制御することができる。適切な電気浸透式ポンプが、例えば米国特許第６２７７２５７号、同第６０１３１６４号及び同第３９２３４２６号、米国特許出願第２００４／００７４７６８号及び第２００４／００７４７８４号、及びＷＯ２００４／０３６０４に記載されており、それら特許文献の開示内容全体を、参照により本明細書に包含する。
方法
本発明の方法のステップに関する更なる情報が、ＷＯ２００４／０４６６９５の８ページ２１行目ないし２８行目に提供されている。
【００２４】
並列及び／又は直列に接続された処理チャンバ
複数の処理チャンバを並列及び／又は直列に配置することができ、よって、好ましくは、複数の異なる処理チャンバ、好ましくは全ての異なる処理チャンバに受容される粒子の一部、好ましくは全てが同一平面内に並ぶことにより、同時に又は順次にほぼ同じ方法で試験することができる。直列接続された処理チャンバは単一の流入口に接続されるので、それらはほぼ同一のサンプルを受容する。位置決め液を用いる場合、それは同一供給源から供給することができるが、分岐管を介して各処理チャンバに分かれるように供給することができるか、又は２つ以上の処理チャンバを順番に流れるように供給することができる。複数の処理チャンバの使用に関する更なる情報は、ＷＯ２００４／０４６６９５の８ページ３０行目ないし９ページ９行目により提供される。
【実施例】
【００２５】
本発明を添付図面に例示する。図面中、同一又は同様の構成要素は同一の参照番号で示す。
図１及び図２は、堰１５に隣接する頂部部材２中にポケット１５１を有する処理チャンバの部分断面図である。
【００２６】
図３は、ＷＯ２００４／０４６６９５の図１５と同様であるが、はるかに多数の方向転換部を有し、１サイクル当り多数の粒子を処理することができる。サンプルは流入口１１から流入し、流出口１２から流出する。位置決め液は流入口１６から流入し、流出口１７から流出する。
図４ないし図７は、液体サンプルの流れによって粒子の位置決めが行われる処理チャンバを示す。複数のＥＰＲＰ１２ａ１／ａ２、１２ｂ１／ｂ２、・・・は、それらの間に平行な堰１４ａ、１４ｂ、・・・を伴って２つ一組で配置される。ＥＰＲＰ１２ａ２及び１２ｂ１、１２ｂ２及び１２ｃ１・・・の間にも、平行な堰１４ａ／ａ’、１４ｂ／ｂ’、・・・が存在する。各対の１番目のＥＰＲＰは、粒子を包含するサンプルの流入口１１に接続する分岐管１１１に一定の角度で接続する。各対の２番目のＥＰＲＰは、堰を越えて２番目のＥＰＲＰに流入し、粒子を有さない液体の流出口１３に接続する出口導管１３１に一定の角度で接続し、補助チャンバとして機能する。粒子はＥＰＲＰ１２ａ１、１２ｂ１、・・・に流入してそれらＥＰＲＰを通過し、堰に保持される。受容された粒子は、処理後、液体流を逆流させることにより除去することができる。液体の逆流は２番目の粒子を包むサンプルにより提供することができ、よって２番目のＥＰＲＰが２番目の粒子を保持し、このとき１番目のＥＰＲＰは補助チャンバとして機能する。
【００２７】
図８は、ＥＰＲＰ中に保持された粒子の共焦点試験を示す。レーザ５２が選択された波長を有する散乱光を二色性反射器５９に当て、光学素子５６を介して粒子に当てる。粒子により発せられた光（散乱光とは異なる波長、一般に散乱光より長い波長）を検出器６０により集光して分析する。
図９ないし図１０は、ＥＰＲＰにより保持された粒子の軸外し照明により得られる一般的な結果（図９）及び共焦点照明による一般的な結果（図１０）を示す。
【００２８】
図１１は、粒子から得られる信号が入射光の強度に依存するときの、信号のフラットフィールド補正が行われなかった場合の、色素注入粒子からの信号強度の一般的な結果を示し、これは５０％を超える偏差を伴う。図１２は、フラットフィールド補正が行われた場合の、同様の試験データを示し、この場合偏差は約１６％である。
図１３は、隔膜含有ポンプを使用した、処理チャンバへのサンプル及び位置決め液送達の制御及び処理チャンバからの除去の制御を示す。サンプルポンプ２は、隔膜２１１及び２１２により閉じ込められたポンプ液２１０を含み、そのポンプ液の動きにより粒子を包含する液体２１５はＥＰＲＰ１２を含む処理チャンバまで送達される。サンプルポンプ４は隔膜４１１及び４１２により閉じ込められたポンプ液４１２を含み、そのポンプ液の動きによって位置決め液４１５は処理チャンバまで送達される。
【００２９】
図１４は、ポンプ２Ａ及び２Ｂを使用した、ＥＰＲＰ１２へのサンプルの送達及びＥＰＲＰ１２からの除去の制御、及びポンプ４Ａ及び４Ｂを使用した、ＥＰＲＰへの位置決め液の送達及びＥＰＲＰからの除去の制御を示す。ポンプは電気空圧式に制御することができるので、異なる時点でシステムの異なる部分に望ましい流量を生み出すプログラムに従って、種々の圧力を異なる流入口及び流出口に同時に印加することができる。
図１５は、処理前に粒子の前処理を行う本発明のシステムを示す。サンプルは、サンプル導入ポンプから処理チャンバへのライン上にあるサンプルループアセンブリ３２を通して導入される。ループアセンブリは、サンプル流入口ポート３０２、サンプルループ３０５を有するマルチポート回転バルブ３０４、及び廃液溜め３０３への廃液導管を備える。バルブが第１の（サンプル導入）位置にあるとき、ループはサンプルポート及び廃液ラインと一列に並ぶ。過剰量のサンプルが３０２からサンプルループ３０５に導入され、その際余分なサンプルは廃液溜め３０３に流れる。サンプルを導入したら、バルブを第２位置（運転位置）に切り替えて、サンプルループをサンプル導入ポンプと処理チャンバとの間のライン上に置くことにより、ポンプによってループ３０５から処理チャンバの方へ液体を押し出す。
【００３０】
サンプルは導管３２を介してチャンバ３６に流入し、余分な流体は堰３７（粒子を通さない）を越えて導管３５を通して廃液溜めへ流れることができる。任意選択的な締切りバルブ３９が図示されている。粒子が堰３７に沿って集まったら、導管３４を通して洗浄液を導入し、アッセイ用混合液の余剰成分を洗い流す。洗浄液は例えばアッセイに必要な反応物質を含むことが可能で、この場合、洗浄液は反応を完了するのに必要な時間に亘って粒子上を流れる。洗浄ラインは複数の反応混合物に接続する分岐管（図示しない）に接続することができ、よって一連の化学反応が行われる。一又は複数の反応の進行は、場合によっては粒子からの信号を観察することによりモニタリングすることができる（例えば、適切な蛍光体を反応連鎖の一部として添加する場合）。洗浄ラインはチャンバ３６内の他の位置に配置することができる。再度、洗浄液溜めからの液体が、チャンバから第１堰を越えて導管３５を通して廃液溜めへ流入する。
粒子を洗浄した後、洗浄液を、導管３４を介してチャンバの第２の堰３８を越えて導管２０まで短時間に亘って流すことにより、粒子を堰３７から第２の堰３８へ移動させることができる。粒子が堰３８に配置されたら、導管２０を通して流体を送達することにより、粒子を処理チャンバの方へ移動させることができる。粒子は、処理チャンバの方へ移動するとき、希釈チャンバ３０１を通過し、流体が希釈チャンバ中で膨張するとき粒子が分散する。希釈チャンバの容量は、アッセイにおいて粒子分析システム内に受容される粒子密度と、ＥＰＲＰ中の粒子滞留部位の数に最適な粒子密度とを連絡させる役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】処理チャンバの操作の一ステップを示す断面図である。
【図２】処理チャンバの操作の、図１に連続するステップを示す断面図である。
【図３】複数の処理チャンバを備えるシステムを示す。
【図４】液体サンプルの流れによって粒子が位置決めされる処理チャンバの断面図である。
【図５】液体サンプルの流れによって粒子が位置決めされる処理チャンバの断面図である。
【図６】液体サンプルの流れによって粒子が位置決めされる処理チャンバの断面図である。
【図７】液体サンプルの流れによって粒子が位置決めされる処理チャンバの断面図である。
【図８】保持された粒子の共焦点試験を示す。
【図９】照明を用いて処理された粒子の画像を示す。
【図１０】図９とは別の種類の照明を用いて処理された粒子の画像を示す。
【図１１】光源の強度特性が補正されていないとき、信号が照明の強度に依存する場合の粒子により提供される信号を表す（縦軸は正規化された強度を表し、横軸は位置を表す）。
【図１２】光源の強度特性が補正されているとき、信号が照明の強度に依存する場合の粒子により提供される信号を表す（縦軸は正規化された強度を表し、横軸は位置を表す）。
【図１３】サンプル及び位置決め液を処理チャンバへ送達するためのポンプシステムを示す。
【図１４】サンプル及び位置決め液を処理チャンバへ送達するためのポンプシステムを示す。
【図１５】本発明のシステムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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