(57)【要約】  本発明は、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドでの併用治療を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
TもしくはB細胞が関与する疾患もしくは状態の、これらを必要とする被検者における管理、治療または予防のための医薬の製造のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくはこれらの活性断片、IL-21擬態、またはIL-21ポリヌクレオチドの使用。
【請求項２】
請求項1に記載の使用であって、IL-21は、配列番号：2のポリペプチドに対して、または配列番号：2の残基30〜162に対して少なくとも70%の配列同一性を有するIL-21ポリペプチドである使用。
【請求項３】
請求項1または2に記載の使用であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、自己免疫疾患または状態である使用。
【請求項４】
請求項3に記載の使用であって、自己免疫疾患または状態は、RAである使用。
【請求項５】
請求項3に記載の使用であって、自己免疫疾患または状態は、MSである使用。
【請求項６】
請求項3に記載の使用であって、自己免疫疾患または状態は、T1Dである使用。
【請求項７】
請求項1または2に記載の使用であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、同種異系移植片拒絶反応である使用。
【請求項８】
IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態、またはIL-21ポリヌクレオチドの有効な量を、これらを必要とする被検者に投与することにより、TもしくはB細胞が関与する疾患もしくは状態を管理し、治療し、または防止する方法。
【請求項９】
請求項8に記載の方法であって、IL-21は、配列番号：2のポリペプチドに対して、または配列番号：2の残基30〜162に対して少なくとも70%の配列同一性を有するIL-21ポリペプチドである方法。
【請求項１０】
請求項8または9に記載の方法であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、自己免疫疾患または状態である方法。
【請求項１１】
請求項10に記載の方法であって、自己免疫疾患または状態は、RAである方法。
【請求項１２】
請求項10に記載の方法であって、自己免疫疾患または状態は、MSである方法。
【請求項１３】
請求項10に記載の方法であって、自己免疫疾患または状態は、T1Dである方法。
【請求項１４】
請求項8または9に記載の方法であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、同種異系移植片拒絶反応である方法。
【請求項１５】
IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態、またはIL-21ポリヌクレオチドと、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態に関与する1つまたは複数の活性物質との組み合わせ。
【請求項１６】
請求項15に記載の組み合わせであって、配列番号：2のポリペプチドに対して、または配列番号：2の残基30〜162に対して少なくとも70%の配列同一性を有するIL-21ポリペプチドである組み合わせ。
【請求項１７】
請求項15または16に記載の組み合わせであって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、自己免疫疾患または状態である組み合わせ。
【請求項１８】
請求項17に記載の組み合わせであって、自己免疫疾患または状態は、RAである組み合わせ。
【請求項１９】
請求項17に記載の組み合わせであって、自己免疫疾患または状態は、MSである組み合わせ。
【請求項２０】
請求項17に記載の組み合わせであって、自己免疫疾患または状態は、T1Dである組み合わせ。
【請求項２１】
請求項15または16に記載の組み合わせであって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、同種異系移植片拒絶反応である組み合わせ。
【請求項２２】
請求項15〜21のいずれか1項に記載の組み合わせであって、活性物質の1つまたは複数が以下の1つまたは複数である組み合わせ：
・DC修飾薬
・T細胞を修飾するか、または抑制性の薬剤
・サイトカイン
・成長因子
・関連した疾患または状態における病原性の部分であることが公知である抗原
・サイトカインアンタゴニスト
・サイトカイン受容体アンタゴニスト
・Toll様受容体（TLR）アンタゴニスト。
【請求項２３】
IL-21を含む、請求項15〜22のいずれか1項記載の組み合わせ。
【請求項２４】
IL-21の類似体を含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載の組み合わせ。
【請求項２５】
IL-21の誘導体を含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載の組み合わせ。
【請求項２６】
IL-21の活性断片を含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載の組み合わせ。
【請求項２７】
IL-21の擬態を含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載の組み合わせ。
【請求項２８】
IL-21ポリヌクレオチドを含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載の組み合わせ。
【請求項２９】
配列番号：2のポリペプチドに対して、または配列番号：2の残基30〜162に対して、少なくとも70%の配列同一性を有するIL-21ポリペプチドを含む、請求項15〜22のいずれか1項に記載の組み合わせ。
【請求項３０】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、GM-CDF、IL-10、TNF-α、CD40アンタゴニストなどのDC修飾薬を含む組み合わせ。
【請求項３１】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、IL-10、CD3アンタゴニスト、CTLA-4アゴニストなどのT細胞を修飾するか、または抑制性の薬剤を含む組み合わせ。
【請求項３２】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、IL-10、TNF-α、TGFなどのサイトカインを含む組み合わせ。
【請求項３３】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、成長因子を含む組み合わせ。
【請求項３４】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、コラーゲン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素、熱ショックタンパク質などの抗原を含む組み合わせ。
【請求項３５】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、IL-2アンタゴニスト、IL-6アンタゴニスト、IL-12p40アンタゴニスト、IL-12p70アンタゴニスト、IL-23アンタゴニストなどのサイトカインアンタゴニストを含む組み合わせ。
【請求項３６】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、CD25アンタゴニスト、CD122アンタゴニスト、IL-6Rアンタゴニスト、IL-12Rアンタゴニスト、IL-23Rアンタゴニストなどのサイトカイン受容体アンタゴニストを含む組み合わせ。
【請求項３７】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、Toll様受容体（TLR）アンタゴニストを含む組み合わせ。
【請求項３８】
請求項15〜29のいずれか1項に記載の組み合わせであって、疾患関連抗原を含む組み合わせ。
【請求項３９】
TもしくはB細胞が関与する疾患もしくは状態の、これらを必要とする被検者における管理、治療または予防のための医薬の製造のための、請求項15〜38のいずれか1項に記載の組み合わせの使用。
【請求項４０】
請求項39に記載の使用であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態が自己免疫疾患または状態である使用。
【請求項４１】
請求項40に記載の使用であって、自己免疫疾患または状態は、RAである使用。
【請求項４２】
請求項40に記載の使用であって、自己免疫疾患または状態は、MSである使用。
【請求項４３】
請求項40に記載の使用であって、自己免疫疾患または状態は、T1Dである使用。
【請求項４４】
請求項39に記載の使用であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、同種異系移植片拒絶反応である使用。
【請求項４５】
請求項15〜38のいずれか1項に記載の組み合わせを、いずれかの薬学的に許容される添加物と共に含む薬学的組成物。
【請求項４６】
請求項15〜38のいずれか1項に記載の組み合わせの有効な量を投与することによって、TもしくはB細胞が関与する疾患もしくは状態の、これらを必要とする被検者における管理、治療または予防のための方法。
【請求項４７】
請求項46に記載の方法であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、自己免疫疾患または状態である方法。
【請求項４８】
請求項47に記載の方法であって、自己免疫疾患または状態は、RAである方法。
【請求項４９】
請求項47に記載の方法であって、自己免疫疾患または状態は、MSである方法。
【請求項５０】
請求項47に記載の方法であって、自己免疫疾患または状態は、T1Dである方法。
【請求項５１】
請求項46に記載の方法であって、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態は、同種異系移植片拒絶反応である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野  
本発明は、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片を投与することによるか、またはインビトロで細胞をIL-21と共に培養し、続いて細胞を再導入することによる、自己免疫疾患または状態および同種異系移植片拒絶反応の管理、治療、並びに予防に関する。さらに、本発明は、また、上記管理、治療および／または予防におけるその他の薬学的化合物と組み合わせたIL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景  
自己免疫疾患および同種異系移植片拒絶反応の両方において、T細胞および／またはB細胞は、病原性に必要とされる中心的エフェクター細胞である。したがって、同種異系移植片拒絶反応において、T細胞は、移植された組織によって発現されるアロMHCを認識し、移植片のT細胞を媒介した拒絶反応に至る。自己免疫疾患では、T細胞またはB細胞のいずれかが、自己抗原を認識し、これらの抗原を発現する自己組織に対する免疫応答を誘発し得る。最近の文献は、樹状細胞（DC）のサブセットが、T細胞が初回刺激を受けてエフェクター細胞になるか、または寛容細胞になるかを決定することを証明した。これに影響を及ぼす因子は、DC（骨髄球性またはプラズマ細胞様DC）の特定のサブタイプ、分化の間および／または成熟の間のサイトカイン（たとえばIL-4、IL-10、IL-13、TNF-α）、成長因子および一定の細胞表面分子のアンタゴニスト（非限定の例は、CD40、DEC-205である）の存在である。したがって、GM-CSF +IL-4の存在下における骨髄由来のDCの分化は、エフェクターT細胞を誘導することができるDCを生じるが、一方、GM-CSF +IL-10の存在下における骨髄由来のDCの分化は、エフェクターT細胞のエフェクター機能を抑制して減少した免疫応答を生じることができる寛容T細胞またはさらに抑制性T細胞を誘導することができるDCを生じる。
【０００３】
いくつかの刊行物は、DCは、これらが適切に刺激されることを条件として、アネルギー性／免疫寛容原性／抑制性T細胞を誘導することができ、次に、自己免疫性状態（Feili-Hariri et al. 1999, Diabetes 48：2300-2308）およびGVHD（Sato et al. 2003, Immunity 18：367-379 および Sato et al. 2003, Blood 101：3581-3589）を治療するために使用することができる防御免疫応答を生じ得ることを示す。
【０００４】
IL-21は、Zalpha11とも呼ばれており、抗CD3抗体またはホルボールエステルにプラスしてイオノマイシンで刺激後の活性化されたCD4+ Tリンパ球によって産生されることが示されたサイトカインである（Parrish-Novak et al. 2000, Nature 408：57-63）。最近、IL-21は、T細胞反応を刺激することができなかった一定のDCサブセットの成熟を阻害することが証明された（Brandt et al. 2003, Blood, DOI 10.1182）。したがって、IL-21は、一般的な免疫系の機能を損なうことなく、DCを分化させ／成熟させて、T細胞反応を抑制することができ、および／または抗原特異的もしくは疾患特異的様式で抑制性T細胞反応を誘導する調節性DCになるように使用することができる。
【０００５】
本発明は、IL-21、これらの類似体、誘導体、もしくは活性断片を、単独で、もしくはその他のサイトカイン、成長因子および／または抗原と共に投与することによって、自己免疫疾患および宿主対移植片疾患を含む（しかし、限定されない）リンパ球が前記障害もしくは状態の病因および／または病原にとって重要である障害または状態を治療し、予防し、および／または管理するための方法に関する。IL-21の投与は、DCの調節性または免疫寛容原性表現型を誘導し、次いで、これがT細胞反応を修飾して、アネルギー性、調節性または免疫寛容性になる。IL-21処置をさらなるDC修飾薬および／またはT細胞修飾薬もしくは抑制性薬と共に組み合わせることより、有害なエフェクター機能の抑制を増大してもよい。抗原の同時投与により、DCがMHC分子上のこれらの抗原の断片を吸収し、プロセスし、および提示することができ、したがって、抗原特異的反応をプライミングすることができる。本方法は、伝統的に適用された免疫抑制と比較して利点を有し、これを抗原特異的様式で適用することができ、したがって、免疫系の一般的機能を損なわない。それ故、調節性DCは、機能的移植片対白血病（GVL）反応を維持すると共に、たとえば移植片対宿主病（GVHD）から保護し得る（Sato et al. 2003, Immunity 18：367-379）。
【０００６】
また、本発明は、DC特異的表面分子を認識する抗体にIL-21を抱合することによって、DCにIL-21をターゲットするための方法を提供する。DCにIL-21をターゲットすることより、IL-21Rを発現するその他の白血球またはその他の細胞に対するIL-21の結合によって生じる副作用を最小化し得る。さらにまた、DCの特定のサブセットのみによって発現されるタンパク質に向けられる抗体を、これらのサブセットに対してIL-21をターゲットするために使用してもよい。
【０００７】
また、本発明は、その他のサイトカイン、成長因子、および／または抗原の有り無しで、IL-21と共にインビトロでDCを培養して、インビボでの再導入により、免疫応答を抑制する能力を有する調節性DCを作製するための方法を提供する。本方法は、その他の白血球に対するIL-21結合によって生じる免疫系の不適当な活性化を回避することができるという利点を有する。さらに、本方法でDCは、培養に添加される選択されたプロセス抗原を吸収することができ、これによってその他の抗原に対するDC反応の修飾を回避する。したがって、本方法は、また、自己免疫疾患および同種異系移植片拒絶反応を治療するために使用してもよい。
【０００８】
また、本発明は、自己免疫疾患または状態および同種異系移植片拒絶反応の管理、治療および／または予防におけるその他の薬学的化合物と組み合わせた、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、医薬としてのIL-21の類似体、誘導体、または活性断片を提供する。
【００１０】
また、本発明は、IL-21の類似体、誘導体、または活性断片を薬学的に許容される希釈剤および／またはキャリアと共に含む薬学的組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、自己免疫疾患および同種異系移植片拒絶反応の治療または予防のための医薬の製造のための、IL-21の類似体、誘導体、または活性断片の使用を提供する。
【００１２】
また、本発明は、これらを必要とする患者にIL-21の類似体、誘導体または活性断片の有効な治療的量を投与することによって、自己免疫疾患および同種異系移植片拒絶反応（宿主対移植片疾患）を治療または予防する方法を提供する。
【００１３】
また、本発明は、IL-21療法を、DC反応およびT細胞反応を修飾することができるその他の薬剤と組み合わせるための方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、自己免疫疾患に関与するIL-21療法をサイトカイン、成長因子および／または抗原などのその他の薬剤と組み合わせるための方法を提供する。
【００１５】
また、本発明は、同種異系移植片拒絶反応に関与するIL-21療法をサイトカイン、成長因子および／または抗原などのその他の薬剤と組み合わせるための方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、療法をDCに向けるために、IL-21をDCターゲッティング化合物、好ましくは抗体またはこれらの断片に抱合することに関する。
【００１７】
また、本発明は、自己免疫疾患を治療するか、もしくはインビボで再導入することによって同種異系移植片拒絶反応を予防するために使用することができるDCの調節性または免疫寛容原性表現型を誘導するために、DC反応を修飾することができるその他の薬剤と共に、および／または抗原と共にIL-21とDCを培養することにも関する。
【００１８】
定義
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の重合体であり、天然または合成で産生してもよい。約10未満のアミノ酸残基のポリペプチドを一般に「ペプチド」と呼称する。
【００１９】
「タンパク質」は、1つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨大分子であり、これは天然または合成で産生してもよい。また、タンパク質は、炭水化物基またはその他の非ペプチド性置換基などの非ペプチド性成分を含んでいてもよい。炭水化物およびその他の非ペプチド性置換基は、タンパク質が産生される細胞によってタンパク質に付加してもよい（細胞のタイプで異なるであろう）。また、炭水化物およびその他の非ペプチド性置換基は、細胞に基づいたタンパク質の産生後に合成的に付加してもよい。タンパク質は、本明細書においてこれらのアミノ酸主鎖構造に関して定義され；炭水化物基またはその他の非ペプチド性置換基などの置換基は、一般に特定していないが、それもかかわらず存在してもよい。
【００２０】
「IL-21」は、2000年9月14日に公表された、国際特許出願PCT／US06067、刊行物番号国際公開公報第00/53761号と同様に定義され、その全体が本出願において本明細書に援用される。国際公開公報第00/53761号は、配列番号2としてIL-21（「サイトカインzalpha11リガンド」として）（その全体が本出願において本明細書に援用され、これは、本出願においても配列番号2として示してある）、並びにこれを産生するための方法およびこれに対する抗体および配列番号1としてIL-21をコードするポリヌクレオチド配列を開示する。
【００２１】
また、本発明は、配列番号1、これらの機能的誘導体および断片としてペプチドをコードするDNA配列を包含する。また、本出願は、IL-21の類似体およびこれらの誘導体を記載する。したがって、本発明の状況において、「IL-21」という用語は、国際公開公報第00/53761号に記載されているとおりのIL-21を意味するが、一方で、したがって、「IL-21およびこれらの誘導体」は、これらの変異体、類似体、誘導体および活性断片も同様に包含する。
【００２２】
また、「IL-21」という用語は、本明細書に使用されるものとして、配列番号：2のポリペプチドまたは少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または95%以上を含むこれらの相同分子種に対して配列同一性をもつポリペプチドを意味するはずである（should be taken to mean）IL-21ポリペプチドを包含するために使用される。また、本発明は、配列番号：2のアミノ酸残基1〜162、残基30〜162または残基33〜162の配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの使用を含む。パーセント同一性を決定するための方法を下記に記載してある。また、本発明は、融合タンパク質またはキメラタンパク質の一部であるIL-21ポリペプチドの使用を含む。
【００２３】
本明細書に使用される「IL-21擬態（IL-21 mimetic）」という用語は、上記のとおりのIL-21ポリペプチドでないが、IL-21の生物活性を有する化合物を包含する。IL-21擬態は、ポリペプチドまたはオリゴペプチドなどのペプチドであってもよく、またはより小さな有機分子などの非タンパクであってもよい。
【００２４】
本明細書に使用される「IL-21ポリヌクレオチド」という用語は、IL-21をコードするポリヌクレオチド、または全体ポリペプチド、配列番号：2のアミノ酸残基1〜162、残基30〜162もしくは残基33〜162、もしくは少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%もしくは95%以上の配列同一性のこれらの相同分子種に対して配列同一性を有するIL-21ポリペプチドもしくはこれらの断片を含むベクターを包含する。このようなポリヌクレオチドの例は、配列番号2に示したとおりの配列をもつポリペプチドをコードする配列番号1として示してある。
【００２５】
本発明によれば、当技術分野の技術内の従来の分子生物学、微生物学および組換えDNA技術を使用してもよい。このような技術は、文献に完全に説明されている。たとえば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (本明細書において“Sambrook et al., 1989”) DNA Cloning： A Practical Approach, Volumes I and II /D.N. Glover ed. 1985)； Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984)； Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds (1985))； Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984))； Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986))； Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986))； B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)を参照されたい。
【００２６】
本明細書に使用される「自己免疫疾患」という用語は、体がそれ自体の組織を外来のものとして認識し、これらに対して免疫応答を向ける全ての状態を包含する。自己免疫疾患という用語内に入る状態は、リウマチ様関節炎（RA）、多発性硬化症（MS）、全身性エリテマトーデス（SLE）、1型糖尿病（T1D）、乾癬、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）、グレーヴス病、重症筋無力症（myesthenia gravis）、強皮水疱症、橋本甲状腺炎および強直性脊椎炎を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２７】
本明細書に使用される「DC」という用語は、リンパ系および非リンパ系組織において見いだされる形態学的に同様の細胞型の多様な集団のいずれのメンバーをもいう。これらの細胞は、これらの特有の形態およびMHCクラスIIの発現によって特徴づけられる（Steinman et al, Ann. Rev. Immunol. 9：271-296）。「DC」という用語は、ランゲルハンス細胞、経皮、および間質性DCを含む骨髄球性DC（CD11cを発現する）、並びにCD11c-/CD123+/CD4+である（Fonteneau et al. 2003, Blood 101：3520-3526 および Vermi et al. 2003, J Pathology 200：255-268を参照されたい）形質細胞様DC（形質細胞様単球またはI型インターフェロン産生細胞（国際特許分類）とも呼ばれる）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２８】
本明細書に使用される「同種移植する」という用語は、ドナー組織とレシピエント組織とが、主要およびマイナー組織適合性遺伝子の発現の異なっている同種内の各種の移植術を包含する。
【００２９】
本明細書に使用される「治療」および「治療すること」という用語は、疾患または障害などの状態と戦うための患者の管理および看護を意味する。本用語は、状態の予防、疾患、障害もしくは状態の進行の遅延、症候および合併症の緩和または軽減、および／または疾患、障害もしくは状態の治癒または除去などの、患者が罹患している所与の状態のための治療の全範囲を含むことが企図される。治療される患者は、好ましくは哺乳類、特にヒトである。
【００３０】
本明細書に使用される「有効な量」という用語は、臨床効果をもたらすために十分な量である。これは、投与、標的部位、患者の状態、治療が、被検者において、または単離された細胞に対して行われるのか、治療の頻度その他に依存する。用量範囲は、通常、1日あたり体重1kgあたり0.1マイクログラム〜3000マイクログラムと予想される。薬物製剤および用量範囲に関する完全な議論については、Remington´s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Co., Easton, Penn., 1996)を参照されたい。
【００３１】
本発明は、記載されている特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されず、したがって変更してもよいことが理解される。また、本明細書に使用される用語法は、特定の態様のみを記載するためにあり、本発明の範囲を限定することは企図されないことが理解される。
【００３２】
当業者であれば、用量レベルを特定の化合物、症候の重症度および副作用に対する被検者の感受性の関数として変化させることができることを容易に認識するであろう。所与の化合物についての好ましい投薬量は、種々の手段によって当技術分野の当業者が容易に決定できる。好ましい手段は、所与の化合物の生理学的能力を測定することである。
【００３３】
本発明の状況において、「投与」、「組み合わせ投与」または「組み合わせ療法」は、IL-21と、自己反応性TおよびB細胞の活性化または持続を妨害し、および／または病理学的反応を減弱させ、疾患を調整するいずれかの薬剤または薬剤の組み合わせとを投与することによる、自己免疫疾患もしくは状態および同種異系移植片拒絶反応の治療、管理または予防をいう。前記組み合わせ療法は、前記薬剤もしくは薬剤の組み合わせの前にIL-21を投与することによって、および／またはIL-21と前記薬剤もしくは薬剤の組み合わせとの同時投与によって、および／または前記薬剤もしくは薬剤の組み合わせの投与後にIL-21を投与することによって行うことができる。
【００３４】
本発明の状況において、組み合わせは、IL-21にまたはいずれかの組み合わせに適用されるのと同じ「有効な量」を提供し、宿主の生存のために有効な混合物のそれぞれの成分の量をいう。
【００３５】
本発明の記述
一つの態様において、本発明は、TもしくはB細胞が関与する疾患または状態の治療のための医薬の調製のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドの使用に関する。
【００３６】
もう一つの態様において、本発明は、自己免疫疾患または状態の治療のための医薬の調製のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドの使用に関する。
【００３７】
もう一つの態様において、本発明は、RAの治療のための医薬の調製のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドの使用に関する。
【００３８】
もう一つの態様において、本発明は、MSの治療のための医薬の調製のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドの使用に関する。
【００３９】
もう一つの態様において、本発明は、T1Dの治療のための医薬の調製のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドの使用に関する。
【００４０】
もう一つの態様において、本発明は、アロ反応の治療のための医薬の調製のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドの使用に関する。
【００４１】
もう一つの態様において、本発明は、同種移植生存を延長するための医薬の調製のための、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドの使用に関する。
【００４２】
「IL-21」は、2000年9月14日に公表された国際特許出願刊行物国際公開公報第00/53761号に記載されている〔これは、その全体が本出願において本明細書に援用され、配列番号2としてIL-21を（「Zalpha11リガンド」として）（これは、その全体が本出願において本明細書に援用され）、並びにそれおよびそれに対する抗体を産生するための方法および上述した出願において配列番号1としてIL-21をコードするポリヌクレオチド配列が開示されている〕。本発明は、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または95%以上の配列同一性を含むこれらの相同分子種を含む。また、本発明は、配列番号：2のアミノ酸残基1〜162、残基41（Gln）〜148（Ile）の配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または95%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの使用を含む。パーセント同一性を決定するための方法は、下記に記載してある。本発明のIL-21ポリペプチドは、たとえば感染および癌を治療するために有用なIL-21を生じるIL-21の全てまたはいくらかの生物活性を保持した。また、いくつかのポリペプチドは、IL-21の生物活性よりも高い生物活性を有し得る。
【００４３】
本発明は、その他の種（「相同分子種」）由来の対応タンパク質およびポリヌクレオチドを包含する。齧歯類、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、およびその他の霊長類を含むその他の哺乳類種由来のIL-21ポリペプチドも、特に興味がもたれる。ヒトIL-21のタンパク質の種相同分子種は、従来のクローン技術と組み合わせて、本発明によって提供される情報および組成物を使用してクローン化することができる。使用し、および主張したとおり、語「ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド（前記ポリヌクレオチドは、配列番号：2によって定義されている）」は、このポリペプチドの全ての対立遺伝子変異体および種相同分子種を含む。
【００４４】
また、本発明は、配列番号：2のタンパク質ポリペプチドおよびその種相同分子種と実質的に同一である単離されたタンパク質ポリペプチドを提供する。「単離された」は、血液および動物組織から離れたものなどの、その天然の環境以外の状態で見いだされるタンパク質またはポリペプチドを意味する。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは、その他のポリペプチド、特に動物起源のその他のポリペプチドが実質的にない。高度に精製された形態、すなわち95%以上純粋で、より好ましくは99%以上純粋であるポリペプチドを提供することが好ましい。「実質的に同一の」という用語は、国際公開公報第00/53761号の配列番号：2に示された配列または種相同分子種に対して50%、好ましくは60%、より好ましくは少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドを意味するために本明細書に使用される。このようなポリペプチドは、より好ましくは配列番号：2またはその種相同分子種と少なくとも90%同一、および最も好ましくは95%以上同一である。パーセント配列同一性は、従来法によって決定される。たとえば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-616 (1986) および Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915-10919 (1992)を参照されたい。ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上に開示したとおりの比率を使用して同様の方法によって決定される。
【００４５】
変異体IL-21のポリペプチドまたは実質的に同一のタンパク質およびポリペプチドは、1つまたは複数アミノ酸置換、欠失または付加を有するものとして特徴づけられる。これらの変化は、好ましくは軽微な性質のもの、すなわち保存的アミノ酸置換（表1を参照されたい）およびタンパク質もしくはポリペプチドの折りたたみまたは活性に有意に影響を及ぼさないその他の置換；わずかな欠失、典型的には1〜約30アミノ酸；およびアミノ末端のメチオニン残基などのわずかなアミノもしくはカルボキシ末端の伸張、約20〜25残基までのわずかなリンカー・ペプチド、またはポリヒスチジン域、プロテインA、Nilsson et al., EMBO J. 4：1075 (1985)； Nilsson et al., Methods Enzymol. 198：3 (1991)、グルタチオンSトランスフェラーゼ、Smith and Johnson, Gene 67：31 (1988)、もしくはその他の抗原エピトープもしくは結合ドメインなどの、精製を容易にするわずかな伸張（親和性タグ）である。一般的には、Ford et al., Protein Expression and Purification 2： 95-107 (1991)を、参照されたい。親和性タグをコードするDNAは、市販の供給元（たとえば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手可能である。
【００４６】
[表1]
保存的アミノ酸置換  
塩基性：アルギニン  
リジン  
ヒスチジン  
酸性：  グルタミン酸  
アスパラギン酸  
極性：  グルタミン  
アスパラギン  
疎水性：ロイシン  
イソロイシン  
バリン  
芳香族：フェニルアラニン  
トリプトファン  
チロシン  
小さい：グリシン  
アラニン  
セリン  
スレオニン  
メチオニン
【００４７】
また、本発明のタンパク質は、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。天然に存在しないアミノ酸は、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、Nメチルグリシン、アド（addo）-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-および4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン、並びに4-フルオロフェニルアラニンを含むが、これらに限定されるわけではない。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み入れるために、いくつかの方法が当技術分野において公知である。たとえば、非センス突然変異が、化学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAを使用して抑制されるインビトロ系を使用することができる。アミノ酸を合成し、およびtRNAをアミノアシル化するための方法は、当技術分野において公知である。本発明のポリペプチドの必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャニング突然変異誘発などの当技術分野において公知の手順に従って同定することができる[Cunningham and Wells, Science 244： 1081-1085 (1989)]； Bass et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：4498-4502 (1991)。後者の技術では、単一のアラニン突然変異を分子内のあらゆる残基に導入し、生じる変異体分子を生物活性（たとえば、リガンド結合およびシグナル伝達）について試験して分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。また、リガンドタンパク質相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学または光親和性標識化などの技術によって決定される結晶構造の解析によって決定することができる。たとえば、de Vos et ad., Science 255：306-312 (1992)； Smith et al., J. Mod. Biod. 224：899-904 (1992)； Wlodaver et ad., FEES Lett. 309：59-64 (1992)を参照されたい。また、必須アミノ酸の同一性は、関連タンパク質との相同性の解析から推定することもできる。
【００４８】
Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241：53-57 (1988) または Bowie and Sauer Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：2152-2156 (1989)によって開示されたものなどの、突然変異誘発およびスクリーニングの公知の方法を使用して、複数のアミノ酸置換を作製して、試験することができる。簡潔には、これらの著者は、ポリペプチドに2つ以上の位置を同時にランダム化し、機能的ポリペプチドを選択し、次いで変異誘発されたポリペプチドをシーケンスして、それぞれの位置において許容可能な置換の範囲を決定するための方法を開示する。使用することができるその他の方法は、ファージディスプレイを含む（たとえば、Lowman et al., Biochem.30：10832-10837 （1991）；Ladner et al.,米国特許第5,223,409号； Huse, WIPO公開国際公開公報第92/06204号）および領域特異的突然変異誘発、Derbyshire et al., Gene 46：145 (1986)； Ner et al., DNA 7：127 (1988)を含む。
【００４９】
上で開示したとおりの突然変異誘発法は、宿主細胞におけるクローン化され、変異誘発されたタンパク質の活性を検出するための方法を高スループットスクリーニングと組み合わせることができる。この点に関して好ましいアッセイ法は、下記に記載してある細胞増殖アッセイ法およびバイオセンサーに基づいたリガンド結合アッセイ法を含む。活性タンパク質またはこれらの一部（たとえば、リガンド結合断片）をコードする変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収し、現代の設備を使用して迅速にシーケンスすることができる。これらの方法により、関心対象のポリペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な決定ができ、未知の構造のポリペプチドに適用することができる。
【００５０】
本発明は、種々のその他のポリペプチド融合物[および1つまたは複数のポリペプチド融合物を含む関連した多量体タンパク質]をさらに提供する。たとえば、IL-21ポリペプチドは、米国特許第5,155,027号および第5,567,584号に開示したように、二量体化タンパク質に対する融合物として調製することができる。この点に関して好ましい二量体化タンパク質は、免疫グロブリン定常領域ドメインを含む。免疫グロブリン-IL-21のポリペプチド融合物は、遺伝的に操作された細胞において発現することができる。補助ドメインをIL-21ポリペプチドに融合させて、これらを特定の細胞、組織または巨大分子（たとえば、コラーゲン）にターゲットすることができる。たとえば、IL-21ポリペプチドまたはタンパク質は、標的細胞表面上の受容体と特異的に結合するリガンドに対してポリペプチドを融合することによって、予め定められた細胞タイプにターゲットすることができる。このような方法で、ポリペプチドおよびタンパク質は、治療目的または診断目的のためにターゲットすることができる。IL-21ポリペプチドは、精製のための親和性タグおよびターゲティング・ドメインなどの2つ以上の部分に融合することができる。また、ポリペプチド融合物は、特にドメイン間に、1つまたは複数の切断部位を含むことができる。Tuan et al., Connective Tissue Research 34：1-9 (1996)を参照されたい。
【００５１】
IL-21の誘導体は、別の官能分子に対する誘導体化または結鎖（linking）を含む。結鎖は、抗体、毒素、放射性同位元素、細胞障害能または細胞分裂停止薬などのその他の分子実体に対する化学的結合、遺伝的融合、非共有結合性会合等であることができる。
【００５２】
上で論議した方法を使用して、当業者であれば、配列番号：2またはこれらの対立遺伝子変異体と実質的に同一であるが、IL-21の生物活性を有する種々のポリペプチドを調製することができるであろう。本明細書において表され、および主張したとおり、「配列番号：2によって定義されるポリペプチド」は、ポリペプチドの全ての対立遺伝子変異体および種相同分子種を含む。
【００５３】
全長タンパク質、タンパク質断片（たとえばリガンド結合断片）および融合ポリペプチドを含む本発明のタンパク質ポリペプチドは、従来技術に従って遺伝的に操作された宿主細胞で産生することができる。適切な宿主細胞は、外来性DNAで形質転換か、またはトランスフェクトすることができ、かつ培養において培養することができる細胞タイプであり、細菌、真菌細胞および培養された高等真核細胞を含む。真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化されたDNA分子を操作し、外来性DNAを種々の宿主細胞に導入するための技術は、Sambrook et al., Molecular Cloning： A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)およびAusubel et al.,同書によって開示されている。
【００５４】
本発明に従って、上記のとおりにcDNAが請求されるときに、請求されるものが、センス鎖、アンチセンス鎖の両方であり、かつ二本鎖としてのDNAが、これらのそれぞれの水素結合によって共にアニールされたセンスおよびアンチセンス鎖を有することが理解されることが、認識される。また、本発明のポリペプチドをコードし、かつmRNAが上記したcDNAによってコードされるメッセンジャーRNA（mRNA）が主張される。メッセンジャーRNA（mRNA）は、それぞれのチミンヌクレオチド（T）がウラシルヌクレオチド（U）に置換されることを除き、上で定義したものと同じコドンを使用してポリペプチドをコードすると考えられる。
【００５５】
IL-21ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）が発現ベクター内に提供される。分泌シグナル配列は、タンパク質のモノであってもよく、または別の分泌されるタンパク質（たとえば）に由来するか、もしくは新規合成されてもよい。分泌シグナル配列は、正確な読み枠でIL-21 DNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、一般に、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列に対して5'に配置されるが、一定のシグナル配列は、関心対象のDNA配列内の他の場所に配置されてもよい（たとえば、Welch et al.,米国特許第5,037,743号；Holland et al., 米国特許第5,143,830号を参照されたい）。
【００５６】
また、本発明は、IL-21ポリペプチドの化学修飾を含む。化学修飾は、選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機薬剤による共有結合性修飾を含む。このような修飾の例は、親油性置換基が上記のとおりの配列番号：1または2のアミノ酸配列を基準とした位置の1つまたは複数のアミノ酸残基に対して付着されている。配列番号：2のアミノ酸配列を基準とした位置のアミノ酸残基は、いずれのアミノ酸残基であってもよく、その位置に天然に存在するアミノ酸残基だけでなくてもよいことが理解される。一つの態様において、親油性置換基は、リジンに付着される。IL-21のリジンの1つまたは複数が、本出願に記載したとおりの誘導体であることができる。
【００５７】
他の好ましい態様において、さらなるリジンが置換され、配列内に挿入され、またはN末端もしくはC末端に付加され、次いで、任意に誘導体化される。
【００５８】
好ましい挿入の領域は、タンパク質の全体の活性が悪影響を受けないところである。好ましい領域は、ループ領域である。N末端およびC末端の切断は、同時に生じてもよい。
【００５９】
「親油性置換基」という用語は、4〜40炭素原子を含み、約0.3mg／100ml水〜約75mg／100ml水の範囲内などの約0.1mg／100ml水〜約250mg／100ml水の範囲内の20℃における水への溶解度を有することによって特徴づけられる。例えば、オクタン酸（C8）は、68mg／100mlの20℃における水への溶解度を有し、デカン酸（C10）は、15mg／100mlの20℃における水への溶解度を有し、およびオクタデカン酸（C18）は、0.3mg／100mlの20℃における水への溶解度を有する。
【００６０】
IL-21誘導体の作用の満足な遅延性プロフィールを得るためには、（IL-21部分に付着される親油性置換基は、一例として8〜25炭素原子などの4〜40の炭素原子を含む。親油性置換基は、これが付着するアミノ酸のアミノ基とアミド結合を形成する親油性置換基のカルボキシル基によってIL-21部分のアミノ基に付着してもよい。あるいは、親油性置換基は、親油性置換基のアミノ基がアミノ酸のカルボキシル基とアミド結合を形成するような方法で前記アミノ酸に付着されていてもよい。さらなる選択肢として、親油性置換基は、エステル結合を経てIL-21部分に連結されていてもよい。形式的には、エステルは、IL-21のカルボキシル基部分と形成される置換基のヒドロキシル基との間の反応によって、またはIL-21のヒドロキシル基部分と形成される置換基のカルボキシル基との間の反応によって形成することができる。さらに別の方法として、親油性置換基は、IL-21部分の一級アミノ基に導入されたアルキル基であることができる。
【００６１】
本発明の一つの態様において、IL-21誘導体は、IL-21ペプチドに付着された1つの親油性置換基を有するだけである。
【００６２】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、4〜40炭素原子を含む。
【００６３】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、8〜25炭素原子を含む。
【００６４】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、12〜20炭素原子を含む。
【００６５】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、親油性置換基のカルボキシル基がアミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成するような方法でアミノ酸残基に付着される。
【００６６】
他の好ましい実施形態において、さらなるリジンが置換され、配列に挿入され、またはN末端もしくはC末端にて付加され、次いで任意に誘導体化される。
【００６７】
好ましい挿入の領域は、タンパク質の全体の活性が悪影響を受けていないところである。好ましい領域は、ループ領域である。
【００６８】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、親油性置換基のアミノ基がアミノ酸残基のカルボキシル基とアミド結合を形成するような方法で、アミノ酸残基に付着される。
【００６９】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、スペーサーによってIL-21ペプチドに付着される。
【００７０】
本発明の一つの態様において、スペーサーは、2つのメチレン基などの1〜7メチレン基を有する分枝のないアルカンα,ω-ジカルボン酸基であり、このスペーサーは、IL-21ペプチドのアミノ基と親油性置換基のアミノ基との間でブリッジを形成する。
【００７１】
本発明の一つの態様において、スペーサーは、Cys残基またはジペプチド以外のアミノ酸残基である。適切なスペーサーの例は、β-アラニン、γ-アミノ酪酸（GABA）、γ-グルタミン酸、コハク酸、Lys、GluもしくはAsp、またはGly-Lysなどのジペプチドを含む。スペーサーがコハク酸であるときは、これらの1つのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成していてもよく、これらのその他のカルボキシル基は、親油性置換基のアミノ基とアミド結合を形成していてもよい。スペーサーが、Lys、GluまたはAspであるときは、これらのカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成していてもよく、これらのアミノ基は、親油性置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成していてもよい。Lysがスペーサーとして使用されるときは、さらなるスペーサーを、いくつかの例において、Lysのεアミノ基と親油性置換基との間に挿入してもよい。
【００７２】
一つの態様において、このようなさらなるスペーサーは、Lysのεアミノ基と、および親油性置換基に存在するアミノ基とアミド結合を形成しているコハク酸である。
【００７３】
もう一つの態様において、このようなさらなるスペーサーは、Lysのεアミノ基と、および親油性置換基に存在するカルボキシル基（すなわち、親油性置換基はNεアシル化されたリジン残基である）と別のアミド結合を形成するGluまたはAspである。
【００７４】
本発明の一つの態様において、スペーサーは、β-アラニン、γ-アミノ酪酸（GABA）、γ-グルタミン酸、Lys、Asp、Glu、Asp含有ジペプチド、Glu含有ジペプチドまたはLys含有ジペプチドからなる一覧より選択される。本発明の一つの態様において、スペーサーは、β-アラニンである。本発明の一つの態様において、スペーサーは、γ-アミノ酪酸（GABA）である。本発明の一つの態様において、スペーサーは、γ-グルタミン酸である。
【００７５】
本発明の一つの態様において、親IL-21ペプチドのカルボキシル基は、スペーサーのアミノ基とアミド結合を形成し、アミノ酸またはジペプチド・スペーサーのカルボキシル基は、親油性置換基のアミノ基とアミド結合を形成する。
【００７６】
本発明の一つの態様において、親IL-21ペプチドのアミノ基は、スペーサーのカルボン酸基とアミド結合を形成し、スペーサーのアミノ基は、親油性置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成する。
【００７７】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、部分的に、または完全に水素付加されたシクロペンタノフェナスレン骨格を含む。
【００７８】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、直鎖または分枝のアルキル基である。
【００７９】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、直鎖または分枝脂肪酸のアシル基である。
【００８０】
本発明の一つの態様において、親油性置換基のアシル基は、CH3(CH2)6CO、CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-およびCH3(CH2)22CO-などのCH3（CH2）nCO-（式中、nは、4〜38である）を含む基から選択される。
【００８１】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、直鎖または分枝アルカンα,ω-ジカルボン酸のアシル基である。
【００８２】
本発明の一つの態様において、親油性置換基のアシル基は、HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-およびHOOC(CH2)22CO-などのHOOC（CH2）mCO-（式中、mは、4〜38である）を含む基から選択される。
【００８３】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-の基である（式中、pおよびqは整数であり、およびp+qは、12〜35などの8〜40の整数である）。
【００８４】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-の基である（式中、rは、10〜24の整数である）。
【００８５】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-の基である（式中、sは、8〜24の整数である）。
【００８６】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式COOH(CH2)tCO-の基である（式中、tは、8〜24の整数である）。
【００８７】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3の基である（式中、uは、8〜18の整数である）。
【００８８】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3の基である（式中、wは、10〜16の整数である）。
【００８９】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)xCH3の基である（式中、×は、10〜16の整数である）。
【００９０】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)yCH3の基である（式中、yは、ゼロまたは1〜22の整数である）。
【００９１】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、N-リトコロイルである。
【００９２】
本発明の一つの態様において、親油性置換基は、N-コロイルである。
【００９３】
本発明の一つの態様において、IL-21誘導体は、1つの親油性置換基を有する。
【００９４】
本発明の一つの態様において、IL-21誘導体は、2つの親油性置換基を有する。
【００９５】
本発明の一つの態様において、IL-21誘導体は、3つの親油性置換基を有する。
【００９６】
本発明の一つの態様において、IL-21誘導体は、4つの親油性置換基を有する。
【００９７】
また、本発明の方法は、IL-21ポリペプチドが重合体と連結された、化学的に修飾されたIL-21組成物を使用することが想定される。例証となるIL-21ポリペプチドは、成熟IL-21ポリペプチドなどの機能的膜貫通ドメインを欠いた可溶性ポリペプチドである。典型的には、重合体は水溶性であり、その結果、IL-21抱合体は、生理学的環境などの水性環境において沈殿しない。適切な重合体の例は、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾されたものであり、この方式で、重合度を制御することができる。反応性アルデヒドの例は、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドもしくはモノ-（C1-C10）アルコキシまたはこれらのアリールオキシ誘導体である（たとえば、Harris、et al., 米国特許第5,252,714号を参照されたい）。重合体は、分枝でも、または分枝していなくてもよい。さらに、重合体の混合物を、IL-21抱合体を産生するために使用することができる。
【００９８】
治療のために使用されるIL-21抱合体は、薬学的に許容される水溶性重合体部分を含むことができる。適切な水溶性重合体は、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ-PEG、モノ-（C1-C10）アルコキシ-PEG、アリールオキシ-PEG、ポリ-（N-ビニルピロリドン）PEG、トレシルモノメトキシPEG（tresyl monomethoxy PEG）、PEGプロピオンアルデヒド、ビス-スクシンイミジル・カルボナートPEG、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化されたポリオール（たとえば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、デキストラン、セルロースまたはその他の炭水化物に基づいた重合体を含む。たとえば、適切なPEGは、5,000、12,000、20,000および25,000を含む約600〜約60,000の分子量を有していてもよい。また、IL-21抱合体は、このような水溶性高分子の混合物を含むことができる。
【００９９】
2つのアミノ酸配列間のパーセント配列同一性は、タンパク質およびDNA整列のために有用な、Needelman-Wunsch整列によって決定される。タンパク質整列のためには、使用するデフォルト・スコアリング・マトリックスがBLOSUM50であり、ギャップにおける最初の残基に対するペナルティーは-12であるが、その一方で、ギャップにおけるさらなる残基に対するペナルティーは-2である。整列は、FASTA package version v20u6からのアライン・ソフトウェアで作製してもよい（W.R. Pearson and D.J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85：2444-2448；および W.R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183：63-98）。
【０１００】
一つの態様において、本発明に使用されるポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。もう一つの態様において、本発明に使用されるポリヌクレオチドは、単離されたポリヌクレオチドである。
【０１０１】
本発明のポリペプチドを、混入する巨大分子、特にその他のタンパク質および核酸に関して：＞80%純度に、より好ましくは＞90%の純度に、さらにより好ましくは＞95%の純度に精製し、かつ感染性および発熱性の因子がないことが好ましく、混入する巨大分子、特にその他のタンパク質および核酸に関して98%を超えて純粋か、または好ましくは99.9%を超えて純粋である薬学的純粋状態が特に好ましい。好ましくは、精製したポリペプチドは、その他のポリペプチド、特に動物起源のその他のポリペプチドが実質的にない。
【０１０２】
本発明の更なる態様において、本IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドは、自己免疫疾患または状態に関与する1つもしくは複数の活性物質と共に任意の適切な比率で組み合わせて投与される。
【０１０３】
本発明のなお更なる態様において、本IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドは、単独で、または同種異系移植片拒絶反応に関与する1つもしくは複数の活性物質と共に任意の適切な比率で組み合わせて投与される。
【０１０４】
自己免疫疾患または状態の併用療法において、および同種異系移植片拒絶反応において、IL-21、これらの類似体、誘導体もしくは活性断片、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドと共に使用することができるこのような活性物質の以下の非限定の例は、いかなる形であれ本発明の範囲を限定することは企図されない：
・DC修飾薬
・T細胞を修飾するか、または抑制性の薬剤
・サイトカイン
・成長因子
・関連した疾患または状態における病原性の部分であることが公知である抗原
・サイトカインアンタゴニスト
・サイトカイン受容体アンタゴニスト
・Toll様受容体（TLR）アンタゴニスト。
【０１０５】
DC修飾薬の非限定の例は、GM-CSF、Flt3-リガンド、IL-10、TNF-α、ウイルスのIL-10、TGF-β、ビタミンD受容体リガンド、CD40のアンタゴニスト、CD154のアンタゴニスト、CD152のアゴニスト、IL-12のアンタゴニスト、IL-23のアンタゴニストまたはIFN-γのアンタゴニストである。前記薬剤は、IL-21と同時に、IL-21の前に、またはIL-21の後に投与してもよい。
【０１０６】
本発明の一つの態様において、IL-21、これらの類似体または誘導体は、1つまたは複数DC修飾薬と組み合わせて投与される。
【０１０７】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体または誘導体は、1つまたは複数のGM-CSF、IL-10、TNF-α、CD40アンタゴニスト、CD154アンタゴニストと組み合わせて投与される。
【０１０８】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、GM-CSFと組み合わせられる。
【０１０９】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-10と組み合わせられる。
【０１１０】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、TNF-αと組み合わせられる。
【０１１１】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、CD40アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１１２】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、CD154アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１１３】
T細胞修飾薬および抑制薬の非限定の例は、IL-10、CTLA-4アゴニストまたはCD3アンタゴニストである。
【０１１４】
本発明の一つの態様において、IL-21、これらの類似体または誘導体は、1つまたは複数のT細胞修飾薬および抑制薬と共に投与される。
【０１１５】
本発明のもう一つの態様において、IL-21類似体またはIL-21の誘導体は、以下を含む群より選択される化合物の1つまたは複数と組み合わせられる：IL-10、CTLA-4アゴニスト、CD3アンタゴニスト。
【０１１６】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、CTLA-4アゴニストと組み合わせられる。
【０１１７】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、CD3アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１１８】
サイトカインの非限定の例は、IL-10、TNF-α、TGF-βである。
【０１１９】
本発明の一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、1つまたは複数のサイトカインと組み合わせられる。
【０１２０】
本発明のもう一つの態様において、IL-21類似体またはIL-21の誘導体は、以下を含む群より選択される化合物の1つまたは複数と組み合わせられる：IL-10、TNF-α、TGF-β。
【０１２１】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、TGF-βと組み合わせられる。
【０１２２】
本発明の一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、1つまたは複数の成長因子と組み合わせられる。
【０１２３】
自己免疫疾患の病因に関与する抗原は、IL-21、IL-21擬態、もしくはIL-21ポリヌクレオチドの前に、または同時に、さらなるDC修飾薬および／またはT細胞修飾薬もしくは抑制薬と共に、または伴わずに投与してもよい。
【０１２４】
IL-21と組み合わせて使用してもよい抗原の非限定の例は、コラーゲン、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、プロテオリピドタンパク質、インスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素、熱ショックタンパク質およびその他の自己抗原である。抗原は、抗原デリバリーおよびDCによるプロセシングを容易にするために、たとえばDEC-205特異抗体または前述のタンパク質か何かなどのDCターゲッティング抗体に抱合してもよい。
【０１２５】
その他の例は、MHCクラスIまたはII分子に提示され得る前述の抗原を含む、前述の抗原および自己抗原に由来するペプチドの断片を含む。
【０１２６】
その他の例は、膵臓β細胞を含むが、これらに限定されない自己抗原を発現する細胞または組織の可溶化液である。一つの態様において、1つまたは複数の抗原は、IL-21、IL-21擬態またはIL-21ポリヌクレオチドと組み合わせて、本発明にしたがって自己免疫疾患もしくは状態を治療する際に使用するための、DC修飾薬および／またはT細胞修飾薬もしくは抑制薬のさらなる投与と共に、または伴わずに投与される。
【０１２７】
サイトカインアンタゴニストの非限定の例は、IL-2アンタゴニスト、IL-6アンタゴニスト、IL-12p40アンタゴニスト、IL-12p70アンタゴニストおよび／またはIL-23アンタゴニストである。
【０１２８】
本発明の一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、1つまたは複数のサイトカインアンタゴニストと組み合わせられる。
【０１２９】
本発明のもう一つの態様において、IL-21類似体またはIL-21の誘導体は、以下を含む群より選択される化合物の1つまたは複数と組み合わせられる：IL-2アンタゴニスト、IL-6アンタゴニスト、IL-12p40アンタゴニスト、IL-12p70アンタゴニスト、IL-23アンタゴニスト。
【０１３０】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-2アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１３１】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-6アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１３２】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-12p40アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１３３】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-12p70アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１３４】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-23アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１３５】
サイトカイン受容体アンタゴニストの非限定の例は、CD25アンタゴニスト、CD122アンタゴニスト、IL-6Rアンタゴニスト、IL-12Rアンタゴニストおよび／またはIL-23Rアンタゴニストである。
【０１３６】
本発明の一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、1つまたは複数のサイトカイン受容体アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１３７】
本発明のもう一つの態様において、IL-21類似体またはIL-21の誘導体は、以下を含む群より選択される化合物の1つまたは複数と組み合わせられる：CD25アンタゴニスト、CD122アンタゴニスト、IL-6Rアンタゴニスト、IL-12Rアンタゴニストおよび／またはIL-23Rアンタゴニスト。
【０１３８】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、CD25アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１３９】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、CD122アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１４０】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-6Rアンタゴニストと組み合わせられる。
【０１４１】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-12Rアンタゴニストと組み合わせられる。
【０１４２】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、IL-23Rアンタゴニストと組み合わせられる。
【０１４３】
本発明のもう一つの態様において、IL-21、これらの類似体、誘導体または活性断片は、1つまたは複数のToll様受容体（TLR）アンタゴニストと組み合わせられる。
【０１４４】
IL-21とモノクローナル抗体（mAb）との抱合体またはIL-21とmAb断片（たとえば、FabまたはF（ab'）2断片）との抱合体は、IL-21をDCまたはDCのサブセットにターゲットするために使用してもよい。
【０１４５】
IL-21mAb抱合体によってターゲットされるかもしれない、DCまたはDCサブセットによって発現される表面分子の非限定の例は、CD11c、DEC-205、CD123（IL-3R）、BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4、CD206（マンノース受容体）、CD207（ランゲリン（Langerin））、CD208（DC-LAMP）、CD209（DC-SIGN）およびCLA／HECAである。一つの態様において、DC結合mAb、mAbのFab断片またはF（ab'）2断片に抱合されたIL-21は、本発明にしたがって自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するために投与される。上記のとおりのIL-21 mAb抱合体は、DC修飾薬および／またはT細胞修飾薬もしくは抑制薬および／または上記のとおりの抗原と組み合わせて使用してもよい。
【０１４６】
被検者から単離されたDCは、インビトロにおいてIL-21またはIL-21擬態と共に培養して調節性または寛容原性表現型を誘導してもよい。さらにまた、上記のとおりのさらなるDC修飾薬を、調節性または寛容原性DCの発生、分化および増殖を増強するために添加してもよい。さらにまた、抗原、これらの断片、自己抗原に由来するペプチド、および細胞または組織可溶化液を培養に添加して、DCによって発現されるMHC（HLA）分子上に関連抗原を提示させてもよい。インビトロ培養後に、DCを自己反応性およびアロ反応性の抑制を促進するためにインビボにおいて再導入してもよい。一つの態様において、DCを自己免疫疾患または状態に罹患した被検者から単離し、さらなるDC修飾薬および／または上記のとおりの抗原の投与と共に、または伴わずに、IL-21またはIL-21擬態でインビトロにおいて処置し、続いてインビボにおいて再導入する。その後のインビボにおけるDC増殖薬または修飾薬の処置を、さらに有益な反応に使用してもよい。一つの態様において、DCを同種移植ドナーから単離し、IL-21またはIL-21擬態で、上記のとおりのさらなるDC修飾薬と共に、または伴わずに処置し、続いて同種移植レシピエントにインビボにおいて導入する。その後のインビボにおけるDC増殖薬または修飾薬の処置を、さらに有益な反応に使用してもよい。このような薬剤は、前述のDC修飾薬を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１４７】
薬学的組成物
本発明に従って自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するためのIL-21またはその他のIL-21のポリペプチドは、単独で、または一回もしくは複数用量で、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と組み合わせて投与される。組み合わせ製剤は、一用量単位として化合物を組み合わせてもよく、またはこれらを別々の用量として処方してもよい。本発明に従って自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するためのIL-21またはその他のIL-21のポリペプチドは、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995に開示されたものなどの従来技術に従って、薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤、並びに他のいずれかの公知のアジュバントおよび賦形剤と共に処方してもよい。組成物は、従来の形態、たとえばカプセル、錠剤、エアロゾル、溶液または懸濁液中に生じてもよい。
【０１４８】
薬学的組成物は、経口、直腸、経鼻、肺、局所的（頬および舌下腺を含む）、経皮、大槽内、腹腔内、膣、および非経口的（皮下、筋肉内、髄腔内、静脈内、および皮内を含む）経路などの、いずれの適切な経路によって投与するために特異的に処方してもよい。好ましい経路は、治療される被検者の全身状態および年齢、治療される状態の性質、並びに選択される活性成分に依存することが認識されるであろう。投与の経路は、活性化合物を適切または所望の作用点に効率的に輸送するいずれの経路であってもよい。
【０１４９】
経口投与のための薬学的組成物は、硬または柔カプセル、錠剤、トローチ、ドラゼー、丸剤、ロゼンジ、粉末および顆粒などの固体剤形を含む。必要に応じて、これらは、腸溶コーティングなどのコーティングと共に調製することができ、またはこれらは、当技術分野において周知の方法に従って持続性放出または延長性放出などの活性成分の徐放を提供するように処方することができる。
【０１５０】
経口投与のための液体剤形は、溶液、エマルジョン、水性または油性懸濁液、シロップおよびエリキシルを含む。
【０１５１】
非経口投与のための薬学的組成物は、無菌の水性および非水溶注射用溶液、分散液、懸濁液またはエマルジョン、並びに使用の前に無菌の注射用溶液または分散液に再構成される無菌粉末を含む。デポー注射剤製剤（Depot injectable formulations）も、本発明の範囲内にあるものとして想定される。
【０１５２】
その他の適切な投与形態は、坐薬、スプレー、軟膏、クリーム、ゲル、吸入薬、皮膚用パッチ、インプラントなどを含む。
【０１５３】
典型的な経口投薬は、1日につき約0.01〜約50mg/kg体重などの、1日につき約0.001〜約100mg/kg体重、たとえば1日につき約0.05〜約10mg/kg体重の範囲で、1〜3投薬量などの一回または複数の投薬量で投与される。正確な投薬量は、選択されるIL-21ポリペプチドの性質、投与の頻度および様式、治療される被検者の性、年齢、重量、および全身状態、治療される状態および治療される任意の随伴性疾患の性質および重症度、並びに当業者に明らかなその他の要因に依存する。
【０１５４】
製剤は、都合よくは、当業者に公知の方法によって単位剤形で提示してもよい。1日あたり1〜3回などの、1日あたり一回または複数回の経口投与のための典型的な単位剤形は、0.05〜約1000mg、たとえば約0.5mg〜約200mgなどの約0.1から〜約500mgを含んでいてもよい。
【０１５５】
経静脈、髄腔内、筋肉内および同様の投与などの非経口的経路については、典型的には、用量は、経口投与のために使用される半分の桁（order）の用量である。
【０１５６】
本発明に従って自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応の治療の際に使用するための非タンパク質IL-21擬態は、一般に遊離物質として、またはこれらの薬学的に許容される塩として利用される。例には、遊離塩基の有用性を有する化合物の酸付加塩および遊離酸の有用性を有する化合物の塩基付加塩がある。「薬学的に許容される塩」という用語は、一般に適切な有機酸または無機酸と遊離塩基を反応させることによって、または適切な有機塩基もしくは無機塩基と酸を反応させることによって調製される、このような化合物の無毒の塩をいう。このような化合物が遊離塩基を含むとき、このような塩は、化合物の溶液または懸濁液を化学当量の薬学的に許容される酸で処置することによって、従来の様式で調製される。このような化合物が遊離酸を含むとき、このような塩は、化合物の溶液または懸濁液を化学当量の薬学的に許容される塩基で処置することによって、従来の様式で調製される。ヒドロキシ基による化合物の生理的に許容される塩は、前記化合物の陰イオンを、ナトリウムまたはアンモニウムイオンなどの適切な陽イオンと組み合わせて含む。薬学的に許容されないその他の塩は、本発明の化合物の調製に有用な可能性もあり、これらも本発明の更なる局面を形成する。
【０１５７】
IL-21ポリペプチドの塩は、タンパク質が固体または結晶形態であるときに、特に適切である。
【０１５８】
非経口投与のために、IL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態の無菌水溶液、水性プロピレングリコールまたはゴマもしくは落花生油の溶液を使用してもよい。このような水溶液は、必要に応じて最適に緩衝化され、液状希釈剤には、最初に十分な塩類溶液またはグルコースで等張性が与えられるべきである。水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与のために適している。使用される無菌水性媒体の全てが、当業者に公知の標準的技術によって容易に利用することができる。
【０１５９】
適切な薬学的キャリアは、不活性固体希釈剤または充填剤、滅菌水溶液および種々の有機溶媒を含む。固体キャリアの例は、乳糖、白土、ショ糖、シクロデキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸およびセルロースのより低級アルキルエーテルである。液体キャリアの例は、シロップ、落花生油、オリーブ油、リン脂質、脂肪酸、脂肪酸アミン、ポリオキシエチレンおよび水である。同様に、キャリアまたは希釈剤は、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレートなどの当技術分野において公知のいずれかの徐放材料を単独で、または蝋と混合されて含んでいてもよい。本発明に従って自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するためのIL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態と薬学的に許容されるキャリアとを組み合わせることによって形成される薬学的組成物は、開示された投与経路に適した種々の剤形で次いで容易に投与される。製剤は、都合よくは、薬学の技術分野において公知の方法によって単位剤形で提示してもよい。
【０１６０】
鼻噴投与については、調製は、エアロゾル適用のために、液体キャリア、特に水性キャリアに溶解または懸濁されたIL-21ポリペプチドもしくはIL-21擬態を含んでいてもよい。キャリアは、溶解剤、たとえばプロピレングリコール、界面活性物質、レシチン（ホスファチジルコリン）もしくはシクロデキストリンなどの吸収促進薬またはパラベンなどの防腐剤などの添加物を含んでいてもよい。
【０１６１】
IL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態の製剤は、任意に、経口投与のために適した本発明に従って自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するための組み合わせ薬剤と共に、それぞれ活性成分の予め定められた量を含む（適切な賦形剤を含んでいてもよい）カプセルまたは錠剤などの別々の単位として提示してもよい。さらにまた、経口利用できる製剤は、粉末または顆粒、水性または非水溶液体中の溶液もしくは懸濁液または水中油型もしくは油中水型の液状エマルジョンの形態であってもよい。
【０１６２】
経口的使用が企図される組成物は、いずれの公知の方法に従って調製してもよく、このような組成物は、薬学的に上品かつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、風味薬、着色薬、および保存剤からなる群より選択される1つまたは複数の薬剤を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造のために適した無毒の薬学的に許容される賦形剤との混合物中に活性成分を含んでいてもよい。これらの賦形剤は、たとえば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤；顆粒化および崩壊剤、たとえばコーンスターチまたはアルギン酸；デンプン、ゼラチンまたはアカシアなどの結着剤；並びに滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクあってもよい。錠剤は、コーティングしていなくてもよく、またはこれらは、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、かつこれにより長期間にわたる持続作用を提供するために、公知の技術によってコーティングしてもよい。たとえば、モノステアリン酸グリセリンまたはグリセリルジステアレートなどの時間遅延材料を使用してもよい。また、これらは、徐放のための浸透圧性の治療的錠剤を形成するために、米国特許第4,356,108号；第4,166,452号；および第4,265,874号（参照として本明細書に援用される）に記載されている技術によってコーティングしてもよい。
【０１６３】
また、経口的使用のための製剤は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合された硬ゼラチンカプセル、または活性成分が水または油性媒体、たとえば落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合された軟ゼラチンカプセルとして提示してもよい。
【０１６４】
水性懸濁液は、IL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態を、任意に水性懸濁液の製造のために適した賦形剤との混合物中の組み合わせ薬剤と共に含んでいてもよい。このような賦形剤は、懸濁剤、たとえばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントおよびアラビアゴムであってもよく；分散剤または湿潤剤は、レシチンなどの天然に存在するホスファチド、またはエチレンオキシドの、脂肪酸、たとえばポリオキシエチレンステアラートとの縮合物、またはアルキレンオキシドの、長鎖脂肪族アルコールとの縮合物、例えばヘプタデカエチル-エネオキシセタノール、またはエチレンオキシドの、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアートなどの脂肪酸とヘキシトールとに由来する部分エステルとの縮合物、またはエチレンオキシドの、脂肪酸とヘキシトール無水物とに由来する部分エステルとの縮合物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレアートである。また、水性懸濁液は、1つまたは複数の着色薬、1つまたは複数の風味薬および1つまたは複数の、ショ糖またはサッカリンなどの甘味料を含んでいてもよい。
【０１６５】
油性懸濁液は、植物油、たとえば落花生油、オリーブ油、ゴマ油またはやし油中に、または流動パラフィンなどの鉱油中に活性成分を懸濁することによって処方してもよい。油性懸濁液は、糊料、たとえば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでいてもよい。口に合う経口調製を提供するために、上記したものなどの甘味料および風味薬を添加してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存してもよい。
【０１６６】
水の添加による水性懸濁液の調製のために適した分散可能な粉末および顆粒は、混合物中に活性化合物に分散剤または湿潤剤、懸濁剤および1つまたは複数の防腐剤を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既述のものによって例示される。さらなる賦形剤、たとえば、甘味薬、風味薬、および着色薬が存在してもよい。
【０１６７】
また、IL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態の薬学的組成物は、任意に、本発明に従って自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するための組み合わせ薬剤と共に、水中油型乳剤の形態であってもよい。油性相は、植物油、たとえばオリーブ油もしくは落花生油または鉱油、たとえば流動パラフィンもしくはこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム質、たとえばアラビアゴムまたはトラガント、天然に存在するホスファチド、たとえば大豆、レシチンおよびエステル、または脂肪酸とヘキシトール無水物に由来する部分的エステル、例えばソルビタンモノオレアート、並びにエチレンオキシドと前記部分エステルの縮合物、たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートであってもよい。また、乳剤は、甘味料および風味薬を含んでいてもよい。
【０１６８】
シロップおよびエリキシルは、甘味料、たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはショ糖と共に処方してもよい。このような製剤は、粘滑薬、防腐剤および調味料、並びに着色薬を含んでいてもよい。薬学的組成物は、無菌の注射可能な水性または油性の懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、上記で記載されている適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の方法に従って処方してもよい。また、無菌注射用製剤は、無毒の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注射用の溶液または懸濁液で、たとえば1,3-ブタンジオールの溶液としてもよい。水、リンゲル液および等張食塩液は、使用してもよい許容される媒体および溶媒の一つである。加えて、無菌の不揮発性油は、都合よくは、溶媒または懸濁媒として使用される。この目的のためには、合成のモノまたはジグリセリドを使用して、任意の無刺激の不揮発性油を使用してもよい。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も注射剤の調製における使用が見いだされる。
【０１６９】
また、組成物は、本発明の化合物の直腸投与のための坐薬の形態であってもよい。これらの組成物は、常温では固体であるが、直腸温にて液状であり、したがって直腸にて融解して薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤である薬物を混合することによって調製することができる。たとえば、このような材料は、カカオ脂およびポリエチレングリコールを含む。
【０１７０】
局所的使用のためには、本発明の化合物を含むクリーム、軟膏、ゼリー、懸濁液の溶液、その他が想定される。本出願の目的のためには、局所適用には、口内洗剤およびうがい薬を含むであろう。
【０１７１】
また、IL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態は、任意に、本発明にしたがって自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するための組み合わせ薬剤と共に、小さな単層小胞、大単ラメラ小胞および多層状小胞などのリポソーム送達系の形態で投与してもよい。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどの種々のリン脂質から形成してもよい。
【０１７２】
加えて、本発明に従って自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するためのいくつかのIL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態は、水または一般的有機溶媒と溶媒和化合物を形成させてもよい。また、このような溶媒和化合物は、本発明の範囲内に包含される。
【０１７３】
固体キャリアが経口投与のために使用される場合、製剤は、タブレット化して、粉末もしくはペレット形態の硬ゼラチンカプセルに配置してもよく、またはこれは、トローチもしくはロゼンジの形態であることができる。固体キャリアの量は、広く変化するが、通常約25mg〜約1gまである。液体キャリアが使用される場合、製剤は、水性もしくは非水性液状の懸濁液または溶液などのシロップ、エマルジョン、軟ゼラチンカプセルまたは無菌の注射用液体の形態であってもよい。
【０１７４】
IL-21ポリペプチドまたはIL-21擬態は、任意に、本発明にしたがって自己免疫疾患もしくは状態または同種異系移植片拒絶反応を治療する際に使用するための組み合わせ薬剤と共に、このような治療を必要とする哺乳類、特にヒトに投与してもよい。また、このような哺乳類は、野生生物などの動物、家畜、たとえば家庭内ペットおよび非家庭内動物の両方を含む。
【０１７５】
本発明にしたがった化合物を含む薬学的組成物は、1日または1週あたり一回または複数回で投与されてもよく、都合よくは、食事時間に投与される。このような薬学的組成物の有効な量は、臨床的に有意な効果を提供する量である。このような量は、部分的には、治療される特定の状態、患者の年齢、重量および一般的健康、並びに当業者に明らかなその他の因子に依存する。
【実施例】
【０１７６】
表A
ヒトIL-21 cDNA断片作製：
インターロイキン21（IL-21）タンパク質アクセッション番号Q9HBE4。
インターロイキン21（IL-21）オリジナルDNAアクセッション番号AF254069。
プローブ配列489 bp：
ATGAGATCCAGTCCTGGCAACATGGAGAGGATTGTCATCTGTCTGATGGTCATCTTCTTGGGGACACTGGTCCACAAATCAAGCTCCCAAGGTCAAGATCGCCACATGATTAGAATGCGTCAACTTATAGATATTGTTGATCAGCTGAAAAATTATGTGAATGACTTGGTCCCTGAATTTCTACCAGCTCCAGAAGATGTAGAGACAAACTGTGAGTGGTCAGCTTTTTCCTGTTTTCAGAAGGCCCAACTAAAGTCAGCAAATACAGGAAACAATGAAAGGATAATCAATGTATCAATTAAAAAGCTGAAGAGGAAACCACCTTCCACAAATGCAGGGAGAAGACAGAAACACAGACTAACATGCCCTTCATGTGATTCTTATGAGAAAAAACCACCCAAAGAATTCCTAGAAAGATTCAAATCACTTCTCCAAAAGATGATTCATCAGCATCTGTCCTCTAGAACACACGGAAGTGAAGATTCCTGA
embl|af254069|af254069 Homo sapiens interleukin 21 (IL-21) mRNA,
complete cds.
Length = 642
Score =  961 bits (485), Expect = 0.0
Identities = 488/489 (99%)
Strand = Plus / Plus
【化１】
2007522109.tif 000002
【０１７７】
表B
残基1〜29を含むシグナルペプチドを含むヒトIL-21アミノ酸配列タンパク質アクセッション番号Q9HBE4（配列番号2としても示される）：
1...MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLVHKSSSQGQDRHMIRMRQLIDIVDQLK...50
51..NYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSI...100
101.KKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQ...150
151 HLSSRTHGSEDS
【０１７８】
薬理学的方法
IL-21およびその他のDC修飾薬および／または抗原と共に培養したDCを、抑制性T細胞を誘導するために使用することができることを証明する：DC培養は、Gilliet et al.（J. Exp. Med. 2002, 195：695-704）によって記載されているように、健康なドナーから単離された末梢血単球から調製する。IL-21および／またはその他のDC修飾薬は、培養の最初の5日間に、または24時間の刺激期間後の間に添加してもよく、CD40L-トランスフェクト細胞でのシミュレーション（simulation）は省略してもよい。ナイーブCD8+ T細胞を調製し、Gilliet et al.（J. Exp. Med. 2002, 195:695-704）によって記載されているように、混合白血球反応、増殖アッセイ法、細胞障害性アッセイ法、抑制アッセイ法、共培養実験およびサイトカイン測定においてDCと共に培養する。あるいは、DCは、Sato et al.（Blood 2003, 101： 3581-9）によって記載されているように調製する。IL-21および／またはその他のDC修飾薬は、培養の最初の7日の間に、または3日の刺激期間後の間に添加してもよい。DCとの共培養による抑制性T細胞の調製および抑制性T細胞機能の解析は、Sato et al.（Blood 2003, 101： 3581-9）によって記載されているように、混合白血球反応、細胞障害性アッセイ法、抑制アッセイ法および共培養実験において実施される（Blood 2003, 101：3581-9）。あるいは、DCは、O'Connel et al.（J. Imm. 2002, 168：143-154）によって記載されているようにマウスの脾臓から単離され、またはHaase et al.（Immunology 2002, 107：489-499）によって記載されているように骨髄由来のDCから単離されて培養される。IL-21および／またはその他のDC修飾薬は、初期の培養の間、またはその後の24時間の刺激期間の間に添加してもよい。その後、O'Connel et al.（J. Imm. 2002、168：143-154）またはFeili-Hariri et al.によって記載されているように、増殖アッセイ法、混合白血球反応において、およびサイトカイン放出の測定によってDCが抑制性T細胞を誘導する能力について試験する。
【０１７９】
その他のDC修飾薬および／または免疫抑制因子と共に、または伴わずに、IL-21でのインビボ治療により、同種移植生存を延長するために使用することができることを証明する方法：マウスをIL-21および／またはその他のDC修飾薬で2週まで処置し、ストレプトゾトシンの単回投与によって糖尿病にさせた。少なくとも250個の同種間ランゲルハンス島を腎臓カプセル下で移植し、マウスをIL-21および／またはその他のDC修飾する薬剤および／または免疫抑制因子で連続的に処置する。移植片生存は、血糖値の測定によって、および免疫組織化学によって測定され：20mM以上の非空腹時血糖は、移植片不全を示す。同様の方法は、Adorini et al.（J. Cell. Biochem. 2003, 88：227-33）によって記載されている。
【０１８０】
IL-21およびその他のDC修飾薬および免疫抑制因子が同種移植生存を延長するために培養されたDCを使用することができることを証明する方法：脾臓マウスまたは骨髄由来DCは、上記のとおりに（O'Connel et al., J. Imm. 2002, 168：143-154およびHaase et al., Immunology 2002, 107：489-499）単離し、IL-21および／またはその他のDC修飾する薬剤を初期の培養の間またはその後の24時間の刺激期間の間に添加してもよい。その後、DCを同種間宿主に注射し、O'Connel et al.（J. Imm. 2002, 168：143-154）によって記載されているように、同種異系移植片拒絶反応から守る能力を、上記の通りの同種間の島（DCに対して自己由来）の移植術によって、または同種間の心臓移植術によって試験する。
【０１８１】
IL-21およびその他のDC修飾薬および／または抗原と共に培養されたDCが、RAを治療するために使用することができることを証明する方法：脾臓マウスまたは骨髄由来DCを、上記のとおりに（O'Connel et al.,J. Imm. 2002、168：143-154およびHaase et al., Immunology 2002、107：489-499）単離する。IL-21および／またはその他のDC修飾薬は、初期の培養の間、またはその後の24時間の刺激期間の間に添加してもよい。関節炎を、コラーゲン注射によって誘導し、Morita et al.（J. Clin. Invest. 2001, 107：1275-1284）によって記載されているように自己のDCで処置する。治療の効果は、発病率、関節炎肢の割合およびMorita et al.（J. Clin. Invest. 2001, 107：1275-1284）によって記載されているように、CIAの平均臨床スコアおよび抗コラーゲンII抗体価によって評価する。
【０１８２】
インビボにおけるIL-21での処置により、その他のDC修飾薬またはT細胞修飾薬もしくは抑制薬および／または抗原と共に、または伴わずに、RAを治療するために使用することができることを証明する方法：関節炎を、コラーゲン注射によって誘導し、Morita et al.（J. Clin. Invest. 2001, 107：1275-1284）によって記載されているように自己DCで処置する。マウスには、その他のDC修飾薬またはT細胞修飾薬もしくは抑制薬、たとえばTNF-αアンタゴニストと共に、または伴わずに、毎日または一日おきにIL-21で注射する。IL-21での処置は、臨床症状の発症の前に、および後に開始してもよい。処置の効果を、発病率、関節炎肢の平均割合、並びにCIAの平均臨床スコアおよびMorita et al.（J. Clin. Invest. 2001, 107：1275-1284）によって記載されているように抗コラーゲンII抗体価によって評価する。
【０１８３】
IL-21およびその他のDC修飾薬および／または抗原と共に培養されたDCが、MSを治療するために使用することができることを証明する方法。脾臓マウスまたは骨髄由来のDCは、上記のとおりに単離する（O'Connel et al., J. Imm. 2002, 168：143-154およびHaase et al., Immunology 2002, 107：489-499）。IL-21および／またはその他のDC修飾薬は、初期の培養の間に、またはその後の4〜24時間の刺激期間の間に添加してもよい。さらにまた、DCには、その後の4〜24時間の刺激期間の間に、MOGペプチド、MBPペプチドまたはPLPペプチドをロードしてもよい。実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、Menges et al. （J. Exp. Med. 2002, 195：15-21）によって記載されているように、MOGペプチド、MBPペプチドまたはPLPペプチドの完全フロイントアジュバント溶液での免疫化、続く0および2日における百日咳毒素注射によって誘導する。DCを後者の時点において一回または繰り返し注射して、疾患スコアおよびサイトカイン産生をMenges et al. （J. Exp. Med. 2002, 195：15-21）によって記載されているように評価する。
【０１８４】
インビボにおけるIL-21での処置により、その他のDC修飾薬またはT細胞修飾薬もしくは抑制薬および／または抗原と共に、または伴わずに、MSを治療するために使用することができることを証明する方法：実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、Menges et al. （J. Exp. Med. 2002, 195：15-21）によって記載されているように、MOGペプチド、MBPペプチドまたはPLPペプチドの完全フロイントアジュバント溶液での免疫化、続く0および2日における百日咳毒素注射によって誘導する。マウスには、DC修飾薬および／またはEAEの病原に関与する抗原、たとえばMOG、MBPもしくはPLPまたはこれらのタンパク質に由来するその他のペプチドと共に、または伴わずに、毎日または一日おきにIL-21を注射する。IL-21での処置は、臨床症状の発症の前に、および後に開始してもよい。DCを後者の時点において一回または繰り返し注射して、疾患スコアおよびサイトカイン産生をMenges et al. （J. Exp. Med. 2002, 195：15-21）によって記載されているように評価する。
【０１８５】
IL-21およびその他のDC修飾薬および／または抗原と共に培養されたDCが、T1Dを治療するために使用することができることを証明する方法：プレ糖尿病性非肥満性の糖尿病（NOD）マウスからの脾臓の、または骨髄由来のDCを、上記（O'Connel et al., J. Imm. 2002, 168：143-154およびHaase et al., Immunology 2002, 107：489-499）で記載されたとおり単離した。IL-21および／またはその他のDC修飾薬は、初期の培養の間に、またはその後の4〜24時間の刺激期間の間に添加してもよい。さらにまた、DCには、その後の4〜24時間の刺激期間の間に、インスリン、GAD65またはHSP60ペプチドをロードしてもよい。DCは、Feili-Hariri et al. （Eur. J. Immunol. 2002, 32：2021-2030）によって記載されているように、プレ糖尿病性NODマウスに対して一度注射するか、または繰り返し注射し、糖尿病の発症は、血糖値の測定により行う。
【０１８６】
インビボにおけるIL-21での処置により、その他のDC修飾薬またはT細胞修飾薬もしくは抑制薬および／または抗原と共に、または伴わずに、T1Dを治療するために使用することができることを証明する方法：4〜12週齢のNODマウスには、DC修飾薬および／または糖尿病の病原に関与する抗原、たとえばインスリン、GAD65もしくはHSP60、またはこれらのタンパク質に由来するその他のペプチドと共に、または伴わずに、毎日または一日おきにIL-21を注射する。糖尿病の発症は、血糖値の測定によって行う。
【０１８７】
DCターゲティング抗体に抱合されたIL-21での治療は、DCにおけるシグナリングを優先して誘導することを証明する方法：マウスには、DCターゲティング抗体に抱合されたIL-21または偽薬を一回注射して、この後の選択した時点（15分〜4時間）にて血液試料を抜いて、白血球サブセットを同定することができる抗体と共にStat1、Stat3およびStat5特異的抗体での染色、続くフローサイトメトリー解析によってStat1、Stat3およびStat5リン酸化について解析する。これらのタンパク質は、IL-21Rの会合後にリン酸化されることが公知である。
【国際調査報告】
2007522109.tif 000003
2007522109.tif 000004
2007522109.tif 000005
2007522109.tif 000006
2007522109.tif 000007
2007522109.tif 000008