(57)【要約】  サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤様活性を有するポリペプチドをコードする単離されたまたは精製された核酸分子; ベクター; 宿主細胞; CDK阻害剤様活性を有するポリペプチド; CDK阻害剤様活性の抑制のための核酸構築体;トウモロコシ細胞、組織、器官、または植物中の１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現を抑制かつアップレギュレートする方法; そのような方法に従い、CDK阻害剤様遺伝子の発現が抑制またはアップレギュレートされているトウモロコシ細胞、組織、器官、または植物; および１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現が抑制またはアップレギュレートされている植物から得られた種子（およびその油および食料）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)配列番号: 1、3、および9のヌクレオチド配列、およびそれに対して少なくとも約70%配列同一性を有するDNA、
(ii)配列番号: 2、4および10よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
(iii)配列番号: 2、4および10よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約70%同一であり、CDK阻害剤様活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および
(iv)当該断片が配列番号: 1または3の少なくとも35の連続したヌクレオチドあるいは配列番号: 9の少なくとも120の連続したヌクレオチドを含む、(i)-(iii)のいずれか１の断片
よりなる群から選択されるDNAを含む単離されたまたは精製された核酸分子。
【請求項２】
トウモロコシの雄性生殖組織において優先的に発現されるプロモーターに操作可能に連結した請求項１記載の単離されたまたは精製された核酸分子。
【請求項３】
該プロモーターが、トウモロコシのSILKY1プロモーター、タバコのNTM19プロモーター、トウモロコシのPCA55プロモーター、タバコのNPG1プロモーター、ArabidopsisのAP3プロモーター、BrassicaのBgp1プロモーター、葯優先プロモーター、花粉優先プロモーター、または小胞子優先プロモーターである請求項２記載の単離されたまたは精製された核酸分子。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１記載の単離されたまたは精製された核酸分子を含むベクター。
【請求項５】
所望により、ベクターの形態であってもよい、請求項１ないし３のいずれか１記載の単離されたまたは精製された核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項６】
請求項１ないし３のいずれか１記載の単離されたまたは精製された核酸分子に対して相補的またはアンチセンスな配列を含み、ここに単離されたまたは精製された核酸分子が、所望により、ベクターの形態であってもよい該単離されたまたは精製された核酸分子。
【請求項７】
請求項１ないし３のいずれか１記載の単離されたまたは精製された核酸分子によってコードされた単離されたまたは精製されたポリペプチド。
【請求項８】
その発現が、配列番号: 1 [ZmKRP1]、配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 3 [ZmKRP2]、および配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択される内因性核酸の単独の、あるいは配列番号: 5 [ZmKRP3]、配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 7 [ZmKRP4]、配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 9 [ZmKRP5]、配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 11 [ZmKRP6]、配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 13 [ZmKRP7]、配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 15 [ZmKRP8]、配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 17 [ZmKRP9]、配列番号: 18 [ZmKRP9]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択される少なくとも１つの他のヌクレオチド配列とのさらなる組合せの抑制を生じ、
ここに、当該核酸構築体が２以上の転写可能なヌクレオチド配列を含む時、ヌクレオチド配列は核酸構築体に対していずれかの順序で存在し得、かつポリシストロン性であってもよく、
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100の連続するヌクレオチドを含み、次いで
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘発してもよいことを特徴とする、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含む核酸構築体。
【請求項９】
さらに、トウモロコシの粒の胚および／または糊粉において優先的に発現されるプロモーターを含み、該プロモーターが、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列に操作可能に連結された請求項８記載の核酸構築体。
【請求項１０】
該プロモーターが、トウモロコシのオレオシンプロモーター、トウモロコシのグロブリンプロモーター、トウモロコシのMIPシンターゼプロモーター、オオムギのPer1プロモーター、コメからのP-Os.CPC214のような胚芽優先プロモーターまたはトウモロコシからのP-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、またはP-Zm.CPC214tr2のような胚芽優先プロモーターである請求項９記載の核酸構築体。
【請求項１１】
該少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列が、非コーディング配列である請求項８記載の核酸構築体。
【請求項１２】
非コーディング配列が、イントロン、プロモーター領域からのヌクレオチド配列、5'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、3'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、または前述のもののいずれか１の断片である請求項１１記載の核酸構築体。
【請求項１３】
その発現が、配列番号: 7 [ZmKRP4]および／または配列番号: 17 [ZmKRP9]から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を招く少なくとも１つの他の転写可能なヌクレオチド、その発現が：
(i) 配列番号: 1 [ZmKRP1]または配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(ii) 配列番号: 3 [ZmKRP2]または配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(iii) 配列番号: 5 [ZmKRP3]、但し、転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号: 5のヌクレオチド175-342に完全には対応せず、
(iv)配列番号: 9 [ZmKRP5]または配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号: 9のヌクレオチド450-570に完全には対応せず、
(v)配列番号: 11 [ZmKRP6]または配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号: 11のヌクレオチド380-765に完全には対応せず、
(vi)配列番号: 13 [ZmKRP7]または配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号: 13のヌクレオチド 335-718に完全には対応せず、および
(vii)配列番号: 15 [ZmKRP8]または配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は、配列番号: 15のヌクレオチド 350-405または420-698に完全には対応せず、
よりなる群から選択される内因性核酸の抑制を招く、少なくとも１つの他の転写可能なヌクレオチド配列とさらに組合せた該転写可能なヌクレオチド配列の一方または双方のいずれかを含む核酸構築体であって、
ここに、該転写可能なヌクレオチド配列は、核酸構築体上でいずれかの順序で存在し得、かつポリシストロン性であり得、
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100の連続したヌクレオチドを含み、かつ、
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘発してもよい該核酸構築体。
【請求項１４】
トウモロコシの粒の胚および／または糊粉で優先的に発現するプロモーターをさらに含み、該プロモーターが、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列に操作可能に連結された請求項１３記載の核酸構築体。
【請求項１５】
該プロモーターが、トウモロコシのオレオシンプロモーター、トウモロコシのグロブリンプロモーター、トウモロコシのMIPシンターゼプロモーター、オオムギのPer1プロモーター、コメからのP-Os.CPC214のような胚芽優先プロモーターまたはトウモロコシからのP-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、またはP-Zm.CPC214tr2のような胚芽優先プロモーターである請求項１４記載の核酸構築体。
【請求項１６】
少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列が非コーディング配列である請求項１３ないし１５のいずれか１記載の核酸構築体。
【請求項１７】
該非コーディング配列が、イントロン、プロモーター領域からのヌクレオチド配列、5'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、3'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、または前述のいずれか１の断片である請求項１６記載の核酸構築体。
【請求項１８】
少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含む核酸構築体であって、その発現は:
(i) 配列番号: 1 [ZmKRP1]または配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(ii) 配列番号: 3 [ZmKRP2]または配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(iii)配列番号: 5 [ZmKRP3]または配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 5のヌクレオチド 175-342に完全には対応せず、
(iv) 配列番号: 9 [ZmKRP5]または配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 9のヌクレオチド 450-570に完全には対応せず、
(v) 配列番号: 11 [ZmKRP6]または配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、配列番号: 11の転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 11のヌクレオチド380-765に完全には対応せず、
(vi) 配列番号: 13 [ZmKRP7]または配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 13のヌクレオチド 335-718に完全には対応せず、
(vii) 配列番号: 15 [ZmKRP8]または配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 15のヌクレオチド 350-405または420-698に完全には対応せず、および
(viii) 配列番号: 17 [ZmKRP9]または配列番号: 18 [ZmKRP9]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 17のヌクレオチド 1-183に完全には対応せず、
よりなる群から選択される内因性核酸の抑制を招き、
ここに、転写可能なヌクレオチド配列は、核酸構築体上でいずれの順序で核酸構築体上に存在し得、かつポリシストロン性であり得、
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100の連続したヌクレオチドを含み、かつ
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘発してもよいことを特徴とする該核酸構築体。
【請求項１９】
トウモロコシの粒の胚および／または糊粉中に優先的に発現されるプロモーターを含み、該プロモーターが、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列に操作可能に連結される請求項１８記載の核酸構築体。
【請求項２０】
該プロモーターが、トウモロコシのオレオシンプロモーター、トウモロコシのグロブリンプロモーター、トウモロコシのMIPシンターゼプロモーター、オオムギのPer1プロモーター、コメからのP-Os.CPC214のような胚芽優先プロモーターまたはトウモロコシからのP-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、またはP-Zm.CPC214tr2のような胚芽優先プロモーターである請求項１９記載の核酸構築体。
【請求項２１】
該少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列が非コーディング配列である請求項18-20のいずれか１記載の核酸構築体。
【請求項２２】
該非コーディング配列が、イントロン、プロモーター領域からのヌクレオチド配列、5'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、3'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、前記のいずれかの断片である請求項２１記載の核酸構築体。
【請求項２３】
トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物における１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現を抑制する方法であって、該トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官またはトウモロコシ植物を、請求項８、１４、または１８記載の核酸構築体と接触させることを特徴とする該方法。
【請求項２４】
該抑制が、アンチセンス抑制、センス抑制、dsRNA、リボザイム、またはその組合せによって達成される請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
核酸構築体が、さらに、トウモロコシの粒の胚および／または糊粉中で優先的に発現されるプロモーターを含み、該プロモーターが、少なくとも１つのヌクレオチド配列に操作可能に連結される請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
プロモーターが、トウモロコシのオレオシンプロモーター、トウモロコシのグロブリンプロモーター、トウモロコシのMIPシンターゼプロモーター、オオムギのPer1プロモーター、コメからのP-Os.CPC214のような胚芽優先プロモーターまたはトウモロコシからのP-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、またはP-Zm.CPC214tr2のような胚芽優先プロモーターである請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
CDK阻害剤様遺伝子の発現が、請求項２３記載の方法に従い抑制されているトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物。
【請求項２８】
請求項２７記載の植物から得られる種子。
【請求項２９】
請求項２８記載の種子から得られる油。
【請求項３０】
請求項２８記載の種子から得られる食料。
【請求項３１】
該抑制が増加した油を生じる請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その全文において引用によって本明細書中に援用される7/14/2003に出願された米国仮出願60/486,935の利益を主張する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、サイクリン依存性キナーゼ(CDK)阻害剤様活性を有するポリペプチド、相補的およびアンチセンス核酸分子、ベクター、宿主細胞、CDK阻害剤様活性を有するポリペプチドをコードする単離されたまたは精製された核酸分子ならびにトウモロコシにおける１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現を抑制かつアップレギュレートするための材料および方法に関する。
【０００３】
発明の背景
サイクリンによるCDKの活性化／不活化は、細胞周期の異なる相の間の転移を促進する。また、CDK活性は、KRP(Kip関連蛋白質、ここに「Kip」は、「キナーゼ阻害剤蛋白質」の略語である)として知られるCDK阻害剤によって制御される。植物および動物系からの他のCDK阻害剤は、CKI、ICK、Cip、およびInk (De Veylder, 2001, Plant Cell, 13:1653-1667)およびKIS (Jasinski et al., J. Cell. Sci., 115:973-982 (2002))として知られる。CDK阻害剤は、Arabidopsisおよびタバコを含む植物において同定されている。植物のCDK阻害剤は、p21Cip1/p27Kip1/p57Kip2型の動物CDK阻害剤のアミノ末端サイクリン／CDK結合ドメインに対して相同的なカルボキシ末端にて、約35アミノ酸を有する。カルボキシ末端領域の外では、これまで同定された植物CDK阻害剤は、構造的に異なる。
【０００４】
発明の概要
CDK阻害剤様遺伝子の発現の抑制は、細胞増殖を増加させ、および／または分裂指数を増加し得る。また、CDK阻害剤様遺伝子の発現の抑制は、増加した油および増加した収量を生じ得る。
【０００５】
本発明は、トウモロコシからのCDK阻害剤様ポリペプチドをコードする単離されたまたは精製された核酸分子を提供する。１つの具体例において、該分子は、(i)配列番号: 1 [ZmKRP1; 「Zm」はZea maysを示す; 「KRP」はKip関連蛋白質を示す;数字は特定の遺伝子に与えられた順序である]のヌクレオチド配列、(ii)配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii)配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列と少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、または(iv)(i)-(iii)のいずれか１の断片（ここに該断片は少なくとも約35の連続したヌクレオチドを含む）を含む。
【０００６】
もう１つの具体例において、該分子は、(i) 配列番号: 3 [ZmKRP2]のヌクレオチド配列、(ii)配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii)配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列と少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、または(iv) (i)-(iii)のいずれか１の断片（ここに該断片は少なくとも約35の連続したヌクレオチドを含む）を含む。
【０００７】
さらにもう１つの具体例において、該分子は、主に、(i) 配列番号: 7 [ZmKRP4]のヌクレオチド配列、(ii) 配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または(iii) 配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列と少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列よりなる。
【０００８】
なおさらにもう１つの具体例において、該分子は、(i) 配列番号: 9 [ZmKRP5]のヌクレオチド配列、(ii) 配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii) 配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列に対して少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、または(iv) (i)-(iii)のいずれか１記載の断片（該断片は少なくとも約120の連続したヌクレオチドを含む）を含む。
【０００９】
さらなる具体例において、該分子は、元来、(i) 配列番号: 11 [ZmKRP6]のヌクレオチド配列、(ii) 配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii) 配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列と少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、または(iv) (i)-(iii)のいずれか１記載の断片（該断片は少なくとも約390の連続するヌクレオチドを含む）よりなる。
【００１０】
上記を鑑みて、本発明は、さらに、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。所望によりベクターの形態である単離されたまたは精製された核酸分子を含む宿主細胞も提供する。
【００１１】
また、上記を鑑みて、本発明は、上記の核酸分子によってコードされる単離されたまたは精製されたポリペプチドを提供する。本質的に、上記の分子のいくつかに対して相補的およびアンチセンスな配列、配列番号: 13、15、および17、ならびに配列番号: 6、14、16、および18のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むまたはよりなる所望によりベクターの形態である単離されたまたは精製された核酸分子もまた提供される。配列が配列番号: 1である、配列番号: 2をコードする、配列番号: 3である、あるいは配列番号: 4をコードする時、相補またはアンチセンス配列は、少なくとも35の連続するヌクレオチドを含む。
【００１２】
さらに、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含む核酸構築体であって、その発現は:
配列番号: 1 [ZmKRP1]、配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 3 [ZmKRP2]、および配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列単独でまたは少なくとも１つの他のヌクレオチド配列とのさらなる組合せで、その発現は、配列番号: 5 [ZmKRP3]、配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 7 [ZmKRP4]、配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 9 [ZmKRP5]、配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 11 [ZmKRP6]、配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 13 [ZmKRP7]、配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 15 [ZmKRP8]、配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 17 [ZmKRP9]、および配列番号: 18 [ZmKRP9]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
よりなる群から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を招き、
ここに、核酸構築体は、２以上の転写可能なヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、核酸構築体上にいずれかの順序で存在し得、かつポリシストロン性であり得、
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100の連続したヌクレオチドを含み、および
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘発する該核酸構築体を提供する。
【００１３】
もう１つの具体例において、核酸構築体は少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含み、それは、その発現が：
(i) 配列番号: 1 [ZmKRP1]または配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(ii) 配列番号: 3 [ZmKRP2]または配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(iii) 配列番号: 5 [ZmKRP3]または配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 5のヌクレオチド 175-342に完全には対応せず、
(iv)配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 9 [ZmKRP5]またはヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 9のヌクレオチド 450-570に完全には対応せず、
(v) 配列番号: 11 [ZmKRP6]または 配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 11のヌクレオチド 380-765に完全には対応せず、
(vi) 配列番号: 13 [ZmKRP7]または配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 13のヌクレオチド 335-718に完全には対応せず、および
(vii) 配列番号: 15 [ZmKRP8]または配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 15のヌクレオチド 350-405または420-698に完全には対応せず、よりなる群から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を招く、少なくとも１つの他の転写可能なヌクレオチド配列とさらに組合せた該転写可能なヌクレオチド配列の一方または双方のいずれかを含む配列番号: 7 [ZmKRP4]および／または配列番号: 17 [ZmKRP9]から選択される内因性核酸配列の抑制を招く核酸構築体であって、
ここに、転写可能なヌクレオチド配列は、核酸構築体上でいずれかの順序で存在し得、ポリシストロン性であり得、
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100の連続したヌクレオチドを含み、次いで
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は遺伝子抑制を誘導する。
【００１４】
さらにもう１つの具体例において、核酸構築体は、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含み、その発現は：
(i) 配列番号: 1 [ZmKRP1]または配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(ii) 配列番号: 3 [ZmKRP2]または配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(iii) 配列番号: 5 [ZmKRP3]または配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 5のヌクレオチド 175-342に完全には対応せず、
(iv) 配列番号: 9 [ZmKRP5]または配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 9のヌクレオチド 450-570に完全には対応せず、
(v) 配列番号: 11 [ZmKRP6]または配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し配列番号: 11の転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 11のヌクレオチド 380-765に完全には対応せず、
(vi) 配列番号: 13 [ZmKRP7]または配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 13のヌクレオチド 335-718に完全には対応せず、
(vii) 配列番号: 15 [ZmKRP8]または配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し、転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 15のヌクレオチド 350-405または420-698に完全には対応せず、および
(viii) 配列番号: 17 [ZmKRP9]または配列番号: 18 [ZmKRP9]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 17のヌクレオチド 1-183に完全には対応せず、
よりなる群から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を生じ、
ここに、転写可能なヌクレオチド配列は、核酸構築体上でいずれかの順序で存在し得、ポリシストロン性であり得、
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100の連続したヌクレオチドを含み、および
ここに、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘導する。
【００１５】
トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物中の１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現を抑制する方法が提供される。該方法は、該トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官またはトウモロコシ植物を、上記の核酸構築体と接触させることを特徴とする。
【００１６】
この関連で、CDK阻害剤様遺伝子の発現がそのような方法によって抑制されているトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物も提供される。また、１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現が抑制されている植物から得られた種子も提供される。
【００１７】
配列の簡単な記載
配列番号: 1はZmKRP1のヌクレオチド配列である。
配列番号: 2はZmKRP1のアミノ酸配列である。
配列番号: 3はZmKRP2のヌクレオチド配列である。
配列番号: 4はZmKRP2のアミノ酸配列である。
配列番号: 5はZmKRP3のヌクレオチド配列である。
配列番号: 6はZmKRP3のアミノ酸配列である。
配列番号: 7はZmKRP4のヌクレオチド配列である。
配列番号: 8はZmKRP4のアミノ酸配列である。
配列番号: 9はZmKRP5のヌクレオチド配列である。
配列番号: 10はZmKRP5のアミノ酸配列である。
配列番号: 11はZmKRP6のヌクレオチド配列である。
配列番号: 12はZmKRP6のアミノ酸配列である。
配列番号: 13はZmKRP7のヌクレオチド配列である。
配列番号: 14はZmKRP7のアミノ酸配列である。
配列番号: 15はZmKRP8のヌクレオチド配列である。 
配列番号: 16はZmKRP8のアミノ酸配列である。
配列番号: 17はZmKRP9のヌクレオチド配列である。 
配列番号: 18はZmKRP9のアミノ酸配列である。
配列番号: 19は、ZmKRP1 (F1)の3'末端からの200塩基対(bp)のヌクレオチド配列である。
配列番号: 20は、ZmKRP2 (F2)の3'末端近くからの200 bpのヌクレオチド配列である。
配列番号: 21は、ZmKRP3 (F3)の3'末端からの200 bpのヌクレオチド配列である。
配列番号: 22は、ZmKRP4 (F4)の3'末端からの200 bpのヌクレオチド配列である。
配列番号: 23は、ZmKRP5 (F5)の3'末端からの200 bpのヌクレオチド配列である。
配列番号: 24は、ZmKRP6およびZmKRP7 (F6)の3'末端近くからの200 bpのヌクレオチド配列である。
配列番号: 25は、ZmKRP8 (F7)の3'末端近くからの200 bpのヌクレオチド配列である。
配列番号: 26は、ZmKRP8 (F8)の3'末端からの183 bpのヌクレオチド配列である。
配列番号: 27は、ZmDnaKイントロン断片のヌクレオチド配列である。
配列番号: 28は、プライマーP1-StuIのヌクレオチド配列である。
配列番号: 29は、プライマーP1-2Rのヌクレオチド配列である。
配列番号: 30は、プライマーP2-3のヌクレオチド配列である。
配列番号: 31は、プライマーP4-Bglのヌクレオチド配列である。
配列番号: 32は、プライマーP3-4のヌクレオチド配列である。
配列番号: 33は、プライマーP5-Bamのヌクレオチド配列である。
配列番号: 34は、プライマーP5-Bglのヌクレオチド配列である。
配列番号: 35は、プライマーP1-SseBamのヌクレオチド配列である。
配列番号: 36は、プライマーPi-Bglのヌクレオチド配列である。
配列番号: 37は、プライマーPi-Bamのヌクレオチド配列である。
配列番号: 38は、プライマーP5-Ncoのヌクレオチド配列である。
配列番号: 39は、プライマーP5-6のヌクレオチド配列である。
配列番号: 40は、プライマーP6-7のヌクレオチド配列である。
配列番号: 41は、プライマーP8-Bglのヌクレオチド配列である。
配列番号: 42は、プライマーP7-8のヌクレオチド配列である。
配列番号: 43は、プライマーP8-iのヌクレオチド配列である。
配列番号: 44は、ZmKRP1の5'非翻訳領域 (UTR)のヌクレオチド配列である。
配列番号: 45は、ZmKRP1の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 46は、ZmKRP2の5' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 47は、ZmKRP2の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 48は、ZmKRP3の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 49は、ZmKRP4の5' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 50は、ZmKRP4の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 51は、ZmKRP5の5' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 52は、ZmKRP5の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 53は、ZmKRP6の5' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 54は、ZmKRP6の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 55は、ZmKRP7の5' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 56は、ZmKRP7の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 57は、ZmKRP8の5' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 58は、ZmKRP9の3' UTRのヌクレオチド配列である。
配列番号: 59は、特定のポリペプチドのC-末端領域からの保存配列である。
【００１８】
発明の詳細な記載
CDK阻害剤様遺伝子の発現の抑制は、細胞増殖の増加および／または分裂指数の増加を招き得る。例えば、細胞増殖を増加すると、胚芽サイズの増加および油の量の増加が生じ得る。
【００１９】
また、CDK阻害剤様遺伝子の発現の抑制は、収量を増加し得る。多くの農学的特徴は「収量」に影響を与え得る。例えば、これらは、制限なしに、植物の高さ、鞘の数、植物における鞘の位置、節間の数、鞘破砕の発生率、粒の大きさ、根粒形成および窒素固定の効率、栄養蓄積の効率、生物的および非生物的ストレスに対する抵抗性、炭素蓄積、植物構造、ロッジングに対する抵抗性、パーセント種子発芽、実生活力、および未発達の特徴を含み得る。例えば、これらは、制限なしに、（ストレスのある条件下での発芽を含めた）発芽の効率、（ストレスのある条件下での成長率を含めた）成長率、穂の数、種子の数／穂、種子の大きさ、種子の組成（澱粉、油、蛋白質)、種子充填量の特徴も含み得る。「収量」は、多くの方法で測定することができ、これらは、テスト重量、種子重量、種子の数／植物、種子重量、種子の数／単位面積（つまり、種子、または種子の重量／エーカー）、ブッシェル／エーカー、メータートン／エーカー、トン／エーカー、キロ／ヘクタールを含み得る。１つの具体例において、本発明の植物は、収量の要素である促進された特徴を呈し得る。促進された特徴は、同じ、または非常によく似た遺伝子型の非トランスジェニック植物と比較した時、農学的改良とみなすことができる様式で変化した植物の特徴、または表現型である。
【００２０】
本発明は、なかでも、CDK阻害剤様活性を有するトウモロコシのポリペプチドをコードする単離されたまたは精製された核酸分子を提供する。「CDK阻害剤様活性」によって、ヒストンH1キナーゼアッセイ(実施例14参照)におけるCDK活性を減少する能力を意味する。好ましくは、CDK活性は、少なくとも約10%、より好ましくは少なくとも約20%、さらにより好ましくは少なくとも約30%、なおさらにより好ましくは少なくとも約40%、50%、60%、70%、または80%、最も好ましくは少なくとも約90%以上、減少する。「単離された」によって、その天然の環境から除去されたことを意味する。核酸ならば、単離されたは、他の核酸分子からの核酸の分離および、他の細胞物質、組換え技術によって生産されるなら培養液媒体、または合成されるなら化学的前駆体のいずれかからの実質的分離を意味する。「精製された」によって、純度が増加したことを意味し、ここに「純度」は相対的用語であって、絶対的純度として解釈されるべきではない。「核酸分子」は、DNA(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)またはRNA(例えば、mRNA)のポリマー、つまり、ポリヌクレオチドを網羅するように意図され、これは、一本鎖または二本鎖であってよく、キメラDNA/RNAオリゴヌクレオチドを含み得、ならびに非天然または改変されたヌクレオチドを含有していてもよい。
【００２１】
１つの具体例において、(i) 配列番号: 1 [ZmKRP1]のヌクレオチド配列、(ii) 配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii) 配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列と少なくとも約70% (または75%、80%、85%、90%、95%、または99%)同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、または(iv) (i)-(iii)のいずれか１記載の断片（ここに、該断片は、少なくとも約35 (または40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、またはそれ以上)の連続するヌクレオチドを含む）を含む単離されたまたは精製された核酸分子が提供される。
【００２２】
もう１つの具体例において、(i)配列番号: 3 [ZmKRP2]のヌクレオチド配列、(ii)配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii)配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列と少なくとも約70% (または75%、80%、85%、90%、95%、または99%)同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK 阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、または(iv) (i)-(iii)のいずれか１の断片（ここに、該断片は、少なくとも約35 (または40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、またはそれ以上)の連続したヌクレオチドを含む）を含む単離されたまたは精製された核酸分子が提供される。
【００２３】
さらにもう１つの具体例において、本発明は、本質的に(i)配列番号: 7 [ZmKRP4]のヌクレオチド配列、(ii)配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、または(iii) 配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列と少なくとも約70% (または75%、80%、85%、90%、95%、または99%)同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK 阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列よりなる単離されたまたは精製された核酸分子を提供する。
【００２４】
なおさらにもう１つの具体例において、本発明は、(i) 配列番号: 9 [ZmKRP5]のヌクレオチド配列、(ii) 配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii)配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列と少なくとも約70% (または75%、80%、85%、90%、95%、または99%)同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK 阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、または(iv) (i)-(iii)のいずれかの断片を含む単離されたまたは精製された核酸分子を提供し、ここに該断片は、少なくとも約120 (または125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、またはそれ以上)の連続したヌクレオチドを含む。
【００２５】
(i)配列番号: 11 [ZmKRP6]のヌクレオチド配列、(ii) 配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、(iii) 配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列と少なくとも約70% (または75%、80%、85%、90%、95%、または99%)同一であるアミノ酸配列をコードし、CDK阻害剤様活性を有するヌクレオチド配列、および (iv) (i)-(iv)のうちのいずれか１の断片を含み、該断片は少なくとも約390 (または400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、またはそれ以上)の連続したヌクレオチドを含む単離されたまたは精製された核酸分子も提供される。
【００２６】
そのような核酸分子は、標準的PCR増幅技術に従い、鋳型としてcDNA、mRNAまたはゲノムDNAおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することができる。別法として、それらを、自動DNA合成器のような、標準的合成技術を用いて合成してもよい。
【００２７】
上記の単離されたまたは精製された核酸分子を、部分的に、「配列同一性のパーセンテージ」に関して特徴付ける。この関連で、所与の核酸分子を、比較ウィンドウにわたり、核酸配列を最適に並べることによって、上記の核酸分子 (つまり、参照配列)と比較することができ、ここに、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適な整列のために、付加または欠失を含まない参照配列と比較するように、付加または欠失 (つまり、ギャップ)を含み得る。配列同一性のパーセンテージを、同一の核酸塩基が両方の配列において生じる位置の数、つまり、マッチした位置の数を決定し、マッチした位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数によって割り、結果に100を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算する。比較のための配列の最適な整列は、既知のアルゴリズムのコンピューター化された実行によって実施することができる。配列整列およびパーセント同一性計算は、以降、本明細書において、「Clustal W アルゴリズム」と呼ばれる、LASARGENEバイオインフォマティクスcomputing suite (DNASTAR Inc., Madison, WI)のMegalignプログラムのデフォルトパラメーターを用いて、Clustalアルゴリズム (Higgins et al., CABIOS, 5 (2):151-153 (1989))によって行うことができる。他のコンピューター化された履行は、GCG Wisconsin Package (Accelrys, San Diego, CA)におけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA、またはNational Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD)から入手可能なBlastNおよびBlastXを含む。加えて、整列を、検査によって実施することができる。配列は、典型的には、BESTFITまたはBlastNを用いて、デフォルトパラメーターによって比較する。同一性を決定する好ましい方法は、実施例1記載のパラメーターに従い、Clustal W アルゴリズムである。
【００２８】
しかしながら、２つのポリヌクレオチド配列は、核酸レベルでは実質的に異なり得るが、遺伝暗号の縮退のため、もし同一でないなら、実質的に同様のアミノ酸配列をコードし得ることを、当業者は理解するであろう。本発明は、そのようなポリヌクレオチド配列を網羅するように意図される。これに関連して、上記核酸分子の断片をプローブとして使用して、他のポリヌクレオチド配列を同定することができることが留意されるべきである。
【００２９】
実質的に、上記の単離されたまたは精製された核酸分子に対して、ならびに配列番号: 13、15、および17、および配列番号: 6、14、16、および18のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して相補的またはアンチセンスな配列 (または少なくとも約35の連続したヌクレオチドを含むもののようなその断片)を含むまたはそれよりなる単離されたまたは精製された核酸分子も提供される。単離されたまたは精製された核酸分子は、所望により、ベクターの形態である。
【００３０】
所望により、上記の単離されたまたは精製された核酸分子を、プロモーターに操作可能に連結することができる。プロモーターは、雄性生殖組織中で優先的に発現されるプロモーターを含めた、細菌、バクテリオファージ、プラスチドまたは植物細胞において機能するプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。いずれかの適当なプロモーターを、本明細書下記のとおり使用することができる。そのようなプロモーターの例は、トウモロコシのSILKY1プロモーター(Ambrose et al., Molec. Cell, 5(3):569-579 (2000))、タバコのNTM19プロモーター(Oldenhof et al., Plant Molec. Biol., 31:213-225 (1996); 米国特許6,407,314; およびWO 97/30166)、タバコのNPG1プロモーター(例えば、米国出願公報2003/0061635参照)、トウモロコシのPCA55プロモーター(例えば、WO 92/13957参照)、ArabidopsisのAP3プロモーター(Zhou et al., Planta, 215:248-257 (2002))、およびBrassicaのBgp1プロモーター(Zhou et al. (2002), infra)を含むが、これらに限定されるものではない。他の例は、LAT52 (Twell et al., Molec. Gen. Genet., 217(2-3):240-245 (1989); and Twell et al., Genes Dev., 5(3):496-507 (1991))からのもののような、葯優先プロモーター、またはコメのRA8(Jeon et al., Plant Mol. Biol., 39(1):35-44 (1999))、トウモロコシZm13 (Guerrero et al., Molec. Gen. Genet., 224:161-168 (1993))またはコメPS1 (Zou et al., Amer. J. Bot., 81(5):552-561 (1994))からのもののような花粉優先プロモーター、apg (葯優先; Twell et al., Sex. Plant. Repro., 6:217-224 (1993))からのもののような小胞子優先プロモーターを含む。いくつかの例において、トウモロコシの雄性生殖組織において優先的に発現されるプロモーターが望ましいであろう(例えば、実施例5参照)。
【００３１】
所望により、上記の単離されたまたは精製された核酸分子は、プロモーターに操作可能に連結することができる。本発明のプロモーターは、一般的には、細菌、バクテリオファージ、または植物細胞において機能するプロモーターを含むが、これらに限定されるものではない。細菌発現に有用なプロモーターは、lacZ、Sp6、T7、T5、またはE. coli glg C プロモーターである。植物細胞に有用なプロモーターは、グロブリンプロモーター (例えば、Belanger and Kriz, Genet., 129:863-872 (1991)参照)、gamma zein Z27プロモーター(例えば、Lopes et al., Mol. Gen. Genet., 247:603-613 (1995)参照)、L3オレオシンプロモーター (米国特許6,433,252)、オオムギPER1プロモーター (Stacey et al., Plant Mol. Biol., 31:1205-1216 (1996)、本明細書中に引用によって援用されるP-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、P-Zm.CPC214tr2またはP-Os.CPC214 (米国仮出願60/531,483)のような胚芽優先プロモーター、本明細書中に引用によって援用されるUSPプロモーター (米国出願公報2003/229918)、7Sαプロモーター、7Sα'プロモーター (例えば、Beachy et al., EMBO J., 4:3047 (1985) または Schuler et al., Nucleic Acid Res., 10(24):8225-8244 (1982)参照)、CaMV 35S プロモーター (Odell et al., Nature, 313:810 (1985))、CaMV 19S (Lawton et al., Plant Mol. Biol., 9:31F (1987))、nos (Ebert et al., PNAS U.S.A., 84:5745 (1987))、Adh (Walker et al., PNAS U.S.A., 84:6624 (1987))、ショ糖シンターゼ (Yang et al., PNAS U.S.A. 87:4144 (1990))、チューブリン、アクチン(Wang et al., Mol. Cell. Biol., 12:3399 (1992))、cab (Sullivan et al., Mol. Gen. Genet., 215:431 (1989))、PEPCaseプロモーター (Hudspeth et al., Plant Mol. Biol., 12:579 (1989))、またはR遺伝子複合体に関連したもの(Chandler et al., The Plant Cell, 1:1175 (1989))を含む。Figwort Mosaic Virus (FMV)プロモーター (Richins et al., Nucleic Acids Res., 20:8451 (1987))、arcelin、トマトE8、パタチン、ユビキチン、mannopine シンターゼ (mas)、大豆種子蛋白質グリシリン(Gly)、および大豆栄養貯蔵蛋白質 (vsp)プロモーターは、有用なプロモーターの他の例である。
【００３２】
１つの好ましい具体例において、使用されたプロモーターは、胚および／または糊粉組織中で高度に発現される。トウモロコシおよび他の植物中で機能することが分かっている好ましいプロモーターは、オレオシンのためのプロモーター(例えば、L3 プロモーター、米国特許6,433,252)、グロブリンプロモーター (例えば、Belanger and Kriz, Genet., 129:863-872, 1991参照)、オオムギペルオキシレドキシンプロモーター (Per1, Stacy et al., Plant Mol. Biol., 31:1205-1216, 受託 #X96551)、本明細書中に引用によって援用されるP-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、P-Zm.CPC214tr2、またはP-Os.CPC214 (米国仮出願60/531,483)のような胚芽優先プロモーター、またはトウモロコシ(WO 01/40440 A2)のMIPシンターゼプロモーターを含む。
【００３３】
内胚乳で高度に発現されるプロモーターの例は、トウモロコシ内胚乳で見受けられる貯蔵蛋白質の群であるトウモロコシをコードする遺伝子からのプロモーターを含む。トウモロコシ遺伝子に対するゲノムクローンは単離されており(Pedersen et al., Cell, 29:1015-1026 (1982) and Russell et al., Transgenic Res., 6(2):157-168 (1997))、15 kD、16 kD、19 kD、22 kD、および27 kD遺伝子を含むこれらのクローンからのプロモーターを使用することができる。トウモロコシにおいて、および他の植物において機能することが分かっている他の好ましいプロモーターは、以下の遺伝子に対するプロモーターを含む：waxy (顆粒結合澱粉シンターゼ)、Brittle and Shrunken 2 (ADP グルコースピロホスホリラーゼ)、Shrunken 1(ショ糖シンターゼ)、分枝酵素IおよびII、澱粉シンターゼ、脱分岐酵素、オレオシン、グルテリン、ショ糖シンターゼ(Yang et al., PNAS U.S.A., 87:4144-4148 (1990))、Betl1 (basal endosperm transfer layer)およびグロブリン1。当業者に知られる本発明の実施に有用な他のプロモーターもまた本発明によって考えられる。
【００３４】
さらに、転写エンハンサーまたはエンハンサーの複製を使用して、特定のプロモーターからの発現を増加することができる。そのようなエンハンサーの例は、Adhイントロン1 (Callis et al., Genes Develop., 1:1183 (1987))、ライスアクチンイントロン (McElroy et al., Mol. Gen. Genet., 231(1):150-160 (1991)) (米国特許 5,641,876)、ショ糖シンターゼイントロン (Vasil et al., Plant Physiol., 91:5175(1989))、トウモロコシHSP70イントロン (Rochester et al., EMBO J., 5:451-458 (1986)) TMVオメガエレメント(Gallie et al., The Plant Cell, 1:301 (1999)) CaMV 35S エンハンサーまたはオクトピンシンターゼエンハンサー (Last et al., 米国特許5,290,924)を含むが、これらに限定されるものではない。転写開始部位およびコーディング配列,つまり、非翻訳リーダー配列の開始の間のDNA配列が遺伝子発現に影響を及ぼすことができるように、特定のリーダー配列を使用することを望むものがいるかもしれない。当業者に入手可能ないずれかのリーダー配列を使用してよい。好ましいリーダー配列は、例えば、mRNA安定性を増加するまたは維持することによっておよび／または翻訳の不適切な開始を防ぐことによって、結合遺伝子の発現の最適レベルを向ける(Joshi, Nucl. Acid Res., 15:6643 (1987))。そのような配列の選択は、当業者の判断による。高等植物、特に大豆、トウモロコシ、コメ、およびキャノーラにおいて高度に発現される遺伝子から由来する配列が考えられる。
【００３５】
誘導性プロモーターは、操作可能に連結された核酸の発現もまたオンされたりまたはオフされたりするように、外から加えられた剤によってオンしたりオフしたりできる。例えば、Ptacプロモーターのような細菌プロモーターを、形質転換された細菌細胞に添加されたイソチオプロピルガラクトシドのレベルによって、遺伝子発現の変動するレベルに導入することができる。植物において、宿主植物が成熟に達した後、所与の遺伝子の発現が望まれる場合においては、誘導プロモーターを使用することができる。そのような誘導プロモーターは、ヒートショックプロモーター、ストレス応答プロモーター、化学的誘導プロモーターを含む。
【００３６】
また、本発明の発現カセットは、異種核酸からの転写を終了するための信号として作業し、得られたmRNAのポリアデニル化を指向するカセットの3'末端近くの配列を含むであろう。これらは、一般的に、3'非翻訳領域または3' UTRと呼ばれる。転写終了信号として作用し得るいくつかの3'エレメントは、Agrobacterium tumefaciensのノパリンシンターゼ遺伝子(Bevan et al., Nucl. Acid Res., 11:369 (1983))、ナピン3'非翻訳領域 (Kridl et al., Seed Sci Res., 1:209-219 (1991))、グロブリン 3'非翻訳領域 (Belanger and Kriz, Genetics, 129:863-872 (1991))、またはZ27のようなトウモロコシ遺伝子からのもの (Lopes et al., Mol Gen Genet., 247:603-613 (1995))からのものを含む。
【００３７】
さらに、本発明は、上記の単離されたまたは精製された核酸分子を含むベクターを提供する。上記の核酸分子を、いずれかの適当なベクターにクローン化することができ、ならびにそれを使用して、いずれかの適当な宿主を形質転換または形質移入することができる。ベクターの選択およびそれらを構築するための方法は、一般に、当業者に知られており、一般的な技術文献に記載されている(一般的には、"Recombinant DNA Part D," Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)参照)。望ましくは、ベクターは、適切にかつベクターがDNAまたはRNAであるか否かを考慮して、該ベクターが導入される宿主(例えば、細菌、真菌、または植物)のタイプに特異的である転写および翻訳開始および終了コドンのような制御配列を含む。
【００３８】
円形または線形であるベクターの構築体を、上記のような全核酸配列または原核あるいは真核宿主細胞において機能的な複製システムに連結されたその一部を含有するように調製することができる。複製システムは、ColE1、2 mμ プラスミド、λファージ、f1線状ファージ、Agrobacterium種 (例えば、Ag. tumefaciensおよびAg. rhizogenes)等から由来することができる。
【００３９】
複製システムおよび挿入された核酸に加えて、構築体は、形質転換されたまたは形質導入された宿主の選択を可能にする１以上のマーカー遺伝子を含み得る。マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質、重金属、除草剤等への抵抗性といった殺生剤抵抗性、栄養要求性宿主における相補性を含んで、原栄養体等を提供する。
【００４０】
適当なベクターは、増殖または発現あるいは両方に設計されたものを含む。好ましいクローニングベクターは、pUCシリーズ、pBluescriptシリーズ(Stratagene, LaJolla, CA)、pETシリーズ(Novagen, Madison, WI)、pGEXシリーズ(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)、およびpEXシリーズ(Clonetech, Palo Alto, CA)よりなる群から選択される。λGT10、λGT11、λZapII (Stratagene)、λEMBL4、およびλNM1149のようなバクテリオファージベクターを使用することもできる。植物発現ベクターの例は、pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI121、およびpBIN19 (Clonetech, Palo Alto, CA)を含む。酵母発現ベクターの例は、pYES2.1、pYES2、および他のpYES誘導体(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含む。
【００４１】
植物発現ベクターは、上記の核酸分子に操作可能に連結された天然のまたは非天然のプロモーターを含み得る。例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的（つまり、組織内で特異的または優先的に発現される）、器官特異的（つまり、器官内で特異的または優先的に発現される）および成長特異的（つまり、成長の（複数の）特定の段階の間、特異的または優先的に発現される）プロモーターの選択は、当業者の範囲内である。同様に、上記の核酸分子をプロモーターと組み合わせることも、当業者の範囲内である(例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)参照)。
【００４２】
もし、CDK阻害剤様遺伝子の発現をアップレギュレートする、つまり、いずれかの手段によって、mRNAレベルまたは蛋白質レベルで約２倍、１０倍、１００倍以上のように、CDK阻害剤様遺伝子の発現を増加させることを望むならば、本明細書中で提供されるように、CDK阻害剤様ポリペプチドをコードする遺伝子を導入することによってそうすることが好ましい。遺伝子は、好ましくはベクターを通して導入される。多くの阻害剤が、関心のある組織内で発現されることが好ましい。遺伝子の複数の余分なコピーを、植物細胞、植物組織、植物器官、または植物に導入することができ、あるいは優先的または特異的に雄性繁殖組織内で発現されるプロモーターのような、強いプロモーターを含むベクターを、植物細胞、植物組織、植物器官、または遺伝子がより高い割合で発現される植物に導入し、それにより、代わりに、より多くのコードされた蛋白質へと翻訳されるより多くのmRNAを生じる。
【００４３】
本明細書中で使用されるように「抑制」または「抑制する」は、転写後遺伝子抑制および転写抑制を含めた遺伝子からの転写体または蛋白質を抑制するためのよく知られた方法のいずれかを意味する。転写後遺伝子抑制は、抑制に標的された遺伝子と相同性を有する転写されたRNAによって媒介される。抑制する導入遺伝子から転写されたRNAは、好ましくは、二本鎖要素を有して、RNA干渉(RNAi)と呼ばれるものを有効にする。転写抑制は、プロモーターDNA配列に対して相同性を有する転写された二本鎖RNAによって媒介されて、プロモータートランス抑制と呼ばれるものを有効にする。
【００４４】
より具体的には、二本鎖RNAによる転写後遺伝子抑制は、Shewmaker et al. (米国特許5,107,065および5,759,829)によって開示されるようなアンチセンスDNA構築体を有する植物形質転換から、Jorgensen et al. (米国特許5,283,184 and 5,231,020)によって開示されるようなセンス配向されたDNA構築体を有する植物形質転換から、またはRedenbaugh et al. (Safety Assessment of Genetically Engineered Flavr SavrTM Tomato, CRC Press, Inc., 1992)によって、 Goldbach et al. (EP 0426195 A1,  1991)によって、Sijen et al. (The Plant Cell, 8:2277-2294, 1996)によって、Waterhouse et al. (WO 99/53050)によって、Graham et al. (WO 99/49029)によって、Lowe et al. (米国出願公報2003/0175965 A1)によって、Fillatti (米国特許出願10/465,800)によって、Plaetinck et al. (米国出願公報2003/0061626 A1)によって、Liu et al. (米国特許6,326,193)によって、Agrawal et al. (WO 94/01550)によって、Werner et al. (WO 98/05770)によって、Oeller (米国出願公報2002/0048814 A1)によって、Gutterson et al. (米国出願公報2003/0018993 A1)によって、Glassman et al. (米国出願公報2003/0036197 A1)によって、開示されるようなRNAi構築体を有する植物形質転換から生じ得る。植物における転写後遺伝子抑制のための物質および方法を開示する全ての上記特許、出願、および国際公報は、引用によって、本明細書中に援用される。
【００４５】
プロモータートランス抑制のような転写抑制は、標的遺伝子のためのプロモーターDNAの反転された反復に操作可能に連結されたプロモーターを含むDNA構築体を発現することによって、有効にすることができる。プロモータートランス抑制によって媒介されたそのような遺伝子抑制に有用な構築体は、両方とも本明細書中に引用によって援用されるMette et al., The EMBO Journal, 18(1):241-148, 1999およびMette et al., The EMBO Journal, 19(19):5194-5201, 2000によって開示される。
【００４６】
植物における転写後遺伝子抑制の好ましい方法は、例えば、末端ヘアピン構造によって安定化された、センス配向またはアンチセンス配向された、転写されたRNAを使用する。転写後遺伝子抑制を有効にするための好ましいDNA構築体は、抑制に標的された遺伝子に対して相同性を有するアンチセンス配向されたRNAのセグメントに転写され、ここに3'末端にて、アンチセンスRNAセグメントに続いて、センス配向のRNAの連続した、相補的な、より短いセグメントがある。植物中の自己安定化したアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドの使用は、WO 94/01550 (Agrawal et al.)に開示されている。また、アンチセンスRNAがポリ(CG)ヌクレオチドのヘアピン形成反復によって安定化されるWO 98/05770 (Werner et al.)を参照、また、センスまたはアンチセンスRNAがポリ(T)-ポリ(A)テイルによって安定化される米国出願公報2002/0048814 A1 (Oeller)を参照。また、センスまたはアンチセンスRNAが、NOS遺伝子のサブ配列の逆位反復によって安定化される米国出願公報2003/0018993 A1 (Gutterson et al.)を参照。また、標的に対して相同性を有するRNAが、2つの相補的RNA領域によって安定化される米国出願公報2003/0036197 A1 (Glassman et al.)参照。安定化されたRNAを使用するための物質および方法および植物における遺伝子抑制におけるその使用を開示する全ての上記特許、出願、および国際公報は、本明細書中に、引用によって援用される。
【００４７】
プロモータートランス抑制のような転写抑制は、標的遺伝子に対する逆位反復に操作可能に連結されたプロモーターを含むDNA構築体を発現することによって達成することができる。プロモータートランス抑制によって媒介されるそのような遺伝子抑制に有用な構築体は、両方とも引用によって本明細書中に援用されるMette et al., The EMBO Journal, 18(1):241-148, 1999 and Mette et al., The EMBO Journal, 19(19):5194-5201, 2000によって開示される。
【００４８】
なおさらにもう１つの方法は、優性ネガティブ突然変異体の使用である。例えば、本明細書中に記載されるようにCDK阻害剤様活性を有するポリペプチドの優性ネガティブ突然変異体は、C-末端コーディング配列、特に本明細書中に記載のポリペプチドの間で高度に保存されたC-末端コーディング配列の全てまたは一部を、完全にまたは部分的に欠失することによって、発生させることができる。得られた突然変異体は、トウモロコシからの胚芽特異的プロモーターのようなプロモーターに操作可能に連結し、トウモロコシ植物またはその一部への導入のために、ベクターにクローン化することができる。例えば、Jasinski et al., Plant Physiol., 130:1871-1882 (2002))参照。
【００４９】
また、リボザイムは、内因性植物遺伝子の発現を阻害するための手段としての使用を有すると報告されている(例えば、Merlo et al., Plant Cell, 10(10):1603-1622 (1998)参照)。実質的にいずれの標的RNAとも特異的に対をなすリボザイムを設計し、特異的な位置にて、ホスホジエステル骨格を開裂して、それにより、標的RNAを機能的に不活化することは可能である。この開裂を実施する際、リボザイムは、それ自体、全く改変されず、従って、他の分子を再生し、開裂して、それを真の酵素とすることができる。アンチセンスRNA内のリボザイム配列の包含は、それらに対してRNA-開裂活性を授与し、それにより、構築体の活性を増加する。標的RNA-特異的リボザイムの設計および使用は、Haseloff et al., Nature, 334:585-591 (1988)において記載される。好ましくは、リボザイムは、リボザイムの活性部位の各側面上に、標的配列に対して相補的な少なくとも約20の連続したヌクレオチドを含む。
【００５０】
別法として、当該分野でよく知られる逆遺伝学システムを使用して、抑制されたまたはヌルの突然変異体を発生させ単離することができる。１つのそのようなシステム、Trait Utility System for Corn、つまりTUSCは、他の生物からの成功したシステムに基づいている(Ballinger et al., PNAS U.S.A., 86:9402-9406 (1989); Kaiser et al., PNAS U.S.A. 87:1686-1690 (1990); and Rushforth et al., Mol. Cell. Biol., 13:902-910 (1993))。システムの中心的特徴は、これらの挿入対立遺伝子のうちの少なくともいくつかが突然変異体であるであろうと予期して、関心のあるDNA配列内のMuトランスポゾン挿入を同定することである。トウモロコシにおいてシステムを開発するために、Mutatorトランスポゾンストックの大集団から収集し、次いで、それを自家受粉させて、F2種子を生産した。特異的なDNA配列内にMuトランスポゾン挿入を見つけるために、DNA試料の収集を、遺伝子特異的プライマーおよびMuトランスポゾンの逆方向反復にアニールするプライマーを用いて、PCRを介してスクリーニングする。PCR産物は、標的遺伝子内にMuトランスポゾン挿入を含有する植物から鋳型DNAが来る時のみに望まれる。一旦、そのようなDNA試料が同定されると、対応する植物からのF2種子は、トランスポゾン挿入対立遺伝子につきスクリーニングされる。an1遺伝子のトランスポゾン挿入突然変異体は、TUSC手順(Bensen et al., Plant Cell, 7:75-84 (1995))を介して入手されている。このシステムは他の植物種に適用可能であり、時には、必要に応じて、当該分野の知識および技術に従って修飾される。
【００５１】
T-DNA挿入突然変異誘発を使用して、所与の遺伝子の発現に悪影響を及ぼすように、上記遺伝子のうちの１つにおいて、挿入突然変異体を発生させることができる。植物のT-DNAタグ系統を、PCRを用いてスクリーニングすることができる。例えば、プライマーは、T-DNAの一方の末端のために設計することができ、もう一方のプライマーは、関心のある遺伝子のために設計することができ、両方のプライマーをPCRにおいて使用することができる。PCR産物が得られなければ、関心のある遺伝子において挿入はない。対照的に、もしPCR産物が得られれば、関心のある遺伝子に挿入がある。しかしながら、挿入突然変異体は、しばしば、致命的であり得るヌル対立遺伝子を生じる。別法として、もし所与の酵素をコードする１以上の遺伝子が存在すれば、遺伝子のうちの１つにおける突然変異体は、遺伝子によってコードされる酵素の発現の減少を招きかねない。
【００５２】
所与の遺伝子の発現を減少させるもう１つの別法は、上記の遺伝子のうちの１つの発現を阻害するまたは上記の遺伝子のうちの１つによってコードされた蛋白質の活性を阻害する化合物を使用することである。この関連で、x線またはガンマ線を、スルホン酸エチルメチル(EMS)または酪酸ジメチル(DMB)のような化学的突然変異原として使用することができる。
【００５３】
上記に加えて、遺伝子置換技術を使用して、所与の遺伝子の発現を増加または減少することができる。遺伝子置換技術は、相同組換えに基づく(Schnable et al., Curr. Opinions Plant Biol., 1:123 (1998)参照)。関心のある酵素の核酸を、突然変異誘発（例えば、挿入、欠失、複製、または置換）によって操作して、酵素機能を増加または減少させることができる。改変された配列をゲノムに導入して、相同組換えを介して、現存する、例えば野生型遺伝子を置換することができる (Puchta and Hohn, Trends Plant Sci., 1:340 (1996); Kempin et al., Nature, 389:802 (1997))。
【００５４】
所与のCDK阻害剤様ポリペプチドの活性を、インビトロで測定することができる。例えば、所与のCDK阻害剤様ポリペプチドのH1ヒストンのリン酸化反応をCDKによって防ぐ能力を測定することができる（例えば、実施例14参照）。
【００５５】
所与のCDK阻害剤様ポリペプチドが他の遺伝子の発現に影響を及ぼすか否かは、例えば、トランスジェニック植物を用いて決定することができる。マイクロアレイチップ技術が確立され、利用可能になるにつれ(DeRisi et al., Science, 278:680-686 (1997))、所与の遺伝子改変のトウモロコシの全ての同定された遺伝子に対する効果を、マイクロアレイチップを用いて決定することができる。代謝放射性トレーサー研究を行って、インビトロで、異なる産物プールの発生を測定することができる。そのような研究において、放射活性物質で標識した前駆体を無傷の組織に提供し、放射性標識を、前駆体が代謝される時にモニターする。野生型植物およびCDK阻害剤様ポリペプチド遺伝子のうちの１つの活性を減少させた植物を比較することによって、所与のCDK阻害剤様ポリペプチドにおける減少の効果を決定することができる。
【００５６】
上記を鑑みて、本発明は、所望によりベクターの形態である上記の単離されたまたは精製された核酸分子を含む宿主細胞を提供する。適当な宿主は、E. coli、B. subtilis、A. tumefaciens、S. cerevisiae、およびN. crassaを含めた、細菌、酵母および植物細胞を含む。E. coli宿主は、TB-1、TG-2、DH5α、XL-Blue MRF' (Stratagene, Austin, TX)、SA2821、Y1090、およびTG02を含む。植物細胞はトウモロコシ細胞を含む。
【００５７】
また、上記を鑑みて、本発明は、上記の単離されたまたは精製された核酸分子によってコードされる単離されたまたは精製されたポリペプチドを提供する。ポリペプチドは、好ましくは、アミノ末端およびカルボキシル末端を含む。ポリペプチドは、D-アミノ酸、L-アミノ酸、またはD-およびL-アミノ酸の混合物を含む。しかしながら、D-アミノ酸は天然に生じるプロテアーゼによって認識されないことから、D-アミノ酸よりなる蛋白質は、インビボで、その生物学的活性のより大きい保持を有すると予測されるため、アミノ酸のD-形態は特に好ましい。
【００５８】
天然のアミノ酸配列を改変して、変異型ポリペプチドを生産することは、当業者に知られる種々の手段によって実施することができる。例えば、アミノ酸置換は、便宜に、合成時に、ポリペプチドへ導入することができる。別法として、部位特異的な突然変異体を、発現ベクターに、修飾された部位を含む合成されたオリゴヌクレオチドを連結することによって導入することができる別法として、Walder et al., Gene, 42:133 (1986); Bauer et al., Gene, 37:73 (1985); ならびに米国特許4,518,584および4,737,462に開示されるような、オリゴヌクレオチド指向、部位特異的突然変異誘発手順を使用することができる。
【００５９】
いずれかの特定の天然に生じるアミノ酸に対して、保存的または中性置換を有効にする合成および天然に生じるアミノ酸を選択することは、当業者の技量内である。側鎖の疎水性または極性、側鎖の一般的な大きさおよび生理学的状況下の酸性または塩基性特徴を有する側鎖のpK値を考慮することに加えて、当業者は、望ましくは、いずれかの特定のアミノ酸置換がなされる状況を考慮するであろう。例えば、リシン、アルギニン、およびヒスチジンは、しばしば、アルギニンおよびヒスチジンはより頻繁に、適当に相互に置換される。当該分野において知られるように、これは、全ての３つのアミノ酸が、塩基性側鎖を有する一方、リシンおよびアルギニンの側鎖に対するpK値がヒスチジン (約6)に対するより、相互(約10および12)に対するのにずっとより近いからである。同様に、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、しばしば、相互に適当に置換され、但し、グリシンは、しばしば、群のうちの他のメンバーに対して適当に置換されない。これは、これらのアミノ酸の各々は、ポリペプチドに組み込まれる時、比較的疎水性であるが、グリシンのα-炭素の欠乏が、（α-炭素周辺の）回転のファイ（phi）およびプサイ（psi）角度に、グリシニル残基が、他のアミノ酸が相互に置換される時、ほとんど生じない立体構造または二次構造の変化を触発することができる立体配座の自由を許容するからである。頻繁に相互に適当に置換されるアミノ酸の他の基は、グルタミン酸およびアスパラギン酸よりなる基;フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンよりなる基;セリン、スレオニンおよび所望によりチロシンよりなる基を含むがこれらに限定されるものではない。加えて、当業者は、天然に生じるアミノ酸を有する合成アミノ酸を容易にグループ分けすることができる。
【００６０】
所望により、ポリペプチドは、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、またはリン酸化反応によって、あるいは酸付加塩、アミド、エステル、特に、C-末端エステル、および本発明のポリペプチドのN-アシル誘導体の作成によって、修飾することができる。また、ポリペプチドを修飾して、当該分野で知られる方法に従い、他の部位を有する共有結合または非共有結合複合体を形成することによって、蛋白質誘導体を作成することができる。共有結合複合体は、ポリペプチドを含むアミノ酸の側鎖上またはN-またはC-末端の官能基に、化学部位を連結することによって調製することができる。望ましくは、そのような修飾および結合は、ポリペプチド (およびその変異体)の活性に悪影響を与えない。そのような修飾および結合は、より大きいまたは小さい活性を有し得るが、活性は望ましくは打ち消されず、改変されていないポリペプチドの特徴である。
【００６１】
ポリペプチド(および断片、変異体、および融合蛋白質)は、多くの慣用的技術のうちのいずれかによって調製することができる。ポリペプチドは、天然に生じる源からまたは組換え源から単離する、あるいは精製することができる。例えば、組換え蛋白質の場合、所望の蛋白質をコードするDNA断片を、よく知られた分子遺伝学的技術(例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)および本明細書中で「実施例」下で援用される他の引用文献参照)を用いて、適切なベクターへとサブクローン化することができる。
【００６２】
断片を転写し、引き続いて、蛋白質をインビトロで翻訳することができる。また、(例えば、Clontech, Palo Alto, CA; Amersham Life Sciences, Inc., Arlington Heights, IL; InVitrogen, San Diego, CAによって製造されるもの等のような)商業的に入手可能なキットを使用することもできる。
【００６３】
ポリメラーゼ連鎖反応を、所望により、核酸の操作において使用することができる。
【００６４】
また、そのようなポリペプチドを、当該分野で知られる方法に従い、自動ペプチド合成器を用いて合成することができる。別法として、ポリペプチド(および断片、変異体、および融合蛋白質)を、当業者によく知られる標準的ペプチド合成技術(例えば、Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, (Springer-Verlag, Heidelberg: 1984)に概略されるように)を用いて合成することができる。特に、ポリペプチドは、固相合成の手順を用いて合成することができる(例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:214954 (1963); Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30:705-739 (1987);および米国特許5,424,398参照)。所望により、これを、自動化ペプチド合成器を用いて行うことができる。
【００６５】
t-ブチルオキシカルボニル(t-BOC)または9-グルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)アミノ酸遮断基の除去および樹脂からの蛋白質の分離を、例えば、減少された温度にて、酸処理によって達成することができる。次いで、ポリペプチド含有混合物を、例えば、ジエチルエーテルによって抽出して、非ペプチド有機化合物を除去することができ、合成された蛋白質を、樹脂粉から（例えば、約25% w/v酢酸)抽出することができる。ポリペプチドの合成後、（例えば、HPLCを用いる）さらなる精製を実施して、いずれかの不完全な蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、または遊離アミノ酸を除去することができる。アミノ酸および／またはHPLC分析を、合成されたポリペプチドに対して実施して、その同一性を立証することができる。本発明による他の適用につき、当業者に知られるような、化学結合によって、または遺伝子手段を介してかのいずれかで、より大きい融合蛋白質の一部として、ポリペプチドを生産することが好ましいであろう。このように、本発明は、また、単離されたまたは精製されたポリペプチド (またはその断片)またはその変異体およびいずれかの所望の特性またはエフェクター機能を有する１以上の他のポリペプチド/（複数の）蛋白質を含む融合蛋白質を提供する。
【００６６】
核酸分子、ベクター、およびポリペプチドを、農学方法および種々のスクリーニングアッセイ(例えば、WO 02/28893および米国特許6,215,048参照)において使用することができる。例えば、核酸分子を使用して、例えば、ベクターを介して、宿主細胞においてCDK阻害剤様ポリペプチドを発現させる、生物学的試料においてCDK阻害剤様ポリペプチドをコードするmRNAを検出する、サザーンブロットを介してのように、CDK阻害剤様ポリペプチドをコードする遺伝子の遺伝子改変を検出する、CDK阻害剤様ポリペプチドを抑制する、あるいは植物に雄性不稔性または矮性を与えるために、CDK阻害剤様ポリペプチドをアップレギュレートする、あるいは特定の器官の形成を阻害することができる。ポリペプチドを使用して、CDK阻害剤様ポリペプチドにおける欠陥またはトウモロコシ植物において減少した活性を有するまたは全く活性を有さない突然変異CDK阻害剤様ポリペプチドの存在を補う、あるいは直接または間接に拘わらず、トウモロコシ植物中のCDK阻害剤様ポリペプチドに対して、過剰なレベルの基質を処理することができる。別法として、ポリペプチドを使用して、それらの活性を変調する能力につき、剤をスクリーニングすることができる。
【００６７】
上記を鑑みて、本発明は、CDK阻害剤様ポリペプチドを抑制するのに使用することができる種々の核酸構築体を提供する。１つの具体例において、核酸構築体は、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含み、その発現は:配列番号: 1 [ZmKRP1]、配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 3 [ZmKRP2]、および配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を生じ、単独でまたは少なくとも１つの他の転写可能なヌクレオチド配列とのさらなる組合せで、その発現は、配列番号: 5 [ZmKRP3]、配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 7 [ZmKRP4]、配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 9 [ZmKRP5]、配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 11 [ZmKRP6]、配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 13 [ZmKRP7]、配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 15 [ZmKRP8]、配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 17 [ZmKRP9]、および配列番号: 18 [ZmKRP9]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を生じ、ここに、核酸構築体が２以上の転写可能なヌクレオチド配列を含む時、ヌクレオチド配列は、核酸構築体上でいずれかの順序で存在し得、ポリシストロン性であり得、ここに各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100 (または125、150、175、200、225、250、275、300、325、375、400、425、450、500、750、1,000、1,500、2,000、またはそれ以上) 連続したヌクレオチドを含み、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘発する。「所望により」によって、構築体上に存在するいずれかのおよび全ての他のヌクレオチド配列とは独立した、各転写可能なヌクレオチド配列が、遺伝子抑制を誘導するあるいは遺伝子抑制を誘導しないかのいずれかであることを意味する。
【００６８】
別法として、核酸構築体は転写可能なヌクレオチド配列を含み、その発現は内因性ヌクレオチド配列の抑制を招く: 
(i) 配列番号: 1 [ZmKRP1]または配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(ii) 配列番号: 3 [ZmKRP2]または配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(iii) 配列番号: 5 [ZmKRP3]または配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(iv) 配列番号: 7 [ZmKRP4]または配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(v) 配列番号: 9 [ZmKRP5]または配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(vi) 配列番号: 11 [ZmKRP6]または配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(vii) 配列番号: 13 [ZmKRP7]または配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
(viii) 配列番号: 15 [ZmKRP8]または配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、および
(ix) 配列番号: 17 [ZmKRP9]または配列番号: 18 [ZmKRP9]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
【００６９】
もう１つの具体例において、核酸構築体は、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含み、その発現は、いずれか一方または両方が、少なくとも１つの他の転写可能なヌクレオチド配列とのさらなる組合せの配列番号: 7 [ZmKRP4]および／または配列番号: 17 [ZmKRP9]の内因性ヌクレオチド配列の抑制を招き、その発現は:
(i)配列番号: 2 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 1 [ZmKRP1]またはヌクレオチド配列、
(ii)配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 3 [ZmKRP2]またはヌクレオチド配列、
(iii) 配列番号: 5 [ZmKRP3]または配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 5のヌクレオチド 175-342に完全には対応せず、
(iv) 配列番号: 9 [ZmKRP5]または配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 9のヌクレオチド 450-570に完全には対応せず、
(v) 配列番号: 11 [ZmKRP6]または配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 11のヌクレオチド 380-765に完全には対応せず、
(vi) 配列番号: 13 [ZmKRP7]または配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 13のヌクレオチド 335-718に完全には対応せず、および
(vii) 配列番号: 15 [ZmKRP8]または配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 15のヌクレオチド 350-405または420-698に完全には対応せず、
よりなる群から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を招き、
ここに、転写可能なヌクレオチド配列は核酸構築体上でいずれかの順序で存在し得、ポリシストロン性であり得、ここに各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100 (または125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、750、1,000、1,500、2,000、またはそれ以上)の連続したヌクレオチドを含み、ここに各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘発する。本明細書において使用されるように、遺伝子発現は、センス抑制、アンチセンス、dsRNA、およびリボザイム技術を含むがこれらに限定されるものではない種々の技術を介する遺伝子発現の減少を指す。
【００７０】
さらにもう１つの具体例において、核酸構築体は、少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列を含み、その発現は:
(i)配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 1 [ZmKRP1]またはヌクレオチド配列、
(ii)配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 3 [ZmKRP2]またはヌクレオチド配列、
(iii)配列番号: 6 [ZmKRP3]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 5 [ZmKRP3]またはヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 5のヌクレオチド 175-342に完全には対応せず、
(iv)配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 9 [ZmKRP5]またはヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 9のヌクレオチド 450-570に完全には対応せず、
(v)配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 11 [ZmKRP6]またはヌクレオチド配列、但し配列番号: 11の転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 11のヌクレオチド 380-765に完全には対応せず、
(vi)配列番号: 14 [ZmKRP7]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 13 [ZmKRP7]またはヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 13のヌクレオチド 335-718に完全には対応せず、
(vii)配列番号: 16 [ZmKRP8]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 15 [ZmKRP8]またはヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 15のヌクレオチド 350-405または420-698に完全には対応せず、および
(viii)配列番号: 18 [ZmKRP9]のアミノ酸配列をコードする配列番号: 17 [ZmKRP9]またはヌクレオチド配列、但し転写可能なヌクレオチド配列は配列番号: 17のヌクレオチド 1-183に完全には対応せず、
よりなる群から選択される内因性ヌクレオチド配列の抑制を招き、
ここに、転写可能なヌクレオチド配列は、核酸構築体上でいずれかの順序で存在し得、ポリシストロン性であり得、ここに、各転写可能なヌクレオチド配列は、少なくとも約100 (または125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、500、750、1,000、1,500、2,000、またはそれ以上)連続したヌクレオチドを含み、ここに、各転写可能なヌクレオチド配列の発現は、所望により、遺伝子抑制を誘導する。「完全には対応しない」によって、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも約３つのヌクレオチドが、ヌクレオチドの指定された範囲の外のヌクレオチドに対応することを意味する。
【００７１】
上記核酸構築体に関して、その発現が抑制を招く少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列は、非コーディング配列からであり得る。例えば、非コーディング配列は、イントロン、プロモーター領域からのヌクレオチド配列、5'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、3'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、または前述のいずれかの断片であり得る。そのような配列の例は、配列番号: 44-58のものを含む。
【００７２】
上記の構築体は例示的なものであって、制限するように意図されていない。抑制構築体において、例えば、ZmKRP1またはZmKRP2を、単独であるいは一緒に抑制することができる。これに関連して、ZmKRP1またはZmKRP2を、単独であるいはZmKRP3、ZmKRP4、ZmKRP5、ZmKRP6、ZmKRP7、ZmKRP8、およびZmKRP9のいずれか１とのさらなる組合せで一緒に抑制することができる。利便性のために、略語「ZmKRP」を、組合せの以下のリストから省いている。例えば、1、2および3; 1、2および4; 1、2および5; 1、2および6; 1、2および7; 1、2および8; 1、2および9; 1および3; 1および4; 1および5; 1および6; 1および7; 1および8; 1および9; 2および3; 2および4; 2および5; 2および6; 2および7; 2および8; 2および9; 1、3および4; 1、3および5; 1、3および6; 1、3および7; 1、3および8; 1、3および9; 2、3および4; 2、3および5; 2、3および6; 2、3および7; 2、3および8; 2、3および9; 1、4および5; 1、4および6; 1、4および7; 1、4および8; 1、4および9; 1、5および6; 1、5および7; 1、5および8; 1、5および9; 2、4および5; 2、4および6; 2、4および7; 2、4および8; 2、4および9; 1、5および6; 1、5および7; 1、5および8; 1、5および9; 2、5および6; 2、5および7; 2、5および8; 2、5および9; 1、6および7; 1、6および8; 1、6および9; 2、6および7; 2、6および8; 2、6および9; 1、7および8; 1、7および9; 2、7および8; 2、7および9; 1、8および9; 2、8および9; 1、3、4、および5; 1、3、4、および6; 1、3、4、および7; 1、3、4、および8; 1、3、4、および9; 2、3、4、および5; 2、3、4、および6; 2、3、4、および7; 2、3、4、および8; 2、3、4、および9; 1、4、5、および6; 1、4、5、および7; 1、4、5、および8; 1、4、5、および9; 2、4、5、および7; 2、4、5、および8; 2、4、5、および9; 1、5、6、および7; 1、5、6、および8; 1、5、6、および9; 2、5、6、および7; 2、5、6、および8; 2、5、6、および9; 1、6、7、および8; 1、6、7、および9; 2、6、7、および8; 2、6、7、および9; 1、7、8、および9; 2、7、8、および9; 1、3、4、5、および6; 1、3、4、5、および7; 1、3、4、5、および8; 1、3、4、5、および9; 2、3、4、5、および6; 2、3、4、5、および7; 2、3、4、5、および8; 2、3、4、5、および9; 1、3、4、5、6、および7; 1、3、4、5、6、および8; 1、3、4、5、6、および9; 2、3、4、5、6、および7; 2、3、4、5、6、および8; 2、3、4、5、6、および9; 1、3、4、5、6、7、および8; 1、3、4、5、6、7、および9; 2、3、4、5、6、7、および8; 2、3、4、5、6、7、および9; 1、3、4、5、6、7、8、および9; 2、3、4、5、6、7、8、および9; 1、2、3、および4; 1、2、3、および5; 1、2、3、および6; 1、2、3、および7; 1、2、3、および8; 1、2、3、および9; 1、2、4、および5; 1、2、4、および6; 1、2、4、および7; 1、2、4、および8; 1、2、4、および9; 1、2、5、および6; 1、2、5、および7; 1、2、5、および8; 1、2、5、および9; 1、2、6、および7; 1、2、6、および8; 1、2、6、および9; 1、2、7、および8; 1、2、7、および9; 1、2、8、および9; 1、2、3、4、および5; 1、2、3、4、および6; 1、2、3、4、および7; 1、2、3、4、および8; 1、2、3、4、および9; 1、2、4、5、および6; 1、2、4、5、および7; 1、2、4、5、および8; 1、2、4、5、および9; 1、2、5、6、および7; 1、2、5、6、および8; 1、2、5、6、および9; 1、2、6、7、および8; 1、2、6、7、および9; 1、2、7、8、および9; 1、2、3、4、5、および6; 1、2、3、4、5、および7; 1、2、3、4、5、および8; 1、2、3、4、5、および9; 1、2、3、4、5、6、および7; 1、2、3���4、5、6、および8; 1、2、3、4、5、6、および9; 1、2、3、4、5、6、7、および8; 1、2、3、4、5、6、7、および9; or 1、2、3、4、5、6、7、8、および9を抑制することができる。さらに、構築体は、いずれかの順序で、ヌクレオチド配列を含み得る。また、ヌクレオチド配列の長さは変動し得る。
【００７３】
抑制構築体において、ZmKRP4またはZmKRP9を、単独または一緒に抑制することができる。これに関連して、ZmKRP4またはZmKRP9を、単独あるいは一緒に、ZmKRP1、ZmKRP2、ZmKRP3、ZmKRP5、ZmKRP6、ZmKRP7、およびZmKRP8のうちのいずれか１との組合せで抑制することができる。例えば、4および1; 4および2; 4および3; 4および5; 4および6; 4および7; 4および8; 4、1および2; 4、1および3; 4、1および5; 4、1および6; 4、1および7; 4、1および8; 4、1、2および3; 4、1、2、および5; 4、1、2、および6; 4、1、2、および7; 4、1、2、および8; 4、1、2、3、および5; 4、1、2、3、および6; 4、1、2、3、および7; 4、1、2、3、および8; 4、1、2、3、5、および6; 4、1、2、3、5、および7; 4、1、2、3、5、および8; 4、1、2、3、5、6、および7; 4、1、2、3、5、6、および8; 4、1、2、3、5、6、7、および8; 4、2および3; 4、2および5; 4、2および6; 4、2および7; 4、2および8; 4、3および5; 4、3および6; 4、3および7; 4、3および8; 4、5および6; 4、5および7; 4、5および8; 4、6および7; 4、6および8; 4、7および8; 4、2、3、および5; 4、2、3、および6; 4、2、3、および7; 4、2、3、および8; 4、3、5、および6; 4、3、5、および7; 4、3、5、および8; 4、3、6、および7; 4、3、6、および8; 4、5、6、および7; 4、5、6、および8; 4、6、7、および8; 4、2、3、5、および6; 4、2、3、5、および7; 4、2、3、5、および8; 4、2、3、5、6、および7; 4、2、3、5、6、および8; 4、2、3、5、6、7、および8; 9および1; 9および2; 9および3; 9および5; 9および6; 9および7; 9および8; 9、1および2; 9、1および3; 9、1および5; 9、1および6; 9、1および7; 9、1および8; 9、1、2、および3; 9、1、2、および5; 9、1、2、および6; 9、1、2、および7; 9、1、2、および8; 9、1、2、3、および5; 9、1、2、3、および6; 9、1、2、3、および7; 9、1、2、3、および8; 9、1、2、3、5、および6; 9、1、2、3、5、および7; 9、1、2、3、5、および8; 9、1、2、3、5、6、および7; 9、1、2、3、5、6、および8; 9、1、2、3、5、6、7、および8; 9、2および3; 9、2および5; 9、2および6; 9、2および7; 9、2および8; 9、3および5; 9、3および6; 9、3および7; 9、3および8; 9、5および6; 9、5、および7; 9、5、および8; 9、6および7; 9、6および8; 9、7および8; 9、2、3、および5; 9、2、3、および6; 9、2、3、および7; 9、2、3、および8; 9、3、5、および6; 9、3、5、および7; 9、3、5、および8; 9、3、6、および7; 9、3、6、および8; 9、5、6、および7; 9、5、6、および8; 9、6、7、および8; 9、2、3、5、および6; 9、2、3、5、および7; 9、2、3、5、および8; 9、2、3、5、6、および7; 9、2、3、5、6、および8; 9、2、3、5、6、7、および8; 4、9および1; 4、9および2; 4、9および3; 4、9および5; 4、9および6; 4、9および7; 4、9および8; 4、9、1、および2; 4、9、1、および3; 4、9、1、および5; 4、9、1、および6; 4、9、1、および7; 4、9、1、および8; 4、9、1、2、および3; 4、9、1、2、および5; 4、9、1、2、および6; 4、9、1、2、および7; 4、9、1、2、および8; 4、9、1、2、3、および5; 4、9、1、2、3、および6; 4、9、1、2、3、および7; 4、9、1、2、3、および8; 4、9、1、2、3、5、および6; 4、9、1、2、3、5、および7; 4、9、1、2、3、5、および8; 4、9、1、2、3、5、6、および7; 4、9、1、2、3、5、6、および8; 4、9、1、2、3、5、6、7、および8; 4、9、2、および3; 4、9、2、および5; 4、9、2、および6; 4、9、2、および7; 4、9、2、および8; 4、9、3、および5; 4、9、3、および6; 4、9、3、および7; 4、9、3、および8; 4、9、5、および6; 4、9、5、および7; 4、9、5、および8; 4、9、6、および7; 4、9、6、および8; 4、9、7、および8; 4、9、2、3、および5; 4、9、2、3、および6; 4、9、2、3、および7; 4、9、2、3、および8; 4、9、3、5、および6; 4、9、3、5、および7; 4、9、3、5、および8; 4、9、3、6、および7; 4、9、3、6、および8; 4、9、5、6、および7; 4、9、5、6、および8; 4、9、6、7、および8; 4、9、2、3、5、および6; 4、9、2、3、5、および7; 4、9、2、3、5、および8; 4、9、2、3、5、6、および7; 4、9、2、3、5、6、および8;または4、9、2、3、5、6、7、および8を抑制することができる。さらに、構築体は、いずれかの順序で、ヌクレオチド配列を含み得る。また、ヌクレオチド配列は、長さが変動し得る。
【００７４】
さらに、上記構築体のいずれかは、トウモロコシの粒の胚および／または糊粉において優先的にまたは特異的に発現されるプロモーターを含み、プロモーターは少なくとも１つのヌクレオチド配列に操作可能に連結される。プロモーターは、例えば、L3のようなオレオシンプロモーター、グロブリンプロモーター、またはPer1プロモーターであり得る。上記の抑制構築体において、抑制を生じる少なくとも１つの転写可能なヌクレオチド配列の発現は、非コーディング配列であってもよい。非コーディング配列は、イントロン、プロモーター領域からのヌクレオチド配列、5'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、3'非翻訳領域からのヌクレオチド配列、または前述のいずれかの断片であり得る。そのような配列の例は、配列番号: 44-58のものを含む。
【００７５】
上記の構築体は、当該分野で知られる方法に従い、作成することができる(一般的には、"Recombinant DNA Part D," Methods in Enzymology, Vol. 153, Wu and Grossman, eds., Academic Press (1987)および本明細書中で「実施例」下で引用される文献参照)。構築の適当な方法は、本明細書中に記載される実施例において例示される。
【００７６】
核酸構築体が、単独であるいは植物組織、植物器官、または植物の一部として、植物細胞によって取り込まれ、その中で発現するように、植物細胞、植物組織、植物器官または植物を、ベクターのような核酸構築体と接触させるための技術は、当該分野で知られている。例えば、そのような方法は、植物組織培養技術を含む。本明細書において、「接触」は、ベクターが細胞に進入し、その中で発現するような様式で、細胞、組織、器官、または植物が、核酸構築体またはベクターと接触させることを意味するように意図される。
【００７７】
植物細胞、植物組織、植物器官、または植物を、当該分野で知られるいずれかの適当な手段によって、ベクターと接触させることができる。好ましくは、所望の蛋白質を発現するトランスジェニック植物が生産される。所望の蛋白質をコードする所望のポリヌクレオチド配列の植物細胞への導入のための種々の方法は： (1)マイクロインジェクション(Capecchi, Cell, 22(2):479-488 (1980))ｍエレクトロポレーション(Fromm et al., PNAS U.S.A., 82(17):5824-5828 (1985); 米国特許5,384,253)およびマイクロプロジェクタイル媒介送達(微粒子銃または遺伝子銃技術) (Christou et al., Bio/Technology, 9:957 (1991); Fynan et al., PNAS U.S.A. 90(24):11478-11482 (1993))のような物理的方法; (2) ウィルス媒介送達法(Clapp, Clin. Perinatol., 20(1):155-168 (1993); Lu et al., J. Exp. Med., 178(6):2089-2096 (1993); Eglitis and Anderson, Biotechniques, 6(7):608-614 (1988);および(3)Agrobacterium媒介形質転換方法; (Fraley et al., PNAS U.S.A., 80:4803 (1983)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
植物細胞の形質転換に最も一般的に使用される方法は、Agrobacterium媒介DNA導入プロセスおよび微粒子銃またはマイクロプロジェクタイル衝撃媒介プロセス（つまり、遺伝子銃）である。Agrobacterium媒介形質転換は、Agrobacterium属に属する遺伝子操作された土壌菌の使用を介して達成される。いくつかのAgrobacterium種は、多くの植物種に、DNAのいずれかの所望の一片を運ぶように遺伝子操作することができる「T-DNA」として知られる特異的なDNAの導入を媒介する。T-DNA媒介発病のプロセスを作る主な事象は：毒性遺伝子の導入、T-DNAの処理および移動である。このプロセスは多くのレビューの主題である(Ream, Ann. Rev. Phytopathol., 27:583-618 (1989); Howard and Citovsky, Bioassays, 12:103-108 (1990); Kado, Crit. Rev. Plant Sci., 10:1-32 (1991); Zambryski, Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43:465-490 (1992); Gelvin, In Transgenic Plant, Kung and Wu, eds., Academic Press, San Diego, pp. 49-87 (1993); Binns and Howitz, In Bacterial Pathogenesis of Plants and Animals (Dang, ed.). Berlin: Springer Verlag, pp. 119-138 (1994); Hooykaas and Beijersbergen, Ann. Rev. Phytopathol., 32:157-179 (1994); Lessl and Lanka, Cell, 77:321-324 (1994); and Zupan and Zambryski, Annual Rev. Phytopathol., 27:583-618 (1995))。
【００７９】
植物のAgrobacterium媒介遺伝子形質転換は、いくつかの工程を含む。毒性のAgrobacteriumおよび植物細胞が、お互いと初めて接触する第１工程は、一般的には、「植菌」と呼ばれる。次いで、Agrobacterium含有溶液は、排出または吸引によって、外植片との接触から除去される。植菌後、Agrobacteriumおよび植物細胞／組織を、成長およびT-DNA導入に適した条件下で、数時間ないし数日間またはそれ以上の器官、一緒に成長させる。この工程を、「共培養」と呼ぶ。共培養およびT-DNA送達後、植物細胞を、殺菌剤または静菌剤によって処理して、外植片と接触しているおよび／または外植片を含有する容器中にあるAgrobacteriumを滅菌する。もし、これが、トランスジェニック対非トランスジェニック植物細胞の優先的成長を促進するためのいずれかの選択剤の不在下で行われるならば、これは、典型的には、「遅延」工程と呼ばれる。もし、トランスジェニック植物細胞に有利に働く選択圧力の存在下で行われるならば、それは「選択」工程と呼ばれる。「遅延」を使用する時、その後、典型的には、１以上の「選択」工程が続く。「遅延」および「選択」工程の両方は、典型的には、殺菌剤または静菌剤を含んで、いずれかの残っているAgrobacterium細胞を滅菌するが、これは、Agrobacterium細胞の成長が、感染(植菌および共培養)工程後、望ましくないからである。
【００８０】
TiまたはRiプラスミドを有するAgrobacterium tumefaciensおよびAgrobacterium rhizogenesの多くの野生型および安全株を、植物への遺伝子導入に使用することができる。Agrobacterium宿主は、それぞれ、腫瘍形成または発根を引き起こす腫瘍遺伝子を含有しない安全なTiおよびRiプラスミドを含有し、それらはベクターとして使用され、引き続いて植物に導入される関心のある遺伝子を含有する。好ましい株は、Agrobacterium tumefaciens 株C58、植物へのDNAの導入を媒介するのに使用されるノパリン型株、LBA4404または例えばEHA101またはEHA105といったsuccinamopine 型株のようなオクトピン型株を含むが、これらに限定されるものではない。インビトロでDNA組成物として調製される核酸分子は、E. coliのような適当な宿主に導入され、Agrobacteriumへと交配され、あるいは形質転換受容性Agrobacteriumへと直接形質転換される。これらの技術は当業者によく知られている。
【００８１】
Agrobacteriumは、Luria Burtani (LB)培地のような液体を、グリセロールストックから直接植菌するまたはAgrobacteriumを、グリセロールストックからの固形培地上に画線培養して、細菌を一般的には約26℃-30℃、または約28℃の適切な選択条件下で成長させる、および単一コロニーまたはプレートからのAgrobacteriumの小ループを取る、および選択剤を含有する液体培養培地を植菌することによってのいずれかで調製できる。当業者は、成長の手順およびAgrobacteriumに適当な培養条件ならびに引き続いての植菌手順を知っている。植菌に使用されるAgrobacterium培養液の密度およびAgrobacterium細胞対外植片の割合は、１つのシステムから次へと変動し得、従って、いずれかの形質転換方法に対するこれらのパラメーターの最適化が予測される。
【００８２】
典型的には、Agrobacterium培養液を、画線培養されたプレートまたはグリセロールストックから植菌し、一晩成長させ、殺菌細胞を洗浄し、外植片の植菌に適当な培養媒体中で再懸濁する。
【００８３】
マイクロプロジェクタイル衝撃 (米国特許5,550,318; 5,538,880; 5,610,042;およびWO 95/06128; これらの各々は、その全文において、引用によって本明細書中に援用される)に関して、粒子は核酸で覆われ、推進力によって細胞に送達される。例示的な粒子は、タングステン、白金、および好ましくは金よりなるものを含む。いくつかの例において、金属粒子上へのDNA沈殿は、マイクロプロジェクタイル衝撃を用いる受容細胞へのDNA送達に必要ないであろう。しかしながら、粒子が、DNAで覆われるよりも、むしろDNAを含有し得ると考えられる。従って、DNA被覆粒子は、粒子衝撃を介するDNA送達のレベルを増加し得るが、それ自体、必要ではないと言える。
【００８４】
衝撃について、懸濁液中の細胞を、フィルターまたは固体培養媒体上で濃縮する。別法として、未成熟な胚芽または他の標的細胞を、固体培養媒体上で並べてもよい。撃たれる細胞は、マイクロプロジェクタイル停止プレート下の適切な距離に置かれる。
【００８５】
加速によって植物細胞にDNAを送達するための方法の説明的な具体例は、Biolistics Particle Delivery System (BioRad, Hercules, CA)であり、これを使用して、ステンレス鋼またはNytexスクリーンのようなスクリーンを介して、懸濁液中で培養された単子葉植物細胞で覆われたフィルター表面上へと、DNAで覆われた粒子を進めることができる。スクリーンは、粒子が、大きい凝集体で、受容細胞へ送達されないように、粒子を分散する。プロジェクタイル装置および撃たれる細胞の間を介在するスクリーンは、プロジェクタイル凝集体のサイズを減少させ、大きすぎるプロジェクタイルによって受容細胞が負う損傷を減少させることによって、より高い頻度の形質転換に寄与し得ると考えられる。
【００８６】
マイクロプロジェクタイル衝撃技術は、広範に適用可能であり、これを使用して、実質的にいずれの植物種も形質転換することができる。マイクロプロジェクタイル衝撃によって形質転換された種の例は、トウモロコシ(WO 95/06128)、オオムギ、小麦(米国特許5,563,055、その全文において引用によって本明細書中に援用される)、コメ、オートムギ、ライ麦、サトウキビおよびソルガムのような単子葉種; ならびにタバコ、大豆(米国特許5,322,783、その全文において引用によって本明細書中に援用される)、ヒマワリ、落花生、綿、トマト、および一般的には野菜(米国特許5,563,055、その全文において引用によって本明細書中に援用される)を含めた多くの双子葉を含む。
【００８７】
形質転換手順に拘わらず、形質転換された植物細胞を選択またはスコア取するために、細胞に導入されたDNAは、再生可能な植物組織において機能する遺伝子を含有して、植物組織に、さもなければ有害である化合物に対する耐性を授与する化合物を生成する。選択可能、スクリーニング可能、またはスコア可能なマーカーとしての使用のための関心のある遺伝子は、GUS、緑色蛍光蛋白質 (GFP)、ルシフェラーゼ(LUX)、抗生物質または除草剤耐性遺伝子を含むが、これらに限定されるものではない。抗生物質抵抗性遺伝子の例は、ペニシリン、カナマイシン (およびネオマイシン、G418、およびブレオマイシン); メトトレキサート(およびトリメトプリム); クロラムフェニコール; カナマイシンおよびテトラサイクリンを含む。
【００８８】
本発明における使用に特に好ましい選択マーカー遺伝子は、カナマイシン (nptII)、ヒグロマイシンB (aph IV)、およびゲンタマイシン (aac3およびaacC4) (Dekeyser et al., Plant Physiol., 90:217-223 (1989))のような抗生物質、およびグリホセート (Della-Cioppa et al., Bio/Technology, 5:579-584 (1987))のような除草剤等のような化合物に抵抗性を授与する遺伝子を含む。また、フォスフィノスリシン、ビアラフォス、および陽性選択メカニズム(Joersbo et al., Mol. Breed., 4:111-117 (1998))に対する耐性を含むが、これらに限定されるものではない他の選択デバイスを導入することもでき、本発明の範囲内で考えられる。
【００８９】
上記の形質転換技術のいずれかによって誘導される形質転換された植物細胞を培養して、所望の形質転換された表現型を有する全植物を再生することができる。いずれの適当な植物培養媒体を使用することができる。適当な培地の例は、オーキシン、サイトカイニン、ABA、およびジベレリンを含むがこれらに限定されるものではないさらなる植物成長抑制剤によって補われたMS系培地(Murashige and Skoog, Physiol. Plant, 15:473-497, 1962)またはN6系培地 (Chu et al., Scientia Sinica, 18:659, 1975)を含むが、これらに限定されるものではないであろう。当業者は、適切に補われた時、植物組織成長および発達を支持し、植物形質転換および再生に適当である種々の植物培養培地を知っている。これらの組織培養培地は、商業用調製物、またはカスタム調製および修飾されたものとしてのいずれかで購入することができる。当業者は、形質転換および再生における使用のための栄養物および成長調節剤のような培地および培地補充物ならびに特定の種類の関心に最適化することができるインキュベーションの間の光強度、pH、およびインキュベーション温度のような他の培養条件を理解している。
【００９０】
当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物中に安定して組み込まれ、操作可能であると確認された後、それを性的交配によって他の植物に導入できることを理解するであろう。交配される種によって、多くの標準的育種技術のいずれかを使用することができる。
【００９１】
上記を鑑みて、本発明は、トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物における１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。該方法は、上記のように、トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物を、核酸構築体と接触させることを特徴とする。
【００９２】
従って、本発明は、さらに、そのような方法によって、CDK阻害剤様遺伝子の発現が抑制されているトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物を提供する。また、そのような植物から得られる種子およびそのような種子から得られる油および食物を提供する。
【００９３】
また、本発明は、約10,000以上、より好ましくは約20,000、さらにより好ましくは約40,000種子の容器を提供し、ここに種子の約10%以上、より好ましくは約25%、より好ましくは約50%、およびさらにより好ましくは約75%またはより好ましくは約90%は、本発明の植物から由来した種子である。
【００９４】
また、本発明は、約10kg以上、より好ましくは約25kg、およびさらにより好ましくは約50kg種子の容器を提供し、ここに種子の約10%以上、好ましくは約25%以上、より好ましくは約50%、さらにより好ましくは約75%またはより好ましくは90%は、本発明の植物から由来する種子である。
【００９５】
本発明の植物またはその部分のいずれかを加工して、飼料、食物、蛋白質、または油性製剤を生産してもよい。この目的に特に好ましい植物部分は種子である。好ましい具体例において、飼料、食物、蛋白質、または油性製剤は、反芻動物のために設計される。飼料、食物、蛋白質、および油性製剤を生産する方法は、当該分野で知られている。例えば、米国特許4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669;および6,156,227参照。好ましい具体例において、蛋白質調製物は高蛋白質調製物である。そのような高蛋白質調製物は、好ましくは、5% w/v以上、より好ましくは10% w/v、さらにより好ましくは15% w/vの蛋白質含有量を有する。
【００９６】
さらなる具体例において、本発明の飼料は、他の飼料と混ぜてもよい。好ましい具体例において、本発明の植物から生産されるまたは本発明の方法によって生じる飼料は、いずれかの産物の飼料要素の約0.5%、約1%、約5%、約10%、約25%、約50%、約75%、または約90%容量または重量をなす。もう１つの具体例において、該飼料調製物は、混ぜてもよく、混合物の約10%、約25%、約35%、約50%、または約75%容量以上をなし得る。
【００９７】
さらに、本発明は、トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ器官、またはトウモロコシ植物中の１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現をアップレギュレートする方法を提供する。該方法は、トウモロコシ細胞、組織、器官、または植物を、配列番号: 1 [ZmKRP1]、配列番号: 2 [ZmKRP1]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 3 [ZmKRP2]、配列番号: 4 [ZmKRP2]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 7 [ZmKRP4]、配列番号: 8 [ZmKRP4]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 9 [ZmKRP5]、配列番号: 10 [ZmKRP5]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、配列番号: 11 [ZmKRP6]、および配列番号: 12 [ZmKRP6]のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列よりなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの核酸構築体と接触させることを特徴とし、ここに細胞、組織、または器官が核酸構築体と接触する時、該方法は、さらに、１以上のCDK阻害剤様遺伝子の発現が、トウモロコシ細胞、組織、器官、または植物においてアップレギュレートされる細胞、組織、または器官から植物を発生させることを特徴とする。該方法は、細胞、組織、器官、または植物を、１以上の核酸構築体と接触させることを特徴とし得、各核酸構築体は、異なるヌクレオチド配列を含む。核酸は、トウモロコシの雄性生殖器官において優先的に発現するプロモーターを含み得、ここに該プロモーターは、少なくとも１つのヌクレオチド配列に操作可能に連結される。そのようなプロモーターの例は、本明細書において上記したように、トウモロコシのSILKY1プロモーターおよび他である。トウモロコシの雄性生殖器官における優先的発現は、雄性不稔植物の発生を招き得る。
【実施例】
【００９８】
実施例
本発明を、続く実施例の文脈中でさらに記載する。これらの実施例は、本発明をさらに説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するように意図されていない。
【００９９】
実施例１
この実施例は、トウモロコシからのCDK阻害剤の同定を記載する。
Monsantoが独自に開発したESTデータベースの初期tBLASTnサーチ(Altschul et al., Nuc. Acid Res., 25:3389-3402 (1997))を、Arabidopsis CDK阻害剤様遺伝子AtKRP1 (「At」はArabidopsis thalianaを示す; KRP1は上記定義とおり; GenBank #AAC49698)、AtKRP2 (GenBank #CAB76424)、AtKRP3 (GenBank #CAC41617)、AtKRP4 (GenBank #CAC41618)、AtKRP5 (GenBank #CAC41619)、AtKRP6 (GenBank #CAC41620)、およびAtKR P7 (GenBank #CAC41621)の公に入手可能な配列を用いて行った。加えて、上記のポリペプチドのC末端領域からの以下の保存された配列を、tBLASTnサーチにおいて使用した: (PTTAEIEDFFSEAEEQQQKQFIEKYNFDIVNDEPLEGRYEWVKLKP) [配列番号: 59]。
【０１００】
BLASTサーチから得られた７つのトウモロコシ配列クラスターは、上記のArabidopsis CDK阻害剤様遺伝子と相同性を有すると同定した。本明細書において使用されるように、「配列クラスター」は、相同性の重複する領域を有するEST配列の群を指す。各クラスターからの代表的なクローンを、全長二本鎖配列決定し、Monsantoが独自に開発したESTデータベースに対するBLASTサーチに使用した。さらなる2つのクラスターを、この第２のBLASTサーチから同定し、代表的なクローンを、全長二本鎖配列決定した。DNA配列分析は、トウモロコシにおいて少なくとも9つの異なるCDK阻害剤様クラスターの存在を示した。これらの9つのクラスターおよび（ZmKRP1からZmKRP9と名付けられた）それらの代表的なクローンを、表1において要約する。
【０１０１】
【表１】
2007531497.tif 000002
【０１０２】
これらの9つのクラスターの代表的なクローンのコード領域および推定アミノ酸配列を、配列番号: 1-18として配列表に示す。全長オープンリーディングフレーム(ORF)を、ZmKRP1、2、4、5、および6につき同定し、他方、部分的ORFを、ZmKRP3、7、8、および9につき同定した。
【０１０３】
蛋白質配列整列は、トウモロコシKRPが、特に、C末端領域にて、Arabidopsis ICK/KRPを有する小さな保存領域を共有することを示した(図 1)。加えて、いくつかのトウモロコシKRPは、相互に高い配列同一性を有した。例えば、ZmKRP6およびZmKRP7は90%同一であり、ZmKRP1およびZmKRP2は84%同一であった。他のZmKRPメンバーは、16-50%同一性を共有したに過ぎない。
【０１０４】
配列整列およびパーセント同一性計算を、Clustal W アルゴリズムによって実施した。
【０１０５】
実施例2
この実施例は、トウモロコシ胚芽における抑制のために標的とされたCDK阻害剤の同定を記載する。
【０１０６】
Monsantoが独自に開発したトウモロコシcDNAデータベースを、CDK BLASTnプロトコルを用いて、実施例1 (配列番号: 1、3、5、7、9、11、13、15、および17)において同定されたトウモロコシKRPコード領域からのDNA配列を用いて検索した。これを実施して、どの配列が、成長する穀粒／胚芽組織、ならびに種々の非穀粒組織からのcDNAライブラリにおいて示されるかを決定した。ZmKRP1、ZmKRP2、ZmKRP4、ZmKRP6、ZmKRP7、およびZmKRP9 (配列番号: 1、2、4、6、7、および9)に対応するcDNA配列を、穀粒または胚芽cDNAライブラリにおいて同定した。ZmKRP3、ZmKRP5、and ZmKRP8に対応するcDNA配列は、非穀粒ライブラリから生じたライブラリにおいてのみ見受けられた。これらの結果は、少なくとも、穀粒または胚芽cDNAライブラリにおいて見受けられた配列によって表される遺伝子の群は、抑制に対して標的とされる必要があることを示した。しかしながら、穀粒ライブラリにおける所与の遺伝子に対応するcDNA配列を同定することができなくても、配列は所与のライブラリに示されないかもしれないため、穀粒発現の可能性を排除しない。全9つの遺伝子は、胚芽において発現され得るため、全ては、dsRNA抑制構築体を用いる抑制に標的とされた。
【０１０７】
実施例3
この実施例は、ZmKRP遺伝子の組織特異的抑制のためのベクターの構築およびこれらのベクターを有するトウモロコシ植物の形質転換を記載する。
【０１０８】
実施例1において同定された9つのトウモロコシCDK阻害剤様遺伝子を抑制するために、dsRNA戦略を使用した。dsRNA構築体を構築して、全9つのZmKRP遺伝子(ZmKRP1-9)を抑制するために、200の塩基対断片(F)を、183の塩基対が選択され(配列番号: 26)ポリシストロン性様式で連結されるZmKRP9を除く各遺伝子(F1ないしF7, 配列番号: 19ないし25)の3'末端領域から選択した。ZmKRP6およびZmKRP7は、この3' 200塩基対領域において同一であるため、１つの断片を使用して、両方の遺伝子(F6)の抑制を標的とすることができる。最終トウモロコシ発現構築体を作成するために、２つの中間構築体を、生成した。2つの中間dsRNA構築体の構築は、図4および5に、模式的に示される。
【０１０９】
各中間dsRNA構築体は、介在するイントロン領域によって分離されたセンスおよびアンチセンス向きの両方において、4つの3'末端断片を含有した。第１の中間構築体は、F1からF4配列を含有し、第２は配列F5からF8を含有した。それぞれのプロモーターおよび3' UTRを有する２つのステムループ構造を、１つのトウモロコシ発現ベクターにおいて組み合せ(図 2)、実施例10記載のAgrobacterium形質転換方法を用いて、トウモロコシ形質転換に使用した。
【０１１０】
F1ないしF4配列を含有する中間dsRNA構築体を構築するために、F1ないしF4のセンス連結、F1ないしF4のアンチセンス連結、およびZmDnaK (HSP70をコードする遺伝子)イントロン断片(配列番号: 27) (例えば、米国特許5,424,412; Rochester et al., EMBO J., 5:451-458 (1986)参照)を、個々に、PCRによって発生させ、BamHI/BglII直接クローニング方法 (図 4)を用いて集める。PCR方法の前に、製造者 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)によって記載された標準プロトコルを行い、特記されない限り、5% DMSOを添加した。トウモロコシDNAの高GC含有量のため、DMSOを添加した。
【０１１１】
F1断片を、プライマーP1-StuI (配列番号: 28)およびP1-2R (配列番号: 29)を用いて、ZmKRP1 ESTクローンのDNAからPCR増幅した。プライマーは、表2に記載され、図 5に示される。次いで、F1断片を、当該分野でよく知られる標準的手順を用いて精製した。F1-2断片を、鋳型としてのZmKRP2 ESTクローン、およびプライマーとしてのP1-StuI (配列番号: 28)およびP2-3 (配列番号: 30)のDNAの同等量と混合された精製されたF1 PCR産物を用いることによって、PCR増幅を用いて発生させた。PCR産物F1-2を、標準の手順を用いてゲル精製した。同様に、F3およびF4を、プライマーP4-Bgl (配列番号: 31)、P3-4 (配列番号: 32)、およびP5-Bam (配列番号: 33)を用いてPCR連結して、PCR産物 F3-4を得た。引き続いて、F1-2およびF3-4産物を、プライマーP1-StuI、P2-3、およびP5-Bam (配列番号: 33)を用いて、PCR連結した。得られたPCR産物、F1-4を精製し、Topo-TAクローニングシステム(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてベクターへとクローン化した。得られたクローン、F14B3-センスを、完全長二本鎖配列決定した。次いで、F1-4断片を、プライマーP5-Bgl (配列番号: 34)およびP1-SseBam (配列番号: 35)を用いてF14B3-センスクローンからPCR増幅して、アンチセンス断片を発生させた。得られたPCR産物を、再び、Topo-TAクローニングシステムを用いてクローン化して、F14B3-アンチセンスクローンを形成した。このクローンを、標準の手順を用いて、配列決定によって確認した。
【０１１２】
【表２】
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【０１１３】
ZmDnaK-イントロン (例えば、米国特許5,424,412参照)を、プライマーPi-Bgl(配列番号: 36)およびPi-Bam(配列番号: 37)を用いて、Z27トウモロコシプロモーター (Lopes et al., Mol. Gen. Genet., 247:603-613 (1995)およびZmDnaKイントロンを含有する植物発現ベクターpMON70091からPCR増幅した。PCR産物、DnaK-1を、Topo-TA クローニングシステムを用いてクローニングした。このクローンを、全長二本鎖配列決定によって確認した。F1-4センス、ZmDnaKイントロン、およびF1-4 アンチセンス断片を、段階を追って集めた。まず、ZmDnaKイントロンを、BglIIおよびBamHIを用いて、上記のDnaK-1構築体から切り出した。次いで、ZmDnaK-イントロン/BamHI-BglIIのBglII部位が、F1-4の3'末端にて、（プライマーP5-Bamによって導入された）BamHI部位に連結されるように、このイントロンを、F14B3-センス構築体のBamHI部位に連結した。この連結反応は、構築体F14In2を得た。第２に、F1-4/ BglII-BamHI BglII部位がZmDnaKイントロンの3'末端にて（プライマーPi-Bamによって導入された）BamHI部位に連結されるように、F1-4断片をBglIIおよびBamHIによってクローンF14B3-アンチセンスから切り出し、F1-4/BglII-BamHI断片をF14In2のBamHI部位に連結した。この連結反応は構築体F142c1を得た。
【０１１４】
最後に、F1-4センス; ZmDnaKイントロン; F1-4アンチセンス断片を含有する全DNAセグメントを、StuIおよびSse8387Iを用いて、クローンF142c1から切り出し、pMON80611へとクローン化した。pMON80611は、植物のAgrobacterium形質転換用のバイナリーベクターである。それは、T-DNA導入、促進された35sプロモーター::グリホセート抵抗性マーカー遺伝子::nos 3' UTR (米国特許5,627,061)およびオレオシン L3 プロモーター (米国特許6,433,252)および関心のある遺伝子の発現に入手可能なクローニング部位を有するトウモロコシグロブリン 3' UTR (例えば、Belanger and Kriz, Genet., 129:863-872, (1991)参照)を含む植物発現カセット配列よりなる植物選択マーカーカセットに対する左および右ボーダーを含有する。得られた発現カセットを、WWZHEN03.0024と名付けた。
【０１１５】
次いで、F5ないしF8断片を含有する中間dsRNA構築体が生じた。F5ないしF8のセンス連結、F5ないしF8のアンチセンス連結、およびZmDnaKイントロン (配列番号: 27)を、個々に、PCRによって発生させ、上記および図5に示されたように、PCRまたはBamHI/BglII方向クローニング方法のいずれかを用いて集めた。それらのPCR連結に使用されたプライマーを、表2および図5にリストした。次いで、F5-8センス;ZmDnaKイントロン;F5-8アンチセンスを含む集められたセグメントを、ベクターpMON80611へとクローン化して、第２の発現カセットWWZHEN03.0023を発生させた。WWZHEN03.0023およびWWZHEN03.0024を組み合わせるために、F5-8センス; ZmDnaKイントロン; F5-8 アンチセンスを含むWWZHEN03.0023からの4528 bp AscI-FseI セグメントをゲル精製し (Qiagen Inc., Valencia, CA)、MluIおよびFseIによって消化されたWWZHEN03.0024に連結して、最終トウモロコシ形質転換構築体pMON71270を生じた(図 2)。
【０１１６】
Per1 プロモーター駆動ZmKRP抑制構築体を、２つの中間体dsRNA構築体WWZHEN03.0023およびWWZHDN03.0024 (上記)から作成した。まず、F1-4センス; ZmDnaKイントロン; F1-4 アンチセンスを含むセグメントを、SfiI およびSse8387I消化によって、WWZHDN03.0024から切り出し、次いで、Per1を含有するベクター pMON68290のSfiIおよびSse8387I部位にクローン化して、WWZHEN03.0041を生じた。同様に、F5-8センス;ZmDnaKイントロン;F5-8アンチセンスを含むセグメントを、SfiIおよびSse8387I消化によって、WWZHEN03.0023から切り出し、次いで、Per1を含有するベクター pMON68290のSfiIおよびSse8387I部位へとクローン化して、WWZHEN03.0042を発生させた。WWZHEN03.0041およびWWZHEN03.0042を組み合わせるために、F5-8センス; ZmDnaKイントロン; F5-8 アンチセンスを含むWWZHEN03.0042からの4481 bp AscI セグメントをゲル精製し(Qiagen Inc., Valencia, CA)、MluIによって消化されたWWZHEN03.0041に連結して、最終トウモロコシ形質転換構築体pMON71279を発生させた(図 3)。
【０１１７】
実施例4
この実施例は、トウモロコシ中の１以上のZmKRP遺伝子の抑制のための植物形質転換ベクターの構築を記載する。
【０１１８】
さらなる種子特異的抑制構築体を、50塩基対ないし全長遺伝子の範囲の代替の大きさの断片を用いて、単独または種々の組合せでのいずれかで生成する。一例として、トウモロコシL3 (オレオシン) プロモーターに操作可能に連結されたZmKRP1の200塩基対断片を用いて、dsRNA構築体を生成する。F1断片およびZmDnaK-イントロンを、実施例3で上記のとおりに生成する。２つの断片を連結して、中間体F1; ZmDnaK-イントロン断片を生成する。次いで、単離され精製されたF1断片のアリコットをPCR増幅して、F1-アンチセンスを発生させる。次いで、F1-アンチセンスを、中間F1; ZmDnaK-イントロン断片に連結して、dsRNA構築体F1; ZmDnaK-イントロン; F1-アンチセンスを発生させる。別法として、構築体を、P-Zm.CEP1、P-Zm.CPC214、P-Zm.CPC214tr1、P-Zm.CPC214tr2、P-Os.CPC214、およびP-Hv.PER1のようなプロモーターならびに当業者に知られる他の胚芽優先プロモーターのような下流のベクターにクローン化する。同様の構築体を、ZmKRP2、ZmKRP3、ZmKRP4、ZmKRP5、ZmKRP6、ZmKRP7、ZmKRP8、and ZmKRP9で生じさせるトランスジェニックトウモロコシ植物を生産する。トランスジェニック種子をこれらの構築体から分析して、続く実施例に記載のように、胚芽質量、粒質量、細胞増殖、全核油レベル、全種蛋白質レベル (%乾燥重量)、全種アミノ酸組成物、遊離アミノ酸レベル、および微量栄養素組成物における改変を同定する。次いで、上記の特性のいずれかにおいて改変を生じるdsRNA構築体において使用されるZmKRP遺伝子断片を、形質転換された植物の所望の表現型によって、次いでAgrobacterium形質転換を用いてトウモロコシに形質転換される単一のポリシストロン性dsRNA構築体において組み合わせ;トランスジェニック植物を実施例10に記載のように発生させる。
【０１１９】
実施例5
この実施例は、どのようにして植物中の内因性CDK阻害剤様遺伝子の発現を、アンチセンス技術を用いることによって抑制することができるかを記載する。
【０１２０】
トウモロコシ植物中に生じたZmKRP1のレベルを、ZmKRP1ポリペプチドのアンチセンスRNAを発現する導入遺伝子を、ゲノムに導入することによって減少させることができる。例えば、ZmKRP1 cDNAまたは長さ少なくとも100 bpのその断片を、L3 プロモーターの制御下で発現を駆動し、グロブリン 3' UTRを含有するアンチセンス配向において、植物発現ベクター pMON80611へとクローン化する(Belanger and Kriz, Genet., 129:863-872 (1991))。得られたベクターを、実施例10に記載のとおり、トウモロコシ植物に形質転換する。アンチセンス遺伝子の複数のコピーを、ゲノムへ導入することができる。他のCDK阻害剤様遺伝子、例えばZmKRP2をアンチセンス構築体へと作成し、ZmKRP1について上記のように、別々でまたは組み合わせて発現させることができる。
【０１２１】
実施例6
この実施例は、どのようにして、植物中の内因性CDK阻害剤様遺伝子を、リボザイム技術を用いることによって抑制することができるかを記載する。
【０１２２】
トウモロコシ植物の細胞において生じたZmKRP1 mRNAのレベルを、ZmKRP1 ポリペプチドをコードするmRNAに対して標的されたリボザイムを発現する導入遺伝子を、ゲノムに導入することによって減少させることができる。リボザイム構築体を、L3 プロモーターから発現を駆動し、グロブリン 3' UTR(Belanger and Kriz, Genet., 129:863-872 (1991))を含有するpMON80611に、内因性遺伝子(Merlo et al., Plant Cell, 10(10):1603-1622 (1998))の標的AUGに隣接して付加されたリボザイム配列を有する少なくとも24 bpのZmKRP1 cDNAをクローニングすることによって発生させる。得られた構築体を、実施例10に記載のように、トウモロコシ植物に形質転換する。リボザイム含有ZmKRP遺伝子の複数のコピーを、実施例10に記載のように、ゲノムへと導入することができる。(本明細書において上記のように)他のZmKRPポリペプチドの組合せに対して標的されたリボザイム含有遺伝子を、複数のZmKRP遺伝子が同時に抑制されるように、ZmKRP1に対して上記のように、ゲノムに導入することができる。
【０１２３】
実施例7
この実施例は、どのようにして植物中の内因性CDK阻害剤遺伝子の発現を、相同組換え技術を用いることによって抑制することができるかを記載する。
【０１２４】
トウモロコシ植物の細胞中に生じるZmKRP1のレベルは、相同組換えを介する遺伝子置換法によって減少させることができる。この方法において、内因性ZmKRP1遺伝子は、突然変異ZmKRP1遺伝子によって置換される。突然変異遺伝子は、内因性の置換された遺伝子によってコードされたものより、CDKの阻害において、効果的でないかあるいは完全に不足しているZmKRP1をコードする。ZmKRP1生産遺伝子を、１以上のヌクレオチド欠失、挿入、複製または置換によって突然変異する。突然変異遺伝子を、選択マーカー遺伝子に融合し、実施例10に記載のように、トウモロコシ植物の細胞に形質転換する。遺伝子置換を生じ得る相同組換え事象を、選択マーカー遺伝子に基づき、選択する(Puchta et al., Trends Plant Sci., 1:340 (1996); Kempin et al., Nature, 389:802 (1997))。遺伝子置換を、サザーンブロット分析またはPCRおよびDNA配列決定によって確認する。
【０１２５】
上記と同じ様式で、他のCDK阻害剤遺伝子を、独立してまたは組合せで、抑制することができる。
【０１２６】
実施例8
この実施例は、どのようにして、植物中の内因性CDK阻害剤遺伝子の発現を、センス抑制技術を用いることによって抑制することができるかを記載する。
【０１２７】
植物の細胞において生じるZmKRP1ポリペプチドのレベルは、センス抑制によって減少する。例えば、ZmKRP1 ポリペプチドをコードするcDNAを、Per1のような上流(5')、および／または下流(3')の転写または翻訳制御配列に融合し、キメラ遺伝子を、選択マーカー遺伝子を持つ適切な形質転換ベクターへとクローン化し、ベクターを実施例10に記載のようにトウモロコシ植物の細胞に形質転換する。形質転換体を、マーカー遺伝子(例えば、グリホセート耐性)の存在に基づき選択する。形質転換体を、推定上の形質転換体からのDNAのサザーンブロット分析によって確認する。そのような実験から由来するであろうトランスジェニック生物のほとんどは、内因性発現に影響を及ぼさずに、導入遺伝子を発現するであろう。しかしながら、２、３の場合において、導入遺伝子および内因性遺伝子の両方は抑制されるであろう。これらのセンス抑制植物を同定するために、少なくとも60のトランスジェニック植物からのRNAまたは蛋白質抽出物は、それぞれ、ZmKRP mRNAまたはポリペプチドの存在につき分析されるであろう。他のCDK阻害剤様遺伝子を、単独でまたは種々の組合せで使用することができる。
【０１２８】
実施例９
この実施例は、雄性生殖組織において、トウモロコシCDK阻害剤を発現することによって、雄性不稔トウモロコシ植物を発生させる１つの方法を記載する。
【０１２９】
トウモロコシSILKY1プロモーターを、nos 3' UTR (Bevan et al., Nucl. Acid Res., 11:369 (1983)) (他の可能性が存在する)およびグリホセート耐性選択マーカーを含有する別々の発現カセット中のZmKRP1、ZmKRP2、ZmKRP4、ZmKRP5、and ZmKRP6に操作可能に連結する。(米国特許5,627,061参照)。１以上の得られた発現カセットを、実施例10に記載のAgrobacterium形質転換プロトコルを用いて、トウモロコシに形質転換し、トランスジェニック植物が発生する。
【０１３０】
雄性不稔性は、もし花粉が存在するならば、花粉発芽アッセイ(Walden, D.B. (1994), In vitro Pollen Germination (pp 723-724), The Maize Handbook, Freeling, M. and Walbot, V. eds, Springer-Verlag, New York, Inc.)を行うことによって決定する。加えて、花粉生存性は、トランスジェニック花粉の非トランスジェニック植物の胚珠を受粉させ、導入遺伝子を有する生存可能な種子を生産する能力によってアッセイされる。不稔トランスジェニック植物は、トランスジェニック植物を、非トランスジェニックドナー花粉によって受粉させることによって維持する。
【０１３１】
実施例10
この実施例は、トウモロコシCDK阻害剤様配列を含有する構築体を有するトウモロコシ植物の形質転換を記載する。
【０１３２】
上記の形質転換ベクターを使用して、以下の手順を用いて、トウモロコシ植物を形質転換する。トウモロコシ植物を、標準的技法下で、暗室内で成長させる。制御された受粉を実施する。グリセロールストック中にベクターを含有するAgrobacterium ABIを、抗生物質カナマイシン (50mg/L)、スペクチノマイシン (50 mg/L)、ストレプトマイシン(50 mg/L)、およびクロラムフェニコール (25 mg/L)で補われた固体LB媒体上で画線培養し、2日間、28℃でインキュベートする。トウモロコシ未成熟胚芽のAgrobacterium植菌の2日前、AgrobacteriumプレートからのAgrobacteriumの１コロニーまたは小ループを取り出し、250-mL フラスコにおいて、100 mg/Lのスペクチノマイシンおよび50 mg/Lのカナマイシンで補われた25 mLの液体LB媒体に植菌する。フラスコを、約150 rpmおよび26℃にて、一晩、攪拌器に置く。次いで、Agrobacterium培養液を、同じ液体媒体中で希釈し(1ないし5)、撹拌器に戻す。数時間後、植菌の１日前に、Agrobacterium細胞を、15分間、3500 rpmにて撹拌する。bacterium細胞ペレットを200 μM のアセトシリンゴンおよび50 mg/L スペクチノマイシンおよび25 mg/L カナマイシンを有する誘導培地において再懸濁し、細胞密度をO.D.660にて、0.2に調整する。次いで、bacterium細胞培養液(各250-mL フラスコ中に50 mL)を撹拌器に戻し、一晩成長させる。植菌の日の朝、細菌細胞を撹拌し、200 μM のアセトシリンゴンで補われた液体1/2MS VI媒体(表3)で洗浄する。もう一度撹拌した後、細菌細胞ペレットを、200 μM のアセトシリンゴン(表3)を有する1/2 MS PL媒体 (表3)中で再懸濁し、細胞密度を植菌のために、O.D660にて1.0に調整する。
【０１３３】
試薬（Reagent）は商業的に入手可能であり、多くの供給者から購入することができる(例えば、Sigma Chemical Co., St. Louis, MO参照)。
【０１３４】
【表３】
2007531497.tif 000004
【０１３５】
優れたトウモロコシ系統(LH244)を、本発明に関連した形質転換に使用する。未成熟な胚芽を含有する穂を、受粉後約10日で収穫し、使用するまで4℃にて冷凍保存する（収穫後5日まで）。形質転換のこの方法に好ましい胚芽サイズは、~1.0-2.0 mmである。このサイズは、通常、87°Fの平均温度、14時間の日長およびGE 1000ワットの高圧ナトリウムランプによって供給される補助光の成長条件で、温室内で受粉後10日に達成される。
【０１３６】
未成熟な胚芽を、表面を滅菌した穂から単離し、1.5-mL 微小遠心管中の調製されたAgrobacterium細胞懸濁液に直接落とす。単離は、続いて、15分間保つ。次いで、管を5分間脇に置き、これにより、個々の胚芽に対する植菌時間は、5ないし20分間となった。先の細かい滅菌導入ピペットを用いてAgrobacterium細胞懸濁液を除去した後、未成熟な胚芽を、共培養媒体(表3)へと移す。胚芽を、胚盤の面を上にして、媒体上に置く。胚芽を、約24時間、暗いインキュベーター(23℃)内で培養する。
【０１３７】
次いで、胚芽を0.1または0.25 mMグリホセートおよび250 mg/Lカルベニシリンで補われた修飾されたMS媒体(MSW50, 表3)に移して、ペトリ皿(100 mm x 25 mm)中のAgrobacteriumを阻害する。培養液を、2-3週間、27℃にて、暗い培養室でインキュベートする。次いで、全カルス片を、個々に、同レベルのグリホセートで補われた第１の再生媒体(MS/6BA, 表3)上に移す。培養物を、この媒体上で、5-7日、16時間光/8時間闇光周期および27℃によって、培養室内で成長させる。次いで、それらを、約2週間、ペトリ皿(100 mm x 25 mm)において、第２の再生媒体(MSOD, 表3)上に移す。再生する根および生存する組織を持つ全カルス片を、土壌に動かす前に、根をさらに成長させるため、phytatraysに含有された同じ媒体に移す。それは2-4週間かかる。再生培地(MS6BAおよびMSOD)を、全て、250 mg/Lカルベニシリンおよび0.1または0.25 mMグリホセートで補う。
【０１３８】
次いで、これらの成長する小植物を、土壌に移し、約1週間、27℃、80%湿度、低照度にて、成長チャンバーに慣れさせ、次いで温室に移し、標準温室条件で成長させる。
【０１３９】
次いで、温室で育てた植物を、発現レベルならびに油および蛋白質レベルにつき分析する。
【０１４０】
実施例11
この実施例は、トランスジェニック植物の発現分析を記載する。
RNA発現分析を使用して、トランスジェニック植物におけるCDK阻害剤の異所性発現または抑制を確証する。この出願において使用されるように、「異所性発現」は、例えば、過剰発現および異所発現といった内因性発現以外の空間的または時間的発現を意味する。RNAは、標準的な手順によって抽出される(Wadsworth et al., Analytical Biochemistry, 172(1):279-283 (1988))。トウモロコシ胚芽組織におけるZmKRP遺伝子の異所性発現または抑制を決定するために、TaqMan分析を、TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents Kit and Protocol を用いて行う(#4310299 rev. C) (Applied Biosystems, Foster City CA)。cDNAを合成し(SMART PCR cDNA Synthesis Kit, #K1052-1, Clonetech Laboratories, Inc.)、遺伝子特異的プライマーおよびアガロースゲル電気泳動を用いて標準的PCRを行って、PCR産物を可視化した。
【０１４１】
実施例12
この実施例は、トランスジェニックトウモロコシ植物の油および蛋白質含有量、質量差、アミノ酸組成、遊離アミノ酸レベル、および微量栄養素含有量を決定するための分析手順を提供する。
【０１４２】
第１世代の単一トウモロコシ種および解剖された胚芽ならびに内胚乳の(質量ベースでのおよび組織重量のパーセントとしての)油レベルを、低解像度1H核磁気共鳴(NMR) (Tiwari et al., JAOCS, 51:104-109 (1974); or Rubel, JAOCS, 71:1057-1062 (1994))によって決定し、ここに、単一穀粒試料のNMR緩和時間を測定し、重量測定法で次の加速された溶媒抽出を決定するように、変動する油レベルを有するトウモロコシ種の分析から生じた標準曲線を用いて、回帰分析に基づき、油レベルを計算する。一元配置分散分析およびスチューデントのT検定(JMP, version 4.04, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を行って、導入遺伝子特異的PCRによって決定されるように、トランスジェニックおよび非トランスジェニック粒の間の有意な差を同定する。
【０１４３】
第２世代の種子の油レベルおよび蛋白質レベルを、NIT分光法によって決定し、ここに個々の植物から収穫されたプールされた種子試料のNITスペクトルを測定し、油および蛋白質レベルを、それぞれ、加速された溶媒抽出または元素(%N)分析に続いて重量測定法で決定されたように、変動する油または蛋白質レベルを有するトウモロコシ種の分析から生じた標準曲線を用いて、回帰分析に基づき、計算する。一元配置分散分析およびスチューデントのT検定を行って、マーカー陽性およびマーカー陰性植物からの種子の間の油(%粒重量)および蛋白質 (%粒重量)の有意な差を同定する。
【０１４４】
遊離アミノ酸のレベルを、次の手順を用いて、トランスジェニック事象の各々から分析する。トランスジェニック植物の各々からの種子を、個々に、つぶして粉末状にし、約50 mgの得られた粉末を、予め重み付けした遠心管に移す。正確な試料重量を記録し、1.0 mlの5%トリクロロ酢酸を各試料管に添加する。試料をボルテックスによって室温にて混合し、次いで、エッペンドルフ型微小遠心管 (Model 5415C, Brinkmann Instrument, Westbury, NY)上で14,000 rpmにて15分間遠心する。上澄みのアリコートを取り出し、Agilent Technical Publication “Amino Acid Analysis Using the Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC,” March 17, 2000に記載の手順を用いて、HPLC (Agilent 1100)によって分析する。
【０１４５】
トウモロコシからの総アミノ酸の定量的決定を、次の方法によって行う。種は丸く、得られた食物の約60 mgを、24時間、100℃にて、再還流下で、6 N HClを用いて、酸加水分解する。試料を、HPLC分析のために、乾燥させ、0.1 N HCl中で復元して、続けてα-フタルアルデヒド(OPA0）によるプレカラム誘導体化する。アミノ酸を、Agilent 1100 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA)上の逆相Zorbax Eclipse XDB-C18 HPLCカラムによって分離する。アミノ酸を蛍光によって検出する。システイン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびトリプトファンは、このアミノ酸スクリーン (Henderson et al., "Rapid, Accurate, Sensitive and Reproducible HPLC Analysis of Amino Acid, Amino Acid Analysis Using Zorbax Eclipse-AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC," Agilent Publication (2000); また、"Measurement of Acid-Stable Amino Acid," AACC Method 07-01 (American Association of Cereal Chemists, Approved Methods, 9th edition (LCCC# 95-75308)参照)に含まれない。総トリプトファンを、記載（Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists 10th edition, AACC ed, (2000) 07-20 Measurement of Tryptphan アルカリ加水分解)のように、アルカリ加水分解法を用いて、トウモロコシ種において測定する。
【０１４６】
種子中のトコフェロールおよびトコトリエノールレベルを当該分野でよく知られる方法によってアッセイする。簡潔に言えば、10 mgの種子組織を、500 μl 1%ピロガロール(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)/エタノールを添加した殺菌したマイクロチューブ中の1 gのマイクロビーズ(Biospec Product Inc, Barlesville, OK)に添加する。混合物を、「早い」速度で、ミニビーズビーター(Biospec)中で、3分間撹拌し、次いで、0.2 μmフィルターを介して、オートサンプラー管へと濾過する。濾過された抽出物を、蛍光検出、290 nmでの励起、336 nmでの発光、および帯域およびスリットを有するZorbaxシリカHPLCカラムを用いるHPLCによって分析する。溶媒組成物およびラニング条件を、ヘキサンとしての溶媒Aおよびメチル-t-ブチルエーテルとしての溶媒Bによって、下記にリストする。注入容量は20 μlであり、流速は1.5 ml/分であり、ラン時間は40℃にて12分間である。溶媒グラジエントは、10分間で90%溶媒A、10%溶媒B;11分間で25%溶媒A、75%溶媒B;ならびに12分間で90%溶媒A、10%溶媒Bである。1% ピロガロール/エタノールにおけるトコフェロール基準は、比較のために(α-トコフェロール、γ-トコフェロール、β-トコフェロール、δ-トコフェロール、およびトコフェロール(トコール))、ランする。アルファ、ベータ、デルタ、およびガンマトコフェロールを、Chemstationソフトウェア (Hewlett Packard)を用いて計算する。1% ピロガロール/エタノール中のトコトリエノール基準を、比較のために(α-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、β-トコトリエノール、δ-トコトリエノール)、ランする。α-、β-、δ-、およびγ-トコトリエノールの標準曲線を、Chemstationソフトウェア(Hewlett Packard)を用いて計算する。
【０１４７】
トランスジェニックトウモロコシ粒内のカロチノイドレベルを、標準プロトコルによって決定する(Craft, Meth. Enzymol., 213:185-205 (1992))。Plastiquinolsおよびphylloquinonesを、標準プロトコルによって決定する(Threlfall et al., Methods in Enzymology, XVIII, part C, 369-396 (1971); and Ramadan et al., Eur. Food Res. Technol., 214(6):521-527 (2002))。
【０１４８】
pMON71270を含有する事象からの結果を、表4に示す。
【０１４９】
【表４−１】
2007531497.tif 000005
【表４−２】
2007531497.tif 000006
【表４−３】
2007531497.tif 000007
【表４−４】
2007531497.tif 000008
【０１５０】
増加された油および器官サイズの例を、いくつかの事象において示す。油のミリグラム／胚芽を、２つの独立した事象、ZM_S86578 (p=0.05)およびZM_S86487 (p=0.1)において増加させた。油のミリグラム／種(p=0.05)および乾燥重量(p=0.01)のパーセンテージとしての穀粒油を、両方とも、事象ZM_S86481において増加させた。乾燥重量のパーセンテージとしての胚芽油を、３つの独立した事象、ZM_S86521 (p=0.1)、ZM_S86548 (p=0.01)およびZM_S86578 (p=0.05)において増加させた。胚芽重量（グラム乾燥重量）(p=0.1）および総穀粒重量(p=0.1)のパーセンテージとしての胚芽重量を、事象ZM_S86487において増加させた。
【０１５１】
pMON71279を含有する事象からの結果を、表5に示す。
【０１５２】
【表５−１】
2007531497.tif 000009
【表５−２】
2007531497.tif 000010
【表５−３】
2007531497.tif 000011
【表５−４】
2007531497.tif 000012
【表５−５】
2007531497.tif 000013
【０１５３】
増加された油および器官サイズの例を、いくつかの事象において示す。胚芽重量(g 乾燥重量)を、３つの独立した事象、ZM_S105183 (p=0.01)、ZM_S105166 (p=0.05)およびZM_S106973 (p=0.01)において増加させた。油のミリグラム／胚芽を、３つの独立した事象、ZM_S105183 (p=0.01)、ZM_S105185 (p=0.05)、およびZM_S106979 (p=0.01)において増加させた。総穀粒重量のパーセンテージとしての胚芽重量を、２つの独立した事象、ZM_S105183 (p=0.1)およびZM_S106940 (p=0.1)において増加させた。油のミリグラム／穀粒を、２つの独立した事象、ZM_S105166 (p=0.1)およびZM_S106979 (p=0.05)において増加させた。乾燥重量のパーセンテージとしての穀粒油を、事象ZM_S106985 (p=0.1)において増加させた。穀粒重量(g 乾燥重量)を、２つの独立した事象ZM_S105166 (p=0.05)およびZM_S106979 (p=0.01)において増加させた。
【０１５４】
結果は、pMON71270を有する種子、および実施例3および4記載の他の構築体が、次の表現型のうちの少なくとも１つを有することを示す:  増加した胚芽質量(穀粒重量のパーセントとしての)、増加した全穀粒油レベル(穀粒重量のパーセントとしての)、改善された蛋白質の質 (例えば、増加されたリシン、トリプトファン、スレオニン、イソロイシンおよびメチオニン)、遊離アミノ酸 (上または下)またはトコフェロール、トコトリエノール、カロチノイド、プラスチキノールおよびフィロキノンを含む増加した微量栄養素含有量。
【０１５５】
実施例１３
この実施例は、トランスジェニックトウモロコシ植物からの組織の組織学的分析を記載する。
新鮮なまたは冷凍したトウモロコシの成熟したまたは成長している穀粒を、矢じり状にスライスする。1 mm以下の組織片を、1ないし2分間、0.1M リン酸緩衝液, pH 8.0中の0.01%アニリンブルーC.I. 42755 (Baker, Phillipsburg, N.J.)の溶液中で染色する。試料を、0.1 M リン酸緩衝液, pH 8.0中で濯ぎ、狭い紫外線キューブNikon V-4 (EX 380-420nm, DM 430 nm, BA 450 nm)または紫外光源(EX330-380, DM400, BA420)を用いる標準蛍光顕微鏡のいずれかによって検査する。別法として、試料を、アルゴンイオンレーザー（発光波長488 nmおよび514 nm)を用いて、共焦点顕微鏡を用いて視覚化することができる。アニリンブルーは、植物の細胞壁および核を染色する(Smith and McCully, Stain Technology, 53(2):79-85 (1978))。細胞の大きさは、Nikon EZ C-1ソフトウェアのアウトライニングツールを用いることによって決定する。約25ないし50の細胞をアウトラインし、細胞が占有する領域を記録し、平均的な領域／細胞を計算する。
【０１５６】
pMON71270を含有する事象の組織学的分析によって、胚芽におけるより多くの細胞／単位領域(1.3x, 1.7x, 2.4x, p=0.05)によって特徴付けられるように、細胞数の有意な増加および胚芽質量の減少なしを示す3つの事象を得た。
【０１５７】
pMON71279を含有する事象の組織学的分析によって、野生d-型細胞数／単位領域(1.1x, 0.97x, 0.96x, p=0.05)を有する3つの事象が得られたが、増加した胚芽質量のため、細胞／胚芽の総数の増加を得た。
【０１５８】
分裂指数を決定するために、トウモロコシ組織を固定し、蛍光プローブで染色し、クリアし、蛍光顕微鏡または走査型共焦点レーザー顕微鏡(CLSM)を用いてイメージする。分裂指数は、前中期、中期または後期にある領域内の細胞の数を計数することによって決定され、パーセンテージとして報告される。例えば、トウモロコシ組織を、ホルマリン、プロピニオン酸およびエタノール中で固定しヨウ化プロピジウムで染色し、キシレンでクリアすることができる(Running et al., Confocal Microscopy of the Shoot Apex, Methods in Cell Biology, 49:217-229 (1995))。
【０１５９】
実施例１４
この実施例は、CDK阻害剤活性の測定方法を記載する。
トランスジェニックおよび非トランスジェニック植物組織からの蛋白質抽出物を、p13Suc1樹脂(腫瘍遺伝子 Sciences, Cambridge, MA)を用いて、CDKに対して豊富化し、ヒストンH1キナーゼアッセイを実施する(Wang et al., Plant J., 15:501-510 (1998))。増加したCDK阻害剤活性を有するトランスジェニック植物組織は、キナーゼ活性を減少させたが、一方、減少したCDK阻害剤活性を有するトランスジェニック植物組織は、キナーゼ活性を増加させた。
【０１６０】
以下の引用文献は、本明細書中に引用によって、具体的に援用される:
Birren et al., Genome Analysis:  A Laboratory Manual Series, Volume 1, Analyzing DNA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1997),
Birren et al., Genome Analysis:  A Laboratory Manual Series, Volume 2, Detecting Genes, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998),
Birren et al., Genome Analysis:  A Laboratory Manual Series, Volume 3, Cloning Systems, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999),
Birren et al., Genome Analysis:  A Laboratory Manual Series, Volume 4, Mapping Genomes, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999),
Harlow et al., Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988),
Harlow et al., Using Antibodies:  A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1999), 
Sambrook et al., Molecular Cloning:  A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), 
Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1999), and
Croy, Plant Molecular Biology Labfase, BIOS Scientific Publications, Ltd. (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK) (1993).
【０１６１】
本明細書中に援用された公報、特許出願、および特許を含む全引用文献は、各引用文献が、個々にかつ具体的に、引用によって援用され、本明細書中にその全文に記載されるように示されたのと同じ程度に、ここに引用によって援用される。
【０１６２】
本発明は、好ましい具体例に重点を置いて記載されてきたが、好ましい具体例において変形を調製し使用することができ、さもなければ、本発明は、本明細書中に具体的に記載されるとおりに実施することができることが、当業者には明白であろう。本発明は、そのような変形および代替の実践を含むように意図される。従って、本発明は、続く請求の範囲によって定義されるように、本発明の精神および範囲内に網羅される全修飾を含む。
【０１６３】
本発明を記載する文脈における（特に、続く請求の範囲の文脈における）用語「１つの（a）」および「１つの（an）」および「その（the）」および同様の指示対象は、本明細書において特記しない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方に及ぶと解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含めた（including）」および「含有する（containing）」は、特記されない限り、制限のない用語（つまり、「含むが、限定されるものではない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特記しない限り、単に、範囲内にある各別々の値に個々に言及する簡単な方法として役立つように意図され、各別々の値は、本明細書において個々に列挙されたように、明細書に援用される。本明細書に記載される全方法は、本明細書において特記しない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、いずれかの適当な順序で実施することができる。本明細書において提供される全ての例、または例示的言語（例えば、「のような（such as）」は、特記されない限り、単に、本発明をより解明するように意図されたものであって、本発明の範囲に制限を課すものではない。明細書中の言語はどれも、本発明の実施に重要なように、いずれかの主張されないエレメントを示すと解釈されるべきでない。
【０１６４】
発明者らに知られている本発明を実施するのに最適な態様を含めた本発明の好ましい具体例を、本明細書中に記載する。好ましい具体例の変形は、前述の記載を読むと、当業者には明白であろう。発明者らは、当業者が、適宜にそのような変形を使用することを予測し、さもなければ、発明者らは、発明が本明細書に具体的に記載されたとおりに実施されることを意図する。従って、本発明は、適用される法によって許さるように、本明細書に添付される請求の範囲に援用される主題の全修飾および相当物を含む。さらに、その全可能な変動における上記エレメントのいずれの組合せも、本明細書において特記されない限り、あるいは内容によって明確に矛盾しない限り、本発明によって網羅される。
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】図１は、Arabidopsisの公開された配列を有する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列整列である。Arabidopsisの配列は、実施例１に示す。
【図２】図２はpMON71270の構築体マップである。
【図３】図３はpMON71279の構築体マップである。
【図４】図４は、プライマーの領域および方向(A)および組立手順(B)を示すdsRNA中間構築体の模式図である。
【図５】図５は、プライマーの領域および方向(A)および組立手順(B)を示すdsRNA中間構築体の模式図である。
【図１】
2007531497.tif 000014
【図２】
2007531497.tif 000015
【図３】
2007531497.tif 000016
【図４】
2007531497.tif 000017
【図５】
2007531497.tif 000018
【配列表】
2007531497000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月23日(2006.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007531497000001.app
【国際調査報告】
2007531497.tif 000040
2007531497.tif 000041
2007531497.tif 000042
2007531497.tif 000043
2007531497.tif 000044
2007531497.tif 000045