(57)【要約】  本発明は、抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニストの組合せ療法を用いたＢ細胞ベースの悪性腫瘍およびＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合した細胞集団にＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体を作用させることを含む、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法。
【請求項２】
Ｂ細胞がヒトＢ細胞であり、混合細胞集団にＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体をインビボで作用させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＢＬｙＳアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号：２のＢＲ３−Ｆｃである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＬｙＳ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗ＢＬｙＳ抗体がＢＬｙＳの残基１６２−２７５を含むＢＬｙＳ領域内に結合する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗ＢＲ３抗体がヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むＢＲ３領域内に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抗ＣＤ２０抗体がリツキサンTMである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗ＣＤ２０抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が相乗的に働いてＢ細胞を枯渇する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
腫瘍又は悪性腫瘍に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを投与することを含む、ＣＤ２０を発現するＢ細胞により特徴付けられるＢ細胞腫瘍又は悪性腫瘍の治療方法。
【請求項１４】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは同時に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは連続的に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＢＬｙＳアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）、濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び毛様細胞白血病である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
Ｂ細胞腫瘍が非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）又は小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＢＬｙＳアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号：２のｈＢＲ３−Ｆｃである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＬｙＳ抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
抗ＢＬｙＳ抗体がＢＬｙＳの残基１６２−２７５を含むＢＬｙＳ領域内に結合する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２５】
抗ＢＲ３抗体がヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むＢＲ３領域内に結合する、請求項８に記載の方法。
【請求項２６】
ＣＤ２０結合抗体がヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２７】
キメラ抗体がリツキサンTMである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２９】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＣＤ２０結合抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するリツキサンTM又はｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
ＢＲ３−Ｆｃが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサンが約３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項１３に記載の方法。
【請求項３３】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体が化学療法と組み合わせて投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項３４】
Ｂ細胞制御性自己免疫疾患に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを投与することを含む、該疾患の寛解方法。
【請求項３５】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは連続的に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＢＬｙＳアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓症血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＢＬｙＳアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号：２のＢＲ３−Ｆｃである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＬｙＳ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４３】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４４】
ＣＤ２０結合抗体がヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４５】
キメラ抗体がリツキサンTMである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体でなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項４７】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
ＣＤ２０結合抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するリツキサンTM又はｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４９】
ＢＲ３−Ｆｃが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサンが約２．５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項３４に記載の方法。
【請求項５１】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾン、及び疾患変更抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）から選択された薬剤を用いた療法と組み合わせて投与される、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
必要とする患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを投与することを含む、Ｂ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患罹患患者の辺縁帯又は胚中心Ｂ細胞を枯渇する方法。
【請求項５３】
ＢＬｙＳアンタゴニストは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９又は配列番号：１０に示す配列を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項１、１３、３４及び５２の何れか一に記載の方法。
【請求項５４】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを含んでなる組成物。
【請求項５５】
ＣＤ２０結合抗体と、ＢＬｙＳアンタゴニストと、ラベルを含んでなり、該ラベルが組成物がＢ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療のためのものであることを示す、製造品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本出願の請求の範囲は、２００３年６月５日提出の米国特許出願第６０／４７６，４８１号、２００３年６月５日提出の米国仮出願番号６０／４７６，４１４号；及び２００３年６月６日出願の米国仮出願番号６０／４７６，５３１号より利を得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、Ｂ細胞悪性腫瘍並びに自己免疫疾患の治療のための新規の併用療法に関する。
（発明の背景）
リンパ球は外来の抗原を特異的に認識して、反応する、様々な白血球細胞の一つの集団である。リンパ球の３つの主な分類は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。Ｂリンパ球は抗体産生を担い、体液性免疫を供給する細胞である。Ｂ細胞は骨髄内で成熟して、その細胞表面上に抗原結合抗体を発現する。Ｂ細胞がその膜結合性抗体に特異的な抗原と初めて遭遇すると、細胞は速やかに分離し、その子孫はメモリーＢ細胞と「プラズマ細胞」と呼ばれるエフェクター細胞に分化する。メモリーＢ細胞は長い寿命を持ち、本来の親細胞と同じ特異性を有する膜結合性抗体を発現し続ける。プラズマ細胞は、膜結合性抗体を発現する代わりに、分泌型抗体を産生する。分泌された抗体は、体液性免疫の主要なエフェクター分子である。
ＣＤ２０抗原（ヒトＢリンパ球制限分化抗原、Ｂｐ３５とも呼ばれる）はプレＢ及び成熟Ｂリンパ球上に位置するおよそ３５ｋＤの分子量の疎水性膜貫通型タンパク質である（Valentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)；及びEinfeldら, EMBO J. 7(3):711-717 (1988)）。該抗原はまたＢ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の９０％以上に発現されるが（Andersonら, Blood 63(6):1424-1433 (1984)）、造血幹細胞、プロＢ細胞、正常なプラズマ細胞又は他の正常な組織上には見出されない（Tedderら, J. Immunol. 135(2):973-979 (1985)）。ＣＤ２０は分化及び細胞周期の開始の活性化過程における初期段階を調節し（上掲のTedderら）、おそらくはカルシウムイオンチャネルとして機能する（Tedderら, J. Cell. Biochem. 14D:195 (1990)）。
【０００３】
Ｂ細胞リンパ腫ではＣＤ２０が発現されるため、この抗原はこのようなリンパ腫治療の有用な治療標的であった。合衆国ではＢ細胞ＮＨＬの人々は３００，０００人以上おり、毎年５６，０００人以上の人々が新しく診断されている。例えば、ヒトＣＤ２０抗原に対する遺伝子的操作を施したキメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であるリツキシマブ(rituximab)（リツキサン(RITUXAN)(登録商標)）（Genentech, Inc., サウスサンフランシスコ,カリフォルニア, 合衆国より販売）は、再発性または低抵抗性の（refractory low-grade）または濾胞性の（follicular）、ＣＤ２０陽性、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫患者の治療に有用である。リツキシマブは１９９８年４月７日に発行された米国特許第５７３６１３７号（Andersonら）において「Ｃ２Ｂ８」と呼ばれている抗体である。インビトロの作用機序の研究は、リツキサン(登録商標)がヒト補体に結合し補体依存性細胞障害性（ＣＤＣ）を通してリンパＢ細胞系を溶解することを実証している（Reffら, Blood 83(2):435-445 (1994)）。加えて、その抗体は抗体依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）のアッセイにおいて有意な活性を有している。インビボ前臨床研究では、リツキサン(登録商標)が、おそらく補体および細胞媒介性の過程によって末梢血、リンパ節、およびカニクイザルの骨髄からのＢ細胞を消耗させることを示した(Reffら. Blood 83(2):435-445 (1994))。ＮＨＬ治療に必要とされる他の抗ＣＤ２０抗体には、放射性同位体を結合させたマウス抗体ＺｅｖａｌｉｎＴＭ、Ｙｔｔｒｉｕｍ-９０(IDEC Pharmaceuticals、サンフランシスコ、カリフォルニア州), Ｉ-１３１を結合させたもう一つの完全なマウス抗体であるＢｅｘｘａｒＴＭ (Corixa、ワシントン州)を含む。
【０００４】
ＢＬｙＳ(BAFF、TALL-l、THANK、TNFSF13Bまたは zTNF4としても知られる)は、Ｂ細胞生存および成熟に必須であるＴＮＦ１リガンドスーパーファミリーのメンバーである。トランスジェニックマウスでのＢＬｙＳ過剰発現によりＢ細胞過形成および深刻な自己免疫疾患が進行する(Mackay, 等. (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710；Gross, 等. (2000) Nature 404, 995-999；Khare, 等. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97,3370-33752-4)。ＢＬｙＳレベルは多様な自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよびシェーグレン症候群のヒト患者において亢進している(Cheema, G. S, 等., (2001) Arthritis Rheum. 44, 1313-1319；Groom, J., 等, (2002) J. Clin. Invest. 109, 59-68；Zhang, J., 等., (2001) J. Immunol. 166, 6-10)。さらに、ＢＬｙＳレベルは疾患の重症度に相関していることから、ＢＬｙＳはこれらの疾患の病理に直接重要な役割を担っているといえる。ＢＬｙＳはＢ細胞上でＴＮＦレセプタースーパーファミリーの３つのメンバーであるＴＡＣＩ、ＢＣＭＡおよびＢＲ３(BAFFRとしても知られる)に結合することによって働く(Gross, 等., 上掲；Thompson, J. S., 等., (2001) Science 293, 2108-2111；Yan, M., 等., (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552；Yan, M., 等., (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41；Schiemann, B., 等., (2001) Science 293, 2111-2114)。３つのうち、ＢＲ３のみがＢＬｙＳ特異的であり；他の２つも関連のＴＮＦファミリーメンバーであるＡＰＲＩＬを結合する。ＢＬｙＳおよびレセプターノックアウトまたは突然変異マウスの表現型を比較すると、ＢＲ３を介するシグナル伝達がＢＬｙＳのＢ細胞生存機能を媒介することが示唆される(Thompson, 等., 上掲；Yan, (2001), 上掲；Schiemann, 上掲)。対照的に、ＴＡＣＩは阻害レセプターとして働くようである(Yan, M., (2001) Nat. Immunol. 2, 638-643)一方で、ＢＣＭＡの役割は不明である(Schiemann, 上掲)。
【０００５】
ＢＲ３はＢ細胞表面上に発現する１８４残基のタイプＩＩＩ膜貫通タンパク質である(Thompson, 等., 上掲；Yan, (2002), 上掲)。細胞内領域には公知の機能的ドメインまたはタンパク質相互作用モチーフに類似の配列を持たない。にもかかわらず、ＢＲ３を介したＢＬｙＳ誘導性シグナル伝達により転写因子NF-B2/p100がp52へと進行する(Claudio, E, 等., (2002) Nat. Immunol. 3, 958-965；Kayagaki, N., 等., (2002) Immunity 10, 515-524)。また、ＢＲ３の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は一致していない。ＴＮＦＲファミリーメンバーは、通常細胞外領域の多数のシステイン豊富なドメイン（ＣＲＤ）の存在により特徴づけられる；各々のＣＲＤは一般的に、３つのジスルフィド結合中の６つのシステインによって安定化された４０以下の残基から成る。従来のこのファミリーメンバーは、リガンド表面の２の異なった部分と相互作用する２つのＣＲＤを介してリガンドと接触する(Bodmer, J.-L., 等., (2002) Trends Biochem. Sci. 27, 19-26に概説)。しかしながら、ＢＲ３  ＥＣＤは、最大でもＣＲＤの一部を形成するにとどまる４つのシステイン残基を含むのみであるので、このような小さなレセプターがどのようにして高い親和性リガンド結合を与えているのかという疑問が生じる。
既に、ＢＲ３のＢＬｙＳ結合ドメインが２６残基のコア領域内にあることが示されている(Kayagaki, 等,上掲)。６つのＢＲ３残基は、βヘアピンペプチド（ｂｈｐＢＲ３）内にある場合、十分にＢＬｙＳ結合を与え、ＢＲ３媒介性シグナル伝達をブロックした。他に、ＢＬｙＳと相互作用することを意図したポリペプチドが報告されている(例えば、ＷＯ０２／２４９０９、ＷＯ０３／０３５８４６、ＷＯ０２／１６３１２、ＷＯ０２／０２６４１)。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、混合した細胞集団にＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体を作用させることを含む、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇する方法を提供する。この方法は、Ｂ細胞にＢＬｙＳアンタゴニストおよび抗ＣＤ２０抗体を作用させることによって、例えば、混合細胞集団からＢ細胞を効果的かつ選択的に枯渇するための商業的インビトロアッセイに有用である。前述のＢ細胞枯渇方法の他の側面は、胚中心Ｂ細胞および周辺帯（辺縁体）Ｂ細胞等の特定のＢ細胞サブセットを特異的に枯渇することである。特定の実施態様では、胚中心Ｂ細胞は脾臓およびパイエル板にある。本発明のさらに他の態様は、Ｂ細胞にＢＬｙＳアンタゴニストおよびＣＤ２０結合抗体を作用させることによってインビトロまたはインビボですべてのＢ細胞サブセットを枯渇する方法である。
また本発明は、すべてのＢ細胞集団を枯渇するために有効量のＢＬｙＳアンタゴニストおよび抗ＣＤ２０抗体を哺乳動物に投与することにより脾臓のすべてのＢ細胞集団を枯渇する方法を提供する。特定の実施態様では、当該方法は脾臓、リンパ節およびパイエル板の周辺帯および胚中心Ｂ細胞を枯渇するのに有効である。
【０００７】
また本発明では、腫瘍又は悪性腫瘍に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを投与することを含む、ＣＤ２０を発現するＢ細胞により特徴付けられるＢ細胞腫瘍又は悪性腫瘍の治療方法を提供する。一実施態様では、ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは同時に投与される。異なる実施態様では、ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは連続的に投与される。特定の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体より前に投与される。ある実施態様では、Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）、濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び毛様細胞白血病である。この治療方法では、ＢＲ３−Ｆｃおよびリツキサンは用量の節で開示する用量で投与する。他の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストおよびＣＤ２０結合抗体は化学療法と組み合わせて投与する。
本発明のさらに他の態様は、Ｂ細胞制御性自己免疫疾患に罹患している患者に治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを投与することを含む、該疾患の寛解方法である。一実施態様では、自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓症血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択される。ここで自己免疫疾患は、慢性関節リウマチまたは全身エリテマトーデスであり、一実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストおよびＣＤ２０結合抗体は非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾン、及び疾患変更抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）から選択された薬剤を用いた療法と組み合わせて投与する。
ＣＤ２０結合抗体およびＢＬｙＳアンタゴニストを患者に投与する疾患の治療または寛解の任意の方法では、ＣＤ２０結合抗体およびＢＬｙＳアンタゴニストは同時にまたは連続して投与することができる。特定の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体の前に投与する。
【０００８】
また、ＣＤ２０結合抗体およびＢＬｙＳアンタゴニストを含んでなる組成物が提供される。
さらに、本発明により、ＣＤ２０結合抗体と、ＢＬｙＳアンタゴニストと、ラベルを含んでなり、該ラベルが組成物がＢ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療のためのものであることを示す、製造品が提供される。
本発明の方法、組成物および製造品の任意の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体には、キメラおよびヒト化抗体が含まれる。抗ＣＤ２０抗体の特定の実施態様には、アミノ酸配列を有する、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ｍ２Ｈ７（マウス２Ｈ７）、ｈｕ２Ｈ７（ヒト化２Ｈ７）、およびそのすべての機能的変異体、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６（ｖは型を表す）、ｖ３１、ｖ９６、ｖ１１４、ｖ１１５が含まれる。完全なｈｕ２Ｈ７．ｖ１６は成熟した配列番号：１５に示すＬ鎖配列および配列番号：１６に示すＨ鎖配列を有する。
本発明の方法、組成物および製造品の任意の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストはある実施態様ではイムノアドヘシンである。特定の実施態様では、イムノアドヘシンはＢＲ３の細胞外ドメインを含むＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含むＴＡＣＩイムノアドヘシン、およびＢＣＭＡの細胞外ドメインを含むＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択される。他の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストは抗ＢＬｙＳ抗体、特に残基１６２−２７５を含むＢＬｙＳの領域内でＢＬｙＳを結合する抗ＢＬｙＳ抗体である。他の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストはヒトＢＲ３の残基２３−３８を含む領域でＢＲ３を結合するものを包含する抗ＢＲ３抗体である。請求の範囲で意味するヒトＢＲ３アミノ酸位置は、定義「ＢＲ３」に開示したヒトＢＲ３または選択的ヒトＢＲ３の配列番号に従う。
【０００９】
特定の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストは、配列ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、またはECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、並びにこれら１７ｍｅｒのペグ化(PEGylated)型；
以下の配列を有するポリペプチド
MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCD PLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号. 10)；
以下の配列を有するｈＢＲ３-Ｆｃイムノアドヘシン
MSALLILALVGAAVASTRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号. 2)
を有する１７ｍｅｒのポリペプチドからなる群から選択される。
本発明の前述の任意の方法のうち一実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストおよび抗ＣＤ２０抗体はＢ細胞枯渇に相乗的に働く。
【００１０】
（好ましい実施態様の詳細な説明）
抗ＣＤ２０ＭＡｂ処置によりある種のＢ細胞サブセットが枯渇する一方、周辺帯Ｂ細胞、胚中心Ｂ細胞および血漿細胞は保存されることを我々は既に明らかにしている。対照的に、ＢＲ３−ＦｃのＢ細胞生存シグナルの遮断も程度は異なるがＢ細胞を枯渇するまたはＢ細胞数を調節する。ＢＲ３はＢ細胞の生存に影響すると考えられている。ここに記載した実施例より、抗ＣＤ２０抗体をＢＬｙＳアンタゴニストと組み合わせて投与すると驚くべき相乗効果が生じて、結果としてインビボのＢ細胞を枯渇する。抗ＣＤ２０抗体をＢＬｙＳ経路に直接関する治療と組み合わせるとＢ細胞ベースの悪性腫瘍およびＢ細胞制御性自己免疫疾患を含むＢ細胞媒介性疾患の新規の治療方法となる。抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニストの組合せ療法は、ある種の疾患、例えば慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）および小リンパ性白血病（ＳＬＬ）の現行治療より効果的な毒性の低い代替療法であるかもしれない。
ここで「自己免疫疾患」とは、非悪性腫瘍性疾患または個体が持つ（個体自身の）抗原および／または組織から生じる、および直接結びつく疾患である。
【００１１】
ここで用いる「Ｂ細胞枯渇」は、処置前のレベルと比較して薬剤または抗体処置後に動物またはヒトにおいてＢ細胞レベルが減少することを表す。Ｂ細胞レベルは、全血球計算値を求める、公知のＢ細胞マーカーに対するＦＡＣＳ分析スキャニング及び実験的実施例に示した方法などの公知のアッセイを用いて測定する。Ｂ細胞枯渇は完全または部分的なものであり得る。一実施態様では、ＣＤ２０発現Ｂ細胞の枯渇は少なくとも２５％である。Ｂ細胞枯渇薬剤を投与されている患者では、一般的にＢ細胞は、薬剤が患者体内を循環し、Ｂ細胞が回復する持続時間の間枯渇される。
「ＣＤ２０」抗原は、末梢血又はリンパ系器官の９０％以上のＢ細胞の表面で見出される分子量およそ３５ｋＤの非グルコシル化膜結合型リンタンパク質である。ＣＤ２０は初期のプレＢ細胞発育中に発現し、プラズマ細胞分化まで残る；ヒトの幹細胞、リンパ球祖先細胞（プロジェニタ）または正常血漿細胞にはみられない。ＣＤ２０は正常なＢ細胞及び悪性のＢ細胞の双方に存在する。文献でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球限局性分化抗原」及び「Ｂｐ３５」がある。ＣＤ２０抗原は、例えば、ClarkおよびLedbetter, Adv. Can. Res. 52:81-149 (1989)、およびValentineら, J. Biol. Chem. 264(19):11282-11287 (1989)に記載されている。
【００１２】
ＣＤ２０結合抗体および抗ＣＤ２０抗体はここで交換可能に用いられ、抗体が抗原を発現する細胞を標的とした治療薬剤として有効な程度に親和性を持ってＣＤ２０を結合するすべての抗体を包含し、以下に記載のアッセイのネガティブ対照タンパク質などの他のタンパク質と顕著な交差反応を示さない。また、抗体の一アームがＣＤ２０を結合する二重特異性抗体を包含する。このＣＤ２０結合抗体の定義によって前述の抗体の機能的断片（フラグメント）も包含する。ＣＤ２０結合抗体は１０ｎＭより小さいＫｄでＣＤ２０を結合するであろう。好ましい実施態様では、該結合は７．５ｎＭより小さい、より好ましくは５ｎＭより小さい、さらにより好ましくは１−５ｎＭの間、最も好ましくは１ｎＭより小さいＫｄである。
ＣＤ２０抗原に結合する抗体の例には：現在「リツキシマブ」（「リツキサン（登録商標）」）と呼称される「Ｃ２Ｂ８」（米国特許第５，７３６，１３７号、出典明記によりここに特別に組み込まれる）；「Ｙ２Ｂ８」または「イブリツモマブチウキセタン(Ibritumomab Tiuxetan)」ゼバリン（登録商標）と呼称される「イットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体（米国特許第５，７３６，１３７号、出典明記によりここに特別に組み込まれる）；「トシツモマブ(Beckman Coulter)とも呼称され場合によっては１３１Ｉで標識して「１３１Ｉ−Ｂ１」抗体となるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(ヨードＩ１３１トシツモマブ、 BEXXARTM) 米国特許第５，５９５，７２１号、出典明記によりここに特別に組み込まれる）；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press 等. Blood 69(2):584-591 (1987)および「フレームワーク部分」またはヒト化１Ｆ５を含む変異体(WO03/002607, Leung, S.)；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−９６４５０)；マウス２Ｈ７およびキメラ２Ｈ７抗体（米国特許第５，６７７，１８０号、出典明記によりここに特別に組み込まれる）；ヒト化２Ｈ７；huMax-CD20 (Genmab, Denmark)；ＡＭＥ−１３３(Applied Molecular Evolution)；Ａ２０抗体又はその変異体、例としてＡ２０抗体又はキメラないしヒト化Ａ２０抗体(それぞれcA20、hA20) (ＵＳ２００３／０２１９４３３、Immunomedics)などの変異体；およびInternational Leukocyte Typing Workshopより入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８−２、９３−１Ｂ３、Ｂ−ＣｌまたはＮＵ−Ｂ２(Valentine 等., In: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))が含まれる。
【００１３】
ここで「リツキシマブ」または「リツキサン（登録商標）」なる用語は、一般的にＣＤ２０抗原に偏向性のある遺伝的に操作したキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体であり、出典明記によって特別にここに組み込まれる米国特許第５，７３６，１３７号において「Ｃ２Ｂ８」と呼称され、ＣＤ２０を結合する能力を持つ断片を含むものを意味する。
特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はヒトおよび霊長類のＣＤ２０を結合する。特定の実施態様では、ＣＤ２０を結合する抗体はヒト化またはキメラである。ＣＤ２０結合抗体には、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ｍ２Ｈ７（マウス２Ｈ７）、ｈｕ２Ｈ７（ヒト化２Ｈ７）、限定するものではないが、およびそのすべての機能的変異体、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６（ｖは型を表す）、ｖ３１、ｖ７３、ｖ７５並びにフコース欠乏性変異体が含まれる。いくつかのｈｕ２Ｈ７変異型抗体の配列を、Ｎ末端配列の成熟ポリペプチドでは取り除かれるリーダー配列に下線を付けて以下に示す：
hu2H7.v16 Ｌ鎖[232 aa] (配列番号. 3)
MGWSCIILFLVATATGVHSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGK APKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
hu2H7.v16 H 鎖[471 aa] (配列番号. 4)
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
hu2H7.v31 H 鎖[471 aa] 配列番号. 11:
MGWSCIILFLVATATGVHSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ｖ３１のＬ鎖は上記のｖ１６のものすなわち配列番号３と同じである。
【００１４】
ここでは純粋に、「ヒト化２Ｈ７ｖ．１６」は、可変軽鎖配列を含んでなる完全抗体又は抗体断片を意味する：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR
(配列番号: 13)；および
可変重鎖配列：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS
(配列番号: 14)
ヒト化２Ｈ７ｖ．１６抗体が完全な抗体の場合、好ましくはｖ１６軽鎖アミノ酸配列を含む：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC (配列番号: 15)；および
v16 重鎖アミノ酸配列
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号: 16)。
【００１５】
型１６をベースとしたすべての他の変異体のＶ領域は、以下の表に示したアミノ酸置換の部位を除いてｖ１６のアミノ酸配列を有するであろう。特に示さなければ、２Ｈ７変異体はｖ１６と同じＬ鎖を有するであろう。
2007526220.tif 000002
【００１６】
前述のヒト化２Ｈ７ｍＡｂの変異型は上記配列番号：１５と同じＬ鎖配列と以下のＨ鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７ｖ．３１である：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAP
GKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVY YSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号：17)。
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体、ｍ２Ｈ７は、ＶＨ配列：
QAYLQQSGAELVRPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPRQGLEWIGAIYPGNGDTSY NQKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARVVYYSNSYWYFDVWGTGTTVTVS (配列番号：23)
およびＶＬ配列
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYAPSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGAGTKLELK (配列番号: 24)を有する。
示さない限り、ここに開示したヒト化２Ｈ７ｖ．１６およびその変異体の配列は、成熟ポリペプチド、すなわちリーダー配列を持たないものである。
【００１７】
ＣＤ２０抗体に関する特許および特許文献には、米国特許第5,776,456号、同第5,736,137号、同第5,843,439号、同第6,399,061号、および同第6,682,734号、並びに米国特許出願公開 US 2002/0197255Al、US 2003/0021781A1、US 2003/0082172 Al、US 2003/0095963 Al、US 2003/0147885 Al (Anderson 等.)；米国特許第6,455,043B 1およびW000/09160 (Grillo-Lopez, A.)；W000/27428 (Grillo-LopezおよびWhite)；W000/27433 (Grillo-LopezおよびLeonard)；W000/44788 (Braslawsky 等.)；W001/10462 (Rastetter, W.)；WO01/10461 (RastetterおよびWhite)；W001/10460 (WhiteおよびGrillo-Lopez)；US2001/0018041A1、US2003/0180292A1、WO01/34194 (HannaおよびHariharan)；米国出願公開 US2002/0006404およびW002/04021 (HannaおよびHariharan)；米国出願公開 US2002/0012665 AlおよびWO01/74388 (Hanna, N.)；米国出願公開 US 2002/0058029 Al (Hanna, N.)；米国出願公開 US 2003/0103971 Al (HariharanおよびHanna)；米国出願公開 US2002/0009444A1,およびWO01/80884 (Grillo-Lopez, A.)；W001/97858 (White, C.)；米国出願公開 US2002/0128488A1およびW002/34790 (Reff, M.);WO02/060955 (Braslawsky 等.);W02/096948 (Braslawsky 等.);WO02/079255 (ReffおよびDavies)；米国特許第6,171,586B1,およびW098/56418 (Lam 等.)；W098/58964 (Raju, S.)；W099/22764 (Raju, S.);W099/51642、米国特許第6,194,551B 1、米国特許第6,242,195B 1、米国特許第6,528,624B 1および米国特許第6,538,124 (Idusogie 等.)；W000/42072 (Presta, L.)；W000/67796 (Curd 等.)；W001/03734 (Grillo-Lopez 等.)；米国出願公開 US 2002/0004587A1およびWO01/77342 (MillerおよびPresta)；米国出願公開 US2002/0197256 (Grewal, I.)；米国出願公開 US 2003/0157108 Al (Presta, L.)；US Patent Nos. 6,565,827B 1、6,090,365B 1、6,287,537B 1、6,015,542、5,843,398,および5,595,721、(Kaminski 等.)；US Patent Nos. 5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852B1 (Robinson 等.)；US Pat No. 6,410,391B1 (Raubitschek 等.)；米国特許第6,224,866B1およびW000/20864 (Barbera-Guillem, E.)；W001/13945 (Barbera-Guillem, E.)；W000/67795 (Goldenberg)；米国出願公開 US 2003/0133930 AlおよびW000/74718 (GoldenbergおよびHansen)；W000/76542 (Golay 等.)；WO01/72333 (WolinおよびRosenblatt)；米国特許第6,368,596B 1 (Ghetie 等.)；米国特許第6,306,393および米国出願公開 US2002/0041847 Al、(Goldenberg, D.)；米国出願公開 US2003/0026801A1 (WeinerおよびHartmann)；W002/102312 (Engleman, E.)；米国特許出願公開 2003/0068664 (Albitar 等.)；W003/002607 (Leung, S.)；WO 03/049694、US2002/0009427A1,およびUS 2003/0185796 Al (Wolin 等.) ；W003/061694 (SingおよびSiegall)；US 2003/0219818 Al (Bohen 等.)；US 2003/0219433 AlおよびWO 03/068821 (Hansen 等.)；US2003/0219818A1 (Bohen 等.)；US2002/0136719A1 (Shenoy 等.)；W02004/032828 (Wahl 等.)が含まれ、これらは出典明記により特別に組み込まれる。また、米国特許第5,849,898およびEP appln no. 330,191 (Seed 等.)；米国特許第4,861,579およびEP332,865A2 (MeyerおよびWeiss)；USP 4,861,579 (Meyer 等.)；W095/03770 (Bhat 等.)；US 2003/0219433 Al (Hansen 等.)を参照のこと。
【００１８】
ＣＤ２０抗体は、そのままの抗体または細胞障害性合成物、例えば放射性同位元素又は毒素などに抱合したものでありうる。このような抗体には、放射性同位元素、イットリウム-９０に連結した抗体ＺｅｖａｌｉｎＴＭ(IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA)、とＩ-131を抱合したＢｅｘｘａｒＴＭ(Corixa, WA)とが含まれる。ヒト化２Ｈ７変異体には、ＦＲのアミノ酸置換と移植されたＣＤＲに変異を持つ親和性成熟変異体を有するものが含まれる。ＣＤＲ又はＦＲの置換されたアミノ酸は、ドナー又はアクセプタ抗体にあるとは限らない。他の実施態様では、さらに本発明の抗ＣＤ２０抗体は、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ機能およびＢ細胞殺傷（またここではＢ細胞枯渇とも称する）の亢進を含むエフェクター機能の改善を導くＦｃ領域のアミノ酸残基変化を含む。記載のように(Idusogie 等., 上掲(2001)；Shields 等., 上掲)、特に、３つの突然変異はＣＤＣおよびＡＤＣＣ活性を改良することが同定された：Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（またここでは３つのＡｌａ突然変異または変異体として意味する；Ｆｃ領域の番号付けはＥＵ番号付けシステムに従う；Kabat 等., 上掲)。
本発明の他の抗ＣＤ２０抗体には、安定して改善する特定の変化を有するものが含まれる。一実施態様では、キメラ抗ＣＤ２０抗体はマウスＶ領域およびヒトＣ領域を有する。そのようなある特定のキメラ抗ＣＤ２０抗体はリツキサン（登録商標）(リツキシマブ（登録商標）；Genentech, Inc.)である。リツキシマブおよびｈｕ２Ｈ７は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞性細胞障害（ＡＤＣＣ）の両方を介してＢ細胞の溶解を媒介しうる。改変したＦｃ領域アミノ酸配列および亢進または減弱したＣ１ｑ結合能を有する抗体変異体は、米国特許第６，１９４，５５１号およびＷＯ９９／５１６４２に記載されている。それら特許公報の内容は出典明記によって特別にここに組み込まれる。また、Idusogie 等. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
【００１９】
ＷＯ００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上または減弱させたポリペプチド変異型が述べられている。この特許公報の内容はここには文献として特別に組み込まれる。Shields ら J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＩｇＧのＮグリコシル化部位はＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７である。Ｆｃ領域を有するヒト化ＣＤ２０結合抗体をここに包含し、組成物中約８０−１００％（好ましくは約９０−９９％）の抗体はフコースを欠損し、糖タンパク質のＦｃ領域に結合した成熟コア炭水化物構造を含む。このような抗体は、ヒトＩｇＧと相互作用する際にＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｖ１５８）ほど効果的ではないが、ＦｃγＲＩＩＩＡ（Ｆ１５８）への結合改善を驚くほど示すことがここに示された。
「抗体」なる用語は、広義な意味で用いられ、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多エピトープ特異性を有する抗体、一本鎖抗体および抗体の断片を具体的に包含する。いくつかの実施態様によると、本発明のポリペプチドは抗体フレームワーク内、例えば可変領域内、ＣＤＲ内に融合して、抗体が結合してＢＬｙＳのＢＲ３への結合またはＢＬｙＳシグナル伝達を阻害する。本発明のポリペプチドを含む抗体は、キメラ、ヒト化またはヒトのものでありうる。本発明のポリペプチドを含む抗体は抗体断片でありうる。そのような抗体およびそれらを生成する方法は以下に詳細に記載する。あるいは、本発明の抗体は動物を本発明のポリペプチドで免疫化して生成することができる。ゆえに、本発明のポリペプチドに直接関係する抗体を包含する。
【００２０】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。それら特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンと交わらない点で利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)およびMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作成することもできる。
ここでのモノクローナル抗体は具体的に、特定の種由来または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似する重鎖および／または軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致するまたは類似するものである「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第4,816,567号；およびMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。キメラ抗体の作成方法は当業者に公知である。
【００２１】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列） である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラットまたはウサギなどの所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種のＣＤＲの残基（ドナー抗体）によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくは導入したＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するおよび最大にするために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、たとえＦＲ領域が結合特性を改善するような一又はそれ以上のアミノ酸置換を含んでも、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ＦＲのアミノ酸置換数は一般的にＨ鎖では６個、Ｌ鎖では３個にすぎない。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。ヒト化抗体には、抗体の抗原結合領域が、例えば対照の抗原でマカクザルを免疫化することによって産生した抗体由来のものであるＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤ（登録商標）抗体が含まれる。ヒト化抗体の作製方法は当分野において公知である。
【００２２】
また、ヒト化抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当分野に公知の様々な技術を用いて生成することができる。HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks 等., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)。また、Cole等. および Boerner 等.の技術はヒトモノクローナル抗体の調製に有用である。Cole 等., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner 等., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)。
本発明のＣＤ２０結合抗体の「機能的断片」は、それ自体が由来する原型の完全鎖分子と実質的に同じ親和性でＣＤ２０への結合を維持する断片であり、ここで開示するようなインビトロまたはインビボアッセイにより測定されるＢ細胞を枯渇することができるものである。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００２３】
「抗体依存性細胞障害活性」または「ＡＤＣＣ」は、ある細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上にあるＦｃレセプター(ＦｃＲ）に結合したＩｇによりその細胞障害性エフェクター細胞が抗原負荷標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅するという細胞障害性の形態である。抗体は細胞障害性細胞を武装させ（arm）、完全に死滅することが必要とされる。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦＣγＲIIIのみを発現する一方、単球はＦＣγＲI、ＦＣγＲII及びＦＣγＲIIIを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes等 .PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体存在下における標的細胞の溶解に関する。古典的補体経路活性化は、同系の抗原に結合される（適当なサブクラスの）抗体に補体系(Ｃ１ｑ）の最初の構成物が結合することによって開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
【００２４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様においては、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％の抗体より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように充分な程度まで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２５】
ここで用いられる「ＢＬｙＳ」、「ＢＬｙＳポリペプチド」、「ＴＡＬＬ-１」または「ＴＡＬＬ-１ポリペプチド」、「ＢＡＦＦ」なる用語は、「天然配列ＢＬｙＳポリペプチド」および「ＢＬｙＳ変異体」を包含する。「ＢＬｙＳ」は以下：
ヒトＢＬｙＳ配列（図３；配列番号．  ）
1 mddstereqs rltsclkkre emklkecvsi lprkespsvr sskdgkllaa tlllallscc 
61 ltvvsfyqva alqgdlaslr aelqghhaek lpagagapka gleeapavta glkifeppap 
121 gegnssqnsr nkravqgpee tvtqdclqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee 
181 kenkilvket gyffiygqvl ytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl 
241 pnnscysagi akleegdelq laiprenaqi sldgdvtffg alkll
マウスＢＬｙＳ配列（配列番号．  ）
1 mdesaktlpp pclcfcsekg edmkvgydpi tpqkeegawf gicrdgrlla atlllallss 
61 sftamslyql aalqadlmnl rmelqsyrgs atpaaagape ltagvklltp aaprphnssr 
121 ghrnrrafqg peeteqdvdl sappapclpg crhsqhddng mnlrniiqdc lqliadsdtp
181 tirkgtytfv pwllsfkrgn aleekenkiv vrqtgyffiy sqvlytdpif amghviqrkk 
241 vhvfgdelsl vtlfrciqnm pktlpnnscy sagiarleeg deiqlaipre naqisrngdd 
301 tffgalkll
および図３に示すアミノ酸配列の何れか一によりコードされるポリペプチドと、天然配列のＢＬｙＳの生物学的活性を有するそれらの相同物ないし断片ないし変異体を意味する。ＢＬｙＳの生物学的活性は、Ｂ細胞生存を促進する、Ｂ細胞成熟を促進する、およびＢＲ３に結合することからなる群から選択されうる。ＢＬｙＳの変異体は、天然配列のＢＬｙＳポリペプチドと好ましくは少なくとも８０％ないし１００％までの連続的整数、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」ＢＬｙＳポリペプチドは、天然由来の対応するＢＬｙＳポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例えば、ＢＬｙＳはフューリン型のプロテアーゼにより細胞表面から切断された後の可溶型で存在する。そのような天然配列のＢＬＹＳポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＬｙＳポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型ないし分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。「ＢＬｙＳ」なる用語は、Shu 等., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)；GenBank寄託番号 AF136293；１９９８年５月７日公開のW098/18921；１９９８年１０月７日公開のEP 869,180；１９９８年６月２５日公開のW098/27114；１９９９年３月１８日公開のW099/12964；１９９９年７月８日公開のW099/33980；Moore 等., Science, 285:260-263 (1999)；Schneider 等., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)；Mukhopadhyay 等., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
【００２６】
ここで用いられる「ＢＬｙＳアンタゴニスト」なる用語は、広義の意味で用いられ、（１）天然配列ＢＬｙＳポリペプチドないし天然配列ＢＲ３ポリペプチドに結合してＢＬｙＳポリペプチドと相互作用するＢＲ３を部分的又は完全にブロックする、および（２）天然配列ＢＬｙＳシグナル伝達を部分的又は完全にブロック、阻害ないし中和（無効化）する任意の分子を含む。とりわけ、天然配列ＢＬｙＳポリペプチドシグナル伝達はＢ細胞生存およびＢ細胞成熟を促進する。とりわけ、ＢＬｙＳシグナル伝達の阻害、ブロックまたは中和によりＢ細胞数が減少する。本発明によるＢＬｙＳアンタゴニストはインビトロまたはインビボのＢＬｙＳポリペプチドの一以上の生物学的活性を部分的または完全にブロック、阻害ないし中和するであろう。一実施態様では、生物学的活性なＢＬｙＳはインビトロまたはインビボで以下の事象の何れか一またはそれらのいくつかを増強する：Ｂ細胞の生存促進、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭレベルの増加、血漿細胞数の増加、および脾臓Ｂ細胞でのＮＦ−κｂ２／１００のｐ５２ＮＦ−κｂへの進行(例えば、Batten, M 等., (2000) J. Exp. Med. 192:1453-1465；Moore, 等., (1999) Science 285:260-263；Kayagaki, 等., (2002) 10:515-524)。本発明のＢＬｙＳアンタゴニストを試験するのに有用な様々なアッセイをここに記載する。
【００２７】
上記のように、ＢＬｙＳアンタゴニストは直接的または間接的な方法で、インビトロまたはインビボのＢＬｙＳシグナル伝達を部分的ないし完全にブロック、阻害又は中和する機能を持つ。例えば、ＢＬｙＳアンタゴニストは直接ＢＬｙＳに結合する。例えば、抗体がＢＬｙＳのＢＲ３への結合を立体的に妨げるようにヒトＢＬｙＳの残基１６２−２７５および／または、１６２、１６３、２０６、２１１、２３１、２３３、２６４および２６５からなる群から選択した残基の近傍残基を含んでなる、ヒトＢＬｙＳの領域内に結合する抗ＢＬｙＳ抗体を包含する。他の実施例では、直接結合するものは、ＴＡＣＩ、ＢＲ３およびＢＣＭＡなどのＢＬｙＳレセプターの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチドである。他の実施例では、ＢＬｙＳアンタゴニストには、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)の配列、ないしここに記載のような図３２に挙げる配列を有するポリペプチドが含まれる。あるいは、ＢＬｙＳアンタゴニストは天然配列ＢＲ３の細胞外ドメインをＢＬｙＳ結合領域で結合して、ＢＬｙＳのインビトロ、インサイツまたはインビボのＢＲ３への結合を部分的あるいは完全にブロック、阻害ないし中和することができる。例えば、そのような間接的なアンタゴニストは、ヒトＢＲ３のＢＬｙＳへの結合を立体的に妨げるようにヒトＢＲ３の残基２３−３８またはそれら残基の近傍領域を含む、ＢＲ３の領域内に結合する抗ＢＲ３抗体である。
【００２８】
いくつかの実施態様では、本発明のＢＬｙＳアンタゴニストには、抗ＢＬｙＳ抗体、イムノアドヘシンおよび小分子が含まれる。更なる実施態様では、イムノアドヘシンはＢＬｙＳレセプターのＢＬｙＳ結合領域（例えば、ＢＲ３、ＢＣＭＡまたはＴＡＣＩの細胞外ドメイン）を含む。更なる実施態様では、イムノアドヘシンはＢＲ３-Ｆｃ、または式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)の配列、ないしここに記載のような図３２に挙げる配列を有するポリペプチド、場合によってはイムノグロブリンのＦｃ部位を融合または抱合しているポリペプチドである。
一実施態様によると、ＢＬｙＳアンタゴニストは１００ｎＭ以下の結合親和性を持ってＢＬｙＳポリペプチドまたはＢＲ３ポリペプチドに結合する。他の実施態様によると、ＢＬｙＳアンタゴニストは１０ｎＭ以下の結合親和性を持ってＢＬｙＳポリペプチドまたはＢＲ３ポリペプチドに結合する。さらに他の実施態様によると、ＢＬｙＳアンタゴニストは１ｎＭ以下の結合親和性を持ってＢＬｙＳポリペプチドまたはＢＲ３ポリペプチドに結合する。
【００２９】
ここで用いられる「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」または「ＢＲ３レセプター」なる用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」および「ＢＲ３変異体」を包含する（ここでさらに定義する）。「ＢＲ３」は以下のポリヌクレオチド配列およびその相同体：
（ａ）ヒトＢＲ３配列（配列番号：  ）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ
61 ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD
121 KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG
181 PEQQ
（ｂ）選択的ヒトＢＲ３配列（配列番号：  ）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGAAS SPAPRTALQP
61 QESVGAGAGE AALPLPGLLF GAPALLGLAL VLALVLVGLV SWRRRQRRLR GASSAEAPDG
121 DKDAPEPLDK VIILSPGISD ATAPAWPPPG EDPGTTPPGH SVPVPATELG STELVTTKTA
181 GPEQQ
（ｃ）マウスＢＲ３配列（配列番号：  ）
1 MGARRLRVRS QRSRDSSVPT QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FHTPDTGHTS SLEPGTALQP
61 QEGSALRPDV ALLVGAPALL GLILALTLVG LVSLVSWRWR QQLRTASPDT SEGVQQESLE
121 NVFVPSSETP HASAPTWPPL KEDADSALPR HSVPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
（ｄ）ラットＢＲ３配列（配列番号：  ）
1 MGVRRLRVRS RRSRDSPVST QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FYTPETRHAS SLEPGTALQP
61 QEGSGLRPDV ALLFGAPALL GLVLALTLVG LVSLVGWRWR QQRRTASLDT SEGVQQESLE
121 NVFVPPSETL HASAPNWPPF KEDADNILSC HSIPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
およびそれらの変異体または断片の何れか一を含むポリペプチドを意味する。本発明のＢＲ３ポリペプチドは、ヒト組織型または他の供給源などの様々な供給源から単離する、または組み換えおよび／または合成法によって調製することができる。ＢＲ３なる用語は、WO02/24909およびWO03/14294に記載のＢＲ３ポリペプチドを含む。
【００３０】
「天然配列」ＢＲ３ポリペプチドは、天然由来の対応するＢＲ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＢＲ３ポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型ないし分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。本発明のＢＲ３ポリペプチドには、ヒトＢＲ３のアミノ酸残基１−１８４の近接した配列からなるまたは含むＢＲ３ポリペプチドを含む。
ＢＲ３「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを実質的に含まないＢＲ３ポリペプチド型を意味する。ＢＲ３のＥＣＤ型には、ＢＲ３のアミノ酸１−７７、２−６２、２−７１、１−６１、および２−６３の何れか一を含んでなるものを包含する。
ミニ-ＢＲ３はＢＲ３のＢＬｙＳ結合ドメインの２６残基のコア領域である：
TPCVPAECFD LLVRHCVACG LLRTPR (配列番号：  )。
【００３１】
「ＢＲ３変異型（変異体）」は、天然配列完全長ＢＲ３またはＢＲ３ ＥＣＤのアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＲ３ポリペプチドを意味し、天然配列ＢＬｙＳポリペプチドを結合する。場合によっては、ＢＲ３変異体は単一システイン豊富なドメインを含む。そのようなＢＲ３変異体ポリペプチドには、例えば完全長アミノ酸配列のうちの一以上のアミノ酸残基がＮおよび／またはＣ末端で、並びに一以上の内部ドメイン内で付加または欠損しているＢＲ３ポリペプチドが含まれる。天然配列ＢＬｙＳポリペプチドを結合するＢＲ３ ＥＣＤの断片もまた包含される。場合によっては、ＢＲ３変異型ポリペプチドは、ヒトＢＲ３ポリペプチドまたはその特定の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＢＲ３変異型ポリペプチドは天然のＢＲ３ポリペプチド配列を包含しない。場合によっては、ＢＲ３変異型ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、頻繁には少なくとも約２０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約４０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約６０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約７０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約８０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約９０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３２】
ここで用いられる「ＴＡＣＩ」、「ＴＡＣＩポリペプチド」または「ＴＡＣＩレセプター」なる用語は、「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」および「ＴＡＣＩ変異体」を包含する（ここでさらに定義する）。「ＴＡＣＩ」は、図１Ａ−１Ｂに示すアミノ酸配列、図５Ｂに示すアミノ酸１−２４６、および図８に示すアミノ酸配列、図１Ａ−１Ｂおよび５Ａに示すポリヌクレオチド配列を含む核酸分子およびその相同体、変異体ないし断片、図１Ａ−１Ｂおよび５Ａに示す配列を含む核酸分子およびその変異体によってコードされるポリペプチド、並びに上記の断片を含むポリペプチドを意味する。本発明のＴＡＣＩポリペプチドは、ヒト組織型または他の供給源などの様々な供給源から単離する、または組み換えおよび／または合成法によって調製することができる。
「天然配列」ＴＡＣＩポリペプチドは、天然由来の対応するＴＡＣＩポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＴＡＣＩポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＴＡＣＩポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型ないし分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。本発明のＴＡＣＩポリペプチドには、限定するものではないが、von Bulow 等, 上掲、および１９９８年９月１１日公開のW098/39361に記載のポリペプチド、スプライス変異型（「ｈＴＡＣＩ（２６５）」として上記および図８に表し、図８のアミノ酸残基１−２９３の近接した配列を含んでなるＴＡＣＩポリペプチド）が含まれる。
【００３３】
ＴＡＣＩ「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを実質的に含まないＴＡＣＩポリペプチド型を意味する。ＴＡＣＩのＥＣＤ型には、von Bulow等., 上掲、WO 98/39361、WO 00/40716、WO 01/85782、WO 01/87979、WO 01/81417に記載のもの、図１のアミノ酸残基１−１６６、図１のアミノ酸残基１−１６５、図１のアミノ酸残基１−１５４、図１のアミノ酸残基１−１１４、図５Ｂのアミノ酸残基１−１１９、図５Ｂのアミノ酸残基１−１２０、および図５Ｂのアミノ酸残基１−１２６を含む。
「ＴＡＣＩ変異型」は、天然配列完全長ＴＡＣＩまたはＴＡＣＩ ＥＣＤのアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＴＡＣＩポリペプチドを意味し、天然配列ＢＬｙＳポリペプチドを結合する。そのようなＴＡＣＩ変異体ポリペプチドには、例えば完全長アミノ酸配列のうちの一以上のアミノ酸残基がＮおよび／またはＣ末端で、並びに一以上の内部ドメイン内で付加または欠損しているＴＡＣＩポリペプチドが含まれる。天然配列ＢＬｙＳポリペプチドを結合するＴＡＣＩ ＥＣＤの断片もまた包含される。場合によっては、ＴＡＣＩ変異型ポリペプチドは、図１Ａに示す核酸分子によってコードされるＴＡＣＩポリペプチドまたはその特定の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＴＡＣＩ変異型ポリペプチドは天然のＴＡＣＩポリペプチド配列を包含しない。場合によっては、ＴＡＣＩ変異型ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、頻繁には少なくとも約２０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約４０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約６０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約７０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約８０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約９０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３４】
ここで用いられる「ＢＣＭＡ」、「ＢＣＭＡポリペプチド」または「ＢＣＭＡレセプター」なる用語は、「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」および「ＢＣＭＡ変異体」を包含する（ここでさらに定義する）。「ＢＣＭＡ」は、図２に示すポリヌクレオチド配列を含む核酸分子およびその変異体、図２に示す配列を含む核酸分子およびその変異体によってコードされるポリペプチド、並びに上記の断片を含むポリペプチドを意味する。本発明のＢＣＭＡポリペプチドは、ヒト組織型または他の供給源などの様々な供給源から単離する、または組み換えおよび／または合成法によって調製することができる。
「天然配列」ＢＣＭＡポリペプチドは、天然由来の対応するＢＣＭＡポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＢＣＭＡポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＣＭＡポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型ないし分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。本発明のＢＣＭＡポリペプチドには、Laabi 等, EMBO J., 11:3897-3904 (1992)；Laabi 等., Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994)；Gras 等., Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995)；Madry 等., Int. Immunology, 10:1693-1702 (1998)に記載のポリペプチド；および図２（配列番号：２７）に示すアミノ酸残基１−１８４の近接する配列を含むＢＣＭＡポリペプチドが含まれる。
ＢＣＭＡ「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを実質的に含まないＢＣＭＡポリペプチド型を意味する。ＢＣＭＡのＥＣＤ型には、Laabi 等, EMBO J., 11:3897-3904 (1992)；Laabi 等., Nucleic Acids Res., 22:1147-1154 (1994)；Gras 等., Int. Immunology, 7:1093-1106 (1995)；Madry 等., Int. Immunology, 10:1693-1702 (1998)に記載のもの、図２に示すアミノ酸残基４−５５、図２に示すアミノ酸残基１−４８、図２に示すアミノ酸残基８−４１、図２に示すアミノ酸残基４−５１、または図２に示すアミノ酸残基２１−５３が含まれる。
【００３５】
「ＢＣＭＡ変異型」は、天然配列ＢＣＭＡまたはＢＣＭＡ ＥＣＤのアミノ酸配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有するＢＣＭＡポリペプチドを意味し、天然配列ＢＬｙＳポリペプチドを結合する。そのようなＢＣＭＡ変異体ポリペプチドには、例えば完全長アミノ酸配列のうちの一以上のアミノ酸残基がＮおよび／またはＣ末端で、並びに一以上の内部ドメイン内で付加または欠損しているＢＣＭＡポリペプチドが含まれる。天然配列ＢＬｙＳポリペプチドを結合するＢＣＭＡ ＥＣＤの断片もまた包含される。場合によっては、ＢＣＭＡ変異型ポリペプチドは、図２に示す核酸分子によってコードされるＢＣＭＡポリペプチドまたはその特定の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、さらにより好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。ＢＣＭＡ変異型ポリペプチドは天然のＢＣＭＡポリペプチド配列を包含しない。場合によっては、ＢＣＭＡ変異型ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、頻繁には少なくとも約２０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約４０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約６０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約７０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約８０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約９０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約１５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２００アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約２５０アミノ酸長、より頻繁には少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００３６】
ＢＡＦＦは、脾臓、リンパ節、ＰＢＬ、単球、マクロファージ、ＤＣ、Ｔ細胞、Ｋ５６２、ＨＬ−６０およびＧ３６１に発現する。ＡＰＲＩＬは、脾臓、膵臓、大腸でわずかに発現する。ＡＰＲＩＬは、ＰＢＬおよび様々な腫瘍細胞株および組織で発現する。ＢＣＭＡは、脾臓、リンパ節、胸腺、ＰＢＬ、肝臓、副腎およびＢ細胞で発現する。ＴＡＣＩは、脾臓、胸腺、ＰＢＬ、小腸、Ｂ細胞および活性化Ｔ細胞で発現する。ＢＡＦＦ-Ｒは、脾臓、リンパ節、胸腺、ＰＢＬ、Ｂ細胞で発現する。ＢＡＦＦ-Ｒは、休止Ｔ細胞で低レベルに発現する。(MackayおよびBrowning, 2002年7月, Nature Reviews, Immunology, 2: 465-475)。
【００３７】
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
(1) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) 
(2) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) 
(3) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(1) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(3) 酸性：Asp, Glu；
(4) 塩基性：His, Lys, Arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(6) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
本発明内で用いる「保存的」アミノ酸置換とは、機能的に相同なアミノ酸に置換するアミノ酸置換を指すことを意味する。保存的アミノ酸変化により、結果として生じるペプチドのアミノ酸配列にサイレント変化が生じる。例えば、一以上の同じ極性のアミノ酸は機能的に相同に働き、ペプチドのアミノ酸配列内のサイレント変化となる。一般的に、グループ内の置換は構造および機能に関して保存されているとみなされる。しかしながら、当分野の技術者は、特定の残基の役割が生じた分子の三次元構造内の前後関係によって決定されることを認識するであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は酸化（ジスルフィド）型に生じ、それは還元（チオール）型より極性が小さい。Ａｒｇ側鎖の長鎖脂肪族部分は構造的または機能的役割の重要な特徴に寄与しており、これは、他の塩基性残基よりもむしろ非極性の置換によって最も保存されるようである。また、芳香族グループ（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）を含む側鎖はイオン性芳香族または「陽イオン-ｐｉ」相互作用に関与しうる。この場合、酸性または非荷電性の極性グループを有する側鎖の一置換は構造および機能に関して保存されるであろう。Ｐｒｏ、ＧｌｙおよびＣｙｓ（ジスルフィド型）などの残基は主鎖形成に直接影響し、たびたび構造的歪みを伴う置換となりうる。
【００３８】
ここで同定したリガンドまたはレセプターポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、ここで同定したリガンドまたはレセプター配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表に提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって以下に記載のように得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、下記の表に示したソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ（登録商標）Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００３９】
突然変異誘発の好ましい位置である特定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と結合標的との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
「二面角」なる用語は、一結合についての回旋度を意味する。例として、Creighton, T.E., (1993) Protein:Structures and Molecular Properties, 2版., W. H. Freeman and Company, New York, NYを参照。
「φ（ｐｈｉ）」なる用語は、アミノ酸のＮ−Ｃα結合についての回旋度を示す二面角である。例として、Creighton, T.E., (1993) Protein:Structures and Molecular Properties, 2版., W. H. Freeman and Company, New York, NYを参照。
タイプＩベータターンは、Hutchinson, E. G. & Thornton, J. M. (1994) A revised set of potentials for beta turn formation in proteins. Protein Science 3, 2207-2216に記載される。
【００４０】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、互いに共有結合した２つの部位を有するポリペプチドを意味し、それぞれの部位は異なる性質を有するポリペプチドである。その性質はインビトロまたはインビボなどの生物学的性質であるかもしれない。また、その特性は標的分子への結合、反応の触媒などの単一の化学的または物理学的性質かもしれない。２つの部位は、単一のペプチド結合によって直接的に、又は一以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結してもよい。一般的に、２つの部位とリンカーは各々のリーディングフレーム内にあるであろう。
「抱合（コンジュゲート）」は、融合タンパク質、並びにアミノ酸ないしタンパク質部位と非タンパク質部位の両方を含む分子を含む任意のハイブリッド分子を意味する。抱合は、例えば組み換えＤＮＡ技術、固相合成法、液層合成法、有機化学的合成技術またはこれら技術を組み合わせるなどする、当分野の公知の様々な技術により合成してもよい。生成する特定の分子に応じて合成法を選択するであろう。例えば、天然では完全な「タンパク質」ではないハイブリッド分子は、組み換え技術と液層合成法を組み合わせて合成してもよい。
【００４１】
ここで用いられているように、「イムノアドヘシン」という用語は、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を持つ異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性を付与した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは抗体の抗原認識及び結合部位以外の所望の結合特異性を持つアミノ酸配列（即ち「異種」）と免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物である。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む近接アミノ酸配列を含む。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３、又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。例えば、本発明の有用なイムノアドヘシンは、ＢＬｙＳレセプターの膜貫通配列ないし細胞質配列を持たないＢＬｙＳレセプターのＢＬｙＳ結合部位を含むポリペプチドである。一実施態様では、ＢＲ３、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡの細胞外ドメインはイムノグロブリン配列の定常ドメインに融合している。例えば、本発明のマウスＢＲ３−ＦｃイムノアドヘシンおよびヒトＢＲ３−Ｆｃイムノアドヘシンは式：
ｍＢＲ３−Ｆｃ  （配列番号．１）：
MSALLILALVGAAVASTGARRLRVRSQRSRDSSVPTQCNQTECFDPLVRNCVSCELFHTPDTGHTSSLEPGTALQPQEGQVTGDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSEL
PIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHH TEKSLSHSPGK
ｈＢＲ３−ｈＩＧｇ１  Ｆｃ  （配列番号．２）
MSALLILALVGAAVASTRRGPRSLRGRDAPAPTPCVPAECFDLLVRHCVACGLLRTPRPKPAGASSPAPRTALQPQESQVTDKAAHYTLCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
で表される。
【００４２】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類、；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイシン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)などの抗生物質；メトトレキセート及び５−フルオロウラシル(５−ＦＵ）のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似物；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、及びフロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵ；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２&quot;-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；シトシンアラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン、カルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(navelbine)；ノバントロン(novantron)；テニポシド；ダウノマイシン；カルミノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＴＰ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は類似体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働くホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、トレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)及びニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、リュープリン(leuprolide)、及びゴセレリン；上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は類似体が含まれる。
【００４３】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、細胞、特にＣＤ２０発現癌細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期でＰＳＣＡ発現細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００４４】
「哺乳動物」なる用語は、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む。ここで好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「治療的有効量」という用語は、患者または哺乳動物の疾患又は疾病を「寛解」または「治療」するのに効果的な抗体又はアンタゴニスト薬剤の量を指す。癌の場合、治療的に有効量の薬は癌細胞の数を減じ；腫瘍の大きさを減じ；末梢器官への癌細胞の浸潤を阻害（すなわち、ある程度まで減速、好ましくは停止）し；腫瘍転移を阻害（すなわち、ある程度まで減速及び好ましくは停止）し；腫瘍成長をある程度まで阻害し；及び／又は癌に関連する一又は複数の症状をある程度まで緩和する。以下の「治療する」の定義を参照せよ。薬が存在する癌細胞の成長を妨げ及び／又は死滅させる程度まで、それは、細胞分裂停止及び／又は細胞障害性であり得る。
本発明の抗ＣＤ２０抗体は、ＣＨＯ細胞などの一過性または安定な形質移入真核宿主細胞により生成されうる。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる服用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(登録商標)を含む。
【００４５】
１．ポリペプチドＢＬｙＳアンタゴニスト
ＢＬｙＳのアンタゴニストとして有用なポリペプチドには、例としてＷＯ０２／０９２６２０の配列番号：１２３に記載のＴＡＬＬ−１１２−３として示され、アミノ酸配列：
MLPGCKWDLLIKQWVCDPLGSGSATGGSGSTASSGSGSATHMLPGCKWDLLIKQWVCDPLGGGGGVDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (配列番号. 10)
をここに提供するポリペプチドが含まれる。
このポリペプチドはＢＬｙＳを結合し、ＢＲ３のＢＬｙＳへの結合を阻害する。
いくつかの実施態様では、１７ｍｅｒのペプチドは可溶性であり（好ましくは膜結合性でない）、コア配列として用いられるか、さもなければ以下に記載の多様な構造と結合ないし抱合するであろう。１７ｍｅｒポリペプチド内のいくつかのアミノ酸は、保存的置換および非保存的置換について無作為化してスクリーニングした。当分野の技術者およびこの記載によってわかるように、付加および置換は、結果として生じる１７ｍｅｒのペプチドのＢＬｙＳ結合および１７ｍｅｒのペプチドを含む構造を損なうことなく限られた塩基上に起こるであろう。ＢＬｙＳ結合機能を与えると思われる置換については、以下および実施例で示す。いくつかの実施態様では、構造的または結合的親和性関係に関わる残基は保存されており、このことは式および以下の解説に記載のようにアミノ酸同一性が維持されているか保存的置換が起こっていることを意味する。
本発明のＢＬｙＳポリペプチドアンタゴニストは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、図３２に挙げる配列、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、およびそれらの混合からなる群から選択される配列を含む。
【００４６】
本発明の一態様では、ポリペプチドは、式Ｉ：
Ｘ１−ＣＮ−Ｘ３−Ｄ−Ｘ５−Ｌ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−ＣＴ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（式Ｉ）（配列番号：１４３）
のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ７、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５およびＸ１７はシステインを除くアミノ酸配列であり；Ｘ１６はＬ、Ｆ、ＩおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；およびここでのポリペプチドは式ＩのＣＮ（システインＮ末端）への７アミノ酸残基Ｎ末端およびＣＴ（システインＣ末端）への７アミノ酸残基Ｃ末端内にシステインを含まない。
いくつかの実施態様では、式Ｉの配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合によるＣＮおよびＣＴ結合を有する；Ｘ５ＬＸ７Ｘ８がＬおよびＸ７間に回転中心を有するタイプＩβターン構造の高次構造を形成し；正数のＸ８の二面角φを持つ。
いくつかの実施態様では、Ｘ１０はＷ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｍおよび非極性アミノ酸からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ１０はＷである。いくつかの実施態様では、Ｘ３はＭ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗおよび非極性のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である。いくつかの実施態様では、Ｘ５はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、ＡおよびＲからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ７はＶ、Ｔ、ＩおよびＬからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ７はＴないしＩではない。いくつかの実施態様では、Ｘ８は任意のＲ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、ＨおよびＤアミノ酸からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、ＲおよびＱからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ１１はＩないしＶである。いくつかの実施態様では、Ｘ１２はＰ，Ａ，Ｄ、ＥおよびＳからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、Ｘ１６はＬである。
特定の実施態様では、式Ｉの配列は、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、 ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)からなる群から選択される配列である。
【００４７】
本発明の他の態様では、ポリペプチドは、式ＩＩ：
Ｘ１−ＣＮ−Ｘ３−Ｄ−Ｘ５−Ｌ−Ｖ−Ｘ８−Ｘ９−Ｗ−Ｘ１１−Ｘ１２−ＣＴ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｌ−Ｘ１７（式ＩＩ）（配列番号：１４４）
のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１７はシステインを除く任意のアミノ酸配列であり；およびここでのポリペプチドは式ＩＩのＣＮ（システインＮ末端）への７アミノ酸残基Ｎ末端およびＣＴ（システインＣ末端）への７アミノ酸残基Ｃ末端内にシステインを含まない。
いくつかの実施態様では、式ＩＩの配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合によるＣＮおよびＣＴ結合を有する；Ｘ５ＬＶＸ８がＬおよびＸ７間に回転中心を有するタイプＩβターン構造の高次構造を形成し；正数のＸ８の二面角φを持つ。
式ＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ３はＭ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｙ、Ｆ、Ｗおよび非極性のアミノ酸からなる群から選択されるアミノ酸である。式ＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ５はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｉ、ＡおよびＲからなる群から選択される。式ＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ８はＲ、Ｋ、Ｇ、Ｎ、ＨおよびＤアミノ酸からなる群から選択される。式ＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、ＲおよびＱからなる群から選択される。式ＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ１１はＩおよびＶからなる群から選択される。式ＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ１２はＰ、Ａ、Ｄ、ＥおよびＳからなる群から選択される。
他の態様では、ポリペプチドは図３２に示す何れかの配列から選択される配列を含む。
【００４８】
本発明の他の態様では、式ＩＩＩ：
Ｅ−ＣＮ−Ｆ−Ｄ−Ｘ５−Ｌ−Ｖ−Ｘ８−Ｘ９−Ｗ−Ｖ−Ｘ１２−ＣＴ−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７（式ＩＩＩ）（配列番号：１４５）
のアミノ酸配列を含み、ここで、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５、およびＸ１７はシステインを除く任意のアミノ酸配列であり；Ｘ１６はＬ、Ｆ、ＩおよびＶからなる群から選択されるアミノ酸であり；ここでのポリペプチドは式ＩＩＩのＣＮ（システインＮ末端）への７アミノ酸残基Ｎ末端およびＣＴ（システインＣ末端）への７アミノ酸残基Ｃ末端内にシステインを含まず；およびＣＮおよびＣＴはジスルフィド結合で結合している。
式ＩＩＩのいくつかの実施態様では、式ＩＩＩの近接する配列を含むポリペプチドは、ＣＮとＣＴ間にジスルフィド結合を有し、Ｘ５ＬＶＸ８でＬおよびＶ間に回転中心を有するタイプＩβターン構造を形成し；正数のＸ８の二面角φを持つ。
式ＩＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ５、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５およびＸ１７はＬ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、ＤおよびＧからなる群から選択される。式ＩＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ５はＬで、Ｘ８はＲである。式ＩＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ９はＨ、Ｋ、Ａ、Ｓ、ＲおよびＱからなる群から選択される。式ＩＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ１２はＰ、Ａ、Ｄ、ＥおよびＳからなる群から選択される。式ＩＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ１２はＰである。式ＩＩＩのいくつかの実施態様では、Ｘ１６はＬである。
特定の実施態様では、式ＩＩＩの配列は、ECFDLLVRAWVPCSVLK(配列番号：5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号：6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号：7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号：8)およびECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号：9)からなる群から選択される。
【００４９】
また、ECFDLLVRAWVPCSVLK、ECFDLLVRHWVPCGLLR、ECFDLLVRRWVPCEMLG、ECFDLLVRSWVPCHMLR、およびECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号：５から９)からなる群から選択される近接したポリペプチド配列を含むポリペプチドを提供する。また、本発明は、図３２に記載の何れかの配列から選択される配列を含むポリペプチドに関する。好ましくは、図３２に記載の何れか一の配列を含むポリペプチドは、ジスルフィド結合によりシステインの配列を結合している。いくつかの実施態様では、配列の５番目と８番目の残基の間の配列はＬとＸ７の間に回転中心を有するタイプＩβターン構造の高次構造を形成し、８番目の残基は正数の二面角φを持つ。
いくつかの実施態様では、本発明のＢＬｙＳポリペプチドは近接した配列である。また、本発明は、ECFDLLVRAWVPCSVLK、ECFDLLVRHWVPCGLLR、ECFDLLVRRWVPCEMLG、ECFDLLVRSWVPCHMLR、およびECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号：５から９)からなる群から選択される近接した１７ｍｅｒのポリペプチドと少なくも８８％の配列同一性を含むポリペプチドに関する。他の実施態様では、配列同一性は、最大の相同性を得られるように配列した後に少なくとも６４％から１００％までの連続した整数である。最大の相同性が得られるように配列した配列間隙と本発明の１７ｍｅｒより少ない配列を入れることで相同性が低くなる。ＮないしＣ末端の伸展および挿入は相同性が低くなるとはみなさない。
本発明のいくつかの実施態様によると、ポリペプチドは５０アミノ酸長以下、２５アミノ酸長以下、ないしは１７ｍｅｒである。
【００５０】
いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、または図３２に挙げる配列に、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方に付加的ポリペプチドを含む。付加的ポリペプチド配列は、天然配列ＢＲ３ポリペプチドに非相同で、例としてイムノグロブリンのＦｃ部位を含む。
本発明の他の態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストポリペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、または図３２に挙げる配列を含むポリペプチドの少なくとも一および好ましくは一以上を含む。互いに連結するポリペプチドは同じ配列または異なる配列を持ちうる。いくつかの実施態様では、これらのポリペプチドは互いに、場合によってはリンカーを介して結合しうる。リンカーはスペーサーとして機能し、多種の化学的化合物からなりうる。いくつかの実施態様では、リンカーは、約１から５０アミノ酸、より好ましくは１から３０アミノ酸を含むポリペプチドである。リンカー配列は当分野の技術者に公知である。例えば、リンカー配列は、GGGKGGGGおよびGGGNSSGGなどを含む。特定の実施態様では、互いに連結したポリペプチドは同じ配列を持ち、式：ＰＰ１−Ｌ１−ＰＰ１−Ｌ２−ＰＰ１を含むもので、ここでＰＰ１は式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、および図３２に挙げる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｌ１およびＬ２は配列が異なるリンカー配列である。
ここで示したポリペプチドなどのＢＬｙＳのＢＲ３への結合のアンタゴニストは、好ましくは配列番号：  のＢＲ３  ＥＣＤまたは配列番号：  のミニＢＲ３などの天然のＢＲ３配列と同じかそれよりも大きい親和性を持ってＢＬｙＳに結合する。いくつかの実施態様では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、または図３２に挙げる配列を有するポリペプチドはＢＬｙＳに対して、約１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の結合親和性を持つ。結合親和性を測定する一方法は実施例に示す。
【００５１】
ＢＬｙＳアンタゴニストを見つけるために本発明に使用される方法は、ＢＲ３の１７残基のコア配列を同定すること、修飾すること、および選択的に無作為化することを含む。用いた特定の技術はさらに以下および実施例で記載する。いくつかの実施態様では、部位Ｘ２でのＮ末端システイン残基（ＣＮ）および部位Ｘ１３でのＣ末端システイン（ＣＴ）は保存されており、好ましくはジスルフィド架橋を形成する。いくつかの実施態様では、ＣＮおよびＣＴは１０の近接するアミノ酸により分離されている。好ましくは、１７ｍｅｒ配列は部位Ｘ２およびＸ１３以外に全くシステインを含まない。加えて、１７ｍｅｒが大きな構造に包含される場合、好ましくは１７ｍｅｒに隣接する配列はＣＮまたはＣＴの７アミノ酸内に全くシステイン残基を含まない。Ｘ１０はシステインを除く任意の非極性アミノ酸；例えば：Ｗ、Ｆ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、ＹまたはＭに置換される。いくつかの実施態様では、Ｘ１０はＷである。
【００５２】
いくつかの実施態様では、モチーフＤ−Ｘ５−Ｌ−Ｘ７は立証されたＢＬｙＳ結合への寄与に応じて保存される。いくつかの実施態様では、ＣＮとＣＴ間に位置するβターンはＸ４とＸ７の間に形成される。いくつかの実施態様では、βターンの中心はＬ−Ｘ７間に位置する。いくつかの実施態様では、本発明の１７ｍｅｒペプチドの構造は一般的に、ＣＮとＣＴ間のジスルフィド結合により連結されるβヘアピンを形成するタイプＩβターンにより連結される２つのβ鎖である。加えて、いくつかの実施態様では、Ｘ８の残基は、βヘアピン構造のタイプＩβターンに順応するようにＸ８の二面角φに正の数を与える。
付加的構造的情報により、Ｘ４のＤおよびＸ６のＬはＢＬｙＳ−ＢＲ３複合体のＢＬｙＳ−ＢＲ３境界面内に埋没していることが示唆される。いくつかの実施態様では、これらの残基は保存されている。また、Ｘ７の残基もＢＬｙＳ−ＢＲ３境界面内に埋没している。いくつかの実施態様では、Ｘ７はＶ、Ｔ、ＩおよびＬからなる群から選択してよい。いくつかの実施態様では、好ましくはＸ７はＶである。いくつかの実施態様では、Ｘ４からＸ７のモチーフはＤＬＬＶである。
いくつかの実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストの結合領域の長さは１７アミノ酸である。いくつかの実施態様では、ポリペプチドＢＬｙＳアンタゴニストは１７アミノ酸である。いくつかの実施態様では、４つのアミノ酸、Ｘ１４−Ｘ１７は、Ｃ末端のＣＴに続く。いくつかの実施態様では、１７ｍｅｒが結合し保存されている場合、Ｘ１６はＢＬｙＳと疎水性作用を形成する。いくつかの実施態様では、Ｘ１６はＬである。
【００５３】
２．ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞
いくつかの実施態様によると、本発明のＢＬｙＳアンタゴニストポリペプチドは、ここに示す１７ｍｅｒのペプチド、一以上の１７ｍｅｒのペプチドをコア領域として組み込んでいるポリペプチド、および１７ｍｅｒのペプチドとポリペプチドの共有結合的に修飾した型（例えば、イムノアドヘシン、標識したポリペプチド、保護したポリペプチド、抱合したポリペプチド、融合タンパク質など）：からなる群から選択される。これらの型のポリペプチドを作製するために用いる多種の技術をここに記載する。ポリペプチドを標識する方法およびポリペプチドに分子を抱合する方法は当分野に公知である。
本発明の組成物は、当分野に公知の組み換え技術を用いて調製することができる。以下の記載は、コード化核酸を包含するベクターを形質移入または形質転換した宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによってそのようなポリペプチドを生成する方法に関する。（例として、Sambrook 等., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)；Dieffenbach 等., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)を参照）。
所望のポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター内に挿入してもよい。多種のベクターが公然に市販されている。一般的にベクター成分は、限定するものではないが、一以上の以下：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモータ、および転写終末配列を含み、その各々については以下に記載する。用いる選択的なシグナル配列、複製起点、マーカ遺伝子、エンハンサーエレメントおよび転写終末配列は当分野に公知であり、ＷＯ９７／２５４２８にさらに詳述されている。
【００５４】
通常、発現およびクローニングベクターは宿主生物によって認識されるプロモーターを含み、コード化核酸配列に作用可能に結合している。プロモータは、特定の核酸配列の転写と翻訳を制御する構造的遺伝子（一般的に約１００から１０００ｂｐ内）の開始コドンの上流（５’）に位置して、作用可能に結合している非翻訳領域である。一般的にそのようなプロモータは２つのクラス、誘発性と恒常性に分類される。誘発性プロモータは、培養条件、例えば栄養の有無や温度の変化などのいくつかの変化に応じた制御下でＤＮＡからの転写レベル亢進を惹起するプロモータである。現在、様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータの多くが公知である。これらのプロモータは、制限酵素消化によって元のＤＮＡからプロモータを除去して単離したプロモータをベクター内に挿入することによってコード化ＤＮＡに作用可能に結合している。
一以上の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又は、必要とされるプラスミドの生成のためにＤＮＡ断片を切断し、整え、そして望ましい型に再ライゲーションする。構築されたプラスミド中において正しい配列であることを確認する解析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）に形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、成功した形質転換細胞を選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により解析し、及び／又は当分野に公知の標準的な技術を用いて解析する。（例として、Messing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)；Maxam等, Methods in Enzymology, 65:499（1980）を参照）。
【００５５】
哺乳動物細胞でコード化ＤＮＡを一過的に発現するために提供される発現ベクターを用いてもよい。一般的に、一過性発現は宿主細胞内で効率よく複製することができる発現ベクターを用いることを含み、そうして宿主細胞は発現ベクターをたくさんコピーして順に、発現ベクターによってコードされる所望のポリペプチドを高レベルに合成する（Sambrook 等., 上掲）。好適な発現ベクターおよび宿主細胞を含む一過性の発現系により、クローンしたＤＮＡによってコードされるポリペプチドを簡便にポジティブ同定するだけでなく、所望の生物学的または生理学的性質についてポリペプチドを素速くスクリーニングすることができる。
組換え脊椎動物細胞培養での所望のポリペプチドの合成に適用するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；EP117,060；及びEP117,058に記載されている。
ここでベクターにＤＮＡをクローニング又は発現するのに適した宿主細胞は、原核生物、酵母または高次の真核生物を含む。本発明の目的に適した原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例として、エシェリキア属などの腸内細菌科、例えば大腸菌（E. coli）、エンテロバクター、Erwinia、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチアmarcescans、及び赤痢菌属、並びに枯草菌（B. subtilis）やB. licheniformis等の桿菌（例えば、1989年4月12日公開のDD266,710に開示されたB. licheniformis 41P）、緑膿菌等のシュードモナス属、及びストレプトマイシンが挙げられる。好ましくは、宿主細胞は最小限量のタンパク質分解性酵素を分泌する。
【００５６】
原核生物に加えて、線状の菌類又は酵母菌のような真核生物微生物は、ベクターのための好適なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は多細胞生物体から得られる。すべてのこのような宿主細胞の例は更にＷＯ９７／２５４２８に記載されている。
宿主細胞は、上記の発現又はクローニングベクターを形質移入および好ましくは形質転換して、プロモータの誘導に適するように変更した栄養培地で培養して、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコード化している遺伝子を増幅する。
形質転換（トランスフェクション）とは、任意のコード配列を実施的に発現するかどうかにかかわらず、宿主細胞に発現ベクターが取り込まれることを意味する。膨大な数の形質転換方法が通常の当分野の技術者に公知であり、例えばＣａＰＯ４や電気穿孔法などである。宿主細胞内でこのベクターの何らかの働きが生じたときに、一般的に形質転換が成功していると認識する。
形質転換（トランスフォーメーション）とは、ＤＮＡが複製するように、染色体外成分としてまたは染色体成分によって生物体内にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞に応じて、その細胞に適する標準的技術を用いて形質転換を行う。一般的に、Sambrook 等., 上掲に記載のような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理ないし電気穿孔法が原核生物または実質的に細胞壁バリアを持つ他の細胞に用いられる。Shaw 等., Gene, 23:315 (1983)および１９８９年６月２９日公開のWO 89/05859に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換にはアグロバクテリウム腫大物での感染を用いる。加えて、植物は、１９９１年１月１０日に公開のWO 91/00358に記載のように、超音波処理を用いて形質転換してもよい。
【００５７】
そのような細胞壁のない哺乳動物細胞には、Grahamおよびvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法を用いてもよい。哺乳動物細胞宿主系形質転換の一般的な態様は、米国特許第4,399,216号に記載されている。一般には、Van Solingen等., J. Bact., 130:946 (1977) およびHsiao 等., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って、酵母菌内への形質転換を行う。しかしながら、細胞へのＤＮＡ導入のための他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、電気穿孔法、完全細胞とのバクテリアプロトプラスト融合、ないしポリブレンやポリオルニチンなどのポリカチオンもまた用いてもよい。哺乳動物細胞の形質転換のための多種の技術については、Keown 等., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)およびMansour 等., Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
Sambrook 等., 上掲に一般的に記載されているように、原核細胞は好適な培養培地で培養することができる。市販の培養培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「MEM」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)がある。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００５８】
一般に、哺乳動物細胞培養の生産性を最大にするための原則、プロトコールおよび実質的技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, 編. (IRL Press, 1991)にある。
発現したポリペプチドは、分泌シグナルを持たずに直接精製された場合には宿主細胞溶解物から回収するが、分泌したポリペプチドとして培養培地から回収してもよい。ポリペプチドが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から切り離すか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を切り離すことができる。
ポリペプチドがヒト起源のもの以外の組み換え細胞内で生成される場合、ヒトのタンパク質ないしポリペプチドは含まない。しかしながら、通常は実質的に均一な調製物を得るために組み換え細胞タンパク質ないしポリペプチドからポリペプチドを回収ないし精製することが必要である。第一工程として、培養培養液ないし溶解物を遠心分離して粒子状の細胞破壊物を取り除く。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くためのプロテインＡセファロースカラムである。
【００５９】
ファージディスプレイ
一実施態様によると、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、および図３２に挙げる配列からなる群から選択される本発明のポリペプチドは、ファージディスプレイに用いてもよい。
ファージディスプレイ技術の使用により、高い親和性で標的分子に結合する配列について迅速に分類することができるタンパク質変異体の大きなライブラリを作製することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルス性コートタンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質ないしポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)；Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリを作製してそのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている(例として、米国特許第5,723,286号、米国特許第5,432, 018号、米国特許第5,580,717号、米国特許第5,427,908号および米国特許第5,498,530号)。
いくつかの実施態様では、式Ｉ、式ＩＩないし式ＩＩＩはファージ上でペプチドライブラリとして発現する。ついで、式Ｉ、式ＩＩないし式ＩＩＩのポリペプチドのライブラリを発現するファージはＢＬｙＳ結合に基づいて選択することを目的としている。いくつかの実施態様では、選択の過程はニュートラビジン(neutravidin)プレートに続いて結合させたビオチニル化ＢＬｙＳへいくつかのファージが結合することを伴う。ＢＬｙＳ-ビオチン-ニュートラビジン結合を介するプレートへのファージ結合が回復し、増殖する。いくつかの実施態様では、ファージは何段階かの選別を目的としている。いくつかの実施態様では、ファージはＢＬｙＳ-ビオチンと共にインキュベートし、ついで競合的結合体として非ビオチニル化ＢＬｙＳを付加する。本発明の内容におけるファージディスプレイの使用については実施例で付加的に解説する。
【００６０】
異種性ポリペプチドへのポリペプチド融合または抱合
さらに、本発明のポリペプチドを含むイムノアドヘシン分子のここでいう方法への使用を包含する。いくつかの実施態様では、分子はイムノグロブリンないしイムノグロブリンの特定領域と本発明のポリペプチドとの融合を含む。イムノアドヘシンの一価型について、そのような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域を有効に含む。更なる実施態様では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１分子由来である。いくつかの実施態様では、イムノグロブリン融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合の作製については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号およびChamow 等., TIBTECH, 14:52-60 (1996)も参照のこと。
最も簡単で複雑でないイムノアドヘシンのデザインは、アドヘシンの結合ドメイン（例えば、本発明のアンタゴニストポリペプチド）とイムノグロブリン重鎖のＦｃ領域に結合しているものがある。例えば、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、および図３２に挙げる配列を含むポリペプチドは、イムノグロブリンのＦｃ部位に共有結合しうる。加えて、これらポリペプチドの一以上は互いに連結し、イムノグロブリンのＦｃ部位に連結している。
通常、本発明のイムノアドヘシンを調製するとき、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸はイムノグロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合するが、Ｎ末端の融合も可能である。
【００６１】
一般的に、そのような融合体では、コードされたキメラポリペプチドは、少なくともイムノグロブリン重鎖の定常領域の機能的活性化ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを保持するであろう。また、定常ドメインのＦｃ部位のＣ末端、または重鎖のＣＨ１ないし軽鎖の対応する領域へのＮ末端に接して融合体が作製される。融合体が作製される正確な部位は重要でなく；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択してよい。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列はイムノグロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合させる。重鎖定常領域の全体をアドヘシン配列に融合させることができる。しかしながら、より好ましくは、ＩｇＧ  Ｆｃを化学的に定義する（すなわち、残基２１６、重鎖定常領域の最初の残基と１１４とする）パパイン切断部位に接したヒンジ領域上流で始まる配列、または他のイムノグロブリンの類似体部位が融合に用いられる。特定の好ましい実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列は、ＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域およびＣＨ２およびＣＨ３、または（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインに融合させる。
二重特異性イムノアドヘシンについて、イムノアドヘシンは、多量体として、および特にヘテロ二量体ないしヘテロ四量体として集合している。一般的に、集合したイムノグロブリンは公知の単位体構造であろう。基本的な４鎖構造単位は、ＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＥに存在する形態である。４鎖単位は高次の分子量イムノグロブリンに反復しており；一般的にＩｇＭはジスルフィド結合でまとまった４基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、時にはＩｇＧグロブリンもまた血清中で多量体形態で存在する。多量体の場合、４つの単位体の各々は同じないし異なっていてもよい。
【００６２】
ここでいう範囲内の様々な例示的集合イムノアドヘシンは、以下に概略的に図示する：
（ａ）ＡＣＬ−ＡＣＬ；
（ｂ）ＡＣＨ−（ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；
（ｃ）ＡＣＬ−ＡＣＨ−（ＡＣＬ−ＡＣＨ、ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、ＶＬＣＬ−ＡＣＨ，またはＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ）
（ｄ）ＡＣＬ−ＶＨＣＨ−（ＡＣＨ、またはＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；
（ｅ）ＶＬＣＬ−ＡＣＨ−（ＡＣＬ−ＶＨＣＨ、またはＶＬＣＬ−ＡＣＨ）；および
（ｆ）（Ａ−Ｙ）ｎ−（ＶＬＣＬ−ＶＨＣＨ）２
ここで、各々のＡは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、および図３２に挙げる配列、ないしその組み合わせのアミノ酸配列を含む同一のないし異なるポリペプチドを表し；
ＶＬはイムノグロブリン軽鎖可変ドメイン；
ＶＨはイムノグロブリン重鎖可変ドメイン；
ＣＬはイムノグロブリン軽鎖定常ドメイン；
ＣＨはイムノグロブリン重鎖定常ドメイン；
ｎは１以上の整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を表す。
【００６３】
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3' 末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
【００６４】
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたcDNAライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); 米国特許第5,716,805号; WO94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniateis等, Nature, 341:24 (1989); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列を本発明のポリペプチドの５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【００６５】
また、本発明のポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。いくつかの実施態様によると、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。いくつかの実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＷＩＳＰ−１ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
【００６６】
ペプチド-ポリマー抱合体の構築
いくつかの実施態様では、合成ペプチドのポリマー（例えば、ペグ化(PEGylation))の抱合体の方法は、溶液中で抱合連結を形成することによって、各々が他方に対して相互に反応する特定の機能を保持するペプチドとＰＥＧ分子を結合させることからなる。ペプチドは従来の固相合成法を用いて簡単に調製することができる。ペプチドは特定の部位の適する機能的な基に「前活性化」される。前駆体(precursor)はＰＥＧ分子と反応する前に精製して、完全に分類する。通常、ペプチドとＰＥＧとのライゲーションは液体中で起こり、逆相分析用ＨＰＬＣによってモニターすることができる。ペグ化ペプチドは、分離用ＨＰＬＣによって簡単に精製し、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱離質量分析法によって分類することができる。
【００６７】
ａ．ペプチド反応部位
いくつかの実施態様では、ペプチドは、主に反応条件、ポリマーの分子量などに応じてペプチドの一以上のアミノ酸残基を介してポリマーの末端反応基に共有結合する。反応基を持つポリマーはここでは活性化ポリマーとする。反応基は、ペプチド上の遊離アミノ酸ないし他の反応基と選択的に反応する。潜在的反応部位には、Ｎ末端アミノ基、リジン残基上のεアミノ基、並びに他のアミノ、イミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、水酸基および他の親水基が含まれる。しかしながら、最適な結果を得るために選択した反応基のタイプや量、並びに用いるポリマーのタイプは、反応基がペプチド上のとても多くの特定の活性基と反応するのを防ぐために用いる特定のペプチドに依存するであろうことが理解されるであろう。いくつかの実施態様では、反応基（例えば、リジン（Ｋ）、修飾した非中性のアミノ酸、ないし他の小分子）は抱合に適する位置で置換してよい。
いくつかの実施態様では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、および図３２に挙げる配列を含むペプチドは末端の反応基を有する。いくつかの実施態様では、ペプチドは、少なくとも一、より好ましくは一以上の式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、および図３２に挙げる配列を含むポリペプチドを含んでなる。互いに連結しているポリペプチドは同じ配列を持つか、異なる配列ないし末端反応基を有しうる。いくつかの実施態様では、これらのポリペプチドは互いに、場合によってはリンカーを介して接合することができる。
【００６８】
抱合がポリペプチド上の任意の反応アミノ酸で起こる一方で、いくつかの実施態様では、反応アミノ酸は、その遊離εアミノ基を介して活性化ポリマーの反応基に連結するリジンであり、またはアミド結合を介してポリマーに連結するグルタミン酸ないしアスパラギン酸である。いくつかの実施態様では、ペプチドの反応アミノ酸は位置Ｘ２およびＸ１２のシステイン残基ではない。
各ペプチドとのポリマー抱合の程度は、ペプチド上の反応部位の数、ポリマーの分子量、親水性および他の性質、および選択した特定のペプチド類似体化部位によって異なるであろう。いくつかの実施態様では、抱合体は、ペプチド分子当たり最終モル比１から１０ポリマー分子であるが、本発明のペプチドに接着するポリマー分子がより多いものも組み込まれる。いくつかの実施態様では、各抱合体は一ポリマー分子を内包する。所望の量を類似体化するには、サイズ排斥クロマトグラフィや当分野の他の方法によって抱合体のポリマー置換のレベルを決定した後、時間、温度および他の反応条件を変えて置換の程度を変化させるといった実験的マトリクスを用いて容易に達成される。
【００６９】
ｂ．活性化ポリマー
いくつかの実施態様では、ポリマーは反応する単一の基しか含まない。これによってタンパク質分子の交差結合を防ぐ。しかしながら、交差結合を減らすために反応条件を最大にすること、または実質的に同質の類似体を回収するためのゲル濾過ないしイオン交換クロマトグラフィを用いた反応生成物を精製することは本発明の範囲内である。他の実施態様では、ポリマーは複数のペプチドをポリマー中心に連結するために２以上の反応基を含んでいる。再び、実質的に同質の形態で所望の類似体を回収するために、ゲル濾過ないしイオン交換クロマトグラフィを用いることができる。いくつかの実施態様では、ポリマーは、多重機能性（通常は二重機能性）架橋剤を使用しないでペプチドに直接共有結合する。いくつかの実施態様では、ＰＥＧ鎖とペプチドは１：１のモル比である。
ペプチド上の反応基がリジン基の場合、一般的に用いる適当な方法によって共有的修飾反応を起こして、生物学的活性な物質を挿入ポリマーと、好ましくは約ｐＨ５−９、より好ましくはｐＨ７−９で反応させてもよい。一般的にこの過程には、活性化ポリマー（通常活性化されるために少なくとも一の末端水酸基を有するポリマー）を調製すること、該ポリマーから活性な基質を調製すること、およびその後に形成に適するペプチドを生成するためにペプチドを活性基質と反応させることを伴う。上記の修飾反応は、一以上の工程を伴う様々な方法によって行うことができる。一工程反応で活性化ポリマーを生成するために用いることができる修飾剤の例には、塩化シアヌル酸（２,４,６-トリクロロ-Ｓ-トリアジン）およびシアヌル酸フルオライドが含まれる。
【００７０】
いくつかの実施態様では、修飾反応は二工程で行い、その工程は、初めにカルボキシル酸を形成させるためにコハク酸無水物ないしグルタル無水物などの酸性無水物とポリマーを反応させ、ついで、ペプチドと反応可能な反応性エステル基を有する活性化ポリマーを形成させるためにカルボキシル酸と反応可能な化合物とカルボキシル酸を反応させる。そのような化合物の例には、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド、４-水酸基-３-ニトロベンゼンスルホン酸などが含まれ、そして好ましくはＮ-ヒドロキシスクシンイミド又は４-水酸基-３-ニトロベンゼンスルホン酸が用いられる。例として、モノメチル置換ＰＥＧは、高い温度、好ましくは約１００−１１０℃で４時間で、グルタル無水物と反応するであろう。ついで、それによって生成したモノメチルＰＥＧグルタル酸は、ＧＨと反応する活性化ポリマー、すなわちメトキシポリエチレングリコリル-Ｎ-スクシンイミジルグルタラートを生成するために、ジシクロヘキシル又はイソプロピルカルボジイミドのようなカルボジイミド試薬の存在下でＮ-ヒドロキシスクシンイミドと反応させる。この方法は、Abuchowski 等., Cancer Biochem. Biophys., 7: 175-186 (1984)に詳しく記載されている。他の実施例では、モノメチル置換ＰＥＧは、活性化ポリマーを生成するために、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下で、グルタル酸無水物と反応させて、続いて４-ヒドロキシ-３-ニトロベンジンスルホン酸（ＨＮＳＡ）と反応させてもよい。ＨＮＳＡは、Bhatnagar 等., Peptides: Synthesis-Structure-Func- tion. Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium, Rich 等. (編.) (Pierce Chemical Co., Rockford Ill., 1981), p. 97-100, および Nitecki 等., High-Technology Route to Virus Vaccines (American Society for Microbiology: 1986), タイトル "Novel Agent for Coupling Synthetic Peptides to Carriers and Its Applications"に記載されている。
【００７１】
いくつかの実施態様では、アミノ基への共有結合は、シアヌル酸塩化物、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応基（ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタールを加えたＰＥＧアルコキシド；ＤＭＳＯおよび無水酢酸を加えたＰＥＧ又は４―ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシドを加えたＰＥＧ塩化物、活性化スクシンイミジルエステル類、活性化ジチオ炭酸塩ＰＥＧ、２，４，５トリクロロフェニルクロロホルメート又はＰ-ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく公知の成分によって達成される。カルボキシル基は、カルボジイミドを用いてＰＥＧ-アミンを結合することによって類似体化される。スルフヒドリル基は、１９９７年３月２７日発行のＷＯ９７／１０８４７に記載されているように、マレイミド置換ＰＥＧ（例えばスルホスクシンイミジル４-（Ｎマレイミドメチル）シクロヘキサン-１-カルボキシレートを加えたアルコキシＰＥＧアミン）に、又はNektar Technologies, San Carlos, CA (formerly Shearwater Polymers, Inc.)から市販されているＰＥＧ-マレイミドに結合することによって類似体化される。あるいは、ペプチド上の遊離アミノ基（例えばリジン残基上のεアミノ基）は、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミジル置換ＰＥＧ（Nektar Technologiesから入手可能なＰＥＧ-ＮＨＳ；）に結合させるか、又は２-アミノチオラン（トラウトの試薬）にてチオレートしてから、Pedley 等., Br. J. Cancer, 70: 1126-1130 (1994)に記載のように、ＰＥＧのマレイミド含有類似体に結合させてもよい。
【００７２】
限定するものではないが、ＰＥＧを含む多くの挿入ポリマーは薬剤への使用に適している。例として、Davis 等., Biomedical Polymers: Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use, pp.441-451 (1980)を参照のこと。本発明のいくつかの実施態様では、非タンパク質性のポリマーが用いられる。一般的に、非タンパク質性ポリマーは親水性の合成ポリマー、すなわち天然では特に存在しないポリマーである。しかしながら、天然に存在するポリマーおよび組み換えないしインビトロ法によって生成したポリマーも、天然源から単離したポリマー同様有用である。例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンなどの親水性のポリビニルポリマーは本発明の範囲内である。特に有用なのは、ポリアルキレンエーテル、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレン(Pluronics)のブロックコポリマー）；ポリメタクリレート；カルボマ；ホモ多糖およびヘテロ多糖、例えば酸性のムコ多糖（例えばヒアルロン酸）のラクトース、アミロペクチン、澱粉、ヒドロキシエチル澱粉、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン又は多糖類サブユニットを含有する、糖類単量体Ｄ-マンノース、Ｄ-およびＬ-ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ-キシロース、Ｌ-アラビノース、Ｄ-グルクロン酸、シアル酸、Ｄ-ガラクツロン酸、Ｄ-マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸又はアルギン酸）、Ｄ-グルコサミン、Ｄ-ガラクトサミン、Ｄ‐グルコース、およびノイラミン酸を含んでなる分岐又は枝状に分かれていない多糖類；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖質アルコール類のポリマー；ヘパリン又はヘパロン(heparon)である。
【００７３】
抱合前のポリマーは、必要ではないが好ましくは水溶性であるが、好ましくは最終的な抱合体は水溶性である。好ましくは、抱合体は、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶解度である。加えて、ポリマーは抱合体形態で高度に免疫原性でなくても、静脈内注入、注射又は吸入によって抱合体を投与するつもりがある場合に、それらの投与経路に適合しない粘性をもっていてもよい。
ポリマーの分子量は、約１０００００Ｄ以下の範囲、好ましくは少なくとも約５００Ｄ、または少なくとも約１０００Ｄ、または少なくとも約５０００Ｄである。いくつかの実施態様では、ＰＥＧまたは他のポリマーは５０００ないし２００００Ｄの範囲の分子量である。選択した分子量は、作製する抱合体の効果的な大きさ、ポリマーの性質（例えば、線状や分枝状などの構造）、および類似化の程度、すなわちペプチド当たりのポリマー分子の数やポリマー接着部位ないしペプチド状の部位に依存する。いくつかの実施態様では、分枝状ＰＥＧはペプチドの効果的大きさを大幅に増加するために用いてよい。ＰＥＧまたは他のポリマー抱合体は、半減期の延長、溶解性の増加、タンパク質分解性作用に対する安定化、および免疫原性の減少に有用であろう。
【００７４】
本発明のペプチドを修飾するための機能的ＰＥＧポリマーはNektar Technologies of San Carlos, CA (以前はShearwater Polymers, Inc.)より入手可能である。そのような市販のＰＥＧ類似体には、限定するものではないが、アミノＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル類、ＰＥＧ-Ｎ-ヒドロキシスクシンアミド化合物（ＮＨＳ）、ＰＥＧ-ヒドラジド、ＰＥＧ-チオール、ＰＥＧ-琥珀酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ-プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジル琥珀酸塩、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオン酸塩、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジル炭酸塩、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル類、ＰＥＧ-キシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ-ニトロフェニル炭酸塩、ＰＥＧトレシレート(tresylate)、ＰＥＧ-グリシジルエーテル、ＰＥＧ-アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ-マレイミド、ＰＥＧ-オルソピリジル-ジスルフィド、異種機能的ＰＥＧ、ＰＥＧビニル類似体、ＰＥＧシラン、およびＰＥＧホスホリドが含まれる。これらＰＥＧ類似体を連結する反応条件は、タンパク質、所望するペグ化の程度、および用いるＰＥＧ類似性に依存して異なるであろう。ＰＥＧ類似体の選択に伴ういくつかの要因には、所望する接着の位置（例としてリジンまたはシステインＲ基）、加水分解安定性と類似体の反応性、連結の安定性、毒性および抗原性、分析の適性などが含まれる。特定の類似体の使用についての特別な注意書きは製造者より入手する。
【００７５】
ｃ．抱合体の性質決定
抱合体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ゲル濾過、ＮＭＲ、トリプシンのマッピング、液性クロマトグラフィ-質量分析法、およびインビボ生物学的アッセイによって性質決定してもよい。例えば、ＰＥＧ抱合体の大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥやゲル濾過によって示され、ついでＰＥＧのメチレン水素に特定の共振ピークを持つＮＭＲで分析してもよい。各分子のＰＥＧ基の数はＮＭＲスペクトルまたは質量分析から算出することができる。溶出緩衝液として１０ｍＭトリス-ＨＣｌｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌにて１０％ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動を適切に行う。残基がペグ化されたかどうかを確認するために、トリプシンのマッピングを行うことができる。したがって、ペグ化ペプチドは、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム、１０ｍＭ トリス-ＨＣＩ、１ｍＭ 塩化カルシウム, ｐＨ８．３中で、タンパク質／酵素をｍｇ単位で１００対１の比にして３７℃で４時間、トリプシンにて消化し、ｐＨ４より小さく酸性化して消化を停止させ、ＨＰＬＣ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ-１８（４．６ｍｍ．ｔｉｍｅｓ．１５０ｍｍ、５ｍｕ、１００Ａ）にて分離する。クロマトグラムを非ペグ化の開始物質のものと比較する。ついで、各ピークを質量分析法にて分析してピークにある断片の大きさを確認することができる。通常、ＰＥＧ基を持つ断片は注入後ＨＰＬＣカラム上に残らず、クロマトグラムから消失する。このようなクロマトグラムからの消失は、少なくとも一リジン残基を含む特定の断片上がペグ化されたことを示す。ついで、ペグ化されたペプチドは、従来の方法によってＢＬｙＳへの結合能について分析してもよい。
【００７６】
いくつかの実施態様では、抱合体は、イオン交換クロマトグラフィ（例えばイオン交換ＨＰＬＣ）によって精製する。多くの求電子性活性化ＰＥＧの化合物は、ペグ化された生成物のアミノ基荷電が減少する。したがって、高分解能イオン交換クロマトグラフィは、遊離したタンパク質と抱合したタンパク質を分離するため、およびペグ化の程度に応じて化学種を分離するために用いることができる。実際、異なる化学種（例えば１または２のＰＥＧ残基を含む）の分離もまた、反応しないアミノ酸のイオン特性の違いに応じて可能となる。一実施態様では、ペグ化の程度が異なる化学種はＷＯ９６／３４０１５に記載の方法に従って分離する（１９９６年１０月３１日に公開の国際出願番号PCT/US96/05550）。抱合体の異種性化学種は同じ融合体中のそれぞれから精製される。
いくつかの実施態様では、ＰＥＧ-Ｎ-ヒドロキシスクシンアミド（ＮＨＳ）は第一アミン（例えばリジンおよびＮ末端）と反応する。いくつかの実施態様では、ＰＥＧ-ＮＨＳはポリペプチドのＣ末端のリジン（Ｋ）と反応する。いくつかの実施態様では、リジン残基は１７ｍｅｒのポリペプチドのＣ末端に付加される一方、他の実施態様では、Ｘ１７はリジンに置換される。いくつかの実施態様では、ポリマーはＮ末端と反応する。好ましい実施態様では、抱合体は、以下の実施例に記載の類似体化と精製方法を用いて生成される。
一態様では、本発明は、抱合体の構成成分によって形成される上述の何れかの抱合体、すなわち抱合体の共有分子構造内に異質の物質を全く含むことなく一以上のポリマー分子に共有的に接着した一以上のペプチドを提供する。
【００７７】
抗体の生成
本発明の方法および製造品は、ＣＤ２０に結合する抗体を用いるまたは組み込む。したがって、そのような抗体を精製する方法を、ここおよび実施例に記載する。
抗体の生成またはそのスクリーニングに用いるＣＤ２０は、例えば所望のエピトープを含む抗原または抗原の一部の可溶型であってもよい。ヒトＣＤ２０の配列は公知であり、図１０および図１１を参照のこと。ヒトＣＤ２０のクローニングおよび配列決定は、少なくとも以下の文献に記載されている：Stamenkovic I., Seed B., J. Exp. Med. 167, 1975-1980, 1988. Analysis of two cDNA clones encoding the B lymphocyte antigen CD20 (B 1, Bp35), a type III integral membrane protein."；Tedder T.F., Streuli M., Schlossman S.F., Saito H., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 208-212, 1988. "Isolation and structure of a cDNA encoding the B1 (CD20) cell-surface antigen of human B lymphocytes"；Tedder T.F., Klejman G., Schlossman S.F., Saito H., J. Immunol. 142, 2560-2568, 1989. "Structure of the gene encoding the human B lymphocyte differentiation antigen CD20 (B 1)"；Einfeld D.A., Brown J.P., Valentine M.A., Clark E.A., Ledbetter J.A., EMBO J. 7, 711-717, 1988.: "Molecular cloning of the human B cell CD20 receptor predicts a hydrophobic protein with multiple transmembrane domains. "。細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のペプチド断片は免疫源として用いることができる。これら公知の配列およびドメイン描写に基づいて、当業者はＣＤ２０ポリペプチドを発現させ、その断片を抗体産生に用いることができる。
【００７８】
ヒトＣＤ２０に対する抗体を生成するために、細胞外ドメインアミノ酸残基１４２−１８８および６以上の残基長のペプチド断片を、マウス、ハムスターおよびラットを含む齧歯類、ウサギ、ヤギないし他の適当な動物内で抗体を上昇させるために免疫源として用いることができる。可溶性ＣＤ２０ポリペプチドまたはその免疫源性断片を、細菌や真核生物などの適切な宿主細胞内で発現させることができる。一実施態様では、ヒトおよびマウスの界面活性剤溶解性完全長ＣＤ２０を大腸菌内で産生して（以下の実施態様を参照）、免疫化するために用いて、抗ＣＤ２０抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングする。
あるいは、または加えて、細胞表面上にＣＤ２０を発現するＢ細胞や細胞株を抗体の生成、および／またはスクリーニングに用いることができる。このような細胞株はヒトリンパ芽球腫細胞株ＳＢ(ATCC寄託番号ATCC CCL 120、ATCC, Rockville, Mdより入手)である。抗体はヒトの治療のためにヒトＣＤ２０に対して産生される。抗体産生に有用なＣＤ２０の他の型は当業者に明らかであろう。
また、ファージディスプレイ方法をＣＤ２０結合抗体を産生するために使用することができる。
ＣＤ２０を結合する抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト抗体でもよい。このような抗体およびその産生方法については以下に詳述する。
【００７９】
(ｉ)  ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００８０】
(ｉｉ)  モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在する起こりうる天然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第4,816,567号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【００８１】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００８２】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法を用いて(例えば、マウスの重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130:151-188(1992)がある。
【００８３】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marksら, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖混合による高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４，８１６，５６７号；Morrisonら, Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【００８４】
(ｉｉｉ)  ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は従来からよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【００８５】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００８６】
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)；Bruggermanら, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,591,669号、同5,589,369号及び同5,545,807号を参照されたい。
【００８７】
別に、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、非免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３の大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のいずれかにおいてイン-フレームをクローンする。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５，５６５，３３２号及び同５，５７３，９０５号を参照のこと。
またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第５，５６７，６１０号及び同５，２２９，２７５号を参照)。
【００８８】
(ｖ)  抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。
【００８９】
(ｖｉ)  二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、Ｂ細胞表面上のマーカーの２つの異なるエピトープに結合しうる。他のこのような抗体では一方のＢ細胞マーカーと更に他方のＢ細胞表面上のマーカーが結合しうる。あるいは、抗Ｂ細胞マーカー結合アームは、Ｂ細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＢ細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＢ細胞マーカー結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【００９０】
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法がＷＯ９３／８８２９及びTrauneckerら、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
異なるアプローチ法に従って、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【００９１】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、ＷＯ９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。米国特許第５，７３１，１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【００９２】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること（米国特許第４，６７６，９８０号）及びＨＩＶ感染の治療（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）等の用途が提案されてる。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４，６７６，９８０号に記されている。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【００９３】
最近の進歩により、大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは科学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalabyら,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役させて二重特異性抗体を形成する。従って、形成された二重特異性抗体は、ヒト乳腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性を誘発すると同時に、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞及び正常ヒトＴ細胞へ結合することが可能であった。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００９４】
ここに記載のタンパク質又はペプチドアンタゴニストおよび抗体のアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、ＣＤ２０結合抗体ないしアンタゴニストの結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化をアンタゴニスト核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終構造物に達するまでなされるが、その最終構造物は所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化など、アンタゴニストの翻訳後過程を変更しうる。
突然変異のための好ましい位置にあるアンタゴニストの残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリペプチドアニリン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現されたアンタゴニスト変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００９５】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つアンタゴニスト又は細胞障害ポリペプチドに融合したアンタゴニストを含む。アンタゴニスト分子の他の挿入変異体は、アンタゴニストの血清半減期を向上させる酵素(ＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドのアンタゴニストのＮ-又はＣ-末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、アンタゴニスト分子において少なくとも一つのアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。抗体アンタゴニストの置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００９６】
表１
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【００９７】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
（２）中性の親水性：cys、ser、thr、
（３）酸性：asp、glu；
（４）塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
（６）芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
アンタゴニストの適切な配置の維持に関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋を防止する。逆に、アンタゴニストにシステイン結合を付加して、その安定性を向上させてもよい（特にここでのアンタゴニストは抗体断片、例としてＦｖ断片である）。
【００９８】
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異である。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
アンタゴニストのアミノ酸変異の他の型は、アンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、アンタゴニストに見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又はアンタゴニストに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
【００９９】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元のアンタゴニストの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製されたアンタゴニストの変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１００】
エフェクター機能、例えばアンタゴニストの抗原依存性細胞媒介性細胞障害性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞障害性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明のアンタゴニストを修飾することが望ましい。このことは、抗体アンタゴニストのＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。代わりにまたは加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上および／または補体媒介性細胞障害および抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）を増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) およびShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗腫瘍活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff ら Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。または、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解およびＡＤＣＣ能を亢進した。StevensonらAnti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。
アンタゴニストの血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているようにアンタゴニスト（特に抗体断片）内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを表す。
【０１０１】
アッセイ
末梢血Ｂ細胞濃度は、ＣＤ３−／ＣＤ４０＋細胞を数えるＦＡＣＳ法によって決定する。試料中の全リンパ球におけるＣＤ３−ＣＤ４０＋Ｂ細胞の割合は、以下のゲーティング(gating)法によって得ることができる。領域１（Ｒ１）を定義するために前方散布／側方散布の散布図上のリンパ球集団に印を付ける。Ｒ１内の事象を用いて、ＣＤ４０およびＣＤ３マーカを表す蛍光強度ドット図とする。ＣＤ４０およびＣＤ３陽性についてそれぞれのカットオフ値を求めるために、蛍光標識アイソタイプ対照を用いる。
【０１０２】
ＦＡＣＳ分析
５０万個の細胞を洗浄して、１００μｌのＦＡＣＳバッファ（５μｌの染色した抗体ないし対照抗体を含有する１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝食塩水）に再懸濁する。アイソタイプ対照を含むすべての染色した抗体は、PharMingen, San Diego, CAより入手する。ヒトＣＤ２０発現は、ＦＩＴＣ抱合抗ヒトＩｇＧ１第二抗体と共にリツキサン（登録商標）にて染色することによって評価する。ＦＡＣＳ分析は、FACScanおよびCell Quest (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA)を用いて行う。全リンパ球は前方および側方軽散布で定義される一方、Ｂリンパ球は細胞表面上にＢ２２０を発現していることで定義される。
Ｂ細胞の枯渇と回復は、末梢血Ｂ細胞数の分析および、脾臓、リンパ節および骨髄における注射後初めの１週間を１日の基本値およびその後を週の基本値としたＦＡＣＳによりｈＣＤ２０＋Ｂ細胞を分析することによって評価する。注射した２Ｈ７変異体抗体の血清レベルをモニターする。
【０１０３】
薬剤的剤形
本発明に関連して使用されるＣＤ２０結合抗体の治療的剤形は、所望の純度を有する抗体を選択的に薬剤的許容可能な担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥の剤形または液状溶液の形態の貯蔵に適するものである(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体）又はトゥイーン(TWEEN)（商品名）、プルロニクス(PLURONICS)（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０４】
例示的抗ＣＤ２０抗体の剤形はＷＯ９８／５６４１８に記載されており、参考としてここに組み込まれる。他の剤形は、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つように、抗ＣＤ２０抗体４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭロレハロース、０．９％ベンジルアルコール、ｐＨ  ５．０の０．０２％ポリソルベート２０を含む液状複数回用量の剤形である。目的の他の抗ＣＤ２０剤形は、抗体１０ｍｇ／ｍＬ、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベート８０、および注入用の滅菌水を含むｐＨ  ６．５のものである。さらに、他の液状薬剤的剤形は、約ｐＨ４．８から約ｐＨ５．５、好ましくはｐＨ５．５の１０−３０ｍＭ酢酸ナトリウム、界面活性剤として約０．０１−０．１％ ｖ／ｖ量のポリソルベート、約２−１０％ ｗ／ｖ量のトレハロース、および保存剤としてベンジルアルコールを含む（Ｕ．Ｓ．６，１７１，５８６）。凍結乾燥剤形はＷＯ９７／０４８０１に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥剤形は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれない、また再編成された剤形はここで治療される哺乳動物に皮下注射されうる。
ヒト化２Ｈ７変異体の一剤形は、１２−１４ｍｇ／ｍｌ抗体、１０ｍＭヒスチジン、６％ショ糖、０．０２％ポリソルベート２０,ｐＨ５．８である。特定の実施態様では、２Ｈ７変異体、特に２Ｈ７．ｖ１６の剤形は、ｐＨ５．８で、２０ｍｇ／ｍｌ抗体、１０ｍＭヒスチジン硫酸塩、６０ｍｇ／ｍｌショ糖、０．２ｍｇ／ｍｌポリソルベート２０、および注射用の滅菌水を含む。
【０１０５】
また、ここでの剤形は治療を特異的に示すために必要な一以上の活性化合物、好ましくはお互い負に作用しない相補的活性を持つものを含みうる。例として、さらに細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカインまたは免疫抑制剤（例として、シクロスポリンまたはＴ細胞結合抗体、例としてＬＦＡ-１に結合するもの等のＴ細胞作用性のもの）を提供することが望まれる。そのような他剤の有効量は剤形に存在するアンタゴニスト量、疾患または疾病または治療の型、および上述した他の因子に依存する。これらは一般に同じ用量およびここに示した投与経路またはここで用いられる用量の約１〜９９％量で用いられる。
また、活性成分は、例としてコアセルべーション技術または界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、個々のコロイド状のドラッグデリバリーシステム（例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョン中の、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１０６】
持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(2ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第３７７３９１９号), L-グルタミン酸およびエチルＬグルタミン酸の共重合体、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸グリコール酸共重合体、例としてLUPRON DEPOTＴＭ(乳酸-グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、およびポリD-(-)-3ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与に用いる剤形は無菌でなければならない。これは滅菌濾過膜を通す濾過によって容易く達成できる。
【０１０７】
疾患治療
疾患
本発明のＣＤ２０結合抗体およびＢＬｙＳアンタゴニストは、Ｂ細胞悪性腫瘍およびＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療に有用である。
Ｂ細胞制御性自己免疫疾患には、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、骨関節症、乾癬の関節炎）、乾癬、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎；慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮性表皮壊死症、全身性硬皮症および硬化症、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病、潰瘍性大腸炎）と関連している反応、呼吸窮迫症候群、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、アレルギー性鼻炎、脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、糸球体腎炎、アレルギー性症状、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症性反応を伴う症状、アテローム性動脈硬化症、自己免疫心筋炎、白血球癒着不全、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、狼瘡（腎炎、非腎性、ジスコイド、脱毛症を含む）、若年型糖尿病、多発性硬化症、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカインおよびＴリンパ球が媒介する急性および遅発性過敏症を伴う免疫反応、結核、類肉腫症、ヴェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎（ＡＮＣＡを含む）、無形成性貧血、クームス陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む免疫性溶血性貧血、悪性貧血、赤芽球癆（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、多臓器損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、カールスマン症候群、グッドパスチュア症候群、ランバートイートン筋無力症症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、固形臓器移植拒否（高パネル反応性の抗体価のための前処置、組織のＩｇＡ沈澱物などを含む）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、水疱性類天疱瘡、天疱瘡（尋常性、落葉状を含むすべて）、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター症候群、全身強直性症候群、巨細胞動脈炎、免疫複合体腎炎、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発神経障害又はＩｇＭ媒介性神経障害、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病 （ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、自己免疫性睾丸炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫疾患、一次甲状腺機能低下；自己免疫甲状腺炎、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、亜急性甲状腺炎、特発性甲状腺機能低下、アジソン病、甲状腺機能亢進症、自己免疫多腺性症候群（または、多腺性内分泌障害症候群）、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ）とも呼称されるＩ型糖尿病、およびシーアンの症候群を含む自己免疫内分泌性疾患；自己免疫肝炎、リンパ系間質性肺炎（ＨＩＶ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン-バレー症候群、大血管性血管炎（リウマチ性多発筋痛症および巨細胞性（高安）動脈炎を含む）、中血管性血管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎を含む）、強直性脊椎炎、ベルジェ病（ＩｇＡネフロパシ）、急速進行性糸球体腎炎、原発性胆汁肝硬変、セリアックスプルー（グルテン腸疾患）、クリオグロブリン血症、ＡＬＳ、冠状動脈疾患が含まれる。
【０１０８】
Ｂ細胞悪性腫瘍には、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）を含むＣＤ２０陽性ホジキン病；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫；急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；毛様細胞白血病が含まれる。非ホジキンリンパ腫には、軽度の／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中程度の／濾胞性ＮＨＬ、中程度の拡散性ＮＨＬ、重度の免疫芽細胞ＮＨＬ、重度のリンパ芽球ＮＨＬ、重度の非正円形細胞でない小細胞性ＮＨＬ、バルキー疾患(bulky disease)性ＮＨＬ、形質細胞様リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症が含まれる。これら癌再発の治療も包含する。ＬＰＨＤは、放射線照射や化学療法にも関わらずたびたび再発するホジキン疾患のタイプであり、ＣＤ２０陽性悪性腫瘍細胞に特徴があるものである。ＣＬＬは白血病の主要な４タイプのうちの一つである。リンパ球と呼称される成熟したＢ細胞の癌であるＣＬＬは、血液、骨髄およびリンパ系組織での細胞の蓄積によって確認される。無痛性リンパ腫は、低成長性で難治性であり、多くの緩解と再発を繰り返して患者の平均生存率は６〜１０年となる。
特定の実施態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストとＣＤ２０結合抗体は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、一種の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、慢性関節リウマチおよび若年性慢性関節リウマチ、狼瘡腎炎を含む全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群および糸球体腎炎の治療に用いられる。
【０１０９】
Ｂ細胞枯渇の所望のレベルは疾患に依存するであろう。ＣＤ２０陽性癌の治療には、本発明の抗ＣＤ２０抗体の標的であるＢ細胞の枯渇を最大限にすることが望まれる。したがって、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞悪性腫瘍の治療には、Ｂ細胞を十分枯渇して、例えば腫瘍の成長（大きさ）、癌性細胞タイプの増殖、転移、特定の癌の他の兆候や症状をモニターすることによって当業者の医者によって評価できる疾患の進行を少なくとも防ぐことが望まれる。好ましくは、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも２か月、より好ましくは３か月、さらにより好ましくは４か月、より好ましくは５か月、さらにより好ましくは６か月以上の間、疾患の進行を防ぐために十分な程度である。さらにより好ましい実施態様では、Ｂ細胞の枯渇は、少なくとも６か月、より好ましくは９か月、より好ましくは１年、より好ましくは２年、より好ましくは３年、さらにより好ましくは５年以上緩解の時間を増やすのに十分な程度である。最も好ましい実施態様では、Ｂ細胞枯渇は十分に疾患を治癒する。好ましい実施態様では、癌患者のＢ細胞の枯渇は、治療の前の基本の値の少なくとも約７５％、およびより好ましくは８０％、８５％、９０％、９５％、９９％およびさらに１００％である。
自己免疫疾患の治療では、各個人の疾患および／または症状の重症度に応じて、ＣＤ２０結合抗体の用量を調節することによってＢ細胞の枯渇の程度を調節することが望ましい。したがって、Ｂ細胞の枯渇は完全にすべきではないかもしれない。あるいは、全Ｂ細胞の枯渇は初期治療で望まれるかもしれないが、続く治療では部分的な枯渇のみとなるように用量を調節してもよい。一実施態様では、Ｂ細胞枯渇は少なくとも２０％であり、すなわち治療前の基本の値と比較して８０％以下のＣＤ２０陽性Ｂ細胞が残っている。他の実施態様では、Ｂ細胞枯渇は２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％ないしそれ以上である。好ましくは、Ｂ細胞枯渇は、疾患の進行を停止させる程度、より好ましくは治療の元で特定の疾患の兆候や症状を緩解する程度、さらにより好ましくは疾患を治癒する程度である。
【０１１０】
リツキシマブを用いた治療法に関する文献には：Perotta及びAbuel 「Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab」 Abstract # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): p. 88B (1998)；Stashi等. 「Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura」 Blood 98(4):952-957 (2001)；Matthews, R. 「Medical Heretics」 New Scientist (7 April, 2001)；Leandro等. 「Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion」 Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002)；Leandro等. 「Lymphocyte depletion in thrumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response.  Arthritis and Rheumatism 44(9): S370 (2001)；Leandro等. 「An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus」, Arthritis & Rheumatism 46(1):2673-2677 (2002)；Edwards and Cambridge 「Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes」 Rhematology 40:205-211 (2001)；Edwards等. 「B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders」 Biochem. Soc. Trans. 30(4):824-828 (2002)；Edwards等. 「Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197 (2002)；Levine and Pestronk 「IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab」 Neurology 52: 1701-1704 (1999)；DeVita等. 「Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheum 46:2029-2033 (2002)；Hidashida等. 「Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab.」  Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; Ne Orleans, LA 2002；Tuscano, J. 「Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab」  Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orleans, LA 2002.が含まれる。
【０１１１】
治療的応用として、本発明の抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニスト組成物は、例えば化学療法剤、ホルモン、抗血管形成物質、放射性標識化合物、あるいは手術、寒冷療法および／または放射線療法と組み合わせて用いることができる。前述の治療法は、従来の治療法に続いて、従来の治療法の前ないしはその後の何れかの従来法の様式と組み合わせて投与することができる。抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニストは、治療的有効量の化学療法剤と共に投与するであろう。他の実施態様では、化学療法剤の活性や効果を亢進するために抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニストは化学療法と組み合わせて投与する。医師用卓上参考書（Physicians' Desk Reference）では、多種の癌の治療に用いられた化学療法剤の用量を開示している。治療的有効量である前述の化学療法剤の投与計画および用量は、治療する特定の癌、疾患の程度、および当分野の医師に知られた他の要因に依存し、医師により決定されうる。
本発明の組成物の投与後に治療前と比較して症状や他の適応基準に顕著な改善がみられる場合に、患者は、本発明の方法によってＢ細胞腫瘍ないしＢ細胞制御性自己免疫疾患が緩解したないしは成功裏に治療される。治療の効果は、本発明の組成物の投与後３−１０週間後に現れるかもしれない。各疾患の適応基準は適切な分野の医師に公知であろう。例えば、医師は治療した患者を、臨床学的に、ないしは疾患の血清学的証拠、例えば疾患の血清学的マーカ、Ｂ細胞数を含む完全血球数および血清イムノグロブリンレベルについてモニターすることができる。ＩｇＧおよびＩｇＭの血清レベルはＢＲ３-Ｆｃ処置マウスで減少する。ＢＲ３-Ｆｃないし抗ＣＤ２０抗体、あるいはその両方の処置に応答するヒト患者の血清ＩｇＧおよびＩｇＭレベルも同様に減少を示すことが予測される。患者は以下の一以上の観察可能なおよび／または測定可能な減少あるいは消失を示すかもしれない：癌細胞数の減少ないし癌細胞の消失；腫瘍サイズの減少；癌細胞の器官への浸潤抑制（すなわちある程度の減退および好ましくは停止）；腫瘍転移の抑制（すなわちある程度の減退および好ましくは停止）；ある程度の腫瘍成長の抑制；および／または、特定の癌に伴う一以上の症状のある程度の除去；罹患率および死亡率の減少、および生活の質の改善。好ましくは、本発明の組成物の投与後、本発明の方法によって治療する前に得た特定の症状の基準値ないしは標準より少なくとも２０％、より好ましくは２５−３０％、さらにより好ましくは３０−３５％、最も好ましくは４０％およびそれ以上の改善がある。
【０１１２】
腫瘍治療の効果ないしは成功を評価するパラメータは適切な疾患で医師に公知であろう。一般的に、医師は特定の疾患の兆候や症状の減少を求めるであろう。パラメータには、疾患が進行する平均的時間、緩解および疾患安定の時間が含まれる。Ｂ細胞腫瘍の測定可能な判定基準には、例として疾患進行時間、全体的および／または進行しない生存継続時間の延長が含まれる。白血病の場合には、緩解の程度を決定するために骨髄生検が行われうる。完全な緩解は、治療後３０日の患者骨髄に見られる全細胞のうちの５％未満が白血球で構成されていることによって決定することができる。
以下の文献は、リンパ腫およびＣＬＬ、それらの診断、治療、および治療の有効性を測定するための標準的な医学的手法について記載している。Canellos GP, Lister, TA, Sklar JL: The Lymphomas. W.B.Saunders Company, Philadelphia, 1998；van Besien KおよびCabanillas, F: Clinical Manifestations, Staging and Treatment of Non-Hodgkin's Lymphoma, 第70章, pp 1293-1338, : Hematology, Basic Principles and Practice, 第3版. Hoffman 等. (編集). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000；およびRai, KおよびPatel, D:Chronic Lymphocytic Leukemia, 第72章, pp 1350-1362, : Hematology, Basic Principles and Practice, 第3版. Hoffman 等. (編集). Churchill Livingstone, Philadelphia, 2000。
自己免疫性ないしは自己免疫関連疾患の治療の有効性ないしは成功を評価するためのパラメータは適切な疾患で医師に知られているであろう。一般的に、医師は特定の疾患の兆候や症状の減退を求めるであろう。例として以下に挙げる。
【０１１３】
リウマチ様関節炎（RA）は、病因が未知である自己免疫不全である。大部分のRA患者は疾患の慢性経過に悩まされ、治療を行っても、結果として進行性関節破壊、奇形、障害及びさらに早死になりうる。ＲＡ治療の目的は、関節損傷の予防又は制御、機能の損失を予防すること、及び、疼痛を軽減することである。通常、ＲＡの初期治療は、以下の薬剤の一つ以上の投与を伴う：非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、糖質コルチコイド（関節注入による）及び低服用プレドニゾン。「Guidelines for the management of rheumatoid arthritis」 Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346 (February, 2002)を参照。新しくＲＡと診断された大多数の患者は、診断から３ヵ月以内に疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）により治療を始める。一般的に、ＲＡで用いられるＤＭＡＲＤは、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、メトトレキサート、レフルノミド、エタネルセプト（etanercept）、インフリキシマブ（経口及び皮下メトトレキサートに加えて）、アザチオプリン、D-ペニシラミン、ゴールド（Gold）（経口）、ゴールド（筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリン、ブドウ球菌プロテインＡ免疫吸着である。
ＲＡの間、体内で腫瘍壊死因子α（TNFα）を産生するので、ＴＮＦαインヒビターがその疾患の治療に使用されていた。エタネルセプト（ENBREL（登録商標））は、活性なＲＡの治療のための米国で承認されている注射可能な薬剤である。エタネルセプトはＴＮＦαと結合して及び関節及び血液から大部分のＴＮＦαを取り除くように働き、それによって、ＴＮＦαが炎症及び慢性関節リウマチの他の症状を促進するのを防止する。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結しているヒトの７５ｋＤ（ｐ７５）腫瘍壊死因子レセプタ（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる「イムノアドヘシン」融合タンパク質である。インフリキシマブ（商品名REMICADE（登録商標）として販売）は、ＲＡ及びクローン病を治療するために処方される免疫抑制剤である。インフリキシマブは、ＴＮＦαと結合するキメラモノクローナル抗体であって、炎症をもたらすＴＮＦαを標的として結合することによって身体の炎症を軽減する。
【０１１４】
既にＤ２Ｅ７として知られているアダリムマブ（adalimumab）（ＨＵＭＩＲＡＴＭ、Abbott Laboratories）は、ＴＮＦαと結合するヒトモノクローナル抗体であり、一以上の典型的な疾患を変更するＤＭＡＲＤに十分に反応を示さない中程度〜重度の活性なＲＡを有する成人患者の兆候及び症状を軽減し、構造的障害の進行を抑制することで認可されている。
抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニストを投与することによるリウマチ様関節炎の治療は、ＲＡのための前述の一以上の薬剤を用いた治療と組み合わせて行うことができる。
リウマチ様関節炎では、例えば治療の進行状況の測定手段に、腫大して弱い関節の数や朝のこわばりの長さがある。患者は、手と足の関節がどの程度腐食しているかについて、Ｘ線やシャープスコア(Sharp score)として知られるスコアシステムを用いて検査するのがよい。他のスコアシステムは、治療法に対する応答性を評価するためのアメリカリウマチ学会判定基準に基づくものである。
【０１１５】
ＲＡの治療効果を評価するある方法は、American College of Rheumatology (ACR)診断基準に基づくものであり、圧痛および腫大した関節の改善の割合を測定するものである。ＲＡ患者は、無抗体治療（例として、治療前の基準）またはプラセボ治療と比較して例としてＡＣＲ２０（２０パーセントの改善）でスコア付けをする。抗体治療の効果を評価する他の方法は、Ｘ線画像、例として骨の侵食および関節腔の狭小化等の構造的傷害のスコア付けに用いられる鋭Ｘ線スコアを含む。また、患者は、治療期間中または治療後にHealth Assessment Questionnaire [HAQ]スコア、AIMSスコア、SF-36に基づいて能力障害の予防または改善の評価をすることができる。ＡＣＲ２０診断基準は、圧痛（痛み）関節数と腫大関節数の両方に２０％の改善があり、５つの追加測定のうち少なくとも３つに２０％の改善があることを含む。
１．視覚的類似尺度（ＶＡＳ）による患者の痛み評価
２．疾患活動性の患者の全体評価（ＶＡＳ）
３．疾患活動性の医師の全体評価（ＶＡＳ）
４．Health Assessment Questionnaireにより測定した能力障害の患者の自己評価、および
５．急性期反応、ＣＲＰまたはＥＳＲ
ＡＣＲ５０および７０も同様に定義する。好ましくは本発明のＣＤ２０結合抗体を少なくともＡＣＲ２０のスコア、好ましくは少なくともＡＣＲ３０、より好ましくは少なくともＡＣＲ５０、さらにより好ましくは少なくともＡＣＲ７０、最も好ましくは少なくともＡＣＲ７５より高いスコアに達する用量を患者に投与する。
【０１１６】
乾癬性関節炎は特異的で明瞭なＸ線撮影像的特徴を有する。乾癬性関節炎の関節侵食および関節腔狭小化も同様にシャープ(sharp)スコアにより評価しうる。ここに記載のヒト化ＣＤ２０結合抗体は関節傷害の予防だけでなく疾患の兆候および疾病の症状の減弱に利用可能である。
さらに、本発明の他の側面では、本発明のヒト化ＣＤ２０結合抗体の治療的有効量をＳＬＥ患者に投与することによるループスまたはＳＬＥの治療方法である。ＳＬＥＤＡＩスコアでは疾患の活動性を数量で表す。ＳＬＥＤＡＩは疾患活動性に相関することが知られている２４の臨床および治験の荷重指数であり、０−１０３の数的範囲である。Bryan Gescuk & John Davis, “Novel therapeutic agent for systemic lupus erythematosus” in Current Opinion in Rheumatology 2002, 14:515-521を参照。二本鎖ＤＮＡに対する抗体は、血清クレアチニン、尿蛋白、または尿中の血液で顕著に生成され増加することで定義される腎性発赤および他のループスの症状を引き起こすと信じられている。代わりに、または加えて、抗核抗体および二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルで患者をモニターする。ＳＬＥ治療は高用量の副腎皮質ステロイドおよび／またはシクロホスファミド(HDCC)を含む。
【０１１７】
脊椎関節症は関節疾患のグループであり、硬直性脊椎炎、乾癬性関節炎、クローン病を含む。治療成果は、確認された患者および医師の全体的評価測定方法によって決定しうる。
全身性エリテマトーデスの患者は、抗核抗体および二本鎖ＤＮＡに対する抗体のレベルをモニターすることができる。
様々な医薬が乾癬治療に用いられる；疾患重症度に関連して治療が異なる。より軽度な感染患者は一般的に局所治療、例として局所ステロイド、アンスラリン(anthralin)、カルシポトリエン(calcipotriene)、クロベタゾール(clobetasol)、およびタザロテン(tazarotene)が、全身的（メトトレキセート、レチノイド、シクロスポリン、ＰＵＶＡおよびＵＶＢ）治療を行うと思われる中度および重症乾癬患者では疾患の管理に有効である。タールも利用される。これらの治療は、安全性の考慮、時間のかかる投与計画、または不便な治療過程を複合して有する。さらに、いくつかは高価な設備および設置のための場所を必要とする。全身性医薬は、高血圧、高脂血症、骨髄抑制、肝疾患、腎疾患、および消化器系不調を含む様々な副作用を引き起こしうる。また、光線療法の使用は皮膚癌の発症を増加させうる。局所療法の使用に伴う不便および不快感に加え、光線療法および全身性治療は患者を処置および非処置の周期におき、その副作用のために生涯曝露をモニターする必要がある。
【０１１８】
乾癬の治療効果は、医師の包括的評価（ＰＧＡ）変化、および乾癬領域および重症度指数（ＰＡＳＩ）スコア、乾癬症状評価（ＰＳＡ）を含む臨床兆候および疾患の症状の変化をモニターし、基礎となる症状と比較することによって評価する。特定の時点で経験した掻痒の程度を表すために用いられる視覚的類似尺度の処置を通して定期的に患者を測定する。
【０１１９】
用量
当業の医師によく知られた治療効能および用量に関する因子次第で、毒素および副作用を最小限にする一方で治療効能を有効にする用量で本発明のＢＬｙＳアンタゴニストとＣＤ２０結合抗体を投与するであろう。Ｂ細胞腫瘍、例として非ホジキンリンパ腫患者の治療のための特定の実施態様では、本発明の抗ＣＤ２０抗体は１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇ体重量、好ましくは２．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇの用量で患者に投与するであろう。好ましい実施態様では、抗ＣＤ２０抗体は、１０ｍｇ／ｋｇないし３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与するであろう。ＮＨＬの治療のある用量投与計画では、３７５ｍｇ／ｍ２の抗ＣＤ２０抗体を２−４用量で隔週に、ないし治療の初めの１週間は抗体組成物を一用量で投与し、２週間の間隔の後、同量の第二用量抗体を投与する。一般に、ＮＨＬ患者は１年に１度リンパ腫の再発によってこのような治療を受けるが、このような治療は繰り返される。ＮＨＬの治療では、ＢＬｙＳアンタゴニスト療法に加えて抗ＣＤ２０抗体をＣＨＯＰなどの化学療法と組み合わせることができる。他の実施態様では、ＣＬＬやＳＬＬなどのＢ細胞腫瘍の治療では、ＢＲ３−Ｆｃ投与の前または後に週当たり３７５ｍｇ／ｍ２のリツキサンを４週間患者に投与してもよい。再発性のＣＬＬ、ＣＬＬには、例えばフルダラビンおよびシトキサン(cytoxan)などの化学療法と組み合わせて、抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニストにて治療することができる。
リウマチ様関節炎の一実施態様では、キメラ抗体であるリツキサンＴＭを一用量当たり５００ｍｇで隔週、全２用量で投与する。ヒト化抗ＣＤ２０抗体、例えばｈｕ２Ｈ７ｖ．１６はここで開示したｈｕ２Ｈ７の任意の他の変異体を一用量当たり５００ｍｇ以下で、例えば一用量当たり約２００−５００ｍｇ、約２５０ｍｇ−４５０ｍｇ、あるいは３００−４００ｍｇで隔週あるいは毎３週ごとに２−４用量で投与することができる。
【０１２０】
ＢＲ３−Ｆｃは、０．５ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇから５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１．５ｍｇ／ｋｇから２．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与することができる。一実施態様では、ＢＲ３−Ｆｃは、治療の第１日目から第１２日目まで隔日５ｍｇ／ｋｇで投与することができる。また、毎２−３日ごとに約２−５ｍｇ／ｋｇで全２−５用量で投与することも考えられる。
本発明の治療方法は、抗ＣＤ２０抗体とＢＬｙＳアンタゴニスト（ここでは両方とも薬剤を意味する）を同時におよび連続して投与することを含む。連続的投与では、薬剤は何れの投与順番でもよい、すなわち初めにＢＬｙＳアンタゴニストでついで抗ＣＤ２０抗体を投与する。患者は一薬剤で治療し、一薬剤での治療前に効果についてモニターする。例えば、ＢＬｙＳアンタゴニストにより部分的な反応を生じた場合、完全に反応が起こるように続いて抗ＣＤ２０抗体で治療することができる。また逆の場合も同様である。イムノアドヘシンであるＢＲ３−Ｆｃは完全長の抗ＣＤ２０抗体と比較して半減期が短い。リウマチ様関節炎などの自己免疫疾患の治療では、抗ＣＤ２０抗体がリツキサンでＢＬｙＳアンタゴニストがＢＲ３−Ｆｃである場合、好ましい実施態様では、必要とする患者にリツキサンでの治療前にＢＲ３−Ｆｃを与える。あるいは、初めに患者に両方の薬剤を投与し、続く用量では一方のみあるいは他の薬剤とする。
【０１２１】
患者を薬剤耐性に順応させるためおよび／または、治療用化合物の初回投与や持続投与から生じる注入関連症状などの逆効果の発生を減らすために、必要とする哺乳動物に一又は両薬剤の初回ないし開始用量を投与し、ついで少なくとも第二の治療的有効量の一又は両薬剤を投与する、このとき第二およびそれに続く用量は初回用量より多い。初回用量により哺乳動物に用量が多い第二治療用量に耐性を与える。この方法では、哺乳動物は初回投与量よりも高い用量の治療用化合物に耐性ができる。「順化用量」とは、治療用化合物の投与に伴う初回投与逆副作用の頻度や重症度を減弱ないし減少させる用量である。順化用量は、治療的用量、副治療的用量、症状用量、ないし副症状用量でもよい。治療的用量は、患者に治療的効果を示す用量であり、副治療的用量は治療する患者に治療的効果を示さない用量である。症状用量は投与に少なくとも一の逆効果を起こす用量であり、副症状用量は逆効果を起こさない用量である。いくつかの逆効果は、発熱、頭痛、吐き気、嘔吐、呼吸困難、筋肉痛および悪寒である。
【０１２２】
投与方法
ＢＬｙＳアンタゴニストと抗ＣＤ２０抗体は公知の方法で、例としてボーラスなどの静脈内投与、または一定期間中の継続注入、皮下的、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、動脈血管内、滑膜内、クモ膜下腔内、または吸入、の方法でヒト患者に投与される。一般的に、抗ＣＤ２０抗体は、静脈内ないし皮下投与される。薬剤は同じないし異なる経路で投与することができる。
【０１２３】
製造品およびキット
本発明の他の実施態様は、先に開示したＢ細胞ベースの悪性腫瘍ないしＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療に有用なＢＬｙＳアンタゴニストと抗ＣＤ２０抗体を含む製造品である。特定の実施態様では、製造品は、非ホジキンリンパ腫の治療のための配列番号２に示すＢＲ３−Ｆｃとｈｕ２Ｈ７ｖ．１６抗体を含む。
製造品は、少なくとも一の容器と容器上ないし容器に付属するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、症状の治療に有効な本発明の組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも一の活性剤は、リツキサンＴＭないしｈｕ２Ｈ７ｖ．１６などの本発明のＣＤ２０結合抗体であり、他の活性作用剤はＢＲ３−ＦｃなどのＢＬｙＳアンタゴニストである。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が特定の症状、例として非ホジキンリンパ腫ないしリウマチ様関節炎の治療のために使用されることを示している。さらに、ラベルまたはパッケージ挿入物は抗体組成物の患者への投与についての説明を含むであろう。加えて、さらに製造品は薬剤的に受容可能なバッファ、例として注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝液食塩水、リンガー液およびデキストラン溶液を収容する第二容器を含んでもよい。さらに、他のバッファ、希釈剤、フィルター、針およびシリンジなどの商業および使用者の立場から望ましい他の材料を内包してもよい。
【０１２４】
キットもまた様々な目的、例としてＢ細胞死滅分析に有用である。製造品として、キットは容器および容器上または容器に付随したラベルないしパッケージ挿入物を含む。容器は本発明の少なくとも一の抗ＣＤ２０抗体と一のＢＬｙＳアンタゴニストを含む組成物を有する。付加的容器には、例として希釈剤および緩衝液、対照抗体を包含しうる。ラベルまたはパッケージ挿入物は組成物の解説、並びにインビトロまたは診断的使用を意図した指示書も含みうる。
【０１２５】
例示的実施例
実施例１
ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体の開発
６匹のBalb／cマウス、３匹のLewisラット(Charles River Laboratories, Hollister, CA)および３匹のArmenianハムスター(Cytogen Research and Development, Inc., Boston, MA)を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で過渡的にマウスＣＤ２０(Genentech, Inc., South San Francisco, CA)を発現するアデノウイルス感染ヒト２９３細胞で過剰免疫化した。大腸菌内で内在性レベルのマウスＣＤ２０と組み換えｍＣＤ２０を発現するマウス細胞からなる前融合促進物質(pre-fusion boosts)(Genentech, Inc., South San Francisco, CA)を融合の３日前に投与した。すべての動物由来のＢ細胞を、既に記載されている方法(KohlerおよびMilstein, 1975；Hongo等., 1995)と類似の変更プロトコールを用いてマウス骨髄腫細胞(X63.Ag8.653；アメリカ培養細胞系統保存機関、Manassas, VA)と融合した。
１０−１４日後、マウスとハムスター融合体の上清を回収し、直接的酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）にて抗マウスＣＤ２０と抗ヒトＣＤ２０抗体産生についてスクリーニングした。ｍＣＤ２０ ＥＬＩＳＡスクリーニングによりハムスター融合体から５９のポジティブハイブリドーマが（ｈＣＤ２０との２交差反応）、マウス融合体から１のポジティブハイブリドーマ（ｈＣＤ２０との２交差反応）が同定された。限定希釈によるサブクローニング後に高い免疫結合を示すポジティブクローンを、Ｍａｂのインビボ産生のためのPristane-初回抗原刺激マウス(FreundおよびBlair, 1982)への注入か、インビトロでの培養の何れかを行った。腹水液および／または上清を回収し、既に記載されている(Hongo 等., 1995)ような親和性クロマトグラフィ(Pharmacia 急速タンパク質液性クロマトグラフィ[FPLC]；Pharmacia, Uppsala, Sweden)ないしは、既に記載されているプロトコールの変更法を用いて精製した。精製した抗体調製物を濾過滅菌して（０．２μｍ孔径；Nalgene, Rochester NY）、ＰＢＳにて４℃で保存した。
【０１２６】
免疫血清の評価のための直接ＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート(NUNC)を１００μｌ／ウェルのマウスないしヒトＣＤ２０(１μｇ／ｍｌ；Genentech, Inc., South San Francisco, CA)、０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液,ｐＨ９．６にてコートした。コートしたプレートをＥＬＩＳＡ洗浄用緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて３度洗浄し、０．５％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(PBS/BSA/T20)にて少なくとも１時間ブロックした。ついで、ブロック用緩衝液を除去して、１００μｌの希釈した試料と対照を加え、室温にて１時間インキュベートした。ついで、プレートを洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ抱合種特異的抗ＩｇＧ抱合体(Sigma, St. Louis, MOまたはICN Cappel, Durham, NC)を添加し（１００μｌ／ウェル）、室温にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄して、テトラメチルベンジジン基質(BioFX Laboratories, Owings Mills, MD)と共に５−１０分インキュベートした後、停止用溶液(１００μｌ／ウェル；BioFX Laboratories)を添加した。その後、プレートを自動プレートリーダー(EL808, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT)にて読み込んだ。
【０１２７】
参考文献：
Hongo, J.S., Mora-Worms, M., Lucas, C.およびFendly, B.M.: Development and characterization of murine monoclonal antibodies to the latency-associated peptide of transforming growth factor β1. Hybridoma 1995; 14:253-260.
Kohler, G.およびMilstein, C.: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256: 495-497.
Freund YR およびBlair PB: Depression of natural killer activity and mitogen responsiveness in mice treated with pristane. J Immunol 1982; 129:2826-2830.
【０１２８】
実施例２
２Ｈ７抗ＣＤ２０マウスモノクローナル抗体のヒト化
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体の２Ｈ７（ここではマウスをｍとしてｍ２Ｈ７とも呼ぶ）のヒト化を一連の部位特異的突然変異誘発工程で実施した。２Ｈ７のＣＤＲ残基は、マウス２Ｈ７可変ドメインのアミノ酸配列（米国特許第５８４６８１８号に開示）を既知の抗体の配列と比較することにより同定された（Kabat等, Sequences of proteins of immunological interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。軽鎖と重鎖のＣＤＲ領域は配列高頻度可変性（上掲のKabat等）に基づいて定まり、図１２及び図１３にそれぞれ示す。合成オリゴヌクレオチド（表２）を用いて、部位特異的突然変異誘発（Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. 82:488-492 (1985)）を使用して、プラスミドｐＶＸ４に含まれるコンセンサス配列ＶｋＩ,ＶＨＩＩＩ（ＶＬカッパサブグループＩ，ＶＨサブグループＩＩＩ）に対応する完全ヒトＦａｂフレームワーク中に６つ全てのマウス２Ｈ７ＣＤＲ領域を導入した。ファージミドｐＶＸ４を突然変異誘発並びに大腸菌中でのＦ(ａｂ)の発現に使用した。ｐＢ０４７５の誘導体（Cunningham等, Science 243: 1330-1336 (1989)）であるファージミドｐｂ０７２０に基づいて、ｐＶＸ４は、ヒト化コンセンサスκ-サブグループＩ軽鎖（ＶＬκＩ-ＣＬ）とヒト化コンセンサスＩＩＩ重鎖（ＶＨＩＩＩ-ＣＨ１）抗ＩＦＮ-α（インターフェロンα）抗体をコードするＤＮＡ断片を含む。ｐＶＸ４はまた共に別の過去に開示されたｐＵＣ１１９ベースのプラスミドｐＡＫ２（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992)）から誘導されたアルカリホスファターゼプロモーター及びシャイン-ダルガーノ配列を有している。独特のＳｐｅｌ制限部位をＦ(ａｂ)軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡ間に導入した。抗ＩＦＮ-α重鎖及び軽鎖双方の最初の２３のアミノ酸はＳｔＩＩ分泌シグナル配列である（Chang等, Gene 55: 189-196 (1987)）。  
【０１２９】
２Ｈ７のＣＤＲスワップ型（２Ｈ７．ｖ２）を構築するために、部位特異的突然変異誘発をｐＶＸ４のデオキシウリジン含有鋳型で実施した；抗ＩＦＮ-αの６つ全てのＣＤＲがマウス２Ｈ７ＣＤＲに変化した。得られた分子をヒト化２Ｈ７型２（２Ｈ７.ｖ２）又は２Ｈ７の「ＣＤＲスワップ型」と呼ぶ；これは図１２及び１３に示されるコンセンサスヒトＦＲ残基を有するｍ２Ｈ７ＣＤＲ残基を有する。ヒト化２Ｈ７.ｖ２は更なるヒト化に用いた。
表２はＨ及びＬ鎖においてマウス２Ｈ７（ｍ２Ｈ７）ＣＤＲのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、ＣＤＲ-Ｈ１オリゴヌクレオチドを使用してｍ２Ｈ７のＨ鎖を再作製した。ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３はＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ意味する；同様に、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３はＬ鎖ＣＤＲのそれぞれを意味する。ＣＤＲ-Ｈ２における置換はＣＤＲ-Ｈ２ＡとＣＤＲ-Ｈ２Ｂの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表２．ｐＶＸ４のヒトフレームワーク中へのマウス２Ｈ７ＣＤＲのＣＤＲスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
2007526220.tif 000004
【０１３０】
ヒトＶｋＩ,ＶＨＩＩＩコンセンサスフレームワーク（図１２及び１３）及び過去のヒト化抗体（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)）とのマウス２Ｈ７フレームワーク残基の配列比較に基づいて、幾つかのフレームワーク変異を部位特異的突然変異誘発によって２Ｈ７.ｖ２Ｆａｂコンストラクト中に導入した。これらの変異により、ＣＤＲコンフォメーション又は抗原接触に影響を及ぼすかも知れない部位において、あるヒトコンセンサスフレームワーク残基がマウス２Ｈ７フレームワークに見出されたものに変化した。型３はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）を、型４はＶＨ（Ｒ７１Ｖ）を、型５はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ）を、型６はＶＨ（Ｒ７１Ｖ，Ｎ７３Ｋ）及びＶＬ（Ｌ４６Ｐ，Ｌ４７Ｗ）を含んでいた。
ｍ２Ｈ７抗体のヒト化及びキメラＦａｂ型を次のようにして大腸菌中で発現させ、精製した。二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの調製のためにプラスミドを大腸菌株ＸＬ-１ブルー（Stratagene, San Diego, CA）中に形質転換した。各変異体に対して、軽鎖と重鎖の双方をジデオキシヌクレオチド法（Sequenase, U.S. Biochemical Corp.）を使用して完全に配列決定した。プラスミドを、ＭＭ２９４の誘導体である大腸菌株１６Ｃ９に形質転換し、５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含むＬＢプレート上に蒔き、単一のコロニーをタンパク質発現のために選択した。その単一のコロニーを３７℃で５−８時間、５ｍｌのＬＢ-１００μｇ／ｍｌカルベニシリン中で成長させた。５ｍｌの培養物を５００ｍｌのＡＰ５-１００μｇ／ｍｌカルベニシリンに添加して、３７℃で４Ｌの邪魔板振盪フラスコ中で１６時間成長させた。ＡＰ５培地は１．５ｇのグルコース、１１．０のHycaseＳＦ、０．６ｇの酵母エキス（保証付き）、０．１９ｇの無水ＭｇＳＯ４、１．０７ｇのＮＨ４Ｃｌ、３．７３ｇのＫＣｌ、１．２ｇのＮａＣｌ、１２０ｍｌの１Ｍトリエタノールアミン、ｐＨ７．４からなり、１Ｌの水に加えた後、０．１μｍのSealkeenフィルターを通して滅菌濾過した。
【０１３１】
細胞を、３０００×ｇにて１Lの遠心分離瓶（Nalgene）で遠心分離によって収集し、上清を除去した。１時間の凍結後、ペレットを２５ｍｌの非放射性１０ｍＭ ＭＥＳ-１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０（バッファーＡ）中に再懸濁させた。２５０μｌの０．１Ｍ ＰＭＳＦ（シグマ）を添加してタンパク質分解を阻止し、３．５ｍｌの原液１０ｍｇ／ｍｌのニワトリの卵の白色リゾチーム（シグマ）を添加して細菌細胞壁の溶解を補助した。氷上で１時間、穏やかに振盪した後、試料を４００００ｘｇで１５分、遠心分離した。上清をバッファーＡを用いて５０ｍｌにし、バッファーＡで平衡にした２ｍｌのＤＥＡＥカラムに充填した。ついで、バッファーＡで平衡にしたプロテインＧセファロースＣＬ-４Ｂ（ファルマシア）カラム（０．５ｍｌ床容積）に流通させた。カラムを１０ｍｌのバッファーＡで洗浄し、１．２５ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ８．０に入れた３ｍｌの０．３Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させた。ついで、Ｆ(ａｂ)をセントリコン-３０（アミコン）を使用してＰＢＳ中にバッファー交換し、０．５ｍｌの最終容積まで濃縮した。全てのＦ(ａｂ)のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを実施して純度を確保し、各変異体の分子量をエレクトロスプレー質量分析法によって証明した。
【０１３２】
完全長ＩｇＧの発現のためのプラスミドは、キメラＦａｂのＶＬ及びＶＨドメイン並びにｈｕ２Ｈ７抗体のヒト化Ｆａｂを、哺乳動物細胞の発現のための過去に記載されたｐＲＫベクター（Gorman等, DNA Prot. Eng. Tech. 2:3-10 (1990)）中にサブクローニングすることによって構築した。簡単に述べると、各ＦａｂコンストラクトをＥｃｏＲＶ及びＢｌｐＩを用いて消化させてＶＬ断片を切除し、これを、完全な軽鎖（ＶＬ-ＣＬドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ１のＥｃｏＲＶ／ＢｌｐＩ部位にクローニングした。また、各ＦａｂコンストラクトをＰｖｕＩＩ及びＡｐａＩで消化させてＶＨ断片を切除し、これを、完全な重鎖（ＶＨ-ＣＨ１-ＣＨ２-ＣＨ３ドメイン）の発現のためにプラスミドｐＤＲ２のＰｖｕＩＩ／ＡｐａＩ部位中にクローニングした。各ＩｇＧ変異体に対して、軽鎖発現プラスミドと重鎖発現プラスミドをアデノウイルス形質転換ヒト胎児腎臓細胞株２９３（Graham等, J. Gen. Virol., 36:59-74, (1977)）中に同時形質移入することによって、一過性トランスフェクションを実施した。簡単に述べると、２９３細胞をトランスフェクションの前の日に分裂させ、血清含有培地に蒔いた。次の日に、リン酸カルシウム沈殿物として調製した二本鎖ＤＮＡと、続いてｐＡｄＶＡｎｔａｇｅＴＭＤＮＡ（Promega, Madison, WI）を添加し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。細胞を無血清培地で培養し４日後に収集した。抗体を、プロテインＡ-セファロースＣＬ-４Ｂを使用して培養上清から精製した後、バッファーを１０ｍＭコハク酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に交換し、セントリコン-１０（アミコン）を使用して濃縮した。タンパク質濃度は定量アミノ酸分析法によって決定した。
【０１３３】
実施例３
この実施例は、ヒトＣＤ２０  ＢＡＣトランスジェニック（Ｔｇ）マウスの作製および、ｈＣＤ２０＋マウスでの抗ＣＤ２０抗体又はＢＬｙＳアンタゴニスト単独の効果を研究するための実験を示す。
ヒトのＣＤ２０トランスジェニックマウスは、ヒトＣＤ２０  ＢＡＣ  ＤＮＡ (Invitrogen, Carlsbad, CA)から作製した。マウスはヒトＣＤ２０発現のＦＡＣＳ分析に基づいてスクリーニングした。図１４のＦＡＣＳプロット線からわかるように、導入遺伝子に関して半接合（Ｔｇ＋／−）およびホモ接合（Ｔｇ＋／＋）マウスは、Ｂ２２０＋Ｂ細胞上でヒトＣＤ２０を発現する。図１５は、Ｂ細胞分化および成熟の間の様々な細胞表面マーカー（ＣＤ４３、ＩｇＭ、ＩｇＤ）の発現を示す。Ｔｇ＋マウスでは、ｈＣＤ２０は、ｐｒｅ-Ｂおよび未成熟Ｂ細胞上、および主に成熟したＢ細胞上で発現する。Ｔｇ＋マウスは、骨髄、脾臓、腸間膜ＬＮおよびパイエル板のＢ細胞でのヒトＣＤ２０発現についてスクリーニングした；結果は図１６−１９に示す。Ｂ２２０およびＣＤ４３上での細胞のゲーティングによって、多種のＢ細胞集団が描写される。ついで、図２０の模式図で概説されるように、Ｂ細胞に対する効果を見るために、Ｔｇ＋マウスを、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（１ｍｇ総量＝５０ｍｇ／ｋｇ、７０ｋｇの男性では３．５ｍｇに相当）で処理した。ＦＡＣＳ分析は、末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄およびパイエル板について行った。抗ＣＤ２０ｍＡｂの血清レベルをモニターした。マウスでのＢ細胞枯渇は、抗ＣＤ２０抗体を用いた治療の３−４日以内に生じる。理論に基づくものではないが、Ｂ細胞死は、ＡＤＣＣ又はアポトーシスあるいはその両方が関与しているようである。抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（ｍ２Ｈ７）単独でＴｇ＋マウスを処置すると、末梢血でのＢ細胞、成熟した周辺リンパ節Ｂ細胞、脾臓でのＴ２および濾胞性Ｂ細胞の枯渇が生じる（図２１−２４を参照）。しかしながら、特定のＢ細胞サブセットは、細胞表面上での抗ＣＤ２０抗体が非常に多く、適度に飽和しているレベルであるにもかかわらず、抗ＣＤ２０抗体による殺傷に抵抗すると思われた。これらの抵抗性Ｂ細胞は、脾臓（図２３）の辺縁帯Ｂ細胞および、パイエル板（図２５）および脾臓（図２７）の胚中心Ｂ細胞である。ある実験（図２７）では、マウスに、第１日目に初回用量の１００μｇの抗ＣＤ２０ｍＡｂを注射し、その後、第３日目に２回目の１００μｇ用量を投与した（５０μｇの単回用量がＢ細胞の飽和に十分であったようである）；Ｔ２／濾胞性Ｂ細胞は枯渇したが、パイエル板由来の胚中心Ｂ細胞は抗ＣＤ２０ｍＡｂとの結合を示し、殺傷に対して抵抗性を示した。
【０１３４】
抗ＣＤ２０抗体治療に続いてＢ細胞の回復が起こった。第１日目にマウスに抗体を投与した。図２６は、抗体治療６日後には、末梢血でＢ細胞が検出されなかったことを示す。第６週に、抗体のクリアランスに応じて、ｈＣＤ２０＋細胞は検出され始め、第１４週までにＢ細胞は正常レベルに回復したと思われる。回復は、ＣＤ２０＋成熟Ｂ細胞に発達するＣＤ２０を発現しない前駆Ｂ細胞から起こる。
図２７は、短期間の（単回注射）抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療に対して脾臓胚中心Ｂ細胞の抵抗性を表すＦＡＣＳプロット線を示す。脾臓の胚中心を誘導するために、マウスを免疫化しないものと、第１日目にヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を腹腔内注射することによって免疫化するものとに分けた。胚中心は第７日目に出現した。第８日目に、マウス一方のグループを、ヒトＣＤ２０に対するｍ２Ｈ７  ｍＡｂで処置した。マウスの対照群はｍＩｇＧ２ａ同基準標本対照抗体で処置した。マウス由来の脾臓細胞は第１２日目に分析した。ＰＮＡ（ピーナッツ凝集素）は胚中心を染色する。免疫化マウスの脾臓が０．３％ＰＮＡの染色細胞を示すのに対して、ＳＲＢＣで免疫化しなかったマウスの脾臓では胚中心細胞は検出されなかった。Ｔ２／濾胞性Ｂ細胞が抗ＣＤ２０抗体処置によって枯渇する一方、脾臓の辺縁中心のＢ細胞は抗体に対して耐性を示す。
次に、Ｂ細胞枯渇の際に、マウスがＴ非依存性免疫応答を起こすことができるかどうかについて試験した。マウスは、第０日目にｍ２Ｈ７又は同基準標本対照抗体ｍＩｇＧ２ａで処置した。第３−７日目にＢ細胞枯渇が生じた。第７日目に、多糖類への反応を誘発するために、マウスに、肺炎連鎖球菌ＩＶを静脈内注射した。Ｔ細胞非依存性応答は第１１日目に上昇した。図２８に示す結果は、抗ＣＤ２０（２Ｈ７又はリツキサン）での治療が脾臓の辺縁帯および胚中心由来のＢ細胞応答に影響を及ぼさない。すなわち、枯渇しないＭＺおよびＢ１Ｂ細胞がＴ非依存性抗原に対して保護されることを示唆する。このデータは、抗ＣＤ２０ｍＡｂでの治療にもかかわらず、体液性免疫-特異的にＴ非依存性Ｂ細胞応答（この場合）が維持されることを示唆する。
【０１３５】
実施例４
この実施例は、Ｂ細胞変調／枯渇のための抗ＣＤ２０ｍＡｂおよびＢＬｙｓアンタゴニスト治療の間での相乗効果を試験する。
ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＡＬＬ−１（ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー）は、未成熟のＴ２、ＦＯおよびＭＺ  Ｂ細胞の生存および成熟において重要な役割を果たし、自己応答性Ｂ細胞の生存を競合的に亢進する(S. Mandala 等., Science 296, 346-9 (2002)；F. Mackay, P. Schneider, P. Rennert, J. Browning, Annu Rev Immunol 21, 231-64 (2003)；P. A. Moore 等., Science 285, 260-3 (1999))。マウスでＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＡＬＬ-１の可溶形態の過剰発現が起こると、Ｂ細胞過形成、高ガンマグロブリン血症および自己免疫ループス様症候群となる。(S. A. Marsters 等., Curr Biol 10, 785-8 (2000))。逆にいえば、ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ融合タンパク質（ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳを中和する）でループス易発性マウスを処置すると、自己免疫血清学、腎臓病理学および死亡率が改善する(R. Lesley 等., Immunity 20, 441-53 (2004))。
材料および方法：
例示的実施例において、用いられるＢＲ３−Ｆｃ又はＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃは、配列番号２のｈＢＲ３−Ｆｃである。図２９に示す実験のために、ヒトＣＤ２０をコードする細菌人工染色体を発現するＦＶＢマウス（ｈＣＤ２０＋マウスと呼称）を、抗ＣＤ２０ｍＡｂ（第９日目に１００μｇを単回注射）、ＢＲ３−Ｆｃ（第１日目から１２日目まで隔日１００μｇ）、又は抗ＣＤ２０ｍＡｂおよびＢＲ３−Ｆｃの組合せを腹腔内注射により処置した。各グループは４匹のマウスとした。最後の注射後２日目に、マウスを屠殺し、ｈＣＤ２０＋Ｂ細胞について分析した。脾臓、血液、リンパ節およびパイエル板のＦＡＣＳ分析により、Ｂ細胞マーカー（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋）について分析した。
図３０に示す実験のために、ｈＣＤ２０  Ｔｇ＋マウスを、対照ＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ（マウス当たり１００μｇ、１２日間毎日ＩＰ）、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ、第９日目にＩＰ）又はＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃおよび抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（単一処置群として同じ投薬）の組合せで処置した。Ｂ２２０＋脾細胞は、第１３日目に単離して、ＣＤ２１およびＣＤ２３について染色した。一群当たりＮ＝５マウス。図３０は、ヒトＣＤ２０  Ｔｇ＋マウスにおける抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃの組合せのＢ細胞枯渇に対する相乗効果を示す。図３１は、ｈＣＤ２０  Ｔｇ＋マウス由来のＢ２２０＋総脾臓Ｂ細胞、辺縁帯（ＭＺ）および濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞の枯渇の量を示す。マウスを、０．１ｍｇの対照ＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦ／ＢＲ３−Ｆｃ又は抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの単回用量で処置した。脾細胞を第４日目に分析した。一群当たりＮ＝５マウス。
【０１３６】
結果：
これらの結果を、図２９、図３０および図３１に示す。
１．抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療により、血液およびリンパ節の成熟循環Ｂ細胞の９９％未満が枯渇する。
２．ＢＲ３−Ｆｃは、血液およびリンパ節の成熟循環Ｂ細胞を枯渇する。
３．抗ＣＤ２０ｍＡｂ治療により、脾臓の辺縁帯Ｂ細胞でなく、Ｔ２および濾胞性Ｂ細胞が枯渇した。
４．ＢＲ３−Ｆｃは、脾臓のＴ２／濾胞性および辺縁帯Ｂ細胞を枯渇する。
５．抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃは相乗的に働いて、脾臓のすべてのＢ細胞集団を枯渇する。
２週間以下の間ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−ＦｃでｈＣＤ２０＋マウスを処置すると、ＭＺおよびＴ２／ＦＯ  Ｂ細胞が著しく減少した（図３０、パネル３）。ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃと抗ｈＣＤ２０ｍＡｂを併用して処置すると、驚くべきことに、全ての脾臓Ｂ細胞サブセットが枯渇した（図３０、パネル４）。更にＢＡＦＦ中和と抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの潜在的相乗効果を調べるために、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃの単回投与での処置後４日のＢ細胞損失の程度を定量化した。抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃの単回投与で処置すると、ＭＺ  Ｂ細胞の４０−５０％以下の消失、およびＦＯ  Ｂ細胞の３３−７０％以下の消失となり、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃの組合せによって、ＭＺおよびＦＯ  Ｂ細胞の９０％未満が消失した（図３１）。したがって、生存要因も、Ｂ細胞枯渇に関与した抗ｈＣＤ２０ｍＡｂへの感受性の決定において重要な役割を果たす。
【０１３７】
実施例５
ＢＬｙＳアンタゴニストの生成
ＢＬｙＳ８２−２８５生成
ヒトＢＡＦＦ（残基８２−２８５）をコードするＤＮＡ断片をｐＥＴ１５ｂ(Novagen)発現ベクターにクローニングし、Ｎ末端基Ｈｉｓ−タグの後ろにトロンビン切断部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）培養物を、５０ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含有するＬＢ培地にて３７℃で対数中間期(mid-log phase)まで生育し、ついで１．０ｍＭ  ＩＰＴＧでの誘導前に、１６℃に冷却した。さらに１２時間生育した後細胞を遠心分離によって回収し、−８０℃に保存した。細胞ペレットを５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および５００ｍＭ  ＮａＣｌ中に再懸濁して、氷上で超音波破壊した。遠心分離後、上清を、Ｎｉ―ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）に流した。カラムを、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールにて洗浄し、次いで、２５０ｍＭイミダゾールを含有する同様の緩衝液にて段階的に希釈して溶出した。ＢＡＦＦを含有する分画を貯留し、トロンビンを添加して、試料を２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０および５ｍＭ  ＣａＣｌ２にて４℃で終夜透析した。さらに、タンパク質を、ｍｏｎｏＱ(Pharmacia)カラムにて、最後に２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭのＭｇＣｌ２のＳ−２００サイズ排斥カラムにて精製した。結果として生じるＢＬｙＳタンパク質を後述するように用いた。
ＢＲ３細胞外ドメイン生成
ヒトＢＲ３（残基１〜６１）の細胞外ドメインをｐＥＴ３２ａ発現ベクター(Novagen)にサブクローニングして、Ｎ末端基チオレドキシン（ＴＲＸ）−Ｈｉｓ−タグの後にエンテロキナーゼプロテアーゼ部位を有する融合体を作製した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Novagen）を３０℃で生育し、ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘発した。ＴＲＸ−ＢＲ３は、Ｎｉ-ＮＴＡカラム（Qiagen）を通じて精製し、イミダゾール勾配にて溶出し、エンテロキナーゼ（Novagen）によって切断した。ついで、ＢＲ３をＳ-セファロースカラムで精製し、３ｍＭ酸化グルタチオンと１ｍＭ還元グルタチオンを含有するＰＢＳ,ｐＨ７．８にて終夜リフォールドさせ、ＰＢＳに対して透析し、ＭｏｎｏＳカラムにて再精製し、濃縮してＰＢＳに透析した。
【０１３８】
ペプチド合成
標準のＦｍｏｃ化学法を用いてパイオニアペピチド合成機(PE Biosystems)にて、ミニＢＲ３をＣ末端のアミドとして合成した。システイン１９および３２の側鎖チオールをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）-安定アセトアミドメチル（Ａｃｍ）誘導体として保護した。ペプチドを、５％トリイソプロピルシランを含むＴＦＡで１．５−４時間室温にて処理することによって、樹脂から切断した。回転式蒸発によってＴＦＡを除去した後、ペプチドをエチルエーテルの添加によって沈殿させ、次いで逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ）にて精製した。エレクトロスプレー質量分析によって確実にペプチドを同定した。凍結乾燥の後、酸化型ペプチドをＨＰＬＣにて精製した。還元型ミニＢＲ３を含むＨＰＬＣ分画を、ＮＨ４ＯＨにてｐＨ９以下に調整した；ついで、Ｋ３Ｆｅ(ＣＮ)６を少し過剰に添加することによってシステイン２４と３５間をジスルフィド結合し、酸化型ペプチドをＨＰＬＣによって精製した。少し過剰なＩ２を用いて４時間以下にわたってＨＰＬＣ溶出処理をすることによってＡｃｍ基を除去した（第２のジスルフィドが付随的に形成される）。分析的ＨＰＬＣによって酸化経過をモニタし、終末産物をＨＰＬＣによって再び精製した。１０倍モルの過剰なスルホ-ＮＨＳ-ビオチン(Pierce Chemical, Co.)を用いた反応によって樹脂上でミニＢＲ３のアミノ末端をビオチン化した。ついで、ビオチン化したミニＢＲ３を樹脂から切断して、ビオチン化されなかったミニＢＲ３のために上記の通りに精製した。
以下のペプチドECFDLLVRHWVACGLLR (BLyS0027)（配列番号：９）、ECFDLLVRHWVPCGLLR (BLyS0048)（配列番号：６）およびECFDLLVRAWVPCSVLK (BLyS0051)（配列番号：５）を、以下の通りに一般的に合成した。Ｒｉｎｋアミド樹脂を用いたRainin Symphonyペプチド合成機システムと、５倍の過剰量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）含有の２-(１Ｈ-ベンゾトリアゾン-１-イル)-１,１,３,３-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）で活性化した３倍の過剰量の９-フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）被保護アミノ酸でペプチドを合成した。アミノ酸を各部位で２回結合させ、ピペリジンを２０％含むジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液によって非保護し、次の残基へ移動した。各結合工程の間にジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）にて洗浄した。ペプチド上に最終アミノ酸を結合させて２０％ピペリジンを含むＤＭＦにて脱保護した後、３等価量の無水酢酸と５等価量のＤＩＰＥＡを含むＤＭＡを用いてペプチドのアミノ末端をアシル化した。あるいは、アミノ末端を、５-カルボキシフルオレセインにて、(＋)-ビオチンにて、あるいは、他のフルオロフォア又はリポーター分子にてアシル化することによって修飾した。ついで、２．５％水と２．５％トリイソプロピルシランを含む９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液にて９０分間処理することによって樹脂から切断した。圧力を下げることによって揮発性物質を除去し、ジエチルエーテルを加え、固形物を濾過した。結果として生じた沈殿物をジエチルエーテルにて再度洗浄し、結合した有機物質を除いた。ついで、洗浄した固形物を酢酸、酢酸およびアセトニトリル１：１混合液、酢酸、アセトニトリルおよび水１：１：１混合液、酢酸、アセトニトリルおよび水１：１：８混合液で連続的に洗浄して、最後に水で洗浄した。結合した洗浄物を凍結乾燥し、毎分１５ｍｌの流速で、各々の溶媒液中に０．１％のトリフルオロ酢酸を含有する水で１０％から７０％の勾配を付けたアセトニトリルにて３０分間のＣ１８逆相高速液体クロマトグラフィを行うことによって結果として生じた粗ペプチドを精製した。所望のペプチドを含む分画に、溶液が着色されるまで酢酸のヨウ素飽和溶液を添加して酸化した。次いでこの溶液を凍結乾燥した。最後に、凍結乾燥された粗酸化型ペプチドを同様の条件で２度精製し、所望のペプチドを含む分画を凍結乾燥した。４倍の過剰量のアミノ酸を用いたPerSeptive自動合成機での合成を除き、同じ条件で残基当たり一度しか結合していないいくつかのペプチドを合成した。
【０１３９】
実施例６
１７ｍｅｒのファージディスプレイ
ライブラリーの構築。  ＳＴＩＩ分泌シグナル配列（「STII ss」）、リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ、配列番号  ）、及びＭ１３ファージの微量タンパク質ＩＩＩのＣ末端残基をコードする配列（例えば残基２６７−４２１）（以下、「ｃＰ３」）をコードするファージミドをライブラリー構築の鋳型として用いた。Kunkel突然変異誘発法と、「１７ｍｅｒＣ３２Ｗ」としても知られているＣ３２Ｗ変異を持つヒトＢＲ３の残基２３−３９に対応する断片を導入し、１７ｍｅｒＣ３２Ｗ領域内に更に変異をコードしたオリゴヌクレオチドを用いて、二組のライブラリーを構築した。すなわち、ライブラリー１は ３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＮＮＳ＝任意のコドン）の番号の残基をコードし、ライブラリー２は 置換コドン残基２７、３０、３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＶＮＣ＝アミノ酸Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ及びＧをコード）をコードしていた。置換コドンにおいて：Ｎは２５％Ａ、２５％Ｃ、２５％Ｇ、２５％Ｔ；Ｓは５０％Ｇ／５０％Ｃ；Ｖは３３％Ｇ／３３％Ａ／３３％Ｃ；及びＣは１００％Ｃである。ライブラリー１は１．１×１０９メンバーをコードし、ライブラリー２は４．３×１０８メンバーをコードしていた。
ライブラリー選別。  そのファージを４ラウンドの選別にかけた。一般に、１ラウンド当たりのファージインプットは第一回ラウンド（固相選別）に対して１０１４ファージ、更なるラウンド（液相選別）に対して３×１０１２ファージであった。
ファージ選別。  第一選別ラウンドは固相選別法であった。マキシソープ(Maxisorp)イムノプレート（９６ウェル）を４℃にて一晩かけて上述のようにして調製したＢＬｙＳ８２−２８５（５０ｍＭの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌで１００μｌ）でコートした。ついで、ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用いて１時間ブロックし、３−５回、ＰＢＳ、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０で洗浄した。ファージ粒子（（ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）中１００μｌ／ウェル）をウェルに添加した。２時間後、ウェルをＰＢＳ、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０で数回洗浄した。ウェルに結合したファージを室温（ＲＴ）で１０分間０．１ＮのＨＣｌを用いて溶出させた。溶出させたファージを、１／２０容量の２Ｍトリス（ｐＨ１１．０）を加えることによって中和した。
ファージをタイターするために、対数期ＸＬ-１（ＯＤ６００ｎｍ〜０．３）を３７℃で３０分、溶出したファージに感染させた。ついで、感染した細胞を１０倍の増分で２ＹＴによって段階希釈した。感染した細胞の１０μｌのアリコートをカルベニシリンプレート毎に播種した。各ライブラリーから〜１０８のファージを第一ラウンドの選別から取得した。
【０１４０】
ファージを増殖させるために、溶出したファージを用いて３７℃で３０分間、対数期ＸＬ-１（ＯＤ６００ｎｍ〜０．３）を感染させた。ヘルパーファージＫＯ７とカルベニシリンを１×１０１０ｐｆｕ／ｍｌＫＯ７及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリンの最終濃度で３７℃にて更に３０分間、感染体に加えた。その培養をカルベニシリン５０μｇ／ｍｌ及び２５μｇ／ｍｌカナマイシンを有する２ＹＴ培地中で最終容積２５ｍｌまで３７℃で一晩成長させた。
そのファージを１００００ｒｐｍで１０分間細胞をスピンすることによって精製した。上清を集めた。２０％のＰＥＧ／２．５ＭのＮａＣｌを上清容積の１／５まで加えて、混合し、室温で５分静置させた。そのファージを１００００ｒｐｍで１０分間スピンさせてペレットにした。上清を捨て、ファージペレットを５０００ｒｐｍで５分間再びスピンさせた。そのペレットを０．７ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、１３０００ｒｐｍで１０分間スピンさせて、細胞片を破棄した。再懸濁されたファージペレットのＯＤを２６８ｎｍで読み取った。
第２−第４選択ラウンドは溶液選別法を利用した。第２ラウンドでは、ＮＵＮＣ(登録商標)マキシソープの９６-ウェルプレートを、４℃で一晩かけて５μｇ／ｍｌのニュートラアビジン（Pierce）で被覆した。次に、プレートをＰＢＳ中２００μｌ／ｍｌのＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ（Pierce）を用いて室温で３０分間、ブロックした。ＴＷＥＥＮ２０を０．２％（ｖ／ｗ）の最終濃度まで各ウェルに添加し、室温で更に３０分間ブロックした。第１選択ラウンドからの増幅した精製ファージを、室温で１時間、ＳＵＰＥＲＢＬＯＣＫ(登録商標)０．５％及び０．１％ＴＷＥＥＮ２０を含む１５０μｌバッファー中の５０ｎＭのビオチン化ＢＬｙＳ（最終濃度）と共にインキュベートした。ついで、混合物をＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮで５−１０Ｘに希釈し、ニュートラアビジン被覆プレートに１００μｌ／ウェルで塗布した。そのプレートを室温で５分間穏やかに振とうして、ビオチン化ＢＬｙＳに結合したファージをウェル中に捕捉させた。ついで、ウェルをＰＢＳ／０．０５％のＴＷＥＥＮ２０で数回洗浄した。結合したファージを０．１ＮのＨＣｌで１０分間溶出させ、中和し、滴定し、増殖させ、上述のようにして精製した。各ライブラリーから〜３×１０６ファージが第２選択ラウンドから得られた。
第３選択ラウンドは、２ｎＭの濃度のビオチン化ＢＬｙＳを希釈と各ウェルへの添加の前にファージと共にインキュベートした点を除いて、第２ラウンドと同様である。結合ファージを１０分間、０．１ＮのＨＣｌで溶出させ、中和し、滴定し、上述のようにして増殖させた。各ライブラリーから〜１０４ファージを第３選択ラウンドから得た。
第３選択ラウンドからのファージを、ついで第４ラウンドの二種の異なる選択方法にかけた。方法４ａは、０．５ｎＭのビオチン化ＢＬｙＳの存在下で室温で１時間インキュベートした点を除いて第２及び第３選択ラウンドと同様であった。ついで、混合物を、希釈及び被覆ウェルへの添加の前に１０００倍過剰（５００ｎＭ）の未ビオチン化ＢＬｙＳの存在下で室温で更に１５分間インキュベートした。方法４ｂは、０．２ｎＭのＢＬｙＳを希釈と各ウェルへの添加の前にファージと共にインキュベートした点を除いて第２及び第３選択ラウンドと同様である。第４ラウンドの選択からの結合ファージを１０分間、０．１ＮのＨＣｌで溶出させ、中和し、滴定し、上述のようにして増殖させた。〜１０３ファージが第４ラウンド（４ａ及び４ｂ）の選択のそれぞれから各ライブラリーに対して得られた。
【０１４１】
クローン分析。  第４ラウンドの選別後、個々のクローンを、カルベニシリン及びＫＯ７ヘルパーファージを補填した４００μＬの２ＹＴ培地中、９６ウェル形式で成長させた。これらの培養物の上清をファージＥＬＩＳＡにおいて使用した。ファージＥＬＩＳＡに対して、ＮＵＮＣマキシソープ９６-ウェルプレートを炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中のＢＬｙＳの２μｇ／ｍｌ溶液１００μｌで一晩かけて４℃で被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡで２時間の間ブロックした。ファージ上清を５０ｎＭのＢＬｙＳの不存在又は存在下でＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）で１：４に希釈し、室温で１時間インキュベートした。１００μｌの希釈したファージ上清をついで被覆プレートに移し、ファージを捕捉するために２０分間穏やかに振とうした。ついで、プレートをＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０を用いて数回洗浄した。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０（１：５０００）中ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体のウェル当たり１００μｌをプレートに移し、２０分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮの後ＰＢＳによって洗浄した後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)と０．０１％のＨ２Ｏ２を含む１００μｌのＰＢＳ基質溶液と共に５分インキュベートした。反応を１００μｌ／ウェルの１ＭのＨ３ＰＯ４で停止させ、プレートを４９０ｎｍで読み取った。ついで、クローンの配列を先に記載されているようにして(Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A.及びSidhu, S. S. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 8950-8954)決定した。許容できる品質の配列を翻訳し整列させた。１７ｍｅｒの配列を図３２に示す。
１４のクローンを更にＢＬｙＳ結合アッセイにおいて分析してＩＣ５０値を決定した。クローン２及び７は第４ラウンドで多い数の同胞（同一配列のクローン）を有していた。ファージＥＬＩＳＡアッセイによれば、クローン１３、１９、２２、２６、３２、３９及び４４は５０ｎＭのＢＬｙＳによってプレートへの結合が大きく阻害された（図１１）。クローン３５、４５、６８、８２及び９０の結合もまたファージＥＬＩＳＡアッセイにおいて大きく阻害された（図１１）。これらの１４クローンのファージ上清を、上述のようにして増殖させ精製した対数期ＸＬ-１を感染させるために用いた。
ディスプレイ及びファージ収量を正規化し、ＩＣ５０測定のためのファージの適切な希釈度を決定するために、各クローンからの精製ファージの段階希釈物を室温で１時間ＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）中でインキュベートした。１００μｌの各希釈物をＢＬｙＳ被覆プレートに移し、上述のようにして２０分間ファージを捕捉するために穏やかに振とうした。結合したファージをＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体とついでＯＰＤ／Ｈ２Ｏ２基質反応によって検出し、急冷し、上述のように４９０ｎｍで読み取った。このプロセスによって、４９０ｎｍで〜１Ｏ.Ｄ.を示した各クローンの希釈を決定し、ＩＣ５０アッセイにおいて使用した。
１４クローンのそれぞれのＩＣ５０値を決定するために、ＮＵＮＣマキシソープ９６-ウェルプレートを炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６に入れたＢＬｙＳの２μｇ／ｍｌの溶液を１００μｌ用いて４℃で一晩被覆し、上述のようにして洗浄しブロックした。１４クローンのそれぞれに対して増幅し精製したファージの希釈物を１３０μｌのＥＬＩＳＡ結合バッファー（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）中０．００３−１０００ｎＭの範囲のＢＬｙＳの濃度列の存在下で室温にて１時間インキュベートした。これらの濃度列のそれぞれ１００μｌをＢＬｙＳ被覆プレートに移し、捕捉し、洗浄し、ＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体で検出し、上述のようにしてプロセシングした。ＩＣ５０値は１４クローンのそれぞれに対してＥＬＩＳＡシグナルの４変数フィットによって決定した。ＩＣ５０値は０．４（クローン４４）から１１ｎＭ（クローン２２）の範囲であった。  
【０１４２】
競合置換ＥＬＩＳＡ。  次の１７ｍｅｒ、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号  ）（「ＢＬｙＳ００２７」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号  ）（「ＢＬｙＳ００４８」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ-ＮＨ２（配列番号  ）（「ＢＬｙＳ００５１」）を上述のようにして合成した。ＮＵＮＣマキシソープ９６-ウェルプレートを、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中ＢＬｙＳの２μｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ用いて４℃で一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％の脱脂乳でブロックした。ＢＲ３ ＥＣＤ（残基１−６１）と上記の１７ｍｅｒペプチドの段階希釈物を、３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３を含むＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０で調製した。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)での洗浄後、１００μｌ／ウェルの各希釈物を移し、室温で１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮで洗浄し、１００μｌ／ウェルの０．１Ｕ／ｍｌのＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ中ストレプトアビジン-ＰＯＤ(Boehringer Mannheim)と共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮと次のＰＢＳでの洗浄後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)と０．０１％のＨ２Ｏ２を含む１００μｌのＰＢＳ基質溶液と共に５分インキュベートした。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ、Ｈ３ＰＯ４で停止させ、４９０ｎｍでプレートを読み取った。ＩＣ５０値は競合置換ＥＬＩＳＡシグナルの４変数フィットによって決定した。ミニＢＲ３及びＢＲ３細胞外ドメインの初期原液の濃度は定量アミノ酸分析によって決定した。
ＢＲ３ ＥＣＤ、ＢＬｙＳ００２７、ＢＬｙＳ００４８及びＢＬｙＳ００５１のＩＣ５０を示す。１７ｍｅｒペプチドは全て６２ｍｅｒＢＲ３ ＥＣＤよりもＢＬｙＳに対してより大なる親和性を有していた。
【０１４３】
実施例４
ペプチド-ＰＥＧ抱合体
ＢＬｙＳ８２−２８５産生とペプチド合成。前述の実施例５に記載。
ペプチドへのポリマーの抱合。第一アミン（リジンとＮ末端）と反応させるためにＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で修飾した線状ＰＥＧを用いてペグ化１７ｍｅｒのペプチドを生成した。すべてのＰＥＧ-ＮＨＳ（ＰＥＧ-ＳＰＡ）試薬をNektar Therapeutics, San Carlos, CAから購入し、−７０℃の窒素下で保存した。ペプチド１ｍｇ／ｍｌをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。０．４ｍｌのペプチド溶液に固形の２ＫＰＥＧ−ＳＰＡ、５ＫＰＥＧ−ＳＰＡまたは２０ＫＰＥＧ−ＳＰＡを添加した。ＰＥＧ-ＳＰＡとペプチドを３：１のモル比となるように十分な固形を加えた。これらの溶液を室温で１時間インキュベートして、反応の過程を溶液５０μｌを用いた逆相分析用ＨＰＬＣによって分析した。すべてのペプチドが修飾されるまでＰＥＧの添加とインキュベートを２度繰り返した。更なる精製をしないでペグ化ペプチドをＢＬｙＳ結合について試験した。精製した抱合ペプチド中のＰＥＧ：ペプチドの比はおよそ１：１である。
競合的置換ＥＬＩＳＡ。１７ｍｅｒのＡｃ−ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ−ＮＨ２(配列番号：  ) (「ｂｌｙｓ００４８」)を前述のように合成した。ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＫ（ｂｌｙｓ００９５）(配列番号：  )を前述のように合成して、２Ｋ、５Ｋおよび２０ＫのＰＥＧ−ＮＨＳ各々と結合させた。Nunc Maxisorp９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌのＢＬｙＳ溶液１００μｌを含む炭酸塩緩衝液,ｐＨ９．６にて終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳにて洗浄して、１％スキムミルク含有のＰＢＳにてブロックした。３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３含有のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて、ミニＢＲ３（配列番号：  ）と上記の１７ｍｅｒペプチドとＰＥＧ-ペプチド抱合体の連続的希釈液を調製した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎにて洗浄した後、各希釈液１００μｌをウェルに移し、室温にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、１ウェル当たり１００μｌの０．１Ｕ／ｍｌストレプトアビジン-ＰＯＤ(Boehringer Mannheim)含有ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎと共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ついでＰＢＳにて洗浄した後、プレートを０．８ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＤ(Sigma)と０．０１％Ｈ２Ｏ２含有の１００μｌＰＢＳ基質溶液と共に５分間インキュベートした。反応液１００μｌ／ウェルを１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４にて冷却し、４９０ｎｍで読み込みを行った。競合的置換ＥＬＩＳＡ信号の４つのパラメータに当てはめてＩＣ５０値を測定した。方程式は以下の通りである：ｙ＝ｍ１＋（ｍ２−ｍ１）／（１＋ｍ０／ｍ４）＾ｍ３、ここでｍ１は無限の競合体濃度での吸光度、ｍ２は競合体がないときの吸光度、ｍ３は中間値付近のカーブの傾き、ｍ４はＩＣ５０値、ｍ０は競合体、この場合はペプチドの濃度である。ビオチン化したミニＢＲ３の濃度は約１０ｐＭである。ミニＢＲ３の初期保存用溶液の濃度は量的アミノ酸分析法にて決定した。
【０１４４】
結果
競合的置換ＥＬＩＳＡ信号の４パラメータへ当てはめることにより、ＩＣ５０値：ｂｌｙｓ００９５  １９ｎＭ、ｂｌｙｓ００４８  １４ｎＭ、およびｂｌｙｓ００９５−２ｋＰＥＧ抱合体  ４３ｎＭ、およびｂｌｙｓ００９５−５ｋＰＥＧ抱合体  ５１ｎＭ  が得られた。同様に、各実験について競合的置換ＥＬＩＳＡ信号の４パラメータへ当てはめることにより、ｂｌｙｓ００９５−２０ｋＰＥＧ抱合体  ９９ｎＭおよびｂｌｙｓ００４８  １５ｎＭのＩＣ５０値が得られた。
１７ｍｅｒペプチド-ＰＥＧ抱合体（２ｋ、５ｋおよび２０ｋ）のＢＬｙＳへの結合能を試験した。ＰＥＧのｂｌｙｓ００９５への抱合により抱合していない同じペプチドと比較してその結合能に顕著な減少はなかった。
結論
ここでの実験により、抗ＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃを組み合わせることによってＢ細胞のすべてのサブセットの枯渇に大きな相乗的効果を示すという驚くべき結果が証明された。
参考文献
特許、公開公報および他の出版物を含む本明細書内に挙げる参考文献は、出典明記によりここに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図１Ｂ】天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図２】天然配列ヒトＢＣＭＡをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図３】天然配列ヒトＢＬｙＳをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図４Ａ】天然配列ヒトＡＰＲＩＬをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図４Ｂ】天然配列ヒトＡＰＲＩＬをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図５】図５Ａは天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）（開始コドンと停止コドンを下線で示す）および、図５Ｂはそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図６Ａ】天然配列ヒトＢＲ３をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）（開始コドンと停止コドンを下線で示す）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す
【図６Ｃ】天然配列マウスＢＲ３をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）（開始コドンと停止コドンを下線で示す）および、図９Ａはそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図７】「比較タンパク質」と称するアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称するアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の例示的算出方法を示す。ここでの目的のために、「ＰＲＯ」は、この図でいうところのＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩまたはＢＲ３配列でありうる。
【図８】スプライス変異型と思われる「ｈＴＡＣＩ（２６５）」（配列番号：  ）と、図１Ａ−１Ｂに示す「ｈＴＡＣＩ」である、ＴＡＣＩレセプターの２つのアミノ酸配列の比較を示す。
【図９】ヒト（配列番号：  ）とマウスＢＲ３（配列番号：  ）の配列比較を示し、同一アミノ酸を文字で、保存されたアミノ酸を＋記号でその下に示す。
【図１０】予測される膜貫通領域（囲み）と細胞外領域（下線）を示すヒトＣＤ２０アミノ酸配列（配列番号：６３）を示す。潜在的ドメインは、１−６３：細胞質；６４−８４：膜貫通領域；８５−１０５：膜貫通領域；１０６−１２０：細胞質；１２１−１４１：膜貫通領域；１４２−１８８：細胞外；１８９−２０９：膜貫通領域；２１０−２９７：細胞質；８１−１６７：ジスルフィド結合である。
【図１１】ヒトＣＤ２０の核酸配列。
【図１２】マウス２Ｈ７（配列番号：  ）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号：１５）、およびヒトκ軽鎖サブグループＩ（配列番号：  ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む配列の比較。２Ｈ７とｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＬのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号  ）、ＣＤＲ２（配列番号  ）、およびＣＤＲ３（配列番号  ）。各々の鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は括弧の範囲内で囲み、示されるように、フレームワーク領域、ＦＲｌ-ＦＲ４が隣接している。２列の配列間の星印は２つの配列の間で異なる部位を示す。残基番号付けは、Rabat 等., Sequences of Immunological Interest. 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従い、挿入をａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅで示す。
【図１３】マウス２Ｈ７（配列番号：  ）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号：  ）、およびヒト重鎖サブグループＩＩＩの一致配列（配列番号：  ）のＶＨ配列を含む配列の比較。２Ｈ７とｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＨのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号  ）、ＣＤＲ２（配列番号  ）、およびＣＤＲ３（配列番号  ）。各々の鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は括弧の範囲内で囲み、示されるように、フレームワーク領域、ＦＲｌ-ＦＲ４が隣接している。２列の配列間の星印は２つの配列の間で異なる部位を示す。残基番号付けは、Kabat 等., Sequences of Immunological Interest. 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従い、挿入をａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅで示す。
【図１４】ｈＣＤ２０ＢＡＣ Ｔｇ＋マウスのマウスＢ２２０＋細胞（Ｂ細胞）でのヒトＣＤ２０導入遺伝子の発現を示す。
【図１５】ｈＣＤ２０  ＢＡＣＴｇマウスにおけるＢ細胞成熟の間のヒトＣＤ２０の発現を示す。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１６】Ｔｇ＋マウスの骨髄での異なる成熟／分化過程にあるＢ細胞（成熟、プレＢと未成熟Ｂ、プロＢ、および祖先細胞（プロジェニタ）Ｂ）でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１７】Ｔｇ＋マウス脾臓Ｂ細胞でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。細胞をＢ細胞を得るためにＢ２２０＋上でゲートした。ＩｇＭとＣＤ２１により、Ｔ２／濾胞性、辺縁帯およびＴ１の多種のＢ細胞サブセット内に描写された。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１８】Ｔｇ＋マウス腸間膜リンパ節（ＬＮ）でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１９】Ｔｇ＋マウスパイエル板でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。細胞をＢ２２０＋についてゲートした。ＣＤ３８マーカにより胚中心Ｂ細胞と成熟のものを区別する。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図２０】ヒトＣＤ２０  Ｔｇ＋マウスでの抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの効果についての実験の概要を示す。第０日目にマウスに１．０ｍｇ（５０ｍｇ／ｋｇに相当）の抗ＣＤ２０抗体を注射し（直線上の上の矢印）、各日（直線の下の赤い矢印で示す）に細胞を分析した。末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄およびパイエル板のＦＡＣＳ分析を行った。抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの血清レベルをモニターした。
【図２１】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂでの末梢血Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロット。左のパネルはＩｇＧ対照、すなわち非特異的の同基準標本に相当する抗体で処理した個体を示す。
【図２２】右のパネルは抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによる成熟末梢ＬＮ  Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロットを示す。左のパネルはＩｇＧ対照、すなわち非特異的の同基準標本に相当する抗体で処理した個体を示す。すべてのＢ細胞のＣＤ２１＋ＣＤ２３＋をゲートした。
【図２３】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによって、辺縁帯Ｂ細胞でなくＴ２  Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロット。
【図２４】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによって未成熟／プレＢ細胞でなく再環流成熟Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロット。赤はＩｇＧ処置群、緑はｈＣＤ２０を発現する抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処置マウス群を表す。ＩｇＧ処置マウス群（赤）はｈＣＤ２０発現成熟Ｂ細胞を保持しているが、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処置群はｈＣＤ２０保持細胞を枯渇した。ヒトＣＤ２０発現を非結合およびＡｂ結合ＣＤ２０両方の検出のためにモニターした。
【図２５】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂに対するパイエル板胚中心Ｂ細胞の耐性を示すＦＡＣＳプロット。左のパネルは対照ＩｇＧ処置マウス群由来の細胞を示す。右のパネルは抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置Ｔｇ＋マウス群由来の細胞を示す。
【図２６】Ｔｇ＋マウスの抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処置後の末梢血でのＢ細胞の枯渇と回復を示すＦＡＣＳプロット。上のパネルは対照ｍＡｂ処置マウス群由来の細胞の染色を示す。第１日目にマウスに抗体を投与した。時間と共に、ｈＣＤ２０を発現しない前駆Ｂ細胞はＣＤ２０＋成熟Ｂ細胞に分化した（第６および第１４週目の染色を参照）
【図２７】短期（単回投与）の抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置に対する脾臓胚中心Ｂ細胞の耐性を示すＦＡＣＳプロット。胚中心形成を誘導するためにヒツジ赤血球細胞で免疫化して８日後に、一群のマウスをヒトＣＤ２０に対するｍ２Ｈ７ｍＡｂで処置した。マウスの対照群はｍＩｇＧ２ａ同基準抗体で処置した。第１２日目にマウスの脾臓細胞を分析した。胚中心のＰＮＡ（ピーナッツ凝集素）を染色した。胚中心Ｂ細胞は抗ＣＤ２０処置にて枯渇しなかった。
【図２８】枯渇されない辺縁帯（ＭＺ）とＢ１Ｂ細胞がＴ非依存性の抗原に対して保護することを示すＦＡＣＳプロット。右の３つのパネルでは、脾臓細胞を連鎖球菌多糖類ホスファチジル基コリン（ＴＩ抗原）について染色した。ＣＤ１３８は血漿細胞に対するマーカである。
【図２９】実施例４に記載のように動物モデルをＢＬｙＳアンタゴニスト、ＢＲ３−Ｆｃ、および抗ＣＤ２０ｍＡｂであるｍ２Ｈ７の組合せで処置した時の異なる生物学的効果を示す。脾臓、血液、リンパ節Ｂ細胞（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋でゲート）についてＦＡＣＳ分析を行った。組み合わせて処置するとＢ細胞、特に脾臓の辺縁帯、Ｔ２および濾胞性Ｂ細胞の枯渇において明らかに相乗効果が見られた。
【図３０】実施例４に記載のように、ヒトＣＤ２０  Ｔｇ＋マウスを抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃを組み合わせた時のＢ細胞枯渇に対する相乗効果を示す。マウスを対照ＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ（マウス当たり１００μｇ、１２日間毎日ＩＰ）、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ、第９日目にＩＰ）又はＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃおよび抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（単一処置群として同じ投薬）の組合せで処置した。Ｂ２２０＋脾細胞は、第１３日目に単離して、ＣＤ２１およびＣＤ２３について染色した。一群当たりＮ＝５マウス。
【図３１】実施例４と図３０に記載のように、０．１ｍｇの対照ＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦ／ＢＲ３−Ｆｃ又は抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの単回用量で処置したマウスを除き、ｈＣＤ２０  Ｔｇ＋マウス由来のＢ２２０＋総脾臓Ｂ細胞（ＭＺ＋ＦＯ＋Ｔ１＋Ｔ２のすべてのサブセット）、辺縁帯（ＭＺ）および濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞の枯渇の量を示す。脾細胞を第４日目に分析した。一群当たりＮ＝５マウス。
【図３２Ａ】抗親和性ＢＬｙＳ結合についてファージディスプレイライブラリから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号：６５−１４２）を示す。
【図３２Ｂ】抗親和性ＢＬｙＳ結合についてファージディスプレイライブラリから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号：６５−１４２）を示す。
【図３２Ｃ】抗親和性ＢＬｙＳ結合についてファージディスプレイライブラリから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号：６５−１４２）を示す。
【図１Ａ】
2007526220.tif 000005
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
2007526220.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月9日(2006.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体を含んでなる、混合細胞集団からＢ細胞を枯渇するための作用剤。
【請求項２】
Ｂ細胞がヒトＢ細胞であり、混合細胞集団にＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体をインビボで作用させる、請求項１に記載の作用剤。
【請求項３】
ＢＬｙＳアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項１に記載の作用剤。
【請求項４】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項３に記載の作用剤。
【請求項５】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号：２のＢＲ３−Ｆｃである、請求項４に記載の作用剤。
【請求項６】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＬｙＳ抗体である、請求項１に記載の作用剤。
【請求項７】
抗ＢＬｙＳ抗体がＢＬｙＳの残基１６２−２７５を含むＢＬｙＳ領域内に結合する、請求項６に記載の作用剤。
【請求項８】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項１に記載の作用剤。
【請求項９】
抗ＢＲ３抗体がヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むＢＲ３領域内に結合する、請求項８に記載の作用剤。
【請求項１０】
抗ＣＤ２０抗体がリツキサンＴＭである、請求項１に記載の作用剤。
【請求項１１】
抗ＣＤ２０抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項１に記載の作用剤。
【請求項１２】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及び抗ＣＤ２０抗体が相乗的に働いてＢ細胞を枯渇する、請求項１に記載の作用剤。
【請求項１３】
治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを含んでなる、ＣＤ２０を発現するＢ細胞により特徴付けられるＢ細胞腫瘍又は悪性腫瘍の治療のための医薬。
【請求項１４】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは同時に投与される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１５】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは連続的に投与される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１６】
ＢＬｙＳアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１７】
Ｂ細胞腫瘍が、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、リンパ球支配的ホジキン病（ＬＰＨＤ）、濾胞性中心細胞（ＦＣＣ）リンパ腫、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）及び毛様細胞白血病である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項１８】
Ｂ細胞腫瘍が非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）又は小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬである、請求項１７に記載の医薬。
【請求項１９】
ＢＬｙＳアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項１３に記載の医薬。
【請求項２０】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項１９に記載の医薬。
【請求項２１】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号：２のｈＢＲ３−Ｆｃである、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２２】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＬｙＳ抗体である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項２３】
抗ＢＬｙＳ抗体がＢＬｙＳの残基１６２−２７５を含むＢＬｙＳ領域内に結合する、請求項２２に記載の医薬。
【請求項２４】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項２５】
抗ＢＲ３抗体がヒトＢＲ３の残基２３−３８を含むＢＲ３領域内に結合する、請求項２４に記載の医薬。
【請求項２６】
ＣＤ２０結合抗体がヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項２７】
キメラ抗体がリツキサンＴＭである、請求項２６に記載の医薬。
【請求項２８】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項１３に記載の医薬。
【請求項２９】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２８に記載の医薬。
【請求項３０】
ＣＤ２０結合抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するリツキサンＴＭ又はｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項２１に記載の医薬。
【請求項３１】
ＢＲ３−Ｆｃが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサンが約３７５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される、請求項３０に記載の医薬。
【請求項３２】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項１３に記載の医薬。
【請求項３３】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体が化学療法と組み合わせて投与される、請求項１３に記載の医薬。
【請求項３４】
治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを含んでなる、Ｂ細胞制御性自己免疫疾患を寛解するための医薬。
【請求項３５】
ＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストは連続的に投与される、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３６】
ＢＬｙＳアンタゴニストはＣＤ２０結合抗体より前に投与される、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３７】
自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ヴェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、血栓症血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫血小板減少、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡネフロパシ、ＩｇＭ多発神経障害、重症筋無力症、脈管炎、真性糖尿病、レーノー症候群、シェーグレン症候群及び糸球体腎炎からなる群から選択される、請求項３４に記載の医薬。
【請求項３８】
自己免疫疾患が慢性関節リウマチ及び全身性エリテマトーデスである、請求項３７に記載の医薬。
【請求項３９】
ＢＬｙＳアンタゴニストがイムノアドヘシンである、請求項３４に記載の医薬。
【請求項４０】
イムノアドヘシンが、ＢＲ３の細胞外ドメインを含んでなるＢＲ３イムノアドヘシン、ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるＴＡＣＩイムノアドヘシン及びＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるＢＣＭＡイムノアドヘシンからなる群から選択したものである、請求項３９に記載の医薬。
【請求項４１】
ＢＲ３イムノアドヘシンが配列番号：２のＢＲ３−Ｆｃである、請求項４０に記載の医薬。
【請求項４２】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＬｙＳ抗体である、請求項３４に記載の医薬。
【請求項４３】
ＢＬｙＳアンタゴニストが抗ＢＲ３抗体である、請求項３４に記載の医薬。
【請求項４４】
ＣＤ２０結合抗体がヒト抗体の定常領域に融合したマウス抗体の可変領域を含んでなるキメラ抗体である、請求項３４に記載の医薬。
【請求項４５】
キメラ抗体がリツキサンＴＭである、請求項４４に記載の医薬。
【請求項４６】
ＣＤ２０結合抗体がヒト化抗体である、請求項３４に記載の医薬。
【請求項４７】
ヒト化抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項４６に記載の医薬。
【請求項４８】
ＣＤ２０結合抗体が、それぞれ配列番号：１５及び配列番号：１６の軽鎖及び重鎖を有するリツキサンＴＭ又はｈｕ２Ｈ７ｖ．１６である、請求項４１に記載の医薬。
【請求項４９】
ＢＲ３−Ｆｃが約２−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、リツキサンが約２．５−１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４８に記載の医薬。
【請求項５０】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体の投与によりＢ細胞を枯渇するための相乗効果が生じる、請求項３４に記載の医薬。
【請求項５１】
ＢＬｙＳアンタゴニスト及びＣＤ２０結合抗体が、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコイド、プレドニゾン、及び疾患変更抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）から選択された薬剤を用いた療法と組み合わせて投与される、請求項３８に記載の医薬。
【請求項５２】
治療的有効量のＣＤ２０結合抗体及びＢＬｙＳアンタゴニストを含んでなる、Ｂ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患罹患患者の辺縁帯又は胚中心Ｂ細胞を枯渇するための医薬。
【請求項５３】
ＢＬｙＳアンタゴニストは、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：８、配列番号：９又は配列番号：１０に示す配列を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項１、１３、３４及び５２の何れか一に記載の作用剤又は医薬。
【請求項５４】
ＣＤ２０結合抗体と、ＢＬｙＳアンタゴニストと、ラベルを含んでなり、該ラベルが組成物がＢ細胞腫瘍又はＢ細胞制御性自己免疫疾患の治療のためのものであることを示す、製造品。
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月16日(2007.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
ここで用いられる「ＢＬｙＳ」、「ＢＬｙＳポリペプチド」、「ＴＡＬＬ-１」または「ＴＡＬＬ-１ポリペプチド」、「ＢＡＦＦ」なる用語は、「天然配列ＢＬｙＳポリペプチド」および「ＢＬｙＳ変異体」を包含する。「ＢＬｙＳ」は以下：
ヒトＢＬｙＳ配列（図３；配列番号．２９）
1 mddstereqs rltsclkkre emklkecvsi lprkespsvr sskdgkllaa tlllallscc 
61 ltvvsfyqva alqgdlaslr aelqghhaek lpagagapka gleeapavta glkifeppap 
121 gegnssqnsr nkravqgpee tvtqdclqli adsetptiqk gsytfvpwll sfkrgsalee 
181 kenkilvket gyffiygqvl ytdktyamgh liqrkkvhvf gdelslvtlf rciqnmpetl 
241 pnnscysagi akleegdelq laiprenaqi sldgdvtffg alkll
マウスＢＬｙＳ配列（配列番号．４７）
1 mdesaktlpp pclcfcsekg edmkvgydpi tpqkeegawf gicrdgrlla atlllallss 
61 sftamslyql aalqadlmnl rmelqsyrgs atpaaagape ltagvklltp aaprphnssr 
121 ghrnrrafqg peeteqdvdl sappapclpg crhsqhddng mnlrniiqdc lqliadsdtp
181 tirkgtytfv pwllsfkrgn aleekenkiv vrqtgyffiy sqvlytdpif amghviqrkk 
241 vhvfgdelsl vtlfrciqnm pktlpnnscy sagiarleeg deiqlaipre naqisrngdd 
301 tffgalkll
および図３に示すアミノ酸配列の何れか一によりコードされるポリペプチドと、天然配列のＢＬｙＳの生物学的活性を有するそれらの相同物ないし断片ないし変異体を意味する。ＢＬｙＳの生物学的活性は、Ｂ細胞生存を促進する、Ｂ細胞成熟を促進する、およびＢＲ３に結合することからなる群から選択されうる。ＢＬｙＳの変異体は、天然配列のＢＬｙＳポリペプチドと好ましくは少なくとも８０％ないし１００％までの連続的整数、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する。「天然配列」ＢＬｙＳポリペプチドは、天然由来の対応するＢＬｙＳポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。例えば、ＢＬｙＳはフューリン型のプロテアーゼにより細胞表面から切断された後の可溶型で存在する。そのような天然配列のＢＬＹＳポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＬｙＳポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型ないし分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。「ＢＬｙＳ」なる用語は、Shu 等., J. Leukocyte Biol., 65:680 (1999)；GenBank寄託番号 AF136293；１９９８年５月７日公開のW098/18921；１９９８年１０月７日公開のEP 869,180；１９９８年６月２５日公開のW098/27114；１９９９年３月１８日公開のW099/12964；１９９９年７月８日公開のW099/33980；Moore 等., Science, 285:260-263 (1999)；Schneider 等., J. Exp. Med., 189:1747-1756 (1999)；Mukhopadhyay 等., J. Biol. Chem., 274:15978-15981 (1999)に記載のポリペプチドを含む。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
ここで用いられる「ＢＲ３」、「ＢＲ３ポリペプチド」または「ＢＲ３レセプター」なる用語は、「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」および「ＢＲ３変異体」を包含する（ここでさらに定義する）。「ＢＲ３」は以下のポリヌクレオチド配列およびその相同体：
（ａ）ヒトＢＲ３配列（配列番号：３３）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGASS PAPRTALQPQ
61 ESVGAGAGEA ALPLPGLLFG APALLGLALV LALVLVGLVS WRRRQRRLRG ASSAEAPDGD
121 KDAPEPLDKV IILSPGISDA TAPAWPPPGE DPGTTPPGHS VPVPATELGS TELVTTKTAG
181 PEQQ
（ｂ）選択的ヒトＢＲ３配列（配列番号：４８）
1 MRRGPRSLRG RDAPAPTPCV PAECFDLLVR HCVACGLLRT PRPKPAGAAS SPAPRTALQP
61 QESVGAGAGE AALPLPGLLF GAPALLGLAL VLALVLVGLV SWRRRQRRLR GASSAEAPDG
121 DKDAPEPLDK VIILSPGISD ATAPAWPPPG EDPGTTPPGH SVPVPATELG STELVTTKTA
181 GPEQQ
（ｃ）マウスＢＲ３配列（配列番号：３５）
1 MGARRLRVRS QRSRDSSVPT QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FHTPDTGHTS SLEPGTALQP
61 QEGSALRPDV ALLVGAPALL GLILALTLVG LVSLVSWRWR QQLRTASPDT SEGVQQESLE
121 NVFVPSSETP HASAPTWPPL KEDADSALPR HSVPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
（ｄ）ラットＢＲ３配列（配列番号：４９）
1 MGVRRLRVRS RRSRDSPVST QCNQTECFDP LVRNCVSCEL FYTPETRHAS SLEPGTALQP
61 QEGSGLRPDV ALLFGAPALL GLVLALTLVG LVSLVGWRWR QQRRTASLDT SEGVQQESLE
121 NVFVPPSETL HASAPNWPPF KEDADNILSC HSIPVPATEL GSTELVTTKT AGPEQ
およびそれらの変異体または断片の何れか一を含むポリペプチドを意味する。本発明のＢＲ３ポリペプチドは、ヒト組織型または他の供給源などの様々な供給源から単離する、または組み換えおよび／または合成法によって調製することができる。ＢＲ３なる用語は、WO02/24909およびWO03/14294に記載のＢＲ３ポリペプチドを含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
「天然配列」ＢＲ３ポリペプチドは、天然由来の対応するＢＲ３ポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。そのような天然配列のＢＲ３ポリペプチドは天然から単離するか、組み換えおよび／または合成方法により生成することができる。「天然配列ＢＲ３ポリペプチド」なる用語は、ポリペプチドの天然に生じる切断型ないし分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）および天然に生じる対立変異型を具体的に包含する。本発明のＢＲ３ポリペプチドには、ヒトＢＲ３のアミノ酸残基１−１８４の近接した配列からなるまたは含むＢＲ３ポリペプチドを含む。
ＢＲ３「細胞外ドメイン」または「ＥＣＤ」は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを実質的に含まないＢＲ３ポリペプチド型を意味する。ＢＲ３のＥＣＤ型には、ＢＲ３のアミノ酸１−７７、２−６２、２−７１、１−６１、および２−６３の何れか一を含んでなるものを包含する。
ミニ-ＢＲ３はＢＲ３のＢＬｙＳ結合ドメインの２６残基のコア領域である：
TPCVPAECFD LLVRHCVACG LLRTPR (配列番号：５０)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
いくつかの実施態様では、本発明のポリペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、または図３２に挙げる配列に、Ｎ末端、Ｃ末端またはその両方に付加的ポリペプチドを含む。付加的ポリペプチド配列は、天然配列ＢＲ３ポリペプチドに非相同で、例としてイムノグロブリンのＦｃ部位を含む。
本発明の他の態様では、ＢＬｙＳアンタゴニストポリペプチドは、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、または図３２に挙げる配列を含むポリペプチドの少なくとも一および好ましくは一以上を含む。互いに連結するポリペプチドは同じ配列または異なる配列を持ちうる。いくつかの実施態様では、これらのポリペプチドは互いに、場合によってはリンカーを介して結合しうる。リンカーはスペーサーとして機能し、多種の化学的化合物からなりうる。いくつかの実施態様では、リンカーは、約１から５０アミノ酸、より好ましくは１から３０アミノ酸を含むポリペプチドである。リンカー配列は当分野の技術者に公知である。例えば、リンカー配列は、GGGKGGGGおよびGGGNSSGGなどを含む。特定の実施態様では、互いに連結したポリペプチドは同じ配列を持ち、式：ＰＰ１−Ｌ１−ＰＰ１−Ｌ２−ＰＰ１を含むもので、ここでＰＰ１は式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、および図３２に挙げる配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、Ｌ１およびＬ２は配列が異なるリンカー配列である。
ここで示したポリペプチドなどのＢＬｙＳのＢＲ３への結合のアンタゴニストは、好ましくは配列番号：５１のＢＲ３  ＥＣＤまたは配列番号：５０のミニＢＲ３などの天然のＢＲ３配列と同じかそれよりも大きい親和性を持ってＢＬｙＳに結合する。いくつかの実施態様では、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、ECFDLLVRAWVPCSVLK (配列番号 5)、ECFDLLVRHWVPCGLLR (配列番号 6)、ECFDLLVRRWVPCEMLG (配列番号 7)、ECFDLLVRSWVPCHMLR (配列番号 8)、ECFDLLVRHWVACGLLR (配列番号 9)、または図３２に挙げる配列を有するポリペプチドはＢＬｙＳに対して、約１００ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下、または１ｎＭ以下の結合親和性を持つ。結合親和性を測定する一方法は実施例に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
２Ｈ７のＣＤＲスワップ型（２Ｈ７．ｖ２）を構築するために、部位特異的突然変異誘発をｐＶＸ４のデオキシウリジン含有鋳型で実施した；抗ＩＦＮ-αの６つ全てのＣＤＲがマウス２Ｈ７ＣＤＲに変化した。得られた分子をヒト化２Ｈ７型２（２Ｈ７.ｖ２）又は２Ｈ７の「ＣＤＲスワップ型」と呼ぶ；これは図１２及び１３に示されるコンセンサスヒトＦＲ残基を有するｍ２Ｈ７ＣＤＲ残基を有する。ヒト化２Ｈ７.ｖ２は更なるヒト化に用いた。
表２はＨ及びＬ鎖においてマウス２Ｈ７（ｍ２Ｈ７）ＣＤＲのそれぞれを作製するために用いたオリゴヌクレオチド配列を示す。例えば、ＣＤＲ-Ｈ１オリゴヌクレオチドを使用してｍ２Ｈ７のＨ鎖を再作製した。ＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３はＨ鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をそれぞれ意味する；同様に、ＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３はＬ鎖ＣＤＲのそれぞれを意味する。ＣＤＲ-Ｈ２における置換はＣＤＲ-Ｈ２ＡとＣＤＲ-Ｈ２Ｂの二つのオリゴヌクレオチドを用いる二工程で行った。
表２．ｐＶＸ４のヒトフレームワーク中へのマウス２Ｈ７ＣＤＲのＣＤＲスワップの構築に使用したオリゴヌクレオチド配列。
2007526220.tif 000043
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
実施例６
１７ｍｅｒのファージディスプレイ
ライブラリーの構築。  ＳＴＩＩ分泌シグナル配列（「STII ss」）、リンカー（ＧＧＧＳＧＧＧ、配列番号６１）、及びＭ１３ファージの微量タンパク質ＩＩＩのＣ末端残基をコードする配列（例えば残基２６７−４２１）（以下、「ｃＰ３」）をコードするファージミドをライブラリー構築の鋳型として用いた。Kunkel突然変異誘発法と、「１７ｍｅｒＣ３２Ｗ」としても知られているＣ３２Ｗ変異を持つヒトＢＲ３の残基２３−３９に対応する断片を導入し、１７ｍｅｒＣ３２Ｗ領域内に更に変異をコードしたオリゴヌクレオチドを用いて、二組のライブラリーを構築した。すなわち、ライブラリー１は ３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＮＮＳ＝任意のコドン）の番号の残基をコードし、ライブラリー２は 置換コドン残基２７、３０、３１、３４及び３６−３９（置換コドン：ＶＮＣ＝アミノ酸Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｒ、Ｉ、Ｔ、Ｎ、Ｓ、Ｖ、Ａ、Ｄ及びＧをコード）をコードしていた。置換コドンにおいて：Ｎは２５％Ａ、２５％Ｃ、２５％Ｇ、２５％Ｔ；Ｓは５０％Ｇ／５０％Ｃ；Ｖは３３％Ｇ／３３％Ａ／３３％Ｃ；及びＣは１００％Ｃである。ライブラリー１は１．１×１０９メンバーをコードし、ライブラリー２は４．３×１０８メンバーをコードしていた。
ライブラリー選別。  そのファージを４ラウンドの選別にかけた。一般に、１ラウンド当たりのファージインプットは第一回ラウンド（固相選別）に対して１０１４ファージ、更なるラウンド（液相選別）に対して３×１０１２ファージであった。
ファージ選別。  第一選別ラウンドは固相選別法であった。マキシソープ(Maxisorp)イムノプレート（９６ウェル）を４℃にて一晩かけて上述のようにして調製したＢＬｙＳ８２−２８５（５０ｍＭの炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中２μｇ／ｍｌで１００μｌ）でコートした。ついで、ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中０．２％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを用いて１時間ブロックし、３−５回、ＰＢＳ、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０で洗浄した。ファージ粒子（（ＥＬＩＳＡバッファー（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）中１００μｌ／ウェル）をウェルに添加した。２時間後、ウェルをＰＢＳ、０．０５％のＴＷＥＥＮ２０で数回洗浄した。ウェルに結合したファージを室温（ＲＴ）で１０分間０．１ＮのＨＣｌを用いて溶出させた。溶出させたファージを、１／２０容量の２Ｍトリス（ｐＨ１１．０）を加えることによって中和した。
ファージをタイターするために、対数期ＸＬ-１（ＯＤ６００ｎｍ〜０．３）を３７℃で３０分、溶出したファージに感染させた。ついで、感染した細胞を１０倍の増分で２ＹＴによって段階希釈した。感染した細胞の１０μｌのアリコートをカルベニシリンプレート毎に播種した。各ライブラリーから〜１０８のファージを第一ラウンドの選別から取得した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４２】
競合置換ＥＬＩＳＡ。  次の１７ｍｅｒ、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＡＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号９）（「ＢＬｙＳ００２７」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ-ＮＨ２（配列番号６）（「ＢＬｙＳ００４８」）、Ａｃ-ＥＣＦＤＬＬＶＲＡＷＶＰＣＳＶＬＫ-ＮＨ２（配列番号５）（「ＢＬｙＳ００５１」）を上述のようにして合成した。ＮＵＮＣマキシソープ９６-ウェルプレートを、炭酸塩バッファー（ｐＨ９．６）中ＢＬｙＳの２μｇ／ｍｌ溶液を１００μｌ用いて４℃で一晩かけて被覆した。プレートをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中１％の脱脂乳でブロックした。ＢＲ３ ＥＣＤ（残基１−６１）と上記の１７ｍｅｒペプチドの段階希釈物を、３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３を含むＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ２０で調製した。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ(登録商標)での洗浄後、１００μｌ／ウェルの各希釈物を移し、室温で１時間インキュベートした。そのプレートをＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮで洗浄し、１００μｌ／ウェルの０．１Ｕ／ｍｌのＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ中ストレプトアビジン-ＰＯＤ(Boehringer Mannheim)と共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮと次のＰＢＳでの洗浄後、プレートを、０．８ｍｇ／ｍｌのＯＰＤ(Sigma)と０．０１％のＨ２Ｏ２を含む１００μｌのＰＢＳ基質溶液と共に５分インキュベートした。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ、Ｈ３ＰＯ４で停止させ、４９０ｎｍでプレートを読み取った。ＩＣ５０値は競合置換ＥＬＩＳＡシグナルの４変数フィットによって決定した。ミニＢＲ３及びＢＲ３細胞外ドメインの初期原液の濃度は定量アミノ酸分析によって決定した。
ＢＲ３ ＥＣＤ、ＢＬｙＳ００２７、ＢＬｙＳ００４８及びＢＬｙＳ００５１のＩＣ５０を示す。１７ｍｅｒペプチドは全て６２ｍｅｒＢＲ３ ＥＣＤよりもＢＬｙＳに対してより大なる親和性を有していた。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
実施例４
ペプチド-ＰＥＧ抱合体
ＢＬｙＳ８２−２８５産生とペプチド合成。前述の実施例５に記載。
ペプチドへのポリマーの抱合。第一アミン（リジンとＮ末端）と反応させるためにＮ-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で修飾した線状ＰＥＧを用いてペグ化１７ｍｅｒのペプチドを生成した。すべてのＰＥＧ-ＮＨＳ（ＰＥＧ-ＳＰＡ）試薬をNektar Therapeutics, San Carlos, CAから購入し、−７０℃の窒素下で保存した。ペプチド１ｍｇ／ｍｌをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した。０．４ｍｌのペプチド溶液に固形の２ＫＰＥＧ−ＳＰＡ、５ＫＰＥＧ−ＳＰＡまたは２０ＫＰＥＧ−ＳＰＡを添加した。ＰＥＧ-ＳＰＡとペプチドを３：１のモル比となるように十分な固形を加えた。これらの溶液を室温で１時間インキュベートして、反応の過程を溶液５０μｌを用いた逆相分析用ＨＰＬＣによって分析した。すべてのペプチドが修飾されるまでＰＥＧの添加とインキュベートを２度繰り返した。更なる精製をしないでペグ化ペプチドをＢＬｙＳ結合について試験した。精製した抱合ペプチド中のＰＥＧ：ペプチドの比はおよそ１：１である。
競合的置換ＥＬＩＳＡ。１７ｍｅｒのＡｃ−ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＲ−ＮＨ２(配列番号：６) (「ｂｌｙｓ００４８」)を前述のように合成した。ＥＣＦＤＬＬＶＲＨＷＶＰＣＧＬＬＫ（ｂｌｙｓ００９５）(配列番号：６２)を前述のように合成して、２Ｋ、５Ｋおよび２０ＫのＰＥＧ−ＮＨＳ各々と結合させた。Nunc Maxisorp９６ウェルプレートを、２μｇ／ｍｌのＢＬｙＳ溶液１００μｌを含む炭酸塩緩衝液,ｐＨ９．６にて終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳにて洗浄して、１％スキムミルク含有のＰＢＳにてブロックした。３ｎｇ／ｍｌのビオチン化ミニＢＲ３含有のＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて、ミニＢＲ３（配列番号：５０）と上記の１７ｍｅｒペプチドとＰＥＧ-ペプチド抱合体の連続的希釈液を調製した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎにて洗浄した後、各希釈液１００μｌをウェルに移し、室温にて１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎにて洗浄し、１ウェル当たり１００μｌの０．１Ｕ／ｍｌストレプトアビジン-ＰＯＤ(Boehringer Mannheim)含有ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎと共に１５分インキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ、ついでＰＢＳにて洗浄した後、プレートを０．８ｍｇ／ｍｌ  ＯＰＤ(Sigma)と０．０１％Ｈ２Ｏ２含有の１００μｌＰＢＳ基質溶液と共に５分間インキュベートした。反応液１００μｌ／ウェルを１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４にて冷却し、４９０ｎｍで読み込みを行った。競合的置換ＥＬＩＳＡ信号の４つのパラメータに当てはめてＩＣ５０値を測定した。方程式は以下の通りである：ｙ＝ｍ１＋（ｍ２−ｍ１）／（１＋ｍ０／ｍ４）＾ｍ３、ここでｍ１は無限の競合体濃度での吸光度、ｍ２は競合体がないときの吸光度、ｍ３は中間値付近のカーブの傾き、ｍ４はＩＣ５０値、ｍ０は競合体、この場合はペプチドの濃度である。ビオチン化したミニＢＲ３の濃度は約１０ｐＭである。ミニＢＲ３の初期保存用溶液の濃度は量的アミノ酸分析法にて決定した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１Ａ】天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図１Ｂ】天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図２】天然配列ヒトＢＣＭＡをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図３】天然配列ヒトＢＬｙＳをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図４Ａ】天然配列ヒトＡＰＲＩＬをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図４Ｂ】天然配列ヒトＡＰＲＩＬをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）およびその予測されるアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図５】図５Ａは天然配列ヒトＴＡＣＩをコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）（開始コドンと停止コドンを下線で示す）および、図５Ｂはそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図６Ａ】天然配列ヒトＢＲ３をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）（開始コドンと停止コドンを下線で示す）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す
【図６Ｃ】天然配列マウスＢＲ３をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号：  ）（開始コドンと停止コドンを下線で示す）および、図９Ａはそのアミノ酸配列（配列番号：  ）を示す。
【図７】「比較タンパク質」と称するアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称するアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の例示的算出方法を示す。ここでの目的のために、「ＰＲＯ」は、この図でいうところのＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ、ＴＡＬＬ−１、ＡＰＲＩＬ、ＴＡＣＩまたはＢＲ３配列でありうる。
【図８】スプライス変異型と思われる「ｈＴＡＣＩ（２６５）」（配列番号：  ）と、図１Ａ−１Ｂに示す「ｈＴＡＣＩ」である、ＴＡＣＩレセプターの２つのアミノ酸配列の比較を示す。
【図９】ヒト（配列番号：  ）とマウスＢＲ３（配列番号：  ）の配列比較を示し、同一アミノ酸を文字で、保存されたアミノ酸を＋記号でその下に示す。
【図１０】予測される膜貫通領域（囲み）と細胞外領域（下線）を示すヒトＣＤ２０アミノ酸配列（配列番号：６３）を示す。潜在的ドメインは、１−６３：細胞質；６４−８４：膜貫通領域；８５−１０５：膜貫通領域；１０６−１２０：細胞質；１２１−１４１：膜貫通領域；１４２−１８８：細胞外；１８９−２０９：膜貫通領域；２１０−２９７：細胞質；８１−１６７：ジスルフィド結合である。
【図１１】ヒトＣＤ２０の核酸配列（配列番号：６４）。
【図１２】マウス２Ｈ７（配列番号：３７）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号：１５）、およびヒトκ軽鎖サブグループＩ（配列番号：３８）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）のアミノ酸配列を含む配列の比較。２Ｈ７とｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＬのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号３９）、ＣＤＲ２（配列番号４０）、およびＣＤＲ３（配列番号４１）。各々の鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は括弧の範囲内で囲み、示されるように、フレームワーク領域、ＦＲｌ-ＦＲ４が隣接している。２列の配列間の星印は２つの配列の間で異なる部位を示す。残基番号付けは、Rabat 等., Sequences of Immunological Interest. 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従い、挿入をａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅで示す。
【図１３】マウス２Ｈ７（配列番号：２３）、ヒト化２Ｈ７ｖ１６変異体（配列番号：１６）、およびヒト重鎖サブグループＩＩＩの一致配列（配列番号：４２）のＶＨ配列を含む配列の比較。２Ｈ７とｈｕ２Ｈ７．ｖ１６のＶＨのＣＤＲは以下の通りである：ＣＤＲ１（配列番号４３）、ＣＤＲ２（配列番号４４）、およびＣＤＲ３（配列番号４５）。各々の鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は括弧の範囲内で囲み、示されるように、フレームワーク領域、ＦＲｌ-ＦＲ４が隣接している。２列の配列間の星印は２つの配列の間で異なる部位を示す。残基番号付けは、Kabat 等., Sequences of Immunological Interest. 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に従い、挿入をａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅで示す。
【図１４】ｈＣＤ２０ＢＡＣ Ｔｇ＋マウスのマウスＢ２２０＋細胞（Ｂ細胞）でのヒトＣＤ２０導入遺伝子の発現を示す。
【図１５】ｈＣＤ２０  ＢＡＣＴｇマウスにおけるＢ細胞成熟の間のヒトＣＤ２０の発現を示す。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１６】Ｔｇ＋マウスの骨髄での異なる成熟／分化過程にあるＢ細胞（成熟、プレＢと未成熟Ｂ、プロＢ、および祖先細胞（プロジェニタ）Ｂ）でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１７】Ｔｇ＋マウス脾臓Ｂ細胞でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。細胞をＢ細胞を得るためにＢ２２０＋上でゲートした。ＩｇＭとＣＤ２１により、Ｔ２／濾胞性、辺縁帯およびＴ１の多種のＢ細胞サブセット内に描写された。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１８】Ｔｇ＋マウス腸間膜リンパ節（ＬＮ）でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図１９】Ｔｇ＋マウスパイエル板でのヒトＣＤ２０の発現を示すＦＡＣＳプロット。細胞をＢ２２０＋についてゲートした。ＣＤ３８マーカにより胚中心Ｂ細胞と成熟のものを区別する。赤い線はネガティブな対照を示し、導入遺伝子ネガティブな（Ｔｇ−）同腹仔由来の細胞を抗ｈＣＤ２０ｍＡｂで染色した。緑の線はＴｇ＋マウスでのヒトＣＤ２０の染色を示す。Ｔｇ＋マウスはｈＣ２０  ＢＡＣトランスジェニックマウスを指す。
【図２０】ヒトＣＤ２０  Ｔｇ＋マウスでの抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの効果についての実験の概要を示す。第０日目にマウスに１．０ｍｇ（５０ｍｇ／ｋｇに相当）の抗ＣＤ２０抗体を注射し（直線上の上の矢印）、各日（直線の下の赤い矢印で示す）に細胞を分析した。末梢血、脾臓、リンパ節、骨髄およびパイエル板のＦＡＣＳ分析を行った。抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの血清レベルをモニターした。
【図２１】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂでの末梢血Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロット。左のパネルはＩｇＧ対照、すなわち非特異的の同基準標本に相当する抗体で処理した個体を示す。
【図２２】右のパネルは抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによる成熟末梢ＬＮ  Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロットを示す。左のパネルはＩｇＧ対照、すなわち非特異的の同基準標本に相当する抗体で処理した個体を示す。すべてのＢ細胞のＣＤ２１＋ＣＤ２３＋をゲートした。
【図２３】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによって、辺縁帯Ｂ細胞でなくＴ２  Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロット。
【図２４】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂによって未成熟／プレＢ細胞でなく再環流成熟Ｂ細胞の枯渇を示すＦＡＣＳプロット。赤はＩｇＧ処置群、緑はｈＣＤ２０を発現する抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処置マウス群を表す。ＩｇＧ処置マウス群（赤）はｈＣＤ２０発現成熟Ｂ細胞を保持しているが、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処置群はｈＣＤ２０保持細胞を枯渇した。ヒトＣＤ２０発現を非結合およびＡｂ結合ＣＤ２０両方の検出のためにモニターした。
【図２５】抗ｈＣＤ２０ｍＡｂに対するパイエル板胚中心Ｂ細胞の耐性を示すＦＡＣＳプロット。左のパネルは対照ＩｇＧ処置マウス群由来の細胞を示す。右のパネルは抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置Ｔｇ＋マウス群由来の細胞を示す。
【図２６】Ｔｇ＋マウスの抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ処置後の末梢血でのＢ細胞の枯渇と回復を示すＦＡＣＳプロット。上のパネルは対照ｍＡｂ処置マウス群由来の細胞の染色を示す。第１日目にマウスに抗体を投与した。時間と共に、ｈＣＤ２０を発現しない前駆Ｂ細胞はＣＤ２０＋成熟Ｂ細胞に分化した（第６および第１４週目の染色を参照）
【図２７】短期（単回投与）の抗ＣＤ２０ｍＡｂ処置に対する脾臓胚中心Ｂ細胞の耐性を示すＦＡＣＳプロット。胚中心形成を誘導するためにヒツジ赤血球細胞で免疫化して８日後に、一群のマウスをヒトＣＤ２０に対するｍ２Ｈ７ｍＡｂで処置した。マウスの対照群はｍＩｇＧ２ａ同基準抗体で処置した。第１２日目にマウスの脾臓細胞を分析した。胚中心のＰＮＡ（ピーナッツ凝集素）を染色した。胚中心Ｂ細胞は抗ＣＤ２０処置にて枯渇しなかった。
【図２８】枯渇されない辺縁帯（ＭＺ）とＢ１Ｂ細胞がＴ非依存性の抗原に対して保護することを示すＦＡＣＳプロット。右の３つのパネルでは、脾臓細胞を連鎖球菌多糖類ホスファチジル基コリン（ＴＩ抗原）について染色した。ＣＤ１３８は血漿細胞に対するマーカである。
【図２９】実施例４に記載のように動物モデルをＢＬｙＳアンタゴニスト、ＢＲ３−Ｆｃ、および抗ＣＤ２０ｍＡｂであるｍ２Ｈ７の組合せで処置した時の異なる生物学的効果を示す。脾臓、血液、リンパ節Ｂ細胞（ＣＤ２１＋ＣＤ２３＋でゲート）についてＦＡＣＳ分析を行った。組み合わせて処置するとＢ細胞、特に脾臓の辺縁帯、Ｔ２および濾胞性Ｂ細胞の枯渇において明らかに相乗効果が見られた。
【図３０】実施例４に記載のように、ヒトＣＤ２０  Ｔｇ＋マウスを抗ｈＣＤ２０ｍＡｂとＢＲ３−Ｆｃを組み合わせた時のＢ細胞枯渇に対する相乗効果を示す。マウスを対照ＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃ（マウス当たり１００μｇ、１２日間毎日ＩＰ）、抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（マウス当たり１００μｇ、第９日目にＩＰ）又はＢＡＦＦＲ／ＢＲ３−Ｆｃおよび抗ｈＣＤ２０ｍＡｂ（単一処置群として同じ投薬）の組合せで処置した。Ｂ２２０＋脾細胞は、第１３日目に単離して、ＣＤ２１およびＣＤ２３について染色した。一群当たりＮ＝５マウス。
【図３１】実施例４と図３０に記載のように、０．１ｍｇの対照ＩｇＧ２ａ、ＢＡＦＦ／ＢＲ３−Ｆｃ又は抗ｈＣＤ２０ｍＡｂの単回用量で処置したマウスを除き、ｈＣＤ２０  Ｔｇ＋マウス由来のＢ２２０＋総脾臓Ｂ細胞（ＭＺ＋ＦＯ＋Ｔ１＋Ｔ２のすべてのサブセット）、辺縁帯（ＭＺ）および濾胞性（ＦＯ）Ｂ細胞の枯渇の量を示す。脾細胞を第４日目に分析した。一群当たりＮ＝５マウス。
【図３２Ａ】抗親和性ＢＬｙＳ結合についてファージディスプレイライブラリから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号：６５−１４２）を示す。
【図３２Ｂ】抗親和性ＢＬｙＳ結合についてファージディスプレイライブラリから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号：６５−１４２）を示す。
【図３２Ｃ】抗親和性ＢＬｙＳ結合についてファージディスプレイライブラリから選択した１７ｍｅｒのアミノ酸配列（配列番号：６５−１４２）を示す。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２Ａ】
2007526220.tif 000044
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２Ｂ】
2007526220.tif 000045
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３２Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３２Ｃ】
2007526220.tif 000046
【国際調査報告】
2007526220.tif 000047
2007526220.tif 000048
2007526220.tif 000049
2007526220.tif 000050
2007526220.tif 000051
2007526220.tif 000052
2007526220.tif 000053