(57)【要約】亜麻油種子をそこから粘液を除去するため最初に抽出した後、粉砕して油を回収し、粕を生成する手順で、亜麻タンパク質単離物を得る。次いで、この亜麻タンパク質粕を処理して、そこから亜麻タンパク質単離物を回収する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜麻タンパク質単離物を調製する方法であって、
最初に亜麻油種子を抽出して、そこから粘液を除去すること、
前記抽出した油種子を粉砕して、油を回収し粕を残すこと、および
前記粕を処理して、そこから亜麻タンパク質単離物を回収すること
を含む方法。
【請求項２】
前記最初に油種子を抽出してそこから粘液を除去することが、アルカリ性材料の弱アルカリ性水溶液を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記弱アルカリ性溶液が、約７．５〜約９のｐＨを有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記最初に油種子を抽出してそこから粘液を除去することが、重炭酸ナトリウムの水溶液によってそのままのｐＨで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
約３０〜約７０℃の温度で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
約５０℃の温度で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
種子と溶液の比が約１：１〜約１：２０で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
種子と溶液の比が約１：５〜約１：１０で実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液が、濃度約０．２〜約０．７Ｍの弱アルカリ性材料を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液中で約１５〜約６０分間前記油種子を撹拌することによって実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記水溶液中で約３０〜約６０分間前記油種子を撹拌することによって実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記油種子からそれ以上粘液が抽出されなくなるまで、前記油種子を複数回抽出する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記弱アルカリ性材料が、重炭酸ナトリウムである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記最初に油種子を抽出してそこから粘液を除去することが、ｐＨ約６．０〜約７．５の重炭酸ナトリウム水溶液中で約１５〜約６０分間、約３０〜約７０℃の温度で、種子と溶液の比が約１：１〜約１：２０で前記種子を撹拌することによって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記重炭酸ナトリウム水溶液が、約０．２〜約０．７Ｍの濃度を有し、前記油種子と溶液の比が、約１：５〜約１：１０であり、前記撹拌が、約３０〜約６０分間実施され、油種子の抽出が、前記油種子から粘液が抽出されなくなるまで複数回実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
濃度約０．５Ｍの０．５Ｍの重炭酸ナトリウム水溶液を使用して、約５０℃で、種子と溶液の比が約１：１０で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記亜麻油種子粕が、前記粕をアルカリ性水溶液で抽出して生成した亜麻タンパク質のアルカリ性溶液から亜麻タンパク質溶液を等電沈澱することを含む手順により、亜麻タンパク質単離物を回収するために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
濃度約５〜約４０ｇ／Ｌのタンパク質水溶液を用意するために、ｐＨが約５〜約７でイオン強度が少なくとも約０．１０Ｍの塩化ナトリウム水溶液を使用して抽出することにより、前記亜麻油種子粕中のタンパク質を可溶化し、
前記タンパク質水溶液を、選択的膜技術により少なくとも約１５０ｇ／Ｌの濃度に濃縮し、
前記濃縮タンパク質溶液を約１５℃未満の温度の水で希釈してタンパク質ミセルを形成し、
前記タンパク質ミセルを亜麻タンパク質単離物のタンパク質ミセル集塊物として集め回収すること
により、亜麻タンパク質溶液を回収するために前記亜麻油種子粕が処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質ミセル集塊物を乾燥する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質ミセル集塊物の回収で残った液体を処理して、さらなる量の亜麻タンパク質単離物を回収する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質含有量が少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）であって、分子量が約１６２，０００〜１６９，０００Ｄａの７Ｓタンパク質を含む、亜麻タンパク質単離物。
【請求項２２】
タンパク質含有量が少なくとも約１００重量％（Ｎ×６．２５）である、請求項２１に記載の亜麻タンパク質。
【請求項２３】
実質的に変性されていない、請求項２１に記載の亜麻タンパク質。
【請求項２４】
７Ｓタンパク質を約６０〜約９５重量％、リニンを０〜約２０重量％、コリニンを０〜約２０重量％含む、請求項２１に記載の亜麻タンパク質。
【請求項２５】
分子量が約１６２，０００〜１６９，０００である亜麻の７Ｓタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、亜麻油種子粕からの亜麻タンパク質単離物の回収に関する。
関連出願の参照
本出願は、米国特許法第１１９条の（ｅ）に基づき、２００３年８月１日出願の米国特許出願第６０／４９１，５６４号および２００３年１１月４日出願の同第６０／５１６，８７５号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本願の譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む２００２年１０月９日出願の米国特許出願第１０／２６６，６７７号（ＷＯ０３／０３０６５２）は、亜麻タンパク質単離物の調製について記載している。その明細書に記載されているように、乾燥重量基準でケルダール窒素×６．２５（Ｎ×６．２５）で測定した場合、タンパク質含有量が少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約１００重量％である亜麻油種子タンパク質単離物が提供される。
【０００３】
こうした方法では、水溶性粘液の存在によりタンパク質溶液を高タンパク質含有物に濃縮することができないため、亜麻タンパク質単離物の収率は限られる。亜麻種子粘液は、実質的に多糖からなる粘着性物質である。他の方法によって亜麻油種子粕から分離したタンパク質生成物に粘液が存在すると、単離物として分類するのに十分に高いタンパク質含有量を有する生成物を生成することが困難となる。
【０００４】
様々な沈降係数（Ｓ）によって区別される、タンパク質および複数の異なるタンパク質成分を約３４〜約３７重量％含むことが知られている亜麻種子が知られている。こうしたタンパク質としては、リニンとして知られる１２Ｓグロブリンおよびコリニンとして知られる２Ｓアルブミンがを含まれる。
【０００５】
Ａｇｒｉｃｏｒｅ  Ｕｎｉｔｅｄから販売されているリノーラ（Ｌｉｎｏｌａ）（登録商標）油種子は、亜麻油種子中の脂肪酸組成物が変えられた亜麻油種子の変種であり、リノレン酸（Ｃ１８：３）が、従来の品種改良操作によって従来の亜麻油種子の約５０％から約２％へと大幅に減らされている。こうした改良により、得られたリノーラ油種子から脂肪酸組成物においてひまわり油と実質的に同様の食用ポリ不飽和油が提供された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今回、驚くべきことに、粘液を除去するために重炭酸ナトリウムの弱アルカリ性溶液を使用して高温で亜麻種子の最初の抽出を行うと、その後非常に高い濃度の濃縮タンパク質水溶液を生成することができ、得られる亜麻タンパク質単離物の収率を向上させることができることが分かった。さらに、等電沈澱またはミセル経路によって、亜麻タンパク質粕から亜麻タンパク質単離物を生成することができる。
【０００７】
さらに、本発明の亜麻タンパク質単離物の主なタンパク質成分は、７Ｓタンパク質であり、リニンとして知られる１２Ｓグロブリンの半分であるように見え、ＢｉｏＲａｄの動物タンパク質標準と比較してＨＰＬＣ保持時間を測定して、約１６２，０００〜１６９，０００Ｄａの分子量を有することが分かった。本発明の亜麻タンパク質単離物の他のタンパク質成分は、ＢｉｏＲａｄの動物タンパク質標準と比較してＨＰＬＣ保持時間を測定して、約４１５，０００〜４４０，０００Ｄａの分子量を有するリニン、およびＢｉｏＲａｄの動物タンパク質標準と比較してＨＰＬＣ保持時間を測定して、約１６，０００〜１７，０００Ｄａの分子量を有するコリニンを含む。
【０００８】
さらに、これらのタンパク質成分の相対的な割合は、本発明のタンパク質ミセル集塊物（ＰＭＭ）由来亜麻タンパク質単離物と上澄液由来亜麻タンパク質単離物とでは類似していることが分かった。
【０００９】
特に、タンパク質含有量が少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％であるＰＭＭ由来亜麻タンパク質単離物は、約６５〜９５重量％が７Ｓ亜麻タンパク質（リニンの半分）、約０〜２０重量％がリニン、約０〜２０重量％がコリニンであるタンパク質成分含有量を有することが分かった。タンパク質含有量が少なくとも約９０重量％（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％である上澄液由来亜麻タンパク質単離物は、約６５〜９５重量％が７Ｓ亜麻タンパク質（リニンの半分）、約０〜２０重量％がリニン、約０〜２０重量％がコリニンであるタンパク質成分含有量を有することが分かった。
【００１０】
ＰＭＭ由来および上澄液由来の亜麻タンパク質単離物についてのタンパク質成分特性（ｐｒｏｆｉｌｅ）の類似性は、亜麻タンパク質単離物が使用される環境において類似した性質（ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）をもたらす。類似したタンパク質含有物特性により、組成物を変えることなく所望の割合でＰＭＭ由来亜麻タンパク質単離物と上澄液由来亜麻タンパク質単離物を一緒にすることが可能であり、したがってプロセスの収率が増大する。
【００１１】
ＰＭＭ由来、上澄液由来および等電沈澱（ＩＥＰ）由来の亜麻タンパク質単離物は、非常に似たアミノ酸特性を有する。得られたアミノ酸特性を、以下の実施例において説明する。
【００１２】
本発明は、特有のタンパク質特性を有する亜麻タンパク質単離物および油種子の最初の抽出を含む亜麻タンパク質単離物の調製方法を提供する。タンパク質単離物は、Ｎ×６．２５のケルダール窒素変換率でタンパク質を少なくとも約９０重量％含有するタンパク質と定義される。本明細書で使用する「タンパク質含有量」という用語は、乾燥重量基準で表したタンパク質単離物中のタンパク質の量を指す。
【００１３】
本明細書の方法に従って調製される亜麻タンパク質単離物は、加工食品のタンパク質強化、油脂の乳化、べーク製品（ｂａｋｅｄ  ｇｏｏｄｓ）の本体形成材およびガス混入させる製品における発泡剤など、タンパク質単離物の従来の応用分野で使用できる。さらに、タンパク質単離物を、肉類似物に有用なタンパク質繊維に形成し、卵白を結合材として使用する食料品における卵白代用物または増量材として使用することもできる。亜麻タンパク質単離物は、栄養補助食品としても使用できる。亜麻タンパク質単離物の他の使用は、ペットフード、動物飼料、工業および化粧品への利用ならびに介護（ｐｅｒｓｏｎａｌ  ｃａｒｅ）製品においてである。
（発明の一般的な説明）
亜麻種子の最初の抽出は、一般にｐＨが約７．５〜約９の水溶液、好ましくはそのままのｐＨのアルカリ性材料の水溶液を使用し、約３０℃〜約７０℃、好ましくは約５０℃の高い温度で行われる。亜麻油種子の抽出は、約０．２〜約０．７Ｍの弱いアルカリ性材料を含有する水溶液を使用して、種子と溶液の比が約１：１〜約１：２０、好ましくは約１：５〜約１：１０で行われ得る。好ましくは、約５０℃で亜麻種子と溶液の比が約１：８で、濃度が約０．５Ｍである重炭酸ナトリウム水溶液を使用する。
【００１４】
一般に、約１５〜約６０分間、好ましくは約３０〜約６０分間、アルカリ性水溶液に油種子を撹拌しながら混合することによって油種子の１回目の抽出をした後、粘液が油種子からさらに抽出されなくなるまで、新しいアルカリ性水溶液で抽出を繰り返すことが好ましい。
【００１５】
次いで、抽出油種子を処理して油を回収し、油種子粕がもたらされ、この油種子粕から亜麻タンパク質単離物を生成することができる。
【００１６】
亜麻タンパク質単離物を亜麻油種子粕から生成することができる手順の１つは、等電沈澱によるものである。本発明で提供されるような粘液を最初に除去することを実施するより前には、本出願人は、亜麻油種子粕の等電沈澱処理で亜麻タンパク質単離物を生成させることができなかった。等電沈澱は、一般に、他のタンパク質単離物、例えば、大豆タンパク質単離物を調製するのに使用される。
【００１７】
こうした等電沈澱では、亜麻油種子粕またはリノーラ油種子粕は、アルカリ性水溶液、一般にｐＨが約８〜約１２、好ましくは約９〜約１１の水酸化ナトリウム水溶液で、約０〜約４０℃、好ましくは約１５〜２５℃の温度で、粕濃度が約２．５〜約１０％ｗ／ｖ、好ましくは約５％ｗ／ｖで抽出される。
【００１８】
この粕の抽出に続いて、残存する粕をタンパク質水溶液から、例えば、真空ろ過、続いて遠心分離および／またはろ過を使用するなど好都合な任意のやり方で分離して、残存する粕を取り除く。分離した残存粕を廃棄のために乾燥してもよい。
【００１９】
次いで、塩酸など従来の任意の酸を使用してこの亜麻タンパク質溶液を、ｐＨが約３〜約５、好ましくは約４に酸性化して、亜麻またはリノーラタンパク質単離物の沈澱物を形成させる。この沈澱物を、上澄液から除去し乾燥する。乾燥した等電沈澱（ＩＥＰ）による亜麻タンパク質単離物は、約９０重量％（Ｎ×６．２５）よりも高い、好ましくは少なくとも約１００重量％の高タンパク質含有量を有する。
【００２０】
あるいは、そして好ましくは、この亜麻タンパク質単離物は、前述の同時係属米国特許出願第１０／２６６，６７７号に記載される手順に従って調製される。この方法は、一連のバッチ操作または連続的もしくは半連続的な方法で実施され得る。
【００２１】
前述の適用の手順による亜麻タンパク質単離物を生成する方法の最初のステップは、亜麻油種子粕からのタンパク質性物質を可溶化するものである。亜麻種子粕から回収されるタンパク質性物質は、亜麻種子中に天然に存在するタンパク質でもよく、またはそのタンパク質性物質が遺伝子操作で改変されているが、天然タンパク質に特徴的な疎水性および極性の性質を有するタンパク質でもよい。亜麻粕は、様々なレベルの非変性タンパク質を含む亜麻油種子から亜麻油を除去して得られる、例えば、熱へキサン抽出または低温油押出法で得られるいずれの亜麻粕も可能である。亜麻油種子からの亜麻油の除去は、本明細書に記載するタンパク質単離物回収方法の中の分離操作として実施される。
【００２２】
タンパク質の可溶化は、塩が存在すると油種子粕からの可溶性タンパク質の回収が増加するので、塩溶液を使用して実施するのが最も効率的である。この塩は、塩化カリウムなど他の塩も使用できるが、通常は塩化ナトリウムである。塩溶液は、可溶化が行われるかなりの量のタンパク質の可溶化を可能にするために、少なくとも約０．１０Ｍ、好ましくは少なくとも約０．１５Ｍ、一般には約２．０Ｍまでのイオン強度を有する。塩溶液のイオン強度が増加すると、油種子粕中のタンパク質の可溶化は、最初、最大値に達するまで増加する。その後はどんなにイオン強度が増加しても、可溶化されるタンパク質の総量は増加しない。最大のタンパク質可溶化を生じさせる塩溶液のイオン強度は、関係する塩および選択する油種子粕によって異なる。
【００２３】
イオン強度が増加するにつれて、タンパク質の沈澱に必要とされる希釈の度合が大きくなるので、通常、約１．０未満、より好ましくは約０．１５〜約０．６の値のイオン強度値を利用することが好ましい。
【００２４】
バッチ法では、タンパク質の塩可溶化を、約０℃より高い、好ましくは約３５℃までの温度で実施し、好ましくは撹拌を行って可溶化時間を短縮する。可溶化時間は通常では約１０〜約９０分である。生成物の収率を向上させるために、可溶化を実施して、油種子粕から実質的に最大量のタンパク質を抽出することが好ましい。好ましい温度上限として約３５℃が選択される。バッチ方式ではそれより高い温度レベルではこの方法は非経済的になるからである。
【００２５】
連続法では、亜麻油種子粕からのタンパク質の抽出は、亜麻油種子粕からのタンパク質の連続抽出を実施するのに矛盾しない任意の方式で実施する。一実施形態では、亜麻油種子粕を連続的に塩溶液と混合し、本明細書に記載のパラメータによる所望の抽出を実施するのに十分な滞留時間になるように、適当な長さのパイプまたは導管を通して、そして適当な流速でその混合物を輸送する。このような連続方式では、塩可溶化ステップを最長約１０分間で速やかに実施し、好ましくは可溶化を実施して亜麻油種子粕から実質的に最大量のタンパク質を抽出する。連続方式での可溶化は、好ましくは高温で、一般には最高で約６０℃またはそれ以上で実施される。
【００２６】
塩水溶液および亜麻油種子粕は、以下でより詳細に説明するように、タンパク質単離物がミセル経路で形成されることを可能にするために、そのままのｐＨが約５〜約７である。亜麻またはリノーラタンパク質単離物を収率最大にするための最適ｐＨ値は、選択した亜麻油種子粕によって異なる。
【００２７】
ｐＨ範囲の限界点およびその付近では、タンパク質単離物の形成は、ミセル経路により部分的にのみ、かつｐＨ範囲内の他の点で得られるよりも低収率で生じる。これらの理由により、ｐＨ値は約５．３〜約６．２が好ましい。
【００２８】
抽出ステップで使用するために、必要に応じ、好都合な任意の酸、通常は塩酸、またはアルカリ、通常は水酸化ナトリウムを用いて、塩溶液のｐＨを約４〜約７の範囲内の任意の所望値に調整することができる。
【００２９】
可溶化ステップにおける塩溶液中の油種子粕の濃度は、広範囲にわたって変わり得る。典型的な濃度値は、約５〜約１５％ｗ／ｖである。
【００３０】
塩水溶液によるタンパク質抽出ステップは、亜麻種子粕中に存在するかもしれない油脂を可溶化する追加の効果を有し、その結果水相中に油脂が存在することになる。
【００３１】
抽出ステップから得られるタンパク質溶液は、一般に、約５〜約４０ｇ／Ｌ、好ましくは約１０〜約３０ｇ／Ｌのタンパク質濃度を有する。
【００３２】
次いで、真空ろ過を使用するなど、好都合な任意の方式で、抽出ステップで得た水相を残りの亜麻油種子粕から分離し、続いて遠心分離および／またはろ過を行って、残存粕を除去する。分離した残存粕は、廃棄のために乾燥してもよい。
【００３３】
亜麻種子粕がかなりの量の油脂を含む場合には、次いで、本願の譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載の、カノーラのための脱脂ステップを、以下で述べる分離タンパク質水溶液および濃縮タンパク質水溶液について実施することができる。
【００３４】
水だけを使用すると、亜麻油種子粕からのタンパク質の抽出が塩水溶液よりも少なくなる傾向があるが、亜麻油種子粕を塩水溶液で抽出する代わりに、こうした抽出を水のみを用いて行うこともできる。こうした代替法を採用した場合には、その後、残りの亜麻油種子粕から分離した後、以下で記載する濃縮ステップでタンパク質を溶液中に維持するために、そのタンパク質溶液に上で述べた濃度で塩を添加することができる。
【００３５】
次いで、そのイオン強度を実質的に一定に維持しながら、タンパク質水溶液を濃縮して、そのタンパク質濃度を高める。一般に、こうした濃縮を実施して、タンパク質濃度が少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも約２５０ｇ／Ｌである濃縮タンパク質溶液を得る。
【００３６】
濃縮ステップは、約３，０００〜約１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンなど、適当な分子量カットオフをもつ中空糸膜やスパイラル膜などの膜を用いた、限外ろ過やダイアフィルトレーションなど好都合な任意の選択膜技術を使用することなどにより、様々な膜材料および構造を考慮し、連続操作の場合はタンパク質水溶液が膜を通過する際に所望の濃縮度が可能になるような寸法とし、バッチまたは連続操作に合った任意の好都合な方式で実施することができる。
【００３７】
次いで、この濃縮タンパク質溶液は、抽出溶液と同じモル濃度およびｐＨの塩水溶液、通常は塩化ナトリウム水溶液を使用してダイアフィルトレーションステップにかけることができる。こうしたダイアフィルトレーションは、ダイアフィルトレーション溶液約２〜約２０容量、好ましくはダイアフィルトレーション溶液約５〜約１０容量を使用して実施することができる。ダイアフィルトレーション操作では、透過液が膜を通過することによってタンパク質水溶液からさらに大量の汚染物が除去される。かなりの量の汚染物が透過液中に存在しなくなるまで、ダイアフィルトレーション操作を実施することができる。こうしたダイアフィルトレーションは、様々な膜材料および構造を考慮し、約３，０００〜約１０，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜約１０，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフを有する膜を使用して実施することができる。
【００３８】
酸化防止剤は、ダイアフィルトレーションステップの少なくとも一部でダイアフィルトレーション媒質中に存在させることができる。この酸化防止剤は、亜硫酸ナトリウムやアスコルビン酸など好都合な任意の酸化防止剤とすることができる。ダイアフィルトレーション媒質中で使用する酸化防止剤の量は、使用する材料によって変わり、約０．０１〜約１重量％の範囲で変わり得、好ましくは約０．０５重量％である。
【００３９】
この濃縮ステップおよび任意のダイアフィルトレーションステップは、好都合な任意の温度、一般には約１５〜約６０℃で、所望の濃縮度をもたらす期間実施することができる。使用する温度および他の条件は、濃縮および溶液の所望のタンパク質濃度をもたらすために使用する膜の設備にある程度まで依存する。
【００４０】
周知のように、限外ろ過および類似の選択膜技術により、高分子量の種が通過するのを阻止すると同時に低分子量の種を通過させることができる。低分子量の種には、食品級塩のイオン種だけでなく、炭水化物、色素、抗栄養因子など原料から抽出される低分子量物質、ならびにタンパク質の任意の低分子量型が含まれる。膜の分子量カットオフは、通常、確実に汚染物を通過させると同時に溶液中のタンパク質のかなりの部分を保持するように、さまざまな膜材料および配置を考慮して選択される。
【００４１】
濃縮および任意のダイアフィルトレーションにかけた（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）タンパク質溶液は、低温殺菌を受けて、貯蔵またはその他により、最初の粕に存在する可能性があり、かつ抽出ステップで亜麻タンパク質単離物溶液に粕から抽出されるかもしれないバクテリアを、殺菌することができる。所望の任意の低温殺菌条件下で、こうした低温殺菌を実施することができる。一般に、濃縮および任意のダイアフィルトレーションにかけたタンパク質溶液を、約５５〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の温度に、約１０〜約１５分間、好ましくは約１０分間加熱する。次いで、低温殺菌した濃縮タンパク質溶液を、以下に記載するさらなる工程で、好ましくは約２５〜約４０℃の温度に冷却する。
【００４２】
濃縮ステップで使用する温度に応じて、濃縮タンパク質溶液を、少なくとも約２０〜約６０℃まで、好ましくは約２５〜約４０℃の温度に加温し、濃縮タンパク質溶液の粘度を低減して、後に続く希釈ステップおよびミセル形成の実施を容易にすることができる。冷水で希釈した際に、その温度を超えると濃縮タンパク質溶液の温度によりミセルの形成が不可能になる温度を超えて、濃縮タンパク質溶液を加熱すべきではない。米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号に記載されているように、必要に応じて、濃縮タンパク質溶液をさらなる脱脂操作にかけることができる。
【００４３】
次いで、濃縮ステップおよび任意の脱脂ステップから得られる濃縮タンパク質溶液を希釈して、濃縮タンパク質溶液を所望の希釈度を実現するのに必要な容量の冷水と混合することによってミセルを形成させる。この濃縮タンパク質溶液を、約１５倍以下、好ましくは約１０倍以下まで希釈する。
【００４４】
タンパク質ミセル集塊物の形でのタンパク質単離物の収率の向上は、使用する希釈率でのこうした低温により達成されるので、濃縮タンパク質と混合する冷水は、約１５℃未満の温度、一般には約３〜約１５℃、好ましくは約１０℃未満の温度である。
【００４５】
バッチ操作では、上で述べたように、濃縮タンパク質溶液のバッチを、所望の容量を有する静止している大量の冷水に添加する。濃縮タンパク質溶液の希釈およびその結果として起こるイオン強度の低下により、ミセル状に分離したタンパク質小滴の形で高度に会合したタンパク質分子の雲様集塊物の形成が生じる。バッチ法では、大量の冷水中にタンパク質ミセルを沈降させて、凝集し合着した、密で無定形の粘着性グルテン様タンパク質ミセル集塊物（ＰＭＭ）を形成させる。遠心分離などによって沈降を補助することができる。こうして誘導した沈降により、タンパク質ミセル集塊物の液体含有量が減少し、それによって水分含有量が、ミセル集塊物総量に対して、一般には約７０重量％〜約９５重量％から、一般には約５０重量％〜約８０重量％の値にまで減少する。このようにしてミセル集塊物の水分含有量が減少すると、ミセル集塊物の吸蔵された塩の含有量、ひいては乾燥分離物の塩含有量が減少する。
【００４６】
あるいは、Ｔ型パイプの一方の流入口に濃縮タンパク質溶液を連続的に通過させ、同時に、Ｔ型パイプの他の流入口に希釈水を供給し、パイプ中で混合できるようにして希釈操作を連続的に実施することができる。濃縮タンパク質溶液の所望の希釈度を達成するのに十分な割合で、Ｔ型パイプの中に希釈水を供給する。
【００４７】
濃縮タンパク質溶液と希釈水とをパイプ中で混合することにより、タンパク質ミセルの形成が始まり、Ｔ型パイプの出口から沈降槽に混合物が連続的に供給され、沈降槽が満杯になると、そこから上澄液がオーバーフローすることができる。液体本体内での乱れを最小にする方法で、沈降槽中の液体内部に混合物を供給することが好ましい。
【００４８】
連続方式では、タンパク質ミセルを沈降槽内で沈降させて、凝集し合着した、密で無定形で、粘着性のグルテン様タンパク質ミセル集塊物（ＰＭＭ）を形成させ、この手順を沈降槽の底部に所望量のＰＭＭが蓄積するまで継続し、その後、蓄積したＰＭＭを沈降槽から取り出す。
【００４９】
この沈降集塊物からの残留水相のデカンテーションまたは遠心分離などによって、残留水相または上澄液から沈降分離物を分離する。ＰＭＭは、湿潤形で使用してもよいし、噴霧乾燥、凍結乾燥または真空ドラム乾燥など、任意の従来技術によって乾燥させて乾燥形にすることができる。乾燥亜麻タンパク質単離物は、高タンパク質含有量、約９０重量％を超えるタンパク質、好ましくは少なくとも約１００重量％のタンパク質（Ｎ×６．２５）を有し、実質的に未変性である（示差走査熱量測定法で判定して）。また、脂肪油種子粕から単離される乾燥タンパク質単離物は、米国特許第５，８４４，０８６号および同第６，００５，０７６号の方法を使用した場合、約１重量％未満の低い残留脂肪含有量を有する。
【００５０】
ＰＭＭ形成および沈降ステップからの上澄液には、希釈ステップで沈降しなかった、かなりの量の亜麻タンパク質が含まれている。この上澄液を処理して、そこからさらに大量のタンパク質を回収することができる。
【００５１】
こうした方法では、ＰＭＭを取り除いた後に、希釈ステップからの上澄液を濃縮して、そのタンパク質濃度を増加させることができる。こうした濃縮は、溶液中の亜麻タンパク質を保持しながら、食品級塩および原料から抽出される非タンパク質性低分子量種を含む低分子量種を膜を通して通過させることのできる、適切な分子量カットオフを持つ膜を使用する、限外ろ過などの好都合な任意の選択膜を使用して実施される。様々な膜および構造を考慮し、約３０００〜１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外ろ過膜を使用できる。このようにして上澄液を濃縮すると、タンパク質を回収するために乾燥する必要のある液体の容量が減少し、したがって乾燥に必要なエネルギーも減少する。一般には、乾燥する前に、上澄液を約５０〜３００ｇ／Ｌ、好ましくは約１００〜約２００ｇ／Ｌのタンパク質濃度まで濃縮する。
【００５２】
濃縮上澄液を、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空ドラム乾燥など好都合な任意の技術によって乾燥して乾燥形態とし、更なる亜麻タンパク質単離物を得る。こうしたさらなる亜麻タンパク質単離物は、高いタンパク質含有量、通常約９０重量％を超え、好ましくは少なくとも１００重量％のタンパク質（Ｎ×６．２５）を有し、（示差走査熱量測定法で判定して）実質的に未変性である。所望により、湿潤ＰＭＭを濃縮上澄液と一緒にした後、この一緒にしたタンパク質流れを好都合な任意の技術によって乾燥し、複合亜麻タンパク質単離物を得ることができる。複合亜麻タンパク質単離物は、約９０重量％を超え（Ｎ×６．２５）、好ましくは少なくとも約１００重量％の高いタンパク質含有量を有し、（示差走査熱量測定法で判定して）実質的に未変性である。
【００５３】
別の代替法としては、濃縮上澄液の一部のみをＰＭＭの少なくとも一部および得られた乾燥済み混合物と混合することができる。濃縮上澄液の残りをなんらかのＰＭＭの残留物として乾燥できる。さらに、乾燥ＰＭＭおよび上澄乾燥物を、どんな所望相対比にも乾燥混合することができる。
【００５４】
この方式で操作することによって、多くの亜麻タンパク質単離物を、様々な機能的および栄養学的性質を達成するのに望ましい、乾燥ＰＭＭ、乾燥上澄物、およびＰＭＭと上澄物の様々な重量比、一般には約５：９５〜約９５：５の乾燥混合物の形で回収することができる。
【００５５】
あるいは、カノーラタンパク質単離物回収のための、本願の譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む２００４年２月１７日出願の同時係属米国特許出願第６０／５４４，３４６号に記載の方法を使用して、亜麻タンパク質単離物を回収することができる。そこに記載される方法によれば、タンパク質溶液濃縮ステップから得られる濃縮タンパク質溶液を処理してＰＭＭを生成し、別々に上澄液を処理する代わりに直接乾燥する。上で述べたように、場合によりダイアフィルトレーションおよび脱脂も行った濃縮タンパク質溶液の乾燥は、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空ドラム乾燥など従来のいずれの方法でも実施することができる。
【００５６】
一般に、直接乾燥法によって形成されたタンパク質単離物は、上で述べた方法によって得られるものよりも、特に高い塩含有量のために純度が劣るので、このタンパク質単離物をヒト用以外の用途で使用することが好ましいが、このタンパク質単離物を処理して、透析によってなど好都合な任意の方法で塩含有物を減らすことができる。
【００５７】
所与のどんなタンパク質単離物におけるそれぞれのタンパク質の相対量も、分析的分離技術など従来のいずれの分析技術によっても決定することができる。これらの技術のうち最も一般的なものは、サイズに基づいて分離ができるカラム中で選択的媒質を使用するものである。ゲルパーミエーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）の応用例では、球状ゲル様材料を使用する。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のように圧力を使用する場合は、剛直な媒質を使用する。後者の技術は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）としても知られている。本明細書に記載するように調製した亜麻タンパク質単離物のサンプルにこうした技術を使用して得た結果は、以下の実施例に含まれている。
【００５８】
ＰＭＭ由来亜麻タンパク質単離物および上澄液由来亜麻タンパク質単離物は、主に、分子量が約４１５，０００〜４４０，０００Ｄａである少量のリニンと共に、分子量が約１６２，０００〜１６９，０００Ｄａである７Ｓ亜麻タンパク質（リニンの半分）および分子量が約１６，０００〜１７，０００Ｄａであるコリニンからなる。一般に、ＰＭＭ由来タンパク質は、７Ｓ亜麻タンパク質（リニンの半分）を約６５〜９５重量％、リニンを約０〜２０重量％、コリニンを約０〜２０重量％含む。一般に、上澄液由来タンパク質は、７Ｓ亜麻タンパク質（リニンの半分）を約６５〜９５重量％、リニンを約０〜２０重量％、コリニンを約０〜２０重量％含む。
実施例
【００５９】
実施例１
この実施例では、リノーラ油種子粕からの粘液の除去について例証する。
高速に設定したオーバーヘッドミキサを使用して、種子：溶媒比が１：８の重炭酸ナトリウム水溶液をリノーラ油種子と１時間５０℃で混合することによって、重炭酸ナトリウムの濃度値を変えて、リノーラ油種子を洗浄した。
種子から回収した粘液の量を比較するために、試験する各濃度の炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄を行った。総量５００ｇのリノーラを、各濃度の炭酸水素ナトリウム４Ｌ中で洗浄した。
各洗浄からの上澄液をデカンテーションし、各上澄液からの１００ｍｌを８８％エタノールで１：１に希釈して、いずれの可溶化粘液も沈澱させた。次いで、この粘液を集め乾燥して、種子から除去した粘液の総量を計算した。
様々な濃度の重炭酸ナトリウム溶液で抽出した量を、表Ｉに示す。
【００６０】
【表１】
2007520442.tif 000002
表Ｉから分かるように、０．５Ｍの重炭酸ナトリウム濃度が、より低い濃度よりもはるかに粘液を除去するのに効率的である。さらに、０．５Ｍの濃度では、種子はまだ、粘液に起因する粘性によるねばねば感を有する。２回目の同じ洗浄を行い、さらに粘液３４ｇが除去された。この２回目の洗浄に続いて、３回目の洗浄を行い、さらに粘液３６．４ｇが除去された。４回目の洗浄で、極僅かの粘液を得た。これは、リノーラ種子５００ｇから粘液が完全に除去されたことを示す。総量１０２．８ｇの粘液が除去された。
こうした洗浄をした後、種子は、粘液が与える「粘性」特徴を持たなくなった。これは、ほとんどの粘液が除去されたという別のよい目安を提供する。
【００６１】
実施例２
この実施例では、本発明の一実施形態による亜麻粕の調製について例証する。
リノーラ油種子の変種２０４７、２５Ｋｇを、５０℃で４００Ｌ混合槽中で０．５Ｍ重炭酸ナトリウム２００Ｌに加えた。スラリーを１時間激しく撹拌した。沈降後、水相をデカンテーションし、不要物を廃棄した。デカンテーションした水相１リットルを当量のエタノールで希釈して、粘液を沈澱させて、回収した粘液の量を概算した。
水相をデカンテーションした後、種子を加熱した水道水で２回洗浄して、残存する洗浄溶液を除去した。重炭酸ナトリウムによる抽出、分離および洗浄の方法を、５回繰り返した。次いで、種子を加熱水道水で４回洗浄して、残存する洗浄溶液および粘液を除去した。この種子が、その特有のねばねば感を失ったことが分かった。これは、粘液が除去されたというよい目安を提供する。
重炭酸ナトリウム水溶液の連続した各洗浄では、先に行った洗浄よりも少ない粘液が除去され、５回目の洗浄を経て、洗浄溶液１Ｌ分をエタノールで希釈すると、そこから極僅かの粘液が沈澱したことが分かり、これにより、ほとんどの粘液が種子から除去されたというよい目安が提供された。
次いで、この種子を乾燥、洗浄、脱脂して、種子から油を除去した。
【００６２】
実施例３
この実施例では、等電沈澱によって粘液を減らした粕からのリノーラタンパク質単離物の調製について例証する。
実施例２で記載したように調製した脱脂リノーラ油種子粕１０Ｋｇを、０．１５ＭのＮａＣｌ２００Ｌに室温で加え、この混合物のｐＨを５０重量％炭酸水素ナトリウム溶液で１１．０に調整した。このスラリーを１時間撹拌し、その後、得られたタンパク質溶液から抽出した粕を１時間沈降させた。
次いで、タンパク質含有物が１３ｇ／Ｌのタンパク質溶液１００Ｌをデカンテーションし、この溶液を清澄するためにフィルタープレス中の２０μｍおよび０．２μｍのフィルターを通してろ過した。その後、清澄した溶液を４℃の冷却器に１６時間入れて、存在する油を表面に浮き上がらせ、その表面から油をすくい取ることができた。極僅かの油しか見られなかったことから、非常に有効な脱脂ステップであったことが示された。
その後、周囲温度のタンパク質溶液のｐＨを、３ＮのＨＣｌを使用して４．０に調整した。この溶液の色が鮮黄色から乳白色に変化して、タンパク質が直ちに沈澱し始めた。混合を止めると、このタンパク質は速やかに溶液から沈澱した。２時間の沈降後、上澄液をデカンテーションし、タンパク質含有物について分析した。
上澄液除去後、ペレット材料１０Ｌを１０，０００ｘｇで５分間遠心分離機にかけて、沈澱タンパク質に残っている上澄液含有量を低下させた。得られたペレットを水４Ｌで戻し、噴霧乾燥を行って乾燥ＩＥＰ由来リノーラタンパク質単離物２９３ｇを得た。噴霧乾燥済みタンパク質のタンパク質含有量は、乾基準（ｄ．ｂ）で１０１重量％（Ｎ×６．２５）であった。
【００６３】
実施例４
この実施例では、実施例３で生成したリノーラタンパク質単離物の機能的特性について例証する。
【００６４】
実施例３の手順に従って生成したＩＥＰ由来リノーラタンパク質単離物（ＩＥＰリノーラ）を、本願の譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む２００２年５月３日出願の係属中米国特許出願第１０／１３７，３９１号（ＷＯ０２／０８９５９７）に記載される方法に従って生成したＰＭＭ由来および上澄液由来カノーラタンパク質単離物（ＣＰＩ）の通常のサンプルと比較して、発泡および油保持力の機能的特性について試験した。
【００６５】
使用した試験方法は、本願の譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む２００２年５月３日出願の同時係属米国特許出願第１０／１３７，３０６号（ＷＯ０２／０８９５９７）で説明する方法である。
【００６６】
発泡については、利用した方法は、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．、５５：１４４１、１９９０年に記載される方法である。タンパク質単離物のサンプル３．７５ｇを、別個の１５０ｍｌビーカーに入れた。０．０７５ＭのＮａＣｌ溶液６０ｍｌをタンパク質に加えた。このタンパク質を溶解するために数ｍｌの液体で最初にペーストを作っておいた。この混合物を、磁気撹拌棒を備えた撹拌機上で１０分間混合した。０．１ＭのＮａＯＨで溶液のｐＨを７．００に調整し、この溶液をもう１０分間撹拌した。ｐＨを７．００に再調整し、液体の容量を必要量の０．０７５ＭのＮａＣｌで７５ｍｌにして、５％ｗ／ｖタンパク質溶液を得た。この溶液７５ｍｌをホバートミキサ（Ｈｏｂａｒｔ  Ｍｉｘｅｒ）のボール中に注ぎ、溶液、ボールおよび付属泡立て器の合計質量を記録した。このタンパク質溶液を、速度３で５分間泡立たせた。
十分な泡を緩やかにすくって、ゴムスパチュラを使用して２個の風袋を測定した１２５ｍｌ計量カップに一杯にした。余分な泡を大きめのナイフの平らな端を使用してこすり落として、泡の上部を計量カップの上部とちょうど同じ高さにし、泡の質量を記録した。この泡を混合ボールに緩やかに戻し、もう５分間泡立てた。次いで、この手順を繰り返した。泡を混合ボールに緩やかに戻し、さらに５分間、合計で１５分間泡立てた。この手順を再度繰り返した。
超過量を以下の式から計算した。
【００６７】
【数１】
2007520442.tif 000003
泡の安定性も試験した。％超過量の測定のために、タンパク質溶液を１５分間レベル３で泡立たせることを除いて、上述と同じ方法でタンパク質溶液を調製した。ゴムスパチュラを使用して、２５０ｍｌメスシリンダーの上部に入れた１Ｌの首長漏斗（ｌｏｎｇ−ｎｅｃｋｅｄ  ｆｕｎｎｅｌ）に泡を慎重に移した。少量の石英ウールを漏斗口の上部に置いて、液体が排出される間、泡が排出するのを阻止した。
メスシリンダーに集めた、５、１０および１５分の液体の容量を測定した。ウール中に保持された容量を最終容量に加えた。
【００６８】
油保持力について、この実施例で使用した方法は、Ｓｗｉｆｔら、Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１５、４３６〜７２、（１９６１年）に記載された方法である。
表ＩＩに示す配合を使用して、エマルジョンを調製した。
【００６９】
【表２】
2007520442.tif 000004
砂糖、塩およびタンパク質単離物を、６００ｍｌビーカーに乾式混合した。水および酢を混合した。このタンパク質を溶解するために数ｍｌの液体で最初にペーストを作っておいた。この混合物を磁気棒を使用して撹拌機上で５分間混合した。２０００ｍｌビーカーをカノーラ油で満たし、質量を記録した。サクションホースを油中に入れた。
このホースの分配口をホモジナイザーに取り付け、約４０〜５０ｍｌ／分で分配するために設定＃１を使用してポンプに油を入れた。同時に、ホモジナイザー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  ＬＨＲＴ）を５，０００ｒｐｍで回転させ、ポンプのスイッチを入れて油を分配した。エマルジョンが最も粘り気がでた時点を、視覚的に観察した。反転した時点で、ポンプおよびホモジナイザーのスイッチを直ちに切った。サクションホースの端をクリップで挟んで油をホース中に維持し、２００ｍｌビーカー中に残った油の質量を測定した。
得られた結果を以下の表ＩＩＩおよびＩＶに示す。
【００７０】
【表３】
2007520442.tif 000005
【００７１】
【表４】
2007520442.tif 000006
表ＩＩＩから分かるように、ＩＥＰリノーラタンパク質単離物は、高い泡容量および少ない排出量（より良い安定性）を示し、ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物よりも優れた泡特性を有した。ＩＥＰリノーラタンパク質単離物の油保持力は、ＰＭＭ由来カノーラタンパク質単離物に匹敵するが、より大きな球状サイズを有した。
表ＩＶから分かるように、ＩＥＰリノーラタンパク質単離物から生成される泡容量は、上澄液由来カノーラタンパク質単離物から生成される泡容量よりも少ないが、泡は非常に安定であった。リノーラタンパク質単離物は、上澄液由来カノーラタンパク質単離物よりも優れた乳化特性を有した。リノーラタンパク質単離物の油保持力は、上澄液由来カノーラタンパク質単離物より約２倍高く、より小さな球状サイズを有した。
【００７２】
実施例５
この実施例では、ミセル経路によって粘液を減らした粕からのリノーラタンパク質単離物の調製について例証する。
実施例２に記述したように調製した脱脂リノーラ油種子粕４ｋｇを、室温で０．５ＭのＮａＣｌ溶液８０Ｌに加えた（５％ｗ／ｖ）。このスラリーを１時間混合し、続いてこのスラリーを１／２時間沈降させ、タンパク質水溶液をデカントした。デカントしたタンパク質水溶液は、タンパク質含有量が７．１ｇ／Ｌ、容量が５５Ｌであった。フィルタープレス中の２０μＭフィルターパッドを通してこの溶液をろ過して、浮遊物を除去した。圧力をかけ水２０Ｌを流して、タンパク質含有量が５．２８ｇ／Ｌのろ液７５Ｌを得た。
【００７３】
３００ダルトン分子量カットオフ限外ろ過膜を使用して、このろ液を限外ろ過にかけて、溶液を濃縮し、タンパク質含有量が１７４ｇ／Ｌの濃縮タンパク質水溶液（濃縮物）１．３Ｌを得た。次いで、この濃縮物を９容量の４℃の水で希釈し、タンパク質ミセルの白色雲状物を生成した。
１６時間沈降させ、その後上澄液をデカントし、遠心分離機にかけて、できる限り沈澱した材料を回収して、タンパク質含有量が１．１１ｇ／Ｌの上澄液１１Ｌを得た。沈澱ステップから得たリノーラタンパク質単離物ペレットを遠心分離機にかけて、その容量を最小レベルに低減した。
このリノーラタンパク質単離物ペレットを乾燥して、乾燥タンパク質８１ｇを生成し、それによりリノーラ種子粕から抽出したタンパク質の収率は２０重量％を示した。乾燥リノーラタンパク質単離物は、タンパク質含有量が乾基準で１１２重量％（Ｎ×６．２５）であった。
３００ダルトン分子量カットオフ膜を使用し、清澄にされた上澄液を濃縮して、６３．３ｇ／Ｌのタンパク質を含有する濃縮上澄液１．２５Ｌを得た。濃縮上澄液を乾燥し、タンパク質含有量が乾基準で１０６重量％（Ｎ×６．２５）であるリノーラタンパク質単離物７７ｇ（収率２０％）を生成した。
本願の譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む２００３年４月１５日出願の同時係属米国特許出願第１０／４１３，３７１号（ＷＯ０３／０８８７６０）の記載の通りに、２個のリノーラ画分について高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析を行った。
【００７４】
実施例６
この実施例では、実施例５において生成したＰＭＭ由来および上澄液由来リノーラタンパク質単離物の機能的特性を例証する。
実施例５の手順に従って調製したＰＭＭ由来および上澄液由来リノーラタンパク質単離物を、前述の米国特許出願第１０／１３７，３９１号（ＷＯ０２／０８９５９７）に記載される方法に従って生成したＰＭＭ由来および上澄液由来カノーラタンパク質単離物（ＣＰＩ）と比較して、実施例４に記述した方法により発泡および油保持力の機能的特性について試験した。
得られた結果を以下の表ＶおよびＶＩに示す。
【００７５】
【表５】
2007520442.tif 000007
【００７６】
【表６】
2007520442.tif 000008
表ＶおよびＶＩから分かるように、ＰＭＭ由来および上澄液由来リノーラタンパク質単離物の機能的特性は、これらの類似したＨＰＬＣ特性から予想できるように非常に類似しており、主な違いはエマルジョン特性であり、油保持力および球状サイズにおいて２つの画分の間に違いがあった。
ほとんどの範疇で、ＰＭＭ由来および上澄液由来のリノーラタンパク質単離物の機能は、ＰＭＭ由来および上澄液由来カノーラタンパク質単離物と同等またはより優れていた。ＰＭＭ由来および上澄液由来リノーラタンパク質単離物は、泡容量においてはカノーラ上澄液由来より劣っていたが、リノーラの泡の安定性ははるかに優れていた。
【００７７】
実施例７
この実施例では、実施例５において生成したＰＭＭ由来および上澄液由来のリノーラタンパク質単離物の分析について例証する。
２つのリノーラ単離物のＨＰＬＣ分析を、本願の譲受人に譲渡され、その開示を参照により本明細書に組み込む２００３年４月１５日出願の同時係属米国特許出願第１０／４１３，３７１号（ＷＯ０３／０８８７６０）に記載される通りに行って、図１および２から分かるように、各単離物が主として同じ成分からできていることが示された。両方のリノーラタンパク質単離物において、主なタンパク質成分は、分子量が約１６２，０００〜１６９，０００Ｄａであり、一緒に少量の諸成分を有し、この諸成分の一方は１６，０００〜１７，０００Ｄａの範囲にある分子量を有し、もう一方は４１５，０００〜４４０，０００Ｄａの分子量を有する。これらの結果を以下の表ＶＩＩおよびＶＩＩＩにまとめて示す。
【００７８】
【表７】
2007520442.tif 000009
【００７９】
【表８】
2007520442.tif 000010
【００８０】
実施例８
この実施例では、アミノ酸分析について例証する。
実施例３および５に記述したように調製したリノーラタンパク質単離物を、アミノ酸含有量について分析した。
アミノ酸分析を以下の表ＩＸに示す。
【００８１】
【表９】
2007520442.tif 000011
表ＩＸ中の値は、１００ｇ乾燥質量当たりのグラム数に基づいたアミノ酸を表している。このデータをアミノ酸１００ｇに基づいて調整した。この改訂したデータを以下の表Ｘに示す。
【００８２】
【表１０】
2007520442.tif 000012
表ＩＸおよびＸから分かるように、ＰＭＭ由来、上澄液由来およびＩＥＰ由来リノーラタンパク質単離物についてのアミノ酸プロフィルは、非常に類似している。
表ＩＸには、個々のアミノ酸の分子量を挙げている。個々の量と一緒に、３種のタンパク質単離物についての「遊離」アミノ酸の平均分子量が示してあり、それは全て約１３５Ｄａである。タンパク質は無水アミノ酸の生体重合体（ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）（それらは各々、ポリペプチド１個につき末端アミノ酸１個を含み、水分子１個がない形）であるので、無水物の重量平均分子量も示している。アミノ酸の重合体の平均分子量は全て、約１１７〜１１８Ｄａである。さらに、表１０は、ヒトには合成できない必須アミノ酸も示している。１１種の必須アミノ酸の全体含有量は、こうした３種のタンパク質単離物について非常に似ている。
【００８３】
実施例９
この実施例では、リノーラタンパク質単離物の示差走査熱量測定法分析について例証する。
実施例３および５に記述したように調製したリノーラタンパク質単離物を、示差走査熱量測定法にかけた。示差走査熱量測定法は、生体分子により生じる相転位を測定する計測法である。試料を、いくらかの水または緩衝溶液と一緒に密閉皿に入れ、２０℃〜１５０℃など特定の温度範囲にわたり、１０℃／分など一定の速度で熱を加える。水または緩衝液を入れた２番目の皿を、同時に加熱して標準とする。温度上昇中の吸熱流れ（ｅｎｄｏｔｈｅｒｍｉｃ  ｈｅａｔ  ｆｌｏｗ）と呼ばれるエネルギー吸収のサーモグラムを記録した。タンパク質など複雑な生物学的物質は、エネルギーを吸収する。このエネルギーが、分子を変質（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）または変性（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）させて分子の立体構造を変化させる。変性作用は、個々のタンパク質または他の生体分子に特異的であり、この分析は変性温度ＴDおよび、試料１ｇ当たりのジュールで表したエンタルピー変化（ΔＨ）を提供する。サーモグラムは、未変性のタンパク質から変性タンパク質までの相転位を表すエネルギーの「凹み（ｗｅｌｌ）」を示す。「凹み」の底が、ＴD値を表す。どんなエネルギーの「凹み」もなくなると、完全に変性が起こったことを示す。
図３、４および５から分かるように、ＰＭＭ由来および上澄液由来のリノーラタンパク質単離物は、上澄液由来リノーラタンパク質単離物がわずかに高い安定性を有し、こうした類似のＨＰＬＣ特性から予想できるように、熱安定性に関して類似している。ＩＥＰ由来リノーラタンパク質単離物の示差走査熱量測定法サーモグラムは、このタンパク質単離物が、実質的に変性していないＰＭＭ由来および上澄液由来のリノーラタンパク質単離物とは違い、実質的に変性されたことを示唆している。
【００８４】
開示の概要
この開示の概要では、本発明は、亜麻タンパク質単離物の改良した生成方法を提供する。この方法では、まず亜麻油種子から粘液を抽出した後、亜麻油を除去し、亜麻油種子粕を調製し、それにより、得られるタンパク質単離物の収率を高め、実施される単離法の柔軟性を高めることができる。本発明はさらに、特有のタンパク質単離物を有する新規な亜麻タンパク質単離物を提供する。本発明の範囲内で改良は可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】ＰＰＭ由来のリノーラタンパク質単離物のクロマトグラムである。
【図２】上澄液由来のリノーラタンパク質単離物のクロマトグラムである。
【図３】ＰＰＭ由来のリノーラタンパク質単離物のサーモグラムである。
【図４】上澄液由来のリノーラタンパク質単離物のサーモグラムである。
【図５】ＩＥＰ由来のリノーラタンパク質単離物のサーモグラムである。
【図１】
2007520442.tif 000013
【図２】
2007520442.tif 000014
【図３】
2007520442.tif 000015
【図４】
2007520442.tif 000016
【図５】
2007520442.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月16日(2006.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
亜麻タンパク質単離物を調製する方法であって、
最初に亜麻油種子を抽出して、そこから粘液を除去すること、
前記抽出した油種子を粉砕して、油を回収し粕を残すこと、および
前記粕を処理して、そこから亜麻タンパク質単離物を回収すること
を特徴とする方法。
【請求項２】
前記最初に油種子を抽出してそこから粘液を除去することが、好ましくはｐＨが７．５〜９であり、好ましくは弱アルカリ材料の濃度が０．２〜０．７Ｍであるアルカリ性材料の弱いアルカリ性水溶液を使用して実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３０〜７０℃、好ましくは５０℃の温度で、種子と溶液の比が１：１〜１：２０、好ましくは１：５〜１：１０で実施される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記油種子を前記水溶液中で１５〜６０分間、好ましくは３０〜６０分間撹拌することによって実施される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記油種子からそれ以上粘液が抽出されなくなるまで、前記油種子を複数回抽出することを特徴とする、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記弱アルカリ性材料が、重炭酸ナトリウムであり、好ましくはそのままのｐＨで重炭酸ナトリウム水溶液として使用されることを特徴とする、請求項２から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記粕をアルカリ性水溶液で抽出して生成した亜麻タンパク質のアルカリ性溶液から亜麻タンパク質溶液を等電沈澱することを含む手順により、前記亜麻油種子粕を処理して亜麻タンパク質単離物を回収することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｐＨが５〜７でイオン強度が少なくとも０．１０Ｍの塩化ナトリウム水溶液を使用して抽出することにより前記亜麻油種子粕中にタンパク質を可溶化して、濃度が５〜４０ｇ／Ｌのタンパク質水溶液を用意し、
前記タンパク質水溶液を、選択的膜技術により少なくとも１５０ｇ／Ｌの濃度に濃縮し、
前記濃縮タンパク質溶液を１５℃未満の温度の水で希釈してタンパク質ミセルを形成し、
亜麻タンパク質単離物のタンパク質ミセル集塊物として前記タンパク質ミセルを集め回収することにより、前記亜麻油種子粕を処理して亜麻タンパク質溶液を回収することを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質ミセル集塊物を乾燥することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質ミセル集塊物の回収で残った液体を処理して、さらなる量の亜麻タンパク質単離物を回収することを特徴とする、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
分子量が約１６２，０００〜１６９，０００Ｄａの７Ｓタンパク質を含む、タンパク質含有量が少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも１００重量％（Ｎ×６．２５）の亜麻タンパク質単離物。
【請求項１２】
示差走査熱量測定法で測定して、実質的に変性していない、請求項１１に記載の亜麻タンパク質単離物。
【請求項１３】
７Ｓタンパク質を６０〜９５重量％、リニンを０〜２０重量％、コリニンを０〜２０重量％含むことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の亜麻タンパク質単離物。
【請求項１４】
分子量が約１６２，０００〜１６９，０００である亜麻の７Ｓタンパク質。
【国際調査報告】
2007520442.tif 000018
2007520442.tif 000019
2007520442.tif 000020
2007520442.tif 000021