(57)【要約】  本発明は、遊離形態またはエタノール溶媒和形態、有利にはヘミエタノレート溶媒和物形態で提供される４’−デメチル−４’−ホスフェート−２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−エピポドフィロトキシングルコシドの結晶性化合物に関する。本発明はまた、これらの化合物の製造方法および抗腫瘍薬としてのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式２の、遊離形態またはエタノール溶媒和形態である、結晶性化合物４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェート：
【化１】
2007505868.tif 000008
【請求項２】
エタノール溶媒和物が、下式３のヘミエタノレート溶媒和物である、請求項１に記載の結晶性化合物：
【化２】
2007505868.tif 000009
【請求項３】
Ｘ線図が図２または６のものに実質的に相当する、式２の遊離形態の請求項１に記載の結晶性化合物。
【請求項４】
Ｘ線図が図３のものに実質的に相当する、式３のヘミエタノレート溶媒和物形態の請求項１または２に記載の結晶性化合物。
【請求項５】
非晶質形態の式２の化合物を超音波の存在下で無水エタノールに溶解させることを特徴とする、ヘミエタノレート溶媒和物の形態の請求項１、２または４に記載の結晶性化合物を製造する方法。
【請求項６】
超音波を少なくとも２０分間適用する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
式３のヘミエタノレート溶媒和物形態の結晶性化合物を有利には真空下で乾燥することを特徴とする、請求項１または３に記載の結晶性化合物を製造する方法。
【請求項８】
エタノール溶媒和物形態の請求項１、２または４に記載の結晶性化合物を製造する方法であって、
下記の一連の工程：
ａ）非晶質形態の式２の化合物にエタノールを加え、
ｂ）溶液を濃縮し、
ｃ）エタノール溶媒和物形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートを、濃縮溶液を１０℃で１．５時間冷却し、遊離形態の式２の化合物の結晶、またはヘミエタノレート溶媒和物形態の式３の化合物の結晶からなるイニシエーターを加えることにより結晶化し、
ｄ）１０℃で濾過して、エタノールですすぎ、
ｅ）得られた生成物を乾燥させる
ことを含んでなる、方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の結晶性化合物を含んでなる、医薬品。
【請求項１０】
液性腫瘍または固形腫瘍、特に、小細胞性肺癌、胚性腫瘍、神経芽細胞腫、腎臓癌、小児癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、急性白血病、胎盤絨毛癌、および乳腺癌の抗癌治療に用いるための、請求項９に記載の医薬品。
【請求項１１】
結腸直腸癌、黒色腫、神経膠腫、前立腺癌および乳癌のように、通常の治療に対して治療抵抗性である腫瘍を治療するために、トポイソメラーゼ１および２阻害化合物の治療効果を高めることを意図した、請求項９に記載の医薬品。
【請求項１２】
経口投与または非経口投与を意図した形態の、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬品。
【請求項１３】
別の抗癌剤も含んでなる、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
式１で示される、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン二塩形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートはその構造的価値、その製造方法およびその抗癌活性により知られている（ＷＯ９６／１２７２７）。また、この化合物を製造する別法が特許ＦＲ２７９１６８２にも記載されている。
【化１】
2007505868.tif 000002
式１
【０００２】
この式１の化合物は特に著しい抗癌活性を有する。その抗癌活性はin vivoで証明されている。特に、それはＰ３８８白血病モデルを移植したマウスにおいて長期生存を可能とする(British Journal of Cancer (2000), 83(11), 1516-1524)。さらに、in vitroにおいてトポイソメラーゼ１および２活性の阻害能がこの化合物で示されている(Biochem. Pharmacol. (2000), 59, 807)。
【０００３】
この化合物１は、中性および酸性ｐＨに関して、また、温度に関しての通常条件下で安定である。しかし、長期間の保存が望まれる場合には、−２０℃の乾燥した場所にて、気密性ベルボトル中で保存する必要がある。一方、４℃で保存する場合や周囲温度で保存する場合にはなおのこと、この化合物は時間が経つにつれて分解する。従って、病院環境で抗癌治療プロトコールに用いるために満足のいく方法で取り扱うことができない。よって、使用時に製造しなければならないが、これは不利なことである。
【０００４】
この化合物の化学前駆体は式２の遊離型リン酸誘導体：４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートである。
【化２】
2007505868.tif 000003
式２
【０００５】
この化合物は単離せず、そのまま非晶質形態で、式１のそのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン塩の製造に用いられる（ＷＯ９６／１２７２７）。式２のこの遊離型のリン酸誘導体は、一度単離すると、吸湿性で、比較的不安定な非晶質形態となる。その後は、すぐに、無水条件下でＮ−メチル−Ｄ−グルカミン塩を形成させ、低温で保存するか、または、すぐに使用する必要がある。従って、この非晶質形態の式２の誘導体は、それ自体、工業水準では良好な条件下で保存も取り扱いもできない。さらに、非晶質形態の式２の化合物は式１の化合物の重要な生物特性を示さないことが見出されている。従って、結晶形態の式２の化合物を得るという、解決すべき問題がなお残っている。
【０００６】
従来、非晶質化合物の結晶化には非常に困難な点があり、いつも最初の結晶得るのが問題であることが知られている。
その後の結晶化は、シーディングにより容易に起こる。
【０００７】
２分子のエタノールを含む溶媒和物は、エトポシド（etoposide）のプロドラッグである化合物エトポホス（etopophos）に関して、特許ＥＰ５３７５５５に記載されている。この特許に記載されている方法と同様の手順を行うことにより、式２の化合物の結晶化を得ることを期待するというのが論理的である。
【０００８】
その特許に明示されている溶媒和物としてのジエタノレートを得るための方法（補助溶媒または水を含んだエタノールによる治療）は、本発明者らの場合には適さない。
エトポホスと式２の生成物の溶解度には実質的に大きな違いがある。
【発明の概要】
【０００９】
エトポホスは水溶性（１００ｍｇ／ｍｌ）であるが、非晶質である式２の化合物は水溶性ではない。後者はエタノールに可溶であるが、本発明者らの場合、エトポホスの溶媒和物を得るために奨励されている水を加えると、結晶化できないガム質が得られた。
【００１０】
式２の化合物の結晶化を試みるため、本実験室では多くの試験を行った。メタノール、エタノール、イソプロピルアルコールまたはブタノールのようなアルコール類を用いたが、酢酸エチル、アセトン、メチルエチルケトンまたはジオキサンのような他種の溶媒を含む場合でも成功はしなかった。エチルエーテルもしくはイソプロピルエーテルのようなエーテル類、またはペンタン、ヘプタンもしくは石油エーテルのようなアルカン類を用いた場合にのみ、固形粉末ではあるが、非晶質形態の生成物が得られる。
【００１１】
従って、驚くべきことに、式２の遊離ホスフェートが特定の条件下でエタノール１／２分子を含む溶媒和物を形成する特性を有し、その結果、式３の、結晶性で安定なそのヘミエタノレート誘導体が得られ、この誘導体を乾燥させると、結晶形態の式２の誘導体が得られることが見出された。さらに、式２または３の結晶性化合物を用いてシーディングすることにより、４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートのヘミエタノレート溶媒和物以外の結晶性のエタノール溶媒和物が取得可能であった。
【００１２】
よって、本発明は、下式２の遊離形態またはエタノール溶媒和形態である結晶性化合物４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートに関する：
【化３】
2007505868.tif 000004
【００１３】
有利には、このエタノール溶媒和物は下式３のヘミエタノレート溶媒和物である：
【化４】
2007505868.tif 000005
【００１４】
有利には、式２の遊離形態の結晶性化合物のＸ線図は、実質的に図２のものに相当し、式３のヘミエタノレート溶媒和物形態の結晶性化合物のＸ線図は、実質的に図３のものに相当する。有利には、式３のヘミエタノレート溶媒和物以外のエタノール溶媒和形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの結晶性化合物のＸ線図は、実質的に図４のものに相当する。
【００１５】
本発明の他の課題および利点は、当業者ならば、以下の詳細な説明から、また、以下の図面を参照すれば、明らかとなろう。
【発明の具体的説明】
【００１６】
本発明はまた、式３のヘミエタノレート溶媒和物形態の結晶性化合物を製造する方法であって、非晶質形態の式２の化合物を超音波の存在下で無水エタノールに溶解させることからなる工程を含む方法に関する。
有利には、超音波は少なくとも２０分間適用する。
【００１７】
本発明はまた、式２の遊離形態の結晶性化合物を製造する方法であって、式３のヘミエタノレート溶媒和物形態の結晶性化合物を、有利には真空下で乾燥させることからなる工程を含む方法に関する。
【００１８】
事実、式２の遊離型ホスフェートを無水エタノール溶液中、超音波の存在下で、有利には２０分間処理すると、結晶性形態の出現が促進される。それは結晶化のためにエタノール１／２分子と溶媒和物を形成する。この現象は、メタノールでの比較試験を行ったところ、全般的なものであるとは考えにくい。その後、結晶化は見られなかった。同様に、式２の生成物系の種々の化合物、例えば、特許出願ＷＯ９６／１２７２７に記載されている生成物である、ペンタフルオロフェノキシアセテート鎖の代わりにフェノキシアセテート、４−トリフルオロメトキシフェノキシアセテートまたは４−メトキシフェノキシアセテート鎖を有する生成物にも同等の条件を適用した。これらの類似の構造では結晶化は起こらない。ペンタフルオロフェノキシアセテート鎖を有する式２の化合物だけが、上記の処理によって結晶を形成する特殊性を有している。
【００１９】
数回結晶化させた後、周囲温度で真空乾燥させた後であっても、この化合物はなお、同じエタノール化学量、すなわち、化合物１モル当たり溶媒１／２モルを維持している。この段階で、溶媒和物、式３のヘミエタノレートが得られる。
【００２０】
さらに、４０℃で１０日間、徹底的に真空乾燥させると、困難ではあるが、エタノールを完全に除去できることが明らかになった。よって、溶媒を含まない結晶形態を得る前に、溶媒和物としての結晶形態を経由する必要がある。この化合物は直接得ることはできない。
【００２１】
結晶化における主要な難しさは最初の結晶を得ることにあること、そして、他の結晶化技術は、すべての形成されている結晶によるシーディングを含めることができ、そのシーディングにより将来のバッチの結晶化が起こり得る。よって、本発明はまた、エタノール溶媒和形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの結晶性化合物を製造する方法であって、下記の一連の工程：
ａ）非晶質形態の式２の化合物にエタノールを加え、
ｂ）溶液を濃縮し、
ｃ）エタノール溶媒和物形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートを、濃縮溶液を１０℃で１．５時間冷却し、遊離形態の式２の化合物の結晶、またはヘミエタノレート溶媒和物形態の式３の化合物の結晶からなるイニシエーターを加えることにより結晶化し、
ｄ）１０℃で濾過して、エタノールですすぎ、
ｅ）得られた生成物を乾燥させる
ことを含んでなる方法に関する。
【００２２】
溶液の濃縮からなる工程（ａ）は、有利には、約５０％の溶液の蒸発により行われる。
有利には、本発明の方法によって得られた結晶性生成物に同調性がない場合、アセトンに再溶解させ、得られた溶液を再濃縮し、有利には、溶液の７５％を蒸発させ、その後、工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返すことにより２回目の結晶化を行う。
有利には、生成物の乾燥からなる工程（ｅ）は、炉中、真空下、４０℃で行う。
【００２３】
また、真空下で徹底的に乾燥させると（有利には４０℃で１０日間）、困難ではあるが、エタノールを完全に除去できることも明らかになった。このようにして、溶媒を含まない結晶性形態、すなわち、遊離形態の式２の結晶性化合物が得られる。
【００２４】
本願はまた、本願の結晶性化合物（有利には、式２または３）を含んでなる医薬品に関する。
【００２５】
有利には、この医薬品は、有利には液性腫瘍または固形腫瘍、特に、小細胞性肺癌、胚性腫瘍、神経芽細胞腫、腎臓癌、小児癌、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、急性白血病、胎盤絨毛癌、および乳腺癌の抗癌治療に用いるためのものである。
【００２６】
特に、この医薬品は、結腸直腸癌、黒色腫、神経膠腫、前立腺癌および乳癌など、通常の治療に対して治療抵抗性（refractory）である腫瘍の治療のために、トポイソメラーゼ１または２阻害化合物の治療効果を高めることを意図したものである。
【００２７】
有利な一実施形態では、本医薬品は、液性腫瘍であれ固形腫瘍であれ、いずれの腫瘍種も治療するのに用いられる抗癌剤である。
【００２８】
有利には、本発明の医薬品は、経口投与を意図した形態、有利には、ゼラチンカプセル、カプセルもしくは錠剤の形態、または非経口投与を意図した形態であり、有利には、経口投与としては、２４時間ごとの用量が５〜４００ｍｇ／ｍ２であり、注射による投与としては、２〜２００ｍｇ／ｍ２である。
【００２９】
本発明の医薬品は、第一治療として患者に投与することもできるし、あるいは、外科術、放射線療法または化学療法による１以上の治療の後に投与することもできる。それは単独で投与することもできるし、あるいは、他の化学療法と組み合わせて投与することもできる。従って、この医薬品は別の抗癌剤も含むことができる。
【００３０】
以下の実施例は非限定的に示すものである。
【実施例】
【００３１】
製造方法
実施例１：
非晶質形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ジベンジルホスフェートからの４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートのヘミエタノレートの製造
非晶質形態の式２の遊離型ホスフェートを、特許出願ＷＯ９６／１２７２７の実施例２２に記載の方法か、または特許ＦＲ２７９１６８２の実施例８に記載の方法かのいずれかに従って得る。例えば、１５ｇ（１１．６ｍｍｏｌ）の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ジベンジルホスフェートを、水素化のため、常圧、水素雰囲気下、酢酸エチル−エタノール（１／３）混合物２００ｍｌ中に、１０％パラジウム／炭１．２ｇとともに、攪拌しながら３０分間置く。反応媒体を濾過し、濾液を蒸発させ、イソプロピルエーテルでトリチュレートし、式２の非晶質粉末を得た。
【００３２】
融点（エレクトロサーマル９３００キャピラリー融点装置）：〜１３８℃（軟化）。分析的ＨＰＬＣ純度：９９．５％。ＴＬＣ：Ｒｆ０．５、溶媒；ジクロロメタン−メタノール−酢酸９０／１０／５。Ｘ線図：図１。
【００３３】
ヘミエタノレートの製造：
上記で得られた非晶質形態１０ｇを５００ｍｌのエタノールに溶解した。この溶液を、３０℃の超音波槽（バイオブロック−サイエンティフィックＴ７００型、周波数３５ｋＨｚ）中に２０分間置く。厚い沈殿が現れ、次に、これを濾過し、真空乾燥させた。７ｇの結晶が得られる。融点：１６１℃。ＮＭＲスペクトルは、１／２モルのエタノールの存在を示す。これらの結晶をもう一度結晶化した後、還流下、１３０ｍｌのエタノールから３回目の結晶化を行い、その後、１２時間ゆっくり冷却する。濾過および真空乾燥後、結晶が得られた。
融点１６５〜１６６℃。ＮＭＲスペクトルは、ここでも、１／２モルのエタノールの存在を示す。Ｘ線図：図３。
【００３４】
実施例２：
結晶性形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートのヘミエタノレートからの結晶性形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの製造
上記で得られた結晶のアリコートを薄層として、１０日間、４０℃の加熱デシケーター中に置いた。ＮＭＲスペクトルはエタノールが存在しないことを示す。融点１６９℃。Ｘ線図：図２。
【００３５】
実施例３：
ヘミエタノレート以外の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの結晶性エタノール溶媒和物の製造
非晶質形態の式２のホスフェートを、特許出願ＷＯ９６／１２７２７の実施例２２に記載の方法か、または特許ＦＲ２７９１６８２の実施例８に記載の方法かのいずれかに従って得る。その後の結晶化工程は次の通りである：
・ＥｔＯＨの添加：濃縮前の最初の容量に対して約１容量、
・溶液の濃縮：溶液の約５０％の蒸発、
・溶液を１０℃まで冷却し、この溶液を１．５時間１０℃に維持すると同時に、実施例１または２に従って得られた化合物の結晶を用いてシーディング、
・得られた結晶性生成物を１０℃で濾過し、エタノールですすぐ（生成物に同調性がなければ、アセトンに再溶解し、予備濃縮した後、上記で示した工程を繰り返すことにより２回目の再結晶化を行う、
・精製物を炉中、真空下４０℃で乾燥。
結晶性エタノール溶媒和物が得られた。
【００３６】
Ｘ線図：図４および５
ＨＰＬＣ純度：９９．１％
エタノール含量：１．４％
水分含量：１％未満
【００３７】
実施例４：
結晶性形態の４−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートのエタノール溶媒和物（実施例３）からの結晶性形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの製造
上記で得られた結晶１２ｇ（実施例３）を、加熱プラットフォームを備えた真空ベルジャー内の大型の結晶化鉢に置いた。真空にし、温度を４０℃で一定とした。
この結晶を１０日間乾燥させる。この１０日の終了時に、エタノールを完全に蒸発させた。Ｘ線回折図を作製すると、完全な結晶性を示す（図６）。
【００３８】
実施例５：
４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェート、４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビス（４−トリフルオロメトキシフェノキシアセチル）−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェート、および４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビス（４−メチルフェノキシアセチル）−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの結晶化試験
非晶質形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェート、４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビス（４−トリフルオロメトキシフェノキシアセチル）−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェート、および４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビス（４−メチルフェノキシアセチル）−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートを、特許出願ＷＯ９６／１２７２７に記載の方法に従って得た。
【００３９】
これらの化合物１００ｍｇを周囲温度で５ｍｌのエタノールに溶解した。これら種々の溶液を超音波槽内に２０分間置く。結晶化を開始させる常法に従い、壁のトリチュレーションを行っても、または数日間静置しても結晶化は見られなかった。
【００４０】
結晶性形態の研究
結晶性形態の存在を証明するため、上記で得られた種々の形態（非晶質形態、結晶性形態の式２、結晶性形態の式３、およびエタノール溶媒和形態の他の結晶性化合物）に対するＸ線回折研究、また、熱顕微鏡研究を行った。
【００４１】
Ｘ線回折：
非晶質形態と結晶性形態の式２の化合物、式３のヘミエタノレート化合物、および上記で得られたヘミエタノレート以外の、化合物４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの結晶性エタノール溶媒和物をＸ線粉末回折分析により研究した。
【００４２】
装置は、銅対陰極を持つＣ型水平ＣＧＲ角度計を備えたＰｈｉｌｉｐｓ  ＰＮ１７３０である（λ＝１．５４０５１オングストローム、Ｉ＝２０ｍＡおよびＶ＝４０ｋＶ）（図１〜４）。
【００４３】
サンプルに対し、以下の操作条件下で分析を行った。
・探査角範囲３〜２５°θ
・取得時間５００ｍｓごと
・取得数５（図１〜４）
【００４４】
図５に関しては、装置は、銅対陰極を持つ角度計を備えたＰｈｉｌｉｐｓ  Ｘ’Ｐｅｒｔ  ＰＷ３０４０である（Ｋαライン）。探査角範囲は２〜５０°θである。カウントは各段階２または２．４ｓであり、各段階は０．０２°２θの値を有する。サンプルは、平面を得るために弱い圧力をかけること以外は特別な処理を施さずに測定した。静菌サンプルによるチャンバーの汚染を防ぐため、サンプルの上にカプトンシートをかけた。使用大気は周囲空気である。
【００４５】
図６に関しては、モノクロメーターを用いず、ニッケルフィルターを用い、エクセレレーター(Xcelerator)検出器と銅対陰極を備えたＰｈｉｌｉｐｓ  Ｘ’Ｐｅｒｔ  ＭＰＤ装置（Ｋαライン、強度：２０ｍＡ、電圧：４０ｋＶ、波長λ：１．５４１８３６７オングストローム）で線図を記録した。
【００４６】
記録は連続モードで行った。スキャンはω２θである。
カウントは各段階で１００ｓとし、各段階の値は０．０２°２θである。
１００％強度は、カウント数の最高値を有するラインによる。このカウント数はこれら各ラインの絶対強度に比例する。
【００４７】
結果：
回折図は、結晶性（１００％ラインのカウント数に関する）は、式２のサンプルの場合（図２および６）、また、式３の溶媒和物サンプルの場合（図３）、および他の溶媒和物の場合（図４および５）に明らかに極めて大きいことを示す。式２の非晶質サンプルでは、このようなラインを示さない（図１）。
【００４８】
熱顕微鏡観察：
物理化学的熱顕微鏡観察研究を行ったところ、温度の上昇とともに式３のヘミエタノレートを伴う結晶状態が示された。
用いた装置は、ＦＰ５プログラミング装置(Mettler)に接続したＦＰ５２システムである。サンプルをスライディングカバースリップの間に挟み、３０〜１５０℃の間のプログラムされた速度に従って加熱する。
【００４９】
非晶質形態の式２のサンプルは非晶質のままであり、温度が上昇しても結晶化はしない。
式３のヘミエタノレートは結晶性である。それは１５０℃まで溶媒の損失を示し、１６５℃前後で、分解を伴った融解が見られる。
【００５０】
安定性試験
粉末形態の安定性の実証
上記で得られた非晶質形態の式２の化合物と結晶性形態の式３の化合物に対して、次のような条件下で粉末形態における安定性の研究を起こった。
・４０℃、密閉瓶で１ヶ月、
・３０℃、相対湿度７５％、開放瓶で１ヶ月。
【００５１】
密閉瓶安定性試験では、サンプルを琥珀色のガラスバイアル(Alltech ref. vial 98037, ref. stopper 6687)中に密閉する。
【００５２】
開放安定性試験は、ＮａＣｌで飽和させた塩水を含むデシケーター内に粉末を保存することにより行う（相対湿度７５％／３０℃）。
式２の遊離ホスフェート化合物の含量を、次のＨＰＬＣクロマトグラフィーシステムを用いた内部標準化により評価する。
【００５３】
カラム：Ｃ８シンメトリー、５μ、２５０×４．６ｍｍ(Waters)
溶離剤：ＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＫＨ２ＰＯ４  ６００／４００／３．４（ｍｌ／ｍｌ／ｇ）、
１０％Ｈ３ＰＯ４でｐＨ４に調整
流速：１ｍｌ／分、
検出：２２０ｎｍ。
【００５４】
分析は、Ｌ−７１００ポンプ、Ｌ−７２００オートサンプラー、Ｌ−７４５０ダイオードアレイ検出器およびＨＳＭ  Ｄ−７０００システム管理ソフトウエアを備えたＭｅｒｃｋ  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌａｃｈｒｏｍ  ＨＰＬＣシステムにて行う。
この試験結果を下表１にまとめる。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
粉末形態における安定性試験は、安定性条件にかかわらず、非晶質形態の式２の化合物が、結晶性形態の式３のヘミエタノレート化合物より安定性が低いことを示す。
４０℃、密閉瓶中で１ヶ月後、非晶質形態の式２の化合物では１１．９％の分解産物が見られたのに対し、結晶性形態の式３のヘミエタノレート化合物では１．５％であった。
【００５７】
３０℃、相対湿度の存在下で１ヶ月後、非晶質形態の式２の化合物では５０％の分解産物が見られたのに対し、結晶性形態の式３のヘミエタノレート化合物では１．８％であった。
よって、本発明の特徴は、その非晶質遊離形態（式２）と比べて、式３のヘミエタノレート結晶性形態が安定であるという点で利点がある。
【００５８】
薬理試験
臨床試験段階では、式１のＮ−メチル−Ｄ−グルカミンで塩化したホスフェート形態は良好な条件で使用することができないことから、式２の非晶質遊離ホスフェート形態の試験が考えられる。薬理試験の過程で、その非晶質遊離ホスフェート形態のこの化合物は、British Journal of Cancer (2000), 83(11), 1516-1524で公開されているような、そのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン塩で証明されたin vivo活性を持たないことが明らかとなった。他方、式３のヘミエタノレート形態か、または式２の遊離形態のいずれかで得られた結晶性形態は、必要とされる薬理活性を示す。
【００５９】
材料および方法
in vivo評価のための化合物の溶解
式２および３の化合物の種々の非晶質形態および結晶性形態を、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ５％と、５％グルコース含有血清９５％とを含む混合物に溶解／懸濁させる。
【００６０】
試験腫瘍モデル
用いたモデルはＰ３８８白血病(Dykes, D.J. and Waud, W.R.: Murine L1210およびP388 Leukemias. In Tumor Models in Cancer Research, Teisher, B. A. ed, Humana Press Inc., Totowa, NJ, pp. 23-40, 2002)を、これまでに記載されているような(Kruczynski, A, and Hill, B.T,: Classic in vivo cancer models: Three examples of mouse models used in experimental therapeutics. Current Protocols in Pharmacology Unit 5.24:5.24.1-5.24.16, 2001)、ＤＢＡ／２マウス（ＤＢＡ／２ＪＩｃｏ, Charles River)に対する一連の腹腔内移植により維持したものである。
【００６１】
試験化学療法
これらの動物は、実験動物管理者として認可を受けた研究者の指示の下、the Guidelines for the Welfare and Use of Laboratory Animals (National Research Council, 1996)およびEuropean directive EEC/86/609に準拠して飼育、維持管理、取り扱いを行う。さらに、試験は総て、仏国法律、および実験腫瘍学における動物の健康に関するＵＫＣＣＣＫ(United Kingdom Coordinating Commitee on Cancer Research)の指示に基づく(Workman, p,, Twentyman, P., Balkwill, F,, Balmain, A., Chaplin, D., Double, J., Embleton, J., Newell, D., Raymond, R., Stables, J., Stephens, T., およびWallace, J,,; United Kingdom coordinating committee on cancer research (UKCCCR) guidelines for the welfare of animals in experimental neoplasia. Br. J. Cancer 77; 1-10, 1998))、the Centre de Recherche Pierre Fabre [PF Research Center]の倫理委員会の規則に準拠して行う。試験は、すでに記載されているプロトコール(Kruczynski, A., Colpaert, F., Tsrayre, J.P., Mouillard, P., Fahy, J., and Hill, B.T.: Preclinical in vivo antitumor activity on vinflumine, a novel fluorinated. Vinca alkaloid. Cancer Chemother. Pharmacol. 41: 437-447, 1936)に従って行う。これは、第０日にＣ２ＤＦ１ハイブリッドマウス(CD2F1/CrlBR, Charles River, St Aubin-les-Elbeuf, France)において１０６個のＰ３８８白血病細胞を静脈移植することからなる。治療ケージと対照ケージに動物を無作為に分けた後、腫瘍の移植の翌日、すなわち第１日に１回の腹腔内注射で評価する化合物を投与する。その後、動物を毎日モニタリングし、１週間に２回秤量し、臨床反応を記録した。
【００６２】
抗腫瘍活性の評価
生存率は抗腫瘍活性を評価するためのパラメーターである。生存率の増加は、（処理群の生存率の中間値／対照群の生存率の中間値）×１００に相当するＴ／Ｃ比（％）で定義される。
【００６３】
結果
in vivoにおける失血病モデルに対する、種々の形態の式２および３の化合物の抗腫瘍活性の評価
３形態の化合物、すなわち、非晶質形態の式２の化合物（非晶質式２）、結晶性形態の式２の化合物を乾燥させてエタノール溶媒の痕跡を総て除去したもの（結晶性式２）および１／２モルのエタノールを含有する結晶性形態の式３の化合物（結晶性式３）をin vivoにおいて評価した。結果を下表２に示す。
【００６４】
【表２】
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【００６５】
これらの結果は、結晶性形態の式２および３の２つの化合物が、４０ｍｇ／ｋｇの用量から動物の生存率の有意な上昇を誘導することを示し、これはＴ／Ｃの比の値１４３％で示され、結晶性形態のこの２つの化合物の一方または他方で動物を処理することで、動物の生存を４３％引き延ばすことができたことを示している。実際、ＮＣＩ(National Cancer Institute)の判定基準によれば、Ｔ／Ｃ値は、少なくとも１２０％より大きければ有意であると見なされ、１７５％よりも大きければ有意性が極めて高い、または高レベルの抗腫瘍活性を反映していると見なされる(Venditti, J.M. : Preclinical drug development : Rationale and methods. Semin. Oncol. 8: 349-361, 1981)。結晶性形態の式２または３の化合物によって誘導される抗腫瘍活性は化合物用量とともに高まり、用量１６０ｍｇ／ｋｇで最適値に達し、これは結晶性形態の式３の化合物ではＴ／Ｃ比３２９％、そして、結晶性形態の式２の化合物では３００％で表される。これらの値は、Ｐ３８８白血病を患う動物を結晶性形態の式２または３の化合物で処理することで、  動物の生存をそれぞれ２００％または２２９％引き延ばすことができたことを示している。
【００６６】
結晶性形態とは異なり、非晶質形態の式２の化合物は用量４０および８０ｍｇ／ｋｇ（それぞれＴ／Ｃ値１２０％未満、すなわち、１００％および１１４％で表される）で有意な抗腫瘍活性を誘導しない。非晶質形態の式２の化合物は用量１６０ｍｇ／ｋｇのみで抗腫瘍活性を誘導するが、この活性は同じ用量で結晶性形態の式２または３の化合物で得られる活性よりずっと低い。具体的には、非晶質形態の式２の化合物で用量１６０ｍｇ／ｋｇにおいて得られたＴ／Ｃ値は１５７％であるのに対し、結晶性形態の式３および２の化合物では、それぞれ３２９％と３００％であった。
【００６７】
これらの活性は動物の有意な体重減を誘導せず、このことはこれらの化合物が動物に十分許容されることを示唆することに注目すべきである。
【００６８】
結論としては、結晶性形態の式２または３の化合物はＰ３８８白血病モデルにおいて高レベルの抗腫瘍活性を誘導し、この活性は非晶質形態の式２の化合物の活性よりも明らかに高い。
【００６９】
よって、これらの化合物は癌に対する治療兵器庫に大きな利点をもたらす。点滴として非経口投与または経口投与すると、液性腫瘍であれ固形腫瘍であれ、あらゆるタイプの癌の治療が可能となる。それらは第一治療として患者に投与することもできるし、あるいは、外科術、放射線療法または化学療法による１以上の治療の後に投与することもできる。これらの化合物は単独で投与することもできるし、あるいは、他の化学療法と併用することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】非晶質形態の式２の化合物のＸ線図を示す。
【図２】結晶形態の式２の化合物のＸ線図を示す。
【図３】結晶形態の式３の化合物のＸ線図を示す。
【図４】式３のヘミエタノレート溶媒和物以外のエタノール溶媒和形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの結晶性化合物のＸ線図を示す。
【図５】式３のヘミエタノレート溶媒和物以外のエタノール溶媒和形態の４’−デメチルエピポドフィロトキシン２”，３”−ビスペンタフルオロフェノキシアセチル−４”，６”−エチリデン−β−Ｄ−グルコシド４’−ホスフェートの結晶性化合物のＸ線図を示す。
【図６】結晶形態の式２の化合物のＸ線図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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