(57)【要約】【課題】【解決手段】  ゲル被覆ビード（登録商標ハイドロゲル被覆ビードを含む）が開示されており、これは、ゲルコーティング表面又は内部でタンパク質及び他の生体分子を吸着、吸着することが出来る。吸着又は吸着生体分子を有するゲル被覆ビードは、分析、精製又は他の目的での使用に好適である。ビードはゲル−シェルで被覆されたラテックスを含む多くの物質のいずれかから作られるコアを有する。生体分子は、吸着後、共有結合によって、又はそれらが更に反応することなく保持されるように周囲ｐＨ及び／又はイオン強度の条件を選択することによってゲル内に保持することが出来る。従って、吸着タンパク質は、個々のリガンドに結合する能力を維持する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の結合分子を検出する方法において：
コア及びシェルを有するビードを提供するステップであって、前記シェルがイオン化ゲルを含み、生体分子がイオン化ゲルに固定化されているビードを提供するステップと；
前記ビードを前記結合分子に接触させるステップと；
前記結合分子と関連する標識化からのシグナルの検出に基づいて、結合が行われるかどうかを決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記生体分子がタンパク質又はオリゴヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記生体分子がタンパク質であり、前記結合分子が抗体、抗原又は酵素であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、前記生体分子がオリゴヌクレオチドであり、前記結合分子がオリゴヌクレオチドであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項３記載の方法において、前記標識化が、標識化された二次抗体又は別の標識化分子を用いており、それが、前記抗体、抗原又は酵素と結合することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１記載の方法において、前記イオン化ゲルがハイドロゲル（登録商標）であることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項２記載の方法において、前記タンパク質を、前記タンパク質と前記イオン化ゲル中の官能基とイオン化ゲルとの間の共有結合によって固定することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記共有結合が、ＥＤＡＣ介在結合反応を使用することによって、ハイドロゲル（登録商標）におけるカルボキシル基と、タンパク質上のアミノ酸の側鎖に存在するアクセス可能な遊離アミン基との間のアミド結合を形成することによって得られることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、前記共有結合が、同種の又は異種の二官能性リガンドに最初に結合され、次いでタンパク質の共有結合に利用するリガンドの官能基に結合されたカルボキシル基によって得られることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項２記載の方法において、タンパク質が、ｐＨが約３であり、イオン濃度が約１００ｍＭよりも小さい条件下で固定化されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、イオン濃度を決定するためにモニタされるイオンがナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、前記イオン濃度が約１Ｍより大きいことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記イオン濃度を決定するためにモニタされるイオンがナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
タンパク質結合分子を検出及び精製する方法において：
透明なカラムの内部にコア及びシェルを有する複数のビードを提供するステップであって、前記シェルがイオン化ゲルを含み、前記タンパク質が前記イオン化ゲルに固定化されているビードを提供するステップと；
前記ビードを前記タンパク質結合分子と接触させるステップと；
前記カラムからビードを除去することなく、前記タンパク質結合分子とこのタンパク質結合分子に関連した標識からのシグナルの検出に基づくタンパク質との間に結合が行われるかどうかを決定するステップと；
前記ビードを除去し、当該ビードから前記タンパク質結合分子を除去するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記タンパク質結合分子が、抗体、抗体フラグメント、抗原又は酵素を含有するタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５記載の方法において、前記イオン化ゲルがハイドロゲル（登録商標）であることを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５記載の方法において、前記タンパク質が、前記タンパク質とイオン化ゲルの官能基との間の共有結合によって固定化されることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１６記載の方法において、ＥＤＡＣ介在結合反応を使用することにより、共有結合が、ハイドロゲル（登録商標）とタンパク質分子上にアミノ酸の側鎖に存在するアクセス可能な遊離アミン基との間のアミド結合を形成することによって得られることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１７記載の方法において、前記共有結合が、同種の又は異種の二官能性リガンドに最初に結合され、次いで、タンパク質の共有結合に利用するリガンドの官能基に結合されたカルボキシル基によって得られることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１７記載の方法において、前記タンパク質が、ｐＨが約３であり、イオン濃度が約１００ｍＭよりも小さい条件下で固定化されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記イオン濃度を決定するためにモニタされるイオンがナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の方法において、イオン濃度が約１Ｍより大きいことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、イオン濃度を測定するのに監視されるイオンがナトリウムであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
分子の反応をモニタする方法において：
コア及びシェルを有する複数のビードを提供するステップであって、親水性及び疎水性ドメインを有するシェルが両親媒性ゲルを含み、親水性生体分子を前記両親媒性ゲルの親水性ドメインに固定化し、疎水性生体分子を両親媒性ゲルの疎水性ドメインに固定化するビードを提供するステップと；
前記ビードを親水性生体分子を結合した分子及び疎水性生体分子を結合した分子と接触させるステップと；
前記結合が、分子と分子に関連した標識からのシグナルの検出に基づいた生体分子との間に結合が行われるかどうかを決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項２４又は１５記載の方法において、前記分子が抗体、抗体フラグメント、抗原及び酵素を含むタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項２６】
ゲル中の生体分子とある種の分子間のある種の反応を起こさせ、その他の分子間の反応を阻害する方法において；
コア及びシェルを有する複数のビードを提供するステップであって、シェルが生体分子を含有するゲルと、あるサイズより大きい又は指定電荷を有しており、前記ゲルに入ることができない分子分子を含むビードを提供するステップと；
前記ビードに前記分子の試料を、試料中のいくらかの分子がゲルに入り、前記生体分子と反応するが、他の分子が排除されるように接触させるステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項２６記載の方法において、分子と関連した標識化からのシグナルの検出に基づいて分子と生体分子との間で行われるかどうかを決定することを更に含むことを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項２６記載の方法において、前記分子が抗体、抗体フラグメント、抗原又は酵素を含むタンパク質であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２００３年１０月２８日に出願された米国暫定出願第６０／５１５，０７９号に対して優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、ゲルで被覆されたビードに関する。
【０００３】
背景
マイクロアレイは、タンパク質−タンパク質及びオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド相互作用を含む、生体分子相互作用の総合的分析用の強力なツールである。そのような分析は、分子キャラクタリゼーション及び生理状態又は病状の診断に有用であり、広範な可能性を有する。総てのマイクロアレイにおいて、相互作用はスライドガラス上の配列フォーマットで一連の生体分子をまず固定することによって分析される。次いで、このスライドガラスは、一連の蛍光標識相補リガンドで精査され、どのような結合も観察される。
【０００４】
ＤＮＡマイクロアレイと比較して、有用なタンパク質マイクロアレイの製造は、一般的により困難であり、技術的には挑戦である。これは、タンパク質が低温及び高温の双方の温度、極端なｐＨ、疎水性表面の存在、高剪断にさらすこと、及び水の除去に対して敏感である本質的に壊れやすい分子であるからである。従って、タンパク質マイクロアレイの準備、貯蔵及び取り扱いの間、そのような条件を避けることが必須である。
【０００５】
これらの問題の多くに対する好ましい解決策は、ポリマー樹脂で出来たエンコードされた粒子を含むタンパク質を、エンコードされたマイクロビード粒子に付着することである。（２００２年８月２３日に出願された米国出願第１０／２０４，７９９号；ＷＯ０１／９８７６５「Ｍｕｌｔｉａｎａｌｙｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｒｒａｙｓ」必要ならば参照されたい）次いで、エンコードされたキャプチャータンパク質被覆粒子は２Ｄ配列フォーマットにアセンブルされ、ターゲットタンパク質を含むように前処理されたサンプルに接触する。次に、キャプチャータンパク質とターゲットタンパク質との間のあらゆる結合が、蛍光配列シグナルの存在によって決定される。正配列シグナルを生成する特定のキャプチャータンパク質は、配列をデコードすることによって決定される。微粒子上にタンパク質を固定する幾つかの既知の及び市販の方法がある。（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，ＴｅｃｈＮｏｔｅ  ＃  ２０５  Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ、２００２及びＴｅｃｈＮｏｔｅ  ＃  ２０４、Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ、１９９９）最も普通に使用されているアプローチは、ランダムな共有結合又は微粒子表面上へのタンパク質の付着させ、それはしばしば結合に参加することの出来ない誤った配向分子をもたらす。加えて、本質的に不適切な化学反応の使用は、化学的に修飾し、それ故にタンパク質分子を変性させることがある。
【０００６】
サイト選択化学を使用して表面にタンパク質を結合することは、これらの問題の幾つかを回避する。原理上、そのような配向性吸着は、タンパク質の活性サイトをアクセス可能にしておき、また、それらの安定性（Ｐｅｌｕｓｏ，  Ｐ．他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１２（２００３）  １１３−１２４）を改善する。しかし、そのような技術は、使用が限定されている。というのも、それらは、追加のタンパク質修飾、精製及び濃縮ステップが必要であるからであり、多数の固有分子と共に使用するには実用的ではない。従って、様々な型のタンパク質を固定し、しかもそれらの二次構造、従ってそれらの生物学的活性を維持する表面化学及び表面トポロジーの選択が必要とされる。
【０００７】
ハイドロゲルは、多量の水を吸収することが出来る３次元親水性ポリマーネットワークである。これらの高含水量は、「タンパク質フレンドリー」環境を提供し、これらは、マイクロアレイに基板としての使用可能性があるため、注目を集めてきた。（www.perkilelmer.com/proteomics：ＨｙｄｒｏＧｅｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ）Ａｒｅｎｋｏｖ他（Ａｒｅｎｋｏｖ，  Ｐ．他  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７８，１２３−１３１（２０００））は、スライドガラス表面に順番に付着されたゲルパッド（１００μｍ×１００μｍ×２０μｍ）にタンパク質を固定することによって製造された配列の製造を報告した。３次元マトリックス構造により、タンパク質固定は、非常に効率的であると報告されている。水性の環境は、タンパク質をその天然型で保持するのに役立ち、配列結合反応を自由に利用できた。この方法の主要な不都合は、複雑な製造方法であることと輸送が限定されることに起因して、ゲルパッドからの非結合タンパク質の除去が困難なことである。
【０００８】
従って、これらのアプローチはいずれも、タンパク質構造及び機能の膨大な多様性に対応し、二次及び三次タンパク質構造の維持を許容する多重化タンパク質リガンド相互作用分析の広範なプラットフォームを提供するのに十分ではない。
【０００９】
要約
ゲル被覆ビード（登録商標ハイドロゲル被覆ビードを含む）が開示されており、これは、ゲルコーティングの表面又は内部でタンパク質及び他の生体分子を吸着、吸収することが出来、分析、精製又は他の目的での使用に好適である。生体分子はゲル中に吸着されるか吸収されることが出来、各ケースでの吸収は、異なる機構によって駆動されるであろうが、現実には、各ケースにおける結果は、配位結合に使用可能である結合サイトを有する生体分子負荷ゲルである。リガンドの結合時に発生する分析シグナルは、結合サイトが、ゲルへの吸着／吸収に利用できる状態にしておく（そのようなプロセスを、以下で便宜上「吸着」と総称する）傾向があるので、生体分子が他の方法によってビードに結合されるならばより大きいであろう。ビードは、コア−シェルビード（又はコア−シェル粒子）と称してもよいが、ゲル−シェルで被覆されたラテックスを含む、いくつかの物質のいずれかで出来たコアを有する。生体分子は、吸着後、共有結合によって、又は生体分子が更に反応することなく維持されるように周囲ｐＨ及び／又はイオン強度の条件を選択することによってゲル内に維持出来る。
【００１０】
上述のように、その中にタンパク質又は他の生体分子を吸着したゲル−シェルビードは、分析に使用出来る。特に、タンパク質を吸着し、吸着したタンパク質とよく反応する酵素、抗原又は抗体を含むリガンドを分析することが出来る。ゲル層の特性は、吸着したレセプター又はキャプチャータンパク質のエピトープ及び／又は活性が変化しない又は影響を受けないといったことである。従って、吸着したタンパク質は、各々のリガンドに結合する能力を保持している。
【００１１】
また、検体の粗製混合物、例えば全血又は細胞溶解物から、特殊な核酸又はタンパク質を選択的に捕獲するためのゲル−シェル粒子の使用プロセスが開示されている。全血を含有するサンプルは、重要なリガンド分子と官能化されるゲル−シェル粒子と接触して配置される。赤色及び白色細胞は、その大きさから、ゲルによって自動的に排除され、ゲルの微細孔よりも小さい分子のみ入り、リガンドに結合することが出来る。ゲルに入るのに十分小さいプラズマにおける成分はリガンドに結合し、この結合を既知の方法によって検出することが出来る。成分の残余は容易に洗い落とすことが出来る。この方法では、大きな検体が分離され、結合事象を発生させないので、分析結果の信頼性が向上する。
【００１２】
また、ゲル−シェル粒子は、例えば、ＥＬＩＳＡを使用して検出されるような、様々なビードで行われる様々な結合反応の識別を分離及び増加させるに当たり、マイクロリアクターとして使用される。表面上にレセプター−リガンド複合体を有する従来のスポット配列において、結合事象は、第２の探知剤（第２抗体、ストレプトアビジン又はその類似物）に典型的に関連した酵素の存在によって探知される。適当な基質の存在において、酵素は、局所的に蛍光又は着色された生成物の形成に触媒作用を及ぼす。しかし、一般的にこの生成物は、配列を通して放散する傾向があり、近接スポットからのシグナルを不鮮明にする。これは、ＥＬＩＳＡフォーマットで有用である高特性密度を有するマイクロアレイの開発を妨げるものであった。しかし、本発明のゲル−シェル粒子を用いると、結合事象からのシグナルを粒子のゲルシェル中でローカライズされた状態に保つことが出来、基質と生成物との間の分配係数差についての利点を得ることが出来る。例えば、ゲル−シェルは、両親媒性であり、親水性及び疎水性ドメインを有する。親水性ドメインは、酵素の反応槽としての役割を果たし、疎水性ドメインは、蛍光性及び疎水性生成物を仕切る働きをする。そのような化学的性質は、最近、文献（Ｋｉｙｏｓｈｉｍａ，  Ｓ．他  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌ，３，５８−６４（２００４））で報告されている。
【００１３】
ゲル−シェル吸着タンパク質又は他の生体分子は、一段階分析及び同種リガンドの精製用薬剤として使用出来る。このような方法では、吸着生体分子を有するコア−シェルビードは、窓付き保持セルに詰められ、分析／精製すべき物質を含むサンプルは、このセルを通って通過する。分析結果は、透明なセル穴を介して元の場所でモニタすることが出来る。また、精製段階のために、ビードをカラムから除去して、次いで、既知の方法を使用してタンパク質をビードから溶出することが出来る。
【００１４】
コア−シェルビード及びその様々な使用を、以下でに更に説明する。
【００１５】
詳細な説明
高度な生物学的活性を維持する係留された又は物理的に吸収されたタンパク質又は他の生体分子を運ぶゲル被覆（ゲル−シェル）ビードの製造方法は、以下のように実施される。
（１）適切な緩衝液内に本発明のゲル−シェルビードを分散させる（図１Ａ）；
（２）固定すべき生体分子（図１Ｄ）の水溶液又は緩衝溶液をビード混濁液に加える；
（３）この混合物を生体分子固定化（図１Ｂ及び図１Ｅ）のステップにさらす；及び
（４）ビードから生体分子を分離し、最適の緩衝液でビードを再分散させる。（図１C及び図１F）
【００１６】
ポリマー粒子の安定した分散が利用できるならば、どのポリマーでもコアポリマー粒子を提供するのに使用することが出来る。好ましいポリマーには、ホモポリマー又はコポリマーが挙げられ、ここではコポリマーは、２又はそれ以上のモノマーユニットで形成されたポリマーを含み、これは「ターポリマー」と称される、３又はそれ以上のモノマーユニットを含む。ビニルクラスのモノポリマー、すなわち、ビニル基含有モノマーを含む疎水性ポリマーが好ましく、これはスチレン基を有するものを含む。好ましいポリマーの群には、約５０〜１００重量％のスチレンモノマーユニットを含むポリスチレン又はポリスチレンコポリマーがある。ポリマーは、選択的に架橋されているか、或いは非架橋であってよい。一の実施例では、微粒子は、微粒子の重量に基づいて１％のジビニルベンゼンで架橋したポリスチレンで出来ている。別の実施例では、この微粒子は、微粒子の重量に基づいて、約０．６〜１％のメタクリル酸を含むスチレン／メタクリル酸コポリマーを具える。
【００１７】
好ましいポリマー物質は、一例として、及び限定されない例として、次のモノマーを含むポリマーである；
【００１８】
アクリル酸又はアクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸プロピル、アクリル酸ブチル、２−アクリル酸エチルヘキシル又はアクリル酸グリシジルなどのアクリル酸のエステル；
【００１９】
メタクリル酸又はメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸プロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ラウリル、メタクリル酸セチル、メタクリル酸ステアリル、ジメタクリル酸エチレングリコール、ジメタクリル酸テトラエチレングリコール、メタクリル酸グリシジル又はＮ，Ｎ−（メタクリロキシヒドロキシプロピル）−（ヒドロキシアルキル）アミノエチルアミドアゾリジノンなどのメタクリル酸のエステル；
【００２０】
メタクリル酸アリルなどのアリルエステル；
【００２１】
イタコン酸又はそのエステル；
【００２２】
クロトン酸又はそのエステル；
【００２３】
マレイン酸又はマレイン酸ジブチル、マレイン酸ジオクチル、マレイン酸ジオクチル、又はマレイン酸ジエチルなどのマレイン酸のエステル；
【００２４】
スチレン又はエチルスチレン、ブチルスチレン又はジビニルベンゼンなどのスチレンの置換誘導体；
【００２５】
メタクリル酸ジメチルアミノエチル又はメタクリル酸ブチルアミノエチルなどのアミン官能基を含むモノマーユニット；
【００２６】
アクリルアミド又はメタクリルアミドなどのアミド官能基を含むモノマーユニット；
【００２７】
ビニルエーテル；ビニルチオエーテル；ビニルアルコール；ビニルケトン；塩化ビニルなどのハロゲン化ビニル；ビニル酢酸塩又はビニルバーサテートなどのビニルエステル；アクリロニトリル又はメタクリロニトリルなどのビニルニトリル；
【００２８】
塩化ビニリデン及びフッ化ビニリデンなどのハロゲン化ビニリデン；
【００２９】
テトラフルオロエチレン；
【００３０】
ブタジエン及びイソプレンなどのジエンモノマー；及び
【００３１】
アリルグリシジルエーテルなどのアリルエーテル。
【００３２】
好適なポリマー物質は、一例として及び限定されない例として、次のポリマー；
ポリ（エチレンオキシド）及びポリ（プロピレンオキシド）などのポリオキシド；ポリ（エチレンテレフタレート）などのポリエステル；ポリウレタン；ポリスルホン酸；ポリ（ジメチルシロキサン）などのポリシロキサン；多硫化物；ポリアセチレン；ポリスルホン；ポリスルホンアミド；ポリカプロラクタム及びポリ（ヘキサメチレンアジパミド）などのポリアミド；ポリイミン；ポリ尿素；ポリビニルピリジン及びポリビニルピロリジノンなどの複素環式ポリマー；天然ゴム、ゼラチン、セルロースなどの天然産ポリマー；ポリカーボネート；ポリ無水物；及びポリエチレン、ポリプロピレン及びエチレン−プロピレンコポリマーなどのポリアルケン；を含む。
【００３３】
ポリマー物質は、これは、カルボン酸塩、エステル、アミン、アルデヒド、アルコール又はハロゲン化物などの官能基を含み、化学的又は生物学的分析における粒子の実用性を強化するのに望ましい、化学的又は生物学的モエティを吸着させる部位を提供する。このようなポリマーからの微粒子製造方法はこの分野において公知である。コア微粒子を製造する典型的な手順を、以下の例で説明する。
【００３４】
ゲル−シェルは、任意のポリマー被覆技術によって形成してもよい。シェル形成ポリマーが、コア形成ポリマーよりも高い極性、又は低い表面張力を示すならば、ゲル−シェルビードのコア−シェル形態が熱力学的に好ましい。また、シェル形成ポリマーの体積分率がコア形成ポリマーより大きいならば、やはりコア−シェル形態が好ましい。従って、コア−シェル粒子の合成は、１よりも大きいシェル／コア重量比で行われる。ある実施例では、コアポリマーは疎水性であり、ゲル−シェルポリマーは、比較的親水性であり対象となる官能基を有する。
【００３５】
これらの制約の中で、任意のモノマー又はモノマーのの組み合わせを、ゲル−シェルポリマーとして選択することが出来る。ビニルモノマーの混合物が好ましい。本発明の一つの実施例によれば、主成分としてメタクリル酸メチルのモノマー混合物を、微量成分としてメタクリル酸ヒドロキシエチル及びメタクリル酸を用いて、ポリスチレン又は修飾したポリスチレンコア上にシェルを形成する。このようなモノマー混合物の一つは、重量で約６％のメタクリル酸ヒドロキシエチル、約５％乃至約２０％のメタクリル酸から成り、残りはメタクリル酸メチルである。これらのモノマーは、ポリスチレンより親水性である。
【００３６】
ビードサイズは、意図されている最終使用に適切になるように選択することが出来る。典型的に、粒子は直径約０．１乃至約１００ミクロンのサイズの範囲であり、より典型的には、約０．５乃至５０ミクロンであり、更に典型的には、約１乃至約１０ミクロンである。好ましくは、ビードは「単分散」である。すなわち、組ビードは、サイズ範囲が狭く、好ましくは、約５％を超えない平均径の変動係数（「ＣＶ」）を示す。
【００３７】
ゲル−シェルビードは、よく知られた手順に従って、コア内又はシェル内で、適切な磁性材料に結合することによって磁気的に反応するようにしてよい。このような方法の一つによれば、粒子が例１７に記載されるフェロ流動体のようなフェロ流動体で被覆されている。本明細書において使用される「磁気的反応」は、磁場の作用に応じて位置又は方向を変化する能力を意味する。
【００３８】
また、ゲル−シェルビードは、蛍光染料を組み込むことによって蛍光にしてよい。この染料は、選択的に色を検知できる又は蛍光を与える任意の染料を含んでいてもよい。色又は蛍光は、肉眼で又は顕微鏡若しくは他の機器を用いて検知することが出来る。１又はそれ以上の染料を使用する場合は、染料が本質的に異なる吸収スペクトル、発光スペクトル又は発光寿命を有するように、染料を選択することが出来る。
【００３９】
ゲル−シェル合成に続いて、対象となる生体分子が、ゲル−シェルビードと接触して配置される。生体分子などの溶質を含む溶液に接触すると、生体分子がゲルと周囲液体との間を仕切る。荷電し、ｐＨ感受性のゲル中の生体分子の分配係数は、ハイドロゲル中のｐＨ、温度及びイオン強度などの溶液特性、及びゲル組成、電荷密度、架橋及びポリマー留分などの物質特性によって影響される。これらのパラメーターのいずれか一つの変化は、荷電ハイドロゲルの分配に寄与する３つの主要なメカニズム：サイズ排除、静電学、及び疎水性のような短距離相互作用に影響を与える。ゲル中の大きな生体分子の分配は、ゲルの気孔率に依存する。しかし、通常使用される製造方法は、大きな、永続する気孔を導入しないため、ゲル内に存在する気孔率又は口径は、直ちに決定されることが出来ない。むしろ、気孔率はフレキシブルで可動な水和ポリマー鎖の間に一時的な空間が生じる結果出来る。従って、より大きな膨張が疑いなく大きな生体分子により高い分配係数をもたらす。マクロスコーピックゲルの場合の一つの問題は、ゲルへ及びゲルからの分子の移送が、しばしば拡散によって制御され、このためプロセスが遅くなることである。しかし、本件では、拡散のための特徴時間は、シェルの厚さの２乗に比例し、ミクロンの割合しかないので、ゲル−シェルの中及び外への移送は速い。気孔率に加えて、静電及び勤電効果は、帯電ゲルにおけるタンパク質分配に、主要な役割を果たす。膨張した帯電ゲルとタンパク質との間の相互作用の力は、そのｐＨがタンパク質のｐＩよりも低いか高いか、及びタンパク質がゲルに対して反対に帯電しているかどうかによって、ネット誘因あるいはネット反発のいずれであってよい。タンパク質とゲルの高いゲル電荷密度及び対立する電荷は、静電学的相互作用により高い分配を助ける。
【００４０】
本発明によれば、重要な生体分子の固定化は、上記のような物理的吸収段階に続いて、共有結合（カルボジイミド結合、アルデヒド結合、トシルエステル結合（以下、参照）などの、よく知られた結合反応のいずれか一つの使用（図１Ｂ、参照））を行うことによって実施することが出来る。エステル類、アルコール類、アミン類、チオール類、ハロゲン化物又はエポキシドを使用する他の対象となる結合方法を、この分野で公知の方法を用いて同様に使用することが出来る。
【００４１】
代替的に、最初の生体分子吸収後、刺激感受性のゲル−シェルを利用して、破壊遷移が始まり、吸収された生体分子（図１Ｅ、参照）を効果的物理的に捕獲することが出来る。刺激感受性のゲルは、それらの環境で小さな変化に対する平衡体積における不連続な遷移に反応するポリマーである。そのようなゲルは、温度、ｐＨ、イオン強度、光、電気、又は電磁場感受性などの、それらが反応する刺激に従って分類することが出来る。このようなゲルは、再生医療用の潜在的骨格及び医薬用タンパク質の制御された放出（Ｎ．Ａ．Ｐｅｐｐａｓ：Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌ．１．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８６，１８０ページ、Ｎ．Ａ．Ｐｅｐｐａｓ：Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌ．２．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８７，１７２ページ、及びＮ．Ａ．Ｐｅｐｐａｓ：Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌ．３．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８７，１９６ページ）として、及びタンパク質の分離及び精製のためのクロマトグラフィー担体メディア（Ｓａｓｓｉ，Ａ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  ＡＩＣｈＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４２（８）：２３３５−２３５３（１９９６））として広く研究されてきた。また、崩壊ゲルにおいて、低度の膨張は、タンパク質の高い分配を示すが、この体制における分配は、異なるメカニズムによってなされる。収縮ゲル層における増加したポリマー濃度は、誘因ポリマー−タンパク質相互作用（主として疎水性相互作用などの短距離相互作用）をもたらす。ｐＨ感受性ゲルの破壊遷移ｐＨを調整する幾つかの方法が、文献で報告されている。例えば、ポリアクリル酸ベースゲル内に疎水性構成成分の結合のために、破壊が生じるｐＨは、５乃至７に調整されていた（Ｐｈｉｌｉｐｐｏｖａ，  Ｏ．他  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，３０，８２７８−８２８５（１９９７））。加えて、疎水性相互作用に起因する分配は、しばしばハイドロゲル（Ｓｕｋｈｉｓｈｖｉｌｉ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｇｒａｎｉｃｋ  Ｓ．Ｊ．  Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１１０，２０，１０１５３−１０１６１（１９９９））におけるタンパク質分子の不可逆的捕獲を導き、それは、タンパク質を固定するための分配後の共有結合反応を不必要にする。
【実施例】
【００４２】
１．粒子の製造
実施例１−ポリマーコア粒子の製造
ハイドロゲルに被覆するための好ましいポリマー粒子を次のように製造した。環流冷却器及びＮ２注入−排出アダプター及び攪拌器を具えた２５０ｍｌ丸底ガラスフラスコをサーモスタット付き水浴に置いた。フラスコを４．２ｇのポリビニルピロリドン（Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＷ  〜２９，０００）及び１０６ｇのエチルアルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ，２００ｐｒｏｏｆ，９９．５％）の溶液で満たした。フラスコ内容物を７０℃に加熱し、２６ｇのスチレン（Ａｌｄｒｉｃｈ，９９＋％）及び０．１５６ｇのメタクリル酸（Ａｌｄｒｉｃｈ，９９％）を加えた。スチレン及びメタクリル酸の双方を減圧蒸留によって精製したてにした。１０ｇのエーテルに溶かした０．２６５ｇの２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ，８９％）を加えることにより重合を始めた。攪拌速度を２００ｒｐｍとし、反応時間を２４時間とした。反応終了時に、系を室温まで冷却した。重量測定法で測定したモノマー換算は、８１．７％であった。ラテックスを１，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄みを除去した。エタノールでの再分散及び遠心分離によって、ポリマー粒子を３回洗浄した。次いで、蒸留水に０．２％のポリビニルピロリジン及び０．０２％のビス（２−エチルヘキシル）スルホ琥珀酸ナトリウム塩（Ｆｌｕｋａ，９９．０％）の１：１の混合物にポリマーを再分散し、２，０００ｒｐｍで２０分間混合及び遠心分離した。この操作を繰り返し、最後に粒子を乳化剤溶液の同じ混合物に懸濁させた。ラテックス固体成分は、１６．９％であった。ＳＥＭにより測定したＣＶ２．０％を有する２．７８±０．０６μｍの平均数直径を有する単分散ポリスチレン粒子を得た。
【００４３】
より大きい径のコア粒子を生成するために、１０ｇのエタノールに０．２５ｇの２，２’−アゾビスイソブチロニトリルを除いて、同様の手順を上記のように使用し、ポリマー化を開始するために使用した。２２時間後、反応を冷却によって停止し、モノマーの変換を８９．０％として測定した。ラテックスを洗浄し、最後に２１．９％固体として決定した。粒子直径をＳＥＭにより測定し、３．５％のＣＶを有する３．０８±０．１１μｍが分かった。
【００４４】
実施例２−１．０のシェル／コア重量比を有するゲル−シェル粒子の合成（シック−シェル）
シック−シェルコアシェルビードを生成するために、上記で製造した粒子を次の手順を使用してハイドロゲルで被覆した。粒子径２．７８μｍ及び１６．９％の固体成分を有する、４９．４ｇのラテックス粒子（上記の例のように製造された）に、０．２１ｇのｔ−ブチルペルオキシ−２−ヘキサン酸エチル（Ｌｕｐｅｒｏｘ  ２６，  ＡＴＯＦＩＮＡ）と一緒に６％のメタクリル酸ヒドロキシエチル及び２０％のメタクリル酸を含有する８．３３ｇのメタクリル酸メチルを加えた。混合物を２５０ｍｌスクリューキャップガラス瓶に入れて少なくとも０．５時間振った。次いで、蒸留水に１６．６７ｇの０．２％のＰＶＰ及び０．０２％のビス（２−エチルヘキシル）スルホ琥珀酸ナトリウム塩の１：１混合物を溶解した０．２１ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏを加え、更に、０．２％のポリビニルピロリドン及び０．０２％のビス（２−エチルヘキシル）スルホ琥珀酸ナトリウム塩の同じ１：１混合物の溶液３．３ｇに０．２７ｇのホルムアルデヒド・スルホオキシル酸ナトリウム塩、０．０１４ｇのエチレン二アミン四酢酸鉄ナトリウム錯体を加えた。瓶は、４５℃にした水浴攪拌器に置いた。反応を６時間行った。ラテックスを１００μｍナイロン膜を通してろ過し、１０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上澄みを除去し、ｐＨ１０の０．１％のツウィーン溶液を用いて、１０時間ローラーで混合することにより、粒子を数回洗浄し、次いで、遠心分離及びデカンテーションを行った。最後に、粒子を０．１％ツウィーン溶液で懸濁した。平均粒子直径は３．２９μｍ±０．０６であり、ＣＶは、１．９％であった。
【００４５】
実施例３−０．５のシェル／コア重量比を有するゲルシェル粒子の合成（シン−シェル）
シン−シェルコアシェルビードを生成するための手順は、（前の例で記載されたように）コア粒子が３．０８μｍ径を有すること及び構成成分の特定の量が異なること以外、上述された手順と同様とした。要約すると、前の例で調整された５７．２ｇのラテックス（２１．９％固体）を０．１０７ｇのｔ−ブチルペルオキシ−２−ヘキサン酸エチルと一緒に６％のメタクリル酸ヒドロキシエチル及び２０％のメタクリル酸を含有する４．１７ｇのメタクリル酸メチルと混合した。０．２％のＰＶＰ及び０．０２％のビス（２−エチルヘキシル）スルホ琥珀酸ナトリウム塩の１６．６７ｇの１：１混合物に溶解した０．１ｇのＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏを蒸留水に加え、次いで、同じ１：１乳化剤混合物の溶液３．３ｇに溶解した０．１５ｇのホルムアルデヒド・スルホキシル酸ナトリウム塩、０．００７ｇのエチレン二アミン四酢酸鉄ナトリウム錯体を加えた。ラテックス粒子は、３．２３μｍ±０．０８の直径を有し、ＣＶは２．７％であった。
【００４６】
２．様々な条件下でのゲル−シェルビードに対するタンパク質の受動的吸着
以下の実施例において、ビードに被覆するハイドロゲル内にタンパク質を吸着した。ある条件下（低ｐＨ及び低塩濃度又は高塩濃度）での吸着については、タンパク質はハイドロゲルシェル内に保持されることが出来、条件が修正されたにも関わらず、受動的に拡散しないであろう。ｐＨ及びイオン強度は、吸着タンパク質のリガンドとの相互作用に影響を及ぼさない範囲にあるときに選択することが出来る。
【００４７】
実施例４−シン−シェル上のタンパク質の受動的吸着の温度依存性
組み替え型タンパク質Ｌ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．が提供している「Ｐｒｏ−Ｌ」）を使用した、シン−シェルビード上のタンパク質の受動的吸着に対する温度の影響を試験する実験を行った。識別できる蛍光染色されたシン−シェルビードを洗浄し、ビード１ｍｇ当たり２５、１００、４００及び１６００μｇの濃度で、Ｐｒｏ−Ｌと混合した。３つの温度条件下−室温（おおよそ２５℃）、３７℃及び５０℃で各々４時間、５００μＬのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ＝３、ＨＣｌを加えることにより調整された）で反応を実施した。次いで、Ｐｒｏ−Ｌ被覆ビードを、ブロッキング目的のために、室温で一夜、５００μＬの貯蔵緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２、０．１％のＢＳＡ及び０．１％のアジド）で実施した。これらのビードを使用するまで、４℃で個別に貯蔵した。
【００４８】
タンパク質Ｌは、ヒト免疫グロブリンに対して高い結合親和性を有するので、各ビードタイプのヒトＩｇＧ結合活性の測定により、カップリング効率を間接的にモニターした。シリコンチップ上にＰｒｏ−Ｌ被覆ビードを混合し、アッセンブルし、次いで、それがＰｒｏ−Ｌ及びヒトＩｇＧ分子の相互作用させるヒト血清サンプル（ＳＬＲ  Ｒｅｓｅａｃｈが提供しているＡＡＢ２２４、１乃至５０希釈）に接触した。非特定の結合抗体の除去後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ特定抗体Ｃｙ−５複合体を捕獲された抗体を視覚化するために使用した。復号及び分析イメージをＣＣＤカメラを取り付けた顕微鏡を使用して得た。分析シグナルを抽出して分析した。図１は、（１）抗体結合活性が、１ｍｇのビードに対して１６００μｇのＰｒｏ−Ｌで結合されたビードで監視された最も高い活性と共に、濃度依存法で増加し；（２）また、抗体結合活性が、試験された最も高い温度の５０℃被覆されたビードで監視された最も高い活性と共に、温度依存法で増加することを示している。シグナル強度は、各々のビード上に結合したプロテインの量を示す。
【００４９】
これらの結果は、より高い温度条件（約５０℃まで）が、シン−シェルビード上にタンパク質吸着を容易にすることを意味する。
【００５０】
シン−シェルビードに対して結合するタンパク質Ｌのための手順：
【００５１】
１．５００μＬのＰＢＳＬＴを含有する管内に１０μＬの１％ビード（１０μｇ）を加え、ボルテックスすることによって混合する。
【００５２】
２．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００５３】
３．５００μＬのＰＢＳＬＴにビードを再懸濁し、ボルテックスして混合する。
【００５４】
４．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００５５】
５．５００μＬのＰＢＳ、ｐＨ＝３にビードを再懸濁する。
【００５６】
６．各管に適量のタンパク質Ｌを加える。ボルテックスして混合する。
【００５７】
７．回転させつつ、４時間適切な温度でインキュベートする。
【００５８】
８．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００５９】
９．５００μＬの貯蔵緩衝液で一度洗う。
【００６０】
１０．５００μＬの貯蔵緩衝液で再懸濁し、回転の間一夜ＲＴでインキュベートする。
【００６１】
１１．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００６２】
１２．５００μＬの貯蔵緩衝液で一度洗う。
【００６３】
１３．開始容量の２倍の容量で再懸濁する。
【００６４】
１４．使用のために４℃で貯蔵する。
【００６５】
実施例５−ゲル−シェルビード上へのタンパク質の受動的吸着の時間依存性
シン−シェルビード上のタンパク質Ｌ（Ｐｒｏ−Ｌ）の受動的吸着における時間経過の効果を試験するための実験を実施した。はっきりと識別できる蛍光染色されたシン−シェルビードを洗浄し、５００μＬのＰＢＳ（ｐＨ＝３）で再懸濁し、５６４μＬの全容量中の６４μＬを加えることによりビード１ｍｇ当たり１００μｇの濃度でＰｒｏ−Ｌと混合した。１５分間、３０分間、１時間、２時間、３時間及び４時間回転する間に、３７℃インキュベーターで反応を実施した。次いで、Ｐｒｏ−Ｌ被覆ビードをブロッキング目的のために室温で一夜５００μＬの貯蔵緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２、０．１％のＢＳＡ及び０．１％のアジド）を用いてインキュベートした。これらのビードを使用されるまで４℃で個別に貯蔵した。
【００６６】
Ｐｒｏ−Ｌ被覆ビードを混合してシリコンチップ上でアッセンブルし、次いで、Ｐｒｏ−Ｌ及びヒトＩｇＧ分子の相互作用を許容するヒト血清サンプル（ＳＬＲ  Ｒｅｓｅａｃｈが提供しているＡＡＢ２２４、１乃至５０希釈）に接触させた。非特定結合抗体を除去した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ特定抗体−Ｃｙ５複合体を捕獲された抗体を視覚化するために使用した。復号及び分析イメージをＣＣＤカメラを取り付けた顕微鏡を使用して得た。分析シグナルを抽出して分析した。図２は、抗体結合活性が、タンパク質の吸着時間の長さに関連していることを示す。抗体結合活性は、インキュベーションの４時間後、すなわち、試験される最も長い時間の後、ピークレベルを伴って１５分で現れ始める。
【００６７】
実施例６−ゲル−シェルビード上のタンパク質の受動的吸着のｐＨ依存性
シン−シェルビード上のタンパク質の受動的吸着のｐＨの影響をＰｒｏ−Ｌ及びヒト血清サンプルを使用して評価した。受動的吸着を通してはっきりと識別できる蛍光復号されたシン−シェルビードとタンパク質を結合した。３７℃で４時間、異なるｐＨ（すなわち、３、５、７、９、１１）を用いて、リン酸緩衝生理食塩水中で反応を実施した。次いで、Ｐｒｏ−Ｌ被覆ビードをＲＴで６０分間、ＢＳＡ（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．２、０．１％のＢＳＡ及び０．１％のアジド）含有貯蔵緩衝液でインキュベートした。ビードを結合させたＰｒｏ−Ｌを貯蔵緩衝液で再懸濁し、使用するまで４℃で個別に貯蔵した。
【００６８】
Ｐｒｏ−Ｌと結合したビードをシリコンチップ上で混合してアッセンブルし、室温で３０分間、２つのヒト血清サンプルで実質的にインキュベートした。次いで、非特定結合を除去した後、室温で１５分間、蛍光標識検出抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ特定抗体−Ｃｙ５複合体）でインキュベートして、ビードチップを各々個別のビードによって捕獲されたＩｇＧ分子の量を視覚化した。復号及び分析イメージをＣＣＤカメラ付きの顕微鏡を使用して得た。次いで、分析シグナルを抽出して分析した。図４Ａは、最も高いＩｇＧ捕獲活性を、ｐＨ３で結合したビードで観察され、有意でない活性をＢＳＡ（負の制御）被覆ビードのいずれかで観察したことを示す。これらの結果は、低いイオン強度（ｐＨ＝３）が受動的吸着を容易にすることを示す。
【００６９】
同様に、シック−シェルビードに関連する別の実験において、酸性緩衝液（ｐＨ＝３）で行われた蛍光標識タンパク質（ヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体−Ｃｙ５複合体）の受動的吸着は、中性（ｐＨ＝７）又はアルカリ性（ｐＨ＝１１）緩衝液で結合したビードと比較して有意により高い蛍光シグナル強度をもたらす。色素タンパク質複合体を、第２段階の分析を用いずに固定化及び視覚化したので、シグナル強度は、各ビードに結合したタンパク質の実際の量を示す（データでは示さず）。
【００７０】
同様の実験をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，ＯＲ．Ｂｒｉｅｆｌｙ，から得たＢｏｄｉｐｙ−ＦＬ標識アビジン（１０という高いｐＩ値を有するタンパク質）を使用して実施した。要するに、５００μｇの洗浄シンゲル−シェルビードを、適切なｐＨ（ｐＨを希ＨＣｌ又はＮａＯＨを使用して調整した）で、５００μＬの５０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で懸濁させた５００μｇの標識タンパク質でインキュベートした。混合物を１時間インキュベートし、次いで、ビードを遠心分離によって分離し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄して貯蔵した。分析のために、ビードの小さなアリコートをチップ上に取ってアッセンブルし、それらの緑色蛍光を記録した。図４Ｂは、緑色オン−ビード蛍光のプロットは、ｐＨの機能として記録した。以前に見られたように、ｐＨ＝３で取り込んだタンパク質が強化されていることが明示されている。
【００７１】
総ての実験的証拠は、シン又はシックシェルビード上にタンパク質の受動的吸着を中性又はアルカリ性緩衝液条件よりも酸性緩衝条件でよりよく達成することを支持する。従って、他のタンパク質の受動的吸着にこの酸性緩衝液を使用した。
【００７２】
異なるｐＨレベルでのシン−シェルビードへのＰｒｏ−Ｌ結合のための手順：
【００７３】
１．５００μＬのＰＢＳＬＴを含む管内に１０μＬの１％ビード（１０μｇ）を加えてボルテックスすることによって混合する。
【００７４】
２．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００７５】
３．５００μＬのＰＢＳＬＴにビードを再懸濁し、ボルテックスして混合する。
【００７６】
４．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００７７】
５．異なるｐＨ（３、５、７、９、１１）で５００μＬのＰＢＳＬＴにビードを再懸濁する。
【００７８】
６．各管に適量のタンパク質Ｌを加える。ボルテックスして混合する。
【００７９】
７．回転させながら、３７℃で４時間インキュベートする。
【００８０】
８．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００８１】
９．５００μＬ貯蔵緩衝液で１度洗浄する。
【００８２】
１０．５００μＬの貯蔵緩衝液で再懸濁し、回転させながらＲＴで６０分間インキュベートする。
【００８３】
１１．１００００ｒｐｍで３分間ビードを遠沈し、上澄みを捨てる。
【００８４】
１２．５００μＬ貯蔵緩衝液で１度洗浄する。
【００８５】
１３．開始容量の２倍の容量で再懸濁する。
【００８６】
１４．使用のために４℃で貯蔵する。
【００８７】
実施例７−ゲル−シェルビード上へのタンパク質の受動的吸着に対する低塩効果
タンパク質固定化への塩効果を試験するために、タンパク質Ｌ、ＳＳＡ−６０及びＪｏ−１を異なる塩濃度を有するＰＢＳ緩衝液に識別できる蛍光復号されたシン−シェルビードに結合した。これらの緩衝液は総てＨＣｌを使用してｐＨ３に調整した。３つの異なる塩濃度条件−通常のＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム；０．１５Ｍ塩化ナトリウム）；１乃至１０希釈ＰＢＳ（１０ｍＭリン酸ナトリウム；１５ｍＭ塩化ナトリウム）及び１乃至５０希釈ＰＢＳ−３７℃で４時間反応を実施し、次いで、それをＲＴでＢＳＡを含有する貯蔵緩衝液で６０分インキュベートした。ビードを、混合してシリコンチップ上でアッセンブルし、それを、抗ＳＳＡ−６０及び抗Ｊｏ−１抗体を含有するプールヒト血清サンプル、又は負の制御としてのみの緩衝液を用いてインキュベートした。非特定結合抗体を除去した後、ＲＴで１５分間ヤギ抗ヒトＩｇＧ特定抗体−Ｃｙ５複合体でチップをインキュベートした。復号及び分析イメージを得て、分析シグナルを抽出して解析した。
【００８８】
図５に示されるように、低塩緩衝液を使用して結合したビードは、通常のＰＢＳで結合したビードと比較して、有意により高い抗体反応性を有し、その結果、受動的吸着が低イオン強度環境でより好ましいことを示す。同様に、低塩及び酸性緩衝条件でビード上に固定したＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ、ＣｌａｓｓＩＩ抗原、ヒトＩｇＧ、マウスＩｇＧ、ＳＳＢ及びＣＥＮＰを含有するタンパク質に対して、より高い抗体反応性が達成された（結果は示さず）。
【００８９】
実施例８−疾病陽性血清サンプルの自己抗体スクリーニング及び滴定カーブ用の受動的吸着によって結合した抗原パネル
自己抗体スクリーニング用の受動的に吸着したタンパク質の実現可能性を評価するために、低塩及び低ｐＨ条件下で受動的吸着によって、シン−シェルビード上に自己抗原ＳＳＡ−６０、Ｓｍ、Ｓｍ／ＲＮＰ、Ｊｏ−１、ＣＥＮＰ及びＳＳＢ−を結合することによって６−抗原パネルを作った。０．１％（Ｗ／Ｖ）含有貯蔵緩衝液でブロッキングする手順の後、これらのビードを使用するまで個別に４℃で貯蔵した。
【００９０】
様々な抗原と結合したビードをシリコンチップ上でプールしてアッセンブルした。これらのチップ及び前特性化抗Ｊｏ−１陽性血清サンプルを使用して、抗体滴定曲線を得た。一連の希血清サンプルを１：３、１：９、１：２７、１：８１、１：２４３、１：７２９、１：２１８７、１：６５６１比で準備した。これらの希釈サンプルを室温で３０分間８つのチップを用いて順次インキュベートした。非特定結合抗体を除去した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ特定抗体−Ａｌｅｘａ複合体を結合ＩｇＧ抗体を視覚化した。復号及び分析イメージを収集して、次いで、分析シグナルを抽出して解析した。図６は：（１）Ｊｏ−１結合シン−シェルビードは、総ての他の抗原結合シン−シェルビードが観測されるように、バックグラウンド最小活性を有する特定反応性を生じさせ、その結果、特定抗体−抗原相互作用を示し；（２）抗Ｊｏ−１反応性の強度が、濃度依存的に増加する；ことを示す。
【００９１】
加えて、抗ＳＳＡ−６０、抗ＳＳＢ、抗ＣＥＮＰ及び抗Ｊｏ−１抗体を含有するプール血清サンプルを、６−抗原パネルで被覆されたチップと反応させた。図７に示すように、強特定反応性をＳＳＡ−６０、ＳＳＢ、ＣＥＮＰ及びＪｏ−１抗原と結合したビードを観察したが、ｓｍ、ｓｍ／ＲＮＰ又は負の制御（ｈ−ＳＡ；ヒト血清アルブミン）と結合したビードを観察しなかった。
【００９２】
実施例９−タンパク質チップ分析手順
Ｃｙ５抗体複合体を使用するタンパク質チップ分析手順Ａ：
１．１５μＬの調整血清サンプルを各チップに加える。加湿室にチップを置く。振動させながら、室温で３０分間インキュベートする。
【００９３】
２．血清サンプルを除去し；各チップを、１５乃至２０μＬの洗浄緩衝液（０．２５％（Ｖ／Ｖ）ツウィーン−２０を含む通常のＰＢＳ）で素早く３回洗浄する。
【００９４】
３．１５μＬの１乃至１００希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧガンマ特定抗体−Ｃｙ５複合体を加える。湿度室にチップを置く。振動させながら、室温で１５分間インキュベートする。
【００９５】
４．検出抗体を除去し；各チップを、素早く３回１５乃至２０μＬの洗浄緩衝液で洗浄する。
【００９６】
５．各チップに１０μＬの通常のＰＢＳを加える。上にカバースリップを置く。
【００９７】
６．ＣＣＤカメラを具える顕微鏡を用いてイメージを得る。
【００９８】
７．データ抽出及び解析。
【００９９】
Ａｌｅｘａ−抗体複合体を使用するタンパク質チップ分析手順Ｂ：
１．１５μＬの調整血清サンプルを各チップに加える。加湿室にチップを置く。振動させることなく、室温で３０分間インキュベートする。
【０１００】
２．血清サンプルを除去し；各チップを、１５乃至２０μＬ洗浄緩衝液（０．２５％（Ｖ／Ｖ）ツウィーン−２０を含む通常のＰＢＳ）で素早く３回洗浄する。
【０１０１】
３．１５μＬの１乃至５０希釈ヤギ抗ヒトＩｇＧガンマ特定抗体−Ａｌｅｘａ複合体を加える。加湿室にチップを置く。振動させることなく、室温で１５分間インキュベートする。
【０１０２】
４．検出抗体を除去し；各チップを１５乃至２０μＬ洗浄緩衝液で３回素早く洗浄する。
【０１０３】
５．１０μＬの通常のＰＢＳを各チップに加える。上にカバースリップを置く。
【０１０４】
６．ＣＣＤカメラを備えた顕微鏡を使用してイメージを得る。
【０１０５】
７．データ抽出及び解析。
【０１０６】
実施例１０−ゲル−シェルビード上にタンパク質の受動的吸着への高塩効果
また、シン−シェルビード上にタンパク質吸着の高塩の影響を試験した。２つの抗原−ＳＣＬ−７０及びＳｍ（ＩｍｍｕｎｏＶｉｓｉｏｎ、アリゾナ）−を異なる塩濃度でＰＢＳ緩衝液に、はっきりと識別できる蛍光復号されたシン−シェルビードに結合した。緩衝液を、ＨＣｌを使用してｐＨ３に調整した。特に、３７℃で４時間５つの異なる塩条件（５倍、１倍、０．２倍、０．０４倍及び０．００８倍  ＰＢＳ）下で、反応を実施した。５倍濃縮緩衝液は、０．５Ｍリン酸ナトリウムと；ｐＨ７．２の０．７５Ｍ塩化ナトリウムであった。次いで、ビードを０．１％ＢＳＡ含有貯蔵緩衝液でブロックした。これらのビードをシリコンチップ上にプールしてアッセンブルした。
【０１０７】
これらのビードの抗体結合活性を評価するために、２つの高特性化血清サンプル（抗Ｓｍ陽性、及び抗ＳＣＬ−７０陽性）を使用した。サンプルを、１：１０の比率で標準緩衝液で希釈し、次いで室温で３０分間、チップで順次インキュベートした。非特定結合抗体を除去した後、ＲＴで１５分間ヤギ抗ヒトＩｇＧ特定抗体−Ａｌｅｘａ複合体でチップをインキュベートした。第２洗浄ステップ後、復号及び解析イメージを得、分析シグナルを抽出して解析した。図８に示されるように：（１）特定抗ＳＣＬ−７０の反応をＳＣＬ−７０抗原と結合したビードで観察したが、Ｓｍと結合したビードと観察しなかった；（２）抗ＳＣＬ−７０の反応強度は塩濃度に依存し、５倍ＰＢＳで結合したビードで最も高活性が得られた。最も高い抗Ｓｍ反応性を５倍ＰＢＳで結合したビードで観察した。図９参照。
【０１０８】
実施例１１−ゲル−シェルビード上の酵素の固定化及び酵素活性の効果
ハイドロゲルコアシェルビード上に固定化された酵素が酵素活性を失うかどうかを決定する実験を行った。ストレプトアビジン合成ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ストレプトアビジン−ＨＲＰ）をコアシェルビードを特徴づけるモデル酵素として使用した。ストレプトアビジンは、ビオチン及びビオチン化分子に対して高い親和性を有することがよく知られている。ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ラベリング広く使用されており、化学発光法などの酸化反応で抗原−抗体複合体の検出のための第２抗体と結合する。結合タンパク質複合体におけるストレプトアビジン及びホースラディッシュペルオキシダーゼの活性を検出する公知の方法がある。
【０１０９】
ストレプトアビジン−ＨＲＰを受動的吸着によってカラーエンコードシン及びシック−シェルコアビードに固定した。要するに、７５０μｇのタンパク質複合体を結合緩衝液（３ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）中で３７℃で一夜、定回転で、１ｍｇのカラーエンコードシン及びシック−シェルコアビードとインキュベートした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を負の制御タンパク質として使用した。タンパク質官能化後、０．０５％のツウィーン−２０（ＰＢＳＴ）を添加して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）を使用することによって、粒子を洗浄した。次いで、官能化した全ビードを試験管内でアッセンブルして、混合した。使用前にチップ結合サイトをＰＢＳＴに１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用することによってブロックした。
【０１１０】
ビード上のストレプトアビジン−ＨＲＰの固定化を確認するために、５’及び３’末端をビオチン及びＣｙ５．５染料で標識した５チミン塩基を含有するオリゴヌクレオチドで、チップをインキュベートした。インキュベート後、チップをＰＢＳＴで洗浄して非結合オリゴヌクレオチドを除去し、蛍光顕微鏡を使用してビードからのシグナルを調べた。Ｃｙ５．５蛍光シグナルをビードを結合したストレプトアビジン−ＨＲＰを識別して、ＨＲＰ活性を失うことなくビードによってタンパク質複合体の固定化を示した（図１０）。
【０１１１】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が提供しているチラミドシグナル増幅技術などの既知の方法を使用してコアシェルビードを結合したストレプトアビジン−ＨＲＰ上でＨＲＰ活性を決定することが出来る。チラミドシグナル増幅において、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、近接タンパク質のチロシン残渣に共有結合することが出来る、高反応性で短命のチラミドラジカルを生じる蛍光標識チラミドの活性化を触媒する。実験を要約すると、チップ上のビードを官能化したストレプトアビジン−ＨＲＰ官能化ビードをチラミド試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．  例  カタログ  ＃  Ｔ−２０９１２，Ｔ−２０９１６）でインキュベートし、次いで、公知の方法により、ビードチップ上の蛍光シグナルを決定した。ストレプトアビジン−ＨＲＰシン及びシック−シェルビードからのシグナル強度は、ＢＳＡ被覆制御ビードからのシグナル強度よりもかなり高く、ビード上のペルオキシダーゼ活性があったことを示唆している（図１１）。
【０１１２】
実施例１２−ゲル−シェルビード上に固定化されたヒト白血球抗原の相補抗体との反応
本明細書に記載されたコアシェルビードをヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に対して特異的な同種抗体を分析するために使用することが出来る。ヒトクラスＩ及びＩＩ分子は、組織及び細胞中に現れるＨＬＡ抗原の２つの特異なクラスである。ヒト細胞から単離したクラスＩ及びＩＩ分子を、実施例４で述べた方法による着色エンコードコアシェルハイドロゲルビードに固定した。並行して、非関連タンパク質を負の制御としての他の型の着色コアシェルビードに結合した。結合後、官能化した全ビードを結合して、シリコンチップ上のランダム平面アレイにアッセンブルした。次いで、クラスＩ又はクラスＩＩ−特異ヒト血清又はマウスモノクローナル抗体とチップをインキュベートした。チップ上のＨＬＡ抗原と結合した抗体を、蛍光標識ヒト又はマウス−特異第２抗体を使用することによって検出し、蛍光顕微鏡法によって調べた。
【０１１３】
図１２Ａ、１２Ｂ、１３Ａ、１３Ｂで示されるように、クラスＩ及びクラスＩＩ−特異ヒト抗体を、固定化クラスＩ及びＩＩ抗原を含有するコアシェルビードからそれぞれ特定した。更に、ヒト抗体結合の選択性を、分析においてクラスＩ又はクラスＩＩ−特異マウスモノクローナル抗体を使用することによって確認した（図１２Ｂ、１３Ｂ）。従って、コアシェルビード上のクラスＩ及びＩＩＨＬＡを、有用な抗原−抗体分類における、例えば移植又は輸血の適合性を決定するときにおける、パネル反応抗体（ＰＲＡ）に用いることが出来る。
【０１１４】
３．ゲル−シェルビードに対するタンパク質の共有結合
実施例１３−カルボン酸修飾ゲルシェルビードに対するタンパク質の結合
自由アミン基を有する分子（例、タンパク質）を、第１段階カルボジイミド（ＥＤＡＣ）反応を使用したカルボキシル化されたビードに対して結合することが出来る。しかし、大きな分子に対しては、水溶性スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを加えて、カップリング効率を増加出来る（図１Ｂ参照）。Ｎ−ヒドロキシ化合物によって形成された活性エステル中間体は、別の方法で形成されたアシルイソ尿素中間体を置換し、それは、極めて不安定である。ＮＨＳエステルは、加水分解に対してより安定であるが、結合されるタンパク質上のアミンに対する非常に反応性が高い。
【０１１５】
Ａ．タンパク質カップリングの手順（ＥＤＡＣ反応）
２ｍｌのガラス瓶中で、１０ｍｇのカルボキシル化官能化ハイドロゲル（登録商標）−シェル微粒子を含むアリコートを１ｍｌの１０ｍＭホウ酸塩緩衝剤（ｐＨ＝８．５）と混合した。次いで、粒子を遠沈によって分離し、上澄みを吸い上げた。これに次いで、分離沈殿物を０．１ＭのＭＥＳ緩衝剤（ｐＨ＝４．５）で２回洗浄し、最後に６００μｌの同じもので再懸濁した。別のガラス瓶中で、事前に計算した量のタンパク質を、３００μｌのＭＥＳ緩衝剤に溶解して、溶液をポリマー微粒子の懸濁液にゆっくりと加えた。懸濁液を、プローブソニケーターを使用して、簡単な超音波処理を行った。これに次いで、１５０μｌの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ、ミルウォーキー、ＷＩ）（ＥＤＣＡ）溶液（２００ｍｇ／ｍｌ）を粒子溶液に加えた。混合物を、室温で２時間反応させ、次いで、タンパク質官能化ポリマー微粒子を分離して、１度目はカップリング緩衝剤で、２度目はホウ酸緩衝液で洗浄し、最後に貯蔵緩衝剤（ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ツウィーン２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）に２乃至８℃で貯蔵した。図１４Ａ参照。
【０１１６】
Ｂ．タンパク質カップリングの手順（ＥＤＡＣ−ＮＨＳ反応）
１．１．５ｍＬエッペンドルフ管に１ｍＬのＰＢＳＴを加える。
【０１１７】
２．５０μＬの１％カルボキシル化ビード（０．５ｍｇ）を対応する管に移し、ボルテックスすることにより、よく混合する。
【０１１８】
３．７５００ｒｐｍで２時間遠心分離し、上澄みを静かに移す。
【０１１９】
４．１ｍＬのＰＢＳＴで１回、１ｍＬのカップリング緩衝剤（０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液、ｐＨ６．０）で１回洗浄し、上澄みを静かに移す。
【０１２０】
５．３０ｍｇのＥＤＡＣ及び６ｍｇのＮＨＳを３ｍＬのカップリング緩衝剤へ加えて、完全に混合して１ｍＬの溶液を管に加える。
【０１２１】
６．エンド−オーバー−エンドミキシングを用いて、室温で１５分間反応させる。
【０１２２】
７．７５００ｒｐｍで２時間遠心分離し、上澄みを静かに移す。
【０１２３】
８．１ｍＬのＰＢＳＴで１回、１ｍＬのカップリング緩衝剤（０．１Ｍ  ＭＥＳ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ溶液、ｐＨ６．０）で１回洗浄し、上澄みを静かに移す。
【０１２４】
９．必要量のタンパク質（タンパク質量の詳細を含む）を０．５ｍＬのカップリング緩衝剤に溶解してよく混合する。
【０１２５】
１０．ステップ＃９のタンパク質溶液５００μＬをステップ＃８のビードを含む管に移し、よく混合して、４℃で一夜緩やかに混合してタンパク質とビード懸濁液の混合物をインキュベートする。
【０１２６】
１１．室温にする。反応物を、５０μＬのエタノールアミンを５００μＬ体積の反応溶液に加えることにより急冷する。
【０１２７】
１２．エンド−オーバー−エンドミキシングを用いて、室温で３０分間インキュベートする。
【０１２８】
１３．１ｍＬのＰＢＳＴで２回洗浄し、上澄みを静かに移して、１０ｍｇ／ｍＬ（１％固体）のビード濃度で５０μＬの貯蔵緩衝剤（０．１％ＢＳＡ、０．１％ツウィーン２０及び０．１％ＮａＮ３を含有する０．１Ｍ  ＰＢＳ）に再懸濁する。図１４Ｂ参照。
【０１２９】
様々なビオチン−結合タンパク質を上記のようなプロトコルを使用するビードに結合した。ニュートラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）（ビオチン−結合タンパク質、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｌｄ、ＩＬ）を１段階ＥＤＡＣ反応を使用してシン及びシック−シェルコアビードの双方に結合した。マウス抗ビオチンｍＡｂ及び抗ビオチンＦａｂ（ビオチン−結合全体及び断片化ＩｇＧ、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、インディアナポリス、ＩＮ）をＥＤＡＣ−ＮＨＳプロトコルを使用して結合した。以下のように全ビードの捕獲活性を試験した。
【０１３０】
構造５’−／５Ｃｙ５５／ＴＴＴＴＴ／３ＢｉｏＴＥＧ／−３’を有するビオチン化オリゴヌクレオチドをＩＤＴ（Ｃｏｒａｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から得た。また、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）又は他のビオチン−結合タンパク質既被覆ビードを得た。２６．５ｎｇ／μＬの溶液濃度で存在するビオチン化オリゴと０．５ｍｌ反応緩衝剤（ＰＢＳ、０．１Ｍリン酸ナトリウム及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に５０μＬのタンパク質被覆粒子溶液の１％溶液中で結合反応を実施した。反応混合物をボルテックスしながら、室温で３０分間インキュベートした。結合反応の完了時に、粒子を遠心分離によって集め、ＰＢＳＴ（０．０５％ツウィーン２０と一緒の１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を用いて３回洗浄して、０．２ｍｌＰＢＳに再懸濁した。次いで、オリゴヌクレオチド官能化エンコードゲル−シェル粒子を、シリコン層にアッセンブルし、（５’Ｃｙ５５蛍光プローブタグからの）蛍光強度を蛍光顕微鏡及び社内で開発された分析イメージソフトウェアを使用して解析した。結果を図１５Ａ、１５Ｂ、及び１５Ｃに示す。また、全ケースで、比較のために、同じバッチのタンパク質を市販類似サイズ粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、インディアナ）に共有結合した。結果は、ゲル−シェルビードがよりよく機能し、又は最悪の場合でも、市販のビードと同様であることを示している。
【０１３１】
別に、アフィニティー精製ＳＣＬ−７０タンパク質（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ、ＡＲ）をＥＤＡＣ−ＮＨＳプロトコルを使用してゲル−シェルビードに結合した。ここでも、比較のために、同じバッチのタンパク質を市販類似サイズ粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、インディアナ）に共有結合した。前述のように、ビードをＳＣＬ−７０陽性血清と反応させた。結果を図１５Ｄ及び１５Ｅに示す。
【０１３２】
実施例１４−アルデヒド修飾ゲル−シェルビードに対するタンパク質の結合
Ａ．アミノジオールリガンドと−ＣＯＯＨゲル−シェル粒子の結合
０．５乃至１Ｍのリガンド濃度を有する１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝４．５）中で、ｐＨを調節した３−アミノ−１，２−プロパンジオールリガンド［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］を調整する。（一度溶解した自由塩基がｐＨを４．５に戻すために濃縮酸溶液との滴定を必要とする。）１００μｌの１％ビード懸濁液、沈殿物を取り、５００μｌのリガンド溶液で２回洗浄する。１ｍｌのリガンド溶液に再懸濁し、ボルテックスしてよく混合する。
【０１３３】
２本の別個の遠心分離管に、２０ｍｇ及び１０ｍｇのＥＤＡＣをそれぞれ量り取る。（量り取る前にＥＤＡＣを室温にする）。上記のように調整した１ｍｌのビード懸濁液を２０ｍｇＥＤＡＣを入れた管に加えて、ボルテックスしてＥＤＡＣを溶解し、ＲＴで３０分間エンド−オーバー−エンドで回転する。内容物を、１０ｍｇのＥＤＡＣを含む第２遠心分離管に移し、室温でもう１時間エンド−オーバー−エンドで回転する。
【０１３４】
沈殿物；ＰＢＳＴ（３倍）で洗浄し、更に使用に必要になるまで（２乃至４℃で）ＰＢＳＴ（１ｍｌ、０．１％）に保存する。
【０１３５】
Ｂ．アミノ−ジオール結合ゲル−シェルの酸化
１２０ｍＭ  過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）を２０ｍＭ  ＰＢＳ（Ｐｉｅｒｃｅが提供する５倍希釈標準ＢｕＰＨ）に調整する。５０ｍｌ貯蔵溶液を調整するために過ヨウ素酸ナトリウムを１．３ｇまで量り取り、それを５０ｍｌの２０ｍＭ  ＰＢＳに溶解する。
【０１３６】
上記のように調整したビード懸濁液１ｍｌを取り、沈殿物を５００μＬの過ヨウ素酸ナトリウム溶液で１回洗浄して１ｍｌの同じもので懸濁する。光から保護して、室温で３０分間エンド−オーバー−エンドで回転する。
【０１３７】
インキュベーションが終了した後、沈殿させてＰＢＳＴでビードを２回洗浄し、同じ溶液で保存する。［各洗浄後、短時間（１０秒まで）超音波で分解する］
【０１３８】
Ｃ．アルデヒド  ゲル−シェルに対するタンパク質の結合
初期シアノホウ化水素ナトリウム溶液（ＮａＣＮＢＨ３）を調整する：０．５ｍｌの１０ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）に３２ｇのシアノホウ化水素を量り取る［注意：ＮａＣＮＢＨ３は有毒であり、フード下で扱われるべきであり、また、溶液を前もって１時間以上前に調整しておくべきである］。図１６参照。
【０１３９】
サブパートＢにおいて調整したビードを取り、沈殿させて５００μｌ  ＰＢＳで２回洗浄する。３００μｌのＰＢＳを加え、再懸濁し、次いで、所定の濃度で２００μｌのタンパク質溶液を加える（ＰＢＳ中に作られる又は供給されるように）（１ｍｇ／ｍｌまで）。よく混合し、１０μＬのホウ化水素溶液を加え、光から保護して、室温で２時間エンド−オーバー−エンド回転で反応する。インキュベーション後、ブロッキング緩衝液で２回洗浄して、５００μｌの同じものに再懸濁する。更なる使用に必要になるまで、２乃至４℃で貯蔵する。
【０１４０】
図１７Ａ、１７Ｂ及び１７Ｃは、アルデヒドビードに固定化されたモノクローナルマウス抗ビオチン抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用した分析結果を示す。２タイプの検出を、ビオチン化Ｃｙ５．５標識化オリゴヌクレオチド（５’−／５Ｃｙ５５／ＴＴＴＴＴ／ｓｐａｃｅｒ／ビオチン／−３’）（ＩＤＴ  Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＮ）及びヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｆ（ａｂ’）２（Ｃｙ５標識化）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用して実施した。抗体制御ビード（わずかな３−アミノ−１，２−プロパンジオール官能化ビード）は負の制御として使用しなかった。総ての場合で、分析シグナルは特異的であり、バックグラウンド結合は低かった。また、抗ビオチン被覆ビードをヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）全分子（Ｃｙ５標識化）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）にさらすことにより試験を実施した。非特異結合は無視した。
【０１４１】
図１８は、アフィニティー精製自己抗原ＳＳＢ（Ｉｍｍｕｎｏｖｉｓｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｄａｌｅ、ＡＲ）ビードを使用した分析結果を示す。ビードをＳＳＡ／ＳＳＢ陽性血清（１：２５０希釈）と反応させ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）全分子（Ｃｙ５標識化）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用して結合を検出した。反応を２重に行い、各場合で非特異結合にアクセスするための抗原制御ビード（わずかな３−アミノ−１，２−プロパンジオール官能化ビード）は含まれていなかった。
【０１４２】
実施例１５−トシル修飾ゲル−シェルへのタンパク質の結合
Ａ．トシル化リガンドの合成
パラ−スルホニル塩化トルエン及びエタノールアミンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。１９０ｍｇの塩化トシル及び６０μｌのエタノールアミンを１０ｍｌの乾燥ジクロロメタンを加えて、２５０μｌのピリジンをそれに加えた。無色の溶液がすぐに黄色になり；次いで、色は徐々に消えて、溶液は再び無色になった。反応を室温で３時間進行させ、その後混合物を蒸発乾固し、べとべとした粘着性ペーストを最終生成物として得た。
【０１４３】
Ｂ．カルボキシル化ゲル−シェルに対するリガンドの結合
０．１乃至１Ｍのリガンド濃度を有する１００ｍＭ  ＭＥＳ緩衝溶液（ｐＨ＝４．５）中でｐＨを調節した２−アミノ−１−エタントシル酸溶液を調整した。１００μｌの１％ビード懸濁液を沈殿し、ＭＥＳ緩衝剤で２回洗浄し、次いで、１ｍｌのリガンド溶液で再懸濁し、ボルテックスしてよく混合した。２本の別々の遠心分離管に、２０ｍｇ及び１０ｍｇのＥＤＡＣそれぞれを量り取った（ＥＤＡＣは量り取る前に室温にした）。ステップ１で調整したビード懸濁液１ｍｌを２０ｍｇのＥＤＡＣを入れた管に加え、ボルテックスしてＥＤＡＣを溶解し、ＲＴで３０分間エンド−オーバー−エンドで回転した。内容物を１０ｍｇのＥＤＡＣを含む第２遠心分離管に移し、室温でもう１時間エンド−オーバー−エンドで回転した。次いで、沈殿させ、ＰＢＳＴ（３倍）で洗浄して更なる使用まで（２乃至４℃）でＰＢＳＴ（１ｍｌ、０．１％）に貯蔵した。
【０１４４】
Ｃ．タンパク質結合
２ｍｌのガラス瓶中で、１０ｍｇのトシル−官能化コア−シェル微粒子を含むアリコートを、１ｍｌの１００ｍＭホウ酸緩衝剤（ｐＨ＝９．０）と混合した。次いで、粒子を遠心分離によって分離し、上澄みを吸い上げた。これに続いて、分離沈殿物を１００ｍＭホウ酸緩衝剤（ｐＨ＝９．０）で２回洗浄し、最後に６００μｌの同じもので再懸濁した。別のガラス管に、事前に計算した量のタンパク質を３００μｌのホウ酸緩衝剤に溶解し、溶液をポリマー微粒子の懸濁液に徐々に加えた。懸濁液をプローブソニケーターを使用して短時間で超音波で分解した。混合物を３７℃で一夜反応させ、次いで、タンパク質官能化ポリマー微粒子を分離し、ホウ酸緩衝剤で２回洗浄して、最後に懸濁して貯蔵緩衝剤（ＰＢＳ  ｐＨ＝７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．５％（ｗ／ｖ）ツウィーン２０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３）に２乃至８℃で保存した。図１９参照。
【０１４５】
実施例１６−サイトカインモニタリングのためのゲル−シェルビード分析
本明細書で記載されているゲル−シェルビードのその他の可能な使用可能性は、細胞が分泌するサイトカインの多重分析を実施することである。この方法は、基質上のアッセンブル、ゲルに固定化した抗体を有する符号化したゲル−シェル微粒子の分析を含む。次いで、適切な刺激性細胞を（分析フォーマットにおいても）特定の期間、加湿した３７℃ＣＯ２インキュベーターにおける微粒子配列と接触させる（層にする）。細胞は、微粒子よりも大きく、従って、各細胞が幾つかの異なる微粒子と接触しやすく、各微粒子は別の細胞生成物の分析を可能にする。
【０１４６】
このインキュベーション時間中に、細胞はサイトカインを分泌し、分泌細胞のすぐ近くの固定化抗体官能化ビードに分配し、サイトカインを捕獲する。シェル化学は、他の大きな分子を排除するように、分配を最適化させることが出来る。細胞の除去及び任意の非結合性物質を洗い流した後、選択されたサイトカインに対して特異的な蛍光標識化第２抗体のカクテルを配列に加える。次いで、任意の非結合性第２抗体を除去するための洗浄をし、配列を標準蛍光顕微鏡を使用して画像にし、異なるエンコード微粒子に対する記録済みの蛍光強度からサイトカイン分泌の程度及びタイプを決定する。この分析フォーマットにおける、細胞及びビードの相対的な位置（サイトカイン放出前後）を、図２０に図示する。
【０１４７】
サイトカイン分析の標準フォーマットに勝るこの分析の利点は、各細胞が幾つかの微粒子に接触することが出来、その各々が異なるサイトカインを検出することである。この方法で、特定の細胞から分泌されるサイトカインを、現在可能ではない多重及びより高スループット態様で特定することが出来る。
【０１４８】
実施例１７−マグネティックゲル−シェルビードの作成
本発明のビードのゲル−シェルは、従来の様々な方法のいずれか１つを使用して磁化することが出来る。例えば、ゲル−シェルに先駆物質磁気ミネラル塩溶液を含浸させることが出来た。反応剤及び任意に酸化剤又は加熱の追加は、金属塩をゲルシェルの全体に含まれる磁気酸化物の結晶に転化する（Ｃｈａｎｇ  Ｍ．  ＵＳ４，８７３，１０２）。また、マグネティックゲル−シェルビードを、２段階プロセスを介して生成することが出来る。このプロセスにおける第１のステップは、（１）表面が適切に修飾されたゲル−シェルビードの合成、及び（２）超常磁性マグネティックナノ粒子に修飾された表面、を含む。合成されたナノ粒子及びビードを一旦一緒に混合すると、ゲル−シェルビード上のナノ粒子の蒸着及び結合を導く。表面修飾マグネティックナノ粒子は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒ）、Ｍｉｃｒｏｍｏｄ（Ｒｏｓｔｏｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ（Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）などの源から商業的に入手するか、又はこの分野で公知の方法（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｋ．Ｓ．他、Ｅｕｒｏｐｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｖｏｌ．３  Ｓｕｐｐｌ．２（２００２）２０６乃至２０９；Ｇｒｕｔｔｎｅｒ，Ｃ．ａｎｄ  Ｔｅｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｍａｇｎ．Ｍａｔ．１９４（１９９９）８乃至１５）によって製造することが出来る。ナノ粒子被覆ビードを、この分野で公知の方法の任意の１つを使用して製造することが出来る（Ｒａｄｔｃｈｅｎｋｏ  Ｉ．Ｌ．他  Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００１，１３，Ｎｏ．２２（１６８４乃至１６８７）；Ｇｒａｆ  Ｃ．他  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２００３，１９，６６９３乃至６７００；Ｍａｒｇｅｌ他  ＵＳ６，１０３，３７９；Ｃａｒｕｓｏ，Ｆ．他  Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１９９９，１１，９５０乃至９５３；Ｃａｒｕｓｏ，Ｆ．他  Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２００１，１３，１０９乃至１１６）。
【０１４９】
この特定の実施例において、高分子電解質被覆の多層方法のバリエーション（Ｃａｒｕｓｏ，Ｆ．他  Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．２００１，１３，１０９乃至１１６）を用いて磁気ゲル−シェル粒子を製造した。１ｍｇ／ｍｌのポリアリルアミン塩酸塩（Ｍｏｌ．Ｗｔ．１５，０００，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）及びポリアクリル酸ナトリウム塩（Ｍｏｌ．Ｗｔ．８，０００，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を含む２つの個別の溶液を調整した。５ｍｇの洗浄カルボキシル化ゲル−シェルビード（直径３．４μｍまで、上で記載されたように合成された）を１．５ｍｌのエッペンドルフ管に取り、５００μｌの１ｍｇ／ｍｌポリアリルアミン溶液を加えた。懸濁液をボルテックスし、放置して、３０分間エンド−オーバー−エンド回転によって混合した。次いで、ビードを遠心分離を介して分離し、上澄みを除去した。沈殿物を遠心分離再分散サイクルを介して、ＤＩ水で２回洗浄した。次に、５００μｌのポリアクリル酸溶液を沈殿物に加えて、懸濁液をボルテックスして混合した。次いで、懸濁液を上述したのと同様に処理した。各５層が沈殿するまで、ポリアリルアミン及びポリアクリル酸の交互のサイクルを続けた。第５ポリアリルアミン層の沈殿後、ビードを遠心分離によって分離し、沈殿物をＤＩ水で完全に洗浄し、５００μｌの同じものに分散した。次の１０μｌのポリサッカリド被覆カルボキシル官能化ナノ粒子（供給されたように）をビード懸濁液（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に加えて、ボルテックスすることによって混合し、一夜エンド−オーバー−エンド回転によって混合しておいた。次いで、ビードは、遠心分離によって分離され、ビードに関係しないナノ粒子又はナノ粒子集合体を確保せず、最終的に沈殿物になった。沈殿物をＤＩ水で完全に洗浄し、ＰＢＳＴ（０．１％ツウィーン（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ緩衝剤、及び保存料としてアジ化ナトリウムを含む）に懸濁した。磁気粒子濃縮器（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内に設置すると、粒子は、サンプル管の側面に移動することによって判断されるように、磁化した。適切な移動時間は２分であった。
【０１５０】
本明細書中で使用される用語、表現及び実施例は、典型的に単一であるが、限定ではなく、本発明の適用範囲は、後に続く特許請求の範囲にのみ規定され、特許請求の範囲の対象の総ての同等物を含むことを理解されたい。特許請求の範囲におけるプロセス及び方法のステップは、他で特許請求の範囲に定められていない限り、特許請求の範囲に記載されている順番を含む、任意の順番で実施される。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１は、共有結合及びゲル−シェルビード上へのタンパク質の吸着／吸収を模式的に示す。
【図２】図２は、ゲル−シェルビードに固定されたタンパク質Ｌからのシグナル強度対３つの異なる温度でタンパク質Ｌの濃度をプロットする。
【図３】図３は、ゲル−シェルビードに固定されたタンパク質Ｌからのシグナル強度対タンパク質がビードとインキュベートされる時間をプロットする。
【図４Ａ】図４Ａは、ゲル−シェルビード上の様々なｐＨで固定されたタンパク質Ｌからのシグナル強度と様々なｐＨでゲル−シェルビードとインキュベートされたＢＳＡのシグナル強度をプロットする。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａにおけるシグナル強度対ｐＨのヒストグラムを示すグラフである。
【図５】タンパク質がビードにインキュベートされる時間対ゲル−シェル上に様々なｐＨで固定されたヤギ抗ヒトＩｇＡ抗体Ｃｙ５複合体からのシグナル強度をプロットする。
【図６】図６は、様々な塩濃度とｐＨ３．０でゲル−シェル上に行われた反応で固定された様々なタンパク質からのシグナル強度をプロットする。
【図７】図７は、比較的低く固定されたイオン濃度でｐＨ３．０でゲル−シェル上に行われた反応で固定された様々な濃度で、様々なタンパク質からのシグナル強度をプロットする。
【図８】図８は、図に示す抗原パネルで反応した、抗−ＳＳＡ−６０、抗−ＳＳＢ、抗−ＣＥＮＰ及び抗−Ｊｏ−１抗体を含むプールされた血清サンプルの反応からの結果を示す図であり、ここでは抗原がゲル−シェルビードに吸着されている。
【図９】図９は、ｐＨ３．０及び様々な濃度でゲル−シェルビードに対して吸着したＳＣＬ−７０及びＳｍと抗−ＳＣＬ−７０との反応による結果を示す。
【図１０】図１０は、ｐＨ３．０及び様々な濃度でゲル−シェルビードに対して吸着したＳＣＬ−７０及びＳｍと抗−Ｓｍの反応からの結果を示す。
【図１１】図１１は、シン及びシック−シェルゲル−シェルビードの双方に固定されたストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＢＳＡコントロールに対する蛍光ビオチンターゲットを使用する蛍光シグナルを示す。
【図１２】図１２は、図１１に比べて異なる試薬によって発生されたシグナルで、受動的吸着によってシン及びシック−シェルゲル−シェルビードを固定されたストレプトアビジン−ＨＲＰ及びＢＳＡコントロールからの蛍光シグナルを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、特定のヒト血清によって分析されるように、ゲル−シェルビードによってＨＬＡクラスＩ抗原の吸着からの結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、抗クラスＩモノクローナル抗体によって分析されるように、ゲル−シェルビードによってＨＬＡクラスＩ抗原の吸着からの結果を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、特定のヒト血清によって分析されるように、ゲル−シェルビードによってＨＬＡクラスＩＩ抗原の吸着からの結果を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、抗クラスＩＩモノクローナル抗体によって分析されるように、ゲル−シェルビードによってＨＬＡクラスＩＩ抗原の吸着からの結果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、機能的ゲル−シェルに対するタンパク質の共有結合固定化のためのＥＤＡＣ媒介反応を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、機能的ゲル−シェルに対するタンパク質の共有結合固定化のためのＥＤＡＣ−ＮＨＳ媒介反応を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、第１段階ＥＤＡＣ反応を使用する機能的ゲル−シェルビードに結合したニュートラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）からの結果を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＥＤＣＡ−ＮＨＳプロトコルを使用する機能的ゲル−シェルに対するマウス抗−ビオチンｍＡｂの結合のビオチン−（ｄＴ）５−Ｃｙ５．５を結合することによって決定されるような結果を示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＥＤＣＡ−ＮＨＳプロトコルを使用する機能的ゲル−シェルに対するマウス抗−ビオチン−Ｆａｂの結合のビオチン−（ｄＴ）５−Ｃｙ５．５を結合することによって決定されるような結果を示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＥＤＣＡ−ＮＨＳプロトコルを使用する機能的ゲル−シェルに対するＳＣＬ−７０の結合から標識された探知抗体によって決定されたような結果を示す。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、ＥＤＣＡ−ＮＨＳプロトコルを使用する機能的ゲル−シェルに対するＳＣＬ−７０の結合から標識された探知抗体によって決定されたような結果を示す。
【図１６】図１６は、機能的ゲル−シェルに対するタンパク質のアルデヒド媒介共有結合反応を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、アルデヒドゲル−シェルビードに固定されたマウス抗ビオチン抗体に対するビオチン−（ｄＴ）５−Ｃｙ５．５の結合によって測定された結果を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、アルデヒドゲル−シェルビードに固定されたマウス抗ビオチン抗体に対するビオチン−（ｄＴ）５−Ｃｙ５．５の結合によって測定された結果を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、アルデヒドゲル−シェルビードに固定されたマウス抗ビオチン抗体に対する標識ヤギ抗マウスＩｇＧの結合によって測定された結果を示す。
【図１８】図１８は、ＳＳＡ／ＳＳＢ陽性血清と反応した、自己抗原ＳＳＢで被覆したアルデヒドゲル−シェルビードを使用した結果、及び、標識抗ヒトＩｇＧを用いて検出した結合を用いた結果を示す。
【図１９】図１９は、機能的ゲル−シェルに対するタンパク質のトシル介在共有結合反応である。
【図２０】図２０は、細胞によって放出されるサイトカインをモニターし、決定するための分析フォーマットにおける細胞及びビードの相対的位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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