(57)【要約】  移植対象において異なって発現される遺伝子に基づいた、移植対象における拒絶反応の診断、拒絶反応のリスクにある移植対象のそのモニタリング、移植対象における拒絶反応の予防、阻害、低下または処置、または拒絶反応の予防、阻害、減少または処置に有用な薬剤の同定のための方法が記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片拒絶反応をモニタリングする方法であって、
ａ)基線値として、拒絶反応を発症しないことが既知の移植対象の特定の組織サンプルにおける、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを取り；
ｂ)移植後患者から得たａ)と同じ組織タイプの組織サンプルにおいて、ａ)で同定した少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し；そして
ｃ)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が移植対象が拒絶反応を発症するリスクにあるとの予測であり、該遺伝子は表１、２または３に定義の通りである)
ことを含む、方法。
【請求項２】
移植片拒絶反応をモニタリングする方法であって、
ａ)少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを、ドナーから得た組織サンプルにおいて移植の日に検出し；
ｂ)移植後患者から得た組織サンプルにおいて、ａ)で同定した少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
ｃ)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が移植対象が拒絶反応を発症するリスクにあるとの予測であり、該遺伝子は表１、２または３に定義の通りである)
ことを含む、方法。
【請求項３】
リスクにある対象における移植片拒絶反応をモニタリングする方法であって、
ａ)移植対象から、拒絶反応阻害剤の投与前に投与前サンプルを得て、
ｂ)投与前サンプルにおける少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
ｃ)移植患者から１個またはそれ以上の投与後サンプルを得て、
ｄ)投与後サンプル(複数もある)における少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
ｅ)投与前サンプルのｍＲＮＡの発現または少なくとも１個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルと、投与後サンプル(複数もある)におけるｍＲＮＡの発現または少なくとも１個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを比較し、そして
ｆ)薬剤をそれに準じて調整する
(ここで、該遺伝子は表１、２または３に定義の通りである)
ことを含む、方法。
【請求項４】
処置を必要とする対象における移植片拒絶反応を予防、阻止、低下または処置する方法であって、拒絶反応の少なくとも１個の症状が改善するように、表１、２または３に同定した１個もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調整する化合物を該対象に投与することを含む、方法。
【請求項５】
移植片拒絶反応の予防、阻害、低下または処置に使用するための薬剤を同定する方法であって、表１、２または３に同定した１個もしくはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現または遺伝子産物のレベルをモニタリングすることを含む、方法。
【請求項６】
移植対象が腎臓移植対象である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
遺伝子発現の発現レベルを、遺伝子発現産物に対応するタンパク質の存在の検出により評価する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
タンパク質の存在を、該タンパク質に特異的に結合する試薬を使用して検出する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
１個またはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを、ノーザンブロット分析、逆転写ＰＣＲおよび実時間定量的ＰＣＲから成る群から選択される技術により検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
一組の遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを検出する、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
移植片拒絶反応のバイオマーカーとしての、表１、２または３に列記の遺伝子または該遺伝子の発現産物の使用。
【請求項１２】
対象における移植片拒絶反応の予防または処置用医薬の製造のための、表１、２または３に列記の１個またはそれ以上の遺伝子、またはその発現産物の合成、発現または活性を調整する化合物の使用。
【請求項１３】
移植片拒絶反応が慢性移植片拒絶反応であり、かつ遺伝子が表２に定義の通りである、請求項１から１２のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１４】
移植片拒絶反応が急性移植片拒絶反応であり、かつ遺伝子がインドルアミンデオキシゲナーゼである、請求項１から１３のいずれかに記載の方法または使用。
【請求項１５】
組織サンプルが体液である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、移植組織または臓器のレシピエントにおける状態をモニタリングする方法に関する。特に、本発明は、同種移植片拒絶反応、より特に急性同種移植片拒絶反応(ＡＲ)または慢性同種移植片拒絶反応(ＣＲ)を指示するための遺伝子発現分析の使用に関する。ある種の遺伝子の発現(ＲＮＡまたはタンパク質レベル)が移植片の拒絶反応の検出ならびに／または組織学的および／もしくは病理学的状態の描写の手段として使用し得る。
【０００２】
慢性同種移植片拒絶反応は、長期移植片生存の失敗の主要な原因である。処置可能な急性拒絶反応事象とは対照的に、慢性拒絶反応は、組織学的に検出されたとき今日までいかなる処置によっても可逆的ではなく、いかなる免疫抑制性レジメンでも予防できると証明されておらず、そしてその病因は免疫学的ならびに非免疫学的要因を含む以外、完全に理は理解されていない。全ての固形臓器移植片における慢性拒絶反応で特徴的なことは、血管リモデリングによる同心性同心性動脈内膜肥厚である。慢性拒絶反応を有する腎臓同種移植片は、加えて著しい実質の線維症および糸球体硬化症を示す：臨床的に、慢性拒絶反応(ＣＲ)は、タンパク尿および高血圧を伴う腎臓機能の進行的低下により顕在化する。
【０００３】
同種移植片拒絶反応、特にＣＲの同定、予後診断およびフォローアップのための、好ましくは何らかの明白な臨床的または組織学的顕在化の前、または移植片の機能損失前、例えば移植後一年以内の、ＣＲの早期予後診断の信頼できるツールの必要性がある；このような助けは、例えば現在のレジメンの最適化および、新しいＣＲ阻害剤でのものを含む臨床試験の設計に価値があろう。
【０００４】
本発明は、同種移植片拒絶反応のバイオマーカー、例えば、移植対象、例えば、腎臓生検サンプルにおいて拒絶反応の発症の前後で、健常組織(拒絶反応が発症していない場所である)と比較して異なって発現される遺伝子の同定に関する。遺伝子の一部の得られる遺伝子発現パターンは、ＣＲを経験している組織および急性拒絶反応(ＡＲ)を経験している組織および健常組織の統計学的に非常に有意な区別を可能にする。これらの遺伝子の完全配列は表１から３に示すGenBank受託番号またはRefSeq Identifierを使用して入手可能である。対応するGenBank受託番号またはRefSeq Identifierの下に示す配列は、引用により本明細書に包含する。
【０００５】
本発明により同定された遺伝子は、移植対象における拒絶反応の同定および／または予後診断のための有用なバイオマーカーである。本発明は、移植片拒絶反応の指標である遺伝子群(ＡＲまたはＣＲのいずれか、表１参照)、慢性拒絶反応の指標である遺伝子群(表２参照)および急性拒絶反応の指標である遺伝子(表３参照)を提供する。これらの遺伝子の、少なくとも一個の、任意の選択物が、拒絶反応、例えばＣＲの診断および／または予後診断のための代用バイオマーカーとして利用できる。特に有用な態様において、これらの遺伝子の複数を選択し、それらのｍＲＮＡ発現を同時にモニターして、様々な局面において使用するための発現プロファイルを提供する。
【０００６】
該バイオマーカー遺伝子は製造組織で低レベルで発現され、拒絶反応中発現される。ＣＲをＡＲと区別するために、好ましくは２個またはそれ以上の遺伝子を使用する。該バイオマーカーは移植片の状態の指標および病理学的変化の発症の指標である。それらは、臨床的検出の観点で血清クレアチニンおよびウレアの上昇(低下した糸球体濾過率)として解釈される機能の著しい損失に至る前に、より感受性の検出手段として使用できる。
【０００７】
表１から３に同定した遺伝子は、それらが体液(例えば血清、血漿または尿)中で検出できる可能性があるための、バイオマーカーとして特に有用である。故に移植組織からの生検サンプルは必ずしも必要ではない。
【０００８】
従って、本発明は、移植片拒絶反応のバイオマーカー、例えばＣＲのバイオマーカーとしての表１、２または３に列記の遺伝子の使用を提供する。好ましくは表２中の１個またはそれ以上の遺伝子を、ＣＲのバイオマーカーとして使用し、またはインドルアミンデオキシゲナーゼがＡＲのバイオマーカーとして有用である。
【０００９】
さらなる態様において、遺伝子発現産物(タンパク質)のレベルを、血漿、血清、リンパ、尿、便および胆汁を含むが、これらに限定されない様々な体液において、または生検組織においてモニターできる。この発現産物レベルを拒絶反応の早期診断の代用マーカーとして使用でき、そして治療応答性の指標を提供できる。
【００１０】
従って、本発明はまた表１、２または３に列記の遺伝子の発現産物(例えばそれによりコードされるタンパク質)の、(例えば慢性)移植片拒絶反応のバイオマーカーとしての使用を提供する。
【００１１】
本発明の方法はインビトロで行うことができ、例えばバイオマーカーのレベルを、移植対象から抽出したまたは得た組織または液体において分析できる。
【００１２】
ｍＲＮＡ発現レベルの検出法は当分野で既知であり、逆転写ＰＣＲ、実時間定量的ＰＣＲ、ノーザンブロッティングおよび他のハイブリダイゼーション法を含むが、これらに限定されない。
【００１３】
複数の記載の遺伝子から得たｍＲＮＡ転写物の検出に特に有用な方法は、標識ｍＲＮＡのオリゴヌクレオチドの秩序配列へのハイブリダイゼーションまたはＴａｑＭａｎ低密度アレイによる全ＲＮＡの分析のいずれかを含む。このような方法は、これらの遺伝子の複数の転写レベルを、遺伝子発現プロファイルまたはパターンを産生するために同時に決定することを可能にする。拒絶反応、例えばＣＲまたはＡＲを発症するリスクの移植対象から得た組織由来の遺伝子発現プロファイルを、正常臓器から得たサンプル由来の遺伝子発現プロファイルと比較できる。
【００１４】
さらなる態様において、１個または複数のこれらの遺伝子またはコードするタンパク質の発現プロファイルの測定は、拒絶反応の阻止、例えば予防または処置に関する薬剤の効果の試験用の価値ある分子ツールを提供できる(例えば移植患者が治療を受けている間の発現プロファイルの基線プロファイルからの変化)。
【００１５】
従って、本発明はまた、対象が抗拒絶反応治療に応答する可能性を決定するための移植対象のスクリーニング法、(例えばＣＲの徴候を示す)移植対象の処置に有用な薬剤の同定法および拒絶反応、例えばＣＲまたはＡＲを処置するためのある種の薬剤の効果をモニタリングする方法を提供する。
【００１６】
“異なって発現される”なる用語は、所定の同種移植片遺伝子発現レベルに関し、対応する基線発現レベルの量より著しく多いまたは少ない量として定義される。基線は、ここで、健常組織における発現レベルとして定義する。健常組織は、病理学的所見のない移植臓器を含む。
【００１７】
他の局面において、本発明は、所定の組織サンプルにおける異なって発現される遺伝子の検出により、試験移植対象における移植片拒絶反応、例えばＣＲをモニタリングするための、(例えばインビトロ)法を提供する。例えば、該方法は：
ａ)基線値として、拒絶反応、例えばＣＲを発症しないことが既知の対照移植対象の特定の組織サンプルにおける、例えば表１、２または３に同定した通りの、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを取り；
ｂ)試験移植後患者から得たａ)と同じ組織タイプの組織サンプルにおいて、ａ)で同定した少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し；そして
ｃ)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が試験移植対象が拒絶反応、例えばＣＲを発症するリスクにあるとの予測である)
ことを含み得る。
【００１８】
他の態様によって、該(例えばインビトロ)法は
ａ)例えば表１、２または３に同定した通りの、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを、ドナー、好ましくは生存ドナーから得た組織サンプルにおいて移植の日に検出し、
ｂ)移植後患者から得た組織サンプルにおいて、ａ)で同定した少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
ｃ)第一値と第二値を比較する(ここで、第二値より低いまたは高い第一値が移植対象が拒絶反応を発症するリスクにあるとの予測である)
ことを含み得る。
【００１９】
上記工程ｂ)において、ｍＲＮＡまたはコードされるタンパク質のレベルは、好ましくは移植後４から７ヶ月以内、より好ましくは移植後６ヶ月前後に検出する。
【００２０】
本発明による拒絶反応、例えばＣＲの診断法は、また維持患者、すなわち１年以上前に移植を受けた患者にも適用できる。従って、組織サンプルを取り、少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現のレベルを参照対照値のレベルと比較して、ＣＲを発症する可能性がある患者を同定する。
【００２１】
他の局面において、本発明は、拒絶反応を発症するリスクの移植対象において、阻害剤(例えば小分子、抗体もしくは他の治療剤または候補薬剤)で拒絶反応、例えばＣＲを、モニタリング、例えば、予防もしくは阻害または低下もしくは処置をする方法を提供する。薬剤(例えば薬剤化合物)の本発明のマーカーの発現レベルに対する影響のモニタリングは、基礎的薬剤スクリーニングだけでなく、臨床試験においても適用できる。例えば、マーカー発現に影響する薬剤の効果を、拒絶反応の阻害のための処置を受けている移植対象の臨床試験においてモニターできる。
【００２２】
このような方法は：
ａ)移植対象から、該阻害剤の投与前に投与前サンプルを得て、
ｂ)投与前サンプルにおける少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
ｃ)移植患者から１個またはそれ以上の投与後サンプルを得て、
ｄ)投与後サンプル(複数もある)における少なくとも１個の遺伝子に対応するｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルを検出し、
ｅ)投与前サンプルのｍＲＮＡの発現または少なくとも１個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルと、投与後サンプル(複数もある)におけるｍＲＮＡの発現または少なくとも１個の遺伝子によりコードされるタンパク質のレベルを比較し、そして
ｆ)薬剤をそれに準じて調整する
ことを含む。
【００２３】
例えば、薬剤投与の増加または減少が、少なくとも１個の遺伝子の発現レベルを検出されたより高いまたは低いレベルに変えるために望ましいかもしれない。上記方法において、該薬剤をまた、単独でまたは組み合わせ治療で他の薬剤、好ましくは免疫抑制性剤および／または移植片拒絶反応、例えばＡＲまたはＣＲに有効な薬剤と組み合わせて投与できる。工程ｆ)は処置用量の変化、レジメンの変化、処置剤の変化、または既に使用している薬剤との組み合わせ治療で１個またはそれ以上のさらなる薬剤の(例えば連続的または同時的)追加を含む。
【００２４】
従って、ヒト組織からの遺伝子発現プロファイリングデータの取り込みは、拒絶反応、例えばＣＲまたはＡＲの進行の処置および予防の両方を目的とした臨床試験中の患者選択工程の改善を助けるであろう。
【００２５】
さらに別の局面において、本発明は、上記通りの少なくとも１個の遺伝子のｍＲＮＡ発現またはそれによりコードされるタンパク質のレベルのモニタリングを含む、移植片拒絶反応、例えばＣＲまたはＡＲの予防、阻害、低下または処置に使用する薬剤の同定法を提供する。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、処置を必要とする対象における移植片拒絶反応、例えばＣＲまたはＡＲを予防、阻止、低下または処置する方法であって、拒絶反応の少なくとも１個の症状が改善するように、表１、２または３に同定した１個もしくはそれ以上の遺伝子または遺伝子産物の合成、発現または活性を調整する化合物を該対象に投与することを含む、方法を提供する。
【００２７】
さらなる局面において、本発明は、例えば対象における移植片拒絶反応の予防または処置のために医薬として使用するための、上記で同定した１個またはそれ以上の遺伝子、またはその発現産物(例えば表１、２または３に同定する遺伝子)の合成、発現または活性を調整する化合物(例えば小分子、抗体または他の治療剤または候補薬剤)を提供する。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、例えば対象における移植片拒絶反応、例えばＣＲの予防または処置のための、上記で同定した１個またはそれ以上の遺伝子、またはその発現産物(例えば表１、２または３に同定する遺伝子)の合成、発現または活性を調整する化合物(例えば小分子、抗体または他の治療剤または候補薬剤)の使用を提供する。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、例えば移植対象におけるＣＲの予防または処置用医薬の製造のための、上記で同定した１個またはそれ以上の遺伝子、またはその発現産物(例えば表１、２または３に同定する遺伝子)の合成、発現または活性を調整する化合物(例えば小分子、抗体または他の治療剤または候補薬剤)の使用を提供する。
【００３０】
このような化合物または薬剤の例は、例えば移植において使用されている通りの、例えば免疫抑制性特性を有する化合物または薬剤、例えばカルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンまたはその誘導体、例えば４０位および／または１６位および／または３２位を置換されたラパマイシン、例えば３２−デオキソラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２−デオキソラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２(ＳまたはＲ)−ジヒドロ−ラパマイシン、１６−ペント−２−イニルオキシ−３２(ＳまたはＲ)−ジヒドロ−４０−Ｏ−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、４０−[３−ヒドロキシ−２−(ヒドロキシ−メチル)−２−メチルプロパノエート]−ラパマイシン(ＣＣＩ７７９とも呼ばれる)、４０−エピ−(テトラゾリル)−ラパマイシン(ＡＢＴ５７８とも呼ばれる)、４０−０−(２−ヒドロキシエチル)−ラパマイシン、または、例えばＷＯ９８／０２４４１、ＷＯ０１／１４３８７およびＷＯ０３／６４３８３に記載の通りのラパログ、例えばＡＰ２３５７３、ＡＰ２３４６４、ＡＰ２３６７５またはＡＰ２３８４１、またはＣＣＲ５アンタゴニスト、例えば(２,４−ジメチル−１−オキシ−ピリジン−３−イル)−[４'−メチル−４−(フェニル−ピリジン−３−イル−アミノ)−[１,４']ビピぺリジニル−１'−イル]−メタノンである。これらの化合物または薬剤を組み合わせて使用できる。
【００３１】
移植対象は、好ましくは同じ種由来の、ドナーから細胞、組織または臓器、例えば腎臓、心臓、肺、複合心臓肺、肝臓、膵臓(例えば膵臓島細胞)、腸(例えば、結腸、小腸、十二指腸)、神経組織、肢を受けた対象を意味する。該対象は、好ましくはヒトである。あるいは、該方法を他の動物、例えばサルまたはラットのような哺乳動物で行い得る。本発明の移植片拒絶反応の処置に使用するための薬剤の同定法は、このような方法で同定した薬剤がヒトでも有効である高い確率のため、有利にはサルで行う。
【００３２】
好ましくは１個以上の遺伝子、例えば一組の遺伝子を本発明の方法で使用する。本発明の方法は特に腎臓移植において好ましい。
【００３３】
遺伝子発現プロファイルは、例えばAffymetrixマイクロアレイ技術を使用して産生できる。マイクロアレイは当分野で既知であり、遺伝子産物(例えばｍＲＮＡ、ポリペプチド、それらのフラグメントなど)と順番に対応するプローブが、特異的にハイブリダイズできるか既知の位置に結合できる表面を含む。スキャナーにより検出したハイブリダイゼーション強度データを自動的に獲得し、GENECHIPＲソフトウエアまたはAffymetrixマイクロアレイ分析パッケージソフトウエアにより、処理する。生データを、２００の標的強度を使用して、発現レベルに対して標準化する。
【００３４】
細胞の転写状態は、当分野で既知の他の遺伝子発現技術により測定し得る。いくつかのこのような技術は、二重制限酵素消化と位相プライマー(例えばＥＰ−Ａ１−０５３４８５８)を組み合わせた方法、または定義されたｍＲＮＡ末端に最も近い部位で制限フラグメントを選択する方法(例えばPrashar et al, Proc. Nat. Acad. Sci., 93, 659-663, 1996)のような、電気泳動的分析のための限られた複雑さの制限フラグメントのプールを産生する。他の方法は、ｃＤＮＡプールを、各多数のｃＤＮＡにおいて、各ｃＤＮＡを同定するために十分な塩基(例えば２０−５０塩基)を配列決定することにより、または定義されたｍＲＮＡ末端に対して既知の位置で産生される短タグ(例えば９−１０塩基)(例えばVelculescu, Science, 270, 484-487, 1995)経路パターンにより統計学的サンプルする。
【００３５】
本発明の他の態様において、マーカーに対応するタンパク質を検出する。本発明のタンパク質の検出に好ましい薬剤は、例えばタンパク質と結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体はポリクローナル、または好ましくは、モノクローナルであり得る。完全な抗体またはそのフラグメント(例えばＦａｂまたはＦ(ａｂ')２)を使用できる。“標識”なる用語は、抗体への検出可能な物質の結合による抗体の直接標識、ならびに直接標識されている他の試薬との反応性による抗体の間接的標識を含むことを意味する。サンプルが、所定の抗体と結合するタンパク質を含むか否かを決定するために様々な形態を用いることができる。このような形態の例は、例えば酵素免疫アッセイ、放射免疫アッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡを含む。
【００３６】
好ましい態様において、生物学的システムのモデルの形成および試験のための去力で簡便な設備を提供するために、前記方法のコンピュータ工程が、コンピュータシステム上、または１台しくはそれ以上のネットワーク接続されたコンピュータシステム上で実行される。該コンピュータシステムは、内部コンポーネントを含み、かつ外部コンポーネントにリンクしている単一のハードウェアプラットフォームであり得る。このコンピュータシステムの内部コンポーネントは、主メモリと相互連絡している処理要素を含む。外部コンポーネントは大容量データ記憶装置を含む。この大容量データ記憶装置は１個またはそれ以上のハードディスクであり得る。他の外部コンポーネントは、ポインティング・デバイスまたは他の画像入力装置と共に、モニターおよびキーボードであり得るユーザー・インターフェースを含む。典型的に、該コンピュータシステムはまた他のローカルコンピュータシステム、リモートコンピュータシステムまたは広域ネットワーク、例えばインターネットにリンクする。このネットワークリンクは、コンピュータシステムが他のコンピュータシステムとデータおよびプロセッシングを共有することを可能にする。
【００３７】
数個のソフトウエアコンポーネントが、このシステムの操作中メモリ内に位置する。これらのソフトウエアコンポーネントは、集合的にコンピュータシステムが本発明の方法にしたい機能させる。これらのソフトウエアコンポーネントは、典型的に大容量記憶装置または除去可能媒体、例えばフロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭに貯蔵される。該ソフトウエアコンポーネントは、コンピュータシステムおよびそのネットワーク相互連結の管理を担うオペレーティングシステムを表す。好ましくは本発明の方法は、使用すべきアルゴリズムを含む数式およびプロセッシングの高レベルの仕様の記号的入力を可能にする数学ソフトウエアパッケージとしてプログラムされ、それにより、ユーザーが手続的に個々の方程式またはアルゴリズムをプログラムする必要を無くす。
【００３８】
好ましい態様において、分析的ソフトウエアコンポーネントは、実際互いに相互作用する別々のソフトウエアコンポーネントを含む。分析的ソフトウエアは、該システムの操作に必要な全てのデータを含むデータベースを表す。このようなデータは、一般に、以前の実験の結果、ゲノムデータ、実験法および費用ならびに他の上方を含むがこれらに限定されず、当分野の当業者には明らかであろう。分析的ソフトウエアは、本発明の分析的方法を実行する１個またはそれ以上のプログラムを含む、データ整理および計算コンポーネントを含む。分析的ソフトウエアはまた、コンピュータシステムの使用者が試験ネットワークモデルおよび所望により実験データをコントロールおよび入力可能にする、ユーザー・インターフェースを含む。該ユーザー・インターフェースはシステムの仮説を明記するためのドラッグ・アンド・ドロップインターフェースを含み得る。該ユーザー・インターフェースはまた大容量記憶装置から、除去可能媒体から、または当該システムとネットワークを介して連絡する異なるコンピュータシステムから実験データを読むための手段を含み得る。
【００３９】
本発明はまた、本明細書に明示のマーカーの少なくとも１個、例えばｍＲＮＡを含む、データベースの調製法も提供する。例えば、該ポリヌクレオチド配列を、データプロセッシングシステムが移植片拒絶反応を同定する遺伝子の標準化された表示をするようにデジタル記憶媒体に貯蔵する。該データプロセッシングシステムは、異なる時点で、例えば、移植日と移植後に採った２個の組織サンプル間の遺伝子発現を分析するのに有用である。単離されたポリヌクレオチドを配列決定する。サンプル由来の配列を、相同性探索技術を使用して、データベースに存在する配列(複数もある)と比較する。本発明の分析的方法を実行するための別のコンピュータシステムおよび方法が当分野の当業者には明らかであり、そして添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されると意図する。
【００４０】
拒絶反応の診断マーカーの同定
急性および慢性拒絶反応の腎臓移植非ヒト霊長類(カニクイザル)モデル由来の組織サンプルを得る。これらのモデルで誘発された病巣を試験し、ヒトにおいて観察される組織学的変化と非常に類似していることが判明した。
【００４１】
急性拒絶反応を、カニクイザルにおいて、生命維持的腎臓同種移植片において試験する。移植は、移植片インプラント時の両側腎切除を伴う。動物を、最適用量より少ないシクロスポリンＡ(Neoral(登録商標))、２０mg／kgまたは(２,４−ジメチル−１−オキシ−ピリジン−３−イル)−[４'−メチル−４−(フェニル−ピリジン−３−イル−アミノ)−[１,４']ビピぺリジニル−１'−イル]−メタノン単剤  ２０mg／kg  １日２回または両化合物の組み合わせで処置する。動物を移植後６日目から９日目の間に殺す。移植片の組織病理学的試験は、全例でＡＲを明らかにする。
【００４２】
慢性拒絶反応を、カニクイザルで非生命維持腎臓同種移植片において試験する。移植は、片側腎切除を伴い、故に自然の腎臓が左側の正位置に残る。動物を抗チモグロブリン／ステロイド／シクロスポリンＡ(２０mg／kg  ｉ.ｖ.  ２日毎に５回／１０mg／kg  ｉ.ｖ.  ２日毎に５回／１５０mg／kg／日  ｐ.ｏ.)を組み合わせた抗拒絶反応治療で処置し、移植後４４日目から１４７日目の間に殺すか、またはシクロスポリンＡを移植後１４９日に止め、動物を移植後２３１日目から３３１日の間に殺す。移植片の組織学的試験は、様々な程度のＣＲを明らかにする。
対照腎臓を移植日(片側または両側腎切除)に採取する。
【００４３】
組織ホモジネーション
全て液体窒素で急速冷凍した腎臓皮質サンプルを、クライオチューブ(cryotube)中、−８０℃で貯蔵する。７００μlホモジネーション緩衝液(ＡＢＩ融解緩衝液／ＰＢＳ  １：１)添加直後、ホモジネーション工程を、Polytronローター／ステーター・ホモジナイザーＰＴ  ３１００の棒を、組織含有混合液に浸し、ホモジナイザーを最高速度で３０秒運転することにより行う。この後、残存組織片が見えるならば、この工程を、均質性が達成されるまで繰り返す。その後、該均質物をＲＮＡ抽出工程において使用するまで−８０℃で貯蔵する。
【００４４】
ホモジネート前濾過およびＲＮＡ抽出
ホモジネートの前濾過およびＲＮＡ抽出を、ABI 6700 Biorobotワークステーション(Applied Biosystems, USA)により行う。組織ホモジネートを、９６深ウェルプレートのウェルに入れ、該６７００ワークステーションの濾液位置に置く。組織前濾過トレイを精製キャリッジに入れ、その位置に固定する。その装置のドアを占め、そしてワークステーションソフトウエアを開始する。
【００４５】
ＲＮＡ抽出工程は、サンプル移送工程、濾過工程、洗浄工程、および溶出工程を含む。前濾過したホモジネートを９６深ウェルプレートからＲＮＡ精製トレイに移すサンプル移送工程は、５５０μl溶液の最初の移送を含む。２回目の移送の前に、１５０μlホモジネーション緩衝液(Applied Biosystems融解緩衝液／ＰＢＳ  １：１)を深ウェルプレートの各ウェルに添加し、３回混合し、次いで１５０μlをそこから精製トレイに移す。濾過工程は、８０％の減圧の１８０秒の適用により行う。洗浄工程は下記の通り行う：
工程１：洗浄溶液１、４００μl、減圧８０％を１８０秒、２回；
工程２：洗浄溶液２、５００μl、減圧８０％を１８０秒、１回；
工程３：洗浄溶液２、３００μl、減圧６０％を１２０秒、２回。
【００４６】
９０％圧の溶出前減圧を３００秒適用する。その後溶出工程を、１２０μl溶出溶液(Applied Biosystems)の添加および１００％減圧の１２０秒の適用により行う。ＲＮＡサンプルを９６ウェルプレート(Applied Biosystems)に回収する。溶出液を等量の２個のアリコートに分ける。一方のアリコートを−８０℃で貯蔵し、他方のアリコートをＲＮＡ増幅およびGeneChip分析に使用する。
【００４７】
ＲＮＡビオチニル化工程は、製造業者の指示に従ったHigh-Yield RNA Labelling Kit(Enzo Diagnostics, NY, USA;P/N 900182)の使用を含む。下記成分を最初の工程で混合する：
２２μl  ａＲＮＡ
４μl  １０Ｘ  ＨＹ反応緩衝液、
４μl  １０Ｘ  ビオチン標識リボヌクレオチド、
４μl  １０Ｘ  ＤＴＴ、
４μl  ＲＮａｓｅ阻害剤混合物、
２μl  ２０Ｘ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ。
【００４８】
該混合物を３７℃で３−４時間インキュベートする。標識ａＲＮＡを、製造業者の指示に従ってRNeasy chemistry(Qiagen)を使用して精製する。溶出容量は６０μlであり、２μlを使用してＲＮＡ濃度を２６０nmの吸光度で分光光度的に決定する。
【００４９】
ＲＮＡフラグメント化
１５μg標識ａＲＮＡを、２０μl容量中、４μl  ５Ｘ  ＭＥＳ  フラグメント化緩衝液およびＲＮａｓｅを含まない水の添加によりフラグメント化する。該混合物を２０分、９４℃でインキュベートする。
【００５０】
１２Ｘ  ＭＥＳフラグメント化緩衝液(１０００mlで)：
【表１】
2007520209.tif 000002
０.２μmフィルターを通して濾過し、ｐＨは調節なしで６.５から６.７の間でなければならない。
【００５１】
マイクロアレイハイブリダイゼーション混合物
ハイブリダイゼーションを、３００μl容量で行う。フラグメント化したａＲＮＡを１５０μl  ２Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液、３μlニシン精子ＤＮＡ(１０mg／ml)、３μl  ＢＳＡ(５０mg／ml)、３μl  ９４８ｂ対照オリゴヌクレオチド(５nM)、および３μl  ２０Ｘ  真核生物ハイブリダイゼーション対照(Affymetrix)と混合する。ＤＥＰＣ水を最終容量３００μlまで添加する。
【００５２】
２Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液(５００mlで)：
【表２】
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０.２μmフィルターを通して濾過。
次いで：１.０ml  １０％Triton X-100添加。室温で貯蔵。
【００５３】
マイクロアレイ前処置
マイクロアレイを４５℃で１５分インキュベートする。該アレイチャンバーを、４５℃に予め温めた新たに調製した前処置溶液で満たす。
【００５４】
前処置溶液(３００μl／マイクロアレイ)
【表３】
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【００５５】
マイクロアレイハイブリダイゼーション
ＲＮＡを、約１２,０００ヒト遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブを含むAffymetrix HG U133Aチップにハイブリダイズさせ、分析する。
マイクロアレイは４５℃で前処置されているが、該ハイブリダイゼーション混合物を９９℃で５分インキュベートする。５分、１４,０００rpmで遠心分離後、上清を新しいエッペンドルフ試験管に移し、４５℃で５分インキュベートする。前処置溶液をマイクロアレイチャンバーから除き、泡を避けながらハイブリダイゼーション混合物で置き換える。プラスチックカートリッジの隔壁をテープで覆い、カートリッジを４５℃のオーブンに、ガラス前面を下に向けておく。ハイブリダイゼーションを１６から１８時間続ける。
【００５６】
洗浄法
ハイブリダイゼーション混合物をプローブアレイから除き、マイクロ遠心管に取っておく。２８０μl  １Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液をチャンバーに添加し、流体工学的洗浄をGeneChip Fluidics Station 400上で、６Ｘ  ＳＳＰＥ−Ｔ緩衝液を使用して行う。
【００５７】
６Ｘ  ＳＳＰＥ−Ｔ洗浄緩衝液(１０００ml)
３００ml  ２０Ｘ  ＳＳＰＥ(BioWhittaker, P/N 16-010Y)
６９９ml  水
０.２μmフィルターを通して濾過。１ml  １０％  Triton X-100添加。
流体工学的洗浄後、ＳＳＰＥ−Ｔ緩衝液をチャンバーから除き、泡を避けながらストリンジェント緩衝液に置き換える。
【００５８】
ストリンジェント洗浄緩衝液(１０００ml)：
【表４】
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０.２μmフィルターを通して濾過。１ml  １０％  Triton X-100添加。
マイクロアレイカートリッジを上に向けて４５℃インキュベーションオーブン中に３０分重ねる。ストリンジェント緩衝液を除去し、アレイを２００μl  １Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液で洗浄する。１Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液を完全に除去し、アレイチャンバーをＳＡＰＥ着色剤で満たし、３７℃で１５分インキュベートする。
【００５９】
ＳＡＰＥ着色剤(６００μl)：
【表５】
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１５分後、ＳＡＰＥ着色剤溶液を除去し、チャンバーを２００μl  １Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液で満たし、流体学的洗浄を行う。ＳＳＰＥ−Ｔ溶液をマイクロアレイチャンバーから除き、３００μl  ＡＢ着色剤で満たす。
【００６０】
ＡＢ着色剤(３００μl)：
【表６】
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カートリッジを３７℃で３０分インキュベートし、ＡＢ着色剤を２００μl  １Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液で置き換え、流体学的洗浄を行う。洗浄工程後、ＳＳＰＥ−Ｔ溶液を除去し、チャンバーをＳＡＰＥ着色剤で満たし、３７℃で１５分インキュベートする。ＳＡＰＥ着色剤を２００μl  １Ｘ  ＭＥＳハイブリダイゼーション緩衝液で置き換え、流体学的洗浄を行う。中隔をテー部でカバーし、緩衝液滲出を防止する。
マイクロアレイをAffymetrix GeneArray(登録商標)スキャナーでスキャンする。生データセットを、生のデータセットは、２００の目標強度に対して各チップの全プローブセットの７５％分位に縮小するとにより標準化する。
【００６１】
データ解析
統計学的解析をS-Plus(Insightful, Inc., USA)およびGeneSpring 5.0.3R(Silicon Genetics, USA)で行う。
一つの実験において、ＡＲまたはＣＲ群において２およびＰ値＜０.００１(パラメトリック検定、分散は等しくない)以上の平均発現変化を示す遺伝子を選択する。この最初のフィルターにより１４３４遺伝子のリストができる。このリストから、下記遺伝子を、対照、ＡＲおよびＣＲ群を区別する能力、急性または慢性拒絶反応の組織学的徴候との相関、および末梢体液での検出の能力を基に選択する。
【００６２】
【表７】
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【００６３】
【表８】
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【００６４】
【表９】
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【国際調査報告】
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