(57)【要約】  本発明は、生物系におけるＣａ２＋動態の光学的検出法に関し、該方法は、該生物系に存在する、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなる、組換えＣａ２＋感受性ポリペプチドにより放射される光子をモニタリングすることを含む。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）を可能とするリンカーにより連結されたエクオリンおよびＧＦＰを含むかまたはからなり、該組換えポリペプチドを特定の細胞ドメインまたは区画に標的化させることのできるペプチド断片を場合により含む。本発明はまた、インビボでのＣａ２＋動態のモニタリングの可能な条件において、カルシウム濃度に感受性の該組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック非ヒト動物にも関する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドの発現および／または局在は、特定の組織、単一細胞型および／または特定の細胞区画もしくはドメインに限局されている。
2007531514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物系におけるＣａ２＋動態の光学的検出法であって、前記方法は、前記生物系に存在する、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなる、組換えＣａ２＋感受性ポリペプチドにより放射される光子をモニタリングすることを含む、前記方法。
【請求項２】
細胞内Ｃａ２＋シグナル伝達の光学的検出のための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ある細胞から別の細胞への伝達を検出するためにＣａ２＋シグナルの伝播を光学的に検出するための、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記検出を、インビボで行なう、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記検出を、生体外で行なう、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記化学発光タンパク質が、カルシウムイオンと結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記化学発光タンパク質が、エクオリンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記エクオリンが、カルシウムイオンに対する低い親和性を有する変異エクオリンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記の変異エクオリンが、次の置換Ａｓｐ４０７→Ａｌａを有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記蛍光タンパク質が、異なる波長で発光するＧＦＰの変種である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記のＧＦＰの変種が、ＣＦＰ、ＹＦＰ、およびＲＦＰからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記蛍光タンパク質が、前記組換えポリペプチドの光子放射強度および／または安定性を向上させる、ＧＦＰの変異体である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換えポリペプチドが、エクオリンおよびＧＦＰまたはそのそれぞれの変異体もしくは変種を含むかまたはからなり、前記エクオリンおよびＧＦＰが、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）を可能とするリンカーにより連結されている、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リンカーが、４〜６３アミノ酸、好ましくは１４〜５０アミノ酸を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカーが、配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ］ｎを含むかまたはからなり、ここでのｎは１〜５であり、好ましくはｎは１であるか、またはｎは５である、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換えポリペプチドがさらに、前記の得られる生物発光タンパク質を特定の細胞ドメインまたは細胞区画へと標的化させることのできる、ペプチド断片を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ペプチド断片が、シナプトタグミン、ＰＳＤ９５、チトクロムＣオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ、免疫グロブリン重鎖を含む群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記の生物系が、細胞または細胞群より選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記の生物系が、組織またはその一部である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記の生物系が、動物完全体または植物である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
光子放射をモニタリングする前に、エクオリンを活性とするために、コエレンテラジンを投与するステップを含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
光子放射をモニタリングする前に、前記組換えポリペプチドを生物系に投与するステップを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えポリペプチドを、生物系に、好ましくは静脈内、腹腔内、または筋肉内に注入する、請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記組換えポリペプチドをコードする核酸を、生物系に導入する、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸を、組換えベクターにより、特に組換えウイルスベクターにより、生物系に送達する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組換えポリペプチドをコードする前記核酸を、遺伝子導入により生物系に導入する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記光学的検出を、ゲノムから前記組換えポリペプチドを発現している非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物で行なう、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記非ヒトトランスジェニック動物が哺乳動物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記非ヒトトランスジェニック動物がマウスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記組換えポリペプチドの発現および／または局在が、特定の組織、単細胞型、または細胞区画もしくはドメインに限定される、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記単細胞型が、神経細胞、心臓細胞、または肝臓細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞区画が、ミトコンドリアまたは葉緑体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）ＧＦＰ蛍光検出による、細胞群、組織、細胞、または細胞区画もしくはドメインの発達、形態、または機能の特徴づけ、および
ｂ）請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法による、前記細胞群、前記組織、前記細胞、または前記細胞区画もしくはドメインにおけるＣａ２＋動態の特徴づけ
を含む、生理的過程および／または病的過程の同定法。
【請求項３５】
インビボでのＣａ２＋動態のモニタリングが可能な条件において、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなるカルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドを発現している、トランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３６】
前記化学発光タンパク質がカルシウムイオンと結合する、請求項３５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３７】
インビボで非侵襲性のモニタリングを実現させることのできる、請求項３５〜３６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３８】
前記組換えポリペプチドが、前記動物に遺伝子的にコードされている、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項３９】
カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドが、前記トランスジェニック動物のゲノムに挿入されているポリヌクレオチドによりコードされている、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４０】
カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドが、適切な転写系および／または翻訳系の制御下に置かれている、請求項３９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４１】
前記組換えポリペプチドの発現および／または局在が、特定の組織に限定されている、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４２】
前記組換えポリペプチドの発現および／または局在が、単細胞型に限定されている、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４３】
前記単細胞型が、神経細胞、心臓細胞、または肝臓細胞である、請求項４２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４４】
前記組換えポリペプチドの発現および／または局在が、特定の細胞区画またはドメインに限定されている、請求項３５〜４０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４５】
前記細胞区画が、ミトコンドリアである、請求項４４に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４６】
カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドの発現が、条件的である、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４７】
カルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている前記ポリヌクレオチドが、βアクチンプロモーターおよびＬｏｘ−ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ配列の制御下に置かれている、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４８】
前記化学発光タンパク質が、エクオリンである、請求項３５〜４７のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項４９】
前記エクオリンが、カルシウムイオンに対する高い親和性を有する変異エクオリンである、請求項４８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５０】
前記エクオリンが、変異エクオリンＡｓｐ４０７→Ａｌａである、請求項４９に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５１】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰである、請求項３５〜５０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５２】
前記蛍光タンパク質が、異なる波長で発光するＧＦＰの変種である、請求項３５〜５１のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５３】
前記のＧＦＰの変種が、ＣＦＰ、ＹＦＰ、およびＲＦＰからなる群より選択される、請求項５２に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５４】
前記蛍光タンパク質が、前記組換えポリペプチドの光子放射強度または安定性を向上させる、ＧＦＰの変異体である、請求項３５〜５１のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５５】
前記組換えポリペプチドが、エクオリンおよびＧＦＰまたはそのそれぞれの変異体もしくは変種を含むかまたはからなり、前記エクオリンおよびＧＦＰは、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）を可能とするリンカーにより連結されている、請求項３５〜５４のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５６】
前記リンカーが、４〜６３アミノ酸、好ましくは１４〜５０アミノ酸を含む、請求項５５に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５７】
前記リンカーが、配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ］ｎを含むかまたはからなり、ここでのｎは１〜５であり、好ましくはｎは１であるか、またはｎは５である、請求項５５〜５６のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５８】
前記組換えポリペプチドがさらに、前記の得られる生物発光タンパク質を特定の区画または細胞ドメインへと標的化させることのできる、ペプチド断片を含む、請求項３５〜５７のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項５９】
前記ペプチド断片が、シナプトタグミン、ＰＳＤ９５、チトクロムＣオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ、免疫グロブリン重鎖を含む群より選択される、請求項５８に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６０】
前記動物が、哺乳動物である、請求項３５〜５９のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６１】
前記動物が、マウスである、請求項３５〜６０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項６２】
請求項３５〜６１のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物のトランスジェニック子孫。
【請求項６３】
請求項４５〜６１のいずれか１項に記載の動物を、変異動物、特に既知の病態を有している動物モデルと交雑することにより得ることのできる、トランスジェニック動物。
【請求項６４】
ａ）ＤＮＡ構造物を、非ヒト動物の胚幹細胞に導入すること、ここで、前記ＤＮＡ構造物は、カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドをコードしている配列、いわゆる導入遺伝子を含むかまたはからなり、前記組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなり、前記導入遺伝子は、プロモーターおよび場合により条件的発現配列の制御下に置かれている、
ｂ）前記ＤＮＡ構造物が前記胚幹細胞のゲノムに挿入されている、陽性クローンを選択すること、
ｃ）前記陽性クローンを胚盤胞に注入し、キメラ胚盤胞を回収すること、そして
ｄ）前記キメラ胚盤胞を育成して、非ヒトトランスジェニック動物を得ること
を含む、請求項３５〜６０のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の作製法。
【請求項６５】
ａ）請求項６３の方法により第一のトランスジェニック非ヒト動物を作製すること、
ｂ）前記の得られた第一のトランスジェニック非ヒト動物を、前記組換えポリペプチドの発現が必要とされる組織または細胞において、前記の条件的発現配列に作用するエンドヌクレアーゼを発現している動物と交雑させること、
ｃ）特定の組織または細胞において前記組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック非ヒト動物を回収すること
を含む、請求項４６〜６１のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物の作製法。
【請求項６６】
前記の条件的発現配列がＬｏｘ部位であり、前記エンドヌクレアーゼがＣｒｅである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記エンドヌクレアーゼをコードしている前記ポリヌクレオチドが、細胞特異的プロモーターの制御下に置かれている、請求項６５〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞特異的プロモーターが、肝臓、心臓、または脳において活性である、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＤＮＡ構造物が、プロモーター、条件的発現配列、およびカルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている導入遺伝子を含むかまたはからなる、請求項６５〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＤＮＡ構造物が、β−アクチンプロモーター、Ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ配列、およびカルシウム濃度に感受性の前記組換えポリペプチドをコードしている導入遺伝子を含むかまたはからなる、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＤＮＡ構造物が、相同的組換えにより、前記胚幹細胞のゲノムに挿入される、請求項６５〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＤＮＡ構造物が、再構成されたＨＰＲＴ遺伝子座に挿入される、請求項６５〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記化学発光タンパク質が、エクオリンである、請求項６４〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記蛍光タンパク質が、ＧＦＰである、請求項６４〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記組換えポリペプチドが、エクオリンおよびＧＦＰを含むかまたはからなり、前記エクオリンおよびＧＦＰが、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）を可能とするリンカーにより連結されている、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記リンカーが、４〜６３アミノ酸、好ましくは１４〜５０アミノ酸を含む、請求項６４〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記リンカーが、配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ］ｎを含むかまたはからなり、ここでのｎは１〜５であり、好ましくはｎは１であるか、またはｎは５である、請求項６４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
ａ）請求項３５〜６１のいずれか１項に記載のカルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック動物において、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法により、Ｃａ２＋の動態を検出し、場合によりＣａ２＋を定量すること、
ｂ）対象の分子を、前記トランスジェニック動物に投与または前記トランスジェニック動物において発現させること、
ｃ）ステップａ）を繰り返すこと、
ｄ）注入前後のＣａ２＋の位置、動態、場合により量を比較すること、ここで、Ｃａ２＋の位置、動態、および／または量の変動は、前記分子がＣａ２＋をモデュレートできることを示唆している、
を含む、請求項３５〜６１のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト動物におけるＣａ２＋をモデュレートできる分子をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子的にコードされている生物発光リポーターを使用して、局所カルシウムシグナル伝達（例えばＣａ２＋濃度の高いミクロドメイン）の光学的検出を可能とする方法を提供する。本発明は、局所Ｃａ２＋シグナル伝達に対する薬理学的物質または神経修飾物質の効果を検出する方法を記載する。本発明は、特に、神経活性化などの細胞または組織活性化に関連し、イオンチャネル機能（Ｃａ２＋透過性の受容体／チャネル）及びシナプス伝達の光学的検出に関する、局所Ｃａ２＋の動的変動を可視化するための方法を提供する。本発明はまた、生物系におけるＣａ２＋動態の光学的検出法に関し、該方法は、該生物系に存在する、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなる組換えＣａ２＋感受性ポリペプチドにより放射される光子をモニタリングすることを含む。また、本発明は、局所カルシウム動態のインビボでのモニタリングが可能な条件において、蛍光タンパク質に連結した少なくとも１種類の化学発光タンパク質からなる、カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック非ヒト動物を提供する。Ｃａ２＋は、受精、分泌、収縮−弛緩、細胞運動性、細胞質およびミトコンドリアでのタンパク質の代謝、合成、産生、遺伝子発現、細胞周期進行、並びにアポトーシスを含む、ほぼ全ての細胞機能において役割を果たしている、最も遍在的で生理的に重要なシグナル伝達分子の１つである（Rizzutoら、2002)。
【０００２】
細胞および細胞下（subcellular）レベルでのＣａ２＋トランジェントの特徴は、複雑であって、空間的、時間的、および定量的因子により変化する。細胞質と細胞外空間ではＣａ２＋濃度に２０，０００倍以下の差異があり、そのため、チャネルが短時間しか開口していなくても、Ｃａ２＋流入が高速で起こるだろう。拡散、緩衝タンパク質へのＣａ２＋の結合、および細胞区画（cellular compartments）による隔離（sequestration）などの因子によりＣａ２＋勾配が生じ、チャネル孔から数百ｎｍ以内に高濃度のミクロドメインが生じる。１０μｍなどのより長い距離を越えると、Ｃａ２＋の有効拡散係数は強く減少するであろう。
【０００３】
Ｃａ２＋シグナルは、空間、時間および振幅が高度に調節されているので、画定されたプロファイル（例えば振幅および反応速度）を有する。Ｃａ２＋トランジェント（transient）は、サイトゾルでのＣａ２＋拡散、Ｃａ２＋結合タンパク質による緩衝化、および細胞小器官によるＣａ２＋輸送により形作られる（Bauer、2001；Llinasら、1995）。任意の所与の細胞ミクロドメインにおいて到達されるＣａ２＋濃度およびその反応速度は、シグナル伝達経路がその標的に到達することに成功したか否かを決定するのに非常に重要である。Ｃａ２＋は、キナーゼおよびホスファターゼなどの酵素、転写因子、および分泌に関与するタンパク質機械を含む、多くの重要な細胞タンパク質の活性化に必要である。Ｃａ２＋シグナル伝達カスケードはまた、生化学経路または機能的受容体および輸送機序の調節における負のフィードバックを媒介する場合もある。細胞内のＣａ２＋の伝播はまた、局所シグナル伝達経路を、細胞内のより遠い場所にあるシグナル伝達経路と連関させるのを助けたり、あるいは、細胞または細胞ネットワーク（例えば中枢神経系）間の長距離伝達を容易にすることができる（Augustineら、2003）。
【０００４】
高濃度Ｃａ２＋ミクロドメインを生じるＣａ２＋トランジェントは、発達、分泌、およびアポトーシス、並びに多くの細胞過程（遺伝子発現、神経伝達、シナプス可塑性、および神経細胞死を含む）において重要である多種多様の機能に関連している（Augustineら、2003；Bauer、2001；Llinasら、1995；Neher、1998）。Ｃａ２＋プロファイルの空間時間的特異性を特徴付けることは、多くの病理過程（偏頭痛、統合失調症、並びに、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン舞踏病などの神経変性疾患の発症に関連する早期事象を含む）に関与している、細胞内Ｃａ２＋恒常性撹乱の原因である機序を解明するのに重要である（MattsonおよびChan、2003）。Ｃａ２＋は、ほぼ全ての細胞シグナル伝達経路に直接的または間接的に関連しているので、Ｃａ２＋の光学的検出は、分子、細胞、組織、および動物完全体レベルでの生物活性の万能的指標である。光学顕微鏡を使用する局所Ｃａ２＋事象の画像化は大きく進歩した。その結果、蛍光ダイを使用した、単一樹状突起棘（Yuste、2003）およびより近年では単一シナプス（Digregorio、2003）におけるＣａ２＋シグナル伝達が成し遂げられた。しかし、Ｃａ２＋の測定を空間的に向上させる１つの方法は、リポータータンパク質を特定の位置に遺伝子的に標的化（targeting）させることであり、これにより、Ｃａ２＋活性を直接可視化できる。特に、このようなリポータータンパク質を、ミクロドメイン（発生源または受容体から２００ｎｍ以内）またはさらにはナノドメイン（２０ｎｍ以内）に固定することができた（論評についてはAugustineら、2003を参照）。トランスジェニック動物における細胞型特異的プロモーター制御下でのリポーター遺伝子の発現はまた、単一細胞型、組織、または解剖学的な動物完全体の画像化における動的な変化を追跡するための非侵襲的な方法を提供することができる。
【０００５】
リアルタイムでのカルシウムのモニタリングは、生物系、例えば中枢神経系の発達、可塑性、および機能の解明を向上するのに役立つ。実際に、単一細胞型、特に単一ニューロンおよびニューロンネットワークにおける電気的活性を画像化するための光学技術の発展に多大なる努力がなされてきたが、電気生理的技術も使用してこの目標を達成する必要が依然としてある。細胞または生体系の空間的に限局された領域におけるＣａ２＋リポータープローブの遺伝子標的化（例えば区画内に、ミクロドメインまたはナノドメインに、あるいは特異的ポリペプチドへの融合により）は、特定の細胞活性または生理的機能を検出するための分子画像化手法である。本発明は、生物系におけるＣａ２＋の動態を光学的に検出する方法（該方法は、該生物系に存在する、蛍光タンパク質に連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなる、組換えＣａ２＋感受性ポリペプチドにより放射される光子をモニタリングすることを含む）、並びに、カルシウムに感受性の該組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック非ヒト動物を提供することにより、当該技術分野でのこうした必要性を充足することを助ける。この技術の非侵襲的な性質、並びに、該組換えタンパク質が無毒性であるという知見は、該方法が、おそらくヒトにおいても応用できることを意味する。
【０００６】
本発明を、以下の図面を参照して記載する。
【０００７】
発明の説明
腔腸動物の中に、生物発光種が存在する。数多くの研究により、生物発光は、カルシウムに感受性であることが多い光タンパク質により発生することが示された。タンパク質に言及する場合に本明細書で使用した感受性は、該感受性タンパク質のそのコンフォメーション、他の分子に対する親和性、局在、または光放射のあらゆる改変を意味する。この種の特定のタンパク質は、カルシウムイオン濃度の増加に応答して、一瞬の光を放射する。これらの光タンパク質の中で、エクオリン（Aequorin）は、最もよく研究されているものの１つである（Blinksら、1976）。
【０００８】
クラゲAequoria victoria（Shimomuraら、1962）で単離されたエクオリンは、Ｃａ２＋感受性光タンパク質であり、すなわち、それはＣａ２＋と相互作用すると改変および／または活性化される。該改変および／または活性化は、特に非侵襲的方法で検出できる。より具体的には、エクオリンは、Ｃａ２＋と相互作用すると、２または３個のカルシウムイオンと結合した後、最大波長スペクトル４７０ｎｍの一瞬の青い光を放射する。古典的なルシフェラーゼ−ルシフェリン反応とは対照的に、光の放射には外来酸素が必要とされず、光の総量は、タンパク質量とＣａ２＋濃度に関連する。酸素は分子状で結合し、エクオリンの再構成は、分子量２１ｋＤａのタンパク質のアポエクオリンとコエレンテラジンの作用により起こる。光子放射は、エクオリンタンパク質上のカルシウムイオンと結合した後に、コエレンテラジンの過酸化反応により引き起こされる。この過程には２つの仮説が示唆されている：（ｉ）エクオリンとカルシウムイオンの結合が、タンパク質のコンフォメーション変化を起こし、これにより酸素がコエレンテラジンと反応することが可能となり、光の放射を誘発する、（ｉｉ）酸素が、コエレンテラジンとアポエクオリンの結合に役割を果たす（ShimomuraおよびJohnson、1978）。エクオリンは、インビトロおよびインビボでコエレンテラジンにより、例えば、それを直接培地に添加することにより、または、投与により、特に器官への注入により再創造される場合がある（ShimomuraおよびJohnson、1978）。
【０００９】
エクオリン中のコエレンテラジン部分を、異なるコエレンテラジン類似体で置き換えることにより、３０個までの異なる半合成エクオリンを製造できる（Shimomura、1995）。異なる半合成エクオリンは、スペクトルの違い、異なるＣａ２＋結合親和性、安定性、膜透過性および相対再生速度の違いを示す。Ｃａ２＋濃度の測定は、様々な組合せを使用して、１００ｎＭから１ｍＭまで実施できる。天然エクオリンを天然コエレンテラジンで再構成すると、Ｃａ２＋に対する親和性が低く（Ｋｄ＝１０μＭ）、そのため生理的Ｃａ２＋濃度変動範囲における良好なセンサーとなる。光放射とカルシウムイオン濃度の関係は線形ではない可能性があるが、それにも関わらず光放射とカルシウムイオン濃度のｌｏｇ関係は決定されている（JohnsonおよびShimomura、1978）。エクオリン消費速度分率は、生理的ｐＣａ範囲において［Ｃａ２＋］に比例している。実際、Ｃａ２＋濃度が１０−７Ｍから１０−６Ｍへと、また１０００倍の１０−６Ｍから１０−５Ｍへと移行すると、バックグラウンド雑音比に対して２００倍のシグナルの増加が測定されている（CobboldおよびRink、1987）。さらに、シグナル発生の反応速度は、Ｃａ２＋イオン濃度の瞬間的な増加を検出するのに十分なほどに急速である。カルシウム飽和条件下で６ミリ秒の時定数で光強度の増加が示されている（Blinksら、1978）。したがって、エクオリンは、生理的条件下でＣａ２＋イオンの急速で上昇した増加を測定するのに十分に適合した光タンパク質である。近年の研究で、リンカーを含むＧＦＰ−エクオリンリポーターのＣＲＥＴ応答時間が調べられた（Gorokhovatskyら、2004）。Ｃａ２＋が引き起こすＧＦＰ−エクオリンの生物発光反応は、典型的な瞬間型のエクオリンの生物発光反応を示すことを示している。流れを停止させた装置にＣａ２＋を添加した後、光放射が直ちに始まり、５０ミリ秒以内にピークに達した。応答反応速度は、「カメレオン」で示される会合速度定数と同等のようである（Miyawakiら、1997）。
【００１０】
Prasherら（1985）およびInouyeら（1985）によるアポエクオリン遺伝子のクローニングにより、核、細胞質、ミトコンドリア、小胞体、または形質膜シグナルペプチドとの融合により、特定の細胞区画への標的化を可能とする、発現ベクターが創造された（Kendallら、1992；Di Giorgioら、1996）。さらに、該タンパク質のインビボでの発現により、カルシウムの細胞内生理機能を撹乱することなく、低レベルでのその検出が可能となる。
【００１１】
天然には、光タンパク質活性は、第二タンパク質と連関していることが非常に多い。最も一般的なのは、「緑色蛍光タンパク質」すなわちＧＦＰである。この場合に、放射される光は、事実、緑色である。放射機序によるエクオリンとＧＦＰの間でのエネルギー移動の仮説は、１９６０年代にJohnsonら（1962）により提案された。Ｃａ２＋の存在下でエクオリンにより放射される青い光は、おそらく、ＧＦＰにより吸収され、最大波長５０９ｎｍを有するスペクトルで再放射される。他の研究により、このエネルギー移動は、ＧＦＰとエクオリンの間のヘテロテトラマーの形成により可能となる非放射機序により起こることが示されている。Moriseら（1974）は、ＤＥＡＥセルロース膜上に２個の分子を同時吸着させることにより、このエネルギー移動をインビトロで可視化することに成功した。しかし、これらの研究により、この条件でＣａ２＋の引き起こしたエクオリンの発光の量子収量は０．２３であり、これは、エクオリン単独のものと一致することが示された（Moriseら、1974）。
【００１２】
ＧＦＰは、クラゲAequoria victoriaでも単離されているが、これがクローニングされた（Prasherら、1992）。細胞発現および系統マーカーとして様々な生物系で使用されている（Cubittら、1995）。古典的な蛍光顕微鏡を使用したこのタンパク質の検出は、生きた生物および固定組織の両方において比較的実施し易い。さらに、蛍光放射は、補因子または補酵素の添加を必要とせず、自己触媒翻訳後過程に依存する。９個のアミノ酸からなるフルオロフォアは、セリン６５とグリシン６７の間で環を形成し、これは中間体のイミダゾリジン５を与え、その後、チロシン６６の酸化により、デヒドロチロシンへと変換されることにより特徴付けられる（Heimら、1994）。この群は、発色団と直接相互作用する環境を構成する１１個のβ層を含む円柱内に認められる（Yangら、1996）。
【００１３】
カルシウム流入をリアルタイムでモニタリングすることにより、中枢神経系、心臓、脳および肝臓などの多くの器官の発達、可塑性、および機能、並びにその関連する病態の解明に役立つ。クラゲでは、化学発光しカルシウムに結合するエクオリンタンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と会合し、Ｃａ２＋刺激時には緑色生物発光シグナルが発生する。エクオリンのみでは、励起後の光子の放射が弱いために、細胞および細胞下レベルで検出することは困難であり、単一細胞または良好な時間的解像度で検出することは極めて困難である。
【００１４】
より高い量子収量を有するであろうカルシウムに感受性の新規マーカーが、第ＷＯ０１／９２３００号に記載されている。このマーカーは、２つの分子間の化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）を利用している。カルシウム感受性生物発光リポーター遺伝子は、ＧＦＰとエクオリンを融合させることにより作製され、これによりはるかに明るい光が放射される。エクオリンに連結したＧＦＰをコードしている核酸分子の組換えにより得られた様々な構造物が、国際特許出願第ＷＯ０１／９２３００号に開示され、これは引用例として本明細書に取り込む。
【００１５】
哺乳動物細胞における、これらの融合タンパク質の化学発光活性および蛍光活性を評価した。サイトゾルＣａ２＋増加を、単一細胞レベルで、冷却した増感ＣＣＤ（結合電荷素子）カメラで画像化した。この二機能的リポーター遺伝子は、トランスジェニック動物のニューロンネットワークおよび特定の細胞下区画におけるカルシウム活性の調査を可能とする。
【００１６】
本発明は、Ｃａ２＋誘起生物発光の量子収量を増加させるために、エクオリンおよびＧＦＰを用いて作成した融合タンパク質または組換えタンパク質を利用する。この活性は、単に、エクオリンとＧＦＰを同時発現させることにより増加させることはできない。
【００１７】
エクオリンは、カルシウム結合親和性が低く（Ｋｄ＝１０μＭ）、よって、［Ｃａ２＋］ｉ緩衝系として主要な効果は持っていないはずであり、また、Ｃａ２＋勾配を平板化することもないはずである。シグナル発生の反応速度は、カルシウム飽和条件下で６ミリ秒の時定数でＣａ２＋イオン濃度の瞬間的な増加を検出するのに十分なほど急速である。光の総量は、タンパク質量およびＣａ２＋濃度に比例する。それ故、任意の所定の時点において放射される光の量をカルシウム濃度に較正することが可能である。研究により、エクオリンのみでは、光子放射レベルが弱いために、単一細胞および細胞下レベルで検出することは極めて困難である。
【００１８】
Ｃａ２＋のエクオリン（Ｃａ２＋結合部位に特徴的な３個のＥＦハンド構造を有する）への結合は、コンフォメーション変化を誘起し、これにより、分子内反応を介してコエレンテラジンが酸化される。生成されたコエレンテラミドは励起状態にあり、基底状態に戻る時に青い光（最大：４７０ｎｍ）を放射する（Shimomura & Johnson、1978）。ＧＦＰを、柔軟性リンカーによりエクオリンに融合させると（第ＷＯ０１／９２３００号）、Ｃａ２＋結合後にエクオリンにより獲得されるエネルギーは、青い光を放射することなく、活性化オキシルシフェリンからＧＦＰへと移動する。ＧＦＰアクセプターフルオロフォアは、放射を伴わないエネルギー移動により、オキシコエレンテラジンにより励起される。その結果、励起したＧＦＰがその基底状態に戻る時に、緑色にシフトした光（最大、５０９ｎｍ）が放射される。
【００１９】
本発明のＧＦＰ−エクオリンは、Ｃａ２＋感受性特性並びにエクオリンとＧＦＰのそれぞれの蛍光を複合した、二機能リポータータンパク質である。該組換えタンパク質は、生きたサンプルまたは固定サンプルにおいて古典的なエピ蛍光により検出でき、生きたサンプルにおける生物発光の検出によりＣａ２＋活性をモニタリングするために使用することができる。ＧＦＰ−エクオリンポリペプチドは遺伝子によりコードされ、コード配列および／または発現ポリペプチドは、特定の細胞ドメインに局在させることができる。光タンパク質の機能を撹乱することなく、ＧＦＰ−エクオリンポリペプチドを追加的にまたは代替的に遺伝子導入により生物に導入することができる。本発明の組換えポリペプチドをコードするこの核酸はまた、適切な転写および／または翻訳系の制御下で発現させることができる。本明細書で使用した「適切」は、所与の細胞型、所与の組織、所与の細胞区画（例えばミトコンドリア、葉緑体など）または所与の細胞ドメインにおいての本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸の転写および／または翻訳に必要な要素を意味する。該特異的発現を達成するために、核酸は、例えば、細胞型特異的プロモーターまたは組織型特異的プロモーターの制御下で組換え、これにより、所定の組織または動物完全体内の単一細胞型または単一組織型におけるＣａ２＋シグナル伝達の測定が可能となる。
【００２０】
哺乳動物細胞におけるＧＦＰ−エクオリンタンパク質の化学発光活性および蛍光活性を評価した。サイトゾルＣａ２＋増加は、以前に、単一細胞レベルで、冷却した増感ＣＣＤ（結合電荷素子）カメラ（第ＷＯ０１／９２３００号）を用いて画像化されている。単一細胞レベルでのＧＦＰ−エクオリンの本発明者らの研究により、プローブとして使用するための、この組換えポリペプチドの感受性が実証された（後記の結果を参照）。ＧＦＰ−エクオリンは、Ｃａ２＋に対する親和性が低いために、局所Ｃａ２＋シグナル伝達を有意に妨害しない。それ故、ＧＦＰ−エクオリンは、細胞内Ｃａ２＋活性の生物発光リポーターであり、単一細胞、組織切片、または生きた動物における動的変化を追跡するために使用できる。ＧＦＰ蛍光はまた、価値ある遺伝子発現リポーターであり、細胞内位置決定マーカーである。さらに、生物発光分子は、光を発生するために化学的エネルギーを利用するため、放射エネルギーの入光を必要としない。したがって、実質的にシグナルのバックグラウンドはない。
【００２１】
これに対し、蛍光ダイは、排他的に細胞下ドメインに局在化させることができない。他方でカメレオンは、遺伝子的に標的化できる。これらのリポーターは、一般的に、信号雑音比が低く、長期画像化は、光毒性および光退色に関連した問題により困難である。これにより、長期におよぶ動的変化を可視化するために、例えば、学習および記憶、発達および心リズムの研究においてこれらのプローブを使用することは制限される。蛍光は、放射エネルギーを必要とし、これにより光退色、光毒性、自己蛍光、および高いバックグラウンドシグナルが発生する。蛍光分子を励起するために、外部光源が必要である。励起光が組織を通る時に吸収され蛍光分子を励起する。同様に、放射光が組織を通って検出された場合には、同じことが起こるだろう。さしあたり、インビボでの非侵襲的な動物完全体の画像化は、主に生物発光リポーターに限定されている。
【００２２】
他の関連技術：
電気生理的記録は、マイクロピペットが近づける細胞体または大きな樹状突起領域に限定される。
【００２３】
Yusteらは、２つのニューロン間または複数のニューロン間の接続の光学的検出に関連する「後続の」ニューロンの活性化を検出するための、蛍光指示物質の使用を記載している（Yusteら、2003）。しかし、この手法は、これらの蛍光指示物質が、遺伝子標的できないため、短期または低速度撮影の画像化適用にのみ有用であるという欠点がある。特に、（１）非選択的染色および生理的温度での短時間後の細胞からのダイ（dye）の漏出問題、（２）光励起が必要とされることにより、生きた（または固定された）解離細胞培養液または組織サンプルに引き起こされる光退色および光動的傷害により、長期の動的画像化が制限される、（３）蛍光ダイによる局所Ｃａ２＋動態または高濃度Ｃａ２＋のミクロドメインの画像化は困難であり、光学顕微鏡技術により提供される空間的解像度の限界を下回る。
【００２４】
電圧感受性ダイは、「未処置（intact）中枢神経系における多ニューロン活性」をモニタリングするための有用な技術として考察されている（Wuら、1998）。これらのプローブは蛍光性であり、それ故、Ｃａ２＋感受性蛍光ダイで考察されるのと同じ制限を受ける（論評についてはKnopfelら、2003を参照）。遺伝子的にコード可能な形態も開発されているが（Siegel&Isacoff、1997）、信号雑音比が低い。
【００２５】
「カメレオン」は、カルモジュリン結合配列により共有結合的に連結した２個のＧＦＰからなる、遺伝子的にコードされているＣａ２＋感受性蛍光プローブに属する。カメレオンは一般的に信号雑音比が低く、長期画像化は、光毒性および光退色に関連した問題により困難である。このプローブの標的化は、ミトコンドリアマトリックスに（Fillipinら、2003）、小胞体腔に（Varadi & Rutter、2002）、大きな濃い中心の分泌小胞の表面に、フォグリンとして知られる膜貫通タンパク質との融合により行なわれる（Emmanouilidouら、1999）。
【００２６】
本発明は、シナプス伝達に関連したカルシウムシグナル伝達ミクロドメインを検出し、リアルタイムで単一細胞型（ニューロンおよびニューロンネットワーク）並びに他の器官および組織におけるカルシウム動態を可視化するための、単一細胞型（ニューロンおよびニューロン個体群を含む）の蛍光／生物発光を複合した画像化を使用する新規手法を記載する。
【００２７】
特に、本発明は、Ｃａ２＋ミクロドメインの検出に有用な組換えポリペプチドを提供する。該組換えポリペプチドは、細胞下ドメインに標的化できるペプチドまたはタンパク質に場合により融合させた、生物発光ポリペプチドを含む。本発明の１つの実施形態において、生物発光ポリペプチドには、カルシウムイオンに結合する化学発光ペプチドおよび蛍光ペプチドを含む。別の例において、該組換えポリペプチドは、カルシウムイオンに結合する化学発光ペプチドおよび該蛍光ペプチドからなる。該組換えポリペプチドはまた、化学発光ペプチド、蛍光ペプチド、およびリンカーからなり、場合によりさらに、細胞下ドメインに標的化できるペプチドまたはタンパク質に融合している。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、化学発光ペプチド、蛍光ペプチド、および細胞下ドメインに標的化できるペプチドもしくはタンパク質からなる。別の例は、化学発光ペプチド、蛍光ペプチド、リンカー、および細胞下ドメインに標的化できるペプチドもしくはタンパク質からなる。
【００２８】
細胞下区画または細胞ミクロドメインへのＧＦＰ−エクオリン（ＧＡ）の標的化は、ペプチドシグナルまたは対象のペプチドもしくはタンパク質と融合させることにより可能となる。
【００２９】
特定の実施形態によれば、本発明は、細胞区画、特にシナプス伝達に関連したカルシウムミクロドメインにおけるカルシウムシグナル伝達を検出するための、二機能蛍光／生物発光組換えタンパク質（ＧＦＰ−エクオリン）の標的化および使用を記載する。本発明はまた、単一ニューロンおよびニューロン個体群などの単一細胞または細胞個体群におけるカルシウム動態の「リアルタイム」な光学的検出のための、これらの組換えポリペプチドの使用を記載する。これらの研究は、ニューロンにおけるこの組換えポリペプチドの使用を記載するが、このリポーターポリペプチドにより提供される感受性および他の重要な特徴を強調するためのものでもある。この組換えポリペプチドの使用は、確かに、ニューロンにおける使用に限定されない。ＧＦＰ−エクオリンは、他の細胞型でも多大なる有用性があるが、確かに大半の動物、植物、細菌およびまた酵母、特にカルシウムシグナル伝達が重要であるあらゆる生物系においても有用性がある。
【００３０】
化学発光ペプチドの例は、エクオリンまたはエクオリン変異体である。好ましい実施形態において、変異エクオリンは、変異エクオリンＡｓｐ４０７→Ａｌａのように、カルシウムイオンに対して、異なる、好ましくは低い親和性を有する。別の例において、ｈ−コエレンテラジン類似体を使用してエクオリンタンパク質を再生する場合には、より高い親和性を示す場合もある。
【００３１】
蛍光ペプチドの例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰ変種、またはＧＦＰ変異体である。このような変種は、異なる波長で光子を放射する特徴を有する。このようなＧＦＰ変種の例は、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、およびＲＦＰ（赤色蛍光タンパク質）である。
【００３２】
化学発光ペプチドまたは蛍光ペプチドの変異体または変種は、本明細書では、参照配列を参照して置換、欠失、または付加を有する配列として定義される。アミノ酸置換は、保存的、半保存的、または非保存的であってもよい。
【００３３】
それ故、特定の組換えポリペプチドは、リンカーを含むまたは含まない、エクオリンおよびＧＦＰ、特に融合ポリペプチドＧＦＰ−エクオリンからなる。本発明の範囲内には、シアン蛍光タンパク質とエクオリンの融合物（ＣＦＰ−エクオリン）、黄色蛍光タンパク質とエクオリンの融合物（ＹＦＰ−エクオリン）、赤色蛍光タンパク質とエクオリンの融合物（ＲＦＰ）、またはこれらのいずれかの組合せを含む３重融合物（例えば、ＲＦＰ−ＹＦＰ−エクオリン）、並びに、ＧＦＰ−エクオリンの赤色にシフトした形態であるか、または、リポータータンパク質の明度、安定性、および／または成熟度を向上させる変異を有する、元来のＧＦＰ−エクオリンの変異体または変種が含まれる。
【００３４】
本発明はまた、エクオリン、ＧＦＰ、およびリンカー、特にペプチドリンカーからなる組換えポリペプチドを提供する。特定の組換えポリペプチドにおいて、該化学発光ペプチドはエクオリンであり、蛍光ペプチドはＧＦＰであり、エクオリンとＧＦＰは、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）を可能とするペプチドリンカーにより連結されている。ＣＲＥＴを可能とするペプチドリンカーは、好ましくは４〜６３アミノ酸、特に１４〜５０アミノ酸を含むかまたはからなる。特定の実施形態において、このようなペプチド配列は、配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ］ｎを含むかまたはからなり、ここでのｎは１〜５であり、好ましくはｎは１であるか、またはｎは５である。
【００３５】
本発明の組換えポリペプチドの別の特定の実施形態において、細胞下ドメインに標的化させることのできるペプチドまたはタンパク質は、シナプトタグミン、ＰＳＤ９５、チトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩ、および免疫グロブリン重鎖またはその断片、例えばＮ末端断片から選択される。
【００３６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドも提供する。
【００３７】
さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、および、該組換えポリヌクレオチドもしくは該ベクターを含む宿主細胞も提供する。該細胞は、例えば、真核細胞もしくは原核細胞、例えば動物細胞、植物細胞、細菌、または酵母であってもよい。
【００３８】
本発明は、生物系におけるＣａ２＋動態の光学的検出法に関し、該方法は、該生物系に存在する、蛍光タンパク質に融合または連結した化学発光タンパク質を含むかまたはからなる、本発明の組換えＣａ２＋感受性ポリペプチドにより放射される光子をモニタリングすることを含む。本出願に記載した任意のポリペプチドを、該検出法の実施に使用できる。この方法は、細胞内Ｃａ２＋シグナル伝達または細胞間の伝達を検出するためのＣａ２＋シグナル伝播の光学的検出に有用である。
【００３９】
該方法は、光子放射をモニタリングするために、様々な生物系において、インビトロで細胞もしくは細胞群において、インビボで本発明の該組換えポリペプチドを発現している動物もしくは植物において、または生体外でトランスジェニック動物もしくは植物の組織もしくは細胞群において行なうことができる：
【００４０】
該方法は、光子放射のモニタリングの前に、該組換えポリペプチドまたは該組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生物系に投与することを含む。動物完全体系において、該組換えポリペプチドまたはそれをコードする核酸（または対応するベクター）を、好ましくは、静脈内、腹腔内、または筋肉内注射により投与する。本発明の組換えポリペプチドをコードする核酸の投与は、任意の適切な手段、特に組換えベクター、特に組換えウイルスベクターにより行なうことができる。本発明の特定の実施形態において、組換えポリペプチドをコードする核酸により特に形質転換されている、トランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物を提供する。形質転換は、一過性であってもまたは確定的であってもよい。この場合、本発明の組換えポリペプチドは、植物または動物の改変されたゲノムから発現される。
【００４１】
該組換えポリペプチドの発現および／または局在は、トランスジェニック植物または動物のゲノムから発現させる場合、特定の組織、単一細胞型（例えば神経細胞、心臓細胞、または肝臓細胞）または細胞区画もしくはドメイン（例えばミトコンドリアまたは葉緑体）に限定することができる。
【００４２】
該方法はまた、光子放射のモニタリングの前に、生物発光および／または蛍光タンパク質の活性化を可能とする分子の投与を含むことができる。ＧＦＰ−エクオリンリポータータンパク質において、該方法は、エクオリンの活性化を可能とする条件および濃度において、生物系へのコエレンテラジンの投与を含む。エクオリン／コエレンテラジン系は、当該技術分野において開示されている（Shimomura、1991）。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明は、細胞下レベルでＣａ２＋を検出または定量する方法を提供する。該方法は、インビボで、宿主細胞において、特に非ヒト動物において、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる本発明の組換えポリペプチドを発現させ、Ｃａ２＋の存在を可視化することを含む。場合により、Ｃａ２＋は、半定量してもよい。好ましい実施形態において、検出は、いわゆる「リアルタイム」検出である。
【００４４】
本発明はまた、ＧＦＰ蛍光検出による細胞群、組織、細胞、または細胞区画もしくはドメインの発達形態または機能の特徴付け、および本発明の光学的検出法による該細胞群、該組織、該細胞または該細胞区画もしくはドメインにおけるＣａ２＋動態の特徴付けを場合により含む、生理的および／または病的過程の同定法を提供する。
【００４５】
本発明はさらに、既知の正常範囲を逸脱したカルシウム流入またはシグナル伝達の変動を含む場合がある、生理的および／または病的過程の同定法に関し、該方法は、本発明の適用によるＣａ２＋動態の光学的検出を含む。あるいは、Ｃａ２＋動態の該光学的検出はむしろ、プロトコルの一部として、このような過程の同定のために、特に診断またはモニタリングを行なうために、例えば治療応答をモニタリングするために含めることができる。
【００４６】
さらに、本発明は、本発明の宿主細胞を含む、トランスジェニック非ヒト動物または植物を提供する。
【００４７】
本発明はまた、上記した遺伝子的にコードされた本発明の組換えポリペプチドを発現している、上記の光学的検出法に使用できる、トランスジェニック非ヒト動物を提供する。特定の実施形態において、該組換えポリペプチドは、ポリヌクレオチドにより、場合により該トランスジェニック動物のゲノムに挿入された適切な転写および翻訳系の制御下でコードされている。この非ヒト動物は、脊椎動物、特に哺乳動物、例えば霊長類またはげっ歯類であってもよい。特定の実施形態において、この非ヒト動物は、ラット、ウサギ、またはマウスである。
【００４８】
本発明はまた、本発明のトランスジェニック非ヒト動物の作製法に関し、
−ＤＮＡ構造物（DNA construct）を、非ヒト動物の胚幹細胞に導入すること、ここで、該ＤＮＡ構造物は、カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドをコードする配列、いわゆる導入遺伝子を含むかまたはからなり、該組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質に連結させた化学発光タンパク質を含むかまたはからなり、該導入遺伝子は、プロモーターおよび場合により条件的発現配列の制御下に置かれている、
−該ＤＮＡ構造物が該胚幹細胞のゲノムに挿入されている、陽性クローンを選択すること、
−該陽性クローンを胚盤胞に注入し、キメラ胚盤胞を回収すること、そして
−該キメラ胚盤胞を育成して、非ヒトトランスジェニック動物を得ること
を含む。
【００４９】
組換えポリペプチドの発現が条件的である特定の実施形態において、以下のトランスジェニック非ヒト動物の作製法を使用できる：
−ＤＮＡ構造物を、非ヒト動物の胚幹細胞に導入し、ここで、該ＤＮＡ構造物は、カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドをコードしている配列、いわゆる導入遺伝子を含むかまたはからなり、該組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質に連結させた化学発光タンパク質を含むかまたはからなり、該導入遺伝子は、プロモーターおよび場合により条件的発現配列の制御下に置かれている、
−該ＤＮＡ構造物が該胚幹細胞のゲノムに挿入されている、陽性クローンを選択し、
−該陽性クローンを胚盤胞に注入し、キメラ胚盤胞を回収し、
−該キメラ胚盤胞を育成して、非ヒトトランスジェニック動物を得、
−得られた第一の該トランスジェニック非ヒト動物を、該組換えポリペプチドの発現が必要とされる組織または細胞において、条件的発現配列に作用するエンドヌクレアーゼを発現している動物と交雑させ、
−特定の組織または細胞において該組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック非ヒト動物を回収する。
【００５０】
本明細書で使用した「条件的」は、本発明のカルシウム濃度に感受性の組換えタンパク質が、非ヒトトランスジェニック動物の全発達期間中の選択された時点で発現されていることを意味する。それ故、特定の実施形態において、組換えタンパク質は、リコンビナーゼが、条件的発現配列の組換えを触媒した場合、例えばＣｒｅ酵素が、Ｌｏｘ認識部位の組換えを触媒した場合に発現される。
【００５１】
Ｃｒｅなどのリコンビナーゼまたはエンドヌクレアーゼの発現は、該リコンビナーゼをコードする核酸の上流に位置するプロモーターにより空間的時間的に調節することができる。該プロモーターは、例えば肝臓細胞、心臓細胞または脳細胞におけるリコンビナーゼの発現を可能とする、細胞特異的プロモーターであってもよい。
【００５２】
特定の実施形態において、リコンビナーゼの発現は、天然分子または合成分子により活性化されてもよい。それ故、リガンド依存的キメラＣｒｅリコンビナーゼ、例えばＣｒｅＥＲＴまたはＣｒｅＥＲＴ２リコンビナーゼを使用できる。それは、エストロゲン受容体の改変されたホルモン結合ドメインに融合したＣｒｅからなる。ＣｒｅＥＲＴリコンビナーゼは不活性であるが、合成エストロゲン受容体リガンドのタモキシフェンにより活性化することができ、それ故、Ｃｒｅ活性の外部から時間的に制御することが可能となる。実際、ＣｒｅＥＲＴリコンビナーゼの組織特異的発現を、そのタモキシフェン依存的活性である条件的発現部位（例えばＬｏｘ部位）の組換えと合わせることにより、タモキシフェンを動物に投与することにより空間的にも時間的にもＤＮＡを制御することができる。
【００５３】
本発明はまた、本発明の非ヒトトランスジェニック動物の子孫にも関する。これらの子孫は、本発明のトランスジェニック動物を、変異疾患動物またはモデルと交雑させることにより得られる場合がある。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態において、Ｃａ２＋トランジェントをモデュレートする能力をアッセイするために、対象の分子をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
ａ）カルシウム濃度に感受性の組換えポリペプチドを発現しているトランスジェニック動物において、本発明の光学的検出法により、Ｃａ２＋の動態を検出すること、
ｂ）対象の分子を、該トランスジェニック動物に投与または該トランスジェニック動物において発現させること、
ｃ）ステップａ）を繰り返すこと、
ｄ）注入前後のＣａ２＋の位置、動態、場合により量を比較すること、ここで、Ｃａ２＋の位置、動態、および／または量の変動は、該分子がＣａ２＋トランジェントをモデュレート（modulate）できることを示唆している、
を含む。
【００５５】
本発明はまた、インビボで非ヒト動物において、ＧＦＰ、エクオリン、該組換えペプチドを細胞ドメインに標的化させることのできるペプチドもしくはタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより発現されることのできる組換えペプチド組成物を提供する。該ペプチド組成物は、対象の細胞、細胞群、細胞下ドメインまたは組織における、Ｃａ２＋変化の可視化または定量に関与している。
【００５６】
本発明は、生物発光リポーターであるＧＦＰ−エクオリンを、シナプス伝達において重要なミクロドメインを含む様々なミクロドメインに遺伝子的に標的化させる手段を提供する。ＧＦＰ−エクオリンは、優れた信号雑音比を有し、光タンパク質機能を撹乱することなく、タンパク質または細胞区画に標的化させることができる。それ故、本発明は、分子、細胞、組織、および動物完全体レベルにおける、または、解離細胞培養物、切り出した組織、急性および器官型培養物もしくは生きた動物における、局在Ｃａ２＋動態の「リアルタイム」可視化を可能とする。
【００５７】
本発明のリポーターは、細胞下または高濃度Ｃａ２＋ミクロドメインの選択的検出を可能とする。それ故、遺伝子的にコードされた生物発光Ｃａ２＋リポーターのＧＦＰ−エクオリンは、シナプス伝達を光学的に検出するために、また、哺乳動物神経系における機能的神経回路のマッピングを容易にするために使用できる。
【００５８】
動物完全体の生物発光による画像化は、生きた未処置の動物における生物学的過程をモニタリングするための、非常に重要な非侵襲的戦略を示す。現在までに、生物発光リポーターを使用してインビボで細胞活性の画像化を記載した適用は、ほぼ専ら、ホタルのルシフェリン−ルシフェラーゼ系を用いて行なわれてきた。該手法は、特定の生物学的過程に連関した内部発生光について、ルシフェラーゼリポーター系を利用する。生物発光反応は、通常、有機基質（ルシフェリンまたは発色団）の酸化を伴う。ルシフェラーゼを発現する細胞が、基質のルシフェリンと合体すると、光が発生する（極大は５６０ｎｍ）。ＡＴＰおよびＯ２の両方が、光反応が起こるのに必要とされる。これらのリポーターは、より長い波長で赤色にシフトした光を発生するように開発されたので、生じる光は、組織により吸収される度合いが低く、これによりこの技術は、腫瘍進行または感染を追跡するのに理想的である。
【００５９】
エクオリンを基礎とした系は、ＢＬＩのためのルシフェラーゼを基礎としたリポーター系に代わる適用を提供する。Ｃａ２＋および基質のコエレンテラジンの存在下で光が発生する。ルシフェリン−ルシフェラーゼ系とは対照的に、ＧＦＰ−エクオリンのＣａ２＋依存的光放射（極大５１５ｎｍ）は、外来性のＯ２を必要としない。これに対し、分子状Ｏ２が堅く結合しており、それ故、空気の完全な不在下で発光反応が起こることが可能である。それ故、光タンパク質の生物発光反応速度は、酸素濃度により影響を受けない。エクオリンの第二の特徴は、カルシウムの添加により、光強度を１００万倍以下まで増加させることができることである。それ故、コエレンテラジン−ＧＦＰ−エクオリン系は、Ｃａ２＋活性の特異的解析を可能とし、補因子のＡＴＰおよびＭｇ２＋を必要としないので、リポーターとしてのホタル系よりも適切である可能性がある。ルシフェラーゼ反応により赤色の光が放射されるので、コエレンテラジン−ＧＦＰ−エクオリン系は深部組織解析により適しており、それ故、感染過程または腫瘍進行を追跡するのに理想的である。しかし、エクオリンを基礎とした系は、空間的および微細な時間的解像度で、より表在組織部位で、Ｃａ２＋依存的生物学的過程をモニタリングするために使用できる（哺乳動物皮質、骨格筋または皮膚におけるＣａ２＋シグナルの解析）。新しい装置の開発により、ＧＦＰ−エクオリン−コエレンテラジン系は、深部組織層において、ルシフェラーゼ−ルシフェリンと同じように画像化できる。それ故、インビボでの動物完全体のＧＦＰ−エクオリン−コエレンテラジン系の画像化により、ヒトの生態および疾患の生きた動物モデルにおける動的生物学的過程を調べることが可能となる。
【００６０】
本発明者らは、様々なＧＦＰ−エクオリンリポーターポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスを開発した。本発明のこの組換えポリペプチドをコードする核酸の発現は、適切な転写および／または翻訳要素により駆動され、これは、優先的には該核酸の上流に位置するが、下流に位置していてもよい。
【００６１】
これらのリポーターマウスは、他の遺伝子を基礎としていないまたは遺伝子を基礎としたリポーターより優れた数多くの利点を提供する。なぜなら、それは、生きたサンプルにおいて非侵襲的に複数の活性を報告でき、インビボで実現できるからである。好ましい実施形態は、ミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現するトランスジェニックマウスであり、これにより、ミトコンドリアＣａ２＋活性を、生物発光画像化によりモニタリングでき、ＧＦＰ蛍光を可視化して、リポーター発現の場所を決定し、特異的な形態学的特徴を研究できる。ミトコンドリア機能は、特に以下の病的過程における、細胞活性の有用なバイオセンサーである。
【００６２】
ＧＦＰ−エクオリンリポーターを発現するトランスジェニック動物は、診断を行なうために、または、新しい薬物をスクリーニングするために、または、前臨床試験における治療応答を評価するために使用できる。ＧＦＰ−エクオリンリポーターを発現するトランスジェニック動物はまた、トランスジェニック疾患動物モデルと交雑させて、病的過程を研究することもできる。例えば、全ての細胞または選択された細胞型においてミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現するトランスジェニックマウスを、トランスジェニックアルツハイマー病マウスモデルと交雑させ、病的過程を評価したり、新しい診断を行なったり、または、前臨床試験における治療応答を評価できる。ＧＦＰ−エクオリンリポーターを発現するトランスジェニック動物から得られた切り出した組織および／または解離細胞はまた、新しい薬物を発見するために、あるいは、既存薬物の活性を評価するために、あるいは、前臨床試験における治療応答を評価するために、あるいは、診断を行なうために、ハイスループットスクリーニングアッセイに適用できる。
【００６３】
トランスジェニック動物の作製において解決すべき問題は、挿入した導入遺伝子の発現であり、それは、コードタンパク質の産生において十分に効率的でなければならない。これは、カルシウム濃度に感受性の組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは対応するＤＮＡ構造物を形質転換する動物のゲノムの転写活性領域に挿入することにより、あるいは、再構成ＨＰＲＴ遺伝子座などの正しい遺伝子発現が確実になされる特に好ましい環境を再構成することにより行なってもよい。挿入は、当業者に既知のあらゆる技術に頼り、特に相同的組換えにより行なう。
【００６４】
直面する別の問題は、組織、器官、または細胞型における、この組換えタンパク質の特異的発現である。これは、条件的発現配列および対応するリコンビナーゼ（例えばエンドヌクレアーゼ）を含む、組換え系を使用することにより達成できる。具体的な条件的発現配列は、Ｌｏｘ部位であり、対応するエンドヌクレアーゼはＣｒｅであり、これは、細胞または組織特異的プロモーターの制御下で優先的に発現される。
【００６５】
インビボでの本発明に記載のＧＦＰ−エクオリンの画像化は、非侵襲的であることが示され、生きた動物において機能を司る生理的過程、薬物動態、生体分子的過程の病的側面および他の側面をモニタリングするために使用できる。Ｃａ２＋の検出を使用して、様々な病態、薬物効果、および生理的過程を研究する際の、多くの異なる細胞シグナル伝達経路を評価しモニタリングできる。Ｃａ２＋の検出は、癌、感染過程、神経病的疾患、筋肉疾患（例えば筋ジストロフィー）を含む多くの病的容態において、また心臓血管疾患の処置および診断のために、有用な診断である。ＧＦＰ−エクオリン技術はまた、全ての哺乳動物および他の動物、例えば虫（例えば線虫）、魚類（例えばゼブラフィッシュ）、カエル類（クセノプス属）およびハエ類（ショウジョウバエ属）に適用できる。
【００６６】
例えば、カルシウム画像化は、肝臓、心臓、または脳の活性をモニタリングするための代替的な手法を提供する。例えば、Ｃａ２＋シグナルは、ニューロンの電気活性に連関し、グリア細胞間、グリア細胞からニューロン、ニューロン間、またはニューロンからグリア細胞へのシグナル伝達（例えば、化学的およびギャップジャンクション結合）を介した活性の伝播に連関している。さらに、Ｃａ２＋は、多くの細胞内シグナル伝達経路に関与している。細胞ミクロドメインにおけるＣａ２＋の空間時間的プロファイルは、重要なシグナル伝達経路の活性化を調節する。したがって、リポーターをナノドメインまたはミクロドメインに遺伝子的に局在させることにより、動物完全体の画像化の場合のように、空間的な解像がほとんどなされない場合でさえも、細胞事象をリアルタイムで分子レベルでモニタリングできる。以後に記載したのは、研究および開発適用におけるインビボ、生体外、およびインビトロでの画像化のための、多機能リポーターマウスである。
【００６７】
材料および方法
標的化ベクターの作製（図１および２）
ＧＡは、２つのタンパク質間に５回反復の柔軟性リンカーを含む、Ｇ５Ａと称される、標的化されていないＧＦＰ−エクオリンを示す。ＧＦＰ−エクオリン（ＧＡ）およびシナプトタグミン−Ｇ５Ａ（ＳｙｎＧＡ）の作製は、以前に記載されている（ＷＯ０１／９２３００）。ＧＦＰ−エクオリンキメラをシナプス後ドメインに標的化するために、本発明者らは、ＰＳＤ９５のＮ末端領域とＧＡの融合物を創造した。この構造物では、ＰＳＤ９５遺伝子（図１２）の全長を、ｐＧＡ（Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．Ｉ−２５０７、２０００年６月２２日に寄託）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩにクローニングし、プラスミドＰＳＤＧＡを得た。その後、以下の配列５’Ａ  ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＡＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＣＣＧ  Ｃ’３（図１１）からなる柔軟性リンカーを、ＰＳＤ９５とＧＦＰの開始部位の間に加えた。
【００６８】
リポーター遺伝子を、チトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩの切り出し可能な標的化配列を含むベクター（pShooter、インビトロジェン製）のＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングすることにより、プラスミドｍｔＧＡを得、ＧＦＰ−エクオリンキメラ（ＧＡ）をミトコンドリアマトリックスに標的化させた（図１２）。また、リーダー配列のＶＤＪおよびＣＨ１ドメインからなる免疫グロブリン（ＩｇＧ）重鎖遺伝子のＮ末端領域に枠内でクローニングすることによりＧＡをＥＲ腔に標的化させた。ＩｇＧ重鎖遺伝子のＮ末端領域のコード配列を、ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて、プラスミドｅｒＡＥＱｍｕｔ（ご懇意によりJ Alvarez博士（Universidad de Valladolid、スペイン）により提供された）から取り出した。該遺伝子挿入断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１ベクター（クロンテック製）中のＧ５Ａ遺伝子のＮ末端に枠内で連結させ、プラスミドｅｒＧＡを得た。
【００６９】
光タンパク質のＣａ２＋結合親和性を低下させる変異（Ａｓｐ４０７→Ａｌａ）（Kendallら、1992）が、ＰＣＲにより、各々の標的化ＧＡ構造物において作製され、プラスミドであるｍｔＧＡｍｕｔ、ｅｒＧＡｍｕｔ、ＳｙｎＧＡｍｕｔ、およびＰＳＤＧＡｍｕｔを得た。全ての構造物は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）の制御下にある。全ての配列は、ＤＮＡシークエンスにより確認されている。
【００７０】
単一細胞生物発光研究（図５〜９）
培養液を、ガラス底の皿に入れ、ブラックボックスに据え付けた完全自動化倒立顕微鏡のステージアダプターに固定した。ＧＦＰ−エクオリンを、２．５〜５μＭのコエレンテラジンを用いて３７℃で３０分間かけて再構成した。ＳｙｎＧＡでトランスフェクトさせておいた細胞とコエレンテラジンを共に室温でインキュベートし、再構成過程中の光タンパク質の消費を減少させた。細胞を、タイロード緩衝液で灌流した。ＮＭＤＡの溶液を適用前に、細胞を、Ｍｇ２＋の非存在下で１分間灌流した。記録は全て室温（２２〜２５℃）で行なった。顆粒状の外見を持たない位相の明るい１０〜１５μｍの細胞体直径有する細胞を測定用に選択した。ＳｙｎＧＡでトランスフェクトさせ野生型コエレンテラジンで再構成した細胞は、規則的に、静止状態で低レベルの生物発光活性を示した。活性は、均一のようであり、細胞体領域ではより明確のようであった。このことは、このように標的化したＧＡが、高濃度のＣａ２＋を付与されたドメイン内にあることを示唆する。２つの場合において、ＰＳＤＧＡでトランスフェクトさせた細胞が、自発的活性を示し、これは樹状突起領域に局在していた。
【００７１】
器官型切片培養物におけるＣａ２＋動態の画像化（図１０および１９）
器官型海馬切片を、４〜５日令の子マウスから調製した。簡潔には、脳を、氷冷ハンク緩衝液中で迅速に取り出し、組織チョッパーで２００μｍの切片にスライスした。海馬切片を、立体顕微鏡を使用して同定し、無菌トランスウェルコラーゲン被膜チャンバー（直径１２ｍｍ、孔径３．０μｍ）に移した。切片を、３７℃で、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中、Ｂ２７で補充した神経基礎培地中で維持した。切片を、９日目にアデノウイルス−ＧＦＰ−エクオリンベクターで感染させ、さらに４または５日間培養中で維持し、その後、画像化した。この段階で、切片は健康のようであり、個々の細胞は、ＧＦＰ蛍光により明らかに識別できた。コエレンテラジンと共にインキュベートした後、切片を、室温で、９時間まで倒立顕微鏡上に維持でき、その９時間目の時点で、生物発光活性の大きな増加および細胞蛍光の消失により示される細胞死が明らかとなった。Ｃａ２＋リポーターの検出に光励起が必要とされないので、光線力学傷害を引き起こすことなく長期画像化を実施することができる。長時間におよぶ画像化は連続的である。積分期間を選択する必要はない。バックグラウンドは、２５６×２５６画素領域（６６５．６×６６５．６μｍ）において極めて低く、１光子／秒未満である。いくつかの実験では、トランスジェニックマウスの体性感覚皮質の４００〜４５０μｍ冠状切片を、振動器を使用して切り出し、画像化の前に４〜５日間培養中に入れた。切片を、９５％Ｏ２および５％ＣＯ２で泡立てたＡＣＳＦで灌流した。１時間インキュベートした後、切片をＭｇ２＋を含まないＡＣＳＦで灌流した。室温（２５〜２８℃）で記録した。薬物を灌流液を通して加えた。
【００７２】
トランスジェニック動物の作製（図１５〜２３）
本発明者らは、遺伝子工学した新しいリポーター分子を有し、これによれば、ＧＡは、トランスジェニックマウスの細胞下ドメインに標的化されている。ＧＡ導入遺伝子は、任意の細胞型および／または任意の発達段階で発現させることができる。発現は、強力なプロモーターであるβ−アクチン（ＣＡＧ）の直後にあるＬｏｘ−ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ配列を使用して条件的とした。発現細胞の選択は、特異的プロモーターにより駆動される、適切なエンドヌクレアーゼＣｒｅを使用して行なう。転写が開始される時点は、遺伝子Ｃｒｅ−ＥＲＴ２を使用する場合にはタモキシフェンを注入することにより開始される。最後に、任意の細胞で発現できるように、転写単位を、ＥＳ細胞の再構成ＨＰＲＴ遺伝子座（Ｘ染色体）に相同的組換えにより導入し、発現レベルに対する組込み部位の影響を最小限にした。ここに示した実験において、非常に初期の胚においてＧＡ導入遺伝子を活性化するＰＧＫ  Ｃｒｅトランスジェニックマウスを使用した。
【００７３】
細胞特異的プロモーターの調節下にあるＣＲＥを含む組換えウイルスも使用できる。マウスは、遺伝子改変したＥＳ細胞を胚盤胞に注入することにより作製した。
【００７４】
ｍｔＧＡを用いた免疫局在化研究（図１８）
ミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンリポーターを発現している皮質ニューロンまたは脳切片を、ＰＢＳ中４％ホルムアルデヒド中で室温で２０分間固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞膜を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００およびＢＳＡを含むＰＢＳで透過性とした。その後、細胞を、一次抗体と共に室温で１〜２時間インキュベートした。標的化を、抗チトクロムｃ（１：５００； BD Biosciences Pharmingen、米国CA州）およびMito Tracker（登録商標）Red CMXRos（２００ｎＭ；Molecular Probes社）と比較した。抗体の結合は、Alexa Fluor（登録商標）５４６（Molecular Probes社）にコンジュゲートさせた二次抗体中で１時間インキュベートした後に測定した。洗浄後、細胞を、フルオロマウント（Fluoromount）のスライドにのせ、共焦点解析により可視化した。画像を、ＬＰ５６０およびＢＰ５０５−５５０フィルターを使用して油浸対物レンズ（６３倍／１．４ＮＡ）を通して、Axiovert 200Mレーザー走査共焦点顕微鏡（Zeiss LSM-510；バージョン３．２）で獲得した。ピンホール開口部を９８Ｔｍで設定し、画像を、８ビット解像度で５１２×５１２アレイにデジタル化した。
【００７５】
蛍光／生物発光を複合した画像化（図５〜７、８〜１０、１３、１４、および１９）
蛍光／生物発光広視野顕微鏡システムは、ScienecWares社に特別注文して製造された。該システムは、完全自動化倒立顕微鏡（２００Ｍ、Zeiss、ドイツ）を含み、光を通さない暗いボックスに入れられている。メカニカルシャッターが、ボックスの外に据え付けられ、ファイバーオプティックケーブルを介して顕微鏡に接続されている、ハロゲンおよびＨＢＯアークランプの両方からの照射を制御する。低レベル光放射（光子速度＜１００ｋＨｚ）を、顕微鏡のベースポートに接続されたImage Photon Detector（IPD3、Photek社）を使用して収集し、これは各々の検出された光子のＸ、Ｙ座標および時点を割り当てる（Millerら、1994）。該システムは、データ取得ソフトウェアにより完全に制御されており、これはまた単一の光子事象を画像に変換し、これを、Ｃポートへと接続されたＣＣＤカメラにより作成された明視野または蛍光画像と重ね合わせることができる（Coolsnap HQ、Roper Scientific）。それ故、可視化されるあらゆるＣａ２＋活性を、対象の領域を選択し、光子データを出力することにより、より詳細に解析できる。実験が完了した後、記録したムービーファイルを再生し、データをユーザーの必要性に応じて抽出できる。ＩＰＤは、ミリ秒未満の時間解像度を提供でき、取得のために積分時間が明確である必要はない。本発明者らが使用する該システムは、２５６×２５６画素領域において、＜１光子／秒という、非常に低いバックグラウンド光子計数レベルを有する。
【００７６】
生きた細胞の細胞内Ｃａ２＋値への生物発光測定の較正は、インビトロでの較正により実施できる。細胞内［Ｃａ２＋］測定は、光タンパク質消費速度分率を決定することにより行なった。インビトロでの較正のために、Neuro2A細胞を、異なる構造物で一過性にトランスフェクトした。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、セルスクレーパーを使用して収集した。細胞懸濁液を、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ＰＢＳ中１０ｍＭのメルカプトメタノール、５ｍＭのＥＧＴＡ、および野生型（ｗｔ）ｎもしくはｈコエレンテラジン５μＭを含むエクオリン再構成緩衝液中で４℃で２時間インキュベートした。２時間後、細胞を洗浄し、ｄＨ２Ｏ中に２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭのＥＧＴＡ、および５ｍＭのメルカプトエタノール並びにＥＤＴＡを含まないプロテアーゼ阻害剤（ロシュ・ジアグノスティック）を含む低浸透圧緩衝液中に再懸濁した。細胞膜をさらに３回の凍結解凍サイクルにより溶解し、その後、懸濁液を２６ＧＡ針に通過させた。リポータータンパク質を含む１０μｌのアリコートの細胞溶解液を、既知濃度のＣａＣｌ２（モレキュラー・プローブズ社）を有するＥＧＴＡ緩衝溶液を含む白の不透明の９６ウェルプレートのウェルに分配した。遊離Ｃａ２＋を、ＷＥＢＭＡＸＣプログラム（www.stanford.edu/~cpatton/webmaxc.html）（Bersら、1994）を使用して計算した。発光は、９６ウェルプレート解読器（Mithras、Berthold Tech.、ドイツ）を使用して直接測定した。光を、細胞溶解液注入後に１００ミリ秒の積分で１０秒間記録した。１０秒後、１００μＬの１ＭのＣａＣｌ２溶液を同じウェルに注入し、光が基礎レベルに戻り全ての光タンパク質が消費されるまで（Ｌｍａｘ）記録し続けた。光放射は、光タンパク質消費速度分率として表現され、これは、その時点（画定された［Ｃａ２＋］）の光放射（Ｌ、ｓ−１）と、光タンパク質が完全に消費されるまでの時点（Ｌｍａｘ）（飽和Ｃａ２＋）の全光放射の積分の間の比である。実験は２５〜２８℃で行なった。
【００７７】
電気刺激およびウイルストランスフェクション
いくつかの実験において、電気パルスを、ホウケイ酸塩ガラス（World Precision Instruments、米国フロリダ州）から引き伸ばした、古典的なパッチピペット（５〜１０ＭΩ）を介して、試験下の細胞に送達した。実験室内で作成された電気作動するリレーシステムにより、隔絶された刺激器（ＤＳ２Ａ、Digitimer社、英国）により送達される刺激間のピペット抵抗性の測定が可能となった（図１４参照）。Ｃａ２＋波の伝播速度は、刺激後に放射される光の最大値の半分に対応する時点をとり、解析した２つの領域の中心間で測定された距離で割ることにより計算した。
【００７８】
動物完全体の生物発光による検出
天然のコエレンテラジン（体重１ｇあたり４μｇ；Interchim、フランス）を、腹腔内注入によりＰ１〜Ｐ４マウスに導入した。マウスの画像化は、基質（コエレンテラジン）注入の１〜１．５時間後に開始した。リアルタイムの画像化を可能とし、生きた生物内の細胞活性をモニタリングおよび記録することのできるＩＶＩＳ（登録商標）画像化システム１００シリーズを、これらの研究で使用し、動物完全体レベルでの局所Ｃａ２＋変化を検出した。該システムは、光を通さない低バックグラウンド画像化チャンバー内の、冷却された背面の薄い背面照射のＣＣＤカメラを特徴とする。マウスのグレースケール表面画像を、最初に、１０ｃｍの撮像視野、０．２秒間の露光時間、２というビニング解像度係数、１６ｆ／ｓｔｏｐ（開口部）およびオープンフィルターを使用して獲得した。生物発光画像は、グレースケール画像の直後に獲得した。生物発光画像の獲得時間は、１〜５秒間、ビニング８および１６、撮像視野１０ｃｍ；ｆ／ｓｔｏｐ１の範囲であった。インビボでの生物発光から伝達される光の相対強度は、紫（最も強度が低い）から赤（最も強力）の範囲の偽色画像として表示した。対応するグレースケール写真およびカラーのルシフェラーゼ画像を、LivingImage（Xenogen）およびIgor（Wavemetrics、Lake Oswego、オレゴン州）画像解析ソフトウェアを用いて重ね合わせた。
【００７９】
結果
結果１：ＧＡを細胞下ドメインに標的化
特定の細胞下区画において発現させるために、様々なＧＡリポーターを、対象のシグナルペプチドまたはタンパク質と融合させることにより作成した（図１および２）。ＧＡは、シナプス伝達に重要なドメイン：ミトコンドリアマトリックス、小胞体、シナプス小胞、およびシナプス後肥厚部に標的化された。共焦点解析により、ミトコンドリアマトリックスに標的化させるためにチトクロムｃのシグナルペプチドに融合させた後（ｍｔＧＡ）、ＥＲ腔に標的化させるためにＩｇＧ重鎖に融合させた後（ｅｒＧＡ）、シナプス小胞膜のサイトゾル側に標的化させるためにシナプトタグミンＩタンパク質に融合させた後（ＳｙｎＧＡ）、またはシナプス後肥厚部に標的化させるためにＰＳＤ−９５に融合させた後に（ＰＳＤＧＡ）、期待されるＧＡリポーター発現パターンが示された（図４）（Christophersonら、2003；Conroyら、2003）。
【００８０】
結果２：ＧＡは、単一細胞の解像によりＣａ２＋濃度を報告する
本発明者らは、ニューロンに均一に分布している標的化されていないＧＡを用いてこれらの研究を開始した（図５）。ＧＡをｈコエレンテラジン（高親和性型のルシフェリン）を用いて再構成した後、ＮＭＤＡ（１００μＭ）およびＫＣｌ（９０ｍＭ）で刺激すると、皮質ニューロンにおいて強力なシグナルが発生した（図５ＢおよびＣ）。これは、小さな哺乳動物ニューロンにおけるＣａ２＋応答が、単一および細胞下レベルにおいて、生物発光リポーターを用いて直接可視化された始めての例であった。実験の最後にジギトニンおよび高濃度のＣａ２＋を適用することにより、依然として十分な量の光タンパク質が残存していることが示された（図５Ｄ）。実験の最後に高濃度Ｃａ２＋およびジギトニンも加えて、データを標準化するために全体の利用可能なＧＦＰ−エクオリン（Ｌｍａｘ）を測定した（方法の章のＬｍａｘの定義を参照）。
【００８１】
結果３：カルシウムシグナル伝達に関連するシナプスタンパク質に標的化されたＧＦＰ−エクオリンの光学的検出
【００８２】
高濃度Ｃａ２＋のミクロドメインを、皮質ニューロンを刺激した後に、標的化ＧＦＰ−エクオリンを用いて検出した。
実施例１：ＧＡを、ミトコンドリアマトリックスなどの区画に標的化させると、Ｃａ２＋応答の反応速度特性の差異を細胞下で検出できた（図６）。ＮＭＤＡの適用が、異なる時間プロファイルを有する、画定された細胞位置におけるＣａ２＋応答を引き起こした代表例を示した。図６ＡおよびＢは、慣用の蛍光と比べて低レベルの光放射および中程度の空間的解像度にも関わらず、特定の領域におけるＣａ２＋応答を解析できたことを示す。リポーターを細胞下に標的化した場合、バックグラウンドと比べて１０００倍以下の大きさのシグナルを依然として検出できた（１５×１５画素領域、１画素＝０．６５μｍ）。グラフで示される局所領域から導いたグラフデータは、ミトコンドリアＣａ２＋変化の空間時間的特性の多様性を実証する。
【００８３】
実施例２：カルシウムセンサーのシナプス小胞膜貫通タンパク質のシナプトタグミンＩに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを使用した、ニューロンにおけるＣａ２＋により誘起される生物発光の光学的検出。図１、２  ４Ｄおよび７を参照。シナプトタグミンＩは、急速なエキソサイトーシス事象の調節に関与していると考えられている低親和性Ｃａ２＋センサーである（Davisら、1999）。以前の研究により、シナプトタグミンＩは、シナプス小胞膜融合を引き起こすＣａ２＋濃度（２１〜７４μＭ）に応答するように「調律」されていることが示された（閾値＞２０μＭ、１９４μＭにおいて最大値の半分の速度）。本発明者らは、ＳｙｎＧＡｍｕｔとして知られる、シナプトタグミンＩへの融合によりシナプス小胞に標的化される低親和性型のＧＦＰ−エクオリンを作成した。高濃度カルシウムドメインのみしか検出しない低親和性型のＣａ２＋リポーターを使用することにより、特異的に神経エキソサイトーシスを光学的にプローブすることが可能であるはずである。例えば、ＳｙｎＧＡｍｕｔは、神経伝達物質放出のためにドッキングする、電位開口型Ｃａ２＋チャネルの近くに位置する小胞の特異的検出を可能とした（図４）。これらの小胞は、チャネル口に十分近くに位置し、それ故、高濃度Ｃａ２＋ドメイン内に位置し、これはシナプス伝達を容易にする小胞エキソサイトーシスを駆動するに必要であると考えられている。リポーターはＣａ２＋に対する親和性が低いため、放出のためにドッキングされない小胞は、十分に遠く検出されないであろう。
【００８４】
実施例３：Ｃａ２＋誘起生物発光はまた、ＮＭＤＡ適用後にＰＳＤＧＡおよびｍｔＧＡを発現している皮質ニューロンにおける細胞下解像により可視化できる（図７および８）。ＧＡとは対照的に、ＰＳＤＧＡでトランスフェクトしたニューロンへのＮＭＤＡの適用により、より速い反応速度およびより大きな振幅を有するＣａ２＋トランジェントが生じた（３回の実験の代表例については図８参照）。樹状突起（図８Ｄ１およびＤ２）と細胞体ではＣａ２＋動態の明確な差異が観察された（図８、細胞体）。特に、解析した樹状突起領域は、Ｃａ２＋応答のより急速な上昇速度および急速な崩壊を示した。急速な崩壊速度は、光タンパク質が完全に消費され、Ｃａ２＋応答の時間的動態および増幅は人為的なものであることを示唆した。さらに、もはや利用可能な光タンパク質は残っておらず、このことは、ＰＳＤＧＡが標的化したドメインにおけるＣａ２＋濃度は、非常に高かったであろうことを示唆していた（Ｃａ２＋結合曲線については図３を参照）。
【００８５】
実施例４：皮質ニューロンをＰＳＤＧＡで一過性にトランスフェクトすると、ＧＡが樹状突起構造に局所発現された（図８および９）。ＰＳＤ−９５に融合させた場合にＧＡを局所標的化することにより、基礎状態で留まっていた皮質ニューロンにおいて特殊な種類の活性を観察できた。本発明者らは光放射速度が一定であるＳｙｎＧＡとは対照的に、いくつかの実験において空間的に局在していた非常に低いバックグラウンドよりも高い無作為で同調的ではないＣａ２＋トランジェントを観察した。少なくとも２回の実験において（代表例を図９に示す）、カルシウムトランジェントは比較的頻繁に起こり、樹状突起領域に限局していた（図９Ａ、ＣおよびＢ参照）。
【００８６】
実施例５：ＰＳＤＧＡでトランスフェクトした皮質ニューロンでの細胞内でのＣａ２＋の伝播（図１３）
【００８７】
結果４：神経連結度をマッピングするためのニューロン個体群におけるカルシウム動態の「リアルタイム」可視化のための遺伝子的に標的化したＧＦＰ−エクオリンの使用
【００８８】
本発明者らは、培養ニューロンにおける細胞間伝達を追跡するためのこれらのリポーターの使用を検証した。本発明者らはまた、ＧＡリポーターを発現する海馬ニューロンを電気的に刺激し、単純な神経ネットワーク内のＣａ２＋活性の伝播および細胞伝達を可視化した。これらの実験において、本発明者らは、解離海馬ニューロンをトランスフェクトするために、ＧＡをコードする複製欠陥アデノウイルスベクター（Ａｄ５−ＧＡ）を使用した。図１４Ｆ１は、ＧＡリポーターを発現している少なくとも２個の細胞を示す。短い電気パルスをＩで標識される細胞の体領域に適用すると（図１４ＢＦ）、Ｃａ２＋波が、隣のＩＩＩで標識される細胞へと伝播した。３箇所の領域におけるＣａ２＋応答の解析により、Ｃａ２＋の伝播は、各領域間で変動することが示唆された。ＩからＩＩの領域では、波は、６０μｍ／秒の速度で伝わると計算された。これに対し、ＩＩからＩＩＩの領域では、１０μｍ／秒の速度で伝わると計算された。合計で６回の連続的な刺激（１回の単一のパルスは約２秒間毎）を適用し（そのうち最初の５回をグラフ表示した）、その後、自発的に起こる振動が出現した（図１４Ａ〜Ｆ）。各Ｃａ２＋の「スパイク」は、急速な上昇速度を示し、その後、ゆっくりとした下降を示した。これらのＣａ２＋トランジェントを約４５分間記録した後も、有意な光タンパク質活性が依然として残っていた（機械的な細胞膜の破壊により決定）。
【００８９】
ＧＡをコードする複製欠陥アデノウイルスベクター（Ａｄ５−ＧＡ）で感染させた器官型切片において記録された自発的活性（図１０）。ＧＡが組織切片、例えば皮質の器官型切片において発現されている場合には、長期記録（８時間まで）を行なうことができた。一般に、本発明者らは、光タンパク質消費およびＣａ２＋の変動を検出するための感度レベルは、発現されるリポーターの量、リポーターの位置、および使用するコエレンテラジン類似体の種類に関連していることを見出した（Shimomura、1997；Shimomuraら、1993）。これは、適用により、細胞により異なる場合があり、蛍光プローブと同様に各場合において最適化する必要がある。
【００９０】
結果５：動物完全体の研究におけるカルシウム動態の研究のための、ＧＦＰ−エクオリンを、特定の細胞型、細胞下区画または細胞ミクロドメインに発現しているトランスジェニック動物の作成
【００９１】
標的化ＧＦＰ−エクオリンリポーターを発現しているトランスジェニック動物を作成した。ＧＡ導入遺伝子は、任意の細胞型および／または任意の発達段階で発現させることができる。発現は、強力なプロモーターであるβ−アクチン（ＣＡＧ）の直後のＬｏｘ−ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ配列を使用することにより条件的とした。発現細胞の選択は、特異的プロモーターにより駆動される、適切なエンドヌクレアーゼＣｒｅを使用することにより行なった。任意の細胞で発現できるように、転写単位が、相同的組換えによりＥＳ細胞の再構成ＨＰＲＴ遺伝子座に導入され、発現レベルに対する組込み部位の影響を最小限にした。細胞特異的プロモーターの調節下にあるＣＲＥを含む組換えウイルスも使用できる。ミトコンドリアマトリックスに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを用いて作成したトランスジェニック動物についてのここに示した例では、これらのマウスをＰＧＫ−ＣＲＥマウスと交雑させることにより、全ての細胞においてそして発達開始時期から導入遺伝子発現の活性化を誘発した。全胚および新生児マウスの蛍光画像化により、ｍｔＧＡ導入遺伝子が、全ての細胞型において発現されていることが判明した（図１５、１７、１８および１９）。リポータータンパク質もまた、ミトコンドリアマトリックスに良好に標的化されていた（図１６Ｃ２および１８）。ＧＦＰ−エクオリンのいくつかの利点は、哺乳動物細胞によって通常発現される内因性タンパク質ではなく、結合親和性が低いことからＣａ２＋シグナル伝達にはほとんど影響を及ぼさないことである。したがって、本発明者らにより、ＧＦＰ−エクオリンリポーターで得られたトランスジェニック系における異常な表現型の知見は認められなかった。
【００９２】
共焦点解析により、ミトコンドリアマトリックスに標的化させるためのチトクロムｃのシグナルペプチドに融合させた後（ｍｔＧＡ）、期待されるＧＡリポーターの発現パターンが示された（図１６Ｃ２）。主要な器官のＧＦＰ蛍光画像により、主要な器官における強力なリポーター発現レベルが示された（図１７）。より高い発現レベルが心臓および肝臓で見られた。脳では、それぞれＧＦＡＰおよびＮｅｕＮに対する抗体と比較した後、導入遺伝子の発現が、グリア細胞およびニューロンの両方において明らかであった（図１９）。これらの結果により、トランスジェニックｍｔＧＡリポーターマウスをＰＧＫ−ＣＲＥマウスと交雑させた場合、ｍｔＧＡ導入遺伝子は上手く標的化されており、脳の全ての細胞において発現されていることが示された。
【００９３】
発光活性の解析により、ＧＦＰ−エクオリンタンパク質は、Ｃａ２＋の検出に関して機能していることが示された。本発明者らは、本発明者らのトランスジェニックマウスを使用して、新皮質の器官型切片におけるミトコンドリアＣａ２＋振動を検出できることを示す予備データを得た（図２０）。Ｃａ２＋トランジェントは、同調的に１５〜４５秒間に１回の割合で広い領域にかけて起こった。Ｃａ２＋活性の検出のために生物発光を使用しているので、切片画像化は、リアルタイムで８時間までの時間におよび行なうことができた。本発明者らの結果により、ＧＦＰ−エクオリンリポーターは、トランスジェニック動物の脳切片におけるＣａ２＋トランジェントを検出するための、優れた信号雑音比を提供することが示された。
【００９４】
ミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現しているトランスジェニックマウスにおいても生物発光が検出された。ＧＦＰ−エクオリンリポーターを発現しているトランスジェニックマウス内のＣａ２＋誘起生物発光を画像化するために、コエレンテラジンを注入する必要があった（例えば腹腔内または尾静脈により）。本発明者らは、新生児にコエレンテラジンを腹腔内注入し、その後、種々の時間解像度でそれらを画像化した後、局所Ｃａ２＋動態を、生きたマウスにおいて検出できるかどうかを試験した。５秒間かけて撮影した枠からなる一連の連続画像を画像化することにより、トランスジェニックマウスを非トランスジェニックマウスと直接比較した。マウスのグレースケール写真を最初に収集し、マウスの動きを追跡し、これらの画像を、生物発光画像を重ねたものと相関させた。本発明者らは、連続物ファイルが、マウスの動きに相関した動的な生物発光放射を示すことを見出した（図２０および２１）。検出された生物発光は、短い瞬間の反応速度を有し（１つの枠に出現していた）、マウスの動きに対応している、光を特徴としていた。２〜４秒間の枠という、より長時間の解像度では（図２２）、Ｃａ２＋シグナルは、自由に動いているマウスのミトコンドリアマトリックス内にも検出できた。本発明者らはまた、１秒間の撮影時間を使用して、良好な信号雑音比をもつシグナルを検出できた（図２３）。短い瞬間の生物発光が、後足、前足、脊髄、脳幹、および他の身体の背領域などの領域に検出された。全ての場合において、これらのＣａ２＋シグナルは、各発光画像の前に撮影したグレースケール写真に見られる、骨格筋の収縮−弛緩が起こっている身体の領域と同調していた。２光子顕微鏡によるインビボでの蛍光Ｃａ２＋リポーター解析を使用して、骨格筋ミトコンドリアが、筋肉の収縮−弛緩中にＣａ２＋を取り込み放出することがごく最近になって示されたばかりであった。しかし、この手法はより侵襲性であった。なぜなら、それは、ＤＮＡを筋肉線維に送達する手段として励起光および電気穿孔技術を使用するからであり、２光子顕微鏡を使用したインビボでの画像化のために、遠くの腱を脱着し、対象の筋肉線維を外科的に露出させることが必要であるからであった。さらに、手術中にマウスを麻酔下に維持することが必要であり、揮発性麻酔薬は、ミトコンドリア呼吸鎖内の複合タンパク質に直接影響を及ぼす可能性があることを示唆している証拠がいくつかある。それにも関わらず、これらの研究により、非常に高度な空間的解像度でもって、筋肉線維の収縮−弛緩中のミトコンドリアＣａ２＋取り込みおよび放出の画像が得られた。
【００９５】
可能性ある適用１：遺伝子的に標的化されたＧＦＰ−エクオリンを使用した、ニューロンにおける形態学的または発達的変化に関連したカルシウム変動の検出
【００９６】
Ｃａ２＋は、ニューロンにおける成長円錐運動性の中心的修飾物質であると考えられている。光解離性ケージド（photolabile caged）Ｃａ２＋を使用して、研究により、Ｃａ２＋の一過性上昇は、成長円錐運動性を正にモデュレートすることが示された。ＧＡＰ４３は、発達中の軸策ガイダンスおよび神経損傷後の再生に関与する重要なタンパク質であると考えられている。軸策／成長円錐タンパク質であるＧＡＰ４３は、膜でカルモジュリンと会合し、成長円錐運動性と関連していると考えられている一過性Ｃａ２＋増加により活性化されると考えられている。したがって、シナプス後肥厚部タンパク質のＧＡＰ４３に標的化されたＧＦＰ−エクオリンは、神経突起成長に関連した局所カルシウムシグナル伝達および対応する形態学的変化を、発達中および神経再生中にモニタリングすることを可能とした。
【００９７】
可能性ある適用２：標的化ＧＦＰ−エクオリンを使用して、受容体機能、Ｃａ２＋に透過性のもの、またはカルシウム濃度の局所的増加に関連したもののモニタリング
【００９８】
実施例１：ＮＭＤＡ受容体活性化後の局所Ｃａ２＋増加、および、アルツハイマー病などの神経疾患におけるカルシウムシグナル伝達に関連した異常を特にモニタリングするための、ＰＳＤ９５に融合させたＧＦＰ−エクオリンの使用
【００９９】
実施例２：神経疾患を処置できる薬理学的物質候補の検出のための、薬理学的物質または化学的化合物またはコンビナトリアル化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニング（すなわちマルチウェル形式、９６、３８６、または１５４４ウェルプレート）のための、細胞個体群研究における高濃度カルシウムミクロドメインの選択的検出のための、標的化され低親和性のＧＦＰ−エクオリンの使用。この技術は、カルシウムを感知する蛍光ダイを使用したものよりもかなりより強力である。
【０１００】
可能性ある適用３：前臨床試験研究：
Ｃａ２＋活性の動的画像は、インビボでの生きた被験者の動物完全体の生物発光による画像化により獲得できる（図１５〜１８）。生じた光は、哺乳動物の組織を貫通し、外的に検出でき、感度の高い光画像化システムを使用して定量できる。生きた動物内から発生するＧＦＰ−エクオリンシグナルにより、高い信号雑音比のＣａ２＋流入画像が得られ、これは、高度な時間的解像度をもって追跡できた。この技術は、生きた被験者において非侵襲的な機能的アッセイを実施するための強力なツールを示し、前臨床試験研究のためのより予測的な動物データを提供するはずである。
【０１０１】
考察
したがって、本発明は、光タンパク質に共有結合的に連結した蛍光分子を含む、改変された生物発光システムを提供し、ここで、２つのタンパク質間の連結は、改変された生物発光システムを安定化させる機能を有し、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）によりエネルギーが移動することを可能とする。好ましい実施形態において、生物発光システムは、エクオリンタンパク質に共有結合的に連結したＧＦＰタンパク質を含み、ここで、２つのタンパク質間の連結は、改変された生物発光システムを安定化させる機能を有し、化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）によりエネルギーが移動することを可能とする。
【０１０２】
本発明は、組換えポリペプチドを含む組成物を提供し、該組成物は、カルシウムイオンと結合し、エネルギーを測定可能なものとする機能的特徴を有し、該エネルギーは、あらゆる光励起の非存在下で、該組成物中の結合したカルシウムの量およびポリペプチドの量に依存する。
【０１０３】
本発明は、翻訳後に最適な条件下でドナー部位をアクセプター部位に近づける機能を有するペプチドリンカーを取り込み、これにより、本発明に記載のポリペプチドにおいて化学発光によりエネルギーの直接的な移動が可能となった。好ましいリンカーは、２００１年１２月６日に発行されたＰＣＴ出願第ＷＯ０１／９２３００号、米国出願番号第０９／８６３，９０１号および第１０／３０７，３８９号に記載されており、その全開示を信頼し、引用例として本明細書に取り込む。
【０１０４】
したがって、本発明は、式：
ＧＦＰ−リンカー−ＡＥＱ
の組換えポリペプチドを利用する。
【０１０５】
ここでＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質であり；ＡＥＱはエクオリンであり；リンカーは、４〜６３アミノ酸、好ましくは１４〜５０アミノ酸のポリペプチドである。
【０１０６】
リンカーは、以下のアミノ酸：
（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ）ｎ（ここでｎは１〜５である）
を含むことができる。好ましくは、ｎは１であるか、またはｎは５である。リンカーはまた、アミノ酸配列Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒを含むことができる。
【０１０７】
Ｃａ＋＋の存在下でのエクオリンの活性化後の化学発光共鳴エネルギー移動（ＣＲＥＴ）によるエクオリンから緑色蛍光タンパク質へのエネルギー移動のための別の組換えポリペプチドは、式：
ＧＦＰ−リンカー−ＡＥＱ
を有する。
【０１０８】
ここで、ＧＦＰは、緑色蛍光タンパク質であり；ＡＥＱはエクオリンであり；リンカーは、以下のアミノ酸
（Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ）ｎ（ここでｎは１〜５である）
を含み；ここで、融合タンパク質は、Ｃａ２＋イオンに対する親和性および少なくとも２４時間の半減期を有する。リンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｓｅｒを含むことができる。さらに、該組換えポリペプチドはさらに、組換えポリペプチドを細胞または細胞下区画に標的化させるためのペプチドシグナル配列を含むことができる。
【０１０９】
本発明はまた、上記した組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
【０１１０】
本発明のポリヌクレオチドを含むプラスミドは、以下のように、Collection Nationale de Cultures de Microorganismes（「Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．」）、パスツール研究所、２８、rue du Docteur Roux、75724 Paris Cedex 15、フランスに寄託されている。
【０１１１】
【表１】
2007531514.tif 000003
【０１１２】
ＰＳＤＧＡプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞は、慣用の細胞培養条件でＬＢ培地中で３７℃で培養できる。
【０１１３】
Ｃａ２＋トランジェントは、発達、神経可塑性、神経伝達、興奮毒性、および他の重要な過程に必要である、多種多様なシグナル伝達経路に関与している。細胞および細胞下レベルでコードされているＣａ２＋依存的活性は、複雑であり、空間的、時間的および定量的因子が関与する。ここで本発明者らは、遺伝子的にコードされている組換えポリペプチドであるＧＦＰ−エクオリンの生物発光を可視化することにより、局所Ｃａ２＋シグナル伝達を定量する手法を実証した。シナプス伝達に重要なシグナルペプチドまたはタンパク質に融合させることにより、単一細胞またはより複雑な系における局所Ｃａ２＋シグナル伝達を直接可視化するために使用できる１セットのＣａ２＋感受性組換えポリペプチドを作成した。生物発光の検出により、良好な信号雑音比で、異なる空間的時間的特性を有する局所Ｃａ２＋シグナルを測定することが可能であった。
【０１１４】
組換えＧＦＰ−エクオリンポリペプチドの毒性および分解
【０１１５】
本発明は、この二機能性組換えポリペプチドが、解離細胞培養物、急性もしくは器官型切片およびトランスジェニック動物の、神経ネットワーク、特定の細胞下区画および細胞ミクロドメインにおけるカルシウム活性の調査を可能とすることを示した。
【０１１６】
異なる生物系における本発明のこの組換えポリペプチドの発現により、インビトロまたはインビボで、単一細胞、組織、またはさらにはトランスジェニック動物完全体もしくは植物段階においても毒性が全くないことが示された。この結果はまた、該組換えポリペプチドを強力に発現した場合にも達成された。それ故、組換えポリペプチドを、トランスジェニックマウスの発達初期段階から成体まで発現させた場合でも、毒性は全く報告されなかった。さらに、組換えポリペプチドは内因性タンパク質でもなければ内因性成分も含んでいないという事実にも関わらず、該発現は、正常な生理的機能を撹乱しなかった。挙動欠陥も報告されなかった。ＧＦＰ−エクオリンのＣａ２＋結合親和性が低いため（図２Ｃ参照）、Ｃａ２＋シグナルの有意な妨害が引き起こされることはなかった。
【０１１７】
この組換えポリペプチドの別の特徴は、それが外来性起源であるにも関わらず、発現されている細胞型または発達段階によって、該組換えタンパク質の分解が起こらなかったことである。
【０１１８】
これらの二機能性組換えポリペプチドの特徴により、疾患過程における局所Ｃａ２＋シグナル伝達を研究するための有用なツールとなっている。特に、標的化二機能性組換えポリペプチドを使用して、ＮＭＤＡ受容体を含むシナプス後肥厚部に標的化するＰＳＤＧＡｍｕｔタンパク質を使用する、神経変性疾患モデルにおけるＮＭＤＡ受容体機能の研究のように、Ｃａ２＋濃度の局所的増加に関連している場合の受容体の機能をモニタリングできた。
【０１１９】
これらの二機能性組換えポリペプチドの特徴により、発達中の神経接続の期間、または学習および記憶、加齢および慢性的な薬物への暴露に関連した変化に伴うネットワーク特性の変化を伴う神経接続の期間などの、長い時間にわたり起こり得る、中枢シナプスにおけるＣａ２＋の動的または変動的な変化の可視化のための極めて有用なツールとなる。
【０１２０】
これらの二機能性組換えポリペプチドの特徴により、診断および薬物発見過程における極めて有用なツールとなる。特に、標的化された二機能性組換えポリペプチドを使用して、既知のＣａ２＋濃度の局所的増加に関連した受容体の機能を特にモニタリングできた。ＧＦＰ−エクオリンは、高濃度Ｃａ２＋ミクロドメインに関連した特定の細胞部位に標的化させることができ、ハイスループットスクリーニングを使用して細胞個体群における薬物効果をより特異的にモニタリングするために使用できた。現在の方法は、この目的のために標的化されていない蛍光指示物質を使用し、光退色、光毒性、低い信号雑音比、ダイ漏出、不均一なダイの分布、受容体活性化に間接的に関連している他のカルシウム動態（例えばカルシウムにより誘起されるカルシウム放出）の検出に関連した問題がある。ハイスループット薬物候補スクリーニングの近年の研究により、非標的化型のＧＦＰ−エクオリンは、蛍光プローブにより提供される信号雑音比よりも有意に良好な信号雑音比を有することが実証された。これは、多くの神経疾患に関与している抑制性Ｇ−タンパク質の活性化により誘起されるＣａ２＋流入などの少ないＣａ２＋流入をモニタリングするのに特に有用である（Niedernbergら、2003）。それ故、ＧＦＰ−エクオリンは、蛍光指示物質による検出が困難であるα−７含有ニコチン受容体として知られる、ニコチン受容体サブタイプに関連したＣａ２＋流入をモニタリングするのに有用であり得る。
【０１２１】
Ｃａ２＋の光学的検出は、特定の表現型または病態に関連する「リアルタイム」動的活性および長期細胞変化を可視化するための簡単な手法を提供できる。例えば、シナプス機能におけるＣａ２＋プロファイルの空間的時間的特異性を特徴づけることは、統合失調症、並びに、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびハンチントン舞踏病などの神経変性疾患の発症に関連した早期事象に関与している、細胞Ｃａ２＋恒常性撹乱の原因である機序を解明するのに重要である（Lidow、2003；MattsonおよびChan、2003；Stutzmanら、2004；Tangら、2003）。
【０１２２】
生物発光を用いて作業する利点は、非常に高度な時間解像度を用いた記録を長期間におよび行なうことができることである。長期記録のために、エクオリン光タンパク質の消費を考慮する必要がある。しかし、本発明者らは、皮質切片を含む組織切片において非常に高度な時間解像度（１ミリ秒間の解像度）で長期記録（９時間まで）をとることができた。全体的に、本発明者らは、光タンパク質消費およびＣａ２＋変動の検出感度レベルは、発現される組換えポリペプチドの量、発現組換えポリペプチドの位置、および使用するコエレンテラジン類似体の種類に関連していることを見出した（Shimomura、1997；Shimomuraら、1993）。これは、適用により、細胞により異なる場合があり、蛍光プローブと同様に各場合において最適化する必要がある。Ｃａ２＋感受性生物発光組換えポリペプチドはまた、光に感受性の生物系の研究において選択されるリポーターを代表することもできる。
【０１２３】
Ｃａ２＋感受性蛍光リポーターシステムとの比較
【０１２４】
蛍光の可視化は、光による蛍光分子の励起のために外的な光源を必要とし（光は放射線の吸収により生じる）、これは光退色、光毒性、および自己蛍光（時間の経過と共に変動する強度をもつ高いバックグラウンド）を引き起こす。生物発光リポーターは、蛍光リポーターよりも信号雑音比が有意により高い。画像化適用においては、高い信号雑音比が、より良好な品質のデータを得るために望ましい。なぜなら、低レベルのシグナルは、干渉により影響をより受けにくいからである。
【０１２５】
生物発光の検出は、生きた未処置動物における生物過程をモニタリングするための非侵襲的な方法である。蛍光リポーターは、組織上での光励起により大量の自己蛍光を生じるので問題である。さらに、光は組織を通過して、蛍光分子を励起しなければならず、その後、より長い波長の放射光は、組織を通って戻ってきて検出器により検知されなければならない。遺伝子的にコードされたＣａ２＋感受性蛍光リポーターは、温度およびｐＨに対して感受性であるか、または、哺乳動物細胞の天然タンパク質であるカルモジュリンを含む。カルモジュリンの過剰発現は、トランスジェニック動物において表現型を生じる可能性がある。
【０１２６】
インビボでの動物完全体の生物蛍光による画像化に関して、エクオリン−コエレンテラジンシステムをルシフェラーゼ−ルシフェリンシステムと比較
【０１２７】
ルシフェラーゼリポーターシステムは、生きた動物における感染過程、腫瘍進行、および遺伝子発現を追跡するために利用されてきた。このシステムは、臨床試験において薬物候補を試験するための動物モデルとして現在では十分に確立されている。単一細胞および脳切片における本発明者らの近年のデータにより、生物発光リポーターとして単一細胞レベルでのＧＦＰ−エクオリンの使用をルシフェラーゼシステムと好意的に比較したことが示唆されている。ＧＦＰ−エクオリンは、Ｃａ２＋活性のリポーターとして使用できる組換えポリペプチドであるので、本発明者らは、生きたマウスにおけるより動的な変化を追跡するために組換えポリペプチドを発現するマウスを使用し、動物完全体レベルで良好な時間的解像度でＧＡ生物発光を検出することが可能であることを示した。特定の細胞ドメインにおける［Ｃａ２＋］ｉ濃度の上昇は、多くの病的過程の発症に関連している。カルシウムはまた、発達およびアポトーシス過程に関与する重要なシグナル伝達イオンでもある。本発明者らは、本発明者らの研究において、大きなＣａ２＋変化が、アポトーシス事象に関連していることを見出した。この過程の早期事象は、ミトコンドリアによるＣａ２＋の放出に関与していると考えられている。静止状態の健康な細胞のミトコンドリアにおけるＣａ２＋レベルは、一般に、サイトゾル［Ｃａ２＋］に近いので、ミトコンドリアＣａ２＋レベルの増加は、細胞死に至る非常に早期な変化を示すようである。ミトコンドリアは、現在は細胞バイオセンサーとして明確に捉えられており、ミトコンドリアＣａ２＋取扱いの変化は、この特性の中心的なものである。これは、ルシフェラーゼリポーターの代替的な手法を提供し、この技術で可能となる適用を広げる。検出技術の連続的な改良と来たるべき補因子の化学反応の改良とを合わせると、これらの組換えポリペプチドを発現するマウスは、生物学の全ての側面において、新規処置形式の臨床試験のための強力な解析システムとなる可能性を有する。
【０１２８】
最後に、本発明者らは、強力なプロモーターであるβ−アクチンおよびまたＬｏｘ−Ｓｔｏｐ−Ｌｏｘシステムの制御下であるｍｔＧＡをコードする導入遺伝子を作成した。ここで示した結果により、ＣＲＥ調節導入遺伝子は、マウス胚において機能的であることが示された。マウスの任意の発達段階においてリポータータンパク質の細胞型特異的発現を誘起することにより、本発明者らは、今回、生きた動物内で起こっている細胞過程をより正確に研究することができた。例えば、本発明者らは、細胞特異的プロモーターの調節下にあるＣＲＥを含む組換えウイルスを使用できた。それ故、発癌過程または腫瘍進行を、選択された細胞型もしくは組織、急性もしくは器官型切片、または動物完全体レベルにおいて研究できた。
【０１２９】
主な利点は、これらの動物を変異疾患動物またはモデルと交雑させて、異なる病態を調べることができたことである。これらの動物はまた、生体外またはインビトロでの研究のための特定の標識された組織、細胞および腫瘍の取得源を提供できる。
【０１３０】
定義
以下の用語は、本明細書で使用する場合、以下の意味を有する。
【０１３１】
発光
原子または分子からのＵＶ、可視、またはＩＲの電気磁気的放射線の放射。この放射は、電気的に励起された状態から、より弱いエネルギー状態、一般には基底状態への遷移により生じる。
【０１３２】
蛍光
非常に短い電気的に励起された一重線により生じる蛍光。この発光は、励起源と同時に消失する。
【０１３３】
化学発光
化学反応により生じる発光。
【０１３４】
生物発光
生きた生物により生じる可視的な化学発光。本発明は、支持体に固定することなく、クラゲに天然に存在するシステムを模倣した。
【０１３５】
生物発光システム
本発明に記載の生物発光システムは、真ん中にペプチドリンカーと補酵素（すなわちコエレンテラジン）を含むキメラ三量体分子である。リンカーと共有結合的に付着している第一分子および第二分子は、第一にドナー部位、第二にそれに付着したアクセプター部位を有していれば、どんなものでもよい（受容体−リンカー−リガンド、抗体−リンカー抗原）。該キメラタンパク質は、Coen.L.、Osta.R.、Maury,M.、およびBrulet,P.、Construction of hybrid proteins that migrate retrogradely and transynaptically into the central nervous system.、Proc.Natl.Acad.Sci.(米国）94(1997)9400-9405により、軸策での逆行的なシナプス経由輸送のために破傷風毒素断片に融合させても、または膜受容体に融合させてもよい。
【０１３６】
放射なし
エクオリンがカルシウムイオンと結合した時、エクオリンからＧＴＰへの光子の放射はない。（それ故、本発明においてエクオリンによる青色光の伝達はなく、エネルギー移動は、２つのタンパク質間で直接なされる）。
【０１３７】
ＦＲＥＴシステム
蛍光による共鳴によるエネルギー移動（すなわち２つのＧＦＰ変種間での）。
【０１３８】
参考文献
緑色蛍光タンパク質およびカルモジュリンに基づいたＣａ２＋の蛍光指示物質。
【０１３９】
Miyawaki,A.、LIopis,J、Heim,R.、McCaffery,J.M.、Adams,J.A.、Ikura,M.およびTsien,R.Y.、Nature(1997)Vol.388p.882-887。
【０１４０】
生きた細胞における、カルモジュリン結合配列により連結された２つの緑色蛍光タンパク質変種を含む指示物質の蛍光放射のＣａ２＋依存的変化の検出。新しい分類の蛍光指示物質。
【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
ＣＲＥＴ
化学発光による共鳴エネルギー移動（すなわち、リンカーを含まないＧＦＰ−エクオリン（クラゲエクオリア（Aequorea））とのまたはＧＦＰ−オベライン（obeline）との融合タンパク質。
【０１４３】
参考文献
化学発光エネルギー移動
【０１４４】
【表３】
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【０１４５】
ＢＲＥＴ
生物発光による共鳴によるエネルギー移動（すなわち、ＧＦＰとルシフェラーゼ（クラゲ・レニラ（Renilla））の間の相互作用）。
【０１４６】
参考文献
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）システム：相互作用している生体時計タンパク質への適用。
【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
参考文献
以下の文献を本明細書に引用する。本明細書に引用したこれらの各々の文献および他の各々の文献の全開示を信頼し本明細書に取り込む。
【０１４９】
米国特許文書：
第６，６６２，０３９  Ｂ２号。蛍光指示物質を用いての神経接続の光学的プロービング。２００３年１２月、Yusteら。
【０１５０】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】シナプス前および後区画の特定の細胞下ドメインに標的化された様々なＧＦＰ−エクオリンリポーターの局在を示す図。ＧＦＰ−エクオリンリポーターは、シナプトタグミンＩ（ＳｙｎＧＡ）への融合によりミトコンドリアマトリックス（ｍｔＧＡ）に、そしてＰＳＤ９５（ＰＳＤＧＡ）への融合により小胞体（ｅｒＧＡ）腔など様々な細胞ドメインに標的化される。低親和型の各リポーターにより、高濃度カルシウムミクロドメインを選択的に検出でき、これにより特定の細胞活性が示される。
【図２】細胞特異的標的化のための様々なＧＡキメラの図。白いアステリスクは、Kendallら、1992の記載した、光タンパク質のＣａ２＋結合親和性を低下させる、エクオリンの（Ａｓｐ−１１９→Ａｌａ）変異の位置を示す。ＧＡは、標的化能をもたないＧＦＰ−エクオリンを示し、これはＧ５Ａと称され、２つのタンパク質の間に柔軟性のリンカーを含んでいる（ＧＡおよびＳｙｎＧＡは、ＰＣＴ／ＥＰ０１／０７０５７号出願に公表されている）。ｍｔＧＡは、ＧＡを、チトクロムｃオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩの切り出し可能な標的化配列に融合させることにより、ミトコンドリアに標的化させたＧＦＰ−エクオリンであり；ｅｒＧＡは、免疫グロブリン重鎖のＮ末端領域への融合後に小胞体腔に標的化されるＧＦＰ−エクオリンであり；ＰＳＤＧＡは、シナプス後構造に局所標的化するために、ＧＦＰ−エクオリンをＰＳＤ９５に融合させたものである。全ての構造物は、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）の制御下にある。
【図３】ｍｔＧＡのＣａ２＋濃度応答曲線。該組換えタンパク質を、天然または合成類似体であるｈコエレンテラジン（天然複合体よりもＣａ２＋感受性が高いと報告されている）を用いて再構成した後のｍｔＧＡのＣａ２＋濃度応答曲線（ｐＨ７．２、２６℃で測定（ｎ＝３））。エクオリンの消費速度分率は、生理的ｐＣａ範囲において［Ｃａ２＋］に比例する。光タンパク質の消費速度分率は、画定された［Ｃａ２＋］（Ｌ）における光放射と、飽和［Ｃａ２＋］（Ｌｍａｘ）における最大光放射の間の比として表現する。
【図４】特定の細胞下ドメインに標的化された様々なＧＦＰ−エクオリンキメラの共焦点顕微鏡による解析。（Ａ）ｍｔＧＡ、ＧＦＰ−エクオリンは、ＣＯＳ７および皮質ニューロンにおけるミトコンドリアマトリックスに良好に標的化されている。（Ｂ）ｅｒＧＡ、ＧＦＰ−エクオリンは、小胞体腔に良好に標的化されている。（Ｃ）ＰＳＤＧＡ、ＰＳＤ９５タンパク質のＣ末端に融合させたＧＦＰ−エクオリンにより、Ｃａ２＋−リポーターが点状に標識され、これは、解離皮質ニューロンにおける天然タンパク質の標的化に似ている。（Ｄ）ＳｙｎＧＡ、シナプス小胞の膜貫通タンパク質であるシナプトタグミンＩのＣ末端に融合させたＧＦＰ−エクオリンにより、シナプス領域が標識される。標的化ＧＡリポーターはまた、関連抗体を用いた免疫組織化学的染色によっても確認される。
【図５】標的化能を有さない型のＧＦＰ−エクオリンでトランスフェクトされた皮質細胞。ＧＦＰ−エクオリンを、高親和性のｈ型のコエレンテラジンを用いて再構成した。（Ａ）ＧＦＰ蛍光により、Ｃａ２＋リポーターの均一分布が示される。（Ｂ、ｂ）１００μＭのＮＭＤＡおよび（Ｃ、ｃ）９０ｍＭのＫＣｌを、ＧＡでトランスフェクトした単一皮質ニューロンに適用した後のＣａ２＋により誘起される生物発光、並びに、対応するグラフデータ。（Ｄ）ジギトニンを含む高濃度Ｃａ２＋溶液を、実験の最後に加え、Ｃａ２＋濃度を較正するために光タンパク質の総量を定量した。４０倍の対物レンズ（１．３ＮＡ）を使用して室温（２３〜２５℃）で画像を得た。尺度基準棒＝１５μｍ。検出される光子の数により示される［Ｃａ２＋］の変化は、偽色で暗号化され（１〜５光子／画素）、暗青色は少ない画素数を示し、赤は、多い画素数を示す。
【図６】ｍｔＧＡでトランスフェクトされた皮質ニューロンにおけるＮＭＤＡにより誘起されるＣａ２＋の流入。ＧＦＰは、最初の画像であるベースラインに示されているように蛍光顕微鏡によりＣａ２＋リポーター発現パターンを可視化させることができ、ここでベースラインのＧＦＰ蛍光画像を、刺激前の光子画像と重ね合わせている。高感度の画像光子検出器（ＩＰＤ）を使用して、Ｃａ２＋により誘起された生物発光を、ＮＭＤＡ（１００μＭ）の適用後に記録した。ＩＰＤ検出により、高度の時間的解像度と、中程度の空間的解像度が得られる。（Ａ）ＣＣＤ蛍光画像、尺度基準棒＝５μｍと（Ｂ）ＩＰＤ光子画像との間の空間的解像度の比較を示したズーム領域を参照されたい。（Ｃ）対象の領域を示すＧＦＰ蛍光画像および対応するグラフデータ。尺度基準棒＝１０μｍ。グラフはまた、細胞全体の応答についても示す。各光子画像は、３０秒間累積された光を示す。バックグラウンド＜１光子／秒。色尺度は、１〜５光子／画素としての発光流入を示す。
【図７】ＳｙｎＧＡでトランスフェクトされた皮質ニューロンにおけるＣａ２＋により誘起された生物発光活性。神経モデュレーターの添加前の基礎状態において、解析された領域は、バックグラウンドに比べて高いレベルの活性を示した。これは、ＳｙｎＧＡでトランスフェクトされたニューロンにおいて一貫して観察される。通常、ＧＦＰ−エクオリンを天然エクオリンで再生した場合にはリポーターの結合親和性は低いので、Ｃａ２＋の静止レベルを検出することは難しい。ｍｔＧＡおよびＰＳＤＧＡは、一般に、同種の活性を示さないが、ＰＳＤＧＡは時に、自発的に偶然的に起こる非常に限局されたＣａ２＋流入を示す場合がある。これらの結果は、ＳｙｎＧＡが、サイトゾルＣａ２＋の静止レベルに関して通常報告されているよりも高いＣａ２＋濃度である細胞ドメインに標的化されていることを示唆する。バックグラウンド光子は、２５６×２５６画素領域において１光子／秒未満であった。細胞体幹および神経突起に沿った種々の場所から２０×２０画素領域が選択された。グラフデータはまた、各領域におけるバックグラウンド計数の増加も示す。バックグラウンドはゼロに非常に近く、よって見られないことが特筆される。高濃度のＫ＋（９０ｍＭ  ＫＣｌ）の添加後の、細胞体幹および神経突起におけるＣａ２＋の流入。対応する（ＢＦ）明視野および（ＦＩ）蛍光画像、並びに、蛍光画像と光子画像の重ね合わせが示されている。尺度基準棒＝２０μｍ。光子画像は、１〜５光子／画素となるように縮尺した。
【図８】ＰＳＤＧＡでトランスフェクトされた皮質ニューロン。（Ａ）ＧＦＰ蛍光を可視化して、Ｃａ２＋リポーターの発現を示すニューロンを同定し、この発現は、天然ＰＳＤ９５タンパク質の発現に似ている。Ｄ１およびＤ２と称される２つの樹状突起領域（１５×１５画素）並びに同じサイズの細胞体幹の領域における光子放射を調べ、グラフ表示した。Ｃａ２＋シグナル伝達の動態は、解析した２つの樹状突起領域において同一であることが判明したが、細胞体幹と比べると顕著に異なることが判明した。（Ｂ）ＮＭＤＡを最初に適用した後に放射された光子の全積分（５０〜２００秒）を示す光子画像。解析した２つの樹状突起領域における全ての光タンパク質が、初回のＮＭＤＡの適用後に完全に消費されたので、二回目のＮＭＤＡ適用後には細胞体幹領域においてのみ光子が検出された。偽色尺度は、１〜５光子／画素を示す。尺度基準棒＝１０μｍ。
【図９】ＰＳＤＧＡ（ＰＳＤ９５に融合させたＧＦＰ−エクオリン）を発現している皮質細胞から記録された自発的活性の観察。基礎的な条件下で応答を記録し、グラフ表示する（色は、同じ２０×２０画素領域から収集したデータを示す、１画素＝０．６５μｍ）。対応する例の実地説明がなされ、これには積分光子画像とグラフデータが含まれる。
【図１０】アデノウイルス−ＧＦＰ−エクオリンベクターで感染させた、新生児マウス脳の器官型海馬切片培養における長期にわたるＣａ２＋動態の生物発光による画像化。（Ａ）ＧＦＰ蛍光は、Ｃａ２＋リポーターを発現している個々の細胞を示す。生物発光活性の大きな増加および蛍光の消失により示される細胞死が明らかになるまで、約９時間におよび活性を記録した。蛍光画像は、撮っている間は周期的に（３０分毎に）撮影した。代表的な光子画像並びに対応するグラフデータ（最後の７時間）を示す。バックグラウンド＜１光子／秒×１０。
【図１１Ａ】ＰＳＤＧＡベクターのマップ。
【図１１Ｂ】ＰＳＤ９５（ヌクレオチド６１６〜２７８８位）、アダプター（大文字）、ＧＦＰ（２８４２〜３５５５）、リンカー（３５５６〜３７０５、大文字）、およびエクオリン（３７０６〜４２７５）を含む挿入断片のコード配列（および対応するタンパク質配列）。
【図１２Ａ】ｍｔＧＡベクターのマップ。
【図１２Ｂ】チトクロムＣオキシダーゼのサブユニットＶＩＩＩの切り出し可能な標的化配列（ヌクレオチド６３６〜７２２位、大文字）、ＧＦＰ（７４１〜１４５４）、リンカー（１４５５〜１６０４、大文字）およびエクオリン（１６０５〜２１７４）を含む挿入断片のコード配列（および対応するタンパク質配列）。
【図１３】ＧＦＰ−エクオリンが特定の細胞ドメインに局在している場合の単一細胞における動的活性の検出。ＰＳＤＧＡでトランスフェクトされた皮質ニューロンにおけるＣａ２＋により誘起される生物発光。細胞下（subcellularly）で生じるＣａ２＋波の伝播と応答プロファイルは非常に複雑であることが示された。これらの研究で使用したＩＰＤカメラでは、μ秒の時間軸での解像度が得られ、オンラインの視覚化の場合のみ積分時間が特定される。非常に変動性の時間尺度で作業することにより、これ自体、生理的パラメータである、Ｃａ２＋活性の空間時間的な特性を完全に調べることが可能となる。尺度基準棒＝２０μｍ。
【図１４】海馬ニューロンにおける電気により誘起されるＣａ２＋振動。２４時間培養液の蛍光（ＦＩ）および明視野画像（ＢＦ）であって、パルス発生器に接続したパッチ様のピペット（７〜１０ＭΩ）を、画像で示される「下の」細胞の体領域と穏やかに接触させた。尺度基準棒＝２０μｍ。１回の２ミリ秒の電気パルスにより誘起された光放射（Ａ）が５秒間隔で、下のパネルに示されたＡ〜Ｅのグラフに示されている。印加した電圧を各グラフに記載する（電極は、ピペットが接続されたバッテリー側を意味する）。光子画像を明視野画像と重ね合わせる。ＢＦに示された３個の領域の光放射分率（Ｌ／Ｌｍａｘ）がグラフＡ〜Ｅに示され、連続的な電気刺激に相当する。（Ｆ）２０秒間の時間中に対象の各領域で記録された全てのＣａ２＋トランジェントが、時間の関数として示されている。アステリスクは、一連の自発的に生じたトランジェントの最初のものを示す。（Ｇ）電気配置図。Ｉ．Ｓ．隔絶された刺激器、Ｒ、電気中継器、Ａ、パッチ増幅器ヘッド。ニューロンを、ＧＦＰ−エクオリン遺伝子を含むウイルスベクターでトランスフェクトさせた（より詳細には方法を参照されたい）。
【図１５】１０、５日令のトランスジェニック胚と野生型胚のＧＦＰ蛍光。キメラｍｔＧＡ（ｐＣＡＧ−Ｌｏｘ−ｓｔｏｐ−Ｌｏｘ−ｍｔＧＡ）マウスをＰＧＫ−ＣＲＥマウスと交雑させ、発達開始から生体の全ての細胞における導入遺伝子の発現を活性化させた。（Ａ）野生型およびトランスジェニックマウスの１０、５日令の胚の明視野画像。（Ｂ）対応するＧＦＰ蛍光画像。表現型異常は認められない。
【図１６】全ての細胞においてミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンタンパク質を発現している新生児トランスジェニックマウスにおけるＧＦＰ蛍光。発達開始から生体の全ての細胞における導入遺伝子（ＰＧＫ−ＣＲＥとの交雑による）の活性化後のｍｔＧＡマウスの明視野画像および対応するＧＦＰ蛍光画像。（Ａ）足、（Ｂ）上半身の背中図、（Ｃ１）頭部の背面の図、および（Ｃ２）Ｐ１ｍｔＧＡマウスの皮質におけるｍｔＧＡの標的化。新生児または成体マウスにおける身体的または挙動的異常は全く認められない。
【図１７】トランスジェニック新生児マウスから切り出した器官と野生型マウスの器官のＧＦＰ蛍光画像。Ｐ５トランスジェニックｍｔＧＡと野生型マウスのＧＦＰ蛍光画像。主要な器官の画像を撮影し、全ての器官において強力な発現レベルを示す。最も高い発現レベルが心臓および肝臓において認められる。導入遺伝子を全ての細胞において発達開始時に活性化した場合、器官の異常は全く認められない。
【図１８】全ての細胞において導入遺伝子を発現しているトランスジェニック動物の皮質におけるｍｔＧＡの共焦点解析。生きた動物の全ての細胞におけるｍｔＧＡ導入遺伝子の発現を活性化するために、トランスジェニックマウスを、ＰＧＫ−ＣＲＥマウスと交雑させた。器官型切片をＰ４マウスから調製し、４日間培養中に保持し、その後、Ｃａ２＋により誘起される生物発光を検出する実験を行なった。実験完了時に、切片を固定し、次いで、ＧＦＡＰ（グリア細胞の検出のため）およびＮｅｕＮ（ニューロンの検出のため）で染色した。両方の抗体が、ｍｔＧＡ導入遺伝子の発現の場所に両方共局在した。ミトコンドリアマトリックス（ｍｔＧＡ）に標的化させるためにチトクロムｃのシグナルペプチドに融合させた後、ＧＦＰ蛍光は、期待されるＧＡリポーターの発現パターンを示す。これらの結果は、トランスジェニックｍｔＧＡリポーターマウスを、全細胞のＣｒｅを活性化するＰＧＫ−ＣＲＥマウスと交雑させた場合、ｍｔＧＡ導入遺伝子が、脳の全ての細胞に発現されることを示す。
【図１９】未熟マウス脳の体性感覚皮質におけるミトコンドリアＣａ２＋トランジェントの同調振動。（ＢＦ、明視野、ＦＩ、蛍光画像）器官型切片（皮質）を、脳の全ての細胞においてミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現しているＰ４トランスジェニックマウスから切り出した。切片を、画像化前に、４〜５日間、培養で保持した。コエレンテラジン（ｗｔ）と共にインキュベートした後、切片を緩衝液（Ｍｇ２＋を含むまたは含まない）中で灌流した。２つの切片の結果を提示し、これによれば、緩衝液からＭｇ２＋を除去すれば、Ｃａ２＋振動が生じ、これはミトコンドリアマトリックス内に検出され、Ｄ−ＡＰＶ（５０μＭ）というＮＭＤＡアンタゴニストにより完全かつ可逆的に遮断されることが示される。光子を、脳皮質のＩ〜ＩＩＩ／ＩＶおよびＶの層の体性感覚皮質に相当する５５０μｍ２領域から収集した。
【図２０】ミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを有するＰ１マウスの動物完全体の生物発光による画像化。左手のマウスは野生型マウスであり、右手のマウスは、全ての細胞においてミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現しているトランスジェニックマウスである。両方のマウスにコエレンテラジン（４μｇ／ｇ）を腹腔内注射した。Ａ〜Ｃは、別個の連続物であり、時間をかけて連続画像を獲得した。マウスのグレースケール写真を、ほの暗い光を放射するダイオード照射の下でチャンバー中で最初に収集し、その後、偽色発光画像を獲得し、重ねた。各枠は、５秒間の光累積を示す。紫（最も強度が低い）から赤（最も強力）の光強度に相当する色基準棒を、各連続物の端に記載している。尺度基準棒＝２ｃｍ。
【図２１】ミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを有するＰ３マウスの動物完全体の生物発光による画像化。左手のマウスは野生型マウスであり、右手のマウスは、全ての細胞においてミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現しているトランスジェニックマウスである。両方のマウスにコエレンテラジン（４μｇ／ｇ）を腹腔内注射した。ＡおよびＢは、別個の連続物を示し、時間をかけて連続画像を獲得した。マウスのグレースケール写真を、ほの暗い光を放射するダイオード照射の下でチャンバー中で最初に収集し、その後、偽色発光画像を獲得し、重ねた。各枠は、５秒間の光累積を示す。紫（最も強度が低い）から赤（最も強力）の光強度に相当する色基準棒を、各連続物の端に記載している。尺度基準棒＝４ｃｍ。
【図２２】より高度な時間解像度を用いた、動物完全体におけるミトコンドリアＣａ２＋動態の生物発光による画像化。左手のマウスは野生型マウスであり、右手のマウスは、全ての細胞においてミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現しているトランスジェニックマウスである。両方のマウスにコエレンテラジン（４μｇ／ｇ）を腹腔内注射した。２〜５秒間の露光時間を、各連続枠に示す。
【図２３】より高度な時間解像度を用いた、動物完全体におけるミトコンドリアＣａ２＋動態の生物発光による画像化。左手のマウスは野生型マウスであり、右手のマウスは、全ての細胞においてミトコンドリアに標的化されたＧＦＰ−エクオリンを発現しているトランスジェニックマウスである。画像は、１秒間の光累積を示す。色棒は、光の強度に対応する。画像は、Xenogen IVIS 100動物完全体生物発光システムを使用して獲得した。ビニング＝１６、Ｆ／ｓｔｏｐ＝１。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｂ−１】
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【図１１Ｂ−２】
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【図１１Ｂ−３】
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【図１１Ｂ−４】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｂ−１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2007531514.tif 000042
2007531514.tif 000043
2007531514.tif 000044