(57)【要約】【要約】  本発明により、組成物及び細胞に加え、成熟哺乳類の体腔空間由来幹細胞の蓄積、補充及び回収方法が開示される。本発明の別の局面により、哺乳類の体腔空間に異物を移植し、移植の結果生じた幹細胞を収集することによって、幹細胞の新起源を得る方法が提供される。さらに本発明により、異物の移植後、哺乳類の体腔空間の幹細胞を回収し、幹細胞を操作し、かつ幹細胞が必要な被験者に幹細胞を導入することによって、本発明の１種以上の幹細胞が必要な被験者に本発明の１種以上の幹細胞を提供する方法が特定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞の収集方法であって、以下の工程：
哺乳類の体腔空間に異物を導入する工程；
前記体腔空間を少なくとも１回生理的溶液で洗浄する工程；及び
前記生理的溶液を収集して多能性幹細胞を回収する工程；
を含む方法。
【請求項２】
前記体腔空間が、腹膜腔、皮下空間、胸膜空間、肺空間、及び脳空間から成る群の１種以上の空間である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記生理的溶液が、培養基、デキストラン、生理食塩水、血清、抗生物質、医薬点滴注入液、及びその組合せから成る群より選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
前記洗浄工程が、前記体腔空間への異物の導入後少なくとも約２時間で行われ、かつ任意的に、少なくとも約２時間毎に繰り返される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記洗浄工程が、胃洗浄、透析、及び医薬点滴注入から成る群より選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
前記多能性幹細胞を遺伝子操作する工程をさらに含む、請求項１の方法。
【請求項７】
前記多能性幹細胞を必要な患者に再導入する、請求項１の方法。
【請求項８】
血清及びGM-CSFをさらに含む培地中でインキュベートすることによって、かつ任意的に血清及びTNF-αを含む培地中で樹状型細胞を再塗布することによって、多能性幹細胞を誘導して樹状細胞に分化させる、請求項１の方法。
【請求項９】
血清と、骨形態形成タンパク質及びTGF-β1から成る群より選択される骨特異的成長因子とをさらに含む培地中でインキュベートすることによって、多能性幹細胞を誘導して骨細胞に分化させる、請求項１の方法。
【請求項１０】
血清及びβ-メルカプトエタノールをさらに含む培地中でインキュベートすることによって、多能性幹細胞を誘導して神経細胞に分化させる、請求項１の方法。
【請求項１１】
血清及び抗生物質をさらに含む培地中でインキュベートし、かつ完全なコンフルエンシーに達しないように数週間細胞を成長させることによって、多能性幹細胞を誘導して筋細胞に分化させる、請求項１の方法。
【請求項１２】
血清、デキサメタゾン、インシュリン、及び5,8,11,14-エイコサテトライン酸をさらに含む培地中でインキュベートすることによって、多能性幹細胞を誘導して脂肪細胞に分化させる、請求項１の方法。
【請求項１３】
血清と、FGF、IGF-1、及びTGF-β1から成る群より選択される１種以上の成長因子とをさらに含む培地中でインキュベートすることによって、多能性幹細胞を誘導して軟骨細胞に分化させる、請求項１の方法。
【請求項１４】
治療が必要な患者の病気を治療する方法であって、以下の工程：
被験者の体腔空間から多能性幹細胞を収集する工程；
前記多能性幹細胞を培養する工程；及び
前記多能性幹細胞が必要な患者に該多能性幹細胞を導入する工程；
を含む方法。
【請求項１５】
分化誘導シグナルの存在下で、多能性幹細胞を誘導して分化させる工程をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記体腔空間に異物を導入後、少なくとも約２時間で前記体腔空間を洗浄することによって多能性幹細胞を収集する、請求項１４の方法。
【請求項１７】
前記被験者が患者である、請求項１４の方法。
【請求項１８】
核酸配列、アミノ酸、抗体、分化誘導シグナル、増殖誘導シグナル、生物学的化合物、化学薬品、選択可能マーカー、三次元骨格、及びその組合せから成る群より選択される１種以上を導入することによって、多能性幹細胞を操作する工程をさらに含む、請求項１４の方法。
【請求項１９】
前記多能性幹細胞をin vivo操作する、請求項１４の方法。
【請求項２０】
以下の工程：
哺乳類の体腔空間に異物を導入する工程；
前記体腔空間を少なくとも１回生理的溶液で洗浄する工程；及び
前記生理的溶液を収集して細胞集団を回収する工程；
を含む請求項１の方法で得られる細胞集団。
【請求項２１】
哺乳類の体腔空間に異物を導入後少なくとも約２時間で前記体腔空間から回収され、かつ幹細胞のクローン集団を創造できる幹細胞。
【請求項２２】
遺伝子操作、スクリーニング、診断、表現型化、異種移植、自家移植、移植、細胞置換、組織置換、細胞強化、組織強化、細胞異常の治療、及びその組合せから成る群より選択される１種以上の用途で幹細胞を使用する、請求項２０の幹細胞。
【請求項２３】
被験者の体腔空間に三次元物を移植する工程を含む幹細胞の製造方法であって、前記三次元物が、幹細胞の蓄積及び成長用の骨格として作用する、前記方法。
【請求項２４】
遺伝子修飾、誘導補充、誘導分化、誘導成長、誘導増殖、及びその組合せから成る群より選択することによって、幹細胞をin vivo操作する、請求項２３の方法。
【請求項２５】
幹細胞を用いて、腫瘍、病気、癌、組織損傷、細胞死から成る群より選択される状態を治療する、請求項１７の方法。
【請求項２６】
非-体腔空間由来細胞の少なくとも一つの特性を発現するように誘導されている被験者の体腔空間から回収され、かつ宿主への移植に適切である細胞集団であって、前記細胞集団が、前記体腔空間への三次元異物の導入後少なくとも約２時間で回収される、前記細胞集団。
【請求項２７】
化合物を生産できる少なくとも１種の遺伝子で不死化されている、被験者の体腔空間から回収される単離幹細胞であって、前記単離幹細胞が、前記化合物の生産を刺激するシグナルの誘導によって前記化合物を発現することができ、かつ前記単離幹細胞が、前記体腔空間への異物導入後少なくとも約２時間で回収される、前記単離幹細胞。
【請求項２８】
非-体腔空間由来細胞の少なくとも１つの特性を発現するように誘導されている、被験者の体腔空間から回収される幹細胞と、医薬的に許容しうる担体とを含んでなる組成物であって、前記幹細胞が、前記体腔空間への異物の導入後少なくとも約２時間で回収される、前記組成物。
【請求項２９】
前記特性が、神経細胞、星状膠細胞、樹状細胞、造血細胞、肝細胞、心臓細胞、骨格細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肺胞細胞、眼球細胞、内皮細胞、造骨細胞、軟骨細胞、膵細胞、リンパ細胞、表皮細胞、腎細胞、腱細胞、及び生殖細胞の特性から成る群より選択される、請求項２８の組成物。
【請求項３０】
非-体腔空間由来細胞の少なくとも１つの特性を発現するように誘導されている、被験者の体腔空間から回収される幹細胞と、医薬的に許容しうる担体とを含んでなる組成物であって、少なくとも１種の非内因性核酸配列が前記幹細胞に導入されており、かつ前記幹細胞が、前記体腔空間への異物の導入後少なくとも約２時間で回収される、前記組成物。
【請求項３１】
非-体腔空間由来細胞の少なくとも１つの特性を発現するように誘導されている、被験者の体腔空間から回収される幹細胞と、医薬的に許容しうる担体とを含んでなる組成物であって、少なくとも１種の非内因性アミノ酸配列が前記幹細胞に導入されており、かつ前記幹細胞が、前記体腔空間への異物の導入後少なくとも約２時間で回収される、前記組成物。
【請求項３２】
非-体腔空間由来細胞の少なくとも１つの特性を発現するように誘導されている、被験者の体腔空間から回収される幹細胞と、医薬的に許容しうる担体とを含んでなる組成物であって、少なくとも１種のモノクロナール抗体が前記幹細胞に導入されており、かつ前記幹細胞が、前記体腔空間への異物の導入後少なくとも約２時間で回収される、前記組成物。
【請求項３３】
in vitro又は宿主細胞の成長に関与する物質の同定に使用できる、哺乳類の体腔空間から回収される幹細胞であって、前記幹細胞が、前記体腔空間への異物の導入後少なくとも約２時間で回収される、前記幹細胞。
【請求項３４】
哺乳類の体腔空間から回収される幹細胞に基づいて調製される組成物の安全性の試験方法であって、以下の工程：
前記体腔空間への異物の導入後少なくとも約２時間で前記体腔空間を生理的溶液で洗浄することによって、前記哺乳類の体腔空間から回収される幹細胞を収集する工程；及び
１種以上の調製組成物の存在下、適切な培地中で前記幹細胞をインキュベートする工程；
を含む前記方法。
【請求項３５】
インキュベーション後の種々な時間に幹細胞を検査して細胞の変化を評価する工程をさらに含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
請求項１の方法で得られ、かつcDNAライブラリーを構築するために使用される幹細胞ライン。
【請求項３７】
前記cDNAライブラリーから１種以上の診断プローブが得られる、請求項３６の幹細胞ライン。
【請求項３８】
前記幹細胞が１種以上の治療組成物を生成する、請求項３６の幹細胞ライン。
【請求項３９】
多能性幹細胞を収集する方法であって、以下の工程：
哺乳類の体腔空間に異物を導入する工程；及び
前記体腔空間から多能性幹細胞を回収する工程；
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、国立保健研究所の助成金番号EB-00287によって一部支援されている。政府は本発明の特定の権利を有するものである。
この出願は2003年5月29日出願の米国仮特許出願第60/474,020号の優先権を主張する。
本発明は、細胞生理学の一般分野に関し、さらに詳細には、診断、スクリーニング、試験、治療、及びリハビリテーションのような医療用途の臨床的に生存能力のある幹細胞、並びにスクリーニング、試験及び生物工学のような商用で使用する細胞を開発及び製造する組成物及び方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞の研究は、幹細胞には可塑性がありかつ病的な、損傷した又は老いた組織及び器官と置き換わる可能性があることから、癌、脊髄損傷、脳卒中、変性疾患、及び他の症状に苦しむ患者のための新規な万能薬を提供する。薬物、生物製剤、及び他の現在の療法に代えて幹細胞移植を使用することにより、幹細胞は種々のヒトの障害及び症状の予防及び／又は治療のための新療法を提供できることが示唆されている。
何年間も、科学者は幹細胞を胚、成体骨髄及び他の組織、又は胎児（例えば、臍帯血）から誘導できることを知っていた。幹細胞を胚組織から回収することに関する倫理的懸念のため、最近、この特定範囲の研究はあまり注目されていなかった。その代わりに研究は、成体及び胎児組織から誘導される幹細胞の単離、増殖、及び組織／細胞移植に焦点を当てている。このタイプの幹細胞を使用することの１つの限界は、幹細胞は移植片拒絶反応を引き起こしうるので、一般的に同一患者由来の幹細胞が必要なことである。別の限界は、いずれの一組織からも小数の成体幹細胞又は胎児幹細胞しか回収しえないことである。
このことは広範又は費用効率の高い臨床治療に幹細胞を使用することを妨げていた。今日まで、成体幹細胞の最も豊富な起源は骨髄由来である。しかし、現在、15mLの骨髄液から500,000個未満の成体幹細胞が回収される（ヒト成体から一般的に回収される量）。さらに、これら幹細胞は、移植のためのような使用に適当な数を生成するまで数週間又は数ヶ月の細胞培養を必要とする。さらに、ヒトの液体骨髄培養は、６〜８週間後でも有意な数の非付着性造血前駆細胞又はクローン原性前駆細胞を生成し損なうことが多い。
さらに別の限界は、数タイプの成体組織しか幹細胞を含むと報告されていないことである。これには脳、骨髄、末梢血、血管、骨格筋、心臓、皮膚及び肝臓が含まれる。さらに重要なことに、成体組織から回収される幹細胞（本明細書では成体幹細胞とも呼ぶ）はその分化する能力が制限されている。最も多くの場合、成体幹細胞は元の組織の細胞型にしか分化することができない。ほとんどの成体幹細胞は、本当の意味で真に多能性とみなすことができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
現在の技術では、成体幹細胞を使用するときにいくつかの欠点が残っている。具体的には、成体幹細胞は成熟組織内には滅多になく、培養で回収及び増量する方法は一般的に不十分であり、結果として非常に低収率となり、組織に対して破壊的である。すなわち、幹細胞を得るプロセスで、元の組織のすべてでなくても一部が破壊される。このため、多数の細胞が必要であり、及び／又は元の組織が必須であって破壊できない置換療法又は強化療法では成体幹細胞の使用が困難である。従って、現在の幹細胞回収技術を改良して、元の組織を破壊せずに幹細胞収率を高める必要がある。組織破壊を排除することによって、幹細胞の供与後、成体がその細胞のレシピエントであることができる。このようなプロセスは免疫系による拒絶反応を排除し、免疫抑制薬の生涯使用の必要を低減又は排除する。
本発明は、上述した多くの要求のみならず当業者には明かな他の目的を取り扱う。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、元の組織を破壊せずに高収率で幹細胞を得る新規かつ改良された方法及び該幹細胞の使用方法を提供することによって、現在の幹細胞収集及び回収技術に付随する問題を解決する。さらに、本発明は、臨床用、診断用、医薬用及び商用の幹細胞集団、幹細胞系、及び幹細胞の組成物を提供する。
本発明の一局面により、哺乳類の体腔空間に異物又は移植片を導入し、かつ移植の結果として生じる幹細胞を収集することによって、幹細胞の新起源を得る方法が提供される。
さらに、本発明により、異物を移植後哺乳類の体腔空間から幹細胞を回収し、この幹細胞を操作し、それが必要な被験者に幹細胞を導入することによって、本発明の１種以上の幹細胞が必要な被験者に本発明の１種以上の幹細胞を提供する方法が特定される。幹細胞は遺伝的に操作してもよく、別の組成物と接触させてもよく、所望の細胞型への分化に方向づけてもよく、及び／又は被験者に導入する前に三次元骨格と接触させてもよい。さらに、被験者は幹細胞の起源と同一でも異なってもよい。
【０００５】
本発明に従って回収される幹細胞の利点は、それらの回収が安価であり、高収率の細胞を生成し、分化、増殖及び遺伝子修飾（in vivo及びex vivo）が可能であり、生理的様式で機能し（例えば、生物学的化合物を伝導し、生成し、分泌し、調節するなど）、真の多能性を示し、かつ臨床用、診断用及び商用（例えば、細胞／組織移植、置換、インプランテーション、グラフティング、遺伝子又は診断スクリーニング、製品開発）、及び治療、予防又は他の処理目的（例えば、例として脊髄損傷、他の組織又は器官の損傷、火傷、肝硬変、肝炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、筋ジストロフィー、糖尿病、関節炎、骨粗しょう症、白血病、鎌状血球症及び他の貧血症）に適用できることである。さらに、本発明は、比較的健康とみなされる患者でしか行えない骨髄収集のような、大部分の伝統的な幹細胞回収法を用いるときには利用できない選択肢である、癌又は末期の病気を患う人のような他の治療の選択肢には感受性でありうる個体で使うのに好適である。さらに、本発明は、合併症を伴わなわない骨髄収集のような現在の伝統的方法より安全であり、如何なる既知の困難又は副作用もなく同一患者にさえ繰り返し使用することができる。
【０００６】
本発明は、免疫系による移植片拒絶反応に関する現在の問題に対応し、かつ移植術での免疫抑制薬の使用を低減又は排除する。本発明は、経済的な臨床治療の選択肢を提供し、移植、遺伝子、タンパク質及び細胞療法を含む臨床手順用の多数のヒト幹細胞を補充及び回収する組成物及び方法に対する研究者、ヘルスケア提供者、産業の現在の要求を満たす。本発明の組成物と方法は、特に幹細胞が必要な人に幹細胞を供給するためのユニークかつ強力なツールとして役立つ。本発明のカスタムデザイン製品の例として医療、治療、診断、エンジニアリング、及びバイオテクノロジー用途の組成物が挙げられる。
図面と共に以下の詳細な説明を読めば、当業者は、本発明の上記利点及び優れた特徴をその他の重要な局面と共にさらに理解するだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明の種々の態様の製造及び使用について詳述するが、本発明は種々多様の態様に具体化しうる多くの発明概念を提供するものと認識されるべきである。本明細書で述べる特定の局面及び態様は、本発明を製造及び使用するための方法の単なる例示にすぎなず、本発明の範囲を限定するものではない。
一般に、幹細胞は、１つ以上の未特殊化細胞を生じさせうる未特殊化（例えば未分化）状態の多能性細胞である。幹細胞を同定する１つの重要な特徴は、その自己再生を示す能力又は複数の幹細胞自体を生成する能力であり；よって、幹細胞は自己維持能を有する細胞である。さらに、本明細書では、幹細胞は増殖（何度も何度も複製）、自己維持、及び多数の特殊化機能性子孫の生産が可能であるのみならず、損傷後の組織を再生する能力を有する未特殊化細胞である。
【０００８】
幹細胞の１つの役割は、自然細胞死、老化、損傷又は疾患で失われた細胞を補給することである。組織内の幹細胞の存在は、通常、当該組織内の細胞の高回転(turnover)と関係するが、高回転率を欠く組織内にも幹細胞は存在しうる。何度も複製する能力（“複製”又は“増殖”とも呼ぶ）を持たない特殊化細胞と異なり、成体幹細胞は多月間、分化せずに複製できるだろう。しかし、現在の方法は、細胞によって（時には自動的に）分化が開始する前に成長／増殖する有限能力しかない成体幹細胞を回収する。とりわけ、本発明の利点は、未特殊化状態を維持しながら、多月間（１年を超えることさえある）複製する能力のある幹細胞の回収を提供し、ひいては長期の自己再生のための無数の細胞をもたらす方法を提供することである。
【０００９】
幹細胞の別の興味深い特性は、幹細胞は通常それらが誘導される組織と同じ細胞型を生成することである。例えば、骨髄由来の血液形成性成体幹細胞は通常血液細胞だけを生じさせ；間充織幹細胞（骨髄間質性細胞）は通常特有の結合組織細胞型を生じさせ；造血幹細胞は通常すべての型の血液細胞を生じさせ；脳内の神経幹細胞は通常神経細胞／ニューロン、星状膠細胞、希突起膠細胞を生じさせ；消化管壁由来の上皮幹細胞は通常消化特異的細胞型を生じさせ；表皮の基底層から回収される皮膚幹細胞は通常ケラチノサイトを生じさせ、さらに毛包表皮の基部から回収される濾胞性幹細胞は通常毛包細胞と表皮細胞を生じさせる。
本発明は、非誘導組織（例えば、それらが誘導された組織と異なる細胞型）に分化できる幹細胞を提供する。この能力は可塑性と言われる。従って、本発明の幹細胞は、（ａ）遺伝的に同一細胞（例えば、同じ細胞又はクローン）の系統を生成することによって、及び（ｂ）多数の特殊化細胞型に分化することによって機能しうる。
【００１０】
本発明の幹細胞は、（１）生きている組織中の細胞を分子マーカーで標識して特殊化細胞型を決定すること；（２）生きている組織（すなわち、ドナー、被験者又は患者）から細胞を除去し、細胞を培養後、in vivo操作（例えば、１以上の核酸配列の導入又は１以上の分化誘導置換基の添加）によって前記細胞がなりうる特殊化細胞型の範囲を決定すること；及び（３）生きている組織（すなわち、同一又は異なる遺伝的バックグラウンドのドナー、被験者又は患者）から細胞を除去し、この細胞を培養後に標識してから細胞を移植して宿主（例えば、同一又は異なる遺伝的バックグラウンドのドナー、別の被験者又は患者）に戻して該細胞が元の組織に以前のように住みつくかどうか決定することによって同定される。それぞれの新しい幹細胞の子孫に対するユニークなアイデンティファイヤーを与えるウイルスで幹細胞を感染させて、幹細胞クローンが、必要な患者（例えば、ドナー又は宿主）内の１種以上の損傷組織に以前のように住みつくことを実証する。
【００１１】
本明細書で述べるように、本発明は、成熟哺乳類宿主の体腔空間由来の多能性幹細胞を発育させ、補給し、及び回収する方法を提供する。本発明により、成熟哺乳類宿主の体腔空間から回収される細胞は（ａ）幹細胞のクローン集団を創造でき；（ｂ）in vitro又はin vivo（例えば、in situ）増殖して多数の幹細胞子孫を生成することができ；（ｃ）in vitro操作（例えば、可塑性を示す）又はin vivo操作で１つ以上の特殊化細胞型に分化しうる。哺乳類宿主の体腔空間から回収される幹細胞の増殖、操作、及び分化方法も提供される。本明細書では、成熟哺乳類宿主の体腔空間から回収される幹細胞の増殖、操作、及び分化は、一般的に懸濁液中又は細胞が付着しうる基材（例えば、単層、三次元網目構造）上で行われる。１つ以上の付着分子、化学薬品又は生物学的物質をその表面上に有する基材又は第２の細胞を使用しうる（例えば、架橋した又は架橋していないアミノ酸、核酸、ポリマー、多糖類など）。或いは、幹細胞の増殖、操作及び分化を回収前又は回収せずに宿主内で実施することができる。本明細書では、生物学的物質は、細胞、組織、又は器官に影響しうる有機化合物である。
【００１２】
本発明の幹細胞の増殖及び分化は適切な条件下、ex vivo又はin vivoのどちらかで以下のように誘導される：（ａ）in vitro増殖及び分化後、宿主への組込み；（ｂ）in vivo増殖後、宿主への組込み、さらにin vivo増殖及び／又は分化；（ｃ）宿主への組込み後、増殖及び分化（すなわち、in vivo）。本明細書では、in vivo（例えば、宿主内）増殖及び／又は分化は、外科的手順、注入手順、非外科的アプローチ（例えば、医薬操作で幹細胞を増殖させるアプローチ）、又はこれらアプローチの組合せと共に起こりうる。増殖及び分化は、可能な場合は制御された刺激下である。一般に、in vitro細胞培養の条件は生理的条件に近い。
【００１３】
幹細胞を培養するとき、培養基は一般的に幹細胞又は細胞特殊化に適した標準条件下で使用される培養基である。当業者に知られているように、成長促進シグナル又は置換基で補充することができる。本明細書では、用語“成長促進シグナル”、“成長促進置換基”、“増殖誘導シグナル”、“増殖誘導置換基”、又は“成長因子”は、通常、細胞に対して成長、増殖、及び／又は栄養効果を有する化合物（例えば、タンパク質、ペプチド又は他の分子）又は刺激物を指す。本明細書では、“分化誘導シグナル”、“分化誘導置換基”は、通常、細胞の分化又は特殊化を誘導する化合物又は刺激物を指す。このような化合物は一般的に“シグナル”又は“置換基”と呼ばれる。当業者は、１種以上の置換基を併用しうることを認識しており、成長、増殖及び細胞型特異的分化を促す組合せは技術的に周知なので、成長、増殖、及び分化の誘導は過度の実験を要しない。シグナル又は置換基の例として、サイトカイン、成長促進薬剤、成長因子（例えば上皮成長因子（EGF）、アンピレグリン(amphiregulin)、線維芽細胞成長因子（PDFG）、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（TRH）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、及びインシュリン様成長因子（IGF）が挙げられる。通常このような置換基は、約１fg/ml〜１mg/mlの範囲の濃度で培養基に添加される。培養条件を最適化するため、簡単な滴定を行って最適な置換基濃度を容易に決定することができる。さらなるシグナルとして、機械的シグナル及び／又は電気的シグナル（例えば、細胞-細胞接触、接着、移動、電気的刺激、物理的圧力、歪み等が挙げられる。
【００１４】
〔体腔空間〕
本発明は、哺乳類（例えば、ドナー又は宿主）の体腔空間内に異物を導入又は移植して体腔空間内での幹細胞の形成、蓄積及び補充を誘導する。例として腹膜腔、皮下空間、胸膜空間、肺及び／又は脳空間が挙げられる。これら領域は特に、保護かつ空間が制限されている器官、血管、又は骨髄に比べて一般的に大きく（生物学的に）、周囲を取り巻く有意な面積を有することが多く、一般にアクセスが容易である。本明細書では、体腔空間を“腔”、“腹膜腔”、“皮下腔”、“肺腔”、“胸膜腔”、“脳空間”及び“腔空間”と呼ぶこともある。
【００１５】
本明細書では、“異物”は、体腔空間に導入して体腔幹細胞内で幹細胞を形成するように誘導するいずれの物体（固体、液体又はゲル）をも含み、ここで、形成は、体腔空間内での幹細胞の移動、補充及び蓄積を包含する。例として、分解性移植片、非分解性移植片、炎症薬（例えば、ワクチンアジュバント、死細胞フラグメント）、線維性物質、医薬組成物、注射可能物質（液体、ゲル、又は固体）、生体適合性組成物（タンパク質、核酸、ポリマー、染料、プラスチック、合成若しくは天然薬物、化学的同位体、金属複合材など）、医薬点滴注入液（例えば、生理食塩水、デキストラン、水）並びに外科手順で用いる組成物又は材料が挙げられる。生体適合材料(biomaterila)は、層又は混合物状態の単一組成物若しくはポリマー又は多くの材料の複合ブレンドでよく、生物学的成長を促すと考えられる物質を包含しうる。本発明の一態様では、本発明の移植片は、細胞の生物学的固定を可能にする生体適合性支持体である。或いは、医薬点滴注入液（例えば、水、デキストラン、生理食塩水）のような異物の体腔空間への流入によって幹細胞惹起を促進する。
【００１６】
体腔空間へのアクセスは外科的アプローチ、注射、潅流などによる。外科手術として、腹横壁切開術、腹腔鏡検査外科手術（１又は複数の小切開術又は体腔にアクセスするための器具の使用）、内視鏡検査（フレキシブル内視鏡によるアクセス）などが挙げられる。注射は通常針と注射器で行う。当業者は体腔空間アクセス及び体腔空間への浸入を可能にする方法及び技術を知っている。
【００１７】
一般に、腔が大きいほど（例えば、腹膜腔、肺腔、又は胸膜腔）、多能性幹細胞の収率が高い。これは部分的に、空間が大きいほど細胞移動の通路が広く、大量の流体を注入かつ取り出せるので、大量の細胞を空間から収集しうる。必要な場合、数ラウンドの注入及び取り出しを行って持続的に体腔空間から幹細胞を回収してもよい。一態様では、細胞の腔からの収集は、腹膜に流体を装填すること及び流体を排出することと同じくらい簡単である。本発明は、異物を腔中に導入した後だけ、本当の意味で流体が幹細胞を含有することを見出した。例えば、腹膜透析と同様の方法を行うことができ、この方法ではカテーテルを用いて腹部を３リットルまでの溶液（例えば、透析液）で満たし、体から排出すときは腹腔の壁（すなわち腹膜）から流体を腔内由来の他の粒子といっしょに溶液として戻す（透析する）。
【００１８】
〔幹細胞回収〕
一般的に、哺乳類であるドナーの腔から本発明の幹細胞を回収する。体腔空間と多能性幹細胞を生成する能力のあるいずれの動物も幹細胞ドナーとして使用することができ、例として昆虫、魚類、爬虫類、鳥類、両生類、及び哺乳類が挙げられる。本発明により、ドナーから回収した幹細胞は、多くの用途で利用可能であり、遺伝子操作、診断、表現型化(phenotyping)、スクリーニング、及び／又は異種(heterologous)、自家、又は異種(xenogeneic)の宿主への移植が挙げられる。
【００１９】
ドナーの腔から得られる幹細胞は、一般的に、体腔空間を洗浄するために用いる流体を収集することによって回収される。細孔のある三次元マトリックスのような移植材料内及びその周辺から該細胞を収集することもできる。本明細書では、洗浄には胃洗浄(lavage)、透析、医薬滴下注入及び体腔空間から細胞を収集するための他の洗浄、潅流、破壊又は分離方法が含まれる。また、腔内かつ一般的に無菌手順下でいずれかの細胞外マトリックス組織又は移植片からの分離（洗浄前又は後）によって細胞を収集してもよい。分離及び／又は破壊が必要な場合、酵素（例えば、トリプシン、コラゲナーゼ）による処理又は物理的方法（例えば、鈍器使用）のような技術的に周知の日常的方法を実施する。洗浄／分離に使う流体は水、生理食塩水、医薬滴下注入液、デキストラン、又は組織培養基（例えば、HEH、DMEM、PRMI、F-12を単独使用又は併用）のような定型的又は改変したpH平衡（生理的に）溶液でよい。一態様では、細胞を低速（例えば、200〜2000rpm）で遠心分離してから新鮮な培養基に再懸濁後、固定物質上又は懸濁液中で培養する。或いは、細胞を流体と共に収集する。洗浄／分離に使う流体は、例えば成長、細胞代謝に必要なもの（例えば、成長因子、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、及び／又はタンパク質など）及び酵母、細菌、真菌などによる感染を予防するもの（例えば、抗菌剤、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤）のような１種以上のシグナル、置換基及び／又は補充物質を含有してもよい。洗浄及び分離流体並びに新鮮培養基は血清と共に又は血清なしで使用する（例えば、ウシ、ウマ、ニワトリなどから）。細胞を収集し、細胞の成長、分化、脱分化、増量、不死化、特殊化を誘導するため、また移植のために使用する日常的な培養基は技術的に周知である。洗浄に好適な流体を得るために過度の実験は必要ない。さらに、細胞収集の最適化方法は当業者には日常的なことである。収集した細胞を成長、分化、又は他の操作のために移す場合、必要に応じて連続的又は周期的に適切な培地を交換又は潅流する。標準的な培養法を使用して、回収／収集した細胞をいずれの所望量まで（例えば、細胞増量のため）もさらに富化することができる。別の既知方法を用いてこの富化を達成しうる（例えば、ネガティブ選択法又はポジティブ選択法）。この手順又は他の技術的に公知の手順によって幹細胞及び前駆細胞を望ましいいずれかの程度に濃縮することができる。代替手段として、レトロウイルスで感染させたパッキング細胞系を用いることが挙げられ、或いはこのようなパッキング細胞系の培養から得た上清を、本発明に従い、かつ富化幹細胞プールと共に実施する場合（さらなる分化又は増殖誘導置換基の存在する場合でさえ）に回収される幹細胞に加えると、幹細胞のin vitro感染を得るための非常に効率的な手段を与える。
【００２０】
回収に関する幹細胞の用途の例として、増殖の誘導、細胞増量、１以上の特殊化細胞型への分化、遺伝子修飾、短期又は長期貯蔵（例えば、凍結保存又は技術的に既知のいずれかの方法）、スクリーニング、診断探索、表現型化、及び移植のような治療措置、化学療法、病気治療、病気予防、及び細胞、器官又は組織の置換又は強化が挙げられる。
【００２１】
１以上の補充誘導置換基をドナーの腔に添加すると、腔から回収される幹細胞の実際の数を増やすことができる。本明細書では、“補充誘導置換基”は細胞の補充及び／又は増殖を刺激する置換基を指し、例として抗-縮瞳薬、抗-分化置換基、又は増殖誘導シグナルが挙げられる。この被験者やドナーから回収される幹細胞の補充及び増殖を高める能力が回収と治療措置との間の時間を減らし、本発明の効率を高め、かつこれが細胞強化の一形態である。
【００２２】
〔増殖〕
増殖を誘導するため、一般的に少なくとも１種の増殖誘導置換基又は物質（すなわち、細胞の表面上の受容体に結合して栄養効果又は成長誘導効果を発揮する分子のような、細胞分裂を含む通常栄養のある化学的因子又は生物学的因子）を通常補充してもよい。増殖誘導成長因子の例として、EGF、アンフィレグリン(amphiregulin)、FGFs、TGFsが挙げられ、単独で使用又は併用される。さらなる置換基、特に例えばビタミン、NGF、PDGF、TRH、TGF、BMP、GM-CSF、又はIGFのような血統特異的置換基を培養基に加えることができる。
【００２３】
本発明の細胞の増殖は体腔空間からの収集前又は収集後に起こってよく、同様の増殖誘導シグナルを使用することができる。腔から回収した細胞の増殖は、数時間ほどの早期に始まることもあり、数日かかることもある。一般に、体腔空間から回収した細胞を基材の上に置くと、細胞は数時間以内で付着するようになる。増殖後、新しい未特殊化細胞が培養中に現れる。これら増殖性細胞は一般的にクローン性である（すなわち、単一幹細胞の子孫である）。増殖誘導シグナルが持続して存在すると、培養の総細胞数が増加する。さらに、腔から回収される元の細胞は大きさが増す。上述したように適切な培養基を持続して提供すると、増殖性細胞が懸濁液中で増殖し続ける。培養中の増殖性細胞を継代して増殖を再開してもよい。重要なことに、増殖の継代と再開を連続的に繰り返すと（例えば、毎週）、各継代後に細胞数の対数的増加をもたらす。増殖及び／又は継代後、後述するような技術を用いて幹細胞を遺伝的にin vitro修飾することができる。
【００２４】
〔分化〕
成長につながる生物学的事象のカスケードを活性化するいずれの方法によっても本発明の細胞の分化を誘導することができ、例えば、遊離イノシトール三リン酸（ITP）、細胞内Ca2+、ジアシルグリセロールの遊離及び／又はタンパク質キナーゼC（PKC）及び他の細胞性キナーゼの活性化が挙げられる。分化は、他の細胞による化学的分泌、隣接細胞との物理的接触、及び環境内の他の特定分子（例えば、分子置換基）のような外部シグナルによって制御される。分化を誘導する方法の他の例として、ホルボールエステル、分化誘導成長因子及び他の化学的シグナル単独で、又は他のシグナルと時系列的又は併用した処理が挙げられる。さらに、細胞を固定基材（例えば、フラスコ、培養プレート、又はポリ-L-リジン及びポリ-L-オルニチンのようなイオン的に荷電した表面で覆われていてもよいカバースリップ）上に細胞を塗布して分化を誘導することもできる。分化を誘導しうる他の基材として、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンのような細胞外マトリックスに似たものが挙げられ、単独又は組み合わせて使用しうる。増殖誘導置換基の存在する懸濁液中でも分化を誘導することができる。
【００２５】
本発明の細胞の分化は、２時間ほどの短時間で起こり、或いは少なくとも１週間ほどの長期間で起こり、選択した血統によって決まる。本発明の方法で回収した細胞に適切な分化誘導剤を添加すると、多くの細胞が分化する。特有の細胞型又は血統の分化及び検出は、形態学的方法、免疫細胞化学的方法及び／又は免疫組織化学的方法によって、或いは細胞型特異的RNA又はDNAの発現によって決定しうる。例えば、細胞型特異的抗体、特異的遺伝子の発現、又は特異的組織化学アッセイを用いて細胞の特徴又は特殊化細胞の表現型特性を区別することができる。当業者は最もよい特異的細胞型を特徴づける方法論が分かるだろう。細胞は、細胞培養基に添加する置換基（又はその時系列）によって決まる１つのいずれかの細胞型に特殊化しうる。細胞型の例として、神経細胞（例えば、グリア、樹状突起）、非神経細胞（星状膠細胞、希突起膠細胞）、上皮細胞、造血細胞、肝細胞、心臓細胞、内皮細胞、筋細胞（平滑及び骨格）、表皮細胞、造骨細胞、軟骨細胞、間質性細胞、脂肪細胞が挙げられる。
【００２６】
〔遺伝子修飾及び操作〕
腹膜又は他のこのような腔空間から回収される幹細胞は非形質転換細胞であるが、それらは連続的細胞系の特徴を有する。未特殊化状態では、増殖誘導置換基の存在下、細胞は連続的に分裂するので、遺伝子修飾の優れた標的である。本明細書では、用語“遺伝子修飾”又は“遺伝子操作”は、異種核酸の意図的導入によって動物の腔から回収される細胞の遺伝子型を安定的又は過渡的に変えることを指す。核酸は合成的に誘導され、或いは天然由来でよく、遺伝子、遺伝子の一部、又は他の有用な核酸配列を含有しうる。
【００２７】
所望タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現を方向づけ、また分化を促すために使用しうるウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、変性肝炎ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、サイトメガロウイルス）又は哺乳類細胞特異的プロモーター又はトランスフェクション（例えば、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション）によって本発明の幹細胞に異種核酸を導入することができる。本明細書では、タンパク質は、問題のいずれのタンパク質又はタンパク質の組合せでもよく、検出用の選択可能マーカーに連結することができる。さらに、ベクターは薬物選択マーカーを含みうる（例えば、当該技術で公知の方法、Maniatis et al., 1982, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harabor, N.Y.を参照されたい）。
【００２８】
代替アプローチは、細胞の遺伝子構成を変える発癌物質を導入して細胞を無期限に増殖するように誘導することによって幹細胞を意図的に不死化することである。さらに、Bcl-2を投与して、或いはbcl-2遺伝子（その産物はプログラム細胞死（アポトーシス）を妨げることが分かっている）で細胞を遺伝子修飾することによって、細胞死をなくすように幹細胞、特に分化誘導された幹細胞を遺伝子修飾することができる。
【００２９】
本発明の遺伝子修飾した細胞は、細胞型特異的細胞になるように完全に特殊化する能力を有するという追加の利点を持っている。特殊化は再現性があり、かつ多くの周知の分化プロトコルのいずれによっても操作できる。一態様では、細胞／遺伝子治療のため、腔から回収した遺伝子修飾した幹細胞を、この遺伝子修飾幹細胞によって生成される１種以上の生物活性分子が必要な１種以上の異種及び／又は自家宿主に移植する。移植術については後で詳述する。或いは、移植前に遺伝子修飾幹細胞を１種以上の分化プロトコルに供してもよい。一旦細胞が特殊化したら、細胞を単離して、遺伝子修飾細胞によって発現されるタンパク質又は生物活性分子が必要な１種以上の宿主に移植することができる。
【００３０】
〔幹細胞の移植、リハビリテーション及び治療用途〕
本発明の一態様では、本発明の１種以上の幹細胞及び／又は組成物による移植を行って、１種以上の障害、病気、又は変性状態を治療又は予防し、或いは損傷した不十分な機能又は機能不全の組織／器官を修復又は交換し、或いは細胞、組織、又は器官の機能を高める。このような器官又は組織の損傷（患部とも呼ぶ）は、機械的、化学的、分子的、又は電解的な発作、変化又は異常由来でよい。本発明の組成物による移植は、当業者が必要と考えるような免疫抑制と共に行ってよい。ある場合には、遺伝子修飾（相同組換えによる遺伝子置換又は遺伝子ノックアウトを含む）した幹細胞を利用することができる。例えば、主組織適合複合体（MHC）遺伝子の切除術は技術的に周知である（Zheng et al., 1991, PNAS, 88:8067-8071）。MHC発現を欠く幹細胞は、免疫抑制を必要とせずに、同種間及び異種間の組織適合性関門を越えて本発明の細胞を使用することを可能にする。さらに、変化又は欠失したMHC抗原によるトランスジェニック動物の腔から移植用幹細胞を回収することができる。
【００３１】
移植により、本発明の幹細胞及び組成物が、神経患部全体又は当業者に適切と考えられる１以上の特定部位に送達される。器官又は組織の統合性を維持することが分かっているいずれかの方法で細胞を投与する。本発明の一態様では、移植した幹細胞又は細胞の特有成分を遺伝子修飾して１種以上のトレーサー（例えば、ローダミン-若しくはフルオレッセイン-標識ミクロスフェア、又は色あせない青の(fast blue)のビスベンズアミド、又はレトロウイルスを導入した組織化学マーカー、又は同位元素化合物、又は光-可変性化学薬品又は緑色蛍光タンパク質のような染料又はマーカー）を導入した。ここで、幹細胞は診断マーカーとして、探索のため、組織若しくは器官の再構築変化の可視化のため、１種以上の刺激物（例えば、電場、タンパク質、化学薬品、薬物などのような機械的又は化学的物質）に対する反応のマーカーのため、又は他の治療目的のために使用することができる。
【００３２】
生物工学目的でも本発明の幹細胞を使用することができる。一態様では、問題の組織を表現する三次元マトリックス（例えば、骨格）内で幹細胞を回収する。回収時、分化するように幹細胞を誘導してもよく、或いは誘導しなくてもよい。幹細胞を骨格内に留め、そこで幹細胞を遺伝子修飾又は誘導して分化させ、或いは幹細胞を骨格から取り出し、使用前にさらに操作してもよい。重要なことに、問題の部位で幹細胞をin vivo回収かつ誘導して分化させて新しい器官及び／又は組織を生じさせることができる。或いは、骨格を回収し、他の場所に移植し、又は被験者に供与する。
【００３３】
〔幹細胞によるスクリーニング、診断、試験、及び探索〕
腔から回収される本発明の幹細胞（分化誘導されているか又はされていない幹細胞）は治療の可能性のある組成物及び医薬製剤の毒素のスクリーニングに必須である。技術的に周知なように、in vitroで、薬用量を変えて組成物を細胞に適用し、増殖及び／又は分化の時間を変え、さらに細胞応答を経時的にモニターする。形態学的（物理的）、遺伝的、分泌性、伝導性（例えば、イオンチャンネル又は神経伝達）及び他のこのような応答を技術的に周知な１つ以上の方法（例えば、一般例としてウエスタンブロット、サザンブロット、ノーザンブロット遺伝子スクリーニング、免疫組織化学、タンパク質、受容体及び酵素アッセイ、エンザイム-リンクドイムノソルベントアッセイ（ELISA）、電気泳動分析、HPLC、ラジオイムノアッセイ、電気生理学的測定）で分析する。同様に、本発明の細胞型特異性又は増殖性幹細胞をフィーダー層（基材として作用）上で、又は三次元網目構造内で成長させうる。従って、スクリーニング前に幹細胞は既に分化を受けていてもよい。
【００３４】
in vitroスクリーニング及び試験と同様に、１種以上の特有の組成物又は製剤の非存在下及び存在下で移植した本発明の幹細胞（分化誘導あり又は無し）をその効率と安全性について観察する（例えば、宿主生存率、薬理学、生化学及び免疫学的効果など）。さらに、本発明の幹細胞又は型特異的細胞を用いて、細胞又は宿主上のインプラント又は別の移植片の効果を測定する。
【００３５】
用語“治療の可能性のある組成物”又は“医薬製剤”は、例えば、化学薬品、ポリマー、放射性物質、ウイルス、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、ヌクレオチド、薬物、プロドラッグ、インプラント、及びデバイスのようないずれの物質をも指す。本発明では、スクリーニング前に既に誘導して特殊化した細胞をもスクリーニングする。
【００３６】
本発明の幹細胞によるスクリーニング（in vitro又はin vivo、及び特殊化するためのさらなる誘導がある場合とない場合）は、工業的又は生物学的な薬品と化合物を試験及びモニターするための経済的方法を提供する。一態様では、in vitro又は宿主細胞の増殖、分化及び生存に関与する物質の迅速同定（例えば、高処理能力スクリーニング法によって）のために細胞を利用する。さらに、技術的に周知の方法を用いて本発明の幹細胞又は血統特異的細胞からcDNAライブラリーを構築することができる。それ自体では、細胞の調節、機能不全、修復、再構築などに関与する核酸又はその因子を分析し、工業的組成物及び／又は医薬製剤を設計してポジティブな細胞特徴を向上させ、かつネガティブな細胞特徴を中和する。診断プローブ、特に１以上の遺伝的障害又は機能不全を同定する診断プローブも開発される。さらに、可能性のある治療組成物又は工業組成物を分泌又は生成する能力について本発明の細胞を研究する。
本発明の種々の態様を完全に説明するため、以下に例を提供する。しかし、例は、添付の特許請求の範囲で定義したとおりの本発明の範囲を制限するものと決して解釈すべきでない。
【００３７】
〔多能性細胞の形成を蓄積及び誘導する例〕
本発明では、本発明の体腔空間内の幹細胞の補充又は回収によって炎症反応が起こる。炎症反応は一般的に体腔空間中に異物を導入することで（外科的又はその他のやり方で）誘導される。一態様では、マウスの腹膜腔内にインプラント（ポリエチレンテレフタレート（PET）ディスクが挙げられる）を外科的に置き、結果を偽手術を受けたマウスの結果と比較する。腔内での多能性細胞（例えば、幹細胞）の誘導は、腹膜空間へのインプラントの導入後少なくとも約２時間程度の早さで起こる（データ示さず）。インプラントは、少なくとも約14日間以上、多能性細胞の形成を誘導し続ける（データ示さず）。存在する細胞と腔に補充した細胞を腔の洗浄によって収集した。収集した細胞を培養に入れ、基材（例えば、培養プレート）に付着させた。培養では、付着した細胞は指数関数的速度で増量することが分かった。最初に付着細胞を見ると、図２に示されるようにいくつかの異なった形態的特徴が観察された。培養での細胞成長の数日、数週間及び／又は数ヶ月後、後述するように、幹細胞を誘導して異なる細胞型（造骨細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、及び樹状細胞が挙げられる）に分化させる。
明らかなように、腹膜腔由来の幹細胞の補充及び回収（例えば、洗浄液からの回収）には炎症反応及び異物が必要である。異物自体は、幹細胞が洗浄液に現れるため、及び培養で増殖するために必要である（データ示さず）。
【００３８】
〔幹細胞回収の例〕
一態様では、正中線切開でスイスウェブスターマウスの腹膜中に直径1.2cmのPETディスクの移植によって細胞を補充した。２枚のPETディスク（腹膜腔のどちらかの面に１枚のディスク）を移植後、創傷をスチール製創傷クリップで閉じた。インプラントの導入後種々の時間にマウスを犠牲にし、腹膜内の細胞を洗浄で収集した。洗浄は、少なくとも約４〜５mLのDMEM培地をマウスの腹膜へ注入し、種々の時点後に移動ピペットで洗浄液を慎重に回収することで実施した。次に、少なくとも約10％のウシ胎児血清（FBS）と、瀕死のマクロファージからの可能性のある細菌に対して、又は腸を保護するための１〜５％の抗生物質（例えば、ペニシリン及びストレプトマイシン）と共に回収培地（洗浄液）を組織フラスコ又は細胞培養プレートに入れた。付着する細胞は多能性幹細胞だった。最も重要なことに、最初の洗浄後、マウス１ｇ当たり約500,000個の幹細胞が回収された。同じ被験者について同一手順を数回以上繰り返して幹細胞の回収を続けた。例えば、腹膜透析を受けている被験者は、腹膜腔内に炎症反応を誘導する異物がある限り、毎透析処理後に幹細胞を回収する。
次に、増殖又は分化を誘導し又は誘導しない培養で付着性幹細胞を継代して維持した。普通の培養基、抗生物質及び最小限の血清補充の存在下では、幹細胞は少なくとも約１年間成長し続けた（例えば、前駆細胞の集団に分裂）（データ示さず）。
【００３９】
〔幹細胞成長の例〕
培養表面に洗浄液（腹膜腔を洗浄するために用いた）を添加後、通常紡錘状の付着性細胞が容易に認められた。十分な塗布時間、通常少なくとも約24時間後、非付着性細胞を除去し、この細胞に新鮮な培地を導入した。培養表面のランダムな領域で経時的に付着性紡錘状細胞を数えることでそれら細胞をモニターした。図３は、付着性細胞が指数関数的速度で成長したことを示す（菱形）。他方、インプラントの非存在下（例えば、洗浄前に腔内に異物を導入しない）のマウスの腹膜腔から回収し、上述したとおりの同じ方法で付着させた細胞は成長せず、最終的には通常少なくとも１週間以内に死んだ。一般に、最初の継代後、幹細胞だけが培養中に残った。純粋な多能性集団を保証するため、α-フェトプロテインをマーカーとして用いて集団をさらに“純化”することができる。
【００４０】
〔幹細胞補充の例〕
前述したように、炎症又は同様の反応（例えば、線維又は創傷治癒反応）の誘発は、幹細胞が蓄積し及び／又は体腔空間に移動するように誘導する。このことは、異物の非存在下では流体及びその炎症成分が幹細胞を回収できないので、異物と一緒に起こる。一態様では、16匹のマウス（その８匹の動物はインプラントを受け、８匹は死んだ）の腹膜から細胞を集めた。胃洗浄後、その抽出細胞から簡単な遠心分離で洗浄液を分離するさらなる工程によって細胞を腔から回収した。遠心分離後の洗浄液を蓄えてから２群（インプラントを受けた４匹、インプラントを受けなかった４匹）間で交換した。残存している８匹の動物（インプラントのある４匹、インプラントのない４匹）はそれ自身の洗浄液を保持した。全群から得た細胞を培養し、数日間にわたって紡錘状細胞を数えた。
図４は、これら培養細胞の成長曲線を示す。２週間を超えて数えた細胞数から分かるように、インプラントを受けたマウス由来の細胞は指数関数的速度で成長し（菱形と四角）、一方インプラントのないマウス由来の細胞は死んだ（三角と×印）。インプラント無しのマウスから回収した細胞にインプラントのあるマウス由来の洗浄液（多くの炎症性タンパク質及びケモカインを含有する）を導入した場合でさえ細胞は成長しなかった。さらに、図４は、幹細胞の形成、浸潤、及び回収を誘導するのは洗浄液自体ではなく異物の導入であることを示している。インプラントに導入した細胞は洗浄液の非存在下（四角）又は存在下（菱形）で成長したからである。
【００４１】
〔幹細胞の可塑性の例〕
異物の導入後のマウスの腹膜腔から回収した細胞を数週間及び数ヶ月間培養し、幹細胞として残し、いくらかを誘導して分化させた。普通の幹細胞については、本発明の幹細胞を数日又は数週間培養して細胞をコンフルエントに達するようにすると、分化のみならず細胞外マトリックスの生産をも促進することができる。培養基添加剤を加え、及び／又は培養条件を変えても分化が誘導された。同様に適切な条件下で細胞外マトリックス形成が誘導された。両挙動は本発明の幹細胞の可塑性を実証する。さらなる例を以下に提供する。
【００４２】
〔骨細胞への特殊化の例〕
骨細胞形成を誘導する技術的に周知な培養条件を取り入れることに加え、本発明の細胞による骨細胞分化は以下のように起こりうる。一態様では、DMEM、ウシ胎児血清（FBS）及び抗生物質の存在下、長期間の細胞成長で培養骨の小骨細胞の細胞凝集及び形成が起こり、継代前に高密度（例えば、コンフルエンス近傍又はコンフルエンス）になった。また、以下のように細胞を誘導すると骨細胞になる。洗浄後、インプラントのあるマウスから本発明の細胞を収集する。DMEM、５％のFBS及び２％の抗生物質を用いた24-ウェル培養プレートに細胞を塗布する。３時間後、新鮮な培地を各群に加えた（非付着性細胞と洗浄液を除去するため）。細胞を同じ培地内で少なくとも約５×104細胞／cm2の近似密度になるまで成長させる。次に、以下のような分化誘導添加物（置換基）を細胞に加える：（ａ）DMEM、５％のFBS、及び1000ng/mLの骨形態形成タンパク質（BMP）-2；（ｂ）DMEM、５％のFBS、及び300ng/mLのBMP-2；（ｃ）DMEM、５％のFBS、１％の抗生物質及び2.5ng/mLのTGF-β1；又は（ｄ）DMEM、５％のFBS、１％の抗生物質（コントロール）。少なくとも約１週間後、培地を同じ添加物と共に取り換える。少なくとも約第２週後、すべての群に、DMEM、５％のFBS、１％のPNC、及び４mmolのNaHPO4（細胞外マトリックス生産を促すため）を含有する新鮮な培地を与える。さらにNaHPO4含有培地と少なくとも約第３週後、脱イオン水に混合した２％のアリザリンレッドＳを用いて技術的に周知なように標準的なアリザリンレッドＳプロトコルで骨無機質化のために骨を染色する。図５Ａは、BMP-2を用いて骨細胞に誘導する例を示す。BMP-2で処理した細胞のカルシウムリッチマトリックスと周囲の小結節、並びにやはり赤に染色している周辺の多くの個々の細胞に注目されたい。図５Ｂは、BMP前処理のない幹細胞はポジティブな赤染色を示さないことを示している（画像上の暗部）。
【００４３】
〔神経細胞への特殊化の例〕
神経細胞形成を誘導する技術的に周知の培養条件を取り入れることに加え、以下のように本発明の細胞による神経細胞の分化が起こりうる。図６に示されるように、β-メルカプトエタノールとのインキュベーション後、細胞は、細胞体中心からの長く、分岐した突起があるニューロン様細胞に分化しうる。一態様では、突起は、培養プレートの半分に及ぶ長さに成長しうる。本発明の細胞は、培養中長時間後に突起を形成する（例えば、血清と抗生物質の存在下で少なくとも１カ月）。
別の態様では、DMEM、10％のFBSと培養後、洗浄で回収した幹細胞を以下のように誘導すると神経細胞になる。細胞を少なくとも約50％コンフルエンスに成長させた後、培地に10mMのβ-メルカプトエタノール（BME）を加える。BMEの導入後少なくとも約24時間で細胞のモルフォロジーが変化し始め；細胞本体が収縮してプロセスが仕上がる。BMEの添加後少なくとも約48時間で細胞は特殊化した多極性のモルフォロジーを示す。図７Ａと７Ｂは分化誘導置換基の導入後少なくとも約24時間で分化した神経細胞の２例であり、分化誘導置換基の添加前には観察されないモルフォロジーである。さたにＨ＆Ｅ染色（図８Ａと８Ｂ）及び神経特異的エノラーゼ（NSE）と神経フィラメント-M（NFM）（図９Ａ、９Ｂ、及び９Ｃ）に対する疫組織化学染色で細胞を神経細胞と同定した。神経特異的誘導置換基で分化するように誘導した神経細胞だけが、NSEとNFMの両方にポジティブに染色する。
【００４４】
〔骨格筋細胞への特殊化の例〕
技術的に周知なように骨格筋細胞形成を誘導する培養条件を実施し、かつ以下の条件を実施することによって、本発明の細胞による骨格筋細胞の分化が起こりうる。腹膜腔から洗浄によって回収した幹細胞を培養表面に導入後少なくとも約数週間で、DMEM、FBS、抗生物質及び5-アザシチジンの存在下で骨格筋細胞のモルフォロジーが変化し始める。これら細胞が形態学的にどのように見えるかの例を図10に示す。図10Aと10Bではっきり見える骨格横紋筋及びさらなる培養後、筋管が形成され、図10C及び10Dのように見えることに注目されたい。
【００４５】
〔平滑筋細胞への特殊化の例〕
平滑筋細胞形成を誘導する技術的に周知な培養条件を実施し、かつ以下の条件を実施することによって、本発明の細胞を誘導して平滑筋細胞に分化させることができる。腹膜腔から細胞を回収し、DMEM、FBS及び抗生物質中で少なくとも約２週間培養、時には２回の二次培養後、幹細胞から抽出したRNAは、増殖性平滑筋細胞に優先的又は特異的に存在する特有のタンパク質と同様のモルフォロジー及び発現を示す。例えば、培養少なくとも約２週間後、平滑筋細胞も本発明の幹細胞もIII型コラーゲン及び平滑筋アクチン重鎖-5'を発現する（データ示さず）。
【００４６】
〔樹状細胞への特殊化の例〕
樹状細胞形成を誘導する技術的に周知な培養条件を実施し、かつ以下の条件を実施することによって、本発明の細胞を誘導して樹状細胞に分化させることができる。前述したように、インプラントのあるマウスの腹膜腔から回収した本発明の細胞を洗浄によって収集する。少なくとも約10％のFBSと１％の抗生物質を有するDMEMに細胞を懸濁させる。次に、少なくとも約３時間24ウェルプレート上で細胞を培養後、非付着性細胞を捨て、新鮮な培地（上述したような）を細胞に加える。細胞をコントロール群と分化誘導する群に分ける。一態様では、分化誘導置換基がGM-CSF（20ng/mL）とIL-4（20ng/mL）を含む。このような置換基の添加後、通常均一に、培養プレートを越えてモルフォロジー変化が起こり、各細胞の伸長（例えば、コントロールより長いモルフォロジー）及び図11に示されるような高速の成長を含む。図11は、６日間観察した場合のコントロール細胞（四角）とGM-CSF及びIL-4の分化誘導置換基を受けた細胞（菱形）の成長プロファイルを示す。培養少なくとも約１週間後、新鮮な培地を加えた。なお、コントロール細胞は上述した同一の培地（DMEM、FBS及び抗生物質）を受け、高度に増殖している細胞は、GM-CSF（20ng/mL）とIL-4（20ng/mL）に加えて同一の培地を受けて樹状細胞の成熟を誘導した（培養における樹状細胞の例については図12Aを参照されたい）。次に、少なくとも約24時間細胞を培養してから10％ホルマリンで固定化して樹状細胞マーカー存在の免疫染色法を行った（図12B及び12C参照）。技術的に公知なように、樹状細胞は、他のマーカーのうち、MHC II、CD86、及びCD40を発現する。さらに、最近の研究は、CD11cの発現によって樹状突起を選択できることを示した。従って、CD11cに対する抗体で免疫染色される細胞（例えば、抗体結合磁気ビーズ）は樹状細胞と考えられる。図13A及び13Bは、上述したように樹状細胞に分化するように誘導した細胞はCD11cにもポジティブであることを示している（抗-CD11-FIT-C連結抗体を用いて示されるように；矢印参照）。ポジティブ蛍光は細胞周辺で最も顕著である。他方、図13C及び13Dに示されるようにコントロール幹細胞（分化誘導シグナル無し）の表面上ではCD11c抗体が検出されない。
【００４７】
〔脂肪細胞への特殊化の例〕
脂肪細胞(adipocyte and fat cells)形成を誘導する技術的に周知な培養条件を実施し、かつ以下の条件を実施することによって、本発明の細胞を誘導して脂肪細胞に分化させることができる。洗浄によって腹膜腔から回収した細胞を、DMEM中20％のFBSと共にDMEM中で培養して90％以上のコンフルエンスまで成長させた。次に、培養基をα-MEM、10％のFBS、10％のウサギ血清、10％のデキサメタゾン、５μg/mLのインシュリン、及び50μMの5,8,11,14-エイコサテトライン酸(eicosatetraynoic acid)と交換した。培養少なくとも約２日後、デキサメタゾンを除く同一培地で細胞を培養した。次に、少なくとも１週間細胞を維持すると、通常その間に脂肪細胞の誘導が始まることが分かる。細胞が大きく、丸く、かつ細胞膜内に非常に大きい黄色の嚢を示す場合、細胞が脂肪細胞であることを示唆している。図14A及び14Bに示されるように細胞をオイルレッドＯ（脂質レザバー内で、細胞マトリックス又は細胞体の残部より可溶性な染料）で染色して脂肪細胞と同定した。
分化誘導していない幹細胞はオイルレッドＯポジティブに染色しなかった（図14D）。
【００４８】
〔分化／細胞特殊化を誘導するために用いるいくつかのプロトコルの例〕
神経細胞特殊化プロトコル：
１．20％FBSで70％のコンフルエンシーに増量
２．少なくとも約24時間、EMEM中１mMのβ-メルカプトエタノール、20％FBSで誘導
３．EMEM中10mMのβ-メルカプトエタノール、20％FBSを有する新鮮な培地
神経細胞特殊化の代替プロトコル：
１．神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、又は星状膠細胞系との共培養
２．神経細胞、グリア細胞、シュワン細胞、又は星状膠細胞系から得た条件づけ培地で育て、或いは少なくとも１種の細胞外マトリックスタンパク質を導入
脂肪細胞特殊化プロトコル：
１．DMEM、20％FBSで90％以上のコンフルエンシーに増量
２．α-MEM、10％FBS、10％ウサギ血清、10-8 デキサメタゾン、５μg/mLのインシュリン、及び50μMの5,8,11,14-エイコサテトライン酸を有する培地と交換
３．少なくとも２日後、２と同様であるがデキサメタゾンのない培地で育てる
４．分化は、数日という早期に始まり、或いは少なくとも約１週間かかることもある
樹状細胞特殊化プロトコル：
１．少なくとも約９日間又は９日まで、IL-4及び／又はSCF（幹細胞因子）と組み合わせたDMEM、血清及びGM-CSFで培養して細胞を成長させる
２．３〜５日毎に新鮮な培地と交換
３．少なくとも24時間、１用量のGM-CSF及びTNF-αと共に続ける
筋細胞特殊化プロトコル（筋芽細胞、筋管、及び心筋細胞を含む）
１．10〜20％のFBS（任意に、かつ５％のウマ血清）を有するDMEM中で細胞を成長させ、少なくとも約90％を超えるコンフルエンシーには細胞を到達させない
２．細胞を再塗布して少なくとも約80％のコンフルエンシーを達成させる
３．5-アザシチジン又は5-アザ-2'-デオキシシチジンを含有するDMEMで育てる
４．24時間後、5-アザシチジン又は5-アザ-2'-デオキシシチジンを有する培地を除去し、添加物のない同じ培地で再び育てる
５．培養を続けると、通常少なくとも約７日後に筋管が現れる
筋細胞特殊化の代替プロトコル：
１．筋芽細胞又は心筋細胞系と共培養
２．筋芽細胞条件づけ培地又は細胞外マトリックスタンパク質で育てる
軟骨細胞特殊化プロトコル（軟骨細胞(chondrocyte)及び軟骨芽細胞(chondroblast)を含む）
１．DMEM、血清及び抗生物質で細胞を培養
２．FGF、及び／又はIGF-I、及び／又はTGF-β1を含有する培地を添加
軟骨細胞特殊化の代替プロトコル：
１．DMEM、血清及び抗生物質で細胞を培養
２．少なくとも１週間後、細胞を三次元マトリックス（例えば、生体適合材料ベース、ポリマーベース、又は例としてヒアルロン酸、プロテオグリカン、コラーゲン、及び／又は脱塩化骨を含有）に細胞を導入
３．任意的に：細胞株勾配を培養条件に導入（技術的に周知のプロトコルで）して細胞外マトリックス生産を促進
骨細胞特殊化プロトコル（造骨細胞(osteoblast)及び骨細胞(osteocyte)を含む）
１．少なくとも約90％のコンフルエンシーまで、血清と抗生物質を有するDMEM中で細胞を成長させる
２．組換えBMP-2（又は別のBMP）を含有する同一培地と交換
３．任意的に：少なくとも約12〜24時間後、別の用量の組換えBMP-2を添加
４．培養すると、肉眼で小骨が認められる
骨細胞特殊化の代替プロトコル：
１．DMEM、血清及び抗生物質で細胞を培養
２．少なくとも１週間後、いずれかの３次元マトリックス（例えば、生体適合性材料ベース、ポリマーベース、又は例としてヒアルロン酸、プロテオグリカン、コラーゲン、及び／又は脱塩化骨を含有）に細胞を導入
【００４９】
本発明は、哺乳類の体腔空間に異物を移植し、該体腔空間内に幹細胞を蓄積させることによって、多数の未特殊化幹細胞及び多くの型の特殊化細胞を生成する手段を提供する。それ自体では、幹細胞の回収のために現在利用されている方法（例えば、骨髄から）に比し、本発明の方法では200倍を超える数の幹細胞を回収することができる。本発明の蓄積された幹細胞（特殊化及び／又は未特殊化）は、in vivo又はex vivo用途に適用できる。従って、本発明の幹細胞は宿主哺乳類内で蓄積して当該宿主内に幹細胞として留まるか、或いは特殊化細胞型に誘導又は宿主から回収後、それが必要な別の被験者のために使用することができる（例えば、生物工学目的のため）。同様に、本発明の幹細胞は、細胞及び製品スクリーニングのため、診断ツールとして（例えば、生物学的マーカー）、細胞の機能不全又は異常に関与する１以上の状態の予防と治療のためのような多くの商業的用途に適用でき、かつ樹立細胞系、cDNAライブラリーを作成するため、治療薬を製造するため、また遺伝子工学で使用することができる。それ自体では、本発明の細胞、細胞系、及び組成物は多くの用途で使用することができ、移植(transplantation)、移植(engraftment)、リハビリテーション、細胞置換、診断、化合物及び薬物スクリーニング、生物工学などが挙げられる。
【００５０】
以前に確立された方法で回収される幹細胞と異なり、本発明の幹細胞は、誘導して骨髄由来造血幹細胞、骨髄由来間充織幹細胞、及び脳及び脊髄の神経細胞に分化させることができるので、真の可塑性を示す。
本発明の別の局面により、哺乳類の体腔空間に異物を移植し、幹細胞を蓄積させることによって、分化及び増殖能力を有する多能性細胞の形成を誘導する方法が提供される。さらに、別の局面は、体腔空間への異物の導入後、生理学的溶液で体腔空間を洗浄することによって、哺乳類の体腔空間から増殖及び分化能力を有する多能性細胞を回収する方法である。重要なことに、生理学的溶液は、例えば、ペプチド、サイトカイン、抗生物質、抗炎症薬及び／又は炎症誘発薬、抗酸化剤、他の栄養物、成長誘導シグナル、増殖誘導シグナル、分化誘導シグナル、及び／又は分化遮断シグナルを含みうる。
本発明のさらに別の局面により、哺乳類の体腔空間内に少なくとも約２時間異物を導入することによって、分化能及び増殖能を有する幹細胞の蓄積のための環境を創造する方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらに別の局面は、哺乳類の体腔空間に異物を導入後、哺乳類の体腔空間に蓄積した幹細胞を回収して、この回収した細胞をそれが必要な患者に導入することによって、哺乳類の体腔空間から回収した幹細胞による宿主の病気を治療する方法である。一般的に、幹細胞を患者に導入する前に幹細胞を増殖（例えば、増量）させうる。一般的に幹細胞を用いて、細胞異常のある疾患（遺伝子疾患、老化及び年齢関連障害、獲得疾患、腫瘍（例えば、癌）を含む）、並びに組織損傷（例えば、傷害又は炎症）を治療し、また修復する。さらに別の局面では、１以上の幹細胞が増殖し、遺伝子操作を受け（例えば、１つ以上のウイルス、医薬品、又はタンパク質、遺伝子、ペプチド、標識、細胞若しくは化学的防護剤のような生物学的物質など）、及び／又は分化するように誘導される。
本発明の別の局面は、幹細胞のクローン集団を作製する方法である。それ自体では、幹細胞を誘導して分化、増殖させ、及び／又は被験者に導入しうる（典型的に、所望の細胞型の細胞が被験者内に存在する）。さらに、１以上の多能性幹細胞を被験者に提供する方法に加え、多能性幹細胞が提供される。なおさらに、cDNAライブラリー、該ライブラリーの構築方法、該cDNAライブラリーから得られる１以上の診断プローブが提供される。それ自体では、細胞の調節、機能不全、修復、再構築などに関与する核酸又はその因子を分析し、かつ組成物及び／又は医薬製剤を設計してポジティブな細胞の特徴を高め、かつネガティブな細胞の特徴を中和する。
【００５２】
本発明のさらに別の局面により、体腔空間に異物を導入し、体腔空間に蓄積する細胞を回収して培養後、不死化遺伝子の取込みに許容される条件下で細胞に不死化遺伝子を導入し、細胞に自己再生及び特殊化させることによって、哺乳類の体腔空間から回収した細胞を不死化する方法が提供される。
本発明のさらに別の局面は、哺乳類の体腔空間から回収し、タンパク質を生産できる１以上の遺伝子で不死化した幹細胞（又はその集団）であり、ここで、幹細胞は、前記タンパク質の生産を刺激する物質で誘導されると該タンパク質を発現できる。
本発明のさらに別の局面は、非-腔由来細胞の少なくとも１つの特性を発現するように誘導されている、哺乳類の体腔空間から回収される幹細胞と、医薬的に許容しうる担体とを含んでなる組成物であって、（ａ）少なくとも１種の非内因性核酸配列が前記細胞に導入されており、（ｂ）少なくとも１種の非内因性ペプチドが前記細胞に導入されており、及び／又は（ｃ）少なくとも１種のモノクロナール抗体が前記細胞に導入されている、組成物が提供される。前記特性の例として、神経細胞、星状膠細胞、樹状細胞、造血細胞、肝細胞、心臓細胞、骨格細胞、上皮細胞、脂肪細胞、肺胞細胞、眼球細胞、内皮細胞、造骨細胞、軟骨細胞、表皮細胞、膵細胞、腎細胞、腱細胞、及び生殖細胞として定義される特性が挙げられる。これら幹細胞は、細胞機能（例えば、肝臓細胞、腎臓細胞の機能）、物理的構造（骨又は脂肪細胞）を有することがあり、或いは糖尿病、肝不全又は腎不全のような病気の治療、形成外科などのための必須タンパク質又は生物学的物質（例えば、インシュリン、成長因子）を生成しうる。
【００５３】
本発明のさらに別の局面では、in vitro又は宿主細胞の成長に関与する物質の同定に使用できる、本発明の体腔空間から回収される幹細胞が、そのような物質の試験方法に加えて提供される。前記物質の例として、認可医薬品及び治験医薬品、農薬、食品、工業目的で使用する化学製品、及び既知又は疑いのある毒素が挙げられる。
本発明は、細胞ベース治療に使用しうる細胞の製造方法であって、哺乳類の体腔空間から回収される細胞が１以上の特殊化細胞型に分化するように方向づけられ、かつヒトの病気を治療するために患者に導入される置換細胞の再生可能源（例えば、損傷組織若しくは器官又は病的組織若しくは器官への移植に耐え、器官又は組織に以前のように住みつき、移植後の周囲組織に統合する）として役立つ方法が提供される。
前述の詳細な説明を読めば、本明細書で述べるとおりの本発明のさらなる目的、利点及び新規な特徴が当業者には明かであり、或いは本発明の実施によって確認することができる。本発明の目的及び利点は、本明細書で詳細に指摘した手段及び組合せによって実現かつ達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の幹細胞の多能性を示す例である。
【図２】本発明の細胞の回収及び基板への塗布後の光学顕微鏡写真を示す。
【図３】時間と本発明の幹細胞生産との関係を示し、インプラントにさらした細胞（菱形）とインプラントにさらさない細胞（四角）を示している。
【図４】本発明による経時的な線維細胞の成長を示し、洗浄液と共にインプラントにさらした細胞（菱形）と洗浄液なしでインプラントにさらした細胞（四角）とインプラントにさらさない細胞（×印又は三角）を示す。
【図５Ａ】カルシウムリッチ造骨細胞凝集体を形成するように誘導した本発明の細胞の概観を示す。
【図５Ｂ】ランダムな分布を示すコントロール細胞又は未分化細胞の概観を示す。
【図６】特殊化神経細胞になるように誘導した後の本発明の細胞の概観を示す。
【図７Ａ】典型的な神経細胞モルフォロジーを有する特殊化神経細胞になるようにさらに誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図７Ｂ】典型的な神経細胞モルフォロジーを有する特殊化神経細胞になるように
【図８Ａ】典型的な神経細胞モルフォロジーを表示することで特殊化神経細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図８Ｂ】典型的な神経細胞モルフォロジーを表示することで特殊化神経細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図９Ａ】NFMにポジティブな染色後、特殊化神経細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図９Ｂ】NFMにポジティブな染色後、特殊化神経細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図９Ｃ】NFMにポジティブな染色後、特殊化神経細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図９Ｄ】分化誘導せず、かつNFMポジティブ染色を示さないな幹細胞を示す。
【図１０Ａ】横紋筋を有する特殊化筋細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図１０Ｂ】横紋筋を有する特殊化筋細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図１０Ｃ】線状成長パターンを有する特殊化筋細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図１０Ｄ】筋管形成能（長期培養後、筋管の末端でアンカーに溝がついている）を有する特殊化筋細胞になるように誘導した本発明の幹細胞の概観を示す。
【図１１Ａ】本発明による時間の関数としての細胞成長を示し、成長誘導シグナルがない場合（四角）と比較したGM-CSF及びIL-4（菱形）への暴露を示す。
【図１１Ｂ】本発明による時間の関数としての細胞成長を示し、成長誘導シグナルがない場合（四角）と比較したGM-CSF及びIL-4（菱形）への暴露を示す。
【図１２】細胞の樹状細胞への特殊化を促進する１種以上の分化誘導シグナルの添加後の本発明の細胞の概観を示す。
【図１３Ａ】樹状細胞への分化を誘導後、免疫細胞化学が達成された本発明の幹細胞パネル概観を示し、矢印は、CD11cを表示しない（非ポジティブ染色）コントロール細胞と比較したいくつかのCD11cポジティブ細胞、すなわち樹状細胞のユニークマーカーを示す。
【図１３Ｂ】樹状細胞への分化を誘導後、免疫細胞化学が達成された本発明の幹細胞パネル概観を示し、矢印は、CD11cを表示しない（非ポジティブ染色）コントロール細胞と比較したいくつかのCD11cポジティブ細胞、すなわち樹状細胞のユニークマーカーを示す。
【図１３Ｃ】樹状細胞への分化を誘導後、免疫細胞化学が達成された本発明の幹細胞パネル概観を示す。
【図１３Ｄ】樹状細胞への分化を誘導後、免疫細胞化学が達成された本発明の幹細胞パネル概観を示す。
【図１４Ａ】脂肪細胞への細胞の特殊化を促進する１種以上の分化誘導シグナルの添加後の本発明の幹細胞の画像を示し、分化した幹細胞はオイルレッドｏポジティブであり（暗部）、脂肪細胞への分化を誘導しない細胞はオイルレッドｏポジティブでない（非暗部）。
【図１４Ｂ】脂肪細胞への細胞の特殊化を促進する１種以上の分化誘導シグナルの添加後の本発明の幹細胞の画像を示し、分化した幹細胞はオイルレッドｏポジティブであり（暗部）、脂肪細胞への分化を誘導しない細胞はオイルレッドｏポジティブでない（非暗部）。
【図１４Ｃ】脂肪細胞への細胞の特殊化を促進する１種以上の分化誘導シグナルの添加後の本発明の幹細胞の画像を示し、分化した幹細胞はオイルレッドｏポジティブであり（暗部）、脂肪細胞への分化を誘導しない細胞はオイルレッドｏポジティブでない（非暗部）。
【図１４Ｄ】脂肪細胞への細胞の特殊化を促進する１種以上の分化誘導シグナルの添加後の本発明の幹細胞の画像を示し、分化した幹細胞はオイルレッドｏポジティブであり（暗部）、脂肪細胞への分化を誘導しない細胞はオイルレッドｏポジティブでない（非暗部）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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2007525193.tif 000009
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2007525193.tif 000013
【図１２】
2007525193.tif 000014
2007525193.tif 000015
2007525193.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月24日(2007.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を製造するための異物の使用であって、該幹細胞が以下の工程を含む方法によって製造される、該使用：
哺乳類の体腔空間に前記異物を導入する工程；
前記体腔空間を少なくとも１回生理的溶液で洗浄する工程；及び
前記生理的溶液を収集して多能性幹細胞を回収する工程。
【国際調査報告】
2007525193.tif 000017