(57)【要約】  本発明は、哺乳類の体腔の粘膜内層からの毒性ＬＰＳ流入を防御するか、若しくは減少させるための薬剤を製造するためのアルカリホスファターゼの使用を提供する。アルカリホスファターゼの供給源は、ＬＰＳが媒介するか、若しくはＬＰＳによって悪化する疾患の予防若しくは治療のために投与される。本発明はまた、粘膜層からの（毒性）ＬＰＳの流入若しくは通過を防御するか、若しくは減少させるためのアルカリホスファターゼの供給源を含む組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の体腔の粘膜内層でのＬＰＳ毒性を防御するか、若しくは減少させるための薬剤を製造するためのアルカリホスファターゼの供給源の使用。
【請求項２】
ＬＰＳ毒性の防御若しくは減少が、ＬＰＳが媒介するか、若しくはＬＰＳにより悪化する疾患の予防若しくは治療のためである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＬＰＳが媒介するか、若しくはＬＰＳにより悪化する疾患が、炎症性腸疾患、敗血症／敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、髄膜炎菌血症、外傷／出血性ショック、熱傷、心臓血管手術／心肺バイパス、肝臓手術／移植、肝臓疾患、膵炎、壊死性腸炎、歯周病、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、冠動脈心疾患、うっ血性心不全、腎疾患、溶血性尿毒症症候群、腎臓透析、自己免疫疾患、癌、アルツハイマー、関節リウマチ、狼瘡、全身性エリテマトーデスからなる群から選択される請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
アルカリホスファターゼの供給源を経口的に投与する請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
体腔が胃腸管である請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
胃腸管の炎症性疾患の予防若しくは治療のためにアルカリホスファターゼの供給源を投与する請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
胃腸管の炎症性疾患が、炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、潰瘍性大腸炎、胆肝疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝線維症、胆管炎症、胆道閉塞、膵炎、急性膵炎、腹膜炎、歯周病、全腸炎、壊死性腸炎からなる群から選択される請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
胃腸管のＬＰＳの粘膜透過性が腸の血流減少若しくは虚血によって増加する請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
腸の血流減少若しくは虚血が、心肺バイパス、手術、外傷／創傷、熱傷、心臓手術、先天性心臓疾患、うっ血性心不全、冠動脈心疾患、虚血性心疾患によって引き起こされる請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
アルカリホスファターゼの供給源が吸入によって投与される請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
体腔が、呼吸器官の気管支粘膜及び／又は肺粘膜である請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
組成物が、呼吸器系の炎症性疾患の予防若しくは治療のために投与される請求項１０又は１１に記載の使用。
【請求項１３】
疾患が、肺炎、肺感染、喘息、嚢胞性線維症、気管支炎、肺気腫からなる群から選択される請求項１０から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
アルカリホスファターゼの供給源を粘膜層に局所的に投与する請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
体腔が鼻腔、口腔、膣及び直腸からなる群から選択される請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
組成物が、局所的若しくは全身的炎症性疾患のために投与される請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
疾患が、鼻腔、膣腔、口腔、直腸腔の感染、膣炎、性行為感染症、尿路感染症、歯周病からなる群から選択される請求項１４又は１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
アルカリホスファターゼの供給源を含み、薬剤として許容される安定剤、活性化剤、担体、透過剤、噴射剤、消毒剤、保護剤、希釈剤、栄養剤及び体腔の粘膜にアルカリホスファターゼを輸送するためのその他の賦形剤を任意で含む組成物。
【請求項１９】
アルカリホスファターゼの供給源を経口投与用に腸溶コーティングし、腸粘膜に輸送する請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
アルカリホスファターゼが、哺乳類の腸アルカリホスファターゼ、組織非特異的アルカリホスファターゼ、胎盤アルカリホスファターゼ及び肝臓アルカリホスファターゼである請求項１８又は１９に記載の組成物。
【請求項２１】
アルカリホスファターゼがヒト又はウシのものである請求項１８から２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
組成物が、経口摂取及びアルカリホスファターゼの胃腸管粘膜内層への輸送に適したアルカリホスファターゼの豊富な食品若しくは栄養補助食品である請求項１８から２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
食品は、アルカリホスファターゼの供給源を含む、任意で遺伝的に改変された植物、野菜若しくは果物である請求項１８から２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
食品が、アルカリホスファターゼの供給源を含む乳製品である請求項１８から２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
乳製品が、低温殺菌されていないか、若しくは部分的に低温殺菌されたミルク若しくはミルク画分である請求項１８から２４のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
ミルク画分が、乳脂肪球膜画分である請求項１８から２５のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
請求項１８から２６のいずれかで定義された組成物及び噴射剤及び／又は噴霧器を備えた吸入若しくは噴霧装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品分野に関し、特にＬＰＳの解毒中和酵素の使用に関する。本発明はまた、薬学分野に関し、特にアルカリホスファターゼ酵素の薬剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖類（ＬＰＳ、エンドトキシンとも称される）は、グラム陰性菌の細胞壁に存在する。脊椎動物の身体に提示されると、ＬＰＳは多種多様な細胞型において固有の細胞免疫応答を刺激する。サイトカイン及びケモカイン（ＴＮＦ、種々のインターロイキン、インターフェロンなど）の産生は、免疫系細胞を引きつけ、活性化し、ある条件下で、ＬＰＳ誘発性の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）に最終的に至る可能性がある。
【０００３】
ＬＰＳ若しくはエンドトキシンは、ほとんどの哺乳類に対して毒性があり、細菌源に関係なくどのエンドトキシンも動物宿主において同様の範囲の生物学的効果を生じる。生きた、若しくは死んだグラム陰性細胞又は精製されたＬＰＳを実験動物に注射すると、発熱、頻脈、多呼吸、高体温若しくは低体温、白血球数の変化、播種性血管内凝固、低血圧、臓器不全などの様々な非特異的な病態生理学的反応を引き起こし、ショック及び死にさえ至る可能性がある。
【０００４】
少量のエンドトキシンを注射すると、ほとんどの哺乳類で炎症誘発反応が生じるが、用量反応範囲及びそれらの急峻さは種類によって著しく変化し、同種であっても、例えば、ＬＰＳ耐性に応じて著しく異なる可能性がある。炎症誘発事象の順序は規則正しく（炎症カスケード）、（１）潜伏期、（２）生理学的困難（下痢、疲はい、ショック）が生じ、重篤な敗血症性ショック及び多臓器不全の場合は（３）死に至る。死に至る速さはエンドトキシンの量、投与経路及び動物の種類に左右される。
【０００５】
エンドトキシンの生理学的効果は、主にＬＰＳのリピドＡ部分によって媒介される。リピドＡは、細菌細胞の外膜に埋め込まれているので、増殖する細胞から可溶型で放出されると、又は自己分解、補体及び膜侵襲複合体（ＭＡＣ）、食細胞による消化及び死、若しくはある種の抗体による死の結果として該細菌が溶解すると、ようやく毒性効果を発揮する。血流中に放出されたＬＰＳは、多くの血液成分、中でも数種の血漿脂質及び蛋白質、とりわけＬＰＳ結合蛋白質によってある程度は中和され得る。ＬＰＳ結合蛋白質複合体は、単球及びマクロファージ上のＣＤ１４及びトール様受容体と、また内皮細胞のその他の受容体を介して相互作用する。単球及びマクロファージでは、ＬＰＳとの相互作用中に３種類の事象が引き起こされる。
【０００６】
第１に、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び血小板活性化因子を含めたサイトカインが産生される。これらは次にプロスタグランジン及びロイコトリエンの産生を誘発する。これらは、エンドトキシン血症を伴う炎症及び敗血症性ショックの強力な媒介物である。ＬＰＳは、マクロファージを活性化して、食作用及び細胞毒性を高める。マクロファージが刺激されて、リソソーム酵素、ＩＬ−１（「内因性発熱物質」）及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）並びにその他のサイトカイン及び媒介物を産生放出する。
【０００７】
第２に、補体カスケードの活性化である。Ｃ３ａ及びＣ５ａはヒスタミン放出（血管拡張を導く）を引き起こし、好中球の走化性及び蓄積をもたらす。その結果が炎症である。
【０００８】
最後に、凝固カスケードの活性化である。ハーゲマン因子（血液凝固因子ＸＩＩ）が最初に活性化されると、凝固を引き起こすいくつかの体液系、すなわち凝固、血栓症、急性播種性血管内凝固（血小板及び様々な凝固因子が消耗して内出血が生じ、補体代替経路の活性化（前述のように炎症を引き起こす）ももたらされる）の原因となる血液凝固カスケードが活性化され得る。繊溶及び出血を引き起こすプラスミンが活性化され、キニン活性化によってブラッディキニン及び低血圧の原因となるその他の血管作動性ペプチドが放出される。最終的な効果は、炎症、血管内凝固、出血及びショックの誘発である。
【０００９】
ＬＰＳはまた、ポリクローナル分化及びＢ細胞の増殖及び免疫グロブリン、特にＩｇＧ及びＩｇＭの分泌を刺激するＢ細胞分裂促進因子として作用する。
【００１０】
ＬＰＳの生理学的活性は、主にＬＰＳのリピドＡ成分によって媒介される。リピドＡは、哺乳類の免疫系を刺激することができる強力な生物学的反応調節剤である。グラム陰性菌によって引き起こされる感染症では、増殖する細胞若しくはその一部から放出されたエンドトキシンが動物に対して同様の効果を及ぼし、生じた疾患の症状及び病理に著しく影響を与える。リピドＡの1次構造は解明されており、リピドＡは化学合成されている。その生物学的活性は、グルコサミン二糖、ＰＯ4基、アシル鎖及びＬＰＳ分子のＫＤＯ含有内核によっても求められる独特の構造に左右されるものと考えられる。
【００１１】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、インビトロ及びインビボの両方において生理学的条件下でＬＰＳの解毒中和に対する自然な反応として、ＬＰＳ（エンドトキシン）を脱リン酸化する重要な酵素としてこれまで記載されてきた。（米国特許第６２９０９５２号、Poelstra, et al., Am J Pathol. 1997 Oct; 151(4):1163-9）。
【００１２】
ＡＰの酵素活性に関する報告は、通常の外因性基質に対して至適ｐＨが極めて高いこと、及び細胞外酵素として局在することに関係している。エンドトキシンは、いくつかのリン酸基を有し、通常細胞外空間に存在する分子である。ＡＰは、とりわけＬＰＳの毒性リピドＡ部分からリン酸基を除去することによって生理学的ｐＨ値でこの細菌生成物を脱リン酸化することができる。リピドＡ部分のリン酸残基が分子の毒性を決定するので、ラットの敗血症モデルを使用したインビボにおけるＡＰ阻害剤レバミゾールの効果によって、リン酸基を含有するＬＰＳに対するＡＰの特異性が確かめられた（Poelstra他、1997）。この結果は、レバミゾールで外因性ＡＰを阻害することによって大腸菌を腹腔内注射したラットの生存率が有意に減少するが、この薬物は、致死量以下のグラム陽性菌の黄色ブトウ球菌を投与されたラットの生存率には影響を与えないことを示しており、宿主の防御におけるこの酵素の極めて重要な役割が示された。グラム陰性菌感染においてレバミゾールが影響を及ぼすこと、ほとんどの器官において細胞外酵素としてＡＰは局在すること、並びに炎症反応及び胆汁鬱滞において酵素活性が誘導されることは、このような防御的役割と一致している。
【００１３】
人体におけるＬＰＳの最初の曝露源は、ヒトの消化管若しくは胃腸（ＧＩ）管内で生息するグラム陰性微生物である。消化系には皮膚若しくは体のその他の部分よりもはるかに多くの細菌が存在し、ＧＩ管及びＧＩ粘膜はＬＰＳが循環系に侵入する主要な経路となっている。平均的な成人は、腸に約１００兆個の細菌を有し、そのほとんどが結腸に存在し、それが体重の１〜１．５ｋｇを占めている。消化系には４００種以上の細菌が発見されている。これには有益な（共生）種と潜在的に有害な（病原性）種の両方が含まれており、均衡の取れた腸管内菌叢を維持するために絶えず競争している。
【００１４】
粘膜表面、特に（限定はしないが）腸粘膜は、この多種多様な片利共生的な潜在的病原菌、とりわけ多くのグラム陰性菌エンドトキシン／ＬＰＳを産生するグラム陰性菌、例えば、大腸菌、サルモネラ、シゲラ、シュードモナス、ナイセリア、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クラミジア及びその他の主要な病原体に曝される。腸上皮は、栄養素及び水の吸収を調節する動的関門を形成すると同時に、微生物及びＬＰＳなどのその他の有毒物質の腸管腔からの摂取を制限するので特に重要である。
【００１５】
腸管腔から粘膜内層を通って脊椎動物の体循環に流入するＬＰＳの大部分は、カイロミクロンによって媒介される（Harris et al、1998,2000,2002）。脂質が消化され、カイロミクロンが循環に導入されるのと同時に、ＬＰＳの輸送が可能となり、ＧＩ管由来のリンパ性ＡＰが有意に増加することが報告されている（Nauli et al、2002）。ＧＩ関門を通って流入するＬＰＳは、飽和した高脂肪食で通常増加する。ＬＰＳは、リピドＡアシル鎖と共にリポ蛋白質リン脂質に挿入される。それによって、ＬＰＳはカイロミクロンと共に移動することによって腸関門を通過し、大部分が小腸の回腸で吸収される（Harris et al., 2002）。高脂肪食摂取後、リポ蛋白質に結合させたグリコシル−ホスファチジル−イノシトール（ＧＰＩ）固定ＡＰの有意な上昇がまた、リンパ液で検出された（Nauli, et al., 2003）。
【００１６】
ＡＰの血清中レベルの生理学的役割及び解釈は明らかではないが、ＬＰＳの解毒における役割が最近の研究から明らかになってきた。カイロミクロンの豊富な画分にＡＰ及びＬＰＳの両者が共存することは、既に近くにある腸由来ＬＰＳの脱リン酸化におけるＡＰの役割を示唆している。解毒は、腸管腔において、或いは肝臓に行く途中、又は肝臓、特にこの場合は循環系からカイロミクロンを除去するクッパー細胞及び肝細胞への提示において起こり得る。
【００１７】
血清中ＡＰレベルは肝臓の損傷に伴って上昇する。エンドトキシンの侵襲を受けると、循環ＡＰは再び肝細胞に向かい、それによって受容体（アシアロ糖蛋白質受容体）の媒介によって摂取されて循環ＡＰレベルが最初に減少する（Bentala et al, 2002）。肝細胞はまた、ＬＰＳを運搬するカイロミクロン（Harris et al, 2002）を循環から迅速に半減期５〜１０分で除去する。次に、ＬＰＳは胆汁排出によって除去され、それによって循環ＬＰＳの主要な標的となってクッパー細胞が活性化されるのを防御する（Harris、2002）。Bentala et al.,2002は、ＬＰＳに侵襲された動物モデルでは、クッパー細胞がまたＡＰを蓄積することを示した。これは、ＬＰＳ（リピドＡ部分）若しくはその誘導体ＭＰＬＳ（ＭＰＬＡ、リピドＡの誘導体）は主にリポ蛋白質受容体によって肝細胞に提示され、次に胆汁分泌によって除去されるので、通常の条件下ではクッパー細胞は活性化されないことを示唆している。しかし、ＬＰＳ過剰の条件下では、クッパー細胞はＴＬＲ−４（ＬＰＳ）受容体によって活性化される。
【００１８】
様々な動物は、ＡＰと、局所若しくは全身ｍｐ（細菌による）侵襲に対抗するために存在する、防御／監視機能を誘導するか、或いは防御／監視機能として有用ないくつかのその他の実体とを備えている。特に、活性化された好中球若しくはマクロファージは、侵襲を抑える多種多様な炎症媒介物を発現する。ＬＰＳ結合蛋白質（ＬＢＰ）、ＣＤ１４、アポ−Ｅ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬ、アルブミン、免疫グロブリン及びＡＰのような部分は全て、それだけに限定はしないが、この機能を備えていることが記載されている。しかし、このような侵襲が制圧されないと、例えば、重篤なグラム陰性菌若しくは陽性菌の侵襲の場合、生じた炎症媒介物は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を惹起する可能性がある。
【００１９】
ＬＰＳに対する触媒作用の結果、ＡＰは消費されることが示唆された（Poelstra et al, 1997）。これは、その後、制御機構によって正常レベルに回復することを意味している。敗血症に罹患した患者では、血清中ＡＰの増加に先だってＡＰの血清中レベルの減少が生じる可能性があり（Manintveld and Poelstra、欧州特許出願番号第９８９６２６９４０号）、循環ＡＰはＬＰＳ相互作用によって循環系から除去されることが報告された（Bentala et al., 2002）。したがって、その後のＡＰレベルの上昇は、このＡＰ減少に応答したフィードバック機構である可能性がある。このようなＬＰＳ／ＡＰ応答の機構は、今までに報告されていない。
【００２０】
炎症過程では、血清中ＡＰの（一時的な）増加が見られる。本発明の場合、このようなＡＰの増加は、ＬＰＳ侵襲に対して、これらの侵襲を防御し、自然な均衡を取り戻すために本来備わっている免疫系の自然な応答と見なされる。ＡＰの血漿中レベルの増加は、ＬＰＳ侵襲に応答した肝細胞からのＡＰ大量放出の結果である。ＬＰＳはホスホリパーゼ−Ｄ活性を誘導し（Locati et al., 2001）、次に、ＧＰＩ固定蛋白質、特にＡＰ（Deng et al., 1996）及び、例えば、ＣＤ１４に作用し、それによって、効果的に該蛋白質を循環系に放出することが報告された（Zhang F et al., 2001、Loati M. et al., 2001）。
【００２１】
循環血漿中ＡＰ、主に非結合型肝臓ＡＰ（Ahn et al., 2001）は、したがって、既に形質膜表面でそのＬＰＳ解毒活性を発揮して、その後肝細胞膜から循環系に放出されており、その後は、循環系から、例えば、アシアロ糖蛋白質経路によって除去される。
【００２２】
ＡＰは、膜の近くの、いわゆる脂質ラフト（ｄｒｍ若しくは界面活性剤耐性膜画分）におそらく存在することが報告されているＬＰＳに主に触媒活性を発揮する。いくつかの報告は、組織レベルで存在するか、或いは循環する肝形質膜断片（ＬＰＭＦ）のように循環系に放出されている膜表面ＡＰのこのような触媒活性を好んで取り上げている。慢性的に炎症を起こしている患者で認められるＡＰレベルの増加は、腸からのＬＰＳ流入の最適以下の解毒が原因で生じる可能性があり、病的な条件下では肝ＡＰの動員の前にしばしば高まる。
【００２３】
炎症性疾患の治療は、開発途上国における総医療費のかなりの割合を占め、これらの炎症疾患の発症率は、集団の加齢並びに心臓疾患、自己免疫疾患及びアレルギーなどの多様な疾患の薬物治療及び治療、臓器移植、癌の化学療法若しくは放射線療法及びＡＩＤＳなどの感染症の結果として免疫系の抑制された患者数の増加といった重要な要素によって絶え間なく増加している。ある程度までは、これらの疾患は細菌性ＬＰＳの流入に関与している。ＬＰＳの流入は、患者の病状によって増大することが多く、本来の免疫系の機能不全若しくは不均衡によって炎症過程が引き起こされ、これが、例えば、微生物侵襲、特にＬＰＳ／エンドトキシン産生微生物に対する第１の防御線となる。
【００２４】
【特許文献１】米国特許第６２９０９５２号
【特許文献２】Manintveld and Poelstra、欧州特許出願番号第９８９６２６９４０号
【非特許文献１】Poelstra, et al., Am J Pathol. 1997 Oct; 151(4):1163-9
【非特許文献２】Harris et al, 1998
【非特許文献３】Harris et al, 2000
【非特許文献４】Harris et al, 2002
【非特許文献５】Nauli et al、2002
【非特許文献６】Nauli, et al., 2003
【非特許文献７】Bentala et al, 2002
【非特許文献８】Locati et al., 2001
【非特許文献９】Deng et al., 1996
【非特許文献１０】Zhang F et al., 2001
【非特許文献１１】Loati M. et al., 2001
【発明の開示】
【００２５】
本発明は、ＬＰＳが粘膜層を通過して、循環系に侵入し、毒性効果及び／又は炎症反応を惹起する前に、体腔の粘液組織においてインサイチューでＬＰＳを解毒、中和若しくは複合体化するための新規方法及び組成物を提供することを目的とする。
【００２６】
定義
エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁の外膜の一部である。エンドトキシンは、生物が病原体であろうとなかろうとグラム陰性菌に常に関連している。「エンドトキシン」という用語は、任意の細胞関連細菌毒を指すのに時々使用されるが、大腸菌（E. coli）、サルモネラ、シゲラ、シュードモナス（Ps. aureginosa）、ナイセリア（N. meningitidis）、ヘモフィルス（H. influenzae）、クラミジア（CHl. pneumoniae）、ヘリコバクター（H. pylori）及びその他の主要な病原体などのグラム陰性菌の外膜と関連したリポ多糖若しくはＬＰＳ複合体のことを指すことは適切には控えられる。
【００２７】
リポ多糖類は、細菌種の間で化学組成が大きく異なる、単体の分子量が約１０ｋＤａである複合両親媒性分子である。ＬＰＳは、リピドＡ、Ｒ多糖及びＯ多糖の３個の成分若しくは領域から構成される。リピドＡはＬＰＳの疎水性膜結合領域を含有する。リピドＡは、６個若しくは７個の脂肪酸（ＦＡ）が結合したリン酸化Ｎ−アセチルグルコサミン（ＮＡＧ）から構成される。コア（Ｒ）抗原若しくはＲ多糖は、１個のＮＡＧの６位に結合している。Ｒ抗原は、短鎖糖から構成される。コア多糖には通常、ヘプトース及び２−ケト−３−デオキシオクトン酸（ＫＤＯ）といった通常にはない糖が２個存在している。ＫＤＯは独特で、ＬＰＳに常に存在し、そのため、ＬＰＳ（エンドトキシン）の試験における指標となっている。
【００２８】
多少の変動はあるが、コア多糖及びリピドＡは細菌属（例えば、サルモネラ）の膜全てに共通しており、グラム陰性菌のその他の属においては構造的に明確に区別できる。サルモネラ、シゲラ及び大腸菌は、コアが類似しているが、同一ではない。
【００２９】
エンドトキシンの生物活性は、リポ多糖（ＬＰＳ）に関連している。毒性は脂質成分（リピドＡ）に関連し、免疫原性は多糖成分に関連する。グラム陰性菌の細胞壁抗原（Ｏ抗原）はＬＰＳの成分である。ＬＰＳは動物において様々な炎症反応を惹起する。代替プロパージー経路によって補体を活性化するので、グラム陰性菌感染の病理の一部となることが多い。
【００３０】
リムルス試験（ＬＡＬ）は、ＬＰＳの濃度及び毒性を測定するための当業界で周知の生物検定法である。この試験は、古代からのカブトガニ、リムルス  ポリへムス（Limulus polyphemus）の極めて鋭敏な原始的防御系に基づいている。この系に基づいた試験は、色素原基質若しくは蛍光基質の切断後の色変化によって測定することができる。ＬＡＬは、ピコグラム以下の量のこれらの微生物産生物を非常に迅速に最低限の装置で測定するために使用することができ、生きている生物、死んでいる生物及び培養できない生物を検出することができる。リムルスの赤血球若しくはカブトガニのアメーバ様細胞は、原始的な「固有の」免疫防御を構成しており、したがって微生物細胞の細胞外壁構造に結合し、血液凝固反応を引き起こす。可溶性ＬＰＳ並びにその他の微生物の細胞壁成分、例えば、酵母及び真菌のβグルカンは、カブトガニの血液の凝固を引き起こすことが示された。この凝固反応は、現在では、アメーバ様細胞内の顆粒に成分が存在する酵素カスケードであることが知られている。アメーバ様細胞の溶解物は、無菌的に、エンドトキシンを含まない方法で血液細胞を収集することによって生成され、ＬＰＳ及びＡＰ酵素によるＬＰＳの解毒及びＡＰの供給源を含む組成物の試験として現在使用されている市販の製品である（ＬＡＬ、Charles River Endosafe, Charleston, S.C.）。
【００３１】
アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、ＩＵＢＭＢ酵素命名法ではＥＣ３．１．３．１、俗称はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）であるが、リン酸モノエステル＋Ｈ2Ｏ＝アルコール１個＋リン酸の反応を触媒する酵素である。ＡＰのその他の名称は、アルカリホスホモノエステラーゼ、ホスホモノエステラーゼ、グリセロホスファターゼ、アルカリホスホヒドロラーゼ、アルカリフェニルホスファターゼ、オルトホスホリックモノエステルホスホヒドロラーゼ（アルカリ性に至適）である。ＡＰの分類名称は、リン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ（アルカリ性に至適）である。
【００３２】
ＡＰは特異性の広い酵素で、リン酸基転移も触媒する。ヒト及びその他の哺乳類では、少なくとも４種類の異なるが関連性のあるアルカリホスファターゼが知られている。それらは、腸、胎盤、胎盤様、及び肝臓／骨／腎臓（若しくは組織非特異的）アルカリホスファターゼである。最初の３種類は一緒に第２染色体に位置し、一方組織非特異的型は第１染色体に位置する。ＡＰの正確な生理学的機能は知られていないが、ＡＰは、多数の生理学的過程、特に毒性を決定するＬＰＳのリピドＡ部分の脱リン酸化によるＬＰＳの解毒に関与していると考えられる。本発明では、アルカリホスファターゼという用語は、リムルス試験若しくは他の生物検定法によって測定してＬＰＳの解毒を示すいかなる酵素も含むことができる。ＡＰ酵素又はＡＰを含む組成物若しくは調製物の活性は、インビトロでの市販のＬＰＳの解毒によって、次にＡＰ処理の前後に標準的リムルス試験（ＬＡＬ）によって測定することができる（例えば、Ｓｉｇｍａ社のリポ多糖類（ＬＰＳ）、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｌ−８２７４）。或いは、ＡＰ活性によるＬＰＳ毒性減少は、Beumer et al., 2003によって記載された生物検定法によって定量することができる。
【００３３】
粘膜は、外部と情報交換する、体腔全て若しくは管を被覆する粘液分泌膜である。粘膜は、多くの器官（例えば、腸）及び体腔（例えば、鼻、口、肺、膣、胆管、食道）を被覆し、粘液（濃厚液）を分泌する湿潤組織である。粘膜若しくは粘液膜は、環境条件、病原体及び毒性物質から体腔を保護する組織の種類であり、通常、分泌物（例えば、腸、肺、鼻、口及び膣による分泌物）に浸された湿潤組織である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、体腔の粘膜組織においてインサイチューでＬＰＳを解毒するための新規方法及び組成物を提供することを目的とする。体内の粘膜表面においてインサイチューでＬＰＳを解毒する第１の目的は、このような表面における局所的炎症反応を防御し、若しくは減少させることである。さらに、このように解毒されたＬＰＳは、粘膜層からの通路ではもはや利用されず、したがって循環系に侵入してその毒性効果を生じ、かつ／又は他の局所的及び／又は全身的炎症反応の原因となることはできない。解毒はまた、ＡＰによるＬＰＳの中和若しくは複合体化を含むことができ、接近していると解毒された組成物を形成することができる。該方法は、ＬＰＳ解毒の有力な手段であることが知られているアルカリホスファターゼ供給源の使用を含む。ＡＰの供給源は、任意のＡＰ酵素、若しくはＡＰ酵素を含む任意の組成物及び本発明の場合、機能的ＡＰ酵素を産生することができる任意の手段、例えば、ＡＰ酵素をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡ核酸であってよい。ＡＰをコードする核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ、（レトロ）ウイルス、トランスポゾン、遺伝子治療ベクター及びＡＰを誘導するか、若しくは産生をもたらすことができるその他のベクターなどの適切なベクターに組み込むことができる。細菌、真菌、原生動物及び酵母などの天然若しくは組換え微生物もまた、本発明の場合ではＡＰの供給源として使用することができる。
【００３５】
第１の実施形態では、本発明は、粘膜層においてＡＰの供給源を投与するステップを含む、哺乳類体腔の粘膜内層（a mucosal lining of a mammalian body cavity）において毒性のあるＬＰＳを防御するか、若しくは減少させる方法を提供する。治療方法が法律によって特許を与えられない管轄では、本発明はさらに前記で定義したようなＡＰの使用、若しくは前記で定義したようなアルカリホスファターゼの供給源を含有する組成物の使用に関する。ＡＰの供給源は、哺乳類体腔の粘膜内層からの毒性ＬＰＳの流入を防御若しくは減少させるために、粘膜層にＡＰを輸送するための薬剤を製造するために使用される。他の実施形態では、本発明は、粘膜層にＡＰの供給源を投与するステップを含む、哺乳類体腔の粘膜内層からの毒性のあるＬＰＳ流入を防御若しくは減少させる方法を提供する。
【００３６】
特に、体腔の粘膜層にＡＰの供給源を投与する前述の方法は、ＬＰＳが媒介する、若しくはＬＰＳによって悪化する疾患の治療若しくは予防に適しているが、この方法は、ＬＰＳが誘導する毒性及び／又はＬＰＳが誘発する、若しくは悪化させる疾患の防御を目的とする予防的処置として健康な対象に、有利に使用することもできる。本発明によって体腔及び粘膜層での毒性ＬＰＳレベルを減少させるＡＰ投与の有益な効果は、治療する対象の健康状態に関係なく、一般的な健康促進効果を生じる。この健康促進効果はさらに、粘膜層からのＬＰＳ流入の結果的な減少によって増大させることができる。ＬＰＳが媒介するか、若しくは誘発する疾患は、ＬＰＳ毒性によって引き起こされる任意の疾患、症状若しくは症状群であってよい。ＬＰＳが悪化させる疾患は、ＬＰＳ若しくはＬＰＳ毒性によって直接的には引き起こされない任意の疾患若しくは症状であってよいが、症状及び臨床的特徴がＬＰＳによって悪化する可能性がある疾患及びこのような疾患に罹患した対象の臨床状態は、ＬＰＳ及びＬＰＳ毒性によって悪化してよい。
【００３７】
好ましくは、該方法は、炎症性腸疾患、敗血症／敗血症性ショック、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、髄膜炎菌血症、外傷／出血性ショック、熱傷、心臓血管手術／心肺バイパス、肝臓手術／移植、肝臓疾患、膵炎、壊死性腸炎、歯周病、肺炎、嚢胞性線維症、喘息、冠動脈心疾患、うっ血性心不全、腎疾患、溶血性尿毒症症候群、腎臓透析、自己免疫疾患、癌、アルツハイマー、関節リウマチ、狼瘡、全身性エリテマトーデスからなる群から選択されるＬＰＳによって媒介される、若しくは悪化する疾患の治療を目的とする。
【００３８】
循環エンドトキシンは、炎症性腸疾患の患者、特にクローン病及び潰瘍性大腸炎の患者で検出された。その存在は、腸粘膜の損傷及びＬＰＳ流入増加若しくは腸転位の結果であり、腸の炎症性反応を引き起こすか、若しくは悪化させる。腸細菌の転位及びＬＰＳ腸転位はまた、急性膵炎及び肝硬変、アルコール乱用、閉塞性黄疸及びその他の肝臓状態が原因の肝臓疾患において認められる。エンドトキシンはまた、歯肉上皮／粘膜を貫通し、続いて局所的炎症反応を起こす歯周病の発症に関係している。好ましい実施形態では、該方法は、粘膜で、及び／又は粘膜からのＬＰＳの経路でＬＰＳ毒性を減少させるためにＡＰの供給源を経口投与することを含む。
【００３９】
好ましい投与形態は、長期間ＧＩ管腔での毒性ＬＰＳレベルを減少させる１日投与計画で輸送することが可能なＡＰの供給源を含む医薬組成物の使用を含む。好ましくは、該医薬組成物は、胃液（ｐＨ１．０から２．５）の有害な影響からＡＰを保護し、腸管の粘膜に効果的かつ確実にＡＰを輸送する腸溶コーティングを含む。より好ましくは、該医薬組成物は、腸溶コーティング内に含まれる供給源を含む。
【００４０】
腸溶コーティングは、経口的に消化可能な剤形からの活性化合物の放出を抑制する。組成物及び／又は厚さに応じて、腸溶コーティングは必要な期間胃酸に耐え、その後胃下部若しくは小腸上部においてＡＰ（薬剤）の崩壊を開始させ、ゆっくり放出させる。いくつかの腸溶コーティングの例は、米国特許第５２２５２０２号（参照として組み込む）に開示されている。腸溶コーティングの例には、蜜蝋及びモノステアリン酸グリセリン；蜜蝋、セラック及びセルロース、場合によってはポリメタクリル酸エステルの中性コポリマー；メタクリル酸及びメタクリル酸メチルエステルのコポリマー若しくはステアリン酸金属塩を含有するポリメタクリル酸エステルの中性コポリマーが含まれる（腸溶コーティングの例については、米国特許第４７２８５１２号、第４７９４００１号、第３８３５２２１号、第２８０９９１８号、第５２２５２０２号、第５０２６５６０号、第４５２４０６０号、第５５３６５０７号を参照のこと）。ほとんどの腸溶コーティングポリマーは、ｐＨ５．５以上で可溶性になり始め、ｐＨ６．５以上で溶解速度が最大になる。腸溶コーティングはまた、例えば、腸上部のｐＨとは対照的なＧＩ管のより下部、すなわち結腸（ｐＨ６．４から７．０、回腸ｐＨ６．６）、（膵液及び胆液添加後）ｐＨ範囲が７．７から８である小腸の十二指腸に特異的に輸送するように企図された医薬組成物のために、サブコーティングするステップと、外部コーティングするステップを含むことができる。腸内のｐＨの違いは、消化管の特異的な領域に腸溶コーティングＡＰ組成物を狙わせるために利用することができる。これはまた、腸の特定のｐＨで最も活性がある特異的ＡＰ酵素の選択を可能にする。例えば、ＣＩＡＰ（ウシ小腸ＡＰ）及びヒト胎盤（ＨＰＬＡＰ）ＡＰは、小腸十二指腸、空腸及び回腸のアルカリ性ｐＨ８．２で最も活性があり、一方乳由来のＡＰ及び骨／肝臓／腎臓若しくは組織非特異的ＡＰ（ＴＳＮ  ＡＰ）は中性ｐＨで最も活性があり、結腸（ｐＨ７．４）の治療により適している。
【００４１】
本発明によって治療すべき最も好ましい粘膜組織は、腸管体腔を被覆する粘膜組織である。経口的に投与されたＡＰは、食道、胃、小腸若しくは腸、（十二指腸、空腸、回腸）及び大腸若しくは結腸（盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、Ｓ字結腸、直腸及び肛門）を含むＧＩ管の粘膜組織に輸送される。本発明の範囲内では、口、胆管及び膵管を被覆する粘膜組織もまた、腸管の一部であり、本発明の方法で治療することができる。
【００４２】
本発明によるＡＰの供給源を含む組成物は特に、胃腸管の炎症疾患を予防的治療、軽減、治療若しくは緩和するために経口投与するのに適している。胃腸管の炎症疾患は、ＬＰＳの流入によって有意に誘導及び／若しくは悪化する可能性がある。ＡＰの供給源の投与によってＬＰＳのリピドＡ部分を解毒して腸管腔における毒性ＬＰＳの量を減少させると、対応して患者の循環系における全身的な毒性ＬＰＳ流入の減少が生じる。最も好ましい実施形態では、ＡＰの供給源の経口投与は特に、以下の胃腸管の炎症性疾患、クローン病、大腸炎、壊死性腸炎、潰瘍性大腸炎、肝胆道系疾患、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝線維症、胆管炎症、胆管閉塞、膵炎、急性膵炎、腹膜炎及び歯周病の予防若しくは治療に好ましい。
【００４３】
本発明の他の実施形態では、ＡＰの供給源は、胃腸管の粘膜透過性が増大した患者に経口的に投与される。ＧＩ管の粘膜透過性の増大は、腸の血流減少若しくは虚血の結果であることが多い。虚血、血流による酸素供給の欠如は、心不全、傷害、外傷若しくは手術によって引き起こされる可能性がある。腸の虚血は、粘膜の機能不全及びその結果として起こる腸からの毒性ＬＰＳの流入若しくは転位の増加をもたらし、局所的及び全身的毒性及び炎症を引き起こす。毒性及び炎症反応は、さらに粘膜透過性を増大させ、悪循環をもたらす。ＧＩ管の粘膜透過性の増大は、炎症性腸疾患若しくはその他のＧＩ管の病的状態の結果である可能性がある。本発明によるＡＰの供給源を経口投与すると、腸腔内のルーメンにおけるＬＰＳの解毒によって毒性ＬＰＳ流入の増加が有意に減少するか、若しくは消失する。ＡＰを外部から投与すると、粘膜からのＬＰＳ流入、炎症及び粘膜透過性の増大、その結果としてのＬＰＳ流入の増大の悪循環が断たれる。腸の血流減少若しくは虚血、及び同時に起こるＬＰＳ流入の増加は、以下の疾患若しくは状態の群、事故、射撃若しくはナイフによる創傷手術、特に心肺バイパスを伴う手術によって生じる可能性がある熱傷、外傷及び／又は創傷、に認められる。先天性心臓疾患、うっ血性心不全、冠動脈心疾患及び虚血性心疾患などの心臓の機能不全も、腸の虚血及びＬＰＳの流入増大を引き起こす可能性がある。これらの疾患群に罹患した患者にＡＰの供給源を含む組成物を適時及び定期的に経口投与して、ＬＰＳ透過性の増大した腸粘膜からのＬＰＳ流入を防御するか、若しくは減少させて治療することが、本発明の好ましい実施形態である。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は呼吸器管を被覆する粘膜内層にＡＰの材料をもたらすことが目的である。該呼吸器管は、ＬＰＳの毒性効果に曝露した粘膜内層を有する別の体腔である。遊離の状態若しくは吸い込まれた細菌に関連したＬＰＳは、通常の呼吸、例えば粉塵粒子を吸入することによって、又はグラム陰性菌による呼吸器管及び粘膜組織の感染によって呼吸器管の気管支及び肺の粘膜に進入する。さらに、タバコはＬＰＳの豊富な供給源であることが知られており、喫煙は、受動的にせよ、能動的にせよ、気管支及び肺の粘膜のＬＰＳ負荷にさらに著しく関係する可能性がある。通常の条件下で、このＬＰＳは、呼吸器管において局所的粘膜免疫防御系によって解毒される。したがって、他の好ましい実施形態では、本発明は、ＬＰＳに対する正常な防御反応が機能不全になりつつあるそれらの条件について、呼吸器管の粘膜からのＬＰＳ流入を防御若しくは減少させるために、吸入による気管支及び肺粘膜へのＡＰの供給源の投与に関する。本発明はまた、気管支及び肺粘膜へのＡＰの輸送に適した組成物を提供する。これらの組成物は、呼吸器管の炎症性疾患を予防又は治療するために投与されることが好ましい。最も好ましい実施形態では、本発明によるＡＰの供給源の肺への投与は、肺炎、肺感染、喘息、ＣＡＲＡ、嚢胞性線維症、気管支炎及び肺気腫からなる群から選択される疾患の治療若しくは予防に適用される。本発明はまた、気管支及び肺粘膜でのＡＰの投与に適した、ＡＰの供給源及び噴射剤などの様々な賦形剤を場合によっては含む組成物、担体、噴霧器及び／又は拡散器を備えた噴霧装置を提供する。噴霧装置、吸入器及び噴霧器は、当製薬業界では公知であり、Remmington's Pharmaceuitcal Sciences, Mace Publishing, Company, Philadelphia PA, 17th ed, 1985を参照すれば、当業者には明らかであろう。
【００４５】
さらに他の実施形態では、本発明は、体腔を被覆する粘膜層でＡＰの供給源を局所投与することが目的である。好ましい実施形態では、体腔は鼻腔、口腔、膣若しくは直腸である。体腔を被覆する粘膜組織におけるＡＰの供給源の局所投与は、局所若しくは全身性炎症性疾患の治療に適用することが好ましく、鼻腔、膣腔、口腔若しくは直腸腔の感染、性行為感染症、尿路感染症、膀胱感染症及び歯周病の治療若しくは予防に特に好ましい。
【００４６】
本発明はまた、ＡＰの供給源を含む組成物、中でもＡＰの供給源を含む医薬組成物及び栄養補給組成物を提供する。該組成物は、場合によっては、薬剤として許容される賦形剤、安定剤、活性化剤、担体、透過剤、噴射剤、消毒剤、希釈剤及び保存剤を含むことができる。適切な賦形剤は、製薬業界では公知で、例えば、Remmington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing, Company, Philadelphia PA, 17th ed. 1985を参照すれば、当業者には明らかであろう。好ましい実施形態では、ＡＰの供給源を含む組成物は経口投与に適しており、胃液及び低ｐＨの悪影響からＡＰを防御するための腸溶コーティングを含む。腸溶コーティング及び放出制御製剤は、当業界では周知である（前記参照）。当業界の腸溶コーティング組成物は、ＡＰなどの有効成分及びその他の賦形剤と混合した水溶性腸溶コーティングポリマーの溶液を含むことができ、水性溶液に分散させ、その後乾燥させ、かつ／又はペレット化することができる。形成された腸溶コーティングは、保存する間大気中の水分及び酸素並びに摂取後の胃液及び低ｐＨによるＡＰへの攻撃に対する抵抗性をもたらすが、腸管下部に存在するアルカリ条件下では容易に分解される。
【００４７】
本発明によるＬＰＳを解毒するために粘膜組織にＡＰを輸送するためのＡＰ含有組成物は、好ましくは真核細胞ＡＰを含み、より好ましくは哺乳類ＡＰを含み、肝臓−骨若しくは腎臓型などの組織非特異的ＡＰ型又は胎盤ＡＰ及び腸ＡＰなどの組織特異的であってよい。最も好ましい哺乳類ＡＰはヒト若しくはウシＡＰである。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、ＡＰの供給源は、ミルク、好ましくは牛乳から産生若しくは単離されたＡＰである。該ミルクは、野生型動物と比較してミルク中に高レベルのＡＰを産生するように飼育された、若しくは遺伝的に改変された動物から得ることができる。ミルクからＡＰの豊富な画分を調製することは当業界では公知である。例えば、乳脂肪球膜の豊富な、若しくは乳脂肪球膜から得られた画分は、好ましいＡＰの豊富なミルク画分であり、従来通り生乳の乳脂をすくい取ることによって常法に従って得ることができる。ミルクから単離されたＡＰは、医薬組成物及び食品組成物若しくは栄養補助食品に製剤化することができる。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明によって胃腸管の粘膜にＡＰを経口投与するためのＡＰ含有組成物は、ＡＰの豊富な食品若しくは栄養補助食品である。一実施形態では、該食品は、高レベルのＡＰを含有するために場合によっては遺伝的に改変された植物、果物若しくは野菜であってよい。他の実施形態では、ＡＰを含有する食品若しくは栄養補助食品は、乳製品である。低温殺菌していないミルク若しくはそれらの画分、好ましくは牛乳を含有する調製物及び組成物は、高レベルのＡＰを含有し、本発明によるＡＰの供給源として経口的に投与するのに特に適している。
【００５０】
本発明はまた、ＡＰの豊富な乳製品、好ましくはミルク、ミルク画分若しくはミルク製品を調製する方法に関する。該方法は、腐りにくく、ＡＰの豊富な乳製品を得るために、生乳、好ましくは牛乳の分画と、ＡＰを含有しない、若しくはＡＰが豊富ではない画分の低温殺菌と、前記画分と低温殺菌していないＡＰの豊富な画分との再製剤化とを含む。低温殺菌していないＡＰの豊富な画分は、その他の手段、例えば、限定はしないが、ＵＶ、Ｘ線若しくはγ線の照射、濾過、圧縮、浸透圧、化学物質若しくは抗生物質によって殺菌し、確実にＡＰ酵素が実質的に活性を保持し、ミルク画分が実質的に無菌の状態になることが可能である。この乳製品は、組成物中で使用し、ＬＰＳが媒介するか、若しくはＬＰＳにより悪化する疾患及び／又は炎症に罹患した、若しくは発症する危険性のある患者に直接投与することができる。しかし、該ＡＰの豊富な乳製品はまた、胃腸管における毒性ＬＰＳを減少させるため、及び胃腸粘膜からのＬＰＳ流入を減少させるための医薬品若しくは栄養補助食品として健常対象者に提供することができる。
【実施例１】
【００５１】
本発明は、特にＡＰ酵素、調製物及び組成物の有効性並びにＡＰの様々な投与形態を当業界で公知の炎症性腸疾患の様々な動物モデルで試験することができる。ヒトＩＢＤを模倣した動物モデルには、抗原誘発性大腸炎及び微生物によって誘発された大腸炎、その他の誘発型大腸炎、化学物質（例えば、Montfrans et al.,2002におけるトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ））、免疫学的及び物理学的及び遺伝的大腸炎モデル（遺伝子導入モデル及びノックアウトモデル、例えば、ＳＣＩＤマウス、Davis et al.,2003、ＩＬ−１０  ＫＯマウス、Rennick et al.,2000、ＳＡＭＰ１／Ｙｉｔマウス、Kosiewicz et al.,2001及びStrober et al.,2001）、養子移入モデル及び自然発症大腸炎モデル（Kosiewicz et al.,2001）が含まれる。
【００５２】
化学物質誘発デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎モデルは、最初Okayasu et al; Gastroenterology, 1990:98, 694-702によって記載されたヒト潰瘍性大腸炎のモデルである。該モデルには、飲料水に３〜１０％のＤＳＳを投与することによって引き起こされるマウスの急性及び慢性潰瘍性大腸炎が含まれる。形態学的変化及び腸内ミクロフローラの変化は、潰瘍性大腸炎の臨床例に見られるものと同様である。結腸の障害は、上皮細胞に対するＤＳＳの毒性効果及び固有層細胞による貪食によって発症し、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γが産生される。
【００５３】
急性ＤＳＳ大腸炎の実験設計
ＤＳＳ（ＩＣＮ化学物質から得られる。分子量４００００）を、５％（ｗ／ｖ）の濃度で酸性飲料水に溶解し、メスのｂａｌｂ／ｃマウス（Harlan）に自由に与える。該溶液は、毎日取り替える。処理７日後に、処理したマウス及び対照マウスを殺処分し、腸を分析することができる。結腸全体（盲腸から直腸まで）を切り取り、その長さを記録する。結腸の約半分を液体窒素で凍結させ、凍結切片を形態分析用に作製する。脾臓及び肝臓の小部分も免疫組織化学的分析のために液体窒素で手早く凍結させる。結腸の小部分を使用して、サイトカイン測定のために組織ホモジェネートを調製する。小さな結腸切片をＬＰＳの非存在下若しくは存在下でＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２４時間培養する。上清のサイトカイン分泌（ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＦＮγ）を、特異的ＥＬＩＳＡ試験を使用して測定する。脾臓及び腸間膜リンパ節を切り出し、押しつぶして単細胞懸濁液を調製する。結腸の近くのバイエル板４個を切り出し、コラゲナーゼを使用して単細胞懸濁液を調製する。フローサイトメトリー技術を使用して細胞を特徴付ける。脾細胞をＬＰＳ若しくはＣｏｎＡの非存在下若しくは存在下でＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで２４時間培養する。上清のサイトカイン分泌（ＴＮＦα、ＩＬ１β、ＩＦＮγ）を、特異的ＥＬＩＳＡ試験を使用して測定する。糞便を収集し、腸内細菌含量用にMcConkey寒天プレートで培養する。好気性菌総量のために、糞便を血液寒天プレートで培養する。
【００５４】
結果
前述した試験を使用してインビボにおいてＡＰを含む組成物の有効性を測定する。サイトカイン分泌の減少を観察する。ＴＮＦα、Ｉｌ−１β及びＩＦＮγレベルの減少は、牛乳のアルカリホスファターゼの豊富な乳脂肪球膜の画分を経口投与した炎症性腸で測定する。
【実施例２】
【００５５】
ＡＰ処理マウスでは、ＴＮＢＳ若しくはＤＳＳ処理後重篤な大腸炎の発症が少ない
材料及び方法
実験計画
３種類の独立した実験を実施した。Charles River及びHarlan Nederland（Horst、オランダ）から、第１のＤＳＳ実験用には８週齢野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス４２匹を入手し、ＴＮＢＳ実験用には８週齢野生型ＢＡＬＢ／ｃマウス２０匹を入手した。第２のＤＳＳ実験用には、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス７２匹をCharles River Nederlandから入手した。実験中、マウスは標準的条件下に収容し、水及び食餌を自由に摂取させた。
【００５６】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスによる第１の実験では、マウスの飲料水に１．５％（ｎ＝１８）若しくは２．５％（ｎ＝２０）のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）を１週間投与することによって大腸炎は誘発された。
【００５７】
ＢＡＬＢ／ｃマウスでは、大腸炎を、肛門から３センチメートルに配置したビニルカテーテルを使用して、４０％エタノールのＰＢＳ溶液に溶解した２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）（Sigma Chemical Co製, St.Louis, MO, USA）１ｍｇを０日目及び７日目に直腸投与することによって誘発した。点滴前に、マウスをイソフルラン（1−クロロ−２，２，２，−トリフルオロエチル−イソフランジフルオロメチルエーテル）（Abbott Laboratories Ltd.製, Queen-borough, Kent,イギリス）で麻酔し、点滴後マウスを３０秒間直立で維持した。２回目のＴＮＢＳ投与の４８時間後にマウスを殺処分した。
【００５８】
大腸炎の誘発中、ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹及びＣ５７ＢＬ／６マウス２０匹に１日に１回１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）１００μｌに溶解したアルカリホスファターゼ１００ｕｎｉｔを経口的に投与した。その他のマウスには１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．８）１００μｌのみを与えた。Ｃ５７ＢＬ／６マウス４匹を参考対照として使用し、大腸炎も発症させず、処理も行わなかった。
【００５９】
第２のＤＳＳ実験では、大腸炎を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝４８）に５日間飲料水に２％  ＤＳＳを投与することによって誘発した。これらのマウスの２４匹には、５日目から１４日目まで、１日に１回１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，８）２５０μｌに溶かしたアルカリホスファターゼ１００Ｕｎｉｔを投与し、一方その他の２４匹のマウスには媒体のみを与えた。通常の飲用水及び媒体のみを投与した２４匹のマウス群を、参考対照として使用した。この設定は、一旦大腸炎が証明されたときの緊急薬剤としてのＡＰの使用を研究するために使用した。
【００６０】
全実験において、マウスの体重及び体温を毎日記録した。マウスを殺処分した後、尾部リンパ節（ＣＬＮ）及び結腸をマウスから得た。正中切開によって、結腸を取り出し、長軸に切開した。糞便物質を除去した後、結腸の重さを測定し、疾患に関連した腸肥厚の指標として使用した。該結腸を２つに分け、その１つを組織学的分析に使用し、他方をサイトカイン検出に使用した。
【００６１】
組織化学的分析
長軸に切断した結腸を、通常の組織学のために４％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。各結腸試料から採取した３枚の横断切片（５μｍ）をヘマトキシリン−エオジンで染色し、光学顕微鏡で調べた。結腸の炎症は、盲検法で、１）関連領域の割合、２）濾胞の量、３）浮腫、４）線維症、５）びらん／潰瘍、６）陰窩破壊(crypt loss)及び７）顆粒球浸潤及び８）単球を見積もることによって評価し、最高スコア２６とした。
【００６２】
関連する領域の割合及び陰窩破壊は、以下のように０から４の範囲の尺度で評価した、０、正常、１、１０％未満、２、１０％、３、１０から５０％、４５０％を上回る。濾胞集合は、以下の通りに計数して、評価した。：０点、濾胞０〜１個、１点、濾胞２〜３個、２点、濾胞４〜５個、３点、濾胞６個以上。びらんは、上皮が完全であれば０と定義し、粘膜固有層に関連する潰瘍があれば１、粘膜下組織に関与する潰瘍があれば２、潰瘍が経壁であれば３と定義した。その他の変数の重症度は、以下の通り０から３の尺度で評価した：０、なし、１、軽度、２、中程度、３、重度。
【００６３】
細胞培養
ＴＮＢＳマウスの尾部リンパ節細胞は、該リンパ節を４０μｍフィルター細胞濾過器（Becton/Dickson Labware製, New Jersey, USA）に通すことによって単離した。単離したリンパ球はＬ−グルタミン、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）及び抗生物質（ペニシリンＧナトリウム１００００Ｕ／ｍｌ、硫酸ストレプトマイシン２５μｇ／ｍｌ。アンホテリシンＢ  ２５μｇ／ｍｌ、Gibcl/BRL製, Paisley, Scotland）を含むＲＰＭＩ１６４０培地４ｍｌ中で懸濁させた。細胞を計数して、平底９６ウェルプレートにウェル当たり細胞２×１０５個となるように、同培地の全量を２００μｌとして添加した。該細胞を、固定したα−ＣＤ３（濃度１：３０、145.2C11クローン）及び可溶性α−ＣＤ２８（濃度１：１０００、PharMingen）の存在下で３７℃で４８時間培養した。上清を収集し、サイトカインビーズ試験（ＣＢＡ）のために使用した。
【００６４】
均質化及び酵素測定
肛門から６ｃｍのところで採取した結腸のスイスロール試料を窒素で凍結させた。組織ホモゲナイザーでGreenberger溶解緩衝液（ＮａＣｌ  ３００ｍｍｏｌ／Ｌ、トリス１５ｍｍｏｌ／Ｌ、ＭｇＣｌ２  ２ｍｍｏｌ／Ｌ、トリトンＸ−１００  ２ｍｍｏｌ／Ｌ（Sigma製, St Louis, MO））９体積、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、アプロチニン（Roche製, Mannheim, Germany）、いずれも２０ｎｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）でホモジェネートを作製した。該組織を氷上で１時間溶解して、３０００ｒｐｍで７分間及び１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を収集して、酵素測定及びＢＤサイトカインビーズアレイ分析の日まで凍結保存した。
【００６５】
大腸炎の期間中、マウスの糞便を収集した。糞便の重量を記録し、ＭｇＣｌ２  ０．５ｍＭを含む５０ｍＭグリシン緩衝液（２５°ＣでｐＨ＝９．６）０．６ｍｌ中に懸濁させた。遠心分離後（１０秒、１３０００ｒｐｍ）、アルカリホスファターゼ活性の測定の日まで上清を凍結保存した。
【００６６】
結腸及び糞便のアルカリホスファターゼの活性は、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸を使用して、ＭｇＣｌ２  ０．５ｍＭを含む５０ｍＭ  グリシン緩衝液（２５℃でｐＨ９．６）中で分光光時計で測定した。酵素活性は、結腸ホモジェネートではｍＵ／ｍｌで、糞便ではｍＵ／ｍｇで表した。
【００６７】
サイトカインビーズ試験（ＣＢＡ）
サイトカインビーズ試験は、Becton Dickinson（ＢＤ）の製造元の推奨に従って、またその他で記載されたように（３７、図２．２参照）結腸ホモジェネート及びＣＬＮ細胞培養上清中でＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−５の産生を同時に測定するために実施した。簡単に説明すると、粒子（ポリスチレンビーズ）を５段階の蛍光強度で染色した。ふさわしい色素の発光波長は約６５０ｎｍ（ＦＬ−３）であった。各粒子は、チオール−マレイミド化学物質をベースとした共有結合によって、５種類のサイトカインのうちの１つに対する抗体と結合させ、これは固有のＦＬ−３強度を有する別々の集団を表した。Ａｂ粒子を、免疫測定パネルにおいて所与のサイトカインを捕捉するためのもので、混合物中で同時に検出することができた。捕捉したサイトカインは、約５８５ｎｍ（ＦＬ−２）で放射するフィコエリトリン（ＰＥ）に結合させた５種類の異なる抗体を使用して直接免疫試験で検出した。０から２０００ｐｇ／ｍｌの範囲の標準物は５種類のサイトカイン全ての混合物であり、したがって５種類の標準曲線が得られた。各試料及びサイトカイン標準混合物について、捕捉Ａｂビーズ試薬１０μｌ、試料若しくは標準物及び検出Ａｂ−ＰＥ試薬を３時間インキュベートし、未結合の検出Ａｂ−ＰＥ試薬を除去するために洗浄してからフローサイトメトリーでデータを取得した。FACScan（登録商標）フローサイトメトリー（Becton Dickinson Immunocytometry System（ＢＤＩＳ）製、San Jose, CA）を使用して２色フローサイトメトリー分析を実施した。データを採取し、Becton Dickinson Cytometric Bead Array（ＣＢＡ）ソフトウェアを使用して分析した。
【００６８】
統計分析
データは全て、平均±標準偏差で表す。指示されたならば、スチューデントのＴ検定を使用して異なる群の間の特定の測定値の違いについて統計学的有意差を計算した。ｐ＜０．０５の値は、統計学的に有意と見なされた（＊ｐ＜０．０５）。
【００６９】
結果
経口ＡＰがＩＢＤに治療的に有望であるかどうかを調べるために、マウスにおけるＴＮＢＳ及びＤＳＳ誘発大腸炎をモデルとして使用した。予測通り、ＴＮＢＳの直腸点滴注入及びＤＳＳの経口投与は、下痢及び消耗性疾患を引き起こした。２日目に、２治療群それぞれの１０匹のマウスのうち２匹が死亡し（図２及び３参照）、早期炎症反応による死亡をＡＰは妨げないことが示された。ＴＮＢＳを最初に直腸内投与してから２日後若しくは３日後に、遅延型過敏性反応４型が活性化し、ほとんどの炎症の原因となり、さらなる死亡を引き起こす。この最初の反応でＡＰ処理はマウスの死を防御することができなかったが、２次的炎症反応による追加的な死は防御した。
【００７０】
飲用水に２％ＤＳＳを５日間投与し、その後１４日目までＡＰ強制栄養を与えた群では、ＡＰ処理群のマウスの３３％が８日目と１０日目の間に死亡した。この群では、その後マウスは死亡しなかった。しかし、プラセボで処理した群では、８日目から１４日まで全部で６０％のマウスが死亡した。ＴＮＢＳモデルと同様に、ＡＰはＤＳＳ大腸炎のその後の段階での死亡を減少させることができたが、誘導期ではできなかった。
【００７１】
ＴＮＢＳを最初に投与した後、マウスの体重は対照マウスと同様にＡＰ処理マウスで初日に減少した（図４参照）。しかし、対照マウスの体重は、４日目に初期体重の９２％まで減少したが、ＡＰ処理マウスの体重は初期体重の９８％を上回るまで増加し、安定した。６日後に、対照マウスはまた、初期体重に到達した。したがって、体重に対する影響は、説明した生存における利点とほとんど一致している。
【００７２】
ＤＳＳの研究では、２％ＤＳＳを投与し、１４日目まで追跡した第２の群のみが統計学的に有意な差を１０日目、１１日目及び１２日目に示した（図５）。その他の２つの群は前記群のように７日目まで追跡したが、その日までＡＰ処理群と非処理群の間に差は認められなかった（データは示さず）。
【実施例３】
【００７３】
サイトカイン産生及びＡＰ活性は、ＡＰ投与マウスの結腸において減少した
ＴＮＢＳ及びＤＳＳマウスの結腸ホモジェネートを、サイトカインビーズ試験により、サイトカインの産生について分析し、Ｔｈ１反応の大きさを調べた。ＡＰ処理マウスのＣＬＮではサイトカイン産生が増加していたのとは対照的に、対照マウスと比較してこれらのマウスの結腸ホモジェネートではＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−５の産生は低下していたが、有意な差はなかった（表１を参照）。２．５％ＤＳＳ誘発大腸炎のマウスでは同様の結果が確認されるが、これらの結果もまた、統計学的有意には達しなかった（データは示さず）。
【００７４】
2007520549.tif 000002
【００７５】
１．５％ＤＳＳマウスにおけるＩＬ−２、−４及び−５の産生は、ほとんど検出できなかった（データは示さず）。ＴＮＦ−αの産生は、ＤＳＳ対照マウスに対してＡＰ処理マウスでは減少したが、有意ではなかった（図７参照）。ＩＦＮ−γ産生の場合、差は有意であり（ｐ＜０．０５）、ＩＦＮ−γ産生はＤＳＳ対照マウスの１００．５±８２．３ｐｇ／ｍｌからＡＰ処理マウスの３１．６±２１．３ｐｇ／ｍｌに減少した。
【実施例４】
【００７６】
マウスのＢＩＡＰの単回経口投与動力学的試験
材料及び方法
研究の対象は、高用量のＢＩＡＰ（ウシ腸アルカリホスファターゼ）を経口的に１回投与した後の局所的及び全身的生物学的利用率である。試験材料を溶液として送達し、使用するまで４℃で保存した。高圧滅菌した飲料水による希釈投薬物を、処理日に新たに調製した。高圧滅菌した飲料水を対照溶液として使用した。
【００７７】
ｂｌａｃｋ／６マウスは、ＤＳＳ誘発大腸炎に適した齧歯類で、安全性試験用として規制当局に受け入れられている。経口による投与経路は、ヒトにおいて企図した治療的使用に対応する。
【００７８】
研究室及びケージを清掃して消毒した。研究中、該研究室及びケージを定期的な間隔で清掃した。室温を２２±３℃に調節し、相対湿度を３０％と７０％との間に維持した。これらの変数を毎日モニターした。人工光を、１２時間明暗のサイクルで６：００ａｍに点灯するように設定した。動物室の空気を１時間当たり約８回入れ替え、適切に濾過した。動物に自由にＳＤＳ  Ｄ３ペレットを与え、栄養及び混入物は供給元が分析した。高圧滅菌によって殺菌した飲料水は常に飲用瓶から自由に利用できた。消費量を、毎日視覚によって制御する。
【００７９】
表２．実験群及びＤＤＳ前処理は、以下のように割り当てた。
2007520549.tif 000003
【００８０】
表３．実験群及びＢＩＡＰ処理群は以下のように割り当てた。
2007520549.tif 000004
【００８１】
表３によれば、対照群とＤＳＳ処理群両方のプラセボ群以外のマウスにはいずれも強制経口投与（高圧滅菌飲料水２５０μｌ）当たり７５０００Ｕ／ｋｇ  ＢＩＡＰの経口投与量で単回投与した。プラセボ群（ｎ＝５）には、高圧滅菌飲料水２５０μｌのみを与えた。動物は全て１回処理した。ＢＩＡＰで処理する前に、動物数匹を表２に従ってＤＳＳで処理した。
【００８２】
血液採取後、動物の腸を準備し、小腸の３分の１部分それぞれから、また結腸から別々に糞便を収集した。各試料は、激しく撹拌することによってグリシン緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ＝９．６）に溶解した。
【００８３】
アルカリホスファターゼ活性を測定するための試験を使用して、これらの試料のアルカリホスファターゼ含量を分析した。無色のパラニトロフェニルリン酸は、ｐＨ９．６及び２５℃でアルカリホスファターゼによって加水分解され、黄色に着色したパラニトロフェノールを形成する。該反応は、分光光度計によって調べた。単位時間当たりの４０５ｎｍにおける吸光度の変化は、アルカリホスファターゼ活性の測定値である。ｐＨ９．６及び２５℃で１分当たり１マイクロモルのパラニトロフェニルリン酸の加水分解を生じる酵素量を１単位と定義する。試料に存在する単位量は、既知のＡＰ濃度を有するＡＰ試料の曲線に対して計算若しくは対応させることができる。
【００８４】
結果
ＤＳＳによる予備処理の間、マウスは大腸炎発症の指標として体重を毎日測定した。対照マウスと比較して約１０％の体重損失をＤＳＳ誘発大腸炎の同定に使用する。６日目に、ＤＳＳで５日間処理したマウスは約１０％の体重が減少しており（図８）、大腸炎の最中に投与されたＢＩＡＰの局所的及び全身的生物学的利用率を同定するための薬物動態実験に使用した。１日後、対照マウスを同様に使用した。
【００８５】
ＤＳＳ摂取を分析するために、瓶の詰め替え前後に飲用瓶の重さを毎日測定した。最初の３日間は、ＤＳＳ処理動物は対照動物とほぼ同様の量の水を消費した。その後、ＤＳＳマウスは、おそらく生活状態の低下の結果として飲む量が少なくなった。しかし、ＤＳＳの毎日の摂取は約４０ｍｇ／マウスで、その他の実験で大腸炎を誘発するために十分であることが示された（図９参照）。
【００８６】
この研究の目的は、腸管における局所的生物学的利用率を分析することであった。この目的のために、様々な時点でマウスを殺処分し、十二指腸から結腸までの腸管を単離した。（十二指腸を含む）小腸を２、３等分に分割した。各部分及び結腸の糞便を摘出し、アルカリホスファターゼ活性を測定した。図１０は、様々な時点における腸の様々な部分のアルカリホスファターゼ活性を示す。十二指腸及び空腸近位部ではいずれの時点においてもアルカリホスファターゼを測定することはできなかった。これはおそらく、この部分の通過は最初の採取時間である１０分以内に起こるという事実によるものであった。１０分の時点で、ＤＳＳ並びに対照動物の両方は、空腸遠位部及び回腸近位部においてアルカリホスファターゼレベルがピークである。３０分と１時間との間では、ＡＰ値のピークが回腸の遠位部で生じる。結腸では、アルカリホスファターゼは強制投与後１時間半に増加し、６時間後にはほとんどのアルカリホスファターゼは排泄されるか、若しくは分解された。
【００８７】
マウス当たり全部で１３５０Ｕを投与したことを考慮すると、局所的生物学的利用率は空腸の遠位部で２００／１３５０＝１５％、結腸で８０／１３５０＝６％であると概算される。しかし、これらの値は、３匹の個々のマウスの平均ピーク値に基づいているので、おそらく実際より小さく見積もられているであろう（考察参照）。
【００８８】
この研究の目的は、高用量の経口投与後のＢＩＡＰの局所的生物学的利用率を概算することであった。局所的生物学的利用率は、空腸の遠位部で１５％、結腸で６％であると概算された。これらの値は、個々のマウスから所与の時点で得られており、経時的に１匹のマウスの腸管全体のアルカリホスファターゼ活性を表していないので、実際よりずいぶん小さく見積もられているだろう。結果として、ピーク値は個々のマウスでは所与の時間の腸の所与の部分において見落とされる可能性がある。しかし、図１０で示したような結果は、経口投与によるＡＰの局所的生物学的利用率を明確に示している。これらの結果は、哺乳類の体腔の粘膜内層からの（毒性）ＬＰＳ流入を防御若しくは減少させるために、アルカリホスファターゼの供給源を対象に投与するための本発明の方法の実現可能性を強調している。
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【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】本発明のモデルを３段階で説明した図である。１．正常なＡＰ組織化学及びＬＰＳ解毒を備えた健康な状態の粘膜。２．ＡＰ染色が不十分で、ＡＰによるＬＰＳの解毒が不十分で、腸管から循環系への毒性ＬＰＳの流入／転位によって炎症反応が引き起こされている病的状態。３．外部からＡＰの供給源をもたらすことによって粘膜ＡＰレベルが回復し、ＬＰＳが解毒される。
【図２】ＴＮＢＳ誘発大腸炎マウスの致死率を示す図である。
【図３】ＤＳＳ誘発大腸炎マウスの致死率を示す図である。
【図４】ＡＰ処理及び未処理のＴＮＢＳ誘発大腸炎マウスの体重減少を示す図である。
【図５】ＡＰ処理及び未処理のＤＳＳ誘発大腸炎マウスの体重減少を示す図である。
【図６】ＴＮＢＳ大腸炎のマウスの結腸におけるサイトカイン産生を示す図である。ａ．結腸におけるＴＨ１反応ｂ．結腸におけるＴＨ２反応
【図７】結腸ホモジェネートにおけるａ．ＴＮＦ−α及びｂ．ＩＦＮ−γの濃度を示す図である。対照マウスは、病気ではなく、処理をしていないマウスの正常値である。
【図８】ＤＳＳ処理は体重を減少させることを示す図である。マウスは、通常の飲料水若しくは２％ＤＳＳを含有する飲料水で５日間処理した。６日目に、ＤＳＳ処理動物は対照動物と比較して約１０％体重が減少しており、「大腸炎」と確認された。群当たり動物２９匹の平均を標準偏差と共に示す。
【図９】ＤＳＳ処理マウスは１日当たりＤＳＳを４０ｍｇと８０ｍｇとの間で消費することを示す図である。マウスは、飲料水若しくは２％ＤＳＳを含有する飲料水で処理した。瓶の詰め替え前後に飲用瓶の重さを測定した。値は、平均水摂取量ｇ／マウス／日で示す。
【図１０ａ−ｄ】強制投与後の様々な時点における腸管の様々な部分のアルカリホスファターゼレベルを示す図である。強制投与後様々な時点で、マウスを殺処分し、腸を取り出した。腸管の様々な部分から糞便を収集し、アルカリホスファターゼ含量を測定した。時点毎に３匹のマウスの平均値を示す。
【図１】
2007520549.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007520549.tif 000009
【図６】
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【図７】
2007520549.tif 000011
【図８】
2007520549.tif 000012
【図９】
2007520549.tif 000013
【図１０ａ】
2007520549.tif 000014
【図１０ｂ】
2007520549.tif 000015
【図１０ｃ】
2007520549.tif 000016
【図１０ｄ】
2007520549.tif 000017
【国際調査報告】
2007520549.tif 000018
2007520549.tif 000019
2007520549.tif 000020