(57)【要約】  本発明は、  −２〜９ｎｍの範囲に含まれる平均直径を有し、少なくとも９０重量％がＬｎ2Ｏ3から成り、ここでＬｎが任意には希土類又はアクチニドでドープされた希土類又は希土類混合物、又は希土類とアクチニドの混合物であり、ここで金属イオンの少なくとも５０％が希土類イオンである、ナノスフェア；−０．５〜１０ｎｍの範囲、好ましくは２ｎｍ超で１０ｎｍ以下の範囲に含まれる平均厚みを有する、機能化されたポリシロキサンから主として成る、ナノスフェアのまわりのコーティング；及び−ポリシロキサンコーティングに共有結合させることによりグラフト化された少なくとも１つの生物学的リガンド、を含有するハイブリッドナノ粒子及びその調製方法に関する。
2007526471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−２〜９ｎｍの範囲に含まれる平均直径を有し、少なくとも９０重量％がＬｎ2Ｏ3から成り、ここでＬｎが任意には希土類又はアクチニドでドープされた希土類又は希土類混合物、又は希土類とアクチニドの混合物であり、ここで金属イオンの少なくとも５０％が希土類イオンである、ナノスフェア；
−０．５〜１０ｎｍの範囲、好ましくは２ｎｍ超で１０ｎｍ以下の範囲に含まれる平均厚みを有する、機能化されたポリシロキサンから主として成る、ナノスフェアのまわりのコーティング；及び
−ポリシロキサンコーティングに共有結合させることによりグラフト化された少なくとも１つの生物学的リガンド、
を含有するハイブリッドナノ粒子。
【請求項２】
コーティング中、ケイ素原子の５〜７５％好ましくは３０〜５０％が酸素架橋により４つのその他のケイ素原子に結合させられていることを特徴とする、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
コーティングが１．６〜２．４の範囲、好ましくは１．８〜２．１の範囲に含まれる密度を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
コーティングが２未満の密度を有することを特徴とする、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項５】
１０〜１０００００個の発光性有機分子が共有結合によりコーティングにグラフト化されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
蛍光有機分子がローダミン又はフルオレセインの誘導体の中から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
ナノスフェアが、少なくとも８０重量％について、任意にはドープされた希土類セスキ酸化物から成ることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
ナノスフェアが、少なくとも８０重量％について、好ましくは少なくとも９０重量％について、Ｇｄ2Ｏ3から成ることを特徴とする、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項９】
ナノスフェアが、少なくとも８０重量％について、好ましくは少なくとも９０重量％について、Ｙ2Ｏ3から成ることを特徴とする、請求項７に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
ナノスフェアが、金属カチオンの０．１〜２５％を占めるＥｕ、Ｔｂ、Ｅｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｍタイプのランタニドでドープされていることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
ナノスフェアがＮｄ又はＹｂタイプのランタニドでドープされていることを特徴とする、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
ナノスフェアがＥｒタイプのランタニドでドープされていることを特徴とする、請求項１０に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
ナノスフェアが金属カチオンの０．１〜２５％を占める少なくとも２つの異なるランタニドでドープされており、これらのランタニドの少なくとも１つはＥｕ及びＴｂの中から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
ナノスフェアの金属カチオンの１０％超が、Ｇｄ、Ｎｄの中から選択された磁気的挙動を有するランタニドカチオンであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
ナノスフェアの金属カチオンの５０％超が、Ｇｄ、Ｎｄの中から選択された磁気的挙動を有するランタニドカチオンであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１６】
ナノスフェアの金属カチオンの０．０１％〜５０％、好ましくは０．１％〜１０％が、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｎｐ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕの中から選択されたウラニドカチオンであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１７】
広範な中性子捕捉能力を有するナノスフェアの金属カチオンの少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％が、例えば同位体157Ｇｄ及び235Ｕの中から選択されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１８】
生物学的リガンドの１〜１０００個、好ましくは１〜１００個の分子が、共有結合によりコーティング上にグラフト化されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項１９】
ナノ粒子の１０重量％未満が、コーティング上にグラフト化された生物学的リガンドの２個超の分子を含有することを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項２０】
グラフト化された単数又は複数の生物学的リガンドが、ヌクレオチド、糖、ビタミン、ホルモン、ビオチン、ストレプトアビジン又は生物学的ベクター作用に有利な任意のその他の有機分子から誘導されることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項２１】
生物学的リガンド以外の発光性分子又は錯化分子がコーティング上にグラフト化されることを特徴とする、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
有機リン酸エステル、第４級アミンタイプの極性又は荷電分子がコーティング上にグラフト化されていることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項２３】
５０００ｇ／モル未満、好ましくは１０００ｇ／モル未満の分子量を有する水溶性重合体、例えばポリエチレングリコール又はデキストランの分子がコーティング上にグラフト化されることを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のハイブリッドナノ粒子のコロイド懸濁液。
【請求項２５】
ａ）２〜９ｎｍの範囲に含まれる平均直径を有し、少なくとも９０重量％がＬｎ2Ｏ3から成り、ここでＬｎが任意には希土類又はアクチニドでドープされた希土類又は希土類混合物、又は金属イオンの少なくとも５０％が希土類イオンである希土類とアクチニドの混合物であるナノスフェアのコロイド懸濁液を調製する段階；
ｂ）０．５〜１０ｎｍの範囲、好ましくは２ｎｍ超で１０ｎｍ以下の範囲に含まれる平均厚みを有する、少なくとも１つの反応基で機能化されたポリシロキサンから主としてなる、粒子の表面上のナノスフェアのまわりのコーティングを形成するのに必要な量のオルガノアルコキシシランと架橋剤の混合物をコロイド懸濁液に添加する段階；
ｃ）コーティング表面上に存在する反応基とカップリングさせることにより、コーティングに対し少なくとも１つの生物学的リガンドを化学的にグラフト化する段階；
ｄ）任意には、得られたハイブリッドナノ粒子を分離し乾燥させる段階、
を含んで成ることを特徴とする、任意には請求項２４に記載のコロイド懸濁液の形をしている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のハイブリッドナノ粒子を調製する方法。
【請求項２６】
段階ａ）において、溶媒１リットルあたり１００ｍｇと１００ｇの間のナノスフェアを含有するコロイド懸濁液が、特にエチレングリコールタイプのポリオールのような極性溶媒の中に希土類及び／又はアクチニドの前駆物質を溶解させること及び、少なくとも所望のセスキ酸化物を形成するのに必要な量の水、そして任意には溶媒１リットルあたり０．０１〜１モルの濃度のＮａＯＨのような塩基の存在下で１３０〜２５０℃の間の温度まで加熱することによって調製されることを特徴とする、請求項２５に記載の調製方法。
【請求項２７】
希土類又はアクチニドの前駆体が、塩化物、酢酸塩又は硝酸塩タイプであることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
段階ｂ）で、架橋剤としてオルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ）を使用することを特徴とする、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
使用されるオルガノアルコキシシランの分子の一部が、発光性分子に共有結合されることを特徴とする、請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
段階ｃ）の前には、コーティング表面上に存在する反応基とカップリングさせることによる、発光性分子及び／又は錯化分子及び／又は極性又は荷電分子及び／又は水溶性重合体分子のグラフト化段階が先行していることを特徴とする、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体系における検出、追跡及び定量化用のプローブの技術的分野に関する。より特定的には、本発明の主題は、プローブ分子がそれに固定化されている平均直径１０ｎｍ未満のランタニドセスキ酸化物を含有するナノ粒子から成るコアを有する新規のハイブリッドプローブ及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
標的（ターゲット）と呼ばれる特定の物質の検出（認識）又は追跡のための生体系内のラベラーと会合したプローブの使用は、医療診断及び生物学的研究の分野で通常の技術である。プローブは特に、生物学的材料及び非生物学的材料の両方の研究のため、フローサイトメトリ、組織学、免疫学的検定又は蛍光顕微鏡検査法用に使用される。
【０００３】
通常の標識系は例えば、その検出には特定の基質が必要となるペルオキシダーゼ酵素又はアルカリホスファターゼといったような、ヨウ素、リンその他の元素の放射性同位体である。大部分の場合において、ラベラーと検出すべき物質の間の選択的カップリングが単一の機能的分子又は機能的分子の会合により行なわれる。きわめて明確に検出すべき標的物質を同定するためには、結合選択性が不可欠である。このようなカップリングを確保する反応は既知であり、例えば「バイオコンジュケート技術」、G.T. Hermanson, Academic Press １９９６又は「生物活性のための蛍光及び発光性プローブ、定量的実時間分析用技術の実践的指針」第２版、W.T. Mason ed. Academic Press, １９９９の中で記述されている。
【０００４】
蛍光有機染料が標識のために用いられることが極めて多い。これらは、プローブとして作用する規定の生体又は有機物質に対して選択的に連結されているフルオレセイン、テキサスレッド又はＣｙ５である。標識されたプローブが電磁性であることが最も多い外部供給源によって励起された後、プローブに結合された標的生体又は有機物質の存在は、プローブによる蛍光発出によって証明される。
【０００５】
現行の技術の根底にある蛍光有機染料がもつ主たる欠点の１つは、その低い化学安定性にある。これらの染料は、酸又はラジカルの存在下での吸光及び発光の数百万サイクルの後劣化し、さらには分解さえする。同様に、大部分の利用分野において、これらの染料は、入射光に対して不充分な安定性しか示さない。さらに、蛍光有機染料は、生物学的環境に対し光毒性効果を及ぼす可能性がある。
【０００６】
蛍光有機染料はまた、広いスペクトル範囲にわたって発光しきわめて狭い帯域幅の中にある波長を有する放射線により励起されるという欠点をも有する。このような理由から、多重化とも呼ばれる異なる蛍光染料で各々標識された幾つかの物質の同時同定は、発光帯域の重複により困難となり、異なる形で標識された物質の計数は制限されている。同様に、異なる染料の効率の良い励起には一般的にはレーザーである複数の光源、又は励起源として光が使用される場合には一連のフィルタを含む複合光学アセンブリの使用が必要となる。
【０００７】
先行技術はすでに、蛍光有機染料の使用に対する代替案を提案している。第１の代替案としては、蛍光ラベラーとしてランタニド群の金属イオンとの金属錯体（キレート化リガンド）を使用することが可能である（米国特許第４，６３７，９８８号及び同第５，８９１，６５６号）、これらのシステムの主たる利点は、励起された物体が、場合によっては数ミリセカンドにも達する長い寿命を有し、時間分解能をもつ実験を考慮できるようにするという点にある。しかしながら、これらのランタニドキレートの使用には、水性媒質中のルミネセンスの非常に高い希釈（クエンチング）に妨害される。このことは、生体媒質が一般に高い含水量を有するために、キレートの応用分野を制限する。従って検出すべき物質を生体媒質から分離してそれを無水環境内に入れるという試みが行なわれてきた（I. Hemmila, Scand. J. Clin. Lab. Invest. ４８，１９８８  ３８９〜４００頁）。しかしながら、標識点のデータが分離段階中に失われることから、これらが免疫組織学試験を可能にすることはない。米国特許第４，２８２，３８２号及び米国特許第４，２５９，３１３号においては、ランタニドキレートが中に捕捉されている重合体粒子（ラテックス）を蛍光ラベラーとして使用できるということが指示されている。
【０００８】
先行技術において提唱されているもう１つの代替案は、元来発光性の粒子で検出すべき標的に結合することが意図されているプローブを標識することから成る。特に、半導体材料のナノ粒子が、熱心な研究の主題であった。米国特許第５，９９０，４７９号及びＷＯ００／１７６４２号及びＷＯ００／２９６１７号として公開された国際特許出願は、ＩＩ−ＶＩ属又はＩＩＩ−Ｖ属の元素に属する蛍光半導体ナノ結晶及び或る種の条件下で周期表の主要第４族由来の元素から成るものを、生体系用の蛍光ラベラーとして用いることができる、ということを示している。「量子サイズ効果」として知られる現象を理由として、蛍光半導体ナノ結晶の発光波長はそのサイズにより決定される。従って、これらのナノ結晶のサイズを変動させることにより、可視光から近赤外線までの広いスペクトル範囲を網羅することが可能である。生物学的ラベラーとしてのそれらの使用については、Warren C.W.Chan, Shuming Nie, Science, ２８１，２０１６−２０１８，１９９８，及びMarcel Bruchez Jr. Mario Moronne, Peter Gin, Shimon Weiss, A. Paul Alivisatos, Science, ２８１，２０１３−２０１６，１９９８によって記述されている。充分確定された発光長をもつすなわち低いサイズ分散を伴う半導体ナノ結晶の調製には、作動条件及び合成プロセスの完全な制御及びきわめて正確な精度が必要とされる。従ってこれらのナノ結晶の生産は非常にむずかしい。これらの半導体結晶により提供される広い色範囲は、およそ数オングストローム（すなわち数原子層）のサイズ変動に起因するものである。解決法を総括することによってこのような高い精度に達することができるのは稀である。さらに、ナノ結晶の表面上に見られる電子正孔対の組合せは、量子収量を低い値に制限する。
【０００９】
この問題を回避するため、コア／シェル構造が提案されてきた。こうして、より広いギャップをもつ半導体材料（ＺｎＳ、コロイド懸濁液）層で蛍光半導体ナノ結晶を個別にコーティングすることが必要となる。同様に、蛍光半導体ナノ結晶での生体分子の選択的標識には、アミン基により機能化されたポリシロキサン層の形成（エポキシ及びカルボン酸）が必要となる。これらは、生体分子のための定着点を形成する。従ってこれらのナノ結晶の調製には、少なくとも３つの合成段階が必要となり、最初の２つは、非常に繊細で従って工業レベルで応用するのが困難である。
【００１０】
発光性イオン（希土類）でドープすることにより発光性となった酸化物ナノ粒子を用いた標識は、将来性ある結果にも関わらずまだ広く使用されてはいない。その主たる欠点は、結晶マトリクス内に存在する発光性イオンを励起するためにレーザーの使用が求められるその低い量子収量にある。同様に、これらの粒子は水性媒質中で直接使用された場合に著しく品質が低下する。
【００１１】
生物学的に有利な分子のための標識用作用物質として用いることのできるシランでコーティングされた金属酸化物のナノ粒子について記述している米国特許出願公開第２００３／０１８０７８０号として公開された特許出願に特に言及することができる。与えられた唯一の例は、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）から得られた非常に薄いシラン層でコーティングされたＥｕ2Ｏ3のナノ粒子に関するものであり、これらのナノ粒子は、１００〜２００ｎｍの平均直径を有している。
【００１２】
生物学的利用分野のためには、そのコロイド懸濁液がより優れた「安定性」を示しその構成要素がより大きな「穏密性（furtivity）」つまり、「分子性（molecularity）」を示す、より小さなサイズのナノ粒子を使用することが有利である。標識のためのより小さなサイズのナノ粒子の使用は、生物学的機能のターゲティングの改善を可能にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
このような状況の下で、本発明は、充分小さいサイズをもち特に外部水性媒質による攻撃に対する安定性の改善を示す生体標識用のハイブリッドプローブナノ粒子を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、本発明の主題は、
−２〜９ｎｍの範囲に含まれる平均直径を有し、少なくとも９０重量％がＬｎ2Ｏ3から成り、ここでＬｎが任意には希土類又はアクチニドでドープされた希土類又は希土類混合物、又は希土類とアクチニドの混合物であり、ここで金属イオンの少なくとも５０％が希土類イオンである、ナノスフェア；
−０．５〜１０ｎｍの範囲、好ましくは２ｎｍ超で１０ｎｍ以下の範囲に含まれる平均厚みを有する、機能化されたポリシロキサンから主として成る、ナノスフェアのまわりのコーティング；及び
−ポリシロキサンコーティングに共有結合させることによりグラフト化された少なくとも１つの生物学的リガンド、
を含有するハイブリッドナノ粒子にある。
【００１５】
特に、希土類でドープされたＬｎ2Ｏ3セスキ酸化物のナノ粒子の使用は、その発光光線がきわめて狭く、異なるカチオンでのドーピングにより異なる発光光線を得ることが可能であるために特に有利である。
【００１６】
さらに、コアナノスフェア内に希土類イオン（優れた光安定性、励起状態の長寿命）の存在及びコーティングの表面内及び／又は上の発光性分子の存在を通して発光性となったナノ粒子を使用することで、特に時間分解ルミネセンス顕微鏡検査といった光学画像形成のための高性能手段が使用される場合に、時間分解検出が可能になる。
【００１７】
同様に、これらのナノ粒子がガドリニウムといったような有利な磁気特性をもつランタニドを含有する場合、ＭＲＩ用の造影剤としてか又は、外部的に適用される交番磁場を用いるナノ粒子の相互作用に続くターゲティングされた細胞の破壊を可能にする例えば高温を発生させる治療システム内で、これらのナノ粒子を用いることができる。
【００１８】
さらに、これらのナノ粒子は、157Ｇｄ又は235Ｕのような高エネルギーの反応とカップリングされた広範な中性子捕捉能力をもつ元素を含む場合、中性子捕捉に基づいた療法（例えば癌に対する）のために使用可能である。
【００１９】
上述のナノ粒子のコロイド懸濁液も同様に、本発明の一部を成している。
【００２０】
本発明のさらなる主題は、
ａ）２〜９ｎｍの範囲に含まれる平均直径を有し、少なくとも９０重量％がＬｎ2Ｏ3から成り、ここでＬｎが任意には希土類又はアクチニドでドープされた希土類又は希土類混合物、又は金属イオンの少なくとも５０％が希土類イオンである希土類とアクチニドの混合物であるナノスフェアのコロイド懸濁液を調製する段階；
ｂ）０．５〜１０ｎｍの範囲、好ましくは２ｎｍ超で１０ｎｍ以下の範囲に含まれる平均厚みを有する、少なくとも１つの反応基で機能化されたポリシロキサンから主としてなる、粒子の表面上のコーティングを形成するのに必要な量のオルガノアルコキシシランと架橋剤の混合物をコロイド懸濁液に添加する段階；
ｃ）コーティング表面上に存在する反応基とカップリングさせることにより、コーティングに対し少なくとも１つの生物学的リガンドを化学的にグラフト化する段階；
ｄ）任意には、得られたハイブリッドナノ粒子を分離し乾燥させる段階、
を含んで成る、任意にはコロイド懸濁液の形をしている上述の通りのハイブリッドナノ粒子を調製する方法にある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下の説明は、添付図面を参照して、本発明の主題をより良く理解できるようにするものである。以下で説明するいろいろな変形形態は、互いに排除し合うものでないかぎり、組合わせることができる。
【００２２】
本発明のより詳細な説明の最初に、本明細書の残りの部分で使用される用語の定義を以下に説明する。
【００２３】
希土類は、スカンジウム及びイットリウムそしてＣｅ、Ｐｒ、Ｎｄ、Ｐｍ、Ｓｍ、Ｅｕ、Ｇｄ、Ｔｂ、Ｄｙ、Ｈｏ、Ｅｒ、Ｔｍ、Ｙｂ、Ｌｕであるランタニド系列を含む。本発明の意味合いでは、希土類というのは、好ましくはイットリウム及びランタニド系列の中から選ばれた元素を意味する。
【００２４】
アクチニドはＡｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｕ、Ｎｐ、Ｐｕ、Ａｍ、Ｃｍ、Ｂｋ、Ｃｆ、Ｅｓ、Ｆｍ、Ｍｄ、Ｎｏ及びＬｗである。
【００２５】
ｄ50と呼ばれるナノスフェアの平均直径又は中位径は、ナノスフェアの塊の５０％がそれ未満の径に見られ、レーザー拡散技術（光子相関分光法）により決定される直径によって定義される。
【００２６】
Ｌｎ2Ｏ3セスキ酸化物は、金属イオンの２５％以下の割合で存在する場合の希土類又はアクチニドによりドープされるものと言える。この値を超えると、それは混合物となる。
【００２７】
本発明は、少なくとも１つの生物学的リガンド及び任意にはその他の有機分子の共有結合によるグラフト化を可能にする、リングとも呼ばれるコーティングによってとり囲まれたコアナノスフェアを基本的に含んで成る生物学的利用分野のためのプローブに関する。本ナノスフェアは、ナノメートルサイズの基本的に球形の無機発光性コアである。より精確には、この球形コアは、Ｌｎが純粋な希土類を表わすか又は希土類、アクチニド又はその組合せでドープされているか又は希土類の混合物又は、少なくとも金属カチオンの５０％が希土類カチオンである希土類とアクチニドの混合物であるものとしてＬｎ2Ｏ3で構成されている。このコアナノスフェアは、２〜９ｎｍの範囲内の平均直径を有する。本ナノスフェアの少なくとも９０重量％は、上に定義された通りのＬｎ2Ｏ3から成り、残りは場合によって対応する水酸化物から成る。
【００２８】
コーティングは、ナノスフェアをとり囲む中間層であり、これに対し生物学的リガンドが共有結合により結合されている。本コーティングは、主として、機能化されたポリシロキサンから成り、０．５〜１０ｎｍ、好ましくは２ｎｍ超の平均厚みを有する。このコーティングの機能は、少なくとも以下のとおり３重であるが、このリストには制限的意味はない。すなわち、それは外部媒体に対するコアの保護（シール）を確保しなければならず、又はそれに結合された生物学的リガンドのためのグラフト化部位として作用しなければならず、又可視光波長で再発光するコアに向かってのＵＶ吸収リングからのエネルギー伝達により、鉱物コアの光学的性能を増大しなくてはならない。
【００２９】
本発明のナノ粒子の球形コアを形成するナノスフェアのタイプは、目標とする利用分野との関係において選択され、好ましくは、少なくとも８０重量％の任意にはドープされた希土類セスキ酸化物から成る。好ましくは、このナノスフェアは、ドープされるかさらには同時ドープすなわち少なくとも２つの異なるタイプの元素でドープされる。
【００３０】
有利には、ナノスフェアは、少なくとも８０重量％、好ましくは少なくとも９０重量％のＹ2Ｏ3又はＧｄ2Ｏ3から成り、Ｇｄ2Ｏ3が好ましい。
【００３１】
一般的なルミネセンスが望まれる場合、ナノスフェアは、その金属カチオンの０．１〜２５％を占めるＥｕ、Ｔｂ、Ｅｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｍタイプのランタニドでドープされる。赤外線でのルミネセンスが望まれる場合、ナノスフェアは、Ｎｄ又はＹｂタイプのランタニドでドープされる。アンチストークスルミネセンスが望まれる場合、ナノスフェアは、Ｅｒタイプのランタニドでドープされる。
【００３２】
前述した通り、組合せ型検出（多重化）のためには、ナノスフェアは、その金属カチオンの０．１％〜２５％を占める少なくとも２つの異なるランタニドでドープされており、これらのランタニドの少なくとも１つはＥｕ及びＴｂの中から選択される。
【００３３】
また、検出を容易にするためには、特に磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）の分野又は治療的利用分野での応用のためには、ナノスフェアがそのルミネセンス特性に加えて、磁気特性を有するはずであることが有利である。従って、有利には、ナノスフェアは、医療用画像形成利用分野についてはコア中に存在する全ての金属カチオンの少なくとも１０％、そして発熱療法の利用分野については少なくとも５０％を占めるＧｄ、Ｎｄの中から選択された磁気的挙動を示す希土類カチオンを含有している。
【００３４】
もう１つの有利な変形形態に従うと、ナノスフェアの金属カチオンの０．０１〜５０％、好ましくは０．１〜１０％が、Ａｃ、Ｔｈ、Ｐａ、Ｎｐ、Ｕ、Ｐｕの中から選択されたアクチニドカチオンである。放射性核種でのナノスフェアのドーピングは、特に核反応関連療法において利用される。
【００３５】
もう１つの有利な変形形態は、ナノスフェアの金属カチオンの少なくとも０．１％が、１０００年未満の半減期をもつ放射性同位体であるか又はナノスフェアの金属カチオンの少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％が、高反応エネルギーをカップリングされた広範な中性子捕捉能力をもつ同位体（例えば157Ｇｄ、235Ｕ）であるハイブリッドナノ粒子に関する。本ナノ粒子は、核分解反応に基づく療法システム、例えば癌細胞の破壊のためにきわめて有利である。
【００３６】
好ましくは、本ナノスフェアは、任意にはドープされている少なくとも９０重量％のランタニドセスキ酸化物から構成されている。ナノスフェアがＴｂ又はＥｕでドープされた少なくとも９０重量％のＧｄ2Ｏ3から成る本発明のハイブリッドナノ粒子が特に好ましい。Ｇｄ3+は、強い常磁性を示すと同時に、発光性Ｅｕ及びＴｂカチオンのためのマトリクスとして作用し得るカチオンである。
【００３７】
希土類セスキ酸化物、特にガドリニウムセスキ酸化物のナノスフェアは、水性媒質中で加水分解に対して感応性がある。セスキ酸化物から水酸化物への変換を防止するため、機能化されたポリシロキサンから主として成る保護層でコーティングされる。この層は、保護を確保するのに充分な厚みを有していなくてはならない。その平均厚みは、０．５〜１０ｎｍの範囲にあり、好ましくは１ｎｍ超である。コーティング層は有利には、ナノ粒子の合計体積の少なくとも２０％を占め、好ましくは、２５〜７５％を占める。厚みは、レーザー粒度測定（光子相関分光法）によって測定される。同様に、単離されたナノ粒子について、透過電子顕微鏡により層の厚み及びナノスフェアの直径を測定することも可能である。
【００３８】
有利には、このコーティングは、酸化物コアのルミネセンス特性を保護し、かつ／又は球形コアとの関係におけるエネルギー伝達を可能にする。すなわちＵＶ励起はポリシロキサンリングによって吸収され、球形コアまで移送され、これがそのルミネセンスを増大させる。この機能は、ポリシロキサン層のケイ素原子の５〜７５％、好ましくは３０〜５０％が各々酸素架橋により４つのその他のケイ素原子に結合されている場合特に確保され、これが本発明の好ましい一変形形態を構成する。従って、本発明の有利な変形形態に従うと、機能化されたポリシロキサンコーティングのケイ素原子の２５〜９５％、好ましくは５０〜７０％が炭素原子に共有結合され、従って機能化される。
【００３９】
また、この機能化されたポリシロキサン層の密度は、達成が望まれている優先的効果との関係において選択可能である。特に、１．６〜２．４、好ましくは１．８〜２．１の範囲の密度を有する層が、ヒドロキシル化に対する球形コアの保護をさらに促進し、そのルミネセンスを維持するために好まれる。２未満の密度をもつコーティングが、ＭＲＩ又は発熱療法の利用分野のために好適である。
【００４０】
この機能化されたポリシロキサンはまた、少なくとも１つの生物学的リガンドそして任意にはその他の有機分子又は重合体の共有結合によるグラフト化をも可能にする。特にローダミン又はフルオレセインの誘導体の中から特に選択された１０〜１０００００個の発光性有機分子が、生物学的リガンド（単複）に加えて表面上及び／又はコーティング内部でグラフト化され、時間分解検出を可能にする。励起された状態の寿命は、発光性有機分子については数ナノセカンドであり、ランタニドセスキ酸化物のナノ粒子についてはおよそ１マイクロセカンドである。
【００４１】
本発明の１変形形態に従うと、１〜１０００個、好ましくは１〜１００個の生物学的リガンド分子が共有結合により、機能化されたポリシロキサン上にグラフト化される。本発明のもう１つの変形形態に従うと、これらのナノ粒子の１０重量％未満が中間層上にグラフト化された３つ以上の生物学的リガンド分子を含んでいる。
【００４２】
生物学的リガンドというのは、生物学的に有利な標的分子と反応できるようにする少なくとも１つの認識部位を有する化合物を意味する。グラフト化された生物学的リガンドは例えば、ヌクレオチド、糖、ビタミン、ホルモン、ビオチン、ストレプトアビジン又は生物学的ベクター作用に有利な任意のその他の有機分子の誘導体である。
【００４３】
また、生物学的リガンド（単複）以外の発光性分子又は錯化分子が機能化されたポリシロキサン層上にグラフト化され得る可能性もある。有機リン酸エステル、第４級アミンタイプの極性又は荷電分子も中間層上にグラフト化され得る。もう１つの可能性は、例えばポリエチレングリコール又はデキストランのような５０００ｇ／モル未満、好ましくは１０００ｇ／モル未満の分子量を有する水溶性重合体分子をポリシロキサン層上にグラフト化することである。
【００４４】
また、本発明は、任意にはコロイド懸濁液の形で上述のようなハイブリッドナノ粒子を調製するための方法にも関する。この方法は以下に詳述する異なる連続的段階（工程）を含む。
【００４５】
本方法の第１の段階は、低い多分散性を伴い容易に再分散可能であるすなわち凝集体形成を全く伴わない状態で得られる、２〜９ｎｍの間の平均直径の結晶性ナノスフェアを大量に得ることにある。本発明の方法には、等分散されたコロイド分散の直接的調製が含まれる。等分散された分散というのは、光子相関分光法の下で測定されたそのサイズ分布が非常に近い、すなわち、例えば９０％超の粒子が分散の平均直径ｄ50値の±２０％の間にある直径を有する分散を意味する。直径分布が狭くなればなるほど、その系はより等分散した又は単分散したものとなる。
【００４６】
これらのナノ粒子は、ポリオール方法を用いて調製される。この「ポリオール」法は、一般に１３０℃〜２５０℃の間の温度にしたポリアルコール中の固体の直接的沈殿から成る。金属前駆体は、予めポリオール（例えばジエチレングリコール）中に溶解させられ、その後、試薬の任意の添加の後、溶液は１５０℃超の温度にされる。ポリオールは、安定化剤として作用し、粒子の成長を制限し、粉末凝集体を最小限におさえる。
【００４７】
この方法では、異なるサブミクロン酸化物粉末がすでに合成されてきており、なかでも言及できるのは、ＣｅＯ2、Ｃｅ3+ドープドＬａＰＯ4（C. Feldmann, Advanced Materials（先端材料）、１３（２００３）１０１）及びＥＵ3+ドープドＹ2Ｏ3（C. Feldmann, J.Merikhi, Journal of Materials Science（材料科学ジャーナル）、３８（２００３）１７３１〜１７３５）である。本発明において使用されるナノスフェアは、例えば、Journal of Luminescence（ルミネセンスジャーナル）１０２−１０３（２００３）、４４５〜４５０、及び Colloid and Interface Science（コロイド及び界面科学）、doi：１０．１０１６／j. jcis. ２００３．１０．０３１）の中で記述されている「ポリオール」法に従って得られる。このリストは制限的な意味をもたず、使用される前駆体は塩化物、硝酸塩又は酢酸塩であり得る。従って、より高いｇ／ｌ濃度を得ることができる。有利には、溶解１リットルにつき１００mg〜１００ｇの間のナノスフェアを含有するコロイド懸濁液が得られる。
【００４８】
セスキ酸化物 ナノスフェアの合成は、例えば、粒度を制御することを可能にする強い溶媒和力をもつジエチレングリコール（ＤＥＧ）タイプのポリオールのような極性溶媒の中で、２００℃未満の温度で実施される。例えば希土類塩化物ＲＥＣｌ3（ＲＥ：Ｇｄ、Ｙ）及びランタニド塩化物Ｌｎ’Ｃｌ3（Ｌｎ’：Ｅｕ、Ｔｂ、Ｅｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｍ）又はアクチニド硝酸塩（Ｕ）のようなナノスフェアを形成することになる異なる金属セスキ酸化物の前駆体がジエチレングリコール中に分散させられる。金属イオンの大域的濃度は、有利には０．１〜０．５Ｍの間にあり、希土類塩化物ＲＥＣｌ3（ＲＥ：Ｇｄ、Ｙ）、ランタニド塩化物Ｌｎ’Ｃｌ3（Ｌｎ’：Ｅｕ、Ｔｂ、Ｅｒ、Ｎｄ、Ｙｂ、Ｔｍ）又はアクチニド硝酸塩（Ｕ）の相対量は、所望の混合物のタイプ又は所望のドーピングレベルによって左右される。撹拌後、有利には１mlの水酸化ナトリウム水溶液が添加され、混合物はシリコン油浴中で１時間１４０℃まで加熱される。存在する化合物が完全に溶解した時点で、溶液は、勢いよく撹拌しながら４時間１８０℃に加熱される。結果は、数ヵ月にわたり安定しているＤＥＧの中で分散されたナノスフェアのコロイド溶液である。ドーパント（希土類又はアクチニド）の数量とは無関係に、ナノメートルサイズの粒子は、単相から成る固溶体の形をとる。イオン濃度及び加水分解速度（添加水の量対金属イオン量の比）は、サイズ制御のために調整可能である。水酸化物の沈殿を妨げるためＯＨ-濃度は可能なかぎり低いものでなくてはならないことが発見された。希土類カチオンのモル数との関係において当量のＮａＯＨの添加は、優れた妥協案であると思われる。より低い数量は低収量（３０％未満のランタニド酸化物）により特徴づけられ、より高い数量は不可逆的水酸化物沈殿により特徴づけされる。
【００４９】
その結果、特に好ましい要領で、本方法の段階ａ）では、溶媒１リットルあたり１００mgから１００ｇの間のナノスフェアを含有するコロイド懸濁液が、極性溶媒特にエチレングリコールタイプのポリオール内に希土類及び／又はアクチニド前駆体を溶解させ所望のセスキ酸化物の形成に少なくとも必要な量の水そして任意には溶媒１リットルあたり０．０１〜１モルの間のＮａＯＨのような塩基の存在下で１３０〜２５０℃の間の温度まで加熱することによって、調製される。
【００５０】
得られたナノスフェアのコロイド懸濁液は、任意には、例えば減圧下での蒸発により残留する可溶性塩及びポリオールの一部分を除去するか、又は例えばクロマトグラフィ又は透析により溶媒を交換し、溶液中に存在する水の量を制御することによって、精製及び／又は濃縮され得る。
【００５１】
本発明の意味合いにおいては、Ｌｎ2Ｏ3のナノスフェアは、次いで、セスキ酸化物の表面及び有機分子（フルオロフォア、分散剤など）の両方との及び／又はそれに結合されるべき生物学的リガンドとの強い持続性の相互作用を樹立する能力をもつ分子の層でコーティングされる。ナノスフェアが溶解しかつ／又はこれらのナノスフェアが水中に分散させられた場合にルミネセンス強度の低下が存在するということが観察されることから、同様にこの層は、水性媒質中に分散させられた場合、ナノスフェアの保護をも行なう。このような理由から、網目形成成分が使用され、（ナノスフェアのまわりに架橋層が形成できないようにする）重合調整剤は使用されない。網目形成成分は、希土類セスキ酸化物の表面と共にそれが樹立する単数又は複数の結合に加えて、（最も近い隣接体の縮合反応により）互いに反応し合う能力をもち、ナノスフェアを捕捉する真の網目を形成する化合物である。これらの化合物は、一般に、構造式ＲｘＳＩ（ＯＲ’）ｙ（式中、ｙ＝２、３；ｘ＝４−ｙそしてＲは活性有機分子を固定化するように選択される）についてはオルガノアルコキシシランである。密度の高い丈夫な網目を得るためには、ＲｘＳＩ（ＯＲ’）ｙはテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）といった架橋剤と混合させられる。コーティング又はリングと呼ばれるポリシロキサン層は、特に、以前に得られたもののようなＬｎ2Ｏ3セスキ酸化物のナノスフェアの存在下でのＴＥＯＳといったような架橋剤を用いた、アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）、グリシジルオキシプロピルトリエトキシシラン（ＧＰＴＥＳ）、メルカプトプロピルトリエトキシシラン（ＭＰＴＥＳ）及びイソシアナートプロピルトリエトキシシラン（ＩＰＴＥＳ）の中から選択されたオルガノトリアルコキシシランの混合物の加水分解−縮合によって得ることができる。Ｓｉ／Ｃ比は、ＴＥＯＳであることが最も多い添加される架橋剤の量によって制御される。添加されるオルガノアルコキシシラン／架橋剤の量は、溶液中に分散したナノスフェアの数、そのサイズ（ひいてはその表面積）及び吸着された分子が占める面積によって左右される。トリメチルアミンタイプの塩基の存在は好ましく、好適には０．０１〜０．１モル／ｌの間にある。オルガノトリアルコキシシランを使用することで、コーティングに対し反応基を添加でき、こうして活性分子（生物学的リガンド、フルオロフォア）の付着が可能となる。従って、このカップリングを可能にするために、ポリシロキサン層中のオルガノアルコキシシランタイプの前駆体の一部分は、カルボキシル、アミン、アルデヒド又はエポキシ基といった反応基を担持する。これらの前駆体の加水分解−縮合は、生物学的リガンド又はグラフト化されるべきその他のあらゆる有機分子又は重合体と反応することのできるポリシロキサンの機能化された層を提供する。ＴＥＯＳは、形成されたポリシロキサンの架橋を確保し、ここで、酸素原子（架橋節）のみに結合されたすなわちＴＥＯＳのみから誘導されるケイ素原子の数量は、５〜７５％、好ましくは３０〜５０％の間にある。
【００５２】
未吸着分子及び副産物は一般に、エタノール、水又は等体積エタノール／水混合物に対する透析によってコロイド溶液から抽出される。
【００５３】
制限的な意味はないが、有利には４段階で行なわれるポリシロキサンコーティングの形成方法を詳述することは可能である。まず第１の段階は、４＜１００×ｎAPTES(1)／（ｎAPTES(1)＋ｎAPTES(2)＋ｎTEOS）＜１６となるような形でｎAPTES(1)モルのＡＰＴＥＳを含有するＤＥＧ溶液中に分散されたナノスフェアを５mlのＬｎ2ＯSに添加することから成る。少なくとも２０分の撹拌の後、０．１Ｍのトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）を含有するＤＥＧ中で希釈された３ｎAPTES(1)モルの水を添加する（第２段階）。この溶液を１時間撹拌下に置いた後、５＜１００×ｎTEOS／（ｎAPTES(1)＋ｎAPTES(2)＋ｎTEOS）＜７５となるような形でｎTEOSモルのＴＥＯＳとｎAPTES(2)＝５ｎAPTES(2)モルのＡＰＴＥＳを前出の混合物に添加する（第３段階）。最終的に、２０分後に、０．１Ｍのトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）を含有するＤＥＧ中に希釈された（１５ｎAPTES(1)＋４ｎTEOS）モルの水を混合物に加える。その後、混合物を２０℃＜Ｔ＜４０℃の温度で４８時間撹拌下に放置する。
【００５４】
生物学的リガンドに加えて、機能化されたポリシロキサンのコーティングは、特にフルオレセイン及びローダミンから誘導された発光性有機分子の共有グラフト化を可能にすることができる。これらのフルオロフォアによる機能化は、少なくとも２つの異なる要領で実施可能である。第１の要領は、加水分解反応の前にこれらのフルオロフォアによりオルガノアルコキシシランの分子を修飾することから成る。例えば上述の第１又は第２の段階中で添加される特にＡＰＴＥＳといった５〜３０％のオルガノアルコキシシラン分子が、ＡＰＴＥＳのアミン官能基とＦＴＩＣのイソチオシアナート官能基の間の反応により、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＴＩＣ）に予めカップリングされる。かくして修飾されたポリシロキサンの前駆体は次にオルガノアルコキシシランとＴＥＯＳの混合物に添加されてコーティングリングを形成する。第２の方法は、フルオロフォアが担持する反応基とポリシロキサン層内に存在するものの間の縮合により、ポリシロキサン層の形成後にフルオロフォアをグラフト化することから成る。
【００５５】
生物学的リガンドは、その後のプローブ／標的カップリング反応のために使用可能でなくてはならず、従って、任意には活性化段階が先行する存在する反応基との従来のカップリングによってポリシロキサン層上に化学的にグラフト化される。カップリングを確保する反応は既知であり、例えば「バイオコンジュゲート技術」、Ｇ.Ｔ. Hermanson, Academic Press, １９６６又は「活物活性のための蛍光及び発光性プローブ。定量的実時間分析のための技術に対する実践的指針」第２版、W.T. Mason編、Academic Press, １９９９の中で記述されている。例えば、カップリングは、少なくともコーティング上の（反応基に対応する）グラフト化部位の数よりも量が多い生物学的リガンドの水溶液を添加することによって、実施される。ポリシロキサン層がアミン基で機能化される場合、少なくとも１つの−ＣＯＯＨ官能基を担持する生体分子がグラフト化され得る。しかしながら、生体分子の−ＣＯＯＨ官能基は予めＥＤＣとＮＨＳの混合物で活性化されなくてはならない。
【００５６】
生物学的リガンドをグラフト化した後、透析又はカラムクロマトグラフィにより余剰の副産物が除去される。この後者の技術は、フルオレセイン誘導体によりナノ粒子が機能化される場合にのみ使用される。グラフト化と精製段階の反復を通した変性を防ぐため、生物学的リガンドのグラフト化は好ましくは最後に実施される。
【００５７】
本発明のナノ粒子は、さまざまな分野で応用される。特にその用途としては、生体分子の検出（バイオチップ）、生体基質のターゲティング（ＭＲＩ映像法）、細胞又は充実性腫瘍の治療的破壊（発熱療法、中性子捕捉）を挙げることができる。
【実施例】
【００５８】
以下の例は単に例示を目的としてのみ示されており、制限的な性格をもつものではない。
【００５９】
例１：
Ｔｂ3+で５％ドープされたＧｄ2Ｏ3コロイドを、２０ml体積のジエチレングリコールに５０ｇ.ｌ-1量の塩化ガドリニウム及び塩化テルビウムの塩を溶解させることにより調製する。ＨＲＴＥＭで確認されレーザー粒子サイズ測定により測定された最終粒度は３．５ｎｍである。コロイドを２４時間、ジエチレングリコール中で加熱（４０℃）及び撹拌下で透析する。独自のジエチレングリコールの体積と透析すべきコロイドの体積の比は２０である。
【００６０】
これらの粒子のまわりで、厚み５．０ｎｍの機能化されたポリシロキサン層がゾル−ゲル方法によって合成される。５．０mlの透析済みコロイド（４．５３・１０19粒子・ｌ-1）を含有する溶液に以下のものを溶解させる：２８．４ｇ・ｌ-1のアミノプロピル−トリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、１７．６ｇ・ｌ-1のテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）及び１３．２ml／ｌの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液。
【００６１】
撹拌下の油浴中で反応を４０℃で実施する。これには以下の複数の段階が含まれる：
ｔ＝０時間  ＡＰＴＳ合計質量の１６％に対応するｍ1の添加。
ｔ＝０．３３時間  合計水体積の１０％を添加することによるＡＰＴＳの加水分解。
ｔ＝１．３３時間  残りのＡＰＴＳ塊及び全ＴＥＯＳに対応するｍ2の添加。
ｔ＝２．３３時間  ９０％体積の残りの水の添加。
ｔ＝５０．３３時間  合成終了。
【００６２】
例２：
例１と同じ条件下でＴｂ3+で５％ドープされたＧｄ2Ｏ3のコロイドを調製する。
【００６３】
これらの粒子のまわりで、ゾル−ゲル方法により、厚み８．０ｎｍの機能化されたポリシロキサン層を合成する。５．０mlの透析済みコロイド（４・５３・１０19粒子・ｌ-1）を含有する溶液に以下のものを溶解させる：８６．４ｇ・ｌ-1のＡＰＴＳ、５４．２ｇ・ｌ-1のＴＥＯＳ及び１リットルあたり４０mlの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液。
【００６４】
ゾル−ゲル方法によるコーティング反応を例１の場合と同じ条件下で実施した。
【００６５】
例３：
３．５ｎｍのサイズに対応する、Ｔｂ3+で５％ドープされたＧｄ2Ｏ3のコロイドを、例１と同じ条件下で調製する。以前に得たコロイドに対し適切な量の塩化ガドリニウム及び塩化テルビウム物の塩を添加することによって、同じ組成をもつサイズ５．７ｎｍの粒子を得た。
【００６６】
これらの粒子のまわりで、ゾル−ゲル方法により、厚み８ｎｍの機能化されたポリシロキサン層を合成する。５．０mlの透析済みコロイドを含有する（５．６６・１０18粒子・ｌ-1）溶液に以下のものを溶解させる：５８．１ｇ・ｌ-1のＡＰＴＳ、３６．４ｇ・ｌ-1のＴＥＯＳ及び１リットルあたり２８．４mlの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液。
【００６７】
ゾル−ゲル方法によるコーティング反応を例１の場合と同じ条件下で実施した。
【００６８】
例４：
５．７ｎｍのサイズに対応する、Ｔｂ3+で５％ドープされたＧｄ2Ｏ3のコロイドを、例３と同じ条件下で調製する。以前に得たコロイドに対し適切な量の塩化ガドリニウム及び塩化テルビウム物の塩を添加することによって、同じ組成をもつサイズ８ｎｍの粒子を得た。
【００６９】
これらの粒子のまわりで、ゾル−ゲル方法により、厚み３．５ｎｍの機能化されたポリシロキサン層を合成する。５．０mlの透析済みコロイドを含有する（５．６５・１０18粒子・ｌ-1）溶液に以下のものを溶解させる：２０．６ｇ・ｌ-1のＡＰＴＳ、１３．０ｇ・ｌ-1のＴＥＯＳ及び１リットルあたり１０mlの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液。
【００７０】
ゾル−ゲル方法によるコーティング反応を例１の場合と同じ条件下で実施した。
【００７１】
例５：
例１と同じ条件下でＴｂ3+で５％ドープされたＧｄ2Ｏ3のコロイドを調製する。
【００７２】
これらの粒子のまわりで、ゾル−ゲル方法により、厚み５．０ｎｍの機能化されたポリシロキサン層を合成する。２．５mlの透析済みコロイド（４・５３・１０19粒子・ｌ-1）及び２．５ｍｌの独自のジエチレングリコールを含有する溶液に以下のものを溶解させる：２８．４ｇ・ｌ-1のＡＰＴＳ、１７．６ｇ・ｌ-1のＴＥＯＳ及び１リットルあたり１３．２mlの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液。
【００７３】
ゾル−ゲル方法によるコーティング反応を例１の場合と同じ条件下で実施した。
【００７４】
例６：
例１と同じ条件下でＴｂ3+で５％ドープされたＧｄ2Ｏ3のコロイドを調製する。
【００７５】
これらの粒子のまわりで、ゾル−ゲル方法により、厚み８ｎｍの機能化されたポリシロキサン層を合成する。２．５mlの透析済みコロイド（２．２６・１０19粒子・ｌ-1）及び２．５ｍｌの独自のジエチレングリコールを含有する溶液に以下のものを溶解させる：９．４ｇ・ｌ-1のＡＰＴＳ、６．４ｇ・ｌ-1のＴＥＯＳ及び１リットルあたり４４mlの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液。
【００７６】
ＡＰＴＳの塊ｍ2を添加する６時間前に、それを磁気撹拌下で、蛍光分子である１．４ｇ・ｌ-1のフルオレセインイソチオシアナートと混合する。その後、ＡＰＴＳの塊ｍ2をＦＴＩＣと合するという点を除いて、例１の場合と同じ条件下でコーティング反応を実施した。
【００７７】
例７：オリゴヌクレオチドのグラフト化
−ＣＯＯＨ官能基で終る１００μＭｄ（Ｔ）２２のオリゴヌクレオチド溶液を０．２ＭのＥＤＣ及び０．２ＭのＮＨＳ水溶液に添加する。１時間の撹拌後、（例１に従って調製され透析によって精製された）機能化されたポリシロキサンの層でコーティングされた酸化ガドリニウムのナノ粒子の水溶液５００μｌと緩衝液炭酸塩溶液１００μｌ（０．１Ｍ；ｐＨ１１）を、オリゴヌクレオチドストランドを含有する溶液に添加する。２時間の撹拌後、溶液はゲル化する。膜を通してろ過した後、ゲルを２００μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水に再分散させる。
【００７８】
例８：
ウラニウムで１％ドープされたＧｄ2Ｏ3のコロイドを、２０ml体積のジエチレングリコールに５０ｇ.ｌ-1量の塩化ガドリニウム及び硝酸ウランの塩を溶解させることにより調製する。ＨＲＴＥＭで確認されレーザー粒子サイズ測定により測定された最終ナノスフェアサイズは３．５ｎｍである。コロイドを２４時間、ジエチレングリコール中で加熱（４０℃）及び撹拌下で透析する。独自のジエチレングリコールの体積と透析すべきコロイドの体積の比は２０である。
【００７９】
これらのナノスフェアのまわりで、厚み５．０ｎｍの機能化されたポリシロキサン層がゾル−ゲル方法によって合成される。５．０mlの透析済みコロイド（４．５３・１０19粒子・ｌ-1）を含有する溶液に以下のものを溶解させる：２８．４ｇ・ｌ-1のアミノプロピル−トリエトキシシラン（ＡＰＴＳ）、１７．６ｇ・ｌ-1のテトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ）及び１３．２ml／ｌの０．１Ｍトリエチルアミン水溶液。
【００８０】
撹拌下の油浴中で反応を４０℃で実施する。これには以下の複数の段階が含まれる：
ｔ＝０時間  ＡＰＴＳ合計質量の１６％に対応するｍ1の添加。
ｔ＝０．３３時間  合計水体積の１０％を添加することによるＡＰＴＳの加水分解。
ｔ＝１．３３時間  残りのＡＰＴＳ塊及び全ＴＥＯＳに対応するｍ2の添加。
ｔ＝２．３３時間  残りの９０％体積の水の添加。
ｔ＝５０．３３時間  合成終了。
【００８１】
例９：
モル単位でＴｂ3+により５％及びＥｕ3+により５％ドープされたＧｄ2Ｏ3のコロイドを、５０ml体積のジエチレングリコール（２．２６０ｇのＧｄＣｌ3，６Ｈ2Ｏ、０．１２７３ｇのＥｕＣｌ3，６Ｈ2Ｏ及び０．１２５０ｇのＴｂＣｌ3，６Ｈ2Ｏ）に５０ｇ・ｌ-1量の塩化ガドリニウム、テルビウム及びユーロビウムの塩を溶解させることによって調製する。７０℃で２ＮのＮａＯＨの水溶液３mlを添加し、１時間１４０℃まで、次に４時間１８０℃で加熱した後、ＨＲＴＥＭにより確認されレーザー粒度測定で測定した最終粒度は３．５ｎｍである。ジエチレングリコール中で加熱（４０℃）及び撹拌下でコロイドを２４時間透析させる。独自のジエチレングリコールの体積と透析すべきコロイドの体積の比は２０である。
【００８２】
ゾル−ゲル方法によるコーティング反応は、例１と同じ条件で実施される。
【００８３】
（これらのナノ粒子の取扱いを容易にするべく補助的に）時間分解検出の可能性をテストするために、１０％のアミノプロピルトリアルコキシシランを有機染料（フルオレセイン）で機能化させる（図７）。また、その存在は、その進展が裸眼で容易に追跡できることから、クロマトグラフィによるハイブリッドナノ粒子の精製を容易にする。ＵＶ−可視光線分光測光法及び光子相関分光法により収集された画分の分析が、視覚的印象を確認し、ハイブリッドナノ粒子を含有する画分（図７の２及び３）の同定を可能にする。シリカゲルで満たされたカラムを用いてクロマトグラフィが実施される。精製すべき試料の体積は２．５mlに定められ、エタノール又は等体積の水−エタノール混合物で緩衝された水溶液で溶出される。その１０％のアミン官能基がフルオレセイン誘導体に結合されているＴｂでドープされポリシロキサン層でコーティングされたＧｄ2Ｏ3のナノスフェアを、ラベラーとして使用して生物学的リガンド（特にオリゴヌクレオチド）を検出することができる。テルビウム及びフルオレセインのルミネセンス特性を理由として、これらのナノ粒子は、プローブ分子で機能化されたとき、ナノ粒子上にグラフト化されたプローブとの相互作用による生体分子の選択的標識ひいてはそれらの検出を可能にする。この場合、ポリシロキサン網目内に存在するアミン官能基の１つとの活性化−ＣＯＯＨの縮合を通してナノ粒子上にカルボン酸官能基により修飾されたオリゴヌクレオチドをグラフト化することにより、相補的オリゴヌクレオチドによりいくつかの点で被覆されている場合に固体支持体上のナノ粒子の固定化が可能になる（ハイブリダイゼーション）。適合された電磁励起に続いて、フルオレセインは光信号を発出し、ナノ粒子が固定化される支持体上の点の識別を可能にする（図８）。支持体上のオリゴヌクレオチドの配列がわかっていることから、オリゴヌクレオチドストランドのハイブリダイゼーションを支配する塩基相補性の原則を理由として、かくしてナノ粒子上でグラフト化されたオリゴヌクレオチドの配列を演繹することができる。Ｔｂ3+イオンの発出は、レーザー放射線によるフルオレセインの破壊の後に観察される（図９）。活性分子のグラフト化と並行して、セスキ酸化物ナノスフェアをコーティングする機能化されたポリシロキサンの網目は、セスキ酸化物コア内に存在するドーパントのルミネセンス信号の増幅を可能にする。そのセスキ酸化物コアが同一である同一数のナノ粒子について、Ｔｂ3+イオンのルミネセンス強度は、Ｌｎ2Ｏ3 ナノスフェアがポリシロキサン層でコーティングされている場合、コーティングされていないナノスフェアと比べはるかに高い（図１０〜図１２）。さらに、ポリシロキサン層は、希塩酸の水溶液に対する効率の良い保護を保証する。同一のナノ粒子を同量含有するものの１方の試料中ではエタノール中に又もう一方の試料中では０．２ＭのＨＣｌ中に分散されている２つの試料から記録されたスペクトルは、機能化されたポリシロキサンでコーティングされたナノスフェアが（コーティングされていないナノスフェアとは異なり）水の存在に対し感応性をもたないということを示している（図１３）。水性媒質中のナノスフェア及びそのルミネセン���特性の安定性は、生物学的標識の観点からみて不可欠である。これらの結果は、
−Ｌｎ2Ｏ3ナノスフェアをコーティングするポリシロキサン層上にグラフト化された有機染料分子の蛍光性、
−同一のナノスフェア内部でそのタイプが変動しうる、ナノスフェア内に取込まれたドーパントにより発出される電磁放射線（マルチドーピング）、
−特に常磁性であるガドリニウムセスキ酸化物を含有するナノスフェアのための磁気的測定、
によってその存在を明らかにすることのできる生物学的リガンドの標識及び検出のための、本発明のナノ粒子特にガドリニウムセスキ酸化物ナノスフェアの潜在的能力を確認するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】例４において得られる厚み３．５ｎｍの層でコーティングされたＧｄ2Ｏ3：Ｔｂ3+の８ｎｍ粒子の高分解能透過電子顕微鏡写真である。
【図２】例４において得られる厚み３．５ｎｍの層でコーティングされたＧｄ2Ｏ3：Ｔｂ3+の８ｎｍ粒子の長さに沿って測定されたＥＤＸスペクトル分析図（ＨＲＴＥＭにカップリングされたもの）である。
【図３】３．５ｎｍのポリシロキサン層でコーティングした後（例４）の８ｎｍの粒子のサイズ測定の結果を示すグラフである。
【図４】初期粒子（透析済みコロイド、５．７ｎｍ）と８．０ｎｍのポリシロキサン層でコーティングした後（例３）のサイズ測定の比較結果を示すグラフである。
【図５】初期粒子（透析済みコロイド１３．５ｎｍ）と５．０ｎｍのポリシロキサン層でコーティングした後（例１）のサイズ測定の比較結果を示すグラフである。
【図６】初期粒子（透析済みコロイド、３．５ｎｍ）と８．０ｎｍのフルオレセインで機能化されたポリシロキサン層でコーティングした後（例６）のサイズ測定の比較結果を示すグラフである。
【図７】カラムクロマトグラフィで得られた異なる画分との関係における、２３０ｎｍで励起された例６にあるようなフルオレセインによって機能化されたポリシロキサンでコーティングされたコロイドの発光スペクトルを示すグラフである。
【図８】フルオレセイン及びオリゴヌクレオチドストランドによって機能化されたポリシロキサンでコーティングされたガドリニウム酸化物コアを伴うナノ粒子の蛍光を示したグラフであり、ここで、これらのナノ粒子は相補的オリゴヌクレオチドストランドでのハイブリダイゼーションによりバイオチップ上で固定化されている（例９）。
【図９】図７に示されているカラムクロマトグラフィの画分２に対応し、フルオレセインの劣化後に５４０ｎｍで励起されたコロイドの発光スペクトルを示すグラフである。
【図１０】５．７ｎｍの初期透析済みコロイドの粒子と８．０ｎｍのポリシロキサン層でコーティングされたもの（例３）との間のルミネセンス測定の比較結果を示すグラフである。
【図１１】３．５ｎｍの初期透析済みコロイドの粒子と５．０ｎｍのポリシロキサン層でコーティングされたもの（例１）との間のルミネセンス測定の比較結果を示すグラフである。
【図１２】３．５ｎｍの初期透析済みコロイドの粒子と８．０ｎｍのポリシロキサン層でコーティングされたもの（例２）との間のルミネセンス測定の比較結果を示すグラフである。
【図１３】エタノール中での透析及び０．２ＭのＨＣｌで酸性化された水の中での分散との関係における、２３０ｎｍで励起された例５にあるようなポリシロキサンでコーティングされたコロイドの発光スペクトルを示すグラフである。
【図１４】５．０ｎｍのポリシロキサン層でコーティングされたＧｄ2Ｏ3：Ｔｂ3+（５％）の粒子（直径３．５ｎｍ）の励起スペクトル（例１）を示すグラフである。
【図１】
2007526471.tif 000003
【図２】
2007526471.tif 000004
【図３】
2007526471.tif 000005
【図４】
2007526471.tif 000006
【図５】
2007526471.tif 000007
【図６】
2007526471.tif 000008
【図７】
2007526471.tif 000009
【図８】
2007526471.tif 000010
【図９】
2007526471.tif 000011
【図１０】
2007526471.tif 000012
【図１１】
2007526471.tif 000013
【図１２】
2007526471.tif 000014
【図１３】
2007526471.tif 000015
【図１４】
2007526471.tif 000016
【国際調査報告】
2007526471.tif 000017
2007526471.tif 000018
2007526471.tif 000019
2007526471.tif 000020
2007526471.tif 000021
2007526471.tif 000022
2007526471.tif 000023
2007526471.tif 000024