(57)【要約】  Ａｇｇプロモーターを含む核酸および同一物を用いる方法を開示する。本発明はまたＡｇｇプロモーターの活性に基づく疾患を同定および処置する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１−６からなる群から選択される核酸配列またはその縮重変種を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
以下の：
（ａ）配列番号１−６からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９０％同一である核酸配列；
（ｂ）前記の（ａ）の核酸配列の相補体；または
（ｃ）少なくとも２０個のヌクレオチドを含む前記の（ａ）または（ｂ）の核酸配列のフラグメント；
のいずれか１つを含む単離された核酸分子。
【請求項３】
ストリンジェント条件下でハイブリダイゼーションプローブにハイブリダイズする核酸配列を含む配列番号１−６からなる群から選択されるかまたはその相補体である単離された核酸分子。
【請求項４】
（ａ）図１に示すヌクレオチド配列、またはそのフラグメントもしくは変種；
（ｂ）図１に示すヌクレオチド配列に少なくとも８０％同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｃ）図１に示すヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｄ）図１に示すヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一性を有するヌクレオチド配列；
（ｅ）図１に示すヌクレオチド配列；
（ｆ）図１に示す配列の少なくとも１０個の連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列；
（ｇ）図１に示す配列の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有するヌクレオチド配列；および
（ｈ）ストリンジェント条件下で前記の（ａ）−（ｇ）に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列；
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む発現を駆動するプロモーター。
【請求項５】
該発現が構成的である請求項４に記載のプロモーター。
【請求項６】
請求項７に記載のプロモーターを含むベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞。
【請求項８】
該宿主細胞がＨＥＫ  ２９３Ｈ、ＳＶ４０形質転換軟骨細胞Ｃ２８Ａ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ヒト軟骨肉腫ＳＷ１３５３およびＨｅＬａ細胞からなる群から選択される請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
（ａ）Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子またはその誘導体もしくはフラグメントと、結合物質、および試験される作用物質を接触させること；
（ｂ）Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子の結合物質との相互作用を評価すること；および
（ｃ）相互作用のレベルを作用物質の不在下でＡｇｇ−１プロモーター遺伝子またはそのフラグメントの結合物質との相互作用のレベルと比較することであって、ここで作用物質の存在下でのＡｇｇ−１プロモーター遺伝子またはその誘導体もしくはフラグメントの相互作用のレベルが統計的に有意である量まで作用物質の不在下での相互作用のレベルと異なる場合、次いで作用物質はＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の結合物質との相互作用を変化させる作用物質である；
を含む請求項７に記載のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写因子結合物質との相互作用を変化させる作用物質を同定する方法。
【請求項１０】
該転写因子結合物質がサイトカインまたは成長因子を含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該サイトカインがＩＬ−１βおよびＯＳＭからなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該転写因子結合物質が該Ａｇｇ−１プロモーターの転写を阻止する請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
該転写因子結合物質が該Ａｇｇ−１プロモーターの転写を誘導する請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
該転写因子結合物質がＡＰ−１、ＳＴＡＴ３およびＮＦｋＢからなる群から選択される転写因子結合部位に結合する請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
請求項４に記載のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写因子結合物質との相互作用を変化させる請求項９に記載の方法により同定可能な作用物質。
【請求項１６】
（ａ）レポーター遺伝子に作動可能なように連結された図１に示す核酸配列を含むプロモーター領域を含有する溶液を試験する作用物質と接触させること；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現のレベルを評価すること；および
（ｃ）発現のレベルを作用物質の不在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルと比較することであって、ここで作用物質の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルが統計的に有意である量まで作用物質の不在下での発現のレベルと異なる場合、次いで作用物質はＡｇｇの発現を変化させる作用物質である；
の工程を含むＡｇｇの発現を変化させる作用物質を同定する方法。
【請求項１７】
該ＡｇｇがＡｇｇ−１である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）ハイブリダイゼーションに適当な条件下でＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の配列の一部に少なくとも部分的に相補的である連続するヌクレオチド配列を含む核酸配列に該試料を接触させること；および
（ｂ）Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子と該核酸配列との間にハイブリダイゼーションが生じたかどうかを評価すること；
を含むＡｇｇ−１核酸の存在に関して試料を検定するための方法。
【請求項１９】
別個の容器に：
（ａ）Ａｇｇ−１プロモーター核酸配列のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的である連続するヌクレオチド配列を含む１つまたはそれより多い標識核酸；および
（ｂ）該標識の検出のための試薬；
を含むＡｇｇの存在に関して試料を検定するための試薬キット。
【請求項２０】
標識核酸がＡｇｇ−１プロモーター核酸のヌクレオチド配列の一部に完全に相補的である連続するヌクレオチド配列を含む請求項１９に記載の試薬キット。
【請求項２１】
Ａｇｇ−１プロモーター核酸のヌクレオチド配列の一部に少なくとも部分的に相補的であり、そしてプライマー伸長のための条件下で維持した場合に該Ａｇｇ−１プロモーター核酸のプライマーとして作用することができる連続するヌクレオチド配列を含む１つまたはそれより多い核酸を含むメタロプロテアーゼの存在に関して試料を検定するための試薬キット。
【請求項２２】
核酸分子がＤＮＡである請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡが哺乳動物のものである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＤＮＡがヒトのものである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項７に記載の宿主細胞を核酸分子の発現および得られたｍＲＮＡの翻訳に適当な条件下で培養することならびに生成された発現生成物を回収することを含むＡｇｇ−１プロモーターを生成するための方法。
【請求項２６】
（ａ）本明細書に開示するＡｇｇ−１プロモーターがレポーター遺伝子に作動可能なように連結されている宿主細胞をレポーター遺伝子の発現を可能にする条件下で被験化合物を含有する被験培地と接触させること；
（ｂ）被験培地の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；
（ｃ）（ａ）で用いたものと同一の条件下で被験化合物を含有しないが、それ以外は（ａ）の被験培地と同一である対照培地と宿主細胞を接触させること；
（ｄ）対照培地の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；および
（ｅ）（ｂ）および（ｄ）の間での発現の差を被験化合物のＡｇｇ−１プロモーター活性を調節する能力に関連付けること；
によりＡｇｇ−１プロモーターの活性を調節する被験化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
（ａ）本明細書に開示するＡｇｇ−１プロモーター遺伝子がレポーター遺伝子に作動可能なように連結されている宿主細胞をレポーター遺伝子の発現を可能にする条件下でＡｇｇ−１プロモーター活性のインデューサーまたは阻害剤と接触させること；
（ｂ）被験化合物の不在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；
（ｃ）インデューサーと接触させる前、同時または後に宿主細胞を被験化合物に暴露すること；
（ｄ）被験化合物の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；および
（ｅ）（ｂ）と（ｄ）との間の発現の差を転写レギュレーターのＡｇｇ−１プロモーター活性を調整する能力に関連付けること；
を含むＡｇｇ−１プロモーターの転写モジュレーターをスクリーニングする方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子治療薬を含む医薬用組成物。
【請求項２９】
Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子治療薬が図１に示す配列またはそのフラグメントもしくは誘導体を含む単離された核酸分子である請求項２８に記載の医薬用組成物。
【請求項３０】
治療上有効量のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子治療薬を個体に投与することを含む個体における関節変性に関連する障害の発症を処置するかまたは遅延させる方法。
【請求項３１】
該障害が炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、非炎症性関節炎骨関節炎からなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該変性が軟骨、滑液および関節からなる群から選択される組織において生じる請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
治療薬がＡｇｇ−１プロモーター遺伝子アンタゴニストである請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
個体の関節変性に関連する障害の発症を処置するかまたは遅延させるための医薬品の調製におけるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子治療薬の使用。
【請求項３５】
該障害が炎症、関節炎、リウマチ性関節炎、および非炎症性関節炎骨関節炎からなる群から選択される請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
該変性が軟骨、滑液および関節からなる群から選択される組織において生じる請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
治療薬がＡｇｇ−１プロモーター遺伝子アンタゴニストである請求項３４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
軟骨は６５−８０％の水、コラーゲン、プロテオグリカンおよび軟骨細胞からなる。アグレカンおよびII型コラーゲンは関節軟骨で見出される最も豊富なプロテオグリカンである。アグレカンは圧縮抵抗性を提供するが、II型コラーゲンネットワークは剪断力および張力に対する抵抗性を提供する。アグレカンおよびII型コラーゲンの分解は関節炎の重要な特徴である。特に、関節軟骨からのアグレカンの喪失は骨関節炎(ＯＡ)の最も初期の病態生理学の特質の１つである。
【０００２】
ＯＡに関与するアグレカン分解メタロプロテアーゼは米国特許第６４５１５７５号に開示されている。アグレカナーゼ１（Ａｇｇ−１）およびアグレカナーゼ２（Ａｇｇ−２）はＡＤＡＭＴＳ（トロンボスポンジンモチーフを有するジスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）ファミリーのメンバーである。Ａｇｇ−１（ＡＤＡＭＴＳ４）およびＡｇｇ−２（ＡＤＡＭＴＳ１１）ならびに第３のメンバーであるＡＤＡＭ−ＴＳ１の双方はアグレカンの硫酸コンドロイチン結合ドメイン内のＧｌｕ１８７１−Ｌｅｕ１８７２結合を切断し、そして軟骨組織において発現される。Kahn et al., J Clin Invest, pp. 1335-1337 （2000）；Konttinen et al., Ann Rheum Dis, Vol. 58, No. 10, pp. 691-697 （1999）；Hurskainen et at, J Biol Chem, Vol. 274, No. 36, pp. 25555-25563 （1999）；Abbaszade, Liu and Yang, J Biol Chem, Vol. 274, No. 33, pp. 23443-23450 （1999）；Tortorella et al., J Biol Chem, Vol. 275, No.24, pp. 18566-18573 （2000）； Kuno et al., FEBS Lett, Vol. 478, pp. 241-245 （2000）；Rees et al., Biochem J, Vol. 350, Pt. 1, pp. 181-188 （2000）；および Matthews et al., J Biol Chem,Vol. 275, No. 30, pp. 22695-22703 （2000）参照。切断生成物は関節の滑液に蓄積される。II型コラーゲン分解酵素はメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーの中で同定されており、そして関節軟骨細胞はコラゲナーゼ１、２および３を生成する。Shlopov et al., Arthritis Rheum, Vol. 40, No. 11, pp. 2065-2074 （1997）参照。コラーゲン原線維は３つのコラゲナーゼ全ての基質であるが、コラゲナーゼ３（ＭＭＰ−１３）はII型コラーゲンの分解においてその他のコラゲナーゼよりもさらに効率的である。Reboul et al., J Clin Invest, Vol. 97, No. 9, pp. 2011-2019 （1996）参照。Ａｇｇ−１プロモーター領域は特開２００１−２４５６６３に示されている。
【０００３】
ＯＡの病理学的状態を１次ヒト関節軟骨細胞（ＨＡＣ）、軟骨細胞系（Ｃ２８Ａ２またはＳＷ１３５３）またはＰＤＧＦのような成長因子またはインターロイキン１β（ＩＬ−１β）もしくはオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）またはＩＬ−１βおよびＯＳＭの組み合わせのようなサイトカインを伴う非軟骨細胞系（Ｈｅｌａ、ＮＩＨ３Ｔ３または２９３）の刺激によりインビトロでモデル化することができる。Billington, Clark and Cawston, Biochem J, Vol. 336, Pt. 1 pp. 207-212 （1998）；および Cawston et al., Biochem Biophys Res Commun, Vol. 215, No. 1, PP. 377-385 （1995）参照。ＩＬ−１β単独でＡｇｇ−１、ＭＭＰ−１３の２つの重要な軟骨分解酵素、ならびに細胞毒性およびヒト関節軟骨の炎症のメディエーターであるｉＮＯＳをも強力に誘起する。Taylor et al., J Biol Chem, Vol. 273, No. 24, pp. 15148-15156 （1998）；Vincenti and Brinckerhoff, Arthritis Res, Vol.4, No. 3, pp. 157-164 （2002）；Bau et al., Arthritis Rheum, Vol. 46, No. 10, pp. 2648-2657 （2002）；Flannery et al., Matrix Biol, Vol. 18, No. 3, pp. 225-237 （1999）；および Tardif et al., Arthritis Rheum, Vol. 42, No. 7, pp. 1147-1158 （1999）参照。これらの遺伝子がどのように軟骨分解を調節するかを理解するために、その転写活性がサイトカインおよび成長因子によりどのように調節されるかを理解することが重要である。これはこれらの重要な遺伝子のプロモーター領域の特徴付けに必要である。ｉＮＯＳおよびＭＭＰ−１３のプロモーター領域はクローン化され、そしていくつかの群により特徴付けられている（Ganster et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 98, pp. 8638-8643 （2001）；Yu, Zhang and Kone, Biochem J, Vol. 367, Pt. 1, pp. 97-105 （2002）；Tardif et al., Bioichem J, Vol. 323, Pt. 1, pp. 13-16（1997）；Pendas et al., Genomics, Vol. 40, No. 2, pp. 222-233 （1997）；および Li, Dehnade and Zafarullah, J Immunol, Vol. 166, No. 5, pp. 3491-3498（2001）参照）が、Ａｇｇ−１プロモーターに関して利用可能な情報は非常に限定的である。
【０００４】
したがって、ＯＡのような変形性関節疾患に関与する活性メカニズム、特に核酸および化合物の特徴付けおよび制御の必要がある。また疾患を診断するため、または炎症および関節疾患を処置するために開発されている治療薬の効果をモニタリングするための有用な手段もまた必要である。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明はＡｇｇ−１プロモーター遺伝子を含む実質的に精製された核酸分子に関する。
【０００６】
本発明はまた：
（ａ）配列番号１−６の核酸配列またはそのフラグメントに実質的に相同な核酸配列；
（ｂ）（ａ）の核酸配列またはそのフラグメントに実質的に相補的な核酸配列；
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の核酸配列またはそのフラグメントにハイブリダイズする核酸配列；および
（ｄ）任意のＴがＵまたはＩで置換されているならば、（ａ）（ｂ）または（ｃ）のいずれかの配列に同一の核酸配列；
からなる群から選択される配列を有する核酸分子にも関する。
【０００７】
本発明はまた前記した核酸配列を含む発現ベクターおよびこれらの発現ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００８】
本発明はまたレポーター遺伝子に作動可能なように連結されたＡｇｇプロモーターを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を被験作用物質と接触させること、および被験作用物質の存在下で発現されたレポーターのレベルをその不在下で発現されたレポーターのレベルと比較することを含むアグレカナーゼ（Ａｇｇ）プロモーターの活性を調整する被験作用物質を検出するための方法にも関する。
【０００９】
本発明の１つの態様は：
（ａ）本明細書に開示するＡｇｇ−１プロモーター遺伝子がレポーター遺伝子に作動可能なように連結されている宿主細胞をレポーター遺伝子の発現を可能にする条件下で被験化合物を含有する被験培地と接触させること；
（ｂ）被験培地の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；
（ｃ）（ａ）で用いたものと同一の条件下で被験化合物を含有しないが、それ以外は（ａ）の被験培地と同一である対照培地と宿主細胞を接触させること；
（ｄ）対照培地の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；および
（ｅ）（ｂ）と（ｄ）の間で発現の差を、被験化合物のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写を調節する能力に関連付けること；
によるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写を調節する被験化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１０】
本発明の別の態様は：
（ａ）本明細書に開示するＡｇｇ−１プロモーター遺伝子がレポーター遺伝子に作動可能なように連結されている宿主細胞をレポーター遺伝子の発現を可能にする条件下でＡｇｇ−１プロモーター活性のインデューサーと、接触させること；
（ｂ）被験化合物の不在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；
（ｃ）インデューサーと接触させる前、同時または後に宿主細胞を被験化合物に暴露すること；
（ｄ）被験化合物の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；および
（ｅ）（ｂ）と（ｄ）との間の発現の差を、被験化合物のＡｇｇ−１プロモーターの転写を調整する能力に関連付けること；
により被験化合物のＡｇｇ−１プロモーター転写を調整する能力を測定する方法を提供する。
【００１１】
本発明はまた、軟骨分解を低下させ、および／またはタンパク質分解酵素活性もしくは発現を阻止するタンパク質、ポリペプチド、ホルモン、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能なように連結されているＡｇｇプロモーターをコードする核酸配列を含むベクターを軟骨細胞または滑膜細胞に導入することを含む、哺乳動物の関節軟骨分解を調整する方法にも関する。
【００１２】
本発明はまた、哺乳動物の関節軟骨分解を調整するための医薬品の調製における、軟骨分解を低下させ、および／またはタンパク質分解酵素活性もしくは発現を阻止するタンパク質、ポリペプチド、ホルモン、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡをコードする核酸配列に作動可能なように連結されているＡｇｇプロモーターをコードする核酸配列を含むベクターの使用にも関する。
【００１３】
１つの態様では、本発明は：
（ａ）関節軟骨分解を有することが解っている患者からの組織サンプルを提供することであって、ここで該組織サンプルの少なくとも１つの細胞はプロモーター活性を有する配列番号１−６からなる群から選択される１つまたはそれより多い核酸配列を生成することができる；
（ｂ）該組織サンプルを該候補治療薬と接触させること；
（ｃ）組織サンプルにおける該核酸配列の活性を測定すること；
（ｄ）該核酸配列の活性を対照となる対象からの組織サンプルの該核酸配列の活性と比較すること；および
（ｅ）存在する場合、疾患組織および対照組織におけるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の活性レベルの差を同定し、それにより関節軟骨分解を処置するための治療薬を同定すること；
を含む関節軟骨分解を調整する治療用化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００１４】
別の態様では本発明は、炎症に関連する障害を患うか、またはそれを発症させる危険性を有する患者に、配列番号１−６からなる群から選択される１つまたはそれより多い核酸配列の誘導または活性を阻止または低下させる作用物質を投与することを含む、炎症に関連する障害の処置、予防または発症の遅延の方法を包含する。
【００１５】
別の態様では本発明は、炎症に関連する障害を患うか、またはそれを発症させる危険性を有する患者における炎症に関連する障害の処置、予防または発症の遅延のための医薬品の調製における、配列番号１−６からなる群から選択される１つまたはそれより多い核酸配列の誘導または活性を阻止または低下させる作用物質の使用に関する。
【００１６】
本発明はまたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の欠失変種にも関する。好ましい欠失変種は配列番号２−６、最も好ましくは配列番号２−５およびその相補体を含む。
【００１７】
本発明はまた１つまたはそれより多いＡｇｇ−１プロモーター遺伝子または本明細書に記載する構築物に免疫特異的である抗体にも関する。
【００１８】
本発明はまた、その細胞が本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写制御下で異種性遺伝子を発現するトランスジェニック動物またはキメラ動物にも関する。
【００１９】
（図面の簡単な説明）
図１はヒトＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の５’フランキング領域を示す。転写因子ＮＦｋＢ、ＡＰ−１、ＳＴＡＴ３、ＮＦ１およびｃ−ｋｒｏｘの配列には下線を付して示す。ＣＡＡＴおよびＴＡＴＡＡボックスには下線を付して示す。
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本明細書に引用した全ての特許出願、特許および文献はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【００２１】
本発明はＡｇｇ酵素の新規プロモーター、タンパク質、ポリペプチド、ホルモン、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡのような遺伝子生成物をコードする遺伝子に作動可能なように連結されているかかるプロモーターを含む核酸構築物、かかる核酸構築物を含む組換え細胞、かかる細胞を用いる治療薬のスクリーニングの方法、および本発明の新規プロモーター配列を用いるＡｇｇ特異的遺伝子発現に関する。
【００２２】
本発明をより詳細に記載する前に、本明細書にて本発明を記載するために用いる用語の意味および範囲を説明および定義するために以下の定義を示す。
【００２３】
「核酸分子」なる用語はＤＮＡ、ＲＮＡおよび混成ＤＮＡ−ＲＮＡ配列を含むことを意味する。典型的に見出されるＡ、Ｔ、Ｕ、ＧおよびＣ残基に加えて、例えばイノシン（Ｉ）のような関連する残基を含む。
【００２４】
「単離された」核酸分子または単離された酵素はヒトの手によってその元来の環境から離れて存在し、そしてしたがって天然の生成物ではない核酸分子または酵素である。単離された核酸分子または酵素は精製された形態で、または例えば組換え細胞のような元来の環境ではなく存在し得る。
【００２５】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」または「遺伝子」なる用語は任意の長さのリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドの重合形態を意味する。したがって、この用語は二本および一本鎖ＤＮＡ、三本鎖ＤＮＡ、ならびに二本および一本鎖ＲＮＡを含む。これはまた例えばメチル化による、および／またはキャッピングによる修飾形態、ならびに非修飾形態のポリヌクレオチドをも含む。
【００２６】
本明細書で用いる「組換えポリヌクレオチド」なる用語は、その起源または操作のために：
（１）本来結合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部と結合していない；および／または
（２）本来連結されているもの以外のポリヌクレオチドに連結されている；
ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
【００２７】
核酸の局面で「実質的な相同性」とは、比較した場合、セグメントまたはその相補鎖が適切なヌクレオチド挿入および欠失で正確にアラインされた場合に、少なくとも約６０％のヌクレオチドで、典型的には少なくとも約７０％、さらに典型的には少なくとも約８０％、通常的には；少なくとも約９０％、そしてさらに通常的には少なくとも約９５−９８％のヌクレオチドで同一であることを意味する。これに代えて、セグメントまたはその相補鎖がストリンジェント条件下で鋳型鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相同性が２つのセグメント間に存在する。ハイブリダイゼーションが特異性の完全欠如よりもさらに選択的である場合、選択的ハイブリダイゼーションが存在する。Kanehisa, Nucleic Acids Res, Vol.12, No.1,Pt.1, pp.203-213 （1984）参照。
【００２８】
「調節配列」なる用語は、例えば細胞および／または組織に特異性を付与するという意味で、発現の特異性および／またはレベルに影響する配列を意味する。かかる領域は、例えば転写されるが翻訳されないリーダー配列の、転写開始部位の上流に位置し得るが、その下流に位置することもできる。
【００２９】
「プロモーター」なる用語は、遺伝子の転写開始部位の方向に関して上流に位置する１つまたはそれより多い遺伝子の転写を制御するように機能し、そしてＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位、ならびに限定するものではないが転写因子結合部位、レプレッサーおよびアクチベータータンパク質結合部位およびプロモーターからの転写の量を調節するために直接的または間接的に作用する当業者に公知のその他のヌクレオチドの配列を含む任意のその他のＤＮＡ配列の存在により構造的に同定される核酸配列を意味する。
【００３０】
「プロモーター活性」なる用語はそのプロモーター活性が測定されるプロモーターに作動可能なように連結されている遺伝子の転写または誘導の程度を意味する。例えばノーザンブロットにより生成されたＲＮＡ転写物の量を直接的に測定することにより、またはレポーター遺伝子がプロモーターに作動可能なように連結されている様な場合に、ＲＮＡ転写物によりコードされる生成物を間接的に測定することによりプロモーター活性を測定することができる。
【００３１】
「誘導」とは調節タンパク質の活性による遺伝子の発現の増加を意味する。
【００３２】
「転写」とはＤＮＡ（遺伝子）の配列からのＲＮＡコピーの合成；遺伝子発現における第１の工程を意味する。
【００３３】
「実質的に精製された」なる用語は、核酸、ポリペプチド、タンパク質またはその他の化合物が天然に随伴されるポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチドおよびその他の分子を本質的に不含である、すなわち約５０％以上不含、好ましくは約６０％以上不含、好ましくは７５％不含、そしてさらに好ましくは約９０％不含である核酸配列、ポリペプチド、タンパク質またはその他の化合物を意味する。
【００３４】
「縮重ヌクレオチド配列」なる用語は（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比較して）１つまたはそれより多い縮重コドンを含むヌクレオチド配列を示す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有するが、同一のアミノ酸残基をコードする、すなわちＧＡＵおよびＧＡＣトリプレットは各々Ａｓｐをコードする。
【００３５】
「変種」とは本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を保持しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。一般的に変種は全体的に極めて類似しており、そして多くの領域で、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと同一である。変化の結果として、変種タンパク質はＡｇｇ−１プロモーター遺伝子によりコードされるタンパク質に少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９７％同一、さらに好ましくは少なくとも９８％同一、最も好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。少なくとも９５％同一である変種配列は、Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子によりコードされる１００個のアミノ酸あたり、せいぜい５個の変化、すなわち欠失、挿入または置換の任意の組み合わせしか有さない。Altshul et al.,J Mol Biol, Vol. 215, No. 3, pp.403-410 （1990）の方法を用いるＢＬＡＳＴネットワークサービス（the National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD）のベーシックローカルアラインメントサーチツールソフトウェアの方法を用いて同一性パーセントを計算するために配列をアラインする。アラインプログラム（DNAstar, Inc.）により同一性を計算する。同一性計算を行う場合、全例で候補配列の内部ギャップおよびアミノ酸挿入は無視されない。
【００３６】
「作動可能なように連結されている」なる用語は、その意図される様式でセグメントが機能することを可能にするような方式での核酸セグメントの別の核酸セグメントへの連結を意味する。遺伝子生成物をコードする核酸配列は、直接的または間接的に核酸配列の転写を調整することを可能にする様式で、例えばプロモーター、エンハンサーおよびサイレンサーのような調節配列にライゲートされている場合、調節配列に作動可能なように連結されている。例えば、核酸配列はプロモーターの転写開始部位に関して下流で、転写開始部位に関して正しい読み枠でプロモーターにライゲートされており、そして核酸配列を通過する転写伸長を可能にする場合、プロモーターに作動可能なように連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、核酸配列の転写を各々増加または低減させるような様式で核酸配列にライゲートされている場合、遺伝子生成物をコードする核酸配列に作動可能なように連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは核酸配列のコード化領域の上流、下流またはその中に埋め込まれて位置し得る。核酸配列の調節配列への連結は典型的には当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを用い、適当な制限部位またはその代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションにより達成される。
【００３７】
「転写レギュレーター」または「転写因子」なる用語は本明細書で互換的に用いられ、そして特定の環境条件下でプロモーター駆動のＤＮＡ配列の転写を防御または阻止するために作用する生化学的エレメント、例えばレプレッサーもしくは核阻害タンパク質、またはプロモーター駆動のＤＮＡ配列の転写を可能にするかもしくは刺激するために作用する生化学的エレメント、例えばインデューサーもしくはエンハンサーを意味する。
【００３８】
「誘導」なる用語は、いくつかの転写の基本レベルに相対した転写インデューサーによりもたらされる遺伝子転写または発現の増加を意味する。
【００３９】
「抑制」なる用語は、いくつかの転写の基本レベルに相対した転写レプレッサーによりもたらされる遺伝子転写または発現の低下を意味する。
【００４０】
「基本プロモーター活性」または「基本レベル」なる用語は本明細書では互換的に用いられ、そして転写レギュレーターの不在下でのレポーターの活性を意味する。
【００４１】
「異種性」なる用語はそれが存在するゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ配列の一部として天然に生じない、すなわち天然に見出されるところとは異なる細胞またはゲノムもしくは核酸配列の位置に見出される核酸分子を意味する。異種性核酸分子はそれが導入される細胞に対しては同種ではなく、別の細胞から得られるか、または合成もしくは組換えにより生成されている。一般には、必要ではないが、かかる分子は通常配列が転写または発現される細胞により生成されないＲＮＡおよびタンパク質をコードする。当業者によりそれが発現される細胞に対して異種性または外来性であると認識される任意の核酸分子は本明細書では異種性なる用語に包含される。異種性核酸分子の実例には、限定するものではないが、タンパク質、ポリペプチド、受容体、レポーター遺伝、転写および翻訳調節配列、薬物抵抗性を付与するタンパク質のような選択または追跡マーカータンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含むＲＮＡならびにリボザイムが挙げられる。
【００４２】
「レポーター遺伝子」は、検出可能な遺伝子生成物を発現する核酸分子であり、ＲＮＡまたはタンパク質でよい。当業者に公知の任意の方法により検出を達成することができる。例えば、ノーザンブロットを用いることによりｍＲＮＡ発現の検出を達成することができ、そしてタンパク質に特異的な抗体を用いる染色によりタンパク質の検出を達成することができる。好ましいレポーター遺伝子は容易に検出できるものである。レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子生成物の検出により調節配列の転写活性の測定が行われるように、ＤＮＡ構築物において調節核酸配列と作動可能なように連結されている。レポーター遺伝子の実例には、限定するものではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼをコードするものが挙げられる。
【００４３】
「発現ベクター」は、細胞内でポリヌクレオチド複製の自己単位として挙動する、すなわちその独自の制御下で複製可能であるか、または宿主細胞染色体への挿入により複製可能になるかのいずれかであり、それに別のポリヌクレオチドセグメントを結合させて結合されたセグメントの複製および／または発現をもたらす任意の遺伝エレメント、例えばプラスミド、染色体、ウイルスである。適当なベクターには、限定するものではないが、プラスミド、バクテリオファージおよびコスミドが挙げられる。ベクターは、ベクターの望ましい宿主細胞へのライゲーションまたは挿入に影響し、そして結合されたセグメントの発現に影響するのに必要であるポリヌクレオチド配列を含有し得る。かかる配列は宿主生物に依存して異なり；それには転写に影響するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサー配列、リボソーム結合部位配列ならびに転写および翻訳停止配列が含まれる。これに代えて、発現ベクターは、ベクターの宿主細胞ＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組み込みなしにそこでコードされる遺伝子生成物を直接発現することができる。
【００４４】
「形質転換された」または「トランスフェクトされた」なる用語は本明細書では互換的に用いられ、そして外来性の核酸配列が適切な宿主細胞に移入または導入される過程を意味する。かかるトランスフェクトされた細胞は、挿入されたＤＮＡが宿主細胞における複製を可能にする安定してトランスフェクトされた細胞を含む。典型的には、安定したトランスフェクションには、外来性の核酸配列が、例えば安定したトランスフェクト体を選択することを可能にする抗生物質抵抗性を付与する遺伝子のような選択マーカー遺伝子と一緒に移入されていることが必要とされる。このマーカー遺伝子を外来性の配列にライゲートすることができるか、または外来性の配列と一緒に同時に共トランスフェクションにより別個に提供することができる。トランスフェクトされた細胞はまた限定された期間核酸配列を発現することができる一過性発現細胞を含む。宿主細胞は原核または真核細胞でよい。トランスフェクション手順はトランスフェクトされる宿主細胞に依存する。それはウイルス中でのポリヌクレオチドのパッケージングおよびポリヌクレオチドの直接取り込みを含み得る。形質転換の結果、挿入されたＤＮＡの宿主細胞のゲノムへの組み込みまたは挿入されたＤＮＡのプラスミド形態での宿主細胞内での維持に至り得る。形質転換／トランスフェクションの方法は当分野において公知であり、そして限定するものではないが、マイクロインジェクションのような直接注入；ウイルス感染、特に複製欠損アデノウイルス感染；エレクトロポレーション；リポフェクション；リン酸カルシウム媒介直接取り込み；等を含む。一般的な方法、ベクター、遺伝子移入および発現をGene Transfer and Expression ： A Laboratory Manual, Stockton Press （1990）に見出すことができる。
【００４５】
「宿主細胞」なる用語は一般的には原核または真核生物を意味し、そしてタンパク質を発現することができ、そして発現ベクターまたはその他の移入核酸配列の受体として用いることができるか、用いられている任意の形質転換可能な生物を含む。１次ヒト関節軟骨細胞のような軟骨細胞系、およびＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３または２９３のような非軟骨細胞系が発現ベクターに適当な宿主細胞である。
【００４６】
本発明は、均等な機能を提供し、そして当分野において公知になるその他の形態の発現ベクター、宿主細胞および形質転換技術を含むことを意図することは理解されよう。
【００４７】
前記で示したように、本発明はＡｇｇプロモーター遺伝子を含む組換えまたは異種性ポリヌクレオチドに関する。本発明は：
（ａ）配列番号１−６の核酸配列またはそのフラグメントに実質的に相同な核酸配列；
（ｂ）（ａ）の該核酸配列またはそのフラグメントに実質的に相補的な核酸配列；および
（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の該核酸配列またはそのフラグメントにハイブリダイズする核酸配列；
からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを提供する。
【００４８】
好ましくは、かかる核酸分子は図１で示す核酸配列に、そしてさらに好ましくは配列番号２−５の配列に実質的に相同である。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは配列自体の長さに関わらず、本明細書に開示する配列の５’または３’末端のいずれかで、限定するものではないがその他のプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、多重クローニング部位、コード化セグメント等を含む別の核酸配列と組み合わされて、１つまたはそれより多い核酸構築物を創成することができる。かかるポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはタンパク質のような遺伝子生成物を作成するために用いられる核酸配列を含む複数の核酸領域、制限部位等を含有する核酸セグメントを含み得る。全体の長さはかかるポリヌクレオチド間でかなり異なり得る。したがって、ほとんどいずれの長さの核酸セグメントも用いることができ、全長は調製の容易さまたは意図される組換え核酸プロトコールでの使用により限定されるのが好ましい。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、ストリンジェント条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で配列番号１−６のヌクレオチド配列にハイブリダイズすることができる配列をも包含する。ハイブリダイゼーション条件は、Kimmel and Berger, Methods Enzymol, Vol. 152, pp. 307-316 （1987） に記載されるように、核酸結合複合体またはプローブの融解温度、Ｔｍに基づく。本明細書で用いる「ストリンジェント条件」なる用語は約Ｔｍ−５（プローブの融解温度より５℃低い）から約Ｔｍより２０℃低いまでの範囲内で生じる「ストリンジェンシー」である。本明細書で用いる「高度にストリンジェントな」条件は少なくとも０.２×ＳＳＣバッファーおよび少なくとも６５℃を用いる。当分野で認識されているように、プローブの長さおよび性質、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ；標的配列の長さおよび性質、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびポリエチレングリコールのようなハイブリダイゼーション溶液の塩およびその他の成分の濃度のような多くの因子を変えることによりストリンジェンシー条件を実現することができる。これらの因子の全てを変えて前記に列挙したような条件に均等であるストリンジェンシーの条件を作成することができる。
【００５１】
本発明のポリヌクレオチドはまたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子およびその変種をコードする変化したポリヌクレオチドをも包含する。かかる変化には欠失、付加または置換が挙げられる。かかる変化はサイレント変化を生み出し、そして未変化ポリヌクレオチドによりコードされるＡｇｇ−１プロモーターと同一の活性または結合特性を有するＡｇｇ−１プロモーター遺伝子に至り得る。かかる変化は非天然発生コドンを有するヌクレオチド配列を生み出し得る。かかる変化はまた配列に新たな制限または結合部位を導入するか、またはＡｇｇ−１プロモーター変種の生成に至り得る。典型的にはかかる変化は部位特異的変異誘発を用いて達成される。
【００５２】
本明細書にて以後アンチセンスポリヌクレオチドと称する、本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子に実質的な相同性を有するか、または相補的である配列を有する一重鎖ポリヌクレオチドもまた本発明により包含される。本明細書で用いる相補的なる用語は、許容される塩および温度条件下での塩基対合によるポリヌクレオチドの天然結合を意味する。
【００５３】
本発明はまたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写物またはかかる転写物のフラグメントを増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術においてプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドをも包含する。好ましくは、プライマーは１８−３０個のヌクレオチド、さらに好ましくは１９−２５個のヌクレオチドを含む。好ましくは、プライマーは４０％またはそれ以上のＧ＋Ｃ含量を有する。かかるオリゴヌクレオチドは、Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子もしくはフラグメントをコードするＤＮＡ鎖、すなわちセンス鎖またはその対応するアンチセンス鎖の一部に少なくとも９５−９８％相補的である。好ましくは、プライマーはかかるセンス鎖またはその対応するアンチセンス鎖と少なくとも９９％相補性、さらに好ましくは１００％相補性を有している。二重鎖Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子のアンチセンス鎖と１００％相補性を有しているプライマーはセンス鎖内に含まれる配列と同一である配列を有している。
【００５４】
本発明はまたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子、そのフラグメントまたは対立形質のｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離および同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして有用であるオリゴヌクレオチドをも包含する。かかるハイブリダイゼーションプローブはまたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子のマッピングのための転写物の検出にも有用である。好ましくはかかるプローブは少なくとも５個のヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１０個、最も好ましくは約１０−３０個のヌクレオチドを含む。かかるハイブリダイゼーションプローブはＡｇｇ−１プロモーター遺伝子のセンス鎖内に含まれる配列と、またはその対応するアンチセンス鎖内に含まれる配列と少なくとも９０％相補的である配列を有している。かかるハイブリダイゼーションプローブはストリンジェント条件下でセンス鎖と結合する。１０−３０ヌクレオチドの長さであり、そして二重鎖Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子のアンチセンス鎖の一部と完全に相補的であるプローブの同定は、図１に示すヌクレオチド配列を用いて決定される。
【００５５】
かかるプローブまたはプライマーはまたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子が優先的に発現されるか、または構成的にまたは組織分化もしくは発達の特定の状態で、または疾患状態においてのいずれかで誘導される組織または細胞を同定するのにも有用である。特定の組織または細胞の群におけるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の発現は、限定するものではないが、ノーザン分析、ＲＮＡに対するインサイチュハイブリダイゼーションまたは逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）増幅を含む従来の手順を用いて決定される。多くの鋳型依存的な方法が規定の鋳型試料に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するのに利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つはＰＣＲ（ＰＣＲ（商標）と称される）であり、これは米国特許第４６８３１９５号；第４６８３２０２号；および第４８００１５９号に詳記されている。当分野において用いられるその他の周知の増幅手順にはＲＴ−ＰＣＲ（Sambrook et al.,Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY （1989）参照）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを利用する逆転写（ＷＯ９０／０７６４１）、ＲＴ−ＰＣＲ（米国特許第５８８２８６４号参照）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＥＰ３２０３０８および米国特許第４８８３７５０号参照）、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ（ＯＬＡ）（米国特許第５９１２１４８号参照）、Ｑベータレプリカーゼ（ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０参照）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（米国特許第５９１６７７９号参照）ならびに米国特許第５８４３６５０号；第５８４６７０９号；第５８４６７８３号；第５８４９５４６号；第５８４９４９７号；第５８４９５４７号；第５８５８６５２号；第５８６６３６６号；第５９１６７７６号；第５９２２５７４号；第５９２８９０５号；第５９２８９０６号；第５９３２４５１号；第５９３５８２５号；第５９３９２９１号および第５９４２３９１号；ＧＢ出願番号第２２０２３２８号；およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５に開示されるそれの別法が挙げられ、その各々はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【００５６】
単離されたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子はまた連結された遺伝子位置をマッピングする、転座、逆位およびトリソミーのような染色体異常を同定する、遺伝障害可能性を同定するために患者の内因性ＤＮＡ配列と比較する、およびプローブとしてハイブリダイズし、そしてしたがって新規の関連するプロモーター遺伝子を見出すのに有用である。かかる研究およびアッセイにおいて用いるために、プローブを放射性同位元素、蛍光標識または酵素標識で標識することができる。
【００５７】
本発明はまた本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターにも関する。一般に、ポリヌクレオチドに作動可能なように連結されている異種性遺伝子に加えて、ベクターは少なくとも１つの真核生物マーカー遺伝子、適切な真核細胞転写および翻訳停止シグナル、少なくとも１つのシャインダルガルノ配列および開始コドン、転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のポリアデニル化を伝達するシグナル、ならびに異種性ＤＮＡの適切な転写および翻訳に必要なまたは好ましい任意のその他のＤＮＡ配列を含有する。これらの付加配列は宿主細胞から搬出または分泌されるタンパク質のためのシグナル配列および転写調節タンパク質のための少なくとも１つの遺伝子を含み得る。ベクターをそれが発現される真核細胞において染色体外複製ＤＮＡとして用いる場合、ベクターは宿主細胞において機能する複製の起点を含む。ベクターが宿主染色体ＤＮＡに組み込まれる場合、宿主ゲノムへのその組み込みを促進するのに必要なエレメントを含有する。これらのエレメントはワクシニアおよびアデノウイルスのようなウイルスベクターにより、または非ウイルス性組換えプラスミドにより提供され得る。Ａｇｇ−１プロモーターのフラグメントを含む好ましい発現ベクターは、遺伝子生成物をコードする異種性遺伝子に作動可能なように連結されているＮＦｋＢおよび／またはＳＴＡＴ３の結合領域、かかる発現ベクターおよびプロモーター配列で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を含む。適当なフラグメントは＜２０００ｂｐ、および好ましくは＜１０００ｂｐおよび１００−８００ｂｐの間の連続したヌクレオチドを含む。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドの制御下で異種性遺伝子を発現する本発明により提供される宿主細胞を用いてタンパク質、好ましくはヒトタンパク質およびそのフラグメントを生成することができる。その方法は、場合によってはプロモーターの活性を誘導し、そして細胞培養物からタンパク質を精製することにより、望ましいタンパク質が発現される条件下で形質転換された細胞を培養することを伴う。一般に精製は細胞溶解、ホモジナイズ、遠心ならびに塩分画化、沈殿および陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、高分解能クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のような種々のクロマトグラフィー法のような方法による望ましいタンパク質の分離の工程を伴う。
【００５９】
前記で論じた組成物の少なくとも一部または全てを含む多くの発現系が存在する。原核細胞および／または真核細胞基盤の系を用いて本発明で使用するために核酸配列、またはその同族ポリペプチド、タンパク質およびペプチドを生成することができる。多くのかかる系は市販により、そして広く利用可能である。
【００６０】
昆虫細胞／バキュロウイルス系は米国特許第５８７１９８６号および第４８７９２３６号に記載されるように異種性核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を生み出すことができ、これは市販により利用可能である。発現系のその他の実例には、合成エクジソン誘導受容体、またはそのｐＥＴ発現系、大腸菌発現系、テトラサイクリン調節発現系、全長ＣＭＶプロモーターを用いる誘導可能な哺乳動物発現系およびピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）発現系と称される酵母発現系を伴うものが挙げられる。発現構築物のようなベクターを発現する、核酸配列またはその同族ポリペプチド、タンパク質もしくはペプチドを生成する方法は当業者には公知である。
【００６１】
本発明はＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の５’フランキング領域ならびに基本プロモーター活性および／または誘導性に重要な遺伝子内の領域の同定および特徴付けに関する。最近ではMizui et al., Mol Biol Rep. Vol. 27, No. 3, pp. 167-173 （2000）がＡｇｇ−１プロモーターの１.１ｋｂ５’フランキング領域をクローン化し、そしてブタ軟骨細胞におけるそのプロモーター活性を研究した。Mizui et al.により試験されたプロモーターは本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子とは少なくとも１.３ｋｂという点で異なる。本明細書のデータはこの領域が基本プロモーター活性を有しているという知見と合致するが、さらにこの開示の以前には同定されていない、Ａｇｇ−１プロモーターの機能性を調節するのに重要であるメカニズムおよび領域を提供する。
【００６２】
Moos et al., J Rheumatol, Vol. 26, No.4, pp. 870-879（1999）は、Ａｇｇ−１プロモーターが成長因子により強く誘導され得ることを示している。Koshy et al., Arthritis Rheum, Vol. 46, No.4, pp. 961-967 （2002）は、ＩＬ−１βおよびＯＳＭのようなプロ炎症性サイトカインは軟骨細胞系において種々ＡｇｇおよびＭＭＰのｍＲＮＡを誘導することを示している。Ａｇｇ−１遺伝子発現を多くの成長因子およびサイトカインにより調整することができることを理解するために、サイトカインおよび成長因子により活性化されることが解っている転写因子の新規結合部位の位置を決定するためにＡｇｇ−１プロモーター遺伝子に関して実験を行う。さらにＡｇｇ−１プロモーター転写の調節に関与する制御モチーフ、遺伝子発現カスケードおよび分子経路を同定するために、Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子の５’フランキング領域を包含する２.４ｋｂフラグメントをクローン化した。
【００６３】
本発明のポリヌクレオチドは：核因子カッパＢ（ＮＦｋＢ）、シグナル伝達物質および転写活性化（ＳＴＡＴ３）およびアクチベータータンパク質（ＡＰ−１）を含む複数の転写因子結合部位を含む。図１を参照して、そして５’から３’方向で、ＮＦｋＢ結合部位は−１８００残基から−１７９１残基に位置し、ＳＴＡＴ３結合部位は−１８４２残基から−１８３４残基に位置し、双方はコンセンサス配列と同一である。−２１９６残基から−２１９０残基に位置するＡＰ−１部位および−１４４８残基から−１４３９残基に位置するＮＦｋＢ部位はコンセンサス配列と比較して１つの塩基対誤対合を有する。興味深いことに、軟骨特異的ｃｂｆａ−１モチーフは＋６５９残基と＋１５５７残基の間の第１イントロンに見出され、ＳＯＸ９モチーフは＋３９４残基に位置し、そしてｃ−ｋｒｏｘモチーフは−５７５残基からから−５６７残基に位置する。マウスＡｇｇ−１のプロモーター領域を表すゲノムフラグメントもまたマウスゲノム配列のＢＬＡＳＴ検索を利用して同定される。さらに、特異的転写因子結合部位の検索により、マウスとヒトとの間の遺伝子の構造的構成が高度に保存されていることが示された。
【００６４】
別の態様では、本発明はＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の変種を提供する。変種を調製するための１つの手段は本発明のポリヌクレオチドに変異を導入することを含む。かかる変異体は元来の配列に相対して機能が増強、低減または変化している可能性があるか、またはこれに代えて、機能に関してサイレントであり得る。本発明の欠失構築物は、そのセグメントが負または正の調節活性を有していることが示される、図１に示されるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子からの欠失により得られる。図１はまた−２.０ｋｂ構築物（配列番号２）、−１.６ｋｂ構築物（配列番号３）、−１.２ｋｂ構築物（配列番号４）、−０.８ｋｂ構築物（配列番号５）、−０.４ｋｂ構築物（配列番号６）またはその縮重変種を含む好ましい構築物を示す。本明細書の前記およびその他のところで用いた残基位置のナンバリングは特記しない場合、図１で用いたナンバリングを意味する。負の調節領域が除去された欠失構築物は結果的にプロモーター活性が増強される。かかる構築物は、例えばＡｇｇ−１プロモーター活性を調整する薬物に関するスクリーニングに用いた場合、元来のプロモーターよりもより高い感受性を提供する。
【００６５】
特定のプロモーター配列を含むＤＮＡセグメントに変異を誘発するための技術は当業者に周知である。限定するものではないが、特定の調節領域の配列内に１つまたはそれより多い変異を有するオリゴヌクレオチドを合成することのような当分野において公知のいずれかの技術にしたがって変異誘発を実施することができる。特に基礎となる核酸分子の特異的変異誘発による部位特異的変異誘発はプロモーター変異体の調製に有用な技術である。その技術はさらに１つまたはそれより多いヌクレオチド配列変化を核酸分子に導入することにより配列変種を調製および試験する即時能力を提供する。
【００６６】
Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子の機能性を決定するために、種々のプロモーター−レポーター構築物を種々の宿主細胞にトランスフェクトすることができる。望ましい結果がベクターの複製またはベクターコード化核酸配列の一部もしくは全部の発現であるかどうかに依存して、宿主細胞は原核生物または真核生物由来でよい。好ましい宿主細胞にはＨＥＫ  ２９３Ｈ、ＳＶ−４０形質転換軟骨細胞Ｃ２８Ａ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ヒト軟骨肉腫ＳＷ１３５３およびＨｅＬａ細胞が挙げられる。Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子のフラグメントを鋳型として−２.４ｋｂフラグメントに対するＰＣＲプライマーにより作成し、そしてルシフェラーゼシグナル伝達に関して検出することができる。ルシフェラーゼ値をβ−Ｇａｌ値に対して正規化してトランスフェクション効率における差に関して補正する。
【００６７】
１つの態様では、ヒト関節軟骨細胞（ＨＡＣ）のＩＬ−１βでの処理によりＡｇｇ−１、ＭＭＰ−１３およびｉＮＯＳ  ｍＲＮＡが強く誘導される。Ａｇｇ−１  ｍＲＮＡの誘導をリアルタイムＰＣＲにより定量することができる。全ての値をＧＡＰＤＨに対して正規化する。表１に示すように、ＩＬ−１およびＯＳＭの組み合わせでの処理によりＡｇｇ−１プロモーターｍＲＮＡが有意に誘導されるが、ＭＭＰ−１３およびｉＮＯＳ  ｍＲＮＡからは誘導されない。ＰＤＧＦによる誘導はサイトカイン誘導に比較して穏やかである。
表１
【表１】
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【００６８】
Ａｇｇ−１  ｍＲＮＡは広範な組織において発現される（Ａｇｇ−１組織分布を参照）。表２では、基本活性は対照配列、ｐＧＬ３基本ベクターに比較して示される全ての細胞系に存在する。表２に示す構築物はＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の出発領域（ＡＴＧ）から上流の５’末端のその位置にしたがって称される。例えばプロモーター領域の−２.４ｋｂ構築物は出発領域から上流に２４００塩基対である。最高の基本活性はＨＥＫ２９３細胞（ルシフェラーゼ活性で約７０倍増加）で認められ、そしてこれらの構築物に関して最低の基本活性はＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（ルシフェラーゼ活性で約５倍増加）において見出される。Mizui et al.（2000）, supra は、その開示されたプロモーター遺伝子を利用して、ＮＦ−１（−８４７）結合部位がＡｇｇ−１発現の負の調節に関与することを報告している。Mizui et al.（2000）, supra に合致して、ＡＴＧの上流−８４７ｂｐに位置するＮＦ−１部位を担持する、本明細書に開示するＡｇｇ−１プロモーター構築物においてルシフェラーゼ活性の穏やかな抑制効果が見出される。本発明に包含され、そして出発領域から上流の５’末端に位置するＡｇｇ−１プロモーター構築物は−１から−０.４ｋｂ（配列番号６）、−１から−０.８ｋｂ（配列番号５）、−１から−１.２ｋｂ（配列番号４）、−１から−１.６ｋｂ（配列番号３）、−１から−２.０ｋｂ（配列番号２）および−１から−２.４ｋｂ（配列番号１）の間の領域を含む。好ましい構築物は試験した細胞系で最高の基本プロモーター活性を有する−１から−０.８ｋｂ（配列番号５）構築物および誘導領域を包含する−１から−２.４ｋｂ（配列番号４）を含む。
表２  Ａｇｇ−１プロモーターの基本活性
【表２】
2007516700.tif 000003
【００６９】
サイトカインおよび成長因子によるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の誘導性
Ａｇｇ−１基本活性の偏在する性質とは対照的に、Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子の誘導性はさらに特異的である。種々のプロモーター−レポーター構築物を、ＨＥＫ  ２９３Ｈ、ＳＶ−４０形質転換軟骨細胞Ｃ２８Ａ２、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ヒト軟骨肉腫ＳＷ１３５３およびＨｅＬａ細胞にトランスフェクトすることができ、これをトランスフェクションの４８時間後にＩＬ−１およびＯＳＭで誘導する。表３はトランスフェクション効率に関してルシフェラーゼ値を補正した後の、複数の実験からのデータを示す。ルシフェラーゼ活性により決定されるような誘導性の値はｐＧＬ３基本ベクターにより表される基本プロモーター活性と比較して、ＳＷ１３５３細胞（約１０倍）およびＨｅＬａ細胞（約３５倍）において最も高い。試験したその他の細胞系ではルシフェラーゼ活性は検出されない。ＩＬ−１βおよびＯＳＭの組み合わせによるルシフェラーゼ活性の誘導（ＳＷ１３５３で１０倍およびＨｅＬａ細胞で３５倍）は単一のサイトカインの各々の相加効果（これはＳＷ１３５３で約２から３倍およびＨｅＬａ細胞で５倍）よりも非常に高い。理論に制約されることを望むわけではないが、データにより、Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子においてこれらのサイトカインにより活性化された転写因子間で協同的な相互作用が存在し得て、これによりＡｇｇ−１プロモーター転写が強く誘導されることが示唆される。
表３  Ａｇｇ−１プロモーターの誘導領域の描写
【表３】
2007516700.tif 000004
【００７０】
本発明で用いられるインデューサーにより活性化される、Ａｇｇ−１プロモーターに匹敵する種々の結合領域が同定されている。ＭＭＰ−１３に関しては、プロモーター領域のＡＰ−１部位がＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング経路の種々のインデューサーに対する応答性を付与するということを開示するいくつかの報告がある（Tardif et al., Bioichem J, Vol. 323, Part 1, pp. 13-16 （1997）； Pendas et al., Genomics, Vol.40, No.2, pp. 222-233 （1997）；および Li, Dehnade and Zafarullah, J Immunol, Vol. 166, No. 5, pp. 3491-3498 （2001）参照）。しかしながら、ＭＭＰ−１３プロモーターのＳＴＡＴ結合部位は今日までその機能性に関して特徴付けられていない。ヒトｉＮＯＳプロモーターはサイトカインに応答してＮＦｋＢまたはＳＴＡＴ１のいずれかに結合する重複二機能性ＮＦｋＢ−ＳＴＡＴ１モチーフを含有する。本明細書にて同定された結果に基づいて、ｉＮＯＳプロモーターにおけるＳＴＡＴ１シグナリング領域の活性化は細胞型に依存してヒトｉＮＯＳ転写の正または負のレギュレーターとして働き得る。Ganster et al., Proc Natl Acad Sci U S A, Vol. 98, No. 15, pp. 8638-8643 （2001）；および Yu, Zhang and Kone, Biochem J, Vol. 367, Part 1, pp. 97-105 （2002）参照。
【００７１】
ＨＡＣ細胞のサイトカイン処理によりＡｇｇ−１プロモーター、ＭＭＰ−１３およびｉＮＯＳ  ｍＲＮＡが同時誘導されることが示された。ＨＡＣでは、ＩＬ−１およびＯＳＭの組み合わせでの処理によるＮＦｋＢおよびＳＴＡＴシグナリング経路の同時活性化により、Ａｇｇ−１  ｍＲＮＡの有意なまたは超誘導に至り、これはＩＬ−１またはＯＳＭいずれかの単独での処理よりも活性が３から４倍大きい（表１参照）。
【００７２】
その他のアッセイを用いてプロモーター領域または遺伝子における応答エレメントを同定することができる。かかるアッセイは当業者に公知であり（例えばSambrook et al. （1989）, supra； Zhang et al. （1997）； Shan et al. （1997）； Dai and Burnstein （1996）； Cleutjens et al. （1997）； Ng et al. （1994）；および Shida et al. （1993）参照）、そしてＤＮアーゼＩフットプリンティグ試験、電気泳動移動度シフトアッセイパターン（ＥＭＳＡ）、精製された転写因子の結合パターン、推定応答エレメントに対する転写因子の結合の阻止における特異的転写因子抗体の効果、ウェスタン分析、核ランオンアッセイおよびＤＮＡメチル化干渉分析を含む。
【００７３】
別の態様では、対照およびサイトカイン処理ＨＡＣ、ＳＷ１３５３またはＨｅＬａ細胞からの核抽出物を用いるＥＭＳＡにより、サイトカイン処理抽出物においてＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ３およびＡＰ−１核タンパク質複合体が増強されることが示される。ＩＬ−１およびＯＳＭ処理したＨＡＣ、ＳＷ１３５３またはＨｅＬａ細胞から調製した核抽出物でＥＭＳＡを実施することができる。Ａｇｇ−１プロモーター部位特異的ＮＦｋＢ（−１８００）、ＡＰ−１（−２１９６）およびＳＴＡＴ３（−１８４２）オリゴヌクレオチドを研究に用いることができる。サイトカイン処理した細胞からの抽出物はＮＦｋＢ、ＡＰ−１およびＳＴＡＴ３に関してゲルシフト複合体を強く誘導する。これらの複合体は未処理試料の核抽出物では検出されない。結合特異性を実証するために、５０倍過剰のモル濃度の異なる未標識プローブを結合の競合物質として用いることができる。未標識ＮＦｋＢ、ＡＰ−１およびＳＴＡＴ３エレメントは結合を完全に遮断するが、一方変異体オリゴヌクレオチドは結合に関して競合しない。プロモーター配列からのＮＦｋＢ（−１４４８）オリゴヌクレオチドでのゲルシフトにより非常に弱い複合体形成に至る。このデータにより、ＮＦｋＢおよびＳＴＡＴ３活性化は転写因子によるヒトＡｇｇ−１プロモーターの誘導に重大であることを示唆している。
【００７４】
ｃ−ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ１および２、ＣＲＥＢ１および２／ＡＴＦ  １、２および３に対する特異的抗体の存在下で、これらの因子の中でどれがＡＰ−１複合体の形成に寄与するかを同定するために、ＡＰ−１バンドのスーパーシフト分析もまた行うことができる。結果により、ｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎＢがＩＬ−１およびＯＳＭ処理核抽出物におけるＡＰ−１複合体の主成分であることが示唆される。ＩＬ−１およびＯＳＭ処理した抽出物におけるＮＦｋＢ−ｐ５０およびＮＦｋＢ−ｐ６５抗体ならびにＳＴＡＴ１、３および５抗体での類似のスーパーシフト分析により、ＳＴＡＴ複合体の主成分はＳＴＡＴ３であり、そしてＮＦ−ｋＢの主成分はｐ−５０およびｐ−６５サブユニットであることが示唆される。
【００７５】
Ａｇｇ−１プロモーターのどの部位がサイトカイン誘導性に重要であるかを同定するために−２.４ｋｂのＡｇｇ−１プロモーター構築物で変異誘発を実施してＮＦｋＢ（−１４４８、−１８００）、ＡＰ−１（−２１９６）およびＳＴＡＴ３（−１８４２）領域を別個に、または少なくとも２つの組合せで選択的に変異させることができる。ＳＷ１３５３またはＨｅＬａ細胞をＩＬ−１およびＯＳＭで刺激し、続いて構築物の一過性トランスフェクションを行うことができる（表３参照）。
【００７６】
表４のデータは複数の実験を表し、ここでルシフェラーゼ値はβ−Ｇａｌ値に正規化してトランスフェクション効率に関して補正する。表４によりＮＦｋＢ（−１８００）およびＳＴＡＴ３（−１８４２）がＡｇｇ−１プロモーターのＩＬ−１およびＯＳＭ媒介誘導に必須であるが、一方ＡＰ−１（−２１９６）およびＮＦｋＢ（−１４４８）部位は別個または組合せのＮＦｋＢ（−１８００）およびＳＴＡＴ３（−１８４２）ほど誘導の有意な結果を生み出さないことが示される。ＳＴＡＴ３変異はＩＬ−１βおよびＯＳＭにより誘導されるプロモーターも活性の生成において最も不利である。ＮＦｋＢおよびＳＴＡＴ３部位の二重変異はＩＬ−１βおよびＯＳＭでの誘導をさらに低減させる。ＡＰ−１部位を含むその他の二重変異はＩＬ−１βおよびＯＳＭ媒介誘導を有意に低減しない。
【００７７】
したがって、ＥＭＳＡデータにより、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴおよびＡＰ−１部位を包含する−１.２ｋｂと−２.４ｋｂの間の領域が誘導性に重要であることが確認される。変異誘発データを考慮したＥＭＳＡデータにより、近位ＮＦｋＢ（−１８００）およびＳＴＡＴ３（−１８４２）部位が協調的に作用してプロモーターを超誘導することができることが示唆される（表３および４参照）。理論に束縛されずに、各々の転写因子（ＮＦｋＢおよびＳＴＡＴ３）によるこれらの双方の部位の占有により第３の因子の結合を促進することができることが提案される。本明細書に記載する本発明は、サイトカインによるヒトＡｇｇ−１遺伝子発現の調節に及ぼす相乗効果を有するＮＦｋＢおよびＳＴＡＴ３シグナリング経路の間でクロストークを生じることを示すデータの最初の例を提供する。
表４  Ａｇｇ−１プロモーターの部位特異的変異分析
【表４】
2007516700.tif 000005
【００７８】
ｃｂｆａ１がＭＭＰ−１３遺伝子の転写に重大な役割を有していることは報告されている。Jimenez et at., Mol Cell Biol, Vol. 19, No. 6, pp. 4431-4442 （1999）参照。本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子をｃｂｆａ１部位に関して分析し、そして興味深いことに、残基＋６３３と＋１７４６の間のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の第１イントロンに３つの部位が存在する。本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子において同定されたその他の部位にはｃ−ｋｒｏｘ（残基−５７５から−５６７）、ＳＯＸ９（残基＋３９４から＋４００）およびＩＲＳ／ＦＫＨＲＬ（残基−９２８から−９２１）部位が含まれる。Ghayor et al., J BioI Chem, Vol. 275, No. 35, pp. 27421-27438 （2000）はＣＯＬ２Ａ１遺伝子の第１イントロンにｃ−ｋｒｏｘ結合部位が存在し、そしてｃ−ｋｒｏｘ転写因子はＣＯＬ２Ａ１遺伝子の軟骨細胞特異的転写に重大であることを示している。ｃｂｆａ１、ｃ−ｋｒｏｘ、ＳＯＸ９およびＩＲＳ／ＦＫＨＲＬ転写因子はＡｇｇ−１遺伝子転写の調節においてさらに調査される必要がある。
【００７９】
本発明はまた、Ａｇｇ−１プロモーター活性が見出される組織または細胞をターゲティングするために用いることができる、ヒトゲノムＤＮＡに存在する調節配列をも提供する。本発明のポリヌクレオチドを診断目的で用いることができる。そのポリヌクレオチドを用いて、コラーゲンおよび／または軟骨細胞分解酵素が疾患と相関している生検組織においてＡｇｇ−１プロモーター活性または遺伝子転写物の発現を検出および定量することもできる。診断アッセイを用いて特定の治療薬がＡｇｇ−１プロモーター活性を調整するかどうかを決定することもできる。
【００８０】
一般に、ＲＮＡ、タンパク質または双方の生成を測定することにより遺伝子発現を決定することができる。当分野において周知の方法により遺伝子生成物（ＲＮＡまたはタンパク質）を単離および／または検出することができる。検出後、規定の細胞系または個々で認められた結果を非形質転換対照細胞の統計的に有意な参照群と比較することができる。これに代えて、プロモーター配列の種々の変異体に作動可能なように連結されている同一の遺伝子で形質転換された細胞系においてＲＮＡまたはタンパク質生成物の生成を比較することができる。この方式で、作動可能なように連結されている遺伝子の発現に及ぼすその効果により新規プロモーター配列内の調節領域を同定することが可能である。
【００８１】
表２および３では、Ａｇｇ−１プロモーターは種々細胞において誘導されることが示された。したがって、本発明はまたＡｇｇ−１プロモーター活性または本発明のＡｇｇ−１プロモーターに結合するタンパク質の発現を伴う疾患を処置または検出するための異種性ＤＮＡの発現を調節するための方法および組成物をも提供する。かかる疾患はまた、サイトカインまたは成長因子のようなＡｇｇ−１の発現を直接的または間接的に誘導し得る１つまたはそれより多い転写レギュレーターの発現または活性の増強をも伴い得る。具体的には、本発明は炎症、例えばいくつかの神経学的または呼吸器障害、リウマチ性関節炎、骨関節炎または非炎症性関節炎を伴う疾患のための、およびＡｇｇ−１プロモーターが過剰発現される組織におけるその研究ならびに治療における有用性を有する。
【００８２】
本発明はまた前記した本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子（その変種および誘導体を含む）の配列の少なくとも一部を含有する核酸分子にも関する。かかる核酸分子は、それがプロモーター活性を有しているかいないかに関わらず、Ａｇｇ−１プロモーターとそれに結合できるタンパク質、例えば転写因子との間の結合を競合的に阻止することができる。結果的に、核酸分子がプロモーター活性を阻止するタンパク質の結合と競合する場合、プロモーター活性をこの方式で増強することができる。一方、核酸分子がプロモーター活性を増強するタンパク質の結合部位と競合する場合、プロモーター活性をこの方式で阻止することができる。かかる方法を用いて、望ましいプロモーター活性に依存して転写モジュレーターをスクリーニングして新規な治療薬を開発することができる。さらに本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子を用いるかかる方法を用いて、本明細書にて記載したプロモーター遺伝子の協調誘導に関与する新規遺伝子または経路をスクリーニングすることもできる。
【００８３】
別の態様では、本発明のポリヌクレオチドおよび誘導体はまた軟骨細胞および非軟骨細胞におけるタンパク質溶解性分解の阻止、軟骨細胞におけるポリヌクレオチドの転写を選択的に調整する薬物および関節軟骨の分解を調整する薬物のスクリーニングにも有用である。
【００８４】
１つの態様では、本発明は本発明の新規プロモーター配列を含む発現ベクターを用いて、リウマチ性関節炎または骨関節炎のような関節症状を有しやすいか、またはその素因を有する哺乳動物における関節軟骨分解を調整するための方法を提供する。本発明はさらに関節症状を有しやすいか、またはその素因を有する哺乳動物における関節軟骨分解を調整するための医薬品の調製における本発明の新規プロモーター配列を含む発現ベクターの使用を提供する。本発明のＡｇｇ−１プロモーターを変異させ、次いでプロテオグリカンをコードする遺伝子に作動可能なように連結させ、それにより遺伝子生成物の遺伝子発現を阻止することができる。変異したＡｇｇ−１プロモーターはまたＡｇｇ−１プロモーター結合領域内の結合部位に対するサイトカインの結合をも妨げ得る。ＮＦｋＢおよび／またはＳＴＡＴ３部位の点変異および／または欠失はＡｇｇ−１プロモーター活性を阻止し、それにより軟骨分解に寄与するアグレカナーゼ酵素の発現を妨げる。
【００８５】
スクリーニングマーカーは規定の遺伝子の発現を定量するための別の有効な手段を構成する。任意の可能性のあるスクリーニングマーカーを発現させ、そしてマーカー遺伝子生成物を定量し、それによりプロモーターが遺伝子の発現を導く効率を推定することができる。可視的手段または例えばフォトン計測装置のいずれかを用いて定量を容易に実施することができる。
【００８６】
Ａｇｇ−１プロモーター誘導または活性を遮断する作用物質には、抗体、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ホルモン、タンパク質またはポリペプチドが挙げられる。かかる作用物質をインビボまたはエキソビボトランスフェクションにより対象に投与することができる。当分野において用いられるエキソビボ方法を用いることができ、そして一般に哺乳動物からの細胞を移植すること、望ましい分子をコードする遺伝子に作動可能なように連結されているＡｇｇ−１プロモーターを含む核酸を含む発現ベクターで細胞をトランスフェクトすること、ならびに異種性核酸配列が組み込まれており、そしてそれを発現する哺乳動物細胞を選択および再移植することを伴うことができる。前記の発現ベクターの直接注入のような当分野において用いられる方法によりインビボトランスフェクションを達成することができる。
【００８７】
本発明の新規プロモーター配列で形質転換された宿主細胞を用いて、Ａｇｇ−１プロモーターに特異的に結合し、そしてＡｇｇ発現または活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する化合物を同定することもできる。前記したように、Ａｇｇ−１プロモーターの欠失構築物を用いて遺伝子生成物の発現を駆動するその能力を増強または低減させ、そしてそれによりアッセイの感受性を増加させることができる。
【００８８】
抗体
別の態様では本発明はＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の免疫原性領域に特異的であり、そしてそれに結合する抗体に関する。かかる抗体はＡｇｇ−１プロモーターの誘導により生成された高レベルのタンパク質を含有する組織を同定するため、ならびに細胞もしくは組織抽出物、培養細胞の培地、またはアフィニティクロマトグラフィーにより細胞内および細胞外タンパク質の部分的に精製された調製物から各々のタンパク質を精製するための有用な検索手段である。かかる抗体はまたＡｇｇ−１プロモーター活性により生成された高または低レベルのタンパク質に関連する疾患を同定および診断するのにも有用である。かかる抗体はまたインビトロおよびインビボで細胞によるＡｇｇ−１プロモーターの合成、誘導および分泌に及ぼす治療薬の効果をモニタリングするのにも有用である。かかる抗体を、その他のタンパク質、Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子のアクチベーターおよび阻害剤を同定するために、同時免疫沈殿および同時アフィニティクロマトグラフィーのような手順において用いることもできる。
【００８９】
本発明はまたＡｇｇ−１プロモーター遺伝子または遺伝子生成物に免疫特異的な抗体を用いて患者からの身体試料におけるＡｇｇ−１プロモーター活性またはＡｇｇ−１プロモーターの誘導により発現されるタンパク質を検出するための方法をも提供する。その方法は抗体を患者から採取した試料と接触させること；および抗体と、試料中に存在する対応するＡｇｇ−１プロモーター遺伝子、その免疫原性フラグメントまたは遺伝子生成物との間の複合体の形成を検定することを含む。試料は、限定するものではないが、全血、血清、滑液、便、尿、乳房、脳脊髄液、精液、気管、胃およびその他の腸セグメントからの診断用洗浄液、組織生検または切除組織、塗布および塗抹から得られた細胞を含む組織または生物学的液体でよい。関節障害の間のＡｇｇ−１プロモーターの発現の変化をモニタリングするのに好ましい試料は滑液である。炎症の間のＡｇｇ−１プロモーターの発現の変化をモニタリングするのに好ましい試料には、限定するものではないが血清、体液または生検組織が挙げられる。
【００９０】
試料は抗Ａｇｇ−１プロモーター抗体と組み合わせる前に、未処理でよいか、または沈殿、分画化、分離もしくは精製に供してよい。検出を容易にするために、試料から単離したタンパク質をカラム、プラスチック皿、マトリックスまたは膜、好ましくはニトロセルロースのような基体に結合させるのが好ましい。好ましくは、検出方法には酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはウェスタンイムノブロッティング手順を用いる。
【００９１】
試料中のＡｇｇ−１プロモーターと対応する抗Ａｇｇ−１プロモーター抗体との間の相互作用を放射線測定、熱量測定もしくは蛍光測定手段、サイズ分離または沈殿により検出する。好ましくは、抗体−Ａｇｇ−１プロモーター複合体の検出は、例えば酵素、フルオロフォアまたはクロモフォアのような検出タグに結合する２次抗体の添加による。複合体の形成は被験試料中のＡｇｇ−１プロモーターの存在または活性の指標である。したがって、その方法を用いて、対照試料中のプロモータータンパク質のレベルと比較して被験試料中のＡｇｇ−１プロモーター活性が低下または上昇したかどうかを決定し、そして被験試料中のプロモーターの誘導またはタンパク質の発現の量を定量する。対照および試験値の間の偏差により疾患を診断するためのパラメーターが確立される。
【００９２】
薬物スクリーニング
本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子を用いることにより、Ａｇｇ−１プロモーターまたはそれをコードする遺伝子の活性を調節する化合物ならびに核酸分子およびタンパク質をスクリーニングすることも可能である。したがって、本発明はまたＡｇｇ−１プロモーター活性を調節する化合物をスクリーニングする方法にも関する。スクリーニング方法の１つの実施態様は被験化合物の存在下、被験試料をＡｇｇ−１プロモーターと接触させること、および本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子と被験試料中のタンパク質との間の結合を促進または阻止する化合物を選択することの工程を含む。例えば、細胞核抽出物を同位元素等で標識されているＡｇｇ−１プロモーターに結合させること、結合生成物をポリアクリルアミドゲル電気泳動に供すること、およびゲルシフトアッセイにより核抽出物中のタンパク質と本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子との間の複合体を示すバンドを検出することによりその方法を実施することができる。ＤＮＡプローブの添加時に、被験化合物もまた添加して、核抽出物中のタンパク質と本発明のプロモーターとの間の複合体を示すバンドの形成を増強または阻止する化合物を選択する。この方法により、Ａｇｇ−１プロモーターに直接作用する化合物、および本発明のＡｇｇ−１プロモーターに結合するタンパク質に作用する化合物をスクリーニングすることが可能になる。例えば本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子に結合するタンパク質がインビボでプロモーターの活性を阻止する場合、タンパク質と本発明のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子との間の結合を阻止する化合物はＡｇｇ−１プロモーター活性を増強する。さらに、本発明のＡｇｇ−１プロモーターに結合するタンパク質がすでに単離されている場合、次いで細胞核抽出物の代わりにタンパク質の組換えタンパク質を用いることも可能である。
【００９３】
スクリーニング目的で、Ａｇｇ−１プロモーターを発現する適切な宿主細胞、好ましくは軟骨細胞、さらに好ましくはヒト関節軟骨細胞を、本発明のＡｇｇ−１プロモーターに作動可能なように連結されているレポーター遺伝子を含む発現ベクターで形質転換する。形質転換された宿主細胞を種々の被験物質に暴露し、そして次にレポーター遺伝子の発現に関して分析する。この発現を被験物質に暴露しなかった細胞からの発現と比較することができる。Ａｇｇ−１プロモーターの誘導、転写または活性を増加させる化合物は結果的に対照に相対してレポーター遺伝子発現を増加させる。同様に、Ａｇｇ−１プロモーターシグナリング経路のアンタゴニストとして作用する化合物は結果的に対照に相対してレポーター遺伝子発現を低下させる。
【００９４】
形質転換された細胞をサイトカインまたは成長因子のような転写インデューサーで誘導することができる。好ましいサイトカインにはＩＬ−１またはＯＳＭが挙げられる。活性が公知の薬剤、すなわち標準作用物質または活性が推定される作用物質、すなわち被験作用物質の存在下または不在下で転写活性を測定する。被験作用物質の存在下でのレポーター遺伝子の発現のレベルの変化を標準作用物質による影響を受けたものと比較する。この方式で、被験作用物質のＡｇｇ−１プロモーター転写に影響する能力およびその相対的効力を決定することができる。
【００９５】
好ましいレポーター遺伝子は、通常のアッセイで容易に測定されるタンパク質生成物を生成するものである。適当なレポーター遺伝子には、限定するものではないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼが挙げられる。都合のよいアッセイには熱量測定、蛍光測定および酵素アッセイが挙げられる。最も好ましいのは、細胞内で発現され、そしてその細胞外生成物が細胞内メジウム中で、または培養細胞系の細胞内メジウムの抽出物中で直接測定されるレポーター遺伝子である。これにより、その生成物が分泌されるレポーター遺伝子を用いることを超える利点が提供されるが、それは分泌の速度および効率がアッセイの解釈を複雑にするさらなる変量を導入するためである。
【００９６】
したがって、本発明の１つの態様では：
（ａ）本明細書に開示するＡｇｇ−１プロモーター遺伝子がレポーター遺伝子に作動可能なように連結されている宿主細胞を、レポーター遺伝子の発現を可能にする条件下で被験化合物を含有する被験培地と接触させること；
（ｂ）被験培地の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；
（ｃ）（ａ）で用いたものと同一の条件下で被験化合物を含有しないが、それ以外は（ａ）の被験培地と同一である対照培地と宿主を接触させること；
（ｄ）対照培地の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；および
（ｅ）（ｂ）と（ｄ）の間の発現の差を、被験化合物の該Ａｇｇ−１プロモーターの活性を調節する能力に関連づけること；
によりＡｇｇ−１プロモーターの活性を調節する被験化合物をスクリーニングすることができる。
【００９７】
本発明の別の態様は、特にＡＰ−１、ＮＦｋＢおよびＳＴＡＴ３のような転写因子結合部位の中で、必然的に転写に先行するシグナル伝達経路に影響するか、またはＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写に直接影響するかのいずれかにより、Ａｇｇ−１プロモーター活性を調整する薬理学的に活性な被験作用物質に関するスクリーニングにおけるその使用である。被験作用物質の使用を用いて、Ａｇｇ−１プロモーターに、好ましくは特異的にＡｇｇ−１プロモーター内の結合領域に結合する薬物、ポリペプチド、自己抗体またはその他の化合物、およびそこから生成される、プロモーター活性を遮断または促進するのに十分な親和性を有する遺伝子生成物を同定することができる。当分野において公知の、およびまた以下に例示する種々のアッセイのいずれかを用いて推定される阻害剤の存在下または不在下でＡｇｇ−１プロモーターの活性を検定することができる。プロモーター活性を検出するために、またはＡｇｇ−１プロモーターの誘導もしくは転写の結果としての発現の程度をモニタリングするために、タンパク質生成物の発現時に検出可能なシグナルを提供する様式で基質をタグ化する。例えば当分野において用いられる検出可能な標識で基質をタグ化することができる。
【００９８】
したがって本発明の別の態様では：
（ａ）本明細書に開示するＡｇｇ−１プロモーター遺伝子がレポーター遺伝子に作動可能なように連結されている宿主細胞を、レポーター遺伝子の発現を可能にする条件下でＡｇｇ−１プロモーター活性のインデューサーと接触させること；
（ｂ）被験化合物の不在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；
（ｃ）宿主細胞をインデューサーと接触させる前、同時または後に宿主細胞を被験化合物に暴露すること；
（ｄ）被験化合物の存在下でレポーター遺伝子の発現を測定すること；および
（ｅ）（ｂ）と（ｄ）の間の発現の差を、被験化合物のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子転写を調整する能力に関連づけること；
により被験化合物のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子転写を調整する能力を測定する方法を提供する。
【００９９】
様々なインデューサーがシグナル伝達の様々な様式、例えばｃＡＭＰ応答、カルシウムイオン応答に影響することが解っているので、したがって特定のシグナル伝達経路に影響する化合物をより高い特異性を伴って同定することが可能である。さらに、Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子がサイトカイン処理で超誘導されることが示されているので、その誘導性を測定するアッセイにより特異的なシグナル伝達を阻止および／または逆転させる化合物を同定する手段が提供され得る。
【０１００】
別の態様では、本発明は対象における関節軟骨変性症状の存在を決定する方法を提供する。その方法には対象からの試料を提供すること、および対象試料中の配列番号１−６からなる群から選択されるポリヌクレオチドの量を測定することが含まれる。次いで対象試料中のＡｇｇ−１ポリヌクレオチドの量を対象からの対照試料中のＡｇｇ−１ポリヌクレオチドの量と比較する。対照試料中のＡｇｇ−１ポリヌクレオチドまたは転写物の量に相対する対象試料中のＡｇｇ−１ポリヌクレオチドまたは転写物の量の変化は、対象が関節軟骨変性症状を有していることを示している。対照試料を適合する個体、すなわち年齢、性別またはその他の一般症状は類似するが、関節軟骨変性またはプロテオグリカンの上方制御を有する疑いがない個体から採取するのが好ましい。これに代えて、対照試料を対象が関節軟骨変性を有している疑いがない時点で対象から採取することができる。
【０１０１】
さらなる態様では、本発明は対象における関節炎、リウマチ性関節炎または骨関節炎に対する素因を決定する方法を提供する。その方法は対象からの核酸試料、例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ、または双方を提供すること、および対象核酸試料中に発現されたＡｇｇ−１プロモーターポリヌクレオチドの量を測定することを含む。次いで対象核酸中のＡｇｇ−１プロモーターポリヌクレオチドの量を対照試料中のＡｇｇ−１プロモーターポリヌクレオチドの量と比較する。対照試料中のＡｇｇ−１核酸の量に相対する試料中のＡｇｇ−１核酸の量の変化は対象が関節炎に対する素因を有していることを示している。
【０１０２】
さらに別の態様では、本発明はＡｇｇ−１関連障害を処置するか、または予防するか、または遅延させる方法を提供する。その方法は、かかる処置または予防または遅延が望ましい対象に、対象のＡｇｇ−１関連障害を処置するか、または予防するか、または遅延させるのに十分な量のＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写の阻害剤を投与することを含む。
【０１０３】
別の態様では、本発明はかかる処置または予防または遅延が望ましい対象においてＡｇｇ−１関連障害を処置するか、または予防するか、または遅延させるための医薬品の調製におけるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の転写の阻害剤の使用を提供する。
【０１０４】
実施例
本発明を実施する場合に分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多くの従来技術を用いる。これらの技術は周知であり、そして例えばCurrent Protocols in Molecular Biology, Vols. I-Ill, Ausubel, Ed. （1997）； Sambrook et al. （1989）, supra； DNA Cloning： A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed. （1985）； Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. （1984）； Nucleic Acid Hybridization, Hames and Higgins, Eds. （1985）； Transcription and Translation, Hames and Higgins, Eds. （1984）； Animal Cell Culture, Freshney, Ed. （1986）； Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press （1986）； Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning； the series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. （1984）； Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller and Calos, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, NY （1987）；およびMethods in Enzymology Vols. 154 and 155, Wu and Grossman, and Wu, Eds., respectively （1987）において説明されている。
【０１０５】
実施例１
細胞におけるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の誘導
ＨＡＣ  ＳＷ１３５３またはＨｅＬａ細胞［ＡＴＣＣ］を２４ウェルプレートでペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾン（Invitrogen, Carlsbad, CA）を含有するＤＭＥＭ高グルコース培地中でコンフルエントまで成長させる。細胞を一晩血清枯渇にし、そしてＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）（Peprotech, Rockyhill, NJ）単独で、またはOncostatin M （５０  ｎｇ／ｍｌ）（R&D systems, Minneapolis, MN）もしくはＰＤＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）（R&D systems, Minneapolis, MN）で１６時間誘導する。
【０１０６】
実施例２
ＲＮＡ単離およびリアルタイムＰＣＲ
Rneasy Miniキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて製造者により記載されたプロトコールにしたがって全ＲＮＡを単離する。オンカラムＤＮアーゼＩ消化を用いて夾雑するゲノムＤＮＡを排除する。高容量cDNA Archiveキット（PE Applied Biosystems, Foster
City, CA）でランダムプライマーを用いて１００μｌの反応容量で第１鎖ｃＤＮＡを合成する。ABI Prism 7900HT配列検出システム（PE Applied Biosystems）でSYBRGreen PCR Master Mix（PE Applied Biosystems）を用いて３８４ウェル様式でリアルタイムＰＣＲを実施する。
【０１０７】
Biomek FX 液体処理ロボット（Beckman Coulter, Fullerton, CA）を用いてｃＤＮＡ鋳型およびＰＣＲミックスを分配する。反応物２０μｌはｃＤＮＡ５μｌ、２００ｎＭ順方向および逆方向プライマーならびにSYBRGreen PCR Master Mixを含有する。デフォルトサイクリングプログラムの後に解離段階が続き、それにより融解曲線を作成してＰＣＲ生成物の特異性およびプライマー二量体の不在を確認する。デフォルトパラメーターおよび反応物条件下でPrimer Express software （PE Applied Biosystems）を用いてＲＴ−ＰＣＲのプライマーを設計し、その配列は以下のとおりである：
アグレカナーゼＩ順方向５’−ＴＴＴＣＣＣＴＧＧＣＡＡＧＧＡＣＴＡＴＧＡ−３’（配列番号７）
アグレカナーゼＩ逆方向５’−ＡＡＴＧＧＣＧＴＧＡＧＴＣＧＧＧＣ−３’（配列番号８）
ＭＭＰ−１３順方向５’−ＴＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＧＧＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＣＡＴ−３’（配列番号９）
ＭＭＰ−１３逆方向５’−ＡＴＧＧＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＡＡＴＴＴＧ−３’（配列番号１０）
ｉＮＯＳ順方向５’−ＧＣＡＡＡＣＣＴＴＣＡＡＧＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１１）
ｉＮＯＳ逆方向５’−ＴＧＣＴＧＴＴＴＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＴ−３’（配列番号１２）
【０１０８】
実施例３
Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子の同定
ヒトＡｇｇ−１  ｃＤＮＡクローン（ＮＭ＿００５０９９）のＡＴＧコドンを含む３００ｂｐ配列を用いてヒトゲノムアセンブリ配列をＢＬＡＳＴする。The International Human Genome Sequencing Consortium, Nature, Vol. 409, pp. 860-921 （2001）参照。１０ｋｂ上流の領域を同定し（ＮＴ  ００４６６８）、そしてこの配列を用いてプロモーターの異なる領域をクローニングする。
【０１０９】
Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子における転写因子結合部位の同定
インハウス検索プログラムを用いて、転写因子のコンセンサス配列を用いてＡｇｇ−１プロモーターの可能性のある結合部位を検索する。ＮＦｋＢおよびＳＴＡＴ３コンセンサス配列に完全に対合する配列は開始コドンＡＴＧの上流−１８００および−１８４２ｂｐに位置する。コンセンサス配列に１塩基対の誤対合を有するＡＰ−１部位および第２のＮＦｋＢ部位は各々−２１９６ｂｐおよび−１４４８ｂｐに位置する。これらの部位はサイトカインおよび成長因子により活性化されることが解っている。ｃ−ｋｒｏｘおよびｃｂｆａ１のような軟骨特異的であることが解っているその他の部位もまたＡＴＧの下流で同定される。
【０１１０】
Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子の２.４ｋｂ５’フランキング領域のクローニング
鋳型としてヒトゲノムＤＮＡ（Clontech, Palo Alto, CA）を用いるＰＣＲにより本発明のプロモーター領域であるＡＴＧの上流２.４ｋｂを表すＤＮＡセグメント（−２.４ｋｂ）を単離する。ＰＣＲ反応に用いるプライマーのヌクレオチド配列を以下に示す。プライマーは制限エンドヌクレアーゼ切断部位（５’オリゴのＸｈｏ１部位および３’オリゴのＨｉｎｄ  ＩＩＩ）を担持し、これを続くｐＧＬ３ベーシックルシフェラーゼレポータープラスミド（Promega, Madison, WI）へのサブクローニングに用いることができる。
【０１１１】
増幅のためのＰＣＲサイクリング条件は以下のとおりである：
【０１１２】
変性９５℃で３０秒、アニーリング６０℃で４０秒、伸長６８℃で２.５分。Expand Long Template ＰＣＲ増幅システム（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）を用いて３０サイクルＰＣＲ反応を実施する。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ生成物を精製し、Ｘｈｏ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化し、そしてｐＧＬ３ベーシックレポータープラスミドにサブクローニングし、これをＸｈｏ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで直線化する。
【０１１３】
実施例４
Ａｇｇ−１プロモーター遺伝子の欠失構築物の作成
ＰＣＲプライマーを設計してプロモーター領域の−４００ｂｐ、−８００ｂｐ、−１.２ｋｂ、−１.６ｋｂおよび−２.０ｋｂを包含する構築物を作成する。鋳型として−２.４ｋｂフラグメントおよび前記で記載したＰＣＲ条件を用いてＰＣＲにより構築物を作成する。構築物を作成するために用いたプライマーのヌクレオチド配列を以下に示す。Ｘｈｏ  Ｉ（ＣＴＣＧＡＧ）およびＨｉｎｄ  ＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）制限部位には下線を付す：
ＰＣＲプライマー
順方向（−２４００）５；−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＣＣＴＴＧＡＴＣＣ−３’（配列番号１３）
逆方向（−１）５’−ＧＣＧＣＧＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡ−３’（配列番号１４）
順方向（−２０００）５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＧＧＧＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＡ−３’（配列番号１５）
順方向（−１６００）５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＴＡＡＴＴＴＣＣ−３’（配列番号１６）
順方向（−１２００）５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＧ−３’（配列番号１７）
順方向（−８００）５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＧＧＴＴ−３’（配列番号１８）
順方向（−４００）５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＡＣＡＴＡＴＧＣＡＣＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号１９）
【０１１４】
同一の逆方向プライマーを全てのＰＣＲ反応に用いる。括弧の数字はプロモーター配列のプライマーの５’末端の位置を表す。
【０１１５】
実施例５
ＥＭＳＡによるＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の結合部位の特徴付け
ＥＭＳＡでＮＦ−ｋＢ、ＳＴＡＴ３およびＡＰ−１転写因子結合部位を表す野生型および変異体オリゴを合成し、そして以下のように標識する：
【０１１６】
ＮＦ−ｋＢ、ＳＴＡＴ３およびＡＰ−１部位を表す二重鎖オリゴをSigma Genosys, Woodlands, TXにより合成する。
ＮＦ−ｋＢ（−１７９９）野生型オリゴ
順方向５’−ＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＧ−３’（配列番号２０）
逆方向５’−ＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号２１）
ＮＦ−ｋＢ（−１７９９）変異体オリゴ
順方向５’−ＣＣＴＴＣＣＴＧＧａＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＧ−３’（配列番号２２）
逆方向５’−ＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣｔＣＣＡＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号２３）
ＡＰ−１（−２１９５）野生型オリゴ
順方向５’−ＣＡＴＴＧＣＴＴＡＧＴＣＡＣＣＣＣＣＴＴ−３’（配列番号２４）
逆方向５’−ＡＡＧＧＧＧＧＴＧＡＣＴＡＡＧＣＡＡＴＧ−３’（配列番号２５）
ＡＰ−１（−２１９５）変異体オリゴ
順方向５’−ＣＡＴＴＧＣＴＴｇＧｇＣＡＣＣＣＣＣＴＴ−３’（配列番号２６）
逆方向５’−ＡＡＧＧＧＧＧＴＧｃＣｃＡＡＧＣＡＡＴＧ−３’（配列番号２７）
ＳＴＡＴ３（−１８４１）野生型オリゴ
順方向５’−ＧＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号２８）
逆方向５’−ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＡＣＣ−３’（配列番号２９）
ＳＴＡＴ３（−１８４１）変異体オリゴ
順方向５’−ＧＧＴＣＣＡＣａＴａＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号３０）
逆方向５’−ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡｔＡｔＧＴＧＧＡＣＣ−３’（配列番号３１）
【０１１７】
核抽出物を以下のように調製する：１５０ｍＭ皿で、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾンを補充したＤＭＥＭ高グルコース培地中ＨＡＣ、ＨｅＬａまたはＳＷ１３５３細胞をコンフルエントまで成長させる。細胞は１時間、血清枯渇にし、ＩＬ−１（２ｎｇ／ｍｌ）のみ、ＯＳＭ（４０ｎｇ／ｍｌ）のみ、ＩＬ−１およびＯＳＭで誘導し、ならびに／または３時間、未処理のままにする。１０％グリセロール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７.９）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０.２％  ＮＰ４０、０.１ｍＭバナジウム酸ナトリウム、２０ｍＭフッ化ナトリウムおよびプロテアーゼカクテル（Sigma, St. Louis, MO）を含有する低張バッファーに細胞を再懸濁し、そして氷上で１０分間インキュベートする。エッペンドルフ遠心で１３０００ｒｐｍでの遠心により核分画をペレットとして回収する。２０％グリセロール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７.９）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、４２０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含有する高張バッファーにペレットを再懸濁し、そして氷上で３０分間インキュベートし、そしてもう一度遠心する。上澄を核抽出物として収集する。
【０１１８】
電気泳動移動度シフトアッセイ
以下のようにＥＭＳＡを実施する：アニーリングに適切な一重鎖オリゴ対によりＮＦ−ｋＢ、ＳＴＡＴ３およびＡＰ−１二重鎖オリゴを作成する。アニーリングバッファー（１ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５）中６５℃で５分間加熱し、続いてゆっくりと室温まで冷却することによりオリゴを変性する。ゲルシフトアッセイシステムキット（Promega, Madison, WI）で提供される手順および試薬を用いて[γ−３２Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて二重鎖オリゴをリン酸化する。Sephadex G-25スピンカラム（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて遊離のヌクレオチドを除去する。
【０１１９】
ＮＦ−ｋＢおよびＳＴＡＴ３  ＥＭＳＡ
核抽出物５−８μｇを各反応において用いる。核抽出物を結合バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.９、４０ｍＭ  ＫＣｌ、１.０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０.５ｍＭ  ＤＴＴおよび４％  Ficoll）中４℃で５分間、冷競合物質と共にプレインキュベートする。ポリ（ｄＩ−ｄＣ）１μｇの存在下、３２Ｐ標識プローブ（２×１０４ｃｐｍ）１μｌの添加により反応を開始させる。反応物を室温で３０分間インキュベートする。試料を４％ポリアクリルアミド、０.２５×ＴＢＥゲル上、１２０ボルトで電気泳動する。ゲルを乾燥させ、そしてKodak  Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ  Ｘ線フィルムを用いて−７０℃でオートラジオグラフィーに供する。抗体スーパーシフトアッセイのために、ＮＦｋＢ−ｐ５０  ２μｇおよびＳＴＡＴ１、３または５抗体（Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA）２μｇを核抽出物５−８μｇと共に氷上で１０分間プレインキュベートし、その後放射線標識オリゴヌクレオチドプローブを添加する。前記で記載したようにＰＡＧＥにより生成物を分析する。
【０１２０】
ＡＰ−１  ＥＭＳＡ
Promegaゲルシフトアッセイシステムキットで提供される標準結合バッファー（１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.５ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ  ポリ（ｄＩ−ｄＣ）および４％グリセロール）を用いる以外はＮＦ−ｋＢに関して前記で記載したようにアッセイを実施する。
【０１２１】
ＡＰ−１複合体のＦｏｓおよびＪｕｎ成分を同定するために抗体スーパーシフトを実施する。核抽出物約２μｇをｃ−Ｊｕｎ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ  １、２およびＣｒｅｂ  １，２／ＡＴＦ−１、２、３に対する抗体（Santa Cruz Biotech）２μｇと共に室温で３０分間プレインキュベートし、その後放射線標識オリゴヌクレオチドプローブを添加する。前記で記載したようにポリアクリルアミドゲル電気泳動により生成物を分析する。
【０１２２】
実施例５
部位特異的変異誘発
Quick Change Site Directed Mutagenesis 部位特異的変異誘発キット（Stratagene, La Jolla, CA）を用いて製造者の指示どおりに２.４ｋｂ構築物のＡＰ−１（−２１９５）、ＳＴＡＴ３（−１８４１）およびＮＦ−ｋＢ（−１８００）部位の単一および二重変異を作成する。ＰＣＲでは以下のプライマーを用いる：
順方向ＡＰ−１  ５’−ＣＴＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＴｇＧｇＣＡＣＣＣＣＣＴＴＴＧＴＣＣＴＣ−３’（配列番号３２）
逆方向ＡＰ−１  ５’−ＧＡＧＧＡＣＡＡＡＧＧＧＧＧＴＧｃＣｃＡＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＡＡＧ−３’（配列番号３３）
順方向ＳＴＡＴ３  ５’−ＣＡＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＴＣＣＡＣａＴａＴＧＧＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＧＡＣ−３’（配列番号３４）
逆方向ＳＴＡＴ３  ５’−ＧＴＣＴＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡｔＡｔＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＣＣＴｃＴＴＧ−３’（配列番号３５）
順方向ＮＦ−ｋＢ  ５’−ＣＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧａＧＡＴＴＴＣＣＴＧＧＧＧＡＡＡＣ−３’（配列番号３６）
逆方向ＮＦ−ｋＢ  ５’−ＧＴＴＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＡＴＣｔＣＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＧ−３’（配列番号３７）
【０１２３】
ＤＮＡシークエンシングにより部位特異的変異を確認する。２.４ｋｂインサートをＸｈｏ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩにより切断し、そしてＸｈｏ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化したｐＧＬ３ベーシックルシフェラーゼベクターに再クローン化する。
【０１２４】
実施例６
Ａｇｇ−１プロモーター構築物の細胞系へのトランスフェクション
リポフェクトアミン２０００試薬（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用い、供給者により記載された手順にしたがってＳＷ１３５３（ヒト軟骨肉腫細胞）、ＨｅＬａ、ＨＥＫ  ２９３およびＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を一過性にトランスフェクトする。簡単には、細胞を６ウェルプレート中２×１０５／ウェルで播種し、そして１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびファンギゾン（Invitrogen）を補充したＤＭＥＭ高グルコース培地３ｍｌ中で一晩成長させる。ＳＶ４０形質転換軟骨細胞、Ｃ２８Ａ２（Koshy et al. （2002）,supra参照）細胞をMBS Mammalian Transfection キット（Stratagene, La Jolla, CA）を用いるＣａＰＯ４法によりその使用説明書に記載される手順にしたがってトランスフェクトする。全部でプラスミドＤＮＡ４μｇ／ウェル（レポータープラスミド３.５μｇおよびＣＭＶ  β−Ｇａｌ  ０.５μｇ）をトランスフェクションに用いる。トランスフェクションの５時間後に細胞を新鮮培地に交換し、そしてトランスフェクトされたレポーターの発現のための約４０時間インキュベートする。
【０１２５】
トランスフェクトされた細胞のＩＬ−１およびＯＳＭ処理
トランスフェクションの４０時間後、細胞を１−２時間血清枯渇にし、そして２ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−１（Peprotech, Rockyhill, NJ）および４０ｎｇ／ｍｌ  ＯＳＭ（R&D systems, Minneapolis, MN））で４時間誘導する。
【０１２６】
実施例７
ルシフェラーゼアッセイ
細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そしてGlow lysisバッファー（Promega, Madison, WI）４００μｌを細胞に加える。バッファー中へ再懸濁を繰り返すことにより細胞を溶解し、そしてエッペンドルフチューブに移す。細胞溶解物１００μｌを９６ウェルプレート（Falcon、白色不透明の底部）に加え、続いてBright Glow Luciferaseアッセイ（Promega, Madison, WI）１００μｌを加える。ＭＬＸマイクロタイタープレートルミノメーター（Dynex Technologies, Chantilly, VA）でプレートを読む。
【０１２７】
実施例８
βガラクトシダーゼアッセイ
細胞溶解物５０μｌを９６ウェルプレート（Costar、透明の底部、黒色）にピペッティングし、そして２×β−Ｇａｌアッセイバッファー（Promega, Madison, WI）５０μｌを加え、そして全てのウェルが黄色になるまで３７℃でインキュベートする。１Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５  １５０μｌを加えて反応を停止させる。プレートリーダー（Molecular Devices, Sunny Valley, CA）で試料の吸光度を４２０ｎｍで測定する。
【０１２８】
サイトカインによる誘導性はＳＷ１３５３およびＨｅＬａ細胞で最も有効である。ＰＤＧＦのような成長因子はこれらの細胞においてプロモーターの弱いインデューサーである。
【０１２９】
欠失変種の分析により、−０.４ｋｂと−０.８ｋｂとの間の領域は最小プロモーター活性に重要であり、そして−１.２ｋｂと−２.４ｋｂとの間のセグメントはＩＬ−１およびＯＳＭによる誘導性に重要であることが示唆される。部位特異的変異分析により、ＳＴＡＴ３（−１８４１）およびＮＦｋＢ（−１７９９）部位はＩＬ−１およびＯＳＭによる誘導性の中心であるが、ＡＰ−１（−２１９５）部位の変異はＩＬ−１およびＯＳＭに対する応答性を変化しなかったことを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】図１はヒトＡｇｇ−１プロモーター遺伝子の５’フランキング領域を示す。転写因子ＮＦｋＢ、ＡＰ−１、ＳＴＡＴ３、ＮＦ１およびｃ−ｋｒｏｘの配列には下線を付して示す。ＣＡＡＴおよびＴＡＴＡＡボックスには下線を付して示す。
【図１−１】
2007516700.tif 000006
【図１−２】
2007516700.tif 000007
【図１−３】
2007516700.tif 000008
【図１−４】
2007516700.tif 000009
【図１−５】
2007516700.tif 000010
【図１−６】
2007516700.tif 000011
【配列表】
2007516700000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月6日(2006.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007516700000001.app
【国際調査報告】
2007516700.tif 000019
2007516700.tif 000020
2007516700.tif 000021
2007516700.tif 000022
2007516700.tif 000023
2007516700.tif 000024
2007516700.tif 000025