(57)【要約】  本発明は、プロテアーゼ活性について、および脂肪症を含む肝障害についてのモデルとして有用である非トランスジェニック、非ヒト動物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト哺乳動物であって、その肝臓が
Ａ）プロモーター；
Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ、および
Ｃ）レポーターをコードするＤＮＡを含む遺伝子系を含み、Ａ、Ｂ、およびＣが作動可能に連結されており、レポーター活性の存在によりプロテアーゼ活性が示される、哺乳動物。
【請求項２】
前記レポーターが、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１に記載の哺乳動物。
【請求項３】
前記レポーターが分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項２に記載の哺乳動物。
【請求項４】
前記レポーターが、前記哺乳動物の血液、組織、または血清の中で検出可能である、請求項１〜３のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項５】
非ヒト哺乳動物であって、その肝臓が、作動可能に連結されたプロモーターと、その発現が肝障害を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む遺伝子系を含む、哺乳動物。
【請求項６】
前記タンパク質が、プロテアーゼ、キナーゼ、またはエステラーゼである、請求項５に記載の哺乳動物。
【請求項７】
前記プロテアーゼがウイルスプロテアーゼである、請求項１〜４または６のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項８】
前記プロテアーゼがＣ型肝炎プロテアーゼである、請求項７に記載の哺乳動物。
【請求項９】
前記プロテアーゼがＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼである、請求項８に記載の哺乳動物。
【請求項１０】
前記プロテアーゼＤＮＡが野生型ＤＮＡである、請求項９に記載の哺乳動物。
【請求項１１】
前記プロテアーゼＤＮＡが変異型ＤＮＡである、請求項９に記載の哺乳動物。
【請求項１２】
前記遺伝子系が、ウイルスベクター、前記肝臓への直接的注射、静脈内注射、または非ウイルス遺伝子移入を使用することによって前記肝臓に送達される、請求項１〜１１のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項１３】
前記遺伝子系が、アデノウイルスベクターを使用することによって前記肝臓に送達される、請求項１２に記載の哺乳動物。
【請求項１４】
前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、またはアルブミンプロモーターである、請求項１〜１３のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項１５】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１４に記載の哺乳動物。
【請求項１６】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、またはチンパンジーである、請求項１〜１５のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項１７】
前記遺伝子系を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の非ヒト哺乳動物から得られた細胞。
【請求項１８】
Ａ）プロモーター；Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ、およびＣ）レポーターをコードするＤＮＡを含み、Ａ、Ｂ、およびＣが作動可能に連結されており、レポーター活性の存在によりプロテアーゼ活性が示される遺伝子系を含む、肝細胞または肝細胞株。
【請求項１９】
プロモーターと、その発現が肝細胞損傷を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む肝細胞または肝細胞株。
【請求項２０】
Ａ）プロモーター；Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ、およびＣ）レポーターをコードするＤＮＡを含み、Ａ、Ｂ、およびＣが作動可能に連結されている、ウイルスベクター。
【請求項２１】
作動可能に連結されたプロモーターと、その発現が肝障害を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含むウイルスベクター。
【請求項２２】
プロテアーゼ活性についての哺乳動物モデルを作製するためのプロセスであって、
哺乳動物を供するステップと；
Ａ）プロモーター；Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ、およびＣ）レポーターをコードするＤＮＡを含み、Ａ、Ｂ、およびＣが作動可能に連結されており、レポーター活性の存在によりプロテアーゼ活性が示される遺伝子系を前記哺乳動物に送達するステップと
を含みプロセス。
【請求項２３】
前記レポーターが、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項２２に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記レポーターが分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項２３に記載のプロセス。
【請求項２５】
前記レポーターが、哺乳動物の血液、組織、または血清の中で検出可能である、請求項２２〜２４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２６】
肝障害についての哺乳動物モデルを作製するためのプロセスであって、
ａ）哺乳動物を供するステップと；
ｂ）プロモーターと、その発現が肝細胞の損傷を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む遺伝子系を前記哺乳動物に送達するステップと
を含むプロセス。
【請求項２７】
前記タンパク質が、プロテアーゼ、キナーゼ、またはエステラーゼである、請求項２６に記載のプロセス。
【請求項２８】
前記プロテアーゼがウイルスプロテアーゼである、請求項２２〜２５または２７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項２９】
前記プロテアーゼがＣ型肝炎プロテアーゼである、請求項２８に記載のプロセス。
【請求項３０】
前記プロテアーゼがＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼである、請求項２９に記載のプロセス。
【請求項３１】
前記プロテアーゼＤＮＡが野生型ＤＮＡである、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３２】
前記プロテアーゼＤＮＡが変異型ＤＮＡである、請求項３０に記載のプロセス。
【請求項３３】
前記遺伝子系が、ウイルスベクター、前記肝臓への直接的注射、静脈内注射、または非ウイルス遺伝子移入を使用することによって前記肝臓に送達される、請求項２２〜３２のいずれかに記載のプロセス。
【請求項３４】
前記遺伝子系が、アデノウイルスベクターを使用することによって前記肝臓に送達される、請求項３３に記載のプロセス。
【請求項３５】
前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、またはアルブミンプロモーターである、請求項２２〜３４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項３６】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項３５に記載のプロセス。
【請求項３７】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、またはチンパンジーである、請求項２２〜３６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項３８】
非トランスジェニック、非ヒト哺乳動物であって、前記哺乳動物の肝臓細胞が、
Ａ）プロモーター
Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ；および
Ｃ）レポーターをコードするＤＮＡ
を含み、Ａ、Ｂ、およびＣが作動可能に連結されており、レポーター活性の存在により前記構築物の発現が検出され、かつプロテアーゼ活性が示される発現構築物
を含む、哺乳動物。
【請求項３９】
前記レポーターが、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項３８に記載の哺乳動物。
【請求項４０】
前記レポーターが分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項３９に記載の哺乳動物。
【請求項４１】
前記レポーターが、前記哺乳動物の血液、組織、または血清の中で検出可能である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項４２】
その肝臓が、作動可能に連結されたプロモーターと、その発現が肝障害を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む発現構築物を含む、非ヒト哺乳動物。
【請求項４３】
前記タンパク質が、プロテアーゼ、キナーゼ、またはエステラーゼである、請求項４２に記載の哺乳動物。
【請求項４４】
前記プロテアーゼがウイルスプロテアーゼである、請求項３８〜４１または４３のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項４５】
前記プロテアーゼがＣ型肝炎プロテアーゼである、請求項４３に記載の哺乳動物。
【請求項４６】
前記プロテアーゼがＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼである、請求項４５に記載の哺乳動物。
【請求項４７】
前記プロテアーゼＤＮＡが野生型ＤＮＡである、請求項４６に記載の哺乳動物。
【請求項４８】
前記プロテアーゼＤＮＡが変異型ＤＮＡである、請求項４６に記載の哺乳動物。
【請求項４９】
前記発現構築物が、ウイルスベクター、前記肝臓への直接的注射、静脈内注射、または非ウイルス遺伝子移入を使用することによって前記肝臓に送達される、請求項３８〜４８のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項５０】
前記発現構築物が、アデノウイルスベクターを使用することによって前記肝臓に送達される、請求項４９に記載の哺乳動物。
【請求項５１】
前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、またはアルブミンプロモーターである、請求項３８〜５０のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項５２】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項５１に記載の哺乳動物。
【請求項５３】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、またはチンパンジーである、請求項３８〜５４のいずれかに記載の哺乳動物。
【請求項５４】
前記発現構築物からの前記レポーター遺伝子を発現する、請求項３８〜５３のいずれかに記載の非ヒト動物から得られた細胞。
【請求項５５】
Ａ）プロモーター；Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ、およびＣ）レポーターをコードするＤＮＡを含み、Ａ、Ｂ、およびＣが作動可能に連結されている発現構築物で形質転換またはトランスフェクトされており、レポーター活性を示す肝細胞または肝細胞株。
【請求項５６】
プロテアーゼ活性についての非トランスジェニック、非ヒト哺乳動物モデルを作製する方法であって、Ａ）プロモーター；Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ；およびＣ）レポーターをコードするＤＮＡを含み、Ａ、Ｂ、およびＣは作動可能に連結されており、レポーター活性の存在により前記哺乳動物における前記プロテアーゼの発現が示される、発現構築物を含む組成物を、前記哺乳動物の細胞中で前記プロテアーゼを発現させるのに有効な量で、非ヒト哺乳動物に投与するステップを含む、方法。
【請求項５７】
前記レポーターが、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、または西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項５６に記載のプロセス。
【請求項５８】
前記レポーターが分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）である、請求項５７に記載のプロセス。
【請求項５９】
前記レポーターが、前記哺乳動物の血液、組織、または血清の中で検出可能である、請求項５６〜５８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６０】
肝障害のための非トランスジェニック、非ヒト哺乳動物モデルを作製するプロセスであって、プロモーターと、その発現が肝細胞の損傷を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む発現構築物を含む組成物を非ヒト哺乳動物に投与するステップを含む、プロセス。
【請求項６１】
前記タンパク質が、プロテアーゼ、キナーゼ、またはエステラーゼである、請求項６０に記載のプロセス。
【請求項６２】
前記プロテアーゼがウイルスプロテアーゼである、請求項５６〜５９または６１のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６３】
前記プロテアーゼがＣ型肝炎プロテアーゼである、請求項６２に記載のプロセス。
【請求項６４】
前記プロテアーゼがＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼである、請求項６３に記載のプロセス。
【請求項６５】
前記プロテアーゼＤＮＡが野生型ＤＮＡである、請求項６４に記載のプロセス。
【請求項６６】
前記プロテアーゼＤＮＡが変異型ＤＮＡである、請求項６４に記載のプロセス。
【請求項６７】
前記発現構築物が、ウイルスベクター、前記肝臓への直接的注射、静脈内注射、または非ウイルス遺伝子移入を使用することによって前記肝臓に送達される、請求項５６〜６６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項６８】
前記発現構築物が、アデノウイルスベクターを使用することによって前記肝臓に送達される、請求項６７に記載のプロセス。
【請求項６９】
前記プロモーターが、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、またはアルブミンプロモーターである、請求項５６〜６６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７０】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項６９に記載のプロセス。
【請求項７１】
前記、哺乳動物がマウス、ラット、またはチンパンジーである、請求項５６〜７０のいずれかに記載のプロセス。
【請求項７２】
プロテアーゼ活性を増強または阻害する薬剤を試験する方法であって、
ａ）請求項１〜４、６〜１６、３８〜４１、または４３〜５３のいずれかに記載の哺乳動物を供するステップと；
ｂ）前記哺乳動物に前記薬剤を投与するステップと；
ｃ）前記レポーターの発現に対する前記薬剤の効果を評価するステップと
を含む、方法。
【請求項７３】
肝障害を増強または阻害する薬剤を評価する方法であって、
ａ）請求項５〜１６または４２〜５３のいずれかに記載の哺乳動物を供するステップと；
ｂ）前記哺乳動物に前記薬剤を投与するステップと；
ｃ）肝障害に対する前記薬剤の効果を評価するステップと
を含む、方法。
【請求項７４】
脂肪症を調節する化合物を同定する方法であって、
ａ）請求項５〜１６または４２〜５３のいずれかに記載の哺乳動物を供するステップと；
ｂ）前記哺乳動物に化合物を投与するステップと；
ｃ）前記哺乳動物における脂肪症に対する前記化合物の効果を評価するステップと
を含む、方法。
【請求項７５】
ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪症、またはライ症候群を治療するための化合物を同定する方法であって、
ａ）請求項５〜１６または４２〜５３のいずれかに記載の哺乳動物を供するステップと；
ｂ）前記哺乳動物に化合物を投与するステップと；
ｃ）ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪症、またはライ症候群の効果を治療または改善する化合物を選択するステップと
を含む、方法。
【請求項７６】
哺乳動物における脂肪症または脂肪肝を治療する方法であって、前記哺乳動物にＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼインヒビターを投与するステップを含む、方法。
【請求項７７】
哺乳動物における肝保護のための方法であって、前記哺乳動物にＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼインヒビターを投与するステップを含む、方法。
【請求項７８】
哺乳動物におけるＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪症、またはライ症候群を治療する方法であって、前記哺乳動物にＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼインヒビターを投与するステップを含む、方法。
【請求項７９】
プロテアーゼインヒビターがＶＸ−９５０である、請求項７５〜７７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼ活性について、および脂肪症を含む肝障害についてのモデルとして有用である非トランスジェニック、非ヒト動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（「ＨＣＶ(Hepatitis C virus)」）の感染は、抵抗し難いヒトの医学的問題である。ＨＣＶは、非Ａ、非Ｂ肝炎の多くの場合の原因因子として認識されており、全体でヒト血清有病率が３％であると推定される[A.Alberti et al.,「Natural History of Hepatitis C,」J.Hepatology,31.,(補遺1),pp.17-24(1999)]。米国のみでも、ほぼ四百万人の個体が感染している可能性がある[M.J.Alter et al.,「The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States,Gastroenterol.Clin.North Am.,23,pp.437-455(1994);M.J.Alter「Hepatitis C Virus Infection in the United States,「J.Hepatology,31.,(補遺1),pp.88-91(1999)」。
【０００３】
ＨＣＶへの最初の曝露に際して、感染した個体の約２０％のみが臨床的肝炎を発症するのに対して、その他は自発的に感染を無効にするようである。しかし、約７０％の例において、ウイルスは、何十年もの間持続する慢性的感染を確立する[S.Iwarson,「The Natural Course of Chronic Hepatitis,」FEMS Microbiology Reviews,14,pp.201-204(1994);D.Lavanchy,「Global Surveillance and Control of Hepatitis C,」J.Viral Hepatitis,6,pp.35-47(1999)]。これは、通常、再発性かつ進行的に悪化する肝臓炎症を生じ、この肝臓炎症は、しばしば肝硬変および肝細胞癌などのより重篤な疾患状態をもたらす[M.C.Kew,「Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma」,FEMS Microbiology Reviews,14,pp.211-220(1994);I.Saito et al.,「Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma,」Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,pp.6547-6549(1990)]。
【０００４】
ＨＣＶはフラビウイルス科ファミリーに属するＲＮＡウイルスである。このウイルスは、血液由来の病原体として分類され、血液由来の生成物との接触を主として通して伝染される。ＨＣＶは、感染したヒトにおいて慢性肝炎、線維症、および肝細胞癌を引き起こす。そのウイルスゲノムは、９．６Ｋｂの長さでありかつ３つの構造タンパク質および７つの非構造タンパク質をコードする＋鎖ＲＮＡからなる。構造タンパク質であるコア、エンベロープ１、およびエンベロープ２は、ウイルスアセンブリーおよびパッキングのために必要とされる。
【０００５】
ＮＳ２−５から多岐にわたる非構造タンパク質(non structural protein)は、ウイルス複製およびポリタンパク質プロセシングのために必要である種々の機能を実行する。
【０００６】
ＮＳタンパク質は、３０１０〜３０３３アミノ酸ポリタンパク質のタンパク質分解性切断に由来する[R.Bartenschlager et al.,「Nonstructural Protein 3 of the Hepatitis C Virus Encodes a Serine-Type Proteinase Required for Cleavage at the NS3/4 and NS4/5 Junctions」J.Virol.,67,pp.3835-3844(1993);A.Grakoui et al.,「Characterization of the Hepatitis C Virus-Encoded Serine Proteinase:Determination of Proteinase-Dependent Polyprotein Cleavage Sites」J.Virol.,67,pp.2832-2843(1993);A.Grakoui et al.,「Expression and Identification of Hepatitis C Virus Polyprotein Cleavage Products」J.Virol.,67,pp.1385-1395(1993);L.Tomei et al.,「NS3 is a serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein」,J.Virol.,67,pp.4017-4026(1993)]。
【０００７】
ＨＣＶ  ＮＳタンパク質３（ＮＳ３）は、ウイルス酵素の大部分をプロセスすることを補助するセリンプロテアーゼ活性を含み、従って、ウイルス複製および感染性のために必須であると考えられている。ＮＳ３の最初の１８１アミノ酸（ウイルスポリタンパク質の残基１０２７〜１２０７）は、ＨＣＶポリタンパク質の４つ全ての下流の部位をプロセスするＮＳ３のセリンプロテアーゼドメインを含むことが示されてきた[C.Lin et al.,「Hepatitis C Virus NS3 Serine Proteinase:Trans-Cleavage Requirements and Processing Kinetics」J.Virol.,68,pp.8147-8157(1994)]。
【０００８】
ＨＣＶ  ＮＳ３セリンプロテアーゼおよびその結合したコファクター、ＮＳ４Ａは、全てのウイルス酵素をプロセスすることを補助し、従って、ウイルス複製のために必須であると考えられる。
【０００９】
満足のゆくいかなる抗ＨＣＶ剤または抗ＨＣＶ治療も現在存在しない。ＨＣＶ疾患のための唯一の確立した治療は、ペグ化インターフェロンおよびリバビリン治療である。しかし、インターフェロンは顕著な副作用を有し[M.A.Wlaker et al.,「Hepatitis C Virus:An Overview of Current Approaches and Progress」DDT,4,pp.518-29(1999);D.Moradpour et al.,「Current and Evolving Therapies for Hepatitis C,「Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.,11,pp.1199-1202(1999);H.L.A.Janssen et al.,「Suicide Associated with Alfa-Interferon Therapy for Chronic Viral Hepatitis」J.Hepatol.,21,pp.241-243(1994);P.F.Renault et al.,「Side Effects of Alpha Interferon」Seminars in Liver Disease,9,pp.273-277(1989)」、かつ症例の一部(〜25%)のみにおいて長期的な寛解を誘導する[O.Weiland「Interferon Therapy in Chronic Hepatitis C Virus Infection」,FEMS Microbiol.Rev.,14,pp.279-288(1994)]。さらに、有効な抗ＨＣＶワクチンの見通しは不確かなままである。
【００１０】
ＨＣＶプロテアーゼインヒビターを開発する進歩は、堅固(robust)かつ再現可能な動物モデルの欠如によって妨害されている。多くの動物はＨＣＶ感染に対して感受性ではない。
【００１１】
チンパンジーは、ＨＣＶについて最も理解されている動物モデルである(Bassett et al.,J Virol.Feb;73(2):1118-26 1999;Bassett et al.,Hepatology.29(6):1884-92,1999 Brasky et al.,1998;Bassett et al.,J Virol.72(4):2589-99,1998;Bukh、Hepatology,39(6):1469-75,2004;Bukh,Apgar et al.,J Infect Dis.178(4):1193-7 1998;Kolykhalov,Mihalik et al.,J Virol.2000 Feb;74(4):2046-51,2000;Bukh、Forns et al.,Intervirology,44(2-3):132-42,2001)。しかし、倫理的な問題ならびにチンパンジーにおける試験薬物に関連するコストおよび利用可能性の問題が存在する。さらに、チンパンジーのＨＣＶ感染はより穏やかな経過をたどり(Walker,Springer Semin Immunopathol.19(1):85-98 1997)、疾患のスペクトルはヒトＨＣＶ感染とは異なる。ヒトにおける７０％のＨＣＶ感染が慢性感染となり、感染した患者の３０％がウイルスをクリアする。対照的に、６５〜８０％の感染したチンパンジーがウイルスをクリアし、２５〜３０％の感染が急性肝炎を生じる。さらに、チンパンジーにおけるＨＣＶ感染の疾患の経過はヒトよりも穏やかであり、チンパンジーはＨＣＶ感染の結果として肝硬変を発症しない。チンパンジーをＨＣＶに感染させるコストは動物あたり約６０，０００ドルである。
【００１２】
下等霊長類(Bukh,Apgar et al.,J Viral Hepat.,8(3):228-31 2001;Korzaya,Lapin et al.,Bull Exp Biol Med.,133(2):178-81,2002)またはヒヒ(Sithebe,Kew et al.,J Med Virol.,66(4):468-71 2002)などの他の非ヒト霊長類モデルをＨＣＶで感染させる試みは、入り交じった結果を経験してきた。タマリンのＧＢウイルス感染などの代わりの動物モデル(Garson,Whitby et al.,J Med Virol.52(3):286-8.1997);(Bukh,Apgar et al.,Virology.30;262(2):470-8 1999;Beames,Chavez et al.,J Virol.,74(24):11764-72 2000;Beames,Chavez et al.,ILAR J.,42(2):152-60,2001;Sbardellati,Scarselli et al.,2001;Lanford,Chavez et al.,Virology.,311(1):72-80 2003;Martin,Bodolaet al.,Proc Natl Acad Sci U S A.,100(17):9962-7 2003)は、変動する成功を経験してきた。
【００１３】
ＨＣＶ誘導性の肝臓病原性および肝細胞癌（ＨＣＣ）を研究するためにＨＣＶの一部を有するトランスジェニックマウスが報告されてきた(Koike,Moriya et al.,J Gen Virol.,76(Pt 12):3031-8,1995;Kawamura,Furusaka et al.,1997;Moriya,Yotsuyanagi et al.,J Gen Virol.,78(Pt 7):1527-31,1997;Pasquinelli,Shoenberger et al.,Hepatology.,25(3):719-27 1997;A.Honda et al.,J.Med.Virol.,59,pp.281-289(1999);Koike Nippon Rinsho.,59(7):1265-70 2001;He,Cheng et al.,World J Gastroenterol.9(3):474-8 2003)。これらのトランスジェニックモデルは、ウイルス生活環を適切にモデリングしていないことを含むいくつかの欠点に苦しんでいる(V.Brass et al.,Hepatology Elsewhere,H.Jaeschke et al.,ed.,Hepatology,35,pp.722-724(2002))。キメラヒト肝臓を有するマウスもまた、文献に報告されてきた。ＨＣＶ感染したヒトＰＢＭＣを移植されたＳＣＩＤマウスは、接種後８週間のＨＣＶの持続を実証することが報告されたが、８例のマウスの内の２例のみが複製可能な（−鎖）型のＨＣＶの存在（ウイルスの複製を示す）を示した(Bronowicki,Loriot et al.,Hepatology.28(1):211-8,1998)。腫瘍を有するＨＣＶを移植されたヌードマウスは、わずかなＨＣＶ複製を生じた(Labonte,Morin et al.,J Med Virol.66(3):312-9,2002)。腎臓被膜(kidney capsule)において腫瘍を有するＨＣＶの移植を伴う三量体マウスモデル(Galun,Burakova et al.,J Infect Dis,172(1):25-30,1995;Ilan,Arazi et al.,J Infect Dis.185(2):153-61 2002;DaganおよびEren,Curr Opin Mol Ther.,5(2):148-55,2003)およびＳＣＩＤ−ｕＰＡマウスにおけるＨＣＶ感染したヒト肝細胞の首尾よい再増殖(D.F.Mercer et al.,Nature Medicine,7,pp.927-933(2001))もまた実証されてきた。しかし、このモデルは、技術的に要求が厳しく、かつこれは肝細胞の変動する再増殖に依存するため、このモデルに関連する多数の変動性が存在する。
【００１４】
小動物（例えば、マウス）モデルは化合物を節約して使用し、かつ科学者が、抗ウイルス化合物の吸収、分布、代謝、および毒性に依存する化合物の薬物動態学的（ＰＫ）効果を研究すること；および化合物の薬力学的（ＰＤ）効果、すなわち、その化合物のインビボでの効力を研究することを可能にする。ＨＣＶについての現在利用可能であるマウスモデル、例えば、ヒト肝臓再増殖モデルは高度に変動性でありかつ堅固ではないで、これらは抗ウイルス薬物スクリーニングのために適切ではない。
【００１５】
さらに、肝臓損傷がＨＣＶ感染によって直接的に引き起こされるか否かは明らかではない(N.Fausto,Nature Medicine,7,pp.890-891(2001)。ＨＣＶ関連の肝臓損傷についてのモデルは感染プロセスに洞察を与え、肝臓損傷に対して保護するための薬剤のスクリーニングを可能にする。
【００１６】
脂肪症は、肝臓または身体の他の部分における脂肪の蓄積である。脂肪症は、ＨＣＶ感染を有する患者において観察されてきた。しかし、他の疾患が徴候として脂肪症を有する。A.Lonardo et al.,「Steatosis and Hepatitis C Virus:Mechanism and Significance for Hepatic and Extrahepatic Disease」Gastroenterology,126,pp.586-597(2004);M.Romero-Gomez et al.,「Serum Leptin Levels Correlate with Hepatic Steatosis in Chronic Hepatitis C」98,pp.1135-1141(2003);V.Ratziu et al.,「Fat,Diabetes,and Liver Injury in Chronic Hepatitis C」6,pp.22-29(2004);F.Ramalho「Hepatitis C Virus Infection and Liver Steatosis」60 pp.125-127(2003)を参照のこと。これらの疾患、例えば、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、非常に広範囲に及んでいる。これらの疾患のための治療の研究は、適切な脂肪症モデルの欠如によって妨害されている。
【００１７】
従って、より堅固であり、技術的に要求性が少なく（およびしたがって再現性があり）、高価でない、抗ウイルス薬物スクリーニングのため、および肝障害モデルとしての使用のために適切である小動物モデルに対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１８】
本発明は、プロテアーゼ活性についての動物モデルに関する。特に、本発明は、その肝臓においてプロテアーゼ−ＳＥＡＰレポーター構築物を有する動物を提供する。
【００１９】
本発明はまた、肝障害についての動物モデルに関する。このモデルは、肝障害を引き起こす、その肝臓に導入された、タンパク質をコードする発現構築物を有する動物を含む。
【００２０】
本発明はまた、脂肪症および関連する障害についての動物モデルに関する。このモデルは、その肝臓において脂肪症を引き起こす、発現されるタンパク質をコードする発現構築物を有する動物を含む。
【００２１】
本発明はまた、これらの動物に由来する細胞ならびに本明細書に記載される遺伝子系／発現構築物を含む細胞、ベクター、および細胞株に関する。
【００２２】
本発明によって提供される動物モデルは、堅固で、再現性があり、かつ小動物のために適切である。これらのモデルは、例えば、薬物発見ならびにプロテアーゼ活性および肝障害をインビボでモデリングすることにおいて特に有用である。
【００２３】
本発明はまた、動物モデルを調製するためのプロセス、およびこれらのモデルを使用するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明の１つの実施形態によると、その肝臓が、プロテアーゼを発現するＤＮＡに作動可能に連結されているプロモーターを含む構築物により、外因性タンパク質を発現するよう標的化された動物であって、前記プロテアーゼが、当該プロテアーゼによって切断可能である配列に連結されており、前記配列がレポーターに連結されている動物が提供される。レポーターは、プロテアーゼによる切断後、動物の中の任意の場所、例えば、動物の血液、血清、または組織に存在してもよい。１つの実施形態において、レポーターは血清中で検出可能である。
【００２５】
任意の検出可能なレポータータンパク質が本発明において使用されてもよい。レポーターは、代表的には、例えば、化学発光または蛍光によって検出される。代表的なレポーターには、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。本発明においてまた使用されてもよいレポーターは独特なタンパク質であり、すなわち、そのネイティブな状態で動物においては存在しないもの、および検出のために使用されてもよい適切な抗体または抗体模倣物である。
【００２６】
「動物」は、本明細書で使用される場合、ヒト以外の任意の哺乳動物をいう。これは、胚、胎仔、新生仔、および成体を含む任意の齢の動物を含む。本発明における使用のための動物は、例えば、商業的な供給源から利用可能である。このような動物には、実験用動物または他の動物、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモット）、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、ガチョウ）、霊長類（例えば、チンパンジー、サル、タマリンド、アカゲザル）が含まれるがこれらに限定されない。好ましい動物には、ラット、マウス（ＳＣＩＤなど）、イヌ、サルが含まれる。より好ましい動物には、小動物、例えば、マウスまたはラットが含まれる。最も好ましくは、哺乳動物はマウスである。
【００２７】
本発明の別の実施形態によると、その肝臓が、作動可能に連結されたプロモーターとその発現が肝障害を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む系により、外因性タンパク質を発現するよう標的化された非ヒト哺乳動物が提供される。より特定には、動物は非トランスジェニック、非ヒト動物である。このような肝障害は、例えば、肝臓の形態学、組織学、および／または酵素レベルを試験することによって評価することができる。
【００２８】
本発明において実証されるように、本発明の動物モデルは、脂肪症によって特徴付けられる肝臓を有する。提供されるモデルはまた、ＨＣＶ感染の脂肪肝を例証するために使用されてもよい。
【００２９】
従って、本発明の別の実施形態によると、その肝臓が、作動可能に連結されたプロモーターとその発現が脂肪症を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む系により、外因性タンパク質を発現するよう標的化された非ヒト哺乳動物が提供される。このような肝障害は、例えば、肝臓の形態学、組織学、および／または酵素レベルを試験することによって評価することができる。
【００３０】
本発明の動物モデルにおいて得られる肝障害は脂肪症を含む。従って、本発明はまた、ＮＡＦＬＤ、非アルコール性脂肪肝（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪症、またはライ症候群などの疾患および状態についてのモデルを提供する。これらの動物モデルは、脂肪症、およびＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪症、およびライ症候群を含むがこれらに限定されない脂肪症に関連する疾患、障害、または状態を調節する化合物を同定するためのアッセイにおいて使用されてもよい。
【００３１】
酵素、構造タンパク質、哺乳動物タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、および真菌タンパク質を含むがこれらに限定されない、任意のタンパク質が本発明において利用されてもよい。好ましいタンパク質には、例えば、プロテアーゼ、キナーゼ、およびエステラーゼが含まれる。全てのネイティブ、野生型、および変異型のＤＮＡおよびタンパク質が本発明の実施形態において利用されてもよい。
【００３２】
プロテアーゼに関連する本発明の実施形態は、哺乳動物、ウイルス、真菌、および細菌のプロテアーゼを含む任意のプロテアーゼを利用してもよい。
【００３３】
当業者によって認識されるように、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、またはメタロプロテアーゼとして分類され得る。このような全てのプロテアーゼが本発明の実施形態において使用され得る。プロテアーゼの例には、カテプシン（例えば、カテプシン−Ｂ、カテプシン−Ｄ、またはカテプシン−Ｇ）、エラスターゼ、トロンビン、プラスミン、Ｃ−１エステラーゼ、Ｃ−３コンバターゼ、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子、アクロシン、β−ラクタマーゼ、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、カリクレイン、レニン、ペプシン、アンギオテンシン転換酵素、エンケファリナーゼ、シュードモナスエラスターゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、スブチリシン、ブロメライン、パパイン、サーモリシン、カスパーゼ（カスパーゼ−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、および−１０）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３４】
本発明における使用のための好ましいプロテアーゼには、レトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、およびレンチ）、ピコルナウイルス（例えば、ポリオ）、フラビウイルス（例えば、ＨＣＶおよびＢＶＤＶなどの他のペスチウイルス）、植物ウイルス（例えば、キャピロウイルス）、トガウイルス（例えば、シンドビス）、パルボウイルス、およびアデノウイルスなどのウイルス由来のものが含まれる。特に、このようなウイルスプロテアーゼには、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｅ型肝炎、Ｈ型肝炎、またはＧ型肝炎）、ＨＩＶプロテアーゼ、ピコルナウイルスプロテアーゼ、またはヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘‐帯状疱疹ウイルス、カポジ肉腫ウイルス）プロテアーゼからのプロテアーゼが含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】
本発明の１つの実施形態において、プロテアーゼはＣ型肝炎プロテアーゼである。好ましくは、Ｃ型肝炎プロテアーゼはＨＣＶ・ＮＳ３・４Ａプロテアーゼである。
【００３６】
遺伝子系（すなわち、例えば、ＨＣＶ−ＳＥＡＰ融合タンパク質をコードする発現構築物）が、ウイルスベクター、肝臓への直接的注射、静脈内注射、または非ウイルス性遺伝子移入を使用することによって肝臓に送達されてもよい。送達はまた、非感染性アデノウイルス粒子、金粒子、脂質、または任意の非ウイルス遺伝子移入への結合体化を使用して達成されてもよい。
【００３７】
本明細書に開示される１つの好ましい実施形態において、アデノウイルスが肝臓への送達のための伝達手段として使用された。ＳＣＩＤマウスにおいて、ＳＥＡＰと融合されたＨＣＶプロテアーゼを発現するアデノウイルスを感染されたＳＣＩＤマウスの血清中において、ＨＣＶプロテアーゼ依存性のＳＥＡＰ分泌が実証された。好ましい実施形態において、発現構築物は、本明細書に記載されるアデノウイルスベクターを使用することによって肝臓に送達される。
【００３８】
本発明の実施は、遺伝子系（すなわち、発現構築物）の複製、したがって、タンパク質の産生を含む。必要とされる複製をもたらす任意の技術が本発明に含まれる。代表的には、このような複製は、プロモーターによってもたらされる。本発明を実施するために有用であるプロモーターには、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０、またはアルブミンのプロモーターが含まれる。他の技術、例えば、ＩＲＥＳエレメントもまた、本発明に含まれる。
【００３９】
本発明において、アデノウイルスは、ＨＣＶによってコードされたＳＥＡＰレポーターに融合されたプロテアーゼを含む発現構築物を含み、この発現構築物は、ＨＣＶプロテアーゼ−ＳＥＡＰ融合タンパク質の発現を駆動する適切なプロモーターの制御下にある。このプロモーターは、代表的には、これが融合タンパク質の発現を可能にするために作動可能に連結されるような様式で挿入される異種プロモーターである。
【００４０】
用語「発現構築物」または「発現ベクター」は、遺伝子産物（例えば、ＨＣＶおよびＳＥＡＰの融合タンパク質）をコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物であって、一部または全ての核酸コード配列が転写可能であるものを含むことを意味する。好ましくは、転写物はタンパク質に翻訳される。特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写と遺伝子産物へのｍＲＮＡの翻訳の両方を含む。
【００４１】
遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下にある。「プロモーター」とは、細胞の合成機構、または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要であるＤＮＡ配列をいう。語句「転写制御下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するために核酸に対して正確な位置および方向にあることを意味する。
【００４２】
用語プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩについての開始部位の周りにクラスター化された転写制御モジュールの群をいうために本明細書で使用される。プロモーターは、各々が約７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、かつ転写アクチベータータンパク質またはリプレッサータンパク質についての１つ以上の認識部位を含む、別々の機能的モジュールから構成される。
【００４３】
目的の核酸配列の発現を制御するために利用される特定のプロモーターは、それが標的となる細胞中で核酸の発現を指揮可能である限りは、重要であるとは考えられない。従って、好ましい実施形態において、生細胞中で発現させることが可能であるプロモーターに隣接し、かつそのプロモーターの制御下にある核酸コード領域を配置することが好ましい。一般的に言えば、このようなプロモーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターのいずれかのプロモーターを含んでもよい。
【００４４】
種々の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、β−アクチン、ラットインスリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（これらの全ては当業者に周知であり、当業者に容易に利用可能である）が、目的のコード配列の高レベル発現を得るために使用され得る。目的のコード配列の発現を達成するための、当分野において周知である、他のウイルスもしくは哺乳動物の細胞または細菌ファージのプロモーターの使用は、発現のレベルが所与の目的のために十分であるという条件で、同様に意図される。周知の特性を有するプロモーターを利用することによって、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンが最適化され得る。誘導性プロモーター系、例えば、誘導性エクジソン系(Invitrogen,Carlsbad,CA)を本発明において使用してもよく、これは、哺乳動物細胞において目的の遺伝子の発現の調節を可能にするために設計される。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明は、プロモーター、好ましくはＣＭＶを利用する。哺乳動物細胞において、ＣＭＶ最初期プロモーターは、しばしば、強力な転写活性化を提供するために使用される。より強力でないＣＭＶプロモーターの改変バージョンもまた、より少ないレベルの導入遺伝子の発現が所望される場合に使用されてきた。造血細胞中での導入遺伝子の発現が所望される場合、ＭＬＶまたはＭＭＴＶからのＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターがしばしば使用される。所望の効果に依存して使用されてもよい他のウイルスプロモーターには、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、またはＭＬＰ領域からなどのアデノウイルスプロモーター、ＡＡＶ  ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫ、およびトリ肉腫ウイルスが含まれる。
【００４６】
同様に組織特異的プロモーターは、非標的組織に対する潜在的毒性または望ましくない効果を減少するために、特定の組織または細胞における転写をもたらすように使用されてもよい。肝臓特異的プロモーターには、例えば、ＩＧＦＢＰ−１プロモーターが含まれ、Ｃｘ３２遺伝子(Piechocki et al.,Carcinogenesis,Vol.20,No.3,401-406,March 1999)は肝臓特異的プロモーターを有することが知られており、多数の他の肝臓特異的遺伝子が当業者に公知であり、このような遺伝子からのプロモーターエレメントは、本明細書に記載される動物モデルを生成するために組織特異的発現を達成するために利用することができる。
【００４７】
本発明における使用のために意図される別の調節エレメントはエンハンサーである。これらは、同じＤＮＡの分子上で離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増加する遺伝子エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと類似して組織化されている。すなわち、これらは、多くの個々のエレメントから構成され、これらの各々は、１つ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターの間の基本的な識別は機能上のものである。全体としてのエンハンサー領域は、一定の距離をおいて転写を刺激することが可能でなくてはならない；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントでは必ずしも真である必要はない。他方、プロモーターは、特定の部位において、および特定の方向でＲＮＡ合成の直接的開始を方向付ける１つ以上のエレメントを有さなくてはならないのに対して、エンハンサーはこれらの特異性を欠く。プロモーターおよびエンハンサーは、しばしば、重複しかつ連続的であり、しばしば、非常に類似のモジュラー組織化を有するように見える。本発明において有用であるエンハンサーは当業者に周知であり、利用される特定の発現系に依存する(Scharf D et al.,Results Probl Cell Differ 20:125-62,1994;Bittner et al.,Methods in Enzymol 153:516-544,1987)。
【００４８】
ｃＤＮＡインサートが利用される場合、代表的には、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化をもたらすようにポリアデニル化シグナルを含むことが所望される。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に対して決定的であるとは考えられず、任意のこのような配列、例えば、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０のポリアデニル化シグナルが利用されてもよい。発現カセットのエレメントとしてターミネーターもまた意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強するように、およびカセットからの他の配列への読み取りを最小化するように働き得る。
【００４９】
本発明の特定の実施形態において、内部リボソームエントリー部位の使用は、複数遺伝子の、またはポリシストロン性のメッセージを作製するように意図される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルをバイパスすることが可能であり、内部部位で翻訳を開始する(PelletierおよびSonenberg、Nature,334:320-325,1988)。哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ(MacejakおよびSarnow、Nature,353:90-94,1991)と同様に、ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳脊髄炎）からのＩＲＥＳエレメントが記載されている(PelletierおよびSonenberg、1988前出)。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結され得る。複数のオープンリーディングフレームが一緒に転写され得、各々がＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロン性のメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントによって、各々のオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子が、単一のプロモーター／エンハンサーを使用して効率的に発現され、単一のメッセージを転写し得る。
【００５０】
任意の異種オープンリーディングフレームがＩＲＥＳエレメントに連結され得る。これは、非依存性遺伝子、細胞内または膜結合タンパク質、および選択マーカーによってコードされる分泌タンパク質、複数サブユニットタンパク質のために遺伝子を含む。このようにして、いくつかのタンパク質の発現は、単一の構築物および単一の選択マーカーを用いて、細胞に同時に操作され得る。
【００５１】
発現構築物を細胞に導入し得る多数の方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、発現構築物は、ウイルスまたはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。他の実施形態において、非ウイルス送達が意図される。特定のウイルスが、レセプター媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そして安定かつ効率的にウイルス遺伝子を発現する能力は、それらを、哺乳動物細胞への外来性遺伝子の移入のための魅力的な候補にする(Ridgeway:Rodriguez R L,Denhardt D T,ed. Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses.Stoneham:Butterworth,467 492,1988;Nicolas and Rubenstein:Vectors:A survey of molecular cloning vectors and their uses,Rodriguez & Denhardt(eds.),Stoneham:Butterworth,493 513,1988;Baichwal and Sugden,:Gene Transfer,Kucherlapati R,ed.,New York,Plenum Press,117 148,1986;Temin:gene Transfer,Kucherlapati(ed.),New York:Plenum Press,149 188,1986)。遺伝子ベクターとして最初に使用されたウイルスは、パポバウイルスを含むＤＮＡウイルス（シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルス、およびポリオーマ）(Ridgeway,1988前出;BaichwalおよびSugden、1986前出)およびアデノウイルス(Ridgeway,1988前出;BaichwalおよびSugden,1986前出)であった。これらは、外来性ＤＮＡ配列について比較的低い能力を有し、かつ制限された宿主スペクトルを有する。さらに、許容性細胞におけるそれらの発現性能力および細胞変性効果は安全性の懸念を生じる。これらは、外来性遺伝物質の８ｋｂまでのみに適合し得るが、種々の細胞株および実験用動物に容易に導入され得る。
【００５２】
ＤＮＡが種々のウイルスベクターを使用して細胞に導入され得ることは、現在、広く認識されている。このような実施形態において、目的の遺伝子を含むウイルスベクターを含む発現構築物は、アデノウイルス(例えば、米国特許第5,824,544号;同第5,707,618号;同第5,693,509号;同第5,670,488号;同第5,585,362を参照のこと、各々が参照により本明細書に組み込まれる)、レトロウイルス(例えば、米国特許第5,888,502号;同第5,830,725号;同第5,770,414号;同第5,686,278号;同第4,861,719号を参照のこと、各々が参照により本明細書に組み込まれる)、アデノ随伴ウイルス(例えば、米国特許第5,474,935号;同第5,139,941号;同第5,622,856号;同第5,658,776号;同第5,773,289号;同第5,789,390号;同第5,834,441号;同第5,863,541号;同第5,851,521号;同第5,252,479号を参照のこと、各々が参照により本明細書に組み込まれる)、アデノウイルス−アデノ随伴ウイルスのハイブリッド(例えば、米国特許第5,856,152号を参照のこと、これは参照により本明細書に組み込まれる)、またはワクシニアウイルスもしくはヘルペスウイルス(例えば、米国特許第5,879,934号;同第5,849,571号;同第5,830,727号;同第5,661,033号;同第5,328,688号を参照のこと、各々が参照により本明細書に組み込まれる)のベクターであり得る。
【００５３】
本発明の別の実施形態において、発現構築物は、単に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなってもよい。構築物の移入は、物理的または化学的に細胞膜を透過する、上記に言及したいずれの方法によっても実行され得る。これは、特にインビトロでの移入のために適用可能であるが、しかし、これは、インビボ使用のためにも同様に適用されてもよい。Dubensky et al.,(Proc.Nat.Acad.Sci.SA,81:7529-7533,1984;BenvenistyおよびNeshif(Proc.Nat.Acad.Sci.USA,83:9551-9555,1986)。
【００５４】
裸のＤＮＡの発現構築物を細胞に移入するための本発明の別の実施形態は、粒子射撃を含んでもよい。この方法は、ＤＮＡコートした微粒子弾丸を高速にまで加速する能力に依存し、これは、微粒子弾丸が細胞膜を貫通し、かつ殺傷することなく細胞に侵入することを可能にする(Klein et al.,Nature,327:70-73,1987)。小粒子を加速するためのいくつかの方法が開発されている。そのような１つの方法は、電流を生成するための高電圧放電に依存し、これは次には、推進力を提供する(Yang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci USA,87:9568-9572,1990)。使用する微粒子弾丸は、タングステンや金のビーズなどの生物学的に不活性な物質から構成されていた。
【００５５】
本発明の遺伝子系を含む任意の哺乳動物から得られる細胞もまた、本発明によって提供される。例えば、本発明のモデル動物は、本明細書に記載されるように生成される。その動物からの初代肝細胞は、続いて、当業者に公知の技術を使用して単離される(例えば、Culture of Animal Cells,4th Edn.,Freshney,2000,Publ.,Wiley-Liss,Inc.を参照のこと)。次いで、初代細胞は継代培養されてもよく、このように細胞株が生成されてもよい(例えば、Culture of Animal Cells,Freshney,2000の11章および12章を参照のこと)。
【００５６】
本発明はさらに、本発明の遺伝子系を含む肝細胞または肝細胞株を提供する。より詳細には、本発明は、本明細書に記載されるような発現構築物で形質転換またはトランスフェクトされた肝細胞または細胞株に指向される。特に好ましい実施形態において、この発現構築物は、ＳＥＡＰレポーターなどのレポーターに融合されたＨＣＶプロテアーゼをコードする。細胞の形質転換のための方法および組成物は当業者に周知であり、これは、外因性の核酸配列で細胞株を改変するために日常的に利用される任意の技術を含み得る。
【００５７】
例えば、ＳＥＡＰに融合されたＨＣＶプロテアーゼを含む発現構築物の発現のための本発明の遺伝子系を含むウイルスベクターもまた、本発明によって提供される。より詳細には、本発明は、このような融合タンパク質をコードする発現構築物を含むアデノウイルスベクターに向けられる。
【００５８】
プロテアーゼ活性についての哺乳動物モデルを産生するためのプロセスもまた、本発明によって提供され、この方法は、哺乳動物を供する工程、および遺伝子系（すなわち、発現構築物）をその哺乳動物に送達する工程を含み、この遺伝子系は、Ａ）プロモーター、Ｂ）プロテアーゼをコードするＤＮＡ、およびＣ）レポーターをコードするＤＮＡを含み、Ａ、Ｂ、およびＣは作動可能に連結されており、レポーター活性の存在がプロテアーゼ活性を示す。
【００５９】
肝障害についての哺乳動物モデルを産生するためのプロセスもまた、本発明によって提供され、この方法は、哺乳動物を供する工程、およびプロモーターとその発現が肝細胞の損傷を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡとを含む発現構築物をその哺乳動物に送達する工程を含む。
【００６０】
本発明のこれらのプロセスの実施形態は、動物、遺伝子系、発現構築物、および／または本明細書に開示される方法のいずれかを含む。これらのプロセスはさらに、例えば哺乳動物の肝臓において発現することに損害を与えるために十分な時間の間、哺乳動物を維持する工程を含んでもよい。
【００６１】
インビトロ細胞ベースのアッセイ系は、ＣＯＳ−７細胞において分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に融合されたＨＣＶプロテアーゼ(Y.-G.Cho et al.,J.Virol.Methods,72,pp.109-115(1998))、またはＣＯＳ−７およびＨＣＶレプリコン細胞においてＳＥＡＰタンパク質に融合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）(J.-C.Lee et al.,Analyt.Biochem.,316,pp.162-170(2003))のいずれかを使用して報告されている。しかし、これらの方法はインビボでは適用可能ではない。
【００６２】
本明細書に提供される動物は、プロテアーゼ活性のインビボモデルとして有用である。ＨＣＶプロテアーゼ動物モデルの有用性は、ＨＣＶプロテアーゼインヒビターの投与によって、マウスの血清へのＳＥＡＰの分泌を阻害することによって実証された（例えば図７を参照のこと）。プロテアーゼ活性の調節は、レポーター発現を測定することまたは検出することによって試験またはモニターされてもよい。
【００６３】
従って、本発明の１つの実施形態は、プロテアーゼ活性を増強または阻害する薬剤を試験するための方法を提供し、この方法は、
ａ）本明細書の実施形態のいずれかにかかる哺乳動物を供する工程；
ｂ）この哺乳動物に薬剤を投与する工程；および
ｃ）レポーター発現に対するこの薬剤の効果を評価する工程を含む。
【００６４】
この動物モデルにおいて発現されるプロテアーゼに依存して、種々の薬剤および化合物が、プロテアーゼの活性を増強または阻害する際のそれらの有効性についてスクリーニングされ得る。この方法は、抗ＨＣＶ治療としての薬剤の有効性を試験するために特に有用である。
【００６５】
ＳＥＡＰと融合されたＨＣＶプロテアーゼを発現するアデノウイルスが感染したマウスにおけるＨＣＶプロテアーゼ依存性肝臓病理学もまた、実証された。このモデルのＨＣＶプロテアーゼ肝障害成分の有用性は、ＨＣＶプロテアーゼインヒビターが、アデノウイルス感染においてＳＥＡＰを発現する野生型ＨＣＶプロテアーゼと関連する肝障害からマウスを保護することができたことを示すことによって実証された。
【００６６】
肝臓損傷は、ＨＣＶ患者において一般的に見られる。今日まで、これは、ウイルスに対して指向される宿主媒介性の免疫応答に帰せられている。しかし、ＨＣＶ感染の攻撃的な経過は、ＨＩＶ同時感染した患者および免疫不全患者において見られる。本発明のモデルは、免疫系の非存在下においてそれ自体によってＨＣＶの病理学を研究するために有用であり得る。疾患のメカニズムを理解することは、疾患の経過において妨害する新規な方法を生じ得、ならびにＨＣＶ媒介肝臓損傷のための合理的な治療を設計および開発し得る。ＷＴ  ＨＣＶプロテアーゼ発現マウス肝臓において観察される脂肪症は、Ｃ型肝炎の病理学におけるＨＣＶプロテアーゼの役割を示唆する。
【００６７】
従って、本発明の１つの実施形態はまた、肝障害を増強または阻害する薬剤を評価するための方法を提供し、
ａ）本明細書の実施形態のいずれかにかかる哺乳動物を供する工程；
ｂ）この哺乳動物に薬剤を投与する工程；および
ｃ）肝障害に対する薬剤の効果を評価する工程を含む。
【００６８】
任意のクラスの薬剤または化合物が、この肝障害アッセイにおいて試験および／またはスクリーニングされ得る。例えば、肝障害を引き起こすこと、または肝障害を治療および／もしくは予防することに関与している任意の薬剤が試験され得る。これらの薬剤には、プロテアーゼインヒビター、カスパーゼインヒビター（例えば、ＩＣＥインヒビター、カスパーゼ−３インヒビター、カスパーゼ−７インヒビターなど）、キナーゼインヒビター（例えば、セリンおよびスレオニンプロテインキナーゼインヒビター）、ＩＭＰＤＨインヒビター、ホスファターゼインヒビター、プロテアーゼインヒビター、エステラーゼインヒビター、リパーゼインヒビター、サイトカインインヒビター（例えば、ＴＮＦα、ＴＮＦβのインヒビター）、アポトーシスメディエーターおよび／またはインヒビター（例えば、ＰＡＲＰ）、抗体（またはそのフラグメント）、Ｆａｂフラグメント、および抗体様ペプチドまたはタンパク質（またはそのフラグメント）が含まれるがこれらに限定されない。この方法は、脂肪症を含む肝障害を治療または予防する薬剤の有効性を試験するために特に有用である。
【００６９】
従って、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物を投与することによって、肝障害、脂肪症、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪症、またはライ症候群を阻害するための方法を提供する。
【００７０】
肝障害に対する治療効力について試験される薬剤または候補物質は、タンパク質またはそのフラグメント、低分子インヒビター、または核酸分子でさえであってもよい。スクリーニングアッセイの適用を通しての同定のために最も有用な薬理学的化合物は、他の既知の肥満のモジュレーターに構造的に関連する化合物である場合であることが判明し得る。活性化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントまたは部分を含んでもよく、または他では不活性である既知の化合物の活性な組み合わせとしてのみ見い出されてもよい。しかし、ヒトまたは動物のモデルにおけるこのような化合物の試験の前には、どれが潜在能力を有するかを決定するために、種々の候補を試験する必要がある。
【００７１】
従って、活性化合物は、天然に存在する化合物のフラグメントまたは部分を含んでもよく、または他では不活性である既知の化合物の活性な組み合わせとしてのみ見い出されてもよい。従って、本発明は、肥満の徴候を阻害またはさもなければ治療する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。葉および樹皮ならびに海洋サンプルを含む、動物、細菌、真菌、植物の供給源などの天然の供給源から単離された化合物が、潜在的に有用な薬学的薬剤の存在についての候補としてアッセイされてもよいことが提案される。
【００７２】
スクリーニングされる薬学的薬剤はまた、化学的組成物または人工の化合物から誘導体化または合成され得ることが理解される。従って、肝疾患の治療において使用される既知の薬剤から出発して、合理的な薬物設計を通して設計され得る、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、低分子インヒビター、または任意の他の有機もしくは無機の化合物であり得る本発明によって候補物質が同定されることが理解される。
【００７３】
「有効量」とは、特定の状況において、肝疾患の所与の指標を再現可能に変化させるために有効である量である。
【００７４】
試験化合物を用いる動物の治療は、適切な型における、動物への化合物の投与を含む。投与は、臨床的または非臨床的な目的のために利用され得る任意の経路によってであり、これには、経口、鼻、口腔、直腸、膣、または局所的が含まれるがこれらに限定されない。代替的には、投与は、気管内点滴注入、気管支点滴注入、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射によってであり得る。特に意図されるものは、全身性静脈内注射、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、またはリンパの供給を介しての局所的投与、および腫瘍内注射である。
【００７５】
インビボで化合物の有効性を決定することは、種々の異なる判断基準を含み得る。このような判断基準には、生存、炎症性応答の阻害または予防、活性レベルの増加、免疫エフェクター機能の改善、および食物摂取の改善が含まれるがこれらに限定されない。
【００７６】
本明細書に実証されるように、ＨＣＶプロテアーゼインヒビターＶＸ−９５０は、脂肪症を改善する際に有効である。従って、本発明の別の実施形態は、その必要がある患者に、プロテアーゼインヒビターの有効量を投与する工程を含む、脂肪症を阻害するための方法を提供する。本発明はまた、徴候として脂肪症を有する疾患、状態、または障害を治療または予防するための方法を提供する。このような疾患には、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、アルコール性脂肪症、およびライ症候群が含まれるがこれらに限定されない。
【００７７】
ＶＸ−９５０は、競合的、可逆的ペプチド模倣物ＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａプロテアーゼインヒビターであり、３ｎＭの定常状態結合定数（ｋｉ*）を有する（および８ｎＭのＫｉを有する）(Perni et al.,AASLD meeting,Boston,October and 2003によって提示されたポスター;WO02/18369を参照のこと)。
【化１】
2007505603.tif 000002
ＶＸ−９５０
【００７８】
他のプロテアーゼインヒビターもまた、本発明において使用され得る。例えば、ＶＸ−９５０のキラル混合物が使用され得る。特定の実施形態において、使用される化合物は、以下の構造のＮ−プロピル側鎖でのＤ異性体およびＬ異性体の混合物であり得る。
【化２】
2007505603.tif 000003
構造Ａ
【００７９】
「ＶＸ−９５０」と名付けられた、本明細書の実施例において記載される実験において使用される化合物は、ｎ−プロピル側鎖でのエピマーの混合物として存在する。この化合物は、構造Ａとして以下に表される。構造Ａは、ｎ−プロピル側鎖でのＤ異性体およびＬ異性体のジアステレオマー混合物を示すことが認識される。例えば、出発化合物として、ＶＸ−９５０または構造Ａの化合物を使用する合理的薬物設計を通して生成された他の薬剤は、プロテアーゼインヒビターとしてのそれらの活性について試験され得る。さらに、当業者は、本発明の方法において試験され得る多数の他のプロテアーゼインヒビターを知っている。例示的なそのようなインヒビターには、PCT公開番号WO 02/18369、WO 02/08244、WO 00/09558、WO 00/09543、WO 99/64442、WO 99/07733、WO 99/07734、WO99/50230、WO 98/46630、WO 98/17679、およびWO97/43310、米国特許第5,990,276号、M.Llinas-Brunet et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,8,pp.1713-18(1998);W.Han et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,10,711-13(2000);R.Dunsdon et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,10,pp.1571-79(2000);M.Llinas-Brunet et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,10,pp.2267-70(2000);およびS.LaPlante et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,10,pp.2271-74(2000))に記載されたＨＣＶプロテアーゼインヒビターが含まれる。プロテアーゼインヒビターを含むこれらおよび他の組成物が、脂肪症を治療する方法において使用され得る。
【００８０】
脂肪症およびまたは他の肝疾患の組み合わせ治療もまた意図される。本発明のこのような組み合わせ治療方法はまた、免疫調節剤；抗ウイルス剤；ＨＣＶプロテアーゼのインヒビター；ＨＣＶ生活環における別の標的のインヒビター；内部リボソームエントリーのインヒビター、広いスペクトルのウイルスインヒビター；別のシトクロムＰ−４５０インヒビター；肝保護剤(hepatoprotective agent)；脂肪症インヒビター；またはこれらの組み合わせから選択されるさらなる薬剤を含む別の成分の投与を含み得る。WO 02/18369を参照のこと。
【００８１】
従って、別の実施形態において、本発明は、プロテアーゼインヒビター、および別の抗ウイルス剤、好ましくは抗ＨＣＶ剤を投与する工程を含む方法を提供する。このような抗ウイルス剤には、免疫調節剤、例えば、α−、β−、およびγ−インターフェロン、ペグ化誘導体化インターフェロン−α化合物、およびサイモシン；他の抗ウイルス剤、例えば、リバビリン、アマンタビン、およびテルビブジン；Ｃ型肝炎プロテアーゼの他のインヒビター（ＮＳ２−ＮＳ３インヒビターおよびＮＳ３／ＮＳ４Ａインヒビター）；ヘリカーゼ、ポリメラーゼ、およびメタロプロテアーゼインヒビターを含むＨＣＶ生活環における他の標的のインヒビター；内部リボソームエントリーのインヒビター；広範なスペクトルのウイルスインヒビター、例えば、ＩＭＰＤＨインヒビター（例えば、米国特許第5,807,876号、同第6,498,178号、同第6,344,465号、同第6,054,472号、WO 97/40028、WO 98/40381、WO 00/56331の化合物、ミコフェノール酸およびその誘導体、ならびにＶＸ−４９７、ＶＸ−１４８、および／またはＶＸ−９４４が含まれるがこれらに限定されない）；または上記のいずれかの組み合わせが含まれるがこれらに限定されない。
【００８２】
以下の定義は本明細書において使用される（本願の出願日の時点で利用可能な製品を参照する商標を用いる）。
【００８３】
「Peg-Intron」は、Schering Corporation,Kenilworth,NJから入手可能なPEG-Intron(登録商標)、ペグインターフェロンα−２ｂを意味する；
「Intron」は、Schering Corporation,Kenilworth,NJから入手可能なIntron-A(登録商標)、インターフェロンα−２ｂを意味する。
「リバビリン」は、ICN Pharmaceuticals,Inc.,Costa Mesa,CAから入手可能なリバビリン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド）意味し；Merck Index、エントリー8365、第12版において記載され；Rebetol(登録商標)としてSchering Corporation,Kenilworth,NJから、またはCopegus(登録商標)としてHoffmann-La Roche,Nutley,NJから入手可能である；
「Pagasys」は、Hoffmann-La Roche,Nutley,NJから入手可能であるPegasys(登録商標)、ペグインターフェロンα−２ａを意味する；
「Roferon」は、Hoffmann-La Roche,Nutley,NJから入手可能であるRoferon(登録商標)、組換えインターフェロンα−２ａを意味する；
「Berefor」は、Boehringer Ingelheim Pharmaceutical,Inc.,Ridgefield,CTから入手可能であるBerefor(登録商標)、インターフェロンα２を意味する；
Sumiferon(登録商標)は、Sumitomo,Japanから入手可能であるSumiferonなどの天然のαインターフェロンの精製ブレンドである；
Wellferon(登録商標)は、Glaxo#Wellcome Ltd.,Great Britainから入手可能であるインターフェロンα  ｎ１である；
Alferon(登録商標)は、Interferon Sciencesによって製造され、Purdue Frederick Co.,CTから入手可能である天然のαインターフェロンの混合物である。
【００８４】
用語「インターフェロン」は、本明細書で使用される場合、ウイルス複製および細胞増殖を阻害し、かつ免疫応答を調節する高度に相同な種特異的タンパク質のファミリーのメンバーを意味し、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、またはインターフェロンγである。Merck Indexエントリー5015、第12版。インターフェロンはまた、WO 02/018369に記載されている。これらのインターフェロンのいずれもが本発明の実施形態において使用され得る。ＨＣＶ  ＮＳ３／４Ａセリンプロテアーゼは、インターフェロン調節因子−３(IRF-3;Foy et al.,Science 300,1145-1148を参照のこと)のリン酸化およびエフェクター作用をブロックする。ＩＲＦ−３は、鍵となるシグナル伝達分子であり、したがって、この分子上のＨＣＶプロテアーゼの作用は、ＨＣＶインターフェロンの有害な効果を導く可能性がある。ＨＣＶプロテアーゼの阻害は、ＩＲＦ−３の機能を回復させ得、かつＨＣＶ感染の治療において治療的な価値のあるものである。したがって、本発明の動物モデルは、ＩＲＦ−３シグナル伝達に対するＨＣＶプロテアーゼの作用を改善する薬剤の効力について試験するために利用され得る。
【００８５】
本発明の好ましい実施形態に従うと、インターフェロンはαインターフェロンである。別の実施形態に従うと、本発明は、天然のαインターフェロン２ａを利用する。または、本発明は、天然のαインターフェロン２ｂを利用する。別の実施形態において、本発明は、組換えのαインターフェロン２ａまたは２ｂを利用する。なお別の実施形態において、インターフェロンは、ペグ化αインターフェロン２ａまたは２ｂである。本発明のために適切なインターフェロンには以下が含まれる。
（ａ）Intron、
（ｂ）Peg-Intron、
（ｃ）Pegasys、
（ｄ）Roferon、
（ｅ）Berofor、
（ｆ）Sumiferon、
（ｇ）Wellferon、
（ｈ）Amgen,Inc.,Newbury Park,CAから入手可能なコンセンサスαインターフェロン、
（ｉ）Alferon；
（ｊ）Viraferon(登録商標)、
（ｋ）Infergen(登録商標)。
【００８６】
当業者によって認識されるように、経口投与が治療レジメンにおいて好ましい。インターフェロンは、典型的には、経口的に投与されない。それにも関わらず、本明細書におけるいかなるものも、本発明の方法または組成物を、任意の特定の投薬形態またはレジメンに制限されない。従って、本発明の方法および組成物の各々の成分は、別々に、一緒に、またはその任意の組み合わせで投与されてもよい。
【００８７】
本発明にかかる方法はまた、シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼインヒビターを投与する工程を含む。ＣＹＰインヒビターは、ＣＹＰによって阻害される化合物の肝臓濃度を増加させ、および／または血液レベルを増加させる際に有用であり得る。
【００８８】
薬物の薬物動態学を改善すること（例えば、ＣＹＰインヒビターを投与することによって）の利点は、当分野において十分に受け入れられている。ＣＹＰインヒビターを投与することによって、本発明は、プロテアーゼインヒビター、ＶＸ−９５０の代謝を減少させる。ＶＸ−９５０の薬物動態学はそれによって改善される。薬物の薬物動態学を改善することの利点は当分野において十分に受け入れられている。このような改善は、プロテアーゼインヒビターの血液レベルの増加をもたらし得る。ＨＣＶ治療のためにより重要なことには、この改善は、肝臓におけるプロテアーゼインヒビターの濃度の増加をもたらし得る。
【００８９】
本発明の方法において、投与されるＣＹＰインヒビターの量は、ＣＹＰインヒビターの非存在下におけるＶＸ−９５０の血液レベルと比較して、このプロテアーゼインヒビターの血液レベルを増加させるために十分である。有利には、したがって、本発明の方法において、さらに低い用量のプロテアーゼインヒビターでさえ使用することもできる（プロテアーゼインヒビター単独の投与と比較して）。
【００９０】
ＣＹＰインヒビターには、リトナビル(WO 94/14436)、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、クロメチアゾール、シメチジン、イトラコナゾール、フルコナゾール、ミコナゾール、フルボキサミン、フルオキセチン、ネファゾドン、セルトラリン、インジナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、フォスアンプレナビル、サキナビル、ロピナビル、デラビルジン、エリスロマイシン、ＶＸ−９４４、およびＶＸ−４９７が含まれるがこれらに限定されない。好ましいＣＹＰインヒビターには、リトナビル、ケトコナゾール、トロレアンドマイシン、４−メチルピラゾール、シクロスポリン、およびクロメチアゾールが含まれる。
【００９１】
シトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ活性を阻害する化合物の能力を測定するための方法は公知である(米国特許第6,037,157号およびYun et al.,Drug Metabolism & Disposition,vol.21,pp.403-407(1993)を参照のこと)。
【００９２】
本発明において利用されるＣＹＰインヒビターは、１つのみのアイソザイムまたは１つより多くのアイソザイムのインヒビターであり得る。ＣＹＰインヒビターがより多くのアイソザイムを阻害する場合、それにも関わらず、インヒビターは、別のアイソザイムよりもより選択的に１つのアイソザイムを阻害し得る。任意のこのようなＣＹＰインヒビターが、本発明の方法において使用され得る。
【００９３】
本発明の実施形態は、化合物、例えば、ＶＸ−９５０またはその薬学的に受容可能な塩などのプロテアーゼインヒビターを含む組成物を利用し得る。認識されるように、このような組成物は、典型的には、薬学的に受容可能なキャリアを含み、本明細書に記載されるようなさらなる薬剤（例えば、ＣＹＰインヒビター）を含んでもよい。各成分は、個々の成分中で、組み合わせ組成物中で、または単一の組成物中で存在し得る。
【００９４】
薬学的に受容可能な化合物の塩がこれらの組成物中で使用される場合、これらの塩は、好ましくは、無機または有機の酸および塩基に由来する。このような酸の塩には以下が含まれる。酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタン−プロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、およびウンデカン酸塩。塩基の塩には以下が含まれる。アンモニウム塩、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩、アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩、有機塩基との塩、例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ならびにアミノ酸、例えば、アルギニン、リジンなどとの塩。
【００９５】
また、塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド、例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；ジアルキル硫酸塩、例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミルの硫酸塩、長鎖ハライド、例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物、アラルキルハライド、例えば、ベンジルおよびフェネチルの臭化物などの剤で四級化され得る。水溶性または油溶性または分散性の生成物がそれによって得られる。
【００９６】
本発明の組成物および方法において利用される化合物はまた、選択的な生物学的特性を増強するために適切な官能基を付加することによって修飾され得る。このような修飾は当分野において公知であり、かつ所与の生物学的系（例えば、血液、リンパ系、中枢神経系）への生物学的浸透を増強し、経口利用可能性を増加し、注射による投与を可能にするための溶解性を増加し、代謝を変化させ、および排出の速度を変化させるものを含む。
【００９７】
これらの組成物において使用され得る薬学的に受容可能なキャリアには、以下が含まれるがこれらに限定されない：イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、電解質の塩、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、および羊毛脂。
【００９８】
好ましい実施形態に従って、組成物は、哺乳動物、好ましくは、ヒトへの薬学的投与のために製剤化される。
【００９９】
本発明のこのような薬学的組成物（ならびに本発明の方法、組成物、キット、およびパックにおける使用のための組成物）は、経口的、非経口的、舌下に、吸入スプレーによって、局所的に、直腸に、鼻に、口腔に、膣に、または移植リザーバーを介して、投与され得る。用語「非経口」は、本明細書で使用される場合、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、くも膜下腔内、肝臓内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入の技術を含む。好ましくは、組成物は、経口的または静脈内に投与される。
【０１００】
本発明のおよび本発明に従う組成物の滅菌注射形態は、水性または油性の懸濁物であり得る。これらの懸濁物は、分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当分野において公知の技術に従って製剤化され得る。滅菌注射調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁物、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として使用され得る。利用され得る受容可能な媒体および溶媒の中には、水、リンガー液、および等張塩化ナトリウム液がある。さらに、滅菌の、固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来的に利用される。この目的のために、合成モノ−またはジ−グリセリドを含む、任意のブランドの固定油が利用され得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸は、天然の薬学的に受容可能な油、例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンと同様に注射液の調製において有用である。これらの油溶液または懸濁物はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤、例えば、乳化物および懸濁物を含む薬学的に受容可能な投薬形態の製剤において一般的に使用される、カルボキシメチルセルロースまたは同様の分散剤などを含み得る。他の一般的に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎ、および他の乳化剤、または薬学的に受容可能な固体、液体、もしくは他の投薬形態の製造において一般的に使用されるバイオアベイラビリティーエンハンサーもまた、製剤の目的のために使用され得る。
【０１０１】
本発明に従って使用される組成物（すなわち、本発明の方法、キット、組成物、またはパックにおいて使用される組成物）において、化合物および任意のさらなる薬剤は、単回治療レジメンにおいて通常投与される投薬量の約１０〜１００％の間、より好ましくは約１０〜８０％の間の投薬レベルで提示されるべきである。
【０１０２】
薬学的組成物は、カプセル、錠剤、丸薬、散剤、顆粒、水性懸濁物、または溶液を含むがこれらに限定されない、任意の経口的に受容可能な投薬形態で経口投与され得る。経口使用のための錠剤の場合、一般的に使用されるキャリアは、ラクトースおよびコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤もまた、典型的には加えられる。カプセル形態における経口投与のために、有用な希釈剤は、ラクトースおよび乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁物が経口使用のために必要とされる場合、活性成分は乳化剤および懸濁剤と合わせられる。所望される場合、特定の甘味料、香料、または着色料もまた加えられ得る。受容可能な液体投薬形態には、乳化物、溶液、懸濁物、シロップ、およびエリキシルが含まれる。
【０１０３】
代替的には、薬学的組成物は、直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。これらは、室温で個体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸において溶解し薬物を放出する、適切な非刺激性賦形剤と、薬剤を混合することによって調製され得る。このような材料には、ココアバター、蜜ろう、およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１０４】
薬学的組成物はまた、局所的に、特に、治療の標的が、眼、皮膚、または下部消化管の疾患を含む、局所的適用によって容易に接近可能である領域または器官を含む場合に投与され得る。適切な局所的製剤は、これらの領域または器官の各々について容易に調製される。
【０１０５】
下部消化管のための局所的適用は、直腸坐剤製剤（上記を参照のこと）または適切な浣腸製剤においてもたらされ得る。局所的経皮パッチもまた使用され得る。
【０１０６】
局所的適用のために、薬学的組成物は、１種以上のキャリア中に懸濁または溶解された活性成分を含む適切な軟膏中で製剤化され得る。本発明の化合物の局所的投与のためのキャリアには、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、および水が含まれるがこれらに限定されない。代替的には、薬学的組成物は、１種以上の薬学的に受容可能なキャリア中に懸濁または溶解された活性成分を含む適切なローションまたはクリーム中に製剤化され得る。適切なキャリアには、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水が含まれるがこれらに限定されない。
【０１０７】
眼科的使用のために、薬学的組成物は、ベンジルアルコニウムクロライドなどの保存剤を伴うか、または伴わないかのいずれかで、等張のｐＨ調整滅菌生理食塩水中の微粒子化された懸濁物として、または好ましくは、等張のｐＨ調整された滅菌生理食塩水中の溶液として製剤化され得る。代替的には、眼科的使用のために、薬学的組成物は、ワセリンなどの軟膏中で製剤化され得る。
【０１０８】
本発明の、および本発明に従う薬学的組成物はまた、鼻エアロゾルまたは吸入によって投与され得る。このような組成物は、薬学的処方の分野において周知である技術に従って調製され、ベンジルアルコールまたは他の適切な保存剤、バイオアベイラビリティーを増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、および／または他の従来的な可溶化剤もしくは分散剤を使用して、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【０１０９】
当分野において認識されるように、薬学的組成物はまた、リポソームの形態で投与され得る。
【０１１０】
経口投与のために製剤化された、本発明の、および本発明に従う薬学的組成物が好ましい。
【０１１１】
好ましい実施形態に従って、プロテアーゼインヒビター（好ましくは、ＶＸ−９５０）が、サンプル中または患者中の脂肪症を減少するための有効量で存在する。
【０１１２】
１日あたり約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは１日あたり約０．５〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重の間の化合物の投薬量レベル（例えば、ＶＸ−９５０）が、本発明の方法において有用である。ＣＹＰインヒビターについては、１日あたり約０．００１〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の間の投薬量レベルが典型的である。１日あたり約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇまたは約１．１〜約２５ｍｇ／ｋｇの間の投薬量レベルがより典型的である。典型的には、本発明の、または本発明に従う薬学的組成物は、１日あたり約１回〜約５回まで、または代替的には、連続的注入として投与される。このような投与は、長期的または短期的な治療として使用され得る。単回投薬量形態を作製するためのキャリア材料と組み合わせ得る活性成分の量は、治療される宿主および投与の特定の様式に依存して変化する。典型的な調製物は、約５％〜約９５％の活性化合物（ｗ／ｗ）を含む。好ましくは、このような調製物は、約２０％〜約８０％の活性化合物を含む。
【０１１３】
当業者によって認識されるように、インターフェロンの投薬量は、典型的には、ＩＵで測定される（例えば、約４００万ＩＵ〜約１２００万ＩＵ）。
【０１１４】
患者の状態の改善に際して、化合物または組成物の維持用量が、必要な場合、投与され得る。続いて、投薬量または投与の頻度、またはその両方が、徴候の関数として、改善された状態が保持されるレベルまで減少され得、徴候が所望のレベルまで軽減されたならば、治療は中止されるべきである。しかし、患者は、疾患のいかなる徴候の再発に際しても、長期間を基本とした断続的治療を必要とする。
【０１１５】
任意の特定の患者のための特定の投薬量および治療レジメンは、利用される特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間、排出の速度、薬物の組み合わせ、ならびに治療する医師の判断、および治療される特定の疾患の重篤度を含む種々の要因に依存することもまた理解されるべきである。活性成分の量はまた、特に記載される化合物、ならびに組成物中のさらなる抗ウイルス剤の存在または非存在、およびその性質に依存する。
【０１１６】
リトナビルの好ましい投薬形態については、例えば、米国特許第6,037,157号、ならびにそこに引用されている文献：米国特許第5,484,801号、米国特許出願第08/402,690号、および国際公開WO 95/07696およびWO 95/09614を参照のこと。
【０１１７】
別の実施形態に従って、本発明は、本発明の方法によって同定される化合物を含む薬学的に受容可能な組成物を患者に投与することによって、１）ウイルスの生活環のために必要である、ウイルスにコードされているＮＳ３／４Ａセリンプロテアーゼによって特徴付けられるウイルスで感染している患者；または２）肝障害に罹患している患者を治療するための方法を提供する。好ましい患者はヒトである。
【０１１８】
なお別の実施形態において、本発明は、患者への投与のために意図される生物学的物質を前処理する方法を提供し、この方法は、本発明の化合物を含む薬学的に受容可能な組成物と、この生物学的物質を接触させる工程を含む。このような生物学的物質には、血液およびその成分、例えば、血漿、血小板、血液細胞の亜集団など；器官、例えば、腎臓、肝臓、心臓、肺など；精子および卵子；骨髄およびその成分；ならびに患者に注入される他の液体、例えば、生理食塩水、デキストロースなどが含まれるがこれらに限定されない。
【０１１９】
本発明はまた、本発明の方法によって同定される化合物を含む組成物を調製するためのプロセスを提供する。本発明の別の実施形態は、本発明の方法によって同定される化合物および本明細書に記載されるような１種以上のさらなる薬剤によって同定される化合物を組み合わせる工程を含むプロセスを提供する。
【０１２０】
薬学的組成物はまた、単一のパッケージ（例えば、ブリスターパッケージ）に治療の全体の治療単位を含む「患者パック」で患者に処方され得る。患者パックは、従来的な処方では通常失われる患者パック中に含まれる添付文書に患者が常にアクセスできるという点で、薬剤師がバルク供給から医薬の患者への供給に分割する従来的な処方を超えた利点を有する。添付文書を含めることは、医師の指示との患者のコンプライアンスを改善することが示されている。
【０１２１】
本発明の正確な使用のための患者への指示を添付文書中に含む、単一の患者パックの組成物手段、または各製剤の患者パックの投与は、本発明の所望のさらなる特徴であることが理解される。
【０１２２】
本発明のさらなる態様に従うものは、本発明にかかる方法によって同定される少なくとも１種の化合物、およびその化合物の使用に対する指示を含む添付情報を含むパックである。本発明の代替的な実施形態において、薬学的パックはさらに、本明細書に記載されるような１種以上のさらなる薬剤を含む。さらなる薬剤は、同じパックまたは別々のパックにおいて提供され得る。
【０１２３】
本発明の別の態様は、本発明に従う方法を実行するためのパッケージされたキットを含み：この方法を実行するための材料；およびＨＣＶ感染を治療または予防するために有効な様式で薬物投与を実行するための指示書を含む。
【０１２４】
従って、本発明は、本方法に従って同定された、従来的な様式で調製される化合物（および任意にさらなる薬剤）またはその誘導体の同時または連続的な投与のためのキットを提供する。典型的には、このようなキットは、例えば、各インヒビターおよび任意にさらなる薬剤を薬学的に受容可能なキャリア中に（および１つまたは複数の薬学的製剤中に）含み、ならびに同時のまたは連続的な投与のための指示書を含む。
【０１２５】
別の実施形態において、自己投与のための１つ以上の投薬量形態；容器手段、好ましくは保存の間および使用の前の投薬量形態を収納するためのシールした；および患者に薬物投与を実行するための指示書を含む、パッケージされたキットが提供される。この指示書は、典型的には、添付書類、ラベル、および／または他のキットの要素の上に書かれており、投薬量形態は本明細書に記載される通りである。各投薬量形態は、金属ホイル−プラスチックラミネートのシート中のように個々に収納され得、各投薬量形態は、個々のセルもしくは球状の仕切りで他から単離され、または投薬量形態は、プラスチックボトルもしくはバイアル中のように単一の容器中に収納され得る。本発明のキットはまた、典型的には、個々のキット要素をパッケージングするための手段、すなわち、投薬量形態、容器手段、および使用のための指示書を含む。このようなパッケージング手段は、ボール紙または紙箱、プラスチックまたはホイルポーチなどの形態を取り得る。
【０１２６】
［一般的方法論］
ＶＸ−９５０は、一般的に当業者に公知である方法によって調製され得る（例えば、本明細書に引用される文献を参照のこと）。
【０１２７】
当業者に公知である日常的な技術は、本発明を実施するために使用され得る。このようは技術は、公開された文書において見い出され得る。例えば、標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニングの技術は当分野において周知である。例えば、F.M.Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,Media,PA;Sambrook,J.,Fritsch,E.F.およびManiatis,T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989,ならびに米国特許第6,617,156号および同第6,617,130号において引用される文献（これらの全ては参照として本明細書によって組み込まれる）を参照のこと。
【０１２８】
本発明がより完全に理解されるために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示のみの目的のためであり、かついかなる場合においても本発明の範囲を限定するものとはみなされない。
【０１２９】
［実施例１］
［レポーター遺伝子の設計および構築］
オーバーラップＰＣＲを使用して、ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａおよび分泌胎盤アルカリホスファターゼをコードするｃＤＮＡを融合させた。以下を使用してＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ  ＤＮＡをＰＣＲ増幅した：
ａ）ＮＳ４Ａ  Ｕ２  ５’ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＧＴＡ  ＡＧＧ  ＧＡＧ  ＧＴＧ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＴＴＣ  ＣＡＴ  ＣＴＣ  ＡＴＣ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ３’、上流プライマーとして、および
ｂ）ＮＳ４Ａ  Ｌ４  ５’ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＣＧＡ  ＣＣＡ  ＡＣＧ３’、下流プライマーとして。これは、鋳型としてｐＹｅｓ２／ＮＳ３・４Ａプラスミドを使用して、８９３ｂｐのＰＣＲ産物を生じた。ＰＣＲ条件は、９４℃４５秒、５０℃４５秒、７２℃１分であった。
【０１３０】
同様に、分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をＰＣＲ増幅した。
ａ）ＳＥＡＰ  Ｌ３  ５’ＡＧＴＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＧＣＧＧＣＣＧＣ  ＴＴＡ  ＴＣＡ  ＴＧＴ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＧＡＡ  ＧＣ  ＧＧ３’、下流プライマーとして、および
ｂ）ＳＥＡＰ  Ｕ  ５’ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＣＣＴ  ＴＡＣ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  ＣＴＧ  Ｃ３’、上流プライマーとして。ＰＣＲ条件は９４℃４５秒、５５℃４５秒、および７２℃１．３分であった。
【０１３１】
得られたＰＣＲ産物をQiaex IIゲル抽出キット(カタログ番号20021 Qiagen)を使用してゲル精製した。ＰＣＲ産物ＮＳ３・４ＡおよびＳＥＡＰを融合するためのオーバーラップＰＣＲを、これらのゲル精製した産物を鋳型として、ＮＳ４Ａ  Ｌ４およびＳＥＡＰ  Ｌ３をプライマーとして、増幅のためにＰｆＵポリメラーゼ(Stratagene)を使用して実行した。
【０１３２】
さらなる実施形態において、さらなる構築物を作製した。この構築物において、ＨＣＶ遺伝子型１ｂのＮＳ４Ａ・４Ｂジャンクション−(DEMEEC-ASHL)を、オーバーラッピングＰＣＲを使用して、ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａの遺伝子と、分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）をコードするレポーター遺伝子の間でインフレームに融合した。ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａを、ｐＹｅｓ２／ＮＳ３・４Ａプラスミド(Markland et al.,1997)から、９４℃３０秒、５０℃３０秒、および７２℃６０秒で、以下のＰＣＲプライマーを用いて増幅した：
上流プライマー：ＴＧＴＣＴＧＴＣＡＴＣＣＣＧＡＣＣＡＡＣＧ（ＮＳ３のヌクレオチド１１９３〜１２１３またはｐＳｈｕｔｔｌｅ／ＮＳ３４Ａ−ＳＥＡＰ（ＤＥＭＥＥＣ．ＡＳＨＬＰＹジャンクション）構築物のヌクレオチド２２１１〜２２３１）
下流プライマー：
【化３】
2007505603.tif 000004
（斜字体はＳＥＡＰ  ＯＲＦ配列ヌクレオチド４〜１９を表し、下線部の配列はＮＳ４Ａ配列ヌクレオチド１６５〜１４２である）。
【０１３３】
分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を、ｐＳＥＡＰ２(Clontech,Palo Alto,CA)を使用して、９４℃４５秒、５５℃４５秒、および７２℃９０秒で、以下のプライマーを用いて増幅した：
上流プライマー：
【化４】
2007505603.tif 000005
（斜字体はＮｏｔＩ制限部位を表し、下線部の配列はＳＥＡＰ  ＯＲＦ配列ヌクレオチド１５６０〜１５４２を表す）。
下流プライマー：
【化５】
2007505603.tif 000006
（下線部の配列は、４Ａ・４Ｂジャンクションの一部であるＣＡＳＨＬについてのコード配列を表す。斜字体はＳＥＡＰ  ＯＲＦ配列ヌクレオチド４〜２８を表す）。
【０１３４】
８９７ｂｐ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａおよび１５９１ｂｐ  ＳＥＡＰ  ＰＣＲ産物を、オーバーラップＰＣＲのための鋳型として使用し、上流プライマーとしてＴＧＴＣＴＧＴＣＡＴＣＣＣＧＡＣＣＡＡＣＧ（ＮＳ３のヌクレオチド１１９３〜１２１３）を、および下流プライマーとしてＣＣＣＡＣＣＴＴＧＧＣＴＧＴＡＧＴＣ（ＳＥＡＰ  ＯＲＦのヌクレオチド７０９〜７２６またはｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＷＴ／ＭＴ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰのヌクレオチド３７９９〜３８１７［ＤＥＭＥＥＣ．ＡＳＨＬＰＹジャンクション］）を使用した。１．６ｋｂサイズのＰＣＲ産物を、Ｓａｌ  ＩおよびＰｖｕ  ＩＩで制限消化し（１０３９ｂｐサイズの制限フラグメントを生じる）、そしてｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＷＴ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰ（ＤＥＭＥＥＣ．ＡＳＨＬＰＹジャンクション）およびｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＭＴ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰ（ＤＥＭＥＥＣ．ＡＳＨＬＰＹジャンクション）クローンにクローニングした。
【０１３５】
組換えクローンを、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩを用いる診断的制限消化によって確認し（ＣＲＬ  １８３０マウス肝細胞をｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＷＴ−ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＭＴ−ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰ（DEMEEC.ASHLジャンクション）でトランスフェクトした）、そしてＨＣＶプロテアーゼの発現を、トランスフェクションの４８時間後にウェスタンブロットによって試験した。
【０１３６】
ｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＷＴ−ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰおよびｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＭＴ−ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰ（ＤＥＭＥＥＣ．ＡＳＨＬジャンクション）を、ホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｉｃｅｕ  ＩおよびＰＩｓｃｅ  Ｉ）で消化し、以前に記載したようにｐＡｄｅｎｏＸ(Clontech,Palo Alto,CA)にクローニングした。
【０１３７】
［実施例２］
［プラスミドベクター中でのＰＣＲ産物のクローニング］
２．５ｋｂのオーバーラップＰＣＲ産物をＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩで制限消化し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用して、野生型ＨＣＶプロテアーゼ（ＷＴ）、またはＨＣＶプロテアーゼの活性部位にセリンからアラニンへの変異を含む変異型（ＭＴ）プロテアーゼのいずれかをコードするｐＹｅｓ  ＮＳ３・４Ａにクローニングした。ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰをコードする３．７ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡフラグメントを、ｐＣＥＰ４哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られたクローンを、Vertex Pharmaceuticals IncorporatedのＤＮＡコア施設においてＤＮＡ配列決定に供した。
【０１３８】
［実施例３］
［細胞培養におけるＨＣＶ−ＳＥＡＰレポータープラスミドの発現］
１２ウェルプレート中のＣＲＬ  １８３０マウス肝細胞を、ＨＣＶ  ＷＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰまたはＳＥＡＰ  ｃＤＮＡのいずれかをコードする２．４μｇのｐＣＥＰ４で、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いてトランスフェクトした。１２ウェルプレート中のＣＲＬ  １８３０マウス肝細胞を、２．４μｇのＨＣＶ  ＷＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰおよびＨＣＶ  ＭＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰで二連でトランスフェクトさせた。トランスフェクションの７２時間後、培地をＳＥＡＰ活性についてアッセイした。図６に示されるように、ＷＴ  ＨＣＶプロテアーゼ構築物でトランスフェクトした細胞は、変異型（ＭＴ）プロテアーゼを受容した細胞よりも、より多くのＳＥＡＰを培地中に分泌した。
【０１３９】
図７において示される実験において、１２ウェルプレート中のＣＲＬ  １８３０マウス肝細胞を、ＨＣＶ  ＷＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰまたはＳＥＡＰ  ｃＤＮＡのいずれかをコードするｐＣＥＰ４で、リポフェクタミン２０００(Invitrogen)を用いてトランスフェクトし、０〜４０μＭの範囲の種々の濃度のＨＣＶプロテアーゼインヒビターで処理した。４８時間後、培地をＳＥＡＰ活性についてアッセイした。図７は、ＨＣＶプロテアーゼインヒビターＡによるＳＥＡＰ分泌の用量依存性阻害を示す。
【０１４０】
［実施例４］
［ＨＣＶ  ＷＴ  およびＭＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰのアデノウイルスへのクローニング］
図８において示されるように、ｐＣＥＰ４−ＨＣＶ  ３４Ａ−ＳＥＡＰからのＮｈｅＩ−ＮｏｔＩフラグメントを、アデノウイルスのための移入ベクターであるｐＳｈｕｔｔｌｅベクターにクローニングした。ｐＳｈｕｔｔｌｅ  ＨＣＶ  ＷＴおよびＭＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰを、ＰＩ−ＳｃｅＩおよびＩｃｅｕＩで二重消化し、同様に消化したｐＡｄｅｎｏ−Ｘ  ＤＮＡ(BDBioscienes)にクローニングした。ＰａｃＩ制限消化したｐＡｄｅｎｏ−ＨＣＶ  ＷＴ／ＭＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰ  ＤＮＡを、トランスフェクションのリン酸カルシウム法を使用して(Calcium Phosphate transfection reagent,Gibco BRL)、ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。細胞を、アデノウイルス感染の細胞変性効果が現れるまで２週間増殖させ、その後、細胞を組換えアデノウイルスのために収集した。ウイルスを、大量のＨＥＫ２９３細胞を引き続いて感染させることによって増幅した。ＨＣＶ  ＷＴ／ＭＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰをコードするアデノウイルスを、塩化セシウムバンド形成を使用して精製した。
【０１４１】
［実施例５］
［ＨＣＶ  ＷＴおよびＭＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰレポーター構築物を有するアデノウイルスベクターを用いて形質導入された細胞中のＨＣＶ−ＳＥＡＰの発現］
ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰ  ＷＴおよび変異型を発現するアデノウイルスを調製し、２０のＭＯＩまで希釈した。１２ウェルプレート中に播種したＣＲＬ  １８３０マウス肝細胞５×１０5細胞を、２４時間後に感染のために使用した。図９に示されるように、ＮＳ４Ａ−ＮＳ４ジャンクションを通してＳＥＡＰレポーターに融合されたＷＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａを有するアデノウイルスで感染したマウス肝細胞は、変異型構築物を受容した細胞よりも、有意により多くのＳＥＡＰを培地中に分泌した。
【０１４２】
ＨＣＶプロテアーゼインヒビターのＨＣＶプロテアーゼ依存性のＳＥＡＰの分泌を阻害する能力を試験するために、インヒビターＢを、そのＩＣ５０の８０倍、４０倍、２０倍、１０倍、５倍まで希釈し、１ｍｌを、感染３０分前に細胞の各ウェルに加えた（最終濃度は４０、２０、１０、５、２．５×ＩＣ５０）。
【０１４３】
アデノウイルスを、２００μＬ中に２μＬ加えることによって１：１００に希釈し（元来のストック１．８×１０12）、次いで、１２．５ｍｌの培地に１４μＬを加え（これは、２０のＭＯＩを与えるはずである）、そして各ウェルに１ｍｌの培地を加えた。細胞を７２時間インキュベートし、２０μＬの培地をＳＥＡＰ化学発光アッセイ(TROPIX)のために使用した。研究の結果を図１０に示す。
【０１４４】
［実施例６］
［ＨＣＶ  ＷＴおよびＭＴ  ＮＳ３・４Ａレポーター構築物を有するアデノウイルスベクターで形質導入されたマウスの血清中のＨＣＶ−ＳＥＡＰの分泌］
ＷＴを含むアデノウイルスで形質導入されたマウス対ＭＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰを含むアデノウイルスで形質導入されたマウスにおいて分泌されるＳＥＡＰの量を試験および比較するために、各ウイルスのセットをＳＣＩＤマウスの尾静脈に注射した。ＳＥＡＰをこれらのマウスの血清中で測定し、結果を図１１に示す。結果はＰ＜．００１で有意であった。
【０１４５】
ＨＣＶプロテアーゼインヒビターが、ＭＴプロテアーゼではなく、ＷＴ  ＨＣＶプロテアーゼの制御下でのＳＥＡＰの分泌を阻害し得るか否かを研究するために、６週齢のＳＣＩＤマウスに、ＳＥＡＰレポーター遺伝子に融合したＨＣＶ  ＷＴまたはＨＣＶ  ＭＴタンパク質のいずれかを発現する１０10または１０9.5ＩＦＵアデノウイルスを注射した。マウスに、Ｎｉｒｏ懸濁媒体中の３００ｍｇ／ｋｇのインヒビターＢを、２日間の間、１日に２回投薬した。７２時間後、マウスを出血させ、血清中のＳＥＡＰのレベルを、血清の１：５００希釈後にBD Biosciencesキットを使用して見積もった。研究の結果を図１２に示す。
【０１４６】
［実施例７］
［ＨＣＶ肝疾患の病理学のためのモデル］
６週齢ＳＣＩＤマウスに、野生型（ＷＴ）または変異型（ＭＴ）ＨＣＶプロテアーゼのいずれかを発現する示したアデノウイルス構築物（１０11ＩＦＵ／マウス）を注射した（尾静脈注射）。ＷＴウイルスを注射した１つの群のマウス（ｎ＝８）を、３日間、ＨＣＶプロテアーゼインヒビター（インヒビターＢ、３００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ）で処理した。７日後に動物を屠殺し、肝臓を病理検査のために収集した。全体の形態学的変化を図１３に示す。
【０１４７】
［実施例８］
［脂肪肝のオイルレッドＯ染色（脂肪症）およびヘマトキシリン対比染色を用いる核対比染色］
１．−８０℃にて保存した肝臓のクリオスタット凍結切片を試験した。
２．オイルレッドＯ溶液を以下のように調製した：
ａ）ストック溶液オイルレッドＯ：５００ｍｇのオイルレッドＯ染料(Sigma O-0625)を、１００ｍｌのイソプロパノール中で、室温にて一晩、攪拌しながら溶解した。この溶液を#1Whatmanフィルターを通して濾過した。溶液を遮光して室温で保存した。
ｂ）ワーキングオイルレッド溶液を、アッセイの日に新鮮に調製した。４０％の水を６０％のオイルレッドＯストックとひっくり返して混合した。
ｃ）ワーキング溶液を、濾過の前に１時間室温に保った。粒子材料を、#1 Whatman濾紙を使用して濾過した。
３．スライドを、ＰＢＳ中の１０％ホルマリン中に室温で２時間固定した。
４．固定したスライドを、ＤＩ水で３回、５分間注意深くすすいだ。すすぐときに肝臓薄片を洗い流さないように常に注意を払った。
５．固定したスライドを、ワーキングオイルレッドＯ溶液で、２時間室温で染色した。
６．固定し、かつ染色したスライドを、ＤＩ水で１時間注意深くすすいだ。第２のＤＩ水洗浄を一晩行い、第３の洗浄をさらに１時間行った。
７．Harrisヘマトキシリンを用いて核対比染色を１分間行った。
８．スライドを５分間水道水で１回すすいだ。
９．スライドを、ＤＩ水でさらに２回、５分間すすいだ。
１０．媒体への油の抽出を妨害するために、スライドを水性マウンティング媒体（Biomeda-Gel／マウント、抗退色剤＃Ｍ０１Ｄ）にマウントした。
１１．スライドの端を清浄なマニキュア液でシールした。
１２．スライドを平らに６℃で保存した。
１３．結果を顕微鏡によって評価した。
【０１４８】
参考文献：
Flinders Medical centre;Modified Oil Red O Technique,p.108からのHistopathology Methods 4.(www.hoslink.com/histo/4.HTM);Cook HC,Manual of Histological Demonstration Techniques,p 360 Cullings CFA,Handbook of Histopathlogical and Histochemical Techniques 3rd ed;およびHistochemistry(1992)493-497。
【０１４９】
［実施例９］
［ＨＣＶレプリコン細胞の生成］
親のＨｕｈ−７細胞を、１０％加熱変性胎仔ウシ血清（ΔＦＢＳ，ＪＲＨ）を含み、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび非必須アミノ酸（ＪＲＨ）を補充したＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、JRH Biosciences,Lenexa,KS)中で培養した。細胞を、Lohmamnn et al.(Lohmann,V.,F.Korner,J.Koch,U.Herian,L.Theilmann,およびR.Bartenschlager.1999.Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.(Science 285:110-3)によって記載されたＩ377ｎｅｏ／ＮＳ３−３’／ｗｔレプリコンと同一である、インビトロ転写されたサブゲノムＨＣＶレプリコンＲＮＡでトランスフェクトした。自己複製ＨＣＶレプリコンを含む安定な細胞を、２５０μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８(Invitrogen,Carlsbad,CA)の存在下で選択および維持し、次いで、引き続くＨＣＶレプリコンアッセイにおいて使用された。
【０１５０】
［実施例１０］
［２日ＨＣＶ−レプリコン阻害アッセイ］
ＨＣＶレプリコン細胞を、９６ウェルプレート中で、１０％ΔＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、ウェルあたり１０4細胞の密度でプレートし、細胞を接着させ、かつ一晩（〜１６時間）増殖させた。次いで、培養培地を除去し、２％ＦＢＳおよび０．５％ＤＭＳＯの存在下で段階希釈した化合物を含む（またはコントロールとして化合物なし）ＤＭＥＭで置き換えた。細胞を化合物とともに４８時間インキュベートした。化合物の抗ウイルス活性を決定するために、全（細胞内）ＲＮＡを、Qiagen RNeasy 96キット(Qiagen,Valencia,CA)を使用して細胞から抽出した。ＨＣＶ  ＲＮＡのレベルを、リアルタイム多重化定量的ＲＴ−ＰＣＲ(Taqman、WO 02/061149を参照のこと)によって、ＨＣＶ−特異的プライマー（５’−ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＣＴＧ  ＴＧ−３’）および５−ＣＣＧ  ＧＴＣ  ＧＴＣ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＡＴＴ  Ｃ−３’）ならびにＨＣＶ−特異的プローブ（５’−６−ＦＡＭ−ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  Ａ−ＴＡＭＲＡ−３’）、ならびにABI Prism 7700 Sequence Detection System(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用して測定した。ＲＮＡ抽出および定量のための内部コントロールとして、既知量のＢＶＤＶ  ＲＮＡを、抽出の前に各サンプルに加え、そして多重化ＲＴ−ＰＣＲにおいて特異的プライマーおよびプローブを用いて増殖した。各データ点は、５回の複製（細胞培養中）の平均を表す。ＩＣ50は、レプリコン細胞中のＨＣＶ  ＲＮＡレベルが５０％減少する化合物の濃度である。細胞毒性効果をモニターするために、４８時間の化合物処理後に同じレプリコン細胞の生存度を、テトラゾリウム化合物（ＭＴＳ）ベースのアッセイ(CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay,Promega,Madison,WI)を使用して決定した。ＣＣ50は、細胞生存度が５０％減少する化合物の濃度である。
【０１５１】
［実施例１１］
［ＨＣＶ  Ｋｉ  アッセイプロトコール］
５ＡＢ基質および生成物基質：
NH2-Glu-Asp-Val-Val-(alpha)Abu-Cys-Ser-Met-Ser-Tyr-COOH
の分離のためのＨＰＬＣミクロボア方法。
２０ｍＭ  ５ＡＢ（または実験者の選択した濃度）のストック溶液を、ＤＭＳＯ  ｗ／０．２Ｍ  ＤＴＴ中で作製する。これを−２０℃でアリコートで保存する。
緩衝液：５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．８；２０％  グリセロール；１００ｍＭ  ＮａＣｌ
全アッセイ容量は１００μＬであった。
【０１５２】
【表１】
2007505603.tif 000007
【０１５３】
緩衝液、ＫＫ４Ａ、ＤＴＴ、およびｔＮＳ３は合わせて；９６ウェルプレートのウェルに各７８μＬ分配する。これを３０℃で約５〜１０分間インキュベートする。
【０１５４】
適切な濃度の試験化合物２．５μＬをＤＭＳＯ中に溶解し（コントロールのためにＤＭＳＯのみ）、各ウェルに加える。これを室温で１５分間インキュベートする。
【０１５５】
２０μＬの２５０μＭの５ＡＢ基質（２５μＭ濃度は等価であり、または５ＡＢについてのＫｍよりもわずかに低い）の添加によって反応を開始する。
【０１５６】
３０℃で２０分間インキュベートする。
【０１５７】
２５μＬの１０％  ＴＦＡの添加によって反応を停止する。
【０１５８】
１２０μＬのアリコートをＨＰＬＣバイアルに移す。
【０１５９】
以下の方法によって基質およびＫＫ４ＡからＳＭＳＹ産物を分離する。
ミクロボア分離方法：
機器：Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００
脱気装置  Ｇ１３２２Ａ
バイナリポンプ  Ｇ１３１２Ａ
オートサンプラー  Ｇ１３１３Ａ
カラム恒温チャンバー  Ｇ１３１６Ａ
ダイオードアレイ  Ｇ１３１５Ａ
カラム：
Phenomenex Jupiter；５ミクロン  Ｃ１８；３００オングストローム；１５０×２ｍｍ；Ｐ／Ｏ  ００Ｆ−４０５３−Ｂ０
カラムサーモスタット：４０℃
注入量：１００μＬ
溶媒Ａ＝ＨＰＬＣグレード水＋０．１％  ＴＦＡ
溶媒Ｂ＝ＨＰＬＣグレードアセトニトリル＋０．１％  ＴＦＡ
【０１６０】
【表２】
2007505603.tif 000008
停止時間：１７分
実行後時間：１０分
【０１６１】
本明細書で使用される場合、用語「含む」は、特定の薬剤または成分に加えて、他の薬剤または成分を潜在的に含むことを表す。
【０１６２】
本明細書で引用される全ての文献は、参照により本明細書によって組み込まれる。
【０１６３】
本発明者らは本発明の多数の実施形態を記載してきたが、本発明者らの基本的な実施例は、本発明の化合物および方法を利用する他の実施形態を提供するように変化されてもよいことが明らかである。したがって、本発明の範囲は、上記の実施例によって提示されてきた特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によって規定されることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーターと融合された野生型（ＷＴ）および変異型（ＭＴ）のＨＣＶプロテアーゼを発現するレポーター遺伝子の概略図である。
【図２】（ＭＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰタンパク質）間にＣ型肝炎ウイルスの４ＡＢジャンクション（下線部）を有するＳＥＡＰタンパク質に融合された変異型ＨＣＶプロテアーゼのアミノ酸配列を示す。ＨＣＶプロテアーゼの非構造タンパク質３（ＮＳ３）成分および非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）成分のアミノ末端およびカルボキシ末端の境界は矢印で印付けられる。プロテアーゼ活性部位中のＮＳ３タンパク質（ボックスを付す）のセリン１３９はアラニンに変異され（Ｓｅｒ→Ａｌａ）、これはプロテアーゼを不活性にする。
【図３】（ＷＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰタンパク質）間にＣ型肝炎ウイルスの４ＡＢジャンクション（下線部で示される）を有するＳＥＡＰタンパク質に融合された野生型ＨＣＶプロテアーゼのアミノ酸配列を示す。ＨＣＶプロテアーゼの非構造タンパク質３（ＮＳ３）成分および非構造タンパク質４Ａ（ＮＳ４Ａ）成分のアミノ末端およびカルボキシ末端の境界は矢印で印付けられる。
【図４】（ＭＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰ  ＤＮＡ）間にＨＣＶタンパク質の４ＡＢジャンクションを有するＳＥＡＰオープンリーディングフレームに融合された変異型ＨＣＶプロテアーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。プロテアーゼを不活性するがオープンリーディングフレームを変化させることはない活性部位における変異に下線を付す。
【図５】（ＷＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰ  ＤＮＡ）間にＨＣＶタンパク質の４ＡＢジャンクションを有するＳＥＡＰオープンリーディングフレームに融合された野生型ＨＣＶプロテアーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【図６】ＨＣＶ  ＷＴ・ＭＴ  ＮＳ３・４Ａ  ＳＥＡＰプラスミドでトランスフェクトされたマウス肝細胞の上清からのＲＬＵ単位として測定されるＳＥＡＰレベルを示す。
【図７】ＳＥＡＰ分泌に対するＨＣＶプロテアーゼインヒビターの効果を示す。
【図８】ＳＥＡＰレポーター遺伝子に融合されたＨＣＶ  ＷＴ／ＭＴプロテアーゼをコードするアデノウイルス構築物の概略図である。
【図９】Ａｄ／ＨＣＶ  ＷＴまたはＡｄ／ＨＣＶ  ＭＴ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰ感染マウス肝細胞における培地中でのＳＥＡＰ放出を図示する。
【図１０】マウス肝細胞の培地中でのＳＥＡＰのＡｄ／ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ依存性発現に対するＨＣＶプロテアーゼインヒビターの効果を示す。
【図１１】Ａｄ／ＷＴおよびＡｄ／ＭＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰで感染されたＳＣＩＤマウスの血清中でのＳＥＡＰ分泌を示す。
【図１２】ＨＣＶプロテアーゼインヒビターを用いる治療に際してＡｄ／ＷＴおよびＡｄ／ＭＴ  ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰで感染されたＳＣＩＤマウスの血清中でのＳＥＡＰ分泌の効果を示す。
【図１３】ａ）Ａｄ−ＷＴ−ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰ、ｂ）Ａｄ−ＷＴ−ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰおよびＨＣＶインヒビターを用いる処理、ならびにｃ）Ａｄ−ＭＴ−ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａ−ＳＥＡＰの間での形態学的な違いを図示する。
【図１４】本発明の動物モデルにおけるＶＸ−９５０のＮ−プロピル側鎖のＤ異性体およびＬ異性体の混合物の組成物を使用する用量応答研究を図示する。
【図１５】本発明において使用される構築物の要約および得られたデータの要約である。
【図１６】本発明に従うモデルにおける例示的なプロテアーゼインヒビターの活性の要約である。
【図１７】本発明に従うモデルからの未処理および処理したサンプルを示す。
【図１８】ＶＸ−９５０（Ｄ異性体およびＬ異性体の混合物が使用された）の構造およびそれに関連するアッセイデータを示す。
【図１９】ＶｅｒｔｅｘＨＣＶプロテアーゼマウスモデルにおけるＶＸ−９５０（Ｄ異性体およびＬ異性体の混合物）の活性である。  Ａ）感染したマウスにおけるアデノウイルスの分布。感染の２４時間後にＡｄ．ＨＣＶ．ｐｒｏ．ＷＴ．ＳＥＡＰの１０9.5ＩＦＵ／マウスを静脈内注射したマウスの種々の器官におけるＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質の検出。Ｈ−心臓、Ｓｐｌ−脾臓、Ｋｉ−腎臓、Ｌｕ−肺、Ｌｉ−肝臓。種々の器官からの２０μｇのホモジネート溶解物は４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル上で電気泳動され、続いて抗ＮＳ３モノクローナル抗体を用いる免疫検出を行った。１３０ｋＤマーカーは未切断の融合タンパク質を示し、７０ｋＤマーカーは切断されたＮＳ３タンパク質を示す。一番下のパネルは、ストリップされ、マウスＧＡＰＤＨに対して指向されるモノクローナル抗体で再プローブされた同じウェスタンブロットにおいて検出された３６ｋｄａグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）タンパク質を示す。ＧＡＰＤＨレベルは、各レーンにおいて負荷されたタンパク質のほぼ等量を示す。  Ｂ）インビボでのＶＸ−９５０活性の実証：ＳＣＩＤマウスに、Ａｄ．ＷＴ．ＨＣＶｐｒｏまたはＡｄ．ＭＴ．ＨＣＶｐｒｏのいずれかの１０9.5ＩＦＵ／マウスを注射し（尾静脈によって）、続いて、１日に２回、経口的に３００ｍｇ／ｋｇのＶＸ−９５０のあるなしを行う。血清を感染の２４時間後に収集し、続いてＳＥＡＰについて化学発光アッセイを行った。未処理コントロールと比較して、ＶＸ−９５０による血清中でのＳＥＡＰ分泌の２７倍の減少が存在した。変異型ＨＣＶプロテアーゼ活性に対する効果は認められなかった。  Ｃ）ＨＣＶプロテアーゼ動物モデルにおけるＶＸ−９５０の力価測定：ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６／群につき）に種々の量のＶＸ−９５０を経口的に投薬され（図に示されるように）、２時間後、尾静脈によって、１０9.5ＩＦＵ／マウスのＡｄ．ＷＴ．ＨＣＶｐｒｏ／マウスを注射した。血清を、感染の２４時間後に感染したマウスから収集し、ＳＥＡＰ化学発光アッセイに供した。ＶＸ−９５０処理マウスの血清中のＳＥＡＰレベルは、溶剤単独処理群の％として表現された。有効用量５０（ＥＤ５０）は、溶剤単独処理群と比較して５０％、血清中のＳＥＡＰ放出を阻害するＶＸ−９５０の用量として計算される。
【図２０】ＶＸ−９５０は肝臓損傷からマウスを保護する。６週齢ＳＣＩＤマウスに、Ａｄ．ＷＴ．ＨＣＶｐｒｏ（ＷＴとして標識された、１０11ＩＦＵ／マウスＡ、Ｂ、およびＣ）またはＡｄ．ＭＴ．ＨＣＶｐｒｏ（ＭＴとして標識された１０11ＩＦＵ／マウス）いずれかを注射した（尾静脈によって）。ＷＴウイルスを注射したマウス（ｎ＝８）は、１日に２回、経口的にＶＸ−９５０  ３００ｍｇ／ｋｇ、または最初の３日間の間溶剤のみのいずれかで処理した。動物を７日後に屠殺し、病理検査のために肝臓を収集した。いかなる薬物も感染なし（薬物なし）のＷＴプロテアーゼ、または感染しＶＸ−９５０で処理したＷＴプロテアーゼ、および感染したＭＴプロテアーゼからの肝臓の全体の外見が図に示される。病理学的な変化を示す肝臓からのヘマトキシレンおよびエオシン染色された肝臓切片（４００×）もまた、それぞれの肝臓の下に示される。
【図２１】ＶＸ−９５０は肝臓損傷からマウスを保護する。６週齢ＳＣＩＤマウスに、Ａｄ．ＷＴ．ＨＣＶｐｒｏ（ＷＴとして標識された、１０11ＩＦＵ／マウスＡ、Ｂ、およびＣ）またはＡｄ．ＭＴ．ＨＣＶｐｒｏ（ＭＴとして標識された１０11ＩＦＵ／マウス）いずれかを注射した（尾静脈によって）。ＷＴウイルスを注射したマウス（ｎ＝８）は、１日に２回、経口的にＶＸ−９５０  ３００ｍｇ／ｋｇ、または最初の３日間の間溶剤のみのいずれかで処理した。動物を７日後に屠殺し、病理検査のために肝臓を収集した。いかなる薬物も感染なし（薬物なし）のＷＴプロテアーゼ、または感染しＶＸ−９５０で処理したＷＴプロテアーゼ、および感染したＭＴプロテアーゼからの肝臓の全体の外見が図に示される。病理学的な変化を示す肝臓からのヘマトキシレンおよびエオシン染色された肝臓切片（４００×）もまた、それぞれの肝臓の下に示される。
【図２２】ＨＣＶプロテアーゼ動物モデルの模式図である。６週齢ＳＣＩＤマウスに、分泌胎盤アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に融合された野生型ＨＣＶプロテアーゼ、またはコントロールとしてＳＥＡＰに融合された変異型ＨＣＶプロテアーゼのいずれかを発現する複製欠損アデノウイルスを注射する（尾静脈によって）。ＨＣＶ  ＮＳ３・４Ａプロテアーゼ依存性ＳＥＡＰは、感染したＳＣＩＤマウスの血流中に分泌され、これは、化学発光アッセイによってアッセイされ得る。
【図２３】ＨＣＶプロテアーゼの発現と脂肪症の相関を示す。ＳＣＩＤマウスに、野生型ＨＣＶプロテアーゼを発現するアデノウイルスの増加濃度が注射された（半ｌｏｇ増分で１０7ＩＦＵ〜１０11ＩＦＵ／マウスの範囲）。感染の７２時間後、肝臓の凍結切片をオイルレッドＯで染色した。核をヘマトキシレンで対比染色した。分泌されるＳＥＡＰの発現の増加（および従ってＨＣＶプロテアーゼ活性）と相関する、肝臓における脂肪の蓄積の増加が観察される（２０×倍率が図において示される）。
【図２４】ＨＣＶプロテアーゼの発現との脂肪症の相関を示す。図２４は、４０×倍率が示される以外は図２３と同じである。肝細胞における細胞内脂肪の蓄積が観察され得る。
【図２５】ＨＣＶプロテアーゼ発現と関連する脂肪症がＨＣＶプロテアーゼインヒビターＶＸ−９５０によって改善され得ることを示す。ＳＣＩＤマウスは、野生型ＨＣＶプロテアーゼまたは変異型ＨＣＶプロテアーゼまたはＳＥＡＰ単独を発現する複製欠損アデノウイルスの１０11ＩＦＵ／マウスを注射された（ｎ＝６）。野生型ＨＣＶプロテアーゼを発現するアデノウイルスを注射されたマウスの１つの群（ｎ＝６）は、最初の３日間、経口経路を通して、３００ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤで処理された。全てのマウスは７日目に屠殺され、肝臓切片はオイルレッドＯで染色された。変異型ＨＣＶプロテアーゼ群またはＳＥＡＰ単独群のいずれかと比較した、野生型ＨＣＶプロテアーゼを発現するマウスの肝臓における脂肪の有意な蓄積（２０倍拡大）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図３−６】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
2007505603.tif 000039
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2007505603.tif 000042
【図１９Ａ】
2007505603.tif 000043
【図１９Ｃ】
2007505603.tif 000044
【図２０】
2007505603.tif 000045
【図２１】
2007505603.tif 000046
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2007505603.tif 000049
【図２５】
2007505603.tif 000050
【国際調査報告】
2007505603.tif 000051