(57)【要約】ＩＧＦ結合タンパク質配列に基づく新規組成物が提供される。ハイスループットな研究のための新規手段が提供される。ヒト疾患の治療のための新規の方法を提供する。ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドまたは低分子は、疾病を有する被験者に投与され、これにより疾患の症状を緩和する。本発明のＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドは、鉄代謝に重く関与する器官（例えば、心臓および腎臓）へと分子を送達するために特に有用であると考えられる。これらの知見はまた、鉄を運ぶ分子の細胞内取込みを調節する試薬が、ＩＧＦＢＰ−３およびこれから誘導されたペプチドの活性を調節するために使用され得ることを示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドを含む組成物であって、ここで、該ペプチドは、重量基準で、全長の成熟ＩＧＦ結合タンパク質と同等またはそれより大きい程度の生物学的特性を示し、該生物学的特性は、細胞インターナリゼーションであり、該ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドは、カベオリンコンセンサス結合部位をさらに含む、組成物。
【請求項２】
前記ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドは、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧおよびＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧからなる群より選択される配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
心臓障害、血管障害、筋肉障害、免疫障害、肝臓障害、脳障害、および腎臓障害からなる群より選択される障害の処置のための医薬の製造のための、ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドを含む組成物の使用であって、ここで該ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドは、重量基準で、全長の成熟ＩＧＦ結合タンパク質と同等またはそれより大きい程度の生物学的特性を示し、該生物学的特性は、細胞インターナリゼーションであり、該ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドは、カベオリンコンセンサス結合部位をさらに含む、使用。
【請求項４】
前記ＩＧＦ結合タンパク質由来のペプチドは、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧおよびＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧからなる群より選択される配列を含む、請求項３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、米国特許出願第１０／２６４，６７２号（２００２年１０月４日出願）の一部継続出願であり、この一部継続出願は、米国特許出願第１０／２１５，７５９号（２００２年８月９日出願）の一部継続出願であり、この後者の一部継続出願は、米国仮特許出願第６０／３２３，２６７号（２００１年９月１８日出願）に対して米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で優先権を主張している。これらはともに、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、疾患の処置ならびにハイスループットスクリーニングならびにその他の発見および研究適用におけるペプチドまたは低分子の組成物および使用方法に関し、特にインスリン様増殖因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）のＣＤ７４相同性ドメイン中に存在する配列由来の金属結合ペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
規定された標的細胞の増殖因子は、集団における広範囲にわたる生物学的応答（例えば、ＤＮＡ合成、細胞分裂、特定の遺伝子の発現など）を刺激するポリペプチドである。種々の増殖因子が同定され、これらの増殖因子としては以下が挙げられる：トランスフォーミング増殖因子βファミリー（ＴＧＦ−β）、上皮細胞増殖因子およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子ファミリー（ＦＧＦ）ならびに、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを含むインスリン様増殖因子ファミリー（ＩＧＦ）。多くの増殖因子が癌の病因に関係する。
【０００４】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ（「ＩＧＦ」）は、アミノ酸配列および構造において関
連し、それぞれのポリペプチドが約７．５キロダルトン（ｋＤａ）の分子量を有する。ＩＧＦ−Ｉは成長ホルモンの主作用を媒介し、従って出生後の一次成長メディエーターである。ＩＧＦ−Ｉはまた、種々の他の増殖因子の作用に関係する。これは、このような増殖因子による細胞の処置がＩＧＦ−Ｉの産生の増加をもたらすからである。対照的に、ＩＧＦ−ＩＩは胎児の成長において重要な役割を有すると考えられる。相対的に、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方がインスリン様活性（従ってこれらの名前がある）を有し、そして分裂促進性である（細胞分裂を刺激する）。
【０００５】
ＩＧＦ−Ｉが、多数の異なる種の癌由来の細胞の増殖を刺激することが見出された（Ｂｕｔｌｅｒら、１９９８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（１４）：３０２１−３０２７；Ｆａｖｏｎｉ  ＲＥら、１９９８、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７（１２）：２１３８−２１４７）。ＩＧＦ−Ｉは、さらに腫瘍細胞を含む多数の異なる細胞型に対して抗アポトーシス作用を発揮することが見出された（Ｇｉｕｌｉａｎｏ  Ｍら、１９９８  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９（８）：１３００−１３１１；Ｚａ
ｗａｄａ  ＷＭら、１９９８、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７８６（１−２）：９６−１０３；Ｋｅｌｌｅｙ  ＫＷら、１９９８、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４０：５１８−５２４；Ｔｏｍｓ  ＳＡら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８８（５）：８８４−８８９；Ｘｕ  Ｆら、１９９７、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９７（２）：４２９−４４０）。前向きな研究はＩＧＦ−Ｉを前立腺、胸部および結腸の癌に対する危険因子として示されており、一方で、ＩＧＦに対する主要な循環性結合タンパク質であるＩＧＦＢＰ−３は、保護効果を有するように見える（１０〜１２、２８、２９）。種々の他の観察は、さらに、ＩＧＦＢＰ−３と他のＩＧＦ−結合タンパク質（特にＩＧＦＢＰ−２）との相対的なバランスは、インビトロおよびインビボの両方での腫瘍細胞の増殖の制御において何らかの形で役立つという考えを支持する（７〜９）。最近の証拠はまた、ＩＧＦＢＰ−３がＩＧＦ非依存性の様式での腫瘍細胞の増殖（１３〜１７）およびアポトーシス（１４）において中心的な役割を果たし得ることを示唆する。
【０００６】
米国において毎年癌と診断される１３００万人の患者の約半数は、全身性疾患を有する（または、罹患の危険がある）。化学療法が、これらの患者に対する最も一般的な治療アプローチである（３４）。ほとんどの化学療法剤は主として分裂細胞に対して有効であり、そしてしばしば、骨髄抑制が用量を制限する毒性である。化学薬品はいくつかの範疇に
分類され、異なる作用機構を有するが、有効量では多くが、患者の生活の質に深刻な影響を与える副作用を有する。ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イリノテカン（ＣＰＴ−１１）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、シスプラチン、タモキシフェン、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシルは、種々の癌処置に使用される、一般的な薬剤で、これらは時々併用される。骨髄抑制に加え、胃腸管作用、粘膜炎、脱毛症および（ドキソルビシンの場合は）心毒性もまた、これらの薬剤とともに認められる（３４）。明らかに、これらの化学薬品に対して選択的に感受性のある腫瘍細胞を作製する方法を見出すことが目的である。
【０００７】
ほとんど全てのＩＧＦは、非常に小さな遊離型ＩＧＦ−Ｉが検出可能なように、ＩＧＦ−Ｉ、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ−３）および、酸不安定性サ
ブユニット（ＡＬＳ）と称されるより大きいタンパク質サブユニットの非共有結合的に結合した複合体として循環する。三元複合体は、それぞれ等モル量の３つの成分から構成される。いくつかの報告がＩＧＦＢＰ−３はＩＧＦの非存在下でラットＡＬＳと結合し得ることを示唆しているにも拘らず（Ｌｅｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：４９８２−４９８９，１９９５）、ＡＬＳは、ＩＧＦ結合活性が検出されず、ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体とのみ結合するように見える（Ｂａｘｔｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２０）：１１８４３−１１８４８；１９８９）。ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３／ＡＬＳの三元複合体は、約１５０ｋＤａの分子量を有し、二元ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体またはＩＧＦ単体と比較される場合、実質的に増加した循環中半減期を有する（Ａｄａｍｓら、Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．６（２−４）：３４７−３５６；１９９５年１０月に提出され、１９９６年に出版された）。この三元複合体は、「ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩが遊離型ＩＧＦの濃度の急激な変化を防止するためのレザバーおよび緩衝液として」働くと考えられる（ＭＯＤＥＲＮ  ＣＯＮＣＥＰＴＳ  ＯＦ  ＩＮＳＵＬＩＮ−ＬＩＫＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳにおける、Ｂｌｕｍら、（１９９１）「Ｐｌａｓｍａ  ＩＧＦＢＰ−３  Ｌｅｖｅｌｓ  ａｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ」、ｐｐ．３８１−３９３、Ｅ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。本質的に余剰の（非結合性の）循環中ＩＧＦＢＰ−３が存在しない一方で、実質的に余剰の遊離型ＡＬＳは実際に存在する（Ｂａｘｔｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６７：２６５−２７２、１９８８）。
【０００８】
ｐ５３（よく特徴づけられた腫瘍抑制因子）のいくつかの作用を媒介することを示唆する間接的な証拠が存在するにも拘らず（Ｆｅｒｒｙら、（１９９９）Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  ３１（２−３）：１９２−２０２）、ＩＧＦＢＰ−３がその細胞作用をどのように媒介するかはよく分らない。ＩＧＦＢＰ−３は、急速に増殖する細胞の核に移動される（Ｓｃｈｅｄｌｉｃｈら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（２９）：１８３４７−５２；Ｊａｑｕｅｓら、（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８（４）：１７６７−７０）。ＩＧＦＢＰ−３の機能的相互作用を規定するための有用な工程は、ＩＧＦＢＰ−３の細胞内標的および細胞外標的の驚くほど大きなアレイに特異的に結合する能力に関係するタンパク質ドメインを同定することである。既知の標的は以下を含む：ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インスリン（いくつかの条件下で）、酸不安定性サブユニット（ＡＬＳ）、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コラーゲンＩａ型、プレカリクレイン、ＲＸＲ−α、ウイルスの腫瘍性タンパク質、ヘパリン、特異的プロテアーゼ、細胞レセプター、ツーハイブリッドスクリーニングで同定された多くの細胞内標的、および核局在化輸送機構の構成成分（Ｍｏｈｓｅｎｉ−ＺａｄｅｈおよびＢｉｎｏｕｘ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８（１２）：５６４５−８；Ｃｏｌｌｅｔｔ−Ｓｏｌｂｅｒｇら、（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．８３（８）：２８４３−８；Ｒａｊａｈら、（１９９５）Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｓ．６（２−４）：２７３−８４；ＦｏｗｌｋｅｓおよびＳｅｒｒａ（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７１：１４６
７６−１４６７９；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（４２）：３０２１５−２１；Ｄｕｒｈａｍら、（１９９９）Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  ３１（２−３）：２１６−２５；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９８）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５（２Ｐｔ  １）：Ｅ３２１−３１）。
【０００９】
ＩＧＦＢＰ−３は、おおよそＩＧＦＢＰ−３遺伝子のエキソン１、２および３＋４にそれぞれ相当する３つの主要ドメインを有する。ＣＤ７４（インバリアント鎖）に見出されるモチーフおよび多数の他のタンパク質に相同的な配列を含むＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメイン（ドメイン３）は、ＩＧＦＢＰ−３の、血清、細胞外マトリックスおよび細胞表面成分と相互作用する能力に関係しているように見える。この領域中の配列に対して作製されたペプチドは、ＲＸＲ−α、トランスフェリン、ＡＬＳ，プラスミノーゲン、フィブリノーゲンおよびプレカリクレインを含む、多くのその既知のリガンドへのＩＧＦＢＰ−３の結合を干渉することが以前に示されている（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３３６０７−１３、２０００；Ｗｅｉｎｚｉｍｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：１８０６−１３、２００１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｅ３２１−３１、１９９８；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０２１５−２１、１９９９；Ｆｉｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６３１−８、１９９８）。しかし、現在までに、ＩＧＦＢＰ−３由来ペプチドは、これらのいかなるリガンドに対しても選択的で、高親和性な結合に十分であることが示されていない。
【００１０】
本分子のこの領域はまた、核トランスロケーションに関係するが、ＩＧＦＢＰ−３が標的細胞内へインターナリゼーションする機構はよく理解されない（Ｓｃｈｌｅｄｌｉｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１８３４７−５２、１９９８；Ｊａｑｕｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：１７６７−７０，１９９７）。最近記載された、ＩＧＦＢＰ−３のドメイン３の２２８−２３２残基が、対応するＩＧＦＢＰ−１（密接に関係するタンパク質）由来の残基に置換された変異体は、ＡＬＳ、ＲＸＲ−αおよびプラスミノーゲンに対して弱められた結合を示す（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５（２  Ｐｔ  １）：Ｅ３２１−３１；Ｆｉｒｔｈら、（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６３１−２６３８）。妊娠および重症疾病のような特定の生理条件下でのＩＧＦＢＰ−３の特異的なタンパク分解は、結合の変更およびそのＩＧＦリガンドの遊離を生じ得る。ＩＧＦＢＰ−３とＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩ（両方の増殖因子がＩＧＦＢＰ−３と同様の親和性で結合する）との二元複合体は、ＩＧＦＢＰ−３がグリコサミノグリカン、特異的プロテアーゼおよび細胞表面タンパク質と特異的に相互作用し得る細胞内環境に、内皮結合部を横切って溢出し得る。研究報告は、ＩＧＦＢＰ−４のタンパク分解を阻害し得るＩＧＦＢＰ−３中のＣ末端ドメインの存在を言及する（Ｆｏｗｌｋｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７４８１−８、１９９５；Ｆｏｗｌｋｅｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：２２８０−５、１９９７）。しかし、この推定プロテアーゼインヒビタードメインの正確な位置は、まだ記載されていない。ＩＧＦＢＰ−４タンパク分解は、妊娠、血管形成後の平滑筋細胞増殖、骨形成および卵胞優位（ｏｖａｒｉａｎ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｄｏｍｉｎａｎｃｅ）を含む多くの生物学的プロセスの中で重要な事象である（Ｂｙｕｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：８４７−５４、２００１；Ｂａｙｅｓ＿Ｇｅｎｉｓら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．２１：３３５−４１、２００１；Ｍｉｙａｋｏｓｈｉら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４２：２６４１−８、２００１；Ｃｏｎｏｖｅｒら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４２：２１５５、２００１；Ｒｉｖｅｒａら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６５：１０２−１１、２００１）。
【００１１】
ＩＧＦＢＰ−３が最も豊富なＩＧＦ結合タンパク質（「ＩＧＦＢＰ」）である一方で、少なくとも５つの他の異なるＩＧＦＢＰが種々の組織および体液中で同定されていること
は注目されるべきである。これらのタンパク質は、ＩＧＦを結合するにも拘らず、別個の遺伝子から由来し、異なるアミノ酸配列を有する。ＩＧＦＢＰ−３と異なり、他の循環ＩＧＦＢＰはＩＧＦで飽和されない。ＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ−５は、ＩＧＦおよびＡＬＳと１５０ｋＤａの三元複合体を形成し得る最適の既知のＩＧＦＢＰである。血清から単離された当該タンパク質のＮ末端フラグメントがＩＧＦ結合活性を保持するので、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ結合ドメインは、当該タンパク質のＮ末端部分にあると考えられている。しかし、他のＩＧＦＢＰのいくつかは、治療としてＩＧＦ−Ｉと組み合せた使用がまた示唆されている。
【００１２】
血清における主要なＩＧＦキャリアータンパクとしての役割に加え、ＩＧＦＢＰ−３は最近、多くの異なる活性を有することが示されている。ＩＧＦＢＰ−３は、外因的に添加されたＩＧＦ−Ｉの活性を阻害し得る場合、細胞表面上のまだ同定されていない分子に結合し得る（Ｋａｒａｓら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７２（２６）：１６５１４−１６５２０）。細胞表面へのＩＧＦＢＰ−３の結合がヘパリンによって阻害され得るにも拘らず、同定されていない細胞表面結合分子は、ヘパリン様細胞表面グルコサミノグリカンとは考えられない。これは、ヘパリングリコサミノグリカンの酵素学的な除去がＩＧＦＢＰ−３細胞表面結合に影響がないからである（Ｙａｎｇら、１９９６、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３７（１０）：４３６３−４３７１）。細胞表面結合分子が、Ｌｅａｌら（１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（３３）：２０５７２−２０５７６）によって同定されたＩＧＦＢＰ−３レセプターと同じであるか、または異なるかは明らかでない。このＩＧＦＢＰ−３レセプターは、Ｖ型トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）レセプターと同一である。
【００１３】
インビトロアッセイにおいて単独で使用される場合、ＩＧＦＢＰ−３はまた、アポトーシスを促進することが報告されている。興味深いことに、ＩＧＦＢＰ−３は、機能的な１型ＩＧＦレセプターを有する細胞および機能的な１型ＩＧＦレセプターを有さない細胞においてアポトーシスを促進することが示されている（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３７（３）：６９０−６９３；Ｒａｊａｈら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１８）：１２１８１−１２１８８）。しかし、アポトーシスが全長ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３のタンパク分解フラグメントによって誘導されるかどうかに関しては、矛盾する報告がある（Ｒａｊａｈら、同書；Ｚａｄｅｈら、１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８（７）：３０６９−３０７２）。より最近、多数の研究室で集められた多数の未発表のデータが、上記の出版物で作成された特許請求の範囲のいくつかを支持しない。現在までに検定されたインビボモデルにおいて、注入されたＩＧＦＢＰ−３タンパク質単体は、腫瘍増殖の制限において、入り混じった結果を示している。
【００１４】
米国特許第５，６８１，８１８号は、癌の処置におけるソマトメジン依存性腫瘍の増殖を制御するためのＩＧＦＢＰ−３の投与に関する。米国特許第５，８４０，６７３はまた、腫瘍増殖を制御するための方法としてＩＧＦＢＰ−３レベルの間接的な細胞内調節を記載する。米国特許第６，０１５，７８６号は、ＩＧＦ依存性腫瘍の処置のための、ＩＧＦ変異体と複合体化されたＩＧＦＢＰ−３の使用を開示する。しかし、これらの特許のいずれも、投与されたＩＧＦＢＰ−３タンパク質の腫瘍増殖に対する直接的なインビボ効果を開示する。これらの特許はすべて、インタクトなＩＧＦＢＰ−３（そのＩＧＦ結合ドメインを含む）の使用を予見する。多数の出版（Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ
６０（１）：２２−７，２０００；Ｐｅｒｋｓら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７５（４）：６５２−６４，１９９９；Ｍａｉｌｅら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４０（９）：４０４０−５，１９９９；Ｇｉｌｌら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（４１）：２５６０２−７，１９９７）はさらに、培養細胞に対するＩＧＦ結合タンパク質、放射線およびセラミドの併用効果を示す。１つの報告（Ｐｏｒｔｅｒａら、Ｇｒｏｗｔｈ
Ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０００、補遺Ａ、Ｓ４９−Ｓ５０、２０００）において、ＣＰＴ−１１と併用されたＩＧＦＢＰ−３は、インビボおよびインビトロ両方の結腸癌において相加的な効果を示した。上記の研究はすべて、ＩＧＦ（抗アポトーシス性である）を細胞に運ぶことが可能である一方、自身が保有するＩＧＦ依存性のプロアポトーシス作用も発揮し得る多機能分子である、インタクトなＩＧＦＢＰ−３を使用して行われた。明らかに、これらの２つの活性を分子レベルで分離することが目的であるが、インタクトなＩＧＦＢＰ−３の活性の所望のサブセットを示す分子は、記載されていない。
【００１５】
ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３は、天然供給源から精製され得るか、または組換え手段により作製され得る。例えば、ヒト血清からのＩＧＦ−Ｉの精製は、当該分野で周知である（Ｒｉｎｄｅｒｋｎｅｃｈｔら、（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７３：２３６５−２３６９）。組換えプロセスによるＩＧＦ−Ｉの産生は、１９８４年１２月に発行されたＥＰ  ０  １２８  ７３３に示される。ＩＧＦＢＰ−３は、Ｂａｘｔｅｒら（１９８６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１３９：１２５６−１２６１）に示されるようなプロセスを使用して、天然供給源から精製され得る。あるいは、ＩＧＦＢＰ−３は、Ｓｏｍｍｅｒら、ｐｐ．７１５−７２８、ＭＯＤＥＲＮ  ＣＯＮＣＥＰＴＳ  ＯＦ  ＩＮＳＵＬＩＮ−ＬＩＫＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲＳ（Ｅ．Ｍ．Ｓｐｅｎｃｅｒ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）で議論されるように、組換え的に合成され得る。組換えＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−Ｉと１：１の分子比で結合する。
【００１６】
ラットおよびブタの創傷に対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体の局所投与は、ＩＧＦ−Ｉ単独投与（Ｉｄ．）よりも顕著により効果的である。下垂体切除されたラット、卵巣摘出されたラットおよび正常なラットに対するＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体の皮下投与、ならびにカニクイザルに対する静脈内投与は、単独で投与された（Ｉｄ．）ＩＧＦ−Ｉの「低血糖作用を実質的に阻害する」。
【００１７】
ＩＧＦ／ＩＧＦＢＰ−３複合体の使用は、多種多様の障害（例えば、米国特許第５，１８７，１５１号、同５，５２７，７７６号、同５，４０７，９１３号、同５，６４３，８
６７号、同５，６８１，８１８号および同５，７２３，４４１号、ならびに国際特許出願番号ＷＯ  ９５／０３８１７、ＷＯ  ９５／１３８２３、およびＷＯ  ９６／０２５６５を参照のこと）の処置について示唆されている。ＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦＢＰ−３複合体はまた、糖尿病および股関節骨折手術からの復帰を含む、複数の適応症に対する処置として、Ｉｎｓｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．によって開発中である。
【００１８】
当業者にとって、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦＢＰ−３の複合体は通常、異なる化合物であるとみなされ、そして、ＩＧＦＢＰ−３単独と比して異なる生物学的効果を有するとみなされる。
【００１９】
癌の処置に対して利用可能な膨大数の細胞傷害性薬物が存在する一方で、これらの薬物は一般的に、脱毛症、白血球減少症、粘膜炎を含む、種々の深刻な副作用と関連する。従って、当該分野において、従来の細胞傷害性化学療法に付随する深刻な副作用を誘導しない癌治療に対する必要性がある。この目的を達成するための１つの方法は、細胞傷害薬物に選択的に感受性な標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を作製し、それによって深刻な副作用を付随しないより低用量での、このような薬物の効果的な使用を可能にすることである。ＩＧＦ結合タンパク質由来のプロアポトーシスペプチドは、化学療法および他の薬剤に対する腫瘍細胞のアポトーシス応答を促進することが可能であり得る（２００１年９月１８日に提出された、Ｄ．Ｍａｓｃａｒｅｎｈａｓによる「インビボにおける標的細胞の選択的な感作のためのＩＧＦ結合タンパク質の使用方法」と題された米国同時係属出願を参照
のこと）。
【００２０】
現代の西側社会における生活様式の変化は、より長い寿命、よりこってりした食事、変化した睡眠パターン、増大したストレス誘導性の挙動および座っての挙動に関連すると考えられる、多発する疾患を誘発しているようである。生じ得るウイルス補因子（特に、エプスタイン−バーウイルスおよび他のヘルペスウイルス）の関与もまた、推測されている。この疾患群としては、癌、心脈管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、自己免疫疾患（例えば、関節炎）、喘息、および炎症性腸疾患、変性疾患（例えば、骨粗鬆症）、増殖性／炎症性疾患（例えば、網膜症）、ならびに代謝疾患（例えば、糖尿病）が挙げられる（Ｇｒｉｍｂｌｅ  ＲＦ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  Ｍｅｔａｂ  Ｃａｒｅ  ５：５５１〜５５９，２００２）。
【００２１】
これらの疾患のうちの（全てではないにしても）ほとんどの発症の増加に共通する要因は、免疫系（特に、細胞レベルでの慢性炎症応答）の役割変化である。そのような応答の細胞内分子特徴としては、しばしば、全般的な細胞内調節因子および細胞外調節因子（例えば、ＮＦ−κＢ、ＳＴＡＴ３（Ｎｉｕ  Ｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：２０００〜２００８，２００２）、ＶＥＧＦおよびシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２））の活性化が挙げられる。ＮＦ−κＢは、固形腫瘍におけるＨＩＦの生存促進誘導の主要媒介因子である（Ｔａｌｋｓ  ＫＬら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５７：４１１〜４２１，２０００）。ＣＯＸ−２インヒビターは、現在、種々の自己免疫適応症（例えば、関節炎および癌）を処置するために使用されている（Ｃｒｏｆｆｏｒｄ  ＬＪ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １４：２２５〜３０，２００２）。抗炎症剤であるラパマイシン（シロリムス）は、心脈管疾患の処置のために主に関係して、ステントをコーティングするために首尾良く使用されている（Ｄｅｇｅｒｔｅｋｉｎ  Ｍら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：１６１０〜３，２００２）。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（これは、慢性炎症についての代理マーカーである）の循環レベルが、現在、心臓病リスクの主要予測因子として使用されている（Ｆｕｔｔｅｒｍａｎ  ＬＧおよびＬｅｍｂｅｒｇ  Ｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  １１：４８２〜６，２００２；Ｌｉｂｂｙ  Ｐら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：１１３５〜４３，２００２）。肥満（これは、以前には、糖尿病および心臓病におけるリスクファクターとして関係付けられていた）は、これらの疾患に対する因果関係を提供するようである。なぜなら、脂肪細胞は、炎症促進性サイトカインを分泌することが公知である（Ｃｏｐｐａｃｋ  ＳＷ，Ｐｒｏｃ  Ｎｕｔｒ  Ｓｏｃ  ６０：３４９〜５６，２００１）からである。
【００２２】
上記の病因において主要な役割を果たす細胞の別の一般的分子特徴は、表面接着分子（特に、インテグリン）の提示である。研究により、α（ｖ）インテグリンおよびβインテグリンは、転移（Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  Ｂら、ＰＮＡＳ  ９８：１８５３〜８，２００１）、心脈管形成（Ｅｌｉｃｅｉｒｉ  ＢＰおよびＣｈｅｒｅｓｈ  ＤＡ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  ３：Ｓ２４５〜９，２０００）、アテローム性動脈硬化症（Ｎｉｃｈｏｌｓ  ＴＣら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ８５：１０４０〜５，１９９９）、骨粗鬆症（Ｐｆａｆｆ  ＭおよびＪｕｒｄｉｃ  Ｊ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４：２７７５〜２７８６，２００１）および自己免疫疾患のような多岐にわたるプロセスに関係付けられている。明らかに、これらのインテグリンを提示する細胞を特異的に標的とすることが可能な全身薬剤を使用することに対する利点が、存在する。この利点は、同じ薬剤が、標的細胞内の主要な全般的炎症促進性調節因子（例えば、ＮＦ−κＢ）のレベルもまた調節し得る場合には、特に大きい。
【００２３】
ＩＧＦＢＰ−３および本発明のＭＢＤペプチドは、これらの望ましい特性の両方ともを、明らかに示す。実施例の節において示されるように、マウス腫瘍モデル（乳癌１６Ｃ）において、ＩＧＦＢＰ−３タンパク質の一日一回の皮下注射により処置された動物における腫瘍は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）に対する感受性の増加を示した。腫瘍組織の後の実際の分析によって、ＮＦ−κＢは、ＩＧＦＢＰ−３＋アドリアマイシンで処置された動物の腫瘍において、アドリアマイシン単独で処置された動物の腫瘍に対して４分の１〜５分の１にダウンレギュレートされたことが示された。別の実験において、本発明者らは、ＩＧＦＢＰ−３およびＭＢＤペプチドは、特定の表面インテグリンを発現する細胞上で優先的に活性であることを示した。特に、α（Ｖ）インテグリンに対する抗体および特定のβインテグリンに対する抗体は、核によるＭＢＤペプチドの取り込みとその後の共アポトーシス性生化学事象とを防止し得る。従って、ＩＧＦＢＰ−３およびＭＢＤペプチドは、上記に列挙される疾患群と、α（ｖ）インテグリンもしくはβインテグリンおよび／または炎症促進性分子に依存するかあるいはそれらにより刺激される、細胞侵襲性により特徴付けられる他の任意の生物学的プロセスとを処置するための薬剤として、独特の機会を提示する。後者の例は、受精の間の栄養膜細胞層着床のプロセスである（Ｉｌｌｅｒａ  ＭＪら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．６２：１２８５〜１２９０，２０００）。
【００２４】
ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドおよび本発明の関連分子についての他の適用は、調節因子または炎症の診断レポーター、および以下における侵襲性プロセスを含むことを予見され得る：癌転移、腫瘍間質活性化、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような自己免疫疾患、多発性硬化症、糖尿病、強直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、クローン病および他の炎症性腸疾患、関節炎、喘息およびアレルギー、骨吸収性疾患、増殖性疾患、創傷治癒、網膜症を含む眼科系疾患、繊維性疾患、生殖性生物学、アテローム性動脈硬化症および他の心臓血管適応症；ゲノム学関連適用、およびプロテオミクス関連適用において有用な、薬物発見およびその他の研究プログラムにおけるハイスループットスクリーニング手段を含む研究手段、早期発現および新規遺伝子配列のスクリーニングのための現存の技術を強化することが可能な試薬およびベクター、遺伝子治療、診断およびナノテクノロジー適用；ならびに幹細胞関連の適用において有用な研究手段。
【００２５】
多数の天然プロセスおよび病理学的なプロセスが「炎症侵襲性の」または「炎症遊走性の」状態を含む。例としては以下が挙げられる：侵襲性腫瘍、胚盤胞移植／栄養膜細胞層移植、アテローム性プラ−ク沈着、骨交替、関節炎状態における関節腫脹、多発性硬化症、ＳＬＥなどのような再発軽減性（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ）自己免疫状態、増殖性網膜疾患および喘息における気道上皮の活性化。これらの生物学的プロセスの通常の特徴は、疾患状態に関連する局所的なクロストークに関与する、細胞型の活性化状態である。例えば、侵襲性の上皮腫瘍としては一般的に、（自身の腫瘍細胞に加えて）活性型間質細胞、微小血管上皮細胞および炎症性免疫細胞が挙げられる。これらの細胞型のいずれかの標的化の介入は、全ての疾患パターンに劇的に影響することが予想され得る。本発明者は、予期せずしてＩＧＦＢＰ−３およびＩＧＦＢＰ由来のペプチドが、このような活性化されていない同じ細胞型と比べて、活性化されている細胞において優先的に、細胞死／細胞アポトーシスをトリガーするということを見出している。確実な観察は、活性化された細胞および遊走細胞によって（Ｂｏｌｅｓら、２０００、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８：Ｌ７０３−Ｌ７１２；Ｌａｕｋａｉｔｉｓら、２００１、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５３：１４２７−１４４０）、および上皮腫瘍由来の骨髄微小転移巣において優先的に示されることが公知であり（Ｐｕｔｚら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２４１−２４８）、α−５インテグリンおよびβ−１インテグリンに対する共アポトーシス効果に依存する。
【００２６】
これらの効果を、ＩＧＦ−Ｉ依存性増殖作用の排除に関連する作用と区別することが重要である。文献が、乾癬のようなＩＧＦ−Ｉ依存性の炎症性プロセスに十分に言及する。例えば、米国特許第５，９２９，０４０号は、ＩＧＦ−Ｉレセプターを標的化し、それによって皮膚炎症を縮小するインヒビターの使用を教示する。ＩＧＦＢＰは、結合することによってこのレセプターを介するシグナル伝達を減少させ得、従ってＩＧＦ−Ｉを隔離し得る。しかし、本発明のＩＧＦＢＰ由来のペプチドは、ＩＧＦ−Ｉに結合せず、ＩＧＦ−Ｉレセプターを経由してこれらの効果を発揮するとは考えられない。
【００２７】
本発明ならびに、免疫不全および貧血を罹患する患者を治療するためのインタクトなＩＧＦＢＰ−３／ＩＧＦ−Ｉ複合体の使用を示す米国特許第５，５２７，７７６号の間にも
また区別がなされるべきである。本発明は、免疫不全ではなく、免疫刺激によって特徴付けられる状態を処置するためにＩＧＦＢＰ−３由来の非ＩＧＦ−Ｉ結合フラグメントを単独で使用する。
【００２８】
結果として、ＩＧＦＢＰ−３、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドおよび本発明に関連する分子は、脈管形成性の、破骨細胞形成性の（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ）生物学的プロセス、アテローム生成的な生物学的プロセス、侵襲的な生物学的プロセス、転移性の生
物学的プロセス、生殖性の生物学的プロセス、関節炎性の生物学的プロセス、喘息性の生物学的プロセス、繊維性の生物学的プロセス、網膜症性の生物学的プロセス、感染性の生物学的プロセス、炎症性の生物学的プロセス、神経変性の生物学的プロセス、ストレス関連の生物学的プロセス、細胞再構築の生物学的プロセス、または不死化関連の生物学的プロセス、調節因子または診断レセプターとして予見され得る。
【００２９】
特に、本明細書中に開示されるＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドまたはより小さい誘導体分子は、プロテアーゼインヒビター、金属キレート剤、抗増殖性分子、抗転移性分子、または抗血管形成分子として使用され得る。これらはまた、血漿キャリア剤、細胞外マトリックス成分への結合の促進剤、標的化剤、細胞内への大化合物もしくは小化合物の輸送剤（細胞インターナリゼーション剤）、アフィニティー精製タグ、スクリーニングタグ、転写剤もしくはＤＮＡ結合剤、細胞標識化剤、調節モジュレーターとして、または上記の性質のいずれかの組み合せを示す薬剤として有用であり得る。特に、このような誘導体分子は、ＩＧＦＢＰ−３のカルボキシ末端のＣＤ７４相同性ドメイン配列由来であり得、そしてこれらの活性の多くは、これまでＩＧＦＢＰ−３分子のこの領域に局在化しなかった。この領域の配列を作るペプチドは、これまでに、ＲＸＲ−α、トランスフェリン、ＡＬＳ、プラスミノーゲン、フィブロネクチンおよびプレカリクレインを含む、多数のその公知のリガンドとＩＧＦＢＰ−３との結合を妨害することが示されている（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｎｅｍ．２７５：３３６０７−１３、２０００；Ｗｅｉｎｚｉｍｅｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８６：１８０６−１３、２００１；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７５：Ｅ３２１−３１、１９９８；Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３０２１５−２１、１９９９；Ｆｉｒｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２６３１−８、１９９８）。しかし、現在まで、ＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドは、これらのリガンドのいずれかに対する選択的な高アフィニティー結合に十分であることが示されていない。
【００３０】
本明細書中で開示されるＩＧＦＢＰ−３由来の金属結合ドメインペプチドは、ＩＧＦ−Ｉに結合できないこと、独特な抗原性および、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦＢＰ−３推定デスレセプター（Ｐ４．３３）相互作用ドメイン（いわゆる「中央領域」；アミノ酸８８−１４８）の欠如を含む、多数の重要な方法において、以前に開示されたＩＧＦＢＰ−３由来分子と異なる。Ｐ４−３３推定デスレセプターは、国際特許出願番号ＷＯ  ０１／８７２３８（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＢＣ０３１２１７；ｇｉ：２１４１１４７７）に記載される。例えば、国際特許出願番号ＷＯ  ０２／３４９１６は、ＩＧＦ−Ｉへの結合が障害性であるＩＧＦＢＰ−３の点変異体の使用を教示する。しかし、記載される分子は、ＩＧＦＢＰ−３の中央領域を含み、Ｐ４．３３推定レセプターと相互作用することによって生物学的効果を発揮することが予想される。国際特許出願番号ＷＯ  ０１／８７２３８は、疾患の処置に対するＰ４．３３モジュレーターの使用を教示する。本発明の金属結合ペプチドは、Ｐ４．３３推定相互作用ドメイン（ＩＧＦＢＰ−３の中央領域）を含まない。米国特許第６，４１７，３３０号は、加水分解に耐性であるように改変されたＩＧＦＢＰ−３改変体の使用を教示する。ネイティブＩＧＦＢＰ−３中の核局在化シグナル（ＮＬＳ）が変更される改変ＩＧＦＢＰ−３もまた開示される。さらに、種々のＮ末端伸長を含む、アミノ末端伸長ＩＧＦＢＰ−３が開示される。全てのこれらの分子は、本発明の金属結合ドメインペプチドと２つの重要な点において異なる：これらの分子はＩＧＦ−Ｉに結合し、そしてこれらの分子は、Ｐ４．３３推定デスレセプターと相互作用すると考えられているＩＧＦＢＰ−３の中央領域を含む。いくつかの最近の刊行物は、培養中の細胞を処理するためのＩＧＦＢＰ−３ペプチドの使用を記載する。胸部癌細胞に有効であることが見出された唯一のペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の中央領域由来である（ＭｃＣａｉｇら、２００２、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８６：１９６３−１９６９；Ｐｅｒｋｓら、Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２９４：９８８−９９４、２００２）。この領域は、本発明の金属結合ドメインペプチドの配列中には存在しない。
【００３１】
鉄の代謝（特に、第１鉄）は、疾患の進行において、本発明に多くの可能性を提供する。例えば、新生物細胞は、高レベルのトランスフェリンレセプター（ＴｆＲ１）を発現し、非常に高い割合でトランスフェリン（Ｔｆ）から鉄（Ｆｅ）を吸収する。アンチセンスフェリチンオリゴヌクレオチドは、ヒト乳癌細胞において、増殖を阻害し、アポトーシスを誘導する（Ｙａｎｇら、２００２，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２２（３）：１５１３−２４）。アルテミシニン（ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ）は、第１鉄の存在下で細胞傷害性になる。鉄の流入は癌細胞内で高いので、アルテミシニンおよびそのアナログは、細胞内鉄濃度を増加させる条件下では、癌細胞を選択的に殺傷する（Ｓｉｎｇｈら、２００１，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．７０（１）：４９−５６）。鉄キレート剤は、癌細胞において、アポトーシス作用を生じ得る（Ｓｉｍｏｎａｒｔら、２００２，Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．８５（１）：９５−１０２；Ｇｒｅｅｎら、２００１，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７（１１）：３５７４−９）。癌のリスクはまた、身体の鉄貯蔵に関連することが知られている（Ｋａｔｏら、１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８０（５）：６９３−８）。
【００３２】
新生物の条件に加え、多くの他の疾患状態が、鉄のホメオスタイスにおいて特徴的な不均衡を示すことが知られている：これらの中でもとりわけ、パーキンソン病（Ｌｏｇｒｏｓｃｉｎｏら、１９９７，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４９（３）：７１４−７）、慢性関節リウマチ（Ｗｅｂｅｒら、１９８８，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．４７（５）：４０４−９）、炎症（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２７（２）：１０９−２２）およびアテローム性動脈硬化症（Ｓｃｈｍｉｚら、２００１，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ｉｍａｇｉｎｇ  １４（４）：３５５−６１）である。急性鉄毒および慢性鉄過負荷は、心筋不全の周知の原因である。正確な機構は知られていないが、過剰な鉄に触媒されたフリーラジカルの生成が、心筋を損傷し、心機能を変更することにおいて役割を果たしていると推測されている（Ｂａｒｔｆａｙら、１９９９，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐａｔｈｏｌ．８（６）：３０５−１４；Ｐａｒｋｓら、１９９７，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  １１７（２−３）：１４１−５１）。第１鉄は、ミトコンドリアＤＮＡを損傷し得る（Ａｓｉｎら、２０００，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８０（２−３）：１６１−４）。虚血器官への血流の再導入の際に生じる再還流傷害は、心臓発作および心臓拍動におけるかなりの損傷を担う。再還流傷害の主要な原因は、鉄媒介性のヒドロキシラジカル（・ＯＨ）の生成である（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（９）：５２６３−８）。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにより分泌される高度に拡散性の親油性鉄キレート剤の使用は、培養物において平滑筋細胞の増殖を阻害し（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、２００１，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４（１８）：２２２２−７）、インビボにおいて再狭窄を阻害する。
【００３３】
鉄粒子は、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）粒子（Ｆｅｒｕｃｃｉ，１９９１，Ｋｅｉｏ  Ｊ．Ｍｅｄ．４０（４）：２０６−１４；Ｔａｕｐｉｔｚら、１９９３，Ａｃｔａ  Ｒａｄｉｏｌ．３４（１）：１０−５；Ｍａｃｋら、２００２，Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ  ２２２（１）：２３９−４４）の形態で、磁気共鳴画像化においてコントラストを増強するために使用されている。より最近、これらの粒子は、鉄リッチな癌細胞において局所的な作用を生成するために、交流磁場と合わせられ、この手順は、「磁気熱切除」（Ｈｉｌｇｅｒら、２００２，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．３７（１０）：５８０−６；Ｓｈｉｎｋｅｉら、２００１，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９２（１０）：１１３８−４５）と呼ばれている。
【００３４】
この背景の節中におけるいかなる特許、特許出願、または刊行物に対するいかなる参照も、このような特許、特許出願、または刊行物が、本発明に対する先行技術を構成することを承認しないことを注意すべきである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３５】
（発明の開示）
本発明者は、驚いたことに、ヒトＩＧＦＢＰ−３配列の一部を含むＩＧＦＢＰ−３またはペプチドが、多数の有用な物理的性質および生物学的性質を示し得ることを見出している。特に、本発明者は、驚くべきことに、ＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドの細胞内局在化が、鉄の輸送、特に第１鉄（Ｆｅ＋＋）の輸送に関与する経路により媒介されることを発見した。従って、本発明のＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドは、鉄代謝に重く関与する器官（例えば、心臓および腎臓）へと分子を送達するために特に有用であると考えられる。これらの知見はまた、鉄を運ぶ分子の細胞内取込みを調節する試薬が、ＩＧＦＢＰ−３およびこれから誘導されたペプチドの活性を調節するために使用され得ることを示す。
【００３６】
本発明者らは、驚くべきことに、「コア」ＭＢＤの１４マー配列（ＯＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ）のカルボキシ末端へ６つのアミノ酸配列を付加し、カベオリン（ｃａｖｅｏｌｉｎ）のコンセンサス結合配列を作製することにより、核トランスロケーション活性の実質的な上昇を生じることをまた見出した。ＭＢＤの１４マーコア配列＋カベオリンコンセンサス結合配列を含むペプチドは、治療用分子の核トランスロケーションを指向するために有用である。
【００３７】
本発明は、ＩＧＦＢＰ−３のＣ末端ドメイン由来の、ほんの１２〜２２アミノ酸を含む短ペプチドが、全分子の共アポトーシス性質、細胞貫通性性質、および金属結合性質を模倣し得ることを明らかにする。これらのペプチド（「ＭＢＤペプチド」）は、以下に列挙する理由に対して、全長ＩＧＦＢＰ−３の使用の魅力的な代替法を提供する。
【００３８】
効能：ＩＧＦＢＰ−３のアミノ末端ドメインは、循環中でＩＧＦと結合し、かつＩＧＦを輸送し、多くの細胞型についてのＩＧＦの筋肉増強効果および抗アポトーシス効果を増強する一方、カルボキシ末端ドメインは、ＩＧＦＢＰ−３のＩＧＦ非依存性の効果を媒介すると考えられる。従って、この分子の治療剤としての効力は、その機能の二重性により本質的に緩衝され得る。ＭＢＤペプチドは、共アポトーシスアッセイにおいて、全長ＩＧＦＢＰ−３よりも、最大で３倍より活性であり、そしてＩＧＦＢＰ−３と異なり、ＭＢＤ活性は、細胞外マトリックスおよび血漿タンパク質によって激しく抑制されない。
【００３９】
処方：ＩＧＦＢＰ−３の中央ドメインは、タンパク質分解に対し精巧に感受性である。ＩＧＦＢＰ−３の有限の溶解性、その低い安定性および明白な凝集傾向に起因して、インタクトなＩＧＦＢＰ−３に対する適切な処方および都合の良い送達経路の開発は魅力的である。例えば、７０ｋｇの成人ＩＧＦＢＰ−３に対する１ｍｇ／ｋｇ／日の投与量のＩＧＦＢＰ−３（７ｍｇ／ｍｌ、リン酸緩衝食塩水中の最大溶解度）は、１０ｍｌ（皮下ボーラス注射に適さない）である一方、７０ｋｇの成人に対して０．５ｍｇ／ｋｇ／日で与えられるＭＢＤペプチド（ＰＢＳ中３５ｍｇ／ｍｌ）は、たった１ｍｌ（皮下ボーラス注射に適する）である。
【００４０】
安定性：ＭＢＤペプチドは、熱（９５℃、１０分間）に安定であり、そしてサイズが小さく、このことがＭＢＤペプチドを全長ＩＧＦＢＰ−３よりも、経皮または吸入剤に基づく送達経路としてより受け入れられやすくする。
【００４１】
費用：ＩＧＦＢＰ−３分子が生物学的に活性であるために、ＩＧＦＢＰ−３分子の全１８システイン残基は分子内ジスルフィド結合を形成しなければならない。このことは、細
菌性システムまたは酵母のシステムでの臨床グレードのＩＧＦＢＰ−３の十分な量の産生を、非常に魅力的にする。哺乳動物のシステムは、この分子の産業的生産には高価すぎる。ヒトＩＧＦＢＰ−３  ｃＤＮＡが１９８８年にクローン化されて以来、たった一つのグループがグラム量の臨床グレードの組換えＩＧＦＢＰ−３をうまく生産した。単４ｍｇ／ｋｇ皮下投与量のＩＧＦＢＰ−３の計画された販売価格は、１２年間にわたって開発、洗練されたＩＧＦＢＰ−３のための生産技術に基づいて、そして産業標準の原価（Ｃｏｓｔ
ｏｆ  Ｇｏｏｄｓ）（ＣＯＧ）に対する価格比を使用して、数千ドルの範囲であることが多い。払い戻しおよび他の考慮に基づいて、この価格は禁止され得る。一方、ＭＢＤペプチドは、当業者に周知の合成化学的方法または高度に効率的な生物学的生産システムのいずれかを使用して、ＩＧＦＢＰ−３よりも安くかつ簡単に生産されることが予想される。
【００４２】
いくつかの実験室からのデータを組み合わせた配列アラインメントは、構造的に自律性である一方、分子の腫瘍細胞に対するプロアポトーシス効果を特定するのに十分であることが多いＩＧＦＢＰ−３の領域への洞察を提供し得る。他の研究は、この同じドメインの他の配列が核局在化、ＲＸＲ−α結合、ならびに血清およびＥＣＭ成分との結合に関与することを示している（２１，２３〜２５，３５，４０）。我々は、この分子のこれらの領域を、動物界（哺乳動物、カエル、魚、ハエ、線虫）にまたがる、タンパク質の本質的に異なる群に見られるＣＤ７４相同性モチーフと配列比較した。本発明の目的のために、ＩＧＦＢＰ−３のＣＤ７４相同性ドメインは、成熟ＩＧＦＢＰ−３タンパク質のカルボキシ末端のおよそ６０アミノ酸残基、またはこれらの任意のサブセットを含むと規定される。
【００４３】
図２は、ＣＤ７４モチーフを含む、選択されたヒトタンパク質のアラインメントを示す。保存された残基は、太字で示される。ＩＧＦＢＰ−３中のイタリック体の残基は、核局在化およびコラーゲン結合に要求されるが、ＩＧＦ−Ｉ結合には要求されない。アスタリスクはＩＧＦＢＰ−３のＨＢＤ変異体における残基置換を示し、プラスミノーゲン、プレカリクレイン、ＡＬＳおよびＲＸＲ−αへの結合が損なわれる。＃で示されるこのペプチド領域は、緑色蛍光タンパク質と結合された場合に、細胞インターナリゼーションを促進するのに十分である。予備データは、この領域の一部を表現するペプチドが、培養中の細胞においてアポトーシスを促進するのに十分であり得ることをさらに示唆する。
【００４４】
本明細書中に開示されるのは、疾患の症状を緩和するための方法である。特定の実施形態は、目的の組織（例えば、心臓組織、脈管組織、筋肉組織、免疫組織、肝臓組織、脳組織および腎臓組織）に、特に、鉄代謝に重く関与する器官（例えば、心臓および腎臓）に治療用分子を送達するためにＭＢＤペプチドおよびその誘導体を利用する。このような実施形態において、ＭＢＦペプチドおよび治療用分子の結合体は、これらを必要とする被験体（例えば、心臓障害、脈管障害、筋肉障害、免疫障害、肝臓障害、神経障害または腎臓障害）に投与され、処置されると考えられる障害の少なくとも１つの症状の緩和を生じる。
【００４５】
本発明は、新生物、パーキンソン病およびアテローム性動脈硬化症のような変更された鉄代謝に関連する障害を処置する方法をさらに提供する。ＭＢＤペプチドおよび治療用分子を含む結合体は、変更された代謝に関連する障害を有する被験体に投与され、これらの障害のすくなくとも１つの症状の緩和を生じる。
【００４６】
特定の実施形態において、ＭＢＤペプチドは、ＭＢＤペプチド配列に加えて、またはこれと重なって、カベオリンコンセンサス結合配列（＃ｘ＃ｘｘｘｘ＃、ここで、「＃」は、芳香族アミノ酸である）を含む。カベオリンコンセンサス配列は、ペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端にあり得る。特定の好ましい実施形態において、カベオリンコンセンサス結合配列は、ペプチドのカルボキシ末端にあり、ＭＢＤのコア１４マー配列と重なっている。カベオリンコンセンサス結合配列を有する例示的なＭＢＤペプチドは、配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧまたはＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧを含むペプチドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、種々の有用な性質（細胞インターナリゼーションの方向付けを含む）を有する多数の新規ペプチド（およびペプチドの構造を模倣する低分子）に関連する。
【００４８】
疾患の処置のための新規方法が、本明細書中で開示される。本発明のペプチドの種々の活性は、ある種類の障害（心臓血管適応症、腎適応症を含む）を処置するために利用され得る。
【００４９】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「ＩＧＦ結合タンパク質」および「ＩＧＦＢＰ」は、６つのヒトインスリン様増殖因子結合タンパク質１〜６のいずれかに基づく天然分子および誘導体分子をいう。「誘導体ペプチドまたは低分子」は、本発明に適切なＩＧＦＢＰの構造的性質を保持するか、あるいは模倣する、ペプチドまたはペプチドも模倣物をいう。本明細書中の誘導体ペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の全長よりも短い配列を含む。本明細書中で使用される場合、その配列または構造がＩＧＦＢＰに対して同一であるか、または相同的である場合、ペプチドまたは低分子はＩＧＦＢＰ「由来」である。
【００５０】
「ＣＤ７４相同性ドメインペプチドまたは低分子」は、ＩＧＦＢＰ−３のカルボキシ末
端の６０アミノ酸配列の一部を含む誘導体ペプチドまたは低分子を意味する。
【００５１】
「金属結合ドメインペプチド」または「ＭＢＤペプチド」は、約１２〜約６０アミノ酸長の、好ましくは約１３〜４０アミノ酸長のＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたはポリペプチドを意味し、ＩＧＦＢＰ−３のカルボキシ末端６０アミノ酸中にＣＤ−７４相同性ドメイン配列のセグメントを含み、配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含み、そして金属結合性質を示すが、別個の抗原性性質を示すことでインタクトなＩＧＦＢＰ−３とは異なり、ＩＧＦ−Ｉ結合性質を欠如し、そして中央領域配列（ＩＧＦＢＰ−３配列のアミノ酸８８〜１４８）を欠如する。例えば、ペプチドＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは、金属結合ドメインペプチドの例である。これは、金属イオンに結合するが、ＩＧＦ−Ｉには結合せず、そしてこのペプチドに対するポリクローナル抗体はインタクトなＩＧＦＢＰ−３と実質的に交差反応せず、そしてその逆もまた真である。
【００５２】
「伸長金属結合ドメインペプチド」は、天然のＩＧＦＢＰ−３配列とは異なって、さらなる残基と連結された金属結合ドメインペプチドである。例えば、トリペプチドであるアスパラギン−グリシン−アルギニン（ＮＧＲ）のような伸長、または大きいタンパク質の配列が、薬物動態学的な標的化目的のためにか、または脂肪および核酸のような他の分子との結合体（「伸長金属結合ドメインペプチド結合体」）を調製する目的のために、付加され得る。
【００５３】
「改変金属ドメインペプチド」は、天然のアミノ酸配列が改変された金属結合ドメインペプチドまたは伸長金属結合ドメインペプチドであり、このような改変としては、以下が挙げられる：配列の任意の位置における天然のアミノ酸残基の保存的な置換、天然の状況においてＩＧＦＢＰ−３の対応する配列位置で生じることが見出されたリン酸化、アセチル化、グリコシル化もしくは他の化学的状態の変化、配列におけるＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置換、またはタンパク質−核酸（ＰＮＡ）のような鎖骨格化学の改変。
【００５４】
「コア金属結合ドメインペプチド」は、コア１２マー配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含む、１４アミノ酸長未満のペプチドである。例えば、ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ、ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣおよびＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは、コア金属結合ドメインペプチドである。
【００５５】
「伸長コア金属結合ドメインペプチド」は、コア１２マー配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含むが、以下の天然ＩＧＦＢＰ−３の１４マー配列：ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷを含まない、伸長金属結合ドメインペプチドである。
【００５６】
「改変コア金属結合ペプチド」は、コア１２マー配列ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣを含むが、以下の天然ＩＧＦＢＰ−３の１４マー配列：ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷを含まない、改変金属結合ドメインペプチドである。
【００５７】
「レトロ金属結合ドメインペプチド」は、逆転した順序でＤ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸のいずれかを含む、金属結合ドメインペプチドの誘導体である。
【００５８】
「細胞インターナリゼーションペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３のＣＤ７４相同性ドメインに存在する配列ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷまたはその一部を含む、ペプチドまたは他のタンパク質性分子、あるいはその変異体または他の誘導体を意味する。
【００５９】
「血漿循環ペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３の循環血漿タンパク質結合特性のいくらかまたは全てを保持する、ＣＤ７４相同性ドメインペプチドを意味する。プラスミノーゲン、
トランスフェリン、カリクレイン、酸不安定性サブユニットまたはフィブリノーゲンへの結合は、この範疇の例である。
【００６０】
「ＥＣＭ結合ペプチド」は、ＩＧＦＢＰ−３の細胞外マトリックス成分結合特性のいくらかまたは全てを保持する、ＣＤ７４相同性ドメインペプチドを意味する。ヘパリン、コラーゲンおよび細胞表面成分への結合は、この範疇の例である。
【００６１】
用語「処置レジメン」は、治療の過程をいう。処置レジメンは、単一の化学薬剤のような単一の薬剤を使用し得るが、より代表的には、２つ以上の異なる薬剤（例えば、複数の異なる細胞傷害性化学療法剤を用いる併用療法）を含み得、そして２つ以上の異なる型の薬剤（例えば、電離放射線のような物理薬剤と組み合わせた、パクリタキセルのような化学薬剤の投与）を含み得る。処置レジメンはまた、栄養レジメン、ストレスレジメンまたは運動レジメンをいい得る。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「緩和する」は、疾患の症状の改善、減殺（ｌｅｓｓｅｎｉｎｇ）、安定化または減少をいう。「緩和する」はまた、症状の進行の緩徐化、または停止を含む。例えば、癌の症状を緩和することとしては、腫瘍増殖を遅らせることもしくは安定化させること、腫瘍サイズを減少させること、または腫瘍を完全に除去することが挙げられる。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」は、鳥類および哺乳動物個体を含み、より具体的には、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌ）（例えば、犬、猫など）、農業用動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジなど）および霊長類（例えばヒト）を含む、脊椎動物個体をいう。
【００６４】
本明細書中で参照される場合、配列「同一性」および配列「相同性」は、ＢＬＳＡＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０）、特に、デフォルトパラメーター（例えば、Ｍａｔｒｉｘ  ０  ＢＬＯＳＵＭ６２、それぞれギャップオープンペナルティ１１および伸長ペナルティ１、ギャップＸ＿ドロップオフ５０ならびにワードサイズ３）を使用する、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって実行されているＢＬＡＳＴＰ  ２を使用して決定され得る。「連続した」アミノ酸といわれない限りは、配列は、必要に応じて、アラインメントを向上する適切な数のギャップまたは挿入を含み得る。
【００６５】
本明細書中で使用される場合、用語「結合体」は、ペプチドと第２の分子（例えば、転写調節因子または治療用分子）との間の共有結合体および非共有結合体の両方を包含する。非共有結合体は、結合対（例えば、ビオチンとアビジン、またはストレプトアビジン、または抗体（Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、ならびに他の抗体フラグメント／改変体））とその同族の抗原を使用することによって作製され得る。
【００６６】
本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同族は、その包含的意味で使用される；すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｄｉｎｇ）」およびその対応する同族と同等である。
【００６７】
本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別に指示されない限り、複数形の言及を含む。
【００６８】
（ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドおよび低分子組成物）
本発明の方法に従う使用のためのＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、任意の種由来であり得るが、種が一致したＩＧＦ結合タンパク質（すなわち、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子を投与するべき被験体と同じ種由来のネイティブ配列に基づいた、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子）が、好ましい（例えば、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子がヒト被験体に投与されることが意図される場合、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、ヒトＩＧＦＢＰ由来であることが好ましい）。本発明における使用のためのＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、非複合体化ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子であり、すなわち、ＩＧＦの非存在下で投与され（例えば、ＩＧＦ−Ｉ複合体として投与されない）、そして、好ましくはいかなるＩＧＦタンパク質も含まないで投与される。好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子は、ＩＧＦＢＰ−３由来である。
【００６９】
ＩＧＦＢＰ−３についての天然に存在するタンパク質配列の１つは、図１に示される。ヒトＩＧＦＢＰ−３は、２つの天然に存在する対立遺伝子改変体として見出される；アラニンが成熟なタンパク質の位置５で見出され得る（図１Ａに示される）か、あるいはグリ
シンがこの位置に見出され得る。さらに、ＩＧＦＢＰ−３の他の改変体が作製され得る。例えば、［Ｎ１０９Ｄ］−ＩＧＦＢＰ−３は、成熟配列の位置１０９にアミノ酸配列変更を有するが、現在までに試験されている多くのアッセイにおいて、野生型のＩＧＦＢＰ−３と非常に類似して振る舞うＩＧＦＢＰ−３の誘導体である。点変異誘導体はまた、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩまたはＩＧＦＢＰの他の公知のリガンドのいずれかに結合する能力において選択的に衰弱された変異体を含む。例えば、ＩＧＦＢＰ−５の保存的残基または半保存的残基Ｖａｌ４９、Ｔｙｒ５０、Ｐｒｏ６２、Ｌｙｓ６８、Ｐｒｏ６９、Ｌｅｕ７０、Ａｌａ７２、Ｌｅｕ７３およびＬｅｕ７４の１つ以上に対応する位置の点変異が、ＩＧＦ−Ｉ結合を衰弱させ得ることが示されている。これらの残基の多くは、他のＩＧＦ結合タンパク質でもまた、よく保持されている。ＩＧＦＢＰ−３の成熟配列の位置２２８および２３０における変異は、核移行および、コラーゲンのような細胞外マトリックスタンパク質との結合に影響すると考えられる。
【００７０】
ＩＧＦＢＰ−３またはＩＧＦＢＰ−３配列の一部に基づくペプチド誘導体の欠質変異体もまた、誘導体ペプチドおよび低分子の設計のための鋳型として使用され得る。ＩＧＦＢＰ−３分子は、２６４アミノ酸からなり、３つの主要な構造ドメインを有する。システインリッチなアミノ末端ドメイン（おおまかに成熟配列の最初の１００アミノ酸）が、ＩＧＦの高親和性結合に必須であることが公知である。中央ドメイン（約８０アミノ酸）は、システイン残基を有さず、そしてプロテアーゼに対して非常に敏感である。この部分はまた、特異的な細胞レセプターとの結合において重要な役割を果たし得る。カルボキシ末端ドメイン（約８０アミノ酸）はまた、システインリッチであり、そして、細胞外マトリックス分子（例えば、ヘパリンおよびコラーゲン）、血清分子（例えば、ＡＬＳ、プラスミノーゲンおよびフィブリノーゲン）、核レセプター（例えば、ＲＸＲおよびインポーティン（ｉｍｐｏｒｔｉｎ））との結合に必須の配列を含む。欠失変異体または点変異体を得るための核酸操作、タンパク質発現およびタンパク質精製の方法は、当該分野で公知である。
【００７１】
一旦、ＩＧＦＢＰ−３のドメインが、必要に応じて点変異分析または欠失分析によって決定され、そして特定の生物学的活性（例えば、標的細胞の感作）に十分である場合、ＩＧＦＢＰ配列の一部からなる、ペプチドのようなより低分子を設計することが可能である。例えば、配列
（Ｈ２Ｎ）．．．ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号１）；
（Ｈ２Ｎ）．．．ＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号２）；
（Ｈ２Ｎ）．．．ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号３）；および
（Ｈ２Ｎ）．．．ＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣ．．．（ＣＯＯＨ）（配列番号４）
のうちの１つ以上は、ＩＧＦＢＰ−３の生物学的効果のいくつかを模倣するのに十分であり得るが、本発明の特定の実施形態は、配列ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷおよび配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷを含むか、または配列ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷおよび配列ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷからなるペプチドを排除し得る。
【００７２】
ＩＧＦＢＰ−３の三次元構造は知られていないが、ＩＧＦＢＰ−３分子の関連領域とかなりの相同性を共有する、ＣＤ７４インバリアント鎖の構造は記載されている（Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：４５７−４６２、１９９５）。ＩＧＦＢＰ（好ましくはＩＧＦＢＰ−３）配列由来のペプチド模倣物分子は、当該分野で公知の技術を使用して、ＣＤ７４インバリアント鎖の三次元構造を参照して生成され得る。これらの誘導体分子のいずれもが、化学処置に対して標的細胞を感作する能力を含む、所望の生物学的活性につい
てアッセイされ得る。これらのアッセイの結果に基づき、変更された特性を有する、少ない数のＩＧＦＢＰ−３変異体またはＩＧＦＢＰ−３誘導体が、ヒト疾患の状況において、臨床試験のために選択され得る。
【００７３】
本発明は、ＭＢＤペプチドコア１４マー配列およびカベオリンコンセンサス結合部位を組み込むペプチドを提供する。カベオリンコンセンサス配列は、ペプチドの上流に（すなわち、アミノ末端に向かって）または下流に（すなわち、カルボキシ末端に向かって）配置され得、ＭＢＤコア１４マー配列と重複し得る。例示的な実施形態として、ペプチドＭＢＤ２０（ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧおよびＭＢＤ２１（ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＡＶＤＫＹＧ）が挙げられる。
【００７４】
（ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチド生成）
ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体は、通常、ＩＧＦＢＰ配列における全ての可能な改変体の生成を可能にする組換え法によって生成される。組換えＤＮＡの操作に関する技術は、当該分野で周知であるタンパク質の組換え生成に関する技術とも同様である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、１〜３巻（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、（１９８９）；または、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７）および定期的な最新情報を参照のこと）。公知の組成の誘導体ペプチドまたは低分子はまた、当該分野で周知の方法を使用して、化学合成によっても生成され得る。
【００７５】
ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子をコードする配列を含む核酸ベクターは、研究、ハイスループットスクリーニングまたは他のゲノム科学関連技術およびプロテオミクス関連技術の実行を促進するためにこれらの分子の改変された性質を利用し得る。特に、いくつかのＣＤ７４様ペプチドの金属結合特性は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂（例えば、Ｈｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ニッケル−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）およびＴａｌｏｎ樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ））を使用し、このような樹脂の製造業者によって推奨されるプロトコールを使用する、粗抽出物からの発現遺伝子産物の迅速なアフィニティー精製に役立ち得る。同様に、いくつかのＣＤ７４様ペプチドのプロテアーゼインヒビター特性は、精製の間の発現遺伝子産物の安定性に役立ち得る。いくつかのＣＤ７４様ペプチドの細胞インターナリゼーション性質は、特に細胞核への輸送が生物学的性質のスクリーニングを促進し得る場面において、哺乳動物細胞における、特定の遺伝子産物の迅速なスクリーニングに役立ち得る。ベクター内のＩＧＦ結合タンパク質由来配列の選択的タンパク質分解切断部位の使用は、ＩＧＦＢＰまたはそのペプチド誘導体の適切に折り畳まれたドメインの発見に役立ち得る。このような配列を含む遺伝子産物の発現後切断をもたらすためのヒトライノウイルス  ３Ｃプロテイナーゼの使用は、特に推奨される（参照）。
【００７６】
好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体は、組換え宿主細胞として細菌細胞株を使用して産生される。発現構築物（すなわち、宿主細胞における適切な発現に必須のＤＮＡ配列と実施可能に連結された、所望のＩＧＦ結合タンパク質または誘導体をコードする配列を含むＤＮＡ配列（例えば、構築物の５’末端のプロモーターエレメントおよび／またはエンハンサーエレメント、ならびに構築物の３’末端のターミネーターエレメント））が、宿主細胞に導入される。ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体をコードするＤＮＡ配列は、必要な場合、別のタンパク質（「融合パートナー」）をコードする配列と連結され、融合タンパク質を形成し得る。好ましくは、ＩＧＦ結合タンパク質または誘導体をコードするＤＮＡ配列は、米国特許第５，９１４，２５４号に記載されるような融合パートナーをコードする配列と連結される。発現構築物は、プラスミドあるいはコスミドのような染色体外構築物であり得るか、または、例えば、米国特許第５，８６１，２７３号に記載されるように、宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。
【００７７】
（ＩＧＦＢＰ由来のペプチドを組み込んだ結合体および融合物）
本明細書中で開示するように、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは、無関係のタンパク質の細胞インターナリゼーションを方向付けることが可能であり、心臓組織および腎臓組織への細胞インターナリゼーションを方向付けることに特に有用である。従って、本発明は、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドおよび低分子と、細胞内に内部移行されることが所望される分子との、融合物ならびに／または結合体を提供する。融合物パートナー分子は、通常（例えば、大きいサイズ、親水性などの理由で）内部移行されないポリペプチド、核酸、または低分子であり得る。当業者に明らかであるように、このような融合／結合体は、医薬品（通常は内部移行されない治療分子のインターナリゼーションを促進するため）、遺伝子治療（遺伝子治療構築物のインターナリゼーションを促進するため）、および研究（インターナリゼーションマーカータンパク質を用いる細胞の「マーキング」を可能にする）を含む、多数の異なる分野において有用である。好ましいＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドは、配列ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷまたは上記配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％の相同性を有する配列を含むペプチドであり、ここで、このペプチドは、ＩＧＦＢＰ−３の完全配列を含まない。ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドとポリペプチドとの融合物は、好ましくは、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物の作製によって生成されるが、このような融合物はまた、インターナリゼーションペプチドと目的のポリペプチドとの化学連結反応によって作製され得る。ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドと核酸または低分子との結合体は、当該分野で公知の化学架橋技術を使用して作製され得る。好ましくは、結合体は、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して生成され、インターナリゼーションペプチドのマルチマーの生成を回避する。
【００７８】
ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドと転写調節因子（例えば、転写因子）との結合体が、本発明によって提供される。ほとんど全ての転写因子は、通常は細胞外の環境から内部移行されることができず、そのために、そのネイティブの型では薬剤として不適切である、細胞内タンパク質である。しかし、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドと融合または結合体化される場合、転写因子は、内部移行され得、そして細胞の転写に影響し得る。例えば、Ｔ−ｂｅｔ（Ｓｚａｂｏら、２０００、Ｃｅｌｌ  １００  （６）：６５５−６９）、すなわち、Ｔリンパ球をＴｈ１系統に方向付けるように見える転写因子は、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドと融合され、免疫調節に有用な分子を作製し得る。
【００７９】
細胞インターナリゼーションペプチドおよび治療分子の結合体もまた提供される。細胞インターナリゼーションペプチドは、細胞の内部に送達されるように方向付けられる任意の治療分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド構築物（例えば、増殖因子などのようなコード治療分子）を含む）と結合体化され得る。
【００８０】
細胞インターナリゼーションペプチド（例えば、ＭＢＤコア１４マー）およびカベオリンコンセンサス結合配列（ＭＢＤ／カベオリンペプチド）を含むペプチドもまた、結合体に組み込まれ得る。ＭＢＤ／カベオリンペプチドは、細胞の内部に送達されるように方向付けられる任意の治療分子（アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド構築物（例えば、増殖因子などのようなコード治療分子）を含む）と結合体化され得る。
【００８１】
マーカー部分およびＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを含む融合分子／結合体分子もまた、提供される。このような融合／結合体分子に有用なマーカー部分としては、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、および、酵素活性の効力により検出され得る他のタンパク質（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなど）のようなタンパク質、ならびに、二次検出システム（例えば、特異的な抗体）によって検出され得る「発現タグ」部分が挙げられる。発現タグ部分は周知であり、そしてｍｙｃおよび他のタンパク質由来のペプチドを含む。急速に分裂する細胞の核へのＩＧＦＢＰ−３の局在化に起因して、配列ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷまたは上記配列に少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、もしくは９９％の相同性を有する配列を含む、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを含む融合分子／結合体分子は、細胞標識用途、および診断用途に、特に有用であると考えられる。ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを含む、このような融合／結合体分子の他の企図される用途としては、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーション促進ペプチドを組み込む薬学的分子の薬物動態学的な研究が挙げられる。
【００８２】
実施例３で開示されるように、発明者は、ＩＧＦＢＰ−３分子中の金属結合モチーフの存在を発見し、これによってこのモチーフを含むドメインの実用的な回収を可能にした。ＩＧＦＢＰ由来のペプチドＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷおよびペプチドＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷは各々、ニッケルを充填されたアフィニティーカラムに結合する。このような金属結合性質は、複合混合物（例えば、細菌細胞溶解物）からの所望のペプチドの精製に使用され得る。代表的に、各ペプチドをコードするＤＮＡ配列（または金属結合活性および少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列相同性を有するそのホモログ）は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列と融合され、ここで、このペプチドはＩＧＦＢＰ−３の完全配列を含まない。金属結合ペプチドをコードする配列は、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’末端または３’末端に融合され得、そして、目的の配列内に挿入さえされ得る（このことはあまり好ましくないが）。好ましくは、エンドプロテアーゼについての認識部位をコードするＤＮＡは、金属結合ペプチドをコードする配列と目的のポリペプチドをコードする配列との間に挿入され、金属結合ペプチドの除去を可能にする。有用なプロテアーゼ認識部位としては、ヒトライノウイルス  ３Ｃプロテアーゼの認識部位、エンテロキナーゼの認識部位、Ｘａ因子の認識部位、およびユビキチンの認識部位（ユビキチナーゼの認識部位）が挙げられる。次いで、融合ポリペプチド（ＩＧＦＢＰ由来の金属結合ペプチドおよび目的のポリペプチド、ならびに必要な場合プロテアーゼ認識部位を含む）をコードするＤＮＡは、コードされた融合ポリペプチドの転写および翻訳に必須のＤＮＡ配列を含む都合よい任意の発現ベクターに挿入される。ＤＮＡ発現構築物は、組換え宿主（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に形質転換され、そして当該分野で公知の標準の方法を使用して回収される。次いで、融合ポリペプチドは、当該分野で周知のように、二価のカチオン（例えば、亜鉛またはニッケル）を充填されたアフィニティーカラムを使用して精製され得る。融合ポリペプチドがプロテアーゼ認識部位を含む場合、同族のプロテアーゼが、精製プロセスの適切な時点において、目的のポリペプチドから金属結合ペプチドを切断するのに使用され得る。
【００８３】
（治療的な投与）
本発明は、さらに、アテローム性動脈硬化症を含む心血管疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む自己免疫疾患、多発性硬化症（ＭＳ）、糖尿病（特に、Ｉ型糖尿病）、強直性脊椎炎、潰瘍性結腸炎、クローン病を含む炎症性腸疾患、関節炎（特に、慢性関節リウマチ）、喘息およびアレルギー、骨吸収性障害、網膜症を含む眼科系疾患、および繊維性疾患を含む障害を処置する（例えば、その症状を軽減する）方法を提供する。上記の背景において考察されるように、これらの障害は、細胞レベルでの慢性炎症性応答によって媒介される。本発明に従って、これらの障害は、有効量の本発明のＭＢＤペプチドの投与によって処置される。
【００８４】
転写調節因子とＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドとの融合物または結合体を含む、組成物の投与を含む治療的な方法もまた提供される。特定の実施形態において、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドは、さらに、カベオリンコンセンサス結合配列を含む。いくつかの実施形態において、その融合物または結合体は、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドと、Ｔ−ｂｅｔのような転写因子とを含む。Ｔ−ｂｅｔを含む結合体は、Ｔｈ１応答に対する免疫応答を変更するか、または偏らせる、免疫調節に有用であり、この免疫調節は、アレルギー、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ）および他のＴｈ２媒介性障害のような障害の症状を緩和し得る。
【００８５】
心臓障害、脈管障害、筋肉障害、免疫障害、肝臓障害、脳障害および腎臓障害を処置する方法がさらに提供され、この方法は、治療分子およびＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドの結合体を投与する工程を包含する。特定の実施形態において、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドは、さらにカベオリンコンセンサス結合配列を含む。これらの実施形態は、心臓組織、骨格筋組織、脾臓組織および腎臓組織へのＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドの差示的取り込み、治療分子の標的組織中の細胞の内部への送達を利用する。治療分子は、標的器官での活性のために細胞インターナリゼーションを必要とする任意の分子であり得る。これらの実施形態における使用のための好ましい治療分子の１つのクラスは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。小さな阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた好ましいクラスの治療分子である。心臓障害および腎臓障害の処置のため、結合体は、一般的に、非経口経路によって、単純に投与され得る。特定の実施形態において、結合体の投与よりも、治療分子の非存在下でのＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドの投与が先立つ。このような前処置は、治療分子／ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチド結合体の投与の前に、任意の従来の期間（例えば、約２日〜約４週間、または４日〜３週間、または１週間〜１８日間）行われ得る。例えば、心筋梗塞の直後に、心臓細胞の死を妨げるように設計された分子（例えば、適切なプロサバイバル（ｐｒｏ−ｓｕｒｖｉｖａｌ）遺伝子（例えば、ｂａｘ−αまたはカスパーゼ−３の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはｂｃｌ−２の発現を指向するポリヌクレオチド）が、全身投与され得る。他の実施形態において、このような結合体は、腎臓障害（例えば、虚血）、肝臓障害（例えば、薬物過服用（例えば、アセトミノフェンまたはアルコールと組み合わせたアセトミノフェン））、肝臓毒性化合物への曝露（例えば、Ａｍａｎｉｔａ  ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓのような毒性キノコの接種による）の影響を改善するために投与され得る。本発明の結合体はまた、骨格筋および免疫系の細胞へ治療分子を送達するために使用され得、ＭＢＤペプチドの筋肉および脾臓それぞれへの局在化を利用する。
【００８６】
本発明はまた、変化した鉄代謝（例えば、新生物形成、パーキンソン病、およびアテローム性動脈硬化症）と関連する障害を処置する方法を提供する。治療分子に結合体化されたＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチド（例えば、ＭＢＤペプチド）は、変化した鉄代謝と関連する障害を有する被験体に投与され、障害の少なくとも１つの症状の改善を生じる。特定の実施形態において、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチドは、さらに、カベオリンコンセンサス結合配列を含む。例えば、新生物細胞、パーキンソン病およびアテローム性動脈硬化症での増加した鉄の取り込みは、ＩＧＦＢＰ由来のインターナリゼーションペプチド（例えば、ＭＢＤペプチド）との結合体の形態で、これらの障害における影響を受けた細胞へ治療分子を送達するために利用され得る。
【００８７】
ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む分子は、好ましくは経口投与を介してか、または非経口投与を介して投与される。非経口投与には以下が含まれるが、これらに限定されない：静脈内（ＩＶ）経路、腹腔内（ＩＰ）経路、筋肉内（ＩＭ）経路、皮下（ＳＣ）経路、皮内（ＩＤ）経路、経皮経路、吸入経路、および鼻腔内経路。ＩＶ投与、ＩＰ投与、ＩＭ投与およびＩＤ投与は、ボーラス投与によってか、または注入投与によってであり得る。ＳＣ投与については、投与は、ボーラス投与によってか、注入によってか、あるいは移植可能なミニポンプ（例えば、浸透圧性ミニポンプもしくは機械的ミニポンプ）または徐放性の移植片のような移植可能なデバイスによって、であり得る。ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子はまた、ＩＶ投与、ＩＰ投与、ＩＭ投与、ＩＤ投与またはＳＣ投与に適合された徐放性処方物中で送達され得る。吸入されるＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子は、好ましくは、分散した用量で送達される（例えば、タンパク質送達に適合された定用量吸入器によって）。経皮経路を経由する、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む分子の投与は、連続的であるか、または拍動性であり得る。誘導体ペプチドまたは誘導体低分子の投与はまた、経口的に起こり得る。
【００８８】
非経口投与について、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、乾燥粉末処方物、半固形処方物または液体処方物中にあり得る。吸入以外の経路による非経口投与について、ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、好ましくは、液体処方物にて投与される。ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチド処方またはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子処方物を含む組成物は、塩、緩衝液、膨張性薬剤、オスモライト（ｏｓｍｏｌｙｔｅ）、酸化防止剤、洗剤、界面活性剤、および当該分野で公知の他の薬学的賦形剤のような付加的な成分を含み得る。
【００８９】
ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドおよびＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、約０．００１〜約４０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、より好ましくは約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、より好ましくは、約０．０５〜約４ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、なおより好ましくは、約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で、被験体に投与される。
【００９０】
ＩＧＦＢＰ誘導体ペプチドまたはＩＧＦＢＰ誘導体低分子を含む組成物の投与の代替法としては、ＩＧＦＢＰ誘導体ペプチドまたはＩＧＦＢＰ誘導体低分子を含む組成物をコードする核酸構築物が投与され得る。この構築物は、ＩＧＦＢＰ誘導体ペプチドを含む組成物をコードするポリヌクレオチド配列を含み、そして、通常、細胞におけるＩＧＦＢＰ誘導体ペプチド配列を含む組成物の発現および翻訳を生じるＩＧＦＢＰ誘導体ペプチド配列に作動可能に連結された配列（例えば、プロモーター／エンハンサー、翻訳開始部位、ポリアデニル化シグナルなど）を含むが、細胞染色体中に組み込むように設計された構築物もまた、企図される（例えば、その構築物がＩＧＦＢＰ誘導体ペプチド配列に隣接するレシピエント細胞の染色体に相同な配列のような、宿主の染色体への組み込みを促進する配列を含む場合）。
【００９１】
遺伝子移入の方法は、当該分野で周知であり、インビトロ法（例えば、培養細胞（好ましくは被験体に再導入される自己細胞）の形質転換）、エキソビボ法（例えば、インビボで培養されていない細胞（好ましくは被験体に再導入される自己細胞）の形質転換）およびインビボ法（例えば、被験体への核酸構築物の投与によるインサイチュでの細胞の形質転換）が挙げられる。このような遺伝子移入を達成するための方法は、当該分野で周知であり、リン酸カルシウム形質転換、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）形質転換、エレクトロポレーション、脂質媒介性形質転換、裸のＤＮＡ移入、およびウイルス媒介性移入（例えば、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター）を含む、標準の形質転換法が挙げられる。
【００９２】
ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたはＩＧＦ結合タンパク質誘導体低分子を含む組成物は、以下の同時投与剤のうちの１つ以上と一緒に被験体に投与される：化学療法剤；抗体；物理的ストレス（例えば放射線）；処置レジメン（例えば、栄養上のレジメン）；または標的細胞上に存在するレセプター（例えば、レチノイドレセプターおよび甲状腺レセプター）のリガンド。被験体が、同時に両方の薬剤に対する曝露を経験する限りは、２つの薬剤の投与は、同時であっても、重なっていても、または時間的に別々であってもよい。２つの薬剤が同じ投与経路および同じ投与スケジュールのために処方される場合、投与は、好ましくは同時であるか、またはほぼ同時である（例えば、同時注入または連続注入）。しかし、いくつかの実施形態において、２つの薬剤についての投与経路および投与スケジュールは異なり、このことが同時投与を不都合にする。化合物がいつ、どのようにして投与されるかにかかわらず、被験体が両方の化合物に対して同時かつ全身性の暴露を経験する場合、被験体は両方の薬剤を投与されたとみなされる。
【００９３】
ＩＧＦ結合タンパク質誘導体ペプチドまたは低分子を含む組成物との同時投与剤の投与を必要とする方法において、この同時投与剤の用量は通常、その薬剤について当該分野で公知のように、個々の被験体について力価測定される。同時投与剤は、非経口および経口の投薬形態を含む、当該分野で公知の任意の処方物において作製され得る。経口処方物が好ましいが、非経口処方物もまた受容可能であり、そして入院の場面においてより簡便であり得る。非経口投与のための処方は、通常液体として処方されるが、ゲル形態または固形デポー形態でもあり得る。経口投与のための処方物は、通常錠剤またはカプセルの形態であるが、シロップまたは液体もまた受容可能である。同時投与剤の処方は通常、賦形剤（例えば、塩、緩衝液、バルキング剤、洗浄剤、結合剤、界面活性剤、安定化剤、保存剤、酸化防止剤、潤滑剤、コーティング剤、および当該分野で公知の他の薬学的に受容可能な賦形剤）を含む。
【００９４】
同時投与剤の投薬量および投与形態は、当該分野に公知であるように、同一性、処方、投与経路および同時投与剤に関する他の関連特性に従って、調節されるべきである。
【００９５】
誘導物質およびアンタゴニストは、同様の方法で投与される。例として：アンタゴニストがプロピルチオウラシルである場合、プロピルチオウラシルの用量は、１〜４００ｍｇ／日であり得る。被験体は通常、５０〜４００ｍｇ／日の用量（代表的には３回の等用量に分けられる）で開始され、２回または３回の等用量に分けて５０〜１００ｍｇ／日で維持される。メチマゾールおよびカルビマゾ−ルについては、用量は、０．１〜５０ｍｇ／日であり得る。代表的には、被験体は５〜５０ｍｇ／日で開始され、１〜５ｍｇ／日で維持される。
【００９６】
当業者に理解されるように、本方法ならびに症状を測定するために使用される方法によって緩和される疾患の症状は、特定の疾患および個々の患者によって変化する。
【００９７】
本発明の方法に従って処置される患者は、彼らの疾患の症状のいずれかの緩和を経験しうる。例えば、ＭＢＤペプチドおよび同時投与剤で処置される癌患者は、腫瘍安定化（例えば、進行しないようにし得る）、腫瘍縮小、または腫瘍の排除を経験しうる。ＭＢＤペプチドおよび同時投与剤での処置はまた、転移の発生率の減少または減少した数の転移性腫瘍を生じうる。ＭＢＤペプチドで処理される心臓血管疾患患者は、彼らの症状（血管狭窄およびアンギナ、ならびに／またはアテローム硬化性斑の数、サイズまたは形成の減少を含む）のいずれかの減少または排除を経験しうる。ＭＢＤペプチドで処置される自己免疫疾患を有する患者は、彼らの症状（例えば、腎性発赤（ｒｅｎａｌ  ｆｌａｒｅ）、疲労による体重減少、関節痛、蝶型紅斑、貧血（ＳＬＥ）または虚弱、感覚異常、硬化脳病変の数もしくはサイズ（ＭＳ）、あるいは疼痛、硬直（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、腫脹または運動範囲の（関節炎、特に慢性関節リウマチ）改善または安定化、あるいは腹部／上腹部疼痛、痙攣、下痢（クラウン病を含む炎症性腸疾患）、あるいは絶食時血清グルコースレベルもしくはインスリン要件（糖尿病）、あるいは喘鳴、咳き込み、最大呼気流量またはβアゴニスト（喘息）のような緊急的な投薬の必要性、またはアレルギー性鼻炎（アレルギー）を含む）のいずれかの減少、排除または安定化を経験しうる。ＭＢＤペプチドで処置される網膜症患者は、視力における改善または安定化を経験しうる。骨再吸収疾患（例えば、骨粗鬆症）を有する患者は、骨折の危険性または割合の減少として現れうる、骨量の損失の速度の改善、安定化、または減少を経験しうる。
【００９８】
（キット）
本発明は、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたは低分子を備えるキットを提供する。このキットは、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたは低分子を含む組成物を含む少なくとも１つのパッケージを備える。必要に応じて、キットはまた、組成物の使用に関する説明書のセットを備える。
【００９９】
キットに含まれる組成物は、ＩＧＦＢＰ由来のペプチドもしくは低分子、またはＩＧＦＢＰ由来のペプチドもしくは低分子を含む融合体／結合体であり得る。特定の実施形態において、キットはまた、細胞傷害性化学療法薬剤（例えば、パクリタキセルまたはドキソルビシン）のような同時投与剤の少なくとも１パッケージを含み得る。ＩＧＦＢＰ由来のペプチドまたは低分子（および任意の、同時投与剤）を含む組成物の容器は、単位用量であるか、バルクパッケージ（例えば、多用量パッケージ）であるか、またはサブユニット用量であり得る。
【０１００】
説明書を含む実施形態において、この説明書は通常、包含される組成物の意図した使用のための（例えば、癌、過剰増殖障害、または動脈再狭窄の処置のための）、投薬量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。本発明のキットに提供される説明書は、代表的に、ラベルまたはパッケージ挿入物（例えば、キットに含まれる紙の書面）に書かれた説明書であるが、機械で読み取り可能な説明書（例えば、磁気記憶ディスクまたは光学記憶ディスクで実行される説明書）もまた受容可能である。
【０１０１】
本開示を通して引用された特許、特許出願、および出版物は、それら全体が、本明細書中で参考として援用される。
【実施例】
【０１０２】
（実施例１：ＩＧＦＢＰ−３を用いた、栄養的ストレスを与えられたＨＥＫ２９３肝細胞の処置）
ヒト胚性肝臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、２％、４％、６％または８％のウシ胎児血清を補充したダルベッコの改変イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で増殖させた。細胞が８０〜８５％コンフルエンシー（細胞の力価：１プレートあたりおよそ２．１×１０６細胞）に到達したとき、５μｇのＩＧＦＢＰ−３または緩衝液コントロールを各プレートに添加した。細胞を、３７℃で一晩培養した。次の日、培地を除去し、細胞をトリプリン−ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）＋１×リン酸緩衝生理食塩水でリンスした。細胞を遠心分離し、そして上清を除去した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）製のＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ３アッセイキットを使用して、アポトーシスを測定した。細胞を５０μｌの冷却した細胞溶解緩衝液に再懸濁し、氷上で１０分間インキュベートした。得られた細胞溶解物をＢｅｃｋｍａｎ  マイクロ遠心分離機中、１４０００ｒｐｍで４℃にて３分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、５０μｌの２×反応緩衝液／ＤＴＴ＋５μｌの１ｍＭカスパーゼ３基質を各チューブに添加した。水浴中３７℃で１時間インキュベートした後、サンプルをマイクロプレートリーダーの４０５ｎｍで読んだ。この実験の結果を、図３に示す。
【０１０３】
（実施例２：プロアポトーシスペプチド配列の同定）
図４Ａに示すように、そして共有に係る米国特許出願番号０９／９５６，５０８に開示されるように、ＩＧＦＢＰ−３は、アポトーシス促進活性を有する。ＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドを、本質的に実施例１に記載されるように、アポトーシス促進活性について試験した。
【０１０４】
試験したペプチドを、表１に記載する（＊で印を付けたペプチドは、ヘキサヒスチジンタグを含む）。
【０１０５】
【表１】
2007524588.tif 000002
図４Ｂに要約されるこの実験からのデータは、最初に、インタクトなＩＧＦＢＰ−３自体より大きいアポトーシス促進活性（重量ベースに基づく）を示すＩＧＦＢＰ−３由来のペプチドを生成することが可能であることを示した。ペプチドＨとペプチドＩのアポトーシス促進活性を比較すると、ペプチドＩが重量ベースでインタクトなＩＧＦＢＰ−３（Ｂ、Ｃ）または長いペプチド（Ｇ、Ｈ）よりも３〜４倍高いアポトーシス促進活性を示したことは注目すべきである。すなわち、ペプチドＩと比較して、ペプチドＨの９つのさらなるアミノ酸の存在が、劇的に低いアポトーシス促進活性をもたらした。
【０１０６】
（実施例３：ＩＧＦＢＰ−３および誘導体ペプチドの金属結合特性）
図５に示すように、インタクトなＩＧＦＢＰ−３は、固定化されたニッケルおよび亜鉛に結合し、６０ｍＭイミダゾールで樹脂から溶出され得る。このＩＧＦＢＰ−３の以前まで知られていなかった特性は、魅力的であり、そして多数の実用的な意味を有し、その中で、固定化金属アフィニティー（ＩＭＡＣ）樹脂を使用して産物を捕捉する能力が、治療、ハイスループットな発見、および他の研究領域における多数の潜在的な用途をもたらす。
【０１０７】
図５は、Ｎｉ＋＋（パネルａ）ＩＭＡＣおよびＺｎ＋＋（パネルｂ）ＩＭＡＣを使用する、ＩＧＦＢＰ−３のＩＭＡＣ精製からのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。ＩＧＦＢＰ−３は、両方のＩＭＡＣ樹脂に効率的に結合する。
【０１０８】
本発明者らは、金属に結合するＩＧＦＢＰ−３由来のサブドメインおよびペプチドの能力をさらに試験した。以下の実施例５に示すように、インビボで生成されたＩＧＦＢＰ−３の規定されたフラグメントは、ＩＭＡＣ上に捕捉され得る。２つの短いペプチドがＮｉ−Ｈｉｓ結合カラムを通過した：
ペプチド１：（Ｈ２Ｎ）．．．ＤＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）；
ペプチド２：（Ｈ２Ｎ）．．．ＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ．．．（ＣＯＯＨ）。
【０１０９】
両方のペプチドが、カラムに特異的に結合した。ペプチド１は６０ｍＭイミダゾールで溶出されたのに対し、より高濃度のイミダゾール（１Ｍ）がペプチド２の溶出に必要であった。それゆえ、ペプチド２はペプチド１が結合するよりも、より密接に金属に結合するようである。
【０１１０】
（実施例４：ＩＧＢＰ−３および同時投与剤を用いるＬＡＰＣ−４前立腺腫瘍細胞の処置）
ＩＧＦＢＰ−３のＴＡＸＯＬ（登録商標）との併用の、ＬＡＰＣ−４移植片モデルを利用する前立腺癌細胞の増殖および死に対する効果を分析するための研究を実施した。１００万個の細胞（１００μｌ中）をＳＣＩＤマウスにＳＱ注入した。４週間後に、蝕知可能な腫瘍が観察された。４群を処置した（１群あたり６マウス）：１）生理食塩水コントロール；２）ＩＧＦＢＰ−３（４ｍｇ／ｋｇ／日で腹腔内）；３）ＴＡＸＯＬ（登録商標）（２ｍｇ／ｋｇ／日で５〜８日目に腹腔内）；４）ＴＡＸＯＬ（登録商標）とＩＧＦＢＰ−３の併用。毎週の触診により、腫瘍をサイズについて分析し、血清を採取した。動物を２１日目に屠殺し、腫瘍重量を評価した。この実験の結果は、併用治療による減少した腫瘍サイズ（４０％）の傾向を示した。この生物学的作用は、ＩＧＦＢＰ−３のアポトーシス促進活性に起因すると考えられる。
【０１１１】
（実施例５：３Ｃプロテアーゼ標的部位をタンパク質の一次配列中に操作することによるＩＧＦＢＰ−３の定義されたサブドメインの生成）
規定されたＩＧＦＢＰ−３サブドメインを、Ｅ．ｃｏｌｉ発現系において可溶性融合タンパク質として発現される構築物から生成した。この融合体の一般的な構造は、以下である：
ＩＶＳ−１：ＤｓｂＡ（ｍｕｔ）．．．［３Ｃ］．．．ドメイン１．．．［３Ｃ］．．．ドメイン２／３
ＩＶＳ−２：ＤｓｂＡ（ｍｕｔ）．．．［３Ｃ］．．．ドメイン１／２．．．［３Ｃ］．．．ドメイン３。
【０１１２】
ここで、［３Ｃ］は、ＨＲＶ  ３Ｃプロテアーゼによって認識されるペプチド配列である。規定されたドメインを生成するための一般的なストラテジーを、図５に示す。収量は、野生型に匹敵し、実質的な分画は、ＩＧＦ−Ｉに結合するタンパク質の実証された能力に基づいて、正確に折り畳まれると考えられる。切断の後、ＩＶＳ−１構築物（ドメイン１、２／３）から生成されたＩＧＦＢＰ−３のサブドメインを、疎水性相互作用樹脂（例えば、フェニル−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））上または（あまり所望されないが）カチオン交換樹脂（例えば、ＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標））上で捕捉する。他の樹脂（例えば、固定化ヘパリン）もまた使用され得る。３ＣプロテイナーゼとのＩＶＳ−１融合のカラム上での効果的な切断は、１：１０（プロテアーゼ対基質）の割合を使用して４℃または室温で示されている。完全な切断は、２０分未満で見られている。過去に、切断産物のアミノ酸配列は、酵素が異常にきれいな様式（＜５％「でこぼこした」末端）で切断することを示している。さらに、ほとんど均質までの精製が、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーまたは亜鉛アフィニティークロマトグラフィーにより達成され得る。明らかに、金属結合は、ＩＧＦＢＰ−３分子においてＩＧＦ−Ｉ結合のための初期ドメインを構成すると考えられるタンパク質のアミノ末端の約１００アミノ酸を必要としない。
【０１１３】
（実施例６：細胞インターナリゼーションペプチドの同定）
３つのペプチド伸長を、緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に関する遺伝子とインフレームでそれぞれクローン化し、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）中に発現させた。各構築物は、６Ｈタグをさらに含む。産物をＨｉｓ−Ｂｉｎｄ  Ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で捕捉し、６０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出し、次いで、ＨＩＣ（フェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）高性能樹脂、Ａｍｅｒｓｈａｍ）樹脂でさらに精製し、５０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水で溶出した。精製されたペプチド−ｇｆｐを、ＨＥＫ２９３（ヒト胚性肝細胞株）上の細胞インターナリゼーションについて試験した。ＨＥＫ２９３細胞を、８０〜８５％コンフルエント（１プレートあたり約２．１×１０６細胞）になるまでダルベッコの改変イーグル培地中で培養した。各ペプチド（１プレートあたり１１μｇ）を含む新鮮な培地をプレートに添加した。細胞を、およそ３０分間３７℃でインキュベートした。培地を除去し、細胞をトリプシン処理し、１×リン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。蛍光を測定するために、細胞を長波長ＵＶランプ下で維持した。サンプルの写真を図７に示す。サンプル「ｄ」が、強い蛍光を示した唯一のサンプルであった。従って、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷが、大きい無関係のタンパク質の、ＨＥＫ２９３細胞内へのインターナリゼーションを指示するのに必須の全配列情報を含むようである。この同じ配列の部分に属すると考えられる公知の核トランスロケーション特性と組み合わされ、このペプチドは、細胞取り込みならびに種々の分子（例えば、タンパク質、核酸および小さな化学成分）に関する核トランスポーターとして有用であり得る。従来のおよび遺伝子治療、細胞画像化、研究、ならびにハイスループットスクリーニングへの適用が、予見される。
【０１１４】
（実施例７：ＩＧＦＢＰ−３の金属結合特性）
種々の金属で荷電された固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂へのＩＧＦＢＰ−３の結合を測定した。約１ｍｇのＩＧＦＢＰ−３を、各カラム（ＮＴＡ樹脂、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に充填した。充填、フロースルー（ｆｌｏｗｔｈｒｏｕｇｈ）、洗浄、および６０ｍＭイミダゾールでの溶出のＯＤ２８０を測定することによって、「結合割合」を算出した。代表的な回収率は、８５〜９５％であった。結果を表２にまとめる。
【０１１５】
【表２】
2007524588.tif 000003
（実施例８：ＩＧＦＢＰ−３およびパクリタキセルの共アポトーシス活性）
パクリタキセルと組み合わせたＩＧＦＢＰ−３の共アポトーシス活性を、実施例１で記載したＨＥＫ２９３アッセイで測定した。ＨＥＫ２９３細胞を、ＤＭＥＭ＋８％ＦＣＳ中で増殖させ、次いで、０．３ｎｇ／ｍｌのパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））中か、５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−３中か、またはこの２つの組み合せにおいてインキュベートした。いくつかの培養物を、２００ｎｇ／ｍｌの抗−β−１−インテグリン抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で３０分間、前処置した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．製のＡｐｏＡｌｅｒｔカスパーゼ−３キットを使用して、カスパーゼ−３をアッセイした。
【０１１６】
この実験の結果を図８に示す。図８Ａに示す結果は、ＨＥＫ２９３細胞にパクリタキセルとＩＧＦＢＰ−３の強力な共アポトーシス相乗効果を実証する。図８Ｂに示すように、抗−β−１−インテグリン抗体による前処置は、このアッセイにおけるＩＧＦＢＰ−３の共アポトーシス活性を非常に阻害する。しかし、ＩＧＦＢＰ−３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびシスプラチンを使用して行われた同様の実験において、いかなる共アポトーシス活性も実証できなかった（図８Ｃ）。
【０１１７】
（実施例９：ＭＢＤ２ペプチドによって方向付けられるＧＦＰの迅速な細胞取り込み）
ペプチドＫＫＧＨＡＫＤＳＱＲＹＫＶＤＹＥＳＱＳ（無関係なペプチドＧＦＰ３１）、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（長いペプチドＧＦＰ３２）、ペプチドＫＫＧＦＹＫＫＫ（上流ペプチドＧＦＰ３４）、およびペプチドＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ（ＭＢＤ２を含む下流ペプチドＧＦＰ３５）をコードするポリヌクレオチドを、ｐＧＦＰｕｖベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中のＧＦＰコード配列の５’末端へのインフレーム融合としてクローン化した。発現するタンパク質を金属アフィニティークロマトグラフィーおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーを通して精製した。
【０１１８】
各タンパク質を、８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞に、０．５μｇ／ｍｌで添加した。図９Ａは上から下に、精製タンパク質のクマシー染色したゲル、添加１時間後の処置細胞のＧＦＰ蛍光および同じ細胞由来の抽出物のウェスタンブロット（二連の実験）を示す。ウェスタンは、抗ＧＦＰ抗体で探索した。図９Ｂはさらに、これらの細胞へのＧＦＰ３２の取り込みが、細胞を抗フィブロネクチン抗体ではなく、２００ｎｇ／ｍｌの抗インテグリン抗体で前処理することによって選択的に抑制され得ることを示す、ＧＦＰ３２処理細胞の蛍光を示す。
【０１１９】
（実施例１０：ＭＢＤペプチドとパクリタキセルの共アポトーシス活性）
ペプチド（５０ｎｇ／ｍｌ）を、ペプチドと併用して０．３ｎｇ／ｍｌパクリタキセルを補填したＤＭＥＭ中で増殖させた、８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞に添加した。カスパーゼ−３活性を、添加８時間後の細胞抽出物において測定した。
【０１２０】
結果を表３にまとめる。アポトーシス活性を、モルベース（ＭＢＤ２活性を１００単位（３つの実験の平均）として規定した）でＭＢＤ２に対して正規化した、任意のカスパーゼ−３単位で表す；「ｎｄ」は「実施せず」を示し、；「ｐｓ」はホスホセリンを示す。金属結合を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂に結合する充填したペプチドの割合として表す；約１〜１．５ｍｇのペプチドを、カラム上に充填した。細胞取り込みを、実施例９に記載されるように、ＧＦＰとの遺伝的融合を使用して決定した。
【０１２１】
【表３】
2007524588.tif 000004
（実施例１１：ＭＢＤペプチドの抗原性プロファイリング）
ＭＢＤペプチドの抗原性プロファイルを、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。ＭＢＤペプチドまたはＩＧＦＢＰ−３を、９６ウェルＮｉ−ＮＴＡプレート（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のウェルに１５分間添加し、ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ緩衝液で２回洗浄し、次いで、同じ緩衝液中３％ＢＳＡで４時間ブロックした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合体化した二次抗体を使用して、検出を比色定量分析的に（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）（吸光度単位で記録して）行った。
【０１２２】
図１０に示すように、ＭＢＤペプチドは、全長ＩＧＦＢＰ−３と抗原性で異なる。パネル（ａ）に示すように、試験したＭＢＤペプチドのいずれもが、ポリクローナル抗ＩＧＦＢＰ−３抗体と反応しなかった。パネル（ｂ）は、ＭＢＤ５ペプチドに対して産生されるポリクローナル抗体を使用して得られた吸光度単位を示し、ここでポリクローナル抗体は、ＭＢＤペプチドに結合するが、ＩＧＦＢＰ−３には結合しない。
【０１２３】
（実施例１２：ＭＢＤ共アポトーシス活性は、血漿タンパク質による阻害に対して抵抗性である。）
パクリタキセルと、ＭＢＤペプチドまたはＩＧＦＢＰ−３との共アポトーシス活性を、２つの血漿タンパク質；フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンの存在下または非存在下で試験した。ＭＢＤペプチドまたはＩＧＦＢＰ−３、（５０ｎｇ／ｍｌ）、０．３ｎｇ／ｍｌパクリタキセル、および血漿タンパク質（２００ｎｇ／ｍｌ）を、本質的に実施例８に記載されるように、ＤＭＥＭ中で増殖させた８０％コンフルエントのＨＥＫ２９３細胞に添加した。カスパーゼ−３を、８時間のインキュベーション後に測定した。
【０１２４】
アポトーシス活性を、ＭＢＤ２に対して正規化した（ＭＢＤ２活性を１００単位として規定した）、任意のカスパーゼ−３単位で算出した。結果を表４にまとめる（３つの実験の平均）。フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンの、阻害ＩＧＦＢＰ−３共アポトーシス活性は、フィブロネクチンおよびフィブリノーゲンの両方によって本質的に排除される一方、ＭＢＤ２共アポトーシス活性は、本質的に影響を受けないか（フィブロネクチン）、または、適度に減少するだけか（フィブリノーゲン）のいずれかである。
【０１２５】
【表４】
2007524588.tif 000005
（実施例１３：ＩＧＦＢＰ−３とドキソルビシンまたは５−フルオロウラシルでの処置は、腫瘍サイズを減少する）
ＭＡ−１６Ｃ乳腺腺癌腫瘍の断片を、メスＣ３Ｈマウス（８〜１１匹の動物／群）に皮下移植した。その動物を、ビヒクル単独、ＩＧＦＢＰ−３（２１日間、皮下注射により４ｍｇ／ｋｇ／日）、ドキソルビシン（１日目および８日目に、静脈注射により２ｍｇ／ｋｇ）、またはＩＧＦＢＰ−３とドキソルビシンで処置した。別個の研究を行った。この研究において、動物を、ビヒクル単独、５−フルオロウラシル（１〜５日目に腹腔内注射により１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＩＧＦＢＰ−３と５−フルオロウラシルで処置した。腫瘍サイズを１８日目に測定し、マウスを２１日目に屠殺し、移植した腫瘍を、カスパーゼ−３活性（ＤＯＸ群に対して行われるアポトーシスのみのマーカー）を決定するために取り出した。
【０１２６】
ドキソルビシン（ＤＯＸ）または５−フルオロウラシル（５ＦＵ）のいずれかと組み合わせたＩＧＦＢＰ−３での処置は、ビヒクルまたはＩＧＦＢＰ−３のみでの処置と比較して、腫瘍サイズを有意に減少させた（ｐ＜０．０１）。さらに、ＩＧＦＢＰ−３とＤＯＸによる腫瘍縮小は、ＤＯＸ単独の群と比較した場合、有意であった（ｐ＜０．０２）。ＤＯＸ群についての結果を、表５にまとめ、５ＦＵ群についての結果を表６にまとめる。
【０１２７】
【表５】
2007524588.tif 000006
【０１２８】
【表６】
2007524588.tif 000007
（実施例１４：ＭＢＤペプチドによるアポトーシスの刺激は、ＩＧＦ非依存性である）
ＨＥＫ  ２９３細胞を、ストレス負荷条件下で（低血清またはパクリタキセルの存在下で）、ＩＧＦＢＰ−３（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＭＢＤ２（５０ｎｇ／ｍｌ）ありまたはなしで培養した。アポトーシスを、実施例１に記載されるように、カスパーゼ−３アッセイを使用してアッセイした。図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、ＩＧＦＢＰ−３およびＭＢＤ２のアポトーシス促進活性（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、ほぼ同一である。
【０１２９】
ＩＧＦ依存性を、ＨＥＫ  ２９３細胞を使用して調査し、ＩＧＦＢＰ−３またはＭＢＤ２の存在下で（ともに単独か、またはＹ６０Ｌ−ＩＧＦ−Ｉ（ＩＧＦレセプターに結合しないＩＧＦ−Ｉ変異体）と組み合わせて）、０．３ｎｇ／ｍｌのパクリタキセルで処理した。図１１Ｃに示されるように、ＩＧＦＢＰ−３およびＭＤＢ２のアポトーシス促進活性は、ＩＧＦの存在とは無関係である。
【０１３０】
（実施例１５：ＭＢＤペプチドのアポトーシス促進活性および細胞インターナリゼーション活性は、インテグリン依存性である）
ＨＥＫ  ２９３細胞を、パクリタキセルを含めて、実施例１０に記載されるように培養した。細胞を、ＭＤＢ２単独で、またはＭＤＢ２と抗接着タンパク質抗体とを組み合わせてかのいずれかでインキュベートした。抗体は、インテグリン関連タンパク質（ＩＡＰ）、フィブロネクチン（Ｆｎ）、トランスフェリンレセプター（ＴｆｎＲ）、α５インテグリン、α６インテグリン、αｖインテグリン、β１インテグリン、およびβ５インテグリンに対するものであった。カスパーゼ−３活性を、実施例１に記載のようにアッセイした。
【０１３１】
結果を、図１２Ａにまとめる。ＭＢＤ２のアポトーシス促進活性は、インテグリンおよびインテグリン関連タンパク質に対する抗体によって阻害される。
【０１３２】
（実施例１６：ＭＢＤペプチドのアポトーシス促進活性は、配列特異的である）
ＨＥＫ  ２９３細胞を、実施例１０に記載のように培養し、アッセイした。ＭＢＤ２および６ＭＢＤ２（ＭＢＤ２（ｐｓ）は、５位にホスホセリンを有する）改変体を、共アポトーシス活性についてアッセイした。結果を図１３にまとめる。図１３は、ＭＤＢペプチドの共アポトーシス活性が、コア配列に対して非常に配列特異的であることを示す。
【０１３３】
（実施例１７：Ｂａｘ−αの発現は、ＩＧＦＢＰ−３ペプチドおよびＭＢＤペプチドにより刺激される）
ＨＥＫ  ２９３細胞を、パクリタキセル（０．３ｎｇ／ｍｌ）および５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦＢＰ−３またはＭＢＤ２のいずれかとを加えて、実施例１に記載のように、培養した。Ｂａｘ−αおよびｂｃｌ−２のｍＲＮＡおよびカスパーゼ３活性をアッセイした。図１４Ａにまとめるように、ＩＧＦＢＰ−３は、ｂａｘ−α発現を刺激する。Ｂａｘ−α発現は、図１４Ｂに示されるように、カスパーゼ−３活性と相関する。
【０１３４】
（実施例１８：ＭＢＤ共アポトーシス活性は、ＰＩ３Ｋ／ＩＬＫシグナル伝達に依存する）
ＨＥＫ  ２９３細胞を、ｐＵＳＥａｍｐ、またはＡｋｔドミナントネガティブ（ＡｋｔＤＮ）、ＰＴＥＮ、ＩＬＫドミナントネガティブ（ＩＬＫｄｎ）もしくはラットドミナントネガティブ（ｒａｆＤＮ）挿入物を有するｐＵＳＥａｍｐ（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトランスフェクトした。その細胞を、ＭＢＤ２ありまたはなしで、実施例１０に記載のように培養した（場栗田季節を含む）。図１５にまとめるように、ＭＢＤ２アポトーシス促進活性は、ＰＩ３Ｋ／ＩＬＫキナーゼシグナル伝達経路がブロックされる細胞において阻害されるが、ＭＡＰＫシグナル伝達経路がブロックされる細胞においては阻害されない。
【０１３５】
（実施例１８：ＭＢＤペプチドは、低用量の細胞傷害性化学療法剤に癌細胞を感受性にする）
ＭＡ１６Ｃ細胞を、ＭＤＢ２および低用量のドキソルビシン（７５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。アポトーシスを、実施例１に記載のようにカスパーゼ−３アッセイを使用してアッセイした。図１６Ａにまとめるように、ＭＤＢ２は、ＭＡ１６Ｃ乳腺腺癌細胞を低用量のドキソルビシンに対して感受性にする。
【０１３６】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、低用量のパクリタキセル（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、ＭＤＢ２（５０ｎｇ／ｍｌ）ありまたはなしで、培養した。アポトーシスを、ＮＭＰレベルを測定することによってアッセイした。図１６Ｂにまとめるように、ＭＤＢ２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を低用量のパクリタキセルに対して感受性にする。
【０１３７】
（実施例１９：鉄（ＩＩ）イオンは、ＭＢＤペプチドエピトープをマスクしない）
１ｍｇの純粋ＩＧＦＢＰ−３を、（ａ）ＰＢＳ、（ｂ）ＰＢＳ中の１００μＭ塩化鉄（ＩＩ）、（ｃ）ＰＢＳ中の１００μＭ  塩化鉄（ＩＩＩ）、または（ｄ）ＰＢＳ中の１００μＭ  塩化亜鉛において、２００ｎｇ  ＩＧＦ−１の存在下または非存在下のいずれかで、室温にてインキュベートした。アリコートを、０分、２０分、４０分および６０分で除去し、次いで、抗ＭＢＤ抗体を用いてＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０１３８】
アッセイ結果（図１７にまとめる）は、ｉｎｄｉｃａｔｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＧＦＢＰ−３と鉄（ＩＩ）イオン（Ｆｅ＋＋）とのインキュベーションは、全長ＩＧＦＢＰ−３上の通常は検出可能でないＭＢＤペプチドエピトープの非マスキングを生じたが、鉄（ＩＩＩ）イオン（Ｆｅ４＋＋＋）でも亜鉛イオン（Ｚｎ＋＋）でも非マスキングを生じなかった。
【０１３９】
（実施例２０：ＭＢＤペプチドの差次的局在化）
１ｍｇ／ｍｌ  ＭＢＤ−ＧＦＰ３２タンパク質は、（ａ）ＰＢＳ、（ｂ）ＰＢＳ中中の１００μＭ  塩化鉄（ＩＩ）、（ｃ）ＰＢＳ中の１００μＭ  塩化鉄（ＩＩＩ）、または（ｄ）ＰＢＳ中の１００μＭ  塩化亜鉛において６０分間プレインキュベートした。５００ｎｇ／ｍｌ  ＭＢＤ−ＧＦＰ３２を細胞培養培地に添加して２０分後、ＨＥＫ２９３細胞の各抽出物を、ＳｉｇｍａのＮｕｃｌｅａｒ  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｋｉｔを用いて製造業者の説明書に従って、調整した。抽出物を、抗ＧＦＰ  ＥＬＩＳＡによってアッセイした。
【０１４０】
アッセイ結果は、ＭＢＤ−ＧＦＰ３２の鉄（ＩＩ）イオンとのプレインキュベーション（鉄（ＩＩＩ）イオンまたは亜鉛イオンではない）が、タンパク質の核局在化を阻害することを示す。結果を図１８にまとめる。
【０１４１】
（実施例２１：ＭＢＤペプチドの核トランスロケーションは、カベオリン媒介性経路およびクラスリン媒介性経路に関連する）
ＨＥＫ２９３細胞を、インヒビター、すなわち、ナイスタチン（カベオリン経路のインヒビター）またはクロルプロマジン（クラスリン経路のインヒビター）１０μｇ／ｍｌとともに１時間プレインキュベートした。５００ｎｇ／ｍｌ  ＭＢＤ−ＧＦＰ３２を細胞培養培地に添加して２０分後、細胞の核抽出物を、実施例２０に記載のように調製した。抽出物を、抗ＧＦＰ  ＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０１４２】
図１９にまとめるように、ナイスタチンおよびクロルプロマジンはともに、ＭＢＤペプチドの核トランスロケーションを阻害し、このことは、ＭＢＤペプチドの核トランスロケーションが、カベオリン媒介性経路およびクラスリン媒介性経路の両方によって媒介されることを示唆する。示される結果は、データ点あたりの３つのプレートの平均である。
【０１４３】
さらなるセットの実験において、ＨＥＫ２９３細胞を、インヒビターなし（コントロール）で、またはナイスタチンもしくはクロルプロマジン（１０μｇ／ｍｌ）とともに６０分間プレインキュベートし、次いで、４℃に冷却した。細胞を、トリプシンの非存在かでプレートから穏やかに取り出し、５００ｎｇ／ｍｌ  ＭＢＤ−ＧＦＰ３２中でインキュベートした。架橋剤Ｂ３を、細胞にＭＢＤ−ＧＦＰ３２を添加した後に種々の時間で、１０分間パルスの間に添加した。架橋反応を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で終了させた。細胞抽出物を、ニッケル−ＮＴＡコーティングした９６ウェルプレートで捕捉し、次いで、ＧＦＰに対する抗体（サンプルに対する標準化のために）、トランスフェリンレセプターに対する抗体、またはα５インテグリンに対する抗体を用いて、ＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０１４４】
アッセイ結果を、図２０および２１にまとめる。これらは、ｓｈｏｗ  ｔｈａｔ  ナイスタチン（カベオリン媒介性エンドサイトーシス経路のインヒビター）およびクロルプロマジン（クラスリン媒介性エンドサイトーシス経路のインヒビター）の両方が、ＭＢＤペプチドと細胞表面マーカーとの間の会合を阻害することを示す。結果は、三連の平均である。
【０１４５】
（実施例２２：ＭＢＤペプチドの差次的局在化）
メスＣ３Ｈマウスを、ＭＢＤ７ペプチド（２ｍｇ／ｋｇ／日）または生理食塩水いずれかの皮下注射により、１８日間予備処理した。ＭＢＤ−ＧＦＰ３２タンパク質またはＭＢＤ−ＧＦＰ３７（ＭＢＤ３７ペプチド、ＧＦＰに連結されたＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷＮＧＲ）タンパク質の単一の静脈内ボーラスを、２ｍｇ／ｋｇ投与し、その２時間後に、屠殺して組織を採取した。
【０１４６】
組織抽出物を、調製し、そして抗ＧＦＰ  ＥＬＩＳＡにより分析した。図２２および図２３において要約されるように、ＭＢＤペプチドの分布は、非常に以上であり、ＭＢＤペプチドで事前処理することにより変化する。心臓および腎臓への優先的標的化は、鉄ローディング研究において得られたデータと良く相関する。この研究において、心臓毒性および腎毒性が、観察された。
【０１４７】
（実施例２３：高分子のＭＢＤ−ペプチド媒介性核トランスロケーションは、カベオリン結合コンセンサス配列の存在によって、大いに増強される）
ビオチニル化ＭＢＤペプチドであるＭＢＤ９、ＭＢＤ２０（
【０１４８】
【化１】
2007524588.tif 000008
：ＭＢＤコア１４マーに下線を付しており、カベオリンコンセンサス結合配列は、太字である）またはＭＢＤ２１（
【０１４９】
【化２】
2007524588.tif 000009
：ＭＢＤコア１４マーに下線を付しており、カベオリンコンセンサス結合配列は、太字である）を、各々、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体と混合し（３〜６倍モル過剰のＭＢＤペプチド）、ＨＥＫ２９３細胞に添加した。２０分間後、核抽出物および細胞質抽出物を、実施例２０において記載されるように調製し、ペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。
【０１５０】
図２４において要約したアッセイ結果は、この大きな（約９０Ｋｄ）結合体の効率的な核移行が、ＭＢＤ２０またはＭＢＤ２１を使用した場合には、ＭＢＤ９に対してはるかに効率的に進行したことを示す。これらのペプチド配列間の顕著な差異は、ＭＢＤ２０およびＭＢＤ２１の両方にはあるがＭＤＢ９にはない、コアＭＢＤ  １４マー配列（標準ＭＢＤ２ペプチド中に存在する）のＣ末端部位のさらなる６アミノ酸の存在である。この配列の存在は、カベオリンに結合するタンパク質中に存在することが公知であるモチーフ（＃Ｘ＃ＸＸＸＸ＃であり、「＃」は、芳香族アミノ酸である）を完成する。生細胞の外側から核中へと直接大きな分子を迅速に取り込むことを動員するためのＭＢＤ２０配列の使用は、特に、核酸を含む適用（例えば、遺伝子治療）ならびに核酸活性の調節因子において、潜在的に非常に有意である。
【０１５１】
本発明は、直接的な記載および実施例の両方によって詳述されている。本発明の等価物または本発明の改変は、当業者に明らかであり、そして本発明の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】図１Ａ〜図１Ｂは、ＩＧＦＢＰ−３配列を１文字表記のアミノ酸コードで示す。図１Ａは、ネイティブヒトＩＧＦＢＰ−３（Ａｌａ５対立遺伝子改変体）のアミノ酸配列を示す。図１Ｂは、［Ｎ１０９Ｄ］−ｈＩＧＦＢＰ−３誘導体（Ａｌａ５対立遺伝子改変体）を示す。
【図２】図２は、ＣＤ７４モチーフを含む選択されたヒトタンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図３】図３は、実施例１に記載される実験の結果を示す。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、実施例２に記載される実験の結果を示す。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、Ｎｉ＋＋ＩＭＡＣおよびＺｎ＋＋ＩＭＡＣを使用する、ＩＧＦＢＰ−３のＩＭＡＣ精製の結果を示す。パネルａおよびｂ（図５Ａおよび図５Ｂ）は、それぞれＮｉ＋＋ＩＭＡＣおよびＺｎ＋＋ＩＭＡＣからのサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。ＦＴはカラムに吸着しなかった物質を示す；Ｗは洗浄（画分）を示す；５０は５０ｍＭイミダゾール洗浄（画分）を示す；６０は６０ｍＭイミダゾール洗浄（画分）を示す；Ｅは１Ｍイミダゾール溶出緩衝液（画分）を示す；Ｓは１Ｍ  ＥＤＴＡ緩衝液（画分）を示す。
【図６】図６は、融合タンパク質を使用するＩＧＦＢＰ−３ドメインの生成に関するスキームを示す。下パネルは、精製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１は、３Ｃタンパク質分解酵素（１０：１希釈）で消化した粗抽出物を示す；レーン２は、フェニルセファロースＨＩＣクロマトグラフィー後を示す；レーン３は、ニッケル金属アフィニティークロマトグラフィー後を示す。
【図７】図７は、ペプチド−ｇｆｐ融合体とともにインキュベートした後の細胞の蛍光を示す。ａ＝細胞単独（ｇｆｐの添加なし）；ｂ＝細胞＋ＳＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＡＨＱＮＳＱＴ−ｇｆｐ；ｃ＝細胞＋ＫＫＧＨＡＫＤＳＱＲＹＫＶＤＹＥＳＱＳ−ｇｆｐ；ｄ＝細胞＋ＫＫＧＦＹＫＫＫＱＣＲＰＳＫＧＲＫＲＧＦＣＷ−ｇｆｐ。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、実施例８に記載される共アポトーシスアッセイの結果をまとめたグラフを示す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｂは、実施例９に記載される細胞インターナリゼーション実験の結果を示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、実施例１１に記載される抗原性プロファイリング研究の結果を示す。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＩＧＦＢＰ−３およびＭＤＢ２の両方の共アポトーシス活性に関するＩＧＦ非依存性を確認する実験の結果を要約する。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｂは、ＭＤＢ２の共アポトーシス活性がインテグリン依存性であることを示す実験の結果を要約する。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｂは、ＭＤＢ２の共アポトーシス活性が配列特異的であることを示す実験の結果を要約する。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＩＧＦＢＰ−３がｂａｘ−α発現を刺激すること、およびこのｂａｘ−α発現がカスパーゼ−３活性に関連することを示す実験の結果を示す。
【図１５】図１５は、ＭＤＢペプチドの共アポトーシス活性がＰＩ３Ｋ／ＩＬＫに依存性であるが、ＭＡＰＫ、シグナル伝達経路に非依存性であることを示す実験の結果を要約する。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｂは、ＭＤＢペプチドが細胞障害性化学療法剤の用量を低下させるように癌細胞を感作することを示す実験の結果を要約する。
【図１７】図１７は、実施例１９に記載される実験の結果を要約する。白四角は、生理食塩水中でインキュベートされたＩＧＦＢＰ−３に由来するデータを示す；白丸は、塩化第一鉄と共にインキュベートされたＩＧＦＢＰ−３に由来するデータを示す；黒丸は、ＩＧＦ−Ｉおよび塩化第一鉄と共にインキュベートされたＩＧＦＢＰ−３に由来するデータを示す；白菱形は、塩化亜鉛と共にインキュベートされたＩＧＦＢＰ−３に由来するデータを示す。
【図１８】図１８は、実施例２０に記載される実験の結果を要約する。実施例２０は、核トランスロケーションにおける特定の金属とのＭＢＤ−ＧＦＰ３２のプレインキュベートの効果を測定する。各々のバーは、３回測定の平均を示す。
【図１９】図１９は、実施例２１に記載される実験の結果を要約する。実施例２１は、ＭＢＤペプチドの核トランスロケーションにおけるナイスタチンおよびクロルプロマジンの効果を測定する。各々のバーは、３つのプレートの平均を示す。
【図２０】図２０は、実施例２１に記載される実験の結果を要約する。実施例２１は、ＭＢＤペプチドのα５インテグリンとの関連におけるナイスタチンおよびクロルプロマジンの効果を測定する。クロルプロマジンで処理された細胞に由来するデータは、白菱形で示されている。ナイスタチンで処理された細胞に由来するデータは、白丸で示されている。コントロール（未処理）細胞に由来するデータは、白四角で示されている。
【図２１】図２１は、実施例２１に記載される実験の結果を要約する。実施例２１は、ＭＢＤペプチドのトランスフェリンレセプターとの関連におけるナイスタチンおよびクロルプロマジンの効果を測定する。クロルプロマジンで処理された細胞に由来するデータは、白菱形で示されている。ナイスタチンで処理された細胞に由来するデータは、白丸で示されている。コントロール（未処理）細胞に由来するデータは、白四角で示されている。
【図２２】図２２は、ＭＢＤ−ＧＦＰ結合体の分布を研究する実験の結果を要約する。各組織について、データは、左から右へ、生理食塩水、ＭＢＤ−ＧＦＰ−３２、およびＭＢＤ−ＧＦＰ３７について示されている。各々のバーは、３匹の動物からの測定の平均を示す。
【図２３】図２３は、ｍＭＢＤ７で前処理の１８日後にＭＢＤ−ＧＦＰ結合体の分布を研究する実験の結果を要約する。各組織について、データは、左から右へ、生理食塩水、ＭＢＤ−ＧＦＰ−３２、およびＭＢＤ−ＧＦＰ３７について示されている。各々のバーは、３匹の動物からの測定の平均を示す。
【図２４】図２４は、実施例２１に記載される実験の結果を要約する。実施例２１は、ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を複合体化されたビオチン化ペプチドＭＢＤ９、ＭＢＤ２０およびＭＢＤ２１の核トランスロケーションを測定する。カラム１は、コントロール（ペプチドなし）からの結果を示す；カラム２は、ＭＢＤ９／ＨＲＰ結合体からの結果を示す；カラム３は、ＭＢＤ２０／ＨＲＰからの結果を示す；カラム４は、ＭＢＤ２１／ＨＲＰ結合体からの結果を示す。
2007524588.tif 000010
【図２】
2007524588.tif 000011
【図３】
2007524588.tif 000012
2007524588.tif 000013
【図５】
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【図６】
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【図７】
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2007524588.tif 000017
2007524588.tif 000018
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2007524588.tif 000022
2007524588.tif 000023
【図１５】
2007524588.tif 000024
2007524588.tif 000025
【図１７】
2007524588.tif 000026
【図１８】
2007524588.tif 000027
【図１９】
2007524588.tif 000028
【図２０】
2007524588.tif 000029
【図２１】
2007524588.tif 000030
【図２２】
2007524588.tif 000031
【図２３】
2007524588.tif 000032
【図２４】
2007524588.tif 000033
【手続補正書】
【提出日】平成18年1月20日(2006.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007524588000001.app
【国際調査報告】
2007524588.tif 000034
2007524588.tif 000035
2007524588.tif 000036