(57)【要約】好ましくは乳酸菌であるがこれに限定されるものではない、食品グレードに馴化されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物を製造するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の連続する工程を含む、食品中での使用のための適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造プロセス：
a）細菌を、ファーメンター中で、適切な培養培地中で増殖させる工程；
b）得られる細菌を工程a）に適合させる工程；
c）タンジェンシャル精密濾過によって、適合された細菌を含む培養培地を、洗浄溶液を使用して洗浄する工程；
d）タンジェンシャル精密濾過によって、適合された細菌を含む洗浄された培地を、5.1010ufc/mlよりも高い、有利には1.1011ufc/mlよりも高い細菌濃度まで、細菌を濃縮する工程；
e）食品における使用のために適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物を回収する工程。
【請求項２】
細菌が、乳酸菌、特に、乳酸菌種（Lactobacillus spp.）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp.）、連鎖球菌種（Streptococcus spp.）およびラクトコッカス種（Lactococcus spp.）の属の細菌であることを特徴とする、請求項1記載のプロセス。
【請求項３】
工程a）の培養培地が合成培地であることを特徴とする、請求項1および2記載のプロセス。
【請求項４】
工程a）の最後にファーメンター中の細菌を含む培養培地が、3から6の間のpHを有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項５】
増殖工程a）の最後の細菌の濃度が2.1010ufc/mlよりも高いことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項６】
工程b）において行われる細菌の適合が、培養培地のパラメーターおよび/または細菌のパラメーターを測定することによって明らかにされることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項７】
培養培地のパラメーターが、培養培地のpH、浸透圧および/または温度であることを特徴とする、請求項6記載のプロセス。
【請求項８】
培養培地のパラメーターがpHであり、工程b）が自然の酸性化によってpHを減少させることによって実行されることを特徴とする、請求項7記載のプロセス。
【請求項９】
培養培地のパラメーターが温度であり、工程b）が温度を減少させることによって実行されることを特徴とする、請求項7記載のプロセス。
【請求項１０】
細菌のパラメーターが細菌のサイズであることを特徴とする、請求項6〜9のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１１】
各細菌の長さの分布が主として0.1から10マイクロメートルの間、有利には0.5から5マイクロメートルの間であることを特徴とする、請求項6記載のプロセス。
【請求項１２】
適合工程b）がタンジェンシャル精密濾過法によって実行されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１３】
タンジェンシャル精密濾過膜が0.01から0.5μmの間、有利には0.1から0.3μmの間の多孔性を有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１４】
工程c）において精密濾過モジュール中の培養培地の入口圧力が0から3.105Paの間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１５】
工程c）およびd）において、透過液の速度が0.001から0.1m3/h/m2の間の表面交換であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１６】
工程d）において、膜透過圧が0.1.105から2.105Paの間、有利には0.1.105から0.5.105Paの間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１７】
工程d）において、洗浄培地の循環速度が交換表面の0.5から3m3/h/m2の間、有利には交換表面の0.8から1.2m3/h/m2の間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１８】
工程a）の前に、細菌の再生および前培養の連続工程を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１９】
工程e）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中に、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物をパッケージすることのさらなる工程f）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項２０】
工程f）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中に、-50℃から+4℃の間の温度でパッケージされた適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物を保持するさらなる工程g）を含むことを特徴とする、請求項19記載のプロセス。
【請求項２１】
工程g）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中にパッケージされた適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の適合手段によって再加熱するさらなる工程h）を含むことを特徴とする、請求項20記載のプロセス。
【請求項２２】
洗浄溶液を含むバット（1）、ファーメンター（3）中の該洗浄溶液の入口導管（2）、培養培地中の細菌の増殖に働く該ファーメンター（3）、タンジェンシャル精密濾過の1つまたは複数のモジュール（5）に、細菌を含む培養培地を運ぶための出口導管（4）を備え、該モジュール（5）は、細菌を含まない透過液（6）への、および細菌を含む濃縮物（7）への該培養培地の分離を可能にすることを特徴とする、請求項1〜21のいずれか一項記載のような、食品における使用のための、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造のためのプロセスを実行するためのデバイス。
【請求項２３】
濃縮物（7）がファーメンター（3）への再取り込みによって濾過モジュール（5）を離れる際にリサイクルされることを特徴とする、請求項22記載のデバイス。
【請求項２４】
濾過モジュール（5）が1〜10個の濾過膜を含み、各膜が0.1m2〜150m2の総濾過表面を示すことを特徴とする、請求項22および23のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項２５】
請求項1〜21のいずれか一項記載のプロセスによって得られることが可能であることを特徴とする、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物。
【請求項２６】
食品添加物としての、請求項25記載の適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の使用。
【請求項２７】
使用される食品添加物が、請求項25記載の適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物であることを特徴とする、添加食品。
【請求項２８】
乳製品および/または飲料であることを特徴とする、請求項27記載の添加食品。
【請求項２９】
適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物が製造ラインの最後に、好ましくは食品のパッケージングの前に食品に加えられることを特徴とする、請求項27または28のいずれか一項記載の添加食品のための製造プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品における使用のために適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造プロセスに関する。好ましくは、しかし非限定的に、製造されるこの細菌は乳酸菌である。
【背景技術】
【０００２】
特定の細菌の株、特に乳酸菌（Lactobacillus）属およびビフィズス菌（Bifidobacterium）属に属するものの消化は、とりわけ腸内細菌叢の適切な機能を促進することによって、健康のために特に有益である。実際に、これらの細菌は、バクテリオシンおよび乳酸を産生し、これらは食品の消化能力を増加させ、腸のぜん動を促進し、および薄層（plate）の排出を加速する。加えて、これらの細菌は、特定のビタミンB群を産生し、そして一般的に、ビタミンおよびミネラルの吸収を促進し、血液コレステロールを減少し、免疫系を強化し、ならびに有害な微生物の侵入および作用から保護するために腸粘膜を覆う。
【０００３】
このことのために、現在まで数年間の間、農業食品産業は、それらの最終製品、最も一般的にはヨーグルトの中にこのような細菌を取り込むことを試みてきた。
【０００４】
現在、これらの細菌は、凍結または凍結乾燥の形態で商業的に製造されている。しかし、これらの製造プロセスは、細菌にとって傷害性であり、このことは細菌の活性の一部、時折細菌の生存可能性を喪失する。このことは、これらの製品の製造者および消費者にとって不利益である。なぜなら、細菌は、可能であれば何ヶ月もの間、品質および技術的な性能の要求性を満たさなければならないからである。それゆえに、それらの生存可能性および最大活性を保証するプロセスによって細菌を製造することが好ましい。この目的のために、1つの方法は、液体形態で細菌を製造する工程からなる。しかし、この方法もまた、最終製品への細菌の導入の後で、細菌の間で有意な死滅を生じることが明らかにされた。
【０００５】
加えて、細菌の貯蔵のコストを減少させるために、および最終製品への細菌の添加を容易にするために、液体形態で細菌を濃縮することが所望されるべきである。このことを行うために、専門家は、通常、遠心分離または濾過の工程を使用する。しかし、遠心分離は、細菌にとって傷害性のプロセスであり、これは、とりわけ、強力な剪断力（chiselling）によって顕著な細胞死を引き起こし得、また、このプロセスは、食品にプロバイオティックスとして加えられる細菌の産生において必要とされるようなものなどの少量を遠心分離するために非常に適合しているというわけではない。古典的な濾過工程に関しては、これもまた、細菌の死滅および細菌によるフィルターの目詰まりの問題を提示する。
【０００６】
それゆえに、濃縮工程の後、および最終製品への導入後に、最大の活性および生存可能性を有する細菌の液体濃縮物の所望される量を製造することが所望される。
【発明の開示】
【０００７】
驚くべくことに、および予想外に、本発明者らは、細菌の適合工程が、最終製品への導入後に、細菌の活性および生存可能性を顕著に増加させることを補助することを示した。
【０００８】
加えて、本発明者らは、特定の条件下での（圧力、濃度、膜の多孔性など）タンジェンシャル濾過（tangential filtration）工程が、細菌の生存可能性を保ちながら、かつフィルターを目詰まりさせることなく、所望の量の細菌培養物を濃縮させることを補助することを示した。
【０００９】
タンジェンシャル濾過は、膜の性質および構造の関数としての2つの流れ：透過液（細菌を実質的に含まない培養培地）および残渣（細菌を含む、濃縮液とも呼ばれる）を生じる。タンジェンシャル濾過において、液体循環は、膜の表面に対して垂直方向ではなく平行方向であり、従って、その流速は、濾過表面を詰まらせる沈着物の蓄積（一般的にフィルターの目詰まりとも呼ばれる）を妨害する自己洗浄を確実にする。
【００１０】
従って、本発明の目的は、食品中での使用のための適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造プロセスであり、このプロセスは以下の連続する工程を含む：
a）細菌を、ファーメンター中で、適切な培養培地中で増殖させる工程；
b）得られる細菌を工程a）に適合させる工程；
c）タンジェンシャル精密濾過によって、適合された細菌を含む培養培地を、洗浄溶液を使用して洗浄する工程；
d）タンジェンシャル精密濾過によって、適合された細菌を含む洗浄された培地を、5.1010ufc/mlよりも高い、有利には1.1011ufc/mlよりも高い細菌濃度まで、細菌を濃縮する工程；
e）食品における使用のために適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物を回収する工程。
【００１１】
細菌という語は、本発明に従って、以下の属の乳酸菌：乳酸菌種（Lactobacillus spp.）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp.）、連鎖球菌種（Streptococcus spp.）、ラクトコッカス種（Lactococcus spp.）、および特に、ラクトバチルス  カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス  プランタラム（Lactobcaillus plantarum）、ラクトバチルス  ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス  ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス  アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ビフィドバクテリウム  アニマリス（Bifidobaeterium animalis）、ビフィドバクテリウム  ブラベ（Bifidobacterium breve）、ストレプトコッカス  サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）およびラクトコッカス  ラクティズ（Lactococcus lactis）を好ましく意味すると理解される。
【００１２】
適合された細菌は、本発明に従って、異なるストレス、特に異なる物理化学的ストレスに付随する異なるストレスに対してより耐性である細菌を意味すると理解される。
【００１３】
本発明に従って、工程a）の培養培地は合成培地である。
【００１４】
合成培地は、本発明に従って、厳密な定量的および定性的な制御に供せられた化合物が導入されている培地を意味すると理解される。
【００１５】
本発明に従って、洗浄溶液は、細菌濃縮物の食品使用に適合され、細菌の生存可能性と適合可能である浸透圧を与える。
【００１６】
本発明に従って、工程a）の最後にファーメンター中の細菌を含む培養培地は、3から6の間のpHを有する。
【００１７】
本発明に従って、増殖工程a）の最後の細菌の濃度は2.1010ufc/mlよりも高い。
【００１８】
加えて、本発明者らは、工程b）において行われる細菌の適合は、それらの培養培地と加えられる完成した食品との間での、細菌の培地の変化によって引き起こされる細菌の死滅を減少させることを補助することを示した。
【００１９】
本発明に従って、細菌の適合は、培養培地のパラメーターを測定することによって実証される。本発明に従って、培養培地のパラメーターは、好ましくは、pH、浸透圧および/または温度である。
【００２０】
細菌の適合を明らかにするための他のパラメーターが可能であり、これは例えば、細菌培地の糖の濃度などである。
【００２１】
培養培地のパラメーターがpHである事象において、工程b）は、自然の酸性化によってpHを減少させることによって好ましく実行される。
【００２２】
自然の酸性化によるpHにおける細菌の適合の工程を実行するために、例えば、発酵培地の糖濃度を測定することが可能であり、および各細菌種についての閾値濃度より上では、pHがもはや調節されず、かつ培地への適合が非常に容易になることが公知である。
【００２３】
従って、例えば、ラクトバチルス  カゼイの発酵培地の糖濃度が9g/Lである場合、pHはもはや調節されず、かつ5にほぼ等しい。次いで、適合された株にとって、新たな培地に加えられることがより容易になり、そしてこのことは、最終培地中での細菌のより良好な生存可能性を許容する。
【００２４】
本発明に従って、細菌のパラメーターは細菌のサイズである。
【００２５】
適合が細菌のサイズによって開示される事象において、該濃縮物の各細菌の長さの分布は、好ましくかつ主として0.1から10マイクロメートルの間、有利には0.5から5マイクロメートルの間である。
【００２６】
細菌のサイズは適合手段によって測定される。
【００２７】
適合手段は、例えば、細菌の規則的なサンプリング、続いてフローサイトメトリーによって細菌のサイズを測定することであり得る。
【００２８】
加えて、本発明に従って、タンジェンシャル濾過は、細菌の適合のために工程b）のために使用することができる。
【００２９】
本発明に従って、タンジェンシャル濾過膜は、0.01から0.5μmの間、好ましくは0.1から0.3μmの間の多孔性を有する。
【００３０】
これらの膜は、本発明のプロセスの工程c）および工程d）、ならびに任意に工程b）のために使用される。
【００３１】
この濾過膜は、以下によって特徴付けられる：
-透過速度がそれらに依存する、濾過層の多孔性および厚さ；
-分離の効率がそれらに依存する、孔の直径およびそれらの分布；
-機械的、化学的および熱的耐性ならびに洗浄の容易さがそれらに依存する、使用される材料。
【００３２】
濾過膜は、有機またはミネラルの膜を意味すると理解される。
【００３３】
有機膜は、とりわけ、酢酸セルロース、芳香族ポリアミド、ポリスルホン、セルロースエステル、セルロース、硝酸セルロース、PVC、またはポリプロピレンから構成され得る。
【００３４】
ミネラル膜は、とりわけ、焼結セラミック、焼結金属、炭素、またはガラスから構成され得る。
【００３５】
本発明に従って、細菌を含む培養培地は、25〜45℃の間、および好ましくは35〜39℃の間の温度に維持される。
【００３６】
本発明に従って、温度は、それらが加えられる完成製品の温度に株を適合させるために、工程b）において1〜44℃減少される。
【００３７】
本発明に従って、工程c）において濾過モジュール中の培養培地の入口圧力は0から3.105Paの間である。
【００３８】
本発明に従って、工程c）およびd）において、透過速度は、交換表面の0.001から0.1m3/h/m2の間である。
【００３９】
本発明に従って、工程d）において、膜透過圧は、0.1.105から2.105Paの間、好ましくは、0.1.105から0.5.105Paの間、および有利には0.1.105から0.5.105Paの間である。
【００４０】
膜は、孔の直径よりも小さなサイズの成分を通過させることを可能にする純粋な機械的障壁として示される。2つの液相間の分離は、細菌を含む培養培地が循環する側面と、透過液が循環するもの（細菌を実施的に含まない培養培地）の間に圧力の違いを適用することによって得られる。この圧力の違いは、一般的に膜透過圧と呼ばれる。
【００４１】
タンジェンシャル濾過モジュール中の、密閉したループ中に細菌を含む培養培地の再循環は、目詰まりを制限しながら、膜を通しての細菌の濃縮および培養培地の濾過を可能にする。
【００４２】
本発明に従って、工程d）において、洗浄培地の再循環速度は、交換表面の0.5から3m3/h/m2の間、有利には交換表面の0.8から1.25m3/h/m2の間である。
【００４３】
本発明に従って、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造プロセスは、工程a）の前に、細菌の再生および前培養の連続工程を含む。
【００４４】
ファーメンター中での潜伏期を最大まで減少させるために、微生物は完全な対数増殖期で利用される。これを行うために、本発明者らは2つの工程で進行させる：
-事前に-80℃に凍結させた細菌のチューブ中での再生の実行
-微生物の数を増幅するためのエーレンマイヤー前培養サービング。それらの増殖は、最大対数増殖期で停止されるべきである。
【００４５】
本発明に従って、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造プロセスは、工程e）の後で、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の柔軟性、密封性かつ滅菌性のバッグ中にパッケージすることのさらなる工程f）を含む。
【００４６】
柔軟性、密封性バッグは、本発明に従って、好ましくは食品用プラスチック製であるバッグを意味することが理解される。
【００４７】
本発明に従って、本発明のプロセスは、任意の工程f）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中に、-50℃から+4℃の間の低温でパッケージされた適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物を保持するさらなる工程g）を含み得る。
【００４８】
任意選択により、柔軟性バッグ中にパッケージされ、かつ低温で保持された、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物に、例えば、サッカロースなどの凍結保護分子を加えることが可能である。
【００４９】
本発明に従って、本発明のプロセスは、工程g）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中にパッケージされた適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の適合手段によって再加熱するさらなる工程h）を含むことができる。
【００５０】
適合手段は、本発明に従って、例えば、細菌にとって致死的でない温度、例えば、37℃における二重鍋（bain marie）の使用を意味することが理解される。
【００５１】
本発明の目的はまた、洗浄溶液を含むバット（1）、ファーメンター（3）中の該洗浄溶液の入口導管（2）、培養培地中の細菌の増殖に働く該ファーメンター（3）、タンジェンシャル精密濾過の1つまたは複数のモジュール（5）に、細菌を含む培養培地を運ぶための出口導管（4）を備え、該モジュール（5）は、細菌を含まない透過液（6）への、および細菌を含む濃縮物（7）への該培養培地の分離を可能にすることを特徴とする、本発明に従う、食品における使用のための、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造プロセスを実行に移すためのデバイスである。
【００５２】
図1は、本発明に従うデバイスを図示する。
【００５３】
本発明に従って、濃縮物（7）は、ファーメンター（3）への再取り込みによって濾過モジュール（5）を離れる際にリサイクルされる。
【００５４】
本発明に従って、濾過モジュール（5）は、1〜10個の濾過膜を備え、各膜が0.1m2〜150m2の総濾過表面、および0.01から0.5μmの間の、好ましくは0.1から0.4μmの間の多孔性を示す。
【００５５】
本発明の目的はまた、本発明に従うプロセスによって得られることが可能である、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物である。
【００５６】
本発明の目的はまた、食品添加物としての、本発明に従う適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の使用である。
【００５７】
食品添加物は、本発明に従って、所望の技術的効果を生じるために、それらの調製の間またはそれらの貯蔵目的のために食品に添加される任意の化学物質を意味することが理解される。加えて、本発明に従って、細菌は、加えられた最終製品中で生存可能であり、かつ発酵を引き起こさないので、細菌の液体濃縮物は、安定な計数を有する。
【００５８】
本発明の目的はまた、使用される食品添加物が、本発明に従う適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物であることを特徴とする、添加食品である。
【００５９】
本発明に従って、食品は、乳製品および/または飲料である
【００６０】
乳製品は、本発明に従って、乳に加えて、乳由来製品、例えば、クリーム、アイスクリーム、バター、チーズ、ヨーグルト；二次製品、例えば、乳清、カゼイン、ならびに、主成分として乳または乳の構成成分を含む種々の調製食品を意味することが理解される。
【００６１】
飲料は、本発明に従って、例えば、糖分または香料が加えられてもよいし加えられなくてもよい、例えば、フルーツジュース、乳およびフルーツジュースの混合物、植物ジュース、例えば、ダイズジュース、オートジュースまたはライスジュースなど、アルコール飲料、例えば、ケフィアなど、ソーダ、およびわき水またはミネラルウォーターなどの飲料を意味することが理解される。
【００６２】
本発明の目的はまた、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物が、製造ラインの最後に、好ましくは食品のパッケージングの前に食品に加えられることを特徴とする、本発明に従う添加食品のための製造プロセスである。
【００６３】
本発明に従って、添加食品の製造プロセスは、適合され、かつ生存可能である細菌の液体濃縮物が、ポンピングによってライン中の食品に加えられることを特徴とする。
【００６４】
本発明は、本発明に従う、適合されかつ生存可能である液体濃縮物の調製の実施例に言及する、以下の付随する説明によってより良好に理解される。
【００６５】
しかし、これらの実施例は本発明の目的の例示のみのために提供され、いかなる場合においても限定を構成するものではあり得ないことが理解される。
【００６６】
実施例：
これらの実施例において、圧力はバールで示され、1バールは1.105Paに対応する。
【００６７】
I. 再生および前培養
-培養培地の調製
出発培養培地は、ボトル（95ml）中の、糖を含まず、次に、ジサッカリドである場合には10g/l、またはモノサッカリドについては20g/lを生じるために、本発明者らの主要な炭素源の滅菌付加を行う、MRS液体培地（ラクトバチルスの培養のために利用される選択培養培地）である。今回は、1gのラクトースを5mlの温めた蒸留水に取り、次いで、全体を0.2μmの多孔性フィルター上で濾過し、MRSの95mlボトルに全体として加える。10mlを滅菌チューブに移し、再生を意図する。残り（10g/lラクトースの90ml MRS）を前培養のために使用する。
【００６８】
-再生増殖条件（10ml）
○37℃
○オーブン中で静置
○-80℃で凍結したチューブから1%で接種
○時間：16時間
○培養の完了時に、1/20で希釈した試料上で、580nmにおいて、水のバットに対して測定した光学密度：0.35〜0.4
○pH：4近辺
【００６９】
-前培養増殖条件（500ml）
○37℃
○オーブン中で静置
○前培養から1%で接種
○時間：16時間
○培養の完了時に、1/20で希釈した試料上で、580nmにおいて、水のバットに対して測定した光学密度：0.35〜0.4
○pH：4近辺
【００７０】
II. ファーメンター中での増殖
-pHの調節ベースの調製
38%（または9.3モル/l）のKOHを、乳酸製品を中和するために利用する。これを121℃で15分間滅菌する。
【００７１】
10リットルの増殖のためにあらかじめ必要とされた量は、最低で1000mlである。
【００７２】
-増殖培地の調製
炭素源および窒素源を、糖の分解反応（滅菌の間のメイラード化合物の形成）を回避するために別々に滅菌する。
【００７３】
10リットルの最終増殖培地について：
○バットのボトム
-カゼインペプトントリプトン（Merck）  600g
-酵母抽出物（Merck）、6mol/lのHClでpHを6.5に調整  180g
-MnSO4、H2O  1g
sqf  5.5リットル
事前に水で滅菌したファーメンター中で、121℃にて15分間滅菌する。
【００７４】
○炭素源溶液
-ラクトース  800g
-加熱して溶解し、次いで最終的に4リットルにする
110℃で30分間滅菌する
滅菌し加熱したこの溶液を、バットのボトムに移す。
【００７５】
-ファーメンター増殖条件
○接種前の体積：9.5リットル
○37℃
○KOH 10mol/lでpHを6.5に調節
○時間：18時間
○3枚の浸漬した刃を備えた攪拌心棒、200rpmで攪拌
○窒素で脱気
○上記からの永続的な窒素供給（速度11/分）
○前培養から5%で、または500mlでの接種
○培養の完了時に、1/100で希釈した試料上で、580nmにおいて、水のバットに対して測定した最終光学密度：0.32〜0.35
増殖後、結果は2.1010ufc/mlの細菌を含む培地である。
【００７６】
III. 培養の適合および洗浄
それらが注入される最終製品（ヨーグルト型）のpH、および/または浸透圧、および/または温度において産生されるバイオマスを調製するために、2つの工程を合わせて行う：
-培養の17時間後、pH 6.5〜pH 5（=洗浄前の目的のpH）まで変化させるために、1時間の自然の酸性化によってpHの低下を起こさせる。
-細菌を洗浄すること（37℃）は、バッチ後（pH 5における酸性化後工程）に行う。
【００７７】
洗浄は、100℃で30分間滅菌した、250g/lのサッカロースの溶液中で行い、これは、1000mOsmの浸透圧の溶液に相当する。この選択は、合成培地から最終産物までに移動する際の浸透圧ショックのリスクを最小化するために最適化され、その測定されたパラメーターは、pH 5および879mOsmの浸透圧である。
【００７８】
洗浄の間の工程は、濾過ループの開始、系を通しての細菌の再循環、および同じ速度での洗浄溶液の注入/濾液の除去である。
【００７９】
濾過系の開始
濾過開始の間、第1の工程は、100%開いた位置でモジュールの入口バルブおよび出口バルブを用いて、減少した速度（ポンプの最大速度の20〜50%）で5分間系を実行させることによる、極性層の形成である。透過液出口バルブは閉じている。一旦この時間が過ぎると、ポンプの速度は、その使用範囲の100%まで徐々に加速する。透過液バルブは100%まで開き、完全な濾過工程のためにこの位置に保持される。
【００８０】
洗浄の間に定常量の反応媒体を維持するために、透過量は、供給（D1）のそれと等価でなくてならない。洗浄溶液の供給速度は、透過液のそれと同一である。溶液の量は、1時間から2時間の間で変化する時間で通過する。一旦この時間が過ぎると、濾過条件は変化しないままであり、体積の濃縮が開始する。
【００８１】
IV. タンジェンシャル精密濾過による濃縮
培地の濾過は、25から44℃の間の温度範囲において、3.5から5.5の間の目的のpHにおいて、4時間にわたってもたらされる。濾過速度は、培養の進行および培地のレオロジー的特性の修飾に伴って鋭く低下する。ループの入口圧力は増加して3バールの値に達し、濾過膜によって支持される上限を表す。次いで、培地の再循環を停止し、細菌濃縮物を滅菌状態で回収する。この方法は、少なくとも1.1011ufc/mlの細菌を含む1リットルのクリーム状液体を産生する。
【００８２】
-操作条件
1. 完全な系の滅菌
-濾過ループは流れの通過によって滅菌される。この操作を実行するために、濾過モジュールは、拡張補償スクリューを備えなければならない。
【００８３】
処理の効率は、滅菌値Foを計算することによって評価する。これは、参照温度121.1℃において同じ効率を有する滅菌計算値の、分で示した時間である。
【００８４】
処理の時間t、または処理の温度Tのいずれかは、Z=10℃とともに、国際会議の通りである。
Fo=t.10(T-Tref/Z)
【００８５】
ファーメンターから生じる滅菌水（121.1℃、20分間）の2つの通りを、細菌の濾過の前にループ中で作製する。
【００８６】
2. 膜の洗浄およびリサイクル
濾過後の膜の回収は容易であるが、本明細書中下記の参照変数に従わなくてはならない。
【００８７】
-NaOH 0.5Mの溶液による、45℃で30分間、すすぎ前の最大速度でのポンプの処理。このように処理して、膜は、濃縮したL.カゼイの少なくとも5回の再現可能な産生サイクルのために再利用され得る。
【００８８】
3. その場で膜を保存すること
全体のモジュールを、NaOH 0.1Mの溶液を用いて、必要な場合、すべてのバルブを閉じて保存する。
【００８９】
4. 精密濾過工程の開始
精密濾過技術を使用する際の主要なリスクの1つは、実質的かつ迅速な膜の目詰まりである。
【００９０】
この目詰まりは3つの現象によって特徴付けられる：
-膜表面上の粒子および溶質の吸着および付着
-層の分極およびケーキの形成
-孔の遮断。
【００９１】
一般的規則として、弱い膜透過圧ならびに高いタンジェンシャル循環速度は、この操作の実行における基本的パラメーターである。
【００９２】
III  プラットフォームの特徴付け
1. パラメーターの測定
測定の範囲は、平均で300分間の時間にわたって行う。
【００９３】
実行されるアッセイを参照すると（図2を参照されたい）、15分と175分の間の時間範囲が、入口と出口の圧力モジュールの、および結果として、膜透過圧の安定性相を示す。
【００９４】
この160分間の範囲は、維持される最適な濾過条件の代表である。
【００９５】
以下の表は、濾過時間の着手時、中間部および最後において測定される値を表す。
【００９６】
1.1 圧力の展開
多孔性膜上の選択的分離の推進力は、残渣回路と透過液回路の間に存在する圧力の違いである。
【００９７】
(表１)圧力の展開
2007524417.tif 000002
【００９８】
-膜透過圧（TMP）の測定
TMP=（Pモジュールエントリー+Pモジュール出口）/2)-P透過液
再循環圧力に等しい入口圧力モジュールを用いる。
【００９９】
15分間のサイクル後、本発明者らは、系の全体が安定化されることを考慮する。次いで、分極層が確立され、全体の圧力および速度が安定化される。
【０１００】
安定化された測定範囲にわたるアッセイの間の平均測定値
モジュールの入口圧力  1.211バール
モジュールの出口圧力  0.145バール
透過圧力  0.196バール
TMPの展開  0.465バール
【０１０１】
1.2. 速度の展開
（表２）速度およびタンジェンシャル速度の展開
2007524417.tif 000003
【０１０２】
-直線状速度（m/s）
Vt=Q(m3/h)/(3600×全濾過表面)、m/sで
全体の濾過表面=モジュールの数×チャネルの数×セクション（mで）。
【０１０３】
安定化された測定の範囲にわたって
測定された最大残渣速度の平均：124.8 l/h
最大透過液速度  2.19 l/h
平均透過液速度：1.46 l/h
平均タンジェンシャル速度：0.579 m/s
【０１０４】
1.3. 温度の展開
本発明者らのすべてのアッセイを通して、指示に対して測定された最大上昇は2℃であった。
【０１０５】
ポンプ出口またはモジュールに配置される熱変換器は、この温度の上昇に容易に対処することができた。一般的に、測定された温度は37℃で一定であり、0.3℃の測定の広がりを伴った。
【０１０６】
1.4. 濃度因子
体積濃度因子（VCF）は10である。
バッチにおいて達成された最終集団は2.1010ufc/mlである。細菌濃縮物において測定される最終集団は、1.5.1011ufc/mlよりも高い。
【０１０７】
1.5. 濾過操作の再現性
これは、マウス試験の間に4週間にわたって実行された異なる濾過アッセイについて、本明細書中下記の図3から5に現れる曲線をトレースすることによって評価する。
【０１０８】
記載した条件でのタンジェンシャル濾過工程は完全に再現可能であり、速度、温度および圧力のパラメーターは、L.カゼイの濃縮工程の間に制御される。
【０１０９】
タンジェンシャル濾過プラットフォーム：1.1010ufc/mlのL.カゼイの最終集団を得るための条件。
【０１１０】
>一般的条件：
バッチの集団終点：2.101ufc/ml
サッカロース溶液（250g/l）  浸透圧1000mOsm中での細菌洗浄
（同じ速度での濾過によるポンプ/除去による注入：66ml/分）：1h30の間
-濾過の時間：4hの間
（表３）
2007524417.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】タンジェンシャル濾過による細菌の濃縮のためのデバイスを図示する。
【図２】経時的な膜透過圧の展開を図示する。
【図３】入口圧力モジュールの展開を図示する。
【図４】残渣速度の展開を図示する。
【図５】580nmにおける光学密度および膜透過圧の展開を図示する。
【図１】
2007524417.tif 000005
【図２】
2007524417.tif 000006
【図３】
2007524417.tif 000007
【図４】
2007524417.tif 000008
【図５】
2007524417.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月15日(2005.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の連続する工程を含む、食品中での使用のための適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造プロセス：
a）細菌を、ファーメンター中で、適切な培養培地中で増殖させる工程；
b）得られる細菌を工程a）に適合させる工程；
c）タンジェンシャル精密濾過によって、適合された細菌を含む培養培地を、洗浄溶液を使用して洗浄する工程；
d）タンジェンシャル精密濾過によって、適合された細菌を含む洗浄された培地を、5.1010ufc/mlよりも高い、有利には1.1011ufc/mlよりも高い細菌濃度まで、細菌を濃縮する工程；
e）食品における使用のために適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物を回収する工程であって、および/または、工程b）において行われる細菌の適合が、培養培地のパラメーターおよび/または細菌のパラメーターを測定することによって明らかにされる、工程。
【請求項２】
細菌が、乳酸菌、特に、乳酸菌種（Lactobacillus spp.）、ビフィズス菌種（Bifidobacterium spp.）、連鎖球菌種（Streptococcus spp.）およびラクトコッカス種（Lactococcus spp.）の属の細菌であることを特徴とする、請求項1記載のプロセス。
【請求項３】
工程a）の培養培地が合成培地であることを特徴とする、請求項1および2記載のプロセス。
【請求項４】
工程a）の最後にファーメンター中の細菌を含む培養培地が、3から6の間のpHを有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項５】
増殖工程a）の最後の細菌の濃度が2.1010ufc/mlよりも高いことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項６】
培養培地のパラメーターが、培養培地のpH、浸透圧および/または温度であることを特徴とする、請求項1記載のプロセス。
【請求項７】
培養培地のパラメーターがpHであり、工程b）が自然の酸性化によってpHを減少させることによって実行されることを特徴とする、請求項6記載のプロセス。
【請求項８】
培養培地のパラメーターが温度であり、工程b）が温度を減少させることによって実行されることを特徴とする、請求項6記載のプロセス。
【請求項９】
細菌のパラメーターが細菌のサイズであることを特徴とする、請求項1、6、7、8のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１０】
各細菌の長さの分布が主として0.1から10マイクロメートルの間、有利には0.5から5マイクロメートルの間であることを特徴とする、請求項1記載のプロセス。
【請求項１１】
適合工程b）がタンジェンシャル精密濾過法によって実行されることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１２】
タンジェンシャル精密濾過膜が0.01から0.5μmの間、有利には0.1から0.3μmの間の多孔性を有することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１３】
工程c）において精密濾過モジュール中の培養培地の入口圧力が0から3.105Paの間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１４】
工程c）およびd）において、透過液の速度が0.001から0.1m3/h/m2の間の表面交換であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１５】
工程d）において、膜透過圧が0.1.105から2.105Paの間、有利には0.1.105から0.5.105Paの間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１６】
工程d）において、洗浄培地の循環速度が交換表面の0.5から3m3/h/m2の間、有利には交換表面の0.8から1.25m3/h/m2の間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１７】
工程a）の前に、細菌の再生および前培養の連続工程を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１８】
工程e）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中に、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物をパッケージすることのさらなる工程f）を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載のプロセス。
【請求項１９】
工程f）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中に、-50℃から+4℃の間の温度でパッケージされた適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物を保持するさらなる工程g）を含むことを特徴とする、請求項18記載のプロセス。
【請求項２０】
工程g）の後で、柔軟性かつ密封性のバッグ中にパッケージされた適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の適合手段によって再加熱するさらなる工程h）を含むことを特徴とする、請求項19記載のプロセス。
【請求項２１】
洗浄溶液を含むバット（1）、ファーメンター（3）中の該洗浄溶液の入口導管（2）、培養培地中の細菌の増殖に働く該ファーメンター（3）、タンジェンシャル精密濾過の1つまたは複数のモジュール（5）に、細菌を含む培養培地を運ぶための出口導管（4）を備え、該モジュール（5）は、細菌を含まない透過液（6）への、および細菌を含む濃縮物（7）への該培養培地の分離を可能にすることを特徴とする、請求項1〜20のいずれか一項記載のような、食品における使用のための、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の製造のためのプロセスを実行するためのデバイス。
【請求項２２】
濃縮物（7）がファーメンター（3）への再取り込みによって濾過モジュール（5）を離れる際にリサイクルされることを特徴とする、請求項21記載のデバイス。
【請求項２３】
濾過モジュール（5）が1〜10個の濾過膜を含み、各膜が0.1m2〜150m2の総濾過表面を示すことを特徴とする、請求項21および22のいずれか一項記載のデバイス。
【請求項２４】
請求項1〜21のいずれか一項記載のプロセスによって得られることが可能であることを特徴とする、適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物。
【請求項２５】
食品添加物としての、請求項24記載の適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物の使用。
【請求項２６】
使用される食品添加物が、請求項24記載の適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物であることを特徴とする、添加食品。
【請求項２７】
乳製品および/または飲料であることを特徴とする、請求項26記載の添加食品。
【請求項２８】
適合されかつ生存可能である細菌の液体濃縮物が製造ラインの最後に、好ましくは食品のパッケージングの前に食品に加えられることを特徴とする、請求項26または27のいずれか一項記載の添加食品のための製造プロセス。
【国際調査報告】
2007524417.tif 000010
2007524417.tif 000011
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