(57)【要約】  本発明は、弱毒化表現型を有し、ウイルスＰ、Ｍ２−１、および／またはＭ２−２タンパク質における１つもしくはそれ以上の突然変異のほか、かかるウイルスおよびかかるウイルスをコードする核酸を含んで成る生きた弱毒化ワクチンを含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。組換えＲＳＶ  Ｐ、Ｍ２−１、およびＭ２−２タンパク質が記載されている。弱毒化組換えＲＳＶを製造する方法、およびパラミクソウイルス科の組換えウイルスを利用する中和抗体を定量化する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒化表現型を有し、かつリンタンパク質（Ｐ）を含んで成り、前記リンタンパク質が少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項２】
前記リンタンパク質が少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成る、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３】
前記リンタンパク質が少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含んで成る、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４】
前記リンタンパク質が、１７２位、１７４位、１７５位、および１７６位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成る、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項５】
前記リンタンパク質が、１７２位、１７４位、１７５位、および１７６位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成る、請求項４に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項６】
前記リンタンパク質が、１７２位（Ｇ１７２Ｓ）でグリシンからセリンへの置換を含んで成り、または前記リンタンパク質が、かかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項７】
前記リンタンパク質が、１７４位（Ｒ１７４Ａ）でアルギニンからアラニンへの置換を含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８】
前記リンタンパク質が、１７５位（Ｅ１７５Ａ）でグルタミン酸からアラニンへの置換を含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項９】
前記リンタンパク質が、１７６位（Ｅ１７６Ｇ）でグルタミン酸からグリシンへの置換、１７６位（Ｅ１７６Ａ）でのグルタミン酸からアラニンへの置換、１７６位（Ｅ１７６Ｄ）でのグルタミン酸からアスパラギン酸への置換、１７６位（Ｅ１７６Ｃ）でのグルタミン酸からシステインへの置換、または１７６位（Ｅ１７６Ｓ）でのグルタミン酸からセリンへの置換を含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１０】
前記リンタンパク質が、１７２位および１７６位で置換アミノ酸残基を含んで成る、請求項５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１】
前記リンタンパク質が複数の置換アミノ酸残基を含んで成り、前記残基が残基１７２−１７６から選択される、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２】
前記リンタンパク質が、１７４位（Ｒ１７４Ａ）でアルギニンからアラニンへの置換、１７５位（Ｅ１７５Ａ）でグルタミン酸からアラニンへの置換、および１７６位（Ｅ１７６Ａ）でグルタミン酸からアラニンへの置換を含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１３】
前記リンタンパク質が、残基１７２−１７６から選択される複数のアミノ酸残基の欠失を含んで成る、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１４】
前記リンタンパク質が、アミノ酸残基１７２−１７６の欠失を含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１３に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１５】
前記リンタンパク質が、アミノ酸残基１６１−１８０の欠失を含んで成り、前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１３に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１６】
前記リンタンパク質が残基２３６−２４１から選択される複数のアミノ酸残基の欠失を含んで成る、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７】
前記リンタンパク質がアミノ酸残基２３６−２４１の欠失を含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１６に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの変異アミノ酸残基がリン酸化部位を除去する、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１９】
前記リンタンパク質が少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成り、前記置換アミノ酸残基がリン酸化部位を除去する、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの置換アミノ酸残基がセリンを置換する、請求項１９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの置換アミノ酸残基が、１１６位、１１７位、１１９位、２３２位、および２３７位より成る群から選択される１つもしくはそれ以上の位置でセリンを置換する、請求項１９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２２】
前記リンタンパク質がアミノ酸置換Ｓ１１６Ｄ、アミノ酸置換Ｓ１１６Ａ、またはアミノ酸置換Ｓ１１６Ｌを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２３】
前記リンタンパク質がアミノ酸置換Ｓ１１７Ｄ、アミノ酸置換Ｓ１１７Ａ、またはアミノ酸置換Ｓ１１７Ｒを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２４】
前記リンタンパク質がアミノ酸置換Ｓ１１９Ｄ、アミノ酸置換Ｓ１１９Ａ、またはアミノ酸置換Ｓ１１９Ｌを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２５】
前記リンタンパク質がアミノ酸置換Ｓ２３２Ａまたはアミノ酸置換Ｓ２３２Ｄを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２６】
前記リンタンパク質がアミノ酸置換Ｓ２３７Ａまたはアミノ酸置換Ｓ２３７Ｄを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２７】
置換アミノ酸残基が、１１７位および１１９位でセリンを置換する、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２８】
前記リンタンパク質が、Ｓ１１７Ａ、Ｓ１１７Ｄ、およびＳ１１７Ｒより成る群から選択されるアミノ酸置換、およびＳ１１９Ａ、Ｓ１１９Ｄ、およびＳ１１９Ｌより成る群から選択されるアミノ酸置換を含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２７に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２９】
置換アミノ酸残基が、１１６位、１１７位、および１１９位でセリンを置換する、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３０】
前記１１６位での置換アミノ酸残基がアラニン（Ｓ１１６Ａ）、アスパラギン酸（Ｓ１１６Ｄ）、およびロイシン（Ｓ１１６Ｌ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３１】
前記１１７位での置換アミノ酸残基がアラニン（Ｓ１１７Ａ）、アスパラギン酸（Ｓ１１７Ｄ）、およびアルギニン（Ｓ１１７Ｒ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３２】
前記１１９位での置換アミノ酸残基が、アラニン（Ｓ１１９Ａ）、アスパラギン酸（Ｓ１１９Ｄ）、およびロイシン（Ｓ１１９Ｌ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３３】
前記リンタンパク質が、Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１６Ａ、およびＳ１１６Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ１１７Ｒ、Ｓ１１７Ａ、およびＳ１１７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ１１９Ｌ、Ｓ１１９Ａ、およびＳ１１９Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換とを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項２９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３４】
前記置換アミノ酸残基が、２３２位および２３７位でセリンを置換する、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３５】
前記２３２位での置換アミノ酸残基がアラニン（Ｓ２３２Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３２Ｄ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３４に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３６】
前記２３７位での置換アミノ酸残基がアラニン（Ｓ２３７Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３７Ｄ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３４に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３７】
前記リンタンパク質が、Ｓ２３２ＡおよびＳ２３２Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ２３７ＡおよびＳ２３７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換とを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３４に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３８】
置換アミノ酸残基が、１１６位、１１７位、１１９位、２３２位、および２３７位でセ
リンを置換する、請求項２１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３９】
前記１１６位での置換アミノ酸残基がロイシン（Ｓ１１６Ｌ）、アラニン（Ｓ１１６Ａ）、およびアスパラギン酸（Ｓ１１６Ｄ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４０】
前記１１７位での置換アミノ酸残基がアルギニン（Ｓ１１７Ｒ）、アラニン（Ｓ１１７Ａ）、およびアスパラギン酸（Ｓ１１７Ｄ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４１】
前記１１９位での置換アミノ酸残基がロイシン（Ｓ１１９Ｌ）、アラニン（Ｓ１１９Ａ）、およびアスパラギン酸（Ｓ１１９Ｄ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４２】
前記２３２位での置換アミノ酸残基がアラニン（Ｓ２３２Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３２Ｄ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４３】
前記２３７位での置換アミノ酸残基がアラニン（Ｓ２３７Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３７Ｄ）より成る群から選択され、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４４】
前記リンタンパク質が、Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１６Ａ、およびＳ１１６Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ１１７Ｒ、Ｓ１１７Ａ、およびＳ１１７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ１１９Ｌ、Ｓ１１９Ａ、およびＳ１１９Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ２３２ＡおよびＳ２３２Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ２３７ＡおよびＳ２３７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換とを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４５】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４６】
請求項１に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項４７】
前記核酸がＤＮＡである、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４８】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項４７に記載の核酸。
【請求項４９】
前記核酸がＲＮＡである、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５０】
前記核酸がＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムである、請求項４６に記載の核酸。
【請求項５１】
請求項４６に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項５２】
プラスミドを含んで成る、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項１に記載のリンタンパク質、またはその人為的保存性変形物。
【請求項５４】
請求項５３に記載のリンタンパク質をコードする核酸。
【請求項５５】
免疫学的に有効量の請求項１に記載の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項５６】
生理学的に許容できるキャリアをさらに含んで成る、請求項５５に記載のワクチン。
【請求項５７】
アジュバントをさらに含んで成る、請求項５５に記載のワクチン。
【請求項５８】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を生成するための方法であって、生理学的に許容できるキャリアで請求項１に記載の組換えＲＳＶを前記個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項５９】
前記免疫反応が防御免疫反応である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記組換えＲＳＶが前記個人の上気道に投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記組換えＲＳＶが鼻咽頭に投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記組換えＲＳＶが、スプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
別のタンパク質との変化した相互作用を有するリンタンパク質またはヌクレオプロテインを同定する方法であって、
複数のタンパク質変異体を提供し、各タンパク質変異体が第１のＲＳＶタンパク質の少なくとも一部分を含んで成り、その第１のＲＳＶタンパク質が、ＲＳＶリンタンパク質およびＲＳＶヌクレオプロテインより成る群から選択され、かつそのＲＳＶタンパク質の一部分が少なくとも１つの人為突然変異を含んで成るステップと、
第２のＲＳＶタンパク質またはその一部分との変化した相互作用を有する少なくとも１つの候補のタンパク質変異体を同定するステップと
を含んで成る方法。
【請求項６４】
前記第１のＲＳＶタンパク質がＲＳＶリンタンパク質であり、かつ前記第２のＲＳＶタンパク質がＲＳＶヌクレオプロテインである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記第１のＲＳＶタンパク質がＲＳＶヌクレオプロテインであり、かつ前記第２のＲＳＶタンパク質がＲＳＶリンタンパク質である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
第２のＲＳＶタンパク質と変化した相互作用を有する少なくとも１つの候補の変異体を同定するステップが、インビボアッセイを実行するステップを含んで成る、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
第２のＲＳＶタンパク質との変化した相互作用を有する少なくとも１つの候補のタンパク質変異体を同定するステップが、インビトロアッセイを実行するステップを含んで成る、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
前記変化した相互作用が減少した相互作用である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記相互作用が温度依存的に変化する、請求項６３に記載の方法。
【請求項７０】
前記候補のタンパク質変異体の少なくとも１つを含んで成る前記第１のＲＳＶタンパク質の一部分における少なくとも１つの突然変異の性質を判定するステップをさらに含んで成る、請求項６３に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１つの組換えＲＳＶを製造するステップをさらに含んで成り、そのゲノムまたはアンチゲノムが、前記候補のタンパク質変異体の少なくとも１つを含んで成る前記第１のＲＳＶタンパク質の一部分における少なくとも１つの突然変異を含んで成るリンタンパク質またはヌクレオプロテインをコードする、請求項６３に記載の方法。
【請求項７２】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップをさらに含んで成る、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
複製が少なくとも１０分の１に減少している、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
複製が少なくとも１００分の１に減少している、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップが、培養細胞における複製を評価するステップを含んで成る、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップが、動物における複製を評価するステップを含んで成る、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記動物が齧歯類または霊長類であり、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップが、ヒトにおける複製を評価するステップを含んで成る、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
弱毒化表現型を有し、Ｍ２−１タンパク質を含んで成り、そのＭ２−１タンパク質が、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項８０】
前記Ｍ２−１タンパク質が、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基を含んで成る、請求項７９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８１】
前記Ｍ２−１タンパク質が、３位（Ｒ３Ｖ）でアルギニンからバリンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８２】
前記Ｍ２−１タンパク質が、１２位（Ｒ１２Ｑ）でアルギニンからグルタミンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８３】
前記Ｍ２−１タンパク質が、１４位（Ｈ１４Ｆ）でヒスチジンからフェニルアラニンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８４】
前記Ｍ２−１タンパク質が、１６位（Ｌ１６Ｓ）でロイシンからセリンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８５】
前記Ｍ２−１タンパク質が、１７位（Ｎ１７Ｒ）でアスパラギンからアルギニンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８６】
前記Ｍ２−１タンパク質が、２０位（Ｒ２０Ｎ）でアルギニンからアスパラギンへの置換を含んで成り、またはＭ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８７】
前記Ｍ２−１タンパク質がアミノ酸置換Ｌ１６ＳおよびＮ１７Ｒを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８８】
前記Ｍ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｒ１２ＱおよびＨ１４Ｆを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８９】
前記Ｍ２−１タンパク質がアミノ酸置換Ｒ１２ＱおよびＲ２０Ｎを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項９０】
前記Ｍ２−１タンパク質がアミノ酸置換Ｈ１４ＦおよびＲ２０Ｎを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項９１】
前記Ｍ２−１タンパク質がアミノ酸Ｒ１２Ｑ、Ｈ１４Ｆ、およびＲ２０Ｎを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項８０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項９２】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項７９に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項９３】
請求項７９に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項９４】
前記核酸がＤＮＡである、請求項９３に記載の核酸。
【請求項９５】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項９４に記載の核酸。
【請求項９６】
前記核酸がＲＮＡである、請求項９３に記載の核酸。
【請求項９７】
前記核酸がＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムである、請求項９３に記載の核酸。
【請求項９８】
請求項９３に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項９９】
プラスミドを含んで成る、請求項９８に記載のベクター。
【請求項１００】
請求項７９に記載のＭ２−１タンパク質、またはその人為的保存性変形物。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のＭ２−１タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０２】
免疫学的に有効量の請求項７９に記載の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項１０３】
生理学的に許容できるキャリアをさらに含んで成る、請求項１０２に記載のワクチン。
【請求項１０４】
アジュバントをさらに含んで成る、請求項１０２に記載のワクチン。
【請求項１０５】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を生成するための方法であって、生理学的に許容できるキャリアで請求項７９に記載の組換えＲＳＶを前記個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項１０６】
前記免疫反応が防御免疫反応である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記組換えＲＳＶが前記個人の上気道に投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組換えＲＳＶが鼻咽頭に投与される、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記組換えＲＳＶが、スプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
弱毒化表現型を有し、キメラＭ２−１タンパク質を含んで成り、そのキメラＭ２−１タンパク質がＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成る、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項１１１】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、前記ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域からの複数の残基、および前記ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域からの複数の残基を含んで成る、請求項１１０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１２】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、前記ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端３０残基、および前記ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端１４８残基を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１３】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、前記ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域からの複数の残基、および前記ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域からの複数の残基を含んで成る、請求項１１０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１４】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、前記ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端２９残基、および前記ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端１６４残基を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１３に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１５】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、３位、１１位、１３位、１５位、１６位、１９位、および２５位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの置換アミノ酸残基をさらに含んで成る、請求項１１４に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１６】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、３位（Ｖ３Ｒ）でバリンからアルギニンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１７】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、１１位（Ｑ１１Ｒ）でグルタミンからアルギニンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１８】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、１５位（Ｓ１５Ｌ）でセリンからロイシンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１１９】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、１６位（Ｒ１６Ｎ）でアルギニンからアスパラギンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２０】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、１９位（Ｎ１９Ｒ）でアスパラギンからアルギニンへの置換を含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２１】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｓ１５ＬおよびＲ１６Ｎを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２２】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｑ１１ＲおよびＦ１３Ｈを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２３】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｆ１３Ｈ、およびＮ１９Ｒを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２４】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｖ３Ｒ、Ｓ１５Ｌ、およびＲ１６Ｎを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２５】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｓ１５Ｌ、およびＲ１６Ｎを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２６】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｓ１５Ｌ、Ｒ１６Ｎ、およびＮ１９Ｒを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２７】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｆ１３Ｈ、Ｓ１５Ｌ、およびＲ１６Ｎを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２８】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｆ１３Ｈ、Ｓ１５Ｌ、Ｒ１６Ｎ、およびＮ１９Ｒを含んで成り、または前記Ｍ２−１がかかるＭ２−１タンパク質の
人為的保存性変形物である、請求項１１５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１２９】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項１１０に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１３０】
請求項１１０に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項１３１】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１３０に記載の核酸。
【請求項１３２】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１３１に記載の核酸。
【請求項１３３】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１３０に記載の核酸。
【請求項１３４】
前記核酸がＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムである、請求項１３０に記載の核酸。
【請求項１３５】
請求項１３０に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項１３６】
プラスミドを含んで成る、請求項１３５に記載のベクター。
【請求項１３７】
請求項１１０に記載のＭ２−１タンパク質、またはその人為的保存性変形物。
【請求項１３８】
請求項１３７に記載のＭ２−１タンパク質をコードする核酸。
【請求項１３９】
免疫学的に有効量の請求項１１０に記載の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項１４０】
生理学的に許容できるキャリアをさらに含んで成る、請求項１３９に記載のワクチン。
【請求項１４１】
アジュバントをさらに含んで成る、請求項１３９に記載のワクチン。
【請求項１４２】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を生成するための方法であって、生理学的に許容できるキャリアで請求項１１０に記載の組換えＲＳＶを前記個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項１４３】
前記免疫反応が防御免疫反応である、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記組換えＲＳＶが前記個人の上気道に投与される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４５】
前記組換えＲＳＶが鼻咽頭に投与される、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
前記組換えＲＳＶが、スプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４７】
変化した活性を有するＭ２−１タンパク質を同定する方法であって、前記方法が、
１つもしくはそれ以上のキメラＭ２−１タンパク質を提供し、そのキメラＭ２−１タンパク質の各々が第１のウイルスの株からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質かの複数の残基、および第２のウイルスの株からのＭ２−１タンパク質からの複数の残基を含んで成るステップと、
変化した活性を有する少なくとも１つの候補のキメラＭ２−１タンパク質を同定するステップと
を含んで成る方法。
【請求項１４８】
前記第１および第２のウイルスの株が異なる種のＲＳＶである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記第１および第２のウイルスの株が異なる種のウイルスである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記キメラＭ２−１タンパク質の少なくとも１つが、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成る、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域からの複数の残基、およびＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域からの複数の残基を含んで成る、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記キメラＭ２−１タンパク質が、ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域からの複数の残基、およびＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域からの複数の残基を含んで成る、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
変化した活性を有する少なくとも１つの候補のキメラＭ２−１タンパク質を同定するステップが、Ｍ２−１依存伸長性を評価するステップを含んで成る、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５４】
変化した活性を有する少なくとも１つの候補のキメラＭ２−１タンパク質を同定するステップが、前記候補のキメラＭ２−１タンパク質によってＲＮＡ結合を評価するステップを含んで成る、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５５】
変化した活性を有する少なくとも１つの候補のキメラＭ２−１タンパク質を同定するステップが、前記候補のキメラＭ２−１タンパク質によってヌクレオプロテイン結合を評価するステップを含んで成る、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５６】
少なくとも１つの組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を製造するステップをさらに含んで成り、そのゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも１つの候補のキメラＭ２−１タンパク質をコードする、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５７】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップをさらに含んで成る、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
複製が少なくとも１０分の１に減少している、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
複製が少なくとも１００分の１に減少している、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６０】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップが、培養細胞における複製を評価するステップを含んで成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６１】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップが、動物における複製を評価するステップを含んで成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記動物が齧歯類または霊長類であり、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
減少したレベルの複製を有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するステップが、ヒトにおける複製を評価するステップを含んで成る、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１６４】
１つもしくはそれ以上の突然変異を前記候補のキメラＭ２−１タンパク質の少なくとも１つへ導入するステップと、前記変化した活性がさらに変化している少なくとも１つの変異した候補のキメラＭ２−１タンパク質を同定するステップをさらに含んで成る、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６５】
少なくとも１つの組換え呼吸器合胞体ウイルスを製造するステップをさらに含んで成り、そのゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも１つの変異した候補のキメラＭ２−１タンパク質をコードする、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
１つもしくはそれ以上の突然変異を少なくとも１つのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質へ導入するステップと、変化した活性を有する少なくとも１つの変異した候補のＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質を同定するステップをさらに含んで成る、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６７】
少なくとも１つの組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を製造するステップをさらに含んで成り、そのゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも１つの候補の変異ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質をコードする、請求項１６６に記載の方法。
【請求項１６８】
弱毒化表現型を有し、Ｍ２−２タンパク質を含んで成り、そのＭ２−２タンパク質が少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項１６９】
前記Ｍ２−２タンパク質が少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成る、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７０】
前記Ｍ２−２タンパク質が少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含んで成る、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７１】
前記Ｍ２−２タンパク質が、１位、３位、および７位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７２】
前記Ｍ２−２タンパク質が、アミノ酸残基１−２の欠失を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７３】
前記Ｍ２−２タンパク質が、アミノ酸残基１−６の欠失を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７４】
前記Ｍ２−２タンパク質が、Ｎ末端６アミノ酸残基の欠失、Ｎ末端８アミノ酸残基の欠失、Ｎ末端１０アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端１アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端２アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端４アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端８アミノ酸残基の欠失、およびＣ末端１８アミノ酸残基の欠失より成る群から選択される欠失を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７５】
前記Ｍ２−２タンパク質が、２位、４位、５位、６位、１１位、１２位、１５位、２５位、２７位、３４位、４７位、５６位、５８位、６６位、７５位、８０位、および８１位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７６】
前記Ｍ２−２タンパク質が、Ｔ２Ａ、Ｐ４Ａ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｋ、Ｄ１１Ａ、Ｋ１２Ａ、Ｃ１５Ａ、Ｒ２５Ａ、Ｒ２７Ａ、Ｋ３４Ａ、Ｈ４７Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｈ５８Ａ、Ｄ６６Ａ、Ｈ７５Ａ、Ｅ８０Ａ、およびＤ８１Ａよりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７７】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項１６８に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項１７８】
請求項１６８に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項１７９】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項１８０】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１７９に記載の核酸。
【請求項１８１】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項１８２】
前記核酸がＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムである、請求項１７８に記載の核酸。
【請求項１８３】
請求項１７８に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項１８４】
プラスミドを含んで成る、請求項１８３に記載のベクター。
【請求項１８５】
請求項１６８に記載のＭ２−２タンパク質、またはその人為的保存性変形物。
【請求項１８６】
請求項１８５に記載のＭ２−２タンパク質をコードする核酸。
【請求項１８７】
請求項１６８に記載の免疫学的に有効量の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項１８８】
生理学的に許容できるキャリアをさらに含んで成る、請求項１８７に記載のワクチン。
【請求項１８９】
アジュバントをさらに含んで成る、請求項１８７に記載のワクチン。
【請求項１９０】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を起こす方法であって、前記方法が請求項１６８に記載の組換えＲＳＶを生理学的に許容できるキャリアで個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項１９１】
前記免疫反応が防御免疫反応である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記組換えＲＳＶが前記個人の上気道に投与される、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９３】
前記組換えＲＳＶが鼻咽頭に投与される、請求項１９２に記載の方法。
【請求項１９４】
前記組換えＲＳＶがスプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される、請求項１
９０に記載の方法。
【請求項１９５】
抗体価を測定する方法であって、前記方法が、
その組換えウイルスのゲノムまたはアンチゲノムがマーカーを含んで成るパラミクソウイルス科の組換えウイルス、および１つもしくはそれ以上の抗体を含んで成る試料を、前記ウイルスが複製しうる細胞の存在下に接触させるステップと、
前記ウイルスの複製を可能にするステップと、
前記マーカーを検出するステップと
を含んで成る方法。
【請求項１９６】
前記組換えウイルスが呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含んで成る、請求項１９５に記載の方法。
【請求項１９７】
前記呼吸器合胞体ウイルスが、亜群Ａ、亜群Ｂのヒト呼吸器合胞体ウイルス、またはそのキメラを含んで成る、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
前記組換えウイルスがＡ−ｌａｃＺである、請求項１９７に記載の方法。
【請求項１９９】
前記組換えウイルスが亜群ＡのヒトＲＳＶを含んで成り、ここでＧ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質より成る群から選択される１つもしくはそれ以上のタンパク質が、亜群ＢのヒトＲＳＶの１つもしくはそれ以上の相同タンパク質によって置換される、請求項１９７に記載の方法。
【請求項２００】
前記組換えウイルスがＢ−ｌａｃＺである、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記組換ウイルスが、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、または牛疫ウイルスを含んで成る、請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０２】
前記マーカーが、光学的に検出可能なマーカータンパク質をコードするマーカー、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、クロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、またはネオマイシンに抵抗を与える遺伝子の１つもしくはそれ以上を含んで成る、請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０３】
１つもしくはそれ以上の抗体を含んで成る前記試料が、血清、気管支洗浄、または鼻洗浄を含んで成る、請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０４】
前記血清が末梢血由来血清である、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
細胞の存在下に組換えウイルスおよび試料を接触させるステップが、ウイルスおよび試料を結合し、次いで結合ウイルスおよび試料を細胞と結合するステップを含んで成る、請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０６】
前記ウイルスおよび前記試料が、１つもしくはそれ以上の補体因子の存在下に接触される、請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記マーカーを検出するステップがマーカーの発現を検出するステップを含んで成る、
請求項１９５に記載の方法。
【請求項２０８】
前記マーカーの発現を検出するステップが、前記マーカーの発現を定量化するステップを含んで成る、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２０９】
前記マーカーの発現を検出するステップの前に細胞を洗浄し、溶解するステップをさらに含んで成る、請求項２０７に記載の方法。
【請求項２１０】
組成物であって、
そのゲノムまたはアンチゲノムがマーカーを含んで成るパラミクソウイルス科の組換えウイルスと、
１つもしくはそれ以上の抗体と
を含んで成る組成物。
【請求項２１１】
前記組換えウイルスが呼吸器合胞体ウイルスを含んで成る、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２１２】
前記呼吸器合胞体ウイルスが、亜群Ａ、亜群Ｂのヒト呼吸器合胞体ウイルス、またはそのキメラを含んで成る、請求項２１１に記載の組成物。
【請求項２１３】
前記組換えウイルスがＡ−ｌａｃＺである、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１４】
前記組換えウイルスが亜群ＡのヒトＲＳＶを含んで成り、ここでＧ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質より成る群から選択される１つもしくはそれ以上のタンパク質が、亜群ＢのヒトＲＳＶの１つもしくはそれ以上の相同タンパク質によって置換される、請求項２１２に記載の組成物。
【請求項２１５】
前記組換えウイルスがＢ−ｌａｃＺである、請求項２１４に記載の組成物。
【請求項２１６】
前記組換ウイルスが、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、または牛疫ウイルスを含んで成る、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２１７】
前記マーカーが、光学的に検出可能なマーカータンパク質をコードするマーカー、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、クロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、またはネオマイシンに抵抗を与える遺伝子の１つもしくはそれ以上を含んで成る、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２１８】
前記ウイルスが複製することができる細胞をさらに含んで成る、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２１９】
１つもしくはそれ以上の補体因子をさらに含んで成る、請求項２１０に記載の組成物。
【請求項２２０】
マーカー含んで成るゲノムまたはアンチゲノムを含んで成り、そのマーカーが、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、またはネオマイシンに抵抗を与える遺伝子の１つもしく
はそれ以上を含んで成る、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項２２１】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項２２０に記載のウイルス。
【請求項２２２】
前記組換えウイルスがＡ−ｌａｃＺである、請求項２２１に記載のウイルス。
【請求項２２３】
前記組換えウイルスが亜群ＡのヒトＲＳＶを含んで成り、ここでＧ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質より成る群から選択される１つもしくはそれ以上のタンパク質が、亜群ＢのヒトＲＳＶの１つもしくはそれ以上の相同タンパク質によって置換される、請求項２２１に記載のウイルス。
【請求項２２４】
前記組換えウイルスがＢ−ｌａｃＺである、請求項２２３に記載のウイルス。
【請求項２２５】
請求項２２０に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項２２６】
前記核酸がＤＮＡである、請求項２２５に記載の核酸。
【請求項２２７】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項２２６に記載の核酸。
【請求項２２８】
前記核酸がＲＮＡである、請求項２２５に記載の核酸。
【請求項２２９】
前記核酸がＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムである、請求項２２５に記載の核酸。
【請求項２３０】
請求項２２５に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項２３１】
プラスミドを含んで成る、請求項２３０に記載のベクター。
【請求項２３２】
その組換ウイルスがマーカーを含んで成るゲノムまたはアンチゲノムを含んで成り、その組換えウイルスがメタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、またはイヌジステンパーウイルスを含んで成るパラミクソウイルス科の組換えウイルス。
【請求項２３３】
前記マーカーが、光学的に検出可能なマーカータンパク質をコードするマーカー、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、クロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、またはネオマイシンに抵抗を与える遺伝子の１つもしくはそれ以上を含んで成る、請求項２３２に記載のウイルス。
【請求項２３４】
請求項２３２に記載のウイルスをコードする核酸。
【請求項２３５】
前記核酸がＤＮＡである、請求項２３４に記載の核酸。
【請求項２３６】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項２３５に記載の核酸。
【請求項２３７】
前記核酸がＲＮＡである、請求項２３４に記載の核酸。
【請求項２３８】
前記核酸がウイルスゲノムまたはアンチゲノムである、請求項２３４に記載の核酸。
【請求項２３９】
請求項２３４に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項２４０】
プラスミドを含んで成る、請求項２３９に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、以下の優先仮特許出願の優先権および利益を請求する非仮実用特許出願である。すなわち、ホン  ジン（Ｈｏｎｇ  Ｊｉｎ）らによる「呼吸器合胞体ウイルスにおける機能的突然変異（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）」と称する２００２年９月２７日出願の米国特許出願第６０／４１４，６１４号明細書、およびホン  ジン（Ｈｏｎｇ  Ｊｉｎ）らによる「呼吸器合胞体ウイルスにおける機能的突然変異（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）」と称する２００３年１月３１日出願の米国特許出願第６０／４４４，２８７号明細書であり、その各々はすべての目的のためにその全体が参照によって本明細書に組込まれている。
【０００２】
連邦政府委託研究開発により行われた発明に対する権利に関する声明
本発明は、ＮＩＨ  ＳＢＩＲ助成金１Ｒ４３Ａ１４５２６７−０１および２Ｒ４４Ａ１４５２６７−０２の下で米国政府の支援により行われた。米国政府は本発明における一部の権利を有しうる。
【技術分野】
【０００３】
本発明の分野は、呼吸器合胞体ウイルスに対するワクチンである。本発明は、弱毒化表現型を有する組換えＲＳＶ、かかるウイルスをコードする核酸、かかるウイルスを含んで成るワクチン、およびかかるウイルスを用いて免疫反応を誘発する方法を含む。弱毒化ＲＳＶを生成する方法も、抗体価（例えば、ＲＳＶ中和抗体価）を検出する方法と同様、本発明の特徴である。
【背景技術】
【０００４】
ヒト呼吸器合胞体ウイルスは、世界中の乳児および幼児におけるウイルス性呼吸器疾患のための入院の主要な原因であると同時に、免疫不全成人および高齢者における罹患および死亡の重要な原因である。今日まで、ＲＳＶ感染と関連した疾患を予防することができるワクチンは承認されていない。ＲＳＶは、パラミクソウイルス科の肺炎ウイルス属に分類されている（クナイプ（Ｋｎｉｐｅ）とハウリー（Ｈｏｗｌｅｙ）（編）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１巻、リピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウイリアムズアンドウイルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）における、コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（２００１年）、呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）、ｐｐ．１４４３−１４８５、クナイプ（Ｋｎｉｐｅ）とハウリー（Ｈｏｗｌｅｙ）（編）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１巻、リピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウイリアムズとウイルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）における、ラム（Ｌａｍｂ）とコラコフスキー（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ）（２００１年）パラミクソウイルス：ウイルスおよびその複製（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ｐｐ．１３０５−１３４０）。Ａ２株のＲＳＶゲノムは長さが１５，２２２ｎｔであり、１１個のタンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、およびＬ）をコードする１０個の転写単位を含有する。このゲノムはＮタンパク質によってしっかりと結合されてヌクレオキャプシドを形成し、Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質を含有するウイルスＲＮＡポリメラーゼのテンプレートである（グロスフェルト（Ｇｒｏｓｆｅｌｄ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５６７７−５６８６、ユー（Ｙｕ）ら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２４１２−２４１９）。各転写ユニットは、高度に保存されている１０−ｎｔ遺伝子開始（ＧＳ）シグナルによってフランキング
されており、ここでｍＲＮＡ合成が開始し、かつポリアデニル化およびｍＲＮＡの放出を導く半保存されている１２−〜１３−ｎｔ遺伝子終了シグナルで終了する （ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３６−４４、クオ（Ｋｕｏ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６８９２−６９０１）。ＲＳＶ遺伝子の転写は連続的であり、転写減衰によるｍＲＮＡ合成の減少の勾配が認められる（バリック（Ｂａｒｉｋ）（１９９２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６８１３−６８１８、ディッケンス（Ｄｉｃｋｅｎｓ）ら（１９８４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２：３６４−３６９）。ウイルスＲＮＡポリメラーゼは、最初に下流ｍＲＮＡの合成を開始するために上流メッセージの合成を終了しなければならない。
【０００５】
ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、および大きなポリメラーゼタンパク質（Ｌ）は、インビトロのウイルスＲＮＡ複製および転写の最小限の要素を構成する（グロスフィールド（Ｇｒｏｓｆｉｅｌｄ）ら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５６７７−５６８６、ユー（Ｙｕ）ら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２４１２−２４１９）。Ｎタンパク質は、ゲノムＲＮＡと結び付きヌクレオキャプシドを形成するが、これはＲＮＡ合成のテンプレートとしての機能を果たす。Ｌタンパク質は、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ触媒モチーフを含有する多機能タンパク質であり、おそらくウイルスｍＲＮＡのキャッピングおよびポリアデニル化にも関与する。しかし、Ｌタンパク質のみではポリメラーゼ機能には十分ではなく、Ｐタンパク質も必要とされる。ＲＳＶ  ＲＮＡの転写および複製は、肺炎ウイルスに特有であるＭ２−１、Ｍ２−２、ＮＳ１、およびＮＳ２タンパク質によっても調節される。Ｍ２−１は、遺伝子接合部でリードスルーされるプロセッシブＲＮＡ合成および転写に必要とされる転写アンチターミネーション因子である（Ｄ．Ｍ．クナイプ（Ｋｎｉｐｅ）ら（編）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版におけるコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（２００１年）、リピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ハーディー（Ｈａｒｄｙ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１７０−１７６、ハーディー（Ｈａｒｄｙ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）（１９９８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５２０−５２６）。Ｍ２−２は、ウイルスＲＮＡ転写と複製とのスイッチに関与する（バーミンガム（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ）とコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）（１９９９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１１２５９−１１２６４、ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４−８２）。ＮＳ１およびＮＳ２は、インビトロのミニゲノム合成を阻害することがわかっている（アトレヤ（Ａｔｒｅｙａ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４５２−１４６１）。
【０００６】
ＧおよびＦタンパク質は、抗ＲＳＶ中和抗体を発現させ、ＲＳＶ感染および再感染に対する防御免疫を提供する２つの主要な表面抗原である。高レベル循環抗体は、ＲＳＶ感染に対する防御または疾患の重症度の削減と相関する（クロー（Ｃｒｏｗｅ）（１９９９年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３６：１９１−２１４）。２つの抗原性ＲＳＶ  亜群は、ウイルス抗原性および配列の相違に基づき認識されている（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）（１９８５年）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：６２６−６３３、ムフソン（Ｍｕｆｓｏｎ）ら（１９８５年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２１１１−２１２４）。この抗原性の多様性は、反復ＲＳＶ感染に部分的に関与しいているとみられる。
【０００７】
安全かつ有効なＲＳＶワクチンを製造する努力は、精製ウイルス抗原の投与または鼻内投与のための生きた弱毒化ＲＳＶの開発に集中している。例えば、ホルマリン不活性化ウイルスワクチンは、ＲＳＶ感染に対する防御を提供しなかっただけではなく、乳児において野生型ウイルスによってその後の感染中に症状を悪化させることが明らかとなった（カピキアン（Ｋａｐｉｋｉａｎ）ら（１９６９年）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４０５−４２１、チン（Ｃｈｉｎ）ら（１９６９年）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８
９：４４９−６３）。最近になって、努力は、野生型ＲＳＶの化学的突然変異誘発または低温通過による生きた弱毒化温度感受性変異体の開発に向けられている（クロー（Ｃｒｏｗｅ）ら（１９９４年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：６９１−９）。しかし、今日まで、これらの努力により、安全かつ有効なワクチンを製造することはできなかった。ウイルス候補は、過少弱毒化または過剰弱毒化されており（キム（Ｋｉｍ）ら（１９７３年）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ５２：５６−６３、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら（１９７６年）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ８８：９３１−６）、一部の候補は遺伝学的に不安定であり、その結果として弱毒化表現型の喪失が生じた（ホッジス（Ｈｏｄｇｅｓ）ら（１９７４年）Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．１４５：１１５８−６４）。
【０００８】
最近、ワクチン製造に適した弱毒化ウイルスを製造するために適した組換えおよびキメラウイルスを製造するためのシステムが、ジン（Ｊｉｎ）らによる、「組換えＲＳＶウイルス発現システムおよびワクチン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＳＶ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」と称する、国際公開第０２／４４３３４号パンフレットにおける発明者および同僚によって記載されており、その開示はその全体が本明細書に組込まれている。本発明は、生きた弱毒化ワクチンの製造に適した弱毒化および／または温度感受性ＲＳＶの追加の種と同時に、開示を検討すれば明らかになる他の利点を提供する。
【特許文献１】国際公開第０２／４４３３４号パンフレット
【非特許文献１】クナイプ（Ｋｎｉｐｅ）とハウリー（Ｈｏｗｌｅｙ）（編）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１巻、リピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウイリアムズアンドウイルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）における、コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（２００１年）、呼吸器合胞体ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ）、ｐｐ．１４４３−１４８５
【非特許文献２】クナイプ（Ｋｎｉｐｅ）とハウリー（Ｈｏｗｌｅｙ）（編）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第１巻、リピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、ウイリアムズとウイルキンス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）における、ラム（Ｌａｍｂ）とコラコフスキー（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙ）（２００１年）パラミクソウイルス：ウイルスおよびその複製（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、ｐｐ．１３０５−１３４０
【非特許文献３】グロスフェルト（Ｇｒｏｓｆｅｌｄ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５６７７−５６８６
【非特許文献４】ユー（Ｙｕ）ら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２４１２−２４１９
【非特許文献５】ハーモン（Ｈａｒｍｏｎ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３６−４４
【非特許文献６】クオ（Ｋｕｏ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６８９２−６９０１
【非特許文献７】バリック（Ｂａｒｉｋ）（１９９２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：６８１３−６８１８
【非特許文献８】ディッケンス（Ｄｉｃｋｅｎｓ）ら（１９８４年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５２：３６４−３６９
【非特許文献９】Ｄ．Ｍ．クナイプ（Ｋｎｉｐｅ）ら（編）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版におけるコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（２００１年）、リピンコット（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）、ハーディー（Ｈａｒｄｙ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１７０−１７６、ハーディー（Ｈａｒｄｙ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）（１９９８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５２０−５２６
【非特許文献１０】バーミンガム（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ）とコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）（１９９９年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１１２５９−１１２６４
【非特許文献１１】ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４−８２
【非特許文献１２】アトレヤ（Ａｔｒｅｙａ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４５２−１４６１
【非特許文献１３】クロー（Ｃｒｏｗｅ）（１９９９年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３６：１９１−２１４
【非特許文献１４】アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）（１９８５年）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：６２６−６３３
【非特許文献１５】ムフソン（Ｍｕｆｓｏｎ）ら（１９８５年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２１１１−２１２４
【非特許文献１６】カピキアン（Ｋａｐｉｋｉａｎ）ら（１９６９年）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４０５−４２１
【非特許文献１７】チン（Ｃｈｉｎ）ら（１９６９年）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８９：４４９−６３
【非特許文献１８】クロー（Ｃｒｏｗｅ）ら（１９９４年）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：６９１−９
【非特許文献１９】キム（Ｋｉｍ）ら（１９７３年）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ５２：５６−６３
【非特許文献２０】ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら（１９７６年）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ８８：９３１−６
【非特許文献２１】ホッジス（Ｈｏｄｇｅｓ）ら（１９７４年）Ｐｒｏｃ Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．１４５：１１５８−６４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、弱毒化表現型を示すように遺伝子操作が行われている組換え呼吸器合胞体ウイルス（例えば、組換えヒト呼吸器合胞体ウイルス）を提供する。かかる弱毒化組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、生きた弱毒化ＲＳＶワクチンとして利用されうる。組換えウイルスタンパク質、およびかかる組換えタンパク質および／または組換えウイルスをコードする核酸も本発明の特徴である。
【００１０】
本発明の別の態様は、抗体価を測定するための（例えば、亜群Ａおよび／または亜群Ｂ
ＲＳＶに対する、またはパラミクソウイルス科の別のウイルスに対する中和抗体を定量化するための）方法を提供する。これらの方法に関係する組成物、組換えウイルス、および核酸も本発明の特徴である。
【００１１】
実施形態の１つの一般的なクラスにおいては、本発明は、ウイルスリンタンパク質（Ｐ）またはその部分をコードする遺伝子の突然変異誘発に起因する弱毒化表現型を有する組換えＲＳＶを提供する。したがって、実施形態の１つの一般的なクラスにおいては、弱毒化表現型を有し、少なくとも１つの人為的に変異させた（例えば、置換）アミノ酸残基を含んで成るリンタンパク質を含んで成る組換えＲＳＶが提供される。例えば、実施形態の１つのクラスにおいては、リンタンパク質は、１７２位、１７４位、１７５位、および１７６位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの突然変異（例えば、置換）アミノ酸残基を含んで成る。例えば、リンタンパク質は、１７２位でグリシンからセリンへの置換、および／または１７６位でグルタミン酸からグリシンへの置換を含んで成りうる。実施形態の別のクラスは、弱毒化表現型を有し、残基１７２−１７６から選択される複数のアミノ酸残基の突然変異（例えば、欠失）を含んで成るリンタンパク質を含んで成る組
換えＲＳＶを提供する。例えば、リンタンパク質は、残基１７２−１７６の欠失または残基１６１−１８０の欠失を含んで成りうる。実施形態の同様のクラスが、弱毒化表現型を有し、残基２３６−２４１から選択される複数のアミノ酸残基の欠失を含んで成るリンタンパク質を含んで成る組換えＲＳＶを提供する。
【００１２】
さらに別の実施形態のクラスは、弱毒化表現型を有し、リン酸化部位を除去する少なくとも１つの突然変異（例えば、アミノ酸置換）を含んで成るリンタンパク質を含んで成る組換えＲＳＶを提供する。例えば、リンタンパク質は、セリン、例えば、１１６、１１７、１１９、２３２、および／または２３７位でセリンを置換する少なくとも１つの置換アミノ酸を含んで成りうる。セリンは単独または種々の組合せで変異されうるとともに、各々が、例えば、他の残基（例えば、アラニン、アスパラギン酸、アルギニン、またはロイシン）によって置換されうる。
【００１３】
実施形態の関連クラスが、弱毒化ＲＳＶを製造する方法を含む方法を提供する。これらの方法は、例えば、ＲＳＶリンタンパク質（Ｐ）および／またはヌクレオプロテイン（Ｎ）に突然変異誘発を起こさせ、ＰとＮとの間の相互作用の減少（好ましくは、温度感受性の相互作用の減少）のスクリーニングを含みうる。次いで、Ｎ−Ｐ相互作用に影響を及ぼすＰおよび／またはＮにおける突然変異が、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムに導入され、弱毒化ＲＳＶを製造することができる。したがって、本発明の１つの態様は、別のタンパク質と変化した相互作用を有するリンタンパク質またはヌクレオプロテインを同定する方法を提供する。これらの方法においては、複数のタンパク質変異体が提供されるが、ここで各タンパク質変異体は第１のＲＳＶタンパク質の少なくとも一部分を含んで成る。第１のＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶリンタンパク質およびＲＳＶヌクレオプロテインより成る群から選択され、第１のＲＳＶタンパク質の一部分は通常、少なくとも１つの人為突然変異（例えば、少なくとも１つの変異アミノ酸残基、例えば、１つもしくはそれ以上の置換、挿入、または欠失アミノ酸残基）を含んで成る。第２のＲＳＶタンパク質またはその一部分と変化した相互作用を有する少なくとも１つの候補タンパク質変異体が同定されている（例えば、ＲＳＶヌクレオプロテインまたはＲＳＶリンタンパク質）。
【００１４】
実施形態の別の一般的なクラスにおいては、本発明は、ウイルスＭ２−１タンパク質またはその部分をコードする遺伝子の突然変異誘発に起因する弱毒化表現型を有する組換えＲＳＶを提供する。したがって、１つの実施形態のクラスは、弱毒化表現型を有し、３、１２、１４、１６、１７、２０位より成る群から選択されるアミノ酸残基で少なくとも１つの人為的に変異させた（例えば、置換または欠失）アミノ酸を含んで成るＭ２−１タンパク質を含んで成る組換えＲＳＶを提供する。例えば、Ｍ２−１タンパク質は、１６位置でロイシンからセリンへの置換および／または１７位でアスパラギンからアルギニンへの置換を含んで成りうる。
【００１５】
別の例として、Ｍ２−１タンパク質はキメラ（例えば、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質およびＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質の）でありうる。したがって、実施形態の別のクラスは、弱毒化表現型を有し、キメラＭ２−１タンパク質を含んで成り、そのキメラＭ２−１タンパク質が、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびウイルスの別の株および／または種のＭ２−１タンパク質から（例えば、マウスＭ２−１タンパク質の肺炎ウイルスから）の複数の残基を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。キメラタンパク質は、少なくとも１つの変異（例えば、置換）アミノ酸残基をさらに含んで成る。
【００１６】
実施形態の関連クラスは、弱毒化ＲＳＶを製造するための方法を含む、変化した活性を有するＭ２−１タンパク質を同定する方法を提供する。これらの方法においては、１つもしくはそれ以上のキメラＭ２−１タンパク質が提供され、その各々は、ウイルスの第１の
株からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびウイルスの第２の株（例えば、ＲＳＶの異なる株または異なる種のウイルス）からのＭ２−１タンパク質からの複数の残基を含んで成る。変化した活性を有する少なくとも１つの候補キメラＭ２−１タンパク質が、例えば、Ｍ２−１依存伸長性を（例えば、ミニゲノムアッセイにおいて）評価することによって、候補キメラＭ２−１タンパク質によって（例えば、ゲルシフトアッセイにおいて）ＲＮＡ結合を評価することによって、かつ／または候補キメラＭ２−１タンパク質によって（例えば、共免疫沈降法によって）ヌクレオプロテイン結合を評価することによって、同定されている。Ｍ２−１タンパク質の活性は、増加、または、通常、減少しうる。１つもしくはそれ以上の突然変異を候補キメラＭ２−１タンパク質の少なくとも１つへ導入し、かつ少なくとも１つの変異候補キメラＭ２−１タンパク質を同定することができ、ここで変化した活性はさらに変化する（通常、候補キメラＭ２−１タンパク質によって示される活性の減少は、変異候補キメラＭ２−１タンパク質でさらに減少する）。そのゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも１つの候補キメラまたは変異候補キメラＭ２−１タンパク質をコードする少なくとも１つの組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が製造され、その複製が評価されうる。必要に応じて、変異候補キメラＭ２−１タンパク質の活性に影響を及ぼす突然変異をＲＳＶ  Ｍ２−１（すなわち、非キメラＲＳＶ  Ｍ２−１）へ導入することができる。
【００１７】
実施形態の別の一般的なクラスにおいては、本発明は、ウイルスＭ２−２タンパク質またはその部分をコードする遺伝子の突然変異誘発に起因する弱毒化表現型を有する組換えＲＳＶを提供する。したがって、実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有し、少なくとも１つの人為的に変異させた（例えば、置換または欠失）アミノ酸を含んで成るＭ２−２タンパク質を含んで成る組換えＲＳＶを提供する。例えば、Ｍ２−２は、アミノ酸残基１−２、１−６、１−８、または１−１０の欠失、またはＣ末端１、２、４、８、または１８アミノ酸残基の欠失を含みうる。別の例としては、Ｍ２−２タンパク質は、２位、４位、５位、６位、１１位、１２位、１５位、２５位、２７位、３４位、４７位、５６位、５８位、６６位、７５位、８０位、および／または８１位で、少なくとも１つの人為的に変異させた（例えば、置換）アミノ酸残基を含んで成りうる。
【００１８】
他の実施形態は、本発明の免疫学的に有効量の組換えＲＳＶを生きた弱毒化ＲＳＶワクチン、例えば、本明細書に記載されているＰ、Ｍ２−１および／またはＭ２−２タンパク質における１つもしくはそれ以上の突然変異を有する組換えＲＳＶを含んで成るワクチンを提供する。実施形態の関連クラスは、個人の免疫系を刺激し、本発明の組換え弱毒化ＲＳＶを個人に投与することによってＲＳＶに対して、免疫反応、好ましくは防御免疫反応をひき起こす方法が提供される。実施形態の別のクラスは、組換え弱毒化ＲＳＶおよび／または変異体ＲＳＶリンタンパク質、Ｍ２−１またはＭ２−２タンパク質をコードする核酸を提供する。例えば、組換え弱毒化ＲＳＶ、例えば、上記のうちの１つをコードするＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムが、かかるゲノムまたはアンチゲノムを含んで成るベクター（例えば、プラスミド）がそうであるように、本発明の特徴である。
【００１９】
別の態様においては、本発明は、抗体価を測定する（例えば、ＲＳＶまたはパラミクソウイルス科の別のウイルスに対する中和抗体を定量化する）方法を提供する。これらの方法においては、１つもしくはそれ以上の抗体含んで成る試料、およびそのゲノムまたはアンチゲノムがマーカーを含んで成る組換えウイルスが、ウイルスが複製しうる細胞の存在下に接触され、これにより細胞に感染する抗体によってウイルスは中和化されない。ウイルスの複製が可能となり、マーカーが検出される。細胞は、場合により、マーカーを検出する前に（例えば、マーカーの発現を定量化する前に）洗浄され、溶解される。ウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス（例えば、亜群Ａもしくは亜群Ｂのヒト呼吸器合胞体ウイルスまたはそのキメラ）、またはパラミクソウイルス科に属する別のウイルス（例えば、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス
、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、または牛疫ウイルス）を含んで成る。マーカーは、例えば、光学的に検出可能なマーカー（例えば、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸）、または選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える栄養素要求性マーカーまたは遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）の１つもしくはそれ以上を含んで成りうる。１つもしくはそれ以上の抗体を含んで成る試料は、例えば、血清、気管支洗浄、または鼻洗浄を含んで成りうる。ウイルス、抗体を含んで成る試料、および細胞は種々の順序で結合されうる。例えば、ウイルスと抗体は結合されうるが、次いで結合されたウイルスと抗体は細胞と結合されうる。他の要素（例えば、補体）をこれらの方法で用いることができる。例えば、ウイルス、抗体を含んで成る試料、および補体を結合し、次いで結合したウイルス、抗体、および補体を細胞と結合させることができる。マーカー（例えば、核酸マーカーによってコードされるマーカータンパク質の発現）は、当技術分野で公知の多くの方法によって検出可能である。一部の実施形態においては、マーカーの発現が定量化される。
【００２０】
これらの方法に関連した組成物および組換えウイルスは、本発明の追加の特徴を提供する。したがって、実施形態の１つのクラスは、パラミクソウイルス科に属し、そのゲノムまたはアンチゲノムがマーカーを含んで成る１つもしくはそれ以上の抗体および組換えウイルスを含んで成る組成物を提供する。このウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（例えば、亜群Ａもしくは亜群Ｂのヒト呼吸器合胞体ウイルスまたはそのキメラ）、またはパラミクソウイルス科に属する別のウイルス（例えば、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、または牛疫ウイルス）を含んで成りうる。マーカーは、例えば、光学的に検出可能なマーカー（例えば、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、クロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸）、または選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える栄養素要求性マーカーまたは遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）の１つもしくはそれ以上を含んで成りうる。
【００２１】
実施形態の別のクラスは、マーカーを含んで成るゲノムまたはアンチゲノムを含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を提供し、そのマーカーは、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、または選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）の１つもしくはそれ以上を含んで成る。さらに、実施形態の別のクラスは、パラミクソウイルスの組換えウイルスを提供する。この組換えウイルスは、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、またはイヌジステンパーウイルスを含んで成る。この組換えウイルスは、例えば、光学的に検出可能なマーカータンパク質をコードする核酸（例えば、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸）、または選択可能なマーカータンパク質（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）をコードするマーカー核酸の１つもしくはそれ以上のマーカーを含んで成りうるゲノムまたはアンチゲノムを含んで成る。実施形態の関連クラスは、かかる組換えＲＳＶまたはパラミクソウイルス科のウイルスをコードする核酸を提供する。
【００２２】
定義
別途規定されていない限り、本明細書で用いられるすべての技術および学術用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書で記載されたものと同様または任意の同等の方法および材料が本発明の試験のための実施に際して使用されうるが、このましい材料および方法は本明細書に記載されている。したがって、本明細書で使用される術語は、特定の実施形態のみを記載する目的のためであり、限定することを目的としていない。
【００２３】
本明細書および添付の請求の範囲において使用される単数形態の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段に指示していない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ウイルス（ａ ｖｉｒｕｓ）」への言及は複数のウイルスを含み、「宿主細胞（ａ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ）」への言及は、宿主細胞（ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌｓ）の混合等を含む。本発明の説明および請求においては、以下の術語が以下の定義に従って使用される。
【００２４】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」なる用語は、一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマー、もしくはキメラまたはその類似体を指す。本明細書で使用される用語は、場合により、それらが自然発生のヌクレオチド（例えば、ペプチド核酸）と同様の方法で一本鎖核酸にハイブリダイズするという点で自然のヌクレオチドの本質的な性質を有する自然発生のヌクレオチドの類似体のポリマーを含む。別途指示されていない限り、本発明の特定の核酸配列は、明確に示されている配列に加えて補体配列を包含する。
【００２５】
「遺伝子」なる用語は、生物学的機能と関係したすべての核酸を指すように広範囲に使用されている。したがって、遺伝子は、その発現に必要されるコード配列および／または調節配列を含む。「遺伝子」なる用語は、特定のゲノム配列に適用されると同時に、そのゲノム配列によってコードされるｃＤＮＡまたはｍＲＮＡに適用される。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現核酸部分も含む。非発現調節は「プロモーター」および「エンハンサー」を含み、これらに転写因子などの調節タンパク質が結合し、結果として隣接またはすぐ近くの配列の転写が生じる。「組織特異的」プロモーターまたはエンハンサーは、特定の組織型もしくは細胞型、または諸型における転写を調節するものである。
【００２６】
「ベクター」なる用語は、それによって核酸が生物、細胞、または細胞成分間で増殖し、かつ／または移転しうる手段を指す。ベクターは、自己複製し、または宿主細胞の染色体へ組み入れられうるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージド、トランスポゾン、および人工染色体などを含む。ベクターは、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じストランド内のＤＮＡとＲＮＡの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リシン共役ＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチド共役ＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソーム共役ＤＮＡなどでもありうるが、これらは自己複製していない。最も一般的には、本発明のベクターはプラスミドである。
【００２７】
「発現ベクター」は、その中に組入れられた核酸の発現および複製を促進する能力があるプラスミドなどのベクターである。通常、発現される核酸は、プロモーターおよび／またはエンハンサーに「操作可能に結合」され、プロモーターおよび／またはエンハンサーによって転写調節制御にかけられる。
【００２８】
本発明に照らして、「分離された」なる用語は、通常、その自然発生の環境において、それに伴い、またはそれと相互作用する成分から実質的に自由である核酸またはタンパク質などの生物学的材料を指す。分離された材料は、場合により、その自然な環境における
材料では見出されない材料、例えば、細胞を含んで成る。例えば、材料が、細胞などその自然環境においてある場合は、その材料は、その環境で見出される材料を原産としない細胞の位置（例えば、ゲノムまたは遺伝子要素）に配置されている。例えば、自然発生の核酸（例えば、コード配列、プロモーター、エンハンサー等）は、非自然発生手段によって、その核酸を原産としないゲノムの場所（例えば、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクター、またはアンプリコン）に導入される場合には分離される。かかる核酸は「異種」核酸とも呼ばれる。分離されたウイルスは、例えば、野生型ウイルスの原産以外の環境（例えば、細胞培養系、または細胞培養から精製された）においてある（例えば、感染個人の鼻咽頭）。
【００２９】
「組換え」なる用語は、材料（例えば、ウイルス、核酸、またはタンパク質）が、人間の介入によって人為的また合成的（非自然に）変化されていることを示す。変化は、その自然の環境または状態の内部の、またはそこから移動した材料で実行されうる。例えば、「組換え核酸」は、核酸を組換えることによって、例えば、クローニング、ＤＮＡシャッフリング、もしくは他の処置中に、または化学的または他の突然変異誘発によってなされるものである。例えば、ウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルスを参照する場合、ウイルスは組換え核酸の発現によって産生される場合に組換えである。
【００３０】
「人為突然変異」は、人間の介入によって導入される突然変異である。したがって、「人為的に変異させた」アミノ酸残基は、人間の介入の結果として変異されている残基であり、「人為的保存性変形物」は人間の介入によって産生されている保存性変形物である。例えば、野生型ウイルス（例えば、ヒト宿主の中で自然に循環するもの）またはウイルスの他の親株は、組換えＤＮＡ法を用いて「人為的に変異」され、ウイルスゲノムを変化させうる（例えば、ウイルスゲノムはインビトロ突然変異誘発によって、またはそれを化学物質、電離放射線などに暴露し、次いでウイルスの温度感受性、低温感受性、またはその他の弱毒化株のためにインビトロまたはインビボ選択を実行することによって変化されうる）。
【００３１】
「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」なる用語は、ウイルスを参照する場合、そのウイルスが２つ以上の親ウイルス株または源に由来する遺伝子および／またはポリペプチド成分を含むことを示す。同様に、  「キメラ（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」または「キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）」なる用語は、ウイルスタンパク質を参照する場合、そのタンパク質が２つ以上の親ウイルス株または源に由来するポリペプチド成分を含むことを示す。
【００３２】
「導入される」なる用語は、異種または分離核酸を参照する場合、真核細胞または原核細胞への核酸の組入れを指し、ここで核酸は細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）へ組入れられ、自動レプリコンへ転換され、または一時的に発現されうる（例えば、トランスフェクションされたｍＲＮＡ）。この用語は、「感染」、「トランスフェクション」、「形質転換」、および「形質導入」などの方法を含む。本発明に照らして、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿法、脂質仲介トランスフェクション（リポフェクション法）等を含む種々の方法を使用して核酸を原核細胞へ導入することができる。
【００３３】
「宿主細胞」なる用語は、ベクターなどの異種核酸を含有し、核酸の複製および／または発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核細胞、または酵母菌、昆虫細胞、両性動物細胞、鳥類細胞、またはヒト細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞でありうる。本発明に照らして典型的な宿主細胞としては、ＨＥｐ−２細胞、ＣＥＫ細胞、およびベロ細胞が挙げられる。
【００３４】
「アンチゲノム」は、一本鎖ウイルス（例えば、ＲＳＶ）ゲノムを補完する一本鎖核酸である。
【００３５】
「弱毒化表現型を有する」ＲＳＶまたは「弱毒化」ＲＳＶは、野生型ウイルス（例えば、ヒト宿主の中で自然に循環するもの）と比べ実質的に低い程度の毒性を示す。弱毒化ＲＳＶは通常、複製の低い成長速度および／または減少したレベルを示す（例えば、例えば、野生型ＲＳＶのそれよりも少なくとも約１０倍、好ましくは少なくとも約１００倍少ない、細胞培養、ヒトｖａｃｉｎｅｅの鼻咽頭または感染の動物モデルにおけるピーク力価）。
【００３６】
「免疫学的に有効量」のＲＳＶは、その後のＲＳＶに対する暴露に対する個々の（例えばヒトの）独自の免疫を強化するのに十分な量である。誘発された免疫のレベルは、例えば、中和分泌および／または血清抗体の量を測定することによって、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素免疫測定、またはマイクロ中和アッセイによってモニタリングされうる。
【００３７】
ＲＳＶに対する「防御免疫反応」は、個体がその後に野生型ＲＳＶに暴露され、かつ／または感染する場合に重篤な下気道疾患（例えば、肺炎および／または細気管支炎）に対して防御する個体（例えば、ヒト）によって示される免疫反応を指す。場合によっては、野生型（例えば、自然に循環する）ＲＳＶは、特に上気道においてはいまだに感染をひき起こしうるが（鼻炎）、重篤な感染をひき起こすことはありえない。通常、防御免疫反応は結果的に、インビボおよびインビトロで同じ株および／または亜群（かつおそらく異なる非ワクチン株および／または亜群）のウイルスを中和することができる宿主にひき起こされる血清および分泌抗体の検出可能なレベルがもたらされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
条件致死突然変異は、例えば、生きた弱毒化ワクチンの開発にとって重要である。化学的に突然変異誘発を起こさせ、または低温通過させたＲＳＶにおいて以前同定された温度感受性病変は、主にＬタンパク質にマッピングされている（クロー（Ｃｒｏｗｅ）ら（１９９６年）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ１３：２６９−２７３、ユハツ（Ｊｕｈａｓｚ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５８１４−５８１９、トレー（Ｔｏｌｌｅｙ）ら（１９９６年）Ｖａｃｃｉｎｅ１４：１６３７−１６４６、ホワイトヘッド（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２４７：２３２−２３９）が、それはおそらくその大きなサイズによる。発明者およびその同僚による組換え系における欠失変異の製造は有効に用いられ、弱毒化表現型を有する変異体ＲＳＶを生成している（国際公開第０２／４４３３４号パンフレット）。本発明は、生きた弱毒化ウイルスワクチンの製造において重要な弱毒化および／または温度感受性表現型を与える独立した突然変異の同定に関する。
【００３９】
ＲＳＶタンパク質における機能的突然変異
温度感受性を与えるＲＳＶ  Ｐにおける突然変異
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のリンタンパク質（Ｐタンパク質）は、大きなポリメラーゼ（Ｌ）およびヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質といっしょにウイルスＲＳＶポリメラーゼの重要な成分である（グロスフェルト（Ｇｒｏｓｆｅｌｄ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：５６７７−５６８６、ユー（Ｙｕ）ら（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２４１２−２４１９）。ＲＳＶ  Ｐタンパク質のＮおよびＬタンパク質との相互作用は、ウイルスＲＮＡ転写および複製に重要である転写酵素錯体の形成を促進する（ガルシア−バレノ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：９０１−８０８、カタール（Ｋｈａｔｔａｒ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２８５：２５３−２６９、カタール（Ｋｈａｔｔａｒ）ら（２００１年）Ｇｅｎ
Ｖｉｒｏｌ．８２：７７５−７７９）。Ｌタンパク質は触媒ＲＮＡポリメラーゼであり、Ｐタンパク質はウイルスＲＮＡの転写および複製に重要である（クラン（Ｃｕｒｒａｎ）ら（１９９１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３０７９−３０８５、ホリカミ（Ｈｏｒｉｋａｍｉ）ら（１９９２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：４９０１−４９０８）。Ｎ、Ｐ、Ｌタンパク質に加えて、いくつかの他のウイルスタンパク質がＲＳＶ  ＲＮＡ合成には必要である。Ｍ２−１の抗ターミネーション機能はプロセッシブＲＮＡ合成および遺伝子間領域における転写ターミネーションの抑制に重要である（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１５６３−１１５６７、ハーディーとウェルツ（Ｈａｒｄｙ  ＆  Ｗｅｒｔｚ）（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：５８８０−５８８５）。Ｍ２−２は、ウイルスＲＮＡ転写と複製過程との間のスイッチの調節に関与すると考えられている（バーミンガム（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ）とコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１１２５９−１１２６４、ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４−８２）。
【００４０】
ＲＳＶ亜群Ａ  Ｐタンパク質は長さが２４１個のアミノ酸であり、これは他のパラミクソウイルスのＰタンパク質よりも短い。ＲＳＶ  Ｐタンパク質は他のパラミクソウイルスのＰタンパク質との配列相同性を共有しないが、ウイルス複製の同様の構造および機能を共有し、ホモ四量体を形成し（アセンジョ  ビラヌエバ（Ａｓｓｅｎｊｏ  Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）（２０００年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６７：２７９−２８４）、これはセンダイウイルスＰタンパク質と同様である（タルボウリーヒ（Ｔａｒｂｏｕｒｉｅｃｈ）ら（２０００年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２６６：９９−１０９、ビラヌエラ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）ら（２０００年）Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ７：７７７−７８１）。ＮおよびＰタンパク質の相互作用は、Ｎタンパク質の適切な畳込みを可能にし、Ｎタンパク質のＲＮＡ複製中のウイルスＲＮＡキャプシド化を可能にする（ボーマン（Ｂｏｗｍａｎ）ら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６４７４−６４８３、フーバー（Ｈｕｂｅｒ）ら（１９９１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１８５：２９９−３０８、マスターズ（Ｍａｓｔｅｒｓ）とバネルジー（Ｂａｎｅｒｊｅｅ）（１９８８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：２６５８−２６６４）。パラミクソウイルスＰタンパク質との類推によって、ＲＳＶのＰタンパク質は、Ｌタンパク質を安定化するとともに、ポリメラーゼ錯体をＮタンパク質ＲＮＡテンプレートを配置するのに役立つ共同因子として作用する可能性がある。
【００４１】
Ｐタンパク質のＣ末端の６個のアミノ酸はＮタンパク質との結合に主要な役割を果たすことがわかっているが（ガルシア  バレノ（Ｇａｒｃｉａ  Ｂａｒｒｅｎｏ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０１−８０８、スラック（Ｓｌａｃｋ）とイーストン（Ｅａｓｔｏｎ）（１９９８年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５５：１６７−１７６）、Ｐタンパク質における他の領域もＮ−Ｐ錯体の形成に重要である可能性がある。例えば、Ｎ末端の１０個のアミノ酸を欠く欠失変異体は、共沈実験におけるＮの共凝集を誘発しなかった（ガルシア  バレノ（Ｇａｒｃｉａ  Ｂａｒｒｅｎｏ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０１−８０８）。ウシＲＳＶのＰタンパク質の試験では、Ｃ末端および内部領域に加えて残基１６１〜１８０が、共免疫沈降法によって分析されるようにＮ−Ｐ錯体形成に必要であることがわかった（マリペジ（Ｍａｌｌｉｐｅｄｄｉ）ら（１９９６年）Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．７７：１０１９−１０２３、カタール（Ｋｈａｔｔａｒ）ら（２００１年）Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８２：７７５−７７９）。
【００４２】
本発明は、組換えＲＳＶに対して温度感受性（ｔｓ）表現型を与えるＰタンパク質における突然変異を同定する。これらの変異体は、温度感受性Ｎ−Ｐ相互作用を与える突然変異の酵母ツーハイブリッド（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）システムを用いて無作為に突然変異誘発を起こさせたＰ遺伝子ｃＤＮＡライブラリーを評価することによって分離された（ルー（Ｌｕ）ら（２００２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２８７１−２８８０）。１つは残基
１７２、もう１つは１７６にある２つの独立Ｐ突然変異が同定され、これらは結果としてＮとの温度感受性相互作用を生じた。両方の変異体は、逆遺伝学を用いて突然変異を組換えＲＳＶを導入することによってミニゲノムレプリコンシステムおよび全ウイルスシステムで分析された（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９２：１１５６３−１１５６７、ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５１：２０６−２１４）。
【００４３】
１７２位でのグリシンに対するセリン（Ｇ１７２Ｓ）および１７６位でのグルタミン酸に対するグリシン（Ｅ１７６Ｇ）のアミノ置換は、温度依存的にＮ−Ｐ相互作用に影響を及ぼす。Ｇ１７２ＳまたはＥ１７６Ｇのいずれかの突然変異を有する組換えウイルスの複製は、組織培養におけるｔｓ表現型を示す。同時に、Ｇ１７２Ｓ突然変異は、ＲＳＶ亜群Ｂ  ＲＳＮ−２株で同定された突然変異と一致する（カラボキウリ（Ｃａｒａｖｏｋｙｒｉ）ら（１９９２年）Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．７３：８６５−８７３、フォークナー（Ｆａｕｌｋｎｅｒ）ら（１９７６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０：４８７−５００）。ＲＳＶ亜群Ａ  ＲＳＳ−２株のＰ遺伝子へのＧ１７２Ｓ突然変異に導入によっても、３７および３９℃でＲＳＶミニゲノムの大幅に減少した複製が生じる（マリオット（Ｍａｒｒｉｏｔｔ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５１６２−５１６５）。
【００４４】
Ｅ１７６Ｇ突然変異は、Ｐタンパク質機能に対してＧ１７２Ｓ突然変異よりも強い影響を示す。例えば、組換えｒＡ２−Ｐ１７６ウイルスは、組換えｒＡ２−Ｐ１７２ウイルスよりもマウスおよびコトンラットの気道における細胞培養においてより温度感受性であり、複製においてより制限的である。領域フランキング１７２〜１７６は荷電残基が豊富であり、異なる肺炎ウイルス中できわめて保存性である（図１）。アラニンへの１７４−１７６位での荷電残基の変化はミニゲノムシステムで非機能的タンパク質を産生し、これらの荷電残基の重要な役割を示す。Ｐ遺伝子におけるＧ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異の導入は、結果としてミニゲノムアッセイにおけるＰタンパク質機能を完全に取り除く相乗効果をもたらし、ウイルスはこれら２つの突然変異の組合せを有するｃＤＮＡから回復されなかった。
【００４５】
組換えウイルスｒＡ２−Ｐ１７６は、ウイルス感染細胞が３７℃でインキュベートされると迅速に復帰し（例えば、アミノ酸置換を受ける）、ｔｓ表現型の喪失をもたらす。野生型（ｗｔ）への復帰は稀であるが、もっとも可能性のあるのは、Ｇｌｙ（ＧＧＴ）がＧｌｕ（ＧＡＡ）と比べ２つのヌクレオチド変化を含有するためである。もっと正確に言えば、導入されたＧｌｙは主にＡｓｐ（ＧＡＴ）に変化し、ジスルフィドまたは水素結合により他のタンパク質残基と相互作用することができる負に帯電した残基のほか、ＣｙｓおよびＳｅｒにも変化し、それぞれ、１７６位での荷電残基がＰタンパク質の温度安定性の維持に重要であることを示す。ＣＡＴミニゲノム発現アッセイで分析すると、細胞を発現するＰ−Ｅ１７６Ｄは、ｗｔの約５０％のＣＡＴ発現を有し、Ｅ１７６Ｇの５％活性よりもはるかに高い。同様に、Ｅ１７６のＡｌａによる置換は、ミニゲノムアッセイにおけるＰタンパク質機能を大幅に減少させることはなかった。
【００４６】
Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異も結果として酵母菌におけるＰとＮとの相互作用における温度感受性変化をもたらす。各変異体の機能は３３℃でわずかだけ減少したが、その機能は３７℃で大幅に減少し、さらに３９℃で減少した。３７℃および３９℃でトランスフェクションされた細胞におけるＧ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇタンパク質の発現レベルはｗｔ  Ｐのそれと同様であり、温度感受性がタンパク質の熱不安定性によるものではないことを示す。３７℃でｒＡ２−Ｐ１７２またはｒＡ２−Ｐ１７６に感染した細胞は、Ｐタンパク質で共免疫沈降したＮタンパク質における２倍もしくはそれ以上の削減によって明らかにされるように、Ｎ−Ｐ相互作用の減少を示す。Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異のＮとの相互作用の能力の減少は、これらの突然変異を有するウイルスのｔｓ表現
型を説明する可能性がある。
【００４７】
また、アミノ酸残基１６１〜１８０の欠失を有するヒトＲＳＶ  Ｐタンパク質はＮで共免疫沈降するが、ＲＳＶミニゲノム複製アッセイでは機能しない。
【００４８】
ＲＳＶ  Ｐのリン酸化部位における突然変異
ＲＳＶ  Ｐタンパク質は、ビリオンコア内および感染細胞内で構成的にリン酸化されている。リン酸化は細胞カゼインキナーゼＩＩによって仲介される（デュピュイ（Ｄｕｐｕｙ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８３８４−８３９２、ビラヌエバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）ら（１９９４年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：５５５−５６５）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：５５５−５６５）が、それはセリンの２つのクラスター、すなわち、中央領域における１１６、１１７、および１１９（１１６／１１７／１１９）、およびＣ末端領域における２３２および２３７（２３２／２３７）においてである（ナバロ（Ｎａｖａｒｒｏ）ら（１９９１年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４５５−１４５９、サンチェス−セコ（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｓｅｃｏ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４２５−４３０、ビナヌエバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）ら（２０００年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２９−１３３、ビラヌエバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）ら（１９９４年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：５５５−５６５）。Ｐタンパク質リン酸化の約８０％はＳｅｒ２３２に位置しており、残りの２０％は１１６位、１１７位、１１９位、および２３７位でセリンの中に分布している。
【００４９】
細菌性発現されると、非リン酸化Ｐタンパク質は、インビトロシステムで転写を支持するために必要な（バリク（Ｂａｒｉｋ）ら（１９９５年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１３：４０５−４１２）四量体を形成することができない（アセンジョとビラヌエバ（Ａｓｓｅｎｊｏ  ＆  Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）（２０００年）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６７：２７９−２８４）。細菌性発現Ｐタンパク質のリン酸化は、転写を支持するその能力を復帰させ、リン酸化Ｐタンパク質が新たに開始したポリメラーゼを安定した錯体に転換することが必要であることを示す。これらの所見とは対照的に、ＲＳＶ感染細胞におけるリン酸化の阻害は、ウイルス転写または複製を取り除くことはなく（バリク（Ｂａｒｉｋ）ら（１９９５年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１３：４０５−４１２、ビラヌエバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）ら（１９９４年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．１０１−１０８）、Ｐタンパク質リン酸化のバルクはＲＳＶミニゲノムシステムにおけるＲＮＡ合成に必要でない（ビラヌエバ（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ）ら（２０００年）Ｊ．ＧｅｎＶｉｒｏｌ．８１：１２９−１３３）。また、アラニンによるＳ２３２またはＳ２３７の置換は、同時トランスフェクションされた細胞における封入体の形成によって示されるようにＮタンパク質との相互作用を阻止することなく（ガルシア−バレノ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０１−８０８）、およびリン酸化インヒビターによるリン酸化の減少はＰタンパク質の四量体形成に影響を与えることはなかった（ボーマン（Ｂｏｗｍａｎ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６４７４−６４８３）。Ｐタンパク質リン酸化は、リン酸基によってポリペプチドに負電荷を追加する。Ｐタンパク質のＳｅｒ２３２からのリン酸基の除去が、インビトロの転写延長を停止したが、アスパラギン酸によるＳｅｒ２３２の置換が野生型Ｐタンパク質のそれの５０％に転写活性を復帰させたことを以前に明らかにされている（デュピュイ（Ｄｕｐｕｙ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８３８４−８３９２）。アラニンによる２３２位および２３７位での両残基の置換は、ＲＮＡ転写および複製に対して重要な影響を与えていない。
【００５０】
本発明は、Ｐタンパク質におけるセリン残基が変化してそのリン酸化潜在能力を削減したＲＳＶウイルスおよびＰタンパク質を提供する。典型的な実施形態は、Ｐタンパク質リン酸化部位の２つ（２３２／２３７）：ｒＡ２−ＰＰ２、または５つ（１１６／１１７／１１９／２３２／２３７）：ｒＡ２−ＰＰ５でセリンの突然変異を有する組換えＲＳＶを
含む。例えば、１１６位、１１７位、１１９位、および２３２位、２３７位でセリンはＬＲＬ、およびＡＡにそれぞれ変更された。あるいは、セリンの２つのクラスターはアスパラギン酸に変更され、負電荷を模倣した。同様の活性レベルは、Ｓ２３２Ｄ／Ｓ２３７Ｄ置換またはＳ２３２Ａ／Ｓ２３７Ａ置換を有するＰタンパク質で観察された。対照的に、アスパラギン酸による１１６、１１７、および１１９での３つのセリンの置換はＰタンパク質機能を完全に取り除き、単一のＳ１１６Ｄ変更が最も重要な効果を有する。ＬＲＬによる同じ残基の置換は、Ｐタンパク質に対するほんのわずかな効果を有した。
【００５１】
２つのリン酸化部位（Ｓ２３２Ａ、Ｓ２３７Ａ［ＰＰ２］）または５つのリン酸化部位（Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１７Ｒ、Ｓ１１９Ｌ、Ｓ２３２Ａ、Ｓ２３７Ａ［ＰＰ５］）のいずれかを除去するアミノ酸置換を有するＲＳＶ  Ａ２株の変異体は、リン酸化の減少を示す。３３Ｐ標識感染細胞の免疫沈降法は、Ｐタンパク質リン酸化がｒＡ２−ＰＰ２で８０％、ｒＡ２−ＰＰ５で９５％減少することを示した。２つの組換えウイルスはベロ細胞で十分に複製したが、ｒＡ２−ＰＰ２、および、ｒＡ２−ＰＰ５では相当程度に、ＨＥｐ−２細胞において不十分な複製をした。感染ＨＥｐ−２細胞からのウイルス出芽は、ｒＡ２−ＰＰ５の大部分は細胞内にとどまるため、Ｐタンパク質の脱リン酸化によって影響された。また、ｒＡ２−ＰＰ５は、マウスおよびコトンラットの気道における複製においてｒＡ２−ＰＰ２より弱毒化もされた。
【００５２】
共免疫沈降分析は、ＮおよびＰタンパク質の相互作用がＰタンパク質の脱リン酸化によって減少された。約３０％の減少がｒＡ２−ＰＰ２のＮ−Ｐ相互作用において確認され、そこから２つの主要なリン酸化部位が除去されており、約６０％の減少がｒＡ２−ＰＰ５のＮ−Ｐタンパク質相互作用において確認され、そこから５つのリン酸化部位すべてが除去されていた。この所見は以前の報告と一致しており、ここでＳ−２３２およびＳ−２３７の変化が、ツーハイブリッドシステムで約５０％Ｎタンパク質と相互作用するＰタンパク質の能力を減少させた（スラック（Ｓｌａｃｋ）とイーストン（Ｅａｓｔｏｎ）（１９９８年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ５５：１６７−１７６）。
【００５３】
ウイルスＲＮＡ転写および複製は、ゲノムＲＮＡ合成の同時減少とともに、感染細胞におけるｒＡ２−ＰＰ５  ｍＲＮＡにおける増大によって証明されるようにＰタンパク質リン酸化によって影響もされる。ｒＡ２−ＰＰ５感染ＨＥｐ−２細胞におけるＲＮＡ合成の減少は、複製の効率における減少による可能性が高い。ミニゲノム分析は、わずかに低いアンチゲノム／ｍＲＮＡ比がＬＲＬ変化と相関することを示した。
【００５４】
感染性ウイルスｒＡ２−ＰＰ５はベロ細胞において効果的に複製し、ＲＳＶ  Ｐタンパク質オリゴマー化がＰタンパク質リン酸化によって影響される可能性を低くする。しかし、Ｐタンパク質からの主要なリン酸化部位の除去は、ｒＡ２−ＰＰ５感染細胞からウイルス出芽を大幅に減少させ、ウイルスの大部分は細胞内にとどまる。ｒＡ２−ＰＰ５は、易感染性細胞の感染後に広範囲に及ぶインビトロ通過を維持することが不可能であり、マウスおよびコトンラットにおいてきわめて弱毒化され、弱毒化ワクチン製剤の適切性と合致する。
【００５５】
Ｐ、核酸、およびワクチンにおける突然変異を有する組換えＲＳＶ
本発明の１つの態様は、弱毒化表現型を示し、かつ変異リンタンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。本発明の別の態様は、かかる組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化ＲＳＶワクチンを提供する。組換えリンタンパク質およびかかる組換えリンタンパク質および／または組換えウイルスをコードする核酸も本発明の特徴である。
【００５６】
したがって、実施形態の１つの一般的なクラスは、弱毒化表現型を有し、かつ少なくと
も１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成るリンタンパク質（Ｐ）を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。例えば、リンタンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入、および／または少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成りうる（例えば、野生型タンパク質における特定の位置を占有するアミノ酸残基は、もう１つの２０個の自然発生アミノ酸によって、または非自然アミノ酸によって置換されうる）。
【００５７】
実施形態の１つのクラスにおいては、リンタンパク質は１７２位、１７４位、１７５位、および１７６位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成る。例えば、リンタンパク質は、１７２位、１７４位、１７５位、および１７６位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成りうる。リンタンパク質は、例えば、１７２位でグリシンからセリンへの置換（Ｇ１７２Ｓ）を含んで成りうる。リンタンパク質は、例えば、１７４位でアルギニンからアラニンへの置換（Ｒ１７４Ａ）を含んで成りうる。リンタンパク質は、例えば、１７５位でグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｅ１７５Ａ）を含んで成りうる。リンタンパク質は、例えば、１７６位でグルタミン酸からグリシンへの置換（Ｅ１７６Ｇ）、１７６位でグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｅ１７６Ａ）、１７６位でグルタミン酸からアスパラギン酸への置換（Ｅ１７６Ｄ）、１７６位でグルタミン酸からシステインへの置換（Ｅ１７６Ｃ）、または１７６位でグルタミン酸からセリンへの置換（Ｅ１７６Ｓ）を含んで成りうる。リンタンパク質は、これらの位置の２つもしくはそれ以上ので置換アミノ酸残基を含んで成りうるが、例えば、リンタンパク質は１７２位および１７６位で置換アミノ酸残基を含んで成りうる。
【００５８】
実施形態の関連クラスにおいては、リンタンパク質は複数の置換アミノ酸残基を含んで成り、その残基は残基１７２−１７６から選択される。例えば、リンタンパク質は、１７４位でアルギニンからアラニンへの置換（Ｒ１７４Ａ）、１７５位でグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｅ１７５Ａ）、および１７６位でグルタミン酸からアラニンへの置換（Ｅ１７６Ａ）を含んで成りうる。
【００５９】
実施形態の１つのクラスにおいては、リンタンパク質は、残基１７２−１７６から選択される複数のアミノ酸残基の欠失を含んで成る。例えば、リンタンパク質は、アミノ酸残基１７２−１７６の欠失を含んで成りうる。別の例としては、リンタンパク質はアミノ酸残基１６１−１８０の欠失を含んで成りうる。
【００６０】
実施形態の同様のクラスにおいては、リンタンパク質は、残基２３６−２４１から選択される複数のアミノ酸残基の欠失を含んで成る。例えば、リンタンパク質は、アミノ酸残基２３６−２４１の欠失を含んで成りうる。
【００６１】
実施形態の１つのクラスにおいては、弱毒化組換えＲＳＶは、リン酸化部位を除去する少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るリンタンパク質を含んで成る。例えば、リンタンパク質は、リン酸化部位を除去する少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成りうる。実施形態の好ましいクラスにおいては、少なくとも１つの置換アミノ酸残基は、セリンを置換し、例えば、少なくとも１つの置換アミノ酸残基は、１１６位、１１７位、１１９位、２３２位、および２３７位より成る群から選択される１つもしくはそれ以上の位置でセリンを置換しうる。リンタンパク質は、例えば、アミノ酸置換Ｓ１１６Ｄ、アミノ酸置換Ｓ１１６Ａ、またはアミノ酸置換Ｓ１１６Ｌを含んで成りうる。リンタンパク質は、例えば、アミノ酸置換Ｓ１１７Ｄ、アミノ酸置換Ｓ１１７Ａ、またはアミノ酸置換Ｓ１１７Ｒを含んで成りうる。リンタンパク質は、例えば、アミノ酸置換Ｓ１１９Ｄ、アミノ酸置換Ｓ１１９Ａ、またはアミノ酸置換Ｓ１１９Ｌを含んで成りうる。リンタンパク質は、例えば、アミノ酸置換Ｓ２３２Ａまたはアミノ酸置換Ｓ２３２Ｄを含んで成りうる
。リンタンパク質は、例えば、アミノ酸置換Ｓ２３７Ａまたはアミノ酸置換Ｓ２３７Ｄを含んで成りうる。
【００６２】
一部の実施形態においては、リンタンパク質は、２つもしくはそれ以上の置換アミノ酸残基を含んで成る。例えば、置換アミノ酸残基は、１１７位および１１９位でセリンを置換しうるが、例えば、リンタンパク質は、Ｓ１１７Ａ、Ｓ１１７Ｄ、およびＳ１１７Ｒより成る群から選択されるアミノ酸置換、およびＳ１１９Ａ、Ｓ１１９Ｄ、およびＳ１１９Ｌより成る群から選択されるアミノ酸置換を含んで成りうる（例えば、リンタンパク質はアミノ酸置換Ｓ１１７ＡおよびＳ１１９Ａを含んで成りうる）。
【００６３】
別の例としては、置換アミノ酸残基は、１１６位、１１７位、および１１９位でセリンを置換しする。１１６位での置換アミノ酸残基は、例えば、アラニン（Ｓ１１６Ａ）、アスパラギン酸（Ｓ１１６Ｄ）、およびロイシン（Ｓ１１６Ｌ）より成る群から選択されうる。１１７位での置換アミノ酸残基は、例えば、アラニン（Ｓ１１７Ａ）、アスパラギン酸（Ｓ１１７Ｄ）、およびアルギニン（Ｓ１１７Ｒ）より成る群から選択されうる。１１９位での置換アミノ酸残基は、例えば、アラニン（Ｓ１１９Ａ）、アスパラギン酸（Ｓ１１９Ｄ）、およびロイシン（Ｓ１１９Ｌ）より成る群から選択されうる。例えば、リンタンパク質は、Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１６Ａ、およびＳ１１６Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換、Ｓ１１７Ｒ、Ｓ１１７Ａ、およびＳ１１７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換、およびＳ１１９Ｌ、Ｓ１１９Ａ、およびＳ１１９Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換を含んで成りうる（例えば、リンタンパク質は、アミノ酸置換Ｓ１１６Ｄ、Ｓ１１７Ｄ、およびＳ１１９Ｄ、またはアミノ酸置換Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１７Ｒ、およびＳ１１９Ｌを含んで成りうる）。
【００６４】
さらに別の例としては、置換アミノ酸残基は、２３２位および２３７位でセリンを置換しうる。２３２位での置換アミノ酸残基は、例えば、アラニン（Ｓ２３２Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３２Ｄ）より成る群から選択されうる。２３７位での置換アミノ酸残基は、例えば、アラニン（Ｓ２３７Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３７Ｄ）より成る群から選択されうる。例えば、リンタンパク質は、Ｓ２３２ＡおよびＳ２３２Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換、およびＳ２３７ＡおよびＳ２３７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換を含んで成りうる（例えば、リンタンパク質は、アミノ酸置換Ｓ２３２ＤおよびＳ２３７Ｄ、またはアミノ酸置換Ｓ２３２ＡおよびＳ２３７Ａを含んで成りうる）。
【００６５】
さらに別の例としては、置換アミノ酸残基は、１１６位、１１７位、１１９位、２３２、および２３７位でセリンを置換しうる。１１６位での置換アミノ酸残基は、例えば、ロイシン（Ｓ１１６Ｌ）、アラニン（Ｓ１１６Ａ）、およびアスパラギン酸（Ｓ１１６Ｄ）より成る群から選択されうる。１１７位での置換アミノ酸残基は、例えば、アルギニン（Ｓ１１７Ｒ）、アラニン（Ｓ１１７Ａ）、およびアスパラギン酸（Ｓ１１７Ｄ）より成る群から選択されうる。１１９位での置換アミノ酸残基は、例えば、ロイシン（Ｓ１１９Ｌ）、アラニン（Ｓ１１９Ａ）、およびアスパラギン酸（Ｓ１１９Ｄ）より成る群から選択されうる。２３２位での置換アミノ酸残基は、例えば、アラニン（Ｓ２３２Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３２Ｄ）より成る群から選択されうる。２３７位での置換アミノ酸残基は、例えば、アラニン（Ｓ２３７Ａ）およびアスパラギン酸（Ｓ２３７Ｄ）より成る群から選択されうる。例えば、リンタンパク質は、Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１６Ａ、およびＳ１１６Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換、Ｓ１１７Ｒ、Ｓ１１７Ａ、およびＳ１１７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換、Ｓ１１９Ｌ、Ｓ１１９Ａ、およびＳ１１９Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換、Ｓ２３２ＡおよびＳ２３２Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換、およびＳ２３７ＡおよびＳ２３７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換を含んで成りうる（例えば、リンタンパク質は、アミノ酸置換Ｓ１１６Ｌ、Ｓ
１１７Ｒ、Ｓ１１９Ｌ、Ｓ２３２Ａ、およびＳ２３７Ａ、またはアミノ酸置換Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１７Ｒ、Ｓ１１９Ｌ、Ｓ２３２Ｄ、およびＳ２３７Ｄを含んで成りうる）。
【００６６】
組換えＲＳＶは、ＲＳＶの任意の種、亜群および／または株を含んで成りうる。好ましい実施形態においては、組換えＲＳＶは、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る。
【００６７】
核酸は本発明の別の特徴を提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有する組換え呼吸器合胞体ウイルスをコードし、少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るリンタンパク質を含んで成る核酸を提供する。核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、またはＲＮＡでありうる。核酸は、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムでありうる。ベクター（例えば、プラスミド）は核酸を含んで成りうる。
【００６８】
本発明の別の態様は、人為的に変異させたリンタンパク質（例えば、上述したもの）を提供する。さらに別の態様は、人為的に変異させたリンタンパク質をコードする核酸を提供する。上記の変形物は、これらの核酸にも適用され、したがって、核酸はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡであり、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムであり、かつ／またはベクター（例えば、プラスミド）を含んで成りうる。
【００６９】
本発明は、弱毒化組換えＲＳＶを含んで成るワクチンをも提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有する免疫学的に有効量の組換え呼吸器合胞体ウイルスを含んで成り、かつ少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るリンタンパク質（Ｐ）を含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチンを提供する。ワクチンは、場合により、生理学的に許容できるキャリアおよび／またはアジュバントをさらに含んで成る。
【００７０】
他の実施形態においては、本発明は、個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応をひき起こすための方法を提供する。これらの方法は、個人に組換え呼吸器合胞体ウイルスを投与するステップを含んで成り、このウイルスは弱毒化表現型を有し、生理学的に許容できるキャリアで少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るリンタンパク質（Ｐ）を含んで成る。好ましい実施形態においては、免疫反応は防御免疫反応である。ワクチンは１つもしくはそれ以上の用量で投与され、防御の所望レベルを達成しうる。組換えＲＳＶは、好ましくは個人の上気道（例えば、鼻咽頭）に投与され、かつ好ましくはスプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される。
【００７１】
弱毒化組換えＲＳＶを製造しうる方法
本発明の１つの態様は、別のタンパク質との変化した相互作用を有するリンタンパク質またはヌクレオプロテインを同定する方法を提供する。これらの方法においては、複数のタンパク質変異体が提供されるが、ここで各タンパク質変異体は第１のＲＳＶタンパク質の少なくとも一部分を含んで成る。第１のＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶリンタンパク質およびＲＳＶヌクレオプロテインより成る群から選択される。第２のＲＳＶタンパク質との変化した相互作用またはその一部分を有する少なくとも１つの候補タンパク質変異体が同定される。第１のＲＳＶタンパク質の一部分は通常、１つもしくはそれ以上のドメインを含んで成るが、数個のアミノ酸残基から完全長タンパク質までのどこでも含んで成りうる。変異体は、追加の有用なポリペプチド配列、例えば、１つもしくはそれ以上のタグ（例えば、ポリ−ヒスチジンタグ、エピトープタグ）、ＧＳＴ部分、および／またはＤＮＡ結合または活性化ドメインをさらに含んで成る。変異体は各々同一のまたは異なるサイズの第１のタンパク質の部分を含んで成りうる。
【００７２】
実施形態の１つのクラスにおいては、複数のタンパク質変異体が提供され、ここで各々のタンパク質変異体は少なくとも一部分の第１のＲＳＶタンパク質を含んで成る。第１の
ＲＳＶタンパク質の一部分は、少なくとも１つの人為突然変異を含んで成る（例えば、少なくとも１つの変異アミノ酸残基、例えば、１つもしくはそれ以上の置換、挿入、または欠失アミノ酸残基）。第１のＲＳＶタンパク質は、ＲＳＶリンタンパク質およびＲＳＶヌクレオプロテインより成る群から選択される。第２のＲＳＶタンパク質またはその一部分と変化した相互作用を有する少なくとも１つの候補タンパク質変異体が同定されている。一部の実施形態においては、第１のＲＳＶタンパク質はＲＳＶリンタンパク質であり、第２のＲＳＶタンパク質はＲＳＶヌクレオプロテインである。他の同様の実施形態においては、第１のＲＳＶタンパク質はＲＳＶヌクレオプロテインであり、第２のＲＳＶタンパク質はＲＳＶリンタンパク質である。
【００７３】
第２のＲＳＶタンパク質との変化した相互作用を有する少なくとも１つの候補タンパク質変異体は、インビボアッセイ（例えば、ツーハイブリッドアッセイ）を実行することによって同定されうる。あるいは、第２のＲＳＶタンパク質との変化した相互作用を有する少なくとも１つの候補タンパク質変異体は、インビトロアッセイ（例えば、共免疫沈降法、ＧＳＴプルダウン法、ファーウエスタン法など）を実行することによって同定されうる。第２のＲＳＶタンパク質との変化した相互作用を有する候補タンパク質変異体は、第２のタンパク質と増加した、または、好ましくは減少した相互作用を有しうる。減少が量的（例えば、インビトロアッセイで測定される結合親和性の１０分の１または１００分の１の減少）または質的（例えば、ツーハイブリッドアッセイを生育することができない）。一部の実施形態においては、相互作用は温度依存的に変化する（例えば、変異はｔｓまたはｃｓでありうる）。
【００７４】
これらの方法は、追加のステップを含んで成りうる。例えば、候補タンパク質変異体の少なくとも１つを含んで成る第１のＲＳＶタンパク質の一部分における少なくとも１つの突然変異の性質は測定されうる。これらの方法は、弱毒化組換えＲＳＶを含む、組換えＲＳＶの製造をもたらしうる。したがって、少なくとも１つの組換えＲＳＶが製造されうる。組換えウイルスのゲノムまたはアンチゲノムは、候補タンパク質変異体の少なくとも１つを含んで成る第１のＲＳＶタンパク質の一部分における少なくとも１つの突然変異を含んで成るリンタンパク質またはヌクレオプロテインをコードする。当業者であれば、候補タンパク質変異体が、場合によっては、２つもしくはそれ以上の突然変異を含んで成りうるが、そのうちの１つのみが必要に応じて組換えＲＳＶに導入される必要があることを認めるであろう。候補変異体および組換えＲＳＶにおける突然変異は、コードタンパク質が所望の突然変異を含んで成る限り、核酸レベルで同じである必要はない。
【００７５】
組換えＲＳＶの複製を評価し、減少したレベルの複製、例えば、その複製が、例えば、突然変異が導入されるＲＳＶの野生型の自然循環する株および／またはＲＳＶ株と比べ、少なくとも１０分の１またはさらに少なくとも１００分の１減少している組換えＲＳＶ有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定するために評価することができる。複製は、例えば、ウイルスのピーク力価を測定することによって評価されうる。複製は、培養細胞において、動物において（例えば、上および／または下気道において）、および／またはヒトにおいて（例えば、上および／または下気道において）評価されうる。適切な動物モデルとしては、齧歯類（例えば、マウス、コトンラット）、または霊長類（例えば、アフリカミドリザル、チンパンジー）が挙げられる。感染宿主（例えば、ヒトまたは動物）のＲＳＶのレベル（例えば、鼻咽頭および／または肺における）を測定するための方法は文献において周知である。例えば、鼻咽頭分泌物の吸引または洗浄によって検体が得られ、ウイルスは検査法によって組織培養またはその他で定量化される。例えば、ベルシェ（Ｂｅｌｓｈｅ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １：１５７−１６２（１９７７年）、フリーデワルト（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０４：６９０−６９４（１９６８年）、ガールプア（Ｇｈａｒｐｕｒｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：４１４−４２１（１９６９年）、およびライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、Ａｒｃｈ．Ｇ
ｅｓ．Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ．４１：２３８−２４７（１９７３年）を参照。
【００７６】
Ｍ２−１タンパク質における機能的突然変異
パラミクソウイルス科における他の膜と異なり、ＲＳＶ  ｍＲＮＡの有効な転写は追加のタンパク質、Ｍ２−１を必要とする（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８１−８５）。Ｍ２−１は、Ｍ２  ｍＲＮＡの２つの重複する読み取り枠の第１によってコードされる（アーマジアン（Ａｈｍａｄｉａｎ）ら（２０００年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：２６８１−２６８９、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）（１９８５年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５４：６５−７１）。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）のＭ２−１タンパク質は、ウイルス複製にとって重要である転写抗ターミネーターである。これは転写中の早発ターミネーションを防ぐ機能的伸長性因子として機能し（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（１９９６年）Ｐｒｏｃ
Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：８１−８５、ファーンズ（Ｆｅａｒｎｓ）とコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３８８−３９７、ファーンズ（Ｆｅａｒｎｓ）とコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５８５３−５８６４）、かつ遺伝子接合部での転写リードスルーを強化する（ハーディー（Ｈａｒｄｙ）ら（１９９９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１７０−１７６、ハーディー（Ｈａｒｄｙ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：５８８０−５８８５、ハーディー（Ｈａｒｄｙ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）（１９９８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５２０−５２６）、これによりＲＳＶポリメラーゼの下流転写ユニットへのアクセスが可能となる。機能的Ｍ２−１は、ＲＳＶ複製にとって重要であり、その配列の一部の変化はウイルス伝染力を無効化する（タング（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５）。
【００７７】
ｈＲＳＶ  Ａ２株のＭ２−１タンパク質は、長さが１９４個のアミノ酸であり、約２２，１５０の分子量を有する（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（１９９０年）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０１５−３０２０、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）（１９８５年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：６５−７１）。これは、肺炎ウイルスのヒト、ウシ、ヒツジ、およびマウス株の中で高度に保存されているＮ末端においてＣｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフを含有する（アーマジアン（Ａｈｍａｄｉａｎ）ら（２０００年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：２６８１−２６８９、アランサリ（Ａｌａｎｓａｒｉ）とポトギーター（Ｐｏｔｇｉｅｔｅｒ）、１９９４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３５９７−３６０１、ファン・デン・フーゲン（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎ）ら、２００２年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９５：１１９−１３２、およびユー（Ｙｕ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６９：２４１２−２４１９）。Ｍ２−１機能は、ＮおよびＰタンパク質とのその相互作用を必要とする。最近の研究では、ＲＮＡによって仲介されるＭ２−１とＮタンパク質との間の直接の相互作用が明らかにされた（カルティー（Ｃａｒｔｅｅ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）、２００１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７５：１２１８８−１２１９７、およびクエスタ（Ｃｕｅｓｔａ）ら、２０００年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７４：９８５８−９８６７）。このモチーフにおける３つのシスチンおよび１つのヒスチジンの置換は、Ｍ２−１の転写リードスルーを強化する能力を大幅に減少させ、Ｍ２−１とＮタンパク質との間の相互作用を無効化した（ハーディー（Ｈａｒｄｙ）とウェルツ（Ｗｅｒｔｚ）（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１７０−１７６）が、これはウイルス複製にとって致命的である（タング（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５）。しかし、Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフの保存にもかかわらず、肺炎ウイルス種間には転写の伸長性における著しい差があり、Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフだけではＭ２−１機能には十分ではないことを示す。マウス（ＰＶＭ）のＲＳＶおよび肺炎ウイルスのＭ２−１タンパク質の配列要素を組込むキメラの構造は、Ｎ末端での追加の残基がタンパク質機能の測定において重要な役割を果たすことを示した。例えば、ＰＶＭ  Ｍ２−１（ＲＰ  Ｍ２−１）の残りの１４８個のアミノ酸を有するＲＳＶのＮ末端の３０個のアミノ酸
を含むキメラが活性の十分なレベルを維持したが、ＲＳＶ（ＰＲ  Ｍ２−１）からのＣ末端の１６４個のアミノ酸を有するＰＶＭの２９個のＮ末端アミノ酸を含むキメラはＣｙｓ３Ｈｉｓ１モチーフの保存にかかわらずほとんど活性を有さなかった。
【００７８】
本発明は、ＲＳＶ  Ｍ２−１機能にとって重要であるＮ末端残基におけるアミノ酸置換を有するＲＳＶ  Ｍ２−１変異体（分離タンパク質および組換えウイルス）を提供する。例えば、１６位でロイシンに対するセリン（Ｌ１６Ｓ）および／または１７位でアスパラギンに対するアルギニン（Ｎ１７Ｒ）のアミノ酸置換を含んで成るＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質は、Ｍ２−１機能を大幅に減少させた。例えば、１６位でのロイシンに対するセリンの置換は結果としてタンパク質機能の９７％の減少をもたらすが、１７位でのアスパラギン酸に対するアルギニンの置換は結果としてタンパク質機能の９４％の減少をもたらす。Ｌ１６ＳおよびＮ１７Ｒ突然変異を含んで成るＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質は、１％のみの残留活性を示す。Ｍ２−１機能におけるかかる減少は、生きた弱毒化ワクチンの製造において望ましい弱毒化ウイルス表現型と対応する。
【００７９】
本発明の１つの態様は、弱毒化表現型を示し、かつ人為的に変異させたＭ２−１タンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。本発明の別の態様は、かかる組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化ＲＳＶワクチンを提供する。組換えＭ２−１タンパク質、およびかかる組換えＭ２−１タンパク質および／または組換えウイルスをコードするおよび核酸も本発明の特徴である。
【００８０】
したがって、実施形態の１つの一般的なクラスは、弱毒化表現型を有し、かつ３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置（すなわち、アミノ酸残基位置）での少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成るＭ２−１タンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。例えば、変異残基は、欠失または置換でありうる（例えば、野生型タンパク質における特定の位置を占有するアミノ酸残基が、２０個の自然発生アミノ酸のもう１つによって、または非自然アミノ酸によって置換されうる）。したがって、実施形態の１つのクラスにおいては、Ｍ２−１タンパク質は、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成る。Ｍ２−１タンパク質は、例えば、３位でのアルギニンからバリンへの置換（Ｒ３Ｖ）、１２位でのアルギニンからグルタミンへの置換（Ｒ１２Ｑ）、１４位でのヒスチジンからフェニルアラニンへの置換（Ｈ１４Ｆ）、１６位でにロイシンからセリンへの置換（Ｌ１６Ｓ）、１７位でのアスパラギンからアルギニンへの置換（Ｎ１７Ｒ）、および／または２０位でのアルギニンからアスパラギンへの置換（Ｒ２０Ｎ）を含んで成りうる。
【００８１】
Ｍ２−１タンパク質は、以下の実施例によって示されているように、これらの位置の２つもしくはそれ以上のでの置換アミノ酸残基を含んで成りうる。Ｍ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｌ１６ＳおよびＮ１７Ｒを含んで成りうる。Ｍ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｒ１２ＱおよびＨ１４Ｆを含んで成りうる。Ｍ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｒ１２ＱおよびＲ２０Ｎを含んで成りうる。Ｍ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｈ１４ＦおよびＲ２０Ｎを含んで成りうる。Ｍ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｒ１２Ｑ、Ｈ１４Ｆ、およびＲ２０Ｎを含んで成りうる。
【００８２】
組換えＲＳＶは、ＲＳＶの任意の種、亜群および／または株を含んで成りうる。好ましい実施形態においては、組換えＲＳＶは亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る。
【００８３】
核酸は本発明の別の特徴を提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有し、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置
で少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るＭ２−１タンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスをコードする核酸を提供する。核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、またはＲＮＡでありうる。核酸は、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムでありうる。ベクター（例えば、プラスミド）は核酸を含んで成りうる。
【００８４】
人為的に変異させたＭ２−１タンパク質（例えば、上述したもの）は、本発明の別の特徴である。人為的に変異させたＭ２−１タンパク質をコードする核酸は、さらに本発明の別の特徴を提供する。上記の変形物は、これらの核酸にも適用され、したがって、核酸はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡであり、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムであり、かつ／またはベクター（例えば、プラスミド）を含んで成りうる。
【００８５】
本発明は、弱毒化組換えＲＳＶを含んで成るワクチンも提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有し、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るＭ２−１タンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスの免疫学的に有効量を含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチンを提供する。ワクチンは、場合により、生理学的に許容できるキャリアおよび／またはアジュバントをさらに含んで成る。
【００８６】
他の実施形態においては、本発明は、個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応をひき起こすための方法を提供する。これらの方法は、個人に組換え呼吸器合胞体ウイルスを投与するステップを含んで成り、このウイルスは、生理学的に許容できるキャリアで、弱毒化表現型を有し、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るＭ２−１タンパク質を含んで成る。好ましい実施形態においては、免疫反応は防御免疫反応である。ワクチンは１つもしくはそれ以上の用量で投与され、防御の所望レベルを達成しうる。組換えＲＳＶは、好ましくは個人の上気道（例えば、鼻咽頭）に投与され、かつ好ましくはスプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される。
【００８７】
実施形態の別の一般的なクラスは、弱毒化表現型を有し、キメラＭ２−１タンパク質を含んで成る組換えＲＳＶを提供し、そのキメラＭ２−１タンパク質は、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成る。実施形態の１つのクラスにおいては、キメラＭ２−１タンパク質は、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域（すなわち、Ｎ末端半分からの複数の残基）からの複数の残基、およびＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域（すなわち、Ｃ末端半分からの複数の残基）からの複数の残基を含んで成る。例えば、１つの特定の実施形態においては、キメラＭ２−１タンパク質は、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端３０個の残基、およびＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端１４８個の残基を含んで成る。実施形態の別のクラスにおいては、キメラＭ２−１タンパク質は、ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域（半分）からの複数の残基、およびＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域（半分）からの複数の残基を含んで成る。１つの実施形態においては、キメラＭ２−１タンパク質は、ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端２９個の残基、およびＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端１６４個の残基を含んで成る。
【００８８】
キメラタンパク質は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換、挿入、および／または欠失をさらに含んで成りうる。例えば、ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端２９個の残基、およびＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端１６４個の残基を含んで成るキメラＭ２−１タンパク質は、以下の実施例によって示されているように、３位、１１位、１３位、１５位、１６位、１９位、および２５位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの置換アミノ酸残基をさらに含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、３位でのバリンからアルギニンへの置換（Ｖ３Ｒ）を含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、
１１位でグルタミンからアルギニンへの置換（Ｑ１１Ｒ）を含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、１５位でセリンからロイシンへの置換（Ｓ１５Ｌ）を含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、１６位でアルギニンからアスパラギンへの置換（Ｒ１６Ｎ）を含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、１９位でアスパラギンからアルギニンへの置換（Ｎ１９Ｒ）を含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｓ１５ＬおよびＲ１６Ｎを含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｑ１１ＲおよびＦ１３Ｈを含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｆ１３Ｈ、およびＮ１９Ｒを含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｖ３Ｒ、Ｓ１５Ｌ、およびＲ１６Ｎを含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｓ１５Ｌ、およびＲ１６Ｎを含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｓ１５Ｌ、Ｒ１６Ｎ、およびＮ１９Ｒを含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｆ１３Ｈ、Ｓ１５Ｌ、およびＲ１６Ｎを含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、アミノ酸置換Ｑ１１Ｒ、Ｆ１３Ｈ、Ｓ１５Ｌ、Ｒ１６Ｎ、およびＮ１９Ｒを含んで成りうる。
【００８９】
組換えＲＳＶは、ＲＳＶの任意の種、亜群および／または株を含んで成りうる。好ましい実施形態においては、組換えＲＳＶは、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る。
【００９０】
核酸は本発明の別の特徴を提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有する組換え呼吸器合胞体ウイルスをコードし、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成るキメラＭ２−１タンパク質を含んで成る核酸を提供する。核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、またはＲＮＡでありうる。核酸は、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムでありうる。ベクター（例えば、プラスミド）は核酸を含んで成りうる。
【００９１】
上述したキメラＭ２−１タンパク質は、本発明の別の特徴を提供する。キメラＭ２−１タンパク質をコードする核酸は、本発明のさらに別の特徴を提供する。上記の変形物は、これらの核酸にも適用され、したがって、核酸はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡであり、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムであり、かつ／またはベクター（例えば、プラスミド）を含んで成りうる。
【００９２】
本発明は、弱毒化組換えＲＳＶを含んで成るワクチンも提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有し、かつＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成るキメラＭ２−１タンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスの免疫学的に有効量を含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチンを提供する。ワクチンは、場合により、生理学的に許容できるキャリアおよび／またはアジュバントを含んで成る。
【００９３】
他の実施形態においては、本発明は、個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応をひき起こすための方法を提供する。これらの方法は、個人に組換え呼吸器合胞体ウイルスを投与するステップを含んで成り、このウイルスは弱毒化表現型を有し、生理学的に許容できるキャリアで、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成るキメラＭ２−１タンパク質を含んで成る。好ましい実施形態においては、免疫反応は防御免疫反応である。ワクチンは１つもしくはそれ以上の用量で投与され、防御の所望レベルを達成しうる。組換えＲＳＶは、好ましくは個人の上気道（例えば、鼻咽頭）に投与され、かつ好ましくはスプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される。
【００９４】
本発明の１つの態様は、変化した活性を有するＭ２−１タンパク質を同定する方法を提
供する。これらの方法においては、１つもしくはそれ以上のキメラＭ２−１タンパク質が提供される。各キメラＭ２−１タンパク質は、ウイルスの第１の株からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびウイルスの第２の株からのＭ２−１タンパク質からの複数の残基を含んで成る。変化した活性を有する少なくとも１つの候補キメラＭ２−１タンパク質が同定される。
【００９５】
ウイルスの第１の株および第２の株は、ＲＳＶの異なる株でありうる（例えば、亜群Ａの１つの株、および亜群Ｂの１つの株）。あるいは、ウイルスの第１の株および第２の株は、ウイルスの異なる種でありる（例えば、第１の株はＲＳＶであり、かつ第２の株は肺炎ウイルスまたはメタニューモウイルスでありる）。例えば、キメラＭ２−１タンパク質の少なくとも１つは、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成りうる。キメラＭ２−１タンパク質は、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域（半分）からの複数の残基、およびＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域（半分）からの複数の残基を含んで成りうる。あるいは、キメラＭ２−１タンパク質は、ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端領域（半分）からの複数の残基、およびＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＣ末端領域（半分）からの複数の残基を含んで成りうる。
【００９６】
変化した活性を有する少なくとも１つの候補キメラＭ２−１タンパク質は、例えば、Ｍ２−１依存伸長性を評価することによって（例えば、ミニゲノムアッセイにおいて）評価することによって、候補キメラＭ２−１タンパク質によって（例えば、ゲルシフトアッセイにおいて）ＲＮＡ結合を評価することによって、かつ／または候補キメラＭ２−１タンパク質によって（例えば、共免疫沈降法によって）ヌクレオプロテイン結合を評価することによって、同定されている。Ｍ２−１タンパク質の活性は、増加、または、通常、減少しうる。
【００９７】
この方法は、弱毒化組換えＲＳＶを含む組換えＲＳＶの製造をもたらしうる。したがって、そのゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも１つの候補キメラＭ２−１タンパク質をコードする少なくとも１つの組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が製造されうる。組換えＲＳＶの複製を評価し、減少したレベルの複製、例えば、その複製が、例えば、キメラＭ２−１タンパク質が導入されるＲＳＶの野生型の自然循環する株および／またはＲＳＶ株と比べ、少なくとも１０分の１またはさらに少なくとも１００分の１減少している組換えＲＳＶ有する少なくとも１つの組換えＲＳＶを同定することができる。複製は、例えば、ウイルスのピーク力価を測定することによって評価されうる。複製は、培養細胞において、動物において（例えば、上および／または下気道において）、および／またはヒトにおいて（例えば、上および／または下気道において）評価されうる。適切な動物モデルとしては、齧歯類（例えば、マウス、コトンラット）、または霊長類（例えば、アフリカミドリザル、チンパンジー）が挙げられる。感染宿主（例えば、ヒトまたは動物）のＲＳＶのレベル（例えば、鼻咽頭および／または肺における）を測定するための方法は文献において周知である。例えば、鼻咽頭分泌物の吸引または洗浄によって検体が得られ、ウイルスは検査法によって組織培養またはその他で定量化される。例えば、ベルシェ（Ｂｅｌｓｈｅ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １：１５７−１６２（１９７７年）、フリーデワルト（Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．２０４：６９０−６９４（１９６８年）、ガールプア（Ｇｈａｒｐｕｒｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．３：４１４−４２１（１９６９年）、およびライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、Ａｒｃｈ．Ｇｅｓ．Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ．４１：２３８−２４７（１９７３年）を参照。
【００９８】
１つもしくはそれ以上の突然変異を候補キメラＭ２−１タンパク質の少なくとも１つへ導入し、かつ少なくとも１つの変異候補キメラＭ２−１タンパク質を同定することができ、ここで変化した活性はさらに変化する（通常、候補キメラＭ２−１タンパク質によって
示される活性の減少は、変異候補キメラＭ２−１タンパク質でさらに減少する）。そのゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも１つの変異候補キメラＭ２−１タンパク質をコードする少なくとも１つの組換え呼吸器合胞体ウイルスが製造され、その複製が記載されたとおり評価されうる。
【００９９】
必要に応じて、変異候補キメラＭ２−１タンパク質の活性に影響を及ぼす突然変異をＲＳＶ  Ｍ２−１（例えば、非キメラＭ２−１）へ導入することができる。したがって、これらの方法は、少なくとも１つのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質へ１つもしくはそれ以上の突然変異を導入するステップと、変化した活性を有する少なくとも１つの候補変異ＲＳＶＭ２−１タンパク質を同定するステップとをさらに含んで成りうる。そのゲノムまたはアンチゲノムが少なくとも１つの候補変異ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質をコードする少なくとも１つの組換え呼吸器合胞体ウイルスが製造され、その複製が記載されたとおり評価されうる。
【０１００】
本明細書に記載されたＲＳＶ  Ｍ２−１およびＰタンパク質における任意の突然変異（例えば、アミノ酸置換または欠失）は場合により、ＲＳＶにおける他の突然変異（例えば、ウイルスタンパク質における非コード配列を変化させる突然変異、アミノ酸置換、挿入、または欠失などの突然変異等）と結合され、結果として、例えば、弱毒化の所望の程度を有すると同時に防御免疫反応を誘発する能力を保持する弱毒化ＲＳＶがもたらされうる。
【０１０１】
この点で、ＲＳＶリンタンパク質（Ｐ）およびＭ２−１ならびにＭ２−２タンパク質の特定の位置を参照すると、それぞれの位置はＲＳＶ株Ａ２のＰ、Ｍ２−１、およびＭ２−２タンパク質におけるように番号付けされる。他の種、株および／または亜群のＰ、Ｍ２−１および／またはＭ２−２タンパク質は、例えば、１つもしくはそれ以上のアミノ酸欠失および／または挿入を含有し、それらが株Ａ２タンパク質と同じ数の残基を有さないようにしうる。そのような場合には、他のウイルスＰ、Ｍ２−１、またはＭ２−２の関連位置をＲＳＶ  Ａ２  Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２とのアラインメントによって測定されうる。アラインメントは、当技術分野で周知の手段、例えば、目視検査（一般に、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、下記を参照）、または配列比較アルゴリズム（例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）とウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）の局所相同性アルゴリズム、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）とブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）とリップマン（Ｌｉｐｍａｎ）と同様の方法の検査、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８年）、アルチュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）らによって記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０年）、または、ウィスコンシン  ジェネティクス  ソフトウェア  パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）、ジェネティクス  コンピュータ  グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．（ウィスコンシン州、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、または国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により一般に入手可能なＢＬＡＳＴなどこれらアルゴリズムのコンピュータによる実行によって測定されうる）。
【０１０２】
Ｍ２−２タンパク質における機能的突然変異
Ｍ２−２タンパク質は、ウイルスライフサイクルにおけるＲＳＶ  ＲＮＡ複製および転写の調節に関係している（ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７４：７４−
８２、およびバーミンガム（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ）とコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）（１９９９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９６：１１２５９−１１２６４）。ＲＳＶからのＭ２−２  ＯＲＦの欠失は、ＨＥｐ−２細胞におけるウイルス複製に影響を及ぼすが、ベロ細胞において影響を及ぼさない（ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７４：７４−８２）。Ｍ２−２欠失ＲＳＶは動物においても弱毒化されており、ＲＳＶ  Ｍ２−２欠失ウイルスがワクチン候補であることを示す（ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ７４：７４−８２、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（２００１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２８３：５９−６８、およびジン（Ｊｉｎ）ら（２００３年）ＶａｃｃｉｎｅＩ２１：３６４７−３６５２）。Ｍ２−２タンパク質は、Ｍ２遺伝子によってコードされ、その読み取り枠は上流のＭ２−１  ＯＲＦと重複する。
【０１０３】
本発明は、Ｍ２−２機能を減少させる（以下の実施例５に記載されているようにミニゲノムアッセイにおいて）アミノ酸欠失、挿入および／または置換を有するＲＳＶ  Ｍ２−２変異体（分離タンパク質および組換えウイルス）を提供する。かかるＭ２−２機能の減少は、生きた弱毒化ワクチンの製造において望ましい弱毒化ウイルス表現型に対応しうる。
【０１０４】
本発明の１つの態様は、弱毒化表現型を示し、かつ変異Ｍ２−２タンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。本発明の別の態様は、かかる組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化ＲＳＶワクチンを提供する。組換えＭ２−２タンパク質、およびかかる組換えＭ２−２タンパク質および／または組換えウイルスをコードするおよび核酸も本発明の特徴である。
【０１０５】
したがって、実施形態の１つの一般的なクラスは、弱毒化表現型を有し、少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成るＭ２−２タンパク質を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルスを提供する。例えば、Ｍ２−２タンパク質は、少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、少なくとも１つのアミノ酸残基の挿入、および／または少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成りうる。
【０１０６】
実施形態の１つのクラスにおいては、Ｍ２−２タンパク質は、１位、３位、および７位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成る。実施形態の１つのクラスにおいては、Ｍ２−２タンパク質はアミノ酸残基１−２の欠失を含んで成る（例えば、Ｍ２−２  ｍＲＮＡにおける第１の、かつ場合により第３のＡＵＧが、翻訳の開始が第２のＡＵＧで強いられるように変異されている場合）。実施形態の別のクラスにおいては、Ｍ２−２タンパク質はアミノ酸残基１−６の欠失を含んで成る（例えば、Ｍ２−２  ｍＲＮＡにおける第１および第２のＡＵＧが、翻訳の開始が第３のＡＵＧで強いられるように変異されている場合）。
【０１０７】
実施形態の同様のクラスにおいては、Ｍ２−２タンパク質は、Ｎ末端６個のアミノ酸残基の欠失、Ｎ末端８個のアミノ酸残基の欠失、Ｎ末端１０個のアミノ酸残基の欠失、Ｃ末端１個のアミノ酸残基の欠失、Ｃ末端２個のアミノ酸残基の欠失、Ｃ末端４個のアミノ酸残基の欠失、Ｃ末端８個のアミノ酸残基の欠失、およびＣ末端１８個のアミノ酸残基の欠失より成る群から選択される欠失含んで成る。Ｍ２−２タンパク質は、場合により、かかるＮおよびＣ末端欠失の組合せを含んで成る。
【０１０８】
実施形態の１つのクラスにおいては、Ｍ２−２タンパク質は、２位、４位、５位、６位、１１位、１２位、１５位、２５位、２７位、３４位、４７位、５６位、５８位、６６位、７５位、８０位、および／または８１位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る。例えば、Ｍ２−２タンパク質は、Ｔ２Ａ、Ｐ４Ａ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｋ、Ｄ１１Ａ、Ｋ１２Ａ、Ｃ１５Ａ、Ｒ２５Ａ、Ｒ
２７Ａ、Ｋ３４Ａ、Ｈ４７Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｈ５８Ａ、Ｄ６６Ａ、Ｈ７５Ａ、Ｅ８０Ａ、およびＤ８１Ａよりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成りうる。
【０１０９】
組換えＲＳＶは、ＲＳＶの任意の種、亜群および／または株を含んで成りうる。好ましい実施形態においては、組換えＲＳＶは、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る。
【０１１０】
核酸は本発明の別の特徴を提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有する組換え呼吸器合胞体ウイルスをコードし、少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るＭ２−２タンパク質を含んで成る核酸を提供する。核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、またはＲＮＡでありうる。核酸は、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムでありうる。ベクター（例えば、プラスミド）は核酸を含んで成りうる。
【０１１１】
本発明の別の態様は、人為的に変異させたＭ２−２タンパク質（例えば、上述したもの）を提供する。さらに別の態様は、人為的に変異させたＭ２−２タンパク質をコードする核酸を提供する。上記の変形物は、これらの核酸にも適用され、したがって、核酸はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡであり、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムであり、かつ／またはベクター（例えば、プラスミド）を含んで成りうる。
【０１１２】
本発明は、弱毒化組換えＲＳＶを含んで成るワクチンをも提供する。実施形態の１つのクラスは、弱毒化表現型を有する免疫学的に有効量の組換え呼吸器合胞体ウイルスを含んで成り、かつ少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るＭ２−２タンパク質を含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチンを提供する。ワクチンは、場合により、生理学的に許容できるキャリアおよび／またはアジュバントをさらに含んで成る。
【０１１３】
他の実施形態においては、本発明は、個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応をひき起こすための方法を提供する。これらの方法は、個人に組換え呼吸器合胞体ウイルスを投与するステップを含んで成り、このウイルスは弱毒化表現型を有し、生理学的に許容できるキャリアで少なくとも１つの変異アミノ酸残基を含んで成るＭ２−２タンパク質を含んで成る。好ましい実施形態においては、免疫反応は防御免疫反応である。ワクチンは１つもしくはそれ以上の用量で投与され、防御の所望レベルを達成しうる。組換えＲＳＶは、好ましくは個人の上気道（例えば、鼻咽頭）に投与され、かつ好ましくはスプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される。
【０１１４】
中和抗体の検出
亜群ＡおよびＢからのＲＳＶ感染に対する血清抗ＲＳＶ中和抗体の測定は、レシピエントにおけるＲＳＶワクチン候補の効果の評価、およびＲＳＶ血清疫学研究にきわめて有用である（ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）ら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ１８：１７６３−１７７２）。
【０１１５】
ＲＳＶ中和抗体の検出のためのいくつかの方法が記載されている。これらの方法は、抗体の連続希釈によるウイルスの前処理の後、細胞単層の感染を必要とする。抗体によるウイルス中和後に残留ＲＳＶ感染力を検出するために使用されている方法として挙げられるのは、削減細胞病理学（ビーラー（Ｂｅｅｌｅｒ）とヴァン・ファイク・ケリング（ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ）（１９８９年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２９４１−２９５０）、プラーク数の削減（コーツ（Ｃｏａｔｅｓ）ら（１９６６年）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８３：２９９−３１３）、または削減ＲＳＶ抗原発現（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら（１９８５年）Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２：１０５０−１０５２）である。上記の方法は各々、ＲＳＶ中和抗体を十分に検出しうるが、これらア
ッセイの大部分は手間がかかり、かつ／または読み出しが主観的である。かかるアッセイは、多数の試料の迅速なスクリーニングおよび直接の定量化に適していない。
【０１１６】
本発明は、ｒＡ２およびｒＡ２−ＧＢＦＢキメラにおけるｌａｃＺ遺伝子挿入を含有する組換えＲＳＶ、および亜群Ａまたは亜群Ｂ  ＲＳＶに対する抗ＲＳＶ中和抗体を定量化する迅速マイクロ中和アッセイにおけるその使用を提供する。本発明の方法および組成物では、Ａ２  ＧおよびＦ抗原の代わりにＲＳＶ亜群Ｂ９３２０株のＧおよびＦ抗原をコードする組換えＲＳＶ、ｒＡ２、およびキメラＲＳＶ（ｒＡ２−ＧＢＦＢ）の発現のための以前に記載された逆遺伝学を利用する（（国際公開第０２／４４３３４号パンフレット）、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（２００１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２８３：５９−６８）。
【０１１７】
要するに、ＲＳＶ亜群ＡまたはＢのいずれかに由来するＧおよびＦ抗原を発現する組換えＲＳＶへｌａｃＺを挿入することができる。ＭＶＡ−Ｔ７に感染し、Ｎ、Ｐ、およびＬを発現するＨＥｐ−２細胞など宿主細胞は、ｌａｃＺ（例えば、それぞれＡ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺ）を組込む組換えＲＳＶ  ｃＤＮＡでトランスフェクションされる。インキュベーション後、ウイルスは回収され、新しい宿主細胞、例えば、ベロ細胞において増幅される。β−ガラクトシダーゼは、例えば、ウエスタンブロット法によって、または酵素活性の比色検出によって、Ａ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺのいずれかに感染した細胞において容易に検出可能である。β−ガラクトシダーゼ酵素活性はウイルス複製を反映し、かつ、したがって、これを用いて血清抗ＲＳＶ中和抗体によって中和後にウイルス感染力を測定することができる。
【０１１８】
マイクロ中和は通常、マルチウェルプレートフォーマット、例えば、９６穴プレートで実行される。例えば、加熱不活性化血清または血漿（５６℃、３０分）が、２％血清、例えば、プレートフォーマットに適切な量でのモルモット補体の有無によりＯｐｔｉＭＥＭ／２％ＦＢＳを含有する培地で連続希釈（２倍）され、Ａ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺが各ウェルに添加され、インキュベートされる。約５０，０００個のベロ細胞がウェルに添加され、プレートはウイルス複製に適切な条件下にインキュベートされる。約２〜５日間、例えば３日間のインキュベーション期間後、上清が除去され、細胞は等張性緩衝液、例えば、ＰＢＳで洗浄される。細胞は溶解緩衝液でインキュベートされ、β−ガラクトシダーゼの酵素活性が当技術分野で周知の方法によって測定される。例えば、β−ガラクトシダーゼ活性は好ましくは発色基質、クロロフェノールレッドＰ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲＧ）を用いて検出される。
【０１１９】
このマイクロ中和アッセイは迅速であり（標準のプラーク減少アッセイの６日と比べて３日）、面倒でなく、多くの試料の種々のハイスループットアッセイシステム（例えば、ハイスループットロボットアッセイシステム）およびスクリーニングまたは試験を用いる自動化に適している。このマイクロ中和システムは、ｌａｃＺまたは別の適切なマーカーを組込む適切な組換えウイルスコンストラクトを置換することによってパラミクソウイルス科の他のウイルスの中和抗体のアッセイに容易に適合されうる。
【０１２０】
顕著な異型中和抗体は本発明のマイクロ中和アッセイによって検出されるが、高い中和抗体価は通常、異種ＧおよびＦタンパク質ではなく相同ＧおよびＦタンパク質を含有するウイルスで検出される。したがって、本発明のマイクロ中和アッセイを用いて、ＲＳＶのＧおよびＦタンパク質によって主に寄与されるＲＳＶ株間の抗原性変形物を区別することができる。
【０１２１】
ＲＳＶのＧおよびＦタンパク質に対する抗体は通常、インビボで持続的であるが、内在性タンパク質に対する抗体は持続期間がはるかに短い。（コナーズ（Ｃｏｎｎｏｒｓ）ら（１９９１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１６３４−１６３７、スコット（Ｓｔｏｔｔ）ら
（１９８７年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３８５５−３８６１）。マイクロ中和アッセイによるヒト血清におけるＧおよびＦタンパク質に対する持続的抗体の検出は、例えば、ＲＳＶ感染の血清疫学的調査のためにこのアッセイを適切なものにしている。
【０１２２】
本発明の１つの態様は、抗体価を測定する（例えば、中和抗体を定量化する）方法を提供する。これらの方法においては、パラミクソウイルス科の組換えウイルス、および１つもしくはそれ以上の抗体を含有する試料が細胞の存在下に接触され、ここでウイルスが複製しうる。（抗体によって中和されないウイルスは、したがって、細胞に感染する。）ウイルスの複製が可能となる。組換えウイルスのゲノムまたはアンチゲノムはマーカーを含んで成り、かつマーカー（例えば、マーカーの存在および／または発現）はウイルス複製後に検出される。
【０１２３】
実施形態の１つのクラスにおいては、組換えウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を含んで成る。好ましい実施形態においては、呼吸器合胞体ウイルスは、亜群Ａ（例えば、Ａ−ｌａｃＺ）、亜群Ｂのヒト呼吸器合胞体ウイルス、またはそのキメラ（例えば、Ｇ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質より成る群から選択される１つもしくはそれ以上のタンパク質が、亜群Ｂ、例えば、Ｂ−ｌａｃＺのヒトＲＳＶの１つもしくはそれ以上の相同タンパク質によって置換される亜群ＡのヒトＲＳＶ）。
【０１２４】
実施形態の別のクラスにおいては、組換えウイルスは、パラミクソウイルス科の別のウイルスを含んで成る。例えば、組換えウイルスは、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、または牛疫ウイルスを含んで成る。
【０１２５】
１つもしくはそれ以上の抗体を含んで成る試料は、実質的にすべての起源に由来し、かつ／または実質的に当技術分野で公知の手段によって調製または製造されうる。例えば、実施形態の１つのクラスにおいては、１つもしくはそれ以上の抗体を含んで成る試料は血清（例えば、末梢血由来血清）、気管支洗浄、または鼻洗浄（例えば、血清の連続希釈液、洗浄、または洗浄液）を含んで成る。
【０１２６】
ウイルス、抗体を含んで成る試料、および細胞は、種々の順序で結合されうる。通常、細胞の存在下に組換えウイルスおよび試料を接触させるステップは、ウイルスおよび試料を結合し、次いで結合ウイルスおよび試料を細胞と結合するステップを含んで成る。一部の実施形態においては、ウイルスおよび試料は、１つもしくはそれ以上の補体因子（例えば、補体成分Ｃ１−Ｃ９）の存在下に接触される。当業者であれば、補体の添加が結果として再現可能かつ適度な抗体価が生じるかどうかを実験的に測定することができる（例えば、中和抗体を定量化するために現在許容されている他の方法の結果と一致する力価）。例えば、補体の添加により、ＲＳＶ  Ａ−ｌａｃＺを用いたアッセイにおいて適度の抗体価が得られるが、補体の添加はＲＳＶ  Ｂ−ｌａｃＺを殺し、または阻害するように思われ、したがってＢ−ｌａｃＺを用いたアッセイにおいては適度な抗体価は得られることがない。
【０１２７】
マーカーは実質的にすべての便利なマーカーを含んで成りうる。例えば、マーカーは、光学的に検出可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸）、選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）、またはそれ自体検出可能であるマーカー核酸の１つもしくはそれ以上を含んで成りうる。既述したように、マーカーを検出するス
テップは、マーカーの存在を検出ステップ、および／またはその発現を検出するステップを含んで成りうる。一部の実施形態においては、マーカーの発現が定量化される（例えば、核酸マーカーによってコードされるタンパク質マーカーのレベルが定量化されうる）。必要または希望に応じて、細胞は洗浄されうるとともに、マーカーの発現を検出する前に溶解されうる。
【０１２８】
これらの方法に関係した組成物、組換えウイルス、および核酸は、発明の追加の特徴を提供する。したがって、実施形態の１つの一般的なクラスは、１つもしくはそれ以上の抗体、およびそのゲノムまたはアンチゲノムがマーカーを含んで成るパラミクソウイルス科の組換えウイルスを含んで成る組成物を提供する。組換えウイルスは、呼吸器合胞体ウイルス、例えば、亜群Ａ（例えば、Ａ−ｌａｃＺ）、亜群Ｂのヒト呼吸器合胞体ウイルス、またはそのキメラ（例えば、Ｇ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質より成る群から選択される１つもしくはそれ以上のタンパク質が、亜群Ｂ、例えば、Ｂ−ｌａｃＺのヒトＲＳＶの１つもしくはそれ以上の相同タンパク質によって置換される亜群ＡのヒトＲＳＶ）を含んで成りうる。あるいは、組換えウイルスは、パラミクソウイルス科の別のウイルス、例えば、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、または牛疫ウイルスを含んで成りうる。
【０１２９】
マーカーは実質的にすべての便利なマーカーを含んで成りうる。例えば、マーカーは、光学的に検出可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸）、または選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）の１つもしくはそれ以上を含んで成りうる。
【０１３０】
組成物は、ウイルスが複製しうる細胞および／または１つもしくはそれ以上の補体因子（例えば、補体成分Ｃ１−Ｃ９の１つもしくはそれ以上の）をさらに含んで成りうる。
【０１３１】
実施形態の別のクラスは、ゲノムまたはアンチゲノムを含んで成りうる組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を提供する。ゲノムまたはアンチゲノムはマーカーを含んで成るが、そのマーカーは、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、または選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）の１つもしくはそれ以上を含んで成りうる。一部の実施形態においては、組換えＲＳＶは、亜群Ａ（例えば、Ａ−ｌａｃＺ）、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラ（例えば、Ｇ糖タンパク質およびＦ糖タンパク質より成る群から選択される１つもしくはそれ以上のタンパク質が、亜群Ｂ、例えば、Ｂ−ｌａｃＺのヒトＲＳＶの１つもしくはそれ以上の相同タンパク質によって置換される亜群ＡのヒトＲＳＶ）を含んで成る。
【０１３２】
実施形態の関連クラスは、そのゲノムまたはアンチゲノムがマーカーを含んで成る組換えＲＳＶをコードする核酸を提供するが、そのマーカーは、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、または選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）の１つもしくはそれ以上を含んで成りうる。核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、またはＲＮＡでありうる。核酸は、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムでありうる。ベクター（例えば
、プラスミド）は核酸を含んで成りうる。
【０１３３】
実施形態の別のクラスは、パラミクソウイルス科の組換えウイルスを提供する。組換えウイルスは、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、またはイヌジステンパーウイルスを含んで成る。ウイルスは、例えば、光学的に検出可能なマーカータンパク質をコードする核酸（例えば、ベータガラクトシダーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、緑色蛍光タンパク質をコードするマーカー核酸、ルシフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸、またはクロラムフェニコールトランスフェラーゼタンパク質をコードするマーカー核酸）、または選択可能なマーカータンパク質をコードするマーカー核酸（例えば、抗生物質に細胞抵抗を与える遺伝子、例えば、ネオマイシンに抵抗を与える遺伝子）の１つもしくはそれ以上のマーカーを含んで成るゲノムまたはアンチゲノムを含んで成る。
【０１３４】
実施形態の関連クラスは、パラミクソウイルス科の組換えウイルスをコードする核酸を含んで成り、ここで組換えウイルスは、メタニューモウイルス、センダイウイルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、またはイヌジステンパーウイルスを含んで成り、かつマーカーを含んで成るゲノムまたはアンチゲノムを含んで成る。核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）、またはＲＮＡでありうる。核酸は、ＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムでありうる。ベクター（例えば、プラスミド）は核酸を含んで成りうる。
【０１３５】
キット
本発明のＲＳＶベクターおよびベクターシステムの使用を促進するために、ベクターのいずれか、例えば、キメラＲＳＶウイルスベクター、ポリヌクレオチドをコードするｌａｃＺを組込むＲＳＶベクター、変異体ＲＳＶポリペプチドプラスミド、ＲＳＶポリペプチドライブラリープラスミド等、および、緩衝液、細胞、培養培地など、組換えＲＳＶを製造するために有用な追加の要素をキットの形でパッケージングすることができる。通常、キットは、上記の要素に加えて、例えば、本発明の方法を実行するための使用説明書、包装材、および容器を含みうる追加の材料を含有する。
【０１３６】
また、本発明のマイクロ中和アッセイを用いる中和抗体を検出するためのキットが本発明の特徴である。通常、かかるキットはパラミクソウイルス科の１つもしくはそれ以上の組換えウイルス（例えば、１つもしくはそれ以上の組換えＲＳＶコンストラクト、例えば、Ａ−ｌａｃＺ、Ｂ−ｌａｃＺ、ｒＡ２、またはｒＡ２−ＧＢＦＢ）を含み、かつ場合により、β−ガラクトシダーゼの比色または蛍光発生基質などのアッセイ基質、対照血清、緩衝液、細胞、培養培地などの追加の要素を含有する。さらに、キットは通常、使用説明書、包装材、容器等の材料を含有する。
【０１３７】
パラミクソウイルス科
マイナスセンスゲノムのエンベロープ一本鎖ＲＮＡを含有するウイルス科は、非セグメントゲノム有する群（例えば、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科）またはセグメントゲノムを有する群（例えば、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科）に分類される。パラミクソウイルス科のウイルスは、２つの亜科およびいくつかの遺伝子に分類されている（例えば、ウイルス分類学国際委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ）のユニバーサルウイルスデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＣＴＶｄｂ）に記載）。パラミクソウイルスの亜科として挙げられるのは、レスピオウイルス属（例えば、センダイウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ヒトパラインフルエンザウイルス１および３、シミアンウイルス１０）、ルブラウイルス属（例えば、ムンプスウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス２および４、マプエラウイルス、ブタル
ブラウイルス、ラピエダミコアカンメキシコ（Ｌａ−Ｐｉｅｄａｄ−Ｍｉｃｈｏａｃａｎ−Ｍｅｘｉｃｏ）ウイルス、シミアンパラインフルエンザウイルス５）、麻疹ウイルス属（例えば、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、クジラ麻疹ウイルス、エドモンストンウイルス、小反芻獣疫ウイルス、牛疫ウイルス）、ヘニパウイルス属（例えば、ヘンドラウイルス、ニパウイルス）、アブラ（Ａｖｕｌａ）ウイルス属（ニューカッスル病ウイルス、鳥類パラインフルエンザウイルス１−９）、および「ＴＰＭＶ様ウイルス」属（例えば、ツパイ（Ｔｕｐａｉａ）ウイルス）である。肺炎ウイルス亜科として挙げられるのは、肺炎ウイルス属（例えば、マウス肺炎ウイルス、ウシＲＳＶ、ヒトＲＳＶ（例えば、亜群Ａ２、Ｂ１、Ｓ２））、およびメタニューモウイルス属（例えば、七面鳥鼻気管炎ウイルスウイルス）である。この科には、フェルドランスウイルスおよびナリバウイルスも含まれる。
【０１３８】
負鎖ＲＮＡウイルスは、遺伝子操作され、組換え逆遺伝子学法を用いて回収されうる（パレーゼ（Ｐａｌｅｓｅ）らへの米国特許第５，１６６，０５７号明細書）。この方法は当初、インフルエンザウイルスゲノムを操作するために適用された（ルーチェス（Ｌｕｙｔｊｅｓ）ら、１９８９年、Ｃｅｌｌ  ５９：１１０７−１１１３、エナミ（Ｅｎａｍｉ）ら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１５６３−１１５６７）が、広範囲なセグメントおよび非セグメント負鎖ＲＮＡウイルス、例えば、狂犬病（シュネル（Ｓｃｈｎｅｌｌ）ら、１９９４年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−４２０３）、ＶＳＶ（ローソン（Ｌａｗｓｏｎ）ら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４４７７−４４８１）、麻疹ウイルス（ラデック（Ｒａｄｅｃｋｅ）ら、１９９５年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４）、牛疫ウイルス（バロン（Ｂａｒｏｎ）とバレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）、１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ホフマンとバネルジー（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｂａｎｅｒｊｅｅ）、１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３２７２−３２７７、ドゥビン（Ｄｕｂｉｎ）ら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２）、ＳＶ５（ホー（Ｈｅ）ら、１９９７年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３７：２４９−２６０）、イヌジステンパーウイルス（ガセン（Ｇａｓｓｅｎ）ら、２０００年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１０７３７−４４）、およびセンダイウイルス（パーク（Ｐａｒｋ）ら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：５５３７−５５４１、カトウ（Ｋａｔｏ）ら、１９９６年、Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ
１：５６９−５７９）に有効に適用されている。ＲＳＶの救出は、例えば、コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９６６３−９６６７、ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４、およびジン（Ｊｉｎ）によって、「組換えＲＳＶウイルス発現システムおよびワクチン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＲＳＶ  ｖｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ）」と称される国際公開第０２／４４３３４号パンフレットに記載されており、手短に本明細書に記載されている（例えば、ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４−８２、ジン（Ｊｉｎ）ら（２０００年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７３：２１０−２１８、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（２００１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８３：５９−６８、およびタン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５も参照）。宿主細胞成分からの増殖、分離の方法、および／またはパラミクソウイルス科のウイルスのさらなる精製は当業者には周知である。
【０１３９】
細胞培養
通常、組換えウイルス（例えば、組換えＲＳＶ）の増殖は、宿主細胞が一般的に培養される培地組成物中で行われる。ＲＳＶの複製に適した宿主細胞としては、例えば、ベロ細胞、ＨＥｐ−２細胞が挙げられる。通常、細胞は標準の市販培養培地、例えば、血清（例えば、１０％ウシ胎仔血清）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ）、または中性緩衝ｐＨ（例えば、ｐＨ７．０〜７．２）を維持するために適した管理湿度およびＣＯ２濃度の下、血清非含有培地で培養されている。場合により、培地は抗生物質を含有し、細菌増殖を防ぐ抗生物質、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等、および／または追加の栄養素、例えば、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、好ましい増殖特性を促進するための追加の補給剤、例えば、トリプシン、β−メルカプトエタノールなどを含有する。  
【０１４０】
培養における哺乳動物細胞を維持するための手順は広範囲に報告されており、当業者には公知である。一般的なプロトコールは、例えば、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（１９８３年）の動物細胞の培養：基本技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、アラン
Ｒ．リス（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、ポール（Ｐａｕｌ）（１９７５年）細胞と組織培養（Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）、第５版、リビングストン（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）、エジンバラ、アダムス（Ａｄａｍｓ）（１９８０年）生化学者のための生化学および分子生物学細胞培養における実験室技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ）、ワークとバードン（Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ）（編）エルセビル（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、アムステルダム、に示されている。また、本発明に適合されるかかる手順における変形物は、ルーチンの実験により容易に決定される。
【０１４１】
ＲＳＶの製造のための細胞は、血清含有または血清非含有培地において培養されうる。場合によっては、例えば、精製ウイルスの調製のために、血清非含有条件下に宿主細胞を増殖させることが望ましい。細胞は、小規模、例えば、２５ｍｌ培地未満の培養管もしくはフラスコ、または大きなフラスコ中で攪拌しながら、回転ビン中で、またはフラスコ、ビン、または反応器培養におけるマイクロキャリアビーズ（例えば、ドルマセル（Ｄｏｒｍａｃｅｌｌ）（ファイファーとランゲン（Ｐｆｅｉｆｅｒ  ＆  Ｌａｎｇｅｎ））などＤＥＡＥデキストランマイクロキャリアビーズ、スーパービード（Ｓｕｐｅｒｂｅａｄ）、（フローラボラトリーズ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、ヒレックス（Ｈｉｌｌｅｘ）（ソロヒル（ＳｏｌｏＨｉｌｌ）、アナーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ））などのスチレンコポリマー−トリ−メチルアミンビーズ）上で培養されうる。マイクロキャリアビーズは、小球（直径１００〜２００ミクロン）であり、これは細胞培養増殖の体積当たりの接着細胞に対する大きな表面積を提供する。例えば、１リットル培地は２０００万以上のマイクロキャリアビーズを含み、８０００平方センチメートル超の増殖面を提供しうる。ウイルスの商業生産のために、例えば、ワクチン製造のためには、しばしば、細胞を生物反応器または発酵槽で培養することが望ましい。生物反応器は、１リットル未満から１００リットル超の体積で入手可能であり、例えば、Ｃｙｔｏ３生物反応器（オスモニクス（Ｏｓｍｏｎｉｃｓ）、ミネソタ州（ＭＮ）、ミネトンカ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ））、ＮＢＳ生物反応器（ニュー  ブルンスウッィク  サイエンティフィク（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ニュージャージー州（ＮＪ）、エジソン）であり、Ｂ．ブラウン  バイオテク  インターナショナル（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ドイツ、メルズンゲン（Ｍｅｌｓｉｎｇｅｎ）））製の実験室規模および商業規模の生物反応器である。
【０１４２】
細胞分離および培養（例えば、例えば、その後の核酸分離のためなどの組換え核酸を含有する細菌細胞）のための他の有用な文献として挙げられるのは、フレッシュニー（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ）（１９９４年）の動物細胞の培養：基本技術マニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第３版、ワイリー・リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）（ニューヨーク）および本明細書の引例、ペイン（Ｐａｙｎｅ）ら（１９９２年）液体システムにおける植物細胞
および組織培養（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ
Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）社（ニューヨーク州（ＮＹ）、ニューヨーク）、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）とフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）（編）（１９９５年）植物細胞、組織および器官培養（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ）、フンダメンタル  メソーズ  シュプリンガー  ラボ  マニュアル（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ）、シュピリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）（ベルリン  ハイデルベルク  ニューヨーク）、およびアトラスとパークス（Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ）（編）微生物培地ハンドブック（Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ）（１９９３年）ＣＲＣプレス（Ｐｒｅｓｓ）（フロリダ州（ＦＬ）、ボーカラトーン（Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ））である。
【０１４３】
ベクターの宿主細胞への導入
ベクター、例えば、ＲＳＶポリヌクレオチドを組込むベクターが、例えば、リン酸カルシウム共沈法、電気穿孔法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、およびポリアミントランスフェクション試薬を使用するトランスフェクションを含む異種核酸を真核細胞へ導入するための当技術分野で周知の方法に従って宿主細胞へ導入される（例えば、トランスフェクションされる）。例えば、ベクター、例えば、プラスミドを宿主細胞、例えば、ベロ細胞またはＨｅｐ−２細胞へ、トランスフェクション試薬リポフェクトＡＣＥまたはリポフェクタミン２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して、メーカーの使用説明書に従いトランスフェクションすることができる。あるいは、電気穿孔法を使用して、ＲＳＶゲノムセグメントを組込むベクターを宿主細胞へ導入することができる。  
【０１４４】
モデルシステム
弱毒化ＲＳＶ、例えば、本明細書に記載されているものは、インビトロおよびインビボモデルで試験し、十分な弱毒化、遺伝子安定性、および／またはワクチン使用のための免疫原性を確認することができる。インビトロアッセイ、例えば、培養細胞における複製において、ウイルスは、例えば、遺伝子安定性、ウイルス複製の温度感受性および／または小プラーク表現型について試験されうる。ＲＳＶはさらに、感染の動物モデルで試験されうる。種々の動物モデル、例えば、霊長類（例えば、チンパンジー、アフリカミドリザル）および齧歯類（例えば、コトンラット）が当技術分野で公知であり、本明細書で手短に、かつ「弱毒化呼吸器合胞体ウイルス組成物（Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｒｅｓｐｉｒｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」と称するマーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）らへの米国特許第５，９２２，３２６号明細書（１９９９年７月１３日）、米国特許第４，８００，０７８号明細書、マイグニエル（Ｍｅｉｇｎｉｅｒ）ら編、呼吸器合胞体ウイルス感染の動物モデル（Ａｎｉｍａｌ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、メリュー基金刊行物（Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、（１９９１年）、プリンス（Ｐｒｉｎｃｅ）ら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３：１９３−２０６（１９８５年）、リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．３：９１−１００（１９７８年）、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．、３７：３９７−４００（１９８２年）、およびクロー（Ｃｒｏｗｅ）ら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：１３９５−１４０４（１９９３年）において記載されている。
【０１４５】
ワクチンの予防投与のための方法および組成物
通常、ワクチンにおいて使用される本発明の弱毒化組換えＲＳＶは、感染の症状、または少なくとも重度の感染の症状が、弱毒化ＲＳＶで免疫化（または感染）した大部分の個人において起こらないように十分に弱毒化されている。ウイルス成分（例えば、本明細書
での核酸またはタンパク質）がワクチンとしてまたはワクチンの免疫原性成分として使用される実施形態においては、重度の感染は一般的に問題ではない。場合によっては、弱毒化ＲＳＶ（または本発明のＲＳＶ成分）は、依然として軽度の疾患（例えば、軽度上気道疾患）の症状をひき起こすこと、および／またはワクチン接種されていない個人への播種が可能である。しかし、毒性は十分に無効にされており、重度の下気道感染がワクチン接種された、または偶発的宿主においては一般的に起こらないようになっている。
【０１４６】
例えば、キメラＲＳＶおよび／または本発明のＲＳＶ成分を含む組換えＲＳＶは、適切なキャリアまたは賦形剤で予防的に投与され、例えば、ＲＳＶの１つもしくはそれ以上の株に対して特異的である免疫反応を刺激することができる。通常、キャリアまたは賦形剤は、滅菌水、食塩水溶液、緩衝食塩水溶液、デキストロース水溶液、グリセロール水溶液、エタノール、またはその組合せなど薬学的に許容できるキャリアまたは賦形剤である。滅菌性、ｐＨ、等張性、および安定性を保証するかかる溶液の調製は、当技術分野で確立されたプロトコールに従って行われる。一般に、キャリアまたは賦形剤は、アレルギーおよび他の望ましくない作用を最小限にし、かつ特定の投与経路、例えば、皮下、筋内、鼻内、経口、局所等に適応させるように選択される。結果として得られる水溶液は、例えば、そのまま使用のために、または凍結乾燥してパッケージングされ、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水溶液と結合されている。
【０１４７】
一般に、本発明のＲＳＶまたはＲＳＶ成分は、ＲＳＶの１つもしくはそれ以上の株に特異的な免疫反応を刺激するのに十分な量で投与される（例えば、免疫学的に有効量のＲＳＶまたはＲＳＶ成分が投与される）。好ましくは、ＲＳＶまたはＲＳＶ成分の投与は防御免疫反応を誘発する。ＲＳＶに対する防御免疫反応を誘発するように調節可能な防御抗ウイルス免疫反応を誘発するための投与量および方法は、当業者には公知である。例えば、米国特許第５，９２２，３２６号明細書、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ：３７：３９７−４００（１９８２年）、キム（Ｋｉｍ）ら、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ５２：５６−６３（１９７３年）、およびライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．８８：９３１−９３６（１９７６年）を参照。例えば、ウイルスは用量当たり約１０３−１０６ｐｆｕ（プラーク形成単位）で投与される（例えば、用量当たり１０４−１０５ｐｆｕで投与される）。通常、用量は、例えば、年齢、健康状態、体重、性別、食事、投与の様式および時間、および他の臨床的要因にもとづき調整される。予防ワクチン製剤は、例えば、針および注射器、または針なし注射デバイスを用いて皮下または筋内注射によって全身投与されうる。好ましくは、ワクチン製剤は、たとえば液滴、エアロゾル（例えば、大粒子エアロゾル（約１０ミクロン超））、または上気道へのスプレーによって鼻内に投与される。送達の上記経路のいずれかにより防御全身免疫反応が生じるが、鼻内投与はウイルス侵入部位での粘膜免疫を誘発する追加の利点を与える。鼻内投与のためには、弱毒化生ウイルスワクチン、例えば、弱毒化低温適合および／または温度感受性組換えＲＳＶ、例えば、キメラ組換えＲＳＶがしばしば好まれる。本明細書に記載されたＲＳＶ成分も使用されうる。
【０１４８】
１回投与による防御免疫反応の刺激が好ましいが、同一または異なる経路によって追加の用量が投与され、所望の予防効果を達成することができる。新生児および乳児においては、例えば、十分な免疫レベルを誘発するには複数の投与が必要でありうる。投与は、必要に応じて野生型ＲＳＶ感染に対する防御の十分なレベルを維持するために幼児期の全体を通じて間隔をおいて継続することができる。同様に、例えば、医療従事者、デイケア従事者、幼児の家族、高齢者、障害のある心肺機能を有する個人等など反復または重度のＲＳＶ感染に特に影響されやすい成人は、複数の予防接種により防御反応を確立および／または維持する必要がある。誘発される免疫のレベルは、例えば、分泌物および血清抗体を中和する量を測定することによってモニタリングし、投与量を調節し、または必要に応じて予防接種を反復し、防御の所望レベルを維持することができる。
【０１４９】
あるいは、免疫反応は、ウイルスで樹状細胞をエキソビボまたはインビボターゲティングによって刺激されうる。例えば、増殖性樹状細胞が、樹状細胞によってＲＳＶ抗原の捕捉を可能にする十分な量および十分な期間ウイルスに暴露される。次いで、細胞は標準の静脈内移植法によって予防接種される対象に移される。
【０１５０】
場合により、ＲＳＶの予防投与のための製剤は、ＲＳＶ抗原に対する免疫反応を強化するための１つもしくはそれ以上のアジュバントも含有する。適切なアジュバントとして挙げられるのは、例えば、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル、界面活性物質、例えば、リゾレシチン、Ｐｕｌｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、原油または炭化水素エマルジョン、カルメットゲラン菌（ＢＣＧ）、コリネバクテリウムパルブム、および合成アジュバントＱＳ−２１である。
【０１５１】
必要に応じて、ＲＳＶの予防ワクチン投与は、１つもしくはそれ以上の免疫刺激分子の投与といっしょに実行されうる。免疫刺激分子として挙げられるのは、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３）などの免疫刺激、免疫増強、およびプロ炎症活性を有する種々のサイトカイン、リホカイン、およびケモカイン、成長因子（例えば、顆粒球−マクロファージ（ＧＭ）−コロニー刺激因子（ＣＳＦ））、およびマクロファージ炎症性因子、Ｆｌｔ３リガンド、Ｂ７．１、Ｂ７．２等など他の免疫刺激性分子である。免疫刺激性分子は、ＲＳＶと同じ製剤で投与され、または別々に投与されうる。タンパク質をコードするタンパク質または発現ベクターのいずれかを投与し、免疫刺激性効果をひき起こすことができる。
【０１５２】
特定の亜群の特定の株の弱毒化ＲＳＶによる個人のワクチン接種は、異なる株および／または亜群のＲＳＶに対する交差防御を誘発しうるが、交差防御は、必要に応じて、例えば、その各々が異なる亜群を示す少なくとも２つの株からの弱毒化ＲＳＶで個人を予防接種することで強化されうる。同様に、本発明の弱毒化ＲＳＶワクチンは、場合により、他の感染物質に対する防御免疫反応を誘発するワクチンと結合されうる。
【０１５３】
ウイルス核酸の製造
本発明に照らして、ウイルス（例えば、ＲＳＶ）核酸および／またはタンパク質は、周知の分子生物学法に従って操作される。増幅、クローニング、突然変異誘発、形質転換などを含むかかる手順の多数の詳細なプロトコールは、例えば、オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、分子生物学における最新のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（２００３年補完）ジョン  ワイリー  アンド  サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（「オーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）」）、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング−実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）、第１−３巻、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド  スプリング  ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、２００１年（「サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）」）、およびベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）とキメル（Ｋｉｍｍｅｌ）分子クローニング法ガイド、酵素学における方法（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）第１５２巻、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）社（カリフォルニア州（ＣＡ）、サンディエゴ）（「ベルガー（Ｂｅｒｇｅｒ）」）に記載されている。
【０１５４】
上記の文献に加えて、例えば、本発明のｃＤＮＡポリヌクレオチドを増幅するために有
用なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑｔｉ−レプリカーゼ増幅、および他のＲＮＡポリメラーゼを介した方法（例えば、ＮＡＳＢＡ）などのインビトロ増幅法のプロトコールが、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）ら（１９８７年）米国特許第４，６８３，２０２号明細書、ＰＣＲプロトコールＡ方法と応用のガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（イニシ（Ｉｎｎｉｓ）ら編）アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）社（カリフォルニア州（ＣＡ）、サンディエゴ）（１９９０年）（「イニス（Ｉｎｎｉｓ）」）、アルンハイム（Ａｒｎｈｅｉｍ）とレビンソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ）（１９９０年）Ｃ＆ＥＮ  ３６、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１年）３：８１、コー（Ｋｗｏｈ）ら（１９８９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８６、１１７３、グアッテリ（Ｇｕａｔｅｌｌｉ）ら（１９９０年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８７：１８７４、ロメル（Ｌｏｍｅｌｌ）ら（１９８９年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ３５：１８２６、ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７、バン  ブルント（Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ）（１９９０年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２９１、ウー（Ｗｕ）とウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）（１９８９年）Ｇｅｎｅ４：５６０、バリンジャー（Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ）ら（１９９０年）Ｇｅｎｅ８９：１１７、およびソックナナンとマレック（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ  ａｎｄ  Ｍａｌｅｋ）（１９９５年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：５６３、において見出される。本発明に照らして核酸のクローニングのために有用な追加の方法としては、ウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、米国特許第５，４２６，０３９号明細書が挙げられる。ＰＣＲによる大きな核酸を増幅する改善された方法は、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６９：６８４および本明細書での文献に要約されている。
【０１５５】
本発明の一部のポリヌクレオチド、例えば、オリゴヌクレオチドは、モノヌクレオチドおよび／またはトリヌクレオチドベースのホスホラミダイト結合化学を含む種々の固相法を利用して合成されうる。例えば、核酸配列は、活性化モノマーおよび／またはトリマーを連続添加し、ポリヌクレオチド鎖を延長させることによって合成されうる。例えば、カルターズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）Ｍ．Ｈ．ら（１９９２年）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２１１：３、を参照。
【０１５６】
所望の配列を合成する代わりに、実質的にすべての核酸が、ザ  ミッドランド  セルティファイド  リエージェント  カンパニー（Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ）、ザ  グレート  アメリカン  ジーン  カンパニー（Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ）、エクスプレスジーン（ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ）社（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ）、およびオペロン  テクノロジーズ（Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（ｗｗｗ．ｏｐｅｏｎ．ｃｏｍ）など種々の商業的供給源のいずれかから特別注文されうる。
【０１５７】
また、ウイルスポリペプチドにおける選択されたアミノ酸残基の置換は、例えば、特定部位突然変異誘発によって達成されうる。例えば、所望の表現型特性、例えば、弱毒化表現型、低温適合、温度感受性と機能的に相関したアミノ酸置換を有するウイルスポリペプチドは、特異的突然変異をポリペプチドをコードするウイルス核酸セグメント（例えば、ｃＤＮＡ）へ導入することによって製造されうる。特定部位突然変異誘発の方法は当技術分野で周知であり、例えば、オーズベル、サムブルック、およびベルガー、上記において記載されている。特定部位突然変異誘発を実行するための多数のキットは、例えば、カメレオン特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラ  ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ））が市販されており、メーカーの使用説明書に従って使用し、例えば、ＲＳＶポリヌクレオチドへ１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基を指定する１つ
もしくはそれ以上のヌクレオチド置換を導入することができる。
【０１５８】
種々のタイプの突然変異誘発が場合により本発明において使用され、例えば、核酸を修飾し、ポリペプチドおよび／またはウイルスをコードし、保存性または非保存性変異体を製造する（例えば、アミノ酸置換、挿入、または欠失をＲＳＶ  Ｐ、Ｍ２−１および／またはＭ２−２タンパク質を導入する）。利用可能なすべての突然変異誘発手順を使用することができる。かかる突然変異誘発手順は、場合により、問題の１つもしくはそれ以上の活性のために変異体核酸およびポリペプチドの選択を含む。使用される手順としては、特定部位点変異誘発、無作為点突然変異誘発、インビトロまたはインビボ相同組換え（ＤＮＡシャッフリング）、テンプレートを含有するウラシルを用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発、チオリン酸修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップド二本鎖ＤＮＡを用いる突然変異誘発、点ミスマッチ修復、修復不全宿主株を用いる突然変異誘発、制限選択および制限精製、欠失突然変異誘発、全遺伝子合成による突然変異誘発、二重鎖切断修復、および当業者に公知の他の多くのものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、キメラコンストラクトを含む突然変異誘発も本発明に含まれている。１つの実施形態においては、突然変異誘発が、自然発生の分子、もしくは変化または変異した自然発生分子、例えば、配列、配列比較、物理特性、結晶構造などの公知の情報によって誘導されうる。実施形態の別のクラスにおいては、変更は実質的に無作為である（例えば、伝統的なＤＮＡシャッフリングにおけるように）。
【０１５９】
これら手順の一部は、本明細書でサムブルックおよびオーズベルにおいて記載されている。これらの手順の追加情報は、以下の刊行物およびその引例において見出される。すなわち、アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）、異例の環境のためのタンパク質工学（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５（１９９３年）、バス（Ｂａｓｓ）ら、新しいＤＮＡ結合特異性による変異体Ｔｒｐレプレッサ（Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８年）、ボートシュタイン（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ）とショルトレ（Ｓｈｏｒｔｌｅ）、インビトロ突然変異誘発の方法と応用（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５年）、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｍ１３ベクターを用いる改善されたオリゴヌクレオチドを用いた特定部位突然変異誘発（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：４４３１−４４４３（１９８５年）、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）、部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ２３７：１−７（１９８６年）、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）、Ｍ１３ベクターを用いる改善されたオリゴヌクレオチドを用いた特定部位突然変異誘発（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３８２−４０３（１９８７年）、ダレ（Ｄａｌｅ）ら、ホスホロチオン酸法を用いるオリゴヌクレオチドを用いた無作為突然変異誘発（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ５７：３６９−３７４（１９９６年）、エグデダルツァデー（Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅ）とヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、大きな欠失を生成するオリゴヌクレオチドの使用（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：５１１５（１９８６年）、フリッツ（Ｆｒｉｔｚ）ら、突然変異のオリゴヌクレオチドを用いたコンス
トラクト：インビトロの酵素反応なしのギャップド二本鎖ＤＮＡ法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．  １６：６９８７−６９９９（１９８８年）、グルンドストレーム（Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｅｍ）ら、マイクロスケール「ショットガン」遺伝子合成によるオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ‘ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．  １３：３３０５−３３１６（１９８５年）、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発の有効性（Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（エックシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）Ｆ．およびリレイ（Ｌｉｌｌｅｙ）、Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、シュプリンガー  フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、ベルリン））（１９８７年）、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、表現型選択なしの迅速かつ有効な特定部位突然変異誘発（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５年）、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら、表現型選択なしの迅速かつ有効な特定部位突然変異誘発（Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４、３６７−３８２（１９８７年）、クレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、オリゴヌクレオチドを用いた突然変異構成のギャップド二本鎖ＤＮＡ法（Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：９４４１−９４５６（１９８４年）、クレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）とフリッツ（Ｆｒｉｔｚ）ギャップド二本鎖ＤＮＡによる突然変異のオリゴヌクレオチドを用いた構成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３５０−３６７（１９８７年）、クレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、点ミスマッチ修復（Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ）、Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４年）、クレーマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、変異のオリゴヌクレオチドを用いた構成のギャップド二本鎖ＤＮＡ法における改善された酵素インビトロ反応（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：７２０７（１９８８年）、リング（Ｌｉｎｇ）ら、ＤＮＡ突然変異誘発の方法：概要（Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ）、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５４（２）：１５７−１７８（１９９７年）、ロリマー（Ｌｏｒｉｍｅｒ）とパスタン（Ｐａｓｔａｎ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３、３０６７−８（１９９５年）、マンデキ（Ｍａｎｄｅｃｋｉ）、大腸菌のプラスミドにおけるオリゴヌクレオチドを用いた二重鎖切断修復：特定部位突然変異誘発の方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｘｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１７７−７１８１（１９８６年）、ナカマエ（Ｎａｋａｍａｙｅ）とエクシュタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、制限エンドヌクレアーゼＮｃｉＩ開裂ホスホロチオン酸基の阻害およびそのオリ
ゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発への応用（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：９６７９−９６９８、（１９８６年）ナンビアール（Ｎａｍｂｉａｒ）ら、リボヌクレアーゼＳタンパク質をコードする遺伝子の全合成およびクローニング（Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｂｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２３：１２９９−１３０１（１９８４年）、サカマー（Ｓａｋａｍａｒ）とコラーナ（Ｋｈｏｒａｎａ）、ウシ桿状体細胞外節グアニンヌクレオチド結合タンパク質（トランスデューシン）のａ−サブユニットの遺伝子の全合成および発現（Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ
ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ））、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．
１４：６３６１−６３７２（１９８８年）、セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ）ら、ホスホロチオン酸ベースのオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発におけるＹ−Ｔエキソヌクレアーゼ（Ｙ−Ｔ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：７９１−８０２（１９８８年）、セイヤーズ（Ｓａｙｅｒｓ）ら、臭化エチジウムの存在下に制限エンドヌクレアーゼとの反応によるホスホロチオン酸含有ＤＮＡのストランド特異的開裂（Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、（１９８８年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４、シーバー（Ｓｉｅｂｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９：４５６−４６０（２００１年）、スミス（Ｓｍｉｔｈ）、インビトロ突然変異誘発（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．  １９：４２３−４６２（１９８５年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００：４６８−５００（１９８３年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７年）、ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０、３８９−９１（１９９４年）、テーラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、傷ついたＤＮＡを調製する制限酵素反応におけるホスホロチオン酸修飾ＤＮＡの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：８７４９−８７６４（１９８５年）、テーラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、ホスホロチオン酸修飾ＤＮＡを用いる高頻度でのオリゴヌクレオチドを用いた突然変異の迅速な生成（Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ＤＮＡ）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：８７６５−８７８７（１９８５年）、ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら、スブチリシンの転位状態を安定化する水素結合形成の重要性（Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ  ３１７：４１５−４２３（１９８６年）、ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら、カセット突然変異誘発：明確な部位での多重突然変異の生成のための有効な方法（Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  
ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ）、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５年）、ゾラー（Ｚｏｌｌｅｒ）とスミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｍ１３由来ベクターを用いるオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発：ＤＮＡフラグメントにおける点突然変異の産生のための有効かつ一般的な手順（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：６４８７−６５００（１９８２年）、ゾラーとスミス（Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ）、Ｍ１３ベクターへクローン化したＤＮＡフラグメントのオリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏｎｅｄ
ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００：４６８−５００（１９８３年）、およびゾラーとスミス（Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ）、オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発：２つのオリゴヌクレオチドプライマーおよび一本鎖ＤＮＡテンプレートを用いる簡単な方法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３２９−３５０（１９８７年）。上記の方法の多くに関する追加の詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５４巻で確認されうるが、種々の突然変異誘発法のトラブルシューティングにための有用な管理についても記載されている。
【０１６０】
配列変形物
サイレント変形物
遺伝子コードの縮退により、本発明のポリペプチドおよび／またはウイルスをコードする核酸配列の変形物のいずれかが場合により生じ、その一部は図におけるＲＳＶ核酸およびポリペプチド配列と同一の配列の低いレベルを有しうる。以下は、多くの生物学および生物化学の教科書に見られる遺伝子コードを特定する
典型的なコドン表を示す。
【０１６１】
【表１】
2007531491.tif 000002
【０１６２】
このコドン表は、多くのアミノ酸が２個以上のコドンによってコードされることを示している。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、およびＣＧＵはすべてアミノ酸アルギニンをコードする。したがって、アルギニンがコドンによって特定され
ている本発明の核酸におけるすべて位置で、コドンはコードポリぺプチドを変化させることなく上記の対応するコドンのいずれかに変化しうる。ＲＮＡ配列におけるＵはＤＮＡ配列におけるＴに対応することが理解される。
【０１６３】
例としては、ＲＳＶ  Ａ２リンタンパク質（ＥＥＭ）の残基１７５−１７７に対応する核酸配列は、ＧＡＡＧＡＡＡＴＧである。この配列のサイレント変形物は、ＧＡＧＧＡＧＡＴＧを（コードＥＥＭも）含む。
【０１６４】
かかる「サイレント変形物」は、以下で論じられる「保存性に修飾された変形物」の１つの種である。当業者であれば、核酸における各コドン（通常、メチオニンのための唯一のコドンであるＡＴＧを除く）が、標準の方法によって修飾され、機能的に同一のポリペプチドをコードしうることを理解するであろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変形物は、記載された配列に潜在している。したがって、本発明は、可能なコドン選択に基づく組合せを選択することによってなされうる本発明のポリペプチドをコードする核酸配列の各々およびすべての可能な変形物を明白に提供する。これらの組合せは、本発明のＲＳＶポリペプチドをコードする核酸配列に適用される標準のトリプレット遺伝コード（例えば、表１に記載され、または当技術分野で通常利用可能）に従い行われる。本明細書のすべての核酸のかかる変形物すべては、遺伝コードと組合わせた配列を考慮することによって具体的に示され、記載されている。当業者であれば、本明細書の方法を用いることによってこれらサイレント置換を完全に行うことができる。
【０１６５】
保存性変形物
特定の核酸配列またはポリペプチドの「保存性修飾変形物」、または、単に「保存性変形物」は、同一または実質的に同一のアミノ酸配列をコードするものである。当業者であれば、コード配列における単一のアミノ酸または少数のアミノ酸（一般的には、５％未満、より一般的には４％、２％、または１％未満）を変化させ、追加し、または消去する個々の置換、欠失または追加が「保存性に修飾された変形物」であり、変化の結果としてアミノ酸の欠失、アミノ酸の追加、またはアミノ酸の置換が化学的に同様のアミノ酸とともに生じることを理解するであろう。
【０１６６】
機能的に同様のアミノ酸を示す保存性置換表は当技術分野で周知である。表２には互いに「保存性置換」であるアミノ酸を含有する６つの基が記載されている。
【０１６７】
【表２】
2007531491.tif 000003
【０１６８】
したがって、本発明のポリペプチド配列の「保存性置換変形物」は、同じ保存性置換基の保存性に選択されたアミノ酸とともに、ポリペプチド配列のアミノ酸の一般的には５％未満、より一般的には２％または１％未満の少数の置換を含む。
【０１６９】
例えば、図２ＡにおけるＲＳＶ株Ａ２  Ｍ２−１ポリペプチドの保存性置換変形物は、上記定義された６個の基に従って、全長ポリペプチドで約１０個のまでの残基（すなわち、アミノ酸の約５％）で「保存性置換」を含有することになる。
【０１７０】
別の例では、保存性置換が、ＲＳＶ  Ａ２Ｐ（ＩＧＬＲＥＥ、配列番号：８０）のアミ
ノ酸１７１−１７６に対応する領域に位置していた場合は、この領域の保存性置換の例は、ＩＧＬＲＥＥについてＶＧＩＫＤＤ（配列番号：８１）もしくはＩＧＶＫＤＥ（配列番号：８２）（または表２に従ってなされうるその他）の保存性置換を含む。本明細書のタンパク質配列のリストは、上記の置換表と併せて、すべての保存性置換タンパク質の明確なリストを示す。
【０１７１】
最後に、非機能的配列の追加または欠失など、核酸分子のコード活性を変化させることがない配列の追加または欠失は、基礎核酸またはポリペプチドの保存性変形物である。
【０１７２】
当業者であれば、開示されている核酸コンストラクトの多くの保存性変形物が機能的に同一のコンストラクトを生じることを理解するであろう。例えば、上述されているように、遺伝コードの縮退のため、「サイレント置換」（すなわち、コードポリペプチドにおける変化をもたらすことがない核酸配列の置換）は、アミノ酸をコードするすべての核酸配列の暗黙の特徴である。同様に、アミノ酸配列における１個もしくは数個のアミノ酸における「保存性アミノ酸置換」は、きわめて類似した特性を有するアミノ酸が異なる置換であり、開示されたコンストラクトときわめて類似していると容易に確認もされる。各々開示され、または請求されたウイルス、核酸、またはタンパク質のかかる保存性変形物は、本発明の特徴である。
【０１７３】
ハイブリダイゼーションによる核酸の規定
本発明の核酸は、場合により、ハイブリダイゼーションによって同定されうる。すなわち、本発明の核酸は、人為的に変異させた第３の親核酸にハイブリダイゼーションし、第２の核酸を生じる少なくとも５倍の親和性とともに厳しい条件下に、本発明の人為的に変異させた、またはキメラＰ、Ｍ２−１、またはＭ２−２タンパク質（またはその補体）をコードする第２の核酸を選択的にハイブリダイズする第１の核酸を含みうる。
【０１７４】
「選択的にハイブリダイズする」または「選択的ハイブリダイゼーション」は、厳しいハイブリダイゼーション条件下、その非標的核酸配列へのハイブリダイゼーションよりも検出可能に大きな程度に核酸配列を特定の核酸標的配列へのハイブリダイゼーションを含む。選択的にハイブリダイズする配列は、配列同一性が少なくとも５０％、または６０％または７０％または８０％または９０％またはそれ以上、例えば、好ましくは、配列同一性が９５％、かつ最も好ましくは、互いに配列同一性（すなわち、相補性）が９８−１００％である。
【０１７５】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイフォーマットに照らして、「厳しいハイブリダイゼーション」条件、または「厳しい条件」は、配列依存であり、異なる環境パラメータ下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲なガイドが、チセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）（１９９３年）生化学および分子生物学における実験室技術−−核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ）第１部、第２章「ハイブリダイゼーションの原理の概要および核酸プローブアッセイの方法（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙｓ）」エルゼビア（ニューヨーク）に見られる。一般に、明確なイオン強度およびｐＨで特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いきわめて厳しい条件が選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする（明確なイオン強度およびｐＨ下での）温度である。きわめて厳しい条件は、本発明の特定の核酸のＴｍ点と等しくなるように選択される。厳しいハイブリダイゼーション条件は配列依存であり、異なる環境下では異なる。長い配列は、特に高温でハイブリダイズする。
【０１７６】
サザンまたはノーザンブロットにおけるフィルタで１００個超の相補性残基を有する相補性核酸のハイブリダイゼーションの厳しいハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃のヘパリン１ｍｇとの５０％ホルマリンであり、ハイブリダイゼーションは一夜に実行される。きわめて厳しい洗浄条件の例は、約１５分間、７２℃の０．１５Ｍ  ＮａＣｌである。厳しい洗浄条件の例は、１５分間、６５℃の０．２ｘＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明について、上記のサムブルックを参照）。しばしば、高厳重洗浄に先立って低厳重洗浄が行われ、バックグラウンドのプローブシグナルを除去する。例えば、１００個超のヌクレオチドの二本鎖に対する中間の厳重洗浄の例は、１５分間、４５℃での１ｘＳＳＣである。例えば、１００個超のヌクレオチドの二本鎖に対する低厳重洗浄の例は、１５分間、４０℃での４−６ｘＳＳＣである。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおける対照プローブで確認されたものの２倍（もしくはそれ以上、例えば５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍もしくはそれ以上）の信号対雑音比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。例えば、対照プローブは、上述された第３の親核酸でありうる。厳しい条件下に互いにハイブリダイズすることがない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合は、依然として実質的に同一である。これが起こるのは、例えば、核酸のコピーが、遺伝コードによって許される最大コドン縮退を用いる場合である。
【０１７７】
したがって、本発明のＲＳＶ（例えば、人為的に変異させた、および／またはキメラＰ、Ｍ２−１、および／またはＭ２−２タンパク質を含んで成る弱毒化ＲＳＶ）をコードする核酸に、例えば、野性型ＲＳＶをコードする核酸にそれらがハイブリダイズする少なくとも５倍の親和性で厳しい条件下に選択的にハイブリダイズする核酸が、本発明の特徴である。同様に、本発明のポリペプチド（例えば、人為的に変異させた、またはキメラＰ、Ｍ２−１またはＭ２−２タンパク質、またはその一部分）をコードする核酸に、例えば、野性型Ｐ、Ｍ２−１またはＭ２−２タンパク質をコードする核酸にそれらがハイブリダイズする少なくとも５倍の親和性で厳しい条件下で選択的にハイブリダイズする核酸も、本発明の特徴である。
【０１７８】
免疫反応性によるタンパク質の特徴づけ
本発明のポリペプチドは種々の新しいポリペプチド配列を提供するため、ポリペプチドも、例えば、免疫学的アッセイにおいて認識されうる新しい構造的特徴を提供する。本発明のポリペプチドを特異的に結合する抗血清の生成、およびかかる抗血清によって結合されるポリペプチドは、本発明の特徴である。
【０１７９】
したがって、本発明のタンパク質は、免疫反応性によって同定もされうるが、例えば、本発明のタンパク質は、本発明の人為的に変異させた（またはキメラ）Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２を特異的に結合するが、変化し、人為的に変異させた（またはキメラ）Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２タンパク質を生じた親Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２タンパク質を結合することがない抗体によって特異的に結合されるアミノ酸配列またはサブ配列を含みうる。
【０１８０】
抗体を製造し、イムノアッセイを行うなどの方法は、当技術分野で周知である。例えば、ハロー（Ｈａｒｌｏｗ）とレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  パブリケーションズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（ニューヨーク）を参照。
【０１８１】
１つの典型的なフォーマットにおいては、イムノアッセイでは、本発明の人為的に変異させた、および／またはキメラＰ、Ｍ２−１、および／またはＭ２−２タンパク質、また
はその実質的なサブ配列（すなわち、本発明の全長Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２タンパク質の１つの少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％もしくはそれ以上）の１つもしくはそれ以上に対応する１つもしくはそれ以上のポリペプチドに対して生じたポリクローナル抗血清が使用される。本発明のＰ、Ｍ２−１、またはＭ２−２タンパク質の１つもしくはそれ以上に由来する潜在的なポリペプチド免疫原のフルセットは集合的に以下では「免疫原性ポリペプチド」と呼ばれる。結果として得られる抗血清は、場合により、対照野生型Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドおよび／または他の既知の変異またはキメラＰ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドに対する低い交差反応を有するように選択され、かかる交差反応は、イムノアッセイにおいてポリクローナル抗血清の使用前に、対照Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドの１つもしくはそれ以上による免疫吸収によって除去される。
【０１８２】
イムノアッセイにおいて使用する抗血清を製造するためには、免疫原性ポリペプチドの１つもしくはそれ以上が、本明細書に記載されているように製造され、精製される。例えば、組換えタンパク質は哺乳動物細胞株で製造されうる。マウスの近交系（マウスの実質的な遺伝的同一性により結果がより再現性であるためこのアッセイで使用される）は、フロイントのアジュバントなど標準のアジュバント、および標準のマウス免疫化プロトコールと組合わせて免疫原性ポリペプチドで免疫される（特異的免疫活性を測定するために使用されうる抗体生成、イムノアッセイフォーマット、および条件の標準の説明については、ハローとレーン（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ）（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド  スプリング  ハーバー  パブリケーションズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）（ニューヨーク）を参照）。あるいは、本明細書で開示された配列由来の１つもしくはそれ以上の合成または組換えポリペプチドが、キャリアタンパク質に結合され、免疫原として使用される。
【０１８３】
ポリクローナル血清は、イムノアッセイ、例えば、固相イムノアッセイにおいて、固体担体で固定された免疫原性ポリペプチドに１つもしくはそれ以上で免疫原性ポリペプチドに対して収集され、滴定される。力価が１０６以上のポリクローナル抗血清が選択され、プールされ、対照Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドで除去され、除去されたプール力価ポリクローナル抗血清を生じうる。
【０１８４】
除去されたポール力価ポリクローナル抗血清は、対照Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドに対する交差反応について試験される。好ましくは、免疫原性Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドの少なくとも２つがこの測定において、好ましくは、対照Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドの少なくとも２つとともに使用され、免疫原性ポリペプチドによって特異的に結合される抗体を同定する。
【０１８５】
この比較アッセイにおいては、対照Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドへの結合と比べ、免疫原性Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドへの力価ポリクローナル抗血清の結合に対して結果として少なくとも約５−１０倍の高さの信号対雑音比をもたらす除去された力価ポリクローナル抗血清の差別的結合条件が決定される。すなわち、結合反応の厳重さは、アルブミンまたは脱脂乳など非特異的競合物質の添加、または塩分条件、温度などを調整することによって調整される。これらの結合条件は、試験ポリペプチドがプールされた除去ポリクローナル抗血清によって特異的に結合されるかどうか判定するその後のアッセイで使用される。具体的には、差別的結合条件下の対照ポリペプチドより少なくとも２−５倍高い信号雑音比、かつ免疫原性ポリペプチドと比べ約１／２の信号雑音比を示す試験ポリペプチドは、対照ポリペプチドと比べ免疫原性ポリペプチドとの実質的な構造的類似性または相同性を共有し、したがって、これは本発明のポリペプチドである。
【０１８６】
別の例においては、競合的結合フォーマットにおけるイムノアッセイが試験ポリペプチドの検出のために使用される。例えば、上述したように、交差反応抗体は、対照Ｐ、Ｍ２−１、またはＭ２−２ポリペプチドによる免疫吸収によってプールされた抗血清混合物から除去される。次いで、免疫原性ポリペプチドは除去されたプール抗血清へ暴露される固体担体に固定される。試験タンパク質はアッセイに添加され、プールされた除去抗血清との結合を競う。固定タンパク質と比べプールされた除去抗血清への結合を競う試験タンパク質の能力は、アッセイに添加され結合を競う免疫原性ポリペプチドの能力と比較される（免疫原性ポリペプチドは固定免疫原性ポリペプチドと有効にプール抗血清への結合を競う）。試験タンパク質の交差反応率は、標準の計算を用いて計算される。
【０１８７】
平行アッセイにおいては、プールされた除去抗血清への結合を競う対照タンパク質の能力が、抗血清への結合を競う免疫原性ポリペプチドの能力と比較して測定される。また、対照ポリペプチドの交差反応率は、標準の計算を用いて計算される。交差反応率が試験ポリペプチドで少なくとも５−１０倍の高さである場合は、試験ポリペプチドはポールされた除去抗血清を特異的に結合すると言われ、したがって、これは本発明のポリペプチドである。
【０１８８】
一般に、免疫吸収されプールされた抗血清は、本明細書に記載された競合的結合イムノアッセイにおいて使用され、任意の試験ポリペプチドを免疫原性ポリペプチドと比較することができる。この比較を行うためには、２つのポリペプチドが各々広範囲の濃度で分析され、除去抗血清の固定タンパク質への結合の５０％を阻害するために必要とされる各ポリペプチドの量が標準の方法を用いて測定される。必要とされる試験ポリペプチドの量が、必要とされる免疫原性ポリペプチドの量の２倍よりも少ない場合は、試験ポリペプチドは、その量が対照ポリペプチドの少なくとも約５−１０倍の高さであるという条件で、免疫原性ポリペプチドに生成される抗体へ特異的に結合すると言われる。
【０１８９】
特異性の最後の測定として、プール抗血清は、場合により、免疫吸収において使用される免疫原性ポリペプチドへの結果として得られる免疫原性ポリペプチドの除去された抗血清の結合がほとんどまたはまったく検出可能でないまで、免疫原性ポリペプチド（対照ポリペプチドではなく）により完全に免疫吸収される。次いで、この完全に免疫吸収された抗血清は試験ポリペプチドとの反応性について試験される。反応性がほとんどまたはまったく確認されない（すなわち、免疫原性ポリペプチドへの完全に免疫吸収される抗血清の結合について２倍以下の信号雑音比が確認される）場合は、試験ポリペプチドは免疫原性タンパク質によって誘発される抗血清によって特異的に結合される。
【０１９０】
精製方法
本明細書で言及された他の文献に加えて、種々の精製／タンパク質精製方法が当技術分野で周知であるが、これらには例えば、Ｒ．スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、タンパク質精製（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、シュプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（１９８２年）、ドイチャー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻：タンパク質精製ガイド（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク（１９９０年）、サンダナ（Ｓａｎｄａｎａ）（１９９７年）タンパク質のバイオ分離（Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、アカデミック  プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）社、ボラグ（Ｂｏｌｌａｇ）ら（１９９６年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２版、ワイリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）（１９９６年）プロテインプロトコールハンドブック（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）フマナ  プレス（Ｈｕｍａｎａ
Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）とアンガル（Ａｎｇａｌ）（１９９０年）タンパク質精製応用：実際の方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）ＩＲＬプレス  アット  オックスフォード（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ）（英国、オックスフォード）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）とアンガル（Ａｎｇａｌ）タンパク質精製法：実際の方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＩＲＬプレス  アット  オックスフォード（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ）（英国、オックスフォード）、スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）（１９９３年）タンパク質精製：原理および実際第３版（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）シュプリンガー  フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク州（ＮＹ）、ジョンソン（Ｊａｎｓｏｎ）とライデン（Ｒｙｄｅｎ）（１９９８年）タンパク質精製：原理、高分解能法および応用、第２版（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）ワイリー−ＶＣＨ、ニューヨーク州（ＮＹ）、およびウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）（１９９８年）ＣＤ−ＲＯＭでのタンパク質プロトコール（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ）フマナ  プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、およびその引例が含まれる。
【実施例１】
【０１９１】
本明細書に記載された実施例および実施形態は、例示目的のみであり、それに照らして種々の改造または変更が当業者には示され、本出願の精神および範囲ならびに添付の請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることが理解される。したがって、以下の実施例は、請求された発明を例示するために示され、限定するものではない。
【０１９２】
実施例１：ＲＳＶのＭ２−１タンパク質にける機能的突然変異
ＲＳＶ  Ｍ２−１と対照的に、ＰＶＭ  Ｍ２−１は、転写伸長性の促進におけるきわめて低レベルの活性を有する。この違いの基礎を特徴づけるために、２つのキメラタンパク質を、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびマウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ）の配列をコードするＭ２−１タンパク質間で構成した。すなわち１）ＰＶＭからのＮ末端２９個のアミノ酸およびＲＳＶからの残りのＣ末端１６４個のアミノ酸を含むＰＲ（ＰＶ／ＲＳ）キメラ、および２）ＲＳＶからのＮ末端３０個のアミノ酸およびＰＶＭからの残りのＣ末端を含有するＲＰ（ＲＳ／ＰＶ）キメラである。転写活性は、ＲＳＶ  ｌａｃＺミニゲノムアッセイで分析された。また、突然変異誘発をＰＲ  Ｍ２−１キメラｃＤＮＡで行われ、ＰＶＭ残基をＲＳＶのそれに変更した。
【０１９３】
材料と方法
細胞とウイルス
ＨＥｐ−２細胞の単層を１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ中に維持した。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する修飾ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ＭＶＡ−Ｔ７をベルナルド  モス（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ）博士から入手し（スター（Ｓｕｔｔｅｒ）ら、１９９５年、Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ  ３７１：９−１２、およびワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら、１９９５年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１０：２０２−２０５）、ＣＥＫ細胞（ＳＰＡＦＡＳ）中で増殖させた。
【０１９４】
Ｍ２−１変異の構成
ｐＣＩＴＥ２ａベクター（ノバジーン（Ｎｏｖａｇｅｎ））におけるＴ７プロモーターの管理下にＮ、Ｐ、Ｌ、またはＭ２−１遺伝子をコードするタンパク質発現プラスミドは以前に記載された（タン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２
８−１１３３５、および国際公開第０２／４４３３４号パンフレットであり、これらはすべての目的のためにその全体が本明細書に組込まれる）。ＰＶＭ  Ｍ２−１遺伝子は、５’ＢｓｍＢＩ（ｇｃａｔｃｇｔｃｔｃｃｃａｔｇａｇｔｇｔｇａｇａｃｃｔｔｇｃ、配列番号：１）および３’ＢａｍＨＩ（ｃｔｃｇａｇｃｔｇｃａｇｇｇａｔｃｃｇ、配列番号：２）のプライマーを用いて、ＰＶＭ  Ｍ２−１ｃＤＮＡから増幅し（アーマジアン  イーストン（Ａｈｍａｄｉａｎ  Ｅａｓｔｏｎ）（１９９９年）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８０：２０１１−２０１６）、ｐＣＩＴＥ２ａのＮｃｏｌ部位へクローン化した。キメラＭ２−１プラスミドを構成するために、ｎｔ７６９３でのＲＳＶ  Ｍ２−１に存在するＭｓｃＩ制限酵素部位をクイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ）特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いてｐＰＶＭ−Ｍ２−１の対応する位置へ導入した。ＲＰ  Ｍ２−１は、ＭＳｃＩ部位を通じてＰＶＭ  Ｍ２−１のＣ末端１４８個のアミノ酸とＲＳＶ  Ｎ末端３０個のアミノ酸を融合することによって構成した。同様に、ＰＲ  Ｍ２−１は、ＰＶＭ  Ｍ２−１ＭＳｃ  ＩをＢａｍＨ  Ｉ制限フラグメントへＲＳＶのそれで置換することによって構成した。ＲＳＶまたはＰＶＭ  Ｍ２−１のＭ２−１タンパク質への突然変異の導入は、クイックチェンジ（Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ）特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって行った。
【０１９５】
ｐＲＳＶｌａｃＺミニゲノムは、Ｔ７プロモーターの管理下にマイナスセンスでβ−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードする。このｌａｃＺ遺伝子は、タン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５によって記載されているように、ＲＳＶリーダーおよびトレイラー配列によってフランキングされた。
【０１９６】
細胞のトランスフェクションおよび発現分析
ＨＥｐ−２細胞を、１．０のＭＯＩでＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＶＡ−Ｔ７）を発現する修飾ワクシニアウイルス（ＭＶＡ）に感染させ、種々の量（例えば、０．１μｇ）のＭ２−１発現プラスミドといっしょにｐＰ  ０．４μｇ、ｐＮ  ０．４μｇ、ｐＬ  ０．２μｇ、ｐＲＳＶｌａｃＺ  ０．４μｇでトランスフェクションした。トランスフェクションは、リポフェクトＡＣＥまたはリポフェクタミン２０００（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いて、メーカーのプロトコールに従って行った。トランスフェクションされた細胞を２日間３５℃でインキュベートし、０．５％ＮＰ−４０および２０ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含有する細胞透過化緩衝液中でインキュベートすることによって細胞抽出物を調製した。４℃で、５分間２，５００ｒｐｍでの遠心分離によって細胞溶解物を澄まし、タン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５によって記載されているとおり、５ｍＭクロロフェノールレッド−Ｄ−ガラクトピラノサイド（ＣＰＲＧ、ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を用いてβ−ガラクトシダーゼ活性を分析した。波長５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での光学密度の変化を、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ、ＳＯＦＴｍａｘソフトウェアを用いる３４００ＰＣマイクロプレート分光光度計（モレキュラー  デバイセス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））により測定した。アッセイでは、３．０のＯＤ５５０まで線形に反応性であることが示された。各変異体の相対活性は、ＲＳＶ  Ｍ２−１と比較して計算され、得られたデータは３つの実験の最小の平均であった。
【０１９７】
トランスフェクションされた細胞におけるｌａｃＺレポーターＲＮＡの合成をノーザンブロット法によって分析した。トランスフェクションの２日後、全細胞内ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ抽出キット（キアジーン（Ｑｉａｇｅｎｅ））によって抽出し、１％アガロース／尿素ゲル上で電気泳動した。ＲＮＡブロットをＤｉｇ標識マイナスセンスｌａｃＺまたはＭ２−１プローブでハイブリダイズした。ハイブリダイズしたＲＮＡを、エックス線フィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ））へ暴露後にＤｉｇ−ＲＮＡ検出キット（ロシュ  バイオ
ケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を用いて検出した。
【０１９８】
タンパク質標識および免疫沈降
トランスフェクションされた細胞におけるＭ２−１とＭ２−１−Ｎタンパク質の相互作用のリン酸化反応を免疫沈降によって検査した。ＨＥｐ細胞をＭＶＡ−Ｔ７に感染させ、ｐＮ、ｐＰ、ｐＬ、ｐＭ２−１、およびｐＲＳＶｌａｃＺミニゲノムでトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を１８時間３７℃でインキュベートし、メチオニンおよびシステイン中のＤＭＥ欠乏の３５Ｓ−ｐｒｏｍｉｘ（１００μＣｉ／ｍｌ）またはリン酸中ＤＭＥ欠乏の３３Ｐ−リン酸（１００μＣｉ／ｍｌ）で４時間、放射性標識した。０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有するＲＩＰＡ緩衝液中で細胞を溶解し、抗Ｍ２−２モノクローナル抗体（Ｐ．イオ（Ｙｅｏ）博士の寄贈）または抗ＲＳＶポリクローナル抗体（バイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ））で免疫沈降した。Ｇタンパク質アガロースビーズ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で３０分間インキュベーション後、免疫沈降錯体を０．３Ｍ  Ｎａｃｌを含有するＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、４−１５％グラディエントポリアクリルアミドゲル（ノバジーン（Ｎｏｖａｇｅｎ））上で電気泳動した。免疫沈降したタンパク質をオートラジオグラフィー（コダック（Ｋｏｄａｋ））によって視覚化した。
【０１９９】
結果
ＲＳＶとＰＶＭ  Ｍ２−１機能の比較
ＰＶＭ  Ｍ２−１（配列番号：２０）は、ＲＳＶ  Ｍ２−１（配列番号：１９）と４０％同一であり、そのＮ末端でＣｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフを含有し（図２Ａ）、このタンパク質はＰＶＭ転写の転写伸長性因子として機能することが予想される。ＲＳＶ  Ｍ２−１伸長性機能は、ＲＳＶｌａｃＺミニゲノムアッセイ（タン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５）によって測定されうる。ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質がＲＳＶミニゲノムアッセイにおいて機能しうるかどうかを検査するために、ＭＶＡ−Ｔ７感染ＨＥｐ−２細胞をＲＳＶ  Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質（ｐＮ  ０．２μｇ、ｐＰ  ０．２μｇ、ｐＬ  ０．１μｇ）、ｐＲＳＶｌａｃＺ（ｐＲＳＶｌａｃＺ  ０．２μｇ）および種々の量のＰＶＭ  Ｍ２−１またはＲＳＶ  Ｍ２−１をコードするプラスミドでトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、β−ガラクトシダーゼ活性のレベルを測定した。β−ガラクトシダーゼ活性（ＯＤ５５０）対トランスフェクションされたＲＳＶ（三角形）またはＰＶＭ（ダイヤモンド）Ｍ２−１プラスミドの量を示す図２Ｂに示されているように、ＲＳＶ  Ｍ２−１の伸長性機能はｌａｃＺレポーター発現のために必要とされた。β−ガラクトシダーゼはＭ２−１の非存在下に検出されなかったが、ＲＳＶ  Ｍ２−１プラスミドの量の増大とともに用量依存的に製造された。対照的に、ＰＶＭ  Ｍ２−１はこのアッセイできわめて低い伸長性を示した。ＲＳＶ  Ｍ２−１の２−５％のレベルが１０−５０ｎｇの濃度のＰＶＭ  Ｍ２−１プラスミドで再現可能に検出された。したがって、ＲＳＶ  Ｍ２−１に対して、ＰＶＭ  Ｍ２−１はＲＳＶｌａｃＺミニゲノムアッセイにおいてきわめて低いレベルの伸長性を示した。
【０２００】
ＲＳＶとＰＶＭ  Ｍ２−１キメラタンパク質の伸長性
その伸長性機能に必要とされるＲＳＶ  Ｍ２−１の基本的な機能的ドメインを分析するために、ＰＶＭおよびＲＳＶ  Ｍ２−１  ＯＲＦの一部分由来の２つのキメラタンパク質発現プラスミドを構成した（図３Ａ）。ＲＰ  Ｍ２−１キメラのＮ末端３０個のアミノ酸はＲＳＶ  Ｍ２−１由来であり、残りのＣ末端配列はＰＶＭ由来であった。ＰＲ  Ｍ２−１は、そのＮ末端２９個のアミノ酸がＰＶＭ由来であり、Ｃ末端がＲＳＶ由来であるという点で逆キメラを示した。キメラのＮ末端部分における１個のアミノ酸の違いは、ＰＶＭ配列におけるＡｓｎ−５の欠乏によって説明された。これら２つのキメラタンパク質は、ＲＳＶｌａｃＺミニゲノムアッセイにおいて著しく異なる活性を示した（図３Ｂ）。ＰＲ
Ｍ２−１（正方形）は、ＲＳＶ  Ｍ２−１（三角形）の５％未満のレベルで、ＰＶＭ  
Ｍ２−１と同様の活性を有した。しかし、ＲＰ  Ｍ２−１（ダイヤモンド）は、Ｍ２−１活性の約３６％を維持した。したがって、Ｍ２−１のＮ末端領域は、タンパク質機能の測定において重要な役割を果たした。  
【０２０１】
Ｍ２−１機能に重要である残基の同定
Ｎ末端領域における重要な残基を同定するために、体系的分析を行い、ＲＳＶ配列を伸長性機能を回復したＰＲ  Ｍ２−１へ導入した。Ｎ末端ＰＶＭ  Ｍ２−１の２９個のアミノ酸は１３個のアミノ酸によってＲＳＶと異なり、ＲＳＶ  Ｍ２−１の第５アミノ酸に対応するＡｓｎ残基を欠いている（図３Ａ）。ＲＳＶとＰＶＭとの間で異なる１３個のアミノ酸の中で、５個の残基（Ｉ１１Ｖ、Ｋ１９Ｒ、Ｈ２２Ｋ、Ｆ２３Ｙ、およびＦ２９Ｗ）は同様の生化学特性を有し、置換突然変異誘発のために選択されなかった。ＰＲ  Ｍ２−１のＮ末端３０個の残基における残りの８個のアミノ酸を、別々に、または組合わせて突然変異誘発を起こさせ、ＰＶＭ残基をＲＳＶのものに変更した。全体で１９の変異体を構成し（図４Ａ）、その伸長性機能をＲＳＶｌａｃＺミニゲノムアッセイによって分析した（図４Ｂ）。Ｍ２−１タンパク質の発現を免疫沈降によってモニタリングし、同等のレベルのＭ２−１タンパク質が発現されることを確実にした。最初に構成された１３個の単一および二重突然変異（ＰＲ１−ＰＲ１３）から、Ｓ１５ＬおよびＲ１６Ｎの置換を含む変異体のみが、伸長性の顕著な増大を示した。Ｓ１５Ｌ（ＰＲ６）またはＲ１６Ｎ（ＰＲ７）のいずれかの個別の置換は、ＰＲ  Ｍ２−１機能に対するきわめて小さいプラスの効果を示した。しかし、これら２つの変化のみをいっしょに含有するＰＲ２  Ｍ２−１は、タンパク質伸長性がＲＳＶ  Ｍ２−１の約４８％のレベルに増大した。したがって、ＲＳＶ
Ｍ２−１とＰＶＭ  Ｍ２−１との間で異なる他の残基がタンパク質機能にも影響をおよぼしうると考えられた。
【０２０２】
ＲＳＶ  Ｍ２−１のものまたはＡｓｎ−５の挿入による３位、１１位、１３位、１９位、および２５位でのＰＶＭ残基の置換は、ＰＲ  Ｍ２−１タンパク質機能を増大させることはなかった。したがって、さらにＰＲ２  Ｍ２−１（Ｓ１５ＬおよびＲ１６Ｎ含有）における突然変異誘発を行い、他のアミノ酸の変化がＲＳＶ  Ｍ２−１のレベルに近づくその活性をさらに増大しうるかどうかを判定した（図４Ａ）。タンパク質機能の増大が、荷電残基を含む突然変異で確認された。Ｖ３Ｒ（ＰＲ１５）およびＱ１１Ｒ（ＰＲ１６）の導入は、ＰＲ２  Ｍ２−１の伸長性を約７％増大させ、Ｎ１９Ｒ（ＰＲ１７）突然変異は、ＰＲ  Ｍ２−１活性を２５％以上増大させた。二重Ｑ１１ＲおよびＦ１３Ｈ突然変異（ＰＲ１８）は、ＰＲ２  Ｍ２−１機能を２７％増大させ、ＰＲ２  Ｍ２−１に導入された三重突然変異（Ｑ１１Ｒ、Ｆ１３Ｈ、およびＮ１９Ｒ）は、結果としてＲＳＶ  Ｍ２−１とほとんど同一に活性を有するタンパク質をもたらした。したがって、ＰＲ  Ｍ２−１機能に重要であるＳ１５ＬおよびＲ１６Ｎ残基に加えて、いくつかの荷電残基も完全に機能的なタンパク質を生じるために必要である。
【０２０３】
ＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質の伸長性が、ＬｅｕおよびＡｓｎの導入によって増大しうるかどうかを判定するために、ＰＶＭ  Ｍ２−１において突然変異誘発を行い、ＬｅｕおよびＡｓｎによってＳｅｒ−１５およびＡｒｇ−１６を置換した。意外にも、Ｓ１５ＬおよびＲ１６Ｎの変化を有するＰＶＭ  Ｍ２−１（図４、ＰＶ−ＬＮ）は、ＲＳＶミニゲノムアッセイにおいて伸長性機能を増大させることがなかった。したがって、ＰＶＭ  Ｍ２−１のＣ末端領域は、その機能に対する大きな影響を有するとみられる。
【０２０４】
ＲＳＶ  Ｍ２−１のＮ末端でのＬｅｕ−１６、Ａｓｎ−１７、および荷電残基のその機能への役割を確認するために、ＲＳＶ  Ｍ２−１分子において突然変異誘発をさらに行い、全部で１１個も変異体を生成した（図５Ａ）。単一置換突然変異、Ｌ１６Ｓ（ＲＳ１）またはＮ１７Ｒ（ＲＳ２）は、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質機能をそれぞれ、９７％および９４％と大幅に減少させた（図５Ｂ）。二重置換突然変異、Ｌ１６ＳおよびＮ１７Ｒ（
ＲＳ３）はタンパク質機能をさらに減少させ、ＲＳ３について正常ｌａｃＺ活性の１％しかＲＳＶｌａｃＺミニゲノムアッセイでは検出しえなかった（図５Ｂ）。これらのデータは、Ｌｅｕ−１６およびＡｓｎ−１７がＲＳＶ  Ｍ２−１機能の重要な２つの残基であることを示した。３位（ＲＳ４）、１２位（ＲＳ５）、１４位（ＲＳ６）、または２０位（ＲＳ７）での単一荷電残基の置換は各々、結果としてＭ２−１タンパク質活性の１０−２５％の減少をもたらしたが、しかし、いずれもＬｅｕ−１６およびＡｓｎ−１７ほど重要ではなかった。複数の荷電残基の置換は、ＲＳＶ  Ｍ２−１機能に対する大きな影響を有した。二重置換突然変異は、タンパク質機能をＲＳ８で３０％、ＲＳ９で５３％、ＲＳ１０で５０％減少させた。Ｒ１２Ｑ、Ｈ１４Ｆ、およびＲ２０Ｎを有する三重突然変異は、Ｍ２−１機能を約９０％減少させた。したがって、ＰＲ  Ｍ２−１の突然変異誘発分析と一致して、ＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質のＮ末端における荷電残基は、Ｌｅｕ１６およびＡｓｎ−１７残基に加えてタンパク質の伸長性機能に重要であった。
【０２０５】
Ｍ２−１リン酸化および伸長性
Ｍ２−１突然変異がＭ２−１タンパク質リン酸化状態に影響を及ぼしたかどうかを検査するために、Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質をコードするプラスミド、およびＲＳＶ、ＰＶＭ、ＰＲ、ＰＲ２、またはＲＳ３  Ｍ２−１発現プラスミドといっしょにｐＲＳＶＬａｃＺで二重にＭＶＡ−Ｔ７感染ＨＥｐ−２細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間の時点で、ＲＮＡを一連の細胞から抽出し、ノーザンブロットをＬａｃＺまたはＭ２−１に特異的なリボプローブでプロービングした（図６Ａ）。別の一連の細胞を３３Ｐ−リン酸で放射性標識し、抗Ｍ２−１モノクローナル抗体で免疫沈降した（図６Ｂ）。β−ガラクトシダーゼアッセイと一致して、ｌａｃＺ  ｍＲＮＡは、ＰＶＭ、ＰＲ、またはＲＳ３  Ｍ２−１を発現する細胞、またはＭ２−１タンパク質を発現しなかった細胞において検出されなかった（図６Ａ）。ＬａｃＺ  ｍＲＮＡは、ＲＳＶ  Ｍ２−１の約５０％のレベルでＰＲ２  Ｍ２−１を発現する細胞で検出されたが、これは検出されたβ−ガラクトシダーゼのレベルとも一致した（図４Ｂ）。低い配列相同性によりＲＳＶ  Ｍ２−１プローブによって検出されなかったＰＶＭ  Ｍ２−１を除き、同等レベルのＭ２−１  ｍＲＮＡがすべての変異体でトランスフェクションされた細胞において生じた。また、抗ＲＳＶ  Ｍ２−１抗体によって検出されなかったＰＶＭ  Ｍ２−１を除き、ＰＲ、ＰＲ２、およびＲＳ３  Ｍ２−１タンパク質はその伸長性活性にかかわらずリン酸化された。これらタンパク質の各々は、ＲＮａｓｅ  Ａ処理に感受性であった３３Ｐ標識共免疫沈降材料の存在によって示されたＲＮＡに結合することもでき（データは示さず、カルティーとウェルツ（Ｃａｒｔｅｅ  ＆  Ｗｅｒｔｚ）、２００１年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７５：１２１８８−１２１９７）、ＰＶＭ  Ｍ２−１を発現した、またはＭ２−１タンパク質を発現しなかった細胞においては少ないか、または存在しなかった。これらのデータは、キメラＰＲ  Ｍ２−１またはＭ２−１突然変異が、ｍＲＮＡ合成、タンパク質リン酸化、またはＭ２−１変異体のＲＮＡ結合能における顕著な変化をもたらすことはなかった。
【０２０６】
Ｍ２−１突然変異およびＮ相互作用に対する影響
Ｍ２−１伸長性の差異がＭ２−１およびＮタンパク質相互作用の変化によるものであったかどうを判定するために、ＨＥｐ−２細胞をＮ、Ｐ、およびＬ発現プラスミド、ｐＲＳＶＬａｃＺおよびＭ２−１発現プラスミドでトランスフェクションし、３５Ｓ−Ｍｅｔ／３５Ｓ−Ｃｙｓで放射性標識し、トランスフェクション後１８時間にＲＳＶ  Ｍ２−１に対するモノクローナル抗体（図７Ａ）またはＲＳＶに対するポリクローナル抗体（図７Ｂ）で免疫沈降した。ＲＳＶ感染細胞は、この実験におけるトランスフェクションされた細胞よりも少ないＮタンパク質を生じ（図７Ｂ、レーン１）、抗Ｍ２−１抗体によって免疫沈降したＮタンパク質は長い暴露で検出された。同等レベルのＮおよびＭ２−１タンパク質が、抗ＲＳＶ抗体を用いた免疫沈降によって示されているように各トランスフェクションされた細胞において検出された（図７Ｂ）。抗Ｍ２−１抗体によって認識されなかった
ＰＶＭ  Ｍ２−１を除き、ＲＳＶのＭ２−１タンパク質、ＰＲ、ＰＲ２、またはＲＳ３でＮタンパク質は共免疫沈降した（図７Ａ）。ゆっくり移動するＭ２−１はリン酸化形態を表したが、これはＲＳＶ感染細胞（レーン１）におけるよりもトランスフェクションされた細胞（レーン２−６）において豊富である。各Ｍ２−１タンパク質によって共沈降したＮタンパク質のレベルが実験間でばらつきがあったが、Ｍ２−１タンパク質機能との直接相関があるとはみられなかった。
【０２０７】
実施例２：温度感受性を与えるＲＳＶタンパク質における突然変異
方法と材料
Ｐ遺伝子ライブラリーの構成およびスクリーニング
Ｐ遺伝子ｃＤＮＡ変異体ライブラリーをＰ遺伝子のＣ末端９６個のコドンの無作為突然変異誘発によって構成した。突然変異誘発は、エキソヌクレアーゼを欠くＰＦＵ  ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））ならびにプライマー５’ＡｖｒＩＩ（５’−ＧＡＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＡＴＡＣ、配列番号：３）および３’Ａｃｔ２（５’−ＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＴＣＴＡＴＡＧＡＴＣＡＧＡＧＧ、配列番号：４）による低忠実度ＰＣＲ増幅をテンプレートとしてｐＧＡＤ  ＧＬ−Ｐを用いて行った。５’ＡｖｒＩＩプライマーは、Ｐ  ＯＲＦにおけるサイレントＡｖｒＩＩ部位の約１５０ｂｐ上流の配列にアニールし、３’Ａｃｔ２プライマーはｐＧＤＬ  ＧＬベクターにおけるＸｈｏＩ部位の約１５０ｂｐ下流の配列にアニールした。次いで、ＰＣＲ
ｃＤＮＡフラグメントにおける無作為に導入された突然変異を、Ｐ遺伝子のＣ末端をＡｖｒＩＩおよびＸｈｏＬ制限酵素で消化することによって除去したｐＡＳ２−ＮおよびギャップドｐＧＡＤ  ＧＬ−Ｐとともに、酵母サッカロマイセスセレヴィシエＹ１９０株へ形質転換した。無作為ＰＣＲフラグメントとギャップドベクターの再結合により、Ｐ遺伝子ｃＤＮＡライブラリーが生成された。温度感受性（ｔｓ）Ｐ変異体を同定するために、形質転換体を添加剤を含まない２つのＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレート（Ｂｉｏ１０１）、５０ｍＭ  ３アミノトリアゾール（３−ＡＴ）を含有する２つのＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート、１００ｍＭ  ３−ＡＴを含有する１つのＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート、および１５０ｍＭ  ３−ＡＴを含有する１つのＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート上でレプリカプレーティングした。二重のプレートをそれぞれ、３０℃および３７℃でインキュベートし、単一のプレートを３日間３０℃でインキュベートした。３７℃で、５０ｍＭ  ３−ＡＴを含有するＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート上で成長を示さず、またはきわめて減少した成長を示したが、３０℃で、１００ｍＭ  ３−ＡＴを含有するＳＤ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート上で少なくとも十分な成長を示したコロニーを選択した。全体で６４個のｔｓ変異体が同定された。ｐＧＡＤ  ＧＬ−Ｐ変異体プラスミドは酵母細胞から分離され、大腸菌中で増幅され、ｐＡＳ２−ＮとともにＹ１９０株へ再形質転換され、上述したとおり、レプリカプレート上で温度依存Ｎ−Ｐ相互作用を確認した。ｔｓ相互作用を示したＰ遺伝子変異体が配列決定され、突然変異を同定した。野生型ヒトＲＳＶ  Ａ２株のＰタンパク質の配列は図２４に示されている。
【０２０８】
細胞、ウイルス、および抗体
ＨＥｐ−２およびベロ細胞の単層培養株（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）［ＡＴＣＣ］から入手）を５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する最小必須培地中に維持した。組換えＲＳＶ  Ａ２（ｒＡ２）をＲＳＶ  Ａ２株、ｐＲＳＶＣ４Ｇ由来のアンチゲノムｃＤＮＡから回収し（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４）、ベロ細胞中で増殖させた。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＭＶＡ−Ｔ７を発現する修飾ワクシニアウイルスアンカラ株（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら、１９９５年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１０：２０２−２０５）は、ベルナルド・モス（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ）によって提供され、ＣＥＫ細胞中で増殖させた。ポリクローナル抗ＲＳＶ  Ａ２抗体をバイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（ニューハンプシ
ャー州（Ｎ．Ｈ．）、サンダウン（Ｓａｎｄｏｗｎ））から入手した。モノクローナル抗ＲＳＶ  Ｐ抗体１Ｐ、０２／０２１Ｐ、および７６Ｐは、ジョーズ  Ａ．メレロ（Ｊｏｓｅ  Ａ．Ｍｅｌｅｒｏ）によって提供された。
【０２０９】
酵母ツーハイブリッドシステムにおけるＮーＰタンパク質相互作用のスクリーニング
ＲＳＶ  ＮおよびＰタンパク質の相互作用を酵母ツーハイブリッドシステム（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））によって確立した。２つのハイブリッド融合プラスミドを以下のとおり構成した。ＲＳＶのＮ読み取り枠（ＯＲＦ）をＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を通じてベクターｐＡＳ２におけるＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと枠で融合した。Ｐ
ＯＲＦをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ制限部位を通じてｐＧＡＤ  ＧＬベクターにおけるＧＡＬ４活性化ドメインと枠で融合した。サイレントＡｖｒＩＩ部位をｐＧＡＤ  ＧＬ−ＰにおけるＰ  ＯＲＦのコドン１４５で導入し、Ｐ  ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーの構成を促進した。突然変異誘発は、クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））で、一対のプライマー、５’−ＧＡＡＡＡＡＴＴＡＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＴＡＧＧＡＡＴＧＣＴＴＣＡＣ、配列番号：５（ＡｖｒＩＩ部位には下線）およびその相補性配列とともに行った。
【０２１０】
ＲＳＶミニゲノム複製アッセイによるＰ変異体の機能的分析
Ｔ７プロモーターの管理下にＲＳＶ  Ｎ、Ｐ、およびＬを発現するプラスミドを以前に記載された（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４）。Ｐ遺伝子は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）特定部位突然変異誘発キットまたはＥｘＳｉｔｅ  ＰＣＲベースの特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のいずれかを用いて変異させた。以下の変化をｐＰプラスミドすなわち、Ｇ１７２Ｓ、Ｅ１７６Ｇ、Ｇ１７２Ｓ／Ｅ１７６Ｇ、１７４−１７６Ａ（Ｒ１７４Ａ／Ｅ１７５Ａ／Ｅ１７６Ａ）、ΔＣ６（Ｃ末端からの６個のアミノ酸の欠失）、およびΔ６１−１８０（残基１６１〜１８０の欠失）で行った。ＲＳＶ複製は、ＲＳＶミニゲノムレプリコン、ｐＲＳＶ−ＣＡＴを用いて分析された（タン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５）。ミニゲノムアッセイのために、１２穴プレート中のＨＥｐ−２細胞を５ＰＦＵ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＶＡ−Ｔ７に感染させ、次いで、ｐＮ  ０．２μｇ、ｐＬ  ０．１μｇ、野生型（ｗｔ）ｐＰまたは変異体ｐＰ  ０．２μｇと一緒に３通りにｐＲＳＶ−ＣＡＴ  ０．２μｇでトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を３３℃、３７℃、または３９℃で、４８時間インキュベートした。トランスフェクションされた細胞において発現されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）タンパク質の量は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって測定された。トランスフェクションされた細胞におけるＮおよびＰのタンパク質発現レベルは、ウェスタンブロット法によって測定された。全細胞ポリペプチドを１５％アクリルアミドゲル上のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって電気泳動し、ナイロン膜（アマシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））上に移した。ブロットをヤギ抗ＲＳＶ抗体（バイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ））、およびその後にホースラディシュペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヤギ免疫グロブリンＧ（ダコ（Ｄａｋｏ））とともにインキュベートした。膜は機能強化化学発光基質（アマシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））とともにインキュベートした。タンパク質結合はＢｉｏＭＡＸ  ＭＬフィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ））への暴露後に視覚化された。
【０２１１】
組換えＲＳＶの回収
Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異をＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡクローンへ個別に
導入した。Ｅ１７６Ｇ突然変異には、ＧＡＡからＧＧＴへの２つのヌクレオチドの変化が含まれた。突然変異は最初に、ヌクレオチド２１２８（ＡｖｒＩＩ）からヌクレオチド４４８５（ＳａｃＩ）へのＲＳＶ  Ａ２配列を含むＲＳＶ  ｃＤＮＡサブクローン、ｐＲＳＶ−（Ａ／Ｓ）へ、クイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いて導入した。次いで、導入された突然変異を有するＡｖｒＩＩ−ＳａｃＩフラグメントを、全長ＲＳＶ  Ａ２アンチゲノムｃＤＮＡクローン、ｐＲＳＶＣ４Ｇへシャトルした（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４）。ｐＲＳＶＣ４Ｇは、アンチゲノムセンスにおけるリーダー領域の第４位でＣからＧへの変更を含む（（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５１：２０６−２１４）。組換えウイルスを既述されているとおりトランスフェクションされたＨＥｐ−２細胞から回収し（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５１：２０６−２１４）、ｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６と指定した。回収されたウイルスをプラーク精製し、ベロ細胞中で増幅した。ウイルス力価をベロ細胞でプラークアッセイによって測定し、プラークをポリクローナル抗ＲＳＶ  Ａ２血清（バイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ））で免疫染色後に数えた。回収ウイルスにおける各突然変異の存在をテンプレートとしてウイルスゲノムＲＮＡを用いることによって逆転写ＰＣＲによって増幅されたＰ遺伝子ｃＤＮＡの配列分析によって確認された。
【０２１２】
ＨＥｐ−２およびベロ細胞におけるｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６の複製
各変異体のプラーク形成を３３、３７、３８、および３９℃でＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞において検査した。６穴プレートにおける細胞単層を１０倍の連続希釈ウイルスに感染させ、水中浴中２％ＦＢＳおよび１％メチルセルロースを含有するＬ１５倍地から成る重層下に６日間インキュベートした。ＲＳＶ  Ａ２に対するポリクローナル抗血清（バイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ））で免疫染色後にプラークを視覚化して数えた。プラークサイズの比較のために倒立顕微鏡を用いて写真撮影した。
【０２１３】
ｗｔ  ｒＡ２と比較したｒＡ２−Ｐ１７２、ｒＡ２−Ｐ１７６の成長機構をＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞において検討した。６穴プレート中の細胞を１．０または０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでｗｔ  ｒＡ２、ｒＡ２−Ｐ１７２、またはｒＡ２−Ｐ１７６に感染させた。室温で１時間の吸着後、感染細胞をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄し、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（ライフ  テクノロジース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でオーバーレイし、３３または３８℃のいずれかでインキュベートした。２４時間の間隔を置き、培養上清２００μｌを採取し、ウイルス滴定前にＳＰＧの存在下に−８０℃に保存した（タン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８−１１３３５）。採取した各アリコートを同等量の新鮮培地とともに再配置した。３３℃、ベロ細胞でのプラークアッセイによってウイルス力価を測定した。
【０２１４】
ＮおよびＰタンパク質の共免疫沈降
共免疫沈降を行い、ＮおよびＰタンパク質間の相互作用を検討した。一時的なタンパク質発現のために、１２穴プレート中のＭＶＡ−Ｔ７感染ＨＥｐ−２細胞を、リポフェクトＡＣＥ（ライフ  テクノロジース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって、ｐＮおよびｐＰプラスミド各々２μｇとともに同時トランスフェクションした。ウイルス感染細胞におけるＮ−Ｐ相互作用を検査するために、ベロ細胞を１．０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでｒＡ２、ｒＡ２−Ｐ１７２、またはｒＡ２−Ｐ１７６に感染させた。トランスフェクションされた、または組換えＲＳＶ感染細胞を１２時間３３、３７、または３９℃でインキュベートし、次いで  システインおよびメチオニンが不足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中［３５Ｓ］Ｃｙｓおよび［３５Ｓ］Ｍｅｔ（１００μＣｉ／ｍｌ）へ４時間暴露した。放射性標識細胞単層を放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％
トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中に溶解した。ポリペプチドをポリクローナルヤギ抗ＲＳＶ  Ａ２抗体またはモノクローナル抗体（１Ｐ、０２１Ｐ、および７６Ｐ）の混合物でＰタンパク質に対して１２時間、４℃に免疫沈降した。タンパク質Ｇ−アガロースビーズ（ライフ  テクノロジース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））３０μｌを添加することによって、３０分間、４℃で抗体−タンパク質錯体を沈降し、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する放射性免疫沈降アッセイ緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降されたポリペプチドをＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥによって電気泳動し、オートラジオグラフィーによって検出した。ウインドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）ＮＴ用のイメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いることによって、モレキュラー  ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）デンシトメーターでデンシトメトリーによってオートラジオグラフで検出されたＮおよびＰタンパク質を定量化した。
【０２１５】
マウスおよびコトンラットにおけるウイルス複製
インビボのウイルス複製を呼吸器無菌ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびコトンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ［ハーラン（Ｈａｒｌａｎ）］）において決定した。各８匹の群のマウスまたはコトンラットを、軽いメトキシフルラン麻酔下に、動物当たり１０６ＰＦＵウイルスを含有する接種材料０．１ｍｌを接種した。接種後４日の時点で、ＣＯ２窒息によって犠死させ、その肺を採った。組織をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（ライフ  テクノロジース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でホモジナイズし、ウイルス力価をベロ細胞でプラークアッセイによって測定した。
【０２１６】
結果
酵母ツーハイブリッドアッセイにおけるＮ−Ｐ相互作用を弱めるＰ突然変異の同定
Ｎタンパク質とのその相互作用を不安定化するＰタンパク質における突然変異を同定するために、酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて、３０℃の許容温度でＰのＮとの相互作用を許すが、３７℃の非許容温度でＮとの相互作用を阻止する変異体のためのＰのＣ末端９６個のコドンに導入した突然変異により無作為に突然変異誘発を起こさせたＰｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｗｔ  ＮおよびＰタンパク質は、３０℃および３７℃で、選択的培地での同時形質転換酵母菌株の成長によって示されるように、酵母菌において互いに相互作用した。これらの形質転換体は、３０℃の許容温度では酵母ツーハイブリッドレポーター遺伝子を活性化することが可能であるが、３７℃では可能ではない変異体についてスクリーニングされた。約１，３００個の当初の形質転換体から、６４個の可能性のあるｔｓ変異体が同定された。これら推定上のｔｓクローンを酵母菌Ｙ１９０における第２ラウンドのスクリーニングにかけた。２個の形質転換体はそのｔｓ表現型が確認された。これら酵母菌クローンからのｐＧＡＤ  ＧＬ−Ｐプラスミドが配列決定された。突然変異は、図１に示されているように、Ｓｅｒによって置換された残基１７２でのＧｌｙ（Ｇ１７２Ｓ）またはＧｌｙによって置換された残基１７６でのＧｌｕ（Ｅ１７６Ｇ）のいずれかとして同定された。
【０２１７】
ＮおよびＰを一時的に発現する細胞におけるＮ−Ｐ相互作用の免疫沈降分析
一部の肺炎ウイルスのＰタンパク質の配列アラインメントは残基１７２および１７６を示し、隣接した領域はきわめて保存され、一部の荷電残基を含有する（図１）。荷電残基の機能的役割を検査するため、変異体Ｐタンパク質発現プラスミドを構成したが、ここで３つの荷電残基、１７４位〜１７６位でのＲＥＥがアラニンで置換された。また、Ｐ遺伝子におけるＧ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異の両方を含有するプラスミドを構成した。Ｃ末端６個の残基を欠くか、または１６１〜１８０からの残基を欠くいずれかの２つの欠失変異体が作られたが、その両方はＲＳＶにおいてＮ−Ｐ相互作用を妨げることが明らかにされている（ガルシア−バレノ（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８０１−８０８、カタール（Ｋｈａｔｔａｒ）ら（２００１年）
Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８２：７７５−７７９）。
【０２１８】
Ｎ−Ｐ相互作用に対するＰ突然変異の影響を検査するために、ＭＶＡ−Ｔ７感染ＨＥｐ−２をｐＮおよびｐＰ変異体プラスミドで同時トランスフェクションし、３７℃および３９℃にインキュベートした。３５Ｓ−標識ポリペプチドを抗Ｐモノクローナル抗体によって免疫沈降した。図８に示されているように、Ｎタンパク質はＰタンパク質の存在下に抗Ｐ抗体によってのみ沈降した（レーン１対レーン３）、Ｎタンパク質の免疫沈降がＰタンパク質とのその相互作用により起こったことを示す。Ｐタンパク質のＣ末端からの６個の残基の欠失は、Ｎタンパク質とのその相互作用を大幅に減少させ、微量のＮのみが検出された（図８、レーン８）。Ｎタンパク質は、他のＰ変異体、Ｇ１７２Ｓ、Ｅ１７６Ｇ、Ｇ１７２Ｓ／Ｅ１７６Ｇ、１７４−１７６Ａ、および１６１−１８０のすべてによって同時沈降した。ゲル上で検出された１６１−１８０Ｐタンパク質の量は、ｗｔ  Ｐの量よりも少なかったが、これはこの領域における２つの潜在的な３５Ｓ−標識メチオニンの除去のためと考えられる。したがって、一時的に発現した細胞におけるＮおよびＰの同時免疫沈降は、Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異についてＮ−Ｐ相互作用で欠損を示すことはなかった。
【０２１９】
図８は、一時的にＮおよびＰを発現する細胞におけるＮ−Ｐ相互作用の免疫沈降分析を示す。ＭＶＡ−Ｔ７感染ＨＥｐ−２細胞、Ｔ７プロモーターの管理下にｐＮおよびｐＰタンパク質発現プラスミドでトランスフェクションし、３７℃（上パネル）または３９℃（下パネル）で１６時間インキュベートした。これらのタンパク質を、システインおよびメチオニンが不足したＤＭＥＭ中［３５Ｓ］Ｃｙｓおよび［３５Ｓ］Ｍｅｔ（１００μＣｉ／ｍｌ）で４時間放射性標識し、抗Ｐモノクローナル抗体によって免疫沈降し、１５％ポリアクリルアミドゲルで分離し、コダック（Ｋｏｄａｋ）バイオマックス（ＢｉｏＭＡＸ）フィルムへ暴露した。ＮおよびＰの位置は右側に示されている。
【０２２０】
ＲＳＶ−ＣＡＴミニゲノムの複製および転写に対するＰ突然変異の影響
Ｐ変異体の機能をＣＡＴミニゲノム複製アッセイによって分析した。変異体Ｐ発現プラスミドを、ｐＮ、ｐＬ、およびｐＲＳＶ−ＣＡＴといっしょにＭＶＡ−Ｔ７感染ＨＥｐ−２細胞にトランスフェクションし、ＣＡＴ発現を３３、３７、または３９℃で測定した。ＮおよびＰタンパク質発現のレベルをポリクローナル抗ＲＳＶ抗体によりウェスタンブロット法によって測定した（差し込み図、図９）。異なるＰ変異体によって生じるＣＡＴレポーター遺伝子活性をＣＡＴ酵素結合イムノソルベントアッセイによって測定し、各温度でｗｔ  Ｐの活性のパーセンテージで表されている。エラーバーは、３つの複製実験の標準偏差を示す。
【０２２１】
図９に示されているように、３３℃で、Ｇ１７２ＳまたはＥ１７６Ｇのいずれかを含有する変異体Ｐタンパク質を発現する細胞においてＣＡＴタンパク質発現が検出されたが、それらの活性がそれぞれ、約２４および４５％減少した。３７℃で、検出されたＣＡＴタンパク質のレベルは、Ｇ１７２Ｓでは約８０％、Ｅ１７６Ｇでは約９０％減少した。この減少は、３９℃ではさらに大きくなった（＞９５％）。これらのデータは、突然変異が酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて確認されたｔｓ相互作用表現型と一致する条件ｔｓ表現型を表示することを示した。複合Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異、１７４位〜１７６位で３つの荷電残基のアラニンによる置換、Ｃ末端からの６個のアミノ酸の欠失、または内部の２０個のアミノ酸欠失を含有するＰタンパク質を発現する細胞ではＣＡＴ発現は検出されなかった。
【０２２２】
レポーター遺伝子発現の減少が高温でのこれらＰ変異体の変化したタンパク質発現によってひき起こされる可能性を排除するために、トランスフェクションされた細胞で生じたＰおよびＮタンパク質のレベルをウェスタンブロット法によって試験した。１６０−１８
０変異体を除き、他のＰ変異のすべては、同等のレベルのタンパク質を発現した（図９、差込図）。したがって、他の変異体のＲＳＶミニゲノム複製を支持する能力の減少は、トランスフェクションされた細胞におけるそのタンパク質レベルの変化ではなく、導入された突然変異の直接の結果であった。
【０２２３】
細胞培養におけるｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６の複製
Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異は個別に全長ＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡクローンへ導入され、組換えウイルスが生成された。ｒＡ２−Ｐ１７２とｒＡ２−Ｐ１７６の両方は、３３℃でベロ細胞において２ｘ１０７ＰＦＵ／ｍｌのピーク力価に達したが、このレベルはｗｔ  ｒＡ２のレベルと同等である。異なる温度でのｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６のプラーク形成の効率をベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞において検査され、表３および図１０において要約されている。
【０２２４】
ベロ細胞（図１０、上パネル）およびＨＥｐ−２細胞（図１０、下レベル）の単層をｗｔ  ｒＡ２、ｒＡ２−Ｐ１７２、およびｒＡ２−Ｐ１７６に感染させ、１％メチルセルロースおよび２％ＦＢＳを含有するＬ１５培地でオーバーレイし、６日間、３３、３７、３８、および３９℃でインキュベートした。ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体による免疫染色によってプラークを視覚化した。ニコン（Ｎｉｋｏｎ）倒立顕微鏡でプラークを写真撮影した。下パネルの矢印は、３８および３９℃でＲＳＶ感染ＨＥｐ−２細胞を示す。
【０２２５】
ｒＡ２−Ｐ１７２とｒＡ２−Ｐ１７６の両方は、３７℃以上の温度でｗｔ  ｒＡ２より小さいプラークを形成した。３９℃ではベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞のｒＡ２−Ｐ１７２でプラークは視覚化されなかったが、抗ＲＳＶ抗体によって染色されたＲＳＶ感染の単一または多数の細胞が顕微鏡下に確認された。同様に、３９℃でベロ細胞またはＨＥｐ−２細胞において、３８℃でＨＥｐ−２細胞においてｒＡ２−Ｐ１７６について可視プラークは確認されなかった。ｒＡ２−Ｐ１７６はｒＡ２−Ｐ１７２よりも温度感受性であったが、ｒＡ２−Ｐ１７２の遮断温度はＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞において３９℃であったが、ｒＡ２−Ｐ１７６の遮断温度はＨＥｐ−２細胞では３８℃、ベロ細胞では３９℃であった（表３）。
【０２２６】
【表３】
2007531491.tif 000004
【０２２７】
ｒＡ２−Ｐ１７２（円）およびｒＡ２−Ｐ１７６（ダイヤモンド）の単一サイクル（ＭＯＩ＝１．０）および多重サイクル（ＭＯＩ＝０．０１）成長機構をＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞におけるｒＡ２（正方形）のものと比較した（図１１）。ベロ細胞またはＨＥｐ−２細胞を１．０または０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでウイルスに感染させ、３３または３８℃でインキュベートした。培養上清（２００μｌ）のアリコートを２４時間に間隔で５日間採り、ベロ細胞でのプラークアッセイによってウイルス力価を測定した。各ウイルス力価は２つの実験の平均である。３３℃で、ｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６は同様の複製機構を有し、両方の細胞株の両方のＭＯＩでｒＡ２のものと同等のピーク力価を有した。３８℃で、ｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６は、ｗｔ  ｒＡ２
のものよりもはるかに低いピーク力価に達した。１．０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでは、ｒＡ２−Ｐ１７２は、３８℃でベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞におけるｒＡ２のものよりも、それぞれ約２．０および２．３ｌｏｇ１０低いピーク力価を有した。３８℃でのｗｔ  ｒＡ２に対するそのピーク力価におけるｒＡ２−Ｐ１７６の減少も等しく大きく、ベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞においてそれぞれ、２．５および３．０ｌｏｇ１０であった。この減少は、感染において０．０１のＭＯＩを用いた場合に顕著に少なく、ｒＡ２−Ｐ１７２についてベロ細胞において０．６ｌｏｇ１０、ＨＥｐ−２細胞において１．０ｌｏｇ１０であり、ｒＡ２−Ｐ１７６についてベロ細胞において０．８ｌｏｇ１０、ＨＥｐ−２細胞において２．２ｌｏｇ１０であった。３９℃で、ｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６はアッセイ限界未満のレベルに複製した。これらのデータはＥ１７６Ｇがその機能においてより障害されていたミニゲノムアッセイで確認されたものと一致している（図９）。
【０２２８】
マウスおよびコトンラットにおけるｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６の複製
マウスおよびコトンラットの下気道におけるｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６の複製を検査した（表４）。マウスの肺におけるｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６の複製はそれぞれ、２．７および３．７ｌｏｇ１０減少した。コトンラットの肺におけるｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６の複製はそれぞれ、１．５および２．５ｌｏｇ１０減少した。３７℃でのミニゲノムアッセイおよび３８℃での細胞培養における成長機構からの結果と一致して、マウスおよびコトンラットに下気道における複製によって測定されるように、ｒＡ２−Ｐ１７６はｒＡ２−Ｐ１７２よりも弱毒化された。
【０２２９】
【表４】
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【０２３０】
免疫沈降によるウイルス感染細胞におけるＮ−Ｐ相互作用の分析
ＰにおけるＧ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異が、ウイルス感染細胞におけるＮタンパク質とのその相互作用に影響を及ぼしたかどうかを検査するために、ｒＡ２、ｒＡ２−Ｐ１７２、およびｒＡ２−Ｐ１７６に感染した細胞からのウイルスタンパク質を、ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体またはモノクローナル抗Ｐ抗体の混合物のいずれかで免疫沈降した（図１２）。抗Ｐモノクローナル抗体はＮとＰの両方で沈降し、感染細胞におけるＮ−Ｐ錯体の形成を示した。抗ＲＳＶ抗体によって沈降したＮタンパク質は二重結合として現れたが、抗Ｐ抗体によってＰタンパク質といっしょに沈降させた場合には単一結合として現れた。Ｎの迅速移動種はＮの修飾されていない形態を示しうるが、これはＰにより同時免疫沈降されなかった。ベロ細胞における確認された成長機構から予想されたように、ウイルスタンパク質の総量の全体的な減少が、３９℃でのｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６感染細胞において生じた。したがって、同時免疫沈降を３３および３７℃でインキュベートした感染細胞で行った。抗ＲＳＶ抗体はＰタンパク質と十分に反応することはなかったが、ｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６は、３３および３７℃で抗ＲＳＶ抗体によって沈降された場合にｗｔ  ｒＡ２のものと同様のＮ／Ｐ比を有した。オートグラフで抗Ｐ抗体によって免疫沈降されたＮおよびＰタンパク質の量は、デンシトメトリーによって定量化され、それらの相対比は図１２に示されている。３３℃で、ｒＡ２−Ｐ１７２、およびｒＡ２−Ｐ１７６のＮ／Ｐ比がｒＡ２のそれと同様であり、Ｎ−Ｐ相互作用が低温では影響されないことを示した。しかし、３７℃で、Ｐによって同時沈降されたＮの量はｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６に感染した細胞において減少した。ｗｔ  
ｒＡ２につついてＮおよびＰタンパク質の平均比は３７℃で１．０８であった。ｒＡ２−Ｐ１７２のＮ／Ｐ比は０．６１またはｗｔ  ｒＡ２の５６％のレベルであったが、ｒＡ２−Ｐ１７６がさらに低い０．４５のＮ／Ｐ比を有し、またはｗｔ  ｒＡ２の４２％のレベルであった。３７℃でのｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６について減少したＮ／Ｐ比は再現可能であり、Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異が高温でＮとＰとの相互作用を減少させ、Ｅ１７６Ｇ突然変異がＧ１７２Ｓよりも障害性であることを示した。
【０２３１】
図１２について、１．０のＭＯＩでｗｔ  ｒＡ２、ｒＡ２−Ｐ１７２、またはｒＡ２−Ｐ１７６にベロ細胞を感染させ、１８時間３３および３７℃でインキュベートした。次いで、タンパク質をシステインおよびメチオニンが不足したＤＭＥＭ中［３５Ｓ］Ｃｙｓおよび［３５Ｓ］Ｍｅｔ（１００μＣｉ／ｍｌ）で４時間放射性標識し、抗ＲＳＶまたは抗Ｐモノクローナル抗体によって免疫沈降し、ＳＤＳ−１５％ＰＡＧＥによって分離し、オートラジオグラフを行った。ＮおよびＰタンパク質の位置は右側に示されている。各変異体のＮおよびＰ比は４つの独立した実験から測定された。
【０２３２】
ｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６におけるＰ  ｔｓ突然変異の安定性
Ｐタンパク質におけるＧ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇ突然変異の安定性を検査するために、ｒＡ２−Ｐ１７２およびｒＡ２−Ｐ１７６を５回連続で３３および３７℃で、２通りでベロ細胞で通過させた。ウイルスＲＮＡを感染細胞培養上清から抽出し、Ｐ遺伝子ｃＤＮＡを逆転写ＰＣＲによって増幅し、配列決定した。Ｇ１７２Ｓ突然変異は３３および３７℃で維持された。しかし、Ｅ１７６Ｇ突然変異はＧｌｙからＡｓｐへ迅速に変化し、一連の通過試料で３７℃で、通過３から開始した。ウイルス集団の９５％超が通過５でＥ１７６Ｄを含有した。図１３Ａは、ベロ細胞において通過したｒＡ２−Ｐ１７６からの残基１７６の領域でＰ遺伝子の配列を示す。導入されたＥ１７６Ｇ突然変異は、通過３（Ｐ３）からＥ１７６Ｄへ徐々に復帰した。矢印は１７６個のコドンにおけるＧからＡへの変化を示す。感染細胞を３３℃でインキュベートした場合に１７６位で変化は検出されなかった。
【０２３３】
次いで、Ｅ１７６Ｄウイルスを種々の温度で複製について検査した。ベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞の単層をｒＡ２Ｐ−Ｅ１７６Ｄに感染させ、１％メチルセルロースおよび２％ＦＢＳを含有するＬ１５培地でオーバーレイし、３３、３７、および３９℃でインキュベートした。図１３Ｂに示されているように、３３℃で確認されたものと比べ３９℃でウイルス力価のほんのわずかな減少が確認された。したがって、Ｅ１７６Ｄの変化を有するウイルスは３９℃ではもう温度感受性ではなかった。３７℃で５回通過したｒＡ２−Ｐ１７６の第２のセットの配列分析は、１７６位で混合残基を示した。次いで、ウイルスをプラーク精製し、Ｐ遺伝子ｃＤＮＡを配列決定した。８個のプラーク分離物のうち、４個がＡｓｐ変化を含有し、２個がＣｙｓを含有し、残りの２個がＳｅｒ変化を含有した。ＣｙｓまたはＳｅｒによるＧｌｙの置換も結果として、ウイルスｔｓ表現型の喪失をもたらした。これらの結果から、１７６位で負の電荷を帯びた残基がウイルスによって選好され、ＣｙｓまたはＳｅｒが第２の選択であるとみられた。ＣｙｓおよびＳｅｒは各々、それぞれ、ジスフィルド結合または水素結合を形成しうる側鎖を含有し、Ｐの１７６での残基がタンパク質相互作用に関与することを暗示した。
【０２３４】
実施例３：Ｐタンパク質におけるリン酸化部位の突然変異
材料と方法  
細胞、ウイルス、および抗体
ＨＥｐ−２およびベロ細胞の単層培養株（アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション［ＡＴＣＣ］から入手）を５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する最小必須培地（ＭＥＭ）中に維持した。組換えＲＳＶ  Ａ２（ｒＡ２）をＲＳＶ  Ａ２株、ｐＲＳＶＣ４Ｇ由来のアンチゲノムｃＤＮＡから回収し（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｏｌｏｇ
ｙ  ２５１：２０６−２１４）、ベロ細胞中で増殖させた。バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、ＭＶＡ−Ｔ７を発現する修飾ワクシニアウイルスアンカラ株（ワイアット（Ｗｙａｔｔ）ら、（１９９５年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１０：２０２−２０５）は、ベルナルド・モス（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ）によって提供され、ＣＥＫ細胞中で増殖させた。ポリクローナル抗ＲＳＶ  Ａ２抗体をバイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）（ニューハンプシャー州（Ｎ．Ｈ．）、サンダウン）から入手した。モノクローナル抗ＲＳＶ  Ｐ抗体ＩＰ、０２／０２１Ｐ、および７６Ｐは、ジョーズ  Ａ．メレロ（Ｊｏｓｅ  Ａ．Ｍｅｌｅｒｏ）によって提供された。
【０２３５】
ＲＳＶミニゲノム複製アッセイによるＰタンパク質変異の機能的分析
Ｔ７プロモーター（ｐＣＩＴＥベクター中）の管理下にＲＳＶ  Ｎ  Ｐ、およびＬを発現するプラスミドを以前に記載された（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｏｌｏｇｙ２５１：２０６−２１４）。ＲＳＶミニゲノム、ｐＲＳＶＣＡＴは、マイナスセンスクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をＴ７プロモーターの管理下にコードする（ルー（Ｌｕ）ら（２００２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２８７１−２８８０）。ＣＡＴ遺伝子の下流のＲＳＶ遺伝子開始部および遺伝子末端部の配列によってフランキングされた強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子をｐＲＳＶ  ＣＡＴへ挿入することによってｐＲＳＶ  ＣＡＴ／ＥＧＦＰを構成した。リン酸化突然変異は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を用いることによってＰタンパク質遺伝子において操作された。Ｐタンパク質において操作された主要なリン酸化突然変異は図１４に示されている。
【０２３６】
ＲＳＶ複製に対するＰタンパク質リン酸化突然変異の影響をＲＳＶ  ＣＡＴミニゲノムシステムで分析した。１２穴プレート中のＨＥｐ−２細胞を１時間、５の感染多重度（ＭＯＩ）でＭＶＡ−Ｔ７に感染させ、次いで、プラスミドｐＮ  ０．２μｇ、ｐＬ  ０．１μｇ、野生型ｐＰまたは変異体ｐＰ  ０．２μｇといっしょに３通りにｐＲＳＶ−ＣＡＴまたはｐＲＳＶＣＡＴ／ＥＧＦＰ０．２μｇでトランスフェクションした。ｐＲＳＶ  ＣＡＴおよびｐＲＳＶ  ＣＡＴ／ＥＧＦＰトランスフェクションされた細胞において発現されたＣＡＴタンパク質の量は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））によって測定された。トランスフェクションされた細胞におけるゲノムＲＮＡおよびＣＡＴ  ｍＲＮＡの発現は、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識マイナスセンスＣＡＴリボプローブによるノーザンブロット法によって検査された。
【０２３７】
組換えＲＳＶの回収
２個のセリン部位置換（ＳＳＳＡＡ［ＰＰ２］）または５個のセリン部位置換（ＬＲＬＡＡ［ＰＰ５］）を含有する２個のリン酸化突然変異をｒＡ２へ導入した。突然変異を最初に、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって、ヌクレオチド（ｎｔ  ２１２８（ＡｖｒＩＩ））〜（ｎｔ  ４４８５（ＳａｃＩ））のＲＳＶ  Ａ２配列を含有するＲＳＶ  ｃＤＮＡサブクローン、ｐＲＳＶ−（Ａ／Ｓ）におけるＰタンパク質遺伝子へ導入した。次いで、導入された突然変異を有するＡｖｒＩＩ−ＳａｃＩフラグメントを全長ＲＳＶ  Ａ２アンチゲノムｃＤＮＡクローン、ｐＲＳＶＣ４Ｇへ挿入した。ｐＲＳＶ４Ｇは、アンセゲノムセンスにおけるリーダー領域の第４位でＣからＧへの変化を含有する。２つの組換えウイルスがトランスフェクションされたＨＥｐ−２細胞から回収され、ｒＡ２−ＰＰ２（ＳＳＳＡＡ）およびｒＡ２−ＰＰ５（ＬＲＬＡＡ）として指定された。回収されたウイルスをプラーク精製し、ベロ細胞中で増幅した。ウイルス力価をベロ細胞でプラークアッセイによって測定し、プラークをポリクローナル抗ＲＳＶ  Ａ２血清（バイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ））で免疫染色後に数えた。組換えウイルスにおける各突然変異の存在は、テンプレートとしてウイルスゲノムＲＮＡを用いることによって逆転写ＰＣＲ
（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅されたＰタンパク質遺伝子ｃＤＮＡの配列分析によって確認された。
【０２３８】
ＨＥｐ−２およびベロ細胞におけるｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の複製
各変異体のプラーク形成の効率をＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞で検査した。６穴プレートにおける細胞単層を１０倍の連続希釈ウイルスに感染させ、水中浴中２％ＦＢＳおよび１％メチルセルロースを含有するＬ１５倍地から成る重層下に６日間３５℃でインキュベートした。ポリクローナル抗ＲＳＶ  Ａ２血清による免疫染色後にプラークを視覚化して数えた。
【０２３９】
ｒＡ２のものと比較したｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の成長機構をＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞において検討した。６穴プレート中の細胞を１．０または０．０１の（ＭＯＩ）でｒＡ２、ｒＡ２−ＰＰ２、またはｒＡ２−ＰＰ５に感染させた。室温に１時間の吸着後、感染細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、３ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でオーバーレイし、３５℃でインキュベートした。２４時間の間隔を置き、培養上清２００μｌを採取し、ウイルス滴定前にＳＰＧ（０．２Ｍショ糖、３．８Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４、７．２Ｍ  Ｋ２ＨＰ０４、５．４Ｍ  グルタミン酸１ナトリウム）の存在下に−８０℃に保存した。各アリコートを除去した後、同等量の新鮮培地を細胞に添加した。３５℃で、ベロ細胞でのプラークアッセイによってウイルス力価を測定した。
【０２４０】
ウイルス放出分析をＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞で行った。６穴プレート中の細胞を１．０のＭＯＩでｒＡ２、ｒＡ２−ＰＰ２、またはｒＡ２−ＰＰ５に感染させた。各時点で、培養上清を採取し、次いで細胞単層をＰＢＳで２回洗浄し、ＯｐｔｉＭＥＭＩ  １ｍｌ中でスクレープした。
【０２４１】
感染細胞と結合したウイルスを１回凍結融解によって放出させた。培養培地または感染細胞中に存在する感染ウイルスをベロ細胞でプラークアッセイによって滴定した。
【０２４２】
マウスおよびコトンラットにおけるｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の複製
インビボのウイルス複製をハーラン（Ｈａｒｌａｎ）から得た呼吸器無菌ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびコトンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ）において確認した。各８匹の群のマウスまたはコトンラットを、軽いメトキシフルラン麻酔下に、動物当たり１０６ＰＦＵウイルスを含有する接種材料０．１ｍｌを鼻内接種した。接種後４日の時点で、ＣＯ２窒息によって犠死させ、その肺組織を採った。組織をＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でホモジナイズし、肺組織グラム当たりのウイルス力価をベロ細胞でプラークアッセイによって測定した。
【０２４３】
感染細胞におけるウイルスタンパク質の代謝標識
ウイルス感染細胞におけるＰタンパク質のリン酸化を検査するために、ベロ細胞を１．０のＭＯＩでｒＡ２、ｒＡ２−ＰＰ２、またはｒＡ２−ＰＰ５に２通りに感染させた。３５℃に１０時間インキュベーション後、細胞を３０分間システインおよびメチオニンまたはリンさんが不足したダルベッコＭＥＭ（ＤＭＥＭ）で接種した。次いで、１セットの試料を１００μＣｉ／ｍｌで［３５Ｓ］Ｃｙｓおよび［３５Ｓ］Ｍｅｔ（アマシャム  バイオサイエンシス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））でインキュベートし、他のセットを４時間、１００μＣｉ／ｍｌでの３３Ｐｉ（ＩＣＮ）でインキュベートした。放射性標識タンパク質を放射性免疫沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ［ｐＨ  ７．５］、１５０ｍＭ  ＮａＣＩ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）における細胞単層の溶解によって抽出した。
【０２４４】
免疫沈降およびウェスタンブロット法
放射性標識ポリペプチドをポリクローナルヤギ抗ＲＳＶＡ２抗体または抗Ｐタンパク質モノクローナル抗体（１Ｐ／０２１Ｐ／７６Ｐ）の混合物で４℃で一晩免疫沈降した。タンパク質Ｇ−アガロースビーズ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））３０μｌを添加することによって抗体タンパク質錯体を沈降させ、１時間４℃にインキュベートし、３００ｍＭ  ＮａＣｌを含有するＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄した。免疫沈降されたポリペプチドをドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１５％ポリアクリルアミド）によって電気泳動し、オートラジオグラフィーによって検出した。ウインドウズ（Ｗｉｎｄｏｗｓ）ＮＴ用のイメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いることによって、モレキュラー  ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）デンシトメーターでのデンシトメトリーによってオートラジオグラフで検出されたＮおよびＰタンパク質を定量化した。ウェスタンブロット法については、ベロ細胞を１．０のＭＯＩで各ウイルスに感染させ、感染後４８時間の時点でタンパク質溶解緩衝液中に細胞を溶解した。ポリクローナル抗ＲＳＶ抗体いよるブロットにおけるウイルスタンパク質の検出をルー（Ｌｕ）ら（２００２年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２８７１−２８８０、によって記載されたとおりに行った。
【０２４５】
ウイルスＲＮＡ合成のノーザンブロット法
ＲＳＶ  ＲＮＡ発現を検査するために、ベロ細胞またはＨＥｐ−２細胞をｒＡ２、ｒＡ２−ＰＰ２、またはｒＡ２−ＰＰ５に１．０のＭＯＩで感染させた。全細胞ＲＮＡを感染後４８時間の時点でＱＩＡａｍウイルスＲＮＡミニキット（キアジーン（Ｑｉａｇｅｎ））で調製した。同等量の全ＲＮＡをホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲル上で分離し、ターボブロッター装置（シュライヒャー＆シュネル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆  Ｓｃｈｎｅｌｌ）でナイロン膜（アマシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））上に移した。膜をＤＩＧで標識したＲＳＶ遺伝子特異的リボプローブでハイブリダイズした。プラスセンスＦタンパク質遺伝子プローブを用いてウイルスゲノムＲＮＡを検出し、マイナスセンスＰタンパク質遺伝子を用いてウイルスｍＲＮＡを検出した。リボプローブによる膜のハイブリダイゼーションは０５℃に行った。ハイブリダイズしたプローブからのシグナルをＤＩＧ発光検出キット（ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を使用して検出し、ＢｉｏＭＡＸフィルム（コダック（Ｋｏｄａｋ））への暴露によって視覚化した。
【０２４６】
結果
Ｐタンパク質リン酸化変異の生成
セリン１１６、１１７、および１１９（１１６／１１７／１１９［中央］領域）ならびに２３２および２３７（２３２／２３７［Ｃ末端領域］）でのＰタンパク質における５個のリン酸化部位は、肺炎ウイルスで十分に保存されている。ウイルス複製におけるＰタンパク質リン酸化の役割を検査するために、これら２つのクラスターにおけるセリン残基を突然変異を起こさせ、そのリン酸化の可能性を除去した。中央領域における３つのセリンは、それぞれ、ロイシン、アルギニン、およびロイシンの置換であり（Ｍｕｔｌ［ＬＲＬＳＳ］）、またはリン酸基の負電荷を模倣するアスパラギン酸（Ｍｕｔ２［ＤＤＤＳＳ］）であった。Ｃ末端領域における２つのセリンは、アスパラギン酸（Ｍｕｔ３［ＳＳＳＤＤ］）またはアラニン（Ｍｕｔ４［ＳＳＳＡＡ］）のいずれかに変化した。また、５つのセリンすべては、ＬＲＬＡＡ（Ｍｕｔ５）またはＬＲＬＤＤ（Ｍｕｔ６）に変化し、主要なＰタンパク質リン酸化部位のすべてを除去した。各変異体における置換残基の位置は図１４に要約されている。
【０２４７】
リン酸化不全Ｐタンパク質のインビトロ機能
変化したＰタンパク質の機能をＲＳＶ  ＣＡＴミニゲノムアッセイで評価した。ＭＶＡ−Ｔ７感染ＨＥｐ−２細胞をｐＬ、ｐＮ、および野生型または変異ｐＰとともにｐＲＳＶ
ＣＡＴでトランスフェクションし、ＣＡＴ遺伝子の発現をＣＡＴ−ＥＬＩＳＡによって測定した。各Ｐタンパク質変異体の機能を野生型Ｐタンパク質のものと比較したその相対活性として計算した。エラーバーは、３つの複製実験の標準偏差を示す。図１５Ａに示されているように、ＬＲＬによる３つの中央セリンの置換（レーン２）にはタンパク質機能に対する影響はほとんどなく、アスパラギン酸によるこれら３つの残基の置換（ＤＤＤ、レーン３）はタンパク質の機能をほぼ完全に無効にした。各位置を独立して評価するために、３つの単一のアスパラギン酸の置換を行った。図１５Ａに示されているように、Ｓ１１６Ｄは機能的ではなく（レーン４）、他の２つの変異体（ＳＩ１７Ｄ、レーン５、Ｓ１１９Ｄ、レーン６）は、レベルの減少にもかかわらず、機能的のままであった。しかし、アラニンによるＳｅｒ−１１６またはＳｅｒ−１１７／１１９の置換にはミニゲノムアッセイにおいてＰタンパク質機能に対する影響はなかった。これらの所見は、１１６／１１７／１１９でのセリンがＰタンパク質機能には必要ではなく、アスパラギン酸残基がＰタンパク質に対する構造的な影響を有しうることを示した。Ｃ末端リン酸化部位、２３２／２３７でのＰタンパク質突然変異、アラニン（レーン９）またはアスパラギン酸（レーン１０）による置換は、Ｐタンパク質機能を約１０〜２０％減少させた（図１５Ａ）。レポーター遺伝子活性のわずかに減少したレベルが、５つのセリンすべてを除去した変異体Ｐタンパク質を発現する細胞において検出された（ＬＲＬＡＡ、レーン１１、ＬＲＬＤＤ、レーン１２）。Ｐタンパク質変異体のすべては、ウェスタンブロット法によって測定されるように、これらのアッセイにおける野生型のものと同等のＰタンパク質のレベルを発現した。したがって、ミニゲノムアッセイは、ＲＳＶ  Ｐタンパク質からの５つのリン酸化部位のすべての除去が、インビトロのタンパク質機能に対する顕著な影響を有することがないことを示した。これらＰタンパク質変異体の中のタンパク質活性における差異は、Ｐタンパク質リン酸化の削減またはリン酸化部位の置換によってひき起こされるＰタンパク質構造の変化によるものと考えられる。
【０２４８】
Ｍｕｔ３（ＤＤＤＳＳ）はＰタンパク質機能をほぼ完全に無効にしたため、したがって、この変異体が野生型Ｐタンパク質の機能に対するドミナント・ネガティブ効果を示すかどうかを知ることは興味深かった。プラスミドｐＰ−ＤＤＤを、ｐＮ  ０．４μｇおよびｐＬ  ０．２μｇといっしょに異なる比の野生型Ｐタンパク質プラスミドｐＰ−ｗｔで同時トランスフェクションし、この変異体がミニゲノムアッセイにおける野生型Ｐタンパク質機能を妨げるかどうかを判定した（図１５Ｂ）。Ｔ７発現ベクター（ｐＣＩＴＥ）を対照として使用した。レポーター遺伝子発現のレベル（野生型Ｐタンパク質のレベルパーセンテージで表示）は、野生型ｐＰの量の減少と相関して減少したが、その原因として最も可能性が高いのはＮ、Ｐ、およびＬタンパク質間の次善最適比であった。しかし、ｐＰ−ＤＤＤは、ｐＣＩＴＥベクター対照のものと同様のレベルでレポーター遺伝子発現を減少させた。したがって、Ｍｕｔ３は、野生型Ｐタンパク質機能に対するドミナント・ネガティブ効果を有することはなかった。
【０２４９】
一部のＰタンパク質変異体を発現する細胞におけるｐＲＳＶ  ＣＡＴ／ＥＧＦＰミニゲノムの転写および複製をノーザンブロット分析によって分析した。ｍＲＮＡをアンチゲノムまたはリードスルーＲＮＡから十分に区別するために、ノーザンブロット法においてｐＲＳＶ  ＣＡＴ／ＥＧＦＰを用いた。ＣＡＴ  ｍＲＮＡおよびアンチゲノムＲＮＡは、ｐＰＤＤＤを発現する細胞において検出されず（図１５Ｃ）、この変異体Ｐタンパク質が機能的ポリメラーゼを形成できないことが確認された。ｐＲＳＶ  ＣＡＴミニゲノムアッセイによって機能的であったｐＰ−ＬＲＬ、ｐＰ−ＡＡ、およびｐＰ−ＬＲＬＡＡについては、ＣＡＴ  ｍＲＮＡおよびアンチゲノムＲＮＡが検出された。しかし、アンチゲノムＲＮＡの量は、ＬＲＬ残基の置換を含有するＰタンパク質変異体についてわずかに低かった
とみられる。
【０２５０】
細胞培養における組換えウイルスｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の複製
ウイルス複製に対するＰタンパク質リン酸化突然変異の影響を検査するために、ＲＳＶ
Ａ２アンチゲノムＤＮＡクローンへ２つの変異体を導入した。すなわち、１つは２つのＣ末端セリンでの突然変異（ＳＳＳＡＡ［ＰＰ２］）であり、もう１つは５つのセリンでの突然変異であった（ＬＲＬＡＡ［ＰＰ５］）。両方の組換えウイルスをトランスフェクションされたｃＤＮＡから得て、それぞれ、ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５と指定した。各ウイルスをベロ細胞で増幅させ、放出されたウイルスおよび細胞内ウイルスを採集した。ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５は、ベロ細胞において約２ｘ１０７ＰＦＵ／ｍｌの力価を有し、これは野生型ｒＡ２と同等のレベルであった。
【０２５１】
カラム培地へ放出されたｒＡ２−ＰＰ２（円）およびｒＡ２−ＰＰ５（三角形）の単一サイクル（ＭＯＩ＝１．０）および多重サイクル（ＭＯＩ＝０．０１）複製機構を、ＨＥｐ−２細胞およびベロ細胞において３５℃でｒＡ２（正方形）のものと比較した（図１６）。培養上清のアリコート（２００μｌ）を９６時間、２４時間の間隔をおいて採った。ウイルス力価は２つの実験の平均である。ベロ細胞においては、両方の変異体は野生型ｒＡ２のものよりもわずかに低いピーク力価に達した。しかし、ＨＥｐ−２細胞においては、ｒＡ２−ＰＰ２、および大いに、ｒＡ２−ＰＰ５は野生型ｒＡ２のものよりもはるかに低いピーク力価に達した。１．０のＭＯＩでは、ｒＡ２−ＰＰ２のピーク力価がわずかだけ減少した（０．４  ｌｏｇ１０）が、ｒＡ２−ＰＰ５は２．１  ｌｏｇ１０のピーク力価の減少を示した。０．０１のＭＯＩでは、それらのピーク力価の減少がさらに大きかった。すなわち、ｒＡ２−ＰＰ２では０．８  ｌｏｇ１０、ｒＡ２−ＰＰ５では２．３  ｌｏｇ１０であった（図１６）。
【０２５２】
ｒＡ２−ＰＰ５が、ベロ細胞と比較して感染ＨＥｐ−２細胞から非効率的に放出されたかどうかを検討するために、ＨＥｐ−２細胞またはベロ細胞をｒＡ２（充実バー）、ｒＡ２−ＰＰ２（斜線バー）、またはｒＡ２−ＰＰ５（白色バー）に感染させ、培養培地上清へ放出され、または細胞と結合したウイルスの量をプラークアッセイによってモニタリングした（図１７）。ＨＥｐ−２細胞においては、感染後２４時間の時点で、ｒＡ２およびｒＡ２−ＰＰ２の５０％未満が細胞と結合していた。一方、ｒＡ２−ＰＰ５の約９０％が細胞と結合していた。感染後４８時間の時点でｒＡ２およびｒＡ２−ＰＰ５の細胞内ウイルスのパーセンテージは約２０％に減少した。しかし、ｒＡ２−ＰＰ５の約８５％は、細胞に結合されたままであった（図１７、上パネル）。感染ＨＥｐ−２から得られた結果とは対照的に、ｒＡ２、ｒＡ２−ＰＰ２、およびｒＡ２−ＰＰ５は、感染ベロ細胞と結合したウイルスの同様のレベルを示した。ウイルスの大部分は、感染後２４時間の時点で細胞と結合し、ウイルスの約４０％が感染後４８時間の時点で細胞と結合したままであった（図１７、下パネル）。これらのデータは、Ｐタンパク質の脱リン酸化が、感染ベロ細胞ではなく、感染ＨＥｐ−２細胞からのウイルス放出に影響を及ぼすことを明らかに示した。
【０２５３】
ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５感染細胞におけるＰタンパク質のリン酸化
感染細胞におけるＰタンパク質のリン酸化のレベルを検査するために、１．０のＭＯＩでｒＡ２、ｒＡ２−ＰＰ２、またはｒＡ２−ＰＰ５にベロ細胞を感染させ、３５℃でインキュベートした。感染後１８時間の時点で、タンパク質をシステインおよびメチオニンが不足したＤＭＥＭ中［３５Ｓ］Ｃｙｓおよび［３５Ｓ］Ｍｅｔ（１００μＣｉ／ｍｌ）、またはリン酸が不足したＤＭＥＭ中３３Ｐｉ（１００μＣｉ／ｍｌ）で４時間放射性標識し、抗ＲＳＶポリクローナル抗体によって、または抗Ｐタンパク質モノクローナル抗体の混合のいずれかによって免疫沈降し、ＳＤＳ−ｐａｇｅ（１５％ポリアクリルアミド）によって分離し、オートラジオグラフを行った（図１８）。ＰはＰタンパク質の成熟形態を示し、Ｐ’はＰタンパク質の未熟形態を示す。ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５感染
細胞において発現したＰタンパク質のレベルは、３５Ｓ標識感染の免疫沈降によって示されているように、野生型ｒＡ２のものと同等であった。Ｐタンパク質の成熟形態の移動パターンは、Ｐタンパク質のリン酸化状態によって大幅に変更したとみられる。約３５ｋＤａで移動した主要なＰタンパク質種に加えて、迅速移動タンパク質結合も抗Ｐタンパク質抗体によって検出され、ｒＡ２−ＰＰ５の結合はさらに迅速に移動した。Ｐタンパク質のリン酸化は、ｒＡ２のものと比較して、ｒＡ２−ＰＰ２で約８０％減少し、ｒＡ２−ＰＰ５で９５％減少した。［３３Ｐ］リン酸で標識されたわずかに微量のＰタンパク質がｒＡ２−ＰＰ５感染細胞で検出された。
【０２５４】
抗Ｐモノクローナル抗体も、感染細胞における特異的なＮ−Ｐタンパク質相互作用によりＰタンパク質に加えてＮタンパク質を免疫沈降した。図１８に示されているように、抗Ｐ抗体によって免疫沈降されたＮタンパク質は、ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５感染細胞において減少した。Ｎタンパク質の減少は、ｒＡ２−ＰＰ２感染細胞（３０％）におけるよりもｒＡ２−ＰＰ５感染細胞（６０％）において大きかった。ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５は、抗ＲＳＶ抗体によって沈降されると野生型ｒＡ２のものと同様の比のＮ／Ｐタンパク質を有した。したがって、Ｐタンパク質における潜在的なリン酸化部位の除去は、Ｎタンパク質とＰタンパク質との相互作用に影響を及ぼした。
【０２５５】
ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５感染細胞におけるウイルスＲＮＡおよびタンパク質合成
ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５感染細胞におけるウイルスＲＮＡおよびタンパク質の合成を、ノーザンブおよびウェスタンブロット分析によって評価した。ベロ細胞またはＨＥｐ−２細胞を、野生型ｒＡ２、ｒＡ２−ＰＰ２、およびｒＡ２−ＰＰ５を１．０のＭＯＩで感染させ、感染後４８時間の時点でウイルスＲＮＡを抽出した。図１９Ａに示されているように、感染ベロ細胞においては、ゲノムＲＮＡ（ｖＲＮＡ）合成がｒＡ２−ＰＰ２でわずかに減少し、ｒＡ２−ＰＰ５でさらに減少した。しかし、Ｐタンパク質ｍＲＮＡレベルがｒＡ２−ＰＰ５感染細胞では減少しなかった。その代わりに、わずかに増大した量のｍＲＮＡがｒＡ２−ＰＰ５感染細胞で検出された。感染ＨＥｐ−２細胞においては、ｒＡ２−ＰＰ５は、ｍＲＮＡに対するゲノムＲＮＡの減少した比も有した。興味深いことに、ゲノムｃＲＮＡ／ｍＲＮＡ比の変化は、１．０のＭＯＩを使用した場合に限り感染経過の全体を通じて一貫して確認された。ウイルスのタンパク質合成もｒＡ２−ＰＰ５感染ベロ細胞で増大したかどうかを検査するために、ウェスタンブロット法を行った（図１９Ｂ）。わずかに増大したＧタンパク質合成（Ｇ’はＧタンパク質の部分的にグリコシル化された形態を示す）を除き、Ｎ、Ｐ、およびＭタンパク質のレベルはｒＡ２−ＰＰ５感染細胞で増大しなかった。したがって、ｒＡ２−ＰＰ５感染細胞において生じたｍＲＮＡの増大は、タンパク質発現の同時の増大をもたらすことはなかった。
【０２５６】
Ｐタンパク質リン酸化突然変異の遺伝子安定性
Ｐタンパク質リン酸化突然変異の遺伝子安定性を検査するために、ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５を５回連続、２通りでベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞で通過させた。ウイルス放出実験と一致して、ｒＡ２−ＰＰ５でＨＥｐ−２細胞における各通過の増大とともに感染に時間がかかり、減少した数のウイルス子孫が感染細胞から放出された。ウイルスＲＮＡは、第５の通過で感染細胞培養上清から抽出され、Ｐタンパク質遺伝子ｃＤＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって得られ、配列決定された。導入された突然変異のすべてが、ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の通過の全体を通じて維持された。
【０２５７】
マウスおよびコトンラットにおけるｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の複製
マウスおよびコトンラットの下気道におけるｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の複製を検査した（表５）。
【０２５８】
【表５】
2007531491.tif 000006
【０２５９】
細胞培養におけるその成長機構と一致して、ｒＡ２−ＰＰ５は、マウスおよびコトンラットの下気道における複製においてより弱毒化された。ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の複製は、それぞれ、マウスの肺では１．８４および３．０６  ｌｏｇ１０減少し、それぞれ、コトンラットの肺では１．８１および３．１１  ｌｏｇ１０減少した。
【０２６０】
実施例４：中和抗体の検出
材料と方法
細胞、培地、およびウイルス
アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション（ＡＴＣＣ、メリーランド州（ＭＤ）、ロックビル）から得たベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する最小必須培地（ＭＥＭ）中に維持した。野生型亜群Ａ  ＲＳＶ  Ａ２および亜群Ｂ  ＲＳＶ  ９３２０株をＡＴＣＣから得て、血清を含まないＯｐｔｉＭＥＭ  Ｉ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてベロ細胞で増殖させた。組換えＲＳＶ  Ａ２株およびｒＡ２−ＧＢＦＢは、以前に記載されており（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（２００１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８３：５９−６８）、ベロ細胞で増殖された。バクテリオファージＴ７ポリメラーゼ（ＭＶＡ−Ｔ７）を発現する修飾ワクシニアウイルスアンカラ株は、ベルナルド・モス（Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｍｏｓｓ）博士によって提供され、ＣＥＫ細胞中で増殖させた。
【０２６１】
血漿と血清
ウェスタンブロット法によってＲＳＶ血清陽性であることが試験された健康な成人から血漿試料を得た。アフリカミドリザルを１０５ｐｆｕのｒＡ２または９３２０ＲＳＶに鼻内感染させ、４週間後に同等量の相同性ＲＳＶで鼻内チャレンジした。サル血清を初感染の４週間後、およびチャレンジ感染の２週間後に採集した（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（２００１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８３：５９−６８）。サル４匹の群からの血清をプールし、中和アッセイにおいて使用した。中和アッセイ前に、すべての血漿および血清を３０分間５６℃で加熱不活性化し、残留性補体活性を除去した。ＡおよびＢ株のＲＳＶ感染は全世界で風土病であるため、ＲＳＶ抗体に対して陰性であり、または単一のＲＳＶ種のみに暴露されたヒト血清を得ることは困難である。したがって、亜群Ａ  ＲＳＶの野生型Ａ２株または亜群Ｂ  ＲＳＶの９３２０株で感染した動物から採集されたサル血清を用いて、新しく開発されたマイクロ中和アッセイの特異性および感受性を試験した。
【０２６２】
ｌａｃＺ遺伝子を発現するアンチゲノムＲＳＶ  ｃＤＮＡの構成
ＲＳＶ遺伝子開始部（配列番号：６）および遺伝子末端部の転写シグナルの管理下にｌａｃＺ遺伝子を発現する組換えＲＳＶの構成が図２０に要約されている。ＲＳＶ遺伝子末端部、遺伝子開始部配列、およびＫｐｎ  Ｉ部位を含有する一対のアニールオリゴヌクレオチド（上、配列番号：７、下、配列番号：８）を、ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５Ｈｉｓ／ｌａｃＺ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））のＮｏｔＩとＢｓｔＢＩの制限部位間のｌａｃＺ遺伝子の下流に挿入した。プラスミドをＫｐｎＩ制限酵素で消化し、ＸｍａＩ部位、Ｔ７プロモーター、およびｎｔ１〜２１２８のＲＳＶ配列（ＡｖｒＩＩ）を含有するｐＲＳＶ−Ｘ／Ａ（ｐＥＴ−Ｘ／Ａ）のＫｐｎＩ部位へクローン化した。ＫｐｎＩ部位
をＮＳ１遺伝子開始部とＮＳ１開始部位との間のｎｔ９３の位置でクイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）特定部位突然変異誘発キット（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって導入した。次いで、挿入ｌａｃＺ遺伝子を含有するＸｍａＩ〜ＡｖｒＩＩフラグメントをＡ２株（ｐＲＳＶＣ４Ｇ、ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４）由来のＲＳＶアンチゲノムｃＤＮＡクローンへ導入し、ＧおよびＦ遺伝子を有したキメラＲＳＶを亜群Ｂ  ＲＳＶ９３２０株（ｐＡ２−ＧｂＦｂ、チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら（２００１年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８３：５９−６８）のものによって置換した。ｒＲＳＶＣ４ＧおよびｐＡ２−ＧＢＦＢにおける挿入されたｌａｃＺ遺伝子を有するアンチゲノムｃＤＮＡをそれぞれ、ｐＡ−ｌａｃＺおよびｐＢ−ｌａｃＺと指定した。
【０２６３】
組換えＲＳＶの回収
ｌａｃＺ遺伝子、Ａ−ｌａｃＺ、およびＢ−ｌａｃＺを含有する組換えＲＳＶの回収を以前に記載されたとおり行った（ジン（Ｊｉｎ）ら（１９９８年）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４）。手短に言えば、ＨＥｐ−２細胞をＭＶＡ−Ｔ７に１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、ｐＮ  ０．４μｇ、ｐＰ  ０．４μｇ、ｐＬ  ０．２μｇ、およびｐＡ−ｌａｃＺまたはｐＢ−ｌａｃＺ  ０．８μｇでリポフェクトＡＣＥ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））によってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後、培養上清を用いて新しいベロ細胞に感染させ、回収ウイルスを増幅した。次いで、組換えウイルスをプラーク精製し、ベロ細胞で増幅させた。ウイルス力価をプラークアッセイによって測定し、プラークをポリクローナル抗ＲＳＶ  Ａ２血清（バイオジェネシス（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ））を用いて免疫染色によって数えた。ウイルスゲノムにおけるｌａｃＺ遺伝子の存在をＲＴ−ＰＣＲによって確認し、β−ガラクトシダーゼの発現をβ−ｇａｌ染色キット（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））による感染細胞の染色によって検査した。
【０２６４】
組織培養におけるＡ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺの複製
ベロ細胞およびＨＥｐ−２細胞におけるＡ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺの複製をｒＡ２およびｒＡ２ＧＢＦＢと比較した。６穴プレート中の細胞単層を０．３のｍ．ｏ．ｉ．で２通りに各ウイルスに感染させた。室温に１時間の吸着後、感染細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＯｐｔｉＭＥＭ  ２ｍｌで３５℃にインキュベートした。２４時間の間隔を置き、培養上清２５０μｌを除去し、ウイルス滴定前に−８０℃に保存した。採取した各アリコートを同量の新鮮培地で置き換えた。ウイルス力価をベロ細胞でプラークアッセイによって測定した。
【０２６５】
ウイルス感染細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現
Ａ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺによって発現されたβ−ガラクトシダーゼのレベルをウェスタンブロット法によって検査した。６穴プレート中のベロ細胞を０．０５のｍ．ｏ．ｉ．でウイルスに感染させ、全細胞抽出物を７日間２４時間の間隔を置いて採集した。ＳＤＳを含有する１２％ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離し、ナイロン膜に移した。ブロットを２％脱脂粉乳で遮断し、β−ガラクトシダーゼ（クローンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））に対するポリクローナル抗体でインキュベートした後、ＨＲＰ抱合二次抗体でインキュベートした。ＥＣＬ化学発光検出キット（アマシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））で検出後にＸ線フィルムへ暴露することによってタンパク質結合を検出した。
【０２６６】
Ａ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺによって生じたβ−ガラクトシダーゼタンパク質もその酵素活性によって検査した。９６穴プレート中のベロ細胞を種々の量のＡ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺに３通りで感染させ、３５℃に１〜５日インキュベートした。培養上清の除去後、細胞単層をＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液２００μｌ中で３７℃に１５分間
インキュベーションした。溶解緩衝液は、０．５７Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．０５Ｍ  ＫＣｌ、０．００５Ｍ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＮＰ−４０、２０ｍＭ  β−メルカプトエタノール、およびプロテアーゼインヒビターカクテル  （ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））  を含有し、緩衝液５ｍｌ当たりを１錠として用いた。プレート５分間２５００ｒｐｍで遠心分離し、透明溶解液１００μｌを新しい９６穴プレートに移した後、リン酸緩衝液、ｐＨ７．０中２０ｍＭ  β−メルカプトエタノールおよび０．７５ｍＭ  クロロフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノサイド（ＣＰＲＧ、ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を含有する基質溶液１００μｌを添加した。３７℃に１−２時間のインキュベーション後、波長５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での光学密度を、ＳＯＦＴｍａｘソフトウェア（モレキュラー  デバイセス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ、３４０ＰＣマイクロプレート分光光度計で測定した。
【０２６７】
マイクロ中和アッセイ
マイクロ中和アッセイを下記のプロトコールによって９６穴プレートで行った。加熱不活性化（３０分間５６℃）血清または血漿試料を９６穴プレート中で３通りに、最終容量１００μｌ中１：２０希釈モルモット補体（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有するＯｐｔｉＭＥＭ／２％ＦＢＳまたはＯｐｔｉＭＥＭ／２％ＦＢＳ培地で連続的に２倍に希釈した。容量５０μｌでＡ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺ（約１５０ｐｆｕ）を各ウェルに添加し、４℃に２時間インキュベートした。次いで、約５０，０００ベロ細胞（５０μｌ）を各ウェルに添加し、プレートを３５℃に３日間インキュベートした。培養上清を除去し、細胞単層をＰＢＳで２回洗浄し、３７℃に１５分間、溶解緩衝液２００μｌ中でインキュベートした。次いで、β−ガラクトシダーゼ酵素活性を上述したとおりＣＰＲＧ基質によるインキュベーションによって検出した。アッセイでは３．０のＯＤ５５０まで反応性であることが示された。各試験は、未感染細胞、ウイルスのみ、および既知の抗ＲＳＶ抗体価の陽性血清対照の対照ウェル含んだ。平均抗ＲＳＶ中和抗体価を、中和されていないウイルス感染対照ウェルと比較してＯＤ５５０における７０％減少をもたらす最高抗体希釈の逆ｌｏｇ２と定義した。
【０２６８】
プラーク減少中和アッセイ
プラーク減少中和アッセイ（ＰＲＮＴ）を一部の変更とともに以前に記載されているとおり行った（コーツ（Ｃｏａｔｅｓ）ら（１９６６年）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８３：２９９−３１３）。容量１００μｌ中の２倍連続希釈血清を、１：２０希釈モルモット補体または１５０ｐｆｕのＡ２の存在下の約１５０ｐｆｕのＡ２で４℃に２時間インキュベートした。抗体−ウイルス混合物を１２穴プレート中のベロ細胞単層に移した。室温に１時間の吸着後、接種材料を除去し、細胞単層を１％メチルセルロースおよび２％ＦＢＳを含有する１ｘＬ１５培地でオーバーレイした。６日間３５℃のインキュベーション後、ポリクローナル抗ＲＳＶ血清でプレートを免疫染色した。プラークを数え、抗血清を含有しないウイルス対照ウェルと比較した。各試験のために、ウイルスのみ、未感染細胞、既知の抗ＲＳＶ抗体価の陽性対照血清の対照を用いて、アッセイの一貫性をモニタリングした。抗ＲＳＶ中和抗体価を中和されていないウイルス感染対照ウェルと比較してプラーク数の５０％減少を示した最高抗体希釈の逆ｌｏｇ２と定義した。
【０２６９】
結果
β−ガラクトシダーゼを発現する組換えＲＳＶの複製
β−ガラクトシダーゼの高レベルの発現を達成するために、ＲＳＶによって発現された第１の遺伝子としてＲＳＶゲノムの３’末端でｌａｃＺ遺伝子を挿入した。この場所への外来遺伝子の挿入は、下流ＲＳＶ遺伝子発現の相対比に対する最小の影響を有することが期待されたが、したがって、ウイルス複製に対する最小限の影響を有することが期待され
た。挿入されたｌａｃＺ遺伝子、Ａ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺを含有する組換えＲＳＶは、ＨＥｐ−２細胞から回収され、プラーク精製され、ベロ細胞で増幅された。
【０２７０】
ウイルス複製に対する３．２ｋｂ  ｌａｃＺ遺伝子の影響は、多段階成長周期分析によって検査された。ベロ細胞またはＨＥｐ−２細胞を組換えＲＳＶ（Ａ−ｌａｃＺ、Ｂ−ｌａｃＺ、ｒＡ２、またはｒＡ−ＧＢＦＢ）に０．３のｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、７日間３５℃にインキュベートした。培養上清を６日間毎日採集し、ベロ細胞でプラークアッセイによってウイルス量を滴定した。図２１に示されているように、Ａ−ｌａｃＺの成長はｒＡ２よりもわずかにゆっくりであり、最終的にｒＡ２と同様のピーク力価に達した。ｒＡ−ＧＢＦＢはｒＡ２よりも不十分に複製した。Ｂ−ｌａｃＺの成長はＡ−ｌａｃＺおよびｒＡ−ＧＢＦＢよりもさらにゆっくりであった。２日目および３日目のＢ−ｌａｃＺの力価はｒＡ−ＧＢＦＢの１０分の１未満であったが、５日目にはピーク力価に達し、これはｒＡ−ＧＢＦＢの２倍以内であった。
【０２７１】
ＨＥｐ−２細胞においては、Ａ−ｌａｃＺはｒＡ２のそれと同様に成長したが、Ｂ−ｌａｃＺはｒＡ−ＧＢＦＢよりもゆっくりであった。２日目および３日目のＢ−ｌａｃＺのウイルス力価は、ｒＡ−ＧＢＦＢの約５０分の１であったが、減少は６日目には明らかではなかった。Ａ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺの成長速度の減少は、結果として下流のタンパク質発現すべての全体的な減少をもたらすゲノム長の増大によると考えられた。組換えＲＳＶにおける挿入されたｌａｃＺ遺伝子は、ベロ細胞の１０回の通過後にウイルスプラークの大多数についてβ−ガラクトシダーゼの陽性染色によって検査されたとおり安定であることが示された。
【０２７２】
感染細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現
感染細胞において生じるβ−ガラクトシダーゼタンパク質のレベルを検査するために、ベロ細胞をＡ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺに０．０５のｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。感染細胞を２４時間毎に採集し、抗β−ガラクトシダーゼ抗体を用いてウェスタンブロット法によってβ−ガラクトシダーゼを検出した。図２２Ａに示されているように、β−ガラクトシダーゼは、感染の２日目から容易に検出されるレベルでＡ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺ感染細胞において生じ、タンパク質レベルは感染の４日目にピークに達した。Ｂ−ｌａｃＺはＡ−ｌａｃＺほど効率的に複製することはなかったが、感染の最初の２日でＡ−ｌａｃＺよりもわずかに高いβ−ガラクトシダーゼのレベルを生じ、これはＢ−ｌａｃＺがより多く細胞結合したためと考えられる。β−ガラクトシダーゼ酵素活性もＡ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺ感染ベロ細胞において検出された。図２２Ｂに示された量で各ウイルスに細胞を感染させ、感染細胞を毎日採集し、細胞溶解物を９６穴プレート中ＣＰＲＧでインキュベートすることによって酵素活性について分析し、ＯＤ５５０を分光光度計によって測定した。基質としてクロロフェノールレッド−β−ガラクトシダーゼ（ＣＰＲＧ）を用いるβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の測定によっても、１２０ｐｆｕ超を用いてベロ細胞を９６穴プレートで感染させた場合に感染の４日目に酵素活性が飽和したことが示された（図２２Ｂ）。酵素活性の線形反応が、約１５０ｐｆｕのＡ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺを用いた場合に感染の２日目から４日目に確認された。したがって、このウイルスの量および３日のインキュベーション時間をマイクロ中和アッセイのために選択した。
【０２７３】
ＲＳＶを発現するβ−ガラクトシダーゼを用いたマイクロ中和アッセイ
ウイルス複製はβ−ガラクトシダーゼ活性によってモニタリングされうるため、われわれは、ウイルス中和がこのマーカーを用いて測定されうるかどうかを判定した。連続的に２倍に希釈した成人血清またはＲＳＶに感染させたサルから採集した血清を、１：２０希釈補体または１５０ｐｆｕのＢ−ｌａｃＺの存在下の１５０ｐｆｕのＡ−ｌａｃＺで４℃に２時間インキュベートした後、９６穴プレート中のベロ細胞を添加した。３日間３５℃
のインキュベーション後、細胞を溶解し、ＣＰＲＧの転換をモニタリングすることで分光光度計によってβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。β−ガラクトシダーゼのレベルは、中和されていないウイルス対照に対するＯＤ５５０の減少率として表示された。図２３Ａに示されているように、成人血清が９．０  ｌｏｇ２まで希釈された場合に、β−ガラクトシダーゼ活性の大幅な減少が検出された。計算されたＯＤ５５０の７０％減少は、試験されたヒト血清（三角形）では９．０  ｌｏｇ２であり、したがって、９．０  ｌｏｇ２の逆希釈を抗ＲＳＶ中和抗体価と定義した。ｒＡ２（ダイヤモンド）または９３２０（正方形）ＲＳＶ感染サルから得られた血清を、Ａ−ｌａｃＺまたはＢ−ｌａｃＺ中和ウイルスを用いてこのアッセイによって試験した場合、それぞれ、９．０  ｌｏｇ２および１０．０ｌｏｇ２の中和抗体価が測定された。図２３Ａに示されているように、抗体価のばらつきは、カットオフを７０％で規定した場合には明らかではなかった。また、ＯＤ５５０の７０％の減少によって得られる抗体価は、プラーク減少中和アッセイにより好ましかった。したがって、中和抗体価は、中和されていないウイルス感染対照ウェルと比較してＯＤ５５０の７０％の減少を示した抗血清の最高逆ｌｏｇ２と定義された。
【０２７４】
マイクロ中和アッセイで使用された血清が実際に抗ＲＳＶ抗体を含有したことを試験するために、ウェスタンブロット分析を行った。ベロ感染をＡ２、９３２０ＲＳＶに感染またはモック感染させ、感染の３０時間後の全細胞溶解物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ナイロン膜に移し、図２３Ｂに示されているとおり各血清でブロットした。ヒトおよびサル血清は、完全（Ｇ）または部分的（Ｇ’）にグリコシル化されたＧタンパク質と反応した。抗Ｆタンパク質はウェスタンブロット法によっては検出されなかったが、免疫沈降によっては検出された。一部のウイルス内部タンパク質（Ｎ、Ｐ、およびＭ）に対する抗体も検出された。ヒト血清はＡ２および９３２０のタンパク質に対して十分に反応し、この個人が亜群Ａおよび亜群Ｂ  ＲＳＶの両方へ暴露されているらしいことを示した。ｒＡ２または９３２０ＲＳＶに感染したサルは、異種Ｇタンパク質よりも相同Ｇタンパク質とはるかに十分に反応した（図２３Ｂ）。
【０２７５】
マイクロ中和アッセイのプラーク減少アッセイと比較
本発明のこのマイクロ中和アッセイを、コーツ（Ｃｏａｔｅｓ）ら（１９６６年）Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．８３：２９９−３１３によって記載されたプラーク減少中和アッセイと比較した。異なるレベルの抗ＲＳＶ中和抗体のＲＳＶ感染サル血清試料、および高レベルの抗ＲＳＶ抗体を含有する成人血清を比較において用いた。各中和アッセイを相同または異種ＲＳＶで行った。全体的に、マイクロ中和アッセイによって測定された抗体レベルは、プラーク減少アッセイと同等であった（表６）。
【０２７６】
【表６】
2007531491.tif 000007
【０２７７】
例えば、感染後４週間で採集されたｒＡ２感染サル血清は、マイクロ中和アッセイによ
って９．５  ｌｏｇ２の力価を示したが、プラーク減少中和アッセイによって８．０  ｌｏｇ２の力価が測定された。高い抗ＲＳＶ中和抗体価は、両方のアッセイでの異種ウイルスよりも中和アッセイで相同ウイルスを用いた場合にＲＳＶ感染サル血清で検出されたが、顕著な交差反応が確認された。予想どおり、抗Ａ２抗体は、マイクロ中和アッセイにおいてＢ−ｌａｃＺよりもＡ−ｌａｃＺを大いに十分に中和した（２  ｌｏｇ２より高く）。しかし、抗９３２０抗体を測定すると差異は明らかではなく、感染後４週間に採集された９３２０感染サル血清についてＡ−ｌａｃＺよりもＢ−ｌａｃＺでわずかだけ高い力価が検出された（表４）。ｒＡ２または９３２０に感染したサルの免疫後およびチャレンジ後の血清を用いてプラーク減少中和アッセイを行ったところ、相同ウイルスを用いた場合にも高い力価が検出された。これは、２つのＲＳＶ亜群間には顕著な交差反応があったが、２つの亜群の抗原差が中和アッセイによって区別されうることを示した。ヒト血清は、２つの異なる中和アッセイによって明らかにされる同様のレベルでのＡ２および９３２０に対する中和抗体を包含した。
【０２７８】
実施例５：ＲＳＶ  Ｍ２−２タンパク質の機能
上述したとおり、Ｍ２−２タンパク質は、ウイルスのライフサイクルにおけるＲＳＶ  ＲＮＡ複製および転写の調節に関与している。複製および転写におけるＭ２−２の役割をさらに評価するために、細胞培養におけるウイルス複製に対するＭ２−２の過剰発現の影響、およびＭ２−２における突然変異の種々の影響を検査した。
【０２７９】
Ｍ２−２の過剰発現
ＲＳＶ  Ａ２  Ｍ２−２転写ユニットを、遺伝子開始部または遺伝子末端部配列および適切な制限酵素部位を含有するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅させ、ＮＳ  １遺伝子（第１の位置）の上流、またはＦ遺伝子とＭ２遺伝子（第８の位置）との遺伝子間領域へクローン化した。Ｍ２−２ＯＲＦがゲノムのその正常な位置の上流へ移動することによりＭ２−２の過剰発現が生じ、これは結果として、Ｍ２−２活性を低下させる突然変異を獲得する遺伝学的に不安定なウイルスをもたらした。したがって、Ｍ２−２の過剰発現はＲＳＶによって許容されなかった。
【０２８０】
表７は、配列分析、および種々のＭ２−２変異体タンパク質がミニゲノムアッセイにおいて発現を阻害した程度の分析の要約である。Ｍ２−２Ｇ１は、ゲノムの第１の位置でのＭ２−２のＯＲＦを有し、３ｎｔ（Ｍ２−２Ｇ１）または４９ｎｔ（Ｍ２−２Ｇ１−長）Ｍ２−２／ＮＳ−１遺伝子間配列を示す。Ｍ２−２Ｇ８ウイルスは、ゲノム第８の位置でＭ２−２ＯＲＦを有する。表に示されているとおり、Ｍ２−２Ｇ８＃Ａは突然変異を獲得せず、ミニゲノムアッセイにおける全機能を有したが、しかし、このウイルスにおいては、Ｍ２−２タンパク質発現は野生型ＲＳＶにおけるほど顕著に大きくない。
【０２８１】
【表７】
2007531491.tif 000008
【０２８２】
Ｍ２−２機能のインビトロ分析
Ｍ２−２タンパク質は、ＲＳＶミニゲノムシステムにおいて強いインヒビターであるこ
とが示されている（コリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ）ら（１９９６年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９３：８１−８５）。したがって、その機能をインビトロアッセイで検査した。Ｍ２−２をさらに特徴づけるために、Ｍ２−２開始コドンの用法、ならびにＮ末端とＣ末端の切断およびアミノ酸置換のＭ２−２インビトロ機能に対する影響を検査した。
【０２８３】
Ｍ２−２  ｍＲＮＡは、その５’末端で３つのＡＵＧを含有する。これらのＡＵＧがすべてＭ２−２タンパク質を翻訳するために使用されうるかどうか決定するために、３つのＡＵＧのうち２つをＡ２  Ｍ２−２遺伝子の突然変異誘発から除去し、３つのＡＵＧのうち１つから翻訳されたタンパク質をインビトロ分析した（図２５）。第１のＡＵＧから翻訳されたタンパク質（Ｍ２−Ａ１）は、ｗｔ  Ｍ２−２（３つのＡＴＧをすべて有する）と同様の活性を有した。第２のＡＵＧから翻訳されたタンパク質（Ｍ２−Ａ２）は、Ｍ２−Ａ１よりもわずかに低い活性を有した。第３のＡＵＧから翻訳されたタンパク質（Ｍ２−Ａ３）は、インビトロで機能しなかった。したがって、この試験は、Ｍ２−２  ｍＲＮＡに存在する第１または第２のＡＵＧのいずれかを用いて、機能的Ｍ２−２タンパク質を製造することができ、第２および／または第３のＡＵＧの強制的な利用により、活性の低下したＭ２−２が製造されうることを示した。
【０２８４】
Ｍ２−２タンパク質の構造および機能をさらに分析するために、一連の欠失変異体を構成した。タンパク質をＮ末端またはＣ末端のいずれかより欠失させた（表８）。そのＮ末端からのわずか６個ほどのアミノ酸の切断によりＭ２−２機能の完全な喪失が生じた。しかし、Ｃ末端からの欠失によるＭ２−２切断変異体は、部分的な機能を維持した。
【０２８５】
【表８】
2007531491.tif 000009
【０２８６】
一連の単一および二重のアミノ酸置換がＭ２−２で行われ、変異体Ｍ２−２タンパク質がそのインビトロ阻害活性について試験された。Ｍ２−２読み取り枠をＲＴ／ＰＣＲによって増幅させ、Ｔ７プロモーターの管理下にｐＣｉｔｅ２ａ／３ａベクターへクローン化した。Ｍ２−２におけるアミノ酸置換突然変異は、Ｍ２−２発現プラスミドで行われた。発現された変異体Ｍ２−２タンパク質の機能をミニゲノムアッセイによって以前に記載されているとおり分析した（タン（Ｔａｎｇ）ら（２００１年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７５：１１３２８−１１３３５）。手短に言えば、ＨＥｐ−２細胞を１．０のｍ．ｏ．ｉ．でＭＶＡ−Ｔ７に感染させ、ｐＬ、ｐＮ、ｐＰ、およびｐＲＳＶ  ＣＡＴミニゲノムで種々のＭ２−２変異体プラスミドといっしょにトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、細胞溶解物をＣＡＴタンパク質のレベルについて分析した。ｗｔ  Ｍ２−２がＲＳＶミニゲノム発現を強く阻害し、Ｍ２−２変異体の各々による阻害のレベルを、ｗｔ
Ｍ２−２のものと比較した相対活性として表示した。表９に示されているように、単一および二重の置換のいずれもＭ２−２機能を完全に破壊すことはなく、Ｉｌｅ６の突然変異が最大の効果を有した。
【０２８７】
【表９】
2007531491.tif 000010
【０２８８】
上述の発明は、明瞭さと理解のために詳細に説明されているが、この開示を読み、形態および細部における種々の変更が発明の真の範囲を逸脱することなしになされうることが当業者には明らかであろう。例えば、上述されたすべての方法および装置は、種々の組合せで使用されうる。本出願に引用されたすべての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書は、各個別の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書が、すべての目的のために参照によって組込まれることが個別に示されたのと同一程度に、すべての目的のためにその全体が参照によって組込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】種々の肺炎ウイルスの荷電残基が豊富な領域フランキング位置１７２−１７６を示す残基１６１〜１８０のＰタンパク質の配列アラインメント：ＲＳＶ−Ａ２、ヒトＲＳＶ亜群Ａ２（配列番号：９）、ＲＳＶ−Ｂ１、ヒトＲＳＶ亜群Ｂ１（配列番号：１０）、ＯＲＳＶ、ヒツジＲＳＶ  （配列番号：１１）、ＢＲＳＶ、ウシＲＳＶ（配列番号：１２）、ＡＰＶ、鳥類肺炎ウイルス（配列番号：１３）、およびＰＶＭ、マウスの肺炎ウイルス（配列番号：１４）。以下の変異体も示されている。Ｇ１７２Ｓ、１７２位でＳｅｒによって置換されたＧｌｙ（配列番号：１５）、Ｅ１７６Ｇ、１７６位でＧｌｙによって置換されたＧｌｕ（配列番号：１６）、Ｇ１７２Ｓ／Ｅ１７６Ｇ、Ｇ１７２ＳおよびＥ１７６Ｇを含有する二重変異体（配列番号：１７）、１７４−１７６Ａ、Ａｌａによって置換された１７４位〜１７６位の３つの連続荷電残基（配列番号：１８）、Δ１６１−１８０、残基１６１〜１８０の内部欠失、およびΔＣ６、残基２３６〜２４１のＣ末端欠失。
【図２】Ａ．ＲＳＶ  Ａ２  Ｍ２−１タンパク質配列アラインメント（Ａ２、配列番号：１９）およびマウスの肺炎ウイルスＭ２−１タンパク質（ＰＶＭ、配列番号：２０）。保存性Ｃｙｓ３Ｈｉｓ１モチーフが示されている。Ｂ．ＲＳＶ  ｌａｃＺミニゲノムアッセイにおけるＲＳＶおよびＰＶＭ  Ｍ２−１タンパク質の相対活性を示す線グラフ。
【図３】Ａ．ＲＳＶ（白地に黒点）およびＰＶＭ（黒地に白点）Ｍ２−１と比較したＲＰおよびおよびＰＲ  Ｍ２−１キメラタンパク質を示す概略図。Ｂ．ＲＳＶ  ｌａｃＺミニゲノムアッセイにおけるＲＰおよびＰＲキメラＭ２−１タンパク質の相対活性を示す線グラフ。
【図４】Ａ．各ＰＲ  Ｍ２−１変異体ＰＲ１−ＰＲ１９のＰＶＭからＲＳＶへ変化した残基を示すＭ２−１Ｎ末端変異体の配列アラインメント。ＰＲ１、配列番号：２１、ＰＲ２、配列番号：２２、ＰＲ３、配列番号：２３、ＰＲ４、配列番号：２４、ＰＲ５、配列番号：２５、ＰＲ６、配列番号：２６、ＰＲ７、配列番号：２７、ＰＲ８、配列番号：２８、ＰＲ９、配列番号：２９、ＰＲ１０、配列番号：３０、ＰＲ１１、配列番号：３１、ＰＲ１２、配列番号：３２、ＰＲ１３、配列番号：３３、ＰＲ１４、配列番号：３４、ＰＲ１５、配列番号：３５、ＰＲ１６、配列番号：３６、ＰＲ１７、配列番号：３７、ＰＲ１８、配列番号：３８、ＰＲ１９、配列番号：３９。Ｂ．ＲＳＶ  ｌａｃＺミニゲノムアッセイにおける相対活性を示す棒グラフ、各変異体によって表わされたβ−ガラクトシダーゼはＲＳＶ  Ｍ２−１に標準化されている。
【図５】Ａ．各ＲＳＶ  Ｍ２−１変異体ＲＳ１−ＲＳ１１のＲＳＶからＰＶＭへ変化した残基を示すＭ２−１Ｎ末端変異体の配列アラインメント。ＲＳ１、配列番号：４０、ＲＳ２、配列番号：４１、ＲＳ３、配列番号：４２、ＲＳ４、配列番号：４３、ＲＳ５、配列番号：４４、ＲＳ６、配列番号：４５、ＲＳ７、配列番号：４６、ＲＳ８、配列番号：４７、ＲＳ９、配列番号：４８、ＲＳ１０、配列番号：４９、ＲＳ１１、配列番号：５０。Ｂ．Ｍ２−１変異体の相対活性を示す棒グラフ、各変異体によって表わされたβ−ガラクトシダーゼのレベルはｗｔ  ＲＳＶ  Ｍ２−２に標準化されている。
【図６】Ａ．Ｍ２−１変異体におけるｌａｃＺおよびＭ２−１の相対発現レベルを示すノーザンブロット法。Ｂ．抗Ｍ２−１モノクローナル抗体で放射性標識された細胞からのＲＮＡの共免疫沈降法。
【図７】Ａ．抗Ｍ２−１モノクローナル抗体で放射性標識された細胞からのＮおよびＭ２−１タンパク質の共免疫沈降法。Ｂ．抗ＲＳＶ抗体で放射性標識された細胞からのＮおよびＭ２−１タンパク質の共免疫沈降法。
【図８】ＮおよびＰタンパク質を一時的に発現する細胞におけるＮ−Ｐ相互作用の免疫沈降法。
【図９】ミニゲノムアッセイにおけるＰタンパク質変異体の相対活性レベルを示す棒グラフ。挿入部分はウエスタン分析によるＮおよびＰタンパク質発現レベルを示す。
【図１０】異なる温度でプラーク形成を示す顕微鏡写真。
【図１１】ｒＡ２−Ｐ１７２変異およびｒＡ２−Ｐ１７６変異体の成長機構を示す線グラフ。
【図１２】野生型および変異体ＲＳＶ感染細胞からのウイルスタンパク質の免疫沈降法。
【図１３Ａ】通過中のｒＡ２−Ｐ１７６の復帰を示す配列分析。ｒＡ２−Ｐ１７６（配列番号：５１）、復帰突然変異Ｅ１７６Ｄ（配列番号：５２）、およびｗｔ（配列番号：５３）からの残基１７６の領域におけるＰ遺伝子の配列。
【図１３Ｂ】種々の温度でのＥ１７６Ｄ復帰突然変異の成長を示す棒グラフ。
【図１４】中央領域（ｎｔ１０６−１２１）およびＣ末端領域（ｎｔ２２６−２４１）におけるＰタンパク質の配列アラインメント。これらの領域におけるセリン残基には下線が引かれている。示されているＰタンパク質は、ＲＳＶ−Ａ２、ヒトＲＳＶ亜群Ａ２株（中央、配列番号：５４、Ｃ末端、配列番号：５５）、長、ヒトＲＳＶ亜群Ａ長株（中央、配列番号：５６、Ｃ末端、配列番号：５７）、Ｂ１８５３７、ヒトＲＳＶ亜群Ｂ株１８５３７（中央、配列番号：５８、Ｃ末端、配列番号：５９）、ＭＰＶ、ヒトメタニューモウイルス（中央、配列番号：６０、Ｃ末端、配列番号：６１）、ウシ、ウシＲＳＶ（中央、配列番号：６２、Ｃ末端、配列番号：６３）、鳥類、鳥類肺炎ウイルス（中央、配列番号：６４、Ｃ末端、配列番号：６５）、およびヒツジ、ヒツジＲＳＶ（中央、配列番号：６６、Ｃ末端、配列番号：６７）からのＰタンパク質である。Ｐタンパク質変異体Ｍｕｔｌ−Ｍｕｔ６も描かれている。Ｍｕｔｌ（中央、配列番号：６８、Ｃ末端、配列番号：６９）、Ｍｕｔ２（中央、配列番号：７０、Ｃ末端、配列番号：７１）、Ｍｕｔ３（中央、配列番号：７２、Ｃ末端、配列番号：７３）、Ｍｕｔ４（中央、配列番号：７４、Ｃ末端、配列番号：７５）、Ｍｕｔ５（中央、配列番号：７６、Ｃ末端、配列番号：７７）、Ｍｕｔ６（中央、配列番号：７８、Ｃ末端、配列番号：７９）。
【図１５】ＲＳＶ  Ｐタンパク質リン酸化変異体の機能的分析。Ａ．１１６位、１１７位、１１９位、２３２位、および／または２３７位でリン酸化部位を欠く変異体の相対転写活性を示す棒グラフ。Ｂ．野生型Ｐタンパク質の存在下に変異体の相対活性を示す棒グラフ。Ｃ．１つもしくはそれ以上のリン酸化部位を欠く変異体Ｐタンパク質を発現する細胞におけるＲＳＶＣＡＴ／ＥＧＦＰレポーターミニゲノムの転写および複製のノーザン分析。
【図１６】Ｐリン酸化部位変異体ＲＳＶ  ｒＡ２−ＰＰ２およびｒＡ２−ＰＰ５の相対成長機構を示す線グラフ。
【図１７】種々のリン酸化変異体で細胞関連ウイルスの相対比率を示す棒グラフ。
【図１８】野生型またはリン酸化変異体に感染したＲＳＶ感染細胞も免疫沈降法。
【図１９】Ａ．リン酸化変異体に感染した細胞におけるゲノムまたはＰタンパク質ＲＮＡの発現レベルのノーザン分析。Ｂ．ポリクローナルＲＳＶ抗体で検出されたＲＳＶタンパク質の相対発現レベルを示すウエスタン分析。
【図２０】ＲＳＶ−ｌａｃＺコンストラクト示す概略図。
【図２１】Ａ．ベロ細胞における組換えｌａｃＺウイルスの複製を示す線グラフ。Ｂ．ＨＥｐ−２細胞における組換えｌａｃＺウイルスの複製を示す線グラフ。
【図２２】Ａ．抗β−ガラクトシダーゼ抗体を用いることによるＡ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺ感染細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現のウエスタン分析。Ｂ．Ａ−ｌａｃＺおよびＢ−ｌａｃＺ感染細胞における相対β−ガラクトシダーゼ活性を示す線グラフ。
【図２３】Ａ．マイクロ中和アッセイによる中和抗ＲＳＶ抗体の検出を示す線グラフ。Ｂ．成人血清およびＲＳＶ感染サル血清による感染細胞のウエスタン分析。
【図２４】Ａ．ヒトＲＳＶ株Ａ２のリンタンパク質（Ｐ）の配列（配列番号：８３、遺伝子バンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）番号（ＩＤ）７４９１５）。Ｂ．ヒトＲＳＶ株Ａ２のＭ２−２タンパク質の配列（配列番号：８４）。
【図２５】Ａ．野生型Ｍ２−２および３つの変異体（Ｍ２−Ａ１、Ｍ２−Ａ２、およびＭ２−Ａ３）における潜在的な開始コドンの位置を示す概略図。Ｂ．Ｍ２−２開始コドン変異のインビトロ活性を示す線グラフ。
【図１】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2007531491.tif 000021
【図１２】
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2007531491.tif 000023
2007531491.tif 000024
【図１４】
2007531491.tif 000025
2007531491.tif 000026
【図１６】
2007531491.tif 000027
【図１７】
2007531491.tif 000028
【図１８】
2007531491.tif 000029
2007531491.tif 000030
【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月23日(2006.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒化表現型を有し、かつリンタンパク質（Ｐ）を含んで成り、前記リンタンパク質が、リン酸化部位を除去する少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項２】
前記リンタンパク質が少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成り、前記置換アミノ酸残基がリン酸化部位を除去する、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３】
前記少なくとも１つの置換アミノ酸残基がセリンを置換する、請求項２に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４】
前記少なくとも１つの置換アミノ酸残基が、１１６位、１１７位、１１９位、２３２位、および２３７位より成る群から選択される１つもしくはそれ以上の位置でセリンを置換する、請求項２に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項５】
置換アミノ酸残基が、１１６位、１１７位、１１９位、２３２位、および２３７位でセリンを置換する、請求項４に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項６】
前記リンタンパク質が、Ｓ１１６Ｌ、Ｓ１１６Ａ、およびＳ１１６Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ１１７Ｒ、Ｓ１１７Ａ、およびＳ１１７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ１１９Ｌ、Ｓ１１９Ａ、およびＳ１１９Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ２３２ＡおよびＳ２３２Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換と、Ｓ２３７ＡおよびＳ２３７Ｄより成る群から選択されるアミノ酸置換とを含んで成り、または前記リンタンパク質がかかるリンタンパク質の人為的保存性変形物である、請求項５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項７】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項１に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項８】
請求項１に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項９】
前記核酸がＤＮＡである、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
前記核酸がＲＮＡである、請求項８に記載の核酸。
【請求項１２】
前記核酸がＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムである、請求項８に記載の核酸。
【請求項１３】
請求項８に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項１４】
プラスミドを含んで成る、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１に記載のリンタンパク質、またはその人為的保存性変形物。
【請求項１６】
請求項１５に記載のリンタンパク質をコードする核酸。
【請求項１７】
免疫学的に有効量の請求項１に記載の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項１８】
生理学的に許容できるキャリアをさらに含んで成る、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項１９】
アジュバントをさらに含んで成る、請求項１７に記載のワクチン。
【請求項２０】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を生成するための方法であって、生理学的に許容できるキャリアで請求項１に記載の組換えＲＳＶを前記個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項２１】
前記免疫反応が防御免疫反応である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えＲＳＶが前記個人の上気道に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えＲＳＶが鼻咽頭に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えＲＳＶが、スプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
弱毒化表現型を有し、Ｍ２−１タンパク質を含んで成り、そのＭ２−１タンパク質が、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項２６】
前記Ｍ２−１タンパク質が、３位、１２位、１４位、１６位、１７位、および２０位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基を含んで成る、請求項２５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２７】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項２５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項２８】
請求項２５に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項２９】
免疫学的に有効量の請求項２５に記載の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項３０】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を生成するための方法であって、生理学的に許容できるキャリアで請求項２５に記載の組換えＲＳＶを前記個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項３１】
弱毒化表現型を有し、キメラＭ２−１タンパク質を含んで成り、そのキメラＭ２−１タンパク質がＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質からの複数の残基、およびマウス（ＰＶＭ）Ｍ２−１タンパク質の肺炎ウイルスからの複数の残基を含んで成る、組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項３２】
免疫学的に有効量の請求項３１に記載の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項３３】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を生成するための方法であって、生理学的に許容できるキャリアで請求項３１に記載の組換えＲＳＶを前記個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項３４】
変化した活性を有するＭ２−１タンパク質を同定する方法であって、前記方法が、
１つもしくはそれ以上のキメラＭ２−１タンパク質を提供し、そのキメラＭ２−１タンパク質の各々が第１のウイルスの株からのＲＳＶ  Ｍ２−１タンパク質かの複数の残基、および第２のウイルスの株からのＭ２−１タンパク質からの複数の残基を含んで成るステップと、
変化した活性を有する少なくとも１つの候補のキメラＭ２−１タンパク質を同定するステップと
を含んで成る方法。
【請求項３５】
弱毒化表現型を有し、Ｍ２−２タンパク質を含んで成り、そのＭ２−２タンパク質が少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）。
【請求項３６】
前記Ｍ２−２タンパク質が少なくとも１つの置換アミノ酸残基を含んで成る、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３７】
前記Ｍ２−２タンパク質が少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失を含んで成る、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３８】
前記Ｍ２−２タンパク質が、１位、３位、および７位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項３９】
前記Ｍ２−２タンパク質が、アミノ酸残基１−２の欠失を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４０】
前記Ｍ２−２タンパク質が、アミノ酸残基１−６の欠失を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４１】
前記Ｍ２−２タンパク質が、Ｎ末端６アミノ酸残基の欠失、Ｎ末端８アミノ酸残基の欠失、Ｎ末端１０アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端１アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端２アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端４アミノ酸残基の欠失、Ｃ末端８アミノ酸残基の欠失、およびＣ末端１８アミノ酸残基の欠失より成る群から選択される欠失を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４２】
前記Ｍ２−２タンパク質が、２位、４位、５位、６位、１１位、１２位、１５位、２５位、２７位、３４位、４７位、５６位、５８位、６６位、７５位、８０位、および８１位より成る群から選択される位置で少なくとも１つの人為的に変異させたアミノ酸残基を含んで成る、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４３】
前記Ｍ２−２タンパク質が、Ｔ２Ａ、Ｐ４Ａ、Ｋ５Ａ、Ｉ６Ａ、Ｉ６Ｋ、Ｄ１１Ａ、Ｋ１２Ａ、Ｃ１５Ａ、Ｒ２５Ａ、Ｒ２７Ａ、Ｋ３４Ａ、Ｈ４７Ａ、Ｅ５６Ａ、Ｈ５８Ａ、Ｄ６６Ａ、Ｈ７５Ａ、Ｅ８０Ａ、およびＤ８１Ａよりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含んで成り、または前記Ｍ２−２タンパク質がかかるＭ２−２タンパク質の人為的保存性変形物である、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４４】
前記組換えＲＳＶが、亜群Ａ、亜群ＢのヒトＲＳＶ、またはそのキメラを含んで成る、請求項３５に記載の組換えＲＳＶ。
【請求項４５】
請求項３５に記載の組換えＲＳＶをコードする核酸。
【請求項４６】
前記核酸がＤＮＡである、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４７】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４８】
前記核酸がＲＮＡである、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４９】
前記核酸がＲＳＶゲノムまたはアンチゲノムである、請求項４５に記載の核酸。
【請求項５０】
請求項４５に記載の核酸を含んで成るベクター。
【請求項５１】
プラスミドを含んで成る、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
請求項３５に記載のＭ２−２タンパク質、またはその人為的保存性変形物。
【請求項５３】
請求項５２に記載のＭ２−２タンパク質をコードする核酸。
【請求項５４】
請求項３５に記載の免疫学的に有効量の組換えＲＳＶを含んで成る生きた弱毒化呼吸器合胞体ウイルスワクチン。
【請求項５５】
生理学的に許容できるキャリアをさらに含んで成る、請求項５４に記載のワクチン。
【請求項５６】
アジュバントをさらに含んで成る、請求項５４に記載のワクチン。
【請求項５７】
個人の免疫系を刺激し、ＲＳＶに対する免疫反応を起こす方法であって、前記方法が請求項３５に記載の組換えＲＳＶを生理学的に許容できるキャリアで個人に投与するステップを含んで成る方法。
【請求項５８】
前記免疫反応が防御免疫反応である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組換えＲＳＶが前記個人の上気道に投与される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記組換えＲＳＶが鼻咽頭に投与される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記組換えＲＳＶがスプレー、液滴、またはエアロゾルによって投与される、請求項５７に記載の方法。