(57)【要約】  本発明は、ＨＩＶに対する免疫化のためのＤＮＡワクチンに関する。本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激可能な複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ分子を含む。該ＤＮＡ分子には、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆをコードする遺伝子の破壊によってワクチンとして使用するための安全性が付与されている。該ＤＮＡ分子には更に、３’ＬＴＲの少なくとも部分的な欠失によって安全性が付与される。
2007505923.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有する単離ＤＮＡ分子を含有する、ＨＩＶに対する免疫化のためのワクチンであって、
該ＤＮＡ分子が機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、
該ＤＮＡ分子の３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていること
を特徴とする該ワクチン。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が天然のＳＩＶプロモーター配列をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子が天然のＳＩＶプロモーター配列をさらに含む、請求項２に記載のワクチン。
【請求項５】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
ウイルスゲノム由来のＤＮＡ免疫原性組成物であって：
該ウイルスゲノムが、ＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードすること、及び、５’長末端反復および３’長末端反復、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、及びｖｉｆ遺伝子を有することを特徴とすること；及び
ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の破壊により非病原性が付与されていること
を特徴とする該ＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項７】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項８】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項９】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項８に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項１０】
（ａ）ＳＩＶの５’ＬＴＲ；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ遺伝子；
（ｃ）ＨＩＶのｐｒｏ遺伝子；
（ｄ）ＳＩＶのｖｐｘ遺伝子；
（ｅ）ＳＩＶのｖｐｒ遺伝子；
（ｆ）ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子；
（ｇ）ＨＩＶのｔａｔ遺伝子；
（ｈ）ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子；及び
（ｉ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列
を含むＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１０に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項１２】
ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有する単離ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種方法であって、
該ＤＮＡ分子が機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、
該ＤＮＡ分子の３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていること
を特徴とする該方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスゲノム由来のＤＮＡ免疫原性組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種方法であって、
該ウイルスゲノムが、ＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードすること、及び、５’長末端反復および３’長末端反復、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、及びｖｉｆ遺伝子を有することを特徴とすること；及び
該ＤＮＡ免疫原性組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の破壊により非病原性が付与されていること
を特徴とする該方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ免疫原性組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種方法であって、該ＤＮＡ免疫原性組成物が
（ａ）ＳＩＶの５’ＬＴＲ；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ遺伝子；
（ｃ）ＨＩＶのｐｒｏ遺伝子；
（ｄ）ＳＩＶのｖｐｘ遺伝子；
（ｅ）ＳＩＶのｖｐｒ遺伝子；
（ｆ）ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子；
（ｇ）ＨＩＶのｔａｔ遺伝子；
（ｈ）ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子；及び
（ｉ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列
を含むことを特徴とする該方法。
【請求項１６】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ免疫原性組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有する単離ＤＮＡ分子を含むＤＮＡ組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程と、さらにサイトカインを該個体に投与する工程とを含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法であって、
該ＤＮＡ分子が機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、
該ＤＮＡ分子の３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていること
を特徴とする該方法。
【請求項３３】
前記単離ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ウイルスゲノム由来のＤＮＡ免疫原性組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法であって、
該ウイルスゲノムが、ＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードすること、及び、５’長末端反復および３’長末端反復、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、及びｖｉｆ遺伝子を有することを特徴とすること；及び
該ＤＮＡ免疫原性組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の破壊により非病原性が付与されていること
を特徴とする該方法。
【請求項３５】
ＤＮＡ免疫原性組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法であって、該ＤＮＡ免疫原性組成物が
（ａ）ＳＩＶの５’ＬＴＲ；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ遺伝子；
（ｃ）ＨＩＶのｐｒｏ遺伝子；
（ｄ）ＳＩＶのｖｐｘ遺伝子；
（ｅ）ＳＩＶのｖｐｒ遺伝子；
（ｆ）ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子；
（ｇ）ＨＩＶのｔａｔ遺伝子；
（ｈ）ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子；及び
（ｉ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列
を含むことを特徴とする該方法。
【請求項３６】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ免疫原性組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）作動可能に連結されたプロモーター配列；
（ｂ）ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有し、作動可能に連結された単離ＤＮＡ分子であって、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていることを特徴とする、該ＤＮＡ分子；及び
（ｃ）ポリアデニル化配列
を含む、ＨＩＶに対する免疫化のためのＤＮＡワクチン構築物。
【請求項４３】
前記プロモーターが、配列番号７のＳＩＶの５’ＬＴＲに由来する、請求項４２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４４】
前記免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列が、ＳＩＶまたはＨＩＶのいずれかのｇａｇ、ｐｒｏ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、ｖｐｘ、ｖｐｒ、及びｎｅｆ遺伝子を含むコード配列群から選択される、請求項４２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４５】
前記免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列が、ＨＩＶのｇａｇ、ｐｒｏ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、およびｎｅｆ遺伝子ならびにＳＩＶのｖｐｘおよびｖｐｒ遺伝子を含むコード配列群から選択される、請求項４２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４６】
前記ポリアデニル化配列が、配列番号６のＳＶ４０ポリアデニル化配列である、請求項４２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４７】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項４２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４８】
前記破壊された３’長末端反復領域の中に置換されたポリアデニル化配列をさらに含む、請求項６に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項４９】
少なくとも部分的な配列欠失によって、前記ｒｔ遺伝子、前記ｉｎｔ遺伝子、前記ｖｉｆ遺伝子、および前記３’長末端反復の機能が破壊されていることを特徴とする、請求項４８に記載のＤＮＡワクチン組成物。
【請求項５０】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項４８に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５１】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項４９に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５２】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡワクチン組成物。
【請求項５３】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項５２に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５４】
ＤＮＡ組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対するワクチン接種方法であって、該ＤＮＡ組成物が
（ａ）作動可能に連結されたプロモーター配列；
（ｂ）ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有し、作動可能に連結された単離ＤＮＡ分子であって、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていることを特徴とする、該ＤＮＡ分子；及び
（ｃ）ポリアデニル化配列
を有することを特徴とする、該方法。
【請求項５５】
前記ＤＮＡ組成物がＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードするウイルスゲノムに由来すること、
前記ＤＮＡワクチン組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の機能破壊によって非病原性が付与されていること、及び
前記３’長末端反復領域の中にポリアデニル化配列が置換されていること
を特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＤＮＡ組成物が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項５４に記載のＨＩＶに対するワクチン接種方法。
【請求項６１】
前記ＤＮＡ組成物がＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードするウイルスゲノムに由来すること、
前記ＤＮＡワクチン組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の機能破壊によって非病原性が付与されていること、及び
前記３’長末端反復領域の中にポリアデニル化配列が置換されていること
を特徴とする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＤＮＡ組成物が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
ＤＮＡ組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法であって、該ＤＮＡ組成物が
（ａ）作動可能に連結されたプロモーター配列；
（ｂ）ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有し、作動可能に連結された単離ＤＮＡ分子であって、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていることを特徴とする、該ＤＮＡ分子；及び
（ｃ）ポリアデニル化配列
を有することを特徴とする、該方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡ組成物がＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードするウイルスゲノムに由来すること、
前記ＤＮＡワクチン組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の機能破壊によって非病原性が付与されていること、及び
前記３’長末端反復領域の中にポリアデニル化配列が置換されていること
を特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＤＮＡ組成物が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記３’長末端反復が少なくとも部分的に欠失している、請求項４２に記載のＤＮＡワクチン構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、ＨＩＶ−１により誘導される疾患および感染を防御するための予防ワクチン分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するＤＮＡワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
２０００年の終りまでに、全世界で３６１０万人がＨＩＶに感染していると推定されている。同年のみで、全世界で約３００万人がＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疾患で死亡している。この死亡数うちの推定５００，０００人が１５歳未満の児童であった。世界的公衆衛生におけるＨＩＶワクチンの重要性は、どんなに誇張してもし過ぎることはない。
【０００３】
ヒトにおけるＨＩＶ−１感染またはＨＩＶ−１誘導疾患を阻害または予防する有効なワクチンは、一定のリスクの高い集団の治療およびＨＩＶ−１感染またはＨＩＶ−１誘導疾患の危険性があり得る一般集団のための一般的な予防ワクチン接種として有用であると認識されている。ＨＩＶ−１感染に対する長期防御を付与するワクチンが最も有用であろう。不運なことに、ＨＩＶ−１感染およびＨＩＶ−１疾患の防止のために有用なワクチンの開発方法においては多数の問題が存在する。ある問題は、ＨＩＶ−１ウイルスの固有の性質およびその機能的性質の結果である可能性が最も高く、今までのところ有効なワクチンは開発されていない（概説については、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９５，ｐｐｓ．１３５−１４２，１９９５；Ｃｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｔｏｗａｒｄ  ａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ＡＩＤＳ：Ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２：９２３−９８９；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ＨＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２，ｐｐｓ．４０−４１，１９９２）を参照のこと）。
【０００４】
ＨＩＶはレトロウイルスであり、それは、そのゲノムがＤＮＡよりもむしろＲＮＡからなることを意味する。ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と呼ばれる２つの主なウイルス株が存在し、ＨＩＶ−１は主にヒト感染を担う株である。ＨＩＶのＲＮＡゲノムは、タンパク質の殻で覆われている。ＲＮＡゲノムとタンパク質の殻との組合わせはヌクレオキャプシドとして公知であり、タンパク質および脂質の両方のエンベロープで覆われている。
【０００５】
ＨＩＶによる宿主細胞への感染は、ウイルスエンベロープ中に存在する高度にグリコシル化されたタンパク質であるＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質が、宿主細胞のＣＤ４受容体分子に結合した時に開始される。この相互作用により、ウイルスと細胞膜とが融合し、その後にウイルスが細胞に侵入する一連の事象が開始される。
【０００６】
宿主細胞への侵入後、ＨＩＶ ＲＮＡは、ウイルス逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに転写される。一旦宿主ゲノムに組み込まれると、宿主のＲＮＡポリメラーゼＩＩ酵素による転写を介して、ＨＩＶは自身を発現する。転写の調節および転写後の転写物のプロセシングの両方を介して、ＨＩＶは、ＨＩＶ自体が発現する範囲を超える高い調節レベルを発揮することができる。
【０００７】
ＨＩＶウイルスの研究により、ＨＩＶの病原性に関して重要な多数の遺伝子およびゲノム領域に関する情報を含む、ウイルスの分子生物学についての多くの情報が明らかとなった。これらの遺伝子および領域のうち、ＨＩｖのｒｔ、ｉｎｔ、ｖｉｆ、および３’ＬＴＲが重要である。
【０００８】
ＨＩＶのｒｔ遺伝子は、ウイルス逆転写酵素をコードする。この酵素は、ＨＩＶのＲＮＡゲノムを利用し、宿主ゲノムに組み込み可能な、対応する線状二本鎖ＤＮＡ分子を産生する。
【０００９】
ＨＩＶのｉｎｔ遺伝子は、インテグラーゼをコードする。これは、宿主ゲノムへの逆転鎖酵素によって産生された線状二本鎖ウイルスＤＮＡの挿入を実際に触媒する酵素である。宿主ゲノムへのウイルスＤＮＡの組み込みを完了するために、宿主細胞ＤＮＡ修復機構は、宿主ＤＮＡとウイルスＤＮＡとのライゲーションを行う。
【００１０】
ＨＩＶのｖｉｆ遺伝子は、「ウイルス感染因子」として公知のタンパク質をコードする。このタンパク質は、感染性ビリオンの産生に必要である。タンパク質は、ＨＩＶ−１を阻む細胞インヒビターを切り抜ける可能性が高く、ウイルスコアおよび組み込み前複合体（ｐｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ）の安定性を増強することもできる。
【００１１】
ＨＩＶ−１のＬＴＲ（長末端反復）領域は、ＨＩＶ遺伝子の発現を駆動するのに必要なプロモーター領域を含む。ＨＩＶ−１の５’ＬＴＲは、主にＨＩＶ−１遺伝子発現の駆動を担うプロモーターを含み、５’ＬＴＲ配列が破壊されたとしても、３’ＬＴＲがこの機能を引き受ける。３’ＬＴＲは、宿主ゲノムへのウイルスＤＮＡの組み込みに必要である。
【００１２】
他の重要なＨＩＶ−１遺伝子には、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、及びｖｐｕがある。
【００１３】
ｇａｇ遺伝子は、特に、ＨＩＶのｐ２７キャプシドタンパク質をコードする。このタンパク質は、ウイルスヌクレオキャプシドの集合組立に重要である。ｐ２７タンパク質が、ウイルスの感染力に必要なＨＩＶ細胞タンパク質ＣｙＡと相互作用するということも公知である。ｐ２７とＣｙＡとの相互作用を破壊すると、ウイルス複製が阻害されることが示されている。
【００１４】
ｐｏｌ遺伝子は、ＨＩＶ−１のｒｔ配列及びｉｎｔ配列を含むので、特に、逆転写酵素およびインテグラーゼをコードする。
【００１５】
ｎｅｆ遺伝子産物（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒ又はＮｅｆとして知られている）は、多数の潜在的に重要な性質を有する。Ｎｅｆは、ＣＤ４およびＭＨＣクラスＩタンパク質を下流制御する能力を有し、これらは共に、身体のウイルス感染細胞認識能力にとって重要である。Ｎｅｆについてはまた、細胞タンパク質キナーゼを活性化し、細胞のシグナル伝達プロセスを妨害することも示されている。サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の病原性クローン由来のｎｅｆの欠失により、成体マカクザルにウイルス非病原性が付与されることは、おそらく最も重要であろう。従って、機能的ｎｅｆ遺伝子は、ＳＩＶがｉｎ ｖｉｖｏで疾患を引き起こす能力に不可欠である。さらに、ｎｅｆ遺伝子が大きく欠失しているＨＩＶ陽性個体は、１０年を超えて健康を維持しており、細胞ＣＤ４数も減少しないことが、研究により示されている。
【００１６】
ｖｐｕ遺伝子は、最初は機能が未知であったが（未知のウイルスタンパク質Ｖｉｒａｌ  Ｐｔｏｔｅｉｎ  Ｕｎｋｎｏｗｎ又はＶｐｕとして公知となった）、ＣＤ４およびＭＨＣクラスＩ発現を下流制御しウイルスの出芽を促進することが現在公知となったタンパク質をコードする。Ｖｐｕはまた、イオンチャネルとして作用する別のウイルスタンパク質に類似する。ｖｐｕ遺伝子は、ＨＩＶ−１中には存在するが、ＨＩＶ−２中には存在しない。
【００１７】
ほぼ全てのウイルス感染において、感染集団における一定の部分集団は、回復し、同一病原体による更なるウイルス感染に対し免疫になる。典型的なウイルス病原体の例には、麻疹、灰白髄炎、水痘、Ｂ型肝炎、および痘瘡の病原体が含まれる。ＨＩＶ−１感染の高い死亡率、並びに、ＨＩＶ−１感染に対する回復および防御免疫が非常に稀であることは、病原性ＨＩＶ−１が非改変野生型ウイルス病原体である場合に霊長類がＨＩＶ−１感染に対して天然の免疫を生じる能力に、疑問を投げ掛けるものである。従って、霊長類集団にＨＩＶ−１ウイルスに対する防御免疫を付与するワクチンに対して多大な要求が存在する。
【００１８】
将来のウイルス感染に耐性を示す代表的なものは、ウイルス病原体を認識することができる「中和抗体」の生成である。別の手段は、感染組織に対する細胞性免疫である。典型的なウイルス感染では、中和抗体および細胞性免疫の生成は、感染からの回復の先駆けとなる。しかし、ＨＩＶ−１感染では、中和抗体および細胞性免疫は、感染の非常に初期に出現し、ウイルス負荷の一過性の減少にしか関連しない。中和抗体および細胞性免疫の生成にも関わらず、ＨＩＶ−１感染におけるウイルス複製が回復し、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）が発症する。したがって、ＨＩＶ−１感染では、中和抗体および細胞性免疫は防御免疫を正確に評価する手段ではない。
【００１９】
ＨＩＶ−１の有効なワクチンの開発におけるさらなる問題は、野生型ウイルスの抗原性の多様性である。組換えＨＩＶ−１外殻タンパク質を介して生成されたワクチンは、ウイルスの特定の表現型に対する耐性を付与するが、広範な免疫性を示さない可能性が高い。組換えＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチド（ＨＩＶ−１ウイルス外殻タンパク質）を使用したワクチン開発は、毒性を示さないで第Ｉ相臨床試験を通過する。しかし、中和抗体は一過性にしか出現しないことがデータにより示された。したがって、組換えＨＩＶ−１ｇｐ１２０ペプチドワクチンは、短期間しか作用することができず、将来的に感染する、感受性が逆戻りする。
【００２０】
一般に、生ウイルスワクチンは、単離されたウイルスタンパク質よりも病原体ウイルスに対してより良好な免疫を誘導することが認められている（例えば、Ｐｕｔｋｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＳＩＶmac  Ｃａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍａｃａｑｕｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＳＩＶsm，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９６，ｐｐｓ．２００−２１０，１９９６；Ｄｉｍｍｏｃｋ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４を参照のこと）。ＨＩＶ−１ワクチンなどの生レンチウイルスワクチンの使用は認められていないが、これは、接種された個体の宿主ＤＮＡにウイルスＤＮＡが組み込まれるため、接種された集団中でこのウイルスが無制限にとどまるという強い懸念があるからである（例えば、Ｈａａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＳＩＶ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  Ｍａｃａｑｕｅｓ  Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｖｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＳＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９６，ｐｐｓ．２１９−２２４，１９９６を参照のこと）。従って、ＨＩＶ−１に対する安全且つ有効なワクチンは、最初は非病原性であるワクチンウイルスが無作為に変異または他の変化のいずれかを起こすことによって起こり得る強毒性病原菌感染の発生を防止するような修飾を含む。このようなワクチンとしての可能性を有するものの１つに、ＨＩＶ−１に対するＤＮＡワクチンの形態があり得る。
【００２１】
ＤＮＡワクチンを、一般に、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡ分子の形態でニードルまたは微粒子銃を介して宿主組織に注入する。一旦送達されると、ＤＮＡは、トランスフェクトされた細胞内で抗原ペプチドの発現を誘導する。米国特許第６，１９４，３８９号には、動物被験体中に生理学的免疫応答生成タンパク質を産生するための脊椎動物細胞へのＤＮＡの導入方法が記載されており、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【００２２】
ワクチン有効性試験は、一般に、生きたウイルスまたはＤＮＡを用いて被験体を攻撃することを必要とする。ヒト被験体を使用して予備研究を試みることは倫理的および実際的に困難である。予備デザインおよび候補ワクチンの試験のためのモデル系の使用は、ウイルスの種々の種特異的性質によって妨げられている。ＨＩＶ−１ウイルス自体が、一定の比率で感染するのみであり、ヒトに加えてチンパンジー種が危険にさらされていることが現在知られている。ＨＩＶ−１ウイルスワクチンの完全な予備研究のために十分な数のこのような危険にさらされている動物が得られる可能性は極めて低い。有効な類似の動物モデル系を使用することが好ましい。
【００２３】
ＨＩＶ−１の１つの類似のモデル系は、ＳＩＶmac（サル免疫不全ウイルス、マカクザル）系であった。ＳＩＶは種々のサル（マカクザルが含まれる）に感染するが、ＳＩＶとＨＩＶとの間の相違により、ＳＩＶの潜在的なヒトワクチンとしての使用は制限される。したがって、ＨＩＶの近縁種であるウイルスから作製したワクチンが必要とされているが、試験目的のための動物モデルで依然として感染性を示す。
【００２４】
ＳＩＶmacのバックグラウンドにＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質を置くことによってキメラＳＩＶ−ＨＩＶウイルスが開発されている。キメラウイルスはサルに感染性を示すことが証明されたが、末期のエイズまたは偽ＨＩＶ−１感染サルの正確なモデルは得られなかった。
【非特許文献１】Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９５，ｐｐｓ．１３５−１４２，１９９５
【非特許文献２】Ｃｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｔｏｗａｒｄ  ａ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  ＡＩＤＳ：Ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ−Ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２：９２３−９８９
【非特許文献３】Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ＨＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９２，ｐｐｓ．４０−４１，１９９２
【非特許文献４】Ｐｕｔｋｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｖｅ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＳＩＶmac  Ｃａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍａｃａｑｕｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＳＩＶsm，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９６，ｐｐｓ．２００−２１０，１９９６
【非特許文献５】Ｄｉｍｍｏｃｋ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４
【非特許文献６】Ｈａａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ＳＩＶ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｏｆ  Ｍａｃａｑｕｅｓ  Ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｖｅ  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ＳＩＶ，Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ９６，ｐｐｓ．２１９−２２４，１９９６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、非感染被験体に防御免疫を供与するか感染被験体に治療免疫を供与することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、ＨＩＶに対する免疫化のためのＤＮＡワクチンに関する。本発明は、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有するＤＮＡ分子を含む。該ＤＮＡ分子には、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆをコードする遺伝子を破壊することにより、ワクチンとして使用するための安全性が付与される。該ＤＮＡ分子には、３’ＬＴＲの少なくとも部分的な欠失によって、さらに安全性が付与される。
【００２７】
本発明の該ＤＮＡ分子は更に、ＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。さらに、本発明の該ＤＮＡ分子は、好ましくは、天然のＳＩＶプロモーター配列によって調節される。
【００２８】
本発明はまた、本発明の前記ＤＮＡワクチンの個体への投与によるＨＩＶに対する該個体の免疫化方法に関する。
【００２９】
本発明は、さらに、複数のＨＩＶサブタイプのみならずＨＩＶ以外のウイルスに対するワクチンに関し、ここで該ワクチンは、本明細書中に記載のオルソロガスＨＩＶ及び／又はＳＩＶ遺伝子の、他のウイルス由来の遺伝子への置換によって産生されたワクチンに関する。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の特定のＤＮＡ構築物および方法は、ワクチン接種した宿主におけるＨＩＶ−１に対する免疫応答の惹起に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の１つの態様は、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができるウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子に関する。好ましい実施形態では、該ＤＮＡワクチンは、ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇ、ｐｒｏ、ｖｐｘ、ｖｐｒ、ｎｅｆ、ｔａｔタンパク質をコードする。
【００３２】
本発明のＤＮＡ分子は、病原性において重要なタンパク質をコードする能力が除去されるように機能が破壊されているという点が重要である。より詳細には、好ましい実施形態においては、該ＤＮＡワクチンのｖｉｆ、ｉｎｔ、およびｒｔ遺伝子の機能を破壊する。他の実施形態においては、ｒｔ遺伝子の機能を破壊する。変化した配列におけるヌクレオチドの数が、変化しない配列と異なるよう、少なくとも１つのヌクレオチドを挿入または欠失させることによって、該ＤＮＡをその機能上において破壊することができると予想される。機能的アミノ酸をコードする１つまたは複数のヌクレオチドを非機能的アミノ酸をコードする１つまたは複数の異なるヌクレオチドに置換することによって、病原性関連タンパク質をコードするＤＮＡの機能を破壊できる、ということも予想される。本発明の好ましい実施形態では、病原性関連タンパク質をコードするＤＮＡの機能的破壊はｒｔ、ｉｎｔ、およびｖｉｆ遺伝子の欠失によって起こる。
【００３３】
本発明の別の重要な態様は、宿主ゲノムへのＤＮＡ配列の望ましくない組み込みを可能とする３’ＬＴＲ配列を破壊するＤＮＡワクチンを提供することである。機能的ヌクレオチドを、異なる非機能的ヌクレオチドへ置換することによっても、３’ＬＴＲの機能を無効にすることができる。該欠失した３’ＬＴＲ領域が、ＳＶ４０ポリアデニル化配列によって置換されることが好ましい。当業者は、ＳＶ４０以外の種々の供給源由来のポリアデニル化部位を３ＬＴＲ配列の置換物として使用することもできることを認識するであろう。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、ＳＨＩＶku2またはＳＩＶ５’ＬＴＲプロモーター（配列番号７）の使用による、本発明のＤＮＡ分子の調節である。このプロモーターは、ＤＮＡワクチン中に存在する、ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができるウイルスタンパク質の発現を駆動する。当業者は、本発明の別の実施形態を、所望のウイルスタンパク質の発現も駆動する他の機能的プロモーター配列と置換しうることを認識するであろう。
【実施例１】
【００３５】
Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物の構築
図１は、本発明のΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）の略図である。本発明のＤＮＡワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）の構築を以下のように行う。本発明のワクチンのために使用したベクターは、ｐＥＴ−９ａである。ｐＥＴ−９ａの２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＸｍｍＩフラグメントを、約７．４ｋｂの修飾ＳＨＩＶku2プロウイルスゲノムおよびＳＶ４０の約０．５ｋｂのポリアデニル化シグナル配列と置換して、中間ベクターを得る。ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を、別の中間ベクター中の５’ＬＴＲおよびｎｅｆ遺伝子の末端のすぐ上流に作製する。逆転写酵素（ｒｔ）、インテグラーゼ（ｉｎｔ）、およびｖｉｆの遺伝子を、ｐｒｏ遺伝子の下流末端とｖｐｘ遺伝子の上流との間の約２．５ｋｂ ＤＮＡフラグメントの欠失によって消失させる。次いで、ＳＨＩＶku2プロウイルスゲノムのエンベロープ（ｅｎｖ）、ｎｅｆ、および３’ＬＴＲをコードする約３．８ｋｂのヌクレオチド配列を、ＨＩＶ−１のｅｎｖおよびｎｅｆ遺伝子をコードする約３．２ｋｂのＥｃｏＲＶ／ＮｏｔＩ ＤＮＡフラグメントと置換する。ＳＨＩＶku2中のＳＩＶmac239のリーダー配列、ｇａｇ、およびｐｒｏ遺伝子をコードする約２．５ｋｂのＮａｒＩ／ＢｓｔＥ ＩＩ ＤＮＡフラグメントを、ＨＩＶ−１のＨＩＶ−１リーダー配列、ｇａｇ、およびｐｒｏをコードする約２．４ｋｂのＮａｒＩ／ＢｓｔＥ ＩＩフラグメントと置換して、Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）を得る。而して、本発明のワクチンの５’ＬＴＲ、ｖｐｘ、及びｖｐｒはＳＩＶmac239に由来し、ｇａｇ、ｐｒｏ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、及びｎｅｆはＨＩＶ−１に由来する。本発明のＤＮＡワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡの好ましい実施形態の配列を、配列番号１と命名する。
【００３６】
Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）の構造をより完全に詳述するために以下の情報を提供する。全ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードするＳＨＩＶku2の４，９８１ｂｐフラグメント（従って、ゲノムのｒｔおよびｉｎｔ部分を含む）ならびにｖｉｆ遺伝子の最初の４７２ｂｐを、Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物中のＨＩＶ−１の２，３７６ｂｐのＤＮＡフラグメントと置換する。この２，３７６ｂｐフラグメントは、全ＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子およびＨＩＶ−１ｐｏｌ遺伝子の一部をコードする（プロテアーゼをコードする全領域が含まれ、逆転写酵素の最初の１０４個のアミノ酸に対応するヌクレオチドが除去され、ｉｎｔおよびｖｉｆ遺伝子が完全に除去されている）。置換されたＳＨＩＶku2の４，９８１ｂｐフラグメントを、配列番号２と命名する。置換されたＳＨＩＶku2のｖｉｆ遺伝子の最初の４７２ｂｐのＤＮＡ配列を、配列番号３と命名する。欠失された４，９８１ｂｐ及び４７２ｂｐのＳＨＩＶku2配列（それぞれ、配列番号２および配列番号３）を置換するために使用したＨＩＶ−１の２，３７６ｂｐフラグメントのＤＮＡ配列を、配列番号４と命名する。
【００３７】
上記に加えて、ＳＨＩＶku2の３’ＬＴＲから４１１ｂｐのＤＮＡフラグメントを欠失させて、Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物（配列番号１）を得る。この欠失された３’ＬＴＲ配列を、配列番号５と命名する。Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物では、欠失された３’ＬＴＲ配列を、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列の４８１ｂｐのＤＮＡ配列と置換し、これを配列番号６と命名する。
【実施例２】
【００３８】
Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンの効果
本発明の機能的態様およびその使用に由来する実験結果を詳述する前に、以前のものの有効性との比較によって本発明の有効性を確立することが必要である。本発明のワクチン前およびその試験より以前には、以前のもののワクチンとしての有用性は知られていなかった。
【００３９】
ＨＩＶに対する生ウイルスワクチンがウイルスに対する防御の誘発に非常に有効であることは、本発明者らによって行われた以前の研究から知られている。ＤＮＡワクチンがこのような防御の提供に同様に有効であり得ることを立証するために、５頭のマカクザルを使用した実験を行った。この動物のうちの３頭に、ワクチンの安全性を増大させるためにｒｔおよび３’ＬＴＲを欠損させたΔ２−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ（特許出願１０／２７９，９９２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）においてＶ７として以前に記載）を注射した。Δ２−ＳＨＩＶku2ＤＮＡにおいてはまた、欠損した３’ＬＴＲ配列がＳＶ４０ポリアデニル化配列に置換されている。残りの２頭の動物は、生ウイルスワクチンで免疫化した。ＤＮＡワクチンでワクチン接種した３頭の動物にそれぞれ２ｍｇのＤＮＡを皮内注射し、６週間後に５ｍｇのＤＮＡを筋肉内注射し、３回目は、１２週間後に０．５ｍｇのＤＮＡを筋肉内注射した。最後の免疫化から１２週間後に、マカクザルの静脈内にＳＨＩＶ８９．６Ｐの非希釈ストック調製物で攻撃誘発した。対象区の接種動物では、同一用量のＳＨＩＶ８９．６Ｐによって、その１００％において疾患が発症されるということに留意することが重要である。生ウイルスをワクチン接種した２頭のマカクザルに、ワクチン接種から１０週間後に同一のＳＨＩＶウイルスで攻撃誘発した。
【００４０】
その後該動物を研究することにより、ＤＮＡワクチンが、ＥｎｖおよびＧａｇペプチド中のエピトープに対するＥＬＩＳＰＯＴ（商標）（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）応答、ならびに、ＳＨＩＶku2に対する中和抗体を誘導することが明らかとなった。ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答は、本明細書中で、表示されるエピトープを発現する細胞数の基準と定義する。ＤＮＡワクチンをワクチン接種した３頭全ての動物がＳＨＩＶ８９．６Ｐに感染したが、血漿中でそれぞれ低レベルのウイルスＲＮＡのみを産生し、ＣＤ４ Ｔ細胞を喪失しなかった。ＤＮＡワクチンΔ２−ＳＨＩＶku2ＤＮＡをワクチン接種した動物は、攻撃誘発後に既往性の強いＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答を示した。これらの動物における感染は、２８週間を超えて制御された。２８週間目に、ＤＮＡワクチンで免疫化した３頭の動物は、生ワクチンで免疫化した動物ほどの有効性を有する防御を示した。こうして、前記ＤＮＡワクチンは、異種ＳＨＩＶ８９．６Ｐに対する防御の誘発において生ワクチンと同等であることが証明された。さらに、ＤＮＡワクチン接種を受けた動物は、以前の生ワクチンウイルス接種の負荷に耐える必要はなかった。
【実施例３】
【００４１】
Δ２−ＳＨＩＶku2およびΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンのｉｎ ｖｉｖｏ有効性
実施例２に記載の実験はｒｔ遺伝子および３’ＬＴＲを欠くＤＮＡワクチンであるΔ２−ＳＨＩＶku2ＤＮＡの有効性を示していたものの、本発明のワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶku2がワクチンとして有効であるかどうかは明らかではなかった。この不確定さは、本発明のワクチンであるΔ４−ＳＨＩＶku2が４つの欠失（ｒｔ、ｉｎｔ、ｖｉｆ、および３’ＬＴＲ）を含み、各欠失はウイルスの感染性に重要なウイルスゲノムの一部に対応するという事実に由来する。ウイルスを非感染性にすること及び使用時の安全を目的として欠失させたが、生ウイルスよりもむしろＤＮＡを使用するという事実に加えて、これらの４つの欠失により、ワクチンのＨＩＶ−１に対する防御付与を不可能とするかどうかは知られていなかった。驚くべきことに、本発明のウイルスは、異種ＳＨＩＶ８９．６Ｐに対する防御の誘導において、実施例２の生ウイルスとの比較で記載したΔ２−ＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンと同様に有効であることが証明された。
【００４２】
３頭のマカクザルに、５ｍｇのΔ２−ＳＨＩＶku2ＤＮＡを筋肉内注射し、他のマカクザルに５ｍｇの本発明のΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡを筋肉内注射した。１１週間後に注射を繰り返し、第２の免疫化から６週間後に、動物の静脈内にＳＨＩＶ８９．６Ｐの非希釈ストックで攻撃誘発した。６頭全ての動物が、第１の注射から３週間後にワクチンに対してＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答を示し、この応答は、約３週間後に検出不可能なレベルまで減少した。第２の注射からたった１週間後に応答が再度出現し、低レベルまで再度減少した。攻撃誘発時には最小の応答しか検出されなかった。攻撃誘発から１週間までに、各動物は高力価のウイルス複製を示し、これは強力なＣＭＩ（細胞媒介性免疫）応答と適合した。攻激誘発から２週間後、前記動物におけるウイルス負荷は、１週間前に認められた濃度の１／１０と１／２０との間のレベルに減少した。ＣＤ４ Ｔ細胞を喪失した動物は認められなかった。注射からたった２週間後にＤＮＡが防御を誘導する能力は、前記ＤＮＡワクチンの有効性を強調するものであり、本実験結果は、さらなる欠失にも関わらず、本発明のΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物であるＤＮＡワクチン（配列番号１）が、Δ２−ＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンと同様の有効性を示す、言い換えると、生ウイルスワクチンと同様の有効性を示すことを、明確に示した。
【実施例４】
【００４３】
３’ＬＴＲの置換物としてのＳＶ４０ポリアデニル化配列の有用性
３’ＬＴＲ配列の置換物としてのＳＶ４０ポリアデニル化配列の有用性を比較するために、更なる実験を行った。該実験は、Ｖ５実施形態であるインタクトな３’ＬＴＲを有するＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンと、ＳＶ４０ポリアデニル化配列と置換された３’ＬＴＲを有するＶ６実施形態であるＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチン（配列番号６）との、ベクターがコードするウイルスタンパク質を発現する能力の比較によって完遂された（Ｖ５およびＶ６実施形態は、特許出願番号１０／２７９，９９２号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載されている）。該２つのＤＮＡ分子の細胞内区画および細胞外区画中におけるウイルスタンパク質の発現についての性能を、トランスフェクトした初代ヒト繊維芽細胞細胞、ヒト胚腎臓上皮細胞株２９３、およびＪｕｒｋａｔ細胞中で比較した。発現の持続時間およびタンパク質の産生量ならびに翻訳後修飾および前駆タンパク質の切断についてもＤＮＡを比較した。３’ＬＴＲ欠失Ｖ６実施形態であるＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチン構築物は、驚くべきことに、両ＬＴＲを有するＶ５実施形態であるＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンよりもウイルスタンパク質産生でより有効であると判断した。タンパク質産生の持続時間もまた、３’ＬＴＲ欠失ワクチンにおいての方が長かった。免疫沈降分析により、３’ＬＴＲ欠失により、ｇａｇ前駆体の切断が迅速となり、細胞外区画に輸送されるｐ２７の量が２倍となることが明らかとなった。まとめると、これらのデータは、３’ＬＴＲの欠失により宿主ＤＮＡへのウイルスゲノムの組み込みに関する懸念が軽減されるだけでなく、ウイルスタンパク質がより有効に発現することを示している。
【実施例５】
【００４４】
サイトカインとΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンとの同時投与
次に、本発明のワクチンによって誘導される免疫応答を、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）ＤＮＡの同時投与によって増強することができるかどうかを確認するために研究を行った。ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１００μｇのΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡと２５μｇのマウスＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡとの混合物によって筋肉内を通じて免疫化した。注射を２週間間隔で２回行い、マウスを第２の免疫化から１週間後に屠殺した。脾細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）アッセイにおいて５群に分割したＳＩＶ Ｇａｇペプチドに対する応答について試験した。免疫化用量が低く、且つ組織サンプルを初期に採取したにも関わらず、ＣＭＩ応答がピークになる前に、ワクチンＤＮＡと共にＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡを投与された４頭全ての動物が、２０〜４０細胞／１０6脾細胞の範囲でＥＬＩＳＰＯＴ（商標）応答を示したのに対して、ワクチンＤＮＡのみを投与された動物ではその５０％しかこのような応答を示さなかった。注射部位に多数の単核球が集中したことによって証明されるように、ＧＭ−ＣＳＦが顕著な走化性効果を生じた。この効果は、さらに多くの抗原提示樹状細胞を注射部位に引き付け、該現象はＤＮＡワクチンのみを投与された動物で示された。しかし、驚くべきことに、ワクチンＤＮＡおよびＧＭ−ＣＳＦの両方を投与されたマウスは、ＤＮＡワクチンのみを投与された動物よりも低いＣＭＩ力価を示した。すなわち、ワクチンのみによって生成されたウイルスタンパク質特異的ＥＬＩＳＰＯＴ（商標）陽性細胞数は、ワクチン＋ＧＭ−ＣＳＦによって生成された細胞数より有意に多かった。活性化脾細胞を発生する注射被験体の数の増加が予防的または治療的に望ましい場合、Δ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡワクチンとＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインとの同時投与が望ましいであろうと結論づけられた。
【００４５】
このように、本発明のＤＮＡワクチンは、ＨＩＶに対する防御を得るのに有用である。本発明で使用されたＤＮＡは、ＳＨＩＶku2（病原性を高める有効性の高い複製ストラテジーを有するウイルス）に由来する。該ＤＮＡの転写機構は、ウイルスＤＮＡのプロモーター／エンハンサー配列を格納する５’ＬＴＲの保存によって維持された。さらに、５’ＬＴＲは、ＮＦＫＢ、ＮＦＡＴ、及びＳＰ−１などの転写因子のための結合部位と、ｔａｔ（ウイルスＤＮＡの転写を担うＨＩＶおよびレンチウイルスに固有の分子）のＲＮＡのための結合部位とを含む。該ＤＮＡが宿主細胞ＤＮＡに組み込まれる能力を最小にするためにインテグラーゼ遺伝子および３’ＬＴＲを欠失させた。したがって、該ＤＮＡは、無期限に組織中に存続することができない。さらに、逆転写酵素およびｖｉｆ遺伝子の欠失により、ゲノムが感染性ウイルスをコードする能力が損なわれた。同時に、ｅｎｖ、ｇａｇ、ｖｐｕ、ｔａｔ、及びｎｅｆ遺伝子によってコードされるウイルスタンパク質は、該ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞中で高度に発現された。本発明のＤＮＡワクチンは、マカクザルで免疫原性が高く、異種ウイルスに対して防御免疫を誘発する。該ＤＮＡは抗レトロウイルス薬物療法の実施時にいつでも注射可能であるため、本発明のワクチンが、予防的にのみならず、ＨＩＶに既に感染した個体に治療的にも使用することができる点は重要である。
【００４６】
上記で提供した実施例および開示は本発明の一定の実施形態を説明するが、本発明を制限する意図を有していない。本開示に関して、本発明の精神または範囲を逸脱することなく多数の方法で本発明を修正可能であることは当業者に明らかである。例えば、上記のｅｎｖ、ｇａｇ、およびｎｅｆ遺伝子を切り出して、ＨＩＶの別のサブタイプ由来の対応遺伝子と置換することができる。従って、本発明のワクチンを、ＨＩＶの種々のサブタイプに対する免疫化のために使用することができる。さらに、上記のｅｎｖ、ｇａｇ、ｎｅｆ、および他の遺伝子を、ＳＡＲＳおよびＣ型肝炎などの他のウイルス由来の遺伝子と置換することができる。したがって、上記の本発明のＤＮＡワクチンを、ＨＩＶまたはＳＩＶ以外由来のウイルス遺伝子の発現を駆動し、それにより種々の他のウイルスに対するＤＮＡワクチンを得るための「エンジン」として使用することができる。本発明は、以下の特許請求の範囲のみによって制限される。
【００４７】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００３年９月１６日提出の米国特許仮出願番号６０／５０３，１９７号の利益を主張する。
【００４８】
（発明の背景）
政府の権利に関する記述。本発明は、ＮＩＨ助成金番号１４０１８３０およびＧ１４０２５００によって一部援助を受けた。合衆国政府は、本発明に権利を有し得る。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明のΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物の略図である。
【図２】本発明のΔ４−ＳＨＩＶku2ＤＮＡ構築物の円形図である。
【図１】
2007505923.tif 000003
【図２】
2007505923.tif 000004
【配列表】
2007505923000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月21日(2005.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有する単離ＤＮＡ分子を含有する、ＨＩＶに対する免疫化のためのＤＮＡ免疫原性組成物であって、
該ＤＮＡ分子が機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、
該ＤＮＡ分子の３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていること
を特徴とする該組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項１に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ分子が天然のＳＩＶプロモーター配列をさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡ分子が天然のＳＩＶプロモーター配列をさらに含む、請求項２に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項５】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項６】
ウイルスゲノム由来のＤＮＡ免疫原性組成物であって：
該ウイルスゲノムが、ＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードすること、及び、５’長末端反復および３’長末端反復、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、及びｖｉｆ遺伝子を有することを特徴とすること；及び
ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の破壊により非病原性が付与されていること
を特徴とする該ＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項７】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項８】
配列番号１のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項９】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項８に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項１０】
（ａ）ＳＩＶの５’ＬＴＲ；
（ｂ）ＨＩＶのｇａｇ遺伝子；
（ｃ）ＨＩＶのｐｒｏ遺伝子；
（ｄ）ＳＩＶのｖｐｘ遺伝子；
（ｅ）ＳＩＶのｖｐｒ遺伝子；
（ｆ）ＨＩＶのｎｅｆ遺伝子；
（ｇ）ＨＩＶのｔａｔ遺伝子；
（ｈ）ＨＩＶのｒｅｖ遺伝子；
（ｉ）ＨＩＶのｅｎｖ遺伝子；及び
（ｊ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列
を含むＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項１１】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１０に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載のＤＮＡ組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対する免疫反応付与方法。
【請求項１３】
前記ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６に記載のＤＮＡ免疫原性組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対する免疫反応付与方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載のＤＮＡ免疫原性組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対する免疫反応付与方法。
【請求項１６】
請求項８に記載のＤＮＡ免疫原性組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対する免疫反応付与方法。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載のＤＮＡ組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程と、さらにサイトカインを該個体に投与する工程とを含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法。
【請求項３３】
前記単離ＤＮＡ分子が、逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードする遺伝子を少なくとも部分的に欠失しているために、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードすることができないことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項６に記載のＤＮＡ免疫原性組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法。
【請求項３５】
請求項１０に記載のＤＮＡ免疫原性組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法。
【請求項３６】
請求項８に記載のＤＮＡ免疫原性組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）作動可能に連結されたプロモーター配列；
（ｂ）ＨＩＶに対する免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列を有し、作動可能に連結された単離ＤＮＡ分子であって、機能的逆転写酵素、インテグラーゼ、およびＶｉｆタンパク質をコードできないこと、及び、３’長末端反復が、少なくとも部分的に破壊されていることを特徴とする、該ＤＮＡ分子；及び
（ｃ）ポリアデニル化配列
を含む、ＨＩＶに対する免疫化のためのＤＮＡ免疫原性構築物。
【請求項４３】
前記プロモーターが、配列番号７のＳＩＶの５’ＬＴＲに由来する、請求項４２に記載のＤＮＡ免疫原性構築物。
【請求項４４】
前記免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列が、ＳＩＶまたはＨＩＶのいずれかのｇａｇ、ｐｒｏ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、ｖｐｘ、ｖｐｒ、及びｎｅｆ遺伝子を含むコード配列群から選択される、請求項４２に記載のＤＮＡ免疫原性構築物。
【請求項４５】
前記免疫応答を刺激することができる複数のウイルスタンパク質をコードする配列が、ＨＩＶのｇａｇ、ｐｒｏ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｅｎｖ、およびｎｅｆ遺伝子ならびにＳＩＶのｖｐｘおよびｖｐｒ遺伝子を含むコード配列群から選択される、請求項４２に記載のＤＮＡ免疫原性構築物。
【請求項４６】
前記ポリアデニル化配列が、配列番号６のＳＶ４０ポリアデニル化配列である、請求項４２に記載のＤＮＡ免疫原性構築物。
【請求項４７】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項４７に記載のＤＮＡ免疫原性構築物。
【請求項４８】
前記破壊された３’長末端反復領域の中に置換されたポリアデニル化配列をさらに含む、請求項６に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項４９】
少なくとも部分的な配列欠失によって、前記ｒｔ遺伝子、前記ｉｎｔ遺伝子、前記ｖｉｆ遺伝子、および前記３’長末端反復の機能が破壊されていることを特徴とする、請求項４８に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項５０】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項４８に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項５１】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項４９に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【請求項５２】
（削除）
【請求項５３】
（削除）
【請求項５４】
請求項４２に記載のＤＮＡ組成物をレシピエントに投与する工程を含む、ＨＩＶに対する免疫反応付与方法。
【請求項５５】
前記ＤＮＡ組成物がＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードするウイルスゲノムに由来すること、
前記ＤＮＡワクチン組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の機能破壊によって非病原性が付与されていること、及び
前記３’長末端反復領域の中にポリアデニル化配列が置換されていること
を特徴とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
（削除）
【請求項５７】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
（削除）
【請求項６０】
前記レシピエントにサイトカインを投与する工程をさらに含む、請求項５４に記載のＨＩＶに対する免疫反応付与方法。
【請求項６１】
前記ＤＮＡ組成物がＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードするウイルスゲノムに由来すること、
前記ＤＮＡワクチン組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の機能破壊によって非病原性が付与されていること、及び
前記３’長末端反復領域の中にポリアデニル化配列が置換されていること
を特徴とする、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＤＮＡ組成物が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
請求項４２に記載のＤＮＡ組成物をＨＩＶ−１陽性個体に投与する工程を含む、ＨＩＶ−１陽性個体の治療方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡ組成物がＨＩＶに対する免疫応答を起こすことができる少なくとも１つのタンパク質をコードするウイルスゲノムに由来すること、
前記ＤＮＡワクチン組成物に、ｒｔ遺伝子、ｉｎｔ遺伝子、ｖｉｆ遺伝子、および３’長末端反復の機能破壊によって非病原性が付与されていること、及び
前記３’長末端反復領域の中にポリアデニル化配列が置換されていること
を特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
（削除）
【請求項６９】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＤＮＡ組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
（削除）
【請求項７２】
前記３’長末端反復が少なくとも部分的に欠失している、請求項４２に記載のＤＮＡ免疫原性構築物。
【請求項７３】
ＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカインをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７４】
ＧＭ−ＣＳＦを含むサイトカインをさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項７５】
前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項７６】
前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項７７】
前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項７８】
前記サイトカインがＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項７９】
請求項１に記載のＤＮＡ免疫原性組成物であって、マカクザルに投与され、その後感染性ＳＨＩＶ８９．６Ｐで攻撃誘発した場合、免疫応答によってＣＤ４Ｔ細胞が損失されないことを特徴とする、該組成物。
【請求項８０】
前記免疫応答が、前記組成物をマカクザルに投与し、その後感染性ＳＨＩＶ８９．６Ｐで攻撃誘発した場合、免疫応答によってＣＤ４Ｔ細胞が損失されない程度であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項８１】
前記プロモーターが高性能の複製ストラテジーを有するＳＨＩＶに由来するＳＩＶの５’ＬＴＲに由来する、請求項４２に記載のＤＮＡ免疫原性組成物。
【国際調査報告】
2007505923.tif 000005
2007505923.tif 000006
2007505923.tif 000007