(57)【要約】  本発明は、ジダノシン（ｄｄＩ）の製造方法を提供し、該方法は（ａ）ｄｄＡデアミナーゼ活性を発現する酵素を得て；（ｂ）該酵素を不溶性担体上に固定化し；（ｃ）該酵素を、ｄｄＩ溶液を得るための時間および条件下、水中に少なくとも約４重量／容量％のｄｄＡであるジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）溶液と接触させ；そして、（ｄ）該ｄｄＩ溶液からｄｄＩを単離する、工程を含む。場合により、ｄｄＩ母液は収率を改善するためにその後の実験において再利用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジダノシン（ｄｄＩ）の製造方法であって、工程：
（ａ）ｄｄＡデアミナーゼ活性を発現する酵素を得て；
（ｂ）該酵素を不溶性担体上に固定化し；
（ｃ）該酵素を、ｄｄＩ溶液を得るための時間および条件下、水中に少なくとも約１重量／容量％のｄｄＡであるジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）溶液と接触させ；そして、
（ｄ）該ｄｄＩ溶液からｄｄＩを単離する、
ことを含む、該製造方法。
【請求項２】
接触工程におけるｄｄＡ溶液は、水中に約２〜約１０重量／容量％のｄｄＡである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該接触工程の間のｐＨは約８．０〜約９．５である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
実質的に全てのｄｄＩは接触工程においてｄｄＩ溶液からの析出に耐える、請求項３記載の方法。
【請求項５】
不溶性担体を官能化して酵素がそれと結合するのを可能とする、請求項１記載の方法。
【請求項６】
酵素と不溶性担体との結合は活性化剤を用いて達成する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
酵素はヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＡＤＡは配列番号１のアミノ酸配列またはその同類変異を有する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＡＤＡは、配列番号２、配列番号３またはそれらの同類変異を有するヌクレオチドによってコードされる、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
得られる工程は、形質転換生物中でヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）またはその同類変異体を発現し、そして該生物からＡＤＡを単離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
形質転換生物は大腸菌である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
不溶性担体を官能化して酵素がそれと結合するのを可能とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
酵素と不溶性担体との結合は活性化剤を用いて達成する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
不溶性担体上に固体化された酵素の活性は少なくとも約４０Ｕ／ｇである、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
接触工程の間のｐＨは約７．５〜約９．５である、請求項１０記載の方法。
【請求項１６】
接触工程は充填カラムを用いて行なう連続方法である、請求項１０記載の方法。
【請求項１７】
接触工程におけるｄｄＡ溶液は、水中に約４〜約１５重量／容量％のｄｄＡである、請求項１０記載の方法。
【請求項１８】
ｄｄＡ溶液は、水中に約５〜約８重量／容量％のｄｄＡである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
単離工程は、連続的にｄｄＩ溶液を蒸留し、そして水性母液中のｄｄＩスラリーを得るまで水を加えることを含み、そして、ｐＨは約８以下である、請求項１０記載の方法。
【請求項２０】
更に、工程：
（ａ）単離工程後に反応母液を保ち；
（ｂ）該反応母液を用いる接触工程を少なくとも１回繰り返して、ｄｄＡ溶液を調製し；そして、
（ｃ）単離工程を少なくとも１回繰り返す、
ことを含む、請求項１０記載の方法。
【請求項２１】
単離工程は、少なくとも約９９％純度であるｄｄＩを少なくとも約９６％の収率で与える、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮出願番号60/451,842（このものは本明細書の一部を構成する）からの優先権の利益を主張する。
【０００２】
(技術分野)
本発明は一般的に、２’,３’−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）から２’,３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）を製造する方法に関するものであって、より特には、本発明は、ヒトＡＤＡヌクレオチド配列からのアデノシンデアミナーゼ酵素（ＡＤＡ）を用いてｄｄＩを製造する方法に関する。
【０００３】
（背景技術）
ジデオキシヌクレオチドは、かなり安定なヌクレオシドアナログである。ジデオキシヌクレオシド２’,３’−ジデオキシイノシン（ｄｄＩ）は、抗ウイルス剤としての有用な薬理学的な活性を有することが分かっている。Hartmanらによる, Clin. Pharmacol. Ther. 47: 647 (1990)。特に、ｄｄＩは、ＡＩＤＳの処置において単独でまたは３’−アジド−２’,３’−ジデオキシチミジン（ＡＺＴ）と組み合わせて使用する場合に有用であることが分かっている。ｄｄＩの使用は、ヒト免疫不全症ウイルスのＡＺＴ耐性菌株の開発から見て次第に重要となっている。
【０００４】
実験室においてジデオキシヌクレオシドを製造する努力（例えば、２’または３’位でのヌクレオシドの脱酸素）が報告されている。Chem. Pharm. Bull., 22: 128 (1974)。しかしながら、化学的な合成は、立体的な障害並びに反応を推進するために通常必要とされる温度およびｐＨの条件下でのヌクレオシドの不安定性のために困難である。その上、合成のための出発物質は高価であって且つバルクでは入手できない。今日まで、ジデオキシヌクレオシドの実験室スケールでの合成をこれら化合物の工業的スケールでの商業的な生産にまでスケールアップすることはできなかった。
【０００５】
アデノシンデアミナーゼによるジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）の酵素学的な脱アミノ化による、ｄｄＩの工業的スケールでの生産のための多数の方法が知られている。ウシデアノシンデアミナーゼを用いて２’,３’−ジデオキシアデノシンを脱アミノ化することによるｄｄＩの合成が報告されている。Webbらによる, Nucleosides & Nucleotides, 7(2): 147-153 (1988)。ウシアデノシンデアミナーゼを用いたｄｄＩを製造する方法のスケールアップ（パラメータ（例えば、溶媒および緩衝化剤など）の最適化を含む）もまた報告されている。Nucleosides & Nucleotides, 10(7): 1499-1505 (1991)。
【０００６】
Farinaらによる米国特許第5,011,774号は、(Ｄ)−２’,３’−ジデオキシアデノシンのアノマー混合物を適当な溶媒中でＡＤＡと反応させて、ｄｄＩのより活性なβ−アノマーの酵素学的な脱アミノ化の割合を選択的に有利とする方法を開示している。該方法は、ウシ脾臓由来の商業的に入手可能なＡＤＡを用いる。この方法は、所望しないα−アノマーを分離して除くのに必要なクロマトグラフィーおよび結晶化の方法の工程を回避する。しかしながら、この方法を用いるあり得る欠点は、酵素のウシ供給源を使用する場合に、伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）の伝染の危険である。
【０００７】
Yokozekiらによる米国特許第4,970,148号は、２’,３’−ジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）を、ｄｄＡをｄｄＩに変換することができるＡＤＡ酵素を含有する微生物の培養溶液と接触させる方法を開示している。該方法は、ＡＤＡの供給源として、全微生物、細胞ホモジネート、またはリゾチーム、塩、界面活性剤を用いて処理した細胞の産物などを使用する。この方法の１欠点は、該酵素の天然供給源は８を超えるｐＨで本質的に不安定であって、そして厳密なｐＨのコントロールを要することである。８以下のｐＨで実施する場合に、生成物ｄｄＩは、非常に希釈な濃度（＜１重量／容量％）でわずかに可溶である。その結果として、該方法はバッチ当たりほとんど全くｄｄＩを与えない。その上、そうして誘導されるｄｄＩは、精製されたｄｄＩ生成物を得るために、残留タンパク質の混入を排除するための大規模な精製方法を行なわなければいけない。これらの精製方法は高価であって、そして生成物の損失および収率の低下を生じ得る。
【０００８】
Noguchiらによる特願平5-219978号は、核酸関連物質（例えば、ｄｄＩ）の製造方法を開示し、該方法は、適当な酵素をコードする遺伝子をクローニングし、制御配列を有する発現ベクターを構築して遺伝子の高い発現を得て、該発現ベクターを用いて微生物を形質転換して形質転換体を得て、該クローン遺伝子の発現を誘発し、そしてその結果発現した酵素を単離することを含む。次いで、該単離酵素を用いて適当な出発物質（例えば、ｄｄＡ）と反応させることによって、所望する核酸関連物質を得る。この方法は、Yokozekiの特許と比較して、使用のために入手可能な酵素の量が１００倍増大する。しかしながら、この方法に従って単離される酵素は、微生物の酵素である。例えば、少なくともＡＤＡに関しては、該酵素は８より大きいｐＨ値で安定性を欠く。その結果として、許容し得る収率を得るために、非常に制御しなければいけない。その上、この方法は、該ＡＤＡと密に接触する生成物を与える。該反応混合物は、不純物（例えば、未反応ｄｄＡ、核酸副産物）、並びにＡＤＡおよび生成物を混入する。結果として、該反応混合物からｄｄＩを単離するために、大規模な精製方法を実施しなければいけない。該精製方法は典型的に、液体クロマトグラフィー方法または薄層クロマトグラフィー方法の繰り返しを必要とする。これらの精製方法は、商業的なスケールアップの影響を受けない。
【０００９】
Yokozekiらによる米国特許第4,962,193号は、酵素を用いるプロセスからｄｄＩを精製し（ここで、多孔性で非極性の樹脂を用いて、該樹脂上にｄｄＩを吸着させる）、該溶液から該樹脂を分離し、そして精製された生成物を得るために吸着されたｄｄＩを分画的に溶出する、方法を開示している。しかしながら、この方法はタンパク質を除去し、そして最終的な精製工程前に該生成物を含有する溶液を濃縮し且つろ過するための処理を先に行なう。その結果として、この方法は高価であって且つ時間がかかり得る。
【００１０】
ＴＳＥの伝染の危険または残留タンパク質を除去するための大規模な精製方法を行なう必要性なしで満足な収率を与え、そして広い範囲のｐＨで安定である酵素を使用する、ｄｄＩを製造する工業的スケールの方法に対する本発明の要求が存在する。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は一般的に、ｄｄＡをｄｄＡデアミナーゼ活性を有する酵素（このものは、不溶性担体上に固定化される）と接触させることによって、ｄｄＩを製造する方法に関する。本発明は、ジダノシン（ｄｄＩ）の製造方法を提供し、該方法は、工程：（ａ）ｄｄＡデアミナーゼ活性を発現する酵素を得て；（ｂ）該酵素を不溶性担体上に固定化し；（ｃ）該酵素を、ｄｄＩ溶液を得るための時間および条件で水中に少なくとも約４重量／容量％のｄｄＡであるジデオキシアデノシン（ｄｄＡ）溶液と接触させ；そして、（ｄ）該ｄｄＩ溶液からｄｄＩを単離する、ことを含む。場合により、得られるｄｄＩ母液は、その後の実験において再利用して収率を改善する。
【００１２】
（発明の詳細な記載）
本発明は、費用の点で有効であり且つ信頼できる方法でｄｄＡからｄｄＩを製造する方法に関し、この方法は、従来技術の方法の欠点を回避する。
【００１３】
ｄｄＡからｄｄＩを製造する従来の方法は、商業的に入手可能なＡＤＡ（例えば、ウシＡＤＡ）（Sigma社から入手可能））または微生物ＡＤＡを用いて形質転換した増殖性大腸菌由来のＡＤＡを用いることを含む。該方法は、ｄｄＡをｄｄＩに変換するために、ｄｄＡを有する溶液中での該酵素の混合を含む。次いで、該ｄｄＩを、様々な混入物（例えば、酵素を含む）を含有する溶液から取り出さなければいけない。このことは、混入された反応混合物からｄｄＩを得るための実質的な精製および分離を要する。
【００１４】
これらの先行技術の方法と対比して、本発明は、ＡＤＡ、またはｄｄＡを脱アミノ化することができる他の酵素を、固定化状態で使用する。該固定化は、該反応混合物中での酵素の安定性を改善するのを助ける。より重要なことに、主な混入物、すなわち酵素は不溶性担体上に固定化されたままであるので、該固定化により、該反応混合物からｄｄＩ最終生成物の容易な単離が可能となる。
【００１５】
本発明は更に、ＡＤＡの新規な供給源を提供する。本発明の好ましい実施態様において、ｄｄＩは、ヒトＡＤＡまたはその同類誘導体を用いて形質転換した増殖性生物由来のＡＤＡを用いて、ｄｄＡから製造する。本発明の１利点は、ヒトＡＤＡがより広範囲なｐＨで微生物ＡＤＡよりも安定であることである。約８を超えるｐＨで該反応を実施することができる場合には、ｄｄＡは安定なままでありそしてｄｄＩへの変換効率は改善される。別の利点は、ｄｄＩが、約８以下のｐＨの場合よりもこれらｐＨの溶液中ではるかに容易に残存することである。高いｐＨ（＞８）で生成物ｄｄＩの溶解度が改善されるという性質により、反応をより高濃度で行なうことができ、従ってｄｄＩの収率の改善が得られる。
【００１６】
本発明の方法は、不溶性担体上に固定化された、ヒトＡＤＡ酵素またはｄｄＡデアミナーゼ能力を有する他の酵素を用いる。本発明は、安定性の改善という有用な利点を酵素に与え、これは固定化からもたらされる。その結果、ｄｄＡのｄｄＩへの反応は、典型的には変性でありあるいはその他の場合には該酵素の活性を妨害するｐＨ範囲で進行することができる。加えて、ＡＤＡの固定化は、便利な性質、すなわち簡単なろ過方法によって該反応生成物から該酵素を分離する能力をＡＤＡに与える。
【００１７】
（アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）の製造）
本発明において特に関心あるＡＤＡは、アミノ酸配列番号１（ジェーンバンク寄託番号gi|14043373）を有する、ヒトＡＤＡまたはその同類変異体(conservative variant)である。ＡＤＡのヒト変異体は、微生物起源のものに対して優れた構造的な安定性の理由で選択した。特に、ヒトＡＤＡは、微生物ＡＤＡと比較してかなり広いｐＨおよび範囲において有意な活性を保持する。その上、該ヒトＡＤＡは、微生物起源のものと比較して高温での分解に対してより耐性である。ヒトＡＤＡのＤＮＡ配列は、１,５３３塩基配列であるヒトｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ配列として公開されている。Gwendolyn, S.らによる, Mol. and Cellular Biology, 4(9): 1712-1717 (1984)を参照。
【００１８】
該公開されている配列またはその同類変異を用いて、所望するＡＤＡをコードしそして得ることができる。配列番号：２（ジェーンバンク寄託番号gi|14043372）は、公開されているヒトｃＤＮＡ配列である。特に宿主として大腸菌を使用する場合に、配列番号：３（ジェーンバンク寄託番号gi|140433732）を使用することが好ましい。配列番号３は公開されているヒトｃＤＮＡの同類変異体であって、ここで、コドンの優先置換は、アルギニン、グリシン、ロイシン、イソロイシンおよびプロリンについて行なった。遺伝暗号が縮重される場合には、これらのコドンの置換は、配列によってコードされるアミノ酸の変化を生じない。むしろ、該置換は、大腸菌によるコドンの認識を改善する。以下のコドンの優先置換を使用することができる。
（表１  コドンの優先置換）
【表１】
2007525163.tif 000002
【００１９】
本発明は更に、実質的に等価な活性を有する酵素中で生じる配列番号１と記載するアミノ酸配列の他の小さな改変および全ての天然の対立遺伝子を含む配列の使用を含む。改変は、部位特異的変異誘発による通り意図的であり得て、あるいは自発性の突然変異であり得る。対立遺伝子は、いずれかの種由来であり得る。好ましい対立遺伝子は、ヒト起源のものである。本発明は、ｄｄＡを脱アミノ化する際の酵素の活性が保持される限り、これらポリペプチドの全ての使用を含む。
【００２０】
例えば、本発明はまた、配列番号１の同類変異または等価変異体をも含む。本明細書中で使用する用語「同類変異(conservative variation)」および「等価変異体(equivalent variant)」とは、同様な化学的なもしくは生物学的な性質を有するかまたは一般的に等価であると考えられる他のアミノ酸によるアミノ酸の置換を意味する。
【００２１】
例えば、配列中のアミノ酸を等価アミノ酸、すなわち同類変異で置換することは当該分野の当業者にとって知られる。アミノ酸の群は通常、以下のものは等価であると考えられている。
Ａｌａ（Ａ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）；
Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；
Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）；
Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｖａｌ（Ｖ）；および、
Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）。
【００２２】
酵素配列における置換、付加および／または欠失は、本発明の方法において使用されるＡＤＡの機能が保持される限り、行なうことができる。等価な酵素は通常、天然酵素と実質的に同じアミノ酸配列を有する。別の配列と実質的に同じであるが、１個以上の置換、付加および／または欠失によって他の配列と異なるアミノ酸配列は、等価な配列、等価な変異体、または同類変異であると考える。配列中のアミノ酸残基の数の２５％以下（１０％以下がより好ましい）が、本発明のタンパク質に代わって置換され、該タンパク質に付加され、または該タンパク質から欠失されていることが好ましい。
【００２３】
ヒトＡＤＡは、当該分野において知られる方法によって製造することができる。該方法としては、生物学的な合成法および化学的な合成法を含む。生物学的な合成法において、該酵素は細胞から直接的に単離することができる。別法として、該酵素をコードするＤＮＡを得て、該ＤＮＡを増幅もしくはクローニングし、適当な宿主中で該ＤＮＡを発現し、そして該酵素を収集することによって、該酵素を製造することが知られる。例えば、該酵素は、該酵素アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡから直接的または間接的のいずれかで翻訳され得る。化学的な合成法においては、４個の塩基を未加工(raw)物質として使用して、公知のアミノ酸配列を構築する。
【００２４】
（Ａ．ＡＤＡをコードする核酸配列の入手）
ＡＤＡをコードするＤＮＡは、当該分野において知られる方法によって適当なｃＤＮＡライブラリから誘導することができる。例えば、Gwendolyn, S.らによる, Molecular and Cellular Biology, 4(9): 1712-1717 (1984)（これは、本明細書の一部を構成する）を参照。該配列は、ジェーンバンク受託番号GI: 14043372で寄託されている。
【００２５】
通常、完全ＤＮＡ鎖または該ＤＮＡの別の断片は、プローブとして公知のＤＮＡまたはその断片を用いることによって単離することができる。そのことを行なうために、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリ由来の制限断片を、標識オリゴヌクレオチドプローブを用いるサザンハイブリダイゼーションによって同定することができる。例えば、該酵素をコードするＤＮＡは、公知配列の断片を用いることによってヒトのホモジナイズ組織から単離して、１個以上のオリゴヌクレオチドプローブを製造することができる。該プローブを標識化し、そしてこのものを用いて、適当なベクター（例えば、ファージラムダ）中でゲノムまたはｃＤＮＡのライブラリをスクリーニングする。該ｃＤＮＡライブラリは、公知の方法（例えば、GublerおよびHoffmanによる, Gene, 25: 263-270 (1983)中に記載の方法）によってｍＲＮＡから製造することができる。オリゴヌクレオチドプローブを用いて、異なる組織からｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることができる。該オリゴヌクレオチドプローブを標識化して、その結果、そのものをスクリーニングするライブラリ中のＤＮＡとのハイブリダイズ時に検出することができる。これらの方法は、当該分野においてよく知られる。単離するＤＮＡを配列決定し、そして該配列を用いて、更なるオリゴヌクレオチドプローブを製造する。この方法を繰り返して重なり断片を得て、完全なオープンリーディングフレームを得ることができる。
【００２６】
ＤＮＡの増幅およびクローニングの方法は、当該分野においてよく知られる。例えば、SambrookおよびRusselによる, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3版, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001)（これは、本明細書の一部を構成する）を参照。該クローンを、ラムダ−ｇｔ１０またはラムダ−ｇｔ１１ベクター中でアンプリマー(amplimer)としてラムダ−ｇｔ１０またはラムダ−ｇｔ１１に特異的なオリゴマー（Clontech社（Palo Alto, CA）から入手可能）を用いて増幅するのが便利である。当該分野においてよく知られる他の増幅方法（例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、修復連鎖反応（Repair Chain Reaction)（ＲＣＲ）およびＰＣＲオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＰＣＲ−ＯＬＡ））をも用いて、本発明の核酸を増幅することができる。
【００２７】
上記の遺伝子の生物学的な合成法の別法として、当該分野において知られる方法を用いて、報告されているＤＮＡ配列に基づいて遺伝子を化学的に合成することが可能である。該方法としては、「Modern machine-aided methods of oligonucleotide synthesis」, Brown TおよびDorcas, J. S.による, In Oligonucleotide and Analogues a Practical Approach, F. Eckstern編, IRL Press, Oxford UK (1995)（これは、本明細書の一部を構成する）中に記載されている方法を含む。ＤＮＡはまた、オーバーラップ二本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、該ギャップに満たし、そして共に末端をライゲートすることによって合成することもできる。一般的に、Sambrookらによる, Glover, D. M.およびHames, B. D.による編, Cloning, 2版, 1-4巻, IRL Press, Oxford, UK (1995)を参照。
【００２８】
結局は、ＤＮＡのヒト供給源に関連したあり得るウイルス混入についての関心（例えば、制御要件とのコンプライアンス）が存在し、従ってＤＮＡを得る化学的な合成方法が好ましい。
【００２９】
（Ｂ．ＡＤＡの発現）
上記の通り得られる組換えＤＮＡ分子は、ヒトＡＤＡをコードするポリヌクレオチド配列を含む。この組換えＤＮＡを当該分野においてよく知られる方法によって適当な宿主細胞中でクローン化し、そして発現することができる。一般的に、該クローン化遺伝子は、適当な宿主細胞中で該酵素の発現を指向する発現ベクターと一緒に供する。次いで、該酵素を宿主細胞から回収することができる。核酸の製造および操作に関する方法については、Sambrookらによる(2001)を参照。
【００３０】
該増幅するかまたはクローン化したＤＮＡを、適当なベクター（発現ベクターが好ましい）中で当該分野において知られる方法によって発現することができる。一般的には、Sambrookらによる(2001)を参照。発現ベクターは、作用可能に連結された遺伝子の発現を指向することができる。組換えＤＮＡ方法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。しかしながら、本発明は、等価な機能を有する他の形態の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、複製防御(replication defective)レトロウイルス、アデノウイルスなど））を含み得る。該発現ベクターは、米国特許第6,068,991号（これは、本明細書の一部を構成する）中に開示されているプラスミドであることが好ましい。
【００３１】
ベクターＤＮＡ（制御配列を含有する発現ベクターの形態が好ましい）を、通常の形質転換およびトランスフェクトの方法によって、原核生物または真核生物の宿主細胞中に導入することができる。本明細書中で使用する用語「形質転換」および「トランスフェクション」とは、宿主細胞中に外来性核酸を導入するための当該分野で認識されている様々な方法を意味すると意図し、例えばカルシウムホスフェートもしくはカルシウムクロリドの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション（リポフェクション）またはエレクトロポレーションを含む。宿主細胞を形質転換しまたはトランスフェクトするための適当な方法は、Sambrookら（上記）および他の実験マニュアル中で知ることができる。
【００３２】
該発現ベクターは、発現するＤＮＡ配列または断片と作用可能に連結された少なくとも１つの発現コントロール配列を含むことが好ましい。該コントロール配列は、発現に使用する宿主細胞に基づいて選択し、そしてこのものを該クローン化ＤＮＡ配列の発現をコントロールしそして制御するために、該ベクター中に挿入する。
【００３３】
組換え発現ベクターにおいて、「作用可能に連結された(operably linked)」とは、関心あるヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の発現が可能であるような様式で（例えば、インビトロの転写／翻訳システムにおいて、またはベクターが宿主細胞中に導入される場合には宿主細胞において）、該制御配列と連結する。
【００３４】
用語「制御配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現コントロール要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図する。該制御配列については例えば、Goeddelによる, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中に記載されている。制御配列としては、多数の種類の宿主細胞中でヌクレオチド配列の恒常的な(constitutive)発現を指向するもの、および特定の宿主細胞中でだけヌクレオチド配列の発現を指向するもの（例えば、組織−特異的な制御配列）を含む。
【００３５】
有用な発現コントロール配列としては例えば、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ｔａｃシステム、ｔｒｃシステム、ファージラムダの主要なオペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄ外被タンパク質のコントロール領域、酵母の解糖プロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター）、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母アルファ接合因子のプロモーター、並びにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、サルウイルス（例えば、初期および後期プロモーターまたはＳＶ４０）由来のプロモーター、原核生物もしくは真核生物の細胞およびそれらのウイルスの遺伝子の発現をコントールすることが知られる他の配列、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３６】
適当な誘起型非融合大腸菌発現ベクターとしては例えば、制御配列（例えば、ｐＴｒｃ（Amannらによる, (1988) Gene 69: 301-315）およびｐＥＴ １１ｄ（Studierらによる, Gene Expression Technology: Methods to Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990)）を含む。該ｐＴｒｃベクター由来の標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｐ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現ウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ｇｎ１）によって媒介されるＴ７ ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写コントロール条件下でＴ７ ｇｎ１遺伝子を有する常在性ラムダプロファージからの宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供される。
【００３７】
適当な宿主細胞は、いずれかの原核生物（例えば、大腸菌）または真核生物の細胞（例えば、昆虫細胞、酵母菌細胞または哺乳動物細胞）であり得る。いくつかの適当な原核生物宿主としては例えば、大腸菌（例えば、E. coli SG-936、E. coli HB 101、E. coli DH5α、E. coli X2282、E. coli DHI、およびE. coli MRCl、E. coli BL21）、シュードモナス、バシラス（例えば、枯草菌およびストレプトマイセス）を含む。適当な真核生物細胞としては例えば、組織培養物中での酵母菌細胞および他の真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞、ヒト細胞および植物細胞）を含む。宿主細胞は大腸菌であることが好ましい。
【００３８】
発現ベクターの設計は形質転換される宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることは、当該分野の当業者によって認められるであろう。本発明の発現ベクターは宿主細胞中に導入することができ、それによってＡＤＡ（本明細書中に記載する核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含む）を与えることができる。
【００３９】
融合発現ベクターにおいて、原核生物切断部位は、融合分子および組換えタンパク質の接合部(junction)に導入されて、該融合分子から組換えタンパク質の分離、その後の融合タンパク質の精製が可能となることが多い。該酵素およびそれらの同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターとしては例えば、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech社製；SmithおよびJohnsonによる(1988) Gene 67:31-40）、ｐＭＡＬ（New England Biolabs社製, Beverly, MA）およびｐＲＩＴ５（Pharmacia社製, Piscataway, NJ）（これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを標的組換えタンパク質と融合する）を含む。
【００４０】
大腸菌中での組換えタンパク質の発現を最大とする１方法は、組換えタンパク質をタンパク質加水分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌中で該タンパク質を発現することである（Gottesmanによる, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990), 頁119-128）。別の方法は、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を改変して、その結果、各アミノ酸についての個々のコドンが大腸菌中で優位的に使用されるものである、ことである（Wadaらによる(1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118）。本発明の核酸配列のそれら改変は、標準的なＤＮＡ合成方法または部位特異的突然変異誘発法によって実施することができる。
【００４１】
該細胞は、当該分野においてよく知られる条件下で増殖する。クローン化遺伝子の発現を誘起して、大量の酵素を発現する。大腸菌発現ベクター（例えば、ｌａｃシステムプロモーターシステムを含む）を使用することが好ましい。ＡＤＡの発現は、ＩＰＴＧを用いて誘導することが好ましい。
【００４２】
（Ｃ．ＡＤＡの単離および精製）
通常、酵素は標準的な方法によって可溶化細胞画分から単離することができる。いくつかの適当な方法としては例えば、沈殿プロトコールおよび液体クロマトグラフィープロトコール（例えば、イオン交換、疎水性相互作用、およびゲルろ過）を含む。例えば、Methods Enzymol. - Guide to Protein Chemistry, Deutscher編, VII項, 頁182-309 (1990)；および、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York (1987)（これらは、本明細書の一部を構成する）を参照。
【００４３】
別法としては、精製物質を当該分野において知られる方法によって、プレパラティブＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で該酵素を分離し、関心あるバンドを切片して取り出し(slicing out)、そしてポリアクリルアミドマトリックスから該タンパク質を電気溶出することによって得る。洗浄剤ＳＤＳを公知の方法（例えば、透析または適当なカラム（例えば、Extracti-Gelカラム（Pierce社製））の使用）によって該タンパク質から除去する。酵素の混合物は、例えばLaemmliによるNature 227: 680-685 (1970)によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離することができる。該方法は、当該分野においてよく知られる。
【００４４】
所望しない混入物が有効に除去される限りにおいて、該タンパク質を精製する方法には特別な制限は存在しない。経済的な方法は、マイクロフルイダイザーに発酵ブロスを通すことによって該細胞を分解して、該酵素を細胞から放出することである。撹拌ブロスにろ過助剤およびフロック剤(flocking agent)（例えば、ＰＥＩ（VWR International社製（South Plainfield, NJ）））を加えることにより、混入物（例えば、タンパク質および他の細胞デブリ）は不溶となる。適当なろ過助剤は、ＣＥＬＩＴＥ（World Minerals社（Santa Barbara, CA）から入手可能）である。次いで、該可溶性酵素を、適当なサイズのフィルターを用いるろ過によって該ブロスから除去することができる。該フィルターにより、該可溶性活性酵素が通過することができ、一方で細胞タンパク質および他の混入物の不溶性画分がフィルターによって保持されることが好ましい。次いで、該酵素を限外ろ過を用いて溶液中で濃縮することができる。３０,０００分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）フィルターは、この目的に有用である。
【００４５】
（ＡＤＡ活性のアッセイ）
そのようにして誘導される酵素を、活性についてアッセイすべきである。本明細書中で使用する酵素学的な活性の単位（Ｕ）は、３７℃で１分当たり１μｍｏｌのｄｄＡを脱アミノ化するであろう酵素の量である。最終的な酵素の力価は、約６５０〜７５０Ｕ／ｍＬであることが好ましい。該アッセイは、酵素を３７℃で２．４％のｄｄＡ溶液に加えることによって実施することができる。該反応を、静かに撹拌しながら１５分間進行する。テトラヒドロフランを加えて、該反応を停止する。試料を採取し、そしてこのものをＨＰＬＣについて実験して、生成するｄｄＩの量を測定する。
【００４６】
（ＡＤＡの固定化）
酵素を精製した後に、該酵素溶液を適当な緩衝液を用いてｐＨが約７．３〜約７．６まで処理することが好ましい。使用する緩衝液の種類には特定の制限は存在しないが、リン酸緩衝液が好ましい。該溶液を活性が約２５０〜約３５０Ｕ／ｍＬにまで緩衝液を用いて希釈することが好ましい。
【００４７】
該精製酵素を第１に、ｄｄＡとの反応前に、該反応溶液中では不溶である担体上に固定化する。酵素をその上に固定化し得る限りは、使用する担体の種類については特定の制限はない。通常、緩衝化された酵素の上記希釈溶液を、不溶性担体を含有する溶液に加え、そのもののいくつかは活性化試薬（例えば、架橋剤）による活性化を必要とする。該架橋剤は、ＡＤＡ上のアミン基によってＡＤＡを該担体と共有結合させるのに役立つ。
【００４８】
該担体は不溶性のままであり、そして反応期間中、反応溶液中で該酵素を不溶性に保つ。該担体は直径が約２５０〜６００ミクロンを有する固体樹脂物質であることが好ましい。適当な担体としては例えば、ＩＰＳ−４００（U. O. P.社（Des Plaines, IA）から入手可能）またはＥＵＰＥＲＧＩＴ（Rohm America社（Piscataway, NJ）から入手可能）を含む。
【００４９】
酵素が担体と共有的に結合する限りは、該架橋剤についての特定の制限はない。架橋剤の選択は選択する担体に依存し、そして当該分野の当業者によって容易に明白であろう。樹脂担体および架橋剤の適当な組み合わせは、セライト、グルタルアルデヒド、ＩＰＳ−４００、グルタルアルデヒド、セファロース、ＣＮＢｒ、および１級アミンもしくはカルボキシルのいずれかで官能化した樹脂担体、およびカルボジイミドを挙げられる。固形剤および架橋剤の他の適当な組み合わせは、当該分野の当業者によって明白であろう。
【００５０】
担体上への酵素の固定化は、バッチまたは連続方法で実施することができる。バッチ方法は、例えば緩衝化酵素溶液を活性化担体と一緒に数時間混合することによって実施することができる。次いで、該固定化酵素を、簡単なろ過方法を用いて収集する。粒子保持サイズ(particle retention size)は、固体担体のサイズによって測定する。ＩＰＳ−４００を使用する場合には、粒子径保持を約２０μｍ〜約３０μｍで有するフィルターが有用である。減圧(vacuum)はスピード回収に適用することができるが、しかしながら、担体は乾燥すべきでない。
【００５１】
別法として、該活性化担体を、固体担体を保持するのに十分な粒子保持サイズを有するフィルターを用いて収集することができる。次いで、該緩衝化酵素溶液を該担体上に通す。該ろ過由来の酵素母液をフィルターに繰り返し通して、該酵素の固定化を最大とする。連続方法の場合には、該固体担体をスラリーとし、そしてこのものをクロマトグラフィーカラム中にそそぐことができる。回収後に、該固体化酵素を水ですすいで、いずれかの不純物または未結合酵素を除去する。該固定化酵素の力価は少なくとも約４０Ｕであることが好ましい。
【００５２】
（ｄｄＡとＡＤＡとの反応）
次いで、該固定化ＡＤＡをｄｄＡ溶液と混合して、ｄｄＩを得る。ｄｄＡからｄｄＩへの反応の間、アンモニアが発生する。ｄｄＡを先行技術の場合よりも濃縮した溶液で酵素に加えるために、混合物中のアンモニア副生成物はｐＨを約９．２〜約９．５の範囲に上昇し得る。これらの条件下での微生物ＡＤＡまたは未結合ＡＤＡの使用は、該酵素がこれら上昇したｐＨでは失活するであろう理由で、完結まで進行するとは予想されない。しかしながら、固体担体上に固定化したＡＤＡのヒト変異体の使用はそれら分解を減少する。結果として、該ＡＤＡは活性を保持し、そして該反応はこれまで可能であった場合よりもより速く、より生産的なペースで進行する。
【００５３】
該反応は、約２０℃〜約５０℃の温度で実施する。該反応は、温度を約２５〜３０℃に保つことが好ましい。該反応は、低温で実施することができるが、しかしながら、このことにより、より長い反応時間となる。該反応を約５０℃を超える温度で実施することにより、酵素活性の損失および該酵素の変性を生じ得る。
【００５４】
商業的に入手可能なｄｄＡ（Ajinomoto社（Tokyo, 日本国）から入手可能）を、バッチ方法または連続的なバルク方法で水中の固定化ＡＤＡに加える。該反応は、ＡＤＡを固定化しない方法で用いた場合を十分に超える濃度のｄｄＡを用いて進行することができる。該反応溶液中のｄｄＡの許容し得る範囲の濃度は、約１％〜約１５％である。水中に約４％〜１０％のｄｄＡ（約５〜６％のｄｄＡ溶液がより好ましい）を固定化ＡＤＡに加えることが好ましい。該反応は、約１％以下のｄｄＡが残るまでの条件および時間で進行することができる。
【００５５】
バッチ方法の場合には、ｄｄＡを水中での固定化ＡＤＡの懸濁液に加えて、そして反応させる。反応の完結は、約５〜８時間を費やす。完結後に、固定化ＡＤＡをろ過し、続いて水洗することによって再利用のために回収することができる。更に、ｄｄＩ生成物の除去後に母液を再利用して、収率を最大とすることができる。
【００５６】
連続方法の場合には、ｄｄＡ溶液を固定化ＡＤＡで充填したカラムに加えることができる。直径に対する高さの比は約６であることが好ましいが、該比率は重要ではない。ｄｄＡ溶液を、約１％以下のｄｄＡが残るまでの速度および時間で加える。反応の完結は、約１２０時間を費やす。流速はカラムのサイズ、ｄｄＡの濃度および反応の温度に依存する。別法として、ｄｄＡ溶液を充填カラムにリサイクルする連続方法を使用することができる。該ｄｄＡ溶液を、約１％以下のｄｄＡが残る速度および時間でリサイクルする。流速は、カラムのサイズ、ｄｄＡの濃度および該反応の温度に依存する。ｄｄＡ溶液の導入速度の選択は、当該分野の当業者にとって容易に明らかであろう。
【００５７】
（ｄｄＩの回収）
ｄｄＡからｄｄＩへ反応させた後に、該ｄｄＩは高いｐＨ（＞８）ではアンモニウム塩の形態で溶液中に存在する。回収工程において、該ｄｄＩを溶液から取り出す。このことは、溶液からｄｄＩを結晶化させることによって達成する。単蒸留方法を用いて、アンモニア（反応の副生成物）を除き(drive off)、そしてｄｄＩの遊離酸形態を得ることができる。該蒸留は、該溶液を濃度が約１０〜１２％（最初のｄｄＡ基準で）とする第１の蒸留、続いて水の添加、更に濃度が約１０〜１２％に再び達するまで蒸留し、そしてｄｄＩスラリーのｐＨを約８以下とすることによって連続的に行なうことができる。該懸濁液を約０〜５℃にまで冷却し、そしてこのものを少なくとも１時間保った。
【００５８】
該ｄｄＩをろ過し、そして該ケーキをアセトンを用いて洗浄することができる。次いで、該固体を、例えば約４５〜５０℃で真空下、一定の重量にまで乾燥することができる。該反応母液を、ｄｄＡからｄｄＩに反応させるバッチ方法または連続方法における再利用のために保つことができることが好ましい。加えて、該水性洗浄液もまた再利用することができる。
【００５９】
約８２％の収率を、いずれのリサイクルをも行なわずに得ることができる。しかしながら、反応母液をリサイクルする場合には、収率を約９６〜９９％にまで増大することができる。得られるｄｄＩは、９９％以上の純度である。
【００６０】
以下の実施例は、本発明の実施を示すことを意図するものであって、そしてこのものは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。全てのパーセントは、特に断らない限り、重量／容量単位である。
【００６１】
背景技術、詳細な記載、図面の簡単な説明および実施例において引用する各文書（例えば、特許、特許出願、文献、概要書、実験室マニュアル、書籍、ジェーンバンク受託番号、SWISS-PROT受託番号、またはその他の刊行物）の開示の全ては、本明細書の一部を構成する。更に、提出された配列表のハードコピー、加えて対応するコンピューター読み取り可能な形態は、本明細書の一部を構成する。
【００６２】
（実施例１）
（ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）遺伝子を用いて形質転換した組換え大腸菌の製造）
大腸菌発現プラスミドであるｐＢＭＳ２０００を、制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＢａｍＨＩを用いて処理し(digest)、そして０．７％アガロースゲル上で分画した。４．５Ｋｂに対応する画分をゲルから切除し、溶出し、エタノール沈降によって濃縮した。合成ヒトＡＤＡのＤＮＡを、ヒトＡＤＡ遺伝子をコードする遺伝子を含有するプラスミドから制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いて切除した。合成ヒトＡＤＡ遺伝子を含有するＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ画分を、制限酵素ＢｓｐＨＩおよびＢａｍＨＩを用いる処理によって得られるｐＢＭＳ２０００の４．５Ｋｂ画分にライゲートした。該ライゲートしたＤＮＡを、大腸菌宿主であるＢＬ２１中に形質転換した。該形質転換細胞を、ネオマイシンスルフェート（３０μｇ）で補足したラウリア(Lauria)ブロス寒天プレート上にプレートした。制限酵素分析は、該コロニーのいくつか並びにＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて実施した。正確な制限分析および酵素活性の場合のコロニーの１つを選び、そして上記について実施した。
【００６３】
（実施例２）
（合成ヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子を含有する組換え大腸菌の発酵）
（発酵培地用製剤）
種培地（１００ｍＬ当たり）
【表２】
2007525163.tif 000003
【００６４】
基礎(base)培地(Ｌ当たり）
【表３】
2007525163.tif 000004
【００６５】
栄養(feed)培地（Ｌ当たり）
【表４】
2007525163.tif 000005
【００６６】
ｐＨコントロール−塩基
【表５】
2007525163.tif 000006
【００６７】
ｐＨコントロール−酸
【表６】
2007525163.tif 000007
【００６８】
（Ａ．種ストック液の調製）
解凍した組換え大腸菌（０．２ｍＬ）を、上記の種培地（１００ｍＬ）を含有する三角フラスコ（５００ｍＬ）中に播種する。このものは、ジャイレトリーインキュベーター中、２８℃で２４時間、該フラスコを振り混ぜる（３００ｒｐｍ）ことによってインキュベートして、接種菌液を調製する。
【００６９】
（Ｂ．発酵）
該接種菌液（５０ｍＬ）を、１Ｌの作業容量(working volume)を有する５Ｌ発酵槽中に播種する。実験条件は以下の通りである；温度２８℃；１０００ｒｐｍで撹拌；１ｖｖｍの通気(aeration)；溶存酸素（ＤＯ）設定を記録し、そして１００％と定義する；ｐＨを、ＮＨ４ＯＨおよびリン酸を用いてｐＨ６．８〜７．２にまでコントロールした。
【００７０】
栄養培地（２Ｌ）は、以下の通り調製する。Ｒａｍｐの摂食を、５ｍＬ／時間の摂食速度（１．２ｍＬ／時間／時間で増大する）を用いて６時間後に、開始する。細胞を、追跡しながら、２４時間増殖する。気流、摂食の速度および温度を必要に応じて調節して、最初の設定の２０％以上にまでＤＯをコントロールする。次いで、該培地の温度を１６℃にまで低下する。該細胞をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘発して、播種後の１６〜１８時間の間、最終濃度を８０μｇ／ｍＬとする。６００ｎｍでの光学密度は２０〜３０の間とする。追跡および摂食は、合計４０〜４８時間または栄養を利用するまで続ける。該ブロスは、溶液の８４単位／ｍＬを含む（１単位（Ｕ）＝３７℃での脱アミノ化ｄｄＡの１μｍｏｌ／分）。
【００７１】
（実施例３）
（組換え大腸菌発酵からのヒトＡＤＡの単離および固定化）
発酵ブロス（１０Ｌ）を、マイクロフルイダイザー（Ｍ−１１０Ｙモデル、Microfluidics社（Newton, MA）から入手可能）に通す。少なくとも９０％の活性が該細胞から放出されるまで、作動圧は１２,０００〜２０,０００ｐｓｉとする。該マイクロ(micro)フルイダイズしたブロスの一部を採取し、該試料を遠心分離し、そして該上清み部中の活性を測定することによって、活性を測定する。該上清み中の活性の量は、放出する活性の量を意味する。通常、該マイクロフルイダイザーを１回通すことが必要とされる。
【００７２】
十分に撹拌したマイクロフルイダイズしたブロス（１０Ｌ）に、ＣＥＬＩＴＥ（最終濃度は１５ｗ／ｖ％である）（１．５ｋｇ）を加える。次いで、１０％の水性ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）水溶液（最終濃度は、０．３容量比（ｖ／ｖ）％である）（０．３０Ｌ）を加える。このものを少なくとも３０分間撹拌し、次いでろ過して不溶物を除去する。該ケーキを水洗（３．０〜４．０Ｌ）する。
【００７３】
清浄化したろ液を３０,０００ＭＷＣＯフィルターカセット（ペリコン(Pellicon)２単位、ポリエーテルスルホン低タンパク質結合カセット、０．５ｍ２のろ過面積、Millipore社（Bedford, MA）から入手可能）を用いて遠心ろ過して、最終的な酵素力価を６５０〜７５０Ｕ／ｍＬとする。該試料を、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３〜７．６）（１．２５Ｌ）を用いて希釈する（酵素活性を、２５０〜３５０Ｕ／ｍＬとする）。
【００７４】
ＩＰＳ−４００タンパク質固定化担体（５５０ｇ）に、２．５％グルタルアルデヒド（２．７５Ｌ）を加える。このものを室温で２時間静かに撹拌し、そしてデカントするかまたはサイズが６０メッシュのフィルター上でろ過する。該活性化担体を、水洗（４Ｌ×１０）する。
【００７５】
該希釈酵素溶液（〜０．９５Ｌ）に、活性化ＩＰＳ−４００固定化担体（１．１０ｋｇ）を加え、そしてこのものを２０〜２５℃で２時間静かに撹拌する。固定化担体を保持するのに十分である有効な細孔サイズを有するフィルター上に該固定化酵素を集め、そしてこのものを５容量の水で水洗する。
【００７６】
別法として、該ＩＰＳ−４００をトラップ水中でスラリーとし、そしてこのものを２０〜３０μｍの粒子サイズ保持を有する高速フロー用ろ紙（グレード６０４〜４１５）を備えたブフナーろうとを用いて収集した。減圧を行なって過剰量の水を除去するが、担体は乾燥しない。該希釈酵素を該樹脂に加え、減圧（２０’’Ｈｇ）を行なって、そして母液を収集する。減圧を止めて、該母液を活性のために採取して（通過(pass)番号１）、次いでこのものを該担体に加えて戻し、そして減圧を再度行なう。ＩＰＳ−４００上での合計５回の通過のために、このことを４回以上繰り返す。第５回目の通過後に、水（１．５Ｌ）を該樹脂に加え、そして減圧を行なって、固定化酵素を洗浄する。
【００７７】
別の方法として、該ＩＰＳ−４００をトラップ水中にスラリーとし、そしてこのものをクロマトグラフィーカラム中にそそぐ。該ベッドを設定し、次いで水を該カラムに通して（アップフロー(up flow)する）、該担体をすすぐ。該希釈酵素溶液を、該カラムを用いてポンピングする（１〜２５ｍＬ／分）。該酵素を加えた後に、水（１．５Ｌ）を該カラム上にポンピングして、該固定化酵素を洗浄する。
【００７８】
該固定化酵素のアッセイは、〜１００Ｕ／ｇの酵素活性を示す（１単位＝３７℃での脱アミノ化ｄｄＡの１μｍｏｌ／分）。
【００７９】
（実施例４）
（組換えヒトＡＤＡ固定化酵素を用いる、ｄｄＡからｄｄＩへの製造（バッチ法））
ｄｄＡ（１００．０ｇ）を３０℃で水（１９００ｍＬ）に加える（上記実験由来の母液もまた使用可能である）。ｄｄＡを加えた後に（完全な溶解は必要ではない）、固定化ｒｅｃヒトアデノシンデアミナーゼ（４０００Ｕ）を加える。該反応液を、撹拌しながら３０℃に保つ。残留ｄｄＡのレベルが加えるｄｄＡの最初の量の１％以下となった時に、該反応は完結とする（約５〜８時間）。該酵素固体をろ過によって除去し（２０〜３０μｍの培地）、そして該酵素ケーキを水洗（１００ｍＬ）する。該使用する酵素を０〜５℃で湿性ケーキとして保ち（７２時間まで）、そしてこのものを別のバッチにリサイクルすることができる。該ｄｄＩ溶液をＣＵＮＯろ過パッド（０．４〜１ミクロン）を用いてろ過し、次いで０．２ミクロンフィルターを用いてろ過する。
【００８０】
（実施例５）
（組み換えヒトＡＤＡ固定化酵素を用いる、ｄｄＡからｄｄＩへの製造（連続カラム法））
カラム（ｈ／ｄ比＝６である）は、固定化ｒｅｃヒトアデノシンデアミナーゼ（３８０Ｕ）を水と一緒に充填したスラリーである。該カラムをＮＨ４ＯＨ（３０ｍＭ）を用いてｐＨ９．５にまで洗浄し、次いで水洗してｐＨ６．５〜７とする。温度を２０℃に保ちながら、水中のｄｄＡの４％溶液を該カラムに７．２ｍＬ／分の速度で１２０時間通す。該カラムからの流出液はｐＨ９．２〜９．５であり、そしてこのものは＞９９％のｄｄＩを含み、残りは＜１％のｄｄＡである。最終的な単離前に、該得られたｄｄＩ溶液をＣＵＮＯパッドおよび０．２μフィルターを用いてろ過する。
【００８１】
（実施例６）
（組み換えヒトＡＤＡ固定化酵素を用いる、ｄｄＡからのｄｄＩへの製造（リサイクルカラム法））
カラム（ｈ／ｄ比＝２．７）は、固定化ｒｅｃヒトアデノシンデアミナーゼ（１０００Ｕ）を水と一緒に充填したスラリーである。ｄｄＡ（２５．０ｇ）を、メカニカルスターラーを備えた３つ口丸底フラスコ内で水（４７５ｍＬ）（または、水で４７５ｍＬにまで希釈した、上記バッチ由来の母液）中に３０℃で溶解する。該ｄｄＡ溶液を、該酵素カラムを用いて３０℃で〜５０ｍＬ／分で循環する（循環スピードは、必要に応じて変えることができる）。
【００８２】
残留ｄｄＡのレベルが加えるｄｄＡの最初の量の１％以下となった時に（ＨＰＬＣ分析による）、該反応は完結とする（約３〜９．５時間）。次いで、該カラムを水（２５ｍＬ）を用いてすすぎ、そしてこのものを再利用のために０〜５℃に保つことができる（７２時間まで）。最終的な単離前に、得られたｄｄＩ溶液をＣＵＮＯパッドおよび０．２μｍフィルターを用いてろ過する。
【００８３】
（実施例７）
（ｄｄＩの単離）
該ｄｄＩ溶液を、内部バッチの温度が２０〜４０℃で真空蒸留する。ｄｄＩの濃度が最初のｄｄＡを基準にして１０〜１２ｗ／ｖ％に達した後に、該蒸留を止める。典型的には、該ｐＨはこの時点で８．１〜８．３である。更なる水を加え、次いで、濃度が再び１０〜１２％に達し、そして該ｄｄＩスラリーのｐＨが８以下となるまで（典型的には、７．８〜７．９である）、蒸留を続ける。該ｄｄＩ懸濁液を０〜５℃まで冷却し、そしてこのものを少なくとも１時間保つ。冷スラリーをろ過し、そして該ケーキを０〜５℃の水を用いて洗浄する。該母液および水性洗浄液を、別のバッチにおいてリサイクルするために保つことができる。
【００８４】
該ケーキを０〜５℃のアセトンを用いて洗浄する。該固体を４５〜５０℃で真空下、一定の重量になるまで乾燥する。母液のリサイクルの場合に、第１の操作について収率〜８２％、および続く４回の操作について収率９６〜９９％（全収率は＞９６％である）となる。得られるｄｄＩは、＞９９％純度である。
【００８５】
（比較実験１）
（大腸菌ＡＤＡ活性および組み換えヒト固定化ＡＤＡの比較）
組み換え大腸菌由来の微生物ＡＤＡをいくらか精製し、そしてアンモニウムスルフェート懸濁液として単離した。大腸菌発酵ブロス（４２Ｕ  ＡＤＡ／ｍＬ、２Ｌ）を遠心分離し、該細胞ペレットを収集し、そして１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、１Ｌ）を用いて洗浄した。該細胞を再び遠心分離し、そしてこのものを上記の緩衝液と２０％グリセリン（２Ｌ）中に再懸濁した。該細胞をマイクロフルイダイザーに１回通した。細胞デブリを遠心分離によって除去し、そして得られた上清み液を３０,０００ＭＷＣＯカセットを用いる限外ろ過によって濃縮した。該酵素を、最終的な力価が３９０Ｕ／ｍＬとなるまで濃縮した。アンモニウムスルフェートを５０％飽和になるまで加え、得られた沈降物を遠心分離によって収集し、そしてこのものを脱イオン水（１００ｍＬ）中に再懸濁した。該スラリーの最終的な力価は７４０Ｕ／ｍＬであり；該スラリーのタンパク質含有量は〜７５ｍｇ／ｍＬであった。
【００８６】
以下の表は、実施例４の一般的な方法後の組み換えヒトＡＤＡ固定化酵素を用いた例に対する上記の微生物アデノシンデアミナーゼを用いる場合の、水中でのｄｄＡの５２〜６０ｇ／Ｌ溶液の変換を記載する。表２の結果から知ることができる通り、組み換えヒト固定化酵素は、微生物酵素よりも有意に安定であって、そして酵素単位が低く且つ短期間で反応が完結し得る。
表２．組み換えヒトＡＤＡに対する大腸菌由来のｄｄＡの比較収率
【表７】
2007525163.tif 000008
【００８７】
結果、このものが本発明の好ましい実施態様であると記載しているが、他および更なる実施態様、改良および改善が当該分野の当業者によって知られ、そしてそれら実施態様、改良および改善の全てを包含することを意図し、そしてそれらが特許請求の範囲の真の範囲内にあると意図する。
【配列表】
2007525163000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成17年9月13日(2005.9.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007525163000001.app