(57)【要約】  少なくとも基礎的生物学的活性を有する細菌を含む液体のプロバイオティクス組成物を調製するための方法。この細菌は少なくとも１つの選択圧に従って選択されており、組成物は自己溶解物（細菌を維持するための完全な物質）を好ましくは含み、組成物は、細菌の増殖のためには好適であるが、哺乳動物のためには同じように好適ではない物質（特に、ヒトのためには好適でない物質）を実質的に含まない。ペプトンおよび緩衝化塩（特に、リン酸塩）は、少量では有害でないことがあるが、ヒトのためには特別に好適ではなく、細菌によって生成された物質を含まない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基礎的生物学的活性を有する細菌と液体培地とを含む液体のプロバイオティクス組成物であって、前記細菌は少なくとも１つの選択圧に従って選択されており、組成物は非好適物質を実質的に含まない、液体のプロバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記細菌は少なくとも１つの大腸菌菌株を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細菌は、拮抗特性を有する非病原性のラクトース陽性菌株を含む請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記細菌は、大腸菌の複数の菌株を含むか、または大腸菌の少なくとも１つの菌株と少なくとも１つの追加の細菌菌株を含む請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記選択圧は温度圧を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記温度圧は、前記細菌を含む培地の温度を上昇させることを含む請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記温度圧は、前記細菌を約３６℃〜約５０℃の温度に供することを含み、ここで前記細菌は懸濁物中にある請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記細菌は約４０℃の温度に少なくとも４日間供される請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記温度圧は、前記細菌を含む培地の温度を低下させることを含む請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記低下させることは、前記温度を約１℃〜約１２℃に１２ヶ月間まで低下させることを含む請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記温度は少なくとも約３ヶ月間低下される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記選択圧は、貯蔵時間を含み、ここで前記細菌は少なくとも約１ヶ月間貯蔵される請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記細菌は約１２ヶ月間まで貯蔵される請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記選択圧は浸透圧を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記選択圧は低浸透圧を含む請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記浸透圧は約１気圧より低い圧力を含む請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記浸透圧は約０．３気圧〜約０．４気圧の圧力を含む請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記液体培地は、水、自己溶解物および等浸透圧量の塩を含み、窒素源が約０．３％未満、所望により約０．０３％未満のレベルで存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
細菌を実質的に増殖または分裂なしに維持するための複数の物質をさらに含む請求項７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記液体１ｍｌ当り約１０７〜約１０８コロニー形成単位の前記細菌を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
少なくとも１つの矯味矯臭剤または植物からの抽出物をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
約６．０〜約７．０のｐＨを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ｐＨが約６．５である請求項１４に記載の組成物。
【請求項２４】
１回の投与当り約１０６個〜約１０１２個の生細菌の投与のために好適な用量で組成物を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２５】
１日当り約１回〜約４回の投与で投与されるために好適な用量で組成物を含む請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記細菌は前記液体培地と組合される前に自己溶解に供される請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記自己溶解は機械的撹拌、低浸透圧および懸濁物中の前記細菌の密度に対する変化からなる群から選択されるメカニズムを通して誘導される請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記密度は１ｍｌ当り約１０１１個〜約１０１２個の細菌である請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記液体培地は前記自己溶解から形成された自己溶解物を含む請求項２６に記載の組成物。
【請求項３０】
複数の細菌を増殖させて増殖培地にバイオマスを形成させ；
選択圧に従って細菌を選択し、そして
少なくとも基礎的生物学的活性を有する前記細菌をある時間期間の間、貯蔵状態で維持する
ことを含む、液体プロバイオティクス組成物の調製方法。
【請求項３１】
前記選択圧は温度圧を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記温度圧は、前記細菌を約３６℃〜約５０℃の温度に供することを含み、ここで前記細菌は懸濁物中にある請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌は約４０℃の温度に少なくとも４日間供される請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記温度圧は、前記細菌を含む培地の温度を低下させることを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記低下させることは、前記温度を約１℃〜約１２℃に１２ヶ月間まで低下させることを含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記温度は少なくとも約３ヶ月間低下される請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記選択圧は、貯蔵時間を含み、ここで前記細菌は少なくとも約１ヶ月間貯蔵される請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌は約１２ヶ月間まで貯蔵される請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記選択圧は浸透圧を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記選択圧は低浸透圧を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記浸透圧は約１気圧より低い圧力を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記浸透圧は約０．３気圧〜約０．４気圧の圧力を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記バイオマスを前記増殖培地からおよび阻害性因子から分離し；そして
前記細菌を自己溶解に供する
ことをさらに含む請求項３０に記載の方法。
【請求項４４】
前記自己溶解は機械的撹拌、低浸透圧および懸濁物中の前記細菌の密度に対する変化からなる群から選択されるメカニズムを通して誘導される請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記密度は１ｍｌ当り約１０１１個〜約１０１２個の細菌である請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記自己溶解から形成された自己溶解物を含む前記液体培地で前記細菌を貯蔵することをさらに含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記貯蔵することは、前記液体培地中の前記細菌の濃度を約１０５〜約１０１２ＣＦＵに調整することを含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記濃度は約１０７〜約１０８ＣＦＵである請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記増殖培地は固体増殖培地または液体増殖培地を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
前記増殖培地は酵母抽出物を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項５１】
前記酵母抽出物は１ｌ当り約５〜約２５グラムの量で存在する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記酵母抽出物は１ｌ当り約１５〜約２０グラムの量で存在する請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
植物材料を粉砕して粉砕された材料を蒸気滅菌することによって植物抽出物を調製し；そして
前記植物抽出物を前記組成物に添加する
ことをさらに含む請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
前記蒸気滅菌は減圧下で行われる請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも基礎的生物学的活性を有する細菌を含む液体プロバイオティクス組成物をその治療の必要がある対象に投与することを含む、対象を治療する方法であって、前記細菌は少なくとも１つの選択圧に従って選択されたものである方法。
【請求項５６】
胃腸疾患または障害の治療のために使用される請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記胃腸疾患または障害が微生物感染を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記胃腸疾患または障害が炎症性腸疾患を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記炎症性腸疾患がクローン病、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、微視的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、小腸の特発性炎症、および炎症性腸疾患関連の下痢からなる群から選択される請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記胃腸疾患または障害は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、腸管毒産生大腸菌イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびシー・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からなる群から選択される腸病原体によって生ずる胃腸感染を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記胃腸疾患または障害は、食中毒、消化不良の徴候または急性下痢の症状の発現、または検出されない病原体または未知の病因によって生じる下痢を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項６２】
前記下痢は旅行者下痢症および病院環境における下痢を含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
腸管微小生物叢の微生物バランスの乱れによって、および／または、小腸における細菌の過剰増殖によって引き起こされるか、または維持される消化管の疾患および障害を治療することを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６４】
抗生物質治療、放射線療法または化学療法、または消化管手術を含む消化管の疾患または障害から生じる消化管微小生物叢の微生物バランスの乱れレベルを防止するか、または低下させることを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６５】
消化管の外部の疾患、特定の食事要因および環境的要因から生じる消化管微小生物叢の微生物バランスにおける乱れを防止または治療することを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６６】
高齢者および抵抗力が低下した患者における胃腸管の生理学的活性を改善または正常化することを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６７】
前記組成物が１ｍｌ当り約１０６〜１０１２コロニー形成単位の前記細菌を所望により含み、好ましくは１ｍｌ当り約１０７〜１０８コロニー形成単位の前記細菌を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６８】
１日当り約１０６〜約１０１２個の前記細菌が対象に投与される請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
１日当り約１０７〜約１０９個の前記細菌が対象に投与される請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
１日当り約１０７〜約１０８個の前記細菌が対象に投与される請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物が等浸透圧培地中の自己溶解物を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項７２】
前記組成物が非好適物質を実質的に含まない請求項５５に記載の方法。
【請求項７３】
他の疾患の治療によって生じる副作用としての疾患を含む免疫系の疾患に罹患している対象において免疫系を改善または正常化するための請求項５５に記載の方法。
【請求項７４】
家畜を治療するために使用される請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はプロバイオティクス組成物に関し、より具体的には、長期間にわたって生物学的に活性な形態で貯蔵することができる非病原性の細菌菌株を含む液体のプロバイオティクス組成物を調製する方法、ならびに、その組成物および治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロバイオティクス細菌は、ヒトおよび／または動物にとって有益である。この分野では、プロバイオティクス細菌の使用が、腸管微小生物叢組成における変化または腸管微小生物叢組成に対する変化を伴い、および／またはそのような変化を引き起こし、および／または、微小生物叢組成に対する何らかの変化をもたらし、および／または、そのような変化を維持する胃腸感染症および他の疾患または障害、ならびに、そのような疾患または障害を積極的に引き起こし、または増強する、微小生物叢組成に対する変化を防止または治療するために、哺乳動物の腸管における微生物バランスを改善させることについて知られている。
【０００３】
しかしながら、今日までに行われた研究の結果は矛盾しており、かつ／または曖昧である。例えば、一部の研究では、「旅行者下痢症」を治療するためにプロバイオティクス細菌を単独で使用することは、偽薬と対比したとき、患者において有意な効果を提供するために十分ではなく、それにもかかわらず、プロバイオティクス治療と抗生物質との組合せは非常に有効であることが立証された。他の研究では、プロバイオティクス治療が単独で有益な効果を有したが、多くの場合、そのような効果を感じられるためには３ヶ月〜６ヶ月が必要であったことが示されている（Ｊ．ＪＡＭＡ、１９９６、第２７５巻、第１１号；米国特許第５４３３８２６号（１９９５年）；米国特許第５５８９１６８号（１９９６年）などもまた参照のこと）。
【０００４】
最近の研究は、単独または組合せでのいずれであっても、様々なタイプのプロバイオティクス細菌の作用の研究；プロバイオティクス細菌の生存率の改善、および、長期間の保存を可能にする方法；バイオマスの蓄積；ならびに、ヒトおよび動物の予防および治療におけるプロバイオティクス細菌の使用に向けられている。
【０００５】
約４００の異なる種類の細菌およびバクテロイドがヒトおよび他の哺乳動物の消化管に存在することが知られており、これらは排泄物体積の約３０％〜４０％をもたらし得る。これらの既知のタイプのうち、約１５のみの特徴および機能が何らかで詳しく研究されている。
【０００６】
これらのタイプの細菌のそれぞれが消化管における自身の生態学的地位を占めており、また、それぞれが最適な生存および増殖速度のための特定の条件を有する。
【０００７】
様々な疾患または障害の原因となり得る病原性細菌もまた、自身の特定の環境的領域または生息環境を占めている。病原性細菌とプロバイオティクス細菌との間での競合が様々な条件のもとで生じ得る。しかし、最大の競合作用が、病原性細菌およびプロバイオティクス細菌の両方の最適な生存および増殖速度のための条件が類似しているときに生じる。そのような条件のもとでは、生存は、栄養分または生育因子に対するより厳しい競合、ならびに、相乗的な栄養分利用、および、受容体部位に対する競合に依存する。抗菌性物質の産生、増殖の強さ、および、制限的環境の作出（免疫学的プロセスの誘導および上皮細胞の代謝回転の刺激を含む）などの要因もまた、そのような条件のもとでは重要な意味を有する。
【０００８】
プロバイオティクス組成物が、非病原性大腸菌と、他の非病原性細菌との培養物を使用して開発されている（米国特許第５３４０５７７号；米国特許第５４４３８２６号；米国特許第５４７８５５７号；米国特許第５６０４１２７号）。
【０００９】
大きな拮抗活性を有するラクトース陽性の非病原性大腸菌菌株がドイツおよびロシアにおいて凍結乾燥調製物として作製されている（例えば、大腸菌Ｍ１７の凍結乾燥調製物Ｃｏｌｉｂａｃｔｅｒｉｎ  ｓｉｃｃｕｍの使用、これは、Ｖｉｄａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｒｕｓｓｉａ（Ａｓｔｒａ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、１９９７、Ｍｏｓｃｏｗ）に記載される）。
【００１０】
近年では、非常に多数（３０種まで）の異なる種類の細菌およびバクテロイドを含むプロバイオティクス調製物を開発することに向けた動きがある（例えば、米国特許第５４４３８２６号；米国特許第５４７８５５７号）。
【００１１】
しかしながら、１つだけまたは２つのタイプを含む調製物を上回る、そのような非常に様々な異なる細菌を使用することの利点は立証されていない。実際には、低下した効力が非常に多数の種類により生じ得るという証拠がいくつかもたらされている。Ｂｅｈｌｉｎｇ他は２５個のラクトース陽性大腸菌を調べ、それらのうちの２つのタイプ（大腸菌１２５Ａおよび大腸菌１２８）がニワトリにおけるＳ．ｅｎｔｅｒｉｄｓ感染に対して阻害的作用を有したことを見出した。しかしながら、１２５Ａ株の作用は１２８株の作用よりも著しく大きく、これら２つの菌株の組合せは、１２５Ａ株単独により得られる作用よりも小さい作用をもたらした。
【００１２】
様々な研究により、サルモネラ属からの保護が、盲腸由来の２９５個の単離体の混合物を使用したときにはないことが示され（Ｇｏｒｅｎ他、１９８４）、これに対して、保護が、４つのみの単離体の混合物を使用してもたらされた（カナダ国特許第１１５１０６６号）。
【００１３】
従って、使用された細菌菌株の数と、得られる保護レベルとの間には明確な関係性がないように見える。これは、主として、相乗的または拮抗的な作用をもたらし得る、異なる菌株の間での様々な相互作用のためである。
【００１４】
様々な研究が、乾燥されかつ非常に小さいカプセルに配合されるラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｔｒｉａ）を使用して行われている（米国特許第５５０１８５７号、同第５６１４２０９号および同第５６３５２０２号）。それらの著者らは、そのようなマイクロカプセル化された調製物は、胃を通過する期間中において従来の形態よりも大きい安定性を有することを主張している。
【００１５】
生細菌の保存における研究は、主として、その適用を簡略化するための改善された製造方法および技術的解決策に関して、凍結乾燥された調製物に向けられている（米国特許第５１３９７９２号および同第５４０１５０１号）。
【００１６】
先行技術特許は、細菌を懸濁状態（すなわち、直ちに使用できる状態での液体形態）で保存する方法をほとんど取り扱っていない。米国特許第４９９９３０１号は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔｒｕｍまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓの微生物を、１０％〜３０％の栄養物固体を含有する高濃度培地で２ヶ月の期間にわたって保存するための方法を教示している。しかしながら、これは、実際には、多数のさらなる操作を必要とする多段階の生育サイクルを記載している。細菌の少なくとも０．５％が生存したままである。
【００１７】
米国特許第４５１８６９６号は、ヒマワリ種油とのオイル−細胞の混合物を使用するラクトバチルス属細菌の液体懸濁物を教示している。しかしながら、生細胞は、オイルと混合する前に乾燥されること、および、水の内部濃度が低いことによってさらに特徴づけられる。
【００１８】
背景技術の特許はどれも、細菌細胞が高レベルの生物学的活性を維持する液体のプロバイオティクス培地を教示も、示唆もしていない。そのような培地は、例えば、炎症性腸疾患のような疾患のためには明らかに必要とされる。
【００１９】
炎症性腸疾患（またはＩＢＤ）は、胃腸管の関連するが、異なった慢性的な炎症性障害（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、不確定大腸炎、微視的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎など；クローン病および潰瘍性大腸炎が最も一般的な疾患である）を包含する総称的な用語である。胃腸管のもう１つの慢性的障害が過敏性腸症候群（ＩＢＳ）である。
【００２０】
ほとんどの患者について、ＩＢＤおよびＩＢＳは、症状が数ヶ月から数年間にわたって続く慢性的な状態である。ＩＢＤおよびＩＢＳは若年成人において最も一般的であるが、どの年齢でも発生し得る。ＩＢＤおよびＩＢＳは世界中で見出されるが、合衆国、英国および北ヨーロッパなどの工業化国では非常に一般的である。例えば、ＩＢＤは、合衆国だけで二百万人の人々が罹っていることが推定される。
【００２１】
ＩＢＤおよびＩＢＳの正確な原因は未だ理解されていない。一般的な仮説では、例えば、免疫系における障害、および前炎症性サイトカインの作用、およびリンパ球サブセットの選択的活性化が含まれ、これらにより、腸における炎症性応答の抑制されない活性化が永続化する。病原性細菌および潜在的病原性細菌によって生じる代謝産物が免疫系における障害を引き起こすことがある。従って、これらの細菌はこの種の乱れに関係することがあり、また、腸における微生物学的バランスの乱れに関連づけられ得る。そのような乱れはそれ自体が原因となることがあり、あるいは（または組合せで）、この乱れが次に免疫系の自己免疫反応および／または他の反応を生じさせ得ることが考えられる。例えば、ＩＢＳを罹っている患者では、そのような患者の７０％までが腸系における細菌の過剰増殖を有することが近年に示されたが、この過剰増殖の治療により、症状の軽減または症状の停止さえもが多くのＩＢＳ患者でもたらされた（Ｍａｒｋ  Ｐｉｍｅｎｔｅｌ博士（Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）による研究から）。
【００２２】
ＩＢＤおよびＩＢＳには治療法がない。ＩＢＤまたはＩＢＳに冒された患者は、一般には、現在、炎症プロセスを軽減すること、および、患者に対する炎症プロセスの影響を小さくすることに向けられている治療法により治療される。ＩＢＤの現在知られている医学的治療は、炎症性腸疾患の急性悪化の数、頻度および重篤度を軽減するために、また、二次的な合併症を防止するために意図されているが、いくら良くても、その結果は失望させるものである。
【００２３】
ＩＢＤまたはＩＢＳを治療するための現在知られている方法は、（ｉ）ＩＢＤに対する実質的な治療法を提供することができず、むしろ、症状の治療を提供するだけであり、また、（ｉｉ）重篤な有害副作用が伴う薬物療法、または浸襲的な手術的治療のいずれかを含み、両者とも患者の生活の質に影響を及ぼすので、少なくとも一部のＩＢＤ罹患者またはＩＢＳ罹患者に解決策を提供することができない場合がある。
【発明の開示】
【００２４】
背景技術は、安定かつ効果的な液体プロバイオティクス組成物を教示も、示唆もしていない。背景技術はまた、微生物感染症、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（これらに限定されない）をはじめとする様々な腸障害を治療するためのそのような組成物を教示も、示唆もしていない。
【００２５】
本発明は、少なくとも基礎的生物学的活性を有する細菌を含む液体のプロバイオティクス組成物を調製するための方法を提供することによって背景技術のこの欠点を克服している。この場合、この細菌は少なくとも１つの選択圧に従って選択されており、また、組成物は、細菌の増殖のためには好適であるが、哺乳動物のためには同じように好適ではない物質（特に、ヒトのためには好適でない物質）（以降、「非好適物質」として規定される）を実質的に含まない。例えば、ペプトンおよび緩衝化塩（特に、リン酸塩）は、少量では有害でないことがあるが、ヒトのためには特別に好適ではない。
【００２６】
場合により、選択圧は、温度、時間（一定の期間にわたって貯蔵されたときの安定性）、および浸透圧の少なくとも１つを含むことができる。本発明はまた、選択圧に従って細菌を選択すること、および、少なくとも基礎的生物学的活性を有するこの細菌を一定の期間にわたって保存状態で維持することを含む、液体のプロバイオティクス組成物を調製するための方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、その治療を必要としている対象に本発明の液体プロバイオティクス組成物を投与することを含む、対象を治療するための方法を提供する。本発明の液体配合物は、腸管におけるバイオマス生成を必要としないので、経口投与の直後から治療的に活性である。
【００２８】
好ましくは、この方法は、治療が所望または要求される胃腸疾患または胃腸障害を治療するためのものであり、この場合、そのような胃腸疾患または胃腸障害は、場合により、および、より好ましくは、微生物感染症（例えば、細菌感染症）および／またはＩＢＤおよび／またはＩＢＳを含むことができる。本発明はまた、ＡＡＤ（抗生物質に関連した下痢）、ならびに、急性下痢の任意の形態、例えば、微生物（これには、腸管毒産生大腸菌、サルモネラ属細菌、プロテウス属細菌、シュードモナス属細菌、クロストリジウム属細菌、ブドウ球菌属細菌、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）などが含まれるが、これに限定されない）によって引き起こされる下痢、または、検出されない病原体によって引き起こされる下痢；旅行者下痢症の症状；病院環境における急性下痢を治療するために、また、同様に、下痢を伴うＩＢＳ（過敏性腸症候群）（粘液性または炎症性のいずれかであっても）の症状、および、放射線または化学療法によって引き起こされる下痢を治療するために有用である。
【００２９】
本発明はまた、下記のような、胃腸管における微小生物叢の「異常」または「異常な」分布の存在に関連づけられる様々な疾患状態を治療するために有用である；ＩＢＤ（炎症性腸疾患）（粘液性または炎症性のいずれかであっても）、痙攣性結腸、粘液性大腸炎、抗生物質に関連した大腸炎、特発性または単純な便秘、ならびに、特定の微生物（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ／ｃｏｌｉなど、およびＣａｎｄｉｄａなど）による慢性的な胃腸感染症；および、抗生物質、放射線療法または化学療法、腸感染、消化管手術、免疫不全、不都合な生態学的状況の影響（より大きな放射線および年齢変化を含む）によって引き起こされる消化管微生物バランスの乱れに起因する慢性的な下痢。
【００３０】
本発明の他の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物および方法は、場合により、食中毒、消化不良症状、または、急性下痢の症状発現、あるいは、検出されない病原体または未知の病因によって引き起こされる下痢を治療するために有用である。本発明はまた、場合により、腸管微小生物叢の微生物バランスの乱れによって、および／または、小腸における細菌の過剰増殖によって引き起こされるか、または維持される消化管の疾患および障害を治療するために有用である。本発明はまた、場合により、抗生物質治療、放射線療法または化学療法、消化管の疾患または障害（消化管手術を含む）から生じる消化管微小生物叢の微生物バランスの乱れレベルを防止するか、または低下させるために有用である。
【００３１】
本発明のさらに他の好ましい実施形態によれば、本発明の組成物および方法は、場合により消化管の外部の疾患、特定の食事要因および環境的要因から生じる消化管微小生物叢の微生物バランスにおける乱れを防止または治療するために有用である。本発明はまた、高齢者および抵抗力が低下した患者における胃腸管の生理学的活性を改善または正常化するために有用である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも基礎的生物学的活性を有する細菌を含む液体のプロバイオティクス組成物が提供される。この場合、細菌は、温度、時間安定性（貯蔵における安定性）および浸透圧から選択される少なくとも１つの選択圧に従って選択されており、かつ、組成物は、細菌ペプトン、塩をはじめとする細菌の増殖のために好適な物質を実質的に含まず、また、増殖期の期間中に細胞自身によって産生された阻害因子を有さない。好ましくは、本発明の組成物は、最小限の生物学的活性を伴う生存状態で細菌を維持するために好適である必要な栄養分を提供するが、下等哺乳動物またはヒトにとって有害ではない、より速い調製段階のときに細菌自身から調製された自己溶解物を含む。また、好ましくは、組成物のｐＨは、細菌の生存能力を維持するために好適であるように調節される（より好ましくは約ｐＨ６〜約ｐＨ７である）。
【００３３】
従って、本発明の１つの態様によれば、その必要性のある対象における炎症性腸疾患／過敏性腸症候群（ＩＢＤまたはＩＢＳおよびその他）を治療する方法が提供される。この方法は、液体配合物でのプロバイオティクス大腸菌菌株の治療効果的な量を対象に経口投与することを含む。治療効果的な量は、好ましくは、投与あたり約１０６個〜約１０１２個の生細菌であり、１日あたり１回〜１０回（好ましくは約２回〜４回）の範囲で投与される。
【００３４】
本発明の別の態様によれば、液体配合物でのプロバイオティクス大腸菌菌株を有効成分として含むプロバイオティクス医薬組成物が提供される。
【００３５】
本発明のさらなる態様によれば、液体配合物でのプロバイオティクス菌株（好ましくは大腸菌菌株）の治療効果的な量を対象に経口投与することを含む、微生物感染に対する治療方法が提供される。
【００３６】
下記の表には、様々な疾患および障害を治療するための本発明による組成物の提案される用量が示されるが、この表は例示目的のためだけに意図され、いかなる点でも限定であることを望まない。
【表１】
2007518693.tif 000002
【００３７】
本発明はまた、他の疾患の治療によって引き起こされる副作用のような障害をはじめとする免疫系の障害に苦しんでいる対象における免疫系を改善または正常化するためにも有用であり、そして同様に、家畜を治療するためにも有用である。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、非病原性のラクトース陽性プロバイオティクス菌株（例えば、大腸菌Ｍ−１７株など）は、単独で、あるいは、場合により、１つ以上の大腸菌菌株および／または他の細菌菌株と一緒に含まれる。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の液体配合物は１ｍｌあたり約１０６ＣＦＵ〜約１０１２ＣＦＵのプロバイオティクス大腸菌菌株を含み、より好ましくは、１ｍｌあたり約１０７ＣＦＵ〜約１０１０ＣＦＵのプロバイオティクス大腸菌菌株を含む。
【００４０】
本発明は、プロバイオティクス大腸菌菌株を用いて細菌感染症、炎症性腸疾患／過敏性腸症候群（ＩＢＤまたはＩＢＳまたはその他）を治療するための方法およびプロバイオティクス組成物を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。そのようなプロバイオティクス治療は、有効であり、安全であり、非浸襲性であり、かつ副作用がないので、上記に記載されるような疾患または障害、あるいは、他の疾患または障害を治療する現在の方法と比較したとき、非常に好都合である。
【００４１】
本発明の１つの特徴は、大腸菌または他の細菌が生物学的に活性な形態で保存されることである。
【００４２】
本発明の１つの利点は、細菌のプロバイオティクス作用が、胃腸管に達したときに直ちに開始されることである。
【００４３】
本発明のさらなる利点は、調製物が、細菌の生存能力の著しい喪失を伴うことなく、長期間にわたって貯蔵され得ることである。
【００４４】
本発明のさらなる利点は、本発明の組成物が、胃を通過する期間中において乾燥調製物よりも大きい安定性を示すことである。
【００４５】
本発明のさらなる利点は、調製物が、知られているプロバイオティクス調製物と比較したときに、より大きい用量を用いることによってはるかにより大きな効果の増大を示すことである。
【００４６】
この分野で知られているプロバイオティクス組成物は、それらが調製および貯蔵されている様式のために明らかに劣っている。例えば、上記で記されたように、多くのそのような組成物は、生物学的活性が非常に低下したレベルをもたらす凍結乾燥に依っている。
【００４７】
本発明はまた、液体プロバイオティクス組成物の広い作用スペクトルの効能は、病原体を最初に特定し、抗菌性調製物に対するその感受性を明らかにすることなく、腸感染症を効果的に治療することを可能にし得るという利点を有する。
【００４８】
図面の簡単な記述
本発明は、添付されている図面を参照して、例としてのみ、本明細書中に記載される。
図１は本発明による液体組成物から採取された細菌の増殖速度と、凍結乾燥組成物から採取された細菌の増殖速度との比較を示す。前者の方が明らかに、後者と比較して、優れた生育速度を示している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本発明は、非病原性のプロバイオティクス微生物を含む組成物を調製するための方法、ならびに、ＩＢＳ、ＩＢＤ、抗生物質関連下痢（ＡＡＤ）および任意の他のタイプの下痢または症状だけでなく、胃腸管の微生物感染症の治療における組成物およびその使用に関する。
【００５０】
本発明は、プロバイオティクス細菌を含有する液体組成物の使用を含む。細菌細胞は、代謝に好ましくない条件にさらされているときに依然として生存可能であるそのような細胞を選択するために、選択圧因子の適用によって最初に選択される。このような選択圧因子は、場合により、および、好ましくは、時間安定性（貯蔵における安定性）、温度および浸透圧の条件の少なくとも１つを含むことができる。従って、最大の生存能力を有する細菌が選択される。
【００５１】
温度選択条件は、場合により、および、好ましくは、活発な生命維持の細胞代謝のための最適な範囲を超える温度に、好ましくは、４０℃の温度に４日〜５日の期間にわたって細胞をさらすことを含む。
【００５２】
好ましくは、細胞は、活発な生命維持の細胞代謝のための最適な温度範囲よりも低い温度に、好ましくは、２℃〜１５℃の温度に１ヶ月〜１２ヶ月の期間にわたって、より好ましくは、３ヶ月〜１２ヶ月の期間にわたってさらすことによって選択することができる。
【００５３】
本発明の方法によれば、選択された細菌は、好ましくは、選択された生存可能な非病原性細菌を含有する液体のプロバイオティクス配合物（これは、場合により、および、好ましくは、１ｍｌあたり約１０７コロニー形成ユニット〜約１０８コロニー形成ユニットの選択されたプロバイオティクス大腸菌を含む）を調製するためのバイオマスの製造のために、成長培地に接種するために使用される。懸濁培地は本質的には成長培地を含まない。
【００５４】
懸濁培地はさらに、細菌細胞の生分解性成分の産生を妨げる条件のもとでの自己溶解の結果として細胞懸濁物自体からそのような物質が供給されることによって、最小限のエネルギー消費および柔軟な代謝とともにその基礎的生物学的活性を維持するために、細菌細胞のために使用され得る物質の複合体を含むことができる。自己溶解は、場合により、機械的作用の適用によって、および／または、環境の構成によって増大させることができる。例えば、自己溶解を、細菌細胞の内側の浸透圧と、懸濁培地の浸透圧との間で浸透圧の不均衡を与えることによって誘導することができる。例えば、自己溶解を、低い浸透圧を有する好適な懸濁培地の使用によって、最も好ましくは、０．３％〜０．４％の塩化ナトリウム溶液の使用によって誘導することができる。
【００５５】
あるいは、自己溶解を、細菌懸濁物の密度に対する変化によって、例えば、密度を、１ｍｌあたりの細菌数（ＣＦＵ；これら２つの用語は本出願では交換可能に使用されることに留意しなければならない）が好ましくは約１０１１個〜約１０１２個であるようにすることによって誘導することができる。
【００５６】
同様に、あるいは、別の方法を、細菌の生分解成分の産生を妨げるために使用することができる。そのような方法の例には、例えば、超音波または他の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
場合により、および、好ましくは、細菌懸濁物は、自己溶解物の蓄積を生じさせるために自己溶解を促進する条件に３日間〜７日間にわたって供され、その後、細胞の内部と、好適な懸濁培地（好ましくは、約０．６％〜約０．７％の範囲で、最も好ましくは、０．６％の塩化ナトリウム溶液）との間での浸透圧バランスの条件に供される。
【００５８】
細胞成分（例えば、核酸成分など）は、１ｍｌあたりの細菌数が１０１１個〜１０１２個である細胞濃度を用いて、好ましくは９０μｇ／ｍｌ〜１１０μｇ／ｍｌまでの量で、自己溶解のために有利な条件のもとで蓄積する。
【００５９】
懸濁培地は、細胞を、生存可能であるだけでなく、細胞を生物学的に活性な状態で維持する条件のもとで維持する。培地はまた、好ましくは、（上記で記載されたように）さらなる生育または増殖を実質的には伴うことなく細菌を維持するための必要な成分を含み、かつ、培地は、生育時に微生物によって通常の場合にはもたらされる阻害性因子を本質的には含まない。
【００６０】
配合物は、最大期間にわたって基礎的生物学的活動率で生存可能かつ生物学的に活性な条件のもとで細菌を維持する条件のもとで貯蔵される。このような条件には、約６．０〜約７．０（好ましくは、約６．５〜約６．８）のｐＨ、および、約２℃〜約１０℃の温度が含まれる。
【００６１】
本発明の液体配合物は、ヒトおよび動物の治療において使用することができる。好ましくは、１０ｍｌ〜２０ｍｌの用量の配合物が１日に２回〜４回の間で対象に投与される。
【００６２】
以下、特定の物質を「実質的に含まない」の用語は、好ましくは、その物質が少量または微量（より好ましくは、約５％（重量対重量）未満）で存在する状態を示す。
【００６３】
本明細書中で使用される用語「方法」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これらには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の当業者によって知られているか、または、知られている様式、手段、技術および手順からそのような当業者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書中において、用語「治療する」は、疾患の進行を妨げること、または実質的には阻害すること、または遅くすること、または取り消すこと、あるいは、疾患の臨床的症状を実質的に改善すること、あるいは、疾患の臨床的症状の出現を実質的に防止することを包含する。
【００６５】
用語「防止する」は、対象が障害または疾患を最初に獲得することを禁じることを示す。
【００６６】
本明細書中で使用される表現「炎症性腸疾患（ＩＢＤ）」は、ＧＩ管における炎症性活動によって特徴づけられる障害または疾患を示し、これには、粘液形態のＩＢＤが含まれ得る。本発明のプロバイオティクス菌株によって治療可能であるＩＢＤの例には、クローン病（遠位性および近位性の両方）、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、微視的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、小腸および／または近位腸の特発性炎症、ならびに、ＩＢＤに関連した下痢が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
本明細書中で使用される用語「投与する」は、プロバイオティクス大腸菌菌株（１つ以上）または他の菌株（１つ以上）を疾患または障害によって冒されているＧＩ管内の領域または部位に届けるための方法を示す。
【００６８】
用語「治療効果的な量」は、治療されている疾患または障害の症状の１つ以上を少なくともある程度緩和する、投与されているプロバイオティクス大腸菌菌株または他の菌株のそのような量を示す。
【００６９】
以降、用語「対象」は、治療剤が投与されるヒトまたは下等動物を示す。
【００７０】
経口投与される組成物には、水または非水性媒体における懸濁物または溶液、あるいは液体含有カプセルが含まれる。増粘剤、希釈剤、矯味矯臭剤、分散化助剤、乳化剤または結合剤が望ましい場合がある。
【００７１】
投薬は、症状の重篤度、および、治療剤に対する対象の応答性に依存する。当業者は、最適な投薬量、投薬方法論および反復割合を容易に決定することができる。
【００７２】
治療効果的な量は、本発明の方法によれば、好ましくは、投与あたり約１０６個〜約１０１２個の生細菌の範囲であり、より好ましくは、投与あたり約１０７個〜約１０１０個の生細菌の範囲であり、より好ましくは、投与あたり約１０８個〜約１０１０個の生細菌の範囲であり、最も好ましくは、投与あたり約５ｘ１０９個〜約２ｘ１０１０個の生細菌の範囲である。
【００７３】
本発明による投与回数は、好ましくは、１日あたり１回から１０回の投与に及び、より好ましくは、１日あたり１回から５回の投与に及び、最も好ましくは、１日あたり２回から４回の投与に及ぶ。１日に投与される生細菌の総量は、好ましくは、１日あたり約１０９個〜約１０１１個の生細菌の範囲である。だが、１日に投与される生細菌の総量は、場合により、１日あたり約１０６個〜約１０１２個の生細菌の範囲である。
【００７４】
本発明のプロバイオティクス菌株は、好ましくは、本明細書中下記に詳しく記載され、また、下記の実施例の節においてさらに例示されるように、液体配合物として配合され、かつ投与される。
【００７５】
本発明のプロバイオティクス菌株を液体配合物に配合することは非常に好都合である。生物学的に活性な条件のもとにあるので、そのような配合物は、細菌が嫌気的条件下にある凍結乾燥された配合物（例えば、市販のＭ１７調製物など）とは対照的に、生細菌に対する支持的媒体としてもまた役立つ。結果として、本発明の液体配合物は、例えば、腸管におけるバイオマス生成が要求されないので、経口投与後直ちに治療的に活性となる。
【００７６】
本発明によるプロバイオティクス大腸菌菌株の液体配合物は、典型的には、水溶液における細菌の懸濁物を含む。水溶液は、典型的には、本明細書中下記においてさらに詳述されるように、主として、好ましくは、細菌由来の自己溶解物、等浸透圧量での塩を含む蒸留水からなり、他の成分をさらに含むことができる。好ましくは、溶液は、生存能力を維持するために都合のよいｐＨのために調節される。好ましくは、溶液はまた窒素源を含むが、より好ましくは比較的少量で、最も好ましくは約０．３％未満で、さらにより好ましくは約０．０３％未満で窒素源を含む。別途言及されない限り、本明細書中におけるすべてのパーセントは重量対体積として与えられることに留意しなければならない。
【００７７】
本発明によるプロバイオティクス大腸菌菌株の液体配合物は、典型的には、１ｍｌあたり約１０５ＣＦＵ〜約１０１２ＣＦＵ（コロニー形成ユニット）のプロバイオティクス大腸菌菌株を含む。好ましくは、液体配合物は１ｍｌあたり約１０６ＣＦＵ〜約１０１０ＣＦＵを含み、より好ましくは、１ｍｌあたり約１０７ＣＦＵ〜約１０８ＣＦＵを含む。
【００７８】
本発明の好ましい実施形態によれば、１日あたり１０ｍｌ〜２０ｍｌの液体配合物が１日あたり２回〜４回の間で対象に投与される。
【００７９】
本発明に関連して使用される液体配合物は経口投与される。そのため、液体配合物は好ましくは、１つ以上の矯味矯臭剤および／ならびに１つ以上の植物抽出物をさらに含む。
【００８０】
非病原性のラクトース陽性大腸菌（例えば、Ｍ１７株およびＮｉｓｌｅ株など）は、健康に役立つ好気性微小生物叢の主要群をヒトおよび動物の腸において構成しており、これらは微生物学的バランスを提供し、かつ、栄養および免疫性において重要な役割を果たしている。
【００８１】
この細菌菌株は、下痢を引き起こす原因となっている腸管病原体の大部分と同じ系統発生的群に属しており、従って、それらの生存条件は大部分が類似しており、そのため、これらの菌株の間での大きなレベルの競合的排除が生じる。この競合的作用には、プロバイオティクス細菌の増殖期間中における抗菌性物質の産生、栄養分および成長因子に対する競合、相乗的な栄養利用、ならびに、受容体部位に対する競合が含まれる。
【００８２】
増殖速度（これは競合的拮抗作用における大きな要因である）は、本発明の細菌菌株の方が、例えば、ラクトバチルスまたはＢ．Ｂｉｆｉｄｕｓの場合よりも大きく、また、多くの腸管病原体の増殖速度と少なくとも等しい。そのうえ、本発明の細菌菌株は、栄養要求に関して、ラクトバチルスまたはＢ．Ｂｉｆｉｄｕｓなどの菌株よりもはるかに選択性が低い。
【００８３】
現在利用可能なプロバイオティクス調製物では、乾燥された細菌が、嫌気的条件ではあるが、細菌が依然として生存可能であるように使用されている。そのような調製物が投与されたとき、誘導期間が、生物学的活性が回復されるまでに存在する。腸の内容物は下痢のときには素早く排出されるので、投与された乾燥細菌調製物のほんの小さい割合が結腸に保持されて、増幅し、生物学的活性を獲得する。
【００８４】
本発明の液体プロバイオティクス配合物は、生物学的に活性な形態での細菌の保存を可能にし、その結果、細菌のプロバイオティクス作用が、適合化時間が要求されることなく、胃腸管に到達したとき直ちに開始されるようになる。従って、細菌の増殖が始まるためにかかる時間が、本発明の液体配合物の場合、凍結乾燥された細菌を使用する調製物の場合よりもはるかに速い。
【００８５】
細菌病原体に対する本発明のプロバイオティクス組成物の拮抗作用が、凍結乾燥された調製物に由来するプロバイオティクス細菌の拮抗作用よりもかなり大きいことが見出された。「拮抗（的）」によって、特定の細菌菌株が他の細菌または他の微生物の生育を弱めることができることが意味されることに留意しなければならない。
【００８６】
主として塩酸を含む胃酸の作用は多くの細菌の死を引き起こすことが知られている。乾燥された形態での細菌は、液体培地に含有される細菌よりも弱く、従って、胃酸の作用をより受けやすい。従って、本発明の液体組成物に含有される細菌は、胃を通過するとき、凍結乾燥された調節物における細菌よりも安定である。結腸に進入する細菌が増殖を開始し、その拮抗的性質を発揮する。しかしながら、腸管病原体の大部分に対する最初の作用部位は結腸でなく、胃腸管の上部部分である。知られているプロバイオティクス調製物は、生細菌の競合的濃度を腸の上部部分に送達することができず、従って、事実上、急性の細菌性下痢、および、腸の上部区域におけるミクロ生態学的バランスの乱れによって引き起こされる状態を除くことにおいて効果がない。
【００８７】
従来のプロバイオティクス調製物製造法を使用するとき、調製物の細菌量を増大させることは問題である。そのような方法では、細菌が培地と一緒に乾燥させられ、様々な安定化剤が、細菌の安定性を増大させるために加えられる。従って、投与される細菌の量を増大することは、それ以外の成分の摂取レベルの増大をもたらし、このことは重大な副作用を生じさせ得る。
【００８８】
対照的に、本発明の組成物は、１日あたりに投与される細菌数を、好ましくは約１５０ｍｌまでの体積で、また、以前に述べられたような濃度で、数千万個から約２０００億個の細菌まで変化させることができるように、生物学的に純粋な細菌の液体懸濁物を含む。このことは、細菌の有効な競合的濃度が、消化管の上部区域（すなわち、腸管病原体の大部分が作用する部位）から始まって提供されることを可能する。標的部位により、疾患または障害を治療するために要求される濃度が決定される。
【００８９】
本発明の液体プロバイオティクス組成物の有効性はまた、本発明の液体プロバイオティクス組成物が、治療されるべき疾患または障害に従って最大の用量依存的効力を提供するとして決定される投薬頻度に従って投与され得るという事実によっても増大する。例えば、急性の下痢を治療する際には、本発明の液体プロバイオティクス組成物を、便秘の治療のために使用される効果的な量よりも１０倍〜１００倍大きい量で投与することができる。
【００９０】
本発明の液体プロバイオティクス組成物の調製において、最大の拮抗活性を有し、かつ、長期間にわたる貯蔵（好ましくは約１２ヶ月までの貯蔵）のもとで最も持続する細菌細胞を有する大腸菌細胞（または他の細菌細胞）が、より好ましくは、有益なプロバイオティクス性質を有するラクトース陽性の非病原性大腸菌種から最初に選択される。
【００９１】
本発明のプロバイオティクス組成物において使用される大腸菌細胞または他の細菌は、選択された細胞のみが依然として生存可能であるように、選択圧を細胞に及ぼすことによって選択される。選択圧の適用は、長期間の生存能力を有する細胞が選択されるような時間圧（経時的な安定性）の使用；浸透圧の適用；基礎代謝の低下；または、温度の上昇によって達成することができる。温度による選択は、場合により、および、好ましくは、細胞を４０℃の温度に少なくとも４日間さらすこと、および／または、より高い温度に、より短い期間さらすことを含む。これらの手段によって、大きい生存能力を有する細胞のみが最初の培養物から選択される。
【００９２】
選択された細菌細胞は、実施例６および実施例７を参照して、より詳しくは下記において記載されるように、成長培地への接種のために使用された。本発明の栄養組成物は、実施例を参照して記載される因子などの様々な因子、例えば、酵母抽出物および／または酵母自己溶解物に由来する因子を含むことができる。本発明の成長培地の栄養組成物は、生育因子を場合により含むことができ、また、経済的利益をもたらすそのような生育因子（例えば、酵母抽出に由来する因子）の添加のために、従来の成長培地を用いて得られる細菌バイオマスと比較して、蓄積された細菌バイオマスのかなりの増大をもたらす。酵母抽出物は、好ましくは約５グラム／リットル〜約２５グラム／リットルの量で存在し、より好ましくは約１５グラム／リットル〜約２０グラム／リットルの量で存在する。
【００９３】
栄養組成物の他の供給源が可能であるが、それらには、好ましくは、背景技術において知られているような必要な栄養分、生育因子などのすべてが含まれる（例えば、“Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｇｅｒｈａｒｄｔ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、米国、１９８１）に記載される栄養分、成長因子など）。
【００９４】
本発明の方法は、大量投与時のその関連する副作用を伴う培地を含まず、また、細菌の増殖および活性の開始を遅らせる、生育期間中に微生物によって通常の場合には産生される阻害性因子を含まない生物学的に純粋な細菌を提供する。
【００９５】
グラム陰性細菌（特に大腸菌）の細胞内部の浸透圧が対数増殖期では１５気圧にまで達し、また、増殖の定常期では２気圧〜３気圧に達し得ることが知られている。本発明の方法の好ましい実施形態において、低い浸透圧（好ましくは１気圧未満、より好ましくは０．３気圧〜約０．４気圧）を有する懸濁培地が使用される。本発明の液体プロバイオティクス組成物の最初の調製段階のときにおける浸透圧の不均衡および大きい細菌密度は、対数期において、最も弱く、かつ最も小さい定常的細菌細胞の自己溶解のための条件をもたらす。これらの溶解した細胞は、懸濁培地における細菌由来の細胞成分の蓄積をもたらし、これにより、残存する細胞の栄養学的要求を提供する。この手法を使用して、１０１１細菌／ｍｌ（ＣＦＵ）〜約１０１２細菌／ｍｌ（ＣＦＵ）の細胞濃度が得られた。だが、再度ではあるが、場合により、細胞濃度はより広い範囲で存在し得る。
【００９６】
実施例１に示されるように、最大の細胞安定性のための本発明の懸濁培地のｐＨは、場合により、および、好ましくは、約６．０〜約７．０の範囲である。より好ましくは、懸濁培地のｐＨは約６．５である。
【００９７】
実施例２に示されるように、本発明の細菌細胞は、場合により、および、好ましくは、約２℃〜約２０℃の範囲の温度で貯蔵される。より好ましくは、貯蔵温度は約２℃〜約１０℃の範囲である。最も好ましくは、貯蔵温度は約２℃〜約４℃の範囲である。
【００９８】
細胞安定性にとって有利な条件（例えば、好適なｐＨ、１０７細胞／ｍｌ〜１０８細胞／ｍｌの細胞濃度、最小限のエネルギー消費および柔軟な代謝などとともにその構造を維持するために細菌代謝によって使用される物質の複合体（自己溶解物））のもとでは、本発明の液体プロバイオティクス組成物は、生存可能な条件でだけでなく、直ちに活性な生物学的形態でもまた、少なくとも１２ヶ月間にわたって細菌を保存する様々な因子の組合せをもたらす。この段階のための細菌の濃度は、場合により、約１０６細菌／ｍｌ〜約１０１２細菌／ｍｌの範囲であり得ることに留意しなければならない。物質のこの複合体は、好ましくは、核酸、核酸成分、細菌のリポ多糖、ペプチドグリカン、リン脂質および多くの他の望ましい物質を含む。
【００９９】
本発明のプロバイオティクス組成物はヒトおよび動物の治療において使用することができる。
【実施例】
【０１００】
本発明のプロバイオティクス組成物の配合、調製および使用が、下記の非限定的な実施例を参照して例示される。
【０１０１】
（実施例１）：液体プロバイオティクス組成物の調製プロセス
選択された細菌を、自己溶解物を作製するために、０．３％〜０．４％のＮａＣｌ溶液において１０１１ＣＦＵ／ｍｌ〜１０１２ＣＦＵ／ｍｌの範囲にある高濃度物の形態でバイオマスを形成させるための生育のために最初に調製した。
【０１０２】
液体プロバイオティクス組成物を調製するために、細胞高濃度物を１０７細胞／ｍｌの細胞濃度に０．６％〜０．８％のＮａＣｌ溶液で希釈した（しかし、場合により、細菌の濃度は約１０６細菌／ｍｌ〜約１０１２細菌／ｍｌの範囲にすることができる）。液体プロバイオティクス組成物を細胞生存にとって有利なｐＨに調節した。好ましいｐＨは約６．５〜６．８までであった。味覚を改善するために、長期間にわたって保存された細菌の生存能力を低下させない１つ以上の植物抽出物、矯味矯臭剤および／または他の添加物を加えることができる。植物抽出物を調製するための例示的な方法の説明が下記において実施例１５に示される。
【０１０３】
液体プロバイオティクス組成物は、冷蔵条件のもとでは、生物学的性質の著しい喪失を伴うことなく少なくとも１２ヶ月にわたって保存することができる。
【０１０４】
（実施例２）
＋２±８℃の温度における懸濁培地（浸透圧を平衡化させた溶液を提供する自己溶解物を有する０．７％塩化ナトリウム溶液）のｐＨに依存する大腸菌Ｍ−１７＊細菌の生存能力（ＣＦＵ／ｍｌ）。
【表２】
2007518693.tif 000003
【０１０５】
上記に示されるように、生細胞の数が、８．５のｐＨを有する懸濁培地で貯蔵されたときには１ヶ月以内に大きく減少している。著しい減少が、５．５未満のｐＨまたは７．５よりも大きいｐＨでの貯蔵の２ヶ月以内に認められる。１２ヶ月が終了するまでに、生細胞の著しい数が、６．０〜７．０の間のｐＨを有するそのような培地においてのみ残存している。
【０１０６】
（実施例３）
貯蔵温度に依存する、本発明による選択的サンプリング後の大腸菌Ｍ−１７細菌細胞（１）、および、懸濁状態における市販の凍結乾燥調製物から単離された細菌細胞（２）の生存能力。０．７％塩化ナトリウム溶液を懸濁培地として使用した。懸濁物のｐＨ＝６．７。
【表３】
2007518693.tif 000004
【０１０７】
上記に示されるように、懸濁状態における生細菌の数は、２℃〜１０℃の間の温度での貯蔵の１２ヶ月の期間を通してほとんど減少しておらず、一方、著しい減少が、１８℃〜２０℃での貯蔵により、同じ期間において認められる。２５℃〜３０℃の温度では、生細胞が１２ヶ月後にはほとんど残存していない。
【０１０８】
（実施例４）
凍結乾燥された生細菌（市販の調製物のＣｏｌｉｂａｃｔｅｒｉｎ）および液体プロバイオティクス組成物（細菌が生物学的活性な形態で存在する）からの同じ量の大腸菌Ｍ−１７細菌（各サンプルについて、１ｍｌ、１０８ＣＦＵ）を栄養培養液サンプル（２００ｍｌ）に導入した。混合物を３７℃で９０分間インキュベーションした。
【０１０９】
細菌の代謝活性が低下する速度（すなわち、新しい環境媒体の条件に対するそれらの適合化）をそれらの初期生育速度に関連して評価した。この値を得るために、細菌量（１ｍｌあたりのＣ．Ｆ．Ｕ．）を、細菌を栄養培養液に導入した直後に求め、続いて、インキュベーション過程の期間中においては３０分間隔で求めた。
【０１１０】
液体プロバイオティクス組成物から採取された細胞を使用する細菌の増殖（丸印）は、図１に示されるように、凍結乾燥されたプロバイオティクス物から得られた細胞を用いた細菌増殖速度（三角印）よりもかなり速かった。
【０１１１】
（実施例５）
Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉおよびＳ．ｓｏｎｎｅｉの１０時間〜２０時間の培養物を生理的食塩水で１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度に希釈した。その後、これらを、栄養培養液（５ｍｌ）を含有する試験管に、単独で、あるいは、凍結乾燥プロバイオティクス物（Ｃｏｌｉｂａｃｔｅｒｉｎ）または液体プロバイオティクス物（Ｂｉｏ−Ｃｏ）に由来する（生理的食塩水で１０１２ＣＦＵ／ｍｌの濃度に希釈された）大腸菌Ｍ−１７の培養物との組合せで接種した（１ｍｌ）。試験管を３７℃で２４時間インキュベーションした。病原体のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）数、および、両方のプロバイオティクス調製物に由来する大腸菌Ｍ１７のコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）数を栄養寒天における平板計数によって求めた。
【０１１２】
これらのデータが下記の表に示される。
【表４】
2007518693.tif 000005
【０１１３】
（実施例６）
トリプシン消化ダイズ寒天（ＴＳＡ）およびトリプシン消化ダイズ培養液（ＴＳＢ）として示される培地（固体および液体）に同じ量の細菌培養物（大腸菌Ｍ１７）を播種した。この分野では広く知られているＴＳＡおよびＴＳＢの組成および調製に対する参照については、例えば、“Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ”（ＦＥＲＯＳＡ／Ｓｃｈａｒｌａｕ、１９９６；これは、本明細書中に完全に示されるかのように本明細書により参考として組み込まれる）を参照のこと。微生物を、最適な温度（３６℃）で２４時間（固体培地）および１８時間（液体培地）、好気的条件のもとで培養した。その後、１ｍｌあたりの細菌の濃度を栄養寒天における平板計数によって求めた。
【０１１４】
最適な成長培地（Ｔ．Ｓ．Ａ．およびＴ．Ｓ．Ｂ．）、および、本発明による成長培地における非病原性大腸菌（大腸菌Ｍ１７）のバイオマスの蓄積の比較が下記の表に例示される。
【表５】
2007518693.tif 000006
【０１１５】
（実施例７）
核酸成分の分析を、０．４％塩化ナトリウム溶液における細菌の１０１１ＣＦＵ〜１０１２ＣＦＵの懸濁物のサンプルに対して、＋２±４℃の温度での３日間および３０日間のサンプルの保存の後で行った。
【０１１６】
最初に、無細胞ろ液を得るために、サンプルを０．４５μの微生物学的フィルターでろ過した。ろ液を核酸成分（アデニンおよびウラシル）の存在について調べた。方法の感度に従って、検出限界は２μｇｒ／ｍｌである。これらのデータが下記の表に示される。
【表６】
2007518693.tif 000007
【０１１７】
（実施例８）：液体培養培地を使用する細菌バイオマスの製造
細菌バイオマスの調製のために、通気を伴う標準的な発酵槽を使用することができる。細菌の増殖のために必要な栄養分を２段階で加える。
【０１１８】
典型的な発酵プロセスでは、培地は、ダイズペプトン（１０．０ｇ／ｌ）、酵母抽出物（１８．０ｇ／ｌ）、グルコース（２．５ｇ／ｌ）、塩化ナトリウム（３．０ｇ／ｌ）、ならびに、中性またはわずかに塩基性のｐＨ（７．２±０．２）を提供するために十分なリン酸二ナトリウムおよびリン酸一カリウムの組合せからなり得る。
【０１１９】
さらなる栄養分が、細菌が増殖する過程の期間中に、栄養培地に自動的に供給される。
【０１２０】
さらなるグルコースを、発酵液中のグルコース濃度が２．５ｇ／ｌのレベルで保たれるような方法で培養物の生育に従って連続して加えなければならない。
【０１２１】
さらなる通気（０．５ｖｖｍ）が細菌増殖の全期間中に行われる。
【０１２２】
発酵液のｐＨを、４ＮのＮＨ４ＯＨの連続した添加によって中性に保つことができる。
【０１２３】
培養液は、増殖サイクルの定常期に達するまで約３２℃〜約３６℃の温度でインキュベーションされる。
【０１２４】
１６時間〜１８時間の後、細胞を、総窒素の残存量が１ｍｌの懸濁物あたり１０７個〜１０８個の微生物細胞の細胞濃度について０．３％以下（好ましくは０．０３％以下）であるレベルにまで、遠心分離または限外ろ過によって集め、生理的食塩水に再懸濁して、再沈殿させる。
【０１２５】
細菌が１０１１個〜１０１２個の懸濁物を、４℃〜８℃に冷却された０．４％〜０．６％のＮａＣｌ溶液において調製し、冷蔵条件下で貯蔵する。この段階（および／または対象への投与）のための細菌の濃度は場合により約１０６細菌／ｍｌ〜約１０１２細菌／ｍｌの範囲であってもよいことに留意しなければならない。
【０１２６】
（実施例９）：固体培地を使用する細菌バイオマスの製造
非病原性大腸菌を、本発明に従って細菌バイオマスの最大蓄積をもたらす栄養分の組成を使用して固体培地において生育させた。
【０１２７】
培地の組成は下記の通りである：
【表７】
2007518693.tif 000008
【０１２８】
調製された培地を、５ミリメートル〜７ミリメートルの層厚で対応するマトリックスに注ぐ。冷却後、培地に大腸菌Ｍ−１７の細菌培養物を播種する。
【０１２９】
マトリックスをインキュベーターに入れ、最適な温度（３４℃〜３８℃）で約２４時間〜２８時間、好気的条件下でインキュベーションする。この手順により、１ｍｌの培地あたり１０１０個〜１０１１個の細胞が得られた。
【０１３０】
この期間の後、単離された純粋な培養物は、細菌が、液体（または少なくとも実質的な量の液体）を平板に導入することなく、スパチュラなどの道具により取り出される「乾式法」によって平板から取り出さなければならない。この目的のために、バイオマス回収のための特別な調節が使用されている。
【０１３１】
細菌が１０１１ＣＦＵ〜１０１２ＣＦＵの懸濁物を０．４％〜０．６％のＮａＣｌ溶液において調製する。懸濁物を冷蔵条件下で貯蔵する。
【０１３２】
（実施例１０）−下痢の治療
１日あたりに患者に投与されるプロバイオティクス細菌の量に依存する、サルモネラおよび病因不明の食中毒によって引き起こされる急性の下痢（旅行者下痢症を含む）の症状発現を取り除く効果が示される（用量依存的効力）。
【０１３３】
合計で６４名の患者を、異なる治療効果的な量の本発明の液体プロバイオティクス組成物を用いて治療した。これらの量は、４回〜６回の用量に分けられた１日あたり１００億個〜２０００億個の生細菌の範囲であった。
【０１３４】
第１の患者群には、１日あたり１００億個の細菌の治療効果的な量を含有する本発明の液体プロバイオティクス組成物を処方した。これらの患者の８５％において、急性下痢の症状が３日後も依然として存在した。４日目から、これらの患者には、１日あたり２０００億個の細菌の治療活性な量が処方された。この用量を投与した１日目のうちに、９４％の患者で、下痢が消失したか、または、排便回数がかなり減少した。
【０１３５】
第２の患者群には、観察の１日目から２０００億個の生細菌を含む本発明の液体プロバイオティクス組成物を投与した。顕著な効果（下痢の消失、または、排便回数のかなりの減少）が、主には最初の１２時間〜１４時間の間であったが、液体プロバイオティクス組成物を投与した１日目のうちでさえ認められた。
【０１３６】
（実施例１１）：抗ヘリコバクター治療により治療された患者における腸管微小生物叢の変化の特性に対する液体プロバイオティクス組成物の影響
抗ヘリコバクター治療により治療された１０４名の患者かならる一群を無作為に２つの群に分けた。
【０１３７】
抗生物質による治療を含む標準的な治療に加えて、第２群の患者には本発明の液体プロバイオティクス組成物を投与した。２５日間の治療の後、健康な微小生物叢の主要な代表物であると見なされる細菌（好気性ならびに嫌気性）の量的組成をすべての患者において測定した。
【０１３８】
結果が下記の表に示される。
【表８】
2007518693.tif 000009
【０１３９】
非病原性大腸菌のＭ１７型は腸における好気性微小生物叢の主要な代表体として役立つ。本発明の液体プロバイオティクス組成物が投与されたとき、腸における大腸菌の総数が正常化され、それらの性状が改善された（すなわち、ラクトース陽性細菌のレベルが増大し、ラクトース陰性細菌および低い発酵活性を有する大腸菌のレベルが低下している）。そのうえ、ビフィドバクテリウム（これは健康な嫌気性の腸微小生物叢の最も重要な代表体である）の数が増大している。
【０１４０】
（実施例１２）：プロバイオティクス組成物の調製−例示的方法
本発明による組成物は、場合により、下記の例示的な方法に従って調製することができる。プロバイオティクス大腸菌（１０８細胞〜１０９細胞）（これは場合により種菌ストックに由来する）を、標準的な微生物発酵技術を使用して液体培地成分または固体培地成分に接種する。生育条件には、好ましくは、連続通気、中性ｐＨの維持およびグルコースの補充が含まれる。この生物は、好ましくは、いかなる点でも遺伝子操作されておらず、むしろ、正常なヒトの胃腸管から得られた微小生物叢から単離されている。
【０１４１】
製造は、場合により、また、好ましくは、下記の重要な制御点に関して制御される：
・培養物を受け取るとき、および、培養物を取り扱うときに払われるべき予防的措置
・適切な培養条件を保証するための制御手順
・無菌性の維持
・完成した製造物におけるプロバイオティクス生物の妥当なレベルを保証するための制御手順。
【０１４２】
場合により、また、好ましくは、種菌ストックそのものを下記のように調製することができる。大腸菌Ｍ−１７の１つの凍結乾燥バイアルを−８０℃での貯蔵から取り出し、室温で解凍し、その後、滅菌されたトリプシン消化ダイズ培養液（Ｄｉｆｃｏ）を含有する無菌のバッフル付振とうフラスコに無菌的に移す。１５時間〜２０時間の生育の後、培養物を顕微鏡で調べ、Ｂａｃｔｏ  ｍ  Ｅｎｄｏ  Ａｇａｒ  ＬＥＳ平板に画線して純度について調べる。
【０１４３】
反応槽の準備
それぞれの反応槽は回分処理され、培地を入れて滅菌される。デキストロースは別個に滅菌され、培養物を接種する前に２．５ｇ／Ｌの濃度に加えられる。
【０１４４】
反応槽への接種
種菌培養物をバイオリアクターに無菌的に移し、培養物を、温度、ｐＨ、撹拌および溶存酸素の確立された条件のもとで生育させる。３．５ｇ／Ｌ〜３．９ｇ／Ｌのグルコース供給を接種後４時間から開始する。１８時間〜２２時間の生育の後、培養物を顕微鏡で調べ、Ｂａｃｔｏ  ｍ  Ｅｎｄｏ  Ａｇａｒ  ＬＥＳ平板に画線して純度について調べる。その後、反応槽は捕集のために１０℃未満に冷却される。
【０１４５】
精密ろ過
バイオリアクターの内容物を、０．２μｍの細孔サイズのタンジェンシャルフロー精密ろ過ユニットを使用する濃縮によって集める。濃縮物を、５体積の無菌の生理的食塩水を用いて透析し、その後、４℃〜６℃での貯蔵のための無菌のビンに入れる。サンプルを顕微鏡で調べ、Ｂａｃｔｏ  ｍ  Ｅｎｄｏ  Ａｇａｒ  ＬＥＳ平板に画線して純度について調べ、そして、トリプシン消化ダイズ寒天平板に置床することによって数を数える。
【０１４６】
（実施例１３）：大腸菌を使用するＩＢＤ関連下痢の治療
下痢の症状発現とともにゆるい便通に２年間にわたって悩んでいる、直腸出血または体重減少を有しない２３歳の男性を調べた。この男性の家族歴は腸疾患について注目すべき点はなかった。
【０１４７】
この患者の研究室試験は下記の値を示した：ヘモグロビン＝１７．６（喫煙者）、ＥＳＲ＝１０、血小板＝２１９、アルブミン＝４．１、組織トランスグルタミナーゼＴＴＧ＝２９．８（正常値＜２０）。
【０１４８】
加えて、患者は、陽性のＨ２呼気検査によってラクトース不耐症を有することが見出された。しかしながら、乳製品を含まない食事は患者の状態を改善しなかった。
【０１４９】
患者の上昇したＴＴＧ値により、セリアック病の診断が示唆された。上部ＧＩ内視鏡検査では、正常な外見をする小腸が明らかにされた。十二指腸の第２の部分からの無作為な生検では、正常な小腸粘膜が存在することが立証された。カプセル内視鏡研究が行われ、少数の侵食、粘膜出血、浮腫および絨毛喪失をはじめとする近位小腸における炎症性の変化が明らかにされた。
【０１５０】
患者を、大さじ１杯を１日に２回の服薬法で、食事の約３０分前に、実施例１２に記載されるように調製されたプロバイオティクス組成物を用いて治療した。２週間後、患者の状態には改善が見られなかった。患者のプロバイオティクス治療を、１日用量を１日に大さじ４杯に増大させながら続けた。この治療の後、患者は、２年間で初めて、実質的な改善を報告した。小腸の２回目のカプセル内視鏡検査では、近位小腸の炎症プロセスの改善が明らかにされた。
【０１５１】
（実施例１４）：液体プロバイオティクス組成物を用いた治療方法
上記で記されたように、本発明の液体プロバイオティクス組成物は、微生物感染、ＩＢＳおよびＩＢＤ（これらに限定されない）をはじめとする胃腸の疾患および状態に対する効果的な治療であることが示されている。下記の実施例は、そのような胃腸疾患または胃腸障害（または治療を必要とする状態）、および、任意の他の好適な状態を、本発明の液体プロバイオティクス組成物を用いて治療する方法の例示にすぎず、従って、限定であることは意図されない。
【０１５２】
方法では、治療すべき対象に液体プロバイオティクス培地を投与することが含まれる。液体プロバイオティクス組成物は、好ましくは所定のエンドポイント（例えば、対象における胃腸の疾患、障害または状態および任意の他の好適な状態の症状の非存在、あるいは、対象におけるそのような疾患、障害、状態または症状の出現の防止など）に到達するまで、効果的な服薬方法論に従って医薬的に効果的な量で投与される。
【０１５３】
（実施例１５）植物抽出物の調製
生物学的に活性な食用抽出物を、植物の任意の好適な果実、食用部、葉、茎または根から、あるいはハーブから調製することができる。植物は、キャベツ、ニンニク、パセリ、ディルおよびレモンなどが可能であり、または、ミントなどのハーブが可能である。
【０１５４】
植物抽出物は、場合により、４０℃までの沸騰温度をもたらす減圧のもとでの蒸留によって調製することができる。
【０１５５】
植物抽出物を調製するために、市場に存在する装置を使用することができる（例えば、“Ｒｏｔａｖａｐｏｒ”装置）。
【０１５６】
本発明の組成物に加えられるための植物抽出物を調製するためのプロセスでは、好ましくは、下記が含まれる：
１．植物または植物の一部を粉砕して、植物バイオマスを得ること。
【０１５７】
植物抽出物の製造のためには、新たに調製されたバイオマスが使用されなければならないことは強調すべきことである。植物バイオマスは、好ましくは、室温でせいぜい１時間〜２時間しか貯蔵されない。これは、果実、野菜または他の植物を粉砕した後では、微生物がバイオマスにおいて発生し始めることがあり、また、制御できない発酵および他の反応が生じるからである。このことは、得られる抽出物の品質をかなり低下させる。長期間の貯蔵が必要である場合、粉砕中の植物材料は、１２時間以上は冷蔵庫で貯蔵すべきではない。
２．植物バイオマスを減圧下で蒸気蒸留する。
３．この蒸気蒸留から得られる揮発性画分を集める。この画分は水でさらに希釈することができる。
【０１５８】
植物抽出物は、場合により、その能力を失うことなく、冷蔵条件下で１２ヶ月間貯蔵することができる。この画分自体が食品／飼料添加物となり、また、この画分はまた、場合により、２つ以上の植物抽出物を混合することによって調製することができる。
【０１５９】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの変形と変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような変形と変更をすべて含むものである。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】本発明による液体組成物から採取された細菌の増殖速度と、凍結乾燥組成物から採取された細菌の増殖速度との比較を示す。
【図１】
2007518693.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成17年8月26日(2005.8.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも基礎的生物学的活性を有する少なくとも１つの大腸菌株と液体培地とを含む液体のプロバイオティクス組成物であって、前記細菌は少なくとも１つの選択圧に従って最初に選択されており、組成物は非好適物質を実質的に含まない、液体のプロバイオティクス組成物。
【請求項２】
前記細菌は、拮抗特性を有する非病原性のラクトース陽性菌株を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細菌は、大腸菌の複数の菌株を含むか、または大腸菌の少なくとも１つの菌株と少なくとも１つの追加の細菌菌株を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記選択圧は温度圧を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記温度圧は、前記細菌を含む培地の温度を上昇させることを含む請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記温度圧は、前記細菌を約３６℃〜約５０℃の温度に供することを含み、ここで前記細菌は懸濁物中にある請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記細菌は約４０℃の温度に少なくとも４日間供される請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記温度圧は、前記細菌を含む培地の温度を低下させることを含む請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記低下させることは、前記温度を約１℃〜約１２℃に１２ヶ月間まで低下させることを含む請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記温度は少なくとも約３ヶ月間低下される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記選択圧は、貯蔵時間を含み、ここで前記細菌は少なくとも約１ヶ月間貯蔵される請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細菌は約１２ヶ月間まで貯蔵される請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記選択圧は浸透圧を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記選択圧は低浸透圧を含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記浸透圧は約１気圧より低い圧力を含む請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記浸透圧は約０．３気圧〜約０．４気圧の圧力を含む請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記液体培地は、水、自己溶解物および等浸透圧量の塩を含み、窒素源が約０．３％未満、所望により約０．０３％未満のレベルで存在する請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
細菌を実質的に増殖または分裂なしに維持するための複数の物質をさらに含む請求項６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記液体１ｍｌ当り約１０７〜約１０８コロニー形成単位の前記細菌を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの矯味矯臭剤または植物からの抽出物をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
約６．０〜約７．０のｐＨを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ｐＨが約６．５である請求項１３に記載の組成物。
【請求項２３】
１回の投与当り約１０６個〜約１０１２個の生細菌の投与のために好適な用量で組成物を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
１日当り約１回〜約４回の投与で投与されるために好適な用量で組成物を含む請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記細菌は前記液体培地と組合される前に自己溶解に供される請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記自己溶解は機械的撹拌、低浸透圧および懸濁物中の前記細菌の密度に対する変化からなる群から選択されるメカニズムを通して誘導される請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記密度は１ｍｌ当り約１０１１個〜約１０１２個の細菌である請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記液体培地は前記自己溶解から形成された自己溶解物を含む請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
複数の細菌を増殖させて増殖培地にバイオマスを形成させ；
選択圧に従って細菌を選択し、そして
少なくとも基礎的生物学的活性を有する前記細菌をある時間期間の間、貯蔵状態で維持する
ことを含む、液体プロバイオティクス組成物の調製方法。
【請求項３０】
前記選択圧は温度圧を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記温度圧は、前記細菌を約３６℃〜約５０℃の温度に供することを含み、ここで前記細菌は懸濁物中にある請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌は約４０℃の温度に少なくとも４日間供される請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記温度圧は、前記細菌を含む培地の温度を低下させることを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記低下させることは、前記温度を約１℃〜約１２℃に１２ヶ月間まで低下させることを含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記温度は少なくとも約３ヶ月間低下される請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記選択圧は、貯蔵時間を含み、ここで前記細菌は少なくとも約１ヶ月間貯蔵される請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記細菌は約１２ヶ月間まで貯蔵される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記選択圧は浸透圧を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記選択圧は低浸透圧を含む請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記浸透圧は約１気圧より低い圧力を含む請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記浸透圧は約０．３気圧〜約０．４気圧の圧力を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記バイオマスを前記増殖培地からおよび阻害性因子から分離し；そして
前記細菌を自己溶解に供する
ことをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
前記自己溶解は機械的撹拌、低浸透圧および懸濁物中の前記細菌の密度に対する変化からなる群から選択されるメカニズムを通して誘導される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記密度は１ｍｌ当り約１０１１個〜約１０１２個の細菌である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記自己溶解から形成された自己溶解物を含む前記液体培地で前記細菌を貯蔵することをさらに含む請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記貯蔵することは、前記液体培地中の前記細菌の濃度を約１０５〜約１０１２ＣＦＵに調整することを含む請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記濃度は約１０７〜約１０８ＣＦＵである請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記増殖培地は固体増殖培地または液体増殖培地を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項４９】
前記増殖培地は酵母抽出物を含む請求項２９に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵母抽出物は１ｌ当り約５〜約２５グラムの量で存在する請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記酵母抽出物は１ｌ当り約１５〜約２０グラムの量で存在する請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
植物材料を粉砕して粉砕された材料を蒸気滅菌することによって植物抽出物を調製し；そして
前記植物抽出物を前記組成物に添加する
ことをさらに含む請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
前記蒸気滅菌は減圧下で行われる請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも基礎的生物学的活性を有する細菌を含む液体プロバイオティクス組成物をその治療の必要がある対象に投与することを含む、対象を治療する方法であって、前記細菌は少なくとも１つの選択圧に従って最初に選択されたものである方法。
【請求項５５】
胃腸疾患または障害の治療のために使用される請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記胃腸疾患または障害が微生物感染を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記胃腸疾患または障害が炎症性腸疾患を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記炎症性腸疾患がクローン病、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、微視的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、小腸の特発性炎症、および炎症性腸疾患関連の下痢からなる群から選択される請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記胃腸疾患または障害は、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、腸管毒産生大腸菌イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびシー・ディフィシレ（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）からなる群から選択される腸病原体によって生ずる胃腸感染を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記胃腸疾患または障害は、食中毒、消化不良の徴候または急性下痢の症状の発現、または検出されない病原体または未知の病因によって生じる下痢を含む請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記下痢は旅行者下痢症および病院環境における下痢を含む請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
腸管微小生物叢の微生物バランスの乱れによって、および／または、小腸における細菌の過剰増殖によって引き起こされるか、または維持される消化管の疾患および障害を治療することを含む請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
抗生物質治療、放射線療法または化学療法、または消化管手術を含む消化管の疾患または障害から生じる消化管微小生物叢の微生物バランスの乱れレベルを防止するか、または低下させることを含む請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
消化管の外部の疾患、特定の食事要因および環境的要因から生じる消化管微小生物叢の微生物バランスにおける乱れを防止または治療することを含む請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
高齢者および抵抗力が低下した患者における胃腸管の生理学的活性を改善または正常化することを含む請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
前記組成物が１ｍｌ当り約１０６〜１０１２コロニー形成単位の前記細菌を所望により含み、好ましくは１ｍｌ当り約１０７〜１０８コロニー形成単位の前記細菌を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項６７】
１日当り約１０６〜約１０１２個の前記細菌が対象に投与される請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
１日当り約１０７〜約１０９個の前記細菌が対象に投与される請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
１日当り約１０７〜約１０８個の前記細菌が対象に投与される請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物が等浸透圧培地中の自己溶解物を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物が非好適物質を実質的に含まない請求項５４に記載の方法。
【請求項７２】
他の疾患の治療によって生じる副作用としての疾患を含む免疫系の疾患に罹患している対象において免疫系を改善または正常化するための請求項５４に記載の方法。
【請求項７３】
家畜を治療するために使用される請求項５４に記載の方法。
【国際調査報告】
2007518693.tif 000011
2007518693.tif 000012