(57)【要約】本発明は、配列特異的エンドヌクレアーゼのような核酸結合タンパク質を使用して核酸分子を分析するための方法、生成物およびシステムに関連する。本方法は、上記核酸分子についての配列情報を得るために使用され得る。本発明は、核酸分子を分析するための方法であって、核酸分子と検出可能な配列特異的エンドヌクレアーゼとを、非切断条件下で、配列特異的様式で該配列特異的エンドヌクレアーゼが該核酸分子に結合するのに十分な時間接触させる工程、および該結合された配列特異的エンドヌクレアーゼを検出する工程を包含する、方法を提供する。
2007501003.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸分子を分析するための方法であって、以下：
核酸分子と検出可能な配列特異的エンドヌクレアーゼとを、非切断条件下で、配列特異的様式で該配列特異的エンドヌクレアーゼが該核酸分子に結合するのに十分な時間接触させる工程、および
該結合された配列特異的エンドヌクレアーゼを検出する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制限エンドヌクレアーゼがＩＩ型制限エンドヌクレアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｕｎＩ、ＰｖｕＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎＰＩ、ＮｏｔＩ、ＰｍｅＩおよびＥａｇＩを含む群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記非切断条件が、前記核酸分子の切断を許容しないＭｇ２＋濃度を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｍｇ２＋濃度が０である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記非切断条件が、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋およびＭｎ２＋からなる群より選択される２価のカチオンの存在を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非切断条件がＣａ２＋の存在を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非切断条件が、Ｍｇ２＋濃度を上回るＣａ２＋濃度を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃａ２＋濃度が、前記Ｍｇ２＋濃度を、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍または少なくとも５０００倍上回る、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｃａ２＋濃度が、前記Ｍｇ２＋濃度を少なくとも５００倍上回る、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃａ２＋濃度が約５ｎＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡが、核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡからなる群より選択されるゲノムＤＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子が、非インビトロで増幅された核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、検出可能な標識を用いて標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、検出可能な標識を用いて共有結合的に標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、検出可能な標識を用いてイオン的に標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出可能な標識が、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、荷電された変換分子、核磁気共鳴分子、半導体ナノ結晶、電磁的分子、電気伝導粒子、リガンド、マイクロビーズ、色素生産性基質、親和性分子、量子ドット、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗原、ハプテン、および脂質からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合された配列特異的エンドヌクレアーゼが、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真用フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近視野検出システム、全反射（ＴＩＲ）システム、および電磁的検出システムからなる群より選択される検出システムを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸分子が、検出可能な標識を用いてさらに標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記検出可能な標識が、バックボーン標識（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｌａｂｅｌ）または末端標識である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記結合された配列特異的エンドヌクレアーゼが、単一分子検出システムを使用して検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記単一分子検出システムが、直鎖状ポリマー分析システムである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記直鎖状ポリマー分析システムが、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭシステム、光学的マッピングシステム、およびＤＮＡコーミングシステムからなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、単一の検出可能な標識を用いて標識される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出可能な標識が非ビーズ標識である、請求項１８または請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸が分析の前に非線形化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸分子が流動系において分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記検出可能な標識が非蛍光標識ビーズである、請求項１８または請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
核酸分子を分析するための方法であって、以下：
核酸分子と検出可能な核酸結合タンパク質とを、結合条件下で、配列特異的様式で該検出可能な核酸結合タンパク質が該核酸分子に結合するのに十分な時間接触させる工程、および
該結合された検出可能な核酸結合タンパク質を検出する工程
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記検出可能な核酸結合タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出可能な核酸結合タンパク質が、ポリメラーゼ、メチラーゼ、および転写調節因子からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記結合条件は、前記検出可能な核酸結合タンパク質の前記核酸分子に対する結合を許容するが、該検出可能な核酸結合タンパク質の他の酵素活性を妨げる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記検出可能な核酸結合タンパク質がメチラーゼであり、そして前記結合条件がメチラーゼインヒビターを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出可能な核酸結合タンパク質がポリメラーゼであり、そして前記結合条件が、プライマーまたは取り込まれないヌクレオチドの集団を欠く、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸分子が、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＮＡが、核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡからなる群より選択されるゲノムＤＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＮＡがｃＤＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸分子が、非インビトロで増幅された核酸分子である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出可能な核酸結合タンパク質が、検出可能な標識を用いて標識される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出可能な核酸結合タンパク質が、検出可能な標識を用いて共有結合的に標識される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記検出可能な核酸結合タンパク質が、検出可能な標識を用いてイオン的に標識される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記検出可能な標識が、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、荷電された変換分子、核磁気共鳴分子、半導体ナノ結晶、電磁的分子、電気伝導粒子、リガンド、マイクロビーズ、色素生産性基質、親和性分子、量子ドット、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗原、ハプテン、および脂質からなる群より選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記結合された検出可能な核酸結合タンパク質が、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真用フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近視野検出システム、全反射（ＴＩＲ）システム、および電磁的検出システムからなる群より選択される検出システムを使用して検出される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
前記核酸分子が、検出可能な標識を用いてさらに標識される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出可能な標識が、バックボーン標識または末端標識である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記結合された検出可能な核酸結合タンパク質が、単一分子検出システムを使用して検出される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
前記単一分子検出システムが、直鎖状ポリマー分析システムである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記直鎖状ポリマー分析システムが、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭシステム、光学的マッピングシステム、およびＤＮＡコーミングシステムからなる群より選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記検出可能な核酸結合タンパク質が、単一の検出可能な標識を用いて標識される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記検出可能な標識が非ビーズ標識である、請求項４４または請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸が分析の前に非線形化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸分子が流動系において分析される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５８】
前記検出可能な標識が非蛍光標識ビーズである、請求項４４または請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
単一の検出可能な標識を用いて標識された核酸結合タンパク質を含有する組成物。
【請求項６０】
前記核酸結合タンパク質がＤＮＡ結合タンパク質である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記核酸結合タンパク質が、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、メチラーゼ、および転写調節因子からなる群より選択される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
前記核酸結合タンパク質が、前記単一の検出可能な標識を用いて共有結合的に標識される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６３】
前記核酸結合タンパク質が、前記単一の検出可能な標識を用いてイオン的に標識される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６４】
前記検出可能な標識が、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、荷電された変換分子、核磁気共鳴分子、半導体ナノ結晶、電磁的分子、電気伝導粒子、リガンド、色素生産性基質、親和性分子、量子ドット、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗原、ハプテン、および脂質からなる群より選択される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６５】
前記検出可能な標識が、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真用フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近視野検出システム、全反射（ＴＩＲ）システム、および電磁的検出システムからなる群より選択される検出システムを使用して検出される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６６】
前記単一の検出可能な標識が非ビーズ標識である、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６７】
前記単一の検出可能な標識が非蛍光標識ビーズである、請求項５９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連した出願）
本出願は、米国特許法中１１９条の下で米国仮特許出願番号第６０／４９２，１４３号（２００３年８月１日出願）の優先権を主張し、その内容の全ては、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、配列特異的結合を支持し、切断を支持しない条件下でエンドヌクレアーゼを使用する核酸分子の分析に関連する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
制限エンドヌクレアーゼは、外来ＤＮＡによる侵襲から細菌細胞を保護するために働く細菌酵素である。これらの酵素は、認識部位または認識配列と称されるＤＮＡ分子内の特異的配列を認識し、そしてこれらの部位内またはこれらの部位に近接するホスホジエステル骨格の切断を触媒する。制限改変（ＲＭ）システムは、制限エンドヌクレアーゼおよび同系のＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（Ｍｔａｓｅ）を含む。Ｍｔａｓｅは、上記制限酵素認識部位内の特定のヌクレオチドに対する、メチル基の共有結合的な結合を触媒する。このメチル化は、上記宿主ＤＮＡを制限から保護する一方で、保護されない外来ＤＮＡは切断される。これらは、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型と称される少なくとも３つの型のＲＭシステムである。ＩＩ型制限酵素は、組換えＤＮＡ技術において必要とされる配列特異的切除に対する貴重な手段であると証明されている。それらの有用性から、それらは研究の網羅的な量の研究の主題である。３０００を超えるＩＩ型制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、核酸分子を改変せずに核酸分子に結合可能なタンパク質は、標識化方法および配列決定方法において活用され得るという知見を、一部前提とする。種々の核酸結合タンパク質は、それらが配列特異的結合能力を有する場合、この目的のために使用され得る。これらの核酸結合タンパク質は、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼ）、メチラーゼ、転写調節因子、および特に重要な実施形態における制限エンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されないＤＮＡ結合タンパク質またはＲＮＡ結合タンパク質であり得る。
【０００５】
従って、１つの局面において、本発明は、核酸分子と検出可能な核酸結合タンパク質とを、結合条件において、配列特異的様式で上記核酸結合タンパク質が上記核酸分子に結合するために十分な時間接触させる工程、および上記結合された検出可能な核酸結合タンパク質を検出する工程を包含する、核酸分子を分析するための方法を提供する。上記核酸結合タンパク質は、本質的に検出可能であり得るか、または以下に、より詳細に記載されるように、検出可能にするために外因的に操作され得る。重要な実施形態において、上記核酸結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質である。上記核酸結合タンパク質は、ポリメラーゼ、メチラーゼ、転写調節因子、ミスマッチ修復酵素、クロマチン改変複合体、およびＲＮＡ干渉に関係するタンパク質からなる群より選択され得る。
【０００６】
上記接触は、上記核酸結合タンパク質の上記核酸分子に対する結合を許容するが、この核酸結合タンパク質の他の酵素活性を妨げる結合条件下で起こる。従って、１つの実施形態において、上記核酸結合タンパク質はメチラーゼであり、そして上記結合条件はメチラーゼインヒビターを包含する。上記メチラーゼインヒビターは、ＤＮＡメチラーゼインヒビター（例えば、５−アザシチジン（５−アザ）、５−アザ−２’デオキシシチジン（欧州においてデシタビン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）としても公知である）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザ−２’デオキシシチジン、５−フルオロシチジン、５−フルオロ−２’デオキシシチジン、ならびに５−アザ−２’デオキシシトシン、５，６−ジヒドロ−５−アザ−２’デオキシシトシン、５−フルオロ−２’デオキシシトシン、シンフンギン（ｓｉｎｆｕｎｇｉｎ）、およびホモシステインを含む短いオリゴヌクレオチド）であり得る。
【０００７】
別の実施形態において、上記核酸結合タンパク質はポリメラーゼであり、そして上記結合条件は、プライマーまたは取り込まれないヌクレオチドの集団を欠き、それによって、合成する能力を妨げ、従って、上記核酸分子に沿って転位する能力を妨げる。
【０００８】
本発明はさらに、特定の条件下で、配列特異的様式で配列特異的制限エンドヌクレアーゼが、核酸分子に結合し得るが、上記核酸分子を切断し得ないという知見を前提としている。例えば、制限エンドヌクレアーゼは通常、核酸分子を切断するために、十分な濃度の２価のマグネシウムカチオンを必要とする。制限エンドヌクレアーゼは、配列特異的様式で核酸分子に結合するが、２価のマグネシウムカチオンの非存在下においては、２価のカルシウムカチオンの存在下であり得るとしても、上記核酸分子を切断しないことが、本発明によってここに見出された。同様に、これらの酵素は、不十分な濃度のＭｇ２＋では、核酸分子を切断しない。従って、核酸切断に関して不十分であるＭｇ２＋濃度もまた使用され得る。
【０００９】
従って、別の局面において、本発明は、核酸分子と検出可能な配列特異的エンドヌクレアーゼとを、非切断条件下で、配列特異的様式で上記配列特異的エンドヌクレアーゼが上記核酸分子に結合するために十分な時間接触させる工程、および上記結合された検出可能な配列特異的エンドヌクレアーゼを検出する工程を包含する、核酸分子を分析するための方法を提供する。上記配列特異的エンドヌクレアーゼは、本質的または内因的に検出可能であり得るか、あるいはそれは検出可能にするために外因的に操作され得る。
【００１０】
上記配列特異的エンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ）であり得る。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼの例としては、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｕｎＩ、ＰｖｕＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎＰＩ、ＮｏｔＩ、ＰｍｅＩおよびＥａｇＩが挙げられるがこれらに限定されない。
【００１１】
１つの実施形態において、上記非切断条件は、上記核酸分子の切断を許容しないＭｇ２＋濃度を包含する。別の実施形態において、上記非切断条件はＭｇ２＋を欠く（即ち、０濃度のＭｇ２＋）。上記非切断条件は、好ましくは、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋およびＭｎ２＋からなる群より選択される２価のカチオンの存在を包含する。重要な実施形態において、上記非切断条件は、Ｃａ２＋の存在を包含する。
【００１２】
Ｍｇ２＋およびＣａ２＋の相対的濃度はまた、エンドヌクレアーゼによる、核酸分子の結合の程度および切断の程度を制御することが見出された。従って、上記非切断条件は、Ｍｇ２＋濃度を上回るＣａ２＋濃度を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記Ｃａ２＋濃度は、上記Ｍｇ２＋濃度を、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも２０００倍、および少なくとも５０００倍上回る。さらに他の実施形態において、上記Ｃａ２＋濃度は、約５ｎＭである。好ましくは、上記Ｍｇ２＋濃度は、Ｃａ２＋の存在下またはＣａ２＋の非存在下において、上記核酸分子を切断するのに不十分である。
【００１３】
いくつかの実施形態は、本発明の種々の局面に等しく関連し、そしてそれらは以下に記載される。
【００１４】
上記核酸分子は、ゲノムＤＮＡ（例えば、核ＤＮＡもしくはミドコンドリアＤＮＡ）またはｃＤＮＡのようなＤＮＡ、あるいはｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡのようなＲＮＡであり得る。重要な実施形態において、上記核酸分子は非インビトロで増幅された核酸分子である。上記核酸分子は、本発明の種々の方法における分析の前に、非線形化され得る。あるいは、上記核酸分子は、分析の前、または分析の間に線形化され得る。いくつかの事例において、本方法は、結合された配列特異的エンドヌクレアーゼまたは結合された核酸結合タンパク質の、存在または非存在を決定する工程に基づき、一方で他の事例において、本方法は、１つの、より結合された配列特異的エンドヌクレアーゼ、または１つの、より結合された核酸結合タンパク質の位置を決定する工程に基づく。
【００１５】
さらに他の実施形態において、上記核酸結合タンパク質または上記配列特異的エンドヌクレアーゼは、検出可能な標識を用いて標識され、そしてこの標識化は、共有結合的であり得るか、または非共有結合的（例えば、イオン性）であり得る。いくつかの重要な実施形態において、上記核酸結合タンパク質または上記配列特異的エンドヌクレアーゼは、単一の検出可能な標識を用いて標識される。いくつかの事例における上記検出可能な標識はまた、好ましくは、非ビーズ標識または非蛍光標識ビーズである。
【００１６】
上記検出可能な標識としては、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、荷電された変換分子、核磁気共鳴分子、半導体ナノ結晶、電磁的分子、電気伝導粒子、リガンド、マイクロビーズ、色素生産性基質、親和性分子、量子ドット、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗原、ハプテン、および脂質が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００１７】
上記結合された核酸結合分子または上記結合された配列特異的エンドヌクレアーゼは、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真用フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近視野検出システム、全反射（ＴＩＲ）システム、および電磁的検出システムを含むがこれらに限定されない検出システムを使用して検出され得る。上記検出可能な標識はまた、任意の上述の検出システムを使用して検出されるものとして定義され得る。
【００１８】
上記核酸分子は、検出可能な標識（例えば、バックボーン標識または末端標識が挙げられるがこれらに限定されない）を用いて、さらに標識され得る。あるいは、上記核酸分子は、「目印」（例えば、セントロメア、反復配列など）を同定するために標識され得る。
【００１９】
好ましくは、上記結合された核酸結合タンパク質または上記結合された配列特異的エンドヌクレアーゼは、単一分子検出システムを使用して検出される。より一層好ましくは、上記単一分子検出システムは、直鎖状ポリマー分析システム（例えば、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭシステム、光学的マッピングシステム、およびＤＮＡコーミングシステムが挙げられるがこれらに限定されない）である。上記核酸分子は、遊離形態（例えば、流動系において）、または固定形態のいずれかにおいて分析され得る。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、単一の検出可能な標識で標識された核酸結合タンパク質を含有する組成物を提供する。前述のように、上記核酸結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、またはＲＮＡ結合タンパク質であり得る。上記核酸結合タンパク質は、配列特異的エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、メチラーゼ、および転写調節因子からなる群より選択され得る。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記核酸結合タンパク質は、単一の検出可能な標識を用いて共有結合的に標識される。他の実施形態において、上記核酸結合タンパク質は、単一の検出可能な標識を用いてイオン的に標識される。
【００２２】
上記検出可能な標識は、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位体、酵素基質、ビオチン分子、アビジン分子、荷電された変換分子、核磁気共鳴分子、半導体ナノ結晶、電磁的分子、電気伝導粒子、リガンド、色素生産性基質、親和性分子、量子ドット、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、抗体、抗体フラグメント、抗原、ハプテン、および脂質からなる群より選択され得る。他の実施形態において、上記検出可能な標識は、上述された検出システムを使用して検出される。
【００２３】
本発明のあらゆる局面において、上記検出可能な標識は、非ビーズ標識、または非蛍光標識ビーズであり得る。
【００２４】
本発明の、前述の局面および実施形態の全ては、本明細書中で、より詳細に説明される。
【００２５】
本発明の、これら実施形態および他の実施形態は、本明細書中で、より詳細に議論される。
【００２６】
図は、本発明を可能にするために必要とされないことが理解される。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、核酸分子を改変せずに核酸分子に結合するという特定のタンパク質の能力を、標識化目的および配列決定目的のために活用する。それによって、情報は、結合された核酸結合タンパク質の、存在もしくは非存在について分析する工程によってか、または１つ以上の結合されたタンパク質の、配置および相対的位置を決定する工程によって得られ得る。これらの方法は、直鎖状態にある上記核酸分子に依存しない。例えば、上記核酸分子は、特に、得られる唯一の情報が、タンパク質が核酸分子に結合されるか否かである場合に、詰まった（ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）非直鎖状態で分析され得る。
【００２８】
これらの分析に適したタンパク質は、配列特異的様式で核酸分子に結合し、それによってそのような結合事象から配列情報を得ることを可能にする。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質もしくはＲＮＡ結合タンパク質であり得るか、またはそれらはＤＮＡとＲＮＡの両方に結合可能であり得る。そのようなタンパク質の例としては、ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのようなメチラーゼ、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩのような配列特異的エンドヌクレアーゼ、ならびに配列特異的転写調節因子、またはリプレッサー（例えば、ＧＡＴＡファミリーメンバー、イカロス（Ｉｋａｒｏｓ）、ＮＦ−κＢ、ＳｐＩ、Ｈｏｘファミリーメンバー、ＭｙｏＤ、ｆｏｓ、ｊｕｎ、ＮＦＡＴ、核ホルモンレセプターなどが挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２９】
上記タンパク質は、上記標的核酸を改変するそれらの能力を阻害する条件下で、核酸に結合される。例えば、エンドヌクレアーゼは、以下に記載されるような非切断条件下で、核酸分子に接触される。ポリメラーゼは、新しい核酸鎖の合成を妨げ、そしてより重要なことには、上記標的核酸分子に沿った上記ポリメラーゼの転位を妨げる条件において、核酸分子に接触される。そのような条件としては、取り込まれなかったヌクレオチドまたはプライマーの非存在が挙げられるが、これに限定されない。メチラーゼは、好ましくは上記標的核酸分子のメチル化を防ぐ条件において、核酸分子に接触される。そのような条件としては、メチラーゼインヒビター（例えば、５−アザシチジン（５−アザ）、５−アザ−２’デオキシシチジン（欧州においてデシタビンとしても公知である）、５，６−ジヒドロ−５−アザシチジン、５，６−ジヒドロ−５−アザ−２’デオキシシチジン、５−フルオロシチジン、５−フルオロ−２’デオキシシチジン、ならびに５−アザ−２’デオキシシトシン、５，６−ジヒドロ−５−アザ−２’デオキシシトシン、５−フルオロ−２’デオキシシトシン、シンフンギン、およびホモシステインを含む短いオリゴヌクレオチド）の存在が挙げられ得るが、これに限定されない。
【００３０】
本発明はまた、単一の検出可能な標識を用いて標識される核酸結合タンパク質の組成物を提供する。これらのタンパク質は、本発明の他の局面について本明細書中に列挙されるタンパク質と同じものである。「単一の検出可能な標識」は、複数ではなく、１つの検出可能な標識を称する。
【００３１】
特に重要な局面において、本発明は、特定の条件下で、核酸分子に結合し得るが、その核酸分子を切断し得ない配列特異的エンドヌクレアーゼの使用に基づいて核酸を分析するための、方法、組成物およびシステムを提供する。核酸分子に対する上記エンドヌクレアーゼの結合のパターンは、配列情報を導くために使用され得る。
【００３２】
本発明は、制限エンドヌクレアーゼの同系の認識配列を標識するために、制限エンドヌクレアーゼを利用する。結合反応がカルシウムカチオンの存在下で起こされる場合、上記核酸分子の切断は、ほとんどまたは全く生じないことが見出されている。むしろ、カルシウムイオンの存在下において、上記制限酵素／ＤＮＡ複合体の、結合および安定性は増強される。また、他の２価のカチオンは使用され得、そしてこれらとしては、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋などが挙げられる。従って、Ｍｇ２＋カチオンのみの非存在では、配列特異的エンドヌクレアーゼの標的核酸分子への、適切かつ有効な結合について不十分であるようである。任意の特定の機構によって結合されることを意図しないが、Ｃａ２＋カチオンは、上記切断反応を阻害する可能性がある。さらに、Ｃａ２＋カチオンはまた、上記核酸分子からの上記エンドヌクレアーゼの解離を阻害し得る。
【００３３】
従って、本発明は、「非切断条件」下で、核酸（好ましくはＤＮＡ分子）を標識する標識化方法上のいくつかの局面に基づく。本明細書中で使用される場合、「非切断条件」は、上記配列特異的エンドヌクレアーゼが、配列特異的様式で核酸分子に結合し得るが、上記核酸分子をそれほど切断しない条件である。これは、５０％未満、７５％未満、８０％未満、９０％未満、９５％未満、９９％未満の核酸が切断されるか、または核酸が全く切断されないことを意味する。これは、２価のカチオン（型および濃度の両方）、温度、ｐＨなどの調節によって達成され得る。これはまた、概してカルシウムカチオンの存在を必要とする。非切断条件はさらに、測定可能な量のマグネシウムカチオンを含み得るが、この量は、上記制限酵素が上記核酸を多く切断するのには不十分である。
【００３４】
非切断条件は、上記エンドヌクレアーゼに依存して変動し得るが、概してそれらは、ほとんど、または全くＭｇ２＋の存在を有さないことによって特徴付けられる。それらはまた、概して、別の２価のカチオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋またはＭｎ２＋が挙げられるが、これらに限定されない）を含むこととして特徴付けられる。好ましい実施形態において、上記２価のカチオンはＣａ２＋である。また、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋が両方とも存在する場合に、そのＭｇ２＋濃度は、Ｃａ２＋の濃度より桁が小さいことが重要である。これについての１つの理由は、エンドヌクレアーゼが概して、それらがＣａ２＋に対して示す親和性より大きい親和性をＭｇ２＋に対して示すことである。従って、上記Ｃａ２＋濃度は、上記Ｍｇ２＋濃度より、少なくとももしくは約、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、５０００倍または１００００倍以上であり得る。しかし、前述にかかわらず、上記Ｍｇ２＋濃度は、上記核酸分子の切断を促進するのに不十分であることに関しては、非常に低いことがさらに好ましい。上記Ｃａ２＋濃度は、５ｎＭであり得るが、この量は、上記Ｍｇ２＋濃度に依存して変動し得る。
【００３５】
全ての制限エンドヌクレアーゼは、切断のために２価のカチオンを必要とする。ほぼ例外なく必要とされる上記２価のカチオンはマグネシウムであるが、マグネシウムはいくつかの制限酵素によって使用され得る。切断の触媒における上記２価のカチオンの正確な役割には議論の余地がある。一般的な機構は、水分子に由来する反応性求核物質の発生、切断しやすいホスホジエステル結合上のホスフェートにおける初期の水酸化物の求核攻撃、５配位中間体上の余分な負電荷の安定化、ならびに離脱基（この場合は３‘ＯＨ）のプロトン化を包含すると考えられる。いくつかの制限酵素の結晶構造は、上記Ｍｇ２＋の水和層内における水分子の存在を示す。この水分子は、離脱基のプロトン化に関与し得ると考えられる。上記２価の金属は、上記反応性求核物質の発生を支援し得るか、または上記５配位中間体上の負電荷の安定化を支援し得るかのいずれかである。カルシウムの存在下における配列特異的結合は、ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｎｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＨｉｎＰ１で観察されている。
【００３６】
ＢａｍＨＩ複合体、ＥｃｏＲＩ複合体、およびＥｃｏＲＶ複合体の動態解析は、カルシウムが、上記制限酵素のその認識部位への特異的結合を可能にするだけでなく、上記複合体を安定させることも明らかにした。これらの複合体の半減期は、数時間の次数であり、そして非切断活性は観察可能である。データは、カルシウムが上記エンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ複合体の動態に、２つの効果を有することを示唆する。第１に、低濃度（０．１ｍＭ〜０．２ｍＭ）のカルシウムは、会合平衡定数（Ｋａ）を有意に増加する。このＫａの増加は、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩＩについて観察されている。第２に、カルシウムは、上記エンドヌクレアーゼの、その認識配列からの解離を強力に阻害する。これは、酵素／ＤＮＡ複合体の寿命を、数秒間から数時間に増加する。ＥｃｏＲＶと短いＤＮＡ二本鎖との結合反応へのカルシウムの導入は、上記複合体の寿命を、７４０倍増加（３８秒間から２８，０００秒間）させる。カルシウム存在下での短い二重鎖に対するＢａｍＨＩ結合の寿命は、約３９，６００秒間である（未発表の観察、図１を参照のこと）。
【００３７】
ＤＮＡの直鎖上に上記酵素「タグ」を配置するために、上記制限エンドヌクレアーゼは、可視化されるべきであり、そして上記ＤＮＡ骨格に沿って位置を割り当てられるべきである。上記制限エンドヌクレアーゼの可視化としては、上記エンドヌクレアーゼまたは上記核酸結合タンパク質への、蛍光成分または他の検出可能な成分（例えば、フルオロフォア、フルオロスフェア、量子ドット、ＧＦＰまたは蛍光抗体）の共有結合的付着もしくは非共有結合が挙げられる。上記ＤＮＡに沿った蛍光タグの配置についての位置情報は、標識されたＤＮＡ分子の使用によって達成され得る。上記線形化されたＤＮＡ分子は、末端標識またはバックボーン染色のいずれかを保有し得る。上記タグの位置は、ＧｅｎｅＥｎｇｉｎｅＴＭのような単一分子検出器におけるサンプルの分析によって、直接的に観察され得る。
【００３８】
さらに他の実施形態（本明細書中で議論されるような）において、結合パターンは、公知の配列および公知の構造（例えば、テロメア、セントロメア、Ａｌｕ反復のような反復配列など）について、上記分子を染色する工程によって単一の核酸分子内に配向され得る。なおさらなる実施形態において、上記核酸は、遺伝子地図との比較のためにその核酸を標識するために、さらに加工され得る。例えば、上記核酸地図は、既に特定のゲノムを位置付けるために使用されてきた任意の標識を用いて標識され得る。その後、そのように染色された核酸は、同じ標識を使用して作成された遺伝子地図と比較され得る。特定の例として、上記核酸は、Ａｌｕ反復のような反復配列に結合するプローブを用いて標識され得、その後、上記核酸分子の配置および配向性を決定するために、全ゲノムのＡｌｕ地図と比較され得る。これは一旦決定されると、上記核酸結合タンパク質または上記配列特異的エンドヌクレアーゼの結合の配置は、上記遺伝子地図に対して決定され得る。
【００３９】
上記遺伝子地図は、ヒトゲノム計画を含む公式のデータベースを通じて入手され得、その結果は、ＮＣＢＩウェブサイトまたはＮＩＨウェブサイトから入手可能である。これらの遺伝子地図は、解決の種々のレベルにおける配列地図であり得るか、またはそれらはモチーフ地図、もしくは構造的地図であり得るが、それらに限定されない。
【００４０】
本明細書中において、用語「核酸」は、複数のヌクレオチド（即ち、ピリミジン（例えば、シトシン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）もしくはウラシル（Ｕ））またはプリン（例えば、アデニン（Ａ）もしくはグアニン（Ｇ））のいずれかである、交換可能な有機塩基と結合した糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含む分子）、あるいはイノシン（Ｉ）を意味するために使用される。本明細書中で使用される場合、上記用語は、オリゴリボヌクレオチドならびにオリゴデオキシリボヌクレオチドを称する。上記用語はとしてはまた、ポリヌクレオシド（即ち、ポリヌクレオチドからリン酸を引いたもの）およびポリマーを含む任意の他の有機塩基が挙げられる。核酸分子は、存在する核酸供給源（例えば、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡ）から入手され得るか、または合成手段（例えば、核酸合成、組換えＤＮＡ技術、もしくは増幅反応によって生成される）によって入手され得る。
【００４１】
より具体的には、ＤＮＡは、付随するプリン窒素性塩基または付随するピリミジン窒素性塩基を有するペントースデオキシリボース糖に連結した、ホスホジエステルからなる二本鎖ポリマーである。上記ペントース糖における不斉性は、ホスホジエステル連結における方向性を導き、これによりその糖単位は、異なる糖単位の５’炭素と３’炭素との間のホスホジエステル結合によって連結される。従って、上記ＤＮＡ分子の２つのポリマー鎖は、逆平行である。上記糖に天然に結合する窒素性塩基の型を構成する、２つのプリン（アデニンおよびグアニン）ならびに２つのピリミジン（チミンおよびシトシン）が存在する。アデニンは、チミンに優先的に水素結合し、そしてシトシンは、グアニンに優先的に水素結合する。核酸分子の配列は、その長さに沿った塩基の順序を称する。任意の一本鎖上の塩基の順序は、適切なプリン塩基と適切なピリミジン塩基との間に生じ得る、上記ＤＮＡ鎖の逆平行性質および上記水素結合の相補的性質によって、他の鎖上の塩基の順序を決定する（または代替的に、他の鎖上の塩基の順序によって決定される）。
【００４２】
「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のどちらかである、ＤＮＡであり得るか、またはＲＮＡであり得る。用語「核酸」および用語「核酸分子」は、交換可能に使用される。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ（例えば、核ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡ）、ならびにいくつかの事例においてはｃＤＮＡが挙げられる。上記ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどであり得る。本明細書中に記載される例示におけるＤＮＡに対する参照は単に、便宜および明瞭さのためにすぎず、そして上に列挙された核酸分子を含む任意の核酸分子は、本明細書中に記載されるように、加工され得、および分析され得ることが理解されるべきである。上記核酸分子は、数ヌクレオチドの長さ、数百ヌクレオチドの長さ、数千ヌクレオチドの長さ、そして数百万ヌクレオチドの長ささえも含む任意の大きさであり得る。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は、クロモソームの長さである。
【００４３】
本発明の方法は、インビトロにおける事前の核酸増幅の非存在下で行われ得る。いくつかの好ましい実施形態において、上記核酸分子は、上記核酸分子の増幅を伴わずに生物学的サンプル（例えば、組織または細胞培養物）から、直接的に収集および単離される。従って、本発明のいくつかの実施形態は、「非インビトロで増幅された核酸分子」の分析を包含する。本明細書中で使用される場合、「非インビトロで増幅された核酸分子」は、ポリメラーゼ連鎖反応または組換えＤＮＡ方法のような技術を使用して、インビトロで増幅されていない核酸分子を称する。
【００４４】
しかし、非インビトロで増幅された核酸分子は、生物学的サンプルにおける細胞の発達の当然の結果として、インビボ（例えば、核酸分子が収集された生物学的サンプル中）で増幅された核酸分子であり得る。これは、非インビトロ核酸分子は、遺伝子増幅の一部としてインビボで増幅される核酸分子であり得ることを意味し、その核酸分子は、変異の結果または癌の進行の結果としていくつかの細胞型において通常観察される。
【００４５】
核酸の収集および単離は、当該分野において日常的に行われ、そして適切な方法は、標準的な分子生物学の教科書に見出され得る。上記核酸分子は、生物学的サンプル（例えば、組織または生物体液）から収集され得る。本明細書中で使用される場合、用語「組織」は、局在的な細胞集団および散在的な細胞集団（脳、心臓、乳房、大腸、膀胱、子宮、前立腺、胃、精巣、卵巣、膵臓、下垂体、副腎、甲状腺、唾液腺、乳腺、腎臓、肝臓、腸、脾臓、胸腺、骨髄、気管および肺が挙げられるがこれらに限定されない）の両方を称する。生物体液としては、唾液、精液、血清、血漿、血液および尿が挙げられるが、これらに限定されない。侵襲技術および非侵襲技術の両方は、そのようなサンプルを得るために使用され得、そしてその技術は、当該分野において良く実証されている。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本発明は、核酸誘導体を分析するために使用され得る。本明細書中で使用される場合、「核酸誘導体」は、非天然に存在する核酸分子である。核酸誘導体は、非天然に存在する要素（例えば、非天然に存在するヌクレオチドおよび非天然に存在するバックボーン結合（ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｌｉｎｋａｇｅ））を含み得る。
【００４７】
核酸誘導体は、置換したプリンおよび置換したピリミジン（例えば、Ｃ−５プロピン改変塩基（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４０−８４４，１９９６））を含み得る。プリンおよびピリミジンとしては、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、５−メチルシトシン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、ならびに芳香族成分を置換したおよび芳香族成分を置換していない、他の天然に存在する核酸塩基および非天然に存在する核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されない。核酸誘導体としてはまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸（ＬＮＡＳ）が挙げられる。他のこのような改変は、当業者にとって周知である。
【００４８】
上記核酸誘導体はまた、例えば、塩基および／または糖における置換もしくは改変を包含し得る。例えば、それらとしては、３’位のヒドロキシル基以外かつ５’位のホスフェート基以外の低分子量有機基に、共有結合される骨格糖を有する核酸が挙げられる。従って、核酸誘導体は、２’−Ｏ−アルキル化リボース基を含み得る。さらに、改変された核酸は、リボースの代わりに、アラビノースのような糖を含み得る。従って、上記核酸誘導体は、骨格組成物において異質であり得、それによって一緒に連結されたポリマー単位の、いくつかの可能な組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、上記核酸は、骨格組成物中で同質である。
【００４９】
非天然に存在する骨格結合としては、ホスホロチオネート結合、メチルホスホネート結合、アルキルホスホネート結合、ホスフェートエステル結合、アルキルホスホノチオエート結合、ホスホラミデート結合、カルバメート結合、カルボネート結合、ホスフェートトリエステル結合、アセトアミデート結合、カルボキシメチルエステル結合、メチルホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ｐ−エトキ結合シおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
前述のように、本発明の方法は、種々の状態における核酸分子上で行われ得る。例えば、上記核酸分子は、流動中に存在し得るか、またはそれは、固体表面に固定され得る。別の例として、上記核酸分子は、分析の前または分析の間に線形化され得るが、それに限定されない。むしろ、非線形化核酸分子からも有用な情報を導くことが可能である。これは、直接的分子分析（直鎖状核酸分子を必要とする直接的線形分析と比較して）と称される。直接的分子分析は、核酸分子が、特定の配列（例えば、多型または変異）を含むか否かを決定するために使用され得る。この配列の存在または非存在は、その配列に特異的に結合する核酸結合タンパク質の結合の、存在または非存在に基づいて決定され得る。これらの分析は、そのような配列の、配置または相対的位置にそれほど関係しない。しかし、それらは、上記核酸分子中に存在するそのような配列の数についての有用な情報を提供し得る。この後の実施形態は、上記核酸分子由来のシグナルのレベルを、シグナルレベルが、上記分子に結合した核酸結合タンパク質の数に相関するとして、測定する工程によって達成され得る。
【００５１】
本方法は、単一の核酸結合タンパク質の分析に限定されない。むしろ、多くの核酸結合タンパク質は、所定の時間で核酸結合タンパク質と接触され得、そしていくつかの事例においてタンパク質の型のそれぞれは、他のタンパク質の型から区別して標識される。
【００５２】
本発明のいくつかの局面は、単一分子検出システムを使用する。本発明の他の局面は、上記核酸分子、および上記核酸分子への、上記核酸結合タンパク質または上記配列特異的エンドヌクレアーゼの結合のパターンを検出するために、直鎖状ポリマー分析システムを使用する。直鎖状ポリマー分析システムは、直鎖状様式（即ち、ポリマー上の１つの位置で開始し、そしてそこから、どちらの方向へも直線的に進行する）でポリマーを分析するシステムである。ポリマーが分析された場合、ポリマーに付着した検出可能な標識は、連続的な様式または同時的な様式のいずれかで検出される。同時に検出された場合、そのシグナルは、通常、上記ポリマーの画像を形成し、そこから標識間の距離が決定され得る。連続して検出された場合、上記シグナルは、後に上記核酸分子の速度の知識を用いて地図に翻訳され得るヒストグラム（シグナル強度対時間）と見なされる。いくつかの実施形態において、上記核酸分子は固体支持体に付着されるが、他の実施形態において、その核酸分子は自由に流れることが理解される。いずれの場合においても、通り過ぎる（例えば、相互作用ステーションまたは検出器を）核酸分子の速度は、相互に対する標識の位置および、上記核酸分子上に存在し得る検出可能な他のマーカーに対する標識の位置を決定する工程を支援する。
【００５３】
従って、上記直鎖状ポリマーシステムは、核酸分子上の標識の総量だけでなく、いくつかの実施形態についてより重要な、そのような標識の配置も推定し得る。上記標識を配置し、そして位置付ける能力は、配列決定を容易にするために、上記結合パターンが他の遺伝子地図上に重ね合わされることを可能にする。
【００５４】
ＤＮＡ分子の伸長を包含する他の単一分子核酸分析の方法はまた、本発明の方法に使用され得る。これらはとしては、光学的マッピング（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１１０−１１３；Ｍｅｎｇら、１９９５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．９：４３２；Ｊｉｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８０４６−８０５１）およびファイバー蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ）（Ｂｅｎｓｉｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：２０９６；Ｍｉｃｈａｌｅｔら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：１５１８）が挙げられる。光学的マッピングにおいて、核酸分子は、液体サンプル中で伸長され、そしてゲル中または表面上に、伸長されたコンホメーションとして固定される。その後、制限消化は、伸長されかつ固定された核酸分子について行われる。その後、指定された制限地図は、制限フラグメントの大きさを決定することによって作成される。ファイバー−ＦＩＳＨにおいて、核酸分子は伸長され、そして分子コーミングによって表面上に固定される。蛍光標識プローブ配列を用いるハイブリダイゼーションは、上記核酸分子上の配列目印の決定を可能にする。分子長および／またはマーカー間の距離が測定され得るように、両方法は、伸長された分子の固定を必要とする。パルスフィールドゲル電気泳動はまた、上記標識された核酸分子を分析するために使用され得る。パルスフィールドゲル電気泳動は、Ｓｃｈｗａｒｔｚら（Ｃｅｌｌ（１９８４，３７：６７））によって記載される。他の核酸検出システムは、Ｏｔｏｂｅら（ＮＡＲ，２００１，２９：１０９）、Ｂｅｎｓｉｍｏｎら（２００１年６月１９日に発行された米国特許第６，２４８，５３７号）、ＨｅｒｒｉｃｋおよびＢｅｎｓｉｍｏｎ（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ  １９９９，７（６）：４０９−４２３）、Ｓｃｈｗａｒｔｚ（２０００年１１月２１日に発行された米国特許第６，１５０，０８９号および２００１年９月２５日に発行された米国特許第６，２９４，１３６号）によって記載される。
【００５５】
いくつかの局面において、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭシステムは、核酸分子を調べるために使用される。Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭ技術は、出願番号ＷＯ９８／３５０１２（１９９８年８月１３日公開）および出願番号ＷＯ００／０９７５７（２０００年２月２４日公開）を有する公開されたＰＣＴ特許出願中、ならびに発行された米国特許第６，３５５，４２０Ｂ１号（２００２年３月１２日発行）中に、より詳細に記載される。これらの出願および特許の内容、ならびに本明細書中に列挙される他の特許、出願および参考文献の内容は、その全てが参考として援用される。このシステムは、核酸分子にそった配列特異的タグの空間的な配置を決定できる。上記核酸分子内の特異的配列の地図は、上記タグの相対的な空間配置に由来し得る。上記空間配置は、上記配列特異的タグ上の標識に対応する検出システムを用いて核酸分子（好ましくは単一分子）を調べることによって決定される。前述のシステムの感受性は、単一の核酸が研究されることを可能にする。
【００５６】
「配列特異的エンドヌクレアーゼ」は、適切な条件下において配列特異的様式で核酸を切断する酵素である。本明細書中で使用される場合、「配列特異的」は、上記酵素が、ヌクレオチドまたはこれらの誘導体の、特定の直鎖状配列を認識し、そしてその配列内またはその配列の近傍において、その骨格を切断する（例えば、一本鎖状の切断部または二本鎖状の切断部を生成する）ことを意味する。いくつかの重要な実施形態において、上記切断部は、二本鎖状である。通常、上記配列特異的制限酵素は、それが認識する同じ配列内で、上記骨格を切断する。
【００５７】
多くのＩＩ型制限酵素は、１つのＤＮＡ結合部位、および上記認識配列内において、対称的に切断する２つの触媒ユニットを形成する、２つの同一のサブユニットの二量体である。触媒部位は、上記制限酵素が、その特定の認識部位でその二本鎖ＤＮＡ基質に結合される場合にのみ、活性である。ＥｃｏＲＶは、研究のための原型的な制限酵素であり、そしてかなりの数の機構的研究および構造的研究、ならびにタンパク質工学の対象であった（Ｓｔａｈｌ  Ｆ．，Ｗ．Ｗｅｎｄｅ，Ａ．ＪｅｌｔｓｃｈおよびＡ．Ｐｉｎｇｏｕｄ  ＰＮＡ  ９３：  ６１７５−６１８０  １９９６）。
【００５８】
本方法はまた、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して実施され得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、３５塩基対以上の特異的ＤＮＡ配列部位を認識し、そして適切な条件下で、その認識部位内における二本鎖ＤＮＡの切断を触媒する酵素である。これらの酵素は、遺伝的要素の挿入および遺伝的要素の切除に関係している。ホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、以下のモチーフ：（１）ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、（２）ＧＩＹ−ＹＩＧ、（３）Ｈ−Ｎ−Ｈおよび（４）Ｈｉｓ−Ｃｙｓによって特徴付けられる、４つのサブファミリーに分けられ得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、二量体または単量体のいずれかであり得る。そのような代表的な単量体のホーミングエンドヌクレアーゼの１つであるＰＩ−ＳｃｅＩは、２つの異なる触媒サブユニットであるようであるものの中にＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの２つの複製を有する。それぞれのサブユニットは、上記二本鎖基質の、一番上の鎖および一番下の鎖のそれぞれの切断を、特異的に触媒することが示された。上記単量体ホーミングエンドヌクレアーゼＰＩ−ＳｃｅＩは、そのＤＮＡ基質の２つの鎖の切断のための２つの触媒中心を有する（ＥＭＢＯ  １８：６９０８−６９１６，１９９９）。
【００５９】
全てでなくとも、いくつかの配列特異的エンドヌクレアーゼは、上記エンドヌクレアーゼが配列特異的様式で上記核酸分子に結合するが、その核酸分子をそれほど切断しない条件下で、本発明の方法に使用され得ることが明らかである。
【００６０】
配列特異的エンドヌクレアーゼはとしてはまた、あるタンパク質のＤＮＡ結合モチーフと別のタンパク質の切断モチーフとを連結することによって操作された、合成制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。ＤＮＡ結合タンパク質モチーフ（例えば、ジンクフィンガーモチーフ、ホメオボックス結合ドメイン、ｌａｃリプレッサー、ＧＡＬ、ｃｒｏなど）は、配列特異的制限酵素を構築するために、ＤＮＡ切断ドメインと融合され得る。そのようなキメラ制限酵素が構築され、そして記載されてきた。Ｙａｎｇ−Ｇｙｕｎ  Ｋ．およびＣｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ  Ｓ．（ＰＮＡＳ  ９１：８８３−８８７，１９９４）は、Ｆｏｋ  Ｉ制限酵素の切断ドメインにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｕｌｔｒａｂｉｔｈｏｒａｘホメオドメインが融合することを報告した。より関連することとして、キメラ制限酵素は、ジンクフィンガードメインがＦｏｋ  Ｉの切断ドメインに融合する工程、およびそれによって構築する配列特異的制限酵素から構築され得る。
【００６１】
トランスポザーゼはまた、分離した配列部位で核酸を標識するために使用され得る。トランスポザーゼは、ゲノムにおけるトランスポゾンの周囲への移動に関連する酵素である。トランスポザーゼの配列特異的ＤＮＡ結合特性は、本発明によって活用され得る。
【００６２】
上記核酸結合タンパク質（配列特異的エンドヌクレアーゼを含む）は、検出可能である。それらは、本質的に検出可能であり得るか、もしくは内因的に検出可能（例えば、自発蛍光）であり得るか、または検出可能にするために外因的に操作され得る。従って、いくつかの実施形態において、上記核酸結合タンパク質、上記配列特異的エンドヌクレアーゼおよび／または上記核酸分子は、検出可能な標識を用いて標識される。上記タンパク質または上記エンドヌクレアーゼは、上記検出可能な標識を用いて、共有結合的に標識され得るか、またはイオン的に標識され得る。一般的に、標識の検出は、その標識によるエネルギーの、吸収または放射に関係する。上記標識は、特定波長の光を放射および／または吸収する、その標識の能力によって直接的に検出され得る。直接的検出の例は、特定波長の光を吸収し、そして一般的に、より長い波長の光を放射するフルオロフォアの使用である。あるいは、上記標識は、結合する、補充するおよび、いくつかの場合において、その成分自体が、特定波長の光を放射し得るか、または吸収し得る別の成分を切断するその標識の能力によって、間接的に検出され得る。間接的検出の例は、基質を可視の生成物に切断する、第１の酵素標識の使用である。
【００６３】
上記標識は、化学物質性質の標識、ペプチド性質の標識または核酸性質の標識であり得るが、その標識はそれらに限定されない。標識の他の例としては、放射性同位体（例えば、Ｐ３２またはＨ３）、化学発光基質、色素産生性基質、蛍光色素のような蛍光マーカー（例えば、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＴＲＩＴＣ、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｒ−フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−７、テキサスレッド、ファーレッド（Ｐｈａｒ−Ｒｅｄ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）など）、光学密度マーカーまたは電子密度マーカー、ビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、ＦＬＡＧエピトープまたはＨＡエピトープのようなエピトープタグ、およびアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどのような酵素タグが挙げられるが、これらに限定されない。標識として、米国特許第６，２０７，３９２号に記載される、量子ドットのような半導体ナノ結晶の使用も本発明に想定される。量子ドットは、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎならびにその他から市販されている。
【００６４】
いくつかの事例において、上記検出可能な標識は、多数の検出可能な標識を負荷可能な、ビーズまたは粒子ではない。例えば、上記ビーズまたは粒子が、それ自体、本質的に検出可能であり、そして複数の検出可能な標識（例えば、蛍光成分）を事前に負荷していなければ、上記検出可能な標識は、ビーズまたは粒子であり得る。他の実施形態において、上記検出可能な標識は、非蛍光標識ビーズまたは非蛍光標識粒子である。磁性粒子は、非蛍光標識ビーズまたは非蛍光標識粒子の例である。
【００６５】
上記標識は、直接的に、または間接的にタンパク質、エンドヌクレアーゼまたは核酸分子に結合し得る。
【００６６】
上記核酸分子の分析は、上記標識からシグナルを検出する工程、およびいくつかの事例において、それらの標識の位置を決定する工程を包含する。いくつかの事例において、分析された他の核酸由来の情報、または遺伝子地図を用いて入手されるような情報の比較を容易にする標準マーカーを用いて、上記核酸分子をさらに標識することが所望され得る。例えば、上記標準マーカーは、バックボーン標識、ヌクレオチドの特定の配列（固有であるか否かに関わらず）に結合する標識、または核酸分子中で特定の配置に結合する標識（例えば、複製の起点、転写プロモーター、セントロメアなど）であり得る。
【００６７】
バックボーン標識の部分集合の１つは、実質的に配列非依存様式で核酸に結合する核酸染色物質である。例としては、フェナントリジンおよびアクリジンのようなインターカレーションする色素（例えば、臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、およびＡＣＭＡ）；インドールおよびイミダゾールのようなマイナーグローブバインダー（ｇｒｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３４５８０およびＤＡＰＩ）；そして種々の核酸染色物質（例えば、アクリジンオレンジ（インターカレーションすることも可能である）、７−ＡＡＤ、アクチノマイシンＤ、ＬＤＳ７５１、およびヒドロキシスチルバミジン）が挙げられる。前述した全ての核酸染色物質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．のような業者から市販されている。
【００６８】
核酸染色物質のさらに他の例としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ由来の、以下の色素：シアニン色素（例えば、ＳＹＴＯＸ  Ｂｌｕｅ、ＳＹＴＯＸ  Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯＸ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＹＯＹＯ−１、ＹＯＹＯ−３、ＴＯＴＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＪＯＪＯ−１、ＬＯＬＯ−１、ＢＯＢＯ−１、ＢＯＢＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＢＯ−ＰＲＯ−１、ＢＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−５、ＪＯ−ＰＲＯ−１、ＬＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−３、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＯｌｉＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩＩ、ＳＹＢＲ  ＤＸ、ＳＹＴＯ−４０、ＳＹＴＯ−４１、ＳＹＴＯ−４２、ＳＹＴＯ−４３、ＳＹＴＯ−４４、ＳＹＴＯ−４５（青色）、ＳＹＴＯ−１３、ＳＹＴＯ−１６、ＳＹＴＯ−２４、ＳＹＴＯ−２１、ＳＹＴＯ−２３、ＳＹＴＯ−１２、ＳＹＴＯ−１１、ＳＹＴＯ−２０、ＳＹＴＯ−２２、ＳＹＴＯ−１５、ＳＹＴＯ−１４、ＳＹＴＯ−２５（緑色）、ＳＹＴＯ−８１、ＳＹＴＯ−８０、ＳＹＴＯ−８２、ＳＹＴＯ−８３、ＳＹＴＯ−８４、ＳＹＴＯ−８５（橙色）、ＳＹＴＯ−６４、ＳＹＴＯ−１７、ＳＹＴＯ−５９、ＳＹＴＯ−６１、ＳＹＴＯ−６２、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６３（赤色））が挙げられる。
【００６９】
上記直鎖状ポリマー分析システムは、使用される標識の型に対応して選択される検出システムを備える。上記標識は、空間的様式または時間的様式で検出されるシグナルを放射する。１つの適切なシステムの例として、Ｇｅｎｅ  ＥｎｇｉｎｅＴＭシステムは、単一核酸分子が、直鎖状様式で相互作用ステーションを通過することを可能にする。上記ヌクレオチドは、それらが検出可能な標識に結合されるか否かを決定するために、個別に問い合わせられる。問い合わせは、規定の波長の光学的放射のようなエネルギー源に、上記核酸分子を曝す工程を包含する。上記エネルギー源曝露に対する応答において、上記ヌクレオチド上の検出可能な標識は、特有の検出可能なシグナルを放射する。上記直鎖状ポリマー分析システムはまた、ＤＮＡコーミングシステムのような光学的マッピングシステムであり得る。
【００７０】
シグナル放射の機構は、標識の型に依存する。上記検出システムは、蛍光検出システム、電気的検出システム、写真用フィルム検出システム、化学発光検出システム、酵素検出システム、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）検出システム、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）検出システム、光学的検出システム、核磁気共鳴（ＮＭＲ）検出システム、近視野検出システム、全反射（ＴＩＲ）システム、および電磁的検出システムからなる検出システムの群より選択され得るが、これらに限定されない。
【００７１】
本発明は、核酸分子の長さに従う、標識の任意の組み合わせの使用を包含する。これは、核酸分子がその長さに従って、例えば、フルオロフォア、発色団、核磁気共鳴標識および半導体ナノ結晶を用いて標識され得、そしてその核酸が、本明細書中に記載されるシステムによって分析され得ることを意味する。上記直鎖状ポリマー分析システムは、異なる多数の「シグナル様式」からシグナルを検出する能力を有する。１つの重要な実施形態において、上記システムは、蛍光標識によって明確にされる配列の配置を決定するために、レーザーによって誘導された蛍光検出を使用する。
【００７２】
上記配列特異的情報は、単一分子についての情報または分子の集団についての情報のいずいれかであり得る。従って、分子上の配列特異的部位の全てを標識する必要はない。同種の分子の集団が存在する場合、その集団のメンバーを部分的に標識し、ついで、個々のメンバーが整列され得る場合、特定の配列における完全な地図を作成するためのデータを再構築することが可能である。この方法は、「ネスト化された（ｎｅｓｔｅｄ）」配列特異的データの一式を用いて、単一ＤＮＡ分子データの集団を効率的に生成する。
【００７３】
そのように標識されたそれぞれの核酸分子は、上記エンドヌクレアーゼによる結合の、固有のパターンを有する。この固有のパターンは、上記核酸分子の「フィンガープリント」と同種であり得る。より多くの数の異なるエンドヌクレアーゼを使用（それぞれ異なる認識配列を有する）した場合、より多くの配列情報が、入手可能である。
【００７４】
本発明の方法を使用して導かれる配列決定情報は、ヒトゲノム計画のような情報源から入手可能であるゲノム配列決定情報と比較され得る。本発明の方法を使用して推定される結合パターンはまた、物理的ゲノム地図上に重ね合わされ得る。これらの地図（配列地図、モチーフ地図および構造的地図を含む）はヒトゲノム計画、または他の生物のゲノム配列決定計画のような公式の情報源から入手可能である。配列決定情報もしくは制限酵素結合パターンの、いずれかまたは両方の重ね合わせは、そのような情報を正しく判断するのに役立ち、従って分析されている上記ゲノムの領域を同定するのに役立つ。これにより、ゲノムの物理的地図は、本発明の方法を使用して決定される結合パターンを正しく判断するための参考として使用される。さらに、それはまた、結合された上記遺伝子座を同定するのに役立つ。本発明の全ての局面は、特定の種において、制限酵素結合パターンを、ゲノムまたはそれらの一部の物理的地図と比較する工程を包含し得る。
【００７５】
【化１−１】
2007501003.tif 000003
【００７６】
【化１−２】
2007501003.tif 000004
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
１００ｐＭの、単一のＢａｍＨＩ認識配列を含む放射性標識されたＤＮＡ二本鎖を、５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で２ｎＭ  ＢａｍＨＩと共にインキュベートした。示された時点で、６０００倍過剰のモル濃度の、標識されていない特異的競合ＤＮＡを添加した。複合体の半減期を示す、複合体解離データの最小二乗分析は、約３９，６００分である。
【００７８】
（実施例２）
カルシウムの存在下でのＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ、ＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよびＥａｇＩ制限エンドヌクレアーゼの平衡結合を調べた。予備データは、これらのエンドヌクレアーゼが、カルシウムの存在下で、かなりの切断活性も観察されずにエンドヌクレアーゼの標的認識部位にしっかりと結合することを示す（図２を参照のこと）。従って、制限エンドヌクレアーゼ反応におけるカルシウムの含有は、堅固な複合体形成を促進する一方で、切断を阻害する一般的な方法であり得る。
【００７９】
（実施例３）
図３Ａに示されるように、λＤＮＡは、５つのＢａｍＨＩ結合部位を有する。引き伸ばされているが、未配向のλＤＮＡ分子の集団上で予期されたタグ配置の位置を、下端の分子に示す。青い楕円は、上記λＤＮＡ分子の「ヘッド」を表す一方で、紫の楕円は、テイルを表す。分子は、分析前に配向されないので、それらは「ヘッドを先にした（ｈｅａｄ−ｆｉｒｓｔ）」配向または「テイルを先にした（ｔａｉｌ−ｆｉｒｓｔ）」配向のいずれかで、検出地点に入り得る。
【００８０】
図３Ｂは、Ａｌｅｘａ  ５４６  ＢａｍＨＩによって結合されたλＤＮＡに由来する標識平均を示す。上記標識平均は、分析のために選択されるＤＮＡ分子のＤＮＡ骨格に従って光子カウントを合計する。ピークは、増加した光子放射が観察される、上記λＤＮＡ骨格に沿った位置を、質量の中心（ＣＯＭ）からのマイクロメートルで表す。これらの分子は、分析前に配向されず、従ってそれらの分子は、「ヘッドを先にした」配向および「テイルを先にした」配向の両方で検出地点に入ることが予期される。予期されたＢａｍＨＩタグ配置を、上記λＤＮＡ配列によって示されるように、赤い線によって示す。データを、ガウス分布にあてはめ、そして正規曲線の平均を、観察されたタグ配置を示すために使用する。上記観察されたタグの位置は、予期された位置と良く一致しており、そしてその平均差異は、０．２マイクロメートル未満である。
【００８１】
同様の分析を、λＤＮＡ上のＥｃｏＲＩ結合部位について行った。図４Ａは、λＤＮＡが５つのＥｃｏＲＩ結合部位を有することを図示する。未配向のＤＮＡ分子上に結合するＥｃｏＲＩの予期された配置を示す。図４Ｂは、Ａｌｅｘａ  ５４６  ＥｃｏＲＩによって結合されたλＤＮＡに由来する標識平均を示す。予期されたタグの位置を、赤い線によって示す。観察されたタグの位置は、０．５マイクロメートル未満である平均差異で、予期されたタグの位置と良く一致している。λＤＮＡ分子に結合したＢａｍＨＩとλＤＮＡ分子に結合したＥｃｏＲＩとの間のバーコード（ｂａｒｃｏｄｅ）パターンの違いに注意すること。
【００８２】
同様の分析を、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＲＰ１１  １２Ｍ９消化フラグメント上で行った。図５Ａは、ＮｏｔＩ大フラグメントｂａ１２Ｍ９（１２９３４８塩基対）ＤＮＡが、１３個のＢａｍＨＩ結合部位を有することを図示する。青い楕円は、上記ＤＮＡ分子の「ヘッド」を示す一方で、紫の楕円は「テイル」を示す。未配向分子の集団上のタグ配置を示す。図５Ｂは、Ａｌｅｘａ  ５４６  ＢａｍＨＩによって結合されたＮｏｔＩ大フラグメントｂａ１２Ｍ９ＤＮＡに由来する標識平均を示す。上記標識平均は、観察されたピークと０．５マイクロメートル未満の予測されたピークとの間の平均差異を有する、予測されたタグ配置に密接に対応するピークを含む。
【００８３】
（等価物）
前述の内容は単に、特定の実施形態の詳細な説明にすぎないことが理解されるべきである。従って、種々の改変および等価物が、本発明の精神および本発明の範囲から逸脱することなく、そして汎用的に過ぎない実験法を用いて行われ得ることが、当業者にとって明らかであるべきである。特許請求の範囲内の、そのような改変および等価物の全てを包含することが意図される。
【００８４】
本出願中に列挙される全ての、参考文献、特許および特許出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１Ａは、Ｃａ２＋の存在下かつＭｇ２＋の非存在下における時間の関数としての、ＢａｍＨＩ／ＤＮＡ複合体の複合体の存在を示すオートラジオグラムの表示である。図１Ｂは、時間の関数として全核酸に対する結合された核酸の比の自然対数のグラフであり、上記ＢａｍＨＩ／ＤＮＡ複合体の半減期を計算するために使用される。
【図２】図２は、カルシウム濃度の関数としての、ＮｏｔＩ結合二重鎖およびＮｏｔＩ非結合二重鎖のレベルを示すオートラジオグラムの表示である。
【図３】図３Ａは、λファージＤＮＡ上のＢａｍＨＩ部位を示す構造図である。図３Ｂは、Ａｌｅｘａ  ５４６  ＢａｍＨＩによって結合されたλＤＮＡに由来する標識平均を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、λファージＤＮＡ上のＥｃｏＲＩ部位を示す構造図である。図４Ｂは、Ａｌｅｘａ  ５４６  ＥｃｏＲＩによって結合されたλＤＮＡに由来する標識平均を示すグラフである。
【図５】図５Ａは、ＮｏｔＩ大フラグメントｂａ１２Ｍ９（ＢＡＣに由来する）上のＢａｍＨＩ部位を示す構造図である。図５Ｂは、Ａｌｅｘａ  ５４６  ＢａｍＨＩによって結合されたＮｏｔＩ大フラグメントｂａ１２Ｍ９ＤＮＡに由来する標識平均を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2007501003.tif 000011
2007501003.tif 000012
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