(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの機能的なペリプラズム結合タンパク質、少なくとも１つの標識部分、および少なくとも１つの蛍光タンパク質を含む融合タンパク質に関する。一実施形態では、このペリプラズム結合タンパク質は、機能的なグルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）である。本発明は、細胞または組織中の分析物、例えばグルコースを定量化する方法にも関し、この方法は、細胞または組織に蛍光ペリプラズム結合融合タンパク質部分を含む組成物を投与する工程と、上記蛍光ペリプラズム結合融合タンパク質の蛍光を測定する工程を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分析物を定量化する方法であり、前記方法が、
ａ）融合タンパク質を前記試料に投与する工程であって、前記融合タンパク質が機能的なペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）、少なくとも１つの標識部分、および少なくとも１つの蛍光タンパク質を含む工程と、
ｂ）前記蛍光融合タンパク質のルミネッセンスを測定する工程と
を含み、前記ルミネッセンスは前記試料中の分析物の量を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記測定を同じ試料中で複数の時点で行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記測定を連続的に行うことができることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質は前記分析物に可逆的に結合することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料は生物体液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記定量化は、前記少なくとも１つの標識部分の蛍光に対する前記少なくとも１つの蛍光タンパク質の蛍光の比率を計算することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記融合タンパク質は少なくとも２つの蛍光タンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記定量化は前記少なくとも２つの蛍光タンパク質の蛍光の比率を計算することを含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも２つの蛍光タンパク質は同一でないことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記機能的なＰＢＰは、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタメート結合タンパク質（ＧｌｕＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、ホスフェート結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、グルタミン結合タンパク質（ＧＢＰ）、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記機能的なＰＢＰはＧＧＢＰまたはその誘導体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析物はグルコースであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レッドシフトＧＦＰ（ｒｓ−ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、これらの強化型、およびこれらの変異からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの蛍光タンパク質はＲＦＰであることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＦＰはＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、およびこれらの変異からなる群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＦＰはＤｓＲｅｄ２変異体ＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標識部分はフルオロフォアであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記フルオロフォアは、フルオレセイン、アクリロダン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、エオシン、ピレン、アクリジンオレンジ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
融合タンパク質部分と、少なくとも１つの標識部分とを含む組成物であって、前記融合タンパク質部分は、機能的なペリプラズム結合タンパク質と、少なくとも１つの蛍光タンパク質とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２０】
前記機能的なペリプラズム結合タンパク質は、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタメート結合タンパク質（ＧｌｕＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、ホスフェート結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、グルタミン結合タンパク質、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記機能的なＰＢＰはＧＧＢＰまたはその誘導体であることを特徴とする請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つの追加の蛍光タンパク質をさらに含むことを特徴とする請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも２つ蛍光タンパク質は同一でないことを特徴とする請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レッドシフトＧＦＰ（ｒｓ−ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、これらの強化型、およびこれらの変異からなる群から選択されることを特徴とする請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの蛍光タンパク質はＲＦＰであることを特徴とする請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＲＦＰはＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、およびこれらの変異からなる群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＲＦＰはＤｓＲｅｄ２変異体ＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）であることを特徴とする請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記標識部分はフルオロフォアであることを特徴とする請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記フルオロフォアは、フルオレセイン、アクリロダン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、アクリジンオレンジ、エオシン、ピレン、アクリジンオレンジ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０からなる群から選択されることを特徴とする請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１９に記載の組成物の融合タンパク質部分をコードする核酸配列を含むことを特徴とするベクター。
【請求項３１】
請求項３０に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項３２】
タンパク質を生成する方法であって、前記タンパク質が発現されるような条件下で、請求項３１に記載の宿主細胞を培養する工程と、前記タンパク質を回収する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
試料中の分析物の濃度を検出するためのキットであって、前記キットが請求項１９に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
【請求項３４】
前記機能的なペリプラズム結合タンパク質は、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタメート結合タンパク質（ＧｌｕＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、ホスフェート結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、グルタミン結合タンパク質、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、およびこれらの誘導体からなる群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記機能的なペリプラズム結合タンパク質はグルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）またはその誘導体であることを特徴とする請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記分析物はグルコースであることを特徴とする請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、レッドシフトＧＦＰ（ｒｓ−ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、およびこれらの強化型からなる群から選択されることを特徴とする請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの蛍光タンパク質はＲＦＰであることを特徴とする請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記ＲＦＰはイソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ２）であることを特徴とする請求項３８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの機能的なペリプラズム結合タンパク質、少なくとも１つの標識部分、および少なくとも１つの蛍光タンパク質を含む融合タンパク質に関する。一実施形態では、このペリプラズム結合タンパク質は、機能的なグルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）である。本発明は、細胞、組織、または生物体液中の分析物、例えばグルコースを定量化する方法にも関し、この方法は、細胞または組織に蛍光ペリプラズム結合融合タンパク質部分を含む組成物を投与するステップと、上記蛍光ペリプラズム結合融合タンパク質の蛍光を測定するステップとを含む。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病患者の適切な代謝制御を容易にするためにグルコース濃度をモニターすることは、望ましい目標であり、多くの個人の生活を向上させるであろう。現在、ほとんどの糖尿病患者は、彼らの血糖値をモニターするのに、「指穿刺」法を用いており、頻繁な（すなわち１日に数回）穿刺が引き起こす苦痛のため、患者コンプライアンスに問題が生じている。その結果、血糖、または他のグルコースを含有する生物体液の頻繁および／または連続的なモニタリングを行う、非侵襲的または最小限度に侵襲的なｉｎ  ｖｉｖｏ法およびより効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を開発するための努力がなされている。これらの方法のうち最も有望なもののいくつかは、バイオセンサーを使用するものである。バイオセンサーは、形質導入（検出）要素と組み合わされた生物学的な認識要素を用いて特定の定量的または半定量的分析情報を提供できる装置である。
【０００３】
バイオセンサーの生物学的認識要素が特異性を決定し、それによって、測定される化合物のみがシグナルをもたらす。この選択は、リガンドの生化学的認識であってリガンド（例えばグルコース）の化学構造が変化しないものに基づくものでもよく、または、生物触媒作用であって認識要素が分析物の生化学反応を触媒するものに基づくものでもよい。
【０００４】
次に、変換器が、生物学的認識要素の認識を半定量的または定量的なシグナルに変換する。可能な変換器技法は、光学技法、電気化学技法、音響／機械技法、または比色分析技法である。これまでに利用されている光学特性には、吸光、蛍光／リン光、生物／化学発光、反射、光散乱、および屈折率が含まれる。蛍光化合物などの従来のレポーター基または標識部分を用いてもよく、または代替的に、標識を必要としない直接的な光学的検出の機会もある。
【０００５】
シグナル変換に生物学的要素を使用する、グルコース検出用に特別に設計されたバイオセンサーは、通常、グルコースオキシダーゼ活性を検出する電気化学的方法または比色分析方法を用いる。この方法には、血中の酸素レベルおよび阻害因子の影響、ならびに電極に関する問題を含めた困難が伴う。加えて、検出は、分析物を消費させ、これは低グルコース濃度を測定する場合には、困難を引き起こすことがある。
【０００６】
バイオセンサー開発の領域で急速に前進しているのは、蛍光標識されたペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）の使用である。血液、間質液、眼溶液または汗などの生物学的溶液中のグルコース濃度を正確に測定するためには、対象とする生物学的溶液の生理的および／または病理学的な作用範囲と一致するように、バイオセンサーの検出分子の結合定数を調整することが望ましい。結合定数が適当でなければ、シグナルは、特定の生理的および／または病理学的濃度に適した範囲から逸脱しうる。さらに、広範なグルコース濃度にわたる正確な測定を提供するために、それぞれ異なった結合定数を有する複数のタンパク質を用いてバイオセンサーを構成してもよい（例えば、特許文献１を参照）。
【０００７】
変異型ＰＢＰは有用であるのにもかかわらず、これらのタンパク質のうち、設計および検査されたものは、レポーター基を有するものも、レポーター基をもたないものもわずかでしかない。部位の特定の変異および／またはある種のレポーター基の結合は、結合定数を、予測できない方法で改変するように作用しうる。さらに、レポーター基を含有するバイオセンサーは、望ましい結合定数を有しても、分析物結合の際に、容易に検出できるシグナルをもたらさない場合がある。特定の分析物の検出用に、あるタンパク質に結合されたあるレポータープローブの感度を決定する最も重要な因子のいくつかは、選択されたプローブと、タンパク質のアミノ酸残基との間の特異的な相互作用の性質である。現在のところ、これらの相互作用を組み合わせることがタンパク質機能にどのように影響を与えるかを既存のコンピュータ法を用いて効果的に予測することは可能でない。また、レポータープローブの選択を最適化する合理的設計の方法論を利用することも可能でない。事実、結合タンパク質の結合定数または特異性に対するレポーター基の影響はいずれも予測不能である。
【０００８】
【特許文献１】Lakowicz、米国特許第６１９７５３４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／０１５３０２６号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１３４３４６号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３／０１３０１６７号明細書
【特許文献５】欧州特許出願公開第０４６４  ５３３号明細書
【特許文献６】カナダ国特許出願公開第２０４５８６９号明細書
【特許文献７】欧州特許出願公開第０２３２  ２６２号明細書
【非特許文献１】T. E. Creighton, Proteins-Structure And Molecular Properties, 2nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1993)
【非特許文献２】Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983)
【非特許文献３】Seifter et al., Methods in Enzymol, 182: 626-646 (1990）and Rattan et al., Ann NY Acad Sci., 663: 48-62 (1992)
【非特許文献４】Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001)
【非特許文献５】Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, New York (1985)
【非特許文献６】Computational Molecular Biology, Lesk, A. M, ed., Oxford University Press, New York (1988)
【非特許文献７】Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993)
【非特許文献８】Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)
【非特許文献９】von Heinje, G. , Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987)
【非特許文献１０】Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York (1991)
【非特許文献１１】Carillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48:1073 (1988)
【非特許文献１２】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994)
【非特許文献１３】Carillo, H. & Lipton, D., Siam J Applied Math 48: 1073 (1988)
【非特許文献１４】Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (i):387 (1984）
【非特許文献１５】Atschul, S. F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)
【非特許文献１６】Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、患者の血液または間質液を含めた試料中の分析物のレベルを決定するために正確に測定できるシグナルを生成できる追加の有用な標識された変異型ペリプラズム結合タンパク質を設計する必要性が当技術分野にある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、少なくとも１つの機能的なペリプラズム結合タンパク質、少なくとも１つの標識部分、および少なくとも１つの蛍光タンパク質を含む融合タンパク質に関する。一実施形態では、このペリプラズム結合タンパク質は、機能的なグルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）である。本発明は、細胞、組織、または生物体液中の分析物、例えばグルコースを定量化する方法にも関し、この方法は、細胞または組織に蛍光ペリプラズム結合融合タンパク質部分を含む組成物を投与することと、上記蛍光ペリプラズム結合融合タンパク質の蛍光を測定することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、試料中の分析物を定量化する方法に関し、この方法は、上記試料に融合タンパク質を投与するステップと、蛍光のレベルを測定するステップとを含む。測定されたルミネッセンスの強度は、試料中の分析物の量に相関する。本発明の方法で使用される融合タンパク質は、少なくとも１つの蛍光タンパク質および少なくとも１つの標識部分を融合した機能的なペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）を含む。
【００１２】
分析物の検出は、機能的なペリプラズム結合タンパク質が、分析物に結合した際に行う立体配座変化によって可能となる。次に、この立体配座変化が、その両方が機能的なＰＢＰに結合されている蛍光タンパク質および標識部分の互いに対する相対的位置関係を変えるであろう。相対的位置関係のこの変化が、ドナー分子（蛍光タンパク質または標識部分）からアクセプター分子（標識部分または蛍光タンパク質）へのエネルギー移動を可能にし、次に、これがシグナル、例えば蛍光を介して検出可能となる。測定される蛍光の値は、強度とすることも、寿命とすることもできる。このようにして、蛍光測定を、測定される分析物の濃度と直接的または間接的に結びつけることができる。
【００１３】
さらに、本明細書に記載する発明は、シグナルを生成できる２つの分子を利用するので、エネルギーの変化または移動は、スペクトルにおける２つの異なった波長で検出可能でありうる。例えば、２つ以上の異なった波長でのエネルギー放出の変化を比較して、それによって、「比率（ratiometric）」測定を行うことができ、これを、測定された分析物の値を正規化するのに、並びに、融合タンパク質または分析物の純度を明らかにするのに用いることができる。
【００１４】
本明細書で使用する場合、分析物の定量化は、相対量または絶対量とすることができる。当然ながら、分析物の量は、ゼロに等しくなる場合もあり、これは、求められた分析物の不在を示す。量は、単純に、いかなる追加の測定または操作のない測定された蛍光の値でよい。別法として、量は、標準物質（これに限定されない）を含めた、別の化合物の測定値に対する、分析物の測定値の相違、割合、または比率として表してもよい。相違は負の値でもよく、それは測定された分析物の量の減少を示す。量は、分析物と、異なった時点で測定されたそれ自体との相違または比率として表してもよい。分析物の量は、測定された蛍光の値から直接決定してもよく、あるいは、測定された蛍光の値をアルゴリズムに用いてもよく、その場合アルゴリズムは、測定された蛍光値を試料中の分析物の量に相関させるように設計されたものである。
【００１５】
本発明の方法で測定される分析物には、本発明の方法で使用される融合タンパク質のペリプラズム結合タンパク質部分に結合できるいかなる化合物も含まれる。ペリプラズム結合タンパク質部分への分析物の結合は、可逆的でも、可逆的でなくてもよい。分析物の例には、単糖、二糖、オリゴ糖、および多糖などの炭水化物、限定されるものではないが、オリゴペプチド、ポリペプチド、および成熟タンパク質を含めた、タンパク質、ペプチド、およびアミノ酸核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、脂肪酸、リポタンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク、有機化合物、無機化合物、イオン、ならびに合成および天然の重合体が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、分析物は炭水化物である。詳細には、この炭水化物分析物は、グルコース、ガラクトース、またはリボースなどの糖でよい。より詳細には、分析物は、グルコースでよい。
【００１６】
分析物は試料中で測定される。本明細書で使用する場合、試料は、測定される分析物を含有すると推測されるいかなる環境でもよい。したがって、試料には、溶液、細胞、体液、組織またはその部分、および臓器またはその部分が含まれるが、これらに限定されない。試料が細胞を含む場合、その細胞は、原核細胞、または真核細胞、例えば動物細胞でありうる。動物細胞の例には、昆虫、鳥類、および、例えば、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ならびにヒトおよびヒト以外の霊長類などの哺乳類が含まれるが、これらに限定されない。本発明の範囲を、アッセイされる細胞型で限定するべきではない。アッセイされる生物体液の例には、血液、尿、唾液、滑液、間質液、脳脊髄液、リンパ液、胆汁、および羊水が含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法の範囲を、アッセイされる体液のタイプで限定するべきでない。「対象」および「患者」という用語は、本明細書では互換性をもって使用され、動物、詳細には哺乳動物、より詳細にはヒトまたはヒト以外の霊長類を意味するものとして使用される。
【００１７】
試料は、それらの本来の環境から取り出されていても、取り出されていなくてもよい。したがって、試料の、アッセイされる部分を、試料の残部、または試料を含有しているかもしれない対象から分離する必要も、取り出す必要もない。例えば、患者から血液を取り出さずに、対象の血液をグルコースについてアッセイしてよい。当然ながら、試料をその本来の環境から取り出してもよい。さらに、アッセイする前に、試料を加工してもよい。例えば、試料を希釈または濃縮してもよく、試料を精製してもよく、および／または内部標準のような、少なくとも１つの化合物を試料に添加してもよい。本発明の方法を実施する前に、または同時に、試料を物理的に改変（例えば、遠心法、アフィニティー分離）しても、または化学的に改変（例えば、酸、塩基、または緩衝剤の添加、加熱）してもよい。加工には、アッセイの前に試料を凍結および／または保存することも含まれる。
【００１８】
本発明の方法は、試料に融合タンパク質を投与することに依存する。本明細書で使用する場合、「投与」は、試料を、本発明の融合タンパク質と接触させるか、あるいはその近傍にもたらすいかなる手段を示すのにも使用する。したがって、例えば、融合タンパク質を試料に添加することによって、融合タンパク質を試料に投与することができ、あるいは、試料を融合タンパク質上に、または融合タンパク質の近傍に配置することによって、融合タンパク質を試料に投与してもよい。さらに、試料を含有する環境の中に融合タンパク質をより効果的に配置できる様々な構造または装置を使用して、融合タンパク質を試料に投与することができる。例えば、本発明の一実施形態では、融合タンパク質を、光ファイバーの中またはその上にコーティングし、その後、限定されるものではないが、対象の身体を含めた、試料を含有する環境内に、その光ファイバーを挿入することができる。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの設定で投与することができる。したがって、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏの環境でも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの環境でも利用することができる。
【００１９】
さらに、本発明の方法を用いて、分析物を継続的に測定またはモニターしてもよい。例えば、融合タンパク質を分析物に継続的に結合させてもよく、次に、それが連続的にシグナルを放出し、このシグナルは、検出装置に応じて連続的に検出される場合もあれば、そうでない場合もある。
【００２０】
本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの機能的なペリプラズム結合タンパク質（ＰＢＰ）、少なくとも１つの標識部分、および少なくとも１つのルミネッセンス（例えば蛍光）タンパク質を有するものでなくてはならない。本明細書で使用する場合、機能的なＰＢＰは、アミノ酸配列（一次構造）ではなく、三次元の立体配置（三次構造）で特徴付けられるタンパク質であり、ローブ−ヒンジ−ローブ領域により特徴付けられる。ＰＢＰは、通常、ＰＢＰのローブの間にあるクレフト領域で分析物に特異的に結合するであろう。さらに、次に、このクレフト領域での分析物の結合によって、分析物の検出を可能にする立体配座変化がＰＢＰに引き起こされるであろう。本発明のペリプラズム結合タンパク質には、ここで記載した構造特性を有するいかなるタンパク質も含まれ、タンパク質の三次元構造を分析して、ＰＢＰに特有のローブ−ヒンジ−ローブ構造を決定することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。ＰＢＰの例には、グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）、アラビノース結合タンパク質（ＡＢＰ）、ジペプチド結合タンパク質（ＤＰＢＰ）、グルタメート結合タンパク質（ＧｌｕＢＰ）、鉄結合タンパク質（ＦｅＢＰ）、ヒスチジン結合タンパク質（ＨＢＰ）、ホスフェート結合タンパク質（ＰｈｏｓＢＰ）、グルタミン結合タンパク質、オリゴペプチド結合タンパク質（ＯｐｐＡ）、またはこれらの誘導体が含まれ、さらに、ペリプラズム結合タンパク質様−Ｉ（ＰＢＰ様−Ｉ）およびペリプラズム結合タンパク質様−ＩＩ（ＰＢＰ様−ＩＩ）として知られているタンパク質ファミリーに属する他のタンパク質も含まれるが、これらに限定されない。ＰＢＰ様−ＩおよびＰＢＰ様−ＩＩタンパク質は、平行βシートとそれに隣接したαヘリックスとからなる２つの同様なローブドメインを有する。グルコース−ガラクトース結合タンパク質（ＧＧＢＰ）は、タンパク質のＰＢＰ様−Ｉファミリーに属し、一方、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）は、タンパク質のＰＢＰ様−ＩＩファミリーに属する。リボース結合タンパク質（ＲＢＰ）も、タンパク質のＰＢＰファミリーのメンバーである。ペリプラズム結合タンパク質の他の非限定的な例を、表Ｉに記載する。
【００２１】
【表１−１】
2007513331.tif 000003
【００２２】
【表１−２】
2007513331.tif 000004
【００２３】
【表１−３】
2007513331.tif 000005
【００２４】
本発明の一実施形態では、その方法および組成物が、複数の機能的なＰＢＰを利用する。例えば、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの機能的なＰＢＰを、相互に連結、架橋、または融合体として遺伝的に構築（融合）してもよく、あるいは、それらを、複数の結合部位を有する別の分子に、連結、架橋、または融合体として遺伝的に構築（engineer）（融合）してもよい。本発明の特定の一実施形態では、１つ、２つ、３つ、または４つの機能的なＧＧＢＰタンパク質が、下記の通り、ＤｓＲｅｄ２（蛍光タンパク質）四量体に（ペプチド結合を介して）融合される。ＤｓＲｅｄ２四量体は、４つのＮ末端を有し、機能的なＧＧＢＰまたは他の機能的なＰＢＰをそれらと、そのような通常の組換えＤＮＡ技法または化学合成技法を用いて融合させてもよい。
【００２５】
本発明の機能的なＰＢＰには、その断片が野生型のＰＢＰの結合特異性および／または親和性の少なくとも一部を保有するという条件で、野生型ＰＢＰまたはそれらの断片が含まれるが、これらに限定されない。機能的なＰＢＰの追加の例には、そのＰＢＰ誘導体が野生型のＰＢＰの結合特異性および／または親和性の少なくとも一部を保有するという条件で、野生型ＰＢＰの誘導体（変異体）が含まれる。「誘導体」、「変異体」、および「変種」という用語は、本明細書では互換性をもって使用される。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、互換性をもって使用され、ペプチド結合または修飾ペプチド結合で相互に連結された２つ以上のアミノ酸を含むいかなるペプチドまたはタンパク質を指すのにも使用される。「ポリペプチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチド、またはオリゴマーと呼ばれるより短い鎖を意味するのにも使用される。上記に言及した通り、本発明の機能的なペリプラズム結合タンパク質には、野生型アミノ酸配列における付加、欠失、または変異によってそのペリプラズム結合タンパク質の機能が完全に消失しないという条件で、天然存在のアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を含みうるＰＢＰ誘導体が含まれる。換言すれば、本発明は、ペリプラズム結合タンパク質の機能的誘導体も企図し、その際、これらの誘導体は、野生型タンパク質と同じ分析物に対して少なくとも若干の特異的親和性を依然として有する。したがって、本明細書で使用する場合、機能的なペリプラズム結合タンパク質には、野生型、およびその機能的誘導体が含まれる。本発明の機能的誘導体は、当業者に周知の技法で作製または調製してよい。そのような技法の例には、変異導入および直接合成が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
機能的なペリプラズム結合タンパク質またはその機能的誘導体は、翻訳後プロセシングなどの天然の過程、または当技術分野で周知の化学修飾技法によって修飾されたものでもよい。そのような修飾については、基礎的なテキスト、およびより詳細な研究書、ならびに多数の研究文献によく記述されている。修飾は、ペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖、アミノ酸末端、およびカルボキシル末端を含めた、ポリペプチドのいかなる箇所でも起こりうる。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドのいくつかの部位に、同じ程度か、または異なった程度で存在してもよいことが理解されよう。また、所与のポリペプチドが複数の修飾を含有してもよい。修飾の例には、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合化、ヘム部分の共有結合化、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合化、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合化、ホスファチジルイノシトールの共有結合化、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化反応、ヨウ化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解性プロセシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化のようなタンパク質への転移ＲＮＡ媒介型のアミノ酸付加、およびユビキチン化が含まれるが、これらに限定されない。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分岐しているものでもよく、さらに、分岐の有無に関わらず、環状であってもよい（例えば、非特許文献１、２、および３参照）。
【００２８】
本発明の一実施形態では、機能的な変異体ＰＢＰはＧＧＢＰタンパク質の誘導体である。ＧＧＢＰタンパク質の例示的な変異には、位置１１におけるリシンからシステインへの置換（Ｋ１１Ｃ）、位置１４におけるアスパラギン酸からシステインへの置換（Ｄ１４Ｃ）、位置１６におけるメチオニンからシステインへの置換（Ｍ１６Ｃ）、位置１９におけるバリンからシステインへの置換（Ｖ１９Ｃ）、位置４３におけるアスパラギンからシステインへの置換（Ｎ４３Ｃ）、位置７４におけるグリシンからシステインへの置換（Ｇ７４Ｃ）、位置１０７におけるチロシンからシステインへの置換（Ｙ１０７Ｃ）、位置１１０におけるトレオニンからシステインへの置換（Ｔ１１０Ｃ）、位置１１２におけるセリンからシステインへの置換（Ｓ１１２Ｃ）、位置１１２におけるセリンからシステインへの置換および位置２３８におけるロイシンからセリンへの置換を含む二重変異体（Ｓ１１２Ｃ／Ｌ２３８Ｓ）、位置１１３におけるリシンからシステインへの置換（Ｋ１１３Ｃ）、位置１３７におけるリシンからシステインへの置換（Ｋ１３７Ｃ）、位置１４９におけるグルタミン酸からシステインへの置換（Ｅ１４９Ｃ）、位置１４９におけるグルタミン酸からシステインへの置換および位置２３８におけるロイシンからセリンへの置換を含む二重変異体（Ｅ１４９ＥＣ／Ｌ２３８Ｓ）、位置１４９におけるグルタミン酸からシステインへの置換および位置２３８におけるロイシンからシステインへの置換を含む二重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）、位置１４９におけるグルタミン酸からシステインへの置換および位置２１３におけるアラニンからアルギニンへの置換を含む二重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ）であって、位置１５２におけるヒスチジンからシステインへの置換および位置１８２におけるメチオニンからシステインへの置換（Ｈ１５２Ｃ／Ｍ１８２Ｃ）を含むもの、位置２１３におけるアラニンからセリンへの置換および位置１５２におけるヒスチジンからシステインへの置換を含む二重変異体（Ｈ１５２Ｃ／Ａ２１３Ｓ）、位置１８２におけるメチオニンからシステインへの置換（Ｍ１８２Ｃ）、位置２１３におけるアラニンからシステインへの置換（Ａ２１３Ｃ）、位置２１３におけるアラニンからシステインへの置換および位置２３８におけるロイシンからシステインへの置換を含む二重変異体（Ａ２１３Ｃ／Ｌ２３８Ｃ）、位置２１６におけるメチオニンからシステインへの置換（Ｍ２１６Ｃ）、位置２３６におけるアスパラギン酸からシステインへの置換（Ｄ２３６Ｃ）、位置２３８におけるロイシンからシステインへの置換（Ｌ２３８Ｃ）、位置２８７におけるアスパラギン酸からシステインへの置換（Ｄ２８７Ｃ）、位置２９２におけるアルギニンからシステインへの置換（Ｒ２９２Ｃ）、位置２９６におけるバリンからシステインへの置換（Ｖ２９６Ｃ）、ならびに位置１４９におけるグルタミン酸からシステインへの置換および位置２１３におけるアラニンからアルギニンへの置換および位置２３８におけるロイシンからセリンへの置換を含む三重変異体（Ｅ１４９Ｃ／Ａ２１３Ｒ／Ｌ２３８Ｓ）が含まれる。これらの誘導体ＧＧＢＰは、参照により本明細書に援用する特許文献２、３、および４に記載されている。ＧＧＢＰまたはその機能的誘導体が、本発明で使用される機能的なＰＢＰである場合、検出される分析物は、グルコースまたはガラクトースのいずれかである。
【００２９】
本発明の方法および組成物で誘導体ポリペプチドを使用する目的の１つは、融合タンパク質の表面または中に標識部分を組み込み、それによって、融合タンパク質を標識部分で標識することである。機能的なペリプラズム結合タンパク質の一次構造内への１つまたは複数のシステイン残基を付加／置換することによって、この方法および組成物で使用される標識部分のいくつかを、還元、酸化、結合、および縮合反応などの化学的方法を介して結合させることができる。例えば、いかなるチオール反応性基も標識部分、例えばフルオロフォアをそのポリペプチドの一次構造内の天然存在のシステインまたは遺伝子操作されたシステインに結合させるのに用いることができる。
【００３０】
本発明の融合タンパク質は、標識部分も含む。本明細書で使用する場合、標識部分は、検出可能な非放射性のシグナルを有するか、有するようになる化学化合物またイオンを意味するものとする。標識部分の例には、遷移金属、ランタニドイオン、および他の化学化合物が含まれるが、これらに限定されない。非放射性のシグナルには、蛍光、リン光、生物発光、および化学発光が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、標識部分は、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、５−ＴＭＲＩＡ（テトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｒｅｄ（商標）、テキサスレッド（商標）、Ｃｙ３、Ｎ−（（２−イオドアセトキシ）エチル）−Ｎ−メチル）アミノ−７−ニトロベンゾオキサジアゾール（ＩＡＮＢＤ）、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、ピレン、ルシファーイエロー、Ｃｙ５、Ｄａｐｏｘｙｌ（登録商標）（２−ブロモアセタミドエチル）スルホンアミド、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−イル）ヨードアセトアミド（Ｂｏｄｉｐｙ  ５０７／５４５ＩＡ）、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）−Ｎ−’−ヨードアセチルエチレンジアミン（ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０ＩＡ）、５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−ｌ−スルホン酸（１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ）、およびカルボキシ−Ｘ−ローダミン，５／６−ヨードアセトアミド（ＸＲＩＡ  ５，６）からなる群から選択されたフルオロフォアである。他のルミネッセンス標識部分には、ユウロピウム（Ｅｕ３＋）およびテルビウム（Ｔｂ３＋）などのランタニドが含まれ、さらに、通常はフェナントロリンなどのジイミン配位子との複合体である、ルテニウム［Ｒｕ（ＩＩ）］、レニウム［Ｒｅ（Ｉ）］、またはオスミウム［Ｏｓ（ＩＩ）］の金属−配位子複合体も含まれる。
【００３１】
詳細には、フルオロフォア標識部分は、フルオレセイン、アクリロダン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、エオシン、ピレン、アクリジンオレンジ、ＰｙＭＰＯ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６６０、またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６８０でありうる。より詳細には、標識部分はアクリロダンでよい。別の実施形態では、標識部分は、電気化学的な部分であり、その場合、この標識部分の環境の変化は、その部分の酸化還元状態を変化させるであろう。
【００３２】
本発明の一実施形態では、融合タンパク質の測定可能シグナルが、実際には、ドナー分子からアクセプター分子への励起エネルギーの移動（共鳴エネルギー移動）である。詳細には、この共鳴エネルギー移動は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の形態にある。本発明の方法で分析物を定量化するのにＦＲＥＴを使用する場合、標識部分がドナーまたはアクセプターでありうる。「ドナー」および「アクセプター」という用語は、ＦＲＥＴと関連して使用される場合、当技術分野で容易に理解される。詳細には、ドナーは、光の光子を吸収して、その後、アクセプター分子へのエネルギー移動を開始する分子である。アクセプター分子は、ドナーによって開始されたエネルギー移動を受けて、次に光の光子を放つ分子である。ＦＲＥＴの効率は、２つの蛍光パートナーの間の距離に依存しており、Ｅ＝Ｒ０６／（Ｒ０６＋ｒ６）によって数学的に表すことができ、式中、Ｅはエネルギー移動の効率であり、ｒは蛍光ドナー／アクセプター対の間の距離（オングストローム）であり、Ｒ０はＦｏｓｔｅｒ距離（オングストローム）である。Ｆｏｓｔｅｒ距離は、当技術分野で容易に利用可能な技法によって実験的に決定することができ、ＦＲＥＴが、所与のドナー／アクセプター対で可能な最大限のＦＲＥＴ値の半分となる距離である。
【００３３】
本発明の融合タンパク質は、少なくとも１つの蛍光タンパク質も含む。融合タンパク質は、２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの蛍光タンパク質を含むものでもよい。本発明の融合タンパク質が複数の蛍光タンパク質を含有する場合、それらの蛍光タンパク質は化学的に同一であっても、同一でなくてもよい。蛍光タンパク質は当技術分野で容易に認識される。本発明の融合タンパク質の部分である蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ）、レッドシフトＧＦＰ（ｒｓ−ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ；ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、およびｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓが含まれる）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、Ｚｓｙｅｌｌｏｗ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ならびにこれらのタンパク質の強化型および変異が含まれるが、これらに限定されない。一部の蛍光タンパク質に関して、強化は、タンパク質の明るさを増強すること、またはより迅速な発色団成熟過程を有するタンパク質を生成することによる、発光の最適化を示す。これらの強化は、遺伝子操作によって変異を蛍光タンパク質に導入することによって実現することができる。
【００３４】
蛍光タンパク質を変異することによって、それが標識部分によって標識されるのを阻止することができる。実際、ＤｓＲｅｄ２蛍光タンパク質またはＰＢＰの中の任意のシステイン残基を含めたシステイン残基に標識部分を結合させることができるが、ＤｓＲｅｄ２タンパク質中の標識部分の存在は、グルコース検出を妨害することがある。ＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）変異体の作製（すなわち位置１１９のシステインをアラニンに変異させる）は、蛍光タンパク質部分ではなく、融合タンパク質のＰＢＰ部分、例えばＧＧＢＰが標識部分と部位特異的に複合体形成するのを可能にすることによって、この潜在的な妨害を回避することができる。一実施形態では、本発明の融合タンパク質で使用される蛍光タンパク質はＲＦＰであり、詳細にはイソギンチャクモドキ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ２）である。特定の一実施形態では、本発明の方法および組成物で使用されるＤｓＲｅｄ２の蛍光タンパク質は変異体ＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）であり、ここで、「（Ｃ１１９Ａ）」は、ＤｓＲｅｄ２野生型アミノ酸配列中のアミノ酸位置１１９変異におけるシステインからアラニンへの変異を示す。ＤｓＲｅｄ２タンパク質、またはその変異は四量体として存在でき、したがって、一実施形態では、融合タンパク質は、例えばＤｓＲｅｄ２、またはその変異、例えばＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）のような４つの蛍光タンパク質を含む。本発明の標識部分と同様に、この融合タンパク質の蛍光タンパク質は、ＦＲＥＴシステムで使用される場合、ドナーまたはアクセプター分子のいずれかでありうる。したがって、本発明の方法および組成物は、ＦＲＥＴを利用した多用途のシステムを提供し、その際、蛍光エネルギー移動は、標識部分から蛍光タンパク質への方向でも、蛍光タンパク質から標識部分への方向でもよい。
【００３５】
シグナルは、蛍光の強度を検出することができる、蛍光光度計のようなエネルギー移動を検出する任意の手段を用いて検出または測定することができる。シグナルは、機器の補助によらず目視によって測定または検出してもよい。
【００３６】
本発明の一実施形態では、機能的なＧＧＢＰを固定できる装置は、一束の光ファイバーに結合したセンサーである。この実施形態で使用されるファイバーは、二叉に分岐した光ファイバーバンドルでありうる。一実施形態では、この光ファイバーは、中心ファイバーの周囲に配置された６本の外側ファイバーを含有する。この６本のファイバーは励起用の導管として使用でき、中心ファイバーは、検出用の導管として使用できる。これらの集合的光学要素は追加のファイバーおよび／またはレンズを含んでもよい。ファイバーは研磨することができ、その後、医学グレードの膠剤または任意の他の適当な接着剤、例えばロックタイト４０１１を適用して光ファイバーの一端に検出素子を接着することができる。ファイバーバンドルのもう一方の端は光ファイバー分光光度計に接続する。その後、適切な波長のＬＥＤ（例えばＬＳ−４５０）を使用することができ、蛍光分光計を検出器として使用することができる。励起光源は、限定されるものではないが、アークランプ、レーザーダイオード、またはＬＥＤからなるものでよい。検出器は、限定されるものではないが、例えば、フォトダイオード、ＣＣＤチップ、または光電子増倍管からなるものでよい。Ｏｃｅａｎ  Ｏｐｔｉｃ社製ＯＯＩＢａｓｅ  ３２などのコンピュータプログラムも、蛍光発光を追跡するのに利用してよい。
【００３７】
本発明は、融合タンパク質部分と、少なくとも１つの標識部分とを含む組成物に関する。本発明の組成物の融合タンパク質部分については、本明細書に既に記載した。
【００３８】
本発明は、本明細書に先に記述した組成物のこれらの融合タンパク質部分をコードする単離された核酸に関する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「単離された核酸分子」は、それの本来の環境から取り出されている核酸分子、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡを意味するものとして使用される。例えば、ベクター中に含有された組換え体ＤＮＡ分子は、本発明の目的では、単離されているとみなす。単離されたＤＮＡ分子の他の例には、異種宿主細胞中に保持されている組換え体ＤＮＡ分子、または溶液中の精製された（部分的または実質的に）ＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子には、本発明のＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写物が含まれる。本発明による単離された核酸分子には、合成によって生成されたそのような分子もさらに含まれる。
【００４０】
核酸分子またはポリヌクレオチドの「ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドでは、デオキシリボヌクレオチド配列を意味するものとして、そして、ＲＮＡ分子またはポリヌクレオチドでは、特定のデオキシリボヌクレオチド配列中の各チミジンデオキシリボヌクレオチド（Ｔ）がリボヌクレオチドウリジン（Ｕ）で置換されている、対応するリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）配列を意味するものとして使用される。
【００４１】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡの形態でも、あるいは、例えばクローニングまたは合成によって得られたｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含めたＤＮＡの形態でもよい。ＤＮＡは、二本鎖でも、一本鎖でもよい。一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡは、センス鎖としても知られているコーディング鎖でも、アンチセンス鎖とも呼ばれる非コーディン鎖でもよい。
【００４２】
本発明は、さらに、本明細書に記載の単離された核酸分子の断片も対象とする。本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子の「断片」は、本明細書で論じる診断プローブおよびプライマーとして有用な、長さが少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらになおより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの断片を指すのに使用される。当然ながら長さが５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４２５ｎｔのさらに長いＤＮＡ断片も、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の、全てではないが、大部分に対応する断片も本発明によれば有用である。例えば、長さが少なくとも２０ｎｔの断片は、本発明の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列からの２０個以上の連続した塩基を含む断片を意味するものと理解される。そのようなＤＮＡ断片の生成は当業者には日常的なものであろう。様々な大きさの断片を生成するには、例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断、または超音波処理による剪断を使用することが容易にできるであろう。別法として、そのような断片を合成によって生成することもできるであろう。
【００４３】
別の態様では、本発明は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、上述した本発明の核酸分子の中のポリヌクレオチドの一部にハイブリッド形成するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、当技術分野で理解されており、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５Ｘデンハート液溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、４２℃での終夜のインキュベーションと、それに続く０．１ＸＳＳＣ中、約６５℃でのフィルターの洗浄とを意味するものとして使用される。
【００４４】
ポリヌクレオチドの「部分」にハイブリッド形成するポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも約１５ｎｔ、より好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、さらになおより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリッド形成するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）を意味するものと理解される。参照ポリヌクレオチドの一部にハイブリッド形成するそのような断片は、断片として有用である。
【００４５】
当然ながら参照ポリヌクレオチドのさらに大きな部分、例えば、長さが５０〜３００ｎｔの部分、または参照ポリヌクレオチドの全長にさえハイブリッド形成するポリヌクレオチドも、参照ヌクレオチド配列の全てではないが、大部分に対応するポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドも、本発明に記載のプローブとして有用である。「長さが少なくとも２０ｎｔ」であるポリヌクレオチドの部分は、例えば、参照ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列からの２０個以上の連続したヌクレオチドを意味するものと理解される。前述の通り、そのような部分は、例えば、その全開示を参照により本明細書に援用する非特許文献４に記載されているように、従来のＤＮＡハイブリダイゼーション技法によるプローブとして、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって標的配列を増幅するためのプライマーとして診断上有用である。
【００４６】
本発明はさらに、融合タンパク質の部分、類似体、または誘導体をコードする本発明の核酸分子の変種に関する。変種は、天然のアレル変種のような、天然存在のものでよい。「アレル変種」は、生物の染色体上にある所与の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの代替形態の１つを意味するものと理解される（例えば非特許文献５を参照）。当技術分野で知られている変異誘発技法を用いて、非天然存在の変種を生成してもよい。
【００４７】
そのような変種には、ヌクレオチドの置換、欠失、または付加によって生成されたものが含まれる。この置換、欠失、または付加は、１または複数のヌクレオチドが関与するものでもよい。変種は、コーディング領域で改変されているものでも、非コーディング領域で改変されているものでも、またはこれらの両方で改変されているものでもよい。コーディング領域での改変は、保存性もしくは非保存性のアミノ酸置換、欠失、または付加を生成しうる。
【００４８】
したがって、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに少なくとも約９５％同一なヌクレオチド配列、より詳細には少なくとも約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を企図する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「同一性」は、参照ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列、通常は野生型配列と比較した、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、配列のアラインメントは、最も高いオーダーの一致が得られるように行われる。「同一性」それ自体は、当技術分野で承認されている意味を有し、公表されている技法を用いて計算することができる（例えば、非特許文献６、７、８、９、および１０を参照）。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定する方法はいくつか存在するが、「同一性」という用語は当業者に周知である（非特許文献１１）。２つの配列間の同一性または類似性を測定するのに一般的に利用される方法が非特許文献１２および１３に開示されているが、これらに限定されない。コンピュータプログラムも、同一性および類似性を計算する方法およびアルゴリズムを含有しうる。２つの配列間の同一性および類似性を測定するコンピュータプログラムの方法の例には、ＧＣＳプログラムパッケージ（非特許文献１４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献１５）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
ペリプラズム結合タンパク質、例えばＧＧＢＰをコードする参照ヌクレオチド配列に、例えば少なくとも約９５％「同一」なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドは、参照配列として使用されている野生型ＧＧＢＰをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００のヌクレオチドあたり約５つまでの点突然変異をそのポリヌクレオチド配列が含みうることを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列に同一であることを意味するものと理解される。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に少なくとも約９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの約５％までを、除去、もしくは別のヌクレオチドで置換してもよく、あるいは、参照配列中の全ヌクレオチドの約５％までの数のヌクレオチドを参照配列に挿入してもよい。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端の位置に存在しても、それらの端末の位置の間のどこに存在してもよく、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に間をおいて存在しても、参照配列中に１つまたは複数の連続的なグループで存在してもよい。
【００５１】
本発明は、本発明のＤＮＡ分子を含有するベクター、本発明のベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技法による本発明のタンパク質の産生に関する。
【００５２】
細胞（一時的に形質移入されている）の核内で遊離している核酸分子、または細胞（安定的に形質移入されている）の染色体内に取り込まれる核酸分子を組み込んで、本発明のタンパク質を発現するように宿主細胞を遺伝子操作することができる。これらのポリヌクレオチドは、単独で導入しても、他のポリヌクレオチドと共に導入してもよい。そのような他のポリヌクレオチドは、独立して導入しても、同時導入しても、本発明のポリヌクレオチドに連結して導入してもよい。
【００５３】
本発明のこの態様によれば、ベクターは、例えば、プラスミドベクターでも、一本鎖もしくは二本鎖のファージベクターでも、または一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡウイルスベクターでもよい。そのようなベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するための周知の技法によって、ポリヌクレオチドとして、好ましくはＤＮＡとして細胞に導入しうる。ウイルスベクターは、複製可能型でも、複製欠損型でもよい。後者の場合、ウイルスの増殖は、通常、相補的な宿主細胞でのみ起こるであろう。
【００５４】
ベクターの中で、ある特定の観点で好ましいのは、本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質を発現するためのベクターである。通常、そのようなベクターは、発現されるポリヌクレオチドに作用可能に連結した、宿主内での発現に効果的なシス作用制御領域を含む。適当なトランス作用因子は、宿主によって供給されるか、相補的なベクターによって供給されるか、または宿主への導入の際にベクター自体によって供給される。
【００５５】
極めて多様な発現ベクターが本発明のタンパク質を発現するのに使用できる。そのようなベクターには、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、酵母エピソーム由来、酵母染色体エレメント由来、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鳥禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにコスミドおよびファージミドのようなプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなど、これらの組合せに由来するベクターが含まれる。これらはすべて、本発明のこの態様に従って発現に用いうる。一般に、宿主でポリヌクレオチドまたはタンパク質を維持、増殖、または発現するのに適したいかなるベクターも、この関連で発現に用いうる。
【００５６】
発現ベクターのＤＮＡ配列は、例えば、ｍＲＮＡ転写を指示するプロモーターを含めた適当な発現調節配列に作用可能に連結される。そのようなプロモーターの代表には、周知のプロモーターのいくつかを挙げるのみでも、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＨＩＶプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。一般に、発現コンストラクトは、転写の開始および終止のための部位と、転写領域内における、翻訳のためのリボソーム結合部位とを含有するであろう。コンストラクトによって発現された成熟した転写産物のコーディング部分は、翻訳されるポリペプチドの最初にある翻訳開始ＡＵＧと、終わりに適切に配置された終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）とを含む。
【００５７】
加えて、コンストラクトは、発現を引き起こす領域だけでなく、発現を調節する制御領域を含有してもよい。通常、そのような領域は、とりわけ、リプレッサー結合部位およびエンハンサーのように、転写を制御することによって作用するであろう。
【００５８】
増殖用および発現用のベクターは、通常、選択マーカーを含むであろう。そのようなマーカーも増幅に適したものでよく、あるいは、ベクターはこの目的で追加のマーカーを含有してもよい。この点では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型形質を提供する１つまたは複数の選択マーカー遺伝子を含有していることが好ましい。好ましいマーカーには、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性遺伝子、ならびに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の細菌を培養するためのテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
【００５９】
適当なＤＮＡ配列と、適当なプロモーターおよび他の適当な調節配列とを含有するベクターは、その宿主における、所望のポリペプチドの発現に適した様々な周知の技法を用いて適当な宿主に導入することができる。適当な宿主の代表例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２およびヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が含まれる。発現コンストラクトのための極めて多様な宿主が詳細に知られており、本発明のタンパク質の１つを発現させるための適当な宿主の選択は、この開示によって当業者には可能となろう。
【００６０】
細菌で使用するためのベクターの例には、Ｑｉａｇｅｎ社（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）から入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨＳＡ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、およびｐＮＨ４６Ａ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５；ならびにＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）から入手可能なｐＥＧＦＰ−Ｃ１、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｃ１、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｅｘｐｒｅｓｓ−Ｃ１、ｐＡｃＧＦＰ１、ｐＡｃＧＦＰ−Ｃ１、およびｐＺｓＹｅｌｌｏｗ−Ｃ１が含まれるが、これらに限定されない。真核細胞ベクターの例には、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から入手可能なｐＷ−ＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ；ならびにＣｌｏｎｅｔｅｃｈ社から入手可能なｐＣＭＶＤｓＲｅｄ２−ｅｘｐｒｅｓｓ、ｐＩＲＥＳ２−ＤｓＲｅｄ２、ｐＤｓＲｅｄ２−Ｍｉｔｏ、およびｐＣＭＶ−ＥＧＦＰが含まれるが、これらに限定される。他の多数の市販および周知のベクターが当業者に利用可能である。宿主細胞内での発現に適したベクターおよびプロモーターの選択は、周知の手順であり、発現ベクターの構築、宿主へのベクターの導入、および宿主での発現に必要な技術は、当技術分野における日常的な技術である。
【００６１】
本発明は、上記のコンストラクトを含有する宿主細胞にも関する。宿主細胞は、哺乳類細胞などの高等真核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞である場合もあれば、あるいは宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞である場合もある。宿主細胞は、上記のコンストラクトによって安定的または一時的に形質移入することができる。
【００６２】
宿主細胞内へのコンストラクトの導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、陽イオン性脂質媒介形質移入、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法で行うことができる。そのような方法は、非特許文献１６のような多くの標準的な実験マニュアルに記載されている。
【００６３】
本発明のタンパク質は、修飾された形態で発現させてもよく、これには、付加融合だけではなく、分泌シグナルおよび他の異種機能領域も含まれることがある。したがって、例えば、精製中、またはその後の取り扱いおよび貯蔵中における、宿主細胞内での安定性および持続性を改善するために、追加のアミノ酸の領域、詳細には荷電されたアミノ酸の領域をタンパク質のＮ末端に付加してもよい。また、精製を容易にするために、１つの領域をタンパク質に付加してもよい。そのような領域は、タンパク質の最終調製の前に除去してもよい。とりわけ、分泌または排出を引き起こすため、安定性を改善するため、および精製を容易にするための、タンパク質へのペプチド部分の付加は、当技術分野でよく知られた日常的な技法である。好ましい融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するのに有用な、免疫グロブリン由来の異種領域を含む。例えば、特許文献５、およびその対応カナダ特許（特許文献６）には、別のヒトタンパク質またはその部分と共に、免疫グロブリン分子の定常領域の様々な部分を含む融合タンパク質が開示されている。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は、治療および診断での使用に完全に有利であり、それによって、例えば、薬物動態特性の改善をもたらす（特許文献７）。他方で、一部の用途では、記述した有利な方法によって融合タンパク質を発現、検出、および精製した後に、Ｆｃ部分を除去できることが望ましいであろう。
【００６４】
本発明の融合タンパク質は、限定されるものではないが、硫酸アンモニウム、エタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含めた周知の方法によって組換え体細胞培養から回収および精製できる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）も精製に用いてよい。単離および／または精製中に融合タンパク質が変性される場合には、活性立体配座を再生するために、タンパク質をリフォールディングするための周知の技法を利用してもよい。
【００６５】
本発明の融合タンパク質には、化学合成操作の産物、ならびに例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物の細胞を含めた原核または真核の宿主から組換え技術によって産生された産物が含まれるが、これらに限定されない。組換え体産生の手順に利用された宿主に応じて、本発明の融合タンパク質は、グリコシル化されている場合も、グリコシル化されていない場合もある。加えて、本発明の融合タンパク質は、場合によっては宿主媒介の過程の結果として、修飾された開始メチオニン残基を含む場合もある。
【００６６】
本発明の融合タンパク質は、本発明に従って、様々な適用、詳細には分析物を検出またはモニターするのに有用な適用に用いることができる。その他の適用は、診断、ならびに細胞、組織、および生物の障害の治療に関するものである。
【００６７】
本発明は、タンパク質を生成する方法にも関し、この方法は、前記タンパク質が発現される条件下で、本発明の宿主細胞を培養するステップと、前記タンパク質を回収するステップとを含む。本発明のタンパク質を発現するのに必要な培養条件は、本発明のポリヌクレオチドを保持する宿主細胞に依存している。それぞれの細胞型のための培養条件は、当技術分野で周知であり、必要に応じて、容易に最適化することができる。
【００６８】
本発明は、試料中の分析物をモニターするのに有用なキットにも関する。本発明のキットは、少なくとも１つの本発明の組成物（標識部分を有する融合タンパク質）を含む。このキットは、使用者を補助する説明書または書類も含んでよい。
【実施例１】
【００６９】
変異体ＧＧＢＰおよび融合コンストラクトの調製
プラスミドｐＴＺ１８Ｒは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＪＭ１０９由来のＭｇＬＢ遺伝子を含有する。ＧＧＢＰ遺伝子は、ｐＴＺ１８Ｒから増幅した。ＧＧＢＰ遺伝子をｐＱＥ７０プラスミド中に連結し、ヒスチジンタグ付きのタンパク質を生成させた。このタンパク質は、Ｃ末端における６個のヒスチジンの前の、アミノ酸位置３０９におけるリシンからアルギニンへの変化、およびアミノ酸位置３１０におけるセリンの付加を除けば、配列は野生型である。（ｐＤｓＲｅｄ２）からＤｓＲｅｄ２遺伝子を増幅して、ＧＧＢＰ遺伝子のＮ末端に連結した。蛍光タンパク質と、ヒスチジンタグ付きのＧＧＢＰとの間で、コンストラクトに短い３アラニンリンカーを挿入（engineer）した。標準的方法によってこのコンストラクト中でＧＧＢＰおよび／または蛍光タンパク質の変異を生成させた。例えば、グルコースの主要接触部位またはその近傍のコドンを置換するプライマーを用いてＰＣＲを行った。これは、融合体をフルオロフォアで標識する際に、その標識がＧＧＢＰのみに部位特異的に複合体形成されるように、融合体のＤｓＲｅｄ２部分からシステイン残基を除去する。すべてのタンパク質をヒスチジン融合体とし、配列をシーケンシングによって確認した。ｄｓＲｅｄ２／ＧＧＢＰ融合タンパク質四量体の描写を図２に示す。これは、２つの個別のタンパク質の結晶構造から得られた座標（それぞれ、ＰＤＢ  ＩＤ：１ＧＧＸおよび２ＧＢＰ）を用いて作成した。
【実施例２】
【００７０】
変異体ＧＧＢＰおよびＤｓＲｅｄ２を含む融合タンパク質の精製
ＧＧＢＰは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｓｇ１３００９から発現させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で７２時間誘導した後、細菌を溶解させた。溶菌液を遠心によって透明にし、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社のＴａｌｏｎ（コバルトベース）樹脂を用いた固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によってＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）ＧＧＢＰ（Ｅ１４９Ｃ、Ｌ２３８Ｃ）融合タンパク質を精製した。１００ｋＤａカットオフフィルターを用いて融合タンパク質を濃縮した。その後、このタンパク質を、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、および５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ８）を含有する溶液中、４℃で透析し、２０℃で保存した。
【実施例３】
【００７１】
融合タンパク質の標識
チオール反応性色素へのフルオロフォアのカップリングは、システイン残基での共有結合を介して、色素を部位特異的に結合させることによって行った。最初に融合体をジチオトレイトールで処理し、その後、ジメチルスルホキシド中に新たに調製された１０倍モル過剰量のフルオロフォア（この場合アクリロダン）を添加した。混合物を４時間インキュベートし、サイズ排除カラムクロマトグラフィーおよび／または透析によっていかなる未反応の色素も除去した。タンパク質への色素のカップリングの効率は、吸光度によって測定した。
【実施例４】
【００７２】
本発明の様々な組成物の蛍光強度およびグルコース親和性の測定
グルコースに対する融合タンパク質の親和性を測定するため、および蛍光反応の強度を評価するために蛍光アッセイを用いた。グルコース親和性を測定するために、グルコースの量を増大させながら、アクリロダン標識された融合タンパク質をグルコースとインキュベートした。ＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）ＧＧＢＰ（Ｅ１４９Ｃ、Ｌ２３８Ｃ）−アクリロダンのグルコース親和性を測定するため、グルコース存在下または非存在下に０．５μＭの標識された融合タンパク質を食塩水に入れた。試料は、三つ組でアッセイされ、０、０．１、１．０、２．５、５．０、１０．０、２０．０、３０．０、または１００．０ｍＭのグルコースを含有していた。蛍光分光光度計を用いて、試料を３９０ｎｍで励起させ、約４３０ｎｍから約７００ｎｍまでの発光をスキャンした。アクリロダンおよびＤｓＲｅｄ２の発光は、それぞれ５２０ｎｍおよび５８３ｎｍで測定した。蛍光共鳴エネルギー移動を確認するために、融合タンパク質の非色素標識陰性対照を試験した（図３）。分析物（この例ではグルコース）に対する融合体の親和性を測定するために、方程式：
ｆ＝Ｆ∞＋Ｆ０ｔ／（１＋（ｘ／Ｋｄ））
にしたがって、ＤｓＲｅｄ２の発光をグラフにした（図４）。式中、Ｋｄは、最大半減応答におけるグルコース濃度と等しい。ＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）ＧＧＢＰ（Ｅ１４９Ｃ、Ｌ２３８Ｃ）−アクリロダンのグルコース親和性が約１ｍＭであることを実証した。
【００７３】
他のＧＧＢＰ部位にアミノ酸置換を有する他のＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）−ＧＧＢＰ融合体を構築し、次いで精製し、上記の実施例と同様の方法によってアクリロダン標識した。飽和濃度のグルコースに対するアクリロダン標識されたタンパク質の滴定によって以下のデータが得られた。比率測定でのタンパク質の効率を、式：
ＱＲ＝[[（Ｉａｃ／ＩＲ）−（Ｉｏａｃ／ＩｏＲ）］／（Ｉｏａｃ／ＩｏＲ）］＊１００
にしたがって測定した。この式において、ＱＲ＝比率測定係数（％）；Ｉａｃ＝アクリロダン蛍光発光強度（＋グルコース）；ＩＲ＝ＤｓＲｅｄ２蛍光発光強度（＋グルコース）；Ｉｏａｃ＝アクリロダン蛍光発光強度（グルコース無し）；ＩｏＲ＝ＤｓＲｅｄ２蛍光発光強度（グルコース無し）である。ＱＲの生データおよび計算を表ＩＩに示す。概して、ＱＲの絶対値が高い程、リガンド結合（これらの特定の例ではリガンドはグルコースである）に伴う、比率測定での変化が大きい。
【００７４】
【表２】
2007513331.tif 000006
【００７５】
アクリロダンの発光は通常４９５ｎｍで測定し、ＤｓＲｅｄの発光は５８２ｎｍで測定した。アクリロダン非存在下における３９０ｎｍ励起でのＤｓＲｅｄ２の蛍光（通常、ＩｏＲ値の１０〜１５％のみ）に関するデータの補正は行わなかった。３番目の例であるＥ１４９Ｃ／Ｌ２３８Ｃ変異体を除いたすべてのタンパク質が、ＧＧＢＰ１分子あたり約１つの色素によって標識され、Ｅ１４９Ｃ／Ｌ２３８Ｃ変異体はＧＧＢＰ１分子あたり約２つの色素で標識されていた。
【実施例５】
【００７６】
本発明の方法および組成物を用いた、試料中のグルコース濃度の測定
試料中の未知量のグルコースを測定するために、融合タンパク質を試料に添加し、励起波長（アクリロダン用には３９０ｎｍ）で励起させ、その後、蛍光発光を記録した。分析物を定量化するために、試料の蛍光を、グルコース標準溶液からの既知の蛍光反応と比較した。試料中の未知グルコース濃度は、標準曲線を記述するのに作成した式から決定した。さらに、蛍光分析の前に、このＰＢＰを試料中または細胞内に発現することができた。
【００７７】
ＤｓＲｅｄ２（Ｃｌ１９Ａ）−ＧＧＢＰ（Ｌ２３８Ｃ）−アクリロダンでは、０〜８μＭのグルコース溶液に関して標準曲線を作成した。未知濃度を決定するのに、最も単純な計算は線形回帰方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）を用いる。絶対蛍光データ（図４）と、アクリロダン発光およびＤｓＲｅｄ２発光の比率からのデータ（表ＩＩＩおよび図５）との両方の結合曲線の線形部分に関して線形回帰法を行った。未知グルコース濃度を決定するために、ＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）−ＧＧＢＰ（Ｌ２３８Ｃ）−アクリロダンを試料に添加し、蛍光を測定した。表ＩＶは、試料のグルコース定量の結果を示す。
【００７８】
【表３】
2007513331.tif 000007
【００７９】
【表４】
2007513331.tif 000008
【実施例６】
【００８０】
融合タンパク質の可逆性および分析物の連続的モニタリングの例
試料環境における分析物濃度の経時変動中に試料を連続的にモニターする能力は、ＰＢＰに特有の特性である。ＰＢＰによる連続的なモニタリングは、これらの受容体の可逆的なリガンド結合能力によって可能となる。グルコースを単一試料中でどのように連続的にモニターできるかを実証するため、グルコースを含まない溶液中にＤｓＲｅｄ２（Ｃ１１９Ａ）−ＧＧＢＰ（Ｌ２３８Ｃ）を入れ、蛍光比を測定した。その後、グルコースを６４μＭの濃度にまで添加し、蛍光の測定値を記録した。その後、試料を透析チャンバーに入れ、グルコースを除去するために透析した。透析の後に、試料の蛍光発光を再度、試験した。これは、発光比が、グルコース非存在下で最初に得た測定値に近い値にまで回復したことを実証した。最後に、グルコース濃度を７１μＭにまで上昇させたところ発光比も増大し、グルコースが存在することを示した（表Ｖ）。
【００８１】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】ＤｓＲｅｄ２とＧＧＢＰとの融合タンパク質コンストラクトの描写、およびグルコースに結合したＧＧＢＰが行う立体配座変化の描写を示す図である。
【図２】ＤｓＲｅｄ２／ＧＧＢＰ四量体を示す図である。
【図３】標識部分をもたない融合タンパク質、標識部分を有する融合タンパク質、およびグルコースに結合した標識部分を有する融合タンパク質の蛍光発光スペクトルを示す図である。
【図４】ＤｓＲｅｄ２（Ｃｌ１９Ａ）ＧＧＢＰ（Ｌ２３８Ｃ）−アクリロダン、およびＤｓＲｅｄ２（Ｃｌ１９Ａ）ＧＧＢＰ（Ｅ１４９Ｃ、Ｌ２３８Ｃ）−アクリロダンと、リガンドグルコースとの結合曲線を示す図である。各融合タンパク質について、それぞれ１ｍＭおよび５．７μＭのグルコース親和性が実証された。
【図５】グルコースに対するＤｓＲｅｄ２（Ｃｌ１９Ａ）ＧＧＢＰ（Ｌ２３８Ｃ）−アクリロダンの結合曲線を示す図である。この結合曲線は、ＤｓＲｅｄ２発光に対するアクリロダン発光の比率をグラフにしたものである。この融合タンパク質について、４μＭのグルコース親和性が実証された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2007513331.tif 000016
2007513331.tif 000017