(57)【要約】【課題】特定のＤＭ患者が心血管系疾患の発症リスクが低いか、特定のサブグループの患者に予防的抗酸化療法が有効であるかを予測する方法を提供する。【解決手段】糖尿病患者の血管合併症の治療に抗酸化療法が有効である可能性を測定する方法で、糖尿病患者のハプトグロビン表現型を測定する方法と、それによって糖尿病患者に抗酸化療法が有効である得る可能性を測定する方法が含まれている。ハプトグロビン表現型２−２型を有する患者は、ハプトグロビン表現型１−２型又はハプトグロビン表現型１−１型の患者よりも、抗酸化療法が有効である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病患者の血管合併症の治療に、抗酸化療法が有効である可能性を判定する方法であって、
前記糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定し、
それによって前記抗酸化療法が有効か、前記糖尿病患者の前記可能性を判定する前記方法を含み、
ハプトグロビン表現型２−２型を有する患者は、ハプトグロビン表現型１−２型又はハプトグロビン表現型１−１型を有する患者と比較して、前記抗酸化療法がより有効であることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記血管合併症が、微小血管合併症及び大血管合併症からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記血管合併症が、慢性心不全、心血管系死亡、脳卒中、心筋梗塞及び再狭窄による冠動脈形成術からなるグループから選択される大血管合併症であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記微小血管合併症が、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシー及び糖尿病性神経障害からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記大血管合併症が、冠動脈の側副血管が少ないこと及び心筋虚血からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記ハプトグロビン表現型の前記判定が、前記糖尿病患者のハプトグロビン遺伝子型を判定することによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記糖尿病患者の前記ハプトグロビン遺伝子型を判定する前記手段が、信号増幅法、直接観測法及び少なくとも１つの配列変化の検出法からなるグループから選択される方法によって実行されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記信号増幅法が、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子からなるグループから選択される分子を増幅することを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記信号増幅法が、ＰＣＲ、ＬＣＲ（ＬＡＲ）、自律合成反応（３ＳＲ／ＮＡＳＢＡ）及びＱ−ベータ（Ｑβ）レプリカーゼ反応からなるグループから選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記直接観測法が、サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）及び分岐ＤＮＡ解析からなるグループから選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの配列変化の検出法が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ解析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）解析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析及びジデオキシフィンガープリント法（ｄｄＦ）からなるグループから選択される方法を用いることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ハプトグロビン表現型の前記判定が、前記糖尿病患者の前記ハプトグロビン表現型を直接判定することによって行われることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ハプトグロビン表現型を判定する手段が、免疫学的検出法によって実行されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫学的検出法が、ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
糖尿病性の血管合併症を予防するために、糖尿病患者の酸化的ストレスを減少する重要性を判定する方法であって、
前記糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定する手段と、
それによって特定の前記糖尿病患者の前記酸化的ストレスを減少する前記重要性を判定する方法とを含み、
ハプトグロビン表現型２−２型を有する患者は、ハプトグロビン表現型１−２型又はハプトグロビン表現型１−１型を有する患者と比較して、前記酸化的ストレスを減少する前記重要性がより大きいことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記血管合併症が、微小血管合併症及び大血管合併症からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記血管合併症が、慢性心不全、心血管系死亡、脳卒中、心筋梗塞及び再狭窄による冠動脈血管形成術からなるグループから選択される大血管合併症であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微小血管合併症が、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシー及び糖尿病性神経障害からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記大血管合併症が、冠動脈の側副血管が少ないこと及び心筋虚血からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ハプトグロビン表現型を判定する前記手段が、糖尿病患者のハプトグロビン遺伝子型を判定することによって行われることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記糖尿病患者の前記ハプトグロビン遺伝子型を判定する前記手段が、信号増幅法、直接観測法及び少なくとも１つの配列変化の検出法からなるグループから選択される方法によって実行されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記信号増幅法が、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子からなるグループから選択される分子を増幅することを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記信号増幅法が、ＰＣＲ、ＬＣＲ（ＬＡＲ）、自律合成反応（３ＳＲ／ＮＡＳＢＡ）及びＱ−ベータ（Ｑβ）レプリカーゼ反応からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記直接観測法が、サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）及び分岐ＤＮＡ解析からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの配列変化の検出法が、制限断片長多型（ＲＦＬＰ解析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）解析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析及びジデオキシ指紋法（ｄｄＦ）からなるグループから選択される方法を用いることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記ハプトグロビン表現型を判定する前記手段が、前記糖尿病患者の前記ハプトグロビン表現型を直接測定することによって行われることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハプトグロビン表現型を判定する前記手段が、免疫学的検出法によって実行されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記免疫学的検出法が、ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学解析、及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
糖尿病患者の血管合併症の治療に、抗酸化療法が有効である可能性を評価するためのキットであって、
前記キットが、前記糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定するためのパッケージ化された試薬を含み、
前記キットのラベル又は説明書には、キットは糖尿病患者の血管合併症の治療に、抗酸化療法が有効である可能性を評価するために使用する旨を表示してあることを特徴とするキットである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は糖尿病患者の心血管系疾患の予防のため、抗酸化物質を補給した場合の予測効果を判定する方法に関し、ハプトグロビン２型の対立遺伝子の多型に基づいている。
【背景技術】
【０００２】
心血管系疾患（ＣＶＤ）は、２型糖尿病の合併症で最も頻繁に発生し、症状は重く、費用がかかる１。それは糖尿病を患った期間に関係なく、２型糖尿病患者の主要死亡原因である２。いくつかの集団ベースの試験は、これと矛盾しない結果を示しており、糖尿病患者がＣＶＤに罹る相対リスクは非糖尿病の人に比較して数倍高い３−７。この増加リスクは女性に更に当てはまる４、５、８。高血圧症、高脂血症及び喫煙のようなリスク要因は、それぞれ糖尿病患者においてＣＶＤが進展する相対リスクを互いに独立した要因として増加させるが、糖尿病による影響は従来のリスク要因とはやはり独立して存在する９。
【０００３】
試験が行われた全集団において、糖尿病患者のＣＶＤ発生率は非糖尿病の人と比較して高く、また糖尿病患者のＣＶＤの相対リスクには、地域及び民族間で明らかな違いがあるが、これらグループ間の従来の心臓病のリスク要因における相違によって説明が完全に行われているわけではない１０−２０。例えば、英国に住む異なる民族グループにおけるＣＶＤの相対リスクの分析では、南アジア生まれの患者は明らかに高いリスクを有しており１２、１５、一方でアフリカ系カリブ人の糖尿病患者は、ヨーロッパ生まれの糖尿病患者と比較して、ＣＶＤのリスクは明らかに低い１４、１６。
【０００４】
これらの試験は、遺伝子の違いが糖尿病患者のＣＶＤの罹りやすさの違いの原因であり得ることを示唆している。
【０００５】
本発明を考えるにあたって、その１つの可能性はハプトグロビン遺伝子の機能的な対立遺伝子の多型にあるという仮説が立てられた。
【０００６】
ハプトグロビン（Ｈｐ）は、ヘモグロビンと結合する血清蛋白質であり、ヘム主導の酸化的ストレスに対する防御に重要な役割を果たす２３、２４。Ｈｐ遺伝子が欠乏している鼠は酸化的ストレスが劇的に増加し、酸化組織は特に腎臓にダメージを与えることを明らかにしている。人間にはＨｐ（１型及び２型）という２つの一般的な対立遺伝子があり、主に３つの表現型、１−１型、２−１型及び２−２型で表す２１−２３。
【０００７】
その３つの表現型のヘモグロビン結合能力の機能的な相違は実証されている。Ｈｐ１−１表現型を有する患者のＨｐは、ハプトグロビン２型の対立遺伝子の生成物を含むＨｐよりも、１グラム当たり、より多くのヘモグロビンを結合することができる２３。ハプトグロビン表現型１−１型を有する患者のハプトグロビン分子もまた、更に抗酸化に優れている。なぜなら、ハプトグロビン１−１型のサイズはハプトグロビン２型の対立遺伝子の生成物と比較して小さいので、血管外の部位の酸化組織障害への進入を容易にするからである。これはハプトグロビン１−１型を有する患者は、ハプトグロビンの著しく大きな糸球体を濾過することも含んでいる２２。
【０００８】
ハプトグロビン２型の対立遺伝子は、約２０００万年前の部分的な遺伝子重複を経て１型の対立遺伝子から発生し、感染因子に対する抵抗力に関連した選択圧によって全世界の住民に広まった２４、２５。現在ハプトグロビンの対立遺伝子は、異なる民族グループ間で相対度数が劇的に異なっている２６。遺伝子重複は、２つの対立遺伝子それぞれでエンコードされたハプトグロビン蛋白質の、生物物理的性質及び生化学的性質に劇的な変化を引き起こした。例えば１型の対立遺伝子の蛋白質生成物は、２型の対立遺伝子によって生成されたものと比較して、抗酸化に優れた物質である２３。ハプトグロビン表現型の様々な個体、１−１型、２−１型又は２−２型は、１０マイクロリットルの血漿からゲル電気泳動によって容易に判定される。
【０００９】
ハプトグロビン表現型は、糖尿病患者における多数の微小血管合併症の進展を予測できることが明らかにされた２７−２９。特にハプトグロビン１型の対立遺伝子がホモ接合体である患者は、網膜症及び腎症が進展するリスクが減少することが分かった。少なくとも腎症について、１型及び２型糖尿病患者の両方でこの結果が観察され、その妥当性はハプトグロビン２型の対立遺伝子の数と腎症の進展に関する勾配効果の研究結果によって強まった２９。更にハプトグロビン表現型は、糖尿病患者の大血管合併症の進展を予測し得ることが分かった。我々は経皮的冠動脈血管形成術後の再狭窄の進展が、ハプトグロビン表現型１−１型を有する糖尿病患者では著しく減少することを明らかにした２７、３０。以前の後向き且つ横断的な試験では、母集団におけるハプトグロビン表現型及び冠動脈疾患について調査し、矛盾する結果を生じた３１−３８。糖尿病患者のアテローム動脈硬化性冠動脈疾患の進展に対するハプトグロビン表現型の役割が調査されていなかった。
【００１０】
アメリカンインディアンは、以前は冠動脈疾患の進展に対して抵抗力があると思われていたが、現在はＣＶＤの発生が多発している２０。このＣＶＤの発生率の増加は、この民族で２型糖尿病が急激に増加しているためである１、２。ストロング・ハート・スタディ（Ｓｔｒｏｎｇ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙ）は、１９８８年から現在まで、３つの対象地域におけるアメリカンインディアンの心血管系疾患の発生率、罹患率及びリスク要因について継続して調査を行ってきた２０。この民族の患者の相対的な遺伝的等質性は、糖尿病患者のＣＶＤ疾患の原因となる特定の遺伝子要因の同定を可能にし得る。
【００１１】
従って、米国特許第６，６１３，５１９号のストロング・ハート・スタディからの症例／対照サンプルで、初めてハプトグロビン表現型による糖尿病患者のＣＶＤの相対リスクを判定するための相関関係が作られた。
【００１２】
いくつかの従来技術は、ハプトグロビン表現型と疾患とを関連付ける方法を示している。ＷＯ９８／３７４１９は、ハプトグロビン表現型を判定する方法及びキットを示しており、特に人ハプトグロビンについての発明に関連している。この発明は独立したリスク要因としてハプトグロビン表現型２−２型の使用に焦点を当てており、特に難治性の本態性高血圧症における標的臓器障害の関係、（母集団における）アテローム性動脈硬化と急性心筋梗塞の関係及びＨＩＶ感染による死亡の関係に焦点を当てている。この発明は、ＤＭの心血管系疾患のリスク要因としてのハプトグロビン表現型の使用を示していない。ハプトグロビン表現型２−２型は、患者が酸化的ストレスを受けやすい傾向があるため、ＤＭの心血管系疾患について、表現型２−２型をネガティブな予測の判断材料に使用することが、この発明で間接的に示されていると議論され得る。しかしながら、この発明はハプトグロビン表現型１−１型が、ＤＭが心血管系疾患になる傾向の減少又は抗酸化物質の補給の効果について、ポジティブな予測の判断材料であるというアイデアを含んでいない。実際、最近の研究で、ＰＣＴ  ＷＯ９８／３７４１９の出願人は反対の結果を報告し、Ｈｐ１−１患者は心血管系疾患による死亡に対して高リスクであると結論付けている（De Bacquer et al, Atherosclerosis 2001; 157: 161-6）。ハプトグロビン表現型と疾患との有益な相関関係を導き出すことは、慎重且つ創造的な分析を必要とする。なぜなら多くの研究が何の結果も出せないか又は混乱するような結果を報告しているからである（Buhlin et al Eur Heart J 2003; 24: 2099-107、Lind et al Angiology 2003; 54: 401-10、Hong et al Hum Hered 1997; 47: 283-7）。
【００１３】
つまり、母集団の中のＨｐ表現型２−１型又は２−２型に生じる酸化的ストレスは、血管合併症に導くとされてきた。いくつかの血管合併症は、ＤＭに伴う酸化的ストレスに関係があることも知られている。しかしながら、現時点でＨｐ表現型１−１型が、糖尿病患者の血管合併症予防のための抗酸化薬補給に対する反応に影響を及ぼせるか明らかになっておらず、予測されてもいない。
【００１４】
ＰＣＴ  ＷＯ９８／３７４１９は、ハプトグロビンと結合するパートナーの使用を含んでいる。ＰＣＴ  ＷＯ９８／３７４１９によれば、結合するパートナーは少なくとも２ヶ所でハプトグロビンと結合する様々な分子であって良い。その位置はペプチド、抗体又はその一部で形成されて良く、又レクチン、細胞受容体、分子インプリント又は細菌性抗原又はその一部で形成されて良い。この発明は化膿連鎖球菌のＴ４抗原の使用に特に焦点を当てている。全てのハプトグロビンは、α鎖及びβ鎖の両方を含んでいる。β鎖は全てのハプトグロビンで同一であるが、α鎖はハプトグロビン遺伝子の２つの対立遺伝子間で異なっている。ハプトグロビンのα２鎖は、不等交差に基づく変異の結果であり、１４２アミノ酸を含み、α１鎖の８３アミノ酸と対照をなしている。α２鎖のアミノ酸残留物のユニーク配列（Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を除いては、α１鎖及びα２鎖は免疫学的に類似している。従って、このユニークなペプチド配列の様々な部分は、α１鎖及びα２鎖を含むハプトグロビンを識別するための抗体を増加するのに好適なエピトープであると、「Using Antibodies: A Laboratory Manual」（Ed Harlow and David Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)）に述べられており、これをあらゆる面においてここに言及したことで本願の一部とする。そのような抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又はその様々な部分であって良く、当業者にとって既知の多くの技術の内のいずれかによって濃縮又は純化されても良い。加えて、この配列をエンコードしたヌクレオチド配列は、Ｈｐ遺伝子型を識別するのに容易に用いることができる。
【００１５】
抗酸化物質、ハプトグロビン及び糖尿病患者の心血管系疾患（ＣＶＤ）の予防：成人糖尿病患者（ＤＭ）の冠動脈疾患の総罹患率は５５％を超えているが、これに対して母集団は２．４％である。ＣＶＤによる死亡率をＤＭと非糖尿病の人で比較した場合、ＤＭの方が男性では２倍、女性では４倍高い（Stamler, et al. Diabetes Care 1993; 16: 434-444）。酸化的ストレスの増加は、糖尿病性の血管疾患に介在することを知られているいくつかの信号変換経路の配位の活性化を説明する、魅力的な統合メカニズムを示唆する。（Nishikawa et al., Nature 2000; 404: 787-790）。高血糖及びグルコースの自己酸化の結果としてできた酸化環境は、終末糖化合物（ＡＧＥｓ）（Ohgami et al., J Diabetes Complic 2002; 16: 56-59）及び酸化低比重リポ蛋白質（ｏｘ−ＬＤＬ）（Steinberg D J Biol Chem 1997; 272: 20963-6）の生成をもたらし、糖尿病性の血管疾患で見られる病理学的及び形態学的変化に関わる多数の炎症性サイトカインの生成を刺激することができる。酸化仮説は、ビタミンＥのような抗酸化物質がアテローム性動脈硬化のプロセスを明らかに遅らせることを実証した動物実験のデータによって支持される（Williams et al Atherosclerosis 1992; 94: 153-59）。しかしながら、インビトロ及び実験室の研究での有望な結果にもかかわらず、最近のいくつかの大規模で前向きなプラセボ対照試験は、主要な心血管系疾患の副作用の発生率を減少させる効果が、ビタミンＥ単独（HOPE Study Investigators NE J Med 2000; 342: 154-160、Hodis et al, Circulation 2002; 106: 1453-59、Jiang et al, J Biol Chem 2002; 277: 31850-6）、又は他の抗酸化ビタミンとの併用（GISSI, Lancet 1999; 354: 4477-55、Brown et al NE J Med 2001; 345: 1538-92、Marchioli et al, Lipids; 2001: 36 Suppl: S53-63、Waters et al, JAMA 2002; 288: 2432-40、Witztum et al Trends Cardio Med 2001; 11: 93-102）で得られることを支持する決定的な証拠を提供することができなかった。ＨＯＰＥ試験（Ｈｅａｒｔ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：無作為化二重盲検プラセボ対照試験）は、特に糖尿病患者のＣＶＤを予防するビタミンＥ療法の効果について取り組む試験の１つであった（HOPE Study Investigators NE J Med 2000; 342: 154-160）。ＨＯＰＥ試験は、４年半に渡って４００ＩＵのビタミンＥを連日投与した心血管（ＣＶ）のアウトカムで、何の臨床的有益性も実証することができなかった。いくつかの手段が、これらの試験におけるビタミンＥの明白な機能不全を説明するために提示された。スタインバーグは、抗酸化療法の効果は、強い酸化的ストレスを経験した特定の患者のサブグループだけが証明し得ることを提示した（Steinberg et al Circulation 2002; 105: 2107-111）。
【００１６】
糖尿病患者は、血糖値がインスリン又は経口血糖降下薬によって抑制され得るとしても、時間が経てば血管合併症を発症する。糖尿病患者において進展するリスクのある多くの血管合併症には、糖尿病性網膜症、糖尿病性白内障及び緑内障、糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性神経障害、間欠性跛行及び壊疽、高脂血症及び高血圧症のような心血管障害、アテローム性動脈硬化及び冠動脈疾患が含まれる。アテローム性動脈硬化は、狭心症発作及び心臓発作の原因になることがあり、糖尿病患者は非糖尿病の人よりも発作が２倍起こりやすく、発生に男女差はない。
【００１７】
増加する多数の証拠が、それらの糖尿病性の血管疾患は遺伝的に感受性の強い患者だけに進展していることを示している（UK Prospective Study Group Diab Care 1998; 21: 1271-77）。ハプトグロビン遺伝子は２つの主要な分類を有する多型であり、１型及び２型と表示される。ハプトグロビン遺伝子のこの多型は、糖尿病患者個人のＣＶＤに対する独立したリスク要因であることが最近実証された（２００３年９月２日付公表のレヴィー他による米国特許第６，６１３，５１９号、本明細書後述の実施例Ｉ及び「Levy et al J Am Coll Card 2002; 40: 1984-90」を参照されたい）。ハプトグロビン２型の対立遺伝子がホモ接合体である糖尿病患者は、ハプトグロビン１型の対立遺伝子がホモ接合体である患者と比較して、ＣＶＤのリスクが５倍大きいことが分かった。同出願人は、ハプトグロビン２型の対立遺伝子の蛋白質生成物は、ハプトグロビン１型の対立遺伝子の蛋白質生成物と比較して、抗酸化能力が劣ることも実証した（Melamed-Frank et al Blood 2001; 98: 3693-98）。しかしながら、上述の研究は抗酸化物質の補給と糖尿病患者のＣＶＤとの相関関係、抗酸化物質の補給とハプトグロビン表現型との相関関係、即ち抗酸化療法から得られる効果の予測に関するそのような相関関係の有用性を追求もしなければ、含んでもいない。従って、我々はハプトグロビン２型の対立遺伝子がホモ接合体である糖尿病患者に対する抗酸化物質の補給が、心血管系疾患の副作用を予防する効果があると仮説を立てた。この仮説をテストするために、我々はＨＯＰＥ試験からハプトグロビンの型で分類された参加者を抽出し、考えられる３つのハプトグロビンの型について、ビタミンＥ及びラミプリル治療による主要な心血管系評価項目の相対リスク比を判定した。
【００１８】
特定のＤＭ患者が心血管系疾患の発症リスクが低いか、そして特定のサブグループの患者に予防的抗酸化療法が有効であるかを予測する方法が求められていることは広く認識されており、その方法を実現することは非常に有益である。そのような方法は、医師が利用可能な資源を最大限活用することで、各患者のリスクを最小限にすることができる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明によれば、糖尿病患者の血管合併症の治療に抗酸化療法が有効であるかを判定する方法が提供される。その方法は糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定する方法と、それによって糖尿病患者に前記抗酸化療法が有効であるかを判定する方法とを含み、ハプトグロビン表現型２−２型を有する患者は、ハプトグロビン表現型１−２型又はハプトグロビン表現型１−１型を有する患者と比較して、前記抗酸化療法がより有効である。
【００２０】
本発明のまた別の実施態様によれば、糖尿病に伴う血管合併症を予防するべく糖尿病患者の酸化的ストレスを減少させる重要性を判定する方法が提供される。その方法は糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定する手段と、それによって特定の糖尿病患者の酸化的ストレスを減少させる重要性を判定することを含み、ハプトグロビン表現型２−２型を有する患者は、ハプトグロビン表現型１−２型又はハプトグロビン表現型１−１型を有する患者と比較して、酸化的ストレスを減少させる重要性が大きい。
【００２１】
後述される本発明の好ましい実施態様における更なる特徴によれば、血管合併症は微小血管合併症及び大血管合併症からなるグループから選択される。
【００２２】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、血管合併症は慢性心不全、心血管系死亡、脳卒中、心筋梗塞及び再狭窄による冠動脈血管形成術からなるグループから選択される大血管合併症である。
【００２３】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、微小血管合併症は、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシー及び糖尿病性神経障害からなるグループから選択される。
【００２４】
後述される本発明の好ましい実施態様における更なる特徴によれば、大血管合併症は、冠動脈の側副血管が少ないこと及び心筋虚血からなるグループから選択される。
【００２５】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、ハプトグロビン表現型の判定は、糖尿病患者のハプトグロビン遺伝子型の判定によって行われる。
【００２６】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、糖尿病患者のハプトグロビン遺伝子型を判定する手段は、信号増幅法、直接観測法及び少なくとも１つの配列変化の検出法からなるグループから選択される方法によって実行される。
【００２７】
後述される本発明の好ましい実施態様における更なる特徴によれば、信号増幅法は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子からなるグループから選択される分子を増幅する。
【００２８】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、信号増幅法は、ＰＣＲ、ＬＣＲ（ＬＡＲ）、自律合成反応（３ＳＲ／ＮＡＳＢＡ）及びＱ−ベータ（Ｑβ）レプリカーゼ反応からなるグループから選択される。
【００２９】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、直接観測法は、サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）及び分岐ＤＮＡ解析からなるグループから選択される。
【００３０】
後述される本発明の好ましい実施態様における更なる特徴によれば、少なくとも１つの配列変化の検出法は、制限断片長多型（ＲＦＬＰ解析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）解析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析及びジデオキシフィンガープリント法（ｄｄＦ）からなるグループから選択される方法を用いる。
【００３１】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、前記ハプトグロビン表現型の判定は、糖尿病患者のハプトグロビン表現型を直接判定することによって行われる。
【００３２】
後述される本発明の好ましい実施態様におけるまた更なる特徴によれば、ハプトグロビン表現型を測定する手段は、免疫学的検出法によって実行される。
【００３３】
後述される本発明の好ましい実施態様における更なる特徴によれば、免疫学的検出法は、ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）からなるグループから選択される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、高血糖患者の心血管系疾患の進展に対するリスクを評価する方法であり、適切な予防薬の投与を可能にする。特に本発明は、糖尿病患者の心血管系疾患（ＣＶＤ）の予防に抗酸化療法が有効である可能性を評価する方法である。
【００３５】
本発明の少なくとも１つの実施態様の詳細説明を行う前に、本発明は以下に記載される説明又は表示による詳細な構成要素の構造及び配置に対して、その内容が限定されるわけではないことを理解されたい。本発明は、別の実施態様又は様々な方法によって実施又は実行することが可能である。また、ここで用いられた表現及び専門用語は、説明することが目的であり、意味をこれに限定しているわけではないことを理解されたい。
【００３６】
最近公表されたいくつかの大規模な臨床試験に基づくと、抗酸化療法はＣＶＤに対して高いリスクをもった患者のＣＶアウトカムの副作用防止には勧められない（The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. N Eng J Med 2000; 342: 154-160、Hodis, et al. Circulation 2002; 106: 1453-1459、Gruppo Italiano per lo Studio della Sopravvivenza nell'Infarto Miocardico. Lancet 1999; 354: 447-455、Brown et al. N Engl J Med 2001; 345: 1583-1592）。
【００３７】
しかしながら、これらの試験は、その患者の部分集合に対する潜在的な効果を排除できなかった（Steinberg D, Witzum JL. Circulation 2002; 105: 2107-2111）。抗酸化療法の予防効果についての大規模な試験のデータ分析では、サンプル全体で抗酸化療法から何らかの効果が得られることを示せなかったが、本発明の出願人はサブグループにおいて抗酸化物質の補給による効果を確認できることを初めて実証した。特に、ＨＯＰＥ試験の糖尿病患者がＨｐ表現型２−２型を有していると、ビタミンＥの補給によってＣＶによる死亡と非致死性心筋梗塞が統計的に有意な減少を示し、ラミプリル治療によって各種の要素からなる評価項目（非致死性ＭＩ、脳卒中又は心血管系死亡）が統計的に有意な減少を示した（後述の実施例ＩＩを参照されたい）。ストロング・ハート・スタディのハプトグロビン表現型とＣＶＤの相関関係の分析は、Ｈｐ２−２型を有する患者は糖尿病性のＣＶＤに対してリスクが高いことを示している（後述の実施例Ｉ、「Levy AP et al. J Am Coll Card 2002; 40: 1984-1990」を参照されたい）。そして、Ｈｐ２−２型は抗酸化能力も劣っていることを示している（Melamed-Frank M, et al. Blood 2001; 98: 3693-3698）。１つの仮説によって限定されることを望まないが、抗酸化能力に劣るＨｐ２−２型の特性が、なぜ抗酸化物質の効果が糖尿病患者のこのサブグループで選択的に得られたのかということと、これらの発見が明らかに統計的に有意であることとを説明し得る。ハプトグロビンのそのような効果に対する更なる支持が実際に発見されており、ハプトグロビンの型の非糖尿病患者のＣＶＤ発症率に対する著しい影響は観察されておらず（後述の実施例Ｉを参照されたい）、非糖尿病患者の抗酸化療法（ビタミンＥ使用）には何の効果もなかったことが示された（後述の実施例ＩＩを参照されたい）。１つの仮説によって限定されることを望まないが、Ｈｐ２−２型の抗酸化活性低下の重要性は、酸化的ストレス（糖尿病）を生成する付加的なメカニズムが存在する場合のみ臨床的に証明されると仮定され得る。
【００３８】
従って本発明によれば、糖尿病患者の血管合併症治療に抗酸化療法が有効である可能性を判定する方法が提供される。その方法は糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定することと、それによって前記抗酸化療法が糖尿病患者に有効である可能性を判定することとを含み、ハプトグロビン表現型２−２型を有する患者の方が、ハプトグロビン表現型１−２型又はハプトグロビン表現型１−１型を有する患者と比較して、前記抗酸化療法はより有効である。
【００３９】
ＨＯＰＥ及びＧＩＳＳＩ等による試験結果は、抗酸化療法が有効であるという亜母集団を何ら示すことができなかった。ここに開示されるデータは、Ｈｐ表現型２−２型を有する糖尿病患者において、ビタミンＥの補給によってＣＶによる死亡と非致死性心筋梗塞が統計的に有意な減少を示したことと、ラミプリル治療によって各種の評価項目（非致死性ＭＩ、脳卒中又は心血管系死亡）が統計的に有意な減少を示したことを、初めて明らかした（後述の実施例ＩＩ参照）。従って、本発明は更に、糖尿病に伴う血管合併症を予防するべく糖尿病患者の酸化的ストレスを減少する重要性を判定する方法を提供する。その方法は糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定する手段と、それによって特定の糖尿病患者における酸化的ストレスを減少する重要性を判定することとを含み、ハプトグロビン表現型２−２型を有する患者の方が、ハプトグロビン表現型１−２型又はハプトグロビン表現型１−１型を有する患者と比較して、酸化的ストレスを減少する前記重要性が高い。
【００４０】
本発明は、糖尿病患者の血管合併症治療に抗酸化療法が有効である可能性を評価するキットも提供する。そのキットは、糖尿病患者のハプトグロビン表現型を判定するパッケージ化された試薬を含み、糖尿病患者の血管合併症治療に抗酸化療法が有効である可能性の評価に使用することに特定される。これらの試薬の性質は、下記の説明と更に詳しくは既知のハプトグロビン１型及び２型の対立遺伝子の特徴付けられた配列データから当業者には明らかである。
【００４１】
本発明の判定方法及びキットの有用性は、後述の実施例の表１〜６で示されるデータによって実証される。
【００４２】
従って、集団ベースの長期試験からのサンプルにおいて、ハプトグロビン表現型は、糖尿病患者の血管合併症治療に抗酸化療法が有効である可能性を予測する重要な判断材料であることがここに実証される。本発明の一実施態様において、血管合併症は微小血管合併症及び大血管合併症からなるグループから選択される。
【００４３】
糖尿病患者において進展するリスクがある血管合併症は多くあり、糖尿病性網膜症、糖尿病性白内障及び緑内障、糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性神経障害、間欠性跛行及び壊疽、高脂血症及び高血圧症のような心血管障害、アテローム性動脈硬化及び冠動脈疾患等を含んでいる。アテローム性動脈硬化は、狭心症発作及び心臓発作の原因になることがあり、糖尿病患者は非糖尿病の人よりも発作が２倍起こりやすく、発生に男女差はない。ここで用いられているように、糖尿病の微小血管合併症は、糖尿病性神経障害（神経損傷）、糖尿病性ネフロパシー（腎臓病）及び視覚障害（例えば、糖尿病性網膜症、緑内障、白内障及び角膜疾患）を含んでいる。大血管合併症は、心筋梗塞、慢性心不全、心血管系死亡及び心臓病、脳卒中及び末梢血管障害（潰瘍、壊疽及び切断をもたらし得る）のような、アテローム性動脈硬化症が進展した冠血管の状態を含んでいる。
【００４４】
更にある実施態様において、血管合併症は慢性心不全、心血管系死亡、脳卒中、心筋梗塞、再狭窄に伴う冠動脈血管形成術、冠動脈の側副血管が少ないこと及び心筋虚血からなるグループから選択される大血管合併症である。別の実施態様において、血管合併症は糖尿病性神経障害、糖尿病性ネフロパシー又は糖尿病性網膜症のような微小血管合併症である。
【００４５】
糖尿病患者の血管系疾患に対する抗酸化物質補給の潜在的効果についてのハプトグロビンの適中率は、異なった民族グループにおけるハプトグロビン１型の対立遺伝子の度数とこれらのグループにおける糖尿病性の微小血管合併症及び大血管合併症の相対発生率との相関関係によって更に支持される。
【００４６】
例えば、糖尿病のアフリカ系カリブ人は、ＣＶＤの相対リスクは低く１４、１６、微小血管合併症の相対リスクも低いが、ハプトグロビン１型の対立遺伝子の度数は高い（いくつかの集団では０．８７に達する）２６。一方で、糖尿病のオーストラリア先住民１９及び南アジア人１２、１５は、ＣＶＤ及び糖尿病性の微小血管合併症の相対リスクは高く４７、ハプトグロビン１型の対立遺伝子の度数は比較的低い（各々０．１８及び０．０９）２６。
【００４７】
ハプトグロビン表現型が、アテローム性動脈硬化によるＣＶＤの臨床経過に影響し得るという２つのメカニズムが最近確認された。１つは経皮経管冠動脈血管形成術後の再狭窄の段階的なリスクが、ハプトグロビン２型の対立遺伝子の数に関係していることが実証された２７、３０。もう１つはハプトグロビン表現型２−１型を有する糖尿病患者が、同程度の冠動脈疾患に罹っているハプトグロビン表現型２−２型を有する人と比較して、冠動脈に側副があるという傾向が著しく強いことが実証された。冠動脈の側副血行路の発達に関する個体差が、心筋梗塞の進展の重要な決定要因であることは既に実証されている４８。
【００４８】
ハプトグロビン蛋白質にはいくつかの機能があり、アテローム性動脈硬化の進展に影響し得る。６０年以上に渡って、血清ハプトグロビンの主な機能はフリーヘモグロビンと結合することだとされてきた２２。この相互作用は鉄分を除去し、尿中のその損失を防ぎ、ヘモグロビンの媒介による組織酸化に対して組織を保護する抗酸化物質の役割を果たすと考えられている２３。異なるハプトグロビン表現型の抗酸化能力には差があることがわかっており、ハプトグロビン１−１型蛋白質は、その他の型の蛋白質と比較して優れた抗酸化保護ができる２３。このような抗酸化仮説を、糖尿病性の血管合併症の進展における酸化的ストレスの非常に重要な役割と仮定すると、特に興味深い４９、５０。或いは異なるハプトグロビンの型毎に提供される酸化保護の明らかな違いは、更に詳しくは、異なる表現型の個人が有するハプトグロビン蛋白質のサイズが著しく異なることである。ハプトグロビン１−１型はハプトグロビン２−２型より著しく小さく、従って、血管外コンパートメントに通り抜けやすく、血管障害の部位でヘモグロビンの媒介による組織障害を防ぎ得る２３。いずれにしろ、アテローム性動脈硬化におけるハプトグロビンの役割は、いまだに良く理解されておらず、いくつかの研究では、Ｈｐ１−１型は心血管系死亡率が高いというリスクがあると逆説的に証明している（De Bacquer et al, Atherosclerosis 2001; 157: 161-6）。
【００４９】
ハプトグロビンは、免疫調節物質としての役割も果たすことが実証されており、ヘモグロビン代謝におけるその役割と無関係ではないかもしれない２１、２３。ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の特定の受容体はＣＤ１６３５１、即ちグループＢのスカベンジャー受容体のシステインが豊富なスーパーファミリーのメンバーであると、単球／マクロファージではっきりと確認された５２。スカベンジャー受容体のこのスーパーファミリーの別のメンバーであるＣＤ３６は、アテローム性動脈硬化障害の進展に重要な意味を持つＬＤＬ代謝において重要な役割を果たしていることが以前からわかっている５３−５５。ハプトグロビン２−２型とヘモグロビンの複合体は、ハプトグロビン１−１型とヘモグロビンの複合体よりも、この受容体に対して１０倍高いアフィニティーがあることが発見された５１。ＣＤ１６３へのリガンド結合は、多くの炎症性サイトカインの分泌をもたらすチロシンキナーゼの接触型のシグナルカスケードを生じることがわかっている５６。ハプトグロビン単独でも、顆粒球及び単球に結合することが実証されている。ハプトグロビンは、細胞膜受容体と定義されるアゴニストの一種に対する好中球の反応を妨げようとし、免疫システムの受容体−リガンド相互作用のアンタゴニストとして機能し得ると示唆している５７。ハプトグロビンの特定の結合は、インテグリンファミリーのメンバーであるＭＡＣ−１即ちＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８受容体５８が実証されている。これらのインテグリンは、障害までの血管壁の反応に重要な役割を果たしていることがわかっている５９。
【００５０】
アテローム性動脈硬化血小板の進展及び不安定化における細菌感染の重要な役割が、多くの研究によって最近提示された６０。このことは、ハプトグロビン表現型と関係するアテローム性動脈硬化の特異的リスクに対し重要であり得る２３−２５。表現型は試験管内及び生体外で細菌及びウイルスの複製を予防するその能力が異なるからである。これは異なる表現型による免疫調整の相違５１だけではなく、鉄分除去の相違２３に起因していることもあり得る。
【００５１】
これらの研究結果は、ハプトグロビン表現型及び糖尿病性の血管合併症予防に抗酸化物質補給が有効であるということに関する、本願明細書に開示される結果と完全に一致する。抗酸化療法に対する異なるハプトグロビン表現型を有する糖尿病患者の相対反応の明白な違いは、ＣＶＤリスク階層化アルゴリズムが用いられた糖尿病患者の大規模な試験と、糖尿病患者のＣＶＤを予防するべくデザインされた、例えば抗酸化物質の補給及び抗酸化療法と薬物療法の組み合わせの、潜在的治療効果の評価によって保証される。
【００５２】
本発明の様々な好適な実施態様の方法によれば、被験者のハプトグロビン表現型の判定は、信号増幅法、直接観測法及び少なくとも１つの配列変化の検出法が含まれる複数の方法のいずれか１つによって実行されるが、これらの方法に限定されるわけではない。これらの方法は遺伝子型を判定することによって、表現型を間接的に判定する。後述されるように、ハプトグロビン表現型の判定は、ハプトグロビン遺伝子生成物の解析によって直接行われても良い。
【００５３】
本発明の様々な好適な実施態様による信号増幅法は、例えばＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を増幅し得る。本発明の一部として用いられ得る信号増幅法には、ＰＣＲ、ＬＣＲ（ＬＡＲ）、自律合成反応（３ＳＲ／ＮＡＳＢＡ）又はＱ−ベータ（Ｑβ）レプリカーゼ反応を含むが、これらの方法に限定されるわけではない。
【００５４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、クローニングや純化をせずにゲノムＤＮＡの混合体のターゲット塩基配列の１つのセグメント濃度を増加させる方法であり、米国特許第４，６８３，１９５号（マリス他）及び同第４，６８３，２０２号（マリス）によって開示されている。この技術はターゲット塩基配列濃度が低いという問題に１つのアプローチを提供する。ＰＣＲはターゲットの濃度を容易に検出できるレベルまで、直接増加するために用いられる。ターゲット塩基配列を増幅するこのプロセスは、所望のターゲット塩基配列を含むＤＮＡ混合体に対して二本鎖ターゲット塩基配列の各ストランドを補完する２つのオリゴヌクレオチドプライマが過剰な分子の導入に関係している。その混合体は変性後にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに続いて、プライマはポリメラーゼで相補鎖を形成するように伸長される。変性、ハイブリダイゼーション（アニーリング）及びポリメラーゼによる伸長（エロンゲーション）のステップは、所望のターゲット塩基配列の１つのセグメントが比較的高い濃度を得るために、必要に応じて何回も繰り返される。
【００５５】
所望のターゲット塩基配列のセグメントの長さは、互いのプライマの相対位置によって決定されるので、この長さは制御可能なパラメータである。ターゲット塩基配列の所望のセグメントは、混合体の中で（濃度に関しては）優性配列になるので、「ＰＣＲ増幅」と呼ばれる。
【００５６】
リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ又はＬＡＲ）：リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；時に「リガーゼ増幅反応」（ＬＡＲ）と呼ばれる）は、核酸を増幅する既知のまた別の方法であり、「Barany, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 189 (1991)、Barany, PCR Methods and Applic., 1: 5 (1991)、Wu and Wallace, Genomics 4:560 (1989)」で開示されている。ＬＣＲでは４つのオリゴヌクレオチド、即ちターゲットＤＮＡの１つのストランドにユニークにハイブリダイズする２つの近接するオリゴヌクレオチドと、対向するストランドにハイブリダイズする１組の近接するオリゴヌクレオチドの補集合、が混合され、そしてＤＮＡリガーゼが混合体に追加される。結合部で完全に補完されるように供給されると、リガーゼはハイブリダイズされた分子のそれぞれの集合と共有結合する。重要なことは、ＬＣＲではターゲットサンプルに塩基対の配列があって、ズレ即ち塩基対ミスマッチがないときに限り、２つのプローブが互いに結合される。変性及びライゲーションが繰り返されるサイクルによって、ＤＮＡの短いセグメントを増幅する。ＬＣＲは単一塩基対の変異の検出を増強するために、ＰＣＲと組み合わせて用いられることもあった（Segev, PCT Publication No. W09001069 Al (1990)）。しかしながら、この解析に用いられる４つのオリゴヌクレオチドは、連結可能な２つの短いフラグメントを形成するようにペアにすることができるので、ターゲットに依存しないバックグラウンドシグナルを生成する可能性がある。ＬＣＲを変異のスクリーニングに使用する場合、特定の位置にある核酸の検査に限定される。
【００５７】
自律合成反応（３ＳＲ／ＮＡＳＢＡ）：自律配列複製反応（３ＳＲ）（Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:1874-1878, 1990）Proc. Natl. Acad. Sci., 87:7797, 1990に訂正あり）は、転写ベースのインビトロの増幅システムであり（Kwok etal., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 1173-1177, 1989）、一様な温度でＲＮＡ配列を急激に増幅できる。増幅されたＲＮＡは、変異の検出に使用され得る（Fahy et al., PCR Meth. Appl., 1: 25-33, 1991）。この方法では、オリゴヌクレオチドプライマは、インタレストの配列の５’端へファージＲＮＡポリメラーゼのプロモータを加えるべく用いられる。第２のプライマ、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ  Ｈ、ＲＮＡポリメラーゼ、リボ及びデオキシリボヌクレオシド三リン酸を含む酵素及び基質の混合物において、ターゲット塩基配列は、インタレストの領域で増幅するべく、転写、ｃＤＮＡ合成及び第２のストランド合成が何回も繰り返される。３ＳＲを変異の検出に使用する場合、ＤＮＡの小さなセグメントをスクリーニングするため、動力学的に限定される（例えば、２００−３００塩基対）。
【００５８】
Ｑ−ベータ（Ｑβ）レプリカーゼ：この方法では、インタレストの配列を認識するプローブが、Ｑβレプリカーゼによって転写可能なＲＮＡテンプレートに取り付けられる。ハイブリダイズされていないプローブの転写による偽りの好結果によって以前に証明された重要な問題は、配列特異的ライゲーションの方法を使って発表された。しかしながら、現在ある耐熱性ＤＮＡリガーゼは、このＲＮＡ基質には有効ではないため、ライゲーションは低温（３７度）でＴ４  ＤＮＡリガーゼによって行われなければならない。これはＬＣＲにおいては特異性を得る方法であった高温の使用を妨げる。ライゲーションイベントは結合部位で変異を検出するべく使用されるが、その他の場所では使用できない。
【００５９】
成功した試験方法は、非常に特殊な方法である。核酸ハイブリダイゼーションの特異性を制御する単純な制御方法は、反応温度を制御することである。３ＳＲ／ＮＡＳＢＡ及びＱβシステムのいずれもが、大量の信号を生成できる一方で、互いに干渉する１つ以上の酵素は高温（即ち、５５度より高い温度）で使用できない。従って、反応温度がプローブの非特異性のハイブリダイゼーションを妨げるため上昇させられない。プローブの長さが低温で容易に溶解するように短くなると、複数個の合成ゲノムと完全に一致する可能性が増加する。これらの理由から、現在はＰＣＲ及びＬＣＲが、検出技術の研究分野において優勢である。
【００６０】
ＰＣＲ及びＬＣＲの増幅手順の原理は、１サイクルの生成物が、その後の全てのサイクルで使用可能なテンプレートになるため、結果的に各サイクルで集団を倍増する。そのような倍増システムの最終収量は、（１＋Ｘ）ｎ＝ｙとして表すことができ、「Ｘ」が平均効率（各サイクルでコピーされたパーセント）、「ｎ」がサイクル数、「ｙ」が全体効率即ち反応収率である（Mullis, PCR Methods Applic., 1:1, 1991）。ターゲットＤＮＡの全てのコピーがポリメラーゼ連鎖反応のサイクル毎にテンプレートとして利用される場合、その平均効率は１００%である。ＰＣＲが２０サイクル実行された場合、収率は開始時点の物質が２２０即ち１，０４８，５７６倍となる。反応の状態が平均効率８５%まで減少した場合、その２０サイクルにおける収率は、開始時点の物質の１．８５２０即ち２２０，５１３倍だけとなる。つまり、ＰＣＲを効率８５%で実行すると、効率１００%で実行した反応と比較して、得られる最終生成物はわずか２１%しかない。平均効率が５０%に減少された反応は、本来得られるはずの生成物の１%未満しか得られない。
【００６１】
実施例において、所定のポリメラーゼ連鎖反応が、理論上の最大収量を得ることはまれであり、ＰＣＲは低い収量を補償するために通常は２０サイクル以上実行される。平均効率５０%では、理論上２０サイクルで可能な１００万倍の増幅を達成するのに３４サイクルかかり、更に低い効率では、必要なサイクル数が極めて多くなる。加えて、指定されたターゲットよりも良い平均効率で増幅する様々なバックグラウンド生成物は、優性の生成物となる。
【００６２】
また、多くの変数がＰＣＲの平均効率に影響を与えることができ、いくつかあげると、ターゲットＤＮＡの長さ及び二次構造、プライマの長さ及び構造、プライマとｄＮＴＰ濃度及びバッファ構成等がある。外生的なＤＮＡ（例えば、白衣表面にこぼれたＤＮＡ）による反応の汚染又は二次汚染も、考慮すべき重要な事項である。反応状態は各々異なるプライマペア及びターゲット塩基配列を注意深く最適化しなければならず、このプロセスには経験豊富な研究者でさえも数日かかる。このプロセスの困難さは、多くの技術的要因とその他の要因を含んでおり、臨床設定でＰＣＲを使用することに著しい不利益をもたらす。実際、ＰＣＲは臨床現場にあまり浸透していない。同様な懸念がＬＣＲにもあり、ＬＣＲでは各々のターゲット塩基配列に、異なるオリゴヌクレオチド配列を使用するように最適化しなければならない。加えて、どちらの方法も高価な設備が必要であり、正確な温度サイクルを実行する必要がある。
【００６３】
核酸検出技術の多くの応用、例えば複雑なバックグラウンドにおける特定配列の検出だけではなく、少数の又は単体のヌクレオチドによる異なる配列間の識別に関する対立遺伝子の変異の研究などがある。ＰＣＲによる対立遺伝子の特定変異の検出の１つの方法は、テンプレート鎖とプライマの３’端にミスマッチがある時、ＴａｑポリメラーゼをＤＮＡ鎖に合成させることが難しいという事実に基づいている。対立遺伝子の特定変異は、たった１つの潜在的な対立遺伝子と完全にマッチするプライマを使用することによって検出され得る。他の対立遺伝子に対するミスマッチは、プライマの伸長を妨げるべく働き、それによってその配列の増幅を妨げる。この方法には、ミスマッチの塩基組成が、ミスマッチ全域に伸長するのを防ぐ能力に影響を与えるという重要な制限があり、いくつかのミスマッチは伸長を防げない又は最低限の効果しか有していない（Kwok et al., Nucl. Acids Res., 18: 999, 1990）。
【００６４】
同様な３’ミスマッチ方法の使用は、ＬＣＲのライゲーションを防ぐのに大きな効果がある（Barany, PCR Meth. Applic., 1:5, 1991）。様々なミスマッチは効果的に耐熱性リガーゼの活動を防ぐが、ＬＣＲはターゲットに依存しないバックグラウンドのライゲーションの生成物が増幅を始めるという不利益がまだある。更に、個々の位置でヌクレオチドを確認するためのＬＣＲとＰＣＲの組み合わせも、明らかに臨床研究室では扱いにくい方法である。
【００６５】
本発明のいくつかの好適な実施態様による直接観測法は，例えば、サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）又は分岐ＤＮＡ解析であり得る。
【００６６】
十分な量の核酸が検出される時、（例えばＰＣＲ及びＬＣＲのように）そのターゲットのコピーを大量に作る代わりに、配列を直接検出するという利点がある。最も顕著なのは、信号を急激に増幅しない方法なので、定量分析ができることである。複数の染色体が単体のオリゴヌクレオチドに付着することによって信号が増幅される場合でも、最終的な信号強度とターゲットの量との相関関係は正比例である。このようなシステムは、反応の生成物が、自分自身を更に反応させないという追加的な利点もあり、生成物による白衣表面の汚れが重要なことではなくなる。ノーザン及びサザンバンドＲＮａｓｅプロテクションアッセイを含む直接検出法の従来の方法は、一般的に放射能の使用が必要であり、自動化できない。最近考案された技術は、放射能の使用の排除及び／又は自動化可能なフォーマットでの感度改善を試みた。その２つの例が、「サイクリングプローブ反応」（ＣＰＲ）及び「分岐ＤＮＡ」（ｂＤＮＡ）である。
【００６７】
サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）：サイクリングプローブ反応（ＣＰＲ）（Duck et al., BioTech., 9: 142, 1990）は、長いキメラオリゴヌクレオチドを使用し、その中心部はＲＮＡであり、両端はＤＮＡである。ターゲットＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションと耐熱性ＲＮａｓｅ  Ｈへの暴露は、ＲＮＡ部分が消化される原因となる。これは残りの二本鎖のＤＮＡ部分を不安定にし、ターゲットＤＮＡからプローブの残物を解放し、別のプローブ分子にこのプロセスを繰り返させる。切断されたプローブ分子の形状をした信号が線形速度で蓄積する。その繰り返しのプロセスで信号は増幅するが、オリゴヌクレオチドのＲＮＡ部分は、試料調製を行い得るＲＮａｓｅに影響を受けやすい。
【００６８】
分岐ＤＮＡ：分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）は、「Urdea et al., Gene 61: 253-264 (1987)」によって開示され、分岐構造をしたオリゴヌクレオチドが、個々のオリゴヌクレオチドを３５から４０ラベルにすることに関している（例として、アルカリホスファターゼ酵素）。これがハイブリダイゼーションイベントによって信号を増加させる一方で、非特定結合の信号も同様に増加される。
【００６９】
本発明のいくつかの好適な実施態様による少なくとも１つの配列変化の検出法は、例えば、制限断片長多型（ＲＦＬＰ解析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）解析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）解析又はジデオキシフィンガープリント法（ｄｄＦ）であって良い。
【００７０】
特定の核酸配列及び配列変化の検出を可能にする試験の需要が、臨床診断において急速に拡大している。人間の遺伝子及び病原体を蓄積した遺伝子の核酸配列データのような、特定配列内部での変異に対する、迅速で経済的且つ簡便な試験の需要が、現在急速に増加している。
【００７１】
核酸セグメントの変異をスキャンする、いくつかの方法が考えられてきた。そのうちの１つは、各試験サンプル（例として、細菌分離株）の遺伝子配列全体を判定するものである。約６００個以下のヌクレオチドの配列であれば、この方法は増幅された物質（例として、ＰＣＲ反応生成物）を用いることによって達成し得る。この方法はインタレストのセグメントを転写することに伴う時間と費用を節約する。しかしながら、特殊な装置と良く訓練された人材が必要とされるため、この方法を臨床において実用的且つ効果的に使用するには、大変な手間がかかり、そして高価である。
【００７２】
シーケンスに伴う困難さを考えると、核酸の任意のセグメントが、いくつかの別のレベルに特徴付けられ得る。最低の解像度では、電気泳動法を使用して、同一ゲルの既知の標準稼動との比較によって分子のサイズが測定される。分子の更に詳細な画像は、電気泳動法を実施する前に、制限酵素の組み合わせによる切断によって取得できることがあり、規則正しい写像を構成させ得る。フラグメント内の特定配列の有無が、ラベルされたプローブのハイブリダイゼーションによって検出され得る。即ち、鎖終結ヌクレオチドアナログの存在下で、部分的な化学分解又はプライマ伸長によって、正確なヌクレオチド配列が測定され得る。
【００７３】
制限断片長多型（ＲＦＬＰ）：類似した配列間の単一塩基の相違の検出において、しばしば解析に必要とされるのは、最高レベルの解像度である。ヌクレオチドの位置が疑わしいことが事前にわかっている場合には、ダイレクトシーケンスせずに単一塩基の変異を検査するいくつかの方法が考えられてきた。例えば、インタレストの変異が制限認識配列の範囲に入れば、消化パターンの変異は診断ツールとして使用できる（例として、制限断片長多型［ＲＦＬＰ］解析）。
【００７４】
単一変異はＲＦＬＰの産出又は破壊でも検出されてきた。変異はミスマッチでの切断によって生成されるＲＮＡフラグメントの有無及びサイズによって検出され、位置が特定される。ＤＮＡヘテロ二本鎖における単一ヌクレオチドのミスマッチも、「ミスマッチ化学分解」（ＭＣＣ）（Gogos et al., Nucl. Acids Res., 18: 6807-6817, 1990）と呼ばれる、単一塩基置換を検出する別な方法が提供するいくつかの化学物質によって認識され、切断される。しかしながら、この方法は四酸化オスミウム及びピペリジンの使用を必要とするが、これらは非常に有害な化学物質であるため、臨床検査への使用には適さない。
【００７５】
ＲＦＬＰ解析は低感度に弱く、大量のサンプルを必要とする。ＲＦＬＰ解析が点変異の検出に使用される時、その性質から、既知の制限エンドヌクレアーゼの制限配列の範囲に入るような単一塩基の変異のみの検出に限定される。更に、存在する酵素の大部分は４から６塩基対の制限配列を有しており、多くの大規模なＤＮＡマニピュレーションによって頻繁に分裂する（Eckstein and Lilley (eds.), Nucleic Acids and Molecular Biology, vol. 2, Springer-Verlag, Heidelberg, 1988）。従って、ほとんどの変異が制限認識配列の範囲に入らないので、ごくわずかにしか適用されない。
【００７６】
８塩基対の特異性を持った少数のレアカットな制限酵素が発見されており、これらは遺伝子のマッピングに広く使用されている。しかしこれらの酵素は数少なく、Ｇ＋Ｃが豊富な配列の認識に限定され、高度に密集されやすい場所で分裂する（Barlow and Lehrach, Trends Genet., 3: 167, 1987）。最近、グループＩイントロンによってエンコードされたエンドヌクレアーゼが、１２塩基対の特異性より優れているかもしれないことが発見された（Perlman and Butow, Science 246: 1106, 1989）、しかし、これもまた数は少ない。
【００７７】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：変異が認識配列内ではない場合、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、プライマ伸長又はライゲーションイベントが、マッチ又はミスマッチのインジケータとして働くように、変異されたヌクレオチドに近接してハイブリダイズするようにデザインされる。放射活性物質でラベルした対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）によるハイブリダイゼーションも、特定の点変異の検出に応用されてきた（Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 80: 278-282, 1983）。その方法は、単一ヌクレオチドによって異なる短いＤＮＡフラグメントの融解温度の相違を基にしている。ストリンジェントな条件でのハイブリダイゼーション及び洗浄状態が、変異と野生型対立遺伝子との識別を可能にする。ＰＣＲ生成物に応用されるＡＳＯのアプローチも、様々な研究者に広く利用されており、ラス遺伝子の点変異を検出して特徴付けること（Vogelstein et al., N. Eng. J. Med., 319: 525-532, 1988、Farr et al., Proc. Natl. Acad.Sci., 85:1629-1633, 1988）、ｇｓｐ／ｇｉｐの癌遺伝子の点変異を検出して特徴付けること（Lyons et al., Science 249: 655-659, 1990）に利用されている。複数の位置に様々なヌクレオチド変異が存在するため、ＡＳＯ法は全ての潜在的な発癌性の変異をカバーするべく多くのオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。
【００７８】
上述のいずれの技術（即ち、ＲＦＬＰ及びＡＳＯ）も、疑わしい変異の正確な位置を試験の前に知っていなければならない。つまり、遺伝子又はインタレストの配列の範囲内での変異の有無を検出する必要がある時には、適用することができない。
【００７９】
変性剤濃度勾配ゲル電気泳動／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）：２つの別な方法では、わずかな配列の変化に反応する電気泳動移動度の変化を検出することを利用する。このうちの１つの方法は、「変性剤濃度勾配ゲル電気泳動」（ＤＧＧＥ）と呼ばれ、電気泳動が濃度勾配ゲルを変化させる時、わずかに異なる配列は、異なるパターンの局所融解を示すという観察に基づいている。この方法は、電気泳動移動度に対応する変化により、変異が認識され得る。単一ヌクレオチドで異なるヘテロ二本鎖対ホモ二本鎖の融解特性の違いが、ターゲット塩基配列の変異の有無を検出させる。解析されるフラグメントは通常ＰＣＲ生成物であり、長いＧ−Ｃ塩基対（３０−８０）によって１つの端部で「クランプ」され、ストランドの完全な分裂なしにインタレストの配列の完全な変異を可能とする。ＤＮＡフラグメントに「クランプ」しているＧＣの付着は、ＤＧＧＥによって認識できる変異の割合を増加させる（Abrams et al., Genomics 7: 463-475, 1990）。ＧＣクランプを１つのプライマに付着させるには、増幅された配列が低分裂温度を有していることが不可欠である（Sheffield et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 232-236, 1989、Lerman and Silverstein, Meth. Enzymol., 155:482-501, 1987）。この技術を変更して、温度勾配（Wartell et al., Nucl. Acids Res., 18: 2699-2701, 1990）を用いる方法に発展した。そしてその方法は、ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖にも適用可能である（Smith et al., Genomics 3: 217-223, 1988）。
【００８０】
ＤＧＧＥの使用を制限する要件には、試験されるＤＮＡのタイプ毎に、変性状態を最適化させなければならないということが含まれる。更にこの方法は、ゲルを準備し、電気泳動中は所望の高温に維持するための特殊な装置が必要である。試験される配列毎に、１つのオリゴヌクレオチドにクランプしている端部の合成をするための費用も重要な課題である。加えて、ＤＧＧＥには長い実行時間が必要とされる。ＤＧＧＥの長い実行時間は、均一変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）と呼ばれるＤＧＧＥに変更することによって短縮される（Borrensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8405, 1991）。ＣＤＧＥは、変異の検出を効率良く行うために、異なった変性状態の下でゲルが機能することを必要とする。
【００８１】
ＤＧＧＥに類似の温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）と呼ばれる技術は、化学的な変性勾配ではなく、温度勾配を用いる（Scholz, et al., Hum. Mol. Genet. 2: 2155, 1993）。ＴＧＧＥは、電界に対して垂直に配置される温度勾配を生成できる特殊な装置の使用が必要である。ＴＧＧＥは、ＤＮＡの比較的小さなフラグメントの変異を検出できるため、大きな遺伝子のセグメントをスキャンするには、ゲルを動作させる前に複数のＰＣＲ生成物の使用を必要とする。
【００８２】
一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）：「一本鎖ＤＮＡ高次構造多型」（ＳＳＣＰ）と呼ばれる、また別の一般的な方法は、ハヤシ、セキヤ及びその同僚によって開示されており（ハヤシによって監修された「PCR Meth. Appl., 1: 34-38, 1991」）、核酸の一本鎖が非変性状態において特徴的な構造を得ることができ、これらの構造が電気泳動移動度に影響を与えることを観察する方法を基にしている。相補的なストランドは、１つのストランドが他方のストランドから分解され得る、十分に異なった構造であるとする。フラグメントの範囲内の配列の変化も構造を変化させ、その結果、移動度を変化させるので、配列変異によるアッセイとしてこれが用いられることを可能とする（Orita, et al., Genomics 5: 874-879, 1989）。
【００８３】
ＳＳＣＰプロセスは、両方のストランドにラベルされたＤＮＡセグメント（例えば、ＰＣＲ生成物）を変性し、その後に非変性ポリアクリルアミドゲルによるゆっくりとした電気泳動分離が続くことに関係し、分子内部の相互作用が形成でき、実行中に中断されることがない。この技術はゲル成分及び温度の変化に対してきわめて敏感である。この方法の重大な制限は、明らかに同様の状況下で生成されたデータであっても、それが異なった研究室で生成されたものであれば、データを比較することが比較的難しいことである。
【００８４】
ジデオキシフィンガープリント法（ｄｄＦ）：ジデオキシフィンガープリント法（ｄｄＦ）は、変異の有無について遺伝子をスキャンするために開発された別の技術である（Liu and Sommer, PCR Methods Appli., 4: 97, 1994）。ｄｄＦ技術は、サンガーのジデオキシ法によるシーケンスの構成をＳＳＣＰと組み合わせている。ジデオキシによるシーケンス反応は、１つのジデオキシターミネータを使用することによって実行される。反応の生成物が非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動され、ＳＳＣＰ解析のように、ターミネーションセグメントの移動度の変化を検出する。ｄｄＦは感度を増加させる点でＳＳＣＰより改善されているが、ｄｄＦは高価なジデオキシヌクレオチドの使用を必要とするため、この技術はＳＳＣＰに好適なサイズのフラグメントの解析に限定される（即ち、変異の最適な検出は２００−３００塩基のフラグメント）。
【００８５】
上記の制限に加えて、これら全ての方法は、解析可能な核酸フラグメントのサイズに制限がある。直接シーケンスアプローチでは、６００塩基対より大きい配列がクローニングに必要であり、フラグメント全体をカバーするため、結果として遅れが生じ、欠失サブクローニング又はプライマウォーキングのいずれかを犠牲にする。ＳＳＣＰ及びＤＧＧＥは、更に厳しいサイズの制限がある。配列変化に対して低感度であるため、これらの方法は大きなフラグメントに好適ではないと考えられている。ＳＳＣＰは２００塩基対フラグメント以内で単一塩基置換の９０%は検出できると報告されているが、４００塩基対フラグメントでの検出は５０%未満に下がる。同様に、ＤＧＧＥの感度はフラグメントの長さが５００塩基対に達すると減少する。ｄｄＦ技術も、直接シーケンス法とＳＳＣＰの組み合わせなので、スクリーニングできる比較的小さなサイズのＤＮＡに限定される。
【００８６】
本発明の現状好適な実施態様によれば、上述された様々な遺伝子、例えば癌細胞又は癌患者から得られた細胞にある還元葉酸輸送体（ＲＦＣ）遺伝子の、１つ又は複数の変異を探す方法は、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）技術、例えばｃＤＮＡ−ＳＳＣＰ又はゲノムＤＮＡ−ＳＳＣＰ等によって結果が得られる。しかしながら、別な方法を用いることも可能であり、核酸シーケンス、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、自律合成反応、Ｑβ−レプリカーゼ、サイクリングプローブ反応、分岐ＤＮＡ、制限断片長多型解析、ミスマッチ化学切断法、ヘテロ二本鎖解析、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、均一変性剤濃度勾配ゲル電気泳動、温度勾配ゲル電気泳動及びジデオキシフィンガープリント法等を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８７】
ハプトグロビン表現型の判定は、後述の実施例の項で更に説明されるが、直接実施されても良く、ハプトグロビン遺伝子の蛋白質遺伝子生成物又はその一部の解析によって行われる。そのような直接的な解析は、しばしば免疫学的検出法を用いて実施される。
【００８８】
免疫学的検出法は、例えば、「Using Antibodies: A Laboratory Manual」（Ed Harlow, David Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)）で十分に説明されており、それらの技術に詳しければ、本発明の一部として後述される様々な技術を実施することができる。全ての免疫学的技術は、２つのハプトグロビン対立遺伝子の少なくとも１つに対して特異的な抗体を必要とする。免疫学的検出法は、本発明の一部として用いるのに好適であり、ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学法及び蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８９】
ラジオイミュノアッセイ（ＲＩＡ）：この方法の一つのバージョンは、特定の抗体及び放射性標識の抗体が結合した蛋白質（例として、Ｉ１２５がラベルされたプロテインＡ）を有する所望の基質（この事例及び後述の方法ではハプトグロビン）の沈降が、アガローズビーズのような沈降性キャリアに固定化されることに関係している。
【００９０】
ＲＩＡの別のバージョンでは、ラベルされた基質及びラベルされていない抗体が結合した蛋白質が用いられる。大量の基質を含むサンプルが、様々な量で加えられる。沈降の減少はラベルされた基質から数えられ、加えられたサンプル中の基質の量に比例している。
【００９１】
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）：この方法はサンプル（例えば、固定細胞又は蛋白質溶液）に関係し、蛋白質基質をマイクロタイタープレートのウェルのような表面に浮上させることを含んでいる。酵素に連結される基質に特有の抗体は、基質に結合するべく用いられ、結合される。そして、抗体の有無は抗体に連結された酵素を用いた比色反応によって検出され、計量される。この方法に通常用いられる酵素には、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼを含んでいる。適切に測定され且つ反応が直線範囲内であれば、サンプルに存在する基質の量は生成された色の量に比例している。基質の基準は、一般に定量的精度を改善するために用いられる。
【００９２】
ウエスタンブロット法：この方法は、アクリルアミドゲルを用いて基質を他の蛋白質から分離させ、基質をメンブレン（例えば、ナイロン又はＰＶＤＦ）にトランスファーさせることに関係している。その後、基質の有無は基質に対して特定の抗体によって検出される。基質は抗体結合した試薬によって順に検出される。抗体結合した試薬は、例えば、プロテインＡ又は他の抗体であって良い。抗体結合した試薬は、上述の放射性標識又は酵素連結であって良い。検出はオートラジオグラフィー、比色反応又は化学発光であってよい。この方法は、基質の量の計量と、電気泳動中のアクリルアミドゲルの泳動距離を示すメンブレン上の相対位置によるその正体の判定との両方が可能である。
【００９３】
免疫組織化学法：この方法は、基質に特有の抗体による固定細胞の上皮内基質の検出に関係している。基質に特有の抗体は、酵素結合又は蛍光プローブへの結合であって良い。検出は顕微鏡又は主観的評価によって行われる。酵素結合した抗体が用いられる場合、比色反応が必要とされ得る。
【００９４】
蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）：この方法は、基質に特有の抗体による細胞内の上皮内基質の検出に関係する。基質に特有の抗体は蛍光プローブに連結されている。検出は、光線を通過する時に各セルから放射される光の波長を読むセルソーティング機器を用いて行われる。この方法は２又は３個の抗体を同時に用いても良い。
【００９５】
本発明を実施してみると、ＨＯＰＥ試験のデータ分析から、ビタミンＥ及びラミプリが同類のハプトグロビンの型に特定の効果を有することを初めて明らかにした。ラミプリルは一般に高血圧症に処方され、ＣＶＤの予防に役立つとされている。しかしながら、ラミプリルによる治療の予防効果の大きさ（ＲＲ＝０．５７）及び１つのハプトグロビン表現型サブグループ（Ｈｐ２−２型）に対する予防に限れば、ラミプリルによる治療の予防成分は、高血圧症に対する効果を越えていることを示している。アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤としての機能に加えて、ラミプリルは抗酸化物質としての機能を有し、ラミプリルによる治療で体内のフリーラジカルな酸化種の減少をもたらす（Lopez-Jaramillo, et al J Hum Hypertens 2002; 16Sl: S100-300）。ここに示す、生化学構造が劇的に異なる２つの異なった抗酸化物質が、ハプトグロビンの型によって分類された糖尿病患者のサブグループに対して、同様の臨床効果を提供するということは、抗酸化療法の理論的枠組みが、例えば、トロロックス（Sagach et al Pharma Res 202; 45: 435-39）、ラキソフェラスト（Campo et al, Cardiovasc Drug Rev 1997; 15: 157-73）、ＴＭＧ（Meng et al Bioorg Med Chem Ltrs 2002; 12: 2545-48）、ＡＧＩ−１０６７（Yoshida et al Atheroscler 2002; 162: 111-17）、プロブコール（Kita et al PNAS USA 1987; 84: 7725）のような他の抗酸化物質に加えて、更に、ビタミンＥと類似の抗酸化作用のメカニズムを持つニソルジピン、ニフェジピン及びニカルジピンのような、カルシウムチャンネル遮断薬（Mak I, et al. Pharma Res. 2002; 45: 27-33）に応用され得ることを示唆している。従って、そのような抗酸化物質による予防療法が最も効果があると期待される患者の集団（Ｈｐ２−２型の糖尿病患者）は、ここで実証されたビタミンＥ及びラミプリルの補給が有効な集団と同様であろう。しかしながら、ＤＭ患者の抗酸化物質補給が有効かどうかの判定は、全ての抗酸化ビタミンには応用できないかもしれない。なぜなら、任意抽出のサンプル又は糖尿病患者のどちらにおいても、ＣＶＤアウトカムとビタミンＣの補給には相関関係が発見されなかったからである（データは示していない）。
【００９６】
ここで開示されるＨＯＰＥ試験データの分析に対する新しいアプローチが、今、明らかな証拠を提供した。糖尿病患者を階層化していない集団では、抗酸化ビタミンＥの効果が明らかではなかったのに対して、糖尿病患者のサブグループでは、抗酸化療法が著しい効果を示すことを確認できる。従って、これらのデータは、全ての糖尿病患者に、ハプトグロビン表現型を検査することの重大な価値と、糖尿病性のＣＶＤを予防するために、Ｈｐ表現型２−２型の患者に対する抗酸化物質補給という予防療法の提供を示す。おそらく、この抗酸化物質の予防効果は、単一の抗酸化物質（例えばビタミンＥ）に限定されず、トロロックス、ラキセフィロファスト、ＡＧＩ−１０６７、プロブコール、ＴＭＧ及びカルシウムチャンネル遮断薬のような様々な潜在的な抗酸化物質でも効果的である。これらの異なる試料の相対効果は、更なる臨床研究の分析から測定され得る。
【００９７】
個々のハプトグロビン表現型を直接的に又は遺伝子から判定するのに、被験者から様々な好適な生体サンプルを入手して使用することが効果をもたらす可能性があることは、当業者には理解できるであろう。生体サンプルには、血液、血漿、血球、唾液又は洗口剤によって得られる細胞、尿及び涙のような身体の分泌物及び生検の結果等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００９８】
本発明の追加の目的、利点及び新規性は、以下の実施例に限定されるわけではないが、これらの試験より当業者には明らかである。加えて、本発明の各々の実施態様は、上述の内容及び請求項の内容が、以下の実験の実施例から得られることを明らかにする。
【００９９】
実施例
【０１００】
以下の実施例を、上述の説明と併せて、本発明が限定されないように説明する。
【０１０１】
全体として、ここに使用されている用語及び本発明に用いられる検査法には、分子、生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡ技術を含んでいる。それらの技術は、文献によって全て説明されている。例として、以下の文献を参照されたい。「Molecular Cloning: A laboratory Manual」Sambrook et al., (1989)、「Current Protocols in Molecular Biology」Volumes I-III Ausubel, R. M. , ed. (1994)、Ausubel et al.,「Current Protocols in Molecular Biology」John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal,「A Practical Guide to Molecular Cloning」John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al.,「Recombinant DNA」Scientific American Books, New York、Birren et al. (eds) 「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)。方法論は下記の特許及び文献に記述されている。米国特許第４，６６６，８２８、同第４，６８３，２０２、同第４，８０１，５３１、同第５，１９２，６５９及び同第５，２７２，０５７、「Cell Biology: A Laboratory Handbook」Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、「Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique」Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition、「Current Protocols inImmunology」Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds),「Basic and Clinical Immunology」(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds),「Selected Methods in Cellular Immunology」W. H. Freeman and Co., New York (1980)。利用可能な免疫測定は、特許及び科学文献に広く記述されており、例として下記の特許及び文献を参照されたい。米国特許第３，７９１，９３２、同第３，８３９，１５３、同第３，８５０，７５２、同第３，８５０，５７８、同第３，８５３，９８７、同第３，８６７，５１７、同第３，８７９，２６２、同第３，９０１，６５４、同第３，９３５，０７４、同第３，９８４，５３３、同第３，９９６，３４５、同第４，０３４，０７４、同第４，０９８，８７６、同第４，８７９，２１９、同第５，０１１，７７１及び同第５，２８１，５２１、「Oligonucleotide Synthesis」Gait, M. J., ed. (1984)、「Nucleic Acid Hybridization」Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985)、「Transcription and Translation」Hames, B. D., and Higgins S. J. , eds. (1984)、「Animal Cell Culture」Freshney, R. I., ed. (1986)、「Immobilized Cells and Enzymes」IRL Press, (1986)、「A Practical Guide to Molecular Cloning」Perbal, B., (1984)、「Methods in Enzymology」Vol. 1-317, Academic Press、「PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications」Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al.,「Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual」CSHL Press (1996)。これら全てを、あらゆる面においてここに言及したことで本願の一部とする。他の一般的な参考文献は、本願明細書の様々な場所に提供される。その方法は、公知技術と見られており、読者の利便性のために提供される。それらに含まれる全ての情報は、ここに言及したことで本願の一部とする。
【０１０２】
実験方法
【０１０３】
本発明を支持する実験データを提供する実施例を示す前に、次の内容について述べる。
【０１０４】
患者：
【０１０５】
ストロング・ハート・スタディの計画、調査方法及び試験方法と、インディアンコミュニティーの参加者の詳細説明は、以前に発表されている。２０、３９、４０
【０１０６】
調査コホートは、４５歳から７４歳までの４，５４９人以上の個人からなり、１９８９年７月から１９９２年１月の間に行った１回目の試験に参加していた。全適格者における参加率は、平均６４%であった。非参加者の年齢及び糖尿病の自己報告の度数は、参加者と同様であった。それらの人々の内、２回目の試験（１９９３年７月から１９９５年１２月）時点で生存していた人の再試験率は平均８８%で、３回目の試験（１９９７年７月から１９９９年１２月）時点での再試験率は平均９０%であった。
【０１０７】
各段階の臨床検査は、個人面談及び身体診察からなる。空腹時の血液サンプルが生化学的方法によって採取され、７５グラム経口ブドウ糖負荷試験が実施された。血液サンプルはＥＤＴＡによって収集され、血漿は−２０度で採取されて保存された。標準血圧測定が実施され、心電図が記録され、以前に説明されているとおりコーディングされた３９、４０。参加者は世界保健機構の基準によって糖尿病に分類された４１。降圧薬を服用している参加者又は最高血圧が１４０ｍｍＨｇより高い参加者又は最低血圧が９０ｍｍＨｇより高い参加者は、高血圧とされた。
【０１０８】
ストロング・ハート・スタディのコホートの中で１９８８年から現在までに死亡した人について、部族及び病院の記録及び研究者による参加者とその家族への直接聴取によって確認が行われた。死亡証明書のコピーは州保健局から入手し、分類担当者によってＩＣＤ−９を中心にコーディングされた。潜在的なＣＶＤによる死亡は、以前に説明されているとおり初めは死亡証明書から確認された４２。死亡原因が、検死報告、医療記録要約及び以前に説明されているとおりインタビューによる情報を介して調査された４２。全ての資料が、ストロング・ハート・スタディ・モータリティ・レビュー・コミッティのメンバーの医師によって別々に再調査された。致命的なＣＶＤ及び脳卒中の基準は以前に説明されている４２。
【０１０９】
以前の試験以降に発症した様々な非致死性心血管系イベント、以前に説明されているような確定されたＭＩ及び確定されたＣＶＤを確認するために、各試験での医療記録が再調査された２０、４３。２回目又は３回目の試験に参加しなかった人の記録も再調査された。全ての潜在的なＣＶＤイベント又はインターベンションについて、訓練を受けた医療記録要約者によって、医療記録が再調査された。外来患者の来診の記録が再調査され、ＣＶＤの診断プロセス（例として、トレッドミルテスト、冠動脈造影法）がまとめられた。病歴の再調査から得られた情報は、特定のＣＶＤの診断結果を実証するため、ストロング・ハート・スタディのモータリティ・レビュー・コミッティ又はモービディティ・レビュー・コミッティのメンバーの医師によって再調査された。モービディティ・レビュー・コミッティのメンバーの別の医師による要約記録のブラインドレビューは、診断結果と９０%以上一致した。
【０１１０】
ＨＯＰＥ試験及び患者特性：ＨＯＰＥ試験（Ｈｅａｒｔ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ：無作為化二重盲検プラセボ対照試験）は、２つの予防的インターベンション治療、即ちアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤又はビタミンＥが、プラセボと比較して心血管系イベントの高いリスクをもった患者の発病率及び死亡率が改善するという仮説をテストするために計画された。試験には、年齢（５５歳より高齢）、現在又は過去に心血管系疾患又は糖尿病であるという理由から、将来的に致死性又は非致死性心血管系イベントのリスクが高いと考えられた患者が含まれていた。糖尿病は、少なくとももう１つのリスク要因があり、血管系疾患又は喫煙、高コレステロール又は高血圧症等が知られている。ラミプリル又はプラセボは、かなりの割合の患者に、降圧薬（ＡＣＥ−Ｉを除く）、高脂血症治療薬又はアスピリンを含む併用薬が加えられていた。ＨＯＰＥ試験の計画及び手順の詳細は、既に説明されている（例として、「The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators NE J Med, 2000; 342: 154-60、Sleight, P, J Rennin Angioten Aldost Sys 2000; 1: 18-20」を参照されたい）。簡単に言えば、試験集団はＣＶＤの高いリスクを持った９，４５１人以上の患者からなっていた（ＤＭは３，６５４人）。試験は４００ＩＵの天然ビタミンＥ（ＲＲＲ−ａ−酢酸トコフェロール）又はプラセボをランダム化した２ｘ２の要因計画、及び１０ｍｇのラミプリル又はプラセボをランダム化した２ｘ２の要因計画で行われた。患者には平均４年半継続して行われた。主要な試験アウトカムは、非致死性ＭＩ、脳卒中又は心血管系死亡からなっていた。
【０１１１】
症例及び対照の定義：
【０１１２】
本試験は症例対照サンプルであり、ＣＶＤとハプトグロビン表現型の関係を調査するためにデザインされた。２０６件のＣＶＤ症例及び対照（年齢、性別及び地域によるマッチング）が、この分析の対象となった。
【０１１３】
ハプトグロビン表現型の検査：
【０１１４】
ハプトグロビン表現型の検査は、ゲル電気泳動による１０μｌのＥＤＴＡ血漿及びスターチゲル電気泳動とベンジンによるペルオキシダーゼ染色を用いるスミティーズによって開示された元の方法４６を変更したペルオキシダーゼ染色４４、４５から測定された。患者の血漿は−２０度で保存された。全ての薬品はシグマ・イスラエル（レホボト、イスラエル）から購入された。水中の１０％ヘモグロビン溶液は、血球を先ずリン酸緩衝生理食塩水で５回洗浄し、その後ペレットセル容積１ｍｌにつき９ｍｌの滅菌水で細胞を溶解したヘパリン添加血液から作られた。細胞溶解物は１０，０００Ｇで４０分間遠心分離され、ヘモグロビンを含む上澄みが分離されて−７０度で保存された。血清（１０μｌ）は２μｌの１０％ヘモグロビン溶液と混合され、そのサンプルはハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を形成させるために、室温で５分間放置された。１２５ｍＭ  トリスベース  ｐＨ６．８、２０％（ｗ／ｖ）グリセロール及び０．００１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノール・ブルーを含む、同じ量（１２μｌ）のサンプル緩衝液が、ゲルを泳動させる前に各サンプルに加えられた。ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体は、２５ｍＭ  トリスベース及び１９２ｍＭ  グリシンを含む緩衝液を用いたポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分解された。積層ゲルは１２５ｍＭ  トリスベース、ｐＨ６．８中の４％ポリアクリルアミド（２９：１  アクリルアミド／ビスアクリルアミド）であり、分離ゲルは３６０ｍＭ  トリスベース、ｐＨ８．８中の４．７％ポリアクリルアミド（２９：１  アクリルアミド／ビスアクリルアミド）であった。電気泳動は２５０ボルトの定電圧で３時間実施された。電気泳動完了後、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体は、ガラストレーに新たに準備された染色液にゲルを浸すことによって視覚化された。染色液（記載された順番で試薬を加えることによって作られる）には、メタノール中の５ｍｌの０．２％（ｗ／ｖ）  ３，３’、５，５’−テトラメチルベンジン、０．５ｍｌのジメチルスルホキシド、１０ｍｌの５％（ｖ／ｖ）氷酢酸、１ｍｌの１％（ｗ／ｖ）フェリシアン化カリウム及び１５０μｌの３０％（ｗ／ｗ）過酸化水素が含まれていた。ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体に対応するバンドは１５分以内で容易に視覚化され、４８時間以上安定していた。全てのゲルは写真で記録された。全てのサンプルのハプトグロビン表現型が、患者に関する様々な知識無しに研究所で判定された。
【０１１５】
血漿サンプルは分析のために研究室に渡され、ハプトグロビン表現型の検査は、これらのサンプルのうち６個を除いて全て分析可能であった。これら６人の患者は、いかなるハプトグロビンも作らない患者（Ｈｐ０型表現型）なのか２２、２３、ハプトグロビンの濃度が上述したアッセイの検出リミットより低かったのか、明らかではない。
【０１１６】
ＨＯＰＥ試験のサンプルは、ハプトグロビン表現型の検査を、実証された方法（Hochberg I et al Atherosclerosis 2002; 161: 441-446）に従い、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって１０μｌの血漿を用いて実施された。重要なバンドパターンが、１型対立遺伝子のホモ接合体（Ｈｐ１−１型）、２型対立遺伝子のホモ接合体（Ｈｐ２−２型）又はハプトグロビン遺伝子座においてヘテロ接合体（Ｈｐ２−１型）である個人から得られた。我々は、血漿から判定されたハプトグロビン表現型と、ポリメラーゼ連鎖反応によってゲノムＤＮＡから判定されたハプトグロビン遺伝子型（Koch W, et al Clin Chem 2002; 277 :13635-40）が、１００％一致することを実証した。はっきりとしたハプトグロビン表現型が、全てのサンプルアッセイの９９．６％以上から得られた。ハプトグロビン表現型の検査は、患者の臨床又は治療状況の知識を持たずに実施された。
【０１１７】
統計的分析：
【０１１８】
ＣＶＤのリスク要因である、年齢、性別、ＬＤＬとＨＤＬコレステロール、トリグリセリド、最高血圧、ＢＭＩ、糖尿病、喫煙、ＣＶＤに関する家族歴及び登録センターについて、３つのハプトグロビン表現型間の比較はもちろん、症例と対照間の比較も行われた。加えて、インスリン、空腹時血糖値、ＨｂＡｌｃ、ＤＭ期間及びＤＭの家族歴からなるＤＭ特性について、３つのハプトグロビン表現型間の比較はもちろん、症例と対照間の比較も行われた。単変量及び多項ロジスティック回帰モデルが、これらのＣＶＤのリスク要因とＤＭ特性が表現型に関係しているかを判定するために使用された。尤度比がパラメータをテストするために用いられた。
【０１１９】
ＣＶＤのリスク要因及びＤＭ特性を調整した３つのハプトグロビン表現型毎に、糖尿病患者がＣＶＤイベントを有する確率をモデル化するために、条件付のロジスティック回帰モデルが実行された。糖尿病と表現型の相互作用は、２つの指標変数を用いてコード化されており、１つは糖尿病患者で、もう１つは非糖尿病患者であった。モデルの適合は、残留物の分析によって評価された。
【０１２０】
ＨＯＰＥ試験データの全ての分析は、ＳＡＳ６．０２を使用して行われた。ハプトグロビンによる患者の基準特性は、必要に応じてｔテスト又はχ２テストによって比較された。相対リスク（ＲＲｓ）及び９５％信頼区間が、心血管系死亡、非致死性心筋梗塞及び脳卒中の主要なアウトカムについて報告された。
【０１２１】
実験結果
【０１２２】
実施例Ｉ
【０１２３】
ハプトグロビン表現型は、糖尿病患者のＣＶＤのリスクの予測をする。
【０１２４】
ＣＶＤのリスク要因及びＤＭ特性による、症例対照コホートの臨床特性は、表１に示されている。
【０１２５】
【表１】
2007516718.tif 000002
【０１２６】
症例及び対照は、年齢、性別及び対象地域でマッチングされた。これらのデータは、糖尿病、ＬＤＬコレステロール及び高血圧症が、全てＣＶＤの予測を行うための独立した判断材料であるという、この集団の以前の調査結果と一致している２０。
【０１２７】
このコホートのハプトグロビン表現型の検査は、１−１型が２５％、２−１型が４４％及び２−２型が３１％という分布を明らかにした。１型対立遺伝子の度数は０．４７であり、以前に報告されたこの集団のハプトグロビン対立遺伝子の度数と一致している２６。様々なＣＶＤのリスク要因又はＤＭ特性について、単変量解析及び１−１型表現型を有する確率をモデル化する多項ロジスティック回帰分析の両方で測定されたが、異なるハプトグロビン表現型間に著しい相違は発見されなかった。
【０１２８】
表２は条件付ロジスティック回帰を提供して、ＣＶＤのリスク要因及びＤＭ特性の調整前後の、糖尿病及び非糖尿病の個人のハプトグロビン表現型毎にＣＶＤイベントの確率を予測する。
【０１２９】
【表２】
2007516718.tif 000003
【０１３０】
全てのＣＶＤのリスク要因及びＤＭ特性の調整後のこれらのデータは、ストロング・ハート・スタディ参加者の内の糖尿病患者で、ハプトグロビン表現型２−２型の患者は、ＣＶＤイベントを有している可能性が、１−１型表現型（ｐ＝０．００１）の人より、４．７倍（１．８６−１１．８８  ＯＲ  ９５％  ＣＩ）高く、２−１型表現型（ｐ＝０．０２２）の人より、２．５倍（１．１４−５．６７  ＯＲ  ９５％  ＣＩ）高いことを示している。更に、ハプトグロビン表現型２−１型の患者は、ＣＶＤイベントを有している可能性が、１−１型表現型の患者より１．８倍（０．８６−３．９６  ＯＲ  ９５％  ＣＩ）高いが、統計的に有意ではなかった。総合すれば、これらのデータは糖尿病患者のＣＶＤの進展が、ハプトグロビン２型の対立遺伝子の数によって与えられる段階的なリスクの存在を示唆している。
【０１３１】
最後に、非糖尿病患者では統計学的には五分五分な傾向が観察されており、ハプトグロビン表現型２−２型の非糖尿病患者は、ＣＶＤイベントを有している可能性が、１−１型表現型（ｐ＝０．０７３）の非糖尿病患者より、３．０倍（０．９０−９．７７  ＯＲ  ９５％  ＣＩ）高いことを示している。
【０１３２】
表３はこれらの結果を要約している。
【０１３３】
【表３】
2007516718.tif 000004
【０１３４】
実施例ＩＩ
【０１３５】
ハプトグロビン表現型は、糖尿病患者の抗酸化療法の効果を予測する。
【０１３６】
ハプトグロビン表現型の検査を受けるＨＯＰＥサンプルの患者の特性：血漿が初めに保管されていた元のＨＯＰＥコホートから、患者３１７６人分（糖尿病は１０７８人）のハプトグロビン表現型が得られた。これらの患者は、ＨＯＰＥコホート全体からランダムに選択された一連の患者の代表であった。ＣＶＤのリスク要因及び投薬治療によるＨＯＰＥコホートの臨床特性は表４に示されている。
【０１３７】
【表４】
2007516718.tif 000005
【０１３８】
ＨＯＰＥコホートのこの小集団の基準特性は、全体コホートから著しく異ならなかった。ハプトグロビン表現型によって分類されたサンプルの基準特性は、基準人口統計、臨床又は治療特性に関して、著しい相違を示さなかった（表４）。
【０１３９】
Ｈｐ表現型のＣＶアウトカムへの影響：試験サンプル全体のハプトグロビン表現型（Ｈｐ１−１型  ４５／２５９  １７．４％、Ｈｐ２−１型  １１３／７３７  １５．３％、Ｈｐ２−２型  ９５／５８１  １６．４％、χ２のトレンド０．０８、Ｐ＝０．８７）によれば、抗酸化療法を受けなかった被験者において、主要な評価項目（非致死性ＭＩ、脳卒中又は心血管系死亡）の発生率に著しい相違はなかった。しかしながら、上述のストロング・ハート・スタディで報告された結果（例として、実施例Ｉ及び「Levy AP, et al. Haptoglobin phenotype is an independent risk factor for cardiovascular disease in individuals with diabetes: the strong heart study. J Am Coll Card 2002; 40: 1984-1990」を参照されたい。）と一致するが、抗酸化療法を受けなかったＨＯＰＥ試験のＤＭ患者については、Ｈｐ２型の対立遺伝子と関係がある主要な評価項目（非致死性ＭＩ、脳卒中又は心血管系死亡）のリスクが増加することを発見した（Ｈｐ１−１型  １３／７９  １６．５％、Ｈｐ２−１型  ４４／２２５  １９．６％、Ｈｐ２−２型  ４８／１８７  ２５．７％、χ２のトレンド５．６７、Ｐ＝０．０２）。
【０１４０】
ビタミンＥのＣＶアウトカムへの影響：表５はＣＶアウトカム（非致死性ＭＩ、脳卒中又は心血管系死亡）を、ビタミンＥ補給の有無、ハプトグロビン表現型との相関関係に関して、全患者及び糖尿病（ＤＭ）患者別に分析した結果を表している。
【０１４１】
【表５】
2007516718.tif 000006
【０１４２】
ＲＲＲはビタミンＥ無補給時と比較したビタミンＥ補給時のＣＶイベントのリスクの平均（９５％  ＣＩ）として与えられる。＊、Ｐ＜０．０５は統計的に有意。ＮＳ、統計的に有意ではない。
【０１４３】
試験されたサンプル全体において、ハプトグロビンの型が何であれ、いずれの主要なＣＶアウトカムにもビタミンＥの補給に伴う著しい効果はなかった（表５、全患者）。更に、以前の報告（The Heart Outcomes Prevention Evaluation Study Investigators. Vitamin E supplementation and cardiovascular events in high-risk patients. N Eng J Med 2000; 342: 154-160）のように（表５、ＤＭ患者）、任意抽出のＤＭ患者グループでは、ビタミンＥの補給に著しい効果はなかった。意外にも、ハプトグロビン２−２型表現型を有するＤＭ患者において、ビタミンＥ療法がＣＶによる死亡のリスクを著しく低下させ（ＲＲ０．４５、９５％  ＣＩ  ０．２３−０．９０；Ｐ＝０．００３）、非致死性心筋梗塞（ＭＩ）のリスクも著しく低下させた（ＲＲ０．５７、９５％  ０．３３−０．９７；Ｐ＝０．０２）。その一方で、他のハプトグロビン表現型（Ｈｐ１−１型及びＨｐ２−１型）を有するＤＭ患者では、いずれの主要なＣＶアウトカムに対してもビタミンＥ療法の著しい効果は示されなかった。
【０１４４】
ラミプリルのＣＶアウトカムへの影響：表６はＣＶアウトカム（非致死性ＭＩ、脳卒中又は心血管系死亡）を、ラミプリル補給の有無、ハプトグロビン表現型との相関関係に関して、全患者及び糖尿病（ＤＭ）患者別に分析した結果を表している。
【０１４５】
【表６】
2007516718.tif 000007
【０１４６】
＊、Ｐ＜０．０５は統計的に有意。ＮＳ、統計的に有意ではない。ＲＲＲはラミプリル無補給時と比較したラミプリル補給時のＣＶイベントのリスクの平均（９５％  ＣＩ）として与えられる。
【０１４７】
サンプル全体の分析から明らかなように、ハプトグロビンの型が何であれ、いずれの主要なＣＶアウトカムにもラミプリルの補給に伴う著しい効果はなかった（表６、全患者）。そして、ビタミンＥの効果と同様に（表５、ＤＭ患者）、任意抽出のＤＭ患者グループでは、ラミプリルの補給に著しい効果はなかった。意外にも、脳卒中、ＣＶによる死亡及び心筋梗塞からなる主要な評価項目に対するラミプリルからの著しい効果が、ハプトグロビン２−２型表現型を有する糖尿病（ＤＭ）患者だけに認められた（ＲＲ０．５７、９５％  ＣＩ  ０．３６−０．９０；Ｐ＜０．０５）。他のハプトグロビン表現型（Ｈｐ１−１型、Ｈｐ１−２型）では、いずれの主要なＣＶアウトカムに対してもラミプリルによる効果はなかった（表６）。
【０１４８】
本発明のいくつかの特徴は、その内容を明確にするために実施態様を分けて記載されているが、それらを組み合わせた単一の実施態様で提供されても良いことを理解されたい。反対に、本発明の様々な特徴は、その説明を簡潔にするために単一の実施態様として記載されているが、別の即ちいくつかの好適なサブコンビネーションで提供されても良い。
【０１４９】
本発明は、特定の実施態様を基に記載されているが、多くの選択肢、変更及び変化があることは、当業者には明らかである。従って、そのような選択肢、変更及び変化の全てを含むことは、本願明細書に記載の請求項の精神と範囲を逸脱しない。本願明細書に記載された全ての出版物、特許及び特許出願は、あらゆる面においてここに言及したことで本願の一部とする。同様に、各出版物、特許又は特許出願が具体的及び個別に示されている場合も、ここに言及したことで本願の一部とする。加えて、本願明細書中では、様々な参考文献を引用し、或いは特定しているが、それらが本発明に対する従来技術であると自ら認めたものであると解釈しないでいただきたい。
【０１５０】
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【国際調査報告】
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