(57)【要約】  本発明は、肺送達を介してアンチトロンビンIIIを投与することにより、肺の炎症および損傷などの肺疾患を有する対象を治療する方法に関する。
2007518801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において急性肺損傷を治療する方法であって、
肺損傷が治癒するように治療有効量のアンチトロンビンIIIを吸入によって投与することを含むことを特徴とする治療法。  
【請求項２】
前記肺損傷が敗血症性急性肺損傷であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記肺損傷が急性呼吸窮迫症候群（ARDS）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記肺疾患が、ウイルス性物質への暴露に応答して生じたものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルス性物質がシュードモナス・ニューモニア（Pseudomonas  pneumonia）であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記肺損傷は、1種もしくはそれ以上の煙およびアスベストに応答して生じたものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
超音波ネブライザーを用いてアンチトロンビンIIIを投与することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記アンチトロンビンIIIは、血漿由来のアンチトロンビンIIIであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記アンチトロンビンIIIは、組換え産生アンチトロンビンIIIであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えアンチトロンビンIIIは、遺伝子導入によって産生されたアンチトロンビンIIIであることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
対象に1投与量より多くのアンチトロンビンIIIを投与することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
アンチトロンビンを体重1kgあたり約10〜300Uの投与量範囲で投与することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
アンチトロンビンを体重1kgあたり約25〜125Uの投与量範囲で投与することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
ATIIIおよびアルガトロバンを用いて肺損傷を治療することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
治療する肺損傷は、煙の吸入によって生じたものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
治療する肺損傷は、肺の火傷によって生じたものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質を含む組成物を用いてヒトの急性肺損傷を治療する方法であって、該タンパク質は、ATIIIを含む導入遺伝子DNA構築体によってコードされていることを特徴とする治療法。
【請求項１８】
タンパク質を含む組成物を用いてヒトの急性肺損傷を治療する方法であって、該タンパク質は、ATIIIを含む導入遺伝子DNA構築体によってコードされており、薬剤学的に実質的に純粋な該タンパク質の組成物を有効量のアルガトロバンと共に用いて患者を治療することを含むことを特徴とする治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、2004年1月23日に受理された米国特許出願USSN 60/538,678号に基づき優先権を主張し、該出願の内容を参照として本明細書中に取り入れておく。
【背景技術】
【０００２】
炎症性の肺疾患の場合には、気道にフィブリンが見出される。肺胞でのフィブリン形成は、急性および／または慢性の炎症性肺疾患の特徴であることが知られている。炎症を起こしている状態においては、肺血管の透過性が高まっているので、血漿滲出物が気道に入る。滲出した血漿中のフィブリノーゲンは、活性化された肺胞のマクロファージ（非特許文献１）および上皮細胞（非特許文献２）の表面に発現された組織因子によって活性化され、それによって気道中に血栓が形成される。気管支内のフィブリンは、いくつかの点において肺の病理に関与している。第一に、フィブリンは換気を阻止する。発明者らは、ヒツジが煙吸入および肺炎を起こした後は、40％以上の気管支および細気管支が、フィブリンを含む円柱によって遮断されていることを示した（非特許文献３）。肺が部分的に遮断されると、換気の不一致が生じてガス交換の効率が低下する。患者が機械的に換気を行っている場合には、肺の換気された部分が過度に拡張し、気圧性外傷を引き起こすことがある。第二に、フィブリンは、肺表面活性物質の活性を阻害する（非特許文献４）。気道の遮断を阻止し、遮断に続いて生じる急性肺損傷を防ぐには、ヘパリン噴霧療法が有効であることが知られている（非特許文献５）。しかしながら、ヘパリン噴霧療法は、煙の吸入によって誘導された急性肺損傷には効果がないことを示唆する報告がある（非特許文献６）。発明者らはこの矛盾の理由について、ヘパリンの抗凝固能はアンチトロンビン依存性であり、抗トロンビン活性は、他の作用において正しく考慮されていなかったからだと考えている。
【０００３】
フィブリン円柱による気道の遮断は、煙の吸入によって誘導された急性肺損傷（ALI）においては重大な問題である。気道円柱の形成阻止は、臨床転帰に関して重要である。発明者らは、ヒツジの煙吸入モデルにおいて、気道遮断を阻止するためにはヘパリン噴霧療法が有効であったことを報告している。しかしながら、ヘパリンの抗凝固能はアンチトロンビン依存性であることから、ヘパリンが常に有効なわけではなく、本発明に従う方法を使用することにより、治療結果を向上させることができた。
【０００４】
アンチトロンビンは、生理的セリンプロテアーゼ阻害剤であり、トロンビンを阻止するだけでなく、凝固因子Xa、IXa、XIaおよびXIIaをも阻止する。ヘパリンは、アンチトロンビンの阻害反応を数千倍も増強する。故に、気道中に適量のアンチトロンビンがなければ、エアロゾル化したヘパリンはフィブリン形成を阻害せず、煙または火傷による肺損傷の治療に対する効果はほとんどない。本発明に従えば、アンチトロンビンの噴霧は、煙の吸入による損傷および／もしくは火傷による損傷の治療においてより有効かつ信頼性があり、そのような肺疾患に対する請求項記載の治療法は、より効果的である。
【非特許文献１】Sitrin,R.G., P.G. Brubaker, J.E. Shellito, and H.B. Kaltreider, 1986. The distribution of procoagulant and plasminogen activator activities among density fractions of normal rabbit alveolar macropharges. Am. Rev. Respir. Dis., 133(3):468-472
【非特許文献２】Gross,T.J.、R.H. Simon, and R.G. Sitrin, 1992, Tissue factor procoagulant expression by rat alveolar epitherial cells, Am. J. Respir. Cell Moll. Biol., 6(4):397-403
【非特許文献３】Murakami,K., L.J.Bjertnaes, F.C.Schmalstieg, R. McGuire, R.A.Cox, H.K.Hawkins, D.N.Herndon, L.D.Traber, and D.L.Traber, 2002, A novel animal model of sepsis after acute lung injury in sheep, Crit.Care Med.,30(9):2083-2090
【非特許文献４】Seeger,W., C. Grube, and A. Gunther, 1993, Proteolytic cleavage of fibrinogen:amplification of its surfactant inhibitory capacity, Am. J. Respir. Cell Moll. Biol, 9(3):239-247
【非特許文献５】Murakami,K., R.McGuire, R.A. Cox, J.M.Jodoin, L.J.Bjertnaes, J.Katahira, L.D.Traber, F.C.Schmalstieg, H.K.Hawkins, D.N.Herndon, and D.L.Traber, 2002, Heparin nebulization attenuates acute lung injury in sepsis following smoke inhalation in sheep, Shock,18(3):236-241
【非特許文献６】Tasaki,O, D.W.Mozingo, M.A.Dubick, C.W.Goodwin, L.D.Yantis, and B.A.Pruitt, Jr. 2002, Effect of heparin and lisofylline on plumonary function after smoke inhalation injury in an ovine model, Crit. Care Med., 30(3):637-643
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、部分的には、エアロゾル化したアンチトロンビンIII（ATIII）が、肺の炎症および損傷などの肺疾患の治療に有効であるという発見に基づく。急性敗血症性肺損傷の治療においては、静脈投与した高投与量のATIIIよりも、エアロゾル化した低投与量のATIIIの方がより有効であることがわかった。故に、肺の炎症および損傷などの肺疾患の治療法としては、吸入によるATIIIの投与は、静脈投与より有効である。
【０００６】
本発明のアンチトロンビンの好ましい実施態様に従えば、特に、エアロゾル化したアンチトロンビンは気道遮断を防ぐという点において、ヘパリンまたはその他の物質よりもより有効な抗凝固因子であることがわかった。このことは、煙吸入によって誘導したヒツジALIモデルにおいて、特異的な合成トロンビン阻害剤であるアルガトロバン（argatroban）に対してエアロゾル化アンチトロンビンの試験を行った場合でも正しいことがわかった。
【０００７】
アンチトロンビンおよびアルガトロバンの噴霧により、気道遮断が阻害され、ガス交換が弱められた。さらに、アンチトロンビンは抗炎症効果を有すると考えられ、その結果、肺の炎症および続いて生じる水腫の形成を弱める。
【０００８】
従って、ひとつの側面から見ると、本発明は、肺の炎症および／もしくは損傷などの肺疾患を有する対象の治療法に関し、そのような方法は、吸入によって治療有効量のATIIIを投与することを含む。肺疾患としては、急性または慢性の肺疾患が挙げられる。ひとつの実施態様においては、肺疾患は、敗血症性急性肺損傷もしくは急性気道窮迫症候群（ARDS）、または気道遮断などの急性肺損傷である。肺損傷および／もしくは炎症は、例えば、ウイルス（例えば、シュードモナス・ニューモニア（Pseudomonas pneumonia）など）、煙またはアスベストなどのような外来物質への暴露などに応答して生じる。別の実施態様においては、肺疾患は、肺もしくは胸膜の腫瘍形成、間質性肺疾患および／または器質化胸膜炎などである。
【０００９】
ひとつの実施態様においては、ATIIIは、ジェットエアロゾル装置もしくは超音波ネブライザー装置を用いることにより、または、乾燥粉末吸入装置によって投与する。エアロゾル投与用のそのような装置は既知である。
【００１０】
ひとつの実施態様においては、ATIIIは、ヒトATIIIである。ATIIIとしては、血漿などの天然由来のもの、または組換えによって産生されたものを用いることができる。血漿由来のATIIIは市販されている。好ましい実施態様においては、アンチトロンビンIIIは、トランスジェニック産生されたものであり、例えば、ウシ、ヤギ、ウサギまたはマウスなどのトランスジェニック酪農動物から得られる乳汁由来のものなどである。トランスジェニック動物の乳汁からATIIIを生成する方法については、米国特許第5,843,705号に記載されており、該特許の内容を参照として本明細書中に取り入れておく。
【００１１】
好ましい実施態様においては、ATIIIおよび薬剤学的に許容されるキャリヤーを含むエアロゾル組成物を対象に投与する。薬剤学的に許容されるキャリヤーの例としては、水および生理食塩水などが挙げられる。
【００１２】
ひとつの実施態様においては、吸入により、対象に周期的にATIIIを投与するが、そのような方法としては、一定の間隔で対象にATIIIを投与する方法などである。例えば、対象が肺の炎症を発症したとき、および／もしくは損傷を受けた時にエアロゾルATIIIを投与し、次に、初回投与後から定間隔（例えば、1時間毎、2時間毎、3時間毎、4時間毎、6時間毎、１日2回、1日3回、1日4回、1日5回、1日6回など）で投与することができる。投与期間は、約24時間、48時間、72時間、96時間、120時間、144時間または168時間以上である。別の実施態様においては、必要に応じて、例えば、肺の炎症または損傷についてのひとつもしくはそれ以上の症状の継続または再燃の場合に、対象にATIIIを投与する。
【００１３】
ATIII（例えば、組換え産生ATIIIなど）の有効投与量は、約10〜300U/Kg、25〜125U/Kg、50〜100U/Kgまたは60〜75U/Kgである。別の側面から見ると、有効投与量は約1mg/kg以上、約5mg/kg以上、約10mg/kg以上であるが、約150mg/kg以下、約100mg/kg以下、約70mg/kg以下である。
【００１４】
好ましい実施態様においては、使用するエアロゾルATIIIの投与量は、肺の炎症または損傷のひとつもしくはそれ以上の症状に対する効果と同様な効果を有するような同様の疾患を治療するために静脈投与するATIIIの投与量の10％、20％、30％、40％、50％または60％以下である。
【００１５】
本発明に従えば、アンチトロンビンおよびアルガトロバンを噴霧することにより、気道遮断が阻害され、ガス交換が低下した。それらに加え、アンチトロンビンは、さらに強化された抗炎症作用を有しており、その結果、肺の炎症およびそれに続く浮腫の形成が非常に弱められた。さらに、アンチトロンビンおよびアルガトロバンを一緒に使用して煙吸入および／もしくは火傷による肺損傷を治療した場合には、相乗効果が得られた。
【００１６】
ひとつの実施態様においては、本発明は、肺損傷を治療するためのキットに関する。好ましくは、キットは、治療有効量のエアロゾル型ATIIIおよび使用指示書を含む。好ましくは、エアロゾルは、薬剤学的に許容されるキャリヤーを追有する。薬剤学的に許容されるキャリヤーの例としては、水および生理食塩水などが挙げられる。
【００１７】
ひとつの実施態様においては、ATIII（例えば、組換え産生ATIIIなど）の有効投与量は、約10〜300U/Kg、25〜125U/Kg、50〜100U/Kgまたは60〜75U/Kgである。別の側面から見ると、有効投与量は約1mg/kg以上、約5mg/kg以上、約10mg/kg以上であるが、約150mg/kg以下、約100mg/kg以下、約70mg/kg以下である。
【００１８】
ひとつの実施態様においては、キットは、急性または慢性肺疾患の治療用キットである。好ましくは、肺疾患は、敗血症性急性肺損傷もしくは急性気道窮迫症候群（ARDS）などの急性肺疾患である。肺損傷および／もしくは炎症は、ウイルス性物質（シュードモナス・ニューモニア（Speudomonas pneumonia）など）、煙またはアスベストなどの外的物質への暴露などに応答して生じる。別の実施態様においは、肺疾患は、肺もしくは胸膜の腫瘍形成、間質性肺疾患および／または器質化胸膜炎などである。
【００１９】
ひとつの実施態様においては、キットは、ジェットエアロゾル装置もしくは超音波ネブライザー装置、または、乾燥粉末吸入装置に充填されたATIIIを含む。
【００２０】
ひとつの実施態様においては、キットは、ヒトATIIIのエアロゾル型を含む。ATIIIとしては、血漿などの天然由来のもの、または組換えによって産生されたものを用いることができる。血漿由来のATIIIは市販されている。好ましい実施態様においては、アンチトロンビンIIIは、トランスジェニック産生されたものであり、例えば、ウシ、ヤギ、ウサギまたはマウスなどのトランスジェニック酪農動物から得られた乳汁由来のものなどである。
【００２１】
本発明のひとつもしくはそれ以上の実施態様の詳細については、図面および以下の記述において述べている。本発明のその他の特徴、目的および長所については、請求項、以下の説明および図面から明らかである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下の略号は、本明細書において、特定の意味で使用されている：
略号表：
体細胞核移植（SCNT）
核移植（NT）
合成卵管液（SOF）
ウシ胎仔血清（FBS）
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
ウシ血清アルブミン（BSA）
用語の説明：
ウシ−ウシの多様な種または関連種
生体液−哺乳類、鳥類、両生類または爬虫類などの生体によって産生される水性溶液であって、水性溶液に浸漬されている細胞によって分泌されるタンパク質を含有する。例えば、乳汁、尿、唾液、精液、膣液、滑液、リンパ液、羊水、血液、汗および涙などが挙げられ、さらに、植物によって産生される水性溶液、例えば、浸出液および排水液、木部、支部、樹脂および花蜜などが挙げられる。
【００２３】
生体液産生細胞−生体液に浸漬されている細胞であって、生体液中にタンパク質を分泌するもの。
【００２４】
生体薬剤学的−任意の薬剤、治療剤、ワクチンまたは薬剤学的に有用な任意の組成物であって、それらの起源、合成または製造において、微生物、組換え動物（キメラまたはトランスジェニック動物などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない）、核移植、マイクロインジェクションまたは細胞培養技術を使用したもの。
【００２５】
ヤギ−ヤギの多様な種または関連種
コードされている−一般的には、翻訳可能な様式で存在する配列情報であって、通常は、機能発揮できるようにプロモーターに連結されている。機能性プロモーターが、ある配列の転写または発現を促進する場合に、ある配列は、機能発揮できるようにプロモーターに連結されているという。アクセス可能な様式で同一情報が存在していることから、特に、センス鎖の発現を促進する配列に連結されている場合には、アンチセンス鎖も配列をコードしていると考えられる。情報は、標準または変形遺伝子コードを用いて変換可能である。
【００２６】
発現ベクター−バクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスまたは人工染色体などに由来する遺伝子操作されたプラスミドまたはウイルスであって、これらを用い、機能発揮できるようにプロモーターに連結されているATIIIタンパク質コード配列を宿主細胞に転移させ、宿主細胞内でコードされている組換えATIIIタンパク質を発現させる。
【００２７】
機能性タンパク質−内分泌された場合に観察されるものと同様の生物学的もしくはその他の活性、または用途を有するタンパク質。
【００２８】
スライド−一定の間隔で並べられた平行電極用のガラススライド。電極の間に細胞対を置き、活性化用電流を流す。
【００２９】
相同配列−比較した場合に類似している遺伝子配列。核酸における相同性の基準は、当該分野において通常使用されている相同性の測定、またはハイブリダイゼーション条件である。核酸における実質的な相同性とは、比較を行った場合に、ヌクレオチドの適切な挿入もしくは欠失を伴って最適に並べられた場合に、セグメントまたはそれらの相補鎖が、残基のうちの少なくとも約60％、通常は少なくとも約70％、より一般的には少なくとも約80％、好ましくは少なくとも約90％、さらにより好ましくは少なくとも約95〜98％一致していることを意味する。別の場合においては、選択されたハイブリダイゼーション条件下において、セグメントがある鎖またはその相補鎖にハイブリダイズする場合に実質的に相同である。全体的に選択性が欠如している状態よりも、より高い選択性を伴ってハイブリダイゼーションが生じる場合に、ハイブリダイゼーションの選択性が存在する。一般的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約14個のヌクレオチド中での相同性が少なくとも約55％である場合、好ましくは少なくとも約65％、より好ましくは少なくとも約75％、最も好ましくは少なくとも約90％である場合に生じる。
【００３０】
リーダー配列または「シグナル配列」−タンパク質分泌シグナルをコードしている核酸配列であって、ATIIIタンパク質をコードしている下流の核酸分子に機能発揮できるように連結されており、ATIIIの分泌を指図する。リーダー配列は、天然のヒトATIIIリーダー、人工的に作出されたリーダー、または、ATIIIコード配列の転写を指図するためにに使用されたプロモーターと同一の遺伝子由来、もしくは細胞から正常に分泌される別のタンパク質由来のものを用いることができる。
【００３１】
乳汁産生細胞−乳汁にタンパク質を分泌する細胞（哺乳類表皮細胞など）。
【００３２】
乳汁特異的プロモーター−乳汁にタンパク質を分泌する細胞（哺乳類表皮細胞など）内の遺伝子の発現を指示するプロモーターであり、例えば、カゼインプロモーター類（αS-1カゼインプロモーターおよびαS-2カゼインプロモーターなどのαカゼインプロモーター、ヤギβカゼイン遺伝子プロモーター（ディテュリオ（DiTullio）、Biotechnology,10:74-77,1992）などのβカゼインプロモーター、γカゼインプロモーターおよびκカゼインプロモーターなど）；乳清酸性タンパク質（WAP）プロモーター（ゴートン（Gorton）ら、Biotechnology,5:1183-1187,1987）；β−ラクトグロブリンプロモーター（クラーク（Clark）ら、Biotechnology,7:487-492,1989）；およびα−ラクトアルブミンプロモーター（ソウリアー（Soulier）ら、FEBS.Letts.,297:13,1992）などが挙げられる。さらに、乳腺組織内で特異的に活性化されるプロモーターも含まれ、それらも本発明に有用であり、そのようなものとしては例えば、マウス乳癌ウイルス（MMTV）の長末端反復（LTR）プロモーターなどが挙げられる。
【００３３】
核酸移植−ドナー細胞から除核された卵母細胞へ核を移植する際のクローニング法。
【００３４】
機能発揮できるように連結されている−適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質など）が制御配列に結合している場合に、遺伝子ならびにひとつもしくはそれ以上の制御配列が、遺伝子発現を行わせるような様式で連結されている。
【００３５】
ヒツジ−ヒツジまたは関連種。
【００３６】
単為生殖性−卵母細胞由来の胚が精子の侵入無しに発達する。
【００３７】
薬剤学的に純粋−正確な生物学的試験、およびヒト患者への有効治療のための適切な投与に適したタンパク質。薬剤学的に実質的に純粋とは、少なくとも約99％純粋であることを意味する。
【００３８】
ブタ−子豚もしくはブタ、または関連種。
【００３９】
プロモーター−転写を指示するのに必要な最小限の配列。本発明においては、プロモーター依存性の遺伝子発現に対して、細胞型特異的、組織特異的、時間特異的に制御可能な、または、外的シグナルもしくは物質によって誘導可能なプロモーターエレメントをも含む。そのようなエレメントは、生来の遺伝子の５’もしくは３’位置またはイントロン配列領域に存在している。
【００４０】
タンパク質−本発明においては、糖タンパク質およびその他の付加物を有するタンパク質を含む。生理学的機能を保持しているフラグメントもしくは切断ポリペプチドをも含む。
【００４１】
治療有効量−治療分子もしくはそれらのフラグメントの量であって、患者に投与した場合に、そのような分子によって調節される生物学的活性を阻害または刺激する。
【００４２】
形質転換、「トランスフェクション」または「形質導入」−細胞内に外来分子を導入するための任意の方法。リポフェクション、DEAE−デキストラントランスフェクション、マイクロインジェクション、核移植（例えば、キャンベル（Campbell）ら、Biol.Reprod.,49:933-942,1993；キャンベル（Campbell）ら、Nature,385:810-813,1996などを参照）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降法、形質導入（例えば、バクテリオファージ、アデノウイルス性レトロウイルス、またはその他のウイルス性送達体など）、エレクトロポレーションおよびバイオリスティック形質転換（biolistic transformation）などは、当該分野において使用される既知の方法の一例であり、利用可能である。
【００４３】
形質転換細胞またはトランスフェクト細胞−組換えDNA技術を用いて、ATIIIをコードしている核酸分子を導入された細胞、またはそのような細胞の子孫。核酸分子は、宿主染色体に安定に取り込まれ、または、エピソームとして維持される。
【００４４】
導入遺伝子−ある細胞またはそれらの祖先に実験的に挿入された任意の核酸分子片であって、そのような細胞から発達する動物のゲノムの一部となるもの。そのような導入遺伝子は、トランスジェニック動物にとって部分的に、もしくは全体としてよそ者（すなわち、外来性）である遺伝子を含んでいるか、あるいは、該動物の内在性遺伝子と一致する遺伝子を表現する。
【００４５】
トランスジェニック−ある細胞またはそれらの祖先に実験的に挿入された核酸分子を含む任意の細胞であって、そのような細胞から発達する動物のゲノムの一部となるもの。
【００４６】
トランスジェニック生物−宿主がその遺伝子集合体内に既に持っている遺伝子情報に加え、移植された遺伝子のそれをその染色体内に所有するように、別の生物から遺伝子材料を実験的に移植された生物。
【００４７】
有蹄類−蹄があり、一般的には草食性、四つ足の哺乳類またはそれらに関連する動物であり、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシおよびウマなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００４８】
ベクター−本明細書においては、（1）宿主細胞内で複製可能、（2）宿主細胞の形質転換可能、および（3）形質転換細胞を確認するための適切なマーカーを含むようなプラスミド、ファージDNAまたはその他のDNA配列を意味する。
【００４９】
本発明に従えば、ATIIIのエアロゾル型を使用することにより、静脈投与されたATIIIよりも低投与量で、急性敗血症性肺損傷が軽減されることがわかった。従って、本発明は、ATIIIを含有するエアロゾル製剤、ならびに、そのようなエアロゾル型ATIIIを用いて肺損傷または炎症などの肺疾患を有する対象を治療する方法に関する。
【００５０】
組換えヒトアンチトロンビン（ATIII）およびアルガトロバンの噴霧は、気道遮断を防ぐ上で有用であり、また、煙吸入による損傷に続いて肺炎を起こした後のガス交換の改善にも有効であった。さらに、ATIIは、肺の炎症を軽減し、続いて水腫の形成も減少させた。ATIIIの量は、静脈投与における有効量よりも少なかった。本明細書に示されているデータに従えば、さらに、本発明の好ましい実施態様に従えば、出血傾向を含む副作用は観察されなかった。故に、エアロゾル型ATIIIの噴霧は、煙吸入の治療に対する新規、かつより効果的な治療法である。
【００５１】
本明細書において使用している「治療する」または「治療」とは、肺疾患に関連するひとつもしくはそれ以上の症状を緩和するまたは軽減することをさす。例えば、肺損傷および／もしくは炎症の症状としては次のようなものが挙げられる：1）肺のガス交換の低下
；2）肺のシャント画分の減少；3）細胞外でのフィブリン沈着；4）血管透過性の増加；5）リポタンパク質表面活性物質の沈着減少；6）組織の再構成；7）凝集；および／または8）肺胞圧の上昇など。本明細書において使用しているように、肺疾患の治療に有効なエアロゾル型ATIIIの量、または「治療有効量」とは、本明細書に記載されているような肺疾患を有する患者に対して単回もしくは複数回投与を行った場合に、治療を行わなかった場合よりも疾患の治癒、緩和、軽減または改善に関して効果的であるようなATIIIの量をさす。
【００５２】
ATIIIは、乾燥粉末製剤などとして単独で、または薬剤学的に許容されるキャリヤーと共に投与することができる。薬剤学的に許容されるキャリヤーとしては、例えば、滅菌水、生理食塩水およびアルコール類などが挙げられる。ATIIIの薬剤学的エアロゾル組成物は、その他の治療剤（例えば、肺の炎症もしくは損傷を緩和または軽減するようなその他の物質など）、あるいは、その他の薬剤学的アジュバント、希釈剤などを追有することができる。ATIIIは、リポソームとのコンプレックスとして、またはリポソーム内に封入して投与することができる。
【００５３】
吸入による投与を行うためには、適切な噴射剤（例えば、二酸化炭素などの気体など）を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾルスプレーの形で化合物を送達することができる。本明細書において使用している「エアロゾル」とは、固体または液体の粒子が空気中に分散しているものをさし、そのような粒子は、空気伝送安定性を持たせるために、粒子径が十分に小さく、従って沈降粘度が低い（ナイト（Knight）,V.ら、「気道のウイルスおよびマイコプラズマ感染（Viral and Mycoplasmal Infections of the Respiratory Tract）」、リー（Lea）およびフェビガー（Febiger）、ペンシルバニア州フィラデルフィア、pp.2を参照）。
【００５４】
ATIIIの噴霧は、ガス圧または超音波によって行うことができる。一般的に言えば、ネブライザーは、エアロゾルの投与を可能にする装置である。任意の型のネブライザーを用いることができ、それらの構造は当該分野において既知であり、そのような装置は市販されている。本発明に従うエアロゾルは、既知の多様な噴霧化技術を用いてATIII含有液を噴霧化することによって調製することができる。ひとつの噴霧化系は「WO−相」系であり、これは、液体噴射剤中に活性材料の溶液または懸濁液を含む。液体および気体相は加圧容器内に入れられており、容器の弁が開くと、溶液または懸濁液を含んだ液体噴射剤が放出される。これにより、細かいエアロゾルミストまたはエアロゾルウェットスプレーが得られる。
【００５５】
エアロゾルを放出することができるネブライザーとしては、小容量ネブライザーを含む多様なものが存在する。コンプレッサー稼働性ネブライザーは射出技術を取り入れており、加圧空気もしくは医療用酸素を用いてエアロゾルを調製する。市販されている装置は、ヘスルダイン・テクノロジーズ（Healthdyne Technologies）社、インヴァケア（Invacare）社、マウンテン・メディカル・エクィプメント（Mountain Medical Equipment）社、パリ・レスピラトリー（Pari Respiratory）社、マダ・メディカル（Mada Medical）社、ピューリタン−ベネット（Puritan-Bennet）社、シューコ（Schuco）社、オムロン・ヘルスケア（Omron Healthcare）社、デ・ヴィルビス・ヘルスケア（De Vilbiss Health Care）社、およびホスピタック（Hospitak）社などから購入可能である。超音波ネブライザー（水晶結晶を用いた高頻度振動超音波型ネブライザーなど）を用いてATIIIを送達することもできる。
【００５６】
そのようなATIIIエアロゾルの毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物を用い、LD50（集団の50％が死亡する投与量）およびED50（集団の50％において治療効果が得られた投与量）を求めるなどの標準的な薬剤学的手法によって判断することができる。毒性量と治療量との間の比が治療指数であり、LD50/ED50で表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を使用することができるが、そのような場合には、未感染の細胞に損害を与える可能性を最小限にし、副作用を軽減することを目的として、そのような化合物が作用組織部位を標的にするように、注意を払って送達系を設計する必要がある。
【００５７】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトに使用するための投与量範囲で製剤化することができる。そのような化合物の投与量は、ほとんどもしくは全く毒性を示さないED50値を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。投与量は、採用した投与剤型、および使用した投与経路によって異なる。本発明に従う方法において使用するいずれの化合物に対しても、治療有効投与量は、始めに細胞培養アッセイから確立することができる。投与量は動物モデルにおいて調整され、細胞培養において求められたIC50値（すなわち、症状の半分を阻害することができる被験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得ることができる。そのような情報を用い、ヒトにおける有用な投与量をより正確に求めることができる。血漿中の濃度は、高速液体クロマトグラフィーなどを用いて測定することができる。
【００５８】
ATIIIの投与量を決定するためのその他の方法としては、ATIIIを用いて治療を行う前に、対象体内の循環ATIIIレベルを測定することが挙げられる。循環ATIIIレベルに基づき、初期の循環レベルより50％増し、100％増し、150％増し、250％増し、300％以上増しになるようにATIIIの投与量を調製することができる。
【００５９】
一般的には、エアロゾル製剤の投与量は、体重1kgあたり、約10U/kg〜約250U/kg、好ましくは約25U/kg〜約175U/kgである。
【００６０】
当業者であれば、対象の効果的な治療に必要な投与量およびタイミングは、ある種の因子によって影響を受けることは理解できるはずであり、そのような因子としては、疾病もしくは疾患の重篤度、従前の治療、一般的な健康状態および／もしくは対象の年齢、ならびに併発しているその他の疾患などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。さらに、治療有効量のタンパク質、ポリペプチドまたは抗体を用いた対象の治療には、単回治療あるいは好ましくは、連続治療が含まれる。
【実施例】
【００６１】
実施例１
組換え産生したATIIIを生理食塩水に溶解した（42mg/ml）。雌のヒツジを用いた（n＝24）。綿埃（cotton smoke）（＜40℃）を48回呼吸させた後、緑膿菌（P.aeruginosa）（5×1011CFU）を両肺に点滴注入した。全ての個体は、100％O2を用いて機械的に換気させた（一回の換気量15ml/kg、30回／分、PEEP 5cmH2O）。損傷を受けてから2、4、8、12、16および20時間後に、超音波ネブライザーを用いて組換えアンチトロンビン（n＝6）、アルガトロバン（n＝8）または同容量の通常生理食塩水（n＝10）を噴霧した。実験中に死亡した個体はなかった。PaO2/FiO2比、肺シャント画分、組織学的気道遮断スコアは、アンチトロンビンおよびアルガトロバンによって全て低下した。しかしながら、組織病理学的変化および肺の湿潤／乾燥重量比は、アンチトロンビンによってのみ低下し、アルガトロバンでは低下しなかった。
【００６２】
材料および方法
材料：ヒト組換えアンチトロンビン（ATIII）（7,8）は、GTCバイオセラピューティクス（GTC Biotherapeutics）（マサチューセッツ州フラミンガム）から贈与された。アルガトロバンは、第一製薬（Daiichi Pharmaceutical）（日本国東京）から購入した。その他全ての試薬は分析等級のものを用いた。
【００６３】
動物の準備：テキサス大学医学部の動物保護および使用委員会（The Animal Care and Use Committee of The University of Texas Medical Branch）は、本明細書に報告されている実験を承認した。全ての動物は、アメリカ生理学学会（American Physiological Society）および国立衛生試験所（National Institutes of Health）によって確定されたガイドラインの範囲内で扱った。既に記載しているように（9）、24匹の雌のヒツジについて、ハロタン麻酔下で外科的処置を行った。ベースライン心血管データを測定した後、既に記載しているように（3）、ヒツジに煙吸入と細菌点滴注入による組み合わせ損傷を与えた。この動物モデルは、重篤な急性肺損傷および急激な心血管応答を呈し、これらの症状はヒトの敗血症の場合を模倣したものである。
【００６４】
端的に述べると、綿埃（cotton smoke）に暴露（12呼吸を4回繰り返し、＜40℃）させた後、緑膿菌（P.aeruginosa）（5×109/kg）を気管支内に点滴注入した。煙吸入および細菌点滴注入後、動物をランダムに2つの治療群に分けた。ATIII噴霧群（n＝6）、アルガトロバン噴霧群（n＝8）および生理食塩水噴霧対照群（n＝10）。24時間の実験中、全ての個体は100％酸素で機械的に換気させた（一回の換気量12〜15ml/kg、30回／分、PEEP 7.5cmH2O）。一回の換気量は、PaCO2を正常に維持するように調整した。リンゲル乳酸塩液を十分量注入してヘマトクリット値の上昇を防いだ。最初は、2ml/kg/hでリンゲル乳酸液を注入し、ヘマトクリット値に基づいて10ml/kg/hまで増量した。生理食塩水処置対照群、アンチトロンビン処置群およびアルガトロバン処置群の体重（kg）は、それぞれ、39.3±3.1、37.2±2.6、および36.2±1.4であった（有意差無し）。
【００６５】
処置−組換えヒトアンチトロンビン（rhAT）は、蒸留水に溶解した（250mg/30ml）。次に、ATIII溶液を60mlの生理食塩水と混合し、41.7mgのATIIIを含有する混合液15mlを4時間毎に噴霧した。アルガトロバンは、食塩水と混合し（10mg/90ml）、その15ml（含有量は1.67mg）を4時間毎に噴霧した。対照群には、同様に15mlの生理食塩水を噴霧した。溶液は、超音波ネブライザー（Ultra-Neb99、デ・ヴィルビス（De Vilbiss）社、ペンシルバニア州ソマセット）を用いて噴霧したが、該ネブライザーは、従前の記載（10）に従って気管気管支樹に連結した。ネブライザーによって得られた粒子径は、4ミクロン以下と報告されている。噴霧は、損傷を起こさせてから1時間後に開始し、その後4時間毎に行った。
【００６６】
血漿NO2/NO3（NOx）の測定：血漿中のNOx濃度（窒素酸化物代謝物の総量）は、従前の記載に従い（11）、化学発光NO分析器（Antek、モデル7020）を用いて測定した。
【００６７】
血液培養および凝固パラメーター：動脈血を培養して菌血症を調べた（Septi-check、ベクトン・ディッキンソン（Becton-Dickinson）社、メリーランド州スパークス）。ヘパリン加血サンプルは、ベースラインならびに3、6、12および24時間目に、大腿動脈カテーテルから注意深く採取した。
【００６８】
活性化凝固時間は、ベースラインならびに損傷を起こさせてから12および24時間後に、Hemochron モデル801（インターナショナル・テクニダイン（International Technidyne）社、ニュージャージー州エドソン）を用いてモニターした。
【００６９】
クエン酸処理した血漿は、アンチトロンビンアッセイのために、ベースラインならびに損傷を起こさせてから6および24時間後に採取した。アンチトロンビンの活性は、発色性基質（S-2765、ダイアグノスティカ・スターゴ（Diagnostica Stago）社、ニュージャージー州パーシパニー）を用いて測定した。データは、正常標準血漿に対する％として表した。
【００７０】
肺の組織学および免疫組織化学：右の底部肺葉から採取した肺の薄片について、動物の群分けを知らない組織学者が組織学的評価を行った（5）。実質組織における変化は、充血、水腫、炎症および出血について0〜4（0は正常、4は重篤）の段階評価を行った。円柱の形成による気道遮断についても、従前の記載（3）に従って評価した。
【００７１】
気道圧：極大およびプラトー気道圧は、ベンチレーター（Servo Ventilator 900C、シーメンス−エレマ（Seimens-Elema）社、スウェーデン）を用いてモニターした。極大気道圧は、気道の抵抗性と伸展性の和を反映しており、プラトー気道圧は主に気道の伸展性を反映していることから、極大圧からプラトー圧を差し引いた（Δ気道圧）。故に、Δ気道圧は、気道抵抗性の指標である。
【００７２】
統計的分析：統計ソフトウェアStat View 5.0（SASインスティテュート（SAS Institute）、ノースカロライナ州カリー）を用いて分析を行った。データは平均±SEMで表した。分散の繰り返し測定分析（ANOVA）またはANOVAにTuckeyの前後即因果の虚偽試験（Tuckey's post hoc test）を組み合わせて用いることにより、群内のデータを比較した。適切である場合には、各時間における群間の比較は、非対データに対するStudent Newman-Keuls検定を用いて行った。組織学的試験においては、非パラメーター性Mann-Whitney U検定を行った。p値が＜0.05の場合を統計的に有意であるとみなした。
【００７３】
結果
生理食塩水処置群、ATIII処置群およびアルガトロバン処置群のカルボキシ−ヘモグロビン（％）のピーク値は、それぞれ、58.6±8.2、65.7±7.2および57.5±6.1であり（統計的に有意差無し）、このことから、全ての群がほぼ同量の煙を吸入したことが示唆された。24時間の実験期間中に死亡した個体はなかった。
【００７４】
血液培養：方法の項に記載しているように、実験中、いくつかの時間点において、細菌培養用の動脈血サンプルを注意深く採取した。全てのベースラインサンプルにおいて、緑膿菌（P.aeruginosa）は存在していなかった。24時間の実験期間中に、生理食塩水対照群では33％（3/10）において緑膿菌（P.aeruginosa）が検出されたが、ATIII群およびアルガトロバン群では0％であった。ATIII処置群およびアルガトロバン処置群では割合は低かったが、生理食塩水処置群との統計的有意差はなかった。
【００７５】
肺のガス交換：全ての群において、損傷を受けた後は、PaO2／FiO2比が顕著に低下した。しかしながら、rhAT噴霧群およびアルガトロバン噴霧群においては、下がり方が比較的少なかった（図1A）。ATIIIおよびアルガトロバンによるガス交換の弱まりはほぼ同程度であった（図1A）。損傷を受けた後は、肺のシャント画分が顕著に増加したが、ATIII噴霧群またはアルガトロバン噴霧群では、増加はそれほど大きくなかった（図1B）。
【００７６】
気道圧：極大およびプラトー気道圧は、実験中、ベンチレーターを用いてモニターした。Δ気道圧（＝［極大気道圧］−［プラトー気道圧］）を計算して気道抵抗性を分析した。生理食塩水処置群では、Δ気道圧が徐々に上昇した。ATIII処置群およびアルガトロバン処置群は、Δ気道圧が上昇しなかったが、これらの群間に統計的有意差はなかった（図2）。
【００７７】
肺の組織学：煙および細菌チャレンジを行ってから24時間後において、損傷を受けたヒツジの肺で明らかな炎症反応が生じたが、これは、間質組織および空隙における細胞浸潤物を特徴としていた。浸潤物は主に好中球を含んでいた。間質性の水腫、血管の充血および出血も観察された。充血、水腫、炎症および出血に基づく組織学的スコアは、煙および細菌への暴露後に顕著に高くなった（図3A）。以前に作成した偽損傷偽治療動物（n＝7）では、全ての組織学的スコアにおいて1.0またはそれ以下であった。充血、水腫、炎症および出血に関する各スコアはATIII処置群において低かったが、有意差はなかった。
【００７８】
アルガトロバン処置群は、生理食塩水対照群とほぼ同様のスコアであった。興味深いことに、出血スコアはそれほど高くなかったが、ATIII処置群およびアルガトロバン処置群では低かった。組織学的総スコアを計算した（図3B）。充血、水腫、炎症および出血の各スコアは0（正常）〜4（強度）であるので、組織学的総スコアの最大値は16である。ATIII処置群では顕著に低かった（図3B）。対照的に、アルガトロバン噴霧では組織学的総スコアは低下しなかった（図3B）。以前に作成した偽損傷群のスコアは3.3±0.7であった（n＝7）。
【００７９】
気管支および細気管支は、好中球、脱落した気管支の上皮細胞、粘液およびフィブリンの浸潤によって遮断されていた。生理食塩水処置群においては、気管支および細気管支レベルでは、気道の断面積の30％以上が遮断されていることがわかった（図4）。ATIIIを噴霧することにより、気管支レベルでの気道遮断が顕著に阻害された。アルガトロバンは、気管および細気管支レベルで遮断を顕著に阻害した（図4）。
【００８０】
肺の湿潤／乾燥重量比：肺の湿潤／乾燥重量比は、以前に作成した偽損傷群のデータ（湿潤／乾燥重量比＝3.70±0.17、n＝7）と比較すると、煙吸入およびそれに続いて気管支に細菌を点滴注入してから24時間後に顕著に増加した。この増加は、ATIIIを噴霧することによって顕著に低下したが、アルガトロバンによっては変化しなかった（図5）。
【００８１】
硝酸／亜硝酸（NOx）レベルの変化：損傷を受けた後、血漿中のNOxレベルはベースラインの2〜3倍に上昇した。ATIII処置群では、最初の3時間は同様の増加を示したが、その後24時間までは、増加が明らかに小さかった（図6）。アルガトロバン処置群では、6〜15時間まではNOxレベルが低いように見えたが、その後、生理食塩水処置群と同程度まで上昇した。アルガトロバン処置群と生理食塩水処置群との間には統計的有意差はなかった（図6）。
【００８２】
血球数および凝固パラメーター：ベースラインでの白血球数および血小板数については、群間の差はなかった。損傷を受けてから24時間の間に白血球数は顕著に低下した（表１）。白血球数の低下は、ATIII処置群ではそれほど大きくなかった（表１）。アルガトロバンは、白血球数の低下に影響しなかった。血小板数も損傷を受けた後に大きく低下した。この低下は、ATIIIによって阻害されなかった（表１）。アルガトロバンは、血小板数の低下を若干抑えた。
【００８３】
全ての群において、損傷を受けた後は、活性化凝固時間が延長される傾向があったが、統計的有意差はなかった（表２）。群間でも統計的有意差は認められなかった（表２）。
【００８４】
考察
気道におけるフィブリン形成は、急性／慢性肺損傷の特徴として知られている（12）。敗血症の場合には、血管透過性が増加し、フィブリノーゲンを含んだ血漿が気道に入り、気道では、サイトカイン類の刺激によって組織因子が発現される（12）。故に、フィブリノーゲンは気道中で容易に血塊を形成する。気道におけるフィブリン形成は、2つの意味で肺損傷の原因となる。第一に、フィブリンが気道の一部を阻止し、ガス交換を阻害する。第二に、フィブリンが表面活性物質の活性を阻害し、そのことが肺拡張不全の原因となりうる。患者または動物が機械的に換気されている場合には、気道遮断は、ベンチレーターによる肺損傷をも引き起こす。また、換気を受けている部分の肺が過度に拡張することにより、インターロイキン8などのケモカイン類が誘導される。
【００８５】
発明者らは、ヘパリン噴霧が気道遮断の阻止に有効であり、ガス交換を改善することを既に示している（5）。発明者らは、ヘパリンを噴霧することにより、フィブリンの血塊形成が阻止され、急性肺損傷が弱められると判断した。しかしながら、ヘパリンの抗凝固特性は、アンチトロンビン依存性である。本発明に従えば、ヒトで肺損傷または疾病状態が発生した場合に起こっていることを模倣するために設計した実験動物において、煙吸入、肺損傷および肺炎を引き起こすことができた。本発明のモデルに従い、血漿アンチトロンビン活性を測定し比較した。
【００８６】
本発明の好ましい実施態様に従えば、血漿アンチトロンビン活性のベースライン値は、損傷を受けた後に徐々に低下し、24時間後には約50％に下がった（15）。同様の現象は、火傷（16）または敗血症（17）の患者においても報告されている。そのような状態においては、ヘパリンの効果は見られない。本発明に従えば、肺損傷の治療にはATIIIの注入が有効であることが示された（15）。この静注実験に基づき、より低投与量のATIIIをネブライザーで直接気道に入れることも有効であると考えた。それが本実験を計画した理由である。また、投与し、試験を行ったエアロゾル化ATIIIの量（モル数）を計算したところ、アルガトロバンとほぼ同程度の抗血栓作用を有していた。
【００８７】
アンチトロンビンは、主要な生体抗凝固剤のひとつである。アンチトロンビンは、トロンビン、FXa、FXIa、FXIIaおよびFIXaなどの多様な凝固因子を阻害する一方で、ある種の抗炎症作用を有することが知られている（18）。多くの動物および臨床試験において、静脈内にアンチトロンビンを入れることは、敗血症（19）、エンドトキシンショック（20）、腎虚血レパー（renal ischemia-reper）損傷（21）および火傷（22）の場合に効果的であることが示されている。2つの作用機構が考えられる。第一は、  アンチトロンビンが内皮細胞からのプロスタサイクリンの放出を促進する（23）。プロスタサイクリンはサイトカイン産生、接着分子の発現および血小板の凝固を阻害するので、アンチトロンビンは、プロスタサイクリンを介して間接的に炎症反応を阻害する。第二に、シンデカン−4と呼ばれるアンチトロンビンレセプターが最近発見された（24）。アンチトロンビンが一旦シンデカン−4に結合すると、核因子κBの転位を阻害し、白血球および内皮細胞における炎症性シグナルの伝達を阻害する（25、26）。従って、アンチトロンビンは、NF-κBの活性を阻害することを介して、炎症の過程を直接的に変化させる。
【００８８】
アルガトロバンは、トロンビンの活性を阻害するように設計されたものであり、その特異性は非常に高い（27）。アンチトロンビンと比較すると、アルガトロバンの分子は非常に小さく（分子量は527Da）、トロンビンを直接阻害する。アルガトロバンが抗炎症作用を示すという報告はほとんどない。アンチトロンビンとアルガトロバンとの間のこのような差異が、吸入損傷に対する効果の違いではないかと考えられる。本実験においては、ATIIIおよびアルガトロバンは、煙吸入および肺炎の後に生じた気道遮断を同程度阻害した。その結果、肺のガス交換は、ATIIIおよびアルガトロバンのいずれを用いた場合も弱まった。併用した場合には、相乗効果を示した。気道遮断に関しては、円柱形成の阻止という点において、アルガトロバンはrhATよりも有効であった。アルガトロバンはATIIIよりも分子が小さく、タンパク質ではないことから、送達されやすいはずである。しかしながら、本発明において得られた改善という点に関しては、組織病理学的分析では、ATIIIによって組織学的変化が改善されたことが示されたが、アルガトロバンによっては改善されなかった。この結果と対応して、肺の湿潤／乾燥重量比は、ATIIIの噴霧によって改善したが、アルガトロバンでは改善しなかった。これらの観察結果から、ATIIIおよびアルガトロバンの抗凝固能によって気道のフィブリン形成が阻害され、ガス交換が弱められたものと考えることができる。さらに、ATIIIは抗炎症特性を有しており、それによって肺の炎症状態、さらに、肺水腫の形成も改善した。白血球数の減少は、ATIII処置群ではアルガトロバン処置群と比較してそれほど大きくなかったことから、ATIIIは炎症応答をも阻害することが示唆される。
【００８９】
本発明の一部として、ATIIIおよびアルガトロバンは、敗血症の発生も低下させた。気道が遮断されると、細菌の排出が妨げられ、閉鎖された非換気領域が細菌の温床になる。従って、気道遮断を阻害することは、ガス交換のためのみならず全身への細菌の転位および敗血症予防のためにも有効であると考えている。
【００９０】
図６に示すように、窒素酸化物（NO）形成の指標である血漿中のNOxの上昇は、エアロゾル化ATIIIによって顕著に抑制された。NOは、窒素酸化物シンターゼ（NOS）の3種類のイソ型から合成される。内皮性NOS（eNOS）および神経性NOS（nNOS）は構成性NOS（cNOS）として知られており、常時発現されている。第三のイソ型は誘導性NOS（iNOS）と呼ばれている。iNOSは、組織壊死因子−αなどの炎症性サイトカイン類によって誘導される。本実験においては、ATIIIは、実験を開始してから12時間以降においてNO形成を阻害したが、最初の12時間は阻害しなかったことから、ATIIIはiNOSの発現を阻害することが示唆される。発明者らは、以前に、iNOSは、肺胞マクロファージだけでなく、肺胞上皮細胞からも発現されることを示している（28）。アンチトロンビンはNFκBの活性化を阻害することが報告されていることから（18）、噴霧されたATIIIは、気道上皮細胞からのiNOSの発現を阻害すると判断した。
【表１】
2007518801.tif 000003
【表２】
2007518801.tif 000004
【００９１】
ATIIIの総投与量は、以前に行われた静注実験の半分であったにもかかわらず（ムラカミ（Murakami）、(2001),Am.J.Resp.Crit.Care Med.,163:A553を参照）、結果は、静注の場合よりも有効であった。副作用は観察されなかった。従って、エアロゾル化ATIIIは、ヒツジの煙吸入および肺炎に伴う敗血症性急性肺損傷に有効であった。
【００９２】
本発明に従う多数の実施態様について記載してきた。にもかかわらず、本発明の範ちゅうを超えることなく、多様な変形を行うことができることは明らかである。従って、その他の実施態様も上記の請求項の範囲に含まれる。
【００９３】
トランスジェニック動物作出のための本発明の方法に従い、体細胞核移植に適したトランスジェニック一次細胞系（ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたはその他任意の非ヒト脊椎動物由来）は、目的のタンパク質核酸構築体（例えば、乳腺に対し、ヒトα−フェトプロテイン−β−インターフェロンタンパク質の発現を標的とする乳腺特異的導入遺伝子など）をトランスフェクトすることによって作出することができる。導入遺伝子構築体は、選択マーカー（ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、プロマイシン、ゼオシン、ヒグロマイシンまたはその他任意の選択的マーカー）を有しているか、または、細胞培養内で選択的マーカーを発現することができるカセットと同時トランスフェクトすることができる。
【００９４】
本発明は、本明細書に記載されている核酸配列を含む発現ベクターを提供し、該ベクターは、機能発揮できるように、少なくとも1個の制御配列に連結されている。そのようなベクターの多くは市販されており、その他適切なベクターは、当業者であれば容易に調製することができる。「機能発揮できるように連結されている」または「機能的に連結されている」とは、核酸分子が制御配列に対し、宿主生体による該酸配列の発現が可能であるような方法で連結されていることを意味する。制御配列は当該分野において既知であり、コードされているポリペプチドまたはタンパク質を産生するように選択される。従って、「制御配列」には、プロモーター、エンハンサー、および、ゲッデル（Goeddel）著「遺伝子発現技術：酵素学における方法論185（Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185）」（アカデミック・プレス（Academic Press）社、カリフォルニア州サンディエゴ、1990年）に記載されているその他の発現コントロール要素などが含まれる。例えば、天然の制御配列、または形質転換した宿主細胞に対して天然型の制御配列を用いることができる。
【００９５】
発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、および／または、発現を所望するタンパク質の型などのような因子によって異なることは明らかである。例えば、本発明に従うポリペプチドは、原核細胞、真核細胞またはそれらの両方での発現に適したベクターに対し、クローニングした遺伝子もしくはそれらの一部を連結させることによって産生することができる（「実験室マニュアル（A Labotatory Manual）第二版」、サンブルック（Sambrook）ら編、（コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、1989年）、第16章および17章）。
【００９６】
所望する核酸構築体に関して組換えコロニーを選択した後、細胞を単離、拡張し、同時に、アリコートは、当該分野において既知の手順に従い、長期保存のために凍結した。選択したトランスジェニック細胞系は、標準的な分子生物学的方法（PCR、サザンブロット、FISH）を用いて特性付けを行った。目的の二機能性タンパク質の核酸構築体を適切なコピー数保有している細胞系は、通常、単一組込み部位を用い、（同様の技術で、複数組込み部位を用いることができるが）、当該分野において既知の体細胞核移植プロトコールに従おいて、核体ドナーとして使用することができる。核移植に続き、レシピエント動物に胚移植を行い、妊娠させ、生きたトランスジェニック仔を得た。一般的には、このトランスジェニック仔は、特定の染色体上にひとつの導入遺伝子を有し、他の相同染色体では同一部位に組込みが生じていない。トランスジェニック仔は導入遺伝子に関してヘテロ接合であるので、現在のところ、ホモ接合トランスジェニック動物を作出するためには少なくとも2回連続の出産サイクルが必要である。
【００９７】
生体液からのATIIIタンパク質の精製：本発明に従うATIIIタンパク質は、標準的なタンパク質精製技術を用い、トランスジェニック生物の生体液から精製することができる。そのような精製技術としては、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、アウスベル（Ausbel）ら、「分子生物学における最新プロトコール集（Current Protocols in Molecular Biology）」（ジョン・ウィレー＆サンズ（John Wiley&Sons）社、ニューヨーク州ニューヨーク、1998年）；ルボン（Lubon）ら、米国特許第5,831,141号などを参照）またはタンパク質精製の当業者において既知であるその他の方法などが挙げられる。一度単離を行えば、所望する場合には、ATIIIタンパク質は、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）（例えば、フィッシャー（Fisher）、「生化学および分子生物学における実験室技術集（Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology）」、ワーク（Work）およびバードン（Burdon）編、エルセヴィール（Elsevier）社、1980年などを参照）および／またはタンジェニタルフローろ過などの方法でさらに精製することができる。精製後は、ATIIIタンパク質は、少なくとも80％純粋、好ましくは90％純粋、より好ましくは95％純粋、最も好ましくは99％純粋である。
【００９８】
動物プロモーター：哺乳類組織中でのATIIIの発現に有用なプロモーターとしては、乳タンパク質などの哺乳類特異的ポリペプチドの発現を自然に稼働させるプロモーターなどが挙げられるが、乳汁中にATIIIを分泌させる任意のプロモーターを用いることができる。そのようなものとしては、例えば、乳清酸性タンパク質（WAP）、αS1−カゼイン、αS2−カゼイン、β−カゼイン、κ−カゼイン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミンの発現を本質的に指図するプロモーター（例えば、ドロハン（Drohan）ら、米国特許第5,589,604号；ミード（Meade）ら、米国特許第4,873,316号；およびカラザス（Karatzas）ら、米国特許第5,780,009号などを参照）、ならびに米国特許第5,750,172号に記載されているその他のものなどが挙げられる。齧歯類における主要乳清タンパク質である乳清酸性タンパク質（WAP；Gennbank  アクセッション番号X01153）は、妊娠後期および授乳中に乳腺で特に高レベルで発現される（ホッブス（Hobbs）ら、J.Biol.Chem.,257:3598-3605,1982）。所望する乳腺特異的プロモーターに関するその他の情報については、例えば次の文献を参照のこと：リチャーズ（Richards）ら、J.Biol.Chem.,256:526-532,1981（ラットのα−ラクトアルブミン）；キャンベル（Campbell）ら、Nucleic Acids Res.,12:8685-8697,1984（ラットのWAP）；ジョーンズ（Jones）ら、J.Biol.Chem.,260:7042-7050,1985（ラットのβ−カゼイン）；ユ−リー（Yu-Lee）およびローゼン（Rosen）、J.Biol.Chem.,258:10794-10804,1983（ラットのγ−カゼイン）；ホール（Hall）、Biochem.J.,242:735-742,1987（ヒトのα−ラクトアルブミン）；スチュワート（Stewart）、Nucleic Acids Res.,12:3895-3907,1984（ウシのα−slおよびκ−カゼインcDNA）；ゴロデトスキー（Gorodetsky）ら、Gene,66:87-96,1988（ウシのβ−カゼイン）；アレキサンダー（Alexander）ら、Eur.J.Biochem.,178:395-401,1988（ウシのκ−カゼイン）；ブリグノン（Brignon）ら、FEBS Lett.,188:48-55,1977（ウシのα−S2カゼイン）；ジャミーソン（Jamieson）ら、Gene,61:85-90,1987、イヴァノフ（Ivanov）ら、Biol.Chem.；ホッペ−セイラー（Hoppe-Seyler）369:425-429,1988およびアレキサンダー（Alexander）ら、Nucleic Acids Res.,17:6739,1989（ウシのβ−ラクトグロブリン）；ならびにヴィロッテ（Vilotte）ら、Biochimie.,69:609-620,1987（ウシのα−ラクトアルブミン）。多様な乳タンパク質遺伝子の構造および機能については、マーシアー（Mercier）およびヴィロッテ（Vilotte）によって総説が書かれている（J.Dairy Sci.,76:3079-3098,1993）。発現を最適化するために、追加のフランキング配列が有効である場合には、そのような配列は、プローブとして存在している配列を使用してクローニングすることができる。別異の生物由来の乳腺特異的制御配列は、プローブとして、既知のコグネイトヌクレオチド配列またはコグネイトタンパク質に対する抗体を用い、そのような生物由来のライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００９９】
乳汁へのATIIIの発現および分泌に有用なシグナル配列は、乳汁特異的シグナル配列である。望ましくは、シグナル配列は、乳汁特異的シグナル配列、すなわち、乳汁中に分泌される生成物をコードしている遺伝子から選択する。最も望ましくは、乳汁特異的シグナル配列は、上述したような乳汁特異的プロモーターに関連があるものである。本発明においては、シグナル配列の大きさに制限はない。必要なことは、シグナル配列が、ATIIIを乳腺組織内などに分泌するのに十分な大きさを有していることである。例えば、カゼイン類（α、β、γ、もしくはκカゼイン、β−ラクトグロブリン、乳性酸性タンパク質およびラクトアルブミンなど）をコードしている遺伝子由来のシグナル配列は、本発明に有用である。その他の分泌タンパク質（例えば、肝細胞、腎細胞または膵臓細胞によって分泌されたその他のタンパク質など）由来のシグナル配列も使用することができる。
【０１００】
泌尿器組織内で組換えポリペプチド導入遺伝子を発現させるために有用なプロモーターとしては、ウロプラキン（uroplakin）およびウロモジュリン（uromodulin）プロモーター（カー（Kerr）ら、Nat.Biotechnol.,16:75-79,1998；ズビコウスカ（Zbikowska）ら、Biochem.J.,365:7-11,2002；およびズビコウスキ（Zbikowski）ら、Transgenic Res.,11:425-435,2002）が挙げられるが、導入遺伝子の産物を尿中に分泌できる任意のプロモーターを用いることができる。
【０１０１】
血液産生細胞または血清産生細胞（例えば、肝臓上皮細胞など）により、血中にATIIIを発現および分泌させるために有用なプロモーターとしては、アルブミンプロモーター（例えば、シェン（Shen）ら、DNA,8:101-108,1989；タン（Tan）ら、Dev.Biol.,146:24-37,1991；マクグラン（McGrane）ら、TIBS,17:40-44,1992；ジョーンズ（Jones）ら、J.Biol.Chem.,265:14684-14690,1990；およびシマダ（Shimada）ら、FEBS Letters,279:198-200,1991などを参照）が挙げられるが、導入遺伝子産物を血中に分泌できる任意のプロモーターを使用することができる。
【０１０２】
精液中にATIIIを発現させために有用なプロモーターについては、米国特許第6,201,167号に記載されている。有用な鳥類特異的プロモーターとしては、オボアルブミンプロモーターおよびアポ−Bプロモーターが挙げられる。その他の鳥類特異的プロモーターも当該分野において既知である。オボアルブミンプロモーターを用いて直接ATIIIを発現させ、次に、卵の卵白中に排出させることができる。アポ−Bプロモーターを用いて肝臓中に組換えポリペプチドを直接発現させることもできるが、該ペプチドは、最終的に卵黄中に排出される。次のような理由から、鳥類の卵は、大量の組換えポリペプチドの発現媒体として最適である：（1）各卵には大量のタンパク質が詰まっている；（2）非破壊的に容易に卵を回収することができ、比較的長時間保存できる；（3）乳汁と異なり、卵は無菌であり、細菌の混入がない。特に、鳥類は、卵1個のために約3ｇのアルブミンを卵管中に産生することができ、そのうちの50％以上はオボアルブミンである。これとは別に肝臓中で3ｇが産生され（血清リポタンパク質）、卵黄中に排出される。さらに、鳥類は哺乳類と進化系統的に離れているので、鳥類は哺乳類タンパク質を免疫学的に認識しないことから、鳥類の体内でATIIIを発現させることによって該鳥類の生存率および健康状態に悪影響を及ぼすことはほとんどない。
【０１０３】
本発明に従う方法において有用なその他のプロモーターとしては、誘導性プロモーターが挙げられる。一般的に、大多数の真核生物発現系においては、組換えタンパク質は構成的に発現される。誘導性プロモーターまたはエンハンサーエレメントを追加することにより、ATIIIの発現を時間的または空間的に制御することができ、別の発現メカニズムが出現する。誘導性プロモーターとしては、熱ショックタンパク質、メタロチオネインおよびMMTV-LTRなどが挙げられ、誘導性エンハンサーエレメントとしては、エクジソン、ムリステロンAおよびテトラサイクリン／ドキシサイクリンに対するものが挙げられる。
【０１０４】
本発明に従う発明において有用な誘導性系の一例として、Tet-On and Tet-Off Gene Expression Systems（クロンテック（ Clontech ）社）が挙げられる。この系は、テトラサイクリン（Tc）応答性エレメントを使用し、ATIIIの発現をオン状態（構成的にオフであり、Tcを用いて誘導される）またはオフ状態（構成的にオンであり、Tcまたはドキシサイクリンによって抑制される）に維持する。形質転換された細胞を容易に認識することを目的として、ATIII導入遺伝子内に選択的マーカーを組み込むこともできる。一般的に、選択的マーカーは、機能的に、劣性および優性の2つに分類される。通常、劣性マーカーは、宿主細胞内で産生されない生成物をコードしている遺伝子である（細胞は「マーカー」生成物または機能を欠いている）。チミジンキナーゼ（TK）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）、およびヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）に対するマーカー遺伝子がこの分類に属する。優性マーカーは、代謝的に制限された環境下において、宿主細胞の増殖抑制化合物（抗生物質、薬物）に対する抵抗性を付与する、および／または宿主細胞を増殖させるような生成物をコードしている遺伝子を含む。この分類に属し、通常使用されるマーカーとしては、メトトレキセートに対する抵抗性を付与する突然変異DHFR遺伝子；マイコフェノール酸／キサンチン含有培地中での宿主細胞の増殖を可能にするキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼに対するgpt遺伝子；G418、ゲンタマイシン、カナマイシンおよびネオマイシンに対する抵抗性を付与することができるアミノグリコシド3'−ホスホトランスフェラーゼに対するneo遺伝子などが挙げられる。
【０１０５】
核酸ベクター：ある実施態様においては、本発明は、本明細書に記載している任意の核酸分子を含むベクターまたは組み換え発現ベクターに関する。本発明においては、ベクターを使用し、タンパク質をコードしているDNAもしくはRNAを増幅させ、ならびに／または、SSTRタンパク質をコードしているDNAを発現させる。ベクターとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス性粒子もしくはウイルス、ならびに組込可能な（integratable）DNAフラグメント（すなわち、相同組換えにより、宿主ゲノム内に組み込むことができるフラグメント）など。ウイルス性粒子としては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：アデノウイルス、バキュウロウイルス、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノ関連ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ワクシニアウイルス、レトロウイルス、微小粒子、および裸DNAなど。多様な実施態様において、発現は、標的リガンドにより、特定の細胞型または細胞集団が標的にされている。発現ベクターとしては、pcDNA3（インヴィトロジェン（invitrogen）社）およびpSVL（ファルマシア・バイオテック（ Pharmacia Biotech ）社）などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。その他の発現ベクターとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：pSPORT（商標）ベクター、pGEM（商標）ベクター（プロメガ（Promega）社）、pPROEXベクター（商標）（LTI社、メリーランド州ベテスダ）、Bluescript（商標）ベクター（ストラタジーン（Stratagene）社）、pQE（商標）ベクター（キアゲン（Qiagen）社）、pSE420（商標）（インヴィトロジェン（invitrogen）社）、およびpYES2（商標）（インヴィトロジェン（invitrogen）社）など。発現構築体は、タンパク質をコードし、内在性もしくは外来性の発現コントロールDNA配列に機能発揮できるように連結されているポリヌクレオチド、ならびに、転写ターミネーターを有する。多くのベクターにおいて、核酸挿入のための領域が限定されていることから、小さいレポーターまたはレポーター構築体を挿入することが望ましい。例えば、ソマトスタチンレセプターC末端の全てまたは一部を除去したものを用いることができる。発現コントロールDNA配列としては、プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよび制御エレメント結合部位などが挙げられるが、一般的には、使用する発現構築体の発現系に基づいて選択する。
【０１０６】
一般的に、プロモーターおよびエンハンサー配列は、遺伝子発現を増加させる能力に対して選択を行うが、オペレーター配列は、遺伝子発現の制御能に対して選択を行う。本発明に従う発現構築体は、該構築体を保有する宿主細胞の確認ができるような1個もしくはそれ以上の選択的マーカーをコードしている配列も含む。発現構築体は、宿主細胞内で相同組換えを行わせるような配列も含む。多くの実施態様においては、構築体は、宿主細胞内での複製に必要な配列も有する。
【０１０７】
多数の組織特異的プロモーターの例を本明細書に記載している（ペアース（Pearse）およびタコール（Takor）、1979；ナイレン（Nylen）およびベッカー（Becker）、1995）。完全に網羅しているわけではないが、これらのプロモーターは、本発明の特定の実施態様において使用することができるプロモーターおよびエンハンサーのタイプの例である。本発明において有用な、さらなるプロモーターについては、当業者において既知である。
【０１０８】
誘導性プロモーターとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるけではない：MTII、MMTV（マウス乳癌ウイルス）、c-jun、コラゲナーゼ、ストロメリシン（Stromelysin）、マウスMX遺伝子、GRP78遺伝子、α−2−マクログロブリン、ビメンチン、MHCクラスI遺伝子H-2 κB、HSP70、プロリフェリン、腫瘍壊死因子および甲状腺刺激ホルモン−αなど。細胞または組織特異的発現は、細胞特異的エンハンサーおよび／もしくはプロモーターを使用することによって実施することができる（ヒューバー（Huber）ら、Adv.Drug Delivery Reviews,17:279-292,1995を参照）。
【０１０９】
発現構築体は、コードされているタンパク質の産生に使用することができるが、SSTR-タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを増幅させるためだけにも使用することができる。いくつかの実施態様においては、ベクターは発現ベクターであり、このとき、ポリヌクレオチドは、発現コントロール配列を含むポリヌクレオチドに機能発揮できるように連結されている。ある実施態様においては、プラスミドおよびウイルス性DNAベクターなどの自律複製組換え発現構築体は、ポリヌクレオチドを含む。発現ベクターは、複製可能なDNA構築体であり、その中では、SSTR-タンパク質をコードしているDNA配列は、適切な宿主細胞内でSSTR-タンパク質を効率的に発現させることができるような適切なコントロール配列に、機能発揮できるように連結または接続されている。DNA領域が機能的に互いに関連している場合には、それらは機能発揮できるように連結または接続されている。例えば、あるプロモーターが配列の転写をコントロールしている場合には、該プロモーターは、コード配列に機能発揮できるように連結または接続されている。増幅ベクターは、発現コントロールドメインを必要としないが、通常は複製起点によって付与される宿主内での複製能、および形質転換体の認識を行うための選択遺伝子のみを必要とする。発現ベクター内におけるコントロール配列の必要性は、選択した宿主および選択した形質転換法によって異なる。一般的には、コントロール配列は、転写プロモーター、転写をコントロールするための追加のオペレーター配列、転写および翻訳の終了をコントロールする適切なmRNAリボソーム結合性配列をコードしている配列を含む。
【０１１０】
多くの実施態様において、ベクターは、宿主生物によって認識されるプロモーターを有する。プロモーター配列としては、原核細胞性、真核細胞性、合成によるものまたはウイルス性のものを用いることができる。適切な原核細胞性配列の例としては、バクテリオファージλのプロモーター（「バクテリオファージλ（The Bacteriopharge λ）」、ハーシェイ（Hershey）,A.D.編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（1973）；「λII」、ヘンドリックス（Hendrix）,R.W.編、コールドスプリングハーバー・ラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）社、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー(1980)；およびベノイスト（Benoist）ら、「大腸菌（E . coli）のtrp、recA、熱ショックおよびlacZプロモーターならびにSV40初期プロモーター（The trp, recA, heat schock and lacZ promoters of E.coli and the SV40 early promote）」、Nature,290:304-310(1981)）が挙げられる。さらなるプロモーターとしては次のようなものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：マウス乳癌ウイルス、ヒト免疫不全ウイルスの長末端反復、マロニーウイルス、サイトメガロウイルス初期プロモーター、エプスタイン・バー（Epstein Barr）ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインなど。
【０１１１】
さらなる制御配列としては、ベクターが挙げられる。適切な制御配列の例としては、ファージMS-2のレプリカーゼ遺伝子、およびバクテリオファージλの遺伝子cIIのシャイン−ダルガルノ配列によって代表されるものが挙げられる。シャイン−ダルガルノ配列には、SSTR-タンパク質をコードしているDNAが直接結合しており、その結果、成熟SSTR-タンパク質が発現されると考えられる。
【０１１２】
さらに、適切な発現ベクターとしては、形質転換宿主のスクリーニングを可能にするような適切なマーカーが挙げられる。選択した宿主の形質転換は、当該分野において既知の、およびサンブルック（Sambrook）らの著書（同上）に記載されている多様な技術のうちの任意のひとつを用いて行うことができる。
【０１１３】
複製の起点は、外来性の起点を含むベクターを構築することにより、あるいは、宿主細胞の染色体複製機構によっても提供することができる。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれている場合には、後者が適切である。別の方法としては、ウイルス性の複製起点を含むベクターを用いるよりも、選択的マーカーおよびSSTR-タンパク質をコードしているDNAを用いた同時形質転換法により、哺乳類細胞を形質転換することができる。適切なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼまたはチミジンキナーゼなどが挙げられる（米国特許第4,399,216号）。
【０１１４】
SSTR-2タンパク質などのレポータータンパク質融合体をコードしているヌクレオチド配列は、従来から用いられている方法に従い、ベクターDNAと組み換えることができる。そのような技術としては、ライゲーション用の平滑末端もしくは付着末端、制限酵素切断による適切な末端の作出、付着末端の適切な補充、アルカリホスファターゼ処理による所望しない結合の回避、適切なリガーゼを用いたライゲーションなどが挙げられる。そのような操作技術については、サンブルック（Sambrook）らの著書（同上）に記載されており、当該分野において既知である。哺乳類の発現ベクターの構築法については、例えば、オカヤマ（Okayama）ら、Mol.Cell Biol.,3:280(1983)；コスマン（Cosman）ら、Mol.Immunol.,23:935(1986)；およびコスマン（Cosman）ら、Nature,312:768(1984)などに記載されている。
【０１１５】
好ましくは、導入遺伝子構築体は、プロモーターの下流にリーダー配列を有する。リーター配列は、タンパク質分泌シグナルをコードしている核酸配列であり、本発明に従うATIIIタンパク質をコードしている下流の核酸分子に対して機能発揮できるように連結されている場合には、ATIIIの分泌を指図する。リーダー配列は、ATIIIをコードしている核酸分子の転写を指図するために使用されるプロモーターと同じ遺伝子から入手することができる（例えば、乳汁特異的タンパク質をコードしている遺伝子など）。別の方法としては、天然のヒトATIIIタンパク質分泌シグナルをコードしているリーダー配列（GenBankアクセッション番号V01514のアミノ酸番号1〜19）を用いることができる。  
治療への使用：本明細書に記載している組み合わせは、これらの組織培養の処置においてイン・ビトロ（in vitro）使用することが好ましい。しかしながら、イン・ビボ（in vivo）用途に対してもこの組み合わせは有効である。イン・ビボ（in vivo）投与様式に応じて、組成物は、固体、半固体、または液体の投与剤型（例えば、錠剤、丸剤、粉末、カプセル、ゲル、軟膏、液体、懸濁液など）で使用することができる。好ましくは、組成物は、正確な投与量での単回投与に適した単位投与剤型で投与する。組成物は、所望する製剤に応じ、薬剤学的に許容されるキャリヤーもしくは希釈剤も含有するが、ここで、キャリヤーもしくは希釈剤とは、水性のビヒクルであって、通常、動物またはヒトへの投与用の薬剤学的組成物の調製に使用されるものと定義される。希釈剤は、ヒトα−フェトプロテインの生物学的活性に影響を及ぼさないように選択する。そのような希釈剤としては、蒸留水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびハンクス液などが挙げられる。同様の希釈剤を用いて凍結乾燥ヒトα−フェトプロテインを再構成することができる。さらに、薬剤学的組成物は、その他の薬物、薬剤、キャリヤー、アジュバント、非毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤などを含有することもできる。そのような希釈剤またはキャリヤーの有効量は、構成成分の溶解性、生物学的活性などの点に関して薬剤学的に許容される製剤を得るために効果的な量である。
【０１１６】
本明細書に記載している組成物は、煙吸入および／もしくは火傷による急性肺損傷に対し、エアロゾル化、噴霧、肺内、非経口または経口投与により、また別の方法としては、全身投与剤型を用い、ヒト患者に投与することができる。
【０１１７】
細菌での発現：細菌での使用に有用な発現ベクターは、適切な翻訳開始および停止シグナルを伴って所望するタンパク質をコードしている構造DNA配列を機能性プロモーターと共に、機能性のリーディングフェーズ（operable reading phase）内に挿入することによって構築する。ベクターは、ひとつもしくはそれ以上の表現型選択的マーカー、該ベクターを確実に維持し、さらに、所望するならば、宿主内で複製するための複製起点を有する。形質転換に適した原核細胞性宿主としては、大腸菌（E . coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ならびにシュードモナス属（Pseudomonas）、ストレプトミセス属（Streptomyces）およびスタフィロコッカス属（Staphylococcus）などの多様な菌類が挙げられるが、実際はその他のものも使用することができる。好ましい実施態様においは、原核細胞性宿主は大腸菌（E . coli）である。
【０１１８】
細菌性ベクターとしては、例えば、バクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドに基づくものが挙げられる。これらのベクターは、選択的マーカー、および、一般的には、周知のクローニングベクターpBR322（ATCC 37017）のエレメントを含む市販のプラスミド由来の細菌性の複製起点を有する。そのような市販のベクターとしては、例えば、GEM1（プロメガ・バイオテック（Promega Biotec）社、米国ウィスコンシン州マディソン）、pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a（ストラタジーン（Stratagene）社）、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pKK232-8、pDR540およびpRIT5（ファルマシア（ Pharmacia ）社）などが挙げられる。本発明に従う好ましいベクターは、THE Pt7I発現ベクターである。
【０１１９】
これらの「バックボーン」部分は、発現を行わせるために、適切なプロモーターおよび構造配列と組み合わせる。細菌性プロモーターとしては、lac、T3、T7、λPRもしくはPL、trpならびにaraが挙げられる。
【０１２０】
適切な宿主株の形質転換を行い、宿主株を適切な細胞密度までの増殖させた後、選択したプロモーターを適切な方法（例えば、温度変化または化学的誘導など）で脱抑制／誘導性にし、さらに細胞を培養した。一般的には、細胞は遠心分離によって回収し、物理的もしくは化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出液は、さらなる精製のために保存した。
【０１２１】
真核細胞の発現：多様な哺乳類細胞培養系を用いて組換えタンパク質を発現させることもできる。哺乳類発現系の例としては、チミジンキナーゼ（−）（TK-）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（−）（APRT-）細胞などの選択されたマウスL細胞などが挙げられる。その他の例としては、サル腎臓繊維芽細胞のCOS-7細胞系（グルツマン（Gluzman）,Cell,23:175(1981)に記載）、ならびに、C127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞などのように、適合性ベクターを発現することができるその他の細胞が挙げられる。特に、酵母菌に関しては、サッカロミセス属（Saccharomyces）、クルイヴェロミセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、シュワニオミセス属（Schwanniomyces）またはハンセヌラ属（Hansenula）が挙げられる。本明細書において使用可能な菌類としては、さらに、アスペルギルス属（Aspergillus）またはトリコデルマ属（Trichoderma）が挙げられる。
【０１２２】
哺乳類発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに、必要な任意の結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終了配列および5'フランキング非転写配列を含む。例えば、ウイルス性のSV40ゲノム由来のDNA配列では、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位を用いて必要な非転写遺伝子エレメントが作出される。
【０１２３】
哺乳類のプロモーターとしては、β−カゼイン、β−ラクトグロブリン、乳性酸性プロモーターが挙げられるが、その他に、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルス由来のLTRsおよびマウスメタロチオネイン−1などが挙げられる。哺乳類ベクターの例としては、pWLneo、PSV2cat、pOG44、pXT1、pSG（ストラタジーン（Stratagene）社）、pSVK3、pBPV、pMSGおよびpSVL（ファルマシア（ Pharmacia ）社）などが挙げられる。好ましい実施態様においては、哺乳類発現ベクターは、pUCIG-METである。選択的マーカーとしては、CAT（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）が挙げられる。
【０１２４】
本発明に従う範囲内で使用することができるヌクレオチド配列は、多様な方法で調製することができる。一般的には、リーディングフェーズにおいて、ポリペプチドの各機能性部分をコードしている配列を組み立てることによって得られる。ポリペプチドの各機能性部分は、当業者において既知の技術（例えば、細胞性メッセンジャーRNA（mRNA）から直接的に、もしくは、相補的DNA（cDNA）ライブラリーからの再クローニングなど）によって単離するか、あるいは、別の場合には、完全な合成ヌクレオチド配列である。さらに、そのようなヌクレオチド配列は、該配列の誘導体または変異体を得ることを目的として、遺伝子操作技術などを用いて変形することもできることは明らかである。
【０１２５】
治療組成物：本発明に従うタンパク質は、薬剤学的に有用な組成物を調製するための既知の方法に従って調製することができ、このとき、本発明に従う化合物またはそれらの機能性誘導体は、薬剤学的に許容されるキャリヤービヒクルと共に混合する。適切なビヒクル、およびヒト血清アルブミンなどのその他のヒトタンパク質を含むそれらの製剤は、例えば、効果的な投与に適し、薬剤学的に許容される組成物を調製することを目的にして記載されており、そのような組成物は、本発明に従うひとつもしくはそれ以上のタンパク質の有効量、ならびに適量のキャリヤービヒクルを含む。
【０１２６】
本発明に従って使用される薬剤学的組成物は、生理的に許容されるひとつもしくはそれ以上のキャリヤーまたは賦形剤を用い、従来から行われている方法に従って調製することができる。従って、（口または鼻からの吸入もしくは吹入、または経口、頬内、非経口あるいは直腸投与による投与を目的として、二機能性分子および生理的に許容されるそれらの塩ならびに溶媒和物を製剤化することができる。
【０１２７】
経口投与用には、薬剤学的組成物は、例えば、錠剤またはカプセルなどの剤型にすることができ、それらは、結合剤（例えば、ゼラチン化前のトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルルースなど）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカなど）；崩壊剤（例えば、バレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム（sodium starch glycolate）など）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）などの薬剤学的に許容される賦形剤を用い、従来から行われている方法に従って調製することができる。錠剤は、当該分野において既知の方法に従って被覆することができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の様式にすることができ、あるいは、使用前に水またはその他の適切なビヒクルで再構成するための乾燥製品にすることができる。そのような液体調製物は、薬剤学的に許容される添加剤を用い、従来から行われている方法に従って調製することができ、そのような添加物としては、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体類または硬化食用油など）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシアなど）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル類、エチルアルコールまたは分留植物油（fractioned vegetable oil）など）；ならびに保存剤（例えば、メチルもしくはプロピル−p−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸など）などが挙げられる。該調製物には、緩衝塩類、香料、着色料および甘味料も含む。
【０１２８】
経口投与用調製物は、適切に調製することにより、活性化合物を制御放出することができる。頬内投与用には、組成物は、従来から行われている方法に従って錠剤またはトローチ剤にすることができる。
【０１２９】
吸入による投与用には、本発明に従って使用する二機能性分子は、適切な噴射剤を用い、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレーとして簡便に送達されるが、そのような噴射剤としては、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン−e、二酸化炭素またはその他の適切な気体が挙げられる。加圧エアロゾルの場合には、一定量を送達するための弁を取り付けることによって投与単位を定めることができる。吸入器または吹入器で使用するためにゼラチンなどでつくられたカプセルおよびカートリッジは、化合物の粉末混合物、ならびにラクトースもしくはデンプンなどのような適切な粉末基剤を用いて調製することができる。
【０１３０】
本発明に従う二機能性タンパク質は、注射による非経口投与（例えば、ボーラス静注または連続注入など）用に調製することができる。注射用製剤は、適切な保存剤を加え、アンプルまたは複数投与量用容器などに入れて単位投与様式で提供することができる。そのような組成物は、懸濁液、溶液、または油性もしくは水性ビヒクルを用いたエマルションの様式にすることができ、また、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含む場合がある。別の方法としては、活性成分は、使用前に、滅菌病原性不含水などの適切なビヒクルで再構成するための粉末である。
【０１３１】
組成物は、坐薬または停留浣腸などの肛門用組成物に調製することができ、そのような製剤は、従来から用いられているカカオ脂またはその他のグリセリド類などの坐剤基剤を含む。
【０１３２】
上記の製剤に加え、二機能性分子は、デポー製剤にすることもできる。そのように長時間活性な製剤は、埋込（例えば、皮下または筋肉内など）または筋肉内注射によって投与することができる。故に、例えば、化合物は、適切なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションなど）、またはイオン交換樹脂を用いて調製することができ、あるいは、やや難溶な誘導体（例えば、やや難溶な塩など）として調製することができる。
【０１３３】
所望するならば、組成物は、活性成分を含有する1もしくはそれ以上の単位投与様式を含むパックまたはディスペンサー装置に入れることができる。パックは、ブリスターパックなどのように、例えば、金属またはプラスチック薄片などから構成されている。パックまたはディスペンサー装置には、投与指示書を添付することができる。
【参考文献】
【０１３４】
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】血中の気体と肺機能。PaO2／FiO2比（A）および肺シャント画分（B）の変化を示している。□は、損傷を受け、生理食塩水で処置した群（n＝6）、◇は、損傷を受け、ATIIIで処置した対照群（n＝6）、●は、損傷を受け、アルガトロバンで処置した群（n＝6）を示す。データは、平均±SEで表している。＊は、生理食塩水処置群に対する有意差を表す（p＜0.05）。
【図２】気道抵抗。気道抵抗は、デルタ気道圧（ΔAP）を計算することによって評価した。ΔAPは次の式で計算される；ΔAP＝［ピークAP］−［プラトーAP］。□は、損傷を受け、生理食塩水で処置した群（n＝6）、◇は、損傷を受け、ATIIIで処置した対照群（n＝6）、●は、損傷を受け、アルガトロバンで処置した群（n＝6）を示す。データは、平均±SEで表している。
【図３】肺の組織病理学スコア。煙または細菌チャレンジを行ってから24時間後に評価した充血、水腫、炎症および出血の組織学的変化。各スコアの合計は、組織学的総スコアとして計算した（A）。偽の損傷群のデータは、発明者らの過去のデータを用いている（n＝6）。充血（Con）、水腫（Ed）、炎症（Inf）および出血（Hem）などの各組織学的差異に対するATIIIの効果はBに示している。白抜きの棒は、損傷を受け、生理食塩水で処置した群（n＝6）、黒塗りの棒は、損傷を受け、ATIIIで処置した対照群（n＝6）を示す。データは、平均±SEで表している。＊は、偽の損傷群に対する有意差を表す（p＜0.05）。
【図４】気道の遮断に関する顕微鏡を用いた評価。気道遮断の割合を求めた。データは、気管支および細気管支レベルで分析し、平均±SEで表している。＊は、生理食塩水処置群に対する有意差を表す（p＜0.05）。
【図５】肺の湿潤／乾燥重量比。肺水腫または肺の水分含量の指標として、血液を抜いた肺の湿潤／乾燥重量比を計算した。データは、平均±SEで表している。＊は、生理食塩水処置群に対する有意差を表す（p＜0.05）。
【図６】血漿中の硝酸塩および亜硝酸塩（NOx）レベル。□は、生理食塩水で処置した群（n＝6）、◇は、ATIIIで処置した対照群（n＝6）、●は、アルガトロバンで処置した群（n＝6）を示す。＊は、生理食塩水処置群に対する有意差を表す（p＜0.05）。
【図７】核移植を介してクローン動物を作成する過程に関する一般的方法を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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