(57)【要約】  本発明は、サンプル中の酵素を検出する方法を提供し、該酵素は化学部分を核酸分子に添加または核酸分子から除去することが可能であり、それにより次の工程で核酸分子の感度の変化を付与する。本発明は、本発明の方法を利用する診断方法および本発明の方法を実施するのに有用であるキットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の酵素を検出する方法であって、該酵素は化学部分を核酸分子に添加または核酸分子から除去することが可能であり、それにより次の工程で核酸分子の感度の変化を付与し、前記方法は、
−酵素の存在について試験されるサンプルを核酸分子と相互作用させるステップと、
−酵素によって引き起こされた核酸分子の感度の変化を検出することによって、酵素と核酸分子との相互作用について試験するステップと、
を含む方法。
【請求項２】
前記酵素が核酸分子から末端ホスフェートを除去できるホスファターゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酵素がアルカリホスファターゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルカリホスファターゼが血清アルカリホスファターゼ、子牛小腸由来ホスファターゼ（CIP）、細菌由来アルカリホスファターゼ（BAP）またはエビ由来アルカリホスファターゼのいずれかである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検出される酵素が前立腺酸性ホスファターゼである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
検出される核酸分子の感度の変化がヌクレアーゼ消化からの核酸分子の保護である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記検出ステップが、サンプルをヌクレアーゼ酵素によってインキュベートすることと、ヌクレアーゼ酵素によるインキュベーションの後に核酸分子の存在または非存在について試験することとによって実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
次の工程での感度がサンプル中の酵素活性によって変化した核酸分子と、不変の核酸分子を消化することによって感度が変化していない核酸分子とを区別するために使用されるヌクレアーゼが、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの両方または２つの相補性エキソヌクレアーゼを含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
使用した前記エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
使用した前記相補性エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIであるか、または使用したエンドヌクレアーゼがマングビーンエンドヌクレアーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸分子が平滑末端化されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸分子がｄｓＤＮＡを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子が両方の５’端にてホスホリル化されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸分子が片方の５’端にてホスホリル化されている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸分子がDNA増幅技法によって、ホスホリル化プライマーを使用して生成される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸がキナーゼ酵素によって処理される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記核酸分子がプラスミドから生成される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プラスミドがｐＵＣ誘導体およびｐＢＲ３２２のうち１つを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラスミドが制限酵素を使用して開裂され、平滑末端直鎖核酸分子を生成する、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）サンプルに、一方の５’端のみでホスホリル化されている平滑末端ｄｓＤＮＡを含む核酸分子を添加するサブステップと、
ｂ）ホスファターゼ活性を可能にする条件下でインキュベートするサブステップと、
ｃ）ラムダエキソヌクレアーゼおよびマングビーンエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼIをサンプルに添加して、これらの酵素と共にインキュベートするサブステップと、
ｄ）核酸分子の存在または非存在として測定された核酸分子の感度の変化を検出するサブステップと、
を含む、ホスファターゼ検出のための請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記マングビーンエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼＩがｄｓＤＮＡ消化活性を実質的に防止するのに十分に低い濃度である、請求項１０から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ａ）サンプルに、両方の５’端でホスホリル化されている平滑末端ｄｓＤＮＡを含む核酸分子を添加するサブステップと、
ｂ）ホスファターゼ活性を可能にする条件下でインキュベートするサブステップと、
ｃ）ラムダエキソヌクレアーゼをサンプルに添加して、これらの酵素と共にインキュベートするサブステップと、
ｄ）核酸分子の存在または非存在として測定された核酸分子の感度の変化を検出するサブステップと、
を含む、ホスファターゼ検出のための請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸分子の感度の変化が核酸増幅技法を使用して検出される、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
使用する前記核酸増幅技法がＰＣＲ、ローリングサークル増幅、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記増幅の生成物がリアルタイム技法を使用して検出される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記リアルタイム技法がＴａｑｍａｎ（登録商標）システム、分子ビーコンシステムおよびスコーピオンプローブシステムのいずれか１つより成る、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記酵素がイムノアッセイで抗原／分析物の検出に使用される酵素である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記酵素が抗原／分析物の検出で使用される抗体に、直接または間接的のどちらかで結合される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が一次抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が二次抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が単一管内で実施される、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
検出される酵素が感染性因子に関連し、それにより核酸分子の感度の変化の検出が感染性因子の存在を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３３】
前記感染性因子がアスペルギルスまたはスタフィロコッカス種である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ａ）特異的抗体を介した感染性因子特異的ホスファターゼの捕捉および分離のサブステップと
ａ）分離されたホスファターゼに両方の５’端でホスホリル化されている平滑末端ｄｓＤＮＡを含む核酸分子を添加するサブステップと、
ｂ）ホスファターゼ活性を可能にする条件下でインキュベートするサブステップと、
ｃ）ラムダエキソヌクレアーゼをサンプルに添加して、この酵素と共にインキュベートするサブステップと、
ｄ）核酸分子の存在または非存在として測定された核酸分子の感度の変化を検出して、感度の変化の検出が感染性因子の存在を示すサブステップと、
を含む、感染性因子に関連するホスファターゼ酵素検出のための請求項１、３２および３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
−前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）の存在について試験する対象から取得したサンプルを、核酸分子と相互作用させるステップと、
−後続する工程でＰＡＰによって引き起こされた核酸分子中の感度の変化を検出することによって、ＰＡＰと核酸分子との相互作用を試験して、それによりサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）の存在を、対象が前立腺癌を持っているという徴候として解釈するステップと、
を含む、哺乳類対象での前立腺癌を診断する方法。
【請求項３６】
−血清アルカリホスファターゼの存在について試験する対象から取得したサンプルを、核酸分子と相互作用させるステップと、
血清アルカリホスファターゼによって引き起こされた核酸分子中の感度の変化を検出することによって、血清アルカリホスファターゼと核酸分子との相互作用を試験して、それによりサンプル中の血清アルカリホスファターゼの存在を、対象が血清アルカリホスファターゼレベルの上昇と関連する疾患を持っているという徴候として解釈するステップと、
を含む、哺乳類対象での血清アルカリホスファターゼレベルの上昇と関連する疾患を診断する方法。
【請求項３７】
前記方法が敗血症、ＡＩＤＳ、悪性腫瘍、閉塞性胆管疾患、浸潤性肝疾患、敗血症および胆管癌のいずれか１つを診断するために使用される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記方法がインビトロで実施される、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記サンプルを対象から取得するステップをさらに含む、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象がヒトである、請求項３５から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
化学部分を核酸分子に添加または核酸分子から除去し、それにより次のステップで核酸分子の感度の変化を付与する酵素を検出するキットであって、
−酵素によって作用可能である核酸分子と、
−次の工程で核酸分子の感度の変化を検出する手段と、
を含むキット。
【請求項４２】
前記核酸分子がｄｓＤＮＡを含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記核酸分子が平滑末端化されている、請求項４１または４２に記載のキット。
【請求項４４】
前記核酸分子が一方または両方の５’端にてホスホリル化されている、請求項４１から４３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４５】
制限酵素を使用して切断されて、両方の５’端にてホスホリル化されている平滑末端ｄｓＤＮＡを与えるプラスミドを核酸分子が含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４６】
前記プラスミドがｐＵＣ誘導体またはｐＢＲ３２２である、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記プラスミドを切断するのに必要な制限酵素をさらに含む、請求項４５または４６に記載のキット。
【請求項４８】
核酸分子の感度の変化を測定するための手段が、核酸分子が酵素によって修飾されていない場合に核酸分子を消化する、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼまたは相補性エキソヌクレアーゼを含む、請求項４１から４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４９】
前記エンドヌクレアーゼがマングビーンエンドヌクレアーゼを含むか、または相補性エキソヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼIを含む、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記エキソヌクレアーゼがラムダエキソヌクレアーゼを含む、請求項４８または４９に記載のキット。
【請求項５１】
検出される酵素がアルカリホスファターゼである、請求項４１から５０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
核酸分子の感度の変化を測定するための手段が核酸増幅を必要とする、請求項４１から５１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
前記キットが核酸増幅に必要な試薬をさらに含む、請求項４１から５２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
前記核酸増幅ステップがＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、ローリングサークル増幅、３ＳＲおよびＴＭＡから選択される、請求項５２または５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記キットが核酸増幅生成物のリアルタイム検出に必要なプローブおよび試薬をさらに含む、請求項５２から５４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
前記リアルタイム検出方法がＴａｑｍａｎ（登録商標）システム、分子ビーコンシステムおよびスコーピオンプローブシステムから選択される、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
感染性因子特異的ホスファターゼに対して選択性である抗体をさらに含む、請求項４１から５６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
前記感染性因子がアスペルギルスまたはスタフィロコッカス種である、請求項５７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素によって引き起こされた核酸分子の変化を検出することによって、核酸分子を修飾可能である酵素をサンプル中で検出するための方法およびキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
標的分子、たとえば特定の核酸、タンパク質またはさらに単純な分子を検出するための感度の高い方法が存在する。そのような分子の存在は、たとえば進行中の感染または環境汚染を表すために使用できる。プリオン疾患では、核酸が存在しない場合にプリオンタンパク質を検出できることが有用である。また、ウィルス感染のある段階において、ウィルス抗原は存在するが、ウィルス核酸はほとんど存在しない。ここでウィルス抗原を直接検出できることが有用となる。これらの方法の感度を高くして、ごくわずかな単一分子を検出するために、方法は高い特異性も持たなければならない。この高い特異性は、検出される標的分子に２個のレポーターを結合することによって達成されることが多い。
【０００３】
非常に感度の高いポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の場合、たとえば２個の短い核酸プローブまたはプライマーが標的核酸を認識する。標的核酸の検出はそれゆえ、両方のプライマーが同じ標的分子に結合され、標的分子を通じて連結されたときにのみ達成される。プライマーと他の分子との非特異的相互作用は、両方のプライマーがこの非特異的相互作用によって結合し、連結されなければ検出されない。反応の条件は、後者が極めて起こりにくいようになっている。ＰＣＲ法および他の分子増幅法は当技術分野で周知であり、たとえば核酸配列ベース増幅（NASBA; Compton, 1991）（1）、転写仲介増幅（TMA; Gen-probe, Inc.）および自続配列複製（3SR; Fahy et al., 1991）（2）を使用して標的核酸を検出できる。
【０００４】
イムノアッセイは、関心のある特定の分析物／抗原を検出するために利用されることが多い。ここで抗体、通常、モノクローナル抗体は、分析物／抗原の特異的検出を可能にするために使用される。免疫検出法は、２つの主要なカテゴリ；溶液ベース技法、たとえば酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、免疫沈降および免疫拡散、ならびにサンプルが固体支持体に固定されている手順、たとえばウェスタンブロッティングおよびドットブロッティングに大別できる。
【０００５】
ウェスタンブロット分析は抗原／分析物に向けられた一次抗体に依存し、一次抗体は固定化抗原／分析物を含有する膜に添加されて、潜在的な抗原部位へ結合される。次に一次抗体を認識する二次抗体−酵素複合体が、一次抗体の結合する位置を発見するために添加される。二次抗体に結合された酵素、一般にアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼは、反応部位における膜からの光の放出を引き起こす第３のステップにおいて化学発光基質との反応を触媒する。シグナルに暴露されたＸ線フィルムは、潜在的な一次抗体認識の視覚的表示を与える。化学発光基質へのホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼの作用は、ピコモル範囲までの感度を与えることができる。抗原／分析物は多数の方法によって、ニトロセルロースまたはポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に固定化できる。所与の抗原／分析物を検出する能力は、膜の単位面積当たりの抗原の量および一次抗体の特性によって変わる。
【０００６】
ＥＬＩＳＡは特定の抗原／分析物の高感度で定量的な検出を提供する。最も一般的なＥＬＩＳＡは、抗体サンドイッチ形式に基づいている。一般的に、サンドイッチＥＬＩＳＡは、特定の抗原に向けられた２個の抗体を必要とする。１個の抗原をＥＬＩＳＡプレートのウェルにコーティングする。次にウェルを非特異的タンパク質溶液（たとえば乳タンパク質溶液）を使用して「ブロック」し、バックグランドレベルを最低限に維持する。次に、溶液中に抗原を含有するサンプルをウェルに添加して、固定化抗体への抗原結合を可能にするのに十分な量の時間に渡ってインキュベートする。次に、二次抗体を抗原に結合させて、「サンドイッチ」を完成させることができる。二次抗体は、二次抗体に対して特異的な酵素複合体を用いて検出される。別の手段として、二次抗体は、続いての検出を可能にするために、それ自体標識することができる。最終ステップで酵素基質をウェルに付加するとき、抗原に連結された複合酵素は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して、使用した酵素および基質に依存して比色的、蛍光性または化学発光性である反応生成物を観察することによって検出される。
【０００７】
イムノアッセイで最も一般的に利用される酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）およびアルカリホスファターゼ（AP）である。そのような酵素は、基質色原体と反応することが可能であり、抗原の存在下で着色生成物を生じる。たとえばアルカリホスファターゼとの結合で一般に使用される基質色原体は、５−ブロモ、４−クロロ、３−インドリルホスフェート（BCIP）である。付加剤、たとえばヨードブルーテトラゾリウム（INT）も、反応部位、すなわち一次および二次抗体が抗原に結合した場所での、沈殿の最終的な色を強化するために使用される（INTを用いたBCIPでは黄色がかった褐色となる）。
【０００８】
アルカリホスファターゼは、５’ホスフェート基をDNAおよびRNAから除去する能力も有する。それはホスフェートをヌクレオチドおよびタンパク質から除去することもできる。これらの酵素は、アルカリ性pHにて最も活性である。主要な３タイプがイムノアッセイで一般的に利用される。細菌由来アルカリホスファターゼ（BAP）は高い活性の酵素である。子牛小腸由来アルカリホスファターゼ（CIP）は、ウシ小腸から精製され、たとえばプロテアーゼ消化または熱を使用して不活性化できる。エビ由来アルカリホスファターゼは冷水エビに由来し、熱処理を使用してかなり容易に不活性化することができる。
【０００９】
ＨＲＰは多数のバイオアッセイに使用できる。ペルオキシダーゼ活性も多くの細胞に存在する。ＨＲＰ用の多くの蛍光発生基質が当技術分野で周知であり、市販されている。１つの例は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンであり、これはＨＲＰの存在下で１：１化学量論にてＨ2Ｏ2と反応することが可能であり、高い蛍光性のレゾルフィンを生成する。代わりの基質はスコポレチンであり、ここではＨＲＰが蛍光スコポレチンの非蛍光生成物への変換を触媒する。そのような基質は一般にＥＬＩＳＡキットに含まれており、抗原／分析物が存在する部位の検出を可能にする。
【００１０】
イムノアッセイおよび核酸増幅技法の利点を組合わせる多くの試みが行われてきた。タンパク質を核酸分子に連結するために、間接結合法を使用できる。たとえば酵素、たとえばアルカリホスファターゼは分子、たとえばビオチンおよびジゴキシゲニンへ共有結合される。そしてこの複合体は次に、たとえばサザンブロッティング法およびノーザンブロッティング法で使用されるビオチニル化核酸プローブにストレプトアビジンブリッジを介して非共有結合できる。そのような方法は、一貫した結果を生じ得るが、しかしながらそのプロトコルは、直接結合よりもはるかに長時間かかることがある。酵素および基質が導入可能になる前に、さらなる架橋分子、たとえばストレプトアビジンまたは抗体を標識プローブに結合させるためには、通常、複数のインキュベーションおよび洗浄ステップが必要である。その上、さらなるステップによって、シグナルにバックグラウンドが追加される可能性が高まる。
【００１１】
それゆえプローブへの酵素の直接結合は、速度を増し、感度を最大限するために好ましい選択肢である。アルカリホスファターゼ結合オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）は、常法のスクリーニング用途、たとえばサザン（DNA）ブロッティングおよびノーザン（RNA）ブロッティング、遺伝子マッピングおよび制限断片長多型（RFLP）解析に使用できる。それらはインサイチューハイブリダイゼーションにも使用できる。
【００１２】
酵素イムノアッセイは、抗原の検出にとって最も普遍的な方法として確立されている。それらは簡単で、堅牢であり、実施しやすい。さらなる感度が必要な場合には、さらに複雑で高価な核酸増幅試験、たとえばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を実施できる。両方の手法の利点を組合せるために、多数の試みがなされている。たとえば、抗原を検出できる高感度核酸試験への使用がある。これは関連した核酸のないプリオンの検出、または感染後のある時間におけるウィルス抗原があるが、ウィルス性核酸がほとんどない、血液銀行スクリーニングに有用である。
【００１３】
核酸によって標識された抗体を使用することによって免疫および核酸手法を組合せる以前の試み（いわゆる免疫ＰＣＲ）は、問題を抱えていた。ＤＮＡを抗体に連結することは、問題が多く、連結されたＤＮＡは「粘着性」であり、未結合のＤＮＡは検出前に系から容易に洗浄されず、このことはアッセイにおいて非特異的結合および高いバックグラウンドを引き起こすことがある。
【００１４】
本発明は、以下に述べるように、従来技術の方法に関連する問題を克服する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、酵素によって引き起こされた核酸分子の変化を検出することによって核酸分子を修飾できる酵素をサンプル中で検出するための改良された方法を提供するよう努める。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の第１の態様により、サンプル中で酵素を検出する方法が提供され、ここで酵素は化学部分を核酸分子へ付加または化学部分を核酸分子から除去可能であり、それにより次の工程で核酸分子の感度の変化を付与し、該方法は、
−酵素の存在について試験されるサンプルを核酸分子と相互作用させるステップと、
−酵素によって引き起こされた核酸分子の感度の変化を検出することによって、酵素と核酸分子との相互作用について試験するステップと、
を含む。
【００１７】
上記方法は、酵素が存在する場合に、化学部分を核酸分子に付加することまたは化学部分を核酸分子から除去することが可能であるという事実に依存している。この部分の付加または除去は、次の工程での核酸分子の感度を変化させる。次の工程への感度の上昇または低下が検出され、それによって試験中のサンプル中における酵素の存在を決定できる。
【００１８】
「化学部分(chemical moiety)」という用語は当技術分野で周知であり、一例として、しかし制限するものではないが、ホスフェート基、炭水化物基、ヌクレオチドおよびアセチル基などを含む。いずれの「化学部分」も、核酸分子へのその付加または核酸分子からのその除去が酵素によって触媒され、次の工程で核酸分子の感度を変化させる限り、本発明の範囲内に含まれる。
【００１９】
上記方法は、核酸分子当たり単一の化学部分の付加または除去に制限されない。したがって「化学部分」という用語は、問題の化学部分の複数のコピーを含む。
【００２０】
化学部分の「付加」は、一例として、しかし制限するものではないが、新しい塩基対あるいはアセチルまたはホスフェート基の付加を含む。付加は、５’または３’端あるいは核酸分子内のいずれかの箇所における。
【００２１】
化学部分の「除去」は、これに制限されるわけではないが、核酸分子の末端からの、または核酸分子に沿ったいずれかの箇所からの塩基およびホスフェート基の除去を含む。
【００２２】
「感度の変化」は本明細書では、さらなる工程を受けさせた時の核酸分子の挙動または特性における、開始時の（化学部分の付加または除去に関して）修飾されていない核酸分子と比較したいずれかの変化を含むとして定義される。
【００２３】
次の工程で核酸分子の感度の変化を付与する化学部分の多くのそのような付加または除去は当技術分野で周知であるが、本発明に関して制限するものではないものとする。たとえば核酸分子への化学部分の付加または核酸分子からの化学部分の除去は、その分子の分解に対する感受性を向上させる。これはたとえば、ヌクレアーゼ活性に対する核酸分子の感受性を向上させることによる。ヌクレアーゼ活性、たとえば５’−３’または３’−５’前進的(processive)エキソヌクレアーゼ活性は、非配列特異的でありうる。あるいはそれは配列特異的でありうる。たとえば核酸分子への化学部分の付加または核酸分子からの化学部分の除去は、新しい制限エンドヌクレアーゼ認識部位を核酸分子に導入して（または実際に制限エンドヌクレアーゼ認識部位を除去して）、これは、化学部分が付加または除去された核酸分子を消化できるが、化学部分が付加または除去されない核酸分子は消化できない特異的制限エンドヌクレアーゼを利用することによって検出できる。
【００２４】
上記方法で使用するための、そしてキットに包含させるための、本発明の核酸分子は、サンプル中で検出される酵素が核酸分子への化学部分の付加または核酸分子からの化学部分の除去を引き起こし、それによって次の工程で核酸分子に感度の変化を付与するような配列および構造でなければならない。「核酸」は本明細書では、核酸分子への化学部分の付加または核酸分子からの化学部分の除去によって修飾され、それによって次の工程で核酸分子に感度の変化を付与することができるいずれかの天然核酸および天然または合成類似物質を含むとして定義される。適切な核酸分子はたとえば、一本鎖または二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖または二本鎖ＲＮＡより成る。試験される酵素活性が、その核酸分子に化学部分を付加するか、核酸分子から化学部分を除去しうるという条件で、部分的に二本鎖であり、部分的に一本鎖である核酸分子も考慮される。最も好ましくは、核酸分子はｄｓＤＮＡを含む。「核酸」という用語は、天然核酸と類似した方法でサンプル中の酵素によって修飾することができる合成類似物質、たとえば非天然または誘導体化塩基を包含する核酸類似物質、または修飾主鎖を有する核酸類似物質を含む。特に「二本鎖ＤＮＡ」または「ｄｓＤＮＡ」という用語は、非天然塩基を含有するｄｓＤＮＡを含むとして解釈される。同様に「ｄｓＲＮＡ」は、非天然塩基を含有するｄｓＲＮＡを含むとして解釈される。
【００２５】
本発明の文脈での「サンプル」は、特定の酵素の存在について試験することが望ましいいずれのサンプルも含むとして定義される。それゆえサンプルはたとえば臨床サンプルまたはインビトロでのアッセイシステムである。サンプルはたとえば組織または細胞を含む。
【００２６】
「診断」は、本明細書において、疾患の状態および進行を監視することと、処置後の疾患の再発について点検することと、特定の処置の成功を監視することとを含むとして定義される。試験は、予測値も含み、これは「診断」という用語の定義の範囲内である。試験の予測値は、ホスファターゼレベルの上昇と関連する疾患に対する潜在的な感受性のマーカーとして使用される。それゆえ危険にさらされた患者は、患者において識別可能な症状という点から見て、疾患が発現する機会を得る前に、識別することができる。
【００２７】
本発明の利点および用途
本発明の利点は、「粘着性の」ＤＮＡ−抗体複合体の使用を回避することを含む−実際に、すでに最適化され、多くの免疫用途を特徴とする同じアルカリホスファターゼ複合体が使用できる。加えてアッセイにおいて、ＤＮＡが標的として使用されており、修飾されているときのみに検出できるため、ＤＮＡを洗い流す必要はない。さらなる利点は、免疫ＰＣＲが、抗体を介して抗原に結合したままである各ＤＮＡ標的のみを増幅できることである。しかしながら本明細書で述べる発明において、ＤＮＡは抗体結合アルカリホスファターゼの基質として使用され、ホスファターゼの各分子が検出可能なＤＮＡ標的の多くの分子を生成する。それゆえＰＣＲの前に、検出されるＤＮＡ標的の増幅がすでにある。２回の増幅；抗体結合酵素による１回目、そして核酸増幅法、たとえばＰＣＲによる２回目より成るこの方法は、従来の免疫ＰＣＲよりも、はるかに感度の上昇をもたらす。したがって、イムノアッセイの感度を上昇させるために、イムノアッセイおよび核酸増幅技法を結びつける方法を提供する利点がある。
【００２８】
この技法の別の用途は、感染性または非感染性疾患に関して重要である遊離ホスファターゼの検出にある。たとえば感染性疾患では、大半の細菌または真菌が、細菌由来または真菌由来ホスファターゼ活性を含有する。通常、そのような疾患は、感染生体の培養によって、または特異的な抗原、抗体またはＰＣＲにより核酸を検出することによって診断される。しかしながら感染生体の数が少ないとき、および宿主の免疫性が脅かされるとき（たとえば化学療法後、またはＡＩＤＳのとき）、ある病原体を検出することは非常に困難である。アスペルギルス症による感染は、診断が困難な一例である。これらの症例では、この手法が非常に感度が高いため、病原体と関連するホスファターゼを探すことは有益である。感染において１つ１つの生体はホスファターゼの多くの分子を有する。いかなる宿主ホスファターゼをも除去するために、病原体と関連するホスファターゼに対して特異的である抗体を使用して、試験前にそのホスファターゼを最初に捕捉することが適切でありうる（たとえば抗ｐｈｏＡはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓと関連するアルカリホスファターゼを免疫捕捉するために使用されている；Kriakov et al.,（2003）Journal of Bacteriology, 185: 983-4991）。１つの手法は、適切な抗体でコーティングされたビーズを使用して、病原体に関連するホスファターゼを捕捉することである。捕捉およびビーズの洗浄後、捕捉されたホスファターゼは本出願で述べた方法によって検出できる。多くのアルカリホスファターゼ、たとえば細菌由来のアルカリホスファターゼが、末端ホスフェートで標識されたｄｓＤＮＡを含みうる非常に幅広い基質特異性を有することが観察されている（Moura et al., Microbiology.（2001）147: 1525-33）。
【００２９】
別の用途は非感染性疾患の検出にある。たとえば前立腺は男性生殖腺であり、精液の一部を形成する体液を生成する。前立腺癌は、成人男性における最も一般的な種類の癌のひとつである。前立腺癌を検出する複数の試験が既に存在する。前立腺の表面を検査するために、触指による直腸検査を利用できる。健康な前立腺組織は通例柔らかいが、これに対して悪性組織は硬く、非対称または「石質」であることが多い。前立腺のサイズを測定して、腫瘍を視覚的に識別するために、経直腸超音波も使用される。前立腺特異抗原（PSA）および前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）レベルを点検するために、血液検査も使用される。そのような検査は、上記の検査によって行った診断を確認する。ＰＳＡは、前立腺被膜細胞および尿道周囲腺によって生成される。非常に高レベルのＰＳＡは、前立腺癌の存在を示しうる。しかしながらＰＳＡ検査は、ＰＳＡ上昇で癌のない場合に偽陽性結果を生じ、ＰＳＡレベルが上昇せずに癌が存在する場合にも偽陰性を生じることがある。このためにＰＳＡレベルが高い場合、確認のために生検が通例行われる。ＰＡＰは、前立腺組織によって生成される酵素である。ＰＡＰのレベルは前立腺疾患が進行するにつれて上昇する。ＰＡＰ検出で使用される１つの方法は、Ｈｉｌｌｍａｎｓ法である（放出されたナフタ−１−オールとジアゾニウム化合物とのアゾカップリング）。Ｌｏｒｅｎｔｚ（３）は、自己指示基質を使用するＰＡＰの連続監視を可能にする方法について述べ、好ましい基質は２−クロロ−４−ニトロフェニルホスフェート（ＣＮＰ−Ｐ）である。
【００３０】
アルカリホスファターゼは、主に肝臓および骨に由来する重要な酵素である。小腸、胎盤、腎臓および白血球で少量が見出される。血清アルカリホスファターゼは、ある疾患状態に罹患している患者では上昇したレベルで存在することも示されている。Maldonado et. al（４）は、血清アルカリホスファターゼレベルが敗血症、ＡＩＤＳおよび悪性腫瘍を持つ患者において、顕著に上昇することを示した。Wiwanitkit（５）は、高い血清アルカリホスファターゼレベルを閉塞性胆管疾患、浸潤性肝疾患、敗血症および胆管癌を持つ患者に見出した。血清アルカリホスファターゼレベルがただちに、そして高感度で検出可能ならば、このことは一連の状態の診断試験を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
上述したように、本発明は、酵素によって引き起こされた核酸分子における変化を検出することによって、核酸分子を修飾できる酵素をサンプル中で検出する改良された方法を提供しようと努めている。
【００３２】
そのような方法は、酵素活性の高感度の検出方法が必要である多数の状況で利用できる。たとえば本発明の方法は、分析物の免疫検出の感度を上昇させるために、そして特定の疾患状態を診断するためのさらに感度の高い診断方法を提供するために使用される。
【００３３】
したがって本発明の第１の態様において、サンプル中で酵素を検出する方法が提供され、ここで酵素は化学部分を核酸分子へ付加または化学部分を核酸分子から除去可能であり、それにより次の工程で核酸分子の感度の変化を付与し、該方法は、
−酵素の存在について試験されるサンプルを核酸分子と相互作用させるステップと、
−酵素によって引き起こされた核酸分子の感度の変化を検出することによって、酵素と核酸分子との相互作用について試験するステップと、
を含む。
【００３４】
最も好ましい実施形態において酵素は、末端ホスフェート基を核酸分子から除去する酵素である。好ましくは、前記酵素は５’末端ホスフェート基を核酸分子から除去するホスフェターゼである。本発明に従って使用される多くのホスファターゼが当技術分野で周知である。この活性を有する最も一般的に知られているホスファターゼは、アルカリホスファターゼである。アルカリホスファターゼは、５’ホスフェート基をＤＮＡおよびＲＮＡから除去する。それはホスフェートをヌクレオチドおよびタンパク質からも除去する。これらの酵素はアルカリ性ｐＨにて最も活性である。バイオアッセイにおいては３つの主要なタイプが一般的に利用され、それは本発明の方法で使用されるが、本発明の方法はこれらの特定のタイプに限定されるものではない。細菌由来アルカリホスファターゼ（BAP）は高活性酵素である。子牛小腸由来アルカリホスファターゼ（CIP）はウシ小腸から精製され、たとえばプロテアーゼ消化または熱を使用して不活性化される。エビ由来アルカリホスファターゼは冷水エビに由来し、熱処理を使用してかなり容易に不活性化される。本発明の方法に含まれるさらなるアルカリホスファターゼアイソザイムは、これに限定されるわけではないが、血清、肝臓および骨アイソザイム、ならびに小腸、胎盤、腎臓および白血球において少量が見出されるアイソザイムを含む。
【００３５】
本発明のさらなる実施形態において、好ましくはホスファターゼおよび最も好ましくはアルカリホスファターゼである５’末端ホスフェートを核酸分子から除去する酵素の活性は、核酸分子をヌクレアーゼ消化から保護する。それゆえこの具体的な実施形態において、酵素は、核酸分子の５’端からのホスフェート基の除去を引き起こすことができ、核酸分子の５’端からのホスフェート基の除去はエキソヌクレアーゼがその分子に作用するのを防止するため、このことは適切なエキソヌクレアーゼを使用して検出可能である。
【００３６】
それゆえホスファターゼの作用は、核酸分子をヌクレアーゼ酵素による消化から保護する。エキソヌクレアーゼ酵素は、個々のヌクレオチドを前進的な方法で核酸分子端から除去する。ラムダエキソヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）のホスホリル化鎖を選択的に消化する高度に前進的な５’−３’エキソヌクレアーゼである。ラムダエキソヌクレアーゼにとって最も好ましい基質は、平滑末端５’ホスホリル化ｄｓＤＮＡである。ＤＮＡが一本鎖（ｓｓ）および／または非ホスホリル化である場合、ラムダエキソヌクレアーゼは大きく低下した活性を有する。
【００３７】
ラムダエキソヌクレアーゼは本発明の方法において有用である。しかしながら本発明はラムダエキソヌクレアーゼの使用に限定されない。ホスホリル化核酸分子を選択的に分解するいずれのエキソヌクレアーゼも本発明で有用である。利用される核酸分子が二本鎖および平滑末端であり、５’端にてホスホリル化されている場合、ラムダエキソヌクレアーゼは分子を迅速に消化することができる。この消化は、核酸分子端からの５’ホスフェートの除去を触媒する適切なホスファターゼ、たとえばアルカリホスファターゼが試験されるサンプル中に存在しない場合に起こる。アルカリホスファターゼ活性がサンプル中に存在する場合、核酸分子の５’ホスフェートはアルカリホスファターゼの活性のために除去され、それゆえ分子をラムダエキソヌクレアーゼによる消化から保護する。未消化核酸分子は、ホスファターゼ活性の存在を測定するために続いて検出される。
【００３８】
本方法により、好ましいエキソヌクレアーゼは、末端５’ホスフェートが核酸分子に結合したままである場合に核酸分子を消化するラムダエキソヌクレアーゼである。
【００３９】
本発明の方法の各種の実施形態で利用される二本鎖核酸分子は、一方の５’端または両方の５’端でホスホリル化されていてもよい。
【００４０】
本発明の方法は、使用されている核酸分子の種類によって多少変更する必要がある。ｄｓ核酸分子の両方の５’端でホスホリル化されている場合には、ホスファターゼ酵素が両方の５’ホスフェートまたは一方のみの５’ホスフェートを除去した場合に、核酸中の検出可能な変化が起こるであろう。アルカリホスファターゼが１個の（二本鎖）核酸分子からの両方の５’ホスフェートの除去を触媒する確率は、特に核酸分子が反応混合物中に高濃度で存在する場合に、一方の５’ホスフェートを除去することに比較して低下する。したがってサンプル中の核酸分子の多くは、ホスファターゼ活性の存在下でも結合した５’ホスフェートをなお有するであろう。このことは、サンプル中でのアルカリホスファターゼへの暴露の後に鎖の一方を５’−３’エキソヌクレアーゼ、たとえばラムダエキソヌクレアーゼによる分解に対して感受性にする（あるいは場合により鎖のどちらも感受性にしない）。ホスファターゼの脱ホスホリル化活性によって、鎖の少なくとも一方が５’−３’エキソヌクレアーゼ活性から保護されるという条件で、好ましくは核酸増幅技法を使用して核酸鎖を検出することが可能である。たとえばＰＣＲを使用すると、増幅に必要な２つのプライマーのうち一方はｓｓＤＮＡに結合して（方法で使用する核酸分子がｄｓＤＮＡである場合）、これは第２のプライマーが次に結合する第２のＤＮＡ鎖を増幅し、それゆえＰＣＲのサイクルをさらに実施すると、さらなる増幅が可能になる。この例は図１および実施例１で説明する。
【００４１】
この例において、ホスファターゼの非存在下でもシグナルが生成される場合に、特異性の不足が起こる。たとえばｄｓ核酸分子の一方のみの５’端がホスホリル化されている場合、５’−３’エキソヌクレアーゼの使用がホスファターゼの存在または非存在を識別する分離において不十分であるのは、１本の鎖が５’端でのホスフェート基の不足によって５’−３’特異的エキソヌクレアーゼ消化から自動的に保護され、したがって最も好ましくは増幅によって検出に利用可能であり、ホスファターゼ活性が存在しなくても陽性結果を与えるからである。加えて、ラムダエキソヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡに対して特異的であるため、多くの分解したＤＮＡが長い一本鎖長の形で残るであろう。次のＰＣＲ検出において、これらの鎖は会合して、増幅され、非特異的シグナルを生成しうる。この場合、特異性を上昇させるために、本発明の方法にエンドヌクレアーゼも含まれる。エンドヌクレアーゼは、核酸鎖内の内部結合を加水分解する。あるエンドヌクレアーゼはＤＮＡ（デオキシリボヌクレアーゼ）に特異的に作用するが、他のエンドヌクレアーゼはＲＮＡ（リボヌクレアーゼ）に対して特異的である（図２を参照）。あるいは相補性エキソヌクレアーゼ、たとえば一本鎖ＤＮＡの３’端に対して特異的であるエキソヌクレアーゼ１を使用して１本鎖会合の可能性を低下させることができる。図３および実施例を参照のこと。
【００４２】
相補性エキソヌクレアーゼは、別のエキソヌクレアーゼと併せて、そして試験を行うサンプル中でのホスファターゼ酵素の非存在下で使用するときに、核酸分子の消化を可能にするエキソヌクレアーゼとして定義される。
【００４３】
それゆえ好ましい実施形態において、本発明の方法はエンドヌクレアーゼまたは相補性エキソヌクレアーゼをさらに含む。本発明の特定の方法に特に適したエンドヌクレアーゼはマングビーンエンドヌクレアーゼであり、これはｓｓ特異的エンドヌクレアーゼである。最も好ましい実施形態において、相補性エキソヌクレアーゼはエキソヌクレアーゼIであり、これは当技術分野で周知の一本鎖（ss）核酸特異的エキソヌクレアーゼである。
【００４４】
しかしながら本発明は、マングビーンエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼIの使用に限定されない。一本鎖核酸分子に対して特異的であるいずれのエンドヌクレアーゼまたは相補性エキソヌクレアーゼも本発明の態様で使用できる。１本鎖特異的エンドヌクレアーゼのさらなる例は、アスペルギルスヌクレアーゼS1（Vogt, 1973）（6）およびXPF（http://bbrp.llnl.gov/bbrp/html/thelen.abst.htmlを参照）を含む。マングビーンエンドヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ基質に効果的に作用する。しかしながらマングビーンエンドヌクレアーゼは、十分に高い濃度で存在する場合、ｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡを消化する。
【００４５】
好ましくは相補性エキソヌクレアーゼ、最も好ましくはエキソヌクレアーゼIまたはエンドヌクレアーゼ、最も好ましくは、マングビーンエンドヌクレアーゼは十分に低い濃度で存在するため、ｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡの消化は、全く起こらないか、重大でない程度である。
【００４６】
本発明で使用するヌクレアーゼは最も好ましくは、反応混合物に同時に、そして核酸分子と同じ反応混合物に添加される。ここでは、ホスファターゼ活性とヌクレアーゼ活性との間に競合がある。ホスファターゼ活性は反応混合物に含まれるエキソヌクレアーゼによる消化から、それゆえ二本鎖核酸分子の片端のみがホスホリル化されている反応の場合においては１本鎖特異的エンドヌクレアーゼによる消化から、核酸分子を保護する。ヌクレアーゼ酵素によってすべての核酸が消化される前に少なくとも一部のホスファターゼ活性が生じるという条件で、これは保護された脱ホスホリル化核酸分子の検出を可能にするであろう。したがって最も好ましくは、ホスファターゼ活性はヌクレアーゼ活性よりも効率的である。ホスファターゼ活性に有利である適切な反応条件は、これを達成するために方法に含まれる。
【００４７】
あるいは別の実施形態において、試験サンプル中に存在するホスファターゼに試験サンプル中の核酸分子から末端ホスフェートの除去を触媒させるために、適切な時間量の後に別の試薬添加ステップにおいてヌクレアーゼ酵素を添加することが可能である。適切な時間量は、ホスフェート基が欠如した核酸分子を検出して、末端ホスフェート基がなお結合している核酸分子と区別するために、核酸分子に存在するホスフェートの十分な数の除去を可能にする時間量として定義される。いずれの所与のアッセイシステムでも、最適時間は常法に従った実験によって経験的に決定される。好ましくは核酸分子の実質的にすべてが、ヌクレアーゼが添加される前に脱ホスホリル化される。そのような方法は、より多くの核酸分子が、それらを消化する機会をヌクレアーゼが得る前にホスファターゼ活性によって脱ホスホリル化される時間を有し、それゆえさらに多くの核酸が存在する各ホスファターゼ分子について検出されるため、次の検出の感度を上昇させる。
【００４８】
さらなる実施形態において、ヌクレアーゼは核酸分子と共に初期試験サンプル中に含めることができるが、それらはホスファターゼ（存在する場合）に核酸分子からホスフェート部分を除去させるために、最初は特異的に阻害される。ホスファターゼ活性にｄｓ核酸分子から末端ホスフェートを除去させるための適切な期間の後、ヌクレアーゼは阻害条件を除去することによって活性化される。たとえばマングビーンエンドヌクレアーゼは、高い塩濃度を使用して阻害され、高度に活性とするために亜鉛も必要とする。それゆえ亜鉛が存在しないように初期サンプル条件を作成することによって、これはマングビーンエンドヌクレアーゼ活性の阻害を可能にする。マングビーンエンドヌクレアーゼ活性は、亜鉛を試験サンプルに添加することによって容易に回復される。そのような特異的阻害条件は、上記方法で利用されるホスファターゼおよびヌクレアーゼの両方によって変わる。適切な条件は当業者に周知であり、市販の酵素と共に挙げられているため、本発明の方法にただちに組み入れられる。
【００４９】
好ましい核酸分子
最も好ましい実施形態において、核酸分子はｄｓＤＮＡを含む。さらなる実施形態において、ｄｓＤＮＡは平滑末端であり、５’端の一方または両方でホスホリル化される。
【００５０】
１つの実施形態において、ｄｓＤＮＡ分子は増幅技法、たとえばＰＣＲを使用して生成される。この実施形態では、ＰＣＲは最も好ましくは５’ホスフェート基を有する２つのプライマーを使用して実施される。ＰＣＲ生成物がホスホリル化されるようにするためには、追加ステップとして、使用前にｄｓＤＮＡをキナーゼ、たとえばポリヌクレオチドキナーゼによって処理することも好ましい。
【００５１】
なおさらなる実施形態において、ｄｓＤＮＡ分子はプラスミドから生成される。平滑末端を残す制限酵素によってプラスミドを切断する場合、両端に５’ホスフェート部分を有する直鎖平滑末端核酸分子が生成される。そのようなｄｓＤＮＡ分子は本発明の方法にとって有利な特徴を有する。たとえばプラスミドを規定された位置で２回切断すると、サンプル中の特定の酵素活性の存在について試験するときに、次の検出に２つの核酸生成物を利用できる。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明の方法で使用する核酸分子は、分子生物学で一般に使用されるベクター、たとえばプラスミドｐＵＣ派生物もしくはｐＢＲ３２２またはこれらのベクターのＰＣＲ由来断片を含む。本発明の方法では、サンプル中の酵素によって引き起こされた核酸分子への化学部分の付加または核酸分子からの化学部分の除去が、次の工程で、核酸分子に検出可能である感度の変化を付与するという条件で、いずれの長さの核酸分子も使用できる。
【００５３】
（好ましい検出技法）
技法を最大限の感度にするために、核酸分子への化学部分の付加または核酸分子からの化学部分の除去によって引き起こされた次の工程での核酸分子の感度の変化は、核酸増幅技法の使用によって検出されてもよい。そのような増幅技法は当技術分野で周知であり、たとえばＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Compton,1991）、３ＳＲ（Fahy et al., 1991）、ローリングサークル複製および転写仲介増幅（TMA）などの方法を含む。増幅は、検出される核酸の配列に特異的である増幅プライマーの使用により実現される。核酸分子の特異性を提供するために、配列の適切な領域に対応するプライマー結合部位が選択される。精通した読者は、核酸分子がサンプル中で酵素によって引き起こされた核酸分子の変化の検出に必要であるプライマー結合部位以外の配列、たとえばRNAポリメラーゼ結合部位も含むことを、あるいはプロモータ配列が等温増幅技術、たとえばＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡに必要であることを認識するであろう。
【００５４】
ＴＭＡ（Gen-probe Inc.）は、反応を行わせるために２つの酵素、すなわちＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を使用するＲＮＡ転写増幅システムである。ＴＭＡ反応は等温性であり、ＲＮＡ増幅最終生成物を生成するためにＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかを増幅する。ＴＭＡはＧｅｎ−ｐｒｏｂｅのハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）検出技法と組合わされて、単一管(single tube)内での生成物の検出を可能にする。そのような単一管検出は、本発明を実施するのに好ましい方法である。このリストは網羅的なものではなく、適切な核酸生成物が特異的に増幅されるという条件で、いずれの核酸増幅技法も使用できる。
【００５５】
それゆえ本発明の好ましい態様において、本発明の方法は、化学部分の付加または除去によって引き起こされた核酸分子の感度の変化を検出するために、核酸増幅技法を使用して実施される。好ましい実施形態において、使用される技法はＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡから選択される。
【００５６】
ヌクレアーゼの使用を包含する実施形態において、選択された増幅方法は、本発明の方法で利用されるヌクレアーゼを増幅ステップの前または増幅ステップ中に不活性化する必要があるかどうかを決定する。ヌクレアーゼ活性が増幅中に存在する場合、増幅反応の生成物は、サンプル中のヌクレアーゼによる分解に感受性である。それゆえＰＣＲを使用して検出される酵素によって引き起こされた核酸分子の感度の変化を検出する場合、ＰＣＲ手順は存在するいずれのヌクレアーゼ活性も破壊する加熱ステップで開始するため、不活性化ステップは必要ない。しかしながら等温技法、たとえば３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたはＴＭＡを利用する場合、増幅生成物の異常な分解を防止するために、例えば適切な洗浄ステップを使用することによって、増幅が起こる前にヌクレアーゼを不活性化または除去することが必要である。
【００５７】
増幅生成物の検出は、常法、たとえばゲル電気泳動による。
【００５８】
増幅反応の生成物のリアルタイム検出のための多数の技法が当技術分野で既知である。これらの多くは、連続的に監視できる蛍光読出し値を生成する。具体的な例は、分子ビーコンおよび蛍光共鳴エネルギー移動プローブである。リアルタイム技法は、それらが反応を「単一管」内で維持するため好都合である。このことは、結果を得るために後続する分析の必要がなく、さらに迅速に得られた結果につながることを意味する。さらに反応を「単一管」環境に維持することは、交差汚染の危険を低減させ本発明の方法からの定量的アウトプットを可能にする。これは以下で概説する診断環境において特に重要である。ＰＣＲ反応のリアルタイム定量化は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システム（Applied Biosystems）を使用して実施できる、Holland et al;Detection of specific polymerase chain reaction product by utilising the 5'-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase; Proc.Natl.Acad. Sci. USA 88,7276-7280（1991）（７）, Gelmini et al. Quantitative polymerase chain reaction-based homogeneous assay with flurogenic probes to measure C-Erb-2 oncogene amplification. Clin. Chem. 43,752-758（1997）（８）およびLivak et al. Towards fully automated genome wide polymorphism screening. Nat. Genet. 9,341-342（19995）（９）（参照により本明細書に組み入れられている）を参照。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブは幅広く市販されており、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システム（Applied Biosystems）は当技術分野で周知である。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブは、PCR反応において上流および下流プライマーの間でアニールする。それらは５’−フルオロフォアおよび３’−クエンチャーを含有する。増幅の間、Ｔａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性は、フルオロフォアをプローブから開裂させる。フルオロフォアはもはやクエンチャーに近接していないため、フルオロフォアは蛍光を発することが可能になる。得られた蛍光は測定され、増幅されている標的配列の量と正比例する。
【００５９】
分子ビーコンシステムにおいて、Tyagi & Kramer. Molecular beacons-probes that fluoresce upon hybridization. Nat.Biotechnol. 14, 303-308（1996）（10）およびTyagi et al. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat.Biotechnol. 16,49-53 （1998）（11）（参照により本明細書に組み入れられている）を参照、ビーコンは、その標的に結合したときに蛍光が回復する、内部的に消光されたフルオロフォアを有するヘアピン形状プローブである。ループ部はプローブとして作用するが、ステムはビーコン端の相補性「アーム」配列によって形成される。フルオロフォアおよび消光部分は対向する端に結合され、ステムはそれぞれの部分を近接させて維持しており、エネルギー移動によってフルオロフォアを消光させる。ビーコンがその標的を検出したときに、ステムを離れさせる構造変化を受け、それゆえフルオロフォアとクエンチャーを隔離する。このことは、エネルギー移動を妨害して蛍光を回復させる。
【００６０】
いずれの適切なフルオロフォアも本発明の範囲内に含まれる。本発明の方法でおそらく使用されうるフルオロフォアは一例として、ＦＡＭ、ＨＥＸ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＲＯＸ（商標）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）などを含む。クエンチャー、たとえばＤａｂｃｙｌおよびＴＡＭＲＡは本発明の方法で使用される周知のクエンチャー分子である。しかしながら、本発明はこれらの具体的な例に限定されない。
【００６１】
本発明の方法に組み入れられるさらなるリアルタイムの蛍光ベースシステムは、Zenecaのスコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）システムであり、WhitcombeらによるDetection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence, Nature Biotechnology 17, 804-807（01 Aug 1999）（12）を参照。この参考文献は、本出願にその全体が組み入れられている。上記方法は、５’伸長のコピーを防止するリンカーによってその５’端に結合したテールを備えたプライマーに基づいている。プローブ要素は、標的部位がテール付きプライマーの伸長により同じ分子内に含まれているときのみに、その標的にハイブリダイズするように設計されている。この方法は、プローブ−標的結合が鎖内二次構造よりも動力学的に好ましいため、迅速で信頼性の高いシグナルを生成する。
【００６２】
それゆえ本発明のさらなる態様において、核酸増幅の生成物はリアルタイム技法を使用して検出される。本発明の１つの具体的な実施形態において、リアルタイム技法は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）システム、分子ビーコンシステムまたはスコーピオンプローブシステムのいずれか１つを使用することより成る。
【００６３】
最も好ましい実施形態において、反応混合物は、増幅生成物のリアルタイム検出を可能にするのに必要な試薬に加えて、試験を受けるサンプル、核酸分子、必要なヌクレアーゼならびに緩衝剤およびすべての試薬、増幅に必要な緩衝剤および酵素のすべてを含有する。それゆえ興味のある酵素、最も好ましくはホスファターゼのための検出方法全体は、１回の反応で定量アウトプットを用いて、いずれの中間洗浄ステップの必要なしに行われる。「単一管」反応の使用は、結果を得るために後続する分析の必要がなく、より迅速に得られた結果につながるため、好都合である。さらに反応を「単一管」環境に維持することは、交差汚染の危険を低減させ本発明の方法からの定量的アウトプットを可能にする。また単一管反応は、たとえば高スループットの状況では自動化により適している。
【００６４】
あるいは本発明の方法は、段階的方法で実施できる。それゆえ核酸分子は試験を受けるサンプルに最初に添加され、サンプル中に存在する酵素によって核酸分子を変化させる。これに従って、１つの実施形態において、ヌクレアーゼ酵素が添加されて変化していない核酸分子を消化する。これはサンプルの反応条件を変化させることを含む。ヌクレアーゼはさらなる実施形態において、検出（それは最も好ましくは増幅による）のために必要な試薬を添加する前に不活性化される。等温増幅技法を使用するかどうかによって、検出ステップを実施する前にヌクレアーゼを不活性化する必要があるかどうかを決定するであろう。リアルタイム検出が利用される場合、必要な試薬は増幅段階で必要な試薬と共に添加される。
【００６５】
増幅される核酸分子に特異的であるプライマーは、本発明の方法およびキットで使用される。最小限のバックグラウンドを持つ配列特異的増幅、非特異的増幅を誘導するいずれのプライマーも利用できる。プライマーは利用される増幅技法に応じて、ＤＮＡまたはＲＮＡおよび合成同等物を含む。たとえば標準ＰＣＲでは、短い一本鎖ＤＮＡプライマー対が使用される傾向にあり、両方のプライマーが増幅される興味のある領域に隣接する。核酸増幅技術、たとえばＰＣＲ、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＭＡで使用されるプライマーの種類は、当技術分野で周知である。
【００６６】
リアルタイム方法で使用するのに適切なプローブも、それらが本発明の方法で核酸分子と併せて使用されるように設計される。それゆえたとえば、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）技法を使用する場合、プローブは、次にリアルタイムで検出される変化を与える酵素によって修飾される核酸分子上のプライマー結合部位間にそれらが結合できるような配列である必要がある。同様に分子ビーコンプローブは、本発明の方法およびキットに含まれる核酸配列の関連部分に結合するように設計される。リアルタイム検出にスコーピオンプローブ技法を使用する場合、プローブは、標的部位がテール付きプライマーの伸長によって同じ分子に含まれているときのみに、その標的にハイブリダイズするように設計される必要がある。したがって本発明は、本発明のリアルタイム検出方法で使用するのに適切なプローブの包含をさらに提供する。
【００６７】
核酸分子への化学部分の添加、または核酸分子からの化学部分の除去を検出するために、別の方法が使用できる。そのような検出ステップは、１つの実施形態において、ホスフェート部分が除去されていない核酸分子を消化するために、上述のようにヌクレアーゼを含む必要がなく、核酸分子の末端からのホスフェート基の除去を検出するのに十分な感度である。しかしながらこの場合、実質的にすべての核酸分子が最初にホスホリル化されるようにする必要がある。それらがホスホリル化されない場合、サンプル中にホスファターゼ活性が存在しなくも、見かけの陽性結果が得られることがある。
【００６８】
あるいは上述のヌクレアーゼも反応混合物に含まれるので、本発明のさらなる実施形態において、ホスフェート部分が除去されていないいずれの核酸分子も分解され、それゆえ以下で述べる代わりの技法によって検出されないであろう。代わりの検出技法の例は、マトリックス支援レーザー脱離（ＭＡＬＤＩ）質量分析およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析を含む質量分析、クロマトグラフィーおよびマイクロアレイ技術（Ｍｏｔｏｒｏｌａ，Ｎａｎｏｇｅｎ）の使用を含む。質量分析は、核酸分子の予想分子量が正確に測定されるようにする。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦはイオンを迅速に抽出し、それらを飛行管の下方へ加速する高い電圧電位を利用する。飛行管の端の検出器を使用して、初期レーザパルスからイオン検出までに経過した時間を決定する。飛行時間はイオンの質量に比例する。それゆえ本発明の方法のある実施形態においてヌクレアーゼの非存在下でも、ｄｓ核酸分子の質量の相違は、ホスフェート基が５’末端に結合しているかどうかによって、ホスフェート部分を保持するこれらの核酸分子とホスフェート部分が除去された核酸分子を区別するためになお検出される。明らかに、ホスフェート部分を保持する核酸分子が適切なヌクレアーゼを使用して消化される場合、質量の相違は、ホスフェート部分を保持する核酸分子と保持しない核酸分子との間でよりただちに検出できる。
【００６９】
同様に、適切なタグが固体担体に結合されたマイクロアレイを使用することによって、サンプル中の酵素活性によって化学部分が付加または除去された核酸分子は、後続する工程で識別される。再び本技法は、ホスホリル化核酸分子を非ホスホリル化核酸分子から区別することが可能であり、あるいはヌクレアーゼ消化を使用して化学部分を保持するこれらの核酸分子を除去する。
【００７０】
これらの別の技法は、増幅生成物をキャラクタリゼーションするために、好ましくは核酸増幅技法と併せて使用される。これは予期された生成物でない増幅生成物が生成されている偽陽性結果を除去するのに役立つ。それゆえ感度を上昇させる増幅ステップの利点は、増幅生成物を正確にキャラクタリゼーションするステップと組合されて、それゆえ本発明の方法をさらになお正確にする。
【００７１】
（イムノアッセイ）
特定の実施形態において、本発明の方法は、ホスファターゼ活性の検出に基づくいずれかのアッセイシステム感度を向上させるために使用できる。最も好ましい実施形態において、本発明の方法はイムノアッセイ、たとえばウェスタンブロット、ドットブロット、ELISA、免疫沈降または免疫拡散の感度を向上させるために好都合に使用される。しかしながら、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。
【００７２】
多くのイムノアッセイにおいて、検出される抗原に対して特異的である一次抗体が使用される。第１の、通例標識されていない抗体の抗原への結合を検出するために、未結合抗原を除去する洗浄ステップの後に、一次抗体と交差反応する二次抗体が添加されるであろう。この二次抗体は、酵素、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼに結合されていることが多い。あるいは溶液ベースのアッセイ、たとえばＥＬＩＳＡ、免疫沈降および免疫拡散では、二次抗体は抗原上の第２の部位を認識する。再度、二次抗体は酵素、たとえばＨＲＰまたはＡＰに結合されていることが多い。そのような酵素は基質色原体と反応して、抗原の存在下で着色生成物を与えることができる。たとえばアルカリホスファターゼと共に使用される、一般に使用される基質色原体は、５−ブロモ、４−クロロ、３−インドリルホスフェート（BCIP）である。添加剤、たとえばヨードブルーテトラゾリウム（INT）も反応部位、すなわち一次抗体および二次抗体が抗原に結合した場所での沈殿物の最終的な色を向上させるために使用される（ＩＮＴを用いたＢＣＩＰにおいては黄褐色である）。ＨＲＰ用の多くの蛍光発生基質は当技術分野で周知であり、市販されている。一例はＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、すなわち１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジンであり、HRPの存在下でＨ2Ｏ2と１：１の化学量論で反応して非常に蛍光性であるレゾルフィンを生成できる。代わりの基質はスコポレチンであり、ここでHRPは蛍光性スコポレチンの非蛍光性生成物への変換を触媒する。そのような基質は一般に、抗原／分析物が存在する部位の検出を可能にするためにELISAキットに含まれる。
【００７３】
本発明者らは、イムノアッセイで一般に使用される酵素、たとえばアルカリホスファターゼも核酸基質に作用して、検出可能な変化を与えることができるという事実を利用している。ホスファターゼ、たとえば子牛小腸由来ホスファターゼ（CIP）はたとえば、５’末端ホスフェート基を二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子から除去する。そのような活性が可能であるいずれのホスファターゼも本発明の範囲に含まれる。この活性は、ＤＮＡが平滑末端化されているときに、すなわち一本鎖（ss）オーバーハングがない場合に著しく効率的である。適切な核酸分子をイムノアッセイに包含させることによって、化学部分を核酸分子に付加または核酸分子から除去できる（抗体結合した）酵素によって引き起こされた核酸分子の感度の変化を監視することにより、分析物／抗原の存在が感度の高い方法で検出される。
【００７４】
ＯｂｒｅｃｈｔおよびＤｉｒｈｅｉｍｅｒ（１３）は、ＨＲＰがオクラトキシンＡ（OTA）の存在下で、インビトロでのＤＮＡおよびデオキシグアノシン３’モノホスフェート（dGMP）付加体の形成を触媒できることを示している。反応は、クメンヒドロペルオキシドの存在下よりも、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）の存在下でより効率が低い。ペルオキシダーゼはＯＴＡを代謝して、ＤＮＡおよびｄＧＭＰに共有結合可能な活性化種を形成できる。それゆえ、ＨＲＰがＯＴＡの存在下でＤＮＡと他の分子、たとえばｄＧＭＰとの間で付加体を形成する能力を検出することによって本発明の方法を使用することができる。付加体は当技術分野で周知の方法、たとえばクロマトグラフィー、あるいは質量分析、たとえばＭＡＬＤＩまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、そしてたとえばマイクロアレイ技術（Ｍｏｔｏｒｏｌａ，Ｎａｎｏｇｅｎ）の使用によって検出される。
【００７５】
それゆえ１つの好ましい実施形態において、本発明の方法は酵素の存在を検出するために実施され、ここで酵素はイムノアッセイで抗原／分析物の検出に使用する酵素である。好ましくは検出される酵素は、抗原／分析物の検出に使用される抗体に結合する。抗体は一次抗体でも二次抗体でもよい。
【００７６】
しかしながら本発明の方法は、イムノアッセイの感度を向上させるための使用に限定されない。上述したように、アルカリホスファターゼ結合オリゴヌクレオチド／プローブ（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）は、常法のスクリーニング用途、たとえばサザン（DNA）およびノーザン（RNA）ブロッティング、遺伝子マッピングおよび制限断片長多型（RFLP）解析に使用される。それらはインサイチュー(in situ)ハイブリダイゼーションにも使用される。本発明の方法は、そのような技法の感度を向上させるために使用される。ＡＰ活性の比色検出を使用する代わりに、本発明の方法は、ＡＰ活性を検出し、それゆえプローブの結合を検出するために使用される。ＡＰが核酸分子を修飾する能力を、修飾された核酸を検出するための増幅ステップと結合することによって、感度は上昇する。ＡＰ分子に結合したオリゴヌクレオチドがＡＰによって修飾される核酸分子の検出を妨害しないように注意する必要がある。またプローブされる実際の核酸配列は、本発明の方法の妨害を防止するために処置する必要がある。ラムダエキソヌクレアーゼによるヌクレアーゼ消化はたとえば、プローブおよびその５’端でホスホリル化されていないサンプル配列を利用することによって防止される。これは、検出ステップの前ステップとして、脱ホスホリル化ステップを実施することによって実現される。これは一方または両方の５’端でホスホリル化されたｄｓ核酸分子を添加する前に必然的に起こり、そうでなければホスファターゼ活性によって引き起こされた核酸分子の変化は起こらず、それゆえサンプル中の酵素活性は敏感に検知されない。
【００７７】
感染性疾患の検出
上述したように本発明の方法は、感染性因子に関連する遊離ホスファターゼを検出するために利用される。
【００７８】
それゆえサンプル中の感染性因子からのホスファターゼを検出する方法を提供し、該ホスファターゼは化学部分を核酸分子へ付加または核酸分子から除去することが可能であり、それによって次の工程で核酸分子の感度の変化を付与し、該方法は、
−酵素の存在について試験されるサンプルを核酸分子と相互作用させるステップと、
−ホスファターゼによって引き起こされた核酸分子の感度の変化を検出することによって、ホスファターゼと核酸分子との相互作用について試験して、感度の変化の検出が感染性因子の存在を示すステップと、
を含む。
【００７９】
１つの実施形態において、感染性因子はアスペルギルスまたはスタフィロコッカス種である。
【００８０】
サンプルは一般的に、感染性因子よって感染していることが疑われる対象から採取したサンプルである。感染性因子が存在している可能性があるいずれの種類のサンプルも使用される。一般に組織および細胞サンプルが利用されるが、対象から採取した全血、血清、血漿、尿、乳糜、糞便、射精液、痰、乳頭吸引液、唾液なども上記方法で試験される。
【００８１】
対象は最も好ましくはヒト対象であるが、動物対象、たとえばイヌ、ネコ、ブタ、メウシまたはサルを含む。
【００８２】
上記方法は、単離されたサンプルを利用するインビトロ法であることが意図されている。しかしながら１つの実施形態において、上記方法は試験中の対象から適切なサンプルを取得するステップをさらに含む。
【００８３】
最も好ましい実施形態において、そして感染性因子に関連するホスファターゼ酵素が宿主ホスファターゼ酵素と区別されるようにするために、方法はさらに、
ａ）特異的抗体を介した感染性因子特異的ホスファターゼの捕捉および分離のサブステップと
ａ）分離されたホスファターゼに両方の５’端でホスホリル化されている平滑末端ｄｓＤＮＡを含む核酸分子を添加するサブステップと、
ｂ）ホスファターゼ活性を可能にする条件下でインキュベートするサブステップと、
ｃ）ラムダエキソヌクレアーゼをサンプルに添加して、この酵素と共にインキュベートするサブステップと、
ｄ）核酸分子の存在または非存在として測定された核酸分子の感度の変化を検出して、感度の変化の検出が感染性因子の存在を示すサブステップと、
を含む。
【００８４】
非感染性疾患の検出の診断方法
多くのホスファターゼは疾患との関連を有することが既知である。たとえば前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）レベルの上昇は、前立腺癌と結びついていることが既知である。ＰＡＰによる脱ホスホリル化が可能である適切な核酸分子を利用することによって、前立腺癌の診断試験は本発明の範囲に含まれる。
【００８５】
アルカリホスファターゼは、主に肝臓および骨に由来する重要な酵素である。小腸、胎盤、腎臓および白血球に少量が見出される。さらに血清のアルカリホスファターゼレベルは一連の状態に苦しんでいる対象では上昇することが示されている。Maldonado et. al（３）は、血清アルカリホスファターゼレベルが敗血症、ＡＩＤＳおよび悪性腫瘍の患者で著しく上昇することを示した。Wiwanitkit（４）は、閉塞性胆管疾患、浸潤性肝疾患、敗血症および胆管癌の患者で高い血清アルカリホスファターゼレベルを見出した。本発明の方法を使用して血清アルカリホスファターゼを高感度で検出することにより、診断試験は、患者からの大型のサンプルを必要とせずに、これらの状態それぞれを診断することが想定される。
【００８６】
それゆえ本発明は、哺乳類対象での前立腺癌を診断する方法を提供し、該方法は、
−前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）の存在について試験する対象から取得したサンプルを、核酸分子と相互作用させるステップと、
−後続する工程でＰＡＰによって引き起こされた核酸分子中の感度の変化を検出することによって、ＰＡＰと核酸分子との相互作用を試験して、それによりサンプル中の前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）の存在を、対象が前立腺癌を持ちうる、または持っているという徴候として解釈するステップと、
を含む。
【００８７】
同様に本発明は、哺乳類対象における敗血症、ＡＩＤＳ、悪性腫瘍、閉塞性胆管疾患、浸潤性肝疾患、敗血症および胆管癌のいずれか１つを含む、血清アルカリホスファターゼの上昇に関連する疾患を診断する方法を提供し、該方法は、
−血清アルカリホスファターゼの存在について試験する対象から取得したサンプルを、核酸分子と相互作用させるステップと、
−後続する工程で血清アルカリホスファターゼによって引き起こされた核酸分子中の感度の変化を検出することによって、血清アルカリホスファターゼと核酸分子との相互作用を試験して、それによりサンプル中の血清アルカリホスファターゼの存在を、対象が敗血症、ＡＩＤＳ、悪性腫瘍、閉塞性胆管疾患、浸潤性肝疾患、敗血症および胆管癌のいずれか１つである疾患を持ちうる、または持っているという徴候として解釈するステップと、を含む。
【００８８】
この文脈で「サンプル」は一般的に、臨床サンプルである。使用されるサンプルは、試験される状態によって変わる。前立腺癌の診断において、患者からの適切な前立腺サンプルが必要とされうる。あるいはＰＡＰレベルの上昇は前立腺癌に罹患した患者の血液に見出されるため、血液サンプルが利用されうる。使用されるが、本発明を限定するものではない代表的なサンプルは、患者、最も好ましくはヒト患者から採取した全血、血清、血漿、尿などを含む。
【００８９】
最も好ましい実施形態において、試験とは、対象から除去されたサンプルに対して実施されるインビトロ試験である。
【００９０】
さらなる実施形態において、上述の診断方法は対象からサンプルを取得するステップをさらに含む。対象から適切なサンプルを取得する方法は、当技術分野で周知である。あるいは、該方法は、別の手順で患者からすでに単離されたサンプルによって開始されうる。診断方法は最も好ましくは、ヒトからのサンプルに対して実施されるが、本発明の方法は多くの動物にとって診断上の有用性を有する。
【００９１】
本発明の診断方法は、潜在的に初期診断を確認する方法として、すでに利用可能な診断技法を補完するために使用できる。あるいは該方法は迅速で好都合な診断方法を提供するため、該方法は独自の予備診断方法として使用される。さらにその固有の感度のために、本発明の診断方法は最小限のサンプルのみを必要とし、それゆえ不要な侵襲的手術を防止する。
【００９２】
（キット）
本発明は、本発明の方法を実施するために使用されるキットも提供する。キットは、本発明の方法と関連して上述した好ましい特徴のいずれかを含む。
【００９３】
したがって、本発明のさらなる態様において、化学部分を核酸分子に添加または核酸分子から除去できる酵素を検出して、それにより次の工程で核酸分子の感度の変化を付与するキットが提供され、キットは、
−酵素によって作用可能である核酸分子と、
−次の工程で核酸分子の感度の変化を検出する手段と、
を含む。
【００９４】
キットは、問題の標的酵素を使用することに基づく、すでに利用可能なキットを補完するために好都合に使用される。それゆえたとえば、標準ELISAキットは、酵素、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼが実際に、抗体を介して抗原／分析物が存在する部位に結合しているかどうかを検出するために、おそらく適切な色原体または化学発光基質を含有するであろう。酵素活性を検出するこのステップは、分析物／抗原の検出の感度をなおさらに高くする特別の増幅ステップを好都合に追加するする本発明のキットが取って代わる。
【００９５】
好ましい実施形態において、キットは、アルカリホスファターゼが５’末端ホスフェートをＤＮＡおよびＲＮＡ分子から除去する能力を利用して、抗体の分析物／抗原への結合を検出するための酵素としてアルカリホスファターゼを含む免疫アッセイの感度を向上させるために使用される。それゆえ好ましい実施形態において、核酸分子がｄｓＤＮＡであるキットが提供される。さらに好ましい特徴は、キットに平滑末端化された核酸分子を含むことである。さらに核酸分子は好ましくは一方または両方の５’端にてホスホリル化され、ホスファターゼがサンプル中に存在する場合に、５’末端ホスフェートを除去することによって核酸分子に作用させる。
【００９６】
さらなる態様において、本発明のキットは、制限酵素を使用して切断されて、両方の５’端にてホスホリル化されている平滑末端ｄｓＤＮＡを与えることができるプラスミドを含む核酸分子を含む。これは適切な制限酵素によるプラスミドの処理後に、キットに効果的に両方の５’端にて平滑末端化およびホスホリル化された少なくとも１つの直鎖ｄｓＤＮＡ分子を含ませる。そのような核酸分子は、本発明の方法でも有用であることがわかるであろう。プラスミドに１つを超える制限酵素部位が存在する場合、核酸は多数の独立した、両方の５’端で好ましくは平滑末端化、そして好ましくはホスホリル化された直鎖ｄｓＤＮＡ分子に切断される。
【００９７】
したがって本発明のキットはプラスミドを切断するのに必要な制限酵素をさらに含む。いずれの適切な制限酵素も使用され、最も好ましくは核酸分子において平滑末端切断を与え、分子の５’端をホスホリル化させておく制限酵素である。多くのそのような制限酵素が市販されている。実際に、大半の制限酵素が核酸配列を開裂させて、５’−ホスフェートおよび３’−ヒドロキシル端を残す（ＮｃｉＩは３’−ホスフェートおよび５’−ヒドロキシル端を生成するが）。パリンドローム配列を認識する制限酵素は、しばしば切断して突出塩基のない平滑末端を残すことができる。これらの制限酵素は、本発明のキットにおいて好ましい。
【００９８】
上述のように本発明の方法に関する説明において、化学部分を核酸分子に付加または核酸分子から除去する核酸分子を酵素活性の非存在下で消化するヌクレアーゼが含まれる。これらの方法を提供するために、酵素活性の結果として感度の変化を持つ核酸分子を測定する手段が、酵素活性が存在しない場合に核酸分子を消化して、核酸分子への化学部分の付加または核酸分子からの化学部分の除去を引き起こすエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼを含むキットが提供される。
【００９９】
アルカリホスファターゼが検出され、核酸分子の一方の端または両方の端が５’ホスホリル化される方法において、５’−３’前進的エキソヌクレアーゼは該方法において有用である。それゆえエキソヌクレアーゼが５’−３’前進的エキソヌクレアーゼを含むキットが提供される。最も好ましい実施形態において、このエキソヌクレアーゼはラムダエキソヌクレアーゼを含む。
【０１００】
好ましい実施形態において、核酸分子の両方の５’端がホスホリル化される方法での使用では、キットはエンドヌクレアーゼをさらに含み、好ましくは一本鎖核酸に対して特異的であり、エンドヌクレアーゼは最も好ましくはマングビーンエンドヌクレアーゼを含む。
【０１０１】
上述したように本発明の方法は、修飾酵素によって触媒された化学部分の付加または除去によって引き起こされた核酸分子の感度の変化が核酸増幅技法を使用して検出されるときに、最大限に感度が高いことがわかるであろう。上述したように好ましい増幅技法はＰＣＲ、ローリングサークル複製、ＮＡＳＢＡ、３ＳＲおよびＴＭＡ技法を含む。核酸増幅技法の場合、当技術分野で周知であるが、偽陽性結果の発生を最小限にしながら生成物の特異的増幅を可能にするために、配列特異的プライマーが必要である。このために、本発明のキットは好ましくは配列特異的プライマーを含む。
【０１０２】
キットは核酸増幅ステップに必要な試薬も含む。試薬は一例として、制限なく、増幅酵素、プローブ、ポジティブコントロールの増幅テンプレート、反応緩衝剤などを含む。たとえばＰＣＲ方法において、考えられる試薬は適切なポリメラーゼ、たとえばＴａｑポリメラーゼおよび適切なＰＣＲ緩衝剤を含み、ＴＭＡ方法において、適切な試薬はＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素を含む。これらの試薬はすべて市販されており、当技術分野で周知である。
【０１０３】
キットは、増幅生成物のリアルタイム検知に必要な成分、たとえば蛍光プローブをさらに含む。上述したように、関連するリアルタイム技術、およびそのような方法に必要な試薬は当技術分野で周知であり、市販されている。これらのリアルタイム方法での使用に適切なプローブは、適当な酵素活性によって修飾されるその能力のために本発明のキットに含まれる核酸分子と併せて使用されるように設計されることもある。それゆえたとえばＴａｑｍａｎ（登録商標）技法を使用する場合、プローブは、次にリアルタイムで検出される化学部分を付加または除去する酵素の活性によって後続する工程における感度が修飾された核酸分子のＰＣＲプライマー部位の間に結合されるような配列である必要がある。同様に、本発明のキットに含まれた核酸配列の関連部分に結合する分子ビーコンプローブが設計される。スコーピオンプローブ技法をリアルタイム検出に使用する場合、プローブは、テール付きプライマーの伸長によって標的部位が同じ分子に含まれる場合のみにその標的にハイブリダイズするように設計する必要がある。適切なプローブは従って、本発明のキットのさらなる態様に含まれる。
【０１０４】
感染性因子に関連するホスファターゼの検出キットであって、
−感染性因子特異的ホスファターゼに選択的である抗体と、
−後続する工程において核酸分子の感度の変化を引き起こすために、感染性因子に関連するホスファターゼによって作用されうる核酸分子と、
−後続する工程で核酸分子の感度の変化を検出する手段と、
を含むキットも提供される。
【０１０５】
１つの実施形態において、感染性因子はアスペルギルスまたはスタフィロコッカス種である。
【実施例】
【０１０６】
本発明は、添付の表および図と共に以下の実施例を参照してさらに理解されるであろう。
【０１０７】
方法１
バックグラウンド
アルカリホスファターゼは、プラスミドＤＮＡを基質として使用して検出できる。プラスミドを制限酵素で切断して、平滑末端５’ホスホリル化二本鎖ＤＮＡを得た。このＤＮＡは、二本鎖５’ホスホリル化ＤＮＡに対して特異的であるラムダエキソヌクレアーゼによって分解できる。アルカリホスファターゼによるホスフェート基の除去は、ＤＮＡをエキソヌクレアーゼ消化に対して耐性にする。この耐性ＤＮＡは、核酸増幅方法によって、本実施例では、プラスミドＤＮＡに対して特異的であるプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって検出できる。
【０１０８】
方法
１．ｐＵＣ１９  ＤＮＡを、制限酵素ＰｖｕＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＮＥＢ）を用いて完了まで消化した。
２．抗体アルカリホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈによる抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ、カタログ番号Ａ３５６３）の１０倍連続希釈物を、０．３ｘＮＥＢ緩衝剤３（１０ｘストックとして提供）および切断プラスミドＤＮＡ  １ｎｇを含有する反応緩衝液１０μｌで調製した。
３．反応物を３７℃にて１時間インキュベートした。
４．脱ホスホリル化の後、ラムダエキソヌクレアーゼ（NEB）５単位を含有する１ｘラムダエキソヌクレアーゼ緩衝液  １０μｌを各反応物に添加して、３７℃にて３０分間インキュベートした。
５．次に反応物を９５℃にて５分間加熱して、各反応物  ２μｌをプラスミドＤＮＡに対して特異的なプライマーおよびＰＣＲ２０サイクルを使用して、ＰＣＲによって分析した。
６．ＰＣＲの後、ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０１０９】
結果
アルカリホスファターゼを一切含まない対照反応物は、ＰＣＲ生成物を生成しなかった。ホスホリル化プラスミドＤＮＡはヌクレアーゼによって完全に消化され、増幅できなかった。プラスミドＤＮＡのアルカリホスファターゼによる予備処理は、ホスフェート基をＤＮＡから除去して、それをヌクレアーゼ消化に対して耐性にした。この無傷のＤＮＡは次にＰＣＲによって増幅できた。この手法を使用して、１ピコグラムまたはそれ以上の量のアルカリホスファターゼを含有する連続希釈物中のプラスミドＤＮＡは、ＰＣＲによる増幅およびアガロースゲルでの検出が可能であった。
【０１１０】
考察
これは抗体複合体として存在するアルカリホスファターゼの活性がＤＮＡテンプレートに対する作用を通じて、ＰＣＲによってシグナルに変換できることを証明する。加えて、該方法はアルカリホスファターゼの検出に関して感度の高い方法である。
【０１１１】
方法２
エキソヌクレアーゼIの包含によるアルカリホスファターゼの検出
バックグラウンド
エキソヌクレアーゼＩは、３’−５’方向での一本鎖ＤＮＡからのヌクレオチドの除去を触媒する。ホスホリル化ＤＮＡ（非保護）がラムダエキソヌクレアーゼによって消化されるとき、中間一本鎖構造が生成される（図３、Ａ２）。ポリメラーゼ検出反応の間に、これらは生成物を生じるＰＣＲプライマーのテンプレートを供給できる。このことは偽陽性結果をもたらす。エキソヌクレアーゼＩの添加は、これらの構造をヌクレオチドに完全に分解して、それによりバックグラウンドを消滅または低減させる。
【０１１２】
方法
１．１ｘ仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ緩衝液（ＮＥＢ）１０μｌ中のｐＵＣ１９からの精製平滑末端切断断片  約１０ｎｇを、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（ＮＥＢ）の１／５００希釈物  １μｌと共に３７℃にて１時間インキュベートした（以下の図のＣＩＰ＋を参照）。別の反応物はＣＩＰを用いずに実施した（以下の図のＣＩＰ−を参照）。
２．次に１／１０希釈のラムダエキソヌクレアーゼ（ＮＥＢ）１μｌを上記反応物それぞれに添加し、反応体積を１ｘラムダエキソヌクレアーゼ緩衝液（ＮＥＢ）中で２０μｌとして、３７℃で３０分間インキュベートした。
３．酵素は、７５℃での１０分間のインキュベーションによって不活性化した。
４．次に１／１０希釈のエキソヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ）１μｌを各反応物に添加して、３７℃で３０分間インキュベートした。
５．酵素を８０℃で２０分間のインキュベーションによって不活性化した。
６．各反応物  ５μｌを取り除いて、２５０ｂｐ断片を生成する断片の内部プライマーを用いたＰＣＲ反応でテンプレートとして使用した。
７．生成物をゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロミド染色によって可視化した（以下の結果を参照）。
【０１１３】
結果
結果を図４に示す。
考察
エキソヌクレアーゼＩの添加は、ＣＩＰなしの反応物においてバックグラウンドを低減させるのに有効である（ＣＩＰ−、上）。ＣＩＰで処理した反応物（ＣＩＰ＋、上）では、ＰＣＲ増幅後に明瞭なシグナルが見られる。
【０１１４】
アルカリホスファターゼの検出でのマングビーンエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ１の比較
バックグラウンド
マングビーンヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡ突出（３’および５’）の除去を触媒して平滑末端を残すエンドヌクレアーゼである。これをラムダ消化後の反応物に添加して、残りの一本鎖構造を分解し、それゆえバックグラウンドを消滅または低減させる効率を試験した。エキソヌクレアーゼＩとの比較を実施して、アッセイで２つの酵素を比較した。好ましい反応は、ＣＩＰなしでＤＮＡの完全な分解をもたらす。
【０１１５】
方法
１．１ｘ仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ緩衝液（NEB）１０μl中のｐＵＣ１９からの精製平滑末端切断断片  約１０ｎｇを、仔牛小腸由来アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ）（ＮＥＢ）の１／５００希釈物  １μｌと共に３７℃にて１時間インキュベートした（以下の図のＣＩＰ＋を参照）。別の反応物はＣＩＰを用いずに実施した（以下の図のＣＩＰ−を参照）。
２．次に１／１０希釈のラムダエキソヌクレアーゼ（NEB）１μlを上記反応物それぞれに添加し、反応体積を１ｘラムダエキソヌクレアーゼ緩衝液（NEB）中で２０μlとして、３７℃で３０分間インキュベートした。
３．酵素は、７５℃での１０分間のインキュベーションによって不活性化した。
４．次に１／１０希釈のマングビーンヌクレアーゼ（NEB）または１／１０希釈のエキソヌクレアーゼI（NEB）のどちらか１μlを各反応物に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。
５．酵素を８０℃で２０分間のインキュベーションによって不活性化した。
６．各反応物  ５μｌを取り除いて、２５０ｂｐ断片を生成する断片の内部プライマーを用いたＰＣＲ反応でテンプレートとして使用した。
７．生成物をゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロミド染色によって可視化した（以下の結果を参照）。
【０１１６】
結果
結果を図５に示す。
【０１１７】
考察
マングビーンエンドヌクレアーゼは、アッセイで使用できるが、ＣＩＰなしの反応におけるバックグラウンド・シグナルの低減ではエキソヌクレアーゼＩほど有効ではない。
【０１１８】
アルカリホスファターゼ検出に対する方法２の感度
バックグラウンド
アッセイでのアルカリホスファターゼの濃度を試験した。ＤＮＡを脱ホスホリル化して、それゆえＤＮＡをラムダエキソヌクレアーゼ消化から保護するのに必要なアルカリホスファターゼの最小量を決定した。
【０１１９】
方法
１．本実験ではｐＵＣ１９  ＤＮＡを１ｎｇおよび１００ｐｇの両方で使用した。
２．ＤＮＡは、アルカリホスファターゼ１０倍連続希釈物を、酵素の１／５００希釈から１／５０００００希釈まで使用してインキュベートした。アルカリホスファターゼなしの対照管も作成した。
３．３７℃で１時間の後、上述したように反応物をラムダエキソヌクレアーゼによって、次にエキソヌクレアーゼＩでインキュベートした。
４．ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動は上述の通りであった。
【０１２０】
結果
結果を図６に示す。
考察
【０１２１】
上記から分かるように、アッセイで使用したアルカリホスファターゼの最低濃度１μｌ、すなわち１／５００，０００でも、十分にテンプレートＤＮＡに作用して、ＤＮＡがＰＣＲによって検出できるようにヌクレアーゼからＤＮＡを保護することがわかる。
【０１２２】
固定アルカリホスファターゼ−抗体複合体を用いて実施した方法２
バックグラウンド
溶液中でアルカリホスファターゼ検出アッセイを最適化した後、これをマイクロウェル形式に適合させる必要があった。Ｃ型肝炎をモデルシステムとして選択して、ウィルス核タンパク質を固定抗ＨＣＶモノクローナル抗体による捕捉抗原として使用し、抗核ポリクローナル抗体−アルカリホスファターゼ複合体の結合が続いた。アルカリホスファターゼ（CIP）の、それゆえ核タンパク質（核）の検出は、上述のアッセイによって決定した。方法の概略図を図７Ａに概説する。
【０１２３】
方法
１．抗ＨＣＶ核ポリクローナル抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）をマレイミド活性化アルカリホスファターゼ（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ｋｉｔ、ＰＩＥＲＣＥ）に結合させた。
２．ＨＣＶモノクローナル抗体（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）２００ｎｇを、ＴｏｐＹｉｅｌｄ  ８ウェルストリップ（NUNC）へ３７℃で１時間の吸着によって結合させた。
３．ウェルを洗浄して、次にＴＢＳ中の３％  ＢＳＡによってブロックした。
４．洗浄後、ＨＣＶ核抗原  ２００ｎｇを１時間に渡って添加した。
５．次に抗体−アルカリホスファターゼ複合体を各種の希釈度で（または全くなし）添加して、３７℃で１時間インキュベートした。
６．ウェルを洗浄して、各ウェルに１ｘＣＩＰ反応緩衝液中のｐＵＣ１９  ＤＮＡを３７℃で１時間に渡って添加した。
７．次に各ウェルから１０μｌを取り除いて、上の方法２、ステップ２で述べたようにプロトコルを続けた。
【０１２４】
結果
結果を図７Ｂに示す。
【０１２５】
考察
これは、本発明が免疫プロトコルを核酸増幅検出形式に変換するために使用できることを証明する。本実施例では１／１００希釈（マイクロウェル当たり約１００ｎｇ）の最適濃度での抗体−アルカリホスファターゼ複合体を使用して、ＨＣＶ核抗原を検出することができた。
【０１２６】
方法１で観測したバックグラウンド・シグナルの低減
バックグラウンド
該方法でのバックグラウンドレベルを低減するために、ＤＮＡテンプレートを改良する処置を行った。バックグラウンドＰＣＲシグナルは、ヌクレアーゼによる基質の不完全消化によるものであり、おそらくアルカリホスフェートの非存在下でも非ホスホリル化しているテンプレートによるものである。本実施例では、新しいテンプレートの調製について述べる。
【０１２７】
方法
１．酵素の２８５ｂｐ  ｄｓ５’ホスホリル化ＤＮＡ基質を、ｐＵＣ１９（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）ＤＮＡテンプレートから、以下の５’−ホスホリル化プライマー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ミルトンキーンズ、英国）を用いた標準ＰＣＲ工程を使用して生成した。
ＰＳ１，５’−Ｐ−ＧＧＣＧＡＡＡＧＧＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧ−３’（配列番号１）および
ＰＡＳ１，５’−Ｐ−ＧＴＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧ−３’（配列番号２）ならびに
Ｑｉａｇｅｎ  Ｌｔｄ、クロウリー、英国により供給されたＴａｑポリメラーゼ。「デュアルゲル」精製オリゴヌクレオチドの使用により、高いパーセンテージのホスホリル化プライマーが確保される。
２．ＰＣＲ後のＤＮＡ断片のアガロースゲル精製および次の、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）を用いたＤＮＡの処理は、最小限の非ホスホリル化断片を確保するために実施した追加の処置であった。
３．子牛小腸由来アルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）の１０倍連続希釈物を調製し、ｄｓＤＮＡ基質と共に、緩衝液３（酵素供給者より）中で３７℃にて１時間インキュベートした。次にラムダエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）０．５単位を添加して、インキュベーションをさらに１時間続けた。次に各反応混合物５μｌをＰＳ１およびＰＡＳ１プライマーを用いて標準「検出」ＰＣＲ工程で増幅した。増幅は、９４℃（５分）での初期変性ステップと、続いての以下の特性の熱サイクル２５回：９４℃（３０秒）、６２℃（３０秒）、７２℃（３０秒）を使用して実施した。
【０１２８】
結果
図８は、アガロースゲル電気泳動によって分離され、エチジウムブロミドで染色した「検出」ステップからのＰＣＲ生成物を示す。目視検査は、我々のアッセイにおける、１０ｘ１０-18ｇ、すなわちにアルカリホスファターゼ（AP）分子わずか６０個にほぼ等しい、アルカリホスファターゼ１０-11単位未満の検出限界を示す。
【０１２９】
考察
これらの結果は、この方法がアルカリホスファターゼ活性を非常に高い感度で検出および定量するのに使用できることを証明する。比較として、ｐＮＰＰ比色基質（Ｓｉｇｍａ、プール、英国）を使用したときの検出限界は、アルカリホスファターゼ１０-4単位として決定された。
【０１３０】
アルカリホスファターゼ検出での方法１の感度の上昇
バックグラウンド
方法１へ、特にＡＰ−抗体複合体を検出するときに複数の重要な変更を行って、感度をさらに上昇させた。プロトコルの重要なステップは、高濃度のＤＮＡテンプレートおよび３７℃ではなく５５℃での反応の実施を含む。
【０１３１】
方法
１．抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ複合体（Ｓｉｇｍａ、プール、英国）の１０倍連続希釈物を調製して、ｄｓＤＮＡ基質と共にインキュベートした。
２．ＤＮＡは最終濃度が反応物中で１ｎｇ／ｕｌであった。
３．反応は緩衝液３（酵素供給者より）中で５５℃にて１時間実施した。
４．次にラムダエキソヌクレアーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ビバリー、マサチューセッツ州、米国）０．５単位を添加し、インキュベーションをさらに１時間継続した。
５．次に各反応混合物２μｌを、ＰＳ１およびＰＡＳ１プライマーを用いて標準「検出」ＰＣＲ工程で増幅した。
【０１３２】
結果
検出限界は、抗マウスＩｇＧ−ＡＰ複合体の１０-10希釈物よりも小さいように考えられる。
【０１３３】
考察
結果は、検出されたＡＰ複合体の方法が非常に感度が高いことを示している。説明した方法は、標準比色ｐＮＰＰ基質よりも１０万分の１と低い検出限界を示した。この検出レベルは、遊離ＡＰで見られるレベルに匹敵していた。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本方法において、アルカリホスファターゼは、脱ホスホリル化および次の、ＤＮＡテンプレートの両端のラムダエキソヌクレアーゼからの保護によって検出される。Ａ．アルカリホスファターゼの非存在下で、ラムダエキソヌクレアーゼ（ラムダエキソ）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上でホスフェート基（Ｐ）を認識して、これらの鎖を分解する（１および２を参照）。このＤＮＡ配列に対して特異的であるプライマーによる次のＰＣＲにおいて、分解したＤＮＡ配列はＰＣＲ生成物を一切生成しない。  Ｂ．アルカリホスファターゼの存在下で、二本鎖ＤＮＡの５’端におけるホスフェート基の一方または両方がホスファターゼによって除去され（１を参照、これは両方のホスフェート基が除去される状況を示す）、ＤＮＡはラムダエキソヌクレアーゼによってもはや認識されない（２を参照）。これはＤＮＡを分解から保護する。このＤＮＡ配列に対して特異的であるプライマーを用いた次のＰＣＲにおいて、未分解ＤＮＡ配列はＰＣＲのテンプレートであり、特徴的なＰＣＲ生成物を生成する。
【図２】本方法において、二本鎖ＤＮＡの一端のみが、５’ホスフェート基を有するために、ラムダエキソヌクレアーゼに対して感受性である。Ａ．アルカリホスファターゼの非存在下で、ラムダエキソヌクレアーゼ（ラムダエキソ）が二本鎖ＤＮＡの１本の鎖上のホスフェート基（Ｐ）を認識して、この鎖を分解する（１および２を参照）。鎖が分解するにつれ、これは一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ、たとえばマングビーンエンドヌクレアーゼによって分解される反対側の鎖上の一本鎖ＤＮＡを露出させる（３および４を参照）。このＤＮＡ配列に対して特異的であるプライマーを用いた次のＰＣＲにおいて、分解ＤＮＡ配列はＰＣＲ生成物を一切生成しない。  Ｂ．アルカリホスファターゼの存在下で、二本鎖ＤＮＡの５’端における１個のホスフェート基がホスファターゼによって除去され（１を参照）、ＤＮＡはラムダエキソヌクレアーゼによってもはや認識されない（２を参照）。このことはラムダエキソヌクレアーゼおよび一本鎖マングビーンヌクレアーゼの両方による分解からＤＮＡを保護する。このＤＮＡ配列に対して特異的であるプライマーを用いた次のＰＣＲにおいて、未分解ＤＮＡ配列はＰＣＲのテンプレートであり、特徴的なＰＣＲ生成物を生成する。
【図３】本方法において、二本鎖ＤＮＡの一端のみが、５’ホスフェート基を有するために、ラムダエキソヌクレアーゼに対して感受性である。  Ａ．アルカリホスファターゼの非存在下で、ラムダエキソヌクレアーゼ（ラムダエキソ）が二本鎖ＤＮＡの１本の鎖上のホスフェート基（Ｐ）を認識して、この鎖を分解する（１および２を参照）。鎖が分解するにつれ、これは３’一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ、たとえばエキソヌクレアーゼ１によって分解される反対側の鎖上の一本鎖ＤＮＡを露出させる（３および４を参照）。このＤＮＡ配列に対して特異的であるプライマーを用いた次のＰＣＲにおいて、分解ＤＮＡ配列はＰＣＲ生成物を一切生成しない。  Ｂ．アルカリホスファターゼの存在下で、二本鎖ＤＮＡの５’端における１個のホスフェート基がホスファターゼによって除去され（１を参照）、ＤＮＡはラムダエキソヌクレアーゼによってもはや認識されない（２を参照）。このことはラムダエキソヌクレアーゼおよび一本鎖マングビーンヌクレアーゼの両方による分解からＤＮＡを保護する。このＤＮＡ配列に対して特異的であるプライマーを用いた次のＰＣＲにおいて、未分解ＤＮＡ配列はＰＣＲのテンプレートであり、特徴的なＰＣＲ生成物を生成する。
【図４】エキソヌクレアーゼＩの包含によるアルカリホスファターゼの検出。エキソヌクレアーゼＩの添加は、ＣＩＰ（ＣＩＰ−）なしの反応においてバックグラウンドを低下させるのに有効である。ＣＩＰ（ＣＩＰ＋）で処理した反応において、ＰＣＲ増幅後に明瞭な信号が見られる。
【図５】アルカリホスファターゼの検出におけるマングビーンエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ１の比較。マングビーンエンドヌクレアーゼはアッセイに使用できるが、ＣＩＰなしの反応におけるバックグラウンド・シグナルの低下ではエキソヌクレアーゼＩほど有効ではない。
【図６】エキソヌクレアーゼＩの包含によるアルカリホスファターゼの検出感度。エキソヌクレアーゼＩの添加は、ＣＩＰ（ＣＩＰ−）なしの反応においてバックグラウンドを低下させるのに有効である。ＣＩＰ（ＣＩＰ＋）で処理した反応において、ＰＣＲ増幅後に明瞭な信号が見られる。
【図７】固定アルカリホスファターゼ−抗体複合体を用いて実施した、エキソヌクレアーゼＩの包含によるアルカリホスファターゼの検出。
【図８】アガロースゲル電気泳動によって分離され、エチジウムブロミドによって染色された検出ステップからのＰＣＲ生成物を示す。目視検査は、我々のアッセイにおける、１０ｘ１０-18ｇ、すなわちにアルカリホスファターゼ（AP）分子わずか６０個にほぼ等しい、アルカリホスファターゼの１０-11単位未満の検出限界を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2007501001.tif 000011
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2007501001.tif 000013
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