(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分から免疫原性タンパク質を単離および／または同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法であって、被験体またはその細胞、組織もしくは器官から免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、抗原抗体相互作用によって免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、それによって免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する、方法。
【請求項２】
被験体からタンパク質複合体またはその混合物または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることをさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サンプルから１以上の免疫グロブリン含有画分を得ることをさらに含んでなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群からサンプルを選択する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分がＩｇＧを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分がＩｇＡを含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得る、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記の、サンプルを被験体から分離または精製することが、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１種以上の化合物を固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固体支持体、マトリックスまたは樹脂が、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、磁性粒子、常磁性粒子、ポリマー樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
１種以上の固定化された化合物を洗浄することをさらに含んでなり、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
化合物がタンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
化合物がタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇまたはその混合物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
被験体が感染症を患っているか、以前に感染症を患ったことがある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
感染症が急性感染症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
感染症が慢性感染症である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
感染症が、ウイルス感染症、細菌感染症、酵母感染症、真菌感染症および寄生生物感染症からなる群から選択される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
感染症が細菌感染症である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
細菌感染症がシュードモナス属感染症である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細菌感染症がマイコバクテリウム属感染症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
感染症が肺感染症である、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
肺感染症が緑膿菌または結核菌の存在によって引き起こされるか、それと関連している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
被験体が自己免疫状態に苦しんでいる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２７】
自己免疫状態が炎症性状態と関連している、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
被験体を、免疫原性タンパク質もしくはその断片を含んでなる１種以上の細胞またはその抽出物で免疫することをさらに含んでなり、それによって免疫原性タンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘発する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２９】
１種以上の細胞またはその抽出物が、免疫原性タンパク質またはその断片を発現する感染性病原体に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
１種以上の細胞が、ウイルス細胞、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞もしくは寄生生物の細胞からなる群から選択されるか、または細胞抽出物がウイルスの抽出物、細菌の抽出物、酵母の抽出物、真菌の抽出物および寄生生物の抽出物からなる群から選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
１種以上の細胞が細菌細胞であるか、または細胞抽出物が細菌抽出物である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細菌細胞がシュードモナス種またはマイコバクテリウム種である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細菌細胞が緑膿菌または結核菌である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
被験体が非ヒト動物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３５】
非ヒト動物がマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ヒツジ(sheep)、ヒツジ(ovine)、ウマおよびヤギからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
被験体がヒトである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項３７】
免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに含んでなる、請求項１１から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
結合させることが、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することを含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
架橋剤が、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ピリジルジスルフィド架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
架橋剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤が、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤がスベリン酸ジスクシンイミジルである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
被験体において疾病または疾患を引き起こす病原体の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片を同定する方法であって、
（ｉ）該疾病または疾患を患っているか、以前に該疾病または疾患を患ったことのある被験体またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、該疾病もしくは疾患を引き起こす病原体またはその誘導体を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）抗原抗体相互作用によって前記免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
同定されるタンパク質が、被験体において疾病または疾患を引き起こす病原体の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片である、方法。
【請求項４４】
被験体から、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることをさらに含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
サンプルから免疫グロブリン含有画分を得ることをさらに含んでなる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群からサンプルを選択する、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
サンプルが末梢血単核球(ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
サンプルが血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分がＩｇＧを含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分がＩｇＡを含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得る、請求項４３から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記の、サンプルを被験体から分離または精製することが、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
１種以上の化合物を固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
固体支持体、マトリックスまたは樹脂が、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、ポリマー樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
１種以上の固定化された化合物を洗浄することを含んでなり、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
化合物が、タンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項５３から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
化合物がタンパク質Ａ、タンパク質Ｇまたはその混合物である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに含んでなる、請求項５３から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
結合させることが、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することを含んでなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
架橋剤が、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
架橋剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤が、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤がスベリン酸ジスクシンイミジルである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
サンプルが、疾病または疾患を引き起こす病原体のタンパク質または細胞抽出物を含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項６６】
疾病または疾患を引き起こす病原体が感染性病原体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項６７】
感染性病原体が、ウイルス、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
感染性病原体が細菌である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
細菌が緑膿菌または結核菌である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
細菌が臨床分離株である、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
癌細胞の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片を同定する方法であって、
（ｉ）癌を患っているか、以前に癌を患ったことがある被験体から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、腫瘍細胞またはそのタンパク質抽出物または細胞抽出物を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）抗原抗体相互作用によって、前記免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
同定されるタンパク質が癌細胞の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片である、方法。
【請求項７２】
癌細胞が、膀胱癌細胞、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、子宮内膜癌細胞、頭頚部癌細胞、白血病細胞、肺癌細胞、リンパ腫細胞、メラノーマ細胞、非小細胞肺癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、急性リンパ性白血病細胞、成人急性骨髄性白血病細胞、成人非ホジキンスリンパ腫細胞、脳腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、小児肉腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、食道癌細胞、ヘアリー細胞白血病細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞、多発性骨髄腫細胞、神経芽細胞腫細胞、口腔癌細胞、膵臓癌細胞、中枢神経系原発リンパ腫細胞、皮膚癌細胞および小細胞肺癌細胞からなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
癌細胞が卵巣癌細胞または乳癌細胞である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
被験体からタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることをさらに含んでなる、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
サンプルからタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることをさらに含んでなる、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群からサンプルを選択する、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
サンプルが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
サンプルが血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分がＩｇＧを含んでなる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分がＩｇＡを含んでなる、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得る、請求項７１から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記の、サンプルを被験体から分離または精製することが、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
１種以上の化合物を、固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
固体支持体、マトリックスまたは樹脂が、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、ポリマー樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
１種以上の固定化された化合物を洗浄することを含んでなり、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
化合物がタンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項８３から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
化合物がタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇまたはその混合物である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに含んでなる、請求項８３から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
結合させることが、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することを含んでなる、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
架橋剤がイミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
架橋剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤が、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤がスベリン酸ジスクシンイミジルである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
被験体における自己免疫状態において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法であって、
（ｉ）自己免疫状態に苦しんでいる被験体またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと 、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、自己免疫状態に苦しんでいる被験体由来のタンパク質を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）抗原抗体相互作用によって前記免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
同定されるタンパク質が、被験体における自己免疫状態において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片である、方法。
【請求項９６】
被験体からタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることをさらに含んでなる、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
サンプルから免疫グロブリン含有画分を得ることをさらに含んでなる、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群からサンプルを選択する、請求項９６または９７に記載の方法。
【請求項９９】
サンプルが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる、請求項９５から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
サンプルが血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分がＩｇＧを含んでなる、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分がＩｇＡを含んでなる、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得る、請求項９５から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記の、サンプルを被験体から分離または精製することが、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
１種以上の化合物を、固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
固体支持体、マトリックスまたは樹脂が、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、磁性粒子、常磁性粒子、ポリマー樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
１種以上の固定化された化合物を洗浄することを含んでなり、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する、請求項１０６または１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
化合物がタンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項１０６から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
化合物がタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇまたはその混合物である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに含んでなる、請求項１０５から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
結合させることが、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することを含んでなる、請求項９０に記載の方法。
【請求項１１３】
架橋剤が、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
架橋剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤である、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤が、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤がスベリン酸ジスクシンイミジルである、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
被験体がヒトであり、かつ、自己免疫状態に苦しんでいる、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項１１８】
自己免疫状態が自己免疫疾患である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
自己免疫疾患が、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、自己免疫甲状腺疾患、中枢神経系脈管炎、および自己免疫筋炎からなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
被験体が嚢胞性繊維症を患っている、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
被験体が以前に急性肺疾患増悪を起こしたことがある、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
被験体が急性肺疾患増悪を起こしている、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
被験体が感染症をさらに患っている、請求項１２０から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
感染症が細菌によって引き起こされる、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
細菌が、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、アスペルギルス・フミガーツス、セパシア菌複合体、ステノトロホモナス・マルトフィラ、アルカリゲネス（アクロモバクター）キシロソキシダンス、Ｂ．グラディオリおよびラルストニア・ピックティーまたはその混合物からなる群から選択される、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１２６】
細菌が緑膿菌感染症を含んでなる、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
サンプルが、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分の由来する被験体に由来する、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項１２８】
被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法であって、
（ｉ）免疫原性タンパク質もしくはその断片を含んでなる細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルを事前に投与された被験体に由来するサンプルまたはその被験体によって産生されたサンプルから、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、細胞またはその細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）抗原抗体相互作用によってタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
それによって被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する、方法。
【請求項１２９】
細胞または細胞抽出物を含んでなるサンプルを被験体に投与することをさらに含んでなる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
細胞または細胞抽出物が、疾病または疾患を引き起こす病原体に由来する、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
疾病または疾患を引き起こす病原体が感染性病原体である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
感染性病原体が、ウイルス、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
感染性病原体が細菌である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
細菌が結核菌である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
被験体に由来するか、被験体によって産生されたサンプルを得ることをさらに含んでなる、請求項１２８または１２９に記載の方法。
【請求項１３６】
被験体が非ヒト動物である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
非ヒト動物が、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ヒツジ(sheep)、ヒツジ(ovine)、ウマ、ロバおよびヤギからなる群から選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
被験体が鳥類であり、かつ、被験体によって産生される生体サンプルが卵またはその抽出物またはその誘導体である、請求項１３５から１３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
被験体がニワトリである、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
サンプルから免疫グロブリン含有画分を得ることをさらに含んでなる、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４１】
全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群からサンプルを選択する、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
サンプルが末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
サンプルが血清もしくは血清の免疫グロブリン含有画分または卵黄もしくは卵黄の免疫グロブリン含有画分を含んでなる、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる、請求項９５に記載の方法。
【請求項１４５】
タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分がＩｇＧを含んでなる、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分がＩｇＡを含んでなる、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４７】
タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分がＩｇＹを含んでなる、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４８】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得る、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４９】
前記の、分離または精製することが、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
１種以上の化合物を、固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
固体支持体、マトリックスまたは樹脂が、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、磁性粒子、常磁性粒子、ポリマー樹脂からなる群から選択される、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１５２】
１種以上の固定化された化合物を洗浄することをさらに含んでなり、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する、請求項１５０または１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
１種以上の化合物が、タンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される、請求項１４９から１５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
化合物がタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇまたはその混合物である、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに含んでなる、請求項１４９から１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
結合させることが、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することを含んでなる、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
架橋剤が、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
架橋剤がＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤である、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤が、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤がスベリン酸ジスクシンイミジルである、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分と接触させる、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルが、細胞または細胞抽出物を含んでなる被験体に由来する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１６２】
細胞または細胞抽出物が疾病または疾患を引き起こす病原体に由来し、かつ、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルが疾病または疾患を患っている被験体に由来する、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
疾病または疾患を引き起こす病原体が感染性病原体である、請求項１６２に記載の方法。
【請求項１６４】
感染性病原体が、ウイルス、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
感染性病原体が細菌である、請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
細菌が結核菌である、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
抗原抗体相互作用によって、免疫グロブリンと結合している免疫原性タンパク質またはその断片を、免疫グロブリンから分離することをさらに含んでなる、請求項１から１６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６８】
タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、抗原抗体相互作用を乱す化合物と、抗原抗体相互作用を乱すのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなる方法によって、免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリンから分離する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
抗原抗体相互作用を乱す化合物が、免疫グロブリン画分のｐＨを調節する化合物、塩、イオン性界面活性剤、解離剤およびカオトロピック剤からなる群から選択される、請求項１６８に記載の方法。
【請求項１７０】
免疫グロブリン含有画分と抗原抗体相互作用によって結合しているか、結合していたタンパク質を単離することをさらに含んでなる、請求項１から１６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７１】
タンパク質をゲル電気泳動を用いて単離する、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
ゲル電気泳動が二次元ゲル電気泳動である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
免疫グロブリン含有画分と抗原抗体相互作用によって結合しているか、結合していたタンパク質を質量分析を用いて同定する、請求項１、４３、９５または１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７４】
前記質量分析がマトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）である、請求項１７２に記載の方法。
【請求項１７５】
（ａ）被験体由来のサンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、１種以上の化合物を単離することを含んでなる方法によって、免疫原性タンパク質もしくはその断片に対して免疫応答を起こした被験体またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｂ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることと、
（ｃ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することと、
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることと、
（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することと、
（ｆ）（ｄ）および（ｅ）を場合によって１回以上反復することと、
（ｇ）免疫グロブリンから分離したタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
それによって免疫原性タンパク質またはその断片を同定する、方法。
【請求項１７６】
（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することを、（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることの前に実施する、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることを、（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することの前に実施する、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることおよび（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することを、１種以上の免疫原性タンパク質を同定するのに十分な回数反復する、請求項１７５から１７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７９】
被験体が、疾病または疾患を引き起こす病原体に対して免疫応答を起こしている、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８０】
結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルが、疾病または疾患を引き起こす病原体またはその誘導体を含んでなる、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８１】
疾病または疾患を引き起こす病原体が感染性病原体である、請求項１７９または１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
感染性病原体が細菌である、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
細菌が結核菌である、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
被験体が自己免疫状態に苦しんでいる、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８５】
結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルが、自己免疫状態に苦しんでいる被験体由来のタンパク質を含んでなる、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８６】
被験体が、免疫原性タンパク質もしくはその断片を含んでなる細胞またはその抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルで事前に免疫されている、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８７】
結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルが、細胞またはその抽出物を含んでなる、請求項１８６に記載の方法。
【請求項１８８】
被験体がニワトリである、請求項１８６または１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
被験体が、疾病または疾患と関連のある病原体由来の細胞または細胞抽出物で事前に免疫されている、請求項１８６から１８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９０】
疾病または疾患と関連のある病原体が感染性病原体である、請求項１８９に記載の方法。
【請求項１９１】
感染性病原体が細菌である、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
細菌が結核菌である、請求項１９１に記載の方法。
【請求項１９３】
状態のマーカーを同定するプロセスにおける、請求項１から１９２のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１９４】
状態の診断における、請求項１から１９２のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１９５】
状態が疾病または疾患である、請求項１９３または１９４に記載の使用。
【請求項１９６】
疾病または疾患が感染性疾病である、請求項１９５に記載の使用。
【請求項１９７】
疾病または疾患が癌である、請求項１９５に記載の使用。
【請求項１９８】
状態が自己免疫状態である、請求項１９４または１９５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は１種以上のタンパク質を、ヒトまたは動物被験体の生体サンプルから同定および単離する新規方法に関し、ここで、生体サンプルは、免疫グロブリンと、その免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの混合物と１以上の抗体抗原相互作用によって結合している、単離され同定されるタンパク質とを含んでなるタンパク質複合体、または１種以上の免疫グロブリンと結合している、単離されるタンパク質を含んでなる免疫グロブリン含有画分を含んでなる。本発明は注目するタンパク質の免疫グロブリン画分からの分離を明確に包含する。本発明はまた、免疫グロブリン画分の免疫捕獲と結合していないタンパク質の溶出あるいは除去、および場合によっては、捕獲された免疫グロブリンからの注目する結合しているタンパク質の単離または回収による、注目するタンパク質の部分または完全濃縮または精製を包含する。
【背景技術】
【０００２】
概説
本明細書はパテントイン(PatentIn)バージョン３．１を用いて準備されたヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を含む。各ヌクレオチド配列は、数字表示＜２１０＞とそれに続く配列識別子（例えば、＜２１０＞１、＜２１０＞２、＜２１０＞３など）によって配列表に同定されている。配列の長さおよび種類（ＤＮＡ、タンパク質（ＰＲＴ）など）および各ヌクレオチド配列の供給源生物はそれぞれ、数字表示フィールド＜２１１＞、＜２１２＞および＜２１３＞で提供される情報によって示されている。本明細書においてヌクレオチド配列は、用語「配列番号」とそれに続く配列識別子によって定義される（例えば、配列番号１は配列表中の＜４００＞１と名づけられた配列を指す）。
【０００３】
本明細書に記載したヌクレオチド残基の記号表示はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会(Biochemical Nomenclature Commission)によって推奨されるものであり、これでは、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｙはピリミジン残基を表し、Ｒはプリン残基を表し、Ｍはアデニンまたはシトシンを表し、Ｋはグアニンまたはチミンを表し、Ｓはグアニンまたはシトシンを表し、Ｗはアデニンまたはチミンを表し、Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表し、Ｂはアデニン以外のヌクレオチドを表し、Ｖはチミン以外のヌクレオチドを表し、Ｄはシトシン以外のヌクレオチドを表し、Ｎはいずれかのヌクレオチド残基を表す。
【０００４】
本明細書において用語「に由来する」とは、特定の供給源から、必ずしもその供給源から直接ではないにしても、指定の整数が得られることを示すと取られるものとする。
【０００５】
文脈上他の意味に解すべき場合を除き、または特に断りのない限り、単数形の整数、ステップまたはエレメントとして本明細書に挙げられた本発明の整数、ステップまたはエレメントは、挙げられた整数、ステップまたはエレメントの単数および複数形の双方を明確に包含する。
【０００６】
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、語句「含んでなる(comprise)」または「含んでなる(comprises)」または「含んでなっている(comprising)」のような変形は、記載したステップもしくはエレメントもしくは整数またはステップもしくはエレメントもしくは整数の群の包含を意味するが、何らかの他のステップもしくはエレメントもしくは整数またはエレメントもしくは整数の群の排除を意味しないと理解されるものとする。
【０００７】
本明細書を通じて、特に断りのない限り、または文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単一のステップ、組成物、ステップの群または組成物の群は、１つおよび複数の（すなわち、１以上の）そのようなステップ、組成物、ステップの群または組成物の群を包含すると取られるものとする。
【０００８】
特に断りのない限り、本発明の具体的な態様または実施形態に関して本明細書に記載した各特徴は、本発明のありとあらゆる態様または実施形態について準用すると取られるものとする。
【０００９】
当業者ならば、本明細書に記載された本発明は具体的に記載されたもの以外の変化および改変を受け入れる余地があるということは理解するであろう。当然のことながら、本発明はこのような変化および改変のすべてを含む。本発明はまた、本明細書において、個別にまたは集合的に言及されたか示された、ステップ、特徴、組成物および化合物のすべて、および前記ステップまたは特徴のありとあらゆる組合せまたはいずれか２以上を含む。
【００１０】
本発明は、本明細書に記載された具体的な実施形態による範囲に限定されるものではない。機能的に同等な産物、組成物および方法は、明確に、本明細書に記載された本発明の範囲内にある。
【００１１】
本願に引用されたすべての参照文献は、参照により本明細書に特に組み込まれる。
【００１２】
本発明は過度の実験を行わなくとも、特に示さない限り、分子生物学、微生物学、ウイルス学の従来技術、組換えＤＮＡ技術、溶液中でのペプチド合成、固相ペプチド合成および免疫学を用いて実施される。かかる手順は、例えば、参照により組み込まれる以下の教本に記載されている：
サムブロック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch)&マニアティス(Maniatis)、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)：ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ(Cold Spring Harbor Laboratories)、ニューヨーク、第２版（１９８９）、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ全巻；
ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)：ア・プラクティカル・アプローチ(A Practical Approach)、ＩおよびＩＩ巻(Ｄ．Ｎ．グローバー(Glover)編、１９８５）、ＩＲＬプレス、オックスフォード、教本全体；
オリゴヌクレオチド・シンセシス(Oligonucleotide Synthesis)：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｍ．Ｊ．ゲイト(Gait)編、１９８４）ＩＲＬプレス、オックスフォード、教本全体、および特にその中のゲイトによる論文、１〜２２頁；アトキンソン(Atkinson)ら、３５〜８１頁；スプロート(Sproat)ら、８３〜１１５頁およびウー(Wu)ら、１３５〜１５１頁；
ヌクレイック・アシッド・ハイブリダイゼーション(Nucleic Acid Hybridization)：ア・プラクティカル・アプローチ（Ｂ．Ｄ．ハメス(Hames)＆Ｓ．Ｊ．ヒギンス(Higgins)編、１９８５）ＩＲＬプレス、オックスフォード、教本全体；
イモビライズド・セルズ・アンド・エンザイムス：ア・プラクティカル・アプローチ(Immobilized Cells and Enzymes:A Practical Approach)（１９８６）ＩＲＬプレス、オックスフォード、教本全体；
パーバル(Perbal)、Ｂ．、ア・プラクティカル・ガイド・トゥー・モレキュラー・クローニング(A Practical Guide to Molecular Cloning)（１９８４）；
メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods In Enzymology)（Ｓ．コロウィック(Colowick)およびＮ．カプラン(Kaplan)編、アカデミックプレス社(Academic Press, Inc.)）、シリーズ全体；
ナレッジ・データベース・オブ・アクセス・トゥー・ヴァーチャル・ラボラトリー・ウェブサイト(Knowledge database of Access to Virtual Labolatory website)（インタラクティバ(Interactiva)、ドイツ）中の、Ｊ．Ｆ．ラマルホ・オルチガオ(Ramalho Ortigao)、「ザ・ケミストリー・オブ・ペプチド・シンセシス(The Chemistry of peptide Synthesis)」；
サカキバラ、Ｄ．、タイヒマン(Teichman)、Ｊ．レイン、Ｅ．およびフェニケル(Fenichel)、Ｒ．Ｌ．（１９７６）バイオケミカル・バイオフィジオロジー・リサーチ・コミュニケーション(Biochemical Biophysiology Reseach Communication)７３、３３６〜３４２頁
メリフィールド、Ｒ．Ｂ．（１９６３）ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー(Journal of the American Chemical Society)８５、２１４９〜２１５４頁、
サ・ペプチド(The Peptide)（グロス(Gross)、Ｅ．およびメイエンホファー(Meienhofer)、Ｊ．編）2巻、１〜２８４頁、アカデミックプレス(Academic Press)、ニューヨーク中の、バラニー(Barany)、Ｇ．およびメリフィールド(Merrifield)、Ｒ．Ｂ．（１９７９）、
ビュンシュ(Wunsch)、Ｅ．編（１９７４）ジンテーゼ・フォン・ペプチデン・イン・ホウベン−ヴァイルス・メトーデン・デア・オルガーツシェン・ケミー(Synthese von peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie)（ミュラー(Muler)Ｅ．編）１５巻、第４版、１頁および２頁、ティーメ(Thieme)、シュツッツガルト、
ボダンツキー(Bodanszky)、Ｍ（１９８４）プリンシプルス・オブ・ペプチド・シンセシス(Principles of peptide Synthesis)、スプリンガー−ヴェルラグ(Springer-Verlag)、ヘイデルバーグ、
ボダンツキー、Ｍ．＆ボダンツキー、Ａ（１９８４）ザ・プラクティス・オブ・ペプチド・シンセシス(The Practice of Peptide Synthesis)、スプリンガー−ヴェルラグ、ヘイデルバーグ、
ボダンツキー、Ｍ.（１９８５）、インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ(International journal of Peptide and protein Research)２５、４４９〜４７４頁、
ハンドブック・オブ・エクスペリメンタル・イムノロジー(Handbook of Experimental Immunology)I−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ウィアー(Weir)およびＣ．Ｃ．ブラックウェル(Blackwell)編、１９８６ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ(Blackwell Scientific Publications).。
【００１３】
（関連技術の説明）
新しい診断標的、リード化合物および新規標的同定および確認試薬の要求が高まるのに答えて、製薬産業は、例えば、感染症または自己免疫疾患の診断／予後および／または治療などにおいて、病原性生物または疾病状態に特異的な新規マーカーまたは化合物のスクリーニングを増やしてきた。
【００１４】
多くの病原性生物は独特なタンパク質またはタンパク質のイソ型を発現するので、多くの研究はこのようなタンパク質を同定し、新規診断／予後および／または治療戦略の開発に使用することに焦点を当ててきた。しかし、病原性生物によって発現されたタンパク質のすべてが、診断法において、または治療戦略において使用するのに適した標的に相当するわけではない。したがって、新規診断および／または治療戦略の同定においては多量の研究は、適した標的分子の同定を対象としている。
【００１５】
おそらく、注目する診断／予後標的の同定における最も単純なアプローチは、疾病または状態に関連する病原体に由来するタンパク質を決定すること、あるいは、疾病または状態の結果として発現パターンの変わった宿主細胞タンパク質を決定することである。次いで、決定したタンパク質を用いて、前記タンパク質またはその領域と特異的に結合できる抗体を作製または同定し、このタンパク質が、免疫診断試薬の調製においてこれを使用するのを容易にするのに十分にほど免疫原性であるかどうかを調べる。しかし、このような方法は、試験するタンパク質の多くが免疫原性でないか、少なくとも、免疫診断試薬およびキットまたはワクチンを製造するために、宿主において免疫応答を誘発するために求められる程度ではないので高い確立で失敗する。
【００１６】
さらに、抗体、リガンドまたは小分子の標的は、天然の環境では、すなわち、他のタンパク質との複合体中または細胞内では比較的近づきにくく、それによって免疫アッセイによる検出が妨げられる場合がある。
【００１７】
したがって、推定標的を同定する前にいくつかの可能性ある標的を試験しなければならないことが多いので、このような方法の高い失敗率は、このアプローチが骨の折れるもので、かつ、費用のかかるものであるということを意味する。
【００１８】
いくつかの病原性生物のゲノムの配列決定が完了したので、研究者らは、この情報を用いてこのような病原性生物によって発現されるタンパク質の機能を予測する試みに着手した。研究者らは、機能および配列情報の双方を用いて、病原性生物によって発現されるタンパク質の位置および近づきやすさ、ひいては、タンパク質が感染性生物の治療のための診断または治療標的に相当する可能性を予測しようと試みている。マシグナニ(Masignani)ら、エキスパート・オピニオン・オン・バイオロジカル・セラピー(Expert Opinion on Biological Therapy)２（８）、８９５〜９０５頁、２００２によって報告されるように、このプロセスは、推定診断、治療および／またはワクチン標的の迅速な予測をもたらし、これによって新規治療／診断機会の開発が加速され得る。
【００１９】
生物のゲノム配列の解析に依存する方法では、注目する生物のゲノムまたは少なくともゲノムの相当割合が配列決定されていることが必要である。したがって、この方法は、いまだ配列決定される予定であるゲノムを有する生物における、特に、最近同定されたばかりの生物における診断／治療標的の予測では有効でない。さらに、このようなアプローチは、例えば、高い突然変異率を維持し、したがって、そのゲノム配列が恒常的に変化するいくつかのレトロウイルスなどの病原体における可能性ある治療／診断標的の予測ではあまり役に立たない。
【００２０】
さらに、これらの方法では、あるとすれば、予測された標的タンパク質が病原性生物によってｉｎ  ｖｉｖｏで実際に発現されるかどうかを調べるために熟練した技術者が必要である。このことは、タンパク質の中には疾病または疾患の特定のステージでのみ発現されるものもあるという観察結果を踏まえると、より困難になる。したがって、例えば、感染の後期に発現されるタンパク質は、初期の診断またはワクチンの関係ではあまり役に立たない場合がある。
【００２１】
前記の議論から理解されるように、依然として、診断アッセイおよび／または治療方法の魅力的な標的であるタンパク質の迅速な単離および／または同定法が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、本発明に到達するまでの研究において、結核菌または緑膿菌による感染症の新規診断薬、ワクチンおよび薬剤標的タンパク質を同定しようとしてきた。本発明者らは、患者血清サンプルの免疫グロブリン（Ｉｇ）画分から免疫原性標的タンパク質またはペプチド断片を回収でき、これではタンパク質またはペプチド断片がそのアミノ酸配列を決定できるのに十分なほど分解されていないことを見出した。タンパク質は感染の間に迅速に分解されることが知られていたために、これは驚くべきことであった。したがって、本発明者らは、結核を患っている患者から得た血清のＩｇ画分からいくつかのタンパク質／断片を同定することによって、当技術分野での従来の見識に対抗して突き進んだ。
【００２３】
本発明者らは、この方法を用いてＴＢ患者の痰および血清のＩｇＧ画分から結核菌グルタミンシンセターゼ（Ｒｖ２８６０ｃ）を同定した。また、記載した免疫分離技術を用いてＴＢ患者の血清のＩｇＧ画分から結核菌タンパク質伸張因子Ｔｕ（Ｒｖ０６８５）を単離および同定した。
【００２４】
本発明者らは、感染症を患っている被験体から免疫グロブリン含有画分を獲得することによって本発明の方法をさらに開発した。次いで、獲得した免疫グロブリン含有画分を固定化し、例えば、感染性生物に感染した被験体の体液、または細胞もしくは細胞抽出物と接触させる。この方法では、被験体のＩｇ画分を用いて感染性生物から免疫原性タンパク質を精製する。本発明者らは結合しているタンパク質を、固定化したＩｇ画分から溶出または単離することによって、免疫原性タンパク質の獲得レベルを高めることができ、それによってそのタンパク質の同定および解析が容易になった。本発明者らは、緑膿菌感染症を患っているＣＦを患っている被験体のＩｇ画分を用いて、前記細菌からいくつかの免疫原性タンパク質、例えば、熱ショックタンパク質ＧｒｏＥＳを単離した。
【００２５】
さらに、本発明者らは前述の方法を適用して、ＣＦ被験体の痰から、急性臨床増悪を起こしているＣＦ被験体がそれに対する自己抗体を発生させたタンパク質を単離した。したがって、本方法は自己免疫状態に苦しんでいる被験体がそれに対して特異的免疫応答を起こしたタンパク質を同定するのに有用である。
【００２６】
本発明者らは被験体を感染性生物由来のタンパク質補体で免疫することによって本方法をさらに発展させた。前記動物から、または被験体によって産生されたサンプルから単離した免疫グロブリン含有画分を、次いで、単離し、固定化する。次いで、この固定化したＩｇ画分を、同様の生物に感染した患者の体液と接触させ、感染性生物から、それに対して被験体が抗体応答を起こす、ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されたタンパク質を捕獲し、溶出し、同定し、それによってｉｎ  ｖｉｖｏで発現されたタンパク質を決定する。
【００２７】
本発明者らがとったアプローチは、どんな免疫原性タンパク質の同定においても一般的に用いられるものである。このような免疫原性タンパク質は、魅力的な標的に相当し、例えば、病原性生物または被験体における感染状態または自己免疫状態を同定するための診断適用にとって有用である。さらに、このようなタンパク質はまた、被験体において、そのタンパク質を単離する病原性生物による感染症または自己免疫状態を処置するための治療または予防戦略の開発にも有用である。
【００２８】
本発明は免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法を提供し、この方法は、被験体またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、免疫グロブリンと抗原抗体相互作用によって結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、それによって免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する。
【００２９】
本発明は、例えば、被験体からタンパク質複合体もしくはその混合物または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることをさらに提供する。本発明は、サンプルから１以上の免疫グロブリン含有画分を得ることさらに提供する。
【００３０】
例えば、全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群からサンプルを選択する。もう１つの実施例では、サンプルは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる。さらにもう１つの実施例では、サンプルは血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる。
【００３１】
一実施例では、タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１以上の免疫グロブリンを含んでなる。例えば、タンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分はＩｇＧを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＡを含んでなる。
【００３２】
このようなタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分は、例えば、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得る。例えば、前記の、サンプルを被験体から分離または精製することは、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる。
【００３３】
例えば、化合物を固体支持体、マトリックスまたは樹脂、例えば、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、磁性粒子、常磁性粒子、ポリマー樹脂およびその混合物からなる群から選択される固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する。
【００３４】
本発明の方法は、１種以上の固定化された化合物の洗浄をさらに提供し、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する。
【００３５】
一実施例では、化合物はタンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される。例えば、化合物はタンパク質Ａ、タンパク質Ｇまたはその混合物である。
【００３６】
本発明の方法の一実施例では、被験体は感染症を患っているか、感染症を以前に患ったことがある。例えば、感染症は急性感染症または慢性感染症である。このような感染症は、例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、酵母感染症、真菌感染症、寄生生物感染症からなる群から選択される。例えば、感染症は細菌感染症、例えば、シュードモナス属感染症またはマイコバクテリウ属感染症である。
【００３７】
もう１つの実施例では、感染症は肺感染症、例えば、緑膿菌または結核菌の存在によって引き起こされるか、それに関連する肺感染症（例えば、結核）である。
【００３８】
さらなる実施例では、被験体は自己免疫状態、例えば、炎症状態と関連する自己免疫状態に苦しんでいる。
【００３９】
いっそうさらなる実施例では、本方法は、被験体を免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなる１種以上の細胞またはその抽出物で免疫することをさらに含んでなり、それによって免疫原性タンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘発する（例えば、被験体において、または被験体に由来するか被験体によって産生されたサンプルにおいて）。例えば、１種以上の細胞またはその抽出物は免疫原性タンパク質またはその断片を発現する感染性病原体に由来する。有用な細胞またはその抽出物の例は、ウイルス粒子、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞または寄生生物の細胞もしくは寄生生物に由来する細胞からなる群から選択されるか、あるいは、細胞抽出物はウイルスの抽出物、細菌の抽出物、酵母の抽出物、真菌の抽出物および寄生生物の抽出物からなる群から選択される。例えば、１種以上の細胞が細菌細胞であるか、細胞抽出物が細菌抽出物、例えば、シュードモナス種、例えば、緑膿菌またはマイコバクテリウム属、例えば、結核菌である。
【００４０】
本発明の一実施例では、被験体は非ヒト動物であり、例えば、非ヒト動物はマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ヒツジ(sheep)、ヒツジ(ovine)、ウマおよびヤギからなる群から選択される。
【００４１】
もう１つの実施例では、被験体はヒト被験体である。
【００４２】
本発明の方法は、例えば、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することによって、免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに提供する。
【００４３】
このような架橋剤は、例えば、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される、例えば、この架橋剤はＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤であり、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤は、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤はスベリン酸ジスクシンイミジルである。
【００４４】
本発明はまた、被験体において疾病または疾患を引き起こす病原体の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片を同定する方法を提供し、これは、
（ｉ）疾病または疾患を患っているか、以前に疾病または疾患を患ったことがある被験体、またはその細胞、組織もしくは器官から免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、疾病または疾患を引き起こす病原体またはその誘導体を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）前記免疫グロブリンと、抗原抗体相互作用によって結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
同定されるタンパク質は、被験体において疾病または疾患を引き起こす病原体の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片である。
【００４５】
一例では、誘導体は疾病または疾患を引き起こす病原体、例えば、感染性病原体、例えば、ウイルス感染、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される感染性病原体のタンパク質または細胞抽出物を含んでなる。例えば、感染性病原体は細菌、例えば、緑膿菌または結核菌である。例えば、細菌は臨床分離株である。
【００４６】
本発明は、癌細胞の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片を同定する方法をさらに提供し、これは、
（ｉ）癌を患っているか、以前に癌を患ったことがある被験体から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、腫瘍細胞またはそのタンパク質抽出物もしくは細胞抽出物を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）前記免疫グロブリンと、抗原抗体相互作用によって結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
同定されるタンパク質は、癌細胞の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片である。
【００４７】
例えば、癌細胞は膀胱癌細胞、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、子宮内膜癌細胞、頭頚部癌細胞、白血病細胞、肺癌細胞、リンパ腫細胞、メラノーマ細胞、非小細胞肺癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、急性リンパ性白血病細胞、成人急性骨髄性白血病細胞、成人非ホジキンスリンパ腫細胞、脳腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、小児肉腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、食道癌細胞、ヘアリー細胞白血病細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞、多発性骨髄腫細胞、神経芽細胞腫細胞、口腔癌細胞、膵臓癌細胞、中枢神経系原発リンパ腫細胞、皮膚癌細胞および小細胞肺癌細胞からなる群から選択される。
【００４８】
本発明は、例えば、被験体からタンパク質複合体またはその混合物またはその免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることをさらに提供する。本発明は、サンプルから１以上の免疫グロブリン含有画分を得ることを、なお、さらに提供する。
【００４９】
例えば、サンプルは全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群から選択される。もう１つの実施例では、サンプルは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる。さらにもう１つの実施例では、サンプルは血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる。
【００５０】
一実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる。例えば、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＧを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＡを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＭを含んでなる。
【００５１】
本発明はまた、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得ることを提供する。例えば、前記の、サンプルを被験体から分離または精製することは、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる。
【００５２】
例えば、１種以上の化合物は固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化し、例えば、固体支持体、マトリックスまたは樹脂は、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、磁性粒子、常磁性粒子、ポリマー樹脂およびその混合物からなる群から選択される。
【００５３】
本発明の方法は、１種以上の固定化された化合物の洗浄をさらに提供し、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する。
【００５４】
一実施例では、化合物はタンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびチオフィリック樹脂またはその混合物からなる群から選択される。例えば、化合物はタンパク質Ａ、タンパク質Ｇまたはその混合物である。
【００５５】
本発明の方法は、例えば、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することによって、免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに提供する。
【００５６】
このような架橋剤は、例えば、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される。例えば、この架橋剤はＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤であり、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤は、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤はスベリン酸ジスクシンイミジルである。
【００５７】
本発明はまた、自己免疫状態から、被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法を提供し、この方法は、
（ｉ）自己免疫状態に苦しんでいる被験体またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、自己免疫疾患を患っている被験体に由来するタンパク質を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）前記免疫グロブリンと、抗原抗体相互作用によって結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
同定されるタンパク質は、自己免疫状態に由来する、ヒトまたは非ヒト動物被験体において免疫応答を誘発し得る免疫原性タンパク質またはその断片である。
【００５８】
一例では、本発明は、自己免疫疾患を患っている被験体から、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることと、例えば、サンプルから免疫グロブリンまたはその混合物またはその免疫グロブリン含有画分を得ることとをさらに含んでなる。さらに、本方法は、例えば、サンプルから免疫グロブリン含有画分を得ることをさらに含んでなる。
【００５９】
例えば、サンプルは全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群から選択される。もう１つの実施例では、サンプルは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる。さらにもう１つの実施例では、サンプルは血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる。
【００６０】
一実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる。例えば、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＧを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＡを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＭを含んでなる。
【００６１】
本発明は、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得ることを提供する。例えば、前記の、サンプルを被験体から分離または精製することは、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる。
【００６２】
例えば、化合物を固体支持体、マトリックスまたは樹脂、例えば、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、磁性粒子、常磁性粒子およびポリマー樹脂ならびにその混合物からなる群から選択される固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する。
【００６３】
本発明の方法は、１種以上の固定化された化合物の洗浄をさらに提供し、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去する。
【００６４】
一実施例では、化合物はタンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される。例えば、化合物はタンパク質Ａ、タンパク質Ｇまたはその混合物である。
【００６５】
本発明の方法は、例えば、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することによって、免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることをさらに提供する。
【００６６】
このような架橋剤は、例えば、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される。例えば、この架橋剤はＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤であり、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤は、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤はスベリン酸ジスクシンイミジルである。
【００６７】
一実施例では、被験体はヒトであり、かつ、自己免疫状態に苦しんでいる。例えば、自己免疫状態は、例えば、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、自己免疫甲状腺疾患、中枢神経系脈管炎、および自己免疫筋炎からなる群から選択されるような自己免疫疾患である。
【００６８】
もう１つの実施例では、被験体は嚢胞性繊維症（ＣＦ）を患っている。一実施例では、このようなＣＦ被験体は以前に急性肺疾患増悪を起こしたことがある。もう１つの実施例では、ＣＦ被験体は急性肺疾患増悪を起こしている。さらにもう１つの実施例では、被験体は感染症、例えば、細菌によって引き起こされる感染症をさらに患っている。このような感染症は、例えば、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、セパシア菌複合体、ステノトロホモナス・マルトフィラ(Stenotrophomonas maltophila)、アルカリゲネス（アクロモバクター）キシロソキシダンス(Alcaligenes(Achromobacter)xylosoxidans)、Ｂ．グラディオリ(gladioli)およびラルストニア・ピックティー(Ralstonia picketti)およびその混合物からなる群から選択される細菌によって引き起こされ、例えば、細菌感染症は、緑膿菌感染症を含んでなる。
【００６９】
本発明の方法の一実施例では、サンプルは、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分が由来した被験体に由来する。
【００７０】
本発明は、被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法をさらに提供し、この方法は、
（ｉ）免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなる細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルを事前に投与された被験体に由来するか、被験体によって産生されたサンプルから得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンと、抗原抗体相互作用によって結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、
それによって被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する。
【００７１】
一実施例では、本方法は、被験体に細胞または細胞抽出物を含んでなるサンプルを投与することをさらに含んでなる。細胞または細胞抽出物は、例えば、疾病または疾患を引き起こす病原体に由来する。
【００７２】
疾病または疾患を引き起こす病原体は、例えば、感染性病原体、例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される感染性病原体である。例えば、感染性病原体は細菌、例えば、結核菌、例えば、結核菌の臨床分離株である。
【００７３】
一例では、本発明は、被験体に由来するか、被験体によって産生されたサンプルを得ること、および／またはタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることをさらに含んでなる。さらに、本方法は、例えば、サンプルから免疫グロブリン含有画分を得ることを含んでなる。
【００７４】
本方法の一形態では、被験体は非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ヒツジ(sheep)、ヒツジ(ovine)、ウマ、ロバおよびヤギからなる群から選択される非ヒト動物である。本発明の一例示的形態では、被験体は鳥類（例えば、ニワトリ）であり、被験体によって産生された生体サンプルは卵またはその抽出物またはその誘導体である。
【００７５】
もう１つの実施例では、サンプルは全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群から選択される。もう１つの実施例では、サンプルは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる。さらにもう１つの実施例では、サンプルは血清または血清の免疫グロブリン含有画分または卵黄または卵黄の免疫グロブリン含有画分を含んでなる。
【００７６】
一実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＹまたはその混合物からなる群から選択される１種以上の免疫グロブリンを含んでなる。例えば、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＧを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＡを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分またはタンパク質複合体はＩｇＹを含んでなる。あるいは、またはさらに、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＭを含んでなる。
【００７７】
本発明は、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、サンプルを被験体から分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得ることを提供する。例えば、前記の、サンプルを被験体から分離または精製することは、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる。
【００７８】
例えば、化合物を固体支持体、マトリックスまたは樹脂、例えば、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、 磁性粒子、常磁性粒子、ポリマー樹脂およびその混合物からなる群から選択される固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に事前に固定化する。
【００７９】
本発明の方法は、固定化された化合物を洗浄し、それによって非特異的に結合しているか、結合していないタンパク質を除去することをさらに提供する。
【００８０】
一実施例では、１種以上の化合物は、タンパク質Ａまたはそのミメティック、タンパク質Ｇまたはそのミメティック、タンパク質Ｌまたはそのミメティック、抗免疫グロブリン抗体、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオフィリック樹脂およびその混合物からなる群から選択される。例えば、化合物はタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇまたはその混合物である。
【００８１】
本発明の方法は、例えば、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することによって、免疫グロブリンを化合物と結合させることをさらに提供する。
【００８２】
このような架橋剤は、例えば、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される、例えば、この架橋剤はＮ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤であり、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤は、ジスクシンイミジルグルタレート、スベリン酸ジスクシンイミジル、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）、ジスクシンイミジルタルタレート、ジスルホスクシンイミジルタルタレート、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート、ビスマレイミドヘキサン、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステルおよびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステルからなる群から選択される。例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤はスベリン酸ジスクシニミジルである。
【００８３】
本発明の方法の一実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分と接触させる、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルは、細胞または細胞抽出物を含んでなる被験体に由来する。例えば、細胞または細胞抽出物は、疾病または疾患を引き起こす病原体に由来し、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルは疾病または疾患を患っている被験体に由来する。
【００８４】
一実施例では、疾病または疾患を引き起こす病原体は感染性病原体、例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される感染性病原体である。
【００８５】
本明細書に例示されるように、感染性病原体は細菌、例えば、結核菌である。
【００８６】
本発明は、例えば、免疫グロブリンと抗原抗体相互作用によって結合している免疫原性タンパク質またはその断片を、免疫グロブリンから分離することをさらに含んでなる。このような分離は、例えば、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分を、抗原抗体相互作用を乱す化合物と、抗原抗体相互作用を乱すのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなるプロセスを実施することによって達成する。
【００８７】
例えば、抗原抗体相互作用を乱す化合物は、免疫グロブリン含有画分のｐＨを調節する化合物、塩、イオン性界面活性剤、解離剤およびカオトロピック剤ならびにその混合物からなる群から選択される。
【００８８】
もう１つの実施例では、本発明は、免疫グロブリン含有画分と抗原抗体相互作用によって結合しているか結合していたタンパク質を単離することをさらに含んでなる。例えば、このタンパク質はゲル電気泳動、例えば、二次元ゲル電気泳動を用いて単離する。
【００８９】
さらにもう１つの実施例では、免疫グロブリン含有画分と抗原抗体相互作用によって結合しているか結合していたタンパク質を、質量分析、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて同定する。
【００９０】
本発明は、
（ａ）被験体に由来するサンプルを、免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、１種以上の化合物を単離すること含んでなる方法によって、免疫原性タンパク質またはその断片に対して免疫応答を起こした被験体、またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｂ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンと、１種以上の化合物を結合させることと、
（ｃ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することと、
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることと、
（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することと、
（ｆ）場合によって（ｄ）および（ｅ）を１回以上反復することと、
（ｇ）免疫グロブリンから分離したタンパク質またはその断片を同定することを含んでなり、
それによって免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法をさらに提供する。
【００９１】
本方法の一形態では、（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することは、（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることの前に実施する。
【００９２】
本発明のもう１つの形態では、（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることは、（ｅ）免疫原性 タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することの前に実施する。
【００９３】
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させること、および（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することは、１種以上の免疫原性タンパク質を同定するのに十分な回数反復することが好ましい。例えば、（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させること、および（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することを、ゲル電気泳動、例えば、二次元ゲル電気泳動を用いてゲル上で１種以上のタンパク質またはその断片を区別するのに十分な回数反復する。
【００９４】
本方法の一実施例では、被験体は、疾病または疾患を引き起こす病原体に対して免疫応答を起こしている。この実施例によれば、結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルは、疾病もしくは疾患を引き起こす病原体またはその誘導体を含んでなる。
【００９５】
例えば、疾病または疾患を引き起こす病原体は感染性病原体、例えば、細菌、例えば、結核菌である。
【００９６】
もう１つの実施例では、被験体は自己免疫状態に苦しんでいる。この実施例によれば、結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルは、自己免疫状態に苦しんでいる被験体に由来するタンパク質を含んでなる。
【００９７】
さらにもう１つの実施例では、被験体は、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなる、細胞またはその抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルで事前に免疫されている。この実施例によれば、結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルは、細胞またはその抽出物を含んでなる。一形態では、被験体はニワトリである。
【００９８】
本方法の例示的形態では、被験体は、疾病または疾患と関連する病原体、例えば、感染性病原体、例えば、細菌に由来する細胞または細胞抽出物で事前に免疫されている。一実施例では、細菌は結核菌である。
【００９９】
本発明はまた、状態のマーカーを同定するプロセスにおける、本明細書に記載した方法の使用を提供する。
【０１００】
本発明は、状態の診断における本明細書に記載した方法の使用をさらに提供する。
【０１０１】
一実施例では、状態は疾病または疾患、例えば、感染性疾病または癌である。
【０１０２】
もう１つの実施例では、状態は自己免疫状態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０３】
本発明は免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法を提供し、この方法は、被験体またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、免疫グロブリンと抗原抗体相互作用によって結合しているタンパク質またはその断片を同定することとを含んでなり、それによって免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する。
【０１０４】
本明細書において、用語「免疫原性タンパク質」とは、被験体において免疫応答を誘導し、その結果、被験体によってそのタンパク質に対する特異的抗体が生じる、いずれかのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を意味すると理解されるものとする。したがって、このような「免疫原性タンパク質」は、抗原として抗体と相互作用し得る、すなわち、抗体は、抗体の高頻度可変性領域または相補性決定領域との相互作用によって非共有結合で免疫原性タンパク質と結合できる。
【０１０５】
免疫グロブリンと抗原抗体相互作用によって結合可能なタンパク質または断片は、さまざまな結合または引力のうちのいずれか１以上によってこれを行う。例えば、抗原は水素結合（すなわち、抗体と抗原の適当な分子間での水素橋の形成）、ファンデルワールス結合（電子雲間、すなわち、振動する双極子の相互作用）または無極性の疎水性基の会合に依存する疎水性結合によって抗体と結合する。あるいは、またはさらに、抗原抗体相互作用は静電気力、すなわち、タンパク質側鎖の反対に荷電した基の相互作用によって促進される。
【０１０６】
一実施例では、本発明の免疫グロブリンを用いて単離する免疫原性タンパク質を単離および／または同定する方法によって、天然または非修飾型の免疫原性タンパク質が単離される。本明細書において、用語「天然または非修飾型」とは、天然に見られるタンパク質の一形態を意味すると取られるものとする。したがって、この用語は、このタンパク質が天然に見られる環境において、例えば、このタンパク質が天然に発現される細胞において見られる前記タンパク質の修飾を包含する。このような修飾としては、例えば、タンパク質分解による切断、翻訳後修飾、代替スプライシング型および分子量、電荷の変化、タンパク質のアミノ酸組成の変化をもたらす何らかのその他の修飾が挙げられる。
【０１０７】
もう１つの実施例では、本発明の免疫グロブリン含有画分を用いて単離する免疫原性タンパク質を単離および／または同定する方法では、免疫原性タンパク質の修飾型、断片またはペプチドが単離される。本明細書において、用語「修飾型」は、前記タンパク質の天然型とは異なるタンパク質を意味すると理解されるものとする。このような方法によって検出され得る修飾としては、例えば、タンパク質分解による切断、翻訳後修飾および分子量、電荷、またはアミノ酸組成の変化をもたらす何らかのその他の修飾が挙げられる。この実施形態によれば、免疫原性タンパク質の修飾型、断片またはペプチドは、生体サンプルが由来する被験体による免疫応答の結果として産生され得る。このような免疫応答の際には、多数のタンパク質分解性酵素、例えば、好中球エラスターゼおよび病原体由来エラスターゼなどが産生され、その結果、タンパク質が切断され、分解されることが多い。したがって、本発明によって明確に包含される免疫原性タンパク質の修飾型は、前記タンパク質の断片である。結果として、本発明は免疫原性タンパク質の断片またはタンパク質の免疫原性断片の単離を明確に包含する。
【０１０８】
好ましい断片としては、個体がそれに対して特異的免疫応答を開始するタンパク質の断片が挙げられ、特異的抗体応答を開始するタンパク質の断片がより好ましい。本発明の方法によって同定されるタンパク質の断片は、少なくとも約５個のアミノ酸を含んでなることが好ましく、少なくとも約６個のアミノ酸がより好ましく、約１０個のアミノ酸がより好ましく、約２０個のアミノ酸がよりいっそう好ましく、約５０個のアミノ酸がさらによりいっそう好ましく、約１００個のアミノ酸がさらによりいっそう好ましい。
【０１０９】
本明細書において、用語「免疫応答を誘発すること」とは、被験体の、抗原に対する特異的抗体応答および／または特異的Ｔ細胞応答を生じる能力を指すことと理解されるものとする。免疫応答は抗体応答であることが好ましい。理論または作用様式に拘束されようとは思わないが、このような抗体応答は、免疫原性タンパク質または抗原と特異的に結合するＩｇＤおよびＩｇＭを産生するＢリンパ球（または細胞）を含んでなると予想される。次いで、前記Ｂリンパ球が、前記免疫原性タンパク質と特異的に結合するＩｇＭおよび／またはＩｇＧおよび／またはＩｇＥおよび／またはＩｇＡおよび／またはＩｇＹを分泌する血漿細胞に分化することが特に好ましい。
【０１１０】
本明細書において、用語「免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体」とは、１種以上の免疫グロブリンタンパク質および／または１以上の種類の免疫グロブリンタンパク質を含んでなる複数の相互作用タンパク質を意味すると取られるものとする。一実施形態では、このようなタンパク質複合体は抗体複合体、例えば、共有結合で（例えば、ジスルフィド結合によって）結合して抗体を形成しているいくつかの免疫グロブリン分子である。例えば、ＩｇＧの場合では、このような抗体複合体は、２つの軽鎖と２つの重鎖を含んでなり、各軽鎖は少なくとも１つのジスルフィド結合によって重鎖と結合しており、重鎖はまた、少なくとも１つのジスルフィド結合によって結合している。他の型の抗体複合体、例えば、ＩｇＭの五量体構造も本発明によって明確に意図される。さらに、一実施形態では、このような抗体複合体は、免疫グロブリンと結合している抗原を含んでなる。タンパク質複合体が、１種以上の免疫グロブリンと抗原抗体相互作用によって結合している免疫原性タンパク質またはその断片を含むことは明確である。
【０１１１】
本明細書において、用語「免疫グロブリン含有画分」とは、免疫グロブリンを用いて単離される生体サンプルの成分を意味すると取られるものとする。このような画分は、例えば、免疫複合体、抗体−ＨＬＡ複合体、抗体、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、補体経路の成分、フィブリノーゲン、ハプトグロビン、α−１−抗トリプシン、α−１−酸性糖タンパク質、α−１−マクログロブリン、トランスフェリン、低密度リポタンパク質、セルロプラスミン、もしくは血清アルブミンタンパク質または抗原抗体相互作用によって免疫グロブリンと結合しているそれらの断片、あるいは他の成分の中でもそれらの混合物を含んでなり得る。
【０１１２】
好ましい実施形態では、「免疫グロブリン含有画分」および／または「免疫グロブリンまたはその混合物を含んでなるタンパク質複合体」は、免疫グロブリン結合性化合物、例えば、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌなどによって直接結合されているタンパク質と考えられるものとする。
【０１１３】
本明細書において、用語「免疫グロブリン」とは、リンパ球によって産生されるタンパク質を意味すると取られるものとし、ここで、このタンパク質は特異的抗体活性を有すること、すなわち、好ましくは、共有結合を形成しないで、特異的タンパク質と相互作用できる／結合できることが好ましい。免疫グロブリンは４つのポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって結合されている２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖とを含んでなることが好ましい。免疫グロブリンはＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹからなる群から選択されることが好ましい。
【０１１４】
本明細書において、用語「抗体」とは、無傷のモノクローナルまたはポリクローナル抗体、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＹ）画分、ヒト化抗体、組換え単鎖抗体、ならびにその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖ断片などを指す。
【０１１５】
本発明の一実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分は、ＩｇＧおよび／またはＩｇＡおよび／またはＩｇＹを含んでなる。本発明のもう１つの実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＧを含んでなる。本発明のさらにもう１つの実施例では、免疫グロブリン含有画分はＩｇＡを含んでなる。本発明のさらなる実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＹを含んでなる。本発明のなおさらなる実施例では、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分はＩｇＭを含んでなる。
【０１１６】
本発明は、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリン含有画分の成分の単離を提供する。このプロセスは、抗原または免疫原性タンパク質と複合体を形成している免疫グロブリンから遊離免疫グロブリンを精製せずに実施することが好ましい。
【０１１７】
（生体サンプル）
免疫グロブリンは種々の体内組織および／または体液内で見られるので、本発明は、このような体内組織または体液を含んでなるサンプルから、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなる生体サンプルを得ることを明確に包含する。タンパク質複合体もしくはその混合物または免疫グロブリン含有画分を単離するのに有用な生体サンプルの例としては、全血、血漿、血清、痰、唾液、胸腔内液、心嚢液、腹水、リンパ液、リンパ節、脾臓、卵黄、全血の画分、血漿の画分、血清の画分、痰の画分、唾液の画分、胸腔内液の画分、心嚢液の画分、腹水の画分、リンパ液の画分、リンパ節の画分、脾臓の画分および卵黄の画分からなる群から選択されるサンプルがある。
【０１１８】
本発明を実施するのに有用な生体サンプルは、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、リンパ球、Ｂ−リンパ球、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、多形核細胞および肥満細胞からなる群から選択される細胞を含んでなる。例えば、このような生体サンプルは血清または血清の免疫グロブリン含有画分を含んでなる。
【０１１９】
また本発明が、前記生体サンプルの誘導体を包含することは明確である。例えば、本発明は生体サンプルから１種以上のタンパク質を単離するよう（例えば、所定の分子量より小さいタンパク質を除去するよう、または一般的なタンパク質、例えば、アルブミンなどを除去するよう）処理されたサンプルを包含する。あるいは、またはさらに、生体サンプル、例えば、全血などを赤血球の凝固を引き起こすよう処理して、血漿または血清の単離を容易にする。
【０１２０】
本発明は生体サンプルを得ることを包含するので、本発明のいくつかの形態では、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、シリンジを用いて、または手術などによって、生体サンプルを被験体から事前に得ることは明らかであろう。
【０１２１】
本発明の方法は、抗原に対する免疫応答を誘発可能な被験体であれば、いずれに由来する生体サンプルも包含する。例えば、このような被験体は非ヒト動物、例えば、ショウジョウバエ、シノラプディス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ヒツジ(sheep)、ヒツジ(ovine)、ウマまたはヤギなどである。これらの動物の発達段階もまた本発明によって包含されることは明確であり、例えば、本明細書に例示されるように、ニワトリに細胞抽出物を注射することで、その細胞抽出物中の特異的抗原に対する特異的免疫応答を引き起こし、そのニワトリが産んだ卵から、抽出物中の抗原と結合する免疫グロブリンを単離する。
【０１２２】
あるいは、本発明の方法は、ヒト由来の生体サンプル中の免疫原性タンパク質またはその断片を同定するのに同様に有用である。このような方法は、例えば、感染症または自己免疫疾患を患っているヒトにおいて、診断標的または治療標的であるタンパク質またはその断片を同定するのに有用である。
【０１２３】
あるいは、またはさらに、タンパク質またはその断片と特異的に結合する免疫グロブリンは、被験体中に存在するか、または被験体によって感染後に産生されるので、以前に感染したか、現在感染している被験体に由来する免疫グロブリン含有画分は、感染性病原体に由来する免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。
【０１２４】
感染症を患っているか、以前に感染性病原体に感染した被験体に由来する生体サンプルは、例えば、前記感染症のマーカーおよび／または治療標的を同定するのに有用である。このような感染症としては、例えば、急性感染症または慢性感染症がある。「慢性」とは、感染症が長期に持続しているか、頻繁な再発を特徴とすることを意味する。例えば、慢性細菌感染症は、嚢胞性繊維症を患っている被験体においてしばしば観察される。
【０１２５】
「急性」とは、感染症が急激に発症し、続いて、短いが場合によって重大な経過をたどることを意味する。例えば、Ｃ型肝炎感染症またはインフルエンザ菌を患っている被験体は急性感染症に苦しむことが多い。
【０１２６】
ウイルス感染症、細菌感染症、酵母感染症、真菌感染症および寄生生物感染症からなる群から選択される感染症を患っているか、以前に感染症（急性または慢性にかかわらず）を患っていた被験体に由来する生体サンプルは、本発明に包含される。
【０１２７】
例えば、生体サンプルは細菌感染症を患っている（または以前に患っていた）被験体に由来し、この場合、その細菌感染症の原因である細菌は、アビオトロフィア(Abiotrophia)、アクロモバクター、アシダミノコッカス、アシドボラックス(Acidovorax)、アシネトバクター、アクチノバチルス、アクチノバキュラム(Actinobaculum)、アクチノマヅラ、アクチノミセス、アエロコッカス、アエロモナス、アフピア(Afipia)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、アルカリゲネス、アロイオコッカス(Alloiococcu)、アルテロモナスアミコラタ(amycolata)、アミコラトプシス(Amycolatopsis)、アナエロボスピリルム(Anaerobospirillum)、アナエロラブヅス(Anaerorhabdus)、「アンギリナ(Anguillina)」、アラクニア、アルカノバクテリウム、アルコバクター(Arcobacter)、アルスロバクター、アトポビウム(Atopobium)、オーレオバクテリウム(Aureobacterium)、バチルス、バクテロイデス(Bacteroides)、バルネアトリックス(Balneatrix)、バルトネラ、ベルゲイエラ(Bergeyella)、ビフィドバクテリウム、バイロフィラ(Bilophila)、ブランハメラ、ボレリア、ボルデテラ、ブラキスピラ(Brachyspira)、ブレビバチルス(Brevibacillus)、ブレビバクテリウム、ブレブンジモナス(Brevundimonas)、ブルセラ、バーコルデリア(Burkholderia)、バッチオークセラ(Buttiauxella)、ブチリビブリオ、カリマトバクテリウム、カンピロバクター、カプノシトファガ、カルディオバクテリウム、カトネラ(Catonella)、セデセア(Cedecea)、セルロモナス(Cellulomonas)、センチペダ(Centipeda)、クラミジア、クラミドフィラ(Chlamydophila)、クロモバクテリウム、チセオバクテリウム(Chyseobacterium)、クリセオモナス(Chryseomonas)、シトロバクター、クロストリジウム、コリンゼラ(Collinsella)、コマモナス(Comamonas)、コリネバクテリウム、コクシエラ、クリプトバクテリウム(Cryptobacterium)、デルフチア(Delftia)、デルマバクター(Dermabacter)、デルマトフィルス(Dermatophilus)、デスルフォモナス(Desulfomonas)、デスルホビブリオ(Desulfovibrio)、ジアリスタ、ジシェロバクター(Dichelobacter)、ドロシコッカス(Dolosicoccus)、ドロシグラヌルム(Dolosigranulum)、エドワードシエラ、エッゲルセラ(Eggerthella)、エールリヒア、エイケネラ(Eikenella)、エンペドバクター(Empedobacter)、エンテロバクター、エンテロコッカス、エルビニア、エリジペロスリックス、エシェリキア、ユウバクテリウム(Eubacterium)、ユーインゲラ、エキシグオバクテリウム(Exiguobacterium)、ファクラミア(Facklamia)、フィリファクター(Filifactor)、フラヴィモナス(Flavimonas)、フラボバクテリウム(Flavobacterium)、フレキシスピラ(Flexispira)、フランシセラ、フゾバクテリウム、ガルドネレラ、ジェメラ(Gemella)、グロビカテラ(Globicatella)、ゴルドナ(Gordona)、ヘモフィルス、ハフニア、ヘリコバクター、ヘロコッカス(Helococcus)、ホールデマニア(Holdemania)、イグナビグラナム(Ignavigranum)、ジョンソネラ(Johnsonella)、キンゲラ(Kingella)、クレブシエラ、コクリア(Kocuria)、コセレラ(Koserella)、クルシア(Kurthia)、キトコッカス(Kytococcus)、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、ロートロピア(Lautropia)、レクレルシア(Leclercia)、レジオネラ、レミノレラ(Leminorella)、レプトスピラ、レプトトリキア(Leptotrichia)、ロイコノストック(Leuconostoc)、リステリア、リストネラ(Listonella)、メガスフェラ(Megasphaera)、メチロバクテリウム(Methylobacterium)、ミクロバクテリウム(Microbacterium)、ミクロコッカス、ミツオケラ(Mitsuokella)、モビルンカス(Mobiluncus)、メレレラ(Moellerella)、モラクセラ、モルガネラ、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ミロイデス、ナイセリア、ノカルジア、ノカルジオプシス(Nocardiopsis)、オクロバクトラム(Ochrobactrum)、オエスコビアオリゲラ(OeskoviaOligella)、オリエンチア(Orientia)、パエニバチルス(Paenibacillus)、パンテア(Pantoea)、パラクラミジア、パスツレラ、ペジオコックス、ペプトコッカス、ペプトストレプトコッカス、フォトバクテリウム(Photobacterium)、フォトラブヅス(Photorhabdus)、プレシオモナス、ポリフィリモナス(Porphyrimonas)、プレポテラ(Prevotella)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、プロテウス、プロビデンシア(Providencia)、シュードモナス、シュードノカルジア(Pseudonocardia)、シュードラミバクター(Pseudoramibacter)、サイクロバクター(Psychrobacter)、ラーネラ(Rahnella)、ラルストニア(Ralstonia)、ロドコッカス、リケッチア、ロカリメア(Rochalimaea)、ロセオモナス(Roseomonas)、ロチア、ルミノコッカス(Ruminococcus)、サルモネラ、セレノモナス、セルプリナ、セラチア、シェウェネラ(Shewenella)、シゲラ、シムカニア、スラキア(Slackia)、スフィンゴバクテリウム(Sphingobacterium)、スフィンゴモナス(Sphingomonas)、スピリルム、スタフィロコッカス、ステノトロフォモナス(Stenotrophomonas)、ストマトコッカス(Stomatococcus)、ストレプトバシラス、ストレプトコッカス、ストレプトミセス、スクシニビブリオ(Succinivibrio)、ステレラ(Sutterella)、ストネラ(Suttonella)、タツメラ(Tatumella)、チシエレラ(Tissierella)、トラブルシエラ(Trabulsiella)、トレポネーマ(Treponema)、トロフェリマ(Tropheryma)、ツサカムレラ(Tsakamurella)、ツルシア(Turicella)、ウレアプラズマ(Ureaplasma)、バゴコッカス(Vagococcus)、ベイヨネラ、ビブリオ、ウィークセラ(Weeksella)、ウォリネラ(Wolinella)、キサントモナス(Xanthomonas)、キセノラブヅス(Xenorhabdus)、エルシニア(Yersinia)およびヨーケネラ(Yokenella)からなる群から選択される属のものである。
【０１２８】
例えば、細菌感染症は、アクチノミセス・ユーロペウス(Actinomyces europeus)、アクチノミセス・ゲオルギエ(Actinomyces georgiae)、アクチノミセス・ゲレンスセリエ(Actinomyces gerencseriae)、アクチノミセス・グラエベニトジー(Actinomyces graevenitzii)、アクチノミセス・イスレリー(Actinomyces israelii)、アクチノミセス・メエリ(Actinomyces meyeri)、アクチノミセス・ネスランディ(Actinomyces naeslundii)、アクチノミセス・ニューイー・ニューイー(Actinomyces neuii nueii)、アクチノミセス・ニューイー・アニトラツス(Actinomyces neuii anitratus)、アクチノミセス・オドントリチクス(Actinomyces odontolyticus)、アクチノミセス・ラジンゲ(Actinomyces radingae)、アクチノミセス・ツリセンシス(Actinomyces  turisensis)、アクチノミセス・ビスコスス(Actinomyces viscosus)、アルスロバクター・クレアチノリチクス(Arthrobacter creatinolyticus)、アルスロバクター・クミンシー(Arthrobacter cumminsii)、アルスロバクター・ウォルウェンシス(Arthrobacter woluwensis)、炭疽菌、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・リシェニフォルミス(Bacillus licheniformis)、巨大菌、バチルス・ミロイデス、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、バチルス・スファエリクス(Bacillus sphaericus)、枯草菌、バチルス・スリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、ボレリア・アフゼリー(Borrelia afzelii)、ボレリア・アンデルソニー(Borrelia andersonii)、ボレリア・ビセッティー(Borrelia bissettii)、ライム病菌、ボレリア・ガリニー(Borrelia garinii)、ボレリア・ジャポニカ(Borrelia japonica)、ボレリア・ルシタニエ(Borrelia lusitaniae)、ボレリア・タヌキー(Borrelia tanukii)、ボレリア・ツルジ(Borrelia turdi)、ボレリア・バライシアナ(Borrelia valaisiana)、ボレリア・カウカシカ(Borrelia caucasica)、ボレリア・クロシデュレ(Borrelia crocidurae)、ボレリア・レキュレンティス(Borrelia recurrentis)、ボレリア・ヅットニ(Borrelia duttoni)、ボレリア・グラインゲリ(Borrelia graingeri)、ボレリア・ヘルムシー(Borrelia hermsii)、ボレリア・ヒスパニカ(Borrelia hispanica)、ボレリア・ラチシェウィー(Borrelia latyschewii)、ボレリア・マゾッティー(Borrelia mazzottii)、ボレリア・パルケリ(Borrelia parkeri)、ボレリア・ペルシカ(Borrelia persica)、ボレリア・レキュレンティス(Borrelia recurrentis)、ボレリア・ツリカテ(Borrelia turicatae)、ボレリア・ベネズエレンシ(Borrelia venezuelensi)、気管支敗血症菌、ボルデテラ・ヒンジー(Bordetella hinzii)、ボルデテラ・ホルムセイー(Bordetella holmseii)、ボルデテラ・パラペルツシス(Bordetella parapertussis)、百日咳菌、ボルデテラ・トレマツム(Bordetella trematum)、クロストリジウム・アブソナム(Clostridium absonum)、クロストリジウム・アルゲンチネンセ(Clostridium argentinense)、クロストリジウム・バラティー(Clostridium baratii)、クロストリジウム・ビフェルメンタンス(Clostridium bifermentans)、クロストリジウム・ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)、クロストリジウム・カダベリス(Clostridium cadaveris)、クロストリジウム・カルニス(Clostridium carnis)、クロストリジウム・セラツム(Clostridium celatum)、クロストリジウム・クロストリジオフォルメ(Clostridium clostridioforme)、クロストリジウム・コクレアリウム(Clostridium cochlearium)、クロストリジウム・コクレアツム(Clostridium cocleatum)、クロストリジウム・ファラッ���ス(Clostridium fallax)、クロストリジウム・ゴニー(Clostridium ghonii)、クロストリジウム・グリコリカム(Clostridium glycolicum)、クロストリジウム・ヘモリチカム(Clostridium haemolyticum)、クロストリジウム・ハスティフォルメ(Clostridium hastiforme)、クロストリジウム・ヒストチリカム(Clostridium histolyticum)、クロストリジウム・インドリス(Clostridium indolis)、クロストリジウム・イノキュム(Clostridium innocuum)、クロストリジウム・イレギュラレ(Clostridium irregulare)、クロストリジウム・レプツム(Clostridium leptum)、クロストリジウム・リモサム(Clostridium limosum)、クロストリジウム・マレノミナツム(Clostridium malenominatum)、クロストリジウム・ノービー(Clostridium novyi)、クロストリジウム・オロチカム(Clostridium oroticum)、クロストリジウム・パラプトリフィカム(Clostridium paraputrificum)、クロストリジウム・ピリフォルメ(Clostridium piliforme)、クロストリジウム・プトレファシエンス(Clostridium putrefasciens)、クロストリジウム・ラモサム(Clostridium ramosum)、クロストリジウム・セプチカム(Clostridium septicum)、クロストリジウム・ソルデリー(Clostridium sordelii)、クロストリジウム・スフェノイデス(Clostridium sphenoides)、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)、クロストリジウム・サブテルミナール(Clostridium subterminale)、クロストリジウム・シンビオサム(Clostridium symbiosum)、クロストリジウム・テルチウム(Clostridium tertium)、大腸菌(Escherichia coli)、エシェリキア・フェルグソニー(Escherichia fergusonii)、エシェリキア・ヘルマニー(Escherichia hermanii)、エシェリキア・ブルネリス(Escherichia vulneris)、エンテロコッカス・アビウム(Enterococcus avium)、エンテロコッカス・カッセリフラブス(Enterococcus casseliflavus)、エンテロコッカス・セコラム(Enterococcus cecorum)、エンテロコッカス・ジスパル(Enterococcus dispar)、エンテロコッカス・デュランス(Enterococcus durans)、エンテロコッカス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・フラベセンス(Enterococcus flavescens)、エンテロコッカス・ガリナラム(Enterococcus gallinarum)、エンテロコッカス・ヒレ(Enterococcus hirae)、エンテロコッカス・マロドラツス(Enterococcus malodoratus)、エンテロコッカス・ムンドティー(Enterococcus mundtii)、エンテロコッカス・シュードアビウム(Enterococcus pseudoavium)、エンテロコッカス・ラッフィノサス(Enterococcus raffinosus)、エンテロコッカス・ソリタルルス(Enterococcus solitarlus)、ヘモフィルス・アエギプチウス(Haemophilus aegyptius)、ヘモフィルス・アプロフィルス(Haemophilus aphrophilus)、ヘモフィルス・パラプロフィルス(Haemophilus paraphrophilus)、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・セグニス(Haemophilus segnis)、ヘモフィルス・デュクレイ(Haemophilus ducreyi)、インフルエンザ菌、クレブシエラ・オルニトリチカ(Klebsiella ornitholytica)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・プランチコラ(Klebsiella planticola)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・オザエネ(Klebsiella ozaenae)、クレブシエラ・テリゲナ(Klebsiella terrigena)、リステリア・イバノビー(Lysteria ivanovii)、リステリア・モノサイトジェネス(Lysteria monocytogenes)、マイコバクテリウム・アブセサス(Mycobacterium abscessus)、マイコバクテリウム・アフリカナム(Mycobacterium africanum)、マイコバクテ���ウム・アルベイ(Mycobacterium alvei)、マイコバクテリウム・アジアティカム(Mycobacterium asiaticum)、マイコバクテリウム・オーラム(Mycobacterium aurum)、マイコバクテリウム・アビウム(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・ボヘミカム(Mycobacterium bohemicum)、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)、マイコバクテリウム・ブランデリ(Mycobacterium branderi)、マイコバクテリウム・ブルメ(Mycobacterium brumae)、マイコバクテリウム・セラタム(Mycobacterium celatum)、マイコバクテリウム・シェロネ(Mycobacterium chelonae)、マイコバクテリウム・チュベンセ(Mycobacterium chubense)、マイコバクテリウム・コンフルエンティス(Mycobacterium confluentis)、マイコバクテリウム・コンスピカム(Mycobacterium conspicuum)、マイコバクテリウム・クッキー(Mycobacterium cookii)、マイコバクテリウム・フラベセンス(Mycobacterium flavescens)、マイコバクテリウム・フォルツイタム(Mycobacterium fortuitum)、マイコバクテリウム・ガディウム(Mycobacterium gadium)、マイコバクテリウム・ガストリ(Mycobacterium gastri)、マイコバクテリウム・ジェナベンセ(Mycobacterium genavense)、マイコバクテリウム・ゴルドネ(Mycobacterium gordonae)、マイコバクテリウム・グッディー(Mycobacterium goodii)、マイコバクテリウム・ヘモフィラム(Mycobacterium haemophilum)、マイコバクテリウム・ハシカム(Mycobacterium hassicum)、マイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・インタージェクタム(Mycobacterium interjectum)、マイコバクテリウム・ヘイデルベレンセ(Mycobacterium heidelberense)、マイコバクテリウム・カンサシー(Mycobacterium kansasii)、マイコバクテリウム・レンチフラバム(Mycobacterium lentiflavum)、ライ菌、マイコバクテリウム・マルモエンセ(Mycobacterium malmoense)、マイコバクテリウム・マリナム(Mycobacterium marinum)、マイコバクテリウム・ミクロゲニカム(Mycobacterium microgenicum)、マイコバクテリウム・ミクロチ(Mycobacterium microti)、マイコバクテリウム・ムコゲニカム(Mycobacterium mucogenicum)、マイコバクテリウム・ネオオーラム(Mycobacterium neoaurum)、マイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(Mycobacterium nonchromogenicum)、マイコバクテリウム・ペレグリナム(Mycobacterium peregrinum)、マイコバクテリウム・フレイ(Mycobacterium phlei)、マイコバクテリウム・スクロフラセウム(Mycobacterium scrofulaceum)、マイコバクテリウム・シモイデイ(Mycobacterium shimoidei)、マイコバクテリウム・シミエ(Mycobacterium simiae)、マイコバクテリウム・スメグマティス(Mycobacterium smegmatis)、マイコバクテリウム・スズルガイ(Mycobacterium szulgai)、マイコバクテリウム・テッレ(Mycobacterium terrae)、マイコバクテリウム・サーモレシスタビル(Mycobacterium thermoresistabile)、マイコバクテリウム・トリプレックス(Mycobacterium triplex)、マイコバクテリウム・トリバイアル(Mycobacterium triviale)、結核菌、マイコバクテリウム・ツシエ(Mycobacterium tusciae)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、マイコバクテリウム・バッセ(Mycobacterium vaccae)、マイコバクテリウム・ウォリンスキー(Mycobacterium wolinskyi)、マイコバクテリウム・ゼノピ(Mycobacterium xenopi)、マイコプラズマ・ブッカル(Mycoplasma buccale)、マイコプラズマ・ファウシウム(Mycoplasma faucium)、マイコプラズマ・ファーメンタンス(Mycoplasma fermentans)、マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium)、マイコプラズマ・ホミニス(Mycoplasma hominis)、���イコプラズマ・リポフィラム(Mycoplasma lipophilum)、マイコプラズマ・オラル(Mycoplasma orale)、マイコプラズマ・ペネトランス(Mycoplasma penetrans)、マイコプラズマ・ピラム(Mycoplasma pirum)、肺炎マイコプラズマ、マイコプラズマ・プリマタム(Mycoplasma primatum)、マイコプラズマ・サリバリウム(Mycoplasma salivarium)、マイコプラズマ・スペルマトフィラム(Mycoplasma spermatophilum)、 緑膿菌、シュードモナス・アルカリゲネス、シュードモナス・クロロラフィス(Pseudomonas chlororaphis)、蛍光菌、シュードモナス・ルテオラ(Pseudomonas luteola)、シュードモナス・メンドシナ(Pseudomonas mendocina)、シュードモナス・モンテイリー(Pseudomonas monteilii)、
シュードモナス・オリジハビタンス(Pseudomonas oryzihabitans)、シュードモナス・ペルトシノゲナ(Pseudomonas pertocinogena)、シュードモナス・シュードアルカリゲネス(Pseudomonas pseudalcaligenes)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・スチュツェリ(Pseudomonas stutzeri)、リケッチア・アフリケ(Rickettsia africae)、リケッチア・アカリ(Rickettsia akari)、リケッチア・オーストラリス(Rickettsia australis)、リケッチア・コノリー(Rickettsia conorii)、リケッチア・フェリス(Rickettsia felis)、リケッチア・ホネイ(Rickettsia honei)、リケッチア・ジャポニカ(Rickettsia japonica)、「リケッチア・モンゴロチモネ(Rickettsia mongolotimonae)」、発疹チフスリケッチア、リケッチア・リケッチエ(Rickettsia Rickettsiae)、リケッチア・シビリカ(Rickettsia sibirica)、リケッチア・スロバカ(Rickettsia slovaca)、リケッチア・チフィ(Rickettsia typhi)、サルモネラ・コレレスイス・コレレスイス、(Salmonella choleraesuis choleraesuis)、サルモネラ・コレレスイス・アリゾネ(Salmonella choleraesuis arizonae)、サルモネラ・コレレスイス・ボンゴリ(Salmonella choleraesuis bongori)、サルモネラ・コレレスイス・ジアリゾネ(Salmonella choleraesuis diarizonae)、サルモネラ・コレレスイス・ホウテネ(Salmonella choleraesuis houtenae)、サルモネラ・コレレスイス・インディカ(Salmonella choleraesuis indica)、サルモネラ・コレレスイス・サラメ(Salmonella choleraesuis salamae)、腸炎菌、チフス菌、ネズミチフス菌、シゲラ・ボイジー(Shigella boydii)、シゲラ・ジセンテリエ(Shigella dysentaeriae)、シゲラ・フレクスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・オーリクラリス(Staphylococcus auricularis)、スタフィロコッカス・カピティス・カピティス(Staphylococcus capitis capitis)、スタフィロコッカス  ｃ．ウレオリティカス(Staphylococcus c. ureolyticus)、スタフィロコッカス・カプレ(Staphylococcus caprae)、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・コーニー・コーニー(Staphylococcus cohnii cohnii)、スタフィロコッカス  ｃ．ウレアリティカス(Staphylococcus c. urealyticus)、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・エクオラム(Staphylococcus equorum)、スタフィロコッカス・ガリナラム(Staphylococcus gallinarum)、スタフィロコッカス・ヘモリティカス(Staphylococcus haemolyticus)、スタフィロコッカス・ホミニス・ホミニス(Staphylococcus hominis hominis)、スタフィロコッカス  ｈ．ノボビオセプティシウス(Staphylococcus h. novobiosepticius)、スタフィロコッカス・ヘイカス(Staphylococcus hyicus)、スタフィロコッカス・インターメディウス(Staphylococcus intermedius)、スタフィロコッカス・ラグジュネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、スタフィロコッカス・パステウリ(Staphylococcus pasteuri)、スタフィロコッカス・サッカロリティカス(Staphylococcus saccharolyticus)、スタフィロコッカス・サプロフフィティカス(Staphylococcus saprophyticus)、スタフィロコッカス・シェレイフェリ・シェレイフェリ(Staphylococcus schleiferi schleiferi)、スタフィロコッカス  ｓ．コアグランス(Staphylococcus s. coagulans)、スタフィロコッカス・シウリ(Staphylococcus sciuri)、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)、スタフィロコッカス・キシロサス(Staphylococcus xylosus)、ストレプトコッカス・アガラクチエ(Streptococcus agalactiae)、ストレプトコッカス・カニス(Streptococcus canis)、ストレプト��ッカス・ジスガラクチエ・ジスガタクチエ(Streptococcus dysgalactiae dysgalactiae)、ストレプトコッカス・ジスガラクチエ・エキシミリス(Streptococcus dysgalactiae equisimilis)、ストレプトコッカス・エキ・エキ(Streptococcus equi equi)、ストレプトコッカス・エキ・ズーエピデミクス(Streptococcus equi zooepidemicus)、ストレプトコッカス・イニエ(Streptococcus iniae)、ストレプトコッカス・ポルシナス(Streptococcus porcinus)、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・アンギノサス(Streptococcus anginosus)、ストレプトコッカス・コンステラツス・コンステラツス(Streptococcus constellatus constellatus)、ストレプトコッカス・コンステラツス・ファリンギジス(Streptococcus constellatus pharyngidis)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mitis)、ストレプトコッカス・オラリス(Streptococcus oralis)、ストレプトコッカス・サンギニス(Streptococcus sanguinis)、ストレプトコッカス・クリスタツス(Streptococcus cristatus)、ストレプトコッカス・ゴルドニー(Streptococcus gordonii)、ストレプトコッカス・パラサンギニス(Streptococcus parasanguinis)、ストレプトコッカス・サリバリウス(Streptococcus salivarius)、ストレプトコッカス・ベスチブラリス(Streptococcus vestibularis)、ストレプトコッカス・クリセチ(Streptococcus criceti)、ミュータンス菌、ストレプトコッカス・ラッチ(Streptococcus ratti)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)、ストレプトコッカス・アシドミニマス(Streptococcus acidominimus)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス・エキナス(Streptococcus equinus)、肺炎連鎖球菌、ストレプトコッカス・スイス(Streptococcus suis)、ビブリオ・アルギノリティクス(Vibrio alginolyticus)、Ｖ．カルチャレ(V, carchariae)、コレラ菌、Ｃ．シンシナティエンシス(C. cincinnatiensis)、ビブリオ・ダムセラ(Vibrio damsela)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、ビブリオ・フルニシー(Vibrio furnissii)、ビブリオ・ホリセ(Vibrio hollisae)、ビブリオ・メチニコビー(Vibrio metschnikovii)、ビブリオ・ミミクス(Vibrio mimicus)、腸炎ビブリオ菌、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ペスト菌、エルシニア・アルドベ(Yersinia aldovae)、エルシニア・ベルコビエリ(Yersinia bercovieri)、エンテロコリチカ菌、エルシニア・フレデリクセニー(Yersinia frederiksenii)、エルシニア・インターメディア(Yersinia intermedia)、エルシニア・クリステンセニー(Yersinia kristensenii)、エルシニア・モラレティー(Yersinia mollaretii)、エルシニア・シュードツベルキュロシス(Yersinia pseudotuberculosis)およびエルシニア・ローデイ(Yersinia rohdei)からなる群から選択される細菌によって起こる。
【０１２９】
本明細書に例示したように、本発明の方法は、前記感染症を患っている（および／または以前に患ったことがある）被験体に由来する免疫グロブリン含有画分を用いて、緑膿菌または結核菌から免疫原性タンパク質を単離するのに有用である。
【０１３０】
あるいは、ウイルス感染症を患っている（または以前に患ったことがある）被験体に由来する／した生体サンプルに由来する免疫グロブリン含有画分は、そのウイルスから免疫原性タンパク質を決定するのに有用である。例えば、被験体は、例えば、アストロウイルス科(Astroviridae)、カリチウイルス科、ピコマウイルス科(Picomaviridae)、トガウイルス科、フラビウイルス科、カロナウイルス科(Caronaviridae)、パラミックスウイルス科(Paramyxviridae)、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、レオウイルス科、ボルナウイルス科(Bornaviridae)、レトロウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ヘパドナウイルス科からなる群から選択される科のウイルス（例えば、コクサッキーＡ−２４ウイルスアデノウイルス１１、アデノウイルス２１、コクサッキーＢウイルス、ボルナ病ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、コロラドダニ熱ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、パラインフルエンザウイルス１、パラインフルエンザウイルス２、パラインフルエンザウイルス３、デングウイルス、エボラウイルス、パルボウイルスＢ１９コクサッキーＡ−１６ウイルス、ＨＳＶ−１、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、コクサッキーＢ１〜Ｂ５、インフルエンザウイルスＡ、ＢまたはＣ、ラクロスウイルス、ラッサ熱ウイルス、麻疹ウイルスコクサッキーＡまたはＢウイルス、エコウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ＨＳＶ−２、流行性耳下腺炎ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ポリオウイルスエンテロウイルス、狂犬病ウイルス、ルビウイルス、痘瘡ウイルス、ＷＥＥウイルス、黄熱病ウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスからなる群から選択されるウイルス)によるウイルス感染症を患っている場合がある。
【０１３１】
あるいは、酵母または真菌感染症を患っている（または以前に患ったことがある）被験体に由来する免疫グロブリン含有画分は、その酵母または真菌に由来する免疫原性タンパク質を決定するのに有用である。例えば、宿主に感染する真菌または酵母は、アスペルギルス種、デルマトフィテス(Dermatophytes)、ブラストミセス・デルマチチジス、カンジダ種、ヒストプラスマ・カプスラーツム、スポロスリックス・シェンキー(Sporothrix schenckii)、ヒストプラスマ・カプスラーツムおよび黒色真菌からなる群から選択される。
【０１３２】
本明細書において、用語「寄生生物」または「寄生虫学的感染」とは、単細胞であるか多細胞であるかにかかわらず、別の生物、例えばヒトに感染できる、ウイルス、細菌、真菌または酵母以外の生物を意味すると取られるものとする。このような寄生生物の例としては、例えば、アンシロストマ・セイラニカム(Ancylostoma ceylanicum)、ズビニ鈎虫、回虫、大腸バランチジウム、ブラストシスチス・ホミニス(Blastocystis hominis)、肝ジストマ、サイクロスポーラ・カイエタネンシス(Cyclospora cayetanensis)、二核アメーバ、広節裂頭条虫、瓜実条虫、エンセファリトゾーン・インテスチナリス(Encephalitozoon intestinalis)、赤痢アメーバ、ヒトギョウチュウ、肝蛭、ヒトギョウチュウ、肝蛭、肥大吸虫、ランブル鞭毛虫(Giardia intestinalis)、（同義語Giardia lamblia)、異形吸虫、縮小条虫、小形条虫、戦争イソスポーラ、横川吸虫、アメリカ鈎虫、ネコ肝吸虫、ウェステルマン肺吸虫、ビルハルツ住血吸虫、シストソマ・インターカラツム(Schistosoma intercalatum)、日本住血吸虫、マンソン住血吸虫、無鈎条虫、鞭虫、バベシア・ディベルゲンス(Babesia divergens)、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ブラジルリーシュマニアおよびドノバンリーシュマニアからなる群から選択される寄生生物が挙げられる。
【０１３３】
本発明はまた、例えば、自己免疫状態に苦しんでいる被験体がそれに対して免疫応答を起こしているタンパク質を同定するのに有用である。「自己免疫状態」とは、被験体の免疫系が、被験体の１種以上の細胞成分、例えば、タンパク質に対して１種以上の特異的抗体を生じていることを意味する。自己免疫状態は自己免疫疾患と、自己免疫応答と関連する疾病または疾患または感染症のそのような態様の双方を包含する。例えば、慢性炎症の場合には、急性臨床増悪を起こしているか、以前に起こしたことがあるＣＦ被験体で観察されるように、被験体の免疫系が、その被験体の炎症性タンパク質に対して特異的抗体を生じることがある。
【０１３４】
本発明は、自己免疫疾患において、被験体がそれに対して自己免疫応答を起こしているタンパク質またはその断片を同定するのに有用である。例えば、本発明は、関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、自己免疫甲状腺疾患、中枢神経系脈管炎、および自己免疫筋炎からなる群から選択される自己免疫疾患を患っている被験体において、免疫原性タンパク質またはその断片を同定するのに有用である。
【０１３５】
さらに、本発明は、前述のように、被験体が疾病の自己免疫要素の際にそれに対して免疫応答を起こしたタンパク質を同定するのに有用である。本明細書に例示したように、このよなアプローチは、炎症状態、例えば、ＣＦ被験体の急性臨床増悪を起こしている被験体から、被験体がそれに対して自己免疫応答を起こしている免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。
【０１３６】
本明細書において、用語「炎症状態」とは、被験体のある部分の機能の見た目の１以上の変化、例えば、透過性および血流の増加を伴う血管の拡張、液体（例えば、血漿タンパク質）の滲出、白血球浸潤、腫脹および／または機能喪失などを特徴とする状態を意味すると理解されるものとする。さらに、炎症状態は化学物質、例えば、ヒスタミン、ブラジキニン、セロトニン、炎症性サイトカインおよび血管が炎症性組織中に液体を漏出させるようにし、その結果局所腫脹をもたらすその他のものなどの放出と関連する。一実施例では、炎症状態は肺の炎症状態である。
【０１３７】
本明細書において、用語「急性臨床増悪」、「急性増悪」、「臨床増悪」、「増悪」、または「増悪状態」は、ＣＦ患者との関連では、ＣＦの肺の症状の悪化を意味すると理解されるものとする。
【０１３８】
本発明のさらなる適用では、本方法を用いて癌を患っている被験体に由来する免疫原性タンパク質を決定する。癌細胞はいくつかのタンパク質またはタンパク質の断片を異常に発現する。したがって、このような異常に発現されたタンパク質または断片に対して抗体応答が起こることが多い。本発明の方法を用いて、癌の診断および／または治療マーカーが同定される。例えば、本発明は、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭頚部癌、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、非小細胞肺癌、卵巣癌、前立腺癌、急性リンパ性白血病、成人急性骨髄性白血病、成人非ホジキンスリンパ腫、脳腫瘍、子宮頸癌、小児肉腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、食道癌、ヘアリー細胞白血病、腎臓癌、肝臓癌、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、膵臓癌、中枢神経系原発リンパ腫、皮膚癌および小細胞肺癌からなる群から選択される癌に由来する免疫原性タンパク質を決定するのに有用である。
【０１３９】
本発明の一実施例は、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなる、１種以上の細胞またはその抽出物で被験体を免疫し、それによって免疫原性タンパク質またはその断片に対する免疫応答を誘発することをさらに含んでなる。この方法は、例えば、感染性生物に由来する免疫原性タンパク質を決定するのに有用である。例えば、被験体を感染性生物のサンプル（例えば、生存しているか死亡しているかにかかわらない生物自身、または生物に由来する抽出物、例えば、タンパク質抽出物）で免疫する。次いで、この被験体に前記サンプルに対する免疫応答を十分な時間生じさせ、本発明の方法を実施して免疫原性タンパク質を同定する。
【０１４０】
当業者には明らかであろうが、サンプルは、サンプルに対する免疫応答レベルを増強する化合物、例えば、アジュバントの存在下で投与してもよい。アジュバントは当技術分野では公知であり、例えば、フロイント完全または不完全アジュバント、リゾレシチンまたはジニトロフェノールが挙げられる。
【０１４１】
例えば、被験体をウイルス細胞、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞および寄生生物由来の細胞からなる群から選択される１種以上の細胞で免疫する。適した細胞抽出物は、例えば、ウイルスの抽出物、細菌の抽出物、酵母の抽出物、および真菌の抽出物および寄生生物の抽出物またはその混合物からなる群から選択される。このような感染性生物の実施例は本明細書に記載されている。例えば、本発明者らは、ニワトリをマイコバクテリウム（すなわち、結核菌）の抽出物で免疫することによって、ニワトリが産んだ卵中に、その生物に由来するタンパク質に対する特異的抗体が生じることを実証した。
【０１４２】
本発明の別の形態では、被験体を、例えば、癌細胞で免疫する。
【０１４３】
免疫グロブリン含有画分の獲得
本発明の方法は、被験体から、および／または被験体に由来するか被験体によって産生された生体サンプルから、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分得ることを含んでなる。例えば、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、被験体に由来するか被験体によって産生されたサンプルを分離または精製することを含んでなり、それによって前記タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が得られるプロセスによって得る。
【０１４４】
被験体に由来するか被験体によって産生されたサンプルを分離または精製し、それによって免疫グロブリン含有画分を得る方法は、当技術分野では公知であり、例えば、エタノール、ポリエチレングリコール、硫酸アンモニウムおよびリン酸カリウムといった離液性(抗カオトロピック）塩を用いる沈殿が挙げられる。
【０１４５】
あるいは、またはさらに、本質的には、ビュルヌフ(Burnouf)およびラドセビッチ(Radosevich)、ジャーナル・オブ・バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・メソッヅ(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)、４９（１〜３）、５７３〜８６頁、２００１に記載されたように、イオン交換クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーによって免疫グロブリン含有画分を生体サンプルから単離または精製する。
【０１４６】
免疫グロブリン含有画分の単離または精製を容易にする方法は、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することを含んでなる。
【０１４７】
本発明の方法を実施するために必須ではないものの、固体支持体、マトリックス、または樹脂、例えば、セルロースビーズ、アガロース、ナイロン、磁性粒子、常磁性粒子およびポリマー樹脂からなる群から選択される固体支持体、マトリックス、または樹脂などの上に事前に固定化されている１種以上の化合物により、免疫グロブリン含有画分を得ることが容易になる。このような固定化された化合物によって、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分のより迅速な単離が容易になり、固体支持体を洗浄して、生体サンプルの、非特異的に結合しているか、結合していない成分、例えば、タンパク質を除去することが可能となる。
【０１４８】
例えば、本質的には、例えば、ドールガスト(Doellgast)およびプラウト(Plout)、イムノケミストリー、１３（２）、１３５〜１３９頁、１９７６に記載されたように、疎水性クロマトグラフィーによって免疫グロブリン含有画分を生体サンプルから単離または精製する。このような方法には、離液性塩の存在下で免疫グロブリンと結合するマトリックスを利用する。離液性塩を被験体に由来する生体サンプル加え、このサンプルを前記マトリックスと接触させる。次いで、サンプル中の離液性塩の濃度を段階的に下げることによって前記マトリックスから免疫グロブリンを放出させる。
【０１４９】
本質的には、ポラス(Porath)ら、ＦＥＢＳレターズ(FEBS Letters)、１８５、３０６頁、１９８５およびクヌーセン(Knudsen)ら、アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)、２０１、１７０頁、１９９２に記載されたようなチオフィリック吸着クロマトグラフィーも、免疫グロブリン含有画分を生体サンプルから単離するのに有用である。この方法は、遊離メルカプト基を含んでなる１以上のリガンドが結合されているジビニルスルホン活性化アガロースの使用を本質的に含んでなる。これらのリガンドは、硫酸カリウムの存在下で免疫グロブリンと特異的に結合する。このようなリガンドとしては、例えば、２−メルカプトピリジン、２−メルカプトピリミジンおよび２−メルカプトチアゾリンが挙げられる。再度、サンプル中の離液性塩（すなわち、硫酸カリウム）の濃度を下げることによってリガンドから免疫グロブリンを放出させる。
【０１５０】
チオフィリック樹脂は、例えば、ＢＤバイオサイエンシズ(Biosciences)から市販されている。このようなチオフィリック樹脂の使用では、免疫グロブリン含有サンプルを、例えば、硫酸カリウム、硫酸ナトリウムおよび／または硫酸アンモニウムといった塩と混合する。次いで、サンプルを、サンプル中の免疫グロブリンの結合に十分な条件下で一定時間チオフィチック樹脂と接触させる。サンプルを場合によっては洗浄して、結合していないか非特異的に結合しているタンパク質を除去し、低濃度の塩で溶出することによって免疫グロブリンを樹脂から単離する。チオフィリック樹脂により、例えば、重力流精製またはバッチ流精製による免疫グロブリンの精製が可能となる。
【０１５１】
例えば、米国特許第６，４９８，０１６号に記載されたものなどのマトリックスも、免疫グロブリン含有画分を生体サンプルから単離するのに有用である。このようなマトリックスは、固相骨格、例えば、セルロース、アガロース、デキストランベースのビーズまたは有機ポリマーなど、場合によっては、スペーサーエレメント、および芳香族基またはヘテロ芳香族基、好ましくは、ヘテロ芳香族環系と縮合したベンゼン環を含んでなるリガンドを含んでなる。このようなマトリックは、離液性塩の使用を必要とせず、むしろ中性条件下で免疫グロブリンと結合できる。当技術分野で公知の条件、例えば、マトリックスの低ｐＨのバッファー、例えば、グリシン、ｐＨ３での洗浄などを用いて、免疫グロブリンをこのようなマトリックスから溶出するか解離させる。
【０１５２】
組換えまたは合成タンパク質またはペプチドリガンドも、免疫グロブリン含有画分を単離するのに有用である。このようなリガンドは当技術分野では公知であり、例えば、ンゴ(Ngo)およびカッター(Khatter)、アプライド・バイオケミストリー・アンド・バイオテクノロジー(Applied Biochemistry and Biotechnology)３０：１１１〜１１９頁、１９９９、ベルドリバ(Verdoliva)ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ(Journal of Immunological Methods)２７１：７７〜８８頁、２００２またはカビール(Kabir)、イムノロジカル・インベスティゲーションズ(Immunological Investigations)、３１：２６３〜２７８頁、２００２に記載されている。
【０１５３】
あるいは、またはさらに、カプティブ(Kaptive)−Ｍ（商標）−セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって免疫グロブリン含有画分を他の成分と分離する。当業者ならば、ＩｇＭは、その有効成分がＩｇＭと結合するペプチドミメティック化合物であるカプティブ−Ｍと結合するということは承知している。したがって、この方法を用いることで、ＩｇＭとＩｇＭによって結合されている免疫原性タンパク質とを含んでなる画分が単離される。
【０１５４】
あるいは、ＭＢＰ−セファロースを用いる。当業者ならば、ＭＢＰがＩｇＭ  Ｆｃ５μ領域上に存在し、結果としてＩｇＭに特異的であるマンノース残基と結合することは承知している。結合の最初のステップは、何らかのタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、抗体に結合しているＭＢＰ、あるいはまたはさらに、抗体−抗原相互作用）を乱さないよう天然条件下で実施する。ＩｇＭと抗原性タンパク質を、抗体と免疫原性タンパク質を結合していない成分として放出する解離バッファー、例えば、高塩濃度を含んでなるバッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２中の３Ｍ  ＭｇＣｌ2）などを用いてアフィニティーマトリックスから溶出する。
【０１５５】
あるいは、本質的には、スチュアート(Stewart)ら、ボックス・サンギニス(Vox Sanguinis)、８３：３３２〜３３８頁、２００２に記載されたように、免疫グロブリン含有画分、例えば、免疫グロブリンＧ画分を生体サンプルから単離する。この方法は、本質的には、分子量および電荷に基づいてタンパク質を単離するメンブランベースの分取電気泳動技術である。サイズ排除のためにさまざまな孔サイズのポリアクリルアミドメンブランを用い、さらに電気泳動バッファーのｐＨによりタンパク質がそのｐＩに応じて荷電される。この方法を用いることで、免疫グロブリンが１ステップまたは２ステッププロセスで単離される。この方法により、免疫グロブリン含有画分を単離するために多量の生体サンプルを処理することが可能となる。
【０１５６】
免疫グロブリン含有画分と結合可能な１種以上の合成リガンドを含んでなるクロマトグラフィー媒体、例えば、アルファ(Alpha)（商標）ミックスド−モードクロマトグラフィー媒体（リゴケム社(LigoChem Inc.)、フェアフィールド、ニュージャージー州）またはリゴセプ(LigoSep)（登録商標）ＨＴＬＣクロマトグラフィー媒体（リゴケム）なども、免疫グロブリン含有画分のアフィニティー精製に有用である。
【０１５７】
当業者には明らかであろうが、色素リガンドも、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリン含有タンパク質複合体の精製に有用である。このような色素リガンドおよびその使用方法は、例えば、クロニス(Clonis)ら編、リアクティブ・ダイズ・イン・プロテイン・アンド・エンザイム・テクノロジー(Reactive Dyes in Protein and Enzyme Technology)、ロンドン、マクミラン・プレス(MacMillan Press)、１９８７中のクロニスに記載されている。
【０１５８】
ＩｇＹは、例えば、キット、例えば、アフィランド(Afiland)(ベルギー)またはピエルス(Pierce)（イリノイ州、ロックフォード）から入手できるキットを用いて精製する。このようなキットは、ＩｇＹ画分を卵またはその誘導体またはその抽出物、例えば、卵黄から単離するのに有用であることが好ましい。あるいは、チオフィリック樹脂がＩｇＹ含有画分を卵またはその誘導体またはその抽出物から単離するのに有用である。
【０１５９】
本明細書に例示したように、タンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌは、免疫グロブリン含有画分を単離するのに有用である。タンパク質Ｇを用いて、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を単離する方法は当技術分野では公知であり、例えば、ビョルク(Bjorck)およびロンバル(Kronvall)、ジャーナル・オブ・イムノロジー(Journal of Immunology)３３（２）、９６９〜９７４頁、１９８４に記載されている。タンパク質Ａを用いて、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を単離する方法は、当技術分野では公知であり、例えば、イェルム(Hjelm)ら、ＦＥＢＳレターズ２８（１）、７３〜７６頁、１９７２に記載されている。タンパク質Ｌを用いて、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を単離する方法は、当技術分野では公知であり、例えば、アケルストロム(Akerstrom)およびビョルク、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological chemistry)２６４（３３）１９７４０〜１９７４６頁、１９８９に記載されている。
【０１６０】
免疫グロブリン含有画分は、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、例えば、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ｌと結合しているマトリックス、固体支持体、または樹脂、例えば、タンパク質Ａ−セファロースおよび／またはタンパク質Ｇ−セファロースおよび／またはタンパク質Ｌセファロース(これらの各々は、アマシャム・ファルマシア(Amersham Pharmacia)から入手可能である)あるいはタンパク質Ｇアガロースおよび／またはタンパク質Ａアガロースおよび／またはタンパク質Ｌアガロース（これらの各々は、シグマ・アルドリッチ(Sigma Aldrich)から入手可能である）あるいはタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａに磁性ビーズを結合させたもの（ニュー・イングランド・バイオラブズ(New England Biolabs)から入手可能）を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。結合の最初のステップは、何らかのタンパク質−タンパク質相互作用（例えば、抗体と結合しているタンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ、次いで、これが免疫原性タンパク質と結合する）を乱さないよう天然条件下で実施する。マトリックスは場合によって洗浄して何らかの結合していないか非特異的に結合しているタンパク質を除去する。抗体は、抗体を結合していない成分として放出する解離バッファー、例えば、高塩濃度を含んでなるバッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２中の３Ｍ  ＭｇＣｌ2）などを用いて、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇまたはタンパク質Ｌから溶出する。
【０１６１】
本明細書に例示したように、タンパク質Ｇまたはタンパク質Ａを用いて免疫グロブリン含有画分を単離する。
【０１６２】
本明細書において、用語「タンパク質Ｇ」は、タンパク質Ｇの１以上の天然ＩｇＧ結合ドメインを含んでなるタンパク質、天然のもしくは天然に存在するタンパク質ＧのＩｇＧ結合ドメインを含んでなるハイブリッドもしくは融合タンパク質、または天然のタンパク質ＧのＩｇＧと結合する能力を保持する、天然のもしくは天然に存在するタンパク質Ｇの突然変異体もしくは変異体、または天然のタンパク質ＧのＩｇＧと結合する能力を保持する、天然もしくは天然に存在するタンパク質Ｇの断片を含むと取られるものとする。例示目的で、ストレプトコッカスのタンパク質Ｇのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【０１６３】
タンパク質Ｇの例示的形態はストレプトコッカス種、ランスフィールド(Lancefield)群Ｇに由来する。このタンパク質の分子量は約２３ｋＤａである。タンパク質Ｇは、種々の種、例えば、ヒトおよびマウスなどに由来するＩｇＧのＦｃ部分と結合することが好ましい。
【０１６４】
本明細書において、用語「タンパク質Ａ」は、タンパク質Ａの１以上の天然ＩｇＧ結合ドメインを含んでなるタンパク質、天然のもしくは天然に存在するタンパク質ＡのＩｇＧ結合ドメインを含んでなるハイブリッドもしくは融合タンパク質、または天然のタンパク質ＡのＩｇＧと結合する能力を保持する、天然のもしくは天然に存在するタンパク質Ａの突然変異体もしくは変異体、または天然のタンパク質ＡのＩｇＧと結合する能力を保持する、天然もしくは天然に存在するタンパク質Ａの断片を含むと取られるものとする。例示目的で、黄色ブドウ球菌のタンパク質Ａのアミノ酸配列を配列番号２に示す。
【０１６５】
例えば、タンパク質Ａは、およそ５つの相同ＩｇＧ結合ドメインを含んでなり、各々は約６０個のアミノ酸からなる。タンパク質Ａの例示的形態は約５．１の等電点を有する。
【０１６６】
一実施例では、タンパク質Ａは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域と結合できる。
【０１６７】
好ましいタンパク質Ａは、ウサギ、ブタ、マウス、ラット、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ネコ、イヌ、ヒトＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４および／またはＩｇＭおよび／またはＩｇＡおよび／またはＩｇＥと結合できる。
【０１６８】
本明細書において、用語「タンパク質Ｌ」は、タンパク質Ｌの１以上の天然抗体軽鎖結合ドメインを含んでなるタンパク質、天然のもしくは天然に存在するタンパク質Ｌの抗体軽鎖結合ドメインを含んでなるハイブリッドもしくは融合タンパク質、または天然のタンパク質Ｌの抗体軽鎖と結合する能力を保持する、天然のもしくは天然に存在するタンパク質Ｌの突然変異体もしくは変異体、または天然のタンパク質Ｌの抗体軽鎖と結合する能力を保持する、天然もしくは天然に存在するタンパク質Ｌの断片を含むと取られるものとする。例示的タンパク質Ｌを配列番号３に示す。
【０１６９】
例示的タンパク質Ｌはペプトストレプトコッカス・マグナス(peptostreptococcus magnus)に由来する。このようなタンパク質の分子量は、約３６ｋＤａであり、４つの免疫グロブリン結合ドメインを含む。このような例示的タンパク質Ｌは、主として免疫グロブリンκ軽鎖と結合する。
【０１７０】
本明細書に記載されるタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌは、商業的供給源から得るか、あるいは、従来法によって製造する。商業的供給源は当業者には公知であろう。
【０１７１】
例えば、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌはアマシャム・ファルマシア、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、キャッスルヒルから入手できる。
【０１７２】
あるいは、タンパク質Ｇまたはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｌはそれぞれ、米国特許第４，９４５，１５７号、同６，５５５，６６１号または同４，８７６，１９４号に記載された方法を用いて単離する。あるいは、組換えタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌは、例えば、サムブロック(Sambrook)ら（モレキュラー・クロニング(Molecular Cloning)：ア・ラボラトリー・マニュアル(A Laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ(Cold Spring Harbor Laboratories)、ニューヨーク、第２版（１９８９）、Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ全巻中）に記載されるような当技術分野で公知の技術を用いて作製する。例えば、組換えタンパク質Ｇは、米国特許第５，０８２，７７３号に記載された方法を用いて作製できる。
【０１７３】
当業者には明らかであろうが、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌを固体支持体、樹脂またはマトリックスに付着させることにより、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンまたはその混合物を含んでなるタンパク質複合体のアフィニティー精製が容易になる。タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌの付着に適した固体支持体、樹脂またはマトリックスとしては、例えば、遊離またはエステル化型のいずれかの、１以上のヒドロキシル基を含むポリマー、例えば、アガロース、セルロースエステル（例えば、硝酸セルロース、ジアゾセルロース、酢酸セルロースおよびプロピオン酸セルロース）をはじめとするセルロース、またはアクリルアミドポリマーまたはコポリマー（例えば、ポリアクリルアミドまたはアクリルアミド）など、マイクロタイタープレート、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アガー、デンプン、あるいはタンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌを固定化できる活性化剤の残基と化学的に結合している、疎水性の、微多孔の、皮のない、ポリアミドメンブレンを含んでなる表面積の大きい化学的に活性なメンブレンからなる群から選択される固相支持体が挙げられる。
【０１７４】
タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌは、当業者に公知の方法に従って、固体支持体、樹脂またはマトリックス上に固定化する。例えば、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌを共有結合によってか吸着によってのいずれかで固相にコートするか、結合させる。タンパク質を固相支持体に固定化する方法は、例えば、米国特許第３，６５２，７６１号、同３，８７９，２６２号、同３，９８６，２１７号および同４，６９３，９８５号に教示されている。例えば、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌをトレシル活性化したか臭化シアン活性化したアガロースまたはマレイミド活性化したアガロース支持体に固定化する。この支持体は、例えば、修飾されるアガロース（特に、ＡＨセファロース、ファルマシア社(Pharmacia Co.)）を一級アミノ基を含むよう、スルホスクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレートを用いて処理することによって調製する。
【０１７５】
固定化したタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌは、免疫グロブリンのアフィニティー精製にとって有用である。アフィニティー精製技術は当技術分野では公知であり、例えば、スコープス(Scopes)（プロテイン・プリフィケーション：プリンシプルス・アンド・プラクティス(Protein purification:principles and practice)、第３版、スプリンガー・ベルラグ(Springer Verlag)、１９９４中）に記載されている。アフィニティー精製法は、通常、被験体から単離した生体サンプルまたは被験体に由来するか被験体によって産生されたサンプルを、固定化したタンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌと接触させることと、（場合によっては）続いて、洗浄して何らかの結合していないか非特異的に結合しているタンパク質を除去することと、タンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌと結合している免疫グロブリンを溶出することとを含む。
【０１７６】
あるいは、タンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌを、例えば、ビオチンなどの分子へ共有結合させる。したがって、このような結合しているタンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌが関与するアフィニティー精製法では、例えば、固体支持体に結合させてあるストレプトアビジンを用いて、結合しているタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌを結合または捕獲する。
【０１７７】
あるいは、タンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌを、例えば、ダイナビーズ(Dynabead)（登録商標）（ダイナル・バイオテック(Dynal Biotech)、ノルウェー、オスロから入手可能）などの磁性または常磁性ビーズに共有結合させる。被験体に由来するか被験体によって産生される生体サンプルを、このような結合しているタンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌと接触させ、続いて、サンプルを磁場または常磁場に曝すことによって、免疫グロブリン画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を単離する。
【０１７８】
あるいは、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌを被験体に由来する生体サンプルと、前記タンパク質Ｇ、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌが免疫グロブリン含有画分と結合するのを可能にする条件下で一定時間接触させる。次いで、このサンプルをタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌと特異的に結合する抗体と接触させる。この抗体は、固体支持体または生体サンプルからのタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌの単離を容易にする別の手段、例えば、アガロース、プラスチック製固体支持体またはガラス製固体支持体などと結合していることが好ましい。タンパク質Ｇまたはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｌと特異的に結合するポリクローナル抗体は、例えば、サファイア・バイオサイエンス(Sapphire Bioscience)、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、クロウズ・ネストから入手できる。
【０１７９】
タンパク質Ｇまたはタンパク質Ａまたはタンパク質Ｌのミメティックもまた、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分を単離するのに有用である。このようなミメティックは当技術分野では公知であり、かつ／または例えば、カビール(Kabir)、イムノロジカル・インベスティゲーションズ(Immunological Investigations)；３１、２６３〜７８頁、２００２またはダウド(Dowd)ら、ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)１６：１９０〜５頁、１９９８に記載されている。例えば、タンパク質Ａのペプチドミメティックはアミノ酸配列ＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲ（配列番号４）またはＲＴＹＲＴＹＲＴＹＲＴＹＫＫＫＧ（配列番号５）を含んでなる。
【０１８０】
あるいは、免疫原性タンパク質は、タンパク質チップを用いて生体サンプルから得る。このようなタンパク質チップを作製するには、注目する免疫グロブリンと結合できるタンパク質、例えば、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｌなどを、固体支持体、例えば、ガラス、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスチレン、酸化ケイ素、金属または窒化ケイ素などに結合させる。この固定化は直接（例えば、共有結合、例えば、シッフ塩基形成、ジスルフィド結合またはアミドもしくは尿素結合形成などによって）または間接のいずれかである。タンパク質チップを作製する方法は当技術分野では公知であり、例えば、米国特許出願第２００２０１３６８２１号、同２００２０１９２６５４号、同２００２０１０２６１７号および米国特許第６，３９１，６２５号に記載されている。タンパク質を固体支持体に結合させるには、固体支持体を、表面に化学反応基が生じるよう、例えば、アルデヒド含有シラン試薬などを用いて処理する必要があることが多い。あるいは、アレンコブ(Arenkov)ら、アナリティカル・バイオケミストリー(Analitical Biochemistry)２７８：１２３〜１３１頁、２０００に記載されるように、注目する免疫グロブリンと結合できるタンパク質を微細加工したポリアクリルアミドゲルパッド上に捕獲し、顕微鏡電気泳動を用いてゲル中へ加速させることもできる。
【０１８１】
免疫グロブリン含有画分の免疫グロブリン結合性化合物への結合
一形態では、本発明の方法は、免疫グロブリン含有画分、または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を、免疫グロブリンを結合するために用いる化合物に結合させることをさらに含んでなる。
【０１８２】
免疫グロブリン含有画分を化合物に結合させる手段はヒドラジドを用いることによる。このような方法は、本質的には、オシャネシー(O'Shannessy)およびホフマン(Hoffmann)、バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー(Biotechnology and Applied Biochemistry)９（６）、４８８〜４９６頁、１９８７に記載されたように実施する。本質的には、この方法は、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載された方法を用いて免疫グロブリンを単離することと、その免疫グロブリンを過ヨウ素酸ナトリウムで酸化することとを含んでなる。この酸化によって、いずれかのオリゴ糖部分にアルデヒドが形成される。次いで、酸化されたサンプルをヒドラジド誘導体化した固体支持体と接触させる。これによって、酸化された免疫グロブリンと前記固体支持体の間に安定なヒドラゾン結合が形成される。適した固体支持体としては、例えば、アガロース、ガラスビーズ、またはポリスチレン、ポリプロピレンもしくはポリカーボネートビーズまたはマイクロタイタープレートが挙げられる。ヒドラゾン結合は低ｐＨ範囲でさえも安定であるので、このような方法によって、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載した方法によって免疫グロブリン含有画分から免疫原性タンパク質を解離させることが可能となる。
【０１８３】
本発明の方法の一例示的形態では、免疫グロブリン含有画分またはタンパク質複合体を、免疫グロブリンと結合する化合物に結合させることは、架橋剤を、結合している免疫グロブリンを有する１種以上の化合物と、化合物と免疫グロブリン間に共有結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させることを含んでなる。
【０１８４】
例えば、光反応性架橋試薬を用いて免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質またはその免疫グロブリン含有画分を免疫グロブリン結合性化合物に結合させる。このような光反応性架橋試薬としては、例えば、アリールアジド（照明すると、アリールアジドが、求核基と結合を形成する反応性中間体を生じる）、フッ化アリールアジド（ＵＶ光分解時に反応性ナイトレンを生じる）またはベンゾフェノン誘導体が挙げられる。例えば、適した光反応性架橋試薬は、Ｎ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド（ＰＥＡＳ）、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロベンジルアミン、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸の反応性誘導体、ベンゾフェノンマレイミドおよびベンゾフェノンイソチオシアネートからなる群から選択される。光反応性架橋試薬を添加した後、サンプルにＵＶ光を、免疫グロブリン結合性化合物とそれに結合される免疫グロブリン画分間に結合が形成するのに十分な条件下で一定時間曝露させる。
【０１８５】
あるいは、適した架橋剤は、例えば、イミドエステル架橋剤、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド架橋剤、マレイミド架橋剤、ハロアセチル架橋剤、ヒドラジド架橋剤、およびカルボジイミド架橋剤からなる群から選択される。
【０１８６】
例えば、イミドエステル架橋剤はアルカリ性ｐＨでアミン基と反応し、アミジン結合の形成をもたらす。ホモ二官能基型イミドエステルは、架橋後にタンパク質の正味の電荷が維持されるのでタンパク質を架橋するのに有用である。適したイミドエステル架橋剤は、ジメチルアジピミデート−２−ＨＣｌ（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート−ＨＣｌ（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート−２ＨＣｌ（ＤＭＳ）およびジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート−２ＨＣｌ（ＤＴＢＰ）からなる群から選択される。
【０１８７】
マレイミドもまた、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を免疫グロブリン結合性化合物と架橋するのに有用である。マレイミドは、ほぼ中性のｐＨでスルフィドリル基と特異的に反応する。しかし、マレイミドはまた、スルフィドリル基とよりも低速ではあるが、アミン基とも反応する。マレイミドは反応したスルフィドリル基とともに、通常の生理条件下では切断され得ない安定なチオエステル結合を形成する。適したマレイミド架橋剤の例は、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−ｌ−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＢＰ）、スルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（スルホ−ＳＭＢＰ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）およびスルホ−Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）からなる群から選択される。
【０１８８】
あるいは、またはさらに、ハロアセチル架橋剤を用いて、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を免疫グロブリン結合性化合物と架橋する。よく用いられるα−ハロアセチル架橋剤の大部分は、ヨードアセチル基を含んでなる。生理的ｐＨではこのようなヨードアセチル基のスルフィドリル基との反応は、ヨウ素のチオールでの求核置換によって進行し、これによって安定なチオエステル結合が生じる。本発明の方法に適したハロアセチル架橋剤としては、例えば、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）またはスルホ−Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）が挙げられる。
【０１８９】
免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を、免疫グロブリン結合性化合物と架橋するのに有用なピリジルジスルフィド架橋剤は、例えば、１，４−ジ−［３’−２’−ピリジルジチオ−（プロピオンアミド）ブタン］（ＤＰＤＰＢ）、４−スクシンイミジル−オキシカルボニル−ａ−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、スルホスクシンイミジル−６−［ａ−メチル−ａ（２−ピリジルジチオ）トルアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ）、Ｎ−スクシンイミジル−（ピロジルジチオ）−プロピオネート、スクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル６−［３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）および３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオニルヒドラジド（ＰＤＰＨ）からなる群から選択される。ピリジルジスルフィドは、ジスルフィド結合を得るのに中性ｐＨを使用できるが、弱酸性のｐＨ（例えば、約ｐＨ４〜ｐＨ５の間）で脂肪族チオールと反応する。
【０１９０】
カルボジイミド架橋剤もまた、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を免疫グロブリン結合性化合物と架橋するのに有用である。カルボジイミドはカルボキシルを一級アミンまたはヒドラジドとカップリングし、これによってアミドまたはヒドラゾン結合が形成される。カルボジイミドは、多数の他の架橋試薬とは異なり、カップリングされる分子間に架橋を形成しない。適したカルボジイミド架橋剤の例は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）、Ｎ，Ｎ’ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および４−（ｐ−アジドサリチルアミド）−ブチルアミンからなる群から選択される。
【０１９１】
本明細書に例示したように、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）架橋剤は、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンを含んでなるタンパク質複合体を免疫グロブリン結合性化合物と結合させるのに有用である。ＮＨＳ架橋剤は通常、一級アミン、例えば、タンパク質のＮ末端のα−アミン基などと相互作用するが、ε−アミンもまたＮＨＳエステルと相互作用する。ＮＨＳ架橋剤が一級アミンと相互作用するか反応してＮ−ヒドロキシスクシンイミドを放出する場合には、共有アミド結合が形成される。例示目的で、適したＮＨＳ架橋剤は、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、スベリン酸ビス（スルホスクシンイミジル）（ＢＳ3）、ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＳＰ）、３，３’−ジチオビス（プロピオン酸スクシンイミジル）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコビス（コハク酸スクシンイミジル）（ＥＧＳ）、エチレングリコビス（コハク酸スルホスクシンイミジル）（スルホ−ＥＧＳ）、ジスクシンイミジルタルタレート（ＤＳＴ）、ジスルホスクシンイミジルタルタレート（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシ−カルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＢＰ）、スルホ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（スルホ−ＳＭＢＰ）、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）、Ｎ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）およびＮ−（ｇ−マレイミドブチリルオキシ）スルホスクシンイミドエステル（スルホ−ＧＭＢＳ）からなる群から選択される。
【０１９２】
本明細書に例示したように、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）は、免疫グロブリン含有タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を免疫グロブリン結合性化合物、例えば、タンパク質Ｇと架橋するのに有用である。例えば、免疫グロブリン含有画分を被験体に由来する生体サンプル（例えば、血清）から、例えば、タンパク質Ｇセファロースを用いて単離する。次いで、免疫グロブリン含有画分が結合しているタンパク質Ｇを適量のＤＳＳと、タンパク質Ｇと免疫グロブリン含有画分間にアミド結合が形成する条件下で一定時間接触させることによって、結合している免疫グロブリン含有画分をタンパク質Ｇと架橋する。
【０１９３】
免疫原性タンパク質の免疫グロブリンからの分離
免疫原性タンパク質またはその断片を同定するので、本発明の一形態では、前記免疫原性タンパク質またはその断片を、抗原抗体相互作用によって結合されている免疫グロブリン含有画分から分離することが望まれる。例えば、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分を、抗原抗体相互作用を乱す化合物と、抗原抗体相互作用を乱すのに十分な条件下で一定時間接触させることによって、免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から分離する。
【０１９４】
例えば、免疫原性タンパク質を、結合している免疫グロブリンから解離させ、次いで、さらに解析する。免疫原性タンパク質は、免疫グロブリンによってもはや結合されない、すなわち、免疫グロブリンが免疫原性タンパク質またはその断片と非共有結合（前記のような）を形成しない場合に、その免疫グロブリンから解離されていると考えられる。タンパク質を免疫グロブリン（例えば、抗体）から分離する方法は、当技術分野では公知であり、例えば、スコープス(Scopes)（プロテイン・プリフィケーション：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、第３版、スプリンガー・ベルラグ、１９９４中）に記載されている。例えば、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を含んでなるサンプルのｐＨを変更または改変することによって、免疫原性タンパク質を前記免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から分離する。前記サンプルのｐＨは、例えば、グリシン（例えば、ｐＨが約３である）またはトリエタノールアミン（ｐＨが約１１である）を用いて変更する。
【０１９５】
あるいは、またはさらに、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を含んでなるサンプルの塩濃度を高めることによって（例えば、５Ｍ塩化リチウムを用いて）、免疫原性タンパク質を免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から分離する。
【０１９６】
免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を含んでなるサンプルをイオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で、および／または解離剤（例えば尿素）で、および／またはカオトロピック剤（例えばチオシアネート）で処理することによって、免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から分離する。
【０１９７】
当業者には明らかであろうが、このような方法の組合せもまた、免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から分離するのに有用である。
【０１９８】
本発明の例示的一形態では、免疫原性タンパク質を、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から、前記免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体と結合している前記免疫原性タンパク質を含んでなるサンプルのｐＨをグリシンで下げることによって解離する。例えば、グリシンは約１．５〜約４のｐＨであり、約１．９のｐＨ〜約２．７のｐＨがより好ましく、約２．３のｐＨ〜約２．７のｐＨが最も好ましい。
【０１９９】
あるいは、カプリル酸と硫酸アンモニウム沈殿を用いて、免疫原性タンパク質を免疫グロブリン含有画分から単離または解離する。このような試薬を用いることによって、免疫グロブリンまたは免疫原性タンパク質を本質的に含んでなる調製物が得られる。
【０２００】
免疫グロブリン含有画分を溶解バッファー、例えば、高塩バッファー（例えば、３Ｍ  ＭｇＣｌ2／ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２）などに溶解させることによって、免疫原性タンパク質またはその断片が結合していない成分として放出される。次いで、免疫原性タンパク質画分および免疫グロブリン含有画分を、例えば、免疫グロブリン成分を結合していない成分として維持するために、溶出剤として、例えば、解離バッファーを用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって分離する。
【０２０１】
あるいは、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を、変性条件下でフリーフロー電気泳動に付す。生体サンプルを清澄化し、免疫グロブリンを溶液中に残す条件下でタンパク質を沈殿させる。次いで、例えば、本質的には、ホフマン(Hoffman)ら、プロテオミクス(Proteomics)１、８０７〜８１８頁、２００１に記載されたように、免疫グロブリン含有画分を沈殿させ、適したバッファーに再溶解させ、連続溶液相等電点電気泳動法によって分離するためのフリーフロー電気泳動（FFE）装置（例えば、オクトパス(Octopus)（商標）、テカン(Tecan)（商標））にアプライする。例えば、免疫原性タンパク質またはその断片に対応する画分を得、ＰＤ−１０または高速脱塩カラム（アマシャム・バイオサイエンシズ(Amersham Biosciences)）を用いて適したバッファー（例えば、ＰＢＳ）に交換し、次いで、当技術分野で周知であり、かつ／または本明細書に記載した方法を用いてさらに分析して免疫原性タンパク質の正体を調べる。
【０２０２】
免疫原性タンパク質および／または免疫グロブリン含有画分の単離
あるいは、または免疫原性タンパク質を免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から分離することに加えて、このような免疫原性タンパク質を、例えば、抗原抗体相互作用によって結合していた、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から単離する。
【０２０３】
したがって、免疫原性タンパク質またはその断片および／または免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体の単離は、まず前記タンパク質／画分を分離した後か、前記タンパク質／画分を分離せずにのいずれかで実施する。
【０２０４】
タンパク質を分離する方法は当技術分野では公知であり、例えば、スコープス（プロテイン・プリフィケーション：プリンシプルズ・アンド・プラクティス、第３版、スプリンガー・ベルラグ、１９９４中）に記載されている。
【０２０５】
例えば、免疫原性タンパク質を免疫グロブリンから分離し、続いて、未変性ゲル電気泳動を用いて分離する。本明細書において、用語「未変性ゲル電気泳動」とは、タンパク質を変性しない、すなわち、電気泳動されるタンパク質が天然の大きさ、コンホメーションおよび／または電荷を保持する条件下で実施する電気泳動の何らかの形態を意味すると取られるものとする。したがって、未変性ゲル電気泳動を用いるタンパク質の移動度は、タンパク質の電荷とタンパク質の流体力学的大きさの双方に応じて変わる。このような方法は、未変性ゲル電気泳動がタンパク質の大きさ、形および電荷を維持するだけでなく、この方法がまた、通常相互作用するタンパク質を結合されているままにできるため、免疫原性タンパク質と免疫グロブリンの分離において役立つ。免疫グロブリンは２つの重鎖と２つの軽鎖を含んでなるため、免疫グロブリンの分子量は少なくとも約１５０ｋＤａであると予想される（ＩｇＧの予想分子量に相応して）。したがって、前記の方法を用いて調製したサンプルの電気泳動によって、免疫グロブリン含有画分からの免疫原性タンパク質またはその断片の分離が容易になる。
【０２０６】
例えば、免疫原性タンパク質と免疫グロブリンとを含んでなるサンプルを、当技術分野で公知の技術を用いて一次元未変性ゲル電気泳動を用いて電気泳動する。このような場合、タンパク質は、単にその分子量および電荷によって分離される。したがって、このような方法は、免疫グロブリンをより小さい免疫原性タンパク質またはその断片と分離するのに役立つ。次いで、免疫原性タンパク質を当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法を用いて同定する。
【０２０７】
あるいは、免疫原性タンパク質と免疫グロブリンとを含んでなるサンプルを、未変性二次元ゲル電気泳動を用いて電気泳動する。例えば、タンパク質を等電点電気泳動を用いて一方向に分離する。このような方法を用いて、タンパク質をその等電点、すなわち、そこでのタンパク質の正味の電荷がゼロに等しいｐＨによって分離する。タンパク質をその等電点によって分離するためには、サンプルを、ｐＨ勾配を含んでなるゲルで電気泳動する。このような条件下では、タンパク質はそこでの正味の電荷がゼロに等しい前記勾配上のある位置に移動する。等電点電気泳動に続いて、標準的な未変性ゲル電気泳動を用いて、タンパク質をその質量に従って分離する。したがって、このような方法は、免疫グロブリンを免疫原性タンパク質から分離するのに役立つ。
【０２０８】
あるいは、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法を用いて、免疫原性タンパク質を免疫グロブリンから解離することと、ゲル濾過カラムを用いて、前記免疫原性タンパク質またはその断片と前記免疫グロブリンを分離することとによって、免疫原性タンパク質を免疫グロブリンから単離する。このようなカラムは商業的供給源、例えば、シグマ−アルドリッチまたはアマシャム−ファルマシアなどから入手できる。ゲル濾過法は当技術分野では公知であり、例えば、スコープス（プロテイン・プリフィケーション：プリンシプルス・アンド・プラクティス、第３版、スプリンガー・ベルラグ、１９９４中）に記載されている。ゲル濾過クロマトグラフィーはタンパク質をその大きさに基づいて分離する。このような方法は、サンプルを、指定の孔の大きさからなる固体マトリックスを含んでなるカラムと接触させることを含んでなる。十分に分子量の小さいタンパク質はこれらの孔を通って移動し、含まれ、そうでないものは排除されると考えられている。タンパク質は、このカラムから、排除されたものが含まれたものよりも先に溶出されながら溶出される。したがって、天然の状態の免疫グロブリンは、比較的大きな分子であるので、分子量の小さい免疫原性タンパク質またはその断片よりも先に溶出される。免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを回収した後、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法を用いてそのサンプルを解析／同定する。あるいは、電気泳動、例えば、未変性または変性一次元または二次元ゲル電気泳動を用いて免疫原性タンパク質を含んでなるサンプルを分離した後、その免疫原性タンパク質の何らかの解析を行う。
【０２０９】
あるいは、免疫原性タンパク質を免疫グロブリンから解離させた後、他のサイズ排除法、例えば、中でも、サイズ排除フィルター（例えば、ミリポア(Millipore)から入手できるような）を用いる遠心分離、高速液体クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーなどを用いてその免疫グロブリンから単離する。
【０２１０】
免疫原性タンパク質はまた、あるいは、免疫グロブリンから解離させた後、例えば、密度勾配分画を用いてその免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から分離する。密度勾配を用いる分画法は当技術分野で公知である。例えば、超遠心を用いてタンパク質を分離するが、これでは、サンプルを、例えば、５％〜２０％の範囲の直線的スクロース勾配に加え、次いで遠心分離する。したがって、タンパク質は遠心力、摩擦力および浮力に関係して分離される。免疫グロブリンは比較的大きなタンパク質であるので、このような方法を用いれば免疫原性タンパク質またはその断片から分離される。免疫グロブリンから分離した後、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法を用いて免疫原性タンパク質を解析する。
【０２１１】
本明細書に例示したように、変性電気泳動を用いて免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から単離する。変性電気泳動は、前記のように実施するが、未変性条件化で実施するのではなく、タンパク質を変性させる試薬を、電気泳動ゲルとサンプル調製物中のいずれかまたは双方に含める。したがって、タンパク質サンプルを、例えば、界面活性剤（例えばＳＤＳ）、またはその他の変性剤（例えば２−メルカプトエタノール、ＤＴＴおよび／または熱）を用いて変性させる。
【０２１２】
例えば、当技術分野で公知であり、例えば、スコープス（プロテイン・プリフィケーション：プリンシプルス・アンド・プラクティス、第３版、スプリンガー・ベルラグ、１９９４中）に記載された方法を用いて、還元性一次元ゲル電気泳動を用いて免疫原性タンパク質を免疫グロブリンから単離する。この実施形態によれば、タンパク質はその分子量によって分離される。したがって、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の双方と分子量の異なる免疫原性タンパク質またはその断片は、この方法を用いれば容易に検出できる。
【０２１３】
もう１つの実施形態では、還元性二次元ゲル電気泳動を用いて免疫原性タンパク質を免疫グロブリンから単離する。この実施形態によれば、タンパク質は、例えば、その等電点または正味の電荷および分子量によって分離される。そのようなものとして、この方法は分子量および／または等電点が免疫グロブリン軽鎖または重鎖のものと異なる免疫原性タンパク質またはその断片を決定するのに役立つ。
【０２１４】
２つの前記の実施形態のいずれかによれば、還元性電気泳動を用いて免疫原性タンパク質を免疫グロブリンから分離した後、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法を用いて免疫原性タンパク質を同定する。
【０２１５】
免疫グロブリンからの免疫原性タンパク質の解離または分離に関する前記の実施形態のいずれかによれば、単離された免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、さらなる解析の前に場合によっては濃縮することもある。タンパク質を濃縮する方法は当業者には公知であり、例えば、沈殿、凍結乾燥、漏斗管ゲルの使用（ターブッシュ(TerBush)およびノビック(Novick)、ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・テクニークス(Journal of Biomolecular Techniques)、１０（３）、１９９９）、限外濾過または透析が挙げられる。
【０２１６】
免疫グロブリンからの解離を伴わない、免疫原性タンパク質の同定
本発明は、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から単離されていない、免疫原性タンパク質またはその断片の同定を提供する。
【０２１７】
例えば、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法を用いて免疫グロブリン含有画分を被験体由来の生体サンプルから単離し、プロテアーゼを用いてその免疫グロブリンのＦｃ領域を切断する。例えば、パパイン、エラスターゼ、化膿性連鎖球菌由来のＳｐｅＢおよびＥｎｄｏＳおよびペプシンからなる群から選択されるプロテアーゼ。パパインとエラスターゼは双方とも、例えば、メルク(Merck)から市販されており、ペプシンはカルザイム・ラボラトリーズ(Calzyme Laboratories)、米国、カリフォルニア州、サンルイスオビスポから市販されている。
【０２１８】
この実施形態によれば、免疫原性タンパク質は免疫グロブリンの断片に結合されたままであり、この複合体を前記免疫グロブリンのＦｃ領域から分離する。次いで、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法を用いてこのサンプルを解析する。
【０２１９】
あるいは、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載の方法、例えば、非還元性または還元性一次元または二次元ゲル電気泳動などを用いて、免疫原性タンパク質および切断した免疫グロブリンをまず分離し、次いで、解析して免疫原性タンパク質の正体を決定する。
【０２２０】
免疫原性タンパク質またはその断片の同定
免疫グロブリン含有画分を含むか、免疫グロブリンを切断し、免疫原性タンパク質またはその断片を回収したかにかかわらず、免疫原性タンパク質またはその断片の捕獲および／または分離および／または単離に続いて、その免疫原性タンパク質を解析して前記タンパク質の正体を決定する。タンパク質の正体の決定においてタンパク質を解析する方法は当技術分野では公知であり、例えば、中でも、エドマン(Edman)配列決定、混合ペプチド配列決定、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、ＥＳＩおよびイオントラップ分析をはじめとする質量分析からなる群から選択される方法が挙げられる。
【０２２１】
例えば、エドマン配列決定（本質的には、エドマン、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Archives of Biochemistry and Biophysics)、２２、４７５〜４８３頁、１９４９によって記載されたような）を用いて免疫原性タンパク質の正体を同定して、免疫原性タンパク質のＮ末端配列を決定し、この配列を既知の配列と比較する。このような方法は、免疫原性タンパク質またはその断片の正体を調べるのに有用である。エドマン配列決定の前に、免疫原性タンパク質またはその断片を夾雑分子、例えば、別のタンパク質などから分離することが好ましい。免疫原性タンパク質の単離に続いて、このタンパク質のアミノ末端を、塩基性条件下でフェニルイソチオシアネートを用いて誘導体化する。例えば、このステップで用いる塩基は非求核試薬、例えば、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどである。このカップリングステップにより、フェニルチオカルバミルペプチドまたはタンパク質が得られる。フェニルチオカルバミルペプチドまたはタンパク質のチオカルボニル機能は中程度の強さの求核試薬であり、酸性条件下で、隣接するペプチド結合のカルボニル炭素を切断する。この切断ステップの結果、末端アミノ酸のアニロチアゾリノンが生じ、最初のペプチドまたはタンパク質は１アミノ酸残基短くなる。末端アミノ酸のアニロチアゾリノンは、ペプチドまたはタンパク質とは異なる溶解特性を有する。そのようなものとして、抽出し、さらなる解析に付すことができる。短くなったペプチドまたはタンパク質は再び裸のアミノ末端を含み、結果として、さらなるカップリング、切断および抽出サイクルに付すことができる。
【０２２２】
しかしながら、抽出した末端アミノ酸のアニロチアゾリノンは安定ではない。酸性水性条件下では、アニロチアゾリノンは迅速に再構成し、より安定なフェニルチオヒダントインを形成し、これが解析を受け入れられる。次いで、安定なフェニルチオヒダントインを、例えば、ＵＶ吸収検出逆相高速液体クロマトグラフィーによって分析して末端アミノ酸の正体を決定する。
【０２２３】
免疫原性タンパク質のＮ末端配列を決定した後、導いた配列が既知の配列と同一であるかどうか、または実質的に同一であるかどうかを調べるため、この配列を配列のデータベースと比較する。このようなデータベースは例えば、ＮＣＢＩで利用できる。
【０２２４】
本明細書において、用語「ＮＣＢＩ」とは、米国政府の国立衛生研究所の国立医学図書館(National Library of Medicine)にある米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information)、２０８９４、メリーランド州、ベテスダのデータベースを意味すると取られるものとする。
【０２２５】
２つのアミノ酸配列が、前記の規定の同一性パーセンテージ限界内に収まるかどうかを調べる際には、当業者であれば、アミノ酸配列の並列比較を実施できるということを承知している。このような比較またはアラインメントでは、アラインメントを実施するために用いるアルゴリズムに応じて、同一でない残基の位置づけに相違が生じる。これに関連して、２以上のアミノ酸配列間の同一性および類似性パーセンテージとは、当業者に公知の何らかの標準的なアルゴリズムを用いて決定される、その配列間の、それぞれ同一および類似の残基の数を指すと取られるものとする。特に、アミノ酸同一性および類似性は、例えば、ニードルマン(Needleman)およびブンシュ(Wunsch)のアルゴリズム、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)４８、４４３〜４５３頁、１９７０を利用する、デベロー(Devereaux)ら、ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ(Nucleic Acids Research)、１２、３８７〜３９５頁、１９８４のＧＡＰプログラムを用いる、コンピュータ・ジェネティクス・グループ社(Computer Genetics Group, Inc.)、米国、ウィスコンシン州、マディソン、ユニバーシティー・リサーチ・パーク(University Research Park)のソフトウェアを用いて算出する。あるいは、トンプソン(Thompson)ら、ヌクレイック・アシッヅ・リサーチ２２、４６７３〜４６８０頁、１９９４のＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを用いて、複数の配列のアラインメントを得るが、これでは、アラインメント中の同一／類似残基の数を最大にし、配列ギャップの数および／または長さを最小にすることが必要であるか望まれる。アミノ酸配列アラインメントはまた、種々のその他の市販の配列解析プログラム、例えば、ＮＣＢＩで入手できるＢＬＡＳＴプログラムなどを用いても実施できる。
【０２２６】
あるいは、デイマー(Damer)ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Journal of Biological Chemistry)２７３、２４３９６〜２４４０５頁、１９９８に記載される混合ペプチド配列決定を用いて免疫原性タンパク質またはその断片を同定する。この実施形態によれば、免疫原性タンパク質を臭化シアンまたはスカトールを用いてペプチドに切断し、これらのペプチドをエドマン配列決定法を用いて配列決定する。
【０２２７】
本明細書に例示するように、免疫原性タンパク質またはその断片を質量分析を用いて同定する。例えば、電気泳動を用いて免疫原性タンパク質を分離し、場合によっては、免疫原性タンパク質をプロテアーゼで消化し、次いで質量分析を用いて解析する。
【０２２８】
例えば、電気泳動を用いて免疫原性タンパク質を分離した後、このタンパク質を電気泳動を行ったゲル中で消化する。タンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのインゲル消化により、他の方法、例えば、エレクトロブロッティングなどよりも多くの前記タンパク質をゲルから回収できる。したがって、免疫原性タンパク質の量が増加することにより、前記タンパク質の解析が容易になる。インゲル消化法は当技術分野では公知であり、例えば、シェベンコ(Schevenko)ら、アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)６８、８５０〜８５８頁、１９９７に記載されている。さらに、タンパク質のインゲル消化を容易にするキットが、例えば、ミリポア(Millipore)、米国、０１８２１、マサチューセッツ州、ビレリカから市販されている。
【０２２９】
あるいは、またはさらに、免疫原性タンパク質またはそのペプチドを精製し、場合によっては、濃縮し、次いでさらに分析する。例えば、逆相クロマトグラフィーを用いて免疫原性タンパク質またはそのペプチドを精製する。
【０２３０】
別の例では、免疫原性タンパク質を電気泳動するのではなく、免疫グロブリンから解離させたサンプルを解析に用いる。場合によっては、免疫原性タンパク質をプロテアーゼ、例えば、トリプシンなどで消化することで、免疫原性タンパク質またはその断片のペプチドの解析が容易になる。したがって、精製、および場合によっては濃縮後、このようなサンプルを質量分析によって解析する。
【０２３１】
免疫原性タンパク質またはそのペプチドを精製した後、サンプルをイオン化する。
【０２３２】
例えば、本質的には、例えば、フェン(Fenn)ら、サイエンス(Science)、２４６、６４〜７１頁、１９８９またはウィルム(Wilm)ら、ネイチャー(Nature)、３７９、４６６〜４６９頁、１９９６に記載されたように、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いてサンプルをイオン化する。ＥＳＩのプロセスによって、マイクロキャピラリーチューブを通して、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを質量分析計に入れる。質量分析計のチャンバーおよびマイクロキャピラリーチューブ間の電位差によって、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルが細かい霧として前記チューブから出される。この霧の中の液体（すなわち、タンパク質が懸濁されている液体）が蒸発すると、タンパク質またはそのペプチドが脱溶媒和される。したがって、タンパク質またはペプチドがイオンに変換される。
【０２３３】
あるいは、例えば、本質的には、例えば、カラス(Karas)およびヒレンカンプ(Hillenkamp)、アナリティカル・ケミストリー(Analitical Chemistry)６０、２２９９〜２３０１頁、１９８８によって記載されたように、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）を用いてサンプルをイオン化する。例えば、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルをマトリックス、例えば、ａ−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸、３，５ジメトキシ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シナピン酸）または２，５ジヒドロキシ安息香酸（ゲンチジン酸）などに加える。次いで、サンプルおよびマトリックスを金属板上にスポットし、レーザーによる照射に付し、分子イオンの形成を促す。当業者には明らかであろうが、この方法の変形、例えば、大気圧ＭＡＬＤＩなどが本発明に包含されることは明確である。
【０２３４】
当業者には明らかであろうが、他の形態のイオン化、例えば、大気圧化学イオン化も本発明に包含されることは明確である。
【０２３５】
タンパク質またはそのペプチドをイオン化した後、これらの分子イオンの質量を解析する。
【０２３６】
例えば、本質的には、バーリンゲーム(Burlingame)ら、アナリティカル・ケミストリー７０、６７５Ｒ〜７１６Ｒおよび本明細書に引用された参照文献に記載されたように、四重極質量分析計または線形四重極を用いて分子イオンの質量を分析する。この方法では、ｒｆおよびｄｃ電圧が供給される、４つの金属製ロッドのアレイによって生じた電界を通してイオンを送る。この電圧によってイオンが振動するが、この振動周波数はイオンのｍ／ｚ値に応じて変わる。安定した振動を示すイオン、すなわち、ロッドアセンブリー、振動周波数、ｒｆ電圧およびｄｃ電圧から決定される所与のｍ／ｚ値を有するもののみをさらなる解析のために保持する。したがって、これによってペプチドまたはタンパク質の電荷に対する質量の比（ｍ／ｚ）の分析が容易になる。次いで、これを、例えば、イギリスのヒトゲノムマッピングプロジェクトリソースセンター(UK Human Genome Mapping Project Resource Centre)によって提供されるデータベース検索ソフトウェアなどを用いて分子量のライブラリーと比較する。
【０２３７】
複数の四重極の組合せを用いて、タンパク質またはペプチドのアミノ酸配列を決定する。
【０２３８】
あるいは、本質的には、クックス(Cooks)ら、ケミカル・アンド・エンジニアリング・ニュース(Chemical and Engneering News)６９、２６、１９９１に記載されたように、イオントラップ質量分析計を用いて分子イオンの質量を解析する。この分析形態は、四重極質量分析計の一形態であり、これでは電荷の発生器を線形様式ではなく３次元にアレイする。この実施形態によれば、あるｍ／ｚ比の分子イオンが３次元電界にトラップされる。イオントラップ質量分析計はまた、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）実験においてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の配列を決定するのに有用である。ＭＳ／ＭＳ法は当技術分野では公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
【０２３９】
あるいは、またはさらに、本質的には、イェーツ(Yates)、ジャーナル・オブ・マス・スペクトロメトリー(Journal of Mass Spectrometry)３３、１〜１９頁、１９９８および本明細書に引用した参照文献よって記載されたように、分子イオンの質量を、その飛行時間（ＴＯＦ）によって分析する。飛行時間機器は、イオンが飛行管の長さを通過するのに必要な時間を測定することによってそのｍ／ｚ比を測定する。場合によっては、このようなＴＯＦ質量分析計は、飛行管の一方の末端に、前記イオンを反射して飛行管を通って検出器へと戻すイオンミラーを含む。したがって、イオンミラーは飛行管の長さを増加させる働きをし、これによってこの分析形態の精度が増す。
【０２４０】
飛行時間分析はまた、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の質量およびひいては推定配列を求めるのに有用である。
【０２４１】
本質的に米国特許第３，９３７，９５５号に記載されるようなフーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析計もまた、本発明の方法を用いて単離した免疫原性タンパク質またはその断片の分析および同定に有用である。イオンサイクロトロンは、質量がわかっており、ある速度で磁界を通って移動するイオンを固定磁界を用いて偏向させる。磁界強度がわかれば、ｍ／ｚ比を求めるにはイオンサイクロトロン周波数を測定することで十分である、すなわち、静磁場における質量対電荷比は、イオンサイクロトロン周波数によって独自に求められる。実際、静磁場はイオン質量を周波数アナログに変換する。
【０２４２】
例示した発明の内容から明らかであるように、質量分析計は、例えば、ＭＳ／ＭＳを用いて、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を決定するのに有用である。例えば、注目するイオン（すなわち、イオン化した注目するペプチドまたはタンパク質）を質量分析計のチャンバー（「衝突用チャンバー」）内を通過させ、ここでイオンがガス、例えば、窒素またはアルゴンなどと相互作用する。このガスとの相互作用によって、例えば、ペプチド主鎖内でイオンのフラグメンテーションが起こる。イオンの切断後、別の断片と一アミノ酸で質量の異なる得られた断片の質量分析をすることで、注目するイオンのアミノ酸配列を決定できる。すなわち、ただ１個のアミノ酸で異なるペプチド間の重量差を求めることによって、各アミノ酸の正体を調べる。ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列を分析するための質量分析計としては、例えば、三連四重極（本質的には、ハント(Hunt)ら、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Prociidings of the National Academy of Sciences of the United States of America)８３、６２３３〜６２３７頁、１９８６に記載されるような）、四重極ＴＯＦ（本質的には、モリス(Morris)ら、ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー(Rapid Communications in Mass Spectrometry)１０、８８９〜８９６頁、１９９６に記載されるような）またはＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ（本質的には、ロボダ(Loboda)ら、ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー１４、１０４７〜１０５７頁、２０００に記載されるような）がある。
【０２４３】
次いで、場合によっては、いくつかの重複するイオンの配列をアセンブルし、その結果、ある領域、またはさらに全ポリペプチドまたはタンパク質の配列を決定する。あるいは、各個々のイオンの配列をさらなる分析に用いる。
【０２４４】
少なくとも免疫原性タンパク質に由来するペプチドの配列を決定した後、この配列を配列のデータベースと比較して、導いた配列が既知の配列と同一であるかどうか、または実質的に同一であるかどうかを調べる。このようなデータベースは、例えば、ＮＣＢＩまたはＥｘＰＡＳＹまたはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔで利用できる。さらに、質量分析計はまた、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の質量も調べることができるので、この情報も、例えば、タンパク質質量ライブラリー、例えば、イギリスのヒトゲノムマッピングプロジェクトリソースセンターによって提供されるものなどと比較することによって免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。
【０２４５】
本明細書において、用語「ＥｘＰＡＳＹ」は、バーゼル大学、スイス、４０５６、バーゼルのスイス生命情報学研究所(Swiss Institute of Bioinformatics)のエキスパート・プロテイン・アナリシス・システムを意味すると取られるものとする。
【０２４６】
本明細書において、用語「Ｓｗｉｓｓ−Ｐrｏｔ」は、バーゼル大学、スイス、４０５６、バーゼルのスイス生命情報学研究所のタンパク質配列データベースを意味すると取られるものとする。
【０２４７】
生体分子相互作用解析質量分析計（ＢＩＡ−ＭＳ）も、前記免疫グロブリンと結合している免疫原性タンパク質を検出および／または特性決定および／または同定するのに有用である（ネルソン(Nelson)ら、エレクトロフォレシス(Electrophoresis)２１、１１５５〜１１６３頁、２０００）。
【０２４８】
あるいは、本発明の方法を用いて単離したタンパク質を、単離したタンパク質と特異的に結合できる抗体またはリガンドを用いて同定する。これについては、抗体および／またはリガンドチップが、タンパク質同定のための迅速解析に有用である。例えば、抗体アレイ（すなわち、３８０または５００種の個別の抗体が、各々２連で、規定の領域に各々固定化されているガラススライド）をクローンテック(Clontech)から入手できる。このようなアレイを使用するためには、本発明の方法を用いて単離した免疫原性タンパク質またはその断片（免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体と結合しているかどうか）を、検出可能なマーカー、例えば、蛍光標識（例えば、Ｃｙ３またはＣｙ５）で標識する。次いで、標識したタンパク質を抗体アレイと、抗原抗体相互作用が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させる。次いで、アレイを洗浄し、結合している標識されたタンパク質をいずれも検出する。どの抗体にタンパク質が結合しているかを調べることによって、免疫原性タンパク質の正体を調べる。
【０２４９】
疾病または疾患を引き起こす病原体からの免疫原性タンパク質の同定
本発明はまた、被験体において疾病または疾患を引き起こす病原体の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片の同定法を提供し、これは
（ｉ）疾病もしくは疾患を患っている被験体または以前に疾病もしくは疾患を患ったことのある被験体またはその細胞、組織もしくは器官から、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、疾病もしくは疾患を引き起こす病原体またはその誘導体を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）抗原抗体相互作用によって前記免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定すること
とを含んでなり、
同定されるタンパク質は、被験体において疾病または疾患を引き起こす病原体の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片である。
【０２５０】
当業者には明らかであろうが、本方法はまた、場合によっては、被験体からタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを得ることを含んでなる。例えば、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリン含有画分もしくはその混合物を含んでなるタンパク質を含んでなるサンプル。適したサンプルは前述されており、本方法について準用されると取られるものとする。
【０２５１】
免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体は、本明細書に記載の方法を用いて、例えば、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することによって、被験体またはサンプルから単離するか、または得る。
【０２５２】
事前に固体支持体、マトリックスまたは樹脂上に固定化した１種以上の免疫グロブリン結合性化合物を用いることで、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分とそれに結合しているタンパク質もしくはその断片の単離が容易になる。さらに、このような固定化された免疫グロブリン結合性化合物によって、単離された固定化された化合物を洗浄して何らかの非特異的に結合しているタンパク質または結合していないタンパク質を除去することが容易になる。
【０２５３】
例えば、本発明の方法は磁性または常磁性ビーズ上に固定化された１種以上の免疫グロブリン結合性化合物を用いて実施する。このビーズを生体サンプルと接触させることによって、サンプルを磁場または常磁場に曝露し、それによってビーズとそれに結合しているタンパク質を単離することによって、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を単離する。次いで、このビーズを場合によっては洗浄して何らかの非特異的に結合しているタンパク質または結合していないタンパク質を除去する。その結果、このビーズは免疫原性タンパク質を捕獲するのに有用である。
【０２５４】
あるいは、免疫グロブリン結合性化合物を、例えば、アガロース上に固定化する。アガロースは分子量の大きい、比較的大きな分子であるので、遠心分離によって容易に単離される。したがって、免疫グロブリン結合性化合物が結合しているそのアガロースを、生体サンプル、例えば、本明細書に記載されたサンプルと接触させることによって、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を単離する。次いで、サンプルを遠心分離し、沈殿したアガロースを回収する。場合によっては、アガロースを洗浄して何らかの非特異的に結合しているタンパク質または結合していないタンパク質を除去し、再度回収する。その結果、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が結合しているこのようなアガロースは、その後のサンプルと接触させて免疫原性タンパク質を捕獲することにとって有用である。
【０２５５】
本明細書に例示したように、本発明者らはセファロース上に固定した１種以上の免疫グロブリン結合性化合物（例えば、タンパク質Ｇまたはタンパク質Ａ）を用いた。免疫グロブリン結合性化合物が結合しているセファロースを、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプル（例えば、血清）と、免疫グロブリン結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、次いで、これを用いてカラムを作製する。このカラムにより免疫グロブリン結合性化合物の洗浄および／またはその後のサンプルの、結合している免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分との接触が容易になる。
【０２５６】
当技術分野で公知の化合物および／または方法、例えば、前記のものを用いて、免疫グロブリン結合性化合物（例えば、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ｌ）を、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分と場合によっては結合させる。
【０２５７】
場合によっては、当技術分野で公知であり、かつ／または前記の方法を用いて、免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリン含有画分から分離し、かつ／または単離する。次いで、当技術分野で公知であり、かつ／または前記の方法を用いて、免疫原性タンパク質を同定する。
【０２５８】
免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分が由来する被験体は、以前にまたはその時点で疾病または疾患を患っているので、その被験体には前記疾病または疾患を引き起こす病原体に対する抗体が生じている。これらの抗体（免疫グロブリン）により、免疫原性タンパク質またはその断片を疾病または疾患を引き起こす病原体から単離するのが容易になる。
【０２５９】
したがって、前記抗体（タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分の形の）を疾病もしくは疾患を引き起こす病原体またはその抽出物と接触させることによって、それに対して被験体が免疫応答を起こしたタンパク質またはその断片を単離および／または同定する。
【０２６０】
本明細書において、用語、疾病または疾患を引き起こす病原体の（または、に由来する）「抽出物」とは、前記病原体の１種以上の成分の調製物を意味すると取られるものとする。例えば、用語「抽出物」は前記病原体の細胞溶解物、細胞画分（例えば、細胞壁画分、膜画分、原形質画分、核画分またはミトコンドリア画分）または細胞のタンパク質抽出物（例えば、当技術分野で公知の方法を用いて、細胞を溶解し、画分を含むタンパク質を回収することによって得られる）を包含する。あるいは、またはさらに、用語「抽出物」はまた、病原体に由来する細胞の特定のサブセット（および／またはその抽出物）、例えば、癌由来の細胞集団、または病原菌、例えば、寄生生物由来の細胞集団を包含する。
【０２６１】
本発明の方法は、立体配座抗原（すなわち、タンパク質または断片の三次元構造によって形成された抗原）および／またはリニア抗原によって免疫グロブリンと結合しているタンパク質を同定するのに有用である。例えば、細胞の抽出物は、それに含まれるタンパク質の構造を保つような方法で調製する。すなわち、細胞抽出物は非変性条件下で調製する。このような方法は、立体配座エピトープまたはリニアエピトープのいずれかを同定するのに有用である。
【０２６２】
あるいは、サンプルを変性条件下で調製する。「変性された」または「変性」とは、タンパク質の立体配座エピトープがタンパク質のリニアＢ細胞エピトープを保持する条件下で破壊されることを意味する。例えば、細胞抽出物を分子内結合を破壊する温度に加熱するか、イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で、および／または解離剤（例えば、尿素またはメルカプトエタノール）で処理する。
【０２６３】
一実施例では、疾病または疾患は、感染性疾病または疾患、例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される病原体（このような感染性病原体は前述されている）による感染によって引き起こされる疾病または疾患である。したがって、このような病原体に感染した被験体は、その病原体に対して免疫応答を起こしている。免疫グロブリン画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を、感染性病原体またはそれに由来する抽出物と接触させることによって、その病原体に由来する免疫原性タンパク質を同定する。このような免疫原性タンパク質は、前記病原体の診断および／または治療マーカーとして有用である。
【０２６４】
当業者には明らかであろうが、感染性生物から免疫原性タンパク質を決定するために本発明の方法を用いる場合には、前記感染性病原体の臨床分離株、例えば、細菌の臨床分離株を用いることが有利である場合がある。このような分離株は疾病および／または疾患と関連していることが知られており、感染性病原体が夾雑病原体を実質的に含まないことを確実にするよう培養（および／または単離）されている。
【０２６５】
本発明者らは、本発明の方法を用い、細菌（すなわち、結核菌）から、前記細菌による感染症を患っている被験体に由来する免疫グロブリン画分を用いて免疫原性タンパク質を同定した。
【０２６６】
本方法はまた、疾病または疾患を引き起こすその他の病原体から免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。例えば、本発明の方法は、癌細胞から免疫原性タンパク質を決定するのに有用である。例えば、免疫グロブリン画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を、癌を患っている被験体から得るか、単離し、その画分または複合体を、その癌を引き起こす細胞またはその抽出物と接触させる。その結果、本発明の方法を用いて同定した免疫原性タンパク質またはその断片は、その癌細胞の診断／予後および／または治療マーカーとして有用である。適した癌細胞の例としては、膀胱癌細胞、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、子宮内膜癌細胞、頭頚部癌細胞、白血病細胞、肺癌細胞、リンパ腫細胞、メラノーマ細胞、非小細胞肺癌細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、急性リンパ性白血病細胞、成人急性骨髄性白血病細胞、成人非ホジキンスリンパ腫細胞、脳腫瘍細胞、子宮頸癌細胞、小児肉腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、慢性骨髄性白血病細胞、食道癌細胞、ヘアリー細胞白血病細胞、腎臓癌細胞、肝臓癌細胞、多発性骨髄腫細胞、神経芽細胞腫細胞、口腔癌細胞、膵臓癌細胞、中枢神経系原発リンパ腫細胞、皮膚癌細胞および小細胞肺癌細胞からなる群から選択される癌細胞が挙げられる。
【０２６７】
本明細書に例示したように、本発明は卵巣癌または乳癌を研究して免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。
【０２６８】
自己免疫状態からの免疫原性タンパク質またはその断片の同定
本発明は、自己免疫状態から、被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法をさらに提供し、この方法は
（ｉ）自己免疫状態に苦しんでいる被験体またはその細胞、組織もしくは器官から免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを、自己免疫疾患を患っている被験体に由来するタンパク質を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）抗原抗体相互作用によって前記免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定すること
とを含んでなり、
同定されるタンパク質は、自己免疫状態に由来する、被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片である。
【０２６９】
当業者には明らかであろうが、本方法は、場合によっては、被験体からタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を含んでなるサンプルを獲得することをさらに含んでなる。例えば、免疫グロブリン含有画分またはタンパク質複合体を含んでなるサンプル。適したサンプルおよび免疫グロブリン画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体は前述されており、本方法に準用されると取られるものとする。
【０２７０】
例えば、橋本病、全身性エリテマトーデス、シューグレン病、抗リン脂質症候群、原発性胆汁性肝硬変、混合性結合組織病、慢性活性肝炎、グレーブス病、Ｉ型糖尿病、慢性関節リウマチ、強皮症、重症筋無力症、多発性硬化症および慢性特発性血小板減少性紫斑病からなる群から選択される自己免疫疾患を患っている被験体からサンプルを得る。
【０２７１】
免疫グロブリン含有画分またはタンパク質複合体は、本明細書に記載の方法を用いて、例えば、サンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、その化合物を単離することによって、被験体またはサンプルから単離するか、得る。免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質を単離する方法および／または化合物は、前述されており、本方法に準用されると取られるものとする。
【０２７２】
場合によっては、免疫グロブリン結合性化合物（例えば、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ｌ）を、当技術分野で公知の化合物および／または方法、例えば、前述したものを用いてタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分と結合させる。
【０２７３】
被験体は自己免疫状態に苦しんでいるので、彼らは、自己抗原（例えば、タンパク質またはその断片）を特異的に認識する抗体を産生したか、抗体を生じている。「自己抗原」とは、被験体が、被験体内に生じるか、被験体によって産生される抗原（例えば、タンパク質またはその断片）と結合可能な抗体を生じていることを意味する。このような抗体（免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体の形態の）は、それに対して被験体が免疫応答を起こしている免疫原性タンパク質またはタンパク質断片を単離および／または同定するのに有用である。このような免疫原性タンパク質または断片は、自己免疫疾患にとって魅力的な治療および／または診断／予後標的に相当する。
【０２７４】
本発明は、自己免疫疾患から免疫原性タンパク質を単離および／または決定するのに有用である。例えば、自己免疫疾患は関節リウマチ、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、自己免疫甲状腺疾患、中枢神経系脈管炎、および自己免疫筋炎からなる群から選択される。このような疾病または疾患の臨床症状は、１種以上の自己抗原に対する被験体の自己免疫応答によって引き起こされる。例えば、膵島細胞に対する自己免疫応答は、これらの細胞を死滅させ、それによってインスリンの産生が抑制され、Ｉ型糖尿病を引き起こす。
【０２７５】
本発明はまた、疾病または疾患に由来する自己免疫成分から免疫原性タンパク質を単離および／または同定するのに有用である。例えば、炎症状態に苦しんでいる被験体には、炎症応答の成分である１種以上のタンパク質と結合する自己抗体が生じる。
【０２７６】
したがって、本発明の方法は、それに対してかかる被験体が抗体を生じている免疫原性タンパク質またはその断片を決定するのに有用である。例えば、本発明者らは本発明の方法を用いて、嚢胞性繊維症を患う被験体において免疫原性タンパク質を同定している。問題の被験体は急性臨床増悪、例えば、細菌（例えば、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、アスペルギルス・フミガーツス、セパシア菌複合体、ステノトロホモナス・マルトフィラ、アルカリゲネス(アクロモバクター)・キシロソキシダンス、Ｂ．グラディオリおよびラルストニア・ピックティーからなる群から選択される細菌）感染によって引き起こされた急性臨床増悪を以前に起こした、かつ／または起こしていた。このような急性臨床増悪は炎症応答を特徴とし、これはいくらかのＣＦ被験体では自己免疫応答の発生と関連があるとわかっている。
【０２７７】
免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を含むサンプルを、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなる生体サンプル、例えば、前述した生体サンプルと接触させる。例えば、このような生体サンプルは自己免疫状態に苦しんでいる被験体、例えば、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を得た、または単離した被験体と同一の自己免疫状態に苦しんでいる被験体から得る。例えば、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体と生体サンプルを同一の被験体から得る。
【０２７８】
本明細書に例示したように、本発明者らは免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を、急性臨床増悪を起こしている１以上の被験体から得、このサンプルを急性臨床増悪を起こしている１以上のＣＦ被験体から得た痰サンプルと接触させた。この方法を用いて、急性臨床増悪を起こしているＣＦ被験体がそれに対して免疫応答を起こしているいくつかのタンパク質を単離した。
【０２７９】
あるいは、サンプルは被験体が免疫応答を起こしていると思われるタンパク質またはその断片を含んでなる細胞またはその抽出物を含んでなる。例えば、Ｉ型糖尿病を患っている被験体から得た、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体を、膵島細胞またはその抽出物と接触させる。
【０２８０】
場合によっては、当技術分野で公知であり、かつ／または前述した方法を用いて、免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリン含有画分から分離し、かつ／または単離する。次いで、当技術分野で公知であり、かつ／または前述した方法を用いて、免疫原性タンパク質を同定する。
【０２８１】
免疫原性タンパク質またはその断片を同定するための被験体の免疫化
本発明は被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法をさらに提供し、この方法は、
（ｉ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなる、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルを事前に投与された被験体に由来するか、被験体によって産生されたサンプルから、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｉｉ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルと接触させることと、
（ｉｉｉ）抗原抗体相互作用によってタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンと結合しているタンパク質またはその断片を同定すること
とを含んでなり、
それによって被験体において免疫応答を誘発可能な免疫原性タンパク質またはその断片を同定する。
【０２８２】
場合によっては、本方法は細胞または細胞抽出物を被験体に投与することをさらに含んでなる。例えば、被験体を細胞または細胞抽出物で免疫する。細胞または細胞抽出物を被験体に投与する方法は当技術分野では公知である。例えば、細胞または細胞抽出物を、経口、吸入によって、経皮投与、局所投与によって、または注入（例えば、腹腔内注射、筋肉注射、皮下注射または静脈注射または点滴）によって投与する。本明細書に例示したように、注入によって投与される、細胞または細胞抽出物またはその混合物は、その細胞または細胞抽出物またはその混合物に対する免疫グロブリンの産生を誘導するのに有用である。
【０２８３】
細胞または細胞溶解物を投与するのに適した被験体は前述されており、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、イヌ、ヒツジ(sheep)、ヒツジ(ovine)、ウマおよびヤギからなる群から選択される被験体が挙げられる。本明細書に例示したように、本発明者らは、ニワトリを免疫して細胞抽出物に対する免疫応答を誘導し、その抽出物から免疫原タンパク質を同定した。さらに、実施例に記載したように、マウスは本発明の方法に有用であり、例えば、マウスを細胞または細胞抽出物で免疫し、免疫グロブリンを、例えば、免疫したマウスの血清から単離する。
【０２８４】
当業者には明らかであろうが、細胞または細胞抽出物またはその混合物を、例えば、被験体に投与し、被験体に十分な時間を与え、前記細胞または細胞抽出物またはその混合物と結合する免疫グロブリンを産生させる。場合によっては、１回以上のブースター免疫または投与を組み込んでいる所定のスケジュールに従って、細胞または細胞抽出物を被験体に投与するか、それで免疫する。このようなスケジュールは、細胞または細胞抽出物またはその混合物に対するより強力な抗体（すなわち、免疫グロブリン）応答を引き起こすのに役立つ。
【０２８５】
場合によっては、本発明の方法は、細胞または細胞抽出物またはその混合物中の免疫原性タンパク質と結合可能な免疫グロブリンを産生している被験体を決定することをさらに含んでなる。サンプル中の抗体または免疫グロブリンの存在を調べる方法は当技術分野では公知であり、例えば、中でも、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはその改変、バイオセンサー技術またはエバネッセントファイバー光学技術が挙げられる。
【０２８６】
例えば、標準的な固相ＥＬＩＳＡ形式は、被験体から得た、または被験体によって産生されたサンプル中の細胞または細胞抽出物と結合可能な免疫グロブリンの存在を調べるのに有用である。
【０２８７】
一形態では、このようなアッセイは、細胞または細胞抽出物を固体マトリックス、例えば、ポリスチレンまたはポリカーボネートマイクロウェルまたはディップスティック、メンブラン、またはガラス製支持体（例えば、ガラススライド）などの上に固定化することを含む。
【０２８８】
被験体由来の、または被験体によって産生されたサンプルを、固定化した生体サンプルと直接接触させると、前記細胞または細胞抽出物と結合可能な免疫グロブリンのいずれかが、前記サンプル中に存在するその標的タンパク質のいずれかと直接結合を形成する。
【０２８９】
次いで、標識した抗体を用いて、結合された免疫グロブリンを検出する。適した標識としては、例えば、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣまたはテキサスレッド）、蛍光半導体ナノ結晶（米国特許第６，３０６，６１０号に記載されたような）、または酵素（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。例えば、ニワトリサンプルから捕獲または単離された免疫グロブリンを、抗ニワトリ抗体を用いて検出する。あるいは、二次（検出）抗体と結合する三次標識抗体を使用できる。洗浄して何らかの結合してない抗体を除去した後、標識を蛍光標識の場合には直接、または適した基質、例えば、過酸化水素、ＴＭＢ、トルイジン、または５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）などの添加を介してのいずれかで検出する。適した基質は、用いるリポーター分子に応じて変わるが、当業者には明らかである。
【０２９０】
適した細胞または細胞抽出物は前述されており、例えば、疾病または疾患を引き起こす病原体、例えば、感染性生物（例えば、ウイルス、細菌、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される生物）または癌細胞（例えば、卵巣癌細胞もしくは乳癌細胞）が挙げられる。このような病原体は前述されており、本方法に準用されると取られるものとする。
【０２９１】
本発明の方法は、細胞および／または細胞抽出物中またはそれら上の抗原に対して産生されている免疫グロブリンを利用するので、その細胞および／または細胞抽出物を場合によっては、病原体または免疫応答を増強する化合物とともに投与する。例えば、細胞または細胞抽出物を、アジュバントとともに投与して細胞または細胞抽出物に対する免疫応答を増大させる。免疫学的応答を増大させるために用いるアジュバントは、宿主種に応じて変わり、例えば、フロイントのアジュバント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性化物質、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘマシアニンおよびジニトロフェノールが挙げられる。その他の有用である可能性のあるアジュバントとしては、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌）およびコリネバクテリウム・パルヴムが挙げられる。
【０２９２】
当業者には明らかであろうが、細胞または細胞抽出物は、場合によっては組成物の形態で投与する。例えば、投与する細胞または細胞抽出物を含んでなる適当な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中で調製することができる。溶液またはエマルションに適した担体としては、例えば、生理食塩水および緩衝媒体をはじめとする、水性またはアルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、乳酸化リンガー液または不揮発性油が挙げられる。静脈内ビヒクルとしては、種々の添加剤、保存料、または液体、栄養および電解質補給剤などが挙げられる（一般的には、レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第１７版、マックパブリッシング社(Mack Publishing Co.)、ペンシルバニア州、１９８５参照）。吸入には、薬剤を可溶化し、投与に適したディスペンサー（例えば、アトマイザ、噴霧器または加圧型エアロゾルディスペンサー）に入れることができる。前述したように、このような組成物は、場合によっては、アジュバントを含む。
【０２９３】
当業者には明らかであろうが、本方法は場合によっては、被験体に由来するサンプルを得ることをさらに含んでなる。例えば、免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質を含んでなるサンプル。適したサンプルおよび免疫グロブリン画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体は、前述されており、本方法に準用されると取られるものとする。
【０２９４】
あるいは、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を単離するサンプルは、被験体によって産生される。例えば、被験体によって産生されるサンプルとしては、鳥類によって産生される卵、胚または胎児が挙げられる。例えば、本発明者らは、ニワトリを細胞または細胞抽出物で免疫し、そのニワトリが産んだ卵を回収し、卵からその免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質またはその免疫グロブリン含有画分を単離した。
【０２９５】
産生されたサンプルから、タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を単離するのに適した被験体としては、鳥綱のものがある。すべてのトリ類（例えば、中でも、アヒル、ダチョウ、エミュー、シチメンチョウ、ニワトリ）が考慮される。好ましいトリとしては、ニワトリがある。鳥類、例えば、ニワトリにおいて免疫グロブリンを産生する方法は当技術分野では公知であり、例えば、Ａ．Ａ．ベネディクト(Benedict)およびＫ．ヤマカ(Yamaqa)、コンパラティブ・イムノロジー、（Ｊ．Ｊ．マーカロニ(Marchaloni)編）、第１３章、「イムノグロブリンズ・アンド・アンチボディー・プロダクション・イン・エイビアン・スピーシーズ(Immunoglobulins and Antibody Production in Avian Species)」、３３５〜３７５頁、ブラックウェル、オックスフォード（１９６６）に記載されている。
【０２９６】
産卵鶏は、血清中に見られるものと同等またはそれを上回る濃度の免疫グロブリンを卵黄に送り出し（例えば、ＩｇＹ）（Ｒ．パターソン(Patterson)ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー(Journal of Immunology)、８９：２７２、１９６２）、卵は免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質またはその免疫グロブリン含有画分を単離するための魅力的な供給源に相当する。卵から免疫グロブリンを単離する方法は当技術分野では公知であり、通常、例えば、機械的手段または電気泳動を用いて卵白から卵黄を分離することを含んでなる。次いで、場合によっては、卵黄を破壊し、希釈し、前述した方法を用いて、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質またはその免疫グロブリン含有画分を単離する。当業者には明らかであろうが、このような方法でＩｇＹを単離する。
【０２９７】
あるいは、ＵＳＳＮ２００２００２８９１７に記載された方法を用いて、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質またはその免疫グロブリン含有画分を単離する。
【０２９８】
本明細書に記載された方法を用いて、例えば、サンプルを免疫グロブリン含有画分と結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件化で一定時間接触させ、結合している免疫グロブリンを含む化合物を単離することによって、被験体または被験体に由来するか、被験体によって産生されたサンプルから、免疫グロブリン含有画分またはタンパク質複合体を単離するか、または得る。免疫グロブリン含有画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質を単離する方法および／または化合物は前述されており、本方法に準用されると取られるものとする。
【０２９９】
免疫グロブリン結合性化合物（例えば、タンパク質Ａおよび／またはタンパク質Ｇおよび／またはタンパク質Ｌ）は、場合によっては、当技術分野で公知の化合物および／または方法、例えば、前述されたものを用いて、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分と結合させる。
【０３００】
場合によっては、当技術分野で公知であり、かつ／または前述した方法を用いて、免疫原性タンパク質またはその断片を免疫グロブリン含有画分から分離し、かつ／または単離する。次いで、当技術分野で公知であり、かつ／または前述した方法を用いて、免疫原性タンパク質を同定する。
【０３０１】
本方法は、例えば、疾病または疾患を引き起こす病原体に由来する免疫原性タンパク質を、その疾病または疾患の診断用／予後用または治療用として使用するために、決定するのに有用である。例えば、本方法は、非ヒト動物を免疫された被験体として用いて疾病または疾患を引き起こす病原体に由来する免疫原性タンパク質を決定するのに有用である。
【０３０２】
あるいは、本方法は被験体において免疫応答を誘発可能なタンパク質またはその断片を含んでなる、何らかの細胞または細胞抽出物から免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。例えば、本方法は、被験体がそれに対して自己免疫応答を起こしている癌細胞または細胞から、免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。
【０３０３】
本方法の一実施例では、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体またはその免疫グロブリン含有画分と接触させる、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルを、細胞または細胞抽出物を含んでなる被験体から得る。例えば、細胞または細胞抽出物を、疾病または疾患を引き起こす病原体から得、細胞または細胞抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルを、疾病または疾患を患っている被験体から得る。したがって、免疫グロブリン画分を、細胞または細胞抽出物で免疫された被験体に由来するか、被験体によって産生されたサンプルから単離し、その免疫グロブリン画分を用いて、細胞または細胞抽出物を含んでなる被験体から免疫原性タンパク質または断片を単離する。免疫した被験体と、細胞または細胞抽出物を含んでなる被験体とは、場合によっては、同一被験体ではない。例えば、免疫グロブリン画分を、細胞または細胞抽出物で免疫したニワトリの卵から単離し、次いで、これを用いて、細胞または細胞抽出物を含んでなるヒト被験体に由来するサンプル中の免疫原性タンパク質を同定する。
【０３０４】
このような方法は、例えば、感染性病原体である、疾病または疾患を引き起こす病原体から免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。例えば、感染性病原体は、ウイルス、細菌（例えば、結核菌）、酵母、真菌および寄生生物からなる群から選択される。
【０３０５】
同定された免疫原性タンパク質の数および／または量の増大
本発明の方法は、種々の供給源のいずれか、例えば、疾病または疾患または自己免疫疾患を引き起こす病原体などから免疫原性タンパク質を同定するのに有用である。本発明者らは、反復して、免疫グロブリン画分または免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体から免疫原性タンパク質またはその断片を分離し、免疫グロブリン画分を生体サンプル（例えば、最初に接触させたサンプル）と接触させることによって、同定されるタンパク質の数および／または回収されるタンパク質の量が増大することをさらに見出した。
【０３０６】
したがって、本発明は、
（ａ）被験体に由来するサンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、１種以上の化合物を単離することを含んでなる方法によって、免疫原性タンパク質もしくはその断片またはその細胞、組織もしくは器官に対して免疫応答を起こしている被験体から免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｂ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることと、
（ｃ）結合している免疫グロブリンから免疫原性タンパク質またはその断片を分離することと、
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることと、
（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することと、
（ｆ）場合によっては、（ｄ）および（ｅ）を１回以上反復することと、
（ｇ）免疫グロブリンから分離したタンパク質またはその断片を同定すること
とを含んでなり、
それによって免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法をさらに提供する。
【０３０７】
もう１つの形態では、本発明の方法は、
（ａ）被験体に由来するサンプルを免疫グロブリンと結合可能な１種以上の化合物と、結合が生じるのに十分な条件下で一定時間接触させ、１種以上の化合物を単離することを含んでなる方法によって、免疫原性タンパク質またはその断片に対して免疫応答を起こしている被験体によって産生されたサンプルから、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分を得ることと、
（ｂ）タンパク質複合体または免疫グロブリン含有画分中の免疫グロブリンを１種以上の化合物と結合させることと、
（ｃ）結合している免疫グロブリンから免疫原性タンパク質またはその断片を分離することと、
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることと、
（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することと、
（ｆ）場合によっては、（ｄ）および（ｅ）を１回以上反復することと、
（ｇ）免疫グロブリンから分離したタンパク質またはその断片を同定すること
とを含んでなり、
それによって免疫原性タンパク質またはその断片を同定する方法を提供する。
【０３０８】
本方法の一形態では、（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することを、（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることの前に実施する。
【０３０９】
本発明のもう１つの形態では、（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることを、（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することの前に実施する。
【０３１０】
（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることと（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することを、１種以上の免疫原性タンパク質を同定するのに十分な回数反復することが好ましい。例えば、（ｄ）免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルを、結合している免疫グロブリンと接触させることと、（ｅ）免疫原性タンパク質またはその断片を、結合している免疫グロブリンから分離することを、１種以上のタンパク質またはその断片を、ゲル電気泳動、例えば、二次元ゲル電気泳動を用いてゲル上で区別するのに十分な回数反復する。
【０３１１】
本方法の一実施例では、被験体は疾病または疾患を引き起こす病原体に対して免疫応答を起こしている。この実施例によれば、結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルは、疾病もしくは疾患を引き起こす病原体またはその誘導体を含んでなる。
【０３１２】
例えば、疾病または疾患を引き起こす病原体は感染性病原体、例えば、細菌、例えば、結核菌である。
【０３１３】
もう１つの実施例では、被験体は自己免疫状態に苦しんでいる。この実施例によれば、結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルは、自己免疫状態に苦しんでいる被験体に由来するタンパク質を含んでなる。
【０３１４】
さらにもう１つの実施例では、被験体は、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなる、細胞またはその抽出物またはその混合物を含んでなるサンプルで事前に免疫されている。この実施例によれば、結合している免疫グロブリンと接触させる、免疫原性タンパク質またはその断片を含んでなるサンプルは、細胞またはその抽出物を含んでなる。一形態では、被験体はニワトリである。
【０３１５】
本方法の例示的形態では、被験体は、疾病または疾患と関連のある病原体、例えば、感染性病原体、例えば、細菌に由来する細胞または細胞抽出物で事前に免疫されている。一実施例では、細菌は結核菌である。
【０３１６】
本明細書に例示したように、免疫原性タンパク質またはその断片と、免疫グロブリンもしくはその混合物を含んでなるタンパク質複合体または免疫グロブリン画分中の免疫グロブリンを分離することを反復するというプロセスを、免疫原性タンパク質が同定されるまで反復する。あるいは、またはさらに、このプロセスを、十分な数の免疫原性タンパク質または免疫原性タンパク質断片が同定されるまで反復する。
【０３１７】
前述の議論から明らかなように、本発明の方法は、免疫グロブリン画分から免疫原性タンパク質または断片を溶出または分離することと、免疫グロブリン画分を生体サンプルと再度接触させることとを含んでなる。この方法を免疫原性タンパク質を同定するのに必要な回数だけ反復する。例えば、この方法を少なくとも２回、または３回、または４回、または５回、または６回、または７回、または８回または９回反復する。例えば、免疫グロブリン画分から溶出されるか分離された、免疫原性タンパク質または断片を含んでなるサンプルの各々を合わせるか、プールし、それによってサンプル中のタンパク質レベルを高める。場合によっては、本発明のプロセスは、このようなプールされたサンプルを濃縮することをさらに含んでなる。
【０３１８】
サンプルから免疫原性タンパク質または断片を反復して捕獲および溶出することによって、高レベルの前記タンパク質または断片が単離され、これによって免疫原性タンパク質または断片の同定が容易になる。
【０３１９】
さらに、本発明者らは、免疫グロブリンから免疫原性タンパク質を反復して分離することと、免疫グロブリンを、例えば、感染性生物に由来するサンプルと接触させることとによって、感染性生物由来のプロフィールと実質的に似ているタンパク質のプロフィール（例えば、ゲル電気泳動、例えば、２次元ゲル電気泳動を用いて決定されるような）が得られることを見出した。
【０３２０】
場合によっては、本発明の方法は、例えば、ゲル電気泳動、例えば、二次元ゲル電気泳動によって、抗原抗体相互作用によって免疫グロブリン含有画分と結合していたタンパク質を単離することをさらに含んでなる。したがって、免疫グロブリン画分を生体サンプルと反復して接触させ、結合しているタンパク質を分離するステップを、ゲル電気泳動または二次元ゲル電気泳動を用いて、１種以上の免疫原性タンパク質を区別するのに十分な回数反復することが好ましい。
【０３２１】
本発明の方法を用いて単離されたタンパク質を同定する方法は、当技術分野では公知であり、かつ／または前述されており、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）がある。
【０３２２】
本発明者らは、前述のプロセスを用いて、ヒト疾病と関連のある感染性生物から、および自己免疫状態から、いくつかのタンパク質を同定した。
【０３２３】
さらに、本発明者らは、免疫グロブリン画分を生体サンプルと接触させるプロセスを反復することによって、ゲル上に観察され、同定されるタンパク質数と、各タンパク質の量の双方が増加することを示した。本明細書に記載したプロセスが、サンプルから同定される標的タンパク質またはその断片の量および数の増幅において利点を提供することは明確である。
【０３２４】
本発明の方法を用いて同定されたタンパク質の使用
本発明の方法は免疫原性タンパク質またはタンパク質の断片を同定するのに有用であるので、本方法によって、疾病もしくは疾患の診断／予後に有用な疾病もしくは疾患のマーカーまたは疾病もしくは疾患の治療薬が同定される。
【０３２５】
したがって、本発明は状態のマーカーを同定するプロセスにおける本発明の方法の使用を提供する。
【０３２６】
さらに、本発明は状態、例えば、疾病または疾患、例えば、感染性疾病または癌または自己免疫状態などの診断における本発明の方法の使用を提供する。
【０３２７】
例えば、本発明者らは、緑膿菌感染症を患っている被験体において緑膿菌タンパク質ＧｒｏＥＳに対する抗体が検出可能であり、他方、このような抗体は健常な対照被験体には存在しないことがわかった。
【０３２８】
本発明は、本発明の方法を実施することと、疾病または疾患と関連のある病原体から免疫原性タンパク質を同定することと、前記疾病または疾患を治療するために有効量の化合物を投与することとを含んでなる、治療または予防方法をさらに提供する。
【０３２９】
あるいは、免疫原性タンパク質またはその断片を、予防的治療の一形態として、例えば、ワクチン組成物中の抗原として用いることもできる。
【０３３０】
したがって、本発明は、疾病または疾患と関連のある病原体から免疫原性タンパク質または断片を同定する方法を実施することと、免疫原性タンパク質または断片を含んでなるワクチンを製造することとを含んでなるワクチンの製造方法をさらに提供する。
【０３３１】
このようなワクチンは、例えば、アジュバントを含んでなる。適したアジュバントは当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。本発明の一形態では、ワクチンは同定された免疫原性タンパク質または断片と、場合によってはアジュバントとを含んでなる組成物である。このような組成物の成分は当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
【０３３２】
本発明は、
（ｉ）本明細書に記載した方法を用いて免疫原性タンパク質またはその断片を決定することと、
（ｉｉ）状態の診断または予防または治療のための化合物の製造において免疫原性タンパク質またはその断片を用いること
とを含んでなる、状態の診断または治療または予防のための化合物または組成物の製造方法をさらに提供する。
【０３３３】
例えば、本方法は、免疫原性タンパク質またはその断片を単離するさらなるステップを含んでなる。
【０３３４】
本発明は、イン・シリコ分析法および／または本明細書に記載したスクリーニング法をこのようなスクリーニングで同定された化合物または組成物のパイロットスケール製造または工業規模の製造へ移行するための工業プロセスにおける何らかの使用を明確に包含する。本発明はまた、何らかのこのような製造に関する情報の提供を提供する。したがって、本発明は、免疫原性タンパク質または断片または前記の組成物を同定または決定する方法をさらに提供し、この方法は、
（ｉ）本明細書に記載された方法を実施し、それによって免疫原性タンパク質または断片を同定することと、
（ｉｉ）場合によっては、タンパク質またはその断片の構造を決定することと、
（ｉｉｉ）タンパク質もしくはその断片またはそのタンパク質もしくはその断片を含んでなる組成物あるいはタンパク質もしくはその断片またはそのタンパク質もしくはその断片を含んでなる組成物の名称または構造を、例えば、書面で、機械可読形式で、またはコンピュータ可読形式などで提供すること
とを含んでなる。
【０３３５】
当然ながら、公知のタンパク質、断片または組成物については、たとえこれまでにその機能について本発明の提供するスクリーニングを用いて調べられていなくとも、化合物の構造の決定は、前記のステップ（ｉ）に内含されている。これは、スクリーニングを実施する時点で当業者には化合物の名称および／または構造が明らかであるからである。
【０３３６】
本明細書において、用語「免疫原性タンパク質または断片または組成物を提供すること」とは、その免疫原性タンパク質または断片または組成物を製造するためのいずれかの化学的および／または組換えおよび／または合成手段、あるいは、いずれかの人物または手段によってこれまでに合成されている免疫原性タンパク質または断片または組成物の提供を含むと取られるものとする。
【０３３７】
好ましい実施形態では、本明細書に記載されたスクリーニングによって求められるような、免疫原性タンパク質または断片または組成物あるいは免疫原性タンパク質または断片または組成物の名称または構造を、その用途に応じた指示とともに提供する。
【０３３８】
本発明は前記の免疫原性タンパク質または断片または組成物を製造するプロセスをさらに提供し、この方法は、
前記の免疫原性タンパク質または断片または組成物を同定または決定するプロセスを含んでなり、この方法は、
（ｉ）本明細書に記載された方法を実施し、それによって状態の診断または治療または予防のための免疫原性タンパク質または断片または組成物を同定または決定することと、
（ｉｉ）場合によっては、免疫原性タンパク質または断片または組成物の構造を決定することと、
（ｉｉｉ）場合によっては、免疫原性タンパク質または断片または組成物の名称または構造を、例えば、書面で、機械可読形式で、またはコンピュータ可読形式などで提供することと、
（ｉｖ）免疫原性タンパク質または断片または組成物を提供すること
とを含んでなる。
【０３３９】
好ましい実施形態では、合成されたか製造された免疫原性タンパク質または断片または組成物あるいは免疫原性タンパク質または断片または組成物の名称または構造を、その用途に応じた指示とともに提供する。
【０３４０】
本発明は、状態の診断、治療または予防のための免疫原性タンパク質または断片または組成物の製造方法をさらに提供し、これは
（ｉ）状態の診断または治療または予防のための候補免疫原性タンパク質または断片または組成物を決定することと、
（ｉｉ）状態の治療または診断のための治療薬または予防薬または診断薬の製造において免疫原性タンパク質または断片または組成物を用いること
とを含んでなる。
【０３４１】
一実施形態では、本方法は候補免疫原性タンパク質または断片または組成物を単離するさらなるステップを含んでなる。あるいは、同定された免疫原性タンパク質または断片または組成物を、状態の診断または治療または予防のための、免疫原性タンパク質または断片または組成物の製造において使用するために製造する。
【０３４２】
本発明を以下の限定するものではない実施例を参照してさらに説明する。
【実施例１】
【０３４３】
結核被験体の血清における結核菌グルタミンシンセターゼの同定
１．１  サンプル調製
−８０℃で保存した１．５ｍｌの患者血清を室温で解凍し、次いで、２０ｍＭのリン酸バッファー、ｐＨ７で予め平衡化しておいたタンパク質Ｇ−Ｓセファロース（アマシャム・バイオサイエンシズ、オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、キャッスルヒル）の２ｍｌカラムにアプライし、氷上で時折反転させながら３０分間インキュベートした。この混合物を４℃、６０００ｇで１０分間回転させ、上清をデカントした。Ｓセファロースペレットを２０ｍＭのリン酸バッファーで洗浄した。５０ｍＭグリシンｐＨ２．７を加えることによってＳセファロースに結合しているＩｇＧを２０分間溶出した。前記のように遠心分離した後、上清を廃棄し、グリシンステップを反復した。この２回目のグリシン溶出からの上清を回収し−８０℃で保存した。
【０３４４】
解凍した溶出物でブラッドフォードタンパク質アッセイを実施し、３０ミリグラムの免疫グロブリン画分をセファクリル(Sphacryl)Ｓ−２００高分解能ゲル濾過カラム（アマシャム・バイオサイエンシズ）にロードする。３０００〜１４００００ＭＷの範囲の画分を回収し、１５００００ＩｇＧ画分は排除する。これらの画分をプールし、−２０℃で１０容量の冷アセトンを用いて４８時間沈殿させ、次いで、４℃、５０００ｇで２０分間遠心分離する。沈殿を５Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、２％ＳＢ３−１０および４０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含有するサンプルバッファー１〜２ｍｌに再可溶化し、次いで、同時に１時間、５ｍＭトリブチルホスフィンを用いて還元し、１０ｍＭアクリルアミドを用いてアルキル化する。サンプルを２５０μｌアリコートに分注し、−８０℃で保存する。
【０３４５】
１．２  サンプルの二次元ゲル電気泳動
サンプルのタンパク質含量は、ブラッドフォードアッセイを用いて推定した。サンプルを、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓを５ｍＭ  Ｔｒｉｓに置き換えた前記のサンプルバッファーを用いて２ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【０３４６】
ＩＰＧストリップを再水和する前に、サンプルを２１０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、指示染料として１ｍｌ当たり１０μｌの１％オレンジＧ（シグマ）を加えた。
【０３４７】
第１の次元
乾燥した１１ｃｍのＩＰＧストリップ（アマシャム−バイオサイエンシズ）を、１８０μｌのタンパク質サンプルで１６〜２４時間再水和した。再水和したストリップをプロテアンＩＥＦセル(Protean IEF Cell)（バイオラッド、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）またはプロテオーム・システム(Proteome System)のイソエレクトルＩＱ(IsoElectrIQ)電気泳動装置で、最大１０ｋＶで約１４０ｋＶ時間フォーカスした。次いで、フォーカスしたストリップを尿素／ＳＤＳ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ブロモフェノールブルーバッファー中で平衡化した。
【０３４８】
第２の次元
平衡化したストリップを６〜１５％（ｗ／ｖ）のｔｒｉｓ−アセテートＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャスト１０ｃｍ×１５ｃｍゲルチップス(GelChips)（プレテオーム・システムス、オーストラリア、シドニー）のローディングウェルに挿入した。ゲル当たり５０ｍＡで１．５時間か、追跡用色素がゲルの底部に到達するまで電気泳動を実施した。シプロルビー(SyproRuby)（モレキュラー・プローブス(Molecular probes)）を用いてタンパク質を染色した。脱染した後、アルファイメージャー・システム(AlphaImager System)（アルファ・イノテック社(Alpha Innotech Corp.)）を用いてゲル画像をスキャンした。次いで、その後の解析におけるタンパク質スポットの可視化を補助するためにクマシーＧ−２５０でゲルを染色した。
【０３４９】
ゲル画像の一例を図１に示す。
【０３５０】
１．３  タンパク質同定
結核感染症を患っている被験体から得た血清サンプルにおいていくつかのタンパク質を観察した。次いで、質量分析を用いてこれらのタンパク質を同定した。
【０３５１】
質量分析の前に、インゲルトリプシン消化によってタンパク質サンプルを調製した。エクサイズ(Xcise)（商標）、切り出し／液体処理ロボット（プロテオーム・システムス、オーストラリア、シドニーおよびシマヅバイオテック、日本、京都）を、モンタージュ・インゲル消化キット(Montage In-Gel Digestion Kit)（プロテオーム・システムスによって開発され、ミリポア、米国、０１８２１、マサチューセッツ州、ビレリカによって流通されている）と関連して用いて、タンパク質ゲル小片を切り出し、脱染し、消化し、脱塩した。一定の大きさを維持し、乾燥を防ぐために、スポットを切断する前には、２−Ｄゲルを水中でインキュベートした。続いて、２−Ｄゲルをエクサイズに置き、デジタル画像を獲得し、切断するスポットを選択した。自動的にスポットを切り出した後、ゲル小片を自動液体処理およびインゲル消化に付した。簡単には、各スポットを５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル１００μｌで脱染した。ゲル小片を１００％アセトニトリルを加えることによって乾燥させ、５秒後アセトニトリルを除去し、３７℃で残存するアセトニトリルを蒸発させることによってゲルを完全に乾燥させた。乾燥させたゲル小片を５μｇ／ｍｌの修飾ブタトリプシンを含有する２０ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）３０μｌで再水和させ、３０℃で一晩インキュベートすることによってタンパク質分解による消化を行った。
【０３５２】
液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）ＭＳによるさらなる解析が必要であった場合には、１０μｌのトリプシンペプチド混合物をきれいなマイクロタイタープレートに取り出した。
【０３５３】
トリプシンペプチドを自動脱塩および濃縮し、次いで、Ｃ１８ジップチップ(ZipTip)（ミリポア、マサチューセッツ州、ベッドフォード）を用いてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを実施した。９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルおよび０．０８５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡに溶かした２ｍｇ／ｍｌα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸２μｌを用いて、吸着されたペプチドをチップから３８４位置ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦサンプルターゲットプレート（クラトス(Kratos)、英国、マンチェスターまたはブルカー・ダルトニクス(Bruker Daltronics)、ドイツ）上に溶出した。
【０３５４】
消化物を、アキシマ(Axima)−ＣＦＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（クラトス、英国、マンチェスター）を正イオンリフレクトロンモードで用いて解析した。波長３３７ｎｍの窒素レーザーを用いてサンプルに照射した。各サンプルスポットに６４ポイントラスターを適用して、質量範囲６００Ｄａ〜４０００Ｄａの自動モードでスペクトルを獲得した。特定の基準を通るスペクトルのみをセーブした。すべてのスペクトルに、自己消化トリプシンピーク質量、ｍ／ｚ８４２．５１Ｄａとスパイクした副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）ペプチド、ｍ／ｚ２４６５．１１７Ｄａを用いて内部二点較正を行った。ウェブベースのプロテオミック・データ・マネージメント・システム・バイオインインフォーマットＩＱ(BioinformatIQ)（商標）（プロテオーム・システムス）に含まれる、プロテオーム・システムスによって設計されたソフトウェアを用いて、ＭＳスペクトルから同位体ピークを抽出した。
【０３５５】
タンパク質同定は、イオンＩＱ(IonIQ)データベース検索ソフトウェア（プロテオーム・システム社、オーストラリア、シドニー、ノースライド）を用いてトリプシンペプチドの単一同位体質量（すなわち、ペプチド質量フィンガープリント）をタンパク質データベースからの理論質量とマッチングすることによって実施した。クエリーは非冗長スイスプロット(SwissProt)（リリース４０）およびＴｒＥＭＢＬ（リリース２０）データベース（２００２年６月バージョン）に対して行い、ＭＯＷＳＥスコアリングシステムの変更によってタンパク質の正体をランク付けした。プロピオンアミド−システイン（ｃｙｓ−ＰＡＭ）またはカルボキシアミドメチル−システイン（ｃｙｓ−ＣＡＭ）および酸化メチオニン修飾を考慮し、１００ｐｐｍの質量許容誤差を認めた。
【０３５６】
ミス切断部位は、ミス切断が行われていない最初の検索の後でのみ考慮した。以下の基準を用いて検索結果を評価した：ＭＯＷＳＥスコア、候補タンパク質をマッチングするペプチドの数および強度、マッチングペプチドによる候補タンパク質配列のカバレージおよびゲル位置。
【０３５７】
さらに、またはあるいは、タンパク質をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて解析した。タンパク質のトリプシン消化溶液（１０μｌ）を、オートサンプラーとポンプからなるサーベイヤー(Surveyor)ＬＣシステムを備えたＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計（サーモフィニガン(ThermoFinnigan)、カリフォルニア州、サンジョセ）を用いるナノフローＬＣ／ＭＳによって解析した。ペプチドは、Ｃ１８ピコフリット(PicoFrit)カラム(ニュー・オブジェクティブ(New objective))に連結させたペップファインダー(PepFinder)キット（サーモ−フィニガン）を用いて分離した。３０〜６０分間かけて、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有する水（移動相Ａ）から０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有する９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（移動相Ｂ）への勾配溶出を行った。質量分析計は３スキャンイベント−１つのフルスキャン（４００〜２０００ａｍｕの範囲）、とそれに続く２つのデータ依存ＭＳ／ＭＳスキャンを獲得するようセットした。
【０３５８】
タンパク質は、ＳＥＱＵＥＳＴ（バイオワークス(BioWorks)３．１、サーモ−フィニガン）ソフトウェアを用いて同定した。ペプチドは、実験断片イオンの半分より多くが理論イオン値とマッチしたＭＳ／ＭＳスペクトルから同定し、それぞれ、２．２、０．２および４００より大きい、相互相関（トップ候補ペプチドの生相関スコア）、デルタ相関（上位２つの候補ペプチド間の相関の差）および予備スコア（候補ペプチドのランク付けに用いた生スコア）値を与えた。
【０３５９】
この方法を用いて、ＴＢ被験体の免疫グロブリン画分において４９．７ｋＤａのタンパク質を同定した。このタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて解析し、表１に示される断片（配列番号６〜１１）を同定した。
【０３６０】
【表１】
2007520688.tif 000002
【０３６１】
この情報を用いて配列データベースを検索し、単離したタンパク質スポットは仮定結核菌グルタミンシンセターゼタンパク質（配列番号１２）であると予測した。このことが、この方法が感染症または自己免疫疾患などの疾患の診断／予後、治療または予防において特に役立つタンパク質の単離および同定において役立つということを実証するのは明確である。
【実施例２】
【０３６２】
サンプル調製および免疫グロブリン単離の代替法
−８０℃で保存した１．５ｍｌの患者血清を室温で解凍し、次いで、２０ｍＭのリン酸バッファーｐＨ７で予め平衡化しておいたタンパク質Ｇ−セファロース（アマシャム・バイオサイエンシズ）の２ｍｌカラムにアプライし、氷上で時折反転させながら３０分間インキュベートした。この混合物を４℃、６０００ｇで１０分間回転させ、上清をデカントした。セファロースペレットを２０ｍＭのリン酸バッファーで洗浄した。５０ｍＭグリシンｐＨ２．７を加えることによってセファロースに結合しているＩｇＧを２０分間溶出した。前記のように遠心分離した後、上清を廃棄し、グリシンステップを反復した。この２回目のグリシン溶出からの上清を回収し−８０℃で保存した。
【０３６３】
サンプルを調製した後、本質的には実施例１に記載したように、二次元電気泳動を用いてタンパク質を分離し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて免疫原性タンパク質を同定する。
【実施例３】
【０３６４】
ＴＢを患っている被験体からの免疫原性タンパク質の単離
３．１  サンプル調製
ＡＫＴＡエクスプローラー(Explorer)（アマシャム・バイオサイエンシズ）に取り付けた１ｍｌのタンパク質Ａカラムを用いて、結核菌およびＨＩＶに感染した患者から得た血清（１．８ｍｌ）を精製した。簡単には、サンプルを８．２ｍｌのイムノピュア(Immunopure)ＩｇＧ結合バッファー（ピエルスカトログ番号２１００１）に希釈し、次いで、０．２２μｍフィルターを通して濾過し、次いでカラムにアプライした。結合している抗体の溶出はイムノピュア・ジェントルＡｇ／Ａｂ溶出バッファー（ピエルスカタログ番号２１０２７）を用いて行った。溶出された画分をプールし（抗原に結合しているＩｇＧ）、氷上で３時間静置し、免疫複合体を解離させた。１００，０００分子量カットオフカラム（ミリポア）を通して濾過することによって抗原画分からＩｇＧ画分を分離した。画分とタンパク質Ａカラムからのフロースルーの双方を、ベンゾイル化透析膜（シグマＤ−２２７２）を用いて４リットルのリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．２に対して４℃で一晩、次いでさらに４リットルに対して３時間透析した。すべての画分（１００，０００カットオフカラムからのフロースルーおよび保持物ならびにタンパク質Ａカラムからのフロースルー）を、１０割合のアセトン対１割合のサンプルという割合で−２０℃で１時間アセトン沈殿させ、次いで、４０００ｇで２０分間回転させた。沈殿したサンプルを５Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳ、２％ＳＢ３−１０および４０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含有するサンプルバッファーに可溶化し、約２ｍｇ／ｍｌの最終濃度とし、次いで、同時に１．５時間、５ｍＭトリブチルホスフィンを用いて還元し、１０ｍＭアクリルアミドを用いてアルキル化した。アルキル化反応はＤＴＴを最終濃度１０ｍＭまで添加してクエンチした。サンプルを２００μｌロットに分注し、−２０℃で保存した。
【０３６５】
３画分各々の２００μｌアリコートに２μｌの１％オレンジＧ追跡用色素を加え、１６，１００ｒｃｆで２０分間遠心分離した。
【０３６６】
３．２  ゲル電気泳動
第１の次元
乾燥アマシャム・バイオサイエンシズ１１ｃｍｐＩ３〜１０ＩＰＧを、上清を用いて約２４時間再水和した。
【０３６７】
再水和したストリップをプロテアンＩＥＦセル（バイオ−ラッド、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）またはプロテオーム・システムスのイソエレクトルＩＱ電気泳動装置で最大１０ｋＶで約１０９５００ボルト時間フォーカスした。次いで、フォーカスしたストリップを尿素／ＳＤＳ／Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ブロモフェノールブルーバッファー中で平衡化した。
【０３６８】
第２の次元
平衡化したストリップを６〜１５％（ｗ／ｖ）のｔｒｉｓ−アセテートＳＤＳ−ＰＡＧＥプレキャスト１０ｃｍ×１５ｃｍゲルチップス（プレテオメ・システムス、オーストラリア、シドニー）のローディングウェルに挿入した。ゲル当たり５０ｍＡで１．５時間か、または追跡用色素がゲルの底部に到達するまで電気泳動を実施した。シプロルビー（モレキュラー・プローブス）を用いて保持物およびフロースルー画分からのゲルを染色した。脱染した後、アルファイメージャー・システム（アルファ・イノテック社）を用いてゲル画像をスキャンした。溶出画分からのゲルを、シェフチェンコ(Shevchenko)らのプロトコール（アナリティカル・ケミストリー(Analitical Chemistry)１９９６年３月１日、６８（５）、８５０〜８頁）にしたがって銀で染色した。ゲル画像をＵＭＡＸフラットベッドスキャナーを用いてスキャンした。ゲルの一例が図２に示されており、これでは、等電点が約５．２８であり、分子量が約４３５９０ダルトンのタンパク質がマークされている。次いで、このタンパク質スポットをさらに解析した。
【０３６９】
３．３  質量分析
質量分析に先立って、インゲルトリプシン消化によってタンパク質サンプルを調製した。溶出画分からタンパク質ゲル小片を手動で切り出し、５０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3／５０％アセトニトリルで脱染した。９６ウェルマイクロタイタープレートに入れた各ゲル小片にこの溶液１００μｌを添加し、振盪プラットフォーム上に２０分間置いた。次いで、脱染手順をもう一度反復した。ゲル小片を５０℃のオーブン中で２０分間乾燥させた。次いで、２５ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3および０．１％ｎ−オクチル−グリコシドに溶かした０．０２μｇ／μｌトリプシン２．５μｌを各乾燥ゲル小片に加えた。サンプルを氷上に４０分間静置した。次いで、各ウェルに２５ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3／０．１％ｎ−オクチル−グリコシド１０μｌを加え、反応物を３０℃で一晩静置した。各ウェルに１５μｌの０．１％ＴＦＡを加え、プレートを超音波水浴中で１５分間超音波処理した。ＴＦＡ抽出および超音波ステップを一度反復した。さらに１０分間超音波を実施し、トリプシンペプチドを含有するサンプル溶液１２μｌを新しいプレートに移した。
【０３７０】
タンパク質をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて解析した。タンパク質のトリプシン消化溶液（１０μｌ）を、オートサンプラーとポンプからなるサーベイヤーＬＣシステムを備えたＬＣＱ  Ｄｅｃａイオントラップ質量分析計（サーモフィニガン、カリフォルニア州、サンジョセ）を用いるナノフローＬＣ／ＭＳによって解析した。ペプチドは、Ｃ１８ピコフリットカラム(ニュー・オブジェクティブ)に連結させたペップファインダーキット（サーモ−フィニガン）を用いて分離した。３０分間かけて、０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有する水（移動相Ａ）から０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を含有する９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（移動相Ｂ）への勾配溶出を行った。質量分析計は３スキャンイベント−１つのフルスキャン（４００〜２０００ａｍｕの範囲）、とそれに続く２つのデータ依存ＭＳ／ＭＳスキャンを獲得するようセットした。この方法を用いて、これまでに同定したタンパク質スポットのペプチドのマススペクトルを調べた。このようなペプチドのマススペクトルを図３に示す。
【０３７１】
３．４  タンパク質同定
タンパク質は、ＳＥＱＵＥＳＴ（バイオワークス３．１、サーモ−フィニガン）ソフトウェアを用いて同定した。ペプチドは、実験断片イオンの半分より多くが理論イオン値とマッチしたＭＳ／ＭＳスペクトルから同定し、それぞれ、２．２、０．２および４００より大きい、相互相関（トップ候補ペプチドの生相関スコア）、デルタ相関（上位２つの候補ペプチド間の相関の差）および予備スコア（候補ペプチドのランク付けに用いた生スコア）値を与えた。
【０３７２】
ＳＥＱＵＥＳＴ配列決定によりペプチド配列（Ｋ）ＬＬＤＱＧＱＡＧＤＮＶＧＬＬＬＲ（配列番号１５）（ｍ／ｚ１６８２．９２）（スイスプロット受託番号Ｐ３１５０１）に対してマッチが示された。
【０３７３】
この方法を用いて、ＴＢ被験体において４３．５９ｋＤａのタンパク質を同定した。このタンパク質をＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳを用いて同定し、結核菌の伸長因子Ｔｕタンパク質（配列番号１４）を同定した。
【実施例４】
【０３７４】
ＣＦ被験体からの免疫原性病原体由来タンパク質の同定
嚢胞性繊維症を患っている被験体は、緑膿菌に感染しやすい傾向がある。このような感染症を診断するのに有用であり得る緑膿菌に由来するタンパク質を同定するために、ＣＦ被験体から免疫グロブリン画分を単離し、これを用いて感染性細菌に由来する免疫原性タンパク質を同定した。
【０３７５】
４．１  生体サンプル
ＣＦ被験体から得た全血サンプルから粗血漿を得る。捕獲カラムから得た用いた粗血漿は、２２〜３７歳の年齢群の４人の増悪ＣＦ成人から合わせたものである。予測ＦＥＶ1値は、２２〜６５％の間であり、被験体は過去１２ヶ月において２〜４の増悪を起こしていた。微生物学的試験によって、本研究に用いたすべての成人ＣＦ被験体が、肺で成長した多量の緑膿菌を持っていることがわかった。さらに、一人のＣＦ成人には、肺の黄色ブドウ球菌感染もあった。
【０３７６】
健常な対照およびＣＦ被験体から生理食塩水で誘導した痰を回収し、続いて液化した。得られたサンプルをプールし、アルコール沈殿させ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ｃｈａｐｓ、１０ｍＭ  ｔｒｉｓに再可溶化させた。サンプルを還元し、５ｍＭ  ＴＢＰ  １０ｍＭアクリルアミドで１時間アルキル化した。続いて、サンプルを１００ｋｄａおよび５ｋｄａスピンカラムで回転させ、その後捕獲したタンパク質を２ＤＥアレイによって配置した。
【０３７７】
免疫捕獲に用いる痰：２２歳と３１歳の２人の増悪ＣＦ被験体から痰サンプルをプールした（合計１６ｍｌ）。それらの予測ＦＥＶ1値は１４％と５１％であり、過去１２ヶ月において１〜２の増悪の治療を受けていた。微生物学的試験により、両患者の肺に多量の緑膿菌が示された。さらに、２人の患者のうち一方は、多量の黄色ブドウ球菌も含んでいた。プールした痰を３０ｍＭのＩＡＡとともにインキュベートし、液化プロトコールに用いた残存するＤＴＴを不活化し、タンパク質Ｇ結合セファロースビーズを製造業者（アマシャム・ファルマシア（スウェーデン、アップサラ））によって推奨されるように用いることによってＩｇＧを枯渇させた。
【０３７８】
４．２  緑膿菌に由来するタンパク質の調製
緑膿菌ＰＡ０１の一晩培養物（２００ｍＬ  ＡＴＣＣ培養物）を遠心分離（４０００ｇ、室温で２０分間）によってペレットにした。沈殿した細胞を水中で２回洗浄し、溶解バッファーＡ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％スクロース）＋プロテアーゼ阻害剤（１×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル、ロシュ・ディアグノティクス(Roche Diagnostics)、スイス、バーゼル）に再懸濁した。細胞を、ブランソン・ソニファイアー(Branson sonifier)、モデル２５０−４５０を用いて最大振幅の７０％を用いて４×１０秒間溶解し、破壊されていない細胞を遠心分離（４０００ｇ、１０分、４℃）によってペレットにした。タンパク質のアセトン沈殿の前に、得られた上清を用いて別の遠心分離ステップを実施した。沈殿したタンパク質を１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２に再可溶化した。
【０３７９】
膜タンパク質：膜タンパク質を、プロテオプレップ(ProteoPrep)膜抽出キットを本質的には製造業者（プロテオーム・システムス、米国、ウォバーン）によって推奨されるように用いて抽出した。しかし、最後の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３洗浄後に得られたペレットは、トライトン−Ｘ、１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５および２０ｍＭ  ＤＴＴを含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４に再懸濁した。可溶化した後、サンプルを６０ｍＭヨードアセトアミドとともに室温で２時間インキュベートした。
【０３８０】
４．３  免疫捕獲カラムの調製
５人の増悪ＣＦ患者から得た合計５ｍＬのプールした血漿（全タンパク質濃度約４０ｍｇ／ｍＬ）から免疫捕獲カラムを作製した。プールした血漿をタンパク質Ｇセファロースの５０％スラリー１０ｍＬとともにインキュベートすることによってＩｇＧをタンパク質Ｇセファロースに結合させた。マトリックスを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で洗浄し、ＤＳＳを利用して、結合しているＩｇＧを不可逆的に固定化した。
【０３８１】
４．４  緑膿菌に由来する免疫原性タンパク質の捕獲
捕獲カラムを天然緑膿菌タンパク質抽出物（６．３）とともに一定回転下、４℃で一晩インキュベートし、続いて、ビーズを遠心分離によって回収した。フロースルーを回収し、その後のインキュベーションステップのために確保した（タンパク質抽出物は、各捕獲において捕獲カラムに３回通した）。回収したビーズを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で３回洗浄し、５０ｍＭグリシンｐＨ２．７を用いて捕獲したタンパク質を溶出した。カラムは、最初５０ｍＭグリシンｐＨ２．７、次いで１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２で広範に洗浄し、その後のインキュベーションステップを続けた。
【０３８２】
溶出したタンパク質をアルコール沈殿させ（エタノールを１：１０の割合で用いて）、続いて、プロテオプレップ・ユニバーサル抽出キット（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）の細胞膜および生物膜可溶化試薬(Cellular and Organelle Membrane solubilizing reagent)に再可溶化させた。プロテオプレップ・キットの使用説明書にしたがって、可溶化したタンパク質を、それぞれ最終濃度５ｍＭトリ−ｎ−ブチルホフィンおよび１０ｍＭ  アクリルアミドを用いて還元し、アルキル化した。
【０３８３】
４．５  二次元ゲル電気泳動
１１センチメートルｐＨ３〜１０またはｐＨ４〜７ＩＰＧをアマシャム（スウェーデン、アップサラ）から購入した。等電点電気泳動法をプロテオーム・システムス（マサチューセッツ州、ウォバーン）のイソエレクトルＩＱ2ユニットを用いて製造業者の使用説明書のとおり実施した。二次元６〜１５％または１４％均質Ｔｒｉｓ−アセテートゲルチップゲルを製造業者（プロテオーム・システムス、マサチューセッツ州、ウォバーン）によって推奨されるように実施した。配置されたタンパク質を銀染色によって可視化した（シェフチェンコら、アナリティカル・ケミストリー、６８、８５０〜８５８頁、１９９６）。
【０３８４】
４．６  ＭＳ解析
注目するタンパク質スポットを切り出し、１００ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3：５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）ｐＨ８．２中で２回洗浄し、５０℃で３０分間脱水した。タンパク質をカタヤマら、ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー、１５、１４１６〜１４２１頁、２００１によって記載されたように消化し、３７℃で３時間消化した。超音波処理によってトリプシンペプチドを抽出し、クスマン(Kussmann)らによって記載されたように精製した。ペプチドは約１．５μｌのＭＡＬＤＩマトリックス溶液（７０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ、１．５ｍｇ／ｍｌα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シグマ、ミズーリ州、セントルイス））で溶出した。アキシマＣＦＲ（クラトス、英国、マンチェスター）を用いるマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）またはＡＢＩ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ（ＡＭＥバイオサイエンス(Biocience)、英国、ロンドン）によってペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）を作製した。
【０３８５】
４．７  結果
図４に示したように、免疫捕獲カラムを用いて緑膿菌タンパク質抽出物から６種の免疫原性タンパク質を捕獲した。これらのタンパク質をＭＳを用いて解析した。トリプシン消化後、ペプチドマスフィンガープリンティングを用いて以下のペプチドを同定した。
【０３８６】
【表２】
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【０３８７】
その結果、タンパク質を緑膿菌由来タンパク質であると確認した。タンパク質スポット番号６は、緑膿菌ＧｒｏＥＳ（配列番号２５）と同定した。
【実施例５】
【０３８８】
緑膿菌感染症を患っている被験体を調べるための、同定した緑膿菌タンパク質の使用
緑膿菌ＧｒｏＥＳのアリコートを実施例４に記載した２−ＤＥアレイから切り出し、Ｈ2Ｏおよび１ｍＭ  ＤＴＴ中で洗浄した。タンパク質を０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＤＴＴ中、４℃で激しく振盪することによる２晩連続のインキュベーションによって抽出し、沈殿させ、５０μｌのＰＢＳに再可溶化した。６μｌの抽出したタンパク質のみをニトロセルロースメンブランストリップ（バイオラッド、米国、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）にアプライした。メンブランは使用前に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０ｐＨ９．０中５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを用いてブロッキングした。その後の抗原性標的の位置決定のためにアンカーをメンブランにアプライした。健常な対照およびＣＦ被験体から得た粗血漿を、０．５％（ｗ／ｖ）スキムミルクを含有するＰＢＳＴバッファー（１０ｍＭ  ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０）で１：３希釈し、０．２２μｍＰＶＤＦメンブラン（ミリポア）を通して濾過した。ケミカルプリンタ、ＣｈＩＰ（商標）（プロテオーム・システムス社、オーストラリア、シドニーおよびシマズ・バイオテック、日本、京都）を用いて、０．１５μＬの１：３血漿アリコートの５アプリケーションを、固定化した病原性タンパク質、ＰＢＳおよび１００ｎｇ  ＢＳＡ上に分注した。各スポット位置が１人の患者サンプルに相当する、４または５スポット位置を含むグリッドアレイを、メンブランの標的上にプリントした。ＸおよびＹ座標はソフトウェアイマジェップ(Imagep)ＩＱ（商標）バージョン１．０（プロテオーム・システムス社、オーストラリア、シドニー）を用いて定めた。約１００μＬのＰＢＳＴを用いて過剰の血漿タンパク質を洗い流した。結合している抗体を、ＰＳＢＴ−Ｍバッファー中１：５００００のＨＲＰコンジュゲートウサギ抗ヒトＩｇＧ（ケミコン・オーストラリア社、オーストラリア、ビクトリア）０．１μｌをプリンティングすることによって検出した。次いで、化学発光を検出した。プリントされるグリッドアレイの大きさは固定化した抗原性標的の面積に応じて変わり、本研究では、直径約５ｍｍであった。
【０３８９】
緑膿菌ＧｒｏＥＳに対する、５人の患者の血清学的免疫応答性を、ケミカルプリンタ、ＣｈＩＰ（商標）を用いて調べた。図６に示したように、血清学的に非応答性である健常な対照とは対照的に、スクリーニングしたＣＦ被験体すべてが、病原性タンパク質に関して免疫応答性であり、したがって、このことは、ＣＦ被験体では、これらの病原体がコードするタンパク質の発現は臨床上関連があるということを支持する。
【実施例６】
【０３９０】
ＣＦの自己免疫応答において認識されるタンパク質の同定
ＣＦ被験体から単離した痰（実施例４に記載した）を、本質的には、実施例４に記載したような免疫捕獲実験に用いた。図５に示したように、ＣＦ被験体の痰から１４種のタンパク質を単離した。ＭＳおよび配列解析を用いて同定したところ、これらのうち９種がヒト起源であることがわかった。スポット番号３のＭＳ解析の結果、タンパク質の３９％をカバーする６種のマッチングペプチドが同定された。次いで、このタンパク質をヒトカルグラヌリン(calgranulin)Ｂ（配列番号２６）と同定した。スポット１およびスポット２も、ヒトカルグラヌリンＢと同定された。これらの結果により、本発明の方法は被験体自身の免疫系によって認識されるタンパク質を同定するのに有用であることが示唆される。
【実施例７】
【０３９１】
免疫原性結核菌タンパク質を同定するための、ニワトリの免疫化
７．１  抗体作製
結核菌株ＣＤＣ１５５１を、グリセロール−アラニン−塩（ＧＡＳ）培地で後期対数期（１４日）に増殖させ、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄し、γ照射によって不活化した。次いで、細胞を８ｍＭ  ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤（ペプスタチン、ロイペプチンおよびＰＭＳＦ）、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼを含有するＰＢＳバッファーに再懸濁し（２ｇ／ｍｌ）、その後、フレンチプレスまたはプローブ超音波処理によって約９０％の細胞を破壊する（抗酸性染色法によってモニターする）。細胞溶解物を３，０００ｇで遠心分離して破壊されていない細胞をペレットとし、上清を単離した。ＢＣＡタンパク質アッセイを用いて各画分のタンパク質含量を定量し、アリコートを−８０℃で保存する。培養上清を０．２ミクロンのフィルターに通し、分子量カットオフが１０，０００Ｄａのメンブランを用いるアミコン(Amicon)限外濾過によってタンパク質含量を濃縮した。濃縮した物質を、０．０１Ｍ重炭酸アンモニウムに対して透析し、ＢＣＡタンパク質アッセイで定量し、分注し、凍結乾燥し、−８０℃で保存する。等量の培養濾液と全細胞抽出物とを合わせ、１ｍｇ／ニワトリの濃度でニワトリに注射した。４回接種した後（１回／月）、卵を回収し、壊して開き、硫酸アンモニウム沈殿によってＩｇＹ抗体を回収した。
【０３９２】
７．２  抗原捕獲カラムの調製
５×１０ｍｇの硫酸アンモニウム精製したＩｇＹ抗体を用い、ピエルスカルボリンク(CarboLink)（商標）キットを用いて５つのＩｇＹ固定化カルボリンク（商標）ゲルを作製した。続いて、各ゲル内のアガロースをプールして総容積１０ｍｌとした。このプールしたカラムを以後ＩｇＹ捕獲カラムと呼ぶ。
【０３９３】
７．３  痰または血漿タンパク質のアフィニティー精製
７．３．１  痰タンパク質
中国人のＴＢ被験体から得た１０．８ｍｌの痰に最終濃度３０ｍＭのヨードアセトアミドを２時間添加した。１０．６ｍｌのヨードアセトアミド処理した痰を、プールしたＩｇＹ捕獲カラムにアプライし、回転しながら４℃で一晩インキュベートした。残りの０．２ｍｌの痰は−８０℃で保存し、後にブラッドフォードタンパク質測定アッセイに用いた。結合しない中国人の痰の抗原（フロースルー）を、カラムを４０００ｇで１０分間遠心分離することで回収し、同じＩｇＹ捕獲カラムでの連続２晩のインキュベート用に確保した。ＩｇＹ捕獲カラムを４倍の総容積のＰＢＳで洗浄した。捕獲したタンパク質は５０ｍＭグリシンｐＨ２．７で溶出した。３回の一晩インキュベーションのうちの２回目のためにフロースルーを添加する前に、カラムを３倍の総容積のＰＢＳで再生した。フロースルー、ＰＢＳおよびグリシン洗浄液のタンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて求めた。溶出したタンパク質をアルコール沈殿させ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳおよび４０ｍＭ  Ｔｒｉｓに再懸濁した。可溶化したタンパク質を、それぞれ最終濃度５ｍＭトリ−ｎ−ブチルホフィンおよび１０ｍＭアクリルアミドで還元し、アルキル化した。還元し、アルキル化したタンパク質サンプルを、６倍容積の７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳおよび４０ｍＭ  Ｔｒｉｓを用いて１００ｋＤａミリポア超遠心カラムを通して洗浄した。次いで、１００ｋＤａフロースルーを５ｋＤａミリポア超遠心カラムにアプライし、０．３ｍｌに濃縮し、２次元ゲル電気泳動に用いた。
【０３９４】
７．３．２  血漿タンパク質
１０．６ｍｌの中国人血漿を、プールしたＩｇＹ捕獲カラムにアプライし、回転しながら４℃で一晩インキュベートした。結合しない中国人血漿抗原（フロースルー）を、カラムを４０００ｇで１０分間遠心分離することで回収し、同じＩｇＹ捕獲カラムでの２連続の一晩インキュベート用に確保した。ＩｇＹ捕獲カラムを４倍の総容積のＰＢＳで洗浄した。捕獲したタンパク質は５０ｍＭグリシンｐＨ２．７で溶出した。３回の一晩インキュベーションのうちの２回目のためにフロースルーを添加する前に、カラムを３倍の総容積のＰＢＳで再生した。フロースルー、ＰＢＳおよびグリシン洗浄液のタンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイを用いて求めた。溶出したタンパク質をアルコール沈殿させ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％ＣＨＡＰＳおよび４０ｍＭ  Ｔｒｉｓに再懸濁した。可溶化したタンパク質を、それぞれ最終濃度５ｍＭトリ−ｎ−ブチルホフィンおよび１０ｍＭアクリルアミドで還元し、アルキル化した。
【０３９５】
７．４  二次元ゲル電気泳動
１１センチメートルｐＨ３〜１０またはｐＨ４〜７ＩＰＧをアマシャム（スウェーデン、アップサラ）から購入した。等電点電気泳動法をプロテオーム・システムス（マサチューセッツ州、ウォバーン）のイソエレクトルＩＱ2ユニットを用いて製造業者の使用説明書のとおり実施した。二次元６〜１５％または１４％均質Ｔｒｉｓ−アセテートゲルチップゲルを製造業者（プロテオーム・システムス、マサチューセッツ州、ウォバーン）によって推奨されるように実施した。配置されたタンパク質を銀染色によって可視化するか（シェフチェンコら、マス・スペクトロメトリック・シークエンシング・オブ・プロテインズ・シルバー−ステインド・ポリアクリルアミド・ゲルズ(Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels)、６８、８５０〜８５８頁、１９９６）、またはプロテオーム・システムス（米国、ウォバーン）製のイソエレクトルＩＱ2ユニットに付随するセミウェットメンブランブロッティングカセットを用いることによってＰＶＤＦ−Ｐメンブラン（ミリポア、マサチューセッツ州、ビレリカ）にトランファーした。免疫されたニワトリから得た免疫グロブリンを用いて、結核を患っている被験体の痰から単離したタンパク質を示すゲルの一例を図７に示す。
【実施例８】
【０３９６】
免疫原性卵巣癌タンパク質の同定
卵巣癌を患っている何人かの被験体から腫瘍組織と血清の双方を回収する。すべての腫瘍サンプルが上皮起源のものであることを確認する。
【０３９７】
８．１  腫瘍細胞に由来するタンパク質の調製
細胞を冷ＰＢＳ中で解離し、ペレットとし、冷ＰＢＳ中で２回洗浄する。全細胞タンパク質抽出物の調製のために、細胞を抽出バッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ６．８、３％ＳＤＳ、５％  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２．５ｇ／ｍｌのロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、アンチパインおよびキモスタチン）に再懸濁し、超音波処理する。可溶性および不溶性細胞抽出物の調製には、細胞を冷バッファー（１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ノニデットＰ−４０および前記のプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートし、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を水溶性抽出物として回収し、ペレットを冷バッファー（１０  ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１．０％ノニデットＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、および前記のプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、ボルテックスにかけ、次いで、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。得られた上清を不溶性抽出物として回収する。
【０３９８】
８．２  免疫捕獲カラムの調製
免疫捕獲カラムを、上皮卵巣癌を患っている５人の被験体から得た約５ｍＬの血清をプールすることによって作製した（全タンパク質濃度約４０ｍｇ／ｍＬ）。プールした血漿を、タンパク質Ａセファロースの５０％スラリー１０ｍＬとともにインキュベートすることによって、免疫グロブリンをタンパク質Ａセファロースと結合させる。マトリックスを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で洗浄し、本質的には製造業者（ピエルス）によって記載されたように、ＤＳＳを利用して、結合している免疫グロブリンを不可逆的に固定化した。作製したカラムを捕獲カラムと呼ぶ。
【０３９９】
８．３  免疫原性タンパク質の単離
捕獲カラムを単離した乳癌タンパク質（実施例７．１に記載した）とともに一定回転下、４℃で一晩インキュベートする。続いて、ビーズを遠心分離によって回収する。フロースルーを回収してその後のインキュベーションステップのために確保する（タンパク質抽出物は、各捕獲において数回捕獲カラムに通す）。回収したビーズを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で３回洗浄し、５０ｍＭグリシンｐＨ２．７を用いて捕獲したタンパク質を溶出した。カラムは、最初５０ｍＭグリシンｐＨ２．７、次いで１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２で広範に洗浄し、その後のインキュベーションステップを続けた。
【０４００】
溶出したタンパク質をアルコール沈殿させ、続いて、プロテオプレップ・ユニバーサル抽出キット（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を用い、本質的には製造業者によって記載されたように再可溶化させた。次いで、タンパク質を、それぞれ最終濃度５ｍMトリ−ｎ−ブチルホフィンおよび１０ｍＭアクリルアミドを用いて還元し、アルキル化した。
【０４０１】
８．４  二次元ゲル電気泳動
１１センチメートルｐＨ３〜１０またはｐＨ４〜７ＩＰＧ（アマシャム、スウェーデン、アップサラ）を用いる。等電点電気泳動法をプロテオーム・システムス（マサチューセッツ州、ウォバーン）のイソエレクトルＩＱ2ユニットを用いて製造業者の使用説明書のとおり実施する。二次元６〜１５％または１４％均質Ｔｒｉｓ−アセテートゲルチップゲルを製造業者（プロテオーム・システムス、マサチューセッツ州、ウォバーン）によって推奨されるように実施する。配置されるタンパク質を銀染色によって可視化する（シェフチェンコら、マス・スペクトロメトリック・シークエンシング・オブ・プロテインズ・シルバー−ステインド・ポリアクリルアミド・ゲルズ、６８、８５０〜８５８頁、１９９６）。
【０４０２】
８．５  ＭＳ解析
注目するタンパク質スポットを切り出し、１００ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3：５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）ｐＨ８．２中で２回洗浄し、５０℃で３０分間脱水する。タンパク質をカタヤマらによって記載されたように（インプルーブメント・オブ・イン−ゲル・ダイジェスチョン・プロトコール・フォー・ペプチド・マス・フィンガープリンティング・バイ・マトリックス−アシステッド・レーザー・デソープション／イオニゼーション・タイム−オブ−フライト・マス・スペクトロメトリー(Improvement of in-gel digestion protocol for peptide mass fingerprinting by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)）消化し、３７℃で３時間消化する。クスマンらによって記載されたように、超音波処理によってトリプシンペプチドを抽出し、精製する。ペプチドは約１．５μｌのＭＡＬＤＩマトリックス溶液（７０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡ、１．５ｍｇ／ｍｌα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）で溶出する。アキシマＣＦＲ（クラトス、英国、マンチェスター）を用いるマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）またはＡＢＩ  ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ（ＡＭＥバイオサイエンス、英国、ロンドン）によってペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）を作製する。
【０４０３】
この方法を用いて、免疫原性タンパク質の断片を同定し、データベースと比較して免疫原性タンパク質を同定する。
【実施例９】
【０４０４】
免疫原性タンパク質を調べるための、乳癌細胞でのマウスの免疫化
９．１  マウスの免疫化
何個体かのマウスをＭＣＦ−７乳癌細胞系で免疫する。ＭＣＦ−７細胞をフロイントの完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）と１：１の割合で混合し、混合物を乳化する。次いで、このエマルションを雌のＢａｌｂ／Ｃマウスに皮下注射する。
【０４０５】
細胞溶液とフロイントの不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）の乳化混合物（１：１の割合）のブースター免疫を、皮下注射による約２週間間隔の注射によって投与する。３回目のブースターの３日後に、尾静脈から血液サンプルを採取し、直接固相ＥＬＩＳＡによって血清中の抗体産生を測定する。
【０４０６】
ＭＣＦ−７細胞をＰＢＳで希釈し、得られた溶液をＥＬＩＳＡプレートに約２時間吸着させる。次いで、このプレートを、ブロックエース(Blockace)（雪印乳業製）のＰＢＳでの４倍希釈液によってブロッキングする。プレートを洗浄した後、プレートの各ウェルに、免疫したマウスから得た血清の血清希釈バッファー（５％ＦＢＳを含有するＰＢＳ）での種々の希釈液を加え、室温で２時間インキュベートする。
【０４０７】
プレートを洗浄した後、プレートの各ウェルにアルカリホスファターゼ標識したマウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／カペル(Cappel)製）を加え、室温で約１時間インキュベートする。
【０４０８】
次いで、二ナトリウムｐ−ニトロフェニルホスフェート（シグマ）を、基質反応混合物（０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含有する９．６％ジエタノールアミンバッファー、ｐＨ９．７）に、約２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、基質溶液を調製する。プレートを精製水で７回洗浄し、基質溶液を加える。基質溶液と反応させた後、３Ｎ  ＮａＯＨを加えて反応を停止し、４０５ｎｍの吸光度を測定する。
【０４０９】
ＭＣＦ−７細胞に対して免疫応答を起こしているマウスから血清を抽出し、その血清をプールする。
【０４１０】
９．２  免疫捕獲カラムの調製
組換え免疫グロブリン結合性タンパク質ＰＡＭタンパク質Ａミメティックを用いて、血清サンプルから免疫グロブリンを単離する。
【０４１１】
ＰＡＭ（Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ）4−Ｌｙｓ2−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号５）を、これまでに記載されたように（ファッシナ(Fassina)ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・レコグニション(Journal of Molecular Recognition)９、５６４頁、１９９６）、完全自動化ペプチドシンセサイザー４３１Ａ（パーキン−エルマー(Perkin-Elmer)）でＦｍｏｃ法にしたがって固相ペプチド合成によって製造する。樹脂を切断した後、ペプチドを逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製し、アミノ酸解析および飛行時間型マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＴＯＦ−ＭＡＬＤＩ）質量分析によって、予測値（２１４１ａｍｕ）と同一の分子量であるならばその同一性を確認する。
【０４１２】
ぺプチドをエムフェーズ(Emphaze)マトリックス（ポリアクリルアミド／アズラクトン活性化ゲル）（テクノゲン(TECNOGEN)、イタリア、カゼルタ、ピアナ・ジ・モンテベルナ）と、製造業者のプロトコールによって推奨されるようにカップリングする。１０ミリグラムのペプチドを６ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ3、０．６Ｍ  クエン酸Ｎａ、ｐＨ８．０に溶解し、１３０ｍｇ（１ｍｌに相当）の予め活性化したマトリックスとともにインキュベートする。種々の時点でＲＰ−ＨＰＬＣによってペプチドの組み込み度をモニタリングすることによって、懸濁液を穏やかな攪拌下、室温で数時間インキュベートする。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５で洗浄し、残存する活性基を不活化した後、最後に、樹脂を１００×６．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．ガラスカラムに詰める。
【０４１３】
０．５〜１ｍｌの血清（実施例９．１）に相当するサンプルを希釈し、流速６０ｃｍ／ｈでバッファーを用いて平衡化したカラムにロードする。結合している画分を、数滴の１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．５で直ちに中和し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特性決定し、ゲル透過解析によってＩｇＧ純度を調べ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって免疫応答性および回収された免疫グロブリンの量を評価する。
【０４１４】
次いで、カラムに結合している免疫グロブリンを、ＤＰＳ（ピエルス）を、本質的には製造業者の仕様説明書にしたがって用いて架橋する。
【０４１５】
９．３  腫瘍細胞に由来するタンパク質の調製
ＭＣＦ−７細胞を冷ＰＢＳに回収し、ペレットとし、冷ＰＢＳ中で２回洗浄する。全細胞タンパク質抽出物の調製のために、細胞を抽出バッファー（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ６．８、３％ＳＤＳ、５％  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび２．５ｇ／ｍｌのロイペプチン、ペプスタチン、アプロチニン、アンチパインおよびキモスタチン）に再懸濁し、超音波処理する。可溶性および不溶性細胞抽出物の調製には、細胞を冷バッファー（１０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ８．０、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％  ノニデットＰ−４０および前記のプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートし、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。上清を水溶性抽出物として回収し、ペレットを冷バッファー（１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１．０％ノニデットＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、および前記のプロテアーゼ阻害剤）に再懸濁し、ボルテックスにかけ、次いで、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。得られた上清を不溶性抽出物として回収する。
【０４１６】
９．４  免疫原性タンパク質の単離
捕獲カラムを、単離したＭＣＦ−７タンパク質（実施例９．３に記載した）とともに一定回転下、４℃で一晩インキュベートする。続いて、ビーズを遠心分離によって回収する。フロースルーを回収し、その後のインキュベーションステップのために確保する（タンパク質抽出物は、各捕獲において数回捕獲カラムに通す）。回収したビーズを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で３回洗浄し、５０ｍＭグリシンｐＨ２．７を用いて捕獲したタンパク質を溶出する。カラムは、最初５０ｍＭグリシンｐＨ２．７、次いで１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２で広範に洗浄し、その後のインキュベーションステップを続ける。
【０４１７】
溶出したタンパク質をアルコール沈殿させ、続いて、プロテオプレップ・ユニバーサル抽出キット（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を用い、本質的には製造業者によって記載されたように再可溶化させる。次いで、タンパク質を、それぞれ最終濃度５ｍＭトリ−ｎ−ブチルホフィンおよび１０ｍＭ  アクリルアミドを用いて還元し、アルキル化する。
【０４１８】
本質的に実施例８に記載したように、回収したタンパク質を単離し、ＭＳを用いて解析する。
【実施例１０】
【０４１９】
糖尿病における免疫原性タンパク質の同定
１０．１  免疫捕獲カラムの調製
免疫捕獲カラムを、Ｉ型糖尿病を患っている何人かの被験体から約５ｍＬの血清をプールすることによって作製する（全タンパク質濃度約４０ｍｇ／ｍＬ）。プールした血漿をタンパク質Ｇセファロースの５０％スラリー１０ｍＬとともにインキュベートすることによって、免疫グロブリンをタンパク質Ｇセファロースに結合させる。マトリックスを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で洗浄し、本質的には製造業者（ピエルス）によって記載されたように、ＤＳＳを利用して、結合している免疫グロブリンを不可逆的に固定化した。作製したカラムを捕獲カラムと呼ぶ。
【０４２０】
１０．２  糖尿病に由来する免疫原性タンパク質の同定
本質的には、ルメルスキー(Lumelsky)ら、サイエンス、２９２、１３８９頁、２００１に記載されたように、膵島様細胞を作製する。次いで、これらの細胞を溶解し、タンパク質を抽出する。分化細胞を溶解し、プロテオプレップ・ユニバーサル抽出キット（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を用い、本質的には製造業者によって記載されたようにタンパク質を抽出する。
【０４２１】
捕獲カラムを、単離した分化細胞タンパク質とともに、または糖尿病被験体または非糖尿病被験体から単離した血清とともに、一定回転下、４℃で一晩インキュベートする。続いて、ビーズを遠心分離によって回収する。フロースルーを回収し、その後のインキュベーションステップのために確保する（タンパク質抽出物は、各捕獲において捕獲カラムに数回通す）。回収したビーズを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で３回洗浄し、５０ｍＭグリシンｐＨ２．７を用いて捕獲したタンパク質を溶出する。カラムは、最初５０ｍＭグリシンｐＨ２．７、次いで１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２で広範に洗浄し、その後のインキュベーションステップを続ける。
【０４２２】
溶出したタンパク質をアルコール沈殿させ、続いて、プロテオプレップ・ユニバーサル抽出キット（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を用い、本質的には製造業者によって記載されたように再可溶化させる。次いで、タンパク質を、それぞれ最終濃度５ｍＭトリ−ｎ−ブチルホフィンおよび１０ｍＭアクリルアミドを用いて還元し、アルキル化する。
【０４２３】
回収したタンパク質を単離し、本質的には実施例８に記載したようにＭＳを用いて解析する。
【実施例１１】
【０４２４】
肝炎に由来する免疫原性タンパク質の同定
１１．１  Ｃ型肝炎ウイルス様粒子の作製
ＨＣＶ構造タンパク質（遺伝子型１ｂＪ株）の相補ＤＮＡを含む組換えバキュロウイルスｂｖＨＣＶ．Ｓｐ７の構築を、本質的にはトリヤトニ(Triyatni)らジャーナル・オブ・ビロロジー(Journal of Virology)、７６、９３３５〜９３４４頁、２００２に記載されたように実施する。トリアトニ上記によって従前に記載されたように、スクロース勾配遠心分離によってＨＣＶ−ＬＰを部分精製する。
【０４２５】
１１．２  マウスの免疫化
マウス（６〜８週齢）を、２０μｇのＨＣＶ−ＬＰを用いて各大腿四頭筋に、ＡＳ０１Ｂアジュバント（ガラクソスミスクライン(GalaxoSmithKline)）またはＣｐＧ１０１０５（コーリー・ファーマシューティカル・グループ(Coley Pharmaceutical Group)のいずれかを含む総容量１００μＬで３週間間隔で４回免疫する。
【０４２６】
酵素結合免疫吸着測定法によって、粒子に対する抗体を産生するマウスを調べる。免疫化前と各免疫化の２週間後の血液サンプルを尾静脈から採取し、酵素結合免疫吸着測定法によって、本質的にはレックマン(Lechmann)ら、ヘパトロジー、３４、４１７〜４２３頁、２００１に記載されたようにＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２抗体について解析する。
【０４２７】
１１．３  免疫捕獲カラムの作製
抗ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２抗体を産生する数個体のマウスから得た血清をほぼプールすることによって免疫捕獲カラムを作製する。免疫グロブリンをＰＡＭ−ＥＭＰＨＡＺＥ（実施例９．２に記載したように製造した）に結合させる。結合している免疫グロブリンを、本質的には製造業者（ピエルス）によって記載されたように、ＤＳＳを利用して不可逆的に固定化する。作製したカラムを捕獲カラムと呼ぶ。
【０４２８】
１１．４  肝炎に由来する免疫原性タンパク質の同定
捕獲カラムを部分精製したＨＣＶ−ＬＰとともに、一定回転下、４℃で一晩インキュベートする。フロースルーを回収し、その後のインキュベーションステップのために確保する（タンパク質抽出物は、各捕獲において数回捕獲カラムに通す）。回収したビーズを１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で３回洗浄し、５０ｍＭグリシンｐＨ２．７を用いて捕獲したタンパク質を溶出する。カラムは、最初５０ｍＭグリシンｐＨ２．７、次いで１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．２で広範に洗浄し、その後のインキュベーションステップを続ける。
【０４２９】
溶出したタンパク質をアルコール沈殿させ、プロテオプレップ・ユニバーサル抽出キット（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）を用い、本質的には製造業者によって記載されたように再可溶化する。次いで、タンパク質を、それぞれ最終濃度５ｍＭトリ−ｎ−ブチルホフィンおよび１０ｍＭアクリルアミドで還元し、アルキル化する。
【０４３０】
回収したタンパク質を単離し、本質的には実施例８に記載したようにＭＳを用いて解析する。
【図面の簡単な説明】
【０４３１】
【図１】結核を患っている被験体の免疫グロブリン画分を用いて単離したタンパク質を示す２次元ゲルの写真表示である。
【図２】本発明の方法を用い、免疫学的画分を用いて単離したタンパク質を示す２次元ゲルの写真表示である。タンパク質スポット３Ａと名づけられた注目するタンパク質が強調表示されている。
【図３】図１で同定したタンパク質に由来するトリプシンペプチドのマススペクトルを示すグラフ表示である。
【図４】緑膿菌感染症を患っているＣＦ被験体に由来する免疫グロブリン含有画分を用いて、緑膿菌から捕獲したタンパク質を示す２次元ゲルの写真表示である。
【図５】増悪状態および緑膿菌感染症に苦しんでいるＣＦ被験体に由来する免疫グロブリン含有画分を用いて、ＣＦ被験体の痰から捕獲したタンパク質を示す２次元ゲルを示す写真表示である。
【図６】４人のＣＦ被験体および３人の健常な対照被験体の緑膿菌ＧｒｏＥＳに対する免疫応答性を示す写真表示である。４または５スポットを含むグリッド中の各スポット位置は、タンパク質に対する単一の被験体の免疫応答性を示し、そこで血漿アリコートが解析される。スポット位置１〜３は健常な対照被験体に由来するものである。スポット位置４から７はＣＦ被験体に由来するものである。また、患者のサンプルを負の対照（ＢＳＡまたはＰＢＳ）に対してスクリーニングすることによって、観察した免疫応答性の特異性も示されている。
【図７】結核菌の細胞抽出物で事前に免疫したニワトリが産んだ卵から得た免疫グロブリン含有画分を用いて、結核を患っている被験体の痰から単離したタンパク質を示す２次元ゲルを示す写真表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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