(57)【要約】  本発明は、ニーマンピック病の酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損形態（すなわち、ニーマンピック病Ａ型又はＢ型）に罹患した個体を治療する方法であって、この疾病に関連する欠損酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）酵素に対し、特異的な分子「シャペロン」として低分子を投与することを含む方法を提供する。
2007514661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）タンパク質の活性を強める方法であって、医薬として許容可能なキャリアー中で前記タンパク質を、セラミドアナログ若しくはスフィンゴミエリンアナログである化合物の有効量、又はホスホヌクレオチドアナログである化合物の有効量と接触させることを含む方法。
【請求項２】
前記スフィンゴミエリンアナログ化合物が、下記式（Ｉ）：
【化１】
2007514661.tif 000008
［式中、Ｒが存在する場合には、Ｒは、それぞれ独立に、任意に置換されていてもよいＣ１〜１０アルキル、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシであり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；ｎは０〜５であり、ｍは１〜３である］
を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記スフィンゴミエリンアナログ化合物が、下記式（II）：
【化２】
2007514661.tif 000009
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは、上記で定義されたとおりであり；Ｒ４はＣ１０〜２０アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルである］
を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記セラミドアナログ化合物が、下記式（III）：
【化３】
2007514661.tif 000010
［式中、Ｒｎは上記で定義されたとおりであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８は、Ｈ、酸素、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；Ｒ９はＣ１０〜２０アルキルである］
を有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、下記の構造：
【化４】
2007514661.tif 000011
によって表されるＤ−ＭＡＰＰである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、下記の構造： 
【化５】
2007514661.tif 000012
を有するヌクレオチドアナログである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＳＭタンパク質が、変異ＡＳＭタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記変異タンパク質が、Ｌ３０２Ｐ（配列番号３）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記変異タンパク質が、Ｒ４９６Ｌ（配列番号２）である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記変異タンパク質が、デルタＲ６０８（配列番号４）である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＳＭタンパク質が、野生型ＡＳＭタンパク質である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＳＭが、全長ＡＳＭである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＳＭが、酵素活性を有する、切断されたＡＳＭである、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
医薬として許容可能なキャリアー中の精製されたＡＳＭタンパク質を投与された個体での、前記ＡＳＭタンパク質のin vivoでの半減期を延長し、その活性を持続させる方法であって、セラミドアナログ若しくはスフィンゴミエリンアナログである化合物の有効量、又はヌクレオチドアナログである化合物の有効量に、前記ＡＳＭタンパク質を接触させることを含み、前記化合物がＡＳＭ阻害剤である、方法。
【請求項１５】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（Ｉ）：
【化６】
2007514661.tif 000013
［式中、Ｒが存在する場合には、Ｒは、それぞれ独立に、任意に置換されていてもよいＣ１〜１０アルキル、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシであり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；ｎは０〜５であり、ｍは１〜３である］
を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（II）：
【化７】
2007514661.tif 000014
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは、上記で定義されたとおりであり；Ｒ４はＣ１０〜２０アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルである］
を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が、セラミドアナログであって、下記式（III）：
【化８】
2007514661.tif 000015
［式中、Ｒｎは上記で定義されたとおりであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８は、Ｈ、酸素、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；Ｒ９はＣ１０〜２０アルキルである］
を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、Ｄ−ＭＡＰＰであって、下記の構造：
【化９】
2007514661.tif 000016
によって表される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、ヌクレオチドアナログであって、下記の構造：
【化１０】
2007514661.tif 000017
を有する、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
前記ＡＳＭタンパク質が、前記化合物と共投与される、請求項１４記載の方法。
【請求項２１】
前記共投与が、同一の製剤で行われる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記共投与が、別々の製剤で行われる、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
宿主細胞によるリコンビナントＡＳＭタンパク質の産生を増加させる方法であって（ここで、前記宿主細胞は、前記リコンビナントＡＳＭタンパク質をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含んでいる）、セラミドアナログ若しくはスフィンゴミエリンアナログの有効量、又はヌクレオチドアナログである化合物の有効量を含有する媒体中で前記宿主細胞を培養することを含み、前記化合物がＡＳＭ阻害剤である、方法。
【請求項２４】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（Ｉ）：
【化１１】
2007514661.tif 000018
［式中、Ｒが存在する場合には、Ｒは、それぞれ独立に、任意に置換されていてもよいＣ１〜１０アルキル、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシであり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；ｎは０〜５であり、ｍは１〜３である］
を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（II）：
【化１２】
2007514661.tif 000019
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは、上記で定義されたとおりであり；Ｒ４はＣ１０〜２０アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルである］
を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物が、セラミドアナログであって、下記式（III）：
【化１３】
2007514661.tif 000020
［式中、Ｒｎは上記で定義されたとおりであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８は、Ｈ、酸素、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；Ｒ９はＣ１０〜２０アルキルである］
を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、Ｄ−ＭＡＰＰであって、下記の構造：
【化１４】
2007514661.tif 000021
によって表される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物が、ヌクレオチドアナログであって、下記の構造：
【化１５】
2007514661.tif 000022
を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２９】
ニーマンピック病に罹患した個体を治療する方法であって、精製した野生型ＡＳＭ、及びセラミドアナログ若しくはスフィンゴミエリンアナログである化合物のＡＳＭ活性増進量、又はヌクレオチドアナログである化合物のＡＳＭ活性増進量を含む組成物を、個体に共投与することを含み、前記化合物がＡＳＭ阻害剤である、方法。
【請求項３０】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（Ｉ）：
【化１６】
2007514661.tif 000023
［式中、Ｒが存在する場合には、Ｒは、それぞれ独立に、任意に置換されていてもよいＣ１〜１０アルキル、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシであり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；ｎは０〜５であり、ｍは１〜３である］
を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（II）：
【化１７】
2007514661.tif 000024
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは、上記で定義されたとおりであり；Ｒ４はＣ１０〜２０アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルである］
を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物が、セラミドアナログであって、下記式（III）：
【化１８】
2007514661.tif 000025
［式中、Ｒｎは上記で定義されたとおりであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８は、Ｈ、酸素、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；Ｒ９はＣ１０〜２０アルキルである］
を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物が、Ｄ−ＭＡＰＰであって、下記の構造：
【化１９】
2007514661.tif 000026
によって表される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物が、ヌクレオチドアナログであって、下記の構造：
【化２０】
2007514661.tif 000027
を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３５】
前記個体が、ニーマンピック病Ａ型に罹患している、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
前記個体が、ニーマンピック病Ｂ型に罹患している、請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
前記個体が、変異ＡＳＭタンパク質をコードする変異ＡＳＭ遺伝子を有する、請求項２９記載の方法。
【請求項３８】
前記変異タンパク質が、Ｌ３０２Ｐ（配列番号３）である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記変異タンパク質が、Ｒ４９６Ｌ（配列番号２）である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記変異タンパク質が、デルタＲ６０８（配列番号４）である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
個体の細胞の、in vivoでのリコンビナントＡＳＭタンパク質の発現レベルを増加させる方法であって（ここで前記タンパク質は、前記細胞へと導入されている発現ベクターから発現している）、セラミドアナログ若しくはスフィンゴミエリンアナログである化合物の有効量、又はヌクレオチドアナログである化合物の有効量を個体に投与することを含み、前記化合物がＡＳＭ阻害剤である、方法。
【請求項４２】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（Ｉ）：
【化２１】
2007514661.tif 000028
［式中、Ｒが存在する場合には、Ｒは、それぞれ独立に、任意に置換されていてもよいＣ１〜１０アルキル、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシであり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；ｎは０〜５であり、ｍは１〜３である］
を有する、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（II）：
【化２２】
2007514661.tif 000029
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは、上記で定義されたとおりであり；Ｒ４はＣ１０〜２０アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルである］
を有する、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物が、セラミドアナログであって、下記式（III）：
【化２３】
2007514661.tif 000030
［式中、Ｒｎは上記で定義されたとおりであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８は、Ｈ、酸素、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；Ｒ９はＣ１０〜２０アルキルである］
を有する、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物が、Ｄ−ＭＡＰＰであって、下記の構造：
【化２４】
2007514661.tif 000031
によって表される、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物が、ヌクレオチドアナログであって、下記の構造：
【化２５】
2007514661.tif 000032
を有する、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
前記個体が、変異ＡＳＭタンパク質をコードする変異ＡＳＭ遺伝子を有する、請求項４１記載の方法。
【請求項５０】
前記変異タンパク質が、Ｌ３０２（配列番号３）である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記変異タンパク質が、Ｒ４９６Ｌ（配列番号２）である、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
前記変異が、デルタＲ６０８（配列番号４）である、請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
ニーマンピック病に罹患している個体、又は遺伝的にニーマンピック病を発現しやすい個体を治療する方法であって、セラミドアナログ若しくはスフィンゴミエリンアナログである化合物のＡＳＭ活性増進量、又はヌクレオチドアナログである化合物のＡＳＭ活性増進量を含む組成物を前記個体に投与することを含み、前記化合物がＡＳＭ阻害剤である、方法。
【請求項５４】
前記シャペロンが、スフィンゴミエリンアナログ化合物であって、下記式（Ｉ）：
【化２６】
2007514661.tif 000033
［式中、Ｒが存在する場合には、Ｒは、それぞれ独立に、任意に置換されていてもよいＣ１〜１０アルキル、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシであり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；ｎは０〜５であり、ｍは１〜３である］
を有する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物が、スフィンゴミエリンアナログであって、下記式（II）：
【化２７】
2007514661.tif 000034
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは、上記で定義されたとおりであり；Ｒ４はＣ１０〜２０アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルである］
を有する、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
前記化合物が、セラミドアナログであって、下記式（III）：
【化２８】
2007514661.tif 000035
［式中、Ｒｎは上記で定義されたとおりであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８は、Ｈ、酸素、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；Ｒ９はＣ１０〜２０アルキルである］
を有する、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
前記化合物が、Ｄ−ＭＡＰＰであって、下記の構造：
【化２９】
2007514661.tif 000036
によって表される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記化合物が、ヌクレオチドアナログであって、下記の構造：
【化３０】
2007514661.tif 000037
を有する、請求項５３記載の方法。
【請求項５９】
前記変異タンパク質が、Ｌ３０２（配列番号３）である、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
前記変異タンパク質が、Ｒ４９６Ｌ（配列番号２）である、請求項５３記載の方法。
【請求項６１】
前記変異タンパク質が、デルタＲ６０８（配列番号４）である、請求項５３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニーマンピック病の酸性スフィンゴミエリナーゼ欠損形態（すなわち、ニーマンピック病Ａ型又はＢ型）に罹患した個体を治療する方法であって、この疾病に関連する欠損酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）酵素に対し、特異的な分子「シャペロン」として低分子を投与することを含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ニーマンピック病（ＮＰＤ）Ａ型及びＢ型は、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）の活性欠損によるライソゾーム貯蔵障害であって、その結果、罹患した個体の細胞及び組織内にスフィンゴミエリン、コレステロール及び他の脂質が蓄積する（Schuchman and Desnick, Niemann-Pick disease types A and B: acid sphingomyelinase deficiencies. In: The metabolic and molecular bases of inherited disease. Edited by Schriver CR, Beaudet AL, Valle D, Sly WS; New York. McGraw Hill Inc 3589-3610 2001）。ＮＰＤ Ａ型の患者は、通常、幼少期の早い段階で臓器肥大症と診断され、その後、神経変性過程が急速に進行し、約３歳までに死亡する。対照的に、ＮＰＤ Ｂ型の患者は、中枢神経系障害をほとんど有さず、しばしば成人期まで生き延びる。しかし、ＮＰＤのＢ型形態は、臨床的に多様であり、肝脾腫大、成長遅延、頻発する呼吸器感染、疲労、及び血液学的異常（例えば、ＬＤＬコレステロール及びトリグリセリドの増加、ＨＤＬコレステロールの減少、及び血小板の減少など）を含み得る様々な所見を示すことができる。加えて、ＮＰＤ Ｂ型患者の中には、神経変性に影響を与える中間表現型を有するものがいると報告されている（Elleder and Cihula, Eur J Pediatr 1983; 140: 323-328; Elleder et al., J Inherit Metab Dis 1986; 9: 357-366）。
【０００３】
最も報告されているＮＰＤ Ａ型の症例は、アシュケナージ系ユダヤ人個体間で生じたものだが、ＮＰＤの両方の形態は全ての民族に起こる。対照的に、ＮＰＤ Ｂ型には、北アフリカ人、アラブ人、及びトルコ人集団が最も罹患しているようである。今日まで、ＡＳＭ遺伝子上の７０を超える変異が、ＮＰＤ Ａ型及びＢ型の原因として報告されている（Simonaro et al., Am J Hum Gen. 2002, 71:1413-1419）。これらのうち、特定の表現型が予測される共通の変異はわずかである。例えば、デルタＲ６０８変異（６０８番目の残基であるアルギニンが欠損している（ΔＲ６０８））は、北米及び西欧人の全てのＮＰＤ患者のうち約１０〜１５％で発見されており、この疾病の非神経型（すなわち、ＮＰＤ Ｂ型）を常に伴う（Lervan et al., J Clin Invest. 1991; 88: 806-810）。この変異はまた、北アフリカのＮＰＤ Ｂ型患者の約９０％で発見されている（Vanier et al., Hum Genet. 1993; 92: 325-330）。ΔＲ６０８変異とは対照的に、３種類のさらなる変異、Ｌ３０２Ｐ（３０２番目のアミノ酸残基であるロイシンがプロリンに置き換わったもの）、Ｒ４９６Ｌ（４９６番目のアミノ酸残基であるアルギニンがロイシンに置き換わったもの）、及びｆｓＰ３３０（３３０番目のアミノ酸残基であるプロリンの下流に未成熟終始コドンが導入されたもの）が、アシュケナージ系ユダヤ人集団のＮＰＤ Ａ型患者のうち９０％以上で発見されている（Lervan et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991; 88:3748-3752; Lervan et al., Blood. 1992; 80: 2081-2087; Lervan et al., Hum Mut. 1993; 2: 317-319）。アシュケナージ系ユダヤ人コミュニティーでの、これら３種類の変異のキャリアー頻度は、約１：８０〜１：１００である（Li et al. Am J Hum Genet. 1997; 61 (suppl): A24）。
【０００４】
最近、ヒトＡＳＭ遺伝子の３種類のアイソフォームがクローニングされ、いくつかの変異が同定され、これらは、アシュケナージ系ユダヤ人集団のＮＰＤ Ａ型及びＢ型に必須のヘテロ接合体を測定診断する際に信頼できるものとして使用され得る（Schuchmanらによる米国特許第５，７７３，２７８号及び同第５，６８６，２４０号参照）。
【０００５】
対症療法は、多くのＬＳＤ患者にとって利用可能な唯一の治療方法である。酵素補充療法（ＥＲＴ）が、いくつかのＬＳＤ（ゴーシェ病、ファブリー病、及びムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）を含む）に対して開発されており、又は現在開発中であるが（Desnick and Schuchman, Nat Rev Genet. 2002; 3: 954-966）、この酵素は、静脈注射後、血液脳関門を通過しないので、重度の神経系障害（すなわち、ＮＰＤ Ａ型）の患者に対して有用な方法ではない。病原となる基質の合成を抑制する低分子阻害剤を用いた基質枯渇療法も、いくつかのＬＳＤに対して開発されており、又は評価段階にあり、欧米ではゴーシェ病に対して条件付きでマーケティングが認可されている（Butters et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003; 358: 927-945）。ＥＲＴと比較して、この方法の利点の１つは、低分子阻害剤は脳血液関門を通過し、脳での基質の蓄積を抑制する可能性があることである。
【０００６】
最近開発された別の低分子方法として、ケミカルシャペロン療法又は活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）療法が知られている（Fan et al Nat Med. 1999; 5: 112-115; Fan, Trends Pharmacol Sci. 2003; 24: 355-360）。ＡＳＳＣでは強力な酵素阻害剤を低濃度で使用し、特定のＬＳＤでの変異タンパク質のフォールディング及び活性を強める。この方法は、ファブリー病で初めて評価され、アルファ−ガラクトシダーゼＡの低分子阻害剤である、１−デオキシ−ガラクトノジリマイシン（ＤＧＪ）を用いると、ファブリー病患者由来の細胞株で残存アルファ−ガラクトシダーゼ活性が強められた（Ｆａｎらによる米国特許第６，２７４，５９７号参照）。Ｆａｎらによる米国特許第６，５８３，１５８号では、さらに、多数の他のライソゾーム貯蔵障害（ゴーシェ病及びＧＭ１ガングリオシドーシスを含む）に対するＡＳＳＣ療法が例証されており、患者の細胞の残存酵素活性を強めるためにケミカルシャペロンとして強力な競合的阻害剤を使用するこの療法は、ファブリー病患者に限定されず、多数の酵素欠損病、特にＬＳＤに適用され得ることが実証されている。
【０００７】
ＡＳＳＣ療法は、現在、ゴーシェ病を含むいくつかのＬＳＤに対して開発中であり、ＥＲＴ又は基質枯渇療法よりも有利な点がいくつか提示されている。最も注目すべきは、ＡＳＳＣで用いられる活性部位阻害剤は、病原となる酵素に対して特異的であるので、全ての合成経路を阻害する基質枯渇療法とは異なり、この治療は、単一のタンパク質及び代謝経路に向けられる。基質枯渇療法と同様に、ＡＳＳＣの低分子阻害剤も血液脳関門を通過する可能性があり、神経型のＬＳＤを治療するために用いることができるだろう。
【０００８】
ＬＳＤに関連する欠損酵素の活性を強めることに加えて、ＡＳＳＣはまた、対応する野生型酵素の活性を強めることも実証されており（Ｆａｎらによる米国特許第６，５８９，９６４号参照）、従って、ＬＳＤ患者に対する酵素補充療法との併用療法として有効である。
【特許文献１】米国特許第６５８３１５８号明細書
【特許文献２】米国特許第６２７４５９７号明細書
【特許文献３】米国特許第６５８９９６４号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＮＰＤ Ａ型は、ＡＳＳＣの重要な候補である。第１に、全てのＮＰＤ Ａ型患者は、重度の神経的表現型を発現しており、約３歳までに死亡する。現在、この障害の神経機構に対する治療方法は存在しない。しかし、ＡＳＭノックアウトマウスモデルを用いた研究により、通常活性の約５％まで残存ＡＳＭ活性を強めると、脳疾患の発生を完全に抑制でき、平均寿命まで生存できることが示されており、低レベルの機能的ＡＳＭがＮＰＤ Ａ型患者の神経変性を抑制することが示唆されている（Marthe et al., Hum Mol Genet. 2000; 9: 1967-1976）。加えて、多くのアシュケナージ系ユダヤ人のＮＰＤ Ａ型患者の原因となるこれら３種類の変異のうち２種類（Ｌ３０２Ｐ及びＲ４９６Ｌ）は、ポイントミューテーションであり、ＡＳＳＣに適しているかもしれない。さらに、世界中のＮＰＤ Ｂ型患者の約１５％が、少なくとも１つのΔＲ６０８変異コピーを伝える。従って、この形態の低分子療法の必要性が高い。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
［発明の要旨］
本発明は、ＮＰＤ Ａ型又はＢ型に罹患した患者を治療する方法であって、活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）として、低分子セラミドアナログ、又はホスホ含有スフィンゴミエリン若しくはヌクレオチドアナログを投与することを含む方法を提供する。
【００１１】
１つの実施態様では、ＡＳＳＣは、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）遺伝子上にＬ３０２Ｐ変異を有する個体に投与される。
【００１２】
別の実施態様では、ＡＳＳＣは、ヒト酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＡＳＭ）遺伝子上にＲ４９６Ｌ変異を有する個体に投与される。
【００１３】
別の実施態様では、ＡＳＳＣは、デルタＲ６０８変異を有する個体に投与される。
【００１４】
別の実施態様では、前記低分子はスフィンゴミエリンアナログであって、下記式：
【００１５】
【化１】
2007514661.tif 000003
［式中、Ｒが存在する場合には、Ｒは、それぞれ独立に、任意に置換されていてもよいＣ１〜１０アルキル、ハロ、ＮＯ２、ＣＮ、ＯＨ、Ｃ１〜６アルコキシであり；Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；ｎは０〜５であり、ｍは１〜３、好ましくは２である］
を有する。
【００１６】
別の実施態様では、前記低分子はスフィンゴミエリンアナログであって、下記式：
【００１７】
【化２】
2007514661.tif 000004
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びｍは、上記で定義されたとおりであり；Ｒ４はＣ１０〜２０アルキルであり；Ｒ５及びＲ６は、独立に、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルである］
を有する。
【００１８】
好ましい実施態様では、前記スフィンゴミエリンアナログは下記の構造：
【００１９】
【化３】
2007514661.tif 000005
を有する。
【００２０】
さらに別の実施態様では、前記低分子はセラミドアナログであって、下記式：
【００２１】
【化４】
2007514661.tif 000006
［式中、Ｒｎは上記で定義されたとおりであり；Ｒ７はＨ又はＯＨであり；Ｒ８は、Ｈ、Ｃ１〜１０アルキル、アリール、又はアラルキルであり；Ｒ９はＣ１０〜２０アルキルである］
を有する。
【００２２】
特定の実施態様では、前記ＡＳＳＣはＤ−ＭＡＰＰである（図１参照）。
【００２３】
さらに別の実施態様では、前記低分子アナログが、ホスホヌクレオチドアナログであり、例えば下記式を有する。
【００２４】
【化５】
2007514661.tif 000007
しかし、他のホスホヌクレオチド、例えば、これに限定されないが、アデノシンモノホスフェート、シトシンモノホスフェート、及びアデノシンジホスフェートなども考えられる。
【００２５】
１つの実施態様では、前記低分子アナログは、単療法として投与され得る。
【００２６】
別の実施態様では、前記低分子アナログは、酵素補充療法として投与される野生型のリコンビナントＡＳＭとともに投与され得る。従って、内因性ＡＳＭタンパク質の安定性、すなわち活性が、投与され補充される機能的ＡＳＭタンパク質の安定性が増加されるのと同時に強められるだろう。
【００２７】
さらに別の実施態様では、前記低分子アナログは、機能的ＡＳＭをコードするリコンビナントベクター（すなわち遺伝子治療）とともに投与される。
【００２８】
本発明はさらに、本発明の低分子アナログを含む媒体中で非哺乳動物宿主細胞を接触させることにより、非哺乳動物宿主細胞によるリコンビナントＡＳＭタンパク質の産生を増加させる方法を提供する。
【００２９】
本発明はまた、前記低分子アナログ及び医薬として許容可能なキャリアーを含む組成物も提供する。
【００３０】
本発明はさらに、医薬として許容可能なキャリアー中に、本明細書に記載の精製ＡＳＭタンパク質及び低分子アナログシャペロンを含む組成物を提供する。
【００３１】
本発明はまた、ＮＰＤと診断されている対象、又はＮＰＤを遺伝的に発現しやすい対象に、低分子アナログを単独で投与するか、又は酵素補充療法若しくは遺伝子治療と組み合わせて投与することにより、予防する方法又は治療する方法も提供する。
【００３２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、部分的には、ＮＰＤのＡＳＳＣとしてセラミドアナログ、スフィンゴミエリンアナログ又はホスホヌクレオチドアナログを使用することに基づいている。Ｒ４９６Ｌ変異の２コピーを含むＮＰＤ Ａ型患者由来の培養皮膚線維芽細胞を、Ｄ−ＭＡＰＰ（５〜５０μＭ）の存在下で３日間インキュベートすると、残存ＡＳＭ活性が、３倍まで、つまり正常の約３％まで（正常の１％未満の初期活性から。図５参照）強められた。同様に、スフィンゴミエリンアナログ（２０μＭ）を正常線維芽細胞とともに５日間培養すると、正常のＡＳＭ活性の９０％を阻害したことから、ＡＳＭに対するシャペロンとして有効であると示唆される。
【００３３】
Ｆａｎらによって以前に記載されているＡＳＳＣ（グルコシダーゼ阻害剤として既知の、グルコース及びガラクトースのイミノ糖アナログである）（米国特許第６，２７４，５９７号；同第６，５８３，１５８号；同第６，５８９，９６４号及び同第６，５９９，９１９号）とは異なり、本発明で記載されている低分子アナログはイミノ糖ではない。本発明の化合物は、約５０〜１００μＭの範囲の濃度でＡＳＭを阻害する。これはまた、Ｈａｎｎｕｎらによって米国特許第５，８３０，９１６号に記載されているものとは正反対であり、そこでは、セラミダーゼを阻害することによってセラミドの蓄積を増加させるために、アルカリ性セラミダーゼ阻害剤として、本明細書に記載のセラミドアナログの１つであるＤ−ＭＡＰＰを使用することが開示されている。セラミダーゼは、セラミドをスフィンゴシンと脂肪酸へと加水分解する反応を触媒する酵素である。Ｈａｎｎｕｎはまた、Ｄ−ＭＡＰＰが、内因性のスフィンゴミエリンレベルに影響を及ぼさないことを示し、全細胞スフィンゴミエリナーゼ（スフィンゴミエリンを分解する酵素）への効果に異を唱えている。同様の効果の欠如が、β−グルコシダーゼ（グルコシダーゼ酵素は、in vitroにおいてアリール及びアルキルベータ−Ｄ−グルコシドを加水分解する反応を触媒する（全細胞を使用））でも見られる。
【００３４】
様々な脂質関連酵素の阻害剤である化合物もまた、Ｄａｇａｎらによる米国特許出願公開第２００３／０１３３００４号に記載されている。この出願公開では、スフィンゴリピドの合成又は代謝を調節するいくつかの化合物が記載されている。詳細には、スフィンゴミエリンアナログがスフィンゴミエリンの合成を阻害し、それにより細胞内でのセラミド濃度を上昇させ、アポトーシスが誘導されると記載されている。この出願公開はまた、ＮＰＤなどのいくつかのＬＳＤで蓄積する病原性脂質であるスフィンゴミエリンを阻害することによる、これらの阻害剤を用いた糖脂質貯蔵障害の治療にも言及している。これは、基質枯渇又は基質減少の例である。この出願公開に記載されている１つの化合物が、酸性及び中性のスフィンゴミエリナーゼを阻害することが示されている。
【００３５】
［定義］
本明細書で用いられる、「活性部位特異的シャペロン（ＡＳＳＣ）」という用語は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物などの任意の分子であって、特異的に、タンパク質の活性部位と可逆的に相互作用し、安定した分子コンフォメーションの形成を強める分子を意味する。本明細書で用いられる、「活性部位特異的シャペロン」は、Ｂｉｐ、カルネキシン、若しくはカルレティキュリンなどの、細胞内のＥＲに存在する一般的な内因性シャペロンを含まず、又は、重水、ＤＭＳＯ、若しくはＴＭＡＯなどの一般的な非特異的ケミカルシャペロンを含まない。本発明では、ＡＳＳＣは、セラミドアナログ、スフィンゴミエリンアナログ、又はヌクレオチドアナログであって、それらが相互作用するタンパク質はＡＳＭである。
【００３６】
酸性スフィンゴミエリナーゼ、すなわちＡＳＭは、米国特許第６，５４１，２１８号に記載のとおりのヌクレオチド及びアミノ酸配列を有する。ＡＳＭアミノ酸配列を、配列番号１として以下に記載する。この用語はまた、ＡＳＭの相同分子種及び変種も含む。
【００３７】
本明細書で用いられる、「活性部位」という用語は、基質又は結合パートナーと結合するタンパク質領域であって、化学結合の形成及び切断に直接関与するアミノ酸残基を提供するタンパク質領域を意味する。本発明では、活性部位は、ＡＳＭ酵素の触媒ドメインを包含する。
【００３８】
Ｄ−ＭＡＰＰは、Ｄ−エリトロ−２−（Ｎ−ミリストイルアミノ）−１−フェニル−１−プロパノールを意味する。Ｄ−ＭＡＰＰは、米国特許第５，３６９，０３０号にさらに記載されており、本明細書の図１に示されている。
【００３９】
「適切なコンフォメーションを安定化する」という用語は、野生型ＡＳＭタンパク質のコンフォメーションと機能的に同一となるように、変異ＡＳＭタンパク質のコンフォメーションを誘導する本発明化合物の能力を意味する。「機能的に同一」という用語は、コンフォメーションに軽微な変化があってよいが（実際に、ほとんど全てのタンパク質が、生理状態でいくらかのコンフォメーションの柔軟性を示す）、コンフォメーションの柔軟性が（１）タンパク質の凝集、（２）小胞体関連分解経路を介した排除、（３）ＡＳＭの機能障害、及び／又は（４）細胞内での不適切な輸送をもたらさないことを意味する。この用語はまた、ＥＲＴのために産生されたＡＳＭなどの、野生型ＡＳＭ又は機能的ＡＳＭの安定化を意味する。
【００４０】
「野生型活性」という用語は、細胞におけるＡＳＭの正常な生理的機能を意味する。このような機能性は、タンパク質の機能性を証明する既知の任意の手段によって試験され得る。ある種の試験は、実際のin vivoでの機能と一致するかどうかわからないＡＳＭの特性を評価できるが、いずれにせよ、タンパク質機能性の代理となるものの総計であり、このような試験での野生型挙動は、本発明のタンパク質フォールディング救助技術の許容可能な結果となる。本発明のこのような活性の１つは、小胞体からライソゾームへのＡＳＭの適切な輸送である。
【００４１】
「機能的ＡＳＭタンパク質」という用語は、適したコンフォメーションでフォールディングされ、細胞内の固有部位に局在し、かつスフィンゴミエリン及び他の脂質基質に対して異化活性を有する能力を有するＡＳＭタンパク質を意味する。機能的ＡＳＭタンパク質には、野生型ＡＳＭタンパク質（以下の定義を参照）、例えば、配列番号１で表されるものなど、及び野生型活性を有するＡＳＭタンパク質が含まれる。
【００４２】
ＡＳＭの「活性を強める」という用語は、機能的ＡＳＭタンパク質（すなわち、適したコンフォメーションでフォールディングされ、細胞内の固有部位に局在し、かつスフィンゴミエリン及び他の脂質基質に対して異化活性を有するタンパク質）となるように変異ＡＳＭタンパク質の適切なコンフォメーションを安定化させることを意味する。この用語はまた、体外から投与されたＡＳＭタンパク質の野生型活性を増加させること、すなわち、野生型ＡＳＭの安定性を増加させ、その半減期を延長させることで活性を持続させることを意味する。
【００４３】
「ＡＳＭの阻害剤」という用語は、薬理用量未満の濃度で、スフィンゴミエリン合成に関与する酵素を含む他の酵素よりもＡＳＭを阻害するために、高い特異性を示す化合物を意味する。この阻害剤は、特異的にＡＳＭを阻害しなければならない。本明細書で用いられる阻害剤には、活性部位で結合し得る化合物を含まないが、個体に投与することにつながらない非常に高濃度な場合を除いて、それ自体では阻害活性を有さない。
【００４４】
「ＡＳＭを阻害するために必要とされる濃度未満」という用語は、ＡＳＭ活性を阻害することなく、その活性を強める本発明の化合物の濃度を意味する。本発明では、この濃度は、約５〜５０μＭの範囲となるだろう。
【００４５】
本明細書で用いられる、「変異ＡＳＭタンパク質」という用語は、遺伝子変異（１つ又は複数）を含む遺伝子から翻訳されたＡＳＭを意味し、結果として、そのＡＳＭが、ＥＲに通常存在する状況下で本来のコンフォメーションとならない変性タンパク質配列となることを意味する。本来のコンフォメーションを達成できなかったことにより、ＡＳＭは、タンパク質輸送システム内の通常経路を介してライソゾームへと輸送されるよりもむしろ、分解される。
【００４６】
１つの実施態様では、本発明の方法によって救われるＡＳＭ変異は、Ｒ４９６Ｌ（配列番号２）であり、１４８７番目のコドンヌクレオチドがＧからＴへとトランスバージョンされている。より疎水性のロイシン残基のアルギニン塩基への置換が、酵素の触媒活性、酵素の安定性、又はその両方を変えるかどうかは未だ知られていない。
【００４７】
別の特定の実施態様では、本方法によって救われるＡＳＭ変異は、９０５番目のヌクレオチドのＴからＣへの転移であり、その結果として、ロイシンのプロリンへの置換が生じる（Ｌ３０２Ｐ−配列番号３）。
【００４８】
さらに別の特定の実施態様では、本発明の方法のＡＳＳＣによって救われるＡＳＭ変異は、Ｒ６０８の欠損変異である（ΔＲ６０８−配列番号４）。
【００４９】
［分子生物学定義］
本発明では、当分野において慣習的な分子生物学技術、細菌学技術、及びリコンビナントＤＮＡ技術を使用してもよい。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York （本明細書では、「Sambrook et al., 1989」）; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization; B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985); Transcription And Translation; ［B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture; R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells And Enzymes; IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。
【００５０】
本明細書で用いられる、「単離された」という用語は、参照される物質が、通常存在する環境から取り除かれることを意味する。従って、単離された生物学的物質は、細胞成分、すなわち、その物質が存在する、又は産生される細胞の構成成分から解放され得る。核酸分子の場合、単離された核酸には、ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又は制限断片が含まれる。別の実施態様では、単離された核酸は、好ましくは、その核酸が存在し得る染色体から切り出されたものであり、より好ましくは、染色体上に核酸が存在する場合、単離された核酸分子によって含まれる遺伝子の上流又は下流に位置する、非調節領域、非コーディング領域、又は他の遺伝子ともはや結合していない。さらに別の実施態様では、単離された核酸は、１以上のイントロンを欠失している。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列を含む。従って、特定の実施態様では、リコンビナント核酸は単離された核酸である。単離されたタンパク質は、細胞内で、又は膜結合性のタンパク質である場合には細胞膜で、他のタンパク質若しくは核酸、又はその両方と関連していてもよい。特定の実施態様では、単離されたＡＳＭタンパク質は、発現ベクターから発現しているリコンビナントＡＳＭタンパク質である。単離された物質は、必要ではないが、精製されてもよい。
【００５１】
本明細書で用いられる、「精製された」という用語は、関係のない物質、すなわち混入物質を低減又は除去する条件下で単離されている物質を意味する。例えば、精製されたＡＳＭタンパク質は、好ましくは、ＡＳＭが通常細胞内で関連する他のタンパク質又は核酸から実質的に解放されている。本明細書で用いられる、「実質的な解放」という用語は、その物質の分析的試験との関連で操作上使用される。好ましくは、混入物質から実質的に解放されている精製されたＡＳＭは、少なくとも５０％純粋であり、より好ましくは少なくとも９０％純粋であり、さらに好ましくは少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫学的検定、組成分析、生物学的検定、及び当分野で公知の他の方法によって評価され得る。
【００５２】
「約（about）」及び「およそ（approximately）」という用語は、測定の性質又は精度を考慮した上で、測定された量に対して許容可能な誤差の程度を通常意味するだろう。通常は、誤差の一般的な程度は、得られた値、又は値の範囲に対して、２０％以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。あるいは、特に生物学的システムにおいて、「約（about）」及び「およそ（approximately）」という用語は、得られた値の１オーダー以内、好ましくは１０倍以内又は５倍以内、より好ましくは２倍以内の値を意味する。本明細書に記載の数量は、特記のない限り概算値であり、明確に記載されていなくても「約（about）」又は「およそ（approximately）」という用語を暗示できることを意味する。
【００５３】
「宿主細胞」という用語は、細胞による物質の産生、例えば、ヒトＡＳＭ遺伝子（ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む）、又はＡＳＭ酵素の細胞による発現などのために、任意の方法を用いて選択され、修飾され、トランスフォームされ、成長させられ、又は使用され若しくは操作された任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞はさらに、ＡＳＳＣコンセプトの他のアッセイの予備的評価においても使用され得る。「リコンビナントＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作又は工学技術操作を受けているＤＮＡ分子である。本発明の１つの実施態様では、宿主細胞は線維芽細胞である。
【００５４】
「遺伝子」は、「遺伝子産物」をコードするヌクレオチド配列である。通常、遺伝子産物とはタンパク質である。しかし、遺伝子産物はまた、細胞内の他のタイプの分子、例えばＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ又はｒＲＮＡ）などでもあり得る。本発明では、遺伝子産物はまた、細胞内に存在してよいｍＲＮＡ配列をも意味する。本明細書では、遺伝子は、野生型ＡＳＭ又は変異ＡＳＭをコードするヌクレオチド配列を意味する。
【００５５】
「野生型ＡＳＭ遺伝子」は、in vivoにおいて機能的な生物活性を有し得るＡＳＭタンパク質をコードする核酸配列を意味する。野生型ＡＳＭ核酸配列は、公知の、刊行されている配列、例えば、米国特許第６，５４１，２１８号などに記載の配列とは異なるヌクレオチド変化を含んでもよく、その場合、その変化によって生じるアミノ酸置換は、生物活性にほとんど影響しないものである。本明細書で用いられる、野生型という用語はまた、内因性又は天然のＡＳＭタンパク質と比較して、その活性が増加され得る、又は強められ得るＡＳＭタンパク質をコードするために処理されたＡＳＭ核酸配列を含んでもよい。
【００５６】
「野生型ＡＳＭタンパク質」は、in vivoで発現している、又は導入されている場合に機能的な生物活性を有し得る野生型遺伝子によってコードされる任意のタンパク質を意味する。このような機能性は、タンパク質の機能性を証明する既知の任意の方法によって試験され得る。
【００５７】
「発現する」及び「発現」という用語は、ＡＳＭ遺伝子又はＤＮＡ配列中の情報が現れるようにすることを可能にする、又は引き起こすことを意味し、例えば、ＡＳＭ遺伝子又はＤＮＡ配列、すなわちＡＳＭをコードする配列に対応する転写及び翻訳に関与する細胞の機能を活性化することによってＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ又はｍＲＮＡ）又はＡＳＭタンパク質を産生することなどを意味する。ＡＳＭのＤＮＡ配列は、細胞によって発現され、「発現産物」、例えばＡＳＭのＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ又はｒＲＮＡ）、又はＡＳＭタンパク質などが形成される。発現産物そのもの、例えば、結果として生じるＡＳＭのＲＮＡ又はタンパク質などはまた、細胞によって「発現される」と称されてもよい。
【００５８】
「トランスフェクション」又は「トランスフォーメーション」という用語は、「外来の」、すなわち、外因性又は細胞外の、遺伝子、ＤＮＡ配列、又はＲＮＡ配列を宿主細胞へ導入することを意味し、これにより、所望の物質を産生するために導入された遺伝子又は配列を宿主細胞が発現するだろうことを意味する。本発明において、前記の物質とは、通常、導入される遺伝子又は配列によってコードされるＲＮＡであり、導入される遺伝子又は配列によってコードされる酵素タンパク質である。導入される遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来の」遺伝子又は配列と称されてもよく、調節塩基配列又は制御配列（例えば、細胞の遺伝子機構によって用いられるスタート、ストップ、プロモーター、シグナル、分泌、又は他の配列）を含んでもよい。遺伝子又は配列は、非機能的配列、又は機能すると知られていない配列を含んでもよい。導入されるＤＮＡ又はＲＮＡを受け取り、かつ発現する宿主細胞は、「トランスフォームされ」又は「トランスフェクトされ」ており、「形質転換細胞」又は「クローン」である。宿主細胞へ導入されるＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同一の種若しくは属の細胞、又は異なる種又は属の細胞を含む、任意の供給源に由来し得る。本明細書では、トランスフェクション又はトランスフォーメーションには、変異した内因性のＡＳＭ遺伝子を有する個体に、機能的ＡＳＭをコードする配列を導入することが含まれるだろう。
【００５９】
「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」という用語は、ＡＳＭのＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列（例えば、外来の遺伝子）を宿主細胞に導入できるビヒクルを意味し、その結果、導入される配列が宿主にトランスフォームされ、発現（例えば、転写及び翻訳）が促進される。ベクターには、任意の遺伝的要素、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどが含まれ、遺伝的要素は適切な制御要素と関連する場合に複製可能であり、細胞間でＡＳＭ遺伝子配列を移動させることができる。従って、この用語には、クローニング及び発現ビヒクル、並びにウイルスベクターが含まれる。
【００６０】
「発現系」という用語は、適切な条件下、例えば、ベクターによって運ばれ、宿主細胞に導入される外来のＤＮＡによりコードされたＡＳＭタンパク質の発現のための、宿主細胞及び適合性ベクターを意味する。一般的な発現系には、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｈｉ５、又はＳ２細胞など）及びバキュロウイルスベクター、及び発現系、並びに哺乳類宿主細胞及びベクターが含まれる。
【００６１】
「遺伝子治療」という用語は、外因性の遺伝子、すなわちＡＳＭ遺伝子の投与によって内因性遺伝子の発現を変化させる方法を意味する。本明細書では、遺伝子治療はまた、欠損又は欠失ＡＳＭ遺伝子に対応する機能遺伝子又は遺伝子の一部を、必要としている個体の体細胞又は幹細胞に導入することによって、欠損ＡＳＭ遺伝子を補充し、欠失ＡＳＭ遺伝子を補充することも意味する。遺伝子治療は、「ex vivo」方法で達成され得、この方法では、分化した、又は体細胞の幹細胞が個体の体から取り出され、続いて、欠損遺伝子の正常コピーが、遺伝子導入ビヒクルであるウイルスベクターにより、移植された細胞へと導入される。加えて、in vivoにおける導入は、治療結果を達成するために、広範囲のウイルスベクター、リポソーム、タンパク質ＤＮＡ複合体、又は裸のＤＮＡを用いた、個体のin situ細胞内への直接的な遺伝子導入である。
【００６２】
「リコンビナントタンパク質」という用語は、ベクターにより運ばれる治療用ＡＳＭ遺伝子によってコードされるＡＳＭタンパク質（遺伝子産物）を意味する。通常、ベクターを受け取る細胞は、リコンビナントタンパク質に対応する内因性ＡＳＭタンパク質のいずれもがその発現及び／又は活性を失っているか、又はこのような内因性のＡＳＭタンパク質の発現が存在する場合には、その発現は変異であるか、若しくは非常に低いレベルであるだろう。１つの実施態様では、リコンビナントタンパク質は、実験的目的及び治療目的での組織培養の細胞によって産生される。別の実施態様では、リコンビナントタンパク質は、ベクターとともにトランスフォームされた細胞からin vivoで産生され、そこでは、ベクター及びベクターを含む細胞が、対象に投与されている（すなわち、遺伝子治療）。リコンビナントＡＳＭタンパク質は、正常個体、すなわち、このタンパク質を欠損していない個体の野生型タンパク質とは区別できないだろう。
【００６３】
［治療への適用］
本発明はさらに、ＮＰＤ Ａ型及びＮＰＤ Ｂ型の予防又は治療方法を提供しており、本方法は、変異ＡＳＭ酵素の発現若しくは活性を増加させること、又はリコンビナントな野生型補充ＡＳＭ酵素の活性を増加させることを含み、このような治療を必要とする対象又は患者に対して行われる。
【００６４】
「対象」又は「患者」は、ＮＰＤを発現している、又は発現しそうなヒト又は動物であり、より詳細には哺乳動物、好ましくはげっ歯類又は霊長類であり、より好ましくはヒトである。１つの実施態様では、患者は、アシュケナージ系ユダヤ人集団の一員であって、ＮＰＤを発現していると診断されているか、又はＡＳＭ遺伝子の遺伝的変異によりＮＰＤを発現するリスクが高いと確認されているアシュケナージ系ユダヤ人である。別の実施態様では、患者は、ノバスコシア州のフランス系カナダ人集団の一員、北アフリカのマグレブ地域（チュニジア、モロッコ、アルジェリア）の住民（Ｂ型）、又は南部のニューメキシコ州及びコロラド州のスペイン系アメリカ人集団の一員である。しかし、ニーマンピック病は、全ての民族で起こり、対象という用語には、ＮＰＤを有する世界中の誰もが、又は遺伝的にＮＰＤを発現するリスクを有する誰もが含まれる。
【００６５】
「予防」という用語は、病気の発現を予防することを意味し、病気をもたらす病的メカニズムに予防的に干渉することを意味する。本発明に関連して、このような病的メカニズムは、ＡＳＭの変異タンパク質のフォールディング及び発現を増加させることができる。
【００６６】
「治療」という用語は、この病気の症状を示す対象の病気の進行に対して治療的に干渉することを意味する。本発明に関連して、これらの症状には、これに限定されないが、例えば、網内系のライソゾーム中のスフィンゴミエリンの蓄積が挙げられ、その結果、肝脾腫大症、精神運動遅延、肺の異常、進行性神経変性を生じる。場合によっては、治療により、ＮＰＤによる死を防ぐことができるだろう。
【００６７】
本明細書で用いられる、「治療上有効な量」という用語は、変異ＡＳＭ発現レベルを増加させるのに十分なＡＳＳＣ（すなわち、スフィンゴミエリンアナログ、セラミドアナログ、又はヌクレオチドアナログ）の量又は用量を意味し、例えば、正常細胞で認められるレベルに対して約３〜５％まで、好ましくは約１０％まで、より好ましくは約３０％まで増加させる量又は用量を意味する。好ましくは、治療上有効な量は、対象のＡＳＭ活性の臨床的に重大な欠損を改善できる、又は予防できる。あるいは、治療上有効な量は、対象の臨床的に重大な状況、例えば、ＮＰＤ Ｂ型患者の進行性神経変性などの改善をもたらすのに十分な量である。
【００６８】
本発明では、「治療上有効な量」はまた、ＡＳＭタンパク質の活性を阻害することなくその活性を強める低分子アナログの量も意味し、すなわち、有効な量が、阻害することよりも増強し、最終的な効果が増強されることを意味する。これは、通常、ＡＳＭに対する阻害剤のＩＣ５０値未満に位置し、又は約５０μＭ未満となるだろう。
【００６９】
変異ＡＳＭの発現又は活性を増加させる低分子アナログは、医薬として許容可能なキャリアーとともに、医薬組成物として有利に製剤化されている。これに関連して、低分子アナログは、活性成分又は治療剤である。
【００７０】
活性成分の濃度又は量は、以下に記載したとおりの、所望の用量及び投薬計画によって決まる。低分子アナログの適切な用量範囲は、１日当たり、体重１ｋｇ当たり、約１ｍｇ〜約１００ｍｇを含んでよい。
【００７１】
［併用療法］
ＡＳＳＣ及びタンパク質補充
本発明の医薬組成物はまた、スフィンゴミエリンアナログ、セラミドアナログ、又はヌクレオチドアナログに加えて、他の生物活性化合物を含んでもよい。例えば、１つの実施態様では、低分子アナログが、補充療法の酵素注入の間に、補充物である野生型（又は別の機能的な）リコンビナントＡＳＭとともに溶液として投与されてもよい。タンパク質補充療法は、注入によって、野生型又は生物学的な機能を持つタンパク質を外因的に導入することにより、タンパク質の量を増加させる。この治療法は、ゴーシェ病及びファブリー病を含む多くの遺伝的障害のために開発されている。野生型酵素は、リコンビナント細胞発現系（例えば、哺乳類細胞又は昆虫細胞、Desnickらによる米国特許第５，５８０，７５７号；Seldenらによる同第６，３９５，８８４号及び同第６，４５８，５７４号；Calhounらによる同第６，４６１，６０９号；Miyamuraらによる同第６，２１０，６６６号；Seldenらによる同第６，０８３，７２５号；Rasmussenらによる同第６，４５１，６００号；Rasmussenらによる同第５，２３６，８３８号；Ginnsらによる同第５，８７９，６８０号参照）、ヒトプラセンタ、又は畜乳（Reuserらによる米国特許第６，１８８，０４５号参照）から精製される。
【００７２】
注入後、外因性のＡＳＭ酵素は、非特異的又はレセプター特異的メカニズムを介して組織に取り込まれることが期待される。一般的に、取り込み効率は高くなく、外因性タンパク質の循環時間は短い（Ioannu et al., Am. J. Hum. Genet. 2001; 68: 14-25）。加えて、外因性のＡＳＭは、循環に不安定であり、急速な細胞内分解を受ける。従って、低分子アナログである、ＡＳＭに対するＡＳＳＣとの共投与が、外因的に投与されたＡＳＭの安定性を高め、その分解を抑制するだろうと期待される。
【００７３】
別の実施態様では、低分子アナログはまた、同一の組成物中である必要はないが、リコンビナントな機能的ＡＳＭタンパク質と組み合わせて投与されてもよい。この実施態様では、補充ＡＳＭタンパク質及び低分子アナログは、分離した組成物として製剤化されている。低分子アナログ及び補充ＡＳＭは、同じ経路（例えば、静脈内注射）に従って投与されてもよく、異なる経路（例えば、補充タンパク質を静脈内注射で投与し、ＡＳＳＣを経口投与する）に従って投与されてもよい。
【００７４】
ＡＳＳＣ及び遺伝子治療
加えて、本発明の低分子アナログ組成物は、野生型、又は他の機能的ＡＳＭ遺伝子をコードするリコンビナントベクターと組み合わせて（すなわち、遺伝子治療に関連するもの）投与されてもよい。最近、リコンビナント遺伝子治療法は、ライソゾーム貯蔵障害の治療に対して（例えば、米国特許第５，６５８，５６７号参照）、ファブリー病に対するリコンビナントアルファ−ガラクトシダーゼＡ治療に対して（米国特許第５，５８０，７５７号参照）、融合タンパク質として生物活性α−ガラクトシダーゼＡのクローニング及び発現に対して（米国特許第６，０６６，６２６号参照）、ライソゾーム貯蔵障害に対する治療組成物及び方法に対して（米国特許第６，０８３，７２５号参照）、ヒトアルファ−ガラクトシダーゼＡタンパク質を発現しているトランスフェクトされたヒト細胞に対して（米国特許第６，３３５，０１１号参照）、ライソゾーム貯蔵障害を治療するための、リコンビナントアデノ関連ウイルスを用いた筋細胞へのＤＮＡの導入方法に対して（Bishop, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986; 83: 4859-4863; Medin, J. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996; 93: 7917-7922; Novo, F. J., Gene Therapy 1997; 4: 488-492,; Ohshima, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997; 94: 2540-2544; Sugimoto Y. et al., Human Gene Therapy 1995; 6: 905-915; Sly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99(9): 5760-2; Raben et al., Curr. Mol. Med. 2002; 2(2): 145-66; Eto et al., Curr. Mol. Med. 2002; 2(1): 83-9; Vogler et al., Pediatr. Dev. Pathol. 2001; 4(5): 421-33; Barranger et al., Expert Opin. Biol. Ther. 2001; 1(5): 857-67; Yew et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 2001; 3(4): 399-406; Caillaud et al., Biomed. Pharmacother. 2000; 54(10): 505-12、及び Ioannu et al., J. Am. Soc. Nephrol. 2000; 11(8):1542-7）、臨床開発中又は前臨床開発中である。
【００７５】
発現したＡＳＭ酵素を安定化させることに加えて、低分子アナログはまた、ＥＲ中で適切なフォールディング及びプロセッシングを抑制する変異の結果として欠損となるいずれの内因性の変異ＡＳＭの発現も、安定化し強めるだろうことに注意しなくてはいけない。
【００７６】
［製剤化及び投与］
「医薬として許容可能な」という用語は、多くのヒトに投与した場合に、生理学的に耐性であり、異常亢進や目眩などのアレルギー性又は同様の有害反応を一般的に産生しない分子的実体及び組成物を意味する。好ましくは、本明細書で用いられる「医薬として許容可能な」という用語は、動物、特にヒトへの使用に対して、連邦政府若しくは州政府の管理機関から認可を受けているか、アメリカ合衆国の薬局方若しくは他の一般的に承認される薬局方に収載されていることを意味する。「キャリアー」という用語は、本化合物とともに投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤、又はビヒクルを意味する。このような医薬品キャリアーは、水及び油などの滅菌した液体であることができ、油には、石油、動物油、植物油、又は合成起源油が含まれ、例えば、ラッカセイ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などである。水又は水溶液には、食塩水並びにデキストロース及びグリセロール水溶液をキャリアーとして用いることが好ましく、特に注射剤として用いられる。適した医薬品キャリアーは、E. W. Martinによって「Remington’s Pharmaceutical Sciences」に記載されている。
【００７７】
本発明では、本発明の医薬品組成物、例えばＤ−ＭＡＰＰなどは、非経口的に、経粘膜的に（例えば、経口的に（口から）、経鼻的に、又は経直腸的に）、又は経皮的に導入され得る。非経口経路には、静脈内投与、細動脈内投与、筋内投与、皮内投与、皮下投与、腹腔内投与、脳室内投与、及び頭蓋内投与が含まれる。
【００７８】
タンパク質補充との併用療法に関して、ＡＳＳＣを補充ＡＳＭ酵素と同一組成物で投与する場合の実施態様において、製剤は、非経口投与（静脈内投与、皮下投与、及び腹腔内投与を含む）に適していることが好ましいが、経口投与（例えば、カプセル化酵素）、経鼻投与、又は経皮投与などの他の投与経路に適した製剤も検討される。
【００７９】
１つの実施態様では、経皮投与は、リポソームによって達成される。脂質二重層小胞とは、極性部分（親水性）及び非極性部分（親油性）を有する個々の分子から主に形成される、閉鎖し、液体で満たされた微小な球体である。親水性部分は、ホスファト、グリセリルホスファト、カルボキシ、サルファト、アミノ、ヒドロキシ、コリン、又は他の極性基を含んでもよい。脂質基の例としては、飽和若しくは不飽和炭化水素、例えばアルキル、アルケニル、又は他の脂質基である。ステロール（例えば、コレステロール）及び他の医薬として許容可能なアジュバント（アルファ−トコフェノールなどの抗酸化物質を含む）もまた、小胞の安定性を高めるためか、又は他の所望の特性を与えるために含まれてもよい。
【００８０】
リポソームは、これらの二重層小胞の一部であり、脂肪酸鎖からなる２つの疎水性尾部を含むリン脂質分子から主に構成されている。水に暴露するとすぐに、これらの分子は球状の二分子膜を形成するために自然に配置するが、ここで二分子膜とは、膜の中心に集まる各層の分子の親油末端と、二分子膜（１又は複数）のそれぞれ内外表面を形成する反対の極性末端とを有するものである。従って、膜の各面には、親水性表面が存在する一方で、膜の内側は親油性の媒体を含む。これらの膜は、タマネギの層と異ならない形で、内部の水性空間のまわりに、薄い層状水によって分離される一連の同心球状の膜で調製されてもよい。これらの多重膜小胞（ＭＬＶ）は、剪断力を適用することによって単層小胞（ＵＶ）へと転換され得る。本発明の方法に従ってセラミドアナログ及びスフィンゴミエリンアナログを導入するためにリポソームを使用する利点とは、リポソームが血液脳関門を通過し得ることである。ＮＰＤ Ａ型は、スフィンゴミエリンの蓄積に起因する神経変性によって特徴付けられるので、脳への効果的なターゲティングが、Ａ型治療のいずれにおいても重要となる。
【００８１】
注射剤としての使用に適した医薬品製剤には、滅菌水溶液（水溶性）又はディスパージョン、及び滅菌注射用溶液又はディスパージョンをその場で調製するための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、その形態は無菌でなければならず、容易に注入可能である程度まで流動的でなければならない。その形態は、製造及び保存条件下において安定でなければならず、バクテリア及び菌類などの微生物の汚染作用を受けずに保存されなければならない。キャリアーは、溶媒又はディスパージョンであることができ、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及びポリエチレングリコールなど）、適したそれらの混合物、及び植物油などを含む。適した流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、ディスパージョンの場合は必要とされる粒径を維持することにより、及び界面活性剤を用いることにより維持され得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによってもたらされる。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。吸収を遅らせる作用剤、例えば、アルミニウムモノエステル及びゼラチンの組成物を使用することによって、注射用組成物の吸収を持続させることができる。
【００８２】
滅菌注射用溶液は、精製したＡＳＭ酵素と低分子アナログとを、必要に応じて、上記で列挙した様々なほかの成分とともに、適した溶媒中に所要量で組み込み、それに続いて、濾過滅菌又は終末殺菌を行うことにより調製される。一般に、ディスパージョンは、様々な滅菌活性成分を、ベーシックな分散媒体と上記で列挙した所要の他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に任意の所望の追加成分を加えた粉末を、それらを含む滅菌濾過した溶液から産生する真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。
【００８３】
好ましくは、製剤は賦形剤を含む。製剤に含まれてもよい、医薬として許容可能な賦形剤は、シトレートバッファー、ホスフェートバッファー、アセテートバッファー、バイカーボネートバッファーなどのバッファー；アミノ酸；尿素；アルコール；アスコルビン酸；リン脂質；セラムアルブミン、コラーゲン、及びゼラチンなどのタンパク質；ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡなどの塩類及び塩化ナトリウム；リポソーム；ポリビニルピロリドン；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールなどの糖類；プロピレングリコール及びポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００、ＰＥＧ−６０００）；グリセロール；グリシン又は他のアミノ酸；並びに脂質。製剤に使用されるバッファー系には、シトレート；アセテート；バイカーボネート；及びホスフェートバッファーが含まれる。ホスフェートバッファーが好ましい実施態様である。
【００８４】
製剤はまた、好ましくはノニオン性界面活性剤も含む。好ましいノニオン性界面活性剤には、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ８０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、Ｏｃｔｙｌ α−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｏｃｔｙｌ β−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ、Ｂｒｉｊ ３５、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、及びＴｗｅｅｎ ２０が含まれる。
【００８５】
ＡＳＭ酵素及び低分子ＡＳＳＣ調製において凍結乾燥する場合、酵素の濃度は、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬであり得る。グリシン、マンニトール、アルブミン、及びデキストランなどの充填剤を、この凍結乾燥混合物に添加できる。さらに、二糖類、アミノ酸、及びＰＥＧなどの抗凍結剤となり得るものを、この凍結乾燥混合物に添加できる。上記のバッファー、賦形剤、及び界面活性剤はいずれも添加できる。
【００８６】
吸入投与用の低分子アナログ（ＡＳＭを添加又は無添加）の製剤は、ラクトース若しくは他の賦形剤を含んでもよく、又はポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココーレート、若しくはデオキシココーレートを含んでもよい水溶液であってよい。好ましい吸入エアロゾルは、低密度及び大きなサイズの粒子を有することによって特徴付けられる。０．４ｇ／ｃｃ未満の密度、及び５μｍを超える平均粒径を有する粒子は、吸入された治療剤を循環系へと効果的に運搬する。このような粒子は、肺深くへ吸い込まれ、肺本来の排除メカニズムを免れ、その後、吸入粒子はその治療用ペイロードを運搬する（Edwards et al., Science. 1997; 276: 1868-1872）。本発明の補充タンパク質調製物は、エアロゾル形態で投与されることができ、例えば、それぞれが参照として本明細書で援用する、米国特許第５，６５４，００７号、同第５，７８０，０１４号、及び同第５，８１４，６０７号に記載の調製方法及び製剤化方法が用いられる。経鼻投与用の製剤は、点鼻薬の形態で投与するために油性溶液を含んでもよく、又はゲルとして経鼻的に適用されてもよい。
【００８７】
皮膚表面への低分子アナログの局所投与用の製剤は、ローション、クリーム、オイントメント、又はソープなどの皮膚に対して許容可能なキャリアーと本組成物を分散させることによって調製されてもよい。局所的に適用するため、及び除去を防ぐために、皮膚上に膜又は層を形成できるキャリアーが特に有用である。内部組織表面に局所投与するために、組織表面への吸着を強めることで知られている、液体の組織接着剤又は他の物質中に本組成物を分散してもよい。別法として、組織コーティング溶液、例えばペクチン含有製剤などを使用してもよい。
【００８８】
好ましい実施態様において、本発明の製剤は、所定の調製物用量を簡便に投与する装置中の液剤又は粉剤のどちらかで供給され、このような装置の例には、皮下注射又は筋内注射のどちらかのための無針注射器、及び定量エアロゾルデリバリー装置が含まれる。他の例として、本調製物は、持続放出に適した形態で供給されてもよく、例えば、経皮投与のために皮膚へと適用されるパッチ若しくは包帯、又は経粘膜投与のための侵食可能な装置を介してもよい。Ｄ−ＭＡＰＰ又は他の低分子アナログなどの製剤が、錠剤又はカプセル剤の形態で経口投与される場合、本調製物は、除去可能なカバーを有したボトル、又はブリスターパックに入れて供給されてもよい。
【００８９】
低分子アナログが独立して投与されるか、又はＡＳＳＣが単療法として単独で投与される実施態様では、低分子アナログは、任意の投与経路に適した形態であることができ、限定はされないが、上記の全ての形態を含み、例えば、滅菌水溶液、鼻孔吸入、経皮投与、又は投与前のin vitroでの凝集を防ぐために、再構成の間若しくは再構成後すぐに補充タンパク質の製剤へと添加される乾燥状の凍結乾燥粉末形態などである。別法として、好ましい実施態様では、低分子アナログは、以下に例を挙げる医薬として許容可能な賦形剤とともに常法により調製される錠剤又はカプセル剤の形態で、経口投与のために製剤化され得る：結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；フィラー（例えば、ラクトース、微結晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム）；滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプン又はデンプングリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は、当分野で公知の方法でコーティングされてもよい。
【００９０】
低分子アナログの経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ、若しくは懸濁液の形態であってよく、又はそれらは乾燥産物として存在してもよく、その場合、乾燥産物は、使用前に水若しくは他の適したビヒクルと構成される。このような液体調製物は、以下に例を挙げる医薬として許容可能な添加剤とともに常法により調製されてよい：懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチン又はアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコール、又は分別植物油）；及び保存料（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート、プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾアート、又はソルビン酸）。本調製物はまた、必要に応じて、バッファー塩類、香料、着色料、及び甘味料を含んでもよい。経口投与用の調製物は、活性化合物の放出を制御できるように、適切に製剤化されてもよい。
【００９１】
遺伝子治療との併用療法（又は単療法として）に関して、低分子アナログＡＳＳＣは、例えば、経口経路、非経口経路、経皮経路、又は経粘膜経路による投与用に独立して製剤化されてもよく、この経路には、上記の経路が含まれるがこれに限定されるものではない。好ましい実施態様では、低分子アナログは、上述したような、医薬として許容可能な賦形剤とともに常法により調製された錠剤又はカプセル剤（１つ又は複数）として経口投与される。別法として、低分子アナログは、注射、例えば、静脈内ボーラス又は持続注入などによる非経口用に製剤化されてもよい。注射用製剤は、添加された保存料とともに、ユニット用量形態、例えば、アンプル又は複数用量コンテナの形態で存在してもよい。本組成物は、油状ビヒクル又は水性ビヒクル中で、懸濁液、溶液、又はエマルションの形態であってもよく、懸濁化剤、分解防止剤、及び／又は分散剤などの処方剤（formulatory agent）を含んでもよい。別の実施態様では、低分子アナログは、適したビヒクル、例えばピロゲンを含まない滅菌水などとともに使用前に構成するための粉末形態であってよい。
【００９２】
低分子アナログはまた、例えば、カカオバター又は他のグリセリドなどの一般的な座剤の基剤を含む座薬又は停留浣腸などの直腸用組成物として製剤化されてもよい。
【００９３】
上記の製剤化に加えて、低分子アナログは、持効性調製物として製剤化されてもよい。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下又は筋内に）、又は筋内注射によって投与されてもよい。従って、例えば、低分子アナログは、適したポリマー物質、疎水性物質（例えば、許容可能な油中のエマルションとして）又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性の塩などの難溶性の誘導体として、製剤化されてもよい。
【００９４】
［タイミング］
補充ＡＳＭタンパク質及び低分子アナログが、独立した製剤である場合、投与は同時であってよく、又は低分子アナログをＡＳＭ補充タンパク質投与の前若しくは後に投与してもよい。例えば、ＡＳＭ補充タンパク質が静脈内に投与された場合、低分子アナログは、０〜６時間後の間に投与されてもよい。あるいは、低分子アナログをタンパク質投与の０〜６時間前に投与してもよい。
【００９５】
好ましい実施態様では、低分子アナログ及び補充タンパク質が別々に投与され、循環半減期が短い場合（例えば、低分子）、低分子アナログは、連続して、例えば毎日経口投与されてよく、それにより循環の一定レベルが維持される。このような一定レベルは、患者にとって毒性がないと判断されるレベルであり、非抑制性の治療効果を与えるための投与期間中、標的の補充タンパク質と相互作用することに関して最適であるだろう。
【００９６】
別の実施態様では、低分子アナログは、補充ＡＳＭタンパク質のターンオーバーに必要とされる期間中投与される（低分子アナログの投与により延長されるだろう）。
【００９７】
タイミングに関わらず、ＡＳＭタンパク質及び低分子アナログの濃度は、低分子アナログが、in vivoにおけるタンパク質活性を安定化させるけれども、抑制又は阻害しないようなものでなければならず、そのように投与されなければならない。補充ＡＳＭタンパク質及び低分子アナログが、同一製剤で投与される場合にもこれが適用される。
【００９８】
低分子アナログ及び遺伝子治療との併用療法に関して、本発明の低分子アナログの投与は、一般に、標的細胞／組織によってリコンビナントＡＳＭ酵素を発現させるための、ＡＳＭ遺伝子の導入に続いて行われる。ＡＳＭ遺伝子の発現は、期間中、遺伝子が発現可能である限りは維持されるので、低分子アナログは、リコンビナントＡＳＭ酵素に対するシャペロン及び安定剤としての効果を保持するだろう。従って、低分子アナログの投与は、遺伝子発現と同時期であることが必要となるだろう。
【００９９】
好ましい実施態様では、低分子アナログの循環半減期は短いので、循環中での一定レベルを維持するために、低分子アナログが頻繁に、例えば毎日経口投与されることが好ましい。このような一定レベルは、患者にとって毒性がないと判断されるレベルであり、非抑制性の治療効果を与えるための、連続して産生されるだろうタンパク質との相互作用に関して最適であるだろう。
【０１００】
本発明では、治療用のＡＳＭ遺伝子が、内因性の変異ＡＳＭ遺伝子の不十分な活性を補完した後は、低分子アナログの有効量が内因性の変異ＡＳＭの活性を強め、治療用ＡＳＭ遺伝子産物の効率を高めることができるので、低分子アナログ導入のタイミングは重要でなくなる。
【０１０１】
投与されたＡＳＭ遺伝子によってコードされるＡＳＭ酵素に対するＡＳＳＣ（例えばＤ−ＭＡＰＰ）の存在は、ＥＲでの合成期間中、タンパク質のプロセッシングの効率を高め（すなわち、凝集を防ぐことによって）、循環及び組織におけるＡＳＭ酵素の半減期を延長し、それにより、より長い期間にわたって効果的なレベルを維持するという利点を有するだろう。この結果、臨床上影響を受けている組織での発現が増加するだろう。これにより、ＮＰＤ患者の苦痛を和らげることを強め、治療の頻度を減少させ、及び／又はＡＳＭ遺伝子投与の量を減らすというような患者に対する有益な効果をもたらすだろう。これにより、治療費も減少するだろう。
【０１０２】
［遺伝子治療］
本ＡＳＳＣ発明との併用治療で用いられるＡＳＭ核酸は、当分野で使用可能な遺伝子治療方法を含む、任意の既知の方法によって投与されてもよい。その際、同定され単離された遺伝子は、適切なクローニングベクターへと挿入される。遺伝子治療に適したベクターには、ウイルス（例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニア、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、及びレトロウイルス）、パルボウイルス、レンチウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、及び他のリコンビネーションビヒクルであり、これは、様々な真核生物宿主及び原核生物宿主で発現すると記載されている、当分野で一般的に使用されるものである。
【０１０３】
好ましい実施態様では、前記ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクター、特にアデノウイルスベクターは、カチオン性両親媒性物質、例えば、カチオン性脂質、ポリＬ−リジン（ＰＬＬ）、及びジエチルアミノエチルデキストラン（ＤＥＬＡＥ−デキストラン）などと複合体を形成でき、これは、標的細胞のウイルス感染効率を増加させる（参照として本明細書に援用する、１９９７年１１月２０日出願のＰＣＴ／ＵＳ９７／２１４９６参照）。本発明で用いられる好ましいウイルスベクターには、ワクシニア、ヘルペスウイルス、ＡＡＶ、及びレトロウイルス由来のベクターが含まれる。詳細には、ヘルペスウイルス、特に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）が、神経細胞へのトランスジーンの導入に特に有用である（例えば、米国特許第５，６７２，３４４号で開示されており、この開示は、参照として本明細書に援用する）。ＡＡＶベクターもまた有用であり、その理由としては、これらのベクターが、最小限必要なベクターの反復投与で、宿主染色体に組み込まれるからである（例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、同第５，２５２，４７９号及び同第５，７５３，５００号、並びにＰＣＴ出願 ＷＯ ９７／０９４４１などで開示されており、この開示は参照として本明細書に援用する）。遺伝子治療におけるウイルスベクターに関しては、Mah et al., Clin. Pharmacokinet. 2002; 41(12): 901-11; Scott et al., Neuromuscul. Disord. 2002; 12 Suppl 1: S23-9を参照のこと。さらに、米国特許第５，６７０，４８８号も参照のこと。
【０１０４】
導入される遺伝子のコード配列は、発現制御配列、例えば、遺伝子発現を導くプロモーターなどと実施可能に連結されている。本明細書で用いられる、「実施可能に連結される」という句は、ヌクレオチドの調節塩基配列及びエフェクター配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写停止部位及び翻訳停止部位、並びに他のシグナル配列などと、ポリヌクレオチド／遺伝子との機能的関係を表す。例えば、核酸とプロモーターとの実施可能な連結とは、プロモーターを特異的に認識し結合するＲＮＡポリメラーゼによってそのプロモーターからＤＮＡの転写が開始され、このプロモーターによってポリヌクレオチドからＲＮＡへの転写が導かれるというような、ポリヌクレオチド及びプロモーターとの物理的及び機能的関係を表す。
【０１０５】
１つの実施態様において、ベクターを使用することで、コード配列及びその他の所望する配列の全てが、ゲノム上の所望する部位での相同組み換えを促進する領域に隣接し、それにより、ゲノム上に導入されている核酸分子由来の構築物が発現する（Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989, 86: 8932 8935; Zijlstra et al., Nature 1989, 342: 435 438）。
【０１０６】
特定の実施態様では、ベクターは、in vivoに直接投与され、それにより、生物の細胞中に入り、構築物の発現を媒介する。これは、当分野で公知の多数の方法のどんなものによっても達成され得、また上述したように、例えば、適切な発現ベクターの一部として構築され、それが以下に例を挙げるような方法によって細胞内に入り込むように投与されることにより達成され得る：欠損又は弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスベクターを用いた注射（米国特許第４，９８０，２８６号参照）、裸のＤＮＡの直接注射、微粒子照射の使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）；脂質、細胞表面レセプター、又はトランスフェクション試薬のコーティング、バイオポリマーのカプセル化（例えば、ポリ−β−１−６４−Ｎ−アセチルグルコサミンポリサッカライド；米国特許第５，６３５，４９３号参照）、リポソームのカプセル化、微粒子のカプセル化（マイクロカプセル）；細胞核へ入りこむことが公知のペプチド又は他のリガンドと連結した形態での投与；又はエンドサイトーシスを媒介する受容体に対するリガンドと連結した形態での投与（例えば、Wu and Wu, J. Biol. Chem. 1987, 62: 4429 4432参照）など。別の実施態様では、核酸リガンド複合体は、リガンドがエンドソームを崩壊させる融合性ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を受けないようなものとして形成されるか、又はカチオン性の１２ ｍｅｒペプチド、例えばアンテナペディア由来であって、治療用ＤＮＡを細胞内へ輸送するために使用され得るものとして形成され得る（Mi et al., Mol. Therapy. 2000, 2:339 47）。さらに別の実施態様では、核酸が、特異的な受容体を標的とすることによる細胞特異的な取り込み及び発現のために、in vivoで標的化され得る（例えば、ＰＣＴ出願 ＷＯ ９２／０６１８０、ＷＯ ９２／２２６３５、ＷＯ ９２／２０３１６、及びＷＯ ９３／１４１８８を参照）。最近、マグネトフェクション（magnetofection）と称される技術が、ベクターを哺乳動物へ導入するために使用されている。この技術は、磁場の影響下で導入するために、ベクターを超常磁性微粒子と結合させる。この適用は、導入時間を短縮させ、ベクターの効率を高める
（Scherer et al., Gene Therapy 2002; 9: 102-9）。
【０１０７】
特定の実施態様では、核酸は脂質キャリアーを用いて投与され得る。脂質キャリアーは、細胞膜の通過を容易にするために、裸のＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡ）と結合し得る。カチオン性、アニオン性、又は中性の脂質がこの目的で使用され得る。しかし、好ましいのはカチオン性であり、なぜなら、カチオン性脂質は、一般に、負に帯電しているＤＮＡとよく結合することが示されているからである。カチオン性脂質はまた、プラスミドＤＮＡの細胞内への導入を媒介することも示されている（Felgner and Ringold, Nature. 1989; 337: 387）。カチオン性脂質−プラスミド複合体をマウスへ静脈注射することにより、肺においてそのＤＮＡが発現したことが示されている（Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 1989; 298: 278）。さらに以下も参照されたし：Osaka et al., J. Pharm. Sci. 1996; 85(6):612-618; San et al., Human Gene Therapy 1993; 4: 781-788; Senior et al., Biochemica et Biophysica Acta. 1991; 1070: 173-179); Kabanov and Kabanov, Bioconjugate Chem. 1995; 6: 7-20; Liu et al., Pharmaceut. Res. 1996; 13; Remy et al., Bioconjugate Chem. 1994; 5:647-654; Behr, J-P., Bioconjugate Chem. 1994; 5: 382-389; Wyman et al., Biochem. 1997; 36: 3008-3017; Marshallらによる米国特許第５，９３９，４０１号; Scheuleらによる米国特許第６，３３１，５２４号。
【０１０８】
代表的なカチオン性脂質には、例えば、米国特許第５，２８３，１８５号及び同第５，７６７，０９９号で開示されているものが含まれ、この開示を本明細書に参照として援用する。好ましい実施態様では、カチオン性脂質は、米国特許第５，７６７，０９９号で開示されている、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバマート（ＧＬ−６７）である。好ましい脂質を追加すると、脂質には、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバマート（ＧＬ−５３）及び１−（Ｎ４−スペルミン）−２，３−ジラウリルグリセロールカルバマート（ＧＬ８９）が含まれる。
【０１０９】
好ましくは、ウイルスベクターのin vivoでの投与に際し、適切な免疫抑制治療が、ウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターなどに関連して実施され、ウイルスベクター及びトランスフェクトされた細胞の免疫不活性化を避ける。例えば、免疫抑制性サイトカイン（例えば、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、又は抗ＣＤ４抗体など）が、ウイルスベクターに対する液性又は細胞性免疫反応を阻害するために投与され得る。その際、最少の抗原数を発現するように設計されたウイルスベクターを用いることが有利である。
【０１１０】
［用量］
投与されるＡＳＭタンパク質及び／又は内因性のＡＳＭ変異タンパク質を安定化させるために効果的な低分子アナログの量が、当業者により決定され得る。補充ＡＳＭタンパク質及び低分子アナログの両方における、半減期（ｔ１／２）、ピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）、ピーク血漿濃度の時間（ｔｍａｘ）、濃度曲線下面積（ＡＵＣ）として測定される暴露、及び組織分布、並びに低分子アナログ−補充ＡＭＰタンパク質結合のデータ（親和定数、結合定数、解離定数、及び結合価）などの、薬物動態学及び薬物薬理学を、当業者に公知の一般的方法によって得ることができ、それにより、補充ＡＳＭタンパク質の活性を阻害せずに補充ＡＳＭタンパク質を安定化するために必要な適合量が決定され、治療効果が得られることとなる。
【０１１１】
本組成物の毒性及び治療有効性は、標準的な薬学的手法、例えば、ＬＤ５０及びＥＤ５０を決定するための細胞培養アッセイ又は実験動物の使用などにより決定され得る。パラメータであるＬＤ５０及びＥＤ５０は、当分野で既知であり、それぞれ、集団の５０％が死に至る化合物の用量、及び集団の５０％に治療的効果をもたらす化合物の用量を意味する。毒性効果と治療効果との用量割合は、治療指数と称され、ＬＤ５０／ＥＤ５０の割合で表現されてもよい。治療上有効な用量は、ＩＣ５０を含む循環濃度の範囲を得るために、細胞培養アッセイから初めは概算され、動物系で策定されてもよい。化合物のＩＣ５０濃度とは、症状の最大阻害の半分を得る濃度である（例えば、細胞培養アッセイから決定されるもの）。特定の個体、例えばヒト患者などに使用される適切な用量は、これらの情報を用いて、その後より正確に決定されてもよい。
【０１１２】
血漿中の化合物の測定は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又はガスクロマトグラフィーなどの技術を用いて、患者などの個体に対して定期的に測定されてもよい。
【０１１３】
いずれの治療においても、使用される特定の用量は、実施される特定用量の形態、用いられる投与経路、個体（例えば、患者など）の条件などの因子に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０１１４】
現行の手法に従って、補充ＡＳＭタンパク質の濃度は、体重１ｋｇ当たり０．０５〜５．０ｍｇであり、通常は、週に１度又は２週間に１度投与される。このタンパク質は、体重１ｋｇ当たり０．１μｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ〜約２ｍｇの範囲の用量で投与され得る。例えば、ファブリー病の治療に際し、臨床上認められるリコンビナントα−Ｇａｌ Ａの投与用量は、通常は、体重１ｋｇ当たり０．１〜０．３ｍｇであり、週に１度又は２週間に１度投与される。このタンパク質の規則的に繰り返される投与が、患者の生涯にわたって必要である。皮下注射は、薬剤への全身暴露を長期間維持する。皮下用量は、２週間に一度又は週に一度、体重１ｋｇ当たり０．１〜５．０ｍｇのα−Ｇａｌ Ａであることが好ましい。ＡＳＭは、好ましくは静脈内に投与され、例えば、静脈内ボーラス注射、穏やかな圧力での静脈注射、又は持続静脈注射によって投与される。持続ＩＶ注入（例えば、２〜６時間にわたって）により、血中で特定レベルが維持される。
【０１１５】
低分子アナログの最適な濃度は、リコンビナントＡＳＭタンパク質活性を阻害することなく、in vivo、組織又は循環において、このタンパク質を安定化するために必要な量に従って、組織又は循環における低分子アナログの生体利用効率に従って、及び組織又は循環における低分子アナログの代謝に従って決定されるだろう。例えば、低分子アナログＤ−ＭＡＰＰの濃度は、ＡＳＭに対するＤ−ＭＡＰＰのＩＣ５０値を測定することによって決定され、すなわち５０μＭ未満であった。本化合物の生体利用効率及び代謝を考慮すると、ほぼＩＣ５０値となる濃度又はＩＣ５０値をわずかに超える濃度が、ＡＳＭ活性への影響に基づき評価され得、例えば、ＡＳＭ活性量を増加させるため、又は補充ＡＳＭのＡＳＭ活性を持続させるために必要とされる低分子アナログの量に基づき評価され得る。
【０１１６】
（実施例）
以下に示す実施例を用いて、本発明をさらに説明する。このような実施例は、例証に用いるだけであり、本発明又は例示された項目のいずれにおいても、その範囲又は意味を限定するものではない。同様に、本発明は、本明細書に記載される特定の好ましい実施態様のいずれにも限定されない。実際に、本明細書を読むとすぐに、本発明に多くの修正又は変更を加えることが当業者に理解されるだろうし、それらの修正又は変更は、発明の精神及び範囲から逸脱することなくなされ得るだろう。従って、本発明は、添付の請求項の項目、並びに添付の請求項に与えられる権利と等価な全範囲によってのみ限定される。
【０１１７】
（実施例１：Ｄ−ＭＡＰＰを用いたＡＳＭ活性の回復）
低分子である、Ｄ−ＭＡＰＰとして知られるセラミドアナログ（構造は図１を参照）を、ＮＰＤに対する、可能性あるＡＳＳＣとして評価した。
【０１１８】
［材料及び方法］
Ｄ−ＭＡＰＰは、Ｍａｔｒｅｙａ社（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ、ＰＡ、カタログ番号１８５９）から購入し、２ｍＭの濃度のエタノールで再構成した。
【０１１９】
リコンビナントＡＳＭ
シャペロンＡＳＭに使用され得るＤ−ＭＡＰＰの非抑制濃度の範囲を決定するために、精製した野生型ＡＳＭのＫｉを測定した。リコンビナント ヒトＡＳＭ（ｒＡＳＭ）を、既報の方法（He et al., Biochem et Biophys Acta. 1999; 1432: 251-264）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞を過剰発現している媒体から精製した。簡単に述べると、これは、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｃｅｌ、Ｃｏｎｃａｎｖａｌｉｎ Ａ、及びＳｕｐｅｒｏｓｅ １２を介したクロマトグラフィーを用いることにより得られた。Ｄ−ＭＡＰＰは、Ｍａｔｒｅｙａ Ｉｎｃより購入した（Ｐｌｅａｓａｎｔ Ｇａｐ、カタログ番号１８５９）。
【０１２０】
阻害アッセイ
純粋な酵素を用いたin vitroでの研究のために、原液の一定分量を窒素下で乾燥させ、次いで蛍光ＡＳＭ基質であるＢＯＤＩＰＹ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）を含む酢酸ナトリウムバッファーに再懸濁した。この溶液を超音波処理し、純粋なｒＡＳＭの一定分量を添加した。本アッセイでの基質の最終濃度は、１００マイクロモーラー（μＭ）であり、Ｄ−ＭＡＰＰの濃度は、１０〜５００μＭまで変動させた。アッセイは、以前に記載されたとおりに実施した（He et al., Biochem. 2003; 314: 116-120）。
【０１２１】
Ｒ４９６Ｌ変異の２コピーを有するＮＰＤ Ａ型の皮膚線維芽細胞及び正常な皮膚線維芽細胞を（インフォームドコンセントのもと）取得し、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を含む標準組織培養メディウム（culture medium）（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ）で培養した。様々な濃度（５〜５０μＭ）のＤ−ＭＡＰＰを培養メディウムに添加し、細胞を様々な期間でインキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞をトリプシン処理し、ラバーポリスマンを用いて細胞を回収し、生理食塩水で洗浄し、１０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．０）中に再懸濁した。細胞抽出物を超音波処理により調製し、細胞片を超音波処理し、上清を、以前に記載されているとおり（He et al., Biochem. 2003; 314: 116-120）、ＢＯＤＩＰＩ Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎを用いたＡＳＭ活性測定に使用した。
【０１２２】
結果
図４に、Ｄ−ＭＡＰＰが、約５０μＭのＫｉで純粋なＡＳＭの活性を阻害したことを示す。図５には、Ｒ４９６Ｌ変異の２コピーを有するＮＰＤ Ａ型患者由来の培養皮膚線維芽細胞をＤ−ＭＡＰＰの存在下（５〜５０μＭ）で３日間インキュベートした場合に、残存ＡＳＭ活性が３倍まで、すなわち通常の３％まで（通常の１％未満の初期活性から）強められたことを示す。最大増強が約１０μＭで認められ、この濃度での、細胞の成長又は生存性に対する有害な効果は全く認められなかった。従って、Ｄ−ＭＡＰＰ（野生型ＡＳＭ活性の低分子阻害剤）は、ＮＰＤ治療におけるＡＳＳＣとして有用であり得る。
【０１２３】
（実施例２：新規スフィンゴミエリンアナログを用いたＡＳＭ活性の回復）
材料及び方法
本明細書に記載されるスフィンゴミエリンアナログがＮＰＤ線維芽細胞に投与された場合に、これらの化合物は競合的ＡＳＭ阻害剤（すなわち、これらが基質結合を減少させる−データは示していない）であることから、正常ＡＳＭの活性を強め、変異ＡＳＭ活性を助けることが期待される。このようなスフィンゴミエリンアナログが、図２Ｂ〜Ｄに表されている。好ましい化合物は、図２Ｄで表されるアナログである。
【０１２４】
リコンビナントＡＳＭ
図２ＤのスフィンゴミエリンアナログのＫｉは、Ｄ−ＭＡＰＰについて上述したとおり、野生型リコンビナントＡＳＭに対して測定された。
【０１２５】
線維芽細胞アッセイ
正常線維芽細胞におけるＡＳＭ阻害のＫｉも、ＮＰＤ線維芽細胞におけるＤ−ＭＡＰＰについて上述したとおりに測定された。
【０１２６】
さらに、Ｒ４９６Ｌ変異の２コピーを有するＮＰＤ Ａ型の皮膚線維芽細胞及び正常皮膚線維芽細胞は、約０．５〜５０μＭの図２Ｂ〜Ｄで表されるスフィンゴミエリンアナログとともに、Ｄ−ＭＡＰＰについて上述した条件下で５日間治療されるだろう。
【０１２７】
結果
スフィンゴミエリンアナログは、約７０μＭのＫｉで、純粋なリコンビナントＡＳＭ活性を阻害したが、正常線維芽細胞では、２０μＭで約９０％のＡＳＭを阻害した。
【０１２８】
これらのアナログは、上述のＤ−ＭＡＰＰで示された結果と同様に、野生型活性を強めるだろうと期待される。これらのアナログは、変異線維芽細胞において変異ＡＳＭ活性を助けるだろうことも期待される。
【０１２９】
（実施例３：酵素補充治療又は遺伝子治療を用いて治療されたニーマンピック病マウスに対する低分子アナログの併用療法）
材料及び方法、並びに結果
ＡＳＭ欠損マウス（ＮＰＤ ＫＯマウス）は以前から作製されている（Dhami et al., Lab Invest. 2001; 81(7): 987-99）。これらのマウスは、１０週齢までに、肺のエアースペース中に正常マウスよりも著しく多い細胞（拡大化し、しばしば多核化したマクロファージで主に構成されている）数を有することにより特徴づけられる。低分子セラミド、スフィンゴミエリンアナログ、又はヌクレオチドアナログを単独で、又は遺伝子治療若しくは酵素補充治療との組み合わせとして使用することが、ＮＰＤ患者の治療に対して有用であり得ることを実証するために企図される実験で、これらのマウスを用いることができる。
【０１３０】
いくつかのライソゾーム貯蔵障害に対する酵素補充療法が、Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、及びＴｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ（ＴＫＴ）によって開発されている。補充酵素を注入することによって治療されたＡＳＭノックアウトマウスに対する、Ｄ−ＭＡＰＰ、若しくは他のセラミドアナログ、スフィンゴミエリンアナログ、又はホスホヌクレオチドアナログ（すなわち、ＡＳＳＣ）、例えば本明細書に記載されているものなど、の併用療法は、ＡＳＳＣが酵素を安定化し分解を抑制することから、in vivoにおける補充酵素の安定性、例えば半減期などを増加させるだろう。本低分子アナログは、ファブリー病ＫＯマウスにおいて以前に記載されたプロトコル（Ioannu et al., Am J Hum Genet. 2001; 68: 14-25）と同様のプロトコルに従って、野生型ＡＳＭを注入した後、ＫＯマウスに経口投与される。心臓、腎臓、脾臓、肝臓及び肺を含む様々な組織、並びに血清におけるＡＳＭ活性は、期間中測定され、ＡＳＳＣ投与されていないコントロールマウスのＡＳＭ活性、及び酵素を投与されず低分子アナログのみを投与されているマウスのＡＳＭ活性と比較される。長期間では、ＡＳＳＣの併用療法が酵素補充療法の効果を高めることができることが示されるだろう。
【０１３１】
遺伝子治療を施されたＡＳＭ ＫＯマウスへの低分子アナログの併用療法は、治療用遺伝子産物の発現を著しく高め、詳細には、標的細胞のＥＲ中での凝集を抑制することによって、遺伝子治療の効率を高めるだろう。このＫＯマウスは、遺伝子治療プロトコルの後に、本明細書に記載の、Ｄ−ＭＡＰＰ、スフィンゴミエリンアナログ、又はヌクレオチドアナログ（飲用水で溶解したもの）を投与され、心臓、腎臓、脾臓、肝臓及び肺を含む様々な組織、並びに血清における低分子アナログ活性が、期間中測定され、低分子アナログを投与されていないコントロールマウスの活性、及び遺伝子治療を受けずに低分子アナログを投与されたマウスの活性と比較される。高い酵素活性及び長時間の維持は、低分子アナログの併用療法が、遺伝子治療の効果を高めることができることを示している。
【０１３２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施態様によって範囲を限定されるものではない。実際に、本明細書に記載されている変形に加えて本発明に様々な変形を施すことは、前述の説明及び添付した図から、当業者に明らかであると理解されるだろう。このような変形は、添付の請求項の範囲内に収まるように企図される。
【０１３３】
特許、特許出願、刊行物及び手順などは、本出願を通じて引用され、これらの開示は、その全体を参照として本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本発明の好ましいＡＳＳＣの１つであるＤ−ＭＡＰＰの構造を表した図である。
【図２Ａ】本発明で使用され得るセラミドアナログの構造を表した図である。
【図２Ｂ】本発明を実施するために使用され得るスフィンゴミエリンアナログの構造を表した図である。
【図２Ｃ】本発明を実施するために使用され得るスフィンゴミエリンアナログの構造を表した図である。
【図２Ｄ】ＮＰＤ ＡＳＳＣの候補である、好ましい実施態様でのスフィンゴミエリンアナログの構造を表した図である。
【図３】ＡＳＭの阻害剤及びＡＳＳＣである、ヌクレオチドアナログの構造を表した図である。
【図４】野生型ＡＳＭ活性におけるＤ−ＭＡＰＰ阻害のＫｉを示した図である。
【図５】ＮＰＤ Ａ型を有する個体由来の細胞におけるＡＳＭ活性に対するＤ−ＭＡＰＰの効果を示した図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2007514661.tif 000042
【図３】
2007514661.tif 000043
【図４】
2007514661.tif 000044
【図５】
2007514661.tif 000045
【配列表】
2007514661000001.app
【国際調査報告】
2007514661.tif 000046