(57)【要約】  本発明は、好ましくは、リボース部分がリボース以外の構成部分によって置換されているモノマーを含むｉＲＮＡ剤に関する。このようなモノマーを含めることは、該モノマーが組み込まれるｉＲＮＡ剤の特性を、例えば、リガンドまたは他の実体、例えば、親油性部分（例えば、コレステロール）が直接的または間接的に連結される部位として非リボース部分を使用することによって調節可能にし得る。本発明はまた、このような修飾ｉＲＮＡ剤を作製する方法および使用する方法に関する。
2007525454.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１鎖および第２鎖を含んでなるｉＲＮＡ剤であって、前記鎖の少なくとも一方に、式（Ｉ）を有する少なくとも１つのサブユニットが組み込まれていることを特徴とするｉＲＮＡ剤。
【化１】
2007525454.tif 000089
（式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７、またはＣＨ２であり；
ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるか、または存在せず；
ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、または存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは、独立に、Ｈ、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも１つがＯＲａまたはＯＲｂであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも１つが（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは、独立に、Ｈ、１〜３個のＲ１３により任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか；またはＲ５とＲ１１が一体となって、Ｒ１４により任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをなし；
Ｒ７はＲｄであるか；またはＮＲｃＲｄもしくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；
Ｒａは
【化２】
2007525454.tif 000090
であり；
Ｒｂは
【化３】
2007525454.tif 000091
であり；
ＡおよびＣのそれぞれは、独立に、ＯまたはＳであり；
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【化４】
2007525454.tif 000092
であり；
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンドであり；かつ
ｎは１〜４である）
【請求項２】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺは存在しない、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、かつＲ３はＯＲａである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ３はシス位にある、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ１およびＲ３はトランス位にある、請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
ｎは１である、請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
ＡはＯである、請求項３に記載の化合物。
【請求項８】
ＡはＳである、請求項３に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、かつＲ３はＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａであり、かつＲ３はＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄである、請求項３に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミン
Ｋ基からなる群から選択される、請求項３に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１はＯＲｂであり、かつＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１はＯＲｂであり、かつＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲａである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ１はＯＲａであり、かつＲ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１およびＲ３はシス位にある、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ１およびＲ３はトランス位にある、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
ｎは１である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、かつＲ９はＯＲａである、請求項２に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ１およびＲ９はシス位にある、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１およびＲ９はトランス位にある、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
ｎは１である、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ１はＯＲａであり、かつＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ１およびＲ９はシス位にある、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ１およびＲ９はトランス位にある、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２６】
ｎは１である、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、かつＲ９はＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲａであり、かつＲ９はＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｒ１はＯＲｂであり、かつＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ１はＯＲｂであり、かつＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、かつＲ９はＯＲａである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３２】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、かつＲ９はＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３３】
Ｒ３は（ＣＨ２）ｎＯＲａであり、かつＲ９はＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｒ３はＯＲａであり、かつＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ３はＯＲｂであり、かつＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ３はＯＲｂであり、かつＲ９は（ＣＨ２）ｎＯＲａである、請求項２に記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つがＯＲａであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つが（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つが（ＣＨ２）ｎＯＲａであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つがＯＲｂである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３９】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つがＯＲｂであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つが（ＣＨ２）ｎＯＲｂである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４０】
第１鎖および第２鎖を含んでなるｉＲＮＡ剤であって、少なくとも１つのサブユニットが細胞への侵入を増強する親油性部分で誘導体化されていることを特徴とするｉＲＮＡ剤。
【請求項４１】
親油性部分は、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
親油性部分はコレステロールである、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４３】
前記鎖の少なくとも一方に、式（Ｉ）を有する少なくとも１つのサブユニットが組み込まれている、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【化５】
2007525454.tif 000093
（式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７、またはＣＨ２であり；
ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるか、または存在せず；
ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、または存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは、独立に、Ｈ、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも１つがＯＲａまたはＯＲｂであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも１つが（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは、独立に、Ｈ、１〜３個のＲ１３により任意選択で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか；またはＲ５とＲ１１が一体となって、Ｒ１４により任意選択で置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをなし；
Ｒ７はＲｄであるか；またはＮＲｃＲｄもしくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；
Ｒａは
【化６】
2007525454.tif 000094
であり；
Ｒｂは
【化７】
2007525454.tif 000095
であり；
ＡおよびＣのそれぞれは、独立に、ＯまたはＳであり；
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【化８】
2007525454.tif 000096
であり；
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンドであり；かつ
ｎは１〜４である）
【請求項４４】
Ｒｄは、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４５】
Ｒｄはコレステロールである、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；かつＺは存在しない、請求項４３に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｒ１は（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、かつＲ３はＯＲａである、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
ｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であり、かつ約１９対の二本鎖領域が存在する、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項４９】
ｉＲＮＡ剤が長さ１７〜２３対の二本鎖領域を含む、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５０】
第１鎖または第２鎖がセンス鎖であり、かつ親油性部分がセンス鎖に結合している、請求項４０に記載の化合物。
【請求項５１】
親油性部分が３’末端のサブユニットに結合している、請求項５０に記載の化合物。
【請求項５２】
親油性部分が５’末端のサブユニットに結合している、請求項５０に記載の化合物。
【請求項５３】
親油性部分が内部のサブユニットに結合している、請求項５０に記載の化合物。
【請求項５４】
親油性部分は初代細胞への侵入を増強する、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５５】
親油性部分が、滑膜細胞、筋細胞、ケラチノサイト、肝実質細胞、白血球、内皮細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、上皮細胞、中胚葉細胞、骨髄細胞、神経細胞、新生物細胞、および線維芽細胞からなる群から選択される細胞への侵入を増強する、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５６】
筋細胞は平滑筋細胞または心筋細胞である、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５７】
線維芽細胞は真皮線維芽細胞である、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５８】
細胞は線維芽細胞であり、ｉＲＮＡ剤はＰＴＰ−１Ｂ遺伝子またはＭＡＰキナーゼ遺伝子を標的とする、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５９】
白血球は単球である、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６０】
細胞は上皮細胞または中胚葉細胞であり、ｉＲＮＡ剤は、ＭＤＲ、Ｍｙｃ、Ｍｙｂ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、ａ−Ｍｙｂ、ｂ−Ｍｙｂ、ｖ−Ｍｙｂ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＥ、ＣＤＫ４、ｃｄｃ２５Ａ、ＣＤＫ２、およびＣＤＫ４からなる群から選択される核酸を標的とする、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６１】
細胞は神経細胞であり、かつｉＲＮＡ剤はＧ７２またはＤＡＡＯ遺伝子を標的とする、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６２】
細胞はケラチノサイトであり、かつｉＲＮＡ剤はＴＥＲＴまたはＴＲ／ＴＥＲＣ遺伝子を標的とする、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６３】
細胞はリンパ腫細胞または白血病細胞である、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６４】
ｉＲＮＡ剤はインターロイキン遺伝子またはインターロイキン受容体遺伝子を標的とする、請求項６３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６５】
ｉＲＮＡ剤は染色体転座を標的とする、請求項６３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６６】
ｉＲＮＡ剤は、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＥＬ−ＡＭＬ−１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１、ＥＷＳ−ＥＲＧ、ＴＬＳ−ＦＵＳ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、およびＡＭＬ−ＥＴＯからなる群から選択される染色体転座を標的とする、請求項６５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６７】
上皮細胞は腎臓上皮細胞である、請求項５５に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６８】
細胞は不死化された細胞株由来である、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６９】
細胞は肥満細胞である、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７０】
ｉＲＮＡ剤はＧＲＢ２関連結合タンパク質を標的とする、請求項６９に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７１】
細胞は付着性の腫瘍細胞株由来である、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７２】
付着性の腫瘍細胞株が、膀胱、肺、乳房、子宮頸部、結腸、膵臓、前立腺、腎臓、肝臓、皮膚、および中枢神経系からなる群から選択される組織由来である、請求項７１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７３】
ｉＲＮＡ剤は成長因子または成長因子受容体をコードする遺伝子を標的とする、請求項７２に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７４】
ｉＲＮＡ剤は、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ受容体、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧ
Ｆｒ１、ＶＥＧＦｒ２、ＶＥＧＦｒ３、ＩＧＦ−１Ｒ、ＤＡＦ−２、およびＩｎＲからなる群から選択される遺伝子を標的とする、請求項７３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７５】
ｉＲＮＡ剤は、ＰＲＬ１、ＰＲＬ２、ＰＲＬ３、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＰＫＣ受容体、ＭＤＲ１、ＴＥＲＴ、ＴＲ／ＴＥＲＣ、サイクリンＤ１、ＮＦ−κＢ、ＲＥＬ−Ａ、ＲＥＬ−Ｂ、ＰＣＮＡ、ＣＨＫ−１、ｃ−ｆｏｓ、ｊｕｎ、またはＢＣＬ−２からなる群から選択される遺伝子を標的とする、請求項７１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７６】
細胞は外来遺伝子を含み、かつｉＲＮＡ剤は外来遺伝子を標的とする、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７７】
外来遺伝子は肝炎ウイルス遺伝子である、請求項７６に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７８】
細胞は、３Ｔ３、ＤＬＤ２、ＴＨＰ１、Ｒａｗ２６４．７、ＩＣ２１、Ｐ３８８Ｄ１、Ｕ９３７、ＨＬ６０、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、Ｋ５６２、ＥＬ４、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＶＥＲＯ、ＭＲＣ５、ＣＶ１、Ｃｏｓ７、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ５４９、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ａ３７５、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ＨｅｐＧ２、およびＵ８７からなる群から選択される細胞株由来である、請求項４０に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７９】
親油性部分と複合体化されているｉＲＮＡ剤を細胞に供給する工程を包含する、標的遺伝子をサイレンシングする方法。
【請求項８０】
ｉＲＮＡ剤が生物に投与される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
ｉＲＮＡ剤を生物の体外にある細胞と接触させる、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
細胞は細胞株の細胞である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
親油性部分と複合体化され、生物に投与されるかまたは生物の一部ではない細胞との接触状態におかれるｉＲＮＡ剤が、送達を促進もしくは増強する他の試薬の非存在下で、または該試薬の量が低減された状態で投与される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
他の試薬が存在しないことを特徴とする、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
親油性部分と複合体化されているｉＲＮＡ剤を含んでなる組成物であって、細胞膜を通過する送達を促進もしくは増強する他の試薬を含まないか、低減された量の該試薬を含むか、または該試薬を本質的に含まないことを特徴とする組成物。
【請求項８６】
組成物が、追加の親油性部分；トランスフェクション剤、例えば、ｉＲＮＡ剤の細胞透過性を実質的に変化させる濃度のイオンまたは他の物質を含まないか、その含量が低減されているか、または実質的に含まないことを特徴とする、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
請求項１または４０に記載のｉＲＮＡ剤を対象に投与する工程を包含する、対象における標的遺伝子の発現を調節する方法。
【請求項８８】
請求項１または４０に記載のｉＲＮＡ剤および薬剤として許容可能な担体を含んでなる薬剤組成物。
【請求項８９】
請求項１または４０に記載のｉＲＮＡ剤、ｉＲＮＡ剤が配される滅菌容器、および取扱説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは、リボース部分がリボース以外の部分によって置換されているモノマーを含むｉＲＮＡ剤に関する。このようなモノマーを含めることにより、例えば、その非リボース部分を、リガンドまたは他のもの（例えば、コレステロールなどの親油性部分）が直接的または間接的に連結される点として使用して、そのモノマーが組み込まれているｉＲＮＡ剤の特性を調節することが可能となる。本発明はまた、このような修飾ｉＲＮＡ剤を作製する方法および使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００３年８月８日に出願された米国仮出願第６０／４９３，９８６号；２００３年８月１１日に出願された米国仮出願第６０／４９４，５９７号；２００３年９月２６日に出願された米国仮出願第６０／５０６，３４１号；２００３年１１月７日に出願された米国仮出願第６０／５１８，４５３号；２００３年４月１７日に出願された米国仮出願第６０／４６３，７７２号；２００３年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／４６５，８０２号；２００３年５月９日に出願された米国仮出願第６０／４６９，６１２号；２００３年１０月９日に出願された米国仮出願第６０／５１０，２４６号；２００３年１０月１０日に出願された米国仮出願第６０／５１０，３１８号；２００３年９月１５日に出願された米国仮出願第６０／５０３，４１４号；２００３年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／４６５，６６５号；ならびに２００４年３月８日に出願された国際出願番号第［ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０］；２００４年４月５日に出願された国際出願番号第［ＰＣＴ／ＵＳ０４／ＸＸＸＸＸ］；２００４年４月９日に出願された国際出願番号第［ＰＣＴ／ＵＳ０４／ＸＸＸＸＸ］およびこれと同日付で出願された国際出願番号第［ＰＣＴ／ＵＳ０４／ＸＸＸＸＸ］の利益を主張する。これらの出願すべての内容はその全体を本願明細書に援用する。
【０００３】
［背景］
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が線虫に導入されると遺伝子発現を阻害しうるという観察を説明するために、ファイア（Ｆｉｒｅ）および共同研究者らによって最初に作られた用語である（非特許文献１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的な転写後のサイレンシング（発現抑制）を導き、遺伝子の機能を研究するための新規なツールを提供してきた。ＲＮＡｉはｍＲＮＡ分解を伴うこともある。
【非特許文献１】ファイアら（Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  第３９１巻、ｐ．８０６−８１１、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、修飾ｉＲＮＡ剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、とりわけ、ｉＲＮＡ剤の１つまたは複数のリボヌクレオチド・サブユニットのリボース糖が、別の構成部分、例えば、非糖質（好ましくは、環状）の担体で置換可能であることを発見した。リボヌクレオチド・サブユニットのリボース糖がそのように置換されている場合、本明細書中では、該サブユニットはリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状の担体は炭素環系（すなわち、すべての環原子が炭素原子）であってもよいし、または複素環系（すなわち、１つまたは複数の環原子がヘテロ原子
（例えば、窒素、酸素、硫黄））であってもよい。環状の担体は単環系であってもよいし、または２つ以上の環（例えば、融合した環）を含んでもよい。環状の担体は、完全に飽和した環系であってもよいし、あるいは１つまたは複数の二重結合を含んでもよい。
【０００６】
この担体はさらに、（ｉ）少なくとも２つの「バックボーン結合点」および（ｉｉ）少なくとも１つの「連結部結合点」を含む。「バックボーン結合点」とは、本明細書中で使用される場合、官能基（例えば、ヒドロキシル基）、または一般的に、リボ核酸のバックボーン、例えば、リン酸バックボーンもしくは修飾リン酸バックボーン（例えば、硫黄含有バックボーン）へ該担体を取込むために利用可能である結合、および取込みに適している結合をいう。「連結部結合点」は、本明細書中で使用される場合、選択された構成部分を接続する、環状担体の構成原子である環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子をいう（バックボーン結合点を提供する原子とは区別される）。選択される構成部分は、例えばリガンド、例えば、標的化部分もしくは送達部分、または物理的特性を変化させる構成部分でもよい。最も好ましい構成部分の１つは、細胞内への侵入を促進する構成部分、例えば、親油性部分（例えば、コレステロール）である。理論によって束縛されることを望まないが、親油性物質を結合させるとｉＲＮＡ剤の親油性が増大すると考えられている。場合によっては、選択された構成部分は、介在する連結部によって環状担体に接続される。したがって、選択された構成部分はしばしば官能基（例えば、アミノ基）を含み、または一般的には、別の化学基（例えば、構成環に対するリガンド）の取込みまたは連結に適した結合を提供する。
【０００７】
本明細書に記載される１つまたは複数のＲＲＭＳを、ＲＮＡ剤（例えば、ｉＲＮＡ剤）へ取込むことにより、特に適切な実体に連結させた場合、１つまたは複数の新規な特性をＲＮＡ剤に付与することが可能であり、かつ／または、該ＲＮＡ分子中に存在する１つまたは複数の特性を変化、増強、もしくは調節することが可能である。例えば、親油性またはヌクレアーゼ耐性のうち１つまたは複数を変化させることが可能である。本明細書に記載される１つまたは複数のＲＲＭＳをｉＲＮＡ剤へ取込むことにより、特に、ＲＲＭＳを適切な実体に連結させた場合、例えば、標的ｍＲＮＡへのｉＲＮＡ剤の結合親和性を調節（例えば、増加）すること、二本鎖型のｉＲＮＡ剤の幾何学的性質を変化させること、分布を変化させるかもしくはｉＲＮＡ剤が身体の特定の部分を指向するようにさせること、あるいは核酸結合タンパク質との相互作用を（例えば、ＲＩＳＣ形成時および鎖分離時に）変化させることが可能である。
【０００８】
したがって、１つの態様において、本発明は、好ましくは第１鎖および第２鎖を含んでなるｉＲＮＡ剤であって、前記鎖の少なくとも一方に、式（Ｉ）を有する少なくとも１つのサブユニットが組み込まれていることを特徴とするｉＲＮＡ剤を特徴とする：
【０００９】
【化１】
2007525454.tif 000003
【００１０】
（式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７、またはＣＨ２であり；
ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であるか、または存在せず；
ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、または存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは、独立に、Ｈ、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、但し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０の少なくとも１つがＯＲａまたはＯＲｂであり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０の少なくとも１つが（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり（ＲＲＭＳが末端にある場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち１つがＲａを含み、かつ１つがＲｂを含む；ＲＲＭＳＳが内部にある場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち２つがそれぞれＲｂを含む）；さらに好ましくはＯＲａが（ＣＨ２）ｎＯＲｂを伴ってのみ存在することが可能であり、かつ（ＣＨ２）ｎＯＲａがＯＲｂを伴ってのみ存在することが可能であり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは、独立に、Ｈ、任意選択で１〜３つのＲ１３で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、もしくはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか；またはＲ５とＲ１１が一緒になって、任意選択でＲ１４により置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルであり；
Ｒ７はリガンドであってもよく、例えば、Ｒ７はＲｄであってもよいし、またはＲ７は、例えば連結部分、例えば、ＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキル；またはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルを通して担体に間接的に連結されたリガンドあり；
Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；
Ｒａは
【００１１】
【化２】
2007525454.tif 000004
【００１２】
であり；
Ｒｂは
【００１３】
【化３】
2007525454.tif 000005
【００１４】
であり、
ＡおよびＣのそれぞれは、独立に、ＯまたはＳであり；
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【００１５】
【化４】
2007525454.tif 000006
【００１６】
であり、
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンド、例えば親油性リガンド（例えば、コレステロール）であり；かつ
ｎは１〜４である）。
【００１７】
実施形態は以下の特徴のうち１つまたは複数を含み得る。
本発明のｉＲＮＡ剤は２１ヌクレオチド長であってもよく、かつ約１９対の二本鎖領域が存在していてもよい。
【００１８】
本発明のｉＲＮＡ剤は１７〜２３対の長さの二本鎖領域を含み得る。
Ｒ１がＣＨ２ＯＲａでかつＲ３がＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＣＨ２ＯＲａでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＣＨ２ＯＲａでかつＲ２がＯＲｂであってもよい。
【００１９】
Ｒ１がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ３がＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ２がＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ３がＯＲａであってもよく；またはＲ１がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ９がＯＲａであってもよく；またはＲ１がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ２がＯＲａであってもよい。
【００２０】
Ｒ１がＯＲａでかつＲ３がＣＨ２ＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＯＲａでかつＲ９がＣＨ２ＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＯＲａでかつＲ２がＣＨ２ＯＲｂであってもよい。
【００２１】
Ｒ１がＯＲｂでかつＲ３がＣＨ２ＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＯＲｂでかつＲ９がＣＨ２ＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＯＲｂでかつＲ２がＣＨ２ＯＲｂであってもよく；Ｒ１がＯＲｂでかつＲ３がＣＨ２ＯＲａであってもよく；またはＲ１がＯＲｂでかつＲ９がＣＨ２ＯＲａであってもよく；またはＲ１がＯＲｂでかつＲ２がＣＨ２ＯＲａであってもよい。
【００２２】
Ｒ３がＣＨ２ＯＲａでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ３がＣＨ２ＯＲａでかつＲ４がＯＲｂであってもよい。
Ｒ３がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ３がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ４がＯＲｂであってもよく；またはＲ３がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ９がＯＲａであってもよく；またはＲ３がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ４がＯＲａであってもよい。
【００２３】
Ｒ３がＯＲｂでかつＲ９がＣＨ２ＯＲａであってもよく；またはＲ３がＯＲｂでかつＲ４がＣＨ２ＯＲａであってもよく；またはＲ３がＯＲｂでかつＲ９がＣＨ２ＯＲｂであってもよく；またはＲ３がＯＲｂでかつＲ４がＣＨ２ＯＲｂであってもよい。
【００２４】
Ｒ３がＯＲａでかつＲ９がＣＨ２ＯＲｂであってもよく；またはＲ３がＯＲａでかつＲ４がＣＨ２ＯＲｂであってもよい。
Ｒ９がＣＨ２ＯＲａでかつＲ１０がＯＲｂであってもよい。
【００２５】
Ｒ９がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ１０がＯＲｂであってもよく；またはＲ９がＣＨ２ＯＲｂでかつＲ１０がＯＲａであってもよい。
好ましい実施形態において、リボースは、ピロリン骨格、または４−ヒドロキシプロリン誘導体骨格で置換され、かつＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺは存在しない。
【００２６】
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、またはＲ１およびＲ３はトランス位にあってもよい。
ｎは１であり得る。
【００２７】
ＡはＯまたはＳであり得る。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ３がＯＲｂであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ３がＯＲｂであってもよい。
【００２８】
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであり得る。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００２９】
Ｒ１がＯＲｂでかつＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＯＲｂでかつＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってもよく；またはＲ１がＯＲａでかつＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ９がＯＲａであってもよい。
【００３０】
Ｒ１およびＲ９はシス位にあってもよいし、またはＲ１およびＲ９はトランス位にあってもよい。
Ｒ１がＯＲａでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよく；またはＲ１がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってもよい。
【００３１】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ９がＯＲａであってもよく；またはＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；Ｒ３がＯＲａでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよく；Ｒ３がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよく；またはＲ３がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってもよい。
【００３２】
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、またはＲ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
他の好ましい実施形態において、リボースはピペリジン骨格で置換され、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【００３３】
Ｒ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ１０がＯＲａであってもよい。
ｎは１または２であり得る。
Ｒ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ１０がＯＲｂであってもよく；またはＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ１０がＯＲｂであってもよい。
【００３４】
ＡはＯまたはＳであり得る。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであり得る。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００３５】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ４がＯＲａであってもよく；またはＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ４がＯＲｂであってもよく；またはＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ４がＯＲｂであってもよい。
【００３６】
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ２がＯＲａであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ２がＯＲｂであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ２がＯＲｂであってもよい。
【００３７】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ９がＯＲａであってもよい。
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、またはＲ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
【００３８】
Ｒ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ９がＯＲｂであってもよく；またはＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ９がＯＲａであってもよく；またはＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ９がＯＲｂであってもよい。
【００３９】
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ３がＯＲａであってもよい。
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、またはＲ１およびＲ３はトランス位にあってもよい。
【００４０】
Ｒ３がＯＲａでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよい。
Ｒ１がＯＲａでかつＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよい。
他の好ましい実施形態において、リボースはピペラジン骨格で置換され、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＮＲ８であり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【００４１】
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ３がＯＲａであってもよい。
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、またはＲ１およびＲ３はトランス位にあってもよい。
【００４２】
ｎは１であり得る。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ３がＯＲｂであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ３がＯＲｂであってもよい。
【００４３】
ＡはＯまたはＳ、好ましくはＳであり得る。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであり得る。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基からなる群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００４４】
Ｒ８はＣＨ３であり得る。
Ｒ１がＯＲａでかつＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよい。
他の好ましい実施形態において、リボースはモルホリノ骨格で置換され、ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹはＯであり、かつＺはＣＲ１１Ｒ１２である。
【００４５】
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ３がＯＲａであってもよい。
Ｒ１およびＲ３はシス位にあってもよいし、またはＲ１およびＲ３はトランス位にあっ
てもよい。
【００４６】
ｎは１であり得る。
Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでかつＲ３がＯＲｂであってもよく；またはＲ１が（ＣＨ２）ｎＯＲａでかつＲ３がＯＲｂであってもよい。
【００４７】
ＡはＯまたはＳであり得る。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであり得る。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基からなる群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００４８】
Ｒ８はＣＨ３であり得る。
Ｒ１がＯＲａでかつＲ３が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよい。
他の好ましい実施形態において、リボースはデカリン骨格で置換され、ＸはＣＨ２であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およびＲ１１は一緒になってＣ６シクロアルキルをなす。
【００４９】
Ｒ６はＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり得る。
Ｒ１２は水素であり得る。
Ｒ６およびＲ１２はトランスであり得る。
【００５０】
Ｒ３がＯＲａでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり得る。
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、またはＲ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
【００５１】
ｎは１または２であり得る。
Ｒ３がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであってもよく；またはＲ３がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってもよい。
【００５２】
ＡはＯまたはＳであり得る。
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであり得る。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基からなる群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００５３】
他の好ましい実施形態において、リボースはデカリン／インダン骨格で置換され、例えば、ＸはＣＨ２であり；ＹはＣＲ９Ｒ１０であり；ＺはＣＲ１１Ｒ１２であり；かつＲ５およびＲ１１は一緒になってＣ５シクロアルキルをなす。
【００５４】
Ｒ６はＣＨ３であり得る。
Ｒ１２は水素であり得る。
Ｒ６およびＲ１２はトランスであり得る。
【００５５】
Ｒ３がＯＲａでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり得る。
Ｒ３およびＲ９はシス位にあってもよいし、またはＲ３およびＲ９はトランス位にあってもよい。
【００５６】
ｎは１または２であり得る。
Ｒ３がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってもよく；またはＲ３がＯＲｂでかつＲ９が（ＣＨ２）ｎＯＲａであってもよい。
【００５７】
ＡはＯまたはＳであり得る。
Ｒ１４はＮ（ＣＨ３）Ｒ７であり得る。Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＲｄであり得る。Ｒｄは、葉酸基；コレステロール基；糖質基；ビタミンＡ基；ビタミンＥ基；ビタミンＫ基からなる群から選択され得る。好ましくは、Ｒｄはコレステロール基である。
【００５８】
別の態様において、本発明は、第１鎖および第２鎖を含んでなり、前記鎖の少なくとも１つに式（ＩＩ）を有する少なくとも１つのサブユニットが組み込まれることを特徴とするｉＲＮＡ剤を特徴とする：
【００５９】
【化５】
2007525454.tif 000007
【００６０】
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり；
Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、独立に、ＯＲａ、ＯＲｂ、（ＣＨ２）ｎＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、但し、Ｒ１およびＲ２の一方がＯＲａまたはＯＲｂであり、かつ他方が（ＣＨ２）ｎＯＲａまたは（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり（ＲＲＭＳが末端にある場合、Ｒ１またはＲ２の一方がＲａを含み、かつ一方がＲｂを含む；ＲＲＭＳＳが内部にある場合、Ｒ１とＲ２の両方がそれぞれＲｂを含む）；さらに、好ましくはＯＲａが（ＣＨ２）ｎＯＲｂを伴ってのみ存在することが可能であり、かつ（ＣＨ２）ｎＯＲａがＯＲｂを伴ってのみ存在することが可能であり；
Ｒ７は、ＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；
Ｒ８はＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；
Ｒａは
【００６１】
【化６】
2007525454.tif 000008
【００６２】
であり；
Ｒｂは
【００６３】
【化７】
2007525454.tif 000009
【００６４】
であり；
ＡおよびＣのそれぞれは、独立に、ＯまたはＳであり；
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【００６５】
【化８】
2007525454.tif 000010
【００６６】
であり；
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンドであり；かつ
ｎは１〜４である。
【００６７】
実施形態は、上記の特徴のうち１つまたは複数を含むことが可能である。
さらなる態様において、本発明は、第１鎖および第２鎖を有し、前記鎖の少なくとも１つに式（Ｉ）または式（ＩＩ）を有する少なくとも１つのサブユニットが組み込まれていることを特徴とするｉＲＮＡ剤を特徴とする。
【００６８】
１つの態様において、本発明は、第１鎖および第２鎖を有し、前記鎖の少なくとも１つに式（Ｉ）および式（ＩＩ）のうち少なくともいずれかを有する少なくとも２つのサブユニットが組み込まれていることを特徴とするｉＲＮＡ剤を特徴とする。
【００６９】
別の態様において、本発明は、第１鎖および第２鎖を有する本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤であって、式（Ｉ）および（ＩＩ）のうち少なくともいずれかの少なくとも１つのサブユニットが鎖に組み込まれていることを特徴とするｉＲＮＡ剤を作製する方法を提供する。この方法は、第１鎖を第２鎖と接触させる工程を包含する。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は、標的遺伝子の発現を調節する方法を提供し、この方法は、第１鎖および第２鎖を有し該鎖に式（Ｉ）および式（ＩＩ）のうち少なくともいずれかの少なくとも１つのサブユニットが組み込まれていることを特徴とする本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤を、対象に投与する工程を包含する。
【００７１】
１つの態様において、本発明は、第１鎖および第２鎖を有する本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤であって、式（Ｉ）および（ＩＩ）のうち少なくともいずれかの少なくとも１つのサブユニットが鎖に組み込まれていることを特徴とするｉＲＮＡ剤と、薬剤として許容可能な担体とを有する薬剤組成物を特徴とする。
【００７２】
本明細書に記載されるＲＲＭＳは、本明細書に記載される任意の二本鎖ＲＮＡ様分子（例えば、ｉＲＮＡ剤）に取り込まれ得る。ｉＲＮＡ剤は、ハイブリダイズしたセンスおよびアンチセンス鎖からなる二本鎖を含んでもよく、ここでアンチセンス鎖およびセンス鎖のうち少なくともいずれかが本明細書に記載される１つまたは複数のＲＲＭＳを含んでもよい。ＲＲＭＳは、二本鎖ｉＲＮＡ剤の一方の鎖または両方の鎖の１箇所または複数箇所に導入可能である。ＲＲＭＳは、センス鎖の３’または５’末端もしくはその近傍（１、２、または３位以内）に、あるいはアンチセンス鎖の３’末端もしくはその近傍（２または３位以内）に配置されうる。ある実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端またはその近傍（１、２、または３位以内）にはＲＲＭＳを有していないことが好ましい。ＲＲＭＳは内部にあってもよく、好ましくは、アンチセンス鎖が標的に結合するために重要ではない領域に配置される。
【００７３】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に（またはその１、２、または３位以内に）ＲＲＭＳを有してもよい。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に（またはその１、２、または３位以内に）、およびセンス鎖の３’末端に（またはその１、２、または３位以内に）、ＲＲＭＳを有してもよい。１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に（またはその１、２、または３位以内に）ＲＲＭＳを有し、かつセンス鎖の５’末端にＲＲＭＳを有してもよく、この場合両方のリガンドがｉＲＮＡ剤の同じ末端に配置される。
【００７４】
特定の実施形態において、２つのリガンドは、好ましくは各鎖上に１つ連結され、かつ疎水性部分である。理論によって束縛されることは望まないが、疎水性リガンドを対にすることにより、分子間ファンデルワールス相互作用を介してｉＲＮＡ剤を安定化することが可能であると考えられる。
【００７５】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の３’末端に（またはその１、２、または３位以内に）ＲＲＭＳを有し、かつセンス鎖の５’末端にＲＲＭＳを有してもよく、この場合両方のＲＲＭＳが同じリガンド（例えば、コール酸）上の別々の位置に個々の連結部で接続することによって、該リガンドを共有することが可能である。２つの近接するＲＲＭＳ間で共有されたリガンドは、本明細書中では「ヘアピン・リガンド」と呼ばれる。
【００７６】
他の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の３’末端にＲＲＭＳを有し、かつセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有してもよい。ｉＲＮＡ剤は、センス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有してもよいし；またはアンチセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有してもよいし；またはセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有しかつアンチセンス鎖の内部位置にＲＲＭＳを有してもよい。
【００７７】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、第１の配列および第２の配列を含み、該配列は、好ましくは、同じ鎖上に配置された２つの配列ではなく２つの別々の分子であり、例えば、生理学的条件下で（例えば、生理学的条件下であるが、ヘリカーゼまたは他の巻戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズする（およびその結果二本鎖領域を形成する）ために十分な相補性を有する。
【００７８】
第１の配列および第２の配列は、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤が分子の一端または両端に一本鎖領域または非対合領域を含むように選択されることが好ましい。したがって、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、好ましくは突出部（例えば、１つまたは２つの５’突出部または３’突出部であるが、好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部）を含むように対合した第１の配列および第２の配列を含む。大部分の実施形態は、３’突出部を有する。好ましいｓＲＮＡ剤
は、一本鎖突出部、好ましくは、各末端に、１ヌクレオチド長または好ましくは２もしくは３ヌクレオチド長の３’突出部を有する。突出部は、一方の鎖が他方よりも長い結果でもよいし、または同じ長さの２本の鎖が互いにずれている結果でもよい。５’末端は好ましくはリン酸化される。
【００７９】
本明細書に記載される糖、塩基、またはバックボーンに対する他の修飾がｉＲＮＡ剤に取り込まれてもよい。
ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される構成様式または構造を取ることが可能である。ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載されるようなパリンドローム構造であってもよいし、または二重標的指向性であってもよい。
【００８０】
ｉＲＮＡ剤は、標準的でない構造、または標準的なワトソン−クリック以外の構造が、ｉＲＮＡ剤の２つのモノマー間で、またはｉＲＮＡ剤の鎖と別の配列（例えば、本明細書に記載される標的配列またはオフターゲット（標的ではない）配列）との間で形成されるような配列を有し得る。
【００８１】
ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意の遺伝子を含む、広範囲の遺伝子のいずれかを標的とするように選択することが可能である。
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される構成様式（構成様式とは、全体の長さ、二本鎖領域の長さ、突出部の存在、数、位置、もしくは長さ、形態が一本鎖であるか二本鎖であるか、のうち１つまたは複数をいう）を有する。例えば、ｉＲＮＡ剤は、長さが３０ヌクレオチド未満、例えば、２１〜２３ヌクレオチドであり得る。好ましくは、ｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であり、かつ約１９塩基対の二本鎖領域が存在する。１つの実施形態において、ｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であり、同ｉＲＮＡの二本鎖領域は１９ヌクレオチドである。別の実施形態において、ｉＲＮＡは３０ヌクレオチド長よりも長い。
【００８２】
ある実施形態において、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域はミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的なワトソン−クリック対を形成しないかまたはハイブリダイズしない１、２、３、４、または５個以内の塩基を有する。突出部は、本明細書中の他の箇所で詳細に議論されるが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、または他の配列であってもよい。好ましい突出部の配列はＴＴである。ｉＲＮＡ剤の第１および第２の配列を、例えば、ヘアピンを形成するための追加の塩基によって、または他の非塩基リンカーによって、結合させることも可能である。
【００８３】
ＲＲＭＳ含有塩基に加えて、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性モノマー（ＮＲＭ）を含み得る。
別の態様において、本発明は、例えば、ｉＲＮＡ剤のＲＲＭＳへの結合により親油性部分（例えば、コレステロール）が複合体化しているｉＲＮＡ剤を特徴とする。好ましい実施形態において、該親油性部分は、ｉＲＮＡ剤の細胞への侵入を促進する。好ましい実施形態において、該細胞は、生物体、組織、あるいは細胞株、例えば、初代細胞株、不死化細胞株、または本明細書中に開示される任意の種類の細胞株の一部である。したがって、該複合型ｉＲＮＡ剤は、生物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて標的遺伝子をサイレンシングするために、または細胞株もしくは生物の体外にある細胞において標的遺伝子をサイレンシングするために使用可能である。
【００８４】
親油性部分は、例えば、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、コレステリル残基、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリ
セロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸（O3-(oleoyl cholenic acid）) 、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択可能である。好ましい親油性部分はコレステロールである。
【００８５】
ｉＲＮＡ剤は第１鎖および第２鎖を有することが可能であり、ここで、式（Ｉ）または式（ＩＩ）を有する少なくとも１つのサブユニットが少なくとも一方の鎖に組み込まれる。ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意の特徴のうち１つまたは複数を有することが可能である。例えば、サブユニットが式（Ｉ）のサブユニットである場合、Ｒｄはコレステロールであってもよく；ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７で、ＹがＣＲ９Ｒ１０で、かつＺは存在せず、Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでありかつＲ３がＯＲａであってもよく；ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７で、ＹがＣＲ９Ｒ１０で、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２で、Ｒ９が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでありかつＲ１０がＯＲａであってもよく；ＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７で、ＹがＮＲ８で、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２で、Ｒ１が（ＣＨ２）ｎＯＲｂでありかつＲ３がＯＲａであってもよく；ＸがＣＨ２で；ＹがＣＲ９Ｒ１０で；かつＺがＣＲ１１Ｒ１２で、ここでＲ６がＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であってもよく；あるいは、ＸがＣＨ２で；ＹがＣＲ９Ｒ１０で；かつＺがＣＲ１１Ｒ１２で、ここでＲ１１もしくはＲ１２がＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であるか、またはＲ５とＲ１１が一緒になってＮ（ＣＨ３）Ｒ７で置換されたＣ５もしくはＣ６シクロアルキルであってもよい。
【００８６】
好ましい実施形態において、親油性部分（例えば、コレステロール）は、滑膜細胞、筋細胞、ケラチノサイト、肝実質細胞、白血球、内皮細胞（例えば、腎臓細胞）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、上皮細胞、中胚葉細胞、骨髄細胞、神経細胞、新生物細胞、肥満細胞、または線維芽細胞にｉＲＮＡ剤が侵入するのを促進する。特定の態様において、筋細胞は平滑筋細胞でも心筋細胞でもよく、線維芽細胞は真皮線維芽細胞でよく、白血球は単球でよい。別の好ましい実施形態において、細胞は、例えば、膀胱、肺、乳房、子宮頸部、結腸、膵臓、前立腺、腎臓、肝臓、皮膚、または神経系（例えば、中枢神経系）などの組織に由来する付着性の腫瘍細胞株に由来するものでもよい。
【００８７】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ−１Ｂ）遺伝子またはＭＡＰキナーゼ遺伝子（例えば、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、またはｐ３８）を標的とする。好ましい実施形態において、これらのｉＲＮＡ剤は、線維芽細胞中で遺伝子をサイレンシングするために使用される。
【００８８】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ＭＤＲ、Ｍｙｃ、Ｍｙｂ、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、ａ−Ｍｙｂ、ｂ−Ｍｙｂ、ｖ−Ｍｙｂ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＥ、ＣＤＫ４、ｃｄｃ２５Ａ、ＣＤＫ２、またはＣＤＫ４の遺伝子を標的とする。好ましい実施形態において、これらのｉＲＮＡ剤は、上皮細胞または中胚葉細胞中で遺伝子をサイレンシングするために使用される。
【００８９】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤はＧ７２またはＤＡＡＯ遺伝子を標的とする。好ましい実施形態において、これらのｉＲＮＡ剤は、神経細胞中で遺伝子をサイレンシングするために使用される。
【００９０】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤はテロメラーゼ経路の遺伝子（例えば、ＴＥＲＴまたはＴＲ／ＴＥＲＣ）を標的とする。好ましい実施形態において、これらのｉＲＮＡ剤はケラチノサイト中で遺伝子をサイレンシングするために使用される。
【００９１】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤はインターロイキン遺伝子（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、
またはＩＬ−１８）を標的とする。別の好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤はインターロイキン受容体遺伝子、または染色体転座（例えば、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＥＬ−ＡＭＬ−１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１、ＥＷＳ−ＥＲＧ、ＴＬＳ−ＦＵＳ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、またはＡＭＬ−ＥＴＯ）を標的とする。好ましい実施形態において、これらのｉＲＮＡ剤はリンパ腫または白血病細胞中で遺伝子をサイレンシングするために使用される。
【００９２】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤はＧＲＢ２関連結合タンパク質（GRB2 associated binding protein ）を標的とする。好ましい実施形態において、これらのｉＲＮＡ剤は肥満細胞中で遺伝子をサイレンシングするために使用される。
【００９３】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、成長因子または成長因子受容体（例えば、ＴＧＦβまたはＴＧＦβ受容体；ＰＤＧＦまたはＰＤＧＦＲ；ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦｒ１、ＶＥＧＦｒ２もしくはＶＥＧＦｒ３；ＩＧＦ−１Ｒ、ＤＡＦ−２、またはＩｎＲ）を標的とする。別の好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ＰＲＬ１、ＰＲＬ２、ＰＲＬ３、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＰＫＣ受容体、ＭＤＲ１、ＴＥＲＴ、ＴＲ／ＴＥＲＣ、サイクリンＤ１、ＮＦ−κＢ、ＲＥＬ−Ａ、ＲＥＬ−Ｂ、ＰＣＮＡ、ＣＨＫ−１、ｃ−ｆｏｓ、ｊｕｎ、またはＢＣＬ−２を標的とする。好ましい実施形態において、これらのｉＲＮＡ剤は付着性の腫瘍細胞株中で遺伝子をサイレンシングするために使用される。
【００９４】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は遺伝学的に改変された細胞の外来遺伝子を標的とする。外来遺伝子は、例えば、細胞に侵入もしくは感染した生物に由来するウイルス遺伝子もしくは細菌遺伝子であってもよいし、または、外来遺伝子は、天然もしくは人工的な手段によって（例えば、遺伝子組換え事象によって）細胞に導入された任意の遺伝子であってもよい。ｉＲＮＡ剤は、ウイルス遺伝子、例えば、肝炎ウイルス遺伝子（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶの遺伝子）などを標的とすることが可能である。別例として、または追加として、ｉＲＮＡ剤は、レポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰまたはβガラクトシダーゼなど）をサイレンシングすることが可能である。これらのｉＲＮＡ剤は、付着性の腫瘍細胞株中で外来遺伝子をサイレンシングするために使用可能である。
【００９５】
好ましい実施形態において、親油性成分が結合しているｉＲＮＡ剤は、多数の細胞株のいずれか１つにおいて少なくとも１つの遺伝子、例えば、本明細書に記載される任意の遺伝子をサイレンシングする。該細胞株には：３Ｔ３、ＤＬＤ２、ＴＨＰ１、Ｒａｗ２６４．７、ＩＣ２１、Ｐ３８８Ｄ１、Ｕ９３７、ＨＬ６０、ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、Ｋ５６２、ＥＬ４、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、ＢＣ−３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ−２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＶＥＲＯ、ＭＲＣ５、ＣＶ１、Ｃｏｓ７、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ５４９、Ａ３７５、ＡＲＨ−７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ−ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ａ３７５、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ−３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ、ＨｅＬａ−Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ−３、ＬＮＣａＰ、ＨｅｐＧ２、またはＵ８７細胞株が含まれるがこれらに限定はされない。細胞株は当業者に公知である種々の供給元から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国バージニア州マナッサス所在）参照）。
【００９６】
別の態様において、本発明は、親油性部分と複合体化しているｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書に記載される親油性の複合体型ｉＲＮＡ剤）を細胞に供給することによって標的遺伝子をサイレンシングする方法を提供する。好ましい実施形態において、該複合体型ｉＲＮＡ剤は、生物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）において標的遺伝子をサイレンシン
グするために、または細胞株もしくは生物の体外にある細胞において標的遺伝子をサイレンシングするために使用可能である。生物全体の場合、本発明の方法は、遺伝子（例えば、本明細書に記載される遺伝子）をサイレンシングし、かつ該遺伝子によって媒介される状態を治療するために使用可能である。生物の一部ではない細胞（例えば、初代細胞株、二次細胞株、腫瘍細胞株、または形質転換もしくは不死化された細胞株）に対する使用の場合、親油性部分と複合体化しているｉＲＮＡ剤は、遺伝子（例えば、本明細書に記載されるもの）をサイレンシングするために使用可能である。生物全体の一部ではない細胞は、ｉＲＮＡ剤が遺伝子をサイレンシングするのに有効であるか否かを決定するための最初のスクリーニングにおいて使用可能である。生物全体の一部ではない細胞における試験の後に、完全な動物においてｉＲＮＡ剤を試験することができる。好ましい実施形態において、親油性部分と複合体化しているｉＲＮＡ剤は、送達を促進または増強する他の試薬（例えば、細胞膜の横断を増強する化合物）の非存在下で（または該試薬の量が低減された状態で）、生物に投与されるか、または生物の一部ではない細胞と接触状態におかれる。（量が低減された状態とは、かかる試薬の量が、等量の非複合体型ｉＲＮＡ剤を標的細胞内へ入れるために必要とされる量と比較して少ない量であればよい）。例えば、親油性部分と複合体化しているｉＲＮＡ剤は：さらなる親油性部分；トランスフェクション剤、例えば、ｉＲＮＡ剤の細胞透過性（細胞への浸透性）を実質的に変化させる濃度のイオンまたは他の物質；例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のインビトロジェン（Invitrogen））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）（米国ウィスコンシン州マディソン所在のマイラス（Mirus ））、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロシュ（Roche ））、ポリエチレンイミン、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ
Ｑ２（商品名）（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロシュ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＥＲ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（独国ミュンヘン所在のバイオンテクス（Biontex ））などのトランスフェクション剤、の非存在下で（またはその含量が低減された状態で）、生物に投与されるか、または生物の一部ではない細胞と接触状態におかれる。
【００９７】
好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への送達、例えば、生物中の細胞への送達に適している。別の態様において、ｉＲＮＡ剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞への送達、例えば、細胞株中の細胞への送達に適している。
【００９８】
親油性部分が結合しているｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意の遺伝子を標的とすることが可能であり、本明細書に記載される任意の細胞種、例えば、生物、組織、または細胞株内のある細胞種に送達することが可能である。ｉＲＮＡ剤の送達は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、生物中の細胞に対して）でもよいし、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、細胞株中の細胞に対して）でもよい。
【００９９】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤の組成物、および特に、親油性部分と複合体化しているｉＲＮＡ剤の組成物、例えば、本明細書に記載される親油性の複合体型ｉＲＮＡ剤を提供する。好ましい実施形態において、本発明の組成物は薬剤として許容可能な組成物である。
【０１００】
好ましい実施形態において、本発明の組成物（例えば、薬剤として許容可能な組成物）は、送達を促進または増強する他の試薬（例えば、細胞膜の横断を増強する化合物）を含まないか、その含量が低減されているか、または実質的に含まない。（含量が低減されているとは、かかる試薬の量が、等量の非複合体型ｉＲＮＡ剤を標的細胞内へ入れるために必要とされる量と比較して少ない量であればよい）。例えば、本発明の組成物は、以下の：さらなる親油性部分；トランスフェクション剤、例えば、ｉＲＮＡ剤の細胞透過性を実質的に変化させる濃度のイオンまたは他の物質；例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（
商標）（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のインビトロジェン（Invitrogen））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）（米国ウィスコンシン州マディソン所在のマイラス（Mirus ））、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロシュ（Roche ））、ポリエチレンイミン、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２（商品名）（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロシュ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＥＲ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（独国ミュンヘン所在のバイオンテクス（Biontex ））などを、含まないか、その含量が低減されているか、または実質的に含まない。
【０１０１】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞への送達、例えば、生物中の細胞への送達に適している。別の態様において、ｉＲＮＡ剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞への送達、例えば、細胞株中の細胞への送達に適している。
【０１０２】
ＲＲＭＳ含有ｉＲＮＡ剤は、例えば、本明細書に記載される任意の遺伝子を標的とするために、または本明細書に記載される任意の障害を治療するために、本明細書に記載される任意の方法において使用可能である。該ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意の製剤、送達様式、送達形態、キットまたは調製物、例えば、薬剤調製物に組み込むことが可能である。例えば、本明細書に記載される１種または複数のｉＲＮＡ剤、該ｉＲＮＡ剤が配される滅菌容器、および取扱説明書を含むキットである。
【０１０３】
本発明の方法および組成物、例えば、本明細書に記載されるＲＲＳＭ含有ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意のｉＲＮＡ剤とともに使用可能である。さらに、本発明の方法および組成物は、本明細書に記載される任意の疾患または障害の治療のため、および任意の対象、例えば、任意の動物、任意の哺乳動物（例えば、任意のヒト）の治療のために使用可能である。
【０１０４】
本発明の方法および組成物、例えば、本明細書に記載されるＲＲＭＳ含有ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載される任意の用量および／または製剤を用いて、ならびに本明細書に記載される任意の投与経路を用いて使用可能である。
【０１０５】
本明細書に記載される、非リボース骨格ならびにＲＲＭＳのモノマーおよびダイマーは、本発明の範囲内にある。
「ＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代用物であり、これらのすべてが本明細書中で定義される（例えば、以下の「ＲＮＡ剤」という表題の節を参照されたい）。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代用物が本明細書に記載されるが、好ましい例には、１つまたは複数のＲＲＭＳを含むものが含まれる。好ましい例には、２’糖修飾、一本鎖の突出部（好ましくは一本鎖の３’突出部）における修飾、または、特に一本鎖の場合、１つまたは複数のリン酸基もしくは１つまたは複数のリン酸基アナログを含む５’修飾を有するものも含まれる。
【０１０６】
「ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、標的遺伝子、好ましくは内在性標的ＲＮＡまたは病原体の標的ＲＮＡの発現をダウンレギュレートすることが可能であるＲＮＡ剤、または切断されてそのようなＲＮＡ剤になることが可能なＲＮＡ剤である。理論によって束縛されることは望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当該分野においてＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切断、または転写前もしくは翻訳前のメカニズムを含むいくつかのメカニズムの１つまたは複数によって作用しうる。ｉＲＮＡ剤は、一本鎖を含んでいてもよいし、または複数の鎖を含んでもよく、例えば、ｉＲＮＡ剤は二本鎖のｉＲＮＡ剤であってもよい。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合、１つもしくは複数のリン酸基または１つもしくは複数のリン酸基アナログを含む５’修飾を含むことが特に好ましい。
【０１０７】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明に記載される。本発明のその他の特徴および利点は、該説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなろう。本願は、すべての引用される参考文献、特許、および特許出願の全体を援用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
二本鎖（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを通してｍＲＮＡを配列特異的にサイレンシングする。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む広範な種々の生物において起こる。
【０１０９】
ｄｓＲＮＡの２１〜２３ヌクレオチドのフラグメントが、例えば、ＲＮＡ分解を引き起こすことによるＲＮＡサイレンシングの配列特異的メディエータであることが実証されている。理論に束縛されることを望まないが、これらの２１〜２３ヌクレオチドフラグメント中に存在する、単に特定の長さのフラグメントであるにすぎない分子シグナルが、ＲＮＡｉを仲介する細胞因子をリクルートするということのようである。これらの２１〜２３ヌクレオチドフラグメント、および他のｉＲＮＡ剤を調製および投与するための方法、ならびに遺伝子の機能を特異的に不活性化するためのそれらの使用が本明細書中に記載される。ｉＲＮＡ剤（または同じかもしくは類似の性質の組換え生産もしくは化学合成されたオリゴヌクレオチド）の使用は、哺乳動物細胞におけるサイレンシングのための特異的ｍＲＮＡの標的化を可能にする。さらに、より長いｄｓＲＮＡ剤フラグメントもまた、例えば、以下に記載されるように使用されることが可能である。
【０１１０】
哺乳動物細胞において、長いｄｓＲＮＡは、有害であることの多いインターフェロン応答を誘導することが可能であるが、ｓＲＮＡは、少なくとも細胞および宿主に対して有害である程度まではインターフェロン応答を誘発しない。特に、ｓＲＮＡ剤中のｉＲＮＡ剤の鎖の長さは、例えば、有害なインターフェロン応答の誘発を回避するために十分に短い、３１、３０、２８、２５、または２３ヌクレオチド未満であり得る。したがって、ｓＲＮＡ剤の組成物（例えば、本明細書中に記載されるように処方される）の哺乳動物細胞への投与は、インターフェロン応答を回避しながら標的遺伝子の発現を抑制するために使用されることが可能である。さらに、個々のｉＲＮＡ剤の使用は、例えば、対立遺伝子についてヘテロ接合である対象において、標的遺伝子の１つの対立遺伝子を選択的に標的とするために使用されることが可能である。
【０１１１】
さらに、１つの実施形態において、哺乳動物細胞は、インターフェロン応答の構成成分（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）活性化プロテインキナーゼＰＫＲ）に影響を与えるｉＲＮＡ剤で処理される。このような細胞は、標的ＲＮＡに対して相補的な配列を含み、その他の点ではインターフェロン応答を誘発する可能性のある長さを有する第２のｉＲＮＡ剤で処理されることが可能である。
【０１１２】
代表的な実施形態において、対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類などの哺乳動物である。この対象は酪農用動物（例えば、ウシまたはヤギ）または他の農業用動物（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、魚類、エビ）であり得る。はるかに好ましい実施形態において、この対象はヒトであり、例えば、正常な個人、あるいは疾患もしくは障害を有するか、これらを有すると診断されているか、またはそれらを有すると予測される個人である。
【０１１３】
さらに、ｉＲＮＡ剤により仲介されるサイレンシングはｉＲＮＡ剤組成物を投与した後で数日間の間持続するので、多くの場合において、１日あたり１回未満、またはある例としては、治療計画全体について１回のみの頻度で、組成物を投与することが可能である。例えば、あるがん細胞の治療は、単回のボーラス投与によって行われることが可能である
のに対して、慢性ウイルス感染は規則的な投与、例えば、週に１回または１カ月に１回を必要とする可能性がある。
【０１１４】
対象にｉＲＮＡ剤を投与するために使用されることが可能である多数の例示的な送達の経路が記載される。さらに、ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載される例示的な方法に従って製剤化されることが可能である。
【０１１５】
リボース置換モノマーサブユニット（ＲＲＭＳ）
ＲＲＭＳの構造
好ましい（ただし限定するものではない）ＲＲＭＳを含むＲＮＡ剤、例えばｉＲＮＡ剤を、式（Ｒ−２）として図１に表す。担体は、２つの「バックボーン結合点」（ヒドロキシル基）、１つの「連結部結合点」、および介在する連結部によって担体と間接的に結合した１つのリガンドを含む。ＲＲＭＳはＲＮＡ分子の５’または３’末端サブユニットであってもよく、すなわち、２つの「Ｗ」基の１つはヒドロキシル基であってよく、もう１つの「Ｗ」基は、２つ以上の非修飾または修飾リボヌクレオチドの鎖であってよい。あるいはＲＲＭＳが内部位置を占めてもよく、２つの「Ｗ」基がいずれも１つまたは複数の非修飾または修飾リボヌクレオチドであってよい。２つ以上のＲＲＭＳがＲＮＡ分子、例えばｉＲＮＡ剤中に存在してよい。例えば親油性部分（コレステロールなど）の構成部分に連結されたＲＲＭＳが含まれる好ましい位置は、センス鎖の３’末端、５’末端または内部である。
【０１１６】
式（Ｒ−２）の修飾ＲＮＡ分子は、当分野で知られているオリゴヌクレオチド合成法を使用して得ることが可能である。好ましい実施形態では、式（Ｒ−２）の修飾ＲＮＡ分子は、例えばホスホアミダイト法またはＨ−ホスホネート結合法を使用して、１つまたは複数の対応するＲＲＭＳモノマー化合物（ＲＲＭＳモノマー、例えば図１中のＡ、Ｂ、およびＣを参照）を、伸長中のセンス鎖またはアンチセンス鎖に取り込ませることによって調製することが可能である。
【０１１７】
ＲＲＭＳモノマーは一般に、担体分子（例えば図１中のＡを参照）と結合した２つの異なる官能化ヒドロキシル基（図１のＯＦＧ１およびＯＦＧ２）、および連結部結合点を含む。本願明細書で使用する、用語「官能化ヒドロキシル基」は、ヒドロキシル基のプロトンが他の置換基に置換されていることを意味する。図１に代表的構造ＢおよびＣを示すように、担体上の１つのヒドロキシル基（ＯＦＧ１）は、保護基（ＰＧ）によって官能化されている。もう１つのヒドロキシル基（ＯＦＧ２）は、（１）Ｂのように、液相または固相の合成支持試薬（中実円）でリンカーＬを介して直接的または間接的に、あるいは（２）Ｃのように、リンを含有する構成部分（例えばホスホアミダイト）によって、官能化することが可能である。伸長中のセンス鎖またはアンチセンス鎖中にモノマーを取り込ませるとき、連結部結合点を、水素原子、連結部、または連結部に連結されたリガンドと結合することが可能である（図１の種々の「Ｒ」を参照）。連結部に連結されたリガンドは、伸長中の鎖にモノマーを取り込ませるときにモノマーと結合させることが可能であるが、必ずしもそうする必要はない。いくつかの実施形態では、連結部、リガンドまたは連結部に連結されたリガンドを、「前駆体」ＲＲＭＳモノマーを鎖に取り込ませた後に、「前駆体」ＲＲＭＳと結合させることが可能である。図１（および本明細書の他の部分）の波線は接続を示し、構成部分と連結部との直接的結合を表していてもよいし、または構成部分と連結部との間に介在する連結分子を表していてもよい。直接的に連結される、とは、構成部分が連結部に直接結合していることを意味する。間接的に連結される、とは、連結部と構成部分との間に連結分子が介在していることを意味する。
【０１１８】
例えばティー  ダブリュー  グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびピー  エム  ジー  ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  
Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）から、（ＯＦＧ１）保護基を所望に応じて選択することが可能である。保護基は、アミダイト合成条件、保存条件、およびオリゴヌクレオチド合成条件下で安定であることが好ましい。ヒドロキシル基、−ＯＨは求核基（すなわちルイス塩基）であり、酸素を介して求電子剤（すなわちルイス酸）と反応する。水素が保護基、例えばトリアリールメチル基またはトリアルキルシリル基に置換されているヒドロキシル基は、置換反応では求電子剤としてほとんど反応性がない。したがって、保護ヒドロキシル基は、例えばオリゴヌクレオチド合成中に構造Ｃによって例示される化合物のホモ結合を防ぐ際に有用である。一部の実施形態では、好ましい保護基はジメトキシトリチル基である。他の実施形態では、好ましい保護基は、下式を有するシリコン系の保護基である。
【０１１９】
【化９】
2007525454.tif 000011
【０１２０】
Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’は、置換または非置換のアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、アルコキシ、シクロアルコキシ、アラルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、またはシロキシ（すなわち、Ｒ３ＳｉＯ‐、３つの「Ｒ」基は上記に列挙した基の任意の組合せ）から選択可能である。Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’は、全て同じであっても異なっていてもよく、Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’のうち２つが同じで３番目が異なっているという組合せも考えられる。ある実施形態では、Ｘ５’、Ｘ５’’、およびＸ５’’’は少なくとも１つのアルコキシ基またはシロキシ基を含み、図２に列挙される基のうち任意のものでよい。好ましい組合せには、Ｘ５’、Ｘ５’’＝トリメチルシロキシでＸ５’’’＝１，３‐（トリフェニルメトキシ）‐２‐プロポキシまたはシクロドデシルオキシが挙げられる。
【０１２１】
ＢのＯＦＧ２が、可溶性または不溶性の支持試薬と結合したリンカー、例えば長鎖の有機リンカーを含む場合は、ひとたびＯＦＧ１が脱保護され、求電子基（例えばアミダイト基）を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと求核剤として自由に反応できるようになると、溶液相または固相合成技法を使用して、天然および／または修飾リボヌクレオチドの鎖を構築することが可能である。あるいは、天然もしくは修飾リボヌクレオチドまたはオリゴリボヌクレオチド鎖を、ＯＦＧ２のアミダイト基またはＨ−ホスホネート基を介してモノマーＣと結合させることが可能である。この操作の後に、ＯＦＧ１を脱ブロック化することが可能であり、回復した求核性ヒドロキシル基は、求電子基を含む他のヌクレオシドまたはモノマーと反応することが可能である（図１を参照）。Ｒ’は置換または非置換アルキルまたはアルケニルであってよい。好ましい実施形態では、Ｒ’はメチル、アリルまたは２−シアノエチルである。Ｒ”はＣ１〜Ｃ１０アルキル基であってよく、Ｒ”は３個以上の炭素を含む分岐基、例えばイソプロピルであることが好ましい。
【０１２２】
ＢのＯＦＧ２は、リンカーを用いてヒドロキシルを官能化し、該リンカーが次にリンカーのもう一方の末端に液体または固体相合成支持試薬を含むことも可能である。支持試薬は、本願明細書に記載するモノマーを支持することが可能な任意の支持媒体であってよい。リンカーＬを介してモノマーを不溶性支持体と結合させることによって、該支持体が置かれている溶媒中でモノマー（および伸長中の鎖）を可溶化することが可能である。可溶化しているが依然固定されているモノマーは、周囲の溶媒中で試薬と反応することが可能
であり；未反応試薬および可溶性副産物は、モノマーまたはモノマー由来の生成物が結合している固形支持体から、容易に洗浄除去することが可能である。あるいは、モノマーを可溶性支持体成分、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合させることも可能であり、液相合成技法を使用して鎖を構築することが可能である。リンカーおよび支持媒体の選択は、当分野の技術内にある。一般にリンカーは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ−であってよく、オキサリル、スクシニルまたはチオグリコリルであることが好ましい。標準的な細孔性ガラスの固相合成支持体を、フッ化物に対して不安定な５’シリル保護基とともに使用することは可能ではない。何故なら、ガラスがフッ化物によって分解され、完全長の生成物の量が大幅に減少するからである。フッ化物に対して安定なポリスチレン系支持体、またはＰＥＧが好ましい。
【０１２３】
好ましい担体は、以下に提示する一般式（Ｒ−３）を有する。（該構造中、好ましいバックボーン結合点は、Ｒ１またはＲ２；Ｒ３またはＲ４；あるいはＹがＣＲ９Ｒ１０である場合はＲ９およびＲ１０から選択することが可能である（２つの位置を選択して、２つのバックボーン結合点、例えばＲ１およびＲ４、あるいはＲ４およびＲ９とする）。好ましい連結部結合点はＲ７；ＸがＣＨ２であるときはＲ５またはＲ６を含む。これらの担体は、鎖中に取り込ませることが可能な実体として以下に記載される。したがって、当然ながら、これらの構造は、１つ（末端位置の場合）あるいは２つ（内部位置の場合）の結合点、例えばＲ１またはＲ２；Ｒ３またはＲ４；あるいはＲ９およびＲ１０（ＹがＣＲ９Ｒ１０であるとき）が、リン酸、または修飾リン酸、例えばイオウ含有バックボーンと結合する状態も含む。例えば、前述のＲ基の１つは−ＣＨ２−であってよく、この場合１つの結合は担体と結合しており、１つの結合はバックボーン原子、例えば結合酸素または中心のリン原子と結合している。）
【０１２４】
【化１０】
2007525454.tif 000012
【０１２５】
式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、ＮＲ７またはＣＨ２であり；
ＹはＮＲ８、Ｏ、Ｓ、ＣＲ９Ｒ１０であり；
ＺはＣＲ１１Ｒ１２であるか、あるいは存在せず；
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のそれぞれは独立に、Ｈ、ＯＲａ、または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり、ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ９、およびＲ１０のうち少なくとも２つはＯＲａおよび／または（ＣＨ２）ｎＯＲｂであり；
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ１１、およびＲ１２のそれぞれは独立に、リガンド、Ｈ、任意選択で１〜３個のＲ１３で置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ（Ｏ）ＮＨＲ７であり；あるいは、Ｒ５およびＲ１１が一体となって、任意選択でＲ１４により置換されたＣ３〜Ｃ８シクロアルキルをなし；
Ｒ７はリガンドであってもよく、例えば、Ｒ７はＲｄでもよいし、またはＲ７は、例えば連結部分（例えばＮＲｃＲｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルもしくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキル）を介して間接的に担体に連結されたリガンドで
あってもよく；
Ｒ８はＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
Ｒ１３はヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、またはハロであり；
Ｒ１４はＮＲｃＲ７であり；
Ｒ１５は任意選択でシアノにより置換されたＣ１〜Ｃ６アルキル、またはＣ２〜Ｃ６アルケニルであり；
Ｒ１６はＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒ１７は液相または固相の支持試薬であり；
Ｌは−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）−、または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＳ−であり；
ＲａはＣＡｒ３であり；
ＲｂはＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｈ、Ｐ（ＯＲ１５）Ｎ（Ｒ１６）２またはＬ−Ｒ１７であり；
ＲｃはＨまたはＣ１〜Ｃ６アルキルであり；
ＲｄはＨまたはリガンドであり；
それぞれのＡｒは独立に、任意選択でＣ１〜Ｃ４アルコキシによって置換されたＣ６〜Ｃ１０アリールであり；
ｎは１〜４であり；かつｑは０〜４である。
【０１２６】
代表的な担体には、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺが存在しない担体；またはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２である担体；またはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＮＲ８であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２である担体；またはＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＯであり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２である担体；またはＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、かつＲ５とＲ１１が一体となってＣ６シクロアルキル（式Ｈ、ｚ＝２）を形成する担体、またはインダン環系、例えばＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、かつＲ５とＲ１１が一体となってＣ５シクロアルキル（式Ｈ、ｚ＝１）を形成する担体がある。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、担体は、ピロリン環系または４−ヒドロキシプロリン環系、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺが存在しないものに基づいてよい（式Ｄ）。
【０１２８】
【化１１】
2007525454.tif 000013
【０１２９】
ＯＦＧ１は５員環中の炭素の１つと結合した第１級炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基と結合することが好ましい（式Ｄ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）。ＯＦＧ２は、５員環中の炭素の１つと直接結合することが好ましい（式Ｄ中の−ＯＦＧ２）。ピロリン系
担体に関しては、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；あるいは−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述の炭素の１つとジェミナル位で置換されていてよい。３−ヒドロキシプロリン系担体に関しては、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能である。したがって、ピロリン系および４−ヒドロキシプロリン系モノマーは、結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を有する不斉中心は両方がＲ配置をとってもよいし、両方がＳ配置をとってもよいし、一方の不斉中心がＲ配置をとり他方の不斉中心がＳ配置をとるかその逆であってもよい）。連結部結合点は窒素であることが好ましい。担体Ｄの好適な例には以下のものが挙げられる。
【０１３０】
【化１２】
2007525454.tif 000014
【０１３１】
いくつかの実施形態では、担体はピペリジン環系（式Ｅ）、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２であるものに基づいてよい。
【０１３２】
【化１３】
2007525454.tif 000015
【０１３３】
ＯＦＧ１は６員環中の炭素の１つと結合した第１級炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２）と結合することが好ましい［式Ｅ中の−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］。ＯＦＧ２は、６員環中の炭素の１つと直接結合することが好ましい（式Ｅ中の−ＯＦＧ２）。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でジェミナル位に配置していてもよい、すなわち、２つの基が同じ炭素、例えばＣ−２、Ｃ−３、またはＣ−４に結合することが可能である。あるいは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でビシナル位に配置していてよい、すなわち、２つの基は環の隣接する炭素原子と結合することが可能であり、例えば、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−２と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能であり；あるいは−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能である。ピペリジン系モノマーは、したがって結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を有する不斉中心は両方がＲ配置をとってもよいし、両方がＳ配置をとってもよいし、一方の不斉中心がＲ配置をとり他方の不斉中心がＳ配置をとるかその逆であってもよい）。連結部結合点は窒素であることが好ましい。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、担体は、例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＮＲ８であり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２であるピペラジン環系（式Ｆ）、または例えばＸがＮ（ＣＯ）Ｒ７またはＮＲ７であり、ＹがＯであり、かつＺがＣＲ１１Ｒ１２であるモルホリン環系（式Ｇ）に基づいていてもよい。
【０１３５】
【化１４】
2007525454.tif 000016
【０１３６】
ＯＦＧ１は６員環中の炭素の１つと結合した第１級炭素、例えば環外アルキレン基、例えばメチレン基と結合することが好ましい（式Ｆまたは式Ｇ中の−ＣＨ２ＯＦＧ１）。ＯＦＧ２は、６員環中の炭素の１つと直接結合することが好ましい（式Ｆまたは式Ｇ中の−ＯＦＧ２）。ＦおよびＧに関しては、−ＣＨ２ＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合してもよいし；あるいは逆も然りである。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述の炭素の１つとジェミナル位で置換されていてよい。ピペラジン系およびモルホリン系モノマーは、したがって結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を有する不斉中心は両方がＲ配置をとってもよいし、両方がＳ配置をとってもよいし、一方の不斉中心がＲ配置をとり他方の不斉中心がＳ配置をとるかその逆であってもよい）。Ｒ’’’は例えばＣ１〜Ｃ６アルキル、好ましくはＣＨ３であってよい。式Ｆおよび式Ｇのいずれにおいても、連結部結合点は窒素であることが好ましい。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、担体は、例えばＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、およびＲ５とＲ１１が一体となってＣ６シクロアルキルを形成するデカリン環系（式Ｈ、ｚ＝２）、または例えばＸがＣＨ２であり、ＹがＣＲ９Ｒ１０であり、ＺがＣＲ１１Ｒ１２であり、およびＲ５とＲ１１が一体となってＣ５シクロアルキルを形成するインダン環系（式Ｈ、ｚ＝１）に基づいていてもよい。
【０１３８】
【化１５】
2007525454.tif 000017
【０１３９】
ＯＦＧ１はＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５の１つと結合した第１級炭素、例えば、環外メチレン基（ｎ＝１）またはエチレン基（ｎ＝２）と結合することが好ましい［式Ｈ中の−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１］。ＯＦＧ２は、Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５の１つと直接結合することが好ましい（式Ｈ中の−ＯＦＧ２）。−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でジェミナル位に配置していてよい、すなわち、２つの基が同じ炭素、例えばＣ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、またはＣ−５と結合していてもよい。あるいは、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は環上でビシナル位に配置していてよい、すなわち、２つの基は環の隣接する炭素原子と結合することが可能であり、例えば、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−２と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−２と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−３と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能であり；あるいは−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−３と結合することが可能であり；−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−４と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−５と結合することが可能であり；あるいは−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１はＣ−５と結合し、かつＯＦＧ２はＣ−４と結合することが可能である。デカリン系またはインダン系モノマーは、したがって結合（例えば炭素−炭素結合）を含むことが可能であり、このとき結合の回転はその個々の結合について制限される（例えば環の存在が原因の制限）。したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、前述のあらゆる対において互いにシスでもトランスでもよい。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含むことが可能であり、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を有する不斉中心は両方がＲ配置をとってもよいし、両方がＳ配置をとってもよいし、一方の不斉中心がＲ配置をとり他方の不斉中心がＳ配置をとるかその逆であってもよい）。好ましい実施形態では、Ｃ−１およびＣ−６における置換は、互いにトランスである。連結部結合点はＣ−６またはＣ−７であることが好ましい。
【０１４０】
他の担体は、３−ヒドロキシプロリンに基づく担体を含み得る（式Ｊ）。
【０１４１】
【化１６】
2007525454.tif 000018
【０１４２】
したがって、−（ＣＨ２）ｎＯＦＧ１およびＯＦＧ２は、互いにシスでもトランスでもありうる。したがって、すべてのシス／トランス異性体が明白に含まれる。モノマーは１つまたは複数の不斉中心を含み、したがってラセミ化合物およびラセミ混合物、単一のエナンチオマー、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として存在することも可能である。すべてのこのようなモノマー異性体が明白に含まれる（例えば、ＣＨ２ＯＦＧ１およびＯＦＧ２を有する不斉中心は両方がＲ配置をとってもよいし、両方がＳ配置をとってもよいし、一方の不斉中心がＲ配置をとり他方の不斉中心がＳ配置をとるかその逆であってもよい）。連結部結合点は窒素であることが好ましい。
【０１４３】
代表的な環状の担体を図３に示す。
いくつかの実施形態では、ある構成部分、例えばリガンドを、介在する連結部の仲介によって、担体に間接的に結合させることが可能である。連結部は担体と連結部結合点（ＴＡＰ）において結合し、好ましくは少なくとも１つの窒素原子を有する任意のＣ１〜Ｃ１００炭素含有構成部分（例えばＣ１〜Ｃ７５、Ｃ１〜Ｃ５０、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１〜Ｃ６）を含むことが可能である。好ましい実施形態では、該窒素原子は連結部上の末端アミノ基の一部を形成し、リガンドとの結合点として働くことが可能である。好ましい連結部（下線部）としては、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ−；ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−；ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ−；またはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ−Ｃ（Ｏ）−が挙げられるが、ここでｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである。他の実施形態では、窒素が末端オキシアミノ基、例えば−ＯＮＨ２、またはヒドラジノ基、−ＮＨＮＨ２の一部を形成することが可能である。連結部は任意選択で例えばヒドロキシ、アルコキシ、ペルハロアルキルで置換されてもよいし、かつ／あるいは任意選択で１つまたは複数の追加のヘテロ原子、例えばＮ、Ｏ、またはＳが挿入されてもよい。好ましい連結部に連結されたリガンドには、例えば
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＯＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）、
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）；
ＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＮＨＮＨ２（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｃ（Ｏ）（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）‐（ＣＨ２）ｎ‐Ｃ（Ｏ）Ｏ（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）‐Ｏ（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）‐（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐Ｃ（Ｏ）（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）‐（ＣＨ２）ｎ（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）‐ＮＨ（リガンド）；
ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（リガンド）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ‐Ｃ（Ｏ）（リガンド）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ‐Ｃ（Ｏ）Ｏ（リガンド）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ（リガンド）；または
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎ‐ＮＨ‐Ｃ（Ｏ）（リガンド）；
が挙げられる。
【０１４４】
他の実施形態では、連結部は、好ましくは該連結部の末端位置に、求電子基を含むことが可能である。好ましい求電子基には、例えばアルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシレート、トシレート、ノシレート、またはブロシレート、あるいは活性化カルボン酸エステル、例えばＮＨＳエステル、またはペンタフルオロフェニルエステルがある。好ましい連結部（下線部）には、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣＨＯ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨＯ；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣＨＯ（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）；
あるいはＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＮＨＳ（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）；
ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＣ６Ｆ５（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）；
あるいは−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ；ＴＡＰ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ；またはＴＡＰ−ＮＲ’’’’（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＬＧ（ｎは１〜６であり、Ｒ’’’’はＣ１〜Ｃ６アルキルである）（ＬＧは脱離基、例えばハロゲン化物、メシレート、トシレート、ノシレート、ブロシレートであってよい）が挙げられる。リガンドの求核基、例えばチオールまたはアミノ基と、連結部上の求電子基とのカップリングによって、連結を行うことが可能である。
【０１４５】
他の実施形態では、ＲＲＭＳモノマーまたはＲＲＭＳが連結部の末端位置にフタリミド基（Ｋ）を含むことが望ましい可能性がある。
【０１４６】
【化１７】
2007525454.tif 000019
【０１４７】
連結されるもの
広く様々なもの（実体）を、ｉＲＮＡ剤に、例えばＲＲＭＳの担体に連結させることが可能である。以下にＲＲＭＳと関連付けて実施例を記載するが、該ＲＲＭＳは単に好ましいものであるにすぎず、実体をｉＲＮＡ剤の他の場所に結合させることも可能である。
【０１４８】
好ましい構成部分はリガンドであり、リガンドはＲＲＭＳの担体と、好ましくは共有結合により、直接的あるいは介在する連結部を介して間接的に結合される。好ましい実施形態では、リガンドは介在する連結部を介して担体に結合される。前に論じたように、リガンドまたは連結部に連結されたリガンドは、ＲＲＭＳモノマーが伸長する鎖に取り込まれるときにＲＲＭＳモノマー上に存在していてもよい。いくつかの実施形態では、「前駆体」ＲＲＭＳモノマーを伸長する鎖に取り込ませた後に、「前駆体」ＲＲＭＳにリガンドを取り込ませることが可能である。例を挙げれば、例えばアミノ末端を有する連結部を備えた（すなわちリガンドが結合していない）ＲＲＭＳモノマー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を、伸長するセンスまたはアンチセンス鎖に取り込ませることが可能である。後の操作において、すなわち前駆体モノマーを鎖に取り込ませた後、続いて、求電子基（例えばペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基）を有するリガンドを、リガンドの求電子基と前駆体ＲＲＭＳの連結部の末端求核基とのカップリングによって、前駆体ＲＲＭＳと結合させることが可能である。
【０１４９】
好ましい実施形態では、リガンドは、同リガンドが取り込まれたｉＲＮＡ剤の分布、標的指向性または寿命を変化させる。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが存在しない分子種と比較して、選択された標的、例えば分子、細胞または細胞種、コンパートメント、例えば細胞または器官のコンパートメント、組織、器官または身体の領域に関する高い親和性をもたらす。好ましいリガンドは、二本鎖の核酸における二本鎖の対合には関与しないであろう。
【０１５０】
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性を向上させることが可能であり、生成する天然または修飾オリゴリボヌクレオチド、または本願明細書に記載するモノマーおよび／または天然もしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含んでなるポリマー分子の、ヌクレアーゼ耐性を向上させることも可能である。
【０１５１】
一般的なリガンドとしては、例えば取り込みを増大させるための治療用調節物質；例えば分布を調べるための診断用化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を与える構成部分が挙げられる。一般例には、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体がある。
【０１５２】
リガンドには、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）；または脂質などが挙げられる。リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸などの、組換え分子または合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−アクリル酸エチル）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンがある。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαらせん状ペプチドがある。
【０１５３】
リガンドは、標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば腎臓細胞などの特定の細胞種と結合する抗体も含み得る。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン、糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、あるいはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体であってよい。
【０１５４】
リガンドの他の例には、染料、インターカレート剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）、およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰがある。
【０１５５】
リガンドはタンパク質（例えば糖タンパク質）またはペプチド、例えば共通のリガンドに関する特異的親和性を有する分子、または抗体（例えば癌細胞、内皮細胞、または骨細胞などの特定の細胞種と結合する抗体）であってよい。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も含み得る。リガンドは、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン多価マンノース、または多価フコースなどの、非ペプチドの分子種も含み得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化剤、またはＮＦ−κＢの活性化剤であってよい。
【０１５６】
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させることが可能な物質、例えば薬物であってよい。薬物は例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライドＡ、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であってよい。
【０１５７】
リガンドは、例えば炎症応答を活性化させることによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大させることが可能である。このような効果を有すると思われる例示的なリガンドには、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンがある。
【０１５８】
１態様では、リガンドは脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合することが好ましい。ＨＳＡ結合リガンドは、身体の標的組織、例えば非腎臓標的組織に、本発明の複合体を分布させることが可能である。例えば標的組織は、肝臓の実質細胞を含めた肝臓であってよい。ＨＳＡと結合することが可能である他の分子も、リガンドとして使用することが可能である。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンを使用することが可能である。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）複合体の分解に対する耐性を増大させること、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的指向性または輸送を増大させることが可能であり、かつ／あるいは（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡとの結合を調節するために使用することが可能である。
【０１５９】
脂質系リガンドを使用して、本発明の複合体と標的組織の結合を調節する、例えば制御することが可能である。例えば、ＨＳＡとさらに強く結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓に対する標的指向性が低くなると思われ、したがって身体から除去されにくくなると思われる。ＨＳＡとさらに弱く結合する脂質または脂質系リガンドを使用して、本発明の複合体を腎臓に向けることが可能である。
【０１６０】
好ましい実施形態では、脂質系リガンドはＨＳＡと結合する。リガンドは、本発明の複合体が好ましくは非腎臓組織に分布するような十分な親和性で、ＨＳＡと結合することが好ましい。しかしながら、その親和性は、ＨＳＡとリガンドとの結合が不可逆的であるほど強くはないことが好ましい。
【０１６１】
他の好ましい実施形態では、本発明の複合体が好ましくは腎臓に分布するように、脂質系リガンドがＨＳＡと弱く結合するか、あるいはまったく結合しない。腎臓細胞を標的とする他の構成部分を、脂質系リガンドの代わりに、あるいは脂質系リガンドに加えて、使用することも可能である。
【０１６２】
他の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる構成部分、例えばビタミンである。これらのリガンドは、望ましくない細胞増殖、例えば悪性または非悪性型の細胞増殖、例えば癌細胞の増殖によって特徴付けられる疾患を治療するのに非常に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫがある。他の例示的なビタミンには、Ｂビタミン、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、あるいは癌細胞によって取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素がある。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）も含まれる。
【０１６３】
他の態様では、リガンドは、細胞透過性物質、好ましくはらせん状の細胞透過性物質である。該物質は両親媒性であることが好ましい。例示的な物質は、ｔａｔまたはアンテナペディアなどのペプチドである。該物質がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、インバートマー、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含めて、該ペプチドを改変することが可能である。らせん状物質は、親油性および撥油性の相を好ましくは有する、αらせん状物質であることが好ましい。
【０１６４】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。ペプチド模倣体（本願明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ぶ）は、天然のペプチドと類似した一定の３次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体と、ｉＲＮＡ剤が結合することによって、細胞の認識および吸収を高めることなどにより、ｉＲＮＡの薬物動態学的分布に影響を与えることが可能である。ペプチドまたはペプチド模倣体の構成部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であってよい（例えば表１を参照）。
【０１６５】
【表１】
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【０１６６】
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅから構成される）であってよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、制約型（constrained ）ペプチドまたは架橋ペプチドであってよい。他の代替例では、ペプチド部分は、疎水性の膜移行配列（ＭＴＳ）を含むことが可能である。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号１６）を有するＲＦ
ＧＦである。疎水性ＭＴＳを含むＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１７））も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含めた大きな極性分子を、細胞膜を横切って運ぶことができる「送達」ペプチドであってよい。例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号１８））、およびショウジョウバエのアンテナペディア・タンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１９））は、送達ペプチドとして機能しうることが見出されている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアル・ライブラリーから同定されたペプチドなど、ＤＮＡのランダムな配列によってコードされてもよい（ラムら（Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２〜８４、１９９１）。取り込まれたモノマーユニットを介してｉＲＮＡ剤と連結したペプチドまたはペプチド模倣体は、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、またはＲＧＤ模倣体などの、細胞標的化ペプチドであることが好ましい。ペプチド部分の長さは、約５アミノ酸〜約４０アミノ酸の範囲であってよい。ペプチド部分は、安定性を増大させるため、あるいは立体構造上の特性を得るためなどの、構造的改変を有し得る。以下に記載する任意の構造的改変を、使用することが可能である。
【０１６７】
ＲＧＤペプチド部分を使用して、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの、腫瘍細胞を標的とすることが可能である（ジッツマンら（Ｚｉｔｚｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６２：５１３９〜４３、２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含めた様々な他の組織の腫瘍を標的としたｉＲＮＡ剤の指向性を促進し得る（アオキら（Ａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：７８３〜７８７、２００１）。ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的指向性を促進することが好ましい。ＲＧＤペプチドは直鎖状でも環状でもよく、これらを修飾、例えばグリコシル化またはメチル化して、特定の組織を標的とした指向性を促進することが可能である。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することが可能である（ハウブナーら（Ｈａｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、４２：３２６〜３３６、２００１）。
【０１６８】
増殖する細胞中に豊富なマーカーを標的とするペプチドを、使用することが可能である。例えば、ＲＧＤを含有するペプチドおよびペプチド模倣体は、がん細胞、特にαＶβ３インテグリンを提示する細胞を標的とすることが可能である。したがって、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含む環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することが可能であると思われる。ＲＧＤ以外に、αＶβ３インテグリン・リガンドを標的とする他の構成部分を使用することが可能である。一般に、このようなリガンドを使用して、増殖している細胞および血管新生を制御することが可能である。この型の好ましい複合体には、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他のがん遺伝子、例えば本願明細書で記載するがん遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤がある。
【０１６９】
「細胞透過性ペプチド」は、細胞、例えば細菌または真菌細胞などの微生物細胞、またはヒト細胞などの哺乳動物細胞を透過することが可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα−らせん状直鎖ペプチド（例えばＬＬ−３７またはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシンまたはバクテネシン）、またはわずか１種または２種のアミノ酸を主に含むペプチド（例えばＰＲ−３９またはインドリシディン）であってよい。細胞透過性ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をも含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の融合ペプチドドメインとＳＶ４０大型Ｔ抗原のＮＬＳとに由来するＭＰＧなどの、２部分の両親媒性ペプチドであってよい（シメオニら（Ｓｉｍｅｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：２７１７〜２７２４、２００３）。
【０１７０】
１実施形態では、ＲＲＭＳに連結される標的化ペプチドは、両親媒性のαらせん状ペプチドであってよい。例示的な両親媒性のαらせん状ペプチドには、セクロピン、ライコトキシン、パラダキシン、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシディン、セラトトキシン、Ｓ．ｃｌａｖａペプチド、メクラウナギ腸管の抗菌性ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、ダーマセプチン、メリチン、プレウロシディン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルのペプチド、エスカレンチン−１、およびカエリンがあるが、これらだけには限られない。らせんの安定性を完全に保つために、いくつかの要因を考慮することが好ましいであろう。例えば、らせん安定化残基を最大数使用し（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）、らせん不安定化残基を最小数とする（例えばプロリン、または環状モノマーユニット）。キャップ構造の残基も考えられる（例えば、ＧｌｙはＮキャップ構造残基の例であり、かつ／あるいはＣ末端アミド化を使用して、らせんを安定化させるための特別なＨ結合を与えることが可能である）。ｉ±３、あるいはｉ±４位離れた、正反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって、安定性をもたらす可能性がある。例えば、リシン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチンまたはヒスチジンなどのカチオン性残基は、アニオン性の残基、グルタミン酸またはアスパラギン酸と、塩架橋を形成することが可能である。
【０１７１】
ペプチドおよびペプチド模倣体のリガンドには、天然または修飾ペプチド、例えばＤまたはＬペプチド；α、β、またはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つまたは複数のアミドを有するペプチド、すなわち１つまたは複数の尿素、チオ尿素、カルバメート、またはスルホニル尿素結合で置換されたペプチド結合；または環状ペプチドを有するリガンドがある。
【０１７２】
ｉＲＮＡ剤を作製するための方法
ｉＲＮＡ剤は、修飾塩基または非天然塩基、例えば本願明細書に援用する、２００３年４月１７日に出願された同時係属かつ共同所有の米国仮出願第６０／４６３，７７２号明細書に、および／または本願明細書に援用する、２００３年４月２５日に出願された同時係属かつ共同所有の米国仮出願第６０／４６５，８０２号明細書に記載された塩基を含むことが可能である。このような塩基を任意選択で含みうる、本明細書に記載されるモノマーおよびｉＲＮＡ剤は、２００３年４月１７日に出願された米国仮出願第６０／４６３，７７２号明細書、および／または２００３年４月２５日に出願された米国仮出願第６０／４６５，８０２号明細書に見られる方法によって作製することも可能である。
【０１７３】
さらに本発明は、修飾または非天然塩基および本願明細書に記載する他の要素を有するｉＲＮＡ剤を含む。例えば本発明は、本願明細書に記載するｉＲＮＡ剤、例えばパリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する遺伝子、例えば腎臓中で活性がある遺伝子を標的とするｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する構成様式または構造を有するｉＲＮＡ剤、本願明細書に記載する両親媒性送達物質と結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載する薬剤送達モジュールと結合したｉＲＮＡ、本願明細書に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、または本願明細書に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、修飾または非天然塩基も取り込むｉＲＮＡ剤を含む。
【０１７４】
オリゴヌクレオチドペプチド複合体の合成および精製は、確立されている方法によって実施することが可能である。例えば、テゥルーフェルトら（Ｔｒｕｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５２：３００５、１９９６；およびＭａｎｏｈａｒａｎ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｅｄ中、エス  ティー  クルーク、マルセル  デッカー、インコーポレイティッド社（Ｓ．Ｔ．Ｃｒｏｏｋｅ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、２００１を参照のこと。方法の例について図４および図５に示す。
【０１７５】
本発明の１実施形態では、ペプチド模倣体を修飾して、明確で特異的な好ましい立体構造をとる制約型ペプチドを作製することが可能であり、該立体構造によってペプチドの効力および選択性を増大させることが可能である。例えば、制約型ペプチドはアザペプチドであってよい（Ｇａｎｔｅ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、４０５〜４１３、１９８９）。アミノ酸側鎖の構造を変えずに、アミノ酸のα−炭素を窒素原子で置換することによって、アザペプチドが合成される。例えば、ヒドラジンを「カルボニル・ドナー」、例えばクロロギ酸フェニルと反応させることなどによって、伝統的なペプチド合成カップリング法においてヒドラジンを使用することによって、アザペプチドを合成することが可能である。一般的なアザペプチド合成について図６に示す。
【０１７６】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、Ｎ−メチルペプチドであってよい。Ｎ−メチルペプチドはＮ−メチル・アミノ酸から構成されるが、Ｎ−メチル・アミノ酸はペプチドのバックボーン中に追加のメチル基を与えることによってタンパク質分解酵素による切断に対する他の耐性手段を与える可能性がある。Ｎ−メチルペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である（例えば、リンドグレンら（Ｌｉｎｄｇｒｅｎ
ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：９９、２０００；Ｃｅｌｌ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｌａｎｇｅｌ、ｅｄ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、２００２；フィッシェら（Ｆｉｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ．Ｃｈｅｍ．１２：８２５、２００１；ワンダーら（Ｗａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２４：１３３８２、２００２を参照）。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、Ｎ−メチルペプチドであってもよい。合成例について図７に示す。
【０１７７】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、β−ペプチドであってよい。β−ペプチドは、溶液中でらせん、プリーツ・シート、ターンおよびヘアピンなどの安定した２次構造を形成する。β−ペプチドの環状誘導体は、固体状態で折りたたまれてナノチューブになりうる。β−ペプチドは、タンパク質分解酵素による分解に対して耐性がある。β−ペプチドは、当分野で知られている方法によって合成することが可能である。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドは、β−ペプチドであってもよい。合成例について図８に示す。
【０１７８】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、オリゴカルバメートであってよい。オリゴカルバメートペプチドは、カルバメートトランスポーターによって促進される輸送経路により細胞内に内在化する。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴカルバメートであってもよい。合成例について図９に示す。
【０１７９】
本発明の１実施形態では、ペプチドまたはペプチド模倣体（例えば、ＲＲＭＳに連結されるペプチドまたはペプチド模倣体）は、ペプチド模倣体のアミド結合が尿素部分で置換されているオリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合体）であってよい。アミド結合の置換によって、タンパク質分解酵素、例えば胃腸間内でのタンパク質分解酵素による分解に対する高い耐性が与えられる。１実施形態では、オリゴ尿素複合体を、経口送達において使用するためにｉＲＮＡ剤と連結させる。オリゴ尿素ペプチド模倣体のそれぞれの繰り返しユニット中のバックボーンは、天然アミノ酸と比較して１炭素原子だけ広がる可能性がある。１炭素原子の広がりによって、例えばペプチドの安定性および親油性が増大する可能性がある。したがってオリゴ尿素ペプチドは、ｉＲＮＡ剤が細菌細胞壁の通過を目
的とするとき、あるいは神経障害の治療などのためにｉＲＮＡ剤が血液−脳関門を横断しなければならないときに、有利である可能性がある。１実施形態では、受容体との高い親和性を生み出すために、水素結合ユニットをオリゴ尿素ペプチドに結合させる。例えば、ＡｎｔペプチドまたはＴａｔペプチドが、オリゴ尿素複合体（またはオリゴチオ尿素複合体）であってもよい。合成例について図１０に示す。
【０１８０】
本発明のｓｉＲＮＡペプチド複合体は、ｉＲＮＡ剤上の様々な位置に存在するＲＲＭＳと関連付ける、例えば連結させることが可能である。例えばペプチドを、センス鎖上またはアンチセンス鎖上のいずれかにおいて末端に結合させてもよいし、ペプチドをビス結合（１つのペプチドが各端で連結され、一端がセンス鎖に結合し、一端がアンチセンス鎖に結合する）。他の選択肢では、ペプチドは、短いヘアピン構造のｉＲＮＡ剤のループ中など、内部に結合し得る。さらに他の選択肢では、ペプチドはペプチド−担体複合体などの複合体と関連付けられてもよい。
【０１８１】
ペプチド−担体複合体は、（生体系および／または細胞に送達するためなどの）１つまたは複数のｉＲＮＡ剤を内包しうる少なくとも１つの担体分子と、担体複合体を特定の組織または細胞種に対して指向させるためなどの、前記担体分子の外側に連結されたペプチド部分とから構成される。担体複合体は、該複合体の外側に追加の標的化分子、または細胞への送達を助ける細胞融合剤を担持することも可能である。担体内に被包される１つまたは複数のｉＲＮＡ剤を、担体の内部への物質の送達を助けることが可能な親油性分子と結合させてもよい。
【０１８２】
担体分子または担体構造物は、例えばミセル、リポソーム（例えばカチオン性リポソーム）、ナノ粒子、ミクロスフェア、または生分解性ポリマーであってよい。ペプチド部分は、ジスルフィド結合、酸不安定結合、ペプチド系結合、オキシアミノ結合またはヒドラジン結合などの様々な結合によって、担体分子と連結することが可能である。例えば、ペプチド系結合はＧＦＬＧペプチドであってよい。いくつかの結合は個々の利点を有し、その利点（または欠点）を、標的組織または目的とする用途に応じて考慮することが可能である。例えば、ペプチド系結合は血流中では安定性があるが、リソソーム中では酵素による切断を受けやすい。好ましい担体の略図を図１１に示す。
【０１８３】
保護されたモノマー化合物を反応混合物から分離し、カラムクロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、または再結晶などの方法によってさらに精製することが可能である。当業者には理解されうるように、本明細書中の式の化合物を合成するさらなる方法は当業者には明らかである。さらに、種々の合成工程が、所望の化合物を得るために、代わりの手順または順番で実行されてもよい。本明細書に記載される化合物を合成する際に有用である他の合成化学変換、保護基（例えば、塩基上に存在するヒドロキシル、アミノなど）および保護基の方法論（保護および脱保護）は当該分野において公知であり、例えば、以下の文献に記載されるものなどが含まれる：Ｒ．ラロック（Ｌａｒｏｃｋ）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．グリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）およびＰ．Ｇ．Ｍ．ワッツ（Ｗｕｔｓ）、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．フィーザー（Ｆｉｅｓｅｒ）およびＭ．フィーザー（Ｆｉｅｓｅｒ）、「Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．パケット（Ｐａｑｕｅｔｔｅ）編、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ
Ｓｏｎｓ（１９９５）、ならびにこれらの後続版。
【０１８４】
本発明の保護化モノマー化合物は、１つまたは複数の不斉中心を含んでもよく、したがって、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一エナンチオマー、個々のジアステレオマー、およびジアステレオマー混合物として存在しうる。これらの化合物のこのようなすべての異性体が明確に本発明に含まれる。本明細書に記載される化合物はまた、結合（例えば、炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、例えば、アミド）または結合回転を制限すること（例えば、環もしくは二重結合の存在から生じる制限）が可能である置換基を含むことが可能である。したがって、すべてのシス／トランス、Ｅ／Ｚ異性体、および回転性アイソマー（回転異性体）が明確に本願に含まれる。本発明の化合物はまた、複数の互変異性体で表すことも可能であり、この場合、本発明は、本明細書に記載される化合物のすべての互変異性体を明確に含む（例えば、環系のアルキル化は複数の部位におけるアルキル化を生じる可能性があり、本発明は、このような反応生成物のすべてを明確に含む）。このような化合物のすべてのこのような異性体型が本発明に明確に含まれる。本明細書に記載される化合物のすべての結晶型が明確に本発明に含まれる。
【０１８５】
本明細書に記載されるモノマーおよび方法は、天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、あるいは本明細書に記載されるモノマー化合物および天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチド（１つまたは複数のサブユニットが通常でない塩基または普遍的な塩基を含む）のうち少なくともいずれかの任意の組合せを含むポリマー性分子を調製するために使用可能である。
【０１８６】
上記に議論したように、本明細書に記載されるモノマーおよび方法は、修飾ＲＮＡ分子の調製において使用可能である。修飾ＲＮＡ分子には、例えば、化学的または立体化学的に修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオシド代用物を含む分子が含まれる。ホスホロアミダイトとの５’−ヒドロキシル基のカップリングにより、亜リン酸エステル中間体が形成され、該中間体は次に、例えば、ヨウ素を用いて酸化されてリン酸ジエステルとなる。別例として、亜リン酸塩は、例えば、硫黄、セレン、アミノ、およびホウ素の試薬で処理されて、修飾リン酸バックボーンを形成可能である。本明細書に記載されるモノマーと、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド鎖との間の結合もまた、ヨウ素、硫黄、セレン、アミノ、およびホウ素の試薬で処理されて、それぞれ、非修飾リン酸バックボーンおよび修飾リン酸バックボーンを形成可能である。同様に、本明細書に記載されるモノマーは、本明細書に記載される修飾またはヌクレオシド代用物のいずれかを含むヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドとカップリング可能である。
【０１８７】
本明細書に記載される代表的なＲＲＭＳモノマーならびにＲＲＭＳモノマーおよび関連化合物を調製するための代表的な合成について以下に提示する。別の箇所で議論されるように、ＲＲＭＳモノマーのヒドロキシル基（例えば、ＯＦＧ１）のための保護基には、ジメトキシトリチル基（ＤＭＴ）が含まれるがこれに限定されない。例えば、ある実施形態においては、例えば、２００３年４月１７日に出願された米国仮出願シリアル番号第６０／４６３，７７２号、および／または２００３年４月２５日に出願された米国仮出願シリアル番号第６０／４６５，８０２号に記載された方法を使用して、ＯＦＧ１のための保護基としてシリコン系の保護基を使用することが望ましい可能性がある。従って、シリコン系の保護基は、必要に応じて、または望ましいように、ＤＭＴ基と組み合わせて、またはＤＭＴ基の代わりに使用可能である。したがって、以下に記載されるＲＲＭＳモノマーおよび合成は、ＯＦＧ１のための保護基としてＤＭＴ保護基を特徴としているが、本発明をどのようにも限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１８８】
【化１８】
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【０１８９】
【化１９】
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【０１９０】
【化２０】
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【０１９１】
【化２１】
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【０１９２】
【化２２】
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【０１９３】
【化２３】
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【０１９４】
【化２４】
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【０１９５】
【化２５】
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【０１９６】
【化２６】
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【０１９７】
【化２７】
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【０１９８】
【化２８】
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【０１９９】
【化２９】
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【０２００】
【化３０】
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【０２０１】
【化３１】
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【０２０２】
【化３２】
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【０２０３】
【化３３】
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【０２０４】
【化３４】
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【０２０５】
【化３５】
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【０２０６】
【化３６】
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【０２０７】
【化３７】
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【０２０８】
【化３８】
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【０２０９】
【化３９】
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【０２１０】
標的化
本発明のｉＲＮＡ剤は、肝臓を標的とする場合に特に有用である。本明細書に記載される化学修飾は、２００３年４月９日に出願された米国仮出願第６０／４６２，０９７号（本願明細書に援用する）および２００３年４月１０日に出願された米国仮出願第６０／４６１，９１５号（本願明細書に援用する）に記載される化合物および方法と組み合わせることが可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤に、肝臓を標的とするリガンド（例えば、親油性部分）を含むＲＲＭＳを組み込むことによって、該ｉＲＮＡ剤の標的を肝臓とすることが可能である。好ましい親油性部分には、脂質、コレステロール、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基が含まれる。肝臓標的化剤として機能することが可能である他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン
、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが含まれる。
【０２１１】
ｉＲＮＡ剤はまた、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（例えば、ラクトシル化ＬＤＬ）との結合によって、肝臓を標的とすることが可能である。糖残基と複合体形成したポリマー性担体もまた、ｉＲＮＡ剤が肝臓を標的とするように機能することが可能である。
【０２１２】
血清アルブミン（ＳＡ）（例えば、ヒト血清アルブミン）とのｉＲＮＡ剤の複合体化はまた、ｉＲＮＡ剤が腎臓以外の組織、例えば、肝臓を標的とするために使用されることが可能である。
【０２１３】
本明細書に記載されるＲＲＭＳ標的化部分によって肝臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、肝臓において発現される遺伝子を標的とすることが可能である。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば、肝臓のがんを治療するために、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＤＩＰ１）、Ｐ２７（ＫＩＰ１）、α−フェトプロテイン遺伝子、β−カテニン、またはｃ−ＭＥＴを標的とすることが可能である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、例えば、ＨＤＬ／ＬＤＬコレステロールの不均衡；異常脂質血症、例えば、家族性複合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、もしくは後天性高脂血症；高コレステロール血症；スタチン抵抗性高コレステロール血症；冠状動脈疾患（ＣＡＤ）；冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）またはアテローム性動脈硬化症の治療のために、ａｐｏＢ−１００を標的とすることが可能である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、例えば、糖尿病の治療のために、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）における肝臓のグルコース産生を阻害するために、横紋筋肉腫のフォークヘッドホモログ（ＦＫＨＲ）；グルカゴン；グルカゴン受容体；グリコーゲンホスホリラーゼ；ＰＰＡＲ−γコアクチベータ（ＰＧＣ−１）；フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ；グルコース−６−ホスファターゼ；グルコース−６−リン酸トランスロケーター；グルコキナーゼ阻害性調節タンパク質（glucokinase inhibitory regulatory protein ）；またはホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）を標的とすることが可能である。別の実施形態において、肝臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、例えば、血塊が形成される傾向を低減するために、第Ｖ因子、例えば、ライデン第Ｖ因子対立遺伝子を標的とすることが可能である。肝臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型、またはＨ型肝炎ウイルス）を標的とする配列を含むことが可能である。例えば、本発明のｉＲＮＡ剤は、ＨＣＶ：ＮＳ３、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、または５Ｂの非構造タンパク質のいずれか１つを標的とすることが可能である。Ｂ型肝炎の治療のために、ｉＲＮＡ剤は、例えば、Ｘタンパク質（ＨＢｘ）遺伝子を標的とすることが可能である。
【０２１４】
糖（例えば、ガラクトースおよび／またはそのアナログ）を組み込む標的化剤が有用であり得る。これらの薬剤は、例えば、肝臓の実質細胞を標的とする。例えば、標的化部分には、複数、または好ましくは２つもしくは３つのガラクトース部分が、互いに約１５オングストロームの間隔で含まれうる。代替的には、標的化部分はラクトース（例えば、３つのラクトース部分）でもよい。ラクトースは、ガラクトースにカップリングされたグルコースである。標的化部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−Ａｃ−グルコサミンでもよい。マンノースまたはマンノース−６−リン酸の標的化部分は、マクロファージへの標的化のために使用可能である。
【０２１５】
本発明のｉＲＮＡ剤は、腎臓を標的とする場合に特に有用である。本明細書に記載される化学修飾は、２００３年４月３日に出願された米国仮出願第６０／４６０，７８３号（本願明細書に援用する）および２００３年９月１５日に出願された米国仮出願第６０／５
０３，４１４号（本願明細書に援用する）に記載される化合物および方法と組み合わせることが可能である。ｉＲＮＡ剤に腎臓を標的とするリガンドを含むＲＲＭＳを組み込むことによって、該ｉＲＮＡ剤の標的を腎臓とすることが可能である。
【０２１６】
本明細書に記載されるＲＲＭＳ標的化部分によって腎臓を標的とするｉＲＮＡ剤は、腎臓において発現される遺伝子を標的とすることが可能である。
ＲＲＭＳ上のリガンドには、葉酸、グルコース、コレステロール、コール酸、ビタミンＥ、ビタミンＫ、またはビタミンＡがあげられる。
【０２１７】
細胞への侵入を促進する親油性部分との複合体化
ＲＮＡｉ剤は、細胞への侵入を増強するために、例えば、親油性部分との複合体化によって修飾可能である。親油性部分はいくつかの方法でＲＮＡｉ剤に結合可能であるが、好ましい結合様式は、ＲＲＭＳ、例えば、ピロリン系ＲＲＭＳへの結合によるものである。親油性部分は、ピロリン系ＲＲＭＳのＮ原子に結合可能である。親油性部分の例には、コレステロール、脂質、オレイル、レチニル、またはコレステリル残基が含まれる。他の親油性部分には、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンが含まれる。コレステロールが特に好ましい例である。
【０２１８】
親油性部分は、好ましくはセンス鎖上の、３’末端、５’末端、または内部に結合可能である。親油性部分は、センス鎖の３’末端、５’末端、または内部にあるＲＲＭＳ（例えば、ピロリン系ＲＲＭＳ）に結合可能である。結合は直接的でもよいし、または連結分子を介してもよい。本明細書で議論される、連結部、スペーサー、またはリンカーを、ＲＲＭＳに親油性部分を結合するために使用可能である。
【０２１９】
１つまたは複数の親油性（例えば、コレステロール）分子が結合しているｉＲＮＡ剤（本明細書では「ｉＲＮＡ親油性複合体」と呼ばれる）は、例えば、哺乳動物などの対象（例えば、ヒトまたはマウス）における組織の細胞などの細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達可能である。別例または追加として、ｉＲＮＡ剤は、例えば、細胞株中の細胞に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで送達可能である。細胞株は、例えば、哺乳動物（例えば、ヒトまたはマウス）などの脊椎動物に由来するものでよい。細胞株へのｉＲＮＡ−コレステロール複合体は、他のトランスフェクション試薬の非存在下で送達可能である。例えば、細胞へのｉＲＮＡ親油性複合体の送達は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のインビトロジェン（Invitrogen））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）（米国ウィスコンシン州マディソン所在のマイラス（Mirus ））、ＦｕＧＥＮＥ（登録商標）６（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロシュ（Roche ））、ポリエチレンイミン、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  Ｑ２（商品名）（米国インディアナ州インディアナポリス所在のロシュ）、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＥＲ、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（独国ミュンヘン所在のバイオンテクス（Biontex ））または他のトランスフェクション試薬の非存在下、または任意選択で存在下にて可能である。例示的な細胞株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（米国バージニア州マナッサス所在）から供給可能である。ｉＲＮＡ親油性複合体は、ダウンレギュレーションを目的として特定の遺伝子を標的とするために、細胞株（例えば、本明細書に記載される任意の細胞株）に送達可能である。
【０２２０】
１つの例において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、初代細胞株、例えば、滑膜細胞（例えば、Ｂ型）、心筋細胞、ケラチノサイト、肝細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、または真皮線維
芽細胞の細胞株に送達可能である。
【０２２１】
別の例において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、単球または骨髄細胞の細胞株、例えば、細胞株ＴＨＰ１、Ｒａｗ２６４．７、ＩＣ２１、Ｐ３８８Ｄ１、Ｕ９３７、またはＨＬ６０に送達可能である。
【０２２２】
別の例において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、リンパ腫または白血病細胞の細胞株、例えば、細胞株ＳＥＭ−Ｋ２、ＷＥＨＩ−２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２、ＥＬ４、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ−１、またはＴＦ１に送達可能である。例えば、ｉＲＮＡ親油性複合体が、ダウンレギュレーションと目的として特定の遺伝子を標的とするためにリンパ腫細胞株に送達されてもよい。ｉＲＮＡ−親油性剤は、例えば、インターロイキン遺伝子（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、またはＩＬ−１８）などの免疫因子をコードするＪｕｒｋａｔ細胞株中の遺伝子を標的とする（ダウンレギュレートする）ことが可能である。別の態様において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、インターロイキンの受容体をコードする遺伝子を標的とすることが可能である。
【０２２３】
ｉＲＮＡ親油性複合体は、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＥＬ−ＡＭＬ−１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１、ＥＷＳ−ＥＲＧ、ＴＬＳ−ＦＵＳ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、またはＡＭＬ１−ＥＴＯなどの、染色体転座の結果生じる遺伝子を標的とすることが可能である。例えば、染色体転座の結果生じる遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、白血病細胞株、例えば、上記で議論されたいずれかの白血病細胞株に送達可能である。
【０２２４】
ｉＲＮＡ親油性複合体は、不死化された細胞株に送達可能である。該不死化細胞株には種々の異なる組織由来の不死化細胞株が含まれ、Ｔ細胞、線維芽細胞、上皮細胞（例えば、腎臓上皮細胞）、および筋肉細胞（例えば、平滑筋細胞）が挙げられるがこれらに限定はされない。例示的な不死化細胞株は、細胞株ＣＴＬＬ−２（Ｔ細胞）、Ｒａｔ６（線維芽細胞）、ＶＥＲＯ（線維芽細胞）、ＭＲＣ５（線維芽細胞）、ＣＶ１（線維芽細胞）、Ｃｏｓ７（線維芽細胞）、ＲＰＴＥ（腎臓上皮）、およびＡ１０（平滑筋）である。
【０２２５】
ｉＲＮＡ親油性複合体は、例えば、肥満細胞の細胞株に送達可能である。肥満細胞の細胞株に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、例えば、ＧＲＢ２関連結合タンパク質（例えば、ＧＡＢ２）をコードする遺伝子を標的とすることが可能である。
【０２２６】
ｉＲＮＡ親油性複合体は、付着性の腫瘍細胞株に送達可能である。付着性の腫瘍細胞株には、膀胱、肺、乳房、子宮頸部、結腸、膵臓、前立腺、および肝臓のがん、メラノーマ、ならびにグリア芽細胞腫が挙げられるがこれらに限定はされない種々の異なる組織由来の腫瘍細胞株が含まれる。例示的な腫瘍細胞株には、細胞株Ｔ２４（膀胱）、Ｊ８２（膀胱）、Ａ５４９（肺）、Ｃａｌｕ１（肺）、ＳＷ４８０（結腸）、ＳＷ６２０（結腸）、ＣａＣｏ２（結腸）、Ａ３７５（メラノーマ）、Ｃ８１６１（メラノーマ）、ＭＣＦ−７（乳房）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房）、ＨｅＬａ（子宮頸部）、ＨｅＬａ  Ｓ３（子宮頸部）、ＭｉａＰａＣａｌｌ（膵臓）、Ｐａｎｃ１（膵臓）、ＰＣ−３（前立腺）、ＬＮＣａＰ（前立腺）、ＨｅｐＧ２（肝細胞）、およびＵ８７（グリア芽細胞腫）が含まれる。特定の遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体を付着性の腫瘍細胞株に送達可能である。例えば、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）またはＴＧＦβ受容体の遺伝子など、成長因子または成長因子受容体を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体を、細胞株Ａ５４９もしくはＨｅｐＧ２、ＤＬＤ２結腸がん細胞株、またはＳＫＯＶ３腺がん細胞株に送達可能である。他の例示的な標的となる成長因子遺伝子には、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）およびＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびＶＥＧＦ受容体遺伝子（例えば、ＶＥＧＦｒ１、ＶＥＧＦｒ２、またはＶＥＧＦｒ３）、ならびに１型
インスリン成長因子（ＩＧＦ）受容体（ＩＧＦ−１Ｒ、ＤＡＦ−２、およびＩｎＲを含む）などのインスリン成長因子受容体が含まれる。
【０２２７】
別の例において、ＩＶＡ型タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＲＬ３、ＰＴＰ４Ａ３とも呼ばれる）遺伝子ファミリーのうち１種または複数の遺伝子（例えば、ＰＲＬ１、ＰＲＬ２、もしくはＰＲＬ３）またはＰＲＬ３経路の遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体を、Ａ５４９細胞株、または培養された結腸直腸上皮細胞株に送達可能である。
【０２２８】
別の例において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、マウスのルイス肺がん腫、Ｂ１６メラノーマ、マウス乳腺がんもしくは線維肉腫；またはヒトの肺がん腫、膀胱がん、膵臓がん、胃がん、乳がん、甲状腺がん、もしくはメラノーマなどの付着性腫瘍細胞株における１種または複数のプロテインキナーゼＣ遺伝子を標的とすることが可能である。ｉＲＮＡ親油性複合体は、ＰＫＣα、ＰＫＣβＩ、ＰＫＣβＩＩ、ＰＫＣγ、ＰＫＣδ、ＰＫＣε、およびＰＫＣζのうち少なくともいずれかなどのＰＫＣアイソフォームをコードする遺伝子、またはプロテインキナーゼＣポリペプチドの１種または複数の受容体をコードする遺伝子を標的とすることが可能である。
【０２２９】
別の例において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子ファミリーの遺伝子（例えば、ＭＤＲ１）などのＰ糖タンパク質をコードする遺伝子を標的とすることが可能である。ＭＤＲ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、例えば、ヒトがん腫ＫＢ細胞株、ヒト白血病もしくは卵巣がん腫の細胞株、または肺がん腫細胞株（例えば、Ａ５４９）に送達可能である。
【０２３０】
別の例において、ｉＲＮＡ親油性結合体は、テロメラーゼ経路の遺伝子をコードする遺伝子（例えば、ＴＥＲＴまたはテロメラーゼの鋳型ＲＮＡ（ＴＲ／ＴＥＲＣ））を標的とすることが可能である。テロメラーゼ経路の遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、例えば、ヒトのがん細胞株（例えば、乳がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、髄膜がん、肺がん、精巣がん、または卵巣がんの細胞株）に送達可能である。
【０２３１】
別の例において、付着性細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株、副甲状腺腺腫細胞株、またはＡ５４９細胞株）に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、サイクリン遺伝子、例えば、サイクリンＤ１を標的とすることが可能である。
【０２３２】
別の例において、付着性細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株）に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、ＮＦ−κＢ遺伝子もしくはＲＥＬ−Ａ遺伝子、またはＮＦ−κＢもしくはＲＥＬ−Ａポリペプチドのリガンドもしくは受容体をコードする遺伝子、またはＮＦ−κＢのサブユニット（例えば、ＲＥＬ−Ｂ、ＲＥＬ、ＮＦ−κＢ１、もしくはＮＦ−κＢ２）をコードする遺伝子を標的とすることが可能である。
【０２３３】
別の例において、付着性細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞株またはＡ５４９細胞株）に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）をコードする遺伝子、チェックポイントキナーゼ遺伝子（ＣＨＫ−１）、またはｃ−ｆｏｓ遺伝子を標的とすることが可能である。さらに、ｉＲＮＡ親油性複合体は、ＰＣＮＡ、ＣＨＫ−１、またはｃ−ｆｏｓ経路の任意の遺伝子を標的とすることが可能である。例えば、ｉＲＮＡ親油性複合体は、ｊｕｎ（ｃ−ｆｏｓ経路にある）をコードする遺伝子をダウンレギュレートすることが可能である。
【０２３４】
別の例において、接着性細胞株（例えば、細胞株Ａ５４９、Ｔ２４、またはＡ３７５）に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、ＢＣＬ２をコードする遺伝子を標的とすることが可能である。
【０２３５】
本明細書に記載される細胞株は、外来の、例えば、病原体またはウイルスの核酸を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体を試験するために使用可能である。例えば、肝炎ウイルス遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、ヒト肝臓がん細胞株、例えばＨｅｐＧ２またはＨｕｈ細胞株（例えば、ＨＡＶ、ＨＢＶ、またはＨＣＶなどのウイルスに感染しているＨｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７など）に送達可能である。例えば、感染Ｈｕｈ細胞株中などのＨＣＶ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、ＨＣＶゲノムの保存領域、例えば、５’非コード領域（ＮＣＲ）、コアタンパク質コード領域の５’末端、または３’ＮＣＲを標的とすることが可能である。
【０２３６】
本明細書に記載される細胞株はまた、該細胞系に（一過性または安定に）トランスフェクトされたレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ｌａｃＺ、βガラクトシダーゼなど）などの外来の組換え核酸を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体を試験するために使用可能である。
【０２３７】
１つの態様において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、Ｂ細胞の細胞株、例えば、ＢＣ−３、Ｃ１Ｒ、またはＡＲＨ−７７細胞に送達可能である。別の態様において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、Ｔ細胞、例えば、Ｊ４５．０１、ＭＯＬＴ、およびＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞に送達可能である。ｉＲＮＡ親油性複合体は、内在性または外来の核酸を標的とすることが可能である。例えば、ＨＩＶ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体の開発について、Ｂ細胞もしくはＴ細胞の細胞株において、またはマクロファージもしくは内皮細胞の培養系において、外来のＨＩＶ核酸に対して試験することが可能である。
【０２３８】
ｉＲＮＡ親油性複合体は、内胚葉、上皮、または中胚葉に由来する細胞に送達可能である。例えば、ｉＲＮＡ親油性複合体は、上皮細胞の細胞株ＨｅＬａもしくはＭＣＦ７の細胞、内皮細胞の細胞株ＨＵＶＥＣの細胞、または中胚葉の細胞株ＳＫ−ＵＴもしくはＨＡＳＭＣの細胞に送達可能である。１つの例において、ＴＧＦβの核酸またはＴＧＦβ受容体の核酸を標的とするｉＲＮＡ親油性剤は、血管平滑筋細胞の細胞株、例えば、腎臓の線維芽細胞２９３細胞株に送達可能である。線維芽細胞（例えば、２９３細胞）に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体の他の例示的な標的には、タンパク質チロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）遺伝子またはＭＡＰキナーゼ遺伝子（例えば、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２、およびｐ３８）が含まれる。別の例において、ダウンレギュレーションを目的としてＭＤＲ遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、ヒト腸上皮の細胞株、Ｃａｃｏ−２に送達可能である。
【０２３９】
１つの例において、上皮または中胚葉の細胞株（例えば、それぞれ、ＨｅＬａ細胞株またはＨＡＳＭＣ細胞株）などの細胞株に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、ＭｙｃもしくはＭｙｂポリペプチドをコードする遺伝子、例えば、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、ａ−Ｍｙｂ、ｂ−Ｍｙｂ、およびｖ−Ｍｙｂ、またはＭｙｃもしくはＭｙｂ遺伝子経路における遺伝子、例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＥ、ＣＤＫ４、ｃｄｃ２５Ａ、ＣＤＫ２、もしくはＣＤＫ４を標的とすることが可能である。
【０２４０】
１つの例において、脳などの神経系において発現される遺伝子、例えば、Ｇ７２遺伝子またはＤ−アミノ酸オキシダーゼ（ＤＡＡＯ）遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、培養神経細胞株、例えば、ｈＮＴ細胞株に送達可能である。
【０２４１】
別の例において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、テロメラーゼ経路の遺伝子、例えば、ＴＥＲＴまたはＴＲ／ＴＥＲＣをコードする遺伝子を標的とすることが可能である。テロメラーゼ経路の遺伝子を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、例えば、ＨＥＫ細胞株（例えば
、ＨＥＫｎまたはＨＥＫａ）などのヒトのケラチノサイト細胞株に送達可能である。
【０２４２】
別の例において、組織特異的な細胞株、例えば、ＨＥＫ（ケラチノサイト）、ＨｕＶＥＣ（内皮）、３Ｔ３（線維芽細胞）、またはＮＨＤＦ（線維芽細胞）細胞株に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、ＢＣＬ−２、またはＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦｒ１、ＶＥＧＦｒ２、またはＶＥＧＦｒ３）をコードする遺伝子を標的とすることが可能である。
【０２４３】
ｉＲＮＡ親油性複合体は、特定の組織に由来する細胞のサブグループに送達可能である。例えば、ｉＲＮＡ親油性複合体は、腎臓の近位尿細管細胞株、例えば、マウス細胞株ｍＩＭＣＤ−３に送達可能である。ＴＧＦβの核酸またはＴＧＦβ受容体の核酸を標的とするｉＲＮＡ親油性複合体は、例えば、前立腺組織由来の細胞株、例えば、前立腺のＰＣ３細胞株またはＲＷＰＥ細胞株に送達可能である。前立腺組織の細胞株に送達されるｉＲＮＡ親油性複合体は、別例として、ポリコーム群遺伝子、例えば、ＥＺＨ２を標的とすることが可能である。
【０２４４】
別の例において、ｉＲＮＡ親油性複合体は、膵島ｂ細胞に送達可能であり、膵島ｂ細胞において、例えば、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）遺伝子、またはＧＩＰ受容体遺伝子を標的とする。
【０２４５】
本明細書に記載されるｉＲＮＡ親油性複合体は、適用可能な細胞株に制限されるものではないし、標的とすることが可能な核酸に限定的なものでもない。
定義
用語「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素の任意の基を指す。
【０２４６】
用語「アルキル」は、示した数の炭素原子を含む直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１〜Ｃ１２アルキルとは、該基が１個〜１２個の炭素原子をその中に有することが可能であることを示す。用語「ハロアルキル」は、１つまたは複数の水素原子がハロによって置換されているアルキルを指し、すべての水素がハロによって置換されているアルキル部分（例えばペルフルオロアルキル）を含む。アルキルおよびハロアルキル基は、任意選択でＯ、Ｎ、またはＳが挿入されていてもよい。用語「アラルキル」は、アルキル水素原子がアリール基によって置換されているアルキル部分を指す。アラルキルは、２つ以上の水素原子がアリール基によって置換されている基を含む。「アラルキル」の例には、ベンジル、９−フルオレニル、ベンズヒドリル、およびトリチル基がある。
【０２４７】
用語「アルケニル」は、２〜８個の炭素原子を含み１つまたは複数の二重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルケニルの例には、アリル、プロペニル、２−ブテニル、３−ヘキセニルおよび３−オクテニル基があるが、これらだけには限られない。用語「アルキニル」は、２〜８個の炭素原子を含み１つまたは複数の三重結合を有することを特徴とする、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖を指す。典型的なアルキニルのいくつかの例は、エチニル、２−プロピニル、および３−メチルブチニル、およびプロパルギルである。ｓｐ２およびｓｐ３炭素が、任意選択で、それぞれアルケニル基およびアルキニル基の結合点として作用してもよい。
【０２４８】
用語「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指す。用語「アミノアルキル」は、アミノで置換されたアルキルを指す。用語「メルカプト」は、−ＳＨ基を指す。用語「チオアルコキシ」は、−Ｓ−アルキル基を指す。
【０２４９】
用語「アルキレン」は、２価アルキル（すなわち−Ｒ−）、例えば−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−を指す。用語「アルキレンジオキソ」は、構
造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−（Ｒはアルキレンを表す）の２価の分子種を指す。
【０２５０】
用語「アリール」は、任意の環原子を置換することが可能な、芳香族単環、２環、または３環炭化水素環系を指す。アリール部分の例には、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびピレニルがあるが、これらだけには限られない。
【０２５１】
本願明細書で使用する用語「シクロアルキル」は、任意の環原子を置換することが可能な、３〜１２個の炭素を有する飽和環状、２環、３環、または多環炭化水素基を含む。本願明細書に記載するシクロアルキル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の結合を共有する環である。シクロアルキル部分の例には、シクロヘキシル、アダマンチル、ノルボルニル、およびデカリンがあるが、これらだけには限られない。
【０２５２】
用語「ヘテロシクリル」は、非芳香族３〜１０員の単環、８〜１２員の２環、または１１〜１４員の３環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、２環の場合１〜６個のヘテロ原子、または３環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、単環、２環、または３環である場合、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子それぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個）であり、置換可能な任意の環原子を置換基によって置換することが可能な環系を指す。本願明細書に記載するヘテロシクリル基は、縮合環も含み得る。縮合環は、共通の結合を共有する環である。ヘテロシクリルの例には、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ピペリジニル、モルホリノ、ピロリニルおよびピロリジニルがあるが、これらだけには限られない。
【０２５３】
用語「ヘテロアリール」は、芳香族５〜８員の単環、８〜１２員の２環、または１１〜１４員の３環の環系であって、単環の場合１〜３個のヘテロ原子、２環の場合１〜６個のヘテロ原子、または３環の場合１〜９個のヘテロ原子を有し、前記ヘテロ原子がＯ、Ｎ、またはＳから選択されることを特徴とする環系（例えば炭素原子と、単環、２環、または３環である場合、Ｎ、ＯまたはＳのヘテロ原子それぞれ１〜３個、１〜６個、または１〜９個）であり、任意の環原子を置換することが可能な環系を指す。
【０２５４】
用語「オキソ」は、炭素と結合している場合はカルボニルを形成し、窒素と結合している場合はＮ−オキシドを形成し、イオウと結合している場合はスルホキシドまたはスルホンを形成する酸素原子を指す。
【０２５５】
用語「アシル」は、いずれも置換基によってさらに置換することが可能な、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指す。
【０２５６】
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクロアルケニル、シクロアルケニル、アリール、またはヘテロアリール基上で該基の任意の原子について「置換された」基を指す。適切な置換基には、制限を設けるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、硫酸、リン酸、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオオキソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（ｎは０〜２）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（ｎは０〜２）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラ
ルキル、ヘテロアラルキル、およびこれらの組合せ）、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロシクリル、および非置換シクロアルキルがある。１態様では、基上の置換基は独立に、前述の置換基のいずれか１つ、またはいずれかのサブセットである。
【０２５７】
用語「アデニニル、シトシニル、グアニニル、チミニル、およびウラシリル」などは、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、およびウラシルの基を指す。
本願明細書で使用する「通常でない」核酸塩基は、以下のいずれか１つを含むことが可能である：
２−メチルアデニニル、
Ｎ６−メチルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデニニル、
Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニニル、
Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデニニル、
Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデニニル、
Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニニル、
３−メチルシトシニル、
５−メチルシトシニル、
２−チオシトシニル、
５−ホルミルシトシニル、
【０２５８】
【化４０】
2007525454.tif 000043
【０２５９】
Ｎ４−メチルシトシニル、
５−ヒドロキシメチルシトシニル、
１−メチルグアニニル、
Ｎ２−メチルグアニニル、
７−メチルグアニニル、
Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアニニル、
【０２６０】
【化４１】
2007525454.tif 000044
【０２６１】
Ｎ２，７−ジメチルグアニニル、
【０２６２】
【化４２】
2007525454.tif 000045
【０２６３】
Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアニニル、
１−メチルグアニニル、
７−シアノ−７−デアザグアニニル、
７−アミノメチル−７−デアザグアニニル、
プソイドウラシリル、
ジヒドロウラシリル、
５−メチルウラシリル、
１−メチルプソイドウラシリル、
２−チオウラシリル、
４−チオウラシリル、
２−チオチミニル
５−メチル−２−チオウラシリル、
３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシリル、
５−ヒドロキシウラシリル、
５−メトキシウラシリル、
ウラシリル５−オキシ酢酸、
ウラシリル５−オキシ酢酸メチルエステル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリル、
５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシリルメチルエステル、
５−メトキシカルボニルメチルウラシリル、
５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシリル、
５−アミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチルウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
５−メチルアミノメチル−２−セレノウラシリル、
５−カルバモイルメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチルウラシリル、
５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシリル、
３−メチルウラシリル、
１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウラシリル、
５−カルボキシメチルウラシリル、
５−メチルジヒドロウラシリル、または
３−メチルプソイドウラシリル。
【０２６４】
普遍的な塩基は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基の間をあまり区別せず、該塩基それぞれと塩基対を形成することが可能である。一般に、普遍的な塩基は、非水素結合性、疎水性、芳香族性の部分であり、スタッキング相互作用を介して、例えば二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ様分子を安定化することが可能である。普遍的塩基はまた、水素結合する置換基を含むことも可能である。本明細書中で使用される場合、「普遍的塩基」は以下のいずれか１つ：
アントラセン、ピレン、
【０２６５】
【化４３】
2007525454.tif 000046
【０２６６】
を含むことが可能である。
普遍的塩基はまた、直接的に、または例えば連結部を介して間接的にリガンドが結合しているアリール部分（例えば、フェニル）を含むことが可能である。このアリール部分はさらに、追加の置換基、例えば、１つまたは複数のフルオロ基を含んでもよい。
【０２６７】
ｉＲＮＡ剤の構造
本明細書に記載されるモノマーは、ｉＲＮＡ剤、例えば、対象の内在性遺伝子または病原体の遺伝子に関連してＲＮＡｉを仲介する、例えば、ＲＮＡ分子（二本鎖；一本鎖）などのｉＲＮＡ剤として有用であるオリゴヌクレオチドを作製するために使用可能である。多くの場合において、ｉＲＮＡ剤には、天然に存在するヌクレオシドもしくはヌクレオチドとともに、または他の修飾ヌクレオシドもしくは修飾ヌクレオチドとともに、本明細書に記載されるモノマーが取り込まれる。修飾されたモノマーは、ｉＲＮＡ剤の任意の位置に、例えば、ｉＲＮＡ剤の末端もしくは中央領域に、あるいは二本鎖領域または非対合領域に存在することが可能である。好ましい実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、任意の構成
様式、例えば、本明細書に記載される構成様式を有することが可能である。例えば、本明細書に記載されるような、突出部構造、ヘアピン構造もしくは他の一本鎖構造、または二本鎖構造を有する構成様式がｉＲＮＡ剤に組み込まれうる。
【０２６８】
「ＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代用物であり、これらのすべてが本明細書中で定義される（例えば、以下のＲＮＡ剤という表題の節を参照されたい）。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代用物が記載されるが、好ましい例には、非修飾ＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の高いものが含まれる。好ましい例には、２’糖修飾、一本鎖突出部（好ましくは３’一本鎖突出部）における修飾、または、特に一本鎖の場合、１つ以上のリン酸基もしくは１つ以上のリン酸基アナログを含む５’修飾を有するものが含まれる。
【０２６９】
「ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、標的遺伝子、好ましくは内在性または病原体の標的ＲＮＡの発現をダウンレギュレートすることが可能であるＲＮＡ剤へと切断されることが可能であるＲＮＡ剤である。理論によって束縛されることを望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当該分野においてＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切断、または転写前もしくは翻訳前のメカニズムを含む多数のメカニズムの１つ以上によって作用することが可能である。ｉＲＮＡ剤は、一本鎖を含むことも、または一本以上の鎖を含むことも可能であり、例えば、ｉＲＮＡ剤は、二本鎖ｉＲＮＡ剤であり得る。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基のアナログを含む５’修飾を含むことが特に好ましい。
【０２７０】
ＲＲＭＳ含有ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤またはそのフラグメントが標的遺伝子のダウンレギュレーションを仲介することが可能であるように、標的遺伝子に対して十分な相同性の領域を含み、かつヌクレオチドの長さが十分であるべきである。（説明を簡略化するために、本明細書中では、用語ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、ＲＮＡ剤の１つ以上のモノマーサブユニットを指すために使用されることがある。本明細書中において、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」を使用するとき、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代用物の場合においては、修飾ヌクレオチド、または１つ以上の位置での代用物で置換した部分をも意味し得ることが本明細書中で理解されよう。）したがって、ｉＲＮＡ剤は、少なくとも部分的に、およびある実施形態においては完全に、標的ＲＮＡに相補的な領域であるか、またはその領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間の完全な相補性が存在することは必ずしも必要ではないが、その一致は、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が、例えば、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断によって、配列特異的に発現を抑制することを可能にするために十分でなくてはならない。
【０２７１】
標的鎖との相補性、または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重大である。特に、アンチセンス鎖における完全な相補性が望ましいことが多いが、ある実施形態は、特にアンチセンス鎖において、１つ以上であるが好ましくは６個、５個、４個、３個、２個、またはそれより少ないミスマッチ（標的ＲＮＡに関して）を含むことが可能である。特にアンチセンス鎖におけるミスマッチは、末端領域において最も寛容性が高く、存在する場合、好ましくは末端領域において、例えば、５’末端および／または３’末端の６ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、または３ヌクレオチド以内である。センス鎖は、該分子の二本鎖全体の性質を維持するために十分なだけのアンチセンス鎖との相補性があればよい。
【０２７２】
本明細書中の他の箇所で議論されるように、ｉＲＮＡ剤は、しばしば修飾されるかまたはリボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）に加えてヌクレオシド代用物を含む。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域は、しばしば、修飾されるかまたはヌクレオシド代用物を含み、例えば、ヘアピン構造の対合していない領域（例えば、２つの相補性領域をつなぐ領域）は、
修飾またはヌクレオシド代用物を有し得る。ｉＲＮＡ剤の１つ以上の３’末端もしくは５’末端を、例えば、エキソヌクレアーゼに対して安定化するための修飾、またはアンチセンスｓＲＮＡ剤をＲＩＳＣに優先的に入れるための修飾もまた、好ましい。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチド性スペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、無塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特殊なビオチン、あるいは、ホスホルアミダイトとして提供され、かつ別のＤＭＴ保護されたヒドロキシル基を有し、ＲＮＡ合成の際に複数のカップリングを可能にするフルオレセイン試薬を含むことが可能である。
【０２７３】
ｉＲＮＡ剤には以下のものが含まれる：インターフェロン応答を誘発するために十分に長い分子（これはダイサー（Ｄｉｃｅｒ、ベルンシュタインら（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、２００１．Ｎａｔｕｒｅ、４０９：３６３〜３６６）によって切断され、ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ誘導性サイレンシング複合体）に入る）；およびインターフェロン応答を誘発しないために十分に短い分子（この分子もまたＤｉｃｅｒによって切断されることが可能であり、かつ／またはＲＩＳＣに入る）、例えば、ＲＩＳＣに入ることを可能にするサイズである分子、例えば、Ｄｉｃｅｒ切断産物に類似する分子。インターフェロン応答を誘発しない十分に短い分子は、本明細書中では、ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤と呼ばれる。「ｓＲＮＡ剤または短いｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、ｉＲＮＡ剤、例えば、ヒト細胞において有害なインターフェロン応答を誘導しない十分に短い二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖ＲＮＡ剤をいい、例えば、同ＲＮＡ剤は、６０ヌクレオチド対未満、しかし好ましくは、５０、４０、または３０ヌクレオチド対未満の二本鎖領域を有する。このｓＲＮＡ剤またはその切断産物は、例えば、標的ＲＮＡ（好ましくは、内在性または病原性の標的ＲＮＡ）に関してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子をダウンレギュレートすることが可能である。
【０２７４】
ｓＲＮＡ剤の各々の鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド長以下であり得る。鎖は、好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド長である。例えば、各々の鎖は２１から２５の間のヌクレオチド長であり得る。好ましいｓＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二本鎖、および１つ以上の突出部、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’突出部を有する。
【０２７５】
標的ＲＮＡに対する相同性および標的遺伝子をダウンレギュレートする能力に加えて、ｉＲＮＡ剤は好ましくは以下の特性の１つ以上を有する：
（１）以下の「ＲＮＡ剤」の節において示される式１、２、３、または４のものである；
（２）一本鎖である場合、１つ以上のリン酸基または１つ以上のリン酸基アナログを含む５’修飾を有する；
（３）非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、正確な塩基対を形成可能であり、例えば標的ＲＮＡの切断によって標的のダウンレギュレーションを可能にするために十分な、相同な標的ＲＮＡとの二本鎖構造を形成することが可能なように、正しい三次元構造にある塩基（または修飾塩基）を提供することが可能なアンチセンス鎖を有する；
（４）非常に多数またはすべてのヌクレオシドが修飾されているにもかかわらず、なお「ＲＮＡ様の」特性を有する。すなわち、リボヌクレオチドに基づく含量では独占的でなく、または部分的でさえあるにも関わらす、ＲＮＡ分子の全体的な構造、化学的特性および物理的特性を有する。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば、すべてのヌクレオチド糖が２’ヒドロキシルの代わりに例えば２’フルオロを含むセンス鎖および／またはアンチセンス鎖を含むことが可能である。このデオキシリボヌクレオチド含有剤は、なおＲＮＡ様の特性を示すことが予測されうる。理論によって束縛されることを望まないが、電気的に陰性
のフッ素は、リボースのＣ２’位に結合されたときに軸方向に配向する傾向がある。このフッ素の空間的な優先傾向は、ひいては、糖のＣ３’内部にくぼみを形成させる。これは、ＲＮＡ分子中で観察されるのと同じくぼみ形成様式であり、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じる。さらに、フッ素は良好な水素結合のアクセプターであるので、ＲＮＡ構造を安定化させることが知られている水分子と同じ水素結合相互作用に関与することが可能である。一般的には、糖の２’位で修飾された部分は、デオキシリボヌクレオチドのＨ部分よりも、リボヌクレオチドのＯＨ部分により特徴的であるＨ結合に入ることができることが好ましい。好ましいｉＲＮＡ剤は：その糖の全体、またはその糖の少なくとも５０、７５、８０、８５、９０、または９５％において、Ｃ３’内部にくぼみを示し；ｉＲＮＡ剤の十分量の糖においてＣ３’内部のくぼみを示し、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型ヘリックスを生じることが可能であり；Ｃ３’内部のくぼみ構造ではない２０個、１０個、５個、４個、３個、２個、または１個以下の糖を有する。これらの制限はアンチセンス鎖において特に好ましい；
（５）修飾の性質にかかわらず、およびＲＮＡ剤が、特に突出部または他の一本鎖領域内にデオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含むことが可能であるとしても、ＤＮＡ分子、あるいは、分子中のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％より多く、または二本鎖領域のヌクレオチドの５０、６０、または７０％より多くがデオキシリボヌクレオチド、あるいは２’位がデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドである任意の分子は、ＲＮＡ剤の定義から除外することが好ましい。
【０２７６】
「一本鎖ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、単一の分子から作られているｉＲＮＡ剤である。これは、鎖内の対合によって形成される二本鎖領域を含んでもよく、例えば、該領域はヘアピン構造またはパン−ハンドル構造であってもよいし、これを含んでもよい。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。好ましい実施形態において、一本鎖ｉＲＮＡ剤は５’がリン酸化されるか、または５’プライム末端にホスホリルアナログを含む。５’リン酸修飾は、ＲＩＳＣが仲介する遺伝子サイレンシングと適合性であるものを含む。適切な修飾には以下が含まれる：５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２‐）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）。（これらの修飾はまた、二本鎖ｉＲＮＡのアンチセンス鎖とともに使用されることも可能である。）
一本鎖ｉＲＮＡ剤は、それがＲＩＳＣに入ることが可能であり、かつＲＩＳＣの仲介による標的ｍＲＮＡの切断に関与することが可能であるように、十分に長くあるべきである。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１４ヌクレオチド長、およびより好ましくは、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチド長である。一本鎖ｉＲＮＡ剤は好ましくは、２００、１００、または６０ヌクレオチド長未満である。
【０２７７】
ヘアピンｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。この二本鎖領域の長さは、好ましくは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対以下である。二本鎖領域の好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対長である。ヘアピンは、好ましくは、一本鎖突出部または末端（好ましくはヘアピンのアンチセンス側の好ましくは３’末端）の非対合領域を有する。好ましい突出部は２〜３ヌクレオチド長である。
【０２７８】
「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」は、本明細書中で使用される場合、鎖間のハイブリダイゼーションにより二本鎖構造を形成することが可能である、１本より多くの鎖、好ましくは２本の鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
【０２７９】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長であるべきである。これは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【０２８０】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド長であるべきである。これは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であるべきである。好ましい範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。
【０２８１】
二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド対長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または６０ヌクレオチド対長であるべきである。これは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対長以下であるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対長である。
【０２８２】
多くの実施形態において、ｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、内在性分子によって（例えば、Ｄｉｃｅｒによって）切断されてより小さなｄｓ  ｉＲＮＡ剤（例えば、ｓＲＮＡ剤）を生じることが可能であるように十分に大きい。
【０２８３】
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖およびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましい可能性がある。ある場合において、これらの鎖は同じ修飾または同じクラスの修飾を有するが、他の場合において、センス鎖およびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えば、ある場合において、センス鎖のみが修飾されることが望ましい。センス鎖のみを、例えばセンス鎖を不活性化するために修飾することが望ましい可能性があり、例えば、センス鎖は、センス鎖を不活性化し、かつ活性なｓＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を妨害するために修飾されることが可能である。これは、センス鎖の５’リン酸化を妨害する修飾によって、例えば、５’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを用いる修飾によって達成されることが可能である（ニーケネンら（Ｎｙｋａｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、（２００１）「ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. 」Ｃｅｌｌ  １０７、３０９〜３２１を参照のこと）。例えば、単に５’ＯＨをＯ−ＭｅではなくＨによって置換する、リン酸化を妨害する他の修飾もまた使用可能である。代替例として、大きなかさ高い基が５’リン酸基に付加され、これがホスホジエステル結合に転換されてもよいが、これは、ホスホジエステラーゼがこのような結
合を切断し、かつ機能的ｓＲＮＡ５’末端を遊離することが可能であるので、より望ましくない可能性がある。アンチセンス鎖修飾は、５’リン酸化ならびに本明細書中で議論される他の５’修飾のいずれか、特に単鎖ｉＲＮＡ分子に関する節において上記に議論された５’修飾を含む。
【０２８４】
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤が分子の一方または両方の末端で一本鎖領域または不対合領域を含むように、センス鎖およびアンチセンス鎖が選択されることが好ましい。したがって、ｄｓ
ｉＲＮＡ剤は、好ましくは突出部（例えば、１つまたは２つの５’または３’突出部であるが好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出）を含むように対合したセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。多くの実施形態は３’突出部を有する。好ましいｓＲＮＡ剤は一本鎖突出部、好ましくは、各々の末端に１ヌクレオチド長または好ましくは２もしくは３ヌクレオチド長の３’突出部を有する。この突出部は、ある鎖が他の鎖よりも長い結果であってもよいし、または、ずれを有する同じ長さの２つの鎖の結果であってもよい。５’末端は好ましくはリン酸化される。
【０２８５】
二本鎖領域についての好ましい長さは、例えば、上記に議論したｓＲＮＡ剤の範囲において、１５から３０の間のヌクレオチド長、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓＲＮＡ剤は、長さおよび構造が、長いｄｓＲＮＡからの天然のＤｉｃｅｒ処理産物に類似する可能性がある。ｓＲＮＡ剤の２つの鎖が結合される（例えば、共有結合される）実施形態もまた含まれる。ヘアピン、または必要とされる二本鎖領域を提供する他の一本鎖構造物、および好ましくは３’突出部もまた、本発明の範囲内にある。
【０２８６】
ｄｓ  ｉＲＮＡ剤およびｓＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載される単離ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを仲介することが可能である。便宜上、このようなｍＲＮＡは、本明細書中ではサイレンシングされるｍＲＮＡとも呼ばれる。このような遺伝子はまた、標的遺伝子ともいわれる。一般的に、サイレンシングされるＲＮＡは内在性遺伝子または病原体遺伝子である。さらに、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡおよびウイルスＲＮＡを標的とすることも可能である。
【０２８７】
本明細書中で使用される場合、語句「ＲＮＡｉを仲介する」とは、配列特異的な様式で、標的ＲＮＡをサイレンシングする能力をいう。理論によって束縛されることを望まないが、サイレンシングは、ＲＮＡｉの機構またはプロセスおよびガイドＲＮＡ（例えば、２１〜２３ヌクレオチドのｓＲＮＡ剤）を使用すると考えられる。
【０２８８】
本明細書中で使用される場合、「特異的にハイブリダイズ可能である」および「相補的」は、安定かつ特異的な結合が本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子の間に起こるような、十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。特異的結合は、特異的結合が望ましい条件下で、すなわち、インビボアッセイもしくは治療的処置の場合においては生理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合においてはそのアッセイが実行される条件下で、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、一般的には、少なくとも５ヌクレオチド異なる。
【０２８９】
１つの実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ（例えば、標的ｍＲＮＡ）に「十分に相補的」である。別の実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに対して「厳密に相補的」であり（ＲＲＭＳ含有サブユニットを除外する）、例えば、標的ＲＮＡおよびｉＲＮＡ剤は、好ましくは、厳密に相補的な領域におけるワトソン−クリック塩基対から独占的に構成されるハイブリッドを形成するようにアニールする。「十分に相補
的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに厳密に相補的である内部領域（例えば、少なくとも１０ヌクレオチドの領域）を含み得る。さらに、ある実施形態において、ｉＲＮＡ剤は、単一ヌクレオチドの違いを特異的に区別する。この場合において、ｉＲＮＡ剤は、厳密な相補性が単一ヌクレオチドの違いの領域（例えば、７ヌクレオチド以内の領域）において見出される場合のみにＲＮＡｉを仲介する。
【０２９０】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、好ましくは、１００、２００、３００、または４００未満の長さのヌクレオチドをいう。
【０２９１】
本明細書中で議論されるＲＮＡ剤は、その他の点では未修飾のＲＮＡ、ならびに、例えば、効力を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含む。未修飾のＲＮＡとは、核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在する、好ましくは人体において天然に存在するのと同じかまたは実質的に同じである分子をいう。当該分野では、修飾ＲＮＡのような、まれなまたは一般的でないが天然に存在するＲＮＡについて言及されており、例えば、リンバックら（Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、（１９９４）Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｆ  ＲＮＡ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２１８３〜２１９６を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡと呼ばれる（明らかに一般的には転写後修飾の結果によるからである）、このようなまれなまたは一般的でないＲＮＡは、本明細書中で使用される場合には用語「非修飾ＲＮＡ」の範囲内にある。修飾ＲＮＡは、本明細書中で使用される場合、１つ以上の核酸の成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸の部分が、天然に存在するものと異なる、好ましくは人体において存在するものと異なる分子をいう。これらは修飾「ＲＮＡ」と呼ばれるが、当然、修飾されているのでＲＮＡではない分子を含むことになる。ヌクレオシド代用物は、リボリン酸バックボーンが、塩基が正しい空間的関連において提示されることを可能にする非リボリン酸構築物で置き換えられている分子であり、その結果、ハイブリダイゼーションは、リボリン酸バックボーンの場合に見られるのと実質的に同様である（例えば、リボリン酸バックボーンの非荷電模倣物）。上記のすべての例が本明細書中で議論される。
【０２９２】
以下の議論の多くが一本鎖分子に言及するものである。本発明の多くの実施形態において、二本鎖ｉＲＮＡ剤（例えば、部分的に二本鎖のｉＲＮＡ剤）が必要とされるかまたは好ましい。したがって、以下に記載される一本鎖構造から作られる二本鎖構造（例えば、２つの別々の分子が接触して二本鎖領域を形成する場合、または二本鎖領域が分子内対合（例えば、ヘアピン構造）によって形成される場合）は本発明の範囲内に含まれることが理解される。好ましい長さは本明細書中の他の箇所に記載される。
【０２９３】
核酸は、サブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、以下に記載される修飾の多くが核酸内で反復される位置に存在する（例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾）。ある場合において、修飾は、核酸中の対象の位置のすべてに存在するが、しかし、多くの場合および実際上大部分においてはそうではない。例として、修飾は、３’または５’末端にのみ存在する可能性があり、末端領域（例えば、末端ヌクレオチドの位置または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド）にのみ存在する可能性がある。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方において存在する可能性がある。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域中にのみ存在する可能性もあるし、またはＲＮＡの一本鎖領域にのみ存在する可能性もある。例えば、非結合Ｏ位置のホスホロチオエート修飾が、一方の末端にのみもしくは両方の末端に存在してもよいし、末端領域（例えば、末端ヌクレオチド上の位置に、または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド）にのみ存在してもよいし、または二本鎖および一本鎖の領域、特に末端に存在することも可能である。５’末端（一方または両方）がリン酸化されることも可能であ
る。
【０２９４】
ある実施形態において、一本鎖突出部（例えば、５’もしくは３’突出部、もしくはその両方）において、例えば、安定性を増強すること、突出部に特定の塩基を含ませること、または修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが特に好ましい。例えば、突出部にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいことがあり得る。ある実施形態において、３’または５’の突出部における塩基のすべてまたはいくつかの塩基が、例えば、本明細書中に記載される修飾を用いて修飾される。修飾は、例えば、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりとしてのデオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシチミジン）の使用、およびリン酸基中での修飾（例えば、ホスホチオエート修飾）が含まれうる。突出部は、標的配列と相同である必要はない。
【０２９５】
修飾およびヌクレオチド代用物は以下に議論される。
【０２９６】
【化４４】
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【０２９７】
式１において上記に提示されるバックボーンはリボ核酸の部分を表す。基本成分はリボース糖、塩基、末端リン酸、およびヌクレオチド間リン酸リンカーである。塩基は天然に存在する塩基（例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシン）であり、糖は非修飾２’ヒドロキシルリボース糖（示されているとおり）、およびＷ、Ｘ、およびＺはすべてＯであり、式１は天然に存在する非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
【０２９８】
非修飾オリゴリボヌクレオチドは、ある適用においては最適には満たない可能性があり、例えば、非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解を受ける傾向があり得る。ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することが可能である。しかし、上記のＲＮＡ成分の１つ以上への化学修飾は改善された特性を付与することが可能であり、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安
定性にすることが可能である。未修飾のオリゴリボヌクレオチドはまた、ｉＲＮＡ剤にリガンドまたは他の部分を結合するためのつなぎ止め部分を提供するという観点で最適に満たない可能性がある。
【０２９９】
修飾核酸およびヌクレオチド代用物は、以下の１つ以上を含むことが可能である：
（ｉ）変化、例えば、非結合リン酸酸素（ＸおよびＹ）の一方もしくは両方の置換、および／または結合リン酸酸素（ＷおよびＺ）の１つ以上の置換（リン酸が末端位置にある場合、位置ＷまたはＺの１つは、天然に存在するリボ核酸中ではさらなるエレメントにリン酸を結合しない。しかし、用語の単純化のために、他に注記される場合以外は、核酸の５’末端のＷ位置および核酸の３’末端のＺ位置は、本明細書中で使用される用語「結合リン酸酸素」の範囲内にある）；
（ｉｉ）変化、例えば、リボース糖の構成成分（例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシル）の置換、またはリボース糖の、リボース以外の構造（例えば、本明細書中に記載されるようなもの）による大規模置換；
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の、「リンを含まない（ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ）」リンカーによる大規模置換；
（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース−リン酸バックボーン（括弧ＩＩ）の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または構成部分の結合（例えば、ＲＮＡの３’末端または５’末端のいずれかへの蛍光標識部分の結合）。
【０３００】
用語「置換」、「修飾」、「変化」などは、この文脈で使用される場合、何らかの工程の限定を意味するものではなく、例えば、修飾とは、標準のまたは天然に存在するリボ核酸を用いて開始しかつそれを修飾して修飾リボ核酸を作製しなくてはならないことを意味するものではなく、「修飾された」とは、単に天然に存在する分子との違いを意味する。
【０３０１】
当然のことであるが、ある化学的実体の実際の電子的構造を、たった１つの標準的な型（すなわち、ルイス構造）によって十分に表すことは可能ではない。理論によって束縛されることを望まないが、実際の構造は、その代わりに、共鳴型または共鳴構造として集合的に知られる、２つ以上の標準的な型のある混合物または加重平均であり得る。共鳴構造は、個別の化学的実体ではなく、紙の上でのみ存在する。これらは、特定の化学的実体についての結合電子および非結合電子の配置または「局在」においてのみ、互いに異なる。１つの共鳴構造が他よりもより高い程度でハイブリッドに寄与することが可能であり得る。したがって、本発明の実施形態について記載かつ図示される説明は、特定の種類の実体についての主要な共鳴型として当該分野で認識されているものに関してなされる。例えば、任意のホスホロアミデート（非結合酸素の窒素による置換）が、上記の図においてはＸ＝ＯおよびＹ＝Ｎによって表される。
【０３０２】
特定の修飾は以下により詳細に議論される。
リン酸基
リン酸基は負に荷電した基である。電荷は、２つの非結合酸素原子（すなわち、上記の式１のＸおよびＹ）にわたって均一に分布している。しかし、リン酸基は、１つの酸素を異なる置換基に置換することによって修飾することが可能である。ＲＮＡリン酸バックボーンへのこのような修飾の１つの結果は、ヌクレアーゼ分解に対するオリゴリボヌクレオチドの耐性の増加であり得る。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、ある態様において、荷電していないリンカー、または非対称型の電荷分布を有する荷電したリンカーのいずれかを生じる変化を導入することが望ましい可能性がある。
【０３０３】
修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェー
ト、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが含まれる。ホスホロジチオエートは、両方の非結合酸素が硫黄で置換されている。ＸまたはＹの１つのみが変化している状況と異なり、ホスホロジチオエートにおけるリン中心はアキラルであり、アキラルはオリゴリボヌクレオチドのジアステレオマーの形成を妨害する。ジアステレオマー形成により、個々のジアステレオマーがヌクレアーゼに対する種々の耐性を示す調製物を生じることが可能である。さらに、キラルリン酸基を含むＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する未修飾のＲＮＡ種と比較して低い可能性がある。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、キラル中心を除去するＸおよびＹの両方に対する修飾（例えば、ホスホロジチオエート形成）は、該修飾がジアステレオマー混合物を産生することが可能でないという意味で、望ましい可能性がある。したがって、Ｘは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のいずれか１つであり得る。したがって、Ｙは、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のいずれか１つであり得る。ＸおよびＹのうち少なくともいずれかの硫黄での置換が好ましい。
【０３０４】
リン酸リンカーが、結合している酸素（すなわち、式１におけるＷまたはＺ）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）での置換によって修飾されることも可能である。この置換は、末端の酸素（位置Ｗ（３’）または位置Ｚ（５’））で起こり得る。Ｗの炭素による置換またはＺの窒素による置換が好ましい。
【０３０５】
候補剤は、以下に記載されるような適合性について評価されることが可能である。
糖基
修飾ＤＮＡは、リボ核酸の糖基のすべてまたはいくつかの修飾を含むことが可能である。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換されることが可能である。理論によって束縛されるものではないが、ヒドロキシルがもはや脱プロトン化されて２’アルコキシドを形成することが可能でないので、安定性の増強が予測される。２’アルコキシドは、リンカーのリン原子上への分子内求核攻撃による分解を触媒することが可能である。再び、理論によって束縛されることを望まないが、２’位におけるアルコキシド形成が可能でない変化を導入することが、ある実施形態に対して望ましい可能性がある。
【０３０６】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には以下が含まれる：アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に接続されている「ロックト（固定化された）」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ、（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含むオリゴヌクレオチドが堅固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵しうるヌクレアーゼ安定性を示すことは注目すべきことである。
【０３０７】
「デオキシ」修飾には以下が含まれる：水素（すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的にｄｓのＲＮＡの突出部に特に関連する）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ
（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；およびアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニル（これらは場合により、例えば、アミノ官能基で置換されてもよい）。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロである。
【０３０８】
糖基は、リボース中の対応する炭素の立体化学的配置とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含むことも可能である。したがって、修飾ＲＮＡは、例えば、糖としてアラビノースを含むヌクレオチドを含むことが可能である。
【０３０９】
修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’に核酸塩基を欠く「無塩基」糖を含むことも可能である。これらの無塩基糖はまた、構成成分である糖の１つ以上の原子においてさらに修飾を含むことが可能である。
【０３１０】
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、上記２’修飾が、１つ以上のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用されることが可能である。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含むものである。
【０３１１】
修飾はまた、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の部位においてリボース構造の別の実体による大規模置換を伴い得る。これらの修飾は、ＲＲＭＳのためのリボース置換という表題の節において記載されている。
【０３１２】
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
リン酸基の置換
リン酸基は、リン酸以外のものを含む接続部によって置換されることが可能である（上記の式１中の括弧Ｉを参照のこと）。理論によって束縛されることを望まないが、荷電したホスホジエステル基はヌクレアーゼ分解における反応中心なので、この基を中性の構造模倣物で置換することは、ヌクレアーゼ安定性の増強を付与するはずであると考えられている。この場合も理論によって束縛されることを望まないが、ある態様において、荷電したリン酸基が中性部分によって置換される変化を導入することが望ましい可能性がある。
【０３１３】
リン酸基を置換することが可能である部分の例には以下が含まれる：シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノ。好ましい置換には、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基が含まれる。
【０３１４】
候補修飾は以下のように評価されることが可能である。
リボリン酸バックボーンの置換
リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性のヌクレオシドまたはヌクレオチドの代用物によって置換されるオリゴヌクレオチド模倣バックボーンを構築することも可能である（上記の式１の括弧ＩＩを参照のこと）。理論によって束縛されることを望まないが、反復して荷電したバックボーンが存在しなければ、ポリアニオンを認識するタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ）への結合が減少すると考えられている。再度、理論によ
って束縛されることを望まないが、ある態様において、塩基が中性の代用バックボーンによって連結される変化を導入することが望ましい可能性がある。
【０３１５】
例には、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などのヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物はＰＮＡ代用物である。
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
【０３１６】
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端が修飾されることが可能である。このような修飾は、分子の３’末端、５’末端、または両方の末端においてなされ得る。該修飾は、末端のリン酸全体または末端リン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含むことが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端が、他の機能的分子実体、例えば標識部分（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素などの蛍光団）または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルを含む基など）に複合体化することが可能である。前記機能的分子実体は、リン酸基および／またはスペーサーを介して糖に結合することが可能である。スペーサーの末端原子は、リン酸基の結合原子または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ、Ｎ、Ｓ、もしくはＣ基を接続または置換することが可能である。代替的には、スペーサーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子を接続または置換することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノなど、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含み得る。「スペーサー／リン酸‐機能的分子実体−スペーサーリン酸」という配列構造が、ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に介在するとき、この配列構造は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループの代わりに機能することが可能である。３’末端は−ＯＨ基であり得る。理論に束縛されることを望まないが、特定の部分の複合体化は、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性についての特性を改善することが可能であると考えられている。再度、理論に束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端の変化を導入することが望ましい可能性がある。末端修飾の他の例には、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）が含まれる。
【０３１７】
末端修飾は、本明細書中の他の箇所で議論される理由を含む多くの理由のために、活性を調節するために、または分解に対する耐性を調節するために、加えられることが可能である。活性を調節するために有用である末端修飾には、リン酸またはリン酸アナログによる５’末端の修飾が含まれる。例えば、好ましい態様において、ｉＲＮＡ剤、とりわけア
ンチセンス鎖は、５’リン酸化されてもよいし、または５’プライム末端にリン酸基アナログを含んでもよい。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ介在性の遺伝子サイレンシングと適合可能であるものが含まれる。適切な修飾には以下が含まれる：５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’）。
【０３１８】
末端修飾はまた、分布をモニターするためにも有用でありうるが、このような場合において、付加される好ましい基には、蛍光団（例えば、フルオレセイン）またはＡｌｅｘａ色素（例えば、Ａｌｅｘａ  ４８８）が含まれる。末端修飾はまた、取り込みを増強するために有用でありうるが、このために有用な修飾にはコレステロールが含まれる。末端修飾はまた、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋するために有用でありうるが、このための有用な修飾にはマイトマイシンＣが含まれる。
【０３１９】
候補修飾は、以下に記載されるように評価されることが可能である。
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルはＲＮＡにおいて見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換されることが可能である。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、これらの塩基を用いて、または合成もしくは天然の核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（ｎｕｂｕｌａｒｉｎｅ）、イソグアニシン（ｉｓｏｇｕａｎｉｓｉｎｅ）、またはツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ））および上記の修飾のいずれか１つを用いて調製されることが可能である。代替的には、上記のうち任意の塩基の置換アナログまたは修飾アナログ、例えば、本明細書に記載の「一般的でない塩基」および「普遍的な塩基」が利用されることも可能である。例としては、非限定的に以下が含まれる：２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６，
Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基。さらなるプリンおよびピリミジンは、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ
Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、クロシュビッツ  ジェー  アイ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ  Ｊ．Ｉ．）編、Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されるもの、およびイングリッシュら（Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０巻、ｐ．６１３によって開示されるものが含まれる。
【０３２０】
一般的には、塩基の変化は、安定性を促進するためには好ましくないが、他の理由のために有用である可能性がある。例えば、いくつかの２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリンは蛍光性である。修飾塩基により標的特異性が減少する可能がある。このことは、ｉＲＮＡ剤の設計において考慮されるべきである。
【０３２１】
候補修飾は以下に記載されるように評価されることが可能である。
候補ＲＮＡの評価
候補ＲＮＡ剤（例えば、修飾ＲＮＡ）を、そのＲＮＡ剤または修飾分子および対照分子を適切な条件に曝露すること、ならびに選択された特性の存在について評価することによって、選択された特性について評価することが可能である。例えば、分解剤に対する耐性は以下のようにして評価されることが可能である。候補修飾ＲＮＡ（および好ましくは対照分子、通常は非修飾型）は、分解的な条件、例えば、分解剤（例えば、ヌクレアーゼ）を含む環境に曝露されることが可能である。例えば、生物学的試料を使用することが可能であり、該試料は、例えば、治療的使用、例えば、血液または細胞画分（例えば、無細胞ホモジネートまたは破砕された細胞）において遭遇しうる環境と類似の生物学的試料である。次いで、候補および対照を、多数のアプローチのいずれかによって、分解に対する耐性について評価することが可能である。例えば、候補および対照を、例えば、放射性標識もしくは酵素標識または蛍光標識（例えば、Ｃｙ３もしくはＣｙ５など）を用いて、好ましくは、曝露の前に標識することが可能である。対照ＲＮＡおよび修飾されたＲＮＡを、分解剤、および場合によっては対照（例えば、不活化された（例えば、熱不活化された）分解剤）とともにインキュベートすることが可能である。次いで、物理学的パラメータ（例えば、修飾分子および対照分子のサイズ）を決定する。これらは、物理学的方法によって（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイズ分画カラムによって）、その分子がその元々の長さを維持していたかを評価するために決定してもよいし、または機能的に評価することも可能である。代替的には、ノーザンブロット分析を使用して、未標識の修飾分子の長さをアッセイすることが可能である。
【０３２２】
機能的アッセイもまた、候補剤を評価するために使用することが可能である。機能的アッセイは、修飾が、遺伝子発現をサイレンシングする分子の能力を変化させるか否かを決定するために、最初に、または初期の非機能的アッセイ（例えば、分解に対する耐性についてのアッセイ）の後で適用することが可能である。例えば、細胞（例えば、マウスまたはヒトの細胞などの哺乳動物細胞）を、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）を発現するプラスミドおよびその蛍光タンパク質をコードする転写物に相同である候補ＲＮＡ剤で同時
トランスフェクトすることが可能である（例えば、国際公開公報第００／４４９１４号パンフレットを参照されたい）。例えば、ＧＦＰ  ｍＲＮＡに相同である修飾ｄｓＲＮＡは、トランスフェクションに候補ｄｓＲＮＡを含めなかった対照細胞（例えば、ＲＮＡ剤を加えられなかった対照、および／または非修飾ＲＮＡを加えられなかった対照）と比較して、細胞の蛍光の減少についてモニターすることによって、ＧＦＰ発現を阻害する能力についてアッセイすることが可能である。遺伝子発現に対する候補剤の効力は、修飾ｄｓＲＮＡ剤および非修飾ｄｓＲＮＡ剤の存在下での細胞の蛍光を比較することによって評価可能である。
【０３２３】
代替的な機能的アッセイにおいて、内在性マウス遺伝子（好ましくは、ｃ−ｍｏｓなどの母方で発現される遺伝子）に相同な候補ｄｓＲＮＡ剤が、インビボで遺伝子発現を阻害するＲＮＡ剤の能力を評価するために、未成熟のマウス卵母細胞に注入されてもよい（例えば、国際公開公報第０１／３６６４６号パンフレットを参照されたい）。卵母細胞の表現型（例えば、中期ＩＩにおける停止を維持する能力）を、ＲＮＡ剤が発現を阻害する指標としてモニター可能である。例えば、ｄｓＲＮＡ剤によるｃ−ｍｏｓ  ｍＲＮＡの切断は、卵母細胞が中期における停止を抜け出て単為生殖的発生を開始することを引き起こす（カレッジら（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：６５〜６８、１９９４；ハシモトら（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：６８〜７１、１９９４）。標的ＲＮＡレベルに対する修飾ＲＮＡ剤の効果は、陰性対照と比較して、標的ｍＲＮＡのレベルの減少についてアッセイするためのノーザンブロットによって、または標的タンパク質のレベルの減少についてアッセイするためのウエスタンブロット分析によって確認可能である。対照は、ＲＮＡ剤が添加されない細胞、および／または非修飾ＲＮＡが添加される細胞を含むことが可能である。
【０３２４】
参考文献
一般的参考文献
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成を用いて可能であり、例えば、以下を参照されたい：「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、エム
ジェー  ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８４；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」エフ  エックスタイン（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１（とりわけ、第１章「Ｍｏｄｅｒｎ  ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２章「Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第３章「２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第４章「Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、第５章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ」、第６章「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏ−２’−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ」、および第７章「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｓｅｓ」）。他の特に有用な合成手順、試薬、ブロッキング基、および反応条件は、マーティン  ピー（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．１９９５、７８、４８６〜５０４；ボカジュ  エス  エル（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）およびアイヤル  アール  ピー（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９２、４８、２２２３〜２３１１ならびにボカジュ  エス  エル（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．）およびアイヤル  アール  ピー（Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９３、４９、６１２３〜６１９４、またはそこに引用される参考文献に記載されている。
【０３２５】
国際公開公報第００／４４８９５号パンフレット、国際公開公報第０１／７５１６４号パンフレット、または国際公開公報第０２／４４３２１号パンフレットに記載される修飾は、本明細書中で使用されることが可能である。
【０３２６】
本明細書中で列挙されるすべての刊行物、特許、および公開特許出願の開示は、本願明細書に援用される。
リン酸基の参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，５０８，２７０号に記載される。アルキルホスホン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第４，４６９，８６３号に記載される。ホスホルアミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，２５６，７７５号または米国特許第５，３６６，８７８号に記載される。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，０２３，２４３号に記載される。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１３０，３０２号および米国特許第５，１７７，１９８号に記載される。３’−デオキシ−３’−アミノホスホルアミデートリボオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第５，４７６，９２５号に記載されている。３’−デオキシ３’−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、アン（Ａｎ），Ｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１、６６、２７８９〜２８０１に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、スプロートら（Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ
ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９８８、７、６５１およびクロスティックら（Ｃｒｏｓｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８９、３０、４６９３に記載されている。
【０３２７】
糖基の参考文献
２’修飾に対する改変は、フェルマ（Ｖｅｒｍａ），Ｓ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８、６７、９９〜１３４および同文献内のすべての参考文献において見出されることが可能である。リボースに対する特異的修飾は以下の参考文献において見出されることが可能である：２’−フルオロ（カワサキら（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９３、３６、８３１〜８４１）、２’−ＭＯＥ（マーティン  ピー（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９６、７９、１９３０〜１９３８）、「ＬＮＡ」（ウェンゲル（Ｗｅｎｇｅｌ）、Ｊ．Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９、３２、３０１〜３１０）。
【０３２８】
リン酸基の置換に関する参考文献
メチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書中では、ＭＭＩ結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド（本明細書中では、ＭＤＨ結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（本明細書中では、アミド−３結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（本明細書中では、アミド−４結合オリゴリボヌクレオシドとしても同定される）、ならびに混合バックボーン化合物（例えば、交互にＭＭＩおよびＰＯまたはＰＳ結合を有する）は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号、ならびに公開されたＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号およびＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（それぞれ、国際公開公報第９２／２０８２２号および国際公開公報第９２／２０８２３号パンフレットとして公開されている）に記載されるように調製されることが可能である。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および米国特許第５，２６４，５６４号に記載されるように調製されることが可能である。エチレンオキサイド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号に記載されるように調製されることが可能である。シロキサン置換については、コーミア  ジェー  エフら（Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ
．１９８８、１６、４５８３に記載されている。カーボネート置換は、ティテンサー  ジェー  アール（Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ１９７１、１９３３に記載されている。カルボキシメチル置換は、エッジ  エム  ディーら（Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１  １９７２、１９９１に記載されている。カルバメート置換は、スターチャク  イー  ピー（Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８９、１７、６１２９に記載されている。
【０３２９】
リン酸−リボースバックボーンの置換に関する参考文献
糖代用品のシクロブチル化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号に記載されるように調製されることが可能である。ピロリジン糖代用物は、米国特許第５，５１９，１３４号に記載されるように調製されることが可能である。モルホリノ糖代用物は、米国特許第５，１４２，０４７号および米国特許第５，２３５，０３３号、ならびに他の関連する特許の開示に記載されるように調製されることが可能である。ペプチド核酸（ＰＮＡ）はそれ自体公知であり、「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、４、５〜２３において引用される種々の手順のいずれかに従って調製されることが可能である。これらはまた、米国特許第５，５３９，０８３号に従って調製されることが可能である。
【０３３０】
末端修飾の文献
末端修飾は、マノハラン  エムら（Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２、１０３〜１２８（２００２）および同文献中の引用文献に記載されている。
【０３３１】
塩基の参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号に記載されるように調製されることが可能である。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号に記載されるように調製されることが可能である。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号に記載されるように調製されることが可能である。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号に記載されるように調製されることが可能である。さらなる参考文献は、塩基修飾についての上記の節に開示されることが可能である。
【０３３２】
好ましいｉＲＮＡ剤
好ましいＲＮＡ剤は以下の構造を有する（以下の式２を参照のこと）：
【０３３３】
【化４５】
2007525454.tif 000048
【０３３４】
上記の式２について、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデ
ニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基である。
【０３３５】
Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；シアノ；メルカプト；ＳＲ８；アルキル−チオ−アルキル；アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらの各々は、場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイドで置換されてもよい）であるか；または、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｒ７と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
【０３３６】
Ａ１は
【０３３７】
【化４６】
2007525454.tif 000049
【０３３８】
；Ｈ；ＯＨ；ＯＣＨ３；Ｗ１；脱塩基ヌクレオチドであるか；または存在せず、
（好ましいＡ１は、とりわけアンチセンス鎖に関して、以下の：５’一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’一チオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオール酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）
；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば、５’−α−チオ三リン酸、５’−γ−チオ三リン酸など）、５’−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホスホン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２）、５’−アルキルエーテルホスホン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）から選択される）。
【０３３９】
Ａ２は
【０３４０】
【化４７】
2007525454.tif 000050
【０３４１】
であり、Ａ３は
【０３４２】
【化４８】
2007525454.tif 000051
【０３４３】
であり；かつＡ４は
【０３４４】
【化４９】
2007525454.tif 000052
【０３４５】
；Ｈ；Ｚ４；逆向きのヌクレオチド；脱塩基ヌクレオチドであるか；または存在しない。
Ｗ１は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−Ｒ１０、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０、または−Ｏ−である。Ｗ４は、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳである。
【０３４６】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、およびＸ４は、各々独立して、ＯまたはＳである。
Ｙ１、Ｙ２、Ｙ３、およびＹ４は、各々独立して、ＯＨ、Ｏ−、ＯＲ８、Ｓ、Ｓｅ、ＢＨ３−、Ｈ、ＮＨＲ９、Ｎ（Ｒ９）２、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、アリール、またはヘテロアリールであり、これらの各々が場合によっては置換されてもよい。
【０３４７】
Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３は、各々独立して、Ｏ、ＣＨ２、ＮＨ、またはＳである。Ｚ４は、ＯＨ、（ＣＨ２）ｎＲ１０、（ＣＨ２）ｎＮＨＲ１０、（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＳＳ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣ（Ｏ）ＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、ＮＨ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０；Ｓ（ＣＨ２）ｎＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＮＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＯＲ１０、Ｓ（ＣＨ２）ｎＳＲ１０Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ１０；Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨＲ１０；Ｑ−Ｒ１０、Ｏ−Ｑ−Ｒ１０、Ｎ−Ｑ−Ｒ１０、Ｓ−Ｑ−Ｒ１０である。
【０３４８】
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００である。
Ｒ７はＨであるか、またはＲ４、Ｒ５、またはＲ６と一緒に組み合わさって糖の２’炭
素と４’炭素の間に［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
【０３４９】
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸、または糖であり；Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり；およびＲ１０はＨ；蛍光団（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）；硫黄、ケイ素、ホウ素、もしくはエステルの保護基；インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ；アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール；放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）；またはＲＮＡ剤である。ｍは０〜１，０００，０００であり、かつｎは０〜２０である。Ｑは、脱塩基性の糖（ａｂａｓｉｃ  ｓｕｇａｒ）、アミド、カルボキシ、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミドもしくはモルホリノ、ビオチン、またはフルオレセイン試薬からなる群より選択されるスペーサーである。
【０３５０】
リン酸基全体が置換されている好ましいＲＮＡ剤は以下の構造を有する（以下の式３を参照のこと）：
【０３５１】
【化５０】
2007525454.tif 000053
【０３５２】
式３について、Ａ１０−Ａ４０はＬ−Ｇ−Ｌであり；Ａ１０およびＡ４０のうち少なくともいずれかは存在しなくてもよい。ここでＬはリンカーであり、一方または両方のＬは存在していても存在していなくてもよく、かつＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇからなる群より選択される。Ｇは、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノからなる群より選択される官能基である。
【０３５３】
Ｒ１０、Ｒ２０、およびＲ３０は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニル
ウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基である。
【０３５４】
Ｒ４０、Ｒ５０、およびＲ６０は、各々独立して、ＯＲ８、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＯＲ８；Ｏ（ＣＨ２）ｎＲ９；Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＲ９、Ｈ；ハロ；ＮＨ２；ＮＨＲ８；Ｎ（Ｒ８）２；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｍＣＨ２ＣＨ２Ｒ９；ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ８；；シアノ；メルカプト；ＳＲ７；アルキル−チオ−アルキル；アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケニル、アルキニル（これらの各々は、場合により、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイド基で置換されてもよい）であり；または、Ｒ４０、Ｒ５０、およびＲ６０は、Ｒ７０と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
【０３５５】
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００である。
Ｒ７０はＨであるか、またはＲ４０、Ｒ５０、またはＲ６０と一緒に組み合わさって、糖の２’炭素と４’炭素の間の［−Ｏ−ＣＨ２−］共有結合架橋を形成する。
【０３５６】
Ｒ８は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アミノ酸、または糖であり；Ｒ９は、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸である、ｍは０〜１，０００，０００であり、ｎは０〜２０であり、かつｇは０〜２である。
【０３５７】
好ましいヌクレオシド代用物は以下の構造を有する（以下の式４を参照のこと）：
【０３５８】
【化５１】
2007525454.tif 000054
【０３５９】
Ｓは、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸からなる群より選
択される。Ｌはリンカーであり、かつＣＨ２（ＣＨ２）ｇ；Ｎ（ＣＨ２）ｇ；Ｏ（ＣＨ２）ｇ；Ｓ（ＣＨ２）ｇ；−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−からなる群より選択されるか、または存在していなくてもよい。Ｍは、アミド結合；スルホンアミド；スルフィン酸；リン酸基；本明細書中に記載されるような修飾リン酸基であるか；または存在していなくてもよい。
【０３６０】
Ｒ１００、Ｒ２００、およびＲ３００は、各々独立して、Ｈ（すなわち、脱塩基ヌクレオチド）、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよび５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２，Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、７−デアザグアニン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基である。
【０３６１】
ｘは、本明細書中に記載されるＲＮＡ剤の長さを満足するように選択され、５〜１００であり；ｇは０〜２である。
ヌクレアーゼ耐性モノマー
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤であって、本明細書に記載されるような、さらに同時係属中の共同所有される２００３年５月９日に申請された米国仮特許出願第６０／４６９，６１２号および国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（いずれも本願に援用する）に記載されるようなヌクレアーゼ耐性モノマー（ＮＲＭ）が組み込まれたＲＮＡを調製するために、本明細書に記載のモノマーまたは方法を使用することが可能である。
【０３６２】
ｉＲＮＡ剤は、例えば、対象の体内に見られるヌクレアーゼ（例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解を阻害するように修飾されたモノマーを含みうる。これらのモノマーをここではＮＲＭ、またはヌクレアーゼ耐性促進モノマーもしくはヌクレアーゼ耐性促進修飾体と称する。多くの場合、これらの修飾は、ｉＲＮＡ剤の他の特性、例えばタンパク質（例えば輸送タンパク質（例えば血清アルブミン））もしくはＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレシング複合体）の構成メンバーと相互作用する能力、または最初の配列と２番目の配列が相互に二本鎖を形成もしくは別の配列、例えば標的分子と二本鎖を形成する能力という特性も同様に調節する。
【０３６３】
理論に縛られることは望まないが、ｉＲＮＡ剤の糖、塩基および／またはリン酸バック
ボーンの修飾体は、エンドヌクレアーゼ耐性およびエキソヌクレアーゼ耐性を増強し、さらに輸送タンパク質およびＲＩＳＣ複合体の１つまたは複数の機能的要素との相互作用を亢進すると考えられる。好ましい修飾体は、エキソヌクレアーゼ耐性およびエンドヌクレアーゼ耐性を高め、したがって、ＲＩＳＣ複合体と相互作用する前のｉＲＮＡ剤の半減期を延長するが、同時に、ＲＩＳＣ複合体におけるエンドヌクレアーゼの活性に対してはｉＲＮＡ剤を耐性にしない修飾体である。繰り返すが、いかなる理論にも縛られることは望まないが、上記修飾をアンチセンス鎖の３’末端および／もしくは５’末端またはこれらの近くに配置することにより、上記に描写される好ましいヌクレアーゼ耐性の基準を満たすｉＲＮＡ剤が生じると考えられる。やはり繰り返すが、いかなる理論にも縛られることは望まないが、修飾を、例えばセンス鎖の中央に配置することにより、オフターゲットの可能性が比較的低いｉＲＮＡ剤が作製可能と考えられる。
【０３６４】
本明細書に記載の修飾を、例えばｉＲＮＡ剤などの、本明細書に記載の任意の二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子へ組み込むことが可能である。ｉＲＮＡ剤はハイブリッド形成したセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことができ、この場合アンチセンス鎖および／またはセンス鎖は、本明細書に記載される１つまたは複数の修飾を含むことが可能である。アンチセンス鎖は、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／または鎖のいずれかの末端から１〜６ヌクレオチド、例えば１〜５、１〜４、１〜３、１〜２ヌクレオチドにある１つもしくは複数の位置に修飾を含むことが可能である。センス鎖は、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／または鎖の両末端の間にある介入位置のいずれか１つに修飾を含むことが可能である。また、ｉＲＮＡ剤は、ハイブリッド形成した２つのアンチセンス鎖からなる二本鎖を含むことが可能である。第１および／または第２のアンチセンス鎖は、本明細書に記載の１つまたは複数の修飾を含むことが可能である。したがって、１つおよび／または両方のアンチセンス鎖は、３’末端および／もしくは５’末端、ならびに／または鎖のいずれかの末端から１〜６ヌクレオチド、例えば１〜５、１〜４、１〜３、１〜２ヌクレオチドにある１つもしくは複数の位置に修飾を含むことが可能である。以降に特定の構造について述べる。
【０３６５】
上記により描写される好ましいヌクレアーゼ耐性の基準を満たすｉＲＮＡ剤を作製するために有用と考えられる修飾は、以下に記すような、糖、塩基および／またはリン酸バックボーンについての１つまたは複数の化学的および／または立体化学的修飾を含むことが可能である：
（ｉ）キラル（ＳＰ）チオエート。したがって、好ましいＮＲＭは、通常は酸素によって占められる非架橋位置、例えば位置ＸのＳｐまたはＲｐにヘテロ原子を含む特定のキラル型の修飾リン酸基について富化された、または前記修飾リン酸基について純粋なヌクレオチド二量体を含む。また、Ｘの原子にはＳ、Ｓｅ、Ｎｒ２またはＢｒ３が考えられる。ＸがＳならば、富化された、またはキラル型について純粋なＳｐとの結合が好ましい。富化とは好ましい型が少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％であることを意味する。そのようなＮＲＭについては以下により詳細に記載する；
（ｉｉ）糖、塩基および／またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バックボーン部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合。したがって、好ましいＮＲＭは、末端にカチオン基で誘導体化されたモノマーを含む。アンチセンス配列の５’末端は、末端−ＯＨまたはリン酸基を有する必要があるので、前記のＮＲＭは、アンチセンス配列の５’末端では使用されないことが好ましい。このカチオン基は、水素結合形成およびハイブリッド形成との干渉を最少化する塩基上の位置、例えばもう一方の鎖の相補的塩基と相互作用する面から離れた位置（例えばピリミジンの５’位またはプリンの７位）で結合しなければならない。これらについては以下により詳細に述べる；
（ｉｉｉ）末端での非リン酸結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば切断に対する耐性がリン酸結合よりも大きくなる４原子の結合などの、非リン酸結合を含む。例として、３’ＣＨ２−ＮＣＨ３−Ｏ−ＣＨ２−５’および３’ＣＨ２−ＮＨ−（Ｏ＝）−ＣＨ
２−５’が挙げられる。
【０３６６】
（ｉｖ）３’架橋チオリン酸塩および５’架橋チオリン酸塩。したがって、好ましいＮＲＭは前記の構造を含むことが可能である。
（ｖ）Ｌ−ＲＮＡ、２’−５’結合、逆向きの結合、α−ヌクレオシド。したがって、他の好ましいＮＲＭに含まれるものは、ＬヌクレオシドおよびＬ−ヌクレオシド由来のヌクレオチド二量体；２’−５’リン酸塩、非リン酸塩および修飾リン酸塩の結合、例えばチオリン酸塩、ホスホルアミデートおよびホウ素化リン酸塩；逆向きの結合、例えば３’−３’または５’−５’結合を有する二量体；糖の１’位にα結合を有するモノマー、例えば本明細書に記載のα結合を有する構造が挙げられる；
（ｖｉ）結合基。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば標的結合部分、または、例えば糖、塩基もしくはバックボーンを通してモノマーと結合する、本明細書に記載の結合リガンドを含むことが可能である。
【０３６７】
（ｖｉ）脱塩基結合。したがって、好ましいＮＲＭは、例えば本明細書に記載されるような脱塩基モノマー（例えば核酸塩基のないモノマー）、本明細書に記載されるような芳香族モノマーもしくは複素環式モノマー、または多複素環式芳香族モノマーを含むことが可能である；
（ｖｉｉ）５’−ホスホネートおよび５’−ホスフェート型プロドラッグ。したがって、好ましいＮＲＭは、好ましくは末端部位（例えば５’位）に、リン酸基の１つまたは複数の原子が保護基により誘導体化されているモノマーを含み、この１つまたは複数の保護基は、対象の体内成分、例えばカルボキシエステラーゼまたは対象の体内に存在する酵素の作用により除去される。例えば、カルボキシエステラーゼが保護分子を切断する結果チオエートアニオンが生じ、チオエートアニオンがリン酸塩のＯに隣接する炭素を攻撃する結果として保護されていないリン酸塩が生じるリン酸プロドラッグ。
【０３６８】
１つまたは複数の異なるＮＲＭ修飾をｉＲＮＡ剤またはｉＲＮＡ剤の配列中に導入することが可能である。ＮＲＭ修飾は、配列またはｉＲＮＡ剤に２回以上使用することが可能である。一部のＮＲＭはハイブリッド形成を妨げるので、取り込む総数は、許容可能なレベルのｉＲＮＡ剤の二本鎖形成が維持されるものでなければならない。
【０３６９】
一部の実施形態において、ＮＲＭ修飾は、対象の所望の配列または遺伝子を標的としない配列（センス鎖またはセンス配列）の末端切断部位または切断領域へ導入される。このことによりオフターゲットによるサイレンシングを低減しうる。
【０３７０】
キラルＳＰチオエート
修飾は、１つもしくは両方の非結合（ＸおよびＹ）リン酸酸素および／または１つもしくは複数の結合（ＷおよびＺ）リン酸酸素の変更（例えば置換）を含みうる。下記の式Ｘは２つの糖／糖代用物‐塩基部分（ＳＢ１およびＳＢ２）が結合しているリン酸塩部分を表す。
【０３７１】
【化５２】
2007525454.tif 000055
【０３７２】
特定の実施形態において、リン酸バックボーン部分の非結合リン酸酸素（ＸおよびＹ）の１つは次のいずれか１つ：Ｓ、Ｓｅ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリールなど）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基など）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは水素、アルキル、アリールなど）、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）と置換可能である。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかし、非結合酸素の１つを上記の原子または原子群の１つと置換することにより、リン原子がキラル化される。いいかえれば、このように修飾されたリン酸基内のリン酸原子は立体中心である。立体中心のリン原子は「Ｒ」配置（ここではＲＰ）または「Ｓ」配置（ここではＳＰ）を有することが可能である。したがって、立体中心のリン原子の６０％がＲＰ配置を有するとき、残る４０％の立体中心のリン原子はＳＰ配置を有することになる。
【０３７３】
一部の実施形態において、リン酸非結合酸素が他の原子または原子群で置換されているリン酸基を有するｉＲＮＡ剤は、立体中心の原子の少なくとも約５０％（例えば立体中心の原子の少なくとも約６０％、同原子の少なくとも約７０％、同原子の少なくとも約８０％、同原子の少なくとも約９０％、同原子の少なくとも約９５％、同原子の少なくとも約９８％、同原子の少なくとも約９９％）がＳＰ配置を有する立体中心リン原子の集団を含むことが可能である。あるいは、リン酸非結合酸素が他の原子または原子群で置換されているリン酸基を有するｉＲＮＡ剤は、立体中心の原子の少なくとも約５０％（例えば立体中心の原子の少なくとも約６０％、同原子の少なくとも約７０％、同原子の少なくとも約８０％、同原子の少なくとも約９０％、同原子の少なくとも約９５％、同原子の少なくとも約９８％、同原子の少なくとも約９９％）がＲＰ配置を有する立体中心リン原子の集団を含むことが可能である。他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がＳＰ配置を有し、かつＲＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。さらに他の実施形態において、立体中心リン原子の集団がＲＰ配置を有し、かつＳＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。本明細書では、「ＲＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という語句は、ＲＰ配置を有する立体中心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法（キラルＨＰＬＣ、キラルシフト試薬を使用した１Ｈ  ＮＭＲ分析など）により検出できないことを意味する。本明細書では、「ＳＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まない」という語句は、ＳＰ配置を有する立体中心リン原子を含む部分が当技術分野で公知の従来の方法（キラルＨＰＬＣ、キラルシフト試薬を使用した１Ｈ  ＮＭＲ分析など）により検出できないことを意味する。
【０３７４】
好ましい実施形態において、修飾ｉＲＮＡ剤はホスホロチオエート基、すなわちリン酸の非結合酸素がイオウ原子と置換されているリン酸基を含む。特に好ましい実施形態にお
いて、ホスホロチオエートの立体中心リン原子の集団はＳＰ配置を有し、かつＲＰ配置を有する立体中心リン原子を実質的に含まないことが可能である。
【０３７５】
ホスホロチオエートを、二量体（例えば式Ｘ−１および式Ｘ−２）：
【０３７６】
【化５３】
2007525454.tif 000056
【０３７７】
を使用してｉＲＮＡ剤に組み込むことが可能である。前者は、鎖の３’末端にホスホロチオエートを導入するために使用することができ、後者は鎖の５’末端または例えばいずれかの末端から１、２、３、４、５または６つ目のヌクレオチドの位置に修飾を導入するために使用する。上記の式で、Ｙは２−シアノエトキシでよく、ＷおよびＺはＯでよく、Ｒ２’は、例えば糖にＣ−３末端構造を付与しうる置換基、例えばＯＨ、Ｆ、ＯＣＨ３でよく、ＤＭＴはジメトキシトリチルであり、「塩基」は天然の塩基でも、通常でない塩基でも、または普遍的な塩基でもよい。
【０３７８】
Ｘ−１およびＸ−２は、キラル試薬を使用して、または基本的にＲＰ配置だけを有する（すなわち、実質的にＳＰ配置を含まない）もしくはＳＰ配置だけを有する（すなわち、実質的にＲＰ配置を含まない）立体中心リン原子の集団を有するホスホロチオエート含有二量体を生じさせることが可能な配位性制御基を使用して調製可能である。あるいは、二量体が、約５０％がＲＰ配置を有し、原子の約５０％がＳＰ配置を有する立体中心リン原子の集団を有するように調整することが可能である。ＲＰ配置の立体中心リン原子を有する二量体を特定し、例えば酵素的分解および／または通常のクロマトグラフィ法を使用してＳＰ配置の立体中心リン構造を有する二量体から分離することが可能である。
【０３７９】
カチオン基
また、修飾は、糖、塩基および／またはリン酸バックボーン部分もしくは修飾リン酸バ
ックボーン部分のリン原子への１つまたは複数のカチオン基の結合を含むことも可能である。カチオン基は、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基上で置換可能な任意の原子に結合可能である。好ましい位置は、ハイブリッド形成を妨げない、すなわち塩基対形成に必要な水素結合の相互作用を妨げない位置である。カチオン基は、例えば糖のＣ２’位、または環状もしくは非環状の糖代用物中の類似の位置を介して結合することが可能である。カチオン基は、例えばＯ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）由来のプロトン化アミノ基、例えばＯ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノなど）のアミノアルコキシ、アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸）、またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（例えばＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテルシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ）を含むことが可能である。
【０３８０】
非リン酸結合
また、修飾は鎖の５’末端および３’末端のうち少なくともいずれかに非リン酸結合を組み込むことが可能である。リン酸基を置換することが可能な非リン酸結合の例には、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、炭酸、カルボキシメチル、カルバミン酸、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホン酸、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノを含む。好ましい置換体は、メチルホスホン酸基およびヒドロキシルアミノ基を含む。
【０３８１】
３’架橋チオリン酸および５’架橋チオリン酸塩；ロックトＲＮＡ、２’−５’結合、逆向きの結合、α−ヌクレオシド；結合基；脱塩基結合；ならびに５’ホスホン酸および５’リン酸プロドラッグ
上記の式Ｘについて言及すると、修飾はリン酸バックボーン部分の架橋または結合リン酸酸素（ＷおよびＺ）のうちの１つの置換体を含むことが可能である。ＸまたはＹのうち１つだけを変更する状況とは違い、ホスホロジチオエートのリン原子の中心はアキラルであり立体中心リン原子を含むｉＲＮＡ剤の形成を妨げる。
【０３８２】
また、修飾は、１番目の糖の２’位と２番目の糖の５’位を経るリン酸基または修飾リン酸基を介して２つの糖を結合することを含むことが可能である。同様に考えられるのは、１番目の糖と２番目の糖がそれぞれの３’位を通してそれぞれ結合する逆向きの結合である。また、修飾ＲＮＡは、Ｃ−１’で核酸塩基を欠く「脱塩基性の」糖を含むことも可能である。糖基は、リボースにおける対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する炭素を１つまたは複数含むことも可能である。したがって、修飾ｉＲＮＡ剤は、糖として、例えばアラビノースを含むヌクレオチドを含むことが可能である。上記修飾のもう１つのサブセットでは、天然の塩基、通常でない塩基または普遍的な塩基はα−配置を有することが可能である。また、修飾体は、Ｌ−ＲＮＡを含むことが可能である。
【０３８３】
また、修飾は例えばＰ（Ｏ）（Ｏ−）２−Ｘ−Ｃ５’−糖（Ｘ＝ＣＨ２、ＣＦ２、ＣＨＦなど）の５’−ホスホン酸および例えばＰ（Ｏ）［ＯＣＨ２ＣＨ２ＳＣ（Ｏ）Ｒ］２ＣＨ２Ｃ５’−糖などの５’ホスホン酸プロドラッグを含むことが可能である。後者の場合、プロドラッグ基は、最初にカルボキシエステラーゼで始まる作用を介して分解される可
能性がある。分子内ＳＮ２置換を介した残るエチルチオレート基は、エピスルフィドとして分離され、非誘導体化リン酸基を生じることが可能である。
【０３８４】
また、修飾は、本明細書の他の場所に記載した結合基を追加することも含むことが可能であり、結合基は結合可能な任意のアミノ基を介してｉＲＮＡ剤へ結合されることが好ましい。
【０３８５】
ヌクレアーゼ耐性の修飾には、末端のみに配置することが可能な修飾といかなる位置でも配置可能な修飾とがある。通常、ハイブリッド形成を抑制することが可能な修飾は、末端領域でのみ使用することが好ましく、対象の配列または遺伝子を標的とする配列の切断部位または切断領域では使用しないことが好ましい。ｉＲＮＡ剤の２つの配列間で十分なハイブリッド形成が維持されるという条件であれば、センス配列のどの位置においても使用することが可能である。一部の実施形態では、オフターゲットのサイレンシングを最小化することが可能なため、対象の配列または遺伝子を標的としない配列の切断位置または切断領域にＮＲＭを配することが望ましい。
【０３８６】
さらに、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の他方の配列と二本鎖構造を形成しない突出部を有することが可能である。これは突出部ではあるが、それ自体と、またはｉＲＮＡ剤のもう一方の配列以外の別の核酸と、ハイブリッド形成する。
【０３８７】
ほとんどの場合、ヌクレアーゼ耐性促進修飾は、その配列が対象の配列を標的にするか（多くの場合、アンチセンス配列と呼ばれる）、対象の配列を標的にしないか（多くの場合、センス配列と呼ばれる）により配置が異なる。配列が対象の配列を標的にするならば、エンドヌクレアーゼによる切断を妨害または阻害する修飾は、ＲＩＳＣの仲介による切断を受ける領域、例えば切断部位または切断領域に挿入すべきではない。（エルバッシャーら［Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．］、２００１年、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１５：１８８［参照により本願に援用］に記載されるように、標的の切断は、およそ２０もしくは２１ｎｔのガイドＲＮＡのほぼ中央またはガイド配列に相補的な最初のヌクレオチドの１０もしくは１１ヌクレオチド上流で起きる。本明細書では、切断部位とは、標的上または標的とハイブリッド形成するｉＲＮＡ剤の鎖上の、切断部位の両側のヌクレオチドを指す。切断領域は、切断部位のヌクレオチドとその両方向の１、２または３ヌクレオチドを意味する）。
【０３８８】
そのような修飾は、対象の配列を標的とする配列または標的としない配列の末端領域、例えば末端、または末端の２、３、４もしくは５位の位置へ導入することが可能である。
ｉＲＮＡ剤は以下から選択した第１鎖および第２鎖を有することが可能である。
【０３８９】
配列を標的とせず、かつ３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、かつ５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、かつ３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とせず、切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾を有し、かつ、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾と、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾と、あるいは３’末端および５’末端の
両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾とのうち１つまたは複数を有する第１鎖と、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第２鎖、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）。
【０３９０】
また、ｉＲＮＡ剤は２つの配列を標的とすることも可能であり、次から選択される第１鎖および第２鎖を有することが可能である。
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第１鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第１鎖、
配列を標的とし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第１鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）と、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が
好ましい）、
配列を標的とし、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有し、さらに５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置にＮＲＭ修飾を有する第２鎖、
配列を標的とし、好ましくは切断部位または切断領域にＮＲＭ修飾が存在しない第２鎖、
配列を標的にし、切断部位または切断領域のＮＲＭ修飾、ならびに、３’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、５’末端から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾、あるいは３’末端および５’末端の両方から１、２、３、４、５もしくは６位の位置または１、２、３、４、５もしくは６位以内の位置のＮＲＭ修飾のうち１つまたは複数が存在しない第２鎖（５’末端の修飾は、末端よりむしろアンチセンス鎖の５’末端から１、２、３、４、５または６位離れた位置が好ましい）。
【０３９１】
リボース模倣体
リボース模倣体、例えば本願明細書に記載するリボース模倣体、ならびにいずれも本願明細書に援用する、２００３年３月１３日に出願された同時係属で共同所有の米国仮出願第６０／４５４，９６２号、および国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０中に記載されたリボース模倣体などが取り込まれているＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤を調製するために、本願明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することが可能である。
【０３９２】
したがって、本発明の１態様は、効率を増大させ、かつ／あるいはｉＲＮＡ剤にヌクレアーゼ耐性を与えることが可能である、第２ヒドロキシル基を含むｉＲＮＡ剤を特徴とする。ヌクレアーゼ、例えば細胞ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解し、核酸の部分的または完全な分解をもたらすことが可能である。第２ヒドロキシル基は、この修飾を欠くｉＲＮＡと比べて、ｉＲＮＡ剤がヌクレアーゼ分解を受ける傾向を低下させることによって、ｉＲＮＡ剤にヌクレアーゼ耐性を与える。理論によって縛られることは望まないが、ｉＲＮＡ剤上の第２ヒドロキシル基の存在が３’リボースのヒドロキシル基の構造上の模倣体として働くことによって、ｉＲＮＡ剤が分解を受けにくくなると考えられる。
【０３９３】
第２ヒドロキシル基は、２つの他の炭素および水素によって置換された炭素原子と結合している「ＯＨ」基を指す。上記のようにヌクレアーゼ耐性を与える第２ヒドロキシル基は、任意の非環式炭素含有基の一部であってもよい。ヒドロキシル基は、任意の環式炭素含有基の一部であってもよく、以下の条件、すなわち（１）ヒドロキシル基と末端リン酸基の間にリボース部分が存在しないこと、または（２）該ヒドロキシル基は塩基と結合した糖部分には存在しないこと、のうち１つまたは複数に見合うことが好ましい。ヒドロキシル基は、ｉＲＮＡ剤の末端リン酸基のリンから、少なくとも２結合（化学結合２個）の位置にある（例えば、少なくとも３結合離れて、少なくとも４結合離れて、少なくとも５結合離れて、少なくとも６結合離れて、少なくとも７結合離れて、少なくとも８結合離れて、少なくとも９結合離れて、少なくとも１０結合離れている）。好ましい実施形態では、末端リン酸基のリンと第２ヒドロキシル基の間に５つの介在結合が存在する。
【０３９４】
末端リン酸基のリンと第２ヒドロキシル基の間に５つの介在結合を有する、好ましいｉＲＮＡ剤送達モジュールは、以下の構造を有する（以下の式Ｙを参照）：
【０３９５】
【化５４】
2007525454.tif 000057
【０３９６】
式Ｙに言及すると、ＡはｉＲＮＡ剤であり、本明細書に記載する任意のｉＲＮＡ剤を含む。ｉＲＮＡ剤は、リン酸基の「Ｗ」と直接的あるいは間接的に（例えばスペーサーまたはリンカーを介して）結合することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、脱塩基性の糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチン試薬およびフルオレセイン試薬を含むことが可能である。
【０３９７】
ｉＲＮＡ剤は、非修飾状態（例えば、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺがＯである）の末端リン酸基または修飾されている末端リン酸基を有し得る。修飾されているリン酸基では、ＷおよびＺは独立にＮＨ、ＯまたはＳであってよく；ＸおよびＹは独立にＳ、Ｓｅ、ＢＨ３−、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｈ、Ｏ、Ｏ−、アルコキシまたはアミノ（アルキルアミノ、アリールアミノなどを含む）であってよい。Ｗ、ＸおよびＺがＯであり、ＹがＳであることが好ましい。
【０３９８】
Ｒ１およびＲ３はそれぞれ独立に、水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよい。
【０３９９】
Ｒ２は水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるいはｎが１であるとき、Ｒ２がＲ４またはＲ６と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０４００】
Ｒ４は水素；またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるいはｎが１であるとき、Ｒ４がＲ２またはＲ５と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０４０１】
Ｒ５は水素、またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく；あるいはｎが１であるとき、Ｒ５がＲ４と合わさって５〜１２原子の環を形成してもよい。
【０４０２】
Ｒ６は水素、またはＣ１〜Ｃ１００アルキルであり、Ｃ１〜Ｃ１００アルキルは任意選択でヒドロキシル、アミノ、ハロ、リン酸または硫酸基で置換されており、かつ／あるいは任意選択でＮ、Ｏ、Ｓ、アルケニルまたはアルキニルが挿入されていてもよく、あるいはｎが１であるとき、Ｒ６がＲ２と合わさって６〜１０原子の環を形成してもよい。
【０４０３】
Ｒ７は水素、Ｃ１〜Ｃ１００アルキル、またはＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｑＣ（Ｏ）ＮＨＲ９であり；Ｔは水素または官能基であり；ｎおよびｑはそれぞれ独立に１〜１００であり；Ｒ８はＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり；かつＲ９は水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリールまたは固形支持体物質である。
【０４０４】
好ましい実施形態は、以下のｉＲＮＡ剤送達モジュールのサブセットの１つまたは複数を含むことが可能である。
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの１つのサブセットでは、Ａは該ＲＮＡ剤の末端３’または５’リボース糖の炭素を介して、直接的あるいは間接的に結合することが可能である。
【０４０５】
ＲＮＡｉ剤送達モジュールの他のサブセットでは、Ｘ、ＷおよびＺがＯであり、ＹがＳである。
ＲＮＡｉ剤送達モジュールのさらに他のサブセットでは、ｎは１であり、Ｒ２とＲ６が合わさって６原子を含む環を形成し、Ｒ４とＲ５が合わさって６原子を含む環を形成する。環系はトランス−デカリンであることが好ましい。例えば、このサブセットのＲＮＡｉ剤送達モジュールは、式（Ｙ−１）の化合物を含むことが可能である：
【０４０６】
【化５５】
2007525454.tif 000058
【０４０７】
官能基は例えば、標的化（ターゲティング）基（例えばステロイドまたは糖質）、レポーター基（例えばフルオロフォア）、または標識（同位元素で標識された部分）であってよい。標的化基は、タンパク質結合物質、内皮細胞標的化基（例えばＲＧＤペプチドおよび模倣体）、癌細胞標的化基（例えば葉酸ビタミンＢ１２、ビオチン）、骨細胞標的化基（例えばビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸）、多価マンノース（例えばマクロファージ試験用）、ラクトース、ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、モノクローナル抗体、糖タンパク質、レクチン、メラノトロピン、またはチロトロピンをさらに含むことが可能である。
【０４０８】
当業者によって理解され得るように、本明細書中の式の化合物を合成する方法は当業者には明らかであろう。合成した化合物を反応混合物から分離し、カラムクロマトグラフィ
、高速液体クロマトグラフィ、または再結晶化などの方法によってさらに精製することが可能である。さらに、様々な合成工程を他の順序または順番で行って、所望の化合物を与えることも可能である。本明細書に記載した化合物を合成する際に有用な、合成化学変換および保護基に関する方法（保護および脱保護）は当分野で知られており、例えば、アール  ラロック（Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ）、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；ティー  ダブリュー  グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）およびピー  エム  ジー  ワッツ（Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ）、「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；エル  ファイザー（Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ）およびエム  ファイザー（Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ）、「Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびエル  パクエッテ（Ｌ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ）、ｅｄ．、「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、ならびにその後続版に記載されたものなどを含む。
【０４０９】
パリンドローム
本願明細書に記載するパリンドローム構造、およびいずれも本願明細書に援用する、２００３年３月７日に出願された米国仮出願第６０／４５２，６８２号；２００３年４月１４日に出願された米国仮出願第６０／４６２，８９４号；および２００４年３月８日に出願された国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０の１つまたは複数中に記載されたパリンドローム構造を有するＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤を調製するために、本願明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することが可能である。本発明のｉＲＮＡ剤は、２つ以上のＲＮＡ領域を標的とすることが可能である。例えばｉＲＮＡ剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第１配列および第２配列を含むことが可能である。第１配列は第１の標的ＲＮＡ領域と相補的であってよく、第２配列は第２の標的ＲＮＡ領域と相補的であってよい。ｉＲＮＡ剤の第１配列および第２配列が異なるＲＮＡ鎖上にあり、かつ第１配列と第２配列の間のミスマッチを、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満とすることができる。ｉＲＮＡ剤の第１配列および第２配列が同じＲＮＡ鎖上にあり、かつ関連実施形態では、該ｉＲＮＡ剤の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％より多く、あるいは１％が、２分子の形態であってもよい。ｉＲＮＡ剤の第１配列と第２配列が、互いに完全に相補的であってもよい。
【０４１０】
第１の標的ＲＮＡ領域が第１の遺伝子によってコードされ、かつ第２の標的ＲＮＡ領域が第２の遺伝子によってコードされてもよいし、あるいは第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域が、１つの遺伝子由来のＲＮＡの異なる領域であってよい。第１配列と第２配列は、少なくとも１ヌクレオチド異なる可能性がある。
【０４１１】
第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、第１配列および第２配列の変異体、例えば１つの遺伝子の第１および第２の対立遺伝子によってコードされる転写物上に存在してもよい。配列の変異は、例えば突然変異、または多型性であってよい。第１の標的ＲＮＡ領域が、第２の標的ＲＮＡ領域と比べてヌクレオチドの置換、挿入、または欠失を含むことも可能であり、あるいは第２の標的ＲＮＡ領域が、第１の標的領域の突然変異体または変異体であることも可能である。
【０４１２】
第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、ウイルスまたはヒトのＲＮＡ領域を含むことが可能である。第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ領域は、がん遺伝子の変異体転写物上に存在することも可能であるし、あるいは腫瘍抑制遺伝子の転写物の異なる突然変異を含むことも可能である。さらに、第１の標的ＲＮＡ領域と第２の標的ＲＮＡ
領域は、遺伝的変異のホット・スポットに相当していてもよい。
【０４１３】
本発明の組成物は、ｉＲＮＡ剤分子の混合物を含むことが可能である。例えば、１つのｉＲＮＡ剤は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第１配列および第２配列を含むことが可能であり、さらに第１配列は第１の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、第２配列は第２の標的ＲＮＡ領域と相補的である。この混合物は、互いにハイブリダイズするのに十分相補的な第３配列および第４配列を含む、少なくとも１つの他の種類のｉＲＮＡ剤を含むことも可能であり、この場合第３配列は第３の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、第４配列は第４の標的ＲＮＡ領域と相補的である。さらに、第１配列または第２配列は、第３配列または第４配列と、互いにハイブリダイズすることが可能であるほど十分相補的であってもよい。第１配列と第２配列は同じＲＮＡ鎖上に存在しても異なるＲＮＡ鎖上に存在してもよく、第３配列と第４配列は同じＲＮＡ鎖上に存在しても異なるＲＮＡ鎖上に存在してもよい。
【０４１４】
標的ＲＮＡ領域は、ウイルスＲＮＡまたはヒトＲＮＡの変異体配列であってもよく、いくつかの実施形態では、少なくとも２つの標的ＲＮＡ領域が、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の変異体転写物上に存在しうる。標的ＲＮＡ領域は、遺伝的ホット・スポットに相当してもよい。
【０４１５】
ｉＲＮＡ剤組成物を作製する方法は、標的遺伝子（例えばウイルス遺伝子またはヒト遺伝子、あるいはがん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３）のＲＮＡ領域であって、（例えばヒトにおける）高度の多様性または突然変異頻度を有する領域についての情報を入手することまたは提供することを含み得る。さらに、該領域内の複数のＲＮＡ標的についての情報を入手または提供することが可能であり、この場合それぞれのＲＮＡ標的が該遺伝子の異なる変異体または突然変異体に対応する（例えば、ｐ５３  ２４８Ｑおよび／またはｐ５３  ２４９Ｓをコードするコドンを含む領域）。第１配列が複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第１の標的（例えば２４９Ｑをコードする標的）と相補的であり、第２配列が複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第２の標的（例えば２４９Ｓをコードする標的）と相補的であり、かつ第１配列と第２配列がハイブリダイズするのに十分相補的であり得るように、ｉＲＮＡ剤を構築することが可能である。
【０４１６】
例えば標的遺伝子中の共通の突然変異を同定するために、配列分析を使用して、高度の多様性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域を同定することが可能である。高度の多様性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域は、個体群由来の標的遺伝子についての遺伝子型情報を入手または提供することによって、同定することが可能である。
【０４１７】
互いにハイブリダイズするほど十分相補的な第１配列および第２配列を有するｉＲＮＡ剤を提供することによって、標的遺伝子の発現を調節する、例えばダウンレギュレーションまたはサイレンシングすることが可能である。さらに、第１配列が第１の標的ＲＮＡ領域と相補的であり、かつ第２配列が第２の標的ＲＮＡ領域と相補的であってもよい。
【０４１８】
ｉＲＮＡ剤は、第１の変異体ＲＮＡ標的領域と相補的な第１配列、および第２の変異体ＲＮＡ標的領域と相補的な第２配列を含むことが可能である。この第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的遺伝子、例えばウイルス遺伝子、腫瘍抑制遺伝子またはがん遺伝子の第１および第２の変異体または突然変異体に対応するものでもよい。第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的遺伝子の対立遺伝子変異、突然変異（例えば点突然変異）、または多型を含んでいてもよい。第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、遺伝的ホット・スポットに対応していてもよい。
【０４１９】
複数のｉＲＮＡ剤（例えばパネルまたはバンク）を提供することも可能である。
標準的なワトソン−クリック以外の二本鎖構造
別のモノマー、例えば別の鎖上のモノマーと標準的なワトソンクリック以外の対合を形成することができるモノマー（例えば、本明細書中に記載するもの、ならびに２００３年４月２５日付けで出願された米国仮出願第６０／４６５，６６５号及び２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（これらはともに、参照により本明細書に援用される）に記載されるモノマー）を有するＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書中に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。
【０４２０】
二本鎖のモノマー間の「標準的なワトソン−クリック以外の対合」の使用は、二本鎖のすべて又は一部の融解を制御（多くの場合は促進）するのに使用することができる。ｉＲＮＡ剤は、選択された位置又は制約された位置にモノマーを包含することができ、その結果、ｉＲＮＡ剤二本鎖における（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤の２つの別個の分子間での）第１のレベルの安定性、及びｉＲＮＡ剤の配列と別の配列分子（例えば、対象者における標的配列又はオフターゲット（標的ではない）配列）との間の二本鎖における第２のレベルの安定性をもたらす。場合によっては、第２の二本鎖は、例えばｉＲＮＡ剤のアンチセンス配列と標的ｍＲＮＡとの間の二本鎖において、比較的高いレベルの安定性を有する。この場合、１つ又はそれ以上のモノマー、ｉＲＮＡ剤におけるモノマーの位置、及び標的配列（本明細書中では、選択パラメータ又は制約パラメータと称することもある）の選択は、ｉＲＮＡ剤二本鎖が比較的低い会合の自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、このことはＲＩＳＣに関しては二本鎖ｉＲＮＡ剤の解離を促進することにより有効性に寄与すると考えられる）一方で、標的指向性のアンチセンス配列とその標的配列との間で形成される二本鎖が、比較的高い会合の自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、このことはアンチセンス配列と標的ＲＮＡとの会合を促進することにより有効性に寄与すると考えられる）ようになされる。
【０４２１】
他の場合では、第２の二本鎖は、例えばｉＲＮＡ剤のセンス配列とオフターゲットｍＲＮＡとの間の二本鎖において、比較的低いレベルの安定性を有する。この場合、１つ又はそれ以上のモノマー、ｉＲＮＡ剤におけるモノマーの位置、及びオフターゲット配列の選択は、ｉＲＮＡ剤二本鎖が比較的高い会合の自由エネルギーを有する一方で、標的指向性のセンス配列とそのオフターゲット配列との間で形成される二本鎖が、比較的低い会合の自由エネルギーを有する（メカニズム又は理論により拘束されることを望まないが、センス鎖とオフターゲット配列から形成される二本鎖の解離を促進することにより有効性に寄与し、オフターゲット配列をサイレンシングするレベルを低減すると考えられる）ようになされる。
【０４２２】
したがって、ｉＲＮＡ剤内の二本鎖に関する第１の安定性、ならびにｉＲＮＡ剤由来の配列と別のＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡとの間で形成される二本鎖に関する第２の安定性を有するという特性は、ｉＲＮＡ剤の構造において固有のものである。上述のように、この特性は、選択された位置又は制約された位置の１つ又はそれ以上のモノマーの慎重な選択、選択された位置又は制約された位置を設定するための二本鎖における位置の選択、及び標的配列の配列（例えば、標的とされるべき標的遺伝子の特定の領域）の選択により達成され得る。これらの要件を満たすｉＲＮＡ剤配列は、本明細書中では制約配列と称することもある。制約パラメータ又は選択パラメータは、例えば、検査により、あるいはコンピュータ支援方法により達成することができる。パラメータの使用により、例えば二本鎖の安定性又は相対安定性に関して所望の結果が得られるように、標的配列及び特定のモノマーを選択することができる。
【０４２３】
したがって、別の態様では、本発明は、第１の標的領域を標的とする第１の配列及び第２の標的領域を標的とする第２の配列を包含するｉＲＮＡ剤を特徴とする。第１の配列及
び第２の配列は、例えば生理学的条件下で（例えば、生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域では、選択された位置又は制約された位置で、第１の標的領域が第１のモノマーを有し、第２の標的領域が第２のモノマーを有する。第１のモノマー及び第２のモノマーは、相補的位置又は対応する位置を占める。一方のモノマー、及び好ましくは両方のモノマーが、第１の配列と第２の配列との間での二本鎖に寄与するモノマーの対合の安定性が、第１の配列又は第２の配列と標的配列との間での対合の安定性と異なるように選択される。
【０４２４】
通常、モノマーは、ｉＲＮＡ剤配列と標的ＲＮＡ二本鎖との間の二本鎖におけるモノマーとその相補的モノマーとの対合により保有されるであろう解離の自由エネルギー及びＴｍよりも、低い解離の自由エネルギー及び低いＴｍを有するｉＲＮＡ剤二本鎖における対合をモノマーが形成するように選択される（標的配列の選択も同様に要求され得る）。
【０４２５】
モノマーに与えられる制約は、選択部位に、あるいは２個以上の選択部位に適用され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤二本鎖において、２個以上であるが、３個未満、４個未満、５個未満、６個未満又は７個未満の部位に制約が適用され得る。
【０４２６】
制約部位又は選択部位は、ｉＲＮＡ剤二本鎖の多数の位置に存在することができる。例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の３’末端又は５’末端の一方から３位、４位、５位又は６位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本鎖領域の中央に存在することもでき、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の末端から４位以上、５位以上、６位以上又は７位以上の位置であり得る。
【０４２７】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、選択部位又は制約部位（単数又は複数）のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない１個以下、２個以下、３個以下、４個以下又は５個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他の箇所で詳述しているが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。ＴＴは、突出部の好ましい配列である。第１のｉＲＮＡ剤配列及び第２のｉＲＮＡ剤配列はまた、例えばヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結させることもできる。
【０４２８】
モノマーは、第１のモノマー及び第２のモノマーが天然に存在するリボヌクレオチド又は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであるように、かつ、相補的部位を占有する場合、対合もせず実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は非標準的ワトソン−クリック対合を形成して非標準的なＨ結合のパターンを形成する（通常、標準的なワトソン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーとなるように対合する）ように選択することができる。ｉＲＮＡ剤の配列の一方（又は両方）が標的と二本鎖を形成する場合、第１の（又は第２の）モノマーは、標的上の相補的位置にある塩基と標準的なワトソン−クリック対合を形成するか、あるいはｉＲＮＡ剤における対合で見られるよりも高い解離の自由エネルギー及び高いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。古典的なワトソン−クリック対は、以下の通りである：Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ及びＡ−Ｕ。非標準的なワトソン−クリック対合は、当該技術分野で既知であり、Ｕ−Ｕ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ａトランス、Ｇ−Ａシス及びＧＵを挙げることができる。
【０４２９】
配列の一方又は両方におけるモノマーの選択は、モノマーが対合をしないか、あるいは
他方の配列の対応するモノマーとの対を形成し、その対が安定性を最小限にする（例えば、一方の配列の選択部位のモノマーと他方の配列の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、一方（又は両方）の配列のモノマーと各々の標的配列とにより形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）ようになされる。一方又は両方の鎖におけるモノマーの選択はまた、鎖とその標的配列により作製される二本鎖の一方又は両方における安定性を促進するように為される。例えば、１つ又はそれ以上のモノマー及び標的配列の選択は、選択位置又は制約位置で、ｉＲＮＡ剤二本鎖中でＨ結合が形成されないか、もしくは非標準的な対合が形成されるか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーを付与するように対合するが、一方（又は両方の）配列が各々の標的と二本鎖を形成する場合は、選択部位又は制約部位での対合は標準的なワトソン−クリック対であるようにすることができる。
【０４３０】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち：ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、配列と意図される標的との間の相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０４３１】
例を挙げる。
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ａ（又はＴと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｇ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４３２】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｕ（又はＡと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｕ又はＧ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４３３】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｇ（又はＣと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｇ、Ａシス、Ａトランス、又はＵ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４３４】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｃ（又はＧと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマーから選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４３５】
天然に存在しないモノマー又は修飾モノマー（単数又は複数）の選択は、天然に存在しないモノマー又は修飾モノマーがｉＲＮＡ剤の選択位置又は制約位置に配置される場合は
第１の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方（又は両方）が天然に存在するモノマーと対合する場合は、対が第２の解離の自由エネルギーを示す（通常、第２の解離の自由エネルギーは、第１のモノマーと第２のモノマーの対合の解離の自由エネルギーよりも高い）ように実施することができる。例えば、第１のモノマー及び第２のモノマーが相補的位置を占める場合、第１のモノマー及び第２のモノマーは、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は、該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成するよりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、その二本鎖が解離すると、少なくとも一方の鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては、選択モノマーは安定性を促進する（例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーと、ｉＲＮＡ剤において形成される対合よりも安定な対を形成する）。
【０４３６】
このような対の例は、２−アミノＡ、及びＵ又はＴの２−チオピリミジン類縁体のいずれかである。
ｉＲＮＡ剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーはほとんど対合せず、安定性は最小限となる。しかしながら、２−アミノＡと天然に存在する標的のＵとの間で二本鎖が形成されるか、あるいは、２−チオＵと天然に存在する標的のＡとの間、又は２−チオＴと天然に存在する標的のＡとの間で二本鎖が形成され、比較的高い解離の自由エネルギーを有し、かつより安定となる。これを、図１２に示す。
【０４３７】
図１２に示す対（２−アミノＡならびに２−ｓＵ及びＴ）は例示的なものである。別の実施形態では、センス鎖の選択位置のモノマーは、普遍的に対合する構成部分であり得る。普遍的に対合する物質は、２個以上、好ましくはすべての天然に存在するモノマーとある程度のレベルのＨ結合を形成する。普遍的に対合する部分の例は、３−ニトロピロールを含むモノマーである。（普遍的な塩基類縁体の他の候補は、例えばロークス（Ｌｏａｋｅｓ）、２００１年、ＮＡＲ  ２９：２４３７〜２４４７ページ（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。例はまた、以下の普遍的塩基に関するセクションに見出すことができる。）これらの場合、アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、標的と二本鎖を形成するその能力に応じて選ぶことができ、例えばＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを挙げることができる。
【０４３８】
本発明のｉＲＮＡ剤は、以下のものを包含することができる：
好ましくは対象中に存在する配列を標的としないセンス配列、及び対象中の標的遺伝子を標的とするアンチセンス配列。センス配列及びアンチセンス配列は、例えば生理学的条件下で（例えば生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域では、選択位置又は制約位置について、モノマーは以下を満たすように選択される：
センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと安定性を最小限にするような対を形成する（例えば、センス配列における選択部位のモノマーとアンチセンス鎖の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、アンチセンス配列のモノマーとその標準的なワトソン−クリックパートナー（アンチセンス鎖中のモノマーが修飾塩基を含む場合には、該修飾塩基の天然型類縁体とその標準的なワトソン−クリックパートナー）により形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）ように選択されること；
アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、該モノマーが標的配列とともに形成する二本鎖の安定性を最大限にすること、例えば、該モノマーが標的鎖上の対応する位置のモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するように選択されること；
任意選択で、センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと、オフターゲット配列との安定性を最小限にするような対を形成すること。
【０４３９】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち、ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、アンチセンス配列と意図される標的との間の二本鎖相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０４４０】
モノマーに与えられる制約は、選択部位に、あるいは２個以上の選択部位に適用され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤二本鎖において、２個以上であるが、３個未満、４個未満、５個未満、６個未満又は７個未満の部位に制約が適用され得る。
【０４４１】
制約部位又は選択部位は、ｉＲＮＡ剤二本鎖の多数の位置に存在することができる。例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の３’末端又は５’末端の一方から３位、４位、５位又は６位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本鎖領域の中央に存在することも可能であり、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の末端から４位以上、５位以上、６位以上又は７位以上の位置であり得る。
【０４４２】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、選択部位又は制約部位（単数又は複数）のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない１個以下、２個以下、３個以下、４個以下又は５個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他の箇所で詳述しているが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。ＴＴは、突出部の好ましい配列である。第１のｉＲＮＡ剤配列及び第２のｉＲＮＡ剤配列はまた、例えばヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結させることができる。
【０４４３】
モノマーは、第１のモノマー及び第２のモノマーが天然に存在するリボヌクレオチド又は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであるように、かつ、相補的部位を占有する場合、対合もせず実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は非標準的ワトソン−クリック対合を形成して非標準的なＨ結合のパターンを形成する（通常、標準的なワトソン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーとなるように対合する）ように選択することができる。ｉＲＮＡ剤の配列の一方（又は両方）が標的と二本鎖を形成する場合、第１の（又は第２の）モノマーは、標的上の相補的位置にある塩基と標準的なワトソン−クリック対合を形成するか、あるいはｉＲＮＡ剤における対合で見られるよりも高い解離の自由エネルギー及び高いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。古典的なワトソン−クリック対は、以下の通りである：Ａ−Ｔ、Ｇ−Ｃ及びＡ−Ｕ。非標準的なワトソン−クリック対合は、当該技術分野で既知であり、Ｕ−Ｕ、Ｇ−Ｇ、Ｇ−Ａトランス、Ｇ−Ａシス及びＧＵを挙げることができる。
【０４４４】
配列の一方又は両方におけるモノマーの選択は、モノマーが対合をしないか、あるいは他方の配列の対応するモノマーとの対を形成し、その対が安定性を最小限にする（例えば、一方の配列の選択部位のモノマーと他方の配列の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、一方（又は両方）の配列のモノマーと各々の標的配列とにより形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）ようになされる。一方又は両方の鎖におけるモノマーの選択はまた、鎖とその標的配列により作製される二本鎖の一方又は両方における安定性を促進するように為される。例えば、１つ又はそれ以上のモノマー及び標的配列の選択は、選択位置又は制約位置で、ｉＲＮＡ剤二本鎖中でＨ結合が形成されないか、もしくは非標準的な対合が形成されるか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由
エネルギーを付与するように対合するが、一方（又は両方の）配列が各々の標的と二本鎖を形成する場合は、選択部位又は制約部位での対合は標準的なワトソン−クリック対であるようにすることができる。
【０４４５】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち：ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、配列と意図される標的との間の相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０４４６】
例を挙げる。
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ａ（又はＴと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｇ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４４７】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｕ（又はＡと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｕ又はＧ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖の標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４４８】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｇ（又はＣと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマー（例えば、Ｇ、Ａシス、Ａトランス、又はＵ）から選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４４９】
第１の配列の選択部位のモノマーは、Ｃ（又はＧと対合する修飾塩基）を含み、第２の配列の選択位置のモノマーは、対合しないか、又は非標準的な対合を形成するモノマーから選ばれる。これらは、第１の配列の標的配列が選択位置にＴを有する場合の用途において有用である。標的二本鎖がともに安定化される実施形態では、第２の鎖に関する標的配列が、第２の鎖の選択位置に関して選択されるモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するモノマーを有する場合に有用である。
【０４５０】
天然に存在しないモノマー又は修飾モノマー（単数又は複数）の選択は、天然に存在しないモノマー又は修飾モノマーがｉＲＮＡ剤の選択位置又は制約位置に配置される場合は第１の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方（又は両方）が天然に存在するモノマーと対合する場合は、対が第２の解離の自由エネルギーを示す（通常、第２の解離の自由エネルギーは、第１のモノマーと第２のモノマーの対合の解離の自由エネルギーよりも高い）ように実施することができる。例えば、第１のモノマー及び第２のモノマーが相補的位置を占める場合、第１のモノマー及び第２のモノマーは、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は、該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成するよりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、その二本鎖が解離すると、少なくとも一方の鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては、選択モノマーは安定性を促進する（例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーと、ｉ
ＲＮＡ剤において形成される対合よりも安定な対を形成する）。
【０４５１】
このような対の例は、２−アミノＡ、及びＵ又はＴの２−チオピリミジン類縁体のいずれかである。
ｉＲＮＡ剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーはほとんど対合せず、安定性は最小限となる。しかしながら、２−アミノＡと天然に存在する標的のＵとの間で二本鎖が形成されるか、あるいは、２−チオＵと天然に存在する標的のＡとの間、又は２−チオＴと天然に存在する標的のＡとの間で二本鎖が形成され、比較的高い解離の自由エネルギーを有し、かつより安定となる。
【０４５２】
センス鎖の選択位置のモノマーは、普遍的に対合する構成部分であり得る。普遍的に対合する物質は、２個以上、好ましくはすべての天然に存在するモノマーとある程度のレベルのＨ結合を形成する。普遍的に対合する部分の例は、３−ニトロピロールを含むモノマーである。（普遍的な塩基類縁体の他の候補は、例えばロークス（Ｌｏａｋｅｓ）、２００１年、ＮＡＲ  ２９：２４３７〜２４４７ページ（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。例はまた、以下の普遍的塩基に関するセクションに見出すことができる。）これらの場合、アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、標的と二本鎖を形成するその能力に応じて選ぶことができ、例えばＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを挙げることができる。
【０４５３】
本発明のｉＲＮＡ剤は、以下のものを包含することができる：
好ましくは対象中に存在する配列を標的としないセンス配列、及び対象中の標的遺伝子を標的とするアンチセンス配列。センス配列及びアンチセンス配列は、例えば生理学的条件下で（例えば生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域では、選択位置又は制約位置について、モノマーは以下を満たすように選択される：
センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと安定性を最小限にするような対を形成する（例えば、センス配列における選択部位のモノマーとアンチセンス鎖の対応する部位のモノマーとの間で形成されるＨ結合は、アンチセンス配列のモノマーとその標準的なワトソン−クリックパートナー（アンチセンス鎖中のモノマーが修飾塩基を含む場合には、該修飾塩基の天然型類縁体とその標準的なワトソン−クリックパートナー）により形成されるＨ結合よりも安定性が劣る）ように選択されること；
アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、該モノマーが標的配列とともに形成する二本鎖の安定性を最大限にすること、例えば、該モノマーが標的鎖上の対応する位置のモノマーと標準的なワトソン−クリック対を形成するように選択されること；
任意選択で、センス配列のモノマーは、該モノマーが対合しないか、あるいはアンチセンス鎖の対応するモノマーと、オフターゲット配列との安定性を最小限にするような対を形成すること。
【０４５４】
このようなモノマーを含むことにより、以下の１つ又はそれ以上の効果、すなわち、ｉＲＮＡ剤二本鎖を不安定化すること、センス配列と意図されない標的配列（オフターゲット配列と称することもある）との間の相互作用を不安定化すること、アンチセンス配列と意図される標的との間の二本鎖相互作用は不安定化されないこと、を有することになる。
【０４５５】
モノマーに与えられる制約は、選択部位に、あるいは２個以上の選択部位に適用され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤二本鎖において、２個以上であるが、３個未満、４個未満、５個未満、６個未満又は７個未満の部位に制約が適用され得る。
【０４５６】
制約部位又は選択部位は、ｉＲＮＡ剤二本鎖の多数の位置に存在することができる。例
えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の配列の３’末端又は５’末端の一方から３位、４位、５位又は６位以内の位置に存在することができる。制約部位又は選択部位は、二本鎖領域の中央に存在することも可能であり、例えば、制約部位又は選択部位は、二本鎖の領域の末端から４位以上、５位以上、６位以上又は７位以上の位置であり得る。
【０４５７】
ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する遺伝子のいずれかを含む広範囲の遺伝子を標的とするように選択することができる。
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する構成様式を有する（構成様式とは、全体の長さ、二本鎖領域の長さ、突出部の存在、数、位置又は長さ、二本鎖の形態に対する単鎖の形態のうち、１つ又はそれ以上を指す）。
【０４５８】
例えば、ｉＲＮＡ剤は、３０ヌクレオチド長未満、例えば２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、ｉＲＮＡは２１ヌクレオチド長であり、約１９対の二本鎖領域が存在する。一実施形態では、ｉＲＮＡは、２１ヌクレオチド長であり、ｉＲＮＡの二本鎖領域は１９ヌクレオチド長である。別の実施形態では、ｉＲＮＡは３０ヌクレオチド長を上回る。
【０４５９】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、選択部位又は制約部位（単数又は複数）のほかに、ミスマッチを有する。好ましくは、ｉＲＮＡ剤の二本鎖領域は、標準的なワトソン−クリック対を形成しないか、又はハイブリダイズしない１個以下、２個以下、３個以下、４個以下又は５個以下の塩基を有する。突出部については、本明細書中の他の箇所で詳述しているが、好ましくは約２ヌクレオチド長である。突出部は、標的とされる遺伝子配列に対して相補的であってもよいし、又は他の配列でもよい。ＴＴは、突出部の好ましい配列である。第１のｉＲＮＡ剤配列及び第２のｉＲＮＡ剤配列はまた、例えばヘアピンを形成するための追加の塩基により、あるいは他の非塩基リンカーにより連結させることができる。
【０４６０】
１つ又はそれ以上の選択パートナー又は制約パートナーは、センス配列及びアンチセンス配列の選択部位のモノマーがいずれも天然に存在するリボヌクレオチド又は天然に存在する塩基を有する修飾リボヌクレオチドであり、かつｉＲＮＡ剤二本鎖において相補的部位を占める場合、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は非標準的ワトソン−クリック対を形成して非標準的なパターンのＨ結合を形成する（この非標準的ワトソン−クリック対は通常、ワトソン−クリック対合で見られるよりも低い解離の自由エネルギーを有するか、あるいはそうでなければ予め選択した値の会合の自由エネルギー未満であるか、又は例えば標準的な対合の会合の自由エネルギーよりも低い会合の自由エネルギーを付与するように対合する）ように使用することができる。ｉＲＮＡ剤の配列のうちの一方、通常アンチセンス配列が、別の配列、通常は対象中に存在する配列、及び一般に標的配列と二本鎖を形成する場合、モノマーは、標的上の相補的位置の塩基と古典的なワトソン−クリック対を形成するか、あるいはｉＲＮＡ剤における対合で見られるよりも高い解離の自由エネルギー及び高いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。任意選択で、ｉＲＮＡ剤の他方の配列、通常センス配列が、別の配列、通常は対象中に存在する配列、及び一般にオフターゲット配列と二本鎖を形成する場合、モノマーは、オフターゲット配列上の相補的位置の塩基と標準的なワトソン−クリック対を形成することができず、例えば、モノマーは、より低い解離の自由エネルギー及びより低いＴｍを有する非標準的なワトソン−クリック対を形成する。
【０４６１】
例を挙げる。
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＡ（又はＴと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＴであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる（例えば、Ｇ）；
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＵ（又はＡと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＡであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる（例えば、Ｕ又はＧ）；
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＣ（又はＧと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＧであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる（例えば、Ｇ、Ａシス、Ａトランス又はＵ）；または、
アンチセンス鎖における選択部位のモノマーはＧ（又はＣと対合する修飾塩基）を含み、標的における対応するモノマーはＣであり、センス鎖は、対合しないか、又は非標準的な対を形成する塩基から選ばれる。
【０４６２】
別の実施形態では、天然に存在しないモノマー又は修飾モノマー（単数又は複数）は、該モノマーがｉＲＮＡ剤における相補的な位置を占める場合は第１の解離の自由エネルギーを示し、かつそれらの一方（又は両方）が天然に存在するモノマーと対合する場合は、その対は第２の解離の自由エネルギーを示す（通常、第２の解離の自由エネルギーは、第１のモノマーと第２のモノマーの対合の解離の自由エネルギーよりも高い）ように選ばれる。例えば、第１のモノマー及び第２のモノマーが相補的位置を占める場合、第１のモノマー及び第２のモノマーは、対合もせず、実質的レベルのＨ結合も有さないか、又は該モノマーの一方が天然に存在するモノマーと形成するよりも弱い結合を形成して、その二本鎖の安定性を低減するが、二本鎖が解離すると、少なくとも１つの鎖は標的と二本鎖を形成し、標的との二本鎖においては選択モノマーが安定性を促進する（例えばモノマーは、標的配列中の天然に存在するモノマーとともに、ｉＲＮＡ剤において形成される対合よりも安定な対を形成する）。
【０４６３】
このような対の例は、２−アミノＡ、及びＵもしくはＴの２−チオピリミジン類縁体のいずれかである。上述のように、ｉＲＮＡ剤の相補的位置に配置される場合、これらのモノマーは、ほとんど対合せず、安定性は最小限となる。しかしながら、二本鎖は、２−アミノＡと天然に存在する標的のＵとの間で形成されるか、あるいは二本鎖は、２−チオＵと天然に存在する標的のＡとの間、又は２−チオＴと天然に存在する標的のＡとの間で形成され、比較的高い解離の自由エネルギーを有し、かつより安定である。
【０４６４】
センス鎖の選択位置のモノマーは、普遍的に対合する構成部分であり得る。普遍的に対合する物質は、２個以上、好ましくはすべての天然に存在するモノマーとある程度のレベルのＨ結合を形成する。普遍的に対合する部分の例は、３−ニトロピロールを含むモノマーである。普遍的な塩基類縁体の他の候補は、例えばロークス（Ｌｏａｋｅｓ）、２００１年、ＮＡＲ  ２９：２４３７〜２４４７ページ（参照により本明細書に援用される）に見出すことができる。これらの場合、アンチセンス鎖の対応する位置のモノマーは、標的と二本鎖を形成するその能力に応じて選ぶことができ、例えばＡ、Ｕ、Ｇ又はＣを挙げることができる。
【０４６５】
別の態様では、本発明は、以下のものを包含するｉＲＮＡ剤を特徴とする：
好ましくは対象者中に存在する配列を標的としないセンス配列、及び対象者中の複数の標的遺伝子を標的とするアンチセンス配列（ここで、標的の配列は、１位のみ又は少数、例えば５個以下、４個以下、３個以下又は２個以下の位置で異なっている）。該センス配列及びアンチセンス配列は、例えば生理学的条件下で（例えば生理学的条件下であるが、ヘリカーゼ又は他の巻き戻し酵素とは接触しない条件下で）互いにハイブリダイズするのに十分な相補性を有する。ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の配列は、標的配列間で配列が異なる位置に相当する位置のうち１つ、幾つか又はすべてについて、アンチセンス鎖が、少なくとも２つの異なる標的配列とＨ結合を形成するモノマーを含むように選択される。好ましい例では、アンチセンス配列は、普遍的モノマー又は無差別に対合するモノマー、例えば５−ニトロピロール、２−アミノＡ、２−チオＵ又は２−チオＴ、あるいは本明細書
中で言及する他の普遍的塩基を包含するモノマーを含む。
【０４６６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、単一の遺伝子、複数の遺伝子又はウイルスゲノム（例えば、ＨＣＶゲノム）中の反復配列（互いに１部位のみ又は少数の部位が異なる反復配列）を標的とする。
【０４６７】
一実施形態を図１３及び図１４に示す。
別の態様では、本発明は、例えば測定又は計算により、ｉＲＮＡ剤二本鎖における選択位置又は制約位置のモノマーの間の対合の安定性を決定すること、かつ好ましくは、ｉＲＮＡ剤由来の配列と別のＲＮＡ（例えば、標的配列）との間の二本鎖における対応する対合の安定性を決定することを特徴とする。決定の結果を、比較することができる。したがって、分析したｉＲＮＡ剤を、さらに修飾したＲＮＡ剤の開発に使用することもできるし、あるいは対象に投与することもできる。このような分析は、最適化されたｉＲＮＡ剤を洗練又は設計するために引き続いて実施することができる。
【０４６８】
別の態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の本明細書中以下に記載するｉＲＮＡと、該ｉＲＮＡ剤が封入される滅菌容器と、取扱説明書とを含むキットを特徴とする。
別の態様では、本明細書中に記載する方法により作製される制約配列を含有するｉＲＮＡ剤を特徴とする。該ｉＲＮＡ剤は、本明細書中で言及する１つ又はそれ以上の遺伝子を標的とすることができる。
【０４６９】
例えば本明細書中に記載するような制約部位又は選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する任意の方法で使用することができる。したがって、例えば本明細書中に記載するような制約部位又は選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、例えば本明細書中に記載する方法のいずれかにおいて標的をサイレンシングするために、また本明細書中に記載する遺伝子のいずれかを標的とするために、あるいは本明細書中に記載する障害のいずれかを治療するために使用することができる。例えば本明細書中に記載するような制約部位又は選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、任意の製剤又は調製物、例えば本明細書中に記載する医薬品又は滅菌調製物に組み込むことができる。例えば本明細書中に記載する制約部位又は選択部位を有するｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する投与経路のいずれかにより投与することができる。
【０４７０】
「標準的なワトソン−クリック以外の対合」という用語は、本明細書中で使用する場合、二本鎖の第１の配列の第１のモノマーと第２の配列の対応する位置の第２のモノマーとの間での対合であって、下記のうち１つまたはそれ以上が事実であるものを指す：（１）該２つのモノマーの間に本質的に対合が存在しない、例えばモノマー間に有意なレベルのＨ結合が存在しないか、あるいはモノマー間の結合が二本鎖の安定性に対していかなる有意な寄与もしていない、（２）該モノマーが、天然に存在する塩基を有する非標準的なモノマー対である、すなわち、Ａ−Ｔ、Ａ−Ｕ又はＧ−Ｃ以外であり、かつ該モノマーは、モノマー間のＨ結合を形成するが、概して形成されるＨ結合パターンは、標準的な対合により形成される結合よりも弱い、あるいは（３）該モノマーの少なくとも１つは天然に存在しない塩基を包含し、かつモノマー間で形成されるＨ結合は、好ましくは、標準的な対合すなわちＡ−Ｔ、Ａ−Ｕ、Ｇ−Ｃのうち１つ又はそれ以上により形成される結合よりも弱い。
【０４７１】
「オフターゲット」という用語は、本明細書中で使用する場合、サイレンシングされるべき配列以外の配列を指す。
普遍的塩基：「ワイルドカード」；形状に基づいた相補性
（「ジフルオロトルエンとアデニンとの間の塩基対の、二本鎖の多重部位における複製：「逆」シーケンシングによる確認（Bi-stranded, multisite replication of a base p
air between difluorotoluene and adenine: confirmation by 'inverse' sequencing.）」、リウ、ディー；モラン、エス；クール、イー．ティー（Ｌｉｕ，Ｄ．；Ｍｏｒａｎ，Ｓ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、１９９７年、第４巻、９１９〜９２６ページ）
【０４７２】
【化５６】
2007525454.tif 000059
【０４７３】
（「ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片による３’末端プルーフリーディングにおける末端塩基対水素結合の重要性（Importance of terminal base pair hydrogen-bonding in 3'-end proofreading by the Klenow fragment of DNA polymerase I.）」、モラレス、ジェー．シー；クール、イー．ティー（Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０００年、第３９巻、２６２６〜２６３２ページ）
（「水素結合を伴わない選択的かつ安定なＤＮＡ塩基対合（Selective and stable DNA
base pairing without hydrogen bonds. ）」、マトレイ、ティー、ジェー；クール、イー、ティー（Ｍａｔｒａｙ，Ｔ．Ｊ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８年、第１２０巻、６１９１〜６１９２ページ）
【０４７４】
【化５７】
2007525454.tif 000060
【０４７５】
（「チミンに関する無極性同配体であるジフルオロトルエンは、ＤＮＡ複製において特異的かつ効率的にアデニンをコードする（Difluorotoluene, a nonpolar isostere for thymine, codes specifically and efficiently for adenine in DNA replication.）」、モラン、Ｓ；レン、アール．エックス．−エフ；ラムネイ  アイブイ、エス；クール、イー．ティー（Ｍｏｒａｎ，Ｓ．Ｒｅｎ，Ｒ．Ｘ．−Ｆ；Ｒｕｍｎｅｙ  ＩＶ，Ｓ；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９７年、第１１９巻、２０５６〜２０５７ページ）
（「デオキシアデノシンに関する複製可能な無極性同配体の構造及び塩基対特性（Structure and base pairing properties of replicable nonpolar isostere for deoxyadenosine. ）」、グクキアン、ケー．エム；モラレス、イー．ティー（Ｇｕｃｋｉａｎ，Ｋ．Ｍ．；Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｊ．Ｃ．；Ｋｏｏｌ，Ｅ．Ｔ．）、Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８年、第６３巻９６５３〜９６５６ページ）
【０４７６】
【化５８】
2007525454.tif 000061
【０４７７】
【化５９】
2007525454.tif 000062
【０４７８】
（「ハイブリダイゼーション、複製及び鎖終結用の普遍的塩基（Universal bases for hybridization, replication and chain termination. ）」、バーガー、エム；ウー．ワイ．；オガワ、エー．ケー．；マクミン、ディー．エル．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０００年、第２８巻、２９１１〜２９１４ページ）
【０４７９】
【化６０】
2007525454.tif 000063
【０４８０】
（１．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：非天然の疎水性塩基対による情報保存及び複製（Efforts toward expansion of the genetic alphabet: Information storage and replication with unnatural hydrophobic base pairs.）」、オガワ、エー．ケー．；ウー．ワイ．；マクミン、ディー．エル．；リウ、ジェー．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、３２７４〜３２８７ページ。２．「動力学的選択性の増大による非天然塩基対の合理的設計（Rational design of an unnatural base pair with increased kinetic selectivity. ）」、オガワ、エー．ケー．；ウー．ワイ．；バーガー、エム；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、８８０３〜８８０４ページ）
【０４８１】
【化６１】
2007525454.tif 000064
【０４８２】
（「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：３つの塩基対によるＤＮＡの複製（Efforts toward expansion of the genetic alphabet: replication of DNA with three base pairs. ）」、タエ、イー．エル．；ウー．ワイ．；キシア、ジー．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｔａｅ，Ｅ．Ｌ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｘｉａ，Ｇ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、第１２３巻、７４３９〜７４４０ページ）
【０４８３】
【化６２】
2007525454.tif 000065
【０４８４】
（１．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：塩基間疎水性相互作用の最適化（Efforts toward expansion of the genetic alphabet: Optimization of interbase hydrophobic interactions. ）」、ウー．ワイ．；オガワ、エー．ケー．；バーガー、エム；マクミン、ディー．エル．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（Ｗｕ．Ｙ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．；ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、７６２１〜７６３２ページ。２．「遺伝子アルファベットの拡大に対する取り組み：非常に安定な自己対合疎水性塩基のＤＮＡポリメラーゼ認識（Efforts toward expansion of the genetic alphabet: DNA polymerase recognition
of a highly stable, self-pairing hydrophobic base. ）」、マクミン、ディー．エル．；オガワ、エー．ケー．；ウー．ワイ．；リウ、ジェー．；シュルツ、ピー．ジー．；ロメスベルグ、エフ．イー．（ＭｃＭｉｎｎ，Ｄ．Ｌ．；Ｏｇａｗａ，Ａ．Ｋ．；Ｗｕ．Ｙ．；Ｌｉｕ，Ｊ．；Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．；Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，Ｆ．Ｅ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９年、第１２１巻、１１５８５〜１１５８６ページ）
（「非水素結合及び非形状相補的塩基対を含有する安定なＤＮＡ二本鎖：安定性決定因子としての鎖間スタッキング（A stable DNA duplex containing a non-hydrogen-bonding and non-shape complementary base couple: Interstrand stacking as the stability
determining factor.）」、ボロッツチー、シー．；ハベルリー、エー．；ロイマン、シー（Ｂｒｏｔｓｃｈｉ，Ｃ．；Ｈａｒｂｅｒｌｉ，Ａ．；Ｌｅｕｍａｎｎ，Ｃ、Ｊ．）、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、２００１年、第４０巻、３０１２〜３０１４ページ）
（「２，２’−ビピリジンリガンドシド：二本鎖内金属錯体によりＤＮＡを修飾するための新規構成単位（2,2'-Bipyridine Ligandoside: A novel building block for modifying DNA with intra-duplex metal complexes.）」、ワイツマン、エイチ．；トル、ワイ（Ｗｅｉｚｍａｎｎ，Ｈ．；Ｔｏｒ，Ｙ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００１年、第１２３巻、３３７５〜３３７６ページ）
【０４８５】
【化６３】
2007525454.tif 000066
【０４８６】
（「副溝の水和は、ＤＮＡ二本鎖の安定性に重要である（Minor groove hydration is critical to the stability of DNA duplexes.）」、ラン、ティー．；マクロウグリン、エル．ダブリュ（Ｌａｎ，Ｔ．；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｌ．Ｗ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、６５１２〜６５１３ページ）
【０４８７】
【化６４】
2007525454.tif 000067
【０４８８】
（「隣接天然塩基の選択性に対する普遍的塩基である３−ニトロピロールの影響（Effects of the Universal base 3-nitropyrrole on the selectivity of neighboring natural bases. ）」、オリバー、ジェー．エス．；パーカー、ケー．エー．；サッグス、ジェー．ダブリュ．（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｐａｒｋｅｒ，Ｋ．Ａ．；Ｓｕｇｇｓ，Ｊ．Ｗ）、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔ．、２００１年、第３巻、１９７７〜１９８０ページ。２．「ＤＮＡ二本鎖及び三本鎖の安定性に対する１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール残基の影響（Effects of the 1-(2'-deoxy- β-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol residue on the stability of DNA duplexes and triplexes. ）」、アモソバ、オー，；ジョージ  ジェー．；フレスコ、ジェー．アール．（Ａｍｏｓｏｖａ，Ｏ．；Ｇｅｏｒｇｅ  Ｊ．；Ｆｒｅｓｃｏ，Ｊ．Ｒ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７年、第２５巻、１９３０〜１９３４ページ。３．「普遍的ヌクレオシド：１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロールによる合成、構造及びデオキシリボ核酸シーケンシング（Synthesis, structure and deoxyribonucleic acid sequencing with a universal nucleosides: 1-(2'-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol.）」、バーグストロム、ディー．イー．；ツァング、ピー．；トマ、ピー．エイチ．；アンドリュース、ピー．シー．；ニコルズ、アール．（Ｂｅｒｇｓｔｏｒｍ，Ｄ．Ｅ．；Ｚｈａｎｇ，Ｐ．；Ｔｏｍａ，Ｐ．Ｈ．；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｃ．；Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｒ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年、第１１７巻、１２０１〜１２０９ページ）
【０４８９】
【化６５】
2007525454.tif 000068
【０４９０】
（「一般的な三本鎖ＤＮＡ認識スキームを対象とするモデル研究：有機溶媒中でＣＧ塩基対を結合する新規ＤＮＡ塩基（Model studies directed toward a general triplex DNA recognition scheme: a novel DNA base that binds a CG base-pair in an organic s
olvent. ）」、ジマーマン、エス．シー．；シュミット、ピー．（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｃ．；Ｓｃｈｍｉｔｔ，Ｐ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９５年、第１１７巻、１０７６９〜１０７７０ページ）
【０４９１】
【化６６】
2007525454.tif 000069
【０４９２】
（「普遍的光切断ＤＮＡ塩基：ニトロピペロニル２’−デオキシリボシド（A universal, photocleavable DNA base: nitropiperonyl 2'-deoxyriboside.）」、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、２００１年、第６６巻、２０６７〜２０７１ページ）
【０４９３】
【化６７】
2007525454.tif 000070
【０４９４】
（「２−アシルアミノ−１，８−ナフチリジンによる単一グアニンバルジの認識（Recognition of a single guanine bulge by 2-acylamino-1,8-naphthyridine. ）」、ナカタニ、ケー．；サンド、エス．；サイトー、アイ．（Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．；Ｓａｎｄｏ，Ｓ．；Ｓａｉｔｏ，Ｉ．）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００年、第１２２巻、２１７２〜２１７７ページ。ｂ．「ＧＣダブレットの光酸化により明らかであるような単一グアニンバルジへの２−アミノ−１，８−ナフチリジンの特異的結合（Specific binding of 2-amino-1,8- naphthyridine into single guanine bulge as evidenced by photooxidation of GC doublet.）」、ナカタニ、ケー．；サンド、エス．；ヨシダ、ケー．；サイトー、アイ．（Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｋ．；Ｓａｎｄｏ，Ｓ．；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｋ．；Ｓａｉｔｏ，Ｉ．）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、２００１年、第１１巻、３３５〜３３７ページ）
【０４９５】
【化６８】
2007525454.tif 000071
【０４９６】
非対称的な修飾
本明細書中に記載するように、かつ２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（参照により本明細書に援用される）に記載されるように非対称的に修飾可能なＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。
【０４９７】
非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤とは、鎖が他方の鎖上に存在しない修飾を有するｉＲＮＡ剤である。非対称的な修飾とは、一方の鎖上に見られるが、他方の鎖上には見られない修飾である。任意の修飾、例えば本明細書中に記載する任意の修飾は、非対称的な修飾として存在し得る。非対称的な修飾により、修飾に伴う任意の望ましい特性、例えば本明細書中で論述した特性を付与することができる。例えば、非対称的な修飾は、分解に対する耐性、半減期の変更をもたらすこともできるし、ｉＲＮＡ剤に特定の標的（例えば、特定の組織）を指向させることもできるし、鎖のその相補体又は標的配列に対する親和性を調節（例えば、増大又は低減）することもできるし、あるいは末端部分の修飾（例えば、キナーゼ又はＲＩＳＣ機構の経路に関与する他の酵素による修飾）を妨害又は促進することもできる。ある修飾について１つの特性を有するものとして指定しても、該修飾が他の特性を有していないことを意味するわけではない（例えば、安定化を促進する修飾として言及される修飾が、標的化も増強することもありうる）。
【０４９８】
理論又はいかなる特定の機構モデルによっても拘束されることは望まないが、非対称的な修飾は、ｉＲＮＡ剤をセンス鎖及びアンチセンス鎖の異なるすなわち「非対称的」機能という観点で最適化させることが可能であると考えられる。例えば、両方の鎖がヌクレアーゼ耐性を増大するように修飾されてもよいが、変更によってはＲＩＳＣ活性が阻害され得るため、これらの変更をセンス鎖に関して選択してもよい。さらに、一部の修飾、例えば標的化部分は、例えばＲＩＳＣ複合体の切断活性を妨害しうる大きな嵩高い基を付加することができるので、そのような修飾はセンス鎖に配置されることが好ましい。したがって、標的化部分、特に嵩高い標的化部分（例えば、コレステロール）は、センス鎖に優先的に付加される。一実施形態では、バックボーンのリン酸をＳで置換する非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾がアンチセンス鎖に存在し、かつ２’修飾、例えば２’ＯＭｅがセンス鎖に存在する。標的化部分は、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖の５’又は３’末端のいずれか（又は両方）に存在し得る。好ましい例では、アンチセンス鎖においてはバックボーンのＰがＳで置き換えられ、２’ＯＭｅがセンス鎖に存在し、標的化部分がｉＲＮＡ剤のセンス鎖の５’又は３’末端のいずれかに付加される。
【０４９９】
好ましい実施形態では、非対称的に修飾されたｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖上では見られない修飾をセンス鎖上に有し、アンチセンス鎖は、センス鎖上では見られない修飾を有する。
【０５００】
鎖はそれぞれ、１つ又はそれ以上の非対称的修飾を包含し得る。例を挙げると、一方の鎖は、ｉＲＮＡ剤に対して第１の特性を付与する第１の非対称的修飾を包含することができ、他方の鎖は、ｉＲＮＡに対して第２に特性を付与する第２の非対称的修飾を有することができる。例えば、一方の鎖、例えばセンス鎖は、ｉＲＮＡ剤が組織を標的とするような修飾を有することができ、他方の鎖、例えばアンチセンス鎖は、標的遺伝子配列とのハイブリダイゼーションを促進する修飾を有する。
【０５０１】
幾つかの実施形態では、両方の鎖が同じ特性を最適化するように、例えば核酸分解に対する耐性を増大させるように修飾することができるが、例えば修飾がさらに他の特性に影響を及ぼすという理由で、センス鎖及びアンチセンス鎖に関して異なる修飾が選ばれる。例えば、一部の変更は、ＲＩＳＣ活性に影響を及ぼし得るため、これらの修飾はセンス鎖について選ばれる。
【０５０２】
ある実施形態では、一方の鎖は、非対称的な２’修飾、例えば２’ＯＭｅ修飾を有し、他方の鎖は、リン酸バックボーンの非対称的修飾、例えばホスホロチオエート修飾を有する。したがって、一実施形態では、アンチセンス鎖が非対称的な２’ＯＭｅ修飾を有し、センス鎖が非対称的なホスホロチオエート修飾を有する（あるいは、その逆でもよい）。特に好ましい実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤は、センス鎖上に非対称的な２’−Ｏアルキル、好ましくは２’−ＯＭｅ修飾を、アンチセンス鎖には非対称的なバックボーンのＰ修飾、好ましくはホスホロチオエート修飾を有する。１つ又は多数の２’−ＯＭｅ修飾が存在することができ、例えば、センス鎖の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個のサブユニットを２’−ＯＭｅ修飾することができる。１つ又は多数のホスホロチオエート修飾が存在することができ、例えば、アンチセンス鎖の少なくとも２個、３個、４個、５個又は６個のサブユニットをホスホロチオエート修飾することができる。センス鎖上に多数の２’−ＯＭｅ修飾及びアンチセンス鎖上に多数のホスホロチオエート修飾が存在するｉＲＮＡ剤を有することが好ましい。一方又は両方の鎖上のすべてのサブユニットを前記のように修飾することもできる。両方の鎖上の多数の非対称的修飾の特に好ましい実施形態は、長さが約２０〜２１サブユニット、好ましくは１９サブユニットの二本鎖領域、及び長さが約２サブユニットの１個又は２個の３’突出部を有する。
【０５０３】
非対称的な修飾は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼによる分解に対する耐性を促進するのに有用である。ｉＲＮＡ剤は、分解に対する耐性を促進する１つ又はそれ以上の非対称的修飾を包含することができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。鎖上のすべてではないにしても、ほとんどの部位が、エンドヌクレアーゼによる分解に対してある程度弱い。相対的に弱い部位を特定し、分解を阻害する非対称的修飾を挿入することができる。多くの場合、ｉＲＮＡ剤におけるＵＡ部位の非対称的修飾を提供することが望ましく、場合によっては、両方の鎖上のＵＡ配列に非対称的修飾を提供することが望ましい。エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出すことができる。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば特にセンス鎖上のＵへの２’ＯＭｅ部分の付与）、バックボーンの修飾（例えば、特にアンチセンス鎖上のＵ若しくはＡ又はその両方についてリン酸バックボーンのＯをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）による修飾）、ＵをＣ５アミノリンカーで置き換えること、ＡをＧで置き換えること（配列の変更は、センス鎖上に位置し、アンチセンス鎖上には位置しないことが好ましい）、及び２’、６’、７’又は８’位の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、１つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在しない実施形態、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態である。
【０５０４】
非対称的な修飾は、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害するために使用することができる。非対称的な修飾としては、一方の鎖のみが修飾されるもの、ならびに両方が修飾されるものを挙げることができる。好ましい実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾は、標的のサイレンシングを妨害しない修飾、例えば標的の切断を妨害しない修飾である。幾つかの実施形態は、センス鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端に、及びアンチセンス鎖上、例えば３’突出部の例えば３’末端に、非対称的修飾を有する。修飾により異なるサイズの構成部分が導入される場合、大きいほうがセンス鎖上に存在することが好ましい。修飾により異なる電荷の構成部分が導入される場合、より大きな電荷を有する部分がセンス鎖上に存在することが好ましい。
【０５０５】
エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書中に見出すことができる。特に好適な修飾としては、２’位修飾（例えば３’突出部の例えば３’末端への２’ＯＭｅ部分の提供（３’末端とは、文脈により示されるように、分子の３’位の原子、又は最も３’側の構成部分、例えば最も３’側のＰ又は２’位を意味する））、例えばＰをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用によるバックボーンの修飾、２’位修飾の組合せ（例えば、２’ＯＭｅ部分の提供と、例えばＰをＳで置き換えること（例えば、ホスホロチオエート修飾の提供）もしくは３’突出部の例えば３’末端におけるメチル化Ｐの使用によるバックボーンの修飾との組合せ）、３’アルキルによる修飾、３’突出部の例えば３’末端における脱塩基ピロリジンによる修飾、ナプロキセン、イブプロフェン又はその他の分解を阻害する構成部分による３’末端の修飾が挙げられる。好ましい実施形態は、１つ又はそれ以上のこれらの修飾がセンス鎖上に存在するが、アンチセンス鎖上には存在しないもの、あるいはアンチセンス鎖のほうがこのような修飾の数が少ない実施形態である。
【０５０６】
標的化に影響を及ぼす修飾、例えば本明細書中に記載する修飾を、非対称的修飾として提供することが可能である。例えば標的の切断を阻害することにより、サイレンシングを阻害し得る標的化修飾は、センス鎖の非対称的修飾として提供され得る。体内分布を変化させる構成部分（例えばコレステロール）は、センス鎖における１つ又はそれ以上（例えば、２つ）の非対称的修飾として提供され得る。比較的大きな分子量（例えば４００、５００又は１，０００ダルトンを上回る分子量）を有する構成部分を導入する標的化修飾、あるいは電荷を有する構成部分（例えば、２つ以上の正電荷又は１つの負電荷を有する構成部分）を導入する標的化修飾は、センス鎖上に配置させることができる。
【０５０７】
鎖のその相補体又は標的に対する親和性を調節する（例えば、増大又は低下させる）修飾、例えば本明細書中に記載する修飾は、非対称的修飾として提供され得る。これらの修飾としては、５メチルＵ、５メチルＣ、プソイドウリジン、ロックト核酸、２チオＵ及び２−アミノ−Ａが挙げられる。幾つかの実施形態では、これらの１つ又はそれ以上がアンチセンス鎖上に提供される。
【０５０８】
ｉＲＮＡ剤は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する規定構造を有し、多くの場合例えば２又は３ヌクレオチドの短い一本鎖の突出部が、一方又は両方の３’末端に存在する。非対称的な修飾を、例えばｉＲＮＡ内に選択的に位置させることにより、このような構造の活性を最適化するのに使用することができる。例えば、センス鎖の５’末端及びアンチセンス鎖の３’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端領域は、機能にとって重要である。この領域は、末端の２個、３個又は４個のヌクレオチド対と任意の３’突出部とを含むことができる。好ましい実施形態では、以下、すなわち：センス鎖のキナーゼ活性化を阻害するセンス鎖５’末端の修飾（例えば、キナーゼ分子を標的とする複合体の結合、又は５’エキソヌクレアーゼによる分解に対して保護的に作用する修飾の使用など）、又はセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を増強することにより分子のこの末端にある「緊密
な」構造を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の修飾、のうち１つ又はそれ以上をもたらす非対称的修飾が使用される。
【０５０９】
センス鎖の３’末端及びアンチセンス鎖の５’末端により規定されるｉＲＮＡ剤の末端領域もまた機能にとって重要である。この領域は、末端の２個、３個又は４個のヌクレオチド対と任意の３’突出部とを含むことができる。好ましい実施形態は、センス鎖とアンチセンス鎖との間の結合を減少させることにより分子のこの末端にある「開放的な」構造を促進する、いずれか一方の鎖、好ましくはセンス鎖の非対称的修飾を包含する。このような修飾としては、分子を標的とする複合体を配置すること、あるいはセンス鎖のこの領域におけるヌクレアーゼ耐性を促進する修飾が挙げられる。キナーゼ活性化を阻害するアンチセンス鎖の修飾は、好ましい実施形態では回避される。
【０５１０】
センス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられる。
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き換えること、又はアルキル若しくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオエート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含む；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するのに使用することができる；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）、３’−Ｏアルキル（例えば、３’−ＯＭｅ）（末端及び内部位置の少なくともいずれかを修飾）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を増強するために使用することができ、３’位修飾は、ＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することができる；
（ｃ）２’〜５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの、及びＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによるもの）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有する２’Ｌ−リボース、Ｌ−アラビノース）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｅ）修飾糖（例えば、ロックト核酸（ＬＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）及びシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ））；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を阻害するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、又はアンチセンス鎖へのセンス鎖の結合を促進するために使用することができる；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために使用することができる；
（ｈ）複合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質；これらの修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するため、又は分子を標的化するために使用することもできるし、あるいはＲＩＳＣによるセンス鎖活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端で使用することもできる。
【０５１１】
アンチセンス鎖に非対称的に配置される例示的な修飾としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）バックボーン修飾（例えば、バックボーンのＰの修飾）であって、ＰをＳで置き換えること、又はアルキル若しくはアリル（例えば、Ｍｅ）で置換されたＰ、及びジチオエート（Ｓ−Ｐ＝Ｓ）を含む；
（ｂ）２’−Ｏアルキル（例えば、２’−ＯＭｅ）（末端位置を修飾）；
（ｃ）２’〜５’結合（２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅによるもの（例えば、３’末端での末端修飾）；Ｐ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好ましくは３’末端の修飾）；これらの修飾は、キナーゼ活性のようなＲＩＳＣ酵素活性を妨害し得るため、５’末端領域からは排除されることが好ましい；
（ｄ）Ｌ糖（例えば、２’−Ｈ、２’−ＯＨ及び２’−ＯＭｅを有するＬ−リボース、Ｌ−アラビノース）；例えば、３’末端での末端修飾；例えばＰ＝Ｏ又はＰ＝Ｓによる好ましくは３’末端の修飾；これらの修飾は、キナーゼ活性を妨害し得るため、５’末端領域から排除されることが好ましい；
（ｅ）修飾糖（例えば、ＬＮＡ、ＨＮＡ及びＣｅＮＡ）；これらの修飾は、センス鎖とアンチセンス鎖との間の対合の望ましくない増強に寄与し得るが、多くの場合は５’領域において「緩い」構造を有することが好ましいので、さらに該修飾はキナーゼ活性を妨害し得るので、５’末端領域からは排除されることが好ましい；
（ｆ）核酸塩基修飾（例えば、Ｃ−５修飾ピリミジン、Ｎ−２修飾プリン、Ｎ−７修飾プリン、Ｎ−６修飾プリン）；
（ｇ）カチオン基及び双性イオン基（末端にあることが好ましい）；
複合体基（末端位置にあることが好ましい）、例えば、ナプロキセン、ビオチン、コレステロール、イブプロフェン、葉酸、ペプチド及び糖質であって、但し、嵩高い基又は概してＲＩＳＣ活性を阻害する基はあまり好ましくないはずである。
【０５１２】
アンチセンス鎖の５’−ＯＨは、活性を促進するように遊離型に保たれるべきである。幾つかの好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ耐性を促進する修飾は、３’末端、特に３’突出部に包含されるべきである。
【０５１３】
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤を最適化する方法、例えば安定化する方法を特徴とする。該方法は、活性を有する配列を選択すること、該配列に１つ又はそれ以上の非対称的な修飾を導入することを包含し、非対称的な修飾の導入によりｉＲＮＡ剤の特性が最適化されるが、活性の減少はもたらされない。
【０５１４】
活性の減少とは、予め選択されたレベルの減少よりも小さい減少とすることができる。好ましい実施形態では、活性の減少とは、修飾が導入されないこと以外は同じｉＲＮＡと比較した場合に、５％、１０％、２０％、４０％又は５０％未満の減少であることを意味する。活性は、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定することができ、いずれにおける結果も、所要の活性維持を実証するのに十分である。
【０５１５】
最適化される特性は、本明細書中に記載する任意の特性、特に本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションで論述する特性であり得る。修飾は、任意の非対称的な修飾、例えば、本明細書中の非対称的な修飾に関するセクションで記載する非対称的な修飾であり得る。特に好ましい非対称的な修飾は、特にセンス配列における２’−Ｏアルキル修飾（例えば２’−ＯＭｅ修飾）、及びアンチセンス鎖におけるバックボーンのＯの修飾、特にホスホロチオエート修飾である。
【０５１６】
好ましい実施形態では、センス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される一方で、他の実施形態ではアンチセンス配列が選択されて非対称的な修飾が付与される。幾つかの実施形態では、センス配列及びアンチセンス配列がともに選択され、それぞれ１つ又はそれ以上の非対称的な修飾が付与される。
【０５１７】
多数の非対称的な修飾が、センス配列及びアンチセンス配列の一方又は両方に導入され得る。配列は、少なくとも２個、４個、６個、８個又はそれ以上の修飾を有することができ、配列のすべてのモノマー又は実質的にすべてのモノマーを修飾することができる。
【０５１８】
表２は、選択された修飾を有する鎖Ｉ及び選択された修飾を有する鎖ＩＩを有する例を示す。
【０５１９】
【表２】
2007525454.tif 000072
【０５２０】
Ｚ−Ｘ−Ｙ構成様式
本明細書中に記載の、ならびに２００３年１０月９日付けで出願された同時係属中の共同所有されている米国仮出願第６０／５１０，２４６号（これは、参照により本明細書中に援用される）、２００３年１０月１０日付けで出願された同時係属中の共同所有されている米国仮出願第６０／５１０，３１８号（これは、参照により本明細書中に援用される）及び２００４年３月８日付けで出願された同時係属出願中の共同所有されている国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号に記載のＺ−Ｘ−Ｙ構成様式又は構造を有するＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。
【０５２１】
したがって、ｉＲＮＡ剤は、第１のセグメントであるＺ領域、第２のセグメントであるＸ領域、及び任意選択で第３の領域であるＹ領域：
Ｚ−Ｘ−Ｙ
を有することができる。
【０５２２】
一方ではＺ及び／又はＹの一方又は両方、かつ他方ではＸにおけるサブユニットを修飾することが望ましい場合がある。場合によっては、サブユニットは、同じ修飾又は同じ種類の修飾を有するが、Ｚ及び／又はＹにおいて施される修飾は、Ｘにおいて施される修飾と異なる場合のほうが多い。
【０５２３】
Ｚ領域は通常、ｉＲＮＡ剤の末端を包含する。Ｚ領域の長さは多様であり得るが、通常２〜１４個、より好ましくは２〜１０個のサブユニットの長さである。通常、Ｚ領域は一本鎖状である（すなわちＺ領域は、別の鎖の塩基と塩基対合しない）が、幾つかの実施形態では、自己会合して、例えばループ構造を形成し得る。このような構造は、鎖の末端が折り返して鎖内二本鎖を形成することにより形成され得る。例えば、通常２個又はそれ以上の対合しないサブユニットでできた折り返し領域又は接続領域を有する２個、３個、４個、５個又はそれ以上の鎖内塩基対が生じ得る。これは、鎖の一方の末端で生じてもよいし両末端で生じてもよい。Ｚ領域の典型的な実施形態は、一本鎖突出部、例えば本明細書の他の箇所に記載する長さの突出部である。したがって、Ｚ領域は、３’又は５’末端の一本鎖でもよいし、又は３’又は５’末端の一本鎖を包含していてもよい。Ｚ領域はセンス鎖でもアンチセンス鎖でもよいが、アンチセンスである場合には、領域は３−突出部であることが好ましい。Ｚ領域における典型的なサブユニット間結合としては、Ｐ＝Ｏ、Ｐ＝Ｓ、Ｓ−Ｐ＝Ｓ、Ｐ−ＮＲ２及びＰ−ＢＲ２が挙げられる。キラルＰ＝Ｘ（式中、Ｘは、Ｓ、Ｎ又はＢである）のサブユニット間結合もまた存在することができる（これらのサブユニット間結合は、本明細書中の他の箇所でより詳細に論述している）。他の好ましいＺ領域サブユニット修飾（同様に本明細書中の他の箇所で論述）としては、３’−ＯＲ、３’ＳＲ、２’−ＯＭｅ、３’−ＯＭｅ及び２’ＯＨ修飾ならびに構成部分、α立体配置の塩基、ならびに２’アラビノ修飾を挙げることができる。
【０５２４】
Ｘ領域は多くの場合、一本鎖ｉＲＮＡ剤の場合には一本鎖の対応する領域とともに、あるいは二本鎖のｉＲＮＡ剤の場合には他方の鎖の対応する領域とともに、二本鎖状をなしている。Ｘ領域の長さは多様であり得るが、通常１０〜４５個、より好ましくは１５〜３５個のサブユニットである。特に好ましい領域Ｘは、１７個、１８個、１９個、２９個、２１個、２２個、２３個、２４個又は２５個のヌクレオチド対を包含するが、他の適切な長さは、本明細書中の他の箇所で記載されており、それらを使用することができる。典型的なＸ領域のサブユニットとしては、２’−ＯＨサブユニットが挙げられる。典型的な実施形態では、サブユニット間リン酸結合が好ましい一方で、ホスホロチオエート又は非リン酸結合は存在しない。Ｘ領域において好ましい他の修飾としては、結合を改善するための修飾（例えば、核酸塩基修飾）、カチオン性核酸塩基修飾、及びＣ−５修飾ピリミジン（例えば、アリルアミン）が挙げられる。幾つかの実施形態は、４個又はそれ以上の連続した２’ＯＨサブユニットを有する。ホスホロチオエートの使用は好ましくないこともあるが、４個未満の連続した２’ＯＨサブユニットを結合する場合に使用することもできる。
【０５２５】
Ｙ領域は概して、Ｚ領域に関して記載されたパラメータに準ずる。しかしながら、Ｘ領域及びＺ領域は同じである必要はなく、異なる種類及び異なる数の修飾が存在することができ、実際、一方は通常３’突出部であり、一方は通常５’突出部である。
【０５２６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２’ＯＨが例えば２’−ＯＭｅ又は他のアルキルで置換されたリボヌクレオシドをそれぞれが有するＹ及び／又はＺ領域、ならびに２’−ＯＨが非置換のままである少なくとも４個の連続したリボヌクレオシドサブユニットを含むＸ領域を有する。
【０５２７】
ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合（サブユニット間の結合）は、例えば分解に対する耐性を促進するために修飾されてもよい。このような修飾の数多くの例が本明細書中に開示さ
れており、その一例がホスホロチオエート結合である。これらの修飾は、領域Ｘ、Ｙ及びＺのいずれかのサブユニット間に付与することができる。しかしながら、それらの修飾は最小限に抑えられることが好ましく、特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい。
【０５２８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２’ＯＨが例えば２’−ＯＭｅで置換されたリボヌクレオシドをそれぞれが有するＹ及びＺ領域、ならびに２’−ＯＨが非置換のままである少なくとも４個の連続したサブユニット（例えば、リボヌクレオシドサブユニット）を含むＸ領域を有する。
【０５２９】
上述のように、ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合は、例えば分解に対する耐性を促進するために修飾されてもよい。これらの修飾は、領域Ｙ、Ｘ及びＺのいずれかのサブユニット間に付与することができる。しかしながら、修飾は最小限に抑えられることが好ましく、特に連続した修飾結合は回避されることが好ましい。
【０５３０】
したがって、好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤のサブユニット結合のすべてが修飾されるわけではなく、より好ましくは、ホスホジエステル結合以外の結合により連結された連続サブユニットの最大数は、２個、３個又は４個である。特に好ましいｉＲＮＡ剤は、サブユニットがそれぞれ修飾結合（すなわちＲＮＡ及びＤＮＡで天然に見られるホスホジエステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化するように修飾された結合）により結合された４個又はそれ以上の連続したサブユニット、例えば２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを持たない。
【０５３１】
領域Ｘにおける上記修飾を最小限に抑えることが特に好ましい。したがって、好ましい実施形態では、Ｘにおけるヌクレオシドサブユニット結合のそれぞれがホスホジエステル結合であるか、あるいは領域Ｘのサブユニット結合が修飾される場合、このような修飾は最小限に抑えられる。例えば、Ｙ及び／又はＺ領域は、分解に対して安定化されたサブユニット間結合を包含することができるが、このような修飾はＸ領域では最小限に抑えられ、特に連続した修飾は最小限に抑えられる。したがって、好ましい実施形態ではホスホジエステル結合以外で結合される連続したサブユニットの最大数は、２個、３個又は４個である。特に好ましいＸ領域は、サブユニットがそれぞれ修飾結合（すなわちＲＮＡ及びＤＮＡで天然に見られるホスホジエステル結合と比較した場合に分解に対して結合を安定化するように修飾された結合）により結合された４個又はそれ以上の連続したサブユニット、例えば２’−ヒドロキシルリボヌクレオシドサブユニットを持たない。
【０５３２】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺは、ホスホロチオエート結合を含まないが、一方又は両方が他の修飾、例えばサブユニット結合の他の修飾を含有してもよい。
好ましい実施形態では、領域Ｘ、あるいは場合によっては全ｉＲＮＡ剤が、同一の２’部分を有する３個以下又は４個以下のサブユニットを有する。
【０５３３】
好ましい実施形態では、領域Ｘ、あるいは場合によっては全ｉＲＮＡ剤が、同一のサブユニット結合を有する３個以下又は４個以下のサブユニットを有する。
好ましい実施形態では、１つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合（又はサブユニット結合の他の修飾）がＹ及び／又はＺ中に存在するが、このような修飾結合は、２’位修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル部分）を有する隣接した２つのサブユニット（例えばヌクレオシド）を結合しない。例えば、Ｙ及び／又はＺにおけるすべての隣接した２’−Ｏ−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以外の結合により接続される。
【０５３４】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺのそれぞれが独立して、２’位修飾を有する隣接したヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の
間に１つだけホスホロチオエート結合を有する。Ｙ及び／又はＺにおいて、２’修飾を有する隣接したヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）がもう１組存在する場合、この第２の組は、ホスホロチオエート結合以外の結合、例えばホスホロチオエート結合以外の修飾結合により接続される。
【０５３５】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺのそれぞれが独立して、２’位修飾を有するヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の隣接した対を結合する２個以上のホスホロチオエート結合を有するが、２’位修飾を有するヌクレオシドなどのサブユニット（例えば、２’−Ｏ−アルキルヌクレオシド）の隣接したサブユニットのうち少なくとも１対は、ホスホロチオエート以外の結合、例えばホスホロチオエート結合以外の修飾結合により結合される。
【０５３６】
好ましい実施形態では、Ｙ及び／又はＺにおける隣接したサブユニットに関する上述の制限の１つが、Ｘにおけるサブユニットに関する制限と組み合わされる。例えば、１つ又はそれ以上のホスホロチオエート結合（又はサブユニット結合の他の修飾）がＹ及び／又はＺ中に存在するが、このような修飾結合は、２’修飾（例えば、２’−Ｏ−アルキル部分）を有するヌクレオシドなど、２つの隣接したサブユニットを結合しない。例えば、Ｙ及び／又はＺのあらゆる隣接した２’−Ｏ−アルキル部分は、ホスホロチオエート結合以外の結合により接続される。さらに、Ｘ領域は、３個以下又は４個以下の同一のサブユニット（例えば同一の２’部分を有するサブユニット）を有するか、あるいはＸ領域は、３個以下又は４個以下の同一のサブユニット結合を有するサブユニットを有する。
【０５３７】
Ｙ領域及び／又はＺ領域は、少なくとも１個、好ましくは２個、３個又は４個の本明細書中に開示する修飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中に記載する任意の修飾（例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブユニット、修飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット、及び別の構成部分（例えば、標的化部分）に連結されたサブユニット）から選ぶことができる。好ましい実施形態では、２個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾つかの実施形態では、１個以下、２個以下、３個以下又は４個以下のこのような修飾が行われるか、又は連続して行われることが好ましい。好ましい実施形態では、修飾の頻度は、Ｙ及び／又はＺとＸとの間で異なり、例えば、修飾は、Ｙ及び／又はＺとＸとのうち一方に存在し、他方には存在しない。
【０５３８】
Ｘ領域は、本明細書中に開示する少なくとも１個、好ましくは２個、３個又は４個の修飾を包含することができる。このような修飾は、独立して、本明細書中に記載する任意の修飾から（例えば、ヌクレアーゼ耐性サブユニット、修飾塩基を有するサブユニット、修飾サブユニット間結合を有するサブユニット、修飾糖を有するサブユニット、及び別の構成部分（例えば、標的化部分）に連結されたサブユニットから）選ぶことができる。好ましい実施形態では、２個以上のこのようなサブユニットが存在し得るが、幾つかの実施形態では、１個以下、２個以下、３個以下又は４個以下のこのような修飾が行われるか、又は連続して行われることが好ましい。
【０５３９】
ＲＲＭＳ（本明細書中の他の箇所に記載する）は、二本鎖のｉＲＮＡ剤の一方又は両方の鎖の１つ又はそれ以上の部位に導入することができる。ＲＲＭＳは、Ｙ及び／又はＺ領域においては、センス鎖の３’若しくは５’末端又はその付近（末端から１、２又は３位以内）に、あるいはアンチセンス鎖の３’末端又はその付近（末端から２又は３位以内）に配置させることができる。幾つかの実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端又はその付近（５’末端から１、２又は３位以内）にＲＲＭＳを有していないことが好ましい。ＲＲＭＳをＸ領域に配置することも可能であり、好ましくはセンス鎖に、あるいは標的に対するアンチセンス鎖の結合に重要でないアンチセンス鎖の領域に配置されることになる。
【０５４０】
末端における二本鎖の安定性の差次的修飾
一態様では、末端における二本鎖の安定性の差次的修飾（ＤＭＴＤＳ）を有するｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。
【０５４１】
さらに、ＤＭＴＤＳ及び本明細書中に記載の別の構成要素を有するｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。例えば、本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤、例えば、パリンドローム構造のｉＲＮＡ剤、非標準的な対合を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する遺伝子（例えば、腎臓で活性な遺伝子）を標的とするｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する構成様式又は構造を有するｉＲＮＡ剤、本明細書中に記載する両親媒性送達剤と結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載する薬物送達モジュールと結合されたｉＲＮＡ、本明細書中に記載するように投与されるｉＲＮＡ剤、又は本明細書中に記載するように製剤化されるｉＲＮＡ剤であって、ＤＭＴＤＳも取り入れるｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。
【０５４２】
ｉＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖二本鎖の５’末端の領域において、該二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させること（二本鎖の会合の自由エネルギーを減少させること）により最適化することができる。このことは、例えば、アンチセンス鎖の５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるサブユニットを含めることにより達成することができる。また、５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を増大させるリガンドを結合することにより達成することもできる。理論により拘束されることを望まないが、その効果は、ヘリカーゼのような酵素の作用を促進すること、例えばアンチセンス鎖の５’末端に近接した酵素の作用を促進することに起因し得る。
【０５４３】
本発明者等はまた、アンチセンス鎖二本鎖の３’末端の領域において、該二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させること（二本鎖の会合の自由エネルギーを増大させること）により最適化することができることも発見した。このことは、例えばアンチセンス鎖の３’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させるサブユニットを含めることにより達成することができる。また、５’末端の領域に、二本鎖が解離又は融解する傾向を減少させるリガンドを結合することにより達成することもできる。
【０５４４】
二本鎖の５’末端が解離する傾向を増大させる修飾は、単独で、あるいは本明細書中に記載する他の修飾と、例えば二本鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾と併用して使用することができる。同様に、二本鎖の３’末端が解離する傾向を減少させる修飾は、単独で、あるいは本明細書中に記載する他の修飾と、例えば二本鎖の５’末端が解離する傾向を増大させる修飾と併用して使用することができる。
【０５４５】
二本鎖のＡＳ  ５’末端の安定性の減少
サブユニット対は、解離又は融解を促進するそれらの傾向に基づいて順位付けすることができる（例えば、特定の対の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単なアプローチは、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる）。解離を促進するという観点では、
Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｇ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、
Ｉ：Ｃは、Ｇ：Ｃよりも好ましく（Ｉ＝イノシン）；
ミスマッチ、例えば非標準的な対合すなわち標準的対合以外の対合（本明細書中の他の箇所に記載するようなもの）は、標準的な（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対よりも好ましく；
普遍的塩基を含む対合は、標準的な対合よりも好ましい。
【０５４６】
典型的なｄｓ  ｉＲＮＡ剤は、以下の通りに図示することができる：
【０５４７】
【化６９】
2007525454.tif 000073
【０５４８】
Ｓはセンス鎖を示し、ＡＳはアンチセンス鎖を示し、Ｒ１は任意選択の（かつ好ましくない）５’センス鎖突出部を示し、Ｒ２は任意選択の（しかし、好ましい）３’センス突出部を示し、Ｒ３は任意選択の（しかし、好ましい）３’アンチセンス突出部を示し、Ｒ４は任意選択の（かつ好ましくない）５’アンチセンス突出部を示し、Ｎはサブユニットを示し、［Ｎ］は、さらなるサブユニット対が存在し得ることを示し、Ｐｘは、センス鎖のＮｘとアンチセンス鎖のＮｘとの対を示す。突出部は、Ｐ図では示していない。幾つかの実施形態では、本明細書中の他の箇所に記載するように、３’ＡＳ突出部は領域Ｚに相当し、二本鎖領域は領域Ｘに相当し、３’Ｓ鎖突出部は領域Ｙに相当する。（図は、最大又は最小の長さを暗に示すことを意味するものではなく、長さに関するガイダンスは、本明細書中の他の箇所に提供される）。
【０５４９】
二本鎖を形成する傾向を減少させる対合が、ＡＳ鎖の５’末端で二本鎖の１個又はそれ以上の位置において使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖に関しては最も５’側の対）は、Ｐ−１と称され、それに続く二本鎖内の対合の位置（ＡＳ鎖から見ると３’方向に向かっていく）は、Ｐ−２、Ｐ−３、Ｐ−４、Ｐ−５等と称される。二本鎖形成を調節する修飾を施すための好ましい領域は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より好ましくはＰ−４〜Ｐ−１、さらに好ましくはＰ−３〜Ｐ−１である。Ｐ−１の修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（複数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数可）との併用でもよい。上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群：
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
ミスマッチな対、例えば非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対、あるいは普遍的塩基を含む対合
から選ばれることが好ましい。
【０５５０】
好ましい実施形態では、解離を促進する対合を達成するのに必要とされるサブユニットの変更はセンス鎖で行われるが、幾つかの実施形態では、該変更がアンチセンス鎖で行われる。
【０５５１】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対が、解離
を促進する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ａ：Ｕである。
【０５５２】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：Ｕである。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｉ：Ｃである。
【０５５３】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、ミスマッチな対、例えば、非標準的な対、すなわち標準的な対以外の対である。
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、普遍的塩基を含む対である。
【０５５４】
二本鎖のＡＳ  ３’末端の安定性の増大
サブユニット対は、安定性を促進し、かつ解離又は融解を阻害するそれらの傾向に基づいて順位付けすることができる（例えば、特定の対合の会合又は解離の自由エネルギーに関して、最も簡単な手法は、個々の対ごとに対を検査することであるが、次の同類又は同様の分析もまた使用することができる）。二本鎖の安定性を促進するという観点では、
Ｇ：Ｃは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）は、非標準的な対合、すなわち標準的な対合以外の対合よりも好ましく、
安定性を増大させる類縁体は、ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく、
２−アミノ−Ａ：Ｕは、Ａ：Ｕよりも好ましく、
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、
プソイドウリジン：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、
結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）は、非修飾部分よりも好ましく、二本鎖の安定性を増強するために一方又は両方の鎖上に存在することができる。二本鎖を形成する傾向を増大させる対合が、二本鎖の１つ又はそれ以上の位置でＡＳ鎖の３’末端で使用されることが好ましい。末端の対（ＡＳ鎖から見て最も３’側の対）は、Ｐ１と称され、これに続く二本鎖の対合の位置（ＡＳ鎖から見て５’方向に向かっていく）は、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５等と称される。二本鎖形成を調節する修飾を施すための好ましい領域は、Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ましくはＰ３〜Ｐ１である。Ｐ１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（複数可）（例えば、上記に同定された位置のいずれか）の修飾（複数可）と併用されてもよい。上述の領域に存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立して、以下の群：
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）を上回って安定性を増大させる類縁体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
から選ばれることが好ましい。
【０５５５】
好ましい実施形態では、Ｐ−１〜Ｐ−４における少なくとも２個又は３個の対は、二本鎖の安定性を促進する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ：Ｃである。
【０５５６】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、ワトソン−クリックの対合を上回って安定性を増大させる類縁体を有する対である。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−アミノ−Ａ：Ｕである。
【０５５７】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、Ｇ−クランプ：Ｇである。
【０５５８】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、グアニジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇである。
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、プソイドウリジン：Ａである。
【０５５９】
好ましい実施形態では、Ｐ１〜Ｐ４における少なくとも２個又は３個の対は、一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対である。
【０５６０】
Ｇ−クランプ及びグアニジニウムＧ−クランプについては、以下の参照文献で論述されている。ホルムズ及びガイト（Ｈｏｌｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ）、「２’−Ｏ−メチルＧ−クランプ含有オリゴヌクレオチドの合成及びＨＩＶ−１  Ｔａｔ−ＴＡＲ相互作用のそれらの阻害(The Synthesis of 2'-O-Methyl G-Clamp Containing Oligonucleotides and Their Inhibition of the HIV-1 Tat-TAR Interaction)」、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、第２２巻：１２５９〜１２６２ページ、２００３年、ホルムズら（Ｈｏｌｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．）、「２’−Ｏ−メチルＧ−クランプリボヌクレオシド類縁体を含有するオリゴヌクレオチドによるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの及び細胞におけるヒト免疫不全ウイルス１型Ｔａｔ依存性トランス活性化の立体阻害(Steric inhibition of human immunodeficiency virus type-1 Tat-dependent trans-activation in  vitro and in cells by oligonucleotides containing 2'-O-methyl G-clamp ribonucleoside analogues)」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第３１巻：２７５９〜２７６８ページ、２００３年、ワイルズら（Ｗｉｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．）、「合成三環式シトシン類縁体：グアニジニウムＧ−クランプによるグアノシンの認識に関する構造基盤 (Structural basis for recognition of guanosine by a synthetic tricyclic cytosine analogue:Guanidinium G-clamp) 」、Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、第８６巻：９６６〜９７８ページ、２００３年、ラジェエエフら（Ｒａｊｅｅｖ，ｅｔ  ａｌ．）、「三環式シトシン類縁体を含有する高親和性ペプチド核酸オリゴマー(High-Affinity Peptide Nucleic Acid Oligomers Containing Tricyclic Cytosine Analogues)」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４３９５〜４３９８ページ、２００２年、アウシンら（Ａｕｓｉｎ，ｅｔ  ａｌ．）、「アミノ−及びグアニジノ−Ｇ−クランプＰＮＡモノマーの合成(Synthesis of Amino- and Guanidino-G-Clamp PNA Monomers)」、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：４０７３〜４０７５ページ、２００２年、マイヤーら（Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、「三環式シトシン類縁
体フェノキサジン及び９−（２−アミノエトキシ）フェノキサジン（「Ｇ−クランプ」）を含有するオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性及びそれらのヌクレアーゼ耐性特性の由来(Nuclease resistance of oligonucleotides containing the tricyclic cytosine analogues phenoxazine and 9-(2-aminoethoxy)-phenoxazine ("G-clamp") and origins of their nuclease resistance properties) 」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４１巻：１３２３〜７ページ、２００２年、フラナガンら（Ｆｌａｎａｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．）、「アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する増強された効力を付与するシトシン類縁体(A
cytosine analog that confers enhanced potency to antisense oligonucleotides) 」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、第９６巻：３５１３〜８ページ、１９９９年。
【０５６１】
二本鎖のＡＳ  ５’末端の安定性の減少と二本鎖のＡＳ  ３’末端の安定性の増大とを同時に行うこと
上述のように、ｉＲＮＡ剤は、二本鎖のＡＳ  ５’末端の安定性を減少させ、かつ二本鎖のＡＳ  ３’末端の安定性を増大させるように修飾することができる。このことは、二本鎖のＡＳ  ５’末端における１つ又はそれ以上の安定性を減少させる修飾を、二本鎖のＡＳ  ３’末端における１つ又はそれ以上の安定性を増加させる修飾と組み合わせることにより達成することができる。したがって、好ましい実施形態は、Ｐ−５〜Ｐ−１、より好ましくはＰ−４〜Ｐ−１、さらに好ましくはＰ−３〜Ｐ−１における修飾を包含する。Ｐ−１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置）との併用でもよい。二本鎖領域のＡＳ  ５’末端の上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群から選ばれることが好ましい：
Ａ：Ｕ
Ｇ：Ｕ
Ｉ：Ｃ
ミスマッチな対、例えば非標準的な対合、すなわち標準的な対合以外の対合、あるいは普遍的塩基を含む対合、及び
Ｐ５〜Ｐ１、より好ましくはＰ４〜Ｐ１、さらに好ましくはＰ３〜Ｐ１での修飾。Ｐ１での修飾は特に好ましく、単独でも、あるいは他の位置（例えば、上記に同定された位置）との併用でもよい。二本鎖領域のＡＳ  ３’末端の上述の領域の１つに存在する少なくとも１個、より好ましくは２個、３個、４個又は５個の対は、独立に、以下の群：
Ｇ：Ｃ
ワトソン−クリックの対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）を上回って安定性を増大させる類縁体を有する対
２−アミノ−Ａ：Ｕ
２−チオＵ又は５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ
Ｇ−クランプ（４個の水素結合を有するＣの類縁体）：Ｇ
グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ
プソイドウリジン：Ａ
一方又は両方のサブユニットが、結合を増強する糖修飾、例えば２’位修飾（例えば、２’Ｆ、ＥＮＡ又はＬＮＡ）を有する対
から選ばれることが好ましい。
【０５６２】
本発明はまた、ＤＭＴＤＳを有するｉＲＮＡ剤を選択及び作製する方法を包含する。例えば、ｉＲＮＡ剤として使用するための候補配列に関して標的配列をスクリーニングする場合、本明細書中に記載するＤＭＴＤＳ特性を有する配列、及び、所望のレベルのＤＭＴＤＳを付与するために好ましくはできる限り少ない変更で特にＡＳ鎖に対して修飾を施すことができる配列を選択することができる。
【０５６３】
本発明はまた、ｉＲＮＡ剤候補配列を提供すること、ならびにＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤を提供するために、Ｐ−５〜Ｐ−１における少なくとも１個のＰ及び／又はＰ５〜Ｐ１における少なくとも１個のＰを修飾することを包含する。
【０５６４】
ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する任意の方法において、例えば本明細書中に開示する任意の遺伝子をサイレンシングするために、本明細書中に記載する任意の障害を治療するために、本明細書中に記載する任意の製剤中で、ならびに通常は本明細書中の他の箇所に記載する方法及び組成物において、または本明細書中の他の箇所に記載する方法及び組成物とともに使用することができる。ＤＭＴＤＳ  ｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する他の修飾、例えば標的化剤を結合すること又は安定性を増強する修飾を含めること、例えばヌクレアーゼ耐性モノマーを含めることもしくは自己会合して鎖内二本鎖構造を形成する一本鎖突出部（例えば、３’ＡＳ突出部及び／又は３’Ｓ鎖突出部）を含めること、を取り入れることができる。
【０５６５】
好ましくは、これらのｉＲＮＡ剤は、本明細書中に記載する構成様式を有する。
その他の実施形態
ＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ剤は、例えば細胞へ送達される外来ＤＮＡの鋳型から、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞において産生され得る。例えば、該ＤＮＡ鋳型をベクターに挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）により、あるいは定位注射（例えば、チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
第９１巻：３０５４〜３０５７ページ、１９９４年を参照）により対象へ送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むこともできるし、あるいは遺伝子送達ビヒクルが包埋される徐放性マトリックスを含むこともできる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、２つの転写ユニット（ｉＲＮＡ剤の鎖の上部を包含する転写物を産生するもの、及びｉＲＮＡ剤の下部を包含する転写物を産生するもの）を包含することができる。鋳型が転写されると、ｉＲＮＡ剤が産生され、プロセシングを受けて遺伝子サイレンシングを仲介するｓＲＮＡ剤断片となる。
【０５６６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ送達
ｉＲＮＡ剤は、対象（例えば、ヒトのような哺乳類）へｉＲＮＡ剤を効率的に送達するためのポリマーに結合、例えば非共有結合させることができる。ｉＲＮＡ剤は、例えばシクロデキストリンと複合体形成させることができる。シクロデキストリンは、治療用化合物の送達ビヒクルとして使用されている。シクロデキストリンは、シクロデキストリンの疎水性キャビティ内へ収まることが可能な薬物と包接複合体を形成することができる。他の例では、シクロデキストリンは、オリゴヌクレオチド及びそれらの誘導体のような他の生物学的に活性な分子と非共有結合を形成する。シクロデキストリンの使用により、水溶性の薬物送達複合体が創出され、該複合体は標的指向性の基又は他の官能基で修飾することができる。米国特許第５，６９１，３１６号（これは、参照により本明細書に援用される）に記載されるオリゴヌクレオチド用のシクロデキストリン細胞送達系は、本発明の方法における使用に適している。この系では、オリゴヌクレオチドはシクロデキストリンと非共有結合的に複合体形成されるか、あるいはオリゴヌクレオチドがアダマンチンに共有結合され、続いてアダマンチンがシクロデキストリンと非共有結合的に結合される。
【０５６７】
送達分子には、線状シクロデキストリンコポリマー又は線状酸化シクロデキストリンコポリマーであってシクロデキストリンコポリマーに少なくとも１つのリガンドが結合されたものを挙げることができる。米国特許第６，５０９，３２３号（参照により本明細書に援用される）に記載されるような送達系は、本発明における使用に適している。ｉＲＮＡ剤は、線状シクロデキストリンコポリマー及び／又は線状酸化シクロデキストリンコポリ
マーに結合させることができる。シクロデキストリンコポリマー又は酸化シクロデキストリンコポリマーの一方又は両方を、別のポリマーに架橋させることもでき、かつ／又はリガンドに結合させることもできる。
【０５６８】
ｉＲＮＡ送達用組成物は、付加物の特徴的な構造を有する分子化合物である「包接複合体」を使用することができる。この構造では、「ホスト分子」が、送達ビヒクル中の別の化合物の少なくとも１部を空間的に封入する。封入される化合物（「ゲスト分子」）は、ホスト分子のフレームワーク構造に影響を及ぼすことなくホスト分子のキャビティに配置される。「ホスト」は、好ましくはデキストリンであるが、米国特許公報第２００３／０００８８１８号（参照により本明細書に援用される）で提唱される任意の分子であり得る。
【０５６９】
シクロデキストリンは、各種のイオン及び分子と相互作用することができ、生じた包接化合物は、「ホスト−ゲスト」複合体の種類に属する。ホスト−ゲストの関係内で、ホスト分子及びゲスト分子の結合部位は、立体電子的意味合いで相補的であるべきである。本発明の組成物は、少なくとも１つのポリマー及び少なくとも１つの治療薬を、通常はポリマー及び治療薬（例えば、ｉＲＮＡ剤）の粒子状複合物の形態で含有することができる。ｉＲＮＡ剤は、１つ又はそれ以上の複合化剤を含有することができる。粒子状複合物の少なくとも１つのポリマーは、ホスト−ゲスト又はゲスト−ホスト相互作用で複合化剤と相互作用して、ポリマーと複合化剤との間で包接複合体を形成することができる。より具体的には、ポリマー及び複合化剤は、組成物に機能性を導入するのに使用することができる。例えば、粒子状複合物の少なくとも１つのポリマーはホスト機能を有し、ゲスト機能を有する複合化剤と包接複合体を形成する。別例として、粒子状複合物の少なくとも１つのポリマーはゲスト機能を有し、ホスト機能を有する複合化剤と包接複合体を形成する。粒子状複合物のポリマーはまた、ホスト機能及びゲスト機能の両方を含有し、ゲストの複合化剤及びホストの複合化剤と包接複合体を形成することもできる。機能性を有するポリマーは、例えば細胞標的化及び／又は細胞との接触（例えば、腎臓細胞に対する標的化又は腎臓細胞との接触）、細胞間輸送、ならびに細胞への流入及び細胞からの放出のうち少なくともいずれか）を促進することができる。
【０５７０】
粒子状複合物を形成する際、ｉＲＮＡ剤は、その生物学的又は治療的活性を維持してもよいし、あるいは維持しなくてもよい。治療用組成物から、具体的には粒子状複合物のポリマーから放出されると、ｉＲＮＡ剤の活性は回復する。したがって、粒子状複合物は好適には、例えば分解に起因する活性の損失からｉＲＮＡ剤を保護し、生物学的利用性を増強する。したがって、組成物は、ｉＲＮＡ剤又は任意の活性な化学物質に安定性、特に貯蔵中又は溶液中の安定性を提供するのに使用することができる。ｉＲＮＡ剤は、粒子状複合物又は治療用組成物を形成する前又は後に、リガンドでさらに修飾されてもよい。リガンドは、さらなる機能性を提供することができる。例えば、リガンドは、標的化部分であり得る。
【０５７１】
生理学的影響
本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、治療上の毒性の決定が、該ｉＲＮＡ剤と、ヒト配列および非ヒト動物配列の両方との相補性によってより容易になされるように設計することができる。これらの方法では、ＲＮＡ剤は、ヒト由来の核酸配列及び少なくとも１種類の非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類（例えば、げっ歯類、反すう類又は霊長類）由来の核酸配列に完全に相補的である配列から構成され得る。例えば、非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ピグミーチンパンジー、ナミチンパンジー、アカゲザル又はカニクイザルであり得る。ｉＲＮＡ剤の配列は、非ヒト哺乳類及びヒトの相同遺伝子、例えば発がん遺伝子又は腫瘍抑制遺伝子内の配列に相補的であり得る。非ヒト哺乳類におけるｉＲＮＡ剤の毒性を決定することにより、ヒトにおけるｉＲＮＡ
剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験のためには、ｉＲＮＡ剤を、ヒト及び２種類以上（例えば２種類又は３種類又はそれ以上）の非ヒト動物に対して相補的とすることができる。
【０５７２】
本明細書中に記載する方法は、ヒトに対するｉＲＮＡ剤の任意の生理学的作用、例えば毒性作用のような任意の望ましくない作用、又は任意の好ましい作用、すなわち所望の作用と相関させるのに使用することができる。
【０５７３】
送達モジュール
薬物送達複合体又はモジュール（例えば、本明細書中に記載するもの及び同時係属中の共同所有されている２００３年３月１２日付けで出願された米国特許仮出願第６０／４５４，２６５号及び２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（これらはともに、参照により本明細書に援用される）に記載されるもの）とともに使用することができるＲＮＡ、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。
【０５７４】
ｉＲＮＡ剤は、モジュラー複合体を特徴とする送達剤に複合体形成させることができる。複合体は、（ａ）縮合剤（例えば、核酸を例えばイオン相互作用又は静電相互作用により誘引（例えば、結合）することが可能な作用物質）、（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜（例えば、エンドソーム膜）と融合すること、及び／又は該膜を通過して輸送されることが可能な作用物質）、及び（ｃ）標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質（例えば、腎臓細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質（例えば抗体）、のうち１つ又はそれ以上（好ましくは２つ又はそれ以上、より好ましくは３つすべて）に連結させた担体物質を包含することができる。
【０５７５】
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤は、モジュラー複合体に連結（例えばカップリング又は結合）させることができる。ｉＲＮＡ剤は、複合体の縮合剤と相互作用することができ、複合体は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで、ｉＲＮＡ剤を細胞へ送達するのに使用することができる。例えば、複合体は、ｉＲＮＡ剤の送達を必要とする対象へｉＲＮＡ剤を送達するために、例えば障害（例えば、腎臓の疾患又は障害のような本明細書中に記載する障害）を有する対象へｉＲＮＡ剤を送達するために使用することができる。
【０５７６】
融合剤及び縮合剤は、異なる作用物質であってもよいし、又は１つの同じ作用物質であってもよい。例えば、ポリアミノ鎖、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、融合剤及び／又は縮合剤であり得る。
【０５７７】
送達剤は、モジュラー複合体であり得る。例えば、複合体は、以下の：
（ａ）縮合剤（例えば、核酸を例えばイオン相互作用により誘引（例えば、結合）することが可能な作用物質）、
（ｂ）融合剤（例えば、細胞膜（例えば、エンドソーム膜）と融合すること及び／又は該膜を通過して輸送されることが可能な作用物質）、及び
（ｃ）標的化基、例えば、細胞又は組織を標的とする物質（例えば、腎臓細胞のような特定の細胞種に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質又はタンパク質（例えば抗体）のうち１つ又はそれ以上（好ましくは２つ又はそれ以上の、より好ましくは３つすべて）に連結させた担体物質を包含することができる。標的化基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸
、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ネプロキシン（Neproxin) 、又はＲＧＤペプチド若しくはＲＤＧペプチド擬似体であり得る。
【０５７８】
担体物質
本明細書中に記載するモジュラー複合体の担体物質は、縮合剤、融合剤及び標的化基のうち１つ又はそれ以上を結合するための基剤であり得る。担体物質は内因性の酵素活性を欠いていることが好ましい。担体物質は好ましくは、生体分子、好ましくは高分子である。高分子の生物学的担体が好ましい。担体分子は生分解性であることもまた好ましい。
【０５７９】
担体物質は、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）又はグロブリン）、糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン又はヒアルロン酸）、又は脂質のような天然に存在する物質であり得る。担体分子はまた、合成ポリマー（例えば、合成ポリアミノ酸）のような組換え分子又は合成分子であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−マレイン酸無水物コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−マレイン酸無水物コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、又はポリホスファジン（polyphosphazine)が挙げられる。他の有用な担体分子は、日常的な方法により同定することができる。
【０５８０】
担体物質は、（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも５個の荷電基、好ましくは５〜５，０００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なくとも１：１の担体物質対融合剤の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１の担体物質対縮合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１の担体物質対標的化剤の比で複合体中に存在すること、のうち１つ又はそれ以上を特徴とすることができる。
【０５８１】
融合剤
本明細書中に記載するモジュラー複合体の融合剤は、ｐＨ環境に応答性である、例えばｐＨ環境に応じて電荷を変化させる作用物質であり得る。エンドソームのｐＨに遭遇すると、融合剤は、物理的変化、例えばエンドソーム膜を崩壊するか、又はエンドソーム膜の透過性を増大する浸透圧特性の変化を引き起こすことができる。好ましくは、融合剤は、生理学的範囲未満のｐＨで、電荷を変化させる（例えば、プロトン化されるようになる）。例えば、融合剤は、ｐＨ４．５〜６．５でプロトン化されるようになり得る。融合剤は、複合体が例えばエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれた後、細胞の細胞質へｉＲＮＡ剤を放出するように作用することにより、細胞内のｉＲＮＡ剤の細胞内濃度を増大させることができる。
【０５８２】
一実施形態では、融合剤は、特定のｐＨ範囲に暴露されると、例えば電荷の変化（例えばプロトン化）を受ける構成部分（例えば、アミノ基）を有することができる。融合剤の電荷の変化は、小胞、例えば細胞内小胞（例えば、エンドソーム）の変化（例えば、浸透圧変化）を誘発することができる。例えば、融合剤は、エンドソームのｐＨ環境に暴露されると、エンドソーム膜の多孔性を増大するのに（好ましくは、破裂させるのに）実質的に十分な溶解性又は浸透圧変化を引き起こす。
【０５８３】
融合剤は、ポリマー、好ましくはポリアミノ鎖（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ））であり得る。ＰＥＩは、直鎖状でも、分岐状でも、合成でも天然でもよい。ＰＥＩは、例えばアルキル置換されたＰＥＩでもよいし脂質置換されたＰＥＩでもよい。
【０５８４】
他の実施形態では、融合剤は、ポリヒスチジン、ポリイミダゾール、ポリピリジン、ポリプロピレンイミン、メリチン又はポリアセタール物質（例えば、カチオン性ポリアセタール）であり得る。幾つかの実施形態では、融合剤は、αらせん構造を有することができる。融合剤は、膜崩壊剤（例えばメリチン）であり得る。
【０５８５】
融合剤は、１つ又はそれ以上の以下の特徴を有することができる：（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも１０個の荷電基、好ましくは１０〜５，０００個の荷電基、より好ましくは５０〜１，０００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なくとも１：１の融合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１の融合剤対縮合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１の融合剤対標的化剤の比で複合体中に存在すること。
【０５８６】
他の適切な融合剤は、専門家により試験及び同定され得る。化合物の、ｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力は、日常的な方法により、例えば細胞アッセイにおいて試験することができる。例えば、試験化合物を細胞と組み合わせるか、又は細胞と接触させて、例えばエンドサイトーシスにより細胞に試験化合物を取り込ませる。続いて、接触させた細胞からエンドソーム調製物を作製することができ、該エンドソーム調製物を対照細胞由来のエンドソーム調製物と比較することができる。接触処理した細胞由来のエンドソーム画分の対照細胞に対する変化（例えば、減少）は試験化合物が融合剤として機能することができることを示す。あるいは、接触処理した細胞及び対照細胞を、例えば顕微鏡法により（例えば、光学顕微鏡法又は電子顕微鏡法により）評価して、細胞におけるエンドソーム集団の差を決定することができる。試験化合物を標識してもよい。別のタイプのアッセイでは、本明細書中に記載するモジュラー複合体は、１つ又はそれ以上の試験融合剤又は推定融合剤を用いて構築される。モジュラー複合体は、ｉＲＮＡの替わりに標識された核酸を用いて構築することもできる。融合剤の、ｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力は、モジュラー複合体がいったん細胞により取り込まれれば、上述のように、例えばエンドソーム調製物の調製により、あるいは顕微鏡技法により評価することができる。２工程アッセイもまた実施することができ、該アッセイでは、第１のアッセイが試験化合物単独のｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物を含むモジュラー複合体のｐＨ環境に応答する（例えば、ｐＨ環境に応じて電荷を変化させる）能力を評価する。
【０５８７】
縮合剤
本明細書中に記載するモジュラー複合体の縮合剤は、ｉＲＮＡ剤と相互作用（例えば、ｉＲＮＡ剤を誘引、保持又はｉＲＮＡ剤に結合）することができ、（ａ）ｉＲＮＡ剤を縮合（例えば、ｉＲＮＡ剤のサイズ又は電荷を低減）させ、かつ／又は（ｂ）ｉＲＮＡ剤を保護（例えば、分解に対してｉＲＮＡ剤を保護）するように作用することができる。縮合剤は、例えばイオン性相互作用により、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用することができる構成部分（例えば、荷電基）を包含することができる。縮合剤は好ましくは、荷電ポリマー（例えば、ポリカチオン鎖）である。縮合剤は、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、プソイドペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩又はαらせん状ペプチドであり得る。
【０５８８】
縮合剤は、以下の特徴を有することができる：（ａ）サイズが少なくとも１Ｄａであること、（ｂ）少なくとも２個の荷電基、好ましくは２〜１００個の荷電基を有すること、（ｃ）少なくとも１：１の縮合剤対担体物質の比で複合体中に存在すること、（ｄ）少なくとも１：１の縮合剤対融合剤の比で複合体中に存在すること、（ｅ）少なくとも１：１
の縮合剤対標的化剤の比で複合体中に存在すること。
【０５８９】
その他の適切な縮合剤は、専門家により、例えば、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用する試験剤の能力を評価することにより、試験及び同定され得る。試験剤の、核酸（例えば、ｉＲＮＡ剤）と相互作用する（例えば、ｉＲＮＡ剤を縮合又は保護する）能力は、日常的な技法により評価することができる。１つのアッセイでは、試験剤を核酸と接触させて、接触させた核酸のサイズ及び／又は電荷を、分子の質量及び／又は電荷の変化を検出するのに適した技法により評価する。このような技法としては、非変性ゲル電気泳動、免疫学的方法（例えば、免疫沈降）、ゲル濾過、イオン相互作用クロマトグラフィ等が挙げられる。試験剤は、対照と比較して、接触させた核酸の質量及び／又は電荷（好ましくは、両方）を変化させる場合に、縮合剤として同定される。２工程アッセイもまた実施することができ、該２工程アッセイでは、第１のアッセイが試験化合物単独の核酸と相互作用する（例えば、核酸に結合する（例えば、核酸の電荷及び／又は質量を縮合する））能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物を含むモジュラー複合体の、核酸と相互作用する（例えば、核酸に結合する（例えば、核酸の電荷及び／又は質量を縮合する））能力を評価する。
【０５９０】
両親媒性送達剤
本明細書中に記載の、ならびに係属中の共同所有されている２００３年３月１３日付けで出願された米国仮出願第６０／４５５，０５０号及び２００４年３月８日付けで出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／０７０７０号（本願に援用する）に記載されるような両親媒性送達複合体又はモジュールとともに使用することができるＲＮＡ、例えば本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤を調製するために、本明細書中に記載のモノマーおよび方法を使用することができる。
【０５９１】
両親媒性分子は、疎水性領域及び親水性領域を有する分子である。このような分子は、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）と相互作用する（例えば、浸透又は破壊する）ことができる。したがって、両親媒性分子は、会合された（例えば、結合された）ｉＲＮＡ（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）の送達剤として作用することができる。本明細書中に記載する組成物（例えば、本明細書中に記載する両親媒性ｉＲＮＡ構築物）で使用されるべき好ましい両親媒性分子は、ポリマーである。該ポリマーは、二次構造、例えば反復性の二次構造を有し得る。
【０５９２】
両親媒性ポリマーの一例は、両親媒性ポリペプチド、例えばポリペプチドが親水面及び疎水面を有するような二次構造を有するポリペプチドである。両親媒性ペプチド構造（例えば、αらせん状ポリペプチド）の設計は、当業者には日常的である。例えば、以下の参照文献にガイダンスが提供されている：グレルら（Ｇｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）「タンパク質設計及びフォールディング：自己集合したらせん状の束の鋳型トラッピング(Protein design and folding: template trapping of self-assembled helical bundles) 」、Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ  第７（３）巻：１４６〜５１ページ；チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）（２００２年）、「両親媒性α−らせんにおけるアミノ酸側鎖の立体化学安定性係数の決定(Determination of stereochemistry stability coefficients
of amino acid side-chains in an amphipathic alpha-helix) 」  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ  第５９（１）巻：１８〜３３ページ；イワタら（Ｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）  「両親媒性３（１０）−らせんペプチドの設計及び合成、ならびにそれらのリン脂質二重層との相互作用及びイオンチャネル形成(Design and synthesis of amphipathic 3(10)-helical peptides and their interactions with phospholipid bilayers and ion channel formation)」  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  第２６９（７）巻：４９２８〜３３ページ；コーナットら（Ｃｏｒｎｕｔ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９４年）  「両親媒性α−らせん概念。メリチンの溶血活性よりも高い溶血活性を有する理論上両親媒性のＬｅｕ
、Ｌｙｓペプチドの新規の設計への適用(The amphipathic alpha-helix concept. Application to the de novo design of ideally amphipathic Leu, Lys peptides with hemolytic activity higher than that of melittin)」  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  第３４９（１）巻：２９〜３３ページ；ネグレートら（Ｎｅｇｒｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）（１９９８年）
「タンパク質に関する構造上のコードの解読：ドメインクラスでのヘリックスの傾向及びα−らせんにおける統計学的多重残基情報(Deciphering the structural code for proteins: helical propensities in domain classes and statistical multiresidue information in alpha-helices)」  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  第７（６）巻：１３６８〜７９ページ。
【０５９３】
両親媒性ポリマーの別の例は、２つ又はそれ以上の両親媒性サブユニット、例えば環状部分（例えば、１つ又はそれ以上の親水性基及び１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有する２つ又はそれ以上のサブユニットから構成されるポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド（例えばコール酸）又は芳香族部分を含有してもよい。このような構成部分は、それらがポリマー構造中にある場合、対向する親水面及び疎水面を形成することができるように、アトロプ異性を示すことができることが好ましい。
【０５９４】
推定上の両親媒性分子の、脂質膜（例えば、細胞膜）と相互作用する能力は、日常的な方法により、例えば無細胞アッセイ又は細胞アッセイにおいて試験することができる。例えば、試験化合物を、合成脂質二重層、細胞膜分画又は細胞と組み合わせるか、あるいは接触させて、試験化合物が、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用し、細胞膜又は細胞に浸透し、あるいは細胞膜又は細胞を破壊するその能力に関して評価する。試験化合物を、脂質二重層、細胞膜又は細胞との相互作用を検出するために標識することもできる。別のタイプのアッセイでは、試験化合物をレポーター分子又はｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）に連結させて、レポーター分子又はｉＲＮＡ剤が脂質二重層、細胞膜又は細胞に浸透する能力を評価する。２工程アッセイもまた実施することができ、該２工程アッセイでは、第１のアッセイが、試験化合物単独の、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価し、第２のアッセイが、試験化合物及びレポーター又はｉＲＮＡ剤を含む構築物（例えば、本明細書中に記載する構築物）の、脂質二重層、細胞膜又は細胞と相互作用する能力を評価する。
【０５９５】
本明細書中に記載する組成物において有用な両親媒性ポリマーは、少なくとも２個、好ましくは少なくとも５個、より好ましくは少なくとも１０個、２５個、５０個、１００個、２００個、５００個、１，０００個、２，０００個、５０，０００個又はそれ以上のサブユニット（例えば、アミノ酸又は環状サブユニット）を有する。１つの両親媒性ポリマーを、１つ又はそれ以上、例えば２個、３個、５個、１０個又はそれ以上のｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ剤）に連結させることができる。幾つかの実施形態では、両親媒性ポリマーは、アミノ酸及び環状サブユニット（例えば、芳香族サブユニット）の両方を含有することができる。
【０５９６】
本発明は、両親媒性分子と関係付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」とも呼ばれる。このような組成物及び構築物は、ｉＲＮＡ剤の送達又は標的化、例えばｉＲＮＡ剤を細胞へ送達又は標的化するのに有用である。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲＮＡ剤の細胞への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性を増大させる（例えば、浸透又は崩壊させる）ことができる。
【０５９７】
一態様では、本発明は、両親媒性分子に連結されたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）を含む組成物に関する。ｉＲＮＡ剤及び両親媒性分
子は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、互いに持続的に接触した状態に保持されていてもよい。
【０５９８】
該組成物又は構築物の両親媒性分子は、リン脂質以外、例えばミセル、膜又は膜断片以外であることが好ましい。
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。該ポリマーは、２つ又はそれ以上の両親媒性サブユニットを含んでもよい。１つ又はそれ以上の親水性基及び１つ又はそれ以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次構造ならびに第１の面及び第２の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が疎水面であるような分布であり得る。
【０５９９】
両親媒性分子は、ポリペプチド、例えばその二次構造としてα−らせん構造を含むポリペプチドであり得る。
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、１つ又はそれ以上の環状部分（例えば、１つ又はそれ以上の親水性基及び／又は１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有する１つ又はそれ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部分が交互に疎水性基及び親水性基を有するように環状部分を有するポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド（例えば、コール酸）を含有してもよい。別の例では、サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すことができるもの、例えば２，２’−ビス（置換）−１，１’−ビナフチル又は２，２’−ビス（置換）ビフェニルであり得る。サブユニットは、式（Ｍ）：
【０６００】
【化７０】
2007525454.tif 000074
【０６０１】
を有する芳香族部分を含んでもよい。
本発明は、両親媒性分子と関連付けられたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ又はｓＲＮＡ）を包含する組成物を特徴とする。このような組成物は、本明細書中では「両親媒性ｉＲＮＡ構築物」と称し得る。このような組成物及び構築物は、ｉＲＮＡ剤の送達又は標的化、例えば細胞へのｉＲＮＡ剤の送達又は標的化において有用である
。理論により拘束されることを望まないが、このような組成物及び構築物は、例えばｉＲＮＡ剤の細胞への進入が可能となるように、脂質（例えば、細胞の脂質二重層）の多孔性を増大させる（例えば浸透又は破壊する）ことができる。
【０６０２】
一態様では、本発明は、両親媒性分子に連結されたｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）を含む組成物に関する。ｉＲＮＡ剤及び両親媒性分子は、共有結合又は非共有結合のいずれかにより、互いに持続的に接触した状態に保持されていてもよい。
【０６０３】
組成物又は構築物の両親媒性分子は、リン脂質以外、例えばミセル、膜又は膜断片以外であることが好ましい。
組成物又は構築物の両親媒性分子は、好ましくはポリマーである。ポリマーは、２つ又はそれ以上の両親媒性サブユニットを含んでもよい。１つ又はそれ以上の親水性基及び１つ又はそれ以上の疎水性基がポリマー上に存在してもよい。ポリマーは、反復性の二次構造ならびに第１の面及び第２の面を有してもよい。反復性の二次構造に沿った親水性基及び疎水性基の分布は、ポリマーの一方の面が親水面であり、かつポリマーの他方の面が疎水面であるような分布であり得る。
【０６０４】
両親媒性分子は、ポリペプチド、例えばその二次構造としてα−らせん構造を含むポリペプチドであり得る。
一実施形態では、両親媒性ポリマーは、１つ又はそれ以上の環状部分（例えば、１つ又はそれ以上の親水性基及び／又は１つ又はそれ以上の疎水性基を有する環状部分）を含有する１つ又はそれ以上のサブユニットを包含する。一実施形態では、ポリマーは、環状部分が交互に疎水性基及び親水性基を有するように環状部分を有するポリマーである。例えば、サブユニットは、ステロイド（例えば、コール酸）を含有してもよい。別の例では、サブユニットは、芳香族部分を含有してもよい。芳香族部分は、アトロプ異性を示すことができるもの、例えば２，２’−ビス（置換）−１，１’−ビナフチル又は２，２’−ビス（置換）ビフェニルであり得る。
【０６０５】
サブユニットは、式（Ｍ）：
【０６０６】
【化７１】
2007525454.tif 000075
【０６０７】
を有する芳香族部分を含んでもよい。
式Ｍに関して、Ｒ１は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ又はハロで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、Ｓ、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキル、Ｃ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキル、又はＯＲ５である。
【０６０８】
Ｒ２は、ヒドロキシ、ニトロ、サルフェート、リン酸、リン酸エステル、スルホン酸、ＯＲ６、又は任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアルキルスルフィニル、アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、スルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカルボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキルである。
【０６０９】
Ｒ３は、水素であるか、又はＲ４と一体となって融合フェニル環を形成する。
Ｒ４は、水素であるか、又はＲ３と一体となって融合フェニル環を形成する。
Ｒ５は、任意選択でアリール、アルケニル、アルキニル、アルコキシ又はハロで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、Ｓ、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキル、あるいはＣ１〜Ｃ１００ペルフルオロアルキルであり、Ｒ６は、任意選択でヒドロキシ、ハロ、ニトロ、アリールスルフィニル若しくはアルキルスルフィニル、アリールスルホニル若しくはアルキルスルホニル、サルフェート、スルホン酸、リン酸、リン酸エステル、置換若しくは非置換アリール、カルボキシル、カルボン酸、アミノカルボニル又はアルコキシカルボニルで置換されるか、かつ／又は任意選択でＯ、ＮＨ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、アルケニル又はアルキニルが挿入されるＣ１〜Ｃ１００アルキルである。
【０６１０】
ｄｓＲＮＡの細胞取り込みの増大
本発明の方法は、ｉＲＮＡ剤、ならびにｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みに影響を及ぼす
薬物の投与を包含し得る。該薬物は、ｉＲＮＡ剤が投与される前に、ｉＲＮＡ剤が投与された後に、あるいはｉＲＮＡ剤が投与されると同時に投与され得る。薬物はｉＲＮＡ剤と共有結合され得る。薬物は、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性化因子、又はＮＦ−κＢの活性化因子であり得る。薬物は、細胞に対する一過性の影響を有し得る。
【０６１１】
薬物は、例えば細胞の細胞骨格を崩壊させることにより、例えば細胞の微小管、ミクロフィラメント及び／又は中間フィラメントを崩壊させることにより、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増大させることができる。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノライド（j aplakinolide 
）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホライド(swinholide)Ａ、インダノシン（indanocine）又はミオセルビン（myoservin ）であり得る。
【０６１２】
薬物はまた、例えば、炎症性応答を活性化することにより、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる。このような作用を有する例示的な薬物としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β又はγインターフェロンが挙げられる。
【０６１３】
ｉＲＮＡ複合体
ｉＲＮＡ剤は、第２の作用物質にカップリング（例えば、共有結合）させることができる。例えば、特定の障害を治療するのに使用されるｉＲＮＡ剤は、第２の治療薬、例えばｉＲＮＡ剤以外の作用物質にカップリングさせることができる。第２の治療薬は、同じ障害の治療を対象とするものであり得る。例えば、望ましくない細胞増殖（例えば、がん）を特徴とする障害を治療するのに使用されるｉＲＮＡの場合では、ｉＲＮＡ剤は、抗がん作用を有する第２の作用物質にカップリングさせることができる。例えば、ｉＲＮＡ剤は、免疫系を刺激する作用物質（例えば、ＣｐＧモチーフ）、あるいはより一般的にはｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ受容体を活性化し、かつ／又はγインターフェロンの産生を増大させる作用物質にカップリングさせることができる。
【０６１４】
ｉＲＮＡの生産
ｉＲＮＡは、例えば大量に、各種方法により生産することができる。例示的な方法としては、有機合成及びＲＮＡ切断（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断）が挙げられる。
【０６１５】
有機合成
ｉＲＮＡは、二本鎖のＲＮＡ分子の各々の鎖を別個に合成することにより作製することができる。次に、構成成分の鎖をアニーリングさせることができる。
【０６１６】
大きなバイオリアクター（例えば、ファルマシア  バイオテックＡＢ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＡＢ）（スウェーデンウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）所在）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（商標）ＩＩ）を用いて、所定のｉＲＮＡ用の特定のＲＮＡ鎖を大量に生産することができる。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＩＩリアクターは、１．５Ｍ過剰のホスホロアミダイトヌクレオチドのみを使用して、効率的にヌクレオチドをカップリングすることができる。ＲＮＡ鎖を作製するためには、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。標準的なモノマー添加サイクルを使用して、ｉＲＮＡ用の２１〜２３ヌクレオチド鎖を合成することができる。通常、２つの相補的な鎖を別個に生産した後、例えば固体支持体からの放出及び脱保護の後にアニーリングさせる。
【０６１７】
有機合成を使用して、別個のｉＲＮＡ種を生産することができる。特定の標的遺伝子に対する該ｉＲＮＡ種の相補性を、正確に指定することができる。例えば、該ｉＲＮＡ種は、多型、例えば一塩基多型を含む領域に相補的であり得る。さらに、多型の位置は、正確に規定され得る。幾つかの実施形態では、多型は、内部領域、例えば末端の一方又は両方
から少なくとも４、５、７又は９ヌクレオチドの位置にある。
【０６１８】
ｄｓＲＮＡ切断
ｉＲＮＡはまた、より大きなｄｓ  ｉＲＮＡを切断することにより作製することができる。切断は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで実現され得る。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断によりｉＲＮＡを生産するために、以下の方法を使用することができる：
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写。  ｄｓＲＮＡは、両方向に核酸（ＤＮＡ）セグメントを転写することにより生産される。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）ＲＮＡｉ転写キット（ニュー  イングランド  バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））は、ベクターと、両側にＴ７プロモーターが隣接する位置で該ベクターにクローニングされた核酸セグメントに関してｄｓＲＮＡを生産する方法とを提供する。別個の鋳型が、ｄｓＲＮＡ用の２つの相補鎖のＴ７転写用に生成される。該鋳型は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの添加によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写され、ｄｓＲＮＡが生産される。ＰＣＲ及び／又は他のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３ポリメラーゼ又はＳＰ６ポリメラーゼ）を用いた同様の方法もまた使用することができる。一実施形態では、この方法により生成されるＲＮＡは、組換え酵素の調製物に混入し得るエンドトキシンを除去するように慎重に精製される。
【０６１９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断。  ｄｓＲＮＡは、例えばＤｉｃｅｒ又は匹敵するＲＮＡアーゼＩＩＩベースの活性を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断されてｉＲＮＡとなる。例えば、ｄｓＲＮＡは、ショウジョウバエ由来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抽出物中で、あるいは精製された成分（例えば、精製ＲＮＡアーゼ又はＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体））を用いてインキュベートすることができる。例えば、ケッテイングら（Ｋｅｔｔｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２００１年１０月１５日、第１５（２０）巻：２６５４〜９ページ及びハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１年８月１０日；第２９３（５５３２）巻：１１４６〜５０ページを参照されたい。
【０６２０】
ｄｓＲＮＡの切断により、概して複数のｉＲＮＡ種が生産され、それぞれがもとのｄｓＲＮＡ分子の特定の２１〜２３ｎｔフラグメントである。例えば、もとのｄｓＲＮＡ分子のオーバーラッピング領域及び隣接領域に相補的な配列を含むｉＲＮＡが存在し得る。
【０６２１】
合成方法にかかわらず、ｉＲＮＡ調製物は、製剤化に適した溶液（例えば、水溶液及び／又は有機溶液）中で調製することができる。例えば、ｉＲＮＡ調製物は、純粋な二重に蒸留した蒸留水中で沈殿及び再溶解され、凍結乾燥され得る。続いて、乾燥させたｉＲＮＡは、意図される製剤化プロセスに適した溶液中に再懸濁させることができる。
【０６２２】
修飾ｉＲＮＡ剤及びヌクレオチド代用物のｉＲＮＡ剤の合成は後述する。
製剤化
本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤は、対象への投与用に製剤化することができる。
【０６２３】
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０６２４】
製剤化されたｉＲＮＡ組成物は、様々な状態であると仮定することができる。幾つかの例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶性、一様に結晶性、かつ／又は無水（例えば、水分が８０％未満、５０％未満、３０％未満、２０％未満又は１０％未満）である。別の例では、ｉＲＮＡは、水相中に、例えば水を含む溶液中に存在する。
【０６２５】
水相組成物又は結晶性組成物は、例えば送達ビヒクル、例えばリポソーム（特に水相に関して）又は粒子（例えば、結晶性組成物に関して適切であり得るような微粒子）に組み込むことができる。概して、ｉＲＮＡ組成物は、意図される投与方法と適合性の様式で製剤化される（以下を参照）。
【０６２６】
特定の実施形態では、組成物は、以下の方法：噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥（fluid bed drying）又はこれらの技法の組合せ、あるいは液体を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮及び他の自己集合、の少なくとも１つにより調製される。
【０６２７】
ｉＲＮＡ調製物は、別の作用物質、例えば別の治療薬又はｉＲＮＡを安定化する作用物質（例えば、ｉＲＮＡと複合体形成してｉＲＮＰを形成するためのタンパク質）と組み合わせて製剤化することができる。さらに別の作用物質としては、例えばＥＤＴＡなどのキレート化剤（例えば、Ｍｇ２＋のような二価カチオンを除去するため）、塩、ＲＮＡアーゼ阻害剤（例えば、ＲＮＡｓｉｎのような広域特異性のＲＮＡアーゼ阻害剤）等が挙げられる。
【０６２８】
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、別のｉＲＮＡ剤、例えば第２の遺伝子に関して、あるいは同じ遺伝子に関して、ＲＮＡｉを仲介することができる第２のｉＲＮＡを包含する。さらに別の調製物は、少なくとも３個、５個、１０個、２０個、５０個若しくは１００個又はそれ以上の異なるｉＲＮＡ種を包含することができる。このようなｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に関してＲＮＡｉを仲介することができる。
【０６２９】
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療薬（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ以外の作用物質）を包含する。例えば、ウイルス疾患（例えば、ＨＩＶ）の治療用のｉＲＮＡ組成物は、既知の抗ウイルス剤（例えば、プロテアーゼ阻害剤又は逆転写酵素阻害剤）を含んでもよい。別の例では、がんの治療用のｉＲＮＡ組成物は、化学療法剤をさらに含んでもよい。
【０６３０】
例示的な製剤を以下に論述する。
リポソーム
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつそのような実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばより大きなｉＲＮＡ剤であってｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るもの、あるいはＤＮＡであって例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤若しくはｓＲＮＡ剤、又はそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、膜状分子集合体（例えば、リポソーム又はミセル）中で送達されるように製剤化することができる。本明細書中で使用する場合、「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば１つの二重層又は複数の二重層に配置構成された両親媒性脂質から構成されるビヒクルを指す。リポソームとしては、親油性物質と水性の内部とから形成される膜を有する単層及び多重層ビヒクルを包含する。水性部分は、ｉＲＮＡ組成物を含有する。親油性物質は、水性の外部から水性の内部を分離し、通常ｉＲＮＡ組成物を含まないが、幾つかの例では、ｉＲＮＡ組成物を含んでもよい。リポソームは、作用部位への有効成分の移動及び送達に有用である。リポソーム膜は、構造的に生体膜に類似しているため、リポソームが組織に適用されると、リポソーム二重層は、細胞膜の二重層と融合する。リポソーム及び細胞の融合が進行するにつれ、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物が細胞に送達され、該細胞でｉＲＮＡは標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを仲介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、本明細書中に記載されるような特定の細胞種へ（例えば、腎臓の細胞へ）ｉＲＮＡを誘導するように、特異的に標的化される。
【０６３１】
ｉＲＮＡを含有するリポソームは、各種方法により調製することができる。
一例では、リポソームの脂質成分を洗浄剤中に溶解して、脂質成分によりミセルを形成させる。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン脂質又は脂質複合体であり得る。洗浄剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗浄剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩及びラウロイルサルコシンが挙げられる。続いて、ｉＲＮＡ調製物を、脂質成分を含むミセルに添加する。脂質上のカチオン基は、ｉＲＮＡと相互作用し、ｉＲＮＡの周囲で凝縮して、リポソームを形成する。凝縮後、洗浄剤を、例えば透析により除去して、ｉＲＮＡのリポソーム調製物を得る。
【０６３２】
必要であれば、凝縮を助長する担体化合物を、例えば制御された添加により、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミン又はスペルミジン）であり得る。凝縮を助けるためにｐＨを調節することもできる。
【０６３３】
送達ビヒクルの構造的成分としてポリヌクレオチド／カチオン脂質複合体を取り入れる安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを生産する方法のさらなる説明は、例えば、国際公開公報第９６／３７１９４号に記載されている。リポソーム形成はまた、フェルグナー、Ｐ．Ｌ．ら（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  第８巻：７４１３〜７４１７ページ、１９８７年；米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第５，１７１，６７８号、バングハムら（Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２３巻：２３８ページ、１９６５年；オルソンら（Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第５５７巻：９ページ、１９７９年；スゾカら（Ｓｚｏｋａ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７５巻：４１９４ページ、１９７８年；メイヒューら（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７７５巻：１６９ページ、１９８４年；キムら（Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第７２８巻：３３９ページ、１９８３年及びフクナガら（Ｆｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．第１１５巻：７５７ページ、１９８４年に記載される例示的な方法の１つ又はそれ以上の態様を包含することができる。送達ビヒクルとして使用するための適切なサイズを有する脂質凝集体を調製するための、一般的に使用されている技法としては、超音波処理及び凍結融解と押出しが挙げられる（例えば、マイヤーら（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第８５８巻：１６１ページ、１９８６年を参照）。微小流体操作は、一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）かつ比較的一様な凝集体が望ましい場合に使用することができる（メイヒューら（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第７７５巻：１６９ページ、１９８４年）。これらの方法は、ｉＲＮＡ調製物をリポソームにパッケージングするように容易に適応される。
【０６３４】
ｐＨ感受性の又は負に帯電したリポソームは、核酸分子と複合体形成するのではなく、核酸分子を捕捉する。核酸分子及び脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体形成ではなく反発が起きる。それにもかからず、幾つかの核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性のリポソームは、培養において細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するのに使用されている。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（チョウら（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、第１９巻、（１９９２年）  ２６９〜２７４ページ）。
【０６３５】
リポソーム組成物の主要なタイプの１つとして、天然に由来するホスファチジルコリン
以外のリン脂質が挙げられる。例えば、中性のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成されるのに対して、アニオン性融合性リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、例えばダイズＰＣおよび卵ＰＣのようなホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０６３６】
リポソームをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；米国特許第５，１７１，６７８号；国際公開公報第９４／００５６９号；国際公開公報第９３／２４６４０号；国際公開公報第９１／１６０２４号；フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６９巻：２５５０ページ、１９９４年；ナベル（Ｎａｂｅｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第９０巻：１１３０７ページ、１９９３年；ナベル（Ｎａｂｅｌ）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第３巻：６４９ページ、１９９２年；ゲルション（Ｇｅｒｓｈｏｎ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３２巻：７１４３ページ、１９９３年およびストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ）、  ＥＭＢＯ  Ｊ．第１１巻：４１７ページ、１９９２年が挙げられる。
【０６３７】
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することが可能であるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、原形質膜とは効率的に融合することは可能でないが、ｉｎ  ｖｉｖｏでマクロファージにより取り込まれ、ｉＲＮＡをマクロファージに送達するのに使用することができる。
【０６３８】
リポソームのさらなる利点としては、天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性かつ生分解性であること、リポソームは、広範囲の水溶性および脂溶性薬物を取り込むことができること、リポソームが、リポソーム内部のコンパートメント中に被包されたｉＲＮＡを代謝および分解から保護することが挙げられる（ロゾッフ（Ｒｏｓｏｆｆ）、「薬学的投薬形態(Pharmaceutical Dosage Forms) 」より、リーベルマン、リーガーおよびバンカー（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ）（編）、１９８８年、第１巻、ｐ２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、リポソームの脂質表面電荷、ビヒクルサイズおよび水性容量である。
【０６３９】
正に帯電した合成カチオン性脂質であるＮ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）は、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、その結果ｉＲＮＡの送達をもたらすことができる脂質−核酸複合体を形成する小リポソームを形成するのに使用することができる（例えば、ＤＯＴＭＡおよびＤＮＡとのその使用の説明に関して、フェルグナー、ピー．エルら（Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  第８巻：７４１３〜７４１７ページ、１９８７年および米国特許第４，８９７，３５５号を参照）。
【０６４０】
ＤＯＴＭＡ類縁体である１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）は、リン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体形成するビヒクルを形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（ベテスダ  リサーチ  ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含んでなる、高度にカチオン性の核酸を生体組織培養細胞内に送達するための有効な作用物質である。十分に正に帯電したリポソームが使用されると、得
られた複合体上の正味の電荷もまた正である。このようにして調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に結合して、原形質膜と融合し、例えば組織培養細胞へ機能的核酸を効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（ベーリンガー  マンハイム（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）所在）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなくエステルにより連結されるという点でＤＯＴＭＡと異なる。
【０６４１】
他の報告されているカチオン性脂質成分としては、例えば２種類の脂質のうちの１つに結合されており、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミルアミド（「ＤＰＰＥＳ」）のような化合物を包含するカルボキシスペルミンを含む様々な部分に結合されているものが挙げられる（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号を参照）。
【０６４２】
別のカチオン性脂質複合体としては、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に製剤化されているコレステロールによる脂質の誘導体化（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）が挙げられる（ガオ、Ｘ．およびフアング、エル．（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．第１７９巻：２８０ページ、１９９１年を参照）。ＤＯＰＥにポリリシンを結合させることにより作製されるリポポリリシンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（チョウ、エックスら（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  第１０６５巻：８ページ、１９９１年）。ある特定の細胞株に関して、カチオン性脂質が結合されたこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを提供すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（バイカル（Ｖｉｃａｌ）、米国カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）所在）およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（ライフ  テクノロジー  インコーポレイテッド社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｙ，Ｉｎｃ．）、米国メリーランド州ゲイサーズバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）所在）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開公報第９８／３９３５９号および国際公開公報第９６／３７１９４号に記載されている。
【０６４３】
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤を上回る幾つかの利点を提示する。かかる利点としては、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低減、投与された薬物の所望の標的における蓄積の増大および皮膚へｉＲＮＡを投与する能力が挙げられる。幾つかの実施形態では、リポソームは、上皮細胞へｉＲＮＡを送達するのに、また真皮組織への（例えば、皮膚への）ｉＲＮＡの浸透を増強するのにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に塗布することができる。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所送達については、実証されている（例えば、ウェイナーら（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２年、第２巻、４０５〜４１０ページおよびドゥ  プレシスら（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１８巻、１９９２年、２５９〜２６５ページ；マンニノ、アール．ジェイ．およびフォウルド−フォゲライト、Ｓ．（Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｒｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  第６巻：６８２〜６９０ページ、１９８８年；イタニ、ティーら（Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．）  Ｇｅｎｅ  第５６巻：２６７〜２７６ページ、１９８７年；ニコラウ、シーら（Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．第１４９巻：１５７〜１７６ページ、１９８７年；ストラウビンガー、アール．エム．およびパパハジョポウロス、ディー．（Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａ
ｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．第１０１巻：５１２〜５２７ページ、１９８３年；ワング、シー．ワイ．およびフアング、エル．（Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第８４巻：７８５１〜７８５５ページ、１９８７年を参照）。
【０６４４】
非イオン性リポソーム系もまた、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達における該リポソーム系の有用性を決定するために検査されている。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤は、マウス皮膚の真皮へ薬物を送達するのに使用された。ｉＲＮＡを含むかかる製剤は、皮膚科の障害を治療するのに有用である。
【０６４５】
ｉＲＮＡを包含するリポソームは、高度に変形可能とすることができる。かかる変形能は、リポソームが、リポソームの平均半径より小さな孔を通って浸透することを可能とすることができる。例えば、トランスフェロゾーム（transferosome 、登録商標）は、変形可能なリポソームの一種である。トランスフェロゾームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することにより作製することができる。ｉＲＮＡを含むトランスフェロゾームは、例えば皮膚中のケラチノサイトへｉＲＮＡを送達するために皮下注射により送達することができる。無傷の哺乳類皮膚を通過するためには、脂質ビヒクルは、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれが直径５０ｎｍ未満の一連の微細孔を通って通過しなければならない。さらに、脂質の特性に起因して、これらのトランスフェロゾームは、自己最適化性（例えば皮膚の中の孔の形状に適応可能）、自己修復性であり得るとともに、多くの場合断片化することなく標的に到達することができ、自己装填性であり得ることが多い。ｉＲＮＡ剤は、リポソームとの会合を改善する部分に連結されたＲＲＭＳを包含することができる。
【０６４６】
界面活性剤
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。界面活性剤は、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソーム（上記を参照）のような製剤中で広く適用される。ｉＲＮＡ（または前駆体、例えばプロセシングされてｉＲＮＡになり得るより大きなｄｓＲＮＡ、あるいはｉＲＮＡまたは前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物が、界面活性剤を包含することができる。一実施形態では、ｉＲＮＡは、界面活性剤を含むエマルジョンとして製剤化される。多くの異なるタイプの界面活性剤（天然および合成の両方）の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤に使用される種々の界面活性剤を類別するための最も有用な手段を提供する（リーガー（Ｒｉｅｇｅｒ）、「薬学的投薬形態(Pharmaceutical Dosage Forms) 」内、マーセル  デッカー  インコーポレイテッド社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、米国ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）所在、１９８８年、ｐ２８５）。
【０６４７】
界面活性剤分子がイオン化されない場合は、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品において広く適用されており、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般的に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタン
エステル、スクロースエステルおよびエトキシル化エステルのような非イオン性エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル（例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコールおよびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマー）もまた、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤類のうち最も一般的なものである。
【０６４８】
界面活性剤分子が負の電荷を保有する場合、水中に溶解または分散されるときはアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸のようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェートおよびエトキシル化アルキルサルフェートのような硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートのようなスルホン酸塩、アシルイセチオネート（acyl isethionate）、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、ならびにホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤類のうち最も重要なものは、アルキルサルフェートおよび石鹸である。
【０６４９】
界面活性剤分子が正の電荷を保有する場合、水中に溶解または分散されるときはカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、この種類のうちで最もよく使用されるものである。
【０６５０】
界面活性剤分子が正または負の電荷のいずれかを保有する能力を有する場合、該界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
【０６５１】
薬物製品中、製剤中およびエマルジョン中での界面活性剤の使用は概説されている（リーガー（Ｒｉｅｇｅｒ）、「薬学的投薬形態(Pharmaceutical Dosage Forms) 」、マーセル  デッカー  インコーポレイテッド社（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）所在、１９８８年、ｐ２８５）。
【０６５２】
ミセルおよび他の膜状製剤
説明を簡略化するために、本項でのミセルおよび他の製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらのミセルおよび他の製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物は、ミセル製剤として提供され得る。「ミセル」は、本明細書中では、両親媒性分子が、同分子の疎水性部分すべてが内側に向き、親水性部分が周囲の水相と接触するように球状構造に配置構成される、特定の種類の分子集合体として定義される。反対の配置構成は、環境が疎水性である場合に存在する。
【０６５３】
経皮膜を通っての送達に適した混合ミセル製剤は、ｉＲＮＡ組成物の水溶液と、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルカリサルフェートと、ミセル形成化合物とを混合することにより調製され得る。ミセル形成化合物の例としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびそれらの薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリシン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびそれらの類縁体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびそれらの類縁体、ケノデオキシコレート、デオキシコレート、ならびにそれ
らの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキルサルフェートの添加と同時に、あるいは添加後に添加され得る。混合ミセルは、成分の実質的に任意の種類の混合処理により形成するが、より小さなサイズのミセルを提供するためには強力な混合が好ましい。
【０６５４】
１つの方法では、ｉＲＮＡ組成物および少なくともアルカリ金属アルキルサルフェートを含有する第１のミセル組成物が調製される。次に、この第１のミセル組成物を、少なくとも３つのミセル形成化合物と混合して、混合ミセル組成物を形成する。別の方法では、ミセル混合物は、ｉＲＮＡ組成物、アルカリ金属アルキルサルフェートおよび少なくとも１つのミセル形成化合物を混合し、続いて強力に混合しながら、残りのミセル形成化合物を添加することにより調製される。
【０６５５】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定化し、かつ細菌増殖に対して保護してもよい。あるいは、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールをミセル形成成分と混合してもよい。グリセリンのような等張剤もまた、混合ミセル組成物の形成後に添加してもよい。
【０６５６】
ミセル製剤をスプレーとして送達するために、製剤をエーロゾルディスペンサーに入れることができ、該ディスペンサーを噴射剤で充満させる。加圧下にある噴射剤は、ディスペンサー中では液体形態である。成分の比は、水相および噴射剤相が１つになるように、すなわち１つの相が存在するように調節される。２つの相が存在する場合、例えば定量弁により内容物の一部を投薬する前に、ディスペンサーを振とうする必要がある。医薬品の投薬用量は、微細スプレーで定量弁から噴射される。
【０６５７】
好ましい噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテルおよびジエチルエーテルである。ＨＦＡ  １３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）がより一層好ましい。
【０６５８】
必須成分の特定濃度は、比較的直接的な実験により決定することができる。口腔による吸収のためには、投与量を注射による投与または胃腸管を介した投与に関する投与量の少なくとも２倍または３倍に増大させることが望ましい場合が多い。
【０６５９】
ｉＲＮＡ剤は、ミセルまたは他の膜状製剤との会合を改善する構成部分に連結されたＲＲＭＳを包含することができる。
粒子
説明を簡略化するために、本項での粒子、製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの粒子、製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、粒子（例えば、微粒子）に組み込まれ得る。微粒子は、噴霧乾燥により生産することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥またはこれらの技法の組合せを含む他の方法により生産してもよい。さらなる説明は以下を参照されたい。
【０６６０】
持続放出性製剤。本明細書中に記載するｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、制御された放出（例えば、徐放）用に製剤化す
ることができる。制御放出は、その放出を遅らせる構造または物質内にｉＲＮＡを配することにより達成することができる。例えば、ｉＲＮＡは、多孔質マトリックス内に、あるいは浸食性マトリックス中に配置させることができ、これらのいずれも長期間にわたるｉＲＮＡの放出を可能にする。
【０６６１】
高分子粒子、例えば高分子微粒子は、生分解により微粒子から放出されたときのみ細胞により取り込まれる、ｉＲＮＡの持続放出性リザーバとして使用することができる。したがって、この実施形態の高分子粒子は、食作用を防止するのに十分大きく（例えば、１０μｍより大きい、好ましくは２０μｍより大きく）あるべきである。かかる粒子は、より小さな粒子を作製するのと同じ方法であるが、第１のエマルジョンおよび第２のエマルジョンの混合はあまり強力でない方法により生産することができる。すなわち、均質化速度、ボルテックス混合速度、または超音波処理設定をより低くして、１０μｍではなく直径およそ１００μｍの粒子を得ることができる。混合の時間もまた変更することができる。
【０６６２】
より大きな微粒子は、筋肉内、皮下、皮内、静脈内または腹腔内注射により、吸入により（鼻内または肺内）、経口的にあるいは移植により送達されるように、懸濁液、粉末または移植可能な固体として製剤化することができる。これらの粒子は、比較的長期間にわたる徐放が望ましい場合に、任意のｉＲＮＡの送達に有用である。分解速度、したがって放出速度は、高分子製剤により多様である。
【０６６３】
微粒子は好ましくは、液体懸濁液の媒質が粒子境界を自由に浸透または灌流する孔、空隙、くぼみ、欠損部または他の間質腔を包含する。例えば、有孔の微細構造を用いて、くぼみを有する多孔質噴霧乾燥ミクロスフェアを形成することができる。
【０６６４】
ｉＲＮＡ（例えば、ｓＲＮＡ）を含有する高分子粒子は、例えば二重エマルジョン技法を用いて作製することができる。まず、ポリマーを有機溶媒中に溶解させる。好ましいポリマーは、乳酸／グリコール酸の重量比が６５：３５、５０：５０または７５：２５の乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）である。次に、水溶液中に懸濁させた核酸の試料を該ポリマー溶液に添加して２つの溶液を混合し、第１のエマルジョンを形成する。これらの溶液は、ボルテックス混合または振とうにより混合することができ、好ましい方法では、混合物を超音波処理することができる。最も好ましいのは、核酸が受けるニック形成、剪断または分解の形態の損傷が最少量である一方、依然として適切なエマルジョンの形成を可能にする、任意の方法である。例えば、許容可能な結果は、０．３１７５センチメートル（３．２ｍｍ（１／８インチ））マイクロチッププローブを備えたＶｉｂｒａ−ｃｅｌｌ（商標）モデルＶＣ−２５０ソニケーターにより、設定Ｎｏ．３で得ることができる。
【０６６５】
噴霧乾燥。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、噴霧乾燥により調製することができる。噴霧乾燥したｉＲＮＡを、対象に投与しもよいし、あるいはさらなる製剤化に供してもよい。ｉＲＮＡの医薬組成物は、分散可能な粉末組成物（例えば、医薬組成物）を提供するのに十分な条件下で、ｉＲＮＡを包含する均質水性混合物を噴霧乾燥することにより調製することができる。噴霧乾燥用の材料はまた、１つまたはそれ以上の薬学的に許容可能な賦形剤あるいは分散性を増強する量の生理学的に許容可能な水溶性タンパク質を包含することができる。噴霧乾燥した製品は、ｉＲＮＡを包含する分散可能な粉末であり得る。
【０６６６】
噴霧乾燥は、液体またはスラリー材料を乾燥した粒子形態に変換する処理工程である。噴霧乾燥は、吸入を含む様々な投与経路用の粉末材料を提供するのに使用することができ
る。例えば、エム．サッチェッティおよびエム．エム．ファン  オルト（Ｍ．Ｓａｃｃｈｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．Ｖａｎ  Ｏｏｒｔ）、「吸入エーロゾル：療法に関する物理的および生物学的基盤（Inhalation Aerosols: Physical and Biological Basis for Therapy）」内、エイ．ジェー．ヒッキー（Ａ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ）編、マーセル  デッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋａｒ）、ニューヨーク、１９９６年を参照されたい。
【０６６７】
噴霧乾燥は、液滴の微細ミストを形成するために溶液、エマルジョンまたは懸濁液を噴霧化すること、および液滴を乾燥させることを包含することができる。該ミストを乾燥用チャンバ（例えば、容器、タンク、チューブまたはコイル）内へ発射し、該チャンバ内でミストを乾燥用ガスに接触させることができる。ミストは、固体または液体の細孔形成剤を包含することができる。媒質および細孔形成剤は、液滴から乾燥用ガスへと蒸発して、液滴を固化させ、同時に該固化物（固体）全体にわたって細孔を形成する。続いて、この固体（通常は粉末状粒子形態）を乾燥用ガスから分離および回収する。
【０６６８】
噴霧乾燥は、高度に分散された液体および十分容量の空気（例えば、熱空気）を一緒にして、液体小滴の蒸発および乾燥をもたらすことを包含する。噴霧乾燥されるべき調製物は、任意の溶液、当然、懸濁液、スラリー、コロイド分散液、または選択した噴霧乾燥装置を用いて噴霧化され得るペーストであり得る。通常、該供給物は、媒質を蒸発させて乾燥産物を回収器に運搬するろ過された温気流中に噴霧される。次に、使用済み空気は媒質とともに排出される。幾つかの異なるタイプの装置を用いて、所望の産物を提供してもよい。例えば、ブッチ株式会社（Ｂｕｃｈｉ  Ｌｔｄ．）またはニプロコーポレイション（Ｎｉｐｒｏ  Ｃｏｒｐ．）により製造される市販の噴霧乾燥機は、所望のサイズの粒子を効率的に生産することができる。
【０６６９】
噴霧乾燥した粉末粒子は、形状がほぼ球状であり、サイズがほぼ均一であり、多くの場合くぼみがあり得る。組み込まれる薬物および噴霧乾燥条件に応じて、ある程度の不規則性が存在し得る。多くの場合、噴霧乾燥したミクロスフェアの分散安定性は、該ミクロスフェアの生産において膨張剤（または発泡剤）を使用するとより有効であるようである。特に好ましい実施形態は、分散相または連続相（他方の相は、事実上水性である）として膨張剤を有するエマルジョンを含み得る。膨張剤は好ましくは、界面活性剤溶液を用いて、例えば約３４〜１０３Ｐａ（５，０００〜１５，０００ｐｓｉ）の圧力で市販の微小流動化装置を用いて分散させる。この処理工程により、通常水性連続相中に分散させた水不混和性発泡剤のサブミクロンの小滴を含む、好ましくは組み込まれた界面活性剤により安定化されたエマルジョンが形成される。この技法および他の技法を用いたかかる分散液の形成は、一般的であり、当業者に既知である。発泡剤は、噴霧乾燥処理中に気化して、一般的にくぼんだ多孔質の空力的に軽いミクロスフェアが残るフッ素化化合物（例えば、ペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロブチルエタン）であることが好ましい。以下により詳細に論述するように、他の適切な発泡剤としては、クロロホルム、フレオンおよび炭化水素が挙げられる。窒素ガスおよび二酸化炭素もまた、適切な発泡剤として意図される。
【０６７０】
有孔の微細構造は、上述のように発泡剤を用いて形成されることが好ましいが、当然のことながら、場合によっては、発泡剤を必要とせず、薬物および界面活性剤（複数可）の水性分散液が直接噴霧乾燥される。かかる場合では、製剤は、くぼみを有する比較的多孔質の微粒子の形成を概して導くような処理工程条件（例えば、温度の上昇）に修正可能である。さらに、薬物は、かかる技法における使用に特に適切な特殊な物理化学的特性（例えば、高い結晶性、高い融解温度、界面活性等）を保有し得る。
【０６７１】
有孔の微細構造は、任意選択で１つまたはそれ以上の界面活性剤を伴っても、あるいは含んでもよい。さらに、混和性界面活性剤を、任意選択で懸濁液の媒質液体相と組み合わ
せてもよい。界面活性剤の使用は、さらに分散安定性を増大し得るか、製剤化の手順を簡素化し得るか、あるいは投与時の生物学的利用能を増大させ得ることが当業者に理解されよう。当然のことながら、液体相中で１つまたはそれ以上の界面活性剤を使用し、かつ有孔の微細構造に関連させて１つまたはそれ以上の界面活性剤を使用することを含む、界面活性剤の組合せは、本発明の範囲内であると意図される。「を伴って、あるいは含んで」とは、構造マトリックスまたは有孔の微細構造が、界面活性剤を組み込み得るか、界面活性剤を吸着し得るか、界面活性剤を吸収し得るか、界面活性剤でコーティングされ得るか、あるいは界面活性剤により形成され得ることを意味する。
【０６７２】
使用に適した界面活性剤としては、構造マトリックスと懸濁媒質との間の界面で層を形成することにより、安定化された呼吸器用分散液の形成および維持を助長する任意の化合物または組成物が挙げられる。界面活性剤は、単一の化合物でもよいし任意の化合物の組合せ（例えばコサーファクタントの場合）を含んでもよい。特に好ましい界面活性剤は、噴射剤中に実質的に不溶であり、フッ素化されておらず、飽和脂質および不飽和脂質、非イオン性洗浄剤、非イオン性ブロックコポリマー、イオン性界面活性剤、ならびにかかる作用物質の組合せから成る群より選択される。上述の界面活性剤のほかに、適切な（すなわち、生体適合性の）フッ素化界面活性剤は、本明細書中の技法と適合性であり、所望の安定化された調製物を提供するのに使用され得ることは強調されるべきである。
【０６７３】
天然および合成の供給源の両方に由来するリン脂質を含む脂質は、様々な濃度で使用されて、構造的マトリックスを形成し得る。概して、適合性の脂質とは、ゲルから液晶への相転移が約４０℃より高いものを含む。好ましくは、組み込まれる脂質は、比較的長い鎖（すなわち、Ｃ６〜Ｃ２２）の飽和脂質であり、より好ましくはリン脂質を含む。開示する安定化された調製物において有用なリン脂質の例は、卵ホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステロイルホスファチジルコリン、短鎖ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、糖脂質、ガングリオシドＧＭ１、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン、脂質を含むポリマー鎖（例えば、ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸またはポリビニルピロリドン）、脂質を含むスルホン化単糖、二糖および多糖、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸）、コレステロール、コレステロールエステルおよびコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。それらの優れた生体適合性に起因して、リン脂質、ならびにリン脂質およびポロキサマーの組合せは、本明細書中に開示する安定化された分散物における使用に特に適している。
【０６７４】
適合性の非イオン性洗浄剤は、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎｓ（商標）８５）、ソルビタンセスキオレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレートおよびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを含むソルビタンエステル、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル、グリセロールエステル、ならびにスクロースエステルを含む。他の適切な非イオン性洗浄剤は、「ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ  Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ」（マックパブリッシング社（ＭｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、米国ニュージャージー州グレンロック（Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ）所在）を用いて容易に同定することができる。好ましいブロックコポリマーとしては、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのジブロックコポリマーおよびトリブロックコポリマー（ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｆ６８）、ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｆ−１２７）およびポロキサマー３３８を含む）が挙げられる。スルホコハク酸ナトリウムのようなイオン性界面活性剤および脂肪酸石鹸もまた利用する
ことができる。好ましい実施形態では、微細構造は、オレイン酸またはそのアルカリ塩を含んでもよい。
【０６７５】
上述の界面活性剤のほかに、カチオン性界面活性剤または脂質は、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の送達の場合に特に好ましい。適切なカチオン性脂質の例としては、ＤＯＴＭＡ、すなわちＮ−［−（２，３）−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、ＤＯＴＡＰ、すなわち１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン、およびＤＯＴＢ、すなわち１，２−ジオレイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロールが挙げられる。ポリリシンのようなポリカチオン性アミノ酸、およびポリアルギニンもまた意図される。
【０６７６】
噴霧処理工程に関して、回転噴霧化、圧力噴霧化および二液噴霧化のような噴霧方法を使用することができる。これらの処理工程で使用される装置の例としては、ヤマトケミカル社（Ｙａｍａｔｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）製造の「パルビスミニスプレー  ＧＡ−３２」および「パルビススプレードライヤ  ＤＬ−４１」が挙げられるし、あるいは大川原化工機株式会社製の「スプレードライヤ  ＣＬ−８」、「スプレードライヤ  Ｌ−８」、「スプレードライヤ  ＦＬ−１２」、「スプレードライヤ  ＦＬ−１６」または「スプレードライヤ  ＦＬ−２０」を、回転円板噴霧器を用いた噴霧方法に関して使用することができる。
【０６７７】
噴霧された材料を乾燥させるのに使用するガスに関して、特に制限は課せられないが、空気、窒素または不活性ガスを使用することが推奨される。噴霧された材料を乾燥させるのに使用するガスの入口温度は、噴霧された材料の熱失活を引き起こさないような温度である。その温度範囲は、約５０℃〜約２００℃、好ましくは約５０℃〜１００℃に及び得る。噴霧された材料を乾燥させるのに使用されるガスの出口の温度は、約０℃〜約１５０℃、好ましくは０℃〜９０℃、さらに好ましくは０℃〜６０℃であり得る。
【０６７８】
噴霧乾燥は、呼吸に適切な粒子サイズ、低水分含有量およびエーロゾル化の準備が可能である流動特性を有する、均質構成の実質的に非晶質の粉末を生じる条件下でなされる。得られる粉末の粒子サイズは、約９８％を上回る質量が約１０μｍ以下の直径を有する粒子であり、質量の約９０％が、５μｍ未満の直径を有する粒子となることが好ましい。別例として、質量の約９５％は直径１０μｍ未満の粒子を有し、粒子の質量の約８０％は５μｍ未満の直径を有する。
【０６７９】
ｉＲＮＡ調製物を包含する分散性の医薬品ベースの乾燥粉末は、呼吸器投与および肺投与に適切な薬学的担体または賦形剤と任意に組み合わせてもよい。かかる担体は、患者に送達される粉末中のｉＲＮＡ濃度を低減させることが望ましい場合には単に増量剤としての役割を果たし得るが、ｉＲＮＡのより効率的かつ再現性のある送達を提供し、かつ製造および粉末充填を容易にするための流動性および粘稠度のようなｉＲＮＡの取り扱い上の特性を改善するように、ｉＲＮＡ組成物の安定性を増強し、かつ粉末分散デバイス内の粉末の分散性を改善する役割を果たしてもよい。
【０６８０】
かかる担体材料は、噴霧乾燥前に、すなわち精製バルク溶液に担体材料を添加することにより、薬物と組み合わせてもよい。そのようにして、担体粒子が薬物粒子とともに同時に形成されて、均質な粉末を生じる。あるいは、担体を別個に乾燥粉末形態に調製して、ブレンドすることにより乾燥粉末薬物と組み合わせてもよい。粉末担体は、通常結晶であるが（水吸収を回避するため）、場合によっては、非晶質又は結晶と非晶質の混合物であ
ってよい。担体粒子の大きさは、薬物粉末の流動性を改善するように選択してもよく、通常２５μｍ〜１００μｍの範囲である。好ましい担体材料は、上述の範囲のサイズを有する結晶性ラクトースである。
【０６８１】
上述の方法のいずれかにより調製された粉末は、その後の使用のために従来の様式で噴霧乾燥機から回収される。医薬品および他の目的として使用するために、篩い分けまたは他の従来の技法により、形成された全ての凝集物を崩壊させることが望ましいことが多い。医薬品用途に関しては、乾燥粉末製剤は、通常測り取って単回用量とされ、この単回用量がパッケージに密封される。かかるパッケージは、以下に詳述するように、乾燥粉末吸入器中での分散に特に有用である。あるいは、粉末は、多数回用量用の容器中にパッケージングされてもよい。
【０６８２】
疎水性およびその他の薬物および成分を噴霧乾燥させる方法は、米国特許第５，０００，８８８号、同第５，０２６，５５０号、同第４，６７０，４１９号、同第４，５４０，６０２号および同第４，４８６，４３５号に記載されている。ブロッチおよびスペイソン（Ｂｌｏｃｈ  ａｎｄ  Ｓｐｅｉｓｏｎ）（１９８３年）Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ．Ｈｅｌｖ  第５８巻：１４〜２２ページは、ジオキサン−水および２−エトキシエタノール−水の共沸溶媒中でのヒドロクロロチアジドおよびクロルタリドン（親油性薬物）および親水性補助薬（ペンタエリスリトール）の噴霧乾燥を教示している。ＪＰ第８０６７６６号、ＪＰ第７２４２５６８号、ＪＰ第７１０１８８４号、ＪＰ第７１０１８８３号、ＪＰ第７１０１８９８２号、ＪＰ第７１０１８８１号およびＪＰ第４０３６２３３号を含む多数の日本国特許出願抄録が、親水性−疎水性産物の組合せの噴霧乾燥に関するものである。親水性−疎水性生成物の組合せを噴霧乾燥させることに関連した他の外国特許出願としては、ＦＲ第２５９４６９３号、ＤＥ第２２０９４７７号および国際公開公報第８８／０７８７０号が挙げられる。
【０６８３】
凍結乾燥
ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の調製物は、凍結乾燥させることにより作製することができる。凍結乾燥は、組成物を凍結させた後に組成物から水を昇華させるフリーズドライ処理工程である。凍結乾燥処理工程に関連した特定の利点は、水溶液中で比較的不安定な生物製剤および医薬品を、温度上昇を伴わずに乾燥させることができ（それにより、有害な熱的影響を排除する）、続いて安定性の問題があまりみられない乾燥状態で保管することができることである。本発明に関して、かかる技法は、生理活性を弱めることなく核酸を有孔の微細構造に組込むことと特に適合性を有する。凍結乾燥した粒子状物質を提供する方法は当該技術分野で既知であり、本明細書中の教示にしたがって分散適合性の微細構造を提供するのに過度の実験を要さないことは明らかであろう。したがって、所望の多孔性およびサイズを有する微細構造を提供するように凍結乾燥処理工程が使用され得る限りは、凍結乾燥処理工程は本明細書中の教示と適合し、明らかに本発明の範囲内であると意図される。
【０６８４】
標的化
説明を簡略化するために、本項での製剤、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、かつかかる実施は本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０６８５】
幾つかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるい
は、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、特定の細胞を標的とする。例えば、ｉＲＮＡを包含するリポソームもしくは粒子または他の構造は、標的細胞上の特定の分子を認識する標的化部分を包含することもできる。標的化部分は、標的細胞に関して特異的な親和性を有する分子であり得る。標的化部分には、標的細胞の表面上に見られるタンパク質に対する抗体、あるいは標的細胞の表面上に見られる分子に関するリガンドまたはリガンドの受容体結合部分を挙げることができる。例えば、標的化部分は、腎臓のがん特異的抗原（例えば、Ｇ２５０、ＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡまたはＨＥＲ２／ｎｅｕ）またはウイルス抗原を認識することができ、したがってがん細胞またはウイルス感染細胞へｉＲＮＡを送達する。標的化部分の例としては、抗体（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等、またはそれらの機能的部分）、細胞表面受容体に関するリガンド（例えば、それらの外部ドメイン）が挙げられる。
【０６８６】
表３は、例えば腎臓以外の組織に対するｉＲＮＡ剤の標的化が望ましい場合に、選択された細胞に対してｉＲＮＡを標的化するのに使用することができる多数の抗原を提供する。
【０６８７】
【表３】
2007525454.tif 000076
【０６８８】
一実施形態では、標的化部分はリポソームに結合される。例えば、米国特許第６，２４５，４２７号は、タンパク質またはペプチドを用いてリポソームを標的化する方法について記載している。別の例では、リポソームのカチオン性脂質成分が、標的化部分で誘導体化される。例えば、国際公開公報第９６／３７１９４号は、Ｎ−グルタリルジオレオイルホスファチジルエタノールアミンをＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルに変換することについて記載している。該生成物は続いてＲＧＤペプチドにカップリングされた。
【０６８９】
遺伝子および疾患
一態様では、本発明は、望ましくない細胞増殖、例えば悪性または非悪性の細胞増殖の危険性があるか、あるいは悪性または非悪性細胞増殖に罹患した対象を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載のｓＲＮＡまたはｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載の構造を有するｉＲＮＡ）を提供することと、該ｉＲＮＡは、望ましくない細胞増殖を促進する遺伝子に相同であり、同遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることを特徴とすることと、
ｉＲＮＡ剤（例えば、本明細書中に記載するｓＲＮＡまたはｉＲＮＡ剤）を対象、好ましくはヒト対象に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０６９０】
好ましい実施形態では、遺伝子は、成長因子遺伝子または成長因子受容体遺伝子、キナーゼ（例えば、タンパク質チロシン、セリンまたはスレオニンキナーゼ）遺伝子、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子である。
【０６９１】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＤＧＦβ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＤＧＦβ発現を特徴とする障害（例えば、精巣がんおよび肺がん）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９２】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｂ−Ｂ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９３】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｓｒｃ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳｒｃ発現を特徴とする障害（例えば、大腸がん）を有するか、またはその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９４】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＣＲＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＣＲＫ発現を特徴とする障害（例えば、大腸がん及び肺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＧＲＢ２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＧＲＢ２発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＳ発現を特徴とする障害（例えば、膵臓がん、大腸がん及び肺がん、ならびに慢性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＥＫＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＥＫＫ発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞がん、黒色腫又は白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＪＮＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＮＫ発現を特徴とする障害（例えば、膵臓がん又は乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０６９９】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＦ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん又は白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７００】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｅｒｋ１／２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｋ１／２発現を特徴とする障害（例えば、肺がん）を有するか
、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０１】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＣＮＡ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０２】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＹＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＹＢ発現を特徴とする障害（例えば、大腸がん又は慢性ミエロイド性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０３】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ−ＭＹＣ発現を特徴とする障害（例えば、バーキットリンパ腫又は神経芽細胞腫）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０４】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＪＵＮ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＵＮ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣がん、前立腺がん又は乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＦＯＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＦＯＳ発現を特徴とする障害（例えば、皮膚がん又は前立腺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＢＣＬ−２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＣＬ−２発現を特徴とする障害（例えば、肺がん、前立腺がん又は非ホジキンリンパ腫）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＤ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＤ発現を特徴とする障害（例えば、食道がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＶＥＧＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＶＥＧＦ発現を特徴とする障害（例えば、食道がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７０９】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＥＧＦＲ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥＧＦＲ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１０】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＡ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＡ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん及び子宮頸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１１】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サイクリンＥ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＥ発現を特徴とする障害（例えば、肺がん及び乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１２】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＷＮＴ−１遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＷＮＴ−１発現を特徴とする障害（例えば、基底細胞がん）を有
するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１３】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、β−カテニン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないβ−カテニン発現を特徴とする障害（例えば、腺がん又は肝細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１４】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ−ＭＥＴ発現を特徴とする障害（例えば、肝細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１５】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＫＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＫＣ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＮＦＫＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＮＦＫＢ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＳＴＡＴ３遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳＴＡＴ３発現を特徴とする障害（例えば、前立腺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１８】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、サバイビン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサバイビン発現を特徴とする障害（例えば、子宮頸がん又は膵臓がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７１９】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＨｅｒ２／Ｎｅｕ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２０】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、トポイソメラーゼＩ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２１】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩＩα発現を特徴とする障害（例えば、乳がん及び大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２２】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ７３遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ７３発現を特徴とする障害（例えば、結腸直腸腺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２３】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）発現を特徴とする障害（例えば、肝臓がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２４】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子における突然変異を
サイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２７（ＫＩＰ１）発現を特徴とする障害（例えば、肝臓がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＰＭＩＤ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＰＭＩＤ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＲＡＳ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＳ発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２７】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、カベオリンＩ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないカベオリンＩ発現を特徴とする障害（例えば、食道偏平上皮細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２８】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＩＢ  Ｉ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＩＢ  Ｉ発現を特徴とする障害（例えば、男性の乳がん（ＭＢＣ））を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７２９】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＴＡＩ遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＴＡＩ発現を特徴とする障害（例えば、卵巣がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３０】
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｍ６８遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭ６８発現を特徴とする障害（例えば、食道、胃、大腸及び直腸のヒト腺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３１】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、化学療法剤と組み合わせて、アポトーシス活性を促進する方法として使用することができる。
【０７３２】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子における突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ５３発現を特徴とする障害（例えば、胆嚢がん、膵臓がん及び肺がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３３】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐ５３ファミリーの一員であるＤＮ−ｐ６３をサイレンシングし、したがって、望ましくないＤＮ−ｐ６３発現を特徴とする障害（例えば、偏平上皮細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３４】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐＲｂ発現を特徴とする障害（例えば、口腔偏平上皮細胞がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３５】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子をサイレンシングし、
したがって、望ましくないＡＰＣ１発現を特徴とする障害（例えば、大腸がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＲＣＡ１発現を特徴とする障害（例えば、乳がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＴＥＮ発現を特徴とする障害（例えば、過誤腫、グリア細胞腫、前立腺がん及び子宮内膜がん）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＭＬＬ融合遺伝子、例えばＭＬＬ‐ＡＦ９をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＬＬ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、急性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７３９】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、急性及び慢性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４０】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、小児期急性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４１】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、ユーイング肉腫）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４２】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、粘液脂肪肉腫）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４３】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、粘液脂肪肉腫）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４４】
別の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子発現を特徴とする障害（例えば、急性白血病）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４５】
別の態様では、本発明は、血管新生阻害が有益でありうる疾患又は障害（例えば、がん）の危険性があるか、該疾患又は障害に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載の構造を有するｉＲＮＡ剤を提供することと、該ｉＲＮＡ剤は、血管新生を仲介する遺伝子に相同であり、かつ同遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０７４６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、αｖ−インテグリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないαｖ−インテグリン発現を特徴とする障害（例えば、脳腫瘍又は上皮を起原とする腫瘍）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４７】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、Ｆｌｔ−１受容体遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＦｌｔ−１受容体発現を特徴とする障害（例えば、がん及びリウマチ関節炎）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４８】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、チューブリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないチューブリン発現を特徴とする障害（例えば、がん及び網膜新血管新生）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７４９】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、チューブリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないチューブリン発現を特徴とする障害（例えば、がん及び網膜新血管新生）を有するか、又はその危険性がある対象を治療するのに使用することができる。
【０７５０】
別の態様では、本発明は、ウイルスに感染した対象、あるいはウイルス感染に関連した障害若しくは疾患の危険性があるか、又は該障害若しくは疾患に罹患した対象を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載の構造を有するｉＲＮＡ剤を提供することと、該ｉＲＮＡ剤は、ウイルス遺伝子またはウイルスの機能（例えば、侵入又は増殖）を媒介する細胞遺伝子に相同であり、かつ同遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象（好ましくは、ヒト対象）に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０７５１】
したがって、本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染した患者、あるいはＨＰＶにより媒介される障害（例えば、子宮頸がん）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。ＨＰＶは、子宮頸がんの９５％に関係し、したがって抗ウイルス療法は、これらのがん及びウイルス感染の他の症状を治療するための魅力的な方法である。
【０７５２】
好ましい実施形態では、ＨＰＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ遺伝子は、Ｅ２、Ｅ６又はＥ７の群のうちの１つである。
好ましい実施形態では、ＨＰＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７５３】
本発明はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者、あるいはＨＩＶにより媒介される障害（例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ））の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７５４】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、ＨＩＶ遺伝子は、ＣＣＲ５、Ｇａｇ又はＲｅｖである。
好ましい実施形態では、ＨＩＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、遺伝子はＣＤ４又はＴｓｇ１０１である。
【０７５５】
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した患者、あるいはＨＢＶにより媒介される障害（例えば、肝硬変及び肝細胞がん）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７５６】
好ましい実施形態では、ＨＢＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、標的とされるＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶコアタンパク質のテール領域、ｐｒｅ−ｃｒｅｇｉｏｕｓ（ｐｒｅ−ｃ）領域、又はｃｒｅｇｉｏｕｓ（ｃ）領域の群のうちの１つをコードする。別の好ましい実施形態では、標的とされるＨＢＶ−ＲＮＡ配列は、ポリ（Ａ）テールを含んで構成される。
【０７５７】
好ましい実施形態では、ＨＢＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に感染した患者、あるいはＨＡＶにより媒介される障害の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７５８】
好ましい実施形態では、ＨＡＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者、あるいはＨＣＶにより媒介される障害（例えば、肝硬変）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７５９】
好ましい実施形態では、ＨＣＶ遺伝子の発現が低減される。
別の好ましい実施形態では、ＨＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７６０】
本発明はまた、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型又はＨ型を含む肝炎ウイルス株の群のいずれかに感染した患者、あるいはこれらの肝炎株のいずれかにより媒介される障害の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７６１】
好ましい実施形態では、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型又はＨ型肝炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。
別の好ましい実施形態では、Ｄ型、Ｅ型、Ｆ型、Ｇ型又はＨ型肝炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７６２】
本発明の方法はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した患者、あるいはＲＳＶにより媒介される障害（例えば、乳児における下気道感染及び小児喘息、例えば高齢者における肺炎及び他の合併症）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７６３】
好ましい実施形態では、ＲＳＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、標的とされるＨＢＶ遺伝子は、遺伝子Ｎ、Ｌ又はＰの群のうちの１つをコードする。
好ましい実施形態では、ＲＳＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７６４】
本発明の方法は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に感染した患者、あるいはＨＳＶにより媒介される障害（例えば、陰部ヘルペス及び単純ヘルペスならびに主として免疫不全状態の患者における生命にかかわる疾患又は視覚障害をもたらす疾患）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７６５】
好ましい実施形態では、ＨＳＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、標的とされるＨＳＶ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼ又はＤＮＡヘリカーゼ−プライマーゼをコードする。
【０７６６】
好ましい実施形態では、ＨＳＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ヘルペスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染した患者、あるいはＣＭＶにより媒介される障害（例えば、先天性ウイルス感染及び免疫不全状態の患者における病的状態）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７６７】
好ましい実施形態では、ＣＭＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＣＭＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ヘルペスエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に感染した患者、あるいはＥＢＶにより媒介される障害（例えば、ＮＫ／Ｔ−細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫及びホジキン病）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を提供する。
【０７６８】
好ましい実施形態では、ＥＢＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＥＢＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）（ヒトヘルペスウイルス８型とも呼ばれる）に感染した患者、あるいはＫＳＨＶにより媒介される障害（例えば、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病及びＡＩＤＳ関連原発性滲出液リンパ腫）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７６９】
好ましい実施形態では、ＫＳＨＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＫＳＨＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）に感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した疾患又は障害（例えば、進行性多病巣性白質脳症（ＰＭＬ））を治療する方法を包含する。
【０７７０】
好ましい実施形態では、ＪＣＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＪＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ミクソウイルスに感染した患者、あるいはミクソウイルスにより媒介される障害（例えば、インフルエンザ）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７１】
好ましい実施形態では、ミクソウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ミクソウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７７２】
本発明の方法はまた、ライノウイルスに感染した患者、あるいはライノウイルスにより媒介される障害（例えば、風邪）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７３】
好ましい実施形態では、ライノウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ライノウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７７４】
本発明の方法はまた、コロナウイルスに感染した患者、あるいはコロナウイルスにより媒介される障害（例えば、風邪）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療す
ることを提供する。
【０７７５】
好ましい実施形態では、コロナウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、コロナウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７７６】
本発明の方法はまた、フラビウイルスである西ナイルウイルスに感染した患者、あるいは西ナイルウイルスにより媒介される障害の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７７】
好ましい実施形態では、西ナイルウイルス遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、西ナイルウイルス遺伝子は、Ｅ、ＮＳ３又はＮＳ５を含む群のうちの１つである。
【０７７８】
好ましい実施形態では、西ナイルウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、フラビウイルスであるセントルイス脳炎ウイルスに感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した障害若しくは疾患（例えば、ウイルス性出血熱又は神経系疾患）の危険性があるか、又は該障害若しくは疾患に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７７９】
好ましい実施形態では、セントルイス脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、セントルイス脳炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７８０】
本発明の方法はまた、ダニ媒介性脳炎フラビウイルスにより感染されたか、あるいはダニ媒介性脳炎ウイルスにより媒介される障害（例えば、ウイルス性出血熱及び神経系疾患）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７８１】
好ましい実施形態では、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ダニ媒介性脳炎ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７８２】
本発明の方法はまた、通常ウイルス性出血熱及び神経系疾患をもたらすマレー渓谷脳炎フラビウイルスに感染した患者を治療する方法を提供する。
好ましい実施形態では、マレー渓谷脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。
【０７８３】
好ましい実施形態では、マレー渓谷脳炎ウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、デング熱フラビウイルスに感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した疾患又は障害（例えば、デング熱出血性熱）を治療する方法を包含する。
【０７８４】
好ましい実施形態では、デング熱ウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、デング熱ウイルスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７８５】
本発明の方法はまた、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に感染した患者、あるいはＳＶ４０により媒介される障害（例えば、腫瘍形成）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７８６】
好ましい実施形態では、ＳＶ４０遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＳＶ４０複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ヒトＴ細胞白血球ウイルス（ＨＴＬＶ）に感染した患者、あるいはこのウイルスに関連した疾患又は障害（例えば、白血病及びミエロパシー）を治療する方法を包含する。
【０７８７】
好ましい実施形態では、ＨＴＬＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、ＨＴＶＬ１遺伝子は、Ｔａｘ転写活性化因子である。
好ましい実施形態では、ＨＴＬＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７８８】
本発明の方法はまた、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）に感染した患者、あるいはＭｏ−ＭｕＬＶにより媒介される障害（例えば、Ｔ細胞白血病）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７８９】
好ましい実施形態では、Ｍｏ−ＭｕＬＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、Ｍｏ−ＭｕＬＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９０】
本発明の方法はまた、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に感染した患者、あるいはＥＭＣＶにより媒介される障害（例えば、心筋炎）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。ＥＭＣＶは、マウスおよびブタにおいて心筋炎を引き起こし、ヒト心筋細胞に感染することができる。したがって、このウイルスは、異種移植を受けた患者に関する問題事項である。
【０７９１】
好ましい実施形態では、ＥＭＣＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＥＭＣＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、麻疹ウイルス（ＭＶ）に感染した患者、ＭＶにより媒介される障害（例えば、麻疹）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０７９２】
好ましい実施形態では、ＭＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＭＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に感染した患者、あるいはＶＺＶにより媒介される障害（例えば、水疱瘡又は帯状ヘルペス（帯状疱疹とも呼ばれる））の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０７９３】
好ましい実施形態では、ＶＺＶ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ＶＺＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、アデノウイルスに感染した患者、あるいはアデノウイルスにより媒介される障害（例えば、気道感染）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０７９４】
好ましい実施形態では、アデノウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、アデノウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９５】
本発明はまた、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に感染した患者、あるいはＹＦＶにより媒介される障害（例えば、気道感染）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療する方法を包含する。
【０７９６】
好ましい実施形態では、ＹＦＶ遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では
、好ましい遺伝子は、Ｅ、ＮＳ２Ａ又はＮＳ３遺伝子を包含する群のうちの１つである。
好ましい実施形態では、ＹＦＶ複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９７】
本発明の方法はまた、ポリオウイルスに感染した患者、あるいはポリオウイルスにより媒介される障害（例えば、ポリオ）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０７９８】
好ましい実施形態では、ポリオウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ポリオウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０７９９】
本発明の方法はまた、ポックスウイルスに感染した患者、あるいはポックスウイルスにより媒介される障害（例えば、天然痘）の危険性があるか、又は該障害に罹患した患者を治療することを提供する。
【０８００】
好ましい実施形態では、ポックスウイルス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ポックスウイルス複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８０１】
別の態様では、本発明は、病原体（例えば、細菌、アメーバ、寄生生物又は真菌などの病原体）に感染した対象を治療する方法を特徴とする。上記方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載の構造を有するｓｉＲＮＡ剤を提供することと、ｓｉＲＮＡ剤は、病原体遺伝子に相同であり、かつ例えば病原体遺伝子の切断により同遺伝子をサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象（好ましくは、ヒト対象）に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０８０２】
標的遺伝子は、増殖、細胞壁合成、タンパク質合成、転写、エネルギー代謝（例えばクレブス回路）又は毒素産生に関与するものであり得る。
したがって、本発明は、マラリアを引き起こすマラリア原虫に感染した患者を治療する方法を提供する。
【０８０３】
好ましい実施形態では、マラリア原虫遺伝子の発現が低減される。別の好ましい実施形態では、該遺伝子は、頂端膜抗原１（ＡＭＡ１）である。
好ましい実施形態では、マラリア原虫の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８０４】
本発明はまた、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、ブルーリ潰瘍）を治療する方法を包含する。
【０８０５】
好ましい実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランス遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランスの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８０６】
本発明はまた、ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、結核）を治療する方法を包含する。
【０８０７】
好ましい実施形態では、ヒト結核菌遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、ヒト結核菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８０８】
本発明はまた、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、らい病）を治療する方法を包含する。
【０８０９】
好ましい実施形態では、らい菌遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、らい菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、細菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、皮膚及び粘膜の感染）を治療する方法を包含する。
【０８１０】
好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、黄色ブドウ球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１１】
本発明はまた、細菌の肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、肺炎又は小児期下気道感染）を治療する方法を包含する。
【０８１２】
好ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、肺炎連鎖球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１３】
本発明はまた、細菌の化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、連鎖球菌性咽頭炎又は猩紅熱）を治療する方法を包含する。
【０８１４】
好ましい実施形態では、化膿連鎖球菌遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、化膿連鎖球菌の複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１５】
本発明はまた、細菌の肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、肺炎又は小児期下気道感染）を治療する方法を包含する。
【０８１６】
好ましい実施形態では、肺炎クラミジア遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、肺炎クラミジアの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１７】
本発明はまた、細菌の肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に感染した患者、あるいはこの病原体に関連した疾患又は障害（例えば、肺炎又は小児期下気道感染）を治療する方法を包含する。
【０８１８】
好ましい実施形態では、肺炎マイコプラズマ遺伝子の発現が低減される。
好ましい実施形態では、肺炎マイコプラズマの複製に必要とされるヒト遺伝子の発現が低減される。
【０８１９】
一態様では、本発明は、望ましくない免疫応答を特徴とする疾患又は障害（例えば、炎症性の疾患又は障害、あるいは自己免疫性の疾患又は障害）の危険性があるか、あるいは該疾患又は障害に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤、例えば本明細書中に記載の構造を有するｉＲＮＡ剤を提供することと、該ｉＲＮＡ剤は、望ましくない免疫応答を媒介する遺伝子に相同であり、かつ該遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０８２０】
好ましい実施形態では、疾患又は障害は、虚血又は再灌流傷害、例えば、急性心筋梗塞、不安定狭心症、心肺バイパス、外科的介入（例えば、血管形成術（例えば、経皮的経管的冠状動脈形成術））、移植された臓器若しくは組織（例えば、移植された心臓組織又は血管組織）に対する応答、又は血栓溶解に関連した虚血あるいは再灌流傷害である。
【０８２１】
好ましい実施形態では、疾患又は障害は、再狭窄、例えば、外科的介入（例えば、血管形成術（例えば、経皮的経管的冠状動脈形成術））に関連した再狭窄である。
好ましい実施形態では、疾患又は障害は、炎症性腸疾患、例えばクローン病又は潰瘍性大腸炎である。
【０８２２】
好ましい実施形態では、疾患又は障害は、感染又は傷害に関連した炎症である。
好ましい実施形態では、疾患又は障害は、喘息、狼瘡、多発性硬化症、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、関節炎（例えば、関節リウマチ又は乾癬性関節炎）である。
【０８２３】
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、インテグリン又はインテグリンの共通リガンド（co-ligand ）、例えばＶＬＡ４、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭをサイレンシングする。
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、セレクチン又はセレクチンの共通リガンド、例えばＰ−セレクチン、Ｅ−セレクチン（ＥＬＡＭ）、Ｉ−セレクチン、Ｐ−セレクチン糖タンパク質−１（ＰＳＧＬ−１）をサイレンシングする。
【０８２４】
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、補体系の構成成分、例えばＣ３、Ｃ５、Ｃ３ａＲ、Ｃ５ａＲ、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ５コンバターゼをサイレンシングする。
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ケモカイン又はケモカイン受容体、例えばＴＮＦＩ、ＴＮＦＪ、ＩＬ−１Ｉ、ＩＬ−１Ｊ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＩｇＥ、ＳＣＹＡ１１、ＣＣＲ３をサイレンシングする。
【０８２５】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＧＣＳＦ、Ｇｒｏ１、Ｇｒｏ２、Ｇｒｏ３、ＰＦ４、ＭＩＧ、プロ血小板塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）、ＭＩＰ−１Ｉ、ＭＩＰ−１Ｊ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＣＭＢＫＲ１、ＣＭＢＫＲ２、ＣＭＢＫＲ３、ＣＭＢＫＲ５、ＡＩＦ−１、Ｉ−３０９をサイレンシングする。
【０８２６】
一態様では、本発明は、急性疼痛又は慢性疼痛の危険性があるか、あるいは急性疼痛又は慢性疼痛に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤を提供することと、該ｉＲＮＡは、疼痛の過程を媒介する遺伝子に相同であり、かつ該遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０８２７】
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、イオンチャネルの構成成分をサイレンシングする。
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、神経伝達物質の受容体又はリガンドをサイレンシングする。
【０８２８】
一態様では、本発明は、神経系の疾患又は障害の危険性があるか、あるいは神経系の疾患又は障害に罹患した対象（例えば、ヒト）を治療する方法を特徴とする。該方法は、以下の：
ｉＲＮＡ剤を提供することと、該ｉＲＮＡは、神経系の疾患又は障害を媒介する遺伝子に相同であり、かつ該遺伝子を例えば切断によりサイレンシングすることができることと、
ｉＲＮＡ剤を対象に投与することと、
それにより対象を治療することと
を包含する。
【０８２９】
好ましい実施形態では、疾患又は障害は、アルツハイマー病又はパーキンソン病である。
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、アミロイドファミリー遺伝子（例えばＡＰＰ）、プレセニリン遺伝子（例えば、ＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２）又はＩ−シヌクレインをサイレンシングする。
【０８３０】
好ましい実施形態では、疾患又は障害は、神経変性疾患のトリヌクレオチドリピート病、例えばハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症又は脊髄小脳失調、例えばＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３（マシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ７又はＳＣＡ８である。
【０８３１】
特に好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ＨＤ、ＤＲＰＬＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＭＪＤ１、ＣＡＣＮＬ１Ａ４、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８をサイレンシングする。
ヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）は、ＬＯＨ領域において配列、例えば遺伝子にヘミ接合性をもたらし得る。これは正常細胞と疾患状態の細胞（例えばがん細胞）との間に重大な遺伝的差異をもたらす可能性があり、正常細胞と疾患状態の細胞（例えばがん細胞）との間の有用な差異を提供する。この差異は、遺伝子又はその他の配列が正倍数体細胞ではヘテロ接合体であるが、ＬＯＨを有する細胞ではヘミ接合体であるために生じ得る。ＬＯＨの領域は、多くの場合、喪失すると好ましくない増殖を促進する遺伝子、例えば腫瘍抑制遺伝子、及び例えば別の遺伝子（場合によっては正常に機能（例えば、増殖）するのに必須の遺伝子）を含有する別の配列を含む。本発明の方法は、一部には、必須遺伝子の１つの対立遺伝子を本発明のｉＲＮＡ剤で特異的に切断又はサイレンシングすることによる。上記ｉＲＮＡ剤は、該ｉＲＮＡ剤が、ＬＯＨを有する細胞に見出される必須遺伝子の１つの対立遺伝子を標的にするが、ＬＯＨを示さない細胞に存在する別の対立遺伝子はサイレンシングしないように選択される。実質的に、ｉＲＮＡ剤は２つの対立遺伝子を区別し、選択された対立遺伝子を選択的にサイレンシングする。実質的には、多型、例えばＬＯＨにより影響を受ける必須遺伝子のＳＮＰｓは、ＬＯＨを有する細胞、例えばＬＯＨを有するがん細胞を特徴とする疾患用の標的として使用される。
【０８３２】
例えば、当業者は、腫瘍抑制遺伝子に近接し、且つ腫瘍抑制遺伝子を含むＬＯＨ領域内にある必須遺伝子を同定することができる。ヒトＲＮＡポリメラーゼ  ＩＩ（ＰＯＬＲ２Ａ）の大サブユニットをコードする遺伝子、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３に近接して位置する遺伝子は、このような遺伝子である。このような遺伝子は、がん細胞ではＬＯＨの領域内に
多く存在する。ＬＯＨ領域内に存在し、且つ多くのがん細胞種では欠けているその他の遺伝子は、複製タンパク質Ａ  ７０ｋＤａサブユニット、複製タンパク質Ａ３２−ｋＤａ、リボヌクレオチドレダクターゼ、チミジル酸合成酵素、ＴＡＴＡ関連因子２Ｈ、リボソームタンパク質Ｓ１４、真核生物の開始因子５Ａ、アラニルｔＲＮＡシンテターゼ、システイニルｔＲＮＡシンテターゼ、ＮａＫ  ＡＴＰアーゼ、α−１サブユニット及びトランスフェリン受容体を含む群を包含する。
【０８３３】
したがって、本発明は、ＬＯＨを特徴とする障害、例えばがんを治療する方法を特徴とする。該方法は：
任意選択で、ＬＯＨ領域の遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型を決定することと、好ましくは、正常細胞における該遺伝子の両対立遺伝子の遺伝子型を決定することと、
ＬＯＨ細胞に見出される対立遺伝子を選択的に切断又はサイレンシングするｉＲＮＡ剤を提供することと、
対象にｉＲＮＡを投与すること、
それにより疾患を治療することと
を包含する。
【０８３４】
本発明はまた、本明細書中で開示されるｉＲＮＡ剤、例えば多型遺伝子の１つの対立遺伝子を選択的にサイレンシング（例えば切断）することができるｉＲＮＡ剤を包含する。
別の態様では、本発明は、２つ以上の遺伝子をｉＲＮＡ剤で切断又はサイレンシングする方法を提供する。これらの実施形態では、上記ｉＲＮＡ剤は、２つ以上の遺伝子に見出される配列に十分な相同性を有するように選択される。例えば、配列ＡＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴ（配列番号２８）は、マウスのラミンＢ１、ラミンＢ２、ケラチン複合体２−遺伝子１及びラミンＡ／Ｃ間で保存されている。したがって、この配列を標的とするｉＲＮＡ剤は、該遺伝子集団全体を効率的にサイレンシングするであろう。
【０８３５】
本発明はまた、２つ以上の遺伝子をサイレンシングすることができる、本明細書中で開示されるｉＲＮＡ剤を包含する。
送達経路
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述される。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。ｉＲＮＡを包含する組成物は種々の経路で対象に送達され得る。典型的な経路は、静脈内、局所、経直腸、経肛門、経膣、経鼻、経肺及び経眼経路を包含する。
【０８３６】
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に好適な医薬組成物中に組み込まれることが可能である。かかる組成物は、通常、１種類または複数種類のｉＲＮＡと医薬として許容可能な担体とを包含する。本明細書中で使用する場合、「医薬として許容可能な担体」という用語は、医薬品の投与と適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張な吸収遅延剤等を包含することを意図する。医薬としての活性を有する物質に関するこのような媒体および試薬を使用することは、当該技術分野で周知である。いかなる従来の媒体および試薬も該活性化合物と適合しない場合を除き、組成物に従来の媒体および試薬を使用することが想定される。また、補助的な活性化合物が組成物に包含されることも可能である。
【０８３７】
本発明の医薬組成物は、局所治療又は全身治療のどちらが所望されるかによって、且つ治療されるべき領域によって、多様な方法で投与され得る。投与は、局所（経眼、経膣、経直腸、経鼻、経皮を含む）、経口又は非経口であってよい。非経口投与は、静脈内点滴
投与、皮下投与、腹腔内注射又は筋肉内注射、又は鞘内投与若しくは脳室内投与を包含する。
【０８３８】
投与の経路及び部位は標的指向性を増大するように選択してもよい。例えば、筋細胞を標的とする場合、目的の筋肉に筋肉内注射することは、論理的な選択であろう。エアロゾル形態のｉＲＮＡを投与することにより肺細胞を標的とすることもできよう。バルーン・カテーテルをｉＲＮＡでコーティングすることにより、且つ機械的にＤＮＡを導入することにより血管内皮細胞を標的とすることもできる。
【０８３９】
局所投与用の製剤には、経皮貼布剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉末剤を挙げることができる。従来の医薬担体、水溶性基剤、粉末状基剤又は油状基剤、増粘剤等が、必要又は望ましいものであり得る。コーティングされたコンドーム、グローブ等もまた有用であり得る。
【０８４０】
経口投与用の組成物には、粉剤又は顆粒剤、水中懸濁液又は水溶液、シロップ、エリキシル又は非水溶性媒体、錠剤、カプセル、薬用キャンディ、又はトローチが包含される。錠剤の場合、使用可能な担体は、ラクトース、クエン酸ナトリム及びリン酸塩を含む。デンプン等の種々の錠剤分解物質、ならびに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク等の潤滑剤が、一般に錠剤に使用される。カプセル形態での経口投与については、有用な希釈剤は、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールである。水溶性の懸濁液が経口使用に必要とされる場合、本発明の核酸組成物は、乳化剤及び懸濁剤と組み合わせることができる。所望により、ある種の甘味剤及び／又は香料剤を添加することができる。
【０８４１】
鞘内投与又は脳室内投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤及びその他の好適な添加剤も含有し得る殺菌水溶液を含み得る。
非経口投与のための製剤は、緩衝剤、希釈剤及びその他の好適な添加剤も含有し得る殺菌水溶液を含み得る。脳室内注射は、例えばリザーバに取り付けられた脳室内カテーテルにより容易となり得る。脳室内で使用される場合、溶質の総濃度は、調製物が等張となるように制御されるべきである。
【０８４２】
経眼投与に関しては、軟膏又は滴下可能な液剤が、アプリケータ又は目薬用容器等の当業者には既知の眼球送達システムにより送達され得る。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はポリ（ビニルアルコール）等の粘性剤（mucomimetics）、ソルビン酸、ＥＤＴＡ又は塩化ベンジルクロニウム等の防腐剤、及び通常量の希釈剤及び／又は担体を包含することができる。
【０８４３】
局所送達
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、局所投与を介して対象に送達される。「局所投与」とは、対象の表面に直接製剤を接触させることによって、該対象に送達することを言う。局所送達の最も一般的な形態は皮膚に対してであるが、本明細書中で開示される組成物は、体の別の表面、例えば目、粘膜、体腔の表面又は体内の表面に対して、直接適用することもできる。上記したように、最も一般的な局所送達は皮膚に対してである。この用語は、局所及び経皮を含むいくつかの投与経路を包含するが、これらに制
限されない。これらの投与の形態は、通常、皮膚の透過障壁への浸透及び標的組織又は標的層への効率的な送達を含む。局所投与は、組成物が表皮及び真皮に浸透し、最終的に全身への送達を達成する手段として使用されることができる。また、局所投与は、対象の表皮又は真皮に、又はその特定の層に、又はその下の組織に、オリゴヌクレオチドを選択的に送達する手段として使用されることができる。
【０８４４】
本明細書中で用いる場合、「皮膚」という用語は、動物の表皮及び／又は真皮をいう。哺乳類の皮膚は、２つの主要かつ明確な層から構成されている。皮膚の外側の層は、表皮と呼ばれる。表皮は、角質層、顆粒層、有棘層、及び基底層から成り、角質層は皮膚の表面にあり、基底層は表皮の最も深い部分にある。表皮は、体の場所に応じて５０μｍ〜０．２ｍｍの厚さである。
【０８４５】
表皮の下に真皮があり、真皮は表皮よりもはるかに厚い。真皮は、主として繊維束状のコラーゲンから構成されている。このコラーゲン束は、とりわけ、血管、毛細リンパ管、腺、神経終末及び免疫学的に活性な細胞に対する支えを提供する。
【０８４６】
器官としての上記皮膚の主要な機能の１つは、体内への物質の侵入を制御することである。皮膚の主たる透過障壁は、種々な分化状態の多くの細胞の層から形成される角質層により提供される。角質層での細胞間の空隙は、皮膚透過障壁をさらに増大するように、密閉を提供する格子様の構造に配置構成された様々な脂質で満たされている。
【０８４７】
皮膚により提供される透過障壁は、約７５０Ｄａより大きい分子量を有する分子に対しては主として非透過性である。大きな分子が皮膚の透過障壁を通過するためには、通常の浸透現象以外の機構が使用されなければならない。
【０８４８】
いくつかの要因が、投与される物質に対する皮膚の透過性を決定付けている。これらの要因は、投与を受けた皮膚の特性、送達剤の特性、薬物と送達剤及び薬物と皮膚の両方の間の相互作用、投与された薬物の用量、治療の形態、治療後の措置を包含する。選択的に表皮及び真皮を標的とするために、薬物が予め選択された層へと浸透することを可能とする、１つ又はそれ以上の浸透促進剤を包含する組成物を配合することが可能なこともある。
【０８４９】
経皮送達は、脂質可溶性の治療剤の投与に有用な経路である。真皮は、表皮よりも透過性が高いため、擦過した皮膚、熱傷した皮膚又は剥離した皮膚を介すると吸収はより迅速となる。また、皮膚への血流を増加させる炎症及びその他の生理学的な条件も、経皮吸収を増大させる。この経路を介する吸収は、油状ビヒクル（塗擦剤）の使用により、又は１つ以上の浸透促進剤の使用により増大し得る。経皮経路を介して本明細書中に開示される組成物を送達する別の効率的な方法としては、皮膚の水分補給及び制御放出型の局所貼布剤の使用が挙げられる。経皮経路は、全身治療及び／又は局所治療のための、本明細書中に開示される組成物を送達する潜在的に効率的な手段を提供する。
【０８５０】
加えて、イオントフォレーシス（電場の影響下で生体膜を介してイオン性溶質を移動すること）（リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ）、「治療剤担体システムにおける評論総説（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems）」、１６３ページ、１９９１年）、フォノフォレーシス又はソノフォレーシス（生体膜、特に皮膚及び角膜を横切る種々の治療剤の吸収を増大させるための超音波の使用）（リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ）、「治療剤担体システムにおける評論総説」、１６６ページ、１９９１年）、並びに、投薬の状態及び投与部位における保持力に応じたビヒクル特性の最適化（リーら（Ｌｅｅ  ｅｔ
ａｌ）、「治療剤キャリアシステムにおける評論総説」、１６８ページ、１９９１年）は、皮膚及び粘膜部位を横切って局所投与される組成物の移送を増大させる有用な方法で
あり得る。
【０８５１】
提供された上記組成物及び方法は、種々のタンパク質及び遺伝子の機能を、培養又は保存された真皮組織においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、かつ動物において試験するために使用することもできる。したがって、本発明は、任意の遺伝子の機能を試験するために適用することができる。また、本発明の方法は、治療的に又は予防的に使用され得る。例えば、乾癬、扁平苔癬、中毒性表皮壊死症、多形性紅斑、基底細胞がん、有棘細胞がん、悪性黒色腫、パジェット病、カポジ肉腫、肺線維症、ライム病、ならびにウイルス、真菌及びバクテリアの皮膚感染等の疾患に罹患しているとわかっている動物又は該疾患への罹患が疑われる動物の治療のために使用されうる。
【０８５２】
肺送達
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つこのような実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物は、肺送達により対象に投与されうる。肺送達組成物は、患者により分散剤が吸入され、該分散剤内の組成物、好ましくはｉＲＮＡが肺に到達して肺胞領域を介して直接血液循環へ容易に吸収され得るように、送達されることができる。肺送達は、肺の疾患を治療するために、全身送達及び局所送達の両方に有効であり得る。
【０８５３】
肺送達は、霧状の、エアロゾル化された、ミセル化された、かつ乾燥粉末ベースの製剤の使用など、様々な手法で達成可能である。送達は、液体ネブライザー、エアロゾル吸入器、および乾燥粉末散布デバイスを用いて達成されうる。定量式のデバイスが好ましい。アトマイザー又は吸入器を使用する利点の１つは、上記デバイスが内蔵型であるために雑菌混入の可能性が最小限となることである。乾燥粉末散布デバイスは、例えば、容易に乾燥粉末として製剤化され得る薬物を送達する。ｉＲＮＡ組成物は、凍結乾燥粉末又は噴霧乾燥粉末として、単独又は好適な粉末担体との組み合わせとして安定に貯蔵され得る。吸入用の組成物の送達は、機器に組み込まれた時に、エアロゾル薬の投与期間中の、服用量の追跡、服用順守の監視、及び／又は患者に対する服用の誘発を可能にする、タイマー、投与量計測器、時間測定器、又は時間表示器などの服用時間計測要素を介して実施されてもよい。
【０８５４】
「粉末」という用語は、微小な分散固形粒子から成る組成物を意味し、上記粒子は自由に流動し、且つ吸入器内で容易に分散されうるとともに、続いて対象によって吸入されて肺へ到達し肺胞内に浸透可能となることを特徴とする。したがって、上記粉末は、「呼吸用」であると言える。平均粒径は、直径が約１０μｍ未満であることが好ましく、比較的均一に球状の形状に分布していることが好ましい。直径が、約７．５μｍ未満であることがより好ましく、約５．０μｍ未満であることが最も好ましい。通常、粒径分布は、直径が約０．１μｍ〜約５μｍであり、特に約０．３μｍ〜約５μｍであることが好ましい。
【０８５５】
「乾燥」という用語は、組成物が、約１０重量％（％ｗ）未満の水分含有量、通常は、約５％ｗ未満、好ましくは約３％ｗ未満の水分含有量を有することを意味する。乾燥組成物は、上記粒子が吸入器内で容易に分散可能でエアロゾルを形成するようなものでありうる。
【０８５６】
「治療上有効な量」という用語は、期待される生理学的応答を得るために治療すべき対
象に所望のレベルの薬物を提供するのに必要とされる、組成物中の存在量である。
「生理学的に有効な量」という用語は、所望の症状緩和効果又は治療効果を得るために対象に送達される量である。
【０８５７】
「医薬として許容可能な担体」という用語は、肺に対する重大な悪影響である毒性効果を伴わずに、肺に摂取させることができる担体を意味する。
担体として有用である医薬賦形剤の種類としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の安定剤、糖質、アミノ酸及びポリペプチド等の充填剤、ｐＨ調整剤又は緩衝剤、塩化ナトリウム等の塩等が挙げられる。これらの担体は、結晶形態でも非晶質の形態でもよく、又は該２つの形態の混合物であってもよい。
【０８５８】
特に有用である充填剤としては、適合性の糖質、ポリペプチド、アミノ酸又はそれらの組み合わせが挙げられる。好適な糖質としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖、ラクトース、トレハロース等の二糖、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等のシクロデキストリン、及びラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等の多糖、マンニトール、キシリトール等のアルジトール等が挙げられる。糖質の好ましい群としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリン及びマンニトールが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニン及びグリシンが挙げられ、グリシンが好ましい。
【０８５９】
本発明の組成物の微量成分である添加剤は、噴霧乾燥中の立体構造の安定性及び粉末の分散性の向上のために包含されてもよい。これらの添加剤は、トリプトファン、チロシン、ロイシン及びフェニルアラニン等の疎水性アミノ酸を含む。
【０８６０】
好適なｐＨ調整剤又は緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等の、有機酸及び塩基から調製される有機塩が挙げられるが、クエン酸ナトリウムが好ましい。
【０８６１】
ミセル状ｉＲＮＡ製剤の経肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル、およびその他の非ＣＦＣ噴霧剤及びＣＦＣ噴霧剤等の噴霧剤を用いて、定量噴霧器で達成され得る。
【０８６２】
経口又は経鼻送達
説明を簡略化するために、本項の製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述する。しかしながら、これらの製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。口腔及び鼻腔の膜はいずれも、別の投与経路と比べて有利な点を与える。例えば、これらの膜を介して投与された薬物は、急速に作用を開始し、薬効レベルの血漿中濃度を提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、不都合な胃腸（ＧＩ）環境への薬物の暴露を回避する。更なる利点は、上記膜部位に容易に接近することができるので、薬物を簡単に投与し、局在させ、且つ除去することができることである。
【０８６３】
経口送達では、組成物が、口腔の表面に、例えば、舌下粘膜（舌の腹側表面の膜及び口底を含む）又は頬の内面を構成する頬粘膜を標的とするようにすることが可能である。舌下粘膜は比較的透過性が高いため、迅速な吸収と、且つ多くの薬物に対する許容可能な生物学的利用性が得られる。さらに、舌下粘膜は、便利で、許容可能で、且つ容易に接触可能である。
【０８６４】
分子が口腔粘膜を介して透過する能力は、分子サイズ、脂質溶解度及びペプチドタンパ
ク質のイオン化に関連すると思われる。１，０００ダルトン未満の小さい分子は、迅速に粘膜を通過すると思われる。分子サイズが増加するのに伴い、透過性は急速に減少する。脂質可溶性の化合物は、脂質可溶性でない分子よりも透過性が高い。分子がイオン化されていない、または電荷において中性である場合に、最大吸収が生じる。したがって、荷電分子は、口腔粘膜を介した吸収にとって最も大きな課題となる。
【０８６５】
また、ｉＲＮＡの医薬組成物は、上述のような混合ミセル医薬製剤及び噴霧剤を、定量噴霧器から、吸入ではなくヒトの口腔内へ噴霧することにより、口腔に投与され得る。一実施形態では、上記噴霧器は、医薬製剤及び噴霧剤を口腔内へ噴霧する前にまず振とうされる。
【０８６６】
デバイス
説明を簡略化するために、本項のデバイス、製剤、組成物及び方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して論述される。しかしながら、これらのデバイス、製剤、組成物及び方法は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤に関して実施可能であり、且つかかる実施は本発明の範囲内にあることは理解されるべきである。ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、例えば、対象へ移植するかまたは別の方法で対象に設置されるデバイス等のデバイス上又はデバイス内へ配置されることができる。典型的なデバイスとしては、血管系に導入されるデバイス（例えば血管組織の管腔内に挿入されるデバイス）、又はステント、カテーテル、心臓弁、及び別の血管用デバイスを含有する、デバイス自体が血管の一部を形成するデバイスが挙げられる。これらのデバイス、例えばカテーテル又はステントは、肺、心臓又は足の血管に配置されることができる。
【０８６７】
別のデバイスとしては、血管用デバイス以外のデバイス、例えば腹膜、又は臓器又は腺組織に移植されるデバイス、例えば人工臓器が挙げられる。このデバイスは、ｉＲＮＡに加えて治療物質を放出することが可能であり、例としては、デバイスはインスリンを放出することができる。
【０８６８】
その他のデバイスは、股関節等の人工関節、及び別の整形外科移植片を含む。
一実施形態では、ｉＲＮＡを含む組成物の単位用量又は一定用量は、移植デバイスにより分配される。該デバイスは、対象の体内であるパラメータを監視するセンサーを包含することができる。例えば、該デバイスがポンプを備え、例えば任意選択で電子機器と連携されていてもよい。
【０８６９】
組織、例えば腎臓等の細胞又は器官が、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで処理され、次に対象に投与または移植されることも可能である。
【０８７０】
上記組織は、自己、同種、又は異種の組織であり得る。例えば、組織（例えば腎臓）は、移植片対宿主病を減少させるように処理可能である。別の実施形態では、組織は同種組織であり、該組織（腎臓等）における好ましくない遺伝子発現を特徴とする疾患を治療するために処理される。他の例では、造血性細胞を含有する組織、例えば骨髄造血性細胞は、好ましくない細胞増殖を阻害するように処理され得る。
【０８７１】
自己組織であれ移植組織であれ、処理された組織の導入は、別の治療と組み合わせるこ
とができる。
いくつかの実施では、ｉＲＮＡで処理された細胞は、例えば該細胞が移植片から離れるのを阻止するが、体内の分子が該細胞に到達するのを可能にし、かつ該細胞により産生された分子が体内に侵入するのを可能にする半透過性多孔質障壁により、別の細胞から隔離される。一実施形態では、該多孔質障壁は、アルギン酸から形成される。
【０８７２】
一実施形態では、避妊具（避妊用デバイス）が、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）でコーティングされるか、又は該ｉＲＮＡ剤を含有する。典型的なデバイスとしては、コンドーム、避妊ペッサリー、ＩＵＤ（移植可能な子宮用デバイス）、スポンジ、膣コンドーム、及び産児制限器具が挙げられる。一実施形態では、ｉＲＮＡは精子又は卵を不活性化するように選択される。他の実施形態では、ｉＲＮＡは、ウイルス又は病原体ＲＮＡ、例えばＳＴＤのＲＮＡに相補的であるように選択される。いくつかの例では、ｉＲＮＡ組成物は、殺精子剤を含むことができる。
【０８７３】
用量
一態様では、本発明は、対象（例えばヒト対象）に、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤を投与する方法を特徴とする。該方法は、ｉＲＮＡ剤、例えばｓＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｓＲＮＡ剤であって（ａ）二本鎖部分が１９〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）長、好ましくは２１〜２３ｎｔであり、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内在性標的ＲＮＡ又は病原体標的ＲＮＡ）に相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ヌクレオチド長を含む二本鎖ｓＲＮＡ剤を単位用量投与することを包含する。一実施形態では、上記単位用量は、体重１ｋｇ当たり１．４ｍｇ未満、又は体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５又は０．００００１ｍｇ未満、及び体重１ｋｇ当たり２００ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤（例えば約４．４×１０１６コピー）、又は体重１ｋｇ当たり１，５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌ未満のＲＮＡ剤である。
【０８７４】
規定された量は、疾患又は障害、例えば腎臓に存在するＲＮＡ等の標的ＲＮＡに関連する疾患又は障害を、治療又は抑制するのに効果的な量であり得る。単位用量は、例えば、注射（例えば、静脈内又は筋肉内）、吸入投与、又は局所投与により投与され得る。用量は、体重１ｋｇあたり２、１又は０．１ｍｇ未満であることが特に好ましい。
【０８７５】
好ましい実施形態では、単位用量は、１日に１回未満の頻度、例えば、２，４，８又は３０日毎よりも低い頻度で投与される。他の実施形態では、単位用量は、頻繁に投与されない（例えば、規則正しい頻度では投与されない）。例えば、単位用量が単回で投与されてもよい。
【０８７６】
一実施形態では、有効用量がその他の従来の治療様式で投与される。一実施形態では、対象がウイルス感染症であり、上記治療様式は、ｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス剤（例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤以外）である。他の実施形態では、対象がアテローム性動脈硬化症であり、有効用量のｉＲＮＡ剤（例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤又はｓＲＮＡ剤）が、外科的介入と組み合わせて、例えば外科的介入（例えば血管形成術）の後に投与される。
【０８７７】
一実施形態では、対象に、初回用量及び１又はそれ以上の維持用量のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシ
ングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）が投与される。維持用量は、一般に初回用量より少ない（例えば、初回用量の１／２少ない）。維持投与計画は、対象を、１日に体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１．４ｍｇの範囲、例えば１日に体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、又は０．００００１ｍｇの用量で治療することを包含する。維持用量は、５、１０、又は３０日毎に１回以下で投与されるのが好ましい。さらに、治療投与計画は、個々の疾患の性質、該疾患の重症度及び患者の全体的な状態により変化し得る期間中は持続され得る。好ましい実施形態では、用量は、１日当たり１回以下、例えば２４、３６、４８時間以上当たり１回以下、例えば５又は８日毎に１回以下で送達され得る。治療に続いて、患者の状態の変動及び疾患状態の症状の緩和について、患者をモニタリングしてもよい。患者が現在の用量レベルでは有意に応答しない場合には、化合物の用量は増加されてもよいし、又は疾患状態の症状の緩和が認められる場合、疾患状態が除去されている場合、又は望ましくない副作用が認められる場合には、用量を減らしてもよい。
【０８７８】
有効用量は、個別の状況の下で所望される、又は適切と考えられるように、単回投与で又は２回以上の投与で投与され得る。所望により、反復又は頻繁な注入を容易にするためには、送達デバイス（例えば、ポンプ、半永久ステント（例えば、静脈内、腹腔内、嚢内又は関節内））又はリザーバを移植することが望ましい。
【０８７９】
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤医薬組成物は、複数の種類のｉＲＮＡ剤を包含する。他の実施形態では、複数種類のｉＲＮＡ剤が、天然に存在する標的配列に関して別の種類のｉＲＮＡ剤と重複せずかつ隣接しない配列を有する。他の実施形態では、複数の種類のｉＲＮＡ剤は、天然に存在する異なる標的遺伝子に特異的である。他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は対立遺伝子特異的である。
【０８８０】
場合によっては、患者は、ｉＲＮＡ剤を用いて別の治療様式と併せて治療される。例えば、初期腎疾患等の腎臓病を治療中の患者は、疾患の進行を増大することが知られている標的遺伝子に特異的なｉＲＮＡ剤を、該標的遺伝子の産物の活性を阻害する既知の薬物と併せて投与されてもよい。例えば、初期腎疾患の患者は、ＳＧＬＴ２  ＲＮＡを標的とするｉＲＮＡ剤を、ナトリウム−グルコース共輸送を遮断し、続いて単一ネフロン糸球体ろ過量を減少させることが知られている低分子フロリジンと併用して治療されてもよい。他の実施形態では、腎臓のがんを治療中の患者は、腫瘍細胞の増殖に必須な標的に特異的なｉＲＮＡ剤を、化学療法と併用して投与されてもよい。
【０８８１】
治療の成功に続いて、病状の再発を予防するための維持療法を患者に施すことが望ましく、該療法では、本発明の化合物が、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇの維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号を参照）。
【０８８２】
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、疾患を治療又は抑制するのに、又はヒトにおける生理学的状態を調節するのに十分効果的な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度又は量は、該ｉＲＮＡ剤及び投与方法（例えば、経鼻、経口、経肺）に対して決定されたパラメータに依存し得る。例えば、経鼻製剤は、鼻腔の刺激又は焼けつきを回避するために、いくつかの成分をかなり低濃度とする必要がある傾向にある。好適な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を１０〜１００倍に希釈するのが望ましいこともある。
【０８８３】
疾患又は障害の重症度、事前の治療、対象の通常の健康状態及び／又は年齢、ならびに別の疾患の存在など（これらに限定されない）、ある種の要因が、対象を効果的に治療するのに必要とされる用量に影響を及ぼす可能性がある。さらに、治療上有効な量のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤
へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を用いた対象の治療は、単一の治療を包含することもできるし、又は、好ましくは一連の治療を包含することもできる。また、治療に使用されるｓＲＮＡ剤等のｉＲＮＡ剤の有効用量を、個々の治療の経過により増やしても減らしてもよいことは当然のことである。用量を変化させることは可能であり、本明細書中で記載されるような診断アッセイの結果から明らかになり得る。例えば、対象は、ｉＲＮＡ剤組成物の投与後にモニタリングされ得る。モニタリングの情報に基づいて、ｉＲＮＡ剤組成物の追加量が投与され得る。
【０８８４】
数日間〜数ヶ月間続く治療の経過とともに、又は治療が効果を上げるか若しくは疾患状態の減少が達成されるまで、投薬は治療されるべき病状の重症度及び応答性によって決まる。最適な投与計画は、患者の体内における薬物蓄積量の測定から算出され得る。当業者は、最適の用量、投与の手順及び反復頻度を容易に決定することができる。最適の用量は、個々の化合物の相対的な効能に依存して変化しうるものであり、通常、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデルで効果的であることが見出されたＥＣ５０を基に概算可能である。いくつかの実施形態では、上記動物モデルには、ヒト遺伝子、例えば、標的ＲＮＡを産生する遺伝子を発現するトランスジェニック動物が挙げられる。トランスジェニック動物は、対応する内在のＲＮＡを欠いているものであってもよい。他の実施形態では、試験用の組成物は、少なくとも内部領域においては、動物モデルの標的ＲＮＡとヒトの標的ＲＮＡとの間で保存されている配列と相補的であるｉＲＮＡ剤を包含する。
【０８８５】
本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤が、数多くの方法で、哺乳類、特に大型哺乳類、例えばヒト以外の霊長類又はヒトに投与され得ることを、本発明者等は見出している。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤）組成物の投与は、非経口、例えば静脈内（例えばボーラスとして又は拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、鞘内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜的、口腔内、舌下、経内視鏡的、経直腸、経口、経膣、局所、経肺、鼻腔内、尿道又は経眼で実施される。投与は、対象者により、又は他の人（例えば医療提供者）により行われ得る。該薬剤は、一定用量で、又は一定量を送達する分配容器中に提供され得る。選択された送達様式については、以下により詳細に述べる。
【０８８６】
本発明は、本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤を直腸投与又は直腸送達するための方法、組成物及びキットを提供する。
したがって、本明細書中に記載のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば本明細書中に記載の治療上有効な量のｉＲＮＡ剤、例えば４０ヌクレオチド未満、好ましくはヌクレオチド３０未満の二本鎖領域を有し、１つ又は２つの１〜３ヌクレオチド長の１本鎖３’突出部を有するｉＲＮＡ剤は、直腸投与され得る（例えば、直腸を介して下方大腸又は上方大腸内へ導入され得る）。この手法は、炎症性疾患、好ましくない細胞増殖を特徴とする障害、例えばポリープ又は大腸がんを治療する場合に、特に有用である。
【０８８７】
該薬剤は、分注用デバイス、例えば、大腸の検査又はポリープの除去に使用されるデバイスと類似した、可撓性の、カメラガイド付きデバイスであって、薬剤を送達する手段を備えたものを導入することにより、大腸内の部位に送達され得る。
【０８８８】
ｉＲＮＡ剤の直腸投与には、浣腸剤を用いる。浣腸剤のｉＲＮＡ剤は、生理食塩水又は緩衝溶液に溶解され得る。また、直腸投与には坐剤を用いることも可能であり、坐剤は、別の成分、例えばココアバター又はヒドロプロピルメチルセルロース等の賦形剤を含み得
る。
【０８８９】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、例えば錠剤、カプセル、ゲルカプセル、薬用キャンディ、トローチ又は液状シロップの形状で経口投与され得る。さらに、該組成物は、口腔の表面に局所施用され得る。
【０８９０】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、口腔投与されることができる。例えば、該薬剤は口腔内に噴霧されてもよいし、又は直接、例えば液状、固形またはゲル状で、口腔内の表面に施用されてもよい。このような投与は、口腔内（例えば、歯茎又は舌）の炎症の治療に特に望ましく、例えば一実施形態では、その口腔投与は、例えば吸入を伴わずに、分配容器、例えば医薬組成物及び噴霧剤を分配する定量噴霧容器から口腔内へ噴霧されることにより実施される。
【０８９１】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、眼球組織に投与され得る。例えば、該薬剤は、眼又は隣接する組織（例えば、瞼の内側）に投与され得る。該薬剤は、例えば噴霧することにより、滴剤として、洗眼液として、又は軟膏として局所投与され得る。投与は、対象者により、又は他の人（例えば医療提供者）により実施され得る。該薬剤は、一定用量で、又は一定用量を送達する容器内で提供され得る。また、該薬剤は、眼の内側に投与されることも可能であり、選択された領域又は構造に対して該薬剤を導入することができる針又は別の送達デバイスにより導入され得る。眼球治療は、眼又は隣接する組織の炎症を治療するのに特に望ましい。
【０８９２】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、皮膚へ直接投与され得る。例えば、該薬剤は、例えば、皮膚内に侵入するが、好ましくはその下にある筋組織には侵入しない極微針又は一連の極微針を使用することにより、皮膚層に局所投与又は送達され得る。ｉＲＮＡ剤組成物の投与は、局所的であり得る。局所投与は、例えば、対象の真皮又は表皮に上記組成物を送達することができる。局所投与は、経皮貼布剤、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴剤、坐剤、噴霧剤、液剤及び粉末剤の形態であり得る。局所投与用の組成物は、リポソーム、ミセル、乳化剤又は別の脂溶性分子集合体として製剤化され得る。経皮投与は、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス又はソノフォレーシス等の少なくとも１つの浸透促進法を用いて投与され得る。
【０８９３】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、肺器官系に投与され得る。経肺投与は、吸入により、又は肺器官系内へ送達デバイスを導入することにより、例えば該薬剤を分配することができる送達デバイスを導入することにより達成され得る。肺送達の好ましい方法には、吸入を用いる。該薬剤は、該薬剤（例えば湿った薬剤又は乾燥した薬剤であって、吸入可能なように十分に小さい形状の薬剤）を送達する容器中で提供され得る。該デバイスは、一定用量の薬剤を送達し得る。対象者でも他の人でも該薬剤を投与し得る。
【０８９４】
肺送達は、肺組織に直接影響する疾患だけでなく、別の組織に影響する疾患にも効果的である。
ｉＲＮＡ剤は、液体または液体以外のもの（例えば粉末、結晶）、又は肺送達用のエアロゾルとして製剤化され得る。
【０８９５】
本明細書中に記載の任意のｉＲＮＡ剤は、経鼻投与され得る。経鼻投与は、送達デバイスを鼻内に導入することにより、例えば該薬剤を分配することができる送達デバイスを導入することにより達成され得る。経鼻送達の方法は、鼻腔の表面に、噴霧剤、エアロゾル、液剤を、例えば滴下により又は局所投与により投与することを包含する。該薬剤は、該薬剤（例えば湿った薬剤又は乾燥した薬剤であって、吸入可能なように十分に小さい形状の薬剤）を送達する容器中で提供され得る。該デバイスは、一定用量の薬剤を送達し得る
。対象者でも他の人でも該薬剤を投与し得る。
【０８９６】
経鼻送達は、鼻組織に直接影響する疾患だけでなく、別の組織に影響する疾患にも効果的である。
ｉＲＮＡ剤は、液体または液体以外のもの（例えば粉末、結晶）、又は経鼻送達用として製剤化され得る。
【０８９７】
ｉＲＮＡ剤は、天然のウイルスキャプシド内にパッケージングされてもよいし、化学的若しくは酵素的に生産された人工キャプシド又はそれらに由来する構造内にパッケージングされてもよい。
【０８９８】
ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の用量は、疾患状態（例えばがん又は心疾患）の症状を緩和するために投与され得る。対象は、上記の任意の方法により、該医薬組成物を用いて治療され得る。
【０８９９】
対象における遺伝子発現は、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を投与することにより調節され得る。
対象は、粉末形態、例えば結晶性粒子等の微粒子の集合体である一定量のｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤またはｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤）組成物を投与することにより治療され得る。該組成物は、複数のｉＲＮＡ剤、例えば、１つ又はそれ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的なｉＲＮＡ剤を包含し得る。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９００】
対象は、噴霧乾燥を含む方法（すなわち溶液、乳化剤、又は懸濁液を噴霧し、直後にその液滴を乾燥ガスに暴露させ、得られた多孔質粉末粒子を回収すること）により調製された一定量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することにより治療され得る。上記組成物は、複数のｉＲＮＡ剤、例えば、１つ又はそれ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的なｉＲＮＡ剤を包含し得る。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９０１】
ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）は、粉末形態、結晶形態又はその他の微細に分割された形態で、担体、例えば吸入又は別の経肺送達に適したマイクロ粒子又はナノ粒子とともに、あるいは担体を伴わずに、提供され得る。このことは、エアロゾル調製物、例えばエアロゾル化した噴霧乾燥組成物を提供することを包含する。該エアロゾル組成物は、定量送達デバイス中に提供されるか、又は該デバイスにより分配されるかのうち少なくともいずれかでありうる。
【０９０２】
対象は、吸引により、例えば噴霧乾燥したｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物を、エアロゾル化し、且つ該エアロゾル化組成物を吸引することにより、治療可能な状態を治療され得る。ｉＲＮＡ剤はｓＲＮＡであり得る。上記組成物は、複数のｉＲＮＡ剤、例えば、１つ又はそれ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的なｉＲＮＡ剤を包含し得る。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９０３】
対象は、有効量／一定量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、ある
いは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤、またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物を投与することにより治療されることができ、該組成物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、又はこれらの技法の組合せを含む方法により調製される。
【０９０４】
別の態様では、本発明は、対象の細胞における多量の転写産物に関連したパラメータを評価すること、参照値に対して評価されたパラメータを比較すること、及び評価されたパラメータが参照値に対して予め選択された相関を有する（例えば値が大きい）場合にｉＲＮＡ剤（又は、ｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤等の前駆体、又はｉＲＮＡ剤又はその前駆体をコードするＤＮＡ）を該対象に投与することを包含する方法を特徴とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、評価される転写産物に相補的な配列を含む。例えば、パラメータは、転写レベルの直接的な測定、タンパク質レベルの測定、疾患又は障害の症状又は特徴（例えば細胞増殖速度及び／又は腫瘍質量、ウイルス負荷）の測定であり得る。
【０９０５】
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む第１の量の組成物であって該ｉＲＮＡ剤が標的核酸と実質的に相補的である鎖を含むことを特徴とする組成物を、対象に投与することと、標的核酸によりコードされたタンパク質と関連する活性を評価し、該評価を第２の量が投与されるべきかどうかを決定するために使用することを含む方法を特徴とする。好ましい実施形態では、上記方法は、第２の量の組成物を投与することを包含し、第２の量についての投与時間又は用量は、前記評価の関数である。上記方法は、本明細書中に記載の別の特徴を包含し得る。
【０９０６】
別の態様では、本発明は、二本鎖ｉＲＮＡ剤（ｄｓ  ｉＲＮＡ剤）の供給源を対象に投与する方法を特徴とする。該方法は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖領域を含み、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば、内在性ＲＮＡ又は病原体ＲＮＡ）に相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ｎｔ長を含むｄｓ  ｉＲＮＡ剤、例えばｓＲＮＡ剤の供給源を投与または移植することを包含する。一実施形態では、上記供給源は、長期にわたりｄｓ  ｉＲＮＡ剤を放出し、例えば上記供給源は、制御放出又は遅延放出型の供給源であり、例えばｄｓ  ｉＲＮＡ剤を徐々に放出する微粒子である。他の実施形態では、上記供給源は、ポンプ、例えばセンサーを含むポンプ、又は１つ又はそれ以上の単位用量を放出することができるポンプである。
【０９０７】
一態様では、本発明は、標的ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列、例えば、実質的及び／又は正確に相補的なヌクレオチド配列を含むｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。標的ＲＮＡは、内在性のヒト遺伝子の転写産物であり得る。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ｎｔ長を含む。一実施形態では、医薬組成物は、乳化剤、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー又はリポソームであり得る。
【０９０８】
一例では、医薬組成物は、局所送達剤と混合されたｉＲＮＡ剤を含む。局所送達剤は、複数の微小ビヒクルであり得る。微小ビヒクルは、リポソームであり得る。好ましい実施
形態では、リポソームはカチオン性のリポソームである。
【０９０９】
別の態様では、医薬組成物は、局所浸透促進剤と混合されたｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む。一実施形態では、上記局所浸透促進剤は、脂肪酸である。脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル  １−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１−１０アルキルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド又は医薬として許容可能なその塩であり得る。
【０９１０】
別の実施形態では、局所浸透促進剤は、胆汁酸塩である。上記胆汁酸塩は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル又は医薬として許容可能なその塩であり得る。
【０９１１】
別の実施形態では、浸透促進剤は、キレート剤である。該キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチル酸、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、β−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体又はその混合物であり得る。
【０９１２】
別の実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、例えばイオン性又は非イオン性界面活性剤である。上記界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル、ペルフルオロ化合物の乳化剤又はその混合物であり得る。
【０９１３】
別の実施形態では、浸透促進剤は、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルコン、１−アルケニルアザシクロ−アラカノン、ステロイド性の抗炎症剤及びそれらの混合物から成る群から選択され得る。さらに別の実施形態では、浸透促進剤は、グリコール、ピロール、アゾン（azone ）又はテルペン類であり得る。
【０９１４】
一態様では、本発明は、経口送達に好適な形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経口送達は、胃腸管の細胞又は領域、例えば小腸、大腸（例えば、大腸がんを治療するため）などに対してｉＲＮＡ剤組成物を送達するのに使用され得る。経口送達の形態は、錠剤、カプセル又はゲルカプセルであり得る。一実施形態では、医薬組成物のｉＲＮＡ剤は、細胞接着タンパク質の発現を調節し、細胞の増殖速度を調節し、又は真核生物の病原体又はレトロウイルスに対抗する生物活性を有する。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳類の胃内で、錠剤、カプセル又はゲルカプセルが溶解するのを実質的に抑制する腸溶性材料を包含する。好ましい実施形態では、腸溶性材料はコーティング剤である。該コーティング剤は、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース又は酢酸フタル酸セルロースであり得る。
【０９１５】
別の実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、浸透促進剤を含む。該浸透促進剤は
、胆汁酸塩又は脂肪酸であり得る。胆汁酸塩は、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸及びそれらの塩であり得る。脂肪酸は、カプリン酸、ラウリン酸又はそれらの塩であり得る。
【０９１６】
別の実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤はポリエチレングリコールである。他の例では、賦形剤はＰｒｅｃｉｒｏｌ（登録商標）である。
【０９１７】
別の実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、可塑剤を含む。可塑剤は、ジエチルフタル酸、トリアセチンセバシン酸ジブチル、ジブチルフタル酸又はトリエチルクエン酸であり得る。
【０９１８】
一態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤及び送達ビヒクルを包含する医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、該ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは２１〜２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、且つ任意選択で（ｃ）少なくとも１つの３’突出部１〜５ヌクレオチド長を含む。
【０９１９】
一実施形態では、送達ビヒクルは、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を、局所の投与経路により細胞に送達し得る。送達ビヒクルは、微小ビヒクルであり得る。一例では、微小ビヒクルはリポソームである。好ましい実施形態では、リポソームはカチオン性リポソームである。他の例では、微小ビヒクルはミセルである。一態様では、本発明は、注射可能な投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、医薬組成物の注射可能な投薬形態は、殺菌水溶液又は分散液及び殺菌粉末を含む。好ましい実施形態では、上記殺菌溶液は、水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン又はプロピレングリコール等の希釈剤を含み得る。
【０９２０】
一態様では、本発明は、経口投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経口投薬形態は、錠剤、カプセル及びゲルカプセルから成る群から選択される。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳類の胃内で、錠剤、カプセル又はゲルカプセルが溶解するのを実質的に抑制する腸溶性材料を含む。好ましい実施形態では、腸溶性材料はコーティング剤である。コーティング剤は、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース又は酢酸フタル酸セルロースであり得る。一実施形態では、経口投薬形態の医薬組成物は、浸透促進剤、例えば、本明細書中に記載の浸透促進剤を含む。
【０９２１】
一態様では、本発明は、直腸投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、直腸投薬形態は浣腸剤である。別の実施形態では、直腸投薬形態は坐剤である。
【０９２２】
一態様では、本発明は、膣内投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又は
ｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、膣内投薬形態は坐剤である。別の実施形態では、膣内投薬形態は、泡沫剤、クリーム又はゲルである。
【０９２３】
一態様では、本発明は、経肺又は経鼻投薬形態の、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、粒子、例えばミクロスフェア等のマイクロ粒子内に組み込まれ得る。上記粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥又はこれらの技法の組合せにより産生され得る。ミクロスフェアは、懸濁液、粉末又は移植可能な固形として製剤化され得る。
【０９２４】
一態様では、本発明は、対象が吸入するのに好適な、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の組成物であって、（ａ）吸入によって対象の状態を治療するのに好適な治療上有効なｉＲＮＡ剤の量、（ｂ）糖質及びアミノ酸から成る群から選択される医薬として許容可能な賦形剤、及び（ｃ）任意選択で、分散性を促進する量の生理学的に許容可能かつ水溶性のポリペプチド、を含む組成物を特徴とする。
【０９２５】
一実施形態では、賦形剤は糖質である。該糖質は、単糖、二糖、三糖及び多糖から成る群から選択され得る。好ましい実施形態では、糖質は、デキストロース、ガラクトース、マンニトール、Ｄ−マンノース、ソルビトール及びソルボースから成る群から選択される単糖である。他の好ましい実施形態では、糖質は、ラクトース、マルトース、スクロース及びトレハロースから成る群から選択される二糖である。
【０９２６】
別の実施形態では、賦形剤はアミノ酸である。一実施形態では、該アミノ酸は疎水性アミノ酸である。好ましい実施形態では、疎水性アミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンから成る群から選択される。さらに別の実施形態では、アミノ酸は極性アミノ酸である。好ましい実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リシン、システイン、グリシン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、アスパラギン酸及びグルタミン酸から成る群から選択される。
【０９２７】
一実施形態では、分散性を促進するポリペプチドは、ヒト血清アルブミン、α−ラクトアルブミン、トリプシノーゲン及びポリアラニンから成る群から選択される。
一実施形態では、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤組成物は、１０μｍ（ミクロン）未満の質量中央径（ＭＭＤ）を有する粒子を含む。別の実施形態では、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤組成物は、５μｍ未満の質量中央径を有する粒子を含む。さらに別の実施形態では、噴霧乾燥されたｉＲＮＡ剤組成物は、５μｍ未満の空気力学的質量中央径（ＭＭＡＤ）を有する粒子を含む。
【０９２８】
幾つかの他の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）の医薬製剤を収容している好適な容器を含むキットを提
供する。ある実施形態では、該医薬製剤の個々の成分は、１つの容器内に提供され得る。別例として、医薬製剤の成分を別個に２つ又はそれ以上の容器、例えばｉＲＮＡ剤調製物用の１つの容器、担体化合物用の少なくとももう１つの容器を提供するのが望ましい。上記キットは、単一ボックス内に入った１つ又はそれ以上の容器等の、多くの異なる構成で包装されてもよい。異なる成分が、例えばキットに付属の取り扱い説明書に従って併用されてもよい。上記成分は、例えば医薬組成物を調製して投与するために、本明細書中に記載の方法に従って組み合わせることが可能である。また、上記キットは送達デバイスも含み得る。
【０９２９】
別の態様では、本発明は、デバイス、例えば移植可能なデバイスを特徴とし、該デバイスは、ｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、又はｓＲＮＡ剤（例えば、前駆体、例えばｓＲＮＡ剤へプロセシングされ得るより大きなｉＲＮＡ剤、あるいは、例えば二本鎖のｉＲＮＡ剤もしくはｓＲＮＡ剤などのｉＲＮＡ剤またはそれらの前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば内在性転写産物をサイレンシングするｉＲＮＡ剤を含む組成物を、分配又は投与することができる。一実施形態では、該デバイスは上記組成物でコーティングされる。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤がデバイス内に配置される。別の実施形態では、デバイスは、単位用量の組成物を分配するための機構を備えている。別の実施形態では、デバイスは、例えば拡散により連続的に組成物を放出する。代表的なデバイスとしては、ステント、カテーテル、ポンプ、人工器官又は人工器官部品（例えば、人工心臓、心臓弁等）、及び縫合糸が挙げられる。
【０９３０】
本明細書中で使用される場合、「結晶性」という用語は、結晶の構造又は特性を有する固体、すなわち、一定の角度で平坦な面が交差し、かつ規則的な内部構造を有する三次元構造の粒子を言う。本発明の組成物は、様々な結晶形状を有しうる。結晶形状は、例えば噴霧乾燥等を包含する種々の方法により調製され得る。
【０９３１】
本発明について以下の実施例によりさらに説明するが、該実施例によりさらに制限されると解釈すべきではない。
【実施例１】
【０９３２】
ジエチル２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート  ＡＡ
【０９３３】
【化７２】
2007525454.tif 000077
【０９３４】
４．７Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を、水（５０ｍＬ）に溶解したグリシン酸エチル塩酸塩（３２．１９ｇ、０．２３モル）の溶液（氷冷して撹拌中）に加えた。次いで、アクリル酸エチル（２３．１ｇ、０．２３モル）を加え、この混合物を、反応の完了がＴＬＣによって確認されるまで（１９時間）室温で撹拌した。１９時間後、該混合物をジクロロメタンで分配した（３×１００ｍＬ）。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、蒸発させた。残渣を蒸留して、ＡＡ（２８．８ｇ、６１％）を得た。
【実施例２】
【０９３５】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカル
ボニル−アミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル  ＡＢ
【０９３６】
【化７３】
2007525454.tif 000078
【０９３７】
Ｆｍｏｃ−６−アミノ−ヘキサン酸（９．１２ｇ、２５．８３ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、氷で冷却した。この溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（３．２５ｇ、３．９９ｍＬ、２５．８３ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。次いでこれに、ジエチル２−アザブタン−１，４−ジカルボキシレート（５ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（０．３０５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温に移し、さらに６時間撹拌した。反応の完了をＴＬＣによって確認した。この反応混液を真空中で濃縮し、酢酸エチルを加えてジイソプロピルウレアを沈殿させた。この懸濁液を濾過した。この濾液を５％塩酸水溶液、５％炭酸水素ナトリウム、および水で洗浄した。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して粗生成物を得た。これをカラムクロマトグラフィ（５０％ＥｔＯＡＣ／ヘキサン）によって精製し、１１．８７ｇ（８８％）のＡＢを得た。
【実施例３】
【０９３８】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル  ＡＣ
【０９３９】
【化７４】
2007525454.tif 000079
【０９４０】
３−｛エトキシカルボニルメチル−［６−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−ヘキサノイル］−アミノ｝−プロピオン酸エチルエステル  ＡＢ（１１．５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン中に０℃で溶解した。この溶液を連続して１時間撹拌した。この反応混液を真空中で濃縮し、残渣に水を加え、生成物を酢酸エチルで抽出した。粗生成物を、塩酸塩に変換することによって精製した。
【実施例４】
【０９４１】
３−（｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝エトキシカルボニルメチル−アミノ）−プロピオン酸エチルエステル  ＡＤ
【０９４２】
【化７５】
2007525454.tif 000080
【０９４３】
３−［（６−アミノ−ヘキサノイル）−エトキシカルボニルメチル−アミノ］−プロピオン酸エチルエステル  ＡＣの塩酸塩（４．７ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン中に入れた。この懸濁液を氷で０℃に冷却した。この懸濁液にジイソプロピルエチルアミン（３．８７ｇ、５．２ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液にコレステリルクロロホルメート（６．６７５ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混液を一晩撹拌した。この反応混液をジクロロメタンで希釈し、１０％塩酸で洗浄した。生成物をフラッシュクロマトグラフィで精製した（１０．３ｇ、９２％）。
【実施例５】
【０９４４】
１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−４−オキソ−ピロリジン−３−カルボン酸エチルエステル  ＡＥ
【０９４５】
【化７６】
2007525454.tif 000081
【０９４６】
ｔ−ブトキシドカリウム（１．１ｇ、９．８ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの乾燥トルエン中でスラリー化した。この混合物を０℃に冷却し、５ｇ（６．６ｍｍｏｌ）のジエステルを、撹拌しながらゆっくりと２０分以内に加えた。この添加の間、温度を５℃未満に保った。撹拌を０℃で３０分間継続し、１ｍＬの氷酢酸を加え、直後に４０ｍＬの水に溶解した４ｇのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏを加えた。得られた混合物を、１００ｍＬのジクロロメタンで２回抽出し、合わせた有機抽出物を１０ｍＬのリン酸緩衝液で２回洗浄し、脱水し、そして蒸発乾固させた。残渣を６０ｍＬのトルエンに溶解し、０℃まで冷却し、そして５０ｍＬずつの冷カルボン酸緩衝液（ｐＨ９．５）で３回抽出した。水性抽出物をリン酸でｐ
Ｈ３とし、４０ｍＬずつのクロロホルムで５回抽出し、これを合わせて、脱水し、そして蒸発させて残渣とした。この残渣を、２５％酢酸エチル／ヘキサンを使用するカラムクロマトグラフィによって精製し、１．９ｇのβ−ケトエステルを得た（３９％）。
【実施例６】
【０９４７】
［６−（３−ヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−ピロリジン−１−イル）−６−オキソ−ヘキシル］カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル  ＡＦ
【０９４８】
【化７７】
2007525454.tif 000082
【０９４９】
メタノール（２ｍＬ）を、テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中のケトエステルＡＥ（１．５ｇ、２．２ｍｍｏｌ）および水酸化ホウ素ナトリウム（０．２２６ｇ、６ｍｍｏｌ）の還流混液に１時間にわたって滴下して加えた。撹拌を１時間、還流温度にて継続する。室温に冷却した後、１Ｎ  ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）を加え、混液を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。合わせた酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、真空中で濃縮して生成物を生じ、これをカラムクロマトグラフィ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）によって精製した（８９％）。
【実施例７】
【０９５０】
（６−｛３−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−４−ヒドロキシ−ピロリジン−１−イル｝−６−オキソ−ヘキシル）−カルバミン酸１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルエステル  ＡＧ
【０９５１】
【化７８】
2007525454.tif 000083
【０９５２】
ジオールＡＦ（１．２５ｇ、１．９９４ｍｍｏｌ）を、真空中でピリジン（２×５ｍＬ）とともに蒸発処理することによって乾燥させた。無水ピリジン（１０ｍＬ）および４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（０．７２４ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。室温で一晩反応させた。この反応を、メタノールの添加により停止した。反応混液を真空中で濃縮し、残渣にジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。有機層を１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。この有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濾過し、そして濃縮した。残存ピリジンをトルエンとともに蒸発処理することによって除去した。この粗生成物をカラムクロマトグラフィによって精製した（２％ＭｅＯＨ／クロロホルム、Ｒｆ＝０．５（５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３中））（１．７５ｇ、９５％）。
【実施例８】
【０９５３】
コハク酸モノ−（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）エステル  ＡＨ
【０９５４】
【化７９】
2007525454.tif 000084
【０９５５】
化合物ＡＧ（１．０ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．１５０ｇ、１．５ｍ
ｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０７３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）と混合し、真空中、４０℃で一晩乾燥させた。この混合物を無水ジクロロエタン（３ｍＬ）中に溶解し、トリエチルアミン（０．３１８ｇ、０．４４０ｍＬ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、そしてこの溶液を室温で、アルゴン雰囲気下で１６時間撹拌した。次いで、ジクロロメタン（４０ｍＬ）で希釈し、氷冷クエン酸水溶液（５重量％、３０ｍＬ）および水（２×２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、濃縮して乾固させた。残渣をそのまま次の工程に使用した。
【実施例９】
【０９５６】
コレステロール誘導体化されたＣＰＧ  ＡＩ
【０９５７】
【化８０】
2007525454.tif 000085
【０９５８】
コハク酸塩ＡＨ（０．２５４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン／アセトニトリル混合物（３：２、３ｍＬ）中に溶解した。この溶液に、アセトニトリル（１．２５ｍＬ）中のＤＭＡＰ（０．０２９６ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）、アセトニトリル／ジクロロエタン（３：１、１．２５ｍＬ）中の２，２’−ジチオ−ビス（５−ニトロピリジン）（０．０７５ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を連続して加えた。得られた溶液に、アセトニトリル（０．６ｍｌ）中のトリフェニルホスフィン（０．０６４ｇ、０．２４２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混液は、明るいオレンジ色に変化した。この溶液を、手動式シェーカーを使用して短時間撹拌した（５分間）。長鎖アルキルアミン−ＣＰＧ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）（１．５ｇ、６１μｍ／ｇ）を加えた。懸濁液を２時間撹拌した。ＣＰＧを、焼結漏斗を通して濾過し、アセトニトリル、ジクロロメタン、およびエーテルで連続して洗浄した。未反応アミノ基を無水酢酸／ピリジンを使用してマスクした。ＣＰＧの装荷能力を、ＵＶ測定によって測定した（３７μＭ／ｇ）。
【実施例１０】
【０９５９】
（４−［ビス−（４−メトキシ−フェニル）−フェニル−メトキシメチル］−１−｛６−［１７−（１，５−ジメチル−ヘキシル）−１０，１３−ジメチル２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈシクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシカルボニルアミノ］−ヘキサノイル｝−ピロリジン−３−イル）ホスホルアミダイト  ＡＪ
【０９６０】
【化８１】
2007525454.tif 000086
【０９６１】
化合物ＡＧ（０．１５ｇ、０．１５８ｍｍｏｌ）をトルエン（５ｍＬ）とともに蒸発処理した。この残渣に、Ｎ，Ｎ−テトライソプロピルアンモニウム・テトラゾリド（０．００８９ｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）を加え、この混合物をＰ２Ｏ５で真空オーブン中にて一晩４０℃で乾燥させた。この反応混合物を無水アセトニトリル／ジクロロメタン混液（２：１、１ｍＬ）中に溶解し、そして２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルアミダイト（０．０７１４ｇ、０．０７８１ｍＬ、０．２３７ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混液を大気温度で一晩撹拌した。反応の完了をＴＬＣ（１：１、酢酸エチル：ヘキサン）によって確認した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチル（１０ｍＬ）中に溶解し、そして５％ＮａＨＣＯ３（４ｍＬ）およびブライン（４ｍＬ）で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、減圧下で濃縮した。得られた混合物をクロマトグラフィ処理（５０：４９：１、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン：トリエチルアミン）し、白色泡状物としてＡＪを得た（０．１５２ｇ、８４％）。
【実施例１１】
【０９６２】
ＲＮＡ合成、脱保護、および精製のプロトコール
１．合成
ＲＮＡ分子を、ＡＢＩの３９４装置を用いて、製造業者が作成した標準的な９３工程サイクルを使用し、以下に記載するようにいくつかの待ち工程に改変を加えて合成した。固体支持体は多孔質ガラス（ＣＰＧ、１マイクロモル、５００Å、米国バージニア州スターリング所在のグレン・リサーチ（Glen Research ））とした。モノマーは、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．１５Ｍの濃度で、カップリング時間は７．５分間で使用される、標準的な保護基を有するＲＮＡホスホルアミダイト（米国マサチューセッツ州所在のケモジーン・コーポレイション（Chemgenes Corp）の、Ｎ６−ベンゾイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルアデノシン−２’ｔブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチルウリジン−２’ｔブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルグアノシン−２’ｔブチルジメチルシリル、３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、およびＮ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルシチジン−２’ｔブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト）とした。活性化剤はチオテトラゾール（０．２５Ｍ）とした。ＰＯ酸化のためには、ヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化ではアセトニトリルに溶解したボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬０．５Ｍ溶液を使用した。合成用のすべての試薬を、グレン・リサーチから入手した。
【０９６３】
２．脱保護Ｉ（オリゴマーの切断、塩基およびリン酸の脱保護）
合成の完了後、多孔質ガラス（ＣＰＧ）をスクリューキャップ付バイアル（フィッシャー（Fisher）、カタログ番号０３−３４０−５Ｎ）またはスクリューキャップ付ＲＮａｓｅフリー微量遠心管に移した。オリゴヌクレオチドを、エタノール性アンモニア混合物［アンモニア：エタノール（３：１）］１．０ｍＬを用いた塩基およびリン酸基の同時脱保護（５５℃で６時間から一晩）によりＣＰＧから切断した。バイアルを氷上で短時間冷却し、次いで、エタノール性アンモニア混合物を新たな微量遠心管に移した。ＣＰＧを、５０％アセトニトリル（コレステロールおよびかかる疎水性複合体化オリゴマーについては７０％ＣＨ３ＣＮ）を用いて洗浄した（３×０．２５ｍＬ）。約１．７５ｍＬの該溶液を２本の微量遠心管にうまく等量に分け、固くキャップを閉め、次いで−８０℃で１５分間冷却した。その後ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ（商標）／凍結乾燥機中で約９０分間乾燥させた。
【０９６４】
３．脱保護ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
得られた白色残渣を２００μＬのトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ．３ＨＦ、アルドリッチ（Aldrich ））中に再懸濁し、６５℃で１．５時間加熱して、２’位の第３ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで、反応を、４００μＬのイソプロポキシトリメチルシラン（ｉＰｒＯＭｅ３Ｓｉ、アルドリッチ）で停止させ、キャップを開けてさらに１５分間、加熱ブロック上でインキュベートした；（これによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加物を蒸発させる）。残留している反応停止剤をｓｐｅｅｄ  ｖａｃ中での乾燥によって除去した。次いで、オリゴマーを無水メタノール中（ＭｅＯＨ、８００μＬ）で沈殿させた。遠心機中で、利用可能な最高速度で５分間の遠心分離後に、液体を非常に注意深く取り除いた。残留メタノールを、−８０℃に凍結後ｓｐｅｅｄ  ｖａｃ中で短時間乾燥することにより除去した。粗ＲＮＡを、微量遠心管中に、白色の綿毛状物質として得た。
【０９６５】
４．粗オリゴマーの定量および概算的分析
試料を５０％アセトニトリル水溶液（０．５ｍＬ）中に溶解し、以下のようにして定量した：最初に５０％アセトニトリル水溶液（１ｍＬ）単独を用いてブランク測定を行った。
【０９６６】
５μＬの試料および９９５μＬの５０％アセトニトリルを微量遠心管中で十分に混合し、キュベットに移し、そして２６０ｎｍで得られる吸収の読取りを行った。粗製物を乾燥させ、−２０℃で保存する。
【０９６７】
５．オリゴマーの精製
粗オリゴマーを、ＨＰＬＣ（Ｍｏｎｏ  Ｑ（商標）Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ５／５０）によって分析かつ精製した。緩衝液系は、Ａ＝１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  １０％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（ｐＨ＝８）、Ｂ＝１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０％ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル  １Ｍ  ＮａＣｌ、流速１．０ｍＬ／分、波長２６０ｎｍである。未修飾ＲＮＡ２１ｍｅｒについては、通常０〜０．６Ｍ  ＮａＣｌのグラジエントが適している。ＣＧＥまたはＭＳによって、少量の物質（〜５ＯＤ）を精製および分析することが可能である。一旦この物質の同一性が確認されれば、次いで、粗オリゴマーを、大量の材料を使用して精製可能である。すなわち、１回の実行あたり４０ＯＤ、流速１ｍＬ／分、かつ検出器の飽和を回避するためにより低感度の波長２８０ｎｍとする。次いで、完全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、濃縮し、そして最後に以下に記載するように脱塩する。
【０９６８】
６．精製オリゴマーの脱塩
次いで、精製した乾燥オリゴマーを、Ｃ−１８  ＳｅｐＰａｋ（商標）カートリッジ（ウォーターズ（Waters））またはＳｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５Ｍ（アマシャム・バイオサイエンシズ（Amersham Biosciences））のいずれかを使用して脱塩した。このカー
トリッジを、各１０ｍＬの、アセトニトリル、次に５０％アセトニトリル、１００ｍＭ緩衝液（これは酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸ナトリウム、または酢酸アンモニウムであり得る）で調節した。最後に、１０ｍＬの水（ＲＮＡｓｅを含まない）中に完全に溶解した精製オリゴマーを、非常にゆっくりと滴下溶出させてカートリッジに装填した。このカートリッジを水（１０ｍＬ）で洗浄して塩を除去した。そして最後に、塩を含まないオリゴマーを５０％アセトニトリルまたは５０％メタノールで溶出して、直接スクリューキャップ付バイアルに受けた。
【０９６９】
７．キャピラリー・ゲル電気泳動（ＣＧＥ）およびエレクトロスプレーＬＣ／Ｍｓ
１μＬの約０．０４ＯＤのオリゴマーを最初に乾燥させ、水（２μＬ）に再溶解し、次いでＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析用の専用バイアル中にピペットで移した。一般に、脱塩は分析の前に実行されるべきである。
【０９７０】
【表４】
2007525454.tif 000087
【０９７１】
表中、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯは配列番号を表す。
【０９７２】
【表５】
2007525454.tif 000088
【実施例１２】
【０９７３】
化学修飾ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性および細胞毒性
合成ｓｉＲＮＡ
ホタル・ルシフェラーゼを標的とするオリゴリボヌクレオチド（アンチセンス５’−ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＵＡＧＣＧＵＡＡＧＮＮ−３’）（配列番号５４）を合成し、上記のように特性解析した。１２種の独特なセンス鎖および１２種の独特なアンチセンス鎖をすべての可能な組合せで混合し、１４４種の別個のｓｉＲＮＡ二本鎖を得た。センス鎖およびアンチセンス鎖を、アニーリング緩衝液（１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＭｇＯＡｃ、ｐＨ  ７．４）中、二本鎖の終濃度が１０μＭとなるように
、９６ウェルＰＣＲプレート（米国ペンシルベニア州ウェストチェスター所在のＶＷＲ）内に配した。該ＰＣＲプレートを装着可能なサーマル・サイクラー（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ
７０００、米国カリフォルニア州フォスターシティ所在のアプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems））を利用して、アニーリングを実行した。プレートを９０℃で１分間、そして３７℃で１時間保った。二本鎖の形成を、１４４通りのセンスおよびアンチセンスの組合せのうち無作為の試料についてネイティブ・アガロースゲル電気泳動によって確認した。
【０９７４】
細胞培養
ＨｅＬａ  ＳＳ６細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００□ｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のインビトロジェン（Invitrogen））中、３７℃で増殖させた。細胞を、指数関数的な増殖が維持されるように規則的に継代した。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションの２４時間前に、細胞を、不透明で白色の９６ウェル・プレート（米国ニューヨーク州コーニング所在のコスター（Costar））に、抗生物質およびフェノール・レッドを含まない１５０μＬのＤＭＥＭ（インビトロジェン）中、細胞濃度１５，０００個／ウェルとして播種した。
【０９７５】
二重ルシフェラーゼ遺伝子発現抑制アッセイ
ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を、ハイスループットの９６ウェル・プレート形式のルシフェラーゼサイレンシングアッセイを使用して決定した。細胞を最初に、ホタル・ルシフェラーゼ（標的）およびウミシイタケ・ルシフェラーゼ（対照）をコードするプラスミドで一過性トランスフェクション処理した。ＤＮＡトランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（商標）（インビトロジェン）（総ＤＮＡ１μｇあたり０．５μＬ）ならびにプラスミドｇＷｉｚ−Ｌｕｃ（米国ノースダコタ州ファーゴ所在のアルデブロン（Aldevron））（２００ｎｇ／ウェル）およびプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ（米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガ（Promega ））（２００ｎｇ／ウェル）を使用して実行した。２時間後、プラスミドのトランスフェクション用培地を除去し、ホタル・ルシフェラーゼを標的とするｓｉＲＮＡを１００ｎＭ濃度で細胞に加えた。ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）（米国ウィスコンシン州マディソン所在のマイラス（Mirus ））（０．３□Ｌ／ウェル）を使用して実行した。２４時間後、細胞を、ホタルとウミシイタケの両方のルシフェラーゼの発現について、プレート・ルミノメーター（ＶＩＣＴＯＲ２（商標）、米国マサチューセッツ州ボストン所在のパーキンエルマー（PerkinElmer ））およびＤｕａｌ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ・アッセイ・キット（プロメガ（Promega ））を使用して分析した。ホタル／ウミシイタケのルシフェラーゼ発現の比を使用して、偽処理（ｓｉＲＮＡなし）対照に対する遺伝子サイレンシングの割合（％）を決定した。
【０９７６】
細胞毒性アッセイ
細胞毒性アッセイを、遺伝子サイレンシングアッセイと並行して実行した。これらのアッセイは、ｓｉＲＮＡトランスフェクションの２４時間後に細胞を遺伝子サイレンシングの代わりに細胞毒性について分析したことを除き、遺伝子サイレンシングアッセイ（上記を参照のこと）と全く同じ方式で実行した。相対的な細胞生存率を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（商品名）（プロメガ）を使用した細胞内ＡＴＰ含量の定量によって決定した。
【０９７７】
対照および候補ｉＲＮＡ剤を図１５に表す。
相対的細胞生存率の結果および活性の結果は、図１６および図１７にそれぞれグラフで表されている。１２ＡＳを有する二本鎖では本質的に活性が観察されなかった；９〜１１
ＡＳでは約５０％の活性が観察された；１〜８ＡＳでは完全な活性が観察された。
【０９７８】
代表的なコレステロール連結型ＲＲＭＳモノマーを図１８に示す。固体支持体が連結されたＲＲＭＳモノマー（左下）は、ＲＮＡ、例えば、ｉＲＮＡ剤の３’末端に組み込まれることが可能である。アミダイトを有するＲＲＭＳモノマー（左下）は、ＲＮＡ、例えば、ｉＲＮＡ剤の５’末端または内部の位置に組み込まれることが可能である。
【０９７９】
ＰＡＧＥ精製後の３’コレステロール複合体についてのＬＣＭＳデータを図１９に示す。
【実施例１３】
【０９８０】
コレステロール複合型ｓｉＲＮＡの細胞浸透特性を評価するために、３’コレステロール複合体を含む１１種のセンス鎖を１種類のアンチセンス鎖とアニーリングさせ、いかなるトランスフェクション剤も用いずに細胞培養物に適用した。１Ｓ−１ＡＳ二本鎖を非修飾対照として使用した。ルシフェラーゼの発現は、１１Ｓ−１ＡＳ二本鎖によって、トランスフェクション剤なしで用量依存的にサイレンシングされたのに対し、未修飾１Ｓ−１ＡＳは１１Ｓ−１ＡＳ二本鎖によって遺伝子サイレンシングも示さなかった（図２０を参照のこと）。
【実施例１４】
【０９８１】
５’コレステロール−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡｄＴｄＴ−３’（配列番号５５）
化合物１４−ａ（例えば、［化３９］に記載されている）を使用して、コレステロールがＲＮＡ分子の５’末端に複合体化したｓｉＲＮＡ複合体を合成した。
【０９８２】
ホスホロアミダイト１４−ａを、アセトニトリル／塩化メチレンの１：１溶液に溶解し、０．２Ｍ溶液を得た。これを、オリゴヌクレオチド合成の際の末端のカップリングに使用した。ＰＯ酸化のためには、ヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化ではアセトニトリルに溶解したボーケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬０．５Ｍ溶液を使用した。ジアマトキシトリオチル基（diamathoxy triotyl group）を合成装置中で取り外し、精製および特性解析を実施例１１に記載されているように実行した。
【０９８３】
本発明の多数の実施形態について説明してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされうることが理解されよう。したがって、その他の実施形態が特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０９８４】
【図１】オリゴヌクレオチドにＲＲＭＳモノマーを組み込むための一般的な合成スキーム。
【図２】ＯＦＧ１のシリコン上に存在し得る置換基のリスト。
【図３】代表的なＲＲＭＳ担体のリスト。パネル１はピロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル２は３−ヒドロキシプロリン系のＲＲＭＳを示し；パネル３はピペリジン系のＲＲＭＳを示し；パネル４はモルホリンおよびピペリジン系のＲＲＭＳを示し；パネル５はデカリン系のＲＲＭＧを示す。Ｒ１はコハク酸またはホスホロアミデートであり、Ｒ２はＨまたは複合体リガンドである。
【図４】ペプチドをｉＲＮＡに３’複合体化するための一般的反応スキーム。
【図５】ペプチドをｉＲＮＡに５’複合体化するための一般的反応スキーム。
【図６】アザペプチドの合成のための一般的反応スキーム。
【図７】Ｎ‐メチルアミノ酸およびＮ‐メチルペプチドの合成のための一般的反応スキーム。
【図８】β‐メチルアミノ酸ならびにＡｎｔおよびＴａｔペプチドの合成のための一般的反応スキーム。
【図９】ＡｎｔおよびＴａｔオリゴカルバメートの合成のための一般的反応スキーム。
【図１０】ＡｎｔおよびＴａｔオリゴウレアの合成のための一般的反応スキーム。
【図１１】ペプチド担体の模式図。
【図１２】偽相補的ｓｉＲＮＡ２における塩基対形成の構造を示す図。
【図１３】ＨＣＶゲノムを標的とするように設計された二重標的指向性ｓｉＲＮＡの模式図。
【図１４】ＨＣＶゲノムを標的とするように設計された偽相補的な二機能性ｓｉＲＮＡの模式図。
【図１５】対照ｉＲＮＡ剤および候補ｉＲＮＡ剤のリスト。
【図１６】相対的細胞生存率の結果を示すグラフ。
【図１７】遺伝子サイレンシング活性の結果を示すグラフ。
【図１８】代表的なコレステロール連結型ＲＲＭＳモノマーのリスト。
【図１９】ＰＡＧＥ精製後の３’コレステロール複合体についてのＬＣＭＳデータを示す図。
【図２０】トランスフェクション試薬を用いないＬｕｃのサイレンシングを示すグラフ。
【図１】
2007525454.tif 000097
【図２】
2007525454.tif 000098
【図３】
2007525454.tif 000099
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【図４】
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【図５】
2007525454.tif 000104
【図６】
2007525454.tif 000105
【図７】
2007525454.tif 000106
【図８】
2007525454.tif 000107
【図９】
2007525454.tif 000108
【図１０】
2007525454.tif 000109
【図１１】
2007525454.tif 000110
【図１２】
2007525454.tif 000111
【図１３】
2007525454.tif 000112
【図１４】
2007525454.tif 000113
【図１５】
2007525454.tif 000114
【図１６】
2007525454.tif 000115
【図１７】
2007525454.tif 000116
【図１８】
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【図１９】
2007525454.tif 000118
【図２０】
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【配列表】
2007525454000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月13日(2007.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１鎖および第２鎖を含んでなるｉＲＮＡ剤であって、前記鎖の少なくとも一方に、式（Ｉ）を有する少なくとも１つのサブユニットが組み込まれていることを特徴とするｉＲＮＡ剤。
【化１】
2007525454.tif 000137
（式中、
ＸはＮ（ＣＯ）Ｒ７、またはＮＲ７であり；
Ｒ５はＨ、ＯＨ、ＯＲａ、ＯＲｂであり；
Ｒ７はＲｄであるか；またはＮＲｃＲｄもしくはＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；
Ｒａは
【化２】
2007525454.tif 000138
であり；
Ｒｂは
【化３】
2007525454.tif 000139
であり；
ＡおよびＣのそれぞれは、独立に、ＯまたはＳであり；
ＢはＯＨ、Ｏ−、または
【化４】
2007525454.tif 000140
であり；
Ｒｄは、糖質基；またはステロイド基もしくは少なくとも１つの糖質基に連結されたステロイド基である。）
【請求項２】
【化５】
2007525454.tif 000141
およびＲ５はトランス位にある、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項３】
Ｒ５はＯＲａである、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項４】
ＡはＯである、請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項５】
ＡはＳである、請求項３に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項６】
Ｒ５はＯＲｂである、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項７】
Ｒ５はＯＨである、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項８】
Ｒ７は（ＣＨ２）５ＮＨＲｄまたは（ＣＨ２）５ＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄである、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項９】
Ｒｄは、ガラクトース基、Ｎアセチルガラクトース基、およびマンノース基からなる群から選択される、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１０】
Ｒ７はステロイド基である、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。
【請求項１１】
Ｒ７はＮＨＣ（Ｏ）Ｒｄで置換されたＣ５アルキルであり、Ｒｄはステロイド基である、請求項１に記載のｉＲＮＡ剤。