(57)【要約】  本発明は、ターゲットに対して親和性を有する表面の近くにターゲットを移動させることによってターゲットを検出することに関連する。この移動は電気泳動の使用を伴い、それは、電気泳動力が発生しうる電圧を下げる酸化剤及び還元剤の存在によって増強されて良い。このより低い電位により、ターゲットが検出される、例えば濃縮の間の検出の手段及びターゲットを固定化することなく複数回検出する能力が可能になる。タグはターゲットへと、移動及び／又は検出可能性を与えるために結合させられて良い。ターゲットは分子の例えば、核酸又はタンパク質であり、そして都合良くは微生物である。微生物は表面上に固定化された場合に固定されて増殖して良く、微生物の様々な抗微生物剤に対する感受性の特定が可能になる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中のターゲットを測定するための系であって：
第１の基板上の第１の電気伝導性表面と、第２の基板上の第２の電気伝導性の表面であって、前記第１の表面の一部はターゲットに対する親和性を有する捕捉剤でコートされており、そして前記第１の基板および前記第１の表面と、前記第２の基板および前記第２の表面とから選ばれる基板および表面が一緒に光学的に透明であり、そして前記第１の表面と前記第２の表面とは実質的に互いに平行であり；
前記第１の表面と前記第２の表面との間に電位をセットするパワーコントローラと；
前記第１の表面を照明する照明装置；および
光学的に透明な前記基板およびその表面を通して、前記第１の表面上の捕捉剤へ結合された前記ターゲットの存在を光学的に検出することが可能な、自動化された検出器を含んでなり；
前記コントローラは前記第１の表面と前記第２の表面との間に電位を適用し、かつ前記ターゲットは前記電位により誘導された電気泳動によって前記第１の表面へ移動され、そこでプローブに結合し、前記検出器によって検出される系。
【請求項２】
前記第１の電気伝導性表面が、インジウム酸化第一錫を含んでなる、請求項１の系。
【請求項３】
前記第２の電気伝導性表面が、インジウム酸化第一錫を含んでなる、請求項１の系。
【請求項４】
前記第２の電気伝導性表面が、耐熱性金属を含んでなる、請求項１の系。
【請求項５】
前記検出器が光散乱を検出する、請求項１の系。
【請求項６】
前記検出器が、前記照明装置によって発生されたものとは周波数の異なる光を検出する、請求項１の系。
【請求項７】
前記照明が、前記基板内のエバネセントである、請求項１の系。
【請求項８】
前記照明装置が、前記第２の基板から離れた前記基板上にあり、前記照明装置からの照明が前記基板を通って屈折し、前記第２の基板に面している前記基板の側から反射する、請求項７の系。
【請求項９】
前記照明装置からの照明が、格子を経て前記基板内へ連結される、請求項７の系。
【請求項１０】
前記照明装置からの照明が、エンドカップリングによって前記基板内へ連結される、請求項７の系。
【請求項１１】
前記ターゲットが生物を含んでなる、請求項１の系。
【請求項１２】
前記ターゲットがタンパク質を含んでなる、請求項１の系。
【請求項１３】
前記ターゲットが核酸を含んでなる、請求項１の系。
【請求項１４】
前記溶液が、酸化剤および還元剤を含んでなる、請求項１の系。
【請求項１５】
前記酸化剤が、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、およびハロゲンからなるセットから選ばれる、請求項１４の系。
【請求項１６】
前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、およびハロゲン化物からなるセットから選ばれる、請求項１４の系。
【請求項１７】
前記酸化剤の還元産物が、還元剤を含んでなる、請求項１４の系。
【請求項１８】
前記溶液の標準セル電位が２Ｖ未満である、請求項１４の系。
【請求項１９】
前記溶液の標準セル電位が１Ｖ未満である、請求項１８の系。
【請求項２０】
前記酸化剤の還元産物が、前記還元剤の酸化産物を還元する、請求項１４の系。
【請求項２１】
前記捕捉剤が、機能性化されたコーティングによって前記基板へ付着される、請求項１の系。
【請求項２２】
前記コーティングが、ポリエチレングリコールおよびポリアクリルアミドかなるセットから選ばれるポリマーを含んでなる、請求項２１の系。
【請求項２３】
前記コーティングが、誘導体化されたシランを含んでなる、請求項２１の系。
【請求項２４】
多数の捕捉剤が、前記第１の表面の、重ならない部位に配置される、請求項１の系。
【請求項２５】
溶液の伝導率が、１００マイクロシーメンス／ｃｍ未満である、請求項１の系。
【請求項２６】
溶液の伝導率が、１０マイクロシーメンス／ｃｍ未満である、請求項２５の系。
【請求項２７】
前記ターゲット上の静電荷が、帯電された実体へのその結合によって変化される、請求項１の系。
【請求項２８】
溶液中のターゲットを測定するための方法であって：
実質的に平行であり、かつ５センチメートル未満まで離されている、第１および第２の電気伝導性表面の間に溶液を配置することと；
あらかじめ決められた量よりも少ない組合わされたセル電位を用いて、還元剤および酸化剤の存在下に、前記第１および前記第２の表面を横切って、あらかじめ決められた量よりも少ない電位を適用すること；および
前記第１の表面において、前記ターゲットの存在を検出すること、
の段階を含んでなる方法。
【請求項２９】
前記酸化剤が、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、およびハロゲンからなるセットから選ばれる、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、およびハロゲン化物からなるセットから選ばれる、請求項２８の方法。
【請求項３１】
前記酸化剤の還元産物が、還元剤を含んでなる、請求項２８の方法。
【請求項３２】
前記還元剤が中性に帯電されている、請求項２８の方法。
【請求項３３】
前記酸化剤が中性に帯電されている、請求項２８の方法。
【請求項３４】
第１および第２の電気伝導性表面が、２ｍｍ未満まで離されている、請求項２８の方法。
【請求項３５】
第１および第２の電気伝導性表面が、１ｍｍ未満まで離されている、請求項２８の方法。
【請求項３６】
前記あらかじめ決められた組合わされたセル電位が１Ｖ未満である、請求項２８の方法。
【請求項３７】
前記あらかじめ決められた組合わされたセル電位が２．０Ｖ未満である、請求項２８の方法。
【請求項３８】
前記検出が、光学的検出を含んでなる、請求項２８の方法。
【請求項３９】
前記検出が、光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、表面プラズモン共鳴、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性蛍りん光体イメージング、量子ドットイメージング、および化学発光イメージングからなるセットから選ばれる、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記検出が、エバネセント照明を利用する、請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記検出が、前記溶液からの未結合のターゲットの除去なしに行われる、請求項４０の方法。
【請求項４２】
前記検出が、カメラを利用する、請求項３９の方法。
【請求項４３】
前記カメラが、ＣＣＤおよびＣＭＯＳイメージャーからなるセットより選ばれる、請求項４２の方法。
【請求項４４】
各ピクセルに対応する視野が、２ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項４２の方法。
【請求項４５】
各ピクセルに対応する視野が、０．５ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項４２の方法。
【請求項４６】
表面によって一方の側の上に結合された溶液中のターゲットを検出するための方法であって：
前記溶液に力導入性タグ（force-transducing tag）を混入することであって、フィールドにおいてタグによって誘導された力が、タグを表面へ向かわせるようにし；かつ
前記表面におけるタグの存在を検出すること、
の段階を含んでなる方法。
【請求項４７】
前記フィールドが磁界を含んでなり、前記力導入性タグが常磁性粒子を含んでなる、請求項４６の方法。
【請求項４８】
前記フィールドが電場を含んでなり、前記力導入性タグが、静電荷をもつ力導入性成分を含んでなる、請求項４６の方法。
【請求項４９】
前記タグ上の平均絶対実行電荷が１０００を超える、請求項４８の方法。
【請求項５０】
前記タグ上の平均絶対実行電荷が５０００を超える、請求項４９の方法。
【請求項５１】
前記タグ上の平均絶対実行電荷が２００００を超える、請求項４９の方法。
【請求項５２】
前記力導入性成分が、ホスフェート、第四級アミン、第三級アミン、第二級アミン、第一級アミン、スルフェート、ニトレート、またはカルボキシレートをからなるセットより選ばれる、帯電された正味の静電荷をもつ化学基を含んでなる、請求項４８の方法。
【請求項５３】
前記タグが付加的に、指標成分および結合成分を含んでなる、請求項４６の方法。
【請求項５４】
前記指標成分が、アップコンバート性蛍りん光体、化学発光タグ、酵素、蛍光体、光吸収粒子、量子ドット、光散乱粒子、位相差粒子、放射性物質、および電気化学的指標からなるセットより選ばれる、請求項５３の方法。
【請求項５５】
前記結合成分が、抗体、アビジン、ビオチン、アプタマー、核酸、またはロックド・ヌクレイックアシドからなるセットより選ばれる、請求項５３の方法。
【請求項５６】
前記タグが、付加的にリンカー成分を含んでなる、請求項５３の方法。
【請求項５７】
前記リンカーが、チオール、アリ−ル、アジド、アルコール、アミン、ヒドラジン、エポキシ、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、ビオチン、またはアビジンからなるセットより選ばれる、少なくとも一つの化学的機能性を有する、請求項５６の方法。
【請求項５８】
光学的に検出可能であり、基板の第１の表面上のプローブへ結合するターゲットを検出する方法であって：
前記基板を通して前記第１の表面を照明することであって、照明は前記基板の第２の表面を通って前記基板に進入し、前記第１の表面でもう一度反射し、さらに前記基板の第３の表面から出て行き、前記第２および前記第３の表面は、前記第１の表面とは別個であり；かつ
前記プローブへ結合したターゲットを、エバネセント光照明を用いて検出すること、
の段階を含んでなる方法。
【請求項５９】
前記第１の表面および前記第２の表面が、同じ基板上にある、請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記第１の表面および前記第２の表面が、異なる基板上にある、請求項５８の方法。
【請求項６１】
前記第１の表面および前記第２の表面が、流体によって連結されている、請求項６０の方法。
【請求項６２】
前記第１の表面および前記第２の表面が、圧縮性の透明な物質によって連結されている、請求項６０の方法。
【請求項６３】
前記物質が、シリコンおよびエチル酢酸ビニルからなるセットより選ばれる、請求項６２の方法。
【請求項６４】
前記ターゲットがエバネセント光を散乱する、請求項５８の方法。
【請求項６５】
前記ターゲットが、入射エバネセント照明とは異なる周波数で光を放出する、請求項５８の方法。
【請求項６６】
前記ターゲットが、蛍光色素を含んでなる、請求項６５の方法。
【請求項６７】
前記ターゲットが、アップコンバート性蛍りん光体を含んでなる、請求項６５の方法。
【請求項６８】
前記ターゲットが、量子ドットを含んでなる、請求項６５の方法。
【請求項６９】
前記ターゲットが、量子ドットを含んでなる、請求項６５の方法。
【請求項７０】
検出が、第１の検出、および第２の検出を含んでなり、プローブへのターゲットの結合は、第１の検出と第２の検出との間の時間で割られた、第２の検出において検出されたターゲットからの、第１の検出に置いて検出されたターゲットの差、によって測定される、請求項５８の方法。
【請求項７１】
表面の領域へ結合されているプローブに対する、溶液中のターゲットの結合を促進するための方法であって：
前記溶液を、それが、領域の外側の表面上の第１の電極に接触するように配置することであって、第２の電極は前記領域の外側の前記表面上にあり、前記領域は前記第１の電極と前記第２の電極との間に位置しており、かつ第３の電極は前記表面上になく；
前記第１、第２および第３の電極に電位をセットし、電気泳動力が誘導されて、前記ターゲットが前記第２および前記第３の電極から離れて、前記第１の電極へ向かうようにし、さらに、実質的にすべてのターゲットが前記第１の電極へ集められるまで電気泳動を続けること；および
前記第１、第２および第３の電極に電位をセットして、電気泳動力が誘導されて、前記ターゲットが前記第２および第３の電極から離れて、前記第１の電極へ向かうようにすること；の段階を含んでなり、
前記ターゲットが通ってプローブに近接し、この近接によって、前記プローブへの前記ターゲットの結合を促進するようにする方法。
【請求項７２】
前記溶液が、酸化剤および還元剤を含んでなる、請求項７１の方法。
【請求項７３】
前記酸化剤が、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、およびハロゲンからなるセットから選ばれる、請求項１４の系。
【請求項７４】
前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、およびハロゲン化物からなるセットから選ばれる、請求項７２の方法。
【請求項７５】
前記酸化剤の還元産物が、還元剤を含んでなる、請求項７２の方法。
【請求項７６】
前記溶液の標準セル電位が２Ｖ未満である、請求項７６の方法。
【請求項７７】
前記溶液の標準セル電位が１Ｖ未満である、請求項７６の方法。
【請求項７８】
前記酸化剤の還元産物が、前記還元剤の酸化産物を還元する、請求項７２の方法。
【請求項７９】
第１の電極と第２の電極の間の電位差が、２ボルト未満である、請求項７１の方法。
【請求項８０】
第２の電極が透明である、請求項７１の方法。
【請求項８１】
前記第１、第２および第３の電極に電位を調整することの段階を付加的に含み、電気泳動力が誘導されて、前記ターゲットが前記第２および第３の電極から離れて、前記第１の電極へ向かうようにし、前記ターゲットが前記プローブの上を一回以上通過するようにする、請求項７１の方法。
【請求項８２】
溶液中に浸された第１の電極に対する第１および第２の帯電された物質の結合力を識別するための方法であって、前記溶液は付加的に第２の電極と接触しており、かつ電解質に対する還元剤および酸化剤を含んでおり、系のためセル電位を生じるようにする方法であって；
前記第１および前記第２の電極を横切って前記第１の電位をかけ、前記第１の電位が前記系の前記セル電位よりも大きく、かつ２ボルトより小さくなるようにし、還元剤の酸化、および酸化剤の還元によって生じた電気泳動フィールドが、前記第１および前記第２の物質を前記第１の電極からはね返すようにすること；
前記第１の電極上の前記第１および第２の物質の存在を検出すること；および
前記第１および第２の電極を横切る電圧を増し、前記第２の電位によって発生された電気泳動力が、前記第１の電極から前記第１の物質を除去する一方で、前記第２の物質は前記第１の電極に残り、その除去が検出によって検出されるようにすること、
の段階を含む方法。
【請求項８３】
前記酸化剤が、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、およびハロゲンからなるセットから選ばれる、請求項８２の方法。
【請求項８４】
前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、およびハロゲン化物からなるセットから選ばれる、請求項８２の方法。
【請求項８５】
前記酸化剤の還元産物が、還元剤を含んでなる、請求項８２の方法。
【請求項８６】
前記第１の電極から前記第２の電極まで、実質的に直線的に電位が増加される、請求項８２の方法。
【請求項８７】
前記第１の電極から前記第２の電極まで、実質的にステップ関数において電位が増加される、請求項８２の方法。
【請求項８８】
前記第１の電極と前記第２の電極の間の電位差が、２ボルト未満である、請求項８２の方法。
【請求項８９】
検出が、前記第１の電極からの電解質の除去を伴わずに行われる、請求項８２の方法。
【請求項９０】
検出が光学的に行われる、請求項８２の方法。
【請求項９１】
第１の電極が透明である、請求項８２の方法。
【請求項９２】
前記第１の電極上の前記第１および第２の物質の場所を分類する段階を付加的に含む方法であって、前記第１の電極上の場所からの前記第１、または第２の物質の除去が、検出器に対し前記第１の電極からの前記第１、または第２の物質の除去を示すようにする、請求項８２の方法。
【請求項９３】
電気泳動用の反応チャンバーであって：
扁平な一次電極のアレイがその上に配置された、実質的に扁平なプレートと；
上部および底部を欠くウェル壁のアレイを含んでいる固定具であって、前記ウェルは、側面の位置が、前記一次電極の位置に適合し、前記プレート上に接着してウェルのアレイを創製することができ、前記一次電極がウェル内に存在するようにする固定具；および
シャフトのアレイであって、その各々の末端に二次電極が貼付けられており、前記二次電極の各々の断面は、一つのウェル内に配置可能なディメンションのものであり、前記シャフトは前記扁平なプレートに対して上下されることが可能であって、前記二次電極を壁の内外へ移動できるようするアレイ；を含んでなり、
電解質溶液がウェル内へ配置され、前記二次の電極がウェル内へ下げられると、一次および二次電極の間で電気泳動が行われることが可能なチャンバー。
【請求項９４】
全てのシャフトが互いに固定されており、かつ一緒に移動する、請求項９３のアレイ。
【請求項９５】
全てのシャフトが独立して可動性である、請求項９３のアレイ。
【請求項９６】
前記第２の電極が回転し、ウェル内の溶液に液体流動を生じるようにする、請求項９３のアレイ。
【請求項９７】
前記第２の電極が、遠位に円形の断面を有する、請求項９３のアレイ。
【請求項９８】
表面上の第１のプローブおよび第２のプローブに対する、溶液中のターゲットの結合を促進するための方法であって：
前記ターゲットに対し、重力以外の、前記表面に対して実質的に平行な力を適用すること；
前記ターゲットに対し、重力以外の、前記表面に対して実質的に垂直な力を供給することであって、前記力は表面に対して平行であり、前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの双方と近接して配置されるようにすること、
の段階を含む方法。
【請求項９９】
適用および供給が同時におこる、請求項９８の方法。
【請求項１００】
適用および供給が異なる時間におこる、請求項９８の方法。
【請求項１０１】
前記水平の力が、電気泳動力、電気浸透、音響波、機械的撹拌、液体ポンピングからなるセットより選ばれる、請求項９８の方法。
【請求項１０２】
前記垂直の力が、電気泳動、誘電泳動、遠心分離、濾過、磁場の誘引からなるセットより選ばれる、請求項９８の方法。
【請求項１０３】
前記水平の力が、実質的に１８０度まで方向を切換え、ターゲットがプローブを両方向へ通過するようにする、請求項９８の方法。
【請求項１０４】
前記ターゲットが、前記第２のプローブの近位に移動する前および後の双方で、前記第１のプローブを通過して移動する、請求項１０３の方法。
【請求項１０５】
溶液中の第１のタイプの微生物の定量のための系であって：
チャンバーの相対する壁の上に第１の電極および第２の電極を含んでなるチャンバーと；
インプットポート；
アウトプットポート；
前記インプットポートを通して前記チャンバー内へ、また前記アウトプットポートを通して前記チャンバーの外へ、溶液を輸送するための流体輸送手段；
前記第１のタイプの微生物がそれに付着する、前記第１の電極へ貼付けられた第１の親和性成分と、前記第１の電極と前記第２の電極との間の電位を調節する電気コントローラ；
第１の親和性成分へ付着された前記第１のタイプの微生物の量を検出することが可能な自動検出器；および
前記検出器によって測定された前記第１のタイプの微生物の量を記憶する情報コントローラ；を含んでなり、
この系において、前記溶液は前記インプットポートを通して前記チャンバー内へ投入され、前記第１および前記第２の電極の間の前記コントローラにより、前記電極の間に電気泳動をさせるべく充分な電位がかけられ、前記第１の電極へ向かう前記第１の微生物の移動を引き起こし、前記微生物が前記第１の親和性成分に最も近づいたとき、それらが前記第１の親和性成分へ結合し、その量が前記検出器によって測定され、前記情報コントローラに記憶されるようにするシステム。
【請求項１０６】
前記微生物が、シュードモナス（Pseudomonas）属、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、プロテウス（Proteus）属、セラチア（Serratia）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、カンジダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、およびナイセリア（Neisseria）属からなるセットより選ばれる、請求項１０５の系。
【請求項１０７】
前記酸化剤が、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、およびハロゲンからなるセットより選ばれる、請求項１０５の系。
【請求項１０８】
前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、またはハロゲン化物からなるセットより選ばれる、請求項１０５の系。
【請求項１０９】
前記酸化試薬の前記還元産物が、前記還元剤を含んでなる、請求項１０５の系。
【請求項１１０】
前記溶液の伝導率が１００マイクロシーメンス／ｃｍ未満である、請求項１０５の系。
【請求項１１１】
前記溶液が両性イオン緩衝液を含んでなる、請求項１０５の系。
【請求項１１２】
前記インプットポートを通した前記チャンバー内への導入に先立ち、試料から前記微生物を濃縮する濃縮器を付加的に含んでなる、請求項１０５の系。
【請求項１１３】
前記濃縮器が遠心分離機を含んでなる、請求項１１２の系。
【請求項１１４】
前記濃縮器がイオン交換粒子を含んでなる、請求項１１２の系。
【請求項１１５】
前記試料が、前記溶液よりも高い伝導率を有する、請求項１１２の系。
【請求項１１６】
前記自動検出器が光学検出器を含んでなる、請求項１０５の系。
【請求項１１７】
前記光学検出器が、光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性蛍りん光体イメージング、量子ドットイメージング、および化学発光イメージングからなるセットより選ばれる、請求項１１６の系。
【請求項１１８】
第１電極および第２電極を含んでなるセットから選ばれる電極が、光学的に透明である、請求項１１６の系。
【請求項１１９】
前記ターゲットがレーザによって照らされてもよい、請求項１１６の系。
【請求項１２０】
前記検出器がさらに、前記親和性成分に付着した前記各微生物の位置を測定し、微生物の位置は、その位置の微生物の量とともに前記情報コントローラ内に記憶される、請求項１１６の系。
【請求項１２１】
前記検出器が、前記第１の電極へ貼付けられた前記第１のタイプの微生物の実質的に全てを含んでいる前記表面の、一部分のシグナルの平均化によって、前記第１のタイプの微生物の全量を検出する、請求項１１６の系。
【請求項１２２】
前記第１の電極が、金を含んでなり、前記検出器が表面プラズモン共鳴を利用する、請求項１１６の系。
【請求項１２３】
前記検出器がカメラを含んでなる、請求項１１６の系。
【請求項１２４】
各ピクセルに対応する視野が２ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項１２３の系。
【請求項１２５】
各ピクセルに対応する視野が０．５ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項１２３の系。
【請求項１２６】
前記溶液が、電気泳動の間にバルク移動の中にある、請求項１０５の系。
【請求項１２７】
二つの電気泳動の期間が、溶液がバルク移動の中にある期間に介在される、請求項１０５の系。
【請求項１２８】
前記溶液がさらに第２のタイプの微生物を含んでおり、前記検出器は前記第１のタイプの微生物を前記第２のタイプの微生物から識別することが可能である、請求項１０５の系。
【請求項１２９】
前記第１のタグが、前記検出器により検出可能な第１の指標へ結合された、第１の結合剤を含んでなり、第２のタグが、前記検出器により検出可能な第２の指標へ結合された、第２の結合剤を含んでなり、前記第１の指標および前記第２の指標は前記検出器によって識別可能であり、前記第１の結合剤は前記第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は前記第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグおよび前記第２のタグは、前記親和性成分へ結合された、前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物と反応され、前記検出器は前記微生物に結合された前記タグに基づき、前記微生物の量を実質的に同時に検出する、請求項１２８の系。
【請求項１３０】
第１のタグが、前記検出器により検出可能な指標へ結合された、第１の結合剤を含んでなり、第２のタグが、指標へ結合された第２の結合剤を含んでなり、前記第１の結合剤は前記第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は前記第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグは、前記親和性化合物へ結合された前記第１のタイプの微生物と反応され、前記検出器は前記微生物へ結合された前記タグに基づき前記第１のタイプの微生物の量および位置を検出し、次に、前記第２のタグが、前記親和性化合物へ結合された前記第２のタイプの微生物と反応され、前記検出器は、前記検出器によって先に検出されなかった位置にある微生物へ結合された前記タグに基づき、前記第２のタイプの微生物の量および位置を検出する、請求項１２８の系。
【請求項１３１】
指標へ結合された結合剤を含んでなるタグを付加的に含んでなり、前記結合剤が前記第１のタイプの微生物へ特異的に結合する抗体を含んでなる、請求項１２８の系。
【請求項１３２】
前記検出器が、前記微生物の異なる電気泳動特性に基づき、前記第１のタイプの微生物を前記第２のタイプの微生物から識別する、請求項１２８の系。
【請求項１３３】
前記第１の親和性成分が、高分子電解質を含んでなる、請求項１０５の系。
【請求項１３４】
前記高分子電解質が、ポリカチオンポリマーを含んでなる、請求項１３３の系。
【請求項１３５】
前記ポリカチオンポリマーが、アミン成分を含んでなる、請求項１３４の系。
【請求項１３６】
前記溶液が第２のタイプの微生物を付加的に含んでなり、前記第２のタイプの微生物が前記第１の親和性成分とは結合しない、請求項１０５の系。
【請求項１３７】
前記親和性成分が、抗体またはアプタマーからなるセットより選ばれる、請求項１３６の系。
【請求項１３８】
前記第１の電極へ結合された第２の親和性成分を含んでなり、これに第２のタイプの微生物が結合し、前記検出器は前記第２の親和性成分へ付着した前記第２の微生物の量を検出することが可能であって、前記系が、前記微生物が前記第１の親和性成分または、前記第２の親和性成分へ付着するかどうかによって、前記第１のタイプの微生物を前記第２のタイプの微生物から識別することが可能な、請求項１３６の系。
【請求項１３９】
前記親和性成分が、前記微生物に対して本質的に低い親和性をもつポリマーを付加的に含んでなり、前記ポリマーがポリエチレングリコールまたはポリアクリルアミドからなセットより選ばれる、請求項１３６の系。
【請求項１４０】
前記系が、前記第１の電極と共面である、第３の電極を付加的に含んでなり、それに対して第２の親和性成分が結合し、かつそれに対し前記第２のタイプの微生物が付着することが可能であり、前記第１の電極および前記第３の電極上の電位が、前記電気コントローラによって独立して制御されることが可能な、請求項１３６の系。
【請求項１４１】
前記検出器が、前記第１のタイプの微生物が生きているか死んでいるかを検出する、請求項１０５の系。
【請求項１４２】
前記微生物が、前記検出器によって検出されるに先立ち、死体染色および生体染色からなるセットより選ばれる染色剤によって染色される、請求項１４１の系。
【請求項１４３】
前記第１のタイプの微生物の前記第１の親和性成分への付着に続き、前記微生物は増殖誘導性の条件下に置かれる、請求項１０５の系。
【請求項１４４】
条件が、３４〜４０℃の温度を含む、請求項１４３の系。
【請求項１４５】
前記溶液が、前記アウトプットポートを経て前記チャンバーから除去され、前記インプットポートを通した増殖培地によって置換えられてよい、請求項１４３の系。
【請求項１４６】
前記増殖培地が１ミリシーメンス／ｃｍ未満の伝導率を有しており、前記電気コントローラが、前記第１の電極と前記第２の電極との間に、１００ｍＶより大きい電位を維持する、請求項１４５の系。
【請求項１４７】
前記第１のタイプの微生物が、前記検出器によって最初の時間に検出され、また、前記微生物があらかじめ決められた増殖時間を与えられた後の、第２の時間において検出され、この二つの時間において検出された第１のタイプの微生物における差異が、この増殖条件における前記第１のタイプの微生物の生存能力の証拠を提供する、請求項１４３の系。
【請求項１４８】
抗微生物剤が、増殖時間の間に前記増殖培地へ添加される、請求項１４７の系。
【請求項１４９】
前記検出器が、前記抗微生物剤に反応して、前記第１のタイプの微生物が生きているか、または死んでいるかを検出し、前記検出器による検出に先立ち、前記微生物は、死体染色および生体染色からなるセットより選ばれる染色法によって染色される、請求項１４８の系。
【請求項１５０】
前記抗微生物剤が、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、モノバクタム、ベータ−ラクタム、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、フルオロキノロン、マクロライド、ケトライド、糖ペプチド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、およびリファンピシンからなるセットより選ばれる、請求項１４８の系。
【請求項１５１】
前記微生物剤の濃度が、動物組織中の抗微生物剤の薬物動態を反映するべく、時間の経過とともに変化される、請求項１４８の系。
【請求項１５２】
前記微生物が、第１の期間において過剰の微生物表面結合性反応物と反応されてよく、その後に、続いて前記反応物は除去され、第２の反応時間において前記微生物が、前記検出器によって検出可能となるべく指標によって修飾された、過剰の微生物表面結合性分子と反応され、前記検出器による前記指標の検出が前記微生物の増殖を示す、請求項１４７の系。
【請求項１５３】
前記増殖時間が、少なくともあらかじめ決められた割合の前記微生物が二倍になるのに充分である、請求項１４７の系。
【請求項１５４】
前記あらかじめ決められた割合が１０％未満である、請求項１５３の系。
【請求項１５５】
前記溶液が、前記第１のタイプの微生物と一緒に前記第１の親和性成分へ結合する不純物を付加的に含んでなり、前記微生物を放出することなく前記不純物を放出する条件が、前記第１の親和性成分へ適用され、前記条件の適用によって前記不純物は除去される、請求項１０５の系。
【請求項１５６】
前記条件が、温度、磁場の強さ、電気泳動力、誘電泳動力、剪断流体流動、イオン強度、ｐＨ、非イオン界面活性剤濃度、イオン界面活性剤、または競合物濃度を含む、請求項１５５の系。
【請求項１５７】
溶液はさらに、前記第１のタイプの微生物と一緒に前記第１の親和性成分へ結合する不純物を含んでよく、前記不純物を放出することなく前記微生物を放出する条件が、前記第１の親和性成分へ適用されるが、前記微生物はその後に、前記第１の電極へ貼付けられた第２の親和性成分へ結合される、請求項１０５の系。
【請求項１５８】
前記条件が、温度、磁場の強さ、電気泳動力、誘電泳動力、剪断流体流動、イオン強度、ｐＨ、非イオン界面活性剤濃度、イオン界面活性剤、または競合物濃度を含む、請求項１５７の系。
【請求項１５９】
前記第１のタイプの微生物が、前記第１の親和性成分へ結合される前に、前記溶液中で濃縮され、前記微生物は比較的低いイオン強度の第１の塩類緩衝液中に存在しており、前記第１の塩類緩衝液は比較的高いイオン強度の第２の塩類緩衝液に隣接しており、前記第１の塩類緩衝液および前記第２の塩類緩衝液は境界面において隣接しており、第１の濃縮電極が前記境界面の近位に局在し、第２の濃縮電極が境界面の遠位に局在しており、前記第１の濃縮電極と前記第２の濃度電極との間に電位をかけると、前記微生物に、電気泳動による前記第１の塩類緩衝液を通した移動を引き起こし、その移動は前記境界面に出会うと１０倍よりも多く低減される、請求項１０５の系。
【請求項１６０】
前記第２の濃縮電極が、前記第１の電極を含んでなる、請求項１５９の系。
【請求項１６１】
前記境界面が実質的に前記インプットポートに局在する、請求項１５９の系。
【請求項１６２】
前記第１の塩類緩衝液と前記第２の塩類緩衝液との伝導率の比が１：５０よりも小さい、請求項１５９の系。
【請求項１６３】
電解質中の第１の帯電された実体および第２の帯電された実体を、第１の電極の電極表面の第１の部分および第２の部分へ各々貼付けるための系であって、前記第１の電極が、第２の電極とさらに接触している前記電解質と接触しており、前記第１の部分と前記第２の部分とは重ならず；
前記第１および第２電極の間に、前記第１の電極と前記第２の電極との間に電位差を生成するべく充分な大きさの電位差を適用するためのコントローラと；
前記第１の部分において前記第１の電極をカバーしている第１の親和性成分を含んでなり、これにおいて前記第１の親和性成分は前記第１の実体に対する親和性を有しており；
前記第２の部分において前記第１の電極をカバーしている第２の親和性成分を含んでなり、これにおいて前記第２の親和性成分は前記第２の実体に対する親和性を有しており；
前記コントローラが前記第１および前記第２の電極の間に電気泳動力を生成し、前記第１および第２の実体は、前記電気泳動力の下に前記第１の電極へ向かって移動し、かつ、前記第１および前記第２の実体が、各々前記第１および前記第２の親和性成分と接触するとき、それらが前記第１および第２の部分において、前記第１の電極へ各々貼付けられるようにする系。
【請求項１６４】
前記電解質中の前記第１および第２の実体を、前記第１の電極に対して平行に移動させる、水平ミキサを付加的に含んでなる、請求項１６３の系。
【請求項１６５】
前記電位差の適用により、前記水平ミキサが、前記第１および第２の実体を同時に移動させる、請求項１６４の系。
【請求項１６６】
前記電位差の適用により、前記水平ミキサが、前記第１および第２の実体を連続的に移動させる、請求項１６４の系。
【請求項１６７】
前記水平ミキサが、前記電解質に対し、バルクの物理的移動を適用する、請求項１６４の系。
【請求項１６８】
前記水平ミキサが、電気泳動および誘電泳動からなるセットより選ばれる力を利用する、請求項１６４の系。
【請求項１６９】
前記電極が実質的に平行である、請求項１６３の系。
【請求項１７０】
前記電極間の距離が１ｍｍ未満である、請求項１６９の系。
【請求項１７１】
前記電気泳動フィールドが、前記第１の電極に対して実質的に垂直である、請求項１６３の系。
【請求項１７２】
前記電極泳動フィールドが、前記第１の電極に対して実質的に垂直である、請求項１６３の系。
【請求項１７３】
前記第１の電極上の前記第１および第２の実体の存在を検出するための検出器を付加的に含んでなる、請求項１７２の系。
【請求項１７４】
前記検出器が、二つの時間の間に動作し、その間に前記第１の電極と前記第２の電極との間に電位が適用される、請求項１７２の系。
【請求項１７５】
前記透明電極が、インジウム酸化第一錫を含んでなる、請求項１７４の系。
【請求項１７６】
前記検出器による検出に先立ち、前記第１の帯電された実体が光学的タグで標識される、請求項１７２の系。
【請求項１７７】
前記光学的タグの検出が、光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性蛍りん光体イメージング、量子ドットイメージング、化学発光イメージングからなるセットより選ばれる、請求項１７６の系。
【請求項１７８】
前記電位差が２Ｖ未満である、請求項１６３の系。
【請求項１７９】
前記電解質が還元剤および酸化剤を含んでなり、前記電解質中の前記還元剤および前記酸化剤の存在が、前記還元剤および前記酸化剤の不在下よりも低い電位差による電気泳動力を可能にする、請求項１６３の系。
【請求項１８０】
前記酸化剤が、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、およびハロゲンからなるセットから選ばれる、請求項１７９の系。
【請求項１８１】
前記還元剤が、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、およびハロゲン化物からなるセットから選ばれる、請求項１７９の系。
【請求項１８２】
前記酸化剤の還元産物が、前記還元剤を含んでなる、請求項１７９の系。
【請求項１８３】
前記第１の実体が、前記還元剤とは異なっている、請求項１７９の系。
【請求項１８４】
前記酸化剤の還元産物が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、および炭水化物からなるセットより選ばれる、請求項１６３の系。
【請求項１８５】
前記第１の実体が、生物を含んでいる、請求項１６３の系。
【請求項１８６】
２ミリメートル未満の距離まで離された、平行な第１および第２の電極の間の電気泳動を通して、ターゲットを濃縮する方法であって；
前記ターゲットおよびイオン種を含んでなる電解質を、前記電極の間に配置することと；
前記第１および第２の電極に、前記電極間に電気泳動力を引き起こすべく充分な電位をかけ、前記ターゲットが前記電解質を通して前記第１の電極へ向かって移動するようにすること；
前記電極に対してほぼ垂直である高電流のチャンネルを中断すること、の段階を含んでなり、
高濃度のターゲットおよび低濃度のターゲットの領域が、前記電極上に現れないようにする方法。
【請求項１８７】
前記ターゲットが、微生物、核酸、およびタンパク質からなるセットより選ばれる、請求項１８６の方法。
【請求項１８８】
前記破壊が、前記電極に対して実質的に平行な流体の移動によって引き起こされる、請求項１８６の方法。
【請求項１８９】
破壊が、前記第１および第２の電極の間の電位を、最大に適用された電位からあらかじめ決められた割合まで断続的に低減し、前記電解質中の前記イオン種が、高濃度の領域から拡散できるようにする、請求項１８６の方法。
【請求項１９０】
前記電位が、最大適用電位の半分よりも大きく、連続的に５秒間を超えない、請求項１８９の方法。
【請求項１９１】
前記あらかじめ決められた割合が５０％である、請求項１８９の方法。
【請求項１９２】
第２のタイプの微生物の存在下における、第１のタイプの微生物の定量化のための系であって、双方の微生物は最初一つの試料中に存在しており：
遠心分離機と；
前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物に対する親和性を有する検出表面を含んでなるチャンバーであって、前記検出表面は前記遠心分離機内に配置される同時に前記量溶液と接触することが可能であり、遠心分離に際し、前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物が前記検出表面上に沈着されるようにし；
前記第１のタイプおよび第２のタイプの微生物のための増殖培地と；
前記研修チャンバーと界面で接触している自動化された検出器であって、前記増殖培地の存在下に前記検出表面へ接着した前記第１のタイプの微生物の量を検出することが可能であり；および
前記第１のタイプの微生物の量を記憶する情報コントローラ；を含んでなり、
前記試料溶液は、前記遠心分離機において前記検出表面上へ遠心分離され、それらが前記表面へ結合され、前記微生物は前記増殖培地中で培養され、かつ前記検出器で検出され、前記第１のタイプの微生物の量が前記情報コントローラ内へ記憶されるようにする系。
【請求項１９３】
前記微生物が、シュードモナス属、ステノトロホモナス属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、ヘモフィルス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、マイコバクテリウム属、カンジダ属、アスペルギルス属、およびナイセリア属からなるセットより選ばれる、請求項１９２の系。
【請求項１９４】
前記検出チャンバーが、前記検出表面と可逆的に接合されて堅い防水アセンブリを形成しているチャンバーチューブを付加的に含んでなり、その中に遠心分離の間、試料溶液が保持されることが可能であり、その後に、前記チャンチューブが前記検出表面から脱着されて、前記検出器による検出を可能にする、請求項１９２の系。
【請求項１９５】
前記断面図が四角形または直方体から選ばれる、請求項１９４の系。
【請求項１９６】
前記チャンバーチューブからの脱着に続き、前記検出表面と接合する流体アセンブリを付加的に含んでなり、前記流体アセンブリが透明な窓、インプットポート、およびアウトプットポートを含んでなり、前記インプットポートを通して増殖培地が前記流体アセンブリ内に進入し、前記透明な窓は前記検出表面に平行で向き合っており、前記検出器が前記透明な窓を通して前記第１のタイプの微生物位を検出する、請求項１９４の系。
【請求項１９７】
前記検出器が光学的検出器を含んでなる、請求項１９２の系。
【請求項１９８】
前記光学的検出器が、光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性蛍りん光体イメージング、量子ドットイメージング、化学発光イメージングからなるセットより選ばれる光学的検出を利用する、請求項１９７の系。
【請求項１９９】
前記検出器がレーザ照明を利用する、請求項１９７の系。
【請求項２００】
前記表面が金でコートされており、前記検出器が表面プラズモン共鳴を利用する請求項１９７の系。
【請求項２０１】
前記検出器が、前記検出表面へ接着された各細菌の位置を付加的に測定し、前記の位置がその位置における前記微生物の量とともに、前記情報記憶装置中に記憶される、請求項１９７の系。
【請求項２０２】
前記検出器が、前記検出表面上へ貼付けられた前記第１のタイプの微生物の実質的にすべての前記微生物を含んでなる前記検出表面の、一部についてのシグナルの平均化によって前記第１のタイプの微生物の全量を検出する、請求項１９７の系。
【請求項２０３】
前記検出器がカメラを含んでなる、請求項１９７の系。
【請求項２０４】
各ピクセルに対応する視野が、２ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項２０３の系。
【請求項２０５】
前記検出器が、前記第１のタイプの微生物を前記第２のタイプの微生物から識別することが可能な、請求項１９２の系。
【請求項２０６】
前記検出器により検出可能な第１の指標へ結合された第１の結合物質を含んでなる第１のタグおよび、前記検出器により検出可能な第２の指標へ結合された第２の結合剤を含んでなる第２のタグを、付加的に含んでなり、前記第１の指標および前記第２の指標は前記検出器によって識別可能であり、前記第１の結合剤は前記第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は前記第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグおよび前記第２のタグが、前記検出表面へ結合された、前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物と反応され、前記検出器は前記微生物に結合された前記タグに基づき、前記微生物の量を実質的に同時に検出する、請求項２０５の系。
【請求項２０７】
第１のタグは、検出器により検出可能な指標へ結合された第１の結合剤を含んでなり、第２のタグは、前記指標へ結合された第２の結合剤を含んでなり、前記第１の結合剤は前記第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は前記第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグは、前記親和性化合物へ結合された前記第１のタイプの微生物と反応され、前記検出器は前記微生物へ結合された前記タグに基づき前記第１のタイプの微生物の量および位置を検出し、次に、前記第２のタグが、前記親和性化合物へ結合された前記第２のタイプの微生物と反応されて、前記検出器が、前記検出器によって先に検出されなかった位置にある微生物へ結合された前記タグに基づき、前記第２のタイプの微生物の量および位置を検出する、請求項２０５の系。
【請求項２０８】
結合剤と、前記検出器によって検出可能な指標とを含んでなるタグを付加的に含んでなり、前記結合剤が前記第１のタイプの微生物と結合し、前記第２のタイプの微生物とは結合しない、請求項２０５の系。
【請求項２０９】
前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物に対する前記検出表面が、ポリカチオンポリマーによって与えられる、請求項２０５の系。
【請求項２１０】
前記ポリマーがアミン成分を含んでなる、請求項２０９の系。
【請求項２１１】
前記検出器が、前記第１のタイプの微生物が生きているか死んでいるかを検出ことが可能である、請求項１９２の系。
【請求項２１２】
前記微生物が、前記検出器によって検出されるに先立ち、死体染色および生体染色からなるセットより選ばれる染色法によって染色される、請求項２１１の系。
【請求項２１３】
前記第１のタイプの微生物が、前記検出器によって最初の時間に検出され、また、前記微生物があらかじめ決められた増殖時間が与えられた後の第２の時間において検出され、この二つの時間において検出された前記第１のタイプの微生物における差異が、この増殖条件における前記第１のタイプの微生物の生存能力の証拠を提供する、請求項１９２の系。
【請求項２１４】
抗微生物剤が、前記増殖時間の間に前記増殖培地へ添加される、請求項２１３の系。
【請求項２１５】
前記検出器は、抗微生物剤に応答して、前記第１のタイプの微生物が生きているか、または死んでいるかを検出し、検出に先立ち、前記第１のタイプの微生物が、死体染色および生体染色からなる群から選ばれる染色法によって染色される、請求項２１４の系。
【請求項２１６】
前記抗微生物剤が、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、モノバクタム、ベータ−ラクタム、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、フルオロキノロン、マクロライド、ケトライド、糖ペプチド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、およびリファンピシンからなるセットより選ばれる、請求項２１４の系。
【請求項２１７】
前記抗微生物剤の濃度が、動物組織中の前記抗微生物剤の薬物動態を反映するべく、時間の経過とともに変えられる、請求項２１４の系。
【請求項２１８】
前記増殖時間が、あらかじめ決められた割合の微生物が二倍になるのに充分である、請求項２１３の系。
【請求項２１９】
前記割合が１０％未満である、請求項２１８の系。
【請求項２２０】
前記微生物が、第１の期間において過剰の表面結合性反応物と反応されてよく、その後に、続いて表面結合反応物は除去され、第２の反応時間において前記微生物は、前記検出器によって検出可能となるべく指標によって修飾された、過剰の微生物表面結合性分子と反応され、前記検出器による前記指標の検出が前記微生物の増殖を示す、請求項２１３の系。
【請求項２２１】
第２のタイプの微生物の存在下における第１のタイプの微生物の定量のための系であって、双方の微生物が最初に試料中に存在しており：
出口チャンバーから入口チャンバーを分離している実質的に扁平なフィルタであって、その親和性表面が前記入口チャンバー内に存在しており、前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物に対して親和性を有しており、前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物が濾過の間に前記フィルタ上に保持されるフィルタと；
前記フィルタの入口チャンバーに対する透明なカバーと；
前記入口チャンバーへ連結するインプットポート、前記出口チャンバーへ連結するアウトプットポート；
前記第１のタイプおよび前記前記第２のタイプの微生物のための増殖培地；
前記増殖培地の存在下に前記親和性表面へ接着する前記第１のタイプの微生物の量を検出することが可能な、透明なカバーと接続している自動化された光学的検出器；
前記第１のタイプの微生物の量を記憶する情報コントローラ；を含んでなり、
前記インプットポートから前記入口チャンバーへ進入する試料溶液が、前記フィルタを通して濾過され、前記フィルタ上へ接着された微生物が次に、前記増殖培地中で増殖されて、前記検出器によって検出され、前記第１のタイプの微生物の量が前記情報コントローラ内に記憶されるようにする系。
【請求項２２２】
前記微生物が、シュードモナス属、ステノトロホモナス属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、ヘモフィルス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、マイコバクテリウム属、カンジダ属、アスペルギルス属、およびナイセリア属からなるセットより選ばれる細菌である、請求項２２１の系。
【請求項２２３】
前記検出が、光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性蛍りん光体イメージング、量子ドットイメージング、および化学発光イメージングからなるセットから選ばれる光学的検出を利用する、請求項２２１の方法。
【請求項２２４】
前記検出器がレーザ照明を利用する、請求項２２１の系。
【請求項２２５】
前記検出器が、前記検出表面へ接着された各細菌の位置を付加的に測定し、前記の位置がその位置における前記微生物の量とともに、前記情報記憶装置中に記憶される、請求項２２１の系。
【請求項２２６】
前記検出器が、前記検出表面上へ貼付けられた前記第１のタイプの微生物の実質的にすべての前記微生物を含んでなる前記検出表面の、一部についてのシグナルの平均によって前記第１のタイプの微生物の全量を検出する、請求項２２１の系。
【請求項２２７】
前記検出器がカメラを含んでなる、請求項２２１の系。
【請求項２２８】
各ピクセルに対応する視野が、２ミクロン未満である長軸を含んでなる、請求項２２１の系。
【請求項２２９】
前記検出器が、前記第１のタイプの微生物を前記第２のタイプの微生物から識別することが可能な、請求項２２１の系。
【請求項２３０】
前記検出器により検出可能な第１の指標へ結合された第１の結合物質を含んでなる第１のタグおよび、前記検出器により検出可能な第２の指標へ結合された第２の結合剤を含んでなる第２のタグを、付加的に含んでなり、前記第１の指標および前記第２の指標は前記検出器によって識別可能であり、前記第１の結合剤は前記第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は前記第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグおよび前記第２のタグが、前記検出表面へ結合された、前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物と反応され、前記検出器は前記微生物に結合された前記タグに基づき、前記微生物の量を実質的に同時に検出する、請求項２２９の系。
【請求項２３１】
第１のタグは、検出器により検出可能な指標へ結合された第１の結合剤を含んでなり、第２のタグは、前記指標へ結合された第２の結合剤を含んでなり、前記第１の結合剤は前記第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は前記第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグは、前記親和性化合物へ結合された前記第１のタイプの微生物と反応され、前記検出器は前記微生物へ結合された前記タグに基づき前記第１のタイプの微生物の量および位置を検出し、次に、前記第２のタグが、前記親和性化合物へ結合された前記第２のタイプの微生物と反応されて、前記検出器が、前記検出器によって先に検出されなかった位置にある微生物へ結合された前記タグに基づき、前記第２のタイプの微生物の量および位置を検出する、請求項２２９の系。
【請求項２３２】
結合剤と、前記検出器によって検出可能な指標とを含んでなるタグを付加的に含んでなり、前記結合剤が前記第１のタイプの微生物と結合し、前記第２のタイプの微生物とは結合しない、請求項２２９の系。
【請求項２３３】
前記第１のタイプの微生物および前記第２の微生物に対する前記検出表面が、ポリカチオンポリマーによって与えられる、請求項２２１の系。
【請求項２３４】
前記ポリマーがアミン成分を含んでなる、請求項２３３の系。
【請求項２３５】
前記検出器が、前記第１のタイプの微生物が生きているか死んでいるかを検出ことが可能である、請求項２２１の系。
【請求項２３６】
前記微生物が、前記検出器によって検出されるに先立ち、死体染色および生体染色からなるセットより選ばれる染色法によって染色される、請求項２３５の系。
【請求項２３７】
前記第１のタイプの微生物が、前記検出器によって最初の時間に検出され、また、前記微生物があらかじめ決められた増殖時間が与えられた後の第２の時間において検出され、この二つの時間において検出された前記第１のタイプの微生物における差異が、この増殖条件における前記第１のタイプの微生物の生存能力の証拠を提供する、請求項２２１の系。
【請求項２３８】
抗微生物剤が、前記増殖時間の間に前記増殖培地へ添加される、請求項２３７の系。
【請求項２３９】
前記検出器は、抗微生物剤に応答して、前記第１のタイプの微生物が生きているか、または死んでいるかを検出し、検出に先立ち、前記第１のタイプの微生物が、死体染色および生体染色からなる群から選ばれる染色法によって染色される、請求項２３８の系。
【請求項２４０】
前記抗微生物剤が、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、モノバクタム、ベータ−ラクタム抗体、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、フルオロキノロン、マクロライド、ケトライド、糖ペプチド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、およびリファンピシンからなるセットより選ばれる、請求項２３８の系。
【請求項２４１】
前記抗微生物剤の濃度が、動物組織中の前記抗微生物剤の薬物動態を反映するべく、時間の経過とともに変えられる、請求項２３８の系。
【請求項２４２】
前記微生物が、第１の期間において過剰の表面結合性反応物と反応されてよく、その後に、続いて表面結合反応物は除去され、第２の反応時間において前記微生物は、前記検出器によって検出可能となるべく指標によって修飾された、過剰の微生物表面結合性分子と反応され、前記検出器による前記指標の検出が前記微生物の増殖を示す、請求項２３７の系。
【請求項２４３】
前記増殖時間が、あらかじめ決められた割合の微生物が二倍になるのに充分である、請求項２３７の系。
【請求項２４４】
前記割合が１０％未満である、請求項２４３の系。
【請求項２４５】
前記フィルタが、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ガラス、アルミニウム、酸化アルミニウム、テフロン（登録商標）（Teflon（登録商標））、またはニトロセルロースからなるセットより選ばれる、請求項２２１の系。
【請求項２４６】
前記フィルタが、トラックエッチングされたフィルタを含んでなる、請求項２２１の系。
【請求項２４７】
前記フィルタが孔を含んでなり、前記フィルタ孔の中央値が直径２５０ミクロン未満である、請求項２２１の系。
【請求項２４８】
前記入口チャンバー内に、かつ前記フィルタの反対側に、第１の電極および第２の電極を付加的に含んでなり、前記第１のタイプの微生物および前記第２のタイプの微生物の濾過の間に、前記第１および第２の電極の間に電位がかけられて電気泳動力をもたらし、それが前記微生物に対し、それらの個々の電気泳動特性に基づき、フィルタを横切って前記微生物を分離する力を前記微生物に引き起こす、請求項２２１の系。
【請求項２４９】
前記溶液が還元剤および酸化剤を含んでなり、前記電解質中の前記還元剤および前記酸化剤の存在が、前記還元剤および前記酸化剤の不在下よりも低い電位差による電気泳動力を可能にする、請求項２４８の系。
【請求項２５０】
ある条件に対する検査微生物の応答を検出する方法であって：
適用させた力を用いて基板の表面上に微生物を捕捉することであって、前記表面は前記微生物に対して親和性を有しており；
カメラを用いて、第１の時間にスライド上の微生物の特性を測定すること；
前記微生物をある条件下におくこと；
カメラを用いて、第２の時間にスライド上の微生物の特性を測定すること；および
第１の時間と第２の時間との間の微生物の特性の差異の量により、前記条件に対する前記微生物の応答を測定すること；
を含んでなる方法。
【請求項２５１】
前記微生物が、細菌、マイコプラズマ、原性動物、真菌、および植物または動物細胞からなるセットより選ばれる、請求項２５０の方法。
【請求項２５２】
前記表面の親和性がカチオンポリマーによって与えられる、請求項２５０の方法。
【請求項２５３】
前記適用された力が、電気泳動を含んでなる、請求項２５０の方法。
【請求項２５４】
その中で電気泳動が起こる電解質が、酸化剤および還元剤を含んでなり、前記電気泳動が２ボルト未満で起こる、請求項２５３の方法。
【請求項２５５】
前記適用されたが、濾過を含んでなる、請求項２５０の方法。
【請求項２５６】
前記適用されたが、磁力を含んでなり、磁場に対する前記微生物の応答性を与える目的で、常磁性磁石タグが前記微生物へ結合される、請求項２５０の方法。
【請求項２５７】
前記適用された力が遠心分離を含んでなる、請求項２５０の方法。
【請求項２５８】
前記適用された力が誘電泳動を含んでなる、請求項２５０の方法。
【請求項２５９】
前記特性が、検出される染色剤の量を含んでなる、請求項２５０の方法。
【請求項２６０】
前記染色が、生体染色および死体染色からなるセットより選ばれる、請求項２５９の方法。
【請求項２６１】
前記特性が、生物のサイズを含んでなる、請求項２５０の方法。
【請求項２６２】
前記特性が、第２の時間における、前記検査微生物の位置に隣接した第２の微生物の存在を含んでなり、前記第２の微生物は第１の時間に存在していない請求項２５０の方法。
【請求項２６３】
前記条件が、抗生物質、バクテリオファージ、動物ウイルス、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、抗癌剤、抗真菌薬、抗マラリア薬、および抗原生動物薬からなるセットより選ばれる、請求項２５０の方法。
【請求項２６４】
前記第１の時間に置ける測定が、カメラを用いて前記表面上の前記微生物の位置を決めること、および貯蔵培地中の前記微生物の位置を記憶することを付加的に含んでおり、それにより前記微生物が、前記貯蔵培地からの位置の検索により前記第２の時間において局在化される、請求項２５０の方法。
【請求項２６５】
増殖培地中の抗生物剤に対する、試料中の微生物の感受性を測定するための系であって：
第１のチャンバーおよび第２のチャンバーであって、各チャンバーはインプットおよびアウトプットポート、および親和性表面を含んでなり；
各チャンバーの各インプットおよびアウトプットポートへ連結された流体ハンドラであって、前記流体ハンドラが前記試料の一部を前記第１および第２のチャンバーへ送達することが可能であり、かつ前記流体ハンドラは前記増殖培地中の前記抗生物剤を、前記第１のチャンバー内へ、かつ前記抗生物剤のない前記増殖培地を前記第２のチャンバーへ供給することが可能であり；
前記チャンバーの前記親和性表面上へ、各チャンバー内の前記流体ハンドラによって送達されていた前記微生物を濃縮する濃縮器であって、そのように濃縮された前記微生物は前記各々のチャンバー内の表面へ付着され；かつ
前記増殖培地中の前記抗生物剤に対する応答において、前記親和性表面へ付着された前記微生物の状態を検出する検出器；を含んでなり、
前記流体ハンドラは、試料の一部を第１および第２のチャンバーへ送達し、前記濃縮器は前記微生物を濃縮し、これにおいてそれらは前記親和性表面へ付着され、前記流体ハンドラは前記増殖培地中の前記抗生物剤を前記第１のチャンバーへ、前記抗生物剤のない前記増殖培地を前記第２のチャンバーへ供給し、前記検出器は前記チャンバーの各々における微生物の状態を検出し、これにおいて前記抗生物剤に対する前記微生物の感受性が、前記第１のチャンバーおよび前記第２のチャンバーにおける前記微生物によって示された状態におけるあらかじめ決められた較差によって証拠づけられる系。
【請求項２６６】
前記検出器が光学的検出器を含んでなる、請求項２６５の系。
【請求項２６７】
前記検出器がカメラを含んでなる、請求項２６６の系。
【請求項２６８】
前記第１のタイプの微生物が、前記検出器による検出に先立ち、染色剤によって処理される、請求項２６６の系。
【請求項２６９】
前記濃縮器が、第１の電極および第２の電極を含んでなり、前記親和性表面が前記第１の電極へ貼付けられている、請求項２６５の系。
【請求項２７０】
前記第１および第２の電極の間にかけられた電位が、微生物に電気泳動による第１の電極への動きを引き起こす、請求項２６９の系。
【請求項２７１】
前記試料が還元剤および酸化剤を含んでなる、請求項２７０の系。
【請求項２７２】
前記第１および第２の電極の間にかけられた電位が、微生物に電気泳動による第１の電極への動きを引き起こす、請求項２６９の系。
【請求項２７３】
前記濃縮器がフィルタを含んでなる、請求項２６５の系。
【請求項２７４】
前記濃縮器が遠心分離機を含んでなる、請求項２６５の系。
【請求項２７５】
前記抗生物剤が抗生物質を含んでなる、請求項２６５の系。
【請求項２７６】
前記チャンバーが、１０マイクロリットル未満の容積を含んでなる、請求項２６５の系。
【請求項２７７】
前記状態が、前記微生物の生存率である、請求項２６５の系。
【請求項２７８】
前記状態が、娘微生物の存在である、請求項２６５の系。
【請求項２７９】
前記検出器が個々の微生物の状態を検出する、請求項２６５の系。
【請求項２８０】
前記あらかじめ決められた較差が、前記状態を示している前記第２のチャンバーにおける個々の微生物の割合に対する、前記状態を示している前記第１のチャンバーにおける個々の微生物の割合の間の比である、請求項２６５の系。
【請求項２８１】
前記試料中に第２のタイプの微生物を付加的に含んでなり、各チャンバー内の前記流体ハンドラによって前記チャンバーの親和性表面上に送達された前記第２のタイプの微生物を前記濃縮器が付加的に濃縮し、そのように濃縮された前記第２のタイプの微生物が、前記表面上に付着され、前記検出器は前記増殖培地中の第１の抗生物薬に対する前記第２のタイプの微生物の応答を検出することが可能であり、かつ前記検出器は前記第２のタイプの微生物から前記第１のタイプの微生物を識別することが可能である、請求項２６５の系。
【請求項２８２】
増殖培地中の致死性化学薬品の濃度に対する、試料中の微生物の感受性を評価する方法であって：
微生物の前記試料を、第１の部分および第２の部分に分配することと；
致死性の化学薬品を欠く前記増殖培地中で、第１の部分をインキュベートすること；
前記致死性の化学薬品を、その濃度において用いた増殖培地中で、前記第２の部分を培養すること；
第１の時間および第２の時間において、生存状態を示す第１の部分における、微生物の数を検出すること；
第１の時間および第２の時間において、生存状態を示す第２の部分における、微生物の数を検出すること；
もし前記第２の部分における、生存状態を示している微生物の数の変化が、あらかじめ決められた様式で生存状態を示している前記第１の部分における微生物の数の変化を超えていれば、前記微生物を前記濃度の致死性化学薬品に対して感受性であると評価すること；
の段階を含んでなる方法。
【請求項２８３】
前記生存状態が死である、請求項２８２の方法。
【請求項２８４】
死が、前記微生物の死体染色によって証拠づけられる、請求項２８３の方法。
【請求項２８５】
死が、生体染色の欠如によって証拠づけられる、請求項２８３の方法。
【請求項２８６】
死が、娘微生物の生体染色の欠如によって証拠づけられる、請求項２８３の方法。
【請求項２８７】
死が、細胞サイズの増加の欠如によって証拠づけられる、請求項２８３の方法。
【請求項２８８】
前記あらかじめ決められた様式が、あらかじめ決められた量によって統計的に有意である、前記第１の部分における微生物の数における変化と、あらかじめ決められた確率によって統計的に有意ではない、前記第２の部分における微生物の数における変化とを、測定することを含んでなる、請求項２８２の方法。
【請求項２８９】
前記あらかじめ決められた確率が、０．０５未満のカイ二乗確率である、請求項２８８の方法。
【請求項２９０】
前記あらかじめ決められた確率が、０．０１未満のカイ二乗確率である、請求項２８８の方法。
【請求項２９１】
前記検出が、微生物の数を計数することを含んでなる、請求項２８２の方法。
【請求項２９２】
前記第１の時間と前記第２の時間との間の差が、前記微生物の倍加時間より少ない、請求項２８２の方法。
【請求項２９３】
前記第１の時間および前記第２の時間において検出された微生物の数における変化が、前記第１の時間において検出された微生物の数のあらかじめ決められた割合よりも少ない、請求項２８２の方法。
【請求項２９４】
前記あらかじめ決められた割合が１０％である、請求項２９３の方法。
【請求項２９５】
前記第１の時間および前記第２の時間において検出された微生物の数における変化が、あらかじめ決められた数よりも少ない、請求項２８２の方法。
【請求項２９６】
前記あらかじめ決められた数が１０である、請求項２９５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ターゲットを、表面上に固定されたプローブと反応させることによる生物学的ターゲットの検出法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常のバイオ検出法は、固定されたプローブを利用して溶液中のターゲットを検出する。かかる系はしばしば、ＤＮＡおよびＲＮＡターゲットを検出するためのＤＮＡプローブ、タンパク質様、炭水化物、および有機低分子ターゲットを検出するための抗体プローブ、および核酸、炭水化物、および有機低分子ターゲットを検出するためのアプタマープローブを含む。これらの系は、マクロウェルフォーマット（たとえばマイクロタイタープレート）で行なわれることが可能な、通常のＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ならびに固定されたプローブが構築されるか、または直径１００ミクロン未満のスポット内に「プリント」されることが可能な、マイクロアレイフォーマットを含むことが可能である。かかる方法は、今日、臨床および研究への適用において広く行なわれている（たとえば、ピアラング（Pirrung）らへの米国特許第５，４０５，７８３号、サザンへの米国特許第６，０５４，２７０号、マルチンスキーへの米国特許第６，１０１，９４６号、およびウィーララトゥナ（Weeraratna）ら著、「Gene Expression Profiling: From Microarrays to Medicine（遺伝子発現プロファイリング：マイクロアレイから医薬へ）」、J. Clin. Immunol.、２００４年、第２４巻、ｐ．２１３、パーキンエルマー （（Perkin Elmer）、マサチューセッツ州、ウェルズリー）からの「パッカード・バイオチップ・アレイヤー（Packard Biochip Arrayer）」を参照のこと）。
【０００３】
これらの全ての方法においては、プローブとターゲットとの間に結合反応があり、この結合反応は一般に、多数の反応物（一般には二分子）の系の反応カイネティクスによって支配される。プローブは固定されているため、反応の速度は主として溶液中のターゲットの濃度によって決定される。
【０００４】
多くの系において、反応の速度は重要である。たとえば、ある核酸のハイブリダイゼーションでは、反応が完了するのに４８時間より長く必要であり、そのことは分析のコストを増加させるか、または行なわれ得る分析の数を減少させる。さらに、全てのハイブリダイゼーションが完了まで反応するわけではない場合には、それが異なる完成レベルでのハイブリダイゼーションをなす結果であるかのように混乱させ、分析の定量化は不正確となる可能性がある。
【０００５】
一つの重要な適用においては、ヒトの感染についての医学的成果（たとえば、人工呼吸器関連肺炎、感染性髄膜炎、細菌など）は、細菌の量および正体（素性）、ならびに種々の抗体に対する細菌の感受性について、分析を行なうために必要な時間の長さによって有意に影響されることがある。通常、分析のための時間は２４〜４８時間以上である可能性があり、その間に、細菌の繁殖につれた患者の症状が悪化することがある（たとえば、エリクソン（Ericsson）らへの米国特許第４，７７８，７５８号、ウォーター（Water）らへの米国特許第３，９３５，０７３号、ジョンストン（Johnston）らへの米国特許第６，０４３，０４８号、およびゲイラル（Gayral）への米国特許第４，２５９，４４２号参照）。現代の微生物分析は、痰、血液などのような臨床標本からの細菌の、培地中での高い濃度、典型的にはミリリットルあたり１億個のオーダーまでの菌の増殖によって始まる。臨床標本は、少数の個体微生物を含有することがあり（たとえば、菌血症の検査血液中に）、高濃度の標本であっても診断閾値は、定量的な培養の検出限界よりも典型的には数千倍低い。
【０００６】
適当な作業濃度までの最初のバルクの増殖を達成した後、作業者は次に、一以上の生化学検査または、選択的な生化学試薬を取入れた選択培地上での増殖を行なう。したがって、標準化された今日の手法は、少なくとも二つの連続的な増殖サイクルを必要とし、各々は典型的には完了までに多くの時間を必要とする。
【０００７】
さらに、薬剤感受性試験は、選択培地中での増殖の障害の測定を必要とする。増殖の欠損の証明は、細胞死の直接的な指標に必要とされる時間を超えた、付加的な培養時間を必要とする。医学界では、増殖の欠如を証明しようとするかかる方法が、ある状況においては実際の処理結果と適切に相関しない結果をもたらすことが充分に認識されている。
【０００８】
これらのおよび他の深刻な欠陥の結果として、現行の実施では、所望の時間枠内で、感染を治療するための有効な薬物を選択するために医師が必要とする特定の診断情報を主治医に提供することに失敗している。たとえば、人工呼吸器関連肺炎では、臨床検査は、無効な治療の２４時間後の増加した罹患率および死亡率についてのオッズ比は、有効な治療への変更にもかかわらず、７：１のままであることを証明している。すなわち、医師が有効な治療、すなわち、感染菌を素早く殺すのに適したタイプおよび濃度の抗菌剤を、症状発症から実質的に２４時間より前に開始しない限り、無効から有効への治療法の変更が、そのように治療された患者の約８７％について結果を有意に改善することはないであろう。
【０００９】
医師は、遅れのリスクを充分認識しており、それゆえ、典型的には特定の病院または共同体の微生物の薬剤耐性の歴史を基に、経験的に選択された広スペクトルな薬物の組合せを用いて、治療を処方する。臨床研究は、かかる経験的な薬物治療が約２５〜５０％の症例では無効であることを証明している。さらに、患者を不適当な療法に暴露することは、個々の患者のコストおよび医学的リスクを増すばかりでなく、耐性菌の発生を促進する可能性を増大させる。後者の問題は、個々の患者のみならず、後に耐性菌に感染するかもしれない病院および共同体の他の全ての個人にも、医学的リスクを増大させる。
【００１０】
臨床研究論文においては、患者を無効な抗生物質にあらかじめ暴露することが、その患者における後の耐性菌の発生における有意なリスク因子を構成することが充分に認識されている。これらのおよび他の理由から、今日の診療を特徴づけている遅れおよび不正確という欠陥のない診断法を考案することが、医学界において望まれている。
【００１１】
理論的には、微生物の増殖培養に対する変法は、様々な種類のイムノアッセイのような直接的な微生物分析法を含む。種々の病原菌に対する抗体は市販されているか、または容易に開発されるであろう。実際、微生物感染の診断のある面においては、多くの異なるタイプのイムノアッセイが日常的に使用されている。
【００１２】
しかしながら、多くの重い感染症については、日常的な細菌の同定、定量、および薬剤感受性の検査法はまだ存在していない。
【００１３】
同様に、細菌、ウイルス、糸状菌といった様々な病原菌の迅速な検出法もまた、食品および水中の汚染の検査のため、また潜在的な生物兵器の存在の検出においても望ましい。食品産業においては、微生物汚染の検出用に多くの製品が市販されている。ある環境では、これらのいくつかは、特定の微生物の限られたセットについて、約２４時間で結果を提供する。しかしながら、全ての市販製品はなお、検査の適用に先立ち、細菌培養という手段による試料の増菌を必要としている。
【００１４】
生物兵器用の防衛に関する研究文献においては、１時間以内に結果を提供するいくつかのものを含め、多くの迅速な検出装置も記載されている。さらに、かかる装置のいくつかは、使用される前の増殖培養を必要としていない。
【００１５】
しかしながら、食品検査および生物防衛のための、文献に記載された限りの装置の感度は、医学診断用の要求にははるかに及ばない。さらに、これらの非診断用の適用は、薬剤感受性試験を必要とせず、それゆえ前述の装置はそれを提供することも、それらをかかる目的のために適用しやすくすることもないように見受けられる。
【００１６】
このような装置およびＥＬＩＳＡのような実験室法の重要な制限は、ターゲットアナライト濃度への依存性である。それらは、免疫捕捉または他の検出表面への、ターゲットの受動的な拡散に依存している。密接なプローブ対ターゲットの近接する事象の発生速度、および、それゆえ検出反応速度は、試料溶液または懸濁液中のアナライト濃度に依存する。
【００１７】
これらの装置を用いて感度を高めるためには、アナライトの濃度を実質的に高めることが必要である。研究者達は、ターゲットアナライトの濃度を増すため、およびまた種々の生体分子ならびに微生物ターゲットの分析のための反応時間を速めるための、いくつかの戦略を記述している。たとえば、プローブに対するターゲットの電気泳動は、カリフォルニア州サンディエゴのナノジェン・インク（Nanogen, Inc.）によって先に記述されている（たとえば、ヘラー（Heller）への米国特許第５，８４９，４８６号、ヘラーへの米国特許第6，０１７，６９６号、ソスノフスキー（Sosnowski）らへの米国特許第６，０５１，３８０号、アクリ（Ackley）らへの米国特許第６，０９９，８０３号、ヘラーらへの米国特許第６，２４５，５０８号、およびバイデンハマー（Weidenhammer）らへの米国特許第６，３７９，８９３号）。これらの系および方法は、個々のプローブが個々の電極において付着され、次にそれらが連続的かつ非常に素早くプローブと反応される、電極のアドレサブルなアレイを記述している。ターゲットとプローブとの間の、報告された反応速度の増大は、数百倍または数千倍である。これらの系は、しかしながら、アドレサブルな電極上でプローブを連続的に固定する必要性や、連続的な反応を行なう必要性、および、電気泳動に必要な高電圧のため、使用可能な検出法の制約、ナノジェン・システムによって使用される電圧では動作不能な、透明な電極の使用（たとえば、インジウム酸化第一錫の使用による）の使用を排除することを含め、多くの制約を受けている。さらに、ナノジェン・システムが作動する高い電圧は、プローブまたはターゲットに対し潜在的に有害な酸化物を発生させ、それゆえ、プローブおよびターゲットを保護するための複雑な不動態化処理表面の使用を必要とする。複雑な不動態化処理表面を必要とせず、アドレサブル電極に必要な電子的および他のコントロールを必要としない、高速マイクロアレイプリンティングを利用することが可能な系は、かかる系の費用および複雑さを大いに軽減するであろう。
【００１８】
細菌または他の微生物の検出のための固定されたプローブの使用については、それは抗生物質のような様々な治療薬の抗菌活性を測定するためにも役立つ。試料中の細菌の正体を決定するために、核酸または抗体プローブを使用する多くの系がある（たとえば、クラベリーズ（Claverys）らへの米国特許第５，６５６，４３２号、チャン（Cheng）らへの米国特許第６，４０３，３６７号）。これらの系では、抗菌性の耐性または挙動と確実に相関する核酸または抗体マーカーを発見する困難があるとすれば、抗菌剤に対する感受性を測定することは難しい。
【００１９】
本発明が向けられているのは、これらのおよび他の問題の解決である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
目的は、既存のバイオ検出系および方法の欠陥を考慮して、生物学的分子の検出を迅速に行なうことである。
【００２１】
本発明の目的はさらに、バイオ検出の感度を低下させる非特異的結合を最小化することである。
【００２２】
表面に対するターゲットの特異的な結合を非特異的な結合から区別することができることも、本発明の目的である。
【００２３】
微生物を同定しかつ抗微生物剤に対するその感受性を測定することを可能にすることは、本発明のもう一つの目的である。
【００２４】
プローブを、その検出を可能にするため、表面上に迅速に捕捉することも、本発明のさらなる目的である。
【００２５】
本発明のさらなる目的、利点、および新規な特徴は、以下の記述において一部示されており、当業者には、以下の明細書を調べれば一部は明らかとなるであろうし、あるいは本発明の実施によって習得されることも可能である。本発明の目的および利点は、添付されたクレームにおいて特に指摘された道具、組合せ、および方法によって実現および達成されてよい。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
要約すれば、本発明は、有益な効果のため、単独でまたは組合せて使用されることが可能な、プロセスおよび成分を含む。結果として生じる方法および装置は、核酸、タンパク質、デンプン、脂質、および菌ならびに細胞を含めた、試料中の様々な個別のアナライトのバイオ検出において使用されることが可能である。最も一般的な形状においては、これらの実体は基板上に捕捉され、そこでそれらは検出される。
【００２７】
本発明の一つの観点は、固定された基板上での一回より多い微生物の検出を含む。異なる時間における微生物の状態の変化が、微生物の暴露されている薬剤に対するそれらの応答を示すことができる。細菌の状態は、生体染色および死体染色のような、種々の染色による様相、あるいは、微生物の倍増を示す、そのサイズ、追加の染色剤を受入れる能力、または付近の「娘」微生物の発生を通しての増殖の様相を含むことが可能である。さらに一般的には、状態は、血清学的染色によって示されるかもしれない微生物の正体を含むことが可能である。薬剤は、様々な異なる抗生物質を含むことが可能であり、それらは、最小発育防止濃度または最小殺菌濃度のような細菌の特性を決定するため、多数の異なる濃度において微生物へ与えられることが可能である。微生物は、一定の濃度の薬剤で刺激されるばかりでなく、薬剤の薬物動態を模すことが可能ないろいろな濃度に対して暴露されることも可能である。
【００２８】
現在の微生物モニタリング手段のほとんどが多数の微生物を必要とすること、また充分な数まで微生物を増殖するために長い期間がかかる可能性があるとすれば、個別の微生物の増殖および行動を注視することが大きな有益効果をもつことに注目されるべきである。個別の微生物をモニターすることにより、個々の微生物の全てについて効果を示すことがまだ必要とされるのではなく、統計的な背景の上にその効果が証明されるのに充分な割合ついてのみ必要となる。このことは、非常に迅速な検査を可能にすることができる。
【００２９】
本発明のもう一つの観点は、微生物または他のアナライトの、基板への移動であって、それらはそこで捕捉されることが可能である。この移動は、電気泳動、誘電泳動、遠心分離、磁場捕捉、濾過、重力、または拡散を含めた、多数の異なる力を含むことが可能である。多くの例において、重力および拡散という天然に生じる力は、検査のための実際的な時間の中で移動が起こるためには充分に強くなく、それゆえ他の人為的な力の適用が必要である。力はアナライトに直接的に作用することが可能であり、あるいはアナライトは、人為的な力の適用に応答するタグへ結合されることが可能である。タグは静電的タグを含んでなることが可能であり、それは高分子電解質を含むことが可能であり、それゆえ電気泳動または誘電泳動の領域内を移動する。タグはまた、磁場に応答する常磁性粒子を含んでなることも可能である。
【００３０】
本発明のさらなる観点は、表面に平行な成分によるアナライトの移動を使用することであって、アナライトは、表面へ向かうアナライトの移動と、同時またはそれに点在されて捕捉される。このことは、アナライトが表面に沿って分布するようになることを可能にし、さらに、アナライトのより多くの部分が、多数の潜在的な結合領域がある場所へ結合できるようにすることが可能である。もしこれらの領域が、試料中のアナライトの異なる種に対して異なる特異性を持つとすれば、このことは、アナライトが、適合する特異性を持つ領域と接触するまで、領域から領域へ移動されることを可能にする。表面に平行な移動は、電気泳動、濾過、またはバルクフロー（たとえば、ポンプ、電気浸透、または他の手段によって起こされることが可能である）を含むことが可能である。
【００３１】
本発明のもう一つの観点は、アナライトに検出能を与える指標を用いて、アナライトをタグづけすることである。指標は、光散乱粒子、酵素含有粒子、蛍光体、アップコンバート性蛍りん光体、量子ドット、または電気化学的薬剤を含んでなることが可能である。検出能ならびに人的な力（上述のような）による移動の双方を与えるタグをもつこともまた、非常に有用であることが可能である。
【００３２】
本発明のなおさらなる観点は、表面に対し非特異的に結合するアナライトを除去することである。この洗浄は、アナライトを表面へ向けて移動させるものと同じ力を利用することが可能であるが、今度は別の方向に適用されている。かかる力は、電気泳動、誘電泳動、および磁力を含むことが可能である。力はまた、ｐＨ、イオン強度、およびバルクフロー（層状または別の状態で）といった、物理および化学的状態も含む。
【００３３】
表面上のアナライトの頻繁なモニタリングがあることもまた、本発明の観点である。たとえば、非特異的に結合した物質の除去についての多くの異なる緊縮があることが好ましく、特異的に結合した物質が、より弱い力で結合された非特異的に結合されている物質、ならびに、さらに強力に結合されている物質、の双方から区別されることが可能である。頻繁なモニタリングは、それゆえ、異なる物質が表面から除去される緊縮性を注視することにより、特異的に結合した物質を同定することが可能である。
【００３４】
本発明の一つの観点は、光学的な方法を用いてリアルタイムでモニターすることであり、表面上のアナライトの存在を同定することだけでなく、表面上の個々のアナライトの位置を記憶して、その存在がある期間にわたりモニターされるようにすることができる。光学的検出法は、カメラのようなイメージング検出器を含むことが可能であるが、光電子増倍管であることが可能な、光検出器を用いたスキャニングレーザーも含むことが可能である。検出器は、暗視野、明視野、位相、蛍光、または他の放射光線検出器を含んでなることが可能である。別法として、検出器は、表面が金を含んでいる表面プラズモン共鳴検出器を含んでなることが可能である。
【００３５】
本発明の付加的な観点は、光学的検出法の使用を容易にするインジウム酸化第一錫および他の透明な導電コーティングの使用に関する。これらの場合、使用される電圧は２ボルトのオーダーを超えないことが必要であり、この電位は、多くの通常の緩衝液による電気泳動および誘電泳動に対応しない。電気泳動および誘電泳動に対応するためには、酸化還元試薬を使用することが便利である可能性がある。これらの酸化還元試薬は対になっていることが可能であり、還元剤の酸化は酸化剤を誘発し、酸化剤の還元が還元剤を誘発する。他の取り合わせもまた可能であり、たとえば、還元剤の酸化産物が酸化剤の還元産物を酸化する。これらの試薬については、イオン種が電気泳動および誘電泳動を妨害しないよう、中性に荷電されることもまた便利である。
【００３６】
電気泳動および誘電泳動がその中で起こる溶液について、電解質が電気泳動の有効性を低減しないよう、低いイオン強度をもつこともまた本発明の付加的な観点である。これらの場合、溶液については、両性イオン性の種を含んでなることが、緩衝化、安定化の双方のため、および微生物の増殖を指揮する環境を提供するために便利である。
【００３７】
本発明のもう一つの観点は、エバネセント波照射を含む照射についてであって、その理由は、これが表面に並置されたアナライトのみを検出し、それゆえ、結合しないアナライトまたは指標が表面上の溶液中に残ってもよいことからである。エバネセント波照射は、回折格子、エンドカップリング、およびプリズムを使用して、表面の下の基板内へ連結されることが可能である。エバネセント波照射は基板内で何度もはね返ることが可能であるが、エバネセント波照射が表面に対して単回のはね返りをもつこともまた便利であり、そのことは、脱着可能または永久付着のいずれかの、または基板とともに形成された、プリズムによって便利に行なわれる。もし脱着可能であれば、プリズムと基板との間の境界面は、透明な弾性物質であることが可能である。
【００３８】
本発明のさらなる観点は、試料呈示の用途であって、大量の試料からのアナライトの濃縮、ならびに不純物の除去を含むことが可能である。この試料調製は、遠心分離、イオン交換ビーズまたはカラム、濾過、スタッキング電気泳動、または生化学的分離法の形状を含むことが可能である。
【００３９】
上記のように、本発明の数多くの態様が、本発明のこれらの、および他の観点から組立てられることが可能である。たとえば、本発明の観点の組合せから結果として生じた一つの好ましい態様は、溶液中の第１のタイプの微生物の定量化のための系に関係する。この系は、チャンバーの相対する壁の上に第１の電極および第２の電極を含んでなるチャンバーと、インプットポート、アウトプットポート、および、インプットポートを通してチャンバー内へ、またアウトプットポートを通してチャンバーの外へ溶液を輸送するための、流体輸送手段とを含んでなる。この系はさらに、第１のタイプの微生物がそれに付着する、第１の電極へ貼付けられた第１の親和性成分と、第１の電極と第２の電極との間の電位を調節する電気コントローラと、第１の親和性成分へ付着された第１のタイプの微生物の量を検出することが可能な自動検出器、および該検出器によって測定された第１のタイプの微生物の量を記憶する情報コントローラを含んでなる。この系において、溶液はインプットポートを通してチャンバー内へ投入され、第１および第２の電極の間のコントローラにより、電極の間に電気泳動をさせるべく充分な電位がかけられ、第１の電極へ向かう第１の微生物の移動を引き起こし、微生物が第１の親和性成分に最も近づいたとき、それらが第１の親和性成分へ結合し、その量が検出器によって測定され、情報コントローラに記憶されるようにする。
【００４０】
微生物は、シュードモナス（Pseudomonas）属、ステノトロホモナス（Stenotrophomonas）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、エシェリキア（Escherichia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、プロテウス（Proteus）属、セラチア（Serratia）属、ヘモフィルス（Haemophilus）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属、ナイセリア（Neisseria）属といった属の集合、および医療において遭遇する他のヒト病原体から選ばれる細菌を含んでよい。同様に、微生物は、カンジダ（Candida）属、アスペルギルス（Aspergillus）属のような属の集合、および医療において遭遇する他のヒト病原体から選ばれる真菌を含んでよい。さらに他の微生物は、医療において遭遇されるヒトの病原性ウイルスを含んでもよい。
【００４１】
酸化剤は、ベンゾキノン、ジチオール、ケトン、フェロシニウム、フェリシアニド、ジヒドロアスコルベート、酸化されたグルタチオン、酸化されたメチルビオローゲン、またはハロゲンを含んでなってもよい。還元剤は、ジチオスレイトール、ジチオエリトリトール、ジチオアルカン、ジチオアルケン、チオアルカン、チオアルケン、チオール、ヒドロキノン、アルコール、フェロセン、フェロシアニド、アスコルベート、グルタチオン、メチルビオローゲン、またはハロゲン化物を含んでなってもよい。また、酸化試薬の還元産物も、還元剤を含んでなってもよい。
【００４２】
溶液の伝導率は、１００マイクロシーメンス／ｃｍ未満であってよく、あるいは溶液の伝導率は１０マイクロシーメンス／ｃｍ未満であってよい。溶液は両性イオン緩衝液を含んでなってもよい。
【００４３】
濃縮器が、試料から微生物を濃縮してもよい。濃縮器は遠心分離機を含んでなってもよい。濃縮器はイオン交換粒子を含んでなってもよい。
【００４４】
試料は、溶液よりも高い伝導率を有してよい。
【００４５】
自動検出器は光学検出器を含んでなってもよい。光学検出器は光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、表面プラズモン共鳴、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性蛍りん光体イメージング、量子ドットイメージング、および化学発光イメージングを含めた光学的検出法を利用してよい。
【００４６】
第１電極および第２電極を含んでなるセットから選ばれる電極は、光学的に透明であってよい。
【００４７】
ターゲットはレーザによって照らされてもよい。
【００４８】
検出器はさらに、親和性成分に付着した各微生物の位置を測定してよく、微生物の位置は、その位置の微生物の量とともに情報コントローラ内に記憶されてもよい。
【００４９】
検出器は、第１の電極へ貼付けられた第１のタイプの微生物の実質的に全てを含んでいる表面の、一部分のシグナルの平均によって、第１のタイプの微生物の全量を検出してもよい。
【００５０】
第１の電極は、金を含んでなってもよく、検出器は表面プラズモン共鳴を利用してもよい。
【００５１】
検出器はカメラを含んでなってもよい。
【００５２】
各ピクセルに対応する視野は、２ミクロン未満か、または０．５ミクロン未満でもよい長軸を含んでよい。
【００５３】
溶液は、電気泳動の間、バルク移動の中にあってよい。
【００５４】
二つの電気泳動は、溶液がバルク移動の中にある期間に介在されてもよい。
【００５５】
溶液はさらに第２のタイプの微生物を含んでもよく、検出器は第１のタイプの微生物を第２のタイプの微生物から識別することが可能である。
【００５６】
第１のタグは、検出器により検出可能な第１の指標へ結合された、第１の結合剤を含んでなってもよく、第２のタグは、検出器により検出可能な第２の指標へ結合された、第２の結合剤を含んでなってもよく、第１の指標および第２の指標は検出器によって識別可能であり、第１の結合剤は第１のタイプの微生物に結合し、第２の結合剤は第２のタイプの微生物に結合し、第１のタグおよび第２のタグは、親和性成分へ結合された、第１のタイプの微生物および第２のタイプの微生物と反応され、検出器は微生物に結合されたタグに基づき、微生物の量を実質的に同時に検出する。
【００５７】
第１のタグは、検出器により検出可能な指標へ結合された、第１の結合剤を含んでなってもよく、第２のタグは、指標へ結合された第２の結合剤を含んでなってもよく、第１の結合剤は第１のタイプの微生物に結合し、第２の結合剤は第２のタイプの微生物に結合し、第１のタグは、親和性化合物へ結合された第１のタイプの微生物と反応され、検出器は微生物へ結合されたタグに基づき第１のタイプの微生物の量および位置を検出し、次に、第２のタグが、親和性化合物へ結合された第２のタイプの微生物と反応され、検出器は、検出器によって先に検出されなかった位置にある微生物へ結合されたタグに基づき、第２のタイプの微生物の量および位置を検出する。
【００５８】
タグは、指標へ結合された結合剤を含んでなってもよく、結合剤は第１のタイプの微生物へ特異的に結合する抗体を含んでなってもよい。
【００５９】
検出器は、微生物の異なる電気泳動特性に基づき、第１のタイプの微生物を第２のタイプの微生物から識別してよい。
【００６０】
第１の親和性成分は、高分子電解質を含んでもよい。高分子電解質は、ポリカチオンポリマーを含んでなってもよい。ポリカチオンポリマーは、アミン成分を含んでもよい。ポリマーは、ポリエチルイミンまたはポリリジンを含んでよい。
【００６１】
溶液はさらに、第２のタイプの微生物を含んでよく、第２のタイプの微生物は第１の親和性成分へ結合しない。親和性成分は、抗体またはアプタマーであってよい。
【００６２】
第２の親和性成分は、第１の電極へ結合されてもよく、これに第２のタイプの微生物が結合し、検出器は第２の親和性成分へ付着した第２の微生物の量を検出することが可能であって、この系は、微生物が第１の親和性成分へ、または第２の親和性成分へ付着するかどうかによって、第１のタイプの微生物を第２のタイプの微生物から識別することが可能である。
【００６３】
親和性成分はさらに、微生物に対して本質的に低い親和性をもつポリマーを含んでなってもよく、該ポリマーはポリエチレングリコールまたはポリアクリルアミドを含んでなってもよい。
【００６４】
系は、第１の電極と共面である、第３の電極を付加的に含んでなってもよく、それに対して第２の親和性成分が結合してもよく、かつそれに対し第２のタイプの微生物が付着してよく、第１の電極および第３の電極上の電位は、電気コントローラによって独立して制御されてよい。
【００６５】
検出器は、第１のタイプの微生物が生きているか死んでいるかを検出してもよい。微生物は、検出器によって検出されるに先立ち、死体染色によって染色されてよく、あるいは微生物は、検出器によって検出されるに先立ち、生体染色によって染色されてもよい。第１のタイプの微生物の第１の親和性成分への付着に続き、微生物は増殖誘導性の条件下に置かれてよい。このような条件は、３４〜４０℃の温度を含んでもよい。
【００６６】
溶液は、アウトプットポートを経てチャンバーから除去されてよく、インプットポートを通した増殖培地によって置換えられてよい。また、増殖培地は１ミリシーメンス／ｃｍ未満の伝導率を有してよく、電気コントローラは、第１の電極と第２の電極との間に、１００ｍＶより大きい電位を維持してもよい。
【００６７】
第１のタイプの微生物は、検出器によって最初の時間に検出されてよく、また、微生物の少なくとも１０％が二倍になるのに充分な増殖時間が与えられた後の、第２の時間においても検出されてよく、この二つにおいて検出された第１のタイプの微生物における差異が、この増殖条件における第１のタイプの微生物の生存能力の証拠を提供してもよい。また、抗微生物剤が、増殖時間の間に増殖培地へ添加されてもよい。検出器は、抗微生物剤に反応して、第１のタイプの微生物が生きているか、または死んでいるかを検出してよく、検出器による検出に先立ち、微生物は、死体染色および生体染色からなる集合から選ばれる染色法によって染色される。抗微生物剤は、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、マクロライド、ケトライド、糖ペプチド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、リファンピシンといった抗生物質ファミリー、および、臨床または研究において抗生物質として使用される新規な薬剤を含めた他のファミリーから選ばれる、個々の薬剤または薬剤の組合せを含んでなってもよい。また、抗微生物剤の濃度も、動物組織中の抗微生物剤の薬物動態を反映するべく、時間の経過とともに変えられてよい。
【００６８】
微生物は、第１の期間において過剰の表面結合性反応物と反応されてよく、その後に、続いて反応物は除去され、第２の反応時間において微生物は、検出器によって検出可能となるべく指標によって修飾された、過剰の微生物表面結合性分子と反応されてよく、検出器による指標の検出が微生物の増殖を示す。
【００６９】
溶液はさらに、第１のタイプの微生物と一緒に第１の親和性成分へ結合する不純物を含んでなってもよく、微生物を放出することなく不純物を放出する条件が、第１の親和性成分へ適用され、この条件の適用によって不純物は除去される。この条件は温度、磁場の強さ、電気泳動力、誘電泳動力、剪断流体流動、イオン強度、ｐＨ、非イオン界面活性剤濃度、イオン界面活性剤、または競合物濃度を含んでもよい。溶液はさらに、第１のタイプの微生物と一緒に第１の親和性成分へ結合する不純物を含んでよく、不純物を放出することなく微生物を放出する条件が、第１の親和性成分へ適用されるが、微生物はその後に、第１の電極へ貼付けられた第２の親和性成分へ結合されてもよい。この条件は温度、磁場の強さ、電気泳動力、誘電泳動力、剪断流体流動、イオン強度、ｐＨ、非イオン界面活性剤濃度、イオン界面活性剤、または競合物濃度を含んでもよい。
【００７０】
第１のタイプの微生物は、第１の親和性成分へ結合される前に、溶液中で濃縮されてもよく、微生物は比較的低いイオン強度の第１の塩類緩衝液中に存在しており、第１の塩類緩衝液は比較的高いイオン強度の第２の塩類緩衝液に隣接しており、第１の塩類緩衝液および第２の塩類緩衝液は境界面において隣接しており、第１の濃縮電極は該境界面の近位に局在し、第２の濃縮電極は境界面の遠位に局在しており、第１の濃縮電極と第２の濃度電極との間に電位をかけると、微生物に、電気泳動による第１の塩類緩衝液を通した移動を引き起こし、その移動は境界面に出会うと１０倍よりも多く低減される。第２の濃縮電極は第１の電極を含んでなってもよい。また、境界面は実質的にインプットポートに局在してもよい。第１の塩類緩衝液と第２の塩類緩衝液との伝導率の比は、１：５０よりも小さくてよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７１】
バイオ検出の背景
図１は、ターゲット１１４に対して親和性を有するプローブ１１６を利用したバイオ検出系１００の略線図である。プローブ１１６は、プローブリンカー１１８により、固体基板１２０へ貼付けられている。プローブリンカー１１８は、一般に、基板１２０へのターゲット分子の偶発性の結合を低減するためにさらに役立つコーティングを含む。ターゲット１１４は、ターゲットリンカー１１２を介してタグ１１９へ連結され、これが検出器（示されず）により検出されることが可能である。
【００７２】
ターゲット１１４は、核酸、タンパク質、デンプン、脂質、ホルモンなどを含め、種々の生体分子を含むことが可能である。さらにターゲット１１４は、下文においてさらに詳細に議論されるように、細菌、真菌、マイコプラズマ、細胞分画（ミトコンドリア、核）、動物または植物細胞、および他の生物を含めた、全生物体またはオルガネラを含むことが可能である。各々の場合にプローブ１１６は、ターゲット１１４と適合することができ、それ自身は核酸（ハイブリダイゼーション用およびアプタマーとしての双方）、タンパク質、炭水化物を含むことが可能であり、また上記のような全生物体およびオルガネラを含むことも可能である。実際、ほとんどの場合には、ターゲット−プローブのペアがあれば必ずこれらの成分は、互いにその親和性に基づき、ターゲットがプローブとして作用し、プローブはターゲットとして作用するように、互いにその親和性に基づき、切換えられることが可能である。
【００７３】
操作においては、ターゲット１１４は、タグ１１０へ連結されており、プローブ１１６と接している溶液中へ投入される。プローブ１１６のターゲット１１４に対する分子親和性のゆえに、ターゲット１１４はプローブ１１６へ結合する。タグ１１０はターゲット１１４へ付着されるため、基板１２０の表面に近位のタグ１１０の存在は、ターゲット１１４の存在を示す。タグ１１０の量を測定することにより、ターゲット１１４の量が推定可能である。
【００７４】
別法として、タグ１１０はターゲット１１４へ結合される代わりに、ターゲット１１４に親和性をもつ第２の分子に対し、リンカーを介して付着されることが可能である。プローブ１１６およびターゲット１１４とのインキュベーションの後、ターゲット１１４がプローブ１１６およびタグ１１０の双方と対合する「サンドイッチ」が形成される。
【００７５】
図１による系の一つの難点は、ターゲット１１４およびプローブ１１６の動的な完了に至るまでのインキュベーションにかかる時間である。たとえば、異なるプローブが、縦８列掛ける横１２列のウェルフォーマットに配列されたウェルの格子内に置かれている（下文にさらに詳細に記述されるような）、一般的な研究室用マイクロプレートフォーマットを考慮されたい。プレートのウェルの配置は業界の標準により規定されており、ウェルは典型的には直径９ｍｍのオーダーである。プローブに対するターゲットの結合は、この二つの種がオングストロームのスケールで測定されたごく近接位にあることを必要とする。典型的なマイクロプレートアッセイでは、拡散および、時には対流が利用され、二つの種が表面の複合体に近接するようになる確率を高めている。この戦略は、５０ｋｄのモデルタンパク質のｐｇ／ｍｌの濃度における典型的な通常の検出方法論により、有意なシグナルを時間単位のインキュベーションにおいて発生する。しかしながら、それ以下または低いｐｇ／ｍｌの濃度では、シグナル発生は表面へのアナライトの物質輸送によって制限されるため、アッセイが完了に至るには、数日間にわたって測定される不合理な反応時間を必要とする。
【００７６】
さらに、プローブ１１６へのターゲット１１４の輸送は、マイクロメートルのスケールのプローブのアレイ（すなわち、マイクロアレイフォーマット）においてさらに悪化される。図２Ａは、行なわれるバイオ検出系の略線図であって、異なるプローブ１１６が、基板１２０上の位置１３０からなるアレイ１４０中に置かれている。各々の位置１３０は、典型的には直径５０ミクロン〜５００ミクロンのオーダーであり、１０〜数万の位置１３０により、アレイ１４０の典型的なサイド対サイドのディメンションは、数ミリメートルまたはさらに数センチメートルとなることが可能である。プローブ１１６へのターゲット１１４の結合は、二つの種がオングストロームで測定される近接位にあることを必要とする。生体高分子の受動的拡散が低い（たとえば、秒当たりナノメートルで測定される）とすれば、プローブ１１６へのターゲット１１４の側方運動は、能動的な援助が提供されない限り、数十時間のオーダーを要する可能性がある。
【００７７】
たとえ分子の側方への動きが援助されたとしても、インキュベーションの垂直のスケールは、プローブ１１６へのターゲット１１４の結合を失敗させる可能性がある。図２Ａのアレイ１４０を通した側面図、図２Ｂを考慮されたい。カバー１１１は、インキュベーションセルの上部を含んでおり、もしターゲット１１４がインキュベーションチャンバー（基板１２０とカバー１１１によって範囲の定められた）の上部付近にあるとすれば、垂直のディメンションは分子標準によってもなお大きい。通常のインキュベーションに使用される最小の垂直の厚さが、典型的には約５０ミクロンであることを考慮されたい。ターゲット１１１およびプローブ１１６が数オングストローム以内にある必要があるとすれば、一般的に、互いが結合するためには、この垂直のスケールはこのサイズの１０，０００倍である。最良の場合、ターゲット１１４はその見かけの濃度を増すべく、固定されたプローブ１１６の付近のごく小さい体積中にその動きが制限されることになるであろう。
【００７８】
この問題を克服するための手段についての先行技術の態様は、電気泳動的に高度化されたインキュベーション系の斜視図、図３に提供されている。この場合、異なるプローブ１１６は、導電性の電極１５０上に直接貼付けられている。これらの電極１５０は、基準電極１４０に比較して独立して電圧バイアスされて、インキュベーションチャンバー内に電流を引き起こすようにされており、その中でターゲット１１４分子は電極１５０へ移動する。たとえば、電極１５０Ａが最初に電圧がバイアスされ、ターゲット１１４を引き付ける場合を考慮されたい。ターゲット１１４と電極１５０において固定されたプローブ１１６との速やかな近接のゆえに、二つの種の間の結合は数秒〜数十秒のオーダーで非常に素早く起こる。次いで電極１５０Ａ上の電圧値は中性か、または先のバイアスの反対にされ、電極１５０Ｂが次にバイアスされる。この場合、ターゲット１１４分子は第２の電極１５０Ｂへ移動することとなり、ターゲット１１４の第２の位置に固定されたプローブとの相互作用を可能にするであろう。
【００７９】
この態様は、ナノジェン（Nanogen）（カリフォルニア州サンディエゴ）によって広範囲に使用されおり、先行技術の教示は、米国特許第５，８４９，４８６号、および米国特許第６，０１７，６９６号を含む一連の特許において明示されている。しかしながら、これの態様には多くの制限がある。たとえば、プローブ１１６および個々の電極１５０によってカバーされる領域は、厳密に一致しなければならない。一般に、このことは、インキュベーションの間のターゲット１１４の動きに類似したプローブ１１６の動きを用いて、プローブ１１６が連続的に固定されることを意味する。さらに、プローブ１１６電極１５の各々は、パワーコントローラに対しそれ自身の電気的連結を確立しなければならず、そのことは精巧な製造およびパワーコントロールの双方を必要とする。
【００８０】
成分の配置
本発明のいくつかの態様は、ターゲット１１４に対する電気泳動力の適用を含んでおり、かかる力に関与する電極は、プローブ１１６が貼付けられている場所と必ずしも一致しない。電気泳動力の適用は、多数の態様によることが可能であり、そのうちの二つが議論を目的として提示される：第一には、電極はプローブ位置１１６の下には全くなく、また電気泳動力は主として基板１２０の表面に平行であり、第二には、単一の電極が複数のプローブ１１６位置の下にある。プローブ位置、および電気泳動力を生じる電極の構造的な配置が、本発明による使用のために最適化された種々の成分とともに最初に考慮され、その後に、種々の成分の提携した操作が記述されることに注目するべきである。また、電気泳動よりもむしろ誘電泳動が、大きくかつ静電分極可能なターゲット（またはターゲットに付着されたタグ）を移動するために使用可能であることも注目されるべきである。これらの方法は一般に、一様でない電気的または電気泳動的フィールドを作成するよう、２または３次元のいずれかに形づくられた電極の使用を必要とする。これらの誘電泳動用電極は、マルクス（G. H. Markx）およびペシグ（R. Pethig）著、「Dielectrophoretic Separation of Cells : Continuous Separation（細胞の誘電泳動：連続分離）」、Biotechnol. Bioeng.、１９９５年、第４５巻、ｐ．３３７−３４３、および、マルクス（G. H. Markx）、フアング（Y. Huang）、ゾウ（X.-F. Zhou）、およびペシグ（R. Pethig）著、「Dielecrophoretic characterization and separation of micro-organisms（微生物の誘電泳動的特徴づけおよび分離）」、Microbiology、１９９４年、第１４０巻、ｐ．５８５−５９１、に提示されている。
【００８１】
多数のプローブ位置の下にある単一の電極を含む配置
図４Ａは、バイオ検出用セルの斜視図であって、単一のプローブ電極２００は、アレイ１８０内に配置されている多数のプローブ位置１７０の下にある。セルの壁は線図中には配置されておらず、また一般にはガスケット材を含んでなることができ、水密封シールを形成する。基準電極１９０は、好ましくはプローブ電極２００の上に物理的に配置され、プローブ電極２００とほぼ同じサイズのものであって、二つの電極の間の電場が実質的に均一であるようにする。しかしながら、基準電極２００について、同様の、またはさらになお小さい均一性を可能にする様々な形状および位置を有することもまた、本発明の精神の範囲内にある。一般に、電極はほぼ互いに平行であり、生じる電気泳動フィールドがプローブ電極２００の表面に対してほぼ垂直になるようにし、プローブ位置１７０上にターゲットの沈着さえも生じるようにする。
【００８２】
プローブ電極２００およびプローブ位置１７０のこの配置は、接触式または非接触式（たとえば、ピン型または圧電式）スポッターを用いて、電極表面上にプローブを配置する標準的な方法を可能にする。さらに、ターゲット１１４のプローブ１１６との結合は、先行技術によって行なわれたように連続的であるよりもむしろ、異なるプローブ位置１７０の全てによって平行して行なわれることが可能である。
【００８３】
プローブ位置の下にない電極を含む配置
別の配置は、バイオ検出セルの斜視図、図４Ｂに示されており、これにおいて電極はプローブ位置１７０の下にない。この場合、プローブ１１６はアレイ１８０内に配置されたプローブ位置１７０内に配置される。第１の電極２１０および第２の電極２２０は、アレイ１８０に対して横方向にあり、この図でＰ、Ｑ、およびＲと表示された部分基準電極１９５のアレイの下に位置する。部分基準電極１９５の数およびタイプは異なることが可能であり、第１の電極２１０、第２の電極２２０、および部分基準電極１９５を置くことの目的は、電極の相対的な電圧を調整することにより、電場の強さおよびトポロジーを管理することである。たとえば、第２の電極２２０および部分基準電極１９５Ｐ、Ｑ、およびＲを負のバイアスに、第１の電極２１０を相対的に正のバイアスに配置することは、アレイ１８０の表面にわたり、ほとんど水平の電場を生じることができる。多数の部分基準電極１９５の必要性は、大きい電極にわたる電場を維持することを困難にする、大きい連続電極に伴って生じることがある電場の「短絡（shorting）」に起因するものである。
【００８４】
図５は、第１の電極２１０、第２の電極２２０、および部分基準電極のセット１９５からの電場の強さの線図である。第２の電極２２０および部分電極１９５は負のバイアスを有しており、第１の電極２１０は相対的に正のバイアスを有する。認識されるように、アレイ１８０の位置における電場の垂直成分は、下向きの成分については比較的一定である。異なる電極の電圧バイアスの相対的な強さを調節することにより、多様な異なる電場トポロジーが、以下に記述される目的のために配置されることが可能である。
【００８５】
電気泳動用タグ
ほとんどの生体分子は関連した静電荷を有しており、それは該分子がその中に維持されている溶液のｐＨによって調節されることが可能である。核酸については、電荷は一般に負であってリン酸骨格によって決定され、かつ、それに加えて直接的に核酸の長さに関連している。本発明の目的のためには、ターゲット１１４分子のサイズが異なる可能性があることから、このことは一定の不利益を有する。異なる遺伝子に関連したＲＮＡ分子が測定される適用を考慮されたい。かかる場合には、各遺伝子に関連したＲＮＡの長さは、遺伝子の長さによって変わるであろう。さらに、高等生物からのＲＮＡはポリアデニル化されており、「ポリＡ」テールの長さはＲＮＡごとに異なっている。このことは、異なるＲＮＡの全てにわたって、あるいは同じ遺伝子に関連したＲＮＡにわたってでさえも、比較的一定の力を与えることが難しいことを意味している。
【００８６】
この問題を克服するための一つの方法は、各分子の上に「電気泳動用タグ」を配置することである。このタグの静電荷はポリＡテールの電荷に比較して大きくすることができ、さらにＲＮＡ分子全体の荷電に関しても本当であることが可能である。この場合、特定の遺伝子に関連したＲＮＡについての、ポリＡテールに起因する電荷の変動は、取るに足らないほどに小さく、かつ異なる遺伝子に関連したＲＮＡの間の電荷の差異は、ＲＮＡが有意に異なるサイズのものであっても、電気泳動用タグの電荷が充分に大きい限り、取るに足らないほどに小さい。
【００８７】
図６は、サンドイッチ構造における電気泳動用タグ２７０の略線図である。電気泳動タグ２７０は一般に、三つの機能成分（または、その一以上の成分が多数の機能を含むことができる、より少ない成分）を含んでなる。タグ結合成分２７２は、特定のターゲット１１４（たとえば、特異抗体またはアプタマー）に対して特異的であることが可能か、あるいは多数のターゲット１１４（たとえば、ｍＲＮＡのポリＡ領域へ結合することができるポリＴ）に対して共通であることが可能かのいずれかの手段によって、タグ２７０をターゲット１１４へ結合する。指標成分２９０は、検出器によって検出可能である。静電成分２８０は、荷電物質を含んでなり、電荷は大きく、かつ全てのタグで一致している。静電成分２８０の静電荷の大きさは、本発明の精神の範囲内において幅広いことが可能であるが、電荷には少なくとも１，０００の実効電荷であることが好ましく、少なくとも５，０００の実効電荷であることがさらに好ましく、少なくとも１０，０００の実効電荷であることがさらになお好ましい。さらに、電気泳動用タグ２７０の電荷については、ターゲット１１４の電荷と同じ極性であることが好ましい。たとえば、核酸ターゲット１１４については、静電成分２８０が負に帯電していることが好ましい。
【００８８】
ある時間においては、電気泳動用タグ２７０とターゲット１１４の間に、独立して結合を形成することが便利であってよい。すなわち、ターゲット１１４をプローブ１１６と結合することおよび次にタグ２７０をターゲット１１４と結合することの代わりに、タグ２７０とターゲット１１４が最初に結合され、結合した成分がタグされたターゲット２７５と呼ばれる。
【００８９】
電気泳動用タグ２７０の構造は、本発明の精神の範囲内で全く異なることが可能である。図１１ＡからＦは、電気泳動用タグ１７０の略線図であり、本発明の範囲内で機能性を提供するための様々な成分の配置を示している。
【００９０】
図７Ａは、静電成分２８０としての架橋されたＤＮＡ２８１と、指標成分２９０としての蛍光色素２９１とを含んでなる、電気泳動用タグの略線図である。ＤＮＡは、最も多くは二本鎖であり、核酸ターゲット１１４およびプローブ１１６に干渉することが少なく、また都合のよいことに、互いに相互作用する単鎖の尾をもつ二本鎖ＤＮＡの領域を含んでなる。さらに、相互作用領域については、多様な異なる物理的および化学的条件の下でタグ２７０に完全性を与えるべく、化学的に結合されることが好ましい。この形状の電気泳動用タグ２７０の実例は、３ＤＮＡ（ジェニスフェア（Genisphere）、ペンシルベニア州ハットフィールド）であり、デンドロメリック（dendromeric）な架橋ＤＮＡ構造であって、蛍光色素ならびに結合成分２７２の双方に結合され得る。結合成分２７２は、好都合なことには、ターゲット１１４に対して特異性をもつ抗体、ターゲット１１４へ付着されたビオチン成分に対して特異性をもつアビジン分子（または逆に、ターゲット１１４へ付着されたアビジン分子に対して特異性をもつビオチン成分）、ターゲットに対する特異性によって選ばれたアプタマー、核酸ターゲット１１４に対して相補的な核酸、または他の特異結合成分である。メッセンジャーＲＮＡターゲットとの使用には、結合成分２７２は、好都合なことには、ＲＮＡのポリＡテールへ結合することができるポリＴ単鎖ＤＮＡオリゴマーか、または別法として、未修飾のポリＴよりもポリＡに対して高い親和性を有するポリＴロックド・ヌクレイックアシド（polyTLocked Nucleic Acid）（エキシコン（Exiqon）、デンマーク、ベドバック（Vedback））であることが注目されるべきである。
【００９１】
多くの場合、結合成分２７２とターゲット１１４との間の結合エネルギーが、ターゲット１１４とプローブ１１６との間の結合エネルギーのものよりもおおきくなるように選ばれることに注目するべきである。このことは、プローブ１１６へのターゲット１１４の結合を弱くすること、またはさらに好ましくは、ターゲット１１４への結合成分２７２の結合を強くすることのいずれかによってアレンジされることが可能である。このことを確実にするための一つの方法は、ターゲット１１４と結合成分２７２との間に共有結合を作ることである。このことは、たとえば結合成分２７２のポリＴリンカー内へのＢｒｄＵの取込みを必要とし、これは光活性化されて共有結合を生じることが可能である。タンパク質の場合には、結合成分２７２がタンパク質（たとえば、抗体）からなる場合には、このタンパク質が、アリールアジドのような光活性化可能な架橋試薬（たとえば、フェニルアジド、ヒドロキシフェニルアジド、およびニトロフェニルアジド）で修飾されることが可能であり、ターゲット１１４が結合成分２７２と結合された後に、架橋結合を刺激するべく光が使用されることが可能である。未反応の架橋試薬は、次に、不活性化試薬を用いて使い尽くされることが可能であり、アリールアジドの場合には、それはチオール含有試薬のような還元剤を含むことが可能である。
【００９２】
ほとんどの場合には、識別されている結合エネルギーはプローブ１１６とターゲット１１４との間のものであるが、ターゲット１１４とタグ結合成分２７２との間の結合エネルギーに関して識別が起こることもまた、本発明の精神の範囲内にある。たとえば、プローブ１１６およびタグ結合成分２７２の双方が抗体または抗体部分を含んでいる、抗体サンドイッチアッセイを考慮されたい。その場合、弱い抗体−リガンド結合エネルギーについて、すなわち、アッセイにおいて識別される結合エネルギーについて、どちらの抗体に対してもそうであることが等しく有用である。このことは、サンドイッチアッセイにおいて使用される抗体成分のどちらがターゲット１１４に対して強い親和性を有するかを測定する必要がないため、かかるアッセイのデザインを簡単にする。
【００９３】
ターゲット１１４−プローブ１１６結合エネルギー、ならびにターゲット１１４−タグ結合成分２７２の双方を利用するこの能力は、核酸へも同様に適用可能である。したがって、本発明の方法は、たとえターゲット１１４−タグ結合成分２７２の結合の方が、プローブ１１６に対するターゲット１１４のものよりも弱い場合でも有効であろう。
【００９４】
さらにこの方法は、ターゲット１１４とタグ結合成分との間の結合が、特異的な１対１結合でないとしてもなお適合する。たとえば、タグ結合成分２７２が固定された長さのポリＴオリコヌクレオチドを含んでなり、それがロックド・ヌクレイックアシド（Locked Nuckeic Acid）ヌクレオチドを含んでなってもよく、かつメッセンジャーＲＮＡのポリアデニル化された「テール」と結合する場合を考慮されたい。プローブ１１６の、そのターゲット１１４との特異的な結合は、ターゲット１１４の結合の空間的な特異性、すなわち、アレイ１８０のどこにターゲット１１４が結合するのか、を規定するのに対し、ターゲット１１４とタグ結合成分２７２との間の結合エネルギーは、系によって識別されることが可能な、一貫した結合エネルギーを規定することが可能である。
【００９５】
共有架橋結合が、ターゲット１１４とプローブ１１６との間、ならびにターゲット１１４とタグ結合成分２７２との間の双方で起こり、基板と指標成分２９０との間に連続的な共有結合を作るようにすることもまた、本発明の精神の範囲内である。すなわち、プローブ１１６への、適当な活性化可能な架橋成分の取込みがあるとすれば（活性化可能な架橋試薬については上記を参照）、ターゲット１１４とプローブ１１６との間の反応の後に、プローブ１１６へ結合された架橋成分の活性化が行なわれ、プローブ１１６とターゲット１１４との間に共有架橋結合が形成されるようにすることが可能である。かかる反応は、上記のように、ターゲット１１４とタグ結合成分２７２との間にも同様に生じることが可能である。かかる場合には、基板に対して指標成分２９０を保持している結合エネルギーは非常に大きく、特異的な結合はその大きい結合力によって、容易に識別されることが可能である。
【００９６】
図７Ｂは、静電成分としてのイオンポリマー２８２と、指標成分２９０としてのアップコンバート性蛍りん光体２９２を含んでなる電気泳動用タグの略線図である。イオンポリマーは、都合のよいことには直鎖または分枝したポリアニオンであることが可能であり、イオン基はカルボキシル基（緩衝液の、タグ２７０が使用されるはずのｐＨが、カルボキシル基のｐＫに近いかまたはそれより上である場合）を含んでなるか、またはポリホスフェート、スルフェート（たとえば、ポリビニルスルホネート、ポリスチレンスルホンスルホネート、硫酸化デンプン、またはデキストランスルホネート）か、または他の、ポリホスフェート、第四級アミン、第三級アミン、第二級アミン、第一級アミン、スルフェート、ニトレート、またはカルボキシレートを含んでなることが可能な、無機酸成分を含有することが可能な他のポリマーであることも可能である。これらのイオンポリマーは、モノマー試薬からデノボ合成によって創製されるか、または別法として、ポリビニルアルコールまたは種々のデンプンのような、充分に特徴づけられた非イオンまたは弱イオン性ポリマーの修飾によって生成されることが可能である。強イオン性ポリマーは反対の極性をもつ強イオン種へ高度に引きつけられること、それゆえ静電成分２８０は、検出アッセイにおいて高いバックグラウンドを生じる可能性がある、基板１２０またはアナライト溶液中の他の種に対する非特異的な結合について、チェックするべく検査される必要があることに注目されるべきである。
【００９７】
アップコンバート性蛍りん光体２９２は、低い周波数の光を高い周波数の光へ変換する粒子（オラシュア・テクノロジーズ・インク（Orasure Technologies, Inc.）、ペンシルベニア州ベツレヘム）であり、この特性を有する天然化合物が少ないことから使用に便利であり、一般に検出アッセイでは低いバックグラウンドをもたらす。
【００９８】
図７Ｃは、静電成分２８０としてのイオンポリマー２８２と、指標成分２９０としての直接可視化粒子２９３を含んでなる電気泳動タグの略線図である。粒子は金属（たとえば金）、セラミック、着色ガラス、または不透明またはほとんど不透明な物質であることが可能であり、便利なことには少なくとも２５０ナノメートル、さらに好ましくは少なくとも５００ナノメートルであり、それゆえ光学顕微鏡によって見ることができる。イオンポリマー２８２は、図７Ｂのイオンポリマー２８２と同様の物質を含んでなることが可能である。
【００９９】
図７Ｄは、静電成分２８０としての低非特異結合性ポリマー２８４と、図６の指標成分２９０としての光散乱粒子２９４とともに、イオンポリマー２８２を含んでなる電気泳動用タグの略線図である。イオンポリマー２８２は、図７Ｂに示されたものと類似している。このポリマー２８２が高い非特異結合を示す場合、それは、非常に低い非特異結合を示すポリエチレングリコールまたはポリアクリルアミドのような形状の、第２のポリマー２８４でコートされることが可能である。このコーティングは一般に、イオンポリマー２８２と低非特異結合性ポリマー２８４との間に共有結合を含むであろう。
【０１００】
光散乱粒子２９４は、金属、セラミック、およびガラスを含めた、光を散乱する多様な物質を含んでなることが可能である。これらの粒子のサイズは、好ましくは５００ｎｍよりも小さく、さらに好ましくは２００ｎｍよりも小さく、さらになお好ましくは５０ｎｍよりも小さい。かかる光散乱粒子２９４の実例は、ジェニコン（Genicon）（カリフォルニア州サンディエゴ）による共鳴光散乱粒子である。
【０１０１】
図７Ｅは、静電成分２８０としての二本鎖ＤＮＡ分子と、指標成分２９０としての量子ドット２９５とを含んでなる電気泳動タグの略線図である。この場合、静電成分２８０は分枝または架橋されたＤＮＡ分子よりもむしろ直鎖である。指標成分２９０および結合成分２７２は、ＤＮＡ分子２８５の各々の端に結合される。この構造は、結合成分２７２を単鎖ＤＮＡ分子の一端へ付着すること、および次に指標成分を相補的な単鎖ＤＮＡ分子へ付着することによって組立てられることが可能である。二つの単鎖ＤＮＡ分子が互いにハイブリダイズするにつれ、所望の構造を生じる。二本鎖分子２８５は、単鎖ＤＮＡ分子により、あるいは直鎖のポリイオンポリマーにより、本発明の精神の範囲内において置換え可能であることが、注目されるべきである。
【０１０２】
量子ドット２９５は、蛍光色素と同じ方法でおおいに機能するが、励起および進入周波数の間のかなり大きいシフトによる。この大きいシフトは、検出アッセイにおけるバックグラウンドノイズの量を低減する光学フィルタの、効率の高い使用を可能にする。量子ドット２９５の実例は、クアンタム・ドット・コープ（Quantum Dot Corp）（カリフォルニア州ヘイワード）によって製造されたナノ結晶である。
【０１０３】
図７Ｆは、静電成分２８０としての二本鎖ＤＮＡ分子２８５に結合しているリンカー成分２７４と、指標成分２９０としての量子ドット２９５とを含んでなる、電気泳動用タグ２７０の略線図である。リンカー成分２７４は、三つの成分のための付着部位：結合成分２７２、指標成分２９０、および静電成分２８０、を含んでなる。リンカー成分２７４は一般に、三つの異なる結合基をもつことができ、それらは、別個に三つの成分により、各々の基の選択的な結合を可能にしている。かかるリンカー２７４の実例は、合成については分離可能な反応性をもつ、カルボキシル、アミノ、おおびチオール成分をもつアミノ酸、システインか、またはカルボキシル、アミノ、およびヒドロキシル成分をもつセリンである。リンカー上で成分２７２、２９０、および２８０と相互作用させるために使用されることが可能な多くの官能基がある。これらの官能基は、たとえば、チオール、アリール、アジド、アルコール、アミン、エポキシ、ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、ビオチン、アビジン、または他の化学的活性基、または高い親和性をもつ基（たとえば、アビジンおよびビオチン）を含むことが可能である。
【０１０４】
電気泳動用タグ２７０についての先の議論において、異なる実施例からの静電成分２８０および指標成分２９０が、有用な利益をもつタグを作成するべく、別個に組合せ可能であることが理解されるべきである。議論された静電成分２８０および指標成分２９０は余すところがないというのではなく、同様の機能を与える任意の化学的または物理的成分も本発明の範囲内にあることが、さらに理解される。たとえば、指標成分２９０は、（前文に議論された検出の方式を含めて）酵素指標、化学発光指標、電気化学（たとえば、酸化還元）的指標、放射性指標、および、マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、および他の生化学的および化学的アッセイにおいて使用される他のタイプ、非コンバート性蛍りん光体、蛍光体、量子ドット、光散乱粒子、光吸収粒子（たとえば、着色粒子）、または位相差粒子（すなわち、位相差顕微鏡において、または表面プラズモン共鳴によって可視化されることが可能な、屈折差の指標を与えるための）のような、多くの物質を含んでなることが可能である。
【０１０５】
これらの指標の多くは、指標の検出手段に適合した光学的検出手段によって使用されることが可能である。したがって、蛍光体、量子ドット、および非コンバート性蛍りん光体については、ペアード励起照明（たとえば、バンドパスフィルタによるレーザ励起またはブロードスペクトル照明）、およびエミッション特異検出器（たとえば、バンドパスフィルタされた）が、適切なイメージャー（たとえば、拡大光学があるか、またはないカメラ）とともに利用される。光散乱粒子は、しばしば、斜め入射照明（標準的な暗視野コンデンサを含む）またはエバネセン照明を用いることができ、あるいは別法として、位相差光学を使用してもよく、その理由は、位相光学効果を生じるべく充分な屈折率の差をもつ粒子もまた、光散乱を生じることができるからである。加えて、位相差粒子もまた一般に、表面プラズモン共鳴において可視であることができる。位相顕微鏡は、位相差粒子用に使用可能であり、光吸収粒子および酵素反応は、位相差顕微鏡および明視野イメージング（たとえば、顕微鏡イメージングまたは他の拡大の形状による）の双方において使用可能である。化学発光は、適切な倍率と、化学発光シグナルに対し適切な反応性をもつべくアレンジされた検出器とにより検出可能である。上記の記載は余すところがないというのではなく、他の指標および検出器の組合せは、本発明の精神の範囲内にある。
【０１０６】
各電気泳動用タグ２７０には単一の結合成分２７２のみがあって、各ターゲット分子１１４が単一の電気泳動用タグ２７０とのみ結合するようにすることが好ましいことは、注目されるべきである。このことば、ターゲット１１４を多量の数値的に過剰な電気泳動用タグ２７０と結合させ、平均して、ほとんどの電気泳動用タグ２７０がターゲットと未結合となるようにすること、およびタグされたターゲット２７５のほとんどが単一のターゲット１１４のみをもつようにすることによって対応されることが可能である。
【０１０７】
電気泳動用タグ２７０上の電荷の量は、一般にターゲット１１４上の電荷と同等であるかまたはより大きくされるべきである。タンパク質に関しては、電荷は大きくなくてよく、核酸では一般にヌクレオチド当たり約１電荷を有しており、ターゲットのサイズは数百〜数千ヌクレオチド（少数の場合では数万以上のヌクレオチド）であることが可能である。細菌および他の生物ターゲットは大きい電荷をもつことが可能であるが、一般的にはタグ２７０が結合するための多数の場所もあり、したがって多数のタグ２７０の合計は、しばしば生物表面の電荷を上回ることができる。一般に、電気泳動用タグについては１０００を超える、さらに好ましくは５０００を超える、最も好ましくは２００００を超える平均絶対実効電荷をもつことが好ましい。
【０１０８】
本発明のほとんどの適用において、電気泳動用タグ２７０の使用は必要条件ではないことことが、さらに理解されるべきである。すなわち、ほとんどのターゲット１１４は、静電界または電気泳動フィールド内のターゲット１１４の移動を可能にする静電荷を本来含んでおり、こうしたターゲット１１４については静電成分を必要としない。用語、電気泳動用タグ２７０が本明細書において使用される場合、非電気泳動用タグが、ターゲット１１４上の天然に生じる静電荷とともに使用可能であることは、本発明の精神の範囲以内である。さらに、これらの分子の電荷はしばしばｐＨによって調整されることが可能であり、電気泳動が起こるｐＨに調整して、ターゲット１１４上の静電荷を変えることは便利である可能性がある。
【０１０９】
競合アッセイフォーマット
上記のアッセイフォーマットは、主としてサンドイッチアッセイフォーマットに関する。しかしながら、ホルモンまたは物質乱用の薬物のような非常に小さいターゲット１１４の場合には、プローブ１１６とタグ結合成分２７２の双方の、同時の高親和性の結合を可能にする試薬を見つけるための結合は困難である。かかる二つの結合試薬がなければ、サンドイッチアッセイを実施することには困難が伴う。
【０１１０】
一つの別法は競合アッセイであり、ターゲット１１４に対する特異的結合プローブ１１６は、先と同様に基板上に固定される。ターゲット１１４を含有しているアナライトへ添加されるのは競合剤であって、それはターゲット１１４のものと同様の親和性で、プローブ１１６へ結合し、これに対して指標２９０が共有結合する。アナライト中にターゲット１１４がない場合、所与の量の競合剤はプローブ１１６へ結合することができる。しかしながら、アナライトがターゲット１１４を含んでいれば、競合剤の結合は低減される。したがって、競合アッセイにおいては、ターゲット１１４は直接的に検出されるのではなく、むしろその不在が、競合剤の低減された結合によって立証される。
【０１１１】
競合アッセイフォーマットは、本発明において有利に使用されており、一定しかつ再現性のある結合の必要性があるとすれば、それは本発明の反応の促進によって改善される。さらに、本発明は比較的短時間の反応、ならびに迅速な洗浄を使用していることから、他の方法では通常の洗浄および検出法ではシグナルの損失をもたらす、比較的親和性の低いプローブ１１６が使用されることが可能である。この後者の利点が、競合アッセイフォーマットだけでなく、サンドイッチアッセイフォーマットに対しても生じることに注目されたい。
【０１１２】
プローブの付着
上記のように、プローブ１１６はリンカー１１８を介して基板１２０へ付着される。このリンカー１１８は、官能基によるコーティングを便利に含んでなり、該官能基がプローブ１１６の結合を可能にする。また、コーティングは好ましくは低い非特異結合性をもち、プローブ１１６に特異的ではない溶液中のターゲット１１４または指標２９０が、表面に結合しないようにする。かかるコーティング物質の実例は、アマシャム（Amersham）によるコードリンク（Codelink）および、アクセルｒ８（Accelr8）によるオプティケム（OptiChem）を含み、それらは、ヒドロゲル様のコーティングを、非常に低い非特異バックグラウンド、ならびに電気的特性の双方とともに含んでなる。別法として、コーティングは誘導体化されたシランを含んでなることが可能である。
【０１１３】
他の成分
本発明による競合系を成している他の多くの成分があり、ターゲット１１４上に電気泳動力を引き起こしかつ調節することができる、電極間の電位差を確立するためのパワーコントローラ、指標２９０を照明するための照明装置、指標２９０の照明により発生されるシグナルを検出するための検出器、および、検出器からの情報を記憶し、次いでそれを使用者に提示するか、または多数の供給源または時間からの情報を比較する、記憶コントローラ（たとえば、コントローラおよびハードディスクドライブ）を含む。これらの成分のいくつかは、この技術において周知であり、電気泳動用パワーサプライ（コンピュータ制御可能であり、定電圧または定電流を供給するべく設定可能であり、ディジタルまたはアナログ電子回路が補足されて、本明細書の他の箇所に記述されたような低〜高周波の波形を供給することが可能であり、かつ誘電泳動に使用されることも可能である）、照明（たとえば、レーザ、アークランプ、白熱電球、顕微鏡用光コンデンサ、および光を導波路内へ（coupkling）する方法も含むことが可能である）、インジケータ（前文および下文において記述される）、検出器（カメラ、レンズ、フィルターセット、画像解析用ソフトウエア）など、すなわちそれらの配列および用途が、新規であり、かつ本発明における新規な効果のためである、といったものである。
【０１１４】
本発明の作用の記述
本発明は、本発明の段階の、略ブロック工程系統図、図８に示された三つの段階を含んでなると考えることが可能である。
【０１１５】
第１の段階３００においては、ターゲット１１４を含んでなる試料が、アッセイにおける使用に向けて調製される。調製の方法は、アッセイされる物質のタイプに依存し、固形組織の浸漬、または別法として、アッセイされる物質が細胞内起源のものである場合には、細胞の溶解を含むことが可能である。固形物質は遠心分離、濾過、または他の手段によって標本から除去されることが可能であり、もし核酸がターゲット１１４であれば、核酸は標本の残余のデンプン、脂質、およびタンパク質から浄化されることが可能である（実際、ターゲット１１４の性質が何であっても、後の段階の分析の妨害するかもしれない成分を除去することは便利であり得る）。もし物質が核酸であれば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはローリングサークル増幅または他の増幅法のような手段によって増幅されることが可能である。一般に物質は、ターゲット１１４のプローブ１１６との反応性、ならびに電気泳動用タグ２７０のプローブ１１６との反応性を保存する条件下に維持されるべきである。一般に、コスト、時間、および調製によって一般的に添加されるアーチファクトのため、高シグナルおよび低バックグラウンドの双方を可能にする最少量の標本が使用されるであろう。
【０１１６】
この調製の段階において、電気泳動用タグ２７０は、図６に記述されたタグされた標識２７５を生じるため、ターゲット１１４と反応されることが可能である。別法として、この反応は下文に記述されるように、後に起こることが可能である。
【０１１７】
第２の段階３１０においては、タグされたターゲット２７５とプローブ１１６とが反応される。核酸の場合には、このことはハイブリダイゼーションの段階を含むことが可能である。タンパク質ターゲット１１４であるばあい、このことは抗体−ハプテン反応、タンパク質−アプタマー反応、またはタンパク質−タンパク質反応を含むことが可能である。
【０１１８】
タグされたターゲット２７５とプローブ１１６との間の反応を促進することは、本発明の一つの教示である。もし反応が不完全であれば、プローブ１１６へ結合されたターゲット１１４の量は、最適値よりも少ないであろう。さらに、種々のターゲットの、異なるプローブ１１６に対する反応の速度は一般に異なることから、また、プローブへ結合したターゲットの量が、時間とともに直線的であることはないであろうことから、完了している反応なしでは、プローブ１１６へ結合したターゲット１１４の量を定量することは難しい。
【０１１９】
反応を促進するための手段は、便利なことには電気泳動的、誘電泳動的、または静磁気的な力であることが可能な、外部から適用された力の影響下での、タグされたターゲット２７５の移動を含むことが可能である。本明細書に関しては、実例として電気泳動力が使用されることができる。この力は、電極２００をプローブ１１６の下に配置すること、または、下文に記述されるはずの方式で、プローブ位置１７０の側に置かれた電極２１０および２２０の影響を介して適用されることが可能である。
【０１２０】
第３の段階３２０においては、未反応のタグされたターゲット２７５はプローブ１１６から分離され、プローブ１１６へ付着されて残っているタグされたターゲット２７５が検出される。重要なことには、条件は、適切にプローブ１１６と反応したタグされたターゲット２７５が除去され、かつプローブ１１６または基板１２０へ非特異的に結合している他のタグされたターゲット２７５が除去されるように設定される。多数のタグされたターゲット２７５およびプローブ１１６ペアでは、結合力が個々のペアの場合で異なるであろうことが認識されるべきである。非特異的に結合した物質から区別するため、異なる識別力が、各々のプローブ１１６について最適に使用されることができる。この方法論は、結合した物質の量対結合エネルギーのグラフである図９に略述されている。線３４０は非特異的に結合した物質の量を表しており、緩く結合している非常に多量の物質と、中間のエネルギーによって結合された変わりやすい量の物質、および強く結合しているいくらかの量の物質によって特徴づけられる。この曲線の形状が、アッセイされる物質に依存して異なること、および下文に著わされた論議が、曲線の特別の形状に依存していないことに注目されるべきである。
【０１２１】
この図には二つのターゲットが示されている：ターゲットＸは線３４４で表されており、ターゲットＹは線３４６によって表されている。ターゲットＸ線は、その対応するプローブ１１６に対し、ターゲットＹよりも低い結合エネルギーを有する。全てのターゲット−プローブペアについて単回の識別洗浄が行なわれる通常のアッセイにおいては、識別エネルギーは、最少の堅く結合しているターゲットの結合エネルギーよりも小さくなるよう選択されねばならない。しかしながら、単一の識別エネルギーを使用しているものは、線３４２の右の、全非特異的結合３４０の総量によって表されるバックグラウンドを生じる結果となる。ターゲットＹの位置においては、たとえば、特異的に結合したターゲットＹのものよりも、より小さい、およびより大きい、の双方の結合エネルギーをもつ、かなりの非特異結合物質が存在するであろう。
【０１２２】
本発明においては、多数の結合エネルギー相当する洗浄が使用できる。これらの結合エネルギーは、断続線３５０により、線Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥによって表される力で表され、それらは連続的に適用される。たとえば、識別エネルギーＡにおける第１の「洗浄」が適用され、プローブＸの位置に結合された、ほとんど全てのタグされた物質が検出される。次いで、識別エネルギーＢにおける洗浄が適用され、プローブＸの位置に結合された物質が、もう一度測定される。洗浄Ａと洗浄Ｂとの物質間の差異が、ターゲットＸに相当する特異結合物質とみなされる。その後の、識別力Ｃ、Ｄ、およびＥにおける洗浄の後、ターゲットＹの量は、プローブＹの位置において洗浄Ｄには存在するが、洗浄Ｅには存在しない物質のものであるとみなされる。このように、各ターゲット−プローブのペアについての適切な識別エネルギーは、識別洗浄のひとまとめにしたペアを用いて利用される。各々の場合、非特異的バックグラウンドは、そのプローブ位置に特異的な識別洗浄の対の間に入る、線３４０部分のみである。
【０１２３】
破断力は、適用される力および、適用される力の速度に依存することに注目されるべきである。たとえば、非平衡条件下では、単位時間当たりに適用された力の率が、実際に潜在的なエネルギーランドスケープの幅を有効に変えており、相互作用を破壊するために必要な、統合されたエネルギー（距離を経て適用された総力）を増大する。このことを述べるためのもう一つの方法は、速い引き離す力は、比較的ゆっくりした解くプロセスのための時間を与えず、それゆえ分子を引きはがすためには大きい力が必要であること、および、速い負荷においては、エネルギーランドスケープまたはバリアが、低速の力の負荷を超えて有意に高いことである。それゆえ、力の負荷率に依存して、多数の限界破断力があることになる。さらに、負荷率対限界破断力の形状は、分子間相互作用が異なることから、各々の受容体リガンド相互作用について異なっている。したがって、多数の抗体−抗原相互作用および非特異的結合は、動的な力の分析によって解決されることが可能であり、すなわち、負荷速度に対してプロットされた破断力を観察することにより、重複している結合エネルギー曲線が、負荷速度に依存して分離されることが可能である。それゆえ、適用された電圧曲線の形状は、調節のために非常に重要である。
【０１２４】
反応段階３１０および洗浄および検出段階３２０が、循環して多数回行なわれることができることに注目されるべきである。すなわち、洗浄および検出段階３２０が、プローブ１１６からのターゲット１１４（またはターゲット１１４からのタグ２７０）の全てを除去した後、反応および洗浄／検出のもう一つのサイクルが行なわれることが可能である。このことは二つの主要な利点を有する。第一に、アナライト中に少数のターゲット１１４が存在する場合、検出される結合事象は少なくなるであろう。反応および洗浄／検出の段階を繰返すことにより、より多数の結合事象が計数可能であり、結果の統計を改善する。
【０１２５】
さらに、電圧ダイナミクス（たとえば、電圧ランププロフィール）を変えることは、電圧ダイナミクスに対する応答を変えることによってのみ識別されるであろう、非特異的結合事象から特異的なものを識別するために、二つの段階３１０および３２０からなる各々のサイクルにおいて利用されることが可能である。たとえば、第１のサイクルにおいて、電圧ダイナミクスは電圧が急速に変化するステップ関数を含むことが可能であり、一方第２のサイクルにおいては、電圧ダイナミクスはゆっくりした、傾斜のついた電圧の増加を含むことが可能である。
【０１２６】
前述の方法が使用されるためには、プローブに対してタグされたターゲット２７５のリアルタイム検出が利用可能でなければならないことに注目されるべきである。すなわち、もし各々の洗浄に相当な量の時間がかかり、また多くの操作を必要とするなら、わずかに少数の異なる識別洗浄のみが使用可能であろう。しかしながら、リアルタイム検出によれば、多数の識別洗浄が実現可能であって、特異的対非特異的結合物質の定義を改善する。
【０１２７】
以下の議論において、電気泳動力の使用が、反応を促進すること、ならびに特異的および非特異的な結合物質の識別を提供することの双方において使用可能であることは、さらに注目されるべきである。しかしながら、所与の適用において、ターゲット−プローブ複合体二作用する電気泳動力の双方の用途か、または電気泳動力のこれらの用途の一方または他方のみが、有益効果のために使用可能であることが、本発明の精神の範囲内であることが理解されるべきである。
【０１２８】
所与のアッセイのために使用される識別洗浄の回数は、使用される特定のターゲット−タグのペアに依存することが可能であるが、ほとんどの場合には洗浄の回数は、好ましくは、（特定のターゲット１１４を「ひとまとめにする（bracket）」ために各々二つの段階を用いて）検出されるターゲット１１４の総数の２倍よりも少ない。識別エネルギーの間隔については、均等に間隔を取るのではなく、個々のまたはグループの、ターゲット−プローブ結合エネルギーをひとまとめにするべく変更されることもまた便利である。洗浄については、連続した緊縮性の勾配として行なわれることもまた本発明の精神の範囲内にあり、緊縮性対時間において直線的であるか、または、間隔をあけて行なわれるターゲット１１４の検出により、非直線的であることが可能であり、検出の回数は、好ましくは検出されるターゲット１１４の総数の２倍よりも小さい。
【０１２９】
しばしば熱によって駆動される、確率的解離に関係する、ターゲット−プローブペアの各々についての天然の解離定数のゆえに、この統計的な解離の成分が最も減少する識別洗浄のための条件を選ぶことが便利である。これらの条件は、核酸の場合には、たとえば、中程度のｐＨ、低温、および高い塩濃度を含むであろう。タンパク質に関するこれらの条件は、加えて、イオン強度、ｐＨ勾配、疎水性、および溶媒極性を含む。
【０１３０】
本発明は識別洗浄用の電気泳動電位の使用を教示しているが、本発明の一つの観点は、さらに一般的に、洗浄レジメを変えることによるリアルタイム検出に関係しており、これにおいて洗浄レジメは、電気泳動力をこえて、種々の異なる物理的および化学的条件を含んでなることが可能であることが注目されるべきである。これらの力は、温度を上げること、磁場強さ（もしタグされたターゲットが常磁性粒子を含んでいれば）、誘電泳動（粒子、細菌、および、他のターゲットおよびタグされたタグ）、剪断流体流動、イオン強度（上昇または低下）、ｐＨ（上昇または低下）、界面活性剤濃度（イオン性または非イオン性）、または競合剤濃度（たとえば、ターゲット１１４がタンパク質であれば、そのタンパク質の増加していく量を添加して、結合したターゲット１１４が放出されたとき、好ましくは競合剤がその高い濃度のためにプローブへ結合するようにする）を含むことが可能である。加えて、一以上のこれらの条件が同時に、または連続的に適用されることが可能である。これらの条件については、一般に、徐々に緊縮性を増しながら適用されることが望ましいが、急速な（慎重な）緊縮性がステップ関数において増加されることも本発明の精神の範囲内である。プローブ１１６へ結合されたターゲット１１４の結合を、これらの任意の条件についての種々の増加した緊縮性においてモニターすることにより、非特異的結合からの特異的結合の識別が改良されることが可能である。
【０１３１】
プローブ位置の下にない電極を含む機能
図１０は、プローブ位置の下にない電極を含む系の略ブロック工程系統図である。段階３６０において、負に帯電したターゲット１１４は、図４Ｂに示されたものと類似の反応セルへ添加される。この議論のためは、ターゲット１１４は核酸であると考えられ、プローブ１１６は、実際にはタンパク質、糖タンパク質、デンプン、または他の興味の分子であることも可能であるが、相補的な核酸配列であると考えることができる。段階３６２において、電極Ａが電極Ｂ、Ｐ、Ｑ、およびＲに対して相対的に正にバイアスされ、負に帯電したターゲット１１４をその電極へ引き付け、その上に集めるようにすることができる。段階３６４では、電極Ｂが電極Ａ、Ｐ、Ｑ、およびＲに対して相対的に正にバイアスされ、ターゲット１１４が電極Ｂへ引かれるようにし、その通過の間に、それはアレイ１８０の位置１７０のプローブ１１６に非常に近接した状態にもって行かれ、ターゲット１１４とプローブ１１６との間の反応が起こりやすいようにする。電極Ｐ、Ｑ、およびＲ上の負のバイアスは、ターゲット１１４の移動の間に、下向きの成分による電場ベクトルを維持しており、ターゲットがプローブ１１６と密な近接を維持するようにする。再度、上部の電極Ｐ、Ｑ、およびＲの位置および相対電圧が、セル内の電場ベクトルを形作るべく調整可能であることが注目されるべきである。位置１７０から上向きおよび横向きの電場ベクトルの大きさは、特異的に結合したターゲット１１４を対応するプローブ１１６に対して結合する結合力よりも、低くなければならない。
【０１３２】
任意の段階３６６においては、弱く接着した非特異結合物質は、電極Ｐ、Ｑ、およびＲに対し、アレイ１８０から下向きに物質を引き離す、小さい正味の正のバイアスをかけることにより、アレイ１８０から除去されることが可能であり。段階３７０では、事象の指標、たとえば電気泳動用タグ２７０がセルに添加される。電気泳動用タグ２７０の高い濃度のゆえに、ターゲット１１４との反応は急速に起こる。さらに、電気泳動用タグ２７０のターゲット１１４との反応は、電気泳動手段によって促進されることが可能である。段階３７２においては、電極Ａは電極Ｂ、Ｐ、Ｑ、およびＲに対して相対的に正にバイアスされており、電気泳動用タグ２７０を電極Ａに向けて輸送する。次の段階３７４では、電極Ｂは電極Ａ、Ｐ、Ｑ、およびＲに対して相対的に正にバイアスされ、電気泳動用タグ２７０を電極Ａから電極Ｂへ移動し、一般に下向きの電場ベクトルにより、電気泳動用タグ２７０が、それが反応するターゲット１１４に対して密に近接するようにする。段階３７６では、特異的に結合された物質を測定するため、およびそれを非特異的に結合された物質から識別するため、プローブ位置１７０に結合した物質の量がモニターされるにつれて、電極Ｂの正のバイアスは一般的に、段階的な様式で増大される。もしターゲット１１４自身が帯電していれば、事象の指標が特定の電気泳動特性のないタグであり得ることが認識されるべきである。さらに、もしターゲット１１４自身が蛍光、光吸収、培地による指標差という特性、または、検出可能であるような他の特性をもつとすれば、何ら事象の指標がなくてもよく、段階３７０を任意にした。
【０１３３】
ターゲット１１４は電極２１０と２２０との間を前後に多数回移動するように作成され、各々の場合に、プローブに結合するターゲット１１４の量が増えていくようにすることが可能であることに注目されるべきである。
【０１３４】
プローブ位置の下にある電極を含む機能
図１１Ａは、プローブ位置の下にある電極を含むセルの略ブロック工程系統図であり、図４Ａとの関係において最もよく理解されることが可能である。段階３６０においては、負に帯電したターゲットがセルへ添加される。段階３８２において、電極Ｄは電極Ｃに対して相対的に正にバイアスされ、ターゲットがこの電極上へ移動するようにし、そこにおいてアレイ１８０上のアレイ位置１７０上に配置されたプローブ１１６と密に近接する。この密な緊密のゆえに、ターゲット１１４とプローブ１１６との間の反応は非常に迅速に起こる。段階３７０においては、事象の指標、たとえば電気泳動用タグ２７０がセルへ添加される。段階３８６では、電極Ｄは電極Ｃに対して再度相対的に正にバイアスされる。電場の影響下に、電気泳動用タグ２７０は電極Ｃへ移動し、そこでターゲット１１４と反応する。段階３８８では、電極Ｃは電極Ｄに対して相対的に正バイアスにセットされる。電極Ｃの正バイアスは、特異的に結合された物質を測定するため、およびそれを非特異的に結合された物質から識別するため、プローブ位置１７０に結合した物質の量がモニターされるにつれて、電極Ｂの正のバイアスは一般的に、段階的な様式で増大される。
【０１３５】
段階３７０および段階３８６は、段階３６０におけるターゲット１１４のセルへの添加に先立ち、電気泳動用タグ２７０をターゲット１１４へ添加することにより、削除可能であることが認識されるべきである。この場合、段階３８２において電極Ｃへの正バイアスの適用に先立ち、ターゲット１１４がタグされたターゲット２７５へ転換される。タグされたターゲット２７５の創製は、プローブ位置の下に電極を含むセルの操作についての略ブロック工程系統図、図１１Ｂに示されたようなセル内において、タグされたターゲット２７５を用いて行なわれることが可能である。段階３６０において、負に帯電されたターゲットがセルへ添加され、段階３７０において、電気泳動用タグ２７０がさらにセルへ添加される。この時点で、タグされたターゲット２７５が生成される。段階３８２において、電極Ｄは電極Ｃに対して相対的に正にバイアスされ、タグされたターゲット２７５は移動して、ターゲット位置１７０のプローブ１１６と密に近接し、そこでプローブ１１６との反応が起こる。段階３８８において、特異的に結合した物質対非特異的に結合した物質の識別が前と同様に行なわれる。
【０１３６】
段階３８８において生じるターゲット１１４の結合は、結合した物質の全ての平均について−たとえば、光散乱性指標を有するタグから散乱される光の全出力を測定することにより行なわれることが可能である。しかしながら、もし検出器が光検出器であり、検出器がカメラまたは、光電子倍増管と組合わされたレーザスキャナのような画像検出器であれば、結合に関し、個々のターゲット１１４について測定されることも、本発明の精神の範囲内にある。この場合、検出器は連続的な測定の間に各ターゲット１１４の位置を記憶することが必要となり、各ターゲット１１４の各プローブ１１６に対する結合の強さが次に測定される。
【０１３７】
静磁気力の使用
上記の議論において、電気泳動力ついては、静磁気力が置換可能であることが注目されるべきである。しかしながら、ほとんどの部分について、検出されるべき生体分子または生物体がそれ自身磁性ではないとすれば、静磁気力の使用のためには、ターゲット１１４は常磁性粒子によってタグされねばならない。かかる粒子の実例は、バングズ・ラボラトリーズ（Bangs Laboratories）（インディアナ州フィッシャーズ）からのエスタポール（Estapor）粒子、およびダイナル・インク（Dynal, Inc.）（ノルウェー）からのダイナビーズ（Dynabeads）を含む。したがって、図７Ｃ、Ｅ、およびＦの粒子２９３および２９５は、常磁性粒子で置換されるであろうが、それらは好ましくは直径１ミクロン未満であり、さらに好ましくは直径２５０ｎｍ未満であり、最も好ましくは直径１００ｎｍ未満であり；一般に、粒子が小さいほど、プローブ１１６へ向かうターゲット１１４の拡散を妨げることは少なく、反応のカイネティクスは速い。電極の代わりに、プローブ１１６の上または下のいずれか（基板１２０との関係において）の、永久または電磁石の配置は、力を与えるよりも、磁気的にタグされたターゲット１１４をプローブ１１６へ向かって、または離して移動させる。この力の大きさは、プローブ１１６からの磁場供給源の距離を変えることか、透磁性の異なるシムの配置か、または電磁石の場合には、コイルを通る電流、コイルの物理的分布、コイルの中または周囲の透磁性物質の存在、および他の、この技術において周知の手段を変えることによって調節可能である。
【０１３８】
リアルタイム検出
上記のように、異なる識別による多数回の洗浄の使用、ならびにターゲットのプローブに対する結合のモニタリングは、リアルタイム検出の使用を必要とする。このことは、あらかじめ決められた時間にわたって反応が進行した後に、反応が競合され、洗浄が行なわれ、次にその上で反応が行なわれた基板が検出用に調製される、一般の慣例的な状況から区別されるべきである。本発明の多くの好ましい態様においては、光学的な検出手段が用いられる。電極が互いに向い合っている（たとえば、平行または反対に）これらの例では、光学的検出が行なわれるためには、外部の光学的装置が二つの電極の間に発生された光学的シグナルを受信するため、一方または双方の電極が、好ましくは光学的に透明である。
【０１３９】
図４Ｂに関連して、このことは容易に適応されており、これにおいては、その上にアレイが配置されている基板が透明であることが可能である。その場合、しかしながら、検出器にとっては、電極１９５Ｐ、Ｑ、およびＲの上に配置されることが好ましいことがあり、あるいは別法として、図４Ａのような配置の場合には、検出器は一般に電極１９０および２００の外部にあることができる。かかる場合には、光学的に透明な電極が好ましく、そのために、これらの電極用に好ましい物質は、インジウム酸化第一錫（ＩＴＯ）である。ＩＴＯは一般に２Ｖより上の電圧に対して安定ではないことから、このことは、ＩＴＯの場合には電極間の電圧が、下文にさらに詳細に記述されるように、好ましくはこの電位より下に維持されるべきであることを意味している。
【０１４０】
検出についてのさらに一般的な議論は、下文に提供される。
【０１４１】
反応加速の調節
上記の方法による反応の促進は、電場を空間的および時間的の双方に変えることによって改良され、プローブ１１６のターゲット１１４との反応を改善するようにすることが可能である。図１２Ａは、反応セル内の二つの垂直な軸の上にアレンジされた三つの電極の略線図である。電極Ｅ１および電極Ｅ２は電極１９５を表しており、電極Ｅ４は電極２００を表している。すなわち、アレイ１８０は電極Ｅ４の上に配置されている。異なる電極の間の電圧電位は、以下に記述されるように反応速度を改善するような方法で変えられることができる。以下の議論において、用語、ターゲット１１４およびタグされたターゲット２７５の使用は、大体のところ、交換できるように使用されている。
【０１４２】
図１２Ｂは、電極Ｅ２とＥ４との間の電位差の、それらが時間とともに変化するときのグラフであり、電極Ｅ４はＥ２に対して正にバイアスされている。グラフ上にはＴ１、Ｔ２、およびＴ３として表示された三つの期間が示されている。期間Ｔ１では、電圧はかなりの期間維持されており、ターゲット１１４の大部分がプローブ１１６の近位に運ばれる。電位差のゆえに、プローブ１１６およびターゲット１１４の双方は、基板１２０上へ向かって押し下げられることが可能であり、そこではそれらが互いに反応する能力が制限される電圧が維持される。このことは、核酸のハイブリダイゼーションの場合におけるように、プローブ１１６およびターゲット１１４が同じ極性の電荷をもつときに起こるであろうが、他のターゲット／プローブペア（たとえば、タンパク質−タンパク質相互作用）においては、電荷の極性はプローブ１１６とターゲット１１４との間で異なることが可能である。かかる場合でも、ターゲット１１４は次に、プローブ１１６とターゲット１１４との間の反応を迫っているプローブ１１６を超えて、電気泳動されることが可能である。双方の場合に、電気泳動の影響を逆転または緩和する以下に記述された期間をもつことが便利である。
【０１４３】
期間Ｔ２において、電圧電位は除去されることが可能であり、ターゲット１１４およびプローブ１１６の自由運動が可能となり、反応の速度が加速される。しかしながら、期間Ｔ２においては、ターゲット１１４はプローブ１１６から離れて拡散できるようにされている。したがって、期間Ｔ３の間に、電圧電位がもう一度適用され、プローブ１１６におけるターゲット１１４の密な近接を維持するようにする。期間Ｔ２およびＴ３は、相補的なターゲット１１４とプローブ１１６のほとんどが反応する時まで、循環して反復されることが可能である。種々の期間の継続時間は、反応セルのトポロジー、プローブ１１６およびターゲット１１４の性質、ならびに個別の成分上の種々の静電荷、およびプローブ１１６が基板１２０上に固定されている様式に依存して異なることが可能である。一般に、セルの縦および横のディメンションが大きいほど期間Ｔ１が大きくなり、ターゲット１１４が移動するはずの距離を大きくすることができる。
【０１４４】
図１２Ｃは、電極Ｅ２とＥ４との間の電位差の、それらが時間とともに変わるときのグラフであり、図１２Ｂに対する変法としてアレンジされている。再度、図１２Ｂに置けると同様に、最初の期間Ｔ１の間に、ターゲット１１４はプローブ１１６に対する電気泳動力の影響下に移動できるようにされる。この場合、期間Ｔ４の間、電場は非常に低いレベルに維持されて、プローブ１１６に対するターゲット１１４の近位を維持するようにするが、図１２Ｂで使用されたものより弱い力による。この弱い力は、ターゲット１１４およびプローブ１１６の双方のより大きい動きを可能にする目的で使用されており、そのためそれらは反応を通じて拘束されていない。任意の期間Ｔ５の間、電場は非常に弱く逆転されることが可能であり、基板１２０の表面に巻込まれていたかもしれないすべてのターゲット１１４を解放するようにする。期間Ｔ４およびＴ５の相対的な長さは、その上にプローブ１１６が付着される表面のタイプ、電気泳動用タグ２７０の電荷、プローブ１１６におけるターゲット１１４の間の結合力、電気泳動用タグ２７０の物理的大きさ、および他の因子を含めた多数の因子に依存するであろう。連続した期間Ｔ４または連続した期間Ｔ５の継続時間は、必ずしも等しい必要はなく、徐々に変化してよいこともまた注目されるべきである。
【０１４５】
図１２Ｄは、空間的に移動された電極の間の電位差のグラフであり、電場は大きさだけでなく、方向も変化している。図１２Ａについては、電極Ｅ２は電極２００Ｅ４からほぼ垂直にずらされており（すなわち、直に向き合わされて）、電極Ｅ１は電極Ｅ４から垂直および水平の双方向に移動されている。グラフから分かるように、電極４は垂直にずらされた電極Ｅ１およびＥ２に対して、交互に正および負にバイアスされている。さらに、ある場合には、バイアスはＥ１を基準としており、他の場合にはバイアスはＥ２を基準としている。このことは、電場が、極性、大きさ、および方向において変異するようにする。方向におけるこの変異は、基板１２０上に立体的に捕捉されることになったタグされたターゲット２７５が、その閉じ込めからの解放を促進することができる異なる方向の力に触れることができることを意味する。
【０１４６】
この配置は、種々のトポロジー的な配置を用いて実効されることが可能である。図１３Ａは、単一の電極２００の上に、二次元的に移動された三つの電極１９５についての略線図である。電極Ｅ１およびＥ３は、電極Ｅ４から垂直に移動されている電極Ｅ２から、直角方向に移動されている。図１３Ｂは図１３Ａの電極間の電位差のグラフである。電極Ｅ４はほぼ一定の正電位に維持されている。しかしながら、他の電極はほぼ中性の電位と、負の電位との間を循環しており、電場に比較的一定の大きさで、方向が循環するようにする。
【０１４７】
電極Ｅ１、Ｅ２、およびＥ３のトポロジー的配置は、セルの形状によって変わることができることに注目されるべきである。たとえば、もしセルが顕微鏡スライドとカバーガラスとの間にあり、セルの厚さが数百ミクロンと測定され得るなら、それは電極Ｅ１とＥ４との間にほぼ水平な電場を生じるであろう。もしセルがマイクロタイターウェル内にあれば、セルの深さはその幅に匹敵するものとなり、Ｅ１とＥ４との間の電場は、より垂直に近くなるであろう。
【０１４８】
電気泳動的促進を改良するための電気化学
電気泳動的な反応促進は、通常の緩衝液中で、電気泳動に必要な電流を供給するために必要な、電極における酸化還元反応に携わるための、水または成分塩類イオン（たとえば、ナトリウムおよび塩化物）の電気分解を用いて行なわれることが可能である。これらの緩衝液の使用に関連した多くの問題があるが、そのために、本発明らは一つの実例として塩化ナトリウムを使用することができる。まず、もしインジウム酸化第一錫（ＩＴＯ）または他の酸化還元活性物質が、一方または双方の電極において使用されるなら（たとえば、光学的に透明または半透明の電導電極を供給するため）、電気泳動に動力を提供する酸化還元電位は、それにおいて電極が酸化還元反応に関与する電位よりも低い必要がある。たとえば塩化ナトリウムを用いた緩衝液の場合には、酸化還元反応が高速で起こる電位は２ボルトより大きく、この電位ではＩＴＯは使用不能である。
【０１４９】
さらに、塩化ナトリウム電気化学の酸化還元産物は、Ｎ2物質を含んでおり、これは水中で反応して強塩基ＮａＯＨ、およびＣｌ2を形成し、後者は水と反応して強力な酸化剤を形成する。これらの試薬は、非常に活性があり、電極に向けて電気泳動されているターゲット１１４およびタグ２７０にとって有害なことがある。
【０１５０】
また、塩は電気泳動に対して導電性を与えるが、それはまた、移動中の帯電された物質と競合する−緩衝液の導電率が大きいほど、物質によって発生する電気泳動力は低い。すなわち、緩衝液の導電率を制限することが有利である。それゆえ一般的には、緩衝液の導電性は１ｍＳ／ｃｍ未満であることが好ましく、緩衝液のさらに好ましい導電性は１００μＳ／ｃｍ未満であり、緩衝液の最も好ましい導電性は１０μＳ／ｃｍ未満である。多くの例において、それは緩衝液のイオン強度に関しては重要であるが、たとえば、細胞の生存率のため、またはタンパク質または核酸の反応（たとえばハイブリダイゼーション）を保存するため、またはそのかわりに緩衝液にｐＨ範囲を維持させるためには、ある妥当なレベル（たとえば＞１０ｍＭ）に維持されるべきである。このような場合、両性イオン性分子を使用してイオン強度またはｐＨを維持することが便利である。特に、核酸のハイブリダイゼーションが所望される場合には、ヒスチジン緩衝液の使用が便利である（米国特許第６，０５１，３８０号参照）。
【０１５１】
適当な酸化還元促進剤の選択
これらの影響を低減するためには、前文にリストされた問題に苦しめられない酸化還元剤を供給することが好ましい。かかる試薬の一つの実例は、ベンゾキノン／ハイドキノン系である。この場合、ハイドロキノンはアノードでベンゾキノンヘ酸化され、ベンゾキノンはカソードでハイドロキノンへ還元される。反応は電極において相補的である（すなわち、逆の電位をもつ）ことから、セルの電位は、電極における標準電位の差異よりもむしろ濃度の差異に起因しており、したがって、電気泳動酸化還元反応は二つの電極の間の比較的低い電位において起こる。さらに、この２種は帯電されていないため、この酸化還元剤は溶液の導電性を有意に増大せず、したがって荷電分子（たとえばＤＮＡ）または電気泳動による移動のための物質（たとえば細菌）と競合しない。
【０１５２】
上記のような酸化還元スキームは、開放または閉鎖系のいずれかについて可動させることが可能である。図１４Ａは、電気泳動用の閉鎖系の略線図である。上部の基板１２０８７０の上はカソード８５０であり、下部の基板上はアノード８６０である。電極の間の領域は、二つの化合物、上記の議論によりベンゾキノンであることが可能な酸化された分子（ＯＸ１）、および上記の議論によりハイドロキノンであることが可能な還元された分子（ＲＥＤ１）である。カソード８５０において、ＯＸ１はＲＥＤ１へ還元され、それは次に電気泳動によるか、または拡散によってアノード８６０の付近へ移動する。アノード８６０においては、ＲＥＤ１は次にＯＸ１へ酸化され、それは次いで電気泳動によるか、または拡散によってカソード８５０の付近へ移動し、そこでサイクルがそれを繰返すことが可能である。
【０１５３】
可用性の電荷担体（無関係な電解質、ＲＥＤ１および／またはＯＸ１、または輸送されるべき荷電分子または物質）の量に依存して、電気泳動力、およびそれゆえ分子または物質が輸送され得る速度は、ＯＸ１のカソードへの、およびＲＥＤ１のアノードへの拡散速度に限定されることが可能である。この拡散速度は、カソード８５０とアノード８６０との間の距離を小さくすることにより、有意に改善されることが可能である−この距離については２０００ミクロン未満であることが好ましく、この距離が１０００ミクロン未満であることがさらに好ましく、この距離が５００ミクロン未満であることはさらに好ましい。
【０１５４】
図１４Ａの系は閉鎖されており、これにおいて系は環境から孤立されることが可能であり、電気泳動は酸化還元剤の補給なしに無期限に継続されることが可能である。図１４Ｂは、電気泳動用の開放系の略線図である。基板８７０、カソード８５０、およびアノード８６０の配置は、図４８Ａの物と同様である。しかしながら、この場合、互いに再生はしない（ベンゾキノンおよびハイドロキノンにおけるように直接的に、または以下に記述されるような、酸化還元産物の相互のクエンチングにより）二対の試薬がある。カソード８５０においては、酸化された分子ＯＸ３は分子ＲＥＤ３へ還元され、一方アノード８６０では、還元された分子ＲＥＤ２がＯＸ２へ酸化される。産物ＲＥＤ３およびＯＸ２は、互いに反応して反応物を生じることはなく、それゆえ、ＯＸ３およびＲＥＤ２が枯渇されるや否や、電気泳動は終了するであろう。したがってこの開放系では、電気泳動を維持するため、反応物ＯＸ３およびＲＥＤ２が継続して補給されねばならず、このことは一般的には、電気泳動緩衝液中の新たな反応物の、電極の間の空間内への流れを維持することによって達成される。この流れはまた、緩衝液が電極８５０と８６０との間の領域を出るときまで、カソード８５０またはアノード８６０へ何らかの方法で固定されていない限り、輸送されるべき任意のターゲット１１４もまた除去するであろうことが注目されるべきである。
【０１５５】
本発明の中で操作可能な多くの酸化還元ペアがある。上記のように、ベンゾキノンおよびハイドロキノンはこのことのために充分に研究されており、好ましくは１ｍＭより高い濃度で、さらに好ましくは１０ｍＭよりも高い濃度で、最も好ましくは３０ｍＭよりも高い濃度で使用される。ベンゾキノンおよびハイドロキノンの使用は、それらの限定された溶解度によってある程度に制限され、それゆえより極性の、または帯電している誘導体が、その溶解度を増すべく便利に使用されることが可能であり、かかる誘導体は、炭素に結合されていない環状炭素の、ハロゲン、ニトレート、ヒドロキシル、チオール、カルボキシレート、およびアミン、ならびに他のそのような成分による置換を含むことに注目されるべきである。ことが注目されるべきである。この系にとり、結果として生じる酸化還元剤については帯電されていないことが最適であり（以下に示される以外は）、それゆえその分布は系の電気泳動によって影響されず、正に帯電した基（たとえばアミン）による置換は、２−アミノ，５−カルボキシパラ−ベンゾキノンにおけるように、負に帯電した基（たとえばカルボキシレート）による第二の置換によって平衡がとられるようにする。誘導体化されたベンゾキノンおよびハイドロキノンのような場合には、酸化還元剤の濃度は便利に増加されることが可能である。
【０１５６】
他の類似の酸化還元ペアは、ケトン／アルコール、およびアルデヒド／アルコールペアを含み、そのケトンカルボニル基は、アルキルまたはアリール基によってフランク（側面に位置）されることが可能であり、その基はまた、ハロゲン、ニトレート、ヒドロキシル、チオール、カルボキシレート、アミノ、および他の基によって誘導体化され、分子上の電荷を修飾するか、またはその溶解度を増大するようにすることが可能である。もう一つの便利な系は、ジチオスレイトール／ジチオエリトリトール、およびそれらの酸化された形状のもの（還元された形状の溶液の部分的な酸化によって形成されることが可能なもの、たとえば、過酸化水素による）か、または別法として、末端チオール基をもつアルカンによるものである（たとえば、１，５ジチオブタン）。一般に、二つのチオール基にとって、別個の分子上（たとえば、ベータ−メルカプトエタールにおけるような）とは対照的に、同一の分子上にあること（ジチオスレイトールにおけるように）が好ましく、そのため酸化反応は一分子反応であって、濃度に対して相対的に感受性が低い（しかしながら、ベータ−メルカプトエタールのような単一のチオールは、多くの適用のために許容される）。
【０１５７】
上記の酸化還元ペアが、双方の酸化還元ペア上の電荷が同じであって、かつ好ましくは中性であるような様式で、電子のペアで酸化および還元されることが注目されるべきである。電子のペアが伝達されるという必要条件は、しかしながら、反応の速度を低減する可能性があり、それゆえ一方の電子が酸化還元反応において伝達されるペアを使用することもまた便利である可能性がある。かかるペアの実例は、フェロセン／フェロシニウム、およびそれらの誘導体、およびフェロシアニド／フェリシアニドを含む。かかる場合、還元された産物が中性に帯電され、酸化された産物は正に帯電されるペアを使用することが、負に帯電した分子または物質が輸送される場合には好ましい。この理由は、酸化産物が負に帯電した輸送された分子の輸送に対して反対電荷を供給し、かつ還元産物は帯電されず、それゆえ負に帯電した郵送分子とは輸送に関して競合しないからである。
【０１５８】
この系のもう一つの形態は、酸化還元反応の産物が互いにクエンチする以下のようなものである：
アノード：２Ｉ-−２ｅ-  →  Ｉ2
カソード：Ｓ4Ｏ6-2＋２ｅ-→２Ｓ2Ｏ3-2
この反応の産物は、２Ｓ2Ｏ3-2＋Ｉ2→Ｓ4Ｏ6-2＋２Ｉ-、に従って互いに自発性に反応し、出発状態を再生する。
【０１５９】
再循環のないオープンループ系においては、酸化還元ペアが各々の反応の間に互いに再生することはなく、酸化還元剤の範囲はより広く、かつグルタチオン、アスコルベート、メチルビオローゲン、フェナジンメトサルフェート、トロロックスなどを、それらの酸化還元ペア（グルタチオンにはＧＳＳＧ、アスコルベートにはデヒドロアスコルベート、メチルビオオローゲンには酸化されたメチルビオローゲンのような）を含めて、便利に含む。この場合、分子の電荷は、反応物が電極へ向かって引き寄せられ、そこで酸化還元反応に加わるようにすること（すなわち、アノードにおいて酸化される反応物は負に帯電されるべきであり、カソードにおいて還元される反応物は正に帯電されるべきであること）が時には便利である。このことは、一般に、一以上の適当に帯電された成分を用いて分子を誘導体化することにより達成されることが可能である。これについての主な不都合は、負に帯電した酸化還元剤が、反応の速度が増加する間に、負に帯電した輸送分子と競合する可能性もあり、酸化還元反応物の量を増すことが、輸送分子の全体の輸送を減少させる可能性さえもあることである。したがって、実験を通して、負に帯電された酸化還元剤が全体的に有害作用をもたないことを確認するための注意が払われる必要がある。
【０１６０】
しかしながら、低分子の酸化還元ペアは、その高い拡散速度のゆえに、電気泳動によって穏やかに影響されるのみであり、カソードとアノードとの間に一般的に存在する短い距離にわたる、控えめな勾配を電極の上に示す（しばしばわずか２〜３倍であり、一般的に１０倍未満である）ことが注目されるべきである。この場合、一方または双方の酸化還元剤を中性または正に帯電させることが有用であってもよい。双方の薬剤が正に帯電されている場合、正に帯電したアノードにおいて反応する薬剤は、アノードにおける低い局所濃度を補正するべく、全モル濃度が大きいことが好ましい。
【０１６１】
微生物が酸化還元剤の存在下に輸送される場合は、上記の酸化還元剤のいくつかが微生物に対して毒性をもつ可能性があることに注意することは重要である。生きた生物のその後の増殖およびモニタリングが所望される場合には、このことは重大な問題である。その理由から、低濃度の毒性酸化還元剤（一般には酸化剤）を使用することか、微生物が薬剤に暴露される持続時間を制限すること、または、たとえその薬剤がより少ない所望の酸化還元特性をもつとしても、低い毒性の薬剤を使用することが有用である。さらに、毒性の酸化還元剤に暴露されていた細菌が、暴露の後に、中和的薬剤で処理されることが可能である。たとえば、毒性の酸化還元剤が酸化剤であるなら、ベータ−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールのような還元剤の添加が、該酸化剤の影響を軽減することができる。
【０１６２】
酸化還元剤を使用することの目標が、低い電位において電気泳動が起こることを可能にして、有害な酸化還元産物（たとえば、塩化物からの塩素産物）の産生を最少化すること、ならびにＩＴＯ電極を用いて光学的検出が行なわれるようにすることであって、これらは高い電位では有害である可能性があることに注目されるべきである。したがって、適用のために選ばれる酸化還元ペアのためのセル電位は、好ましくは２Ｖ（この電位においてＩＴＯは侵され始める）未満であり、さらに好ましくは１Ｖ未満であり、最も好ましくは５００ｍＶ未満であるが、このことは、電気泳動が行なわれる最も低い電位（すなわち５００ｍＶ）と終点（すなわち２Ｖ）との間の電位の範囲が、電気泳動の速度にある程度の制御を与えることができるからである。酸化還元剤の標準的なセル電位がこのような範囲を出るかもしれない場合であっても、異なる濃度の酸化剤および還元剤の使用は、有用な操作を可能にするセル電位を提供することが可能である。
【０１６３】
不動態化
酸化還元産物はアノードにおいて発生され、カソードは、これらの表面へ輸送されている分子および物質に対しては潜在的に有害であり得る。たとえば、多くの酸化還元剤はアノードにおいてＨ+を発生し、それは局所的なｐＨの低下を引き起こす。このｐＨの低下は、もし充分に大きい場合には、核酸のハイブリダイゼーションを破壊し、タンパク質を変性させ、タンパク質−タンパク質、またはタンパク質−核酸相互作用を遮るか、または細菌を殺すことが可能である。潜在的に危険な他の酸化還元産物はまた、強塩基、および強力な酸化または還元剤も含む。これらの産物を、アノードまたはカソードにおいて検出されるべき分子または物質に干渉することから防ぐため、電極上に不動態化層をもつことが好ましい。
【０１６４】
一般的には、この不動態化層にとり、タンパク質および核酸が不動態化層の化学的または物理的性質によって、直接的に有害な影響を受けないこと、および不動態化層が電極において起こる酸化還元反応に有意な有害作用をもたないことが便利である。不動態化層は少なくとも厚さ２ナノメートルであることが好ましく、さらに好ましくは、不動態化層は少なくとも厚さ５ナノメートルであり、最も好ましくは、不動態化層は少なくとも厚さ２５ナノメートルであって。ターゲット１１４およびプローブ１１６の、電極における酸化還元反応の産物との相互作用が低減されるようにする。不動態化層の便利な形状は、検出のためのプロセスがそこへ付着されることが可能な官能基を用いて修飾された、ポリアクリルアミド（たとえば、アマシャム（Amersham）によるコードリンク（Codelink））またはポリエチレングリコール成分（アクセルｒ８（Accelr8）によるオプティケム（OptiChem））を含んでなるポリマーを含む。
【０１６５】
不均一性のアーチファクト
１０ｍＭベンゾキノンおよび１０ｍＭハイドロキノン、インジウム酸化第一錫（ＩＴＯ）電極３００ミクロンの分離、および１．５ボルトよりおおきい電位およびＩＴＯの破壊よりも低い電圧、という条件下において、可溶性（たとえば、蛍光色素へ結合された核酸）または不溶性（たとえば、ポリスチレン球）のマーカーに不均一性が発生することが観察されている。不均一性は濃縮および希薄化の領域によって明示され、濃縮の領域は直径数百ミクロンのほぼ円形のスポットの領域で始まり、それは長くなり、セルのパターンに濃縮されていき、これにおいて、エッジは濃縮の領域であり、セルの中央領域は希薄化の領域である。図１５は、その中でかかるセルが形成された、直径約１ｃｍの領域の平面略図である。一般に、この不均一性は電気泳動による輸送の加速の使用に対し、障害である可能性がある。
【０１６６】
この不均一性を軽減する多くの方法がある。第一の軽減法においては、電気泳動力の強さが、電圧を低減することによるかまたは溶液の導電性を増大することにより、軽減されることが可能である。たとえば、１０ｍＭベンゾキノンおよび１０ｍＭハイドロキノンからなる、非常に導電性の低い溶液（たとえば＜１００μＳ／ｃｍ））中では、セルは１．４ボルト未満では非常に強く現れることはない。第二の軽減法においては、強い電気泳動力の期間は、弱い電気泳動力かまたは電気泳動力のない期間によって散在されることが可能であり、弱い電気泳動力の量は、好ましくは最大の力の５０％未満であり、さらに好ましくは最大の力の２５％未満であり、最も好ましくは、最大の力の１０％未満である。一般に、強い電気泳動力の期間は、セルが最初に形成されるときの物よりも少なく、かかる期間は、好ましくは５秒間を超えず、さらに好ましくは２秒間を超えず、最も好ましくは１秒間を超えない。電気泳動力のない期間は、便利なことに、実質的にセルの縦のサイズ（すなわち、電極間の距離）に匹敵する大きさの距離までのイオンの拡散を可能にするべく充分であり、好ましくは１００ミリ秒間より多く、さらに好ましくは３００ミリ秒間より多く、最も好ましくは１秒間よりも多い。第三の軽減法においては、チャンバー８０５の壁の不均等な加熱による温度対流の使用によるか、またはチャンバー８０５を通る流体の動きを通して、液対流にセルを分解させることが便利である。
【０１６７】
ＩＴＯまたは他の透明な電極物質は、可視的な指標によるリアルタイムモニタリングにとって好ましいが、このことが、カソードおよびアノードの双方がＩＴＯを含んでなる必要があることを意味するのではないことに注目されるべきである。別の例では、電極の一つが透明であって、反応セル内の観察を可能にするが、他の電極は相対的に非活性な、金または、電気泳動において安定なプラチナ、パラジウム、またはイリジウムといった耐熱金属のような、半透明電極であることが好ましい可能性がある。これらの場合、金属電極内の抵抗は非常に小さく、そのことは上記の不均一性を軽減することが可能であり、さらに、金属電極上の電位はＩＴＯ電極と同様の有害作用をもたないことがあり（たとえば、Ｐｔ電極について）、より高い電位がセルにおいて使用されるようにする。
【０１６８】
別法として、双方の電極が半透明であって、一つの電極が金でコートされることが可能である。この場合、検出は、表面プラズモン共鳴によって光学的に行なわれることが可能である。
【０１６９】
混合および電気泳動の組合せによる反応の加速
もし電極２００がセルの横のディメンションに対して小さいとすれば、電極２００へ向かう力の適用は、結果として、タグされたターゲット２７５の比較的均等な分布を電極上に生じるであろう。もし特定の位置１７０が電極２００のサイズに比較して小さければ、このことは、タグされたターゲット２７５のわずかな部分のみがプローブ１１６に結合される結果になるであろう。それゆえ、混合する段階を、電極２００へ向かう力の適用と、一緒に、または点在させて、組合せることが有利である。このことは、タグされたターゲット２７５の、プローブ１１６との反応を促進するようにするための、垂直力および水平力を含んでいる、反応の略ブロック図、図１６Ａに描かれている。水平力のような、混合を与える方法は、下文において詳細に議論されるが、セル内の媒体の物理的な混合（たとえば、物理的な撹拌機構、ポンプ、電気浸透流、表面波音響学、および他の手段による）、ターゲット１１４に対する水平な電気泳動力の使用、ターゲット１１４に対する磁力の使用、および他の便利な手段を含むとみなすことができる。溶液の総体流を含むこれらの力（たとえば、電気浸透現象、撹拌、ポンプ、および表面音響学）は、実行することが特に容易である。垂直力は、電気泳動、誘電泳動、濾過、磁場の誘引、および、タグされたターゲット２７５（またはタグされていない適当なターゲット１１４）をプローブ１１６の近くに運ぶことができるような、他の力を含むことが可能である。
【０１７０】
「垂直」および「水平」の使用が電極の表面に対する関係において使用され、重力、上／下、または他の座標スキームに関連していないことに注目されるべきである。線図の方向を仮定すれば、水平とは、この状況において電極（またはさらに一般的には、その上にプローブがある表面）に平行であることと理解されることが可能であり、一方垂直とは、この状況において電極に垂直であることと理解されることが可能である。
【０１７１】
実例を目的として、ターゲット１１４は短鎖ＤＮＡ４７０であり、タグされたターゲット２７５は付加的に電気泳動用タグ２７０を含む。プローブ１１６は、相補的な短鎖ＤＮＡプローブ４８０を含んでおり、それは基板１２０へ付着されている。垂直力は、タグされたターゲット２７５をプローブ４８０に向けて下向きに移動させ、一方水平力は、タグされたターゲット２７５が、アレイ１９０内の種々の位置１７０におけるプローブ４８０と相互作用できるようにする。
【０１７２】
図１６Ｂは、タグされたターゲット２７５の混合を引き起こす水平力に対する時間関係における、タグされたターゲット２７５の垂直の移動を引き起こす電気ポテンシャルのグラフである。このグラフの目的のため、正の水平力は、基板１２０に沿った一定の任意の方向にあるとみなされる。さらに、正の垂直力は、プローブ４８０へ向かうタグされたターゲット２７５の動きを促進する方向にあると考えられる。図から分かるように、水平力は比較的一定である。しかしながら、垂直力はやがて変化し、あるときは中性であり、別のときは非常に強いことがある。垂直力は、垂直力の適用の間に基板１２０上に巻込まれていく可能性のあるタグされたターゲット２７５を、垂直に移動させる。垂直力は、タグされたターゲット２７５をプローブ４８０の近くに運ぶ目的で、長い継続時間Ｔ７にわたって最初に適用される。一旦ターゲットが基板１２０の表面に対して密に近接すれば、次の垂直力の適用は、より短い継続時間か、または大きさの小さいものか、または双方であることが可能である。
【０１７３】
たとえば、水平力が、大きさおよび継続時間において、反応の過程の間にタグされたターゲット２７５が位置１７０のおよその幅を移動させるのに充分であることを考慮されたい。かかる場合に、位置１７０は、拡散を最小と仮定すると、水平力の適用がないときの、約２倍のタグされたターゲット２７５に遭遇する。
【０１７４】
水平力に関しては、方向を切換えて、タグされたターゲット２７５がプローブ１１６の上を前後に移動するようにすることもまた、本発明の精神の範囲内にある。かかる場合には、ターゲット２７５はプローブと相互作用するための多数の可能性をもつことになり、それによりその結合は増加するであろう。また、プローブがヒドロゲルコーティングを介して付着されている場合には、もしターゲットが一方からもう一方の方向へ移動しているなら、プローブ１１６はターゲット２７５との相互作用から立体的に妨害されることがあり、プローブを横切って前後に移動して、ターゲット２７５の異なる動きを提供するようにすることは、ターゲット２７５にとって有利である可能性がある。
【０１７５】
混合された垂直／水平の反応力の調節
図１７Ａは、水平および垂直力を調節する手段の略ブロック図である。電極２００は基板１２０上に位置しており、水平力のアプリケータ５２０によって囲まれている。水平力を適用するための様々な手段は、下文に詳細に記述される。アプリケータ５２０は、コントローラ５１０へ連結されており、それは次に検出器５００からの入力を受信する。コントローラは、アプリケータ５２０によって適用された水平力、ならびに電極１９５および２００によって向けられた垂直力の、双方の大きさを調節する。検出器５００は、電極２００に対して密に近接したタグされたターゲット２７５を、リアルタイムでモニターする。すなわち、電極２００の数十または数百ナノメートル以内にあるタグされたターゲット２７５が検出され、電極からさらに遠い距離にある他のタグされたターゲット２７５は検出されない。検出器５００によってこのリアルタイムのモニタリングが行なわれる手段は、下文に詳細に議論される。
【０１７６】
図１７Ｂは、図１７Ａの系の略ブロック工程系統図である。段階５３０においては、コントローラ５１０が、電極１９５と２００との間に作用されるべき垂直力を引き起こし、タグされたターゲット２７５が電極２００へ向かって移動するようにする。段階５３２においては、検出器５００からの入力が、コントローラ５１０によって使用され、電極２００に対して並置されている、増加しつつあるタグされたターゲット２７５の量が検出されているかどうかを測定する。もし増加しつつあるターゲットが検出されれば、継続した垂直力が段階５３０において適用される。もし、検出器５００によって新たなタグされたターゲット２７５が検出されなければ、コントローラ段階５３４において垂直力を緩める。段階５３６では、水平の力または流れは、維持されるかまたはこの地点で活性化される。段階５３４における垂直力の緩和のゆえに、電極２００の表面からのタグされたターゲット２７５の拡散は、水平の力または流れの影響下となり、電極２００の表面に沿って水平に移動する。段階５３８では、検出器５００は電極２００の表面に並置されたタグされたターゲット２７５の量をモニターする。もしターゲットの量がさらに減少しているなら、段階５３４における垂直力が維持される。別法として、固定量の時間が経過されるようにすることが可能である。ひとたび検出器５００によって検出されたターゲットの量が比較的安定するか、または固定量の時間が経過されれば、段階５３０で始まるサイクルが繰返される。
【０１７７】
水平の力および流れ
本発明の精神の範囲内において使用されてもよい、多くの異なる水平の力および流れがある。とりわけ、これらは電気泳動力、電気浸透、音響波、機械的撹拌、および液体ポンピングを含む。たとえば、図４Ｂにおいては、側方にある電極２１０および２２０が、タグされたターゲット２７５へ水平力を適用するべく使用されることが可能である。かかる場合、垂直の電場の大きさは、電極２１０および２２０からの水平な電場の大きさに関連して、基準電極１９５上の電位によって調整されることが可能である。
【０１７８】
音響波については、電圧アクチュエータが基板１２０上またはカバー１１１上に、トポロジカルな配置に置かれることが可能であり、高周波のコントロールシグナルの下に、ガラス内の表面音響波が流体の物質輸送を引き起こし、その中にタグされたターゲット２７５が浮遊される。かかる場合、セル内には対流が引き起こされ、それが基板１２０の表面を横切る一定の層流を維持する。電圧シグナルの調節を変えることにより、乱流混合の周期が層流の周期とともに変えられることが可能である。
【０１７９】
機械的または電気浸透ポンピングもまた、基板１２０を横切る層流を引き起こすべく使用可能である。機械的ポンピングは、より大きい体積用には便利であるのに対し、電気浸透ポンピングは、極めて小さい体積の場合でも補助するべく使用可能である。かかる場合には、電気浸透表面は基板１２０内へ、またはさらに便利なことには、カバー１１１内へ取込まれることが可能であるが、その理由は、基板１２０はしばしば、主としてプローブ１１６を結合するべく、かつ非特異的結合の量を低減するべく使用された、特定用途向けの表面によってカバーされており、電気浸透力を引き起こすためには有効性の低い表面であるかもしれないことである。
【０１８０】
図１８Ａは、マイクロタイタープレートウェル５５０内で使用可能な機械的撹拌系の斜視図である。マイクロタイタープレートウェル５５０は、電気的トレース５５８によってマイクロタイターウェル５５０の外側に連結された底面上に、丸形のプローブ電極５６０を有する。基準電極５７０は、図に示されていないアクチュエータに対し、機械的および電気的連結の双方を有するシャフト５５２上にマウントされている。
【０１８１】
操作の間、シャフト５５２は、それを通して電位バイアスが基準電極５７０上に置かれることが可能な電気的連結のみならず、加えて、シャフト５５２が基準電極５７０に回転を引き起こす。アナライト流体の粘性のゆえに、流体はマイクロタイタープレートウェル５５０のまわりの円運動において、ウェル５５０の中心からの各々の半径内の運動の程度とほぼ同程度に対流する。基準電極５７０においてシャフト５５２の回転の向きを逆転することにより、ウェル５５０内に乱流が誘導されることが可能である。
【０１８２】
状況の対称性のため、また各々のプローブ位置１７０にほぼ等しい量の導電流をもつことのへの要望から、プローブ電極５６０は円対称性をもつことが好ましいことが注目されるべきである。図１８Ｂは、プローブ５６０電極の平面図である。電極５６０は、トレース５５８へ付着された導電性の物質からなる環状輪としてアレンジされている。プローブ位置１７０は、環の周りにアレンジされ、マイクロタイターウェル５５０の中心からほぼ等距離にある。この配置においては、電場か、またはターゲット１１４のプローブ１１６に対する結合には、何ら物理的な位置に基づく嗜好性はない。さらに、電極５７０によって誘導された導電性の層流は、タグされたターゲット２７５に、電極５６０の周りの円運動における移動を引き起こす。
【０１８３】
基準電極５７０にとり、シャフト５５２の底に対照的に配置されるのではなく、むしろ非対称的に配置されることが、別法として便利であることが可能である。かかる場合には、電場の方向はシャフト５５２によって回転し、上記のように、電場の方向を変えることの利点を提供する。
【０１８４】
マイクロタイタープレートアッセイは、一度に一つか、または一度に多数のアッセイを処理することが可能である。図１９Ａは、電極５７０およびシャフト５５２のセットをもつ、マイクロタイタープレート５９０の斜視図である。電極５７０およびシャフト５５２は各々、格子内にアレンジされた単一のマイクロタイターウェル５５０内にはめ込まれる。電極５７０およびシャフト５５２は、回転するか、または固定された位置にある。配置に依存して、全ての電極５７０およびシャフト５５２が互いに固定されて、全てのウェルにおける平行した操作および単純で高価でない構築を可能にするか、または、個々の電極５７０およびシャフト５５２が独立して制御されることが便利である。別法として、示されたようなシャフト５５２および電極５７０の、二次元のアレイの代わりに、マイクロウェルプレート上の一列のウェルが同時に処理される、一次元のアレイがあることが可能である。
【０１８５】
マイクロタイタープレート５９０は一体型のものか、または別法として、トッププレートおよびボトムプレートから構成され、これにおいてトッププレートはプラスチック製であて、ウェルの側面を規定しており、一方ボトムプレートはプラスチック、ガラス、または、実質的に平らな他の物質からなり、非特異的結合を低減しかつプローブ１１６がそれに対して結合することが可能な物質でコートされている。かかる場合に、ボトムプレートは、好ましくはプローブ位置１７０のアレイ１８０の印刷の後に、接着剤を用いてトッププレートへ接着される。本発明の目的のためには、電極について、プローブ１１６の印刷またはボトムプレートのトッププレートへの接着に先立ち、ボトムプレート上に配置されることが便利である。
【０１８６】
図２０Ａは、ボトムプレート５９２上のウェル電極５９８の配置の平面図である。ウェル電極５９８は、四角形（示されているように）、長方形、楕円形、円形、または輪状（電極５６０のように）であることが可能であり、トレース５５８を介してエンドパッド５９４へ連結される。これらのトレースは比較的一定の幅のものであることが可能であるが、好ましくはウェルの位置では狭く（点線によって示されている）、そこでは電気伝導性の領域のほとんどが好ましくはウェル電極５９８のものである。電極５９８の部分ではない電気伝導性のトレースについては、非導電性のコーティング（たとえば、半導体物質、セラミド、酸化物、および他の物質）でカバーされることも本発明の精神の範囲内にあるが、このことは製造の付加的な段階およびコストであり、常に便利であるというわけではないであろう。さらに、プローブ位置の下にない電極については便利かもしれない、多数のトレースがウェル当たりにあってもよい。
【０１８７】
各電極５９８については、アタッチメントパッド５９４があり、これに対して電気的連結が作られる。このことは、ウェル５５０（および、それゆえ電極５９８）の数が非常に大きくなる場合には便利さが少ない。別法として、ボトムプレート５９２上の電気的に連結されたウェル電極５９８の配置の平面図、２０Ｂに示されるように、多数の電極５９８が単一のパッド５９３へ連結されることが可能である。たとえ全ての電極５９８が同時に使用されるのではないとしても、この配置は単純な電気的連結性を可能にし、不使用の電極５９８との並列連結に関しては、何ら不都合が生じない。全ての電極５９８の連結が、横または縦の単一列のウェル５５０のアレイ内にあるが、各々の縦または横の列は異なるアタッチメントパッド５９４へ連結されているといった、他の配置もまた本発明の精神の範囲内にある。
【０１８８】
上記のように、ボトムプレート５９２はトッププレートへ付着される。もしボトムプレート５９２がトッププレートよりも小さければ、パッド５９４または５９３はプレートの下からの（トップおよびサイドを経るアクセスはトッププレートによって妨げられる。）電気的なアタッチメント装置によって取込まれることが可能である。トッププレートおよびボトムプレート５９２の相対的なサイズに関係なく成功する別の配置は、アクセスポート５９７を含んでなるトッププレートの斜視図、図１９Ｂに示されている。この配置において、アクセスポート５９７は、パッド５９３または５９４と連結するためのサイドアクセスを提供する。アクセスポート５９７は、パッドの位置、数、およびサイズにしたがって配置されており、単一のポート５９７からの多数のパッドへのアクセスは、本発明の精神の範囲内にある。
【０１８９】
別の配置は、均一に導電性であり、かつ大地電位に維持されるためのボトムプレート５９２についてである。かかる場合には、各マイクロタイターウェル５５０内の電場は、対応する電極５７０上の電位を調節することにより、独立して調節されることが可能である。一つの電極５７０がその時点で動作している場合には、均一な導電性のボトムプレート５９２の使用が簡単である。多数の動作している電極５７０によって多くのウェル５５０が同時に動作される場合、もし各ウェル内のアナライト溶液の電気伝導度がボトムプレート５９２のものに対して相対的に低ければそれが最適である。アナライト溶液の電気伝導度は、たとえば、溶液中のイオン濃度を低下することによって調節されることが可能である。
【０１９０】
マイクロタイターウェルは、ボトムプレート５９１上の永久電極の使用なしに、本発明の範囲内で使用可能である。図２１は、マイクロタイタープレート用の一体化された電極の斜視図である。一体化された電極６６０は、独立して調整されることが可能な３つの電極：基準電極６０６、第１の側方電極６１０、および第２の側方電極６１２、のセットを含んでなる。これらの電極の各々が、今度は、独立して調節されることが可能な電極を含んでなることが可能である。
【０１９１】
電極６０６，６１０、および６１２は、垂直の部材６０８およびプレート６０２を含んでなるシャフト上にマウントされており、それは物理的支持ならびに電気的連結の双方を提供する。電気的入力調整はシャフト６０４を介して与えられ、それは物理的および電気的の双方の連結を同様に含む。シャフト６０４の数は、１のように小さいことが可能である。側方電極６１０および６１２は、図４Ｂの電極２１０および２２０にほぼ相当しており、基準電極は電極１９０にほぼ相当する。これらの電極は、金のような、比較的反応性のない高い導電性の金属を便利に含んでなる。側方電極６１０および６１２にとり、比較的薄いことが好ましく、かつその内側のエッジは先細りになって平らな低い表面を維持することができ、電場が電極６００の底の近くに調節されるようにすることが好ましい。
【０１９２】
一体化された電極６００は、マイクロタイタープレートウェル５５０内に配置され、側方電極６１０および６１２の底部表面はウェル５５０の底の、上または非常に近くに置かれ、プローブ１１６のアレイ１８０が二つの側方電極の間に位置するようにする。電極６００は、図４Ｂの配置と同様に動作する。各アッセイの終わりには、電極６００はウェル５５０から除去され、強くかけられた電位、溶液中での物理的撹拌、および、強酸、酸化剤、および他の洗浄溶液中でのできる限りの化学洗浄を用いて洗浄される。電極６００については、ほぼ円形に、または前後運動において向きが変えられ、上記の方法にしたがってターゲット１１４を混合および／または移動させるようにすることもまた、本発明の精神の範囲内にある（図３３Ａおよび３３Ｂ参照）。
【０１９３】
電気泳動操作を用いたシグナル発生の促進
いくつかの場合に、タグされたターゲットは、種々の手段によって検出可能なシグナルを発生する目的で、その後の基質への暴露を必要とする。たとえば、化学発光は、化学発光シグナルを発生するため、酵素タグに対する基質の添加を必要とする。電気泳動力は、酵素の近傍に基質を運ぶことによって酵素反応を駆動しするべく使用されることが可能であり、次いで、反対に荷電された状態への基質の酵素的変換に際し、変換された基質を迅速に酵素から払いのけるべく使用されることが可能であって、酵素による基質のより迅速な変換を可能にする。
【０１９４】
洗浄−検出
概要
上記の段落においては、多くの参照は、電極上のバイアスを増すことにより、得意的に結合したもの対非特異的に結合したものを識別するためになされており、それは静電力の量を増すことにより、タグ２７０および付着されたターゲット１１４をプローブ１１６から引き離す。このプロセスは、電気泳動力を用いた識別についての略ブロック工程系統図、図２２にさらに詳細に記述されている。
【０１９５】
段階４００においては、任意の化学洗浄が使用されて、緩く結合された非特異結合物質を除去する。このような化学的（watches）は、低塩、高ｐＨ、または、ターゲット１１４とプローブ１１６との間の結合力を低下させる他の化学処理を含むことが可能である。
【０１９６】
段階４０２においては、段階４００で行なわれた化学洗浄が、ターゲット１１４とプローブ１１６との間の結合力を増大する傾向があるスタビリティバッファによって置換えられる。スタビリティバッファは、ターゲット１１４およびプローブ１１６が偶発的に離れる機会を減少させる。段階４００がない場合には、段階４０２もまた任意に削除されることが可能であることが注目されるべきである。
【０１９７】
段階４０４においては、プローブ１１６へ付着されたタグされたターゲット２７５が視覚的にモニターされる。一般的には、このことはアレイ１８０の画像を取込むことか、または以下に記述される方式でアレイ１８０を走査することを含むであろう。一般に、検出手段は電気泳動用タグ２７０において使用された指標成分のタイプに適合する。プローブ１１６に結合していないタグされたターゲット２７５が、この状況においてモニターされないことが重要である。結合していない電気泳動用タグ２７０からの結合した電気泳動用タグ２７０の識別のための、リアルタイム検出の方法は、前文および下文において記述されている。段階４１２では、取込まれた視覚データが記憶される。
【０１９８】
段階４０６では、プローブ１１６から離れる正味の垂直のバイアスが、下文に記述されるような方式で増加される。この増加は一般に、図９に示された様式の漸次的増加であろう。段階４０８においては、電気泳動力からの最大の緊縮が達成去れたかどうかが測定される。もし達成されていない場合には、段階４０４において新たな視覚データが取込まれる。もし最大の緊縮が達成されていれば、各々の電気泳動的緊縮に関する結合の差異が、段階４１０における連続的な取込み視覚データ間の差異から、下文に記述されるようにコンピュータ計算される。
【０１９９】
視覚的検出用には、使用可能な多様な照明スキームがあることに注目されるべきである。このような照明スキームのいくつかは、位相差型および他のタイプの顕微鏡における使用のための、特殊化されたコンデンサを必要とする。光散乱の検出における使用、ならびに蛍光、量子ドット、およびアップコンバート性蛍りん光体、およびいくつかの他の検出様式の使用については、他の形状の照明が使用されることが可能である。ターゲット１１４またはそのタグ２７０と相互作用しない光は、しばしば検出に干渉することが防止されることが可能であること、および、光と相互作用することができるタグ２７０のみが、表面または基板上のプローブ１１６の近位にあるそうしたタグであることができることから、多くの場合、エバネセント波照明が特に役立つ。
【０２００】
平行ビーム照明を用いたエバネセント照明
図２３Ａは、本発明の一つの態様の断面図であり、これにおいて、上部表面上のプリズム１１４０は、スライド導波管１１２０内へ光を導入するべく使用される。図に示されたプリズム１１４０は、三角の平行六面体であって、これにおいて一つの表面はスライド１１２０の上部表面上に置かれており、受入れ表面１１４２はスライド１１２０のエッジ１１２３とほぼ同じ方向に面している。ほぼ平行な光線１１３２は、好ましくは表面１１４２に対してほとんど垂直であるが、垂直でなくてもよく、それゆえ表面１１４２において屈折され、ほとんど反射なしに表面１１４２へ進入する。これらの光線１１３２は、プリズム１１４０の底部表面に出会い、プリズムの底部表面およびスライドの上部表面１１２２の平面性および近位のため、光線１１３２は、プリズム１１４０とスライド１１２０との間の隙間を切抜け、スライド１１２０に入る。光線１１３２の方向は、光線１１３２が、スライド１１２０の底部表面１１２４に出会ったとき表面１１２４からほとんど全てが反射するように選ばれ、表面１１２４と下の媒体（一般には空気）との間の臨界角よりも大きい角度で当たるようにする。
【０２０１】
プリズム１１４０の上部表面１１４３は、プリズム１１４０に進入した光線１１３２の全てがスライド１１２０内に捕捉されるように選ばれ、受入れ表面１１４２とプリズム１１４０の上部表面との間の角度が、ほぼ垂直でことは多少便利である。しかしながら、もしプリズムの頂端１１４５がスライドに沿って充分に延長されていたなら、底部表面１１２４から離れて反射された光線経路は、上部表面１１２２へ向かって移動し、プリズム１１４０の底部表面に出会うことも可能であって、結果としてスライドからの光の「逸脱」を生じることに注目されるべきである。このことは、頂端１１４５をスライド１１２０に沿って遠すぎる距離まで延長しないことによって回避されるべきである。
【０２０２】
平行光線１１３２は受入れ表面１１４２に対してほぼ垂直であるように示されており、それゆえほとんど屈折を示していないが、光線１１３２については表面１１４２に対して非垂直に進入し、屈折された光線経路が適当な軌道をもち、スライド内でのほぼ全内部反射を生じる結果となることは、本発明の精神の範囲内である。
【０２０３】
図２３Ｂは、スライドの上部表面上のプリズム１１４０の断面図であり、これにおいて光は、スライド１１２０内への光の導入に先立ち、まずプリズム１１４０内で反射される。多くの場合、アラインメントを助けるため、装置成分を互いにほぼ垂直に保つことが優先され、この場合入射光線１１３２は、スライド１１２０のエッジ１１２３に対し、ほぼ垂直であることが可能である（および、それゆえスライド１１２０の上部表面１１２２に対して平行である）。受入れ表面１１４２は、スライドエッジ１１２３に対して平行であって、光線１１３２が表面１１４２に対して垂直であり、それによって表面１１４２における反射を制限するようにすることが可能である。
【０２０４】
プリズム１１４０の上部表面１１４３での内部反射の後、光線１１３２は次にスライド１１２０内へ適当な角度をとり、全内部反射を示すようにする。プリズム１１４０の表面１１４３での反射の後、光線経路１１３２の角度がプリズム１１４０の傾斜の角度の２倍となること−それゆえ、スライド１１２０内の光線経路１１３２の全内部反射を維持するため、上部表面１４３の傾斜が適度に小さいことが必要であることに注目されるべきである。
【０２０５】
図２４Ａは、遠位の平行光線経路１１３２の配置が見えるように延長された、図２３のプリズム配置の断面図である。平行光線経路１１３２はプリズム１１４０に進入し、次いでスライド１１２０に進入する。光線経路１１３２の平行な性質のゆえに、導波管として作用しているスライド１１２０の平行な壁内の反射のパターンは、スライド１１２０の長さに沿って維持される。もし光線が、平行な一番上の光線経路１１３３および一番下の光線経路１１３５によって境界が付けられ、かつ上部表面１１２２および下部表面１１２４が平行であるなら、照明された部分１１４６には照明されていない部分１１４８が、スライド１１２０の長さに沿って反復して点在する。このことは、スライド１１２０に沿ったレポーター１１１０照明に、有意な差異を生じるであろう。この不均一性は、ワイドビーム照明の使用によってある程度までは対応され得るが、ビームの幅を調節することは一般的に困難となり、照明は厳密には不均一である。
【０２０６】
集光ビーム照明を用いたエバネセント照明検出法
図２４Ｂは、平行照明の代わりに集光照明を使用することによって修飾された、図２４Ａの断面図である。集光照明１１３１はプリズム１１４０に進入し、その間に受入れ表面１１４２においていくぶん屈折される。ガラスのいかなる不具合または界面の汚染物（たとえば、塵）も、光の散乱に寄与することがあるため、光線経路１１３１の集光点は、プリズム１１４０とスライド１１２０との間の界面にないことが便利である。散乱光は、スライド１１２０における全内部反射を必ずしも維持するものではなく、そのため集光点は、好ましくは光１１３１がスライド１１２０に進入する点の前または後である。
【０２０７】
スライド内の光を見ると、一番上の光線光路１１３３および光線光路１１３５の軌道が観察可能である。見て分かるように、光線光路１１３３および１１３５には照明および非照明の領域についての反復性がない。実際には、光１１３１内には広い範囲の光線経路の角度があるため、実際にはスライド１１２０の上部表面１１２２のほとんどが、少数の内部反射のみの後に照明されることとなり、かつ、もし非常に数多くの反射があるとすれば、上部表面１１２２の照明はほぼ均一になる。前と同様に、よい幅広いビームが、一般的には幾分より均一な照明を結果として生じることができる。
【０２０８】
受入れ表面１１４２に進入する照明の発散性の広がりが、集光照明に対して同様の効果をもつこととなり、結果として、上部表面１１２２のほぼ均一なエバネセント照明を生じることが注目されるべきである。
【０２０９】
不均一な照明を用いたエバネセント照明検出法
図２３ＡおよびＢ、および図２４ＡおよびＢの態様は、おそらくスライドの端近くの、固定された位置にある、プリズム１１４０および／または関連する照明源とともに使用されること可能であるが、プリズム１１４０および／または関連する照明源が移動可能であって、スライドの異なる領域、特に照明が意図的に不均一である場所を照明することができることもまた本発明の精神の範囲内にある。
【０２１０】
図２４Ｃは、スライド照明装置の概略断面図であり、これにおいてスライドは不均一に照明される。プリズム１１４０は、スライド１１２０の上部表面１１２２に位置し、コリメータ１１７０からの平行光線１１３２を受入れる。光ファイバーケーブル１１７４は、コリメータ１１７０へ光を伝達し、光ファイバーケーブル１１７４の端から発散する光線はレンズ１１７２によって捕捉および発散され、平行光線１１３２を生じる。
【０２１１】
図２４Ａにおけると同様に、光線１１３２はプリズム１１４０内へ、そこからスライド１１２０内へ進入し、そこで上部層１１２２および底部層１１２４に対して多数回反射し、上部表面１１２２を規則的な間隔１で照明する。長さ１は、２＊ｄ／ｔａｎθ［式中、ｄはスライドの厚さであり、θはスライドの上部または底部表面への光の入射角の補角である］としてコンピュータ計算される。
【０２１２】
検出器１１６０は、スライド１１２０の上部表面１１２０の上の照明のスポット１１４６の上に位置しており、上部表面１１２２の上にあるレポーター１１１０のエバネセント照明から結果として生じるシグナルを検出する。検出器１１６０はまた、上部表面上の距離において、１の整数倍数を超えて位置されることも可能であって、検出器１１６０の、たとえば、プリズム１１４０に対して相対的な位置についてのトポロジー的制約があるべきであることも特に便利であることに注目されるべきである。検出器技術が、イメージング装置（たとえば、比較的一定した光源を用いて動作するＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラ）および非イメージング装置（たとえば、プリズムまたは他のカップリングを通して表面を照明するレーザスキャナと一緒に動作する光電子倍増管（ＰＭＴ））の双方を含むことが可能であることが理解されるべきである。
【０２１３】
この配置は、プリズム１１４０に対して特定の位置にある材料を照明するためには有効であるが、この配置はまた、スライド１１２０の上部の多くの領域を照明するためにも使用可能である。このことは、たとえば、プリズム１１４０および付随しているコリメータ１１７０を一斉に、スライド１１２０の上部表面の上に滑らせることによって達成されることが可能である。プリズム１１４０およびコリメータ１１７０の動きは、結果として、等しい量の照明スポット１１４６の随伴運動を生じるであろう。
【０２１４】
別法として、プリズムは単一の位置に保たれ、コリメータ１１７０がその方向を維持しながら水平または垂直に平行移動され、プリズムに入る光線１１３２の進入点が変えられるようにすることができる。このことは、光線１１３２をスライド内で水平に平行移動することになるであろう。さらに、コリメータ１１７０の回転は、照明スポット１１４６の位置に対して並進効果をもつことになるであろう。上部表面１１２２に沿ったスポット１１４６の効果的な平行移動のためには、おそらくプリズム１１４０の動きと共同した、コリメータ１１７０の一以上の動きの組合せがあるはずであることも、本発明の精神の範囲内である。
【０２１５】
上部表面薄フィルム導波管を用いたエバネセント照明検出法
本発明のもう一つの態様は、一般的には１ミリメートル以上の厚さをもつスライドを使用するよりもむしろ、非常に薄い導波管を作成することである。このことは、様々な方法で達成可能である。たとえば、スライド自体が、おそらくは可尭性のハイインデックスプラスチック材料からなるフィルムとして構築されることが可能である。このことは、フィルムが構造上の剛性を維持するためのものである場合、検出プロセスにおいて用いられる生物学的および化学的反応にとってプラスチック材料が不適当である場合、および、内部反射角度が臨界角よりも小さくなるとき、曲げるための物質が潜在的に光を逃がす可能性のある場合を含め、いくつかの適用においては便利ではないことがある。
【０２１６】
別の態様は、物理的蒸着（たとえば、スパッタリングまたは蒸発）によるか、化学的蒸着によるか、スピンコーティングによるか、ディップコーティングによるか、または、ほぼ一様な厚さのフィルムを供給する他の手段により、スライド基板上に沈着された、ハイインデックス薄フィルム導波管１１８０の断面図、２５Ａに示されている。さらに、グレーデッドインデックス反射薄フィルムは、ゾル−ゲルイオン交換法を用いて産生されることが可能である。かかる薄フィルム導波管の産生法についての総説は、プラウマン（Plowman）、サーベドラ（Saavedra）、レイチャート（Reichert）による「Planar integrated optical methods for examining thin films and their surface adlayers（薄フィルムおよびその表面アドレイヤーを検査するための平面集積光学法）」（Biomaterials、１９９８年、第１９巻、ｐ．３４１−３５５）に提示されている。
【０２１７】
薄フィルム導波管１１８０は、下にある基板１１２０よりも実質的に屈折率の高い物質からなる。この物質は、便利なことにはＴａ2Ｏ5であって、これは薄フィルム干渉フィルタの製造における高インデックス層において一般的に使用されているが、Ｔｉ０2、窒化ケイ素、イオンドープシリカ、およびイオンドープガラスといった他の物質も使用可能である。導波管の厚さは、一般にはガイドされた光の波長のオーダーであり、この場合には、典型的には可視または紫外（ＵＶ）領域内にあり、便利なことには１００〜５００ｎｍ、さらに好ましくは１５０〜２００ｎｍのオーダーである。厚さが小さいことから、厚い導波管（たとえば、スライド）におけるマルチモーダルな光の伝達とは対照的に、一または数モードが導波管内に伝達される（すなわち、シングルモード）。
【０２１８】
薄フィルム導波管内への入射照明の連結は、多くの方法で達成されることが可能である。図２５Ａは、スライド１１２０と一体化された、末端照射された薄フィルム導波管１１８０の断面図である。光ファイバーケーブル１１７４は、カップラ１１８２で終わっているシングルモードファイバー１１７５に沿って光を伝達する。カップラ１１８２はまた、図２５Ａのカップラ１１８２およびスライド１１２０の略平面図、図２５Ｂにおいても見ることができる。ファイバー１１７４を出る光は、コンディショニングレンズ１１７７と出会うが、これは現れる光線の発散を調節するべく使用されるものであって、収束または発散のどちらかでよい。光は次に、円柱レンズ１１７８を通して、ビームが単一のディメンションに収束され、現れる光線が導波管１１８０とほぼ並ぶように方向づけられる。最も適切には、焦点は、導波管１１８０のエッジ表面とほぼ一致する。そのように拘束されたビームは、導波管１１８０内に有意なアドミタンスを得る。
【０２１９】
カップラ１１８２は、光ファイバーケーブル１１７４の末端、ならびにコンディショニングレンズ１１７７および円柱レンズ１１７８を内部に封入している。カップラ１１８２の前頂部上の位置決めリップ１１８３は、導波管１１８０内へ光を連結するべくアレンジされた光学装置類により、スライド１１２０上にカップラ１１８２を位置決めするべく使用される。
【０２２０】
レンズの光学的配置が、本発明の教示の範囲内で変更可能であることが注目されるべきである。たとえば、光ファイバーケーブルは、導波管１１８０のエッジに対し、直接的にバットエンドが並置されることが可能である。別法として、ケーブル１１７４の配置に一部依存して、導波管のエッジ上に収束するコンディショニングレンズ１１７７が除外されることが可能である。
【０２２１】
導波管１１８０の上または、スライド１１２０内へ、多少のビームの漏れがあることが可能であり、連結は非効率的である傾向があることから、非常に狭い導波管については、それが円柱レンズ１１７８からの光の大部分を含む可能性があることが注目されるべきである。導波管上の漏れについては、カップラ１１８２は導波管１１８０の上部に位置する突出部を有しており、これはカップラ１１８２をアラインして光ファイバーケーブル１１７４からの光が導波管１１８０に進入するようにすること、および第二にカップラ１１８２からの前向きの光の漏れを阻止することの双方を助ける。スライド１１２０内への漏れについては、スライド１１２０内へ漏れた少量の光は、スライド１１２０（導波管として作用する）内に拘束される傾向があるであろう。より高い角度をもつ他の光（それゆえ反射しない）は、まずスライド１１２０の底部表面に出会い、そこで漏れることができ、導波管１１８０上のエバネセントまたは他の照明に影響を及ぼすこともない。
【０２２２】
照明を薄フィルム導波管１１８０内へ連結する別の方法は、導波管１１８０の表面上に格子（グレーティング）を配置することである。かかるグレーティングカップラの操作および構築の原理は、プラウマン（Plowman）ら（前文に与えられた参考文献）によって提供されている。図２５Ｃは、導波管１１８０の表面上の格子１１８の断面図であり、これによって入射照明が導波管１１８０内に捕捉される。格子は薄フィルム導波管１１８０の上部表面上に位置されており、入力光１２０２は下から導波管１１８０の上へ向けられる。格子は導波管／基板界面に位置されるか、または多層導波管１１８０内の任意の界面に位置されることも可能である。さらに、導波管１１８０は上から、ならびに下からも照明されることが可能である。
【０２２３】
プリズムは、光を薄フィルム導波管１１８０へ連結するべく使用されることも可能である。図２５Ｄは、薄フィルム導波管１１８０の断面図であり、これにおいて光は、ハイインデックスマテリアルプリズム１２００を経て、導波管１１８０へ連結される。連結のポイントを超えて導波管１１８０に重なっている屈折プリズム１２００のハイインデックスマテリアルは、導波管１１８０において光の漏れを可能にすることから、入力光１２０２がプリズム１２２のエッジに近接して導波管１１８０へ進入していることが注目されるべきである。入力光１２０２は、それゆえ、プリズム１１４０の頂部１２０４へ向けられた、狭い、平行なビームであるか、または頂部１２０４付近へ収束する光のビーム（たとえば、球形の凸レンズかまたは平凸の円柱レンズ）であることが可能である。
【０２２４】
入射光１２０２がプリズム１２００の面に対してほぼ垂直である必要はなく、その表面で屈折して、それが、適切な位置における導波管１１８０への適切な入射角であるようにすることができることに注目されるべきである。導波管１１８０連結のためのプリズム１２００が、三角形か、台形、または他の断面をもつことが、本発明の教示の範囲内にあることが理解されるべきである。
【０２２５】
シングルバウンス非導波管構造を用いたエバネセント照明検出法
上記の態様においては、導波管１１８０内へ捕捉される照明は、スライド１１２０の上部表面の方向へ導入され、そこから検出が行われる。エバネセント波は、光が導波管１１８０内へ捕捉されず、スライド１１２０の上部表面に対して単に一回反射する系によって創製されることが可能であることもまた注目されるべきである。反射の位置において、エバネセント波は創製される。この構造が、いくぶん類似した構造で形成されてはいるが、適当な上部表面位置の照明の後に、光がスライド１１２０によって拘束されないことを除いて、図２４Ｃにおける積分反射の態様と、かなり理論的に重なる部分を共有していることが注目されるべきである。
【０２２６】
図２６Ａは、導波管１１８０の使用のない領域の、エバネセント照明の断面図である。台形プリズム１１９０は、スライド１１２０の底部表面に対して並置されている。入射光１１３２は、受入れ表面１１９２においてプリズム１１９０に進入し、プリズム１１９０を横断し、スライドにその底部表面１１２４において出会う。プリズム１１９０とスライド１１２０の屈折率は等しくなるように選ばれ、それゆえ一般的にはほとんど、または全く屈折なしに、光はスライド１１２０へ進入する。
【０２２７】
光１１３２は、プリズム１１９０およびスライド１１２０の境界において屈折され、基板を横断し、そこでスライド１１２０の上部表面１１２２に出会い、入射光の角度は、その表面１１２２における臨界角よりも大きくなるように選ばれる。したがって、光は上部表面１１２２から反射される。図２６Ａに示されるように、光１１３２は次に、プリズム１１９０へ再進入し、次いで応急の表面１１９４を通って出て行く。目標は、スライド１１２０の上部表面１１２２の領域を照明することであり、それゆえ上部表面１１２２での反射後の光の配置はあまり関心事ではないことに注目されるべきである。したがって、台形プリズム１１９０の代わりに、プリズムはトランケートされる、プリズム１１９０からスライド１１２０に入る光がスライド１１２０内に残り、スライド１１２０がしたがって導波管として機能するようにすることができる。
【０２２８】
実際、プリズム１１９０について、光１１３２がスライド１１２０へ進入するポイントまでのみ延長し、別の方法でトランケートされることがかなり便利であることが可能である。この配列は、スライドの上よりもむしろ下にマウントされている検出器に対し、より空間を与え、いくつかの適用においては、有用であるかもしれない。別法として、適切なスタンドオフ光学があるとすれば、検出はプリズム１１９０を通して行われることが可能である。
【０２２９】
別法として、プリズム１１９０は、検出のための窓を可能にするように構築されることが可能である。図２６Ｂは、図２６Ａによるエバネセント照明の断面図であり、これにおいてプリズム１１９０は、窓１１９３を有しており、これを通して検出器１１６０は、スライド１１２０の上部表面１１２２上の事象を検出する。窓１１９３は、プリズム１１９０の構築の間に作られるか、またはプリズム１１９０が組立てられた後に、プリズム１１９０内に研削される。たとえば、窓１１９３は円錐状のといし車によって作られることが可能であり、スライド１１２０の上部表面１１２２上の照明領域の下に直接穴を開ける。本発明の教示の範囲内で、窓１１９３は、円錐形、長方形の箱、台形の溝、または、異なる形状を組合せた幾何学を含め、多くのトポロジーからなるものであることが可能である。さらに、窓１１９３の代わりに、プリズム１１９０は、二つの「ハーフプリズム」（または入口および出口プリズム）によって配置されることが可能であり、各々がスライド１１２０と連結する領域を含み、ハーフプリズムの間の空間が「窓」領域を含み、そこに検出器１１６０が配置される。
【０２３０】
この窓１９３内において、検出器１６０は、プリズム１１９０からの干渉なしに、下から操作可能であるか、またはプリズム１１９０の側面内にマウントされることが可能であり、検出器１１６０の作動距離は制限されるであろう。
【０２３１】
スライド１１２０およびプリズム１１９０における屈折率は、底部表面１１２４における光の角度が臨界角より小さくて光が基板１１２０内に進入できるようにすること、および、基板１１２０内の屈折光が臨界角より上で上部表面１１２２に出会い上部表面１１２２から反射されるようにすること、という条件とは、異なることが可能であることに注目されるべきである。しかしながら、さらに、プリズム１１９０の境界とスライド１１２０との角度が臨界角に近づくにつれ、透過および反射の間の光の分配は増々反射に向けてバイアスされるようになり、それゆえプリズム１１９０とスライド１１２０との間の屈折率の差は最小であることが好ましい。
【０２３２】
多くの場合、スライド１１２０上の検出領域は、照明装置によって照明される領域に比べて大きく、またスライド１１２０上の照明領域は、スライドに対して相対的に移動されねばならない。この目標を達成する三つの主要な手段がある。第一では、プリズム１１９０および検出器１１６０は、固定位置を維持し、スライド１１２０が移動する。第二では、検出器１１６０および照明が独立して移動する−照明のスポット位置は、コリメータ１１７０の位置を平行移動することによるか、または、コリメータ１１７０がプリズムにマウントされている場合には、プリズム１１９０を移動することによって調節されることが可能である。図２６Ｂの配置は、コリメータ１１７０および検出器１１６０の双方が、プリズム１１９０に対して固定された位置にあり、プリズム１１９０の移動が、自然にかつ便利に、照明および検出手段の位置を一致して変え、固定された相互関係を維持するようにする。プリズム１１９０への照明および検出手段のマウンティングが、窓１１９３の存在に依存せず、図２６Ａにおけるような台形プリズムを用いて、プリズムの底部表面へマウントされた検出器１１６０を用いて、便利に達成されることが可能であることに注目されるべきである。
【０２３３】
プリズム１１９０とスライド１１２０との間の連結は、もし塵または他の粒子によって妨害されるなら困難である可能性があり、また堅い連結は、操作可能な装置内での二つの平らな界面の分離を困難にする。しばしば、スライド１１２０のガラス、またはプリズム１１９０のガラスのものと類似した屈折率をもつ、指数適合性流体が使用されるが、この配置は、流体内に蓄積する可能性のある塵または他の粒子にわずらわされる。さらに、スライドに移された過剰な液体（たとえば、塗抹かまたはスライド１１２０とプリズム１１９０との間からしぼり出されたものが潜在的に導波管から光が漏れるようにすることが可能である。
【０２３４】
光がそれを通して相互作用する三つの別個な表面；表面１１９２、表面１１２４、および表面１１９２、があることが注目されるべきである。これらの表面は、二つの異なる成分上（図２６Ａにおけるように）、三つの異なる成分上（図２６Ｂのように）、または別法として、図２６ＡまたはＢのものと実質的に類似した断面図を有することも可能な、成形された単一の部品内にあるというように、単一の成分の上に存在することが可能である。これらの配置はすべて、本発明の精神の範囲内である。
【０２３５】
別の配置は、可尭性のカップラ１２５０を用いて光を連結するプリズム＆１９０の断面図、図２７Ａに提示されている。プリズム１１９０は、光線１１３２をスライド１１２０内へ連結する。連結を促進するべく、カップラ１１２５はプリズム１１９０とスライド１１２０との間に位置される。カップラ１２５０は、可尭性の透明な物質からなり、その厚さは数百ミクロンから、一般には２ミクロンまでである。カップラ１２５０の組成は、ＮｙｏＧｅｌ、可尭性の光学接着剤、ＵＶ重合性であることが可能なもの、ならびに透明な、硬化性シリコンゴムといった、光重合ゲルを含むことが可能である。このカップラ１２５０の屈折率は、スライド１１２０物質またはプリズム１１９０物質のものと類似しているか、または中間の屈折率のものであることが好ましい。一般に、カップラはプリズム１１９０へ付着されることができ、プリズム１１９０上へ接着剤として成形されることが可能である。
【０２３６】
カップラの間にトラップされている空気の潜在性を低減するためには、付着されたカップラ１２５０とともにプリズム１１９０が、わずかな角度でスライド１１２０上に運ばれ、空気が最初の接点から外側へ向けて圧迫されるようにし、カップラ１２５０とスライド１１２０との間に完全な接触ができるようにすることが便利である。別法として、カップラ１２５０の底面は、この問題を考慮に入れてわずかにカーブしていることが可能である。図２７Ｂは、面のカーブされたカップラ１２５０をもつプリズム１１９０の側面図である。図に示されるように、底面１２５４上に湾曲があるとすれば、プリズム１１９０がスライド１１２０上に降ろされるとき、接触がまだ完成していないカップラ１２５０の部分に向けて空気が押されるであろう。カップラ１２５０の一方の端からカップラ１２５０の他方の端までの厚さの差異は、この例では大きい必要ないが、０．５ミリメートルを超えることが好ましい。
【０２３７】
他の照明および検出法
リアルタイム検出の他の方法は、散乱、蛍光、アップコンバート性蛍りん光体、量子ドット、または他の指標、ならびに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）とともに、共焦点顕微鏡法を含め、本発明の精神の範囲内において便利である。共焦点顕微鏡法は、非常に浅い視野の深さを利用して、プローブ１１６から引き離された指標タグが視野の外となり、光のエネルギーが空間フィルタを通して分散されるかまたは低減されるようにする。共焦点イメージングに類似したイメージングもまた、非常に多数の対象を用いて可能であって、これもまた浅い視野の深さを有する。表面プラズモン共鳴は、上記のようなシングルバウンス非導波管構造を用いた検出法のものと類似した成分の配置を使用しており、これにおいてガラスの上部表面は反射性の、便利なことには金である金属表面でコートされている。この場合に、金によって反射される光の量は、プローブ１１６に結合した物質の存在によって影響される。表面プラズモン共鳴は、本発明に充分適合しており、金表面は、反射性表面として、ならびに反応促進および結合力識別のための電極としての、双方に寄与することが可能である。
【０２３８】
上記の方法は、結合したターゲット１１４だけが可視であることから、プローブ１１６へ結合するターゲット１１４が可視であって、たとえ未結合のターゲット１１４の存在下でも識別可能である、という利点がある。しかしながら、照明装置および検出器の別の配置についても、未結合のターゲット１１４がプローブ１１６の領域から、その中においてターゲット１１４が供給された溶液の除去によるか（たとえば、下文において、細菌の検出用のチャンバーの場合に示されるような）、または別の領域への隔離によって、除去されることが可能であれば、本発明の精神の範囲内である。後者の方法は、たとえば、検出器および／または照明装置のいずれの光路にもないもう一つの電極へのターゲット１１４の電気泳動を含むことが可能である。
【０２３９】
本発明の範囲内で使用可能ないくつかの配置は、二つの平行した基板（上部および下部基板）に関連して、内部の隙間を横切って互いに向き合うこれらの基板上の電極とともに理解されることが可能である。本発明者らは、底部から頂部までの４つの異なる表面−底部下表面、および底部上表面（すなわち、その上にプローブ１１６が付着されている電極がある）、上部下表面（すなわち、プローブのない電極がある）、および上部上表面、を定義することができる。検出器は一般に、底部下表面の下か、または上部上表面の上であることができる（すなわち、これは二つの基板の間の隙間ではない）。
【０２４０】
検出器が底部下表面の下にある場合、底部上表面上の電極は一般に、表面プラズモン共鳴の場合を除いて、透明となる。表面プラズモン共鳴の場合には、検出器もまた底部下表面の下でなければならない。照明もまた底部下表面の下であることも可能であり、後方散乱光か、エバネセント光（底部上表面から反射された）、または、蛍光体、アップコンバート性蛍りん光体、または量子ドットを励起することになっている光を用いて、底部基板電極を通過する。別法として、照明は上記のように底部基板内からでもよい。また、照明は二つの基板間の隙間からでもよく、それは一般に光散乱性の適用には最良である。別法として、照明は上部上表面の上からであることが可能であり、上部表面を通過し、隙間を通り、次いで底部上表面でターゲットまたはタグされたターゲットと相互作用する。これらの場合にもまた、検出器は散乱光（たとえば前方散乱光）、または蛍光体、アップコンバート性蛍りん光体、または量子ドットを検出することが可能であるか、または試料が明視野、暗視野、位相、または他の形状の顕微鏡的イメージング（一般にはコンデンサからの光を使用）について検視されることが可能である。
【０２４１】
もし検出器が上部上表面の上にあり、タグされたターゲットからの光を受けているなら、この場合には底部上表面上の電極は透明である必要はなく、上部下表面上の電極が透明でなければならない。もし上部下表面が半透明なら、照明は電極表面の上から来るか、または化学発光について起こるように、タグされたターゲットにおいて発生されねばならない。半透明な底部上表面については、照明はキャップ内（散乱光分析には最も有望）にあることが可能であり、さもなければ、散乱光か、蛍光体、アップコンバート性蛍りん光体、または量子ドット用の励起照明には最も有望である。しかしながら、もし底部上表面の上の電極が透明なら、上記のようにエバネセント波照明によるものを含め、光は下から透過されることが可能である。
【０２４２】
検出器は一般にイメージャー（たとえば、ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラ）であり、それはまた、ＰＭＴまたは他の集光装置を用いたレーザスキャナを含むことも可能である。いくつかの場合には、検出器はまた、拡散照明による一般的な集光装置（ＰＭＴ、光半導体、フォトレジスタ）を伴うことも可能である。
【０２４３】
ＣＣＤまたはＣＭＯＳカメラを使用する場合、情報は、一般には８〜１２ビットのグレイスケールで、ピクセルごとに得られるが、ある場合には（たとえば、いろいろなターゲット用のカラーコードを用いた）ＲＧＢイメージが別法として使用可能である。個々のターゲット結合を記録することが有用または重要である場合には、潜在的に二つの操作モードがある。第一のモードでは、ターゲット結合は制限され、ピクセルの一部分だけがシグナルによって記録するようにする−ほとんどのピクセルは、あるバックグラウンドレベルにあり、一つのピクセルにおける、バックグラウンドレベルからの、バックグラウンドよりも有意に高いレベルへの変化が結合事象を記録する。ターゲット（および／またはそのタグ）のサイズに依存して、単一の結合事象は、多くの異なる隣接したピクセルにおけるバックグラウンドを超えるシグナルの増加に対応されてよい（ほとんどの画像処理ソフトウエアは隣接するピクセルの領域をまとめて「事象」を識別することが可能なルーチンを有する）。この場合、システムのダイナミックレンジは、１００ターゲット未満および１ターゲットのような（および少数のターゲットの統計的変異によって制限される）小ささから、ほぼカメラにおけるピクセル数のような高さまでの範囲にわたっており、ターゲット当たりのピクセルの平均数で割られ（階層１で）、次いでおよそ１０である因数で割られたものが「飽和点」であって、ここでは新たなターゲットは、ほぼバックグラウンドレベルのシグナルをもつ領域上にデポジットされるよりもむしろ、既存のターゲットと重なり合う。５メガピクセルのカメラ、および約２ピクセルにわたるターゲットについては、これは、ほぼ１０から２５０，０００ターゲットまでにわたるダイナミックレンジか、または２５，０００のレンジスパンに相当する。このレンジは多くの適用に適しており、より大きいダイナミックレンジが必要な適用においては、多くの希釈法が使用可能である。
【０２４４】
第二のモードにおいては、一つのピクセル内の単一のターゲットと異なる数のターゲットとの間の差異が識別される。たとえば、もしシグナルが、８ビットピクセルを用いて、２５６レベルについて、バックグラウンドシグナルが１２で測定されるなら、単一の結合事象は平均６２、同一ピクセル中に二つのターゲットは平均１１２などとなるであろう。この場合、ダイナミックレンジは非常に高く、ほぼ、ピクセル数掛けるレベル数であって、これは、ターゲット当たりの平均ピクセル数で割られて識別されることが可能であり（階層１で）、さらに約１０の因数で割られて飽和を表し、これにおいて、付加的なターゲット結合が、ピクセル飽和レベルを超えた有意なピクセル数においてレベルを上げることができる。この場合、５つのレベルが識別されることが可能であり、ターゲット当たりの平均ピクセル数は１であって、ダイナミックレンジはなおほぼ最低値の１０である（単に統計的考慮によって制限される）が、上のレベルは今やおよそ２５０万までか、あるいは先の実例からさらに１０倍のダイナミックレンジに拡大する。この第二のモードの操作が直面する困難は、画像解析の基盤に基づき、特異結合を非特異結合から識別することが増々困難になることである−平均の各ターゲットがより少数のターゲットにわたっていること、および異なるレベル間のコントラストが一般的に乏しいことの双方から。
【０２４５】
これらの方法は、個々の結合事象を識別することが可能であるが、個々の結合事象を計数することの最大の価値は、有意な非特異的結合または多の形状のノイズがある場合に生じることが注目されるべきである。たとえば、低レベルのバックグラウンドノイズは、広い領域にわたって合計されることが可能であり、それに対して、多量の特異的シグナルがバックグラウンドを超えることを示すこと要求される。しかしながら、シグナルが一般にバックグラウンドを超える場合には、シグナル加算法を使用することが便利であり、これにおいてシグナルは、各ピクセルにおけるシグナル値を加算することによるか、または、光半導体、フォトレジスタ、またはフォトレジスタチューブ（ＰＭＴ）の使用といった、アナログ加算技術を用いることによって加算される。
【０２４６】
洗浄のダイナミクスの調節
以下の議論においては、電極間の電位、電位を通して結果として生じる電気泳動力がターゲット１１４に対する垂直力の実例として使用される。しかしながら、力の調節は、磁気力のような（たとえば磁性粒子を含んでなるタグ２７０に対して）、他の力の適用手段を用いた場合にも、同様な様式でもたらされることが可能であることに注目されるべきである。さらに、力は、横向きの電気泳動、横向きの磁場の適用、および横向きの力の様々な適用手段によって適用された水平力を含むことも可能である。これらの横向きの力の適用が、気泡または、類似の空気−水界面の導入を含むことも可能であって、その理由が、これらの界面が、表面張力を介してターゲット１１４に対し非常に強い力を適用することであることに注目されるべきである。これらの力の適用が、力が垂直でも水平でもなく、図５におけるように双方の局面をもつことが可能であることに注目されるべきである。
【０２４７】
図２８Ａおよび２８Ｂにおいて記述されたように、上述のように生じる結合のリアルタイム検出により、洗浄力は、時間の経過とともに漸次的に増加していく。洗浄の緊縮性を変化させるダイナミクスは、固定された漸次増加的段階において、最も単純な形状で行われる。図２８Ａは、単純なステップ洗浄関数のための、時間の関数としての洗浄電位のグラフである。横軸は時間であり、縦軸は基準電極に対するプローブ電極２００の電位である。最初の期間においては、電位はゼロであるかまたは低く、その場合洗浄力はない。検出されたシグナルは、タグされた標的のプローブ１１６に対する特異的および非特異的結合の合計を表す。時間Ｔ９の後、プローブ電極２００上の負の電位が、およそのステップ関数における値Ｖ１まで増加される。この高い電位における、一般には数百ミリ秒のオーダーの（数十ミリ秒のような小さい期間、および数秒のような大きい期間もあるが）、いくらかの期間の後、リアルタイム検出が行われる。段階的な負電位の増加は、最大の必要電位が生じるまで、何回も繰返される。最大電位は、一般的には現在、全ての特異的に結合したタグターゲットがプローブ１１６から放出される力として測定される。電位増加の段階数は、使用者選択であり、電極２００上に存在する、タグターゲットとプローブ１１６との間の異なる結合力の範囲のような因子によって決定されるであろう。電位の段階は、サイズが等しい必要はなく、同様に期間Ｔ９も必ずしも等しい必要はないことに注目されるべきである。
【０２４８】
タグされた標的２７５とプローブ１１６との間の結合は、複雑である可能性がある。単一の付着点１１７において基板１２０へ結合されている、相補的なＤＮＡプローブ４８０に対して結合している単鎖ＤＮＡターゲット４７０を含んでなる、タグされた標的２７５の略線図、図２９Ａを考慮されたい。見てわかるように、電気泳動タグ２７０に対して作用される電気泳動力は、ＤＮＡターゲット４７０を、相補的なＤＮＡプローブ４８０からまっすぐにほぐそうとする。図２９Ｂは、多数の付着点１１７において基板１２０へ結合されている、相補的なＤＮＡプローブ４８０に対して結合している単鎖ＤＮＡターゲット４７０を含んでなる、タグされた標的２７５の略線図である。この場合、ターゲット４７０は付着点１１７内のプローブ４８０によって拘束されているため、電気泳動用タグ２７０に作用される力は、結果として必ずしも直接にターゲット４７０の放出を生ずるとは限らない。トポロジー的制約および多くの力点のゆえに、ターゲット４７０はプローブ４８０から穏やかに除去される。このことは、下文に記述される種々の手段によって達成去れることが可能である。
【０２４９】
セル上の電極が、セルが操作可能である電位を制限する、電気化学反応に潜在的に関与することができることが認識されるべきである。たとえば、もし電極がインジウム酸化第一錫を含んでなるとすれば、１ボルトを超える電位は、結果として電極の劣化を生じる可能性がある。もしプローブ１１６からターゲット１１４を分離するために、より大きい電圧電位が必要であるなら、電圧電位は非常に短期間に適用されることが可能である−十ミリ秒、さらに好ましくは１ミリ秒、およびさらに好ましくは１００ミリ秒であることが可能であり、この間にターゲット１１４は、プローブ１１６から分離されることが可能であるが、このような短時間では、電極物質の反応が起こることはかなり少ない。中間の時間では、電極を含む電気化学反応を起こさない電圧電位が維持され、プローブ１１６へ付着されたターゲット１１４の量が測定可能である。
【０２５０】
図２８Ｂは、傾斜洗浄関数のための、時間の関数としての洗浄電位のグラフである。この場合、異なる段階の洗浄間の全体の電位は、図２８Ａにおいて使用されたように、同じ電位差である。しかしながら、ステップ関数の代わりに、電位は時間をかけて徐々に上げられる。電位の増加は直線的か、指数関数的、またその他であることが可能である。別法として、電位の増加は単調ではなく、意図された緊縮性のための所望の電位に到達する、一連の増加および減少の段階を含んでなることが可能である。
【０２５１】
さらに、中間電位の「プラトー」は、二つの別個の時間段階に分けられている。第一の時間段階、ＴＤにおいては、ターゲット１１４およびプローブ１１６は高い電位において解離するようにされる。しかしながら、検出プロセスの間には解離の速度が低減されることが望ましく、そのため、電位は時間ＴＣ（たとえば画像の取込み）の間は低減され、その間に結合したターゲット１１４が検出されるようにする。
【０２５２】
洗浄に使用される電場の方向ベクトルは、一方向にある必要はなく、図３０Ａおよび図３０Ｂに例示されているように、プローブ４８０からのターゲット４７０の除去を助けるべく、有効に変更されることが可能である。図３０Ａは、プローブ電極Ｅ１２に対する二つの基準電極Ｅ１０およびＥ１１の略側面図である。図３０Ｂは、図３０Ａに示された二つの基準電極Ｅ１０およびＥ１１に対するプローブ電極Ｅ１２の、２段階の洗浄緊縮性のための電位のグラフである。電極Ｅ１２に対する電極Ｅ１０の相対電位は点線で示されており、電極Ｅ１２に対する電極Ｅ１１の相対電位は破線で示されており、相対電位が重なるところは一点鎖線で示されている。最初の期間については、電極１０に対して相対的な電位は高く、電極１１に対する相対的な電位はゼロである。次に、電極１１に対する相対的な電位が高く、一方、電極１０に対して相対的な電位は小さい。次に、Ｅ１０およびおＥ１１の双方の電極について電位が中間のレベルに置かれる。この３つの段階の間に、電場の方向は、電極１０を指しているものから、電極Ｅ１１へ、二つの間の中間位置へと変化する。ターゲット４７０は、プローブ４８０によるか、または別法としてリンカー１１８か、または表面１２０上にある他の物質によって立体的に巻込まれており、一般に、特異的に結合していようと、非特異的に結合していようと、それを放出する方向に引かれることが可能である。図に示されたような、次に続く時間段階Ｔ１０においては、異なる方向の高い力が適用されることが可能である。加えて、力にステップ関数を適用するかわりに、それらは傾斜時間関数（直線的、指数関数的、またはその他）として適用されることが可能であり、それらもまた非単調性に適用され、所望の効果を提供するべく、異なる継続時間にわたって適用されることが可能である。
【０２５３】
プローブ１１６からタグされた標的２７５を分離するために必要な電位が、電気泳動用タグ２７０上の電荷に依存することが注目されるべきである。さらに、もし適用される必要のある電位が、アレイ１８０内に貼付けられたプローブ１１６を超えて、何オーダーも大きく変わるなら、多数の異なる緊縮性の洗浄が必要となることから、便利ではない可能性がある。したがって、もし電気泳動用タグ２７０が、結合したターゲット１１４とプローブ１１６との間の結合力にほぼ適合するなら、それは便利である。たとえば、より強い結合力をもつターゲット−プローブペアは、より静電荷の大きい電気泳動用タグと便利にペアにされ、ターゲット−プローブペアを分離するために、さらに概略的に同じ電圧電位の適用が必要とされるようにする。
【０２５４】
先の段落の洗浄ダイナミクスは、静電的または電気泳動的な力を扱っているが、濃縮、ｐＨ、溶媒、および競合性リガンドを含めた、他の識別力および条件が，リアルタイム検出の使用とともに適用されることが可能である。かかる条件はさらに、段階的様式で、または連続勾配的に適用可能であって、機械的ポンプ、電気浸透機構、または他の輸送機構を用いて適用されることが可能である。さらに、これらの条件は、互いに組合せて、または上記の静電的または電気泳動的力との組合せにおいて、適用されることが可能である。時には、たとえば、勾配様式にある溶液のｐＨを再現性があるように変化させることは、特に、本発明の多数のアッセイに使用される非常に小さいフォーマットにおいては困難であることから、その結合が既知の条件下に破壊される、多数のターゲット１１４−プローブ１１６ペアをアレイ１８０内に配置し、特定の状態が達成されていることを照明するための内部対照として役立つようにすることは有用である。
【０２５５】
生物の検出および抗生物剤感受性
概要
細菌の正体を、食品病原体、生物戦争用薬剤、および種々の動物およびヒトの疾病に関して同定することは重要である。これらの細菌の迅速かつ感度のよい検出に加えて、動物およびヒトの疾病の場合には、さらに抗生物質、抗真菌剤、および他の医薬品に対する微生物の感受性を測定することは、大きな利益がある。特に興味のある細菌は、ヒトの病原体であり、シュードモナス属、ステノトロホモナス属、アシネトバクター属、エンテロバクター属、エシェリキア属、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、ヘモフィルス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属、エンテロコッカス属、マイコバクテリウム属、ナイセリア属といった属の集合、および医療において遭遇する他のヒト病原体から選ばれる細菌である。本発明は、この適用に非常に充分適している。
【０２５６】
しかしながら、検出系および方法は細菌に限定されたものではなく、真菌（たとえば、カンジダ属、アスペルギルス属）、ウイルス、マイコプラズマ、および他のタイプの生物の検出においても同様に有用であることが可能であり、また化生性または他の疾病の細胞タイプの検出におけるような、動物細胞の検出を含むことが可能である。以下の議論においては、細菌の使用は単なる例として意味されるのみであって、それゆえ議論はこのような他の生物も同様に含むためのものである。上記の議論において、ターゲット１１４は、一般に制限なしに、以下に議論されるように細菌および他の生物であることが可能であることに注目されるべきである。以下の議論は詳細部を拡充し、かつ、それによって上記の方法および装置が細菌および他の生物に適用される、新規な方法および装置を紹介する。
【０２５７】
図３１は、試料中の細菌の、正体、数、および抗生物質感受性を測定するためのプロセスの、ブロックフロー工程系統図である。第一の段階７００においては、試料は任意に濃縮され、これは細菌試料が大量の液体中に存在する多くの場合に必要である。かかる段階７００は、一般的には試料が１０ミリリットルより多い体積中にある場合および、しばしば試料が５００マイクロリットルのような少なさの体積中にある場合に行われる。この理由は、系によっては、検出系内に置かれるべき試料体積が、１００マイクロリットルのような少なさに制限される可能性があるためであるが、他の系では何ミリリットルもの試料を用いて、はるかに多い量を扱うことができる。濃縮は二つの機能を行う。第一に、試料の体積に対する細菌の数の比が増大され、最大の可能性のある試料分画を系において使用可能にすることができる。第二の理由は、細菌は液体中にあり、その電気的または他の特性が、検出系と非適合性であるかまたは非最適であってもよいことである。たとえば、電気泳動法が次に使用されるものとして、かかる方法の有効性は、一般に、低電解質緩衝液の使用によって改善される。かかる場合に、細菌試料の液体は、この系により適合する液体に置換えられることができる。
【０２５８】
段階７１０においては、細菌は検出ゾーンに輸送され、そこで後の段階での使用のためのロケータが設置される。この時点で細菌はまだ固定されていないが、三次元の体積の中で自由に動き回ることができる。検出ゾーンへの輸送は、ポンプ（たとえば、容積計量型シリンジポンプ、空気ポンプ、蠕動性ポンプ、またはその他）によるか、電気浸透によるか、重力によるか、細菌の電気泳動によるか、または他の手段による能動的な物理的輸送を含め、多くの異なる手段において達成されることが可能である。さらに、濃縮段階７００は、ゾーン内への細菌の遠心分離、およびそれに続く再懸濁のような、検出ゾーンにおける細菌の直接的な濃縮を含むことが可能である。
【０２５９】
段階７２０においては、細菌は検出表面上に固定される。検出表面は、細菌のサブセットに対して特異的であるか（たとえば、一以上の細菌に対して特異的な抗体の表面付着によって）。または別法として非特異的であって、試料中のほとんどまたは全ての細菌が充分に表面上に結合することができることが注目されるべきである。
【０２６０】
系には、単一のゾーンまたは多数のゾーンがあることが可能である。たとえば、この系の一つの態様においては、各細菌株に特異的なゾーンがあることが可能であり−個々の検出表面の特性によって識別される−かつ、系は別々のゾーンからなるゾーンを含むことも可能である。別法として、細菌はすべて単一の非特異的ゾーンに付着されることが可能である。また、特異的および非特異的検出ゾーンの組合せがあることが可能であり、これにおいて細菌はまず特異的ゾーンにおいて捕捉され、その後に、特異的ゾーンにおいて捕捉されなかったすべての細菌の非特異的な捕捉が続けられる。多くのゾーンがある場合には、細菌は、個々の検出表面への細菌の付着の間に、一つの検出ゾーンから別の検出ゾーンへ輸送される必要があることが注目されるべきである。
【０２６１】
細菌は表面に付着されている以上、その配置はほぼ二次元の分布にある。用語「二次元」は、付着表面が数ミクロンまでの深さであることが可能であるとすれば（たとえば、ポリマーヒドロゲルまたは類似の物質の取込みにより）、ある妥当な程度の垂直の深さを含むことを意味することが、注目されるべきである。しかしながら、もし検出手段が視野の深さの制限された顕微鏡的検出器を取入れることができるなら、表面は５ミクロンを超えない深さをもつことが好ましく、２ミクロン未満の深さであることはさらに好ましい。
【０２６２】
表面に対する細菌の付着は、表面に対する細菌の拡散によって行われることが可能であり、これにおいてそれらは特異的または非特異的に付着される。しかしながら、拡散は、かかる系において一般的に望まれるタイムスケールでは遅すぎることから、細菌の付着には能動的な手段が好ましい。これらの手段は、表面に対する細菌の電気泳動または誘電泳動の使用、遠心分離力の使用、または検出表面上への細菌の濾過も含むことが可能であって、これにおいて表面は多孔性であるが、孔は細菌の最小の直径よりも小さい。ひとたび細菌が表面と直接接触すれば、一般的には付着プロセスは迅速であって、付着が特異的であろうと非特異的であろうと、およそ数秒または数分間で起こるよう配置されているが、本発明の範囲内ではさらに付着長い時間が与えられている。細菌の付着は、細菌からの付着分子の分泌、ならびに表面に対して、生きていない物質の付着についてさえも正常に生じる付着の数および強さにおける増加により、一般にある期間にかけて増加する（数分から数時間）−しかしながら、上記の付着は、この系を通した拡散、対流、流体流動のような典型的な力では、表面からの細菌を除去するには不十分であって、細菌の除去のために望ましい力の適用が必要であるような付着を指すべく意味される。
【０２６３】
検出表面上への細菌の特異的な付着が所望される場合には、表面に非特異的に付着した細菌を除去することが有用である、このことは一般に、特異的に付着された細菌は全て、比較的狭い範囲の付着力で付着されているという仮定によって遂行される。従って、特異的な付着の範囲の外側の力は、非特異的に付着された細菌を除去することができるか（すなわち、弱い力で付着された細菌）、または特異的に付着された細菌を除去するが、他のもの（すなわち、より大きい力で付着された細菌）は除去しないことができる。さらに、特異的または非特異的結合の強さは、コンダクタンス、およびｐＨといった、培地の性質を変化させることによって変えられることが可能である。
【０２６４】
段階７３０においては、個々の検出表面に付着された、各検出ゾーンの細菌の数が、自動化された手段によって検出される。一般に、細菌を数える手段は、拡大された画像を用いて検出表面から取られた画像についての、自動化された可視検査によるか、またはスペクトル強度、または散乱光強度の測定によるであろう。細菌と周囲の培地との間で、屈折率コントラストがないことから、細菌の検出は、位相差、微分干渉、蛍光、または他の手段の使用を含め、先行技術において周知の技術によって促進されることが可能である。
【０２６５】
細菌の、血清型、株、種、属、または他の特別のタイピングの同定は、表面に対する細菌の付着が特異的である程度まで、達成されていることに注目されるべきである。しかしながら、もし付着表面が非特異的か、または幅広く特異的であるなら（すなわち、ある範囲の細菌タイプに対して特異性をもつこと）、同定はこの時点で不完全である。光学的タグ（たとえば、蛍光、散乱、吸収）をもつ特異的な抗体の使用か、または他の形状の検出を可能にするタグ（たとえば、化学発光、放射性、酸化還元、導電性、または他の検出モード）を含むことが可能な株の使用は、検出表面に付着した細菌のタイプを同定するべく、この時点において任意に使用されることが可能である。
【０２６６】
この時点では、この系によって測定されるものが細菌の数だけでなく、検出表面に対する細菌の特異的な位置もまたわかることが注目されるべきである。細菌のタイプがわかっていることから、個々の細菌が、次に、位置およびタイプに関係づけられる。堅く結合した細菌については、この情報は、系の操作を通じて比較的一定であろう。上記の位置は、個々の細菌の位置、ならびに細菌のクラスターの位置の双方を含むことが可能であり、それはほぼ球形の細菌塊、ならびに細菌の直鎖を表することが可能である。
【０２６７】
系によって検出される細菌の数が正確であるためには、段階７００の元の試料中の細菌の少なくとも５０％が一以上の検出表面へ累積的に付着されることが好ましく、さらに好ましくは８０％より多い細菌が付着されることが、さらに注目されるべきである。段階７２０における細菌の検出表面への能動的な輸送の使用は、この正確さについての重要な観点である。
【０２６８】
疾病の診断および治療における使用のためには、どのくらい多くの細菌が存在するのかを知ることのみならず、細菌の生存率、および、単一または組合せにおける、様々な抗生物質に対する感受性も測定することは大きな利点である。以下の段階は、系によって発生される所望の情報に依存して、任意に使用される。
【０２６９】
段階７４０においては、検出表面上における細菌の生存度が測定される。一般に、このことは二つの手段の内の一つによって行われる。第一の手段においては、検出表面およびその上の細菌は、増殖培地の存在下にインキュベートされ、そのことは細菌が成長し分裂することを可能にする。成長および増殖に携わっていることが視覚的に測定されることが可能な任意の細菌は、それゆえ生存可能として表示される。第二の手段においては、生存可能または生存不能である細菌を検出するべく、生体および死体染色が使用されることが可能である。全細菌数が、生存可能および生存不能の細菌の合計に等しく、それゆえ、全細菌についての任意の二つの測定値、生存可能な細菌、およびお生存不能な細菌、の使用が、第三の測定値の計算を可能にすることが注目されるべきである。
【０２７０】
本発明の方式で検出されるであろう、ある生物が、それ自身では生存可能ではなく、宿主（たとえば、ウイルスの検出のため）を必要とすることがあることに注目されるべきである。その場合、検出表面はウイルスの増殖を支持する宿主細胞か、または他の生物を含むことが可能である。その場合、段階７３０の細菌の計数は、感染された細胞の数が数えられる段階によって置換えられるであろう。かかる計数の段階は。ウイルスおよび宿主の性質に従って遂行され、感染の標示である細胞表面マーカーの存在、感染からの結果である宿主の生理学における変化、または宿主の溶菌または死によることを含むことが可能である。
【０２７１】
段階７５０では、増殖を支持する培地中の抗生物質が、検出ゾーンの培地中へ投入され、細菌が増殖を通じて抗生物質の存在下にあるようにすることができる。もし検出されている生物が細菌でないなら、この処理はその生物に適合することが注目されるべきである。したがって、真菌または酵母の検出は、抗真菌剤の使用に適合し、ウイルスの検出は抗ウイルス剤の使用に適合するであろう。細菌は、抗生物質の存在下に、異なる時間にわたり、臨床上の興味の濃度において維持され、段階７３０および７４０は、適当なインキュベート期間または作用時間の後に繰返される（すなわち、薬剤が効果を表すための時間であり、それは抗生物質の不在下に行われることも可能である）。段階７３０，７４０、および７５０の反復は、異なる薬剤、または異なる治療レジメンの有効性を検査するために行われることが可能である。
【０２７２】
本装置の方法および系が，次にさらに詳細に記述される。
【０２７３】
試料濃度
試料は、いくつかの呼吸器洗浄については、１ミリリットルから１リットルまでの範囲であることが可能であり、さらに細菌濃度では、ミリリットルあたり１０細菌から１０6細菌までの範囲であることが可能である。さらに、試料は血液、尿、痰、洗浄液、または他の培地中に存在することが可能である。試料の濃縮は、試料を濃縮して、少数存在している細菌が全て有効に系へ導入されるようにするとともに、バックグラウンドの液体培地が、系への導入に際して一貫した性質を持つように標準化されることができるようにする。しかしながら、ある試料は、本発明の範囲内の濃縮または他の修飾無しに使用されることが可能であることに注目されるべきである。
【０２７４】
先行技術における通常の試料調整法は、この目的のために使用可能であって、濾過および遠心分離、それに続く少量の液体中での細菌の再懸濁を含む。遠心分離は、凝集沈殿、沈降、または共沈降物の添加に伴われることも可能であり、それらが非常に少数の細菌の操作を可能にし、かつ細菌の凝集を防止することで、かかる方法が促進されていることこともまた注目されるべきである。任意のこれらの方法においては、しかしながら、特に細菌のものと類似の特性（サイズまたは密度）をもつ粒子を残す物質は、何ら添加されないことが好ましい（たとえば、ポリマービーズ）。
【０２７５】
本発明に調和するもう一つの方法は、溶出可能なコレクターによる収集の使用である。かかる系においては、試料は、細菌を非特異的に結合する物質が密に詰められたマトリックスを通して濾過される。この物質はさらなる特性を有しており、細菌を結合する特性が、化学的、酵素的、または物理的手段によって逆転され、細菌が結合に続いてこの物質から溶出されることができるようにする。かかるコレクターは、この方法のさらなる段階に向けて充分適合された均一な培地へ細菌を入れること、ならびに、モニターされることが望まれる細菌とは異なるサイズまたは電荷をもつ汚染物質を除去すること、の双方のために使用されることが可能である。
【０２７６】
この試料調製の一つの好ましい態様は、５０〜１０００マイクロリットル、および好ましくは２５０マイクロリットル未満の体積をもつカートリッジによるものであり、この中にイオン交換樹脂が詰められている。この樹脂は、ビーズの形状で便利に供給されており、永久的に荷電される（たとえば、第四級アミンの使用による）か、または可逆的に荷電される（たとえば、第二級または第三級アミンの使用による）ことが可能である。さらに、ビーズのサイズ（または樹脂の孔サイズ）は、荷電基がない場合には細菌はビーズの隙間を容易に通過して流れ、ビーズを通るその流速は、試料の体積によって妥当となる（ビーズは、好ましくは直径１０ミクロンよりも大きくかつ２０００ミクロンよりも小さく、さらに好ましくは２０ミクロンよりも大きくかつ１０００ミクロンよりも小さく、さらになお好ましくは５０ミクロンよりも大きくかつ５００ミクロンよりも小さい）。
【０２７７】
この好ましい態様においては、試料は、修飾なしに、または、ｐＨを調節するための緩衝液の添加、および／または、好ましくは、系の成分に対する細菌の、または互いの非特異的な結合を低減するため、非イオン界面活性剤の存在下に、カートリッジを通してプレスされることが可能である。ｐＨについては、比較的中性であること（ｐＨ６〜８の範囲内）が好ましく、いずれにせよ、細菌が負電荷を維持しており、かつ樹脂が正電荷を維持していることで充分である。この負電荷はほとんどの細菌に典型的であるが、典型的には正に帯電された任意の生物については、陰イオン樹脂が陽イオン樹脂に置換えられることが可能であり、ｐＨの調整は上記のものと反対となり、負に帯電した生物よりも低くなることに注目されるべきである。生物および樹脂の反対の極性に起因して、樹脂の近くを通過する細菌は、その表面に対する静電的相互作用によって捕捉され、粘着する。このことは、多量の細菌を、大体積からカートリッジの体積に濃縮することに役立つ。
【０２７８】
樹脂から細菌を放出する目的で、溶液のｐＨが変えられ、樹脂と細菌との相互作用が低減されるようにすることが可能である。たとえば、高いｐＨ（すなわち、陰イオン樹脂上のカチオンのｐＫより上）では、樹脂上のカチオンはその電荷を、それゆえ、細菌を捕捉するための相対的な能力を失う。別法として、低いｐＨでは、細菌上の負電荷を生じさせているアニオンはプロトン化され、それゆえ樹脂に対する引力を失う。
【０２７９】
その下で細菌が結合し、別の下では細菌が放出される、条件を見出すことが重要である。細菌と樹脂との引力の強さを調停するために、調節されることが可能な他の因子は、溶液のイオン強度（すなわち、対イオンは静電引力を低減する蛍光があるであろう）、陽イオン交換樹脂上で使用されるカチオン官能基（たとえば、第一級、第二級、第三級、または第四級アミン）、または樹脂の表面のカチオンの密度（すなわち、密度を低下させることは一般に細菌の樹脂に対する引力を低減するであろう）。
【０２８０】
細菌は一般にカートリッジから、カートリッジの体積と有意に異ならない体積中に溶出されることが可能であり、たとえカートリッジの体積よりも小さくても、溶出液を混合しないよう注意が払われる。一般に、カートリッジからの溶出の後、溶液は好ましくは両性イオン性緩衝液により中和され、緩衝液のコンダクタンスがそれほど増加しないようにする。結果として生じる培地の他の特性は、イオン強度、コンダクタンス、界面活性剤の存在、栄養分または細菌の成長因子の存在、およびｐＨを含め、必要に応じて調節されることが可能である。一般に、以下に議論されるように、細菌にとり、比較的コンダクタンスの低い溶液中にいることが好ましい。溶出が３より上かまたは１１より下のｐＨにおいて行われるなら、結果として生じる中和された溶液は、１０ｍＭ塩未満のイオン強度をもつと考えられ、これは以後の段階にとって好ましい。
【０２８１】
濃縮段階の一部として、またはそれに先立ち、多量の汚染物質を除去するため、前濾過を行うこともまた便利であり、その間に細菌の通過がモニターされるようにする。かかるフィルタはニトロセルロース、ナイロン、セルロースを含むことが可能であり、あるいは他の、膜、ビーズフィルタ、または他のフィルタも同様に便利であってよい。上記の溶出可能なコレクターが、イオン交換樹脂として、ならびにサイズフィルタとしての双方に役立つことも本発明の精神の範囲内である。溶出可能なコレクターが使用されない場合でも、サイズフィルタを用いて非細菌性汚染物質を除去することは便利である。さらに、試料の供給源および汚染物質の性質に依存して、試料中の細菌よりも小さい汚染物質を除去するフィルタを用いることもまた便利である；このことは検出器にとって問題ではないかもしれないが、小さい汚染物質は、細菌がそこへ付着しようとする表面上のスポットに対して細菌と競合し、細菌の付着を減少させる可能性がある。
【０２８２】
検出ゾーンへの輸送および検出表面への付着
権出ゾーンは、便利なことに密閉されたセル内にあり、細菌がその上で固定されかつ検出されることとなる一以上の表面を含む。検出セルの一般的なフォーマットは、細菌検出セル８０４の略平面図である図３２Ａ、および横断面Ｘによる図３２Ａの検出セルの側面略線図である図３２Ｂに示されている。
【０２８３】
セル８０４は、二つのチャンバー８０５を含んでなり、それには１個のような少なさ、および、数十または数百を超えるものがあることが可能である。各チャンバーは異なる細菌試料を処理するためか、または単一の試料を並べて処理するために使用され、この中で細菌は異なる増殖培地、抗生物質または他の抗生物剤、抗生物質濃度プロフィール、温度、または他の、細菌がその影響下にあることとなる物理的、化学的、または生物学的条件で処理されることができる。チャンバー８０５は全てのスライド上で囲みに入れて示されているが、チャンバーはマイクロタイタープレートウェルのように開放されることが、本発明に一致する。もしチャンバー８０５が密閉されているなら、インプットポート８０３およびアウトプットポート８０２が、チャンバー８０５内の溶液を交換するために与えられる。
【０２８４】
チャンバー８０５のサイズは、本発明の精神の範囲内で変わることが可能であるが、幅は好ましくは２００〜５０００ミクロン、さらに好ましくは５００〜２０００ミクロン、最も好ましくは５００〜１０００ミクロンであり、高さ（すなわち、電極間の距離）は好ましくは１００〜２０００ミクロン、さらに好ましくは２００〜１０００ミクロン、最も好ましくは２５０〜５００ミクロンであり、長さは好ましくは０．５〜２０ｍｍであることが好ましい（下文に議論されるように、一部は捕捉ゾーンの数に依存する）。これらのディメンションは、主として液体処理（たとえば、より体積が大きいほど、多量の試料を処理しやすい）、検出器光学（たとえば、個々の細菌を見ることが望ましい場合には、倍率がかなり大きくされねばならず、そのことは視野を狭める）、細菌が垂直に移動することが可能な速度（たとえば、チャンバーを通る細菌の流れに依存して、移動の速度は、細菌がセルを離れる前に適切な表面へ沈着させるべく十分に大きくなければならない）、および検出器のダイナミックレンジ（たとえば、表面上に「平に並ぶ」ことができかつ検出器内において別個である細菌の数）に関係する。
【０２８５】
マイクロフルイディクスの適用は、この技術において周知であり、たとえば、レドモンド（ワシントン州）のマイクロニクス・インク（Micronics Inc.）、およびハンツビル（アラバマ州）のＣＦＤリサーチ・コーポレーション（CFD Research Corporation）のサービスおよび製品に見ることができる。これらの装置は、数分の一ナノリットルであることが可能な、非常に少量の物質を処理することが可能であり、試料注入、マイクロディスペンシング、濃縮、マルチプレクサ、セパレータ、センサ、流体圧力駆動、電気浸透、電気泳動、誘電泳動、粒子輸送、エレクトロケミカルセンシング、常磁性粒子を移動するための電磁気学などを含め、多くの機能を持つことが可能な成分を含んでなる。これらのマイクロフルイディクス技術は、本発明に関して充分に研究されている。
【０２８６】
チャンバー８０５において、アノード８１６およびカソード８１５はゾーンを生成し、その中で、適当な緩衝液の存在下に、アノード８１６およびカソード８１５に電位をかけることで、電気泳動が行われるようにする。必須ではないが、アノード８１６およびカソード８１５は、製造の容易さ、ならびに、電極の表面に対して垂直となるべく発生される電気泳動野領域を生じて結果として個々の電極に対する細菌の動きが均等になるようにすることの、双方の面から、チャンバーの相対する壁上で、平行であることが好ましい。電極８１５または８１６の少なくとも一方は、以下に記述されるように、細菌が視覚的検出手段によって電極を通して検出され得る程度に、ほぼ透明であることができる。透明な導電性の表面は、ＩＴＯスパッタフィルム、および、スミトモ・オオサカ・セメント（Sumitomo Osaka Sement）によって供給されたＳ−１００およびＰ−１００インクのような、印刷された透明な導電性インクを含む透明電極として役立つことが可能である。不透明な電極は、蒸発された金属コーティング（金、銀、アルミニウム）を含んでなることが可能であるが、好ましい電極物質は、プラチナまたは他の、種々の形状の化学的または物理的蒸着によって配置されることが可能な他の耐熱性の金属である。
【０２８７】
アノード８１６上には捕捉表面８２０が配置されており、その上に細菌が接着することができる。いくつかの捕捉剤は、後に記述されるように、細菌に対し、または細菌の大きいグルーピングに対し、一般的な親和性を有するが、これらの捕捉表面は、異なる細菌に対して特異的な親和性をもつ捕捉薬剤を有することができる。特異的親和性については、親和性は一般に抗体標品によって供給され、それは、少数の細菌に対して特異性をもつポリクローナルまたはモノクローナルであることが可能であり、あるいは別法として、アプタマーまたは他の特異的な親和性分子によって供給されることが可能である。負荷表面８１０もまた存在しており、捕捉表面８２０への移動に先立ち、その上に任意に濃縮されることが可能である。負荷表面８１０は、細菌に対して弱い、または可逆的な引力を有することが可能であり、細菌は表面８１０の上にある期間とどまるか、または負荷表面８１０は非常に特異性が低いか、または非特異的な引力を細菌に対して有することが可能である。別法として、負荷表面８１０は細菌に対して引力をもたないが、下文に議論されるように、電気泳動フィールドによって負荷表面に近接して保持されることができる。一般に、チャンバー８０５の他の表面は、負荷表面８１６と捕捉表面８２０との間、または別の捕捉表面８２０との間の領域を含め、オプティケム・コーティングス（OptiChem catings（Accelr8テクノロジー・コーポレーション、コロラド州デンバー））によって供給されたもののように、細菌に対して非常に低い結合性をもつ。この低い結合性は、一般に、電極８１５および／または８１６へ適用されたコーティングによって与えられ、これにおいてコーティングは好ましくはポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、または他の、表面エネルギーの低いポリマーからなる成分を有する。好ましくは、このポリマーは機能性化され（たとえば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、チオール、エポキシ、ヒドラジン、またはアミノ基によるか、またはビオチンまたはアビジンによる）、特異的または非特異的に細菌に結合する薬剤が付着され、細菌とのアトラクティブな特性を捕捉表面に与えるようにする。
【０２８８】
細菌は、比較的非アトラクティブな表面との接触の後、特にその表面と一定期間接触していた後に、高い非特異的結合を示す可能性がある。この結合のいくらかは、細菌の付着タンパク質の発現に付随しており、たとえば、種々の接着タンパク質を含むことが可能である。非特異的結合が所望されない場合には（たとえば、負荷表面８１０に対して、または、細菌が、通常はそれに対して結合しない特異的な捕捉表面８２０との間で移動しているとき）、非特異的結合の量を低減するため、アドヘシンと結合する遮断抗体の使用、ガラビオシド、グロボテトラオース、および四糖のような種々のアドへシン結合剤の使用、または種々の界面活性剤（および好ましくは非イオン界面活性剤）の使用を含め、この望ましくない非特異的結合を低減することの可能な種々の薬剤を使用することが便利であることが可能である。さらに、表面に対する細菌の結合は、滞留の時間、ならびに、それによって細菌が表面の上に向けられた力の双方が原因である。電気泳動力を低減することにより、または電気泳動によって細菌が電極へ向けられている時間を低減することにより、非特異的結合の力は調整されることが可能である。さらに、細菌と同じ極性をもつ電極に電荷をかけることもまた、非特異的結合を軽減することができることが見出されている。
【０２８９】
捕捉表面８２０の細菌に対する引力は、細菌のタイプにより、高度に特異的であるか、または比較的非特異的であることが可能である。たとえば、表面８２０は非特異的なポリカチオンポリマー（たとえばポリエチレンイミンまたはポリリシン）、血清型、属、種またはクラス、アプタマー、糖タンパク質結合性タンパク質などに特異的な抗体を含んでなることが可能である。
【０２９０】
単一のカソード８１５および単一のアノード８１６のみが示されているが、多数の電極があることが可能であり、それらが別個に対応可能であることも、本発明の精神の範囲内である。かかる場合に、個々のアノード８１６は、異なる捕捉表面８２０とほぼ同じ位置に配置されることが可能である。以下の議論においては、細菌が電気泳動的に特定の捕捉表面８２０または負荷表面８１０に向けて輸送されているか、または前記表面から離れる方向へ向けられていることが示される場合、このことは、示されたような単一の電極８１５および８１６を活性化することによるか、または別法として、個々の表面の下にある別々の電極を活性化することによって達成されることが可能である。図３２Ｃは、アドレッサブル電極の使用による、図３２Ｂの細菌検出セルの側面略線図である。これらのアドレスサブル電極の使用が水平な電気泳動力を生成するべく利用され、負荷表面８１０へ結合されている細菌が、たとえばアドレッサブル電極８１７Ａおよびアドレッサブル電極８１９Ａの影響下にあり、電極８１７Ａおよび８１９Ａの双方を、電極８１７Ｂと同様に、相対的に負の電位に置くことによって第一の捕捉表面８２０へ移動されることが可能であり、一方電極８１９Ｂを相対的に正の電位に置くことにより、電気泳動力のフィールドラインが、細菌を負荷表面８１０から第一の捕捉表面８２０へ移動するようにすることにも注目されるべきである。互いに水平に向い合って並べられたアドレッサブルカソード８１７およびアドレッサブルアノード８１９の使用を含め、類似した効果をもつ多くの異なる電極の配置があること、または、多数のアドレッサブルカソード８１７があって、電気泳動力のフィールドを形作るために様々な程度に活性化され、比較的均等な細菌の分布を捕捉表面８２０上に供給すようにすることにも注目されるべきである。ある環境においては、捕捉表面８２０上に不均一な細菌の分布をもつことも有益であることが可能である。たとえば、多数の細菌が、系の基準の範囲の数を超えて、均一な細菌の分布によって分布することが可能である場合には、捕捉表面８２０上に不均一な分布をもつことにより、試料中の細菌数が高いい場合に、比較的細菌の少ない領域が使用されることが可能であり、一方、試料中の細菌数が低い場合には、相対的な濃度が使用されることが可能である。
【０２９１】
電極８１５および８１６によって、また表面８１０および８２０によって表される垂直の距離が一定の縮尺で描かれていないことに注目されるべきである。電極間の分離は、一般に数百ミクロンであり、電極８１５および８１６の垂直のディメンションは一般に数十ナノメートルと測定され、表面８１０および８２０は数ナノメートル〜数十ナノメートルの厚さであろう。表面８１０および８２０のサイズは、本発明の範囲内で大きく変わることが可能であるが、平面図のどのディメンションにおいても、好ましくは数百ミクロンから５ミリメートルまでである。同様に、表面８１０および８２０を分離している距離は大きく変動することが可能であるが、好ましくは５ミクロンまたは１ミリメートルのような大きさの間であり、さらに好ましくは５０と２００ミクロンの間である。
【０２９２】
図３３Ａ〜Ｄは、図４６Ａ〜Ｂのチャンバーを用いた細菌の輸送および捕捉の略側面図である。図３３Ａにおいては、二つのタイプの細菌（星８３０および８３５および菱形８４０で示されている）が、インプットポート８０３を経てチャンバー８０５内に導入される（細菌の黒塗りおよび白抜きである記号間の差異は、下文に記述される）。
【０２９３】
アノード８１６およびカソード８１５を横切って電位がかけられ、二つの電極の間の電気泳動が引き起こされる。電気泳動は上述のような化学薬品の使用によって促進されることが可能である。任意に、付加的なカソードがポート８０３の外側に配置されることが可能であって、下文にさらに詳細に議論されるように、チャンバー８０５内への細菌の移動を促進する注入フィールドを生成する。
【０２９４】
細菌８３０，８３５、および８４０が、アノード８１６の頭の部分を過ぎて移動すると、この動きは、その一般的な負電荷に基づき、アノードへ向かう。細菌の負電荷は、電気泳動が行われる培地のｐＨによって、ある程度修飾されることに注目されるべきである。いくらかの細菌が中性またはわずかに正の電荷をもつ程度に対しては、培地のｐＨを上げて細菌により多くの負電荷を与えるようにすることが便利である。
【０２９５】
細菌８３０，８３５、および８４０の動きは、電極８１５および８１６の間の電位、培地のコンダクタンス、および電気泳動を促進する化学薬品の存在を含めた多くの因子に依存する速度にあり、また同時に、インプットポート８０３内へ、およびアウトプットポート８０２の外への、新たな培地（細菌があるかまたはない）による培地の移動がある。上記のように、アドレッサブル電極８１５および／または８１６の使用は、細菌の移動を促進するためにも同様に使用されることが可能である。垂直の動き（たとえば、電気泳動による）と水平の動き（たとえば、流体移動、電気泳動、または他の手段による）のバランスは、細菌が負荷表面８１０と接触できるようにされるべきである。負荷表面においては、細菌は、負荷表面８１０の上の弱い静電力（たとえば、表面での弱い静電荷による）によって水平の動きが妨げられるか、または負荷表面８１０への下向きの電気泳動力の存在下に、表面付近の下部流体流動によって低減された動きを示す。これらの力は一般に直交するかほとんどそうであり、そのことは、垂直および水平の双方向における細菌の動きの独立した調節を可能にすることから、便利である。より大きい水平の動きが必要である場合には、たとえば、より大きい垂直力が部分的に、または完全に補償することが可能である。
【０２９６】
負荷表面８１０の目的は、図３３Ｂに示されたような、捕捉表面上の非常に小さい体積の中に細菌を入れることであり、かつ希釈された試料を補償することである。ひとたび全ての細菌が表面８１０上に集められれば、次に、特定の捕捉表面８２０上へのそれらの移動はさらに容易に達成される。
【０２９７】
図３３Ｃでは、細菌は負荷表面から特定の捕捉表面８２０上へ移動される。もし負荷表面が細菌に対して静電引力を有していれば、下文にさらに詳細に議論されるように、静電引力は逆転される。もし細菌が静電場のみによって負荷表面８１０へ近接して保持されているなら、このフィールドは消されるか、低減されるか、または逆転もされる。
【０２９８】
細菌は次に、チャンバー８０５に沿って、流体の移動によって水平に移動し、この移動は、電気浸透、容積計量型ポンプ、蠕動性ポンプ、または他の手段によって達成されてよい。この移動は、垂直の電気泳動のさらなる適用と連係され、その連係は同時かまたは経時的であることが可能である。すなわち、経時的な連係においては、流体移動が一定の期間行われ、次に流体非移動の期間が続き、この間に電気泳動が適用されるか、または電気泳動は同時的連係において、移動の間に適用されることが可能である。後者の場合、移動の速度、または電気泳動力の大きさは変えられることが可能であり、捕捉表面８２０と接触する前に、細菌が捕捉表面８２０の幅を超えて移動しないようにすることができる。実際、そのリーディングエッジでは、全ての細菌が捕捉表面８２０と接触せず、捕捉表面８２０上により均一な細菌の分布ができるようにすることが好ましい。
【０２９９】
チャンバー８０５を横切って水平に移動している細菌８４０の代わりに、もし種々の表面８１０および８２０Ａ〜Ｅに対応するアドレッサブル電極が使用されるなら、細菌は代替えとして「ジグザグ」式に移動することが可能である。すなわち、細菌８４０は、負荷表面８１０の下のアドレッサブル電極にかけられている適当な電位によって負荷表面８１０から電極８１５へ移動されることが可能であり、その後に、細菌８４０は、表面８２０Ａの下にある電極に正の電位を、かつ電極８１５には負の電位をかけることにより、第一の捕捉表面８２０Ａ上へ移動されることが可能である。次いで、細菌８４０は連続的に、捕捉表面８２０Ａ〜Ｅから電極８１５へ、さらにそこから次の捕捉表面８２０Ｂ〜Ｅへ移動されることが可能である。このことは、細菌８４０が種々の捕捉表面８２０のトレイリングエッジ上に堆積せず（すなわち、それらが出会う最初の部分に粘着する）、むしろ捕捉表面８２０上に、より均一に分布されるという利点をもつ。この効果は、単一の電極８１５を置換えたアドレッサブル電極の使用によってさらに強化されることが可能であり、これらのアドレッサブル電極は、捕捉表面８２０の下の、対応するアドレッサブル電極の頂上に対して直接であるか、または別法として捕捉表面８２０と水平方向において交互であることが可能である。
【０３００】
図３３Ｃに見られるように、一番左の捕捉表面８２０Ａ上には、細菌８４０のみが結合されており、それに対し細菌８３０および細菌８３５は、この表面には結合しない。図３３Ｄにおいては、プロセスが繰返され、細菌試料がさらなる捕捉表面８２０との接触にもっていかれるにつれ、細菌８３０および８３５が、今度は捕捉表面８２０Ｃに付着されている。
【０３０１】
別の態様は図３４Ａ〜Ｄに示されており、これらは検出表面への電気泳動的輸送の側面略線図である。図３４Ａにおいては、低電解質培地８８２中の細菌試料は、ほぼ、サンプルインプットポート８９５が、代替えのインプットポート８９６を有するチャンバーと（インセクトする）位置において、高電解質培地８８０との、それらの間に形成された界面８９０による接触にもっていかれる。この界面は、低電解質試料の、サンプルインプットポート８９５を通したチャンバーとほぼ相互作用するまでの動きによって、次いで、代替えのインプットポートを通した高電解質培地の動きによるとともに、低電解質培地８８２をサンプルインプットポート８９５へもどす動きからの逆圧を防ぎながら形成されることが可能である。界面８９０はシャープに、かつサンプルインプットポートに対して垂直に示されているが、界面８９０の特定の方向および位置が本発明の範囲内で変更可能であることに注目されるべきである。また、高電解質培地と低電解質培地との間の、細菌の移動速度の差は、二つの培地の伝導率の比に関連づけられる。伝導率の差は、１０倍よりも大きいことが好ましく、さらに好ましくは、差は５０倍よりも大きく、なおさらに好ましくは、差は２００倍よりも大きい。
【０３０２】
カソード９１０は、サンプルインプットポート８９５内のサンプルウェル内に、チャンバーに対しほとんどまたは全ての細菌８３０および８４０から遠位に配置される。アノード９００は、最後の捕捉表面８２０の後に配置される。アノード９００およびカソード９１０の配置は、本発明の操作の範囲内で変更可能であるが、細菌８３０および８４０および捕捉表面８２０が、アノード９００およびカソード９１０の間にあるようにされねばならない。実際、アノード９００およびカソード９１０はチャンバーの外側であることが可能である。
【０３０３】
図３４Ｂに示された、操作の第一の段階において、アノード９００およびカソード９１０の間に電位がかけられる。高電解質培地８８０の抵抗は非常に低いことから、電位降下は最初に低電解質培地８８２を通して起こる。したがって、細菌８３０および８４０は低電解質培地を、界面８９０に達するまで迅速に通過し、その地点でそれらの動きは充分にて遅くされる。実際、二つの電解質８８０および８８２のコンダクタンスにおける大きい差のために、二つの電解質内の動きについては何オーダーもの大きさで異なることが可能である。細菌８３０および８４０は、図３３４Ｂに示されたように、界面８９０において濃縮される傾向をもつであろう。
【０３０４】
図３４Ｃでは、細菌８３０および８４０は、電位を逆転することにより、逆の方向へ移動され（電極９１０へ向けて反対に）、細菌を界面から離して移動させるようにする。細菌が移動できる距離は、本発明の範囲内で、かなり短い（たとえば、数百ミクロン）か、または遠い（たとえば、数センチメートル）ことが可能である。この地点で、高電解質培地は、代替えのポート８９６から低電解質培地を押し込むことによって除去され、系全体が、今度は低電解質培地であって、この系は図３３Ａに示されたものと同様の位置にあり、系に導入されるべき細菌がある。
【０３０５】
本発明のもう一つの態様は、図３５Ａ〜Ｄに示されており、これらは、その中で、汚染物質が電気泳動フィールド下の挙動に基づき識別される、チャンバーの側面略線図である。この場合には、細菌８３０および８４０、ならびに第一の汚染物質８３７、および第二の汚染物質８３９を含む、４つのタイプの物質が示されている。図３５Ａにおいて、４つの物質は全て負荷表面８１０に輸送され、結果として図３３Ｂのものと同様の状況を生じている。この場合、負荷表面８１０は、物質８３０，８３０、８３７、および８３９に対して引力をもつようにセットされており、全ての物質が表面８１０に結合されている。
【０３０６】
図３５Ｂでは、電極８１５および８１６の極性が、物質が電極８１５へ向けられるようにされる。物質８３７は負荷表面８１０に対して全般的に低い引力をもつか、または他の物質に比較してより大きい静電力を体験し、表面８１０から除去されるのに対し、他の物質は付着されたままである。図３３Ｃでは、電極８１５および８１６上の電位が増加され、細菌８３０および８４０が負荷表面８１０から除去されるが、表面８１０に対して高い引力をもつ物質８３９は表面８１０へ結合されたままである。細菌８３０および８４０は、次に、チャンバー８０５を通して輸送されることが可能であり、捕捉表面８２０へ付着される。
【０３０７】
細菌を表面から除去するために必要な結合力が、負荷表面８１０また捕捉表面８２０を含む物質の慎重な選択によって変えられることが可能であることは注目されるべきである。たとえば、非特異的結合については、非特異的結合剤（たとえば、ポリエチレンイミンまたは他のポリマー）の濃度が変えられることが可能であり、ポリマー鎖の長さが変えられることが可能であり、イオン荷電（たとえば、第一級、第二級、第三級、または第四級アミン、または窒素に対する置換基群）、ポリマーにおけるイオン荷電の直線密度または容積密度、または他の変化が変えられることが可能である。さらに、これらの特異的結合においいては、結合剤（たとえば、抗体）が、この系の操作の間に細菌をその場所に保持するべく充分な結合力を供給しない場合、特異的結合剤は、さらに堅く結合する非特異的薬剤を補足されることが可能であり、総結合力は非特異的および特異的力の組合せとなる。識別される一連の捕捉表面８２０が、異なる特異的結合（たとえば、抗体またはアプタマーによる）を基盤としてではなく、むしろ、異なる細菌が、全体として異なる親和性をもって結合する、種々のレベルの非特異的結合によるものであることも、本発明の精神の範囲内である。したがって、一般的に、細菌が出会う第一の捕捉表面は、総体的な低い非特定結合をもち、続いて出会う表面８２０は、レベルの増加した非特異的結合をもつこととなる。
【０３０８】
生物検出
生物の検出は、種々の異なる手段において行われることが可能であるが、一般的にはそれは視覚的な検出手段による。これらの場合、検出表面８２０の拡大された画像が、染色を加えて、または加えずに得られ、この画像が好ましくは自動化された電子的手段により解析される。本発明における検出についてのさらに一般的な議論は、前文も参照のこと。
【０３０９】
検出は、明視野、暗視野、蛍光、化学発光、位相、微分干渉を含めた顕微鏡による方法、および他の方法、ならびに全体的な光の強度、およびイメージングなしのスペクトル応答の使用を含む。かかる方法は、散乱光または蛍光応答に使用可能な、通常のコンデンサ照明を使用しない、有向レーザまたはコヒーレント光照明からの照明を用いてさらに促進されることが可能である。さらに、反射光、透過光、またはエバネセント光照明が使用可能である。本発明においては顕微鏡的方法が使用可能であるが、この系には慎重かつ反復性のキャリブレーションを必要としない光学系の使用が有利である。それゆえ、大きい視野の深さを用いている光学が好ましく、またそれらは比較的低倍率である。さらに、たとえば、同じイメージング視野について異なる情報を得る目的で、連続的に行われる、明視野位相イメージングおよび蛍光反射イメージングの使用を含め、多くの方法が同一の試料に対して利用されることは、本発明の教示の範囲内にある。
【０３１０】
この系はしばしば、その中で細菌が捕捉されるチャンバーか、または、測定がかなりの期間にわたって行われるとすれば検出器の、水平の動きを含み、一般的には細菌の増殖を含むものでは数時間を要する（以下参照）。このような場合、系にとって、検出器に対する細菌の元の相対的な関係を再建することができ、時間をかけて得られた画像が比較され得ることは便利である。このことは、時として「オープンループ」制御系を用いて行われるが、一般的にはフィードバックを含む「クローズドループ」系が好まれる。このフィードバックのための二つの好ましい方法は、チャンバー上の視覚基準の使用を含んでおり、この基準は視覚系によって容易に検出され、かかる情報が、系の水平の動きを、細菌に対するチャンバーの元の関係が確立されるまで調節するべく使用される。第二の便利な方法は、元の位置についてのおよその「オープンループ」機械的推定法を作成して画像を得、次いでその時点で画像解析を使用して、チャンバーの細菌および他の視覚的局面を登録することである（潜在的に視覚基準も含む）。かかる登録の形状は、画像を整合するための、フーリエ変換または他の相関法（マトリックスシフティングのような）の使用を含む。
【０３１１】
一般に、系は、ナショナル・インスツルメンツ（National Instruments）（テキサス州オースチン）からのＩＭＡＱビジョンソフトウェアによるラブビュー（LabView）ソフトウェア、イメージ・プロ・スクリプツ（ImagePro scripts）、または通常のコンピュータソフトウェアを用いた高速画像解析のような、自動化されたプログラムを通して生物の存在および性質を検出することができる。系は、細菌の存在のみならず、細菌の位置も記憶する。細菌が、捕捉表面８２０上の位置に固定されているとすれば、生物の増殖を含めた一定の期間に、この細菌は有意に移動しないものとみなされる。さらに、もし細菌が前には局在しなかった場所に記録されたなら、この細菌は別の場所からどかされたか、またはこの細菌が別の細菌から新たに増殖したと推定される。さらに、サイズ、死体または生体染色による染色、または他の因子における変化が、同じ位置において先に見られた生物の状態における変化に関連づけられることが可能である。
【０３１２】
一般的には、特異的な捕捉表面８２０が捕捉しない全ての生物を補足するための、少なくとも一つの非特異的捕捉表面８２０があるであろう。この表面は、ほとんどの細菌が全体的な負の静電荷をもつか、または適当なｐＨにおいてそのような電荷をもつようにされることが可能であるなら、好ましくはポリカチオン表面である。しかしながら、ポリアニオン性の電荷、疎水性の性質、細菌に対する単一または多数の抗体、糖タンパク質結合剤、ならびにポリカチオン性および他の活性成分もまた、単一で、または組合せて使用されることが可能である。それらのために、一つだけの単一の捕捉表面８２０があることも、本発明の範囲内であることが可能であり、この場合、表面は非特異的結合特性をもつことが好ましい。
【０３１３】
非特異的捕捉表面の場合、一以上の数の異なる生物を同定できることが望ましい。この同定は一般に、血清型、属、種またはクラス、または、細菌の他のサブセットセットか、または検出されている他の生物に特異的な指標によって実施され、便利なことには、抗体、アプタマー、または他の分子である。本発明におけるかかる指標の使用は、一つの非特異的表面における多数の細菌の検出についての側面略線図である図３６Ａ〜Ｅにおいて説明されている。
【０３１４】
図３６Ａでは、細菌５３０および５４０は、チャンバー８０５において非特異的表面８２５へ結合される。細菌８４０に特異的な指標８４２が、図３８Ｂにおいて、インプットポート８０２からアウトプットポート８０３を通る流体流動によってチャンバー内へ導入される。この指標８４２は細菌８４０へ結合し、次いで、未結合の指標８４２は図３６Ｃにおけるようにチャンバーから除去される。指標８４２の細菌８４０に対する結合は、表面８２５に対する細菌８３０および８４０の結合を促進するべく使用可能な、アノードおよびカソード（示されず）の使用によって促進されることが可能であることに注目されるべきである。この時点で、指標８４２の存在は、上記の検出法によって測定され、特定の場所が系に記録される（たとえば、コンピュータメモリおよび／または、ハードディスクドライブのような何らかの物理的記憶媒体上に記憶されることが可能な、リスト、データベース、または他のフォーマットにおいて）。図３６Ｄでは、細菌８３０に特異的な第二の指標８３２がセル８０５内へ導入され、次いでポート８０２および８０３を通る流体流動によって除去され、系に図３６Ｅの状態をもたらす。
【０３１５】
指標８３２および指標８４３を検出するために使用される検出手段が同じであってよいことに注目されるべきである。たとえば、もし指標８３２および８４２が蛍光を用いて検出されるなら、同じ蛍光色素が双方の検出に使用可能である。すなわち、図３６Ｅの状態では、系は指標８４２および８３２の双方の存在を一緒に検出する。細菌８３０の場所は、図３６Ｃにおけるように、指標８３２の場所を測定することによって先に確立されており、したがって細菌８４０の場所は、そこで指標８３２および８４２が検出される、新たな場所である。実際、この方法は連続的に延長されることが可能であり、細菌は非特異的な表面８２５上に固定されているにもかかわらず、特異的な指標を用いた多数の特異的な細菌の検出を可能にする。
【０３１６】
検出の手段が異なる場合（たとえば、指標８３３２が一つの蛍光体の蛍光によって検出され、一方指標８４２は、励起および／または発光波長によって分離可能な、もう一つの蛍光体の蛍光によって検出される場合）には、指標８３２および８４２は、チャンバー８０５へ同時に投入され、チャンバーから同時に洗い落とされ、次いで連続的にまたは同時に検出されることが可能である。
【０３１７】
特異的な細菌を識別する薬剤の使用（たとえば、蛍光標識された抗体の使用による）に加えて、それらを識別することが可能な、細菌または生物に固有の他の多くの特徴があることに注目されるべきである。かかる他の特徴は、個々の細菌の形態学（たとえば、球形対桿状対らせん）、コロニー形態学（たとえば、塊状対連鎖状）、異なる光周波数の吸収または散乱、異なるクラスの薬剤に対する耐性または感受性（たとえば、下文を参照）、特定の増殖培地における増殖能、成長速度、サイズなどを含む。これらの因子は、非特異的な捕捉表面８２０へ結合された多くのタイプの細菌を識別するべく使用可能である。また試料中にしばしば汚染物質があり、それがたとえば、散乱または光学的吸収検出手段によってシグナルを発生するなら、これらの方法もまた非細菌性汚染物質から細菌を識別するべく使用されることが可能である。
【０３１８】
この系は特定の細菌の同定およびモニタリングを通して動作するが、検出器が捕捉表面２８０上の全ての細菌の全応答の合計（たとえば、散乱光）を検出することも、本発明の精神の範囲内である。このことはまた、細菌の全数を示すべく使用されることも可能であり、その細菌数における増殖は、全応答の増加によって証拠だてられることができる。
【０３１９】
生物生存率の検出
生物生存率は、多様な方法によって測定されることが可能であり、生存可能な生物（生体染色）ならびに死んだ生物（死体染色）に光を当てる、双方の方法を含むことができる。これらの染色は、エチジウムまたはプロピジウム色素、ヨウ化ヘキシジウム（hexidium iodide）、ＳＹＴＯ核酸染色剤、７−アミニアクチノマイシンＤ（7-aminiactinomycin D）、ＳＹＴＯＸグリーン／橙／青核酸染色剤などを不含むことが可能である。これらのおよび他の染色剤についての良好な序説は、www.probes.com.におけるモレキュラー・プローブズ・ハンドブック（Molecular Probes Handbook）から入手可能である。
【０３２０】
新規な生物の存在、または既存の生物のサイズの増加を検出することが有用であることが可能である。このことを達成するための方法は、生物の増殖検出の略線図である、図３７Ａ〜Ｄに示されている。
【０３２１】
図３７Ａにおいて、細菌８３１は非特異的表面８２５へ付着される。細菌８３１は、分子８４４の結合のための多くの部位８４３を有する。これらの部位８４３は、高い負の静電荷、糖タンパク質、広いかまたは狭い範囲の抗生物質のためのエピトープ、などを表すこともできる。図３７Ｂでは、部位８４３は大過剰の分子８４４の中で分子８４４によって結合され、全ての部位８４３が分子８４４によって占められるようにし、その後に過剰の分子８４４は洗い流される。
【０３２２】
図３７Ｃでは、細菌８３１はサイズまたは、図に示されたように細菌８３１の数の増殖を経験し、新たな細菌８３３を生み出す。新たな細菌はしばしば、細菌８３１の元の場所の近位の表面８３１に結合することができること、および、この近接は、細菌８３１および８３３を表面８２５へ向けて駆動する電気泳動力の、増殖の間の使用によって改善可能であることが認識されるべきである。この近位は、かならずしも新たな細菌の増殖８３３を検出するためのものではないが、むしろ、細菌８３１の生存力および増殖を証明する目的で、新たな細菌８３１を、それが由来した細胞と関連づけるためである。
【０３２３】
新たな細菌８３３は結合部位８４３を有しており、それに対して分子８４４は結合していない。説明図では、分子８４４によって結合されていない部位８４３は、新たな細菌上に局在しており、細菌の増殖の様式に依存して、これらの結合部位８４３は、元の細菌８３１の分裂から生じた双方の娘細菌上に分布するであろう。たとえ新たな細菌との間の分離がなくても−たとえば、細菌８３１の表面積が、新たな細菌８３３の創造なしに増えれば−表面積の増加は一般に新たな結合部位８４３の創製を含むことも注目されるべきである。
【０３２４】
図３７Ｄでは、細菌８３１および８３３は次に、系によって検出可能な指標８４６によって検出され得るべく任意に修飾された分子８４４とインキュベートされ、次いで細菌８８３１および８３３に結合していない、指標８４６をつけた分子８４４が洗い流される。したがって、任意の指標８４６は、増殖された新規な細菌か、または指標８４６がそこへ結合することができる細菌上の部位の数における変化の指標であることができる。
【０３２５】
生物の増殖
細菌は、次に、それらの生存度、増殖特性、および種々の薬剤（抗生物質のような）に対する感受性を測定する目的で増殖される。増殖は、適当な培地の存在下に、適当な温度および酸素飽和または欠乏下（たとえば、一般的には試料の供給源に依存して、たとえば嫌気性または好気性細菌用に）における、細菌のインキュベーションによって起こる。インキュベーション培地は一般に、モニターされる細菌に適合されるであろう−たとえば、肺吸引液、尿検体、および血液検体は、すべて各々の起源の細菌または他の生物に充分適合された培地で、この技術において周知のようにインキュベートされるであろう。さらに、効果について検査されるべき抗増殖剤もまたこの技術において周知であり、新規な薬剤の発見とともに、また、現在使用中の混合物が耐性の出現によって変わるにつれて、変化するであろう。
【０３２６】
細菌の増殖の間に、娘または新たな細菌８３３が、それら由来した元の細菌８３１とほぼ同じ場所にあって、細菌８３３の起源が測定されるようにする目的で、連続的または頻回の電気泳動力を適用することが便利である可能性がある。したがってこのことは、元のどの細菌８３１が増殖しているのかの測定を可能にし、かつ第二に、さらなる検査（たとえば、抗体染色）をする必要なしに、新たな細菌８３３に対して細菌のタイプを決定することを可能にするであろう。
【０３２７】
細菌によって経験された電気泳動力は、培地のコンダクタンスに逆比例し、それゆえ低いコンダクタンスの増殖培地を有することが便利であることに注目されるべきである。細菌、酵母、および他の生物の増殖に使用されるほとんどの培地は、しかしながら、一般にＮａ+、Ｋ+、Ｍｇ+2、Ｃｌ-、ＳＯ4-2、ＮＯ3-および他のイオンを、栄養として、ならびに培地のイオン強度を維持するために有している。増殖培地は５ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率をもつことが好ましく、さらに好ましくは、増殖培地は２ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率をもち、さらになお好ましくは、増殖培地は１ｍＳ／ｃｍ未満の伝導率をもつ。これらの伝導率が、上記のように、細菌または他の分子の、電極におけるそれらの濃縮のための移動において使用されるものよりも一般的に高いことに注目されるべきである。しかしながら、細菌８３３は電極において、または電極の近位において生みだされることから、必要とされる移動は距離が小さく、より少量の電気泳動力が必要である。さらに、電気泳動力の適用は、一定である必要はなく、増殖培地が一定のバルク移動の下にない場合にはとくに、間欠性に適用されることが可能である。微生物の遅い拡散のゆえに、培地がバルク移動内にないとき、電気泳動力を１０秒ごとよりも頻繁ではなくかけることが好ましく、６０秒ごとよりも頻繁ではないことはさらに好ましい。一般に、多くの増殖培地は多量の塩を含有しており（たとえば、Ｌ  Ｂｒｏｔｈでは０．５％ＮａＣｌ）、この塩は好ましくは、コンダクタンスにはほとんど寄与しない、アラニンまたはシステインのような両性イオン性種によって置換えられることが好ましい。培地の浸透力は充分に高く、細菌が浸透圧ショックを受けないようにすることも好ましい。グリセロールまたはスクロースのような非イオン浸透成分は、この目的のために使用可能である。
【０３２８】
増殖は、それ自身により、主として生物の生存力を、かつ潜在的には細菌の増殖の相対的な速度を示す。しかしながら、それはまた、殺菌および静筋剤のような、種々の抗生物剤に対する細菌の感受性を研究するためのも使用可能である。かかる薬剤の実例は、セファロスポリン、ペニシリン、カルバペネム、モノバクタム、他の新規なベータ−ラクタム抗生物質、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤、フルオロキノロン、マクロライド、ケトライド、糖ペプチド、アミノグリコシド、フルオロキノロン、リファンピシン、および、臨床または研究において抗生物質として使用される新規な薬剤を含めた他のファミリーを含む。最も単純な場合には、このことは一定の濃度の抗生物剤（ＡＯＡ）中での生物のインキュベーションおよび、生物の増殖の速度および／または死の速度を測定することを含むであろう。
【０３２９】
図３３Ｅは、このことが本発明により、どのように行われるかを示している。図３３Ｄでは、細菌８３０，８３５、および８４０は、捕捉表面８２０へ特異的に結合されている。増殖培地中の一つの濃度のＡＯＡにおける（薄い斑点で示された）、あるインキュベーション期間の後、細菌８４０は数が増えており、細菌８３０および８３５は増えず、細菌８４０が、使用された濃度ではＡＯＡに感受性ではないこと、細菌８３０および８３５が、使用されたＡＯＡの濃度において感受性であることを示している。細菌８３５が、細菌８３０と、それらが死んだことを除けば、同じタイプのものであることに注目されるべきである。死体または生体染色を仮定すれば、それゆえ、細菌８３０がその濃度のＡＯＡによって殺されておらず、ＡＯＡが増殖を妨げるが、細菌８３０を殺さないこと、または使用された濃度において，ＡＯＡは増殖を停止するべく作用したにすぎないことを示している。
【０３３０】
図３３Ｆでは、ＡＯＡの濃度は増加され、細菌８４０の数はなお増加しており、細菌８４０がこの濃度の（細菌）に対しても感受性でないことを示している。しかしながら、細菌８３０は殺されており（殺された細菌として示された）、この濃度では、ＡＯＡが致死性であることを示している。したがって、図３３Ｅ〜Ｆに示されたように、増殖培地中の濃度をしたＡＯＡの使用により、ＡＯＡに対する細菌の濃度応答が測定可能である。明らかに、ＡＯＡの量をある期間にわたって段階的に増すことにより、最小発育防止濃度（ＭＩＣ）が測定可能である。さらに、細菌の生存率もまた各濃度において測定されることから、最小殺菌濃度（ＭＢＣ）もまた測定可能である。
【０３３１】
異なる濃度のＡＯＡにおける増殖および生存率の測定が、セル８０４内の、各々が特定の濃度のＡＯＡによって細菌にチャレンジする一連のチャンバー８０５の使用によるか、または別法として、所与のチャンバー８０５内の濃度を増すことによって実行されることがかのうであることは注目されるべきである。前者の場合、細菌の時間応答ならびに、ＡＯＡが除去された後の持続性の応答が（たとえば、抗生物質治療効果）、容易に確立されることが可能である。すなわち、細菌は所与の濃度のＡＯＡである期間チャレンジされ、次に、培地はＡＯＡを欠く培地で置換えられ、増殖の欠乏または細菌の死が時間の経過とともにモニターされる。
【０３３２】
上記のように、異なる濃度のＡＯＡ毎に別個のチャンバー８０５を使用しないよう、チャンバー８０５内のＡＯＡの濃度は時間の経過とともに増大されることが可能である。図３８Ａ〜ＢはＡＯＡの濃度を変えることに対する細菌の応答のグラフである。図３８Ａでは、ＡＯＡの濃度は時間をかけて増大され、一般的には指数関数的増加によるが、濃度を直線的に増加するか、または、濃度を増していくステップ関数を含め、他の濃度／時間関係によることもまた便利である；このようなステップ関数は、標準的な濃度間隔において、または別法として、国立臨床検査標準委員会（National Committee for Clinical Laboratory Standards）のような組織体によって制定されるような臨床検査基準によって指示または示唆された標準濃度において設置されることが可能である。系は、したがって、細菌の総数、死んだ細菌の数、および生きている細菌の数を測定するべく使用される（上記のように、これらの数の任意の二つが第三の数を生じさせる）。
【０３３３】
細菌の総数が増殖を続けない、図中では濃度Ａで示された点は、ＭＩＣであると考えられる。生きた細菌の数が減り始める点（濃度Ｂにおいて）は、ＭＢＣであると考えられる。実際のＭＩＣおよびＭＢＣは、各々濃度ＡおよびＢよりも低い可能性があり、濃度における増加の速度が、細菌の増殖に比較して非常に遅い場合のＭＩＣおよびＭＢＣにおいてのみであることに注目されるべきである。したがって、ＡＯＡのＭＩＣおよびＭＢＣがＸ倍の範囲内で測定されることが所望されるとすれば、ＡＯＡの濃度は、ＡＯＡを欠くインキュベーションの条件下での細菌の倍加時間の半分よりも速くない速度でＸ倍まで増加されることが好ましく、ＡＯＡの濃度は、細菌の倍加時間よりも速くない速度でＸ倍まで増加されることがさらに好ましく、細菌の倍加時間の２倍よりも速くない速度でＸ倍まで増加されることがさらに好ましい。
【０３３４】
増殖が起きたという高い確信があることのために必要とされる細菌の増殖がより少なければ、検査を行うために必要な時間を減らすことになる。個々の細菌をモニターすることにより、増殖は少数の細菌の倍加のみによって見ることが可能である。すなわち、もし通常の混濁試験におけるようにバルクで見るなら、たとえば、細菌増殖を検出する感度の限界は、混濁試験におけるシグナル対ノイズ比によって制限される。しかしながら、１匹の細菌の分裂は、たとえその細菌が何千匹もの細菌のうちの１匹であったとしても、検出可能な個別の事象である。したがって、本発明は、好ましくは２５％未満の細菌の倍加を検出することができる、さらに好ましくは１０％の細菌の倍加を測定することができる、および、もっとも好ましくは５％の細菌の倍加を測定することができる系を用いて、非常に高い感度を有することが可能である。一部の細菌の倍加時間があらかじめ決められる（たとえば、実験標本を用いた実験室でのキャリブレーションによる）か、またはさらに好ましくは、ＡＯＡの不在下の細菌を、ＡＯＡの存在下のものと比較すること−このことは結果を内的に調整する−に注目されるべきである。
【０３３５】
抗生物質感受性の決定のための測定のカットオフポイントは、前文に議論されたように、所与のパーセントの細菌の倍加というような、絶対的な用語で表されることが可能である。しかしながら、統計的に価値のある判断を行うために必要な細菌の数は、試料中に存在する細菌の数に依存する可能性がある。たとえば、もし各チャンバーに１０匹の細菌しかいないとすれば、単一の細菌の倍加の表明は、試料の１０％を表す。代わりに、表面上の非常に多数の細菌（すなわち、１００，０００を超える）を用いれば、１，０００匹の細菌（すなわち１％）の倍加でも、おそらくは統計的に有意である。したがって、実験条件下（すなわち、ＡＯＡのある増殖培地）で倍加を示している細菌の数に対して、対照条件下の倍加を示すために必要な細菌数が統計的に妥当であることを分析することは、多くの場合に好ましい。たとえば、通常の方法は、これら二つの数に対し、カイ二乗検定を適用し、結果が特定の有意性の確率に合致するかどうかを決定する。一般に、この確率は０．０５未満であることが好ましく、さらに好ましくは、この確率は０．０２５未満であり、最も好ましくは０．０１未満である。少数の細菌は、非常に小さいカイ二乗された確率を可能にしないことから、確率についての基準が、ごく少数の細菌の場合（たとえば、対照の増殖培地中に２０匹未満の細菌）を便利に減少させることが可能である。
【０３３６】
細菌の倍加時間が集団現象であって、細菌の集団内では、ある細菌は、他よりも素早く分裂することが理解されるべきである。このことは、集団内におけるわずかな遺伝的差異か、または純粋に統計的な影響の双方に起因することも可能であろう。しかしながら、このことは、調製の間に各細菌が増殖している期によることも可能であり、その期に依存して、細菌が新たな培地内に置かれた時、それらの増殖に実質的に異なるラグタイムを示すことになるであろう。より長い期間は一般に、細菌の増殖特性およびＡＯＡ感受性について、より多くの情報を与えることになるが、医療従事者に細菌およびＡＯＡに対するそれらの感受性についての情報を供給する必要がある。興味の細菌のほとんどについてラグタイムが２〜６時間のオーダーであり、細菌の倍加時間が一般に１〜２時間であるとすれば、細菌の増殖およびＡＯＡに対する感受性の測定には、８時間を超えない、さらに好ましくは６時間未満の、細菌の検出を使用することが好ましい。たとえ試料中の全ての細菌が増加を証明するための機会をもたなくとも、こうした細菌の充分に大きい割合が、感受性および増殖を示すことができるようにするであろう。
【０３３７】
この場合、生体および／または死体染色（生きている細菌対死んだ細菌を示す）について、ならびにＡＯＡの存在を用いる、および用いない増殖培地の存在下での増殖について、すべての情報が、個々の細菌について得られるようにすることは有用である。生きた細菌の割合が、ＡＯＡの存在下に、最初の前測定された割合まで減少しているという、あるいは、細菌の増殖（倍加によるか、または細菌のサイズの増加によって立証される）が、ＡＯＡの存在下に、第二の前測定された割合まで減少しているという任意の観察は、ＡＯＡの活性の証拠である。一般に、最初に前測定された割合は、より高いその死の証拠から、第二の前測定された割合よりも少なくなるであろう。好ましい最初の前測定される割合は、２０％であり、さらに好ましい値は３３％であり、最も好ましい値は５０％である。好ましい第二の前測定される割合は、５０％であり、さらに好ましい値は６６％であり、最も好ましい値は８０％である。
【０３３８】
前文に示されたように、ＡＯＡ感受性に関するほとんどの研究は、観察された特定のカイネティクスおよび効果よりもむしろ、特定の効果に出会った濃度に関係づけられる。すなわち、通常の検査では、細菌は普通多くの異なる濃度（または変化する濃度でも）のＡＯＡによってチャレンジされ、細菌が死または低下された増殖速度を示す濃度が測定され、そこからＭＩＣまたはＭＢＣが得られる。たとえば、抗生物質ディスクによる寒天平板を用いた通常の抗生物質試験を考慮されたい。ディスクの周辺は、様々なサイズのコロニーがあり、単に死だけではなく、濃度を変えた抗生物質の存在下でのより遅い増殖も表している。この測定では、プレートをより長い期間インキュベートすることが、阻害性であると考えられる濃度においてもコロニーが見られるようにすることがあるため、ＭＩＣは容易には規定されない。
【０３３９】
しかしながら、時間およびコストの双方見地からは、いくつかの場合には、感受性を測定する目的で、代わりに細菌を単一の、一定した用量のＡＯＡでチャレンジし、次いで、薬剤の特定の効果および効果の速度を観察することが便利である可能性がある。本発明においては、一定用量のＡＯＡが供給されることが可能であり、細菌が殺された速度、またはその増殖が低減された程度が、治療的用量の多重度を正確に評価するべく使用されることが可能である。このような応答は、ＡＯＡの不在下での細菌の倍加時間で割られた、ＡＯＡの存在下での細菌の倍加時間といった、ＡＯＡの効果の新しい測定値によって記述されることが可能である．この場合、ＡＯＡに対して耐性ではあるが、その倍加時間がＡＯＡの存在下に３倍になった細菌については、ＡＯＡを用いた治療はなお有意義である可能性がある。これらの値は、単一の用量か、または多重の用量で提供されることが可能である。異なるレベルの感受性をもつ細菌が単離および研究されることが可能であるという点で、ＡＯＡの一以上の濃度における情報は有用であって、それゆえ他の濃度における応答を予測することが可能である。
【０３４０】
ヒトまたは動物において，ＡＯＡの濃度は、治療の量および頻度（たとえば、注射）ならびにＡＯＡの薬物動態によって決定されることに注目されるべきである。多くの場合、薬物動態は病気のないヒトについては周知であり、モニターされるヒトの既知の医学的状態（たとえば、肝不全）に基づき、モデル化されることが可能である。この情報を用いて、ターゲット臓器（たとえば、血液、尿管、肺）における、時間にわたるＡＯＡの濃度が推定されることが可能である。このＡＯＡ濃度は、チャンバー内で培地を、ＡＯＡのない培地との相対的な割合でＡＯＡと混合することによって近づけられることが可能であり、図３８Ｂに示されたようなＡＯＡの推定プロフィールを生じる。一般に、ＡＯＡの濃度は上昇し、ピークに達し、次に指数的に減衰するであろう。前と同様に、細菌の総数、死んだ細菌、および生きている細菌は、時間をかけてモニターされる。この場合、薬物動態パラメータＭＩＣおよびＭＢＣは、じゅうぶんには規定されず、その理由は、一方はＡＯＡの薬物動態を含めた細菌の応答を見ており、一方はそれゆえ最小阻害用量および、異なる用量における系の反復試験による最小殺菌濃度を見ており、それゆえ全体のＡＯＡの濃度プロフィールが、結果として細菌の増殖の停止または死を生じるかどうかをモニターしているからである。図３８Ｂの分析が単一の用量のＡＯＡを扱っているにもかかわらず（すなわち、立上がり、ピーク、減衰）、しばしば治療において使用されるような、ＡＯＡの連続的な用量（たとえば、毎日４回の注射）について分析を続けることが可能であることに注目されるべきである。
【０３４１】
本発明の方法が、ＡＯＡに対する生物の応答のみでなく、ホルモン、薬物（たとえば、薬物感受性試験のため）、環境、または他の因子といった、他の条件に対する応答についても適用可能であることに注目されるべきである。これらの因子は、用いた検出器によって検出可能な応答であるかぎり、そのように分析されることが可能である。多くの場合、何らかの種類の染色が、条件にたいする応答を可視的にするために必要である。
【０３４２】
上記の議論において、ＡＯＡの適用のタイミングは、細菌が最初に増殖培地中へ置かれた時間、またはその代わりに、細菌の増殖が最初に検出された時間（たとえば、細菌のサイズにおける変化によるか、または娘細胞の存在による）に関係することが可能である。後者の場合、増殖は連続的にモニターされることが可能であり、ＡＯＡは、ラグタイムが完了したことが測定された時間にインキュベーションへ添加される。ラグタイムの完了は、一般に、あるあらかじめ決められた割合の細胞が増殖のサインを示した時点であり、それは、好ましくは５０％未満の細胞、さらに好ましくは３０％未満の細胞、最も好ましくは２０％未満の細胞である。
【０３４３】
細胞増殖を証明するための顕微鏡の使用の実例は、ローレンス（J.R. Lawrence）、コーバー（D.R. kober）、およびカドウェル（D.E. Cadwell）著、「Computer-enhanced dearkfield microscopy for the quantative analysis of bacterial growth and behavior on surface（表面における細菌の増殖および行動の量的解析のためのコンピュータ支援暗視野顕微鏡）」、J. Microbilo. Methods 、１９８９年、第１０巻、ｐ．１２３−１３８、および、エルフウィング（A. Elfwing）、レマルク（Y. Lemark）、バリヤーニ（J. Baryani）およびバラギ（A. Ballgi）著、「Observing Growth and Division of Large Numbers of Individual Bacteria by Image Analysis（画像解析による多数の個別細菌の増殖および分裂の観察）」、Applied and Envilonmental Microbilogy、２００４年、第７０巻、第２号、ｐ．６７５−６７８によって提供される。エルフウィングらからは、細菌の増殖が層流下に測定可能であって、それによって娘細胞は切離され、鋸歯状のプロフィールを生じ、その中で細胞のサイズが増加し、次に娘細胞の除去によって細胞のサイズは急に減少することに、注目されるべきである。本発明においては、細胞サイズ（たとえば、ピクセルの数）に加えて、蛍光または光散乱の量もまた使用されることが可能である。
【０３４４】
別の手段を用いた検出表面への輸送
前文では、電気泳動手段を用いた検出表面への輸送が議論されたが；他の手段がここに議論される。たとえば、細菌は遠心力を用いて検出表面へ輸送されることが可能である。図３９Ａは、捕捉表面９０５上への細菌の濃縮のために修正された遠心チューブ９００の略図であり、図３９Ｂは、図３９Ａの遠心チューブ９００の断面図である。チューブ９００は三つの分離可能な部品、試料チューブ９０３、捕捉部品９１０、および底部品９１２を含んでなる。試料チューブ９０３は、外部構造９０４を含んでなり、それは、好ましくは２００ｘｇを超え、さらに好ましくは１０００ｘｇを超え、さらになお好ましくは２５００ｘｇを超える遠心力を加えることが可能な遠心分離機用の遠心分離用固定具内に、ぴったり適合する直径をもつ円筒である。試料チューブ９００は、さらに内部構造９０７を含んでなり、それは強度を目的として、外部構造９０４と接しており、内部構造９０７は四角形または長方形の断面を有する。試料チューブ９０３は、細菌試料を含有している試料９１６を保持することに注目されるべきであって、遠心分離される場合、試料中の細菌を、捕捉表面９０５上に沈着するが、これは好ましくは四角形または長方形の断面を有しており（他の形状も本発明において可能であるが）、その形状が内部構造９０７の形状に合致する。内部構造９０７の断面の形状は、捕捉表面９０５の形状によって制限されており、遠心力と試料チューブ９０３の材料とが、内部構造９０７が、外部構造９０４なしにその大きさの完全性を維持することができるようになっているか、または、遠心チューブ９００がその中に適合する遠心分離用固定具が、チューブ９００の形状（たとえば、四角形または長方形）にほぼ適合するなら、内部構造９０７および外部構造９０４を有する代わりに、内部構造９０７のみがあることも可能である。
【０３４５】
試料チューブ９０３は、ガスケット９１４を含むことが可能な捕捉部品９１０上へぴったり適合しており、遠心分離下に、細菌試料９１６が試料チューブ９０３から無理に出されないようにする。試料チューブ９０３は一般に、試料チューブ９０３および底部品９１２の双方のための界面を有しており、上部表面は試料チューブ９０３内の細菌試料と接触しており、それは一般に試料上の細菌または他の生物に対する非特異的結合を有する捕捉表面を有する。かかる非特異的表面は、前文において詳細に記述されている。捕捉表面が一体化された捕捉部品９１０上に直接配置される（たとえば、成形されたプラスチック部品）か、または別法として、可撤式の上部部品であることが可能であり、それは除去時には、好ましくは１００ミクロンおよび１５００ミクロンの間の厚さであって、適当なプラスチックまたはガラスで製された、扁平な四角形または長方形であることに注目されるべきである。以下の議論は一体化された捕捉表面部品９１０に関する。
【０３４６】
底部品９１２は遠心分離用の使用のため遠心分離用固定具内へぴったり適合されて成形されており、典型的には半球形または円錐形である。再度、遠心分離用固定具に依存して、底部品の形状は様々であることが可能である。さらに、もし遠心分離用固定具が底部において扁平であれば、底部品９１２は省かれることが可能であり、捕捉部品９１０の底部表面は遠心チューブの底と接することとなる。
【０３４７】
試料９１５内の細菌が捕捉表面９０５上へ遠心分離されると、捕捉部品９１０は、試料チューブ９０３から分離され、図３９Ａ〜Ｂの捕捉部品９１０を用いた検出器９３０の断面側面図、図３９Ｃに示されるように、上部固定具９２２および底部固定具９２４との間に配置される。固定具９２２および９２４は、ねじ９３２、およびナット９３６、または他の手段（たとえば、クランプ）と一緒に保持されており、ガスケット９３４は、上部部品９２２と捕捉部品９１０との間の堅い防水シールを提供する。部品９２２において、上記の捕捉部品９１０の上には、一連の直線的な壁９２３があり、それは捕捉表面９０５上へピッタ適合され、単離されたチャンバー９２０が捕捉表面９０５の上に創製されるようにする。これらのチャンバー９２０はインプットおよびアウトプットポート（示されず）を具備しており、それらは増殖培地、ＡＯＡ、細胞タイプのための指標（たとえば、蛍光性抗体）、死体および生体染色剤、および、図６の段階７３０、７４０、および７５０を実行するために必要な他の培地の導入を可能にする。検出は上部固定具９２２を通して与えられる；しかしながら、もし捕捉表面９０５が上記のように捕捉部品９１０から除去可能であれば、検出は適当な固定具の与えられた捕捉表面を通して行われることが可能である。
【０３４８】
もう一つの態様は、図４０Ａ〜Ｂにおいて提供されており、これはフィルタをベースとする、多孔性の捕捉フィルタ９６０を用いる検出器９５０の断面側面図および側面図であり、図４０Ｂは、図４０Ａの断面Ｅを通して示されている。装置９５０は一連の検出チャンネル（そのうちの４つが示されているが、数十個のチャンネルを含むことができる）を含んでなり、その各々が多孔フィルタ９６０を含んでなり、それはセパレータ９６２と一緒に上部チャンバー９６４および下部チャンバー９６６を分離する。フィルタ９６０はチャンネルの末端にあり、培地は、インプットポート９５２から、セパレータ９６２の上の表面を横切り、フィルタ９６０を通って、セパレータ９６２の下の表面を横切って戻り、次いでアウトプットポート９５４から外へ移動する。チャンネルは外部構造９７０によって反対側で固定されており、単一の部品を含んでなる（示されたように）か、または上部部品が底部部品上に固定され、上部部品はフィルタ９６０上にあり、一般に透明であって、フィルタ９６０の上部表面上に結合された細菌が視覚的に検出されることが可能である。各チャンに別個のアウトプットポート９５４があることが可能であるが、図に示されるように、アウトプットポートは共有されることが可能である。
【０３４９】
フィルタ９６０は、トラックエッチングされた部材（たとえば、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ガラス、アルミニウム、または他の物質）、酸化アルミニウム、テフロン（登録商標）（Teflon（登録商標））、ニトロセルロース、および他の物質を含んでなることが可能である。いくつかの場合には、フィルタ９６０は、セパレータおよび外部構造９７０とは異なる物質であって別個に製造され、それゆえ多孔性の構造要素の上に配置されており（示されず）、それがフィルタを位置に保持し、培地がフィルタ９６０を通ることなく上のチャンバー９６４から下のチャンバー９６２へ流れるのを防止する。
【０３５０】
フィルタは、好ましくは中程度の、５００ｎｍ未満の、さらに好ましくは２５０ｎｍ未満の、最も好ましくは１００ｎｍ未満の孔サイズを有しており、それは検出されるべき最小の細菌生物よりも一般に小さいであろう。一般に、かかる孔は実質的に５０ｎｍ未満二製するのは困難であり、孔の直径よりも小さいオーダーの、非常に小さい生物（たとえばウイルス粒子）には、抗体、アプタマー、または静電引力（たとえば、粒子がポリカチオン表面でカバーされている場合）を用いて、生物に対して粒子を（たとえば、ポリスチレンまたは他のポリマー、金、セラミック、または他の物質からなる粒子）結合することが便利であり、生物と粒子との組合せが孔よりも大きくなるようにする。しかしながら、これらの粒子は、パックされた構造にあるとき、フィルタ９６０の領域よりも大きい領域をもつほど大量に使用されてはならないことに注目されるべきである。
【０３５１】
細菌試料は一般に、上記のように、粒子状の汚染物質（たとえば塵）、哺乳類細胞、粘液、および他の妨害物質を除去するべく、また一般には試料体積を１ミリリットル未満に低減するべく調製される（フィルタを通る試料の流速は、トラックエッチングされたフィルタのようないくつかの場合には、非常に遅い）。細菌は試料中にて、インプットポート９５２からフィルタ９６０を横切って流れ、その表面に捕捉される。細菌は、表面上で、上記の検出手段により、外部構造９７０を通して検出される。次に、上記の増殖および検出についての段落において記述されたような、栄養物、死体および生体染色剤、指標、ＡＯＡ、および他の物質を含んでなる培地が、インプットポート９５２を通して導入され、アウトプットポート９５４から除去される。一定した力が系に配置され、増殖を通して新たに生じた細菌が、培地中を元の場所から遠くへ移動しないようにし、系を通る培地の動きが維持されるようにすることが望ましい。
【０３５２】
もう一つの態様においては、試料の濃縮、輸送、および付着は、非特異的な捕捉表面の上で同時に成遂げられ、そこに多数の力が適用され、サイズ（体積または断面積）、電荷対質量比、静電または磁性タグの相対的付着、電気泳動移動度、および他の特徴に基づき、細菌の異なる分画への分離が達成されるようにする。一つの態様においては、細菌は流体の移動によってチャンバーに沿って水平に移動され、その移動は電気浸透、容積計量型ポンプ、蠕動性ポンプ、または他の手段によって達成されてよく、あるいは別法として、細菌は、指向性の力（たとえば、電気泳動、磁場など）の適用下に移動することが可能である。細菌上の垂直方向の力は、流体流動（たとえば、濾過）、電気泳動、電気浸透、遠心分離、または他の手段によって達成されてよい。任意の一方向の力が、一つ（たとえば、流体流動は、異なる断面位置に置いて反対方向に適用可能である）、または前文に記述された二つ以上の力の付加的または反対の力の結果であることが可能性であることに、注目されるべきである。また、力は、平行、直交、または二つの組合せであることが可能である。
【０３５３】
図４１Ａ〜Ｂは、細菌試料の分離を達成するための、多数の力を用いた検出系の略断面図である。図４１Ａは、インレット８０３における正の移動圧によって引き起こされた、組合わされた水平および垂直の流体の移動が、トラックエッチングされたフィルタ１００１を通してチャンバー８０５内に、エクジットポート８０２から外への流れを生じる。このバルクの流体の移動は、アノード８１５およびカソード８１６を用いた水平電気泳動のさらなる適用と連係され、それは同時または経時的な様式にある流体流動に対向する。すなわち、経時的な連係においては、流体の動きはある一定期間行われ、次いで一定の流体非移動の期間が続き、その間に、電気泳動が適用されるか、または電気泳動は同時的連係において、移動の間に適用されることが可能である。後者の場合、移動の速度または電気泳動力の大きさは可変であり、二つのタイプの細菌（星８３０および８３５および菱形８４０で示されている）、細菌タイプのクラスター（８３０Ｂおよび８３５Ｂで示されている）、および試料汚染物質１０００が、サイズ、位相、および電気泳動移動度のような種々の物理的特徴によって分離される。
【０３５４】
図４１Ｂでは、分離の終わりに、電気泳動流およびバルクの流体流動力が平衡化されており、細菌８３０，８３５、および８４０、および汚染物質１０００が、サイズおよび電荷に基づき分離されるようにする。細菌８３０は、個々の細菌８３０の領域と、細菌のクラスター８３０Ｂに分かれる。また、死んだ細菌８３５からの生きた細菌８３０の分離もあり、その分離は、サイズ、表面特性、および電荷の変化によって起こる（一部は透過性における変化による）。これらの分離は、フィルタ１０００上の細菌の同定および、試料からの汚染物質１０００の分離または除去の助けとなる。
【０３５５】
カソード８１６は、示された系の上の部分にあるが（すなわち、カソード８１６およびアノード８１５は、フィルタ１０００の同じ側にあり、そのカソード８１６が、示された系の下の部分に入れられ、カソード８１６およびアノード８１５がフィルタ１０００の反対側にあるようにすることも、精神の範囲内である。この場合、フィルタを横切って移動する細菌は、流体流動によって影響を受け、その双方が、フィルタ１０００を横切って細菌を、および最終的にはフィルタ１０００上へ下向きに動かすとともに、電気泳動力として、細菌を下向きのみに移動させる（および、それを通して電気泳動力が適用される孔へ）。したがって、流体流動および電気泳動の力は、独立して適用可能であり、これらの二つの力に対する応答に依存して、細菌および汚染物質の分離が成遂げられる。実際、この場合にはアウトプットポート８０２は系の上部にあることが便利である可能性があり、それゆえ流体流動力は、ほぼ完全に水平であるのに対し、電気泳動力は垂直である。電気泳動を支持する任意の透過性の膜は、トラックエッチされたフィルタ１０００の代わりに装置において使用されることが可能である。
【０３５６】
本発明の精神の範囲内で、装置内に多くの構造があることが注目されるべきである。たとえば個別のフィルタ９６０が各チャンネルにあることが可能であるが、単一のフィルタ９６０があって、それが各チャンネルの間の壁によって分離されていることは便利である。さらに、フィルタ９６０は各チャンネル内で長方形であることが示されているが、フィルタ９６０は、フィルタ９６０の表面上で細菌を検出するべく用いられる光学系の視野に適合するような縦横比（四角形またはやや長方形）であることもまた便利である。さらに、インプットポート９５２およびアウトプットポート９５４が、装置９５０の同じ側に示されているが、それらは装置９５０の反対側に位置するか、または互いに垂直方向にあることも可能である。
【０３５７】
本発明の精神の範囲内での多くの態様
当業者には、上記の態様が本発明の多くの可能な特別の態様のうちの一部の例示にすぎないことは明らかであろう。本発明の方法が、ほとんど数えきれない数の、指標、検出器、混合手段、力の適用手段などを提供することが認識されるべきである。
【０３５８】
いくつかの態様は、本発明の生物検出のブロック図、図４３においてコンビナトリアルに記述されている。
【０３５９】
「ターゲット同定」において示されたように、ターゲットはＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、デンプン、脂質（たとえば、ステロイドホルモン）を含むことが可能であり、さらにこれらの組合せ（たとえば糖タンパク質）でもよい。さらに、ターゲットは、細菌、真菌、ウイルス、マイコプラズマ、原生動物、または種々のタイプの動物または植物細胞（たとえば、循環細胞、または組織培養細胞）を含め、生物または組織を含むことが可能である。さらに一般的には、ターゲットは、それに対して特異的なプローブが開発されることが可能な、任意の物質または分子を含むことが可能である。
【０３６０】
任意の試料調製においては、それが汚染物の除去、より扱いやすい体積への濃縮、または、その特性が次の分析段階にさらに適切である緩衝液へのターゲットの配置を含むことが可能であるという理由から、その中にターゲットが存在する（ターゲット）が、次の分析に向けて調製されることが可能である。この試料調製は、遠心分離（別の緩衝液中での再懸濁に向けて、試料からターゲットを遠心沈降するため、または溶液中のターゲットから粒子状の汚染物質を遠心除去するため）、イオン交換（たとえば、イオン交換樹脂を通すか、または試料をイオン交換ビーズと混合する）、濾過、電気泳動（たとえば、スタッキング電気泳動または抽出を伴う電気泳動）、および他の生化学的、化学的、または物理的分離（親和性カラム、相分配、沈殿など）を含むことが可能である。
【０３６１】
任意のタギングにおいて、ターゲットは、プローブへ向かうその動きを改善するためか、または検出器によってより検出可能にするべくタグされる。移動度に影響を及ぼすタグは、静電タグ（たとえば、電気泳動フィールド下での動きのため）、磁性タグ（たとえば、磁場内での動きのため）、静電気的に分極可能なタグ（たとえば、電極フィールド下での動きのため）、および、異なる物理または化学的環境において、ターゲットの移動を変化させる他の物理的特性をもつタグを含む。タグはまた、光散乱粒子のような指標タグ、電気化学タグ、蛍光タグ、アップコンバート性蛍りん光体タグ、量子ドットタグ、または酵素タグ（たとえば、ペルオキシダーゼ）を含み、それは次の段階において、タグされたターゲットの可視性を改善するであろう。タグされたターゲットが、双方の機能性（移動および検出）を、単一の実体の中に取込むことができること（たとえば、光散乱粒子でありまた静電分極可能であるか、または、磁性粒子であって光を散乱するもの）または、異なる機能性をもつ異なる実体を一緒に結合することから結果として生じることに注目されるべきである。
【０３６２】
タギングは、多数回起きてよく、たとえば最初の例では移動度が増強され、第二の例では検出を向上させることもまた注目されるべきである。実際、タギングは、ターゲット捕捉の前（以下に議論される）、ターゲット捕捉後、またはターゲット捕捉の前後双方において起こることが可能である。
【０３６３】
ターゲット捕捉においては、ターゲットは表面上に捕捉される。この捕捉は一般に、ターゲットの表面への移動を含み、かつ電気泳動、誘電泳動、遠心分離、磁場捕捉、濾過、重力、または、結果として表面上にターゲットを捕捉表面する他の力を含むことが可能である。表面は、ターゲットに対して天然の親和性を有するか、または、いくつかのターゲットに対する特異的な親和性（たとえば、抗体で表面をコーティングすること）か、または多くのターゲットに対する全般的な親和性（たとえば、ポリカチオンポリマーで表面をコーティングすること）をもつよう処理されることが可能である。
【０３６４】
ターゲット捕捉と共同して、任意の水平移動が行われることが可能であり、これにおいて水平移動は、電気泳動、濾過、バルクフロ−（たとえば、ポンプまたは電気浸透から）、または、ターゲットを表面上への分布に影響を及ぼすための他の手段を使用する。分布は、より均一（たとえば、ターゲットがより多くの表面の近傍に来ることを可能にするため）か、または別法として、表面上の異なる位置に、異なる性質を持つターゲットを配置するべく（たとえば、細菌をその電気泳動度に基づき「分画する」ため）使用されることが可能である。
【０３６５】
洗浄においては、未結合のターゲットが除去され、非特異的に結合した物質を除去するための注意が払われることが可能である。洗浄は、電気泳動、誘電泳動、化学的（たとえば、ｐＨ、界面活性剤、親和性競合剤）、物理的（たとえば、温度）、磁場、または、プローブ（または非特異的捕捉剤）の捕捉ターゲットに対する結合に影響を及ぼす他の手段を含むことが可能である。非特異的に結合された物質のうちのある割合は、特異的に結合されたターゲットよりも、さらに堅く結合される可能性があることに注目されるべきである。洗浄はまた、特異的に結合したターゲットを、二つの緊縮性のレベルの間で放出される物質として識別することも可能である。
【０３６６】
任意の染色においては、結合されたターゲットは、その可視性に影響を及ぼす目的で染色されることが可能であり、ターゲットの状態を確認するべく使用されることが可能である。このことは、細胞（細菌、動物、または植物）の場合に特に有用であり、これにおいて死体および生体染色は、細胞が生きているかまたは死んでいるかを示し、血清型（一般には標識されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用による）の使用が、細胞の正体（たとえば、属、種、細胞タイプ）を確立することが可能である。染色は、別法として、タギングの一部として（たとえば、蛍光タグは血清型特異抗体によって付着されることが可能である）、ターゲット捕捉の前か、ターゲット捕捉と洗浄との間か、または洗浄後に行われることが可能であることが注目されるべきである。染色が最も良好に行われる時間は、染色の持久性、染色が他の段階を妨害する程度、および他の理由に依存する。
【０３６７】
別法として、または染色との併用であるのは、任意のインキュベーションであり、これにおいてターゲットがインキュベートされるが、それは一般に生きたターゲット（たとえば、細菌）で行われる。この場合、インキュベーションは増殖を誘導する増殖培地において便利に行われ、ＡＯＡの適用、ホルモン、薬物、温度、または他の生物学的媒介物によるチャレンジ、のような生物学的条件に付随されることが可能である。もし、条件に対するターゲットの期待された応答が検出器によって可視的であるなら、染色の使用を含むことが最良である。染色もまた、インキュベーションの後に使用されることが可能であり、染色の適用が分析において多数回起きてよいこと（たとえば、インキュベーションの間に新たに増殖された細胞が染色剤で染色されるようにするか、または、条件に対する細胞の応答のため）が認識されるべきである。
【０３６８】
検出においては、ターゲットは検出器によって検出される。検出器は光学検出器であることが可能であり、それは画像／カメラであること可能であり、明視野、暗視野、周波数変化（たとえば、蛍光、アップコンバート性蛍りん光体、量子ビット、位相差、放射光線（たとえば、化学発光）、または他のイメージング手段によってターゲットを見ることができる。検出はまた、光電子倍増管をレーザスキャナと一緒に、または、全視野または視野のかなりの部分からの光を、集光光源へ広げるアベレージング光学（光半導体、フォトレジスタ、または他の光測定装置を利用することもできる）を含むことが可能である。また、検出は、イメージングモードにおいてか、またはアベレージングモードにおいて、ＳＰＲを含むことが可能である。たとえば、本発明のいくつかの態様において使用可能な、電流検出を用いた非光学的手段があることに注目されるべきである。
【０３６９】
いくつかの例では、異なる洗浄の緊縮性において、多数回の検出を行うことが便利であり、この場合、検出はもう１サイクルの洗浄および検出が続けられることが可能である。また、示されたように、連続的なインキュベーションまたは多数回の染色の後に（たとえば、ＡＯＡに対する生体の感受性を測定するため）、多数回の検出を行うこともまた便利である。
【０３７０】
分析においては、検出器からのデータが分析される。分析は、個々のターゲットをトラッキングすることによるか、または検出器によって発生されるシグナルのバルク特性の測定および分析を含むことが可能である。加えて、分析は、シグナルの変化を時間の経過とともに見ることが可能である（たとえば、生物の増殖、異なるＡＯＡ濃度二置けるその生存率、または異なる洗浄の緊縮性におけるターゲット結合、に反応して）。
【０３７１】
本発明の態様は、図４２において総体的に列挙されたものではなく、図中にコンビナトリアルに埋込まれた多くの態様は、単なる説明のためのものであることに注目されるべきである。
【０３７２】
多数の異なる別の配置が、当業者により、本発明の精神および範囲から離れることなく、容易に考案されることが可能である。さらに、原理を列挙している本文の全ての供述、本発明の観点および態様、ならびにそれらの特別の実施例は、構造上および機能上の双方の同等物を含むことが意図されている。さらに、かかる同等物は、現在知られている同等物、ならびに将来において開発される同等物、すなわち構造には無関係に同一の機能を行う任意の開発された任意の要素、の双方を含むことが意図されている。
【０３７３】
本明細書においては、明記された機能を行うため手段として表された任意の要素は、その機能を行うための任意の方法を含むことが意図されている。かかる明細書によって画定された本発明は、種々の列挙された手段によって提供される機能性が、本明細書が要求する様式において組合わされかつ一緒にされるという事実にある。出願人はしたがって、本文において示されたものと同等の機能を提供することができる任意の手段に注目する。
【図面の簡単な説明】
【０３７４】
【図１】ターゲットに対して親和性を有することを利用したバイオ検出系の略線図である。
【図２Ａ】バイオ検出系の略線図であり、これにおいて異なるプローブ１１６が基板１２０上のアレイの位置に置かれている。
【図２Ｂ】図２Ａのアレイを通した側面図である。
【図３】電気泳動的に高度化されたインキュベーション系の斜視図である。
【図４Ａ】単一のプローブ電極が、アレイ内に配置されている多数のプローブ位置の下にある、バイオ検出用セルの斜視図である。
【図４Ｂ】電極がプローブ位置の下にない、バイオ検出用セルの斜視図である。
【図５】第一の電極、第二の電極、および部分基準電極のセットからの電場の強さの線図である。
【図６】サンドイッチ構造における電気泳動用タグの略線図である。
【図７Ａ−Ｆ】類似の機能性を提供する成分の異なる配置を示している、電気泳動用タグの略線図である。
【図８】本発明の段階の略ブロック工程系統図である。
【図９】結合した物質の量対結合エネルギーのグラフである。
【図１０】プローブ位置の下にない電極を含む系の略ブロック工程系統図である。
【図１１Ａ】プローブ位置の下にある電極を含むセルの略ブロック工程系統図であり、図４Ａとの関係において最もよく理解される。
【図１１Ｂ】タグされたターゲットを用いた、プローブ位置の下にある電極を含むセルの略ブロック工程系統図である。
【図１２Ａ】反応セル内の二つの垂直な軸の上にアレンジされた三つの電極の略線図である。
【図１２Ｂ】電極Ｅ２とＥ４との間の電位差の、それらが時間とともに変化するときのグラフであり、電極Ｅ４はＥ２に対して正にバイアスされている。
【図１２Ｃ】電極Ｅ２と４との間の電位差の、それらが時間とともに変わるときのグラフであり、図１２Ｂに対する変法としてアレンジされている。
【図１２Ｄ】空間的に移動された電極の間の電位差のグラフであり、電場は大きさだけでなく、方向も変化している。
【図１３Ａ】、単一の電極２００の上に、二次元的に移動された三つの電極についての略線図である。図１３Ｂは図１３Ａの電極間の電位差のグラフである。
【図１３Ｂ】図１３Ａの電極間の電位差のグラフである。
【図１４Ａ】電気泳動用の閉鎖系の略線図である。
【図１４Ｂ】電気泳動用の開放系の略線図である。
【図１５】その中で不均一なセルが形成された領域の平面略図である。
【図１６Ａ】タグされたターゲットの、プローブとの反応を促進するようにするための、垂直力および水平力の双方を含んでいる、反応の略ブロック図である。
【図１６Ｂ】タグされたターゲットの混合を引き起こす水平力に対する時間関係における、タグされたターゲットの垂直の移動を引き起こす電気ポテンシャルのグラフである。
【図１７Ａ】水平および垂直力を調節する手段の略ブロック図である。
【図１７Ｂ】図１７Ａの系の操作についての略ブロック図である。
【図１８Ａ】マイクロタイタープレートウェル内で使用可能な機械的撹拌系の斜視図である。
【図１８Ｂ】プローブ電極の平面図である。
【図１９Ａ】電極５７０およびシャフト５５２のセットをもつ、マイクロタイタープレートの斜視図である。
【図１９Ｂ】アクセスポートを含んでなるトッププレートの斜視図である。
【図２０Ａ】ボトムプレート５９２上のウェル電極の配置の平面図である。
【図２０Ｂ】ボトムプレート上の電気的に連結されたウェル電極の配置の平面図である。
【図２１】基板上に検出サンドイッチを含んでなる検出系の断面の略図面である。
【図２２】電気泳動力を用いた識別についての略ブロック工程系統図である。
【図２３Ａ】本発明の一つの態様の断面図であり、これにおいて、上部表面上のプリズムは、スライド導波管内へ光を導入するべく使用される。
【図２３Ｂ】スライドの上部表面上のプリズムの断面図であり、これにおいて光は、スライド導波管内への光の導入に先立ち、まずプリズム内で反射される。
【図２４Ａ】遠位の平行光線経路の配置が見えるように延長された、図３のプリズム配置の断面図である。
【図２４Ｂ】平行照明の代わりに集光照明を使用することによって修飾された、図４Ａの断面図である。
【図２４Ｃ】スライド照明装置の概略断面図であり、これにおいてスライドは不均一に照明される。
【図２５Ａ】スライドと一体化された末端照明薄フィルム導波管の概略断面図である。
【図２５Ｂ】図５Ａのカップラおよびスライドの略平面図である。
【図２５Ｃ】薄フィルム導波管表面の断面図であり、光は格子を経て導波管へ連結される。
【図２５Ｄ】薄フィルム導波管の断面図であり、これにおいて光は、ハイインデックスマテリアルプリズムを経て導波管へ連結される。
【図２６Ａ】導波管の使用のない領域の、エバネセント照明の断面図である。
【図２６Ｂ】図６Ａによるエバネセント照明の断面図であり、これにおいてプリズムは窓を有しており、これを通して検出器は上部表面上のレポーターを検出する。
【図２７Ａ】可尭性のカップラを用いたプリズムによる光連結の断面図である。
【図２７Ｂ】面のカーブされたカップラをもつプリズムの側面図である。
【図２８Ａ】単純なステップ洗浄関数のための、時間の関数としての洗浄電位のグラフである。
【図２８Ｂ】傾斜洗浄関数のための、時間の関数としての洗浄電位のグラフである。
【図２９Ａ−Ｂ】一以上の付着点において基板へ結合されている、相補的なＤＮＡプローブに対して結合している単鎖ＤＮＡターゲットを含んでなる、タグされた標的の略線図である。
【図３０Ａ】プローブ電極に対する二つの基準電極の略側面図である。
【図３０Ｂ】図３０Ａに示された二つの基準電極に対するプローブ電極の、２段階の洗浄緊縮性のための電位のグラフである。
【図３１】試料中の細菌の、正体、数、および抗生物質感受性を測定するためのプロセスの、ブロックフロー工程系統図である。
【図３２Ａ】細菌検出セルの略平面図である。
【図３２Ｂ】横断面Ｘによる図３２Ａの検出セルの側面略線図である。
【図３２Ｃ】アドレッサブル電極の使用による、図３２Ｂの細菌検出セルの側面略線図である。
【図３３Ａ−Ｄ】図４６Ａ〜Ｂのチャンバーを用いた細菌の輸送および捕捉の略側面図である。
【図３４Ａ−Ｄ】検出表面への電気泳動的輸送の側面略線図である。
【図３５Ａ−Ｄ】その中で、汚染物質が電気泳動フィールド下の挙動に基づき識別される、チャンバーの側面略線図である。
【図３６Ａ−Ｅ】一つの非特異的表面における多数の細菌の検出についての側面略線図である。
【図３７Ａ−Ｄ】生物の増殖検出の略線図である。
【図３８Ａ】抗生物剤の濃度を変えることに対する細菌の応答のグラフである。
【図３８Ｂ】抗生物剤の濃度を変えることに対する細菌の応答のグラフである。
【図３９Ａ】捕捉表面９０５上への細菌の濃縮のために修正された遠心チューブの略図である。
【図３９Ｂ】図３９Ａの遠心チューブの断面図である。
【図３９Ｃ】図３９Ａ〜Ｂの捕捉部品を用いた検出器の断面側面図である。
【図４０Ａ−Ｂ】多孔性の捕捉フィルタ用いる検出系の断面側面図および側面図である。
【図４１Ａ−Ｂ】細菌試料の分離を達成するための、多数の力を用いた検出系の略断面図である。
【図４２】本発明によるバイオ検出の略ブロック工程系統図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
2007531863.tif 000069
【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３５Ｄ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３６Ｅ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８Ａ】
2007531863.tif 000089
【図３８Ｂ】
2007531863.tif 000090
【図３９Ａ】
2007531863.tif 000091
【図３９Ｂ】
2007531863.tif 000092
【図３９Ｃ】
2007531863.tif 000093
【図４０Ａ】
2007531863.tif 000094
【図４０Ｂ】
2007531863.tif 000095
【図４１Ａ】
2007531863.tif 000096
【図４１Ｂ】
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【図４２】
2007531863.tif 000098
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月6日(2007.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶液中の第１のタイプの微生物を検出するための装置であって、下記：
チャンバーの相対する壁の上に第１の電極及び第２の電極を含んでなるチャンバーであって、前記電極の間に電位がかけられた場合、電極は、前記微生物が第１の電極に向かって移動を引き起こすように設定され；
前記電極の間のチャンバー内へ前記溶液を輸送するように設定されるインプットポート；
前記チャンバーの外へ前記溶液を輸送するように設定されるアウトプットポート；
前記第１のタイプの微生物に結合する複数の第１の捕捉剤を含んでなる、前記第１の電極上に配置される第１の捕捉表面；
前記第１と第２の電極の間の電位を調節するように設置された、第１と第２の電極に操作可能に結合させる電極コントローラ；
前記第１の捕捉剤に結合した前記第１のタイプの微生物の量を検出するように設定される光学検出器；そして
光学検出器によって測定される第１のタイプの微生物の量を記憶する記憶コントローラ
を含んでなる、前記装置。
【請求項２】
酸化剤又は還元剤を含む溶液をさらに含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記光学検出器が、光散乱イメージング、明視野イメージング、暗視野イメージング、位相イメージング、蛍光イメージング、アップコンバート性リン光体イメージング、量子ドットイメージング、及び化学発光イメージングからなるセットから選ばれる方法によって、第１のタイプの微生物を検出するように設定される、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記第１の電極及び第２の電極からなるセットから選ばれる電極が、光学的に透明である、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記光学検出器が、さらに前記捕捉表面上での少なくとも一部の第１のタイプの微生物の位置を測定するように設定される、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記溶液がさらに第２のタイプの微生物を含んでおり、前記光学検出器は第１のタイプの微生物を第２のタイプの微生物から識別することが可能である、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記第１のタイプの微生物に結合した第１のタグ；及び
前記第２のタイプの微生物に結合した第２のタグ
をさらに含み、前記光学検出器は第１のタグを前記第２のタグから識別することが可能である、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記光学検出器が、第１のタグ及び第２のタグの量及び位置を測定するように設定される、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記第１の捕捉剤が、第１のタイプの微生物に結合する抗体を含んでなる、請求項７に記載の装置。
【請求項１０】
前記光学検出器が、電気泳動によって第１及び第２のタイプの微生物を識別するように設定される、請求項６に記載の装置。
【請求項１１】
前記第１の捕捉剤が、高分子電解質を含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
前記溶液が、さらに第２のタイプの微生物を含み、前記第２の微生物は第１の捕捉剤に結合しない、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記第１の捕捉剤が、抗体及びアプタマーからなるセットから選ばれる、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記第１の電極に結合した第２の捕捉剤をさらに含み、前記第２の捕捉剤は、第２のタイプの微生物を結合することが可能であり、そして、
前記光学検出器は、第２の捕捉剤に結合した第２のタイプの微生物の量を検出することができ、
前記光学検出器は、微生物が第１の捕捉剤又は第２の捕捉剤に結合するかどうかによって、第１のタイプの微生物を第２のタイプの微生物から識別するように設定される、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
前記第１の電極と共面である第３の電極をさらに含み、第２のタイプの微生物を結合することが可能である第２の捕捉剤は、前記第３の電極に結合し、そして、第１の電極と第２の電極との間の第１の電位差、及び第３の電極と第２の電極との間の第２の電位差は、独立して、電極コントローラによって調節することができる、請求項１２に記載の装置。
【請求項１６】
前記光学検出器が、第１の時間と第２の時間との間の第１のタイプの微生物の増殖の差異を測定するように設定される、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
第２のタイプの微生物の存在下における、第１のタイプの微生物の定量化のための装置であって、双方の微生物は最初一つの試料溶液中に存在しており、下記：
遠心分離機；
前記第１のタイプの微生物及び第２のタイプの微生物に対する親和性を有する検出表面を含んでなる検出チャンバーであって、前記検出表面は遠心分離機内に配置され、同時に前記試料溶液と接触することが可能であり、遠心分離に際し、第１のタイプの微生物及び第２のタイプの微生物が前記検出表面上に沈着されるようにし；
前記第１のタイプ及び第２のタイプの微生物のための増殖培地；
前記検出チャンバーと界面で接触している自動化された検出器であって、前記増殖培地の存在下に前記検出表面へ接着した第１のタイプの微生物の量を検出することが可能であり；そして
前記第１のタイプの微生物の量を記憶する情報コントローラ
を含んでなり、ここで、前記試料溶液は、遠心分離機において前記検出表面上へ遠心分離され、それらが前記表面へ結合され、前記微生物は前記増殖培地中で培養され、そして前記検出器で検出され、前記第１のタイプの微生物の量が前記情報コントローラ内へ記憶されるようにする、前記装置。
【請求項１８】
第２のタイプの微生物の存在下における第１のタイプの微生物の定量のための装置であって、双方の微生物が最初に試料溶液中に存在しており、下記：
出口チャンバーから入口チャンバーを分離している実質的に扁平なフィルターであって、その親和性表面が前記入口チャンバー内に存在しており、前記第１のタイプの微生物及び第２のタイプの微生物に対して親和性を有しており、前記第１のタイプの微生物及び第２のタイプの微生物が濾過の間に前記フィルター上に保持され；
前記フィルターの入口チャンバーに対する透明なカバー；
前記入口チャンバーへ連結するインプットポート、前記出口チャンバーへ連結するアウトプットポート；
前記第１のタイプ及び前記前記第２のタイプの微生物のための増殖培地；
前記増殖培地の存在下に前記親和性表面へ接着する前記第１のタイプの微生物の量を検出することが可能な、透明なカバーと界面で接触している自動化された光学検出器；そして
前記第１のタイプの微生物の量を記憶する情報コントローラ
を含んでなり、ここで、前記インプットポートから前記入口チャンバーへ進入する試料溶液が、フィルターを通して濾過され、次に、フィルター上へ接着された微生物が、前記増殖培地中で増殖されて、前記検出器によって検出され、前記第１のタイプの微生物の量が情報コントローラ内に記憶されるようにする、前記装置。
【請求項１９】
前記検出器により検出可能な第１の指標へ結合された、第１の結合剤を含んでなる第１のタグ、及び前記検出器により検出可能な第２の指標へ結合された、第２の結合剤を含んでなる第２のタグを付加的に含み、ここで、前記第１の指標及び前記第２の指標は前記検出器によって識別可能であり、前記第１の結合剤は前記第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は前記第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグ及び第２のタグは、前記検出表面へ結合された、第１のタイプの微生物及び第２のタイプの微生物と反応され、前記検出器は前記微生物に結合された前記タグに基づき、前記微生物の量を実質的に同時に検出する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記検出器により検出可能な指標へ結合された、第１の結合剤を含んでなる第１のタグ、及び指標へ結合された第２の結合剤を含んでなる第２のタグを付加的に含み、ここで、前記第１の結合剤は第１のタイプの微生物に結合し、前記第２の結合剤は第２のタイプの微生物に結合し、前記第１のタグは、前記親和性成分へ結合された第１のタイプの微生物と反応し、前記検出器は前記微生物へ結合された前記タグに基づき前記第１のタイプの微生物の量及び位置を検出し、次に、前記第２のタグは、前記検出表面へ結合された前記第２のタイプの微生物と反応し、前記検出器は前記検出器によって先に検出されなかった位置にある微生物へ結合された前記タグに基づき、前記第２のタイプの微生物の量及び位置を検出する、請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
ある条件に対する検査微生物の応答を検出する方法であって、下記：
適用させた力を用いて基板の表面上に微生物を捕捉することであって、前記表面は微生物に対して親和性を有しており；
カメラを用いて、第１の時間に前記表面上の微生物の特性を測定すること；
前記微生物をある条件下におくこと；
カメラを用いて、第２の時間に前記表面上の微生物の特性を測定すること；そして
第１の時間と第２の時間との間の微生物の特性の差異の量により、前記条件に対する微生物の応答を測定すること
を含んでなる、前記方法。
【請求項２２】
前記適用された力が、電気泳動を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
電気泳動が起こる電解質が、酸化剤及び還元剤を含んでなり、前記電気泳動が起こる電位が２ボルト未満である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
増殖培地中の抗生物剤に対する、試料中の微生物の感受性を測定するための装置であって、下記：
第１のチャンバー及び第２のチャンバーであって、各チャンバーはインプット及びアウトプットポート、並びに親和性表面を含んでなり；
各チャンバーの各インプット及びアウトプットポートへ連結された流体ハンドラであって、前記流体ハンドラが前記試料の一部を前記第１及び第２のチャンバーへ送達することが可能であり、前記流体ハンドラは前記増殖培地中の前記抗生物剤を前記第１のチャンバーへ、前記抗生物剤のない前記増殖培地を前記第２のチャンバーへ供給することが可能であり；
前記チャンバーの前記親和性表面上へ、各チャンバー内の前記流体ハンドラによって送達されていた微生物を濃縮する濃縮器であって、そのように濃縮された前記微生物は各々のチャンバー内の表面へ付着され；そして
前記増殖培地中の前記抗生物剤に対する応答において、前記親和性表面へ付着された微生物の状態を検出する検出器
を含んでなり、ここで、前記流体ハンドラは、試料の一部を第１及び第２のチャンバーへ送達し、前記濃縮器は前記微生物を濃縮し、それらは前記親和性表面へ付着され、前記流体ハンドラは前記増殖培地中の前記抗生物剤を前記第１のチャンバーへ、前記抗生物剤のない前記増殖培地を前記第２のチャンバーへ供給し、前記検出器は前記チャンバーの各々における微生物の状態を検出し、前記抗生物剤に対する微生物の感受性が、前記第１のチャンバー及び前記第２のチャンバーにおける前記微生物によって示された状態におけるあらかじめ決められた較差によって証拠づけられる、前記装置。
【請求項２５】
前記検出器が光学検出器を含んでなる、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記光学検出器がカメラを含んでなる、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
増殖培地中の致死性化学薬品の濃度に対する、試料中の微生物の感受性を評価する方法であって、下記：
前記微生物の試料を、第１の部分及び第２の部分に分配する工程；
致死性の化学薬品を欠く前記増殖培地中で第１の部分をインキュベートする工程；
前記致死性の化学薬品を、その濃度において用いた増殖培地中で、前記第２の部分を培養する工程；
第１の時間及び第２の時間において、生存状態を示す第１の部分における微生物の数を検出する工程；
第１の時間及び第２の時間において、生存状態を示す第２の部分における微生物の数をカウントする工程；そして
もし前記第２の部分における、生存状態を示している微生物の数の変化が、あらかじめ決められた様式で生存状態を示している前記第１の部分における微生物の数の変化を超えていれば、前記微生物を前記濃度の致死性化学薬品に対して感受性であると評価する工程
を含んでなる、前記方法。
【国際調査報告】
2007531863.tif 000099
2007531863.tif 000100
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