(57)【要約】本発明は、Ｎ，Ｎ−アセチルヘパロサンを原料として硫酸化グリコサミノグルカンを製造する方法に関すもので、次の工程から成る。ａ）天然のまたはリコンビナント細菌株から分離したＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化とＮ−硫酸化、（ｂ）グルクロニルＣ５−エピメラーゼ酵素を用いた酵素的エピマー化。（ｃ）部分的脱Ｏ−硫酸化と組み合わせた部分的Ｏ−硫酸化、（ｄ）部分的６Ｏ−硫酸化、（ｅ）Ｎ−再硫酸化中間工程にある制御された解重合で、Ｏ−硫酸化（Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化）は部分的であることが特徴である。さらに、本発明は得られた製品の抗Xaと抗IIa活性の比率がいと等しいかそれより高い製品に関し、また、医薬的に許容される賦形剤および／または希釈剤と組み合わせたものを含む組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程：
ａ）天然のまたはリコンビナント細菌株から単離したＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化、
ｂ）グルクロニルＣ５−エピメラーゼ酵素を用いた酵素的エピマー化、
ｃ）部分的Ｏ−硫酸化とそれに続く部分的Ｏ−脱硫酸化、
ｄ）部分的６Ｏ−硫酸化、
ｅ）Ｎ−再硫酸化、
を含み、さらに工程ｂ）、ｃ）、ｄ）のいずれかの後に制御された解重合工程を含む、アセチルＮ−ヘパロサンを原料としてグリコサミノグルカン−硫酸塩を製造する方法であって、
前記方法は、工程ｃ）の部分的Ｏ−硫酸化が１０時間未満の時間で、かつ前記硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンのモル比が５以下で実施されること、および、工程ｄ）の部分的６Ｏ−硫酸化が２時間以下の時間で、かつ硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比が２以下で実施されることを特徴とする方法。
【請求項２】
工程ｄ）とｅ）の順番を逆にして実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
中間的な解重合が、工程ｂ）のエピマー化の後に実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｃ）のＯ−硫酸化は、硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンのモル比が２．５未満で実施される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記モル比が、１．５以下である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｄ）の部分的Ｏ−硫酸化が、６時間以下の時間で実施される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
工程ｄ）の部分的Ｏ−硫酸化が、１．５以下の硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比を用いて実施される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程ｄ）の６Ｏ−硫酸化が、６０分以下の時間で実施される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
硫酸化が、３０分以下の時間で実施される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程ａ）のＮ−アセチルヘパロサン多糖が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ５から単離される、請求項１〜２に記載の方法。
【請求項１１】
アンチトロンビンIIIまたはその断片を結合した基質上で実施される親和性選択工程ｆ）を追加で含むことを特徴とする、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｃ）の部分硫酸化および工程ｄ）の６Ｏ−硫酸化が、トリエチルアミン−ＳＯ3、トリメチルアミン−ＳＯ、ピリジン−ＳＯ3からなる群から選ばれる硫酸化剤を非プロトン性極性溶媒中で使用して実施されることを特徴とする、請求項１〜１１に記載の方法。
【請求項１３】
非プロトン性極性溶媒が、ホルミル基を供給しない溶媒である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
非プロトン性極性溶媒が、テトラメチレンサルフォン、２，４−ジメチルスルフォラン、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド、またはＮ,Ｎ−ジエチルアセトアミドの中から選ばれる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程ｄの部分的Ｏ−硫酸化が、４℃から３０℃の範囲の温度で実施される、請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記温度が、１０℃から２５℃である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
中間的な制御された解重合が、化学的または物理的方法により実施される、請求項１〜１６いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記物理的方法がガンマ線照射を含み、かつ前記化学的方法が、亜硝酸若しくはその塩での処理、またはベータ解離、または過ヨウ素酸またはフリーラジカル処理である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
解重合が、亜硝酸またはその塩により実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
亜硝酸またはその塩と多糖の比が多糖１ｇあたり１から１００ｍｇであり、かつ、反応が４℃から１０℃の温度で実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
制御された解重合が、亜硝酸またはその塩の存在下で、かつ３０分未満の時間で実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
亜硝酸塩が、亜硝酸ナトリウムである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
解重合が、モル過剰のホウ化水素を加えることで停止される、請求項１７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
下記の工程：
ａ）天然のまたはリコンビナント細菌株から分離したＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化、
ｂ）グルクロニルＣ５−エピメラーゼ酵素を用いた酵素的エピマー化、
ｃ）部分的脱Ｏ−硫酸化と組み合わせた部分的Ｏ−硫酸化、
ｄ）部分的６Ｏ−硫酸化、
を含み、かつ、工程ｂ）、ｃ）、ｄ）のいずれかの後に制御された解重合工程を含む、アセチルＮ−ヘパロサンを原料として硫酸化グリコサミノグルカンを製造する方法であって、
工程ｃ）の部分的Ｏ−硫酸化が１０時間以下の時間で、かつ前記硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンのモル比を５以下として実施されること、および、工程ｄ）の部分的６Ｏ−硫酸化が２時間以下の時間で、かつ前記硫酸化剤とＮ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比が２以下で実施されること、および、工程ｃ）とｄ）のＯ−硫酸化がトリエチルアミン−ＳＯ3、トリメチルアミン−ＳＯ、ピリジン−ＳＯ3の中から選ばれた硫酸化剤を使用して非プロトン性極性溶媒中で実施されることを特徴とする方法。
【請求項２５】
工程ｃ）のＣ５エピマー化反応が、３５℃以下の温度で実施されることを特徴とし、かつグルクロニルＣ５−エピメラーゼは、抽出またはリコンビナントであって、固定相に固定化されたものである、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
リコンビナントＣ５エピメラーゼが、昆虫または酵母細胞で発現したマウス酵素である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記温度が、１５℃から３０℃である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記温度が、２０℃から２５℃である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
固定相が、ＣＮＢｒで活性化されたエポキシ基またはジオール基を有するポリスチレンまたはポリメタクリル樹脂であり、かつＣ５エピメラーゼの固定化が、１００から３００ｍＭ濃度の炭酸水素ナトリウムを含む緩衝液中または１０から５０ｍＭ濃度のリン酸緩衝液中で、７．０から８．３の範囲のｐＨで、４℃から２５℃の範囲の温度で、１２から７２時間の範囲の時間で実施される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｃ）のエピマー化が、１０から３０ｍＭのＥＤＴＡ、７０から１５０ｍＭのＣａＣｌ2を含み、ｐＨが５．５から８．０の範囲であるＨＥＰＥＳ緩衝液中で実施される、請求項２５〜２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０に記載の方法で得られ得る変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３２】
１５０００Ｄａ以下の分子量を有する、請求項３１に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３３】
３０００から９０００Ｄａの範囲の分子量を有する、請求項３２に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３４】
分子中にホルミル基を含まないことを特徴とする、請求項１３に記載の方法で得られ得る変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３５】
還元末端に硫酸化２,５無水マンニトール残基を有することを特徴とする、請求項３１〜３４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項３６】
無水マンニトールの位置１，３および６の水酸基が部分的に硫酸化されている、請求項３５に記載のＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項３７】
無水マンニトールの位置１および６の水酸基が部分的に硫酸化されている、請求項３６に記載のＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項３８】
位置１の水酸基の硫酸化比率が２０％から８５％の範囲である、請求項３７に記載のＫ５ＯＳ６ＯＳＮＳ−ｅｐｉＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項３９】
グルコサミンの位置６の水酸基の硫酸化比率が４０％より高い、請求項３７に記載のＫ５ＯＳ６ＯＳＮＳ−ｅｐｉＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項４０】
硫酸化比率が５０％から８５％の範囲である、請求項３９に記載のＫ５ＯＳ６ＯＳＮＳ−ｅｐｉＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項４１】
グルコサミンの位置３の水酸基の硫酸化比率が６０％より低い、請求項３６に記載のＮ−アセチルヘパロサン。
【請求項４２】
請求項２４に記載の方法で得られ得るＫ５ＯＳ６ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ。
【請求項４３】
請求項２４の工程ａ）〜ｃ）記載の方法で得られ得るＫ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ。
【請求項４４】
血漿の存在下で測定した抗因子Xa活性が、５０  ＩＵ／ｍｇ以上であることを特徴とする、請求項３１〜４１に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４５】
抗因子Xa活性と因子IIa阻害活性の比率が、１．０以上であることを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４６】
抽出ヘパリンと比較して、ＴＦＰＩ活性化活性度が同等以上であることを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４７】
抽出ヘパリンより高いヘパリナーゼＩ耐性を有することを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４８】
トロンビンとXa因子プロテアーゼの生成を抑制することを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項４９】
抽出ヘパリンと比較して、ＰＦ４因子に対する低い親和性を有することを特徴とする、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５０】
抽出ヘより高いパリンＨＣII因子により特徴づけられる、請求項４４に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５１】
13Ｃ−ＮＭＲスペクトルの多重シグナルが７９から８９ｐｐｍの領域で無水マンニトールのシグナルと比較して多く、かつ５１および１６５ｐｐｍにはシグナルが無いこと、および、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルが７−９．５ｐｐｍの領域にシグナルが無いこと、を特徴とする、請求項４４〜５０に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５２】
図２に対応する1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを有する請求項５１に記載のＫ５ＯＳ６ＯＳＮ−ｅｐｉ。
【請求項５３】
図７に対応する13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを有する請求項５１に記載のＫ５ＯＳ６ＯＳＮ−ｅｐｉ。
【請求項５４】
薬理学用途のための請求項３１〜４１および４４〜５３に記載の変性Ｎ−アセチルヘパロサン。
【請求項５５】
ヘパリン様の抗血栓活性と抗凝固活性を有する薬剤の製造用途への、請求項５４に記載の製品の使用。
【請求項５６】
線溶活性と抗凝集活性を有する薬剤の製造用途への、請求項５４に記載の製品の使用。
【請求項５７】
不安定な狭心症、心筋心臓発作、深刻な静脈血栓症、肺塞栓症、および虚血症諸症状に対する予防と治療用の薬剤の製造用途への、請求項５５に記載の使用。
【請求項５８】
敗血症および汎発性血管内凝固症候群（ＣＩＤ）のような併発症の治療用の薬剤の製造用途への、請求項５５〜５６のいずれかに記載の使用。
【請求項５９】
不安定な狭心症、心筋急性心臓発作、静脈および動脈血栓症、肺塞栓症、虚血症諸症状および動脈硬化に対する予防と治療用の薬剤の製造用途への、請求項５６に記載の使用。
【請求項６０】
先天的または後天的なアントロビンIII欠乏症に起因する血栓症症状に対する予防と治療用の薬剤の製造用途への、請求項５４〜５５に記載の使用。
【請求項６１】
適切な賦形剤および／または希釈剤と組み合わせて、請求項３１〜４１および４４〜５３に記載の製品のいずれかを有効成分として含む医薬組成物。
【請求項６２】
経口投与用に適切な組成の、請求項６１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物起源の多糖類を原料とし抗凝固性と抗血栓性を有する硫酸化多糖類の製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然界のヘパリンは、グリコサミノグリカン構造を持つ高分子で、３０００から３００００Ｄａの可変的な分子量を有し、ウロン酸（Ｌ−イズロン酸またはＤ−グルクロン酸）とアミノ糖（グルコサミン）が互いにβ−１，４−結合で結ばれた二糖類単位の繰り返し連鎖からなっている。ウロン酸は位置２で硫酸化されていてもよく、グルコサミンはＮ−アセチル化またはＮ−硫酸化され６−硫酸化されていてもよい。さらに、グルコサミンは、位置３にも硫酸基を含んでいてもよい。
【０００３】
これらの置換基はアンチトロンビン（ＡＴIII）に対する高い親和性結合領域を生成する点で本質的でありこの高分子の抗凝固性と抗血栓性活性を説明している。
【０００４】
ヘパリンは、治療用途において基本的な抗凝固・抗血栓薬であり、今日でさえ動物の臓器からの抽出によって得ている。この供給源を変えようという試みは、この物質のますます増大する需要に応えるために、かつ同時に、主にウイルスやプリオンのような感染性病原体の偶発的汚染を排除するために、ヘパリンと同様の構造を有し同様な性質を持つ分子の製法が、細菌を原料とするので供給に制限が無いＮ−アセチルヘパロサン多糖類を出発物質として、これまでにも発達してきた。
【０００５】
天然のまたはリコンビナントの大腸菌Ｋ５(K5 Escherichia)またはパスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)のような細菌系から分離されたＮ−アセチルヘパロサン多糖類は、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンがα−１，４結合で互いに結ばれた繰り返し連鎖からなる天然のヘパリン前駆体と同じ基本構造を有している。２糖性単位間の結合は逆にβ−１，４結合である。
【０００６】
ウロン酸は、二つの異なった位置で硫酸化されていてもよく、また、グルコサミンはＮ−アセチル化またはＮ−硫酸化されかつ６−Ｏ−硫酸化されていてもよい。さらにグルコサミンは位置３に硫酸基があってもよい。
【０００７】
大腸菌Ｋ５(E. coli K5)から分離したＮ−アセチルヘパロサン（Ｖａｎｎ  Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｍ．Ａ．，Ｊａｎｎ  Ｂ．，Ｊａｎｎ  Ｋ．、欧州生化学雑誌、１９８１年、第１１６巻、３５９−３６４頁）は、Ｌｏｒｍｅａｕら、米国特許５５５０１１６号明細書およびＣａｓｕら（Ｃａｒｂ．Ｒｅｓ．誌、１９９４年、第２６３巻、２７１−２８４頁）に書かれているように、化学的に変性されており、抽出ヘパリンの活性に相当する生物学的活性を持った製品を得る目的で化学的および酵素学的に変性されていた。
【０００８】
さらにこの半合成的な製品は解重合過程を受けて分子量が低下しており、異なった治療的応用にはより適切な製品となっており、とりわけ生体有効性が改良され、使用に際する出血性素因者リスクや他の副作用が減少している。
【０００９】
細菌性の多糖類の化学的、酵素的な変性については、例えばイタリア特許、ＩＴ２３０７８５号明細書に示されていて、それによれば、Ｋ５多糖類は、Ｎ−脱アセチル化されかつＮ−硫酸化されており、グルクロン酸のＣ５位で酵素的エピマー化を受けている。これらの転移に続いてウロン酸とアミノ糖の両者に酵素的硫酸化の他の転移が起こっている。
【００１０】
特許出願ＷＯ９２／１７５０９号明細書では、Ｋ５多糖を出発物質としてＮ−脱アセチル化、Ｎ−硫酸化、Ｃ５酵素的エピマー化工程およびそれに続く化学的Ｏ−硫酸化およびオプションとしてのＮ−硫酸化によって、ヘパリン類似化合物を得る方法が示されている。
【００１１】
特許出願ＷＯ９６／１４４２５号明細書および米国特許５９５８８９９号明細書は、イズロン酸の含有量が多いＫ５多糖類誘導体の製法を記述しており、それによればＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化を実施し、重要な粘性を得るために変性緩衝液を使用した酵素的エピマー化で５０％を超えるグルクロン酸をイズロン酸に転化し、続いてウロン酸およびグルコサミン基のフリーの水酸基の少なくともいくつかを硫酸化することにより製造している。
【００１２】
特許出願ＷＯ９７／４３３１１７号明細書および米国特許６１６２７９７号明細書は、高い抗凝固性と抗血栓性を有するＫ５誘導体の製法について記述しており、かかる製法は、Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化、グルコロン酸の酵素的エピマー化、およびＯ−完全硫酸化とＮ−再アセチル化によりなっている。
【００１３】
特許出願ＷＯ９８／４２７５４号明細書および米国特許６１９７９４３号明細書およびＮａｇｇｉ  Ａ．ら（糖質研究誌、２００１年、第３３６号、２８３−２９０頁）は、インビトロで高い抗血栓性を有するＫ５多糖誘導体類を含む硫酸化グリコサミノグリカン類を製造する方法について記述しており、かかる方法では完全硫酸化前駆体の加溶媒分解的脱硫酸とオプションとしての６Ｏ−再硫酸化により実施された。
【００１４】
特許出願ＷＯ０１／７２８４８号明細書およびＷＯ０２／５０１２５号明細書は、高い抗凝固性と抗血栓活性を有するＫ５多糖からグリコサミノグリカン類を製法について記述している。その製法は次の工程を含んでいる。ａ）Ｎ−脱アセチル化、ｂ）Ｎ−硫酸化、ｃ）イズロン酸中のグルクロン酸の酵素的エピマー化、ｄ）完全硫酸化、ｅ）部分的な化学的脱硫酸化、およびｆ）オプションとしての６Ｏ−再硫酸化。その工程は、Ｃ５グリキュロニルエピメラーゼ酵素を、切断型を用いて、または溶液中で、または固定化して、使用する点で特徴づけられる。
【００１５】
さらに、米国特許出願０９／７３２０２６号明細書およびＬｉら（生化学雑誌、２００１年、第２７６２１３巻、２００６９−２００７７頁）は、Ｎ−末端に付加的連鎖を含むＣ５エピメラーゼ酵素の発現に関する新規なマウス遺伝子の発見を開示しており、かかる発見によりその連鎖に高い活性と安定性を有する酵素の完全型の生産が可能になった。
【００１６】
[発明の要約]
本発明は、アセチルＮ−ヘパロサンから硫酸化グリコサミノグリカンを製造する方法に関し、さらに詳しくは次の工程を含む製法に関する。
ａ）天然のまたはリコンビナント細菌原料から単離したＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化、
ｂ）Ｃ５−エピメラーゼグリュクロニル酵素による酵素的エピマー化、
ｃ）部分的Ｏ−硫酸化とそれに続く部分的Ｏ−脱硫酸化、
ｄ）部分的６Ｏ−硫酸化
ｅ）Ｎ−再硫酸化。
さらにこの製法は、工程ｂ）、ｃ）またはｄ）後のいずれかにおいて中間的な解重合工程を含んでいること、および工程ｃ）における部分的Ｏ−硫酸化における硫酸化剤／Ｎ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比が５以下であり、より好ましくは２．５より小さい値であり、さらに好ましくは１．５より小さい値で実施されること、および工程ｄ）の部分的６Ｏ−硫酸化における硫酸化剤／Ｎ−アセチルヘパロサンの水酸基のモル比が２以下で実施されること、であることで特徴づけられる。
【００１７】
好ましい実施態様として記載の中間的な解重合は工程ｂ）のエピマー化後に実施される。
【００１８】
部分的Ｏ−硫酸化および部分的６Ｏ−硫酸化の両方で用いられる硫酸化試薬としては、トリエチルアミン−ＳＯ3，トリメチルアミン−ＳＯ3、ピリジン−ＳＯ3の中から選ばれ、それらは非プロトン性極性溶媒中で使用され、その溶媒は好ましくはホルミル基の供与体でないもの、例えばテトラメチレンスルホン、２，４−ジメチルスルホラン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミドが例として挙げられる。任意に、この製法はアンチトロンビンIIIまたはその断片を担持した基質上での親和性選択工程を含む。
【００１９】
本発明は、製薬用途で記載された製法に基づいて得られる硫酸化グリコサミノグルカン類Ｋ５ＯＳ６ＯＳＮＳ−ｅｐｉにも関連する。これらの生成物は、４０％より高い６Ｏ−硫酸化率、より好ましくは、抽出ヘパリンの値に極めて近い５０％から８５％から選ばれる６Ｏ−硫酸化率であることで特徴づけられ、また還元末端に無水マンニトール残基が、好ましくは位置１，３および６で硫酸化されているものが存在することでも特徴づけられる。これらの生成物はさらに無水マンニトールの位置１と６にある水酸基が２０％以上の硫酸化率を有していること、および、アミノ糖にホルミル基が全く存在しないことが好ましい態様であること、によっても特徴づけられる。
【００２０】
本発明に記載の硫酸化グリコサミノグルカン類は、血漿中で生物学的活性である抗因子Xa活性を示し、その活性が従来の技術による方法で得られる生物工学的ヘパリン類の活性より高く、抗Xa活性と抗IIa活性の比が抽出ヘパリンのように１以上であることが特徴である。
【００２１】
本発明に記載の製法で得られる生成物は次の特徴を有する。
ａ）脈管内皮細胞からの組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）を遊離でき、その程度は抽出ヘパリンと同等かそれ以上である。
ｂ）ヘパリナーゼIのような加水分解酵素による分解に対しとりわけ耐性が高い。
ｃ）トロンビンおよびXa因子タンパク質分解酵素の遊離を抑制する。
ｄ）ＰＦ４因子（血小板第４因子）に対する親和性が低い。
【００２２】
本発明に記載の別の側面は、治療に使用することを目的にして本発明に記載の製法で得られる生物工学的ヘパリン（変性Ｎ−アセチルヘパロサン類）に関し、かつ、かかるヘパリンを有効成分として含む医薬組成物に関する。本発明に記載の別の側面は、抗血栓性と抗凝縮性についてヘパリンと同様の活性を有する医薬の製造に対して得られる製品の使用に関し、かつ、先天的ないし後天的な抗トロンビンIII欠乏により引き起こされる血栓塞栓症の予防と治療用の薬物の製造に関して得られる製品の使用に関する。
【００２３】
本発明に記載の別の側面は、Ｏ−硫酸化Ｋ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉおよびＫ５ＯＳ６ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ中間生成物の製造に関連し、かかる中間生成物はアミノ糖のアンモニア性基を含まず、さらに好ましくはホルミル基を含まず、またかかる中間生成物はＮ−硫酸化されおよび／またはＮ−アセチル化されたヘパロサン誘導体の製造のために分離・使用可能なものである。
【００２４】
[発明の詳細な説明]
本発明に記載の主体的側面は、Ｎ−アセチル化ヘパロサンを原料として硫酸化グリコサミノグリカンの製法に関し、それは本発明の趣旨を踏まえて「生物工学的ヘパリン」と呼ばれるが、その製法は次の工程を含んでいる。
ａ）天然のまたはリコンビナント細菌原料から単離したＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化
ｂ）グルクロニルＣ５−エピメラーゼ酵素による酵素的エピマー化
ｃ）部分的Ｏ−硫酸化とそれに続く部分的Ｏ−脱硫酸
ｄ）部分的６−Ｏ選択的硫酸化
ｅ）Ｎ−再硫酸化
かかる製法において、反応工程ｂ）またはｃ）またはｄ）のどれかの後で制御された解重合を実施される中間的な工程を含んでいること、およびかかる製法がＯ−硫酸化が部分的であることで特徴づけられ、かかる硫酸化は工程ｃ）では硫酸化剤と基質の水酸基（エピマー化したＮ−アセチルヘパロサン）のモル比を５以下、好ましくは２．５以下、さらに好ましくは１．５以下として、かつ１０時間より短い硫酸化時間で実施されることで特徴づけられる。工程ｄ）における部分的６Ｏ−硫酸化は、硫酸化剤と基質の水酸基（エピマー化したＮ−アセチルヘパロサン）のモル比を２以下、好ましくは１．５以下とし、かつ２時間より短い硫酸化時間、さらに好ましくは９０分より短い硫酸時間、より一層好ましくは６０分より短い硫酸時間で、４℃と３０℃の間、好ましくは１０℃と２５℃の間の温度において実施されること、で特徴づけられる。
【００２５】
工程ｃ）における部分Ｏ−硫酸化および工程ｄ）における６Ｏ−硫酸化は公知の硫酸化剤を用いて非プロトン性溶媒中で実施されるが、かかる非プロトン性溶媒としては、ホルミル基供与性の無いものが好ましく、より好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルアセトアミド（さらに好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドまたはＮ，Ｎ−ジエチルアセトアミド）およびスルホラン（好ましくは、テトラメチレンスルホンまたは２，４−ジメチルスルホラン）から選ばれることが好ましい。
【００２６】
ホルミル基供与性の無い有機溶媒の部分的硫酸化への使用により、アミノ糖にホルミル基またはその誘導体を含まないことで特徴づけられる生成物が得られ、抽出ヘパリン類に類似した硫酸基の分布を持つ生成物を与える。
【００２７】
本発明の製法に記載の制御された解重合は中間的な工程において実施される。すなわち、ｂ）、ｃ）またはｄ）の工程のどれかの後に実施し、先行技術で開示されているように最終工程では実施しない。この解重合は、好ましくは部分的Ｏ−硫酸化の工程であるｃ）の前か後に、Ｎ−硫酸塩ヘパロサン多糖に対して実施されるのがよい。解重合は、ガンマ線照射のような物理的方法によってもよいし、亜硝酸またはその塩の存在化にベータ・ガンマ線照射をする化学的方法、または過ヨウ素酸塩またはフリーラジカル処理のような化学的方法によってもよい。
【００２８】
本発明の好ましい態様として解重合剤は亜硝酸またはその塩であり、使用量は多糖１ｇについて１から１００ｍｇから選ばれる量である。解重合反応は、４℃から１０℃の範囲から選ばれる温度で実施される。より好ましくは、制御された解重合は亜硝酸ナトリウムの存在下で３０分より短い時間で実施し、当量より過剰の水素化ホウ素ナトリウムを添加して反応を停止させるのがよい。
【００２９】
中間的な工程での解重合によって低分子量の生成物を得ることができるが、好ましくは、分子量は１５０００Ｄａ以下であり、より好ましくは３０００と９０００Ｄａの間であり、還元末端に無水マンニトール残基を含み、この残基では位置６の水酸基の硫酸化に加えて抽出ヘパリンのように位置１と３の水酸基に硫酸化が起こる。
【００３０】
上の記述にもかかわらず、本製法は、最終工程でさらに解重合が実施されることを妨げるものではない。中間的な工程で解重合を実施したときに最終生成物は抗凝固性、抗血栓性活性有しており、その抗Xa活性と抗IIa活性の比率は、意外なことに、硫酸化／脱硫酸化および６Ｏ−硫酸化工程の後に解重合を実施した生成物（同一の分子量を有するもので比較）で見られる比率より高いことが見いだされており、それは表１に示した通りである。
【００３１】
好ましい実施態様に記載のＮ−アセチル化多糖ヘパロサンは大腸菌Ｋ５(E. coli K5)を原料とするものである。
【００３２】
本製法は、さらにオプションとして、工程ａ）〜ｅ）の結果として得られた生成物を、ＨｏｏｋらがＦＥＢＳ 速報誌、１９７６年、第６６巻、９０−９３頁に記述している抗トロンビンIIIを用いたアフィニティクロマトグラフィを原理とする濃縮する工程を最終工程として含んでよい。
【００３３】
Ｎ−脱アセチル化およびＮ−アセチル化は、公知文献記載のアルカリ加水分解の方法により実施されるが、その実施温度は３０℃から８０℃の範囲、好ましくは４０℃から６０℃の範囲から選ばれ、また反応時間は１０から３０時間の範囲、好ましくは１５から２０時間の範囲から選ばれ、その後に硫酸化剤による処理、好ましくは炭酸ナトリウム中でのピリジン−三酸化硫黄による処理、を２０℃から６５℃から選ばれる温度範囲で１２時間以下で実施される。
【００３４】
工程ｂ）におけるエピマー化は、天然のまたはリコンビナントグルクロニルＣ５エピメラーゼ酵素を使用して、好ましくは固定化形態で、実施される。
【００３５】
かかる酵素は、好ましくはＷＯ９８／４８００６号明細書に記述されているようなリコンビナントで、さらに好ましくは、米国特許出願０９／７３２０２６号明細書に記述されているもので、好ましくは昆虫の細胞または酵母菌種から取り出し精製されたものであり、酵母菌種の例としては、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces Cerevisiae）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromices lactis）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromices lactis）、クルイベロミセス・フラジリス（Kluyveromices fragilis）を挙げることができる。
【００３６】
酵素の固定化は、好ましくは樹脂CNBr−Sepharose 4B (Pharmacia)またはポリメタクリル樹脂またはポリスチレンン樹脂上に、ＣＮＢｒで活性化させたエポキシ基またはジオール基で、ＮａＨＣＯ3緩衝液１００−３００ｍＭまたはリン酸緩衝液１０−５０ｍＭを使用してｐＨ７．０−８．３、より好ましくはｐＨ７．２−７．８で、４℃から２５℃の温度で１２−７２時間実施される。
【００３７】
より好ましい態様として記載のエピマー化反応は、３５℃を超えない温度で、好ましくは１５℃から３０℃の範囲の温度、さらに好ましくは２０℃から３０℃の範囲の温度で実施される。
【００３８】
かかるエピマー化反応は、公知文献記載の方法で実施されるが、例としてはＷＯ０１／７２８４８号明細書に記述されている方法を挙げることができ、好ましくは３５℃を超えない温度で、より好ましくは１５℃から３０℃の温度範囲、さらに好ましくは２０℃から３０℃の温度範囲で実施される。
【００３９】
エピマー化反応の緩衝液としては、好ましくはＨＥＰＥＳ溶液（好ましくは２５ｍＭの濃度）を使用して実施され、かかる溶液は、ｐＨ５．５−８．０、より好ましくはｐＨ６．５−７．０で、Ｎ−脱アセチル化とＮ−硫酸化された多糖、ＥＤＴＡを１０−３０ｍＭ，好ましくは１５−２５ｍＭ，ＣａＣｌ2（または代替し得るものとして、Ｚｎ++、Ｂａ++，Ｍｇ++，Ｍｎ++などの二価のカチオンの塩）を７０から１５０ｍＭの濃度から選ばれる濃度で、さらに好ましくは７５から１００ｍＭの範囲から選ばれる濃度で、含むものである。かかる溶液は、サーモスタットで温度調節されるが、その温度範囲は１５℃から３０℃（好ましくは２０℃から２５℃）で、３０−２４０ｍｌ／時の流量で１−２４時間循環される。カラムは、温度を保たれた不活性な支持体上に固定化した、好ましくは１．２ｘ１０7から３ｘ１０11ｃｐｍ当量の固定化酵素を入れたものである。
【００４０】
上に開示した操作条件では、とりわけ選択した温度条件では、エピメラーゼＣ５酵素を数千時間安定化するため、かかるエピマー化反応カラム調製において時間と試薬を大幅に節約ができる。
【００４１】
製法中の部分的Ｏ−硫酸化（工程ｃ）は、公知の硫酸化剤を使用して実施されるが、かかる硫酸化剤としては、トリエチルアミン−ＳＯ3，トリメチルアミン−ＳＯ3、ピリジン−ＳＯ3が挙げられ、非プロトン性極性溶媒を用いて実施され、その溶媒は好ましくはホルミル基の供与体でないものである。硫酸化反応は、硫酸化剤／水酸基のモル比が５以下、より好ましくは２．５以下、さらに好ましくは１．５未満で、硫酸化時間が１０時間以下、好ましくは８時間以下、更に好ましくは１から６時間の範囲で、２０℃から７０℃、好ましくは３０℃から６０℃の温度で実施される。
【００４２】
かかる部分的Ｏ−硫酸化に続いて部分的脱硫酸化が実施されるが、これはメタノール溶媒中のＤＭＳＯのような脱硫酸化剤を使用して１０から２４０分の範囲の時間で４５℃から９０℃の範囲の温度で実施される。
【００４３】
それぞれの製法の工程は沈殿操作および／または中間反応としての多糖脱硫反応を含むがこれは公知の方法で実施し得る。
【００４４】
部分的６Ｏ−硫酸化（工程ｄ）は、硫酸化剤を添加して実施されるが、硫酸化剤／水酸基のモル比が２以下、好ましくは１．５より小さい値であり、硫酸化時間が２時間以下、好ましくは９０分以下であり、４℃から３０℃の範囲の温度、好ましくは１０℃から２５℃の範囲の温度で、非プロトン性極性溶媒中、好ましくはホルミル基の供与体でない溶媒中で実施される。製法の別の実施態様としては、部分的６Ｏ−硫酸化（工程ｄ）はＮ−再硫酸化の後に実施され、その場合、工程ｄ）と工程ｅ）の順序は逆転して実施される。
【００４５】
Ｎ−再硫酸化（工程ｅ）は、炭酸塩緩衝液中で公知の硫酸化剤、例えばトリエチルアミン−ＳＯ3，トリメチルアミン−ＳＯ3、ピリジン−ＳＯ3、を添加することにより実施される。
【００４６】
結論として、本発明に記載の製法は次のような革新的要素を含んでいる。つまり、部分的Ｏ−硫酸化（Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化）、最終工程でなく中間的な工程で実施される脱硫酸化、および、非プロトン性極性溶媒、好ましくはホルミル基の供与体でない溶媒、中で実施される６Ｏ−硫酸化、である。
【００４７】
本発明の製法により得られるＮ−アセチルヘパロサンは、公知の先行技術の製法で得られる生物工学的ヘパリンと比較して特徴ある構造および生物学的差異を有している。
【００４８】
化学的な観点からは、本発明の多糖は次の一般式（Ｉ）で表現される多糖鎖混合物として定義できる。
【００４９】
【化１】
2007501305.tif 000002
式中、ｎは３から１５０の範囲であり、Ｒ1は水素、ＳＯ3−基、アセチル基、でも良い。Ｒ1は、ホルミル基のような他の官能基ではない。Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は、水素またはＳＯ3−基であるが、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は好ましくは次の通りである。
− Ｒ1は、８５から９７％がＳＯ3−基、および／または３％から１５％はアセチル基、および／または０から１２％はＨ+、
−Ｒ2は、１５から６０％がＳＯ3−基、
−Ｒ3は、少なくとも４０％、好ましくは５０％から８５％ＳＯ3−基、
−位置Ｒ4とＲ５では、グルクロン酸単位の少なくとも２０％が硫酸化されていない。
【００５０】
とりわけ、本発明の製法に記載の解重合された多糖の特徴は、還元末端に硫酸化された水酸基が一つ以上ある無水マンニトール残基があることである。
【００５１】
この構造は、解重合が亜硝酸または亜硝酸ナトリウムのような亜硝酸塩の存在下で実施され、その後水素化ホウ素ナトリウムで処理をした結果として得られるもので、次構造式（ＩＩ）に記載の構造である。
【００５２】
【化２】
2007501305.tif 000003
式中、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，は、水素、またはＳＯ3-基であり、好ましくは次の通りである。
−Ｒ1は、０から１００％がＳＯ3−基、
−Ｒ2は、０から１００％がＳＯ3−基、
−Ｒ3は、０から１００％がＳＯ3−基。
さらに好ましくは、Ｒ1とＲ3は２０％から８５％がＳＯ3-基、Ｒ2は１５％から６０％がＳＯ3-基である。
【００５３】
本発明で好ましい生成物の分子量は１５０００Ｄａ以下であり、より好ましくは１５００から１５０００Ｄａの範囲にあり、さらに好ましくは３０００から９０００Ｄａの範囲にある。
【００５４】
本発明に記載の好ましい生成物は、その化学構造の観点から公知の先行技術から得られたものと異なっているが、これは、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて多重シグナルが７９から８９ｐｐｍ、とりわけ８０から８６ｐｐｍ、に存在することを根拠とでき、これらのシグナルは無水マンニトールの特性シグナルに因るものとしては多すぎ（実施例９で調製された試料の高分解能13Ｃ−ＮＭＲスペクトルに関する図１０参照）、これは中間的な工程で解重合を実施する本発明の製法に基づいて得られた低分子量生成物においていろいろな形で、とりわけ位置１と６の水酸基において、硫酸化された無水マンニトールの存在を示しているためである。
【００５５】
さらに特徴的なことに、本発明に記載の製法で得られた生成物は無水マンニトールの位置１の水酸基が硫酸化されている点で公知のものと異なっているが、これは13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおける６７−６８ｐｐｍ領域のシグナルの増加および６１−６３ｐｐｍ領域のシグナルの消失によって示される。
【００５６】
かかる差異は図１１のスペクトル（実施例１０に記述した多糖生成物に対応するもの）と図９のスペクトル（実施例８に記述した多糖生成物に対応するもの）を比較することによって示される。このような差異は、二次元ＮＭＲ法によってさらに明確になることはＧｕｅｒｒｉｎｉらが高血栓症セミナー、２００１年、第２７巻、第５号、４７３−４８２頁に記述している通りである。
【００５７】
これらのスペクトル領域の主なる特徴は無水マンニトールに存在する水酸基の部分的または完全な硫酸化によって得られるものであり、かかる無水マンニトールは、硫酸化工程の前、とりわけ位置１および６の水酸基の硫酸化の前に実施された解重合により生じた多糖の還元末端に形成されるものである。
【００５８】
本発明の生成物を先行技術（例として、本発明の比較例として示した実験例６および７で示した）の生成物および製法と比較したときのさらなる特徴は、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて７−９．５ｐｐｍのシグナルが、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて５１ｐｐｍと１６５ｐｐｍのシグナルがそれぞれ消失していることであり、これは低分子量および高分子量の生成物すべてにおいてグルコサミン構造上に解離したアミノ基もしくはアセチル基もしくは硫酸基が無いことを示している。
【００５９】
逆に、通常上記の領域にシグナルが現れるのは、Ｎ−アセチルヘパロサンの硫酸化がＮ，Ｎ−ジアセチルホルムアミドのようなホルミル基供与性有機溶媒中で実施された製法においてである。
【００６０】
本発明に記載の硫酸化グリコアミノグリカンは、血漿の存在下で抗因子Xa活性として測定した抗凝固性が公知の変性法で得られた生物工学的ヘパリンの抗凝固性より高い。さらに重要なことは、本発明によって得られた硫酸化グリコアミノグリカンは、抗Xa活性と抗IIa活性の比が１以上であり、抽出ヘパリンの示す比に非常に近いことである。
【００６１】
本発明の生成物の特徴は次の通りである。
ａ）ヒトの血漿の存在下で実施した試験において、抗因子Xa活性が５０  ＩＵ／ｍｇより高く、より好ましくは７０  ＩＵ／ｍｇより高い。かかる抗因子Xa活性は、Ｔｅｎ  Ｃａｔｅ  Ｈ．臨床化学、１９８４年、３８６０−３８６４頁、または、欧州薬学雑誌、１９９７年、第３版に記述されている測定法に依ることが好ましい。血漿の存在下における本発明の生物学的活性は、驚くべきことに先行技術のどの製法で生産された生物工学的ヘパリンの生物学的活性より高い値であり、高分子量または低分子量の抽出ヘパリンと比べてほぼ同等の活性を有することである。
ｂ）ＴＦＰＩ（Ｂｒｏｎｚｅ  ＧＪ  Ｊｒ．らが、血液誌、１９８８年、第７１巻、３３５−３４３頁に述べた組織因子経路インヒビター）の活性能が抽出ヘパリンの活性能と同等以上である。
ｃ）同様な分子量で比較したときの活性の比、抗Xa／抗IIa、が１以上である。より好ましい比は、１．５以上である。
ｄ）ヘパリナ−ゼＩに対する耐性が、抽出ヘパリンが示す耐性と同等以上である。
ｅ）トロンビンとXa因子プロテアーゼの遊離に対する抑制能。
ｆ）ＰＦ４因子（血小板第４因子）に対する親和性が低い。
【００６２】
脈管内皮細胞におけるＴＦＰＩ活性能が本発明の生成物の抗血栓性と抗炎症性活性を高めており、外科的処置における深刻な静脈血栓症、不安定な狭心症の虚血性併発症、心筋梗塞、および虚血性の諸症状に対する治療法を拡大し改善する。
【００６３】
プロテアーゼの産生阻害能は、ＴＦＰＩ産生向上と結びついて、本発明の治療適用性をさらに拡大し、敗血症および汎発生静脈凝固のような併発症（ＣＩＤ）の処置および先天的または後天的な抗トロンビンIII欠乏症の処置にまで適用可能である。
【００６４】
本発明の生成物で処置した後のＴＦＰＩ因子への活性度の測定は、例えばインビトロではＨＵＶＥＣ細胞について実施されるが、その方法はＧｏｒｙ  Ａ．Ｍ．らが抗血栓症誌、１９９９年、第８１巻、５８９−５９３頁に示している。
【００６５】
本発明に記載のＮ−アセチル化ヘパロサン誘導体（生物工学的ヘパリン）は、ヘパリナーゼＩのような加水分解酵素による分解に対する抵抗性が顕著に高い。この特性に加えて、本質的にバイオアベイラビリティが高く使用時の出血や高分子ヘパリンのような副作用のリスクが低い低分子量生成物を得ることができること、高い抗因子Xa活性と低い硫酸化率であること、によって本発明の生成物は非経口的使用だけでなく経口的投与法も可能である。
【００６６】
前述したように、本発明の製法で得られた生成物はトロンビンプロテアーゼの生成とXa因子を抑制する。
【００６７】
プロテアーゼ生成の抑制はフィブリノーゲンが枯渇した血漿に対して実施するのが望ましい。因子IIと因子Xa生成の両方の抑制についてのモニターは、内因性および外因性凝固系の両方をアミドール法を使用して実施するのが望ましい。
【００６８】
使用した二つの系に対する両方の方法では、本発明で得られた生成物はトロンビンと因子Xaの両方に強い抑制活性を示し、この特性が本発明の生成物の抗血栓薬としてより良いプロフィールを与えている。
【００６９】
本発明に記載の製法で得られた生成物は、さらにＰＦ４因子（血小板第４因子）に対する親和性が低いが、ＰＦ４因子は生物工学的ヘパリンを含む溶液にＰＦ４因子の所定量を添加した後に残っている抗Xa活性として血漿について測定できる。
【００７０】
残存している抗Xa活性は、初期の活性に対する割合として算出されるが、抽出ヘパリンまたは低分子量の抽出ヘパリンよりも高い値を示しており、これはＰＦ４に対する親和性が低いことを示している。
【００７１】
このように低い結合親和性は、ヘパリンを原因とする栓球減少症（ＨＩＴ）を発症するリスクを減少させるので、本発明で得られる生成物に良い臨床的プロフィールを与えている。調製可能な生成物の好ましい分子量が１５０００Ｄａより低い場合でも、またより好ましくは３０００と９０００Ｄａの間にある場合でも、１５０００Ｄａ以上の分子量は解重合の条件を変えることによるだけで得ることができ、その場合も高い抗Xa活性、ヘパリナーゼ耐性およびＴＦＰＩ因子の遊離などの生物学的性質が保たれている。
【００７２】
結論として、本発明に記載の方法で生産される生物工学的ヘパリンは次のような主な特徴を示す。
−  13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて多重シグナルが７９から８９ｐｐｍ、とりわけ８０から８６ｐｐｍ、に存在し、これらのシグナルは無水マンニトールの特性シグナルに因るものとしては多すぎる量であり、さらに13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて６７−６８ｐｐｍ領域のシグナルの増加および６１−６２ｐｐｍ領域のシグナルの消失すること。これらのシグナルは、様々な形の硫酸化マンニトールの存在、とりわけ位置１，３，６の硫酸基の存在、さらに特徴的には、位置１の水酸基の硫酸化されたものの存在、を明らかにしており、これらのことは図１１と９を比較して強調することができる。
−  好ましくは、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおいて７−９．５ｐｐｍのシグナルが消失し、さらに13Ｃ−ＮＭＲスペクトルにおいて５１ｐｐｍと１６５ｐｐｍのシグナルがそれぞれ消失していることであり、これはホルミル基が無いことを示している。
−  血漿中の抗Xa（抗凝固）活性が先行技術で作られた生物工学的ヘパリンより高い値を有する。
−  抗Xa活性／抗IIa因子活性の比率が先行技術で作られた生物工学的ヘパリンより高い値を有し、好ましくは１と等しいかそれより高く、より好ましくは１．５と等しいかそれより高い。
−  ヘパリナーゼ耐性が抽出ヘパリンと等しいかそれより高い。
−  トロンビンとXa因子生成阻害能がある。
−  ＰＦ４親和性が低い。
【００７３】
本発明で新規に作成した生物工学的ヘパリンの生物学的活性は特異的である。とりわけ、抗Xa活性と抗IIa活性の比率が１と等しいかそれより高いが、先行技術で得られる生成物では、ＡＰＴＴ値から得られる抗血栓性と抗凝固性の最適な比率を示している１より通常低い。本発明で得られる比率は抽出ヘパリンの比率に近い。
【００７４】
抽出ヘパリンと同様の好ましい特徴は高いＨＣII値から得られる最適な特徴は評価できるものので、トロンビンに対するより直接的な抑制作用であり、このことは、本発明の生成物が抗血栓症および／または抗血栓による静脈症や先天的または後天的な抗トロンビン欠乏症に使用できる可能性を含んでいる。
【００７５】
本発明のさらなる側面は、抽出ヘパリンの代替として抗凝固や抗血栓の治療用または予防用として、または線溶と抗凝集活性を持つ医薬品の調製用として、上述した製法によって得た生成物の単独での使用、および医薬上容認できる適切な賦形剤や希釈剤を使用した組成物としての調合使用にも関する。
【００７６】
本発明の生成物およびその生成物を含む組成物の用途としてとりわけ適しているのは、不安定な狭心症、心筋心臓発作、深刻な静脈血栓症、肺塞栓症,虚血症の諸症状または敗血症の治療、汎発性血管内凝固症候群（ＣＩＤ）のような敗血症の併発症などの予防や治療を目的とした医薬品への有効成分としての使用である。
【００７７】
本発明の生成物のさらなる側面は、不安定狭心症、動脈血栓症、アンテローム性動脈硬化症の予防と治療、またはアンチトロンビンIIIの先天的または後天的欠乏症に起因する血栓塞栓症の治療のための医薬品の製造用途に関する。
【００７８】
本発明の生成物はミセルやキャリヤ分子などによって体内輸送されるので非経口使用に加えて経口使用用途にもとりわけ適している。
【００７９】
従って、本発明のさらなる側面は、経口および非経口用途の両方に対して適切な調合をすることにより、本発明に記載の製法で作られたＮ−アセチルヘパロサンの多糖誘導体を有効成分として含む医薬組成物である。
【００８０】
本発明のさらなる側面は、アミノ糖の遊離アミノ性基を持ちホルミル基を全く含まず抗凝集活性の無いＯ−硫酸化中間体で、本発明の最終生成物の調製に関する。
【００８１】
とりわけ好ましいものは、本発明に記載の製法で得られ分離された中間体であるＫ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉであり、次の一般式(ＩＩＩ)で表わされる多糖鎖の混合物として定義できる。
【００８２】
【化３】
2007501305.tif 000004
ここで、ｎは３から１５０であり、Ｒ1は水素またはアセチル基であることができ、アセチル化度は３％から１５％の範囲である。
【００８３】
Ｒ１は他の官能基ではなく、好ましくはホルミル基ではない。Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4およびＲ5は、水素またはＳＯ3−基であり、硫酸化度は好ましくは３０％から９８％の間から選ばれる。
【００８４】
Ｋ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ（1Ｈ−ＮＭＲスペクトルは図１６に示した）の好ましい分子量は１５００から１５０００Ｄａの範囲であり、より好ましくは３０００から９０００の間であり、色原体法（Ｃｏａｔｅｓｔヘパリンキット、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）で測定した抗因子Xa活性が１０  ＩＵ／ｍｇより低い抗凝集活性を持つことが特徴である。
【００８５】
Ｋ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉは、例えば本発明のような生成物を製造する上で有用である。
【００８６】
Ｋ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉは、本発明に記載の方法で調製され、かつ単離できるもので、次の一般式(IV)で表される多糖鎖の混合物として定義できる。
【００８７】
【化４】
2007501305.tif 000005
ここで、ｎは３から１５０であり、Ｒ1は水素またはアセチル基であることができ、アセチル化度は３％から１５％である。Ｒ１は他の官能基ではなく、好ましくはホルミル基ではない。Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、水素またはＳＯ3−基であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は好ましくは次の通りである。
−Ｒ2は、１５から６０％がＳＯ3−基、
−Ｒ3は、少なくとも４０％、好ましくは５０％から８５％がＳＯ3−基、そしてＲ4とＲ５の位置では、グルクロン酸単位の少なくとも２０％が硫酸化されていない。
【００８８】
Ｋ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ中間体（13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１５に示した）の分子量は好ましくは１５００から１５０００Ｄａの範囲であり、より好ましくは３０００から９０００の間である。Ｋ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ中間体は、アミノ多糖上に一つの解離したアミノ基があり、硫酸化されておらず、全くホルミル基を含まないことが特徴である。さらに、色原体法（Ｃｏａｔｅｓｔヘパリンキット、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）で測定した抗因子Xa活性が１０  ＩＵ／ｍｇより低い抗凝集活性を持つことも別の特徴である。Ｋ５ＯＳＮＨ2−ｅｐｉ中間体は、例えばＮ−硫酸化誘導体を本発明のような方法で製造する上で有用であり、また、抗凝集活性を持たない。
【００８９】
とりわけ好ましい態様として、Ｎ−アセチルヘパロサン（大腸菌Ｋ５多糖）のような細菌由来の多糖から生物工学的ヘパリンを製造する製法は次の製法からなっている。
【００９０】
Ｎ−アセチルヘパロサン多糖の調製と精製
出発材料は、好ましくは二糖類単位の鎖によって表されるＮ−アセチルヘパロサン多糖であり、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンモノマーがβ１，４結合で結びあわされた構造である、 [−4) −GicA α 1−4 GIcNAc−(I−]n、で表現される。多糖は例えば天然の大腸菌Ｋ５系統（系統  Ｂｉ８３３７／４１血清型Ｏ１０：Ｋ５：Ｈ４）（この場合、対応する多糖はＫ５多糖）またはパスツレラ・マルトシダ(Pasteurella multocida)細菌タイプＤ、またはそれらの誘導体、またはそれらの突然変異種、または大腸菌の組み換え型菌種株で例えばＦｉｎｋｅ  Ａ．らのＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９９１年、１７３巻。１３号４０８８−４０９４頁またはＤｒａｋｅ  ＣＲ，Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＩＳ，Ｊａｎｎ  Ｂ．，Ｊａｎｎ  Ｋ．，およびＢｏｕｌｎｏｉｓ  ＧＪのＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．速報誌．１９９０年、第５４巻、１−３号、２２７−２３０頁、に記述されているものである。
【００９１】
Ｋ５多糖の製造に有用な大腸菌系統はＡＴＴＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、アメリカ合衆国）のＡＴＣＣ２３５０６のような微生物の公共のコレクションから得ることができる。
【００９２】
マルトシダ・パスツレラ(Multocida Pasteurella)タイプＤ株はＡＴＣＣコレクションから得ることができる（ＡＴＣＣ  １２９４８）。
【００９３】
Ｎ−アセチルヘパロサン多糖類は培養液から微生物の発酵と抽出によって得ることができる。精製は、公知の方法によって実施されるが、例としては特許ＷＯ０１／０２５９７号明細書に記述された方法を挙げることができ、この場合次の培養液が使われている。大豆小麦粉 ２g /ｌ、 K2HP０4 ９.７g／l 、 KH2P０4  ２ｇ/ｌ、 MgCl2 ０.１１ g／l 、クエン酸ナトリウム０.５ g／l 、硫酸アンモニウム １g／l  、ブドウ糖（あらかじめ殺菌されたもの）２g/ｌ、水１０００ml q.b、ｐＨ７.３。
【００９４】
予備培養液は、好ましくはＴｒｉｐｉｃ大豆寒天培地から取り出した大腸菌、Ｂｉ８３３７／４１（Ｏ１Ｏ：Ｋ５：Ｈ４）の細胞懸濁液を播種したものである。播種は、攪拌下３７℃で２４時間実施される。次の工程で、上述した培養液を含む発酵槽を上述した予備培養液を使い０．１％で播種し、発酵を１８時間３７℃で実施される。発酵中、ｐＨ、酸素、残存ブドウ糖、生産されたＫ５多糖および細菌の成長をモニターする。
【００９５】
発酵の最後には、温度を８０℃に１０分間維持した。細胞は１００００ｒｐｍの遠心分離で培養液から分離し、上澄液は１０００−１００００Ｄａカットオフ濾過膜で濾過し体積を１／５まで減少させる。そして、このＫ５多糖を体積４倍量のアセトンを加えて沈殿させ遠心分離により取り出す。
【００９６】
ペレットの除タンパクは、好ましくは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus Orizae)のプロテアーゼタイプIIを使用して、ＮａＣｌ  ０．１Ｍ，ＥＤＴＡ０．１５Ｍを含む緩衝液中で、ｐＨ８，ＳＤＳ０．５％、３７℃、９０分で実施される。
【００９７】
溶液は１００００Ｄａカットオフ薄膜を用いて限外濾過を実施し、その後多糖をアセトンで沈殿させる。多糖の純度は通常は８０％以上で以下の分析法の少なくとも一つを用いて策定する。ウロン酸の算出（カルバゾール法）、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルと13Ｃ−ＮＭＲスペクトル、ＵＶおよび／またはタンパク質含有量。
【００９８】
ａ）細菌を原料としたＮ−アセチルヘパロサン多糖のＮ−脱アセチル化とＮ−硫酸化
好ましくは５から１０ｇ量の精製したＫ５多糖を２００−２０００ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、４０−８０℃で反応させ脱アセチル化を完結させる（例、１５−３０時間）。この溶液を中和する。脱アセチル化したＫ５多糖を含む溶液を２０−６５℃に保ち、一段階で１０−４０ｇの炭酸ナトリウムと１０−４０ｇの硫酸化剤を添加する。硫酸化剤は、ピリジン−発煙硫酸アダクツ、トリメチルアミン−発煙硫酸などから選択する。
【００９９】
硫酸化剤は１２時間までに一度に添加する。反応の終了時には、必要であれば溶液を室温に戻しｐＨを７．５から８にする。
【０１００】
生成物を公知の方法で塩から精製するが、方法の例としては、らせん状薄膜１０００Ｄａ（プレップスケールカートリッジ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）のダイアフィルトレーションを挙げることができる。得られた生成物を濃縮して１０％多糖濃度とする。濃縮した溶液は必要に応じて公知の方法で脱溶媒する。
【０１０１】
Ｎ−アセチル化／Ｎ−硫酸化の比率は13Ｃ−ＮＭＲスペクトルで測定する。
【０１０２】
ｂ）Ｃ５グルクロニルエピメラーゼによる酵素的エピマー化
Ｃ−５エピマー化の工程はイズロン酸中のグルクロン酸部分のエピマー化を含むものであるが、Ｃ５グルクロニルエピメラーゼ酵素（Ｃ−５エピメラーゼと呼ぶ）を天然のまままたはリコンビナントものを溶液中で、または好ましくは固定化酵素として、使用し実施される。
【０１０３】
この工程には、ＷＯ９８／４８００６号明細書に記載されたリコンビナントエピメラーゼＣ５酵素を使用する。好ましいものは、米国特許出願０９／７３２０２６号明細書およびＬｉら、生化学雑誌、２００１年、第２７６巻、２３号、２００６９−２００７７頁に記載されているように変性されＮ−端末に付加的な連鎖を含むリコンビナントエピメラーゼである。
【０１０４】
リコンビナント酵素は、好ましくは、昆虫の細胞または酵母の細胞から発現・精製されたもので、好ましくは、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces Cerevisiae）、ピチア・パストリス(Pichia Pastoris)、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、サッカロミセス・ポンベ（Saccharomyces pombe）、クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromices lactis）、クルイベロミセス・フラジリス（Kluyveromices fragilis）の属に含まれるものである。
【０１０５】
ｂ．１）Ｃ−５エピメラーゼの樹脂上への固定
リコンビナント酵素は、樹脂、薄膜、ガラスビーズのような異なった不活性基質上に固定化することができるが、その基質は公知の方法、例えば、臭化シアノジェン、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、で官能基を導入するか、または酵素をイオン交換樹脂に反応させることによるか、または酵素を薄膜上に吸着させることにより実施される。
【０１０６】
好ましい実施態様においては、酵素を次のような市販の樹脂上に固定する。ＣＮＢｒセファロース４Ｂ（ファルマシア）またはポリスチレン樹脂またはポリメタクリル樹脂（Resindion 三菱）であり、これらはエポキシ基またはジオール型ＣＮＢｒ活性基を有しているものである。
【０１０７】
本発明でとりわけ好ましい酵素固定法として、ＮａＨＣＯ3  １００−３００ｍＭの緩衝液中、ｐＨ７．０−８．３、好ましくは７．２−７．８，温度４−２５℃、１２−７２時間、ＣＮＢｒで活性化したジオール基を有するポリメタクリル樹脂を使用する方法を挙げることができる。
【０１０８】
本発明に記載の酵素の不活性基質への結合反応は、酵素活性の低下を防止するためにＫ５Ｎ−脱アセチル化されＮ−硫酸化された基質の存在下に実施される。
【０１０９】
固定化酵素の活性度の測定は、かかる固定化酵素を含むカラムに、その固定化酵素によって毎分のカウントあたりで理論的に転換する量のＮ−脱アセチルＮ−硫酸化Ｋ５をＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ、ＫＣｌ  ０．１Ｍ，ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０１％およびＥＤＴＡ  ０．１５Ｍからなる緩衝液に溶解し、ｐＨ７．４、３７℃、２４時間、流量０．５ｍｌ／分で循環させる方法で実施される。ＤＥＡＥクロマトグラフィー法で精製しセファデックスＧ−１０上で脱塩後、生成物を凍結乾燥し、ＷＯ９６／１４４２５号明細書に従って1Ｈ−ＮＭＲスペクトルでイズロン酸含量を測定する。
【０１１０】
ｂ．２）固定化酵素によるエピマー化
Ｃ５エピマー化反応は、例としてＷＯ９６／１４４２５号明細書の記載にあるように、ＨＥＰＥＳ  ０．０４またはＴｒｉｓ  ０．０５Ｍ、ＫＣｌ  ０．４Ｍ，ＥＤＴＡ  ０．０６ＭおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００およびさらなる添加物、とりわけグリセリンまたはポリビニルピロリドン、からなる反応緩衝液中で実施されることができる。
【０１１１】
反応は、ＷＯ０１／７２８４８号明細書の記述にあるように、ＨＥＰＥＳ２５ｍｌ、ＣａＣｌ2  ５０ｍＭを含む溶液中で，ｐＨ７．４，温度３０−４０℃で実施される。
【０１１２】
とりわけ、カラムに固定化した後にもグルクロニルＣ５エピメラーゼが寿命を維持し安定であるような温度と緩衝液の反応条件であることが好ましい。
【０１１３】
０．００１−１０ｇのＮ−脱アセチルＮ−硫酸化Ｋ５およびＥＤＴＡ１０−３０ｍＭ、好ましくは１５−２５ｍＭ，およびＨＥＰＥＳ２５ｍＭ，およびＣａＣｌ2７０−１５０ｍＭ，（好ましくは、７５−１００ｍＭ）を含む２０−１０００ｍｌの水溶液を、ｐＨ５．５−８．０，好ましくはｐＨ６．５−７．０、サーモスタットで調節した温度１５℃から３０℃（好ましくは、２０−２５℃）で、１．２ｘ１０7から３ｘ１０11当量の固定化酵素で１５−３０℃、好ましくは２０−２５℃で不活性基質上に固定化したものを含むカラムを用い、流速３０−２４０ｍｌ／時、１−２４時間循環させる。
【０１１４】
上述した温度と緩衝液の条件は、カラム上の酵素の安定性を向上させ、３０００時間より長い稼働時間を与え、それ故に製法をとりわけ優れたものにしている。反応の最後には、試料をＤＥＡＥ樹脂またはＳｔａｒｔｂｉｎｄＤＥＡＥカートリッジを通して精製し、２ＭのＮａＣｌを添加して沈殿させ、最後にＧ１０セルファデックス樹脂（ファルマシア社）上で脱塩するかまたは２体積のエタノールを沈殿させＩＲ１２０Ｈ+樹脂上に通してナトリウム塩を得る。
【０１１５】
上述した好ましい条件で得られた生成物は、ＷＯ９６／１４４２５号明細書の記述にある1Ｈ−ＮＭＲスペクトル法で測定すると、少なくとも５０％（全ウロン酸に対するイズロン酸）のエピマー化率を有している。
【０１１６】
制御された解重合
工程ｂ）またはｃ）またはｄ）で得られた生成物に対して公知の方法による制御された解重合を実施される。例えばＷＯ８２／０３６２７号明細書の記述にある亜硝酸を用いた脱アミノ反応、または過ヨウ素酸ナトリウムを用いた酸化開裂（ＥＰ２８７４７７号明細書）、またはフリーラジカル処理（ＥＰ１２１０６７号明細書）、またはベータ脱離（ＥＰ４０１４４号明細書）、またはガンマ線処理（米国特許４９８７２２２号明細書）であり、好ましい分子量画分は１５００から１５０００Ｄａの範囲、より好ましくは３０００から９０００Ｄａの範囲である。
【０１１７】
本発明の好ましい側面は、制御された解重合は硫酸化の工程の前に実施される。
【０１１８】
とりわけ、前工程で得られた生成物に対する制御された解重合は、亜硝酸または亜硝酸ナトリウムを用いて実施される。この場合、使用する塩の量は多糖１ｇあたり１から１００ｍｇであり、続いて過剰のホウ素化水素で還元する。
【０１１９】
２番目の好ましい実施態様は、試料を５０−２５０ｍｌの水に４℃で溶解し、１Ｎ塩酸を添加して酸性とする。亜種酸ナトリウムの量は５から５００ｍｇを添加し反応を６０分より短く、好ましくは３０分より短く実施される。
【０１２０】
過剰のホウ素化水素ナトリウムが消えた後に、３倍容積のエタノールで沈殿させ真空乾燥機で乾燥して生成物を得る。
【０１２１】
製造の最後の工程で解重合を実施される場合、例えばＷＯ０１／７２８４８号明細書の記載にあるように実施されることができる。
【０１２２】
ｃ）部分的Ｏ−硫酸化とそれに続く部分的Ｏ−脱硫酸化
上の工程で得られた生成物を水に１０％の濃度で再懸濁する。この溶液を１０℃に冷却し、１０℃の温度を保持したままＩＲ−１２０Ｈ+カチオン交換樹脂に通す。溶液を樹脂に通した後、樹脂を脱イオン水で洗浄し、流出液のｐＨが６より高くなるまで続ける。得られた酸性溶液を三級アミンまたは四級アンモニウム塩、例えば塩から調製した１５％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液、で中和する。溶液を濃縮して体積を少なくした後に凍結乾燥する。
【０１２３】
得られた生成物を１０−１０００ｍｌの有機溶媒、好ましくはスルホランまたは２，４−ジメチルスルホラン、中に懸濁させる。別の有機溶媒として、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを使用することもできる。これらの有機溶媒を添加するとき、固体状の硫酸化剤、または同じ溶媒に溶かした硫酸化剤溶液として、添加する。
【０１２４】
硫酸化剤と多糖基質（エピマー化したＮ−硫酸化Ｋ５）のモル比率は、硫酸化剤と多糖ダイマー中の水酸基の比率で表現して、５以下に保持し、より好ましくは２．５未満に、さらに好ましくは１．５未満に保持する。
【０１２５】
溶液は２０℃から７０℃の範囲の温度、好ましくは３０℃から６０℃、に１０時間以下、好ましくは８時間以下、さらに好ましくは６時間以下、に保持する。反応の最後には、溶液を室温まで冷却し食塩を飽和させたアセトンを添加して多糖を完全に沈殿させる。
【０１２６】
沈殿物を濾過して溶媒を分離し、最小量の脱イオン水に溶解し、食塩を０．２Ｍとなるように添加する。溶液に２Ｎ水酸化ナトリウムを添加してｐＨ７．５−８にする。アセトンを添加して完全に沈殿させる。沈殿物を濾過して溶媒と分離する。得られた固体を１０−１００ｍｌの脱イオン水に溶解し限外濾過により残存する塩を除き精製する。
【０１２７】
試料の一部を凍結乾燥して13Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよび1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで部分的Ｏ−硫酸化生成物の構造分析をする。
【０１２８】
部分的硫酸化生成物を含む溶液をＩＲ−１２０+カチオン交換樹脂または同等品に通す。
【０１２９】
樹脂を脱イオン水で洗浄し、流出液のｐＨが６より高くなるまで実施し、その後、ピリジンを加える。溶液を最小体積まで濃縮した後に凍結乾燥する。生成物を２０−２００ｍｌのＤＭＳＯ／メタノール（９／１  Ｖ／Ｖ）溶液で処理し、その溶液を４５−９０℃で１０−４２０分保持する。最後に、溶液に１０−２００ｍｌの脱イオン水を加え、食塩で飽和したアセトンで処理して完全に沈殿させる。
【０１３０】
得られた固体を公知の方法でダイアフィルトレーションを実施し、一部の試料を凍結乾燥した後、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルによる構造分析をする。
【０１３１】
ｄ）部分的６Ｏ−硫酸化
上に示した工程で得られた生成物を６Ｏ−硫酸化する。位置６Ｏの硫酸基の量を、公知の方法、例えば13Ｃ−ＮＭＲスペクトルで測定する。この場合の条件は、Ｇｕｅｒｒｉｎｉらが抗血栓症セミナー、２００１年、第２７巻、５号、４７３−４８２頁に記述がある。
【０１３２】
得られた生成物を水に再分散させて５から１０％の濃度にし、室温に保持する。この溶液をＩＲ−１２０+カチオン交換樹脂または同等品に通す。溶液を通し終わった後、三級アミンまたは四級アンモニウム塩、例えば塩から調製した１５％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液で中和する。溶液を最小体積まで濃縮した後に凍結乾燥する。
【０１３３】
得られた生成物を１０−０００ｍｌのジメチルホルムアミドを含む有機溶媒、好ましくはスルホランまたは２，４−ジメチルスルホラン、またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを含む有機溶媒中に懸濁させ、ピリジン−ＳＯ3アダクツのような硫酸化剤を固体状態でまたは同じ有機溶媒を用いた溶液で添加する。
【０１３４】
この分散液を４℃から３０℃、好ましくは１０℃から２５℃、の温度に保ち、硫酸化する水酸基の２当量より少ない量、より好ましくは１．５当量より少ない量、の硫酸化剤、例えばピリジン−ＳＯ3アダクツ、で１０−９０分間処理し、食塩を飽和したアセトンで処理して完全に沈殿させた。得られた固体を公知の方法でダイアフィルトレーションにより精製する。一部の試料を凍結乾燥した後、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルによる構造分析をする。
【０１３５】
ｅ）Ｎ−再硫酸化
６Ｏ硫酸化多糖を含む溶液を２０−６５℃に保ち、１０−１００ｇの炭酸ナトリウムを一度に加え、１０−１００ｇの硫酸化剤、例えば好ましくはピリジン−ＳＯ3、を添加する。硫酸化剤の添加は、１２時間までの反応時間の間に実施される。反応の終了時に、必要であれば、溶液を室温まで冷却して、好ましくは２Ｍの水酸化ナトリウムで、ｐＨ７．５から８に中和する。
【０１３６】
生成物を公知の方法で塩から精製するが、方法の例としては、らせん状薄膜１０００Ｄａ（プレップスケールカートリッジ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）のダイアフィルトレーションを挙げることができる。この製法の簡潔は、透析物の伝導度が１０００ｍＳ、好ましくは１００ｍＳより低くなったときである。得られた生成物を濃縮して１０％多糖濃度とする。一部の試料を凍結乾燥した後、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルによる構造分析をする。
【０１３７】
この工程で上述したように実施した６−Ｏ選択的硫酸化とＮ−再流酸化は、工程ｅ）で得られた生成物に対しては、異なった順番で行うことができ、例としては、Ｎ−アセチル化を先に６−Ｏ硫酸化を後にする方法で、これはＷＯ９８／４２７５４号明細書に記述された方法で、最終生成物の生物学的活性が変わらないものが得られる。
【０１３８】
アンチトロンビンIIIを結合した連鎖の濃縮（任意）
前の工程で述べた方法で得られた生成物は、任意に、アニオン交換クロマトグラフィーでさらに純度を向上できるが、アニオン交換クロマトグラフィーのカラムの例としては、Ｌａｍ  Ｌ．Ｈ．らが生物化学・生物物理学研究速報、１９７６年、第６９巻、２号、５７０−５７７頁に記述しているＤＥＡＥカラムを挙げることができる。この精製法またはそれ以外の別の方法としては、生成物をさらに次のようなアフィニティクロマトグラフィーを通す方法がある。すなわち、ＨｏｏｋらがＦＥＢＳ速報誌、１９７６年、第６６巻、９０−９３頁または米国特許４６９２４３５号号明細書、にあるヒトの全部または一部のアンチトロンビン連鎖を使った方法、またはＬｉｕ  Ｓ．らが、合衆国国立アカデミー科学予稿集、１９８０年、第７７巻、６５５１−６５５５頁に記述したヘパリンに対して高い親和性を有するペプチド連鎖を使用した方法を挙げることができる。この方法を用いれば、次にＮａＣｌ生理食塩溶液による溶出操作で、固相に結合した画分を分離することが可能となる。
【０１３９】
実例として、Ｎ−再硫酸化の工程で得られた生成物１０−５０ｍｇを、５０−１００ｍｇのヒトのアンチトロンビンIIIを固定化したアフィニティカラム（ Ｋｅｄｒｉｏｎ  ＳＰＡ、Ｌｕｃｃａ， イタリア ）に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ，ｐＨ７．４，ＮａＣｌ  ０−０．１５Ｍ、４℃の緩衝液を用いて注入する。カラムは、その後３倍体積のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４の緩衝液で洗浄する。
【０１４０】
カラムに高い親和性を持って結合した分子は、０．５から３ＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ７．４の緩衝液で溶出される。
【０１４１】
溶出したものは、次に、好ましくはカットオフ１０００Ｄａのらせん状薄膜を使用してダイアフィルトレーションを実施して塩を除き凍結乾燥で濃縮する。
【０１４２】
一部の試料をカルバゾール法、ＨＰＬＣ，ＮＭＲおよび抗Xa活性を測る色素生産性による分析をする。
【０１４３】
得られた生成物は、出発物質の１．５から３倍という優れた抗Xa活性を示す。
【０１４４】
同様な抗Xa活性の増加は、抽出ヘパリンを同様な方法で処理しても得られる。このことは、アンチトロンビンIIIに対する結合性において、本発明によって得られた生物工学的ヘパリンが抽出ヘパリンとの類似性を示す新たなシグナルである。
[実験の部]
【０１４５】
実施例１  本発明の製法による生物工学的ヘパリンの製造
次の工程により実施した。
ａ）大腸菌Ｋ５を原料としたＮ−アセチルヘパロサン多糖の調製
ｂ）Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化
ｃ）エピマー化
ｄ）解重合
ｅ）部分的Ｏ−硫酸化および部分的Ｏ−脱硫酸
ｆ）部分的６−Ｏ硫酸化
ｇ）Ｎ−再硫酸化
【０１４６】
ａ）多糖の調製
Ｎ−アセチルヘパロサン多糖を大腸菌、Ｂｉ８３３７／４１（Ｏ１Ｏ：Ｋ５：Ｈ４）（ＡＴＣＣ  ２３５０６）の発酵により得、特許ＷＯ０１／０２５９７号明細書に記述された方法に従って培養液からの抽出と精製を実施した。使用した培養液の組成は、大豆小麦粉 ２g/ｌ、 K2HP04 ９.７g／l 、 K2HP０4  ２ｇ/ｌ、 MgCl2 ０.１１ g／l 、クエン酸ナトリウム０.５g／l 、硫酸アンモニウム１g／l  、ブドウ糖（あらかじめ殺菌されたもの） g/ｌ、水１０００ml q.b、ｐＨ７.３。
【０１４７】
この培養液に、Ｔｒｉｐｉｃ大豆寒天培地から取り出した細胞懸濁液を、攪拌下３７℃で２４時間播種した。発酵槽中の種菌はタイプＦ５（Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ  Ｍｅｃｃａｎｉｃｈｅ  ｄｉ  Ｂａｇｎｏｌｏ  ＳｐＡ）で上述の培養液が使われているが、上述の予備培養液を使い０．１％で播種し、発酵を１８時間３７℃で実施した。発酵中、ｐＨ、酸素、残存ブドウ糖、生産されたＫ５多糖および細菌の成長を測定した。発酵の最後には、温度を８０℃に１０分間維持した。細胞は１００００ｒｐｍの遠心分離で培養液から分離し、上澄液は１０００−１００００Ｄａカットオフ濾過膜で濾過し体積を１／５まで減少させた。そして、このＫ５多糖を体積４倍量のアセトンを加えて沈殿させ遠心分離により取り出した。
【０１４８】
得られた固体からの除タンパクは、好ましくは、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus  Orizae)種のプロテアーゼタイプIIを使用して、ＮａＣｌ  ０．１Ｍ、ＥＤＴＡ０．１５Ｍを含む緩衝液中で、ｐＨ８、ＳＤＳ０．５％、３７℃、９０分で実施した。溶液は１００００Ｄａカットオフ薄膜を用いて限外濾過を実施し、その後多糖をアセトンで沈殿させた。多糖の純度はウロン酸分析（カルバゾール法）により測定し、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルと13Ｃ−ＮＭＲスペクトル、ＵＶおよび／またはタンパク質含有量を測定した。
【０１４９】
ｂ）Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化
工程ａ）で得られた生成物１０ｇを２００ｍｌの２Ｎ水酸化ナトリウムに溶解し、５０℃で１８時間反応させた。この溶液を６Ｎ塩酸で中和した。Ｎ−脱アセチル化多糖を得た。
【０１５０】
脱アセチル化したＫ５多糖を含む溶液を４０℃に保ち、一段階で１０ｇの炭酸ナトリウムを加えた後に１０ｇのピリジン−発煙硫酸アダクツを１０分かけて加えた。得られた生成物はＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化されたＫ５多糖であり、らせん状薄膜１０００Ｄａ（プレップスケールカートリッジ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を使用してダイアフィルトレーションにより塩を除いて精製した。精製は、溶出物の伝導度が１００ｍＳより低くなったときをもって完了とした。
【０１５１】
生成物を同じダイアフィルトレーション法で１０％の多糖濃度としてから凍結乾燥した。Ｎ−アセチル化／Ｎ−硫酸化の比率は13Ｃ−ＮＭＲスペクトルで測定した。
【０１５２】
ｃ）エピマー化
ｃ−１）Ｃ５エピメラ−ゼの樹脂への固定化
５ｍｇのリコンビナントグルクロニルＣ−５エピメラーゼを米国特許０９／７３２０２６号明細書およびＬｉらの生物科学雑誌、２００１年、第２７６巻、２３号２００６９−２００７７頁に従って得た。これを、ＨＥＰＥＳ  ０．２５Ｍ，ＫＣｌ  ０．１Ｍ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．１％およびＥＤＴＡ  １５ｍＭからなるｐＨ７．４の緩衝液２００ｍｌに溶解し、工程ｂ）の記載に従って得られたＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化されたＫ５多糖１００ｇを上の溶液に加えた。溶液を３００００Ｄａ薄膜を用い４℃でダイアフィルトレーションを実施し、Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化されたＫ５多糖が流出しなくなるまで続けた。薄膜に残されている溶液に対して、緩衝液をダイアフィルトレーションにより替えＮａＨＣＯ3  ｐＨ７  ２００ｍＭで置き換え、５０ｍｌに濃縮した後５０ｍｌのＣＮＢｒセファロース４Ｂ活性化樹脂を加え、４℃で終夜反応させた。
【０１５３】
反応の最終工程で、デカンテーションした後、上澄み中の残存酵素の量をＱｕａｎｔｉｇｏｌｄ法（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃ）で測定した。上澄み液中に酵素は無く、上述した方法で固定化は１００％で実施されたことが明確になった。樹脂の残った活性サイトを埋めるために、樹脂をＴｍｐｏｎＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １００ｍＭ、ｐＨ８で洗浄した。
【０１５４】
固定化酵素の活性度を測定するために、理論的に１．２ｘ１０7ｃｐｍに相当する量の固定化酵素をカラムに仕込んだ。こうして調製したカラムに、１ｍｇのＮ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化したＫ５（工程ｂ）で得たもの）を、ＨＥＰＥＳ  ２５ｍＭ，ＫＣｌ  ０．１Ｍ，ＥＤＴＡ  ０．１５Ｍ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００  ０．０１％からなる緩衝液に溶解し、ｐＨ７．４、３７℃、流量０．５ｍｌ／分で終夜循環させる方法で実施した。
【０１５５】
ＤＥＡＥクロマトグラフィー法で精製した後、セファデックスＧ−１０上で脱塩後、生成物を凍結乾燥し、ＷＯ９６／１４４２５号明細書に従って1Ｈ−ＮＭＲスペクトルでイズロン酸含量を測定した。
【０１５６】
ｃ−２）固定化酵素によるエピマー化
１０ｇのＮ−脱アセチルＮ−硫酸化Ｋ５多糖を６００ｍｌの緩衝液に溶解した。緩衝液の組成は、ＥＤＴＡ１５ｍＭ、ＨＥＰＥＳ２５ｍＭ，ＣａＣｌ2  ７５ｍＭで、ｐＨ７．０である。この溶液を、固定化酵素を詰めたカラム５０ｍｌを循環させた。
【０１５７】
この操作を２８℃、流速２０ｍｌ／ｈで２４時間実施した。得られた生成物を限外濾過で精製後、エタノールで沈殿させた。沈殿物を水に再溶解し濃度１０％とした。得られた生成物のエピマー化比率は、1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで測定すると、全ウロン酸あたりのイズロン酸の比率として、５５％であった。（図１に示す）
【０１５８】
ｄ）制御された解重合
工程ｃ−２）で得られた生成物を、特許ＷＯ８２／０３６２７号明細書の記述にある亜硝酸を用いた制御された分解反応を施した。実験では、５ｇの試料を２５０ｍｌの水に溶解し、サーモスタットで調節した水浴に４℃に保持した。１Ｎ塩酸を添加してｐＨ２．０にして、４℃に保ち、その後２００ｍｇの亜硝酸ナトリウムを加えた。必要に応じ１Ｎ塩酸を添加してｐＨ２．０にして、１５分攪拌した。溶液を１Ｎ水酸化ナトリウムで中和した後、４℃に冷却した。
【０１５９】
１３ｍｌの脱イオン水に溶解した２５０ｍｇのホウ素化水素ナトリウムを加え、４時間反応させた。溶液に１Ｎ塩酸を添加してｐＨ５．０にして、１０分放置して過剰のホウ素化水素ナトリウムを分解した。その後、１Ｎ水酸化ナトリウムで中和した。３倍体積のエタノールを使用して生成物を取り出し、真空乾燥機で乾燥した。得られた生成物は分子量が６０００Ｄａであった。
【０１６０】
ｅ）部分的Ｏ−硫酸化および部分的Ｏ−脱硫酸
上の工程で得られた生成物を水に１０％の濃度で再懸濁した。この溶液を１０℃に冷却し、１０℃の温度を保持したままＩＲ−１２０Ｈ+カチオン交換樹脂に通した。溶液を樹脂に通した後、樹脂を脱イオン水で洗浄し、流出液のｐＨが６より高くなるまで続けた。得られた酸性溶液を三級アミンまたは四級アンモニウム塩、例えば塩から調製した１５％水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液、で中和してアンモニウム塩を得た。溶液を濃縮して体積を少なくした後に凍結乾燥した。
【０１６１】
得られた生成物を１００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＡ）に再溶解した後、ピリジン−ＳＯ3を添加した。
【０１６２】
それから、硫酸化剤と多糖基質（エピマー化したＮ−硫酸化Ｋ５）の比率は、硫酸化剤と多糖ダイマー中の水酸基の比率として表現して、１．２５量を添加した。
【０１６３】
溶液は５０℃に３６０分保持した。反応の最後には、溶液を室温まで冷却し食塩を飽和させたアセトンを添加して多糖を完全に沈殿させた。
【０１６４】
沈殿物を濾過して溶媒を分離し、最小量の脱イオン水に溶解し、食塩を０．２Ｍとなるように添加した。溶液に２Ｎ水酸化ナトリウムを添加してｐＨ７．５にした後アセトンを添加して完全に沈殿させた。沈殿物を濾過して溶媒と分離した。得られた固体を１００ｍｌの脱イオン水に溶解し限外濾過により残存する塩を除き精製した。
【０１６５】
試料の一部を凍結乾燥して13Ｃ−ＮＭＲスペクトルおよび1Ｈ−ＮＭＲスペクトルで部分的Ｏ−硫酸化生成物の構造分析をした。
【０１６６】
部分的硫酸化生成物を含む溶液をＩＲ−１２０+カチオン交換樹脂または同等品に通した。溶液を通した後に、樹脂を脱イオン水で洗浄し、流出液のｐＨが６より高くなるまで実施した。得られた酸性溶液にピリジンを加えて中和した。溶液を最小体積まで濃縮した後に凍結乾燥した。生成物を１００ｍｌのＤＭＳＯ／メタノール（９／１  Ｖ／Ｖ）溶液で処理し、その溶液を６５℃で２４０分保持した。最後に、溶液に２００ｍｌの脱イオン水を加え、食塩で飽和したアセトンで処理して完全に沈殿させた。
【０１６７】
得られた固体を公知の方法でダイアフィルトレーションを実施し、一部の試料を凍結乾燥した後、13ＣＮＭＲスペクトルによる構造分析をした。
【０１６８】
ｆ）部分的６Ｏ−硫酸化
工程ｅ）で得られた生成物を水に再分散させて１０％の濃度にし、室温に保持した。この溶液をＩＲ−１２０+カチオン交換樹脂に通した。その後、樹脂を脱イオン水で洗浄し、水酸化テトラブチルアンモニウム水溶液で中和してアンモニウム塩とした。溶液を最小体積まで濃縮した後に凍結乾燥した。
【０１６９】
得られた生成物を１００ｍｌのＤＭＦに懸濁し、このＤＭＦ溶液にピリジン−ＳＯ3を添加した。この溶液を１０℃に保ち、水酸基あたりで１．２５当量の硫酸化剤のピリジン−ＳＯ3アダクツで６０分間処理した。食塩を飽和したアセトンで処理して完全に沈殿させた。得られた固体を公知の方法でダイアフィルトレーションにより精製する。一部の試料を凍結乾燥した後、13Ｃ−ＮＭＲスペクトルによる構造分析をした。
【０１７０】
ｇ）Ｎ−再硫酸化
生成物を水に溶解して４０℃に保ち、１０ｇの炭酸ナトリウムを一度に加え、１０ｇのピリジン−ＳＯ3を１０分間で添加した。
【０１７１】
反応の終了時に、必要であれば、溶液を室温まで冷却して、必要であれば水酸化ナトリウムで、ｐＨ８より低くした。
【０１７２】
生成物を公知の方法、例えばらせん状薄膜１０００Ｄａカットオフ（プレップスケールカートリッジ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）のダイアフィルトレーションで塩から精製した。この製法の完結は、透析物の伝導度が１０００ｍＳ，好ましくは１００ｍＳより低くなった時とした。得られた生成物を濃縮して１０％多糖濃度とした。
【０１７３】
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを図２に示した。
【０１７４】
得られた生成物についてヒトの血漿中で測定した抗Xa活性は１４０  ＩＵ／ｍｇ（表２を見よ）であり、抗Xa活性と抗IIa活性の比率は２．５であった。
【０１７５】
実施例２  ＤＭＦを用いたＯ−硫酸化
実施例１において、工程ｃ）とｆ）で行った部分Ｏ−硫酸化と部分６Ｏ−硫酸化で有機溶媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を使用した以外は実施例１と同じ操作を実施した。得られた生成物の血漿中での抗Xa活性は８５．９  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。ＮＭＲスペクトルを図３に示した。
【０１７６】
実施例３  亜硝酸ナトリウムの基質５０  ｍｇ／ｇの存在下での制御された解重合
実施例１において実施した制御された解重合において、分子量がおよそ８０００Ｄａのものを得る目的で、多糖１ｇあたりに２０ｍｇの亜硝酸ナトリウムを使用した以外は実施例１と同じ操作を実施した。得られた生成物の血漿中での抗Xa活性は６０．１  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４に示した。
【０１７７】
実施例４  分子量がおよそ８０００Ｄａの生物工学的ヘパリンの製造（亜硝酸ナトリウムの基質２０  ｍｇ／ｇの存在下での制御された解重合）
実施例１において実施した制御された工程ｄ）の解重合において、分子量がおよそ４２００Ｄａのものを得る目的で、多糖1ｇあたりに５０ｍｇの亜硝酸ナトリウムを使用した以外は実施例１と同じ操作を実施した。得られた生成物の血漿中での抗Xa活性は１５０  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図５に示した。
【０１７８】
実施例５  分子量がおよそ２００００Ｄａの生物工学的ヘパリンの製造
実施例５は次の工程により実施した。
ａ）大腸菌Ｋ５を原料としたＮ−アセチルヘパロサン多糖の調製
ｂ）Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化
ｃ）エピマー化
ｄ）部分的Ｏ−硫酸化および部分的Ｏ−脱硫酸
ｅ）部分的６−Ｏ硫酸化およびＮ−再硫酸化
工程ａ）〜ｃ）は、実施例１の工程ａ）〜ｃ）と同じ操作であり、実施例１の解重合（工程ｄ）は実施せず、工程ｄ）は実施例１の工程ｅ）と同じで、工程ｅ）は実施例１の工程ｆ）とｇ）と同様にして実施した。得られた最終生成物は分子量がおよそ２００００Ｄａであり、解重合を受けやすいものであった。血漿中での抗Xa活性は１３５  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図６に示した。
【０１７９】
実施例６  分子量がおよそ１５００Ｄａの生物工学的ヘパリンの製造（亜硝酸ナトリウムの基質５  ｍｇ／ｇの存在下での制御された解重合）
実施例１において実施した工程ｄ）において、分子量がおよそ１５０００Ｄａのものを得る目的で、多糖１ｇあたりに５ｍｇの亜硝酸ナトリウムを使用して制御された解重合を実施した以外は実施例１と同じ温度時間条件で操作を実施した。得られた生成物の血漿中での抗Xa活性は１８０  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図７に示した。
【０１８０】
実施例７  公知の方法による生物工学的ヘパリンの製造製法
この実施例では、Ｏ−完全硫酸化および６Ｏ−硫酸化製法条件として、ＷＯ０１／７２８４８号明細書およびＷＯ０２／５０１２５号明細書に記載された方法で実施した。これを簡単に述べると、完全硫酸化はジメチルホルムアミド中で５０℃、１８時間、Ｏ−脱硫酸化は６５℃、１５０分、および６Ｏ−硫酸化はジメチルホルムアミド中で０℃、９０分、の条件で実施した。
【０１８１】
得られた最終生成物の分子量はおよそ２００００Ｄａであった。血漿中での抗Xa活性は４５  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図８に示した。
【０１８２】
実施例８  先行技術の方法による生物工学的ヘパリンの製造
この実施例では、Ｏ−完全硫酸化および６Ｏ−硫酸化製法条件として、ＷＯ０１／７２８４８号明細書およびＷＯ０２／５０１２５号明細書に記載された方法で実施した。これを簡単に述べると、完全硫酸化はジメチルホルムアミド中で５０℃、１８時間、Ｏ−脱硫酸化は６５℃、１５０分、および６Ｏ−硫酸化はジメチルホルムアミド中で０℃、９０分、の条件で実施した。
【０１８３】
さらに、ＷＯ０１／７２８４８号明細書およびＷＯ０２／５０１２５号明細書に記載された硫酸化製法の最後に、亜硝酸ナトリウム４０  ｍｇ／基質ｇを用いて４℃、１５分の条件で解重合を実施した。
【０１８４】
得られた最終生成物は分子量はおよそ６０００Ｄａであった。血漿中での抗Xa活性は３１．５Ｕ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図９に示した。
【０１８５】
実施例９  生物工学的ヘパリンの製造（解重合および硫酸化条件の制御）
実施例１において次のような変化をさせた以外は実施例１と同じ操作を実施した。
実施例１において実施した制御された解重合（工程ｄ）において、エピマー化したＫ５ＮＳ１ｇあたりに４０ｍｇの亜硝酸ナトリウムを使用して実施した以外は実施例１と同じ温度時間条件で操作を実施した。得られた生成物の分子量はおよそ６５００Ｄａであった。
【０１８６】
実施例１における部分的硫酸化（工程ｅ）において、硫酸化剤と硫酸化されエピマー化された基質Ｋ５Ｎとの比率を５とし、１８０分の反応時間とし、Ｏ−硫酸化は６０分実施した。得られた生成物の血漿中での抗Xa活性は８９  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１０に示した。
【０１８７】
実施例１０  生物工学的ヘパリンの製造（解重合および硫酸化条件の制御）
実施例１において、中間工程でのＫ５−Ｎ多糖の解重合（工程ｄ）で分子量がおよそ６５００Ｄａのものを得る目的で、エピマー化したＫ５ＮＳ１ｇあたりに４０ｍｇの亜硝酸ナトリウムを使用して実施した以外は実施例９で記述したものと同じ温度時間条件で操作を実施した。
【０１８８】
実施例１の部分的硫酸化（工程ｅ）において、硫酸化剤と硫酸化されエピマー化された基質Ｋ５Ｎとの比率を０．６とし、８時間の反応時間とし、Ｏ−脱硫酸化は３０分実施した。得られた生成物の血漿中での抗Xa活性は１０１  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。この実施例で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１１に示した。
【０１８９】
実施例１１  アフィニティカラムの選択によるアンチトロンビンIIIとの親和性が優れた多糖画分の分離
実施例１と同様にして多糖を調製した。工程ｇ）のＮ−再硫酸化の後、生成物を次のようにしてアフィニティカラムを通した。実施例１の工程ｇ）で得られた生成物２０ｇを、あらかじめ１００ｍｇのヒトのアンチトロンビンIII（ Ｋｅｄｒｉｏｎ  ＳＰＡ、Ｌｕｃｃａ， イタリア ）を固定化したＣＮＢｒセファロース４Ｂ，（ファルマシア）カラムを用いて、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ，ｐＨ７．４，ＮａＣｌ  ０−０．１５Ｍ、４℃の緩衝液を用いて注入した。６０分の結合反応後に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ７．４の緩衝液を用いてその少なくとも３倍容積量で洗浄した。カラムに高い親和性を持って結合した分子は、２ＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ７．４のグラジエントを加えて溶出させた。溶出したものを、カットオフ１０００Ｄａのらせん状薄膜を使用してダイアフィルトレーションを実施して塩を除き凍結乾燥で濃縮した。
【０１９０】
得られた最終生成物は分子量はおよそ８５００Ｄａであり、血漿中での抗Xa活性は３００  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１２に示した。
【０１９１】
実施例１２  ６０００Ｄａの低い分子量を有する生物工学的ヘパリンの製造
実施例５において、Ｎ−再硫酸化後に生成物を実施例１の工程ｄと同じ条件で制御された解重合を実施した以外は実施例５と同じ操作を実施した。得られた最終生成物の分子量はおよそ６０００Ｄａであり、血漿中での抗Xa活性は６５  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１３に示した。
【０１９２】
実施例１３  生物工学的ヘパリンの製造（硫酸化条件の制御）
実施例１において、実施例１の部分的硫酸化（工程ｅ）の硫酸化剤と硫酸化されエピマー化および硫酸化された基質Ｋ５との比率を５とし、５０℃で８時間反応させた以外は実施例１で記述したものと同じ操作を実施した。
【０１９３】
得られた生成物の血漿中での抗Xa活性は７５  ＩＵ／ｍｇであった。この実施例で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１４に示した。
【０１９４】
実施例１４  中間体Ｋ５ＯＳ６ＯＳＮＨ2,ｅｐｉの調製（生物工学的ヘパリンの再硫酸化していない中間体）
実施例１において、最終工程である再硫酸化を実施しない以外は実施例１で記述したものと同じ操作を実施した。得られた最終生成物の分子量はおよそ６０００Ｄａであり、血漿中での抗Xa活性は５  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１５に示した。
【０１９５】
実施例１５  中間体Ｋ５ＯＳ,ＮＨ2,ｅｐｉの調製（脱硫酸化、６Ｏ−硫酸化およびＮ−再硫酸化前の生物工学的ヘパリンの中間体）
実施例１において、実施例１の部分的Ｏ−硫酸化（工程ｅ）の硫酸化剤と硫酸化されエピマー化および硫酸化された基質Ｋ５Ｎの水酸基との比率を５とし、５０℃で８時間反応させ、この後の脱硫酸、６Ｏ−硫酸化およびＮ−再硫酸化を実施しなかった以外は実施例１で記述したものと同じ操作を実施した。
【０１９６】
得られたＫ５ＯＳ−ＮＨ2−ｅｐｉ生成物の分子量はおよそ６０００Ｄａであり、水酸基の９５％は硫酸化され、血漿中での抗Xa活性は８  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。この実施例で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１６に示した。
【０１９７】
実施例１６  分子量がおよそ６０００Ｄａの生物工学的ヘパリンの製造
実施例１で記述したものと同様に次の工程を実施した。
ａ）大腸菌Ｋ５を原料としたＮ−アセチルヘパロサン多糖の調製
ｂ）Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化
ｃ）エピマー化
ｄ）部分的Ｏ−硫酸化および部分的Ｏ−脱硫酸
ｅ）制御された解重合
ｆ）部分的６−Ｏ硫酸化およびＮ−再硫酸化
工程ａ）〜ｃ）は、実施例１の工程ａ）〜ｃ）と同じ操作であり、工程ｄ）と工程ｅ）実施例１の工程ｄ）と工程ｅ）の順番を逆にしている以外は実施例１で記述したものと同じ操作を実施した。
【０１９８】
得られた最終生成物は分子量がおよそ６０００Ｄａであり、血漿中での抗Xa活性は９５  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１７に示した。
【０１９９】
実施例１７  順番を逆にして得た生成物の生物学的活性の測定
抗Xa活性の測定−抗Xa活性は色原体法（Ｃｏａｔｅｓｔヘパリンキット、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）で測定した。測定は、正常なヒトの血漿中で、色原体基質Ｓ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）、Xaウシ属因子（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）およびヒトのアンチトロンビンIII（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を試薬として使用した。反応は、凝固計ＡＣ９０００（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）中で３７℃で実施し、４０５ｎｍで読み取りをした。結果を表２に示した。公知の方法で得た生成物（とりわけＷＯ０１／７２８４８号明細書およびＷＯ０２／５０１２５号明細書に記載された手順の生成物）についての結果を表１にまとめたが、この表には抽出ヘパリンの文献値も報告した（Ｆａｒｅｅｄ  Ｊら、Ｅｘｐ  Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇ，１９９７年、第６巻、７０５−７３３頁）。
【０２００】
抗IIa因子活性−抗IIa因子活性は、正常なヒトの血漿中で次の手順で実施した。
０．５  Ｕ／ｍｌのヒトのアンチトロンビンIII（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を３０ｍｌを、異なった濃度の検査する試料溶液３０ｍｌと混合し、５．３ｎＫａｔ／ｍｌのウシ属トロンビン（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）６０ｍｌと混合した。
この溶液を３７℃で７０秒間インキュベートし、色原体基質Ｓ２２３８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を６０ｍｌ加えた。反応は、凝固計ＡＣ９０００（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を使用して、４０５ｎｍで９０秒間毎秒読み取りを実施した。公知の生成物（主に、ＷＯ０１／７２８４８号明細書およびＷＯ０２／５０１２５号明細書に記載された製法の生成物）で得られた結果を表１に示した。
【０２０１】
ヘパリナーゼに対する耐性−ヘパリナーゼＩに対する耐性は、低分子量および高分子量の試料を調製して、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ５０ｍＭ、ＣａＣｌ2  ４ｍＭ，０．０１％  ＢＳＡからなる緩衝液、ｐＨ７．５，最終濃度０．０２％、を用いた。２０単位のヘパリナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ，ＣＡＳ番号５２２２７−７６−６）を試料溶液１００ｍｌに加え、反応を２５℃でインキュベートした。１０分、１時間、２時間、２０時間目に、塩酸５０ｍＭを加えて反応を停止させ試料を採取した。
【０２０２】
分画試料を２３５ｎｍの吸光度測定とＧＰＣ−ＨＰＬＣで分析し分子量を求めた。結果を表３に示した。この表で、高分子量（ＨＭＷ）および低分子量（Ｆｒａｘｉｐａｒｉｎａ，Ｓａｎｏｆｉ）の両方の抽出ヘパリンは、長時間では分解して分子量が低下しているが、本発明で得た生物工学的ヘパリンは安定であったことがわかる。（ヘパリナーゼＩの処理で２０時間後も分子量が安定に保たれている）
ＴＦＰＩ活性−ＴＦＰＩファクターを基礎とした活性の測定は、Ｇｏｒｉ  ＡＭら、抗血栓症誌、１９９９年、第８１号、５８９−５９３頁に記述された方法でＨＵＶＥＣ細胞上でインビトロで実施し、市販の無分割ヘパリンと比較した（表４）。
【０２０３】
プロテアーゼ生成の抑制−プロテアーゼ精製の抑制の測定は、Ｆａｒｅｅｄら、Ｐａｔｈ．Ｈａｅｍ．Ｔｈｒｏｍｂ．誌、２００２年、第３２巻、３号、５６−６５頁に報告されている方法に従ってフィブリノーゲンを枯渇させた血漿中で実施した。試験試料を様々な希釈度で添加した後、内因性凝固系の活性化についてはＰＴ（トロンボピラスチンＣ）を添加し、内因性凝固系の活性化についてはＡＰＴＴ（Ｄａｄｅ  Ａｃｔｉｎ）を添加し、血漿を活性化させた。因子IIと因子Xaの両方の抑制をＡＣＬ９０００凝固計（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を用いて観察した。希釈度５０ｍｇ／ｍｌの試料についての結果を表５に示した。
【０２０４】
ＰＦ４因子への親和性−ＰＦ４因子（血小板第４因子）に対する親和性の測定は、血漿中で、本発明で得られた生物工学的ヘパリンを含む溶液に一定量のＰＦ４因子を加えた後残存する抗Xa活性を測定することにより実施した。
【０２０５】
０．８抗Xa活性を含む血漿１００ｍｇを加えてＰＦ４の最終濃度１０ｍｇ／ｍｌとした。試料の抗Xa活性をＡＣＬ９０００凝固計（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を用いてＣｏａｔｅｓｔヘパリンキット（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）で測定した。残存抗Xa活性は初期の活性に対する比率として表される（表６）。
【０２０６】
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）の測定−ＡＰＴＴの測定は、ＡＣＬ９０００凝固計（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を用いて凝固試験により実施した。規定通りに希釈した試料に一定量のセファリン（キットＡＰＴＴ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社ｃｏｄ８４６８７１０）を添加し３７℃で反応を実施し、塩化カルシウムを添加後の塊の生成を６６０ｎｍの吸光度で測定した。
【０２０７】
ＡＰＴＴ値は、第一次国際標準低分子ヘパリン８５／６００に対する活性度の比率として表２に報告した。
【０２０８】
ヘパリン補因子II（ＨＣII）の活性度の測定−ＨＣIIの測定は、０．０８５  ＰＥＵ／ｍｌのＨＣII２０ｍｌ、異なった濃度の試験試料溶液８０ｍｌ、０．０２Ｍのｔｒｉｓ緩衝液中の０．１８  Ｕ／ｍｌのトロンビン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）５０ｍｌ、ｐＨ７，４，０．１５ＭＮａＣｌおよびＰＥＧ６０００  ０．１％の反応混合物を調製することにより実施した。この溶液を３７℃で６０秒間インキュベートした後、１ｍＭのＳｐｅｃｔｒｏｚｙｍｅ色素生成基質（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社）を５０ｍｌ加えた。反応は、ＡＣＬ９０００自動凝固計（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を用いて４０５ｎｍ波長で１８０秒間毎秒測定した。
【０２０９】
ＨＣII値は、第一次国際標準低分子ヘパリン８５／６００に対する活性度の比率として表２に報告した。
【０２１０】
表１および２に示した生物工学的ヘパリンの生物学的活性デ−タは、本発明で調製したもの、またはホルミル基供給型溶媒またはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドのような非供給型溶媒の使用に無関係なＯ−完全硫酸化で特徴づけられる方法によるもの、または最終工程での解重合によるもの、または抽出ヘパリンのものを含んでいる。とりわけこのデ−タでは、本発明で得た生成物が先行技術で得られた生成物に比較して、同様な分子量のものではヒトの血漿中の抗Xa活性が高いことがわかる。
【０２１１】
実際、本発明で得られた生成物では、抗Xa活性として表した生物学的活性と分子量の比が高い。このように優れた値は本発明の次の製法の複合された特性によるものと思われる。
−  マイルドな条件で実施されたＯ−硫酸化（Ｏ−硫酸化と６Ｏ−硫酸化）（実施例５と７で比較されている）
−  Ｏ−硫酸化と６Ｏ−硫酸化でホルミル基非供給型の非プロトン性極性溶媒を使用している（実施例１と２で比較されている）
−  中間工程での解重合がＯ−硫酸化工程の前または６Ｏ−硫酸化工程の前に実施されている。これは製法の最後に実施した解重合と比較できる。（実施例１と１２で比較されている）
【０２１２】
実施例１と６で実施したように、血漿中の抗Xa活性として求められた生物学的活性と生成物の分子量の比が高くなること、および抗Xa活性と抗IIa活性の比率が高くなること、がＯ−硫酸化（Ｏ−硫酸化および６Ｏ−硫酸化）を部分的に実施しかつＯ−硫酸化と６Ｏ−硫酸化でホルミル基非供給型の非プロトン性極性溶媒を使用し、かつ解重合を中間工程で実施したときに見られる。
【０２１３】
しかしながら、実施例１３で実施したように、本発明の製法は強いＯ−硫酸化を部分的な６Ｏ−硫酸化と組み合わせた場合も成功している。
【０２１４】
さらに、実施例１２で実施したように、本発明の製法は解重合を最後に実施した場合も成功している。
【０２１５】
公知の方法で得られた生物工学的ヘパリンと比較して本発明の生成物で改良が見られた他のパラメータは、抗血栓性と抗凝集性の関係を示す抗Xaと抗IIa活性の比率であり、この結果は抽出ヘパリンの値に近いＡＰＴＴ値からも得られている。
【０２１６】
その比率が１と等しいかそれより高い結果が本発明の生成物に得られているが、先行技術で得られた生成物ではその比率は１より低いのである。
ＨＣII値が高いことによって示された他の特性は、抽出ヘパリンと比較してトロンビンに対する直接的に抑止する能力が優れていることである。
【０２１７】
実施例１８  分子量がおよそ６０００Ｄａの生物工学的ヘパリンの製造
実施例１で記述したものと同様に次の工程を実施した。
ａ）大腸菌Ｋ５を原料としたＮ−アセチルヘパロサン多糖の調製
ｂ）Ｎ−脱アセチル化およびＮ−硫酸化
ｃ）エピマー化
ｄ）部分的Ｏ−硫酸化および部分的Ｏ−脱硫酸
ｅ）Ｎ−再硫酸化
ｆ）制御された解重合
ｇ）部分的６−Ｏ硫酸化および
工程ａ）〜ｃ）は、実施例１の工程ａ）〜ｃ）と同じ操作であり、工程ｄ）〜ｇ）が実施例１の工程ｄ）〜ｇ）の順番と逆になっている以外は実施例１で記述したものと同じ操作を実施した。
【０２１８】
得られた最終生成物は分子量がおよそ６０００Ｄａであり、血漿中での抗Xa活性は９２  ＩＵ／ｍｇであった（表２）。13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図１８に示した。
【０２１９】
【表１】
2007501305.tif 000006
【０２２０】
【表２】
2007501305.tif 000007
2007501305.tif 000008
2007501305.tif 000009
【０２２１】
【表３】
2007501305.tif 000010
【０２２２】
【表４】
2007501305.tif 000011
【０２２３】
【表５】
2007501305.tif 000012
【０２２４】
【表６】
2007501305.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０２２５】
【図１】実施例１に述べた、Ｋ５Ｎ−硫酸化エピマー化多糖のアノマ−領域の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図２】実施例１で得られた生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図３】実施例２で得られた生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図４】実施例３で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図５】実施例４で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図６】実施例５で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図７】実施例６で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図８】実施例７で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図９】実施例８で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１０】実施例９で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１１】実施例１０で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１２】実施例１１で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１３】実施例１２で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１４】実施例１３で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１５】実施例１４で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１６】実施例１５で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１７】実施例１６で得られた生成物の13Ｃ−ＮＭＲスペクトル。
【図１８】実施例１８で得られた生成物の1Ｈ−ＮＭＲスペクトル。
【図１】
2007501305.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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