(57)【要約】  本発明は、新規のメチオニンアミノペプチダーゼ酵素及びその使用を提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
基質規定ポケットが変異した大腸菌アミノペプチダーゼバリアント。
【請求項２】
活性部位が変異し、拡張された基質特異性を野生型と比較してP1’ポジションに有している大腸菌アミノペプチダーゼバリアント。
【請求項３】
請求項1〜2の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼバリアントであって、P1’ポジションにおける基質特異性が拡張して、Asn, Leu, Ile, Phe, His, Gln または Trpを、同様に野生型でポジションP1’において認容されたアミノ酸を含む、大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼバリアント。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション168、206または233における残基が、Y168およびM206およびQ233とは異なる配列へと補正されている大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項５】
請求項1〜4の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション168にアミノ酸の補正を具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項６】
請求項1〜4の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション206に補正を具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項７】
請求項1〜4の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション233に補正を具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項８】
請求項1〜4および6〜7の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション206および233に補正を具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項９】
請求項1〜6の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション168および206に補正を具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１０】
請求項1〜5および7の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション168および233に補正を具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１１】
請求項1〜10の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション168、206、および233に補正を具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１２】
請求項1〜11の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、前記補正は、野生型のアミノ酸のGly, Ala, Ser, Thr, Asn または Aspへの変換を備える大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１３】
請求項12に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、前記補正は、Alaおよび／またはGlyを具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１４】
請求項13に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、前記補正は、Alaを具備する大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１５】
請求項5〜14の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション168がAlaである大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１６】
請求項5〜14の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション206がAlaである大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１７】
請求項5〜14の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション233がAlaである大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１８】
請求項5〜14の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼであって、ポジション206および233が両方Alaである大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項１９】
配列番号3で表されるアミノ酸配列を有している大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項２０】
配列番号5で表されるアミノ酸配列を有している大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項２１】
配列番号7で表されるアミノ酸配列を有している大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項２２】
配列番号9で表されるアミノ酸配列を有している大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ。
【請求項２３】
請求項1〜22の何れか１項に記載の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼの、開始メチオニンをポリペプチドから除去するための使用。
【請求項２４】
請求項23に記載の使用であって、前記ペプチドが、IL-21、その変異体、化学的誘導体、又は種ホモログ（species homologue）；或いはIL-20またはhGHである使用。
【請求項２５】
請求項24に記載の使用であって、前記ペプチドが、ヒトIL-21である使用。
【請求項２６】
請求項24に記載の使用であって、前記ペプチドが、ヒトIL-21の変異体である使用。
【請求項２７】
請求項24に記載の使用であって、前記ペプチドが、ヒトIL-21の化学的誘導体である使用。
【請求項２８】
請求項24に記載の使用であって、前記ペプチドが、ヒトIL-21の種ホモログである使用。
【請求項２９】
請求項1〜22に記載のペプチドをコード化している単離されたDNA。
【請求項３０】
配列番号2で表される請求項19に記載のペプチドをコード化している単離されたDNA。
【請求項３１】
配列番号4で表される請求項20に記載のペプチドをコード化している単離されたDNA。
【請求項３２】
配列番号6で表される請求項21に記載のペプチドをコード化している単離されたDNA。
【請求項３３】
配列番号8で表される請求項21に記載のペプチドをコード化している単離されたDNA。
【請求項３４】
請求項29〜33の何れか１項に記載のヌクレオチド配列を具備する宿主細胞。
【請求項３５】
請求項34に記載の宿主細胞であって、Met含有ペプチドをコード化しているヌクレオチド配列をも具備する宿主細胞。
【請求項３６】
請求項35に記載の宿主細胞であって、前記配列が同じプラスミドに存在する宿主細胞。
【請求項３７】
請求項35に記載の宿主細胞であって、前記配列が異なるプラスミドに存在する宿主細胞。
【請求項３８】
GlnをN末端に有している産物ペプチドを基質Met-Gln含有ペプチドから精製するための方法であって、Qシクラーゼを適用し、化合物の電荷差を利用する精製の工程を備える方法。
【請求項３９】
請求項38に記載の方法であって、陽イオン交換カラムにおける精製を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、開始メチオニンがフリーのペプチドを産生するための、開始メチオニン含有タンパク質を酵素メチオニンアミノペプチダーゼでプロセシングする方法及びその変異体に関する。
【０００２】
［発明の背景］
原核生物または真核生物の発現系を用いた組換え技術によるペプチドの産生は、先行するメチオニンアミノ酸を有するペプチドを生得的（inherently）に産出する。このアミノ酸は、本来のタンパク質（即ち、トランスロケーションのためにプロセスされるペプチドのバリアント）には存在しないだろう。先行するメチオニン無しのペプチドを得るには、このような更なるプロセシング工程が必要とされる。本発明において、前記工程は、酵素メチオニンアミノペプチダーゼによって実施され、これによって開始メチオニンがペプチドから選択的に切断される。
【０００３】
先行するペプチド配列が特定の既定のキャラクターである場合、メチオニンアミノペプチダーゼ(Met-AP’s)は、先行するメチオニン（leading methionines）を切断する酵素として当該技術において既知である。P1’ポジションにおける残基がGly、Ala、Ser、Thr、Pro、ValまたはCysである場合、野生型の大腸菌（Escherichia coli）のMet-APは開始Met残基の後を選択的に切断する。
【０００４】
本発明において、前記メチオニンアミノペプチダーゼは、基質結合部位に突然変異が導入されることによって改善され、これによって先行するペプチド配列(P1’ ポジション)とは関係なくメチオニンを切断するメチオニンアミノペプチダーゼを生じる。
【０００５】
［発明の概要］
本発明は、新規の変異体メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【０００６】
本発明は、係るメチオニンアミノペプチダーゼをコード化している単離されたDNAを提供する。
【０００７】
本発明は、係るメチオニンアミノペプチダーゼを産生させるための宿主細胞を提供する。
【０００８】
本発明は、ペプチドを開始メチオニンアミノ酸に関してメチオニンフリーペプチドへとプロセシングするための、変異体メチオニンアミノペプチダーゼの使用を提供する。
【０００９】
また、本発明は、変異体メチオニンアミノペプチダーゼによる特定のペプチドのプロセシングを提供する。
【００１０】
また、本発明は、メチオニンを含有している出発物質（starting material）を、最終的な切断産物から分離するための方法を提供する。
【００１１】
［定  義］
P1は、前記酵素の認識部位に対してＮ端（N-terminal）の最初のアミノ酸を規定する。P1’は、Ｃ端（C-terminal）の方向でP1に隣接するアミノ酸を意味する。本発明においてP1は、メチオニンである。
【００１２】
本発明において、基質特異性は、P1’ポジションに対する選択性を意味する（このポジションは、メチオニンに対しちょうどＣ端のポジションである）。P1’ポジションにおける残基がGly、Ala、Ser、Thr、Pro、ValまたはCysである場合、野生型の大腸菌Met-APは開始Met残基の後を選択的に切断する基質特異性を呈する。本発明の変異体は拡張された基質特異性を示しており、この事項は、更なるアミノ酸がP1’ポジションを占めることが可能であり、メチオニンの更なる切断が観察されることを意味している。
【００１３】
本発明において、バリアントは、親配列（即ち、メチオニンアミノペプチダーゼとして）の定性的活性（qualitative activity）を維持している配列を意味するが、その配列は親配列とは親配列の1以上のアミノ酸の欠失（deletions）、付加（insertions）、拡張（extension）、または置換（substitution）によって異なっている。また、原則的にバリアントは、任意の長さの断片を含む（但し、活性は維持される）。
【００１４】
本発明において、特定のタンパク質の化学的誘導体（chemical derivatives）は、バリアントではなく、親のタンパク質配列の定性的活性を維持する、本来のタンパク質の誘導体（derivative）を意味する。化学的誘導体には、PEG基などの誘導体が含まれる。
【００１５】
ペプチドおよびタンパク質の用語は、互換的（interchangeable）に使用され、前記配列のサイズまたは機能の指標（indications）または限定（limitations）を意味しない。
【００１６】
［発明の記載］
大腸菌からのMet-Apは、基質規定ポケット（活性部位の一部として）を有し、これは基本的に（しかし、おそらくは排他的ではなく）、アミノ酸Tyr 168、Met 206およびGln 233によって規定される。これらのポジションを変異させることによって、前記酵素の基質特異性が拡張される。本発明に記載される新規の大腸菌アミノペプチダーゼは、メチオニンアミノペプチダーゼの適用性が拡張されて、メチオニンの下流のアミノ酸配列(P1’ ポジション)にかかわらず、開始メチオニンをほとんど如何なるタイプのタンパク質またはペプチドから除去することに有用となった。それ故、開始メチオニンが、開始メチオニンを含んでいるペプチドまたはタンパク質から除去されて、開始メチオニンがフリーのペプチドまたはタンパク質を産生することができる。
【００１７】
大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼ遺伝子がクローン化され、変異体バージョンが部位特異的突然変異誘発を用いて作出された。
【００１８】
前記変異体は大腸菌で発現され、結果的に生じた酵素は通常のHis-タグシステムで精製された。また、前記酵素を、FLAGシステムなどによってタグ化する又はWO 03042249に記載された他の技術でタグ化および精製することができる。触媒活性は、開始Met含有hIL-21を基質として用いてモニターされた。
【００１９】
原則的に（In principle）、本発明は、任意のペプチドに一般的に適用可能である。本発明は、hIL-21などのペプチドに関する開始メチオニンの切断に有用であることが実証された。hIL-21は、P1’ポジションがGlnであるモデル系である。IL-21は、WO00/53761に記載され、とりわけ癌およびウイルス感染の治療に効果的であると記載されている。IL-20は、WO9927103に記載されている。hGHは、ヒト成長ホルモンを意味する。双方は、P1’ポジションにおける他のアミノ酸に関するモデル系である。
【００２０】
一側面において、本発明は、大腸菌アミノペプチダーゼ  バリアントを提供する。該バリアントは、活性部位が変異し、拡張された基質特異性を野生型と比較してP1’ポジションに有している。
【００２１】
一側面において、本発明は、P1’ポジションにおける基質特異性が拡張して、Asn, Leu, Ile, Phe, His, Gln または Trpを同様に野生型でポジションP1’において認容されたアミノ酸を含む上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼバリアントを提供する。
【００２２】
一側面において、本発明は、ポジション168、206または233における残基が、Y168および／またはM206および／またはQ233とは異なる配列へと補正されている、上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００２３】
一側面において、本発明は、ポジション168にアミノ酸の補正（amendment）を具備する上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００２４】
一側面において、本発明は、ポジション206に補正を具備する上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００２５】
一側面において、本発明は、ポジション233に補正を具備する上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００２６】
一側面において、本発明は、ポジション206および233に補正を具備する上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００２７】
一側面において、本発明は、ポジション168および206に補正を具備する上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００２８】
一側面において、本発明は、ポジション168および233に補正を具備する上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００２９】
一側面において、本発明は、ポジション168、206および233に補正を具備する上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供する。
【００３０】
一側面において、本発明は、上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供し、該大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼにおいて、前記補正は野生型のアミノ酸のGly, Ala, Ser, Thr, Asn または Aspへの変換を備える。
【００３１】
一側面において、本発明は、上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供し、該大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼにおいて、前記補正はAlaおよび／またはGlyを具備する。
【００３２】
一側面において、本発明は、上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供し、該大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼにおいて、前記補正はAlaを具備する。
【００３３】
一側面において、本発明は、上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供し、該大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼにおいて、ポジション168はAlaである。
【００３４】
一側面において、本発明は、上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供し、該大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼにおいて、ポジション206はAlaである。
【００３５】
一側面において、本発明は、上記のような大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼを提供し、該大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼにおいて、ポジション233はAlaである。
本発明は、以下に記す配列（配列番号１としても記載される）を有しているメチオニンアミノペプチダーゼ酵素を提供する、
【００３６】
MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGYHGYPKSVCISINEVVCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREXa CGHGIGRGFHEEPQVLH
YDSRETNVVLKPGMTFTIEPXb VNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAXc YEHTIVVT
DNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE,
【００３７】
ここで、Xa, Xb および Xc は、可変性アミノ酸（variable amino acids）であり、且つXa, Xb および Xc は、それぞれ同時に Tyr, Met および Glnではない。本発明の一側面において、1以上のXa, Xb および Xcが、野生型のアミノ酸からGly, Ala, Ser, Thr, Asn または Aspへと変換される。本発明の一側面において、Xa, Xb および Xcが、野生型のアミノ酸からGly または Alaへと変換される；本発明の一側面において、Xa, Xb および Xcが、野生型のアミノ酸からAlaへと変換される。
【００３８】
本発明は、置換Y168からAla(Y168A)(配列番号9)を提供する、
MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGYHGYPKSVCISINEVVCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREACGHGIGRGFHEEPQVLHYDSRETNVVLKPGMTFTIEPMVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAQYEHTIVVTDNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE
また、配列番号8として上記をコード化している対応するDNAを提供する；
【００３９】
本発明は、置換Met206からAla(M206A)(配列番号3)を提供する、
【００４０】
MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGYHGYPKSVCISINEVVCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREXCGHGIGRGFHEEPQVLHYDSRETNVVLKPGMTFTIEPAVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAQYEHTIVVTDNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE, 
これによって、酵素の基質特異性が拡張され、次に記すアミノ酸が許容される：そのアミノ酸とは、P1’ポジションにおけるAsn, Leu, Ile および Pheである。
【００４１】
また、本発明は、置換Gln233からAla(Q233A)(配列番号5)を提供する、
【００４２】
MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGYHGYPKSVCISINEVVCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREXCGHGIGRGFHEEPQVLHYDSRETNVVLKPGMTFTIEPMVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAAYEHTIVVTDNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE,  
又は、Met206およびGln233の双方のAlaへの置換(M206A Q233A)(配列番号7)を提供する:
MAISIKTPEDIEKMRVAGRLAAEVLEMIEPYVKPGVSTGELDRICNDYIVNEQHAVSACLGYHGYPKSVCISINEVVCHGIPDDAKLLKDGDIVNIDVTVIKDGFHGDTSKMFIVGKPTIMGERLCRITQESLYLALRMVKPGINLREIGAAIQKFVEAEGFSVVREXCGHGIGRGFHEEPQVLHYDSRETNVVLKPGMTFTIEPAVNAGKKEIRTMKDGWTVKTKDRSLSAAYEHTIVVTDNGCEILTLRKDDTIPAIISHDE, 
これによって、さらにP1’アミノ酸がHis, Gln および Trpとなることが許容される。 
【００４３】
本発明の一側面において、ポジション168は、Gly(Y168G)またはAla(Y168A)またはAsn(Y168N)へと補正される。本発明の一側面において、アミノ酸206はAla (M206A)またはGly(M206G)またはAsn(M206N)である、および／またはアミノ酸233はAla(Q233A)またはGly(Q233G)またはAsn(Q233N)である。本発明の側面は、以下による2または3つの補正の組合せを備え、ここで野生型の組み合わせ(Y168 M206 233Q)は本発明の範囲内ではない。
【００４４】
【表１】
2007514423.tif 000002
【００４５】
従って、本発明の側面で、ポジション206およびポジション233は、双方Ala (M206A Q233A)である又はGlyである又はAsnである、又はその組合せである：(M206G Q233A), (M206G Q233G), (M206A Q233G), (M206N Q233A), (M206N Q233N), (M206A Q233N)。本発明の側面で、ポジション168は、以下にしたがって補正される：
【００４６】
【表２】
2007514423.tif 000003
【００４７】
本発明の側面で、少なくとも1つの補正されるポジションは、Alaに補正される。
【００４８】
本発明の側面は、次に記す変異体である:(Y168G M206A), (Y168G M206A 233A), (Y168G M206N), (Y168G M206N 233A), (Y168A M206A 233A), (Y168A M206A), (Y168A M206N), (Y168A M206N 233A) および (M206A Q233A);
【００４９】
以上のように、本発明は、開始メチオニンに続いてAsn, Leu, Ile, Phe, His, Gln または TrpをP1’ポジションに含んでいる及び野生型大腸菌アミノペプチダーゼによって許容されるアミノ酸を含んでいるペプチドを切断する能力を有する新規酵素を提供する。野生型の大腸菌メチオニンアミノペプチダーゼは、P1’が任意の次に記すアミノ酸であることを認容する、それは即ち：Gly, Ala, Ser, Thr, Pro, Val または Cysである。
【００５０】
また、本発明は、上記配列をコード化している組換えDNAを提供する。前記DNA配列は、配列番号2、4および6に開示されている。
【００５１】
また、本発明は、特に上記の変異体 M206A, Q233A または M206A Q233A)に関する配列をコード化しているDNAを提供する。
【００５２】
本発明において、変異体メチオニンアミノペプチダーゼは大腸菌で発現されるが、原則的に宿主細胞は他の原核生物起源または真核生物起源（例えば、Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris など、又は例えば、哺乳類細胞）であってもよい。
【００５３】
本発明は、上記の組換えDNA分子で形質転換された宿主細胞を提供する。
【００５４】
メチオニンアミノペプチダーゼによる開始メチオニンの除去は、原核生物または真核生物の細胞におけるメチオニンアミノペプチダーゼの発現及び精製に引続いて、インビトロで実施しえる。この手順は、以下に実証されている。或いは、開始メチオニンの除去は、ジシストロン性プラスミド（a di-cistronic plasmid）を発現している細胞において又はメチオニンアミノペプチダーゼおよび基質ペプチドまたはタンパク質を保持しているプラスミドを共発現している細胞においてインビボで生じてもよい。また、インビボ開始メチオニンプロセシングは、メチオニンアミノペプチダーゼとプロセシングされるペプチドまたはタンパク質とをコード化している遺伝子がゲノムに統合されている細胞において実施されえる。 
【００５５】
実験が実施され、これによって反応に関する一連（a set of）の最適条件が提供された：前記反応に対する最適温度は、15および24゜Cの間であると決定された。典型的に（Typically）、前記反応を、以後18゜Cで実施した。
【００５６】
ZnCl2の濃度は7.5μM付近が最適であると決定された。また、NaCl濃度は100mM付近が最適であり、130mM未満が容認されることが見出された。
【００５７】
開始メチオニンの切断後、出発物質からの産物の分離は、2つのペプチドの異なる生物物理学的な特性を利用することによって達成することができる。
【００５８】
本発明の態様において、前記ペプチドはhIL-21であり、これは開始メチオニンの除去後にＮ末端にGlnを含む。Qシクラーゼでの処理は、ピログルタミン(pGlu)を形成する。環状アミド形成によって、産物のネット電荷（the products net change）は、メチオニン含有ペプチドと比較してネガティブである。メチオニン含有ペプチド（Methionine containing peptide）は陽イオン樹脂に対してより強い結合性を有しており、電荷における差は陽イオン交換カラムでの溶出に影響する。更に、非環化hIL-21において、Ｎ末端に配置されたGln残基は、側鎖アミド酸素（the side chain amide oxygen）と荷電したＮ末端バックボーンアミンとの間に水素結合を形成する能力を有し、これによってＮ末端の電荷がマスクされる。Met-hIL-21は、類似する電荷マスキングに関する能力を所有せず、それゆえ陽イオン交換カラムにhIL-21よりも強く結合する。
【００５９】
本発明の態様において、それぞれMet-GlnおよびGlnで開始される同一タンパク質間のタンパク質混合物を分離する方法が提供される。
【００６０】
本発明の特定の態様において、Met-hIL-21およびhIL-21の分離が提供される。
【００６１】
本発明の別の特定の態様において、Met-hIL-21及びhIL-21及びその変異体の分離が提供される。
【００６２】
［例］
様々なMet-AP発現構築物（図1に概要が示される）が作出された。NT1(HHHNSWDHDINR)またはヘキサ-Hisタグが、Met-APの様々な突然変異体形態に精製の目的で付加された。精製タグは、Xa因子を幾つかの構築物に又はエンテロキナーゼを他のものに用いて除去し得る。或いは、精製タグは前記酵素に残存してもよい。mRNA発現は、T7またはtacプロモーターのコントロール下であった。T7プロモーターのコントロール下の構築物をBL21(DE3)において発現させ、他方でtacプロモーターのコントロール下の構築物をBL21において発現させた。発現を、LB-培地中でOD600 0.4にまで成長させた培養物（6 mL）に0.4 mMまでIPTGを添加することによって誘導した。細胞を、2.5時間後に遠心分離によって収穫した。細胞溶解を、複数回の凍結融解サイクルによって行った。そして可溶性または不溶性のタンパク質分画を、遠心分離によって分離した。同等量の細胞（OD600で測定）に由来する可溶性の又は不溶性のタンパク質を、発現誘導の前後で、SDS-PAGEに供試し、引続いてコロイドブルー染色（colloidal blue staining）した(図2)。Met-AP発現レベルは、6mL培養物中で2.5 hの誘導後に〜250 mg/Lと見積もられた。
【００６３】
ヘキサ-His-Met-AP M206A, Q233Aを発現している１Lの培養物から収穫された大腸菌（E. coli）細胞を、細胞破壊機（cell disruptor）を用いて溶解させた。そして清澄化されたライセートを、Ni2+-NTAスーパーフローカラムにアプライした。イミダゾールグラジエントでの溶出によって、約200 mMイミダゾールでMet-AP融合タンパク質が放出された。前記酵素は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて、さらに精製され、緩衝液が交換された（保存／切断緩衝液へと）。前記酵素は、SDS-PAGE、MALDI-MSおよびN末端シークエンシング（酵素の分子量およびアイデンティティを検証する）を用いて分析された。
【００６４】
上記の手順にしたがって、NT1-エンテロキナーゼ-Met-AP突然変異体が調製された。発現は、tacプロモーターのコントロール下であった。IPTGの培養物への添加によって、Met-AP酵素の主に可溶性の発現が誘導された。次に記す変異体を上記の記載にしたがって調製した：(Y168G M206A), (Y168G M206A 233A), (Y168G M206N), (Y168G M206N 233A), (Y168A M206A 233A), (Y168A M206A), (Y168A M206N) および (Y168A M206N 233A）。
【００６５】
ヘキサ-His-Xa-MetAP Q233Aを、Ni2+-NTAスーパーフローを用いてアフィニティー精製した。精製されたヘキサ-His-Xa-Met-AP M206A, Q233AのMaldi-tof es マススペクトルは、正しい酵素が単離されたことを示している。Met-ヘキサ-His-Xa-Met-AP M206A, Q233Aに対応する32038.90の質量およびヘキサ-His-Xa-Met-AP M206A, Q233Aに対応する31942.10の質量は、次の事項を示している；その事項とは、ヘキサ-His-Xa-Met-AP M206A, Q233AがインビボでWT Met-APまたはヘキサ-His-Xa-Met-AP M206A, Q233Aによってプロセスされたことである。結果は、図4で実証されている。
【００６６】
ヘキサ-His-Xa-Met-AP M206A, Q233AのMet-hIL-21への付加（pH7,18°Cで）によって、〜65%のMet-フリーhIL-21が生じた。44 h中に、Met-hIL-21の90%以上の切断が観察できた(図3)。
【００６７】
この方法によって調製された別の突然変異体は、ヘキサ-His-Xa-Met-AP Q233Aであった；
【００６８】
Met-IL21からの開始MetのMet-APによる除去(M206A, Q233A)。
精製されたMet-AP(M206A, Q233A)を使用して、開始メチオニンを、部分的に又は完全に精製されたMet-IL21から除去した。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された：2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間であった。これらの条件を用いて、Met-IL21の検出限界以下でMet-IL21からのメチオニンの除去を実施することができた。
【００６９】
開始MetのMet-IL21からのMet-AP(M206A)による除去。
精製Met-AP(M206A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-IL21から開始メチオニンを除去した。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された：2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間であった。これらの条件を用いて、Met-IL21の検出限界以下でMet-IL21からのメチオニンの除去を実施することができた。
【００７０】
開始MetのMet-IL21からのMet-APによる除去における温度の影響(M206A, Q233A)。
例1に記載された条件およびアッセイを用いて、他のパラメーターを固定した間に温度をそれぞれ4、15、24および30゜C（degrees Celsius）の間で変動させた。前記反応に対する最適温度は、15および24゜Cの間であると決定された。典型的に（Typically）、前記反応を、以後18゜Cで実施した。
【００７１】
開始MetのMet-IL21からのMet-AP(M206A, Q233A)による除去におけるZnCl2濃度の影響。
例1に記載された条件およびアッセイを用いて、他のパラメーターを固定した間にZnCl2濃度をそれぞれ7.5、11および15 μMの間で変動させた。前記反応に対する最適なZnCl2濃度は、7.5 μMであると決定された。典型的に、前記反応を、以後7.5 μM ZnCl2で実施した。
【００７２】
開始MetのMet-IL21からのMet-AP(M206A, Q233A)による除去におけるNaCl濃度の影響。
例1に記載された条件およびアッセイを用いて、他のパラメーターを固定した間にNaCl濃度をそれぞれ80、130および180 mMの間で変動させた。反応を実施するために許容される最大NaCl濃度は、130mMであると決定された。典型的に、前記反応を、以後100 mM NaClで実施した。
【００７３】
開始MetのMet-IL21からのMet-AP(M206A, Q233A)による除去におけるQ-シクラーゼの添加およびピログルタミンの形成の影響。
上記の例に記載された条件を用いて、Q-シクラーゼを反応混合物へと添加する効果を決定した。再度MALDI-TOFが、メチオニンの除去を及び引続いてIL21中のポジション1におけるグルタミンのピロ-グルタミンへの転換をアッセイするために使用された。Q-シクラーゼを反応混合物へと添加することがMet-IL21から開始メチオニンを除去することに負に影響しなかったこと、更に上記の例に記載した反応条件下で、Q-シクラーゼがIL21中のポジション1における転換グルタミンのピロ-グルタミンへの転換に完全に有効（fully efficient）であったことが認められた。
【００７４】
Met-IL21、IL21およびピロ-グルタミンIL-21のMono-Sカラムを用いた精製および分離。
Met-IL21、IL21およびピロ-グルタミンIL21の間の異なる生物物理学的特性（bio-physical properties）を、精製目的／分離に使用することができる。ピロ-グルタミンIL21は、環化したアミド形成によって、N末端の正常なプロトン化が欠除（lack）する。ピロ-グルタミンで開始されるhIl-21とMet-IL21との間の(-1)電荷差（charge difference）を、陽イオン交換カラムに利用することが可能であり、これによってピロ-グルタミン IL21が最初に溶出され（それが１つの陽性電荷を欠除していることから）、引続いてMet-IL21（これは陽イオンレジンに対しより強い結合を示す）が溶出する。更に、非環化IL21において、Ｎ末端に配置されたグルタミンは、側鎖アミド酸素（the side chain amide oxygen）と荷電したＮ末端バックボーンアミンとの間に水素結合を形成する能力を有し、これによってＮ末端の電荷がマスクされる。Met-IL21は、類似する電荷マスキングに関する能力を提示（poses）しなく、それゆえ陽イオン交換カラムにIL21よりも強く結合する。Met-IL21、IL21およびピロ-グルタミンIL21の混合物（300 mM NaClを含み、pH6.5に緩衝された）を、Mono-Sカラムに充填した。A緩衝液はpH 6.5に緩衝された300mM NaClから構成され、B緩衝液はpH 6.5に緩衝された1 M NaClから構成される。0-20%のB緩衝液のリニアグラジエント(AKTAシステムで実施した)を、45カラム容量を超えてアプライした。フラクションを、上記のQ-シクラーゼの例で記載したとおりアッセイした。上記に記載されたグラジエントを用いて、Met-IL21、IL21、ピロ-グルタミンIL21の効率的な分離が達成された（図5）。
【００７５】
Met-hGH
精製Met-AP(M206A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-hGH (ヒト成長ホルモン)から開始メチオニンを除去した（ここで、P1’はPhe残基である）。切断は、典型的には次に記す成分からなる反応緩衝液中で実施された：2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-hGHからのメチオニンの部分的な又は完全な除去が実証された。
【００７６】
Met-hGH
精製Met-AP(M206A, Q233A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-hGH(ヒト成長ホルモン)から開始メチオニンを除去した（ここで、P1’はPhe残基である）。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された：2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-hGHからのメチオニンの部分的な又は完全な除去が達成された。
【００７７】
Met-IL-20
精製Met-AP(M206A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-IL-20から開始メチオニンを除去した（ここで、P1’はLeu残基である）。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された：2〜100 mM K2SO4, 2〜500 mM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-IL-20からのメチオニンの部分的な又は完全な除去が実証された。
【００７８】
Met-IL-20
精製Met-AP(M206A, Q233A)を使用して、部分的に又は完全に精製されたMet-IL-20から開始メチオニンを除去した（ここで、P1’はLeu残基である）。切断は、典型的に次に記す成分からなる反応緩衝液で実施された：2〜100 mM K2SO4, 2〜500 μM NaCl, 1〜100 μM ZnCl2 および 2〜30 mM Hepes 緩衝剤 pH 6〜8。切断を、MALDI-TOF分光学でアッセイした。反応時間は、2〜66時間である。これらの条件を用いて、Met-IL-20からのメチオニンの部分的な又は完全な除去が実証された。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図1は、大腸菌のMet-AP変異体発現構築物レイアウトの例である。精製は、精製目的のタグを示す。プロテアーゼは、プロテアーゼ切断部位を示す。
【図２】図2は、示したとおり、例えば、大腸菌の(A)NT1-エンテロキナーゼ-Met-AP Y168Aまたは(B)NT1-エンテロキナーゼ-Met-AP Y168G, M206N, Q233Aにおける発現を示す。
【図３】図3は、Met-hIL-21のヘキサ-His-Xa-Met-AP (M206A, Q233A)切断を示す。
【図４】図4は、精製されたヘキサ-His-Xa-Met-AP M206A, Q233AのMaldi-tof esマススペクトルを示す。
【図５】図5は、3つの化合物  Met-IL-21、IL-21およびピログルタミンIL-21の分離の精製クロマトグラムを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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