(57)【要約】  本発明は、非常に制限されたアミノ酸配列多様性を含む変異型ＣＤＲを提供する。前記ポリペプチドは新規の抗原結合型ポリペプチドを同定するための母集団として用いることができる柔軟性のある単純な配列多様性の母集団を提供する。また、本発明は少なくともファージやウイルスコートタンパク質の一部などの異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして前記ポリペプチドを提供する。複数の前記ポリペプチドを含むライブラリもまた提供する。加えて、前記ポリペプチド及びライブラリを生成する及び使用するための方法と組成物を提供する。
2007501011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を有する変異型ＣＤＲＨ３領域を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝３〜２０であるポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１がコドンセットＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせによってコード化される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
Ｘ１がコドンセットＴＭＴ及び／又はＫＭＴによってコード化される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列が(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ−Ｄ−Ｙである、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ｎ＝７〜２０である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
Ｘ１が抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に一致する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−(Ｘ３)ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を有する変異型ＣＤＲＨ２を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝１〜２であるポリペプチド。
【請求項８】
制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ｎ＝２である、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−(Ｘ２)ｎ−Ｉ
を有する変異型ＣＤＲＨ１を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１及び／又はＸ２が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４であるポリペプチド。
【請求項１２】
コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ｎ＝４である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を有する変異型ＣＤＲＬ３を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４であるポリペプチド。
【請求項１６】
制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
ｎ＝４である、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を有する変異型ＣＤＲＬ２を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１及び／又はＸ２は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるポリペプチド。
【請求項２０】
制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を有する変異型ＣＤＲＬ１を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝３〜５であるポリペプチド。
【請求項２３】
制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
ｎ＝５である、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
変異型ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及び／又はＬ３を含んでなるポリペプチドであり、該変異型ＣＤＲが溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有し、該変異型アミノ酸が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるポリペプチド。
【請求項２７】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００ａの少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ３を含んでなる、請求項１ないし６及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
ポリペプチドが、位置９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００とＣ末端配列ＡＭＤＹの間の位置の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ３を含んでなる、請求項１ないし６及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
変異型ＣＤＲＨ３が一以上の位置への挿入を含み、該一以上の位置が制限コドンセットによりコードされるアミノ酸を含む、請求項１ないし６及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ２を含んでなる、請求項７ないし１０及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置２８、３０、３１、３２及び３３の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ１を含んでなる、請求項１１ないし１４及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置９２、９３、９４、９５及び９７の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ３を含んでなる、請求項１５ないし１８及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置５１及び５４の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ２を含んでなる、請求項１９ないし２１及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ポリペプチドが、カバットシステムに従って番号付けした位置２９、３０、３１、３２及び３３の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ１を含んでなる、請求項２２ないし２５及び２６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項１ないし３４の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである、請求項１ないし３５の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
請求項１ないし３６の何れか一に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含んでなる核酸。
【請求項３８】
請求項３７に記載の核酸を含んでなるベクター。
【請求項３９】
複製可能な発現ベクターである、請求項３８に記載のベクター。
【請求項４０】
ベクターが、ｌａｃＺプロモータ系、アルカリホスファターゼｐｈｏＡプロモータ（Ａｐ）、バクテリオファージｌＰＬプロモータ（温度感受性プロモータ）、ｔａｃプロモータ、トリプトファンプロモータおよびバクテリオファージＴ７プロモータからなる群から選択されるポリペプチドに連結したプロモータ領域を有する、請求項３９に記載のベクター。
【請求項４１】
ウイルス表面上に表出される請求項１ないし３６の何れか一に記載のポリペプチドを含んでなるウイルス。
【請求項４２】
複数の少なくとも１×１０４の請求項１ないし３６の何れか一に記載の異なるポリペプチド配列を含んでなるライブラリ。
【請求項４３】
請求項３９又は４０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４４】
さらに、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の付加的な変異体ＣＤＲを含み、少なくとも一のＣＤＲが溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有し、該変異型アミノ酸が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化される、請求項１ないし２５の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
制限コドンセットが４又は４以下のアミノ酸をコードする、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
制限コドンセットが２のアミノ酸のみをコードする、請求項４４ないし４６の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
２のアミノ酸がＹ及びＳである、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
変異型ＣＤＲＨ３を含み、付加的なＣＤＲがＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２である、請求項４４ないし４８の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
さらに、変異型軽鎖ＣＤＲを含む、請求項４９に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
変異型軽鎖ＣＤＲがＣＤＲＬ３である、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
さらに、変異型ＣＤＲＬ１及び／又はＣＤＲＬ２を含む、請求項５１に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
ポリペプチドが重鎖抗体可変ドメインである、請求項１ないし３６及び４４ないし５２の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
（ａ）請求項１ないし１４の何れか一に記載のポリペプチドを含む重鎖抗体可変ドメイン；と
（ｂ）請求項１５ないし２５の何れか一に記載のポリペプチドを含む軽鎖抗体可変ドメイン：
を有する少なくとも二つの抗体可変ドメインを含んでなるポリペプチド。
【請求項５５】
さらに、重鎖抗体可変ドメインのＣ末端領域に連結した二量体化ドメインを含む、請求項１ないし３６及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
二量体化ドメインがロイシンジッパードメイン又は少なくとも一のシステイン残基を含む配列を含む、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
二量体化ドメインが抗体からのヒンジ領域及びロイシンジッパーを含む、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
二量体化ドメインが単一システインである、請求項５５に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
請求項１ないし３６及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドであり、該ポリペプチドを有する抗体可変ドメインが少なくとも一のウイルスコートタンパク質の一部と融合している融合ポリペプチド。
【請求項６０】
ウイルスコートタンパク質がタンパク質ｐＩＩＩ、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐｖ1およびそれらの変異体からなる群から選択されたものである、請求項５９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６１】
さらに、可変ドメインとウイルスコートタンパク質との間に二量体化ドメインを含む、請求項５９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６２】
可変ドメインが重鎖のものである、請求項６１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６３】
さらに、ペプチドタグに融合した可変ドメインを含む、請求項５９に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６４】
可変ドメインが軽鎖のものである、請求項６３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６５】
ペプチドタグがｇＤ、ｃ-ｍｙｃ、ポリ-ｈｉｓ、蛍光タンパク質およびＢ-ガラクトシダーゼからなる群から選択されたものである、請求項６３に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６６】
さらに、単一抗体鋳型から得られたＦＲ配列である、変異型ＣＤＲに一致する抗体可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４を含む、請求項１ないし３１及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
各々のＦＲが抗体４Ｄ５の配列（配列番号１）を有する、請求項６６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
請求項４４ないし６７の何れか一に記載のポリペプチドをコード化するポリヌクレオチド分子を含む核酸。
【請求項６９】
請求項６８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項７０】
複製可能な発現ベクターである、請求項６９に記載のベクター。
【請求項７１】
複製可能な発現ベクターが、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージ又はその誘導体、又はλ様ファージ、例えばλ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など又はその誘導体である、請求項７０に記載のベクター。
【請求項７２】
ウイルス表面上に表出される請求項１ないし３１及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドを含んでなるウイルス。
【請求項７３】
複数の請求項１ないし３１及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドを含んでなり、少なくとも１×１０４の異なる抗体可変ドメイン配列を有するライブラリ。
【請求項７４】
請求項７０に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項７５】
複数のポリペプチドを有する組成物を生成する方法であり、
（ａ）ＣＤＲＨ１又はＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３の変異型ＣＤＲの少なくとも一又はそれらの混合を含んでなるポリペプチド
（ｉ）変異型ＣＤＲＨ３を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を有し、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝３〜２０であるポリペプチド；
（ｉｉ）変異型ＣＤＲＨ２を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−（Ｘ３）ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を有し、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝１〜２であるポリペプチド；と
（ｉｉｉ）変異型ＣＤＲＨ１を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−（Ｘ２）ｎ−Ｉ
を有し、Ｘ１及び／又はＸ２が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝２〜４であるポリペプチド
を複数生成することを含む方法。
【請求項７６】
（ｉ）変異型ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３又はそれらの混合を含み、該変異型ＣＤＲが溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に変異を有し、該変異型アミノ酸が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化される複数のポリペプチドを生成する
ことをさらに含む請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ＣＤＲＬ１又はＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の変異型ＣＤＲの少なくとも一又はそれらの混合を含んでなるポリペプチド
（ｉ）変異型ＣＤＲＬ３を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を有し、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４であるポリペプチド；
（ｉｉ）変異型ＣＤＲＬ２を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を有し、Ｘ１及び／又はＸ２は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるポリペプチド；と
（ｉｉｉ）変異型ＣＤＲＬ１を含んでなるポリペプチドが、アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を有し、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝３〜５であるポリペプチド
を複数生成することを含む、請求項７５または７６の方法。
【請求項７８】
（ａ）請求項１ないし３１及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し；
（ｂ）前記組成物から標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し；
（ｃ）非結合体からポリペプチド結合体を単離し；
（ｄ）単離したポリペプチド結合体から所望の親和性を有する結合体を同定する
ことを含む、標的抗原へ結合するポリペプチドの選別方法。
【請求項７９】
（ａ）請求項７３に記載の抗体可変ドメインのライブラリに標的抗原を接触させ；
（ｂ）非結合体から結合体を分離して、標的抗原の結合体を溶出して、そして約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度の減少した量の標的抗原を含む溶液中で結合体をインキュベートし；
（ｃ）最も低い濃度の標的抗原に結合することができる、約０．１ｎＭ〜２００ｎＭの親和性を有する結合体を選別する
ことを含む、抗体可変ドメインのライブラリから標的抗原に結合する抗原結合可変ドメインを選別する方法。
【請求項８０】
標的抗原が、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ-１、ニュートラビジン、マルトース結合タンパク質、アポトーシスタンパク質、エルビンＧＳＴ、インスリン又はＩｇＧである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
標的抗原の濃度が約１００〜２５０ｎＭである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
標的抗原の濃度が約２５〜１００ｎＭである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
（ａ）請求項１ないし３６及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し；
（ｂ）非結合体からライブラリ中のポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して結合体豊富なサブ集団を得て；
（ｃ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団を用いて（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも二度繰り返す
ことを含む、ポリペプチドのライブラリから標的抗原に結合するポリペプチドを選別する方法。
【請求項８４】
（ｆ）結合体が混合物を形成するのに適した条件下で０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃縮した標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体のサブ集団をインキュベートし；
（ｇ）標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ；
（ｈ）標識した標的抗原に結合したポリペプチド結合体を検出して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し；
（ｉ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標識標的抗原を用いて、（ｆ）〜（ｉ）の工程を少なくとも二度繰り返す
ことをさらに含む、請求項８３に記載の選別方法。
【請求項８５】
さらに、過剰量の非標識標的抗原を混合物に添加して、十分な時間インキュベートして標識標的抗原から親和性の低い結合体を溶出することを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
（ａ）請求項１ないし３６及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリに少なくとも約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭ濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し；
（ｂ）標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、ポリペプチド結合体豊富なサブ集団を得て；
（ｃ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも二度繰り返して、もっとも低い濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離する
ことを含む、標的抗原への高い親和性を有する結合体を単離する方法。
【請求項８７】
（ａ）結合に適した条件下にてライブラリに０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度の標識した標的抗原を接触させて、ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体を形成させ；
（ｂ）複合体を単離して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、結合体豊富なサブ集団を得て；
（ｃ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも二度繰り返す
ことを含む、請求項１ないし３６及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリからポリペプチド結合体を選別する方法。
【請求項８８】
さらに、ポリペプチド結合体と標的抗原の複合体に過剰な非標識標的抗原を加えることを含む、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
工程を二度繰り返し、第一回目の選別の標的の濃度が約１００ｎＭ〜２５０ｎＭであり、第二回目の選別では約２５ｎＭ〜１００ｎＭであり、第三回目の選別では約０．１ｎＭ〜２５ｎＭである、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
（ａ）ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を濃縮した標的抗原とともにインキュベートし；
（ｂ）標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし；
（ｃ）ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ；
（ｄ）各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し；
（ｅ）第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料の結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する
ことを含む、請求項１ないし３６及び４４ないし５４の何れか一に記載のポリペプチドを複数含むライブラリのスクリーニング方法。
【請求項９１】
（ａ）ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択した起源抗体の少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲを含む起源抗体のうちの軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、又はその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを構築し；
（ｂ）１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットを用いて、溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に起源抗体の少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲを変異させる
ことを含む方法。
【請求項９２】
変異型ＣＤＲＨ３が、アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を含み、Ｘ１は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎ＝３〜２０である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
変異型ＣＤＲＨ２が、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−(Ｘ３)ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を含み、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝１〜２である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
変異型ＣＤＲＨ１が、アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−(Ｘ２)ｎ−Ｉ
を含み、Ｘ１及び／又はＸ２が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
変異型ＣＤＲＬ３が、アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を含み、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝２〜４である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
変異型ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を含み、Ｘ１及び／又はＸ２は１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
変異型ＣＤＲＬ１が、アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を含み、Ｘ１が１０又は１０以下のアミノ酸をコードする制限コドンセットによりコード化され、ｎ＝３〜５である、請求項９１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（出願について）
この出願は、米国特許法規則１．５３（ｂ）（１）に基づき出願した非仮出願であり、米国特許法１１９（ｅ）に基づき、２００３年８月１日に出願の仮出願第６０／４９１８７７号の優先権を主張し、参照によりここにその内容全体が組み込まれるものである。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に非常に制限されたアミノ酸レパートリーを用いて多様化した変異型ＣＤＲ、及びそのような配列を複数含むライブラリに関する。また、本発明はこれら変異型ＣＤＲを含む融合ポリペプチドに関する。また、本発明は治療に又は試薬として用いることができる新規の結合型ポリペプチドを同定するために有用な方法及び組成物に関する。
【０００３】
（発明の背景）
ファージディスプレイ技術は抗原などのリガンドに結合する新規のタンパク質を生成し、選別するための強力なツールである。ファージディスプレイ技術の使用により、高い親和性で標的抗原に結合する配列について迅速に分類することができるタンパク質変異体の大きなライブラリを作製することができる。変異体ポリペプチドをコードしている核酸をウイルスコートタンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質をコードしている核酸配列に融合する。タンパク質ないしポリペプチドをコードしている核酸配列を遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部をコードする核酸配列に融合した一価ファージディスプレイ系が開発された。(Bass, S., Proteins, 8:309 (1990)；Lowman and Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3:205 (1991))。一価ファージディスプレイ系では、遺伝子融合が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も粒子の感染性が維持されるように発現している。ペプチドライブラリを作製してそのライブラリをスクリーニングする方法は多くの特許で開示されている(例として、米国特許第5,723,286号、米国特許第5,432,018号、米国特許第5,580,717号、米国特許第5,427,908号および米国特許第5,498,530号)。
糸状ファージの表面上のペプチドの発現と大腸菌周辺質での機能的抗体断片の発現を証明することは、抗体ファージディスプレイライブラリの開発に重要であった(Smithら, Science (1985), 228:1315；Skerra及びPluckthun, Science (1988), 240:1038)。抗体又は抗原結合ポリペプチドのライブラリは、ランダムなＤＮＡ配列を挿入したり、関連遺伝子のファミリーをクローニングして単一遺伝子を変更することを含むいくつかの方法で調製していた。ファージディスプレイを用いた抗体又は抗原結合断片を表出させる方法は、米国特許第5,750,373号、同第5,733,743号、同第5,837,242号、同第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,580,717号、及び同第5,658,727号に記載されている。ついで、ライブラリは所望の特性を有する抗体又は抗原結合タンパク質の発現についてスクリーニングする。
【０００４】
ファージディスプレイ技術は、所望の特徴を有する抗体を調製する従来のハイブリドーマおよび組換え方法に勝るいくつかの効果がある。この技術により、より少ない時間で動物を用いることなく多様な配列を有する抗体の大きなライブラリを作製することができる。ハイブリドーマの調製又はヒト化抗体の調製は、きっと数か月で可能である。加えて、免疫化が必要ないので、ファージ抗体ライブラリは毒性のある抗原又は抗原性が低い抗原について作製することができる(Hogenboom, Immunotechniques (1988), 4:1-20)。また、ファージ抗体ライブラリは、新規なヒト抗体を生成して同定するために用いることができる。
抗体は、多種多様な場で治療的作用剤として非常に有効になってきている。例えば、腫瘍抗原であるＨＥＲ-２に対するヒト化抗体は、癌の診断および治療に有効である。抗ＩＮＦ-γ抗体などの他の抗体は、クローン病などの炎症性状態を治療する際に有効である。ファージディスプレイライブラリは、免疫化されたヒト、免疫化されていないヒト、生殖細胞系配列又は未処理のＢ細胞Ｉｇレパートリーからヒト抗体を生成するために用いられた(Barbas & Burton, Trends Biotech (1996), 14:230；Griffithsら, EMBO J. (1994), 13:3245；Vaughanら, Nat. Biotech. (1996), 14:309；Winter EP 0368 684 B1)。未処理、または免疫化されていない、抗原結合ライブラリは種々のリンパ系組織を用いて作製されている。Cambridge Antibody Technology及びMorphosysにより開発されたものなど、いくつかのライブラリが市販されている (Vaughanら, Nature Biotech 14:309 (1996)；Knappikら, J. Mol. Biol. 296:57 (1999))。しかしながら、これらのライブラリの多くは、多様性が制限されている。
【０００５】
高親和性抗体をファージディスプレイライブラリから同定して、単離できることは、治療的用途のための新規なヒト抗体を単離するために重要である。ライブラリからの高親和性抗体の単離は、以前から、ライブラリのサイズ、細菌細胞の産生の効率およびライブラリの多様性に少なくともある程度依存していると思われる。例えば、Knappikら, J. Mol. Biol. (1999), 296:57を参照。ライブラリのサイズは、抗体又は抗原結合タンパク質の不適当な折畳み（ホールディング）および終止コドンの存在による効率的でない産生によって減少する。抗体又は抗原結合ドメインが適切に折り畳まれない場合、細菌細胞での発現は阻害されうる。発現は、可変／定常の境界面の表層、または、選択されたＣＤＲ残基で順に残基を変異させることによって改良することができる。(Dengら, J. Biol. Chem. (1994), 269:9533, Ulrichら, PNAS (1995), 92:11907-11911；Forsbergら, J. Biol. Chem. (1997), 272:12430)。抗体ファージライブラリを細菌細胞において作製するとき、フレームワーク領域の配列は適当な折畳みを提供する因子である。
また、抗体又は抗原結合タンパク質の多様なライブラリを作製することは、高親和性抗体の単離に重要である。限定したＣＤＲに多様化を有するライブラリは種々の方法を用いて作製されている。例えば、Tomlinson, Nature Biotech. (2000), 18:989-994を参照。抗原結合に関与することが明らかなことが多いので、ＣＤＲ３領域にいくらか関心がある。重鎖上のＣＤＲ３領域は、サイズ、配列および構造的立体配座が非常に変化する。
【０００６】
また、各可変重鎖及び可変軽鎖位置の全２０アミノ酸を用いて可変重鎖および可変軽鎖のＣＤＲ領域をランダム化することによって、多様性を生成したものもある。全２０アミノ酸を用いることで変異型抗体の配列に大きな多様性をもたらし、新規な抗体を同定する可能性を増やすと思われた。(Barbas, PNAS 91:3809 (1994)；Yelton, DE, J. Immunology, 155:1994 (1995)；Jackson, J.R., J. Immunology, 154:3310 (1995)及びHawkins, RE, J. Mol. Biology, 226:889 (1992))。
また、天然に生じる抗体のアミノ酸分布を反映させるためにいくつかのＣＤＲのアミノ酸置換の群を制限することによって多様性をつくる試みがあった。Garrard & Henner, Gene (1993), 128:103; Knappikら, J. Mol. Biol. (1999), 296:57を参照。これらの試みは様々な成功があったが、系統的で定量的方法に適用されなかった。ＣＤＲ領域の多様性をつくる一方で、アミノ酸変異の数を最小にすることに取り組んでいる。さらに、例えば、第一ライブラリが一つの基準に従って作製されると、第一ライブラリの多様性をさらに強化することが望まれるであろう。しかしながら、実質的に収率などの実用的限界を超えることなく更なる多様化が可能になるように、この第一ライブラリは十分な多様性がありなおかつ十分にサイズを小さく保つことが必要とされる。
【０００７】
いくつかの研究グループは、タンパク質を生成するために必要な最小数のアミノ酸蓄積の理論上及び実験上の分析を報告している。しかしながら、一般的にこれらの分析は範囲及び性質に限りがあり、制限した一連のアミノ酸タイプを用いて複合的機能を有するポリペプチドを生成することの実施可能性に関してかなりの懐疑的疑問が残る。例として、Riddleら, Nat. Struct. Biol. (1997), 4(10):805-809；Shangら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91:8373-8377；Heinzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89:3751-3755；Regan & Degrado, Science (1988), 241:976-978；Kamtekerら, Science (1993), 262:1680-1685；Wang & Wang, Nat. Struct. Biol. (1999), 6(11):1033-1038；Xiongら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), 92:6349-6353；Heinzら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89:3751-3755；Cannataら, Bioinformatics (2002), 18(8):1102-1108；Davidsonら, Nat. Struct. Biol. (1995), 2(10):856-863；Murphyら, Prot. Eng. (2000), 13(3):149-152；Brown & Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999), 96:1983-1988；Akanumaら, Proc. Natl. Acad. Sci. (2002), 99(21):13549-13553；Chan, Nat. Struct. Biol. (1999), 6(11):994-996を参照。
ゆえに、十分な程度の配列多様性を有する機能的ポリペプチドを含み、さらに更なる多様化、高率な発現などを目的とした操作に反応しやすいライブラリを作製する方法を改良する必要がある。本明細書中に記載する発明は、この必要性に応じたものであり、他の有益性も提供するものである。
【０００８】
（本発明の開示）
本発明は、制限された多様性を有する配列を含むが、抗原結合能を維持している変異型ＣＤＲを含むポリペプチドを生成する簡素化した利便性の高い方法を提供する。特定のＣＤＲ又はすべてのＣＤＲを多様化した場合にのみ標的結合体の十分な多様性が生じるという定理に基づいた従来の方法や、多様な範囲のアミノ酸置換（一般的に２０アミノ酸すべて又はそのほとんどを置換することによる）に依存して十分な多様性を得るという従来の概念と異なり、本発明は、参照ポリペプチド又は由来する抗原の特定のＣＤＲや特定数のＣＤＲを多様化することに頼る必要がない高質の標的結合体を生成することができる方法を提供する。本発明は、標的抗原に結合することができる機能的ポリペプチドを含む高質の非常に多様なライブラリが非常に制限された数のアミノ酸残基がある最小限の数のアミノ酸位置を多様化することによって生成することができるという驚くべきかつ不測の発見に少なくともある程度は基づいている。本発明の方法は、迅速、利便性が高く、順応性があり、少ない数のアミノ酸をコードする制限したコドンセットの使用に基づく。配列の多様性を制限しているので、本発明の方法によって生成したポリペプチドの集団（例えば、ライブラリ）は一般的により小さいので、必要又は希望に応じてこれら集団の更なる多様化が可能となる。これは一般的に従来法では得られなかった有益性である。本発明によって生成される候補結合体ポリペプチドは質の高い標的結合特性を有しており、細胞培養物中の生成物の回収率が高い構造的特性を有する。本発明は、これら結合体ポリペプチド生成方法、これらポリペプチドの使用方法、及びこれらを含む組成物を提供する。
【０００９】
一態様では、本発明は、所望の標的に対する候補結合体となる特異で別々の複数のポリペプチド及び単一のポリペプチドとして異種ポリペプチド配列（好ましくはウイルスポリペプチドの少なくとも一部の配列）及び、多様化したＣＤＲを含む融合ポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドを含む組成物（ライブラリなど）は、例えば所望の標的に結合する候補免疫グロブリンポリペプチド（例えば、抗体及び抗体断片）のプールとして様々な用途に使用される。また、本ポリペプチドは非免疫グロブリンの足場（例えば、ヒト成長ホルモンなどのタンパク質）を用いて生成することができるであろう。本発明は、本発明の方法によって生成したポリヌクレオチド及びポリペプチドを含む様々な態様、本発明の方法を実施するためのシステム、キット及び製造品、及び／又は本発明のポリヌクレオチド／ポリペプチド及び／又は本発明の組成物の使用方法も包含する。
一態様では、本発明はＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の変異型ＣＤＲを有するポリペプチドであり、所望の標的抗原に結合することができるポリペプチドを生成する方法を提供し、該方法は、変異型ＣＤＲに対応する参照ＣＤＲ中の少なくとも一の（又はすべての数までの任意の数の）溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を多様化すること；（ｉｉ）制限したコドンセット（以下の「制限コドンセット」の定義を参照）を用いてＣＤＲの変異型コピーを生成することによって溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を変異させることを含む。
【００１０】
本発明の方法の多様な態様や実施態様は、本発明の複数のポリペプチドを含むプールを生成する及び／又は使用するため、特に所望の標的抗原への候補結合体を選択して同定するために有用である。例えば、本発明は複数のポリペプチドを含んでなる組成物を生成する方法を提供するものであり、各ポリペプチドはＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２又はＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の変異型ＣＤＲを有し、該ポリペプチドが所望の標的抗原に結合することができ、該方法が、変異型ＣＤＲに対応する参照ＣＤＲ中の少なくとも一の（又はすべての数までの任意の数の）溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を多様化すること；（ｉｉ）制限したコドンセットを用いてＣＤＲの変異型コピーを生成することによって溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置を変異させることを含み；複数のポリペプチドは、変異型アミノ酸をコードする配列中に含まれる非常に制限されたオリゴヌクレオチド縮重のある鋳型ポリヌクレオチドを増幅することによって生成され、該制限された縮重が制限コドンセットの限定した数のコドン配列を反映する。
他の例では、本発明は、ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲを含む起源抗原の軽鎖、重鎖又は軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを構築し；少なくとも一の（又はすべての数までの任意の数の）溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置の少なくとも１、２、３、４、５又はすべての起源抗体のＣＤＲを制限コドンセットを用いて変異させることを含む方法を提供する。
【００１１】
他の例では、本発明は、本発明の複数のポリペプチドを表出するファージ又はファジミド粒子のライブラリを構築し；粒子と標的抗原との結合に適した条件下にて粒子のライブラリに標的抗原を接触させて；標的抗原に結合しないものと結合した粒子とを分離することを含む方法を提供する。
本明細書中に記載の何れかの本発明の方法において、溶解性があり利用しやすく及び／又は非常に多様なアミノ酸位置は本明細書に記載の定義に当てはまる任意のもの、特に本明細書に記載の位置の組み合わせ、例えば本発明のポリペプチドについて記載した位置の任意の組み合わせ（ここでより詳細に記載する）であり得る。好適な変異型アミノ酸は、本明細書に記載の定義に当てはまる任意のもの、例えば、以下のより詳細に記載した本発明のポリペプチドの中の変異型アミノ酸であり得る。
ＣＤＲの多様化の設定には、ＣＤＲの長さ及び／又は配列を多様化することを伴うであろう。例えば、ＣＤＲＨ３は、制限コドンセットによってコードされるアミノ酸を有する非常に多様な及び／又は溶媒と接触しうる位置を変異させることによって、例えば７〜１９アミノ酸の長さやその配列を多様化されるかもしれない。いくつかの実施態様では、ＣＤＲＨ３の一部は５〜２２、７〜２０、９〜１５又は１１〜１３アミノ酸の範囲の長さであり、限られた数のアミノ酸をコードする制限コドンセット、例として１０、８、６、４又は２以下のアミノ酸をコードするコドンセットによってコードされる一以上の位置に変異型アミノ酸を有する。ある実施態様では、Ｃ末端にアミノ酸配列ＡＭ又はＡＭＤＹを有する。
【００１２】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドに標的結合する機能がある限り多様な型であってよい。ある実施態様では、本発明のポリペプチドは融合ポリペプチドである（すなわち、異種ポリペプチド由来の２又はそれ以上の配列の融合）。本発明に従って多様化したＣＤＲを有するポリペプチドは、例えばファージディスプレイの使用のために、ウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合ポリペプチドとして調製することができる。本発明のポリペプチドの表出のために使用することができるウイルスコートタンパク質には、タンパク質ｐＩＩＩ、主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ（Ｔ４ファージ）、Ｈｏｃ（Ｔ４ファージ）、ｇｐＤ（λファージ）、ｐＶＩ又はそれらの変異体又はそれらの断片が含まれる。ある実施態様では、融合ポリペプチドは、ｐＩＩＩ、ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐＶＩおよびそれらの変異体又はそれらの断片からなる群から選択されるウイルスコートタンパク質などのウイルスコートタンパク質の少なくとも一部と融合している。
ある実施態様では、多様化されたＣＤＲを有するポリペプチドは一以上の抗体可変ドメインであり、抗体可変ドメインはＳｃＦｖ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ２、Ｆ(ａｂ')２及びＦ(ａｂ)２を含む多様な型でウイルス表面上に表出されうる。二価のポリペプチドの表出には、融合ポリペプチドは好ましくは二量体化ドメインを包含する。二量体化ドメインは、二量体化配列及び／又は一以上のシステイン残基を有する配列を含みうる。二量体化ドメインは好ましくは、重鎖の可変又は定常ドメイン（ＣＨ１など）のＣ末端に直接的にまたは間接的に連結している。二量体化ドメインの構造は、抗体可変ドメインが（二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含まないで）ウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質成分として産生されるか、抗体可変ドメインが（二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含んで）主にウイルスコートタンパク質成分なしで産生されるかによって変わりうる。抗体可変ドメインが主にウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質として産生される場合、一以上のジスルフィド結合及び／又は単一二量体化配列により二価表出される。ウイルスコートタンパク質成分に融合せずに主に産生される抗体可変ドメイン（アンバー停止あり）には、システイン残基と二量体化配列の両方を含む二量体化ドメインを有することが好ましい。
【００１３】
加えて、場合によっては、融合ポリペプチドは精製、検出及び／又はスクリーニングに有用なタグ、例としてＦＬＡＧ、ポリ-ｈｉｓ、ｇＤタグ、ｃ-ｍｙｃ、蛍光タンパク質又はＢ-ガラクトシダーゼを含みうる。一実施態様では、融合ポリペプチドはポリペプチドタグに融合した軽鎖可変又は定常ドメインを含む。
本発明の他の態様では、抗体可変ドメインなどのポリペプチドは単一起源又は鋳型分子から得たものである。起源又は鋳型分子は、原核細胞又は真核細胞の培養で産生される場合に効率よく安定しているなどの特性について選択又は設定する、及び／又は長さの違うＣＤＲＨ３領域に適応するように選択又は設定するのが好ましい。ファージコートタンパク質成分を有する融合タンパク質としてある場合、鋳型分子の配列は可変ドメインのホールディング及び／又は表出を改善するように変更することができる。例えば、起源抗体はヒト化抗体４Ｄ５の可変ドメイン（軽鎖可変ドメイン（図１５；配列番号１））；（重鎖可変ドメイン（図１５；配列番号２））のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、重鎖又は軽鎖の抗体可変ドメイン中のフレームワーク領域残基を起源又は鋳型分子から修飾又は変更して、抗体可変ドメインのホールディング、効率、表出又は親和性を改良することができる。ある実施態様では、起源分子のフレームワーク位置にあるアミノ酸が天然に生じる抗体又はサブグループの一致配列内の位置に共通してみられる単一又は複数のアミノ酸と異なる場合、フレームワーク残基を選択して起源又は鋳型分子から修飾する。この位置にあるアミノ酸を天然に生じる抗体又はサブグループの一致配列内にもっとも共通してみられるアミノ酸に変更することができる。一実施態様では、重鎖のフレームワーク残基７１はＲ、Ｖ又はＡであるかもしれない。他の例では、重鎖のフレームワーク残基９３はＳ又はＡであるかもしれない。更なる他の例では、フレームワーク残基９４はＲ、Ｋ又はＴであるか、ＭＲＴによりコードされるかもしれない。更なる他の例では、重鎖のフレームワーク残基４９はアラニン又はグリシンであるかもしれない。また、軽鎖のフレームワーク残基は変更しうる。例えば、位置６６のアミノ酸はアルギニン又はグリシンであるかもしれない。
【００１４】
本発明の方法は、多様な組み合わせのＣＤＲ配列を含む多種多様なポリペプチドを生成することができる。例えば、一実施態様では、本発明は、アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を有する変異型ＣＤＲＨ３領域を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１は制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持するのに適する数であるポリペプチドを提供する。例えば、ｎは３〜２０、５〜２０、７〜２０、５〜１８又は７〜１８であり得る。一実施態様では、ｎ＝７〜２０である。ある実施態様では、Ｘ１がコドンセットＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせによってコード化される。一実施態様では、Ｘ１がコドンセットＴＭＴ及び／又はＫＭＴによってコード化される。一実施態様では、アミノ酸配列が(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ−Ｄ−Ｙである。ある実施態様では、ＣＤＲＨ３内のアミノ酸位置９５、例えば抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３の位置９５第一Ｘ１の抗体４Ｄ５のＣＤＲＨ３のアミノ酸位置９５に一致する。ある実施態様では、第一Ｘ１の位置は、ＣＤＲＨ２の末端後の位置３３残基、及びシステイン残基後の２残基に一致する。ある実施態様では、第一Ｘ１の位置は、Ｃｙｓ−Ｘａａ−Ｘａａに続く位置に一致し、ある実施態様では、それはＣｙｓ−Ａｌａ−Ａｒｇ又はＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇである。
【００１５】
一態様では、本発明は、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−(Ｘ３)ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を有する変異型ＣＤＲＨ２を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５は制限コドンセットによりコード化され、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持するのに適する数であるポリペプチドを提供する。例えば、ｎは１〜５、１〜３又は１〜２であり得る。一実施態様では、ｎ＝２である。ある実施態様では、制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである。ある実施態様では、制限コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである。
他の態様では、本発明は、アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−(Ｘ２)ｎ−Ｉ
を有する変異型ＣＤＲＨ１を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１及び／又はＸ２が制限コドンセットによりコード化され、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持するのに適する数であるポリペプチドを提供する。例えば、ｎは１〜４、２〜４又は３〜４であり得る。一実施態様では、ｎ＝４である。ある実施態様では、コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである。ある実施態様では、コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである。
【００１６】
他の態様では、本発明は、アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を有する変異型ＣＤＲＬ３を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は制限コドンセットによりコード化され、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持するのに適する数であるポリペプチドを提供する。例えば、ｎは１〜４、２〜４又は３〜４であり得る。一実施態様では、ｎ＝４である。ある実施態様では、制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである。ある実施態様では、コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである。
他の態様では、本発明は、アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を有する変異型ＣＤＲＬ２を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１及び／又はＸ２は制限コドンセットによりコード化されるポリペプチドを提供する。ある実施態様では、制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである。ある実施態様では、コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである。
【００１７】
他の態様では、本発明は、アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を有する変異型ＣＤＲＬ１を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１が制限コドンセットによりコード化され、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持するのに適する数であるポリペプチドを提供する。例えば、ｎは１〜５、２〜５、３〜５又は４〜５であり得る。一実施態様では、ｎ＝５である。ある実施態様では、制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである。ある実施態様では、コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである。
明確にするために、本明細書に記載のＣＤＲ配列中でｎが１より大きい場合、単一変異型のＣＤＲ内のアミノ酸Ｘは特定の制限コドンセットによってコード化される何れかのアミノ酸であり得る。例えば、変異型ＣＤＲＨ３配列内の、Ｘ１はＫＭＴによってコード化され、ｎ＝４であり、変異型ＣＤＲＨ３内の４つのＸ１アミノ酸は、例えばＡＡＤＹ、ＡＡＡＹ、ＤＳＹＡ、ＳＡＹＹ、ＡＡＡＡ、ＳＡＡＹ、ＡＡＡＹ、ＡＹＤＳ又は制限コドンセットによってコードされる４アミノ酸の一以上の何れかの組み合わせであり得る。
【００１８】
本発明の一実施態様では、制限コドンセットは、２〜１０のアミノ酸、２〜８のアミノ酸、２〜６のアミノ酸、２〜４のアミノ酸、又は２アミノ酸のみをコードする。ある実施態様では、制限コドンセットは少なくとも２多くとも１０、多くとも８、多くとも６、多くとも４のアミノ酸をコードする。一実施態様では、制限コドンセットは４単位(tetranomial)コドンセットである。他の実施態様では、制限コドンセットは二価のコドンセットである。
更なる他の態様では、本発明は、変異型ＣＤＲＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及び／又はＬ３を含んでなるポリペプチドであり、該変異型ＣＤＲが溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に変異型アミノ酸を有し、該変異型アミノ酸が制限コドンセットによりコード化されるポリペプチドを提供する。ある実施態様では、制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである。ある実施態様では、コドンセットがＴＭＴ及び／又はＫＭＴである。ある実施態様では、変異型ＣＤＲは前述のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一態様では、本発明は、カバットシステムに従って番号付けした位置９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００ａの少なくとも一（又はすべての数までの任意の数）の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ３を含んでなるポリペプチドを提供する。典型的に、ＣＤＲＨ３のＣ末端残基はＡＭＤＹとして一定に保たれている（しかし所望のポリペプチドの性質（標的抗原結合など）が実質的に維持される限り、いくつか変異させることができる）。ある実施態様では、ある実施態様では、１００とＡＭＤＹ領域のＡの間のすべての位置に変異型アミノ酸を含む。ある実施態様では、１００とＡＭＤＹ領域のＡの間の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を含む。ある実施態様では、ポリペプチドは位置９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００とＣ末端配列ＡＭＤＹとの間の少なくとも一の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ３を含む。これらのポリペプチドのある実施態様では、変異型ＣＤＲＨ３は一以上の残基／位置の挿入を含み、該一以上の位置は制限コドンセットによってコード化されるアミノ酸を含む。ある実施態様では、該挿入は１〜１５、３〜１３、５〜１１又は７〜９の残基／位置を含む。ある実施態様では、該挿入は少なくとも１、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、少なくとも１３の残基／位置を含む。ある実施態様では、該挿入は１５以下、１３以下、１１以下、９以下、７以下、５以下の残基／位置を含む。
【００２０】
一態様では、本発明は、カバットシステムに従って番号付けした位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８の少なくとも一（又はすべての数までの任意の数）の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ２を含んでなるポリペプチドを提供する。
一態様では、本発明は、カバットシステムに従って番号付けした位置２８、３０、３１、３２及び３３の少なくとも一（又はすべての数までの任意の数）の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＨ１を含んでなるポリペプチドを提供する。
一態様では、本発明は、カバットシステムに従って番号付けした位置９１、９２、９３、９４及び９６の少なくとも一（又はすべての数までの任意の数）の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ３を含んでなるポリペプチドを提供する。
一態様では、本発明は、カバットシステムに従って番号付けした位置５０及び５３の少なくとも一又はその両方の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ２を含んでなるポリペプチドを提供する。
一態様では、本発明は、カバットシステムに従って番号付けした位置２８、２９、３０、３１及び３２の少なくとも一（又はすべての数までの任意の数）の位置に変異型アミノ酸を有する変異型ＣＤＲＬ１を含んでなるポリペプチドを提供する。
【００２１】
一態様では、本発明は、前述の変異型ＣＤＲを含むポリペプチドであり、該ポリペプチドはＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の付加的な変異体ＣＤＲをさらに含み、変異型アミノ酸は制限コドンセットによってコード化されるポリペプチドを提供する。ある実施態様では、制限コドンセットがＴＭＴ、ＷＭＴ、ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ、ＷＭＴ又はこれらの組み合わせである。ある実施態様では、制限コドンセットは少なくともＹ及び／又はＳをコード化する。一実施態様では、制限コドンセットはアラニンをコードしない。一実施態様では、制限コドンセットは４又は４以下のアミノ酸をコードする。一実施態様では、制限コドンセットは２のアミノ酸のみをコードし、一実施態様ではＹ及びＳである。本発明の実施態様では、制限コドンセットは２〜１０のアミノ酸、２〜８のアミノ酸、２〜６のアミノ酸、２〜４のアミノ酸、又は２のアミノ酸のみをコードする。ある実施態様では、制限コドンセットは少なくとも２多くとも１０、多くとも８、多くとも６、多くとも４のアミノ酸をコードする。一実施態様では、制限コドンセットは４単位(tetranomial)コドンセットである。他の実施態様では、制限コドンセットは２単位(binomial)コドンセットである。一例では、本発明のポリペプチドは変異型ＣＤＲＨ３、及びＣＤＲＨ１及び／又はＣＤＲＨ２である少なくとも一の付加的な変異型ＣＤＲを含む。ある実施態様では、ポリペプチドはさらに少なくとも一の変異型軽鎖ＣＤＲを含む。一実施態様では、変異型軽鎖ＣＤＲはＣＤＲＬ３である。ある実施態様では、本発明のポリペプチドはさらに変異型ＣＤＲＬ１及び／又はＣＤＲＬ２を（例えば、変異型ＣＤＲＬ３と組み合わせて）含む。
【００２２】
一態様では、本発明のポリペプチドは、重鎖及び軽鎖の抗体可変ドメインの少なくとも一又はその両方を含み、抗体可変ドメインは本明細書中に記載の（例えば前述に記載のような）１、２又は３の変異型ＣＤＲを含む。
ある実施態様では、本発明のポリペプチド（特に抗体可変ドメインを含むもの）は、さらに、抗体フレームワーク配列、例えば変異型ＣＤＲに一致する単一抗体鋳型由来のＦＲ配列である抗体可変ドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４を含む。一実施態様では、ＦＲ配列はヒト抗体由来である。一実施態様では、ＦＲ配列はヒトコンセンサス配列（例えばサブグループＩＩＩコンセンサス配列）由来である。一実施態様では、フレームワーク配列は本明細書中に記載の修飾したコンセンサス配列を含む（例えば重鎖の位置４９、７１、９３及び／又は９４、及び／又は軽鎖の位置６６の修飾を含む）。一実施態様では、各ＦＲは抗体４Ｄ５の配列（配列番号１）を有する。
【００２３】
一態様では、本発明は、本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む組成物を生成する方法を提供する。したがって、一態様では、本発明は、複数のポリペプチドを有する組成物を生成する方法であり、
（ａ）ＣＤＲＨ１又はＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３の変異型ＣＤＲの少なくとも一又はそれらの混合を含んでなるポリペプチド
（ｉ）アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を有する変異型ＣＤＲＨ３を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持しうる適当な数である（例えば３〜２０、５〜２０、７〜２０、５〜１８、７〜１８）ポリペプチド；
（ｉｉ）アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−（Ｘ３）ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を有する変異型ＣＤＲＨ２を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持しうる適当な数である（例えば１〜５、１〜３、１〜２）ポリペプチド；と
（ｉｉｉ）アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−（Ｘ２）ｎ−Ｉ
を有する変異型ＣＤＲＨ１を含んでなるポリペプチドであり、Ｘ１及び／又はＸ２が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持しうる適当な数である（例えば１〜４、２〜４、３〜４）ポリペプチド
を複数生成する
ことを含む方法を提供する。
【００２４】
ある実施態様では、また、本発明の方法は、変異型ＣＤＲＬ１又はＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３又はそれらの混合を含んでなる複数のポリペプチドを生成することを含み、該変異型ＣＤＲは溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置を有し；該変異型アミノ酸は制限コドンセットによりコード化される。一実施態様では、変異型ＣＤＲＬ３を含んでなるポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を有し、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３は制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持しうる適当な数である（例えば１〜４、２〜４、３〜４）。一実施態様では、変異型ＣＤＲＬ２を含んでなるポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を有し、Ｘ１は制限コドンセットによりコード化される。一実施態様では、変異型ＣＤＲＬ１を含んでなるポリペプチドは、アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を有し、Ｘ１は制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎはＣＤＲの機能的活性を維持しうる適当な数である（例えば１〜５、２〜５、３〜５、４〜５）。
【００２５】
ある態様では、本発明は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３からなる群から選択される少なくとも１、２、３、４、５又はすべての変異型ＣＤＲを含むポリペプチドであり、該変異型ＣＤＲが前述に記載のものであるポリペプチドを提供する。
ある実施態様では、本発明のポリペプチドは、軽鎖及び重鎖の抗体可変ドメインを含み、該軽鎖可変ドメインはＣＤＲＬ１、Ｌ２及びＬ３からなる群から選択される少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含み、重鎖可変ドメインはＣＤＲＨ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択される少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含むものである。
ある実施態様では、本発明のポリペプチドはＳｃＦｖである。ある実施態様では、Ｆａｂ断片である。ある実施態様では、Ｆ(ａｂ)２又はＦ(ａｂ')２である。したがって、ある実施態様では、本発明のポリペプチドはさらに二量体化ドメインを含む。ある実施態様では、二量体化ドメインは抗体重鎖又は軽鎖の可変ドメインとウイルスコートタンパク質の少なくとも一部の間に位置する。二量体化ドメインは二量体化配列及び／又は一以上のシステイン残基を含む配列を含みうる。二量体化ドメインは好ましくは重鎖可変ドメイン又は定常ドメインのＣ末端に直接又は間接的に連結する。二量体化ドメインの構造は、抗体可変ドメインが（二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含まないで）ウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質成分として産生されるか、抗体可変ドメインが（二量体化ドメインの後にアンバー停止コドンを含んで）主にウイルスコートタンパク質成分なしで産生されるかによって変わりうる。抗体可変ドメインが主にウイルスコートタンパク質成分を有する融合タンパク質として産生される場合、一以上のジスルフィド結合及び／又は単一二量体化配列により二価表出される。ウイルスコートタンパク質成分への融合なしで主に産生される抗体可変ドメイン（アンバー停止あり）には、たとえ必要でなくとも、システイン残基と二量体化配列の両方を含む二量体化ドメインを有することが好ましい。ある実施態様では、Ｆ(ａｂ)２の重鎖はヒンジ領域を含まない二量体化ドメインで二量体化する。二量体化ドメインはロイシンジッパー配列を含みうる（例えばＧＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲＧ（配列番号３）などのＧＣＮ４配列）。
【００２６】
ある実施態様では、本発明のポリペプチドはさらに、軽鎖可変ドメインに融合した軽鎖定常ドメインを含み、ある実施態様では、少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含む。本発明のポリペプチドのある実施態様では、ポリペプチドはさらに、重鎖可変ドメインに融合した重鎖定常ドメインを含み、ある実施態様では、少なくとも１、２又は３の変異型ＣＤＲを含む。
ある場合では、参照ポリペプチド又は起源抗体に関して変異型となるようにフレームワーク残基を変異させることが好ましい。例えば、重鎖のフレームワーク残基７１はアミノ酸Ｒ、Ｖ又はＡであってよい。他の例では、重鎖のフレームワーク残基９３はアミノ酸Ｓ又はＡであってよい。更なる他の例では、重鎖のフレームワーク残基９４はアミノ酸Ｒ、Ｋ又はＴ又はであるか、ＭＲＴによってコードされてよい。更なる他の例では、重鎖のフレームワーク残基４９はアミノ酸Ａ又はＧであってよい。また、軽鎖のフレームワーク残基は変異されうる。例えば、軽鎖のフレームワーク残基６６はアミノ酸Ｒ又はＧであってよい。
【００２７】
本明細書に記載のように、変異型ＣＤＲは単一参照ポリペプチド／起源抗体の一致するＣＤＲと比較して配列が変異しているＣＤＲを指す。したがって、本発明の単一ポリペプチドのＣＤＲは好ましくは、単一参照ポリペプチド又は起源抗体の一組のＣＤＲに一致する。本発明のポリペプチドは変異型ＣＤＲの何れか一又は組み合わせを含みうる。例えば、本発明のポリペプチドは変異型ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２を含みうる。本発明のポリペプチドは変異型ＣＤＲＨ１、変異型ＣＤＲＨ２及び変異型ＣＤＲＨ３を含みうる。他の例では、本発明のポリペプチドは変異型ＣＤＲＨ１、変異型ＣＤＲＨ２、変異型ＣＤＲＨ３及びＣＤＲＬ３を含む。他の例では、本発明のポリペプチドは変異体ＣＤＲＬ１、変異体ＣＤＲＬ２及び変異体ＣＤＲＬ３を含む。本発明の何れかのポリペプチドはさらに、変異体ＣＤＲＬ３を含んでもよい。本発明の何れかのポリペプチドはさらに、変異体ＣＤＲＨ３を含んでもよい。
一実施態様では、本発明のポリペプチドは図５に示す変異型ＣＤＲ配列の一以上を含む。
本発明のポリペプチドは、互いに複合体であり得る。例えば、本発明は２のポリペプチドを含んでいるポリペプチド複合体を提供するものであり、各々のポリペプチドは本発明のポリペプチドであり、該ポリペプチドのうちの一は少なくとも１、２又はすべての変異体ＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含み、他のポリペプチドは変異体軽鎖ＣＤＲ（例えばＣＤＲＬ３）を含む。ポリペプチド複合体は第１および第２のポリペプチド（第１および第２のポリペプチドは本発明のポリペプチドである）を含んでもよく、第一のポリペプチドは少なくとも１、２又は３の変異体軽鎖ＣＤＲを含み、第２のポリペプチドは少なくとも１、２又は３の変異体重鎖ＣＤＲを含む。また、本発明は、同じ変異体ＣＤＲ配列を含むポリペプチドの複合体を提供する。複合体形成は、ここで記載されているような二量体化／多量体化ドメインでの二量体化／多量体化又は共有結合的相互作用（例えばジスルフィド結合を介して）を含む任意の適切な技術によって可能である（この文脈において、二量体化ドメインの一部、例えば二量体化ドメインが、ロイシンジッパー配列およびシステインを含むものでよい）。
別の態様においては、本発明は、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含んでなる組成物を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に記載の本発明の何れかのポリペプチドを複数含んでなる組成物を提供する。該複数は変異体アミノ酸をコード化している配列の縮重を含んでなる一組のオリゴヌクレオチドを用いて生成した複数のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチドを含んでもよく、該縮重は変異型アミノ酸をコードする制限コドンセットの複数のコドン配列のものである。本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチド又はライブラリを含んでなる組成物が、キット又は製造品（場合によって、指示書、バッファなどを内包する）の形であってもよい。
【００２８】
一態様では、本発明は、ここで記載されているような本発明のポリペプチドをコード化しているポリヌクレオチドを提供する。他の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードしている配列を含んでなるベクターを提供する。ベクターは、例えば、複製発現ベクターであり得る（例えば、複製発現ベクターは、Ｍ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージ又はその誘導体、又はλ様ファージ、例えばλ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４など又はその誘導体でもよい）。ベクターは、本発明のポリペプチドをコードしている配列に連結されたプロモーター領域を含みうる。プロモータは、ポリペプチドの発現に好適な任意のもの、例えばｌａｃＺプロモータ系、アルカリホスファターゼｐｈｏ  Ａプロモータ（Ａｐ）、バクテリオファージｌＰＬプロモータ（温度感受性プロモータ）、ｔａｃプロモータ、トリプトファンプロモータおよびバクテリオファージＴ７プロモータであり得る。したがって、本発明も、前述のプロモータ系からなる群から選択したプロモータを含んでなるベクターを提供する。
本発明のポリペプチドは、専門家の必要および要求に従って任意の好適な形で表出されうる。例えば、本発明のポリペプチドは、ウイルス表層、例えばファージ又はファジミドウイルス粒子上に表出されうる。したがって、本発明は、本発明のポリペプチド及び／又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むウイルス粒子を提供する。
【００２９】
一態様では、本発明は、複数の本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む母集団を提供するものであり、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの各々のタイプはここで記載されているような本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
いくつかの実施態様において、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドはライブラリとして提供され、例えば、ライブラリは複数の少なくとも約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８の異なる本発明のポリペプチド及び／又はポリヌクレオチド配列を含む。他の態様において、また本発明は、複数の本発明のウイルス又はウイルス粒子、本発明のポリペプチドを表出する各々のウイルス又はウイルス粒子を含むライブラリを提供する。本発明のライブラリは、いくらかの異なるポリペプチド、例えば少なくとも約１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８の異なるポリペプチド（配列）を表出するウイルス又はウイルス粒子を含んでよい。
他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００３０】
他の態様では、本発明は、特定の標的抗原、例として成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、インスリン様成長因子、ｎ-メチオニルヒト成長ホルモンを含むヒト成長ホルモン、パラトルモン、チロキシン、インスリン、プロインシュリン、アミリン、アポトーシスタンパク質、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの糖タンパクホルモン、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、造血性成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子、肝細胞増殖因子、肝細胞成長因子レセプタ（ｃ-ｍｅｔ）、ミュラー管阻害物質(mullerian inhibiting substance)、マウスゴナドトロピン関連のポリペプチド、インヒビン、アクチビン、脈管内皮成長因子、インテグリン、ＮＧＦ-βなどの神経成長因子、インスリン様成長因子-ＩおよびＩＩ、エリスロポイエチン、骨誘導因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、インターロイキン、骨形成タンパク質、ＬＩＦ、ＳＣＦ、ニュートラビジン、マルトース結合タンパク質、エルビンＧＳＴ、インスリン、ＩｇＧ、ＦＬＴ-３リガンド及びｋｉｔリガンドに高い親和性のある結合体を選別する方法を提供する。
本発明の方法は、一以上の多様化したＣＤＲ領域を有するポリペプチド（例えばポリペプチド（抗体可変ドメインなど）ライブラリ）の母集団を提供する。これらのライブラリを分類（選別）して及び／又はスクリーニングして、標的抗原に対して親和性の高い結合体を同定する。一態様では、ライブラリからのポリペプチド結合体は、標的抗原に対する結合及び親和性について選択する。ポリペプチド結合体は、この選別方法の一以上を用いて選択して、それから、親和性及び／又は特異性（非標的抗原でなく標的抗原に対してのみの結合）についてスクリーニングしてもよい。
【００３１】
一態様では、本発明の方法は、一以上の多様化されたＣＤＲ領域を有する複数のポリペプチドを生成し、結合に好適な条件下で標的抗原を有する複数のポリペプチドと接触させることによって標的抗原に対する結合体について複数のポリペプチドを分類する；結合しないものから標的抗原との結合体を分離し；結合体を単離し；高親和性結合体（または、所望の結合親和性を有する任意の結合体）を同定することを含む。標的抗原と結合する結合体の親和性は、例えば、当分野に公知の種々の技術、例えば本明細書中に記載の競合的ＥＬＩＳＡなどを用いて測定することができる。場合によって、ポリペプチドは、標的抗原についての分類と組み合わせて結合体の分類に用いることができるポリペプチドタグ、例えばｇＤ、ポリｈｉｓ又はＦＬＡＧに融合させることができる。
他の実施態様では、抗体可変ドメインのライブラリから標的抗原に結合する抗体可変ドメインを単離又は選別する方法であり、（ａ）本発明のポリペプチドを複数含む母集団に、固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させて、標的抗原ポリペプチド結合体を単離し；（ｂ）非結合体からポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出し；（ｃ）場合によっては、（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）繰り返すことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、前記方法はさらに、（ｄ）結合体が混合物を形成するのに適した条件下で０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度の標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体をインキュベートし；（ｅ）標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ；（ｆ）標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し；（ｇ）場合によっては、前回の選別より連続的に低い濃度の標識標的抗原を用いて、（ｄ）〜（ｆ）の工程を少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）繰り返す。場合によっては、前記方法は混合物に過剰な量の非標識の標的抗原を加えて、十分な時間インキュベートして標識した標的抗原から低親和性の結合体を溶出することを含むかもしれない。
【００３２】
本発明の他の態様は、標的抗原に対して高親和性の結合体（又は所望の結合親和性を有する結合体）を単離又は選別する方法を提供する。一実施態様では、前記方法は、（ａ）本発明のポリペプチドを複数含む母集団に標的抗原を接触させて、標的抗原ポリペプチド結合体を単離し（ここで用いる抗原は約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度である）；（ｂ）標的抗原からポリペプチド結合体を分離し；（ｃ）場合によっては、（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）、各回とももっとも低濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離するために連続的により低濃度の標的抗原を用いて繰り返し；（ｄ）様々に異なる濃度の標的抗原とともにポリペプチド結合体をインキュベートすることによって高い親和性（又は所望の親和性）で最も低濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し、ポリペプチド結合体のＩＣ５０を測定し；（ｅ）標的抗原に対して所望の親和性を有するポリペプチド結合体を同定することを含む。前記の親和性は、例えば約０．１ｎＭ〜２００ｎＭ、０．５ｎＭ〜１５０ｎＭ、１ｎＭ〜１００ｎＭ、２５ｎＭ〜７５ｎＭであり得る。
【００３３】
他の実施態様では、ポリペプチド結合体を単離又は選別するためのアッセイであり、（ａ）ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体が形成するための結合に適する条件下にて、本発明のポリペプチドを複数含む母集団に標識した標的抗原を接触させて、（ここで用いる標識した標的抗原は約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度である）；（ｂ）複合体を単離して、標識標的抗原からポリペプチド結合体を分離し；（ｃ）場合によっては、（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも一度、各回ともより低濃度の標的抗原を用いて繰り返すことを含むアッセイを提供する。場合によって、前記方法はさらに、ポリペプチド結合体と標的抗原との複合体を過剰な量の非標識標的抗原と接触させることを含んでもよい。一実施態様において、該方法の工程が二回繰り返され、第１回目の選別に用いる標的の濃度は約１００ｎＭ〜２５０ｎＭの範囲であり、第２回目の選別（行われるならば）では約２５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲であり、第３回目の選別（行われるならば）では約０．１ｎＭ〜２５ｎＭの範囲である。
また、本発明は、複数の本発明のポリペプチドを含む母集団をスクリーニングする方法であり、（ａ）ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ポリペプチド母集団の第一試料を標的抗原とともにインキュベートし；（ｂ）標的抗原なしでポリペプチド母集団の第二試料を同様にインキュベートし；（ｃ）ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ；（ｄ）各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドの量を検出し；（ｅ）第二試料で結合した特定のポリペプチドの量に対する第一試料で結合した特定のポリペプチドの量の割合を算出することによって標的抗原に対する特定のポリペプチドの親和性を測定することを含むスクリーニング方法を提供する。
【００３４】
また、本明細書中に記載のように作製したライブラリを特定の標的への結合と非標的抗原への結合の欠損についてスクリーニングしてもよい。一態様では、本発明は、抗体可変ドメインのライブラリから特定の標的抗原に結合する本発明の抗体可変ドメインなどのポリペプチドについてのスクリーニング方法であり、（ａ）複数の本発明のポリペプチドを含む母集団を作製し；（ｂ）結合に適する条件下で、標的抗原をポリペプチド母集団と接触させ；（ｃ）ライブラリ中の結合ポリペプチドを非結合ポリペプチドから分離し；（ｄ）結合ポリペプチドが非標的抗原と結合するかどうかを決定することによって、標的抗原特異的結合ポリペプチドを同定し；（ｅ）標的抗原特異的結合ポリペプチドを単離することを含む方法を提供する。ある実施態様では、工程（ｅ）に標的抗原から結合ポリペプチドを溶出して、前記結合ポリペプチドをコードする複製発現ベクターを増幅することを含む。
【００３５】
前述の分類／選別の何れかの方法の組み合わせをスクリーニング方法と組み合わせてもよい。例えば、一実施態様では、ポリペプチド結合体は、固定された標的抗原への結合について第一に選択する。ついで、固定された標的抗原と結合するポリペプチド結合体は、標的抗原に結合して非標的抗原に結合しないものをスクリーニングすることができる。標的抗原に特異的に結合するポリペプチド結合体は、必要に応じて増幅することができる。これらポリペプチド結合体は、複合体を形成するように濃縮した標識標的抗原と接触させることによって親和性の高いものを選別することができ、該標識標的抗原の濃度範囲は、約０．１ｎＭ〜約１０００ｎＭであり、該複合体は標的抗原上の標識に結合する作用剤と接触させることによって単離する。ついで、ポリペプチド結合体は標識した標的抗原から溶出させることができ、場合によっては選別の回数を繰り返し、各回にはより低濃度の標識標的抗原を用いる。この選別方法を用いて単離した結合ポリペプチドは、例えば実施例８に記載のような溶液ファージＥＬＩＳＡアッセイや当分野に公知の他の従来法を用いて親和性の高いものをスクリーニングすることができる。本発明の方法に用いた本発明のポリペプチドの母集団は、選別／スクリーニングの工程に適する任意の型で提供される。例えば、ポリペプチドは遊離可溶型、基質吸着型、又はファージやファジミド粒子などのウイルス粒子の表面上に存在する形でもよい。本発明の方法のある実施態様では、複数のポリペプチドはライブラリの型で提供される複数の複製ベクターによってコードされる。本明細書中に記載の選別／スクリーニング方法では、結合ポリペプチドをコードするベクターはさらに、選別／スクリーニングの反復工程（上記のように本発明の方法で選択的に行われる）に用いる十分量のポリペプチドを提供するために増幅してもよい。
【００３６】
一実施態様では、本発明は、標的抗原に結合するポリペプチドの選別方法であり、
（ａ）本明細書中に記載の本発明のポリペプチドの複数を有する組成物を生成し；
（ｂ）前記組成物から標的抗原に結合するポリペプチド結合体を選別し；
（ｃ）非結合体からポリペプチド結合体を単離し；
（ｄ）単離したポリペプチド結合体から所望の親和性を有する結合体を同定する
ことを含む方法を提供する。
他の実施態様では、本発明は、抗体可変ドメインのライブラリから標的抗原に結合する抗原結合可変ドメインの選別方法であり、
（ａ）本発明の（本明細書中に記載のような）抗体可変ドメインのライブラリに標的抗原を接触させ；
（ｂ）非結合体から結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して、そして約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度の減少した量の標的抗原を含む溶液中で結合体をインキュベートし；
（ｃ）最も低濃度の標的抗原に結合することができる、約０．１ｎＭ〜２００ｎＭの親和性を有する結合体を選別する
ことを含む方法を提供する。
一実施態様では、標的抗原の濃度は約１００〜２５０ｎＭ、又は約２５〜１００ｎＭである。
【００３７】
一実施態様では、本発明は、ポリペプチドライブラリから標的抗原に結合するポリペプチドの選別方法であり、
（ａ）本発明の（本明細書中に記載の）ポリペプチドを複数含むライブラリに固定した標的抗原を結合に適した条件下で接触させることによって標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し；
（ｂ）非結合体からライブラリ中のポリペプチド結合体を分離して、標的抗原から結合体を溶出して結合体豊富なサブ集団を得て；
（ｃ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団を用いて（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）繰り返す
ことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、本発明の方法はさらに、
（ｄ）結合体が混合物を形成するのに適した条件下で０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度の標識した標的抗原とともにポリペプチド結合体のサブ集団をインキュベートし；
（ｅ）標的抗原上の標識に結合する固定した作用剤を前記混合物に接触させ；
（ｆ）標識した標的抗原に結合したポリペプチド結合体を検出して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を溶出し；
（ｇ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標識標的抗原を用いて、（ｄ）〜（ｆ）の工程を少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）繰り返す
ことを含む方法を提供する。
ある実施態様では、前記方法はさらに、過剰量の非標識標的抗原を混合物に添加して、十分な時間インキュベートして標識標的抗原から親和性の低い結合体を溶出することを含む。
【００３８】
他の実施態様では、本発明は、標的抗原に対して親和性の高い結合体の単離方法であり、
（ａ）本発明の（本明細書中に記載の）ポリペプチドを複数含むライブラリに少なくとも約０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度の標的抗原を接触させて、標的抗原へのポリペプチド結合体を単離し；
（ｂ）標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、ポリペプチド結合体豊富なサブ集団を得て；
（ｃ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）繰り返して、もっとも低い濃度の標的抗原に結合するポリペプチド結合体を単離する
ことを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の（本明細書中に記載の）複数のポリペプチドを含むライブラリからポリペプチド結合体を選別するアッセイであり、
（ａ）結合に適した条件下にてライブラリに０．１ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲の濃度の標識した標的抗原を接触させて、ポリペプチド結合体と標識した標的抗原との複合体を形成させ；
（ｂ）複合体を単離して、標識した標的抗原からポリペプチド結合体を分離して、結合体豊富なサブ集団を得て；
（ｃ）場合によっては、すでに選別して得られた結合体のサブ集団と前回の選別より低い濃度の標的抗原を用いて（ａ）−（ｂ）の工程を少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）繰り返す
ことを含むアッセイを提供する。
【００３９】
ある実施態様では、前記方法はさらに、ポリペプチド結合体と標的抗原の複合体に過剰な非標識標的抗原を加えることを含む。ある実施態様では、前述の工程は少なくとも一度（ある実施態様では少なくとも二度）繰り返し、選別の第一回目の標的濃度は約１００ｎＭ〜２５０ｎＭ、選別の第二回目では約２５ｎＭ〜１００ｎＭ、選別の第三回目では約０．１ｎＭ〜２５ｎＭである。
他の態様では、本発明は、本発明のポリペプチドを複数含むライブラリのスクリーニング方法であり、
（ａ）ポリペプチドと標的抗原との結合に適した条件下にて、ライブラリの第一試料を濃縮した標的抗原とともにインキュベートし；
（ｂ）標的抗原なしでライブラリの第二試料をインキュベートし；
（ｃ）ポリペプチドと固定した標的抗原との結合に適した条件下にて、第一及び第二試料のそれぞれと固定した標的抗原とを接触させ；
（ｄ）各々の試料について固定した標的抗原に結合したポリペプチドを検出し；
（ｅ）第二試料からの結合ポリペプチドの量に対する第一試料の結合ポリペプチドの量の割合を算出することによって、標的抗原に対するポリペプチドの親和性を測定する
ことを含む方法を提供する。
【００４０】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）ＣＤＲＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３からなる群から選択した起源抗体の少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲを含む起源抗体のうちの軽鎖可変ドメイン、重鎖可変ドメイン、又はその両方をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターを構築し；
（ｂ）制限コドンセットを用いて、溶媒と接触しうる非常に多様な少なくとも一のアミノ酸位置に起源抗体の少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲを変異させる
ことを含む方法を提供する。
一実施態様では、本発明の方法に用いる母集団中のポリペプチドは、Ｘ１が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎがＣＤＲの機能的活性を保持しうる好適な数である、アミノ酸配列：
(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ
を有する変異型ＣＤＲＨ３を含む。
一実施態様では、本発明の方法に用いる母集団中のポリペプチドは、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及び／又はＸ５が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎがＣＤＲの機能的活性を保持しうる好適な数である、アミノ酸配列：
Ｘ１−Ｉ−Ｘ２−Ｐ−(Ｘ３)ｎ−Ｇ−Ｘ４−Ｔ−Ｘ５−Ｙ−Ａ
を有する変異型ＣＤＲＨ２を含む。
【００４１】
一実施態様では、本発明の方法に用いる母集団中のポリペプチドは、Ｘ１及び／又はＸ２が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎがＣＤＲの機能的活性を保持しうる好適な数である、アミノ酸配列：
Ｇ−Ｆ−Ｘ１−Ｉ−(Ｘ２)ｎ−Ｉ
を有する変異型ＣＤＲＨ１を含む。
一実施態様では、本発明の方法に用いる母集団中のポリペプチドは、Ｘ１がＱであるか又は欠損しており、Ｘ２及び／又はＸ３が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎがＣＤＲの機能的活性を保持しうる好適な数である、アミノ酸配列：
Ｑ−Ｘ１−(Ｘ２)ｎ−Ｐ−Ｘ３−Ｔ−Ｆ
を有する変異型ＣＤＲＬ３を含む。
更なる他の実施態様では、本発明の方法に用いる母集団中のポリペプチドは、Ｘ１及び／又はＸ２が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸である、アミノ酸配列：
Ｙ−Ｘ１−Ａ−Ｓ−Ｘ２−Ｌ
を有する変異型ＣＤＲＬ２を含む。
更なる他の実施態様では、本発明の方法に用いる母集団中のポリペプチドは、Ｘ１が制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎがＣＤＲの機能的活性を保持しうる好適な数である、アミノ酸配列：
Ｓ−Ｑ−(Ｘ１)ｎ−Ｖ
を有する変異型ＣＤＲＬ１を含む。
【００４２】
本発明の結合ポリペプチドの診断的及び治療的使用を包含する。ある診断的用途では、本発明は、対象とするタンパク質の存在を検出する方法であり、該タンパク質を含むことが予測される試料を本発明の結合ポリペプチドにさらし、試料への結合ポリペプチドの結合を検出することを含む方法を提供する。この使用には、本発明は、結合ポリペプチドと、タンパク質を検出するための結合ポリペプチドの使用についての指示書とを含むキットを提供する。
さらに本発明は、結合ポリペプチドをコードする単離した核酸；核酸、場合によってはベクターを形質移入した宿主細胞によって認識されるコントロール配列に操作可能に連結している核酸を含むベクター；ベクターを形質移入した宿主細胞；核酸が発現されるように該宿主細胞を培養して、場合によっては宿主細胞培養物（例えば宿主細胞培養液）から結合ポリペプチドを回収することを含む結合ポリペプチドの産生過程を提供する。
また、本発明は、本発明の結合ポリペプチドと担体（薬学的に受容可能な担体）又は希釈剤を含む組成物を提供する。治療的使用のための組成物は滅菌され、凍結乾燥されていてもよい。また、本明細書中に記載の適応症を治療するための医薬の製造における本発明の結合ポリペプチドの使用も包含する。さらに組成物は化学療法剤、細胞障害性剤又は抗血管形成剤などの第二治療剤を含みうる。
【００４３】
本発明はさらに、哺乳動物の治療方法であり、哺乳動物に本発明の結合ポリペプチドの有効量を投与することを含む方法を提供する。前記方法で治療する哺乳動物は非ヒト哺乳動物、例えばギャザリング臨床前データに好適な霊長類又は齧歯動物（例えばマウス又はネズミ又はウサギ）でもよい。非ヒト哺乳動物は健康体（例えば毒物学研究において）、又は対象とする結合ポリペプチドで治療する疾患に罹患していてもよい。一実施態様では、哺乳動物は異常血管形成症（例えば病理学的血管形成症）に罹患しているか、その発症リスクがある。ある特定の実施態様では、疾患は、結腸直腸癌、腎臓細胞上皮癌、卵巣癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、気管支肺胞上皮癌および膵癌からなる群から選択した癌である。他の実施態様では、疾患は、眼血管新生、例えば糖尿病性盲目、網膜症、原発性糖尿病性網膜症、年齢によって誘発された黄斑変性およびルベオーシスに起因する疾病である。他の実施態様では、治療する哺乳動物は、浮腫（例えば脳腫瘍と関連している浮腫、脳卒中と関連している浮腫又は大脳浮腫）に罹患しているか、そのリスクがある。他の実施態様では、哺乳動物は、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、抵抗性腹水、乾癬、サルコイドーシス、動脈の動脈硬化症、敗血症、熱傷および膵炎からなる群から選択される疾患又は疾病に罹患しているか、そのリスクがある。他の実施態様によると、哺乳動物は、多嚢胞性卵巣疾患（ＰＯＤ）、子宮内膜症および子宮類線維腫からなる群から選択される尿生殖器性疾病に罹患しているか、そのリスクがある。一実施態様では、疾患は、限定するものではないが、癌、免疫系の疾患、神経系の疾患および維管束系の疾患を含む細胞生存の調節不全（例えば細胞死の異常な量）に起因する疾病である。投与する本発明の結合ポリペプチドの量は、疾患を治療するために治療的に有効な量であろう。用量段階的増大研究では、様々な用量の結合ポリペプチドを哺乳動物に投与するであろう。他の実施態様では、治療的有効量の結合ポリペプチドをヒト患者の疾患を治療するために患者に投与する。一実施態様では、本明細書中に記載の炎症性疾患又は免疫疾患を治療するのに有用な本発明の結合ポリペプチドはＦａｂ又はｓｃＦｖ抗体である。したがって、このような結合ポリペプチドは炎症性疾患や免疫疾患の治療のための医薬の製造において用いることができる。本明細書中に記載の疾患又は疾病に罹患しているか、その発症リスクがある哺乳動物を、本発明のポリペプチド（例えば抗体）と第二治療薬と同時、連続して、又は組み合わせて投与することによって治療することができる。第二治療薬に加えて他の治療薬は哺乳動物に投与できる、又は所望の適応症の医薬の製造において用いることができることが理解されるであろう。
【００４４】
本ポリペプチドは、例えばヒトの腫瘍を移植したモデルマウスにおいて移植された非宿主腫瘍の成長への宿主間質性細胞の協調の役割を理解するために用いることができる。本ポリペプチドは、本発明のポリペプチドで治療した後の齧歯動物又はウサギに移植した腫瘍の成長を観察又はモニタリングすることによって、治療的処置を回避したヒト腫瘍を同定する方法に用いることができる。また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドと他の治療薬との併用療法を研究し、評価するために用いることができる。本発明のポリペプチドは、疾患又は類似の疾患に罹患した動物に該ポリペプチドを投与して該疾患の一以上の症状が寛解するかどうかを決定することによって他の疾患における対象とする標的分子の役割を研究するために用いることができる。
明確にするために、本明細書中に記載のすべてのアミノ酸番号付けは、特に又は文中でて示さない限り、Kabatら（以下の「定義」の詳述を参照）に従った。
【００４５】
（本発明の実施形態）
本発明は、ＣＤＲ配列（抗体可変ドメイン配列を含む）を多様化するための新規の、非慣習的な、非常に簡略化された順応性のある方法及び、多数、一般的には非常に多くの多様化されたＣＤＲ（抗体可変ドメイン配列を含む）を含むライブラリを提供する。そのようなライブラリは、例えば結合親和性や結合力などの所望の活性を有する合成抗体クローンを選別する及び／又はスクリーニングするのに有用な組み合わせライブラリを提供する。このようなライブラリは、多種多様な任意の標的抗原と相互作用することができる免疫グロブリンポリペプチド配列を同定するために有用である。例えば、本発明のファージディスプレイとして発現される多様化した免疫グロブリンポリペプチドを含むライブラリは所望の抗原結合分子を選択したり、又はスクリーニングするために特に有用であり、そのためのハイスループットで効率が良く、自動化したシステムを提供する。本発明の方法は、起源又は鋳型分子の変異を最小限にして標的抗原への親和性の高い結合体を提供するため、及び抗体又は抗原結合断片が細胞培養物で産生される場合に産生効率が良いように設定するものである。
本発明の方法及び組成物は多くの付加的な利便性をもたらす。例えば、相対的に簡便なＣＤＲ配列を、十分に多様化した特定の標的結合配列を保持しつつ、制限した数のアミノ酸をコードするコドンセットを用いて生成することができる（対照的に従来の方法は最大限の数のアミノ酸をコードするコドンセットを用いる）。本発明に従って生成した配列母集団の性質が単純化されている（一般的に相対的にサイズが小さい）ので、母集団又はそのサブ集団が所望の特性を有するように一度同定したものの更なる多様化が可能である。
【００４６】
本発明の方法によって得られた標的抗原結合体の配列を単純化すると、所望の結果を得るために個別化した更なる配列修飾の余地が著しく広がる。例えば、配列修飾は、親和性成熟化、ヒト化などにおいて通常行われる。限定した数のアミノ酸しかコードしていない制限コドンセットの多様化に基づくことによって、異なる制限コドンセットを用いて異なるエピトープを標的とすることができ、それ故に最大限数のアミノ酸に基づくランダム化と比較して、実施者が多様化の方法を大きくコントロールすることができるであろう。制限コドンセットを用いることはさらに、望ましくないアミノ酸、例えばメチオニンや停止コドンをこの過程から排除し、それによってライブラリの全体の質や生産性を改善することができるという利便性がある。さらに、場合によっては、潜在的結合体の構造的多様性を限定することが望ましいであろう。本発明の方法及び組成物は、この目的を達成するための順応性がある。例えば、あるアミノ酸、例えばチロシンが配列中に存在すると、旋回配位がより少なくなる。本発明の一実施態様では本明細書中に示すように、チロシン残基優勢な配列を含む変異型ＣＤＲ及びその変異型ＣＤＲを含む結合体を生成することができる。
【００４７】
定義
アミノ酸は本明細書中において、一文字表記又は三文字表記又はその両方で表す。
用語「親和性精製」は、化学物質または結合パートナーへ分子が特異的に誘引または結合され、その結果パートナーに結合または誘引されたままの状態でその分子が不純物から分離されるような組合せまたは複合体の形成に基づく分子の精製を意味する。
用語「抗体」は最も広義で使われており、具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、単一のモノクローナル抗体（アゴニストおよびアンタゴニスト抗体を含む）、多エピトープ特異性を有する抗体組成物、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体ならびに抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖおよびＦｖ）をカバーする。一実施態様では、「抗体」なる用語はヒト抗体も包含する。
本明細書で使われるように、「抗体可変ドメイン」は相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む、抗体分子の軽鎖および重鎖の部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。本発明で使用される組成物及び方法によると、ＣＤＲとＦＲに割り当てられるアミノ酸位置はカバットに従って規定される(Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987及び1991))。抗体または抗原結合断片のアミノ酸のナンバリングも、カバットのそれに準じる。
【００４８】
本明細書で使われるように、用語「相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）は、抗原結合のために存在している必要がある抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、一般的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と同定される３つのＣＤＲ領域を持つ。各相補性決定領域はカバットが記載しているような「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))、および／または「超可変ループ」からの残基（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基約２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈ１），５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk, J.Mol.Biol.196:901-917頁(1987)）を含んでもよい。いくつかの場合には、相補性決定領域はカバットの記載により定義されているＣＤＲ領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。例えば、抗体４Ｄ５の重鎖のＣＤＲＨ１は、アミノ酸２６〜３５を含む。
「フレームワーク領域」（以下ＦＲと称す）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、一般的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と同定される４つのＦＲを持つ。ＣＤＲがカバットの定義に従うならば、軽鎖ＦＲ残基は残基約１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが超可変ループからのアミノ酸残基を含むならば、軽鎖ＦＲ残基は軽鎖の残基約１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）および９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基の残基約１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）および１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。いくつかの場合には、ＣＤＲがカバットの定義によるＣＤＲと超可変ループのそれの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれに応じて調節される。例えば、ＣＤＲＨ１がアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５を含むとき、重鎖ＦＲ１残基は位置１〜２５にあり、ＦＲ２残基は位置３６〜４９にある。
【００４９】
本明細書で使われるように、「コドンセット」は所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列を指す。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。標準的なコドン指定形式はＩＵＢコードのそれであり、このコードは当技術分野で公知であり本明細書で記載されている。コドンセットは、一般的に３つのイタリック大文字、例えばＮＮＫ、ＮＮＳ、ＸＹＺ、ＤＶＫなどで表される。ある位置の選択されたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で公知であり、例えば、ＴＲＩＭ手法が知られている（Ｋｎａｐｐｅｋ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）、２９６：５７〜８６頁）；GarrardおよびHenner, Gene(1993), 128:103頁）。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、必ずしもそうではないが、例えばクローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【００５０】
「制限コドンセット（制限されたコドンセット）」なる用語とその変異型は、本明細書中において、配列多様性を生じさせる当分野の方法で典型的に有用なコドンセットより非常に制限された数のアミノ酸をコードしているコドンセットを意味する。本明細書の一態様では、配列多様化に用いる制限コドンセットは２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４又は２のみのアミノ酸をコードしている。ある実施態様では、配列多様化に用いる制限コドンセットは、少なくとも２であるが１０以下、８以下、６以下、４以下のアミノ酸をコードしている。典型的な例では、４単位のコドンセットを用いる。４単位のコドンセットの例を図６に挙げる（ＲＭＣ、ＲＭＧ、ＲＲＣ、ＲＳＡ、ＭＫＣ、ＹＭＴ、ＲＳＴ、ＫＭＴ、ＳＲＣ、ＭＲＴ及びＷＭＴ）。他の典型例では、２単位コドンセットが用いられる。２単位のコドンセットの例にはＴＭＴ、ＫＡＴ、ＹＡＣ、ＷＡＣ、ＴＷＣ、ＴＹＴ、ＹＴＣ、ＷＴＣ、ＫＴＴ、ＹＣＴ、ＭＣＧ、ＳＣＧ、ＭＧＣ、ＳＧＴ、ＧＲＴ、ＧＫＴ及びＧＹＴが含まれる。好適な制限コドンの決定、及び特定の制限コドンセットによってコードされる特定のアミノ酸の同定は公知であり、当業者に明らかであろう。ＣＤＲ配列の多様化に用いられる好適なアミノ酸の決定は、当分野で公知の基準によって経験的に及び／又は導かれうる（例えば、疎水性及び親水性のアミノ酸型などの組み合わせを含む）。
【００５１】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片である。この領域は、堅く結合した重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体から成り、その結合は自然界では例えばｓｃＦｖにおけるように共有結合である。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面の抗原結合部位を確定するのはこの構成である。この６つのＣＤＲまたはそのサブセットは、共同して抗体に抗原結合特異性を賦与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含んでいないＦｖの半分）でさえ、通常は結合部位全体より親和性は低いものの、抗原を認識して結合する能力を有する。
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変および定常ドメインと重鎖の可変ドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は一対のＦａｂ断片を含み、通常これらはその間にあるヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合により連結される。抗体断片の他の化学的結合も当技術分野で公知である。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。通常、ＦｖポリペプチドはＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このリンカーはｓｃＦｖが抗原結合にとって望ましい構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖのレビューに関しては、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.113, RosenburgおよびMoore編, Springer-Verlag, New York, 269-315頁(1994)を参照。
【００５２】
用語「ダイアボディ(diabody)」は、抗原結合部位を２つ備える小さな抗体断片を指し、この抗体断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間で対合させるにはあまりに短いリンカーを用いて、このドメインを他の鎖の相補性ドメインと強制的に対合させ、２つの抗原結合部位をつくる。ダイアボディについては、例えば欧州特許第４０４０９７号；ＷＯ９３／１１１６１号；およびHollinger他, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:6444-6448頁(1993)でさらに詳しく記載されている。
表現「線状抗体」はZapata他, Protein Eng., 8(10):1057-1062頁(1995)に記載されている抗体を指す。つまり、これらの抗体は相補性の軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。線状抗体は二重特異性または単一特異性であり得る。
【００５３】
「細胞」、「細胞系」および「細胞培養」は本明細書では同義で使われ、そのような呼称は細胞または細胞系のすべての後代を含む。このように、例えば、「形質転換体」および「形質転換細胞」のような用語は、継代数に関係なくそれらに由来する一次対象細胞および培養物を含む。また、故意または偶発的な突然変異により、すべての後代においてＤＮＡの内容が正確に同一であるというわけではないことが理解される。当初の形質転換細胞でスクリーニングされたような、同じ機能または生物学的活性を有する変異体後代が含まれる。異なった呼称を意図する場合は、前後関係から明白となろう。
発現に言及する場合の「制御（コントロール）配列」は、特定の宿主生物で作用可能に連結したコード配列の発現のために必要なＤＮＡ塩基配列を意味する。例えば原核生物に好適な制御配列は、プロモーター、場合によってはオペレーター配列、リボソーム結合部位、および恐らくはまだよく理解されていない他の配列を含む。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用することが公知である。
【００５４】
用語「コートタンパク質」はタンパク質を意味し、少なくともその一部はウイルス粒子の表面に存在する。機能上の観点からは、コートタンパク質は宿主細胞でのウイルスの構築過程でウイルス粒子と結合する任意のタンパク質であり、ウイルスが他の宿主細胞に感染するまでそれと結合したままである。コートタンパク質は、主要なコートタンパク質であってもよいし、マイナーなコートタンパク質であってもよい。「主要な」コートタンパク質は、通常ウイルスの外殻に存在するコートタンパク質であり、好ましくは少なくとも約５個、より好ましくは少なくとも約７個、より好ましくは少なくとも約１０個かそれ以上のタンパク質コピーが存在する。主要なコートタンパク質は、１ビリオンにつき数十、数百または数千のコピーが存在しうる。主要なコートタンパク質の例は、繊維状ファージのｐ８タンパク質である。
特定の検定におけるある化学物体の「検出限界」は、その検定でバックグラウンドレベルより高く検出されるその物体の最小限の濃度である。例えば、ファージＥＬＩＳＡでは、特定の抗原結合断片を提示している特定のファージの「検出限界」は、その抗原結合断片を提示していない対照ファージによって生じたものよりも多くのＥＬＩＳＡシグナルを特定のファージが生産するファージ濃度である。
【００５５】
「融合タンパク質」および「融合ポリペプチド」は、共有結合で互いに結合した２つの部分を持つポリペプチドを指し、各部分は異なる特性を有するポリペプチドである。この特性は、例えばインビトロまたはインビボ活性などの生物学的性質でよい。この特性はまた、単一の化学的または物理的性質、例えば対象抗原との結合、反応の触媒などかもしれない。この２つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または１つまたは複数のアミノ酸残基を含んでいるペプチドリンカーを通して結合していてもよい。通常、この２つの部分とリンカーは同じ読み枠に存在する。好ましくは、ポリペプチドの２つの部分は異種または異なるポリペプチドから得られる。
「異種ＤＮＡ」は宿主細胞に導入される任意のＤＮＡである。ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの融合または組合せを含む様々なソースに由来してもよい。ＤＮＡは、宿主または受容細胞と同じ細胞または細胞型からのＤＮＡ、あるいは異なる細胞型、例えば哺乳類または植物からのＤＮＡを含むことができる。ＤＮＡは任意選択にマーカーまたは選択遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子、耐熱性遺伝子、その他を含むことができる。
【００５６】
本明細書で使われるように、「非常に多様な位置」は、公知のかつ／または天然抗体または抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつかの異なるアミノ酸を持つ軽鎖および重鎖可変領域上のアミノ酸位置を指す。非常に多様な位置は一般的にＣＤＲ領域にある。一態様では、公知のかつ／または天然抗体の非常に多様な位置を決定する際には、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）が提供しているデータが有効である。インターネット上のデータベース(http:/immuno/bme/nwu/edu)は収集された多数のヒト軽鎖および重鎖の配列とその配置を提供し、これらの配列の非常に多様な位置の決定に役立つ。本発明によると、アミノ酸がある位置で好ましくは約２から約１１、好ましくは約４から約９、好ましくは約５から約７個の可能な異なるアミノ酸残基変異を有する場合は、その位置は非常に多様と言える。いくつかの実施形態では、あるアミノ酸位置は、好ましくは少なくとも約２、好ましくは少なくとも約４、好ましくは少なくとも約６、好ましくは少なくとも約８つの可能な異なるアミノ酸残基変異を有するならば非常に多様である。
本明細書で使われるように、「ライブラリー」は複数の抗体もしくは抗体断片配列（例えば本発明のポリペプチド）またはこれらの配列をコードする核酸を指し、これらの配列は、本発明の方法によってこれらの配列に導入される変異体アミノ酸の組合せにおいて異なる。
【００５７】
「ライゲーション（連結）」は、２つの核酸断片の間でリン酸ジエステル結合を形成する方法である。この２つの断片のライゲーションのために、断片の末端は互いに適合していなければならない。場合によっては、この末端はエンドヌクレアーゼ消化の後に直ちに適合性を持つようになる。しかし、ライゲーションに適合させるためには、まずエンドヌクレアーゼ消化の後に一般的に形成される付着末端を平滑末端に変える必要がある。平滑末端にするためには、ＤＮＡを適当な緩衝液中で１５℃で少なくとも１５分間、４つのデオキシリボヌクレオチド三燐酸の存在下でＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片の約１０単位で処理する。次にＤＮＡをフェノールクロロホルム抽出とエタノール沈殿、またはシリカ精製によって精製する。連結すべきＤＮＡ断片を溶液に等モル量入れる。この溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝およびＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼも、ＤＮＡ０．５μｇにつき約１０単位含む。ＤＮＡをベクターに連結する場合は、ベクターは適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化作用によってまず線状にする。線状にされた断片は、次に細菌のアルカリホスファターゼまたは仔ウシ腸管のホスファターゼで処理して、ライゲーションのステップの間のセルフライゲーションを予防する。
「突然変異」は、参照ヌクレオチド配列、例えば野生型配列と比較してのヌクレオチドの欠失、挿入または置換である。
【００５８】
本明細書で使われるように、「天然（自然）」または「天然に生じる」抗体は、非合成源、例えば生体外で得られる分化抗原特異的Ｂ細胞、またはその対応するハイブリドーマ細胞系、あるいは動物の血清から得られる抗体から特定された抗体を指す。これらの抗体には、天然のものであれ誘発されたものであれいかなる種類の免疫応答で生じた抗体も含まれる。天然抗体には、これらの抗体を構成するかコードするアミノ酸配列およびヌクレオチド配列、例えばカバットデータベースで特定されているようなものが含まれる。本明細書で使われるように、天然抗体は、ソース配列または鋳型配列を、例えばある位置で起源抗体配列と異なる抗体配列を提供する異なるアミノ酸を用いて１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失または追加により変更した抗体配列を指す「合成抗体」とは異なる。
核酸に関して「作用可能に連結した」は、その核酸が他の核酸配列と機能的な関係にあることを意味する。例えば、プレシーケンス(presequence)または分泌リーダーのＤＮＡは、あるポリペプチドの分泌に関わっている前駆体タンパク質として発現する場合は、そのポリペプチドのＤＮＡと作動可能的に結合している。プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響する場合はその配列と作用可能に連結している。または、リボソーム結合部は、それが翻訳を容易にする位置にある場合は作用可能にコード配列と連結している。通常、「作用可能に連結した」は、結合したＤＮＡ配列が連続しており、分泌リーダーの場合は連続して読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続する必要はない。連結は都合のよい制限部位でライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行に従って使用される。
【００５９】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージの粒子表面でコートタンパク質の少なくとも一部と融合したタンパク質として提示する手法である。ファージディスプレイの有用さは、ランダム化タンパク質変異体の大きなライブラリーから対象抗原と高親和性で結合する配列を迅速に、効率的に選別できることにある。ファージ上のペプチドおよびタンパク質ライブラリーの提示は、何百万ものポリペプチドを特異的結合特性に関してスクリーニングするために利用されてきた。多価ファージディスプレイ方法は、繊維状ファージの遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩとの融合を通して小さなランダムペプチドおよび小タンパク質を提示するために利用されてきた。WellsおよびLowman, Curr.Opin.Struct.Biol., 3:355-362頁(1992)とその中の引用文献。一価のファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドのライブラリーが遺伝子ＩＩＩまたはその一部に融合され、ファージ粒子が融合タンパク質の１個または０個のコピーを提示するように野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質の存在下で低レベルで発現される。アビディティー効果は多価のファージと比較して低下しているので、選別は内在性のリガンド親和性に基づいておりファジミドベクターが使われるが、このベクターはＤＮＡ操作を単純化する。LowmanおよびWells, Methods:A Companion to Methods in Enzymology, 3:205-216頁(1991)。
【００６０】
「ファジミド」は、細菌の複製起点、例えばＣｏ１Ｅ１およびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを有するプラスミドベクターである。ファジミドはいかなる公知のバクテリオファージ、例えば繊維状バクテリオファージおよびラムドイドバクテリオファージでも使用できる。プラスミドは、通常、抗生物質耐性の選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡセグメントは、プラスミドとして増殖することができる。これらのベクターを備える細胞がファージ粒子の生産のために必要なすべての遺伝子を備えているとき、プラスミドの複製様式はローリングサークル複製に変化し、プラスミドＤＮＡの１つの鎖のコピーとパッケージファージ粒子を生成する。ファジミドは感染性または非感染性ファージ粒子を形成することができる。この用語は、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面で提示されるように遺伝子融合としてこの異種ポリペプチドの遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子、またはその断片を含むファジミドを含む。
用語「ファージベクター」は、異種遺伝子を含んでいて複製ができるバクテリオファージの二本鎖複製型を意味する。ファージベクターは、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは好ましくは繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはλ様ファージ、例えばλ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４、その他もしくはその誘導体である。
【００６１】
「オリゴヌクレオチド」は、公知の方法（例えば、固相手法、例えば欧州特許第２６６０３２号、１９８８年５月４日公布、に記載されている手法を利用したリン酸トリエステル、亜リン酸塩、またはホスホラミダイト化学、またはFroeshler他, Nucl.Acids.Res., 14:5399-5407頁(1986)に記載されているデオキシヌクレオチドＨ−ホスホン酸塩中間体を通した方法）によって化学的に合成される短い、一本鎖または二本鎖のポリデオキシヌクレオチドである。他の方法には、以下に記載のポリメラーゼ連鎖反応および他のオートプライマー法、および固体担体上のオリゴヌクレオチド合成が含まれる。これらの方法のすべては、Engels他, Agnew.Chem.Int.Ed.Engl., 28:716-734頁(1989)に記載されている。遺伝子のすべての核酸配列が公知ならば、またはコード鎖と相補的な核酸の配列が利用できるならばこれらの方法が使われる。あるいは、対象アミノ酸配列が公知ならば、各アミノ酸残基の公知で好ましいコード残基を使って可能な核酸配列を推測できよう。オリゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲルもしくは分子サイジングカラムで、または沈殿法によって精製することができる。
ＤＮＡが「精製される」のは、ＤＮＡが非核酸不純物から分離されるときである。不純物は極性、無極性、イオン性、その他である。
本明細書で使われるように、「起源抗体」は、その抗原結合配列が本明細書で記載される基準に従う多様化が実行される鋳型配列としての役目をする抗体、または抗原結合断片を指す。抗原結合配列は、通常、抗体可変部、好ましくは少なくとも１つの好ましくはフレームワーク領域を含むＣＤＲを含む。
【００６２】
本明細書で使われる「溶媒と接触しうる(solventaccessible)位置」は起源抗体または抗原結合断片の重鎖および軽鎖の可変部のアミノ酸残基の位置を指し、それは、この抗体または抗原結合断片の構造、構造アンサンブルおよび／またはモデル化された構造に基づき、溶媒露出が可能かつ／または抗体特異性抗原などの分子との接触が可能と判断されるものである。これらの位置は一般的にはＣＤＲで、またタンパク質の外側に見られる。本明細書で定められるように、抗体または抗原結合断片の溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のいくつかのアルゴリズムのいずれかを使って決定できる。好ましくは、溶媒と接触しうる位置は抗体（又は抗体の一部、例えば抗体可変ドメインやＣＤＲセグメント）の三次元モデルからの座標を使い、好ましくはＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム(Accelrys, San Diego, CA)のようなコンピュータプログラムを使って決定される。溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム（例えば、LeeおよびRichards, J.Mol.Biol.55, 379(1971)、および、Connolly, J.Appl.Cryst.16, 548(1983)）を使用しても決定することができる。溶媒と接触しうる位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体（又はその一部）から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。このような目的のために利用できるソフトウェアには、ＳＹＢＹＬ生体高分子モジュールソフトウェア(Tripos Associates)が含まれる。一般に、また好ましくは、アルゴリズム（プログラム）がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約１．４オングストローム以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒と接触しうる領域の決定法が、Pacios, (1994)「ARVOMOL/CONTOUR:molecular surface areas and volumes on Personal Computers」Comput.Chem.18(4):377-386頁；および同(1995)「Variations of Surface Areas and Volumes in Distinct Molecular Surfaces of Biomolecules」J.Mol.Model.1:46-53頁に記載されている。
【００６３】
「転写調節因子」は、以下の構成成分の１つまたは複数を含む：エンハンサー要素、プロモーター、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子および転写終結配列。このような構成成分は当技術分野において公知である。米国特許第５，６６７，７８０号。
「形質転換体」は、そのＤＮＡと関連する表現型（例えば、そのＤＮＡによってコードされるタンパク質によって付与された抗生物質耐性）の発現によって証明されるような、ＤＮＡを取り込み、維持している細胞である。
「形質転換」は、細胞がＤＮＡを取り込んで「形質転換体」になる過程を意味する。ＤＮＡ取込みは永久的、または一過性である。
【００６４】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994); Schier他、Gene, 169:147-155 (1995);  Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995); Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995); およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００６５】
「遮断（ブロック）」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害又は減退させるものである。遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。
ここで用いる「アゴニスト抗体」は対象とするポリペプチドの少なくとも一の機能的活性を模倣する抗体である。
本発明のアミノ酸配列を含む抗体又はポリペプチドの半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープ接着させることができる。例えば、サルベージレセプター結合エピトープをコードする核酸分子は、操作した核酸分子によって発現される融合タンパク質が本発明のポリペプチド配列とサルベージレセプター結合エピトープを含むように、本発明のポリペプチド配列をコードする核酸のフレーム内に連結させることができる。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する（例えば、Ghetie, Vら., (2000) Ann. Rev. Immunol. 18:739-766, 表１）。Ｆｃ領域内に置換を有する抗体及び血清半減期が増大した抗体については、WO00/42072 (Presta, L.)、WO 02/060919; Shields, R.L., ら.,  (2001) JBC 276(9):6591-6604；Hinton, P.R., (2004) JBC 279(8):6213-6216)にも記載されている。他の実施態様では、例えば他のポリペプチド配列に接着させることによっても血清半減期が増大しうる。例えば、血清アルブミンが抗体又はポリペプチドに結合するように、本発明の抗体又は本発明のアミノ酸配列を含む他のポリペプチドをＦｃＲｎレセプター又は血清アルブミン結合ペプチドに結合する血清アルブミン又は血清アルブミンの一部に接着させることができ、例としてこのようなポリペプチド配列はＷＯ０１／４５７４６に開示されている。一実施態様では、接着した血清アルブミンペプチドはアミノ酸配列DICLPRWGCLWを含む。他の実施態様では、本発明によるＦａｂの半減期はこれらの方法によって増大する。血清アルブミン結合ペプチド配列については、Dennis, M.S., ら., (2002) JBC 277(38):35035-35043も参照のこと。
【００６６】
「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いて治療することによって利益を得る任意の症状である。これには、哺乳動物の問題とする疾患の素因となる病的状態を含む慢性及び急性の疾患又は疾病を包含する。限定するものでなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；非白血病およびリンパ系の悪性腫瘍；神経系、神経膠系、星状膠系、視床下部性及び他の腺性、マクロファージ系、上皮性、間質性、胞胚腔系の疾患；及び、炎症性、免疫系、他の脈管形成関連の疾患が包含される。
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖を伴う疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」、「癌性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語はここに示すように互いに独占的なものではない。
「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝臓性癌、並びに頭部及び頸部の癌が含まれる。
【００６７】
血管形成調節不全により、本発明の組成物及び方法によって治療される多くの疾患が引き起こされうる。これらの疾患には、非腫瘍性又は腫瘍性症状の両方が含まれる。腫瘍性のものは上記に記載のものに限らない。非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬、乾癬の斑、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム動脈硬化性斑、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖性の網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、虹彩(angle)（ルベオーシス）の血管新生、眼性新生血管疾患、脈管再狭窄、動静脈奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成（グレーブズ病を含む）、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫（例えば、急性脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関連している）、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化、高親和性骨形成、骨関節炎（ＯＡ）、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣の疾患、子宮内膜症、液体性疾患の第３の間隔(3rd spacing)（膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患）、子宮類線維腫、早産、慢性炎症、例えばＩＢＤ（クローン病および潰瘍性大腸炎）、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長（癌以外）、血友病関節、肥大した瘢痕、体毛成長の抑制、Ｏｓｌｅｒ-Ｗｅｂｅｒ症候群、化膿性肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、脈管粘着力、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液（例えば心外膜炎と関連しているもの）および胸水が含まれる。
【００６８】
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力のような因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には、予防的量は疾患の初期ステージ又はその前の患者に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００６９】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体）、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又は他の挿入剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００７０】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロホスファミド(CYTOXAN(商品名）)のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール（ドロナビノール、MARINOL（登録商標）；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン（合成アナログトポテカン（HYCAMTIN（登録商標）、CPT-11（イリノテカン、CAMPTOSAR（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照）；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体（JHS Natural Products, Eugene, OR）；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE（登録商標）、FILDESIN（登録商標））；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（「Ａｒａ-Ｃ」）；チオテパ；タキソイド類、例えばＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤（American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドキセタキセル（Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン(gemcitabine) （ＧＥＭＺＡＲ(登録商標)）；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン（VELBAN（登録商標））；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン（ONCOVIN（登録商標））；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標)）；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(capecitabine)（XELODA（登録商標）；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン（ELOXATINTM）を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００７１】
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体調節物質（ＳＥＲＭ）を含み、例えば、タモキシフェン（NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む）、EVISTA（登録商標）ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）トレミフェン；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤（ERD）；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、例えばLUPRON（登録商標）及びELIGARD（登録商標）酢酸ロイプロリド等の黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH）アゴニスト、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ(登録商標)酢酸メゲストロール、ＡＲＯＭＡＳＩＮ(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ(登録商標)ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)レトロゾール、及びＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標)アナストロゾールである。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート（例えばBONEFOS（登録商標）又はOSTAC（登録商標））、DIDROCAL（登録商標）エチドロン酸、NE-58095、ZOMETA（登録商標）ゾレドロン酸／ゾレドロネート、FOSAMAX（登録商標）アレンドロネート、AREDIA（登録商標）パミドロン酸、SKELID（登録商標）チルドロン酸、又はACTONEL（登録商標）リセドロン酸、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)（１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター（EGF-R）；THERATOPE（登録商標）ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ(登録商標)ワクチン、及びＶＡＸＩＤ(登録商標)ワクチン；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ(登録商標)トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ(登録商標)ｒｍＲＨ；ラパチニブ（lapatinib ditosylate）（GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤）及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００７２】
ここで用いられる際の「成長阻害剤」は、対象とする標的分子の活性に依存して成長する細胞の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期で標的分子依存性細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を（Ｓ期以外の位置で）阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類（パクリタキセル及びドセタキセル）は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（TAXOTERE（登録商標）、ローン・プーラン ローラー）は、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、ブリストル-マイヤー スクウィブ）の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００７３】
出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド（例えば、起源抗体またはその可変ドメイン／ＣＤＲ）の「変異体」または「突然変異体」、例えば融合タンパク質（ポリペプチド）または異種ポリペプチド（ファージに対して異種性）は、１）出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドのそれとは異なるアミノ酸配列を有し、また２）自然または人為の（人工）突然変異を通して出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチドから導かれたポリペプチドである。そのような変異体は、例えば対象とするポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失、および／またはそれへの挿入、および／またはその置換を含む。例えば、変異体アミノ酸（起源抗体／抗原結合断片の対応する位置で見られるアミノ酸と比較して）を有する配列をコードする制限したコドンセットを含んでいるオリゴヌクレオチドを使って作製した本発明の融合ポリペプチドは、起源抗体及び／又は抗原結合断片及び／又はＣＤＲと比較して変異体ポリペプチドとなる。このように、変異体ＣＤＲは、出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド配列に対する変異体配列（例えば、起源抗体及び／又は抗原結合断片及び／又はＣＤＲのそれ）を含んでいるＣＤＲを指す。この意味合いでは、変異体アミノ酸は出発ポリペプチドまたは参照ポリペプチド配列の対応する位置のアミノ酸（例えば、起源抗体及び／又は抗原結合断片及び／又はＣＤＲのそれ）とは異なるアミノ酸を指す。最終的な変異体または突然変異体構築物に到達するには欠失、挿入および置換をいかように組み合わせてもよいが、最終的な構築物は所望の機能的特性を有するものとする。本明細書中に記載の実施例に中には、結合体配列は欠損や付加などの点突然変異を含む。例えば、ＹＡＤＳライブラリから得たＶＥＧＦクローンはＣＤＲＬ３中のＱの欠損を示すが、これはベクターコンストラクトの結果ではない。他の例では、４Ｄ５  ＣＤＲＬ３の位置８９のＱはベクターコンストラクトにおいて意図的に欠損している。アミノ酸変化はポリペプチドの翻訳後プロセス、例えばグリコシル化部位の数または位置を変えることもできる。ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作製する方法は、本明細書で参照により取り込まれた米国特許第５，５３４，６１５号に記載されている。
【００７４】
「野生型」または「参照」配列、あるいは、「野生型」または「参照」タンパク質／ポリペプチド、例えばコートタンパク質または起源抗体のＣＤＲまたは可変ドメインの配列は、突然変異の導入を通してそこから変異体ポリペプチドが導かれる参照配列かもしれない。一般的に、所与のタンパク質の「野生型」配列は、自然界で最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、その遺伝子の自然界で最も一般的に見られる配列である。突然変異は、自然過程を通してまたは人為的手段を通して「野生型」遺伝子（したがってそれがコードするタンパク質）に導入することができる。そのようなプロセスの産物は、原「野生型」タンパク質または遺伝子の「変異体」または「突然変異体」形態である。
本明細書で使われるように、「複数」の物質、例えば本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、通常、その物質の２つ以上の種類の集合を指す。ある物質の２つ以上が特定の形質に関して互いと異なるならば、その物質には２種類以上が存在し、例としては特定のアミノ酸位置で見られる変異体アミノ酸がある。例えば、変異体ＣＤＲの配列以外、または特定の溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置の変異体アミノ酸以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の２つ以上のポリペプチドがあるならば、本発明のポリペプチドには複数個存在する。他の実施例では、変異体ＣＤＲをコードする配列以外、または特定の溶媒と接触しうる非常に多様なアミノ酸位置の変異体アミノ酸をコードする配列以外は実質的に同じ、好ましくは同一の配列である本発明の２つ以上のポリヌクレオチドがあるならば、本発明のポリヌクレオチドには複数個存在する。
【００７５】
本発明は、選択した抗原に対して高親和性を有する新規の標的抗原結合ポリペプチド、例として抗体または抗原結合断片を作製し、単離する方法を提供する。制限したコドンセットを用いて元となる抗体（起源抗体）の軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメイン中の一以上の選択したアミノ酸位置を突然変異させる（多様化する）ことによって複数の異なる結合体ポリペプチドを調製して、少なくとも一のＣＤＲ配列に変異型アミノ酸を有するライブラリを作製するものであり、このときの変異型アミノ酸の数は最小にする（すなわち、１０以下、８以下、６以下、４以下、又は２のみ、しかし一般的には少なくとも２）。このようなアミノ酸位置は溶媒と接触しうる位置であり、それは例えば起源抗体の構造を分析することで決定され、かつ／または公知のかつ／または天然に生じる免疫グロブリンポリペプチドの中で高い多様性を有する位置である。さらに本発明の多様化の限定的性質によって、非常に多様化した及び／又は溶媒と接触しうるアミノ酸位置以外の付加的なアミノ酸位置も実施者の必要や希望に応じて多様化することができるという利便性が生じる；この実施態様の例を本明細書中に記載する。
【００７６】
溶媒と接触しうる非常に多様であるアミノ酸位置は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３およびその混合物からなる群から選択した抗体可変ドメインのＣＤＲ領域にあるものであることが好ましい。限定した数のアミノ酸（各位置で共通して生じるアミノ酸に一般的に依存しないアミノ酸を選択する）をコードする制限コドンセットを用いてアミノ酸位置をそれぞれ突然変異させる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ領域中の溶媒と接触しうる非常に多様な位置を突然変異させる場合は、好ましくは２〜１０、好ましくは２〜８、好ましくは２〜６、好ましくは２〜４、好ましくはたった２つのアミノ酸をコードするコドンセットを選択する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ領域中の溶媒と接触しうる非常に多様な位置を突然変異させる場合は、好ましくは２〜１０、３〜９、４〜８、５〜７アミノ酸をコードするコドンセットを選択する。いくつかの実施形態では、少なくとも２，しかし１０以下、８以下、６以下、４以下のアミノ酸をコードするコドンセットを選択する。例えばＣＤＲＨ３に関しては、長さを変えることによってもＣＤＲ配列を多様化することができ、制限コドンセットを用いて、選択した位置の長さが異なる及び／又は選択した位置がランダム化している変異型ＣＤＲＨ３領域を生成することができる。
【００７７】
変異型ＣＤＲを含むポリペプチドのライブラリーの多様性は、限られた数のアミノ酸のみをコードするコドンセットを用いて設定するので、最小であるが十分に多様性のある配列を有するＣＤＲとなる。ＣＤＲ内の変異した位置の数は最小であり、各位置の変異型アミノ酸は限定した数のアミノ酸を包含するように設定してあり、公知の及び／又は天然に生じるＣＤＲ内の同じ位置に共通して生じると思われるアミノ酸とは無関係である。好ましくは、少なくとも一のＣＤＲを含む単一抗体は起源抗体（ソース抗体、元となる抗体）として用いる。驚くべきことに、配列と大きさが多様な抗体可変ドメインのライブラリは単一の起源抗体を鋳型として用いて作製し、従来にはない限定した数のアミノ酸置換によって特定の位置に多様性を持たせることができる。
【００７８】
抗体可変ドメインの多様性の設定（デザイン）
本発明の一態様では、抗体可変ドメインの高品質のライブラリーが作製される。このライブラリーは、限定した多様性のあるＣＤＲ配列の異なる配列、例えば多様性のある抗体可変ドメインを有する。このライブラリーは一以上の抗原、例えば、ニュートラビジン、アポトーシスタンパク質（ＡＰ）、マルトース結合タンパク質２（ＭＢＰ２）、エルビン-ＧＳＴ、インスリン、マウス及びヒトのＶＥＧＦなどに対して高い親和性を有する結合抗体可変ドメインを含む。このライブラリーの多様性は、単一の起源抗体内の溶媒と接触しうる非常に多様であるアミノ酸位置を選択し、制限コドンセットを使って少なくとも１つのＣＤＲ内のそれらの位置を突然変異させることによって設定する。制限コドンセットは、好ましくは１０、８、６、４アミノ酸をコードする、又は２アミノ酸のみをコードする。
【００７９】
起源抗体の一つはヒト化抗体４Ｄ５であるが、多様性の設計方法は配列が公知の他の起源抗体にも適用することができる。起源抗体は、天然抗体、合成抗体、組換え抗体、ヒト化抗体、生殖細胞系派生抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体またはそれらの抗原結合断片でよい。抗体は、ヒト、マウスおよびラットを含む様々な種類の哺乳類から得ることができる。いくつかの実施形態では、起源抗体は最初の１回または複数回の親和性スクリーニングの後で、親和性成熟段階の前に得られる抗体である。細胞培養において高収率で安定した生産を可能にするために、起源抗体を選択または修飾することができる。
抗体４Ｄ５は、Ｈｅｒ−２（ｅｒｂＢ２）として知られている癌関連の抗原に特異的なヒト化抗体である。この抗体は、コンセンサスフレームワーク領域を有する可変領域を含む。ヒト化抗体の親和性を高める過程で、２、３の位置がマウス配列に戻されている。ヒト化抗体４Ｄ５の配列と結晶構造は、米国特許第６，０５４，２９７号、Carter他, PNAS 89:4285頁(1992)に記載され、結晶構造はJ.Mol.Biol.229:969頁(1993)およびインターネットサイトwww/ncbi/nih/gov/structure/mmdb（ＭＭＤＢ＃ｓ−９９０−９９２）で示されている。
【００８０】
抗体可変ドメインで多様性を生み出す基準は、溶媒と接触しうる（上で定義される）位置で残基に突然変異を起こさせることである。これらの位置は一般的にはＣＤＲで、またタンパク質の外側に見られる。好ましくは、溶媒と接触しうる位置は、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩプログラム(Accelrys, San Diego, CA)のようなコンピュータプログラムを用いて、抗体の３次元モデルからの座標を使って決定される。溶媒と接触しうる位置は、当技術分野で公知のアルゴリズム（例えば、LeeおよびRichards, J.Mol.Biol.55, 379(1971)、および、Connolly, J.Appl.Cryst.16, 548(1983)）を使用しても決定することができる。溶媒と接触しうる位置の決定は、タンパク質モデリングに適したソフトウェアおよび抗体から得られる三次元構造情報を使って行うことができる。このような目的のために利用できるソフトウェアには、ＳＹＢＹＬ生体高分子モジュールソフトウェア(Tripos Associates)が含まれる。一般に、また好ましくは、アルゴリズム（プログラム）がユーザーの入力サイズパラメータを必要とする場合は、計算において使われるプローブの「サイズ」は半径約１．４オングストローム以下に設定される。さらに、パーソナルコンピュータ用のソフトウェアを使用した溶媒露出領域およびエリア決定法が、Pacios, (1994)「ARVOMOL/CONTOUR:molecular surface areas and volumes on Personal Computers」Comput.Chem.18(4):377-386頁；および同、「Variations of Surface Areas and Volumes in Distinct Molecular Surfaces of Biomolecules」J.Mol.Model.(1995), 1:46-53頁に記載されている。
【００８１】
いくつかの場合には、溶媒と接触しうる残基の選択は、協同で最小限の連続するパッチを形成する溶媒と接触しうる残基を選ぶことによってさらに洗練され、例えば参照ポリペプチドまたは起源抗体がその三次元折畳み構造の場合がそうである。例えば、図２１で示すように、コンパクト（最小）な連続したパッチは、ヒト化４Ｄ５のＣＤＲＨ１／Ｈ２／Ｈ３／Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３に対して選択された残基によって形成される。コンパクト（最小）な連続したパッチは、ＣＤＲの全域の１つのサブセット（例えば２〜５個のＣＤＲ）、例えばＣＤＲＨ１／Ｈ２／Ｈ３／Ｌ３だけを含むことができる。そのようなパッチの形成に貢献しない溶媒と接触しうる残基は、任意選択に多様化から排除してもよい。この基準による選択の洗練化により、実務者は、希望により多様化する残基数を最小化することができる。例えば、Ｈ１の残基２８はパッチの端にあるので、多様化において任意選択で排除することができる。しかし、この選択基準は、希望により、必ずしも溶媒に露出しているとは考えられない多様化のための残基を選ぶためにも用いることができる。例えば、溶媒に露出していると考えられなくても、溶媒に露出していると考えられる他の残基と共に三次元折畳み構造で連続するパッチを形成する残基は、多様化の対象に選んでもよい。この例はＣＤＲＬ１−２９である。そのような残基の選択は当業者には明らかとなるもので、その適切さも経験的に、また熟練実務者のニーズと希望に応じて決定することができる。
【００８２】
ヒト化抗体４Ｄ５の結晶構造から特定された、各ＣＤＲの溶媒と接触しうる位置は次の通りである（残基の位置はカバットに従う）：
ＣＤＲＬ１：２８、３０、３１、３２
ＣＤＲＬ２：５０、５３
ＣＤＲＬ３：９１、９２、９３、９４、９６
ＣＤＲＨ１：２８、３０、３１、３２、３３
ＣＤＲＨ２：５０、５２、５２Ａ、５３、５４、５５、５６、５７、５８。
さらにまた、ある実施態様ではＣＤＲＬ１の残基２９は、他の溶媒と接触しうる残基を含んでいる連続するパッチに含まれているかどうかに基づいて選択してよい。前述の溶媒と接触しうる位置のすべて又はサブセットは本発明の方法及び組成物で多様化してもよい。例えば、ある実施態様では、ＣＤＲＨ２内の位置５０、５２、５３、５４、５６及び５８のみを多様化する。
【００８３】
突然変異させる位置を選択するための他の基準は、公知のかつ／または天然抗体の配列と比較したときにアミノ酸配列に変異を示す位置である。非常に多様な位置は、公知のかつ／または天然抗体／抗原結合断片のアミノ酸配列を比較した場合に、その位置で提示されるいくつかの異なるアミノ酸を持つ軽鎖または重鎖可変領域上のアミノ酸位置を指す。非常に多様な位置は好ましくはＣＤＲ領域にある。ＣＤＲＨ３の位置はすべて非常に多様であると考えられている。本発明によると、アミノ酸がその位置で好ましくは約２から約１１個（本明細書に記載されているようにこの数字には幅があるが）の可能な異なるアミノ酸残基変異を有する場合は、そのアミノ酸残基は非常に多様と言える。
一態様では、公知のかつ／または天然抗体の非常に多様な位置を同定する際には、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health, Bethesda, Md., 1987年および1991年）が提供しているデータが有効である。インターネット上のデータベース(http/immuno/bme/nwu/edu)は収集された多数のヒト軽鎖および重鎖の配列とその配置を提供し、これらの配列の非常に多様な位置の決定に役立つ。公知のかつ／または天然の軽鎖および重鎖のヒト化抗体４Ｄ５の溶媒露出位置における多様性を、図２２および２３に示す。
【００８４】
本発明の一態様では、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびその混合物からなる群から選ばれた少なくとも１つのＣＤＲの非常に多様化した溶媒と接触しうる残基を突然変異させる（すなわち、本明細書で記載されている制限コドンセットを用いてランダム化する）。例えば、制限コドンを用いて、ＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３の溶媒と接触しうるかつ／または非常に多様な少なくとも一の残基を多様化させることによってポリペプチド母集団を作製してもよい。したがって、本発明は起源抗体の可変ドメインの少なくとも一のＣＤＲの溶媒と接触しうる非常に多様化した少なくとも一の位置を制限コドンによってコードされる変異型アミノ酸で置換することによって形成する大きな数の新規の抗体配列を提供する。例えば、変異型ＣＤＲ又は抗体可変ドメインは、ＣＤＲＨ１の位置２８、３０、３１、３２及び／又は３３のうちの一以上のアミノ酸位置；及び／又はＣＤＲＨ２の位置５０、５２、５３、５４、５６及び／又は５８のうちの一以上のアミノ酸位置；ＣＤＲＬ１の位置２８、２９、３０及び／又は３１のうちの一以上のアミノ酸位置；ＣＤＲＬ２の位置５０及び／又は５３のうちの一以上のアミノ酸位置；及び／又はＣＤＲＬ３の位置９１、９２、９３、９４及び／又は９６のうちの一以上のアミノ酸位置に変異型アミノ酸を含みうる。これらの位置の変異型アミノ酸は、本明細書中に記載のように制限コドンセットによってコードされる。
【００８５】
上で示したように、変異体アミノ酸は制限コドンセットによってコードされる。コドンセットとは、所望のアミノ酸群をコードするのに用いられる一組のオリゴヌクレオチドを形成するのに用いることができる一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。一組のオリゴヌクレオチドは、コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを表す配列であって所望のアミノ酸群をコードする配列を含み、例えば固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているヌクレオチドのセットは、市販の核酸合成機（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは可変ドメイン核酸テンプレートへのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【００８６】
一態様では、ヒト化抗体４Ｄ５のＣＤＲ内の溶媒と接触しうる非常に多様化した位置の一以上を占めるように意図したアミノ酸の制限したレパートリーを決定する（実施者の希望に基づいて、希望する特定の位置の特定のアミノ酸、特定の位置が欠損するような特定のアミノ酸、希望するライブラリの大きさ、分類する抗原結合体の特徴などを含めた任意の数の基準に基づいてよい）。
公知の抗体の重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）は多様な配列、高次構造および長さを持つ。ＣＤＲＨ３は抗原結合ポケットの中央でしばしば見られ、抗原接触にしばしば関与する。このようにＣＤＲＨ３の設定は好ましくは他のＣＤＲのそれとは別に構築されるが、それはＣＤＲＨ３の高次構造を予測することが難しく、またこの領域のアミノ酸の多様性は公知の抗体で特に多様なためである。本発明に従って、ＣＤＲＨ３はＣＤＲＨ３内の特定の位置（例えば位置９５、９６、９７、９８、９９、１００及び１００ａ（例として４Ｄ５内のカバット番号付けに従う））で多様化されるように設定される。ある実施態様では、制限コドンセットを用いてＣＤＲＨ３の長さを変えることによっても多様化する。長さの多様性は、抗原結合タンパク質を十分な割合で含むポリペプチドの母集団を作製するのに適するように経験的に範囲を決定することができる。例えば、配列：(Ｘ１)ｎ−Ａ−Ｍ、Ｘ１は制限コドンセットによりコード化されるアミノ酸であり、ｎは様々な長さ、例えばｎ＝３〜２０、５〜２０、７〜２０、５〜１８又は７〜１８である配列を有する変異型ＣＤＲＨ３を含むポリペプチドを生成することができる。ｎの値としてあり得る他の例は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９及び２０である。ＣＤＲＨ３配列の長さを変えるために有用であり得るオリゴヌクレオチドの例示的実施態様は、図２及び図９に示すものを含む。
【００８７】
特定のＣＤＲ、例えばＣＤＲＨ３内の変異体アミノ酸の導入によってつくられるライブラリーの配列多様性は、抗体の他の領域、特に軽鎖または重鎖何れかの可変配列の他のＣＤＲ内に変異を含む他のＣＤＲを変異型ＣＤＲと組み合わせることによって高めることができると考える。このセットの構成メンバーをコードする核酸配列は、コドンセットを通して、軽鎖または重鎖の配列のＣＤＲにおける他の変異体アミノ酸の導入によってさらに多様化することができると考える。このように、例えば、一実施形態では、対象抗原と結合する融合ポリペプチドからのＣＤＲＨ３配列は、多様化されたＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１またはＣＤＲＨ２配列、あるいは多様化されたＣＤＲのいかなる組合せとも組み合わせることができる。
いくつかの例では、例えばコンセンサス配列を反映させるため、または安定性を向上させるため、または提示するために、フレームワーク残基を起源抗体または抗原結合断片の配列に対して変化させることができる点に留意する必要がある。例えば、重鎖のフレームワーク残基４９、９３、９４または７１は変化させることができる。重鎖フレームワーク残基９３は、セリンまたはアラニン（その位置のヒトコンセンサス配列アミノ酸）でもよい。重鎖フレームワーク残基９４は、フレームワークコンセンサス配列を反映するためにトレオニンからアルギニンまたはリジンに変更してもよい。変えることができるフレームワーク残基の他の例は重鎖フレームワーク残基７１であり、カバットデータベースで見られるようにそれは約１９７０のポリペプチドではＲ、約６２７のポリペプチドではＶ、約５２７のポリペプチドではＡである。重鎖のフレームワーク残基４９は、アラニンまたはグリシンでよい。さらに、任意選択に、Ｈ鎖可変ドメインの３つのＮ末端アミノ酸は取り除くことができる。軽鎖では、任意選択に、アミノ酸位置６６のアルギニンはグリシンに変更することができる。
【００８８】
一態様では、本発明は潜在的なリガンドに顕著な親和性で結合する融合ポリペプチドを生成するためのベクター構築物を提供する。これらの構築物は、融合ポリペプチドに存在するとき重鎖が二量体化してＦａｂまたはＦａｂ’の抗体断片／部分の二量体を形成する傾向を強める二量体化可能なドメインを含む。これらの二量体化ドメインは、例えば、融合ポリペプチドに存在してもよい重鎖ヒンジ配列（例えば、ＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１２０）を含む配列）を含むことができる。融合ファージポリペプチドの二量体化ドメインは２組の融合ポリペプチド（ＬＣ／ＨＣ−ファージタンパク質／断片（例えばｐＩＩＩ））で構成され、こうして２組の融合ポリペプチド間で適当な結合（例えば重鎖間ジスルフィド架橋）の形成を可能にする。そのような二量体化ドメインを含んでいるベクター構築物を用いて、ファージ上で抗体可変ドメイン、例えば、本明細書で記載される多様化された融合タンパク質の二価提示を達成することができる。好ましくは、各単量体抗体断片（融合ポリペプチド）の内在性親和性は、二量体化ドメインとの融合によって著しく変更されることはない。好ましくは、二量体化は、著しく低下した解離速度でファージ結合のアビディティーを高める二価ファージディスプレイをもたらし、このことは当技術分野で公知の方法により、また本明細書で記載されているように測定することができる。本発明の二量体化ドメイン含有ベクターは、二量体化ドメインの後ろにアンバー終止コドンを含んでもよいし含まなくてもよい。
【００８９】
異なる提示特性を達成するために二量体化を変更することができる。二量体化ドメインは、システイン残基、完全長抗体からのヒンジ領域、ロイシンジッパー配列もしくはＧＣＮ４ジッパー配列のような二量体化配列またはその混合物を含んでいる配列を含むことができる。二量体化配列は当技術分野で公知であり、例えば、ＧＣＮ４ジッパー配列（ＧＲＭＫＱＬＥＤＫＶＥＥＬＬＳＫＮＹＨＬＥＮＥＶＡＲＬＫＫＬＶＧＥＲＧ）（配列番号３）などが含まれる。この二量体化ドメインは、好ましくは重鎖可変ドメインまたは定常ドメインの配列のＣ末端、および／あるいは重鎖可変ドメインまたは定常ドメインの配列とウイルスコートタンパク質成分の配列との間に位置する。アンバー終止コドンも、二量体化ドメインのＣ末端またはその後に存在してもよい。アンバー終止コドンが存在する一実施形態では、二量体化ドメインは少なくとも１つのシステインおよびロイシンジッパーなどの二量体化配列をコードする。アンバー終止コドンが存在しない他の実施形態では、二量体化ドメインは単一のシステイン残基を含むかもしれない。
本発明のポリペプチドは、変異体ポリペプチドの提示のために、または前記ポリペプチドの精製、スクリーニングもしくは選別および検出のために他の種類のポリペプチドと融合することもできる。ファージディスプレイを含む実施形態に関しては、本発明のポリペプチドはウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合される。ウイルスコートタンパク質の例としては、タンパク質ＰＩＩＩ、主コートタンパク質、ｐＶＩＩＩ、Ｓｏｃ、Ｈｏｃ、ｇｐＤ、ｐＶＩおよびその変異体が含まれる。さらに、本発明の方法によって生成される変異体ポリペプチドは、ポリペプチドマーカーまたはタグ、例えばＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、ｇＤ、ｃ−ｍｙｃ、β−ガラクトシダーゼなどと任意選択に融合することができる。
【００９０】
ランダム化可変ドメインライブラリー作製法
鋳型核酸に選択されたアミノ酸を置換する方法は当技術分野で確立されており、その幾つかは本明細書で記載されている。例えば、キュンケル方法を使用し、少なくとも１つのＣＤＲ領域の溶媒に露出しかつ／または非常に多様な位置を対象に変異体アミノ酸でアミノ酸を置換することによってライブラリーを作製することができる。例えば、Kunkel他, Methods Enzymol.(1987), 154:367-382頁を参照。ランダム化された配列の生成は、下の実施例でも後述する。
オリゴヌクレオチド配列は、異なる長さのＣＤＲＨ３のためにまたはＣＤＲの溶媒に露出し非常に多様な位置のために設定された制限コドンセットの１つまたは複数を含む。コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。コドンセットは、ＩＵＢコードによって下で示すように、特定のヌクレオチドまたはヌクレオチドの等モル混合物を示すために符号を使って表される。コドンセットは、一般的に３つの大文字、例えばＫＭＴ、ＴＭＴなどで表される。
【００９１】
ＩＵＢコード
Ｇ  グアニン
Ａ  アデニン
Ｔ  チミン
Ｃ  シトシン
Ｒ（ＡまたはＧ）
Ｙ（ＣまたはＴ）
Ｍ（ＡまたはＣ）
Ｋ（ＧまたはＴ）
Ｓ（ＣまたはＧ）
Ｗ（ＡまたはＴ）
Ｈ（ＡまたはＣまたはＴ）
Ｂ（ＣまたはＧまたはＴ）
Ｖ（ＡまたはＣまたはＧ）
Ｄ（ＡまたはＧまたはＴ）
Ｎ（ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）
【００９２】
例えば、コドンセットＴＭＴでは、Ｔはヌクレオチドチミンであり、ＭはＡまたはＣでありうる。このコドンセットは複数のコドンが存在し、限定した数のアミノ酸のみ、すなわちチロシン及びセリンをコードしうる。
オリゴヌクレオチドまたはプライマーのセットは、標準の方法を使って合成できる。一組のオリゴヌクレオチドは、例えば、制限コドンセットによって提供されるヌクレオチドトリプレットの可能な組合せのすべてを代表し、所望の制限されたアミノ酸群をコードする配列を含む固相法によって合成することができる。ある位置での選ばれたヌクレオチド「縮重」を有するオリゴヌクレオチドの合成は、当技術分野で公知である。そのようなある種のコドンセットを有しているオリゴヌクレオチドのセットは、市販の核酸シンセサイザー（Applied Biosystems, Foster City, CAなどから入手可能）を使って合成することができ、または市販品を入手することができる（例えば、Life Technologies, Rockville, MDから）。したがって、特定のコドンセットを有する合成オリゴヌクレオチドセットは、一般的に異なる配列の複数のオリゴヌクレオチドを含み、この相違は配列全体の中のコドンセットによるものである。本発明で使用されるように、オリゴヌクレオチドは可変ドメインＣＤＲ（例えば可変ドメイン内に含まれるもの）の核酸鋳型へのハイブリダイゼーションを可能にする配列を有し、また、クローニングに役立つ制限酵素部位を含むこともできる。
【００９３】
１つの方法では、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は、４Ｄ５の抗体可変ドメインなどのソースまたは鋳型ポリペプチドをコードしている核酸配列のオリゴヌクレオチドを媒介した突然変異生成によって作製することができる。この手法はZoller他, Nucleic Acids Res.10:6487-6504頁(1987)が記載しているように、当技術分野で公知である。つまり、変異体アミノ酸をコードしている核酸配列は所望の制限コドンセットをコードしているオリゴヌクレオチドセットをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズすることによって作製され、前記鋳型は可変部核酸鋳型配列を含むプラスミドの一本鎖型である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて鋳型の二次相補鎖すべてを合成し、この相補鎖はオリゴヌクレオチドプライマーを取り込み、前記オリゴヌクレオチドセットによって提供される制限コドンセットを含むようになる。他のソースまたは鋳型分子をコードしている核酸は公知であるか、または容易に決定することができる。
通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使われる。最適オリゴヌクレオチドは、突然変異体をコードするヌクレオチドの両側が鋳型と完全に相補性である少なくとも１２から１５個のヌクレオチドを持つ。これにより、オリゴヌクレオチドが正しく一本鎖ＤＮＡ鋳型分子にハイブリダイズするようになる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の手法、例えばCrea他, Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA, 75:5765頁(1978)に記載の手法を使って容易に合成される。
【００９４】
ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクター（市販のＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９ベクターが適当）に由来するベクター、またはViera他, Meth.Enzymol.153:3頁(1987)に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの１つに挿入することができる。一本鎖鋳型の生産は、前記Sambrook他のセクション４．２１〜４．４１で記載されている。
未変性のＤＮＡ配列を変えるために、オリゴヌクレオチドが適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型にハイブリダイズされる。ＤＮＡ重合酵素、通常、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を次に加え、合成のためのプライマーとしてオリゴヌクレオチドを使って鋳型の相補鎖を合成する。こうしてＤＮＡの１つの鎖は遺伝子１の突然変異した形態をコードし、他の鎖（元の鋳型）は遺伝子１の未変性、未変更の配列をコードするようにヘテロ二本鎖分子が形成される。このヘテロ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞、通常大腸菌ＪＭ１０１のような原核生物に形質転換される。細胞を増殖させた後にアガロースプレートの上へプレートし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するために３２リン酸塩で放射性標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使ってスクリーニングする。
【００９５】
この上で記載されている方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含むホモ二本鎖分子が作製されるように修正することができる。この修正は以下の通りである。一本鎖オリゴヌクレオチドを先に述べたように一本鎖鋳型にアニールする。３つのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオデオキシリボシトシン（Ａｍｅｒｓｈａｍから入手できる）と合わせる。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に加える。ＤＮＡポリメラーゼをこの混合物へ追加すると、突然変異した塩基以外は鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成する。さらに、この新しいＤＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これはＤＮＡ鎖を制限酵素による消化作用から保護するのに役立つ。二本鎖ヘテロ二本鎖の鋳型鎖に適当な制限酵素でニックを入れた後、突然変異を起こさせる部位を含む領域の後方で鋳型鎖はＥｘｏＩＩＩヌクレアーゼまたは適当な他のヌクレアーゼで消化することができる。反応を終了すると、部分的にだけ一本鎖の分子が残る。次に、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖が、４つのデオキシリボヌクレオチド三リン酸のすべて、ＡＴＰおよびＤＮＡリガーゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを使って形成される。このホモ二本鎖分子は、次に適当な宿主細胞に形質転換することができる。
【００９６】
前に示したように、オリゴヌクレオチドセットの配列の長さは鋳型核酸にハイブリダイズするために十分な長さであり、また、必須ではないが制限部位を含むこともできる。ＤＮＡ鋳型はバクテリオファージＭ１３ベクターに由来するベクター、またはViera他((1987), Meth.Enzymol.153:3頁)に記載されている一本鎖ファージ複製起点を含むベクターによって生成される。このように、突然変異させるべきＤＮＡは、一本鎖鋳型を生成するためにこれらのベクターの１つに挿入する必要がある。一本鎖鋳型の生産は、前記Sambrook他のセクション４．２１〜４．４１で記載されている。
他の方法によると、ライブラリーは上流および下流のオリゴヌクレオチドセットを提供することによって生成することができ、各セットは、オリゴヌクレオチドの配列内で提供されたコドンセットによって確立された異なる配列を有する複数のオリゴヌクレオチドを持つ。上流および下流のオリゴヌクレオチドセットは、可変ドメイン鋳型核酸配列と共に、ＰＣＲ産物の「ライブラリー」を作製するためにＰＣＲ法で使うことができる。ＰＣＲ産物は確立された分子生物学的手法を使って他の関連した、または無関係な核酸配列、例えばウイルスのコートタンパク質構成成分および二量体化ドメインと融合することができるので、「核酸カセット」と呼ぶこともある。
【００９７】
ＰＣＲプライマー配列は、ＣＤＲ領域の溶媒に露出し非常に多様な位置のために設計されたコドンセットの１つまたは複数を含む。前記したように、コドンセットは所望の変異体アミノ酸をコードするのに用いられる、一組の異なるヌクレオチドトリプレット配列である。
オリゴヌクレオチドセットは、核酸カセットを作製するための鋳型として可変部核酸鋳型配列を使ってＰＣＲ法で使うことができる。可変部核酸鋳型配列は、対象核酸配列（すなわち、置換の対象となるアミノ酸をコードしている核酸配列）を含む免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のいかなる部分でもよい。可変部核酸鋳型配列は、第１の核酸鎖および相補性の第２の核酸鎖を有する二本鎖ＤＮＡ分子の一部である。可変部核酸鋳型配列は、少なくとも可変ドメインの一部を含み、また少なくとも１つのＣＤＲを持つ。場合によっては、可変部核酸鋳型配列は複数のＣＤＲを含む。可変部核酸鋳型配列の上流部および下流部は、上流域のオリゴヌクレオチドセットおよび下流域のオリゴヌクレオチドセットの構成メンバーによるハイブリダイゼーションの対象とすることができる。
【００９８】
上流のプライマーセットの第１のオリゴヌクレオチドは第１の核酸鎖にハイブリダイズすることができ、下流のプライマーセットの第２のオリゴヌクレオチドは第２の核酸鎖にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドプライマーは１つまたは複数のコドンセットを含むことができ、可変部核酸鋳型配列の一部にハイブリダイズするように設計することができる。これらのオリゴヌクレオチドの使用により、ＰＣＲ後に２つ以上のコドンセットをＰＣＲ産物（すなわち核酸カセット）に導入することができる。抗体可変ドメインをコードしている核酸配列の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸置換の対象となるＣＤＲ残基をコードする部分を含む。
上流域および下流域のオリゴヌクレオチドセットは、オリゴヌクレオチド配列内に制限部位を含むように合成することもできる。これらの制限部位は、さらなる抗体配列を有している発現ベクターへの核酸カセット（すなわちＰＣＲ反応生成物）の挿入を容易にする。好ましくは、制限部位は外来の核酸配列を導入することなく、または元のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列を取り除くことなく核酸カセットのクローニングを容易にするようになっている。
【００９９】
核酸カセットは、作製した対象アミノ酸置換を含む軽鎖または重鎖の配列の一部またはすべての発現のために、いかなる適当なベクターにもクローニングすることができる。本発明で詳述される方法によると、核酸カセットはウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した軽鎖または重鎖配列の一部またはすべて（すなわち、融合タンパク質を形成）の生産を可能にしているベクターにクローニングされるか、あるいは、粒子または細胞の表面で提示される。数種類のベクターが入手でき、それらは本発明の実施に用いることができるが、ファジミドベクターが本明細書での使用には好ましいベクターであり、その訳はそれらが相対的に容易に構築し、また容易に増幅することができるからである。当業者に公知のように、ファジミドベクターは、通常、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位および他の必要な構成成分を含む様々な構成成分を含む。
特定の変異体アミノ酸の組合せが発現される他の実施形態では、核酸カセットは、重鎖または軽鎖の可変ドメインのすべてまたは一部をコードすることができ、また変異体アミノ酸の組合せをコードすることができる配列を含む。ライブラリーの場合のようにこれらの変異体アミノ酸または変異体アミノ酸の組合せを含んでいる抗体の作製のために、核酸カセットは、さらなる抗体配列、例えば軽鎖および重鎖可変部の可変または定常ドメインのすべてまたは一部を含んでいる発現ベクターに挿入することができる。これらのさらなる抗体配列は他の核酸配列、例えばウイルスコートタンパク質構成成分をコードしている配列と融合することができ、したがって融合タンパク質の生産を可能にする。
【０１００】
ベクター
本発明の１つの態様は遺伝子融合をコードしている核酸配列を含んでいる複製可能な発現ベクターを含み、前記遺伝子融合は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部と融合した、１つのＣＤＲ含有ポリペプチド（抗体可変ドメインなど）、または１つの抗体可変ドメインと１つの定常ドメインを含む融合タンパク質をコードする。先に述べたように多様な配列で生成された複数の融合ポリペプチドを含む複数の異なる融合タンパク質をコードする複数の遺伝子融合を含む、多様で複製可能な発現ベクターのライブラリーも含まれる。ベクターは様々な構成成分を含んでいてもよく、好ましくは異なるベクターの間で抗体可変ドメインが移動できるように、かつ／または異なるフォーマットで融合タンパク質が提示されるように構築される。
ベクターの例としてはファージベクター及びファジミドベクター（ここでは広範囲に例示されるものであり、上記により詳細に記載される）が含まれる。ファージベクターは一般的に、ファージ複製およびファージ粒子形成を可能にするファージ複製起点を有する。ファージは一般に繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３、ｆ１、ｆｄ、Ｐｆ３ファージもしくはその誘導体、またはラムドイドファージ、例えばラムダ、２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４、その他、もしくはその誘導体である。
【０１０１】
ウイルスコートタンパク質の例には、感染性タンパク質ＰＩＩＩ（ときにｐ３とも称される）、主要コートタンパク質ＰＶＩＩＩ、Ｓｏｃ（Ｔ４）、Ｈｏｃ（Ｔ４）、ｇｐＤ（バクテリオファージλ）、マイナーバクテリオファージコートタンパク質６（ｐＶＩ）（繊維状ファージ；J Immunol Methods.1999年12月10日;231(1-2):39-51頁）、Ｍ１３バクテリオファージ主コートタンパク質変異体（Ｐ８）（Protein Sci 2000年4月；9(4):647-54頁）が含まれる。融合タンパク質はファージの表面で提示されるが、適当なファージ系にはＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージ、Ｍ１３Ｒ４０８、Ｍ１３−ＶＣＳおよびＰｈｉ  Ｘ  １７４、ｐＪｕＦｏファージ系（J Virol.2001年8月;75(15):7107-13頁.v）、ハイパーファージ（Nat Biotechnol.2001年1月;19(1):75-8頁）が含まれる。好ましいヘルパーファージはＭ１３ＫＯ７であり、好ましいコートタンパク質はＭ１３ファージ遺伝子ＩＩＩコートタンパク質である。好ましい宿主は大腸菌、および大腸菌のプロテアーゼ欠損株である。ベクター、例えばｆｔｈ１ベクター（Nucleic Acids Res.2001年5月15日;29(10):E50-0）は、融合タンパク質の発現に役立つことがある。
発現ベクターは、ＣＤＲ含有融合ポリペプチド（例えば抗体の各サブユニットまたはその断片）をコードしているＤＮＡと融合した分泌シグナル配列も持つことができる。この配列は典型的には融合タンパク質をコードしている遺伝子の直ぐ５’側に位置し、したがって融合タンパク質のアミノ末端で転写される。しかし、あるケースでは、シグナル配列は分泌されるべきタンパク質をコードしている遺伝子の５’以外の位置にあることが証明された。この配列は、それが細菌細胞の内膜を横切って結合するタンパク質を対象とする。シグナル配列をコードしているＤＮＡは、シグナル配列を持つタンパク質をコードしている遺伝子のいずれかから、制限エンドヌクレアーゼ断片として得られる。原核生物の適当なシグナル配列は、例えば、LamBまたはOmpF(Wong他, Gene,68:1931頁(1983))、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡをコードしている遺伝子および他の遺伝子から得られるかもしれない。一実施態様では、本発明の実施のための好ましい原核生物シグナル配列は、Chang他,Gene 55:189頁(1987)、に記載されている大腸菌耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列及び／又はｍａｌＥである。
【０１０２】
上述のように、ベクターは、一般的に、融合ポリペプチドの発現を促進するためにプロモーターを含む。原核生物ベクターで最も一般的に使われるプロモーターには、ｌａｃ  Ｚプロモーター系、アルカリホスファターゼｐｈｏ  Ａプロモーター（Ａｐ）、バクテリオファージｌＰＬプロモーター（温度感受性プロモーター）、ｔａｃプロモーター（ｌａｃリプレッサーによって制御されるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーター）、トリプトファンプロモーターおよびバクテリオファージＴ７プロモーターが含まれる。プロモーターの総説に関しては、前出Sambrook他のセクション１７を参照。これらが最も一般的に使用されるプロモーターであるが、他の適当な微生物プロモーターも同様に使うことができる。
ベクターは、また、他の核酸配列、例えば、ｇＤタグ、ｃ−Ｍｙｃエピトープ、ポリ−ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）またはファージまたは細胞の表面で発現する融合タンパク質の検出または精製に役立つβ−ガラクトシダーゼタンパク質をコードしている配列を含むことができる。例えばｇＤタグをコードしている核酸配列は、また、融合タンパク質を発現する細胞またはウイルスの正または負の選択を可能にする。いくつかの実施形態では、ｇＤタグは好ましくはウイルスコートタンパク質構成成分に融合していない抗体可変ドメインと融合する。例えば、ポリヒスチジン標識をコードしている核酸配列は、免疫組織化学手法を使って特異的抗原と結合する抗体可変ドメインを含む融合タンパク質を同定するために役立つ。抗原結合の検出に役立つタグは、ウイルスコートタンパク質構成成分に融合していない抗体可変ドメイン、またはウイルスコートタンパク質構成成分に融合した抗体可変ドメインに融合することができる。
【０１０３】
本発明を実践するのに用いられるベクターの他の有用構成成分は、表現型選択遺伝子である。典型的表現型選択遺伝子は、宿主細胞に抗生物質耐性を与えるタンパク質をコードしている遺伝子である。実例として、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐｒ）およびテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔｒ）はこの目的のために容易に使用される。
ベクターは、独特の制限部位および抑制性終止コドンを含んでいる核酸配列も含むことができる。独特の制限部位は異なるベクターおよび発現系の間で抗体可変ドメインを移動させるために役立ち、特に細胞培養による完全長抗体または抗原結合断片の生産に役立つ。抑制性終止コドンは融合タンパク質の発現レベルを調節するのに役立ち、可溶性抗体断片の精製を容易にする。例えば、アンバー終止コドンはファージディスプレイを可能にするｓｕｐＥ宿主ではＧｌｎと解釈することができるが、非ｓｕｐＥ宿主ではそれはファージコートタンパク質と融合していない可溶性抗体断片を産生する終止コドンと解釈される。これらの合成配列は、ベクター内の１つまたは複数の抗体可変ドメインと融合させることができる。
【０１０４】
対象とする抗体配列、例えば変異体アミノ酸を有するＣＤＲをコードしている核酸がベクター系から容易に取り出されて他のベクター系に入れられるようにするベクター系を使うことがときに有用である。例えば、変異体アミノ酸を有する抗体または抗体可変ドメインをコードしている核酸配列の取り出しを容易にするために、適当な制限部位をベクター系に組み込むことができる。制限配列は、通常、効率的な切出しおよび新しいベクターへのライゲーションを容易にするために、ベクター内でユニークなものが選ばれる。抗体または抗体可変ドメインは、その後外来の融合配列、例えばウイルスコートタンパク質または他の配列タグなしでベクターから発現され得る。
抗体可変ドメインまたは定常ドメインをコードしている核酸（遺伝子１）とウイルスのコートタンパク質構成成分（遺伝子２）との間に、終結または終止コドンをコードしているＤＮＡを挿入することができ、そのような終結コドンにはＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）およびＵＧＡ（オペル）が含まれる。（Microbiology, Davis他, Harper & Row, New York, 1980年, 237頁, 245-47頁および374頁）。野生型宿主細胞で発現する終結または終止コドンは、遺伝子２タンパク質が結合しない遺伝子１タンパク質産物の合成をもたらす。しかし、抑制宿主細胞での増殖は検出可能な量の融合タンパク質の合成をもたらす。そのような抑制宿主細胞は公知であり、大腸菌抑制遺伝子株(Bullock他, Bio Techniques 5:376-379頁(1987))などが記載されている。そのような終結コドンを融合ポリペプチドをコードしているｍＲＮＡに入れるために、許容できるいかなる方法でも用いることができる。
【０１０５】
抑制性コドンは、抗体可変または定常ドメインをコードしている第１の遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードしている第２の遺伝子との間に挿入することができる。あるいは、抑制性終結コドンは、抗体可変ドメインの最後のアミノ酸トリプレットまたはファージコートタンパク質の最初のアミノ酸を置換することによって融合部位に隣接して挿入することができる。抑制性終結コドンは、二量体化ドメインのＣ末端またはその後に位置してもよい。抑制性コドンを含んでいるプラスミドがサプレッサー宿主細胞で増殖された場合、ポリペプチドおよびコートタンパク質を含んでいる融合ポリペプチドの検出可能な量が生産される。プラスミドが非サプレッサー宿主細胞で増殖された場合、抗体可変ドメインは挿入された抑制性トリプレットＵＡＧ、ＵＡＡまたはＵＧＡにおける終結のために、実質的にファージコートタンパク質と融合せずに合成される。非サプレッサー細胞では、抗体可変ドメインはそれを宿主メンブランに固定する融合ファージコートタンパク質が存在しないために、合成された後に宿主細胞から分泌される。
いくつかの実施形態では、多様化される（ランダム化される）ＣＤＲは、鋳型配列（本明細書では「終止鋳型」と呼ぶ）に組み込まれた終止コドンを持つことができる。この特徴は、関心の変異体アミノ酸の配列を含むオリゴヌクレオチドの取り込みのために、鋳型配列における終止コドンの修復の成功に基づき、多様化が成功した配列の検出と選択を可能にする。この特徴は、下記の実施例でさらに例示される。
【０１０６】
軽鎖および／または重鎖抗体可変または定常ドメインはさらなるペプチド配列に融合することもでき、このさらなるペプチド配列はウイルス粒子または細胞の表面での１つまたは複数の融合ポリペプチドの相互作用を可能にする。これらのペプチド配列は、本明細書では「二量体化ドメイン」と称す。二量体化ドメインは、少なくとも１つまたは複数の二量体化配列、またはシステイン残基を含んでいる配列を少なくとも１つ、あるいはこの両方共含むことができる。適当な二量体化配列には、疎水残基が一定の間隔をあけて存在し、各タンパク質の疎水残基の相互作用による二量体の形成を可能にする両親媒性のαヘリックスを有するタンパク質のそれらが含まれる。そのようなタンパク質およびタンパク質部分には、例えばロイシンジッパー領域が含まれる。二量体化ドメインは、また、１つまたは複数のシステイン残基を含むことができる（例えば、二量体化ドメイン内に抗体ヒンジ配列を含むことにより提供される）。システイン残基は、１つまたは複数のジスルフィド結合の形成による二量体化を可能にする。終止コドンが二量体化ドメインの後方に存在する一実施形態では、二量体化ドメインは少なくとも１つのシステイン残基を含む。二量体化ドメインは、好ましくは抗体可変または定常ドメインとウイルスコートタンパク質構成成分との間に位置する。
【０１０７】
場合によっては、ベクターは、例えばコートタンパク質に融合した重鎖および軽鎖可変部を含んでいる単鎖形態の単一の抗体ファージポリペプチドをコードする。これらのケースでは、ベクターは、ある種のプロモーターの制御下で１つの転写産物を発現する「一シストロン性」と考えられる。例えばベクターは、ＶＬおよびＶＨドメインの間にリンカーペプチドを有し、ＶＬおよびＶＨドメインをコードしている一シストロン性配列の発現を促進するためにプロモーター（例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはＴａｃプロモーター）を利用してもよい。このシストロン配列は、５’末端でシグナル配列（例えば大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列）に連結し、３’末端でウイルスコートタンパク質（例えばバクテリオファージｐＩＩＩタンパク質）のすべてまたは一部に連結する。本実施態様のベクターによってコードされる融合ポリペプチドは、本明細書では「ＳｃＦｖ−ｐＩＩＩ」と称す。いくつかの実施形態では、ベクターは第２の可変ドメイン配列（例えばＶＨ）とウイルスコートタンパク質配列との間のその３’末端に、二量体化ドメイン（例えばロイシンジッパー）をコードしている配列をさらに含むことができる。この二量体化ドメインを含んでいる融合ポリペプチドは、二量体化により２つのｓｃＦｖポリペプチドの複合体（本明細書では「（ＳｃＦｖ）２−ｐＩＩＩ」と称す）を形成することができる。
【０１０８】
その他の場合、重鎖および軽鎖の可変部は別々のポリペプチドとして発現され、このようにベクターは「二シストロン性」であり、別々の転写産物の発現を可能にする。これらのベクターでは、適当なプロモーター、例えばＰｔａｃまたはＰｈｏＡプロモーターは二シストロン性メッセージの発現を促すために利用する。例えば軽鎖可変および定常ドメインをコードしている第１のシストロンは、５’末端でシグナル配列、例えば大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に連結し、３’末端でタグ配列、例えばｇＤタグをコードしている核酸配列に連結している。例えば重鎖可変および定常ドメインＣＨ１をコードしている第２のシストロンは、５’末端でシグナル配列、例として大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列に連結し、３’末端でウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部に連結している。
二シストロン性メッセージ及びＦ(ａｂ’)２−ｐＩＩＩを表出するための好適なプロモーター、例えばＰｔａｃまたはＰｈｏＡ（ＡＰ）プロモーターを提供するベクターの一実施態様では、５’末端でシグナル配列、例えば大腸菌ｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と作用可能に連結し、３’末端でタグ配列、例えばｇＤタグをコードしている核酸配列と連結した軽鎖可変および定常ドメインをコードしている第１のシストロンの発現を促進する。第２のシストロンは、例えば５’末端でシグナル配列、例えば大腸菌のｍａｌＥまたは耐熱性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）シグナル配列と作用可能に連結した重鎖可変および定常ドメインをコードし、３’末端にはＩｇＧヒンジ配列およびロイシンジッパー配列、さらにその後方に少なくとも一部のウイルスコートタンパク質を含む二量体化ドメインを持つ。
【０１０９】
融合ポリペプチドの表出（提示、ディスプレイ）
ＣＤＲ含有ポリペプチド（例として抗体可変ドメイン）の融合ポリペプチドは、細胞、ウイルスまたはファジミド粒子の表面で様々な形式で提示することができる。これらの形式には、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ(ａｂ)断片およびこれらの断片の多価の形態が含まれる。例えば、多価の形態は、ＳｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ(ａｂ’)の二量体を含み、これらは本明細書では（ＳｃＦｖ）２、Ｆ(ａｂ)２およびＦ(ａｂ’)２とそれぞれ称す。多価の形態の提示は、それらが、通常低親和性クローンの同定をもたらし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にする複数の抗原結合部位を有することにおいて有益である。
バクテリオファージの表面で抗体断片を含んでいる融合ポリペプチドを提示する方法は当技術分野で公知であり、例えばＷＯ９２／０１０４７号および本明細書で記載されている。他の公開特許公報ＷＯ９２／２０７９１号；ＷＯ９３／０６２１３号；ＷＯ９３／１１２３６号および国際出願第９３／１９１７２号は関連した方法を記載しており、参照によりすべて本明細書に組み込まれている。他の刊行物は、ファージ表面で提示された様々な抗原に対する、人工的に再配置されたＶ遺伝子レパートリーによる抗体の同定を示した（例えば、H.R.Hoogenboom & G.Winter J.Mol.Biol.227, 381-388頁, 1992年；またＷＯ９３／０６２１３号およびＷＯ９３／１１２３６号で開示されている）。
【０１１０】
ベクターがｓｃＦｖ形式での提示のために構築される場合、このベクターは抗体可変軽鎖ドメインおよび抗体可変重鎖可変ドメインをコードしている核酸配列を含む。一般的には、抗体重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、ウイルスコートタンパク質構成成分に融合する。抗体可変ドメインの一方または両方は、少なくとも１つのＣＤＲ領域に変異体アミノ酸を持つことができる。抗体可変軽鎖をコードしている核酸配列は、ペプチドリンカーをコードしている核酸配列によって抗体可変重鎖ドメインに連結される。ペプチドリンカーは、一般的に約５から１５個のアミノ酸を含む。任意選択に、例えば精製または検出に役立つ標識をコードしている他の配列を、抗体可変軽鎖もしくは抗体可変重鎖ドメインのいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の３’末端に融合することができる。
ベクターがＦ(ａｂ)提示のために構築される場合、このベクターは抗体可変ドメインおよび抗体定常ドメインをコードしている核酸配列を含む。軽鎖可変ドメインをコードする核酸は、軽鎖定常ドメインをコードする核酸配列に融合される。抗体重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、重鎖定常ＣＨ１ドメインをコードする核酸配列に融合される。一般的には、重鎖可変および定常ドメインをコードしている核酸配列は、ウイルスコートタンパク質のすべてまたは一部をコードしている核酸配列に融合される。抗体軽鎖または重鎖の可変ドメインの一方または両方は、少なくとも１つのＣＤＲ領域に変異体アミノ酸を持つことができる。ある実施態様では、重鎖可変および定常ドメインは好ましくはウイルスコートタンパク質の少なくとも一部との融合体として発現され、軽鎖可変および定常ドメインは重鎖ウイルスコート融合タンパク質とは別々に発現される。重鎖および軽鎖は互いと結合し、その結合は共有結合でも非共有結合でもよい。任意選択に、例えば精製または検出に役立つポリペプチド標識をコードしている他の配列を、抗体軽鎖定常ドメインもしくは抗体重鎖定常ドメインのいずれかまたは両方をコードしている核酸配列の３’末端に融合することができる。
【０１１１】
ある実施態様では、好ましくは、二価の成分、例えばＦ(ａｂ)２二量体またはＦ(ａｂ’)２二量体が、粒子表面で変異体アミノ酸置換を有する抗体断片を提示するために使用される。Ｆ(ａｂ’)２二量体は一般的に溶相抗原結合検定でＦ(ａｂ)二量体と同じ親和性を持つことが分かっているが、Ｆ(ａｂ’)２の解離速度は高アビディティーのため低下している。したがって、二価の形態（例えばＦ(ａｂ’)２）は低親和性クローンの同定を可能にし、また選択過程で稀なクローンのより効率的な選別を可能にするので、特に有用な形態である。
【０１１２】
宿主細胞へのベクターの導入
本発明に従って記載されているように構築されたベクターは、増幅および／または発現のために宿主細胞に導入される。ベクターは、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿などを含む標準の形質転換法を使って、宿主細胞に導入することができる。ベクターがウイルスのような感染性の粒子であるならば、ベクター自体が宿主細胞に侵入する。遺伝子融合をコードする複製可能な発現ベクターを含んでいる宿主細胞のトランスフェクションおよび標準手法によるファージ粒子の生産は、融合タンパク質がファージ粒子の表面で提示されるファージ粒子を提供する。
複製可能な発現ベクターは、様々な方法を使用して宿主細胞に導入される。一実施形態では、ベクターはＷＯ００／１０６７１７号で記載されているようにエレクトロポレーション法を使って細胞に導入することができる。細胞は標準の培養液中で任意に約６〜４８時間（またはＯＤ６００＝０．６〜０．８になるまで）、３７℃で培養し、次にブロースを遠心分離して上清を取り出す（例えばデカンテーションにより）。初期の精製では、好ましくは緩衝液（例えば１．０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）の中に細胞ペレットを再懸濁し、次に再遠心分離を行い、上清を取り出す。得られた細胞ペレットを希釈したグリセリン（例えば５〜２０％ｖ／ｖ）の中に再懸濁し、再度再遠心分離をして細胞ペレットを形成し、上清を取り除く。最終的な菌体濃度は、所望の濃度に細胞ペレットを水または希釈したグリセリンの中に再懸濁することによって得られる。
【０１１３】
特に好ましい受容細胞は本発明のエレクトロポレーション応答能のある大腸菌株ＳＳ３２０である(Sidhu他, Methods Enzymol.(2000), 328:333-363頁)。大腸菌株ＳＳ３２０は、稔性エピソーム（Ｆ’プラスミド）またはＸＬ１−ＢＬＵＥをＭＣ１０６１細胞に移転するのに十分な条件の下で、ＭＣ１０６１細胞をＸＬ１−ＢＬＵＥ細胞と交接させて調製した。大腸菌株ＳＳ３２０は、１９９８年６月１８日、アメリカ基準株保存機構（ＡＴＣＣ）、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia USAに寄託され、寄託番号９８７９５が割り当てられた。この菌株でのファージ複製を可能にするいかなるＦ’エピソームでも、本発明で用いることができる。適当なエピソームはＡＴＣＣに預けられている株から入手可能であるし、または市販品を入手できる（ＣＪ２３６、ＣＳＨ１８、ＤＨＦ’、ＪＭ１０１、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、ＪＭ１０７、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、ＫＳ１０００、ＸＬ１−ＢＬＵＥ、７１−１８、その他）。
エレクトロポレーションでより高いＤＮＡ濃度（約１０倍）を使用すると、形質転換率が向上し、宿主細胞に形質転換されるＤＮＡの量が増加する。高い菌体濃度の使用も効率を高める（約１０倍）。移転されたＤＮＡ量の増加により、より大きな多様性を有し、複合ライブラリーのより多くの独特なメンバーを示すより大きなライブラリーが生じる。形質転換細胞は、通常、抗生物質を含む培地上の増殖によって選択される。
【０１１４】
選択した対象への結合体の選択（選別）とスクリーニング
方法論に様々な置換および変更を加えた、対象抗原結合体を同定するためのファージディスプレイの使用は、当技術分野で確立されている。一手法では、融合ポリペプチドをコードしている遺伝子融合体と作用可能に連結した転写調節要素を含む複製可能な変異体ベクターのファミリーを構築し、適当な宿主細胞に形質転換し、この形質転換細胞を培養して前記融合ポリペプチドをファージ粒子表面で提示するファージ粒子を形成し、その後選択の過程で結合しない粒子と比較して結合する粒子のサブセットを増加させる目的で、少なくとも粒子集団の一部が対象と結合するように組換え体ファージ粒子を対象抗原と接触させることによる選択または選別を伴うプロセスを行う。選択されたプールは、異なるかまたは同じストリンジェンシーで同じ対象をさらに１回選別するために、宿主細胞、例えば新鮮なＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を感染させて増幅することができる。得られた変異体のプールは、次に新規高親和性結合タンパク質を同定するために、対象抗原に対してスクリーニングされる。これらの新規高親和性結合タンパク質は、アンタゴニストまたはアゴニストなどの治療薬として、かつ／または診断薬および研究試薬として有用であり得る。
【０１１５】
変異体アミノ酸を含んでいる抗体可変ドメインのような融合ポリペプチドは、ファージ、ファジミド粒子または細胞の表面で発現され、次に融合ポリペプチド群の構成メンバーの、一般的に関心の抗原である対象抗原に結合する能力について選択および／またはスクリーニングをすることができる。対象結合体についての選択の方法は、タンパク質Ｌまたはファージ上で提示される抗体もしくは抗体断片と結合する標識特異抗体のような抗体可変ドメインと親和性を有する一般的なタンパク質上での選別も含み、これは正しくフォールドされた抗体断片（融合ポリペプチド）を提示するライブラリーメンバーを豊富にするために使うことができる。
標的（対象）タンパク質、例えば受容体は、天然源から単離することができ、または当技術分野で公知の手法による組換え方法により調製することができる。対象抗原としては、治療上関心のある多くの分子が含まれる。
親和性のための選択（選別）のために様々な方策を使うことができる。ある方策は固体担体方法またはプレート選別または固定化対象選別である。他の方策は、溶液−結合法である。
【０１１６】
固体担体方法については、対象タンパク質は当技術分野で公知である適当な固体または半固体マトリックス、例えばアガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、様々なアクリルコポリマー、メタクリル酸ヒドロキシアルキルゲル、ポリアクリルおよびポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性およびイオン性担体などに結合してもよい。マトリックスへの対象タンパク質の結合は、Methods in Enzymology, 44(1976)に記載されている方法、または当技術分野で公知の他の手段で達成することができる。
マトリックスへの対象抗原の結合の後、固定化された対象をファージ粒子集団の少なくとも１サブセットと固定化対象抗原との結合に適した条件下で、融合ポリペプチドを発現しているライブラリーと接触させる。通常、ｐＨ、イオン強度、温度などを含む条件は、生理学的条件を模倣する。前記固定化対象と結合する粒子（「結合体」）は、水洗により対象と結合しない粒子から分離する。洗浄条件は、高親和性結合体以外のすべてが取り除かれるように調節することができる。結合体は様々な方法によって固定化された対象から解離させることができる。これらの方法には野生型リガンド（例えば過剰な対象抗原）を使う競合的解離、ｐＨおよび／またはイオン強度の変更、ならびに当技術分野で公知の方法が含まれる。結合体の選択は、一般的に０．１ＭのＨＣｌなどの酸またはリガンドのような、適当な溶出材料によるアフィニティーマトリックスからの溶出を含む。リガンドの濃度を上昇させて溶出すると、提示されたより親和性の高い結合分子を溶出させることができた。
【０１１７】
結合体は単離してから細胞を結合体であるウイルス粒子（および、例えばウイルス粒子がファジミド粒子である場合は必要に応じてヘルパーファージ）に感染させることによって、適当な宿主細胞で再増幅させることができ、この宿主細胞は所望の融合ポリペプチドを提示する粒子の増幅に適した条件下で培養される。次にファージ粒子を採取し、対象抗原の結合体がいくらか豊富になるまで選択工程を１回または複数回繰り返し、選択または選別は何回でも利用できる。選択または選別方法の１つは、タンパク質Ｌまたは提示されるポリペプチドに存在するポリペプチドタグに対する抗体、例えばｇＤタンパク質またはポリヒスチジンタグに対する抗体のような一般の親和性タンパク質と結合する結合体を単離することを含むこともできる。
【０１１８】
本発明の１つの態様は、「溶液−結合方法」と呼ばれる新規選択法を用いた本発明のライブラリの選別を伴う。本発明は、従来の溶液選別方法よりも効率が非常に改善された溶相選別を可能にする。ランダムなライブラリーから元の結合体を見つけるため、あるいは特定の結合クローンまたはクローン群の親和性を改善することを目的としたライブラリーから改善された結合体を見つけるために溶液結合方法を用いてもよい。この方法は、複数のポリペプチド、例えばファージまたはファジミド粒子（ライブラリー）上で提示されるポリペプチドを、タグ分子で標識されたか融合された対象抗原と接触させることを含む。タグはビオチンまたは他の特異的結合体が入手できる部分でよい。溶相のストリンジェンシーは、第１の溶液結合相で濃度を段階的に低くした標識された対象抗原を用いて変化させることができる。さらにストリンジェンシーを高めるために、第１の溶液結合相の後に、第１の溶相での最初の標識された対象との結合の後に高濃度の標識されていない対象抗原を有する第２の溶相が続いてもよい。通常、標識対象の１００から１０００倍の非標識対象が第２相で使われる（含まれるならば）。第１の溶相のインキュベーション時間は、平衡に達するまで２、３分から１、２時間またはそれ以上の範囲である。結合速度の速い結合体には、この第１相において結合時間を短くする傾向がある、または短くすることが選択されうる。第２相のインキュベーションの時間および温度は、ストリンジェンシーを高めるために変化させることができる。これにより、対象から離れる速度（解離速度）が遅い結合体に対する選択の偏りが生じる。複数のポリペプチド（ファージ／ファジミド粒子上で提示された）を対象抗原と接触させた後に、標識対象と結合したファージまたはファジミド粒子を結合しないファージから分離する。結合の溶相からの粒子−対象混合物は、それを標識対象分子成分と接触させて短時間（例えば２〜５分間）標識対象分子と結合する分子との結合を可能にすることによって単離する。標識対象抗原の初期濃度の範囲は、約０．１ｎＭから約１０００ｎＭまでである。結合粒子を溶出して、次回の選別のために増殖させることができる。各回低い濃度の標識対象抗原を用いて選別を複数回繰り返すのが好ましい。
【０１１９】
例えば、約１００から２５０ｎＭの標識対象抗原を使った最初の選別または選択は広範囲の親和性を捕えるのに十分なはずであるが、この因子は経験的にかつ／または実践者の希望に沿うように決定することができる。２回目の選択では、約２５から１００ｎＭの標識対象抗原を使える。３回目の選択では、約０．１から２５ｎＭの標識対象抗原を使える。例えば、１００ｎＭの結合体の親和性を改善するためには、２０ｎＭの標識対象から始めて５および１ｎＭへと進め、次にさらに低い濃度、例えば約０．１ｎＭの標識対象抗原へ進めるのが望ましい。
従来の溶液選別法ではストレプトアビジンをコーティングしたビーズのようなビーズを使用するが、これは使用するのが非常に厄介であり、またファージ結合体の回収の効率が非常に低いことが多い。ビーズによる従来の溶液選別法は２〜５分よりもかなり長い時間を要し、高スループットの自動操作に適応させるのが上述の本発明より困難である。
本明細書で記載されているように、固体担体と溶液選別方法の組合せは、所望の特性を有している結合体を単離するために有利に使うことができる。対象抗原に対して２、３回選択／選別を繰り返した後、所望の性質／特性を有する特異的結合体を同定するために選択されたプールからの個々のクローンのスクリーニングを通常実行する。好ましくは、スクリーニングのプロセスは、ライブラリー候補物質の高スループットスクリーニングを可能にする自動化システムによって実行される。
【０１２０】
２つの主なスクリーニング方法を以下で記載する。しかし、当技術分野で公知の他の方法も本発明の方法で用いることができる。第１のスクリーニング法は固定化された対象抗原によるファージＥＬＩＳＡ検定を含み、この方法は非結合クローンからの特異的結合クローンの同定を可能にする。特異性は、対象でコーティングされたウェルおよびＢＳＡ、または他の非対象タンパク質でコーティングしたウェル上のクローンの同時検定で測定することができる。この検定は高スループットスクリーニングが自動化可能である。
一実施形態は、抗体可変ドメインのライブラリーから特異的対象抗原に結合する抗体可変ドメインを選択する方法を提供し、この方法は複数のポリペプチドを含む複製可能な発現ベクターのライブラリーを作製するステップと、前記ライブラリーを、結合に適した条件下で対象抗原および少なくとも１つの非対象抗原と接触させるステップと、前記ライブラリーのポリペプチド結合体を非結合体から分離するステップと、前記対象抗原と結合し、前記非対象抗原とは結合しない結合体を同定するステップと、この結合体を前記対象抗原から溶出するステップと、特異的抗原に結合する前記ポリペプチド結合体を含んでいる複製可能な発現ベクターを増幅するステップとを含む。
【０１２１】
第２のスクリーニング検定は低親和性クローンからの高親和性クローンのハイスループット選別を可能にする親和性スクリーニング検定法である。この検定では、各クローンはまずある濃度の対象抗原とある時間（例えば３０〜６０分）インキュベートするかまたはしないで、その後対象でコーティングしたウェルへ短時間（例えば５〜１５分）塗布する。次に結合したファージを通常のファージＥＬＩＳＡ法、例えば抗Ｍ１３  ＨＲＰコンジュゲートを用いて測定する。１つは対象でプリインキュベーションされ他のウェルは対象抗原でプリインキュベーションされていないが、この２つのウェルの結合シグナルの比率は親和性の指標である。第１のインキュベーションのための対象濃度の選択は、関心の親和性の範囲に依存する。例えば、１０ｎＭを超える親和性の結合体が所望であるならば、第１のインキュベーションでは１００ｎＭの対象がしばしば使われる。一旦結合体が特定の回の選別（選択）で検出されると、より高い親和性の結合体を同定するためにこれらのクローンは親和性スクリーニング検定でスクリーニングすることができる。
【０１２２】
前記選別／選択法のいずれの組合せもこのスクリーニング法と組み合わせることができる。例えば、一実施形態ではポリペプチド結合体は、まず固定化対象抗原への結合に関して選択される。前記固定化対象抗原と結合するポリペプチド結合体は、次に増幅して、この対象抗原との結合および非対象抗原への非結合に関してスクリーニングすることができる。特異的に対象抗原と結合するポリペプチド結合体を増幅する。これらのポリペプチド結合体は、次に複合体を形成するためにある濃度の標識された対象抗原と接触させることにより、より高い親和性に関して選択でき、この標識された対象抗原の濃度域は約０．１ｎＭから約１０００ｎＭであり、この複合体は対象抗原上の標識と結合する因子との接触によって単離される。このポリペプチド結合体は、次に標識された対象抗原から溶出され、また各回より低い濃度の標識された対象抗原を用いて選択を繰り返すこともできる。この選択方法を使用して単離された高親和性ポリペプチド結合体は、次に、本明細書中に記載のいくつか、当分野で公知の様々な方法を用いて高親和性に関してスクリーニングすることができる。
【０１２３】
これらの方法は、多数のクローンに対する長く、複雑な競合親和性検定を必要としないで、高親和性のクローンの検出を容易にする。多くのクローンに対して複雑な検定を行うことは手間が掛かり、選択による最良のクローンの検出に対してしばしば著しい障害となる。この方法は、類似した親和性の複数の結合体が選択プロセスから回収される場合の親和性の改善に特に役立つ。異なるクローンは、ファージまたはファジミド粒子上の発現／提示の効率が非常に異なることがある。より多く発現するクローンは、回収される可能性が高い。つまり、選択は変異体の提示または発現の量によって一方に偏らせることができる。本発明の溶液−結合選別方法は、高親和性結合体を見つけるための選択プロセスを改善することができる。この方法は、最良の結合体を迅速かつ容易にスクリーニングする際に著しく有利な親和性スクリーニング検定法である。
結合体が対象抗原への結合により同定された後、核酸を抽出することができる。抽出されたＤＮＡは次に大腸菌宿主細胞を形質転換するのに直接用いることができ、あるいは、コード配列を例えばＰＣＲで適当なプライマーを使って増幅し、典型的シークエンシング方法によって配列決定をすることができる。結合体の可変ドメインＤＮＡは制限酵素で消化し、次にタンパク質発現のためにベクターに挿入することができる。
【０１２４】
本発明の方法に従って生成した多様性のある制限配列を有するＣＤＲを持つポリペプチドを含む母集団を、図３、４、５、８に挙げるものを含む様々な標的に対する結合体を単離するために使用することができる。これらの結合体には制限コドンを用いて生成した多様化配列を含む一以上の変異型ＣＤＲが含まれるであろう。ある実施態様では、変異型ＣＤＲは、長さの異なるＣＤＲＨ３から生じる制限コドンセットへのアミノ酸置換及び／又はアミノ酸挿入によって生じた配列多様性を含むＣＤＲＨ３である。本発明の融合ポリペプチドを生成するために有用な例示的オリゴヌクレオチドには図２、９、１４に挙げるものが含まれる。一以上の変異型ＣＤＲを組み合わせてもよい。ある実施態様では、ＣＤＲＨ３のみが多様化される。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３を含む二以上の重鎖ＣＤＲが変異型である。他の実施態様では、ＣＤＲＨ３を除く一以上の重鎖ＣＤＲが変異型である。ある実施態様では、少なくとも一の重鎖及び少なくとも一の軽鎖ＣＤＲが変異型である。ある実施態様では、少なくとも１、２、３、４、５又はすべてのＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３が変異型である。
【０１２５】
場合によって、一以上の多様化した軽鎖ＣＤＲを一以上の多様化した重鎖ＣＤＲを含むポリペプチドの母集団から単離した新規の結合体と組み合わせることが有益であり得る。この過程は２工程プロセスを指す。２工程プロセスの実施例では、まず１つまたは複数のＣＤＲをランダム化することによって作製された１つまたは複数のライブラリー内の結合体（通常、低親和性結合体）を確定するが、各ライブラリーでランダム化されるＣＤＲは異なるか、あるいは、同じＣＤＲがランダム化される場合はこのＣＤＲがランダム化されて異なる配列を生成する。重鎖ライブラリーからの結合体は、次に例えばキュンケルなどの突然変異生成技術により、または新しい軽鎖ライブラリーを定常軽鎖だけを有する既存の重鎖結合体にクローニングすることによって（カットアンドペースト（例えば、異なるＣＤＲ配列をライゲーションすることによって））、軽鎖ＣＤＲにおけるＣＤＲ多様性でＣＤＲをランダム化することができる。プールは次に親和性の向上した結合体を同定するために、対象に対してさらに選別することができる。例えば、Ｈ１／Ｈ２／Ｈ３ライブラリーの選別から得られた結合体（例えば低親和性結合体）は、Ｌ１／Ｌ２／Ｌ３多様性のライブラリーと融合させて元の固定したＬ１／Ｌ２／Ｌ３と置き換えることができ、この新しいライブラリーは次に他の結合体セット（例えば高親和性結合体）を得るために対象とする標的に対してさらに選別される。様々な標的抗原の何れかに対してより高い結合親和性を示す新規の抗体配列を同定することができる。
いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドを含んでいるライブラリーは複数回選別され、各選別では前回の選別から得られた結合体を前回の対象抗原とは別の対象抗原と接触させる。望ましくは、しかし必ずしもそうとは限らないが、対象抗原は配列が相同的であり、例えば関連するが異なるポリペプチドのファミリーのメンバーであり、例えばそれには限定されないがサイトカイン（例えばαインターフェロン亜型）が含まれる。
【０１２６】
変異型ＣＤＲ含有ポリペプチドを含むライブラリーの作製
抗体可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲ内の溶媒と接触しうるかつ／または非常に多様な位置を突然変異させて、変異型ＣＤＲポリペプチドのライブラリーを作製することができる。いくつかまたはすべてのＣＤＲは、本発明の方法を使用して突然変異させることができる。いくつかの実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはＣＤＲＬ３およびＣＤＲＨ３の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより、またはＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の位置を突然変異させて単一のライブラリーを形成することにより多様な抗体ライブラリーを作製することが好ましいかもしれない。
例えばＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３の溶媒に露出しかつ／または非常に多様な位置に突然変異を有する、抗体可変ドメインのライブラリーを作製することができる。ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３で突然変異を有する他のライブラリーを作製することができる。所望の親和性の結合体を作製するために、これらのライブラリーを互いに一緒に使うこともできる。例えば、対象抗原への結合により重鎖ライブラリーを１回または複数回選択した後、軽鎖ライブラリーは結合体の親和性を増やすために、さらなる選択のために重鎖結合体の集団に戻すことができる。
【０１２７】
一実施形態では、重鎖配列の可変領域のＣＤＲＨ３領域において、元のアミノ酸を限定した一組の変異型アミノ酸で置換することによってライブラリーは作製される。本発明によると、このライブラリーは複数の抗体配列を含むことができ、その配列多様性は主に重鎖配列のＣＤＲＨ３領域にある。
一態様では、このライブラリーはヒト化抗体４Ｄ５配列またはヒト化抗体４Ｄ５配列のフレームワークアミノ酸配列に関連して作製される。好ましくは、このライブラリーは少なくとも重鎖の残基９５〜１００ａをＴＭＴ、ＫＭＴ又はＷＭＴコドンセットによってコードされるアミノ酸で置換することによって作製され、該ＴＭＴ、ＫＭＴ又はＷＭＴコドンセットはこれらの位置のあらゆる位置に対して限定した一組の変異体アミノ酸をコードするために用いられる。適当なオリゴヌクレオチド配列の例には、限定するものではないが、図２および図９に挙げるものが含まれ、本明細書で記載される基準に従って当業者が決定することができる。
【０１２８】
他の実施形態では、異なるＣＤＲＨ３デザインを利用して高親和性結合体を単離し、また様々なエピトープに対する結合体を単離する。ＣＤＲＨ３の多様化のために、長さの異なるＨ３を用いて別々に構築し、混合して、標的抗原に対する結合体を選択することができる。このライブラリーで生成されるＣＤＲＨ３の長さの範囲は３〜２０、５〜２０、７〜２０、５〜１８又は７〜１８個のアミノ酸であるが、これとは異なる長さの生成も可能である。また、前述のようにＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２内を多様化させることもできる。ライブラリの一実施態様では、図２及び図９に例示するオリゴヌクレオチドを用いてＨ１及びＨ２内を多様化する。配列が異なる他のオリゴヌクレオチドも用いることができる。実施者の実用的必要性及び希望に応じてオリゴヌクレオチドを単独に用いる、又は様々な組み合わせの何れかで用いることができる。ある実施態様では、重鎖ＣＤＲ内のランダム化した位置には図１に挙げるものが含まれる。
【０１２９】
本明細書中に記載のように、複数のライブラリーをプールして、固体担体選択および溶液選別方法を使用して選別することができる。複数の選別方策を使用してもよい。例えば、１つの変更は固体に結合した対象に対する選別、続いて融合ポリペプチド（例えば、抗ｇＤタグ）上に存在しているかもしれないタグに対する選別、続いて固体に結合した対象に対する他の選別を含む。別法として、ライブラリーをまず固体表面に結合した対象上で選別し、次に溶相結合法を濃度を段階的に下げた対象抗原を用いて行うことにより溶出した結合体を選別する。異なる選別方法を組み合わせて利用すると、高発現の配列だけが選択されるのを極小化して、いくつかの異なる高親和性クローンの選択を可能にする。
【０１３０】
前述のようなプールしたライブラリから単離した結合体の中から、ある場合では軽鎖内の多様性を限定することによってさらに親和性が改善しうることが明らかとなった。軽鎖の多様性は、必要でなくても以下のような実施態様で生成されうる：多様化するＣＤＲＬ１内の位置にはアミノ酸位置２８、２９、３０、３１、３２が含まれる；多様化するＣＤＲＬ２内の位置にはアミノ酸位置５０、５１、５３、５４、５５が含まれる；多様化するＣＤＲＬ３内の位置には９１、９２、９３、９４、９５、９７が含まれる。一実施態様では、ランダム化した位置は図１３に挙げるものである。
この実施態様のライブラリから単離した親和性の高い結合体は、細菌及び真核生物の細胞培養において効率よく容易に生成される。ｇＤタグ、ウイルスコートタンパク質成分配列などの配列を容易に除去したり、又は定常領域配列内に付加するようにベクターを設定して、完全長抗体又は抗原結合断片を効率よく生成することができる。
本発明の方法に従ってコドンセットとＣＤＲの任意の組み合わせを多様化することができる。様々なＣＤＲの組み合わせ内の好適なコドンの例を図２、６、９、１３に挙げる。
【０１３１】
（ベクター、宿主細胞及び組換え方法）
本発明の抗体ポリペプチドの組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物（一般的に哺乳動物）由来の細胞である。
【０１３２】
（原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成）
ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能（異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方）及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン（Ａｍｐ）及びテトラサイクリン（Ｔｅｔ）耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
【０１３３】
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン（翻訳単位）対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流（５'）に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０１３４】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター（例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター）も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる（Siebenlist等 (1980) Cell 20:269）。
【０１３５】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる（つまりシグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０１３６】
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する（例として大腸菌ｔｒｘＢ−系）。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
本発明は、発現されるポリペプチド成分の量的割合を本発明の抗体の分泌及び好適な集積効率が最大となるように調節することができる発現系を提供する。ポリペプチド成分の翻訳強度を同時に調節することによって少なくともある程度その調節が達成される。
【０１３７】
翻訳強度を調節する一つの方法は、Simmons等の米国特許第５８４０５２３号に開示されている。このアプローチはシストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。与えられたＴＩＲに対して、ある範囲の翻訳強さを持つ一群のアミノ酸又は核酸配列変異体をつくり出すことができ、それによって、所望の発現レベルの特異的鎖に対してこの因子を調節するための簡便な手段を提供する。ＴＩＲ変異体はアミノ酸配列を改変することができるコドン変化を生じる一般的な突然変異誘発法によって産生することができるが、ヌクレオチド配列のサイレント変化が好ましい。ＴＩＲの変異には、例えばシグナル配列の変更と共に、シャイン-ダルガーノ配列の数又は間隔の変更が含まれうる。変異体シグナル配列を作成するためのある方法はシグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（つまり変化がサイレントである）コード配列の最初での「コドンバンク」の産生である。これは、各コドンの第三のヌクレオチド位置を変化させることによって、達成できる；加えて、幾つかのアミノ酸、例えばロイシン、セリン、及びアルギニンはバンクの作製に複雑さを付加し得る複数の第一及び第二の位置を有している。この突然変異誘発の方法はYansura等(1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol. 4:151-158に詳細に記載されている。
好ましくは、そこの各シストロンに対してある範囲のＴＩＲ強さを有する一群のベクターが産生される。この制限された群は各鎖の発現レベルと様々なＴＩＲ強さの組合せ下で所望の抗体産物の収量の比較をもたらす。ＴＩＲ強さはSimmons等の米国特許第５８４０５２３号に記載されているレポーター遺伝子の発現レベルを定量することによって決定することができる。翻訳強度を比較することによって、所望の個々のＴＩＲｓが選択されて、本発明の発現ベクターコンストラクト中で組み合わされる。
【０１３８】
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属（例えば大腸菌）、バシラス属（例えば枯草菌）、エンテロバクター属、シュードモナス種（例えば緑膿菌）、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans）、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bassら., Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０１３９】
抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地（ＬＢ）プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
【０１４０】
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である（例として、Simmonsら., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照）。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
【０１４１】
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
【０１４２】
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー源）を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
【０１４３】
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ）又はＦｋｐＡ（シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ）のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
発現された異種タンパク質（特にタンパク分解を受けやすいもの）のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
【０１４４】
抗体精製
ある実施態様では、本明細書に記載の生成した抗体タンパク質をさらに精製して、更なるアッセイ及び使用のために実質的に均一な調製物を得る。当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を用いたゲル濾過法。
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark ら (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【０１４５】
真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
（ｉ）シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
【０１４６】
（ｉｉ）複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
（ｉｉｉ）選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である（例として、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-９０９６）。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１４７】
（ｉｖ）プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターにょって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞中でのヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照のこと。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０１４８】
（ｖ）エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０１４９】
（ｖｉ）転写終結成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０１５０】
（ｖｉｉ）宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０１５１】
（ｖｉｉｉ）宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１５２】
（ｉｘ）抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０１５３】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸＴＭ樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラム）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体および混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度（例として、約０−０．２５Ｍ塩）の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【０１５４】
活性のアッセイ      
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。
精製された免疫グロブリンは、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された免疫グロブリンはその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の免疫グロブリンはその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、エライザ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を使用する任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。
【０１５５】
一実施態様では、本発明はすべてではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体を考慮し、このことによって抗体のインビボ半減期が重要なある種のエフェクター機能（補体又はＡＤＣＣなど）が不要で有害である多くの手法の所望する候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性が維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している（すなわちＡＤＣＣ活性をほとんど欠損している）が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣに関与している第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現しており、その一方で単核細胞はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現している。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes ら. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro ら., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法、例えば実施例の項目で示す方法を用いて行うことができる。
【０１５６】
ヒト化抗体
本発明は、ヒト抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は当分野でよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくらかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワークとして受け入れる(Simsほか, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Prestaほか, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１５７】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、一方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１５８】
抗体変異体
一態様では、本発明は、Ｆｃ領域を含むＦｃポリペプチドの作用面内に修飾を有する抗体断片を提供するものであり、ここでいう修飾によって異種性二量体化を容易にする及び／又は促進される。この修飾は、第一Ｆｃポリペプチド内への隆起と第二Ｆｃポリペプチド内への腔の導入を含むものであり、ここでいう隆起は第一Ｆｃポリペプチドと第二Ｆｃポリペプチドの複合体化を促進するために腔内に位置する。これらの修飾を有する抗体の生成方法は当分野で公知であり、例えば米国特許第５，７３１，１６８号に記載されている。
ある実施態様では、本明細書中に記載の抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせをその最終コンストラクトに達するまでなされることによって最終コンストラクトが所望の特徴を有する。配列を作製すると同時に目的の抗体アミノ酸配列にアミノ酸修飾を導入するのがよい。
【０１５９】
突然変異誘発の好ましい位置である抗体の所定の残基又は領域の特定のために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）に置換され、アミノ酸と抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精製される。しかして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を持つ抗体ないし細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素(例えばＡＤＥＰＴ)又はポリペプチドへの、抗体のＮ又はＣ末端への融合物を含む。
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置換突然変異に対して最も興味深い部位は高頻度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考えられる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表２に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に「例示的置換」と名前を付け、又はアミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてもよい。
【０１６０】
2007501011.tif 000003
【０１６１】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(1) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) 
(2) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) 
(3) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づくグループに分けられる：
(1) 疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(2) 中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(3) 酸性：Asp, Glu；
(4) 塩基性：His, Lys, Arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(6) 芳香族：Trp, Tyr, Phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、保存的置換部位又はより好ましくは残りの（非保存的）部位内に置換された残基を導入してもよい。
【０１６２】
ある型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１６３】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾（例えば、置換）を有するヒトＦｃ領域配列（例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、ＷＯ９９／５１６４２などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）を変更する（すなわち改良又は減少する）結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；及びWO94/29351を参照。
【０１６４】
免疫コンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素（例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち放射性コンジュゲート）などの細胞毒性剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲート又は抗体−薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）に関する。
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、論理的に腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwinら., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowlandら., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowlandら., (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liuら., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lodeら (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinmanら (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０１６５】
ゼバリン(ZEVALIN)（登録商標）（イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec）は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wisemanら (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wisemanら (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzigら (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球（ＮＨＬ）に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)（登録商標）（ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals）は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として２０００年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ（ＡＥ）及びモノメチルアウリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌細胞上のルイスＹに特異的）及びｃＡＣ１０（血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的）(Doroninaら (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０１６６】
このような免疫複合体（免疫コンジュゲート）の生成に有用な化学治療薬を上に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（PAPI、PAPII、及びPAP-S）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開９４／１１０２６参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０１６７】
メイタンシン及びメイタンシノイド
一実施態様では、本発明の抗体(完全長又は断片)は一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。
【０１６８】
メイタンシノイド-抗体コンジュゲート
治療指標を改善する試みにおいて、メイタンシン及びメイタンシノイドは、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体と結合している。メイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲート及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第５，２０８，０２０号、同５，４１６，０６４号、欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有する免疫コンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合している免疫コンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０１６９】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲート(免疫コンジュゲート)
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。
【０１７０】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施態様において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０１７１】
カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０１７２】
他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)より)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成される免疫コンジュゲートをさらに考察する。
【０１７３】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０１７４】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの４６７−４９８頁を参照。
【０１７５】
抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート（ＡＤＣ）において、抗体（Ａｂ）を、リンカー（Ｌ）を介して、一つ以上の薬剤部分（Ｄ）、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態および試薬を用いて調製されうる：(１)共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(２)共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。
Ａｂ−（Ｌ−Ｄ）ｐ            Ｉ
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオールおよび水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群およびリンカー試薬により共有結合を形成することができる：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ（ジチオトレイトール）による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン（トラウトの試薬）を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。
【０１７６】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する（リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基を用いて反応させることができる）ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；US 5362852)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステルおよびアリールヒドラジド基：(ｉ)活性エステル（例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸および酸ハロゲン化物）；(ｉｉ)アルキルおよびベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(ｉｉｉ)アルデヒド、ケトン、カルボキシルおよびマレイミド基、が含まれる。
【０１７７】
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０１７８】
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーかランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１７９】
医薬製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより（Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A. 編 (1980)）、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１８０】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences １６版, Osol, A.編 (1980)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０１８１】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【０１８２】
使用
例えば、本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法で用いてもよい。本発明の抗体は、インビトロ、エクスビボ及び／又はインビボで特異的抗原活性を部分的に又は完全にブロック（遮断）するアンタゴニストとして用いることができる。さらに、本発明の少なくともいくつかの抗体は、他の種から抗原活性を中和することができる。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含んでいる細胞培養物中、患者、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類対象動物（例えばチンパンジ、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよび赤毛猿、ブタ又はマウス）の特異的抗原活性を阻害するために用いることができる。一実施態様において、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように抗原と抗体とを接触させることによって抗原活性を阻害するために用いることができる。抗原はヒトタンパク質分子であることが好ましい。
一実施態様において、本発明の抗体を抗原活性が有害である疾患に罹患している対象体の抗原を阻害する方法に用いることができ、その方法は対象体の抗原活性が阻害されるように本発明の抗体を対象体に投与することを含む。好ましくは、抗原はヒトタンパク質分子であり、対象体は患者である。あるいは、対象体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現する哺乳動物でありうる。また更に、対象体は、抗原が導入された哺乳動物でありえる（例えば、抗原の投与や、抗原導入遺伝子の発現による）。本発明の抗体は、治療的目的のために患者に投与することができる。さらに、本発明の抗体は、免疫グロブリンが獣医学の分野で、又はヒト疾患の動物モデルとして交差反応する抗原を発現する人間以外の哺乳動物（例えば霊長類、ブタ又はマウス）に投与することができる。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性（例えば用量のテストおよび投与の時間経過）を評価するために有効であるかもしれない。治療的に有効である本発明の遮断抗体には、例えば、限定するものではなく、抗ＨＥＲ２、抗ＶＥＧＦ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ１１、抗インターフェロン、抗インターフェロンレセプタ、抗肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、抗ｃ-ｍｅｔおよび抗組織因子抗体が含まれる。本発明の抗体は一以上の抗原分子の異常発現及び／又は活性が関与する疾患、疾病又は症状、の治療、阻害、経過を遅延、再発を予防／遅延、寛解、又は予防に用いることができる。この疾患、疾病又は症状には、限定するものではないが、悪性及び良性の腫瘍；非白血病及びリンパ系の悪性腫瘍；神経系、神経膠、星状膠、視床下部、他の腺性、マクロファージ性、上皮性、間質性、胞胚腔性の疾患；及び炎症性、血管形成性、免疫系の疾患が含まれる。
【０１８３】
一態様では、本発明の遮断抗体はリガンド抗原に特異的で、リガンド抗原を伴うリガンド-レセプタ相互作用をブロックするかまたは妨げることによって、対応するシグナル経路および他の分子又は細胞性の現象を阻害することによって抗原活性を阻害する。また、本発明は必ずしもリガンド結合を阻害するというわけではなくて、レセプター活性化を妨ぐレセプター特異的な抗体を特徴とし、それによって通常リガンド結合によって開始する任意の応答を阻害する。また、本発明は、好ましくは又は排他的にリガンド-レセプター複合体と結合する抗体を包含する。また、本発明の抗体は、特定の抗原レセプターのアゴニストとして作用し、それによって、リガンド媒介性のレセプター活性の活性化を完全に又は部分的に潜在化、亢進又は活性化する。
ある実施態様では、細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなる免疫コンジュゲートを患者に投与する。ある実施態様では、免疫コンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際の免疫コンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤（例えばメイタンシノイド又はカリケアマイシン）、放射性同位元素、又はＲＮＡ分解酵素ないしＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０１８４】
本発明の抗体は、単独で、または、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤（一又は複数）（化学療法剤の混合を含む）、他の細胞障害性剤（一又は複数）、抗血管形成剤（一又は複数）、サイトカインおよび／または増殖阻害性剤（一又は複数）と同時に投与してもよい。本発明の抗体が腫瘍成長を阻害する場合、腫瘍成長を阻害する一つ以上の他の治療薬と組み合わせることが特に望ましい。例えば、本発明の抗体は、処置、例えば結腸直腸癌、転移性乳癌および腎臓癌を含む本明細書中に記載の何れかの疾患の治療に、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばアバスチン）及び／又は抗ＥｒｂＢ抗体（例えばハーセプチン（登録商標）抗ＨＥＲ2抗体）を組み合わせてもよい。あるいは又は加えて、放射線療法（例えば、外部光線照射、又は放射性標識した抗体などの作用剤を用いた治療）を患者に併用してもよい。上記の併用治療には、併用投与（２以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される）及び別々の投与、別々の場合には、本発明の抗体は補助治療（一又は複数）の前及び／又はその後に投与することができる。
本発明の抗体（及び補助治療薬）は、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与を含む任意の好適な手段によって投与する。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、又は皮下的な投与を含む。加えて、抗体を、特に抗体の用量を減少して、パルス注入によって好適に投与する。投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射によって、好適な任意の方法投与することができる。
【０１８５】
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、および医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するかまたは治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の１〜９９％で用いる。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は（単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合）、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を（又はそれらを組み合わせて）患者に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい（例えば患者に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される）。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０１８６】
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器の又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、それのみによって又は他の組成物と組み合わせて症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる）。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）組成物を中に収容し、その組成物が本発明の抗体を含む第一の容器と；（ｂ）組成物を中に収容し、その組成物が更なる細胞毒性剤を含む第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二抗体組成物を特定の症状、例えば癌の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の（又は第三の）容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１８７】
一般的に本発明を記載したものであって、同様に、限定を意図するのではなく例としてあげる以下の実施例を参照することによって容易に理解しうるであろう。
【実施例】
【０１８８】
実施例１  Ｔｙｒ又はＳｅｒのみでランダム化したＣＤＲ残基を有するファージディスプレイＦａｂライブラリの構築
Ｆａｂ重鎖及び遺伝子３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメイン間に挿入したロイシンジッパードメインによって二量体化した二価のＦａｂ分子を表出するファジミドベクターを用いて、ファージディスプレイＦａｂライブラリを構築した。このベクターは図１８に示す配列（配列番号１４）を含む。前記ベクター（図１９に概略的に示す）はＩＰＴＧ誘導性Ｐｔａｃプロモータ制御下にヒト化抗体４Ｄ５可変ドメインを有する。ヒト化抗体４Ｄ５は、主に重鎖及び軽鎖中のヒトコンセンサス配列フレームワーク領域と、Ｈｅｒ-２に特異的なマウスモノクローナル抗体のＣＤＲ領域を有する抗体である。抗Ｈｅｒ-２抗体の作製方法及び可変ドメイン配列の同定は、米国特許第５８２１３３７号及び同第６０５４２９７号に示される。
【０１８９】
２つのライブラリを構築した。ライブラリＹＳ-Ａは３つすべての重鎖ＣＤＲにランダム化した残基を有するように、一方ライブラリＹＳ-Ｂは３つすべての重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲ３にランダム化した残基を有するように構築した。ランダム化した特定の残基を図１に示す。
ランダム化した各々の位置の野生型コドンを、等モル比のＴｙｒ及びＳｅｒをコードする縮重ＴＭＴコドン（等モル比のＭ＝Ａ／Ｃ）に置換した。加えて、ＣＤＲＨ３の長さを位置１０１〜１０７の７野生型コドンを異なる数のＴＭＴコドン（ライブラリＹＳ-Ａは７〜２０、ライブラリＹＳ-Ｂは７〜１５）で置換したオリゴヌクレオチドを用いて長さを変えた。加えて、ライブラリＹＳ-ＢのＣＤＲＬ３をランダム化して、５０％のライブラリメンバーが位置９１を欠損し、残りの５０％は位置９１に野生型のＧｌｎ残基を含むようにした。
【０１９０】
既に記載の方法(Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C. & Wells, J. A., Methods Enzymol. (2000), 328, 333-363)とKunkel法(Kunkel, T. A., Roberts, J. D. & Zakour, R. A., Methods Enzymol.  (1987), 154, 367-382)を用いてライブラリを構築した。Ｆａｂディスプレイベクターの特定の型である「停止鋳型」を用いて、ライブラリＹＳ-Ａ及びＹＳ-Ｂの両方を作製した。重鎖の位置３０、３３、５２、５４、５６、５７、６０、１０２、１０３、１０４、１０７、１０８にＴＡＡ停止コドンを挿入したｐＶ０３５０-４と称するファジミド鋳型（図２４に記載の配列、配列番号５を含むファジミドベクター）を用いた。軽鎖ＣＤＲ３には停止コドンを導入しなかった。多様化させる位置を縮重ＴＭＴコドンで突然変異させたオリゴヌクレオチドを用いて、ＣＤＲ多様化の導入と停止コドンの修復を同時に行った。オリゴヌクレオチド配列を図２に示す。両方のライブラリとも、オリゴヌクレオチドＨ１及びＨ２それぞれを用いてＣＤＲ-Ｈ１とＣＤＲ-Ｈ２に多様化を導入した。ライブラリＹＳ-Ａは、オリゴヌクレオチドＨ３−７、Ｈ３−８、Ｈ３−９、Ｈ３−１０、Ｈ３−１１、Ｈ３−１２、Ｈ３−１３、Ｈ３−１４、Ｈ３−１５、Ｈ３−１６、Ｈ３−１７、Ｈ３−１８、Ｈ３−１９及びＨ３−２０の等モル混合物を用いてＣＤＲ−Ｈ３を多様化した。ライブラリＹＳ−Ｂは、オリゴヌクレオチドＨ３−７、Ｈ３−８、Ｈ３−９、Ｈ３−１０、Ｈ３−１１、Ｈ３−１２、Ｈ３−１３、Ｈ３−１４及びＨ３−１５の等モル混合物を用いてＣＤＲ-Ｈ３を多様化した。ライブラリＹＳ-Ｂは、オリゴヌクレオチドＬ３ａ及びＬ３ｂの等モル混合物を用いてＣＤＲ-Ｌ３を多様化した。ランダム化するすべてのＣＤＲの突然変異オリゴヌクレオチドを単一の突然変異誘発反応に同時に入れて、すべての突然変異オリゴヌクレオチドの同時移入により各々の位置を所望のように多様化すると同時にすべてのＴＡＡ停止コドンを修復させ、ホモ二量体化したロイシンジッパーとＰ３Ｃに融合したＦａｂライブラリメンバーをコードするオープンリーディングフレームを生成した。
突然変異誘発反応物を大腸菌ＳＳ３２０内に電気穿孔法にて導入し(Sidhu ら., 上掲)、形質転換細胞をＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて一晩培養して、前記ファジミドＤＮＡを包含し、その細胞表面上にＦａｂフラグメントを表出したファージ粒子を生成した。各ライブラリは５×１０９の一致しないメンバーを含有する。
【０１９１】
実施例２  ナイーブライブラリＹＳ-Ａ及びＹＳ-Ｂからの特異的抗体の選別
ライブラリＹＳ-Ａ又はＹＳ-Ｂ（実施例１）のファージについて結合選別操作を繰り返して、対象とする標的に結合するクローンを濃縮した。各ライブラリの８つの標的タンパク質：ヒトＶＥＧＦ、マウスのＶＥＧＦ、ニュートラビジン、アポトーシスタンパク質（ＡＰ）、マルトース結合タンパク質、エルビン-ＧＳＴ融合及びインスリンについて別々に解析した。この結合選別は既に記載の方法（Sidhuら、上記）に従い行った。
捕獲標的（５μｇ／ｍＬ）にてＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートを４℃で一晩コートし、Superblock ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）(Pierce)で２時間ブロックした。既に記載したように（Sidhuら、上記）、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、Superblock ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。上記コートしたイムノプレートにファージ溶液（１０１２ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１Ｍ  ＨＣｌにて結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して５回選別操作を行い、各回、Superblock ＴＢＳにてコートした標的タンパク質又は空のウェルの何れかに結合するファージの力価を測定した。空のウェルに結合したファージの力価で割った標的コートウェルに結合したファージの力価を、標的タンパク質に特異的に結合するファージプールを定量化するために用いた濃縮率として定義した；大きな濃縮率は特異性が高い結合であることを表す。第３、４又は５回目の選別で得られた濃縮率を図３に示す。
【０１９２】
各回の選別から得た個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＶＣＳを添加した５００μＬの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて培養し、培養液上清をファージＥＬＩＳＡ(Sidhuら., 上掲)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイＦａｂを検出した。ＢＳＡコートプレートと比較して標的コートプレート上で少なくとも１５倍より大きなＥＬＩＳＡシグナルを呈するファージクローンを特異的結合体として定義した。個々のクローンを、ヒトＶＥＧＦに対する結合について２回選別した後、又は、他の標的タンパク質への結合について５回選別した後にスクリーニングした。これらのデータを用いて特異的な結合体の割合を算出した。各々の標的タンパク質に対する各々のライブラリの結果を図４に示す；ＭＢＰ２に関するＹＳ-Ａライブラリを除いて、各々のライブラリが各々の標的タンパク質に対して結合体を生産したことが分かる。
特異的な結合体を表している個々のクローンについてＤＮＡ配列分析行い、いくつかの標的についてランダム化したＣＤＲ位置の配列を図５に示す。各々の標的タンパク質について、ランダム化した位置にＴｙｒ又はＳｅｒだけを含んだ特異的な結合体を選択することが可能であったことがわかる（しかしながら、おそらくオリゴヌクレオチド内の不純物のためにライブラリ構築中に生じたと思われる設定していない突然変異がいくつかみられた）。さらに、特異的な結合体の配列は、選択された標的タンパク質に特有のものであった。
【０１９３】
２つの抗ＶＥＧＦ結合体は、ｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦに対しての親和性について試験した。ＢＩＡｃｏｒｅデータを、Chenら., J Mol Biol. (1999), 293(4): 865-81に従って得た。簡潔にいうと、ｈＶＥＧＦおよびｍＶＥＧＦに対するｈＶＥＧＦ結合体の結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-２０００表面プラスモン共鳴系(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いて測定した結合定数及び解離速度定数から算出した。バイオセンサチップは、供給元(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)の指示に従って、Ｎ-エチル-Ｎ´-（３-ジメチルアミノプロピル）-カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ-ヒドロキシスクシニミド（ＮＨＳ）を用いてＶＥＧＦの共有結合的結合を活性化した。ｈＶＥＧＦ又はｍＶＥＧＦは、１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４．８にバッファー交換して、およそ３０ｍｇ／ｍｌまで希釈した。等量のＶＥＧＦを、結合したタンパク質のおよそ２００〜３００の応答単位（ＲＵ）に達成するように、２μＬ／分の流速で、注入した。遮断剤として、１Ｍエタノールアミンの溶液を注入した。動態学的な測定のために、２倍の階段希釈をしたＦａｂを２５℃で１０μＬ／分の流速でＰＢＳ／ツイーン緩衝液に注入した（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝食塩水）。平衡解離定数、表面プラスモン共鳴測定値からのＫｄ値をｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出した。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭデータは図２３に要約した。
上述のように(Sidhuら., 上掲)、選択した抗ＡＰクローンのＩＣ５０値をファージＥＬＩＳＡによって測定した。その値を図１１に示す。
【０１９４】
実施例３  ４のアミノ酸コード化の４単位(tetranomial)コドンでランダム化したＣＤＲ残基を有するファージディスプレイＦａｂライブラリ（Ｆ０５０５）の構築
Ｆａｂ重鎖及び遺伝子３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメイン間に挿入したロイシンジッパードメインによって二量体化した二価のＦａｂ分子を表出するように設定した前述のファジミドを用いて、実施例１に記載のようにファージディスプレイライブラリを構築した（実施例１に記載のように）。ランダム化した重鎖のＣＤＲ位置を図１に示す。４つのアミノ酸のみをコードする４単位のコドンでＣＤＲ位置をランダム化するように設定したそれぞれの突然変異誘発反応によって、１１の別々の突然変異誘発反応を行った。各突然変異誘発反応では、複数のＣＤＲ位置をただ一つのタイプの４単位コドンで同時に置き換えた。１１の突然変異反応に用いた１１個の４単位コドンとそれらがコードするアミノ酸を図６に示す。それぞれの突然変異誘発のために、３つのうちの１つの重鎖ＣＤＲを多様化させるようにそれぞれ設定して３つの変異原性オリゴヌクレオチドを用いた。オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す：
【０１９５】
ＣＤＲ-Ｈ１：ＧＣＡ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＣ  ＸＸＸ  ＡＴＴ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＡＴＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＣＧＴ（配列番号８）
ＣＤＲ-Ｈ２：ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＸＸＸ  ＡＴＴ  ＸＸＸ  ＣＣＡ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＧＧＴ  ＸＸＸ  ＡＣＴ  ＸＸＸ  ＴＡＴ  ＧＣＣ  ＧＡＴ  ＡＧＣ  ＧＴＣ（配列番号９）
ＣＤＲ-Ｈ３：ＧＴＣ  ＴＡＴ  ＴＡＴ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＸＸＸ  ＡＴＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ（配列番号１０）
各オリゴヌクレオチドの「ＸＸＸ」は野生型のコドンが図６に示す４単位コドンの一つに置き換わった縮重コドンを示す。
１１の突然変異誘発反応物をプールして、大腸菌ＳＳ３２０内に電気穿孔法にて導入し(Sidhu ら., 上掲)、形質転換細胞をＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて一晩培養して、前記ファジミドＤＮＡを包含し、その細胞表面上にＦａｂフラグメントを表出したファージ粒子を生成した。各ライブラリは２．６×１０１０の一致しないメンバーを含有する。これをライブラリＦ０５０５とした。
【０１９６】
実施例４  ４単位ナイーブライブラリＦ０５０５からの特異的抗体の選別
ライブラリＦ０５０５（実施例３）のファージについて結合選別操作を繰り返して、異なる４つの標的；ＩＧＦ、ｈ-ＶＥＧＦ、抗ｈＧＨ、ｈＧＨ結合タンパク質に結合するクローンを濃縮した。この結合選別は既に記載の方法（Sidhuら、上記）に従って行った。
捕獲標的（５μｇ／ｍＬ）にてＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートを４℃で一晩コートし、ＢＳＡ(Sigma)で２時間ブロックした。既に記載したように（Sidhuら、上記）、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。上記のコートしたイムノプレートにファージ溶液（〜１０１２ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１Ｍ  ＨＣｌにて結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して４回選別操作を行った。第２及び第３回目の選別から得た個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＶＣＳを添加した５００μＬの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて培養し、培養液上清をファージＥＬＩＳＡ(Sidhuら., 上掲)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイＦａｂを検出した。ＢＳＡコートプレート上のシグナルと比較して標的コートプレート上で少なくとも１０倍より大きなＥＬＩＳＡシグナルを呈する場合にクローンを特異的結合体とした。各々の選別と個々の標的についての特異的な結合体の数を図７に表で示す。
特異的なクローンについてＤＮＡ配列分析を行った。それぞれの異なる配列のライブラリ起源を決定して、図８に示した。
【０１９７】
実施例５  ファージディスプレイＦａｂライブラリＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂの構築
Ｆａｂ重鎖及び遺伝子３微量コートタンパク質（Ｐ３Ｃ）のＣ末端ドメイン間に挿入したロイシンジッパードメインによって二量体化した二価のＦａｂ分子を表出するように設定した前述のファジミドを用いて、実施例１に記載のように２つのファージディスプレイライブラリ（ＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂ）を構築した（実施例１に記載のように）。ランダム化した重鎖のＣＤＲ位置を図１に示す。オリゴヌクレオチド配列を図９に示す。
ライブラリＹＡＤＳ-Ａについて、２つの別々の突然変異誘発反応を行った。はじめの反応では、オリゴヌクレオチドＹＡＤＳ-Ｈ1、ＹＡＤＳ-Ｈ2及びＹＡＤＳ-Ｈ3-７を用いてそれぞれＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３を多様化した。これによって、４つのアミノ酸チロシン、アラニン、アスパラギン酸及びセリンをコードする縮重コドンを導入した。第二の反応では、オリゴヌクレオチドＹＴＮＳ-Ｈ1、ＹＴＮＳ-Ｈ2及びＹＴＮＳ-Ｈ3-７を用いてそれぞれＣＤＲ-Ｈ１、ＣＤＲ-Ｈ２及びＣＤＲ-Ｈ３を多様化した。これによって、４つのアミノ酸チロシン、スレオニン、アスパラギン及びセリンをコードする縮重コドンを導入した。２つの反応をプールした。
【０１９８】
ライブラリＹＡＤＳ-Ｂについて、１３の別々の突然変異誘発反応を行った。その反応によって４つのアミノ酸チロシン、アラニン、アスパラギン酸及びセリンをコードする縮重コドンを導入した。それぞれの反応で、オリゴヌクレオチドＹＡＤＳ-Ｈ1及びＹＡＤＳ-Ｈ2を用いてＣＤＲ-Ｈ１及びＣＤＲ-Ｈ２を多様化した。各反応について、以下のオリゴヌクレオチドの一つを用いて、ＣＤＲ-Ｈ３を多様化した：ＹＡＤＳ-Ｈ3-３、ＹＡＤＳ-Ｈ3-４、ＹＡＤＳ-Ｈ3-５、ＹＡＤＳ-Ｈ3-６、ＹＡＤＳ-Ｈ3-７、ＹＡＤＳ-Ｈ3-８、ＹＡＤＳ-Ｈ3-９、ＹＡＤＳ-Ｈ3-１０、ＹＡＤＳ-Ｈ3-１１、ＹＡＤＳ-Ｈ3-１２、ＹＡＤＳ-Ｈ3-１３、ＹＡＤＳ-Ｈ3-１４又はＹＡＤＳ-Ｈ3-１５。１３の反応をプールした。
２つのライブラリについて、蓄積した突然変異誘発反応物を、大腸菌ＳＳ３２０内に電気穿孔法にて導入した(Sidhu ら., 上掲)。形質転換細胞をＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて一晩培養して、前記のファジミドＤＮＡを包含し、その細胞表面上にＦａｂフラグメントを表出したファージ粒子を生成した。各ライブラリＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂのサイズはともに７×１０９である。
【０１９９】
実施例６  ＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂナイーブライブラリからの抗ｈＶＥＧＦ特異的抗体の選別
ライブラリＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂ（実施例５）のファージについて結合選別操作を繰り返して、ｈ-ＶＥＧＦに結合するクローンを濃縮した。この結合選別は既に記載の方法（Sidhuら、上記）に従って行った。
捕獲標的（５μｇ／ｍＬ）にてＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートを４℃で一晩コートし、ＢＳＡ(Sigma)で２時間ブロックした。既に記載したように（Sidhuら、上記）、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。上記のコートしたイムノプレートにファージ溶液（〜１０１２ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１Ｍ  ＨＣｌにて結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
ライブラリーを各標的タンパク質に対して４回選別操作を行った。個々の選別から得た個々のクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＶＣＳを添加した５００μＬの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて培養し、培養物上清をファージＥＬＩＳＡ(Sidhuら., 上掲)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイＦａｂを検出した。ＢＳＡコートプレート上のシグナルと比較して標的コートプレート上で少なくとも２０倍より大きなＥＬＩＳＡシグナルを呈する場合にクローンを特異的結合体とした。結果を図１０の表に示す。特異的な結合体の複数の異なる配列を得た（データは示さない）。
【０２００】
実施例７  ライブラリＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂから単離したＶＥＧＦ結合クローンの親和性成熟についてのライブラリＹＡＤＳ-ＩＩの構築
ライブラリＹＡＤＳ-Ａ及びＹＡＤＳ-Ｂ（実施例５及び６）から選択したＶＥＧＦ結合クローンの配列決定により、ランダム化した重鎖ＣＤＲ位置にチロシン、アラニン、アスパラギン酸又はセリンのみを含む２４の異なるクローンが明らかとなった。我々は、チロシン、アラニン、アスパラギン酸又はセリンのみをコードする縮重コドンを用いて軽鎖ＣＤＲを多様化することによって１６のクローンの親和性を向上させることを試みた。
部位特異的突然変異誘発のＫｕｎｋｅｌ法(Kunkelら, 上掲)を用いて、この実施例で用いる１６の「停止鋳型」のファジミドを構築した。軽鎖ＣＤＲのコドン（位置２９、３２、５１、５４、５５、９３、９４及び９７）をＴＡＡ停止コドンに置換した。停止コドンの修復と同時にチロシン、アラニン、アスパラギン酸又はセリンをコードする縮重コドンを導入するように設定した３つのオリゴヌクレオチドを用いて、１６の別々の突然変異誘発反応（各鋳型につき１つ）を行った。変異原性オリゴヌクレオチドＹＡＤＳ-Ｌ１、ＹＡＤＳ-Ｌ２及びＹＡＤＳ-Ｌ３を用いてそれぞれＣＤＲ-Ｌ１、ＣＤＲ-Ｌ２及びＣＤＲ-Ｌ３を多様化した。オリゴヌクレオチド配列を図１３に示し、ランダム化した軽鎖ＣＤＲ部位を図１２に示した。
１６の突然変異誘発反応を蓄積して、大腸菌ＳＳ３２０内に電気穿孔法にて導入した(Sidhu ら., 上掲)。形質転換細胞をＭ１３-ＫＯ７ヘルパーファージ(New England Biolabs, Beverly, MA)の存在下にて一晩培養して、前記のファジミドＤＮＡを包含し、その細胞表面上にＦａｂフラグメントを表出したファージ粒子を生成した。ライブラリは６．５×１０９の異なるメンバーを含有し、ライブラリＹＡＤＳ-ＩＩとした。
【０２０１】
実施例８  ＹＡＤＳ-ＩＩライブラリからの抗ｈＶＥＧＦ特異的抗体の選別
ライブラリＹＡＤＳ-ＩＩ（実施例７）のファージについて結合選別操作を繰り返して、ｈ-ＶＥＧＦに結合するクローンを濃縮した。この結合選別は以下のように行った。
ライブラリＹＡＤＳ-ＩＩは固体支持体上で選別した後、溶液中で２回選別した。第一の選別では、捕獲ｈ-ＶＥＧＦ（５μｇ／ｍＬ）にてＮＵＮＣ９６ウェルMaxisorpイムノプレートを４℃で一晩コートし、ＢＳＡ(Sigma)で２時間ブロックした。既に記載したように（Sidhuら、上記）、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。上記のコートしたイムノプレートにファージ溶液（〜１０１２ファージ／ｍＬ）を加えた。２時間インキュベートしてファージを結合させた後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。０．１Ｍ  ＨＣｌにて結合したファージを１０分間溶出し、１．０Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅し、さらなる選別操作のために使用した。
【０２０２】
以下の２回の選別は溶液中で行った。既に記載したように、ファージを一晩３７℃で培養した後、ＰＥＧ／ＮａＣｌで沈殿させて濃縮し、Superblock １％ＴＢＳ(Pierce)、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(Sigma)に再懸濁した。２５ｎＭの濃度のビオチン化ｈ-ＶＥＧＦとともにファージ溶液（１０１２ファージ／ｍＬに近い濃度、２００μＬ）をインキュベートした。優しく撹拌しながら室温で２時間インキュベートした後、８００μＬのSuperblock＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた。８００μＬのこの希釈液を５ｎｇ／μＬのニュートラビジン(Pierce)でコートした８つのウェルでインキュベートして、Superblock溶液にて飽和させた。優しく撹拌しながら室温で５分間インキュベートした後、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０でプレートを１０回洗浄した。１ウェル当たり１００μＬの１００ｍＭ  ＨＣｌにてファージを溶出し、１Ｍ  トリス塩基で溶出物を中和した。溶出したファージを大腸菌ＸＬ１ブルーで増幅した。
【０２０３】
各回の選別から得た２００個ののクローンをカルベニシリン及びＭ１３−ＶＣＳを添加した５００μＬの２ＹＴ培養液を含む９６ウェルフォーマットにて培養し、培養液上清をファージＥＬＩＳＡ(Sidhuら., 上掲)に直接用いて、標的タンパク質でコートしたプレートには結合するがＢＳＡでコートしたプレートには結合しないファージディスプレイＦａｂを検出した。ＢＳＡコートプレート上のシグナルと比較して標的コートプレート上で少なくとも２０倍より大きなＥＬＩＳＡシグナルを呈するクローンを特異的結合体とした。結果を図１４の表に示す。
１００ｎＭのｈＶＥＧＦによる結合阻害の量に基づいて、さらに３つの結合体を分析した。他のタンパク質（図１６）上の結合をこれら３つの結合体について測定した。これら結合体は、大腸菌のＦａｂタンパク質として発現されており、そのｈＶＥＧＦ及びｍＶＥＧＦへの結合親和性を実施例２に記載のように測定した。データを図７に示す。
【０２０４】
本明細書中で挙げたすべての文献（特許及び特許出願を含む）は出典明記によりその全体が個々に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２０５】
【図１】Ｙ及びＳのみをコードする２単位(binomial)コドンセットに基づくライブラリ内で多様化されたＣＤＲの位置を示す。示したＣＤＲの位置はカバット命名法に従って番号を付けた。
【図２】Ｙ及びＳのみをコードする２単位コドンセットに基づく２つの例示的ライブラリの構築に用いた変異原性オリゴヌクレオチドを示す。このライブラリをＹＳ−Ａ及びＹＳ−Ｂとする。等モルのＤＮＡ縮重をコドンセットに示す（Ｍ＝Ａ／Ｃ）。コドンセットはＩＵＢコードで表す。
【図３】様々な標的抗原に対して５回の選別を行った後のライブラリＹＡＤＳ−Ａ及びＹＡＤＳ−Ｂの濃縮率を示す。
【図４】ＹＳ−Ａ及びＹＳ−Ｂライブラリの分類の結果を示す。得られた特異的結合の数を示す。数はＸ／Ｙとして示し、Ｘは特異的クローンの数を表し（すなわち、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の結合よりも少なくとも１０倍高く標的抗原に結合するもの（４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡ信号に基づく））、Ｙは与えられたライブラリ、選別回数（ラウンド）及び標的抗原についてスクリーニングしたクローンの数を表す。
【図５】ライブラリＹＳ−Ａ及びＹＳ−Ｂの選別より得られた結合体の配列を示す。注記：＊は通常鋳型配列の対応する位置にみられるアミノ酸の欠如を表す。
【図６】制限されたコドンセットの例示的セットを示す。示したコドンセットは４単位(tetranomial)、各はすなわち４アミノ酸しかコードしていない。
【図７】ファージＥＬＩＳＡによって評価した特異的な結合体の数を示す。数はＸ／Ｙとして示し、Ｘは特異的な結合体の数、Ｙはスクリーニングしたクローンの数である。
【図８】各標的抗原について異なる制限多様性ライブラリより得たれた特定のクローンの数を示す。
【図９】４アミノ酸のみをコードする４単位(tetranomial)コドンセットに基づいたライブラリＹＡＤＳ−Ａ及びＹＡＤＳ−Ｂの構築に用いた変異原性オリゴヌクレオチドを示す。等モルＤＮＡ縮重をコドンセットで表す（Ｗ＝Ｔ／Ｇ、Ｋ＝Ｔ／Ａ、Ｍ＝Ａ／Ｃ）。ＷＭＴはＳ、Ｙ、Ｔ及びＮをコードする。ＫＭＴはＹ、Ａ、Ｄ及びＳをコードする。コドンセットはＩＵＢコードで示す。
【図１０】ライブラリＹＡＤＳ−Ａ及びＹＡＤＳ−ＢのファージＥＬＩＳＡによって評価した特異的な結合体の数を示す。数はＸ／Ｙとして示し、Ｘは特異的な結合体の数、Ｙはスクリーニングしたクローンの数である。
【図１１】対応するヒト標的抗原及びカニクイザル標的抗原について競合的ファージＥＬＩＳＡによって測定したクローンＹＳ１−ＡＰ、ＹＳ２−ＡＰ及びＹＳ３−ＡＰのＩＣ５０値を示す。
【図１２】４のコドンセット（ＹＡＤＳ）に基づいたライブラリにおいて多様化された軽鎖ＣＤＲの位置を示す。ライブラリはＹＡＤＳ−ＩＩライブラリを指す。ＣＤＲの位置はカバット命名法に従って番号を付けた。
【図１３】ライブラリＹＡＤＳ−ＩＩの構築に用いた変異原性オリゴヌクレオチドを示す。等モルＤＮＡ縮重をコドンセットで表す（Ｗ＝Ｔ／Ｇ、Ｍ＝Ａ／Ｃ）。ＫＭＴはＹ、Ａ、Ｄ及びＳをコードする。コドンセットはＩＵＢコードで示す。
【図１４】ＹＡＤＳ−ＩＩ  ｈＶＥＧＦ選択物のスクリーニングの結果を示す。図は、クローンの数、ＢＳＡ結合体（ファージＥＬＩＳＡによる測定−０．２００以下の数はバックグラウンド以下と判断し太字で示す）、及び１００ｎＭのヒトＶＥＧＦにより阻害される結合の割合（７５％以上の阻害を示す数を太字で示す）。
【図１５】４Ｄ５軽鎖及び重鎖の可変ドメインの配列を示す（それぞれ配列番号１及び２）。
【図１６】異なる標的抗原でコートしたプレートにてＹＡＤＳライブラリから得た３結合体（ファージ量の増加を示す）のファージＥＬＩＳＡの結果をグラフに示す。
【図１７】ヒトＶＥＧＦ及びマウスＶＥＧＦの３結合体の結合値（Ｋａ）、解離率（ｋｄ）及び親和性値（Ｋｄ）を示す。
【図１８Ａ】Ｆａｂ−ｚｉｐ（配列番号４）の表出に用いたＰｔａｃプロモータ作動性カセットのＤＮＡ配列を示す。２つのオープンリーディングフレームを示す。第一のオープンリーディングフレームはｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変及び定常ドメインをコードする。第二のオープンリーディングフレームはｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１）、ジッパー配列及びｐ３のＣ末端（ｃＰ３）をコードする。
【図１８Ｂ】Ｆａｂ−ｚｉｐ（配列番号４）の表出に用いたＰｔａｃプロモータ作動性カセットのＤＮＡ配列を示す。２つのオープンリーディングフレームを示す。第一のオープンリーディングフレームはｍａｌＥ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５軽鎖可変及び定常ドメインをコードする。第二のオープンリーディングフレームはｓｔＩＩ分泌シグナル、ヒト化４Ｄ５重鎖可変ドメイン、ヒト化４Ｄ５重鎖第一定常ドメイン（ＣＨ１）、ジッパー配列及びｐ３のＣ末端（ｃＰ３）をコードする。
【図１９】Ｆ(ａｂ)２の表出のために離れた転写部位の発現を促すバイシストロン性のベクターを図示する。好適なプロモータは第一及び第二のシストロンの発現を作動させる。第一シストロンは分泌シグナル配列（ｍａｌＥ又はｓｔＩＩ）、軽鎖可変及び定常ドメインと、ｇＤタグをコードする。第二シストロンは分泌シグナル、重鎖可変ドメイン及び定常ドメイン１（ＣＨ１）をコードする配列と、ウイルスコートタンパク質の二量体化ドメイン及び少なくともその一部をコードする。
【図２０】隣接するパッチを形成するＣＤＲ残基を示すヒト化４Ｄ５の３-Ｄモデル構造を示す。隣接するパッチはＣＤＲＬ１のアミノ酸残基２８、２９、３０、３１及び３２；ＣＤＲＬ２のアミノ酸残基５０及び５３；ＣＤＲＬ３のアミノ酸残基９１、９２、９３、９４及び９６；ＣＤＲＨ１の２８、３０、３１、３２、３３；及びＣＤＲＨ２の５０、５２、５３、５４、５６及び５８によって形成される。
【図２１】カバットデータベースからのヒト抗体軽鎖ＣＤＲ配列におけるアミノ酸（一文字コードで表示）の頻度を示す。特定のアミノ酸位置にある各アミノ酸の頻度を、左にもっとも頻度が高いアミノ酸を置き、右にもっとも頻度が低いアミノ酸を続けて示す。アミノ酸の下の数字はその位置にそのアミノ酸を有するカバットデータベース中の天然に生じるアミノ酸の数を表す。
【図２２】カバットデータベースからのヒト抗体重鎖ＣＤＲ配列におけるアミノ酸（一文字コードで表示）の頻度を示す。特定のアミノ酸位置にある各アミノ酸の頻度を、左にもっとも頻度が高いアミノ酸を置き、右にもっとも頻度が低いアミノ酸を続けて示す。アミノ酸の下の数字はその位置にそのアミノ酸を有するカバットデータベース中の天然に生じるアミノ酸の数を表す。また、フレームワークアミノ酸位置７１、９３及び９４を示す。
【図２３】ヒトＶＥＧＦ及びマウスＶＥＧＦのＹＳライブラリ（実施例２に示す）から得た２つの抗ＶＥＧＦ結合体の結合値（Ｋａ）、解離率（ｋｄ）及び親和性値（Ｋｄ）を示す。
【図２４Ａ】重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列との間に二量体化ドメインを含むベクターｐＶ−０３５０−４のＤＮＡ配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（軽鎖及び重鎖それぞれ配列番号６及び７）を示す。
【図２４Ｂ】重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列との間に二量体化ドメインを含むベクターｐＶ−０３５０−４のＤＮＡ配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（軽鎖及び重鎖それぞれ配列番号６及び７）を示す。
【図２４Ｃ】重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列との間に二量体化ドメインを含むベクターｐＶ−０３５０−４のＤＮＡ配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（軽鎖及び重鎖それぞれ配列番号６及び７）を示す。
【図２４Ｄ】重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列との間に二量体化ドメインを含むベクターｐＶ−０３５０−４のＤＮＡ配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（軽鎖及び重鎖それぞれ配列番号６及び７）を示す。
【図２４Ｅ】重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列との間に二量体化ドメインを含むベクターｐＶ−０３５０−４のＤＮＡ配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（軽鎖及び重鎖それぞれ配列番号６及び７）を示す。
【図２４Ｆ】重鎖定常ＣＨ１ドメインとｐ３配列との間に二量体化ドメインを含むベクターｐＶ−０３５０−４のＤＮＡ配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（軽鎖及び重鎖それぞれ配列番号６及び７）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【国際調査報告】
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