(57)【要約】  本発明は、エクジステロイド部分のアルキル側鎖上のヒドロキシル基を誘導体化することによって、エクジステロイド部分に蛍光部分を結合させたエクジステロイド誘導体を提供する。該誘導体は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインに結合できる能力があり、アッセイに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エクジステロイド部分のアルキル側鎖上のヒドロキシル基を誘導体化することによってエクジステロイド部分に蛍光部分を結合させ、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインに結合できるエクジステロイド誘導体。
【請求項２】
前記誘導体が、一般構造1a、2aまたは3aを有する、請求項1に記載のエクジステロイド誘導体
【化１】
2007520455.tif 000017
[式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R5は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R7〜R8は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択されるか、あるいはR7とR8は一緒になって=CH2であり、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択されるか、あるいはR6はR7と一緒になって二重結合である]。
【請求項３】
前記アルキル基がC1からC20であり、より好ましくは、R1およびR2に関してそのアルキル基がC1からC5である、請求項2に記載の誘導体。
【請求項４】
R1およびR5がOHであり、R2がHまたはOHであり、R3がHであり、R4がHまたはOHであり、R6が、H、OH、CH3、CH3CH2または(CH3)2CHから選択され、R7およびR8が、H、OH、CH3から独立に選択されるか、あるいはR7とR8が一緒になって=CH2でもよく、R6が、R7と一緒になって二重結合でもよい、請求項2に記載の誘導体。
【請求項５】
Xが、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択される、請求項2から4のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項６】
Bが、CH2OまたはOである、請求項2から5のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項７】
前記蛍光部分が、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択される、請求項2から6のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項８】
前記誘導体が一般構造1aを有し、ここで、R1およびR5がOHであり、R3がHであり、R7がCH3であり、BがCH2Oであり、Xが、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択される、請求項2から7のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項９】
R2、R4およびR8が、H、アルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6が、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択される、請求項8に記載の誘導体。
【請求項１０】
R2がHであり、R4がOHであり、R6がHであり、R8がHである、請求項9に記載の誘導体。
【請求項１１】
R1、R4およびR5がOHであり、R2がHまたはOHであり、R3がHであり、R6がHまたはCH3であり、R7およびR8がHまたはCH3である、請求項2から7のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１２】
前記エクジステロイド部分が、イノコステロン、26-ヒドロキシエクジソン、20,26-ジヒドロキシエクジソン、マキステロンB、アマラステロンA、アマラステロンB、アジュガステロンB、シダステロンA、シダステロンB、26-ヒドロキシ-ポリポジンB、20-ヒドロキシエクジソン、マキステロンA、ポリポジンBおよびラピステロンDからなる群から選択される、請求項1から11のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１３】
前記誘導体が以下
【化２】
2007520455.tif 000018
からなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１４】
前記誘導体が、一般構造1b、2bまたは3bを有する、請求項1に記載のエクジステロイド誘導体
【化３】
2007520455.tif 000019
[式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R4、R7〜R9は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択される]。
【請求項１５】
前記アルキル基がC1からC20であり、より好ましくは、R1およびR2に関してそのアルキル基がC1からC5である、請求項14に記載の誘導体。
【請求項１６】
Xが、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択される、請求項14または15に記載の誘導体。
【請求項１７】
前記蛍光部分が、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択される、請求項14から16のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１８】
R1およびR4がOHであり、R2およびR3が、HまたはOHから独立に選択され、R6がHまたはCH3から選択され、R7、R8およびR9が、基H、OH、CH3、FおよびIから独立に選択される、請求項14から17のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項１９】
前記エクジステロイド部分が、ポナステロンA、20-ヒドロキシエクジソン、ムリステロンA、マキステロンA、ポリポジンB、ラピステロンD、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスタ-8,14-ジエン-6-オン、5-デオキシカラダステロン、26-ヨードポナステロンAおよび25-フルオロポナステロンAからなる群から選択される、請求項14から18のいずれか一項に記載の誘導体。
【請求項２０】
エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用する、一般構造1a、2aおよび3aからなる化合物群から選択される化合物
【化４】
2007520455.tif 000020
[式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R5は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R7〜R8は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択されるか、あるいはR7とR8は一緒になって=CH2であり、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択されるか、あるいはR6はR7と一緒になって二重結合である]。
【請求項２１】
前記アルキル基がC1からC20であり、より好ましくは、R1およびR2に関してそのアルキル基がC1からC5である、請求項20に記載の化合物。
【請求項２２】
R1およびR5がOHであり、R2がHまたはOHであり、R3がHであり、R4がHまたはOHであり、R6が、H、OH、CH3、CH3CH2または(CH3)2CHから選択され、R7およびR8が、H、OH、CH3から独立に選択されるか、あるいはR7とR8が一緒になって=CH2でもよく、R6が、R7と一緒になって二重結合でもよい、請求項20または21に記載の化合物。
【請求項２３】
Xが、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択される、請求項20から22のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
Bが、CH2OまたはOである、請求項20から23のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２５】
前記蛍光部分が、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択される、請求項20から24のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２６】
前記化合物が一般構造1aを有し、ここでR1およびR5がOHであり、R3がHであり、R7がCH3であり、BがCH2Oであり、Xが、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択される、請求項20から25のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２７】
R2、R4およびR8が、H、アルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6が、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択される、請求項26に記載の化合物。
【請求項２８】
R2がHであり、R4がOHであり、R6がHであり、R8がHである、請求項27に記載の化合物。
【請求項２９】
R1、R4およびR5がOHであり、R2がHまたはOHであり、R3がHであり、R6がHまたはCH3であり、R7およびR8がCH3である、請求項20から28のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記蛍光部分を、誘導体化によって、イノコステロン、26-ヒドロキシエクジソン、20,26-ジヒドロキシエクジソン、マキステロンB、アマラステロンA、アマラステロンB、アジュガステロンB、シダステロンA、シダステロンB、26-ヒドロキシ-ポリポジンB、20-ヒドロキシエクジソン、マキステロンA、ポリポジンBおよびラピステロンDからなる群から選択されるエクジステロイドに結合させる、請求項20から29のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３１】
前記化合物が以下
【化５】
2007520455.tif 000021
からなる群から選択される、請求項20から30のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３２】
エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用する、一般構造1b、2bおよび3bからなる化合物群から選択される化合物
【化６】
2007520455.tif 000022
[式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R4、R7〜R9は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択される]。
【請求項３３】
前記アルキル基がC1からC20であり、より好ましくは、R1およびR2に関してそのアルキル基がC1からC5である、請求項32に記載の化合物。
【請求項３４】
Xが、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択される、請求項32または33に記載の化合物。
【請求項３５】
前記蛍光部分が、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択される、請求項32から34のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３６】
R1およびR4がOHであり、R2およびR3がHまたはOHから独立に選択され、R6がHまたはCH3から選択され、R7、R8およびR9が、基H、OH、CH3、FおよびIから独立に選択される、請求項32から35のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３７】
前記蛍光部分を、誘導体化によって、ポナステロンA、20-ヒドロキシエクジソン、ムリステロンA、マキステロンA、ポリポジンB、ラピステロンD、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスタ-8,14-ジエン-6-オン、5-デオキシカラダステロン、26-ヨードポナステロンAおよび25-フルオロポナステロンAからなる群から選択されるエクジステロイドに結合させる、請求項32から36のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３８】
エクジステロイド模擬体であって、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインと相互作用する非エクジステロイド部分を含み、蛍光部分をさらに含む化合物。
【請求項３９】
エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインと相互作用する置換または非置換のジベンゾイルヒドラジン部分を含み、ジベンゾイルヒドラジン部分中のフェニル環置換基または窒素原子を介して結合される蛍光部分をさらに含む、請求項38に記載の化合物。
【請求項４０】
競合阻害様式においてエクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用するその能力について、候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)エクジソン受容体またはそのLBDと共に、候補化合物および請求項1から19のいずれか一項に記載の誘導体をインキュベートするステップと、
(b)エクジソン受容体またはそのLBDに対する請求項1から19のいずれか一項に記載の誘導体の結合度を測定するステップと
を含む方法。
【請求項４１】
競合阻害様式においてエクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用するその能力について、候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)エクジソン受容体またはそのLBDと共に、候補化合物および請求項20から37のいずれか一項に記載の化合物をインキュベートするステップと、
(b)エクジソン受容体またはそのLBDに対する請求項20から37のいずれか一項に記載の化合物の結合度を測定するステップと
を含む方法。
【請求項４２】
競合阻害様式においてエクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用するその能力について、候補化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)エクジソン受容体またはそのLBDと共に、候補化合物および請求項38または39に記載の誘導体をインキュベートするステップと、
(b)エクジソン受容体またはそのLBDに対する請求項38または39に記載の誘導体の結合度を測定するステップと
を含む方法。
【請求項４３】
前記競合阻害様式が蛍光偏光アッセイである、請求項40から42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記アッセイが、マイクロタイタープレートウェル中で実施される、請求項40から43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項40から44のいずれか一項に記載のアッセイによって同定された殺虫性化合物。
【請求項４６】
エクジソン受容体遺伝子スイッチのためのエフェクター化合物であって、請求項40から44のいずれか一項に記載のアッセイによって同定される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エクジソン(ecdysone)受容体リガンドのアッセイに関する。具体的には、本発明は、エクジソン受容体に結合する能力を保持し、かつエクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン部分を含む蛍光偏光(FP)アッセイにおけるトレーサーリガンドとして機能する蛍光複合体を提供する。本発明は、殺虫剤開発のためのリード化合物またはエクジソン受容体遺伝子スイッチのための新規なエフェクターの同定を目的とする化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングにおいて特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
1960年代に、Carroll Williamsは、昆虫種の99%以上が人類にとって無害ないし有益であることを指摘した。昆虫の中には、例えば、受粉において役割を発揮するミツバチのように、必要不可欠なものも存在する。昆虫の中の約0.1%が実際的な害虫である。Williamsは、特定の害虫に対して特異性を示すより安全な新世代殺虫剤を、昆虫自体のホルモンの化学作用に基づいて開発できる可能性があることを示唆した(Williamsの論文、1967a、b)。成長および発達を調節する、非ペプチドホルモンである20-ヒドロキシエクジソン(2β,3β,14α,20R,22R,25-ヘキサヒドロキシ-5β-コレスタ-7-エン-6-オン)および幼若ホルモンの濃度は、精密に制御される。エクジステロイドまたは幼若ホルモン活性を有する化合物の濃度が不適切であると、昆虫発達の重大な攪乱および結果としての致死に繋がる。
【０００３】
初めは認識されなかったが、この方法に伴う問題は、昆虫が、正常な発達中にこれらのホルモンを代謝分解によって除去するために保持する効率的な機構に由来する。この問題は、高い受容体親和性を示すが天然ホルモンとは異なる化学作用を有し、従って宿主の代謝経路に支配されない化合物を発見することによって克服できる可能性がある。
【０００４】
昆虫の成長および発達を調節する上で重要な役割を演じることが知られている2つの非ペプチドホルモンが、ステロイド脱皮ホルモンである20-ヒドロキシエクジソン(以後、エクジソンと呼ぶ)、およびセスキテルペン幼若ホルモン(以後、JHと呼ぶ)である。JHは、脱皮昆虫が幼虫または若虫状態を維持する原因であり、さらに成虫では繁殖過程を調節する役割を演じる。エクジソンの力価は、昆虫の生活環の間に6回またはそれ以上も上昇および下降し、例えば、幼虫齢の間の脱皮過程、新表皮の合成、変態の開始(JH力価の減退後)、および成虫卵巣での卵黄形成の態様を調節する。双翅目キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)に見られる巨大多糸染色体が、遺伝子発現の変化レベルにおけるエクジソン力価の上昇に対する応答の複雑性に知見を与えた。Ashburnerおよび共同研究者らは、エクジソンが、遺伝子発現の調節におけるその作用を、タンパク質受容体を介して発揮すると仮定した(Ashburnerらの論文、1974年)。少数の初期応答遺伝子が、後期応答遺伝子の全バンクに対して応答を伝達するさらなる遺伝子転写調節タンパク質を産生し、これらの調節タンパク質は、後期応答染色体座での作用で検知できる(Hillらの論文、1993年)。
【０００５】
過去10年にわたって、昆虫の発達を制御する上でのエクジソンの重要な役割の根底にある分子メカニズムの理解に関して多くの進歩があった。この研究は、双翅目昆虫であるキイロショウジョウバエ(D. melamogaster)を使用する遺伝学および分子生物学を併用した力を必要とする研究によって先導された。本出願にとって特に重要なのは、エクジソン受容体の本質を解明することであった。その本質は、ecrおよびuspと呼ばれる2つの遺伝子の産生物から構成されるヘテロダイマーであることが示された(Yaoら、1993)。これら遺伝子のタンパク質産生物であるEcRおよびUSPは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーである。このファミリーは、一連のドメインが、N末端から転写活性化、DNA結合、核局在化およびリガンド結合の順序で分かれた全体構造図で特徴付けられる。リガンド結合ドメイン(LBD)は、アゴニストリガンドの結合に応答したトランス活性化も伝達する。エクジソン受容体のEcRおよびUSPサブユニットは、双方とも、幾つかの昆虫からクローン化されている(例えば、Koelleらの論文、1991年、HannanおよびHillの論文、1997年、HannanおよびHillの論文、2001年、Oroらの論文、1990年を参照)。
【０００６】
1980年代まで、エクジソン模擬体を開発するための化学的取り組みは、構造の複雑性および商業的規模で実用するためのステロイドを合成的に得ることの困難性によって妨げられてきた。しかし、1998年に、Rohm & Haas社の科学者らは、会社が思いがけず発見したある種のビスアシルヒドラジン系殺虫剤が、主として、エクジソン受容体との相互作用によって作用していることを発表した(Wingらの論文、1988年、Wingの論文、1988年)。この部類のメンバーのエクジソン受容体に対する結合親和性は、脱皮ホルモン活性の強度とかなり関連している(Minakuchiらの論文、2003年)。この部類のメンバーは、昆虫綱の中で数桁程度の注目すべき選択性を示し、例えば、RH-5992は、双翅目に対してよりも鱗翅目に対して約2〜3桁の大きさでより効果的である。この相違は、その化合物と2種の昆虫集団由来エクジソン受容体との相互作用に対する解離定数の相違と関連している(Dhadiallaらの論文、1998年)。その後の研究によって、若干の場合に能動輸送クリアランスによる寄与が立証されているが(Sundaramらの論文、1998年)、異なる集団間におけるエクジソン受容体自体の構造の差異が、この部類における現存殺虫剤の選択性の基礎となる極めて重要な役割を演じている。
【０００７】
鱗翅目および若干の鞘翅目に対するビスアシルヒドラジン類の選択性は、肯定的および否定的の双方の意味を有する。肯定的側面として、脊椎動物に存在しないだけでなく、害虫と優しいまたは無害な種の間の識別を可能にするために、すべての昆虫綱にわたって十分な差異を示す受容体を標的とする、より安全でより環境に優しい殺虫剤の先駆けと見る。否定的側面としては、現在の比較的狭い活性スペクトルが、販売を限定し、また、エクジソン受容体を標的とする安全な化学作用によって制御できない相当数の昆虫集団を放置する。当業界は、この作用方式を用いる薬剤の活性スペクトルを拡大する努力を払ってきたが、比較的ほとんど成功していない。
【０００８】
エクジソン受容体アゴニストおよびアンタゴニストの活性を測定するための生物学的アッセイは、当分野で周知である。エクジソン受容体アゴニストに関する従来のスクリーニングは、候補化合物を、昆虫幼生の脱皮または蛹化(Beckerの論文、1941年、Cymborowskiの論文、1989年)、成虫椎間板の膨出(FristromおよびYundの論文、1976年)、またはキイロショウジョウバエ(Drosophila)BII細胞系の形態学的形質転換(Clementらの論文、1993年)を誘発する能力について調べる。より最近のアッセイは、組換えエクジソン受容体および適切な応答配列に結合したレポーター遺伝子を用いて共-トランスフェクトされた哺乳動物またはその他の真核細胞を使用する。双方のタイプのスクリーニングを再配列して、非-アゴニストリガンド(アンタゴニスト)を検出することが可能であり、非-アゴニストリガンドは、アッセイの基準成分として提供されるアゴニストによる受容体の活性化を阻害するそれらの能力によって識別することができる(Yangらの論文、1986年、Oberdorsterらの論文、2001年)。さらに、無傷の昆虫細胞、細胞抽出物または精製組換えエクジソン受容体を[3H]ポナステロンAなどの放射活性エクジソン受容体リガンドと共にインキュベートするin vitro結合アッセイがある。これらのアッセイは、双方のタイプのリガンドが、エクジソン受容体に対する結合に関して放射性トレーサーと競合するので、アゴニストとアンタゴニストの双方を検出する(Yundらの論文、1978年、Cherbasらの論文、1988年)。候補阻害剤の結合親和性および阻害剤効力は、バイオセンサー技術を使用して測定することもできるが、この様式のスループットは一般的に言って限られる。
【０００９】
選択されたエクジソン受容体(またはそのリガンド結合部分)に対して化合物ライブラリーを高スループットでスクリーニングを実施できる能力は、エクジソン受容体の新規なアゴニストおよびアンタゴニストの発見を促進するはずである。問題の受容体が、有害昆虫由来のエクジソン受容体であるなら、新たに同定されたリガンドの一部は、関連する害虫の正常な発達および成熟を混乱させることができる可能性がある。すなわち、その化合物は、殺虫剤開発のためのリード化合物として役立つ可能性がある。
【００１０】
さらに、エクジソン受容体およびそれらの機能性ドメインは、哺乳動物細胞のレポーターおよび治療遺伝子の制御(LafontおよびDinanの論文、2003年、Yangらの論文、1986年)のための、およびより一般的には農業上重要な種、動物および植物の双方における導入遺伝子の制御(Lafont & Dinanの論文、2003年、Padidamらの論文、2003年)のためのエクジソンスイッチの構成要素として採用されるので、選択されたエクジソン受容体(またはそのリガンド結合部分)に対して化合物ライブラリーをスクリーニングできる能力は、このようなスイッチのためのエフェクターとして作用するより安全でかつ/またはより効果的なリガンドの発見を促進するはずである。
【００１１】
エクジソン受容体に対する化学ライブラリーの大規模スクリーニングに対する現在の障壁は、(1)有害昆虫に由来する精製エクジソン受容体を入手できる可能性が不足していること、および(2)費用が嵩み、自動化が困難である捕捉/洗浄ステップを必要とし、しかも健康、安全および環境の立場上嫌がられる放射能に基づいたアッセイを使用する必要があることである。
【００１２】
放射能に基づいたアッセイと対照的に、蛍光に基づいたアッセイは、放射性リガンドの合成、取扱い、または廃棄を必要とせず、さらに、有害なシンチラントカクテルを使用する必要がない。それ故、該アッセイは、職業上の健康および安全性の観点から好ましく、かつ環境に対して有害な影響を与えることが少ない。従って、蛍光に基づいたアッセイを使用すると、認可および廃棄規制によって妨害されることが少ない。いずれにしても、該アッセイは、放射性アッセイよりも操作のための費用が高価ではなく、かつ、読出しがほとんど常により迅速である(SportsmanおよびLeytesの論文、2000年)。蛍光に基づいたアッセイの特に有用な形態は、蛍光異方性または蛍光偏光(FP)の現象に依拠するものであり、偏光を使用してフルオロフォア含有リガンドを励起する。偏光面に平行なフルオロフォアのみが、光を吸収し、励起状態になる。得られた励起状態の寿命の間に、遊離リガンド分子は分子の跳躍によって回転し、その結果、放射光の偏光面が励起光束の偏光面と異なることになる。これと対照的に、大きな分子(受容体タンパク質など)に結合したリガンドは、より徐々に跳躍し、もしフルオロフォアの励起寿命が十分に短いなら、放射光は励起光束と概して同一平面にある。アッセイ溶液の偏光を評価するためには、2つの測定、すなわち、最初に励起フィルターに平行な偏光放射フィルター(S-面)を使用する測定、および次に励起フィルターに垂直な偏光放射フィルター(P-面)を使用する測定を必要とする。mP(ミリ偏光度)で与えられる総合的な蛍光偏光値は、次式で与えられ、
偏光度(mP)=1000(S-G.P)/(S+G.P)
式中、SおよびPは、S-面およびP-面の蛍光計数値であり、Gは、装置およびアッセイに依存する格子因子である(Perkin Elmer Life Sciences、Victor2Vマルチラベルカウンター応用集、2000年1月)。基本的結論として、蛍光性リガンドが、小さく、溶液中で自由であるなら、その急速な跳躍によって小さなmP値が得られる。結合した蛍光性リガンドは、それと結合した巨大分子のよりゆっくりした速度で跳躍し、大きなmP値を生じさせる。各アッセイに対して観察されるmP値は、結合したリガンドおよび遊離のリガンド集団から得られる信号の加重平均を表し(Owickiの論文、2000年、Prystayらの論文、2001年)、この値は、適切な光学部品および計算ソフトウェアを備えた装置によって測定できる。このような装置は、実験室装置の供給業者から容易に入手可能であり、個々のチューブまたはマルチウェルプレートを読み取るために設計された型式を入手できる。約4nsの蛍光寿命で、フルオレセインは、受容体-リガンド結合アッセイにおける分子の回転速度に十分適合しており(Owickiの論文、2000年)、それ故、商業的に入手可能なFP検出器のほとんどは、このフルオロフォアに適したフィルターのセットを備えている。
【００１３】
FPアッセイは、抗体への(Jiskootらの論文、1991年)、哺乳動物の核内ホルモン受容体への(Parkerらの論文、2000年)、G-タンパク質共役型受容体への(Prystayらの論文、2001年)、およびその他の巨大分子へのリガンド結合を検出するために開発された。FPアッセイは、酵素活性の測定を可能にするようにも構成されている(Checovichらの論文、1995年、Parkerらの論文、2000年)。FPアッセイの大きな利点は、結合したリガンドを遊離リガンドから分離する必要がないことであり、従って、FPアッセイでは、受容体を捕捉、洗浄する必要がない(Checovichらの論文、1995年)。このような捕捉/洗浄ステップは、典型的には、時間がかかり、かつ自動化するのが困難なので、FPアッセイは、適切なリガンドを利用できる場合には必ず、高スループットでのスクリーニングに対する好ましい基盤となっている(Wedinの論文、1999年)。蛍光に基づいたその他の技術に較べ、FPアッセイは、ライブラリー化合物による吸光に起因する消光の結果として起こる可能性のある変化などの蛍光強度の変化に対して比較的鈍感である(SportsmanおよびLeytesの論文、2000年)。さらに、これらのアッセイは、貧溶性試験化合物を含有するものなど、混濁またはさらには不透明な試験混合物に対して使用できる(Checovichらの論文、1995年)。さらなる利点として、FPは、小型化するのに本質的に適しており、4μl程度の小さい最終容積でのアッセイで機能することが立証されている(Sportsman & Leytesの論文、2000年)。
【００１４】
三次元X線回折研究により、エクジステロイドは、エクジソン受容体のLBDに結合すると、タンパク質で形成された結合ポケット内に完全に閉じ込められることがわかっている。これらの研究は、参照により本明細書に援用する国際特許出願第PCT/AU2004/00713号の主題である。
【非特許文献１】Williamsの論文、1967a
【非特許文献２】Williamsの論文、1967b
【非特許文献３】Ashburnerらの論文、1974年
【非特許文献４】Hillらの論文、1993年
【非特許文献５】Yaoら、1993
【非特許文献６】Koelleらの論文、1991年
【非特許文献７】HannanおよびHillの論文、1997年
【非特許文献８】HannanおよびHillの論文、2001年
【非特許文献９】Oroらの論文、1990年
【非特許文献１０】Wingらの論文、1988年
【非特許文献１１】Wingの論文、1988年
【非特許文献１２】Minakuchiらの論文、2003年
【非特許文献１３】Dhadiallaらの論文、1998年
【非特許文献１４】Sundaramらの論文、1998年
【非特許文献１５】Beckerの論文、1941年
【非特許文献１６】Cymborowskiの論文、1989年
【非特許文献１７】FristromおよびYundの論文、1976年
【非特許文献１８】Clementらの論文、1993年
【非特許文献１９】Yangらの論文、1986年
【非特許文献２０】Oberdorsterらの論文、2001年
【非特許文献２１】Yundらの論文、1978年
【非特許文献２２】Cherbasらの論文、1988年
【非特許文献２３】LafontおよびDinanの論文、2003年
【非特許文献２４】Padidamらの論文、2003年
【非特許文献２５】SportmanおよびLeytesの論文、2000年
【非特許文献２６】Owickiの論文、2000年
【非特許文献２７】Prystayらの論文、2001年
【非特許文献２８】Jiskootらの論文、1991年
【非特許文献２９】Parkerらの論文、2000年
【非特許文献３０】Checovichらの論文、1995年
【非特許文献３１】Wedinの論文、1999年
【特許文献１】PCT/AU2004/00713
【非特許文献３２】Odinokovらの論文(2003年)
【非特許文献３３】Pisらの論文(1994年)
【非特許文献３４】Suksamrarnらの論文(1995年)
【非特許文献３５】Suksamrarnらの論文(2002年)
【非特許文献３６】HornおよびBergamascoの論文(1985年)
【非特許文献３７】Dinanらの論文(1999年)
【特許文献２】PCT/AU/99/00033
【特許文献３】PCT/AU/00/00799
【特許文献４】オーストラリア仮出願第2003902621号
【非特許文献３８】Hulme & Birdsallの論文、1992年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
驚くべきことに、本発明者らは、エクジソン受容体に結合できるエクジステロイドの能力に対して有害な影響を与えないで、そのステロイド分子に対して、好ましくはステロイド側鎖上でフルオロフォアを結合できることを見出した。また、本発明者らは、蛍光偏光アッセイ/エクジソン受容体のリガンドのスクリーニングのための基剤として、このようなエクジステロイド-フルオロフォア複合体を、組換えエクジステロイド受容体タンパク質サブセグメントと合わせて使用できることを立証した。これらのことは本発明の主題を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
蛍光標識を有する化合物、ならびにその調製方法および使用について説明する。これらの化合物は、in vitroリガンド結合アッセイ、および特に、エクジソン受容体リガンドに関する蛍光偏光(FP)アッセイにおけるリガンドとして有用である。また、本発明は、エクジソン受容体と相互作用できる能力について、化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。
【００１７】
第一の態様において、本発明は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用する、一般構造1a、2a、および3aからなる化合物群から選択される化合物を提供し、
【００１８】
【化１】
2007520455.tif 000002
【００１９】
式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R5は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R7〜R8は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択されるか、あるいはR7とR8が一緒になって=CH2であり、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択されるか、あるいはR6がR7と一緒になって二重結合である。
【００２０】
好ましくは、R1およびR5はOHであり、R2はHまたはOHであり、R3はHであり、R4はHまたはOHであり、R6は、H、OH、CH3、CH3CH2または(CH3)2CHから選択され、R7およびR8は、H、OH、CH3から独立に選択されるか、あるいはR7およびR8は一緒になって=CH2でもよく、R6はR7と一緒になって二重結合でもよい。
【００２１】
第二の態様において、本発明は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用する、一般構造1b、2b、および3bからなる化合物群から選択される化合物を提供し、
【００２２】
【化２】
2007520455.tif 000003
【００２３】
式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R4、R7〜R9は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択される。
【００２４】
好ましくは、R1およびR4はOHであり、R2およびR3は、HまたはOHから独立に選択され、R6は、HまたはCH3から選択され、R7、R8およびR9は、基H、OH、CH3、F、およびIから独立に選択される。
【００２５】
第三の態様において、本発明は、エクジステロイド模擬体である化合物を提供し、該化合物は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインと相互作用する非-エクジステロイド部分を含み、かつ、さらに蛍光部分を含む。
【００２６】
第四の態様において、本発明は、競合阻害様式でのエクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用できる能力に関して候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
(a)エクジソン受容体またはそのLBDと共に、候補化合物、および本発明の化合物、模擬体または誘導体をインキュベートするステップと、
(b)本発明の化合物、模擬体または誘導体のエクジソン受容体またはそのLBDに対する結合度を測定するステップと
を含む。
【００２７】
第五の態様において、本発明は、本発明の第四態様によるアッセイによって同定される殺虫性化合物を提供する。
【００２８】
第六の態様において、本発明は、エクジソン受容体遺伝子スイッチのためのエフェクター化合物を提供し、該化合物は、本発明の第四態様によるアッセイで同定される。
【００２９】
他の態様において、本発明は、エクジステロイド部分のアルキル側鎖上のヒドロキシル基を誘導体化することによって、エクジステロイド部分に蛍光部分を結合させたエクジステロイド誘導体を提供し、該誘導体は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインに結合できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、in vitroリガンド結合アッセイ、特に、エクジソン受容体リガンドの蛍光偏光(FP)アッセイにおけるリガンドとして有用な蛍光複合体を提供する。FP様式は均一であり、すなわち、各アッセイの結合反応およびFP測定が同一区画内(例えば、マルチウェルプレート中の1つのウェル)で実施される。従って、このアッセイは、理論的に言って、産業的な高スループットスクリーニング計画を支える小型化および自動化に適している。蛍光化合物は、例えば、蛍光部分中の反応基を、エクジソン受容体に結合する化合物中の求核基と反応させることによって調製できる。
【００３１】
従って、第一の態様において、本発明は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用する、一般構造1a、2a、および3aからなる化合物群から選択される化合物を提供し、
【００３２】
【化３】
2007520455.tif 000004
【００３３】
式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R5は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R7〜R8は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択されるか、あるいはR7とR8が一緒になって=CH2であり、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択されるか、あるいはR6がR7と一緒になって二重結合である。
【００３４】
前記アルキル基はC1からC20であるのが好ましい。R1およびR2に関しては、そのアルキル基がC1からC5であるのが好ましい。
【００３５】
好ましい実施形態において、R1およびR5はOHであり、R2はHまたはOHであり、R3はHであり、R4はHまたはOHであり、R6は、H、OH、CH3、CH3CH2または(CH3)2CHから選択され、R7およびR8は、H、OH、CH3から独立に選択されるか、あるいはR7とR8が一緒になって=CH2でもよく、R6は、R7と一緒になって二重結合でもよい。
【００３６】
Xは、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択されることが好ましい。また、BはCH2OまたはOであるのが好ましい。
【００３７】
好ましくは、Aは、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択される。
【００３８】
好ましくは、本発明は、R1およびR5がOHであり、R3がHであり、R7がCH3であり、BがCH2Oであり、XがC(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択される一般構造1aの化合物を提供する。
【００３９】
R2、R4およびR8が、H、アルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6が、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択されることがさらに好ましい。
【００４０】
好ましくは、R2がHであり、R4がOHであり、R6がHであり、R8がHである。
【００４１】
他の実施形態において、好ましくは、R1、R4およびR5が、OHであり、R2がHまたはOHであり、R3がHであり、R6がHまたはCH3であり、R7およびR8がCH3である。
【００４２】
蛍光部分は、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択されることがさらに好ましい。
【００４３】
蛍光部分は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインに結合できる能力のあるエクジステロイド部分中のアルキル側鎖上のヒドロキシル基を誘導体化することによって結合できる。より好ましくは、イノコステロン、26-ヒドロキシエクジソン、20,26-ジヒドロキシエクジソン、マキステロンB、アマラステロンA、アマラステロンB、アジュガステロンB、シダステロンA、シダステロンBおよび26-ヒドロキシ-ポリポジンB中に存在するようなC-26位の反応性第一級ヒドロキシル基を誘導体化することによって、蛍光部分をエクジステロイドに結合させる。
【００４４】
代替的な実施形態において、蛍光部分は、20-ヒドロキシエクジソン、マキステロンA、ポリポジンBおよびラピステロンDからなる群から選択されるエクジステロイドのC-25位のヒドロキシル基を誘導体化することによって結合される。
【００４５】
式中のBがOである、構造1a、2a、および3aを有する本発明の化合物は、標準的な合成手順によって調製することが可能であり、例えば、Odinokovらの論文(2003年)およびPisらの論文(1994年)を参照されたい。
【００４６】
第一態様のさらに好ましい実施形態において、化合物は、以下からなる群から選択される。
【００４７】
【化４】
2007520455.tif 000005
【００４８】
MB4628の構造は、溶液のpHに応じて上記のように異なる形を取ることができる。
【００４９】
本発明のさらなる実施形態においては、蛍光部分を、22-OHなど、ステロイド側鎖の代替位置のヒドロキシルを介して結合させ、一般構造1b、2b、および3bの化合物を得ることができる。
【００５０】
従って、第二の態様において、本発明は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用する、一般構造1b、2b、および3bからなる化合物群から選択される化合物を提供し、
【００５１】
【化５】
2007520455.tif 000006
【００５２】
式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R4、R7〜R9は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択される。
【００５３】
前記のアルキル基はC1からC20であるのが好ましい。R1およびR2に関して、そのアルキル基はC1からC5であるのが好ましい。
【００５４】
Xは、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択されるのが好ましい。
【００５５】
蛍光部分は、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択されるのが好ましい。
【００５６】
好ましくは、R1およびR4がOHであり、R2およびR3が、HまたはOHから独立に選択され、R6が、HまたはCH3から選択され、R7、R8およびR9が、基H、OH、CH3、F、およびIから独立に選択される。
【００５７】
より好ましくは、蛍光部分を、ポナステロンA、20-ヒドロキシエクジソン、ムリステロンA、マキステロンA、ポリポジンB、ラピステロンD、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスタ-8,14-ジエン-6-オン、5-デオキシカラダステロン、26-ヨードポナステロンA、および25-フルオロポナステロンAからなる群から選択されるエクジステロイドのC-22位のヒドロキシル基を誘導体化することによって結合させる。
【００５８】
式中のBが酸素である、構造1b、2b、および3bを有する本発明の化合物は、標準的な合成手順によって調製することが可能であり、例えば、Suksamrarnらの論文(1995年)およびSuksamrarnらの論文(2002年)を参照されたい。
【００５９】
本発明の化合物の幾つかは、25Rおよび25S異性形の双方で存在することを、当業者は容易に理解できるであろう。本発明は、分離した25Rおよび25S形の双方、およびそれらの混合物を包含するものである。
【００６０】
他の態様において、本発明は、エクジステロイド部分のアルキル側鎖上のヒドロキシル基を誘導体化することによって、エクジステロイド部分に蛍光部分を結合させたエクジステロイド誘導体を提供し、該誘導体は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインに結合できる能力がある。
【００６１】
好ましくは、エクジステロイド誘導体は、一般構造1a、2aまたは3aを有し、
【００６２】
【化６】
2007520455.tif 000007
【００６３】
式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R5は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R7〜R8は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択されるか、あるいはR7とR8が一緒になって=CH2であり、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択されるか、あるいはR6がR7と一緒になって二重結合である。
【００６４】
他の実施形態において、誘導体は、一般構造1b、2bまたは3bを有し、
【００６５】
【化７】
2007520455.tif 000008
【００６６】
式中、Bは、CH2O、CH2S、CH2NH、O、SまたはNHであり、Xは連結基であり、Aは蛍光部分であり、R1〜R4、R7〜R9は、H、アルキル、ハロアルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6は、H、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択される。
【００６７】
前記のアルキル基はC1からC20であるのが好ましい。R1およびR2に関して、そのアルキル基はC1からC5であるのが好ましい。
【００６８】
Xは、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択され、BはCH2OまたはOであるのが好ましい。
【００６９】
蛍光部分は、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択されるのがさらに好ましい。
【００７０】
誘導体が一般構造1a、2a、3aを有する場合、R1およびR5がOHであり、R2がHまたはOHであり、R3がHであり、R4がHまたはOHであり、R6が、H、OH、CH3、CH3CH2または(CH3)2CHから選択され、R7およびR8が、H、OH、CH3から独立に選択されるか、あるいはR7とR8が一緒になって=CH2でもよく、R6がR7と一緒になって二重結合でもよいのが好ましい。
【００７１】
誘導体が一般構造1aを有する場合には、R1およびR5がOHであり、R3がHであり、R7がCH3であり、BがCH2Oであり、Xが、C(O)NH、C(S)NH、SO2およびC(O)からなる群から選択されるのが好ましい。また、R2、R4およびR8が、H、アルキル、OHまたはハロゲンから独立に選択され、R6がH、OH、アルキル、=CH2またはハロゲンから選択されるのが好ましく、より好ましくは、R2がHであり、R4がOHであり、R6がHであり、R8がHである。
【００７２】
誘導体が一般構造1a、2a、3aを有する他の実施形態においては、R1、R4およびR5がOHであり、R2がHまたはOHであり、R3がHであり、R6がHまたはCH3であり、R7およびR8がHまたはCH3であるのが好ましい。
【００７３】
誘導体が一般構造1a、2aまたは3aを有する場合には、エクジステロイド部分が、イノコステロン、26-ヒドロキシエクジソン、20,26-ジヒドロキシエクジソン、マキステロンB、アマラステロンA、アマラステロンB、アジュガステロンB、シダステロンA、シダステロンB、26-ヒドロキシ-ポリポジンB、20-ヒドロキシエクジソン、マキステロンA、ポリポジンBおよびラピステロンDからなる群から選択されるのが好ましい。
【００７４】
特に好ましい実施形態において、誘導体は、以下からなる群から選択される。
【００７５】
【化８】
2007520455.tif 000009
【００７６】
誘導体が一般構造1b、2bまたは3bを有する場合には、R1およびR4がOHであり、R2およびR3がHまたはOHから独立に選択され、R6がHまたはCH3から選択され、R7、R8およびR9が、基H、OH、CH3、F、およびIから独立に選択されるのが好ましい。
【００７７】
誘導体が一般構造1b、2bまたは3bを有する場合には、エクジステロイド部分が、ポナステロンA、20-ヒドロキシエクジソン、ムリステロンA、マキステロンA、ポリポジンB、ラピステロンD、2β,3β,20R,22R-テトラヒドロキシ-25-フルオロ-5β-コレスタ-8,14-ジエン-6-オン、5-デオキシカラダステロン、26-ヨードポナステロンA、および25-フルオロポナステロンAからなる群から選択されるのも好ましい。
【００７８】
一連の発色団が、蛍光化合物が受容体タンパク質またはそのLBDに結合するリガンド結合アッセイにおける観測波長に柔軟性を付与することを認識されたい。好ましくは、蛍光部分は、非置換および置換のフルオレセイン部分、非置換および置換のダンシル部分、ならびに非置換および置換のクマリン部分からなる群から選択される。しかし、次のもの、すなわち、Cy5、Cy7、R-フィコエリスリン、ローダミン、テキサスレッド、アレキサフルオア(Alexa Fluors)の置換および非置換形など、その他多くのフルオロフォアを採用できる可能性があることは、当業者にとって明らかであろう。例としては、MoBiTec社のMFPシリーズ(例えば、MFP488、MFP555、MFP590およびMFP631)、Molecular Probes社のオレゴングリーンシリーズ(例えば、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514)、Molecular Probes社のブルーシリーズ(例えば、マリナブルー、パシフィックブルー、カスケードブルー)、FAM(例えば5-FAM、6-FAM、5(6)-FAM)などのMolecular Probes社の染料を始めとするフルオレセイン誘導体、JOE(例えば、6-JOE)、TET、HEX、ローダミン誘導体例えばMolecular Probes社のローダミングリーン(Akexa Fluors488の非スルホン化体)、テトラメチルローダミン(例えば、5-TRITC、6-TRITC、5(6)-TRITC、6-TAMRA)、ROX(例えば、6-ROX)、ローダミン6G染料(例えば、5-CR6G、6-CR6G、5(6)-CR6G)、ローダミンレッド染料、ビマンおよびその誘導体、Molecular Probes社のBODIPYシリーズ(例えば、BODIPY FL、BODIPY TMR、BODIPY TR-X、BODIPY530/550)、Molecular Probes社の各種クマリン誘導体(例えば、AMCA-X、DMACA)、および参照により本明細書に援用する表1に挙げたその他蛍光部分(Salk Instituteのウェブサイトから入手)が挙げられる。より好ましくは、蛍光部分が、フルオレセインまたは置換フルオレセイン部分である。
【００７９】
【表１−１】
2007520455.tif 000010
【００８０】
【表１−２】
2007520455.tif 000011
【００８１】
【表１−３】
2007520455.tif 000012
【００８２】
本発明のこの実施形態の幾つかの化合物が、25Rおよび25S異性形の双方で存在することを、当業者は容易に理解できるであろう。本発明は、分離した25Rおよび25S形の双方、およびそれらの混合物を包含するものである。
【００８３】
「エクジソン受容体」とは、機能性EcR/USPヘテロダイマー受容体の全体を意味する。化合物は、受容体の機能に影響を与える幾つかの方式で、例えば、(a)EcR受容体サブユニットだけに結合する、(b)USP受容体サブユニットだけに結合する、(c)受容体サブユニットのヘテロダイマー化をもたらす受容体の領域に結合する方式で受容体に結合できる。
【００８４】
「リガンド結合ドメイン」(LBD)とは、機能性受容体中の、エクジステロイドと結合する領域を意味する。典型的には、これは、エクジステロイド結合ポケットを含み、USPサブユニットの対応領域とのヘテロダイマーとして提供される、EcRサブユニット中の領域である。従って、LBDは、典型的には機能性受容体全体の一部であり、受容体サブユニットであるEcRおよびUSP全体の一部を構成する。
【００８５】
しかし、蛍光化合物は、エクジステロイドファミリーの他のメンバーをベースにしてもよいことを当業者は容易に理解するであろう。20-ヒドロキシエクジソンの多くの誘導体が、植物および動物源から単離、同定されている。それに限定するものではないが、このようなエクジステロイドのリストが、HornおよびBergamascoの論文(1985年)中の表1および2に提供されており、該リストを参照により本明細書に援用する。それに限定するものではないが、エクジステロイドのリストが、キイロショウジョウバエ属(Drosophila)のエクジソン受容体に対するそれらの結合効力の指摘と一緒に、参照により本明細書に援用するDinanらの論文(1999年)の表1および2に提供されている。
【００８６】
本発明者らは、MB4628、MB4592、MB4603およびMB4622など、一般構造1aに該当する化合物が、エクジソン受容体またはそのLBD部分を含む蛍光偏光アッセイで使用するのに適していることを明らかにした。MB4628中の蛍光部分は、学会および産業界で最も一般的に使用される蛍光発光体の1つであるフルオレセインなので、その蛍光強度およびFPを測定するための関連フィルターセットは、広範に入手できる。この種の化合物は、エクジソン受容体に基づいた通常の競合リガンド結合アッセイにおいて現在使用されている放射性トレーサーリガンド(例えば、[3H]ポナステロンA)の直接代替物として使用できる。この場合、受容体(またはそのLBDヘテロダイマー)の捕捉は、ガラス繊維ディスクに吸収することによって、または金属キレート被覆マイクロタイタープレートウェルを使用してヘキサヒスチジンで標識した組換え受容体もしくはそのLBDを捕捉することによって、または適切な抗体、抗体フラグメント、もしくは同等の試薬を被覆したマイクロタイタープレートウェルを使用して受容体もしくはドメインを捕捉することによって等の当業者に既知である多くの方法の1つによって実施できる。捕捉した受容体またはドメインを洗浄して非拘束の蛍光リガンドを除去した後、蛍光強度を測定することのできるプレートリーダーなどの適切な装置を使用して、拘束された蛍光の量を測定する。
【００８７】
より有利なことに、FPアッセイは、拘束されたリガンドを非拘束のリガンドから分離することを必要としない。このことおよびその他の理由により、FPプラットフォームは、産業的規模の高スループットスクリーニングにとって極めて好ましい。エクジソン受容体に関するFPアッセイは、上記で提供される蛍光性エクジステロイドリガンドの出現以前には不可能であり、また、蛍光性エクジステロイドの単なる製造が、有用なFPアッセイを考案できる保証ではない。
【００８８】
別法として、フルオロフォアを、置換または非置換ジベンゾイルヒドラジンの化学的作用を有する化合物など、エクジソン受容体の非ステロイド性アゴニストまたはアンタゴニストを始めとするエクジステロイド模擬体に結合させることができる。例えば、蛍光部分を、ジベンゾイルヒドラジン部分中のフェニル環置換基または窒素原子を介して結合させて、エクジソン受容体またはそのLBDと相互作用する蛍光化合物を提供できる可能性がある。
【００８９】
第三の態様において、本発明は、エクジステロイド模擬体である化合物を提供し、該化合物は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインと相互作用する非エクジステロイド部分を含み、かつ、さらに蛍光部分を含む。
【００９０】
好ましくは、その化合物は、エクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメインと相互作用する置換または非置換のジベンゾイルヒドラジン部分を含み、かつ、ジベンゾイルヒドラジン部分中のフェニル環置換基または窒素原子を介して結合した蛍光部分を更に含む。
【００９１】
第四の実施態様において、本発明は、競合阻害様式においてエクジソン受容体またはそのリガンド結合ドメイン(LBD)と相互作用できる能力に関して候補化合物をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、
(a)エクジソン受容体またはそのLBDと共に、候補化合物、および本発明の化合物、模擬体または誘導体をインキュベートするステップと、
(b)本発明の化合物、模擬体または誘導体のエクジソン受容体またはそのLBDに対する結合度を測定するステップと
を含む。
【００９２】
本発明のFPアッセイには、非標識候補化合物(競合剤または阻害剤)が、本発明の標識化合物とエクジソン受容体またはそのLBDへの結合について競合する、競合阻害様式が含まれる。これによって、新規な合成化合物または化学的もしくは天然の既存生産物ライブラリー中の化合物を、特定の昆虫エクジソン受容体に結合できるその能力についてスクリーニングすることが可能になる。このアッセイで高度に有効であることが判明した化合物は、関連害虫(および/またはその近縁虫)に対する殺虫剤としての開発用リード化合物を構成する。競合阻害様式は蛍光偏光アッセイであるのが好ましい。
【００９３】
このアッセイは、蛍光偏光アッセイであるのが好ましい。
【００９４】
本発明は、圃場の無害または有益昆虫に対する副次的傷害を最小化する「グリーン製品」の上市を望んでいる農薬会社にとって魅力的であろう目標殺虫剤の開発に対する見通しを提供する。このような新規な殺虫剤は、近年の規制環境の変化から利益を得るに相違なく、かつ、米国の登録手順(米国環境庁PR Notice97-3、改訂PR Notice93-9)を通じて急速に発展する可能性さえある。
【００９５】
従って、第五の態様において、本発明は、本発明の第四態様によるアッセイによって同定された殺虫性化合物を提供する。
【００９６】
エクジソン受容体およびそれらの機能性ドメインは、哺乳動物細胞における治療遺伝子の制御(LafontおよびDinanの論文、2003年、Yangらの論文、1986年)のための、およびより一般的には農業上重要な種、動物および植物の双方における導入遺伝子の制御(Lafont & Dinanの論文、2003年、Padidamらの論文、2003年)のためのエクジソンスイッチの構成要素として採用される。選択されたエクジソン受容体またはそのLBDに対して化合物ライブラリーをスクリーニングできる能力は、このようなスイッチのためのエフェクターとして作用するより安全でかつ/またはより効果的なリガンドの発見を促進するはずである。
【００９７】
従って、第六の態様において、本発明は、エクジソン受容体遺伝子スイッチのためのエフェクター化合物を提供し、該化合物は、本発明の第四態様によるアッセイで同定される。
【００９８】
本発明のFPアッセイは、商業的に入手可能な蛍光マイクロプレートリーダー(POLARstar Optima、BMG Labtechnologies、ドイツ)を使用して試験され、本発明者らが利用可能な組換えエクジソン受容体LBD、すなわち、モモアカアブラムシ(Myzus persica)(MpLBD)、シルバーリーフコナジラミ(Bemisia tabaci)(BtLBD)、ヒツジキンバエ(Lucilia cuprina)(LcLBD)およびオオタバコガ(Helicoverpa armigera)(HaLBD)由来エクジソン受容体のLBDのすべてで機能することが判明した。実際、2種類のアッセイから得られたKi値の定量的比較から、FPスクリーニングが、放射能に基づく標準的なスクリーニングを超える高い識別力を有することがわかった(以下を参照のこと)。
【００９９】
各アッセイは、ただ1つのマイクロタイタープレートウェルを必要とするだけであり、かつ、受容体を捕捉すること、または非拘束のトレーサーリガンドを洗い流すことが不要なので、この方法は、高スループットスクリーニングのための自動化に極めて対応しやすい。さらに、FPアッセイは、小型化に特に対応しやすく(SportsmanおよびLeytesの論文、2000年)、従って、本発明のFPアッセイは、384穴プレートなどの高密度マルチウェル様式に適合するはずである。
【０１００】
エクジソン受容体は、昆虫細胞中に極めて低濃度で本来的に存在し、このことが、in vitroアッセイにおける粗抽出物の使用を失敗させ、昆虫組織から直接的に由来するエクジソン受容体の精製を複雑にする。従って、本発明では、組換えで発現させたエクジソン受容体リガンド結合ドメインを利用する。本発明は、in vitroリガンド結合アッセイで使用するためのこのような組換えタンパク質を精製する方法を提供する。この種のリガンド結合調製物は、蛍光に基づく本発明のアッセイで使用するのに特に適している。
【０１０１】
エクジソン受容体は、昆虫綱グループ以外にも存在する。本発明が、それらの受容体がエクジステロイドに結合できる限り、その受容体の生物学的起源に拘わらず、エクジソン受容体リガンドに関するアッセイ/スクリーニングに適用可能であることは、当業者にとって明らかであろう。エクジソン受容体は、昆虫綱または節足動物門内のその他分類学的群のメンバーから、あるいは線虫綱などのその他の門内の種からでさえ取り出すことができる。
【０１０２】
本発明の本質をより明瞭に理解できるように、その好ましい形態を、以下の非制約的実施例に関連して説明する。
【０１０３】
(実施例)
方法
蛍光性エクジステロイドの合成および精製
MB4628の調製
25S-イノコステロン(1.3mg、2.5×10-3ミリモル)[Northern Biochemical社、ロシア]のジメチルホルムアミド(DMF)(200μl)溶液に、60℃で3時間にわたって、イソチオシアン酸フルオレセイン-異性体I型(5.41mg、1.25×10-2ミリモル)[Aldrich]を分割添加した。反応物を60℃でさらに24時間撹拌した。DMFを真空で除去し、固体残留物を、メタノール(100μl)に溶かし込み、150×4.6mmのAlltima C18(5μm)カラムを取り付けたWatersのクロマトグラフ装置での逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)を利用するクロマトに供した。移動相としては、0.05%(v/v)のトリフルオロ酢酸を含有する65%(v/v)メタノール水溶液を1.0ml/分の流速で使用した。Waters2487型UV検出器を用いて230nmでの吸光度ピークを検出し、Millenniumデータ管理システムを用いて処理した。生成物であるMB4628を純度95%の固体として単離した(1.2mg、収率55%に相当)。NMRスペクトルは所望の構造と一致した。MB4628のエレクトロスプレーイオン化質量分析は、溶媒としてHPLC級メタノールを用いたシングル四重極型VG Platformを使用して実施した。得られたスペクトルは、m/z 870(M+H)、892、および868(M-1)に主要なMS(ES)ピークを示し、MB4628(式量869.34)の構造に対する期待値と一致した。高分解能質量分析(LSIMS)は、20kVのCsガンおよびグリセロールマトリックスを用いるThermoQuest MAT95を使用して実施した。C48H56NO12Sに対するHRMS(LSIMS)(M+H)の計算値:870.3518、実測値:870.3519。
【０１０４】
当業者にとって明らかであるカップリング法によって、イノコステロンのその他の蛍光複合体を合成し、精製した。若干の実施例では、蛍光性出発原料を、7-ジエチルアミノクマリン-3-カルボニルアジド[Molecular Probes]、7-メトキシクマリン-3-カルボン酸[Fluka Biochemical]およびダンシルクロリド[Aldrich]とした。結果として、MB4592のフルオロフォア部分は7-ジエチルアミノクマリンであり、MB4603の場合は7-メトキシクマリンであり、MB4622の場合はダンシル基であった。
【０１０５】
イノコステロンおよびその蛍光複合体の分子量は、次の通りである、すなわち、イノコステロン(480.6)、MB4592(738.9)、MB4603(697.8)、MB4622(713.9)、MB4628(869.3)。イノコステロンおよびその蛍光複合体の溶液は、重量でエタノール(イノコステロン)またはメタノール(蛍光複合体)中の溶液とし、それらのモル濃度は、化合物の評価純度に対して調整した後に算出した。次いで、各原液の容積を調整し、1.35mM(MB4592)または3mM(イノコステロン、MB4603、MB4628)の最終濃度を得た。
【０１０６】
組換え受容体LBDの精製
ここで計画した方法は、商業上重要な有害昆虫の幾つかの種に由来するエクジソン受容体の組換えリガンド結合部分を精製するのに使用されている。この方法は、蛍光に基づく本発明のアッセイを始めとするin vitroリガンド結合アッセイで使用するのに十分な量で活性材料を提供する。
【０１０７】
各昆虫種に由来するEcRおよびUSPサブユニットのLBDを、組換えバキュロウイルスを使用して培養昆虫細胞中で共-発現させた。それらの検出および精製を容易にするために、各組換えEcR LBDをそのN-末端にヘキサヒスチジン(His6)親和性タグを含むように操作し、かつ、各組換えUSP LBDをそのN-末端にFLAG親和性タグを含むように操作した。ヘキサヒスチジン親和性タグにより、IMACクロマトグラフィーによって組換えEcR/USP LBDヘテロダイマーを分取スケールで精製することが可能になった。in vitroリガンド結合アッセイで使用するのに適した組換え受容体LBDを得るために、添加エクジステロイドまたはその他のEcRリガンドの不在下で抽出および固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)精製を行った。組換え受容体LBDがどんな種に由来するかに拘わらず、組換えLBDと一緒に共-純化する傾向のある望ましくないタンパク質(約75kD)の量を最小にする意図で、変性を起こさない界面活性剤CHAPSを場合によってはIMAC洗浄ステップまで(洗浄中またはその後ではなく)含めた。例えば、IMACで精製した材料をイオン交換クロマトグラフィー(例えば、Pharmacia Mono-Q)またはゲル濾過(例えば、Pharmacia Superdex-200)にかけることによって、組換え受容体LBDをさらに精製することが可能であったが、本発明に必要であるとは考えられなかった。
【０１０８】
ヒツジキンバエ(Lucilia cuprina)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)、シルバーリーフコナジラミ(Bemisia tabaci)のエクジソン受容体由来の機能性EcR/USP LBDを発現させるためのバキュロウイルスの構築は、一連のEcRおよびUSPエクジソン受容体サブユニットを対象にした2つの特許群(PCT/AU99/00033およびPCT/AU00/00799)およびオーストラリア仮出願第2003902621号に記載されている。オオタバコガ(Helicoverpa armigera)のEcR/USP LBDヘテロダイマーを発現させるためのバキュロウイルスは、本発明者らの実験室でクローン化されたHaEcRおよびHaUSPをコードするcDNAから同様の方法によって構築した。
【０１０９】
組換えEcR/USP LBDヘテロダイマーのパイロットスケールでの発現は、27℃に維持されたシェーカー台上のスピナーフラスコまたはショットボトル中のSf9、Sf21および/またはHi-5昆虫細胞の懸濁培養物の感染によって達成された。EcR/USP LBDヘテロダイマーを発現するように操作されたウイルスに感染した昆虫細胞は、ゲル電気泳動によって、タグの付いた2つのドメインに対応して発現したポリペプチドを含むことが示された。リガンド結合アッセイ(Koelleらの論文、1991年から改変)において、組換え細胞溶解物は、対照細胞溶解物に較べ、放射能標識化されたエクジステロイドである[3H]ポナステロンAに結合できる極めて強化された能力を有した。これらの結果は、組換えウイルスが、二量化が可能でかつ高い親和性でエクジステロイドを拘束する組換え受容体LBDヘテロダイマーを形成する機能性ドメインを発現していることを示した。
【０１１０】
組換えタンパク質の大規模製造は、撹拌した6Lのバイオリアクター中の昆虫細胞に感染させることによって実施した。典型的には、バキュロウイルスに感染したHi-5細胞を、制御された条件(27℃、35r.p.m)下にCelligen発酵槽(New Brunswick Scientific)中で増殖させた。組換えドメインの同定、完全性および純度は、下流処理中に、全タンパク質を可視化するためのクーマシー染色、またはドメインのみを可視化するためのイムノブロッティング(抗タグ抗体で)を使用する、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によってモニターした。例として、モモアカアブラムシ(M.persicae)のエクジソン受容体由来の組換えへテロダイマー性EcR/USP LBDであるMpLBDに関する抽出および精製手順を説明する。
【０１１１】
MpLBDヘテロダイマーのEcRおよびUSPサブユニットを共-発現するように操作された組換えバキュロウイルスを増幅し、Braunバイオリアクター中のHi-5昆虫細胞培養物4.5リットルを約5回の複数回感染で感染させるのに使用した。感染後49時間で採取すると、この培養物は、湿重量37gの組換え昆虫細胞を産生し、この細胞を液体窒素中で瞬間凍結し、-70℃で保存した。後程、細胞の全バッチを解凍し、2.1μMのロイペプチン、2.0μMのペプスタチン、0.95mMのフェニルメタンスルホニルフルオリド、19.5mMのNa2S2O5、1.9mMのCHAPS、9.6mMの2-メルカプトエタノールを含む170mlのEcR40緩衝液[25mM Hepes、40mM KCl、10%グリセロール、1mM EDTAナトリウム、3mM アジ化ナトリウム](pH7.0、4℃)中に懸濁させ、超音波処理を行い、細胞を破砕した(等容積の4バッチ、それぞれを、直径19mmのプローブを取り付けたMSE Type1174.MK2超音波処理器で14×5秒パルス処理、各パルス間は氷塩水中で25秒間冷却)。超音波処理物を再び一緒にし(総容積215ml)、次いで、20.8mlの4M KClを添加してイオン強度を高めた。このサンプルを超遠心にかけ、細胞破片をペレット化した(Beckman L8-80M超遠心機、Beckman 60Tiローター:100000g、1時間、4℃)。上清液を4℃で3時間、10mMの2-メルカプトエタノールを含む1100mlのEcR40緩衝液に対して透析しイオン強度を低下させた(Spectrum Spectra/Por1チューブ、長さ40cm×直径5cm)。透析液(曇りを生じた)を、遠心して清澄化した(Beckman J2-21遠心機、Beckman JA14ローター、12000rpm、30分、4℃)。次いで、これを液体窒素中で瞬間凍結し、-70℃で保存した。純度を取り戻すために、サンプルを急速に解凍し(37℃の水浴中で振とうして)、4℃で3時間、1100mlのリン酸塩緩衝液(50mM リン酸ナトリウム、10%グリセロール、0.3M NaCl、2.4mM CHAPS、10mM メルカプトエタノール、3mM アジ化ナトリウム、pH7.4)に対して2回透析した(Spectrum Spectra/Por1チューブ、長さ40cm×直径5cm)。次いで、透析液(総量200ml)を液体窒素中で瞬間凍結し、-70℃で保存した。
【０１１２】
凍結した透析液を急速に解凍し(37℃の水浴中で振とうして)、再び清浄化した(Beckman J2-21遠心機、Beckman JA14ローター、12000rpm、20分、4℃)。清浄化したタンパク質サンプルに3mMのアジ化ナトリウムを含む2mlの2Mイミダゾール(pH7.4)を添加した。Ni-NTAアガロースビーズ(OiagenカタログNo.30210)の50%スラリーの6ml部分を20mlのリン酸塩緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、10%グリセロール、0.3M NaCl、10mM 2-メルカプトエタノール、3mM アジ化ナトリウム、pH7.4)で2回洗浄した。洗浄したビーズをタンパク質サンプルと混合し、懸濁液をゆっくり回転した(RotoTorque:10rpm、3時間、4℃)。次いで、遠心してビーズをペレットにした(Beckman J2-21遠心機、Beckman JA14ローター、10000rpm、20分、4℃)。上清液を注意して除去した後、ビーズを4℃でミニカラム(底にフリットとして役立つWhatman濾紙の円盤を有する、直立に固定した10mlの注射筒)に移した。ビーズの円柱を、4℃で70mlのリン酸塩緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、10%グリセロール、0.3M NaCl、10mM 2-メルカプトエタノール、20mMイミダゾール、3mMアジ化ナトリウム、pH7.4)で洗浄することによって、非拘束のタンパク質を除去した。特異的に拘束されたタンパク質を高濃度のイミダゾールを含む緩衝液(50mMリン酸ナトリウム、10%グリセロール、0.3M NaCl、10mM 2-メルカプトエタノール、250mMイミダゾール、3mMアジ化ナトリウム、pH7.4)で溶離した。回収を最大化するために、各適用の間に20分の間隔を置き2×2.3mlのアリコートとして溶離緩衝液をカラムに適用した。溶離液を混合し、集めたものをアリコートに分割し、液体窒素中で瞬間凍結し、-70℃で保存した。その一部を、タンパク質含量について、Pierce Coomassie Plusアッセイを利用して分析し、ウシ血清アルブミンを使用して較正した。この方法で測定されたタンパク質濃度は、定量的アミノ酸分析によって測定された濃度の6%以内であることがわかった(データは省略)。各へテロダイマー性LBDに対する次のような予想分子質量(すなわち、その2つの概念的に解釈されたLBDポリペプチドの総和)、すなわち、LcLBD:81.5kDa、Mp:68.2kDa、BtLBD:65.8kDa、HaLBD:74.2kDaを用いてモル濃度を算出した。
【０１１３】
同様の手順を利用してLcLBD、BtLBD、およびHaLBDを調製したが、場合によっては、手順からCHAPSを除外した。比較試験(記載省略)により、ヘテロダイマーの抽出およびIMAC捕捉の際に、非配位組換え受容体LBDヘテロダイマーをCHAPSに一時的に暴露しても、最終(CHAPS不含)調製物のリガンド結合活性に対して影響を与えないことが確認された。これと対照的に、以下で極めて詳細に考察するように、リガンド結合アッセイでCHAPSが存在すると、タンパク質の見掛けのリガンド結合能力が向上することも多い。
【０１１４】
各組換え受容体LBDヘテロダイマーについて、様々な濃度の[3H]ポナステロンA(典型的には0.1〜4.0nMの結合可能な放射性リガンド)を、低い一定濃度のLBDヘテロダイマーと一緒にインキュベートする平衡結合実験を実施し、受容体-放射性リガンドの結合を、本質的には以下に記載するようにして測定した(すなわち、総容積を154μlとし、競合リガンドの不存在下で実施される、方法の部の「放射性リガンドに基づくアッセイを利用する、リガンドとしての蛍光性および対照エクジステロイドの試験」の中のMpLBDに対する用手法)。[[3H]ponA]bound<[[3H]ponA]total/10の条件を認めたので、リガンドの減耗は回避され、結合対遊離[3H]ポナステロンAの濃度のプロットは、ラングミュア等温式
[[3H]ponA]bound=[[3H]ponA]free[LBD]tot/(Kd+[[3H]ponA]free)
に直接フィッティングさせることができた(Hulme & Birdsallの論文、1992年)。ここで、[[3H]ponA]totalはアッセイにおいて結合可能な[3H]ポナステロンAの総濃度であり、[[3H]ponA]freeはアッセイにおいて遊離の結合可能な[3H]ポナステロンAの濃度であり、[[3H]ponA]boundは拘束された[3H]ポナステロンAの濃度であり、[LBD]totは、機能性組換え受容体LBDへテロダイマーの総濃度であり、Kdは、アッセイ条件下での該受容体と[3H]ポナステロンAに関する解離定数である。コンピューターアルゴリズム(KaleidaGraph v3.09、Synergy Software)を利用してデータをフィッティングすると、各受容体-放射性リガンド複合体に対するKd値を得ること、および[LBD]totを求めることが可能になる。[LBD]tot値を各精製サンプルのタンパク質濃度と比較すると、機能性である組換え受容体LBDヘテロダイマー分子の比率が判明した。
【０１１５】
放射性リガンドに基づくアッセイを利用する、リガンドとしての蛍光性および対照エクジステロイドの試験
イノコステロンおよびその蛍光複合体がモモアカアブラムシ(M.persicae)の組換えエクジソン受容体に結合する能力を、通常の放射性リガンド結合アッセイ(Koelleらの論文、1991年を改変)を利用して競合阻害様式で評価した。従って、(1)一定濃度のMpLBDおよび[3H]ポナステロンAを含むアッセイ混合物に順次増加する量のイノコステロンまたはその蛍光複合体を添加し、(2)平衡後、MpLBD(MpLBD-リガンド複合物を含む)を、ガラス繊維フィルター上に吸着させて捕捉し、非拘束[3H]ポナステロンAを完全に洗い流し、(3)受容体に拘束された放射性リガンドの量を、フィルターをシンチレーション計数することによって測定した。
【０１１６】
これらの手順は、次のように手動で実施した。アッセイは、0.5mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)を含有するEcR40緩衝液[25mM Hepes、40mM KCl、10%グリセロール、1mM EDTAナトリウム、3mMアジ化ナトリウム]中で実施した。組換えM.persicaeエクジソン受容体であるMpLBDを含む抽出物を前記のようにして調製し、0.5mg/mlBSAを含有するEcR40緩衝液中に、競合するリガンドの不存在下でアッセイを行った場合に約10000cpmのフィルター計数値を生じさせる濃度まで希釈した。[3H]ポナステロンA([24,25,26,27-3H(N)]ポナステロンA、NEN Life SciencesカタログNo.NET-1070)は、極端に高い受容体濃度でさえ結合できないで残存する放射能の比率(典型的には30%)に調整した後に、2.0nMの最終濃度で存在させた。アッセイは、適切な容積の当該原液を含めることによって、様々な最終濃度の蛍光性エクジステロイドを含むように設定した。インキュベーション混合物中のエタノールまたはメタノールの最終濃度は、放射性リガンドの結合程度に重大な影響を与えないことが知られている濃度(データは省略)である0.8%(v/v)を超えなかった。各インキュベーションは、166μlの最終容積で、室温(22℃)で90分間実施し、その後、フィルター吸着/洗浄ステップを実施するまで氷上に保持した。インキュベーションを完了したそれぞれから140μlの3つのアリコートをガラスミクロ繊維フィルター(GF/C直径24mm、WhatmanカタログNo.1822024)に適用、すなわち、インキュベーション毎に3つのフィルターのそれぞれを140μlのインキュベーション混合物で濡らした。室温で30秒間液体に暴露した後、湿潤フィルターを真空焼結器具(Pyrexフィルターホルダー、Millipore社カタログNo.XX1002500)に移し、速やかに洗浄した。洗浄は、2×5mlの氷冷EcR40緩衝液を使用して行い、フィルター端部の完全洗浄を確実にするためにフィルターの円周回りに3×0.5mlの緩衝液を撒き散らした。次いで、湿ったフィルターをシンチレーション瓶に移した。すべてのフィルターをこのように処理したら、各シンチレーション瓶に7mlのPackard InstaGel Plusシンチラントを添加した。密封した瓶をボルテックスし、次いで、室温で少なくとも2時間インキュベートすると、その間にフィルターは透明になった。次いで、瓶をシンチレーション計数した(フィルター毎に1分間、トリチウムプログラム、Packard TriCarb2100TRシンチレーションカウンター)。データ点を、各インキュベーションから発生する3つの複製フィルターについて平均cpm値±SEMとして記録した。様々なイノコステロン誘導体の比較を可能にするために、個々の滴定から得られたcpm値を、100%活性が非放射性競合化合物の不在下で得られるcpm値に相当し、0%活性がMpLBD不在下で得られるバックグラウンドcpm値に相当する、%活性値に変換した。
【０１１７】
Flexicurveを使用すると、放射性リガンドアッセイ競合阻害曲線に対して滑らかな曲線が描かれ、このことは、(印刷の便宜のため)図2に示した点-点の直線プロットよりもデータに対するより実際的な適合を意味する。100%および0%活性値の間の中間点を使用して、滑らかな滴定曲線からIC50値を算出した。この中間点における阻害濃度を、阻害剤に対するIC50値であると考えた。IC50値を、次のCheng-Prusoff式(Cheng & Prusoffの論文、1973年)
Ki=IC50/(1+([[3H]ponA]tot/Kd))
を利用してKi値に変換した。ここで、[[3H]ponA]totは、アッセイにおいて結合可能な[3H]ポナステロンAの総濃度であり、Kdは、アッセイ条件下での[3H]ポナステロンと受容体との解離定数である。[[3H]ponA]tot値は、前述のように2.0nMであり、一方、MpLBDの場合には、Kdに対して0.7nMの値を使用した(結果の部の「組換え受容体LBDの精製」を参照のこと)。
【０１１８】
続いて、MpLBDおよびBtLBDに対して放射性リガンドに基づく競合アッセイの小型化および自動化版を利用して、後にFPアッセイの競合阻害様式を検証するのに使用される、非放射性、非蛍光エクジステロイドに対するKi値を得た。アッセイの概念は上述のものと変わらないが、若干異なる態様で実施した。この場合、アッセイは、96穴プレート(V底ポリプロピレン、Greiner Bio-OneカタログNo.651201)中で実施され、結合可能な[3H]ポナステロンA濃度は1.3nMであり、MpLBDまたはBtLBDの濃度は競合するリガンドの不在下でフィルター当たり約2000cpmを与えるように設計され、各アッセイの総容積は30μlであり、インキュベーション混合物は、Beckman Biomek2000ロボットワークステーションを用いて調製した。今度は室温、4時間で混合物を再び平衡させた。次いで、MpLBDを96-フィルターアレイ(Unifilter-96GF/C、PackardカタログNo.6005174)上に捕捉し、Biomek2000の洗浄具および真空ブロックを使用して洗い流した。次いで、各フィルタープレートの背面を、Packard BackSealのシートを使用して手で覆い、各ウェルに25μlのPackard MicroScint-20シンチレーション液を分注した。各プレートの上端をPackard TopSeal-Aで密封し、フィルターを一夜溶媒和させた。次いで、Packard TopCountシンチレーションカウンターを使用して、拘束された[3H]ポナステロンAの量を測定した(フィルター毎に1分、トリチウム/Microscintプログラム)。Cheng-Prusoff式中の[3H]ポナステロンA濃度に対して1.3nMを使用したこと以外は前と同様にしてIC50およびKiデータを誘導した。拘束された放射能の量は、総存在量の多くても28%なので、リガンドの消耗に対するさらなる修正は行わなかった。
【０１１９】
FPによる蛍光性エクジステロイド結合のモニタリング
標準FPアッセイ緩衝液は、0.5mg/mlウシ血清アルブミンを含有する、50mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH7.4とした。必要なら、典型的には、調製的なピペット操作ステップ(一連の希釈など)は、通常のV底96穴マイクロプレート(例えば、V底ポリプロピレン、Greiner Bio-One、カタログNo.651201)中で行った。アッセイ自体は、蛍光測定用に設計された不透明黒色平底96穴プレート(例えば、Nunc、カタログNo.237108)中で構成した。すべてのアッセイの最終容積は250μlとした。FPプレートリーダーは、蛍光偏光光学部品(製造業者の使用説明書に従って取り付けた)を備え、FLUOstar Optimaソフトウェアによりプレートモード(偏光)で操作されるPOLAstar Optima(ドイツ、Offenburg、BMG LabtechnologiesカタログNo.413-201)とした。励起は485nm(フィルター485)で行い、放射は520nm(フィルター520p)で検出した。装置の標準的な設定には、読取りを開始する前のプレートに対する3秒/3mmの振とうが含まれ、読取りには200フラッシュ/アッセイを使用した。利得値は、1.0に近いまたは等しいK-ファクターを用い、各チャネルに対して典型的には約3000とした。
【０１２０】
50mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl中でフルオレセインが30nMのサンプル(pH7.4)250μlは、35mPの偏光値を有することがわかり、それを用いてFPプレートリーダーを較正した。装置は、同一緩衝液中、MB4628が36nMのサンプル250μlが、100mPに近い偏光値を有することを示した。以後、各実験期間の開始時に、標準FPアッセイ緩衝液中でMB4628が36nMのサンプル250μlに対して100mPの読みを与えるようにFPプレートリーダーを調整した。
【０１２１】
受容体LBDの滴定には、小容積の受容体LBDヘテロダイマー希釈原液(例えば2.5μl)を、36nMのMB4628を含有する大容量の標準FPアッセイ緩衝液(例えば247.5μl)と混合することを含めた。指摘した場合には、CHAPSを2mMの最終濃度で存在させた。受容体の希釈液は、典型的には、広範な濃度範囲、例えば機能性受容体が0.005〜50nMである範囲を包含するように準備した。アッセイ混合物を、典型的には4℃で一夜インキュベートすることによって平衡に到達させ、次いで、室温(20℃)で2〜4時間平衡させた後、mP値を読み取った。データをプロットする際には、Flexicurveを利用してFP滴定について滑らかな曲線を描いた。これらは、(印刷の便宜のため)図3に示した点-点の直線プロットよりもデータに対してより実際的に適合することを意味する。
【０１２２】
試験により、より高濃度のトレーサーリガンドは、アッセイのダイナミックレンジを有意には改善せず、アッセイを実施するのに必要な受容体およびトレーサーの双方の量を増加させることがわかった(データは省略)。別の試験により、FPアッセイに受容体原液から持ち込まれる少量の添加物(IMACカラム溶離緩衝液中の)は、mP値に対して有意な影響を与えないことがわかった(データは省略)。
【０１２３】
化合物ライブラリーは、典型的には、ジメチルスルホキシド(DMSO)またはエタノール(EtOH)などの有機溶媒に溶解した多数の原液からなる。組換えエクジソン受容体によるMB4628の拘束に対する競合阻害剤の影響を試験する前に、FPアッセイに対するこのような溶媒類の影響を判定する必要があった。従って、受容体を含まない、または1.5nMの機能性MpLBDを含むFPアッセイを、1%(v/v)までのEtOHおよび6%(v/v)までのDMSOを用いて試験した。
【０１２４】
放射性リガンドに基づくアッセイを用いた予備実験(記載は省略)は、アッセイに2mMの3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート(CHAPS)を存在させると、このリガンドに対するKd値を見掛け上変えないで、LcLBDおよびMpLBDの[3H]ポナステロンAを拘束する能力が2〜4倍に高まる可能性のあることを示した。従って、FPアッセイに2mMのCHAPSを含めることが、例えばそのダイナミックレンジを増すことによって、そのパフォーマンスを向上できる可能性があるか否かを試験することは適切であると考えられた。
【０１２５】
FPによるエクジソン受容体リガンドに関する化合物ライブラリーのスクリーニング
CHAPSを含まないアッセイウェルを読み取る前に、標準FPアッセイ緩衝液中に36nM MB4628を含む溶液250μlを含むウェルに対して100のmPの示度を与えるようにFPプレートリーダーを調整した。2mMのCHAPSを含むアッセイウェルを読み取る前に、標準FPアッセイ緩衝液中に36nM MB4628+2mM CHAPSを含む溶液250μlを入れたウェルに対して100mPの示度を与えるようにプレートリーダーを調整した。
【０１２６】
競合阻害アッセイの場合、各ウェルには、36nMのMB4628、および5nMの機能性MpLBDまたは6nMの機能性BtLBDのどちらかを含有する標準FPアッセイ緩衝液を入れた。MpLBDは別であるがBtLBDアッセイは、2mMのCHAPSの存在下で定型的に実施した。すべてのアッセイの最終容積は250μlとした。ここに記載する条件下で、競合リガンドが存在しないなら、観察されるmP値はアッセイに対する最大可能値に近い。CHAPSの不在下で、LcLBDに対して類似の条件を準備するためには、36nMのMB4628および20nMの機能性LcLBDを含有する250μlの標準FPアッセイ緩衝液を提示する。同様に、HaLBDに対しては、36nMのMB4628および8nMの機能性HaLBDを含有する250μlの標準FPアッセイ緩衝液を提示する。CHAPSを含めるとLcLBDおよびHaLBDの競争阻害アッセイのパフォーマンスを向上させる可能性があることに留意されたい(結果の部を参照のこと)。
【０１２７】
Flexicurveを使用して、FP競合阻害曲線に対して滑らかな曲線を描いた。この曲線は、(印刷の便宜のため)図4に示した点-点の直線プロットよりもデータに対するより実際的な適合を意味する。100mP以下のmP値を有することによって高い阻害剤濃度において理論的予測から逸脱する実際のプロットであっても、実際の最大mP値(mPmax)と理論的最小mP値(mPmin)の間の中間点を使用して、滑らかな滴定曲線からIC50値を算出した。この中間点における阻害濃度を、阻害剤に対するIC50値であると考えた。IC50値を、次のCheng-Prusoff式(Cheng & Prusoffの論文、1973年)
Ki=IC50/(1+([MB4628]tot/Kd))
を使用してKi値に変換した。ここで、[MB4628]totは、アッセイにおけるMB4628の総濃度であり、Kdは、アッセイ条件下でのMB4628と関連受容体との解離定数である。この式で使用するKd値は、滴定中間点での受容体濃度は、その受容体がMB4628で半飽和される値であるという知見を利用して基礎的FP滴定曲線(図3)から算出した。Kd値は、この点における遊離MB4628の濃度であり、従って、
Kd=[MB4628]tot-([受容体]中間点)/2
でなければならない。
【０１２８】
ここで使用されるKdは、MpLBD(CHAPSなし)およびBtLBD(2mM CHAPSあり)の双方に対して35.3nMとした。MpLBDでのその(CHAPS不含)FP滴定曲線から得られるMB4628に対するKd値を、同一受容体への(CHAPS不含)結合に関して[3H]ポナステロンAと競合する同一リガンドの能力によって決定されるKi値と直接的に比較可能であることに留意されたい(結果の部の「放射性リガンドに基づくアッセイを使用するリガンドとしての蛍光性および対照エクジステロイドの試験」を参照のこと)。それぞれ2つの値35.3nMおよび40.0nMは、近接して一致している。双方の定数はMpLBD-MB4628複合体の解離を記述するので、このことは、理論的予測と一致している。
【０１２９】
BtLBDの競合阻害アッセイからCHAPSを除外することの影響を直接的に試験した。かくして、標準的手順から外れたBtLBD実験において、10nM機能性BtLBDを、36nM MB4628および順次増加する濃度の非蛍光エクジステロイド類と共に、但しCHAPSなしでインキュベートした。Cheng-Prusoff式を利用してKi値を算出する際には、これらの条件下でのMB4628に対するKd値、34.7nMを使用した。
【０１３０】
結果
組換え受容体LBD類の精製
バキュロウイルスを成功裡に感染させた4〜6LのHi-5昆虫細胞培養物は、典型的には、細胞g当たり約0.3mgの組換えLBDタンパク質を含む70〜100gの湿潤細胞を産生した。方法の部に詳細に記載した、MpLBDのIMAC精製により、37gの湿潤細胞から17mgの精製タンパク質が得られた。
【０１３１】
還元SDS-PAGEによるIMAC精製受容体LBDヘテロダイマーの分析により、調製物の純度は90%を超えることがわかり、組換えEcRおよびUSPポリペプチドはほぼ等モル量で存在することを確認した(図1)。各組換えサブユニットの見掛け分子質量は、関連サブ遺伝子でコードされるポリペプチドに対して予測されるものに近かったが、組換え種のすべては、予想よりわずかにより遅く移動した(さらなるデータは省略)。
【０１３２】
組換え受容体LBDヘテロダイマーの各調製物に対して、[3H]ポナステロンAとの平衡結合実験(詳細省略)により、次のようなKdの概算値が得られた。すなわち、LcLBDに対してKd=1.0±0.10nM、MpLBDに対してKd=0.72±0.09nM、BtLBDに対してKd=1.21±0.17nM、HaLBDに対してKd=2.53±0.12nM。ヒツジギンバエ(L.cuprina)胚抽出物を使用して行われた同様の結合研究(詳細省略)により、Kd=0.92±0.10nMが得られ、これによって、組換えLBDのリガンド結合機能は、実験誤差の範囲内で非組換え(全長)エクジソン受容体の機能と同一であることを確認した。
【０１３３】
同様の平衡結合実験は、各調製物中の機能性受容体LBDヘテロダイマー分子の比率が次の通りであることを示した。すなわち、LcLBDで21%、MpLBDで16%、BtLBDで8.4%。HaLBDに対する値は直接的には測定しなかったが、間接的方法によって15%の暫定値を割り当てた。比較的低い活性値は、Sagaらの論文(1986年)が、「非積載受容体の結合活性は標準的なタンパク質精製技術にかけた場合に本質的に不安定である」と述べている、全長キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)の受容体に対して発表されている報告に一致する。従って、エクジステロイド受容体は、ほとんどの操作の際にホルモンを載せて維持する必要がある。機能性受容体タンパク質のより高い比率は、エクジステロイドリガンドの存在下で精製を実施することによって得ることが可能である(データは省略)ことに同意するが、得られる受容体-リガンド複合体はリガンド結合アッセイでの使用に適さない。さらに、拘束されたエクジステロイドリガンドは、組換え受容体LBDから解離するのが遅い。例えば、拘束された[3H]ポナステロンAをLcLBDから室温での透析によって取り去る試みにより、放射性リガンド-受容体複合体の半減期は約10時間であることがわかった(データは省略)。従って、組換え受容体LBDヘテロダイマーをどんなリガンドをも存在させないで定型的に精製し、精製LBDヘテロダイマー調製物の濃度値を修正し、存在する非機能性ヘテロダイマーの比率を把握した。この方法で修正した濃度を、「nM機能性受容体」の用語で表現する。
【０１３４】
放射性リガンドに基づくアッセイを使用するリガンドとしての蛍光性および基準エクジステロイドの試験
イノコステロンおよびその蛍光複合体を、モモアカアブラムシ(M.persicae)由来の組換えエクジソン受容体であるMpLBDへの結合に関して[3H]ポナステロンAと競合できる能力について試験した。これらの状況下で、イノコステロン、およびC-26を経由して結合させた蛍光性誘導体であるMB4603、MB4592、およびMB4628の滴定は、すべて類似のS字状曲線を与えた(図2)。曲線の中間点はイノコステロンに対して65nMの、MB4603に対して40nMの、MB4592に対して20nMの、MB4628に対して40nMのKi値を示す。また、イノコステロンのダンシル誘導体であるMB4622は、MpLBDに対する高度に有効なリガンドであった(データは省略)。一方、ステロイドA環のC-3位を経由して結合させたダンシル部分を有する誘導体であるMB4588は、MpLBDへの結合に関して[3H]ポナステロンと競合しなかった(データは省略)。
【０１３５】
[3H]ポナステロンAと、MpLBDまたはBtLBDのどちらかを使用する同様のアッセイ(詳細は省略)を用いて、後にFPアッセイの競合阻害様式を検証するのに使用される、非放射性、非蛍光性エクジステロイド類に対するKi値を得た。MpLBDの場合、ポナステロンA、ムリステロンAおよび20-ヒドロキシエクジソンに対するKi値を、それぞれ0.28nM、30nMおよび100nMであると判定した。BtLBDの場合、ポナステロンA、ムリステロンAおよび20-ヒドロキシエクジソンに対するKi値を、それぞれ4.8nM、5.3nMおよび240nMであると判定した。MpLBDでのポナステロンAに対するKi値(〜0.3nM)は、MpLBDでの[3H]ポナステロンAに対する前に報告したKd値(〜0.7nM)に似ていることに留意されたい(結果の部、「組換え受容体LBDの精製」を参照のこと)。同様に、BtLBDでのポナステロンAに対するKi値(4.8nM)は、BtLBDでの[3H]ポナステロンAに対して前に報告したKd値(1.2nM)とそれほど大きくは相違しない(結果の部、「組換え受容体LBDの精製」を参照のこと)。それぞれの場合において、2つの定数は、同じ受容体-リガンド複合物の解離を記述するので、各受容体におけるKi値とKd値の一致は、理論的予想と一致する。
【０１３６】
図2は、イノコステロンの3つの蛍光性複合体であるMB4603、MB4592、およびMB4628のすべてが、組換えエクジソン受容体に結合できる能力を傷害されていないことを示す。データは、蛍光発色団が、エクジステロイド部分の受容体に対する結合に関して立体的または電子的影響を有意には発揮しないモデルを提案している。試験した化合物の中で、蛍光複合体(MB4628)のスペクトル特性により、該複合体は、蛍光に基づくアッセイを開発するのに好ましいリガンドとなった。従って、本発明者らは、MB4628に焦点を当てた新規なアッセイを開発し、このリガンドの組換えエクジステロイド受容体LBDへテロダイマーに対する結合を観測するためのFPを開発した。
【０１３７】
FPによる蛍光性エクジステロイド結合の観測
標準FPアッセイ緩衝液中の遊離MB4628に対するmP値は100なので、すべてのアッセイにおいて最小値を100mP(mPmin=100mP)とした。MpLBDを使用する36nM MB4628の滴定では、最大mP値が335mP(mPmax=335mP)で、曲線の中間点が1.1〜1.8nMの機能性受容体に相当するS字状曲線が得られた(図3)。FPアッセイに関して、235mPのダイナミックレンジは優れていると考えられる。LcLBDを使用する36nM MB4628の滴定では、mPmax=220mP(すなわち、MpLBDのダイナミックレンジの約半分)および2.5nM機能性受容体の中間点を有するS字状曲線が得られた(図3A)。BtLBDを使用して同様に滴定すると、mPmax=210〜260mPおよび1〜5nM機能性受容体の中間点を有するS字状曲線が得られた(図3A)。HaLBDを使用して同様に滴定すると、mPmax=230mP(LcLBDおよびBtLBDと同様で、MpLBDに対してよりも実質的に低い)および3.5nM機能性受容体の中間点を有するS字状曲線が得られた(図3A)。
【０１３８】
FPアッセイは、EtOHの最終濃度1%(v/v)で6%のmP値低下を示したが、有意とは思われない。ここで報告する競合阻害アッセイは、EtOH最終濃度が1%(v/v)またはそれ以下なので、溶媒効果に対する修正は行わなかった。これと対照的に、FPアッセイは、DMSOによって有意の影響を受け、DMSOの最終濃度1%(v/v)で18%のmP値低下を、DMSO濃度6%(v/v)で41%のmP値低下を示した。この影響は、いずれかのエクジソン受容体が存在するか否かに関係なく発生するので、DMSOはFPアッセイの本来のダイナミックレンジに対して有害な影響を少しは与える可能性がある。しかし、この影響に加え、若干の組換え受容体LBDは、本質的にDMSOに敏感である。例えば、放射性リガンドに基づくアッセイ(詳細は省略)は、DMSOはLcLBDまたはMpLBDに対するリガンド結合に大きな影響を与えないが、DMSOの最終濃度6%(v/v)でBtLBDへの結合を〜50%程度阻害し、DMSOの最終濃度1%(v/v)でHaLBDへの結合を〜30%程度阻害することを示している。このことは、DMSOにより敏感な受容体に対する適度なまたは劣ったリガンドに関するDMSOをベースにした化合物ライブラリーをスクリーニングできる能力を制約する可能性があるが、放射能を基にした従来のアッセイも確実に同じ制約を受けることを指摘したい。
【０１３９】
BtLBD滴定を2mMのCHAPSの存在下で実行すると、mPmaxの絶対値は増加しないが、mPmin値はゼロ以下にまで低下した。従って、CHAPS含有アッセイウェルの読取りを試みる前に、36nM MB4628および2mM CHAPSを含む標準FPアッセイ緩衝液(受容体不含)250μlを入れたウェルを使用してFPプレートリーダーを100mPに再標準化しなければならない。2mM CHAPSの存在下で行われたBtLBD滴定のダイナミックレンジ(約260mP)は、今のところ優れたものであり、MpLBD滴定(CHAPS不含)のそれに類似していた(図3B)。また、CHAPSが存在すると、BtLBD滴定中間点が有意に低下する。すなわち、この実験において、2mMのCHAPSが存在すると、中間点が、CHAPS不含の4.5nMから1.5nMの新たな機能性BtLBD値に移動した。この効果は、スクリーニングの際の受容体消費を最小化するのに役立つ可能性がある。これと対照的に、2mM CHAPSは、MpLBDアッセイのダイナミックレンジに軽微な増加を生じさせるだけであり、滴定中間点に1.5倍の増加をもたらした。
【０１４０】
FP法によるエクジソン受容体リガンドのための化合物ライブラリーのスクリーニング
モモアカアブラムシ(M.persicae)受容体の場合、競合阻害は、濃度を順次増加させた非蛍光性エクジステロイドの存在下に5nMの機能性MpLBDを36nMのMB4628と共にインキュベートすることによって検出した(図4A)。高濃度の非標識化エクジステロイドは、mPの観測値を遊離MB4628に対する値を超えて低下させ、MB4628の蛍光とのなんらかの干渉、受容体の不在下で観測されない現象を示唆している(データは省略)。遊離MB4628に対する理論値に対してより低い境界を設定した場合でさえ、MpLBDアッセイの使用可能なダイナミックレンジ(225mP)は優れていた。MpLBDの曲線から得られる、ポナステロンA、ムリステロンAおよび20-ヒドロキシエクジソンによる阻害に対するIC50値を、それぞれ1nM、149nMおよび1490nMのKi値に変換した。前記のように(結果の部、「放射性リガンドに基づくアッセイを使用するリガンドとしての蛍光性および対照エクジステロイドの試験」を参照のこと)、放射性リガンドに基づくMpLBDアッセイから得られる対応Ki値は、0.28nM、30nMおよび100nMであった。従って、絶対値の相違にもかかわらず、FPアッセイは、能力に関して競合剤を正しくランク付けし、放射性リガンドに基づくアッセイを超える増大した識別力を示した。それぞれの非標識化エクジステロイドに対してFPから得られたKi値を、それに対応する放射性リガンドに基づくアッセイから得られたKi値に対してプロットした(図5)。
【０１４１】
シルバーリーフコナジラミ(B.tabaci)の受容体の場合、競合阻害は、2mMのCHAPSおよび濃度を順次増加させた非蛍光性エクジステロイドの存在下に6nMの機能性BtLBDを36nMのMB4628と共にインキュベートすることによって検出した(図4B)。この滴定において、高濃度の非標識化エクジステロイドは、mP値を遊離のMB4628に対する値を超えては低下させなかった。BtLBDアッセイの使用可能なダイナミックレンジ(225mP)は優れていた。BtLBDの曲線から得られる、ポナステロンA、ムリステロンAおよび20-ヒドロキシエクジソンによる阻害に対するIC50値を、それぞれ7.4nM、27nMおよび994nMのKi値に変換した。前記のように(結果の部、「放射性リガンドに基づくアッセイを使用するリガンドとしての蛍光性および対照エクジステロイドの試験」を参照のこと)、放射性リガンドに基づくBtLBDアッセイから得られる対応Ki値は、4.8nM、5.3nMおよび240nMであった。従って、FPアッセイは、やはり、能力に関して競合剤を正しくランク付けし、放射性リガンドに基づくアッセイを超える増大した識別力を示した。それぞれの非標識化エクジステロイドに対してFPから得られたKi値を、それに対応する放射性リガンドに基づくアッセイから得られたKi値に対してプロットした(図5)。
【０１４２】
BtLBD競合阻害FPアッセイからCHAPSを排除することの有害な影響が、この受容体に対する標準手順から外れた実験で立証された。この場合(データは省略)、高濃度の非標識化エクジステロイドは、mP値を、ちょうどCHAPS不含MpLBDアッセイで行ったように、遊離MB4628に対する値を超えて低下させた。CHAPS不含BtLBDアッセイの使用可能なダイナミックレンジ(125mP)は、好ましい(標準)CHAPS含有BtLBDアッセイのレンジ(225mP)よりもさらに小さかったが、それにも拘らず、CHAPS不含アッセイは、やはり、最大効力に関して競合剤を正しくランク付けした。しかし、CHAPS不含の変形法と比較すると、標準のCHAPS含有BtLBDアッセイは、より少量のBtLBDを必要とし、放射性リガンドに基づくアッセイから得られるKi値の絶対値に近いKi値を与えるより良好な形状の(すなわち、S字状)滴定曲線を提供するように思われた。さらに、CHAPS含有FPアッセイは、ムリステロンAおよびポナステロンAを、結合親和性に関してちょうど従来の放射性リガンドを基にしたアッセイが行うように、一緒に近接してランク付け、一方CHAPS不含FPアッセイは、ムリステロンAと比較してポナステロンAの結合親和性を誇張した。全体的に、BtLBD競合阻害アッセイのパフォーマンスは、2mMのCHAPSの存在によって強化されたことは明らかである。2mMのCHAPSの存在下でLcLBDおよびHaLBDアッセイを実施すると、例えばそれらのダイナミックレンジを高めることによって、これらアッセイのパフォーマンスの向上が期待される。CHAPSは、MpLBD競合阻害アッセイの若干の態様を改善できる可能性もある。
【０１４３】
本明細書の全体を通して、単語「含む(comprise)」、または「その三人称(comprises)」もしくは「その分詞形(comprising)」などの変形体は、指定した要素、全体もしくはステップ、または要素、全体もしくはステップの群を包含することを意味するが、任意のその他要素、全体もしくはステップ、または要素、全体もしくはステップの群を排除することを意味しないと解される。
【０１４４】
本明細書中で言及したすべての刊行物を、参照により本明細書に援用する。本明細書中に含まれる、文献、記録、材料、装置、論文などの任意の考察は、本発明に対して単に状況を提供する目的のためである。これら事項のいずれかまたはすべてが、先行技術基盤を形成し、あるいは本発明にかかわる分野における、本出願の各特許請求項の優先日以前にオーストラリアまたはその他の場所において存在しているような通常の一般的知見であることを認めるものと解釈すべきではない。
【０１４５】
当業者であれば、概括的に記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態で示された発明に対して多くの変形および/または修正をなし得ることを認めるであろう。従って、本明細書の実施形態は、すべてに関して例示と考えるべきであり、制約するものと考えるべきではない。
【０１４６】
(参考文献)
2007520455.tif 000013
2007520455.tif 000014
2007520455.tif 000015
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】新たに調製した組換えエクジソン受容体サンプルを、12%SDS-PAGEで分析し、クーマシーブルーで染色した図である。サンプルレーンは、3種の昆虫種に由来する受容体の代表的な固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)溶離物を示し、次の通りである。すなわち、Lcはヒツジキンバエ(Lucilia cuprina)由来エクジソン受容体の組換えLBDヘテロダイマー(LcLBD)、Mpはモモアカアブラムシ(Myzus persicae)由来エクジソン受容体の組換えLBDヘテロダイマー(MpLBD)、Btはシルバーリーフコナジラミ(Bemisia tabaci)由来エクジソン受容体の組換えLBDヘテロダイマー(BtLBD)である。受容体サンプル(レーン当たり8〜12μg)は、ロードする前に、5%(v/v)2-メルカプトエタノールの存在下で煮沸した。各受容体レーンで、主なダブレットの上側バンドは組換えEcRサブユニット、下側バンドは組換えUSPサブユニットであり、他の薄いバンドは夾雑タンパク質である(レーン当たりのタンパク質ロード量を高めることによって容易に認識できる)。Mはマーカータンパク質であり、分子質量を左側にキロダルトン(kDa)で表示した。
【図２】イノコステロンおよびその蛍光複合体(MB4603、MB4592およびMB4628)を、Myzus persicae MpLBDへの結合に関して[3H]ポナステロンAと競合できる能力について試験した図である。Y-軸は、受容体に結合した[3H]ポナステロンAの実際量を[3H]ポナステロンAの可能な最大結合に対する割合として表示し、X-軸は、競合するリガンド(イノコステロンまたはその蛍光複合体)の濃度を示す。省略形Inokoはイノコステロンを意味する。この図は、イノコステロンの3種の蛍光複合体は、すべて、イノコステロンそれ自体に比較して、組換えエクジソン受容体に結合するそれらの能力を傷害されていないことを示している。
【図３Ａ】(3A)イノコステロン-フルオレセイン複合体MB4628(36nM)および組換えエクジソン受容体類に対する蛍光偏光(FP)滴定曲線を示す図である。後者の濃度をX-軸で示し、Y-軸は、平衡時点でのアッセイに対する最終偏光値(mP)を示す。100mP近辺の値は、MB4628のすべてが遊離であることを示し、受容体に拘束されたMB4628の割合が増加するにつれて、mP値はこの基線からS字状に増加する。FPアッセイに関して、ここでMpLBDに対して観察されたような235mPのダイナミックレンジは、優れたものであると考えられる。省略形MpはMpLBDを、Bt4はBtLBDを、LcはLcLBDを、HaDEFはオオタバコガ(Helicoverpa armigera)由来エクジソン受容体の組換えLBDヘテロダイマー(HaLBD)を意味する。
【図３Ｂ】(3B)MB4628を用いるBtLBDのFP滴定に非変性界面活性剤CHAPS(3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホナート)を含めることの影響を示した図である。36nMのMB4628を含むアッセイにおいてCHAPSを含めないか(黒丸)、あるいは2mMで含め(白丸)、機能性BtLBDの濃度はX-軸で示した。CHAPSを含まないアッセイでは、始めに、FPプレート-リーダーの読みを、FPアッセイ緩衝液中に36nM MB4628を含む溶液に対して100mPに合わせ、CHAPSを含めたアッセイでは、FP緩衝液中に36nMのMB4628および2mMのCHAPSを含む溶液に対して読みを100mPに合わせた。Y-軸は、平衡時点でのアッセイに対する最終偏光値(mP)を示す。滴定曲線を比較すると、CHAPSの存在が、BtLBDでのFPアッセイのダイナミックレンジを大きく増加させたことがわかる。FPアッセイに関して、拡大したレンジ(260mP)は優れたものであると考えられる。
【図４Ａ】競合阻害様式においてFPアッセイを利用して評価した周知エクジステロイド類の結合力を示す図である。MpLBDおよびBtLBDの双方に対して、FP競合阻害アッセイは、これらの対照リガンドの結合親和性を、ポナステロンA>ムリステロンA>20-ヒドロキシエクジソンとして、通常の放射性リガンドに基づくアッセイによって与えられると同様の順序にランク付けた。          (4A)順次増加する濃度の非蛍光対照エクジステロイド類(20-OH-Ecは20-ヒドロキシエクジソンを、MurAはムリステロンAを、PonAはポナステロンAを意味する)の存在下に、5nMの機能性MpLBDを36nMのMB4628と共にインキュベートしてアッセイした図である。非蛍光エクジステロイド類の濃度をX-軸で表示し、Y-軸は、平衡時点でのアッセイに対する最終偏光値(mP)を示す。また、図は、滴定中間点(点線)の位置を決めるのに使用される上限界および下限界(それぞれ、mPmaxおよびmPmin、後者の位置取りは文中で説明する)を示している(点線として)。
【図４Ｂ】競合阻害様式においてFPアッセイを利用して評価した周知エクジステロイド類の結合力を示す図である。MpLBDおよびBtLBDの双方に対して、FP競合阻害アッセイは、これらの対照リガンドの結合親和性を、ポナステロンA>ムリステロンA>20-ヒドロキシエクジソンとして、通常の放射性リガンドに基づくアッセイによって与えられると同様の順序にランク付けた。          (4B)順次増加する濃度の非蛍光対照エクジステロイド類の存在下に、10nMの機能性BtLBDを36nMのMB4628および2mMのCHAPSと共にインキュベートしてアッセイした図である。省略形、軸、および限界線は、4Aに記載した通りである。
【図５】対照エクジステロイド類のそれぞれに対してFPから得られるKi値と、それに対応する放射性リガンドに基づくアッセイから得られるKi値の関係を示す図である。対照エクジステロイドである20-ヒドロキシエクジソン、ムリステロンAおよびポナステロンAのそれぞれに対するFPから得られるKi値を、それに対応する放射性リガンドに基づくアッセイから得られるKi値に対してプロットした。FPアッセイが、競合剤リガンドを能力に関して適正にランク付けること、および放射性リガンドに基づくアッセイを超える高い識別力を示すことは、明らかである。図は、MpLBD FPおよび放射性リガンドに基づく競合阻害滴定(双方ともCHAPSなしで実施)、BtLBD FP競合阻害滴定(2mM CHAPSを用いて実施)、およびBtLBD放射性リガンドに基づく競合阻害滴定(CHAPSなしで実施)から得られるKi値に基づいた。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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