(57)【要約】本発明は、少なくとも１個のポリエチレングリコール分子、又はその誘導体に共有結合したＦＧＦ−２１化合物を提供し、これにより、生物活性のポリペプチドは、非ポリペプチドと比較して延長された除去半減期及び遅いクリアランスを有する。これらのＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と組成物は、糖尿病、肥満症、及びメタボリック症候群の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のＰＥＧ分子に共有結合したＦＧＦ−２１化合物を含むＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物であって、該各ＰＥＧが、システインアミノ酸残基又はリシンアミノ酸残基においてＦＧＦ−２１化合物に結合し、該ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物が、非ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と比較して延長された作用時間を有するＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項２】
５６、５９、６９及び１２２位のリジンからなる群から選択された１またはそれ以上の残基において該ＰＥＧ分子に共有結合した、配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含む請求項１記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項３】
該配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含み、１またはそれ以上の表面に露出したアミノ酸残基がシステイン残基で置換され、該システイン残基が該ＰＥＧ分子に共有結合する請求項１記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項４】
該置換アミノ酸残基が、Ｄ２５Ｃ、Ｄ３８Ｃ、Ｌ５８Ｃ、Ｋ５９Ｃ、Ｐ６０Ｃ、Ｋ６９Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｈ８７Ｃ、Ｅ９１Ｃ、Ｅ１０１Ｃ、Ｄ１０２Ｃ、Ｌ１１４Ｃ、Ｌ１１６Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｐ１３０Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、又はＰ１４０Ｃからなる群から選択される請求項３記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項５】
該置換アミノ酸残基が、Ｋ５９Ｃ、及びＫ１２２Ｃからなる群から選択される請求項４記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項６】
ＦＧＦ−２１［Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ］であり、アミノ酸番号が配列番号１に基づく請求項１記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項７】
該ＰＥＧ分子が、約２０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する請求項１記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項８】
該ＰＥＧ分子が、約２０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する請求項２記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項９】
該ＰＥＧ分子が、約２０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する請求項３記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項１０】
該ＰＥＧ分子が、約２０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する請求項５記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項１１】
該ＰＥＧ分子が、約２０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する請求項６記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項１２】
（ａ）治療的有効量の請求項１記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と、
（ｂ）許容可能な医薬担体と、を含み、
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療に有効な医薬組成物。
【請求項１３】
（ａ）治療的有効量の請求項２記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と、
（ｂ）許容可能な医薬担体と、を含み、
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療に有効な医薬組成物。
【請求項１４】
（ａ）治療的有効量の請求項３記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と、
（ｂ）許容可能な医薬担体と、を含み、
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療に有効な医薬組成物。
【請求項１５】
（ａ）治療的有効量の請求項４記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と、
（ｂ）許容可能な医薬担体と、を含み、
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療に有効な医薬組成物。
【請求項１６】
（ａ）治療的有効量の請求項６記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と、
（ｂ）許容可能な医薬担体と、を含み、
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療に有効な医薬組成物。
【請求項１７】
治療的有効量の請求項１記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療方法。
【請求項１８】
該患者が、２型糖尿病に罹患している請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該患者が、肥満症に罹患している請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
該患者が、メタボリック症候群に罹患している請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
治療的有効量の請求項２記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療方法。
【請求項２２】
該患者が、２型糖尿病に罹患している請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該患者が、肥満症に罹患している請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該患者が、メタボリック症候群に罹患している請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
治療的有効量の請求項３記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療方法。
【請求項２６】
該患者が、２型糖尿病に罹患している請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該患者が、肥満症に罹患している請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
該患者が、メタボリック症候群に罹患している請求項２５記載の方法。
【請求項２９】
治療的有効量の請求項４記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療方法。
【請求項３０】
該患者が、２型糖尿病に罹患している請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該患者が、肥満症に罹患している請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
該患者が、メタボリック症候群に罹患している請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
治療的有効量の請求項６記載のＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質を、治療を必要とする患者に投与することを含む、肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療方法。
【請求項３４】
該患者が、２型糖尿病に罹患している請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
該患者が、肥満症に罹患している請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
該患者が、メタボリック症候群に罹患している請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群を治療する医薬品の製造における、請求項１〜６のいずれかに記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の使用。
【請求項３８】
該医薬品が、２型糖尿病を治療するために使用される請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
該医薬品が、肥満症を治療するために使用される請求項３７記載の使用。
【請求項４０】
該医薬品が、メタボリック症候群を治療するために使用される請求項３７記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１個又は２個以上のポリエチレングリコール分子に共有結合した神経芽細胞成長因子２１化合物、並びに２型糖尿病、肥満症及びメタボリック症候群の治療に有用な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経芽細胞成長因子は、発達中の組織及び成人組織で幅広く発現する巨大なポリペプチドであり（Ｂａｉｒｄ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ、３：２３９−２４３、１９９１）、血管新生、有糸分裂誘発、パターン形成、細胞分化、代謝調節及び組織損傷の修復を含む多数の生理学的機能において重要な役割を果たしている（ＭｃＫｅｅｈａｎ等、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１３５−１７６、１９９８）。刊行された文献によれば、ＦＧＦファミリーは、現在、２２のメンバーから構成されている（Ｒｅｕｓｓ等、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．３１３：１３９−１５７（２００３））。
【０００３】
神経芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）は、肝臓で優位に発現することが報告されており（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４９２：２０３−２０６、（２０００）、特許文献１及び特許文献２）、虚血性血管疾患、創傷治癒、及び肺、気管支又は肺胞の細胞機能の損失に関連した疾患、並びに他の多数の疾患の治療に用いることが説明されている。より最近になって、ＦＧＦ−２１は、マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞内でインシュリンの存在及び不在下で糖取り込みを刺激し、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウス並びに８週齢のＺＤＦラットにて、栄養が補給された及び空腹時の血糖、トリグリセリド及びグルカゴン値を用量依存的に低下させることによる、糖尿病及び肥満症の治療法としてのＦＧＦ−２１使用の基礎を示した（特許文献３）。加えて、ＦＧＦ−２１は、重篤な疾病患者の死亡率および罹患率の低下に有効であることが示されている（特許文献４）。
【特許文献１】国際公開第０１／３６６４０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０１／１８１７２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０３／０５９２７０号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＦＧＦ−２１化合物の特定の残基に１個又は２個以上のＰＥＧ分子を共有結合させると、天然のＦＧＦ−２１のそれと比較して除去半減期が延長しクリアランスが低下した、生物活性を有するＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物が形成されるという発見に基づくものである。
【０００５】
本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、天然ＦＧＦ−２１の生物学的活性の全部又は一部を維持し、尚かつ天然ＦＧＦ−２１と比較して延長された作用時間を有するため、天然ＦＧＦ−２１を使用する場合と比較して治療法として非常に有用であり、また利便性が高い。
【０００６】
従って、本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、持続的な暴露を要因とする効力の増大、及び必要な投与量の低下により、これらの治療を必要とする患者の利便性、及び投与要求に関する患者のコンプライアンスの容易さの両方が増す可能性を有するという特定の利益を備え、２型糖尿病、肥満症、及びメタボリック症候群を含むがこれらに限定されない疾患に罹患する対象者の治療に有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願に記載する本発明は、１個又は２個以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子、又はその誘導体に共有結合したＦＧＦ−２１化合物を提供し、ここで各ＰＥＧはポリペプチドのシステイン又はリシンアミノ酸残基において結合し、非ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と比較して延長された作用時間を有するＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を形成する。
【０００８】
本発明の一実施態様は、配列番号１に示すようなＦＧＦ−２１のアミノ酸配列を含むＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物であり、ここで少なくとも１個のＰＥＧ分子がシステイン残基において結合し、Ｄ２５Ｃ、Ｄ３８Ｃ、Ｌ５８Ｃ、Ｋ５９Ｃ、Ｐ６０Ｃ、Ｋ６９Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｈ８７Ｃ、Ｅ９１Ｃ、Ｅ１０１Ｃ、Ｄ１０２Ｃ、Ｌ１１４Ｃ、Ｌ１１６Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｐ１３０Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、又はＰ１４０Ｃからなる群から選択された位置にて天然残基を置換している。
【０００９】
本発明の別の一実施態様は、５６、５９、６９及び１２２位からなる群から選択された１個又は２個のリシン残基においてＰＥＧ分子に共有結合した、配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含むＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物である。
【００１０】
更に本発明の別の一実施態様は、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物からなる医薬組成物と、２型糖尿病、肥満症、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者を治療する方法であって、該患者に治療的有効量のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を投与することを含む方法とを包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
詳細な説明
本願に開示され特許請求される本発明のために、以下の用語を以下のように定義する。
【００１２】
ＦＧＦ−２１は、２７個のアミノ酸からなるリーダー配列を含む２０８個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ヒトＦＧＦ−２１は、マウスＦＧＦ−２１（アミノ酸同定〜７９％）及びラットＦＧＦ−２１（アミノ酸同定〜８０％）と高度に一致する。ヒトＦＧＦ−２１は本発明の好ましいポリペプチドであるが、当業者は本願に記載する用途には、ヒトＦＧＦ−２１の類似体，突然変異タンパク質、若しくは誘導体、又は代替的な哺乳動物のＦＧＦ−２１ポリペプチド配列を容易に使用できることを認識されよう。
【００１３】
本発明のアミノ酸の位置は、以下に示す（配列番号１）成熟した、野生型又は天然ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１ポリペプチドから決定される。
【表１】
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【００１４】
成熟した、野生型又は天然ヒト１８１アミノ酸ＦＧＦ−２１ポリペプチドに対応するＤＮＡコードは、（配列番号２）である。
CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGCGGTACCTCTACACAGATGATGCCCAGCAGACAGAAGCCCACCTGGAGATCAGGGAGGATGGGACGGTGGGGGGCGCTGCTGACCAGAGCCCCGAAAGTCTCCTGCAGCTGAAAGCCTTGAAGCCGGGAGTTATTCAAATCTTGGGAGTCAAGACATCCAGGTTCCTGTGCCAGCGGCCAGATGGGGCCCTGTATGGATCGCTCCACTTTGACCCTGAGGCCTGCAGCTTCCGGGAGCTGCTTCTTGAGGACGGATACAATGTTTACCAGTCCGAAGCCCACGGCCTCCCGCTGCACCTGCCAGGGAACAAGTCCCCACACCGGGACCCTGCACCCCGAGGACCAGCTCGCTTCCTGCCACTACCAGGCCTGCCCCCCGCACTCCCGGAGCCACCCGGAATCCTGGCCCCCCAGCCCCCCGATGTGGGCTCCTCGGACCCTCTGAGCATGGTGGGACCTTCCCAGGGCCGAAGCCCCAGCTACGCTTCC
【００１５】
本発明の方法にて有用なＦＧＦ−２１は、配列番号１に示すようなヒトＦＧＦ−２１、以下、総合的にＦＧＦ化合物と称するその類自体、突然変異タンパク質、及び誘導体が好ましい。ＦＧＦ−２１化合物はＦＧＦ−２１と十分な相同性を有するため、ＦＧＦ−２１受容体に結合して、糖取り込み刺激、又は本願に記載する他の生理学的効果を生じるシグナル伝達経路を開始させる能力を有する。例えば、ＦＧＦ−２１化合物は、実施例１に記載した細胞ベースのアッセイによって、糖取り込み活性について試験することができる。
【００１６】
用語「ＰＥＧ化」とは、本発明のＦＧＦ−２１化合物について言及する場合、１個若しくは２個以上のポリエチレングリコール分子、又はその誘導体との共有結合により化学修飾されたＦＧＦ−２１化合物を意味する。また、用語「ＰＥＧ」は、当該技術分野にて周知のポリエチレングリコール又はその誘導体を意味することを意図する（例えば、米国特許第５、９００、４６１号明細書、米国特許第５、９３２、４６２号明細書、米国特許第６、４３６、３８６号明細書、米国特許第６、４４８、３６９号明細書、米国特許第６、４３７、０２５号明細書、米国特許第６、４４８、３６９号明細書、米国特許第６、４９５、６５９号明細書、米国特許第６、５１５、１００号明細書及び米国特許第６、５１４、４９１号明細書参照）。場合により、ＰＥＧ分子はリンカー又はスペーサー分子（典型的なスペーサー分子は、米国特許第６、２６８、３４３号明細書を参照）を介してＦＧＦ−２１化合物に結合していてもよい。
【００１７】
「対象者」又は「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００１８】
２型糖尿病は、利用可能なインシュリン量に対して過剰な糖産生、及び不十分な糖クリアランスの結果として過剰に高い状態に維持された血糖値により特徴付けられる。
【００１９】
糖不耐症は、糖に対する並外れた感受性と定義することができる。
【００２０】
高血糖は、血中の過剰な糖（ブドウ糖）と定義する。
【００２１】
低血糖は、血糖値が低下し過ぎて、身体活動にとって十分なエネルギーを提供し得ない場合に発生する。
【００２２】
高インシュリン血は、正常値よりも高い血中インシュリン濃度と定義する。
【００２３】
インシュリン抵抗性は、正常な量のインシュリンが、正常以下の生物学的反応を引き起こす状態と定義する。
【００２４】
メタボリック症候群は、以下の徴候の中の少なくとも３つの集まりと定義し得る。
腹部脂肪−ウエスト約１０１．６ｃｍ（４０インチ）以上（ほとんどは男性）
高血糖−１１０ミリグラム／デシリットル（ｍｇ／ｄｌ）以上（断食後）
高トリグリセリド−少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ以上（血流中）
低ＨＤＬ−４０ｍｇ／ｄｌ未満
血圧−１３０／８５以上
【００２５】
天然又は野生型とは、配列番号１に示すような、成熟したヒトの１８１アミノ酸からなるＦＧＦ−２１ポリペプチドを指す。
【００２６】
用語「アミノ酸」は、本願において最も広い意味で使用され、天然に存在するアミノ酸、並びにアミノ酸変異体及び誘導体を含む天然に存在しないアミノ酸が含まれる。当業者は、この広い定義を考慮すれば、本願に引用されるアミノ酸には、例えば、天然に存在するタンパク新生Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、例えばアミノ酸変異体及び誘導体のような化学修飾アミノ酸、例えばノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等の天然に存在する非タンパク新生アミノ酸、並びにアミノ酸の特徴として当該技術分野にて知られている性質を有する、化学合成された化合物を含むことが認識されよう。天然に存在しないアミノ酸の例は、α−メチルアミノ酸（例、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジン）、側鎖内に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、並びに側鎖内のカルボン酸官能基が、スルホン酸基で代替されたアミノ酸（例、システイン酸）を含む。しかしながら、本発明のＦＧＦ−２１化合物は、本願に別に特に提供される以外、天然に存在するアミノ酸のみを含むことが好ましい。
【００２７】
ＦＧＦ−２１化合物を示すために本願に使用される命名法において、アミノ酸は、三文字コード、又は代替的に標準的な一文字コードを用いて識別される。突然変異は、元のアミノ酸の三文字コード、続くアミノ酸番号、続く代替アミノ酸の三文字コードで示す。各突然変異タンパク質の数による指定は、成熟した、野生型のヒトＦＧＦ−２１の１８１個のアミノ酸配列を基準とする。例えば、第５９位のリシン（即ち、Ｌｙｓ５９）のシステイン（Ｃｙｓ）による置換は、Ｌｙｓ５９Ｃｙｓ又はＫ５９Ｃと指定する。同様に、第１５２位のイソロイシン及び第１６３位のセリン（Ｉｌｅ１５２、Ｓｅｒ１６３）の負電荷アミノ酸、グルタメート（Ｇｌｕ）による二重置換は、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ／Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ又はＩ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅと指定する。
【００２８】
用語「天然」又は「野生型」は、天然に見出されるアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。用語「天然」又は「野生型」は、問題のポリペプチドの対立遺伝子変異体を包含することを意図する。
【００２９】
本願で使用される「インビトロ効力」は、細胞ベースのアッセイにおけるＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の糖取り込みの測定値、及びＦＧＦ−２１化合物の生物学的効力の測定値を意味する。インビトロ効力は「ＥＣ50」として表され、これは単一用量反応実験において５０％活性を示す化合物の有効濃度である。本発明の目的において、インビトロ効力は３Ｔ３−Ｌ１細胞を使用した糖取り込みアッセイにより決定される（実施例１）。
【００３０】
用語「血漿半減期」は、浄化前、半分の関連した分子が血漿中を循環するまでの時間を指す。代替的に使用される用語は、「除去半減期」である。血漿半減期又は除去半減期の文脈にて使用される用語「延長された作用時間」又は「より長い作用時間」は、類似した条件下で測定して、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の半減期が、基準分子（例、ポリペプチドの非ＰＥＧ化形態、又は天然ポリペプチド）の半減期と比較して有意に延長していることを示す。本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、類似した非ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の除去半減期よりも長い除去半減期を有することが好ましい。本願の実施例５に報告されている半減期は除去半減期であり、これは除去の末期の対数線形の割合（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ  ｒａｔｅ）に相当する。当業者は、半減期がクリアランス及び分布容積の両方の関数として変化する誘導パラメータであることを理解されよう。
【００３１】
クリアランスは、身体が薬物を除去する能力の測定値である。例えば薬物に対する修飾を要因としてクリアランスが低下するにつれて、半減期が延長することが期待されよう。しかしながら、この相反的な関係は、分布容積に変化がない場合にのみ正確である。末期の対数線形半減期（ｔ1/2）、クリアランス（Ｃ）、及び分布容積（Ｖ）間の便利な概算的関係は、式：ｔ1/2≒０．６９３（Ｖ／Ｃ）により提供される。クリアランスは、除去される薬物の量を示すのではなく、薬物が完全に解放されるために必要な血液又は血漿のような生物学的流体の容積を示す。クリアランスは、単位時間当たりの容積として表される（実施例５参照）。
【００３２】
本発明は、除去半減期を延長、及び／又はクリアランスを低下させるＦＧＦ−２１化合物の修飾について記載する。ペプチドの特定のアミノ酸部位内に１個又は２個のＣｙｓ残基を組み込むと、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はＰＥＧ誘導体が共有結合してＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を形成し得るチオール基が提供される。更に、本発明の類似体又は断片のリシン残基は、１個又は２個以上のＰＥＧ分子又はＰＥＧ誘導体分子に共有結合して、延長された除去半減期及び／又は低下されたクリアランスを伴う分子を形成し得る。
【００３３】
ヒトＦＧＦ−２１突然変異タンパク質は、野生型の成熟タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸が、別の一アミノ酸で置換されているヒトＦＧＦ−２１を含むものと定義する。ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の例は、参照により本願に組み入れられる米国特許出願公開第６０／５２８、５８２号明細書に記載されている。一般的には、突然変異タンパク質は、野生型タンパク質のある変更された性質、構造又は機能を有する。例えば、突然変異タンパク質は、好ましい生物活性プロファイルを保持する一方で、濃縮溶液中で向上された又は改良された物理学的安定性（例、疎水性により仲介される凝集が少ない）を有し得る。突然変異タンパク質は（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコールのような）薬剤保存剤に対する適合性がより高い場合があり、そのため貯蔵中にタンパク質の生理化学的性質及び生物学的活性が維持される保存医薬製剤を調製することができる。従って、野生型ＦＧＦ−２１と比較して高い薬剤的安定性を有する突然変異タンパク質は、生理学的条件下、及び保存医薬製剤条件下で、生物学的効力を維持しながら、濃縮溶液中で改良された物理学的安定性を有する。本願に使用されているように、これらの用語は限定的なものではなく、所定の突然変異タンパク質が、野生型タンパク質の１個又は２個以上の変更された性質を持つことは全く可能である。
【００３４】
従って、本発明は、ＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質のリシン残基若しくはシステイン残基におけるｐｅｇ化、又はその生物学的に活性なペプチドを提供する。向上した薬剤的安定性を有するＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の例は、以下の１個又は２個以上のアミノ酸の、電荷アミノ酸及び／又は極性非電荷アミノ酸による置換を含む。
グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リシン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、又はセリン１７２
但し、アミノ酸番号は配列番号１に基づく。
【００３５】
薬理学的に安定性を増した、更なるＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質は、以下の位置における２個以上のアミノ酸残基に対するシステインの置換基を有するＦＧＦ−２１を含む。
アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、スレオニン２３、アスパルテート２４、アスパルテート２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン（ｌｕｔａｍｉｎｅ）２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタメート５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リシン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパルテート７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパルテート１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタメート１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リシン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパルテート１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、又はロイシン１３９
但し、アミノ酸番号は配列番号１に基づく。
【００３６】
Ｃｙｓ７５−Ｃｙｓ９３において自然発生するＦＧＦ−２１に加えて、操作されたジスルフィド結合を有するＦＧＦ−２１の特定の突然変異タンパク質は以下の通りである。
Ｇｌｎ７６Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１０９Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ｓｅｒ８５Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ７３Ｃｙｓ−Ｃｙｓ９３、Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１２５−Ｃｙｓ、Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０４Ｃｙｓ、Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ、Ｓｅｒ９４Ｃｙｓ−Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１１５Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ、Ａｓｎ１２１Ｃｙｓ−Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１００Ｃｙｓ−Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ９５Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０７Ｃｙｓ、Ａｒｇ１９Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２０Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３７Ｃｙｓ、Ａｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｓｐ７９Ｃｙｓ、Ｐｒｏ９０Ｃｙｓ−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５０Ｃｙｓ−Ｌｙｓ６９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ａｓｐ２５Ｃｙｓ、Ａｌａ３１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ、Ｖａｌ４１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ５８Ｃｙｓ−Ｖａｌ６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５４Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６６Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ−Ａｒｇ７２Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、Ａｒｇ７２Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、又はＡｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｌａ８１Ｃｙｓ
但し、アミノ酸番号は配列番号１に基づく。
好ましい操作されたジスルフィド結合を有する突然変異タンパク質は、以下の通りである。
Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１３５Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３０Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１１９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ８０Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１２６Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２７Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ、又はＡｓｐ２５Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ
最も好ましい操作されたジスルフィド結合を有する突然変異タンパク質は、以下の通りである。
Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８ＣｙｓＡｌａ１３４Ｃｙｓ
本発明の目的において、突然変異タンパク質を人工的なジスルフィド結合でｐｅｇ化した場合、システイン残基は、常に唯一の更なる位置で置換及びＰＥＧ化され得る。これは、２つ又は３つ以上の位置をシステインで置換した場合にポリペプチドの該位置をｐｅｇ化する能力を排除する鎖間ジスルフィド結合が形成され得ることによる。
【００３７】
ＦＧＦタンパク質のファミリーは、結晶学により同定した結果、共通のβ−トレフォイル又はβシート構造を有する（Ｈａｒｍｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：６２９−６４０（２００４））。このようなＦＧＦ−２１の解析によって、タンパク質の三字構造内に埋まったアミノ酸残基と対比して、表面に露出したアミノ酸残基を決定することができることを当業者は認識する。従って、表面露出残基であるアミノ酸残基のみをシステイン残基で置換することは、本発明の一実施態様である。システインで代替されているアミノ酸残基の位置は、Ａｃｃｅｌｒｙｓソフトウエア（Ｉｎｃｙｔｅ）を使用した相同性モデリングにより決定される。この方法を用いて、各残基をシステインに変異させ、エネルギーを最小にして計算を行うことにより、異なる溶媒半径について残基に対するアクセシビリティが決定される。通常、１．４Å〜７．０Åが、使用される溶媒半径である（１．４Åは、水分子のおよその半径である）。好ましくは、上記の相同性の方法によって決定されるシステイン置換基は、以下の位置における１またはそれ以上のアミノ酸残基に組み込まれる。
アルギニン１９、ロイシン２１、アラニン２６、グルタミン２８、スレオニン２９、グルタメート３０、アルギニン３６、グリシン３９、グリシン４２、グルタメート５０、リシン５６、グリシン６１、グルタミン６４、イソロイシン６５、バリン６８、スレオニン７０、セリン７１、アルギニン７７、アラニン８１、セリン８５、ロイシン８６、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、ロイシン９８、チロシン１０７、グルタミン１０８、ヒスチジン１１２、グリシン１１３、セリン１２３、又はプロリン１２４
より好ましくは、システイン置換基は以下の位置に組み込まれる。
アスパルテート２４、グルタミン２７、グルタメート３７、スレオニン４０、アラニン４４、アスパルテート４６、プロリン４９、アラニン５７、フェニルアラニン８８、アスパルテート８９、バリン１０６、グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｅ）１１０、アラニン１１１、プロリン１１５、グリシン１２０、又はロイシン１３９
さらに好ましくは、システイン置換基は以下の位置に組み込まれる。
グルタミン１８、アラニン４５、グルタミン４７、セリン４８、プロリン７８、チロシン８３、ロイシン９９、グリシン１０３、ヒスチジン１２５、プロリン１２８、アルギニン１３１、グリシン１３２、又はプロリン１３８
最も好ましくは、システイン置換基は以下の位置に組み込まれる。
アスパルテート２５、アスパルテート３８、ロイシン５８、リシン５９、プロリン６０、リシン６９、アスパルテート７９、ヒスチジン８７、グルタメート９１、グルタメート１０１、アスパルテート１０２、ロイシン１１４、ロイシン１１６、リシン１２２、アルギニン１２６、プロリン１３０、プロリン１３３、又はプロリン１４０
得られたＦＧＦ−２１化合物を、置換Ｃｙｓアミノ酸にてＰＥＧ化して、非修飾化合物又は天然化合物の半減期よりも長い半減期を有する一方、生物学的活性の全部又は一部が維持された修飾分子が形成され得る。
【００３８】
代替的に、本発明では、第５６、５９、６９及び１２２位の１個、２個又は３個のリシン残基にてＰＥＧ化されたＦＧＦ−２１化合物を提供する。得られた分子はリシンアミノ酸にてＰＥＧ化されており、非修飾分子又は天然分子と比較して延長された作用時間を有する一方、生物学的活性の全部又は一部が維持された修飾分子が形成されている。
【００３９】
ＦＧＦ−２１化合物は「ＦＧＦ−２１誘導体」も含み、これはＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１類似体のアミノ酸配列を有するが、更にそのアミノ酸側方基、α−炭素原子、末端アミノ基、又は末端カルボン酸基の１個又は２個以上に化学修飾を有する分子として定義される。化学修飾は、化学部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）の付加、新たな結合の形成、及び化学部分の除去を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
アミノ酸側方基の修飾は、リシンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリシンのＮ−アルキル化、グルタミン酸又はアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミドを含むが、これらに限定されるものではない。末端アミノ基の修飾は、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、及びＮ−アシル修飾を含むが、これらに限定されるものではない。末端カルボキシル基の修飾は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド及び低級アルキルエステル修飾を含むが、これらに限定されるものではない。更に、１個若しくは２個以上の側方基、又は末端基は、タンパク質の化学者に周知の保護基により保護し得る。アミノ酸のα−炭素は、モノ又はジメチル化され得る。
【００４１】
本発明に使用されるポリペプチドを調製及び精製すると、ポリペプチドを少なくとも一つのＰＥＧ分子をＣｙｓ若しくはＬｙｓ残基、又はアミノ−末端アミノ酸に共有結合させることにより修飾する。繊細なポリペプチド又はタンパク質分子に対して、それらの機能を損失させずにポリマーを結合して適切な新しい性質を付与することは困難である。当該技術分野では、ＰＥＧに共有結合するための非常に様々な方法が説明されており、本発明に使用する特定の方法は、本発明を限定することを意図するものではない（再考にはＲｏｂｅｒｔｓ、Ｍ．等、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４：４５９−４７６、２００２を参照のこと）。タンパク質のＰＥＧ化は、治療にペプチド又はタンパク質を使用することに関連した多数の薬理学的、毒物学的／免疫学的問題を克服し得る。しかしながら、任意の個々のポリペプチドについて、ポリペプチドのＰＥＧ化形態の生物活性が、そのポリペプチドの非ＰＥＧ化形態と比較して有意に損失されるか否かは不明確である。
【００４２】
ＰＥＧ化タンパク質の生物活性は、例えばｉ）ＰＥＧ分子のサイズ、ｉｉ）特定の結合部位、ｉｉｉ）修飾の程度、ｉｖ）好ましくない結合条件、ｖ）結合にリンカーが使用されるか、又は直接ポリマーが結合されるか、ｖｉ）有害な副生物の生成、ｖｉｉ）活性化ポリマーが与える損傷、又はｖｉｉｉ）電荷の保存等の要因の影響を受け得る。使用する結合反応に依存して、特にサイトカインのポリマー修飾は、生物活性を劇的に低下させる結果となっている［Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｇ．Ｅ．等、（１９９８）ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｈｅｍ．６８：１−１８］。
【００４３】
本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、天然ＦＧＦ−２１と同様又はより低いインビトロでの生物学的活性を有する。本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の数個は、特定のアッセイで測定した結果によれば、天然ＦＧＦ−２１より低い生物学的活性を有し得る。この活性の低下は、その化合物の延長された半減期及び／又はより低いクリアランス値により補償され、延長された除去半減期を有するＦＧＦ−２１化合物にとってはむしろ好ましい特性であり得る。
【００４４】
ポリペプチド修飾に最も有用な代表的な形態において、ＰＥＧは末端ヒドロキシル基を有する線状ポリマーであり、式：ＣＨ3Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ（式中、ｎは約８〜約４０００である）を有する。末端水素は、例えばアルキル又はアルカノール基のような保護基で置換されてもよい。ＰＥＧは少なくとも１個のヒドロキシ基を有することが好ましく、該ヒドロキシ基は最も好ましくは末端ヒドロキシ基である。このヒドロキシ基が活性化されてポリペプチドと反応することが好ましい。本発明に有用なＰＥＧには、多数の形態が存在する。当該技術分野にて非常に多数のＰＥＧ誘導体が存在し、これらは本発明に使用するに適している（Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６：１５０−１６５、  １９９５）。本発明にてＦＧＦ−２１化合物に共有結合するＰＥＧ分子は、特定のタイプに限定されるものではない。ＰＥＧの分子量は５００〜１００、０００ダルトンであることが好ましく、１０．０００〜８０、０００ダルトンであることがより好ましく、２０、０００〜６０、０００ダルトンであることが更に好ましく、２０、０００〜４０、０００ダルトンであることが最も好ましい。ＰＥＧは線状であっても又は分岐していてもよく、本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、ペプチドに結合した１、２、３、４、５又は６個のＰＥＧ分子を有し得る。１個のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物分子につき１個のＰＥＧ分子が存在することが最も好ましい。しかしながら、１個のペプチド分子につき２個以上のＰＥＧ分子が存在する場合、ＰＥＧ分子は６個以上存在しないことが好ましい。
【００４５】
本発明は、１個又は２個以上のＰＥＧ分子が共有結合したＦＧＦ−２１化合物を提供する。システイン残基上をＰＥＧ化するために、例えばＰＥＧ−マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセトアミド、及び／又はオルトピリジルジスルフィドのようなＰＥＧ誘導体が開発されている（Ｇｏｏｄｓｏｎ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３−３４６  （１９９０）、Ｋｏｇａｎ等、Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２：２４１７−２４２４（１９９２）、Ｍｏｒｐｕｒｇｏ等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７：３６３−３６８（１９９６）、及びＷｏｇｈｉｒｅｎ等、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４：３１４−３１８（１９９３））。本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を製造する好ましい方法では、ＰＥＧ−マレイミドを使用して、ＰＥＧをペプチドのチオール基に直接結合させる。チオール官能基の導入は、ポリペプチドの上述した位置上又は位置内にＣｙｓ残基を付加又は挿入して達成され得る。チオール官能基は、ペプチドの側鎖上にも導入することができる（例、リシンのε−アミノ基をチオール含有酸でアシル化）。本発明のＰＥＧ化プロセスでは、Ｍｉｃｈａｅｌ付加反応を用いて安定なチオエーテルリンカーを形成する。反応は高度に特異的であり、他の官能基の存在下で、穏やかな条件下で実施される。ＰＥＧマレイミドは、明確に定義された、生物活性を有するＰＥＧ−タンパク質複合体を製造するための反応性ポリマーとして使用されている。この手法ではＰＥＧマレイミドに対して過剰モルのチオール含有ＦＧＦ−２１化合物を使用して、反応を完了させることが好ましい。反応はｐＨ４．０〜９．０間にて室温で１５〜４０時間行われることが好ましい。過剰の非ＰＥＧ化チオール含有ペプチドは、従来の分離方法を用いてＰＥＧ化生成物から容易に分離される。ＦＧＦ−２１化合物のＰＥＧ化に必要な典型的な条件を、実施例２及び実施例３に示す。システインＰＥＧ化は、ＰＥＧマレイミド又は分岐ＰＥＧマレイミドを使用して行われ得る。
【００４６】
本発明のＦＧＦ−２１化合物は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）に記載されているような任意の手段により生成及び／又は単離され得る。
【００４７】
多様なタンパク質精製法を使用することができ、これらの方法は当該技術分野にて周知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：８３−９（１９９０）及びＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ（１９８２）に記載されている。選択される精製ステップ（一つ又は複数）は、ＦＧＦ−２１に使用する製造プロセスの種類に依存するであろう。
【００４８】
ＦＧＦ−２１化合物は、多様な生物学的活性を有する。ＦＧＦ−２１は特に、ＮＩＤＤＭ治療法が有するような低血糖の危険性を有さないため、インシュリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ、２型）の治療法として期待できる。ＦＧＦ−２１は肥満症及びメタボリック症候群の治療手段としても想定される。
【００４９】
本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の使用は、２型糖尿病、肥満症及びメタボリック症候群を治療する医薬品の製造における使用を含むことが想定される。ＦＧＦ−２１化合物のＰＥＧ化を、ＦＧＦ−２１の半減期を延長する他の周知の修飾と組み合わせることによって、ＰＥＧ化のみ又は他の修飾のみと比較して更に化合物の半減期を延長し得る。
【００５０】
本願で使用されているように、用語「ＦＧＦ−２１化合物」は、本願に記載する化合物の薬剤的に許容される塩も含む。本発明のＦＧＦ−２１化合物は、十分な酸性、十分な塩基性、又はその双方を有する官能基を含むことができ、従って多くの無機塩基、並びに無機及び有機酸のいずれとも反応して塩を形成する。
【００５１】
本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、非経口投与に特に適しており、また経口、鼻腔内投与、又は吸入によっても送達され得る。非経口投与は、例えば筋内、静脈内、皮下注射等による全身投与を含み得る。ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、上述した疾病の治療のために、医薬組成物の一部としての許容可能な医薬担体、希釈剤又は賦形剤と併せて対象者に投与され得る。医薬組成物は、ＦＧＦ−２１の溶液、又は非経口的に投与される場合、懸濁液であってもよい。適切な医薬担体は、ペプチド又はペプチド誘導体と相互作用を起こさない不活性成分を含み得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されているような標準的な製剤処方技術を使用することができる。非経口投与のための適切な医薬担体は、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、Ｈａｎｋ’ｓ溶液、乳酸リンゲル液及び同様物を含む。数個の適切な賦形剤の例は、乳糖、右旋糖、ショ糖、トレハロース、ソルビトール、及びマンニトールを含む。
【００５２】
本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、血漿濃度が延長された期間有効な範囲を維持するように、投与用に調製されてもよい。
【００５３】
ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の「治療的有効量」は、対象者に投与された際に、許容不可能な副作用を起こすことなく、所望の治療的及び／又は予防的効果を供する量を意味する。「所望の治療的効果」は、以下の一つ又は二つ以上を含む。１）疾病又は状態に関連した症状（一つ又は複数）の改善、２）疾病又は状態に関連した症状の発症の遅延、３）治療しなかった場合と比較して長い寿命、及び４）治療しなかった場合と比較して高い生活の質。例えば、２型糖尿病治療のためのＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の「有効量」は、治療しなかった場合と比較して血糖濃度がより良く制御され、従って例えば網膜症、神経障害又は腎臓病のような糖尿病性合併症の発症が遅延される量を意味する。糖尿病予防のためのＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の「有効量」は、予防しなかった場合と比較して、例えばスルホニル尿素、チアゾリシンジオン、インシュリン及び／又はビスグアニジンのような抗−血糖降下薬による治療を必要とする血糖値上昇の開始を遅延させる量を意味する。また、対象者に投与されるＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の「治療的有効量」は、疾病のタイプ及び重症度、並びに例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重及び薬物耐性のような対象者の特質にも依存するものと思われる。
【００５４】
当業者は、良い医療行為及び個々の患者の臨床的状態から、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を含有する治療組成物の薬剤的に有効な用量と、投与計画とを容易に最適化し得る。本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の典型的な用量は、成人では約０．０１ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の範囲に亘るであろう。用量は約０．１ｍｇ／日〜約１００ｍｇ／日、より好ましくは約１．０ｍｇ／日〜約１０ｍｇ／日の範囲に亘ることが好ましい。用量は約１〜５ｍｇ／日が最も好ましい。投与されるＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の適切な用量は、血糖値を低下させ、また糖をより速くより有効に利用することによりエネルギー消費を増大させ、従って２型糖尿病、肥満症及びメタボリック症候群の治療に有用である。
【００５５】
本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、本発明を例示するために本願に含まれ、本発明を限定することを意図しない以下の実施例によってより明確に理解されるであろう。
【００５６】
本願に引用する全特許文献及び刊行物は、参照により明白に本願に組み入れられる。
【００５７】
調製１
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＦＧＦ−２１化合物の発現及び精製
この実施例では、細菌発現のために細菌発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））を使用した。ｐＥＴ３０ａはカナマイシン抗生物質耐性遺伝子をコードし、細菌の複製起点（「ｏｒｉ」）、強力なＴ７ファージ−ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、及び多数の独特の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を伴う適切なＭＣＳを有する。精製目的に都合のよいことに、ベクターはＮ−末端ペプチド融合のためのＨｉｓ−及びＳ−タグ、並びにＣ−末端融合のためのＨｉｓ−タグをコードし得る。しかしながら、本発明の目的において、ＦＧＦ−２１化合物をコードするｃＤＮＡは、制限部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとの間に挿入され、得られた構造は前記したタグのいずれも利用していない。
【００５８】
リーダー配列を欠くが、メチオニン残基で置換されたＦＧＦ−２１化合物をコードする核酸配列を、オープンリーディングフレームの５’及び３’末端にアニールするＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ｃＤＮＡクローンから増幅する。制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩの認識部位を含む更なるヌクレオチドを、各々、５’及び３’配列に追加する。
【００５９】
当該技術分野にて周知の方法によれば、クローン化のために、５’フォワードＰＣＲプライマー及び３’リバースＰＣＲプライマーは、ＦＧＦ−２１化合物をコードする核酸のコード配列部分と一致する又は相補的なヌクレオチドを有する。当業者は、プライマーが開始するポリヌクレオチド配列内の地点は、変更可能であることを理解されよう。
【００６０】
増幅された核酸断片及びベクターｐＥＴ３０ａを、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、次いで精製した消化されたＤＮＡ断片を互いに連結する。ＦＧＦ−２１化合物をコードするＤＮＡを制限ｐＥＴ３０ａベクター内に挿入して、ＦＧＦ−２１化合物ポリペプチドをコードする領域を、その関連する終止コドンと共にＩＰＴＧ−誘導性プロモーターの下流に、かつ開始ＡＴＧコドンとインフレームで配置する。関連する終止コドン、ＴＡＧは、挿入地点の下流の６−ヒスチジンコドンの翻訳を阻止する。
【００６１】
Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．）に記載されているような標準的手法を用いて、ライゲーション混合物をコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞内に形質転換する。
【００６２】
形質転換反応物をＬＢ／カナマイシンプレート上にてプレーティングし、一夜増殖させた後、形質転換体をプラスミド調製のために選択し、又はＰＣＲによるスクリーニングのためにインシトゥで溶解する。制限解析と、続くＤＮＡ配列解析により、所望のＦＧＦ−２１化合物挿入断片を含有するポジティブな組み換えプラスミドを同定する。これらのプラスミドを、次いでタンパク質産生のための発現株の形質転換に使用する。
【００６３】
ＦＧＦ−２１化合物の発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）ＳＴＡＲ又はＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＰを使用する。これらの株は、ＦＧＦ−２１化合物を発現するに適切な多数の株のうちの一部に過ぎず、各々、Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎから商業的に入手可能である。形質転換体は、カナマイシン存在下にてＬＢプレート上で増殖する能力により同定される。
【００６４】
所望の構造を含有するクローンを、カナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）で補充したＬＢ培地の液体培地中で一夜（ｏ／ｎ）増殖させる。ｏ／ｎ培地を使用して、約１：２５〜１：２５０の希釈にて大きい培地を植菌する。細胞を６００ｎｍでの光学密度０．６（「ＯＤ６００」）まで増殖させる。次いでイソプロピル−ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（「ＩＰＴＧ」）を加えて最終濃度を１ｍＭとし、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することにより、ｌａｃリプレッサー感受性プロモーターからの転写を誘導する。その後、細胞を更に３〜１２時間インキュベートする。次に細胞を遠心分離により回収して、ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ８．０で洗浄し、精製まで−２０℃で保管する。ＦＧＦ−２１は、不溶性分画、即ちＥ．ｃｏｌｉの封入体（又は顆粒）内に発現する。ＦＧＦ−２１化合物に関して一般に観察される発現レベルは、５０ｍｇ／Ｌである。続く精製プロセスは、顆粒の可溶化、及び変異体の再折り畳みから開始し、４つのクロマトグラフィーステップが続く。
【００６５】
Ｅ．ｃｏｌｉからＦＧＦ−２１化合物を精製するために、顆粒を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、７Ｍ尿素及び１ｍＭ  ＤＴＴ中で、室温で１時間撹拌しながらｐＨをｐＨ１１．０に傾斜させることにより可溶化する。次いで、上記と同一のバッファーを使用してＱ−セファロースカラム上にてタンパク質を捕獲し、直線状に傾斜させた０〜４００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出する。次いでＱ−セファロースのプールを１０ｍＭ  ＤＴＴにより２時間、ＲＴで処理して、ジスルフィド結合の全てを還元する。その後、プールを１０倍に希釈し、従ってバッファーは以下の濃度となる。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０、７Ｍ尿素、１０ｍＭシステイン、１ｍＭ  ＤＴＴ、タンパク質濃度約２５０〜５００μｇ／ｍｌ。室温にて還元条件下で更に２時間インキュベートして、ジスルフィド結合がないタンパク質の形態を得た後、プールを約４８時間、２０ｍＭグリシン、ｐＨ９．０中に透析して正確なジスルフィド結合を形成させる。
【００６６】
最初の精製ステップとして、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８カラム上の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーと、移動相としての０．１％ＴＦＡ／０〜５０％ＣＨ3ＣＮとを使用する。このカラムを使用してＦＧＦ−２１化合物を濃縮し、汚染エンドトキシンを除去する。
【００６７】
次の精製ステップは、１ＸＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４中で実施されるＳｕｐｅｒｄｅｘ３５／６００カラム上のサイズ排除クロマトグラフィーである。このステップにおいて、ＦＧＦ−２１化合物の純度は〜９５％である。最終ステップは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中のＭｏｎｏＱクロマトグラフィーであり、直線状に傾斜させた０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出し、ここで通常、純度＞９７％のタンパク質が得られる。
【００６８】
調製２
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞におけるＦＧＦ−２１化合物の発現及び精製
代替的に、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｅｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して哺乳動物細胞発現系でＦＧＦ−２１化合物を生成する。ＦＧＦ−２１化合物を、商業的に入手可能なｐＥＡＫ１０の改変を表す独自に開発した発現ベクター内の、ＭＣＳ内のＮｈｅＩとＸｂａＩ制限部位間にサブクローニングする。ＦＧＦ−２１化合物をコードするｃＤＮＡ配列をＩｇκリーダー配列と共にフレーム内に融合して、組織培地内における所望の生成物の分泌を高める。発現は、強力なウイルスＣＭＶプロモーターにより駆動される。ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、例えばＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ、ＵＳＡ）のような標準的なトランスフェクション試薬と、適量の組み換えプラスミドとを、単層又は懸濁培地として用いて、十分な細胞密度にて過渡的にトランスフェクトする。細胞を無血清培地内で３７℃及び５％Ｃ０2にてインキュベートし、５日間、毎日収集物を作成する。一般に、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ懸濁培地中の発現レベルは、〜３０ｍｇ／Ｌである。哺乳動物細胞におけるＦＧＦ−２１化合物の発現では、ＨＰＩＰ、即ちＮ−末端にメチオニン残基を含まない天然Ｎ−末端配列が得られる。
【００６９】
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞からＦＧＦ−２１化合物を精製するために、濃縮した細胞培地の上澄みを、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５で平衡化した１０ｍｌ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  Ｑセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に負荷し、直線状に傾斜させた０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌを用いてタンパク質を溶出する。適切な分画をプールし、アセトニトリルを加えて最終濃度を１０％とし、０．１％ＴＦＡ水溶液で平衡化した１０×２５０ｍｍ、１０μｍ、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ、Ｈｅｓｐｅｒｉａ  ＣＡ、ＵＳＡ）に材料を負荷する。直線状に傾斜させた１０〜６０％アセトニトリルを用いて、タンパク質を溶出する。
【００７０】
関連した分画をプールし、１×ＰＢＳ  ｐＨ７で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ２６／６０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に負荷する。適切な分画をプールし、濃縮する。タンパク質調製物の完全性を確認する最終的な解析は、ＭＡＬＤＩ質量分析及びＮ−末端配列解析を用いる。精製したタンパク質をアリコートし、将来の使用のために−２０℃で保管する。
【００７１】
調製３
イーストにおけるＦＧＦ−２１化合物の発現
ＦＧＦ−２１化合物を生成させる更なる別の発現系は、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなイーストである。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で生成させるために、商業的に入手可能なシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、組み換えタンパク質を高いレベルで発現させる強力なＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）プロモーターを伴うベクターを使用する。代替的に、高いレベルの恒常的発現のために、ＧＡＰ遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）からのプロモーターを使用するベクターを利用することもできる。多コピーＰｉｃｈｉａ発現ベクターによって、ゲノム内に組み込まれた関心遺伝子の多コピーを伴う株を得ることができる。組み換えＰｉｃｈｉａ株内の関心遺伝子のコピー数を増大させることにより、タンパク質発現レベルを上昇させることができる。
【実施例】
【００７２】
＜実施例１＞
マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における糖取り込み
３Ｔ３−Ｌ１細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。Ｄｕｌｂｅｃｃｏの修飾Ｅａｇｌｅ培地中に、鉄を加えた１０％ウシ胎児血清を含有する増殖培地（ＧＭ）中で細胞を培養した。標準的な脂肪細胞分化のために、細胞が密集（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に到達した２日後（０日目と称す）に、細胞を１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインシュリン、１μＭデキサメタゾン、及び０．５μＭイソブチルメチルキサンチンを含有する分化培地（ＤＭ）に４８時間暴露した。次いで、細胞を１０％ウシ胎児血清、及び１０μｇ／ｍｌのインシュリンを含有する後分化培地(post  differentiation  medium)内で維持した。
【００７３】
糖輸送アッセイ−−０．１ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−［14Ｃ］糖の蓄積によりアッセイされる六炭糖取り込みを、以下のように測定した。１２−ウエルプレート内の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、３７℃に暖めた、０．２％ＢＳＡを含有するＫＲＰバッファー（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．９ｍＭ  ＭｇＳＯ4、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、０．２％ＢＳＡを含有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地中において室内空気中３７℃で２時間インキュベートし、０．２％ＢＳＡを含有するＫＲＰバッファーで再度２回洗浄し、ワートマニンの不在下（Ｍｅ2ＳＯのみ）又は存在下で０．２％ＢＳＡを含有するＫＲＰバッファー中で、室内空気中３７℃で３０分間インキュベートした。次いでインシュリンを１５分間加えて最終濃度１００ｎＭとし、２−デオキシ−Ｄ−［14Ｃ］糖の取り込みを最後の４分間測定した。１０μＭサイトカラシンＢの存在下で測定した非特異的取り込みを、全部の値から減じた。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅのビシンコニン酸アッセイにより決定した。各実験につき、取り込みを常規的に三重又は四重に測定した。
【００７４】
インビトロ効力（ＥＣ50）を、野生型ＦＧＦ−２１のインビトロ活性と比較した。本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物のインビトロ効力を、表１にて野生型ＦＧＦ−２１と比較した。表１に示すように、本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、様々な程度でインビトロ効力を低下させている。しかしながら、インビトロ効力の低下は、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の持続時間（血漿半減期）の延長により補償されると思われる。
【００７５】
表１
【表２】
2007531715.tif 000003
*４０ｋＤａ  ポリエチレングリコール−マレイミド（ＰＥＧ−マレイミド）
【００７６】
＜実施例２＞
４０ｋＤａ−ＰＥＧ−マレイミドのＦＧＦ−２１化合物との反応
マレイミド−活性化分岐４０ｋＤａ  ｍＰＥＧ（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を使用して、例えばＫ５９Ｃ及びＫ１２２ＣのようなＦＧＦ−２１化合物を、導入したシステイン残基において選択的にＰＥＧ化した。ＰＥＧ化反応のために、ＰＥＧ化するべきペプチドをｐＨ８．０の１００ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー中に溶解し、１．２５倍の過剰モルの４０ｋＤａ−ｍＰＥＧ塊を加えた。反応物を室温で２〜３時間撹拌した後、約５℃の１０ｍＭクエン酸塩、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４に対して一夜透析した（７ｋＤａ膜）。ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を、中性ｐＨの傾斜させたＮａＣｌを使用したＭｏｎｏ−Ｑカラム上の陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により精製した。
【００７７】
＜実施例３＞
２０ｋＤａ−ＰＥＧ−マレイミドのＦＧＦ−２１化合物との反応
マレイミド−活性化線状２０ｋＤａ  ｍＰＥＧ（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を使用して、例えばＫ５９Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、又はＫ５９ＣＫ１２２ＣのようなＦＧＦ−２１化合物を、人工的なシステイン残基において選択的にＰＥＧ化した。ＰＥＧ化反応のために、ＰＥＧ化するべきペプチドをｐＨ８．０の１００ｍＭ  ＴＲＩＳバッファー中に溶解し、１．２５倍の過剰モル（スルフヒドリルに対して）の４０ｋＤａ−ｍＰＥＧ塊を加えた。反応物を室温で２〜３時間撹拌した後、約５℃の１０ｍＭクエン酸塩、１０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．４に対して一夜透析した（７ｋＤａ膜）。ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を、中性ｐＨの傾斜させたＮａＣｌを使用したＭｏｎｏ−Ｑカラム上の陰イオン交換クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により精製した。例えばＦＧＦ−２１  Ｋ５９Ｃ  Ｋ１２２Ｃのような二重にＰＥＧ化された分子のために、中性ｐＨのバッファーを使用したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００上のサイズ排除クロマトグラフィー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により、二重ＰＥＧ化種から単一ＰＥＧ化種を分離した。
【００７８】
＜実施例４＞
ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の薬物動態学的分析
ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物を、静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）経路で、０．４ｍｇ／ｋｇの投与量にてＣＤ−１マウスに投与した。投薬後、０〜３３６時間の様々な時間にて動物を採血した。各サンプルから血漿を収集して、ラジオイムノアッセイにより分析した。モデル依存（ＩＶデータ）法及びモデル非依存（ＳＣデータ）法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ）を使用して薬物動態学的パラメータを計算し、下の表２に報告した。ＩＶ投与により、天然ＦＧＦ−２１の０．５時間の除去半減期に対して、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は約３２．１時間の除去半減期を有した。ＳＣ投与により、天然ＦＧＦ−２１の０．６時間の除去半減期に対して、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は約３０．２時間の除去半減期を有した。両方の投与経路により、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物は天然ＦＧＦ−２１と比較した場合、長期の作用時間を示した。
【００７９】
表２
【表３】
2007531715.tif 000004
a  観察される最大血漿濃度
b  最大血漿濃度の観察時間
c  ０から無限大において測定した血漿濃度−時間曲線下の面積
d  除去半減期
e  バイオアベイラビリティの機能としての全身クリアランス
f  バイオアベイラビリティ（％）
【００８０】
別の一研究では、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物又は天然ＦＧＦ−２１を、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量にてボーラス静脈注射（ＩＶ）によりカニクイザルに投与した。投薬後、０〜１６０時間の様々な時間にて動物を採血した。各サンプルから血漿を収集して、ラジオイムノアッセイにより分析した。モデル依存（ＩＶデータ）法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ）を使用して薬物動態学的パラメータを計算し、下の表３に報告した。天然ＦＧＦ−２１が２時間の除去半減期を有する一方、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１は約７５時間の除去半減期を有し、本発明のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の延長された作用時間が示された。更に、当業者はＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の延長された作用時間は、ＰＥＧ部分の効果であり、ＦＧＦ−２１化合物のＰＥＧ部分の位置に依存しないことを認識する。従って、リシン残基又はシステイン残基を介してＰＥＧ部分を結合させることによって、延長された作用時間を有するという特徴を備えたＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物が形成されて、長時間に亘ってＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の高い血中濃度を維持しながら、該化合物の投与量を少なくすることが可能となる。
【００８１】
表３
【表４】
2007531715.tif 000005
a  ０から無限大において測定した血漿濃度−時間曲線下の面積
b  除去半減期（日）
c  バイオアベイラビリティの機能としての全身クリアランス
【００８２】
＜実施例５＞
ｏｂ／ｏｂマウスモデル
ｏｂ／ｏｂマウスモデルは、高血糖、インシュリン抵抗性及び肥満症の動物モデルである。雄のｏｂ／ｏｂマウスを使用して、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物による処理後の血漿中ブドウ糖濃度及びトリグリセリド濃度を、ＦＧＦ−２１単独の場合と比較して監視した。雄のｏｂ／ｏｂマウス（７週齢）の試験グループは、（１）ＦＧＦ−２１、５μｇ／日、７日間、（２）ＦＧＦ−２１、２．５５ｎＭ、０日目のみ投与、（３）ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１  ２．５５ｎＭ、０日目のみ投与、及び（４）ｓ．ｃ．ビヒクルコントロール（０．９％ＮａＣｌ、０．１ｍｌ／マウス）、７日間であった。ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１及びＦＧＦ−２１は、０．１ｍｌにてｓ．ｃ．投与された。
【００８３】
グループ（１）及び（４）の動物は７日間、毎日投薬され、グループ（２）及び（３）の動物は、０日目のみ投薬された。標準的なプロトコールを使用して、投薬から１時間後の血中ブドウ糖濃度を毎日、１０日間測定した。ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１の延長された作用時間を表４に示す。０日目の単回投薬は、血中ブドウ糖濃度を１０日間低下させている。
【００８４】
表４
【表５】
2007531715.tif 000006
*  投与1時間後に測定したブドウ糖レベル
【００８５】
別の実験では、雄のｏｂ／ｏｂマウスを使用して、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の単回処置後の血漿中ブドウ糖濃度を、ＦＧＦ−２１単独の連続注入と比較して監視した。雄のｏｂ／ｏｂマウス（７週齢）の試験グループは、（１）ビヒクルコントロール（０．９％ＮａＣｌ）、７日間の連続注入（Ａｌｚｅｔ  ｐｕｍｐｓ  １００７Ｄ、１００ｍｃｌ、０．５ｍｃｌ／ｈ）、（２）ＦＧＦ−２１、３．４ｎＭ、７日間の連続注入、（３）ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１  ３．４ｎＭ、０．１ｍｌを０日目のみｓ．ｃ．投与、及び（４）ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物Ｋ５９Ｃ（システインＰＥＧ化）３．４ｎＭ、０．１ｍｌを０日目のみｓ．ｃ．投与、（５）ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物Ｋ１２２Ｃ（システインＰＥＧ化）３．４ｎＭ、０．１ｍｌを０日目のみｓ．ｃ．投与であった。
【００８６】
グループ（１）及び（２）の動物は７日間、連続注入により投薬され、グループ（３）及び（５）の動物は、０日目のみ投薬された。標準的なプロトコールを使用して、投薬から１時間後の血中ブドウ糖濃度を毎日、７日間測定した。ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物Ｋ１２２Ｃの卓越的に延長された作用時間を、表５に示す。０日目の単回投薬は、血中ブドウ糖濃度を７日間低下させている。表５に示すように、ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１及びＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物Ｋ５９Ｃも同様に、血中ブドウ糖低下効果を示した。
【００８７】
表５
【表６】
2007531715.tif 000007
*  投与1時間後に測定したブドウ糖レベル
【００８８】
＜実施例６＞
ＦＧＦ−２１化合物Ｋ５９Ｃ及びＫ１２２ＣをコードするＤＮＡの構成
ｐＪＢ０２は、哺乳動物細胞ライン内でタンパク質を十分分泌させる人工的なリーダーペプチドを伴う発現ベクターである。組み換えプラスミド、ｐＪＢ０２／ＦＧＦ２１（Ｐ１６８２０参照）は、野生型ＦＧＦ−２１をコードするｃＤＮＡがＡｇｅＩとＸｂａＩ間に挿入され、部位特異的突然変異を導入してＳＯＥ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によりＦＧＦ−２１のＫ５９Ｃ及びＫ１２２Ｃ変異体を生成するテンプレートとして使用した。ＰＣＲ増幅の一般的な条件は、以下のようなものであった。９５℃で５分間変成、次いで９５℃で１分間の変成を２５サイクル、５５℃で１分間アニーリング及び７２℃で１〜２分間伸長、次いで７２℃で７分間の最終的な伸長、並びに４℃で反応物を冷却した。
【００８９】
以下の内部の突然変異誘発性プライマー（Ｃ＋及びＢ−）をＫ５９Ｃに関して使用した。
フォワードプライマー（５’，Ｃ＋）：ＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＧＣＣＣＧＧＧＡＧＴＴＡＴＴＣＡＡＡＴＣＴＴＧＧＧ
リバースプライマー（３’，Ｂ−）：ＣＣＣＡＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＡＡＣＴＣＣＣＧＧＧＣＡＣＡＡＧＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＣ
【００９０】
以下の内部の突然変異誘発性プライマー（Ｃ＋及びＢ−）をＫ１２２Ｃに関して使用した。
フォワードプライマー（５’，Ｃ＋）：
ＣＧＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣ
リバースプライマー（３’，Ｂ−）：
ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＣＧＧＴＧＴＧＧＧＧＡＧＣＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＧＧＣＣＧ
【００９１】
両方の構造に関する外部の増幅プライマー（Ａ＋及びＤ−）は以下の通りである。
フォワードプライマー（５’，Ａ＋）：ＧＧＡＣＴＴＡＣＣＧＧＴＣＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＴＴＣＧＧ
リバースプライマー（３’，Ｄ−）：
ＣＴＧＴＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＣＡＧＧＡＡＧＣＧＴＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＡＣＣＡＴＧＣ
【００９２】
以下のようにＳＯＥ  ＰＣＲを実施した。
ｐＪＢ０２／ＦＧＦ２１をテンプレートとして使用して、一方の反応にはプライマーＡ＋及びＢ−を、他方の反応にはプライマーＣ＋及びＤ−を使用して２種のＰＣＲを実施した。ＰＣＲは２個の断片、即ちＫ５９Ｃ及びＫ１２２Ｃに関して各々２１２及び４００ｂｐ（塩基対）のＡＢ断片、Ｋ５９Ｃ及びＫ１２２Ｃに関して各々４１８及び２３４ｂｐのＣＤ断片を生成した。続くＰＣＲにて、ほぼ等モル数のＡＢ及びＣＤを重複テンプレートとして加え、外部プライマー、Ａ＋及びＤにより増幅した。ＦＧＦ−２１Ｋ５９Ｃ又はＦＧＦ−２１Ｋ１２２Ｃを含むＡＤ断片と指定される所望の５８１ｂｐＰＣＲ生成物を得た。最終的なＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼ、ＡｇｅＩ及びＸｂａＩで消化し、予備的なアガロースゲル電気泳動で精製し、適切に消化されたベクターｐＪＢ０２断片に結合して、組み換えプラスミド、ｐＪＢ０２／ＦＧＦ−２１Ｋ５９Ｃ又はＦＧＦ−２１Ｋ１２２Ｃを生成した。両方の挿入配列をＤＮＡ配列解析により確認した。
【配列表】
2007531715000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月16日(2006.11.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007531715000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月15日(2006.12.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１個のＰＥＧ分子に共有結合したＦＧＦ−２１化合物を含むＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物であって、該各ＰＥＧが、システインアミノ酸残基又はリシンアミノ酸残基においてＦＧＦ−２１化合物に結合し、該ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物が、非ＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と比較して延長された作用時間を有するＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項２】
５６、５９、６９及び１２２位のリジンからなる群から選択された１またはそれ以上の残基において該ＰＥＧ分子に共有結合し、配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含む請求項１記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項３】
該配列番号１に示すようなアミノ酸配列を含み、１またはそれ以上の アミノ酸残基がシステイン残基で置換され、該システイン残基が該ＰＥＧ分子に共有結合する請求項１記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項４】
該置換アミノ酸残基が、Ｄ２５Ｃ、Ｄ３８Ｃ、Ｌ５８Ｃ、Ｋ５９Ｃ、Ｐ６０Ｃ、Ｋ６９Ｃ、Ｄ７９Ｃ、Ｈ８７Ｃ、Ｅ９１Ｃ、Ｅ１０１Ｃ、Ｄ１０２Ｃ、Ｌ１１４Ｃ、Ｌ１１６Ｃ、Ｋ１２２Ｃ、Ｒ１２６Ｃ、Ｐ１３０Ｃ、Ｐ１３３Ｃ、又はＰ１４０Ｃからなる群から選択される請求項３記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項５】
該ＰＥＧ分子が、約２０，０００〜４０，０００ダルトンの分子量を有する請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物。
【請求項６】
（ａ）治療的有効量の請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物と、
（ｂ）許容可能な医薬担体と、を含み、
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群に罹患した患者の治療に有効な医薬組成物。
【請求項７】
医薬品の製造における請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の使用。
【請求項８】
肥満症、２型糖尿病、インシュリン抵抗性、抗インシュリン血症、耐糖能障害、高血糖、又はメタボリック症候群を治療する医薬品の製造における、請求項１〜４のいずれかに記載のＰＥＧ化ＦＧＦ−２１化合物の使用。
【請求項９】
該医薬品が、２型糖尿病を治療するために使用される請求項８記載の使用。