(57)【要約】  本発明は、物理的撹拌後、および１回または複数回の冷凍解凍事象への暴露後に安定なままである安定な液体成長ホルモン製剤を対象とする。本発明の製剤は、様々な温度において、冷凍してさえ長期保存することができる。本発明において、緩衝液ならびに非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）、ポリマー安定剤（例えば、ポリエチレングリコール）、および他の任意選択の安定剤が含まれる安定化剤の組合せは、協力して、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）の水性製剤に予想外の安定性を提供する。
2007516274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中の治療有効量の成長ホルモン、製剤のｐＨを約５〜約７のｐＨに維持する緩衝液、非イオン性界面活性剤、ポリマー安定剤を含み、さらに水酸化マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、およびエデト酸マグネシウムからなる群から選択されるマグネシウム塩中に存在する二価陽イオン、等張化剤、メチオニン、および保存剤からなる群から選択される１種または複数の添加剤を含んでもよい、少なくとも１回の冷凍と続く解凍事象後に安定性を維持している製剤。
【請求項２】
前記ヒト成長ホルモンは、ヒト成長ホルモンの組換え体である請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
前記成長ホルモンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤中に存在する請求項２に記載の製剤。
【請求項４】
前記緩衝液は、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、およびヒスチジン塩酸塩からなる群から選択される請求項１に記載の製剤。
【請求項５】
前記非イオン性界面活性剤は、約０．０２％〜約１０％の濃度で存在する請求項１に記載の製剤。
【請求項６】
前記非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０からなる群から選択されるポリソルベートである請求項１に記載の製剤。
【請求項７】
前記ポリマー安定剤は、約０．００１％〜約７０％の濃度で存在する請求項１に記載の製剤。
【請求項８】
前記ポリマー安定剤は、約３０００〜約２０，０００の範囲の分子量を有するポリ（エチレン）グリコールである請求項１に記載の製剤。
【請求項９】
前記等張化剤は、ソルビトールである請求項１に記載の製剤。
【請求項１０】
前記保存剤は、フェノールおよびベンジルアルコールからなる群から選択される請求項１に記載の製剤。
【請求項１１】
水溶液中のヒト成長ホルモンの組み換え体約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、製剤を約５〜約７のｐＨに維持するクエン酸塩またはエデト酸塩緩衝液、ポリソルベート界面活性剤約０．０４％〜約５％（ｗ／ｗ）、ポリエチレングリコール約０．００１％〜約２０％（ｗ／ｖ）を含み、さらに製剤をほぼ等張とするのに十分な濃度のソルビトール、メチオニン、塩化マグネシウムまたは水酸化マグネシウム、保存剤からなる群から選択される１種または複数の添加剤を含んでもよい、少なくとも１回の冷凍解凍事象後に安定性を維持している製剤。
【請求項１２】
前記保存剤は、フェノールまたはベンジルアルコールである請求項１１に記載の製剤。
【請求項１３】
３回以上の冷凍解凍事象への製剤の暴露後に、溶液中にｈＧＨの少なくとも約９０％が残存する請求項１１に記載の製剤。
【請求項１４】
前記製剤は、約２℃〜約８℃において少なくとも５２週間は安定である請求項１１に記載の製剤。
【請求項１５】
約２℃〜約８℃で１２カ月間保存した後に、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定される総凝集体は約０．５％未満であり、かつ／または陰イオン交換ＨＰＬＣによって測定される総脱アミド化は約７％未満であり、かつ／または逆相ＨＰＬＣによって測定されるｈＧＨ回収率は８５％を超えるかもしくは等しい請求項１４に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト成長ホルモンなどの成長ホルモンの安定な液体製剤、特に、長期保存後に安定なままであり、撹拌、冷凍、および解凍などの物理的ストレスを受けた後にも安定なままであるような製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、あたかも本明細書に書かれているかのように全体として参照により組み込まれている２００３年１２月２３日に出願した米国仮出願第６０／５３１，８４３号に対し、米国法典第３５編１１９条に基づいて優先権を主張するものである。
【０００３】
天然のヒト成長ホルモンは、２個のジスルフィド架橋により内部架橋した、１９１個のアミノ酸からなる単一ポリペプチド鎖タンパク質である。他の動物種の成長ホルモンは、天然のヒト成長ホルモンと極めて相同的であり、下垂体機能不全による低身長症および骨粗鬆症などのヒトにおける成長ホルモン欠損症に関連する疾患の治療に有効であるという点から見て、類似の生物活性を有する。天然のヒト成長ホルモンと同様の、または実質的に類似のアミノ酸配列および天然のホルモンと同一の生物活性を持つヒト成長ホルモンの組換え体も製造されている。以下、他に注記がない限り、天然のヒト成長ホルモンおよびヒト成長ホルモンの組換え体のすべてを、まとめて「ｈＧＨ」と呼ぶ。ｈＧＨと他の種の成長ホルモンとの構造的類似性のため、ｈＧＨを安定化するのに有効である製剤は、他の種の成長ホルモンを安定化するのにも有効であると予想されるであろう。
【０００４】
今日、ｈＧＨは、凍結乾燥体で主に販売されている。例えば、ジェノトロピン（登録商標）凍結乾燥粉末（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＆  Ｕｐｊｏｈｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ、現在、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．に所有されている）、ヒューマトロープ（登録商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ノルディトロピン（登録商標）注射用（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）、サイゼン（登録商標）注射用（Ｓｅｒｏｎｏ）、およびニュートロピン（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を参照されたい。凍結乾燥製剤は、長期にわたってタンパク質安定性を提供するという利点を有する。しかしながら、凍結乾燥製剤は、凝集および脱アミド化が、水性希釈液による再構成直後に始まる傾向があるため、再構成直後に使用しなければならない。一般的に、このことは、使用直前に製品を再構成することを凍結乾燥製剤の消費者に一任していることを意味する。再構成が適切に行われない場合、または再構成された製剤が使用前にあまりに長く保存された場合、消費者は、成長ホルモンの不適切な用量すなわち不適当なレベルのｈＧＨ分解産物を含有する用量を摂取する可能性がある。さらに、凍結乾燥製剤の製造は、液体製剤の製造に比べて、実質的に過大な費用と時間を必要とする。
【０００５】
凍結乾燥ｈＧＨ製剤に伴う上記の不利益のため、長年にわたってｈＧＨの様々な液体製剤が開発されており、それぞれには、様々な保存および取扱い条件下で様々な程度の安定性がある。ｈＧＨの２種の市販液体製剤がニュートロピンＡＱ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）およびノルディトロピン（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）という商品名で販売されている。これらの、および他のｈＧＨ液体製剤の組成は、以下に要約する特許および公開特許出願に開示されている。以下の各参考文献は、それらに記載のｈＧＨ製剤の液体製剤が、他に注記がない限り、冷蔵温度、約２℃〜約８℃において安定であることを述べている。しかしながら、どれ一つとして、冷凍および解凍、製品が輸送中に暴露される可能性のある条件への暴露に耐えることができる製剤を開示すると主張していない。さらに、以前に開示された製剤の一部において、ｈＧＨは、例えば、輸送中に物理的撹拌を受けた場合に分解するか、あるいは凝集を起こす。これらのタイプの不安定性は、高価な製品の損耗をもたらすばかりではなく、分解産物が患者へ不注意に投与された場合には安全性の問題を引き起こす可能性がある。
【０００６】
米国特許第５，５６７，６７７号（Ｃａｓｔｅｎｓｓｏｎ他によって発明され、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＡＢに譲渡）は、成長ホルモンおよび約５．０〜７．０のｐＨで２〜５０ｍＭの量のクエン酸塩緩衝液からなる水性製剤を開示している。また、‘６７７特許は、そこに開示された製剤にマンニトールおよびグリシンを適当に含めることができると教示している。
【０００７】
米国特許第５，７６３，３９４号および５，９８１，４８５号（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ他によって発明され、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ，ＩＮＣ．に譲渡）は、ｈＧＨ、ｐＨ５．５〜ｐＨ７を提供する緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウム）、０．１％〜１％ｗ／ｖ非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０）および中性塩（例えば、塩化ナトリウム）５０〜２００ｍＭ、および保存剤（例えば、フェノール）を含有する水性ヒト成長ホルモン製剤を開示しており、前記製剤は、グリシンおよびマンニトールを含まない。
【０００８】
米国特許第６，０２２，８５８号（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ他によって発明され、ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ  Ａ／Ｓに譲渡）は、亜鉛塩で前処理されたヒト成長ホルモンを含有し、リジンまたはカルシウムイオンを場合により含有する緩衝水溶液を開示している。
【０００９】
米国特許第５，８４９，７０４号（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ他によって発明され、ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ  Ａ／Ｓに譲渡）は、ヒスチジンまたはヒスチジン誘導体で緩衝された成長ホルモンを含有する緩衝水溶液を開示している。
【００１０】
米国特許第５，９７７，０６９号、米国特許第５，６３１，２２５号、および米国特許第５，５４７，６９６号、（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ他によって発明され、ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ  Ａ／Ｓに譲渡）は、安定化させる量のアミノ酸アスパラギン、イソロイシン、またはバリンそれぞれと一緒にヒト成長ホルモンを含有する緩衝水溶液を開示している。
【００１１】
米国特許第５，７０５，４８２号および米国特許第５，５５２，３８５号（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他によって発明され、ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ  Ａ／Ｓに譲渡）は、安定化させる量のペプチドＬｅｕ−Ｈｉｓ−ＬｅｕおよびＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒそれぞれと一緒にヒト成長ホルモンを含有する緩衝水溶液を開示している。
【００１２】
国際公開第０１／０３７４１  Ａ１号（Ｓｉｅｂｏｌｄ他による発明として、ＧＲＡＮＤＩＳ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＧＭＢＨに譲渡）は、「本質的に等張性リン酸塩緩衝溶液中の成長ホルモンからなる保存に安定な液体成長ホルモン製剤」を開示し、リン酸塩緩衝液および０．２％以下の濃度で存在する非イオン性界面活性剤を含む製剤も請求の範囲に記載している。この刊行物の実施例の項において、使用された唯一の非イオン性界面活性剤は、含まれている各製剤において０．２％（ｗ／ｖ）の濃度のプルロニックＦ−６８である。
【００１３】
国際公開第０２／０６７９８９  Ａ１号（Ｓｅｉｂｏｌｄ他による発明として、ＧＲＡＮＤＩＳ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＧＭＢＨに譲渡）は、「成長ホルモンおよび（ａ）約ｐＨ５．６以上のクエン酸塩緩衝液、または（ｂ）約ｐＨ６．０以上のクエン酸塩以外の緩衝液を含み、保存による結晶化が実質的にない水性成長ホルモン製剤」を対象としている。開示された製剤の保存に適した唯一の温度は、冷蔵温度（４℃〜８℃）およびそれ以上、すなわち８〜２５℃の温度範囲にある。
【００１４】
米国出願公開第２００２／００７７４６１号（Ｂｊｏｒｎ他による発明として、ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ  ＯＦ  ＮＯＲＴＨ  ＡＭＥＲＩＣＡ  ＩＮＣ．に譲渡）は、成長ホルモン（例えば、ｈＧＨ）、アスパラギン、イソロイシン、バリン、ロイシン、ヒスチジン、ヒスチジンの誘導体からなる群から選択されるアミノ酸、または少なくとも１個の塩基性アミノ酸残基および少なくとも１個の酸性アミノ酸残基を含むペプチド、および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベートまたはポリアキサマー（ｐｏｌｙａｘａｍｅｒ））を含む医薬製剤を開示している。また、この出願は、ｐＨ６〜ｐＨ８の緩衝液（例えば、ヒスチジン、クエン酸塩、酒石酸塩、またはリン酸塩）、等張化剤（例えば、マンニトール）を含むそのような製剤を開示している。この出願で開示されている唯一の安定性研究は、冷蔵温度以上で行われた。
【００１５】
国際公開第０１／２４８１４  Ａ１号（Ｃｈｅｎ他による発明として、ＣＨＩＲＯＮ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮに譲渡）は、保存中の凝集体形成を減少させ、水性ポリペプチド製剤を安定化するのに十分なアミノ酸塩基の使用を開示しており、アミノ酸塩基は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される少なくとも１種のアミノ酸を含む。また、この公開出願は、そのような製剤における追加の安定剤の包含を開示しており、メチオニンなどの抗酸化剤、および非イオン性界面活性剤が含まれる。インターロイキン−２は、そのような製剤を用いる安定化がそこに例示されている唯一のポリペプチドである。
【００１６】
現在市場に出ている液体ｈＧＨの市販製剤には、保存剤としてのフェノールが含まれる。例えば、ニュートロピンＡＱ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．によって販売されている組換えｈＧＨの液体製剤）、およびノルディトロピン（登録商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋによって販売されている組換えｈＧＨの液体製剤）を参照されたい。しかしながら、フェノールは、特に冷凍および解凍した場合にｈＧＨの凝集を促進することが知られている（Ｍａａ、Ｙｕｈ−Ｆｕｎ他、Ｉｎｔｅｒｎａｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  １４０：１５５−１６８（１９９６）を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
特に成長ホルモン、一般的にポリペプチドを安定化する製剤の開発において今日までなされてきたすべての進歩にもかかわらず、液体製剤におけるｈＧＨの安定性は課題のままである。安定性は、特にフェノール系添加剤（例えば、フェノール保存剤）が存在する場合、冷凍とそれに続く解凍に暴露される液体ｈＧＨ製剤では特に問題である。１回の冷凍解凍が、タンパク質凝集および沈殿生成の理由から、上記に引用した市販の製剤などの既知液体ｈＧＨ製剤をヒト使用に適さなくする可能性すらある。
【００１８】
冷凍解凍条件下、ならびに物理的撹拌などの物理的ストレスの他の条件下で安定なままであり、適当な保存条件下での長期保存後にも安定なままである液体ｈＧＨ製剤が必要である。そのような製剤は、現在市販のｈＧＨ製剤のように冷蔵庫中に保存できるばかりでなく、冷凍庫中にも保存できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、水溶液中の治療量の成長ホルモン、緩衝液、非イオン性界面活性剤、およびポリマー安定剤を含み、少なくとも１回の冷凍解凍事象への暴露後に安定なままである安定な液体製剤に関する。本発明の液体成長ホルモン製剤は、製剤中に生成される目に見える沈殿物なしに、かつ成長ホルモンの溶液からの有意な損失なしに少なくとも１回冷凍および解凍することができる。
【００２０】
本発明の一実施形態は、水溶液中の治療有効量の成長ホルモン、製剤のｐＨを約５〜約７のｐＨに維持する緩衝液、非イオン性界面活性剤、およびポリマー安定剤を含み、少なくとも１回の冷凍と続く解凍後に安定なままである製剤を対象とする。
【００２１】
別の実施形態は、水溶液中のヒト成長ホルモンの組換え体約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、製剤を約５〜約７のｐＨに維持するクエン酸塩またはエデト酸塩緩衝液、ポリソルベート界面活性剤約０．０４％〜約５％（ｗ／ｗ）、およびポリエチレングリコール約０．００１％〜約２０％（ｗ／ｖ）を含み、少なくとも１回の冷凍解凍事象後に安定なままである製剤を対象とする。具体的実施形態において、製剤は、少なくとも３回の冷凍解凍事象後に安定なままである。具体的実施形態において、製剤は、少なくとも６回の冷凍解凍事象後に安定なままである。
【００２２】
本発明の液体製剤は、複数回の冷凍解凍事象への暴露後でさえ、フェノールなどのフェノール系保存剤の存在下または非存在下で安定である。成長ホルモンの凝集に対するフェノール系化合物の影響に関して現在知られていることを考えると、この結果は意外である（例えば、Ｍａａ、Ｙｕｈ−Ｆｕｎ他、上記参照）。
【００２３】
また、驚いたことに、本発明の製剤は、ある国の一地域から別の地域へ、または世界の一地域から別の地域へ輸送される過程において製剤が暴露される撹拌などの物理的取扱いおよび撹拌の条件下でも安定である。
【００２４】
さらに、驚いたことに、本発明の製剤は、２〜８℃の冷蔵下の保存などの長期保存の推奨条件中で分解に対して抵抗性がある。具体的実施形態において、この製剤は、２〜８℃における保存で少なくとも５２週間安定なままである。本製剤は、冷凍温度またはそれ以下の温度における保存後でも分解に対して抵抗性がある。
【００２５】
本明細書で使用する用語「ヒト成長ホルモン」および「ｈＧＨ」は、天然のヒト組織起源、およびヒト成長ホルモンをコードするデオキシリボ核酸で形質転換された組換え培養系からの抽出および精製が含まれる方法によって製造されるヒト成長ホルモンを指す。ｈＧＨの配列および特徴は、例えば、Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｄｒｕｇｓ、Ｇｕｅｒｉｇｕｉａｎ他、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８２）に示されている。本明細書で使用する同じ用語は、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入を含むｈＧＨのアゴニスト類似体も指す。本明細書で使用する同じ用語は、ｈＧＨの天然１９１アミノ酸体に対して少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するｈＧＨのアゴニスト類似体も指す。特に著名な２種類のｈＧＨには、１９１アミノ酸の天然種（ソマトトロピン）および組換え手段により一般的に得られる１９２アミノ酸のＮ末端メチオニン（ｍｅｔ）種（ソマトレム）が含まれる。
【００２６】
本明細書で使用する用語ｈＧＨの「治療有効量」は、投与計画において治療効果を提供する量を指す。
【００２７】
本明細書で使用する用語「冷凍解凍事象」は、液体溶液または他の製剤を、溶液が冷凍されるまでその凝固点未満の温度、通常は冷凍庫中で−２０℃または−７０℃に暴露し、続いて解凍によりその凝固点を超える温度、通常は冷蔵庫中で２〜８℃に、または周囲の室温に暴露することを指す。この手順に従って２回以上冷凍および解凍されたサンプルは、複数回の冷凍解凍事象を受けたと称される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の製剤の任意の実施形態におけるｈＧＨの治療有効量は、任意の対象に送達される製剤の体積、ならびに対象の年齢および体重、および治療されている疾患または障害の性質によって異なる。製剤がヒト対象に送達される場合、製剤は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨ、または約１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌのｈＧＨを含有する。
【００２９】
本発明の製剤中に含まれる緩衝液は、製剤のｐＨを約ｐＨ５〜約ｐＨ７に維持する。別の実施形態において、緩衝液は、製剤のｐＨを約ｐＨ５．７〜約ｐＨ６．５に維持する。さらに別の実施形態において、緩衝液は、製剤のｐＨを約ｐＨ６に維持する。製剤の他の成分と反応して、１回または複数回の冷凍解凍後、または輸送撹拌後に目に見える沈殿を生成させることはないか、さもなければ成長ホルモンを化学的に不安定化させないものであれば、製剤のｐＨを上記に示した任意のｐＨ範囲内に維持することができるどの緩衝液も、本発明の製剤において使用するのに適している。本製剤において使用される緩衝液は、クエン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、エデト酸塩、ヒスチジン、酢酸塩、アジピン酸塩、アコニット酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、マレイン酸塩、グルタミン酸塩、リン酸塩、および酒石酸塩からなる群から選択される成分を含む。特定の緩衝液は、成分としてエデト酸塩またはクエン酸塩を含む。本発明の製剤において使用するのに適した緩衝液の例には、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、およびヒスチジン塩酸塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。具体的な実施形態は、エデト酸ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム緩衝液である。
【００３０】
緩衝液は、製剤のｐＨを上述のｐＨ範囲内に維持するのに十分な濃度で存在する。製剤における緩衝液の濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、あるいは約２ｍＭ〜約５０ｍＭ、あるいは約４ｍＭ〜約２０ｍＭである。
【００３１】
本発明の製剤において使用される非イオン性界面活性剤およびポリマー安定剤は、少なくとも１回の冷凍解凍事象を受けた後に、または取扱いおよび物理的撹拌を受けた後に、ｈＧＨまたは製剤の他の成分を溶液から沈殿させることなくｈＧＨを安定化するそれらの能力について選択される。非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマーもしくはプルロニック、または別のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーであってよい。ある特定の実施形態において、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベートであり、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０であってよい。
【００３２】
本発明の液体製剤に含められるポリマー安定剤は、ポリエチレングリコールおよびポリエチレングリコール誘導体からなる群から選択される。例示的実施形態において、ポリマー安定剤は、約４００〜約１００，０００ｋＤａの平均分子量範囲、具体的には、約３０００〜約２０，０００ｋＤａの分子量範囲内の任意の分子量のポリエチレングリコールである。これらの分子量範囲で多くの市販形態のポリ（エチレン）グリコール（別名「ＰＥＧ」）が入手可能であり、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ８０００、およびＰＥＧ２０，０００が含まれる。本発明の製剤において、様々な分子量のポリ（エチレン）グリコールの添加は、物理的撹拌ならびに冷凍解凍に対してｈＧＨの安定性を改善することが判明している。
【００３３】
非イオン性界面活性剤およびポリマー安定剤は、界面活性剤と安定剤が一緒になって、物理的撹拌ならびに冷凍解凍に対してｈＧＨ製剤を安定化するのに十分な量でそれぞれ存在する。別の実施形態において、製剤中に存在する界面活性剤の量は、たとえポリマー安定剤が存在しなくても、物理的撹拌に対してｈＧＨ製剤を安定化するであろう量である。
【００３４】
ｈＧＨ液体製剤を安定化するための０．１％以上の濃度でのポリソルベートやポロキサマーなどの非イオン性界面活性剤の使用は、以前にも開示されている（米国特許第５，７６３，３９４号および第５，９８１，４８５号（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ他、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、欧州特許出願公開第０９５５０６２  Ａ１号（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ他、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ））。２タイプの市販ｈＧＨ液体製剤のみが０．２％のポリソルベート２０（ニュートロピンＡＱ（登録商標））、および０．３％のポロキサマー１８８（ノルディトロピン（登録商標））を利用している。予想外に、本発明の液体製剤は、非イオン性界面活性剤濃度が０．１％以下であっても同様に、優れたｈＧＨの物理的安定性を提供することが発見されている。
【００３５】
本発明の安定な液体ｈＧＨ製剤中の非イオン性界面活性剤は、少なくとも約０．０２％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）の濃度、あるいは約０．０４％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）の濃度、あるいは約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。
【００３６】
ポリマー安定剤は、少なくとも約０．００１％の濃度で存在し、７０％までの濃度で存在することが適当である。例えば、注射による製剤の送達を容易にするため、粘度を最小限に抑えることが望ましい製剤では、比較的低濃度のポリマー安定剤が使用される。そのような条件の下で、ポリマー安定剤は、約０．００１％〜約２０％、あるいは約０．０１％〜約１０％、あるいは約０．０５％〜約５％の濃度で存在する。
【００３７】
別の実施形態において、本発明の製剤は、等張化剤をさらに含む。等張化剤は、本発明のｈＧＨ液体製剤における他の安定化剤としての機能を果たすこともある。適当な等張化剤には、中性塩、ならびに糖アルコール、単糖、および二糖などの炭水化物が含まれる。適当な炭水化物等張化剤には、非還元性単糖、二糖、もしくは多糖、またはポリオール、または中性塩が含まれ、マンニトール、ソルビトール、ラクチトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが含まれる。炭水化物等張化剤は、マンニトール、ソルビトール、スクロースもしくはトレハロース、またはソルビトールであってよい。最後の４つの等張化剤のそれぞれを使って調製した本発明の製剤は、冷凍解凍事象、物理的撹拌への暴露および長期保存後に安定であることが判明している。しかしながら、ソルビトールは、他の安定剤なしに物理的撹拌に対してｈＧＨに安定化効果を有することが判明している。以前に開示された液体ｈＧＨ製剤については、等張化剤および安定剤としてのマンニトールの使用が明らかにされ（例えば、米国特許第５，５６７，６７７号）、さらに別の場合には、等張化剤および安定剤としての塩化ナトリウムの使用が明らかにされている（例えば、米国特許第５，７６３，３９４号を参照）ことから、このことは意外である。
【００３８】
等張化剤は、存在する場合、製剤を等張性にし、ヒト対象などの哺乳類の、皮膚、皮下、または筋肉内組織への非経口注射に適するようにするのに十分な量で存在してよい。製剤中の他の成分の濃度に応じて、ソルビトールは、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、あるいは約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、あるいは約２００ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度で存在する。
【００３９】
さらに別の実施形態において、本製剤は、アミノ酸安定剤をさらに含む。様々なアミノ酸安定剤は、液体製剤中のｈＧＨが含まれるタンパク質を安定化することが報告されている、（例えば、米国特許第５，５６７，６７７号（Ｃａｒｓｔｅｎｓｓｏｎ他、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）におけるグリシンの使用ならびに様々な特許（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ他、ＮＯＶＯ  ＮＯＲＤＩＳＫ、同上）におけるヒスチジン、バリン、イソロイシン、アスパラギン、およびリジンの使用を参照）。製剤に含められるアミノ酸安定剤は、１回または複数回の冷凍解凍事象後に、または物理的撹拌への暴露後に物理的不安定性を一切生じることなく、保存時の製剤にさらなる化学的安定性を付加する安定剤である。予想外に、システインは、製剤中に存在する場合、本発明のｈＧＨ液体製剤の化学的安定性を低下させることが判明した。一方、メチオニンは、本製剤においてｈＧＨの化学的安定性を改善することが判明している。
【００４０】
タンパク質は自然酸化を受ける傾向があるため、タンパク質製剤における抗酸化剤としてのメチオニンの使用が文献中に報告されてきた。しかしながら、メチオニンが液体製剤中のｈＧＨを安定化することは報告されたことがない。実際、メチオニンは、本製剤のポリマー安定剤成分が存在しない場合、ｈＧＨの化学的安定性も、その酸化プロファイルも有意な程度までは改善しないことが観察された。予想外に、ポリエチレングリコールなどのポリマー安定剤が存在すると、メチオニンの添加は、安定性に対して有益な効果を有することが観察された。
【００４１】
別の実施形態において、製剤は、二価陽イオンをさらに含む。製剤は、二価陽イオンの性質によって制限されない。例示的二価陽イオンは、マグネシウム、カルシウム、および亜鉛である。二価陽イオンは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、水酸化マグネシウムなどの塩を含むマグネシウムであってよい。製剤中の塩を含むマグネシウムの量は、錯体形成によって緩衝液の緩衝能力を大きく低下させることがないように、緩衝液のモル濃度未満であるが、製剤の化学的安定性を改善するには十分に高いモル濃度で存在する。
【００４２】
別の実施形態において、製剤は、フェノールやベンジルアルコールなどの保存剤を場合によって含む。製剤中の保存剤の量は、ｈＧＨを化学的または物理的に不安定化しない比較的低濃度で存在するが、保存措置に十分な抗菌活性を提供するのに十分な濃度で存在する。
【００４３】
本発明の特定の実施形態は、水溶液中のヒト成長ホルモンの組換え体約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、製剤を約６のｐＨに維持するエデト酸塩またはクエン酸塩緩衝液約４〜約２０ｍＭ、ポリソルベート界面活性剤約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）、およびポリエチレングリコールポリマー約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）を含み、少なくとも１回の冷凍解凍事象後に安定なままである製剤である。具体的実施形態において、製剤は、少なくとも３回の冷凍解凍事象後に安定なままである。具体的実施形態において、製剤は、少なくとも６回の冷凍解凍事象後に安定なままである。本製剤のこの実施形態には、上述のように等張化剤が場合によって含まれる。また、製剤のこの実施形態には、上述のようにメチオニンが場合によって含まれる。また、製剤のこの実施形態には、上述のようにマグネシウム試薬が場合によって含まれる。さらに、製剤のこの実施形態には、上述のように保存剤が場合によって含まれる。
【００４４】
本発明の製剤は、単回、および複数回の冷凍解凍事象への暴露後に安定なままである。また、本発明の製剤は、１つの場所から別の場所へ製品を輸送する際に遭遇することが予想されるであろう物理的撹拌への暴露後にも安定なままである。安定性は、いくつかの異なる方法のうちいずれか１つによって測定することができ、沈殿生成の視覚的検査、ストレス条件への暴露後に溶液中に残るパーセントタンパク質の分析（例えば、ｈＧＨモノマーのサイズ排除ＨＰＬＣによるか、あるいは総ｈＧＨのタンパク質吸光度分析による）、または成長ホルモンの化学的変異形の生成の分析（例えば、陰イオン交換または逆相ＨＰＬＣ分析による）が含まれる。本発明の一実施形態において、少なくとも１回の冷凍解凍事象後に、肉眼で見える沈殿は製剤中に生成しない。具体的実施形態において、製剤は、少なくとも３回の冷凍解凍事象後に安定なままである。具体的実施形態において、製剤は、少なくとも６回の冷凍解凍事象後に安定なままである。別の実施形態において、製剤中のｈＧＨモノマーの少なくとも９０％は、少なくとも１回の冷凍解凍事象後にサイズ排除ＨＰＬＣアッセイによって測定されるように、溶液中に残っている。
【００４５】
また、本発明の製剤は、２５℃で少なくとも４週間保存、または約２〜８℃で少なくとも５２週間保存した後に、サイズ排除ＨＰＬＣアッセイにより、溶液中に少なくとも９０％のｈＧＨモノマーを提供し、さらに、完全に生物活性のままである。冷凍解凍条件に対するそれらの抵抗性により、本発明の製剤は、冷凍以下の温度において長期間適当に保存することができる。
【００４６】
また、本発明の製剤は、サイズ排除ＨＰＬＣによって測定して、溶液中のｈＧＨの少なくとも９０％、具体的には少なくとも９５％、具体的には少なくとも９９％、具体的には少なくとも９９．８８％、具体的には少なくとも９９．９２％の回収率を提供する。
【００４７】
また、本発明の製剤は、逆相ＨＰＬＣによって測定して、溶液中のｈＧＨの少なくとも８５％、具体的には少なくとも８６％、具体的には少なくとも８８％の回収率を提供する。
【００４８】
また、本発明の製剤は、陰イオン交換ＨＰＬＣによって測定して、溶液中の７％未満、具体的には６％未満の脱アミド化を提供する。
【００４９】
本開示で引用したすべての刊行物、特許、および特許出願の完全な内容は、あたかもそれぞれの刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照により組み込まれていることが示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５０】
以下の実施例により、本発明をさらに例示する。これらの実施例は、本発明の例示を意図しており、その範囲を制限または限定するために使用すべきではない。
【実施例】
【００５１】
以下の実施例は、上述のように、本発明のｈＧＨ製剤の製剤のうち１つまたは複数の実施形態を例示している。以下で試験される本発明の各製剤では、ｈＧＨの組換え体であるソマトトロピンとした。以下の実施例で使用するソマトトロピンは、市販形態のジェノトロピン（登録商標）（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＆  ＵＰＪＯＨＮ  ＣＯＭＰＡＮＹ）に見いだされる同じｈＧＨタンパク質である。ジェノトロピン（登録商標）に関するそれ以上の情報については、Ｍｏｎｔｖａｌｅ、ＮＪでＴｈｏｍｐｓｏｎ  ＰＤＲによって出版されたＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版（２００３）を参照されたい。また、以下の実施例は、本発明のｈＧＨ製剤の物理的安定性を既知ｈＧＨ液体製剤の物理的安定性と比較している。
【００５２】
（実施例１）
既知ｈＧＨ液体製剤の物理的安定性
ソマトトロピンを使用し、米国特許第５，５６７，６７７号（Ｃａｓｔｅｎｓｓｏｎ他、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ  ＡＢに譲渡）に開示の水性ｈＧＨ製剤を調製した。ｈＧＨ製剤は、以下の組成：５ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ、５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、１２ｍＭグリシン、および２５０ｍＭマンニトールを有した。以下、この製剤を「ＣＧＭ」製剤と呼ぶ。
【００５３】
市販ｈＧＨ水性製剤、ニュートロピンＡＱ（登録商標）のバイアルを入手した。製品ラベルによれば、ニュートロピンＡＱ（登録商標）の組成は、５ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、８．７ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌ（０．２％）ポリソルベート２０、および２．５ｍｇ／ｍｌ（０．２５％）フェノールであった。この製剤の組成は、米国特許第５，７６３，３９４号にも開示されている。
【００５４】
市販ｈＧＨ水性製剤、ノルディトロピン（登録商標）のカートリッジも入手した。製品ラベルによれば、ノルディトロピン（登録商標）の組成は、３．３ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ、０．６７ｍｇ／ｍｌヒスチジン、４０ｍｇ／ｍｌマンニトール、３ｍｇ／ｍｌ（０．３％）ポロキサマー１８８、および３ｍｇ／ｍｌ（０．３％）フェノールであった。
【００５５】
上述の３種の製剤を、冷凍解凍事象および物理的撹拌が含まれる物理的ストレスに暴露した後の安定性について試験した。冷凍は、−２０℃の冷凍庫中で行い、続く解凍は、冷蔵庫中約５℃において行い、この過程を６回まで繰り返した。物理的撹拌試験は、２５０毎分回転数（「ＲＰＭ」）の機械的なシェーカープラットフォームを用い、約５℃で約２０時間行った。物理的撹拌試験は、輸送中に生じることがある厳しい撹拌条件をシミュレートするように設計した。製剤の安定性は、そのような各試験後に、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（以後、「ＳＥ−ＨＰＬＣ」）を用いるｈＧＨモノマー濃度アッセイにより評価した。９０％を超えるアッセイ値を許容可能と見なした。
【００５６】
ＣＧＭ製剤は、複数回の冷凍解凍事象への暴露後に安定であることが判明し、ｈＧＨモノマー濃度分析によって本質的に１００％のタンパク質が回収された。しかしながら、この製剤は、５℃における物理的撹拌への暴露には不安定であると判明した。撹拌後に、雲のような沈殿がバイアル中に生成し、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析によって１０％未満のタンパク質が溶液中に回収された。
【００５７】
対照的に、市販製剤は、物理的撹拌後に安定であるが、複数回の冷凍解凍事象への暴露後に不安定であることが判明した。具体的に、試験した両市販製剤は、５℃における強制撹拌後に透明のままであり、本質的に１００％のタンパク質が回収された。しかしながら、両市販製剤は、たった１回の冷凍解凍事象後に濁り、６回の冷凍解凍事象への暴露後のＳＥ−ＨＰＬＣ濃度分析により、約３０％のタンパク質のみが溶液中に見いだされた。
【００５８】
物理的撹拌かまたは６回の冷凍解凍事象への暴露後の３製剤についてのＳＥ−ＨＰＬＣ分析の結果のプロットを図１に見いだすことができる。これらの結果を以下の表Ｉに要約する。表Ｉおよび図１から分かるように、この実施例で試験した既知ｈＧＨ液体製剤のそれぞれは、ストレスが物理的撹拌によるか、あるいは冷凍および解凍への暴露によるかにかかわらず、少なくとも１つのタイプの物理的ストレスの条件下で不安定である。
【００５９】
【表１】
2007516274.tif 000003
【００６０】
（実施例２）
フェノール、ポリソルベート界面活性剤およびポリ（エチレン）グリコール（「ＰＥＧ」）を含む、ならびにポリソルベート界面活性剤およびポリ（エチレン）グリコール（「ＰＥＧ」）を含み、フェノールを含まないｈＧＨ液体製剤の物理的安定性
以下の表ＩＩに示すように、ソマトトロピン、エデト酸塩緩衝液、ポリソルベート界面活性剤、ＰＥＧ、および追加の添加剤を使って４種のｈＧＨ液体製剤を調製した。３濃度のｈＧＨ（１、５、および１０ｍｇ／ｍｌ）を初めの３製剤（それぞれ、製剤１、２、および３）に示し、４番目の製剤（製剤４）は、５ｍｇ／ｍｌのｈＧＨおよび保存剤としての０．３％フェノールを含有する。
【００６１】
【表２】
2007516274.tif 000004
【００６２】
実施例１と同様に、直前に記載のように調製した製剤を、６回の冷凍解凍への暴露後にＳＥ−ＨＰＬＣにより、物理的安定性について試験した。また、製剤を、ゲルコールドパックを用いて２℃〜８℃において冷蔵しながら、２市（Ｓｋｏｋｉｅ、ＩＬおよびＣｈｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ、ＭＯ）間で製剤を３回輸送することによる撹拌後に、物理的安定性について試験した。
【００６３】
上述の各物理的安定性試験後の各製剤のＳＥ−ＨＰＬＣ分析の結果を図２に例示する。試験した４製剤すべてについて９０％を超えるｈＧＨ回収率が得られ、冷凍解凍ならびに撹拌に対する極めて良好な物理的安定性を示した。冷凍解凍に対する良好な安定性は、実施例１に記載の試験した市販のフェノール含有ｈＧＨ液体製剤で観察された結果とは対照的に、フェノールが存在する場合にも得られた。フェノールは、組換えｈＧＨの凝集を促進することが知られている（Ｍａａ、Ｙｕｈ−Ｆｕｎ他、上記参照）という事実を考えれば、このことは意外であった。
【００６４】
やはり驚いたことに、撹拌に対する良好な安定性は、界面活性剤濃度が０．０６％である場合にも得られた。本実施例で試験したｈＧＨ製剤における界面活性剤のこの濃度は、実施例１で試験した２種の市販ｈＧＨ液体製剤における非イオン性界面活性剤の０．２〜０．３％という濃度よりかなり低い。この濃度は、米国特許第５，７６３，３９４号で請求の範囲に記載されている０．１〜１％の濃度範囲よりかなり低い。
【００６５】
（実施例３）
様々なポリソルベート界面活性剤および異なる分子量のＰＥＧを使って調製したｈＧＨ製剤の物理的および化学的安定性
以下の表ＩＩＩに記載のように、５ｍｇ／ｍｌソマトトロピン、クエン酸塩緩衝液、ポリソルベート界面活性剤、ＰＥＧポリマー、および追加の添加剤を含有するｈＧＨの４種の液体製剤（製剤５〜８）を調製した。各製剤のうち１つに、３種の異なる分子量のＰＥＧ（３３５０、８０００、および２００００）ならびに２種のＰＥＧ濃度（０．２５％および１％）を含めた。また、比較対照として、上記の実施例１に記載のように、製品ラベル上に示される処方に従って市販のニュートロピンＡＱ（登録商標）の模擬版を調製した。
【００６６】
【表３】
2007516274.tif 000005
【００６７】
実施例１と同様に、本実施例に記載のように調製した各製剤を、６回の冷凍解凍事象および強制撹拌ストレスへの暴露後に、ＳＥ−ＨＰＬＣによって物理的安定性について試験した。すべてのジェノトロピン（登録商標）製剤は、どちらのタイプの物理的ストレスを受けた後も、視覚的に透明のままであり、表ＩＩＩの製剤５〜８すべてについて、ＳＥ−ＨＰＬＣによって測定されるように、９０％を超えるｈＧＨ回収率が得られた。対照的に、ニュートロピンＡＱ（登録商標）の模擬版では、冷凍解凍事象後に目に見える曇りが観察され、平均して、約７０％に過ぎないｈＧＨモノマー回収率が得られた。
【００６８】
２℃〜８℃で６カ月間冷蔵保存した後、および２５℃で６週間保存した後に、また各製剤を陰イオン交換ＨＰＬＣ（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）により分析し、ｈＧＨタンパク質変異形の生成を評価した。ＡＥＸ−ＨＰＬＣによって検出されるｈＧＨ変異形の少なくとも一部は、治療上活性であることが知られていたが、この方法は、ｈＧＨの化学的安定性の相対的尺度を提供した。具体的に、このアッセイ方法は、脱アミド化分子種が含まれる経時的に生成するｈＧＨ変異形のレベルを測定することを可能にする。
【００６９】
ＡＥＸ−ＨＰＬＣアッセイの結果を図３に例示する。ここに示した結果は、ＡＥＸ−ＨＰＬＣが、各温度においてジェノトロピン製剤すべてについてｈＧＨ変異形の同様なレベルを検出したことを示している。変異形のレベルは、模擬ニュートロピンＡＱ（登録商標）製剤（図３における製剤Ｘ）で見いだされるレベルに比べ、製剤５〜８ではより低いレベルであった。これらの結果は、優れた物理的安定性は別にしても、既知ｈＧＨ液体製剤に比べて優れた化学的安定性を示している。また、このデータは、様々な分子量および濃度のＰＥＧポリマーを使用し、同様の化学的および物理的安定性を持つｈＧＨ液体製剤を製造できることを示している。
【００７０】
（実施例４）
ポリソルベート界面活性剤、ＰＥＧ、および様々な緩衝液を使って調製したｈＧＨ製剤の物理的および化学的安定性
以下の表ＩＶに記載のように、５ｍｇ／ｍｌソマトトロピン、様々な緩衝液、ポリソルベート界面活性剤、ＰＥＧポリマー、および追加の添加剤を含有する６種のｈＧＨ液体製剤（製剤９〜１４）を調製した。５０ｍＭ強度の６種の異なる緩衝液（クエン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、エデト酸塩、重炭酸塩およびヒスチジン）を使用し、ｐＨ６で各製剤のうち１つを調製した。
【００７１】
【表４】
2007516274.tif 000006
【００７２】
試験した６製剤はすべて、極めて良好な物理的安定性を有することが判明した。具体的に、６製剤はすべて、実施例２に記載の撹拌および６回の冷凍解凍事象への暴露後に安定であることが判明した。
【００７３】
６製剤をまた、５℃で１８週間保存した後に、ＡＥＸ−ＨＰＬＣを用いて化学的安定性について試験した。化学的安定性試験の結果を図４に例示する。図４に示されるように、化学的安定性に小さな差違が観察された。エデト酸塩緩衝液を使った製剤１２は、化学的安定性試験において最少数のｈＧＨ変異形を生じた。しかしながら、化学的安定性試験結果は、製剤すべてが同等であることを示し、様々な緩衝液を適当に使用し、上記の表ＩＶに記載したタイプの安定なｈＧＨ液体製剤を製造できることを示唆した。
【００７４】
（実施例５）
様々な等張化剤を含むｈＧＨ製剤の物理的安定性
以下の表Ｖに記載のように、５ｍｇ／ｍｌソマトトロピン、クエン酸塩緩衝液、および４種の異なる等張化剤（マンニトール、ソルビトール、スクロースおよびトレハロース）のうち１つを使って４種のｈＧＨ液体製剤（製剤１５〜１８）を調製した。ここで留意すべきは、本実施例で試験した４製剤のいずれも、ポリマー安定剤や非イオン性界面活性剤などの追加の安定剤を含有しなかったことである。
【００７５】
【表５】
2007516274.tif 000007
【００７６】
室温における（約２５℃における）２４時間の２５０ＲＰＭの機械的なシェーカーでの強制撹拌後に、４製剤すべてのサンプル中に目に見える粒子が観察された。図５は、強制撹拌ステップ後のタンパク質分析による、各製剤で観察されたパーセントｈＧＨ回収率のプロットである。マンニトールを含有する製剤（製剤１５）からのｈＧＨのパーセント回収率は約９０％と、追加の安定剤を一切含まない製剤として極めて良好な回収率であった。しかしながら、撹拌後の最高のｈＧＨ回収率（ほぼ１００％）は、ソルビトールを使って調製した製剤、製剤１６で得られた。この最終結果は、ソルビトールが、それ自体でｈＧＨに対する安定化効果を有し、ｈＧＨ液体製剤において使用するのに好ましい等張化剤であることを示唆している。
【００７７】
同様の化学的安定性は、上述のように、これら４種の等張化剤を使って調製した４種のｈＧＨ液体製剤セット間で観察された。
【００７８】
（実施例６）
０．１％未満の濃度の界面活性剤を含むｈＧＨ製剤の物理的安定性
以下の表ＶＩに記載のように、５種の異なるｈＧＨ液体製剤（製剤１９〜２３）を調製した。各製剤は、５ｍｇ／ｍｌソマトトロピン、クエン酸塩緩衝液、等張化剤（マンニトール）、および様々な濃度のポリソルベート２０（０、０．０２、０．０４、０．０６および０．０８％）を含有した。
【００７９】
【表６】
2007516274.tif 000008
【００８０】
実施例５と同様に、室温における強制撹拌後に、ｈＧＨの回収率をタンパク質吸光度分析によりモニターした。このアッセイの結果を図６に示す。図６に示されるように、０．０４％という低いポリソルベート濃度を含有する製剤（製剤２１）から１００％のタンパク質回収率が得られ、回収率の改善は、ポリソルベート濃度が０．０２％という低い製剤（製剤２０）でさえ観察された。
【００８１】
（実施例７）
アミノ酸安定剤としてメチオニンを含有するｈＧＨ液体製剤の化学的安定性
以下の表ＶＩＩに記載のように、液体ｈＧＨの４種の製剤、製剤２４〜２７を調製した。各製剤は、５ｍｇ／ｍｌジェノトロピン（登録商標）ｈＧＨタンパク質、ｐＨ６のクエン酸塩緩衝液、ポリソルベート界面活性剤、ソルビトール、およびＰＥＧを含有し、製剤のうち２種はさらにメチオニンを含有し、２種はメチオニンなしであった。
【００８２】
【表７】
2007516274.tif 000009
【００８３】
直前に記載の４製剤のそれぞれの化学的安定性を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって評価した。ＡＥＸ−ＨＰＬＣと同様、ＲＰ−ＨＰＬＣは、ｈＧＨタンパク質変異形の検出を可能にする。これらの変異形は、治療上活性であることが知られているが、この方法は、ｈＧＨ化学的安定性の相対的尺度を提供する。
【００８４】
図７は、化学的安定性分析の結果のプロットである。図７に示されるように、５℃において３１週後、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析は、メチオニンを含有するｈＧＨ製剤２６および２７が、メチオニンを有さない製剤２４および２５に比べて、低いレベルのタンパク質変異形を有することを示した。添加メチオニンの存在は、ＰＥＧを使わずに以前調製したｈＧＨ液体製剤に対して安定化効果を持たなかった。しかしながら、予想外に、メチオニンは、ＰＥＧポリマーが存在しない本実施例で試験したｈＧＨ液体製剤の化学的安定性を改善することが判明した。ｈＧＨ液体製剤をさらに安定化するため、本発明の製剤を他のアミノ酸安定剤（例えば、ヒスチジン、ロイシン、バリン、およびアスパラギン）と組み合わせることが可能であることが予想される。
【００８５】
（実施例８）
二価陽イオン安定剤としてマグネシウムを含有するｈＧＨ製剤の化学的安定性
以下の表ＶＩＩＩに記載のように、４種のｈＧＨ液体製剤（製剤２８〜３１）を調製した。各製剤は、５ｍｇ／ｍｌソマトトロピン、緩衝液、ポリソルベート界面活性剤、ポリマー安定剤、およびアミノ酸安定剤を含有した。製剤のうち２種（製剤２９および３１）は、マグネシウム試薬を含有し、他の２種（製剤２８および３０）は、マグネシウムを使わずに調製した。
【００８６】
【表８】
2007516274.tif 000010
【００８７】
製剤２８および２９を、２５℃で９週間保存した後にＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。製剤３０および３１を、２５℃で８週間保存した後に分析した。試験した両方の製剤のセットにおいて、マグネシウム試薬が存在する製剤（製剤２９および３１）において、より低いレベルのタンパク質変異形が観察され、マグネシウム存在下のｈＧＨ安定性の改善を示した。
【００８８】
これらの結果が意外であるのは、従来の開示が、ｈＧＨ製剤に対するマグネシウムの安定効果ではなくカルシウムおよび亜鉛の安定化効果について記載していたためである（米国特許第６，０２２，８５８号を参照）。本発明の製剤を、カルシウムや亜鉛イオンなどの他の二価陽イオンと適当に組み合わせることが可能であることが予想される。
【００８９】
（実施例９）
緩衝液、非イオン性界面活性剤、ポリマー安定剤および追加の添加剤を使って調製したｈＧＨ製剤の生物活性
上記の実施例３からの製剤５、６、および８を、欧州薬局方に準拠するｈＧＨのバイオアッセイ法を用い、別々の下垂体切除ラットに１日１回注射することによって２５℃で６週間保存した後の生物活性について試験した。対照として、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を注射した。この試験の結果は、図９に例示され、製剤が、保存時に十分な安定性を有する場合に予想される完全な生物活性を保持していたことを裏付けている。すべてのｈＧＨ製剤は、予想レベルのラットの成長をもたらしたが、対照製剤（ＰＢＳ）は、成長をもたらさなかった。
【００９０】
（実施例１０）
保存剤としてフェノールを含有するｈＧＨ製剤の抗菌効果
５ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ、１０ｍＭエデト酸ナトリウム緩衝液、０．０６％ポリソルベート２０、１％ＰＥＧ３３５０、０．３％フェノール、および追加の添加剤を含有する実施例２からの製剤４（表ＩＩを参照）を、２種の代表的微生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびクロカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ））に対する抗菌効果について試験した。製剤は、米国薬局方に記載の合格判定基準のとおりの十分な抗菌活性を有しており、抗菌活性を期待して、製剤に保存剤を場合によって添加できることを示した。
【００９１】
（実施例１１）
液体ジェノトロピン製剤の長期保存
以下の表ＩＸのとおり、５ｍｇ／ｍＬソマトトロピン、クエン酸塩またはエデト酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）、２５０ｍＭソルビトール、（０．０６％  ｗ／ｗ）ポリソルベート２０、（１％  ｗ／ｗ）ＰＥＧ３３５０ポリマー、１０ｍＭメチオニンを含有するｈＧＨの６種の液体製剤（製剤３２〜３７）を調製し、製剤の一部には、塩化マグネシウムが含まれ、一部は、保存剤としてフェノールを含有した。また、市販のニュートロピンＡＱ（登録商標）およびノルディトロピン（登録商標）の模擬版を、製品ラベル上に示される処方に従って調製した（ＹおよびＺ）。製品ラベルによれば、ニュートロピンＡＱ（登録商標）の組成は、５ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、８．７ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、２ｍｇ／ｍｌ（０．２％）ポリソルベート２０、および２．５ｍｇ／ｍｌ（０．２５％）フェノールであった。この製剤の組成は、米国特許第５，７６３，３９４号にも開示されている。製品ラベルによれば、ノルディトロピン（登録商標）の組成は、３．３ｍｇ／ｍｌ  ｈＧＨ、０．６７ｍｇ／ｍｌヒスチジン、４０ｍｇ／ｍｌマンニトール、３ｍｇ／ｍｌ（０．３％）ポロキサマー１８８、および３ｍｇ／ｍｌ（０．３％）フェノールであった。
【００９２】
【表９】
2007516274.tif 000011
【００９３】
上記の本実施例に記載のように調製した各製剤を、提起の保存条件（２〜８℃）に５３週間保った。サンプルを８、１６、２８および５３週目に分析した。各時点で、サンプルを、粒子の存在、色の変化、および透明度について視覚的に分析した。ｐＨ測定も行った。凝集体の存在をＳＥ−ＨＰＬＣによりモニターした。本実施例で試験したすべての製剤は、視覚的に透明、無色かつ粒子が認められないままであり、ｐＨの有意な変化を示さなかった。さらに、ＳＥ−ＨＰＬＣにより測定されるように、２〜８℃における５３週間保存を受けた後も、表ＩＸの製剤３２〜３７すべて、および本実施例で試験した比較対照すべてについて９９％を超えるｈＧＨ回収率が得られた。
【００９４】
各製剤を逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分析し、５３週間冷蔵保存（５℃）後のｈＧＨタンパク質変異形の生成を評価した。ＲＰ−ＨＰＬＣによって検出されるｈＧＨ変異形の少なくとも一部は、治療上活性であることが知られているが、この方法は、ｈＧＨ回収率の尺度を提供し、ｈＧＨパーセント純度の指標として使用することができる。
【００９５】
ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイの結果を図１１に例示する。そこに示される結果は、すべてのジェノトロピン製剤が、２〜８℃で５３週間保存した後に高いｈＧＨ回収率を報告したことを明らかに示している。製剤３３および３５（エデト酸塩緩衝液）は、最高の回収率を報告し、製剤３２および３４（クエン酸塩緩衝液）がそれに続いた。保存剤（０．３％フェノール）を含有するジェノトロピン製剤は、８６．９〜８７．３％の範囲の回収率を示した。対照的に、模擬比較対照製品（ニュートロピンＡＱ（登録商標）およびノルディトロピン（登録商標））は、８５．５〜８７．３％の範囲の回収率を示した。
【００９６】
また、各製剤を陰イオン交換ＨＰＬＣ（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）により分析し、５３週間冷蔵保存（５℃）後のｈＧＨタンパク質変異形の生成について評価した。この方法は、ｈＧＨの化学的安定性の良好な尺度を提供し、具体的に、このアッセイ法は、脱アミド化分子種を含む経時的に生成されるｈＧＨ変異形のレベルを測定することを可能にする。
【００９７】
ＡＥＸ−ＨＰＬＣアッセイの結果を図１２（総脱アミド化）および図１３（ｈＧＨ回収率）に例示する。そこに示される結果は、ＡＥＸ−ＨＰＬＣが、すべてのジェノトロピン製剤について、比較対照より低いか、あるいは同様のレベルのｈＧＨ変異形を検出したことを示している。変異形のレベルは、模擬ニュートロピンＡＱ（登録商標）およびノルディトロピン（登録商標）（図１２および１３における製剤ＹおよびＺ）で見いだされるレベルに比べ、製剤３２〜３５および３７においてより低値である。これらの結果は、ジェノトロピン製剤が、２種の既知市販ｈＧＨ液体製剤に比べ、優れた化学的安定性および物理的安定性を示すことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】実施例１に記載のように、６回の冷凍解凍事象に暴露される前および暴露された後にサイズ排除ＨＰＬＣ分析によって測定した、市販の液体ｈＧＨ製剤から回収されたｈＧＨのパーセントを示す棒グラフである。
【図２】実施例２に記載のように、冷凍解凍への暴露後、および輸送撹拌への暴露後にサイズ排除ＨＰＬＣ分析によって測定した、本発明の液体ｈＧＨ製剤から回収されたｈＧＨのパーセントを示す棒グラフである。
【図３】実施例３に記載のように、５℃で６カ月間保存した後、および２５℃で６週間保存した後に陰イオン交換ＨＰＬＣで測定した、本発明のｈＧＨ液体製剤から生成されたｈＧＨ変異形の総パーセントをこれまでの既知ｈＧＨ液体製剤と比較した棒グラフである。
【図４】実施例４に記載のように、５℃で１８週間保存した後に陰イオン交換ＨＰＬＣで測定した、様々な緩衝液を使って調製した本発明のｈＧＨ液体製剤からのｈＧＨ変異形の総パーセントの棒グラフである。
【図５】実施例５に記載のように、強制的な物理的撹拌への暴露後にタンパク質吸光度分析を用いて測定した、様々な等張化剤を使って調製したｈＧＨ液体製剤からのｈＧＨの総回収率の棒グラフである。
【図６】実施例６に記載のように、強制的な物理的撹拌への暴露後にタンパク質吸光度分析を用いて測定した、様々な濃度の非イオン性ポリソルベート界面活性剤を使って調製した製剤からのｈＧＨの総回収率の棒グラフである。
【図７】実施例６に記載のように、５℃で３１週間保存した後に逆相ＨＰＬＣを用いて測定した、メチオニンを使って、およびメチオニンなしで調製した本発明のｈＧＨ液体製剤から生成されたｈＧＨ変異形の総パーセントの棒グラフである。
【図８】実施例８に記載のように、５℃で約２カ月間保存した後に逆相ＨＰＬＣを用いて測定した、マグネシウム試薬を使って、およびマグネシウム試薬なしで調製した本発明のｈＧＨ液体製剤からのｈＧＨ変異形の総パーセントの棒グラフである。
【図９】ｈＧＨを含まないプラセボ対照溶液（「ＰＢＳ」）を注射したラットと比較した、この図に示すｈＧＨ液体製剤の連日注射をした後に下垂体切除ラットにおいて経時的に観察される累積的体重増加のプロットである。−□−は、実施例３の製剤６を表す。−△−は、実施例３の製剤５を表す。−◇−は、実施例３の製剤８を表す。−○−は、ＰＢＳ対照を表す。
【図１０】実施例１１に記載のように、５℃で約５３週間保存した後にサイズ排除ＨＰＬＣを用いて測定した、本発明のｈＧＨ液体製剤からのｈＧＨモノマーの総パーセントの棒グラフである。製剤３２〜３７は、本発明の製剤であり、ＹおよびＺは、それぞれ模擬ニュートロピンＡＱ（登録商標）およびノルディトロピンＳＩＭＰＬＥＸＸ（登録商標）製剤である。
【図１１】実施例１１に記載のように、５℃で約５３週間保存した後に逆相ＨＰＬＣを用いて測定した、本発明のｈＧＨ液体製剤からのｈＧＨの総パーセントの棒グラフである。製剤３２〜３７は、本発明の製剤であり、ＹおよびＺは、それぞれ模擬ニュートロピンＡＱ（登録商標）およびノルディトロピンＳＩＭＰＬＥＸＸ（登録商標）製剤である。
【図１２】実施例１１に記載のように、５℃で約５３週間保存した後に陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて測定した、本発明のｈＧＨ液体製剤からの脱アミド化ｈＧＨの総パーセントの棒グラフである。製剤３２〜３７は、本発明の製剤であり、ＹおよびＺは、それぞれ模擬ニュートロピンＡＱ（登録商標）およびノルディトロピンＳＩＭＰＬＥＸＸ（登録商標）製剤である。
【図１３】実施例１１に記載のように、５℃で約５３週間保存した後に陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて測定した、本発明のｈＧＨ液体製剤からのｈＧＨの総パーセントの棒グラフである。製剤３２〜３７は、本発明の製剤であり、ＹおよびＺは、それぞれ模擬ニュートロピンＡＱ（登録商標）およびノルディトロピンＳＩＭＰＬＥＸＸ（登録商標）製剤である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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