(57)【要約】  本発明は、ヒトにおけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα）の新規な標的遺伝子の同定、ならびに代謝異常を処置するかもしくはその処置をモニターすることにおけるおよび代謝異常を処置するために有用な化合物を同定することにおけるそれらの使用を特徴とする。
2007522803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプルにおけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子およびＰａ２１遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の発現レベルを決定する段階を含んでなる、被験体からの生物学的サンプルにおけるＰＰＡＲαの活性の決定方法。
【請求項２】
ａ．処置の間もしくは後の被験体におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３およびＰａ２１よりなる群から選択される遺伝子の発現レベルを決定する段階；および
ｂ．段階ａ）において決定される発現レベルを処置の前の被験体における該遺伝子の発現レベルと比較する段階；
を含んでなり、ここで、処置の間もしくは後の被験体における遺伝子の発現レベルの増加は、被験体における代謝異常の処置が有効であることを示す
被験体における代謝異常の処置の効果の評価方法。
【請求項３】
代謝異常が異常脂質血症もしくは異常脂質血症と関連する症状である請求項２の方法。
【請求項４】
代謝異常がアテローム性動脈硬化症、肥満症、血栓症もしくは冠動脈疾患、高血圧、アンギナ、慢性腎不全、末梢血管疾患、卒中、ＩＩ型糖尿病または代謝症候群（症候群Ｘ）である請求項２の方法。
【請求項５】
代謝異常の処置がペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα）の生物学的活性を調節することができる薬剤を包含する請求項２の方法。
【請求項６】
薬剤がＰＰＡＲαアゴニストである請求項５の方法。
【請求項７】
被験体における遺伝子の発現レベルが生物学的サンプルから決定される、被験体から生物学的サンプルを得る段階をさらに含んでなる請求項２の方法。
【請求項８】
被験体からの生物学的サンプルが末梢血単核細胞である請求項７の方法。
【請求項９】
被験体からの生物学的サンプルが脂肪組織、肝臓、心臓、腎臓もしくは筋肉からのものである請求項７の方法。
【請求項１０】
遺伝子の発現レベルが、被験体における遺伝子のｍＲＮＡの量を測定することにより決定される請求項２の方法。
【請求項１１】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１にハイブリダイズすることができる核酸プローブが、被験体におけるヒトＰａ９  ｍＲＮＡの量を測定するために使用される請求項１０の方法。
【請求項１２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：３にハイブリダイズすることができる核酸プローブが、被験体におけるＰａ１３  ｍＲＮＡの量を測定するために使用される請求項１０の方法。
【請求項１３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：５にハイブリダイズすることができる核酸プローブが、被験体におけるＰａ２１  ｍＲＮＡの量を測定するために使用される請求項１０の方法。
【請求項１４】
遺伝子の発現レベルが、被験体において遺伝子によりコードされるポリペプチドの量を測定することにより決定される請求項２の方法。
【請求項１５】
配列番号：２に特異的に結合することができる抗体が、被験体におけるヒトＰａ９タンパク質の量を測定するために使用される請求項１４の方法。
【請求項１６】
配列番号：４に特異的に結合することができる抗体が、被験体におけるＰａ１３タンパク質の量を測定するために使用される請求項１４の方法。
【請求項１７】
配列番号：６に特異的に結合することができる抗体が、被験体におけるＰａ２１タンパク質の量を測定するために使用される請求項１４の方法。
【請求項１８】
配列番号：１、配列番号：３および配列番号：５、もしくはその相補体よりなる群から選択される核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸プローブを含んでなる、被験体における代謝異常の処置の効果を評価するためのキット。
【請求項１９】
配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６よりなる群から選択されるポリペプチド分子に特異的に結合する抗体を含んでなる、被験体における代謝異常の処置の効果を評価するためのキット。
【請求項２０】
被験体における代謝異常の処置が有効であるかどうかを決定するための説明書をさらに含んでなる請求項１８および１９のキット。
【請求項２１】
ａ．ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子によりコードされるポリペプチドを緩衝剤および候補もしくは試験化合物を含んでなる溶液と接触させる段階；
ｂ．ポリペプチドの活性に対する試験化合物の効果を測定する段階；および
ｃ．段階（ｂ）の結果を、ポリペプチドを緩衝剤のみと接触させるコントロールの結果と比較する段階
を含んでなる被験体における代謝異常を処置するために有用な化合物の同定方法。
【請求項２２】
ポリペプチドが宿主細胞から発現される請求項２１の方法。
【請求項２３】
ポリペプチドが単離された膜調製物と関連する請求項２１の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドが精製される請求項２１の方法。
【請求項２５】
ａ．ＰＰＡＲα応答系を緩衝剤および候補もしくは試験化合物を含んでなる溶液と接触させる段階；
ｂ．ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列により制御される遺伝子の発現レベルをＰＰＡＲα応答系から測定する段階；および
ｃ．段階（ｂ）の結果を試験化合物を欠くコントロールの結果と比較する段階
を含んでなる被験体における代謝異常を処置するために有用である化合物の同定方法。
【請求項２６】
ＰＰＡＲα応答系が動物、組織もしくは細胞である請求項２５の方法。
【請求項２７】
ＰＰＡＲα応答系が機能性ＰＰＡＲαタンパク質およびヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列により制御される遺伝子を含んでなる請求項２５の方法。
【請求項２８】
機能性ＰＰＡＲαタンパク質がＰＰＡＲα応答系から内因的に発現される請求項２７の方法。
【請求項２９】
機能性ＰＰＡＲαタンパク質がＰＰＡＲα応答系に導入された外因的ＤＮＡ分子から組み換え的に発現される請求項２７の方法。
【請求項３０】
ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列により制御される遺伝子が、それぞれ、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子である請求項２７の方法。
【請求項３１】
ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列により制御される遺伝子がレポーター遺伝子である請求項２７の方法。
【請求項３２】
レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、β−グルクロニダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびグアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子よりなる群から選択される請求項３１の方法。
【請求項３３】
機能性ＰＰＡＲαタンパク質およびヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列に操作可能に連結されたレポーター遺伝子のコーディング配列を含んでなる核酸分子を含んでなるＰＰＡＲα応答系。
【請求項３４】
ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列に操作可能に連結されたレポーター遺伝子のコーディング配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項３５】
レポーター遺伝子が緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、β−グルクロニダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびグアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子よりなる群から選択される請求項３４の単離された核酸分子。
【請求項３６】
被験体からの細胞におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の遺伝子発現もしくは生物学的活性を改変する組成物の治療的に有効な量を被験体に投与する段階を含んでなり、ここで、組成物が既知のＰＰＡＲαアゴニストもしくはアンタゴニストではない、被験体における代謝異常の処置方法。
【請求項３７】
組成物が、被験体の細胞における分解のための、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡである請求項３６の方法。
【請求項３８】
組成物が、被験体の細胞においてヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子を発現することができる核酸分子である請求項３６の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝異常を処置するかもしくはその処置をモニターするための方法および組成物に関する。本発明は、また、代謝異常を処置するための化合物を同定するために有用な方法および組成物に関する。特に、本発明の方法は、３個のＰＰＡＲα標的遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満症、糖尿病、高血圧および高脂血症のような代謝異常は、大部分の工業化社会において大きな公衆衛生問題を提起する。これらの代謝異常は、個体を冠動脈疾患、卒中および他の心臓血管疾患にかかりやすくする。新生データは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）が脂質およびグルコース代謝における中心的存在であり、そして代謝異常に関与することを示唆する。
【０００３】
ＰＰＡＲは、核受容体スーパーファミリーに属するリガンド活性化転写因子である。活性化ＰＰＡＲは別の核受容体、レチノイドＸ受容体とヘテロダイマー化し、そして標的遺伝子の転写を改変する。活性化ＰＰＡＲは、標的遺伝子のプロモーターに位置するペルオキシソーム増殖因子応答配列（ＰＰＲＥ）として知られている特定のＤＮＡ配列に結合して転写開始率を上げる。これまでに同定された大部分のＰＰＲＥは、１ヌクレオチド間隔のあいた標準ＡＧＧＴＣＡ配列の直接反復からなる（非特許文献１）。３つのＰＰＡＲサブタイプが特性化されている：ＰＰＡＲα、δおよびγ。ＰＰＡＲα発現は、褐色脂肪組織、肝臓、心臓、腎臓および筋肉における細胞の間でより高いレベルで見られ、そこでそれは脂肪酸異化を調節する。ＰＰＡＲδは普遍的に発現され、そしてその機能は現在解明中である。ＰＰＡＲγは主に脂肪組織、結腸およびマクロファージに存在し、そして脂肪細胞分化、脂質貯蔵およびグルコース恒常性に関与する（非特許文献２）。
【０００４】
ＰＰＡＲのリガンドには、食物脂肪酸、および高脂血症もしくは２型糖尿病の処置において使用される多数の薬剤が包含される。例えば、一群の血清トリグリセリド低下薬、フィブレートは、ＰＰＡＲαの合成アゴニストである。フィブレートの例には、ジェムフィブロジル、ベザフィブレート、フェノフィブレート、クロフィブレートおよび新たに開発された微粉化フェノフィブレートが包含されるがこれらに限定されるものではない。ＰＰＡＲαの他の合成アゴニストには、ＧＷ２３３１、ＷＹ１４６４３およびＬ１６５０４１が包含されるがこれらに限定されるものではない（非特許文献３）。インシュリン感作薬群、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）は、高親和性ＰＰＡＲγアゴニストである。ＴＺＤの例には、アバンジア（ロシグリタゾン）およびレスリン（トログリタゾン）が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【０００５】
フィブレートのような、いくつかのＰＰＡＲαアゴニストの作用は、種特異的であるように思われる（非特許文献４）。げっ歯類において、フィブレートの投与は、ＨＤ（３−エノイルＣｏＡデヒドロゲナーゼ）、ＡＣＯＸ（アシルＣｏＡオキシダーゼ）およびＭＥ（リンゴ酸酵素）の遺伝子のような、脂質恒常性にとって重要である遺伝子を誘導する（非特許文献５）。これは、ＰＰＡＲαがげっ歯類におけるグルコースおよび脂質代謝の主要な標的組織、肝臓、脂肪細胞および骨格筋におけるβ酸化経路の構成的活性を維持することにおいて重要な役割を果たすことを示す、ＰＰＡＲαヌルマウスに関する研究と一致する（非特許文献６）。ヒトならびにモルモットおよびマーモセットのようないくつかの他の「非感受性」種において、フィブレートの投与は、げっ歯類においてフィブレートにより誘導される遺伝子の多くを誘導するように思われない（非特許文献７）。フィブレートによるペルオキシソーム脂肪酸酸化の調節は、ヒト肝細胞においてもしくはいくつかの他の「非感受性」種の肝臓において認められない。しかし、これらの「非感受性」動物は、フィブレートへの強力な脂質低下応答を示す。
【０００６】
ヒトにおいてＰＰＡＲαにより調節される新規な遺伝子を同定することは、ヒト患者におけるフィブレート処置の機序を理解することにとって重要である。新規なＰＰＡＲα標的遺伝子は、フィブレートおよび他のＰＰＡＲαアゴニストの活性を臨床的にモニターするために有益である。さらに、新規なＰＰＡＲα標的遺伝子は、代謝異常を処置するために有用である新規な化合物の迅速な同定および開発を促進する。さらに、新規なＰＰＡＲα標的遺伝子は、代謝異常の処置の新規な方法の開発を促進する。
【非特許文献１】Ｓｃｈｏｏｎｊａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１３０２：９３−１０９
【非特許文献２】Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ｓｕｐｒａ
【非特許文献３】Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．８１（３）：２１７−２５
【非特許文献４】Ｖｏｓｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ＆  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９５：４７−６２
【非特許文献５】Ｃａｓｔｅｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌｏ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６７５４−７５８
【非特許文献６】Ｌｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：７４７３−７４７８
【非特許文献７】Ｓｔａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：１−１４
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
今回、本明細書に示される遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１は、ヒトにおけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα）の標的遺伝子であることが見出された。
【０００８】
１つの一般的な態様として、従って、本発明は、被験体におけるＰＰＡＲαの生物学的活性を決定する方法を提供する。そのような方法は、被験体におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子およびＰａ２１遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の発現レベルを決定する段階を含んでなる。
【０００９】
別の一般的な態様として、本発明は、被験体における代謝異常の処置の効果を評価する方法を提供する。そのような方法は：ａ）処置の間もしくは後の被験体におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子およびＰａ２１遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の発現レベルを決定する段階；およびｂ）段階ａ）において決定される発現レベルを処置の前の被験体における該遺伝子の発現レベルと比較する段階を含んでなり；ここで、処置の間もしくは後の被験体における該遺伝子の発現レベルの増加は、被験体における代謝異常の処置が有効であることを示す。
【００１０】
本発明は、また、被験体における代謝異常の処置の効果を評価するためのキットも特徴とする。該キットは、配列番号：１、配列番号：３および配列番号：５、もしくはその相補体よりなる群から選択される核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸プローブを含むことができる。該キットはまた、配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６よりなる群から選択されるポリペプチド分子に特異的に結合する抗体を含むこともできる。該キットは、被験体における代謝異常の処置が有効であるかどうかを決定するための説明書をさらに含むことができる。
【００１１】
別の一般的な態様として、本発明は被験体における代謝異常を処置するために有用な化合物を同定する方法を提供する。そのような方法の１例は：ａ）ＰＰＡＲα応答系を緩衝剤および試験化合物を含んでなる溶液と接触させる段階；ｂ）ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列により制御される遺伝子の発現レベルをＰＰＡＲα応答系から測定する段階；およびｃ）段階（ｂ）の結果を、ＰＰＡＲα応答系を緩衝剤のみと接触させるコントロールの結果と比較する段階を含んでなる。そのような方法の別の例は：ａ）ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子によりコードされるポリペプチドを緩衝剤および候補もしくは試験化合物を含んでなる溶液と接触させる段階；ｂ）ポリペプチドの活性に対する試験化合物の効果を測定する段階；およびｃ）段階（ｂ）の結果を、ポリペプチドを緩衝剤のみと接触させるコントロールの結果と比較する段階を含んでなる。
【００１２】
本発明の別の一般的な態様は、被験体における代謝異常を処置する方法に関する。そのような方法は、被験体の細胞におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の遺伝子発現パターンもしくは生物学的活性を改変する組成物の治療有効量を被験体に投与する段階を含んでなる。
【００１３】
さらに別の一般的な態様として、本発明は、機能性ＰＰＡＲαタンパク質およびヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列に操作可能に連結されたレポーター遺伝子のコーディング配列を含んでなる核酸分子を含んでなるＰＰＡＲα応答系を提供する。また、本発明に包含されるのは、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列に操作可能に連結されたレポーター遺伝子のコーディング配列を含んでなる単離された核酸分子である。
【００１４】
本発明の他の態様、特徴および利点は、本発明の詳細な記述およびその好ましい態様ならびに添付の請求項を包含する、以下の開示から明らかである。
［発明の詳細な記述］
本明細書において用いる場合、「含んでなる」、「含有する」、「有する」および「包含する」という用語は、それらのオープンな（ｏｐｅｎ）、限定されない意味で使用される。
【００１５】
下記の事項は、本明細書において時々使用される略語である：
ｂｓ＝塩基対
ｃＤＮＡ＝相補的ＤＮＡ
Ｃ２０ｏｒｆ１３９＝第２０染色体オープンリーディングフレーム１３９
ＥＬＩＳＡ＝酵素免疫測定法
ＦＤＲＧ＝フィブリノーゲンドメイン関連タンパク質
ｋｂ＝キロ塩基；１０００塩基対
ｎｔ＝ヌクレオチド
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＰＢＭＣ＝末梢血単核細胞
ＰＣＲ＝ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＰＡＲα＝ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ
ＰＰＲＥ＝ペルオキシソーム増殖因子応答配列
ＲＴ  ＰＣＲ＝逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＳｉＲＮＡ＝低分子干渉ＲＮＡ
ＳＫＭＵ＝骨格筋
ＳＳＣ＝塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム
ＴＺＤ＝チアゾリジンジオン
ＵＴＲ＝非翻訳領域
ＷＡＴ＝白色脂肪組織
ポリペプチドもしくは核酸の「活性」、「生物学的活性」もしくは「機能活性」は、標準的な技術に従ってインビボもしくはインビトロで決定する場合にポリペプチドもしくは核酸分子によりもたらされる活性をさす。そのような活性は、第二のタンパク質との会合もしくはそれへの酵素活性のような直接的活性、または第二のタンパク質と該タンパク質との相互作用により媒介される細胞シグナリング活性のような間接的活性であることができる。
【００１６】
「生物学的サンプル」は、本明細書において用いる場合、被験体から単離される細胞もしくは生物学的液のような、細胞もしくは組織物質を含有するかもしくはそれからなるサンプルをさす。「被験体」は、処置、観察もしくは実験の対象である、ラット、マウス、サルもしくはヒトのような哺乳類であることができる。生物学的サンプルの例には、例えば、唾液、血液、血液細胞（例えば白血球）、羊水、血漿、精液、骨髄、組織もしくは細針生検サンプル、尿、腹水、胸膜液および細胞培養物が包含される。生物学的サンプルにはまた、組織学的目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を包含することもできる。
【００１７】
好ましい態様として、生物学的サンプルはヒト患者由来のサンプルである「臨床サンプル」である。生物学的サンプルはまた、「患者サンプル」と呼ばれることもできる。試験生物学的サンプルは、分析、モニタリングもしくは観察の対象である生物学的サンプルである。コントロール生物学的サンプルは、試験生物学的サンプルの陽性もしくは陰性コントロールのいずれかであることができる。コントロール生物学的サンプルは、試験生物学的サンプルのものと同じタイプの興味のある組織、細胞および生体液を含有することが多い。
【００１８】
「細胞」は、検出方法の感度に適切なような少なくとも１個の細胞もしくは複数の細胞をさす。本発明に適当な細胞は、細菌のものであることができるが、好ましくは真核生物のものであり、そして最も好ましくは哺乳類のものである。
【００１９】
「クローン」は、有糸分裂により単一の細胞もしくは共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系」は、複数世代にわたってインビトロにおける安定な増殖の能力がある初代細胞のクローンである。
【００２０】
「遺伝子」は、コーディング領域ならびにコーディング領域の前（「５’ＵＴＲ」）および後（「３’ＵＴＲ」）の非コーディング領域を包含する、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質を生産することに関与するＤＮＡのセグメントである。「遺伝子」にはまた、個々のコーディングセグメント（「エキソン」）間の介在非コーディング配列（「イントロン」）を包含することもできる。「プロモーター」は、遺伝子の転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するＤＮＡの調節配列をさす。プロモーターは、遺伝子の転写開始部位の上流（「５’」）にあることが多い。「調節配列」は、遺伝子の発現を制御することができる遺伝子の部分をさす。「調節配列」には、プロモーター、エンハンサーならびにポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位（細菌発現のための）および／もしくはオペレーターのような他の発現制御要素を包含することができる。「コーディング領域」は、トリプレット塩基コドンによってアミノ酸ならびに翻訳の開始および終止シグナルをコードする遺伝子の部分をさす。
【００２１】
「遺伝子発現マイクロアレイ分析」は、プローブオリゴヌクレオチドの「マイクロアレイ」を興味のある核酸サンプル、例えば特定の組織タイプからのポリＡ  ｍＲＮＡもしくはその逆転写産物のような、標的サンプルと接触させるアッセイをさす。例えば、Ｎｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ，１（２）：１５５−７５を参照。接触はハイブリダイゼーション条件下で行われ、そして結合していない核酸は除かれる。得られるハイブリダイズした核酸のパターンは、試験したサンプルの遺伝子プロフィールに関する情報を与える。遺伝子発現分析は、何千もの遺伝子の発現を同時に測定することができ、遺伝子相互作用および機能に関する詳細な情報を与える。遺伝子発現分析は様々な応用、例えば、遺伝子の発現を同定すること、遺伝子発現を特定の表現型に相関させること、疾病素因についてスクリーニングすることおよび毒性試験におけるような細胞遺伝子発現への特定の薬剤の効果を同定することにおいて用途を見出すことができる。「マイクロアレイ」は、本明細書において用いる場合、基質の表面上に空間的に分散し、そしてそれと安定に会合するかもしくはその上に固定される複数のポリマー分子を有する基質、例えばバイオチップもしくは遺伝子チップのような実質的に平面の基質をさす。典型的なマイクロアレイ形態には、オリゴヌクレオチドアレイおよびスポットアレイ（ｓｐｏｔｔｅｄ  ａｒｒａｙ）が包含される。遺伝子発現マイクロアレイ分析に関する方法は、当業者に既知である。例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ３（８）：５７９−８８による概説、もしくはＤＮＡマイクロアレイを用いる定量的遺伝子発現分析の方法を開示する米国特許第６，００４，７５５号を参照。
【００２２】
「ヒトＰａ９遺伝子」は、（１）配列番号：１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするか；（２）配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするか；または（３）配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質に対する抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に結合することができるタンパク質をコードする遺伝子をさす。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）に記述されているような、当該技術分野において既知である意味を有する。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、約４５℃６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）におけるハイブリダイゼーション、続いて５０〜６５℃で０．２ｘＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳにおける１回もしくはそれ以上の洗浄が包含される。「ヒトＰａ９遺伝子」には、ＵＳ６３４８３５０に記述されているヒトＮＬ２  ＴＩＥリガンドホモログポリペプチド遺伝子およびＷＯ０１７７１５１に記述されているヒトＦＤＲＧ遺伝子が包含される。典型的なヒトＰａ９遺伝子には、ヒトＰａ９の構造的および機能的多型の遺伝子が包含される。「多型」は、集団における個体間の特定の遺伝子座での１組の遺伝的バリアントをさす。
【００２３】
「単離された」核酸分子は、他の核酸分子から実質的に分離されているものである。「単離された」核酸分子は、例えば、該核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて該核酸分子にその５’及び３’末端で生来隣接するヌクレオチド配列の少なくとも１つを含まない核酸分子であることができる。単離された核酸分子には、他の配列から独立した別個の核酸分子（例えば、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されるｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡフラグメント）、ならびにベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス）または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに導入された以前に単離された核酸に導入される核酸分子が包含されるが、これらに限定されるものではない。さらに、単離された核酸分子には、ハイブリッドもしくは融合核酸分子の一部である核酸分子を包含することができる。
【００２４】
「単離された」もしくは「精製された」タンパク質もしくはその生物学的活性部分は、該タンパク質が由来する細胞もしくは組織源からの細胞物質もしくは他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成される場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という用語には、該タンパク質が単離されるかまたは組換え的に製造される細胞の細胞成分からそれが分離しているタンパク質の調製物が包含される。従って、細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％もしくは５％未満の異種タンパク質（本明細書において「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製物が包含される。１つの態様としてタンパク質もしくはその生物学的活性部分が組換え的に製造される場合、それはまた好ましくは培養培地も実質的に含まず、すなわち、培養培地はタンパク質調製物の容量の約２０％、１０％もしくは５％未満に相当する。タンパク質が化学合成により製造される場合、それは好ましくは化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まず、すなわち、それは該タンパク質の合成に関与する化学的前駆体もしくは他の化学物質から分離されている。従って、タンパク質のそのような調製物は、興味のあるポリペプチド以外の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％未満の化学的前駆体もしくは化合物を有する。単離された生物学的活性ポリペプチドは、いくつかの異なる物理的形態を有することができる。単離されたポリペプチドは、全長の新生すなわちプロセシングされていないポリペプチドとして、または部分的にプロセシングされたポリペプチドもしくはプロセシングされたポリペプチドの組み合わせとして存在することができる。全長の新生ポリペプチドは、全長の新生ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす特定のタンパク質分解切断事象により翻訳後修飾されることができる。フラグメントもしくはフラグメントの物理的会合は、全長ポリペプチドと関連する生物学的活性を有することができるが、しかしながら、個々のフラグメントと関連する生物学的活性の程度は異なることができる。
【００２５】
核酸プローブもしくは抗体のような標識された薬剤に関して、「標識された」という用語には、薬剤に検出可能な物質をカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）による薬剤の直接標識ならびに直接標識される別の試薬での薬剤の間接標識が包含されるものとする。直接検出可能である標識には、蛍光標識および放射性同位体が包含される。実例となる放射性同位体標識には、例えば、３５Ｓ、３２Ｐおよび３Ｈが包含される。好ましい蛍光剤は、約３００〜９００ｎｍ、より好ましくは約４００〜８００ｎｍにおける波長の光を吸収するものであり、そしてここで、吸収最大値は、好ましくは約５００〜８００ｎｍの間の波長である。個々に標識されるプライマーにおいて使用することができる典型的な蛍光剤には、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン染料などが包含される。蛍光剤は、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８６），３２１：６４７−６７９にさらに記述されている。間接標識の例には、蛍光標識した二次抗体を用いる一次抗体の検出、および蛍光標識したストレプトアビジンで検出することができるようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識などが包含される。標識された核酸分子に関して「末端標識される」は、標識部分が末端に少なくとも近位である領域に存在することを意味する。好ましい末端標識は、核酸分子の５’末端で該部分を有する。標識はまた、例えば酵素ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、３’末端であることもできる。
【００２６】
「Ｐａ１３遺伝子」は、（１）ヒトＰａ１３  ｃＤＮＡ（配列番号：３）に約６０％より大きいヌクレオチド配列同一性を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするか；（２）ヒトＰａ１３タンパク質（配列番号：４）に約６０％より大きいアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードするか；または（３）本明細書に記述されるヒトＰａ１３タンパク質に対する抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に結合することができるタンパク質をコードする遺伝子をさす。ヒト「Ｐａ１３遺伝子」には、ヒトＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質（Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．１２２（３）：６２２−６，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ＿Ｉｄ  Ｎｏ：ＢＡＡ１９１５１）が包含される。
【００２７】
「Ｐａ１３遺伝子」は、配列番号：３に約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５パーセントより大きいヌクレオチド配列同一性を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズすることができる。別の態様として、Ｐａ１３遺伝子は、配列番号：４に約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５パーセントより大きいアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする。典型的な「Ｐａ１３遺伝子」には、ヒトＰａ１３の構造的および機能的多型の遺伝子、ならびにラット、マウス、ブタ、イヌおよびサルを包含する他の動物におけるそのオーソログが包含される。
【００２８】
「Ｐａ２１遺伝子」は、（１）ヒトＰａ２１  ｃＤＮＡ（配列番号：５）に約６０％より大きいヌクレオチド配列同一性を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするか；（２）ヒトＰａ２１タンパク質（配列番号：６）に約６０％より大きいアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードするか；または（３）本明細書に記述されるヒトＰａ２１タンパク質に対する抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に結合することができるタンパク質をコードする遺伝子をさす。ヒト「Ｐａ２１遺伝子」には、ヒトＣ２０ｏｒｆ１３９遺伝子（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｄｅｃ  ２４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ；９９（２６）：１６８９９−９０３．Ｅｐｕｂ  ２００２  Ｄｅｃ  １１．，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ＿Ｉｄ  Ｎｏ：ＮＰ＿５４２７６３）が包含される。
【００２９】
「Ｐａ２１遺伝子」は、配列番号：５に約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５パーセントより大きいヌクレオチド配列同一性を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズすることができる。別の態様として、「Ｐａ２１遺伝子」は、配列番号：６に約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５パーセントより大きいアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードする。典型的な「Ｐａ２１遺伝子」には、ヒトＰａ２１の構造的および機能的多型の遺伝子、ならびにラット、マウス、ブタ、イヌおよびサルを包含する他の動物におけるそのオーソログが包含される。
【００３０】
本明細書において用いる場合、「ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ」もしくは「ＰＰＡＲα」は：（１）ヒトＰＰＡＲαタンパク質（Ｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３２（２１）：５５９８−６０４，ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ＿ＩＤ  Ｎｏ：ＮＰ＿００５０２７）に約６０％より大きいアミノ酸配列同一性を有するか；（２）本明細書に記述されるヒトＰＰＡＲαタンパク質に対する抗体、例えばポリクローナルもしくはモノクローナル抗体に結合することができるか；または（３）ヒトＰＰＡＲα  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋヌクレオチド受託番号：ＮＭ＿００５０３６）に約６０％より大きいヌクレオチド配列同一性を有する配列を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドをさす。
【００３１】
「ＰＰＡＲα」は、ヒトＰＰＡＲαタンパク質に約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５パーセントより大きいアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであることができる。別の態様として、「ＰＰＡＲα」は、ヒトＰＰＡＲα  ｃＤＮＡに約６５、７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５パーセントより大きいヌクレオチド配列同一性を有する配列を有する核酸分子にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである。典型的な「ＰＰＡＲα」タンパク質には、ヒトＰＰＡＲαタンパク質の構造的および機能的多型、ならびにラット、マウス、ブタ、イヌおよびサルを包含する他の動物におけるＰＰＡＲαオーソログが包含される。「機能性ＰＰＡＲα」は、食物脂肪酸、フィブレートもしくは他のＰＰＡＲαアゴニストに結合した際に、本明細書に開示されるようなＰａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１を包含する多数の標的遺伝子の転写を活性化することのような、ＰＰＡＲαの生物学的活性を維持するＰＰＡＲαタンパク質の全長もしくは任意のフラグメントをさす。
【００３２】
「ＰＰＡＲα標的遺伝子」もしくは「ＰＰＡＲαの標的遺伝子」という用語は、その発現がＰＰＡＲαにより調節される任意の種類および起源の遺伝子を含んでなる。そのような遺伝子の例は、げっ歯類における脂肪酸アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−エノイルＣｏ−Ａデヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸酵素、ならびに本明細書に記述されるＰａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１遺伝子である。特に、「ＰＰＡＲα標的遺伝子」という用語は、そのプロモーター配列およびさらに特にそのＰＰＡＲα結合配列、例えばペルオキシソーム増殖因子応答配列（ＰＰＲＥ）を含んでなる。標的遺伝子は、任意のＤＮＡ構造で存在することができる。それらは細胞に存在するか、もしくは単離された形で存在することができる。標的遺伝子はまた、さらなる配列と、特にレポータータンパク質をコードするものと連結して存在することもできる。
【００３３】
「組み換え宿主細胞」は、外来ＤＮＡ配列により形質転換されているかもしくはトランスフェクションされている細胞である。本明細書において用いる場合、細胞は、原核細胞もしくは真核細胞にＤＮＡを運ぶことが既知である様々な技術のいずれかを用いてそのような外来ＤＮＡが細胞に導入されている場合に外来ＤＮＡにより「形質転換」されている。外来ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組込まれる（共有結合される）かもしくはそうされない可能性がある。例えば、外来ＤＮＡは、プラスミドのようなエピソーム要素上で維持されることができる。あるいはまた、安定に形質転換されるかもしくはトランスフェクションされた細胞に関して、外来ＤＮＡはそれが染色体複製によって娘細胞により継承されるように染色体に組込まれるようになっている。この安定性は、外来ＤＮＡを含有する娘細胞の集団を含んでなる細胞系もしくはクローンを樹立する安定に形質転換されるかもしくはトランスフェクションされた細胞の能力により示される。組み換え宿主細胞は、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような細菌、酵母のような真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類由来の細胞系を包含する哺乳類細胞、ならびにショウジョウバエおよびカイコ由来の細胞系のような昆虫細胞を包含する、原核生物もしくは真核生物のものであることができる。さらに、「組み換え宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫もしくは潜在的子孫もさすと理解される。突然変異もしくは環境的影響のいずれかのために後の世代においてある種の改変が起こることができるので、そのような子孫は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、それでもなお本明細書に用いる場合に該用語の範囲内に包含される。
【００３４】
「配列」は、モノマーがポリマーにおいて存在する線形順序、例えば、ポリペプチドにおけるアミノ酸の順序もしくはポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を意味する。
【００３５】
「配列同一性もしくは類似性」は、当該技術分野において既知であるように、配列を比較することにより決定されるような、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」はまた、場合により、一続きのそのような配列間の一致により決定されるような、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。
【００３６】
２つのアミノ酸配列のもしくは２つの核酸の同一性もしくは類似性パーセントを決定するために、それらの配列を最適比較目的のために整列させる（例えば、第二のアミノ酸もしくは核酸配列との最適なアライメントのために第一のアミノ酸もしくは核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置もしくはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを比較する。第一の配列におけるある位置が第二の配列における対応する位置と同じもしくは類似するアミノ酸残基もしくはヌクレオチドで占められる場合、それらの分子はその位置で同一であるかもしくは類似する。２つの配列間の同一性もしくは類似性パーセントは、それらの配列により共有される同一もしくは類似位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）ｘ１００）。１つの態様として、２つの配列は同じ長さである。
【００３７】
同一性および類似性は両方とも、容易に計算することができる。同一性パーセントを計算する際には、完全な一致のみを計数する。配列間の同一性もしくは類似性を決定するために一般に用いられる方法には、例えば、Ｃａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３に開示されるものが包含される。同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列間の最大の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムに体系化される。
【００３８】
２つの配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの例は、Ｋａｒｌｉｎｅｔ  ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７におけるように改変された、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに導入される。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に記述されているように利用することができる。あるいはまた、反復検索を行うためにＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いることができ、それは分子間の遠い関係を検出する。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。さらに、同様に用いることができるＦＡＳＴＡ法（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３）がある。
【００３９】
配列の比較のために有用な数学アルゴリズムの別の例は、Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１），３８７）の一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に導入される。
【００４０】
「実質的に同様の」という用語は、本明細書において用いる場合、同一配列ならびに任意の生物学的活性部分を維持しそしてその保存モチーフのいずれかを保有する改変配列をもたらすそれへの欠失、置換もしくは付加を含むポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列をさす。
【００４１】
「治療的に有効な量」という用語は、本明細書において用いる場合、処置している疾病もしくは疾患の症状の軽減を包含する、研究者、獣医、医師もしくは他の臨床医により求められている組織系、動物もしくはヒトにおける生物学的もしくは薬剤応答を引き出す活性化合物もしくは製薬学的薬剤の量を意味する。本発明の製薬学的組成物の治療的に有効な用量を決定する方法は、当該技術分野において既知である。
【００４２】
「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を運ぶことができる核酸分子をさす。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは追加のＤＮＡセグメントをその中に挿入することができる環状二本鎖ＤＮＡループをさす。別のタイプのベクターは、追加のＤＮＡセグメントを挿入することができるウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞への導入の際に宿主細胞のゲノムに組込まれ、そして宿主ゲノムと一緒に複製される。さらに、発現ベクターのようなある種のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を導くことができる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用なベクターは、プラスミドの形態であることが多い。しかしながら、本発明には、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような、他の形態のベクターも包含されるものとする。
代謝異常の処置の効果を評価する方法
１つの一般的な態様として、本発明は被験体におけるＰＰＡＲαの生物学的活性を決定する方法を提供する。そのような方法は、被験体におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子およびＰａ２１遺伝子よりなる群から選択される遺伝子の発現レベルを決定する段階を含んでなる。
【００４３】
本発明は、代謝異常の処置の効果を被験体において評価する方法を提供する。代謝異常は、アテローム性動脈硬化症、肥満症、血栓症もしくは冠動脈疾患、高血圧、アンギナ、慢性腎不全、末梢血管疾患、卒中、ＩＩ型糖尿病、グルコース寛容減損（ＩＧＴ）および代謝症候群（症候群Ｘ）のような、異常脂質血症もしくは異常脂質血症と関連する症状であることができる。
【００４４】
好ましい態様として、本発明の方法は、ＰＰＡＲαアゴニストもしくはモジュレーターを伴う処置の効果を評価するために用いることができる。ＰＰＡＲαアゴニストの例には、ジェムフィブロジル、ベザフィブレート、フェノフィブレート、クロフィブレート、微粉化フェノフィブレート、ＧＷ２３３１、ＷＹ１４６４３、Ｌ１６５０４１、およびその誘導体が包含されるがこれらに限定されるものではない。
【００４５】
被験体におけるＰａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１から選択されるＰＰＡＲα標的遺伝子の発現レベルを決定するために被験体から採取した生物学的サンプルを用いることができる。例えば、針生検によって、生物学的サンプルを得るために当業者に既知である任意の適当な方法を用いることができる。例えば、生物学的サンプルは、ＰＰＡＲα発現が濃縮される、褐色脂肪組織、肝臓、心臓、腎臓もしくは筋肉から得ることができる。生物学的サンプルはまた、脂肪組織もしくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得ることもできる。
【００４６】
ある態様として、ＰＰＡＲα標的遺伝子の発現レベルは、遺伝子のｍＲＮＡ量を測定することにより決定することができる。生物学的サンプルにおける特定の遺伝子のｍＲＮＡの量は、多数の技術を用いて測定することができる。例えば、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを特異的に検出することができる化合物もしくは薬剤と生物学的サンプルを接触させることにより測定することができる。ｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズすることができる標識核酸プローブが使用されることが多い。例えば、ヒトＰａ９  ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブは、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する全長ヒトＰａ９  ｃＤＮＡ、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でヒトＰａ９  ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる長さが少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０もしくは５００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドのような、その一部であることができる。ストリンジェントな条件下で、ヒトＰａ９  ｍＲＮＡに特異的な核酸プローブは、このｍＲＮＡにハイブリダイズするだけであるが、生物学的サンプルに存在する他のｍＲＮＡ種にハイブリダイズしない。本発明に有用な核酸プローブには、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、３もしくは５にハイブリダイズすることができるものが包含される。
【００４７】
生物学的サンプルにおける特定の遺伝子からのｍＲＮＡの量を決定するための別の技術は、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）である。遺伝子、例えばヒトＰａ９遺伝子からの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写によってサンプルから調製することができる。このｃＤＮＡは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＰａ９  ｃＤＮＡにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＣＲによって増幅することができる。ＲＴ−ＰＣＲを容易にするキットは市販されている、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）からの「ワンステップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス試薬」キット。
【００４８】
何十年にもわたって、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、細胞もしくは組織の特定のコンパートメント内のｍＲＮＡの分布および発現を研究するために広く使用されている。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに使用される核酸プローブのタイプには、様々な長さの一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖ＲＮＡプローブ（リボプローブ）もしくは二本鎖ｃＤＮＡ配列が包含される。プローブは、任意の既知の発現される核酸配列に対して特異的に設計することができる。ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて使用することができる多数の異なる放射性同位体および非同位体標識が市販されている。ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法の概説には、ＭｃＮｉｃｏｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７），Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １８２（３）：２５０−６１を参照。生物学的サンプルにおける特定の遺伝子からのｍＲＮＡの量を決定するための他の有用な技術には、ＤＮＡマイクロアレイ分析、ドット−ブロッティングおよびノーザンハイブリダイゼーションが包含される。
【００４９】
ある態様として、生物学的サンプルにおけるＰＰＡＲα標的遺伝子の発現レベルは、該遺伝子によりコードされるポリペプチドの量を測定することにより決定することができる。生物学的サンプルにおけるタンパク質の量は、該タンパク質を特異的に検出することができる化合物もしくは薬剤と生物学的サンプルを接触させることにより測定することができる。例えば、ヒトＰａ９タンパク質を検出するための好ましい薬剤は、該ポリペプチドの一部に特異的に結合することができる抗体である。１つの好ましい方法として、検出可能な標識に結合したヒトＰａ９タンパク質に特異的な抗体が、ヒトＰａ９タンパク質の検出に用いられる。抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルであることができる。全抗体分子もしくはそのフラグメント（例えば、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ’）２）を用いることができる。抗体は、専門の研究所を通して利用可能である。例えば、Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１タンパク質に特異的な合成ペプチド配列に対する抗体は、比較的短い時間スケール内で開発されることができ、興味のあるこれらの標的を研究することに関してより大きい柔軟性度を可能にする。
【００５０】
Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１タンパク質のようなポリペプチドの検出の技術には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光、ならびに免疫組織化学が包含される。これらの方法を行うための詳細は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９８９）に見出されることができる。
【００５１】
さらに、生体ヒト臓器におけるＰＰＡＲα標的遺伝子の発現レベルは、ポジトロンエミッション断層撮影（ＰＥＴ）画像化（Ｓｅｄｖａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｅｒ．，５：２７−３３）のような定量的非侵襲性手段により決定することができる。例えば、微量のＰａ９タンパク質結合放射性トレーサーを被験体に静脈内注射することができ、そして被験体の褐色脂肪組織、肝臓、心臓、腎臓、筋肉もしくは他の組織における放射性標識の分布を撮像することができる。ＰＥＴ画像化ならびに他の定量的非侵襲性画像化手段の方法は、当業者に既知である（Ｐａｓｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７：２７８による概説を参照）。
【００５２】
通常は最適化プロトコルと一緒に、ＰＰＡＲα標的遺伝子の発現レベルの検出に必要な全ての試薬が含まれる完全なアッセイキットを利用可能にすることができる。
被験体における代謝異常の処置の効果を決定するためのキット
従って、本発明はまた、被験体における代謝異常の処置の効果を測定するためのキットも特徴とする。そのようなキットは、好ましくは、少なくとも１つの容器を密接に閉じ込めて保持するために適当な区分化された担体を含んでなる。担体は、生物学的サンプルにおけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子のポリペプチドもしくはｍＲＮＡを検出することができる試薬およびサンプルにおけるポリペプチドもしくはｍＲＮＡの量を決定するための手段（例えば、酵素もしくは基質）をさらに含んでなる。キットはまた、アッセイしそして含まれる試験サンプルと比較することができるコントロールサンプルもしくは一連のコントロールサンプルを含有することもできる。キットの各成分は、個々の容器内に封入することができ、そして様々な容器の全ては、被験体における代謝異常の処置が有効であるかどうかを決定するための説明書と一緒に単一のパッケージ内にある。
【００５３】
抗体に基づくキットでは、該キットは、例えば：（１）Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１の遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合する一次抗体（例えば、固体支持体に結合した抗体）；および場合により；（２）ポリペプチドもしくは一次抗体のいずれかに結合しそして検出可能な薬剤に結合している第二の異なる抗体；および（３）陽性コントロールとしてＰａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１の遺伝子によりコードされる実質的に精製されたポリペプチドを含んでなることができる。例えば、抗体に基づくキットは、配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：６のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含んでなることができる。抗体はポリクローナルもしくはモノクローナルであることができる。抗体を開発するために当業者に既知である任意の適当な方法を用いることができる。
【００５４】
オリゴヌクレオチドに基づくキットでは、該キットは、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１のｍＲＮＡにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、例えば標識オリゴヌクレオチドを含んでなることができる。例えば、キットは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、配列番号：２もしくは配列番号：３の配列またはその相補体にハイブリダイズする標識オリゴヌクレオチドを含んでなることができる。あるいはまた、キットは、遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１のｍＲＮＡからの核酸分子の逆転写および増幅に有用な１対のプライマーを含んでなることができる。例えば、キットは配列番号：１、配列番号：２もしくは配列番号：３から核酸分子を増幅するために有用な１対のプライマーを含んでなることができる。
【００５５】
ＰＰＡＲαの新規な標的遺伝子としての遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１の同定はまた、化合物を代謝障害を処置することにおけるそれらの潜在的効能について同定するための新規なスクリーニング方法もしくはアッセイの開発も可能にする。
代謝異常を処置するために有用な化合物を同定する方法
本発明の一般的な態様は、被験体における代謝異常を処置するために有用な化合物を同定する方法に関する。そのような方法は、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の遺伝子発現レベルまたはヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子によりコードされるポリペプチドの生物学的活性のいずれかを改変する化合物の同定を含む。
【００５６】
化合物同定方法は、通常の実験室フォーマットを用いてもしくはハイスループットに適応したアッセイにおいて行われることができる。「ハイスループット」という用語は、同時に多数のサンプルの容易なスクリーニングを可能にするアッセイ設計をさし、そしてロボット操作の能力を包含することができる。ハイスループットアッセイの別の望ましい特徴は、所望の分析を行うために試薬の使用を減らすかもしくは操作の数を最小限にするように最適化されるアッセイ設計である。アッセイフォーマットの例には、９６ウェルもしくは３８４ウェルプレート、浮揚液滴および液体処理実験に試用される「ラボ・オン・チップ」マイクロチャンネルチップが包含される。当業者により知られているように、プラスチック金型および液体処理装置の小型化が進むにつれて、もしくは改善されたアッセイ装置が設計されるにつれて、より多数のサンプルが本発明のアッセイを用いてより効率よくスクリーニングされることができる。
【００５７】
スクリーニングの候補化合物は多数の化学分類から、好ましくは有機化合物の類から選択することができる。候補化合物は高分子であることができるが、好ましくは、候補化合物は小分子有機化合物、すなわち、５０より大きくそして２５００未満の分子量を有するものである。候補化合物は、ポリペプチドとの構造的相互作用に必要な１つもしくはそれ以上の官能性化学基を有する。好ましい候補化合物は、少なくとも１つのアミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２つのそのような官能基、そしてより好ましくは少なくとも３つのそのような官能基を有する。候補化合物は、上記に例示する官能基の１つもしくはそれ以上で置換された環状炭素もしくは複素環式構造部分および／または芳香族もしくは多環芳香族構造部分を含んでなることができる。候補化合物はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記の誘導体もしくは構造的アナログ、またはその組み合わせなどのような生体分子であることもできる。化合物が核酸である場合、非天然の結合もしくはサブユニットを有する改変された核酸もまた意図されるが、化合物は好ましくはＤＮＡもしくはＲＮＡ分子である。
【００５８】
候補化合物は、合成もしくは天然化合物のライブラリーを包含する様々な供給源から得ることができる。例えば、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機組み合わせライブラリー、ランダムペプチドのファージディスプレイライブラリーなどを包含する、様々な有機化合物および生体分子のランダムおよび指示された（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）合成に多数の手段が利用可能である。候補化合物はまた、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な並行固相もしくは液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および親和性クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（例えば、Ｌａｍ（１９９７），Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５を参照）、当該技術分野において既知である組み合わせライブラリー法における多数の方法のいずれかを用いて得ることもできる。あるいはまた、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが利用可能であり、もしくは日常的に製造することができる。さらに、天然および合成的に製造されたライブラリーおよび化合物は、通常の化学的、物理的および生化学的手段によって日常的に改変することができる。
【００５９】
さらに、既知の薬理学的薬剤は、薬剤の構造的アナログを製造するためにアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などのような選択的もしくはランダム化学修飾を受けることができる。候補化合物は、ランダムに選択することができ、またはＰＰＡＲα活性に結合しそして／もしくはその機能を調節する既存の化合物に基づくことができる。例えば、候補薬剤の供給源は、ＰＰＡＲαの既知のアクチベーターもしくはインヒビターに基づく分子のライブラリーであることができ、ここで、化合物の構造は、より多くのもしくはより少ない化学部分または異なる化学部分を含有するように分子の１つもしくはそれ以上の位置で変えられる。アナログアクチベーター／インヒビターのライブラリーを作製する際に分子に加えられる構造的変化は、選択的、ランダム、または選択的およびランダム置換および／もしくは付加の両方の組み合わせであることができる。
【００６０】
様々な他の試薬もまた混合物に含むことができる。これらには、最適なタンパク質−タンパク質および／もしくはタンパク質−核酸結合を促進するために用いることができる塩、緩衝剤、中性タンパク質（例えばアルブミン）および洗剤のような試薬が包含される。そのような試薬はまた、反応成分の非特異的なもしくはバックグラウンド相互作用を減少することもできる。ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などのような、アッセイの効率を向上する他の試薬もまた用いることができる。
【００６１】
分子ライブラリーの合成の方法の例は、当該技術分野において、例えば：Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），Ｊ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８に見出されることができる。化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、またはビーズ（Ｌａｍ（１９９１），Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３），Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）もしくはファージ（例えば、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（１９９０），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０を参照）上に提示されることができる。
【００６２】
１つの態様として、本発明は：ａ）ＰＰＡＲα応答系を緩衝剤および試験化合物を含んでなる溶液と接触させる段階；ｂ）ＰＰＡＲα応答系からヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列により制御される遺伝子の発現レベルを測定する段階；および場合により段階（ｂ）の結果をＰＰＡＲα応答系が試験化合物の不在下で測定されるコントロールの結果と比較する段階を含んでなる、被験体における代謝異常を処置するために有用な化合物を同定する方法を提供する。
【００６３】
代謝障害を処置するために有用な同定される化合物には、ＰＰＡＲα応答系からのヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の遺伝子発現を増加するかもしくは減少することができる任意の化合物が包含される。例えば、化合物はＰＰＡＲα応答系におけるＰＰＡＲαに結合し、そして直接ＰＰＡＲαの生物学的活性を調節することができ、ＰＰＡＲα応答系からのヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の増加したもしくは減少した発現をもたらす。化合物はまた、ＰＰＡＲα応答系におけるＰＰＡＲαと相互作用する細胞成分に結合し、そして間接的にＰＰＡＲαと関連する生物学的活性を調節することもでき、ＰＰＡＲα応答系からのヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の増加したもしくは減少した発現をもたらす。化合物はさらに、ＰＰＡＲαの生物学的活性から独立している機序によって、ＰＰＡＲα応答系からのヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の発現を増加するかもしくは減少することができる。
【００６４】
「ＰＰＡＲα応答系」は、その最も広い意味において用いる場合、例えばＰＰＡＲαアゴニストを使用する場合のような、ＰＰＡＲα遺伝子の刺激に応答する単一細胞、組織、および哺乳類のような複雑な多細胞生物をさす。好ましい態様として、ＰＰＡＲα応答系は、機能性ＰＰＡＲαタンパク質ならびにＰａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１遺伝子よりなる群から選択される少なくとも１つのＰＰＡＲα標的遺伝子を含んでなる動物、組織もしくは細胞である。ＰＰＡＲα応答系は、内因性ＰＰＡＲαおよび内因性ＰＰＡＲα標的遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１の天然の宿主であることができる。例えば、ヒト肝細胞ＨｕＨ７細胞、ヒト初代脂肪細胞およびヒト初代骨格筋細胞（ＳＫＭＣ）は全て、本発明において用いることができる天然のＰＰＡＲα応答系である。ＰＰＡＲα応答系はまた、ＰＰＡＲαの組み換え宿主細胞であることもできる。組み換えＰＰＡＲαを有するそのようなＰＰＡＲα応答系を得るために当業者に既知である任意の適当な方法を用いることができる。例えば、ＰＰＡＲα応答系は、機能性ＰＰＡＲαタンパク質をコードする外来ＤＮＡを少なくとも１つの内因性ＰＰＡＲα標的遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１の天然の宿主細胞に導入することにより構築することができる。そのようなＰＰＡＲα応答系からのＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の発現レベルは、上記の方法を用いてＰＰＡＲα応答系から該遺伝子のｍＲＮＡもしくはタンパク質の量のいずれかにより測定することができる。
【００６５】
別の態様として、ＰＰＡＲα応答系は、機能性ＰＰＡＲαタンパク質およびヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列に操作可能に連結されたレポーター遺伝子のコーディング配列を含んでなる核酸分子を含んでなる。そのような系は、ＰＰＡＲαモジュレーターに応答したレポーター遺伝子の転写調節を可能にする。従って、ＰＰＡＲα標的遺伝子の発現レベルは、レポーター活性によって間接的に測定することができる。例えば、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合、ＰＰＡＲα標的遺伝子の発現レベルは、ＰＰＡＲα応答系からの生物発光の量として測定することができる。他のレポーター遺伝子には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、β−グルクロニダーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼおよびグアニンキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼが包含されるが、これらに限定されるものではない。レポーターの生物学的活性は、容易に測定することができる。レポーター活性の測定を容易にするためにキットが市販されている。
【００６６】
ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列に操作可能に連結されたレポーター遺伝子のコーディング配列を含んでなる核酸を構築するために当業者に既知である任意の適当な方法を用いることができる。ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の調節配列には、それぞれ、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の遺伝子発現と生来関連しそしてそれを制御する任意のヌクレオチド配列が包含される。好ましくは、調節配列は１つもしくはそれ以上の潜在的ＰＰＲＥを含んでなる。例えば、配列番号：１９のヌクレオチド配列もしくはその一部は、ヒトＰａ１３遺伝子の調節配列を表し；そして配列番号：２０のヌクレオチド配列もしくはその一部は、ヒトＰａ２１遺伝子の調節配列を表す。
【００６７】
別の態様として、本発明は：ａ）ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子によりコードされるポリペプチドを緩衝剤および試験化合物を含んでなる溶液と接触させる段階；ｂ）ポリペプチドの活性への試験化合物の効果を測定する段階；およびｃ）段階（ｂ）の結果を試験化合物を欠くコントロールの結果と比較する段階を含んでなる、被験体における代謝異常を処置するために有用な化合物を同定する方法を提供する。
【００６８】
ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子によりコードされるポリペプチドに結合し、そして潜在的にポリペプチドの生物学的活性を増加するかもしくは減少することができる化合物を同定するために結合アッセイを用いることができる。１つの典型的な結合アッセイは：（ａ）ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子によりコードされるポリペプチドおよびポリペプチドの標識リガンドと試験化合物をインキュベーションする段階；（ｂ）結合していない標識リガンドからポリペプチドを分離する段階；および（ｃ）ポリペプチドに結合する標識リガンドの量の減少によりポリペプチドへのリガンド結合を阻害する化合物を同定する段階を含んでなる。ポリペプチドの標識リガンドの例は、ポリペプチドに特異的な標識抗体である。ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子を発現する宿主細胞（組み換えもしくは天然の）を結合アッセイに用いることができる。好ましくは、宿主細胞から調製した細胞膜を結合アッセイに用いることができる。より好ましくは、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子によりコードされる実質的に精製されたポリペプチドを結合アッセイに用いることができる。
【００６９】
結合していない標識リガンドからのポリペプチドの分離は、様々な方法で成し遂げることができる。都合よく、成分の少なくとも１つを固体基質上に固定し、それから結合していない成分を容易に分離することができる。固体基質は、多種多様な材料でそして多種多様な形状（例えば、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子など）でできていることができる。基質は好ましくは信号対雑音比を最大にするように、主にバックグラウンド結合を最小にするように、ならびに分離の容易さおよび費用に関して選択される。
【００７０】
分離は、例えば、リザーバーからビーズもしくはディップスティックを取り除くこと、マイクロタイタープレートウェルのようなリザーバーを空にするかもしくは希釈すること、またはビーズ、粒子、クロマトグラフィーカラムもしくはフィルターを洗浄溶液もしくは溶媒ですすぐことによりもたらすことができる。分離段階には、好ましくは、複数のすすぎもしくは洗浄が包含される。例えば、固体基質がマイクロタイタープレートである場合、塩、緩衝剤、洗剤、非特異的タンパク質などのような特異的結合に関与しないインキュベーション混合物の成分を典型的に含む洗浄溶液でウェルを数回洗浄することができる。固体基質が電磁ビーズである場合、ビーズを洗浄溶液で１回もしくはそれ以上洗浄し、そして磁石を用いて単離することができる。
【００７１】
リガンドを標識するために、直接的検出（例えば、放射活性、発光、光学もしくは電子密度など）もしくは間接的検出（例えば、ＦＬＡＧエピトープのようなエピトープタグ、西洋ワサビペルオキシダーゼのような酵素タグなど）を与えるもののような多種多様な標識を用いることができる。
【００７２】
本発明の上記のアッセイ方法の１つより多くの態様として、ポリペプチドの複合体を形成していない形態からの複合体を形成した形態の分離を容易にするために、ならびにアッセイの自動化に対応するためにポリペプチドもしくはそのリガンドのいずれかを固定することが望ましい可能性がある。候補化合物の存在下および不在下でのポリペプチドへの試験化合物の結合もしくは標的分子とポリペプチドとの相互作用は、反応物を含有するために適当な任意の容器において成し遂げることができる。そのような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管および微小遠心管が包含される。１つの態様として、ポリペプチドおよびそのリガンドの一方もしくは両方をマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加するポリペプチドの融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとポリペプチドとの融合タンパク質は、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）もしくはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、それらを次に試験化合物もしくは試験化合物とポリペプチドの標識リガンドと合わせ、そして複合体形成を導く条件下で混合物をインキュベーションする（例えば、塩およびｐＨについて生理的条件で）。インキュベーション後に、ビーズもしくはマイクロタイタープレートウェルを洗浄してあらゆる結合していない成分を除き、そして複合体形成を直接的もしくは間接的に、例えば上記のように測定する。あるいはまた、複合体をマトリックスから解離することができ、そして本発明のポリペプチドの結合もしくは活性のレベルを標準的な技術を用いて決定することができる。
【００７３】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技術もまた、本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。例えば、ポリペプチドもしくはそのリガンドのいずれかをビオチンおよびストレプトアビジン結合を利用して固定することができる。
【００７４】
ビオチニル化ポリペプチドもしくは標的分子は、当該技術分野において周知である技術（例えば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から製造し、そしてストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルにおいて固定することができる。あるいはまた、ポリペプチドと反応するがポリペプチドのその標的分子への結合を妨げない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができ、そしてポリペプチドを抗体結合によりウェルにおいて捕捉することができる。ＧＳＴ固定化複合体についての上記のものに加えて、そのような複合体を検出する方法には、本発明のポリペプチドもしくは標的分子と反応する抗体を用いる複合体の免疫検出、ならびにポリペプチドと関連する酵素活性を検出することに依存する酵素結合測定法が包含される。
【００７５】
ＰＰＡＲαの新規な標的遺伝子としての遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１の同定はまた、代謝異常を処置する新規な方法の開発も可能にする。
代謝異常を処置する方法
従って、本発明の別の一般的な態様は、被験体における代謝異常を処置する方法に関する。そのような方法は、被験体の細胞におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の遺伝子発現パターンもしくは生物学的活性を改変する組成物の治療有効量を被験体に投与する段階を含んでなる。
【００７６】
１つの態様として、処置の方法は、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の発現もしくは生物学的活性を増加するかもしくは減少することができる化合物を被験体に投与する段階を含んでなる。そのような化合物は、上記の化合物同定の方法を用いて同定することができる。
【００７７】
別の態様として、被験体における代謝異常を処置するために細胞におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子を標的とする遺伝子治療を用いることができる。例えば、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の減少した発現もしくは活性が望ましい場合、細胞におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の発現を減少するためにアンチセンス治療を用いることができる。
【００７８】
アンチセンスに基づく戦略の原理は、遺伝子発現の配列特異的抑制が、ｍＲＮＡと相補的アンチセンス種との間の細胞内ハイブリダイゼーションにより成し遂げられることができるという仮説に基づく。ハイブリッドＲＮＡ二本鎖の形成は、次に、遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１のもののような、標的ｍＲＮＡのプロセシング／輸送／翻訳および／もしくは安定性を妨げることができる。ハイブリダイゼーションは、アンチセンス効果が生じるために必要とされる。アンチセンス戦略は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用、アンチセンスＲＮＡの注入およびアンチセンスＲＮＡ発現ベクターのトランスフェクションを包含する様々な方法を用いることができる。センス鎖へのアンチセンスハイブリダイゼーションにより誘導される表現型効果は、タンパク質レベル、タンパク質活性測定および標的ｍＲＮＡレベルのような基準の変化に基づく。
【００７９】
アンチセンス核酸は、標的遺伝子の全コーディング鎖にもしくはその一部のみに相補的であることができる。アンチセンス核酸分子はまた、標的遺伝子のコーディング鎖の非コーディング領域の全部もしくは一部に相補的であることもできる。非コーディング領域（「５’および３’ＵＴＲ」）は、コーディング領域に隣接しそしてアミノ酸に翻訳されない５’および３’配列である。好ましくは、非コーディング領域は、標的遺伝子の転写もしくは翻訳の調節領域である。
【００８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号：１、３もしくは５の相補的配列から選ばれた約１５、２５、３５、４５もしくは６５ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであることができる。配列の翻訳を防ぐために標的ｍＲＮＡ配列への十分に強いアニーリングを得るために配列は少なくとも１８ヌクレオチドの長さであることが好ましい（Ｉｚａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｃｅｌｌ，３６：１００７−１０１５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：７０３−７０６）。アニチセンス核酸は、当該技術分野において既知である方法を使用して化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加するようにもしくはアンチセンスとセンス核酸との間で形成される二本鎖の物理的安定性を増加するように設計された様々に改変されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換されたヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を作製するために用いることができる改変されたヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｉ−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンが包含される。アンチセンス核酸分子は、ＣＣ−アノマー核酸分子であることができる。ＣＣ−アノマー核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここで、通常のＰ−ユニットと異なり、これらの鎖は相互に平行する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）もしくはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を含んでなることもできる。
【００８１】
あるいはまた、アンチセンス核酸は、核酸が上記のようにアンチセンスの向きにサブクローン化されている発現ベクターを用いて生物学的に製造することもできる。アンチセンス発現ベクターは、ベクターが導入される細胞タイプによりその活性が決定されることができる高効率調節領域の制御下でアンチセンス核酸が生産される組み換えプラスミド、ファージミドもしくは弱毒化ウイルスの形態であることができる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を得るために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩもしくはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクター構築物が好ましい。アンチセンス遺伝子を用いる遺伝子発現の調節の説明は、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１），ｐｐ．２２−２５）を参照。
【００８２】
典型的に、アンチセンス核酸は、微量注入、リポソーム封入により被験体に投与されるか、もしくはアンチセンス配列を保有するベクターからの発現によりｉｎ  ｓｉｔｕで生成される。アンチセンス核酸分子の投与の経路の例には、組織部位での直接注入が包含される。アンチセンス核酸は、ウイルスベクターが宿主細胞に導入される場合にアンチセンス核酸の導入を媒介するウイルスベクターに連結することができる。適当なウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが包含される。あるいはまた、アンチセンス核酸分子は、選択した細胞を標的とするように改変され、そして次に全身的に投与されることができる。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、例えば、細胞表面受容体もしくは抗原に結合するペプチドもしくは抗体にアンチンセンス核酸分子を連結することにより、それらが選択した細胞表面上に発現される受容体もしくは抗原に特異的に結合するように改変されることができる。
【００８３】
いったん細胞に入ると、アンチセンス核酸分子はＰａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかもしくは結合してそれにより例えば転写および／もしくは翻訳を阻害することにより発現を阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二本鎖を形成するための通常のヌクレオチド相補性によるか、もしくは例えばＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的相互作用によってであることができる。
【００８４】
好ましい態様として、該方法は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の使用を伴う。多くの生物は、遺伝子に対応する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がＲＮＡ干渉として知られているプロセスによって細胞に存在する場合に遺伝子発現を封じる機序を有する。特定の遺伝子の活性を減少するためにｄｓＲＮＡを使用する技術は、最初に蠕虫（ｗｏｒｍ）シノラブディス・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）を用いて開発され、そしてＲＮＡ干渉もしくはＲＮＡｉと呼ばれている（Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１）。ＲＮＡｉはそれ以来多くの生物において有用であることが見出されており、そして最近では哺乳類細胞に拡張されている（Ｍｏｓｓ，（２００１），Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  １１：Ｒ７７２−５による概説を参照）。ＲＮＡｉが２１〜２５ヌクレオチドの低分子ＲＮＡの生成を伴うことが示されると重要な進歩がなされた（Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：２９３−６；Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３）。これらの低分子干渉ＲＮＡ、もしくはｓｉＲＮＡは、該プロセスを開始するより大きいｄｓＲＮＡに最初は由来する可能性があり、そして最終的に分解される標的ＲＮＡに相補的である。ｓｉＲＮＡは、各末端で短い突出を有してそれ自体二本鎖である。それらはガイドＲＮＡとして働き、相補性の領域における標的の単一切断を導く（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １５：１８８−２００；Ｚａｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｅｌｌ  １０１：２５−３３）。
【００８５】
配列番号：１、３もしくは５のヌクレオチド配列に相補的な約２１〜２５ヌクレオチドを含んでなるｓｉＲＮＡを本発明の処置の方法において用いることができる。ｓｉＲＮＡを製造する方法は、当業者に既知である。例えば、ＷＯ０１７５１６４  Ａ２は、インビトロ系から２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の長さのｓｉＲＮＡを製造し、そして細胞もしくは生物における遺伝子のｍＲＮＡを妨げるためにそのようなｓｉＲＮＡを使用する方法を記述した。ｓｉＲＮＡはまた、安定な発現系を用いて哺乳類細胞からインビボで製造することもできる。例えば、哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡの合成を導くｐＳＵＰＥＲと呼ばれるベクター系が、最近報告された（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：５５０−３）。細胞における遺伝子発現を減少するためにｓｉＲＮＡを用いる例を実施例３において示す。
【００８６】
本発明は、（ａ）被験体の細胞に分解のためにヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡを導入する段階；および（ｂ）被験体の細胞におけるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子のｍＲＮＡのｓｉＲＮＡ干渉が起こる条件下で（ａ）において作製した細胞を維持する段階を含んでなる、被験体における代謝異常を処置する方法を提供する。ｓｉＲＮＡは、本明細書に記述するアンチセンス核酸のものと同様の方法を用いて被験体の細胞に導入することができる。
【００８７】
別の態様として、被験体の細胞に遺伝子を発現することができる核酸分子を導入することによりヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の発現を増加するために遺伝子治療を用いることができる。そのような遺伝子治療は、ヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子もしくはＰａ２１遺伝子の発現もしくは生物学的活性を高めることが有益である疾病の処置に特に有用であることができる。
【００８８】
エクスビボ遺伝子治療を行う方法は、米国特許第５，３９９，３４６号にそしてまた該特許のファイルヒストリーに提出された添付書類に概説され、それらの全ては公的に利用可能な文書である。一般に、遺伝子治療は、被験体の細胞（１つもしくは複数）への遺伝子の機能性コピーのインビトロでの導入、および遺伝子操作した細胞（１つもしくは複数）を被験体に戻すことを含むことができる。遺伝子の機能性コピーは調節要素の操作可能な制御下にあり、それは遺伝子操作した細胞（１つもしくは複数）における遺伝子の発現を可能にする。多数のトランスフェクションおよび形質導入技術ならびに適切な発現ベクターが当業者に周知であり、それらのいくつかはＰＣＴ出願ＷＯ９５／００６５４に記述されている。インビボ遺伝子治療は、アデノウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、およびエプスタイン・バーウイルスのようなヘルペスウイルスのようなベクターを使用する。遺伝子導入は、また、インビトロで感染を必要とする非ウイルス手段を用いて行うこともできる。そのような手段には、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔およびプロトプラスト融合を包含することができる。標的化リポソームもまた、細胞へのＤＮＡの送達に潜在的に有益であることができる。
【００８９】
１例として、標的遺伝子をコードするＤＮＡ分子を最初にレトロウイルスベクターにクローン化することができる。ベクターからの標的遺伝子の発現は、その内因性プロモーターからもしくはレトロウイルスの長い末端反復からもしくはある種の標的細胞に特異的なプロモーターから導かれることができる。次に、標的細胞において標的遺伝子を成功して発現させるためにベクターを被験体の細胞に導入することができる。遺伝子は、好ましくは、有効な機能を与えるのに十分なタンパク質をコードするために細胞により用いられることができる形態でそれらの細胞に送達することができる。レトロウイルスベクターは、特にそれらの高効率の感染ならびに安定な組込みおよび発現のために遺伝子治療の好ましい遺伝子送達ベクターであることが多い。あるいはまた、標的遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートもしくはアデノウイルス−リガンド−ＤＮＡコンジュゲートを用いる受容体により媒介される標的化ＤＮＡ導入、リポフェクション膜融合または直接微量注入を包含する非ウイルス技術により遺伝子治療のために細胞に導入することができる。これらの方法およびそのバリエーションは、エクスビボならびにインビボ遺伝子治療に適している。本発明の方法での使用に適当な遺伝子治療の分子方法論のプロトコルは、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐａｕｌ  Ｄ．Ｒｏｂｂｉｎｓ編集，Ｈｕｍａｎ  ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ  ＮＪ，１９９６に記述されている。
【００９０】
処置の間に、個体に投与される本発明の核酸分子の有効量は、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および病状；処置する症状の重症度；投与の経路；患者の腎および肝機能；ならびに用いるその特定の核酸分子を包含する様々な因子に従って異なることができる。遺伝子治療における専門技術を有する医師もしくは獣医は、症状の進行を防ぐか、対処するかもしくは止めるために必要とされる有効量を決定しそして処方することができる。毒性なしに効能をもたらす範囲内の濃度を得ることにおける最適精度は、標的部位への核酸分子の利用可能性の反応速度論に基づく処方計画を必要とする。これは、遺伝子治療に関与する核酸分子の分配、平衡および除去の考慮を伴う。
【００９１】
本明細書に開示する遺伝子治療は、あらゆる潜在的毒性を最小限に抑えながらＰＰＡＲα標的遺伝子活性の最適な増加もしくは減少を得るために日常的な試験により特定される適切な投薬量で単独で用いることができる。さらに、他の薬剤の共投与もしくは順次投与が、望ましい可能性がある。所望の効果を得るためにいくつかの薬剤が組み合わされる場合に投与の投薬量は調整される。これらの様々な薬剤の投薬量は独立して最適化され、そしていずれかの薬剤を単独で使用する場合よりも病状が軽減される相乗作用結果を得るように組み合わされることができる。
【００９２】
以下の実施例は本発明を説明するが、しかしながら、本発明をそれに限定しない。
【実施例１】
【００９３】
ヒト細胞においてＰＰＡＲαアゴニストにより調節される標的遺伝子の同定
ヒト細胞においてフィブレートもしくは他のＰＰＡＲαアゴニストにより調節される標的遺伝子を同定するためにＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた。
【００９４】
肝臓の上皮細胞であるヒト肝細胞ＨｕＨ７細胞は、Ｊａｐａｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｂａｎｋ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から入手した。脂肪の合成および貯蔵のために特殊化した結合組織細胞であるヒト初代脂肪細胞は、Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）から入手した。ヒト初代骨格筋細胞（ＳＫＭＣ）は、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。ＰＰＡＲαアゴニスト、Ｗｙｌ４６４３（Ａｇａｔｈａ，ｅｔ  ａｌ，２０００，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３８０：３５３−３５９）およびフェノフィブレートは、それぞれ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｓ，ＭＯ）から入手した。
【００９５】
ヒトＨｕＨ７細胞を１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ，ＮＹ）を有するダルベッコの改変イーグル培地において培養した。チャコール・ストリッピングした（ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）脱脂仔ウシ血清（５％）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で細胞を約４〜１８時間処理した。次に、細胞を異なる濃度のＰＰＡＲαアゴニスト（Ｗｙ１４６４３もしくはフェノフィブレート）で約２０〜２４時間処理した。ヒトＳＫＭ細胞を骨格筋成長培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）において培養し、そして異なる濃度のＰＰＡＲαアゴニスト（Ｗｙ１４６４３もしくはフェノフィブレート）で約１８〜２０時間処理した。ヒト初代脂肪細胞を前脂肪細胞培地（カタログ番号ＰＭ＿１，Ｚｅｎ−Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，ＮＣ）において培養し、そして異なる濃度のＰＰＡＲαアゴニスト（Ｗｙ１４６４３もしくはフェノフィブレート）で約１８〜２０時間処理した。
【００９６】
全ＲＮＡを細胞から単離し、そしてＤＮＡマイクロアレイに供した。ＪＪＰＲＤバージョンＭＥＧＡおよびＭＥＧＡＢ  ＤＮＡマイクロアレイ（約６，０００遺伝子／チップ）を用いた。合計約１２，０００個の遺伝子を分析した。４０ピースより多くの標的チップおよびＭＥＧ−ＧＡチップを実験分析において使用した。１２，０００を超える遺伝子の発現レベルをＰＰＡＲαリガンドで処理した細胞から測定し、そして賦形剤コントロールで処理した細胞からのものと比較した。ＰＰＡＲαアゴニストによりその発現レベルが増加されるかもしくは減少された遺伝子の体系的検索をソフトウェアＯＭＮＩ−Ｖｉｚ（ＯｍｎｉＶｉｚ，Ｉｎｃ．Ｒｉｃｈｌａｎｄ，ＷＡ）を用いて行った。約２４個の遺伝子が、分析した１つ、２つもしくは３つ全ての細胞：ヒト脂肪細胞、ＳＫＭおよびＨｕＨ７細胞において、ＰＰＡＲαアゴニスト処理に起因する遺伝子発現の約１．８倍より大きい変化を有すると同定された。これらの遺伝子のｃＤＮＡ配列に基づいてＴａｑＭａｎプローブを設計し、そして遺伝子発現改変を確かめるためにリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＲＴＱＰＣＲ）を用いた。３個の遺伝子、Ｐａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１が、３つ全てのヒト細胞においてＰＰＡＲαアゴニストにより調節されることが確かめられた。
【００９７】
製造業者（Ｔｒｉｚｏｎ法、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．Ｃａ）により提供されるプロトコルに従って全ＲＮＡを培養細胞から精製した。Ｐａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーおよび蛍光プローブ（ＴａｇＭａｎプローブ）は、それぞれ、受託番号Ｗ３０９８８、ＡＢ０００５８４およびＮＭ＿０８０７２５のＧｅｎＢａｎｋ配列から設計した。プライマーおよびプローブは、ソフトウェアＰｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて設計した。Ｐａ９のＰＣＲプライマーは、配列番号：７（５−ＣＣＴＧＣＡＧＣＣＡ  ＴＴＣＣＡＡＣＣＴ）および配列番号：８（５−ＴＣＣＣＴＴＣＴＴＡ  ＡＧＣＴＴＣＴＧＣＣＧ）であった。Ｐａ９の蛍光ブローブは、配列番号：９（６ＦＡＭ−ＣＡＧＴＡＣＴＴＣＣ  ＧＣＴＣＣＡＴＣＣＣ  ＡＣＡＧＣＡ）であった。Ｐａ１３のＰＣＲプライマーは、配列番号：１０（５−ＡＧＣＡＧＴＣＣＴＧ  ＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣ  Ｔ）および配列番号：１１（５−ＡＡＴＣＧＧＧＴＧＴ  ＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣ  Ｔ）であった。Ｐａ１３の蛍光ブローブは、配列番号：１２（６ＦＡＭ−ＡＣＣＴＣＡＧＴＴＧ  ＴＣＣＴＧＣＣＣＴＧ  ＴＧＧＡＡＴＧ）であった。Ｐａ２１のＰＣＲプライマーは、配列番号：１３（５−ＴＧＣＴＣＧＴＴＡＣ  ＴＴＣＡＴＧＧＴＣＣ  Ｃ）および配列番号：１４（５−ＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣ  ＣＴＴＣＣＴＴＧＡ）であった。Ｐａ２１の蛍光ブローブは、配列番号：１５（６ＦＡＭ−ＴＧＧＣＴＧＣＴＧＴ  ＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡ  ＡＴＣＡＴＧＴＣ）であった。全てのプライマーおよびプローブは、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｌａｂｓ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）により合成された。
【００９８】
逆転写（ＲＴ）およびＰＣＲは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において「ワンプテップＲＴ−ＰＣＲマスターミックス試薬」キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて１段階で行った。各反応は、４０ｎｇの全ＲＮＡを含有する２５μｌの総容量で行った。反応条件は：４８℃３０分間、６０℃３０分間、９４℃５分間、続いて９４℃２０秒間および６０℃１分間の４サイクルであった。１８ＳリボソームＲＮＡのプライマーが、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより開発され、提供された。ヒト１８ＳリボソームＲＮＡの測定は、測定および装填エラーの正規化のための内部コントロールとして用いた。ＰＣＲデータを製造業者の指針に従ってＣｔ値（対数ＰＣＲプロットが計算閾値線と交差するサイクル数）により集め、そして該値を用いてΔＣｔ（標的遺伝子のＣｔ−１８ＳリボソームＲＮＡコントロールのＣｔ）を決定した。相対的ｍＲＮＡレベルは、以前に記述されているように（Ｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：９８６−９９４）式２−ΔΔＣｔを用いて計算した。
【００９９】
ＰＰＡＲαアゴニストＷｙ１４６４３もしくはフェノフィブレートは、ヒトＨｕＨ７細胞（表１）、初代ＳＫＭＵ細胞（表２）もしくは初代脂肪細胞（表３）においてＰａ９、Ｐａ１３もしくはＰａ２１の遺伝子発現を増加した。驚くことではないが、遺伝子調節は細胞環境により非常に影響を受けるので遺伝子発現パターンは異なる細胞タイプにおいて異なった。強力なＰＰＡＲγアゴニスト、ロシグリタゾンはその有効濃度でヒトＨｕＨ７肝細胞においてこれらの遺伝子発現を有意に増加しなかったので（表４）、これらの標的遺伝子Ｐａ９、Ｐａ１３およびＰａ２１はＰＰＡＲαアゴニスト特異的であった。
【０１００】
【表１】
2007522803.tif 000003
【０１０１】
【表２】
2007522803.tif 000004
【０１０２】
【表３】
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【０１０３】
【表４】
2007522803.tif 000006
【実施例２】
【０１０４】
遺伝子Ｐａ９、１３および２１の生物情報科学特性化
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により提供される生物情報科学プログラムをＤＮＡ配列の分析において使用した。ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）は、ＤＮＡ配列を取り出すために用いた。ＳｗｉｓｓＰｒｏデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）は、タンパク質配列を取り出すために用いた。ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）は、遺伝子検索に使用した。Ｍｏｔｉｆプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｍｏｔｉｆ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ）は、機能性ＤＮＡ構造（モチーフ、調節配列、ドメインなど）を検索するために使用した。ＬｏｃｕｓＬｉｎｋプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ）は、遺伝子座についての配列および記述的情報を検索するために使用した。さらに、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ（ＧＣＧ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）は、配列編集および配列アセンブリ（ＳＥＱＥＤ）、配列比較（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＰＩＬＥＵＰ）ならびにＤＮＡ配列翻訳（ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮ）に使用した。
Ｐａ９
マイクロアレイ上で使用するＰａ９遺伝子配列の最初の注釈は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｗ３０９８８：ヒトフィブリノーゲン関連タンパク質ＨＦＲＥＰ−１前駆体に類似するホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ｃＤＮＡクローンであった。ＢＬＡＳＴ検索により、Ｗ３０９８８の配列（シークエンシングエラーのために配列に多数の「ｎ」を有する）は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ０２３６４７、ＡＦ２０２６３６、ＡＦ１６９３１２、ＡＦ１５３６０６、ＡＢ０５６４７７、Ｅ３９７８４、ＢＤ０７５８０１、ＡＸ５７８０３７、ＡＸ４６４１３６、ＡＸ２７８１３３、ＡＸ２０１３２２、ＡＸ０７９９７１、ＡＸ０７９８７４、ＡＸ０６８５６０、ＡＲ２４３１６３およびＡＲ１９４２１５のような、いくつかのＧｅｎＢａｎｋ配列登録に約９７％（３３９／３４９；比較のスコアはｅ−１６２である）の配列同一性を共有することが示された。これらのＧｅｎＢａｎｋ配列登録は、同一でありそして約４０６アミノ酸残基（配列番号：２）のタンパク質をコードすると思われた。コードされるタンパク質は、ＵＳ６３４８３５０においてヒトＮＬ２  ＴＩＥリガンドホモログポリペプチドとして、そしてＷＯ０１７７１５１においてヒトフィブリノーゲンドメイン関連（ＦＤＲＧ）タンパク質として請求された。該タンパク質の他の注釈には、アンジオポエチン様タンパク質ＰＰ１１５８およびＴＩＥ受容体チロシンキナーゼリガンドホモログなどが包含される。
【０１０５】
ＷＯ０１７７１５１（実施例１２）は、ＰＡＲγを安定に発現するＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞において細胞を１０μｇ／ｍｌのピオグリタゾン（ＰＰＡＲγのアゴニスト）で約２時間処理した後にマウスＦＤＲＧ発現レベルが１０倍増加することを開示した。さらに、ＷＯ０１７７１５１（実施例１３）は、Ｚｕｃｋｅｒ糖尿病肥満マウスにおけるマウスＦＤＲＧ発現が、動物を長期にわたるトログリタゾン（ＰＰＡＲγのアゴニスト）で処理した場合に白色脂肪細胞（ＷＡＴ）において３〜５倍アップレギュレーションされることを開示した。これらの結果は、ＦＤＲＧがげっ歯類におけるＰＰＡＲγの標的遺伝子であることと一致する。
【０１０６】
さらに、Ｋｅｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌｏ．Ｃｈｅｍ．２７５：２８４８８−４９３）は、マウスＦＤＲＧと同一であるマウスＦＩＡＦ（空腹時誘導脂肪因子（ｆａｓｔｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｆａｃｔｏｒ））の発現がＰＰＡＲαヌルマウスの肝臓において減少されることを示した。彼らはまた、マウスＦＩＡＦの発現がＰＰＡＲα野生型マウス肝臓細胞においてＷＹ１４６４３処理により増加されるが、ＰＰＡＲαヌルマウス肝臓細胞ではそうでないことも見出した。さらに、彼らは、マウスＦＩＡＦの発現がヘテロ接合体ＰＰＡＲγ突然変異体マウスのＷＡＴにおいて減少されることを示した。これらの結果は、ＦＤＲＧがげっ歯類におけるＰＰＡＲα（肝臓において）およびＰＰＡＲγ（ＷＡＴにおいて）の両方の標的遺伝子であることと一致する。
【０１０７】
しかしながら、ＦＤＲＧは、単にそれがげっ歯類におけるＰＰＡＲαもしくはＰＰＡＲγの標的遺伝子であるのでヒトにおけるＰＰＡＲαもしくはＰＰＡＲγのいずれかの標的遺伝子であると容易に結論を下すことはできない。フィブレートもしくは他のＰＰＡＲαアゴニストの作用は種特異的であり、そしてげっ歯類においてフィブレートもしくは他のＰＰＡＲαアゴニストにより誘導される多くの遺伝子はヒトにおいて誘導されない。さらに、マウスＦＤＲＧはヒトＦＤＲＧと比較的低い配列同一性：ｃＤＮＡレベルで約７３％の配列同一性およびタンパク質レベルで約７６％の配列同一性を共有するので、マウスおよびヒトにおけるＦＤＲＧの遺伝子調節の機序は異なり得る。
【０１０８】
ヒトＦＤＲＧ遺伝子（ＡＸ２７８１３３）のヌクレオチド配列を配列番号：１に提供し、そしてＷ３０９８８とＦＤＲＧ遺伝子間の配列アライメントを図１に示す。配列アライメントを調べることにより、Ｗ３０９８８とヒトＦＤＲＧ遺伝子間の配列相違は、大部分がＷ３０９８８におけるシークエンシングエラーのためであることが示唆された。ヒトＦＤＲＧ遺伝子の遺伝子発現がＰＰＡＲαにより調節されるかどうかを試験するために定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。実施例１に記述されるものと同様のＲＴ−ＰＣＲ実験を用いて３０μＭもしくは１００μＭのＷｙ１４６４３で刺激したヒト骨格筋細胞から遺伝子Ｐａ９および遺伝子ＦＤＲＧの発現レベルを測定した。Ｐａ９遺伝子発現を測定するために使用したＰＣＲプライマーおよびプローブは、実施例１に記載のとおりの配列番号：７、８および９であった。これらのプライマーおよびプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でＷ３０９８８とハイブリダイズすることができる。ＦＤＲＧ遺伝子発現を測定するために使用したＰＣＲプライマーおよび蛍光プローブは、Ｗ３０９８８のヌクレオチド配列と配列相同性を共有する領域外でそれらがＦＤＲＧ遺伝子とハイブリダイズすることができるように設計した。ＦＤＲＧ遺伝子のプライマーおよびプローブは：配列番号：１６、５’−ＡＧＣＣＣＣＣＴＴＴ  ＣＴＧＡＧＴＧＣＡ、配列番号：１７、５’−ＣＣＣＴＴＧＧＴＣＣ  ＡＣＧＣＣＴＣＴＡおよび配列番号：１８、６ＦＡＭ−ＴＧＡＧＡＴＣＧＡＧ  ＧＣＴＧＣＡＧＧＡＴ  ＡＴＧＣＴＣＡである。表５に示されるように、Ｗｙ１４６４３はＰａ９遺伝子発現を３０μＭの濃度で３．６４倍そして１００μＭの濃度で６．４５倍誘導した。同じＲＮＡサンプルからの測定により、Ｗｙ１４６４３はＦＤＲＧ遺伝子発現を３０μＭの濃度で４．３７倍そして１００μＭの濃度で７．８倍誘導することが示された。同様の結果が異なる組のヒトＳＫＭ  ＲＮＡサンプルから得られた（データは示されない）。Ｐａ９遺伝子（Ｗ３０９８８）とＦＤＲＧ遺伝子（ＮＭ＿１３９３１４）間の配列相同性および本明細書に記述されるｍＲＮＡ定量データに基づいて、１）Ｗ３０９８８は、実際はＮＭ＿１３９３１４の全長ｃＤＮＡ配列の部分配列であり；２）Ｗ３０９８８の配列を含んでなるヒトＰａ９遺伝子はヒトＦＤＲＧ遺伝子と同一であり；そして３）ヒトＦＤＲＧ遺伝子は実際にＰＰＡＲαによりアップレギュレーションされると結論を下すことは理にかなっている。
【０１０９】
【表５】
2007522803.tif 000007
【０１１０】
２）Ｐａ１３
マイクロアレイ上で使用するＰａ１３遺伝子配列の最初の注釈は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｎ２６３１１、他の機能注釈を有さないｃＤＮＡクローンであった。ＢＬＡＳＴ検索により、Ｎ２６３１１のヌクレオチド配列は、ＷＯ０１９４６２９に開示される多数の疑わしい癌細胞遺伝子クローン、例えばＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ３２９９４８に約９８％（４１６／４２４）の配列同一性を共有することが示された。さらに、Ｎ２６３１１は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８８３２３、ＡＦ０１９７７０、ＡＢ０００５８４、Ｅ０９９５２、ＡＸ４６８４２９、ＡＸ４０８８８６、ＡＲ２３６３７４、ＡＲ１２７４０３、ＢＣ０００５２９、ＡＸ０５２６０９、ＡＲ０９１３７６、Ｅ１００３８およびＡＲ１０７２７９を包含する、いくつかの他のＧｅｎＢａｎｋ配列登録に約９５％（３８７／４０４）の同一性を共有した。これらのＧｅｎＢａｎｋ配列登録は、同一でありそして約３０８アミノ酸残基（配列番号：４）のタンパク質をコードすると思われた。このコードされるタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ注釈には、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質、胎盤骨形成タンパク質ＰＬＡＢ、マクロファージ抑制サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質、抗腫瘍特性を有する非ステロイド性抗炎症薬活性化遺伝子、肝臓癌において発現される遺伝子、および前立腺増殖因子などが包含される。該タンパク質と糖尿病（もしくは肥満症、もしくは高脂血症）との間の相関関係は、これまで樹立されるかもしくは記述されていない。
【０１１１】
これらのＧｅｎＢａｎｋ登録の代表、ＡＢ０００５８４のヌクレオチド配列を配列番号：３に記載し、そしてＮ２６３１１とＡＢ０００５８４の間の配列アライメントを図２に示す。配列アライメントを調べることにより、Ｎ２６３１１とＡＢ０００５８４との間の配列相違は、大部分がＮ２６３１１におけるシークエンシングエラーのためであることが示唆された。従って、Ｎ２６３１１のヌクレオチド配列を含んでなるヒトＰａ１３遺伝子は、ＡＢ０００５８４（Ｙｏｋｏｙａｍａ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）．１２２（３）：６２２−６）に表されるＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質遺伝子と同一であると思われる。実際に、ヒトＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質遺伝子は、Ｎ２６３１１のヌクレオチド配列と配列相同性を共有する領域外でＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質遺伝子とハイブリダイズするＰＣＲプライマーおよびプローブ（配列番号：１０、１１および１２）を用いて、ＰＰＡＲαによりアップレギュレーションされることが見出された（実施例１におけるデータを参照）。
【０１１２】
さらに、潜在的ＰＰＲＥがヒトＰａ１３遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）において同定された。配列番号：１９は、Ｐａ１３遺伝子と同一であるＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質遺伝子のＡＴＧ翻訳開始部位のすぐ上流の−２５３８〜−１ｂｐの５’−ＵＴＲを示す。５’−ＵＴＲのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＣ００８３９７の１５２９５６ｂｐ〜１５５４９３ｂｐをヒトゲノム配列データベースからダウンロードした。２個の潜在的転写開始部位が、配列番号：１９の塩基９７０および２５０８で同定された。各々ＡＧＧＴＣＡの配列を含んでなる３個の潜在的ＰＰＲＥが、配列番号：１９の塩基１６０、５６４および１０３３で同定された。ＴＧＡＣＣＴ、ＡＧＧＴＣＧもしくはＧＧＧＴＣＡの配列を有するいくつかの他の潜在的ＰＰＲＥ部位もまた、配列番号：１９内で見出されている。この結果は、Ｐａ１３遺伝子がヒト細胞においてＰＰＡＲにより転写的に調節されることと一致する。
３）Ｐａ２１：
マイクロアレイ上で使用するＰａ２１遺伝子配列の最初の注釈は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｈ４９６０１：アナフィラトキシン走化性受容体に類似するｃＤＮＡクローンであった。ＢＬＡＳＴ検索により、Ｈ４９６０１のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０７５０５３、ＡＬ８３３９４４、ＡＬ１２１７５８、ＢＣ０１７００１、ＡＫ０９８４１８およびＡＸ３６８９５９を包含する、いくつかのＧｅｎＢａｎｋ配列登録に約９３％（３８４／４１０）の配列同一性を共有することが示された。これらのＧｅｎＢａｎｋ配列登録は、同一であると思われた。ＧｅｎＢａｎｋ登録の大部分の注釈は、未知の機能を有するｃＤＮＡクローンである。注釈のいくつかは、疑わしい癌細胞遺伝子クローンである。Ｈ４９６０１はまた、１３７アミノ酸残基（配列番号：６）のタンパク質をコードするＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０８０７２５（配列番号；５）の相補的配列に９３％（３８４／４１０）の配列同一性も共有する。該タンパク質は、以前に第２０染色体オープンリーディングフレーム１３９（Ｃ２０ｏｒｆ１３９）と命名された。Ｃ２０ｏｒｆ１３９と糖尿病（もしくは肥満症、もしくは高脂血症）との間の相関関係は、これまで樹立されるかもしくは記述されていない。
【０１１３】
Ｈ４９６０１とＮＭ＿０８０７２５との間の配列アライメントを図３に示す。配列アライメントを調べることにより、Ｈ４９６０１とＮＭ＿０８０７２５との間の配列相違は、大部分がＨ４９６０１におけるシークエンシングエラーのためであることが示唆された。従って、Ｈ４９６０１のヌクレオチド配列を含んでなるＰａ２１遺伝子は、ＮＭ＿０８０７２５に表されるＣ２０ｏｒｆ１３９遺伝子と同一であると思われる。実際に、ヒトＣ２０ｏｒｆ１３９遺伝子は、Ｈ４９６０１のヌクレオチド配列と配列相同性を共有する領域外でＣ２０ｏｒｆ１３９遺伝子とハイブリダイズするＰＣＲプライマーおよびプローブ（配列番号：１３、１４および１５）を用いて、ＰＰＡＲαによりアップレギュレーションされることが見出された（実施例１におけるデータを参照）。
【０１１４】
さらに、潜在的ＰＰＲＥが、Ｃ２０ｏｒｆ１３９遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）において同定された。配列番号：２０は、Ｐａ２１遺伝子と同一であるＣ２０ｏｒｆ１３９遺伝子のＡＴＧ翻訳開始部位のすぐ上流の−１ｂｐ〜−３０００ｂｐの５’−ＵＴＲを示す。５’−ＵＴＲのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｈｓ２０＿１１５４４の５６８８８７ｂｐ〜５７１８８６ｂｐをヒトゲノム配列データベースからダウンロードした。２個の「ＡＧＧＴＣＡ」ＰＰＲＥ部位が、それぞれ、−２２０１ｂｐおよび−２８６６ｂｐで見出された。３個の「ＴＧＡＣＣＴ」部位が、それぞれ、−８７２ｂｐ、−８９３ｂｐ、−２３４４ｂｐで見出された。この結果は、Ｃ２０ｏｒｆ１３９がヒト細胞においてＰＰＡＲにより転写的に調節されることと一致する。
【実施例３】
【０１１５】
減少したＰＰＡＲαは、Ｐａ９、１３もしくは２１の遺伝子発現の減少した誘導をもたらした
ｓｉＲＮＡ技術を用いて減少したＰＰＡＲα発現を有するヒトＳＫＭ細胞を最初に構築した。次に、これらの細胞におけるＰａ９、１３および２１の遺伝子発現を測定してこれらの遺伝子がＰＰＡＲαにより実際に調節されることを確かめた。
【０１１６】
当業者に既知である方法に従って（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９６：５５０−５５３）、ＰＰＡＲαに特異的なｓｉＲＮＡオリゴを設計し、そしてヒトＳＫＭＵ細胞におけるＰＰＡＲαの発現レベルをノックダウンするかもしくは減少するために用いた。最初に、４組のｓｉＲＮＡオリゴを鋳型としてＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ７４３４９（ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ、ｃＤＮＡ；ＰＰＡＲα）およびソフトウェア、Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いて設計した。４組のオリゴの中で、２組はより効率がよいことが見出され、そしてＰＰＡＲαノックダウン研究のために選択した。２組のｓｉＲＮＡの配列は、開始コドンの最初のヌクレオチドに対してｃＤＮＡの９０７ｂｐ〜９２７ｂｐ（配列番号：２１、５’−ＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧ  ＴＧＡＣＡＴＴＧＣＴ  Ａ）および１１０６ｂｐ〜１１２６ｂｐ（配列番号：２２、５’−ＡＡＣＴＧＧＡＴＧＡ  ＣＡＧＴＧＡＴＡＴＣ  Ｔ）に対応する。これらのオリゴは、Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）により化学的に合成された。ユニバーサル陰性コントロールｓｉＲＮＡオリゴは、Ａｍｂｉｏｎから購入した。
【０１１７】
ヒト初代骨格筋細胞（ｈＳＫＭ，Ｃａｍｂｒｅｘ，ＭＤにより提供された）は、６０ｍｍ皿当たり４．６７ｘ１０４細胞の密度（約２０％の飽和密度）でトランスフェクションの前日に調製した。細胞は、抗生物質を含まないＳＫＧＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ，ＭＤ）で３７℃、５％  ＣＯ２で２４時間培養した。
【０１１８】
培養細胞へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションは、製造業者の説明書に従って実施した。簡潔に言えば、トランスフェクションの前に、ｓｉＰＯＲＴアミン（Ａｍｂｉｏｎ，ＴＸ）を抗生物質および血清を含まないＳＫＧＭ培地で最初に希釈し（１０μｌ  ｓｉＰＯＲＴ／ｍｌ）、続いて、混合物にｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ）を加えた。ＳＫＭ細胞（多数の皿に前もって調製した）を２ｍｌの混合物で４時間トランスフェクションした。さらに８ｍｌの新しいＳＫＧＭ培地（抗生物質なしで）を各皿に加えて細胞増殖を最大にしそしてトランスフェクション試薬によりもたらされる潜在的細胞毒性を減らした。コントロールとして、細胞はまたｓｉＰＯＲＴアミンのみもしくはｓｉＰＯＲＴアミンに加えてユニバーサル陰性コントロールｓｉＲＮＡでもトランスフェクションした。
【０１１９】
改変したＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ法（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａ）を用いてトランスフェクションの４８時間後にトランスフェクションした皿のいくつかから全ＲＮＡを単離した。ＰＰＡＲα発現レベルがｓｉＲＮＡにより本当にノックダウンされていることを確認するためにリアルタイムＰＣＲを用いた。使用した最適条件下で、ＰＰＡＲαの発現レベルは、ｓｉＲＮＡによりＳＫＭ細胞において７０〜８０％減少されることが見出された（図４）。
【０１２０】
検証後に、ＰＰＡＲαノックダウン細胞を異なる化合物でさらに１６時間処理した。再度、全ＲＮＡを細胞から単離し、そしてリアルタイムＰＣＲを行い、Ｐａ９、１３および２１のような興味のある標的遺伝子の発現レベルを実施例１に記述されるＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて定量的に測定した。結果は：Ａ）ＰＰＡＲαの減少した遺伝子発現を有するＳＫＭ細胞において、Ｐａ９の遺伝子発現は、ＰＰＡＲαの減少した発現レベルのない細胞における３３．４８倍の誘導と比較した場合に、Ｗｙ１４６４３処理の際に２．３５倍増加しただけであり（図５）；Ｂ）同様の結果がＰａ１３（図６）およびＰａ２１（図７）の遺伝子について認められ；そしてＣ）ＰＰＡＲαの減少した遺伝子発現を有するＳＫＭ細胞において、既知の非ＰＰＡＲα標的遺伝子、ＰＰＡＲｄの発現レベルは改変されないことを示した。
【０１２１】
前述の事項から明らかであるように、本発明は、本明細書に定義されるヒトＰａ９遺伝子、Ｐａ１３遺伝子およびＰａ２１遺伝子がペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファ（ＰＰＡＲα）の標的遺伝子であることを初めて見出した。上記の詳細な記述および好ましい態様は、本発明ならびにその様々な特徴および利点を説明するために提供されているが、本発明は前述の事項によってではなく、特許法の原則の下で適切に解釈されるような以下の請求項によって定義されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】Ｐａ９マイクロアレイ注釈配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｗ３０９８８）とヒトＦＤＲＧ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＸ２７８１３３）の間のＤＮＡ配列アライメントを示す。
【図２】Ｐａ１３マイクロアレイ注釈配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｎ２６３１１）とヒトＴＧＦ−ベータスーパーファミリータンパク質遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０００５８４）の間のＤＮＡ配列アライメントを示す。
【図３】Ｐａ２１マイクロアレイ注釈配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｈ４９６０１）とヒトＣ２０ｏｒｆｌ３９遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０８０７２５）の間のＤＮＡ配列アライメントを示す。
【図４】ＰＰＡＲα特異的ｓｉＲＮＡがＳＫＭＵ細胞におけるＰＰＡＲα遺伝子の発現レベルを減少したことを説明する。
【図５】ＷＹ１４６４３が、減少したＰＰＡＲα発現を有するＳＫＭＵ細胞においてＰａ９遺伝子発現の減少した誘導を有したことを説明する。
【図６】ＷＹ１４６４３が、減少したＰＰＡＲα発現を有するＳＫＭＵ細胞においてＰａ１３遺伝子発現の検出可能な誘導を有さなかったことを説明する。
【図７】ＷＹ１４６４３が、減少したＰＰＡＲα発現を有するＳＫＭＵ細胞においてＰａ２１遺伝子発現の検出可能な誘導を有さなかったことを説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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