(57)【要約】癌を処置するための、ネイティブＩＧＦＢＰ−３のレンチウイルス送達が、記載されている。癌を処置するための、変異型ＩＧＦＢＰ−３のレンチウイルス送達もまた、記載されている。本発明はまた、ポリペプチドを発現するための方法であって、その方法は、標的哺乳動物細胞中に、ＤＮＡ構築物を安定に導入する工程であって、そのＤＮＡ構築物は、正常（ＩＧＦＢＰ−３）ポリペプチドもしくは変異型ＩＧＦＢＰ−３（ｍＩＧＦＢＰ−３）ポリペプチドまたはそれらの機能的改変体をコードする、ヌクレオチドを含み、このＤＮＡ構築物は、レンチウイルス遺伝子送達ビヒクル中に含まれる、工程を包含する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドを発現するための方法であって、該方法は、
標的哺乳動物細胞中に、ＤＮＡ構築物を安定に導入する工程であって、該ＤＮＡ構築物は、正常（ＩＧＦＢＰ−３）ポリペプチドもしくは変異型ＩＧＦＢＰ−３（ｍＩＧＦＢＰ−３）ポリペプチドまたはそれらの機能的改変体をコードする、ヌクレオチドを含み、該ＤＮＡ構築物は、レンチウイルス遺伝子送達ビヒクル中に含まれる、工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＮＡ構築物は、レンチウイルス遺伝子送達ビヒクルを標的組織もしくは標的器官中に注入することによって、前記標的哺乳動物細胞中へとインビボで導入される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記ＤＮＡ構築物は、レンチウイルス遺伝子送達ビヒクルの形質導入によって、前記標的哺乳動物細胞中へとインビトロで導入される、方法。
【請求項４】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の方法であって、前記標的哺乳動物細胞は、前立腺細胞である、方法。
【請求項５】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の方法であって、前記標的哺乳動物細胞は、結腸直腸細胞である、方法。
【請求項６】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の方法であって、前記標的哺乳動物細胞は、肺上皮細胞である、方法。
【請求項７】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の方法であって、前記標的哺乳動物細胞は、乳房上皮細胞である、方法。
【請求項８】
請求項１、請求項２、または請求項３に記載の方法であって、前記ＤＮＡ構築物は、前記ｍＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドもしくはその機能的改変体をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターをさらに含み、該ＤＮＡ構築物は、前記標的哺乳動物細胞においてインビボまたはインビトロで発現可能である、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記プロモーターは、前立腺特異的プロモーターである、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、前記プロモーターは、結腸直腸細胞特異的プロモーターである、方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の方法であって、前記プロモーターは、肺特異的プロモーターである、方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の方法であって、前記プロモーターは、乳腺特異的プロモーターである、方法。
【請求項１３】
請求項８に記載の方法であって、前記プロモーターは、構成的プロモーターである、方法。
【請求項１４】
請求項８に記載の方法であって、前記プロモーターは、誘導性プロモーターである、方法。
【請求項１５】
請求項８に記載の方法であって、前記ＤＮＡ構築物は、自殺遺伝子をさらに含む、方法。
【請求項１６】
哺乳動物における腫瘍の増殖を阻害するための方法であって、該方法は、
標的組織中の細胞もしくは標的器官中の細胞に、レンチウイルスベクターを直接投与する工程であって、該レンチウイルスベクターは、プロモーターに作動可能に連結された核酸配列を含み、該核酸配列は、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドもしくはｍＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドをコードし、該核酸配列の発現は、腫瘍増殖の調節をもたらす、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記ベクターは、注入によって前記標的組織もしくは標的器官へと投与され、その結果、該ベクターは、前記腫瘍部位または前記腫瘍部位付近に存在するようになる、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記腫瘍増殖の調節は、腫瘍細胞増殖速度の減少である、方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、前記腫瘍増殖の調節は、前記標的細胞におけるＤＮＡ合成の阻害である、方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、前記腫瘍増殖の調節は、前記標的細胞におけるアポトーシスの増強である、方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、該方法は、
外科的介入、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、化学療法、および寒冷療法から選択される、さらなる処置、
をさらに包含する、方法。
【請求項２２】
レンチウイルスＤＮＡ構築物を安定に組み込まれた標的哺乳動物細胞であって、該レンチウイルスＤＮＡ構築物は、該標的哺乳動物細胞において活性であるプロモーターに作動可能に連結された、ヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドもしくはｍＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドまたはそれらの機能的改変体をコードする、細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、前記プロモーターは、前立腺特異的である、細胞。
【請求項２４】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、前記プロモーターは、結腸直腸特異的である、細胞。
【請求項２５】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、前記プロモーターは、肺特異的である、細胞。
【請求項２６】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、前記プロモーターは、乳腺特異的である、細胞。
【請求項２７】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、前記プロモーターは、構成的である、細胞。
【請求項２８】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、前記プロモーターは、誘導性である、細胞。
【請求項２９】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、該細胞は、マウス由来である、細胞。
【請求項３０】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、該細胞は、ラット由来である、細胞。
【請求項３１】
請求項２２に記載の形質転換された標的哺乳動物細胞であって、該細胞は、ヒト由来である、細胞。
【請求項３２】
ＩＧＦＢＰ−３遺伝子もしくはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を発現する上皮細胞であって、該ＩＧＦＢＰ−３遺伝子もしくはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子は、レンチウイルス形質導入を介して該上皮細胞中に導入された、細胞。
【請求項３３】
ＩＧＦＢＰ−３遺伝子もしくはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含む組換えレンチウイルスベクターであって、該ＩＧＦＢＰ−３遺伝子もしくはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子は、ＤＮＡに作動可能に連結されており、かつインビボまたはインビトロで標的細胞において発現可能である、ベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載の組換えベクターであって、前記レンチウイルスのゲノムは、複製欠損性である、ベクター。
【請求項３５】
請求項３３に記載の組換えベクターであって、前記標的細胞は、前立腺上皮細胞である、ベクター。
【請求項３６】
請求項３３に記載の組換えベクターであって、前記標的細胞は、卵巣上皮細胞である、ベクター。
【請求項３７】
請求項３３に記載の組換えベクターであって、前記標的細胞は、肺上皮細胞である、ベクター。
【請求項３８】
請求項３３に記載の組換えベクターであって、前記標的細胞は、乳房上皮細胞である、ベクター。
【請求項３９】
請求項３３に記載のベクターと、薬学的に受容可能なキャリアと、を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インスリン増殖因子結合タンパク質−３（ＩＧＦＢＰ−３）遺伝子またはＩＧＦＢＰ−３遺伝子の変異型バージョン（ｍＩＧＦＢＰ−３）を含むレンチウイルスベクターを、上記遺伝子が、標的組織において、分泌型の生物活性ＩＧＦＢＰ−３タンパク質またはｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質を産生するように発現される様式で患者に投与することによって、癌または悪性疾患を処置するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
正常な細胞分裂および正常な細胞移動は、身体において高度に調節されている。この調節系は、細胞恒常性と称され、数種の機構を利用して細胞を監視状態に保つ。細胞増殖を調節するための主要な機構としては、可溶性媒介物質（例えば、増殖因子）を通じた外部のシグナル伝達、細胞接触阻止（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を介した細胞増殖の遅延、特異的な細胞表面のレセプター−リガンド相互作用を通じた細胞接着、および細胞分化が挙げられる。
【０００３】
癌の発生は、最初に非特許文献１に記載された多段階プロセスである。正常細胞は、そのＤＮＡ内に遺伝的変異（例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、および再配置）を蓄積する。重要な調節遺伝子における複数のこれらの変異の蓄積は、多くの場合、接触阻止の損失、細胞接着の損失、および細胞分化の損失、ならびにそれらの意図された機能を実行することができないことに起因して、細胞ホメオスタシスの損失を生じる。さらに、細胞生存とプログラム細胞死（アポトーシス）との間のバランスは、変化され得る。これらの遺伝的変異の結果として、癌細胞は、細胞分裂を制御下に保つための調節性エレメントを失っており、そして組織または器官中の正常細胞に対する増殖上の利点と、転移として離れた組織および器官に移動する能力との両方を獲得している。
【０００４】
成長因子およびその特異的細胞表面結合タンパク質と細胞内結合タンパク質とは、外部環境と細胞との間を連絡する重要な導管を形成する。増殖因子に対する結合タンパク質の例としては、上皮増殖因子（非特許文献２；非特許文献３）、神経成長因子（非特許文献４；非特許文献５）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）、インスリン（非特許文献１０）、血小板由来成長因子（非特許文献１１）、およびトランスホーミング増殖因子（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献４）が挙げられる。ヘパリン結合増殖因子のファミリーとしては、酸性および塩基性のＦＧＦ、Ｋ−ＦＧＦ、Ｉｎｔ−２、ＦＧＦ−５、ＫＧＦ、およびＦＧＦ−７が挙げられる（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。これらの増殖因子は、増殖刺激、新脈管形成、創傷治癒、および組織再生のような生物学的プロセスに関連している（非特許文献１４；非特許文献１６；非特許文献１７）。
【０００５】
ＩＧＦシグナル伝達系は、身体中の多くの組織の増殖および発生において重要な役割を果たす。このＩＧＦ系は、２つのリガンド（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、細胞表面レセプターＩＧＦ−１ＲおよびＩＧＦ−２Ｒ、ならびにＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）１〜６（非特許文献１８）を含む。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩは、種々の組織によって産生される増殖因子であり、細胞の生存および増殖に必要とされる。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両方は、ＩＧＦ−１Ｒに結合するのに対して、ＩＧＦ−２Ｒは、ＩＧＦ−ＩＩにのみ結合する。このＩＧＦＢＰは、循環および細胞外空間におけるＩＧＦの半減期ならびにバイオアベイラビリティに影響する。ＩＧＦＢＰ−３は、優勢なＩＧＦＢＰであり、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの７５％を隔離する（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒ）（非特許文献１９）。血液中で、ＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−３は、第３のタンパク質である酸性不安定サブユニット（ａｃｉｄ  ｌａｂｉｌｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ）（ＡＬＳ）と複合体化する。細胞外空間において、このＩＧＦ−ＩＧＦＢＰ−３複合体は、優性な形態である。ＩＧＦＢＰのうちでインスリンに結合するものはない。
【０００６】
ＩＧＦＢＰ−３は、ＭａｒｔｉｎおよびＢａｘｔｅｒにより概説されている［非特許文献２０；非特許文献２１］。ＩＧＦＢＰ−３は、正常な成体血清において、およそ６ｍｇ／Ｌの濃度で、多くの場合ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩとＡＬＳとの複合体で見出される。代謝状態または疾患状態において、ＩＧＦＢＰ−３のレベルは、このレベルから変動し得る。組換えＩＧＦＢＰ−３の発現および精製は、特許文献１に記載されている。精製タンパク質は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに対する高い親和性を有する（非特許文献２２）。ＩＧＦＢＰ−３は、以下の他の種において記載されている：例えば、ラット（非特許文献２３）、マウス（非特許文献２４）、およびウシ（非特許文献２５）。
【０００７】
インビトロでの実験は、ＩＧＦＢＰ−３が、ＩＧＦシグナル伝達に依存せずに、細胞に対する増殖、移動、およびアポトーシスへの感受性に関して、その影響を発揮し得ることを示している。ＩＧＦＢＰ−３は、細胞表面または細胞外マトリックスに結合する（非特許文献２６）。非特許文献２７は、ＩＧＦＢＰ−３が、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩとは独立してヒト乳癌細胞の増殖を阻害することを示した。非特許文献２８は、前立腺癌細胞が、ＩＧＦＢＰ−３の添加の際に、アポトーシスを受けることを実証した。非特許文献２９は、ＩＧＦＢＰ−３が変異してＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−ＩＩに結合することが出来ない場合に、前立腺癌細胞が依然としてアポトーシスを受けることを実証した。非特許文献３０は、肺癌細胞の増殖を阻害するためにアデノウイルスベクターによって送達されたＩＧＦＢＰ−３によるこれらの細胞の感染を記載する。結腸癌細胞におけるＩＧＦＢＰ−３レベルの上昇は、細胞死の増加を生じた（非特許文献３１）。
【０００８】
Ｈｏｎｇらは、ヒトＩＧＦＢＰ−３のＮ末端領域における６つの位置に変異を導入し、これらの変異は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへの結合を消滅させたことを示した。この変異型ＩＧＦＢＰ−３（ｍＩＧＦＢＰ−３）は、ＤＮＡ合成を阻害し得、前立腺癌細胞においてアポトーシスを誘導し得た。前立腺癌細胞に対するこの効果は、ネイティブＩＧＦＢＰ−３と同じ濃度において生じた。このことは、ＩＧＦＢＰ−３がアポトーシスを誘導する能力の主要な機構が、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへの結合ならびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの隔離とは無関係であることを示唆する。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに結合し得るＩＧＦＢＰ−３、ならびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩへの結合を消滅させるＩＧＦＢＰ−３内の変異の両方は、前立腺癌細胞において、癌の増殖を阻害し得、アポトーシスを誘導し得る。ｍＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−ＩレベルまたはＩＧＦ−ＩＩレベルの変動が、患者の処置に対して所望されない効果を有する条件下において、処置において治療的な利点を有し得る。
【０００９】
ＩＧＦＢＰ−３系の変動は、癌の進行に関与している。ＩＧＦＢＰ−３レベルの減少は、前立腺癌（非特許文献３２）および進行段階の卵巣癌（非特許文献３３）に相関する。ヒトパピローマウイルスのＥ７タンパク質は、ＩＧＦＢＰ−３の結合に関与しており、そして頸部の癌の発症における重要な要因であり得る（非特許文献３４）。
【００１０】
癌治療についてのＩＧＦＢＰ−３タンパク質またはｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質の使用に伴う１つの問題は、他のタンパク質についてと同様に、腫瘍部位におけるその濃度の変動である。腫瘍部位に対してボーラスとして送達されるか、または静脈内注入を介して全身性に送達されたＩＧＦＢＰ−３タンパク質またはｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質は、タンパク質濃度の急上昇（ｓｐｉｋｅ）を引き起こし、その後の除去および分解が続く。このことは、腫瘍部位におけるタンパク質濃度が治療レベル以下となる可能性を生じる。例として、Ｉｎｔｒｏｎ−Ａ（登録商標）（インターフェロン−α，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ，Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）およびＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（インターロイキン−２，Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）は、それぞれおよそ２時間および１．５時間の排泄半減期（ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｈａｌｆ  ｌｉｆｅ）を有する（各製品に関するパッケージ挿入物を参照のこと）。タンパク質のペグ化は、多くの場合、治療用タンパク質の半減期を延長させる（非特許文献３５）。しかし、患者はなお、タンパク質濃度を治療レベルに上昇させるための再処置を必要とする。長期の患者の処置の間、ＩＧＦＢＰ−３タンパク質およびｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質の複数回の送達が、腫瘍増殖を阻害するために必要とされる。短い半減期の治療用タンパク質（例えば、インターロイキン−２およびインターフェロン−α）については、患者の処置は、１日に１〜３回の頻度であり得る。腫瘍または悪性疾患を改善するために必要とされる長期にわたって一定の治療用量を送達することが、実質的に必要とされる。
【００１１】
治療レベルのＩＧＦＢＰ−３およびｍＩＧＦＢＰ−３を送達するための代替的アプローチとしては、プロモーターに作動可能に連結されたＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を細胞中に送達し、次いで、この細胞が、生物活性ＩＧＦＢＰ−３タンパク質または生物活性ｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質を合成および分泌する工程が挙げられる。裸の（ｎａｋｅｄ）ＤＮＡおよびリポソームコーティングされたＤＮＡは、２つの確立された、非ウイルス式の、細胞中への遺伝子送達方法である。しかし、これらの方法は、治療用タンパク質の一過性の発現を引き起こし（非特許文献３６）、そして最大の治療的処置のために必要とされる一定レベルの長期送達のためには適切ではない。非ウイルス送達システムのさらなる欠点は、細胞の防御システムの結果として、治療効果のために大量の裸のＤＮＡが必要とされることである（非特許文献３７）。
【００１２】
ウイルス遺伝子送達系は、非特許文献３６および非特許文献３８に記載されている。一般的なウイルス系としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびレトロウイルスが挙げられる。これらの系は、種々の遺伝子を送達して、細胞の遺伝的障害を改善するために使用されている。これらはまた、患者への直接投与か、または細胞のエキソビボ処理と、その後のこれらの細胞の動物または患者への再導入かのいずれかによって、動物およびヒトにおける遺伝的疾患を矯正するために使用されている。しかし、アデノウイルスベクターおよびＡＡＶベクターは、宿主細胞中に組込まれず、したがってタンパク質を一過性に発現し、このこともまた、長期の治療処置のためには患者への再投与を必要とする。レトロウイルス配列は宿主細胞に組み込まれるが、多くの場合、宿主細胞によるこれらのプロモーター領域のメチル化によって、数週間後には不活性化される（非特許文献３９；非特許文献４０）。
【００１３】
レンチウイルスベクターは、他の遺伝子送達系に対して数点の利点を有する。これは、哺乳動物細胞への外来遺伝子の形質転換のために非常に有効であり、非分裂細胞を形質転換し得、治療用タンパク質の長期発現を方向付け得る。このベクターは、宿主細胞ゲノム中に組込まれ得、導入遺伝子の安定した産生をもたらし、そしてこれは、インビトロでもインビボでも有効に送達され得る（非特許文献４１）。
【００１４】
レンチウイルスベクターは、種々の遺伝的疾患および後天的疾患の処置のために使用するために開発および標的化されてきた（非特許文献４２；非特許文献４３）。ヒト疾患の処置に関するレンチウイルスベクターの主な焦点は、ＣＮＳ疾患の処置（例えば、リソソーム蓄積疾患、ハンチントン病およびパーキンソン病の処置）のためのニューロンへの遺伝子移送、リンパ−血液疾患（例えば、鎌状赤血球、β−サラセミア）の処置ならびに血友病のための造血性前駆体細胞への遺伝子移送に対して、そしてＨＩＶ感染に対する適用に対してである（非特許文献４４；非特許文献４５；非特許文献４６；非特許文献４７）。
【００１５】
レンチウイルスベクターの用途についての数個の報告が、腫瘍学における潜在的用途に関して存在する。レンチウイルスベクターは、免疫原性タンパク質を送達して癌細胞を不活性化するために、抗癌ワクチンを産生するために、エキソビボで使用されており（非特許文献４８；非特許文献４９）、樹状細胞に免疫調節性タンパク質を送達して抗腫瘍応答を刺激するためにエキソビボで使用されており（非特許文献５０）、そして、癌細胞を直接的に死滅させようとして、毒素（例えば、ジフテリア毒）（非特許文献５１）、自殺遺伝子（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ）（非特許文献５２；非特許文献５３）、またはトランスポータータンパク質（非特許文献５４）を送達するために使用されている。しかし、細胞レポーターを介して作用して癌細胞の増殖を緩和する細胞外溶解性タンパク質モジュレーターの置き換えを目標としたレンチウイルス治療の用途についての報告はない。
【００１６】
癌治療における焦点は、医学会において優先度が高いものであるが、この疾患のセットの進行に対処するために、新しい処置が必要とされる。ほとんどの癌の処置は、高い毒性プロフィールを有し、患者によって許容されない。全身性に送達されることなく腫瘍部位に標的化される新規の治療分子は、副作用を最低限にしながら改善した薬物効果を提供する見込みがある。
【００１７】
ＩＧＦＢＰ−３およびｍＩＧＦＢＰ−３は、前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺癌、ならびにおそらく他の型の癌の処置に関して高い有望性を示す。ほとんどの治療と同様に、投薬レベルは、このタンパク質の最大の効能のために重要である。理想的には、長期にわたる（すなわち、６ヶ月より長い）一定の用量のＩＧＦＢＰ−３タンパク質およびｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質の送達は、前立腺、乳、結腸、卵巣、頸部、および肺の腫瘍もしくは悪性疾患の軽減のための、最も主要な処置である。
【特許文献１】米国特許第５，２５８，２８７号明細書
【非特許文献１】Ｋｎｕｄｓｏｎ「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９７１年，第６８巻，８２０〜３頁
【非特許文献２】Ｔａｙｌｏｒら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９７０年，第６７巻，１６４〜７１頁
【非特許文献３】Ｔａｙｌｏｒら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９７４年，第２４９巻，３１９８〜２０３頁
【非特許文献４】Ｋａｎｚａｋｅら「Ｃｅｌｌ」１９９０年，第６１巻，１０５１〜６１頁
【非特許文献５】Ｄｅｎｎｉｓら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９８９年，第２６４巻，７２１０〜６頁
【非特許文献６】Ｚａｐｆら「Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ」１９７５年，第１６８巻，６３８〜４５頁
【非特許文献７】ＣｏｈｅｎおよびＮｉｓｓｌｅｙ「Ａｃｔａ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」１９７６年，第８３巻，２４３〜５８頁
【非特許文献８】Ｍｏｓｅｓら「Ｎａｔｕｒｅ」１９７６年，第２６３巻，１３７〜４０頁
【非特許文献９】ＨｉｎｔｚおよびＬｉｕ「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．＆Ｍｅｔａｂ．」１９７７年，第４５巻，９８８〜９５頁
【非特許文献１０】Ｈｏｆｆｉｍａｎら「Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．」１９７３年，第８０巻，２７５〜８０頁
【非特許文献１１】Ｈｕａｎｇら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ」１９８９年，第８１巻，３４２〜６頁
【非特許文献１２】Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔおよびＷａｋｅｆｉｅｌｄ「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ」１９８７年，第２６２巻，１４０９０〜９頁
【非特許文献１３】Ｈｕａｎｇら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ」１９８８年，第２６３巻，１５３５〜４１頁
【非特許文献１４】ＢｕｒｇｅｓｓおよびＭａｃｉａｇ「Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ」１９８９年，第５８巻，５７５〜６０６頁
【非特許文献１５】Ｆｉｎｃｈら「Ｓｃｉｅｎｃｅ」１９８９年，第２４５巻，７５２〜５頁
【非特許文献１６】Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」１９８６年，第４６巻，１８７〜２０４頁
【非特許文献１７】Ｋａｎら「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」１９８９年，第８６巻，７４３２〜６頁
【非特許文献１８】ＬｅＲｏｉｔｈおよびＲｏｂｅｒｔｓ「Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．」２００３年，第１９５巻，１２７〜３７頁
【非特許文献１９】ＦｉｒｔｈおよびＢａｘｔｅｒ「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．」２００２年，第２３巻，８２４〜５４頁
【非特許文献２０】ＭａｒｔｉｎおよびＢａｘｔｅｒ「Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．」１９９３年，第３巻，６２〜５頁
【非特許文献２１】Ｂａｘｔｅｒ「Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍ．ＩＧＦ  Ｒｅｓ．」２０００年，第１０巻（補遺Ａ），Ｓ１０−１
【非特許文献２２】ＭａｒｔｉｎおよびＢａｘｔｅｒ「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９８６年，第２６１巻，８７５４〜６０頁
【非特許文献２３】ＢａｘｔｅｒおよびＭａｒｔｉｎ「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．」１９８７年，第１４７巻，４０８〜１５頁
【非特許文献２４】Ｓｃｈｕｌｌｅｒら「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．」１９９４年，第１０４巻，５７〜６６頁
【非特許文献２５】Ｓｐｒａｔｔら「Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．」１９９１年，第１７７巻，１０２５〜３２頁
【非特許文献２６】ＭｏｈａｎおよびＢａｙｌｉｎｋ「Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．」２００２年，第１７５巻，１９〜３１頁
【非特許文献２７】Ｏｈ「Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．」１９９８年，第４７巻，２８３〜９３頁
【非特許文献２８】Ｒａｊａｈら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」１９９７年，第２７２巻，１２１８１〜８頁
【非特許文献２９】Ｈｏｎｇら「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２００２年，第２７７巻，１０４８９〜９７頁
【非特許文献３０】Ｌｅｅら「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．」２００２年，第６２巻，３５３０〜７頁
【非特許文献３１】Ｃｏｌｌａｒｄら「Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ」２００３年，第２４巻，３９３〜４０１頁
【非特許文献３２】Ｈａｍｐｅｌら、「Ｊ．Ｕｒｏｌ．」、１９９８年、第１５９巻，２２２０〜５頁
【非特許文献３３】Ｋａｔｓａｒｏｓら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」、２００１年、第３７巻，４７８〜８５頁
【非特許文献３４】Ｍａｎｎｈａｒｄｔら、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」、２０００年、第２０巻，６４８３〜９５頁
【非特許文献３５】ＨａｒｒｉｓおよびＣｈｅｓｓ、「Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．」、２００３年、第２巻，２１４〜２１頁
【非特許文献３６】Ｒｏｍａｎｏら、「Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ」、２０００年、第１８巻，１９〜３９頁
【非特許文献３７】Ｃｒｙｓｔａｌ、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」、１９９５年、第１巻，１５〜７頁
【非特許文献３８】Ｍａｈら、「Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．」、２００２年、第４１巻，９０１〜１１頁
【非特許文献３９】Ｄｕｃｈら、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」、１９９４年、第６８巻，５５９６〜６０１頁
【非特許文献４０】ＣｈａｎｇおよびＨｅ、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．」、２００１年、第３巻，４６８〜７５頁
【非特許文献４１】Ｎａｌｄｉｎｉ、「Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、１９９８年、第８巻，４５７〜６３頁
【非特許文献４２】ＧａｌｉｍｉおよびＶｅｒｍａ、「Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００１年、第２６１巻，２４５〜５４頁
【非特許文献４３】Ｋｌｉｍａｔｃｈｅｖａら、「Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ」、１９９９年、第４巻、Ｄ４８１〜９６
【非特許文献４４】ＹｅｅおよびＺａｉａ、「Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．」、２００１年、第２６巻，１５９〜７４頁
【非特許文献４５】ＤｅｇｌｏｎおよびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ、「Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００１年、第２６１巻，１９１〜２１０頁
【非特許文献４６】ＳａｌｍｏｎおよびＴｒｏｎｏ、「Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２６１巻，２１１〜２８頁
【非特許文献４７】ＡｍａｄｏおよびＣｈｅｎ、「Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第２６１巻，２２９〜４４頁
【非特許文献４８】Ｎａｗｒｏｃｋｉら、「Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．」、２００１年、第１巻，１９３〜２０４頁
【非特許文献４９】Ｋｏｙａら、「Ｌｅｕｋｅｍｉａ、」２００２年、第１６巻，１６４５〜５４頁
【非特許文献５０】Ｓｔｒｉｐｅｃｋｅら、「Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．」、２００３年、第３１巻，２８〜３７頁
【非特許文献５１】Ｙｕら、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．」、２００１年、第８巻，６２８〜３５頁
【非特許文献５２】Ｋｏｎｇら、「Ｉｎ  Ｖｉｖｏ」、２００３年、第１７巻，１５３〜６頁
【非特許文献５３】Ｄｅｌ  Ｐａｌｍａら、「Ｎａｔ．Ｍｅｄ．」、２００３年、第９巻，７８９〜９５頁
【非特許文献５４】Ｄｉｎｇｌｉら「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．」、２００３年、第１０２巻，４８９〜９６頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍または悪性疾患部位における治療レベルのＩＧＦＢＰ−３またはｍＩＧＦＢＰ−３の産生のための方法に関する。標的組織において活性なプロモーターに作動可能に連結したＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含有するレンチウイルスベクターが、腫瘍部位またはその近くに送達される。レンチウイルスベクターは、プロモーターに作動可能に連結されたＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を、細胞内に送達し、その細胞においてその遺伝子が、細胞ＤＮＡの中に安定に組込まれる。上記プロモーターは細胞から分泌される生物活性ＩＧＦＢＰ−３タンパク質または生物活性ｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質の合成を命令する。生物活性ＩＧＦＢＰ−３タンパク質または生物活性ｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質は、癌細胞の細胞周期を阻害し、前立腺癌、乳癌、結腸癌および肺がんにおいてアポトーシスを誘導する。
【００１９】
前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸部癌および肺癌を、レンチウイルスベクターにより送達されるＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を用いて処置することは、長期の安定なＩＧＦＢＰ−３タンパク質の発現を生じる。レンチウイルスベクターにより命令された外因性ＩＧＦＢＰ−３タンパク質または外因性ｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質の発現は、腫瘍増殖を抑制し、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸部癌および肺癌において癌細胞のアポトーシスを誘導する。
【００２０】
本発明者らは、患者において腫瘍部位で局所的な治療レベルのＩＧＦＢＰ−３タンパク質およびｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質を発現する、ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含有するレンチウイルスベクターを送達することにより、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸部癌および肺癌を処置するための方法を記載する。上記方法は、レンチウイルスベクターを、直接注入（単なる直接注入ではなく種々の送達方法が特定される「発明の詳細な説明」の「送達」を参照のこと）を使用して腫瘍部位または近くに投与する工程を包含する。上記ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含有するレンチウイルスベクターは、他の癌処置と一緒に送達され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、腫瘍部位において治療有効量のＩＧＦＢＰ−３またはｍＩＧＦＢＰ−３を送達するプロモーターに作動可能に連結されたＩＧＦＢＰ−３またはｍＩＧＦＢＰ−３の遺伝子を有するレンチウイルスベクターを投与することにより、患者において癌または悪性疾患を処置する方法に関する。そのような癌または悪性疾患としては、前立腺癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、子宮頸部癌および肺癌ならびにＩＧＦＢＰ−３またはｍＩＧＦＢＰ−３に反応する他の癌が挙げられる。
【００２２】
望ましいＩＧＦＢＰ−３をコードする本発明の方法に使用する遺伝物質は、Ｈｏｎｇらから得られ得るか、または分子生物学的方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ，編）Ｗｉｌｅｙ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ）により作製され得る。ヒトＩＧＦＢＰ−３遺伝子配列が、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号、Ｍ３１１５９、ＢＣ０００１３、Ｍ３５８７８、ＮＭ＿０００５９８、およびＸ６４８７５に記載され、ウシＩＧＦＢＰ−３遺伝子配列が、ＮＭ＿１７４５５６、ＡＹ３５５４３９、ＣＢ２２３２０６、ＡＦ３０５７１２、およびＡＦ３０５１９９に記載され、マウス配列が、ＮＭ＿００８３４３およびＸ８１５８１に記載され、そしてラット配列が、ＮＭ＿０１２５８８に記載される。ＩＧＦＢＰ−３遺伝子全体、またはＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩに結合することが出来るタンパク質をコードするその断片のいずれかが、ｍＩＧＦＢＰ−３を生成する基礎として使用され得る。
【００２３】
本明細書で使用される、ｍＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩのいずれかに結合するＩＧＦＢＰ−３の能力を減少または消失させるが癌細胞においてアポトーシスを誘導する能力を維持する、あらゆる変異体をいう。例としては、ヒトｍＩＧＦＢＰ−３は、Ｈｏｎｇらに記載されるＩＧＦＢＰ−３におけるＩｌｅ５６、Ｔｙｒ５７、Ａｒｇ７５、Ｌｅｕ７７、Ｌｅｕ８０およびＬｅｕ８１の位置にあるアミノ酸の１以上が変化する変異を含む。ｍＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドによるＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩへの結合を減少または消失させる結果をもたらす、部位特異的変異が、化学的方法、酵素的方法または組換え方法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）により遺伝子に導入され得る。１以上のヌクレオチドの変化が、ｍＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドの合成を命令するようにＩＧＦＢＰ−３遺伝子に導入され得る。特定のヌクレオチド変化が、特定のアミノ酸をコードする３つのヌクレオチドのうちの１以上で起こって、そのアミノ酸を変化させ、そしてｍＩＧＦＢＰ−３を生成し得る。上記ヌクレオチド変化は、Ｈｏｎｇ等により記載されているものには限定されず、ｍＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩへ結合する能力を減少または消失させるが、癌細胞におけるアポト−シスを誘導する能力は維持する如何なる変異も含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」とは、哺乳動物のＩＧＦＢＰ−３またはｍＩＧＦＢＰ−３をいい、好ましくはヒトのＩＧＦＢＰ−３またはｍＩＧＦＢＰ−３をいう。「遺伝子」とは、ＩＧＦＢＰ−３の全てまたは部分をコードする遺伝子、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、核酸、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはその断片もしくはその部分であり得る。この遺伝子は、イントロンを含み得る。上記ＩＧＦＢＰ−３遺伝子は、ヌクレオチド配列を変化させ、かつ１以上のアミノ酸配列を変化させ得る、一般的集団において記載される天然の多型を含む。非限定的例としては、断片または部分とは、少なくとも７０〜１００ヌクレオチド以上の核酸断片を含む。上記遺伝子は、化学的方法、酵素的方法または組換え的方法により作製され得る。上記ＩＧＦＢＰ−３遺伝子はまた、ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子に連結して、リーダー配列またはＮ末端もしくはＣ末端に付加的アミノ酸配列を、あるいは融合タンパク質（例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）コードする付加的遺伝子配列を含み得る。
【００２５】
本明細書で使用される「生物活性」があるＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドとは、ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドの活性と、必ずしも同一である必要はないが、同様な活性を示す、ポリペプチドをいう。上記生物活性ＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドは、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと結合し、癌細胞の細胞周期を阻害しそしてアポト−シスを誘導する。生物活性ｍＩＧＦＢＰ−３は、ＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩと結合する能力を減少または消失させるが、癌細胞の増殖を阻害し、ＤＮＡ合成を阻害し、そしてアポトーシスを誘導する能力を維持することを示す。用量依存性は、Ｈｏｎｇらにより記載されるｍＩＧＦＢＰ−３ポリペプチドと同一ではないかもしれない。
【００２６】
本明細書で使用される「レンチウイルスベクター」とは、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２またはサル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ免疫不全ウイルスもしくはウシ免疫不全ウイルス、またはレンチウイルスに基づく、他の哺乳動物種に感染し得るベクターを包含する。本発明の方法に使用するためのよく開発された系は、ＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターを用いる。この系は、ＡｉｌｌｅｓおよびＮａｌｄｉｎｉ［Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１６、３１〜５２］に概説される。レンチウイルスベクターは、ヒトにおける使用のための安全性プロフィールを増大するよう大きく改変されてきた。元のウイルス配列のほんの１０％のみが、転移ベクターに残存する。一般的にそのようなベクターは、複製欠損性である。レンチウイルスベクターを産生するのに必要なパッケージング細胞は、組換えを最小化するように４種までの別個のプラスミドでトランスフェクトされる。
【００２７】
上記レンチウイルスベクターにおいてＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、構成的であっても、誘導性であってもよく、そして前立腺特異的、結腸直腸特異的、肺特異的、乳房特異的などのように組織特異的であり得る。ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子のリーダー配列は、同種由来であっても、または異種由来であってもよい。ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子は、イントロンを含む全長遺伝子、ｃＤＮＡ、その遺伝子もしくはｃＤＮＡの断片、またはそれらの組合せであり得る。レンチウイルスベクターは、誘導性プロモーターに作動可能に結合されるか、またはＩＲＥＳ（内部リボソームエントリーサイト）を介して作動可能に結合された別の治療遺伝子または自殺遺伝子または例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼのような毒素遺伝子を含み得る（ｄｅ  Ｆｌｉｐｅ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２、３５５〜７８）。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」とは、１以上の薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と一緒にＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含むレンチウイルスベクターを含み、そして他の活性成分を含み得る。薬学的組成物の処方は、等張水性滅菌溶液もしくは懸濁液または非水性滅菌溶液もしくは懸濁液であり得る。好ましい処方は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であり得る。ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ヒスチジン、グリシン、ゼラチン、コラーゲン、ポリビニルピロリドンなどの他のキャリアが、ＰＢＳ溶液中に存在し得る。キャリアのリストは、網羅的ではない。薬学的調製物は、４℃、−２０℃または−８０℃で保管され得、患者に投与する前に、室温に戻されるか、あるいは粉末または乾燥処方物から再構成される。
【００２９】
上記ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含むレンチウイルスベクターは、注入または局所適用を含む、種々の経路で患者に投与され得る。レンチウイルスベクター薬学的処方物は、シリンジを使用して組織部位に注入され得る。注入部位は、腫瘍内、血管内、皮下、筋肉内または腹腔内であり得る。上記薬学的処方物は、局所的に手術部位、例えば原発性腫瘍の切除後に、適用され得る。さらに上記処方物は、吸入投与のためにエアロゾル化され得る。上記ベクターはまた、例えば血球細胞または幹細胞のような宿主細胞に、エクスビボでそして宿主に再導入された形質導入細胞に曝露され得る。
【００３０】
レンチウイルスベクターは、他の癌処置とともに薬学的処方物として送達され得る。例えば、トポイソメラーゼ（例えば、カンプトテシン）処方物、チューブリン結合因子（例えば、パクリタキセル）処方物、アルキル化剤（例えば、クロラムブシル）処方物、代謝拮抗剤（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）処方物または免疫抑制剤（例えば、デキサメタゾン）処方物は、レンチウイルスベクター処方物と混合され得、再処方され得、患者に注入され得るか、または局所的に適用され得る。
【００３１】
レンチウイルスベクター処置は、他の癌治療、例えば外科的介入、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、免疫療法、寒冷療法などと組み合わせられ得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、患者は、癌または悪性疾患と医師に診断されたヒトである。癌は、種々の組織もしくは器官に発生またはあり、限定されないが、前立腺、乳房、乳腺上皮、結腸、結腸直腸、卵巣、頸部および肺が含まれる。この患者は、早期癌または後期癌であり得る。他の癌処置は、ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含む薬学的処方物を含むレンチウイルス薬学的処方物による処置の前、同時または後で適用され得る。
【００３３】
治療用量とは、癌または悪性疾患を改善したり、減少させたり除去したりするＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含むレンチウイルスベクターの量をいう。ＩＧＦＢＰ−３遺伝子またはｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含むレンチウイルスベクターの量は、投与の経路、適用される組織および患者の状態（例えば、年齢、体重および性別、ならびに癌もしくは悪性疾患の重篤さ、これらは全て医師もしくは開業医により決定される）に依存して変化する。治療有効性および毒性は、治療用量および毒性用量の範囲を決定するために細胞培養および動物モデルを使用する標準的手順により決定され得る。レンチウイルスベクターの用量の測定は、培養における細胞の感染および限界希釈により決定され得るか、ｐ２４カプシドタンパク質（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を測定するＥＲＩＳＡを基礎にし得る。好ましい用量は、高有効指標および低毒性指標を有する用量である。ヒト患者における癌の治療処置のための形質導入単位（ＴＵ）により測定されるレンチウイルスベクターの範囲は、１０５〜１０１０ＴＵ／用量の範囲にわたる。
【００３４】
上記ベクターは、ＩＧＦＢＰ−３またはｍＩＧＦＢＰ−３を産生するのに使用され得る。従って、細胞がトランスフェクトされ、培養され、発現された導入遺伝子が標準技術を使用して得られ得る。適切な宿主細胞としては、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、昆虫細胞などが挙げられる。上記細胞は、例えば、乳細胞、肺細胞、前立腺細胞、上皮細胞などのような特定の器官型または組織型であり得る。
【００３５】
以下の非限定的な実施例は、対象の本発明を例証するために提供される。
【実施例】
【００３６】
（実施例１．ヒトＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含むレンチウイルスベクターの構築、およびこのベクターが形質導入された哺乳動物細胞において生物活性ＩＧＦＢＰ−３の合成を支配し得ることの証明）
ヒトＩＧＦＢＰ−３遺伝子は、Ｈｏｎｇらより入手可能である。あるいは、ＩＧＦＢＰ−３遺伝子は、ｃＤＮＡライブラリー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して単離し得る。２つのプライマーである、５’−ＴＧＧＡＴＴＣＣＡＣＡＧＣＴＴＣＧＣＧＣＣＧＴ−３’および５’−ＧＣＡＴＡＴＴＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＴＴＡＡＣＴＴＧ−３’を使用し、ヒトＩＧＦＢＰ−３コード領域を含むＤＮＡを生成し得る（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【００３７】
ｍＩＧＦＢＰ−３遺伝子を生成するために、アミノ酸Ｉｌｅ５６、Ｔｙｒ５７、Ａｒｇ７５、Ｌｅｕ７７、Ｌｅｕ８０、およびＬｅｕ８１などをコードするＩＧＦＢＰ−３遺伝子のヌクレオチド配列に変化を導入するように、ＩＧＦＰＢ−３遺伝子を鋳型として使用し、製造者の指示に従って部位特異的突然変異誘発を使用して、ｍＩＧＦＢＰ−３に変換する。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ；Ｍｕｔａ−Ｇｅｎｅ  Ｐｈａｇｅｍｉｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ；Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ（登録商標）ＩＩ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ。
【００３８】
レンチウイルスベクターは、Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２，９８７３−８０；Ｙａｍら、（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，４７９−８４；およびＬｏｇａｎら、（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３，４２９−３６に記載され、商業的供給元（例えば、ＶｉｒａＰｏｗｅｒＴＭ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＬｅｎｔｉＰａｋＴＭ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ））から得ることができる。これらのベクターは、ｃＤＮＡの挿入のために都合が良い制限酵素切断部位を有し、かつＣＭＶプロモーターを含む。上記ＩＧＦＢＰ−３遺伝子を、その同種由来のシグナル配列およびポリ（Ａ）部位と組み合わせて導入する。このベクタープラスミド構築物を、リン酸カルシウム沈殿により、２つのコアパッケージングプラスミド（ｃｏｒｅ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ）およびＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドに、同時トランスフェクトする。２０μｇ（４５０μｌ）のプラスミド混合物を、１０％ＦＢＳを含むＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）で増殖した５×１０６個の２９３細胞（ＣＲＬ−１５７３，ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含む１００ｍｍ皿へ添加する。トランスフェクションの１６時間後に新鮮な培地を添加し、新鮮な培地の添加から２４時間後に、馴化培地を回収する。この培地を低速の遠心分離により除き、０．２μの酢酸セルロースフィルターを通して濾過し、そして−８０℃にて保管する。そのウイルス調製物の力価（形質導入単位（ＴＵ））を、２９３細胞の限定希釈を使用する定量ＰＣＲおよびｐ２４カプシドタンパク質ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を使用する総ウイルス粒子の計測により、決定する。
【００３９】
レンチウイルスベクター調製物（１０７ＴＵ／ｍｌ）を、２×１０５個の細胞で播種したＨｅｌａ細胞に添加する。培地を４８時間で回収し、その培地中のＩＧＦＢＰ−３タンパク質を、ヒトＩＧＦＢＰ−３に対して特異的な抗体を使用してＥＬＩＳＡにより定量する。このＥＬＩＳＡは、ＩＧＦＢＰ−３およびｍＩＧＦＢＰ−３を検出し得る。
【００４０】
（実施例２．ＩＧＦＢＰ−３特異的活性の測定）
２９３細胞の５枚の１００ｍｍプレートを、実施例１に記載されるようにトランスフェクトする。実施例１に記載されるように、馴化培地をトランスフェクトの２４時後および４８時間後に回収し、プールし、処理する。この培地を、ｐ２４カプシドタンパク質およびＴＵ／ｍｌについて特徴付ける。実施例１に記載されるように、この馴化培地をＨｅｌａ細胞に添加し、これらの培養物由来のＩＧＦＢＰ−３を含む馴化培地を２４時後および４８時間後に回収する。
【００４１】
この培地を、スピンカラムを使用して、ＩＧＦＢＰ−３タンパク質約１０μｇ／ｍｌに濃縮する。ＩＧＦＢＰ−３タンパク質産生をＥＬＩＳＡにより定量し、１μｇ／ｍｌを、ヒトＰＣ−３前立腺癌細胞におけるアポトーシスを誘導する能力について試験する。細胞を２４時間および７２時間に回収し、アポトーシスを、アポトーシスＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）により測定する。レンチウイルス指向性ＩＧＦＢＰ−３により誘導されたアポトーシスレベルは、類似の濃度を使用してＥ．ｃｏｌｉにおいて産生された組み換えＩＧＦＢＰ−３に匹敵する。
【００４２】
（実施例３．インビトロでの前立腺癌細胞における形質導入効率）
上記ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ−３を、１〜５のＭＯＩでＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含むレンチウイルスベクターで形質導入する。４８時間後、その細胞の半分を回収し、形質導入された細胞のパーセンテージを、レンチウイルスベクターに特異的なプライマーを使用して定量ＰＣＲにより測定する。同様に４８時間にて、その細胞の残りの半分を回収し、ＥＬＩＳＡによるアポトーシス測定のために処理する。培地を回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＧＦＢＰ−３タンパク質産生について定量する。
【００４３】
（実施例４．予めヒト前立腺癌細胞を接種された雄性ヌードマウスを処理することによる、遺伝子送達を介して送達されたＩＧＦＢＰ−３の、腫瘍増殖および血管形成の軽減についての有効性の決定、ならびにＩＧＦＢＰ−３遺伝子送達  対  ＩＧＦＢＰ−３タンパク質蓄積の送達の有効性の比較）
コホート当たり５匹の動物の４つのヌードマウスコホートを、以下：１）未処置コントロール、２）ＩＧＦＢＰ−３レンチウイルスベクターでの処置、３）ｍＩＧＦＢＰ−３タンパク質での処置、および４）コントロールのレンチウイルスベクターで試験する。３×１０６個のＰＣ−３腫瘍細胞を、各ヌードマウスの前立腺に注射する。腫瘍の注射から７〜１０日後、（実施例３において規定される）３つの濃度のうちの１つの濃度のＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含むレンチウイルスベクターを、シリンジを使用してマウスの１つのコホートの各腫瘍部位に注射する。ポジティブコントロールとして、ＩＧＦＢＰ−３タンパク質を、動物の別のコホートの腫瘍部位に注射する。ネガティブコントロールとして、マウスの第三のコホートに生理食塩水を注射し、第四のコホートにＩＧＦＢＰ−３遺伝子を含まないレンチウイルスベクターを注射する。１２週間後、そのマウスを屠殺し、前立腺および周囲の組織を、肉眼で切開により露出させ（ｇｒｏｓｓ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）、組織病理学および免疫組織化学により試験する。ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲにより、ＩＧＦＢＰ−３タンパク質発現の存在、ＩＧＦＢＰ−３  ＲＮＡ転写物およびＩＧＦＢＰ−３レンチウイルスＤＮＡの存在を測定する。
【００４４】
本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月1日(2006.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007516727000001.app
【国際調査報告】
2007516727.tif 000002
2007516727.tif 000003
2007516727.tif 000004