(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの第１ドメイン及び定常部のＦｃ免疫グロブリンドメインから選択された第２のドメインを含有する融合タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）生物活性のあるポリペプチドを含有する、少なくとも１つの第１ドメイン
と
（ｉｉ）定常部の免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する、異種の第２ドメイン
とを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）は融合していて、その際融合領域中には第１ドメインと第２ドメインとの間に少なくとも１つのアミノ酸の重なりがある、融合タンパク質。
【請求項２】
第１ドメインは、レセプターのリガンド結合ドメイン及びリガンドのレセプター結合ドメインから選択される、請求項１記載の融合タンパク質。
【請求項３】
第１ドメインは、膜結合型レセプターの細胞外ドメイン又はそのリガンド結合フラグメントを含有する、リガンド結合レセプタードメインである、請求項１又は２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
レセプターは、デスレセプター、成長因子レセプター及びサイトカインレセプターから選択される、請求項２又は３記載の融合タンパク質。
【請求項５】
レセプターはＣＤ９５、ＴＲＡＩＬレセプター、ＴＮＦレセプター及びＶＥＧＦレセプターから選択される、請求項４記載の融合タンパク質。
【請求項６】
第１ドメインはレセプター結合リガンドドメインである、請求項１又は２記載の融合タンパク質。
【請求項７】
リガンドは、デスリガンド、成長因子及びサイトカインから選択される、請求項１から６までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項８】
リガンドはＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ及びＩＬ−１５から選択される、請求項７記載の融合タンパク質。
【請求項９】
少なくとも１つの第１ドメインはヒトのタンパク質に由来する、請求項１から８までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
第２ドメインは、定常部の重鎖の免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する、請求項１から９までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
第２ドメインは、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、場合によって少なくとも一部のヒンジ領域とを含有する、定常部の重鎖の免疫グロブリンドメインのＦｃフラグメントである、請求項１から９までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
第２ドメインは、定常部のＩｇＧ免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する、請求項１から１１までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
第２ドメインは、定常部のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリンドメイン又はその変異体の少なくとも一部を含有する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
免疫グロブリンドメインはエフェクター機能、特にＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣから選択されたエフェクター機能を示す、請求項１から１３までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
第２ドメインはヒトの免疫グロブリンに由来する、請求項１から１４までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
重なりは、アミノ酸１、２又は３つの長さを有する、請求項１から１５までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
第１ドメインのカルボキシ末端のアミノ酸の少なくとも１つが、第２ドメインのアミノ末端のアミノ酸の少なくとも１つと重なる、請求項１から１６までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
融合領域には、一つのドメインの最後のアミノ酸と、もう一つのドメインの最初のアミノ酸との間に非自然発生的な移行部がない、請求項１から１７までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
第１ドメイン及び／又は第２ドメインは、有利には６つまでのアミノ酸の欠失を有する、請求項１から１８までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
第１ドメイン及び／又は第２ドメインは、有利には６つまでのアミノ酸の付加を有する、請求項１から１９までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
Ｎ末端のシグナル配列を含有する、請求項１から２０までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
Ｎ末端のシグナル配列を有しない、請求項１から２０までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
重なりアミノ酸配列は、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｔ、Ｐ及びＤから選択される、請求項１から２２までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
第１ドメインはヒトＣＤ９５の細胞外ドメインである、請求項１から２３までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ＣＤ９５の細胞外ドメインは、ヒトＣＤ９５の、アミノ酸１７０、１７１、１７２又は１７３までのアミノ酸配列を含有する、請求項２４記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
図３Ａ及び図３Ｂに示されたアミノ酸配列を含有する、請求項２５記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
第１ドメインはヒトＴＲＡＩＬレセプターの細胞外ドメインである、請求項１から２３までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
ヒトＴＲＡＩＬレセプターは、ヒトＴＲＡＩＬレセプター−１、ヒトＴＲＡＩＬレセプター−２、ヒトＴＲＡＩＬレセプター−３及びヒトＴＲＡＩＬレセプター−４から選択される、請求項２２記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
図５、図７、図８、図１０、図１２、図１３又は図１５に示されたアミノ酸配列を含有する、請求項２８記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
第１ドメインはヒトＴＮＦレセプターの細胞外ドメインである、請求項１から２３までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
ヒトＴＮＦレセプターは、ヒトＴＮＦレセプター−１及びヒトＴＮＦレセプター−２から選択される、請求項３０記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
図１７又は図１９に示されたアミノ酸配列を含有する、請求項３１記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
請求項１から３２までのいずれか１項記載の融合タンパク質又はその前駆体をエンコードする核酸分子。
【請求項３４】
操作により、発現制御配列に連結した、請求項３３記載の核酸分子。
【請求項３５】
ベクターに位置する、請求項３３又は３４記載の核酸分子。
【請求項３６】
請求項３３から３５までのいずれか１項記載の核酸分子で形質転換又はトランスフェクションされた細胞。
【請求項３７】
原核細胞である、請求項３６記載の細胞。
【請求項３８】
真核細胞、有利には哺乳類の細胞、より有利にはヒト細胞である、請求項３７記載の細胞。
【請求項３９】
請求項３３から３５までのいずれか１項記載の核酸分子で形質転換又はトランスフェクションした、非ヒトの有機体。
【請求項４０】
請求項１から３２までのいずれか１項記載の融合タンパク質、又は請求項３３から３５までのいずれか１項記載の核酸分子を活性剤として含有する、医薬組成物。
【請求項４１】
第１ドメインは、アポトーシスに関連した疾患の予防及び／又は治療における使用のための可溶性デスレセプターである、請求項４０記載の組成物。
【請求項４２】
第１ドメインは細胞外ＣＤ９５ドメインである、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心疾患、例えば心筋梗塞、移植片対宿主疾患、例えば移植拒絶、脊髄損傷、例えば対麻痺、敗血症、肝炎、炎症に関連した疾患、虚血性再灌流傷害、及び腎疾患から選択される疾患の予防及び／又は治療における使用のための請求項４１又は４２記載の組成物。
【請求項４４】
（ｉ）生物活性のあるポリペプチドを含有する、少なくとも１つの第１ドメイン
と
（ｉｉ）減少した免疫原性の可能性を有する定常部の免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する第２ドメイン
とを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）は融合していて、その際第１ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸の重なりによって第２ドメインに融合している、融合タンパク質の製造方法。
【請求項４５】
（ｉ）生物活性のあるポリペプチドを含有する、少なくとも１つの第１ドメイン
と
（ｉｉ）融合タンパク質を多量化することが可能である異種の第２ドメイン
とを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）は融合していて、その際融合領域中には第１ドメインと第２ドメインとの間に少なくとも１つのアミノ酸の重なりがある、融合タンパク質。
【請求項４６】
第１ドメインは、膜結合型レセプターの細胞外ドメイン又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項４５記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
レセプターは、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬレセプター、及びＴＮＦレセプターから選択される、請求項４６記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
第１ドメインはレセプター結合リガンドドメインである、請求項４８記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
リガンドはＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＩＬ、及びＴＮＦから選択される、請求項４８記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
第２ドメインは、Ｃ１ｑ、ＭＢＰ、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｄ、ＢＣ、ＣＬ４３及びＡＣＲＰ３０及びＣＯＭＰ又はＥＤＡのコラーゲンドメイン、又は機能的に活性のあるこれらの誘導体から選択されるタンパク質の、多量化部を含有する、請求項４５から４９までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
第２ドメインは、融合タンパク質を二量化、三量化、四量化又は五量化することが可能である、請求項４５から５０までのいずれか１項記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの生物活性のあるポリペプチドドメインと、定常部の免疫グロブリンから選択された第２のドメインとを含有する融合タンパク質に関する。
【０００２】
免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖二量体、又は免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖四量体を含有する融合タンパク質はＥＰ−Ａ−０５２６４５２に記載されていて、前記融合タンパク質中ではレセプター、担体タンパク質、ホルモン、成長因子、又は酵素である、リガンド結合パートナーのアミノ酸配列により、少なくとも１つの免疫グロブリン鎖の可変領域は置換されている。免疫グロブリンＦｃフラグメントに融合した、デスレセプターＣＤ９５（ＡＰＯ−１；Ｆａｓ）の細胞外ドメインを含有する融合タンパク質は、ＷＯ９５／２７７３５に記載されている。免疫グロブリンＦｃフラグメントに場合によって融合した、ＡＰＯ−１分子のＮ末端で切断された誘導体はＥＰ−Ａ−０９６５６３７に開示されている。可溶性のＩＬ−１５ＲαとＦｃフラグメントとを含む融合タンパク質はＷＯ９８／３６７６８に開示されている。アンタゴニストＩＬ−１５変異体とＦｃ  ＩｇＧ２ａフラグメントとを含む融合タンパク質は、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０  （１９９８）、  ５７４２−５７４８）によって開示されている。前記文献は引用によって本発明に組み込まれる。
【０００３】
上記した融合タンパク質は高い生物活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて有することが示されてきたが、前記分子の免疫原性の可能性に関しては、懸念がある。というのも異なる起源の２つのタンパク質ドメインの間には、非自然発生的なアミノ配列を含有する融合領域があり、これは融合タンパク質が投与される有機体において、好ましくない免疫反応を誘発する可能性があるからである。
【０００４】
ＷＯ０２／０６６５１４は人工融合タンパク質を記載し、これはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて種に暴露する場合に、親の非改変分子に比較して減少した免疫原性を有する。前記タンパク質はほぼ免疫グロブリン分子又はそのフラグメントからなり、そのＣ末端を介して共有結合的に、生物活性のある非免疫グロブリン分子、有利にはそのポリペプチド又はタンパク質又は生物活性のあるフラグメントのＮ末端に融合している。前記分子は、１つ以上のアミノ酸残基の位置において変更されたアミノ酸配列を有するが、しかし原則として非変更分子と比較して同様の生物活性を有する。変更は、Ｔ細胞エピトープとして同定される、前記分子の領域においてなされ、前記エピトープは生きた宿主において免疫反応に寄与する。前記方法の不利な点は、しかし、全てのエピトープ、特にＢ細胞エピトープが確実に除去され得ないことである。更に、非自然発生的なアミノ酸配列の導入は、新生エピトープの発生を生じる可能性がある。
【０００５】
従って本発明の課題は、異なる起源の少なくとも２つのドメインを有する、減少した免疫原性の可能性を有する融合タンパク質を提供することである。
【０００６】
従って、本発明は、
（ｉ）生物活性のあるポリペプチドを含有する、少なくとも１つの第１ドメインと
（ｉｉ）定常部の免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する、異種の第２ドメイン
とを含有し、その際融合領域中には第１ドメインと第２ドメインとの間に少なくとも１つのアミノ酸の重なりがある、融合タンパク質に関する。
【０００７】
融合タンパク質は単量体タンパク質又は多量体タンパク質、例えば二量体タンパク質又は四量体タンパク質であってよく、前記多量体タンパク質は定常部の免疫グロブリンドメインを介した多量化によって形成されてよい。
【０００８】
本発明によれば、融合タンパク質の設計は、ｉ）少なくとも１つの第１ドメイン及び、第１ドメインとは異種である第２ドメインの選択、かつｉｉ）第１ドメイン及び第２ドメインに共通な、少なくとも１つの末端アミノ酸の選択を有し、例えば第１ドメインの最後のアミノ酸の１つ又は複数は、これが第２ドメインの最初のアミノ酸の１つ又は複数と同一であるように選択される。有利には、重なりはアミノ酸１つ、２つ、又は３つの長さを有する。従って、一つのドメインの最後のアミノ酸と、もう一つドメインの最初のアミノ酸との間に非自然発生的な移行部のない融合タンパク質が得られる。
【０００９】
本発明の実施態様において、１つ又は複数の第１ドメインは融合タンパク質のＮ末端に位置し、その一方で第２ドメインはＣ末端に位置する。従ってこの実施態様において、第１ドメインのカルボキシ末端アミノ酸の少なくとも１つは、第２ドメインのアミノ末端酸の少なくとも１つと重なっている。
【００１０】
本発明の更なる実施態様において、第２ドメインは融合タンパク質のＮ末端に位置し、かつ１つ又は複数の第１ドメインはＣ末端に位置する。従ってこの実施態様において、第２ドメインの少なくとも１つのカルボキシ末端アミノ酸は、第１ドメインの少なくとも１つのアミノ末端酸と重なっている。
【００１１】
融合タンパク質が１つより多い、例えば２つ又は３つの第１ドメインを含有する場合には、前記ドメインは有利には融合タンパク質のＮ末端又はＣ末端に連続的に位置し、かつ第２ドメインはそれぞれ、Ｃ末端又はＮ末端に位置する。前記タンパク質における第１ドメインは同一又は異なっていてよいことに留意されたい。個々の第１ドメインの間の移行部は有利には、個々の第１ドメインの間に、少なくとも１つのアミノ酸の重なり（及び従って一つのドメインの最後のアミノ酸ともう一つのドメインの最初のアミノ酸との間には非自然発生的でない移行部）も存在するように設計されている。複数の第１ドメインを含有する融合タンパク質はＷＯ００／１８９３２に開示されていて、これは引用によって本発明に組み込まれる。
【００１２】
融合タンパク質の第１ドメインは生物活性のあるポリペプチド、例えば細胞又は有機体中のその天然の環境において、相互作用することが可能な、例えば、結合パートナー（例えば別のポリペプチド）に結合することが可能なポリペプチドで、かつ有利には薬理活性を示すことが可能なポリペプチドを含有する。第１ドメインは有利には非免疫グロブリンポリペプチドである。第１ドメインは所望の、例えば上昇した又は減少した生物活性を有する自然発生的なポリペプチド又はその変異体、又は自然発生的なポリペプチド又はその変異体のフラグメントであってよい。第１ドメインは有利には、レセプターのリガンド結合ドメイン及びリガンドのレセプター結合ドメインから選択されてよい。「リガンド」及び「レセプター」という用語は、本発明に関連して、リガンドはレセプター分子に特異的に結合する働きをすることが公知であるタンパク質と定義されていると理解される。「レセプター」という用語は、疎水性膜貫通領域又はリン脂質アンカーを有する、可溶性レセプタータンパク質又は膜結合型レセプタータンパク質を含む。更に、「レセプター」という用語は、ホルモン、細胞接着タンパク質、レクチン、成長因子、酵素、その他と同様に担体タンパク質を含む。
【００１３】
本発明の有利な実施態様において、第１ドメインは、膜結合型レセプターの細胞外ドメイン又はそのリガンド結合フラグメントを含有する、リガンド結合レセプタードメインである。レセプターは有利には、デスレセプター、成長因子レセプター及びサイトカインレセプターから選択される。より有利には、レセプターはＣＤ９５（ＡＰＯ−１；Ｆａｓ）、ＴＲＡＩＬレセプター、ＴＮＦレセプター、ＶＥＧＦレセプター、インターロイキンレセプター、例えばＩＬ−１５Ｒαから選択される。最も有利にはレセプターは、ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬレセプター、例えばＴＲＡＩＬレセプター−１、ＴＲＡＩＬレセプター−２、ＴＲＡＩＬレセプター−３、又はＴＲＡＩＬレセプター−４又はＴＮＦレセプター、例えばＴＮＦレセプター−１又はＴＮＦレセプター−２である。
【００１４】
更なる実施態様において、第１ドメインはレセプター結合リガンドドメインである。リガンドは有利には、デスリガンド、例えばＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＩＬ、ＴＮＦ、例えばＴＮＦ−α、又はＴＮＦ−β、成長因子、例えばＶＥＧＦ及びサイトカイン、例えばインターフェロン又はインターロイキン、例えばＩＬ−１５又はこれらの変異体から選択される。
【００１５】
更なる実施態様において、融合タンパク質は同一であるか又は異なっていてよい複数の第１ドメインを含有する。そのような複数の融合タンパク質の有利な例は、ＶＥＧＦ  トラップ（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ）融合タンパク質であり、これはＶＥＧＦレセプター１（Ｆｌｔ−１）の第２細胞外ドメインを、ＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ／ＦＩＫ−１）の第３ドメイン及びＩｇＧ定常領域と共に含有する。
【００１６】
第１ドメインタンパク質は有利には哺乳類のタンパク質であり、より有利にはヒトのタンパク質である。治療の目的のためには、特にヒトのタンパク質の使用が有利である。
【００１７】
融合タンパク質の第２ドメインは、定常部の免疫グロブリンドメイン、例えば定常部の重鎖の免疫グロブリンドメイン又は定常部の軽鎖の免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する。有利には、第２ドメインは定常部の重鎖の免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する。定常部の重鎖の免疫グロブリンドメインは有利には、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインと、場合によって少なくとも一部のヒンジ領域とを含有するＦｃフラグメントである。免疫グロブリンドメインはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ免疫グロブリンドメイン又は、前記ドメイン由来の改変された免疫グロブリンドメインであってよい。有利には、第２ドメインは、定常部のＩｇＧ免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する。ＩｇＧ免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ドメインから、又は例えばＵＳ５９２５７３４に記載された改変したドメインから選択されてよい。免疫グロブリンドメインはエフェクター機能、特にＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣから選択されたエフェクター機能を示してよい。いくつかの実施態様においてはしかし、改変されたエフェクター機能、例えば少なくとも部分的に欠如したエフェクター機能を有する、改変された免疫グロブリンドメインが使用される。
【００１８】
本発明の融合タンパク質の設計には、第１ドメイン及び第２ドメインの１つ又は複数の末端アミノ酸の選択を含み、これは両方のドメインの間にアミノ酸の重なりを少なくとも１つ作成するためである。前記目的を達するために、第１ドメイン及び／又は第２ドメインから１つ又は複数のアミノ酸を欠失させること、及び／又は、自然発生的な隣接ドメインからの１つ又は複数のアミノ酸を第１ドメイン及び／又は第２ドメインへ付加することが通常は必要である。例えば、自然発生的なドメイン境界部からの、有利には１０つまでの、より有利には６つまでのアミノ酸、例えば１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸の欠失を有する第１ドメインを提供することが必要である可能性がある。その一方で、自然発生的な隣接ドメインからの、有利には１０つまでの、より有利には６つまでのアミノ酸、例えば１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸を第１及び／又は第２ドメインに付加することが必要である可能性がある。アミノ酸を欠失及び／又は付加させる場合には、しかし、第１ドメイン及び／又は第２ドメインの生物活性が不利に影響されないように配慮しなくてはならない。
【００１９】
本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端のシグナル配列を有してよく、前記シグナル配列は組み換え発現後の宿主細胞からの分泌を可能にする。シグナル配列は、融合タンパク質の第１ドメインと相同的なシグナル配列であってもよい。又は、シグナル配列は非相同シグナル配列、例えばＩｇκ又はＩｇλシグナルペプチド配列であってよい。異なる実施態様においては、融合タンパク質はＮ末端配列がなく、従って融合タンパク質の成熟した状態を表す。
【００２０】
第１ドメインと第２ドメインとの間の重なり、又は２つの第１ドメインの間の重なりは、有利にはアミノ酸１、２又は３つの長さを有する。より有利には、重なりはアミノ酸１つの長さを有する。重なりアミノ酸の例は、Ｓ、Ｅ、Ｋ、Ｈ、Ｔ、Ｐ及びＤである。
【００２１】
本発明は、複数の特定の有利な実施態様に関して、以下に詳細に説明される。しかし、本発明の更なる融合タンパク質は、類似の方法により製造されてよいことに留意されたい。
【００２２】
第１の有利な実施態様において、第１ドメインはヒトＣＤ９５の細胞外ドメインである。融合タンパク質の細胞外ドメインは有利には、ヒトＣＤ９５の、アミノ酸１７０、１７１、１７２又は１７３までのアミノ酸配列を含有する。有利には、ＣＤ９５の細胞外ドメインはヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメント、例えばヒトＩｇＧ１  Ｆｃフラグメントに融合している。ヒトＣＤ９５分子のアミノ酸配列は図１に示されている。ヒトＩｇＧ１鎖の定常部のドメインのアミノ酸配列は図２に示されている。特に有利には、図３Ａ及び図３Ｂに示されたアミノ酸配列を含有する融合タンパク質であり、その際重なりアミノ酸配列はＳである。
【００２３】
更に特に有利な実施態様において、第１ドメインはヒトＴＲＡＩＬレセプター、例えばヒトＴＲＡＩＬレセプター−１、ヒトＴＲＡＩＬレセプター−２、ヒトＴＲＡＩＬレセプター−３、及びヒトＴＲＡＩＬレセプター−４の細胞外ドメインである。細胞外ドメインは有利には、アミノ酸２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９（ＴＲＡＩＬＲ−１）、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０（ＴＲＡＩＬＲ−２  長い）、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１（ＴＲＡＩＬＲ−２  長い−反復なし）、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４（ＴＲＡＩＬＲ−２  短い）、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、（ＴＲＡＩＬＲ−３）、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１（ＴＲＡＩＬＲ−３  反復なし）及び２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１（ＴＲＡＩＬＲ−４）までのアミノ酸配列を含有する。特に有利にはヒトＴＲＡＩＬレセプター−２である。細胞外ヒトＴＲＡＩＬレセプタードメインはヒトＩｇＧ−１  Ｆｃフラグメントと融合していてよい。ヒトＴＲＡＩＬレセプターのアミノ酸配列は図４（ＴＲＡＩＬＲ−１）、図６（ＴＲＡＩＬＲ−２  長い）、図９（ＴＲＡＩＬＲ−２  短い）、図１１（ＴＲＡＩＬ−３）及び図１４（ＴＲＡＩＬＲ−４）に示されている。有利な融合タンパク質の具体的な例は、図５、図７、図８、図１０、図１２、図１３及び図１５に示されたアミノ酸配列を含有する。
【００２４】
更なる有利な実施態様において、融合タンパク質は第１ドメインを含有し、これはヒトＴＮＦレセプター、例えばヒトＴＮＦレセプター−１又はヒトＴＮＦレセプター−２の細胞外ドメインである。細胞外ドメインは有利には、アミノ酸２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１（ＴＮＦ−Ｒ１）又は２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７（ＴＮＦ−Ｒ２）までのアミノ酸配列を含有する。ヒトＴＮＦレセプターの細胞外ドメインは、ヒトＩｇＧ−１  Ｆｃフラグメントに融合していてよい。ヒトＴＮＦレセプターのアミノ酸配列は、図１６（ＴＮＦ−Ｒ１）及び図１８（ＴＮＦ−Ｒ２）に示されている。有利な融合タンパク質の具体的な例は、図１７及び図１９に示されたアミノ酸配列を含有する。
【００２５】
本発明の更なる観点は、上記した融合タンパク質をエンコードする核酸分子に関する。核酸分子はＤＮＡ分子、例えば二本鎖又は一本鎖の、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であってよい。核酸分子は、融合タンパク質又はその前駆体、例えば融合タンパク質のプレプロ型又はプロプロ型（ｐｒｏ−  ｏｒ  ｐｒｅ−ｐｒｏｆｏｒｍ）をエンコードしてよく、これは分泌又は精製のためのシグナル配列又はその他の異種のアミノ酸部分を含有してよく、これらは有利には融合タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に位置する。異種のアミノ酸部分は、第１ドメイン及び／又は第２ドメインに、プロテアーゼ分断部位、例えば第Ｘａ因子、トロンビン又はＩｇＡプロテアーゼ分断部位を介して、結合していてよい。
【００２６】
核酸分子は、発現制御配列、例えば所望の宿主細胞において核酸分子の発現を可能にする発現制御配列に、操作により（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）、連結していてよい。核酸分子は、ベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ、ウィルスベクター、染色体組込みベクター、その他に位置していてよい。適した発現制御配列及びベクターの例は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）、  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓによって説明されている。
【００２７】
様々な発現ベクター／宿主細胞系を本発明の融合タンパク質をエンコードする核酸配列を発現するために使用してよい。適した宿主細胞は、原核細胞、例えば細菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ、真核宿主細胞、例えば酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞又は動物細胞、有利には哺乳類の細胞及び、より有利にはヒト細胞を含むが、前記細胞に限定されない。
【００２８】
更に本発明は、上記した核酸分子で形質転換又はトランスフェクションした非ヒトの有機体にも関する。前記トランスジェニック有機体を、相同組換えを含む遺伝的伝達の公知の方法によって発生させてよい。
【００２９】
本発明の更なる観点は、上記した、少なくとも１つの、融合タンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸分子を活性剤として含有する医薬組成物に関連する。更に有利な実施態様において、第１ドメインは、アポトーシスに関連した疾患の予防及び／又は治療における使用のための、可溶性デスレセプター、例えば上記したデスレセプターの細胞外ドメインである。最も有利には、第１ドメインは細胞外ＣＤ９５ドメインである。
【００３０】
本発明の実施態様において、組成物は、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心疾患、例えば心筋梗塞、移植片対宿主疾患、移植拒絶、脳損傷、例えば脳卒中、脊髄損傷、例えば対麻痺、敗血症、肝炎、炎症に関連した疾患、虚血性再灌流傷害、及び腎疾患から選択される疾患の予防及び／又は治療において使用されてよい。前記疾患及び更なる疾患は、デスレセプター融合タンパク質、特にＣＤ９５融合タンパク質の投与によって治療されてよく、これはＷＯ９５／２７７３５、ＷＯ９９／５０４１３、ＷＯ０１／４１８０３、ＥＰ−Ａ−０９６５６３７及びＥＰ−Ａ−０９９２２４３に記載されていて、これは本発明に引用によって組み込まれる。
【００３１】
融合タンパク質は、これを必要とする被験体、特にヒト患者に、特定の症状の治療のために十分な用量において、適した方法によって投与される。例えば、融合タンパク質は薬剤学的に許容可能なキャリアー、希釈剤及び／又は佐剤と共に、医薬組成物として処方されてよい。治療の効能及び毒性は標準的なプロトコルに従って決定されてよい。医薬組成物は全身に、例えば腹腔内に、筋肉内に、又は静脈内に、又は局所的に、例えば鼻腔内に、皮下に又は髄腔内投与されてよい。有利には、静脈内投与である。
【００３２】
特に有利には、デスリガンドレセプター阻害剤、例えばＦｃフラグメントに融合した、可溶性の細胞外ＣＤ９５又はＴＲＡＩＬレセプターのドメインである。
【００３３】
投与される融合タンパク質の用量は勿論、治療される被験体、被験体の重量、損傷のタイプ及び重傷度、投与の方法、及び処方する医師の判断に依存する。ＣＤ９５又はＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質の投与のためには、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇの一日量が適している。
【００３４】
更に本発明は、
（ｉ）生物活性のあるタンパク質を含有する、少なくとも１つの第１ドメイン
と
（ｉｉ）減少した免疫原性の可能性を有する定常部の免疫グロブリンドメインの少なくとも一部を含有する第２ドメインとを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）は融合していて、その際第１ドメインが、少なくとも１つのアミノ酸の重なりによって第２ドメインに融合している、融合タンパク質の製造方法に関する。
【００３５】
また更に本発明の観点は：
（ｉ）生物活性のあるポリペプチドを含有する、少なくとも１つの第１ドメイン
と
（ｉｉ）融合タンパク質を多量化することが可能である異種の第２ドメインとを含有し、前記（ｉ）及び（ｉｉ）は融合していて、その際融合領域中には第１ドメインと第２ドメインとの間に少なくとも１つのアミノ酸の重なりがある、融合タンパク質に関する。
【００３６】
第３のタンパク質の非存在下で融合タンパク質を多量化することが可能である異種の第２ドメインを含有する融合タンパク質は、例えばＷＯ０１／４９８６６及びＷＯ０２／０９０５５３に記載されていて、これらは引用によって本発明に組み込まれる。融合タンパク質中の第１ドメインと第２ドメインとの間の少なくとも１つのアミノ酸の重なり、例えば１つ、２つ又は３つのアミノ酸の重なりの存在により、−上記に説明したように−、減少した免疫原性の可能性を有する融合タンパク質が生じる。
【００３７】
前記の多量化する融合タンパク質中の第１ドメインは、前述のように定義される。有利には、第１ドメインは、膜結合型レセプターの細胞外ドメイン、又はそのリガンド結合フラグメントである。特に有利には、レセプターはＣＤ９５、ＴＲＡＩＬレセプター、特にＴＲＡＩＬレセプター−２及びＴＮＦレセプター、特にＴＮＦレセプター−２から選択される。又は、第１ドメインは、レセプター結合リガンドドメインであってよく、その際リガンドは有利にはＣＤ９５リガンド、ＴＲＡＩＬ及びＴＮＦから選択される。有利な第１ドメインの具体例は上記の通りである。
【００３８】
融合タンパク質の第２ドメインは、タンパク質の多量化部を含有する。有利には、第２ドメインは、融合タンパク質を二量化、三量化、四量化又は五量化することが可能である。これに関連して、特にＷＯ０１／４９８６６及びＷＯ０２／０９０５５３の開示が参照され、これは本発明に引用によって組み込まれる。第２ドメインの有利な例は、Ｃ１ｑ、ＭＢＰ（マンノース結合タンパク質）、ＳＰ−Ａ（肺サーファクタントタンパク質−Ａ）、ＳＰ−Ｄ（肺サーファクタントタンパク質−Ｄ）、ＢＣ（ウシ血清コングルチニン）、ＣＬ４３（ウシコレクチン−４３）、ＡＣＲＰ−３０（Ｃ１ｑ  ファミリーからのタンパク質）及びＣＯＭＰ  （軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質）、又はＥＤＡのコラーゲンドメイン、又は機能的に活性のあるこれらの誘導体である。特に有利には、ＡＣＲＰ−３０の一部、特にヒトＡＣＲＰ−３０タンパク質の一部、例えばＣＯＭＰのアミノ酸１８〜１０８、又は１８〜１１０である。
【００３９】
前述したように、融合タンパク質の第１ドメインの１個又は複数は、Ｎ末端又はＣ末端に、かつ第２ドメインはＣ末端又はＮ末端に位置してよい。更に、第１及び第２ドメインの両方は、有利には同じ種から、より有利にはヒト起源からであってよい。更に、免疫グロブリンをベースとした融合タンパク質の有利な実施態様に関する特徴は、多量化する融合タンパク質にも当てはまる。
【００４０】
融合タンパク質の減少した免疫原性の可能性は、融合タンパク質中の第１ドメインと第２ドメインとの間の、非自然発生的な移行部がないことに起因し、これは次に、２つの異種ポリペプチド間の融合に起因する新生エピトープの形成に対して減少した可能性を生じる。
【００４１】
本発明は以下の図及び実施例によって更に説明される。
【００４２】
図の説明
図１：ヒトＣＤ９５（ＡＰＯ−１；Ｆａｓ）タンパク質のアミノ酸配列；
図２：ヒトＩｇＧ−１鎖のＣ領域のアミノ酸配列；
図３Ａ及び３Ｂ：重なりアミノ酸を有するＣＤ９５−Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例；
図４：ヒトＴＲＡＩＬレセプター−１のアミノ酸配列；
図５：重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−１  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例；
図６：ヒトＴＲＡＩＬレセプター−２（長い形）のアミノ酸配列；
図７：反復配列を含む、重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−２（長い）Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例；
図８：重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−２（長い形）Ｆｃ融合タンパク質の有利な例（反復配列なし）；
図９：ヒトＴＲＡＩＬＲ−２（短い形）のアミノ酸配列；
図１０：重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−２（短い）Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例
図１１：ヒトＴＲＡＩＬレセプターＲ−３のアミノ酸配列；
図１２：重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−３  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例（反復含む）；
図１３：重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−３  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例（反復含めない）；
図１４：ヒトＴＲＡＩＬレセプター−４のアミノ酸配列；
図１５：重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−４  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例；
図１６：ヒト腫瘍壊死因子レセプター−１のアミノ酸配列；
図１７：重なりアミノ酸を有するＴＮＦＲ−１  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例；
図１８：ヒト腫瘍壊死因子レセプター−２のアミノ酸配列；
図１９：重なりアミノ酸を有するＴＮＦ−Ｒ−２  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例。
【００４３】
実施例１
重なりアミノ酸を有する、ヒトＣＤ９５細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインとを含む融合タンパク質。
【００４４】
ヒトＣＤ９５細胞外ドメイン
ヒトＣＤ９５（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ６３７１７）の塩基２２１〜７３６。Ｏｅｈｍ、Ａ．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＰＯ−１  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ、ａ  Ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ／Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６７巻、１５号、１０７０９〜１０７１５頁、１９９２から利用した配列。ｃＤＮＡを、ドナー血液からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離した全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによってオリゴｄＴプライマーを用いて作成した。ＰＣＲをＣＤ９５の細胞外ドメインのｃＤＮＡを増幅させるために使用し、制限ＨｉｎｄＩＩＩ部位及びコザック配列を細胞外ドメインの５′に、及び３′にＢｇｌ  ＩＩ部位（細胞外ドメインの末端）を含めた
Ｔａｑポリメラーゼを用いた、ＣＤ９５  ｃＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー：
センス  ｈｕＣＤ９５−ＨｉｎｄＩＩＩ：
ＴＡＴＡ  ＡＡＧＣＴＴ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＴＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）
アンチセンス  ｈｕＣＤ９５−Ｂｇｌ  ＩＩ：ＴＡＴＡ  ＡＧＡＴＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）。
【００４５】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン
配列：２０５０〜２７４５ｂｐ。Ｅｌｌｉｓｏｎ、Ｊ．、「Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃ  ｇｅｎｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、  １０巻  １３号、１９８２から使用した配列。ｃＤＮＡを、ドナー血液からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離した全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによってオリゴｄＴプライマーを用いて作成した。プライマーの５′に制限Ｂｇｌ  ＩＩ部位及び、プライマーの３′に停止コドンの後にＸｈｏ  Ｉ部位を含めて、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（一部のヒンジ−ＣＨ３）のｃＤＮＡを増幅させるためにＰＣＲを用いた。
【００４６】
Ｔａｑポリメラーゼを用いた、ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｃＤＮＡの増幅のためのＰＣＲプライマー：
センス  ｈｕＩｇＧＦｃ−ＢｇｌｌＩ  ＴＡＴＡ  ＡＧＡＴＣＴ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３）
アンチセンス  ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ−Ｘｈｏｌ：ＴＡＴＡ  ＣＴＣＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４）
クローニング方法：
増幅後、ＩｇＧ１  Ｆｃ  ＰＣＲ産物を、Ｂｇｌ  ＩＩ及びＸｈｏ  Ｉで消化した。ＣＤ９５  ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌ  ＩＩで、及びｐｃＤＮＡ３．１（ＣＭＶプロモーターを有する）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏ  Ｉで消化した。前記産物をゲル抽出（Ｑｉａｇｅｎ  ｋｉｔ）によって精製した。
ｈｕＩｇＧ１ＦｃとＣＤ９５フラグメントとを、Ｔ４リガーゼを用いてｐｃＤＮＡ３．１中に連結した。Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ  １０、ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｅ．Ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから#Ｃ４０４０−１０発注）のトランスフェクション及び増幅後、プラスミド調整をＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔで実施した。
【００４７】
ｐｃＤＮＡ３．１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩで、ＣＤ９５ＥＣをＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩで、ｈｕｌＩｇＧ１ＦｃをＢｇｌＩＩ及びＸｈｏＩで消化することで、３点連結を実施した。ｐｃＤＮＡ３．１中のＣＤ９５−ｈｕＩｇＧ１挿入の存在は、塩基配列決定法及び制限酵素法により確認した。挿入を含有するベクターをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａｌで消化し、挿入をＥＦ−１プロモーターを含有するｐｃＤＮＡ３．１に連結した。
【００４８】
もともとのＣＤ９５−Ｆｃコンストラクトのコザック配列構造を、ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣからＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧへと、プライマーＳＥＱＩＤ５及びＳＥＱＩＤ６での全ＣＤ９５−Ｆｃ産物の増幅によって変化させた。
【００４９】
ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣからＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧへコザック配列を変更するためのプライマー：
ＳｈｕＣＤ９５ＥＣ＿ａｌｔＫｏｚａｋ      ＴＡＴＡ  ＡＡＧＣＴＴ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＣ  ＡＴＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５）
ＡＳ６９８  ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ−Ｘｈｏ１    ＴＡＴＡ  ＣＴＣＧＡＧ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＡＣＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）
クローニング方法：
ＰＣＲ産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（発注#Ｋ４８００−０１）からのｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５  Ｈｉｓ  Ｔｏｐｏベクターにおいてクローン化し、ｐＥＦプロモーターを含有するｐｃＤＮＡ３．１と同様にＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＸｂａ  Ｉで消化し、Ｔ４リガーゼで連結した。
【００５０】
発現及び単離
最終産物をエンコードするコンストラクトをタンパク質発現に適した細胞系中にトランスフェクションした。トランスフェクションを、この分野における当業者に公知の、全ての標準的な方法によって実施してよい。例には、エレクトロポレーション、リポソームにより媒介された伝達、リン酸カルシウムのトランスフェクションを含む。発現に適した細胞系には２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、及びＣＨＯ細胞を含む。その他の細胞系も使用してよい。
【００５１】
前記例において、２９３Ｔ細胞をリン酸カルシウム法により一過的にトランスフェクションした。又は、ＣＨＯ細胞をＦｕＧｅｎｅ６を利用してトランスフェクションし、安定なクローンを選択した。
【００５２】
所望のタンパク質は、細胞培養培地から、クロマトグラフィー法によって精製されてよい。方法には、プロテインＧ又はプロテインＡカラムに対するアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は前記方法の組み合わせを含むが、これらに限定はされない。
実施例においては、上清をＩｇＧカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）において、製造者の指示に従って精製し、これにより単一の工程において高度に精製された産物が生じた。
【００５３】
実施例２．
重なりアミノ酸を有する、ＴＲＡＩＬレセプター−２とヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインとを含有する融合タンパク質
ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン：
Ｅｌｌｉｓｏｎ、  Ｊ．、「Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃ  ｇｅｎｅ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１０巻  １３号、１９８２．から使用した配列。ｃＤＮＡをドナー血液からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離した全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲにより、オリゴｄＴプライマーを用いて作成した。ＴＲＡＩＬＲ２に対する重なり配列を５′末端に及び３′末端に停止コドン後にＥｃｏＲＩ部位を有するヒトＩｇＧ１Ｆｃ（部分的なヒンジ−ＣＨ３）のｃＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを使用した。
【００５４】
Ｉ．プライマー：センス＿ｈｕＩｇＧ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７）
ｃｃａ  ｇｇｇ  ａｃｔ  ｃｃｔ  ｇｃｃ  ＴＣＴ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ  ＴＧ  （大文字＝＞ｈｕＩｇＧ１の一部）
ＩＩ．プライマー：アンチセンス＿ＥＲＩｈｕＩｇＧ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８）
ＴＡＴＡ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｔｃａ  ｔｔｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ａｇａ  ｃａｇ  ｇｇ
ＴＲＡＩＬＲ２：
Ｗａｌｃｚａｋ  Ｈ．、「ＴＲＡＩＬ−Ｒ２：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＴＲＡＩＬ」  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １６巻、１７号、５３８６−５３９７ページ、１９９７．（受け入れ番号ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０１６８４９）ｃＤＮＡを、ドナー血液からの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から単離した全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲによってオリゴｄＴプライマーを用いて作成した。制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ及びコザック配列を５′末端に及び３′末端にヒトＩｇＧ１に対する重なり配列を含有させて、ＴＲＡＩＬＲ２のｃＤＮＡを増幅するためにＰＣＲを使用した。
【００５５】
ＩＩＩ．プライマー：センス＿ＨＩＩＩ＿ＴＲＡＩＬＲ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）
ＴＡＴＡ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ａｃｃ  ａｔｇ  ｇａａ  ｃａａ  ｃｇｇ  ｇｇａ  ｃａｇ  ａａｃ
ＩＶ．プライマー：アンチセンス＿ＴＲＡＩＬＲ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
ｇｔｇ  ａｇｔ  ｔｔｔ  ｇｔｃ  ａｃａ  ａｇａ  ＧＧＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＣＣＣ  ＴＧＧ  （大文字＝＞ｈｕＴＲＡＩＬ−Ｒ２の一部、逆に）
クローニング方法：
増幅後、改変した挿入を単離するためにゲル抽出を実施した。次に、両方のフラグメントを使用する第３のＰＣＲを実施した。両方のフラグメントの重なり及び末端のプライマーのために、前記ＰＣＲは１つの産物へと連結する。その後で、産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、適した発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。
【００５６】
ＩＩＩ．プライマー：センス＿ＨＩＩＩ＿ＴＲＡＩＬＲ２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
ＴＡＴＡ  ａａｇ  ｃｔｔ  ｇｃｃ  ｇｃｃ  ａｃｃ  ａｔｇ  ｇａａ  ｃａａ  ｃｇｇ  ｇｇａ  ｃａｇ  ａａｃ
ＩＩ．プライマー：アンチセンス＿ＥＲＩｈｕＩｇＧ１  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）
ＴＡＴＡ  ｇａａ  ｔｔｃ  ｔｃａ  ｔｔｔ  ａｃｃ  ｃｇｇ  ａｇａ  ｃａｇ  ｇｇ
発現
コンストラクトをクローン化し、適した宿主細胞において、実施例１に記載したように発現させた。
【００５７】
実施例３．
脊髄損傷後の再生及び機能回復のための、ＣＤ９５−Ｆｃコンストラクトの使用。
【００５８】
実施例１に記載した、アミノ酸の重なりを有するＣＤ９５−Ｆｃコンストラクトを、Ｄｅｍｊｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｎａｔ  Ｍｅｄ．（Ｍａｒｃｈ  ７、  ２００４）によって記載されたマウスモデルにおいて、脊髄損傷の治療のために使用した。コンストラクトの投与は、脊髄損傷後の再生及び機能回復を促進することが見出された。
【００５９】
実施例４．
脳卒中における脳損傷を弱めるための、ＣＤ９５−Ｆｃコンストラクトの使用。
【００６０】
重なりアミノ酸を有するＣＤ９５−Ｆｃコンストラクトを、第一次性虚血性死及び第二次性炎症損傷におけるその影響について、マウスモデルにおいてＭａｒｔｉｎ−Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．  ８  （２００１）、  ６７９−６８６）によって記載されたように検討した。ＣＤ９５−Ｆｃコンストラクトの投与は、梗塞の体積及び死亡率において、顕著な減少を生じた。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１はヒトＣＤ９５（ＡＰＯ−１；Ｆａｓ）タンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図２はヒトＩｇＧ−１鎖のＣ領域のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは重なりアミノ酸を有するＣＤ９５−Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例を示す図である。
【図４】図４はヒトＴＲＡＩＬレセプター−１のアミノ酸配列を示す図である。
【図５】図５は重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−１  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例を示す図である。
【図６】図６はヒトＴＲＡＩＬレセプター−２（長い形）のアミノ酸配列を示す図である。
【図７】図７は反復配列を含む、重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−２（長い）Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例を示す図である。
【図８】図８は重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−２（長い形）Ｆｃ融合タンパク質の有利な例（反復配列なし）を示す図である。
【図９】図９はヒトＴＲＡＩＬＲ−２（短い形）のアミノ酸配列を示す図である。
【図１０】図１０は重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−２（短い）Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例を示す図である。
【図１１】図１はヒトＴＲＡＩＬレセプターＲ−３のアミノ酸配列を示す図である。
【図１２】図１２は重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−３  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例（反復含む）を示す図である。
【図１３】図１３は重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−３  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例（反復含めない）を示す図である。
【図１４】図１４：ヒトＴＲＡＩＬレセプター−４のアミノ酸配列を示す図である。
【図１５】図１５は重なりアミノ酸を有するＴＲＡＩＬＲ−４  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例を示す図である。
【図１６】図１６はヒト腫瘍壊死因子レセプター−１のアミノ酸配列を示す図である。
【図１７】図１７は重なりアミノ酸を有するＴＮＦＲ−１  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例を示す図である。
【図１８】図１８はヒト腫瘍壊死因子レセプター−２のアミノ酸配列を示す図である。
【図１９】図１９は重なりアミノ酸を有するＴＮＦ−Ｒ−２  Ｆｃ  ＩｇＧ１融合タンパク質の有利な例を示す図である。
【図１】
2007524365.tif 000002
【図２】
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2007524365.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
2007524365.tif 000021
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