(57)【要約】  本発明はII型糖尿病の予防及び／又は治療の方法に関するもので、また、シグナル伝達経路におけるインシュリンシグナルを増強するために、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を増す方法に関するものであり；更に、II型糖尿病の予防及び／又は治療に有用な、抽出物質及びその後、選択的にその活性なｎ−ブタノール分画及び活性分子ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る簡便で安価な方法であり；最後に、その医薬用組成物に関するものである。  【選択図】    なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要がある被験体のII型糖尿病の予防及び／又は治療の方法であり、該方法が薬学的に有効な量の、植物クズの抽出物又は抽出物のブタノール分画、又はルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を、随意的に添加剤と共に被験体に投与する方法。
【請求項２】
被験体が動物である、請求項１に記載された方法。
【請求項３】
被験体がヒトである、請求項１に記載された方法。
【請求項４】
抽出物が植物の根から得られる、請求項１に記載された方法。
【請求項５】
添加剤がタンパク質、炭化水素、砂糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルローズ、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒などの様な栄養素からなるグループから選択されたものである、請求項１に記載された方法。
【請求項６】
その分画が１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される、請求項１に記載された方法。
【請求項７】
ルピノシドが１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される、請求項１に記載された方法。
【請求項８】
投与経路が経口、経静脈、経筋肉及び経皮から成る群から選択される、請求項１に記載された方法。
【請求項９】
II型糖尿病を予防及び／又は治療するに有用な医薬用組成物であり、該組成物は植物クズの抽出物、又は抽出物のブタノール分画、又はルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）及び添加剤から成る組成物。
【請求項１０】
添加剤がタンパク質、炭化水素、砂糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルローズ、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒などの様な栄養素からなるグループから選択されたものである、請求項９に記載された医薬用組成物。
【請求項１１】
抽出物が植物の根から得られる、請求項９に記載された医薬用組成物。
【請求項１２】
その分画の濃度範囲が１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項９に記載された医薬用組成物。
【請求項１３】
ルピノシドの濃度範囲が１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項９に記載された医薬用組成物。
【請求項１４】
その組成物がカプセル、シロップ、濃縮物、粉末及び顆粒から成る群から選択される形である、請求項９に記載された医薬用組成物。
【請求項１５】
抽出物が水性抽出物である、請求項９に記載された医薬用組成物。
【請求項１６】
その必要のある被験体のシグナル伝達経路上のインシュリンシグナルを促進するために、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を増加させる方法であり、該方法は医薬的に有効量の植物クズ抽出物又は抽出物のブタノール分画又はルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を随意的に添加剤と共に被験体に投与する方法。
【請求項１７】
被験体が動物である、請求項１６に記載された方法。
【請求項１８】
被検体がヒトである、請求項１６に記載された方法。
【請求項１９】
抽出物が植物の根から得られた、請求項１６に記載された方法。
【請求項２０】
添加剤がタンパク質、炭化水素、砂糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルローズ、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒などの様な栄養素からなるグループから選択されたものである、請求項１６に記載された方法。
【請求項２１】
その分画が１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される、請求項１６に記載された方法。
【請求項２２】
ルピノシドが１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される、請求項１６に記載された方法。
【請求項２３】
該方法がII型糖尿病を予防／治療するのに役立つ、請求項１６に記載された方法。
【請求項２４】
該方法が細胞のグルコース取り込みの増加を示す、請求項１６に記載された方法。
【請求項２５】
該方法が細胞に非毒性である、請求項１６に記載された方法。
【請求項２６】
移行がインシュリン応答細胞の細胞質から膜への移行である、請求項１６に記載された方法。
【請求項２７】
ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）がパルミチン酸塩が引き起こすインシュリンシグナル上の障害を阻止する、請求項１６に記載された方法。
【請求項２８】
ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）がインシュリンによるＩＲ−β及びＡｋｔリン酸化の促進を可能にする、請求項１６に記載された方法。
【請求項２９】
ａ．植物器官を小部分に切断する工程、
ｂ．切断した器官をメタノール及び水で抽出する工程、
ｃ．メタノール及び水抽出物を酢酸エチルと水の間で分配する工程、
ｄ．水層を更にｎ−ブタノールで抽出し、ブタノール分画を得る工程、及び、
ｅ．ｎ−ブタノール分画をクロマトグラフィーにかけ、水及びメタノールを溶出液とし、ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る工程
から成る、II型糖尿病の予防及び／又は治療に有用な抽出物質及びその後、選択的にその活性なｎ−ブタノール分画及び活性分子ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る簡便で安価な方法。
【請求項３０】
その植物器官が根である請求項２９に記載された方法。
【請求項３１】
その溶媒がメタノール及び水から成る群から選択されるものである請求項２９に記載された方法。
【請求項３２】
水とメタノールの比が約１：１である請求項２９に記載された方法。
【請求項３３】
クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである請求項２９に記載された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、II型糖尿病の予防及び／又は治療の方法に関し、また、シグナル伝達経路におけるインシュリンシグナルを増強するために、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を増す方法に関し、更に、II型糖尿病の予防及び／又は治療に有用な抽出物質及びその後、選択的にその活性なｎ−ブタノール分画及び活性分子ルピノシドＰＡ４（Lupinoside PA, LPA4）をも得る簡便で安価な工程に関し、最後に、その医薬用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
潜行性の病気であるII型インシュリン耐性―糖尿病は糖尿病症例の９５％以上の原因となっている。この均質でない疾病は流行となって増加しており、世界的に見たこの疾患の発生率は毎年６％以上増加が予想されている１，２。この疾病は当初、骨格筋、脂肪及び肝臓へのグルコース処理に欠陥がある高血糖症の形で発現し、次第にこれらの臓器はインシュリンに非応答になり、又はインシュリン耐性になる３，４。諸遊離脂肪酸（ＦＦＡｓ）がインシュリン不活化の原因であることを支持する多くの証拠が蓄積されてきた。ＦＦＡｓの循環量が増加すると、インシュリン機能が損なわれ、また一般的に、肥満及びII型糖尿病と結びつく５−７。脂質注入により血漿ＦＦＡ濃度が増すと、ラット及びヒト骨格筋においてインシュリン耐性が引き起こされる７−９。分離した筋肉片又は培養筋肉細胞とＦＦＡとのインキュベート、又は骨格筋中のリポタンパクリパーゼ発現によって、インシュリンが介在するグルコースの取り込みが減少する６−１２。これらの報告は、インシュリン感受性組織において、脂質の沈着が増すと、インシュリン反応低下及び耐性がもたらされることを示唆する。ＦＦＡによるインシュリン活性の阻害はインシュリンシグナル異常と関係しているであろう。ＦＦＡによるグルコース輸送の低下は、ＩＲＳ−１リン酸化、ＩＲＳ−１関連のホスファチジルイノシトール−３リン酸キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）等のインシュリンに感作された活性化が、ＦＦＡによって阻害されることと関係する１３−１５。チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）処理は、標的組織におけるインシュリン作用を抑えるＦＦＡ循環を減少させ、インシュリン活性を改善する１６−１８．ＰＰＡＲγ活性化により脂肪細胞のグリセロールキナーゼ遺伝子発現を誘導することで、ＴＺＤはトリグリセリドにグリセロール取り込みを増し、脂肪細胞からのＦＦＡ分泌を減少させ、このようにしてインシュリン感作に役立つ１９。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明の主要な目的はII型糖尿病を予防及び／又は治療する方法を開発することである。
本発明の他の主要な目的は、シグナル伝達経路におけるインシュリンシグナルを増強するために、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を促進する方法を開発することである。
更に、本発明の他の主要な目的は、II型糖尿病の予防及び／又は治療に有用な抽出物質及びその後、選択的にその活性なｎ−ブタノール分画及び活性分子ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る簡便で安価な工程を開発することである。
更に、本発明の他の主要な目的は、II型糖尿病を予防及び／又は治療するための医薬用組成物を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明はII型糖尿病の予防及び／又は治療の方法に関するもので、また、シグナル伝達経路におけるインシュリンシグナルを増強するために、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を促進する方法に関するものであり；更に、II型糖尿病の予防及び／又は治療に有用な抽出物質及びその後、選択的にその活性なｎ−ブタノール分画及び活性分子ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る簡便で安価な工程に関するものであり；最後に、その医薬用組成物に関するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
本発明は、従って、II型糖尿病の予防及び／又は治療の方法に関するもので、また、シグナル伝達経路におけるインシュリンシグナルを増強するために、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を促進する方法に関するものであり；更に、II型糖尿病の予防及び／又は治療に有用な、抽出物質及びその後、選択的にその活性なｎ−ブタノール分画及び活性分子ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る簡便で安価な工程に関するものであり；最後に、その医薬用組成物に関するものである。
本発明の他の実施態様において、本発明は必要な被検体のII型糖尿病を防止する及び／又は治療する方法に関するものであり、該方法には、植物クズ（Ｐｕｒｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓａ）の抽出物、又は抽出物のブタノール分画、又はルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を、適宜、添加剤と共に被検体に対して、医薬学的に有効量投与する段階がある。
【０００６】
本発明の他の実施態様において、被験体は動物である。
本発明の他の実施態様において、被験体はヒトである。
本発明の他の実施態様において、本分画を１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与する。
本発明の他の実施態様において、本発明は、ルピノシドが１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される、請求項１に記載された方法に関するものである。
本発明の他の実施態様において、本発明は投与経路が経口、経静脈、経筋肉及び経皮下から成る群から選択されるものである、請求項１に記載された方法に関するものである。
本発明の他の実施態様において、本発明はII型糖尿病を予防する及び／又は治療するに有用な医薬用組成物であり、該組成物は植物クズの抽出物、又は抽出物のブタノール分画又はルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）及び添加剤から成る。
本発明の他の実施態様において、添加剤はタンパク質、炭化水素、糖類、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬学的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒から成る群から選択される。
【０００７】
本発明の他の実施態様において、抽出物は植物の根から得られる。
本発明の他の実施態様において、本分画は１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲である。
本発明の他の実施態様において、ルピノシドは１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲である。
本発明の他の実施態様において、本組成物はカプセル、シロップ、濃縮飲料、粉末及び顆粒から成るグループから選択した形をとる。
本発明の他の実施態様において、抽出物は水性抽出物である。
本発明の他の実施態様において、本発明は必要とする被検体にシグナル伝達経路のインシュリンシグナルを増強するために、その方法が植物クズの抽出物、又は抽出物のブタノール分画、又はルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を、適宜添加剤と共に医薬学的に有効量を被検体に対し投与することから成る、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を促進する方法に関するものである。
【０００８】
本発明の他の実施態様において、添加物は、タンパク質、炭化水素、糖類、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルローズ、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒、の様な栄養物から成る群から選択されるものである。
本発明の他の実施態様において、本分画は１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される。
本発明の他の実施態様において、ルピノシドは１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される。
本発明の他の実施態様において、本方法はII型糖尿病を予防及び／又は治療することに役立つ。
本発明の他の実施態様において、本方法は細胞によるグルコース取り込みを増加させることを示す。
本発明の他の実施態様において、本方法は細胞に対し毒性がない。
本発明の他の実施態様において、移行は細胞質からインシュリン応答細胞の膜へのものである。
本発明の他の実施態様において、ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）は、インシュリンシグナル伝達上でパルミチン酸塩により引き起こされる障害から守る。
本発明の他の実施態様において、ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）は、インシュリンにＩＲ−ベーター及びＡｋｔリン酸化を刺激させる。
【０００９】
本発明の他の実施態様において、本発明は、ａ．植物器官を小部分に切断する工程、
ｂ．切断した器官をメタノール及び水で抽出する工程、
ｃ．メタノール及び水抽出物を酢酸エチルと水の間で分配する工程、
ｄ．水層を更にｎ−ブタノールで抽出し、ブタノール分画を得る工程、及び、
ｅ．ｎ−ブタノール分画をクロマトグラフィーにかけ、水及びメタノールを溶出液とし、ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る工程
から成る、II型糖尿病の予防及び／又は治療に有用な抽出物質及びその後、選択的にその活性なｎ−ブタノール分画及び活性分子ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る簡便で安価な方法に関するものである。
本発明の他の実施態様において、植物器官は根である。
本発明の他の実施態様において、溶媒はメタノール及び水から成る群から選択される。
本発明の他の実施態様において、水及びメタノールの割合はおよそ１：１である。
本発明の他の実施態様において、クロマトグラフィーはカラムクロマトグラフィーである。
【００１０】
標的組織のインシュリン感受性の減少、又はインシュリン耐性がII型糖尿病の原因となり、この疾病は今や産業社会において流行にまでなっている。どのようにインシュリンが感受性を失うのかは尚はっきりしない。多くの証拠により、諸遊離脂肪酸（ＦＦＡｓ）がインシュリン耐性の原因となっているとされている。我々は、ＦＦＡｓの一つである、パルミチン酸塩が、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞細胞膜の２１０ＫＤａ受容体タンパク質へのインシュリンの結合を阻害することを示した。Ｋａが変わらないので、パルミチン酸塩はインシュリン結合の親和性を変化させず、インシュリンの受容体飽和度をＢｍａｘ７．３ｐＭ（インシュリン）から３．４６ｐＭ（インシュリン＋パルミチン酸塩）と顕著に減少させる。パルミチン酸塩による、インシュリンとインシュリン受容体（ＩＲ）との相互作用の阻害は、インシュリン−ＩＲ複合体の後に続く重要な標的細胞応答である、ＩＲβチロシンリン酸化の減少と同時に起こる。次ぎに我々は、ＩＲβチロシンリン酸化の後で、結果としてリン酸化される、インシュリンにより刺激された下流シグナルを吟味した。３Ｔ３Ｌ１細胞とパルミチン酸塩との２４時間インキュベーションが影響して、インシュリンにより増加するＩＲＳ１，ＰＩ３キナーゼ及びＡｋｔリン酸化は約半分に減少し、インシュリン誘導型のＧｌｕｔ４移行は完全に阻害された。
これらの結果は、パルミチン酸塩によるインシュリンシグナルの低下を示し、またインシュリン不作用を引き起こす。植物根から抽出したルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）はパルミチン酸塩により引き起こされるインシュリンシグナル伝達の障害から守る。パルミチン酸塩と共インキュベートしたＬＰＡ４は、インシュリンのＩＲβ及びＡｋｔリン酸化及びインシュリン誘導型のＧｌｕｔ４移行を促進させる。従って、ＬＰＡ４はインシュリン耐性とII型糖尿病の治療剤としての使用が約束されていることを示す。
【００１１】
これらの報告により、インシュリン耐性とII型糖尿病を引き起こす主要な化合物として、我々はＦＦＡｓに注意を向けた。以前の報告により、ＦＦＡｓの中で、パルミチン酸塩がインシュリン活性の最も効力のある阻害剤であることが分かる１２，２０−２３，しかしながらパルミチン酸塩がどの様に障害を起こすかについて疑問が残る。３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞をパルミチン酸塩、ミリスチン酸塩、ブチル化物、カプリル酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩及びリノール酸塩で２４時間前処理した後、インシュリンと３０分インキュベートし、３Ｈ−２デオキシグルコース（２−ＤＯＧ）取り込みを測定すると、パルミチン酸塩が最も強力な阻害剤であることが分かった（データ非表示）。このことから我々は、インシュリン刺激によるグルコース取り込みがパルミチン酸塩によって阻害されること、に関わるメカニズムを探索した。パルミチン酸塩とインキュベートした脂肪細胞を溶解し、膜を分離し、可溶化し、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、その後オートラジオグラフィーを行った。１２５Ｉ−インシュリン結合タンパク質はゲルの２１０ｋＤａ領域に位置したので、これは３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞において、非変性条件で界面活性剤に可溶化したインシュリン受容体に関する以前の報告の確認となった２４−２６。
【００１２】
図１ａは、パルミチン酸塩がインシュリンの受容体への結合を効果的に減少させることを示す。β―アドレナリン受容体で報告されたように２７−２９、ＩＲのパルミチン酸塩結合又はパルミトイル化は親和性に影響するのではなく、受容体飽和度を約半分にまで減少させ、Ｂｍａｘは７．３から３．４６ｐＭに減少した（図１ｂ）。１２５Ｉ−インシュリンの受容体への結合はステアリン酸塩又はミリスチン酸塩により減少しなかった（データ非表示）ので、我々はこれがパルミチン酸塩に特異的効果であると推測した。興味深いことに、放射標識したパルミチン酸塩は類似の分子量のタンパク質（１ａ）に結合し、ＩＲのパルミトイル化と示唆される。モデルを使い、この仮説の論理を図１ｃに説明する。可能なパルミトイル化の位置を同定するために、最近決定された、Ｉ型インシュリン類似成長因子受容体の結晶構造３０との相同性に基づき、ラットインシュリン受容体の最初の３個の領域の３−Ｄ構造をモデル化した。アラニン走査突然変異テストにより、インシュリン受容体（図１ｃの青緑色円の内部）のこの領域が、インシュリン結合の可能性が最も高い位置であると強く示唆される３１。
【００１３】
コンセンサスアミノ酸配列が欠けている２７ことから、パルミトイル化優先傾向は３−Ｄ構造で決定され、正荷電表面及び／又は中性表面が好まれると示唆される。モデル化した構造の表面静電ポテンシャルの計算、溶媒可触性及びシステイン残基の近接性の測定により、ＩＲのＬ１−Ｃｙｓリッチ−Ｌ２領域内の１６個のＣｙｓ対の中でパルミトイル化の為の可能性のある２対のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ−８&Ｃｙｓ−２６及びＣｙｓ−２６６&Ｃｙｓ−２７４）を定めた。パルミチン酸塩とＩＲの単なる会合は生物的関連性を意味しないので、結合が機能的な重要性と関係することを明示するために、我々はインシュリン刺激によるシグナルに対するパルミチン酸塩による妨害を研究した。最初、我々は、３Ｔ３Ｌ１細胞をパルミチン存在又は非存在下で２４時間インキュベートした後、インシュリンとのインキュベーションによって、インシュリン受容体β（ＩＲβ）のリン酸化を観測した。ＩＲβのインシュリン刺激によるリン酸化はパルミチン酸塩により顕著に減少したが、ステアリン酸塩の場合はその様な阻害効果は見られなかった（図１ｄ）。これらの結果により、ＩＲβリン酸化はインシュリン標的細胞において決定的応答であるので、パルミチン酸塩会合又は受容体のパルミトイル化は生理的な関連を有する。
【００１４】
更なる証拠を求めて、我々はインシュリンが増強した下流シグナルを吟味したが、下流シグナルは、受容体チロシンキナーゼリン酸化に続いて、結果としてリン酸化される。リン酸化特異的抗体を用いて、我々は、インシュリン刺激によるＩＲＳ−１リン酸化とＰＩ３Ｋ活性は、パルミチン酸塩により顕著に減少することを見出した。パルミチン酸塩は、Ａｋｔ活性化のような他の下流分子のインシュリンによる活性化も阻害した。しかしながら、ステアリン酸塩とのインキュベーションではその様な阻害効果を示さなかった（図２ａ）。インシュリン刺激による、ＩＲＳと関連したリン酸化及びＩＲＳ１と関連したＰＩ３Ｋ活性化がＦＦＡにより減少したこと、は既に報告されているが１３，１５，２０、本稿で我々はパルミチン酸塩単独で上記のような障害を起こすことを示した。我々の研究で観測された他の興味ある傾向は、パルミチン酸塩による阻害程度の近接性である。ウェスタンブロットの黒化度解析によると、インシュリン刺激による、ＩＲβ、ＰＩ３Ｋリン酸化及びＡｋｔリン酸化は、半分に減少した（データは非表示）。ＩＲβ、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔのタンパク質プロフィールに対し、インシュリンもパルミチン酸塩も影響を与えなかった（図２ａ）。我々の発見によると、パルミチン酸塩によるインシュリンシグナルの破壊は恐らく、ＩＲレベルに由来しており、その後、阻害は下流のシグナル分子に波及する様である。従って、ＰＩＰ３キナーゼの補充が制限されて、Ａｋｔと結びついたＰＩＰ３が阻害され、さらにＧｌｕｔ４輸送上の様々な効果がもたらされると考えられる。最後に、この方向での裏付けは、細胞内へのグルコースの取り込みに重要な、Ｇｌｕｔ４移行において得ることが出来た。インシュリン誘導型のＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４の細胞質から脂肪細胞膜への移行は、パルミチン酸塩により完全に阻害された（図２ｂ）。
【００１５】
インドにおける薬草植物の抗―糖尿病活性を探索する過程で、クズ（Ｐｕｒｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｏｓａ）根からのメタノール−水（１：１）抽出物は、パルミチン酸塩によるインシュリン活性の障害を改善することが、３Ｔ３Ｌ１細胞による３Ｈ−２ＤＯＧ取り込みによって、分かった。ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０クロマトグラフィーにより、我々は５個の分画（Ａ−Ｅ）を得、その中、分画Ｅが要求する活性を有することが分かった。Ｅ分画のセファデックスＬＨ２０クロマトグラフィーによる分画は３分画（Ｆ−Ｈ）をもたらし、Ｆ分画はパルミチン酸塩による障害を改善した。Ｆ分画を更にＨＰＬＣにより精製し単一分子を得たが、この分子は２Ｄ  ＮＭＲと質量分析によりルピノシドＰＡ４３２と同定された（図３ａ）。ＬＰＡ４の、パルミチン酸塩によるインシュリンシグナリング分子損傷に対する、防御効果を、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を使って調べた。図３ｂは、脂肪細胞における、インシュリンによる３Ｈ−２−ＤＯＧ取り込み増加の、パルミチン酸塩による減少がＬＰＡ４によって阻止されたことを示す。インシュリンによるＩＲβチロシン及びＡｋｔリン酸化に対する、パルミチン酸塩の弱化効果はＬＰＡ４により抑えられた（図３ｃ）。
【００１６】
Ａｋｔは非常に重要な下流シグナルとして知られているが、これは、インシュリン標的細胞において、細胞膜へのＧｌｕｔ４移行過程で重要なＧｌｕｔ４を活性化する３３，３４。インシュリンに応答して、Ａｋｔ２はＧｌｕｔ４を保持する媒体に補充され、成分タンパク質をリン酸化する３５。従って、インシュリンによるＡｋｔリン酸化をパルミチン酸塩が阻害すると言う障害がインシュリン耐性を引き起こすので、この経路における阻害をＬＰＡ４が抑制することは意味がある。このことは、更に、インシュリン誘導型のＧｌｕＡ４移行をパルミチン酸塩が阻害するという我々の観察を裏付ける。パルミチン酸塩と共インキュベートしたＬＰＡ４は、インシュリン誘導型の、細胞質から細胞膜へのＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４移行を、明らかに阻害しない（図３ｄ）。Ｇｌｕｔ４はインシュリン応答細胞におけるグルコースの極めて重要な担体であり、細胞表面を経由して構成的にもとに戻る。インシュリンは、細胞内位置にあるＧｌｕｔ４を盛んに隔離させ、Ｇｌｕｔ４の細胞膜への輸送速度を増加させる３２。Ｇｌｕｔ４輸送現象に関係する細胞メカニズムは大部分が謎であるが、Ｇｌｕｔ４移行障害がインシュリン耐性に関与する３４。
【００１７】
ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４移行の測定に関する我々の結果によると、パルミチン酸塩はインシュリン誘導型のＧｌｕｔ４移行を完全に阻害し、この阻害はＬＰＡ４によって完全に消失することが示された。これらの結果はインシュリン耐性又はII型糖尿病との関連で、次の理由により、とくに興味深い：（ｉ）多くの研究により、インシュリン耐性の発生過程に、ＦＦＡｓ，特にパルミチン酸塩、が関係すると見なされている２０−２３；（ｉｉ）パルミチン酸塩は、血管循環及び骨格筋肉細胞で最も多く見出されるＦＦＡである１０，１２；（ｉｉｉ）脂肪抽出物のジグリセリド分画に最も一般的なアシル鎖の一つがパルミチン酸塩である３６；（ｉｖ）パルミチン酸塩の消費はインシュリン感受性を減少させる３７，３８また（ｖ）インシュリン耐性筋肉はパルミチン酸塩取り込みを多く行う３９。これらの報告全てから、インシュリン耐性を引き起こすＦＦＡｓの中で、パルミチン酸塩が主要な候補であることが分かる。しかしながら、少数の研究によると、パルミチン酸塩が引き起こすインシュリン作用の障害は、セラミドを介するとされる１２．インシュリン反応低下に関与している多くの経路があるが、セラミドはそれ等の一つかも知れない、また我々の観察によると、パルミチン酸塩は直接インシュリン反応低下の原因に直接関与する。ＬＰＡ４は、パルミチン酸塩によるインシュリン反応低下を救済する。ＬＰＡ４は、細胞質から膜へのＧｌｕｔ４移行を含むあらゆる重要な段階で、パルミチン酸塩が作用するインシュリンシグナリング損傷から救済するので、このルピノシドは、インシュリン耐性とII型糖尿病の治療薬として、有望な可能性を有する。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例にて本発明を例証するが本発明を限定することを意図するものではない。
細胞培養と処理
３Ｔ３Ｌ１細胞株はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｕｎｅ，Ｉｎｄｉａより購入し、３７℃で、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２中で、２５ｍＭグルコース及び１０％仔牛胎児血清を含む、ダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて培養した。記述の際は常に、集密状態の細胞を０．７５ｍＭ遊離脂肪酸（ＦＦＡｓ，パルミチン酸塩、ステアリン酸塩）と共に２４時間処理した。
【００１９】
可溶化した受容体調製物への放射標識したインシュリンの結合
対照(control)及びＦＦＡ処理した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を最初、３回、０．１４Ｍ  ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にプロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、２ｍＭフェニルメチルスルフォニルフルオライド及び１μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤）を補強した溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭヨードアセトアミド、ｐＨ８．４）に懸濁した。これらの細胞を３回、―７０℃の凍結融解を繰り返し、４℃、１５分間、１０、０００ｒｐｍで遠心した。集めた沈殿物を溶解緩衝液に懸濁し、超音波破壊し、再び４℃で、１５−２０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心した。上清を一晩１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液に対して透析し、体積を凍結乾燥で減少させた。次ぎに膜調製物を膜タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように、０．１Ｍジヨードサリチル酸リチウムと混合し、混合物をモーター駆動型のガラスーテフロンホモジナイザーでホモジナイズし、これを２０分間３５，０００ｇで遠心し、上清を１２時間２０ｍＭ重炭酸ナトリウムｐＨ  ９．４に対し透析した。この溶液に、常に攪拌しながら、０．１％トリトンＸ−１００（ｖ／ｖ）及び２５％グリセロールを加えた。この溶液を透析乾燥して体積を減少させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）に対して透析した。遺伝子組み換えヒトインシュリンを１２５Ｉで放射標識し、０．１４Ｍ  ＮａＣｌ及び１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ７．２）で平衡化したセファデクス−Ｇ１５カラムを用いて、１２５Ｉ−インシュリンを遊離ヨードから分離した。１２５Ｉ−インシュリンの比活性は３０．５５μＣｉ／μｇタンパク質であった。
【００２０】
対照及びＦＦＡ処理した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞からの可溶化したインシュリン受容体調製物（各インキュベーションに対し２５μｇ）を、４℃で、一晩、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．２５％ＢＳＡ（ＰＢＳ）を含む、最終５００μｌの０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ  ８．４）の中で２ｎｇの１２５Ｉ標識したヒト組み換えインシュリンとインキュベートした。インキュベーション終了後、１０５ｇ、１時間の超遠心（Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｕｌｔｒａ−８０）により沈殿させた。各チューブの沈殿物を１Ｘ試料緩衝液（６３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８，１０％グリセロール、２％ＳＤＳ，及び０．０２５％ブロモフェノールブルー）に可溶化し、非変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４％スタッキングゲルを６．５％分離用ゲルの上に上層した）。ゲルを乾燥し、Ｋｏｄａｋ  ＸＯＭＡＴ  ＡＲに露光し、オートラジオグラフィーを行った（図１ａ参照）。
【００２１】
スカッチャード解析
受容体タンパクに対する１２５Ｉ−インシュリンの最適の結合条件を決めるために、異なる温度及び時間間隔で、様々な量の可溶化した受容体調製物と結合インキュベーションを行った。ｐＨ８．４及び４℃で、一晩、インキュベーションを行い、最大の放射標識をしたインシュリン結合を得た。受容体調製物（１５μｇタンパク質）は一晩、４℃で、最終体積５００μｌ緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．２５％ＢＳＡを含む０．０２Ｍ  リン酸緩衝液、ｐＨ８．４）中で、様々な濃度の１２５Ｉ−インシュリン（０．１８−０．７２ｎｍｏｌｅｓ／Ｌ）と、１０，０００倍過剰量の非標識インシュリン非存在下（全結合）又は存在下（非特異的結合）で、インキュベートした。他の一連の実験において、非標識０．０８ｍＭパルミチン酸塩の存在以外、上記と同条件で、受容体調製物を同時に１２５Ｉ−インシュリン及び非標識インシュリンとインキュベーションした。インキュベーション終了後、遊離及び結合した放射活性を５００μｌの０．５％冷却ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；ＭＷ６０００）を加えて分離した。試料をボルテクスし充分に混合し、氷下に１０分間保ち、冷却遠心機により１５分間２０，０００ｇで遠心した。上清を吸引廃棄し、沈殿物を洗浄緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び０．２５％ＢＳＡを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液）で３回洗浄した。最終沈殿物中の放射活性を１２５Ｉ−ガンマ計数器で測定した。全結合カウントより非特異的結合にカウントを差し引き、特異的結合体を計算した。データをスキャチャード解析により解析し、親和性及びパルミチン酸塩存在下及び非存在下のインシュリン受容体結合飽和度を定量した（図１ｂ）。
【００２２】
分子モデリング
インシュリン受容体の相同モデルを、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ９８．０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、ＩＧＦ−１Ｒ２７Ｘ−線構造体（アミノ酸同一性５９％を持つＰＤＢ１ＩＧＲ．ＥＮＴ）の上に作成した。ｃｆｆ９１力場を用いてＩｎｓｉｇｈｔＩＩのＤＩＳＣＯＶＥＲモデュールにより、Ｓｉｌｉｃｏｎ  ＧｒａｐｈｉｃｓＲＯＣＴＡＮＥワークステーション上で、エネルギー最小化及び分子動力学計算を行った。最急降下法と共役傾斜法（各１００ステップ）のコンビネーションを使い、０．００１ｋｃａｌ／ｍｏｌの収束基準を使って、エネルギー最小化を行った；これらのステップを、満足のいく立体配座パラメーターが得られるまで繰り返した。１フェムト秒の時間ステップを使い、１００ステップの平衡と１０００ステップの動力学を計算し、分子動力学シミュレーションを行った。選択した断片の調節のために最小化と動力学は計算しながら、距離上の制約を分子の他の部分に適用した（図１ｃ）。
【００２３】
免疫沈殿
２００μｇの対照及びＦＦＡ処理の細胞破壊液（溶解緩衝液中［１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１００ｍＭ  ＮａＦ，１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ］で、氷中１０分間超音波処理）を、２μｇインシュリン受容体（ＩＲ）β抗体と、４℃で、１晩インキュベートした。５０μｌのＰｒｏｔｅｉｎＡ−アガロースを各チューブに加え、４℃で、２時間インキュベートした。４℃、２分間、１０，０００ｇで遠心後、５００μｌのＰＢＳに溶かした０．１％ＣＨＡＰＳを沈殿物に加え、再懸濁し、４℃、２分間１０，０００ｇ遠心を行った。沈殿物を充分洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに掛け、抗―リン酸チロシン抗体（抗マウス；１：１０００）を用いて、ウェスターンブロットを行った（図１ｄ参照）。
【００２４】
電気泳動と免疫ブロッティング
対照及び処理細胞破壊液（６０μｇ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、９０Ｖ，４℃、１．５時間、移動緩衝液中（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１９３ｍＭグリシン、２０％メタノール、ｐＨ  ８．５）で、ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｅｄｆｏｒｄ，  ＭＡ０１７３０）に移動した。膜を５％脱脂粉乳を溶かしたＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ塩基、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ，  １ｍＭ  ＨＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）でブロックし、抗ｐ−ＩＲＳ（抗山羊；１：１０００）、抗ｐ−ＰＩ３Ｋ（抗山羊；１：１０００）及び抗ｐ−Ａｋｔ（抗ウサギ；１：２０００）と一晩インキュベートした。
免疫反応性バンドはアルカリホスファターゼ結合二次抗体により検出した（図２ａ参照）。
【００２５】
トランスフェクションとＧｌｕｔ４移行
３Ｔ３Ｌ１細胞をカバースリップが置いてある６０ｍｍ培養皿に播き、空気／ＣＯ２（１９：１）環境下で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１００μｇ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ中で維持した。２４時間後、細胞をＦＢＳ及び抗生物質なしのＤＭＥＭで洗浄した。業者のプロトコール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬を用いて、各６０ｍｍプレート当たり２ｘ１０５細胞にＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４（２μｇ）のプラスミドＤＮＡを遺伝子導入した。遺伝子導入４８時間後に、細胞を０．７５ｍＭパルミチン酸塩と、又は無しで２４時間処理し、その後１００ｎＭインシュリン非存在下又は存在下で３０分間インキュベートした。カバースリップ上の細胞をパラホルムアルデヒド（３．５％）で固定し、ガラススライド上に埋め込んだ。レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｃｋｌｅｉｇｈ，ＮＪ）下で、カバースリップ上の細胞におけるＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４の移行を調べた（図２ｂ参照）。
【００２６】
クズからルピノシドＰＡ４の抽出と分離
クズ根（１ｋｇ）を細かく切断し、メタノール（３ｘ１．５Ｌ）で抽出した。抽出した溶液から、減圧下で蒸発後、残渣（９０ｇ）が得られ、生物活性を調べた。メタノール抽出物を酢酸エチルと水の間で分配した。水層を、更にｎーブタノールで抽出した。酢酸エチル層、ｎ−ブタノール層及び水層から減圧下で溶媒を除き、それぞれ、２．５ｇ、１２ｇ及び６４ｇの分画を得た。各分画の生物活性を調べ、活性がｎ−ブタノール分画に見出された。この分画を、水及びメタノールを溶出液として、ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０カラムクロマトグラフィーに掛けた。メタノール溶出液を蒸発させて乾燥させ（２．４ｇ）、さらに、メタノール−水（１：１）及びメタノールを溶出液として、セファデクスＬＨ−２０クロマトグラフィーに掛けた。メタノール−水分画を減圧下で蒸発させ、生物活性を持つ固体（１．４ｇ）を得た。この固体を調整用ＨＰＬＣ（μ―Ｂｏｎｄａｐａｋ，Ｃ−１８逆相カラム、メタノール−１％水性酢酸（７：３）、流速１２ｍｍ／ｍｉｎ及びＵＶ検出器２１０ｎｍ）に掛け、ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）３２（０．２８ｇ）と同定した均一化合物を得、この構造を、１Ｄ，２ＤＮＭＲ及びＱ−ＴＯＦ−ＭＳ及び幾つかの化学反応で決定した（図３ａ参照）。
【００２７】
パルミチン酸塩によるグルコース取り込みの阻害に対するＬＰＡ４処理の効果
３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を、０．２％仔牛血清アルブミンを補強したクレプス＝リンガーリン酸（ＫＲＰ）緩衝液（１２．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，６ｍＭ  ＫＣｌ、１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４）中で、２４時間ＬＰＡ４（２０μｇ／ｍｌ）及びパルミチン酸塩（０．７５ｍＭ）非存在又は存在下で処理を行い、次ぎに３０分間１００ｎＭインシュリンと処理し、次ぎに，インキュベーション終了５分間前に、３Ｈ−２−ＤＯＧ（０．４ｎｍｏｌｅｓ）を各インキュベーション細胞に加えた。単純拡散及び放射活性の非特異的トラッピングを補正した、グルコース取り込みデータを得るために、３Ｔ３Ｌ１細胞を、０．３ｍＭフロレチン存在下で、氷令したＫＲＰ緩衝液で３回洗浄した。細胞を１％ＮＰ−４０で可溶化して、［３Ｈ］−デオキシグルコースを液体シンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ，  Ｔｒｉｃａｒｂ  ２１００ＴＲ）により測定した（図３ｂ参照）。
ＬＰＡ４及びパルミチン酸塩非存在下又は存在下で同様にインキュベートした３Ｔ３Ｌ１細胞を、超音波によって破壊し、上記で述べたように、溶解物のｐ−ＩＲ及びｐ−Ａｋｔを検出した（図３ｃ参照）。他の一連の実験において、細胞を、既に記したように、ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４で遺伝子導入し、２４時間ＬＰＡ４及びパルミチン酸塩なし、又は、と共にインキュベートした。その後、細胞を１００ｎＭインシュリンとインキュベートし、Ｇｌｕｔ４移行を、共焦点顕微鏡下で観察した（図３ｄ参照）。
【００２８】
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【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】（ａ）パルミチン酸塩はインシュリンの受容体への結合及び受容体のチロシンキナーゼリン酸化の阻害を引き起こす。可溶化したインシュリン受容体調整品へ結合する放射標識したインシュリンとパルミチン酸塩のオートラジオグラフィー。パルミチン酸塩存在下及び非存在下で、３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を２４時間インキュベートし、受容体調整品を０．１％トリトンＸ−１００に可溶化した。２５μｇタンパク質を一晩、４℃で、２ｎｇ１２５Ｉ−インシュリン（比活性３０．５５μＣｉ／μｇタンパク質）とインキュベートした。インキュベーション終了後、１０５ｇ、１時間の超遠心により沈殿物とした。１２５Ｉ−インシュリンは可溶化した受容体調製物に結合した。インシュリン受容体調製物と１２５Ｉ−インシュリンを非放射性パルミチン酸塩（ＰＡ）又はステアリン酸塩（ＳＡ）存在下で同様にインキュベートした。可溶化した２５μｇタンパク質の受容体調製物と［１−１４Ｃ］−パルミチン酸塩と４℃で、一晩、インキュベートし、オートラジオグラフィー（１４Ｃ−ＰＡ）を行った．（ｂ）結合親和性及びスキャチャード解析による受容体飽和度の定量。インシュリンの可溶化した受容体への結合に対する、Ｂｍａｘ及びＫａは、それぞれ７．３ｐＭ及び０．１６ｘ１０１０Ｍ−１であった。しかしながら、パルミチン酸塩存在下では、インシュリン結合のＫａは殆ど変わらず、０．１５８ｘ１０１０Ｍ−１であったが、Ｂｍａｘは３．４６ｐＭに減少した。（ｃ）パネル（ｉ）はインシュリン受容体の３個の領域（Ｌ１−Ｃｙｓリッチ−Ｌ２）の相同モデルを表す。青緑色帯環で印したＬ１領域の部分はインシュリン結合位置である可能性が高い。アラニンへの突然変異により結合定数がおよそ３００分の１に減少した残基を赤色で示し；突然変異により結合が１０分の１から１００分の１に低下した残基をピンク色で、また結合が３分の１から９分の１になった他の残基を黄色で示した。システイン残基は緑色で示され、これらの中Ｃｙｓ−８&Ｃｙｓ−２６（ｉｉの様に赤色円で印す）及びＣｙｓ−２６６&Ｃｙｓ−２７４（ｉｉｉの様に赤色円で印す）はパルミトイル化の可能性が最も高い位置である。パネル（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）は２個の可能性のあるシステイン対の周りの静電ポテンシャルを示し、Ｃｙｓ−８&Ｃｙｓ−２６及びＣｙｓ−２６６&Ｃｙｓ−２７４の周囲は正電荷（青色）及び中性（白色）静電ポテンシャルが優勢であるのでパルミトイル化の位置として選択した。パネル（ｉｖ）はＣｙｓ−１９２&Ｃｙｓ−２０１対の周りの静電ポテンシャルを示し、この周囲は正（正及び中性）電荷を示すが、表面下に完全に埋め込まれているので可能性のある位置としては選択されなかった。パネル（ｉｖ）はＣｙｓ−１２６&Ｃｙｓ−１５５対の周りの静電ポテンシャルを表し、この位置は負電荷（赤色）が優勢な位置のため、棄てられた位置である。（ｄ）対照及びＦＦＡ処理の３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を溶解緩衝液中で超音波処理により溶解し、１０，０００ｇで１０分間遠心した。対照及び処理細胞からの２００μｇ上清タンパク質を２μｇＩＲβ抗体と４℃で、一晩インキュベートした。抗原―抗体複合体をＰｒｏｔｅｉｎＡ−アガロースと沈殿させ、沈殿を充分に洗浄し、再沈殿し、ＳＤ���−ＰＡＧＥ試料緩衝液中でボイルし、電気泳動した。ゲルからのタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させ、抗−ｐ−Ｔｙｒ抗体、を用いて、免疫ブロットした。Ｉ−インシュリン；Ｐ−パルミチン酸塩；Ｓ−ステアリン酸塩を示す。
【図２】（ａ）３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を、図１において記載したように、パルミチン酸塩及びステアリン酸塩とインキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解緩衝液中で超音波処理により溶解し、１０，０００ｇで１０分間遠心した。上清タンパク質（各５０μｇ）を５分間、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中でボイルし、１２％ゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移動し、アルカリホスファターゼ結合２次抗体を用いて、ｐ−ＩＲＳ−１（１：１０００）、ｐ−ＰＩ３キナーゼｐ８５α（１：１０００）及びｐ−Ａｋｔ１／２（１：１０００）抗体で免疫検知した。抗―ＩＲＳ１，ＰＩ−３Ｋ及びＡｋｔ１／２抗体を用いて、処理によるタンパク質プロフィールを検知した。ｂ）３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞におけるインシュリン誘導型Ｇｌｕｔ４移行へのパルミチン酸塩の効果。カバースリップ上に蒔いた３Ｔ３Ｌ１細胞を、ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４プラスミド（２μｇ）で４８時間、リポフェクタミン試薬を用いてトランスフェクトした。安定化後、細胞をパルミチン酸塩存在下及び非存在下に、２４時間インキュベートし、その後インシュリンと３０分間インキュベートした。対照（Ｃｏｎ）として、ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４トランスフェクトした細胞を、脂肪酸とインシュリン非存在下でインキュベートした。インキュベーション終了時に、ＧＦＰ−Ｇｌｕｔ４の局在位置をレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて調べた。
【図３】（ａ）ＬＰＡ４の構造と精製。ＤｉａｉｏｎＨＰ−２０クロマトグラフィーを用いて、５分画（Ａ−Ｅ）を得、その中、分画Ｅが要求された活性を有した。Ｅ分画のセファデックスＬＨ２０クロマトグラフィーによる分画は３分画（Ｆ−Ｈ）をもたらし、Ｆ分画はパルミチン酸塩により損なわれたインシュリン活性を改善した。Ｆ分画を更にＨＰＬＣにより精製し単一分子を得たが、この分子は２ＤＮＭＲと質量分析によりルピノシドＰＡ４と同定された３２。（ｂ）脂肪細胞を２４時間パルミチン酸塩、又はパルミチン酸塩プラスＬＰＡ４、又はＬＰＡ４とインキュベートし、その後３０分間インシュリンとインキュベートした。インキュベーション終了５分間前に、各インキュベーション細胞に、３Ｈ−デオキシグルコースを加えた。その後、単純拡散及び放射活性の非特異的トラッピングを補正して、グルコースの取り込みを測定するために、細胞を０．３ｍＭフロレティン存在下で、氷冷ＫＲＰ緩衝液で３回洗浄した。細胞を１％ＮＰ−４０で可溶化し、放射活性を液体シンチレーションカウンターにより計数した。（ｃ）３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を２４時間、パルミチン酸塩、又はＬＰＡ４、又はパルミチン酸塩プラスＬＰＡ４非存在下又は存在下でインキュベートし、その後３０分間インシュリンとインキュベートした。 各ケースの細胞溶解物５０μｇを変性ゲルにかけ、ＰＶＤＦ膜に移動し、抗―ｐ−Ａｋｔ抗体を用いて免疫ブロットした。５０μｇの細胞溶解物を抗―ＩＲβ抗体と免疫沈降を行い、抗―ｐ−Ｔｙｒ抗体を用いて免疫ブロットした。（ｄ）処理細胞のＧｌｕｔ４移行は図２ｂに記載したと同様な方法で定量した。
【図１ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図１ａ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月23日(2007.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
II型糖尿病を予防及び／又は治療するための、非ヒト動物に対する、随意的に医薬的に許容可能な添加剤を伴う、薬学的に有効な量の、植物クズの抽出物のブタノール分画又はルピノシドＰＡ４の使用。
【請求項２】
前記抽出物がその植物の根から得られる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記添加剤がタンパク質、炭化水素、砂糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルローズ、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒などの様な栄養素からなるグループから選択されたものである請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
その分画又はルピノシドが１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
投与経路が経口、経静脈、経筋肉及び経皮から成る群から選択される請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
植物クズの抽出物のブタノール分画又はルピノシドＰＡ４を主成分とする、II型糖尿病の予防及び／又は治療用の医薬用組成物。
【請求項７】
前記組成物が、添加剤として、タンパク質、炭化水素、砂糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルローズ、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒から成る群から選択される少なくとも一種を含む請求項６に記載の医薬用組成物。
【請求項８】
前記抽出物が前記植物の根から得られる請求項６又は７に記載の医薬用組成物。
【請求項９】
前記分画の濃度範囲が１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重である請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【請求項１０】
前記組成物がカプセル、シロップ、濃縮物、粉末及び顆粒から成る群から選択される形態である請求項６〜９のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【請求項１１】
前記抽出物が水性抽出物である請求項６〜１０のいずれか一項に記載の医薬用組成物。
【請求項１２】
シグナル伝達経路上のインシュリンシグナルを促進するために、Ｇｌｕｔ４リン酸化及び標的細胞膜へのＧｌｕｔ４移行を増加させるために、非ヒト動物に対する、随意的に医薬的に許容可能な添加剤と共に、医薬的に有効量の植物クズの抽出物のブタノール分画又はルピノシドＰＡ４の使用。
【請求項１３】
前記抽出物がその植物の根から得られる請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記添加剤がタンパク質、炭水化物、砂糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、セルローズ、炭酸カルシウム、デンプン、ゼラチンペースト、医薬的に許容された担体、賦形剤、稀釈剤及び溶媒などの様な栄養素からなるグループから選択されたものである請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
その分画又はルピノシドが１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重の濃度範囲で投与される請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
該使用がII型糖尿病を予防／治療するのに役立つ請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
該使用が細胞のグルコース取り込みの増加を示す請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
該使用が細胞に非毒性である請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
その移行がインシュリン応答細胞の細胞質より膜への移行である請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
ルピノシドＡ４（ＬＰ４）がパルミチン酸塩誘導のインシュリンシグナル上の障害を阻止する請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２１】
ルピノシドＡ４（ＬＰ４）がインシュリンによるＩＲ−β及びＡｋｔリン酸化の促進を可能にする請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２２】
ａ．植物クズの器官を小部分に切断する工程、ｂ．切断した器官をメタノール及び水で抽出する工程、ｃ．メタノール及び水抽出物を酢酸エチルと水の間で分配する工程、ｄ．水層を更にｎ−ブタノールで抽出し、ブタノール分画を得る工程、及び、ｅ．ｎ−ブタノール分画をクロマトグラフィーにかけ、水及びメタノールを溶出液とし、ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）を得る工程から成る活性分子ルピノシドＰＡ４（ＬＰＡ４）の製法。
【請求項２３】
前記植物器官が根である請求項２２に記載の製法。
【請求項２４】
前記溶媒がメタノール及び水から成る群から選択される請求項２２又は２３に記載の製法。
【請求項２５】
水とメタノールの比が約１：１である請求項２４に記載の製法。
【請求項２６】
クロマトグラフィーがカラムクロマトグラフィーである請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の製法。
【国際調査報告】
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