(57)【要約】  ＦＧＦシグナリングを阻害するための方法および組成物が記載されている。本発明の方法は、ＦＧＦ応答細胞を外因性のヘパラン硫酸６−Ｏエンドスルファターゼ（Ｓｕｌｆ１）と、内因性のヘパラン硫酸を修飾するために有効な量で接触させ、これによりＦＧＦシグナリングを阻害することを含む。また本発明はＦＧＦ応答細胞を外因性Ｓｕｌｆ１修飾化合物と接触させることを含み、外因性Ｓｕｌｆ１修飾化合物は、ＦＧＦ２もしくはＦＧＦ４のＦＧＦＲ１への結合を下げる能力を特徴とする。外因性Ｓｕｌｆ１修飾化合物を含んでなる組成物も、本発明の方法と関連して使用するために提供される。
2007522243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
阻害されるＦＧＦシグナリングがＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ４−ＦＧＦＲ１シグナリングであるＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害方法であって、ＦＧＦ応答細胞を、内因性のヘパラン硫酸を修飾するために有効な量の外因性Ｓｕｌｆ１と接触させることを含んでなり、これによりＦＧＦシグナリングを阻害する上記方法。
【請求項２】
阻害されるＦＧＦシグナリングがＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ４−ＦＧＦＲ１シグナリングであるＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害方法であって、ＦＧＦ応答細胞を、外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物と接触させることを含んでなり、外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物がＦＧＦ２またはＦＧＦ４のＦＧＦＲ１への結合を下げる能力を特徴とする上記方法。
【請求項３】
ＦＧＦ応答細胞との接触がインビトロである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＦＧＦ応答細胞との接触がインビボである請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
ＦＧＦ応答細胞が外因性Ｓｕｌｆ１を発現する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＦＧＦシグナリングの阻害が脈管形成の阻害を生じる請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
ＦＧＦシグナリングの阻害が中胚葉形成の阻害を生じる請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
ＦＧＦ応答細胞がガン細胞および幹細胞からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＦＧＦシグナリングの阻害が幹細胞生産の促進を生じる請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＦＧＦシグナリングの阻害が腫瘍細胞増殖の阻害を生じる請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
外因性Ｓｕｌｆ１が、内因性ヘパラン硫酸の６−Ｏ硫酸基のサブセットの少なくとも１つを除去する能力を特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリンが、ヘパリン６−Ｏ硫酸基のサブセットの少なくとも１つの除去を特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
外因性Ｓｕｌｆ１がＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を防止する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
外因性Ｓｕｌｆ１がＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を防止する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリンがＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を防止する、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリンがＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を防止する、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
外因性Ｓｕｌｆ１がＦＧＦＲ１の二量化を防止する請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物がＦＧＦＲ１の二量化を防止する請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
ＦＧＦシグナリングの阻害がＦＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性の減少を生じる請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
ＦＧＦ受容体チロシンキナーゼ活性の減少が下流のＦＧＦ受容体チロシンキナーゼ標的の活性化の阻害を生じる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
下流のＦＧＦ受容体チロシンキナーゼ標的が、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫおよびＥＲＫからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物を含んでなる組成物であって、ＦＧＦ応答細胞を外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物と接触させることを含んでなる方法において、ＦＧＦのＦＧＦＲへの結合を下げる能力を有し、ここでＦＧＦのＦＧＦＲへの結合の低下がＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害を生じる上記組成物。
【請求項２３】
外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物が脈管形成インヒビターである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物が中胚葉形成のインヒビターである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
ヘパリン化合物をＳｕｌｆ１と、ヘパリン６−Ｏ硫酸基のサブセットの少なくとも１つを効果的に除去するための量および十分な時間で接触させることを含んでなる、Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物を生産するためのインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の背景
略号の脚注：ＨＳＰＧ、ヘパラン硫酸プロテオグリカン；ＨＳ、ヘパラン硫酸；ＦＧＦ、繊維芽細胞増殖因子；ＦＧＦ２、繊維芽細胞増殖因子２、ｂＦＧＦとしても知られる；ＦＧＦ４、繊維芽細胞増殖因子４、ｅＦＧＦとしても知られる；ＧｌｃＮＲ６Ｓａｓｅ、ＧｌｃＮＲ６−Ｏエキソスルファターゼ；ＦＧＦＲ１、ＦＧＦ受容体１；ＱＳｕｌｆ１、ウズラのＳｕｌｆ１；ＥＲＫ、細胞外シグナリング調節キナーゼ
ＨＳＰＧは、胚形成中および疾患の病態生理において、細胞表面のシグナリングを調節する細胞外マトリックス糖タンパク質である。ＨＳＰＧにはシグナリング分子に結合するＨＳ鎖に幾つか共有結合されるようにカップリングされたタンパク質コアを含む。ＨＳ鎖は、ウロン酸の２−Ｏ位およびグルコサミン残基の６−Ｏ、３−ＯおよびＮ位で選択的に硫酸化されたウロン酸およびグルコサミン残基の５０〜２００個の二糖反復からなる。ＨＳの硫黄化パターンは、さらにＨＳ鎖の長さに沿って高度に硫酸化されたドメイン、および十分に硫酸化されていない（ｕｎｄｅｒｓｕｌｆａｔｅｄ）ドメインを形成するように、さらに調節されて構造的な不均一性を導く。
【０００２】
ＨＳ鎖の硫酸化は、胚細胞における発生的シグナリングプロセスに必要である。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ）のスルフェートレス（ｓｕｌｆａｔｅｌｅｓｓ）およびスラローム（ｓｌａｌｏｍ）の突然変異体におけるＨＳ硫酸化の損失は、それぞれウイングレス（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ：ＷＧ）およびＦＧＦまたはＷｇおよびヘッジホッグ（Ｈｅｄｇｅｈｏｇ：Ｈｈ）シグナリングの欠陥、および胚での組織パターニング（ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ）における欠陥をもたらす。さらに、ＨＳ二糖単位内の個々の位置の硫酸化の欠失により、ＨＳの生合成を破壊する突然変異の調査で明らかにされるようなシグナリング欠陥も引き起こす。例えば、Ｈｓ２ｓｔ（鍵となるＨＳ２−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ）における遺伝子−トラップ（ｇｅｎｅ−ｔｒａｐ）突然変異を有するマウスは、２−０硫酸化ウロン酸を欠き、そして多数シグナリングプロセスにおける欠陥のために致命的な腎臓の形成不全を表わす。ショウジョウバエのＨＳ  ６−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ遺伝子発現のＲＮＡｉ阻害は、ＦＧＦシグナリング活性を減少させ、そして気管系の一次分枝形成（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）を破壊する。これらの遺伝の調査と合致して、ＨＳ硫酸化を阻害するために、培養中の細胞の塩素酸塩による処置は、ＢＭＰ、ＷｎｔおよびＦＧＦシグナリングに欠陥を生じる。従ってＨＳの硫酸化は胚における多数のシグナリング活性において重要な役割を担う。しかし胚のＨＳの硫酸化状態を調節する生物学的メカニズム、およびリガンド活性および／または受容体の相互作用の制御における特異的ＨＳ硫酸基の生化学的な役割は十分に解明されていない。
【０００３】
最近、胚細胞のＨＳ６−Ｏの硫黄化および発生シグナリングを修飾するＨＳ６−Ｏエンドスルファターゼのフィミリーが同定され、ＨＳ硫酸化に新たな種類の進化的に保存されたレギュレーターが提供された。第２に、密接に関連するファミリーメンバーＳｕｌｆ２が哺乳動物および鳥で同定された。Ｓｕｌｆ１はＨＳ分解中に末端の６−Ｏスルホ基の加水分解を触媒するリソソームのエキソスルファターゼである既知のグルコサミン６−Ｏスルファターゼ（ＧｌｃＮＲ６Ｓａｓｅ）とは明らかに異なる構造および酵素の特徴を表わす。対照的に、Ｓｕｌｆ１はゴルジを通って分泌され、その特有の親水性ドメインを介して細胞の表面に着けられ（ｄｏｃｋｅｄ）、そしてＳｕｌｆ１はＨＳ／ヘパリンの三硫酸化ＩｄｏＡ２Ｓ−ＧｌｃＮＳ６Ｓ二糖単位に対する基質特異性で、６−Ｏエンドスルファターゼとして機能する。鳥類のオルソログであるＱＳｕｌｆ１は、ウズラの胚の筋肉前駆細胞においてＷｎｔ依存的遺伝子発現に必要である。ＱＳｕｌｆ１活性は細胞表面ＨＳＰＧの６−Ｏ硫酸化状態を改造し、そしてＷｎｔリガンドとＨＳとの間の結合親和性を下げ
る。
【０００４】
生化学的および結晶学的研究は、ＨＳの硫酸化がＦＧＦリガンド−受容体の相互作用およびＦＧＦシグナリングに必要であることを示す。三硫酸化二糖単位を含有するＨＳ鎖は、ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１結合およびシグナリングを大きく促進するが、ＦＧＦ２は細胞結合アッセイおよび結晶学的実験においてＨＳの不存在下でＦＧＦＲ１に結合できる。ＨＳに関する硫酸基の中で、グルコサミン残基の６−Ｏ位の硫酸化はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ４−ＦＧＦＲ１相互作用およびシグナリングに必要である。ＨＳ鎖の明確な配列および硫酸化パターンは、ＦＧＦリガンドおよび受容体結合に要求されるが、ＨＳの６−Ｏ硫酸化はＦＧＦシグナリング活性のために重要である。
【０００５】
ＦＧＦおよびＦＧＦＲ（ＦＧＦ受容体）は、脈管形成およびガンを含む多くの発生的および疾患プロセスで重要な役割を果たす。Ｓｕｌｆ１はＦＧＦを含む多数のシグナリング経路により制御される胚細胞系統で発現される細胞表面６−Ｏ  ＨＳのエンドスルファターゼであり、そして最近の研究では、ヒトのＳｕｌｆ１オルソログであるＨＳｕｌｆ１が、ヒトのガン細胞においてＦＧＦ依存的ＥＲＫのキナーゼ活性をダウンレギュレートできることを明らかとする。これらの経路のより詳細な解明を通して、胚においてＦＧＦに制御される発生プロセスを調節する能力は、当該技術分野に重大な進歩を表すだろう。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要約
本発明の目的は、ＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングを阻害するための方法を提供することである。より詳細には本発明はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ４−ＦＧＦＲ１シグナリングの阻害方法に関する。１つの観点では、ＦＧＦシグナリングを阻害する方法は、ＦＧＦ応答細胞を、内因性のヘパラン硫酸を修飾するために有効な量の外因性Ｓｕｌｆ１と接触させることを含んでなり、これによりＦＧＦシグナリングを阻害する。別の観点では、ＦＧＦシグナリングを阻害するための方法は、ＦＧＦ応答細胞を外因性Ｓｕｌｆ１修飾（Ｓｕｌｆ１−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）グリコサミノグリカン化合物と接触させることを含んでなり、外因性Ｓｕｌｆ１修飾グリコサミノグリカン化合物は、ＦＧＦ２およびＦＧＦ４のＦＧＦＲ１への結合を下げる能力を特徴とする。これらの方法では、細胞表面および／または外から加えたグリコサミノグリカンの脱硫酸化が、ＦＧＦ２またはＦＧＦ４のＦＧＦＲ１への結合を防止し、続いて所望の細胞におけるＦＧＦＲ１活性化を阻害する。
【０００７】
１つの態様では、ＦＧＦシグナリングを阻害するために、細胞を外因性Ｓｕｌｆ１と直接接触させるべきである。ＦＧＦ応答細胞とＳｕｌｆ１との接触は、細胞表面のヘパラン硫酸の６−Ｏ硫酸化を酵素的に修飾し、そうするとＦＧＦシグナリングを阻害する。細胞と外因性Ｓｕｌｆ１との接触は、ＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１、三重複合体（ｔｅｒｎａｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）の形成を防ぐ。該三重複合体の形成は、ＦＧＦＲ１二量化およびそれに続くＦＧＦＲ１活性化を防ぐ。
【０００８】
別の態様では、ＦＧＦ応答細胞でのＦＧＦシグナリングの阻害を達成するために、Ｓｕｌｆ１活性を間接的に使用することができる。ＦＧＦ応答細胞のヘパリン（これ自体がＳｕｌｆ１により修飾されている）のような硫酸化グリコサミノグリカン化合物との接触は、ＦＧＦシグナリングを阻害するために使用することができる。この方法では、外因性のＳｕｌｆ１修飾化合物は、ＦＧＦリガンドのＦＧＦＲへの結合を下げる能力を特徴とする。細胞と外因性Ｓｕｌｆ修飾化合物との接触は、ＦＧＦＲ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１の三重複合体の形成を防止する。該三重複合体の形成の防止は、ＦＧＦＲ１の二量化、そしてそれに続くＦＧＦＲ１の活性化を防ぐ。
【０００９】
本発明の方法は、ＦＧＦＲ１活性化に対する細胞応答のモジュレーションに使用されることになる。ＦＧＦシグナリングを阻害するために本明細書に開示する方法は、外因性Ｓｕｌｆ１および／または外因性Ｓｕｌｆ１修飾グリコサミノグリカン化合物に接触した正常および／または異常な細胞での増殖、分化および移動反応（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ）を改変するために使用することができる。そのような細胞は幹細胞またはガン細胞を含んでなることができる。ここで細胞がガン細胞である場合、ＦＧＦ応答細胞と外因性Ｓｕｌｆ１および／またはＳｕｌｆ１修飾化合物との接触は、ＦＧＦシグナリングを阻害し、次いで細胞増殖、細胞移動および脈管形成を阻害する。細胞が幹細胞である場合、ＦＧＦ応答細胞と外因性Ｓｕｌｆ１および／またはＳｕｌｆ１修飾化合物との接触は、ＦＧＦシグナリングを阻害し、次いで中胚葉の形成を抑制し、その後に細胞の外胚葉への分化を再指令するために使用されることになる。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法と関連して使用するための組成物を提供することである。外因性Ｓｕｌｆ１修飾グリコサミノグリカン化合物が提供され、そして外因性ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびヘパリン／ヘパラン硫酸混合物を含む。外因性のＳｕｌｆ１修飾グリコサミノグリカン化合物を生産するためのインビトロ法も本明細書に提供する。
【００１１】
発明の詳細な説明
１つの観点では、本発明はＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害法に関する。より詳細には、本発明は以前に同定されたヘパラン硫酸６−ＯのエンドスルファターゼであるＳｕｌｆ１の酵素活性を活用することにより、ＦＧＦシグナルを阻害する方法に関する。本発明では、細胞表面または外因性のグリコサミノグリカンリガンドの硫酸化を酵素的に修飾するためにＳｕｌｆ１活性が使用されている。細胞表面および／または外から加えられたグリコサミノグリカンの脱硫酸化は、ＦＧＦ−２およびＦＧＦ−４のＦＧＦＲ１への結合を防ぎ、次いで望む細胞でのＦＧＦＲ１活性化を阻害する。
【００１２】
本発明は、Ｓｕｌｆ１の酵素活性がＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングを抑制できるという知見に基づく。以下の実施例の章に開示するように、ＦＧＦ１を介するＦＧＦ２およびＦＧＦ４シグナリングに関する抑制が証明された。本発明の目的は、細胞の表面のヘパラン硫酸および／または外から加えたヘパリン化合物の６−Ｏ硫酸化を修飾することにより、Ｓｕｌｆ１がＦＧＦシグナリングを抑制することである。当該技術分野では、ヘパラン硫酸鎖の６−Ｏ硫酸化が、ＦＧＦ応答細胞において正しいＦＧＦシグナリングを行うために必要であると理解されている。一般にグリコサミノグリカンの硫酸化は、ＦＧＦリガンド−受容体の相互作用およびＦＧＦシグナリングに必要であることが知られている。さらに、当該技術分野ではグリコサミン残基の６−Ｏ位での硫酸化がＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ４−ＦＧＦＲ１の相互作用に特異的に必要であり、そして６−Ｏ硫酸化がＦＧＦシグナリング活性に重要であることが知られている。Ｓｕｌｆ１活性は６−Ｏの硫酸化を調節するが、本発明前にＦＧＦシグナリングの制御にＳｕｌｆ１の関与は知られていなかった。本発明ではＦＧＦシグナリングのモジュレーションの実施において、細胞表面のヘパラン硫酸または外因性のヘパリン化合物の６−Ｏ硫酸化を酵素的に修飾するためにＳｕｌｆ１活性を使用する。
【００１３】
１つの態様では、ＦＧＦシグナリングを阻害するために細胞を外因性Ｓｕｌｆ１と直接接触させることができる。この方法は、ＦＧＦ応答細胞を、内因性のヘパラン硫酸を修飾するために有効な量の外因性Ｓｕｌｆ１酵素と接触させることを含んでなり、これによりＦＧＦ応答細胞でのＦＧＦシグナリングを阻害する。この態様では、Ｓｕｌｆ１は細胞表面のヘパラン硫酸の６−Ｏ硫酸化を酵素的に修飾し、そのようにすることによりＦＧＦシグナリングが阻害される。この態様では、外因性のＳｕｌｆ１は、内因性ヘパラン硫酸の
６−Ｏ硫酸基のサブセットの少なくとも１つを除去する能力を特徴とする。本発明の目的は、外因性Ｓｕｌｆ１がＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を防止することである。本発明の別の目的は、外因性Ｓｕｌｆ１がＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を防止することである。ＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成の防止、およびＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成の防止は、ＦＧＦＲ１の二量化、それに続くＦＧＦＲ１の活性化を防止する。
【００１４】
本発明の別の態様では、ＦＧＦシグナリングの阻害がＳｕｌｆ１により間接的に達成され得る。この態様では、細胞はそれ自体がＳｕｌｆ１によりインビトロで修飾されたヘパリンのような硫酸化グリコサミノグリカンと接触させられる。ＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害は、ＦＧＦ応答細胞を外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物と接触させることを含んでなる。本発明の要件は、外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物がＦＧＦリガンドのＦＧＦＲへの結合を下げる能力を有することである。この態様では、Ｓｕｌｆ１が外因性ヘパリン化合物の６−Ｏ硫酸化を酵素的に修飾するために使用される。好適な態様では、外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物は、外因性ヘパリン化合物の６−Ｏ硫酸基のサブセットの少なくとも１つの除去を特徴とする。本発明の目的は、ＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成の防止において、ＦＧＦ応答細胞を外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物と接触させることである。本発明の別の目的は、外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物が、ＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を防止することである。ＦＧＦＲ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成の防止、およびＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１の三重複合体の形成の防止は、次いでＦＧＦＲ１の二量化、そしてそれに続くＦＧＦＲ１の活性化を防ぐ。
【００１５】
さらに本発明の目的は、Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物の生産のためのインビトロ法を提供することであり、Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物はＦＧＦ応答細胞上でＦＧＦ−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ三重複合体の形成を阻害するその能力を特徴とする。阻害される三重複合体の形成は、ＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１またはＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１のいずれかを含んでなることができる。ＦＧＦ２−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦ４−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体形成の阻害は、ＦＧＦＲ１の二量化、そしてそれに続くＦＧＦＲ１の活性化を防ぐ。本明細書に記載するＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物の生産法は、ヘパリン化合物（１もしくは複数）をＳｕｌｆ１と、ヘパリン６−Ｏ硫酸基のサブセットの少なくとも１つを効果的に除去するための量および十分な時間で接触させることを含んでなる。典型的にはＳｕｌｆ１修飾ヘパリンを提供するために、３７℃で数時間のＳｕｌｆ１とヘパリンとのインキュベーションで十分であり、Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリンはＦＧＦ応答細胞上でＦＧＦ−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を阻害するその能力を特徴とする。任意の特定の温度、インキュベーション時間またはバッファー条件をＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物の生産に使用することは要件とはならないが、Ｓｕｌｆ１とヘパリンとの接触により生産されるＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物が、ＦＧＦ−ヘパラン硫酸−ＦＧＦＲ１三重複合体の形成を阻害できることが要件である。この態様では、Ｓｕｌｆ１酵素が直接ＦＧＦ応答細胞と接触することが要件ではない。
【００１６】
ＦＧＦ応答細胞でＦＧＦシグナリングを阻害するために本明細書で開示する方法は、インビトロで行うことができる。ＦＧＦシグナリングの阻害は、組織培養中のＦＧＦ応答細胞で効果的に行うことができる。ＦＧＦシグナリングは脊椎動物および無脊椎動物で保存され、そしてそのままそれを阻害する方法を、脊椎動物または無脊椎動物のいずれかに由来する組織培養細胞で行ってもよい。ＦＧＦシグナリングが保存されている脊椎動物細胞系統の例には、ヒトおよびマウスがある。ＦＧＦシグナリングが保存されている無脊椎動物細胞系統の例には、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）がある。インビトロでは、本明細書に開示するＦＧＦシグナリングの阻害法
は、ＦＧＦシグナリングを研究するために、またはＦＧＦシグナリングを修飾する治療薬を開発するために使用することができる。本明細書に開示する方法は、培養中の細胞を用いた使用に限定されない。
【００１７】
本明細書に開示するＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害法は、インビボで行うこともできる。ＦＧＦシグナリングの阻害は、動物中の細胞で効果的に達成することができる。動物内の細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害は、動物がヒトまたは非ヒトである場合に達成され得る。ＦＧＦシグナリングは脊椎動物および無脊椎動物で保存され、そしてそのままそれを阻害する方法を、脊椎動物または無脊椎動物のいずれかで行ってもよい。ＦＧＦシグナリングが保存されている脊椎動物の例には、ヒトおよびマウスがある。ＦＧＦシグナリングが保存されている無脊椎動物の例には、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）がある。本明細書に開示する方法は、任意の特定の組織または動物の細胞を用いた使用にのみ限定されないことを意図する。インビボで、本明細書に開示するＦＧＦシグナリングを阻害するための方法は、発生または成熟した動物における細胞の運命の決定を改変するために使用することができる。
【００１８】
本発明の目的は、ＦＧＦＲ１活性化に対する細胞応答をモジュレートするために、本明細書に開示する方法を採用することである。当該技術分野では、ＦＧＦシグナリングの活性化は正常な動物の発生中に正常な細胞の増殖、分化および移動反応が起こるために重要であることが知られている。当該技術分野では、ＦＧＦシグナリングは脊椎動物の発生中の肢芽形成を刺激することが知られており、そして成人組織における正しい損傷治癒および脈管形成を刺激することも知られている。過活動ＦＧＦＲは多くの疾患状態と結び付けられてきた。ＦＧＦＲの活性化が細胞の増殖、分化、移動および脈管形成に及ぼす効果は、ガンにおけるＦＧＦＲの関与と関連づけられた。多数の遺伝的障害がＦＧＦＲ変異と結び付けられ、それらには軟骨無形成症（小人症）、低軟骨形成症および死に至る異形成のような骨格障害、および頭蓋縫合の未熟な閉鎖により、または長骨の成長が未熟なまま終了したことにより起こると予想される障害を含む。これらの変異は、前駆細胞の過活性細胞増殖、分化および移動を生じる過活動ＦＧＦＲから生じることが示唆された。
【００１９】
本明細書に開示するＦＧＦシグナリングを阻害する方法は、外因性Ｓｕｌｆ１および／または外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリンに接触した正常および／異常な細胞における増殖、分化および移動反応を改変するために使用することができる。そのような細胞は、幹細胞およびガン細胞を含んでなることができる。ガン細胞では、ＦＧＦ応答細胞と外因性Ｓｕｌｆ１および／またはＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物との接触がＦＧＦシグナリングを阻害し、そして次いで細胞増殖、細胞移動および脈管形成を阻害する。ガン細胞においてＦＧＦが誘導する細胞増殖の阻害は、腫瘍細胞の増殖を阻害する。ガン細胞においてＦＧＦが誘導する細胞移動の阻害は、悪性反応（ｅｖｅｎｔ）の阻害を生じる。最後にガン細胞においてＦＧＦが誘導する脈管形成の阻害は、血管の形成を阻害し、これにより腫瘍への食料供給を遮断する。
【００２０】
本開示は、胚においてＳｕｌｆ１がＦＧＦにより制御される発生プロセスを調節できるインビボの証拠を初めて提供する。本発明の目的は、胚または前駆細胞においてＦＧＦが制御する発生プロセスを改変するために、ＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングを阻害する方法を使用することである。好適な態様では、ＦＧＦ応答細胞を内因性ヘパラン硫酸を修飾するために十分な量で外因性のＳｕｌｆ１および／またはＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物と接触させることがＦＧＦシグナリングを阻害する。ＦＧＦ応答細胞を外因性ＱＳｕｌｆ１と接触させることは、ＦＧＦ応答前駆細胞においてＦＧＦシグナリングを抑制することが示され、それに続く中胚葉形成の抑制をもたらした。このように本発明の方法は、前駆細胞の分化が生殖系および排出系の器官を生じる細胞に加えて、筋肉、血液および骨細胞を形成することを防ぐために利用することができる。中胚葉の誘導の防止では
、前駆細胞は代わりに外胚葉を形成するように再指令することができる。外胚葉への細胞分化の再指令は、表皮組織および神経系組織の形成を提供する。ＦＧＦ応答前駆細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害は、幹細胞生産の促進をもたらす。故に本明細書に開示するＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングを阻害する方法は、組織および臓器再生のための幹細胞に基づく治療に有用となり得る。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、ＦＧＦＲの下流にあるＦＧＦＲシグナリングカスケードの成分を阻害する方法を提供することである。当該技術分野ではＦＧＦＲは複雑なシグナル伝達カスケードの一部であることが知られている。活性化されるとＦＧＦＲは、Ｒａｓ、Ｒａｆ，ＭＥＫ、ＭＡＰＫおよびＥＲＫを含む下流の細胞内シグナリング成分を活性化する。ＦＧＦのＦＧＦＲへの結合は受容体を二量化し、これによりその受容体であるチロシンキナーゼ活性を活性化する。ＦＧＦ受容体のチロシンキナーゼ活性は、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＭＡＰＫおよびＥＲＫならびに下流の標的のリン酸化、およびそれに続く活性化を含むリン酸化のカスケードを細胞内で刺激する。本明細書に開示するＦＧＦ応答細胞を外因性Ｓｕｌｆ１またはＳｕｌｆ１修飾ヘパリンと接触させることを含んでなる、ＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害法は、ＦＧＦＲ１の下流のこれらシグナリング反応の阻害にも効果的となる。
【００２２】
また本明細書で提供するのは、本明細書に開示する幾つかの方法で使用するための組成物である。外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物を含んでなる組成物が提供され、この組成物はＦＧＦ応答細胞を、外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物と接触させることを含んでなる方法において、ＦＧＦ２またはＦＧＦ４のＦＧＦＲ１への結合を下げる能力を有し、ここでＦＧＦ２またはＦＧＦ４のＦＧＦＲ１への結合の低下は、ＦＧＦ応答細胞におけるＦＧＦシグナリングの阻害を生じる。外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物の例には、ヘパリン、ヘパラン硫酸、およびヘパリン／ヘパラン硫酸混合物がある。個々のヘパリンおよびヘパラン硫酸鎖のサイズは変動することができるが、比較的短鎖が好ましい。外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物は、培養中もしくはインビボでの細胞の細胞増殖、分化および移動を阻害するために使用することができる。また外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物は、組織中の脈管形成または中胚葉形成を阻害するためにも使用することができる。さらに外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物は、幹細胞の生産を促進するために、あるいはガンまたはヘパリン依存的シグナリング経路での欠陥による他の疾患状態を処置するために使用することができる。
【００２３】
本明細書で提供する外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物は、当該技術分野で知られているヘパリンに基づく化合物およびそれらを送達するための方法として特に魅力的な治療用化合物である。ヘパリン化合物は十分に特徴が決定された比較的安定な薬剤であり、そしてヘパリンに基づく治療は当該技術分野で十分に確立されている。ヘパリンは虚血を処置するために長い間、抗凝固剤として広く使用されて来た。ヘパリン化合物はインビボに導入された場合、安定で、しかも非毒性であることが証明されている。
【００２４】
本発明の方法では、外因性Ｓｕｌｆ１または外因性のＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物が治療に有効な量で生理学的に許容され得る担体中にて投与される。該化合物（１もしくは複数）は、単独で、または他の治療薬と組み合わせて投与することができ、そして静脈内、皮下または経口的に動物に投与することができる。投与は全身的でよいが、局所的投与が好ましい。
【００２５】
ＦＧＦ応答細胞は、発現可能なＳｕｌｆ１  ｃＤＮＡ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ寄託番号ＢＣ０１２９９７）を宿す導入された外因性構築物から外因性Ｓｕｌｆ１を発現することができる。ＦＧＦ応答細胞は、発現可能なＳｕｌｆ１  ｃＤＮＡ構築物で形質転換することができる。動物では、構築物は当該技術分野で知られている遺伝子療法の方法により送達す
ることができる。あるいはＳｕｌｆ１  ＲＮＡまたはタンパク質を、当該技術分野ですでに知られている注入もしくは他の送達手段により細胞に送達してもよい。
【００２６】
本発明の治療標的は細胞外であるので、Ｓｕｌｆ１酵素またはＳｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物の送達は細胞外であることが必要となるだけである。外因性Ｓｕｌｆ１または外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物が細胞内に送達されることは本発明の要件ではない。したがって本発明の方法では、細胞内送達の製薬学的難点は克服される。外因性Ｓｕｌｆ１酵素または外因性Ｓｕｌｆ１修飾ヘパリン化合物は、ＦＧＦシグナリングの阻害が望まれるＦＧＦ応答細胞の細胞外表面に送達され得る。
【００２７】
外因性Ｓｕｌｆ１を、発現可能なＳｕｌｆ１  ｃＤＮＡを宿す構築物から発現するＦＧＦ応答細胞では、活性なＳｕｌｆ１が細胞内で発現され、細胞外に分泌され、そして細胞表面上で活性である。細胞表面のヘパラン硫酸の脱硫酸化は、生きている細胞の細胞表面上で起こることが知られている。活性なＳｕｌｆ１を発現している細胞は、不活性な細胞外マトリックス中の標識ヘパラン硫酸で被覆した組織培養プレートに播いた場合、プレートの表面からスルフェートを効果的に放出する。比較して、不活性なＳｕｌｆ１を発現する細胞は、プレートの表面からスルフェートを放出することができず、Ｓｕｌｆ１が酵素的に活性であり、そして細胞の表面上で機能していることを示す。さらにゴルジからの放出を防止するように修飾された活性なＳｕｌｆ１を発現する細胞は、不活性な細胞外マトリックス中の標識ヘパラン硫酸で被覆した組織培養プレートからスルフェートを放出することができない。
【実施例】
【００２８】
Ａ．材料および方法
ｉ）プラスミド、ｍＲＮＡおよび組換えタンパク質。完全長のＱＳｕｌｆ１タンパク質をコードするＱＳｕｌｆ１  ｃＤＮＡは、哺乳動物細胞の発現およびＱＳｕｌｆ１  ｍＲＮＡのインビトロ合成のために、それぞれｐＡＧ−ｍｙｃおよびｐＣＳ２ベクターにサブクローン化した。ｐＣＳ２−ＸＦＧＦＲ１Ｋ５６２Ｅプラスミドは、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆｒｉｅｓｅｌ博士（Ｎｅｉｌｓｏｎ  ＆  Ｆｒｉｅｓｅｌ，Ｊ．ｏｆＢｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２５０４９−５７（１９９６））の好意により提供された。アルカリフォスファターゼ（ｐＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰ）で標識した細胞外ドメインを有する可溶性ＦＧＦＲ１受容体をコードする構築物は、Ａｌａｎ  Ｒａｐｒａｅｇｅｒ博士（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５５，８４５−５８（２００１））の好意により提供された。薬剤−誘導性ｉＦＧＦＲ１は、ＡＰ２０１８７（Ａｒｉａｄにより提供された）（Ｐｏｗｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５６，８９−９９（２００３））で活性化した。ヒト組換えＦＧＦ２タンパク質は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入し、そしてＸｅｎｏｐｕｓ  ＦＧＦ４（ｅＦＧＦ）は、発現構築物であるｐＥＴ−ＸｅＦＧＦｉ（Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１４，７１１−２０（１９９２））を使用して生産した。ＱＳｕｌｆ１、ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）変異体、ＦＧＦＲ１Ｋ５６２ＥおよびｉＦＧＦＲ１  ｍＲＮＡは、ｍＭｅｓｓａｇｅキット（アムビオン）を使用して合成し、そして分光光度計を使用して定量した。活性なＱＳｕｌｆ１および触媒的に不活性なＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）タンパク質は、ｐＡＧ−ＱＳｕｌｆ１およびｐＡＧ−ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）で安定にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から記載されているように精製した（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））。
【００２９】
ｉｉ）アニマルキャップアッセイ。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌｅａｖｉｓ）は、以下の標準的プロトコールに従い得た（Ｓｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，１９７−２００（１９８７）；Ｙａｏ＆Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３７，１６９−１７８（２０００））。胚の動物極に、図面の簡単な説明に記載したようなｍＲＮＡを１細胞段階（ｏｎｅ−ｃｅｌｌ  ｓｔａｇｅ）で注入した。注入した胚を０．１×ＭＭＲ（Ｙａｏ＆Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３７，１６９−１７８（２０００））中で、アニマルキャップが分離する時の８〜９段階まで培養した。アニマルキャップは０．５×ＭＭＲにゼラチン（１００ｎｇ／ｍｌ）、組換えタンパク質ＡＰ２０１８７およびヘパリンを図面の簡単な説明で特定したように加えた中で培養した。１０個のアニマルキャップを各実験群について集めた。示すデータは、少なくとも３回の独立した実験の表示である。ツメカエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）およびウズラ（ｑｕａｉｌ）の胚は、ペンシルバニア大学のＩＡＣＵＣ委員会により認証された。
【００３０】
ｉｉｉ）ＥＲＫ１／２のウエスタンブロッティング分析
アニマルキャップは１５μｌのバッファー（８０ｍＭのベータ−グリセロホィフェート、２０ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．５およびプロテアーゼインヒビターのＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）カクテル（ロッシュ：Ｒｏｃｈｅ）を含む）中で溶解した。サンプルはタンパク質サンプルバッファー（４×濃度、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ））を、１４，０００ｇでの遠心により得た上清に加えた後７５℃で５分間加熱した。二リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｄｐ−ＥＲＫ１／２）およびＥＲＫ１／２検出には、それぞれサンプルの１４μｌおよび２μｌ（１０μｌの１×添加バッファーを加えた）を別個の１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥミニゲル（バイオラッド）に乗せた。５％の脱脂ミルクを加えたＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）をＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロース膜（アマシャム：Ａｍｅｒｓｈａｍ）ブロッキングおよび抗体のインキュベーションに使用した。膜は全ＥＲＫ１／２抗体（１：４０００、シグマ）またはＤｐ−ＥＲＫ１／２抗体（１：２０００、シグマ）と１時間インキュベーションし、ＴＢＳＴで４回、５分で交換しながら洗浄し、ペルオキシダーゼ標識第２抗体（アマシャム、Ｄｐ−ＥＲＫ１／２および全ＥＲＫ１／２検出用にそれぞれ１：２０００および１：４０００）とインキュベーションし、そして洗浄した。シグナルはＥＣＬ−プラスキット（アマシャム）を使用して発色させ、Ｘ−線フィルム上で捕捉し、Ｓｔｏｒｍイメージャーで走査し、そしてＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（モレキュラー  ダイナミックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で定量した。
【００３１】
ｉｖ）ＲＴ−ＰＣＴアッセイ。アニマルキャップは遺伝子発現のために１１段階まで培養した。全ＲＮＡをアニマルキャップおよび胚からＲＮＡｑｕｅｏｕｓ（商標）キット（アムビオン）を使用して精製し、そして分光光度計により定量した。ｃＤＮＡ合成、ＥＤ１α、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＭｙｏＤ用のＰＣＲプライマー、ＰＣＲ条件およびゲル電気泳動に関するプロトコールは、記載されているように行った（Ｅｎｇｌｅｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２３７，１５９−７２（２００１））。示すデータは５回の独立したアッセイの表示である。
【００３２】
ｖ）ＦＧＦ２−ヘパリンビーズ結合アッセイ。アクリル酸ビーズに結合したヘパリン（シグマ）を、ＱＳｕｌｆ１またはＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）変異体タンパク質で３７℃で一晩、振盪機上で消化した（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））。ヘパリン−ビーズは遠心により集め、そしてＨａｎｋ’ｓバランス塩溶液（ＨＢＳＳ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で洗浄し、次いで結合アッセイ用に２０μｌのビーズを含む５０μｌ容量のアリコートに分けた。処理したヘパリン−ビーズは量を変えたＦＧＦ２と室温で３０分間インキュベーションし、次いで洗浄した。ヘパリン−ビーズに結合したＦＧＦを、ウエスタンブロッティングにより分析した。示すデータは３回の独立した実験を表す。
【００３３】
ｖｉ）ＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰへのインビトロＦＧＦ２結合。ＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰタンパク質
は、ｐＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のコンディショニング培地から、無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２（インビトロジェン）に交換してから４８時間後に得た。コンディショニング培地中のタンパク質を、比色的色素濃縮アッセイ（インビトロジェン）により定量した。ＱＳｕｌｆ１の精製およびヘパリンの酵素的消化は、記載されている通りであった（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））。結合アッセイ混合物（ＨＢＳＳ中、１０ｎｇのＦＧＦ２、１０ｎｇのＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰ、およびＱＳｕｌｆ１またはＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）のいずれかで前処理した変動する量のヘパリンを含有する全２００μｌ容量）を、室温で３０分間インキュベーションした。複合体は、アガロースビーズ（シグマ）にカップリングした１０μｌの抗−ＡＰ抗体スラリーと２時間インキュベーションした後、免疫沈降した。ＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰに結合したＦＧＦ２を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、そしてウエスタンブロッィングにより検出し、そしてＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して定量した。抗−ＦＧＦ２抗体の希釈は、１：２０００（シグマ）であった。
【００３４】
ｖｉｉ）漿尿膜（ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｎｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）脈管形成アッセイ。受精したニワトリの卵を、加湿した３８℃のオーブン中で１０日間インキュベーションした。対照のヘパリンまたはＱＳｕｌｆ１−消化ヘパリン（２００ｎｇ）を含む２０ｎｇのＦＧＦ２を含有する１０μｌのＰＢＳに浸した濾紙（０．２５ｃｍ２）を、外皮の窓を通して露出した漿尿膜の無血管領域に乗せた。卵をテープで密閉し、そしてさらに３日間インキュベーションした。次いで漿尿膜を隣接する濾紙から切り出し、固定し、そして顕微鏡下で調査して各濾紙上の血管分枝の数を数えた（Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２４６５３−６０（２０００））。脈管形成は、Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，１５００−０２（１９９５））に従い、１（低い）から４（高い）に採点した。
【００３５】
Ｂ．結果および考察
ｉ）ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ２シグナリングおよび中胚葉誘導を抑制する。ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のアニマルキャップアッセイは、ＦＧＦシグナリングにおけるＱＳｕｌｆ１活性を実験するために採用した。ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胞胚の動物極領域のエクスプラントは、未処理の時に外胚葉誘導体を形成する（Ｙａｏ＆Ｋｅｓｓｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３７，１６９−１７８（２０００））。エクスプラントを外因性ＦＧＦタンパク質で処理すると、延長および中胚葉分化を生じ（Ｓｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，１９７−２００（１９８７））、都合が良いＦＧＦシグナリングアッセイ系を提供する。ＱＳｕｌｆ１および触媒的に不活性な変異体であるＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）（Ｄｈｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，１６６３−６（２００１））は、インビトロで合成されたｍＲＮＡをツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚に１細胞段階で注入することによりアニマルキャップで過剰に発現され、続いて動物極エクスプラントを胞胚段階で単離した。ＱＳｕｌｆ１またはＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）単独の過剰発現は、形態学的変化または中胚葉マーカー遺伝子の発現を誘導しなかった。しかしＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ２誘導型の組織延長（図１Ａ）、および中胚葉遺伝子であるＢｒａｃｈｙｕｒｙの発現によりアッセイされる中胚葉分化の両方を抑制した（図１Ｂ）。酵素的に不活性なＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）は、ＦＧＦ２誘導型の組織延長を遮断せず、そしてＢｒａｃｈｙｕｒｙ発現をわずかに阻害した。ＱＳｕｌｆ１発現はＥＲＫ１／２のリン酸化を強力に抑制し、これはＦＧＦ２シグナリング経路の直接的な標的である（図１Ｃ、１Ｅ）。対照的に、ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）はリン酸化ＥＲＫ１／２（図１Ｃ、１Ｅ）の誘導に効果が無く、ＱＳｕｌｆ１がその酵素活性を介してＦＧＦシグナリングを直接調節していることが確立される。したがってＢｒａｃｈｙｕｒｙ発現に及ぼすＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）のわずかな阻害活性は、非特異的応答であることを反映しているようだ。ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ４（ｅＦＧＦ）により誘導される中胚葉形成阻害にも同様に活性であり、ＦＧＦアイソフォームは通常、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚で活性である（図１Ｄ）（Ｓｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２６，１９７−２０００（１９８７））。したがってこれらのデータは、ＱＳｕｌｆ１がＥＲＫ１／２リン酸化の上流を操作するメカニズムを介して酵素的に機能して、ＦＧＦが誘導する中胚葉分化を阻害することを確立する。興味深いことには、ＦＧＦシグナリングに及ぼすＱＳｕｌｆ１の阻害活性は、Ｗｎｔシグナリングに及ぼすその正の調節活性と対照をなし（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））、ＱＳｕｌｆ１が二重調節機能を有し、そしてＨＳ媒介型のＦＧＦおよびＷｎｔシグナリングがＨＳの６−Ｏ硫酸化に異なる要件を有することを示す。
【００３６】
ｉｉ）ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦＲ１受容体の上流で機能して、細胞外ＨＳを修飾する。細胞外ＨＳの脱硫酸化におけるＱＳｕｌｆ１の活性から予想されるように（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））、ＱＳｕｌｆ１がＦＧＦＲ１受容体の上流に作用してＦＧＦシグナリングを阻害するのかどうかを決定することに焦点をおいた１組の実験を行った。これらの実験のために、構成的に活性なＦＧＦＲ１の変異体をＱＳｕｌｆ１と一緒にアニマルキャップ中で同時発現させ、これは中胚葉誘導およびＥＲＫ１／２リン酸化によりアッセイされるように、ＦＧＦシグナリングに応答する能力について試験した。ＦＧＦＲ１受容体の２種の変異体をこの実験に使用した。１つの場合ではＦＧＦＲ１  Ｋ５６２Ｅを使用し、これはＨＳ媒介型の受容体の二量化のための標準的な要件からは独立した、チロシンキナーゼ活性を構成的に活性化する細胞内チロシンキナーゼドメインに変異を有する（Ｎｅｉｌｓｏｎ  ＆  Ｆｒｉｅｓｅｌ，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２５０４９−５７（１９９６））。第２のＦＧＦＲ１変異体（ｉＦＧＦＲ１）は細胞外リガンド結合ドメインを欠くが、膜標的化アミノ末端ミリスチル化配列、および合成薬剤ＡＰ２０１８７に結合して、薬剤の添加に応答した受容体の二量化および受容体の活性化を促進する２つの変異したＦＫＢＲ１２ドメインを有する（Ｐｏｗｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５６，８９−９９（２００３））。これらの構成的に活性化されるＦＧＦＲ１受容体は、受容体の二量化に必要な細胞表面ＨＳを修飾するためにＱＳｕｌｆ１が機能する場合、ＦＧＦシグナリングのＱＳｕｌｆ１阻害に対して耐性となるだろうと推論される。高レベルのＤｐ−ＥＲＫ１／２活性化（図２Ａ、Ｃ）および中胚葉遺伝子の誘導（図２Ｂ）により示されるように、ＦＧＦＲ１Ｋ５６２ＥまたはｉＦＧＦＲ１は両方ともＦＧＦシグナリング活性化のためのＱＳｕｌｆ１の阻害活性に非感受性であった。
【００３７】
ＱＳｕｌｆ１が細胞外ＨＳの硫酸化を修飾することにより機能するのかどうかを試験するために、外から加えたヘパリンがアニマルキャップアッセイでＦＧＦシグナリングのＱＳｕｌｆ１阻害をレスキューできるかどうかを決定する実験を行った。ＱＳｕｌｆ１を注入したアニマルキャップは、ヘパリンの存在または不存在下で培養し、ヘパリンはＳｕｌｆ１の高度に硫酸化されたＨＳグリコサミノグリカン基質であり（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ−Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，４９１７５−８５（２００２）；Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））、そしてＨＳ生合成が欠損している細胞のＦＧＦ２シグナリングをレスキューすることができる（Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，２４０−２４７（１９９２）；Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５．２４６５３−６０（２０００））。培養した細胞においてＦＧＦ２シグナリングをレスキューする濃度（１５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ）で（Ｆａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９，１４３４−４５（２０００））、外因性ヘパリンはＦＧＦ２が媒介するＥＲＫ１／２活性化および中胚葉誘導（図３）のＱＳｕｌｆ１阻害を完全にレスキューした（図３）。またＳｕｌｆ１は、ＦＧＦ２に応答し、そしてヘパリン依存的ＥＧＦのＥｒｋ１／２活性化も遮断するが、培養した卵巣細胞株でヘパリン依存的ＥＧＦによる活性化には応答せず（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２３１０７−２３１１７（２００３））、Ｓｕｌｆ１がＨＳ−依存的シグナリングに特異的な細胞外ＨＳの硫酸化を酵素的に修飾するという結論を指示する。特記すべきは、ＦＧＦ２の存在または不存在下で可溶性ヘパリンで処理した非注入アニマルキャップは、ＦＧＦシグナリングにおいてさらに刺激されず、胚のアニマルキャップの細胞表面上のＨＳは、ＦＧＦＲ１受容体の活性化およびＦＧＦシグナル伝達を制御するために過剰に存在することを示す。
【００３８】
ｉｉｉ）ＱＳｕｌｆ１修飾ヘパリンはＦＧＦ２が誘導する脈管形成を阻害する。外因性ヘパリンはＱＳｕｌｆ１発現アニマルキャップ細胞でＦＧＦシグナリングをレスキューするので、ＱＳｕｌｆ１修飾ヘパリンがＦＧＦシグナリングを遮断できるかどうかを試験する実験を行った。これらの実験には、漿尿膜の脈管形成系におけるＦＧＦ２シグナリングを調査し、ＦＧＦ誘導に関して、血管分枝により監視されるような感度のある、しかも定量的なインビボアッセイを準備し（Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２４６５３−６０（２０００））、そしてそれに続いてＰＢＳ対照１（低レベルの脈管形成）から４（ＦＧＦ２が誘導する脈管形成レベル）に採点した（Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，１５００−０２（１９９５））。ＰＢＳで処理した対照の漿尿膜は、１と採点されるレベルで血管を形成し（表１、図４Ａ）、それに対してＦＧＦ２で処理した膜は、かなりの分枝がある血管を形成し、そして１〜４の尺度のうちの２．９と採点され（図４Ｂ）、ここで１の採点は膜あたり０〜２個の分枝に等しく、そして４の採点は膜あたり２５の分枝に等しい。ＦＧＦに誘導される血管の分枝は、ＱＳｕｌｆ１により酵素的に脱硫酸化された外因性ヘパリンの添加によりほぼ完全に遮断され、１．１と採点されたが、不活性なＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）酵素には遮断活性が無く、そして２．９と採点された（図４ＣおよびＤを比較されたい）。したがって、ＱＳｕｌｆ１修飾ヘパリンは、有力な脈管形成インヒビターである。
【００３９】
表１        ＱＳｕｌｆ１  ６−Ｏ硫酸化ヘパリンは、
ヒナ漿尿膜上のＦＧＦ２が誘導する脈管形成を阻害する。        
胚処理                        採点の数            脈管形成  
ＰＢＳ                        １４                  １      
ＦＧＦ２（２５ｎｇ）          １５            ２．９±０．５  
ＦＧＦ２＋ヘパリン            １５            ２．５±０．７
／ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）                                      
ＦＧＦ２＋ヘパリン            １４            １．１±０．５
／ＱＳｕｌｆ１                                                
【００４０】
脈管形成は１（低い、ＰＢＳ）から４（高い）に、Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０，１５００−０２（１９９５）に従い採点した。示したデータは各処理から少なくとも１４個の胚についての平均および標準偏差である。
ｉｖ）ＱＳｕｌｆ１修飾ヘパリンは、ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体形成を破壊する。ＱＳｕｌｆ１活性がＨＳを修飾してＦＧＦシグナリングを遮断するメカニズムを調査するために、ＱＳｕｌｆ１はヘパリンがＦＧＦ２に結合する能力を改変するかどうかを決定する実験を行った。アクリル酸ビーズに結合したヘパリンを、ＱＳｕｌｆ１または触媒的に不活性なＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）で酵素的に処理し、そして次に過剰なＦＧＦ２タンパク質と一緒にインキュベーションして結合をアッセイした。次いで結合したＦＧＦ２を含むビーズを洗浄し、そして結合したＦＧＦをウエスタンブロッティグを使用して定量した。これらのアッセイにより、ＦＧＦ２がＱＳｕｌｆ１処理ヘパリンおよびＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）処理ヘパリンに等しく十分に結合することが明らかとなり（図５Ａ）、ＱＳｕｌｆ１処理はＨＳへのＦＧＦ２結合を減少しないことが確立された。これはヘパリンへのＦＧＦ２結合に２−Ｏを必要とするが、６−Ｏスルフェートは必要としない事前の知見と一致する（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６，７４３−５０（２０００）；Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２４６５３−６０（２０００）；Ｐｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２２９３６−４２（１９９８））、これらにはＱＳｕｌｆ１の基質を含む（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ−Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，４９１７５−８５（２００２）；Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３）。
【００４１】
次いでＱＳｕｌｆ１は、ヘパリンがＦＧＦ２−ヘパリン−ＦＧＦＲ三重複合体を形成する能力を破壊するかどうかを決定した。ヘパリンが媒介するＦＧＦ２リガンド−受容体結合は、ＡＰタグに融合されたＦＧＦＲ１の細胞外ドメインを含有する可溶性ＦＧＦＲ１ｃを使用することによりアッセイした（Ａｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５５，８４５−５８（２００１））。ＦＧＦ２およびＦＧＦＲ１ｃは、ＱＳｕｌｆ１またはＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）の濃度を上昇させて処理したヘパリン（０−１０００ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションして、ＦＧＦ２−ヘパリン−ＦＧＦＲ三重複合体を形成できるようにした。次いで複合体は抗ＡＰ抗体と免疫沈降させた。ヘパリンの不存在下では低レベルのＦＧＦ２がＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰに結合しただけであった（図５Ｂ−Ｃ）。対照ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）酵素で処理したヘパリンは、ＦＧＦ２のＦＧＦＲ１ｃへの結合を促進したが、ＱＳｕｌｆ１で処理したヘパリンは、２〜５倍まで結合を減少させ（図５Ｂ−Ｃ）、ＱＳｕｌｆ１消化がヘパリンの三重複合体の形成を促進する能力を下げることを示す。ＱＳｕｌｆ１はＨＳ鎖の６−Ｏ硫酸化二糖のサブセットに対する基質特異性を有するので（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））、ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１相互作用およびシグナリングを促進するための受容体の二量化に必要であるが、ＦＧＦ２リガンド結合には必要無い６−Ｏ硫酸基を除去する（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６，７４３−５０（２０００）；Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２４６５３−６０（２０００）；Ｐｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２２９３６−４２（１９９８））。
【００４２】
ＦＧＦ２での結果とは対照的に、ＱＳｕｌｆ１はヘパリンのＷｎｔリガンドへの結合親和性を下げ、Ｗｎｔシグナリングを強化する（Ａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６２，３４１−５１（２００３））。ＱＳｕｌｆ１は、原節、底板、神経管および腎臓を含む初期胚の前駆細胞の多重系統で異なるパターンで発現される（Ｄｈｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，１６６３−６（２００１）；Ｏｈｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ７，１７３−８５（２００２））。これらＱＳｕｌｆ１発現前駆系統は、それらの前駆系統としての特異性について、ＷｎｔおよびＦＧＦを含む多くの発生シグナルに応答している。理論に拘束されることを望まないが、ＱＳｕｌｆ１は神経管および原節のような多型潜在性胚組織の系統特異性において、Ｗｎｔシグナリングを促進し、そしてＦＧＦシグナリングを遮断するための二重調節機能により、空間的および一時的「スイッチ」として機能することができる。Ｓｕｌｆ１オルソログは、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびヒトを含む多様な動物のゲノムに存在し（Ｄｈｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３，１６６３−６（２００１）；Ｍｏｒｉｍｏｔｏ−Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７７，４９１７５−８５（２００２））、そして第２の関連するアイソフォームが脊椎動物で同定され、Ｓｕｌｆ１酵素が進化の過程で高度に保存され、そして多くの系でＦＧＦおよび他の発生シグナルを調節できることを示す。これらの研究は、胚におけるＱＳｕｌｆ１の発生シグナリング機能に関する将来の調査のための基礎となる。
ｖ）ＱＳｕｌｆ１が媒介するＨＳ修飾は、ＦＧＦ２リガンド−受容体相互作用および受容体の活性化を調節する。ＦＧＦ２−ヘパリン−ＦＧＦＲ１三重複合体形成のＱＳｕｌｆ１調節のこれら実験は、ＱＳｕｌｆ１が中胚葉誘導および脈管形成におけるＦＧＦ２シグナリングを阻害するという知見を解釈するための基礎を提供する（図６）。細胞表面のＨＳＰＧはＦＧＦ２リガンド−受容体相互作用の周知コファクターであり、受容体の二量化および細胞内シグナリング伝達を活性化を制御する（Ｏｒｎｉｔｚ  ＆  Ｉｔｏｈ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２．ＲＥＶＩＥＷＳ３００５（２００１））。またＨＳの硫酸化状態も、そのＦＧＦ２シグナリング機能に重要である。ＨＳ２−Ｏ硫酸化は、ＦＧＦ２リガンド結合に必要とされ、そして６−Ｏ硫酸化は受容体結合／二量化に必要であり（Ｌｕｎｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，２４６５３−６０（２０００）；Ｐｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２２９３６−４２（１９９８））、ＦＧＦ２−ＨＳ−ＦＧＦＲ１三重複合体を形成する（図６Ａ）。本明細書に報告する実験は、ＱＳｕｌｆ１  ６−Ｏエンドスルファターゼ活性が、細胞表面ＨＳの特異的６−Ｏ脱硫酸化、リガンド−受容体三重複合体の形成を阻害する修飾、および受容体の二量化によりＦＧＦ２シグナリングを遮断することを示す。この結論は、ＦＧＦＲ１の活性化形態がＱＳｕｌｆ１の阻害活性に非感受性であるという知見により支持される（図６Ｂ）。さらにアニマルキャップ細胞でのＱＳｕｌｆ１の阻害活性は、外因性の可溶性ヘパリンによりレスキューされることができる。ヘパリンは豊富な６−Ｏ硫酸化残基を含み、すなわちＱＳｕｌｆ１を発現している細胞上の６−Ｏ脱硫酸化ＨＳ鎖を置き換えて、ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１複合体の形成および受容体の二量化を可能にする（図６Ｃ）。また本明細書では、ＱＳｕｌｆ１がヘパリンを酵素的に修飾して、脈管形成におけるＦＧＦ２シグナリングの有力な可溶性インヒビターを生産するために使用することができることも示す。ＱＳｕｌｆ１消化により生産された阻害ヘパリンは、ＦＧＦ２に結合するがＦＧＦＲ１には結合しない６−Ｏ脱硫酸化多糖であるらしく、これは細胞表面上で内因性のＨＳと競合して、三重複合体の形成を遮断し、そして脈管形成を阻害する（図６Ｄ）。
【００４３】
胚におけるＳｕｌｆ１の機能に加えて、これは成人の組織でも発現され、そしてガンのような病態生理プロセスでも機能するらしい。最近の研究は、ＨＳｕｌｆ１発現が卵巣ガン細胞で抑制され、そしてこれらのガン細胞中のＨＳｕｌｆ１過剰発現がＦＧＦ２およびＥＧＦによるＥＲＫ活性化を遮断し、そして増殖を阻害することを示す（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２３１０７−２３１１７（２００３））。細胞中のＱＳｕｌｆ１の増殖因子シグナリング機能は、その酵素活性およびＨＳ鎖の６−Ｏ脱硫酸化に対する特異性に基づく。さらにＱＳｕｌｆ１は可溶性ヘパリンを酵素的に修飾して、脈管形成の有力なインヒビターを生産することができる。これらの知見、およびリガンド受容体相互作用に関与するＨＳドメインに対するＱＳｕｌｆ１の特異性は、ＱＳｕｌｆ１酵素がインビボおよびインビトロの両方でヘパリンに基づく化合物を生成するための有用な試薬となることを示す。これらの修飾ヘパリンは、組織および器官の再生のための幹細胞生産を促進するための、そして特異的なガンの処置において、腫瘍細胞の増殖および脈管形成を制御するための治療薬としても有用となることができる（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９，１５−１８（２００２））。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）のアニマルキャップアッセイにおいて、ＦＧＦが誘導する中胚葉のＱＳｕｌｆ１抑制を示すデータを表す。ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚に野生型のＱＳｕｌｆ１または変異体ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）のｍＲＮＡ（７５０ｐｇ）を１細胞段階で注入した。アニマルキャップは８〜９段階で切開し、そして中胚葉誘導およびＥＲＫ１／２活性化を評価するために培養した。（Ａ）ＦＧＦ２の不存在下で、アニマルキャップのエクスプラントは表皮を形成し、そして球状と想定されるが、ＦＧＦで誘導した時にキャップは延長し、そして中胚葉組織を形成した。触媒的に不活性なＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）ではなく野生型ＱＳｕｌｆ１の発現は、ＦＧＦが誘導するアニマルキャップの延長を遮断する。（Ｂ）アニマルキャップは、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより遺伝子発現を評価するために、ＲＮＡの単離前に第１１段階まで培養した。ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ２（３０ｎｇ／ｍｌ）により誘導される中胚葉の遺伝子発現（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）を抑制するが、触媒的に不活性なＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）はＦＧＦ２が誘導するＢｒａｃｈｙｕｒｙ発現を遮断しない。ＥＦ１αはゲル添加用対照として使用し、そして全胚ＲＮＡは中胚葉遺伝子の陽性対照として使用した。（Ｃ，Ｄ）ＥＲＫ１／２リン酸化のアッセイについては、アニマルキャップをＦＧＦ２またはＦＧＦ４（３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で、１時間培養し、そしてタンパク質抽出物は、二リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｄｐ−ＥＲＫ１／２）および全ＥＲＫ１／２タンパク質を検出するための抗体を使用したウエスタンブロット分析用に調製した。Ｅｒｋ１／２リン酸化はＦＧＦシグナリングに広く応用されているアッセイである（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，２３１０７−２３１１７（２００３）；Ｐｏｗｎａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２５６，８９−９９（２００３））。全ＥＲＫ１／２レベルは、ゲル添加を監視するための標準として使用した。ＦＧＦ２−誘導化Ｄｐ−ＥＲＫ１／２リン酸化はＱＳｕｌｆ１により抑制されるが、酵素に不活性なＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）では抑制されない（Ｃ）。またＱＳｕｌｆ１は、ＦＧＦ４が誘導するＤｐ−ＥＲＫ１／２活性化を抑制する（Ｄ）。Ｅ．パネルＣで示すＥＲＫ１／２のリン酸化を定量し、そして４回の独立した実験から標準偏差を含む平均として提示した。相対的なＤｐ−ＥＲＫ１／２レベルは、全ＥＲＫ１／２に対するＤｐ−ＥＲＫ１／２の比を測定することにより算出し、そして次に任意に１０の値に割り当てたＦＧＦ２が誘導するレベルに対して標準化した。ＦＧＦ２が誘導するＤｐ−ＥＲＫ１／２のＱＳｕｌｆ１抑制は、ＦＧＦ２対照から統計的に有意であったが（ｐ＜０．００１）、ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）はＦＧＦ２シグナリング活性に効果が無かった（ｐ＝０．７２）。
【図２】構成的に活性化されたＦＧＦＲ１受容体はＦＧＦ２およびＦＧＦ４シグナリングのＱＳｕｌｆ１阻害を迂回することを示すデータを表す。ＦＧＦＲ１Ｋ５６２Ｅは、ＦＧＦリガンド結合から独立して、構成的な活性を付与する細胞内ドメインの変異をもつＦＧＦＲ１受容体である（Ａ，Ｂ）。ｉＦＧＦＲ１は、欠失した細胞外ドメインを持ち、そして受容体の二量化および薬剤ＡＰ２０１８７の添加に応答した誘導性の活性化を促進する細胞内ドメインが加えられた膜に着いたＦＧＦＲ１受容体である（Ｃ）。ＱＳｕｌｆ１のｍＲＮＡ（２ｎｇ）を単独で、またはＦＧＦＲ１Ｋ５６２Ｅ  ｍＲＮＡ（１００ｐｇ）もしくはｉＦＧＦＲ１のｍＲＮＡ（２０ｐｇ）と一緒に、１細胞段階のツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚に注入した。アニマルキャップは８〜９段階で切開し、そしてリン酸化ＥＲＫ１／２（Ｄｐ−ＥＲＫ１／２）および全ＥＲＫ１／２（ＥＲＫ１／２）（Ａ，Ｃ）のウエスタンブロット分析用に、および中胚葉の遺伝子発現をアッセイするためのＲＴ−ＰＣＲ分析に（Ｂ）培養した。（Ａ）タンパク質抽出物は、ＦＧＦ２処理から１時間後にＤｐ−ＥＲＫ１／２のウエスタンブロット分析によりアッセイした。ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ２（３０ｎｇ／ｍｌ）を抑制するが、Ｄｐ−ＥＲＫ１／２のＦＧＦＲ１Ｋ５６２Ｅ活性化は抑制しない。（Ｂ）ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ２を抑制するが、中胚葉マーカーであるＢｒａｃｈｙｕｒｙおよびＭｙｏＤのＦＧＦＲ１Ｋ５６２Ｅ誘導は抑制しない。全胚サンプルは中胚葉の遺伝子発現のための陽性対照を提供した。（Ｃ）ｉＦＧＦＲ１受容体のＡＰ２０１８７（１．２５μＭ）活性化は、ＱＳｕｌｆ１の存在下でＤｐ−ＥＲＫ１／２の活性化を誘導する。
【図３】外因性ヘパリンがＱＳｕｌｆ１によるＦＧＦ２シグナリングの抑制をレスキューすることを示すデータを表す。ＱＳｕｌｆ１のｍＲＮＡを１細胞段階のツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の胚に注入した（２ｎｇ）。アニマルキャップを８〜９段階で切開し、そして培養した。硫酸化ヘパリンを１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で培養基に加えた。（Ａ）アニマルキャップはＦＧＦ２処理から２時間後に集めた。ＱＳｕｌｆ１は、ＦＧＦ２タンパク質（３０ｎｇ／ｍｌ）により誘導されるＥＲＫ１／２活性化を抑制し、この抑制は外因性ヘパリンによりレスキューされた。全ＥＲＫ１／２はゲル添加対照としてアッセイした。（Ｂ）アニマルキャップは遺伝子発現を評価するために第１１段階まで培養した。中胚葉遺伝子（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）発現のＱＳｕｌｆ１抑制は、外因性ヘパリンによりレスキューされた。構成的に発現されたＥＦ１αはゲル添加対照として役立て、そして全胚から調製したＲＮＡは中胚葉の遺伝子発現のアッセイに関する陽性対照として使用した。
【図４】ＱＳｕｌｆ１処理ヘパリンは、ＦＧＦ２が誘導する脈管形成を抑制することを示すデータを表す。ヘパリンを含むか、または含まないＦＧＦ２に浸した濾紙を、１０日目のニワトリの胚の漿尿膜に適用した。膜上の血管形成を３日後に分析した。３回の独立した実験から１２枚より多くの濾紙を、各実験群について調査した。（Ａ）対照ＰＢＳの濾紙の適用は、１３サンプルのうちの９サンプルで血管分枝の形成を誘導しなかった。（Ｂ）ＦＧＦ２（２０ｎｇ）濾紙の適用は、１２サンプルのうちの８サンプルに血管分枝の形成を誘導した。（Ｃ）ＦＧＦ２およびＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）処理ヘパリン（２００ｎｇ）を含有する濾紙の適用は、１４サンプルのうちの１２サンプルでＦＧＦ２により誘導される血管分枝の形成に影響を及ぼさなかった。（Ｄ）ＦＧＦ２およびＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）処理ヘパリン（２００ｎｇ）を含有する濾紙の適用は、１５サンプルのうちの９サンプルで血管分枝のＦＧＦ２誘導を抑制した。矢印は血管分枝の形成を示す。
【図５】ＱＳｕｌｆ１処理ヘパリンはＦＧＦ２のＦＧＦＲ１への結合を下げるが、ヘパリンはさげないことを示すデータを表す。（Ａ）ＱＳｕｌｆ１はＦＧＦ２のヘパリンへの結合に影響を及ぼさない。ＱＳｕｌｆ１またはＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）変異体タンパク質で前処理したヘパリンビーズを、示した量のＦＧＦ２とインキュベーションした。ヘパリンが結合したＦＧＦ２は、ウエスタンブロッティングにより分析した。ＱＳｕｌｆ１処理およびＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）処理ヘパリンへのＦＧＦ２結合に有意差は検出されなかった。（Ｂ）ヘパリンのＱＳｕｌｆ１処理は、ＦＧＦ２−ヘパリン−ＦＧＦＲ１複合体の形成を減少させた。ＱＳｕｌｆ１処理またはＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）処理した可溶性ヘパリンは、示した濃度でＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰ（１０ｎｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。ＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰは、アガロースビーズに結合した抗ＡＰ抗体と免疫沈降し、そして結合したＦＧＦ２をウエスタンブロッティングにより検出した。（Ｃ）ＱＳｕｌｆ１処理またはＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）処理したヘパリンの存在下で、ＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰに結合したＦＧＦ２の定量。ＱＳｕｌｆ１処理ヘパリンの存在下でのＦＧＦ２のＦＧＦＲ１ｃ−ＡＰへの結合は、ＱＳｕｌｆ１（Ｃ−Ａ）処理したヘパリンの存在下での結合と比べて２〜５倍低下した。
【図６】ＦＧＦリガンド−受容体の相互作用のモジュレーティングを介するＳｕｌｆ１によるＦＧＦシグナリング調節のモデルを表す。２：２：２モデル（２つのリガンド、２つのＨＳ鎖および２つの受容体）は、シグナリング中にＦＧＦ２−ＨＳ−ＦＧＦＲ１の三重複合体の形成を具体的に説明するために他者により提案された（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ６，７４３−５０（２０００）；Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２９，１５−１８（２００２））。（Ａ）Ｓｕｌｆ１の不存在下で、硫酸化された細胞表面のＨＳはＦＧＦリガンド−受容体の相互作用、受容体の二量化および細胞内シグナリングの活性化を促進する。（Ｂ）ＱＳｕｌｆ１による内因性ＨＳの選択的な６−Ｏ脱硫酸化はＦＧＦリガンド−受容体の結合を下げるが、ＨＳへのＦＧＦリガンド結合にはほとんど影響しない。低下したリガンド−受容体相互作用は、受容体の二量化およびシグナリングを抑制する。（Ｃ）内因性の硫酸化ヘパリンは、ＱＳｕｌｆ１で脱硫酸化した内因性の細胞表面ＨＳを置き換え、そしてＦＧＦリガンド−受容体の相互作用を促進することによりシグナリングをレスキューする。（Ｄ）Ｓｕｌｆ１  ６−Ｏ脱硫酸化外因性ヘパリンはＦＧＦＲ１に対して低下した親和性を有するが、ＦＧＦ２に競合的に結合し、そして内因性のＨＳが媒介するＦＧＦ２脈管形成活性を妨害する。ＦＧＦＲ１の細胞内ドメインの“Ｐ”は、リン酸化および活性化を示す。
【図６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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