(57)【要約】本発明は、B型肝炎(HBV)プレコアタンパク質によるトール様受容体の発現の制御、またはその細胞外発現産物であるB型肝炎E抗原(HbeAg)の発現の制御を提供する。このような発現を制御する化合物は、動物においてHBV感染の治療および予防に用途がある。また、本発明は、HBVを診断するための方法、および診断プロトコールに有用な薬剤を提供する。本発明はさらに、ヒトおよび動物モデルを含む他の動物種において病態をモニターするための方法、ならびにHBVによる感染、または他の病的状態の進行に関する被験体の指標を提供するための方法を意図する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TLRシグナル伝達のレベルを調節するHBV特定エフェクター分子の存在もしくは非存在を判定する段階を含む、HBVによる感染または疾患状態もしくはその素因の存在を検出するための方法であって、該エフェクター分子の存在もしくは非存在、またはTLRのレベルの高低、またはTLRシグナル伝達経路内の成分が、HBVによる感染または関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる、方法。
【請求項２】
プレコア発現産物が細胞内型である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
プレコア発現産物が細胞外型である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
TLRがTLR-2またはそのホモログである、請求項1または2または3記載の方法。
【請求項５】
TLRシグナル伝達のレベルがTLRまたはTLR-2のレベルで判定され、次にそれがコードするmRNAの量で判定される、請求項1または4記載の方法。
【請求項６】
細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物のレベルまたはTLRのレベルがタンパク質レベルで判定される、請求項4記載の方法。
【請求項７】
TLRシグナル伝達を調節するHBV特定エフェクター分子のレベルまたは活性を判定する段階を含む、HBVによる感染または疾患状態の進行に対する治療プロトコールへの応答をモニターするための方法であって、該エフェクター分子の存在もしくは非存在、またはTLRのレベルの高低、またはTLRシグナル伝達経路内の成分が、HBVによる感染または関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる、方法。
【請求項８】
HBVがプレコアおよび/またはBCP突然変異体である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
HBVに特定されるエフェクター分子が細胞内または細胞外のプレコア発現産物である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
TLRがTLR-2またはそのホモログである、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
TLRシグナル伝達のレベルがTLRまたはTLR-2のレベルで判定され、次にそれがコードするmRNAの量で判定される、請求項7または10記載の方法。
【請求項１２】
細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物のレベルまたはTLRもしくはそのホモログのレベルがタンパク質レベルで判定される、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物のレベルを下方制御するまたはTLRのレベルを上方制御もしくは下方制御するワクチンを含む有効量の薬剤を被験体へ投与する段階を含む、HBVに感染したまたは疾患状態を有するもしくはその素因を有する被験体を治療するための方法。
【請求項１４】
HBVがプレコアおよび/またはBCP突然変異体である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
HBVに特定されるエフェクター分子が細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物である、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
TLRがTLR-2またはそのホモログである、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物のレベルまたはTLRのレベルが、それをコードするmRNAの量で判定される、請求項13または16記載の方法。
【請求項１８】
細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物のレベルまたはTLRのレベルがタンパク質レベルで判定される、請求項13または16記載の方法。
【請求項１９】
細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物の調節因子および任意でTLRまたはそのホモログの調節因子と、1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈液とを含む、HBVによる感染または疾患状態もしくはその素因の治療に用いるための薬学的組成物またはワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、動物種においてB型肝炎ウイルス(HBV)の感染の治療および予防に有用な化合物を提供する。本発明はさらに、HBVによる感染または他の疾患状態を診断するための方法および診断プロトコールに有用な薬剤を提供する。本発明はさらに、ヒトおよび動物モデルを含む他の動物種において病態をモニターするための方法、ならびにHBVによる感染または他の病的状態の進行に対する被験体の感受性の指標を提供するための方法を意図する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
本明細書において言及される刊行物の参考文献詳細もまた、本明細書の末尾に収載する。
【０００３】
本明細書における任意の先行技術への言及は、この先行技術が任意の国における共通の常識の一部をなすということの認識でも、または何らかの示唆でもなく、またそのように解釈されるべきではない。
【０００４】
B型肝炎ウイルス(HBV)は、衰弱性の疾患状態をもたらし、急性肝不全を引き起こし得る。HBVは、RNA中間体を介して複製し、その複製戦略に逆転写を利用するDNAウイルスである。HBVゲノムは、表面遺伝子、プレコア遺伝子、コア遺伝子、ポリメラーゼおよびX遺伝子をコードする重複するオープンリーディングフレームを備える部分的な二本鎖DNA構造を有する複雑な性質を持つ。
【０００５】
HBVプレコア/コア遺伝子は、共通の末端であるN末端を有するHBcAg(コア遺伝子にコードされる)の合成およびHBeAg(プレコア遺伝子にコードされる)の合成を制御する2つのインフレーム開始コドンを含む。実際に、プレコア遺伝子は、同じタンパク質の2種類の型：HBeAg細胞外型および本明細書においてP22と称するP22またはP25細胞内型をコードする。プレコア遺伝子発現産物をHBeAg/P22と称する。細胞外タンパク質は、免疫介在性のウイルスの排除機構のための標的である。
【０００６】
プレコアタンパク質に関して、このORFの最初のAUGから翻訳が開始され、シグナルペプチドをコードするpreC領域を備える25kDポリペプチドを生じる。シグナルペプチドは、そのペプチドが切断されて、分泌経路から搬出される17kDタンパク質産物を生ずるERに前駆体タンパク質を挿入することによって機能する。この17〜25kDタンパク質がP22である。搬出の間、塩基性のC末端ドメインが切断されて15〜17kDの可溶性タンパク質を生成し、それが最終的に血清中に分泌されてHBeAgとして測定されるが、その中には外側の細胞膜へ取り込まれるものもある。HBeAg/P22は、生産的なウイルス複製を必要としない。
【０００７】
HBcAgは、その合成が2番目のインフレーム開始コドンから開始され、より短いゲノム転写物から翻訳される、21kDのリンタンパク質である。HBcAgは、ヌクレオカプシドの主要なタンパク質成分である。C末端ドメインは高度に塩基性であり、非配列特異的核酸結合ドメインを保有する。
【０００８】
重複するXオープンリーディングフレーム領域(X-ORF)中に存在する基底コアプロモーター[BCP](ヌクレオチド1744〜1804位)は、プレコア領域およびコア領域両方の転写を制御し、2つのmRNA、つまりプレコアmRNAとプレゲノム/C mRNAの合成を命令する。プレコアmRNAはHBeAg/P22をコードし、プレゲノム/C mRNAはコアタンパク質をコードする。DNAポリメラーゼは、逆転写のための鋳型であるプレゲノムRNA(pgRNA)として働く。
【０００９】
HBeAg/P22合成に作用する突然変異の2つの主要なグループが、プレコアタンパク質突然変異(G1896A)ならびにヌクレオチド1762位およびヌクレオチド1764位の基底コアプロモーター(BCP)における突然変異であり、それらは全てHBeAg/P22産生の低下およびその結果生じる宿主免疫応答の増加をもたらす。尤もこれは患者の中には一過性である場合もあり、免疫抑制されていない患者においてはより悪性度の高い肝疾患との明確な相関性はない。プレコア突然変異は類似した時期に頻繁に生じ、しばしばコア遺伝子突然変異/欠失に関連している。
【００１０】
プレコア停止突然変異とHBV遺伝子型との間には関連性がある。ヌクレオチド1896位はグアノシン(G)であり、キャプシド形成に関与しているRNA構造エレメント、イプシロン内に見出される。これはヌクレオチド1858位と塩基対を形成し、ヌクレオチド1858位での突然変異は、ヌクレオチド1896位でのプレコア停止突然変異と共に、イプシロンのステムループ領域内でウイルスの塩基対形成を促進し得る。遺伝子型AのHBV感染患者において(北アメリカおよびヨーロッパの一部で最も一般的な遺伝子型)、ヌクレオチド1858位はCである。この遺伝子型では、ヌクレオチド1896位(GからA)とヌクレオチド1858位(CからT)の双方での突然変異がステムループ構造を安定化させるために必要であると考えられる。遺伝子型AのHBVにおいてヌクレオチド1858位での代償的な突然変異なく、C-1858がA-1896と対になろうとする場合に塩基対形成不全が生じ、そのことがパッケージングシグナルのステムループ構造を不安定化する。パッケージングのための安定なイプシロンがないと、キャプシド形成の低下およびその結果複製の低下が起こる可能性があり、複製欠損ウイルスとなる。従って、2つの突然変異事象の必要条件のために、遺伝子型Aにおいてはプレコア停止コドン突然変異の頻度が低くなる可能性がある。対照的に、アジア、アフリカ、地中海盆地または中東の70％より多い慢性HBV保菌者においてHBV配列は既にヌクレオチド1858位にTを含む。従って、安定なステムループ対形成をもつプレコア突然変異体を生じるためには、ヌクレオチド1896位での単一の突然変異のみが必要とされる。ヌクレオチド1858位がTであるこれらの他の遺伝子型(遺伝子型B、C、D、およびE)を有する患者におけるプレコア停止突然変異HBVが高い頻度であることは、停止コドンおよびイプシロンの安定なステムループ構造をもたらすために単一の突然変異(G1896A)のみが必要とされるという必要条件の反映である(Hunt et al, Hepatology. 31(5):1037-44, 1994; Lok et al, Proc Natl Acad Sci USA.91(9):4077-81, 1994)。
【００１１】
BCPでの、特にヌクレオチド1762位およびヌクレオチド1764位での突然変異はT-1762および/またはA-1764となり、種々の持続感染患者、劇症肝炎患者、ならびに免疫抑制患者において検出されている。T-1762およびA-1764での二重の突然変異は、HBeAg/P22の減少(しかし消失ではない)およびウイルス量の増加に関連する(Gunther et al, Adv Virus Res. 52:25-137, 1999; Hunt et al, 1994 前記)。概して、このパターンのプレコア変化は、遺伝子型Aの感染患者の中に見出される。
【００１２】
コアタンパク質は、2つの主要なドメイン、アミノ酸144位までのN末端集合ドメインと機能上重要な、アルギニンに富むC末端ドメインとに分けられる。C末端ドメインは、プレゲノムRNAの結合およびゲノム複製に必要とされる上、核輸送にも関与している。興味深いことに、HBeAg陽性免疫耐性フェーズの患者のHBVのコアタンパク質配列は、アミノ酸変化を含まないかまたはごく僅かしか含まず、免疫圧が少ないことが臨床的に明白な突然変異が少ないという結果をもたらす可能性を示唆する。HbcAgおよびHBeAgアミノ酸変化の蔓延は、pre-C欠損のものと非常に類似しており、慢性感染の複数の段階に見られる。しかし、一度患者が免疫再活性化(排除)フェーズに入ると、HbcAgおよびHBcAgアミノ酸変化の平均変化率は5倍より多く増加し、おそらく免疫圧およびその後のウイルス「選択」の影響を受けて36ヶ所のホットスポット部位にクラスターを形成する。これらのホットスポット部位は、主要な細胞傷害性Tリンパ球(CTL)[アミノ酸18〜30]領域およびヘルパーT(TH)細胞[アミノ酸50〜70]領域、ならびにそれぞれ75〜90および120〜140アミノ酸残基の2つのB細胞[HBc/e1およびHBc/e2]エピトープと連結されている(Gunther et al, 1999 前記)。
【００１３】
特定の慢性HBV感染集団を理解するためには、HBV感染の自然歴を理解しなければならない。肝硬変およびまたは肝癌を発症している慢性HBV感染患者の30％以下について、HBVの経過は、臨床試験または治療のために評価された各患者に対して個別に定義されねばならない。HBeAg陰性の慢性肝炎は、これまでのところ遺伝子型A感染が一般的でない世界中のいくつかの地域、例えば、アフリカ、アジア、中東、地中海盆地、および南アメリカにおいてHBVに起因する慢性肝炎の優勢型を表している。
【００１４】
HBeAgから抗HBeAg抗体への重要な自発的セロコンバージョン(およびHBV DNAレベルの付随的減少)は、毎年、慢性B型肝炎保菌者(野生型ウイルスを有する患者中)の1〜10％に起こるが、HBVの肝臓からの排除を伴うHBsAgから抗HBsAg抗体へのセロコンバージョンは、非常に稀である(年1％以下)。
【００１５】
慢性HBV感染は、6ヶ月より多いHBsAgの持続として定義される。HBVの持続は、共有結合で閉じられた環(cccDNA)の安定な性質、免疫学的特権部位の感染および/またはHBV特異的免疫抑制に起因する可能性がある。HBeAgは、FASに媒介されるアポトーシスを介してHBeAg特異的Th1 CD4+T細胞およびHBcAg特異的Th1 CD4+T細胞を枯渇させることによって、HBVの持続に役割を果たすと考えられている(Milich et al, J. Immunol 160:2013-21, 1998)。HBeAgは胎盤を通過する、それによって新生児においてHBVへの耐性を確立することができ、垂直感染で持続性のHBV感染の頻度を増加させる。Th1/Th2応答の不均衡が、IL-4およびIL-10などの抗炎症性サイトカインの産生によるHBeAg特異的CD8+T細胞応答およびHBcAg特異的CD8+T細胞応答ならびにTh1エフェクター細胞の抑制を促進する(Ferrari et al, J Immunol. 145: 3442-9, 1990; Milich et al, 1998 前記; Milich et al, Proc Natl Acad Sci USA. 92:6847-51, 1995)。また、慢性HBV感染個体において全身性のCD4+T細胞反応低下を引き起こし得る他の機構も存在する。それは分裂促進因子に対する応答がHBV陰性対照と比較して減少し、抗HBV治療でHBVウイルス量が減少した後に増加するためである(Boni et al, J Clin Invest. 102:968-75, 1998)。このT細胞の「反応低下」は、IFN-γ、TFN-αおよびIL-12産生が減少し、従ってCD8+T細胞応答の刺激が減少した、HBV感染樹状細胞における機能低下から生じ得る(Beckebaum et al, Immunology. 109:487-95, 2003)。
【００１６】
概して、首尾よく感染を除去した個体と比較して、持続性のHBV感染ではHBV特異的なCD4+およびCD8+の機能的T細胞が減少している。HLA-A2陽性の慢性保菌者における全HBV抗原または定義済みのエピトープに対する増殖応答で評価した場合、持続性のHBV感染個体において、HBV特異的CD8+T細胞応答は有意に減少している(Ferrari et al, J Immunol. 145:3442-9, 1990; Maini et al, J Exp Med. 191:1269-80, 2000)。特に、HBeAg陽性の慢性保菌者において、コアエピトープ(領域c18-27中)を認識する特異的CD8+T細胞は、四量体で測定した場合ほぼ検出不可能であり、IFN-γを産生する能力が減弱している。また、HBV特異的CD8+T細胞は、炎症反応を起こし得る肝臓にも見出されるが、HBV感染の除去には効果がない(Jung et al, Virology. 261:165-72, 1999; Maini et al, 2000 前記)。
【００１７】
宿主とウイルスの関係というのは、HBVなどの多くのウイルスがそれらの不可視性を最大化しようと試みるのに対し、宿主が感染を予防および根絶しようと試みる動的なプロセスである。最初に、ウイルスは、自己複製して他の細胞を感染させるために、標的細胞と結合し、標的細胞に侵入して適当な細胞コンパートメントへ移動しなければならない。感染した細胞は、ウイルスに誘発されてウイルスの複製サイクルの1つまたは複数の段階を阻害するサイトカイン(例えばTNF-αおよびIFN-γ)を産生する可能性があり、それによって感染の範囲を制限する。
【００１８】
宿主の単球およびマクロファージは、ウイルスへの初期応答において、感染に間接的および直接的な効果を有する炎症促進性サイトカイン、例えばIL-1、TNF-α、IL-6、IL-12およびIL-18を分泌することで重要な役割を果たす。単球およびマクロファージはさらに単球、ナチュラルキラー(NK)細胞およびT細胞を補充して機能を遂行でき、さらに適切なTh機能を切り替えてウイルスの根絶を促進できる。
【００１９】
これらの炎症促進性サイトカインの産生をもたらす、微生物病原体に対する自然免疫は、トール様受容体(Toll Like Receptor, TLR)の活性化の結果として生じる。TLRはパターン認識受容体の主要なクラスとして同定されている。細菌産物、例えばエンドトキシンおよびペプチドグリカンに関与するTLRの役割は、近年明らかにされた(Akashi et al., J Immunol. 164: 3471-3475, 2000; Takeuchi et al., Immunity, 11: 443-451, 1999; Tapping et al., J Immunol. 165: 5780-5787, 2000)。13個より多いTLRが同定され、それらは多数の異なる細菌による活性化に重要な役割を果たしている。近年、このことは、ネズミモデルにおいて呼吸器合胞体ウイルス(RSV)がTLR-4を刺激することが証明されたウイルスへも及んでいる(Kurt-Jones et al., Nat Immunol. 1: 398-401, 2000; Haeberle et al., J Infect Dis. 186: 1199-1206, 2002)。さらに、麻疹ウイルス(MV)は、TLR-2依存シグナルを活性化させることが示されており(Bieback et al., J Virol. 76: 8729-8736, 2002)、二本鎖RNA(多くのウイルスのコア)は、TLR-3による応答を直接媒介することが示されている(Matsumoto et al., Biochem Biophys Res Commun. 293: 1364-1369, 2002)。
【００２０】
TLRのリガンドによる刺激は、細胞内シグナル伝達経路の複雑なネットワークの活性化を惹起してその後の炎症応答を調整する。これらのシグナル伝達ネットワークの重要な成分は、アダプタータンパク質MyD88(および関連タンパク質)、数個のプロテインキナーゼ(IRAK-1、p38 MAPキナーゼおよびIκBキナーゼを含む)、TRAF6および転写因子NF-κBである(図7)。NF-κBの活性化は、種々の炎症促進性メディエーター(例えばTNFα、IL-1、IL-6およびMCP-1)の発現を引き起こす(Akira, S. J Biol Chem 278, 38105-8; 2003; Barton, G. M. & Medzhitov, R. Science 300, 1524-5 2003; Beutler, B., et al., J Leukoc Biol 74, 479-85; 2003)。また、TLR3およびTLR4は、アダプター分子TRIF(TLR3とTLR4に関する)およびTRAM(TLR4に関する)の関与するMyD88非依存性経路を介してシグナル伝達が可能であるLien, E. & Golenbock, D. T. Nat Immunol 4, 1162-4, 2003。
【００２１】
TLR活性化の際に伝達されるシグナルは、次に特異的免疫応答の活性化を制御する。特異的免疫系は、自然免疫系により認識され、処理された後、病原体に対してのみ応答するという証拠がある。T細胞受容体は、活性化を生じさせるためにペプチド-MHC複合体と関連して抗原提示細胞の表面に発現される共刺激分子、例えばCD80およびCD86を必要とする。これらの共刺激分子の発現は、一部TLRに制御される(Pasare, C. & Medzhitov, R. Curr Opin Immunol 15, 677-82, 2003)。また、それらはB細胞を活性化させてリウマチ因子を産生する際にも重要である(Leadbetter, E. A. et al. Nature 416, 603-7 2002)。
【００２２】
病原体に媒介されるTLRの下方制御の役割を調査すること、および自然免疫系を補助することにより感染と戦う機構を開発することが必要である。
【発明の開示】
【００２３】
発明の概要
本明細書を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む(comprise)」という単語、または「含む(comprises)」もしくは「含んでいる(comprising)」などの変化形は、明記した要素もしくは整数または要素もしくは整数の群を包含することを意味するが、任意の他の要素もしくは整数または要素もしくは整数の群の排除を意味するものではないと理解される。
【００２４】
本発明は、HBV特定エフェクター分子の存在もしくは非存在によりその発現または活性が改変される細胞表面マーカーを同定する。細胞表面マーカーは自然免疫に関与し、HBVによって指定される分子はこれらのマーカーのレベルまたは活性を特異的に調節することが提唱される。従って、細胞表面マーカーおよびHBVに特定されるエフェクター分子は、有用な治療標的および/または診断標的である。特に、本発明は、HBVに特定される抗原の存在下でトール様受容体(TLR)の調節を同定する、従って抗原とTLRの双方が、HBV感染のための、かつ治療プロトコールをモニターするための有用な治療マーカーおよび診断マーカーである。さらにより特定の態様では、HBVに特定されるエフェクター分子は、細胞内型P22もしくはP25などのプレコアタンパク質であるか、HBeAgなどのその分泌された形態である。集合的に、本明細書においてこれらの分子は「HBeAg/P22」と称する。
【００２５】
本発明の好ましい態様に従って、TLR、特にTLR-2およびTLR-4は、HBVもしくはその突然変異型による感染の後、肝細胞上または肝細胞中でHBeAg/P22の存在もしくは非存在により異なって影響されることが認識される。HBVの突然変異としては、プレコア突然変異および/またはBCP突然変異が挙げられる。プレコアタンパク質(P22)もしくはその分泌された形態(HBeAg)ならびにTLR、特にTLR-2およびTLR-4は、従って、HBVによる感染を治療するための、または予防に役立つワクチンを含む治療薬または予防薬の有用な標的である。これらはまた、被験体がHBVに感染したかまたは感染しているかどうか、あるいは被験体に持続感染の素因があるかまたは被験体が持続感染しているかどうか、または別の疾患状態であるかどうかを判定する有用な診断標的でもあり、さらに臨床上または疫学上の管理ツールとして用いることができる。
【００２６】
特に、HBVによる感染は、結果として感染プロセスを促進するTLRの下方制御をもたらす。プレコア突然変異などの突然変異HBVによる感染は、結果としてTLRの上方制御をもたらす。
【００２７】
従って、本発明は、HBVに特定されるHBeAg/P22などのエフェクター分子ならびに/またはTLR-2およびTLR-4などのTLRのレベルを調節することのできる治療薬および/または予防薬を提供する。HBVに特定されるエフェクター分子には、TLR-2またはTLR-4などのTLRを上方制御または下方制御する(すなわち調節する)任意の分子が含まれる。例えば、HBVにおいて、エフェクター分子はHBeAg/P22である。
【００２８】
さらに、本発明は、HBVによる感染の存在または疾患状態もしくはその素因を検出するための方法を提供し、該方法はTLRシグナル伝達のレベルを調節するHBV特定エフェクター分子の存在もしくは非存在を判定する段階を含み、該エフェクター分子の存在もしくは非存在、またはTLRのレベルの高低、またはTLRシグナル伝達経路内の成分が、HBVによる感染または関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる。
【００２９】
さらに、本発明は、TLRのレベルを調節するHBV特定エフェクター分子の存在および/またはレベルによりHBVによる感染を診断または評価するための方法、あるいは肝細胞でのTLR-2および/またはTLR-4などのTLRのレベルを判定するための方法を提供する。
【００３０】
また、本発明は、TLRシグナル伝達のレベルを調節するHBV特定エフェクター分子の存在および/またはレベルを判定することによる、あるいは肝細胞でTLRおよびシグナル伝達経路の成分、例えばTLR-2および/またはTLR-4およびNFκβなどのレベルを判定することによる、HBVによる感染の診断または評価のための方法を提供する。
【００３１】
従って、本発明は、HBVもしくはその突然変異体による感染または感染に対する素因または感染の持続の治療、予防および/または診断、あるいは感染の排除に有用な治療薬および診断薬ならびにこれを含む組成物を意図する。本発明の本局面は特に、HBV感染の治療および診断、ならびにプレコア突然変異を含むHBVによる感染またはプレコア突然変異を含まないHBVによる感染を区別することに及ぶ。
【００３２】
また、本発明は、HBVに感染したかまたは疾患状態を有するかまたはその素因を有する被験体を治療する方法を提供し、該方法は、細胞内もしくは細胞外のプレコア発現産物のレベルを下方制御するかまたはTLRのレベルを上方または下方制御するワクチンを含む、有効量の薬剤を該被験体へ投与する段階を含む。
【００３３】
本発明はさらに、治療に対する応答をモニターすると同時に治療計画の有効性を判定するための方法を提供する。
【００３４】
さらに、本発明は、HBVによる感染または疾患状態の進行に対する治療プロトコールへの応答をモニターするための方法を意図し、該方法はTLRシグナル伝達を調節するHBV特定エフェクター分子のレベルまたは活性を判定する段階を含み、該エフェクター分子の存在もしくは非存在、またはTLRのレベルの高低、またはTLRシグナル伝達経路内の成分が、HBVによる感染または関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる。
【００３５】
好ましい哺乳類はヒトである。また、動物モデルも本発明により意図される。
【００３６】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、プレコアタンパク質もしくはHBeAgなどのその分泌された形態を産生するHBVによる感染は、肝細胞(肝実質細胞およびクッパー細胞を含む)およびPBMC(末梢単球を含む)においてTLR-2およびTLR-4のレベルを低下させるが、プレコア突然変異および/またはBCP突然変異を有するHBVによる感染は、TLR-2およびTLR-4を上方制御させ、さらにTLRシグナル伝達を調節する可能性もあるという決定に基づいて述べられている。TLR-2およびTLR-4のレベルの調節を、HBVに特定されるエフェクター分子、プレコアタンパク質もしくはHBeAgなどのその分泌された形態により判定した。プレコアタンパク質もしくはHBeAgなどのその分泌された形態の存在、非存在またはレベル、あるいはTLR-2およびTLR-4のレベル、ならびに/あるいはプレコアタンパク質もしくはHBeAgなどのその分泌された形態の機能または活性は、HBV感染または感染の原因となるHBVの種類またはHBV感染の素因もしくは持続の診断指標を提供する。さらに、プレコアタンパク質もしくはHBeAgなどのその分泌された形態、TLR-2およびTLR-4は、プレコアタンパク質もしくはHBeAgなどのその分泌された形態またはTLR-2および/もしくはTLR-4レベルまたはTLRシグナル伝達経路の成分を調節するワクチンを含む薬剤の治療標的となる。
【００３７】
プレコアタンパク質もしくはHBeAgなどのその分泌された形態は、以下「プレコアタンパク質/HBeAg」と称する。本発明は、プレコア突然変異、例えば切断、点突然変異もしくはヌル突然変異を有するHBV変異体、およびまたHBVプレコア遺伝子の転写を下方制御するBCP突然変異を含むHBV変異体に及ぶ。
【００３８】
従って、本発明は、プレコアタンパク質/HBeAgならびに/またはTLRおよび特にTLR-2および/もしくはTLR-4、またはTLRシグナル伝達経路の成分のレベルを調節する薬剤、プレコアタンパク質/HBeAgならびに/またはTLR-2および/もしくはTLR-4ならびに/またはTLRシグナル伝達経路の成分のレベルを判定する診断薬ならびにHBV感染に対するワクチンの開発を含む感染の治療および/もしくは予防のための方法を提供する。
【００３９】
本発明は、さらに治療プロトコールに対する応答をモニターすると同時に治療計画の有効性を判定するための方法を意図する。特に、本発明は、哺乳類などの動物において、さらに特にヒトにおいて、他の疾患状態の感染および進行のための臨床的または疫学的管理ツールを提供する。
【００４０】
本発明は、さらにTLRレベルまたはTLRシグナル伝達経路の成分に基づいて、プレコアタンパク質/HBeAgを産生するHBVまたは産生しないウイルス(すなわち、プレコアおよび/またはBCP突然変異体)による感染の識別を可能にする。
【００４１】
従って、本発明の一局面は、TLRのレベルもしくは活性を調節するHBV特定エフェクター分子の存在もしくは非存在を判定する段階、またはTLRもしくはそのホモログのレベルもしくは活性を判定する段階を含み、該エフェクター分子の存在もしくは非存在またはTLRもしくはそのホモログのレベルの高低が、HBVによる感染または関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる、HBVによる感染の存在または疾患状態もしくはその素因を検出するための方法を意図する。
【００４２】
特に、本発明は、TLRシグナル伝達のレベルを調節するHBV特定エフェクター分子の存在もしくは非存在を判定する段階を含み、該エフェクター分子の存在もしくは非存在、またはTLRのレベルの高低、またはTLRシグナル伝達経路内の成分が、HBVによる感染、または関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる、HBVによる感染の存在または疾患状態もしくはその素因を検出するための方法を提供する。
【００４３】
さらに、本発明の別の局面は、TLRのレベルもしくは活性を調節するHBV特定エフェクター分子の存在もしくは非存在を判定する段階、あるいはTLR、またはそのホモログ、またはTLRシグナル伝達経路の成分のレベルまたは活性を判定する段階を含み、該エフェクター分子の存在もしくは非存在またはTLRもしくはそのホモログのレベルの高低またはそのTLRシグナル伝達経路の成分がHBVによる感染あるいは関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる、HBVによる感染の存在または疾患状態もしくはその素因を検出するための方法を意図する。
【００４４】
本発明の別の態様は、HBVに特定されるエフェクター分子のレベルまたは活性あるいはTLRまたはそのホモログのレベルまたは活性を判定する段階を含み、該エフェクター分子の存在もしくは非存在またはTLRもしくはそのホモログのレベルの高低、TLRシグナル伝達経路の成分が、HBVによる感染あるいは関連する疾患状態もしくはその素因の存在の指標となる、HBVによる感染または疾患状態の進行に対する治療プロトコールへの応答をモニターするための方法を提供する。
【００４５】
本発明のさらにまた別の局面は、プレコアタンパク質/HBeAgを下方制御するか、あるいはTLRのレベルまたはシグナル伝達経路の成分を上方制御するかまたは下方制御するワクチンを含む有効量の薬剤を被験体へ投与する段階を含む、HBVに感染したかまたは疾患状態を有するかまたはその素因を有する被験体を治療する方法に向けられる。
【００４６】
本発明を詳細に記載する前に、特に断りのない限り、本発明は、特定の成分の製剤、製造方法、投与計画などに限定されず、それ自体変動し得ることが当然理解される。また、本明細書において用いられる用語は、特定の態様を説明する目的のためのみに用いられ、限定する目的で用いられるものではないことも当然理解される。
【００４７】
本明細書において用いられる単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」は、文脈上明確にそうでないことが指示されている場合を除いて、複数の局面を含むことに留意しなければならない。従って、例えば、1つの「化合物」への言及には単一の化合物のほかに2つ以上の化合物も含まれる；「1つの活性物質」には単一の活性物質のほかに2つ以上の活性物質が含まれる；など。
【００４８】
本発明の記載および請求において、下記の定義に従って以下の用語が用いられる。
【００４９】
用語「化合物」、「活性物質」、「薬理学的活性物質」、「医薬品」、「活性物」および「薬物」は本明細書において同義的に用いられ、所望の薬理学的および/または生理学的効果を誘発する化学物質を指す。また、これらの用語は、限定されるものではないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体などをはじめとする本明細書において具体的に言及される活性物質の薬学的に許容される成分および薬理学的に活性のある成分を包含する。用語「化合物」、「活性物質」、「薬理学的に活性のある物質」、「医薬品」、「活性のある」および「薬物」が用いられる場合、それ自体活性な物質、ならびに薬学的に許容される、薬理学的に活性のある塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝生成物、代謝産物、類似体、その他を含むことも当然理解される。用語「化合物」は、化学物質という意味のみに解釈されるべきでなく、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質ならびにRNA、DNAおよびその化学類似体などの遺伝分子にも及ぶ。「ペプチド」、「ポリペプチド」、または「タンパク質」への言及には、多糖またはリポ多糖成分を備える分子が含まれる。用語「アンタゴニスト」は、プレコアタンパク質/HBeAgまたは他の病原体特異的エフェクター分子のレベルを下方制御するか、あるいはTLRを下方制御する化合物、活性物質、薬理学的活性物質、医薬品、活性物、および薬物の例である。「アゴニスト」または「増強剤」は、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR、例えばTLR-2もしくはTLR-4のレベルを上方制御する。
【００５０】
本発明は、ワクチン、ならびに化合物あるいはTLR-2および/もしくは4のアゴニストまたはアンタゴニストおよびヌクレオシド類似体または抗プレコア/HBeAg抗体、または抗ウイルス性サイトカイン(例えば、IFN-α、IFN-γ、IL-2、TNF-α)または他の免疫調節薬などの物質の組み合わせに及ぶ。
【００５１】
従って、本発明は、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR-2および/もしくはTLR-4などのTLRのレベルを調節する際に有用な、あるいは一般のまたは特異的TLRシグナル伝達を増強する際に有用な化合物を意図する。これらの化合物は、HBVによる感染の緩和または予防または治療、あるいは別の疾患状態の治療に効果がある。調節されるTLRを保有する好ましい細胞としては肝細胞が挙げられる。肝細胞としては肝実質細胞が挙げられる。「化合物」、「活性物質」、「薬理学的活性物質」、「医薬品」、「活性物」、および「薬物」への言及には、プレコアタンパク質/HBeAgのアンタゴニストまたはTLRもしくはTLRシグナル伝達のアゴニストもしくは増強剤などの2つ以上の活性物の組合せが含まれる。また、「組合せ」には、薬剤が別々に提供されて投与されるか、別々に投薬されるか、または投薬前に混合される2部分などの複数部分の薬学的組成物が含まれる。
【００５２】
例えば、複数部分の薬学的パックは、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの調節因子および1つまたは複数の抗菌薬もしくは抗ウイルス薬を有し得る。用語「調節(modulating)」または「調節する(modulate)」または「調節(modulation)」などのその誘導体は、上方制御または下方制御を説明するために用いられる。
【００５３】
本明細書において薬剤の「有効量」および「治療上有効量」という用語は、所望の治療効果または生理的効果を提供するのに十分な薬剤の量を意味する。さらに、薬剤の「効果的なHBeAg調節量または効果的なTLR調節量」は、プレコアタンパク質/HBeAgの機能を直接的もしくは間接的に上方制御もしくは下方制御する、またはTLR-2もしくはTLR-4などの特定のTLRを上方制御もしくは下方制御する、またはTLRシグナル伝達を増強するのに十分な薬剤の量である。これは、例えば、プレコアタンパク質/HBeAgのアンタゴニストとして、またはTLRもしくはそのシグナル伝達成分、例えばTLRシグナル伝達経路の成分もしくはその模倣物である薬剤のアゴニスト(すなわち増強剤)として作用する薬剤によって、他の細胞受容体を介してTLRシグナル伝達経路を誘発する薬剤によって、あるいはTLRシグナル伝達成分の阻害剤を拮抗する薬剤によって達成され得る。望ましくない効果、例えば副作用が所望の治療効果とともに時々現れる；従って、実行者は適切な「有効量」を決定する際に見込まれる恩典と潜在的リスクの均衡を保たせる。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢、および全体的な健康状態、投与方法などに応じて、被験体によって変動することになる。従って、正確な「有効量」を特定することは不可能であると考えられる。しかし、任意の個々の場合における適切な「有効量」は、日常的な実験のみを用いて当業者によって決定され得る。
【００５４】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤または希釈液とは、生物学的にもあるいはその他の点でも望ましい薬学的媒体を意味し、すなわちその物質はいかなる副作用も起こさずに、または実質的な副作用を起こさずに、選択された活性物質とともに被験体へ投与することができる。担体には、賦形剤、および、希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、防腐剤などの他の添加剤が含まれ得る。また、薬学的組成物は、処方に応じてワクチン組成物と記述されることもある。
【００５５】
同様に、本明細書において提供される「薬理学的に許容される」塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは化合物の誘導体とは、生物学的にもあるいはその他の点でも望ましい塩、エステル、アミド、プロドラッグまたは誘導体である。
【００５６】
本明細書において用いられる用語「治療(treating)」および「治療(treatment)」とは、感染または疾患の症状の重篤度および/または頻度の低下、症状および/または根本的な原因の排除、感染症状および/またはその根本的原因の発生の予防ならびに障害の好転または改善を指す。付随する障害は、例えばウイルス感染後であれば、肝硬変または肝細胞癌などの肝臓障害であり得る。
【００５７】
患者の「治療」は、感受性の高い個体における感染または他の疾患状態または有害な生理的事象の予防、ならびに感染または他の疾患状態または、肝臓障害もしくは癌などの下流の状態を抑制することによる臨床徴候を示す個体の治療を含み得る。一般に、そのような状態また疾患は感染であり、より詳細にはウイルス感染であり、さらに詳細にはHBVによる感染である。従って、例えば、感染を有する患者または感染を進行させる傾向のある患者を「治療する」本方法は、感染または他の疾患の予防ならびに一度確立された感染または他の疾患状態の治療を包含する。
【００５８】
「HBV」またはその完全な用語「B型肝炎ウイルス」への言及は、ヌクレオシド類似体または免疫薬などの特定の治療薬に耐性のある変異体をはじめとする、あらゆる変異体を含む。特に重要な変異体は、HBVのプレコアおよび/またはBCP突然変異体である。
【００５９】
本明細書において用いられる「患者」とは、動物、好ましくは哺乳類をさし、より好ましくは本発明の医薬製剤および方法から恩恵を受け得るヒトを指す。本明細書に記載される医薬製剤および方法から恩恵を受け得る動物の種類に制限はない。ヒトであるかまたは非ヒト動物であるかにかかわらず、患者は個体、被験体、動物、宿主またはレシピエントと称され得る。本発明の化合物および方法は、ヒト医学、獣医学ならびに一般的に、家畜学または野生動物の管理に用途を有する。
【００６０】
本発明の化合物は、大分子もしくは小分子、核酸分子(アンチセンス分子もしくはセンス分子を含む)、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、または、RNAi複合体もしくはsiRNA複合体などのハイブリッド分子(RISC複合体およびDicer複合体を含む)、リボザイム、もしくはDNAzymeであってよい。化合物は細胞への進入を促進するように修飾される必要がある可能性がある。化合物が細胞外受容体と相互作用する場合には、これは必要ではない。薬剤の例としては、プレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRと相互作用する化学物質および抗体、またはプレコア発現を調節する遺伝分子が挙げられる。
【００６１】
上記のように、好ましい動物はヒトである。
【００６２】
実験動物の例(動物モデルを含む)としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターが挙げられる。ウサギならびにラットおよびマウスなどのげっ歯類動物は、便宜な試験系または動物モデルを提供する。家畜動物としては、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマおよびロバが挙げられる。非哺乳類動物、例えば鳥類(アヒルなど)、ゼブラフィッシュ、両生類(オオヒキガエルを含む)およびキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)などのショウジョウバエ(Drosophila)種も意図される。
【００６３】
従って、本発明は、プレコアタンパク質/HBeAgを調節するか(例えば作動させるまたは拮抗する)、あるいはTLR-2および/またはTLR-4などのTLRを調節する(すなわち増強する、または活性化する、または拮抗する)薬剤を提供する。
【００６４】
本発明は、候補薬物を、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR-2もしくはTLR-4などのTLRまたはその一部と接触させることを含む、このような薬剤のためのスクリーニング方法を意図する。プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR分子は、本明細書において「標的」または「標的分子」と称される。スクリーニング手法は、(i)薬物と標的との間の複合体の存在、または(ii)標的をコードする核酸分子の発現レベルの変化についてアッセイする段階を含む。アッセイの1つの形式は、競合的結合アッセイ法を含む。このような競合的結合アッセイ法では、一般に標的を標識する。遊離している標的を任意の推定複合体から分離し、遊離している(すなわち複合体化していない)標識の量が標的分子に対する試験薬剤の結合の尺度である。また、遊離している標識でなく結合している標識を測定してもよい。標的でなく化合物を標識して、試験される薬物の存在下および非存在下で標的に結合する化合物の量を測定することも可能である。このような化合物は、例えば、HBV感染の治療または予防に必要とされるプレコアタンパク質/HBeAgの調節因子またはTLRの調節因子を見出す際に有用な標的を阻害する可能性がある。
【００６５】
薬物スクリーニングの別の技法は、標的に対して適した結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニング法を提供し、これはGeysen(国際公開公報第84/03564号)に詳細に記載されている。簡潔に述べると、プラスチックピンまたは他の表面などの固相担体上で、多数の異なる小ペプチド試験化合物を合成する。ペプチド試験化合物を標的と反応させ、洗浄する。次に、結合した標的分子を当技術分野において周知の方法により検出する。本方法は非ペプチド化学物質のスクリーニングに適合させることができる。従って、この局面は、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR-2もしくはTLR-4などのTLRの標的調節因子のスクリーニングのための組合せ方法にまで及ぶ。
【００６６】
精製された標的を、上記の薬物スクリーニング技法において用いるプレート上に直接コーティングすることができる。しかし、標的に対する非中和抗体を用いて標的を固相上に固定化することもできる。プレコアタンパク質/HBeAgに特異的な抗体もまた、プレコアタンパク質/HBeAgの阻害剤として有用である可能性がある。
【００６７】
また、本発明は、標的と特異的に結合することの可能な中和抗体が、標的もしくはその断片に対する結合に関して試験化合物と競合する、競合的な薬物スクリーニングアッセイの使用も意図する。本方法では、抗体を用いて標的の1つまたは複数の抗原決定基を共有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
【００６８】
プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRに対する抗体は、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。抗体は、多数の手段のいずれかによって調製することができる。プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの検出のため、抗体は、必然的ではないが一般的に非ヒト動物、例えば霊長類、家畜動物(例えばヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ)、実験動物(例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ)およびコンパニオンアニマル(例えばイヌ、ネコ)に由来する。一般に、抗体に基づくアッセイは細胞または組織生検でインビトロにて実施する。しかし、抗体が適切に非免疫化されるか、ヒト使用の場合はヒト化されるならば、抗体を例えば核タグで標識し、被験体へ投与し、核標識の蓄積する部位を放射線学的技術によって決定することができる。プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR抗体は、従って、病原性マーカー標的化剤とみなされる。従って、本発明は、ヒトおよび非ヒト被験体における病原性標的イメージングにおける使用のための抗体の非免疫化型に及ぶ。これを以下にさらに説明する。
【００６９】
プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRに対する抗体の作製のためには、分子がヒト組織を含む動物由来のものであろうと、組換え手段によって産生される場合には細胞培養由来のものであろうと、この分子を生物試料から抽出する必要がある。一般に、単球および肝実質細胞が便宜な供給源である。プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRは、任意の適当な手段によって生物試料から分離することができる。例えば、分離には、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの表面電荷特性、大きさ、密度、生物活性および別の実体(例えばそれが結合もしくは会合する別のタンパク質もしくは化学物質)に対するその親和性のうちの任意の1つまたは複数を利用してよい。従って、例えば、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの生物試料からの分離は、超遠心分離法、イオン交換クロマトグラフィー法(例えば陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー)、電気泳動法(例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動)、サイズ分離(例えば、ゲル濾過、限外濾過)および親和性に媒介される分離(例えば、限定されるものではないが、Dynabead(商標)分離などの磁性ビーズ分離、免疫クロマトグラフィー、免疫沈降を含む免疫親和性分離)のうちの任意の1種類以上によって達成することができる。分離技術の選択は、プレコアタンパク質/HBeAgもしくは求められる特定のTLRまたはそれを得るための組織の生物活性もしくは物理的特性に依存し得る。
【００７０】
好ましくは、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRを生体液から分離することによりキナーゼ上に存在する高次構造エピトープが保存され、従って、分子の変性をもたらす技術を回避するのにふさわしい。当業者であれば、動物に曝露されるプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR上の抗原決定基または活性部位が確実に天然分子のものと構造上同一であるようにするために、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR(例えばそれを得るための生物試料)に特有の生理学的条件に可能な限り近い条件を維持または模倣することの重要性を認識するであろう。これにより、免疫化された動物において天然分子を認識し得る適切な抗体を確実に作製することができる。
【００７１】
免疫化およびその後のモノクローナル抗体の産生は、例えばKohler and Milstein, Nature. 256: 495-499, 1975; Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6(7): 511-519, 1976), Coligan et al. (「Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 1991-1997) and Toyama et al. (Monoclonal Antibody, Experiment Manual」, published by Kodansha Scientific, 1987に記載される標準的なプロトコールを用いて実行することができる。本質的に、標準法によってプレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLR、またはプレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRを含む試料で動物を免疫化して抗体産生細胞、特に抗体産生体細胞(例えばBリンパ球)を産生させる。次に、不死化のためにこれらの細胞を免疫化した動物から採取することができる。
【００７２】
プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの断片を用いて抗体を作製する場合、それをまず担体と会合させる必要があり得る。「担体」とは、非免疫原性であるか免疫原性の乏しい物質(例えばハプテン)と自然にまたは人工的に結合してその免疫原性を高める、一般に高分子量の任意の物質を意味する。
【００７３】
抗体産生細胞の不死化は、当技術分野において周知の方法を用いて行うことができる。例えば、エプスタイン-バーウイルス(EBV)を用いる形質転換法により不死化を達成することができる(Kozbor et al., Methods in Enzymology. 121: 140, 1986)。好ましい態様では、細胞融合法を用いて抗体産生細胞を不死化させるが(Coliganら、1991-1997、前記に記載)、本方法はモノクローナル抗体の産生に広く用いられている。本方法では、抗体を産生する可能性のある抗体産生体細胞、特にB細胞を骨髄腫細胞株と融合させる。これらの体細胞は、感作動物、好ましくはマウスおよびラットなどのげっ歯類動物のリンパ節、脾臓、および末梢血に由来し得る。マウス脾細胞が特に有用である。しかし、ラット、ウサギ、ヒツジ、もしくはヤギの細胞、または他の動物種由来の細胞を代わりに用いることも可能であろう。
【００７４】
ハイブリドーマを作製する融合手法で使用するための特化した骨髄腫細胞株がリンパ性腫瘍から開発されている(Kohler and Milstein, 1976, 前記; Shulman et al., Nature. 276: 269-270, 1978; Volk et al., J. Virol. 42(1): 220-227, 1982)。これらの細胞株は、少なくとも3つの理由から開発された。第1の理由は、融合しておらず同様に無限に自己増殖する骨髄腫細胞からの、融合したハイブリドーマの選択を容易にするためである。これは通常、ハイブリドーマの増殖を後押しする特定の選択培地での増殖を不能にさせる、酵素を欠損した骨髄腫を用いることによって達成される。第2の理由は、リンパ性腫瘍細胞の自らの抗体を産生する固有の能力に起因する。ハイブリドーマによる腫瘍細胞抗体の産生を排除するため、内因性の免疫グロブリン軽鎖または重鎖を産生不能な骨髄腫細胞株を用いる。これらの細胞株を選択する第3の理由は、融合に対するそれらの適合性および効率のためである。
【００７５】
多くの骨髄腫細胞株が融合細胞ハイブリッドの作製に用いることができ、例えばP3X63-Ag8、P3X63-AG8.653、P3/NS1-Ag4-1(NS-1)、Sp2/0-Ag14およびS194/5.XXO.Bu.1が挙げられる。P3X63-Ag8およびNS-1細胞株はKohlerおよびMilsteinにより記載されている(1976, 前記)。Shulmanら(1978, 前記)はSp2/0-Agl4骨髄腫株を開発した。S194/5.XXO.Bu.1株はTrowbridge(J. Exp. Med. 148(1): 313-323, 1978)により報告された。
【００７６】
抗体産生脾臓細胞またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞のハイブリッドを作製するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する1つまたは複数の作用因子(化学的因子、ウイルス性因子または電気因子)の存在下で、体細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ10:1の割合で混合する段階を含む(この割合は約20:1から1:1まで変動し得る)。融合法は既に記載されている(Kohler and Milstein, 1975, 前記; Kohler and Milstein, 1976, 前記; Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3: 231-236, 1977; Volk et al., 1982, 前記)。これらの研究者らの用いた融合促進剤はセンダイウイルスおよびポリエチレングリコール(PEG)であった。
【００７７】
融合手法から生存可能なハイブリッドが作製されるのは非常に低い頻度であるため(例えば脾臓を体細胞の供給源として用いる場合、およそ1×105個の脾臓細胞につき1個のハイブリッドしか得られない)、残りの融合していない細胞、特に融合していない骨髄腫細胞から融合細胞ハイブリッドを選択する手段を有することが好ましい。生じた他の融合細胞ハイブリッドの中から所望の抗体産生ハイブリドーマを検出する手段も必要である。一般に、融合細胞ハイブリッドの選択は、細胞をハイブリドーマの増殖を後押しするが、通常は無限に分裂を続けるであろう融合していない骨髄腫細胞の増殖を妨げる培地で培養することにより達成される。融合に用いられる体細胞はインビトロ培養において長期の生存能を維持しないため、問題は起こらない。本発明の実施例では、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼを欠く骨髄腫細胞(HPRT-陰性)を用いた。これらの細胞に対する選択は、脾臓細胞のHPRT陽性遺伝子型のため融合細胞ハイブリッドが生存するヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン(HAT)培地で行われる。遺伝子型の上で適格性のあるハイブリッドの増殖を後押しする培地中で選択され得る異なる遺伝的欠損(薬物感受性など)を備える骨髄腫細胞の使用も可能である。
【００７８】
融合細胞ハイブリッドを選択的に培養するには数週間が必要である。その後にクローニングし増殖させることのできるように、この期間の初期に、所望の抗体を産生するハイブリッドを同定することが必要である。一般に、得られたハイブリッドの10％前後が所望の抗体を産生するが、約1〜約30％の範囲であることも珍しくない。抗体産生ハイブリッドの検出は、例えば、Kennetら(Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, pp 376-384, Plenum Press, New York, 1980)に記載される酵素結合免疫測定法および放射免疫測定法技術をはじめとするいくつかの標準的なアッセイ法のうちのいずれか1つによって、またFACS解析(O'Reilly et al., Biotechniques. 25: 824-830, 1998)によって実現され得る。
【００７９】
ひとたび所望の融合細胞ハイブリッドが選択され、個々の抗体産生細胞株へクローニングされたならば、2つの標準的な方法のいずれかで各細胞株を増殖させることができる。ハイブリドーマ細胞の懸濁液を組織適合性動物へ注入することができる。次に、注射された動物は融合細胞ハイブリッドによって産生された特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を生じることになる。この動物の体液、例えば血清または腹水を採取して高濃度のモノクローナル抗体を得ることができる。または、個々の細胞株を実験用培養容器内でインビトロにて増殖させてもよい。高濃度の単一の特異的モノクローナル抗体を含む培地はデカンテーション、濾過または遠心分離によって回収し、その後精製することができる。
【００８０】
任意の適した免疫検出手段により、関心対象のプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRを検出する特異性について細胞株を試験する。例えば、細胞株を多数のウェルに分注し、培養することができ、各ウェルからの上清を酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、間接蛍光抗体法などにより解析する。標的プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRを認識することは可能であるが非標的エピトープは認識しないモノクローナル抗体を産生する細胞株を同定し、次にインビトロで直接培養するか、または組織適合性動物へ注射して腫瘍を形成させ、必要な抗体を産生させ、回収し、精製する。
【００８１】
これらの抗体はプレコアタンパク質/HBeAg特異的またはTLR特異的である。つまり、抗体が特定のプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRと他の分子を区別できることを意味する。正常細胞中の分子と交差反応しないならば、より広域性の抗体を用いてもよい。
【００８２】
モノクローナル抗体を、例えばプレコアタンパク質/HBeAgを阻害するための治療薬としての使用を予定している場合、抗体を導入する宿主(例えばヒト)に関してこれを非免疫化する必要があるであろう。非免疫化プロセスは、本発明に従って調製されたモノクローナル抗体と同一または類似の特異性を有するキメラ抗体の調製物をはじめとする多数の形態のいずれかであってよい。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、一般に遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリン可変領域および定常領域遺伝子に由来する構築された抗体である。従って、本発明によれば、ひとたび所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られると、技術を用いて1つの種の結合領域と別の種の抗体の非結合領域とを組み合わせた種間モノクローナル抗体を作製する(Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 84: 3439-3443, 1987)。例えば、非ヒト(例えばネズミ)モノクローナル抗体の相補性決定領域(CDR)をヒト抗体へ移植し、それにより「ヒト化」ネズミ抗体とすることができる(欧州特許第0 239 400号; Jones et al., Nature. 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science. 239: 1534-1536, 1988; Richmann et al., Nature. 332: 323-327, 1988)。この場合、非免疫化プロセスはヒトに特異的である。より詳細には、CDRを、ヒト定常領域を含むまたは含まないヒト抗体可変領域に移植する。CDRを提供する非ヒト抗体を一般に「ドナー」と称し、フレームワークを提供するヒト抗体を一般に「アクセプター」と称する。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合はヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約85〜90％、好ましくは約95％またはそれ以上同一でなければならない。従って、ヒト化抗体の全ての部分は、おそらくCDRを除いて、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。従って、「ヒト化抗体」とは、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ドナー抗体は「ヒト化」のプロセスにより「ヒト化」したと言われるが、これは得られるヒト化抗体がCDRを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合すると予期されるためである。本明細書における「ヒト化」への言及は、特定の宿主、この場合はヒト宿主に対して非免疫化された抗体への言及を含む。
【００８３】
非免疫化抗体が、抗原結合または他の免疫グロブリン機能に実質的に影響のない保存的アミノ酸置換をさらに有する可能性のあることは当然理解される。表1に従って例示的な保存的置換を行うことができる。
【００８４】
（表１）
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【００８５】
本発明の非免疫化抗体を作製するために用いられ得る例示的方法は、例えば、Richmann et al., 1988, 前記；欧州特許第0 239 400号；米国特許第6,056,957号、米国特許第6,180,370号、米国特許第6,180,377号に記載されている。
【００８６】
従って、一態様では、本発明はプレコアタンパク質/HBeAgに対するモノクローナル抗体により認識されるエピトープに対して特異性を有する非免疫化抗体分子を意図し、この際、該非免疫化抗体の可変ドメインのCDRのうちの少なくとも1つは該プレコアタンパク質/HBeAgに対する該モノクローナル抗体に由来し、非免疫化抗体分子の残りの免疫グロブリン由来部分は抗体を非免疫化する宿主の免疫グロブリンまたはその類似体に由来する。
【００８７】
本発明のこの局面は、非ヒト抗体のフレームワーク領域の操作を含む。
【００８８】
本発明は、依然としてプレコアタンパク質/HBeAgに対する特異性を保持する、本抗体の突然変異体および誘導体に及ぶ。
【００８９】
用語「突然変異体」または「誘導体」は、1つまたは複数のアミノ酸置換、付加および/または欠失を含む。
【００９０】
本明細書において用いられる用語「CDR」には、分子の結合部分でβ鎖を架橋する、抗体フレームワーク領域の可変部分における3本の軽鎖および3本の重鎖領域を包含するCDR構造ループが含まれる。これらのループは特徴的な極限構造を有する(Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901, 1987; Chothia et al., J. Mol. Biol. 227: 799, 1992)。
【００９１】
「フレームワーク領域」とは、CDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって中断された免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域の領域を意味する。フレームワーク領域およびCDRの範囲は正確に定義されている(例えば、Kabat et al., 「Sequences of Proteins of Immunological Interest」, U.S. Department of Health and Human Sciences, 1983参照)。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は種の内部で比較的保存されている。本明細書において用いられる「ヒトフレームワーク領域」とは、天然に存在するヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域と実質的に同一な(約85％以上、通常90〜95％以上)フレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、つまり、構成要素である軽鎖および重鎖の複合フレームワーク領域は、CDRを配置および整列させるのに役立つ。CDRは、主にHBeAgのエピトープとの結合を担う。
【００９２】
本明細書において用いられる用語「重鎖可変領域」とは、重鎖のアミノ末端(N末端)アミノ酸残基を発端として、そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列に対応する、約110〜125アミノ酸残基長のポリペプチドを意味する。同様に、用語「軽鎖可変領域」とは、軽鎖のN末端アミノ酸残基を発端として、そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列に対応する、約95〜130アミノ酸残基長のポリペプチドを意味する。全長免疫グロブリン「軽鎖」(約25Kdまたは214アミノ酸)は、NH2末端(約110アミノ酸)の可変領域遺伝子およびCOOH末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。全長免疫グロブリン「重鎖」(約50Kdまたは446アミノ酸)も同様に、可変領域遺伝子(約116アミノ酸)および他の前述の定常領域遺伝子のうちの1つ、例えばγ(約330アミノ酸をコードする)によってコードされる。
【００９３】
用語「免疫グロブリン」または「抗体」は、本明細書において免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指すために用いられる。認識されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。免疫グロブリンの1つの形態が抗体の基本構造単位を構成する。この形態は四量体で免疫グロブリン鎖の2つの同一の対からなり、それぞれの対が1本の軽鎖および1本の重鎖を有する。それぞれの対において、軽鎖可変領域および重鎖可変領域はともに抗原との結合を担い、定常領域は抗体エフェクター機能を担う。抗体以外に、免疫グロブリンは、例えば、Fv、Fab、Fab'および(Fab')2をはじめとする種々の他の形態で存在し得る。
【００９４】
また、本発明は、例えば、Fv、Fab、Fab'およびF(ab')2断片をはじめとする、本発明の方法により産生されたモノクローナル抗体の断片の使用および作製を意図する。このような断片は、例えばColiganら(1991-1997, 前記)に記載される標準法によって調製することができる。
【００９５】
また、本発明は、本発明のモノクローナル抗体と同一または類似の特異性を有する合成または組換え型抗原結合分子を意図する。この種の抗原結合分子には、安定化された合成Fv断片が含まれ得る。この種の例示的な断片としては、ペプチドリンカーを用いてVHドメインのN末端またはC末端をVLドメインのそれぞれC末端またはN末端と架橋した一本鎖Fv断片(sFv、しばしばScFvと称される)が挙げられる。ScFvは全抗体の定常部分を全て欠いているので、補体を活性化することができない。VHおよびVLドメインを連結するために適したペプチドリンカーは、VHおよびVLドメインが折り畳まれて、Fv断片の由来する全抗体の抗原結合部位に類似する三次元構造をもつ抗原結合部位を有する単一のポリペプチド鎖となることを可能にするリンカーである。所望の特性を有するリンカーは、米国特許第4,946,778号に開示される方法によって得ることができる。しかし、場合によって、リンカーの存在しないことがある。ScFvは、例えば、Krebber et al. J. Immunol. Methods.201(1): 35-55, 1997に概説される方法に従って調製することができる。または、米国特許第5,091,513号、欧州特許第239,400号またはWinterおよびMilsteinによる論文(Nature. 349: 293, 1991)ならびにPlueckthunらによる論文(Antibody engineering: A practical approach, 203-252, 1996中)に記載される方法によってScFvを調製することもできる。
【００９６】
または、安定化された合成Fv断片は、システイン残基がVHおよびVLドメインに導入されて、完全に折り畳まれたFv分子において2つの残基間にジスルフィド結合が形成される、ジスルフィド安定化Fv(dsFv)を含む。適したdsFv作製の方法は、例えば、(Glockshuber et al., Biochem. 29: 1363-1367, 1990; Reiter et al., J. Biol. Chem. 269: 18327-18331, 1994; Reiter et al., Biochem. 33: 5451-5459, 1994; Reiter et al., Cancer Res. 54: 2714-2718, 1994; Webber et al., Mol. Immunol. 32: 249-258, 1995)に記載されている。
【００９７】
また、合成または組換え型抗原結合分子として意図されるのは、例えば、(Ward et al., Nature. 341: 544-546, 1989; Hamers-Casterman et al., Nature. 363: 446-448, 1993; Davies and Riechmann, FEBS Lett. 339: 285-290, 1994)に開示される、単一の可変領域ドメイン(dAbsと称される)である。
【００９８】
または、合成または組換え型抗原結合分子には、「ミニボディ(minibody)」が含まれ得る。この点について、ミニボディは全抗体に必須の要素を一本鎖にコードする、全抗体の小型版である。ミニボディは、例えば米国特許第5,837,821号に開示されるように、免疫グロブリン分子のヒンジ領域およびCH3ドメインと融合した、天然抗体のVHおよびVLドメインからなるのが適している。
【００９９】
別の態様では、合成または組換え型抗原結合分子は、非免疫グロブリン由来のタンパク質フレームワークを含み得る。例えば、抗原結合のために選択された、CDRを作り出すためにランダム化された2つのループを有する4-へリックスバンドルタンパク質シトクロムb562を開示する(Ku & Schutz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 6552-6556, 1995)が参照され得る。
【０１００】
合成または組換え型抗原結合分子は多価(すなわち、2つ以上の抗原結合部位を有する)であってよい。このような多価分子は、1つまたは複数の抗原に特異的であり得る。この種の多価分子は、例えば(Adams et al., Cancer Res. 53: 4026-4034, 1993; Cumber et al., J Immunol. 149: 120-126, 1992)により開示されるように、システイニルを含有するペプチドによる2つの抗体フラグメントの二量化により調製することができる。または、二量化は、自然に二量体化する両親媒性のへリックスと抗体フラグメントの融合によるか(Pluenckthun, Biochem 31: 1579-1584, 1992)、または優先的にヘテロ二量体化するドメイン(ロイシンジッパーのjunおよびfosなど)の使用により(Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553, 1992)促進してもよい。多価抗体は、例えば、TLR-2およびTLR-4などのTLRの異なる形態を検出する際に有用である。
【０１０１】
プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの活性もしくはレベルを調節する際に有用な化合物のさらに別の有用な供給源は、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの化学的に修飾されたリガンドである。
【０１０２】
さらに、プレコアタンパク質/HBeAgとTLRとの間の相互作用を遮断するまたは拮抗するまたは作動させる化合物を選択できる。
【０１０３】
本明細書において意図されるタンパク質性分子の類似体(例えばプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRのリガンド)としては、限定されるものではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および/またはその誘導体の取り込み、ならびにタンパク質性分子もしくはその類似体へ高次構造上の制約を課す架橋剤および他の方法の使用によるものが挙げられる。
【０１０４】
本発明により意図される側鎖修飾の例としては、アルデヒドとの反応の後にNaBH4で還元する還元的アルキル化によるなどのアミノ基の修飾；メチルアセトイミデートを用いるアミジン化；無水酢酸を用いるアシル化；シアン酸塩を用いるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール-5-リン酸を用いるリシンのピリドキシル化に続くNaBH4を用いる還元が挙げられる。
【０１０５】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサールおよびグリオキサールなどの試薬を用いた複素環縮合産物の形成により修飾してよい。
【０１０６】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレアの形成を介してカルボジイミドを活性化し、その後、例えば対応するアミドへ誘導体化することにより修飾してよい。
【０１０７】
スルフィドリル(sulphydryl)基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物を用いる混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応；4-クロロメルクリ安息香酸、4-クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノールおよび他の水銀剤を用いる水銀誘導体の形成；アルカリ性pHでシアン酸を用いるカルバモイル化などにより修飾してよい。
【０１０８】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドを用いる酸化または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニルを用いるインドール環のアルキル化により修飾してよい。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いて3-ニトロチロシン誘導体を形成するニトロ化によって変化させてよい。
【０１０９】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いるアルキル化またはジエチルピロカーボネートを用いるN-カルボエトキシル化(carbethoxylation)により達成することができる。
【０１１０】
ペプチド合成中に非天然アミノ酸および誘導体を取り込む例としては、限定されるものではないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタノン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD-異性体の使用が挙げられる。本明細書において意図される非天然アミノ酸のリストを表2に示す。
【０１１１】
（表２）非従来型アミノ酸に対するコード
2007538232.tif 000003
2007538232.tif 000004
2007538232.tif 000005
2007538232.tif 000006
【０１１２】
架橋剤を用いて、例えば、(CH2)nスペーサー基(n＝1からn＝6)を有する二官能性のイミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性の架橋剤、ならびに、通常、N-ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分およびマレイミドまたはジチオ部分(SH)またはカルボジイミド(COOH)などの別の基に特異的な反応性部分を含むヘテロ二官能性の試薬を用いて3D高次構造を安定化させることができる。さらに、例えば、CαおよびNα-メチルアミノ酸の取り込み、アミノ酸のCα原子とCβ原子との間への二重結合の導入、ならびに、N末端とC末端間、2本の側鎖間、または1本の側鎖とN末端もしくはC末端との間のアミド結合の形成などの共有結合の導入による環状ペプチドまたは類似体の形成により、ペプチドを高次構造的に制約することができる。
【０１１３】
従って、本発明の一局面は、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR-2もしくはTLR-4などのTLR、あるいはTLRシグナル伝達経路の成分と結合するかまたは相互作用し、その結果プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRのレベルまたは活性の調節をもたらす任意の化合物を意図する。
【０１１４】
別の有用な化合物群は模擬物である。用語「ペプチド模擬物」、「標的模擬物」または「模擬物」は、標的に対して何らかの化学的類似性を有するが、標的を拮抗するかまたは作動させるかまたは模倣する物質を指すことを意図する。この場合標的はプレコアタンパク質/HBeAgのリガンドまたはTLRのリガンドであり得る。ペプチド模擬物は、タンパク質二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子であってよい(Johnson et al., 「Peptide Turn Mimetics」 in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993)。ペプチド模擬物の使用の背後にある根本的な理論的根拠は、タンパク質のペプチド骨格は主に抗体と抗原、酵素と基質または足場タンパク質との相互作用などの分子相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を配向させるために存在するというものである。ペプチド模擬物は、天然分子に類似する分子相互作用を可能にするよう設計されている。ペプチドまたは非ペプチド模擬物は、例えば、競合的に阻害するため、あるいはその反対にプレコアタンパク質/HBeAgと結合するかまたはTLRもしくはTLR経路を活性化させるために有用であり得る。この場合、好ましいTLRはTLR-2およびTLR-4である。
【０１１５】
さらに、本発明の化合物は、単独で標的と相互作用するよう選択してもよいし、または単一もしくは複数の化合物を用いて複数の標的に影響を与えることもできる。例えば、複数の標的にはプレコアタンパク質/HBeAgおよび病原体自体が含まれ得る。例えば、1種類の有用な治療用の組合せは、プレコアタンパク質/HBeAgの拮抗剤とヌクレオシド類似体および/または抗ウイルス性サイトカインであろう。
【０１１６】
スクリーニングアッセイで使用した標的または断片は、溶液中に遊離しているか、固相支持体に取り付けられているか、または細胞表面上にあるかのいずれかであり得る。薬物スクリーニングの一方法は、好ましくは競合的結合実験において、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRまたは断片を発現している組換え型ポリヌクレオチドで安定に形質転換された真核生物または原核生物宿主細胞を利用する。このような細胞は、生存に適した形であっても固定された形であっても、標準の結合実験に使うことができる。例えば、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRまたは断片と試験される薬剤との間の複合体形成を測定するか、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRまたは断片とリガンドとの間の複合体の形成を試験される薬剤が助けるかまたは妨げる程度を調べてもよい。
【０１１７】
標的機能もしくは遺伝子活性の調節因子と同定される物質は、本質的にペプチドまたは非ペプチドであり得る。非ペプチド「小分子」は、多くのインビボ製薬用途に好ましい場合が多い。従って、物質(特にペプチドである場合)の模擬物または模倣物を製薬用途のために設計してよい。
【０１１８】
薬学的に活性のある化合物に対する模擬物の設計は、「リード」化合物に基づく医薬の開発に対する公知のアプローチである。このアプローチは、活性化合物の合成が困難または費用のかかる場合、または特定の投与方法に不適当な場合、例えばペプチドが消化管でプロテアーゼにより即座に分解される傾向があるため経口組成物の活性物質に適さない場合に望ましいであろう。模擬物の設計、合成および試験は、一般に1つの標的特性について多数の分子を無作為にスクリーニングすることを避けるために用いられる。
【０１１９】
所定の標的特性を有する化合物からの模擬物の設計には通常いくつかの段階を要する。最初に、標的特性の決定に決定的かつ/または重要な化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これはペプチド中のアミノ酸残基を体系的に変えることによって、例えばそれぞれの残基を順に置換することによってなされ得る。ペプチドのアラニンスキャンは、一般にこのようなペプチドモチーフを絞り込むために用いられる。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファーマコフォア」として公知である。
【０１２０】
ひとたびファーマコフォアが見出されると、一連の情報源、例えば分光学的技法、x線回折データおよびNMRからのデータを用いて、その物理的特性、例えば立体化学、結合、サイズ、および/または電荷に従ってその構造をモデル化する。コンピュータ解析、類似性マッピング(原子間結合ではなくファーマコフォアの電荷および/または体積をモデルとする)ならびに他の技術をこのモデル化プロセスに用いることができる。
【０１２１】
このアプローチの変法では、プレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRおよびそれらのリガンドの三次元構造をモデル化する。これは、プレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRおよび/またはそれらのリガンドが結合で高次構造を変える場合に、模擬物の設計の際にモデルに三次元構造を考慮に入れることを可能とするので、特に有用であり得る。モデル化を用いて直鎖状の配列または三次元の立体配置と相互作用する阻害剤を作成することができる。
【０１２２】
次に、ファーマコフォアを模倣する化学基をその上に接ぎ合わせることのできる鋳型分子を選択する。鋳型分子およびその上に接ぎ合わせる化学基は、リード化合物の生物活性は保持しながらも、模擬物が合成しやすく、薬理学的に許容される可能性が高く、インビボで分解されないように便宜に選択することができる。または、模擬物がペプチドに基づく場合、ペプチドを環化させてその強固さを増大させることによりさらなる安定性を達成できる。このアプローチにより見出された模擬物を、次に、それらが標的特性を有しているか否か、またはそれをどの程度提示しているかを調べるためにスクリーニングできる。次に、さらなる最適化または修飾を行って、インビボ試験または臨床試験のための1つまたは複数の最終模擬物に到達できる。
【０１２３】
合理的薬物設計の目的は、例えば、ポリペプチドのより活性のある形態または安定な形態、あるいは、例えばインビボでポリペプチドの機能を増強するかまたは妨げる薬物を作り出すために、関心対象の生物活性ポリペプチドまたはそれらと相互作用する小分子(例えばアゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤またはエンハンサー)の構造類似体を作製することである。例えば、Hodgson(Bio/Technology. 9: 19-21, 1991)参照。1つのアプローチでは、最初に、x線結晶学によるか、コンピュータモデル化によるか、または最も一般に、アプローチの組合せにより、プレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRリガンドの三次元構造を決定する。プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRリガンドの構造に関する有用な情報も、相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることがある。合理的薬物設計の例は、HIVプロテアーゼ阻害剤の開発である(Erickson et al., Science. 249: 527-533, 1990)。さらに、標的分子をアラニンスキャンにより解析してもよい(Wells, Methods Enzymol. 202: 2699-2705, 1991)。この技法では、アミノ酸残基をAlaに置き換えてそのペプチドの活性への効果を判定する。ペプチドのそれぞれのアミノ酸残基をこの方法で解析してペプチドの重要な領域を決定する。
【０１２４】
また、プレコアタンパク質/HBeAg特異的抗体またはTLR特異的抗体を単離し(例えば上記の方法などによる)、その後その結晶構造を解くことも可能である。基本的に、このアプローチによってその後の薬物設計の基礎となり得るファーマコフォアが得られる。薬理学的に活性のある機能抗体に対する抗イディオタイプ抗体(抗id)を作製することによりタンパク質結晶学を完全に迂回することが可能である。鏡像の鏡像ということで、抗idの結合部位は元の受容体の類似体であることが予想される。次に、抗idを用いて化学的または生物学的に作製されたペプチドのバンクからペプチドを同定し、単離することができると考えられる。次に、選択されたペプチドをファーマコフォアとして機能すると考えられる。
【０１２５】
本発明は、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR-2もしくはTLR-4などのTLRをコードする遺伝子の発現を上方制御または下方制御する遺伝的アプローチに及ぶ。一般に、遺伝的手段を用いて転写前または転写後の遺伝子サイレンシングなどの遺伝子サイレンシングを誘導することがより便宜であり、従ってHBVのプレコア遺伝子または別の病原体におけるその同等物をサイレンシングすることがより適当または便宜である。しかし、一般的技法は、遺伝子のコピー数を増加させることまたは遺伝子発現の阻害因子を拮抗することなどによる発現の上方制御に使用できる。
【０１２６】
用語「核酸」、「ヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、センス鎖およびアンチセンス鎖双方のRNA、cDNA、ゲノムDNA、合成形および混合ポリマーが含まれ、さらに当業者に容易に理解されるように、化学的にまたは生化学的に修飾されていてもよく、あるいは非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。このような修飾としては、例えば、標識、メチル化、1つまたは複数の天然に存在するヌクレオチドの類似体(モルホリン環など)での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合(例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)、荷電結合(例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)ペンダント部分(例えばポリペプチド)、インターカレーター(例えばアクリジン、ソラレンなど)、キレート剤、アルキル化剤および修飾された結合(例えばα-アノマーの核酸など)が挙げられる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列と結合するポリヌクレオチドの能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も挙げられる。このような分子は当技術分野において公知であり、例えば、分子の骨格中のリン酸結合をペプチド結合が置換している分子が挙げられる。
【０１２７】
例えば、アンチセンスポリヌクレオチド配列は、プレコアタンパク質/HBeAgをコードするプレコア遺伝子の転写物のサイレンシングに有用である。このような細胞内でのアンチセンス構築物の発現は、プレコアタンパク質/HBeAg遺伝子の転写および/または翻訳を妨げる。さらに、共抑制および、短鎖干渉RNA(siRNA)またはONAに由来するRNAi(ddRNAi)を用いるRNAiを誘導する機構を使用してもよい。従って、アンチセンス分子またはセンス分子を直接投与してもよい。この最後の態様では、アンチセンス分子またはセンス分子を組成物中に処方して、その後任意の数の手段により標的細胞へ投与するか、または発現構築物を介して投与することができる。
【０１２８】
アンチセンス分子およびセンス分子の変化形には、モルホリンヌクレオチド誘導体およびホスホロジアミデート結合で構成されるオリゴヌクレオチドである、モルホリノの使用が含まれる(例えば、Summerton and Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Development. 7: 187-195, 1997)。このような化合物を胚へ注入し、mRNAによる干渉の効果を観察する。
【０１２９】
一態様では、本発明は、プレコアタンパク質/HBeAgをコードする分子などの核酸分子の機能または効果を調節する際に使用するための、オリゴヌクレオチドおよび類似の種などの化合物を使用する。言い換えば、このオリゴヌクレオチドが転写前または転写後の遺伝子サイレンシングを誘導する。これは、プレコアタンパク質/HBeAgをコードする核酸分子と特異的にハイブリダイズするか、またはプレコアタンパク質/HBeAgをコードする核酸分子を補完するオリゴヌクレオチドを提供することによって達成される。オリゴヌクレオチドは直接細胞へ提供してもよいし、また細胞内で作製してもよい。本明細書において用いられる用語「標的核酸」および「プレコアタンパク質/HBeAg遺伝子転写物をコードする核酸分子」は、便宜上、プレコアタンパク質/HBeAgをコードするDNA、そのようなDNAから転写されたRNA(プレmRNAおよびmRNAまたはその部分を含む)、およびそのようなRNAに由来するcDNAをも包含するために用いられている。本発明の化合物のその標的核酸とのハイブリダイゼーションは、一般に「アンチセンス」と称され、またはRISCなどのダイサーを含む複合体の一部であり得る。
【０１３０】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」とは、オリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、好ましい対形成の機構としては、オリゴマー化合物の鎖の相補的なヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基(核酸塩基)間の、ワトソン-クリック型水素結合、フーグスティーン型水素結合、または逆フーグスティーン型水素結合であってよい、水素結合が挙げられる。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成によって対形成される相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは様々な環境下で起こり得る。
【０１３１】
アンチセンスまたはRNAi化合物は、化合物と標的核酸との結合が標的核酸の正常機能を妨げて活性の損失をもたらす場合、かつ特異的結合が所望される条件下で、すなわちインビボアッセイまたは治療上の処置の場合には生理的条件下で、およびインビトロアッセイの場合にはアッセイを行う条件下で、アンチセンス化合物と非標的核酸配列の非特異的結合を回避するために十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１３２】
本明細書において用いられる「相補的」とは、オリゴマー化合物の2つの核酸塩基間の正確な対形成のための能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチド(オリゴマー化合物)の特定の位置の核酸塩基が、標的核酸の特定の位置の核酸塩基と水素結合可能である場合(該標的核酸はDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子である)、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の水素結合の位置は相補的な位置であると考えられる。オリゴヌクレオチドおよびさらにDNA、RNA、またはオリゴヌクレオチド分子は、それぞれの分子における十分な数の相補的な位置が互いに水素結合できる核酸塩基に占有されている場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」とは、安定かつ特異的な結合がオリゴヌクレオチドと標的核酸との間に生じるような、十分な数の核酸塩基にわたる十分な程度の正確な対形成または相補性を指すために用いられる用語である。
【０１３３】
本発明の文脈において、用語「オリゴマー化合物」とは、複数のモノマー単位を含むポリマーまたはオリゴマーを指す。本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸(RNA)またはデオキシリボ核酸(DNA)またはその模擬物、キメラ、類似体およびホモログのオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖およびヌクレオシド(骨格)間共有結合で構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに同様に機能する非天然に存在する部分を有するオリゴヌクレオチドが含まれる。このような修飾オリゴヌクレオチドまたは置換オリゴヌクレオチドは、所望の特性、例えば、強化された細胞取り込み、強化された標的核酸に対する親和性およびヌクレアーゼの存在下での強化された安定性などのために、天然型よりも好ましい場合が多い。
【０１３４】
オリゴヌクレオチドは本発明の化合物の好ましい形態であるが、本発明は、限定されるものではないが、本明細書において記載されるものなどのオリゴヌクレオチド類似体および模擬物をはじめとする、他の化合物ファミリーも同様に包含する。
【０１３５】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域を指すとして当技術分野において公知のオープンリーディングフレーム(ORF)または「コード領域」は、効果的に標的化され得る領域である。本発明の文脈で、1つの領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)の翻訳開始コドンまたは翻訳終止コドンを包含する遺伝子内の領域である。
【０１３６】
他の標的領域には、翻訳開始コドンから5'方向のmRNAの部分をさし、従ってmRNAの5'キャップ部位と翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)を含むことが当技術分野において公知の5'非翻訳領域(5'UTR)、および翻訳終止コドンから3'方向のmRNAの部分をさし、従ってmRNAの翻訳終止コドンと3'末端の間のヌクレオチド(または遺伝子上の対応するヌクレオチド)を指すとして当技術分野において公知の3'非翻訳領域(3'UTR)が含まれる。mRNAの5'キャップ部位は、5'-5'三リン酸結合を介してmRNAの最も5'側の残基と結合したN7-メチル化グアノシン残基を含む。mRNAの5'キャップ領域は、5'キャップ構造自体ならびにキャップ部位に隣接する最初の50ヌクレオチドを含むと考えられている。5'キャップ領域を化することもまた好ましい。
【０１３７】
当技術分野において公知のように、ヌクレオシドは塩基-糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常複素環塩基である。このような複素環塩基の中で最も一般的な2つのクラスはプリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分と共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関して、リン酸基が糖の2'、3'または5'ヒドロキシル部分のいずれかと結合できる。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基が隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して直鎖状のポリマー化合物を形成する。順に、この直鎖状のポリマー化合物それぞれの末端がさらに結合して環状の化合物を形成することもできるが、直鎖状の化合物が一般に好ましい。さらに、直鎖状の化合物は内部に核酸塩基相補性を有する可能性があり、従って、完全にまたは部分的に二本鎖化合物が作製されるように折り畳まれる可能性がある。オリゴヌクレオチド内部で、リン酸基は、一般にオリゴヌクレオチドのヌクレオシド間の骨格を形成するとされる。RNAおよびDNAの通常の結合または骨格は、3'-5'のホスホジエステル結合である。
【０１３８】
本発明において有用な好ましいアンチセンス化合物またはRNAi化合物の特定の例としては、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。本明細書において定義されるように、修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドには、骨格中にリン原子を保持するオリゴヌクレオチドおよび骨格中にリン原子を持たないオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書の目的において、また当技術分野において時折言及されるように、ヌクレオシド間骨格中にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもオリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。
【０１３９】
リン原子を含む好ましい修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、正常な3'-5'結合を有する、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートをはじめとするホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの2'-5'結合類似体、ならびに1つまたは複数のヌクレオチド間結合が3'-3'、5'-5'または2'-2'の結合である、逆向きの極性を有するオリゴヌクレオチド骨格が挙げられる。逆向きの極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、最も3'側のヌクレオチド間結合において単一の3'-3'結合を含む、すなわち脱塩基(核酸塩基が欠失しているかまたはその場所にヒドロキシル基を有する)であり得る単一の逆向きのヌクレオシド残基を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。
【０１４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはRNAiオリゴヌクレオチドは、吸入、局所的手段または全身性の手段をはじめとする任意の便宜な手段により投与してよい。
【０１４１】
別の態様では、DNAワクチンを含む遺伝子構築物を用いてインビボにてアンチセンス分子またはddRNAi分子を生成することができる。
【０１４２】
プレコアタンパク質/HBeAgと相互作用するかまたはTLRもしくはTLR経路を調節する薬剤の同定の後に、これを調製物、すなわち製造物もしくは処方物、または医薬品、薬学的組成物または薬物などの組成物中に製造および/または使用することができる。これらは感染の治療または予防の方法において個体へ投与してよい。または、パッチまたは徐放性のカプセル剤またはインプラントへ組み込んでもよい。
【０１４３】
従って、本発明は、それ従って、プレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRの活性もしくは遺伝子発現またはTLRシグナル伝達経路の成分の活性もしくは遺伝子発現の調節因子を含む薬学的組成物、医薬品、薬物またはパッチもしくは徐放性製剤をはじめとする他の組成物に及ぶ。
【０１４４】
本発明の別の局面は、このような組成物を例えば感染または他の疾患状態の治療または予防のために被験体へ投与する段階を含む方法を意図する。さらに、本発明は、本発明の化合物と薬学的に許容される賦形剤、媒体または担体、および所望により他の成分とを混合する段階を含む、薬学的組成物を作出する方法を意図する。複数の組成物が提供される場合、このような組成物を同時にまたは連続して与えてよい。連続投与には、数ナノ秒、数秒、数分、数時間または数日以内の投与が含まれる。好ましくは、連続投与は数秒または数分以内である。
【０１４５】
また、プレコアタンパク質/HBeAg活性またはレベルと相互作用し、TLR-2もしくはTLR-4などのTLRを共に調節する成分など複数の成分を含む、2部分を含む複数部分の薬学的組成物またはパックも意図される。さらにヌクレオシド類似体などの抗病原体剤も含まれ得る。このような複数部分の薬学的組成物またはパックは、異なる薬剤または薬剤群を別々に維持する。これらは別々に投薬されるか、または投薬の前に混合される。
【０１４６】
従って、本発明の別の局面は、被検体における感染または他の疾患状態の治療または予防のための方法を意図し、該方法は該被験体へ有効量の本明細書において記載される化合物またはそれを含む組成物を投与する段階を含む。
【０１４７】
好ましくは、被験体は哺乳類、例えばヒトあるいは動物モデル系、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ゼブラフィッシュまたは両生類もしくはアヒルなどの鳥類である。
【０１４８】
また、この方法は細胞へ野生型または突然変異標的遺伝子機能を提供する段階を含む。これは動物モデルを作成する場合に特に有用である。または、これは遺伝子療法アプローチの一部となり得る。標的遺伝子または遺伝子の一部は、遺伝子が染色体外に残るようにベクター中の細胞内へ導入することができる。このような状況では、遺伝子は染色体外の位置から細胞により発現されることになる。突然変異標的対立遺伝子を保有する細胞へ遺伝子部分を導入して発現させる場合、遺伝子部分は標的タンパク質の一部をコードしているべきである。組換えのためおよび染色体外維持のための遺伝子の導入用ベクターは当技術分野において公知であり、任意の適したベクターを用いてよい。エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法およびウイルスの形質導入などのDNAを細胞へ導入するための方法は当技術分野において公知である。本発明のこの局面は、ddRNAiをコードする構築物に及ぶ。
【０１４９】
当技術分野において公知の遺伝子導入系は、遺伝子操作の実践に有用であり得る。これらにはウイルス性および非ウイルス性導入法が含まれる。パポバウイルス(例えば SV40, Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-1536, 1992)、アデノウイルス(Berkner, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-66, 1992; Berkner et al., BioTechniques 6; 616-629, 1988; Gorziglia and Kapikian, J. Virol. 66: 4407-4412, 1992; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584, 1992; Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155, 1992; Wilkinson et al., Nucleic Acids Res. 20: 2233-2239, 1992; Stratford-Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1: 241-256, 1990; Schneider et al., Nature Genetics 18: 180-183, 1998)、ワクシニアウイルス(Moss, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348, 1996)、アデノ随伴ウイルス(Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-129, 1992; Ohi et al., Gene 89: 279-282, 1990; Russell and Hirata, Nature Genetics 18: 323-328, 1998)、HSVおよびEBVをはじめとするヘルペスウイルス(Margolskee, Curr. Top., Microbiol. Immunol. 158: 67-95, 1992; Johnson et al., J Virol, 66: 2952-2965, 1992; Fink et al., Hum. Gene Ther. 3: 11-19, 1992; Breakefield and Geller, Mol. Neurobiol. 1: 339-371, 1987; Freese et al., Biochem. Pharmacol. 40: 2189-2199, 1990; Fink et al., Ann. Rev. Neurosci. 19: 265-287, 1996)、レンチウイルス(Naldini et al., Science 272: 263-267, 1996)、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林熱ウイルス(Berglund et al., Biotechnology 11: 916-920, 1993)ならびに鳥類起源のレトロウイルス(Bandyopadhyay and Temin, Mol. Cell. Biol. 4: 749-754, 1984; Petropoulos et al., J. Virol. 66: 3391-3397, 1992)、ネズミ起源のレトロウイルス[Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24, 1992; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 5: 431-437, 1985; Sorge et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1730-1737, 1984; and Baltimore, J. Virol. 54: 401-407, 1985; Miller et al., J. Virol. 62: 4337-4345, 1988]およびヒト起源のレトロウイルス[Shimada et al., J. Clin. Invest. 88: 1043-1047, 1991; Helseth et al., J. Virol. 64: 2416-2420, 1990; Page et al., J. Virol. 64: 5270-5276, 1990; Buchschacher and Panganiban, J. Virol. 66: 2731-2739, 1982]を含む多数のウイルスが遺伝子導入ベクターとして、または遺伝子導入ベクターを調製するための基礎として用いられている。
【０１５０】
非ウイルス性遺伝子導入法、例えばリン酸カルシウム共沈殿をはじめとする化学的技法、機構による技法、例えば、マイクロインジェクション、リポソームを介する膜融合に媒介される導入およびDNAの直接取り込みならびに受容体に媒介されるDNA導入などは、当技術分野において公知である。ウイルスに媒介される遺伝子導入は、リポソーム送達を用いる直接のインビボ遺伝子導入法と組み合わせることができ、ウイルスベクターを特定の細胞へ導くことが可能となる。または、レトロウイルスベクター産生細胞株を特定の組織へ注入することができる。産生細胞の注入は、その後、ベクター粒子の継続的な供給源をもたらす。
【０１５１】
生物学的遺伝子導入法と物理的遺伝子導入法を組み合わせるアプローチでは、任意のサイズのプラスミドDNAをアデノウイルスヘキソンタンパク質に特異的なポリリジン結合抗体と結合させ、生じた複合体をアデノウイルスベクターと結合させる。次に、この3分子複合体を用いて細胞を感染させる。アデノウイルスベクターは、連結されたDNAが損傷する前に効果的な結合、内部移行およびエンドソームの分解を可能にする。アデノウイルスに基づくベクターの送達に関する他の技法については、米国特許第5,691,198号を参照。
【０１５２】
リポソーム/DNA複合体は、直接インビボ遺伝子導入を媒介する能力があるということが示されている。標準的なリポソーム調製物において遺伝子導入プロセスは非特異的であるが、例えば、直接インサイチュー投与後に局在的なインビボ取り込みおよび発現が腫瘍沈着物において報告されている。
【０１５３】
ポリヌクレオチドがセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムもしくはDNAzymeをコードする場合、発現するとセンスもしくはアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムもしくはDNAzymeを産生する。従って、この状況において、発現にはタンパク質産物が合成されることを必要としない。発現ベクターへクローニングされたポリヌクレオチドに加えて、発現ベクターはまた、真核細胞において機能するプロモーターも含む。クローニングされたポリヌクレオチド配列はこのプロモーターの制御下にある。適した真核生物プロモーターとしては、上記のものが挙げられる。また、発現ベクターは本明細書において記載される選択マーカーおよび他の配列などの配列も含み得る。
【０１５４】
突然変異標的遺伝子(例えばプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR-2もしくはTLR-4)を保有する細胞は、感染または他の疾患状態の効果を調べるためのモデル系として用いることができる。
【０１５５】
本発明の化合物、薬剤、医薬品、核酸分子および他の標的アンタゴニストもしくはアゴニストは、従来の薬学的配合技術に従って調製される薬学的組成物中に処方することができる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A.)参照。組成物は、活性物質または活性物質の薬学的に許容される塩を含み得る。これらの組成物は、活性物質のうちの1種類に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、バッファー、安定剤または当技術分野において周知の他の材料を含み得る。このような材料は無毒であるべきであり、有効成分の効力を妨げるべきでない。担体は、投与、例えば局所、静脈内、経口、くも膜下腔内、神経鞘または非経口投与に望ましい調製物の形態に応じて多種多様の形態をとり得る。
【０１５６】
経口投与を目的として、化合物を、カプセル剤、丸剤、錠剤、トローチ剤、粉剤、懸濁液またはエマルジョンなどの固体または液体調製物へ処方することができる。組成物を経口投与形に調製する際には、例えば、経口液体調製物(例えば、懸濁液、エリキシル剤および溶液など)の場合の水、グリコール、油、アルコール、香味剤、防腐剤、着色剤、および沈殿防止剤など；または経口固体調製物(例えば、粉剤、カプセル剤および錠剤など)の場合の担体、例えばデンプン、糖、希釈液、造粒剤、滑沢剤、結合剤、および崩壊剤など、任意の通常の薬学的媒体を用いてよい。投与における容易さのために、錠剤およびカプセル剤が最も有利な経口投与単位形態を表すが、この場合は当然固体の薬学的担体が用いられる。所望であれば、標準的な技術により錠剤に糖衣をかけるかまたは腸溶コーティングしてもよい。活性物質をカプセルに封入して消化管を安定して通過させると同時に血液脳関門の通過も可能にすることができる。例えば、国際公開公報第96/11698号参照。
【０１５７】
非経口投与を目的として、化合物を薬学的担体に溶解し、溶液または懸濁液のいずれかとして投与することができる。適した担体の例は水、生理食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物または合成起源の油である。また、担体に他の成分、例えば、防腐剤、沈殿防止剤、可溶化剤、バッファーなどを含めてもよい。化合物をくも膜下腔内に投与する場合、化合物を脳脊髄液中に溶解してもよい。
【０１５８】
活性物質は、好ましくは治療上有効な量で投与する。実際の投与量ならびに投与の速度および時間経過は、治療される状態の性質および重篤度に依存することになる。治療の処方、例えば投与量、タイミングなどの決定は、一般開業医または専門医の責任の範囲内にあり、一般に、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に公知の他の因子を考慮に入れる。技法およびプロトコールの例は前記Remington's Pharmaceutical Sciencesに見出すことができる。
【０１５９】
または、ターゲティング療法を用いて、抗体もしくは細胞特異的リガンドまたは特異的核酸分子などのターゲティング系の使用により、活性物質をより特異的に特定の種類の細胞へ送達してもよい。ターゲティングは種々の理由から望ましい場合があり、例えば薬剤が許容されないほど有毒である場合、またはさもなければ非常に高い投与量を必要とする場合、またはさもなければ標的細胞に進入することができない場合である。
【０１６０】
これらの物質を直接投与する代わりに、物質を標的細胞内に、例えば上記のようなウイルスベクター内に、または米国特許第5,550,050号および国際公開公報第92/19195号、同第94/25503号、同第95/01203号、同第95/05452号、同第96/02286号、同第96/02646号、同第96/40871号、同第96/40959号および同第97/12635号に記載のものなどの細胞に基づく送達系において産生させることができる。ベクターは標的細胞に対して標的化され得る。細胞に基づく送達系は、患者の身体内の所望の標的部位に移植されるよう設計され、標的物質のコード配列を含む。または、物質を、治療する細胞内で産生されるか、または治療する細胞を標的化する活性化剤により活性型へ変換される前駆体の形態で投与することもできる。例えば、欧州特許出願第0 425 731A号および国際公開公報第90/07936号を参照。
【０１６１】
本発明はさらに、感染または他の疾患状態の存在または非存在、感染が慢性となっているかどうか、感染および/または治療プロトコールの有効性に対する被験体の感受性を判定するためなどの診断プロトコールを意図する。
【０１６２】
免疫学に基づくプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR検出プロトコールは、種々の形態をとり得る。例えば、プレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRまたはプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRを含む単球もしくは肝細胞に対してそれぞれが異なる特異性を有する複数の抗体をアレイ内に固定化してもよい。次に、生検細胞を抗体アレイと接触させ、細胞上または細胞内で上昇したかまたは下方制御されたプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRのレベルおよび種類に関して診断を行うことができる。
【０１６３】
ELISA、ウエスタンブロット解析、免疫沈降解析、免疫蛍光解析、免疫化学解析またはFACS解析によるなど他のより常套的なアッセイを行ってもよい。
【０１６４】
従って、本発明は、試料と抗体またはその断片もしくは誘導体を接触させる段階および、該抗体およびHBeAgもしくはTLRまたはその断片、変異体もしくは誘導体を含む複合体のレベルを正常対照と比較して検出する段階を含み、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRのレベルの変化が、感染または他の疾患状態の存在または非存在の指標となる、プレコアタンパク質/HBeAgもしくはTLRまたはそれを含む細胞またはその断片、変異体もしくは誘導体を検出する方法を提供する。
【０１６５】
好ましくは、TLRはTLR-2および/またはTLR-4である。
【０１６６】
上記に考察したように、複合体の形成を判定するために適した任意の技術を用いてよい。例えば、本発明の抗体は、それと会合しているレポーター分子を有するが、免疫測定法に利用することができる。このような免疫測定法としては、限定されるものではないが、当業者に周知の放射免疫測定法(RIA)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)および免疫クロマトグラフィー法(ICT)、ウエスタンブロッティングが挙げられる。例えば、本発明に従って用いることのできる種々の免疫測定法を開示しているColigan et al., 1991-1997, 前記を参照することもできる。免疫測定法には、競合アッセイ法が含まれ得る。本発明が定性的および定量的な免疫測定法を包含することは当然理解されるであろう。
【０１６７】
適した免疫測定法は、例えば、米国特許第4,016,043号、同第4,424,279号および同第4,018,653号に記載されている。これらには、非競合型の一部位アッセイ法および二部位アッセイ法の双方、ならびに従来の競合結合アッセイ法が含まれる。また、これらのアッセイ法には、標識抗原結合分子と標的抗原との直接結合も含まれる。この場合の抗原はTLRまたはその断片である。
【０１６８】
二部位アッセイ法は、本発明における使用に特に好ましい。これらのアッセイ法には多数の変法が存在し、それは全て本発明に包含されるものとする。要するに、典型的な順方向アッセイでは、非標識抗体などの非標識抗原結合分子を固体基板上に固定化し、試験する試料を結合している分子と接触させる。抗体抗原複合体の形成を可能にするために十分な期間である、適したインキュベーション期間の後、検知可能なシグナルを生じることのできるレポーター分子で標識した別の抗原結合分子、適当にはこの抗原に特異的な二次抗体を、その後添加してインキュベートし、抗体-抗原-標識抗体からなる別の複合体の形成に十分な時間置く。未反応材料を洗浄除去し、レポーター分子により生じたシグナルを観察して抗原の存在を判定する。結果は可視シグナルの簡単な観察による定性的なものであってもよいし、または既知量の抗原を含む対照試料との比較により定量化してもよい。順方向アッセイの変法としては、試料と標識抗体の双方を同時に結合抗体へ添加する同時アッセイが挙げられる。容易に理解されるであろうわずかな変形を含め、これらの技法は当業者に周知である。
【０１６９】
典型的な順方向アッセイでは、抗原またはその抗原性部分に対する特異性を有する一次抗体を固体表面と共有結合させるかまたは受動的に結合させる。固体表面は一般に、ガラスまたはポリマーであり、最も慣用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンである。固相支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、または免疫測定法の実施に適した任意の他の表面の形態であってよい。結合プロセスは当技術分野において周知であり、一般に架橋共有結合または物理的吸着からなり、ポリマー-抗体複合体を試験試料の調製の際に洗浄する。次に試験する試料のアリコートを固相複合体に添加し、十分な時間および適した条件下でインキュベートして存在する抗原と抗体とを結合させる。インキュベーション期間の後、抗原-抗体複合体を洗浄し、乾燥させ、抗原の一部分に特異的な二次抗体でインキュベートする。二次抗体は一般に、二次抗体と会合しているレポーター分子を有し、レポーター分子は二次抗体と抗原との結合を示すために用いられる。会合しているレポーター分子によって判定される、結合する標識抗体の量は、固定化された一次抗体と結合した抗原の量に比例する。
【０１７０】
別の方法には、抗原を生物試料中で固定化することと、その後固定化された抗原をレポーター分子で標識していてもしなくてもよい特異的抗体へ曝露することとが含まれる。標的の量およびレポーター分子シグナルの強度にもよるが、結合した抗原は抗体で直接標識することにより検出可能となり得る。または、一次抗体に特異的な標識二次抗体を標的-一次抗体複合体に曝露して標的-一次抗体-二次抗体の三次複合体を形成する。この複合体はレポーター分子の発するシグナルにより検出される。
【０１７１】
前記から、抗原結合分子と会合したレポーター分子には以下のものが含まれ得ることが当然理解される：
(a)レポーター分子と抗体との直接結合；
(b)レポーター分子と抗体との間接結合；すなわち、レポーター分子と、その後に抗体と結合する別のアッセイ試薬との結合；および
(c)抗体のその後の反応生成物との結合。
【０１７２】
レポーター分子は、色素原、触媒、酵素、蛍光色素、化学発光分子、常磁性イオン、ユウロピウム(Eu34)などのランタニドイオン、他の核標識タグおよび直接可視化する標識をはじめとする放射性同位元素を含む群から選択され得る。
【０１７３】
直接可視化する標識の場合、コロイド金属粒子または非金属粒子、色素粒子、酵素もしくは基質、有機ポリマー、ラテックス粒子、リポソーム、またはシグナル生成物質などを含む他の小胞を用いることができる。
【０１７４】
レポーター分子としての使用に適した多数の酵素が、米国特許第4,366,241号、同第4,843,000号、および同第4,849,338号に開示されている。本発明において有用な適した酵素としては、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼなどが挙げられる。酵素は単独で用いても溶液中の二次酵素と組み合わせて用いてもよい。
【０１７５】
適した蛍光色素としては、限定されるものではないが、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)、R-フィコエリトリン(RPE)、およびテキサスレッドが挙げられる。他の例示的な蛍光色素としては、国際公開公報第93/06121号に考察されるものが挙げられる。米国特許第5,573,909号および同第5,326,692号に記載される蛍光色素を参照してもよい。または、米国特許第5,227,487号、同第5,274,113号、同第5,405,975号、同第5,433,896号、同第5,442,045号、同第5,451,663号、同第5,453,517号、同第5,459,276号、同第5,516,864号、同第5,648,270号および同第5,723,218号に記載される蛍光色素を参照してもよい。
【０１７６】
酵素免疫測定法の場合には、一般にグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸によって、酵素を二次抗体と結合させる。しかし、容易に認識されるように、当業者に容易に達成可能な多種多様の異なる結合法が存在する。特定の酵素と用いられる基質は、一般に、対応する酵素による加水分解の際に、検出可能な色の変化を生じる目的で選択される。適した酵素の例としては、前記に記載されるものが挙げられる。また、上記の発色基質ではなく蛍光生成物を生じる蛍光発生基質を使用することも可能である。全ての場合において、酵素標識抗体を一次抗体-抗原複合体に添加し、結合させ、その後過剰な試薬を洗浄除去する。その後、適切な基質を含む溶液を抗体-抗原-抗体の複合体へ添加する。この基質は二次抗体と連結した酵素と反応して、定性的な視覚シグナルを生じるが、これを、通常は分光測定により、さらに定量化して試料中に存在していた抗原の量の指標を得ることができる。
【０１７７】
交互に、フルオレセイン、ローダミンおよびランタニド、ユウロピウム(EU)などの蛍光化合物を、化学的に抗体とそれらの結合能を変えることなく結合させてもよい。特定の波長の光での照射により活性化されると、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子の励起状態を誘発し、その後、光学顕微鏡で視覚により検出可能な特徴的な色の光を発する。蛍光標識抗体は、一次抗体-抗原複合体と結合させておく。結合していない試薬を洗浄除去した後、次に残存する三次複合体を適当な波長の光に曝露する。観察される蛍光は、関心対象の抗原の存在を示す。免疫蛍光アッセイ法(IFMA)は当技術分野において十分確立されており、本方法に特に有用である。しかし、他のレポーター分子、例えば放射性同位元素、化学発光分子または生物発光分子などを用いてもよい。
【０１７８】
また、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRに対するモノクローナル抗体をELISAによるTLRの検出に用いてもよい。これは、抗プレコアタンパク質/HBeAgまたは抗TLR抗体を固相支持体へ固定化し、これらを肝細胞と接触させるなど多くの手段で行われ得る。次に、標識した抗プレコアタンパク質/HBeAgまたは抗TLR抗体を用いて固定化されたプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRを検出する。または、他の肝臓細胞表面マーカーに対する抗体を用いる。このアッセイ法は多様に変化する可能性があり、全ての変法は本発明に包含される。このアプローチにより、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRレベルの迅速な検出および定量化が可能となる。
【０１７９】
また、本抗体は生検物質などのインサイチューハイブリダイゼーション解析にも有用である。このような解析により、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR-2およびTLR-4などのTLRのレベルの迅速な診断が可能となる。
【０１８０】
好ましくは、診断アッセイは、FACSまたはウエスタンブロット手法に基づく。
【０１８１】
別の態様では、検出のための方法は、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRをコードするポリヌクレオチドの細胞内発現のレベルを検出する段階を含む。このようなポリヌクレオチドの発現は、任意の適した技術を用いて判定することができる。例えば、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRをコードする標識ポリヌクレオチドを細胞から得たRNA抽出物のノーザンブロットでのプローブとして用いることができる。好ましくは、RT PCRなどの核酸増幅反応において動物の核酸抽出物を、キナーゼをコードするポリヌクレオチド、またはその隣接配列のセンス配列およびアンチセンス配列に相当するオリゴヌクレオチドプライマーと共に利用する。種々の自動固相検出技術も適している。例えば、例えばFodorら(Science. 251: 767-777, 1991)およびKazalら(Nature Medicine. 2: 753-759, 1996)に記載されるように、非常に大規模な固定化プライマーアレイ(VLSIPS(商標))が核酸の検出に用いられる。上記の遺伝子技術は当業者に周知である。
【０１８２】
例えば、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRをコードするRNA転写物に関して、RNAをプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR RNAを含むと思われる細胞試料から単離する。RNAは、当技術分野において公知の方法により、例えばTRIZOL(商標)試薬(GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, Md.)を用いて単離できる。オリゴ-dT、またはランダム配列オリゴヌクレオチド、ならびに配列特異的オリゴヌクレオチドを、逆転写酵素反応においてプライマーとして使用し、単離RNAから第1鎖cDNAを調製できる。次に、生じた第1鎖cDNAをPCR反応において配列特異的オリゴヌクレオチドで増幅して増幅産物を得る。
【０１８３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」とは、核酸、RNAおよび/またはDNAの予め選択しされた断片の量を、米国特許第4,683,195号に記載されるように増幅する手法または技術を指す。「PCR」への言及は、多重PCR法を含む。
【０１８４】
一般に、関心対象の領域の末端またはその向こうの配列情報を用いてオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。これらのプライマーは、増幅させる鋳型の逆鎖と同一であるかまたは類似の配列となる。PCRを用いて特定のRNA配列および全細胞RNAから転写されたcDNAを増幅できる。一般に、Mullisら(Quant. Biol. 51: 263, 1987; Erlich, eds., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989)を参照。従って、PCRによる特定の核酸配列の増幅は、関連遺伝子またはタンパク質配列のアラインメント、例えば哺乳類TLR遺伝子の配列比較から推定される、保存された核酸配列を有するオリゴヌクレオチドまたは「プライマー」に依存する。例えば、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRをコードするcDNA分子のアンチセンス鎖とアニーリングすると予測される一方のプライマーを調製し、センス鎖とアニーリングすると予測されるもう一方のプライマーを調製する。
【０１８５】
増幅産物を検出するため、反応混合物を一般にアガロースゲル電気泳動または他の便宜な分離技術に付し、増幅されたプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR特異的DNAの相対的存在を検出する。例えば、増幅されたプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRのDNAを、特異的オリゴヌクレオチドプローブでのサザンハイブリダイゼーションを用いて検出することができる。または既知分子量のDNA標準物質を用いる電気泳動移動度で比較することができる。増幅されたプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR DNAの単離、精製および特徴付けは、ゲルから断片を切除するか溶出させ(例えば、参照文献Lawn et al., Nucleic Acids Res. 2: 6103, 1981; Goeddel et al., Nucleic cids Res. 8: 4057-1980参照)、増幅産物をpCRIIベクター(Invitrogen)などの適したベクターのクローニング部位へクローニングし、クローニングされた挿入物をシークエンシングし、DNA配列をプレコアタンパク質/HBeAgまたはTLRの既知配列を比較することにより、達成することができる。次に、プレコアタンパク質/HBeAgまたはTLR mRNAおよびcDNAの相対量が決定され得る。
【０１８６】
リアルタイムPCRは、PCR遺伝子の転写レベルの判定の際に特に有用である。転写活性の判定には、得られるmRNA転写物に基づく潜在的翻訳活性の測定も含まれる。リアルタイムPCRならびに他のPCR手法には、PCR産物の検出のために、DNA結合フルオロフォアの結合、5'エンドヌクレアーゼ、隣接する線状プローブおよびヘアピン型オリゴプローブならびに自己蛍光型アンプリコンをはじめとする多数の化学が用いられる。これらの化学およびリアルタイムPCRは、概して、例えば、Mackay et al., Nucleic Acids Res. 30(6): 1292-1305, 2002; Walker, J. Biochem. Mol. Toxicology. 15(3): 121-127, 2001; Lewis et al., J. Pathol. 195: 66-71, 2001において考察されている。
【０１８７】
本発明は、さらにmRNA転写物の上方制御または下方制御についてスクリーニングするための遺伝子アレイおよび/または遺伝子チップおよび/またはリボヌクレアーゼ保護を提供する。本発明のこの局面は、HBeAg転写物の下方制御またはTLR遺伝子転写物の調節をもたらす状態の同定に特に有用である。
【０１８８】
さらなる方法では、TLRシグナル伝達の直接的または間接的な結果として産生されたかまたは阻害された細胞外サイトカインをスクリーニングしてもよい。適したサイトカインの例としては、TNF-α、IFN-α、IFN-βおよびIFN-γが挙げられる。便宜には、3種類のサイトカインを血清、全血、尿または他の体液においてスクリーニングする。細胞外または細胞内のHBeAgのレベルまでも測定することができる。
【０１８９】
以下の限定されない実施例により本発明をさらに説明する。
【０１９０】
実施例1
TLR2およびTLR4レベルの測定
方法
HBVバキュロウイルス感染HepG2
HepG2細胞をHBV1:3野生型、HBV1:3プレコア突然変異株または偽感染バキュロウイルスで感染させ、7日間培養した後回収し、フローサイトメトリーのために染色した。RNeasyミニキット(Qiagen)を製造業者の仕様書に従って用いて全RNA抽出のためにいくつかの細胞を保存した。
【０１９１】
フローサイトメトリー
TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience)およびTLR4-PE(HTA125; eBioscience)抗体を用いてHepG2細胞の細胞表面染色を行った。適当なアイソタイプ対照(isotype control)を用いた。死細胞を散乱特性に基づいてゲートから排出した。FACSCaliburフローサイトメーター(BD)で実験を行った。各試料につき合計10000個の細胞を得た。FlowJoソフトウェア(Tree Star Inc.)を用いてデータを解析した。偽感染細胞の幾何平均蛍光強度を野生型またはプレコア突然変異株感染細胞の幾何平均蛍光強度から引くことにより相対蛍光強度を決定した。
【０１９２】
QPCR
cDNAのリアルタイムPCR解析の前にランダムヘキサマーを用いて全RNAを逆転写した。TaqMan Universal PCR Master MixならびにAssays-On-Demand Gene Expression Assayプローブおよびプライマー(Applied Biosystems)を用いて最終容量10μlでPCRを3通り行った。以下の通りにプログラムされたABI Prism 7700配列検出システムによってシグナル検出を行った：50℃,2分間；95℃,10分間；40サイクルの95℃,15秒間；60℃,1分間。各遺伝子のサイクル閾値(CT)、を18SのCT値(ΔCT)と比較し、相対発現単位(REU)を各試料について計算した。従って、REU＝2^CT(関心対象遺伝子)−Ct(18S)＝2^ΔCtである。
【０１９３】
結果
結果を図1および2ならびに表3に示す。TLR2およびTLR4のレベルをHBV野生型とプレコア突然変異HBV株の感染細胞において比較する。
【０１９４】
（表３）
2007538232.tif 000007
【０１９５】
実施例2
慢性HBV感染におけるTLR発現の低下
患者
肝生検
シングルパス肝生検を5名のCHB患者に行った。これらは大学病院の肝臓専門外来に通院する臨床的に安定な患者であった。患者らのトランスアミナーゼは正常または軽度に上昇していた(平均ALT 87.8 U/L(N＜45)；平均AST 32.2 U/L(N＜45)。Ishak改変組織活動性指標のスコアは1/6〜3/6の間の病期で1/18〜7/18まで変化した。5名の患者のうちの4名はHBeAg陽性でウイルス複製が進行していた(HBV DNA 200〜1.1×108コピー数/ml中央値1500コピー/ml)。生検試料を、実験室へ輸送するためにRPMI-1640(Gibco-BRL)に入れ、そこで単細胞浮遊液を調製した。半分の生検(1.5×8mm)を、他の細胞と混ざり合った約6×104個の肝細胞を分離するため、緩いピストルの付いた、ワイヤーメッシュまたはガラスホモジナイザーのいずれかに供した。受容体の損傷を防ぐため、このプロセスにはコラゲナーゼもデオキシリボヌクレアーゼも用いなかった。次に、この単細胞浮遊液を適当な抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した(下記参照)。
【０１９６】
B型肝炎ウイルス試薬およびインビトロモデル細胞培養系
細胞培養
ヒト肝芽腫細胞株HepG2を、ペニシリンおよびストレプトマイシン、L-グルタミンおよび10％v/v熱不活性化ウシ胎児血清(FCS)(Invitrogen)を補充したMinimum Essential Medium(MEM; Invitrogen/Gibco)で維持した。全ての細胞株を週毎に継代し、3日毎に培地を交換して5％v/v C02中、37℃にて維持した。
【０１９７】
ヒト肝癌(Huh-7)細胞を、10％熱不活性化FCS、100U/mlペニシリンGおよび100U/mlストレプトマイシン(Gibco-BRL)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Gibco-BRL, Grand Island, NY)中で維持した。
【０１９８】
ヒト肝癌細胞株PLC/PRF/5は、時に微細線維とともに、HBsAgを主に22nm粒子の形態で細胞培養上清へ放出する(Alexander et al, S. Afr Med J 54(23):973-974, 1978)。これらの細胞は10％FCSを含むMEM中で培養され、維持されるが、HBVを産生しない。この細胞株はAmerican Type Culture Collection(ATCC: CTL-8024)から入手した(マイコプラズマは含まない)。PLC/PRF/5細胞からの細胞培養上清を播種から5日後に回収し、酵素免疫測定法により高レベルのHBsAg(＞1ug/ml)を含むことが実証された(IMX: Abbott Laboratories, North Chicago, ILL)。
【０１９９】
一時的トランスフェクションによるB型肝炎ウイルス産生
HepG2細胞にFugene 6試薬(Roche, IN)を用いてHBVの感染性cDNAクローンをトランスフェクトして組換え型HBVを作製し(Chen et al, Hepatology 27(1):27-35, 2003)、5日後、細胞培養上清を回収した。分泌されたウイルスを含有する上清を回収し、プールし、遠心分離してペレット状の細胞片を得た。次に、SW28ローター(Beckman)を用いて、20％スクロースクッション(20％ w/vスクロース、1mM EDTA、30mM Tris pH7.4、150mM NaCl)による、12℃で25,000rpmにて16時間の上清の超遠心分離によりHBVを濃縮した。
【０２００】
ペレット状の材料中のウイルスを定量するため、MagNA Pure(商標)抽出系を製造業者の説明書に従って用いて濃縮HBVのアリコート20μlをDNAのために抽出した。次にHBV DNAを、Light-Cycler(Roche)において、ARTUSリアルタイムPCRキットをウイルスゲノムのコピー数/mlで表される力価で製造業者の仕様書に従って用いて定量化した。また、標準的な酵素免疫測定法(IMX: Abbott Laboratories, North Chicago, ILL)により、試料をHBsAgおよびHBeAgについて試験した。
【０２０１】
HBVプレコアタンパク質およびコアタンパク質産生細胞株
HBVプレコアおよびコアタンパク質の緊密な誘導発現をもつHuh-7細胞を、遺伝子型DのcDNA(Chen 2003前記)からのHBVコア遺伝子またはプレコア遺伝子をテトラサイクリン応答性発現系(pTRE-2; Clontech, Palo Alto, CA)へクローニングすることにより作製した。これらの3種類の細胞株PC47(プレコア産生細胞株)、C4B(コア産生細胞株)および親株(対照細胞株)の樹立および特徴付けは、詳細に公開されている(Locarnini et al., J Clin Virol. 32:113-21, 2005)。テトラサイクリンの存在下(タンパク質発現抑止)または非存在下(タンパク質発現誘導)での10日間の培養の後、細胞培養上清を回収した。
【０２０２】
組換え型HBVバキュロウイルス形質導入細胞
既に記載したように(Chen 2003 前記)、1.3ゲノム長の野生型(WT)HBV鋳型(遺伝子型D、サブタイプayw)(Invitrogen, Stratagene, CA)を用いる位置指定突然変異誘発および同時トランスフェクションにより組換え型HBVバキュロウイルス構築物を作製した。次に、HepG2細胞に、対照、WTおよびプレコア突然変異組換え型HBVバキュロウイルスを50プラーク形成単位(PFU)/細胞の感染多重度(MOI)で平行して形質導入した(22、23)。細胞培養の培地を形質導入後1、3、および5日目に交換し、7日目に回収した。
【０２０３】
全血培養のインビトロHBV刺激
500μlのリチウム-ヘパリン全血を、抗生物質および5％v/v熱不活性化ウシ胎児血清を補充した500μlのRPMI-1640に希釈し、しっかりと蓋をした5mlポリスチレン管(Becton Dickinson, San Jose, CA)中で緩やかに回転させながら37℃でインキュベートした。細胞を、濃度1、10、および50×106ウイルスゲノムコピー/mlのHBV野生型1.5(遺伝子型A)、1μg/mlラミブジン、PLC/PRF/5細胞の細胞上清(HBsAg)またはHBVプレコアの上清(pC47：HBeAg陽性)またはコアタンパク質(C4B)産生細胞株ならびに適当な対照細胞株で刺激した。20時間後、培養上清を回収し、サイトカイン解析まで-20℃で保存した。残りの細胞をフローサイトメトリー用に染色した。
【０２０４】
TNF-α ELISA 
TNF-αを、OptEIAセット(Becton Dickinson, San Jose, CA)を製造業者の仕様書に従って用いて捕捉ELISAにより測定した。ELISAの感受性は8pg/mlであった。
【０２０５】
フローサイトメトリー 
肝細胞懸濁液
患者の肝生検から得た肝細胞懸濁液の細胞表面染色を、CD14-PerCP(MφP9; Becton Dickinson, San Jose, CA)、TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA)およびTLR4-PE(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)を用いて行った。適当なアイソタイプ対照を用いた。細胞をCD14表面発現の量；CD14が高度であるかまたはCD14が低度であるか、に応じてゲートした。これはその散乱特性と相互に関連した。CD14の高い細胞(肝細胞)は、CD14の低い細胞(クッパー細胞)よりもさらに大きく、より粒状であった。
【０２０６】
患者血
新鮮なリチウム-ヘパリン血の細胞表面染色を、既に記載したように(Riordan et al., Hepatology 37:1154-64, 2003)、CD14-PerCP(MφP9; Becton Dickinson, San Jose, CA)、TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA)およびTLR4-PE(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)を用いて行った。適当なアイソタイプ対照を用いた。それらの散乱特性に基づいて、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)で単球をゲートしてリンパ球の尾部を捕捉した。合計8000個のCD14+単球を各試料から得た。FlowJoソフトウェア(Tree Star Inc., Ashland, OR)を用いてデータを解析した。相対蛍光強度を、そのアイソタイプの合致する対照を越える、試料の幾何平均蛍光強度の比として決定した。結果はTLRの変化率(％)として表した。
【０２０７】
全血培養
患者の培養全血の細胞表面染色を、CD14-PerCP(MφP9; Becton Dickinson, San Jose, CA)、TLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA)およびTLR4-PE(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)を用いて行った。適当なアイソタイプ対照を用いた。それらの散乱特性に基づいて、FACSCaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson, San Jose, CA)で単球をゲートしてリンパ球の尾部を捕捉した。合計8000個のCD14+単球を各試料から得た。FlowJoソフトウェア(Tree Star Inc., Ashland, OR)を用いてデータを解析した。相対蛍光強度を、非刺激または親刺激対照と比較して、そのアイソタイプの合致する対照を越える試料の幾何平均蛍光強度の比として決定した。結果はTLRの変化率(％)で表した。
【０２０８】
ヒト肝癌細胞株
その後のフローサイトメトリーのために細胞の状態および受容体の完全性を最適化するため、全てのヒト肝臓細胞株単層をハンクス平衡塩類溶液(カルシウム、マグネシウムを含まない)中で5回洗浄してから、Versene溶液(ハンクス平衡塩類溶液と1:1で混合した0.02％ w/v EDTA.4Na)中で培養して細胞単層を剥離した。次に無血清のMEMを用いて単細胞浮遊液を作製してからフローサイトメトリーのために染色した。次に、細胞を室温にて回収した後、直ちに細胞をTLR2-FITC(TL2.1; eBioscience, San Diego, CA)およびTLR4-APC(HTA125; eBioscience, San Diego, CA)で染色した。細胞を1％v/vホルマリンを加えたPBSで固定し、染色後直ちに行った。
【０２０９】
定量的PCR
RNAを、RNeasy MiniKit(Qiagen)を製造業者の仕様書に従って用いて細胞株から単離した。RNAをカラムから溶出してヌクレアーゼを含まない水50ulに入れ、-70℃で保存した。OD 260nmでの分光測定によりRNAの濃度を推定した。
【０２１０】
ランダムヘキサマーを用いて、1ugのRNAからcDNAを合成した。このcDNA試料を-70℃で保存した。
【０２１１】
Assays-On-Demand Gene Expression Products(Applied Biosystems)およびABI Prism 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)を用いて384ウェルプレートでTaqManリアルタイムPCR(QPCR)を行った。標的DNAの量を18sリボソームRNAに標準化し、偽cDNAと比較する比較Ct法を用いてPCR産物の相対量を決定した(2-ΔΔCT)。
【０２１２】
結果
末梢血および肝細胞の示す類似したTLR2の下方制御
4名のHBeAg陽性CH-B患者、3名のHBeAg陰性CH-B患者および脂肪肝対照の5つの肝生検試料からの末梢血および肝細胞を調べた。これらの肝生検試料の肝細胞を、方法セクションに記載されるように単細胞浮遊液へ分離し、図3に示すようにフローサイトメトリーにより2つの別個のCD14+ve細胞集団をゲートした。これらの2つの集団、(1つは肝細胞に代表され、1つはクッパー細胞に代表される)において、TLR2およびTLR4を測定した(図4および5)。TLR2も肝細胞上に検出され、さらに、その発現レベルが、HBeAg陰性CHBおよび脂肪肝患者の幹細胞と比較してHBeAg陽性CHBの肝細胞で下方制御された(図5)。このTLR2の下方制御は、末梢血での以前の実証がHBV感染患者の肝細胞とクッパー細胞の双方でも明白であることを確信させる(図5)(Visvanathan et al, GUT 52:130, 2003)。TLR4発現のレベルは3つの集団間で有意に異なることはなかった。
【０２１３】
HepG2細胞におけるバキュロウイルス構築物
臨床的に観察したプレコアタンパク質とTLR経路の相互作用をさらに調査するため、HepG2細胞の組換え型HBVバキュロウイルス形質導入系をインビトロで用いた。HepG2細胞に、対照、野生型またはプレコア突然変異組換え型HBVバキュロウイルスを平行して形質導入し、7日後に処理し、既に概説したようにフローサイトメトリーによるTLR2およびTLR4の発現のために染色した(図4)。
【０２１４】
形質導入細胞もまた、リアルタイムPCRによりTLR2、TLR3、TLR4(2つの転写変異体)、TLR9およびTNF-αのmRNAのレベルを定量化するためRNA抽出のために処理した(図6)。TLR2およびTLR4の幾何平均蛍光を、アイソタイプ対照抗体の幾何平均蛍光との比として表し、データをTLRの変化率(％)として表した。
【０２１５】
これらのフローサイトメトリー実験の結果から、プレコア突然変異ウイルス(HBeAg陰性)形質導入HepG2細胞は、野生型ウイルス(HBeAg陽性)形質導入HepG2細胞と比較して、TLR2のレベルが有意に増加したことが証明された。TLR4発現のレベルは3つの集団間で有意に変化しなかった。これらの結果は度重なる実験で確認された。
【０２１６】
PCR産物の相対量を各転写物について図6(下のパネル)に示し、方法セクションに概説したように、標的DNAの量を18S rRNAに標準化し、偽CDNAと比較する、比較CT法を用いて決定した。このデータは、3つの別個の実験の平均値および標準誤差を表す。顕著な特色は、野生型HBeAg陽性形質導入細胞における転写物の意味深い下方制御と比較した、プレコア突然変異(HBeAg陰性)形質導入細胞でのTLR2 mRNAの上方制御である(双方とも対照細胞に対する)。組換え型HBVバキュロウイルス形質導入細胞も、HBeAgの状態に関係なく、TLR3、TLR4、およびTLR9の下方制御をもたらす結果となった(図6)。最も重要なことに、メッセージ(図6)とタンパク質レベルの双方での対応するTNF-αの産生減弱はTLR2の減少と機能的な相互関係がある。
【０２１７】
HBVおよびその成分による全血の刺激
発明者らは次に、HBVの種々の希釈液およびその個々の抗原成分による全血のインビトロ刺激を調べた。培養の20時間後、フローサイトメトリーによりCD14陽性単球でのTLR2およびTLR4の発現について血液を解析した(図5)。さらにこれらの刺激から上清を回収し、TNF-αをELISAにより測定した(図6)。CD14+細胞をHBVに曝露した結果、TLR2の抑制が顕著となったが、TLR4ではそうではなく、慢性HBeAg陽性HBV感染患者において得られた臨床データがさらに確かめられた。TNF-α抑制はTLR2の減少と平行し、これらの刺激実験においてTLRの減少と機能的な相関があったことを示す。また、プレコアタンパク質刺激も、野生型ウイルスで示された同様のTNF-αの平行抑制を実証し、CHBにおいてTLR2を下方制御する因子である可能性を示している。
【０２１８】
本明細書に記載される本発明が、具体的に記載したもの以外の変形および修正を受けやすいことは、当業者であれば理解されるであろう。本発明がこのようなあらゆる変形および修正を含むことは当然理解される。また、本発明は、本明細書において言及または指摘した全ての段階、特徴、組成物および化合物を個別にまたは集合的に含み、さらに該段階または特徴の任意の2つ以上のすべての組合せを含む。
【０２１９】
参考文献
2007538232.tif 000008
2007538232.tif 000009
2007538232.tif 000010
2007538232.tif 000011
2007538232.tif 000012
2007538232.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】プレコア突然変異HBV感染細胞と比較した、HBV野生型感染細胞におけるTLR-2およびTLR-4のレベルを示すグラフである。バキュロウイルス系を用いた。
【図２】プレコア突然変異HBV感染細胞と比較した、HBV野生型感染細胞におけるTLR-2およびTLR-4のレベルを示すグラフである。100moiのバキュロウイルス系を用いた。
【図３】肝細胞でのTLR2のレベルを示すグラフである。一番上のパネル：例となる脂肪肝患者(破線)、慢性HBV患者(斜線)およびアイソタイプ対照(点線)の肝生検の肝細胞のTLR2およびTLR4の単細胞浮遊液フローサイトメトリーのヒストグラム。このグラフは、正常な肝生検をもつ個体と比較して、慢性HBV患者における肝細胞の表面のTLR2の下方制御を証明する。下のパネル：3名のHBeAg陽性HBV感染患者、5名のHBeAg陰性HBV感染患者および5名の脂肪肝対照(C)の末梢血および肝生検を調べた。末梢血(血液)をCD14陽性単球でのTLR2およびTLR4について解析した。肝生検組織を単細胞浮遊液へ分離し、フローサイトメーターにかけた。次に、クッパー細胞および肝細胞をゲートし、TLR2およびTLR4を測定した。幾何平均蛍光を、アイソタイプ対照抗体の幾何平均蛍光との比として表した。データはTLRにおける変化率(％)として表す。個別の実験から得た平均値および標準偏差を示す。アスタリスクは対照と比較したp値＜0.05を示す。
【図４】TLR2、TLR4、およびTNF-αレベルにおける変化を示すグラフである。ヘパリン添加全血を、HBVウイルスの投与量を変化させて20時間刺激し、CD14陽性単球でのTLR2レベル(B)およびTLR4(A)を測定した。幾何平均蛍光を、アイソタイプ対照抗体の幾何平均蛍光との比として表した。データはTLRにおける変化率(％)として表す。パネル(C)は、ELISAにより測定した上清中のTNF-αを表す。異なるドナーからの5回の個別の実験から得た平均値および標準偏差を示す。TLR2に関するの結果はp＜0.02で有意であり、同様にTNFの結果もp＜0.02で有意であった。
【図５】TLRレベルおよびTNF-αレベルの変化を示すグラフである。ヘパリン添加全血を、培地(C)、HBVの野生型1×107ウイルス粒子(WT)、B型肝炎表面抗原(sAg)、HBVプレコアタンパク質(PC)およびHBVコアタンパク質(Co)を用いて20時間刺激した。CD14陽性単球でのTLR2およびTLR4レベルを測定した(上のパネル)。幾何平均蛍光を、アイソタイプ対照抗体の幾何平均蛍光との比として表した。下のパネルは、上記に示す刺激についてELISAにより測定した上清中のTNF-αを表す。さらに、HBVの異なる2つの遺伝子型(AおよびD)を示す。データをTLRにおける変化率(％)として表す。異なるドナーからの5回の個別の実験から得た平均値および標準偏差を示す。アスタリスクは対照と比較したp値＜0.05を示す。
【図６】TLRおよびTNFレベルにおける変化を示すグラフである。HepG2細胞中の偽感染(M)、プレコア(PC)およびコア(C)バキュロウイルス構築物を、フローサイトメーターにかけ、TLR2およびTLR4を測定した。幾何平均蛍光を、アイソタイプ対照抗体の幾何平均蛍光との比として表した(一番上のパネル)。データをTLRにおける変化率(％)として表す。下のパネルは、TaqMan Real time PCR(QPCR)に供された同じ細胞を表す。これは384ウェルプレートにおいてAssays-On-Demand Gene Expression Products(Applied Biosystems)およびABI Prism 7900HT Sequence Detection System(Applied Biosystems)を用いて行われた。標的DNAの量を18sに標準化し、偽cDNAに対する比較Ct法を用いてPCR産物の相対量を決定した(2-ΔΔCT)。組換え型HBVバキュロウイルス構築物を、既に記載した1.3ゲノム長の野生型(WT)HBV鋳型(遺伝子型D、サブタイプayw)(Invitrogen, Stratagene, CA)を用いて、位置指定突然変異誘発および同時トランスフェクションによって作出した。次に、HepG2細胞に、WT、PC、BCP、およびPC/BCP組換えHBVバキュロウイルスを50プラーク形成単位(PFU)/細胞の感染多重度(MOI)で平行して形質導入した。次に、ウシ胎児血清を含まないMEMを用いて単細胞浮遊液を作成してからフローサイトメトリーのために染色した。データは、3回の実験の平均値および標準偏差を表す。アスタリスクは、ノンパラメトリックなMann WhitneyのU検定により決定した、対照と比較したp値＜0.05を示す。
【図７】TLRシグナル伝達経路を表す図である。
【図１】
2007538232.tif 000014
【図２】
2007538232.tif 000015
【図３】
2007538232.tif 000016
【図４】
2007538232.tif 000017
【図５】
2007538232.tif 000018
【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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