(57)【要約】    本発明は組織特異的キナーゼのファミリー（ｔｓｓｋファミリー）、それらのキナーゼをコードする核酸配列およびそれらキナーゼに対する抗体に関する。本発明はさらに、ｔｓｓｋキナーゼ活性の特異的な阻害物質またはアンタゴニストを単離するための、ｔｓｓｋ４キナーゼおよびｔｓｓｋキナーゼファミリーの他のメンバーの標的としての使用に関する。図５は、種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ４特異的プライマーを用いて実施されたリアルタイムＰＣＲから得られたデータをグラフで示したものである。そのような阻害物質は避妊剤として使用できることが予想される。
2007501614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｔｓｓｋキナーゼ活性のアンタゴニストを同定する方法であって、標識化されたリン酸供給源、ｔｓｓｋ基質およびｔｓｓｋ４キナーゼを含むインビトロ・キナーゼアッセイ組成物を提供し、該組成物を候補阻害化合物と接触させて試験アッセイ組成物を形成させ、その試験アッセイ組成物をキナーゼ活性が発揮される条件のもとでキナーゼ阻害物質の非存在下でインキュベートし；そして、ｔｓｓｋキナーゼ活性を低下させる化合物を同定する方法。
【請求項２】
標識化されたリン酸供給源が［３２Ｐ］ＡＴＰであるところの、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ｔｓｓｋ基質が配列番号：８記載のアミノ酸配列を含むところの、請求項２記載の方法。
【請求項４】
キナーゼアッセイ組成物が、ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２およびｔｓｓｋ３から成る群から選択されるｔｓｓｋキナーゼをさらに含むところの、請求項１記載の方法。
【請求項５】
標識化されたリン酸供給源、ｔｓｓｋ基質およびｔｓｓｋ４キナーゼを含むインビトロ・キナーゼアッセイ組成物をキナーゼ活性が発揮される条件の下でインキュベートする第２の反応を実施する工程、および生成された標識化ｔｓｓｋ基質の量と試験アッセイ組成物により生成された標識化ｔｓｓｋ基質の量とを比較する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
候補化合物を、候補化合物、標識化されたリン酸供給源、キナーゼ基質および非ｔｓｓｋキナーゼを含む対照組成物と接触させる第２の反応を実施する工程、および候補合物が非ｔｓｓｋキナーゼ活性を低下させるかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
雄の哺乳動物種の受精能力を低下させる方法であって、ｔｓｓｋ４キナーゼ活性の阻害剤を含む組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項８】
配列番号：１９記載の核酸配列と操作可能に連結された非天然プロモーターを含む、組換えヒトｔｓｓｋ遺伝子構築物。
【請求項９】
請求項８記載の構築物を含むトランスジェニック細胞。
【請求項１０】
配列番号：２０記載のポリペプチドと結合する抗体。
【請求項１１】
抗体が配列番号：４〜６記載のペプチド配列と結合しないところの、請求項１０記載の抗体。
【請求項１２】
抗体がモノクローナル抗体であるところの、請求項１０記載の抗体。
【請求項１３】
潜在的なヒト治療物質をスクリーニングする方法であって、配列番号：２０および配列番号：２０の生物活性のある断片から成る群から選択されるｔｓｓｋポリペプチドを生理学的条件下で候補化合物と接触させ；
結合しなかった物質および非特異的に結合した物質を取り除くためにｔｓｓｋポリペプチドを洗浄し；そして
ｔｓｓｋポリペプチドと引き続き結合している化合物を単離することを含む方法。
【請求項１４】
ｔｓｓｋポリペプチドが固層表面に固定化され、候補物が標識化されているところの、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
候補化合物が他のキナーゼポリペプチドと比較して、ｔｓｓｋポリペプチドと選択的に結合するかどうかを決定する工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（米国合衆国政府の権利）
本発明は、国立衛生研究所により付与されたグラント番号ＨＤ３８０８２およびＵ５４  ２９０９９のもと、アメリカ合衆国政府の支援により成された。米国合衆国政府は本発明の権利の一部を所有する。
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２００３年８月７日出願の米国仮出願番号第６０／４９３，４０１号および２００４年１月８日出願の米国出願番号第１０／７５４，８２９号についての３５ＵＳＣ§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張し、それらの開示内容は出展明示により本発明の一部とされる。
【０００３】
（従来技術）
精子形成、すなわち機能的な精子細胞が精巣内で生成される過程には、分化中の生殖細胞とそれらの支持体であるセルトリ細胞との間の特異的相互作用、並びにアンドロゲンを産生するライディッヒ細胞によるホルモン調節が関与する。精子形成の一般的機構は、全ての哺乳動物において本質的に同じであり、３つの異なる段階：１）最初の段階は、精原細胞が有糸分裂し、精母細胞のプールを形成する増殖段階または精原段階；２）一倍体の精細胞が生じる減数期段階；および３）それぞれ球形の精細胞が精子に分化する精子変態段階、に分けることができる。初めの２つの段階を調節する分子機構は比較的よく特徴付けられているが、精子変態の分子的な基礎は、ほとんど知られていない。
【０００４】
哺乳類の精子変態、すなわち精子形成における減数分裂後の段階は、一倍体精細胞に生じる劇的な形態変化により特徴付けられる。この変化には、アクロソームおよびその内容物の形成、染色質の凝縮および再構成、細胞の伸長および種特異的な再形成、並びに鞭毛の組み立てが含まれる。これらの事象は、発生期間中に生じる遺伝子転写とタンパク質翻訳の両方の変化に起因する。一倍体精細胞中で翻訳されるタンパク質の幾つかは、精巣を出た後の形態的に成熟した精子中に残っている。このことを考慮すると、精子形成中に合成されるタンパク質は、精細胞分化に、および／または授精時の精子機能に必要かもしれない。
【０００５】
本発明の１つの態様は、哺乳動物の精子における高度に分化した細胞の機能を調節する信号伝達事象に関する。より詳細には、１つの実施形態において、本発明は精子の受精能獲得を調節する信号伝達に関する。射精後、精子は活発に動くことができるが、受精能力を欠いている。それら精子は、女性生殖管中で受精能獲得と称される、時間に依存した過程で受精能を獲得する。受精能獲得は、幾つかのタンパク質のセリン／トレオニンおよびチロシン残基両方のリン酸化に伴って示され、このタンパク質のチロシンのリン酸化は、ｃＡＭＰ／ＰＫＡ経路により下流調節されており、これら２つの信号伝達経路間の相互干渉が必要とされる。ＰＫＡを除いては、受精能獲得の調節に関与する他のキナーゼ（群）は、未だ知られていない。
【０００６】
精巣−特異的キナーゼの具体例として、最近示されたマウス遺伝子、ｔｓｓｋ１、２および３(Bielkeら、1994、Gene 139、235-9; Kuengら、1997、J Cell Biol 139、1851-9; Zuercherら、2000、Mech Dev 93、175-7)が挙げられる。酵母ツー・ハイブリッド技術と免疫共沈降法とを組み合わせることで、Ｋｕｅｎｇら（1997）はマウスｔｓｓｋ１および２が５４Ｋｄａのタンパク質と結合しリン酸化することを見出した。この５４Ｋｄａのタンパク質はｔｓｓｋの基質であり、ｔｓｋｓと称される。ｔｓｋｓタンパク質もまた精巣に大量に存在し、この発生的発現により生殖細胞中で減数分裂後に発現されることが示される。ｔｓｓｋ基質のマウスｃＤＮＡ配列は既に報告されており(Kuengら、1997)、ＥＳＴデータベース検索に用いた。ヒトＥＳＴ相同体ＡＬ０４１３３９が見出され、ヒト精巣マラソンレディー（marathon ready）ｃＤＮＡ (Clontech, Inc.)を用た５’および３’ＲＡＣＥにより全長クローンを得るためにセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを作製するために使用した。ヒトｔｓｋｓの全長ヌクレオチド配列は配列番号：７として提供され、予測されるタンパク質配列は配列番号：８として提供される。
【０００７】
ｔｓｓｋキナーゼファミリーの機能は未知である。しかしながら、このファミリーのメンバーは減数分裂後の精子変態段階で発現されるため、それらは生殖細胞分化に、またはその後の精子機能に役割を果たす仮定される。従って、このキナーゼファミリーの機能を妨害する化合物は避妊物質として利用可能であると予想される。
【０００８】
各種の避妊方法が利用できるにもかかわらず、世界中および米国合衆国における妊娠の５０％以上は意図されたものでない。従って、女性および男性の多様な要求に、より適し、種々の民族、文化および宗教的価値を考慮した避妊法の必要性は大きい。コンドームの使用または精管切除を除いては、男性用避妊方法の利用は非常に限定されている。
【０００９】
１つの実施形態において、ｔｓｓｋ４は新規避妊物質の同定を含む新規薬剤の開発の標的として役立つ。最後に、ｔｓｓｋキナーゼが精子形成後に精子中に残留し、精子生理機能に役割を果たす場合、特異的ｔｓｓｋキナーゼ阻害剤の設計は、受精を阻止する目的で男性および女性のいずれもが利用できるであろう。
【００１０】
（本発明の種々の実施形態の要約）
本発明は、精子特異的キナーゼ（ｔｓｓｋ）ファミリーの遺伝子の、それらにコードされたタンパク質、およびこれらタンパク質に対する抗体に関する。より詳細には、本発明は、ヒトキナーゼ４（ｔｓｓｋ４）、およびそのキナーゼのｔｓｓｋ４キナーゼ活性のアゴニストまたはアンタゴニストを同定するための使用に関する。ｔｓｓｋ４活性のアンタゴニストは避妊物質として有用であると予想される。本発明はまた、ｔｓｓｋ４に特異的な抗体を含み、かかる抗体を治療および診断の手段として用いることを含む。
【００１１】
（図面の簡単な記載）
図１は、ヒトｔｓｓｋ１（配列番号：４）、ヒトｔｓｓｋ２（配列番号：５）、ヒトｔｓｓｋ３（配列番号：６）およびヒトｔｓｓｋ４（配列番号：２０）のアミノ酸配列間の比較である。図１において見られるように、４つのタンパク質間のアミノ酸配列の差異はカルボキシ末端付近にある。
図２は、種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ１特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
図３は、種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ２特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
図４は、種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ３特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
図５は、種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ４特異的プライマーとを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
図６は、ｔｓｓｋ４プローブを用いたマウス精巣組織のインシトゥ（in situ）ハイブリダイゼーションである。
図７は、種々の組織から単離され、３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いたランダムプライミングにより標識化された１．４キロベースのマウスＴＳＳＫ４ｃＤＮＡプローブを用いて探索されたマウスのポリ−Ａ  ｍＲＮＡのノーザンブロットである。
【００１２】
（実施形態の詳細な説明）
定義
本発明の明細書および請求の範囲にて、次の用語を以下に示す定義により使用する。
【００１３】
本明細書にて用いる「精製された」なる用語およびその類義語は、天然の環境中でその分子または化合物と通常関連する他の成分と比較してその分子または化合物が豊富であることを表す。「精製された」なる用語は、特定分子の完全な精製が工程を通じて達成されることを必ずしも意味するものではない。本明細書中にて用いる「高度に精製された」化合物とは、純度９０％以上の化合物を表す。
【００１４】
本明細書にて用いる「医薬上許容される担体」なる用語は、標準的な医薬担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水または水／油乳剤などの乳剤、および様々な潤滑剤のいずれをも含む。この用語はまた、ヒトを含む哺乳動物における使用について、アメリカ合衆国連邦政府の規制機関により承認された、またはアメリカ薬局方に列記されているすべての薬剤を包含する。
【００１５】
ポリリンカーは、３つまたはそれ以上の密集した一連の制限エンドヌクレアーゼ認識配列を含む核酸配列である。
【００１６】
「操作可能に連結された」は、構成要素が通常の機能を果たすように構成された並列を表す。従って、コード配列に操作可能に連結された制御配列またはプロモーターは、コード配列の発現に効果を発揮できる。
【００１７】
本明細書にて用いる「核酸」「ＤＮＡ」およびその類義語にはまた、核酸類似物、すなわちリン酸ジエステル主鎖以外の主鎖を有する類似物が含まれる。例えば、当分野で既知であり、リン酸ジエステル結合の代わりに主鎖にペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」が本発明の範囲内にあると考えられる。
【００１８】
「ペプチド」なる用語は、３つまたはそれ以上のアミノ酸から成る配列であって、そのアミノ酸が天然または合成（非天然）アミノ酸である配列を包含する。ペプチドミメティックは、以下に示す１つまたはそれ以上の修飾を有するペプチドを含む：
１．１つまたはそれ以上のペプチジル−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−連結（結合）が、非ペプチジル連結、例えば−ＣＨ２−カルバメート連結（−ＣＨ２ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−）、ホスホナート連結、−ＣＨ２−スルホンアミド（−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−）連結、尿素（−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−）連結、−ＣＨ２−第二級アミン連結によって、あるいはアルキル化ペプチジル連結（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−）（ここで、Ｒは、Ｃ１−Ｃ４アルキルである）で置換されているペプチド；
２．Ｎ末端が、−ＮＲＲ１基に、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基に、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基に、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基に、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基、（ここで、ＲおよびＲ１は水素であるか、またはＲおよびＲ１の両方が水素でない場合にはＣ１−Ｃ４アルキルである）に誘導されているペプチド；
３．Ｃ末端が、Ｒ２がＣ１−Ｃ４アルコキシからなる群から選択される−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、並びにＲ３およびＲ４が水素およびＣ１−Ｃ４アルキルからなる群から独立して選択される−ＮＲ３Ｒ４に誘導されているペプチド。
【００１９】
ペプチドの天然アミノ酸残基は、次のようにＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ 生化学命名法委員会（Biochemical Nomenclature Commission）により推奨される以下の略語に略される：フェニルアラニンはＰｈｅまたはＦであり；ロイシンはＬｅｕまたはＬであり；イソロイシンはＩｌｅまたはＩであり；メチオニンはＭｅｔまたはＭであり；ノルロイシンはＮｌｅであり；バリンはＶａｌまたはＶであり；セリンはＳｅｒまたはＳであり；プロリンはＰｒｏまたはＰであり；トレオニンはＴｈｒまたはＴであり；アラニンはＡｌａまたはＡであり；チロシンはＴｙｒまたはＹであり；ヒスチジンはＨｉｓまたはＨであり；グルタミンはＧｌｎまたはＱであり；アスパラギンはＡｓｎまたはＮであり；リシンはＬｙｓまたはＫであり；アスパラギン酸はＡｓｐまたはＤであり；グルタミン酸はＧｌｕまたはＥであり；システインはＣｙｓまたはＣであり；トリプトファンはＴｒｐまたはＷであり；アルギニンはＡｒｇまたはＲであり；グリシンはＧｌｙまたはＧ、およびＸはすべてのアミノ酸である。その他の天然のアミン酸としては、例えば４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、および類似物がある。
【００２０】
合成または非天然アミノ酸は、インビボ（in vivo）天然物ではないが、それでも本明細書中記載のペプチド構造に組み込まれ得るアミノ酸を意味する。得られる「合成ペプチド」は、ペプチド中に１箇所、２箇所またはそれ以上の箇所に、２０個の天然の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含む。例えば、合成を容易にするためにトリプトファンに代えてナフチルアラニンを用いてもよい。ペプチド中に置換され得る他の合成アミノ酸には、Ｌ−ヒドロキシプロピル、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニル、アルファ−アミノ酸、例えばＬ−アルファ−ヒドロキシリシル（hydroxylysyl）およびＤ−アルファ−メチルアラニル、Ｌ−アルファ．−メチルアラニル、ベータ.−アミノ酸およびイソキノリルが含まれる。Ｄアミノ酸および非天然合成アミノ酸もまた、ペプチド中に組み込むことができる。他の誘導体には、２０個の遺伝子にコードされたアミノ酸（またはすべてのＬもしくはＤアミノ酸）の天然の側鎖をその他の側鎖で置換されたものが含まれる。
【００２１】
本明細書中にて用いる「保存的アミノ酸置換」は、本明細書中では以下の５つの群のいずれかの範囲内でのアミノ酸置換として定義される：
Ｉ．      小さい脂肪族、非極性もしくは僅かに極性のある残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．    極性、負電荷の残基およびそのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ；
ＩＩＩ．  極性、正電荷の残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；
ＩＶ．    大きい脂肪族、非極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．      大きい芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００２２】
本明細書にて用いる「抗体」なる用語は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体もしくはその結合断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を意味する。
【００２３】
本明細書にて用いる、ｔｓｓｋポリペプチドの「生物活性のある断片」または「生物活性断片」なる用語には、それらの天然リガンドに特異的に結合することのできる全長タンパク質の天然または合成部分を包含する。
【００２４】
本明細書にて用いる「非天然プロモーター」なる用語は、コード配列と操作可能に連結された任意のプロモーターであって、そのコード配列とプロモーターとは天然には関係していないプロモーター（すなわち組換えプロモーター／コード配列構築物）を意味する。
【００２５】
本明細書にて用いるトランスジェニック細胞は、哺乳動物の細胞中に導入された核酸配列を含む任意の細胞であって、導入された核酸配列にコードされた遺伝子を発現し得る細胞である。
【００２６】
本明細書にて用いる「ｔｓｓｋ４キナーゼ活性の阻害物質」または「ｔｓｓｋ４阻害物質」は、ｔｓｓｋキナーゼ以外の活性に著しい影響を与えることなく、全体としてｔｓｓｋキナーゼ活性を低下させる任意の化合物、組成物または環境因子を含むものである。従って、阻害物質には、このキナーゼの特異的活性を低下させる因子に加えて、反応に利用される活性キナーゼ分子の数を減少させる因子（すなわち、インビボ状態での転写および翻訳の阻害物質）が含まれる。「ｔｓｓｋ４特異的阻害物質」なる用語は、ｔｓｓｋ４キナーゼの活性を低下させるが、他のｔｓｓｋファミリーメンバーまたは他のキナーゼの活性を低下させないｔｓｓｋ４阻害物質を意味する。
【００２７】
実施形態
本発明は、精巣に豊富に存在し、これらに限らないがヒトおよびマウスの雄生殖細胞おいて主として発現するキナーゼのファミリー（ｔｓｓｋキナーゼファミリー）に関する。より詳細には、本発明は、ｔｓｓｋ４並びに診断薬や避妊薬として使用できる化合物を調製および単離するための、このタンパク質の使用に関する。
【００２８】
ｔｓｓｋキナーゼの発生時の発現様式ならびに生理的過程におけるキナーゼの一般的な関連性により、出願人は精巣に豊富に存在するこのキナーゼのファミリーが精子形成の一端を担うと考える。ｔｓｓｋキナーゼファミリーおよび想定される基質の１つが精子形成中の同時期に発現するという知見は、避妊薬の標的としてこれらタンパク質の潜在的な使用に繋がる。従って、本発明の１つの態様は、ヒトｔｓｓｋ相同体の単離、およびｔｓｓｋキナーゼ活性を阻害する物質を単離するための、それらの使用に関する。次いで、そのような阻害剤は、受精を阻害するための避妊物質として用いることができる。１つの実施形態に関して、ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３およびｔｓｓｋ４を含む精子特異的ｔｓｓｋ遺伝子産物を用いて、ｔｓｓｋキナーゼ活性の特異的阻害剤をスクリーニングし、その阻害剤を単独でもしくは他の避妊物質と併用して意図されたものでない妊娠を防ぐために使用されよう。より詳細には、１つの実施形態において、ｔｓｓｋ４は、ｔｓｓｋ活性を特異的に阻害することで避妊物質として役立つ化合物を同定するための標的として用られる。ｔｓｓｋキナーゼファミリーのメンバー特有の配列により、非ｔｓｓｋキナーゼ活性を大きく阻害することなく、その活性に対する特異的な阻害剤を見つけ出す可能性を保持することは有利なことである。全てのｔｓｓｋキナーゼ活性を阻害するｔｓｓｋ特異的阻害剤をスクリーニングすることに加えて、本発明はまた、ｔｓｓｋファミリーメンバーの幾つかを阻害する阻害剤（例えば、ｔｓｓｋ１／ｔｓｓｋ３／ｔｓｓｋ４特異的阻害剤）、または単一のｔｓｓｋファミリーメンバーの活性だけを阻害する阻害剤（例えばｔｓｓｋ４特異的阻害剤）をスクリーニングすることを包含する。
【００２９】
精子は転写的におよび翻訳的に不活性であるため、分子レベルでの候補精子プロテインキナーゼのクローニングおよび特徴付けには、雄生殖細胞から単離されるＲＮＡの使用が必要である。雄生殖細胞系列で発現されるＲＮＡ転写物は、精子機能において絶対的に重要であり得るが、精巣の精子形成時にかかる転写物が機能する可能性もある。この方法論を用いることで、特有のｃＤＮＡをマウス雄生殖細胞からクローン化し、そのｃＤＮＡがｓｅｒ／ｔｅｒプロテインキナーゼサブファミリーの推定プロテインキナーゼをコードすることが決定された。そのキナーゼ（ｔｓｓｋ３ｂ）は、マウスの雄生殖細胞において減数分裂後に特異的に発現する。ｔｓｓｋ３ｂのアミノ酸配列および核酸配列をそれぞれ配列番号：９および配列番号：１０として提供する。
【００３０】
ｔｓｓｋ３ｂのヒト相同体もまたクローニングされ（ヒトｔｓｓｋ３と称する）、タンパク質レベルで推定マウスタンパク質と９８％の相同性を示した。ヒトｔｓｓｋ３の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：３および配列番号：６として提供する。近年、類似のマウスプロテインキナーゼが記載され、精巣特異的セリンキナーゼ３（マウスｔｓｓｋ３）(Zuercherら、2000、Mech Dev 93, 175-7)で、精巣特異的プロテインキナーゼの小ファミリーのメンバーとして同定された(Bielkeら、1994, Gene 139, 235-9; Kuengら、1997、J Cell Biol 139, 1851-9)。この相同性にも拘わらず、本出願にてクローニングおよび記載されたヒトｔｓｓｋ３およびマウスｔｓｓｋ３ｂのいずれのｃＤＮＡ、マウスｔｓｓｋ３とアミノ酸のいくつかにおいて相違を示す。
【００３１】
ジーンバンクを検索するために予測されるマウスｔｓｓｋ１および２のアミノ酸配列（Kuengら、1997により記載されている）を用いて、マウスｔｓｓｋ１およびｔｓｓｋ２の両方のゲノム配列を入手した。次いで、これらのゲノムマウス遺伝子をコード領域の３’端および５’端を用いてそれぞれセンスおよびアンチセンスプライマーを設計し、ＰＣＲ技術を用いてヒト相同体を単離するために使用した（実施例２参照）。増幅されたｃＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキッド（インビトロジェン）を用いてクローニングし、配列決定した。増幅されたヒトｔｓｓｋ１遺伝子は大きさが約１．３ｋｂであり、単離されたヒトｔｓｓｋ２遺伝子は大きさが約１．２ｋｂであった。ヒトｔｓｓｋ１の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１および配列番号：４として提供する。ヒトｔｓｓｋ２の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２および配列番号：５として提供する。現在ではヒトｔｓｓｋファミリーの第４のメンバーが発見され、ｔｓｓｋ４と称されている。ｔｓｓｋ４の核酸配列およびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：１９および配列番号２０として提供する。
【００３２】
本発明の１つの実施形態に関して、精製されたポリペプチドは配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：２０のアミノ酸配列、あるいは１つまたはそれ以上の保存的アミノ酸置換により配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：２０とは異なるアミノ酸配列を含んで提供される。他の実施形態において、精製されたポリペプチドは、５個以下の保存的アミノ酸置換、更なる実施形態においては、２個またはそれ以下の保存的アミノ酸置換により配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：２０とは異なるアミノ酸配列を含む。１つの実施形態において、精製されたポリペプチドは、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６または配列番号：２０のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明のポリペプチドは、組換え技術により生成されるポリペプチドの安定化および／または精製を補助する付加的なアミノ酸配列を含んでいても良い。このような付加的な配列は、当業者に既知の細胞内−または細胞間の標的ペプチドもしくは様々なペプチドタグを含んでいても良い。１つの実施形態において、精製されたポリペプチドは、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：２０からなる群から選択されるアミノ酸配列ならびにｔｓｓｋペプチド配列に連結されたペプチドタグを含む。このようなタンパク質および好適なペプチドタグ融合体を発現するのに好適な発現ベクターは当業者に既知であり、商業的に入手可能である。１つの実施形態において、タグにはＨｉｓタグが挙げられる（実施例４を参照）。他の実施形態において、精製されたポリペプチドにはペプチドタグに連結された配列番号：２０記載のアミノ酸配列が挙げられる。
【００３４】
他の実施形態において、本発明はｔｓｓｋポリペプチドのアミノ酸断片を含む精製されたポリペプチドに関する。より詳細にはｔｓｓｋポリペプチド断片は、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：９および配列番号：２０からなる群から選択される全長ポリペプチドの天然または合成タンパク質から成り、それらは、その天然リガンドに特異的に結合できる。１つの実施形態において、ヒトｔｓｓｋ断片はｔｓｋｓへの結合能を維持している。
【００３５】
本発明はまた、ヒトｔｓｓｋをコードする核酸配列を包含する。１つの実施形態において、核酸配列は配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：１０、配列番号：１９またはその断片の配列を含んで提供される。他の実施形態において、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：１９からなる群から選択される、精製された核酸配列が提供される。
【００３６】
本発明はまた、組換えヒトｔｓｓｋ遺伝子構築物に関する。１つの実施形態において、組換え遺伝子構築物は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：７、配列番号：１０および配列番号：１９からなる群から選択される核酸配列と操作可能に連結された非天然プロモーターを含む。１つの実施形態において、組換え遺伝子構築物は、配列番号：１９の酸配列と操作可能に連結された非天然プロモーターを含む。非天然プロモーターは、前決定された宿主細胞での発現を可能にする強力な構成的プロモーターであることが好ましい。これらの組換え遺伝子構築物は、ｔｓｓｋ遺伝子産物を合成するトランスジェニック細胞系を作り出すために宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、多種多様な真核生物および原核生物から選択可能であり、２つの好ましい宿主細胞は大腸菌および酵母細胞である。
【００３７】
１つの実施形態に関して、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３および配列番号：１９からなる群から選択される核酸配列を、適当な調節配列に操作可能に関連させる形式で真核生物または原核生物発現ベクター中に挿入し、ヒトｔｓｓｋが適当な真核生物または原核生物細胞宿主細胞において発現される。１つの実施形態において、遺伝子構築物は、真核プロモーターに操作可能に連結された配列番号：１９の核酸配列を含む。適当な真核生物宿主細胞およびベクターは当業者に既知である。バキュロウイルス系もまた、本発明のトランスジェニック細胞を作り出すこと、およびｔｓｓｋ遺伝子を合成することに適している。本発明の１つの態様は、組換え遺伝子を含み、ヒトｔｓｓｋ４およびヒトｔｓｓｋ４コード配列の断片を発現するトランスジェニック細胞系に関する。本明細書にて用いるトランスジェニック細胞は、外来から導入された核酸配列を含むすべての細胞である。
【００３８】
１つの実施形態において、導入された核酸は、トランスジェニック細胞中で十分に安定であり（すなわち、細胞のゲノムに組み込まれるか、またはハイコピープラスミドで存在する）、子孫細胞に受け継がれる。細胞は、標準的な細胞培養法を用いたインビトロ（in vitro）増殖させてもよいし、または別の実施形態においては、宿主細胞は真核細胞であり、例えばトランスジェニック動物を含む動物の一部として増殖させてもよい。１つの実施形態において、トランスジェニック細胞はヒト細胞であり、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：７および配列番号：１９からなる群から選択される核酸配列を含む。１つの実施形態において、トランスジェニック細胞は、非天然プロモーターと操作可能に連結された配列番号：１９またはその断片を含む組換え核酸配列を含む。本発明はまた、ヒト以外のトランスジェニック生物であって、トランスジェニック生物の１つまたはそれ以上の細胞が組換え遺伝子を含み、ヒトｔｓｓｋ産物を発現し、より具体的に１つの実施形態においてはヒトｔｓｓｋ４配列を発現するトランスジェニック生物を含む。
【００３９】
本発明はまた、ｔｓｓｋ４を含むヒトｔｓｓｋを産生する方法を包含する。その方法は、ヒトｔｓｓｋをコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸配列を宿主細胞に導入する工程、およびヒトｔｓｓｋ遺伝子の発現を可能とする条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。１つの実施形態において、プロモーターは条件付きまたは誘導可能なプロモーターであるか、あるいはプロモーターは組織特異的または時間制限的プロモーター（すなわち、操作可能に連結された遺伝子が特定の組織において、または特定の時間でのみ発現する）であってもよい。合成されたｔｓｓｋ（例えばｔｓｓｋ４）は、標準的な技術を用いて精製することができ、これをハイスループット・スクリーニングに用いてｔｓｓｋ活性の阻害剤、より特異的にｔｓｓｋ４の阻害剤を同定することができる。別に、１つの実施形態において、組換え技術により生成されたｔｓｓｋ４ポリペプチドまたはその断片は、ｔｓｓｋ４ポリペプチドに対する抗体の産生に使用される。組換え技術により生成されたｔｓｓｋ４タンパク質はまた、結晶構造を得るために用いることができる。その構造を結晶学的分析することにより、ｔｓｓｋ４の機能を阻害する特異的な薬剤の設計が可能となろう。
【００４０】
好ましくは、精子特異的キナーゼをコードする核酸配列を、予め選択された宿主細胞で発現させるために適当な調節配列と操作可能に連結させる形式で、適当な発現ベクター中に挿入する。好適な宿主細胞、ベクターおよび細胞へのＤＮＡ構築物の導入方法は、当業者に既知である。特に、精子特異的キナーゼをコードする核酸配列を、リポソーム、ウイルスベクターまたは顕微注射などの運搬機構を用いてインビトロまたはインビボにて細胞または細胞群に加えることができる。
【００４１】
１つの実施形態に関して、組成物は、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：２０からなる群から選択される配列、またはそれらの抗原断片を有する精製されたペプチドを含んで供給される。１つの実施形態において、そのペプチドは配列番号：２０の配列から成る。組成物は、免疫応答を低下させるために、医薬上許容される担体または補助剤と組み合わせて哺乳類種に投与されてもよい。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、ｔｓｓｋ４を含む各々のｔｓｓｋアイソタイプに特異的な抗体に関する。１つの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の抗体または抗体断片は、担体または希釈液と組み合わせて組成物を形成させてもよい。１つの実施形態において、担体は医薬上許容される担体である。かかる担体および希釈液には、界面活性剤並びに補助剤、賦形剤または安定剤を含む他の医薬上および生理学上許容される担体をさらに含むことある、水および油などの滅菌液が含まれる。油の例示として、石油性、動物性、植物性、または合成性のもの、例えば落花生油、ダイズ油または鉱物油がある。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールが液体担体として好ましく、特に注射可能な溶液として好ましい。
【００４３】
ヒトｔｓｓｋ抗体は、当分野で周知の方法にて産生することができる。１つの実施形態に関して、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９および配列番号：２０からなる群から選択されるポリペプチドと特異的に結合する抗体が提供される。１つの実施形態において、配列番号：２０を含むポリペプチドまたはその抗原断片と結合する抗体が提供される。抗体は、修飾有りか修飾無しで用いることができるし、抗体とレポーター分子を共有結合で若しくは非共有結合で連関させて標識化していてもよい。加えて、抗体は、治療上または診断上の組成物を調製するため標準的な担体と共に処方され、場合によっては標識されても良い。
【００４４】
抗体の産生について、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物を、ｔｓｓｋ４ポリペプチドまたはそのペプチド断片を注射することにより免疫することできる。免疫応答を増大させるために、様々な補助剤を宿主種に応じて使用してもよく、限定するものではないが、フロインド（Freund's）（完全または不完全）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニック（pluronic）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒト補助剤、例えばＢＣＧ（カルメット・ゲラン(Calmette-Guerin)桿菌）およびコリネバクテリウム-パルバムが含まれる。
【００４５】
モノクローナル抗体の調製について、培地中の連続継代細胞系による抗体分子の産生を提供するすべての技術を用いることができる。例えば、初めにＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマ技術（1975、Nature 256:495-497)、並びにトリオーマ（trioma）技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（(Kozborら、1983、Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術(Coleら、1985、in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、 Alan R. Liss, Inc.、 pp. 77-96)が挙げられる。本発明の付加的な実施形態において、モノクローナル抗体は、最新の技術を利用した無菌動物にて産生することもできる（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５）。本発明に従って、ヒト抗体を用いることができ、ヒトハイブリドーマを用いることによって(Coteら、1983、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2026-2030)、またはヒトＢ細胞をインビトロにてＥＢＶウイルスで形質転換させることによって（Coleら、1985、in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss、 pp. 77-96）得ることができる。実際に、本発明に従って、ＳＬＬＰ１、ＳＬＬＰ２またはＳＬＬＰ３のエピトープに特異的なマウス抗体分子由来の遺伝子を適当な生物活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に連結するとにより「キメラ抗体」を生成するために開発された技術を用いてもよく；そのような抗体は本発明の範囲内にある。
【００４６】
本発明に従って、一本鎖抗体の生成について記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、卵の表面タンパク質特異的一本鎖抗体を生成するために適応することができる。本発明の付加的な実施形態では、ｔｓｓｋエピトープに関して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とするための、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について記載された技術(Huseら、1989、Science 246:1275-1281)を利用する。
【００４７】
分子のイディオタイプを含む抗体断片を既知技術により生成することができる。例えば、そのような断片には、限定するものではないが：抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元することにより生成することができるＦａｂ’断片、抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成することができるＦａｂ断片、およびＦｖ断片が挙げられる。
【００４８】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当分野で既知の技術、例えばＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着アッセイ)により達成することができる。前記抗体は、本発明のｔｓｓｋ４タンパク質の局在および活性に関して当分野で既知の方法、例えばこれらのタンパク質のイメージング、適当な生理学的試料中でのレベル測定に関する方法、診断方法に用いることができる。本発明に基づいて生成される抗体は、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ（すなわち「ヒト化された」抗体）一本鎖（組換え）、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリーにより生成される断片が含まれ得る。
【００４９】
本発明はまた、ヒトｔｓｓｋの存在を検出する方法を提供する。この方法には、試料をヒトｔｓｓｋと特異的に結合する標識化された抗体と接触させる工程、結合していない物質および非特異的に結合している物質を除去する工程、および標識化された抗体の存在を検出する工程が含まれる。１つの実施形態において、標識された化合物は、直接または間接的に（すなわち、標識化された二次抗体を介して）標識化された抗体を含む。特に、本発明のｔｓｓｋ抗体は、ｔｓｓｋの発現並びに細胞内局在を確認するために用いることができ、または避妊手段としてｔｓｓｋ抑制組成物を受ける患者をモニターするアッセイに用いることができる。
【００５０】
ｔｓｓｋ４は、精巣で産生されると限定するものではないが、本明細書において精巣に豊富に存在することが示されている（図５〜７参照）。従って、ｔｓｓｋ４キナーゼは、精子変態におけるｔｓｓｋの役割を研究するために、その活性を調整する薬剤を開発するのに最適な標的となる。さらに、ｔｓｓｋ４活性の阻害剤は避妊物質として有用であると予想される。本発明の１つの態様に関して、ｔｓｓｋキナーゼファミリーおよび特にｔｓｓｋ４は、新規薬剤の開発のための標的として使用される。ハイスループット・スクリーニングと組み合わされる組合せ化学的方法を用いた小分子ライブラリー形成分野の発展により、理想的な細胞浸透性阻害剤の探索が促進された。さらに、結晶学的方法を用いた構造に基づく設計により、リガンド設計に活用され得るリガンド−タンパク質相互作用部位を詳細に特徴付ける能力が向上している。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明はｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３、ｔｓｓｋ４の配列からなるポリペプチドと相互作用する薬剤、小分子またはタンパク質またはその生物活性断片をスクリーニングする方法を提供する。本明細書中で用いるｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３およびｔｓｓｋ４の「生物活性のある断片」または「生物活性断片」なる用語は、ｔｓｋｓを含むそれぞれ天然ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３およびｔｓｓｋ４の少なくとも１つの天然リガンドと特異的に結合することのできる天然ペプチドの天然または合成部分を包含する。本発明は、ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３およびｔｓｓｋ４と結合するかまたはその活性を調整するために、治療上または診断上の受精能力マーカーとして有用である小分子、化合物、組換えタンパク質、ペプチド、核酸、抗体などをスクリーニングするインビボおよびインビトロアッセイのいずれをも包含する。
【００５２】
本発明の１つの実施形態において、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：２０からなる群から選択されるｔｓｓｋポリペプチドは、生理学的条件下でｔｓｓｋと結合するリガンドを単離するために使用される。１つの実施形態において、配列番号：２０記載の配列またはその生物活性断片は、生理学的条件下でｔｓｓｋ４と結合するリガンドを単離するために使用される。スクリーニング方法には、ｔｓｓｋポリペプチドを生理学的条件下で化合物の混合物と接触させる工程、結合していない物質および非特異的に結合している物質を除去する工程、ｔｓｓｋポリペプチドと結合して残留する化合物を単離する工程が含まれる。一般的に、標準的な技術を用いて、ｔｓｓｋポリペプチドを固体支持体に結合させることで化合物を迅速にスクリーニングできるようになる。固体支持体は、生物学的化合物を固定するのに使用される表面のいずれかから選択することができ、限定するものではないが、ポリスチレン、アガロース、シリカまたはニトロセルロースを含む。１つの実施形態において、固体支持体には、機能化されたシリカまたはアガロースビーズが含まれる。該化合物のスクリーニングは、当業者に既知の医薬製剤のライブラリーおよび標準的な技術を用いて達成することができる。
【００５３】
次いで、ｔｓｓｋポリペプチドと結合するリガンドは、実施例７に記載のように、インビトロ・キナーゼアッセイの使用を通じてアゴニストおよびアンタゴニスト活性をさらに分析することができる。ｔｓｓｋキナーゼ活性の阻害剤は、精子の成熟／受精能獲得を妨害する物質として潜在的に使用できる。１つの実施形態に関して、ｔｓｓｋ４の阻害剤が潜在的な避妊物質として単離される。そのような阻害剤は、医薬組成物として処方され、精子形成を阻害するために患者に投与されることで、避妊法を提供し得る。
【００５４】
１つの実施形態に関して、ヒトｔｓｓｋキナーゼ活性の特異的阻害剤は、リン酸化事象を検出することができるインビトロ・キナーゼアッセイの使用を通じて同定される。１つの実施形態において、ｔｓｓｋキナーゼ活性の阻害剤を同定する方法は、標識化されたリン酸供給源を、１つまたはそれ以上の潜在的阻害化合物の存在下で１つまたはそれ以上のヒトｔｓｓｋポリペプチドと組み合わせることを含む。１つの実施形態において、ｔｓｓｋ４キナーゼ活性の阻害剤は、１つまたはそれ以上の潜在的阻害化合物の存在下で標識化されたリン酸供給源をヒトｔｓｓｋ４ポリペプチド（またはその生物活性断片）と組み合わせることで同定される。この反応は、潜在的阻害化合物の非存在下で、ｔｓｓｋ基質またはｔｓｓｋ酵素それ自体のリン酸化が始まるのに好適な標準的な条件下で実行される。
【００５５】
ｔｓｓｋ活性の低下は、時間に対してキナーゼ活性をプロットした標準曲線とアッセイ中のリン酸化されたｔｓｓｋ基質の量とを比較することにより検出することができる。あるいは、キナーゼ活性における阻害低下は、標識化されたリン酸化供給源、ｔｓｓｋ基質およびｔｓｓｋ４キナーゼを含むインビトロ・キナーゼアッセイ組成物を試験アッセイ（このアッセイは潜在的な阻害化合物の存在下で実施される）で用いたものと同一の条件を用いたキナーゼ活性が発揮される条件下でインキュベートする、第２のキナーゼ反応を実施することによって検出することもできる。次いで、試験アッセイにより生成されたリン酸化されたｔｓｓｋ基質の量と、第２のキナーゼアッセイ（候補阻害剤の非存在下で実施される）により生成されたリン酸化されたｔｓｓｋ基質の量とを比較し、候補化合物のｔｓｓｋ阻害効果を検出する。
【００５６】
化合物がｔｓｓｋ活性を阻害すると同定されると、ｔｓｓｋ活性を特異的に阻害するこれらの化合物を単離するためにさらなる試験を実施することが必要であろう。１つの実施形態に関して、ｔｓｓｋ阻害剤を同定する方法には、さらに、候補化合物を、候補化合物、標識化されたリン酸供給源、キナーゼ基質および非ｔｓｓｋキナーゼを含む対照組成物に接触させる第２の反応を実施する工程、および候補化合物が非ｔｓｓｋキナーゼ活性を低下させるかどうかを決定する工程が含まれる。
【００５７】
実施例４に記載のように、ｔｓｓｋタンパク質は、自己リン酸化される性質を有する。そのため、候補阻害化合物の存在下および非存在下で生ずる自己リン酸化の割合を比較することにより、特異的阻害化合物を同定することができる。１つの実施形態において、ｔｓｓｋ基質が提供され、そのアッセイは、候補阻害化合物の存在下および非存在下でのその基質のリン酸化の割合を測定することに基づいている。好ましくは、多数の化合物を、ｔｓｓｋ特異的阻害化合物を同定するためのハイスループット技術を用いてスクリーニングされる。
【００５８】
１つの実施形態に関して、ｔｓｓｋキナーゼ活性の特異的阻害剤は、インビトロ・キナーゼアッセイ組成物を提供することにより同定され、ここで該組成物は、標識化されたリン酸供給源、ｔｓｓｋ基質、および配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：９および配列番号：２０からなる群から選択されるｔｓｓｋキナーゼを含む。ｔｓｓｋ基質リン酸化率は、いずれかの阻害化合物の非存在下における制御条件下で決定され、次いで、同一条件を用いて、１つまたはそれ以上の潜在的な阻害化合物の存在下でアッセイを行った場合のｔｓｓｋ基質リン酸化率を測定する。ｔｓｓｋキナーゼの活性を低下させるこれらの化合物を同定し、その阻害効果がｔｓｓｋキナーゼファミリーに特異的かどうか決定するため試験する。
【００５９】
１つの実施形態において、ヒトｔｓｓｋ阻害剤を同定する方法には、標識化されたリン酸供給源、ｔｓｓｋ基質、および配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：２０からなる群から選択されるｔｓｓｋキナーゼを提供する工程、その組成物を１つまたはそれ以上の潜在的な阻害化合物と接触させる工程、およびリン酸化の割合を測定する工程が含まれる。１つの実施形態において、ｔｓｓｋ４活性の調節因子はインビトロ・キナーゼアッセイを実施することにより同定され、そのアッセイには、ｔｓｓｋ４を標識化されたリン酸供給源（例えば［γ３２Ｐ］ＡＴＰ）およびｔｓｓｋ基質と組み合わせる工程が含まれる。１つの実施形態において、ｔｓｓｋ基質は、配列番号：８記載のアミノ酸配列を含む。このキナーゼアッセイはまた、ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３およびｔｓｓｋ４からなる群から選択される２つまたはそれ以上のヒトｔｓｓｋキナーゼを用いて実施され、いくつかのｔｓｓｋキナーゼを抑制する阻害剤を同定する。ｔｓｓｋファミリーの特定のメンバーのみを抑制する阻害剤、例えば、ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、およびｔｓｓｋ４の活性を低下させるが、ｔｓｓｋ３または他の非ｔｓｓｋキナーゼは低下させない阻害剤を同定することもまた有利である。
【００６０】
本発明の１つの実施形態は、雄の哺乳動物の受精能力を低下させることに関し、本方法はｔｓｓｋキナーゼファミリー（ｔｓｓｋ１、ｔｓｓｋ２、ｔｓｓｋ３およびｔｓｓｋ４を含む）の活性を阻害する工程を含む。１つの実施形態において、雄の哺乳動物の受精能力は、ｔｓｓｋ活性を特異的に妨げる物質を含む医薬組成物の投与により低下される。１つの実施形態において、雄の哺乳動物はヒトであり、医薬組成物はｔｓｓｋ４活性の阻害剤を含む。１つの実施形態において、組成物はｔｓｓｋ４特異的阻害剤を含む。
【００６１】
１つの実施形態において、受精能阻害組成物は、実施例７に記載されるキナーゼアッセイにより決定されるように１つまたはそれ以上のｔｓｓｋキナーゼの酵素活性を特異的に阻害する化学的構成要素を含む。その他の実施形態において、阻害組成物は、１つまたはそれ以上のｔｓｓｋキナーゼに対する抗体を含んでいても良く、または組成物は哺乳動物においてｔｓｓｋキナーゼの発現を妨げ若しくは混乱させるアンチセンス若しくは干渉ＲＮＡを含んでいても良い。哺乳動物系における干渉ＲＮＡには、１９〜２２ｎｔの二本鎖ＲＮＡ分子からなる短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、またはループ配列で連結した１９〜２９ｎｔのパリンドローム配列からなるｓｈＲＮＡの存在が必要とされる。遺伝子発現の下方制御は、相同体ｓｉＲＮＡと標識ＲＮＡとをペアにする配列特異的様式で達成される。ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの安定した発現系は、トランスジェニック動物を作り出すのに利用され(Hasuwaら、FEBS Lett 532、227-30 (2002)、Rubinsonら、Nat Genet 33、401-6 (2003)およびCarmellら、Nat Struct Biol 10、91-2 (2003))、受精能力を調節することができる哺乳動物を生成するために本発明に従って使用することができる。条件ＲＮＡｉ−に基づくトランスジェニック系は、動物の一生中の所定の段階での遺伝子発現レベルを制御できる付加的な利点を提供するであろう。
【００６２】
実施例１
新規マウス精巣特異的セリン／スレオニンキナーゼの単離
プロテインキナーゼ中に存在する保存領域に対応する変性オリゴヌクレオチドを用いた逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、精巣特異的セリン／スレオニンキナーゼの新規メンバーを単離した。このＰＣＲ断片は、ノーザンブロット分析により雄生殖細胞における１０２０ｂｐ転写物を認識した。プローブとしてこの断片を用いて、全長ｃＤＮＡをマウス混合生殖細胞ｃＤＮＡライブラリーからクローニングした。このｃＤＮＡは、２６８アミノ酸のタンパク質をコードする８０４塩基の読み取り枠を有する。組織発現分析により、このプロテインキナーゼは、マウス精巣生殖細胞中で発生時に発現し、脳、卵巣、腎臓、肝臓または初期胚細胞には存在しないことが示された。
【００６３】
この新規推定セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（配列番号：９）は、コード領域のシフトを生ずるいくつかの塩基欠失および２２アミノ酸（１０９から１３１残基）を除いては、最近記述されたマウス精巣特異的プロテインキナーゼ、ｔｓｓｋ３（Zuercherら、2000, Mech Dev 93, 175-7）とほぼ同一である。次いで、この新規プロテインキナーゼのヒト相同体（配列番号：６）がクローニングされ、もっぱら精巣で発現が見られた。ヒトおよびマウスｃＤＮＡクローンの両方を用いた蛍光インシトゥ（in situ）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、それぞれの染色体ｌｐ３４−３５および４Ｅでシンテニック局在が示された。ｔｓｓｋ３との相同性により、この新規プロテインキナーゼはｔｓｓｋ３ｂと命名された。
【００６４】
材料および方法
精原細胞群の単離
パキテン期染色体、球形精細胞および濃縮精細胞（condensing spermatids）の精製された集団を、コラゲナーゼおよびトリプシン−ＤＮａｓｅＩでの連続分離（Bellveら、1977; Romrellら、1976）により、成体マウス（CD-1; Charles Rivers）の被膜剥離精巣から調製した。細胞を、強化クレブスリンゲル重炭酸培地（enriched Krebs Ringer Bicarbonate Medium）（ＥＫＲＢ）（Bellveら、1977; Romrellら、1976）中の２−４％ＢＳＡ勾配における単位重量の沈降速度により、個別の集団に分離した。パキテン期染色体および球形精細胞群は、各々少なくとも純度８５％であったが、濃縮精細胞群は約４０〜５０％の純度であった（主に無核残留物（anucleated residual bodies）およびいくつかの球形精細胞が混入している）。
【００６５】
ＲＮＡ単離およびノーザンブロット分析
体細胞組織、特定年齢のマウスの精巣、および成体マウスの単離精原細胞からの全ＲＮＡを、５Ｍ  グアニジウムイソチオシアネート、２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、０．５％サルコシル（Sarkosyl）、および０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール中で細胞をホモジナイズすることにより単離した（Chirgwinら、1979）。溶菌液を、５．７Ｍ  ＣｓＣｌ、０．１Ｍ  ＥＤＴＡのクッションにて１１４，０００×ｇで一晩２０℃で遠心分離した。ペレットを再懸濁し、フェノール：クロロホルムで抽出し、そのＲＮＡをエタノールで沈殿させた。そのＲＮＡの完全性は、１％アガロースゲルにおけるリボゾームＲＮＡのエチジウムブロミド染色により証明された。等量のＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲル中で電気泳動させた（Sambrookら、1989）。ＲＮＡをニトロセルロース紙に移し、８０℃で２時間ベイク（bake）し、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  トルラＲＮＡ、５×ＳＳＰＥ中で最低４２℃で１時間、プレハイブリダイズした。適当なＤＮＡプローブをＰＣＲで作成し、ランダムプライム法により３２ｐ−ｄＣＴＰで放射標識し、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  トルラＲＮＡ、１０％硫酸デキストランを含む５×ＳＳＰＥ中のブロット（１×１０６  ｃｐｍ／ｍｌ）でインキュベートし、４２℃で一晩ハイブリダイズした。ブロットを２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄し、次いで０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳで洗浄した（いずれも室温で２×１０分間）。洗浄後、フィルターを風乾させ、増強スクリーンを伴うフィルムに−７０℃で露光させた。ヒト組織のノーザンブロットはＣｌｏｎｔｅｃｈから取得し、ハイブリダイゼーションを上記のとおり行った。
【００６６】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬのスパースクリプト（Superscript）ＩＩを用いて使用説明書に従って行い、次いでプロメガ（Promega）のＴａｑポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ条件は次の通りであった：９５℃、２分間を１サイクルし；９５℃で１分間、５５℃で１分間および７２℃で１分間を３５サイクルし；７２℃、７分間を１サイクルして、このサイクルを終了し、次いで４℃に冷やした。次いで、ＤＮＡ産物を２％アガロースゲルで分析した。チロシンキナーゼの標的保存領域に対して、以下の変性プライマーを用いた：逆転写工程については、３つの無作為なヌクレオチドに続いてサブクローニング用の５’ＥｃｏＲＩ共通部位を付加したチロシンキナーゼのサブファミリーに共通するコード小領域ＩＸに対応する変性アンチセンス２０−マー（ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡ（Ａ／Ｔ）ＡＧＧＡＣＣＡ（Ｃ／Ｇ）ＡＣ（Ａ／Ｇ）ＴＣ；配列番号：１１）；（２）ＰＣＲ工程については、同じプライマーをチロシンキナーゼのサブファミリーと共通する小領域ＶＩｂに対応する変性センス２０−マーと一緒に使用し、さらにＥｃｏＲＩの共通部位を４つの無作為なヌクレオチドの後ろに導入した（ＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣ（Ａ／Ｃ）Ｇ（Ａ／Ｃ／Ｔ／Ｇ）ＧＡ（Ｃ／Ｔ）（Ｃ／Ｔ）Ｔ（配列番号：１２）。ＰＣＲ反応が完了し、その産物を分析した後に、そのｃＤＮＡを使用説明書に従ってＴＯＰＯ  ＴＡクローニングベクター（In Vitrogen）にサブクローニングしたが、ＥｃｏＲＩサブクローニング用共通部位は使用しなかった。３５個の陽性コロニーからキアゲン（Qiagen）キットを用いてミニプレップ調製し、次いでＴ７プライマーを用いて配列決定した。
【００６７】
マウスｔｓｓｋ３ｂのクローニング
ｔｓｓｋ３ｂをクローニングするため、ＲＴ−ＰＣＲにより得られた特有配列を用いて、この新規キナーゼに対する特定プライマーを設計した。プライマーＡ２（アンチセンス：ＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＣＴＴＧＣＴＡＴＣＡＴＧＧＧ；配列番号：１３）およびＳ２（センス：ＴＧＴＧＡＧＡＡＣＧＣＣＴＴＧＴＴＧＣＡＧ；配列番号：１４）を用いて、１６９塩基のＰＣＲ断片を得た。続いて、ランダムプライム法により、このＰＣＲ断片を３２ｐ−ｄＣＴＰで放射標識し、プローブとして用いて、前記したようにオリゴ−ｄＴプライム化混合生殖細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
【００６８】
ヒトｔｓｓｋ３ｂ相同体のクローニング
ヒトＥＳＴデータベースを検索するため予測されるマウスｔｓｓｋ３ｂアミノ酸配列を用いて、ＢＬＡＳＴ検索において登録ＡＩ５５３９３８を得た。このＥＳＴ配列を用いてアンチセンスプライマーＡ３（ＧＡＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＴＣＧＴ；配列番号：１５）を設計した。鋳型としてヒト精巣マラソンレディーｃＤＮＡ（Clontech, Inc）を用いて、このプライマーおよびアダプタープライマー（ＣＣＡＴＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ；配列番号：１６）を５’ＲＡＣＥに使用した。まず、ＰＣＲ反応混合液を９４℃で１０分間加熱し、次いでその混合液を次の条件下で４０サイクルのＰＣＲを行った：９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分間。これらのサイクルに続いて、混合液を７２℃で１０分間インキュベートした。ＡｍｐＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Perkin Elmer）を、従来のＰＣＲ用Ｔａｑポリメラーゼの代わりに用いた。増幅ｃＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングし、配列決定した。５’ＲＡＣＥ後に得られたｃＤＮＡ配列の５’端を用いてセンスプライマーＳ３（ＧＣＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＧＣＴＧ；配列番号：１７）を設計し；アンチセンスプライマーＡ４（ＴＣＴＣＣＣＣＣＴＡＣＴＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡＧＣ；配列番号：１８）は、ＡＩ５５３９３８の３’末端に基く。次いで、これら２つのプライマーを用いて、前記条件を用いて同じライブラリーから全長ヒトｔｓｓｋ３ｂ相同体を増幅した。増幅された１．０５８ｋｂ断片を切り出してクローニングし、バージニア大学の配列決定設備を用いて配列決定した。ｃＤＮＡライブラリー増幅ｔｓｓｋ３ｂヒト相同体のＣ末端１４００ｂｐ断片をヒト組織のノーザンブロットに使用した。
【００６９】
ＤＮＡ配列決定およびコンピューター分析
すべての配列決定は、ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＦＳダイ・ターミネーターサイクルシーケンシングキット・ケミストリーおよび適当なプライマーで、３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサー（PE Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて行った。不明瞭な部分は、逆鎖を配列決定することにより解決した。ＤＮＡおよびタンパク質配列分析は、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  ＭＴ（Kodak Scientific Imaging Systems、ニューヘブン、コネチカット州）およびＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＴＭ（Gene Codes Corp.、アナーバー、ミシガン州）ソフトウェアプログラムを用い行った。
【００７０】
蛍光性インシトゥハイブリダイゼーションおよび染色体マッピング
蛍光性インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および免疫蛍光の検出を、前記のように行った（Bellら、1995、Cytogenet. Cell Genet、70: 263-267）。１ｋｂのマウスｃＤＮＡクローンおよび相当する１ｋｂのヒト相同体を、１μｇ  ＤＮＡ、各２０μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ（Perkin Elmer）、１μＭ  ｄＴＴＰ（Perkin Elmer）、２５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Sigma）、１０ｍＭ  Ｂ−メルカプトエタノール（Sigma）、１０μＭ  ビオチン−１６−ｄＵＴＰ（Boehringher Mannheim）、２ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩ／ＤＮａｓｅＩ（GIBCO, BRL）およびＨ２Ｏを含み総容量が５０μｌの反応液中のニックトランスレーションによりビオチン化した。プローブを変性させ、ヒト末梢リンパ球およびマウス胚線維芽細胞のそれぞれに由来する分裂中期スプレッド（metaphase spreads）にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズプローブを、フルオレセイン標識アビジンを用いて検出し、抗アビジン抗体（Oncor）およびフルオレセイン標識アビジンの第二層を加えることよりシグナルを増幅した。染色体調製物をＤＡＰＩで対比染色し、マッキントッシュコンピューターワークステーションにより操作される冷却ＣＣＤカメラ（Photometrics、トゥーソン、アリゾナ州）を装着したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ落射蛍光顕微鏡で観察した。ＤＡＰＩ染色およびＦＩＴＣシグナルのデジタルイメージを取り込み、擬色化し、Ｏｎｃｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６ソフトウェアを用いてマージした。
【００７１】
結果
マウス雄生殖細胞からのプロテインキナーゼのクローニング
哺乳類精子受精能獲得は、いくつかのタンパク質のタンパク質チロシンリン酸化の増加に随伴している。成熟精子はタンパク質を合成できず、これらの細胞中にＲＮＡが存在するかが議論されているため、ＲＴ−ＰＣＲによりプロテインキナーゼを同定し、最終的にはその機能を推測するために、まず、ＲＮＡをマウス混合生殖細胞群から単離した。チロシンキナーゼのサブファミリー中の保存領域を標的とする変性プライマーを用い、ＴＡクローニングに続いて、「方法」に記載したようにして得られた２７個の配列をＧｅｎｅ  Ｂａｎｋの配列と比較し、分析した。殆どの配列が、チロシンキナーゼサブファミリーの既知メンバーと一致したが、得られた配列のいくつかは、ｓｅｒ／ｔｈｒプロテインキナーゼのサブファミリーのメンバーと一致した。
【００７２】
Ｂ−Ｒａｆｋｉｎａｓｅなどのサブファミリーの既知メンバー間で、精子形成に関与するｓｅｒ／ｔｈｒプロテインキナーゼの新規ファミリーに相同性を有する配列を検出した（Kuengら、1997、J Cell Biol 139、1851-9）。この新規ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼをクローニングするため、この配列に対応する１６９塩基の特異的ＰＣＲ断片を放射標識し、マウス混合生殖細胞ｃＤＮＡライブラリーを前記の「方法」に記載したようにスクリーニングした。１．０２ｋｂのｃＤＮＡ挿入物を含むクローンが得られ（配列番号：１０）、Ｋｕｅｎｇらの命名法に従ってｔｓｓｋ３ｂと命名した。配列分析により、２６６アミノ酸の推定ｓｅｒ／ｔｈｒプロテインキナーゼをコードする８０４ヌクレオチドの単一の読み取り枠が示された。開始メチオニンに隣接するヌクレオチドは、コザック共通配列と良く一致する。３’−非翻訳領域は、ポリ（Ａ）テイルの上流の２１ヌクレオチドのポリアデニル化シグナルを表わした。この配列は、ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼに対応する期待される保存ドメインのすべてを含む。
【００７３】
マウスｔｓｓｋ３の発現様式
マウスｔｓｓｋ３ｂの発現様式を、ｔｓｓｋ３ｂの全長転写産物に相当するｔｓｓｋ３ｂ特異的プローブを用いて異なるマウス組織由来の全ＲＮＡのノーザンブロット分析により調査した。このプローブは、前記「方法」に記載のようにして調製された、もっぱら混合マウス生殖細胞群中に存在するおよそ１ｋｂの単一の転写産物を認識した。高露光しても、もっぱら生殖細胞中で１．３５ｋｂ転写産物を識別することができ、この転写物は、マウス生殖細胞ライブラリーをスクリーニングした場合には観察されなかったことから、ｔｓｓｋ３ｂのスプライシング変化を示すかもしれない。精巣中のｔｓｓｋ３ｂの発現様式をさらに分析するために、成体精巣の精製された生殖細胞から得られたＲＮＡを用いたノーザンブロットを行った。ｔｓｓｋ３ｂ  ｍＲＮＡは、球形および濃縮精細胞中で減数分裂後に発現されることが見出されたが、減数分裂パキテン期染色体では発現されなかった。マウス精巣は胚発生の１１−１２日で分化し、始原生殖細胞が大部分を占める。最初の精子形成波は、生後数日で始まり、精原細胞は思春期前に初期精細胞に分化する。成熟精子への分化は、テストステロンに依存的であり、思春期後に生ずる。
【００７４】
ｔｓｓｋ３ｂが減数分裂後に発現するかどうかをさらに調査するため、全精巣ＲＮＡを、出生後日数の異なる（１、３、７、１０、１５、２０、２４、３０日および成体）マウスから調製し、ノーザンブロット分析により分析した。ｔｓｓｋ３ｂの転写は、生後２０日と２４日の間に始まり、このｍＲＮＡの減数分裂後発現を確認した。
【００７５】
これらの結果は、ｔｓｓｋ３ｂの発現様式がマウスｔｓｓｋ１およびｔｓｓｋ２の発現様式（Kuengら、1997、J Cell Biol 139、1851-9）と類似することを実証し、これにより、ｔｓｓｋ３  ｍＲＮＡ発現が発生的に調節されており、その発現が精子形成の開始期付近で減数分裂後に刺激されることを示唆している。
【００７６】
ｔｓｓｋ３ｂの発現パターンを更に分析するため、我々は、卵母細胞、中期ＩＩ停止卵子および未着床胎児発生の異なる段階において、特定のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを行った。正確な大きさのｔｓｓｋ３ｂＰＣＲ産物が混合生殖細胞全ＲＮＡから増幅され得る条件のもと、いずれの段階においてもＰＣＲ産物が観察されなかった。
【００７７】
ｔｓｓｋ３ｂのヒト相同体のクローニングおよび発現
マウスｔｓｓｋ３配列を用いて、生殖細胞腫瘍由来のヒトＥＳＴをデータベースのＢＬＡＳＴ検索により同定し、３’および５’ＲＡＣＥと組み合わせて使用して「方法」に記載のように適宜ライゲーションされたヒト精巣ｃＤＮＡライブラリー（Clontech）から全長ヒト相同体（配列番号：３）をクローニングした。
【００７８】
ヒト組織中のｔｓｓｋ３の発現パターンを調査するため、ヒトｔｓｓｋ３  ｃＤＮＡのＣ末端４００ｂｐ断片を用いて組織ノーザンブロット（Clontech）探索を行った。１ｋｂおよび１．３５ｋｂＲＮＡ転写産物がもっぱら精巣中に発現されていた。マウスの場合と同様に、１．３５ｋｂ断片が別に連結された転写物を示し得る。これら新規なｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼであるマウスｔｓｓｋ３ｂとヒト相同体ｔｓｓｋ３のいずれも、互いに最も高い相同性（９８％）を有し、続いてマウスｔｓｓｋ３（９２％）、マウスｔｓｓｋ１およびマウスｔｓｓｋ２（５６％）と相同性を有しており、このキナーゼが新規ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼの同じサブファミリーに属することを示唆している。記載のように、ｔｓｓｋ３とｔｓｓｋ３ｂは非常に高い相同性（９２％）を有し、これら２つの配列間の相違は、２２アミノ酸（残基１０９から１３１）の範囲に限定される。この範囲をヌクレオチドレベルで分析すると、コード領域がシフトし、上記２２アミノ酸の変更を引き起こす３つの塩基対欠失がマウスｔｓｓｋ３配列に観察された。現段階ではこれらのフレームシフトの起源は不明であるが、１つの可能性としてマウス精巣に２種類のｔｓｓｋ３が存在することがある。より可能性があるのは、これら２つの配列の１つがその配列中に小さな誤りを有することである。ｔｓｓｋ３ｂヒト相同体はマウスｃＤＮＡクローンから独立して得られ、マウス相同体とアミノ酸レベルで１００％の相同性を有するため、出願人らはマウス３ｂとヒトｔｓｓｋ３配列のいずれについても正確であると確信している。
【００７９】
ヒトおよびマウスｔｓｓｋ３の染色体マッピング
ｔｓｓｋ３ｂの染色体位置もまた、全長ヒトｃＤＮＡプローブを用いた蛍光性インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によりマッピングした。評価した２０個の中期スプレッドすべてにおいて第１染色体上で蛍光シグナルが検出された。観察された合計１０９個のシグナルのうち、４９個（４５％）が１ｐにあった。すべての染色体特異的シグナルは１ｐ３４．１−３４．３に局在していた。これらシグナルの分布は次の通りであった：第１染色分体（６細胞）、第２染色分体（１４細胞）および第３染色分体（５細胞）。マウスｔｓｓｋ３ｂ  ｃＤＮＡ相同体は、第４染色体のシンテニック領域、バンドＥにマッピングされた。
【００８０】
実施例２
ｔｓｓｋキナーゼファミリーのヒト相同体の全長ｃＤＮＡおよびｔｓｓｋ基質からの部分的なｃＤＮＡ配列のクローニング
ジーンバンクを検索するために、予想されるマウスｔｓｓｋ１および２アミノ酸配列を用いて、マウスｔｓｓｋ１およびｔｓｓｋ２の両方のゲノム配列が得られた。これらの遺伝子は第５および第２２染色体にそれぞれマッピングされており、イントロンはない。コード領域の３’末端および５’末端に相当する配列を用いて、それぞれセンスおよびアンチセンスプライマーを設計した。両方のヒトキナーゼ相同体の全長配列を最終的に得るため、鋳型としてヒト精巣マラソンレディーｃＤＮＡ（Clontech, Inc.）を用いて、アンチセンスプライマーを５’ＲＡＣＥに使用し、センスプライマーを３’ＲＡＣＥに使用した。増幅されたｃＤＮＡ断片をＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Invitrogen）を用いてクローニングし、配列決定した。全長ヒトｔｓｓｋキナーゼｃＤＮＡを増幅するため、５’ＲＡＣＥ後に得られたｃＤＮＡ配列の５’端を用いて５’センスプライマーを設計した。３’ＲＡＣＥ後に得られたｃＤＮＡ配列の３’端を用いて、アンチセンスプライマーを設計した。次いで、これらの２対のプライマーを用いて、同じライブラリーからヒトｔｓｓｋ１および２を増幅した。増幅配列１．３ｋｂ（ｔｓｓｋ１）および１．２ｋｂ（ｔｓｓｋ２）をサブクローニングし、配列決定した。ｔｓｓｋキナーゼファミリーの３つのメンバーの翻訳されたヒト相同体をそれぞれ配列番号：４〜６として提供する。
【００８１】
発現の特異性を分析するため、いくつかのヒト組織を表す市販のブロットを、ヒトｔｓｓｋ１および２の全長ｃＤＮＡ由来のランダムプライム標識プローブを用いて行った。加えて、部分的な８００塩基対配列由来のランダムプライム標識プローブを用いて、ｔｓｓｋ基質の組織分布を決定した。ノーザンブロットは、商業的に入手可能なヒト組織ブロット（Clonetech）を用いて行った。
【００８２】
ノーザンブロットにより、ｔｓｓｋ１、２およびｔｓｓｋ基質が精巣特異的ｍＲＮＡであることが示された。これら同一のブロットはｔｓｓｋプローブに対して分離され、ベータアクチン配列を用いた再探索をすることで、各レーンに等量のＲＮＡが充填されたことを確認した。発現の特異性を更に分析するために、同じプローブを用いて、７６種のヒト組織由来の商業的に入手可能なｍＲＮＡアレイを使用するドットブロットを行った（Clontech, Cat#7775-1のMultiple Tissue Expression(MTETM)Arrayを用いる）。それぞれ探索されたＭＴＥで得られた唯一のシグナルが、精巣ＲＮＡを含むグリッド中にあった。この実験により、これらのメッセージによりヒトでは精巣特異的であることが確認された。さらに、Ｋｕｅｎｇら  （１９９７）は、ｔｓｓｋ１および２がマウス生殖細胞中で減数分裂後に発現されること、およびこれらのメッセージが他の１１の組織には存在しないことを実証した。
【００８３】
実施例３
免疫学的局在決定およびイムノブロッティング実験
ｔｓｓｋ１、２および３キナーゼおよびそれらの基質が精巣および／または成熟精子中に存在するかどうか決定するため、組換えタンパク質に対する特異的抗体を作製する。別に、各ｃＤＮＡの予想されるアミノ酸配列から設計される特異ペプチドに対する抗ペプチド抗体を作製する。作製された各抗体の特異性を、組換えｔｓｓｋ１、２および３に対して試験する。各タンパク質の特定のアミノ酸配列に対して設計された抗ペプチド抗体が特異的であると予想される。
【００８４】
ｔｓｓｋキナーゼおよびｔｓｓｋ基質に対して作製された抗体を用いて、他の組織中のこれらキナーゼの存在について分析する。この目的のため、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、卵巣、胎盤、骨格筋および脾臓などの種々の組織のＣｌｏｎｔｅｃｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｅｄｌｅｙｓＴＭを、抗ｔｓｓｋ抗体および抗ｔｓｓｋ基質抗体を使用するウェスタンブロットにより試験する。ｔｓｓｋ１、２および３をコードするｍＲＮＡが精巣にのみ存在するため、同様のタンパク質分布が期待される。ｔｓｓｋキナーゼのヒト相同体はそのマウス対応物と比較した場合に８０％を超える相同性を有するため、ヒト組換えｔｓｓｋキナーゼに対する抗血清はマウス相同体を同様に認識することが期待される。従って、ヒトｔｓｓｋキナーゼに対して作製された抗体もまた、マウス組織で試験する。
【００８５】
精製された組換えタンパク質に対するポリクローナル抗体の作製のために、ラットおよびウサギが用いられる。この目的のために、Ｍａｎｄａｌら(Biol. Reprod. 61 (1999)、pp. 11841197)により記載されたプロトコルに従う。抗体力価はＥＬＩＳＡによりモニターし、抗体の特異性はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析により確認する。
【００８６】
精子調製
免疫学的局在決定およびイムノブロッティング実験を行うため、ヒト精子を健常なドナーから採取し、以前に記載されたようにＰｅｒｃｏｌｌ（Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden）密度勾配遠心分離を用い精製する（Naaby-Hansenら、Biol Reprd 1997; 56:771-787）。次いで、精子を最終濃度２×１０７細胞／ｍｌとなるよう再懸濁する。
【００８７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング
精子および異なる組織からの別の細胞型を遠心分離でペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１ｍｌで洗浄し、メルカプトエタノールを含まないサンプル緩衝液（Laemmli, 1970）に再懸濁し、５分間煮沸する。遠心分離した後、上清を回収し、２−メルカプトエタノールを最終濃度５％となるように加え、５分間煮沸し、次いで、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける。タンパク質濃度は、ＰｉｅｒｃｅのＡＢＣキットにより決定する。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐへのタンパク質の電気泳動転移および免疫検出を、以前に記載されたように行う（Kalabら、Mol Reprod Dev. 1994 May;38(1):91-3）。ゲルを、銀またはクマジーブルーで染色するか、ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ（Millipore）へ転移させ、抗組換え抗体で探索する。
【００８８】
免疫蛍光
ｔｓｓｋ１、２および３の細胞内の局在を決定するため、可溶性の酵素に対する特異抗体をヒト精巣組織およびヒト精子の免疫蛍光実験ならびに免疫電子顕微鏡検査に使用する。さらに、抗体がマウス抗原を認識する場合には、その局在を、マウス生殖細胞および精子の免疫蛍光により調査する。
【００８９】
精子を適当な実験条件下で処置し、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド−０．０５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒドの溶液を用いて懸濁液中で１時間固定し、ＰＢＳ中３７℃で洗浄し、次いで、ＰＢＳ中の０．１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で３７℃１０分間の透過処理をする。次いで、精子をＰＢＳで洗浄し、以前に記載されたように（Viscontiら、1996）、適当な抗体の希釈系列（５、１０、５０および１００）と共に一晩インキュベートする。ＰＢＳで精子を洗浄した後、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共にインキュベートし、次いでポリリシン被覆顕微鏡スライドに付着させる。ＰＢＳで３回洗浄した後、そのスライドをフルオロモント（fluoromont）を用いてマウントし、蛍光を評価する。精巣生検から得た精巣試料を以前に記載されているように（Westbrookら、Biol Reprod. 2000 Aug;63(2):469-81）処理する。
【００９０】
実施例４
組換えｔｓｓｋタンパク質の発現
多くのキナーゼが大腸菌内で活性分子として発現されている（Bodenbachら、1994; Letwinら、1992）。大腸菌には比較的単純で容易にスケールアップできるという利点がある。Ｔｓｓｋ１、２、３の読み取り枠を増幅し、ｐＥＴ２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のＨｉｓタグと融合させる。そのプラスミドをＢＬ２１  ＤＥ３または他の適当な宿主株に形質転換する。組換えタンパク質産生は培養培地に最終濃度１ｍＭとなるようＩＰＴＧを加えることにより誘導される。組換えタンパク質は、天然の条件下でＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて大腸菌溶解物から精製される。結晶形成の促進のため、高純度のタンパク質が最適である。上記のタンパク質調製物を精製するため、ＰｒｅｐＣｅｌｌ（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）を使用する予備的な電気泳動を用いる。キナーゼアッセイを結晶化させる前に行う。
【００９１】
細菌中で組換え精巣ｔｓｓｋキナーゼおよびｔｓｓｋ基質を産生させるため、ｔｓｓｋ１、２および３の、ならびにｔｓｓｋ基質のための発現構成物を作製する。これらタンパク質のそれぞれのコード領域を、ｐＥＴ２８ｂ発現ベクター中にサブクローニングし、Ｃ末端に６残基のＨｉｓタグを付加する。特にこの構成物は、５’末端にＮｄｅＩ部位および３’末端にＸｈｏＩ部位を設けるように設計された完全ＯＲＦプライマーを用いて作製される。増幅産物を、ｐＥＴ２８ｂ発現ベクターのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位中にライゲーションする。組換えタンパク質は発現ベクターの６個のヒスチジン残基と融合されているため、この発現タンパク質はＮｉ−ヒスチジン結合樹脂親和性クロマトグラフィーを用いて精製される。精製するとすぐに、キナーゼ活性をｔｓｓｋ基質を用いて評価し、この酵素が正しく折りたたまれていることを確認する。
【００９２】
ｔｓｓｋ２タンパク質は、大腸菌内でうまく発現され精製された。ｔｓｓｋ２を発現させるため、読み取り枠を、Ｈｉｓタグを有するｐＥＴ２８ｂ発現ベクター中にサブクローニングした。組換えタンパク質はＩＰＴＧでの誘導後に産生された。細菌で発現され、部分的に精製されたｔｓｓｋ２を、ＢｉｏｒａｄのＰｒｅｐＣｅｌｌを使用する予備的ゲル電気泳動によりさらに精製した。その画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ｔｓｓｋ基質を同様に発現させ精製した。これらの精製タンパク質を使用して、標準技術を用いてラットポリクローナル抗体を作製した。
【００９３】
複数のキナーゼがインビボおよびインビトロで自己リン酸化される性質を有するため、細菌で発現させた精製組換えｔｓｓｋ２を自己リン酸化についてアッセイした。この実験は、４０μＭ  ＡＴＰ（１μＣｉの［３２Ｐ］ＡＴＰ）、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、ｐ−ニトロ−フェニルホスフェートおよびグリセロールホスフェートなどのホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤（ロイペプチンおよびアプロチニン１０μｇ／ｍｌ）の存在下で行われ、このアッセイをサンプル緩衝液で停止させ、ｔｓｓｋ２を１０％ＰＡＧＥで分離した。乾燥ゲルの自動Ｘ線撮影法により、組換えｔｓｓｋ２が３２Ｐを取り込んだことが示されたが、これにより、細菌で発現されたｔｓｓｋ２が生ずるリン酸化に関して正確に折りたたまれており、構造研究に使用できることが示唆される。
【００９４】
細菌で発現される組換えタンパク質のすべてが正確に折りたたまれる訳ではないので、酵母中でｔｓｓｋ１、２および３を発現させる同様のアプローチが行われる。酵母でｔｓｓｋキナーゼおよび基質を発現させるため、このキナーゼをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad, CA）のｐＰＩＣＺαＢベクターにサブクローニングし、分泌タンパク質としておよび細胞内タンパク質としてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中で発現させる。これらの構成物はまた、培養培地または細胞抽出物のいずれかからの組換えタンパク質の精製を容易にするＣ末端Ｈｉｓタグを有する。
【００９５】
実施例５
酵母ツー・ハイブリッドシステムにおけるｔｓｋｓとのｔｓｓｋ２相互作用
ｔｓｓｋ２とｔｓｋｓとのタンパク質−タンパク質相互作用を実証するため、ツー・ハイブリッドシステムを用いた。この実験では、ベイト遺伝子（ｔｓｓｋ２）を、最初にＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＮＡ−ＢＤ）に対する融合体としてレポーター株中に形質転換した。ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）に対する融合体としてｔｓｋｓを発現する第２のプラスミドもまたＡＨ１０９レポーター株中に導入した。ウェスタンブロットを行い、酵母中での融合タンパク質の発現の確認を行った。ｔｓｓｋ２とｔｓｋｓとの相互作用により、ヒスチジン（ＨＩＳ）遺伝子の転写が促進され、Ｈｉｓ不含培地で酵母が増殖し得ることが観察された。同様に、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインに融合されたｐ５３を発現する第１の構築物およびＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）に融合されたＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する第２の構築物を酵母細胞に同時トランスフェクトすることにより、ｐ５３とＳＶ４０ラージＴ抗原とが相互作用し、Ｈｉｓ遺伝子活性化が促進されることが示された。この相互作用を陽性対照として使用した。対照的に、ｔｓｓｋ２およびｐ５３とＤＮＡ−ＢＤとの融合タンパク質は、ＧＡＬ−ＡＤプラスミドを同時トランスフェクトしても増殖は促進されなかった。ＧＡＬ−ＡＤ単独、またはＧＡＬ−ＡＤとＴＳＫＳとの融合タンパク質またはＧＡＬ−ＡＤとＳＶ４０ラージＴ抗原との融合タンパク質のいずれも、Ｈｉｓ遺伝子の転写を活性化する能力を有さなかった。この実験により、ｔｓｓｋ２および基質ｔｓｋｓが相互作用し得ることが示され、これによりこれらのタンパク質のヒト相同体が、マウス対応物と同様の挙動を示すことが示唆される。
【００９６】
ｔｓｓｋ２とｔｓｋｓとがインビボでも相互作用するかどうかを調査するため、受精能獲得した精子および受精能獲得していない精子を、タンパク質−タンパク質相互作用を防ぐ条件でトライトンＸ１００を用いて抽出し、次いで、特異抗体を用いて免疫沈降を行う。相互作用は、典型的な交差免疫沈降実験における他の抗体を用いてウェスタンブロットにより分析する。相互作用するタンパク質は共局在するため、二重標識免疫蛍光を行い、共局在を調査する。ヒトｔｓｓｋに対するウサギ抗体はまだ得られていないが、ラット抗ｔｓｓｋ２抗体およびラット抗ｔｓｋｓ抗体が既に得られているため、ヒトｔｓｓｋに対する抗体を得るのが困難であると予想する理由はない。
【００９７】
実施例６
ｔｓｓｋ１、２、３およびｔｓｓｋ基質の結晶構造の単離
２つの方針をｔｓｓｋ特異的阻害剤の合理的設計に利用する。第一に、ハイスループット・スクリーニングを両立するインビトロ・キナーゼアッセイを開発する。第二に、ｔｓｓｋキナーゼ単独の結晶構造またはその基質との複合体の結晶構造を得る。
【００９８】
Ｘ線結晶を用いる構造研究の場合、およそ５ｍｇの活性キナーゼを得る必要がある。このタンパク量は、一般に最初の結晶化の試行に適当な量である。最初の試行は、組換え完全タンパク質で行われる；これは、いくつかの酵素の構造研究を含み、多くの場合に成功すると証明されている一般的な結晶化技術である。結晶スクリーニングの前に、発現断片は、酵素活性の適当なレベルについて、ならびに純度、均一性および溶解性について確認されよう。懸滴蒸気拡散法（hanging drop vapor diffusion method）と合わせて使用する、いくつかの商業的に入手可能な結晶スクリーニングキットは、結晶成長条件を探索する標準的な最初の工程を提供する。触媒的に要求される金属イオン、基質および／または阻害剤の存在下での断片の結晶スクリーニングは、アポ酵素のスクリーニングと同時に行われる。
【００９９】
結晶は、シッティングドロップを２１℃で平衡化することにより得られる。低温回折（cryodiffraction）実験の場合、結晶を、これらの試薬の中間濃度を有する３つの溶液を通じて同様の緩衝溶液に移す。室温および低分解での回折実験の場合、回転陽極Ｘ線発生装置（rotating anode X-ray generator）からのＣｕ  Ｋαを用いる。最終的な構造は、予備的な改良、モデルの改善および更なる改善の後に確立される。
【０１００】
ｔｓｓｋキナーゼファミリーの場合には、基質の存在下での結晶化は、キナーゼ活性の分子基盤を確立するために実験される。最初の結晶化条件が得られると、その条件は、少なくとも３．０Å分解能で回折する結晶が得られるように、最適化される。ＭＡＤ（多波長異常分散法）およびＭＩＲ（多重同形置換法）技術による構造の直接の移送整合を同時に行って成功を確かめる。位相構造の半自動モデル構築および改良技術を用いることで迅速に構造結果が得られるであろう。構造が得られると、その結果は、精子形成および／または精子機能におけるｔｓｓｋキナーゼファミリー特有の役割を理解する観点で分析される。これらの研究の最終目標は、避妊として役立つ可能性のあるｔｓｓｋ１、２および／または３の特異的阻害剤を設計するための鋳型として、その構造を使用することであろう。
【０１０１】
実施例７
ｔｓｓｋ特異的キナーゼアッセイの開発
ｔｓｓｋファミリー用の特異的キナーゼアッセイの設計は、別の観点から利点がある。第一に、キナーゼアッセイにより、ＡＴＰ、二価陽イオンおよび基質に対するＫｍなどのこれら酵素の動力学的な特徴づけが可能となる。第二に、活性酵素だけが結晶学的研究に適当であるため、キナーゼアッセイにより、組換えタンパク質の折りたたみを確認し得る。第三に、ｔｓｓｋ特異的阻害剤のハイスループットスクリーニングに適当なキナーゼアッセイに対する基礎となる研究室規模でのインビトロキナーゼアッセイを開発するのに望ましい。
【０１０２】
ｔｓｓｋキナーゼ活性を測定するアッセイの開発は、基質、［γ３２Ｐ］ＡＴＰ、Ｍｇ２＋および／またはＭｎ２＋およびホスファターゼ阻害剤の存在など、キナーゼアッセイの一般的特性に従う。しかし、まずｔｓｓｋキナーゼの起源が提供されるべきである。ｔｓｓｋキナーゼは、これらのタンパク質を組換え技術により発現させ、この発現されたキナーゼを精製することにより作り出される。
【０１０３】
哺乳類細胞抽出物でのキナーゼアッセイ
それぞれのヒトｔｓｓｋキナーゼのＯＲＦをｐＣＭＶ−ＨＡエピトープタグ付き哺乳類発現ベクター（Clontech cat#K6003-1）中にサブクローニングする。同様に、ｔｓｓｋ基質のＯＲＦをｐＣＭＶ−Ｍｙｃ哺乳類発現ベクター（Clontech、上記と同じ）にサブクローニングする。それぞれ３つのＨＡ−キナーゼを、ヒトｔｓｓｋの各３種それぞれについてのＣＯＳ細胞系でｃＭｙｃ−ｔｓｓｋ基質と共に共発現させる。共発現は、それぞれの抗タグ抗体を用いた免疫蛍光を行うことによって確認される。ＨＡおよびＨｙｃに対する抗体はＣｌｏｎｔｅｃｈから入手できる。抗ｃ−Ｍｙｃはマウスモノクローナルであり、抗ＨＡはウサギポリクローナルであるため、キナーゼと基質の両方が同じ細胞中で共発現されているかどうか分析することができる。
【０１０４】
次いで、タンパク質を１％Ｔｒｉｔｏｎで抽出し、抗ＨＡ−タグ抗体を用いて免疫沈降を行う。他に、抗ｔｓｓｋ−キナーゼ／抗−ｔｓｓｋ基質抗体を用いて、ｔｓｓｋキナーゼおよびｔｓｓｋ基質を免疫沈降し得る。典型的には抗体は、標的リガンドの単離を促すためにセファロースビーズのような固体支持体に結合されている。プロテインＡセファロースによる沈殿の後、そのペレットを、種々の濃度のＡＴＰ（１０μＭ、１００μＭおよび１ｍＭ）、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋（１００μＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ）および１μＣｉの［γ３２Ｐ］ＡＴＰを用いて、キナーゼ活性についてアッセイする。リン酸化タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびオートラジオグラフィーにより評価する。免疫沈降後のキナーゼ活性の評価は、頻繁に用いられる方法であり、１つの特定キナーゼの活性を特異的に測定できる（Cosoら、1995、Cell 81、1137-46; Moosら、1995, Biol Reprod 53、692-9）。Ｋｕｅｎｇら（１９９７）が、ｔｓｓｋ１および２の免疫沈降後にｔｓｓｋ基質のリン酸化の検出に成功したため、哺乳類系での共発現後のｔｓｓｋキナーゼのキナーゼ活性を測定できることが期待される。
【０１０５】
インビトロ・キナーゼアッセイ
それぞれ精製した酵素を、種々の濃度のＡＴＰ（１０μＭ、１００μＭおよび１ｍＭ）、Ｍｇ２＋またはＭｎ２＋（１００μＭ、１ｍＭおよび１０ｍＭ）、１μＣｉの［γ３２Ｐ］ＡＴＰ、および種々の濃度の精製ｔｓｓｋ基質（１、１０および１００ｎｇ／アッセイ）と混合する。リン酸化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離およびオートラジオグラフィーにより評価する。このタンパク質が正確に折りたたまれている場合には、その基質のリン酸化は、この方法で容易に検出されると期待される。
【０１０６】
実施例８
ｔｓｓｋ抗体の作製
精製ｔｓｓｋ２およびｔｓｋｓを使用し、ラットポリクローナル抗体を作製した。組換えヒトｔｓｓｋ１、２および３ならびにヒトｔｓｓｋ基質に対する抗血清を用いて、タンパク質レベルの組織分布および細胞内局在を決定する。ラット抗ｔｓｓｋ抗体および抗ｔｓｋｓ抗体は、組換えタンパク質を認識し、精子および精巣中で予想されるＭＷのタンパク質をも認識したことから、ｔｓｓｋファミリーの少なくとも１つのメンバーおよびその基質（ｔｓｋｓ）が精子中に存在することが示唆される。次いで、これらの抗体を用いて、受精能を獲得したヒト精子中のこれらタンパク質の細胞内局在を研究した。Ｔｓｓｋ２は、ヒト精子の赤道部分に局在することが観察された。ｔｓｋｓもまた赤道部分に局在した。それにも拘わらず、抗ｔｓｋｓ抗体は、前頭および尾に存在するタンパク質をも認識する。これら分子の免疫学的局在決定により、ｔｓｓｋ２およびｔｓｋｓがヒト精子群の少なくとも１区画で精子の類似領域中に存在することが示唆される。対照実験は、各抗体のラット免疫前血清を用いて行った。ウェスタンブロットおよび免疫蛍光の両方は陰性であった。ｔｓｓｋ２に対する抗体はｔｓｓｋ２に対して作製されたが、配列に高い相同性があるためこの抗体がｔｓｓｋファミリーの他のメンバーを認識したことは否定しきれない。しかしながら、３つのｔｓｓｋイソ酵素間の識別は、ｔｓｓｋ１と２の間で相違し、ｔｓｓｋ３中には存在しないＣ末端ドメインに対する抗体を作製することにより可能となり得る。
【０１０７】
実施例９
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
最初のストランドｃＤＮＡを、製造業者から提供された反応バッファーを用いた１００μｌ反応液中の１μＭオリゴｄ（Ｔ）プライマー(Ambion、オースティン、テキサス州)およびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素 (Qiagen、アラメダ、カルフォルニア州)を用いてヒト精巣由来の全ＲＮＡ５μｇ(Ambion、オースティン、テキサス州)から調製した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲをＢｉｏ−Ｒａｄ(Hercules、カルフォルニア州) ｉ−サイクラーＩＱシステムを用いて実施した。プライマー対は、２μｌの精巣ｃＤＮＡ、１０μｌのＩＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｓｕｐｅｒｍｉｘ(BioRad)および各プライマーの１０μＭストック溶液０．６μｌ（最終濃度０．３μＭ）を含む２０μｌのＰＣＲ反応液中にて確認された。サイクルの条件は、９５℃で３分間、続いて９５℃で１０秒間および６０℃で３０秒間を４５サイクルであった。増幅の後、そのＰＣＲ産物を９５℃で１分間変性させ、７２℃で１０秒間アニーリングさせる融解曲線分析を行った。次いで、ＳＹＢＲグリーンの蛍光の消失をモニターしながら温度を０．１℃刻みで上昇させた。各プライマー対は、予想されたＰＣＲ産物の推測Ｔｍ値と一致した温度で鋭い融解ピークを有する単一の産物を増幅した。アガロースゲル電気泳動により増幅産物は期待されたサイズであることが確認された。逆転写酵素をｃＤＮＡ合成反応から除いた場合には、産物は得られなかった。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、すべてＱｉａｇｅｎ Ｏｐｅｒｏｎ(アラメダ、カルフォルニア州)から購入した。可能な場合には、プライマーはスプライス部位にまたがるように選択される。ＴＳＳＫ１およびＴＳＳＫ２などのイントロンの無い遺伝子の場合に、これを実施できないことは明らかである。各遺伝子のプライマー対は：ＴＳＳＫ１の場合、ＧＣＣＣＣＴＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧ (フォワード；配列番号：２１)およびＴＣＡＣＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＴＡ (リバース；配列番号：２２)；ＴＳＳＫ２の場合、ＧＧＧＴＴＣＣＴＡＣＧＣＡＡＡＡＧＴＣＡ（フォワード；配列番号：２３）およびＧＴＴＴＴＣＴＴＧＣＧＧＴＣＧＡＴＧＡＴ（リバース；配列番号：２４）；ＴＳＳＫ３の場合、ＧＧＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＣＴＣＡＡＡ（フォワード；配列番号：２５）およびＧＴＣＣＡＧＧＧＴＡＣＧＧＡＣＧＡＴＴＴ（リバース；配列番号：２６）；ＴＳＳＫ４の場合、ＴＡＣＧＣＧＴＣＡＣＣＣＧＡＧＴＧＣＴ（フォワード；配列番号：２７）およびＡＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＡＣＡ（リバース；配列番号：２８）；ＴＳＫＳの場合、ＧＣＴＧＡＧＣＧＡＧＡＡＴＣＴＧＧＡＧ（配列番号：２９）およびＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＣＣＡＣＡＧＡＣＣ；（配列番号：３０）；ＴＳＫＳ−１の場合、ＧＧＡＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＧＣＴＣＣＡＡＣ（フォワード；配列番号：３１）およびＴＧＧＡＧＧＴＡＧＣＧＣＡＧＣＴＴＣＴ（リバース；配列番号：３２）；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の場合、ＡＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＣＴＧ（フォワード；配列番号：３３）およびＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴ（リバース；配列番号：３４）である。
【０１０９】
ヒト精巣におけるｍＲＮＡ発現の相対レベルを、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社(パロアルト、カルフォルニア州)製の多組織ｃＤＮＡ（ＭＴＣ）を用い、前記したリアルタイムＰＣＲ反応にて決定した。固定された閾値以上のＰＣＲ産物が最初に検出されるポイント、サイクル閾値（cycle threshold）（Ｃｔ値）と称されるポイントを試料ごとに決定した。融解曲線分析により、期待された産物のみの増幅が確認された。精巣に対する各組織ｃＤＮＡ中に存在する遺伝子特異的転写産物の量を決定するために、各々のＣｔ値をＧＡＰＤＨ対照から得られたＣｔ値を差し引くことにより（例えば、――ΔＣｔ値＝Ｃｔ  ＴＳＳＫ３−Ｃｔ  ＧＡＰＤＨ）まず正規化する。次いで、精巣に対する所定組織中の遺伝子特異的ｍＲＮＡの濃度は、精巣で得られた正規化Ｃｔ値から各組織で得られた正規化Ｃｔ値を差し引くことで（例えば、――ΔΔＣｔ値＝脳のΔＣｔ値−精巣のΔＣｔ値）計算され、相対濃度が決定された（相対濃度＝２−ΔΔＣｔ）。図２〜５を参照のこと。
【０１１０】
実施例１０
Ｔｓｓｋ４のインシトゥ局在およびノーザンブロット分析
インシトゥ分析
インシトゥハイブリダイゼーションにて用いるプローブをハツカネズミ（Mus musculus）セリン／トレオニンプロテインキナーゼＳＳＴＫ（Ｓｓｔｋ−保留）、ｍＲＮＡ  ＮＭ  ０３２００４（配列番号：３５）から調製した。増幅された領域は（配列番号：３６）の３２０〜７１４の範囲の３９４塩基対のコード配列領域である。フォワードプライマーは、配列tcg agt tca tcg aag tgt gc (配列番号：３７)であり、リバースプライマーは、配列ggt gac cat gac gta gag ca (配列番号：３８)であった。
【０１１１】
材料：
鋳型は、マウス精巣ｃＤＮＡファーストストランドキット(Invitrogen)を含み、成分はＰＣＲ反応に用いた成分およびそれらの濃度は以下の通りである：
【表１】
2007501614.tif 000003
ＰＣＲプログラム：
１    ９４°Ｃ        １分
２    ９２°Ｃ        ３０秒
３    ６６°Ｃ        ３０秒
４    ７２°Ｃ        ２分
５    ２に戻る、３３×
６    ７２°Ｃ        １０分
７    ４°Ｃ          
【０１１２】
アガロースゲル分析により、３９４断片の増幅が確認され、次いで配列決定するために、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット(Invitrogen No.: K4575-01)を用いてｐＣＲ  ４  ＴＯＰＯベクターにクローニングした。得られたプラスミドをＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ(Qiagen No: 27106)を用いて単離した。インシトゥハイブリダイゼーションに用いられるクローン中のマウスＴＳＳＫ４配列を、プラスミド中の挿入物を配列決定することにより確認した。
【０１１３】
プラスミドをＮｏｔＩ(アンチセンス)またはＰｍｅＩ(センス)のいずれかを用いて線状化した。線状化鋳型をＴ３−ＲＮＡポリメラーゼの存在下（アンチセンスプローブ、ＮｏｔＩ線状化）で、またはＴ７−ＲＮＡポリメラーゼを用いて（センスプローブ、ＰｍｅＩ線状化）インキュベートすることにより、標識化センスおよびアンチセンスｃＲＮＡを合成した。標識化は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ(マンハイム、ドイツ)社製のジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ＲＮＡ−標識キットに概説される方法を用いて行った。
【０１１４】
インシトゥハイブリダイゼーション
６時間のＢｏｕｉｎ固定およびパラフィン包埋されたマウス精巣を４μｍの薄片に切断した。Ｐｒｏ  Ｔａｑｓ  Ｃｌｅａｒ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ(Quartett GmbH、ベルリン、ドイツ)にて脱パラフィンし、エタノール勾配溶液の系列に通じて再水和させた後に、組織を室温にて０．２Ｎ  ＨＣｌ中で２０分間インキュベートし、次いで２×ＳＳＣ中７０℃で１５分間インキュベートした。このスライドを室温にて５分間ＰＢＳ中で洗浄した。その後、プロテイナーゼＫ（２μｇ／ｍｌ最終濃度）で３７℃にて１０分間部分消化した。０．２％（ｗ／ｖ）グリシン中で４℃にて１０分間インキュベートし、４℃で５分間４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）を用いて後固定した後、この薄片をＰＢＳにて室温で２回洗浄した。
【０１１５】
薄片を０．１Ｍエタノールアミンおよび０．２５％（ｖ／ｖ）無水酢酸中で室温にて５分間アセチル化し、その後ＰＢＳ中で室温にて２回洗浄した。続いて、少なくとも３時間室温でプレハイブリダイゼーション工程を行った。プレハイブリダイゼーション溶液は、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハート(Denhardts:１％  ｗ／ｖ)ウシ血清アルブミン、１％（ｗ／ｖ）フィコール、１％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＤＥＰＣ水中）、最終濃度４００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ（ベーカーズイーストトランスファーＲＮＡ、Roche）および最終濃度２００μｇ／ｍｌのヘリング精子（hering sperm）ＤＮＡ(Gibco)を含でいた。ハイブリダイゼーションバッファーは、プレハイブリダイゼーションバッファーおよび２０〜５０ｎｇのＤＩＧ標識センスまたはアンチセンスプローブを含む。ハイブリダイゼーションを５５℃で一晩実施した。余剰プローブを２ｘＳＳＣを用いて室温で５分間の連続洗浄工程により取り除いた。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／  ＨＣｌ中の２ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  Ａ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を用いて３７℃にて３０分間インキュベートした後、洗浄を３回行った（最初に２ｘＳＳＣを用いて３７℃で５分間、次いで１ｘＳＳＣを用いて３７〜５５℃で１５分間、その後０．２ｘＳＳＣを用いて５５℃で１５分間）。最後に、この薄片を１ｘＴＢＳ中で室温で５分間洗浄した。
【０１１６】
ハイブリダイズされたプローブを抗ＤＩＧアルカリホスファターゼ(Boehringer)で一時間インキュベートして薄片に局在させ、次いでマレイン酸バッファー中で各１０分間の洗浄を３回行い、基質(ニトロブルーテトラゾリウムクロリドおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸溶液［NBT/BCIP］)を添加することによって可視化した。インキュベートは暗所で室温にて一晩実施された。次いで、薄片をマイヤーズヘマトキシリンで対比染色し、ＧＶＡマウント溶液(Zymed Laboratories、サンフランシスコ、アメリカ合衆国)中にてマウントした。結果を図６に示す。
【０１１７】
各レーン中に１マイクログラムのマウスポリ−Ａ  ｍＲＮＡを含むノーザンブロットメンブレン(BD Biosciences)を、ランダムプライミングにより３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識された１．４キロベースのマウスｔｓｓｋ４  ｃＤＮＡプローブにハイブリダイズさせた。プレハイブリダイゼーションを、プローブを含まないＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入したＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ中でまず６５℃にて２時間実施した。同じ温度で標識化プローブを加え一晩した後、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂを新しいバッチで置き換えることにより、続けてハイブリダイゼーションを行った。ブロットを２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳを用いて室温で２回洗浄し、さらに０．１ｘＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳを用いて６０℃で２回洗浄した。シグナルは、ブロットを−８０℃で一晩Ｘ線フィルムに露光させることにより検出された。ベータアクチン対照のハイブリダイゼーションは、ノーザンブロットメンブレンを煮沸することにより放射性プローブを剥がした後に、上記と同じ条件下で行われた。フィルムを６時間露光した。結果を図７に示し、検出可能なシグナルのみが精巣ｍＲＮＡに現れた。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】ヒトｔｓｓｋ１（配列番号：４）、ヒトｔｓｓｋ２（配列番号：５）、ヒトｔｓｓｋ３（配列番号：６）およびヒトｔｓｓｋ４（配列番号：２０）のアミノ酸配列間の比較である。
【図２】種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ１特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
【図３】種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ２特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
【図４】種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ３特異的プライマーを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
【図５】種々のヒト組織から調製されたｃＤＮＡとｔｓｓｋ４特異的プライマーとを用いて行われたリアルタイムＰＣＲから得られたデータを表したグラフである。
【図６】ｔｓｓｋ４プローブを用いたマウス精巣組織のインシトゥハイブリダイゼーションである。
【図７】種々の組織から単離され、３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いたランダムプライミングにより標識化された１．４キロベースのマウスＴＳＳＫ４ｃＤＮＡプローブを用いて探索されたマウスのポリ−Ａ  ｍＲＮＡのノーザンブロットである。
【図１】
2007501614.tif 000004
【図２】
2007501614.tif 000005
【図３】
2007501614.tif 000006
【図４】
2007501614.tif 000007
【図５】
2007501614.tif 000008
【図６】
2007501614.tif 000009
【図７】
2007501614.tif 000010
【配列表】
2007501614000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月17日(2006.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007501614000001.app
【国際調査報告】
2007501614.tif 000034
2007501614.tif 000035
2007501614.tif 000036