(57)【要約】  本発明は、一般に骨成長因子に関するものであり、さらに詳しくは、ＮＥＬＬ１を含む組成物、ＮＥＬＬ１を含む製造物品及びＮＥＬＬ１を用いた骨形成を誘導する方法に関する。本発明はまた、ＮＥＬＬ１ペプチド及びＮＥＬＬ２ペプチドの発現及び精製のための方法も提供する。【選択図】図２８【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により昆虫細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ１ペプチドを発現できるような条件下で前記昆虫細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ１ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ１ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、ＮＥＬＬ１ペプチドの活性を調べること、
を含む方法。
【請求項２】
前記昆虫細胞がハイファイブ細胞である請求項１の方法。
【請求項３】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項１の方法。
【請求項４】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項１の方法。
【請求項５】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１の方法。
【請求項６】
昆虫細胞においてＮＥＬＬ１ペプチドを発現するための核酸構築物であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物。
【請求項７】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項５の核酸。
【請求項８】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項５の核酸。
【請求項９】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項５の核酸。
【請求項１０】
機能的ＮＥＬＬ１ペプチドを発現する細胞株であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する前記細胞株。
【請求項１１】
前記細胞が昆虫細胞である請求項１０の細胞。
【請求項１２】
前記細胞がハイファイブ細胞である請求項１１の細胞。
【請求項１３】
前記細胞がＮＥＬＬ１ペプチドを分泌する請求項１０の細胞。
【請求項１４】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項１０の細胞。
【請求項１５】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項１０の細胞。
【請求項１６】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１の方法。
【請求項１７】
ＮＥＬＬ１ペプチド及び昆虫の分泌型シグナルペプチドを含むポリペプチド。
【請求項１８】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１６のポリペプチド。
【請求項１９】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項１７のポリペプチド。
【請求項２０】
哺乳類細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により哺乳類細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ１ペプチドを発現できるような条件下で前記哺乳類細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ１ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ１ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、骨形成を誘導するＮＥＬＬ１ペプチドの活性を調べること、
を含む方法。
【請求項２１】
前記昆虫細胞がＣＯＳ７細胞である請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項２０の方法。
【請求項２３】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項２０の方法。
【請求項２４】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項２０の方法。
【請求項２５】
哺乳類細胞においてＮＥＬＬ１ペプチドを発現するための核酸構築物であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む前記核酸構築物。
【請求項２６】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項２４の核酸。
【請求項２７】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項２４の核酸。
【請求項２８】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項２４の核酸。
【請求項２９】
機能的ＮＥＬＬ１ペプチドを発現する細胞株であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ１ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する細胞株。
【請求項３０】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項２９の細胞。
【請求項３１】
前記細胞がＣＯＳ７細胞である請求項３０の細胞。
【請求項３２】
前記細胞がＮＥＬＬ１ペプチドを分泌する請求項２９の細胞。
【請求項３３】
前記分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項２９の細胞。
【請求項３４】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択される請求項２９の細胞。
【請求項３５】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項２０の方法。
【請求項３６】
ＮＥＬＬ１ペプチド及び分泌型シグナルペプチドを含むポリペプチド。
【請求項３７】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項３５のポリペプチド。
【請求項３８】
前記分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項３５のポリペプチド。
【請求項３９】
昆虫細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
少なくともＮＥＬＬ２ペプチド及び昆虫の分泌型シグナルペプチドををコードする少なくとも核酸をＮＥＬＬ２ペプチドのフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により昆虫細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ２ペプチドを発現できるような条件下で前記昆虫細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ２ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ２ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、ＮＥＬＬ２ペプチドの活性を調べること、
を含む方法。
【請求項４０】
前記昆虫細胞がハイファイブ細胞である請求項３９の方法。
【請求項４１】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項３９の方法。
【請求項４２】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項３９の方法。
【請求項４３】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項３９の方法。
【請求項４４】
昆虫細胞においてＮＥＬＬ２ペプチドを発現するための核酸構築物であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む前記核酸構築物。
【請求項４５】
前記昆虫の分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項４３の核酸。
【請求項４６】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項４３の核酸。
【請求項４７】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項５の核酸。
【請求項４８】
機能的ＮＥＬＬ２ペプチドを発現する細胞株であって、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する前記細胞株。
【請求項４９】
前記細胞が昆虫細胞である請求項４８の細胞。
【請求項５０】
前記細胞がハイファイブ細胞である請求項４９の細胞。
【請求項５１】
前記細胞がＮＥＬＬ２ペプチドを分泌する請求項４８の細胞。
【請求項５２】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項４８の細胞。
【請求項５３】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項４８の細胞。
【請求項５４】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項３９の方法。
【請求項５５】
ＮＥＬＬ２ペプチド及び昆虫の分泌型シグナルペプチドを含むポリペプチド。
【請求項５６】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項５５のポリペプチド。
【請求項５７】
前記分泌型シグナルペプチドがメリチンのシグナル配列である請求項５５のポリペプチド。
【請求項５８】
哺乳類細胞において機能的ペプチドを発現する方法であって、
少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸及び分泌型シグナルペプチドをコードする核酸をＮＥＬＬ２ペプチドのフレーム内に包含する核酸構築物を提供すること；
前記核酸構築物により哺乳類細胞に形質移入を行なうこと；
ＮＥＬＬ２ペプチドを発現できるような条件下で前記哺乳類細胞を培養すること；
任意選択で、細胞株から分泌されたＮＥＬＬ２ペプチドを回収すること；
任意選択で、ＮＥＬＬ２ペプチドを実質的に精製すること；及び
任意選択で、神経細胞の生き残りを促進するＮＥＬＬ２ペプチドの活性を調べること、
を含む方法。
【請求項５９】
前記哺乳類細胞がＣＯＳ７細胞である請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記哺乳類の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項５８の方法。
【請求項６１】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項５８の方法。
【請求項６２】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項５８の方法。
【請求項６３】
哺乳類細胞においてＮＥＬＬ２ペプチドを発現するための核酸構築物であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む前記核酸構築物。
【請求項６４】
前記哺乳類の分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項６３の核酸。
【請求項６５】
ＮＥＬＬ２をコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項６３の核酸。
【請求項６６】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項６３の核酸。
【請求項６７】
機能的ＮＥＬＬ２ペプチドを発現する細胞株であって、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸と共に少なくともＮＥＬＬ２ペプチドをコードする少なくとも核酸をフレーム内に含む核酸構築物を包含する前記細胞株。
【請求項６８】
前記細胞が哺乳類細胞である請求項６７の細胞。
【請求項６９】
前記細胞がＣＯＳ７細胞である請求項６８の細胞。
【請求項７０】
前記細胞がＮＥＬＬ２ペプチドを分泌する請求項６７の細胞。
【請求項７１】
前記分泌型シグナルペプチドがＮＥＬＬペプチドのシグナル配列である請求項６７の細胞。
【請求項７２】
ＮＥＬＬ２ペプチドをコードする核酸が、配列番号７、配列番号９、配列番号１１又は配列番号１３を含む群から選択される請求項６７の細胞。
【請求項７３】
ＮＥＬＬ２ペプチドが、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２又は配列番号１４を含む群から選択される請求項５８の方法。
【請求項７４】
骨形成細胞の分化を増大させる方法であって、
骨形成細胞においてＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、第２の骨形成剤を添加すること；及び
骨芽細胞分化の細胞性マーカーの発現を誘導すること、
を含む方法。
【請求項７５】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成細胞にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項７４の方法。
【請求項７６】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項７７】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項７４の方法。
【請求項７８】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、Ｃｂｆａ１の細胞性レベルを高めることを含む請求項７７の方法。
【請求項７９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物により骨形成細胞に形質移入することを含む請求項７４の方法。
【請求項８０】
ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項７４の方法。
【請求項８１】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項８２】
骨形成細胞が、骨芽細胞、間葉細胞、線維芽細胞、胎児性胚細胞、幹細胞(単数）、骨髄細胞、硬膜細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、一次頭蓋冠細胞、幹細胞（複数）、脂肪幹細胞を含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項８３】
第２の骨形成ペプチドが、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲンを含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項８４】
骨芽細胞分化の誘導される細胞性マーカーが、アルカリホスファターゼ活性、オステオカルシンｍＲＮＡの発現、オステオポニンｍＲＮＡの発現、デコリンの発現及びラミニンＢの発現を含む群から選択される請求項７４の方法。
【請求項８５】
骨芽細胞の石灰化を高める方法であって、
骨形成細胞においてＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、骨形成細胞に作用剤を適用すること；及び
石灰化の細胞性マーカーの発現を誘導すること、
を含む方法。
【請求項８６】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成細胞にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項８５の方法。
【請求項８７】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項８５の方法。
【請求項８８】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項８５の方法。
【請求項８９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、Ｃｂｆａ１の細胞性レベルを高めることを含む請求項８８の方法。
【請求項９０】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により骨形成細胞に形質移入することを含む請求項８５の方法。
【請求項９１】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項８５の方法。
【請求項９２】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項８５の方法。
【請求項９３】
骨形成細胞が、骨芽細胞、間葉細胞、線維芽細胞、胎児性胚細胞、幹細胞（単数）、骨髄細胞、硬膜細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、一次頭蓋冠細胞、幹細胞(複数）、脂肪幹細胞を含む群から選択される請求項８５の方法。
【請求項９４】
第２の骨形成剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲンを含む群から選択される請求項８５の方法。
【請求項９５】
石灰化の誘導される細胞性マーカーがカルシウムの取り込みを含む群から選択される請求項８５の方法。
【請求項９６】
膜内骨形成を増大させる方法であって、
骨形成が所望される領域におけるＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、骨形成が所望されるほぼ同一領域に第２の作用剤を適用すること；及び
膜内骨形成の形成を誘導すること、
を含む方法。
【請求項９７】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成が所望される領域にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項９６の方法。
【請求項９８】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項９６の方法。
【請求項９９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項９６の方法。
【請求項１００】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入すること、及び該細胞を骨形成が所望される領域の近傍に適用することを含む請求項９６の方法。
【請求項１０１】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項９６の方法。
【請求項１０２】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項９６の方法。
【請求項１０３】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項９６の方法。
【請求項１０４】
膜内骨の形成が、ＣＴ、遺伝子発現、組織学、機械的試験によって評価される請求項９６の方法。
【請求項１０５】
軟骨内の骨形成を増大させる方法であって、
骨形成、及び／又は骨の治癒又は骨の再生が所望される領域でＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、骨形成が所望される領域に作用剤を適用すること；及び
骨形成が所望される領域で少なくとも軟骨芽細胞の肥大を誘導すること、
を含む方法。
【請求項１０６】
骨形成が骨の治癒又は骨の再生を含む請求項１０５の方法。
【請求項１０７】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、骨形成が所望される領域にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項１０５の方法。
【請求項１０８】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１０５の方法。
【請求項１０９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項１０５の方法。
【請求項１１０】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入すること、及び該細胞を骨形成が所望される領域の近傍に適用することを含む請求項１０５の方法。
【請求項１１１】
ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項１１０の方法。
【請求項１１２】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１１０の方法。
【請求項１１３】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項１０５の方法。
【請求項１１４】
軟骨芽細胞の肥大を誘導することがアポトーシスの軟骨芽細胞の増加を起こす請求項１０５の方法。
【請求項１１５】
椎骨の近傍で骨形成を増大させる方法であって
脊椎固定が所望される椎骨の最も近くでのＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること；
任意選択で、脊椎固定が所望される椎骨の最も近くに追加の活性剤を適用すること；及び
脊椎固定が所望される領域で軟骨芽細胞の肥大又は骨芽細胞の分化を誘導すること、
を含む方法。
【請求項１１６】
骨芽細胞の分化を増大させることをさらに含む請求項１１５の方法。
【請求項１１７】
骨芽細胞の石灰化を増大させることをさらに含む請求項１１５の方法。
【請求項１１８】
膜の骨形成を誘導することをさらに含む請求項１１５の方法。
【請求項１１９】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、脊椎固定が所望される領域にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することを含む請求項１１５の方法。
【請求項１２０】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１１５の方法。
【請求項１２１】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することを含む請求項１０５の方法。
【請求項１２２】
ＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることが、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入すること、及び該細胞を脊椎固定が所望される領域の近傍に適用することを含む請求項１１５の方法。
【請求項１２３】
ＮＥＬＬ１をコードする核酸構築物が、群：配列番号１、配列番号３又は配列番号５から選択される少なくとも１つを含む請求項１２２の方法。
【請求項１２４】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１２２の方法。
【請求項１２５】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項１１５の方法。
【請求項１２６】
骨形成を誘導するための組成物であって、
ＮＥＬＬ１ペプチド、及びＮＥＬＬ１ペプチドの発現を変化させる作用剤、又はＮＥＬＬ１ペプチドの活性を変化させる作用剤を含む群から選択される、骨形成を誘導するための、有効量の第１の作用剤、並びに任意選択でキャリアを含む組成物。
【請求項１２７】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１２６の組成物。
【請求項１２８】
作用剤が、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲンを含む群から選択される請求項１２６の組成物。
【請求項１２９】
作用剤が、骨基質、腱基質又は靭帯基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される請求項１２６の組成物。
【請求項１３０】
前記キャリアが酵素的メカニズム又は加水分解のメカニズムで分解可能である請求項１２６の組成物。
【請求項１３１】
前記キャリアが、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリグリコリド、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアリーレート類、ポリヒドロキシブチラート、ポリ無水物、ポリ（無水物−コ−イミド）、プロピレン−コ−フマレート類、ポリラクトン類、ポリエステル類、ポリカーボネート類、ポリアニオン系ポリマー類、ポリ無水物、ポリエステルアミド類、ポリ（アミノ酸）、ホモポリペプチド類、ポリ（ホスファゼン類）、ポリ（グラクサノン）、多糖類、及びポリ（オルソエステル類）、ポリグラチン、ポリグラチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート類を含む群から選択される合成ポリマーから構成される請求項１２６の組成物。
【請求項１３２】
前記キャリアが、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらのカチオン系塩から構成される請求項１２６の組成物。
【請求項１３３】
前記キャリアが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、アパタイト、生体活性ガラス材料、及びサンゴ由来のアパタイトを含む群から選択される合成の又は天然のバイオセラミックから構成される請求項１２６の組成物。
【請求項１３４】
前記キャリアが、コラーゲン、ヒアルロナン、フィブリン、キトサン、アルギネート及びゼラチンを含む群から選択される請求項１２６の組成物。
【請求項１３５】
デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸ヘパリン、フカン、アルギネートを含む群から選択されるヘパリン結合剤をさらに含む請求項１２６の組成物。
【請求項１３６】
前記キャリアが流動性ゲルの形態である請求項１２６の組成物。
【請求項１３７】
前記キャリアが光重合性である請求項１２６の組成物。
【請求項１３８】
前記キャリアが温度感受性である請求項１２６の組成物。
【請求項１３９】
組成物が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギネート、ポリ（エチレングリコール）、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）、血液、フィブリン、ポリオキシエチレンオキシド、硫酸カルシウム半水化物、アパタイト類、カルボキシビニルポリマー、又はポリ（ビニルアルコール）を含む群から選択される金属イオン封鎖剤をさらに含む請求項１２６の組成物。
【請求項１４０】
組成物が、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はプルロニックＦ−６８を含む群から選択される界面活性剤をさらに含む請求項１２６の組成物。
【請求項１４１】
組成物が、グリシン、グルタミン酸塩酸塩、塩化ナトリウム、グアニジン、ヘパリン、グルタミン酸塩酸塩、酢酸、コハク酸、ポリソルベート、デキストラン硫酸、スクロース及びアミノ酸を含む群から選択される緩衝剤をさらに含む請求項１２６の組成物。
【請求項１４２】
膜内の骨形成を増大させるために患者を治療する方法であって、骨形成を増すために選択された間隔で、有効な投与形態で、治療上有用な用量にてＮＥＬＬペプチドを投与することを含む方法。
【請求項１４３】
骨形成が所望される領域に、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨基質、腱基質又は靭帯基質を含む群から選択される少なくとも１種の作用剤を投与することをさらに含む請求項１４２の方法。
【請求項１４４】
骨形成を誘導するために患者を治療する方法であって、哺乳類の骨形成細胞を回収すること；該骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの濃度を高めること；骨形成が所望される領域に該骨形成細胞を投与することを含む方法。
【請求項１４５】
骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの発現の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドを含む組成物を骨形成細胞に適用することを含む請求項１４４の方法。
【請求項１４６】
骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの発現の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドの内因性の発現を誘導することを含む請求項１４４の方法。
【請求項１４７】
骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの発現の濃度を高めることが、ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物により細胞に形質移入することを含む請求項１４４の方法。
【請求項１４８】
ＮＥＬＬ１ペプチドが、配列番号２、配列番号４又は配列番号６を含む群から選択される請求項１４５、１４６又は１４７の方法。
【請求項１４９】
骨形成が所望される領域に、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、基質、靭帯基質、腱基質、骨形成細胞又は骨芽細胞を含む群から選択される少なくとも１種の作用剤を投与することをさらに含む請求項１４５、１４６又は１４７の方法。
【請求項１５０】
人体で使用するためのインプラントであって、基材がインプラントの近傍で骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む基材を含むインプラント。
【請求項１５１】
人体で使用するためのインプラントであって、表面の少なくとも一部がインプラントの近傍で骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む表面を有する基材を含むインプラント。
【請求項１５２】
人体で使用するためのインプラントであって、表面の少なくとも一部が骨形成細胞を含む表面を有する基材を含み、該基材が骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含むインプラント。
【請求項１５３】
前記基材がメッシュ、ピン、ネジ、プレート又は人工装具の継ぎ目の形状に形成される請求項１４５、１４６又は１４７のインプラント。
【請求項１５４】
前記基材が吸収性である請求項１４５、１４６又は１４７のインプラント。
【請求項１５５】
前記基材がコラーゲンを含む請求項１４５、１４６又は１４７のインプラント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜連邦政府によって経済援助を受けた研究開発のもとで行なわれた発明の権利に関する声明＞
本研究は、ＮＩＨ／ＮＩＤＲ助成金番号ＤＥ９４００及びＣＲＣ／ＮＩＨ助成金番号ＲＲ００８６５による支援を受けた。米国政府は本発明に特定の権利を有してもよい。
【０００２】
本発明は、一般に骨成長因子に関するものであり、さらに詳しくは、ＮＥＬＬ１を含む組成物、ＮＥＬＬ１を含む製造物品及びＮＥＬＬ１を用いた骨形成を誘導する方法に関する。本発明はまた、ＮＥＬＬ１ペプチド及びＮＥＬＬ２ペプチドの発現及び精製のための方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
成長因子は、試験管内又は生体内で規定された細胞集団の増殖及び分化に影響を及ぼす、たとえば、ペプチドのような物質である。
【０００４】
骨形成は、長骨（軟骨内の骨形成）及び扁平骨（膜内の骨形成）の発達の間で起きる。さらに、骨形成は、骨格の整合性を維持するために成人で継続して生じる骨リモデリングの間に起きる。最後的に、骨形成は、たとえば、骨折又は手術で骨創傷が生じた場合のような骨修復の間に起きる。長骨及び扁平骨の胎児発生では別個の骨形成メカニズムが関与すると考えられ、修復には、膜内骨形成が関与すると考えられている。
【０００５】
いずれのメカニズムによる骨形成にも、成長因子により調節される骨芽細胞の活性が関与する。骨芽細胞は、骨髄幹細胞（間葉幹細胞：ＭＳＣとしても知られる）のプールに由来する。これらの細胞は種々の組織に存在するが、骨髄間質で優勢である。ＭＳＣは、多能性であり、骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、筋細胞及び脂肪細胞を含む多様な細胞種に分化することができる。成長因子は、骨形成性細胞の増殖、分化及び骨芽細胞の石灰化に影響を与えると考えられ、そのそれぞれが骨形成に影響を与える。
【０００６】
たとえば、頭蓋骨癒合症の患者及び中裂移植の患者で骨を修復するのに自家骨が用いられてきた。頭蓋骨癒合症(ＣＳ)は、頭蓋縫合の早すぎる閉鎖であり、３，０００人の１人の乳児を冒すので、ヒトの最も一般的な頭蓋及び顔面の変形の１つである。早過ぎる縫合の閉鎖は、頭蓋の二形性を生じ、手術による矯正を必要とする可能性がある。ヒトのＣＳにおける早過ぎる縫合の閉鎖は、２つのおそらく別個の過程：頭蓋冠の過形成及び骨融合により生じる可能性がある。最近、ＣＢＦＡ−１が介在する経路を介した頭蓋縫合の早過ぎる融合にＦＧＦ２及びＦＧＦＲ１が関与するとみなされている（８）。縫合の遅延閉鎖として現れる鎖骨・頭蓋異形成症には、ＣＢＦＡ１のミスセンス変異が連鎖している。
【０００７】
たとえば、腸骨稜又は頭蓋冠からの自家骨を利用して自家骨移植処置が行なわれている。これらの供給部位は、腸骨稜については、疼痛、歩行障害、錯感覚を含む病的状態と無関係はなく、頭蓋冠移植については、感染、神経障害及び血腫を含む病的状態と無関係ではない。さらに、供給部位は、容積が限定され、且つ手術時間及び入院期間を長くする可能性がある。
【０００８】
異物形成的移植素材も利用されており、動物モデルでは成長因子も調べられている。たとえば、ｂＦＧＦは骨の再生及び修復における使用に可能性を示している。骨形成性成長因子の別のファミリーは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）として記載されている。具体的には、ＢＭＰ−２組換えタンパク質が、下顎連続性障害及び口蓋裂を再生し、粒子状の自家骨及び骨髄と同等か又はそれ以上の結果が得られたことが明らかにされている。ＢＭＰ及びそのほかの骨形成因子が臨床応用における使用について検討されている。しかしながら、最小の有効性を上げるのに使用するＢＭＰ投与量のコストが臨床での使用の限定要因になっている。
【０００９】
脊髄の１以上の椎骨をその間での動きがもはや生じないように一体化する脊椎固定は外科手法である。適応には、骨折（破壊）した椎骨の治療、変形の矯正、動きからの疼痛の除去、不安定性の治療、及び一部の頸椎椎間板ヘルニアの治療が挙げられる。手術には、椎骨間に骨移植片を留置して椎骨間のしっかりした結合を得ることが含まれる。その処置にはまた、プレート、ネジ、ケージ及び最近では、骨形成タンパク質２及び７を留置して骨移植片の安定及び癒合を助けることを含む補完治療も関与する。自家骨移植は臨床的には好まれる方法ではあるが、未だに３０〜５０％の失敗率を有する。自家骨移植は別個の手術であり、重大な病的状態ももたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、骨の発達、障害又は骨の外傷において骨形成を誘導するために、安全で、効果的な、且つ手ごろな価格の組成物及び方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＮＥＬＬ１ペプチド及びＮＥＬＬ２ペプチドの発現及び精製のための方法を提供する。実施態様の１つでは、方法は、ＮＥＬＬペプチド、ＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物、及びＮＥＬＬペプチドの分量を産生するのに有用であってもよいＮＥＬＬペプチドを発現する細胞を含む。実施態様の１つでは、ＮＥＬＬペプチドを発現する核酸構築物は、宿主細胞におけるタンパク質の輸送及びＮＥＬＬペプチドの産生後修飾を促進するシグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含んでもよい。実施態様の１つでは、シグナルペプチドは、宿主細胞からのペプチドの分泌を促進してもよい。従って、本発明は、臨床上又は研究上使用するために精製してもよい機能的ＮＥＬＬペプチドの分量を提供する上で少なくとも有利である。
【００１２】
本発明は、ＮＥＬＬペプチドを含む組成物及び基材を含んでもよい。一部の実施態様では、組成物は、ＮＥＬＬ１を含んでもよく、且つ、たとえば、適用部位に関して、適用、安定性、活性、希釈及び／又は濃度を達成してもよい追加の作用剤を含んでもよい。一部の実施態様では、基材は、移植近傍の骨修復を促進してもよい細胞及び／又はＮＥＬＬ１ペプチドを含んでもよい。
【００１３】
本発明は、種々の臨床応用において骨形成性の分化、骨芽細胞の石灰化及び／又は骨形成を誘導する方法を含んでもよい。
【００１４】
本発明は、ＮＥＬＬペプチドが既知の成長因子よりも高い効果を提供してもよい、又は他の成長因子の活性を高めてもよいという点で少なくとも有利である。従って、さらに低用量の各成長因子を臨床応用に使用してもよい。このことは、臨床治療がさらに安価であってもよいという点で少なくとも重要である。さらに、本発明は、ＮＥＬＬ１が、ＢＭＰのみによる治療の臨床割合及び有効性を高めてもよい、骨形成性の分化、骨芽細胞の石灰化及び骨形成を高めるという点で少なくとも有利である。
【００１５】
＜定義＞
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書では交換可能に使用してもよく、アミノ酸残基の重合体を言う。該用語は、天然に生じるアミノ酸重合体に適用されるのと同様に、１以上のアミノ酸残基が相当する天然に生じるアミノ酸の人工的な化学的類縁体であるアミノ酸重合体にも適用されてもよい。
【００１６】
用語「ＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ」は、配列番号１、３及び５（それぞれ図１、３及び５）を言ってもよく、「ＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ」は、配列番号７、９、１１及び１３（それぞれ図７、９、１１及び１３）を言ってもよい。
【００１７】
ＮＥＬＬ１ペプチドは、ＮＥＬＬ１遺伝子又はｃＤＮＡによって発現されてもよいタンパク質であり、配列番号２、４及び６（それぞれ、図２、４及び１６）を含む。ＮＥＬＬ１ペプチドは、骨形成細胞の分化、骨芽細胞の石灰化及び骨形成を誘導する能力を保持するＮＥＬＬ１ペプチド断片を含んでもよい。ＮＥＬＬ２ペプチドは、ＮＥＬＬ２遺伝子又はｃＤＮＡによって発現されてもよいタンパク質であり、配列番号８、１０、１２及び１４（それぞれ、図８、１０、１２及び１４）を含む。ＮＥＬＬ２ペプチドは、完全なＮＥＬＬ２ペプチド配列に類似する活性を保持するＮＥＬＬ２ペプチドを含んでもよい。
【００１８】
用語「抗体」は、たとえば、未処理の免疫グロブリン、Ｌ鎖及びＨ鎖の可変領域しか含有しないＦｖ断片、ジスルフィド結合で結合したＦｖ断片、可変領域及び定常領域の一部を含有するＦａｂ又は（Ｆａｂ）’２断片、単鎖抗体などのような種々の形態の改変抗体又は改造抗体を含んでもよい。抗体は、未処理の分子を含んでもよいのと同様にその断片、たとえば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２、及び／又はエピトープ決定基に結合してもよい単鎖抗体（たとえば、ｓｃＦｖ）を含んでもよい。抗体は、動物（たとえば、マウス又はラット）又はヒト起源であってもよく、或いはキメラ抗体であってもよく、又はヒト化されてもよい。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいし、又はモノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）、たとえば、ＮＥＬＬ１タンパク質又はＮＥＬＬ２タンパク質によりコードされたポリペプチドに特異性を持つモノクローナル抗体であってもよい。
【００１９】
用語「捕捉剤」は、他の分子を特異的に結合し、たとえば、抗体−抗原、レクチン−炭水化物、核酸−核酸、ビオチン−アビジンなどのような結合複合体を形成する分子を言ってもよい。
【００２０】
用語「特異的に結合する」は、生体分子（たとえば、タンパク質、核酸、抗体など）を言ってもよく、異質集団の分子（たとえば、タンパク質及びそのほかの生物製剤）において存在する生体分子を決定するような結合反応を言う。従って、指定された条件下（たとえば、抗体の場合、免疫アッセイ条件又は核酸の場合、ストリンジェントなハイブリッド形成条件）で、特定のリガンド又は抗体は、その特定の「標的」分子に結合してもよく、試料に存在するそのほかの分子には有意な量では結合してはならない。
【００２１】
用語「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」は、共に共有結合する少なくとも２つのヌクレオチドを言う。本発明の核酸は、場合によっては、たとえば、リンアミド結合、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ｏ−メチルリンアミド結合、及び／又はペプチド核酸主鎖及び結合を含む代替主鎖を有してもよい核酸類縁体を含んでもよいが、一本鎖でもよいし、二本鎖でもよく、ホスホジエステル結合を含有してもよい。類縁体核酸は正の主鎖及び／又は非リボースの主鎖を有してもよい。核酸はまた、１以上の炭素環式の糖を含んでもよい。リボース−リン酸の主鎖の修飾を行なって、たとえば標識のような追加部分の付加を促進してもよいし、又はたとえば、生理的環境におけるそのような分子の安定性高め、半減期を延ばしてもよい。
【００２２】
用語「特異的なハイブリッド形成」は、プローブがその標的の部分配列に優先的にハイブリッド形成し、他の配列により少ない程度にハイブリッド形成してもよい条件下を含むストリンジェントな条件下での特定のヌクレオチド配列への核酸分子の優先的な結合、二本鎖形成、又はハイブリッド形成を言う。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、ＮＥＬＬ１を用いた骨形成を誘導するための作用剤及び方法に関する。本発明はまた、ＮＥＬＬ１タンパク質及びＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製のための方法に関する。
【００２４】
ＮＥＬＬ１は、Ting及びWatanabeによって同時に同定された。ＮＥＬＬ１は主として骨に分布する８１０アミノ酸のペプチドである。成人では、ＮＥＬＬ２は頭蓋顔面の骨に高レベルで発現され、長骨では低レベルで発現される。骨芽細胞の分化、骨形成及び骨再生におけるその役割は調べられている。ＮＥＬＬ２は、１９９６年Watanabeにより同定されたが、それは、神経細胞及び脳に分布する８１６ペプチドである。
【００２５】
ヒトのＮＥＬＬ１遺伝子は、プロモータ領域に少なくとも３つのＣｂｆａ１反応エレメントを含む。Ｃｂｆａ１はＮＥＬＬ１のプロモータにおけるこれらの反応エレメントに特異的に結合する。ＮＥＬＬ１の発現は、発達中及び成人で少なくとも前骨芽細胞、骨芽細胞及び肥大軟骨細胞で内因性に発現されるこの転写因子の制御下にあってもよい。鎖骨頭蓋骨形成不全症は、少なくとも部分的にはＣｂｆａの破壊により生じると考えられている発達上の頭蓋欠陥である。
【００２６】
ＮＥＬＬ１ペプチド及びＮＥＬＬ２ペプチドの機能を検討するために、該ペプチドを生産し、精製することを試みた。残念ながら、多数の発現系においてＮＥＬＬ１ペプチド及びＮＥＬＬ２ペプチドを発現させることはできなかった。具体的には、大腸菌直接発現系及び酵母発現系において発現は検出されず、大腸菌融合発現系及びＣＨＯ−ｄｈｆｒ発現系では、きわめて低レベルの発現が生じた。バキュロウイルス系でペプチドは発現された。
【００２７】
ＮＥＬＬ１ペプチド及びＮＥＬＬ２ペプチドを昆虫細胞で高レベルに発現することができ、昆虫系で発現させたＮＥＬＬ１ペプチド及びＮＥＬＬ２ペプチドがタンパク質の機能的形態であるということは本発明の驚くべき発見であった。
【００２８】
ＮＥＬＬ１タンパク質及びＮＥＬＬ２タンパク質を、たとえば、１リットルの培地当たり約１０マイクログラムのような低レベルで生産するのにＣＯＳ７細胞を使用することができるが、発現には血清を含有する培地を必要とする。残念ながら、この培地はタンパク質の生産には好適ではない。シグナルペプチドについては、ＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２の内因性シグナルペプチドは、ＣＯＳ７細胞では低レベルの発現でしかない。
【００２９】
実施態様の１つでは、本発明は、昆虫の細胞株を用いて、ＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ２ペプチドのような機能的ＮＥＬＬペプチドを発現させる方法を含む。実施態様の１つでは、昆虫細胞は、ハイファイブ細胞(high five cell)、Ｓｆ９細胞及びそのほかのＳｆ細胞であってもよい。
【００３０】
実施態様の１つでは、方法は、ＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ２ペプチドのようなＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列を提供することを含んでもよい。核酸配列は、ＮＥＬＬタンパク質の少なくとも機能的部分をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡであってもよい。たとえば、核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）又はヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含む群から選択されてもよいが、これらに限定されない。核酸配列はまた、たとえば、上に列記した配列のいずれかの部分に少なくとも約７５％の配列類似性を有する配列のような、実質的な配列類似性を持つもののような配列を含んでもよい。
【００３１】
さらに核酸は、ＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ２ペプチドのようなＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列を発現させるための発現ベクターを含んでもよい。たとえば、発現ベクターは、ｐｌＺＴＮ５−Ｈｉｓ（インビトロゲン）であってもよく、選択マーカーもブラストシジン及びネオマイシンを含んでもよい。
【００３２】
さらに、核酸配列は、遺伝子の発現レベルをモニターするリポータ産物をコードする追加の核酸、又はペプチドの発現レベルをモニターするために当該技術で既知の方法を用いて視覚化することができるペプチドタグをコードする追加の核酸も含んでもよい。追加の配列は、核酸の発現又は発現されたペプチド産物の機能性を妨害しないように選択されてもよい。
【００３３】
実施態様の１つでは、方法は、分泌型シグナルペプチドをコードする核酸配列と共に、フレーム内にＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ２ペプチドのようなＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列を提供することを含んでもよい。実施態様の１つでは、分泌型シグナルペプチドは、分泌されたミツバチタンパク質に由来する分泌型シグナルペプチドであってもよい。たとえば、核酸配列は、メリチンのシグナル配列、ショウジョウバエの免疫グロブリン結合タンパク質のシグナル配列、ウマのインターフェロン−γ（ｅＩＦＮγ）のシグナルペプチド、ヘビのホスホリパーゼＡ２阻害剤のシグナルペプチド、ヒト及びニワトリのリゾチームのシグナルペプチドを含む群から選択されてもよいが、これらに限定されない。哺乳類の発現系では、プロトリプシンのリーディング配列も使用されてもよい。
【００３４】
実施態様の１つでは、方法は、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により昆虫の細胞株に形質移入し、ＮＥＬＬペプチドを発現できる及び／又は分泌できる条件下で昆虫の細胞株を培養することを含んでもよい。たとえば、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により一過性に又は安定的に細胞株に形質移入してもよい。
【００３５】
方法は、分泌されたＮＥＬＬペプチドを回収し、及び／又は使用のためにＮＥＬＬペプチドを精製することも含んでもよい。種々の機能性アッセイ又は発現アッセイにおいて活性についてペプチド生成物を調べてもよい。たとえば、いずれかのアッセイにおいて、任意のパラメータで対照物質よりも有意な効果をＮＥＬＬペプチドが有するならば、ＮＥＬＬペプチドは、測定されたパラメータを達成するのに機能的であると言われてもよい。
【００３６】
実施態様の１つでは、本発明は、昆虫細胞においてＮＥＬＬ１ペプチド及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドのようなＮＥＬＬペプチドを発現するための核酸構築物を含んでもよい。核酸配列は、ＮＥＬＬペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするｃＤＮＡであっても、ゲノムＤＮＡであってもよい。たとえば、核酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号１）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号３）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号５）又はヒトＮＥＬＬ２（配列番号７）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号９）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１１）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）を含む群から選択されてもよいが、これらに限定されない。核酸配列はまた、たとえば、上に列記した配列のいずれかの部分に少なくとも約７５％の配列類似性を有する配列のような、実質的な配列類似性を持つもののような配列を含んでもよい。
【００３７】
核酸構築物は、シグナルペプチドをコードする核酸配列を含んでもよい。核酸は、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列を発現するための発現ベクターであってもよい。さらに核酸配列は、遺伝子の発現レベルをモニターするリポータ産物をコードする追加の核酸、又はペプチドの発現レベルをモニターするために当該技術で既知の方法を用いて視覚化することができるペプチドタグをコードする追加の核酸も含んでもよい。
【００３８】
たとえば、ベクターで形質転換された宿主細胞の生き残り又は増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子のような、選抜可能なマーカーとも呼ばれる選抜遺伝子を含有するならば、核酸構築物は、発現ベクター及びクローニングベクターを含んでもよい。この遺伝子の存在によって、確実に、ベクターを欠失した宿主細胞が、形質転換された宿主に対して増殖や再生で将来利点を得ないようにする。典型的な選抜遺伝子は、（ａ）抗生物質又はそのほかの毒素、たとえば、アンピシリン、ネオマイシン、メソトレキセート又はテトラサイクリンに耐性を付与する、（ｂ）自己栄養欠乏を補足するタンパク質をコードする。
【００３９】
核酸構築物は、宿主生物により認識され、ＮＥＬＬをコードする核酸に操作可能に連結されるプロモータを含んでもよい。プロモータは、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐの範囲内）の開始コドンから上流に位置し、誘導性プロモータ及び構成的プロモータを含めてそれらの制御下で核酸の転写及び翻訳を制御する非翻訳配列である。誘導性プロモータは、培養条件の何らかの変化、たとえば、栄養物の存在又は非存在或いは温度の変化に反応してその制御下でＤＮＡからの転写レベルの上昇を開始させるプロモータである。現時点で、種々の可能性のある宿主細胞により認識される多数のプロモータが周知である。
【００４０】
核酸は、もう１つの核酸配列との機能的関係に置かれる場合、操作可能に連結されてもよい。たとえば、再配列又は分泌リーダー用のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに操作可能に連結され；プロモータ又はエンハンサは、それが配列の転写に影響を及ぼすのであれば、コーディング配列に操作可能に連結され；或いはリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように位置するのであれば、コーディング配列に操作可能に連結される。
【００４１】
実施態様の１つでは、本発明は機能的なＮＥＬＬペプチドを発現する細胞を含んでもよい。実施態様の１つでは、細胞は昆虫細胞であってもよい。実施態様の１つでは昆虫細胞はハイファイブ細胞であってもよい。
【００４２】
実施態様の１つでは、細胞は、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により形質移入されてもよい。たとえば、ＮＥＬＬペプチドをコードする核酸構築物により一時的に又は安定的に細胞株が形質移入されてもよい。実施態様の１つでは、遺伝子発現ベクター又は細胞（たとえば、昆虫細胞）に形質移入する能力があるウイルス粒子で、ＮＥＬＬを発現する核酸（たとえば、ｃＤＮＡ)をクローニングしてもよい。
【００４３】
核酸配列は、昆虫の分泌型シグナルペプチドをコードする核酸配列と共に、ＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ２ペプチドのようなＮＥＬＬペプチドをコードする核酸配列もフレーム内に含んでもよい。
【００４４】
実施態様の１つでは、本発明は機能的なＮＥＬＬペプチドを発現する細胞を含んでもよく、機能的タンパク質を分泌してもよい細胞を含んでもよい。
【００４５】
実施態様の１つでは、本発明はＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ２ペプチドのようなＮＥＬＬペプチドを含むポリペプチド（アミノ酸配列）を含んでもよく、分泌型シグナルペプチドを含んでもよい。
【００４６】
たとえば、ＮＥＬＬペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）、ラットＮＥＬＬ１（配列番号４）、マウスＮＥＬＬ１（配列番号６）又はヒトＮＥＬＬ２（配列番号８）、ラットＮＥＬＬ２（配列番号１０）、マウスＮＥＬＬ２（配列番号１２）、ニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１４）を含む群から選択されてもよいが、これらに限定されない。アミノ酸配列はまた、たとえば、上に列記した配列のいずれかの部分に少なくとも約７５％の配列類似性を有する配列のような、実質的な配列類似性を持つもののような配列を含んでもよく、ＮＥＬＬ１ペプチドに類似の活性のある結合ドメインを含有してもよい。
【００４７】
実施態様の１つでは、本発明は、以下に記載されたものを含むがこれらに限定されない標準的なペプチド精製プロトコールに従って培養培地に分泌されたＮＥＬＬ１ペプチド及び／又はＮＥＬＬ２ペプチドを精製する方法を含む。
【００４８】
実施態様の１つでは、選択された細胞が選択された核酸配列を発現しＮＥＬＬペプチドを発現し、及び／又は分泌するかどうかを調べてもよい。実施態様の１つでは、ＮＥＬＬペプチドの存在、量及び／又は活性を調べてもよい。
【００４９】
実施態様の１つにおける、当業者に周知の多数の方法のいずれかにより検出される及び定量されるＮＥＬＬペプチド。これらには、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、高分散クロマトグラフィなどのような分析生化学的方法、又は液体若しくはゲルの沈降反応、免疫拡散（単一又は二重）、免疫電気泳動、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロットなどのような種々の免疫学的方法が挙げられてもよい。
【００５０】
実施態様の１つでは、ウエスタンブロット(免疫ブロット）解析を用いて、選択された試料におけるＮＥＬＬペプチドの存在を検出し、定量してもよい。本技法には、分子量に基づいてゲル電気泳動により試料のタンパク質を分離すること、好適な固形の支持体（たとえば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、又は誘導体化したナイロンフィルター）に分離したタンパク質を移すこと、及び標的ペプチドを特異的に結合する抗体と共に試料をインキュベートすることが含まれてもよい。
【００５１】
本発明のアッセイは、当業者に周知の標準的な方法に従って評点化（陽性又は陰性又は標的ポリペプチドの量として）してもよい。評点化の特定の方法は、アッセイ形式及び標識の選択に依存する。たとえば、酵素標識により生じる発色生成物を視覚化することによりウエスタンブロットアッセイを評点化してもよい。正しい分子量での明瞭な目に見える色のついたバンド又はスポットを陽性の結果として評点化してもよく、一方、明瞭に目に見えるスポットやバンドの非存在を陰性として評点化してもよい。バンドやスポットの濃さが、標的ポリペプチドの濃度の定量的測定を提供してもよい。
【００５２】
そのような発現系で生成されたＮＥＬＬ１は、骨形成タンパク質（たとえば、ＢＭＰ−１〜ＢＭＰ−２４）に対して類似の方式で使用することができる。従って、骨折の修復を急がせるのに、或いは自然治癒に限界がある又は自然治癒がないような状況下で骨の修復又は置換を誘導するのにＮＥＬＬ１ポリペプチドを使用することができる。さらに、骨移植材にＮＥＬＬ１ポリペプチドを組み入れることができる。骨折の治療、或いは人工補助物又は骨移植及び脊椎固定の置換／治癒を促進するためにこれらの移植材を使用することができる。
【００５３】
本発明はまた、骨形成の程度及び／又は速度を高めるための作用剤及び方法を含んでもよい。さらに具体的には、本発明は、骨形成を高めるための作用剤の全身性及び／又は局所の適用を含んでもよい。ＤＥＸＡスキャンにより評価されるように骨形成の所望の部位にて骨密度の改善によって、骨形成の程度及び／又は速度を高める方法又は作用剤の臨床指標を立証する。選択した時間間隔での骨折部位の通常のＸ−線によって、治癒しつつある骨折における骨形成の増大を日常的に評価する。定量的ＣＴスキャンのような、上記指標を決定するためのさらに進んだ技法を使用してもよい。
【００５４】
実施態様の１つでは、本発明は、骨形成細胞におけるＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること、任意選択で第２の作用剤を適用すること、及び骨芽細胞分化の細胞性マーカーの発現を誘導することを含む骨形成細胞の分化を増大させる方法を含んでもよい。
【００５５】
該方法は、骨形成細胞にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することによりＮＥＬＬ−１遺伝子産物の濃度を高めることを含んでもよく、ＮＥＬＬ１ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６、或いは骨芽細胞分化を増大させることに有効であるＮＥＬＬ１ペプチドのいずれかの部分を含む群から選択されてもよい。方法は、たとえば、発現調節分子、Ｃｂｆａ１の細胞性レベルを高めることのような、内因性ＮＥＬＬ１遺伝子の発現を誘導することによってＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることを含んでもよい。方法は、ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物により骨形成細胞に形質移入することによってＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることを含んでもよく、ＮＥＬＬ１ペプチドをコードする核酸構築物は、配列番号１、配列番号３又は配列番号５を含む群から選択されてもよい。
【００５６】
骨形成細胞には、骨芽細胞、間葉細胞、線維芽細胞、胎児性胚細胞、幹細胞、骨髄細胞、硬膜細胞、軟骨細胞、軟骨幹細胞及び脂肪幹細胞が挙げられてもよいが、これらに限定されない。
【００５７】
骨形成細胞はまた、骨組織内に局在する、骨組織に接触する又は骨組織に移動する
（すなわち、「ホーミングする」）細胞、及び細胞が直接又は間接的に骨組織の形成を刺激する細胞も含んでもよい。そういうものとして、骨形成細胞は、最終的に成熟骨芽細胞自体に分化する細胞、すなわち、「直接」骨組織を形成する細胞であってもよい。
【００５８】
第２の作用剤には、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、及びコラーゲンが挙げられてもよいが、これらに限定されない。第２の作用剤は、骨芽細胞分化を誘導する際、ＮＥＬＬ−１と相補的又は相乗的な効果を有するように選択されてもよい。
【００５９】
骨芽細胞分化の細胞性マーカーには、アルカリホスファターゼ活性の上昇、オステオカルシン及びオステオポニンのｍＲＮＡ発現、ＢＭＰ７の発現、デコリンの発現及びラミニンＢ１の発現が挙げられるが、これらに限定されない。しかしながら、その活性又は発現が骨芽細胞分化の結果として変化するいかなる細胞性マーカーもそのようなマーカーとして使用してもよい。
【００６０】
実施態様の１つでは、骨芽細胞の石灰化を高める方法は、骨芽細胞におけるＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること、任意選択で第２の作用剤を適用すること、及び石灰化の細胞性マーカーの発現を誘導することを含んでもよい。
【００６１】
該方法は、骨形成細胞にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することによってＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることを含んでもよく、ＮＥＬＬ１ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６、或いは骨芽細胞の石灰化を高めることに有効であるＮＥＬＬ１ペプチドのいずれかの部分を含む群から選択されてもよい。第２の作用剤は、骨芽細胞の石灰化を誘導する際、ＮＥＬＬ−１と相補的又は相乗的な効果を有するように選択されてもよい。
【００６２】
骨芽細胞石灰化の細胞性マーカーには、カルシウムの取り込みレベルの増加が挙げられるが、これに限定されない。しかしながら、その活性又は発現が骨芽細胞石灰化の結果として変化するいかなる細胞性マーカーもそのようなマーカーとして使用してもよい。
【００６３】
実施態様の１つでは、膜内骨形成を増大させる方法は、骨形成が所望される位置にてＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること、任意選択で骨形成が所望されるほぼ同一位置領域に第２の作用剤を適用すること、及び膜内骨形成の形成を誘導することを含んでもよい。
【００６４】
該方法は、骨形成が所望される位置にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することによりＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることを含んでもよく、ＮＥＬＬ１ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６、或いは膜内骨形成を高めることに有効であるＮＥＬＬ１ペプチドのいずれかの部分を含む群から選択されてもよい。
【００６５】
第２の作用剤には、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨形成細胞、骨、骨基質、腱基質、靭帯基質が挙げられるが、これらに限定されない。第２の作用剤は、膜内骨形成を誘導する際、ＮＥＬＬ−１と相補的又は相乗的な効果を有するように選択されてもよい。
【００６６】
膜内骨の形成は、骨形成が所望される領域における骨密度の組織学、ＤＥＸＡスキャン又はＣＴスキャンを目的とした顕微鏡的検査によって評価してもよい。
【００６７】
実施態様の１つでは、軟骨内の骨形成を増大させる方法は、骨形成が所望される領域におけるＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めること、任意選択で、骨形成が所望される領域に第２の作用剤を適用すること、及び骨形成が所望される領域で軟骨芽細胞の肥大を少なくとも誘導することを含んでもよい。
【００６８】
該方法は、骨形成が所望される位置にＮＥＬＬ１ペプチドを適用することによりＮＥＬＬ１遺伝子産物の濃度を高めることを含んでもよく、ＮＥＬＬ１ペプチドは、配列番号２、配列番号４又は配列番号６、或いは軟骨内骨形成を高めることに有効であるＮＥＬＬ１ペプチドのいずれかの部分を含む群から選択されてもよい。
【００６９】
第２の作用剤には、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨形成細胞、骨、骨基質、腱基質、靭帯基質が挙げられてもよいが、これらに限定されない。第２の作用剤は、軟骨内骨形成を誘導する際、ＮＥＬＬ−１と相補的又は相乗的な効果を有するように選択されてもよい。
【００７０】
軟骨内骨の形成は、ＴＵＮＥＬスキャンにより解明される肥大した及びアポトーシスの軟骨芽細胞の増加により見られるような軟骨芽細胞の肥大によって評価してもよい。
【００７１】
実施態様の１つでは、本発明は、キャリア又は基材にＮＥＬＬ１を組み入れる方法、及び得られる基材を含んでもよい。
【００７２】
実施態様の１つでは、骨形成を誘導する組成物は、ＮＥＬＬ１ペプチド、及びＮＥＬＬ１ペプチドの発現を変化させる作用剤又はＮＥＬＬ１ペプチドの活性を変化させる作用剤を含む群から選択されるが、これらに限定されない、骨形成を誘導する、有効量の第１の作用剤、並びに任意選択でのキャリアを含んでもよい。
【００７３】
該組成物は、配列番号２、配列番号４又は配列番号６、或いは骨形成を誘導することに有効であるＮＥＬＬ１ペプチドのいずれかの断片を含む群から選択されるＮＥＬＬ１ペプチドを含んでもよい。
【００７４】
組成物は、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、骨基質、腱基質又は靭帯基質、骨形成細胞及び／又は骨芽細胞を含むが、これらに限定されない第２の作用剤を含んでもよい。
【００７５】
実施態様の１つでは、たとえば、酵素的メカニズム又は加水分解のメカニズムによって分解できるような生分解性であってもよい。キャリアの例には、たとえば、ポリ（Ｌ−ラクチド）（ＰＬＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＤＬＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ｐ−ジオキサノン）、ポリ（カプロラクトン−コ−グリコリド）、ポリ（グリコリド−コ−トリメチレンカーボネート）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−トリメチレンカーボネート）のようなポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリアリーレート類、ポリヒドロキシブチラート（ＰＨＢ）、ポリ無水物、ポリ（無水物−コ−イミド）、プロピレン−コ−フマレート類、ポリラクトン類、ポリエステル類、ポリカーボネート類、ポリアニオン系ポリマー類、ポリ無水物、ポリエステルアミド類、ポリ（アミノ酸）、ホモポリペプチド類、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（グラクサノン）、多糖類、及びポリ（オルソエステル）、ポリグラチン、ポリグラチン酸、ポリアルドン酸、ポリアクリル酸、ポリアルカノエート類のような、しかし、これらに限定されない合成の吸収性ポリマー類、これらのコポリマー及び混合物、並びに任意の誘導体及び修飾体にが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第４，５６３，４８９号及びＰＣＴ国際出願ＷＯ／０３０２４３１６を参照のこと。キャリアのそのほかの例には、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースのようなセルロース系ポリマー類、及びそれらのカチオン系の塩が挙げられるが、これらに限定されない。キャリアのそのほかの例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、アパタイト類、生体活性ガラス材料、及びサンゴ由来のアパタイト類のような合成及び天然のバイオセラミックスが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、参照により本出願に組み入れられる、米国特許出願２００２１８７１０４号、ＰＣＴ国際出願ＷＯ／９７３１６６１及びＰＣＴ国際出願ＷＯ／００７１０８３を参照のこと。
【００７６】
実施態様の１つでは、キャリアはさらに、ゾルゲル技法に由来する生体ガラス及び／又はアパタイトを含む組成物、或いは、天然の血清濃度の約１．５〜７倍の範囲内でのカルシウム及びリン酸の濃度を持ち、約１５〜６５℃の温度で約２．８〜７．８のｐＨ範囲を持つ溶液に種々の手段で調製された人工体液のような、しかし、これに限定されない浸漬技法に由来する生体ガラス及び／又はアパタイトを含む組成物によって被覆されてもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第６，４２６，１１４号及び同第６，０１３，５９１号、並びにＰＣＴ国際出願ＷＯ／９１１７９６５を参照のこと。
【００７７】
キャリアのそのほかの例には、コラーゲン（たとえば、Collastat、Helistatコラーゲンスポンジ）、ヒアルロナン、フィブリン、キトサン、アルギネート及びゼラチンが挙げられる。たとえば、参照により本出願に組み入れられるＰＣＴ国際出願ＷＯ／９５０５８４６、ＷＯ／０２０８５４２２を参照のこと。
【００７８】
実施態様の１つでは、キャリアは、ヘパリン様ポリマー、たとえば、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、硫酸ヘパリン、フカン、アルギネート、又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されないヘパリン結合剤；及びアミノ酸修飾を持つペプチド断片を含んでヘパリンへの親和性を高めてもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられるJournal of Biological Chemistry, 278(44):43229-43235, 2003を参照のこと。
【００７９】
実施態様の１つでは、基材は液体、固体又はゲルの形態であってもよい。
【００８０】
実施態様の１つでは、基材は流動性ゲルの形態であるキャリアを含んでもよい。ゲルは、骨形成が所望される部位に注射器を介して注入できるように選択してもよい。ゲルは、一次結合により形成され、ｐＨ、イオン基及び／又は溶媒濃度により制御される化学作用によるゲルであってもよい化学作用によるゲルであってもよい。ゲルはまた、二次結合により形成され、温度及び粘度により制御されてもよい物理作用によるゲルであってもよい。ゲルの例には、プルロニック類、ゼラチン、ヒアルロナン、コラーゲン、ポリアクチド−ポリエチレングリコール溶液及び抱合体、キトサン、シトサン＆ｂ−グリセロホスフェート（ＢＳＴ−ゲル）、アルギネート類、アガロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ポリエチレンオキシド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン中のポリアクチド／グリコリドが挙げられるが、これらに限定されない。たとえば、参照により本出願に組み入れられるAnatomical Record, 263(4):324-349, 2001を参照のこと。
【００８１】
実施態様の１つでは、キャリアは、たとえば、少なくとも約２５０ｎｍの波長での電磁波照射による光重合が可能であってもよい。光重合が可能なポリマーの例には、ポリエチレン(ＰＥＧ）アクリレート誘導体、ＰＥＧメタクリレート誘導体、プロピレンフマレート−コ−エチレングリコール、ポリビニルアルコール誘導体、ＰＥＧ−コ−ポリ（ヒドロキシ酸）ジアクリレートマクロマー、並びに、たとえば、ヒアルロン酸誘導体及びデキストランメタクリレートのような修飾多糖類が挙げられる。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第５，４１０，０１６号を参照のこと。
【００８２】
実施態様の１つでは、基材は、温度感受性であるキャリアを含んでもよい。例には、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮｉＰＡＭ）、又は低下させた低臨界溶解温度（ＬＣＳＴ）で修飾したＮｉＰＡＭ、並びにエチルメタクリレート及びＮ−アクリルオキシスクシンイミドの取り込みにより向上させたペプチド（たとえば、ＮＥＬＬ１）の結合；又はブチルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート及びドデシルメタクリレートのようなアルキルメタクリレートから作製されたキャリアが挙げられる。参照により本出願に組み入れられるＰＣＴ国際出願ＷＯ／２００１０７０２８８；米国特許第５，１２４，１５１号。
【００８３】
実施態様の１つにおける、受容体介在性のメカニズムを介して細胞−マトリクスの結合を促進してもよい細胞接着分子、接着ペプチド及び接着ペプチド類縁体によって装飾される及び／又は固相化される表面を、及び／又はたとえば、ポリカチオン系ポリアミノ酸ペプチド（たとえば、ポリリジン）、ポリアニオン系ポリアミノ酸ペプチド、Ｍｅｆｐクラス接着分子及びそのほかのＤＯＰＡリッチペプチド（たとえば、ポリリジンＤＯＰＡ）、多糖類及びプロテオグリカン類のような、しかし、これらに限定されないものを結合する受容体非介在性のメカニズムを介して接着を促進してもよい分子部分によって装飾される及び／又は固相化される表面を、キャリアが有してもよい場合。たとえば、参照により本出願に組み入れられるＰＣＴ国際出願ＷＯ／２００４００５４２１、ＷＯ／２００３００８３７６、ＷＯ／９７３４０１６を参照のこと。
【００８４】
実施態様の１つでは、キャリアは、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギネート、ポリ（エチレングリコール）、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピル−メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース（ヒドロキシアルキルセルロースを含む）、血液、フィブリン、ポリオキシエチレンオキシド、硫酸カルシウム半水化物、アパタイト類、カルボキシビニルポリマー、及びポリ（ビニルアルコール）のような、しかし、これらに限定されない金属イオン封鎖剤を含んでもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第６，６２０，４０６号を参照のこと。
【００８５】
実施態様の１つでは、キャリアは、たとえば、ポリオキシエステル（たとえば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０又はプルロニックＦ−６８）のような、しかし、これらに限定されない、キャリア物質の中におけるＮＥＬＬ１の安定性及び／又は分布を促進するための界面活性剤を含んでもよい。
【００８６】
実施態様の１つでは、キャリアは、たとえば、グリシン、グルタミン酸塩酸塩、塩化ナトリウム、グアニジン、ヘパリン、グルタミン酸塩酸塩、酢酸、コハク酸、ポリソルベート、デキストラン硫酸、スクロース及びアミノ酸のような、しかし、これらに限定されない緩衝剤を含んでもよい。たとえば、参照により本出願に組み入れられる米国特許第５，３８５，８８７号を参照のこと。実施態様の１つでは、上記で列記したもののような物質の組み合わせを含んでもよい。
【００８７】
例示の目的で、キャリアは、ＰＬＧＡ／コラーゲンキャリア膜であってもよい。ＮＥＬＬ１ペプチドを含む溶液中に該膜を浸してもよい。
【００８８】
実施態様の１つでは、人体に使用するインプラントは、インプラントの近傍で骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む基材を含んでもよい。
【００８９】
実施態様の１つでは、人体に使用するインプラントは、インプラントの近傍で骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む表面を有する基材を含んでもよい。
【００９０】
実施態様の１つでは、人体に使用するインプラントは、骨形成細胞、及び骨形成を誘導するのに十分な量のＮＥＬＬ１を含む表面を有する基材を含んでもよい。実施態様の１つでは、インプラントは、自己の細胞、骨形成細胞又は骨芽細胞、ＮＥＬＬ１又はもう１つの骨形成分子を発現する細胞を含むが、これらに限定されない細胞と共に播かれてもよい。
【００９１】
インプラントは、メッシュ、ピン、プレート又は人工装具の継ぎ目に形成された基材を含んでもよい。例示の目的で、基材は歯科用インプラント又は整形外科用インプラントの形態であってもよく、ＮＥＬＬ１は、インプラント近傍の骨における統合を向上させるのに使用されてもよい。インプラントは、たとえば、コラーゲンを含む基材のような吸収可能である基材を含んでもよい。
【００９２】
一例では、本発明に係る組成物は、時間放出の錠剤の中に含有されてもよい。
【００９３】
ＮＥＬＬ１を許容可能なキャリアと組み合わせて医薬組成物を形成してもよい。許容可能なキャリアは、たとえば、組成物を安定化させるように、又は作用剤の吸収を増減するように作用する生理学的に許容可能な化合物を含有することができる。生理学的に許容可能な化合物には、グルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸及びグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、細胞分裂防止剤のクリアランス又は加水分解を減らす組成物、又は賦形剤又はそのほかの安定剤及び／又は緩衝液を挙げることができる。
【００９４】
そのほかの生理学的に許容可能な化合物には、湿潤剤、乳化剤、分散剤、微生物の増殖や作用を妨げるのに特に有用である防腐剤が挙げられる。種々の防腐剤が周知であり、たとえば、フェノール及びアスコルビン酸が挙げられる。当業者は、生理学的に許容可能な化合物を含むキャリアの選択が、たとえば、投与経路に依存することを十分理解するであろう。
【００９５】
投与の方法に依存する種々の単位投与形態で組成物を投与することができる。たとえば、好適な単位投与形態には、散剤、錠剤、丸薬、カプセルが挙げられてもよい。
【００９６】
本発明の組成物は、たとえば、水溶性ペプチドのための水性キャリアのような薬学上許容可能なキャリアに溶解されたＮＥＬＬ１ペプチドの溶液を含んでもよい。たとえば、緩衝化した生理食塩水などのような種々のキャリアを使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に望ましくないものは含まれていない。従来の、周知の滅菌技法でこれらの組成物を滅菌してもよい。組成物は、たとえば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤などのような、必要に応じて生理的条件に近似させるための薬学上許容可能な補助的物質を含有してもよい。
【００９７】
これらの処方におけるＮＥＬＬ１ペプチドの濃度は、幅広く変化させることができ、選択された投与形式及び患者のニーズに従って、主として液体容積、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう。
【００９８】
投与計画は、種々の患者の変数（たとえば、体重、年齢、性別）及び臨床提示（たとえば、負傷の程度、負傷の部位など）と同様に、対処する臨床適応によって決定されるであろう。
【００９９】
しかしながら、本発明において有用なＮＥＬＬ１ペプチド又はＮＥＬＬ１剤の治療上の有効用量は、上述のような骨芽細胞の分化、石灰化、骨形成を向上させる作用剤の能力によって測定されるとき、患者において陽性の臨床効果を有する、又は細胞において所望の効果を有するものである。各ペプチド又は作用剤の治療上有効な用量を調節して、負の副作用をできるだけ抑える一方で、所望の臨床効果を達成することができる。ペプチド又は作用剤の投与量は、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢及び体重、患者が服用しているそのほかの薬物、並びに通常、主治医により考慮されるそのほかの要因によって、個々の計画及び特定の患者に適した用量レベルを決定する際、個々の患者について選択されてもよい。
【０１００】
投与形態。投与形態に含まれる作用剤の治療上有効な用量は、選択された作用剤の種類及び投与経路を考慮することによって選択されてもよい。投与形態は、製薬技術の当業者に既知であるように、患者への投与形態を円滑にするためのアジュバント及び薬学上許容可能なキャリアを含む、そのほかの不活性成分と組み合わせた作用剤を含んでもよい。
【０１０１】
実施態様の１つでは、本発明は、骨形成を増大させるために選択された間隔で有効な投与形態にて治療上有効な用量でＮＥＬＬ１ペプチドを投与することを含む、患者を治療して骨形成を誘導する方法を含んでもよい。該方法は、ＴＧＦ−β、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７、ｂＦＧＦ、コラーゲン、骨、骨基質、腱基質又は靭帯基質、骨形成細胞及び／又は骨芽細胞を含むが、これらに限定されない少なくとも１種の第２の作用剤を骨形成が所望される領域に投与することをさらに含んでもよい。
【０１０２】
実施態様の１つでは、患者を治療して骨形成を誘導する方法は、哺乳類の骨形成細胞を回収すること、骨形成細胞に接触するＮＥＬＬ１ペプチドの発現濃度を高めること、及び骨形成が所望される領域に骨形成細胞を投与することを含んでもよい。
【０１０３】
実施態様の１つでは、頭蓋顔面の障害又は口蓋裂を有する胎児、乳児又は成人に生じる頭蓋の外傷又は頭蓋の障害を修復するための骨形成が所望されてもよい。実施態様の１つでは、治癒しない骨損傷（骨が損傷において再生できない又は治癒できない場合、臨界サイズ欠陥としても知られる）の領域で骨形成が所望されてもよい。全骨創傷治癒は、膜（膜内とも呼ばれる）の骨形成によると考えられているので、臨界サイズ欠陥モデルは、長骨骨折を含む全骨治癒を達成する作用剤における厳格試験として検討されている。たとえば、長骨の骨折及び頭蓋冠の欠陥は双方共に、膜の骨形成により治癒する。実施態様の１つでは、歯槽骨移植又は歯槽堤の増強、或いは歯周骨欠陥において骨形成が所望されてもよい。実施態様の１つでは、関節用又は歯科用インプラントのようなインプラント、或いは美容整形用オンプラントの統合を向上させるために骨形成が所望されてもよい。
【０１０４】
実施態様の１つでは、骨移植のための自己材料、自家材料又は異物形成的材料の代替的に、或いはそれに加えて、骨形成が使用されてもよい。
【実施例】
【０１０５】
以下の実施例は説明のために提供されるのであって、請求される本発明を限定するものではない。
【０１０６】
実施例１：ＮＥＬＬペプチドの発現
【０１０７】
発現ベクターＰｉＺＴＮ５−Ｈｉｓ（３．４ｋｂ）（ＥｃｏＲＶ部位、インビトロゲン）にｃＤＮＡ断片を連結し、ｃＤＮＡ断片は、メリチンのシグナルペプチド、ラットの成熟ＮＥＬＬ１のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩｃＤＮＡ断片及びＦＬＡＧタグ配列を包含した。図１６は、本実施例で使用したｃＤＮＡ構築物の核酸配列、及び相当する推定上のペプチド配列の描写である。
【０１０８】
ハイファイブ細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）を無血清培地に馴化させ、ＮＥＬＬ１ペプチド発現ベクターにより細胞に形質移入した。ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧ構築物を発現する細胞集団のみを選択するように細胞をゼオシンで処理した。生き残った細胞集団が安定した形質転換体であることを確認した。細胞外の培地を回収し、ＮＥＬＬ１ペプチドの存在について調べた。ＮＥＬＬ１ペプチドを精製し、以下に記載する機能的アッセイに用いた。
【０１０９】
図１７Ａは、精製されたＮＥＬＬ１ペプチドを含有するＵｎｏＱ溶出液のＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥの説明である。本明細書に記載されたように培地をＵｎｏＱカラム（バイオラッド）にかけた。図４Ｂは、タンパク質マーカーを参照したＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの発現を示す抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットの説明である。ペプチド：１４０ｋＤａ（細胞内の前駆体）、１３０ｋＤａ（成熟型：９０ｋＤａのペプチド）、４００ｋＤａ（分泌型、ホモ三量体）。上記実施例では、発現系における生産性は培地１Ｌ当たりＮＥＬＬ１ペプチド約３ｍｇであった。
【０１１０】
ペプチドを全く発現しない又は分泌しない他の発現系（たとえば、酵母を含む、細菌での発現）、或いはそのペプチド生産が極めて低い他の発現系（たとえば、大腸菌融合ペプチド系、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞、＞１０ｍｃｇ／Ｌ）に比べて、記載した系（哺乳類細胞及び昆虫細胞）による生産は、驚くべきことに、且つ実質的に大量の機能的タンパク質の生産でさらに効果的である。
【０１１１】
ラットの組換えＮＥＬＬ１タンパク質の発現及び精製。Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付けたＮＥＬＬ１ペプチドの昆虫細胞による産生について。ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミド（Kuroda, BBRC）に由来するＦＬＡＧエピトープ配列に融合したラットのＮＥＬＬ１ｃＤＮＡを昆虫の発現ベクター、ｐｌＺＴＮ５−Ｈｉｓ（インビトロゲン）に挿入することにより、ｐｌＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。さらに、ＰＣＲ法を用いて、ＮＥＬＬ１の本来の分泌シグナル配列をミツバチのミリチンのシグナル配列に置き換えた。ハイファイブ細胞はインビトロゲンから購入し、ハイファイブ無血清培地（インビトロゲン）で培養した。ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ）を用いてｐｌＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドによりハイファイブ細胞に形質移入した。形質移入後４８時間に、４００ｍｇ／ｍＬのゼオシン（インビトロゲン）で細胞を選抜した。安定した発現細胞株を確立するまで３〜４日に１回選抜培地を交換する。免疫沈降及びウエスタンブロット解析を用いてＮＥＬＬ１の分泌を確認した。ハイファイブ細胞は、培養培地中でＮＥＬＬ１ペプチド（１４０ｋＤａ）を発現することが見い出された。
【０１１２】
ＵｎｏＱ−１カラム（バイオラッド）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィによって、ゼオシン耐性ハイファイブ細胞の培養培地からラットの組換えＮＥＬＬ１−ＦＬＣペプチドを精製した。ＮＥＬＬ１ペプチドは５００ｍＭのＮａＣｌにて溶出された。
【０１１３】
Ｃｏｓ７細胞によりＣ末端にＦＬＡＧタグを付けたＮＥＬＬ１ペプチドを生産するために、ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドに由来するＦＬＡＧエピトープ配列に連結したラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡを哺乳類の発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン）に挿入することによってｐｃＤＮＡ３．１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣプラスミドを構築した。１０％ＦＢＳを補完したＤＭＥＭにてＣｏｓ７細胞を培養した。内因性ＮＥＬＬシグナルペプチドプラスミドを用い、エレクトロポレーション法を用いて、ｐｃＤＮＡ３．１−ＮＥＬＬ１−ＦＬＣによりＣｏｓ７細胞に形質移入した。形質移入の４８時間後、培養培地を、ＮＥＬＬ１ペプチド用の免疫沈降及びウエスタンブロット解析の対象とした。
【０１１４】
図１７Ｃは、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧを含むＵｎｏＱの溶出液のＣＢＢで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの説明である。これらの発現試験は、たとえば、シグナル配列を含むことのように、分泌効率を高めるためにＮＥＬＬのＮ末端を修飾しなければ、ＣＯＳ７が機能的ＮＥＬＬペプチドを発現しないことを示した。図１７Ｄは、ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの発現を示す抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットの説明である。
【０１１５】
ラットの組換えＮＥＬＬ２タンパク質の発現及び精製。Ｃ末端にＦＬＡＧタグを付けたＮＥＬＬ２ペプチドの昆虫細胞による産生について。ｐＴＢ７０１−ＮＥＬＬ２−ＦＬＣプラスミドに由来するＦＬＡＧエピトープ配列に融合したラットのＮＥＬＬ２ｃＤＮＡを昆虫の発現ベクター、ｐｌＺＴＮ５−Ｈｉｓ（インビトロゲン）に挿入することにより、ｐｌＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧプラスミドを構築した。ハイファイブ細胞はインビトロゲンから購入し、ハイファイブ無血清培地(インビトロゲン）で培養した。ＦｕＧｅｎｅ６（ロシュ）を用いてｐｌＺＴ−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧプラスミドによりハイファイブ細胞に形質移入した。形質移入後４８時間に、４００ｍｇ／ｍＬのゼオシン（インビトロゲン）で細胞を選抜した。安定した発現細胞株を確立するまで３〜４日に１回選抜培地を交換した。免疫沈降及びウエスタンブロット解析を用いて培養培地におけるＮＥＬＬ２の発現を確認した。ハイファイブ細胞は、培養培地中でＮＥＬＬ２ペプチド（１４０ｋＤａ）を発現することが見い出された。
【０１１６】
ＵｎｏＱ−１カラム（バイオラッド）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィによって、ゼオシン耐性ハイファイブ細胞の培養培地からラットの組換えＮＥＬＬ２−ＦＬＣペプチドを精製した。ＮＥＬＬ２ペプチドは５００ｍＭのＮａＣｌにて溶出された。
【０１１７】
実施例２：培養培地からのＮＥＬＬ２タンパク質の精製
【０１１８】
ｐｌＺＴ−ＦＬＣ−ＮＥＬＬ２を持つハイファイブ細胞を無血清培地（１Ｌ）で約３日間培養した。培養培地を３０００ｘｇにて５分間遠心し、上清を回収した。最終濃度１ｍＭでＰＭＳＦを加えた。飽和硫安溶液（８０％飽和、ｖ／ｖ）を加え、溶液を４℃にて１時間保持した。溶液を１５０００ｘｇにて３０分間遠心し、沈殿物を回収した。沈殿物を２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍのＥＤＴＡ５０ｍＬに４℃にて溶解し、４℃（１ｍＬ／分の速度）にてＦＰＬＣ（アマシャム−ファルマシア）により、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡで平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィＵｎｏＱカラム（６ｍＬ、バイオラッド）にかけた。同一緩衝液でカラムを十分に洗浄した。
【０１１９】
次いで、同一緩衝液中の０Ｍ〜１．５ＭのＮａＣｌの勾配により結合しているタンパク質を溶出した。抗ＦｌａｇＭ２（シグマ）Ａｂを用いたウエスタンブロットにより、ＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧの分画を同定した。陽性の分画を１本の試験管に回収した。最終生成物を継ぎ目のないセルロースチューブ（和光、ＭＷ１２０００カットオフ）にて１ＬのＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。生成物を−７０℃に保存した。
【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢ染色によりＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧペプチドの純度を調べた。図１８は、精製したＮＥＬＬ２ペプチドを含有するＵｎｏＱの溶出液のＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの説明である。カラムＡは、約１３０ｋＤａでのペプチドのバンドが細胞の培地から単離されたことを示す。「ＩＰ」は、免疫沈降に用いた抗ＦＬＡＧ抗体を言い、「ＷＢ」は、ウエスタンブロット検出に用いた抗ＦＬＡＧ抗体を言う。
【０１２１】
図１９は、ファイブＳＦＭからのＮＥＬＬ１及びＮＥＬＬ２の発現を説明するブロットである。「ＥＳＦ９２１」は無血清培地の商品名を言い、「ファイブＳＦＭ」は培地の商品名を言う。双方のＮＥＬＬタンパク質の発現のための構築物は上述のものと同様である。
【０１２２】
実施例３：アルカリホスファターゼ活性の上昇は、骨芽細胞の分化の初期細胞性マーカーである。試験の１つでは、経過時間の間、本明細書で記載された方法を用いて産生されたＮＥＬＬ１（１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下、又はＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍＬ）の存在下、ラット胎児の頭蓋冠細胞を増殖させた。従来の方法により各試料においてアルカリホスファターゼをアッセイした。
【０１２３】
図２０は、ラットの頭蓋冠細胞の培養における処理の作用としてのアルカリホスファターゼの誘導を示す棒グラフである（「ＯＤ」＝光学密度）。従って、アルカリホスファターゼ誘導によって測定されたとき、ＮＥＬＬ１による処理は、骨芽細胞の分化の誘導においてＢＭＰ４よりも強力だった。
【０１２４】
図２１は、ＮＥＬＬ１で処理したラット頭蓋冠細胞の培養の顕微鏡写真である。ＮＥＬＬ１による処理は、アスコルビン酸の非存在下でアルカリホスファターゼ活性及び細胞の微小小体形成を誘導したが、それは、骨芽細胞の分化及び骨形成の前駆体の指標である。
【０１２５】
実施例４：アルカリホスファターゼのアッセイは、骨芽細胞分化の初期の細胞性マーカーである。試験の１つでは、２４ウエルプレートでラットの頭蓋冠の骨芽細胞を増殖させた。ＮＥＬＬ１、ＢＭＰ２、ＮＥＬＬ１／ＢＭＰ２及び対照（ペプチドなし）を含む群にウエルを分割した。処理は、１００ｎｇ／ｍＬのペプチドの適用を含んだ。従来の方法により各試料においてアルカリホスファターゼをアッセイした。
【０１２６】
【表１】
2007524360.tif 000002
【０１２７】
従って、アルカリホスファターゼの活性により測定したとき、対照又は単一ペプチドのみで処理した細胞と比べてＮＥＬＬ１及びＢＭＰは、骨芽細胞の分化に対して相加効果を有する。
【０１２８】
実施例５：骨芽細胞の分化におけるＮＥＬＬ１の発現の効果を検討するために、β−ｇａｌを発現する構築物を感染させた細胞と比較して、ＮＥＬＬ１を発現する構築物を感染させて３、６及び９日後のＭＣ３Ｔ３細胞のマイクロアレイで、骨に関連する遺伝子の発現を評価した。
【０１２９】
【表２】
2007524360.tif 000003
【０１３０】
ＮＥＬＬ１を形質移入した細胞における幾つかの骨関連遺伝子は、β−ｇａｌ対照を形質移入した細胞に比べて少なくとも２倍高いレベルで発現されていた。従って、骨芽細胞の後期分化の細胞性マーカー（たとえば、オステオカルシン及びオステオポニン）が上方制御されるので、ＮＥＬＬ１の発現及び産生は骨芽細胞の分化を促進した。
【０１３１】
実施例６：微小小体の形成、又は多数の骨芽細胞の凝集は、骨芽細胞の分化及び骨形成の前駆体の指標である。その過程はアスコルビン酸により調節されると考えられる。
【０１３２】
微小小体の形成に対するＮＥＬＬ１の効果を検討するために、ＮＥＬＬ１をコードする構築物によりＭＣ３ＴＣ細胞に形質移入し、アスコルビン酸の非存在下で細胞を増殖させた。
【０１３３】
図２２Ａ及びＢは、ＮＥＬＬ１を発現し、微小小体を形成する、且つアルカリホスファターゼで染色された（Ｂ）ＭＣ３ＴＣ細胞の顕微鏡写真である。ＮＥＬＬ１の発現は、微小小体の形成と同様にアルカリホスファターゼの誘導も誘導した。従って、ＮＥＬＬ１は、骨形成の前駆体である細胞の微小小体の形成において活性があり、ＮＥＬＬ１単独で骨芽細胞の分化を誘導するのに十分である。
【０１３４】
実施例７：石灰化又はカルシウムの細胞内蓄積は、骨芽細胞の分化及び骨形成の前駆体の指標である。石灰化に対するＮＥＬＬ１の効果を検討するために、ＮＥＬＬ１をコードする構築物、β−ｇａｌをコードする対照構築物、又はアンチセンスＮＥＬＬ１をコードするアデノウイルスによって、一次頭蓋冠細胞に形質移入した。培養の３、６、９及び１２日後に、フォン・カッサ（Von Kassa）染色により細胞を調べ、細胞内のカルシウム蓄積の存在を検出した。これによりＮＥＬＬ１は骨の石灰化を促進できることが明らかにされた。
【０１３５】
図２３Ａ〜Ｃは、（Ａ）アンチセンスＮＥＬＬ１ウイルス、（Ｂ）β−ｇａｌ又は（Ｃ）ＮＥＬＬ１で処理された頭蓋冠細胞の顕微鏡写真である。対照の細胞は、中程度の量の石灰化を有し、ＮＥＬＬ１を発現している細胞は、高いレベルの石灰化を有したが、アンチセンスＮＥＬＬ１の細胞では、石灰化は抑制された。この「ノックアウト」試験は、ＮＥＬＬ１が骨芽細胞の分化に必要とされることを示している。
【０１３６】
図２３Ｄ及びＥは、培養の３、６、９及び１２日後における対照、ＧＡＰＦＨに対する比としてのオステオカルシン及びオステオポニンのｍＲＮＡの発現を示す棒グラフである。１２日後、ＮＥＬＬ１を発現している細胞は、有意に高いレベルのオステオカルシン及びオステオポニンのｍＲＮＡを発現した。従って、ＮＥＬＬ１は、骨形成の前駆体である、骨芽細胞の分化及び石灰化の後期細胞性マーカーの発現を誘導することに活性がある。
【０１３７】
実施例８：トランスジェニック動物モデルを用いて骨形成におけるＮＥＬＬ１の過剰発現の影響を調べた。ＣＭＶプロモータをＮＥＬＬ１ｃＤＮＡに連結し、受精卵に微量注入した。強力なＣＭＶプロモータのもとにＮＥＬＬ１は、汎過剰発現された。
【０１３８】
図２４は、フォン・カッサ染色を示す、ＮＥＬＬ１トランスジェニックマウスの組織の顕微鏡写真である。図２４に示されるように、ＮＥＬＬ１トランスジェニックマウスが頭蓋冠の過剰増殖を有するということは、骨成長を誘導するＮＥＬＬ１の能力は膜の骨形成を包含することを裏付けている。
【０１３９】
図２５Ａ及びＢは、ＮＥＬＬ１トランスジェニックマウス（Ａ）及び正常の同腹仔（Ｂ）の頭蓋冠のフォン・カッサ染色を示す顕微鏡写真である。図２５Ａに示されるように、正常同腹仔に比べてＮＥＬＬ１トランスジェニックマウスが高い石灰化を有したということは、膜の骨形成におけるＮＥＬＬ１の役割を裏付けている。
【０１４０】
実施例９：トランスジェニック動物モデルを使用して、Ｃｂｆａ１の欠損が誘導する発達障害に対するＮＥＬＬ１の発現の効果を調べた。
【０１４１】
ＮＥＬＬ１の調節においてＣｂｆａ１が役割を担ってもよいかどうかを確定するために、マウスのＣｂｆａ１を含有するプラスミドベクターによりラット胎児の頭蓋冠細胞に形質移入した。
【０１４２】
図２６は、対照細胞と比べた、２４及び４８時間でのＣｂｆａ１形質移入細胞におけるＮＥＬＬ１の発現を示すブロットである。Ｃｂｆａ１の形質移入は、２４時間以内にＮＥＬＬ１の発現を上方制御した（陽性対照、オステオカルシンと共に）。このことは、ＮＥＬＬ１が、鍵となる「骨芽細胞転写因子」であるＣｂｆａ１の下流にあることを示している。
【０１４３】
図２７Ａ〜Ｃは骨格染色（上、中）及びマイクロＣＴ（下）の写真である。図２７Ａは、野生型マウスの正常な骨格パターンを示す。石灰化の典型的な境界を示す（点線）が、前後の泉門（星印）、及び右冠状縫合の輪郭（矢印）を見ることができる。また、正常な頭蓋冠も示す（Ａ、中）。マイクロＣＴは、典型的な頭蓋顔面骨の形態を明らかにしている。図２７Ｂは、Ｃｂｆａ１＋／−動物の骨格欠損を示す。具体的には、頭蓋冠の欠損の側面から中央にかけてよく染色されていない組織（点線の間）に欠陥のある骨石灰化及び骨形成が存在し、冠状縫合（矢印）の領域に透明像も見られうる。有意な程度の頭蓋冠の形成不全を示す（Ｂ、中）。図２７Ｃは、Ｃｂｆａ＋／−＋ＮＥＬＬ１過剰発現動物の骨格欠損を示し、骨格染色及びマイクロＣＴにおいてＣｂｆａ１＋／−半数体欠損動物に比べて頭蓋冠の骨形成に有意な増加が見られる。また、Ｃｂｆａ１＋／−半数体欠損動物に比べて有意に少ない鎖骨形成不全（中）。冠状縫合（矢印）における骨の重なりの修復に注意のこと。従って、トランスジェニックマウスにおいてＮＥＬＬ１の過剰発現は、Ｃｂｆａ１の欠損を救済したということは、膜の骨形成及び軟骨内の骨形成におけるＮＥＬＬ１の役割を裏付けている。さらに、ＮＥＬＬ１は、誕生時欠損した骨において骨を再生することができる。
【０１４４】
実施例１０：臨界サイズ欠損は、膜内骨修復を誘導する作用剤の能力の試験のための重要なモデルである。骨修復におけるＮＥＬＬ１の効果を検討するために、野生型成熟オスＣＤ−１マウスにおいて左右の頭蓋冠欠損（３ｍｍ）を創った。左の欠損（対照）は、ＰＬＧＡ／コラーゲンキャリア膜のみを移植したが、右の欠損は、部位当たり２００ｎｇのＮＥＬＬ１又はＢＭＰ２のいずれかに浸したＰＬＧＡ／コラーゲンキャリア膜を移植した。頭蓋冠を摘出し、マイクロＣＴ解析により調べた。
【０１４５】
図２８Ａは、頭蓋冠欠損の対照（左）及びＢＭＰ２（右）処理の写真であり；頭蓋冠欠損の対照（左）及びＮＥＬＬ１（右）処理の写真であり；図２９は頭蓋冠欠損のＮＥＬＬ１（左）及びＢＭＰ２（右）の処理の写真である。ＮＥＬＬ１及びＢＭＰ２双方の群で有意な量の骨形成が認められた。従って、ＮＥＬＬ１の発現が、臨界サイズ欠損モデルにおいて骨形成を有意に達成し、骨再生を誘導したということは、膜の骨形成におけるＮＥＬＬ１の役割を裏付けている。
【０１４６】
実施例１１：口蓋の急速拡大（ＲＰＥ）は、膜内骨修復を誘導する作用剤の能力の試験のためのもう１つのモデルである。骨修復におけるＮＥＬＬ１の効果を検討するために、４週令のスプラーグドーリー系ラットを（１）対照の拡大及び（２）ＮＥＬＬ１処理による拡大の群に分けた。ラットを屠殺し、口蓋を摘出し、器官培養で生かし続けた。口蓋は拡大し、ＮＥＬＬ１を処理群に９日間添加した。
【０１４７】
図３０Ａ及びＢは、ＮＥＬＬ１で処理して拡大した（Ａ）及び対照（Ｂ）の拡大した口蓋の写真である。ＮＥＬＬ１及びＢＭＰ２の双方の群で有意な量の骨形成が認められた。従って、ＲＰＥモデルにおいてＮＥＬＬ１処理が骨形成を有意に達成したということは、膜の骨形成におけるＮＥＬＬ１の役割を裏付けている。
【０１４８】
実施例１２：長骨の発達では軟骨内の骨形成が鍵となる過程である。それには、軟骨芽細胞の増殖、肥大、アポトーシス、血管への侵入、骨芽細胞による置換を含む幾つかの段階がある。これら段階のいずれか１つの加速が軟骨内の骨成長を誘導するであろう。
【０１４９】
図３１Ａ及びＢは、ＮＥＬＬ１過剰発現のトランスジェニックマウス（Ａ）及び野生型マウス（Ｂ）におけるアポトーシス細胞を染色するＴＵＮＥＬにより染色された軟骨組織の写真である。
【０１５０】
図３１Ａに示されるように、マウスにおけるＮＥＬＬ１の過剰発現では、軟骨組織は、肥大した軟骨芽細胞及びアポトーシス（アポトーシス核の収縮を同定するためのＴＵＮＥＬアッセイを用いて茶色に染色することにより示される）を示す。ＴＵＮＥＬ染色による正常マウス（野生型）の軟骨組織である図３１Ｂでは、極めて少ないアポトーシス細胞が存在し、細胞は肥大していない。従って、ＮＥＬＬ１は、軟骨組織の肥大及びアポトーシスを誘導し、それによって長骨の形成及び再生を誘導することができる。
【０１５１】
実施例１３：ＮＥＬＬの基材の調製
【０１５２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ。ポリアクチド−コ−グリコリド（８５：１５；固有粘度〜０．６ｄＬ／ｇ；アラバマ州、バーミンガム・ポリマーズ）をクロロホルムに溶解し、５％溶液を調製し、ガラス製の培養皿に注いで２４時間ゆっくりと蒸発させた。溶媒の抽出後、以下の８群：（ａ）被覆なしのポリマーのみ；（ｂ）従来のアパタイト（１ｘＳＢＦその後１．５ｘＳＢＦ）；（ｃ）加速生物模倣のアパタイト（５ｘＳＢＦその後Ｍｇなし且つカーボネートなしの５ｘＳＢＦ）；（ｄ）フィブロネクチン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）；（ｅ）ポリ−Ｌ−リジン（０．０１ｍｇ／ｍＬ）；（ｆ）コラーゲン；（ｇ）Ｍｅｆｐ−１（０．０１ｍｇ／ｍＬ）及び（ｈ）コラーゲンとヒアルロナンの混合物、に従って膜を被覆した。各群をＮＥＬＬ１含有群（１００ｎｇ）とＮＥＬＬ１なし群とにさらに分割し、非分化培地（アスコルビン酸なし、βグリセロールホスフェートなし）にて一次骨芽細胞とともに７日間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。各物質について、ＮＥＬＬ１群は、その相手群よりも高いアルカリホスファターゼ活性を刺激した。物質の中では、加速アパタイト（ｃ群）が最も高い活性を誘導し、ポリマーのみ（ａ群）が最も少ないアルカリホスファターゼ活性を誘導した。
【０１５３】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ。ポリアクチド−コ−グリコリド（８５：１５；固有粘度〜０．６ｄＬ／ｇ；アラバマ州、バーミンガム・ポリマーズ）をクロロホルムに溶解し、ポロゲン（直径〜１００〜３００μｍのスクロース顆粒）と混合し、粒子浸出及び溶媒抽出の後、〜９０％多孔率のＰＬＧＡ足場を作製した。多孔性の足場をアルゴンプラズマでエッチングし、滅菌し、２００ｎｇのＮＥＬＬ１ペプチドを含有するウシ１型コラーゲンの水性混合物で被覆し、乾燥して、成熟オス野生型マウスの頭蓋冠欠損に移植した。陽性対照（ＰＬＧＡ／コラーゲン／ＢＭＰ）及び陰性対照（ＰＬＧＡ／コラーゲンのみ、成長因子なし）も同様の欠損に移植した。４週目でのマイクロＣＴ解析は、陰性対照（ＰＬＧＡ／コラーゲンのみ）の足場によってはほとんど又はまったく骨形成が誘導されなかったのに対して、ＮＥＬＬ１含有及びＢＭＰ含有の足場は、４週間までに欠損を横切って迅速且つ完全な石灰化を誘導した。従来の組織学により、石灰化が成熟骨の古典的特長を呈することを確認した。
【０１５４】
本明細書に記載された実施例及び実施態様は、単に説明を目的とするものであり、その観点からの種々の修正又は変更が当業者に示唆され、それらは、本出願の精神及び範囲並びに添付のクレームの範囲の中に包含されるべきであることが理解される。本明細書で引用した出版物、特許及び特許出願はすべて、あらゆる目的でその全体を参照により本出願に組み入れる。本発明はまた、記載された実施態様の組み合わせ又は既知の方法及び組成物との組み合わせも含むことが理解されるであろう。
【０１５５】
今や、ＮＥＬＬペプチド発現系及びＮＥＬＬペプチドの骨形成活性の特定の実施態様を有しているが、これらの実施態様に絶対的な概念は、同様に他の実施態様に用いられてもよいことが理解されるべきである。手短に言えば、本出願の保護は、すぐ後に続くクレームのみに限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号１）である。
【図２】アミノ酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ１（配列番号２）である。
【図３】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号３）である。
【図４】アミノ酸配列をコードするラットＮＥＬＬ１（配列番号４）である。
【図５】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１ｃＤＮＡ（配列番号５）である。
【図６】アミノ酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ１（配列番号６）である。
【図７】核酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号７）である。
【図８】アミノ酸配列をコードするヒトＮＥＬＬ２（配列番号８）である。
【図９】核酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号９）である。
【図１０】アミノ酸配列をコードするラットＮＥＬＬ２（配列番号１０）である。
【図１１】核酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２ｃＤＮＡ（配列番号１１）である。
【図１２】アミノ酸配列をコードするマウスＮＥＬＬ２（配列番号１２）である。
【図１３】核酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１３）である。
【図１４】アミノ酸配列をコードするニワトリＮＥＬＬ２（配列番号１４）である。
【図１５Ａ】機能的ＮＥＬＬペプチドを産生させる方法の１つのフローチャートである。
【図１５Ｂ】機能的ＮＥＬＬペプチドを産生させる方法の１つのフローチャートである。
【図１６】シグナルペプチド−ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの核酸構築物の説明である。下線のアミノ酸配列はメリチンのシグナルペプチドに由来する。アラニンとプロリンとの間の結合は、ハイファイブ細胞による分泌のための推定上の切断部位である。ＲＴＶＬＧＦＧ・・・の残基は、ラット／ヒトＮＥＬＬ１タンパク質の成熟タンパク質に由来する。
【図１７ＡＢ】ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の生成物の説明である。図１７Ａは、無血清培地においてハイファイブ細胞により産生された精製ＮＥＬＬ１ペプチド（生産性：３ｍｇ／Ｌ培地）を含有するＵｎｏＱ溶出物のＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図１７Ｂは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットである。
【図１７ＣＤ】ＮＥＬＬ１−ＦＬＡＧの細胞外発現の生成物の説明である。図１７Ｃは、無血清培地においてＣＯＳ７細胞により産生された精製ＮＥＬＬ１ペプチド（生産性：＜０．１ｍｇ／Ｌ培地）を含有するＵｎｏＱ溶出物のＣＢＢ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。図１７Ｄは、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたウエスタンブロットである。
【図１８】無血清培地における昆虫細胞によるＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧペプチドの細胞外の発現を説明するウエスタンブロットである。
【図１９】２種類の無血清培地（ファイブＳＦＭ及びＥＳＦ９２１における発現）におけるハイファイブ細胞によるＮＥＬＬ−１及びＮＥＬＬ２−ＦＬＡＧペプチドの細胞外の発現を説明するウエスタンブロットである。
【図２０】ＮＥＬＬ−１（１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ４（１００ｎｇ／ｍＬ）に暴露したラット胎児の頭蓋冠細胞におけるアルカリホスファターゼの誘導を示す棒グラフである。
【図２１】ＮＥＬＬ１（Ａ及びＢ：５ｎｇ／ｍＬ；Ｃ及びＤ：５０ｎｇ／ｍＬ）で処理した骨芽細胞の顕微鏡写真である。
【図２２】アスコルビン酸非存在下で微小小体を形成するＮＥＬＬ１ＭＣ３Ｔ３微小小体の顕微鏡写真である。Ｂはアルカリホスファターゼの染色である。
【図２３】Ａ〜Ｃは、（Ａ）抗ＮＥＬＬ、（Ｂ）β−Ｇａｌ及び（Ｃ）ＮＥＬＬアデノウイルス構築物における石灰化を示す顕微鏡写真である。Ｄ及びＥは各群のオステオカルシン及びオステオポニンの経時的レベルを表す棒グラフである。
【図２４】は、頭蓋冠の過剰増殖を示す石灰化を表すように染色されたＮＥＬＬ１を過剰発現するトランスジェニックマウスの顕微鏡写真である。
【図２５】（Ａ）ＮＥＬＬ１過剰発現のトランスジェニックマウス及び（Ｂ）正常な同腹仔において石灰化について染色された頭蓋冠の顕微鏡写真である。
【図２６】（Ａ）Ｃｂｆａ１で処理した又は（Ｂ）対照のラット胎児の頭蓋冠細胞においてＮＥＬＬ１遺伝子の発現を示す逆転写ポリメラーゼ鎖反応のブロットである。
【図２７】（Ａ）野生型、（Ｂ）Ｃｂｆａ１＋／−及び（Ｃ）Ｃｂｆａ１＋／−＋ＮＥＬＬ１過剰発現のマウスの頭蓋(上）、鎖骨（中）の骨格染色及び頭蓋のマイクロＣＴの写真である。
【図２８】（Ａ）ＢＭＰ処理した、及び（Ｂ）ＮＥＬＬ１処理した頭蓋冠欠損の処理(右）及び対照（左）のマイクロＣＴの写真である。
【図２９】頭蓋冠欠損におけるＮＥＬＬ１処理（右）及びＢＭＰ処理（左）のマイクロＣＴの写真である。
【図３０】口蓋欠損におけるＮＥＬＬ１処理（左）及び対照（右）のマイクロＣＴの写真である。
【図３１】（Ａ）ＮＥＬＬ１過剰発現のマウス及び（Ｂ）野生型マウスにおけるＴＵＮＥＬ染色した軟骨組織の顕微鏡写真である。
【図３２】選択された位置において骨を形成するために患者を治療する方法の１つのフローチャートである。
【図３３】Ａはインプラントの実施態様の１つを模式的に表し、Ｂは、選択された位置において骨を形成するために患者を治療する実施態様の１つを模式的に表す。
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【図１７】
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【図１８】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２６】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３２】
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【配列表】
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