(57)【要約】  式（Ｉ）：2007505876.tif 000021（式中、Ａは、ＮＨおよびＮ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”の間の鎖長が少なくとも炭素原子２個であるＣアルキレン基であり、そしてＲ’およびＲ”は各々別々に、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル基およびＣ２−４ジヒドロキシアルキル基から選択されるか、または、Ｒ’およびＲ”は共にＣ２−６アルキレン基である）の化合物の安定な無菌水溶液を密閉容器中に単位用量形態で調合する。該溶液は、式（Ｉ）の化合物の濃度が１５０ｍｇ／ｍｌまでであり、ｐＨが５〜９の範囲内である。該溶液は凍結乾燥工程なしで調製することができる。
2007505876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2007505876.tif 000020
（式中、Ａは、ＮＨおよびＮ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”の間の鎖長が少なくとも炭素原子２個であるＣアルキレン基であり、そしてＲ’およびＲ”は各々別々に、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル基およびＣ２−４ジヒドロキシアルキル基から選択され、ここで、窒素原子に結合した炭素原子はヒドロキシ基をもたず、また、２個のヒドロキシ基で置換されている炭素原子は存在しないか、または、Ｒ’およびＲ”は共にＣ２−６アルキレン基であり、このＣ２−６アルキレン基は、Ｒ’およびＲ”が結合している窒素原子とともに、３〜７個の原子を環内に有する複素環式基を形成している）
の化合物の安定な無菌水溶液であって、
密閉容器中の単位用量形態において、式（Ｉ）の化合物の濃度が１５０ｍｇ／ｍｌまでであり、ｐＨが５〜９の範囲内である、前記溶液。
【請求項２】
溶液のｐＨが５．０〜８．４の範囲内である、請求項１記載の溶液。
【請求項３】
溶液のｐＨが６．０〜８．０の範囲内である、請求項２記載の溶液。
【請求項４】
式（Ｉ）の化合物が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項５】
Ａが直鎖アルキレン基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項６】
Ａがエチレンである、請求項に記載の溶液。
【請求項７】
Ｒ’およびＲ”が直鎖アルキル基またはヒドロキシ置換アルキル基である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項８】
Ｒ’およびＲ”が各々ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３である、請求項７記載の溶液。
【請求項９】
式ＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”の各々の基が式ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ３）２の基である、請求項８記載の溶液。
【請求項１０】
追加の成分を含有する混合物中に調合され、その結果、溶液のｐＨが５〜９の範囲内にあるように緩衝化されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項１１】
治療に使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の溶液。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の溶液の調製方法であって、式（Ｉ）の化合物の安定な無菌水溶液を容器中に導入し、該容器を密封することを含み、該溶液を凍結乾燥工程なしで調製する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、がんの治療に有効なビス−バイオリダクティブエージェント（bis-bioreductive agent）であるＡＱ４Ｎのような新規のアントラキノン誘導体調合物に関する。
ＷＯ−Ａ−９１／０５８２４（National Research Development Corporation）は、式：
【０００２】
【化１】
2007505876.tif 000003
【０００３】
｛式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々別々に、水素、Ｘ、ＮＨ−Ａ−ＮＨＲおよびＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”（式中、Ｘは、ヒドロキシ、ハロゲノ、アミノ、Ｃ１−４アルコキシまたはＣ２−６アルカノイルオキシであり、Ａは、ＮＨとＮＨＲまたはＮ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”との間の鎖長が少なくとも炭素原子２個であるＣアルキレン基であり、そしてＲ、Ｒ’およびＲ”は各々別々に、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル基およびＣ２−４ジヒドロキシアルキル基から選択され、ここで、窒素原子に結合した炭素原子はヒドロキシ基をもたず、また、２個のヒドロキシ基で置換されている炭素原子は存在しない、または、Ｒ’およびＲ”は共にＣ２−６アルキレン基であり、このＣ２−６アルキレン基は、Ｒ’およびＲ”が結合している窒素原子とともに、３〜７個の原子を環内に有する複素環式基を形成している）から選択される｝
の化合物であって、場合により生理学的に許容され得る塩の形態である化合物を開示している。
【０００４】
この一般式の範囲内の好適な化合物は、ビス−Ｎ−オキシドであるＡＱ４Ｎ（バノキサントロン）であり、これはＡＱ４を酸化することにより合成することができる：
【０００５】
【化２】
2007505876.tif 000004
【０００６】
ＡＱ４Ｎは実際にはプロドラッグであり、インビボでは逆反応が起こり、低酸素性がん細胞内における還元的代謝により、そのプロトン化した形態である活性物質ＡＱ４を与える。このプロドラッグは、活性物質であるＡＱ４と比べた場合、比較的非毒性であり、医薬として投与するためには特に魅力的である。しかし、ＡＱ４Ｎは、容易には結晶形態を与えない。今までは、投与用には、塩または凍結乾燥物質の形態で、ＡＱ４Ｎを製造し調合することが望ましいと考えられてきた。
【０００７】
ＡＱ４Ｎは、二塩酸塩であるＡＱ４Ｎ・２ＨＣｌの形態として報告されてきた。例えば、J. Chem. Soc., Perkin Trans. I, 1999, 2755-2758（Leeら）およびＷＯ−Ａ−００／０５１９４（BTG International Limited）を参照されたい。しかし、ＡＱ４Ｎ・２ＨＣｌ原料の研究により、不純物である１−アミノ−４−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−５，８−ジヒドロキシアントラキノン（ＡＱＭＮと表す）を有意な量含むことが実証されている。ＡＱＭＮは、ＬＣＭＳによって特性解析され、さらに、ＡＱＭＮ物質：
【０００８】
【化３】
2007505876.tif 000005
【０００９】
の純粋試料を合成することによって確認されている。
この不純物は、ＡＱ４Ｎの分解により形成することができ、更に有意なことには、望ましくない水準の細胞毒性を示し、これは一般にＡＱ４Ｎ自体の細胞毒性より高い。この細胞毒性の水準は、比較的非毒性であるプロドラッグの形態で投与することが意図された化合物においては回避すべきである。
【００１０】
ＡＱＭＮ分解は、優勢な経路であるが、酸性および中性の水溶液条件下でのＡＱ４Ｎの更なる分解生成物は、更に望ましくない生成物、すなわちモノ−Ｎ−オキシドであるＡＱ４Ｍ：
【００１１】
【化４】
2007505876.tif 000006
【００１２】
である。
同時係属する特許出願であるＷＯ−Ａ−０３／０７８３８７（BTG International Limited）は更に、−３．０〜９．０の範囲内のｐＫａを有する、生理学的に許容され得る酸とのＡＱ４Ｎの塩を開示している。また、この特許出願は、水溶液中に溶解したときに溶液のｐＨが５〜９の範囲内であるようにこの化合物を調合することも開示している。
【００１３】
医薬製品の製造後にこの製品の期限が切れる（もはや患者に使用できない）時点は、意図される薬剤の含有量の減少、および／または、付随する不純物の増加によって定義される。親化合物の分解速度を減少させることにより、この化合物が、期限が切れる時点（有効期限）に到達するまでにかかる時間が増加する。必要であれば、最終生成物を凍結乾燥調合物として製造することによって、薬剤化合物を安定化する。
【００１４】
しかし、ＡＱ４Ｎに関して、本発明者らは、凍結乾燥調合物としてのＡＱ４Ｎの安定性および製造品質が、凍結乾燥ケーキの水分含有量と反比例することを見出した：即ち、水分が少なければ少ないほど、最終生成物の品質および安定性は悪くなる。さらに、相当する凍結乾燥調合物よりも、（適当なｐＨの）水溶液としての方が安定である。このように、凍結乾燥を行わず、ＡＱ４Ｎを製造する方がよい。
【００１５】
したがって、本発明によれば、式（Ｉ）
【００１６】
【化５】
2007505876.tif 000007
【００１７】
（式中、Ａは、ＮＨおよびＮ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”の間の鎖長が少なくとも炭素原子２個であるＣアルキレン基であり、そしてＲ’およびＲ”は、各々別々に、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル基およびＣ２−４ジヒドロキシアルキル基より選択され、ここで、窒素原子に結合した炭素原子はヒドロキシ基を持たず、また、２個のヒドロキシ基で置換されている炭素原子は存在しないか、または、Ｒ’およびＲ”は共にＣ２−６アルキレン基であり、このＣ２−６アルキレン基は、Ｒ’およびＲ”が結合している窒素原子とともに、３〜７個の原子を環内に有する複素環式基を形成している）
の化合物の安定な無菌水溶液であって、
密閉容器中の単位用量形態において、式（Ｉ）の化合物の濃度が１５０ｍｇ／ｍｌまでであり、ｐＨが５〜９の範囲内である、前記溶液が提供される。
【００１８】
好ましくは、かかる溶液のｐＨは、５．０〜８．４の範囲内であり、より好ましくは、６．０〜８．０であり、７．０〜８．０のｐＨが最適である。式（Ｉ）の化合物がＡＱ４Ｎである場合は、ｐＨ７．４が最も安定であることが示された。これは、最も安定であるのはｐＨ６と観察された、凍結乾燥ＡＱ４Ｎ調合物とは対照的である。
【００１９】
好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
式（Ｉ）の化合物は、あらかじめ生理的に許容され得る塩の形態で単離してもよく、これは有機または無機酸との酸付加塩となる。好ましくは、この生理的に許容され得る酸は、−３．０〜９．０の範囲内、より好ましくは、２．０〜９．０の範囲内のｐＫａを有する。より好ましくは、この生理的に許容され得る酸は、２．０〜６．０の範囲内のｐＫａを有する。
【００２０】
好ましくは、この生理的に許容され得る酸は、酒石酸、マロン酸、ジクロロ酢酸、クエン酸、マレイン酸、ベンゼンスルホン酸、ピメリン酸、および酢酸からなる群より選択される。
【００２１】
より好ましくは、この生理的に許容され得る酸は、３．０〜６．０の範囲内のｐＫａを有する。この生理的に許容され得る酸は、特に有機酸、特定的には、有機モノ−、ジ−、またはトリ−酸、そして特に、酒石酸、クエン酸、ピメリン酸および酢酸からなる群より選択されるものであってもよい。
【００２２】
式（Ｉ）中のＡ基は、分枝であってもよいが、都合の良いことには、直鎖アルキレン基、即ち、テトラメチレン、特にトリメチレン、または、特定的にはエチレン、が好都合である。
【００２３】
また、Ｒ’およびＲ”は、分枝炭素鎖を有していてもよいが、アルキル基またはヒドロキシ置換アルキル基のいずれかである直鎖が好都合である。Ｒ’およびＲ”がモノヒドロキシアルキル基である場合、末端が置換されていると好都合であり、また、Ｒ’およびＲ”がジヒドロキシアルキル基である場合、末端がヒドロキシ基の一つで置換されていると好都合である。Ｒ’およびＲ”がアルキルである場合、炭素原子が３個、または、特に２個もしくは１個である基が好ましく、また、Ｒ’およびＲ”がヒドロキシ置換アルキルである場合、炭素原子が３個であるアルキル基が好ましく、あるいは、モノヒドロキシアルキル基の場合は、代わりに、炭素原子が２個であるアルキル基が好ましい。Ｒ’およびＲ”の好ましい個々の基の例は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ，ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨおよびＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨである。
【００２４】
Ｒ’およびＲ”は、通常は同一となる。
別の態様では、既に示したように、Ｒ’およびＲ”は、それらが結合している窒素原子とともに、複素環式基−Ｎ（ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは２〜６である）、即ち、アジリジン−１−イル、アゼチジン−１−イル、ピロリジン−１−イル、ピペリジン−１−イル、およびペルヒドロアゼピン−１−イルであってもよく、アゼチジン−１−イルおよび特にアジリジン−１−イルのようなより小さい基が最も重要である。
【００２５】
特に重要である具体的なＮＨ−Ａ−Ｎ（Ｏ）Ｒ’Ｒ”基は、ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ３）Ｃ２Ｈ５、ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（Ｃ２Ｈ５）２、ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２、ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）２、ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＯＨ）２、ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨＯＨＣＨ２ＯＨ）２、および特にＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｏ）（ＣＨ３）２である。
【００２６】
この生理的に許容され得る塩は、単に水溶液中に溶解している場合は、通常、所望の範囲より低いｐＨを有する溶液を与えることになる。例えば、１．４ミリモル溶液のＡＱ４Ｎ酢酸塩水溶液は、ｐＨが３．８である。このように、好ましくは、式（Ｉ）の化合物は、追加の成分を含有する混合物中に調合し、溶液のｐＨが５〜９の範囲内になるよう緩衝化する。
【００２７】
緩衝液は、塩および酸の溶媒和混合物であり、少量の酸および塩基をこの溶液に加える場合にｐＨ変化に対抗する。適する緩衝液としては、酢酸ナトリウム緩衝液およびオルトリン酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。
【００２８】
生理的に許容され得る酸との塩は、任意の慣用的な手段、例えば、有機塩基（Ｉ）と適切な無機または有機の酸との反応により、通常は、溶液中での単なる混合により、調製することができる。酸付加塩は、一般的には、水、メタノール、エタノールおよび同様の溶媒中で比較的可溶性である結晶性固体である。また、一つの塩の形態は、所望の生理的に許容され得る酸で前処置したカラムを用いるクロマトグラフィーにより、他の形態に転化させてもよい。
【００２９】
式（Ｉ）の化合物は、家畜および特定的にはヒトの両方の用途のための医薬として用いるため、生理的に許容され得る希釈剤またはキャリヤーとともに様々な方法により調合してもよい。例えば、この化合物は、液体希釈剤またはキャリヤー、例えば、水溶液、懸濁液または乳濁液を組み込んだ組成物として施用されてもよく、この組成物は、しばしば、非経口投与のために注射可能な形態で使用されてもよく、したがって、無菌かつ発熱因子を含まないことが好都合であろう。また、経口投与を用いてもよい。
【００３０】
ヒトおよび家畜の両方の状況において使用する、注射または経口経路以外の他の投与のタイプとしては、座薬またはペッサリーの使用が挙げられる。医薬組成物の別の形態は、頬または鼻へ投与するためのもの、あるいは別の態様では、眼に投与するための滴剤であり、これは都合のよいことには、無菌の液体希釈剤またはキャリヤーを含有してもよい。局所投与のための他の調合物としては、ローション、軟膏、クリーム、ゲルおよびスプレーが挙げられる。
【００３１】
組成物は、単位用量形態、即ち、単位投与量を含有するか、または、複数の単位投与量もしくは単位投与量以下を含有する、別個の部分の形態で調合されてもよい。
使用される化合物の用量は、特定の化合物の活性と治療される状態に従って変わることになるが、指標としては、一日あたり２５〜５００ｍｇ／ｍ２の範囲内、特定的には、一日あたり５０〜３００ｍｇ／ｍ２の範囲内で選択された用量が多くの場合に適していると言うことができるが、化合物（Ｉ）によりもたらされる有毒な副作用がより低いレベルであることを考慮して、これより高い用量、例えば、一日あたり２５〜７５０ｍｇ／ｍ２の範囲内、または更に最大で１２００ｍｇ／ｍ２の用量を考慮してもよい。この用量養生法は、どんなに多くの日数であっても問題の患者にとって適切であれば継続してもよく、所望により、一日の用量をいくつかの分離投与に分けてもよい。このように、例えば、進行した乳がん、非ホジキンリンパ腫および肝がんのような状態の場合、治療を一日行い、次いで、２１日などの間隔をあけた後に繰り返し投与することによって治療することが適切であろうが、急性非リンパ性白血病を治療するためには、連続して５日以上の治療がより適しているであろう。別の方法としては、数日の間隔をあけて一回投与する、例えば、２または３週間毎に一回の投与を用いてもよい。
【００３２】
化合物（Ｉ）は、ヒトを含む温血動物のがん治療に特別な価値がある。これら化合物は、種々の形態の肉腫およびがん腫のような固形腫瘍の治療に関して重要であり、また、白血病のような散在性腫瘍のためにも重要である。特に重要な領域は、乳がん、肺がん、前立腺がん、膵臓がん、および食道がんの治療、ならびに、非ホジキンリンパ腫および急性非リンパ性白血病の治療である。がんの治療において、非経口および時には局所投与が、多くの場合特に重要である。さらに、化合物（Ｉ）を、有糸分裂阻害剤（例えば、ビンブラスチン）；アルキル化剤（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、およびシクロホスファミド）；他の代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、およびヒドロキシ尿素）；介在性（intercalating）抗生物質（例えば、アドリアマイシンおよびブレオマイシン）；酵素（例えば、アスパラギナーゼ）；トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド）、ならびに生物学的応答調節剤（例えば、インターフェロン）のような他の抗がん剤と共に、別々に与えるかまたは同一組成物内で一緒に与える併用治療に用いることは好都合であろう。また、化合物（Ｉ）は、腫瘍の放射線療法と共に、併用療法に用いてもよい。
【００３３】
このように、本発明は、がんの退縮および緩和を助けるための方法を含み、この方法は、これまでに説明したように、治療上有効な量の化合物（Ｉ）を患者に投与することを含む。
【００３４】
抗がん使用に加えて、化合物（Ｉ）は、キレート化剤としての活性を考慮して、種々の他の製薬用途に関して重要である。
また、本発明は、これまでに定義したように、密閉容器内に単位用量形態で溶液を調製するための方法を含み、この方法は、式（Ｉ）化合物の安定かつ無菌の水溶液を容器内に導入し、そしてこの容器を密封することを含み、その際、溶液は凍結乾燥工程なしで調製される。
【００３５】
本発明は、以下の実施例により説明する。
実施例
実施例１：ＡＱ４Ｎの物理化学的性質へのｐＨの影響の実証
ＡＱ４Ｎジヒドロクロリド溶液のｐＨの変化をモニターして、ＡＱ４ＮのＡＱＭＮへの分解を測定した。ｐＨ曲線を図１および図２に示す。図１は、ｐＨ７．７〜ｐＨ９．４の間での明らかな解離を示し、これは、図２に示すおよそ２モル当量での解離事象に相当する。低いｐＨでの解離事象を観察することができ、推論としては、４．１〜４．６の間のｐＨが割り当てられ、モル当量は０．９５〜１．１５の間である。
【００３６】
実施例２：ＡＱＭＮの細胞毒性の実証
ＡＱ４ＮおよびＡＱＭＮのＰ３８８系における純粋試料（９９．３％）の毒性を測定した。得られた結果を表２に示す。
【００３７】
【表１】
2007505876.tif 000008
【００３８】
これらのデータに基づけば、ＡＱＭＮは、同一系内でのＡＱ４Ｎの細胞毒性より少なくとも５倍大きい細胞毒性を有する。ＡＱ４Ｎのすべての試料は実質的な割合のＡＱＭＮを含有し、細胞毒性の結果に影響を与えることになるから、「より大きい」と言う修飾語句は必要である。
【００３９】
実施例３：溶液中でのＡＱ４Ｎジヒドロクロリドの不安定性−ＡＱＭＮの蓄積−の実証
ＡＱ４Ｎの５ｍｇ／ｍｌ溶液を用い、それぞれ、水、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液および２０ｍＭオルトリン酸ナトリウム緩衝液に相当する、ｐＨ２．４、４．５および６．８にてＡＱ４Ｎの分解を調べた。ＡＱ４Ｎの最初の分解経路は、ＡＱＭＮへの転化である。４０℃で中間時間点（１４日）までインキュベートした５ｍｇ／ｍｌ溶液中のＡＱＭＮ濃度の増加を図３に示す。
【００４０】
分解速度は、これらの条件下で一日あたり、０．８４％（ＡＱ４Ｎに関して）、０．１９％（ＡＱ４Ｎに関して）および０．０２％（ＡＱ４Ｎに関して）のＡＱＭＮ含量の増加に相当する。
【００４１】
標準として用いた物質中の既知量のＡＱＭＮに関して直線回帰および相互相関を用いると、これらのデータは表３に示したＡＱＭＮの蓄積速度を示す。
【００４２】
【表２】
2007505876.tif 000009
【００４３】
図４に示すように、６３日後のデータにおいて類似の傾向が観察された。蓄積速度（上記と同じやり方で計算）は、リン酸緩衝液中で、ＡＱＭＮが一月あたり０．６％増加することを示している。
【００４４】
実施例４：溶液中のＡＱ４Ｎジヒドロクロリドの不安定性−ＡＱ４Ｎの分解−の実証
ＡＱ４Ｎの安定性へのｐＨの影響を、異なる溶液においてＡＱ４Ｎ分解を調べることにより検討した。選択した溶液は、前実験のとおり、蒸留水、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４）および２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）である。５ｍｇ／ｍｌのＡＱ４Ｎの緩衝溶液を調製した後、そのｐＨを必要とされる緩衝液のｐＨに校正した。最終ｐＨ値は、蒸留水、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液および２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液についてそれぞれ、２．４、４．５および６．８であった。これら試料を４０℃でインキュベートし、規則的な間隔で採取した。試料を希釈してからＨＰＬＣ分析により、アッセイを行った。
【００４５】
１４日後に暫定的な分析を行った。そのデータを図５に示す。
さらに、これら溶液を全体で６３日間４０℃でインキュベートした。最終的なグラフを図６に示す。ＡＱ４Ｎ含量について得られた値は、もとの試料中で重量測定されたＡＱ４Ｎの量と（実験誤差の範囲内で）一致した。
【００４６】
実施例５：「標準的」オートクレーブ条件に対する、ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の４０ｍｇ／ｍｌ溶液としてのＡＱ４Ｎの不安定性の実証
ｐＨ７．４の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中、４０ｍｇ／ｍｌにてＡＱ４Ｎの溶液を調製した。この溶液の試料を、標準的なオートクレーブサイクル（１２１℃、１５分間）の前および後で分析した。オートクレーブ後の試料は、７．３％のＡＱ４Ｎ濃度の減少を示した。これに相当する増加が関連する不純物に関して認められた。
【００４７】
実施例６：種々の濃度でのＡＱ４Ｎ安定性とｐＨとの関係の実証
幾つかのＡＱ４Ｎ溶液を、異なるｐＨ値にて異なる濃度のＡＱ４Ｎを含むリン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ）として調製した。得られた結果を表４に示す。
【００４８】
【表３】
2007505876.tif 000010
【００４９】
これら試料をインキュベーション前に分析し、次いで、５５℃のインキュベーター内に置いた。溶液を、１日、１週間、２週間、４週間および８週間後に繰返し採取した。
ＡＱ４Ｎ含量に関する結果を図７に示し、ＡＱＭＮの増加に関する結果を図８に示す。
【００５０】
これらの結果は、１０〜４０ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ７．４にて）の間では、分解速度に対して濃度変化の影響がほとんどないことを示している。また、これらの結果は、次のようなＡＱ４ＮのｐＨ安定性のプロフィールを示している：
【００５１】
【数１】
2007505876.tif 000011
【００５２】
実施例７：種々のｐＨ値での凍結乾燥調合物としてのＡＱ４Ｎの安定性の実証
ＡＱ４Ｎの３つの凍結乾燥したバッチ（４０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ＝６．０、７．０および８．０のリン酸ナトリウム緩衝液１０ｍＭ）を、それぞれ、ＢＮ９９０１９、ＢＮ９９０２０およびＢＮ９９０２１として製造した。これらのバッチの試料を、４℃、２５℃および４０℃で貯蔵し、表５にしたがって種々の時間点で分析した。
【００５３】
【表４】
2007505876.tif 000012
【００５４】
それぞれの時間点での、ＡＱ４Ｎ含量、ＡＱ４Ｎ関連不純物レベル、水分含量、ｐＨおよびモル浸透圧濃度（osmolality）を調べた。後者の３要素については、さらなる検討を行わない。
【００５５】
ｐＨ＝６．０、７．０および８．０調合物（それぞれ、ＢＮ９９０１９、ＢＮ９９０２０、ＢＮ９９０２１）のＡＱ４Ｎ含量のレベルを、個々の温度について図９〜１１に時間に対して示す。図９は４℃で、図１０は２５℃で、そして図１１は４０℃で貯蔵した場合のＡＱ４Ｎ含量を示す。
【００５６】
ＡＱ４Ｎの分解（親化合物の減少により測定される）は、２５℃および４０℃で明りょうに認めることができた。ＢＮ９９０１９（ｐＨ＝６．０）は、最も安定であると思われる。
【００５７】
４℃および２５℃の貯蔵条件下で、３つのバッチについて関連する不純物のレベルをプロットした。
ＡＱ４Ｎ製造生成物の分解プロフィールは、主要な分解生成物がＡＱ４ＭおよびＡＱＭＮであることを示している。ｐＨ＝６．０、７．０および８．０（それぞれ、ＢＮ９９０１９、ＢＮ９９０２０およびＢＮ９９０２１）の調合物について、関連する不純物レベルを図１２〜１５に示す。図１２および１３は、それぞれ、４℃でのＡＱ４ＭおよびＡＱＭＮの変化を示し、図１４および１５は、２５℃でのＡＱ４ＭおよびＡＱＭＮの変化を示している。
【００５８】
２５℃の結果から、ｐＨ＝６．０の調合物が最も安定であることが確認される。しかしながら、４℃で貯蔵したＢＮ９９０１９試料中の分解生成物のレベルは、ｐＨ＝７．０および８．０の調合物よりわずかに高いことが明らかである。
【００５９】
実施例８：４０ｍｇ／ｍｌでのＡＱ４Ｎの安定性とｐＨとの関係の実証
低濃度（５ｍｇ／ｍｌ）でのＡＱ４Ｎの安定性に関する前述の検討（実施例３および４を参照されたい）により、中性ｐＨにおいてＡＱ４Ｎ分子の安定性が高いことが示唆された。この実験は、調合されたＡＱ４Ｎ生成物が水で戻した調合物（４０ｍｇ／ｍｌ）としてどれだけ安定であるかを調査するために計画された。調合されたＡＱ４Ｎ材料を、ｐＨ６．０、７．０、８．０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中において４０ｍｇ／ｍｌにて調製し、凍結乾燥した。これらのバッチを、凍結乾燥材料の安定性を示すものとして（実施例７を参照されたい）、３年間の安定性を調べるために置いておいた。前記時間の後、（ＡＱ４Ｎの損失が最小であると示された）４℃で貯蔵したバイアルを２ｍｌの蒸留水中で戻した。（安定性についての最終時点でのｐＨは、それぞれ、５．９１６、６．９４６、７．９２８であった。）戻した後、２つのバイアルを、ＡＱ４Ｎ、ＡＱＭＮおよび他の関連する不純物について分析した。凍結乾燥したままのバイアルおよび戻したバイアルの両方を表６〜８に詳細に示すとおり貯蔵した。
【００６０】
【表５】
2007505876.tif 000013
【００６１】
【表６】
2007505876.tif 000014
【００６２】
【表７】
2007505876.tif 000015
【００６３】
５５℃で貯蔵した試料についてのＡＱ４Ｎ含量の結果を図１６に示す。
これらのデータから、ｐＨ６．０では凍結乾燥物質は相当するｐＨ７または８の材料より安定であることが確認されたが、調合したＡＱ４Ｎは、凍結乾燥調合物としてよりも溶液としての方が安定であることが示された。本実験でのＡＱ４Ｎ溶液のｐＨ安定性のプロフィールは次に示すとおりである：
【００６４】
【数２】
2007505876.tif 000016
【００６５】
分解生成物（ＡＱＭＮおよびＡＱ４Ｍ）に関する結果を、溶液試料について図１７および１８に示す。
【００６６】
実施例９および６の分解速度は、これらの個々の実験において標準および試料として異なるＡＱ４Ｎ原料を用いたため、直接数値的に比較することはできない。
【００６７】
実施例１０：ＡＱ４Ｎ製品の品質への（溶液調製物に対する）凍結乾燥の影響の実証
調合したＡＱ４Ｎ物質を、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中４０ｍｇ／ｍｌに調製した。この溶液の一部分をアンプルへ、残りをバイアルに満たし、表９および１０に詳細に示したサイクルに従って凍結乾燥した。
【００６８】
【表８】
2007505876.tif 000017
【００６９】
【表９】
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【００７０】
凍結乾燥の前および後の試料（それぞれアンプルおよびバイアルに満たした）のＡＱ４Ｎ含量を測定した。結果は表１１に示すとおりである。
【００７１】
【表１０】
2007505876.tif 000019
【００７２】
関連するＡＱ４Ｎ原料のＡＱＭＮ含量は、標準と比較して２２．６％である。このことは、ＡＱＭＮが凍結乾燥サイクル中に生成され、凍結乾燥段階を除去することが製品の全体品質を改良することを示している。
【００７３】
実施例１１：ＡＱ４Ｎ安定性への温度の影響の実証
実施例１０で調製したＡＱ４Ｎ溶液（液体で満たした）アンプルを、４℃および２５℃でインキュベーションすることによって、その安定性について試験した。種々の時間点においてバイアル中のＡＱ４Ｎ、ＡＱＭＮおよび関連する不純物の含量をＨＰＬＣで分析した。４℃で貯蔵したアンプル（ＢＮ０３−０５と表示）のＡＱＭＮ含量を、実施例１０で調製した（４℃で貯蔵）ＡＱ４Ｎ凍結乾燥バイアル（ＢＮ０３−０６）と比較して図１９に示す。２５℃で貯蔵したアンプルでのＡＱＭＮ含量を、実施例７で調製し２５℃で貯蔵した相当するＡＱ４Ｎ凍結乾燥バイアル（ＢＮ９９０２０、ｐＨ＝７）と比較して図２０に示す。（両グループについてのデータは、およそ２００日での同等の時間について示しているにすぎない。）
ＢＮ０３−０５およびＢＮ９９０２０は、異なる原料のバッチから調製されている（そのため最初から異なるレベルのＡＱＭＮを含んでいる）ので、ｙ−軸は最終製品バッチの初期ＡＱＭＮ含量の割合（％）として表されていることを銘記すべきである。
【００７４】
実施例１２：４℃でのＡＱ４Ｎの安定性の実証
水性調合物の安定性に関するさらなる例示を、実施例１０と同様の方法で調製した追加バッチの（液体で満たした）ＡＱ４Ｎ溶液のアンプル（ＢＮ０３−１２）によって実証した。しかし、ＢＮ０３−１２は、５ｍｌ溶液中により大容量の２００ｍｇを有するように調製した。バッチを４℃に置いておき、適する有効期限の範囲を与えるように種々の時間点で分析した。この材料のＡＱＭＮレベルは実施例１１と一致し、ＡＱＭＮ含量の値（標準に対して）は、製造後の０．２２６から、４℃にて１６２日後の０．２３２に増加した。
【００７５】
実施例１３：凍結乾燥調合物としてのＡＱ４Ｎの水分含量に関する不安定性の実証
ＡＱ４Ｎ凍結乾燥生成物（４０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液）のいくつかのバッチを、これまでに説明したものと類似または同一のやり方で調製した。
【００７６】
ＡＱＭＮの増加は２つの方法で観察される：製造中におけるＡＱＭＮ含量の段階的増加（前述の実施例１０を参照されたい）および時間経過による漸進的増加（図２１を参照されたい）。
【００７７】
いくつかのバッチにおける４℃でのＡＱＭＮの増加を図２２に示す。
グラフ上の直線は、特定のバッチを製造するために用いた原料中で認められたＡＱＭＮレベルを示している。（原料１は、バッチ０１−１３、０２−１８および０３−０６のために用いられた。原料２は、バッチ９９０２０、００−１５および０１−１０のために用いられた。）
【００７８】
これらバッチの水分含量（ＱＣ／製造後試験にてカールフィッシャー滴定により測定）を、４℃での分解速度（直線プロットに適合させた場合のＡＱＭＮ増加の傾きにより測定した）に対してプロットした。結果を図２３に示す。
【００７９】
これらバッチの水分含量（ＱＣ／製造後試験にてカールフィッシャー滴定により測定）を、製造（具体的には凍結乾燥）中のＡＱＭＮレベルの段階的増加に対してプロットした。結果を図２４に示す。
【００８０】
これらのグラフはいずれも、（製造の間および製造後の）生成物の分解と製造後の凍結乾燥ケーク中の水分量との間に相関があることを示している。これは、水分含量によって表される凍結乾燥過程自体の作用であることが明らかである。
【００８１】
実施例１４：安定な無菌水溶液の調製
装置および周囲環境の準備ならびに条件
ＡＱ４Ｎ最終製品を製造するための装置および容器を、無菌製品の無菌製造のために適切に処置した（乾熱滅菌、オートクレーブ殺菌およびＩＰＡ消毒を含む）。調製および製造中に使用したクリーンルームおよびクリーンベンチ（laminar air flow cabinet）は、無菌製品の製造のために適切な様式で監視した（固定接触プレート、気圧差ならびに粒子計測を使用）。製造過程において重量測定に使用する天秤は、製造の直前に分銅で校正した。
【００８２】
緩衝液の調製
３桁天秤を用いて、３．４５０ｇのオルトリン酸二水素ナトリウム一水和物（一塩基）を６００ｍｌビーカー中に秤量し、８．９００ｇのオルトリン酸水素二ナトリウム二水和物（二塩基）を１０００ｍｌビーカー中に秤量した。潅水（ＷＦＩ）を一塩基のビーカーに４００ｍｌ、二塩基のビーカーに８００ｍｌ、それぞれ加えた。磁気攪拌子を加え、１５分間攪拌させた。各々の溶液を、それぞれ５００ｍｌ（一塩基）および１０００ｍｌ（二塩基）のメスフラスコに無菌状態で移した。各々フラスコを、適切にラベルを貼って分類し、規定容量にあわせて栓をした。
【００８３】
３９０ｍｌの一塩基溶液および６１０ｍｌの二塩基溶液を、５００ｍｌおよび１０００ｍｌのメスシリンダーを用いて２０００ｍｌのビーカーに加えた。これらを混合し、０．０５Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．０とラベルを貼った。
【００８４】
３７５ｍｌのｐＨ７．０緩衝液を、重量（溶液の密度は１．００４２ｇ／ｍｌであると測定されたため、必要とされる重量は３７６．５８ｇである）で５００ｍｌメスフラスコに移し、ＡＱ４Ｎの可溶化に用いた。
【００８５】
バルク溶液の処理
３０．００ｇのＡＱ４Ｎ（ジヒドロクロリドとして）を１０００ｍｌビーカーに加えた。重量を記録し、磁気攪拌棒を加えた。
【００８６】
４３．５ｍｌの２Ｍ水酸化ナトリウムを、５０ｍｌの注射器および５ｍｌの注射器により５００ｍｌビーカーに加え、ＷＦＩでおよそ１５０ｍｌ容量にした。１５０ｍｌのＮａＯＨをＡＱ４Ｎ粉末に加えた。およそ２２５ｍｌのｐＨ７．０緩衝液をＡＱ４Ｎ混合物に加え、１０００ｍｌビーカー中の全ＡＱ４Ｎが、この手順の間に緩衝液に溶解したことを確認した。次いで、この溶液を２０００ｍｌビーカーに移し、残っている緩衝液溶液ですすぎ、１５分間かくはんした。ＡＱ４Ｎ溶液を、ＷＦＩでおよそ６００ｍｌ容量にした。ｐＨを測定し、必要であれば７．０±０．１に調整した。７６０ｇの目標とする重量になるまで、ＷＦＩをＡＱ４Ｎ溶液に加えた。
【００８７】
バルク溶液のろ過
清潔、無菌、不活性であるチューブを備えたぜん動ポンプを無菌的に組み立て、バルク溶液から２枚のＭｉｌｌｉｐａｋ（商標）２０フィルターを通して、清潔、処理済み、無菌のスコット瓶アセンブリ（充てんラインおよびベントフィルターを含む）中に、ＡＱ４Ｎ溶液をポンプで入れた。
【００８８】
アンプルへの充てんおよび封印
アンプル充てんが必要であれば、アンプルを購入し、準備し、処理し、そして、ＡＱ４Ｎ溶液調製の前に、医薬として利用するために適する品質標準を受け入れた。ろ過したＡＱ４Ｎ溶液を、清潔、無菌、不活性であるチューブを備えたぜん動ポンプを用いて、アンプル中に分配した。分配は容量基準で行われたが、充てん前、および製造中は規則的な間隔（名目上は５０番目毎のアンプル後であるが、これはバッチの大きさに従って変わるであろう）で重量を確認検査した。溶液密度は前もって確認しておいた。アンプルをクリーンルーム内でガスバーナーの炎を用いて手で密封した。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１は、ＡＱ４Ｎジヒドロクロリドの溶液中でのｐＨの一次導関数対ｐＨを示す。
【図２】図２は、同一条件下でのｐＨの一次導関数対ＮａＯＨモル当量を示す。
【図３】図３は、４０℃で１４日間インキュベートした５ｍｇ／ｍｌ溶液中でのインキュベーション時間の間のＡＱＭＮの増加を示す。
【図４】図４は、４０℃で６３日間インキュベートした５ｍｇ／ｍｌ溶液中でのインキュベーション時間の間のＡＱＭＮの増加を示す。
【図５】図５は、４０℃で１４日間インキュベートした５ｍｇ／ｍｌ溶液中でのインキュベーション時間の間のＡＱ４Ｎの減少を示す。
【図６】図６は、４０℃で６３日間インキュベートした５ｍｇ／ｍｌ溶液中でのインキュベーション時間の間のＡＱ４Ｎの減少を示す。
【図７】図７は、異なるｐＨ値および濃度での、インキュベーション時間の間のＡＱ４Ｎの減少を示す。
【図８】図８は、異なるｐＨ値および濃度での、インキュベーション時間の間のＡＱＭＮの増加を示す。
【図９】図９は、４℃で貯蔵した場合の、時間に対する凍結乾燥調合物のＡＱ４Ｎ含量を示す。
【図１０】図１０は、２５℃で貯蔵した場合の、時間に対する凍結乾燥調合物のＡＱ４Ｎ含量を示す。
【図１１】図１１は、４０℃で貯蔵した場合の、時間に対する凍結乾燥調合物のＡＱ４Ｎ含量を示す。
【図１２】図１２は、４℃の異なる凍結乾燥バッチにおける、ＡＱ４Ｍ含量の変化を示す。
【図１３】図１３は、４℃の異なる凍結乾燥バッチにおける、ＡＱＭＮ含量の変化を示す。
【図１４】図１４は、２５℃の異なる凍結乾燥バッチにおける、ＡＱ４Ｍ含量の変化を示す。
【図１５】図１５は、２５℃の異なる凍結乾燥バッチにおける、ＡＱＭＮ含量の変化を示す。
【図１６】図１６は、５５℃で貯蔵した場合の、時間に対する凍結乾燥および溶液調合物のＡＱ４Ｎ含量の減少を示す。
【図１７】図１７は、４℃および５５℃で貯蔵した場合の、時間に対する溶液調合物のＡＱＭＮ含量の増加を示す。
【図１８】図１８は、４℃および５５℃で貯蔵した場合の、時間に対する溶液調合物のＡＱ４Ｍ含量の増加を示している。
【図１９】図１９は、４℃で貯蔵した場合の、時間に対する溶液調合物のＡＱＭＮ含量の増加を示している。
【図２０】図２０は、２５℃で貯蔵した場合の、時間に対する溶液調合物のＡＱＭＮ含量の増加を示している。
【図２１】図２１は、２つのやり方においてＡＱＭＮの増加がどのように観察されるかを示す。
【図２２】図２２は、４℃に貯蔵した場合の、いくつかのバッチにおいて時間に対する凍結乾燥調合物のＡＱＭＮ含量の増加を示す。
【図２３】図２３は、４℃におけるバッチの水分含有量に対する分解速度（直線プロットに適合させた場合のＡＱＭＮ増加の傾きにより測定）を示す。
【図２４】図２４は、４℃におけるバッチの水分含有量に対する、製造中のＡＱＭＮレベルの段階的増加を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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