(57)【要約】本発明は、無血清細胞凍結培地、および、ウイルスワクチン生産のための安定な無血清細胞バンクの作製プロセスにおける、この培地の使用に関する。本発明の無血清ベロ細胞バンク作製プロセスは、ウイルスワクチン生産のための、信頼のおける、かつ安定な細胞バンクを生産するための、標準化され、そして一貫した方法を提供する。増殖培地および凍結培地において、動物由来の物質を、植物由来の物質と置換することは、解凍における細胞の生存率を増加させ、そして回復時間を減少させ、それによってより正確な製造スケジュール、およびより堅実なプロセスを可能とする。
2007514449.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
無血清細胞凍結培地であって、基本的に、
（ａ）該培地１リットルあたり約２ｇ加えられる、ダイズ加水分解産物およびコメ加水分解産物からなる群より選択される、酵素性加水分解産物凍結安定剤、および
（ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）
を補充される、ウイルス産生無血清培地（ＶＰ−ＳＦＭ）からなる、無血清細胞凍結培地。
【請求項２】
約１０％のＤＭＳＯを補充される、請求項１に記載の無血清細胞凍結培地。
【請求項３】
安定な無血清ベロ細胞バンクを作製するプロセスであって、該プロセスは以下の工程：
（ａ）培養物を開始する工程であって、該工程は、凍結されたベロ細胞を解凍し、そして該細胞を、Ｔ−１５０ｃｍ２フラスコ内の増殖培地に添加する工程、該細胞を約３７℃および５％のＣＯ２にて一晩インキュベートする工程、および、翌日に該培養物に新鮮な培養培地にリフィーディングする工程を包含し、ここで該増殖培地は、４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＶＰ−ＳＦＭからなる、工程；
（ｂ）該細胞を増殖させ、そして増幅させる工程であって、該工程は、約３７℃および５％のＣＯ２にてインキュベートした該Ｔ−１５０ｃｍ２フラスコ内にて、該細胞をコンフルーエンスまで増殖させる工程、該培地を除く工程、該フラスコを、カルシウムおよびマグネシウムを有さないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する工程、該フラスコにトリプシンを加え、そして該フラスコから該細胞を取り除くに十分な時間、室温にてインキュベートする工程、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）で該トリプシンを中和し、そして栄養補給のためにＶＰ−ＳＦＭを添加する工程、得られた懸濁液を５つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに播種し、そしてそれぞれのフラスコにＶＰ−ＳＦＭを５０ｍｌのレベルまで添加する工程、３日間〜４日間、約３７℃および５％のＣＯ２にて該細胞をインキュベートする工程、該５つのフラスコから該細胞懸濁液をプールする工程、該プールされた懸濁液を含むセルファクトリーに播種する工程、該セルファクトリーにリフィーディングする工程、ならびに該セルファクトリーを収集する工程、を包含する工程；ならびに
（ｃ）該細胞バンクを凍結する工程であって、該工程は、該セルファクトリーに由来する該収集した細胞を、４℃、２１０×ｇにて１０分間遠心分離する工程、該細胞を、請求項１に記載の前記無血清細胞凍結培地に、２×１０６細胞／ｍｌ〜２×１０７細胞／ｍｌの密度にて再懸濁する工程、該細胞懸濁液を凍結バイアルに、バイアルあたり１ｍｌの細胞懸濁液にて分配する工程、能動的速度制御フリーザーを用いて、該細胞を凍結する工程、および該細胞を液体窒素中に保存する工程を包含する、工程
を包含し、
ここで、１年後に、このようにして作製された該安定な無血清ベロ細胞バンクは少なくとも８０％の細胞生存率、および４０時間〜６０時間の間の回復倍加時間を有する、プロセス。
【請求項４】
安定な無血清ベロ細胞バンクを作製するプロセスであって、該プロセスは以下の工程：
（ａ）培養物を開始する工程であって、該工程は、２×１０７の凍結ベロ細胞を解凍し、そして該細胞を、Ｔ−１５０ｃｍ２フラスコ中の増殖培地５０ｍｌに添加して、４×１０５細胞／ｍｌ〜５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度を得る工程、該細胞を３７℃および５％のＣＯ２にて一晩インキュベートする工程、および、翌日に、該培養物に新鮮な増殖培地にリフィーディングする工程を包含し、ここで、該増殖培地は、４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＶＰ−ＳＦＭからなる、工程；
（ｂ）該細胞を増殖させ、そして増幅させる工程であって、該工程は、約３７℃および５％のＣＯ２にてインキュベートした該Ｔ−１５０ｃｍ２フラスコ内にて、該細胞をコンフルーエンスまで増殖させる工程、該培地を除く工程、該フラスコを、カルシウムおよびマグネシウムを有さないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）２０ｍｌで２回洗浄する工程、該フラスコにトリプシンを５ｍｌ加え、そして該フラスコから該細胞を取り除くに十分な時間、室温にてインキュベートする工程、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）５ｍｌで該トリプシンを中和し、そして栄養補給のために改変ＶＰ−ＳＦＭを１０ｍｌ添加する工程、得られた懸濁液を５つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに、４×１０４細胞／ｃｍ２の濃度にて播種し、そしてそれぞれのフラスコにＶＰ−ＳＦＭを５０ｍｌのレベルまで添加する工程、３日間〜４日間、約３７℃および５％のＣＯ２にて該細胞をインキュベートする工程、該５つのフラスコから該細胞懸濁液をプールする工程、該プールされた懸濁液をセルファクトリーに播種する工程、該セルファクトリーにリフィーディングする工程、ならびに該セルファクトリーを収集する工程、を包含する工程；ならびに
（ｃ）該細胞バンクを凍結する工程であって、該工程は、該セルファクトリーに由来する該収集した細胞を、４℃、２１０×ｇにて１０分間遠心分離する工程、該細胞を、請求項２に記載の前記無血清細胞凍結培地に、１×１０７細胞／ｍｌ〜２×１０７細胞／ｍｌの密度にて再懸濁する工程、該細胞懸濁液を凍結バイアルに、バイアルあたり１ｍｌの細胞懸濁液にて分配する工程、能動的速度制御フリーザーを用いて、該細胞を凍結する工程、ならびに該細胞を液体窒素中に保存する工程を包含する、工程
を包含し、
ここで、１年後に、このようにして作製された該安定な無血清ベロ細胞バンクは少なくとも８０％の細胞生存率、および４０時間〜６０時間の間の回復倍加時間を有する、プロセス。
【請求項５】
前記酵素性加水分解産物凍結安定剤がダイズ加水分解産物である、請求項１または請求項２に記載の無血清細胞凍結培地。
【請求項６】
前記酵素性加水分解産物凍結安定剤がコメ加水分解産物である、請求項１または請求項２に記載の無血清細胞凍結培地。
【請求項７】
１年後に、少なくとも８０％の細胞生存率、および４０時間〜６０時間の間の回復倍加時間を有する、安定な無血清ベロ細胞バンク。
【請求項８】
安定な無血清ベロ細胞バンクであって、１年後に、少なくとも８０％の細胞生存率、および４０時間〜６０時間の間の回復倍加時間を有し、ここで該細胞バンクは請求項３または請求項４に記載のプロセスによって作製される、安定な無血清ベロ細胞バンク。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、無血清細胞凍結培地、および、ウイルスワクチン生産のための安定な無血清細胞バンクの作製プロセスにおける、この培地の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、細胞バンク作製において広く用いられる凍結安定剤である。しかし、血清含有培養系は、ワクチンの大規模生産には望ましくなくなりつつある。血清補充には多くの不都合が存在し、この不都合としては、組成物におけるバッチ間変動、生成物の精製を邪魔するタンパク質の高い含有、およびウイルスの混入の可能性、マイコプラズマの混入の可能性、またはプリオンの混入の可能性が挙げられる。さらに、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の未定義の因子に起因するヒトの健康への最近の脅威は、ウイルスワクチンのような健康管理製品の合成のために使用される、培養プロセスにおけるウシ血清の継続的な使用を制限しそうである（非特許文献１）。それゆえ、非動物起源の凍結安定剤が、ＦＢＳに代わるために必要である。
【非特許文献１】Ｂｕｔｌｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．（２０００）、１６、８５４−８５８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の要旨）
本発明は、無血清細胞凍結培地を提供し、これは基本的に、（ａ）この培地１リットルあたり約２ｇ加えられる、ダイズ加水分解産物およびコメ加水分解産物からなる群より選択される、酵素性加水分解産物凍結安定剤、ならびに（ｂ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を補充される、ウイルス産生無血清培地（ＶＰ−ＳＦＭ）からなる。１つの実施形態において、この無血清細胞凍結培地は、約１０％のＤＭＳＯを補充される。
【０００４】
本発明はさらに、標準化され、および一貫性の、マスター細胞バンクおよび作業用細胞バンクを生産するプロセスにおける、この無血清細胞凍結培地の使用を提供し、これはワクチン生産における原料として用いられる。このプロセスは以下の工程：
（ａ）培養物を開始する工程であって、この工程は、凍結されたベロ細胞を解凍して、そして、これらのベロ細胞を、Ｔ−１５０ｃｍ２フラスコ内の増殖培地に添加する工程、この細胞を約３７℃および５％のＣＯ２にて一晩インキュベートする工程、ならびに、翌日にこの培養物に新鮮な培養培地にリフィーディングする工程を包含し、ここで上記増殖培地は、４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＶＰ−ＳＦＭからなる、工程；
（ｂ）上記細胞を増殖させ、そして増幅させる工程であって、この工程は、約３７℃および５％のＣＯ２にてインキュベートしたＴ−１５０ｃｍ２フラスコ内にて、上記細胞をコンフルーエンスまで増殖させる工程、上記培地を除く工程、このフラスコを、カルシウムおよびマグネシウムを有さないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する工程、このフラスコにトリプシンを加え、そしてこのフラスコから上記細胞を取り除くに十分な時間、室温にてインキュベートする工程、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）でこのトリプシンを中和し、そして栄養補給のためにＶＰ−ＳＦＭを添加する工程、得られた懸濁液を５つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに播種し、そしてそれぞれのフラスコにＶＰ−ＳＦＭを５０ｍｌのレベルまで添加する工程、３日間〜４日間、約３７℃および５％のＣＯ２にて上記細胞をインキュベートする工程、これらの５つのフラスコからこの細胞懸濁液をプールする工程、このプールされた懸濁液を含むセルファクトリーを播種する工程、このセルファクトリーにリフィーディングする工程、ならびにこのセルファクトリーを収集する工程、を包含する工程；ならびに
（ｃ）この細胞バンクを凍結する工程であって、この工程は、上記セルファクトリーに由来する上記収集した細胞を、４℃、２１０×ｇにて１０分間遠心分離する工程、上記細胞を、請求項１に記載の無血清細胞凍結培地に、２×１０６細胞／ｍｌ〜２×１０７細胞／ｍｌの密度にて再懸濁する工程、上記細胞懸濁液を凍結バイアルに、バイアルあたり１ｍｌの細胞懸濁液にて分配する工程、能動的速度制御フリーザーを用いて、上記細胞を凍結する工程、および上記細胞を液体窒素中に保存する工程を包含し、ここで、１年後に、これにより作製された上記の安定な無血清ベロ細胞バンクは少なくとも８０％の細胞生存率、および４０時間〜６０時間の回復倍加時間（ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ）を有する。
【０００５】
特定の実施形態において、このプロセスは以下の工程：
（ａ）培養物を開始する工程であって、この工程は、２×１０７の凍結ベロ細胞を解凍し、そしてこれらのベロ細胞を、Ｔ−１５０ｃｍ２フラスコ中の増殖培地５０ｍｌに添加して、４×１０５細胞／ｍｌ〜５×１０５細胞／ｍｌの細胞密度を得る工程、上記細胞を３７℃および５％のＣＯ２にて一晩インキュベートする工程、ならびに、翌日に、この培養物に新鮮な増殖培地にリフィーディングする工程を包含し、ここで、上記増殖培地は、４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＶＰ−ＳＦＭからなる、工程；
（ｂ）上記細胞を増殖させ、そして増幅させる工程であって、この工程は、約３７℃、５％のＣＯ２にてインキュベートしたこのＴ−１５０ｃｍ２フラスコ内にて、上記細胞をコンフルーエンスまで増殖させる工程、この培地を除く工程、このフラスコを、カルシウムおよびマグネシウムを有さないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）２０ｍｌで２回洗浄する工程、このフラスコにトリプシンを５ｍｌ加え、そしてこのフラスコから上記細胞を取り除くに十分な時間、室温にてインキュベートする工程、ダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）５ｍｌでこのトリプシンを中和し、そして栄養補給のためにＶＰ−ＳＦＭを１０ｍｌ添加する工程、得られた懸濁液を５つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに、４×１０４細胞／ｃｍ２の濃度にて播種し、そしてそれぞれのフラスコにＶＰ−ＳＦＭを５０ｍｌのレベルまで添加する工程、３日間〜４日間、約３７℃で、５％のＣＯ２にて上記細胞をインキュベートする工程、これらの５つのフラスコから上記細胞懸濁液をプールする工程、このプールされた懸濁液をセルファクトリーに播種する工程、このセルファクトリーにリフィーディングする工程、およびこのセルファクトリーを収集する工程、を包含する工程；および
（ｃ）この細胞バンクを凍結する工程であって、この工程は、上記セルファクトリーに由来する上記収集した細胞を、４℃、２１０×ｇにて１０分間遠心分離する工程、上記細胞を、上に記載された無血清細胞凍結培地に、１×１０７細胞／ｍｌ〜２×１０７細胞／ｍｌの密度にて再懸濁する工程、上記細胞懸濁液を凍結バイアルに、バイアルあたり１ｍｌの細胞懸濁液にて分配する工程、能動的速度制御フリーザーを用いて、上記細胞を凍結する工程、次いで上記細胞を液体窒素中に保存する工程を包含する、工程
を包含し、ここで、１年後に、このようにして作製された上記の安定な無血清ベロ細胞バンクは少なくとも８０％の細胞生存率、および４０時間〜６０時間の間の回復倍加時間を有する。
【０００６】
本発明はさらに、すぐ上に記載されたプロセスによって生産されるワクチン生産のための、安定な無血清ベロ細胞バンクを提供し、ここで、１年後に、平均的な細胞バンクの生存率は少なくとも８０％であり、そして平均的な回復倍加時間は４０〜６０時間の間である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
正確な、そして標準化された細胞バンク作製プロセスの実行は、一貫した性能および特性を有する細胞ストックの取得の基本である。細胞バンク作製は、同質な供給源の細胞のマスター細胞バンク、およびこのマスター細胞バンクから調製される多数の作業用細胞バンクを含むはずである。所定のバンクのバイアルの数は、意図される使用に依存して変化するが、本発明のバンク作製プロセスを利用して、代表的なマスター細胞バンクは２００バイアルを含み得、そして代表的な作業用細胞バンクは４００以下のバイアルを含み得る。このプロセスは、堅実な生産のための安定した物質を提供する、標準化された細胞の長期間にわたる供給を保証する。
【０００８】
ベロ細胞（不死化された、アフリカミドリザル腎臓細胞、ＡＴＣＣ番号ＣＣＩ−８１）は、長年にわたって、ヒトのウイルスワクチンの生産のための分野において、公知であり、そして用いられてきた。この細胞は良く特徴付けられており、そして優れた安全記録を有する。
【０００９】
本発明の無血清ベロ細胞バンク作製プロセスは、３つの主要な工程からなる：培養物の開始工程、この細胞の増殖および増幅工程、そしてこのバンクの凍結工程。これらの工程のそれぞれの最適化が、質の高い無血清細胞バンクの調製を可能にさせる。「質の高い」とは、細胞の生存率が高く、そしてその回復が早いこと、すなわち、回復倍加時間が小さいことを意味する。これらの細胞増殖条件、および凍結条件の組み合わせの結果、ベロ細胞の改善された回復が得られる。細胞バンクに由来する細胞の一貫した生産にとって、最も重要な２つの回復のパラメーターは、回復倍加時間および解凍生存率である。回復倍加時間は、コロニー形成率に密接に関連するが、しかしまた、解凍後の細胞の能力に関するより多くの情報を提供する。これらのパラメーターの双方は、本細胞バンク作製プロセスを最適化するために、測定され、そして使用される。
【００１０】
フェノールレッドは、この細胞凍結培地から除かれた。なぜなら、この成分は細胞にエストロゲン性効果を有し得るからである（Ｂｅｒｔｈｏｉｓら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、８３、２４９６−５０００（１９８６））。この細胞凍結培地の組成は、２ｇ／ＬのＨｙ−Ｓｏｙ（または、ＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅ）、１０％のＤＭＳＯ、および増殖培地として残りのＶＰ−ＳＦＭを含むように最適化された。
【００１１】
本明細書で用いられる場合、「ＶＰ−ＳＦＭ」は、表１に収載される成分を含むように改変された、ＧｉｂｃｏＴＭのＶＰ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから市販される）を意味する。
【００１２】
【表１】
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プロセスの改良として、この培養物は、当該分野で慣例である２連の細胞密度から開始された。それゆえこの培養物は、１つのバイアルから始めるのではなく、１つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに解凍された供給源バンクに由来する、２つの凍結バイアルから開始される。温ＶＰ−ＳＦＭが１滴ずつ加えられ、細胞への衝撃または損傷を避ける。翌日に解凍後、培養物にリフィーディングすることで、残存する凍結安定剤および細胞残渣を除き、そして回復を改善させる。
【００１３】
本発明のスケールアップした計画およびスケジュールは、最小数の継代（例えば、４継代以下）および最小数の操作で、ベロ細胞の増殖を可能とし、一方で、健全な培養物を維持するほど一貫して高い細胞濃度を、なお維持する。このスケールアップした計画は：１つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに解凍された供給源バンク由来の２つの凍結バイアルであり、１０トレイのセルファクトリー１つを播種するために用いられる、５つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに拡大される。１００バイアルの細胞バンクが、１つのセルファクトリーから調製され得る。この計画は、バンクの大きさに容易に適合し得る。
【００１４】
トリプシン処理（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）もまた最適化された。細胞単層の２回の緩衝液リンスが、解凍後の良好な回復に最適であることが見出された。γ線を照射されたブタトリプシンが、ウイルス混入の可能性を最小化するために選択された。不必要な微環境を作成する、１０レベルのセルファクトリー全てへの十分な熱移動は不確かであるので、このトリプシン処理は、凍結されたトリプシンを用いて室温にて行われる。
【００１５】
この凍結プロセス条件の組み合わせは、バンクの回復を相当に改善した。第一に、収集され、そしてプールされた細胞懸濁液は、２１０×ｇにて１０分間（５分間または７分間ではなく）遠心分離されるが、このことが、かなりの細胞の損失の原因である。冷却された凍結培地を用いて、再懸濁が穏やかに行われる。第二に、この細胞を、リピーターピペッタをもちいて凍結バイアルに分配することで、分配手順をより早くし、そして、実際の凍結サイクルの前に、凍結培地に細胞が曝される時間を減少させた。そして第三に、凍結バイアルに分配する最中の細胞懸濁液、および既に充填されたバイアルが、２〜８℃に冷却された。
【００１６】
ベロ細胞の凍結保存の２つの局面が、このバンク作製プロセスに扱われるために必要である：凍結バイアル中の最適な細胞密度、および解凍にあたっての細胞の良好な回復のための、速度制御フリーザーのプログラミング。相転位の間、物質は凍結につれて、液体から固体への転位熱が放出される（融解熱）。このプログラムは、この融解熱が解消されるように最適化されて、サンプルを一定の速度で凍結させる。最適化された細胞密度は１×１０７細胞／ｍｌ〜２×１０７細胞／ｍｌであり、そして凍結プログラムへの改変が細胞の良好な回復に寄与していることが、明らかに示された。
【００１７】
本発明の無血清ベロ細胞バンク作製プロセスは、ウイルスワクチン生産のための、信頼のおける、および安定な細胞バンクを調製するための、標準化され、および一貫性のある方法を提供する。増殖培地および凍結培地において、動物由来の物質が、凍結安定剤として役立つ植物由来の物質（例えば、Ｈｙ−ＳｏｙおよびＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅ）で置換された。この結果は、２ｇ／ＬのＨｙ−Ｓｏｙまたは２ｇ／ＬのＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅのいずれかを用いた無血清細胞バンクが、少なくとも１年間安定であることを示す。
【００１８】
結果として本細胞バンクプロセスをもたらす改善は、解凍にあたって細胞の生存率を増加させ、そして回復時間を減少させる。このことは、より正確な製造スケジュール、およびより堅実なプロセスを可能にする。またここで、この製造プロセスは、より少ない数の凍結バイアルから開始することが可能である。したがって、１つのフルサイズの４００バイアルのバンクはより長く継続し、そして連続的な実施はより一貫性のあるものになる。
【００１９】
現在、本発明を一般的に記載したが、以下の実施例の参照を通して、同じことがより容易に理解される。以下の実施例は例示の目的で提供され、そして明確に述べない限り、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００２０】
本研究において、いくつかの因子を凍結安定剤として試験した。Ｈｙ−Ｓｏｙ、ＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅ、ＨｙＰｅｐ  Ｗｈｅａｔおよびメチルセルロースを含む細胞バンクを、ＦＢＳ含有細胞バンクと比較し、そして細胞バンクの安定性を調べた。本研究の最初の年について、凍結安定剤として、Ｈｙ−ＳｏｙおよびＨｙＰｅｐ  ＲｉｃｅがＦＢＳと同じ程度に効果的であることを示した。それゆえ、Ｈｙ−Ｓｏｙは無血清細胞バンクにおいて用いられ得、そしてＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅが代替として用いられ得る。
【００２１】
（材料および方法）
（個人の保護装備）
滅菌グローブ、滅菌スリーブ、滅菌つなぎ、クリーンルーム用頭部カバー、クリーンルーム用あごカバー、クリーンルーム用脚部カバー。
【００２２】
（使い捨て装備）
使い捨て血清学ピペット；１．８ｍｌ  Ｓａｒｓｔｅｄｔ凍結バイアル；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔｅｒ  ７５ｃｍ２組織培養フラスコおよび１５０ｃｍ２組織培養フラスコ；１０トレイＮｕｎｃセルファクトリー［ｗｗｗ．ｎｕｎｃｂｒａｎｄ．ｃｏｍ］。
【００２３】
（ガラス器具および付属物）
１０Ｌ培地トートおよび２０Ｌ培地トートから培地を分配するための、Ｃ−ｆｌｅｘチューボトルグを有するガラスベル；Ｃ−ｆｌｅｘチューボトルグを有するＧｅｌｍａｎフィルター；セルファクトリーアダプター；移送装置およびチューボトルグを有する、５００ｍｌ、１Ｌ、２Ｌ、および５Ｌのボトル；手動バルブ。
【００２４】
（試薬）
表１中の成分を含むように処方されたＧｉｂｃｏＴＭＶＰ−ＳＦＭ；Ｇｉｂｃｏダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）；Ｇｉｂｃｏ  Ｌ−グルタミン；カルシウムおよびマグネシウムを含まない、Ｇｉｂｃｏ  リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）；Ｇｉｂｃｏ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｎｏｒｗｉｃｈ、ＮＹ）から入手した、Ｈｙ−Ｓｏｙ、ＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅ、およびＨｙＰｅｐ  Ｗｈｅａｔ；Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびメチルセルロース；７０％  イソプロピルアルコール；Ｇｉｂｃｏ  ０．２５％  照射されたトリプシン／クエン酸塩；Ｇｉｂｃｏ  ０．０２５Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液；Ｈｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、または照射されたＦＢＳ（ｉｒＦＢＳ）；Ｇｉｂｃｏ  ダルベッコ最小必要培地（ＤＭＥＭ）；注射用水または脱イオン水；Ｇｉｂｃｏ  ０．０５％トリパンブルー溶液。
【００２５】
（装備）
バイオ安全フード；層流フードまたはバイオ安全キャビネット；スピナーフラスコ台；自動（リピーター）ピペッタ；顕微鏡；倒立顕微鏡；血球計；循環水浴；Ｆｏｒｍａ  Ｃｒｙｏｍｅｄ速度制御フリーザー（ＲＣＦ）；ぜん動ポンプ；投薬ポンプ；３７℃および５％  ＣＯ２におけるＦｏｒｍａインキュベーター；Ｆｏｒｍａ遠心分離機；２１６スイングバケット型ローター。
【００２６】
（実施例１  解凍および細胞増殖）
２×１０７ベロ細胞を含む２つの凍結ストックバイアルを、３７℃の水浴に置いた。このバイアルを、攪拌しながら水浴中に固定し、そして凍結した細胞が解凍するまで頻繁に点検した。バイアルの外側を、７０％のイソプロピルアルコールで消毒し、そして層流フード中に置いた。解凍した細胞をすぐにＴ−１５０ｃｍ２フラスコに移し、そして、培養容器を振動させながら、５０ｍｌの増殖培地を一滴ずつ添加した。増殖培地は、４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＶＰ−ＳＦＭからなる。約半分の培地を添加した後、残りをわずかに速い速度で添加した。細胞をＦｏｒｍａインキュベーター（３７℃、５％のＣＯ２）内に置き、そして一晩付着させた。翌日に、培地を吸引して除き、そして５０ｍｌの新鮮な増殖培地をこのフラスコに添加した。
【００２７】
（実施例２  細胞継代）
細胞を、Ｆｏｒｍａインキュベーター中で３７℃および５％のＣＯ２にてインキュベートしたＴ−１５０ｃｍ２フラスコにて、コンフルーエンスまで（４日または５日）増殖させた。培地を吸引して除き、そしてこのフラスコを、マグネシウムおよびカルシウムを含まないＰＢＳ  ２０ｍｌで２回洗浄した。５ｍｌのトリプシンをこのフラスコに添加し、そしてこのフラスコを室温にて２〜３分間インキュベートして、フラスコから細胞を除いた。トリプシンを５ｍｌのＳＴＩを用いて中和し、そして、手順が完了するまで、栄養補給のために１０ｍｌのＶＰ−ＳＦＭを添加した。ここで懸濁液の際、細胞を、計数のためにサンプリングした。トリパンブルー溶液１ｍｌを、１ｍｌの細胞サンプルに添加した。ボルテックサー（ｖｏｒｔｅｘｏｒ）を用いて、これを穏やかに混合した。混合物１０μｌを血球計のチャンバー中に置いた。染色に耐性の細胞を生存するものとして計数し、そして総細胞数を決定した。
【００２８】
次いで、この細胞懸濁液を、５つの新たなＴ−１５０ｃｍ２フラスコに、４×１０４細胞／ｃｍ２の濃度で播種した。それぞれのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに、５０ｍｌのレベルまでＶＰ−ＳＦＭを添加し、次いでこれらのフラスコを、３７℃および５％のＣＯ２のＦｏｒｍａインキュベーターに置いた。３日後、これらのフラスコにリフィーディングした。これらのフラスコを、全てで５日間インキュベートした。この５つのフラスコに由来する細胞懸濁液をプールし、そしてこのプールされた懸濁液を、Ｎｕｎｃセルファクトリーに播種するために用いた。１つのコンフルエントなセルファクトリーは、１００バイアルの細胞バンクに十分な細胞を提供する。
【００２９】
（実施例３  セルファクトリーのセットアップおよび播種）
Ｎｕｎｃによって提供される、セルファクトリーのためのアダプターの１つを、シリコンチューボトルグ（内径３／１６”、外径３／８”）の１０インチの小片に連結した。チューボトルグコネクターを用いて、８インチの長さのＣ−ｆｌｅｘチューボトルグ（内径．１２５”、外径．２００”）をこのセルファクトリーにつながれたシリコンチューボトルグに接続した。これは、インレット／アウトレットアダプターである。チューボトルグの両端をバイオシールドで覆った。Ｎｕｎｃによって提供される、セルファクトリーのための第２のアダプターを、小さなＧｅｌｍａｎフィルター（０．２２μｍ）を有する、シリコンチューボトルグ（内径３／１６”、外径３／８”）の３インチの小片に接続した。このアダプターの端部をバイオシールドで覆った。双方のアダプターを、３０分間オートクレーブし、１５分間乾燥した。バイオ安全キャビネット（ＢＳＣ）において、これらのアダプターを、Ｎｕｎｃによって提供される取扱説明書に従って、セルファクトリーに接続した。セルファクトリーのいずれの接続部分も、インレット／アウトレットラインおよびフィルターアセンブリーラインのために用い得る。ＶＰ−ＳＦＭの１０Ｌバッグ、または１Ｌボトル×３をチルドルームから得て、３７℃まで暖めた。５ＬのＣ−ｆｌｅｘ移送ラインを、細胞播種のための滅菌した５Ｌボトルに配置した。用いられる全てのバッグを、製造者が、Ｃ−ｆｌｅｘに装備した。滅菌した結合デバイス（ＳＣＤ）を用いて、培地を播種ボトルに連結し、そして２．５Ｌの培地を播種ボトルに分配した。細胞懸濁液をこの播種ボトルに添加した。ＳＣＤを用いて、この播種ボトルをセルファクトリーに連結した。セルファクトリーを、充填位置および排出位置に配置した。細胞を含むこの培地を、セルファクトリーにゆっくりと手動ポンプで送った。インレット／アウトレットラインに連結されたシリコンチューボトルグを、すぐにクランプで締めた。Ｃ−ｆｌｅｘを有する０．２２μｍのＧｅｌｍａｎフィルター（Ａｃｒｏ  ５０）を、ＳＣＤを用いてセルファクトリーに連結した。このセルファクトリーを、レベル点検位置に配置した。液体が、１０レベルに一様に分配されたとき、セルファクトリーを水平位置に配置し、そして３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーターに置いた。
【００３０】
（実施例４  セルファクトリーへのリフィード）
このセルファクトリーを、播種の２日後および５日後にリフィーディングした。ＳＣＤを用いて、セルファクトリーに空のバッグを連結した。セルファクトリーを、充填位置および排出位置に穏やかに配置し、そして液体のレベルに印をつけた。空のバッグを床に配置し、培地の排出を補助した。時々、セルファクトリーを加圧する必要があった。手動バルブをフィルターアセンブリーに連結し、穏やかにセルファクトリーを加圧した。流動が一旦始まったら、手動バルブを外した。培地が空になったとき、リフィード培地を含むバッグを、ＳＣＤを用いてセルファクトリーに連結し、同じ体積の培地をゆっくりと、セルファクトリーに手動ポンプで送った。セルファクトリーをレベル点検位置に配置した。レベル点検が完了した後、セルファクトリーを、３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター中にて、水平な作業用位置に配置した。
【００３１】
（実施例５  セルファクトリー収集）
上に記載したように、セルファクトリーを排出した。第一の洗浄液は、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液３００ｍｌ、または３００ｍｌの、カルシウムもマグネシウムも含まないＰＢＳからなった。第一の洗浄液を、セルファクトリーにポンプで送った。洗浄液を、それぞれのレベルに等しくさせた。セルファクトリーを穏やかに振盪して、全ての細胞表面をリンスした。第一の洗浄液を排出し、そして第一の洗浄と同じ様式で、第二の洗浄液を適用した。第二の洗浄液を排出し、そしてトリプシン溶液（２．５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液３００ｍｌ中に、１．４ｍｌのＧｉｂｃｏ  ２．５％トリプシン）のボトルをセルファクトリーに接続した。トリプシン溶液をセルファクトリーにポンプで送り、そして、全ての細胞表面が覆われるように、セルファクトリーを穏やかに振動させた。細胞が剥離し始めたかどうかを見るために、細胞表面を２分または３分毎に調べた。細胞がセルファクトリー表面から剥離し始めたとき、セルファクトリーを激しく叩いて、残りの細胞を遊離させた。セルファクトリーが透明にに見えるまで、このことを行った。次いで、セルファクトリーを、５ｍｇ／ｍｌのダイズトリプシンインヒビター（ＳＴＩ）を１００ｍｌ含む細胞収集ボトルに連結した。細胞混合物をこのボトルに排出した。培地洗浄ボトルをセルファクトリーに連結し、細胞収集ボトルを注意深くクランプで締めた。６００ｍｌの増殖培地を含むボトルをセルファクトリーに接続して、表面をリンスした。セルファクトリーを細胞収集ボトルに再連結し、そしてリンス培地を排出した。この洗浄液は、全細胞の１／３以下を含み得る。
【００３２】
（実施例６  凍結プロトコル）
フラスコまたはＮｕｃセルファクトリーから収集した細胞を、計数のためにサンプリングし、プールし、そして、Ｆｏｒｍａ遠心分離機にて、２１０×ｇで４℃にて、１０分間遠心分離した。１０％のＤＭＳＯ、および本研究で試験される凍結安定剤の１つを２ｇ／Ｌ補われた、基本的にＶＰ−ＳＦＭからなる細胞凍結培地を調製した。細胞を、このプロセスの間、氷中に保った。次いで、細胞を、１．５×１０７細胞／ｍｌの密度にて、凍結培地に再懸濁した。細胞濃縮物を、１．８ｍｌのＳａｒｓｔｅｄｔ凍結バイアル中に、１バイアルあたり１ｍｌの細胞懸濁液にて注いだ。能動的速度制御フリーザーを用いて、細胞を凍結した。凍結後、細胞を液体窒素中に保存した。
【００３３】
（実施例７  細胞バンク）
（細胞バンク）
種々の凍結安定剤を試験する最初の実験を、Ｔ−フラスコに由来する１０バイアルの細胞バンクを用いて達成した。これらの１０バイアルの細胞バンクの結果に基づき、見込みのある凍結安定剤を、１００バイアル、２００バイアル、および４００バイアルの、より大きな細胞バンクにて用いた。大規模な細胞バンクに必要な細胞を、セルファクトリーで増殖した。
【００３４】
（大規模な細胞バンクのための細胞の拡大）
細胞バンクのための細胞の拡大を、以下のように行った。作成されるべきそれぞれ１００バイアルの細胞バンクに対して、２バイアルの凍結細胞を解凍した。２つのバイアルを用いて、１つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに播種した。翌日に、このＴ−１５０ｃｍ２フラスコにリフィーディングした。４日の増殖の後、細胞を５つのＴ−１５０ｃｍ２フラスコに分けた。分割の３日後、これらのフラスコにリフィーディングした。これらのフラスコを５日間インキュベートした。これらのフラスコを収集し、そして１つのＮｕｎｃ１０層セルファクトリーに播種するために用いた。２日後、および５日後にセルファクトリーにリフィーディングした。７日目に、セルファクトリーを収集した。細胞バンクの調製に用いた工程のスケジュールについては、図１を参照のこと。
【００３５】
（細胞バンクの試験）
それぞれの細胞バンクに由来する５つのバイアルを、実施例１に記載するように解凍した。それぞれのバイアルを用いて、２５ｍｌのＶＰ−ＳＦＭを含む２つのＴ−７５ｃｍ２フラスコに播種した。細胞がコンフルーエンスに近づいたとき、および翌日に、細胞をフラスコから収集した。細胞の計数および増殖の時間を用いて、倍加時間を決定した。上に記載したように、トリパンブルーを用いて、細胞生存率を決定した。
【００３６】
（結果および考察）
（細胞バンクの回復）
細胞バンクの安定性を決定するために、２つのパラメーターを用いた：細胞回復倍加時間（フラスコがコンフルーエンスに近づいたとき、およびその翌日に収集し、そして計数したフラスコ）、および解凍後の細胞の生存率。凍結後すぐに、および種々の時点において、細胞を解凍した。生存率について細胞をすぐに試験し、そしてＴ−フラスコに置いた。Ｔ−フラスコを収集し、細胞の回復倍加時間を決定した。
【００３７】
（１０バイアルのベロ細胞バンク（図２および図３を参照のこと））
図２において、それぞれの細胞バンクの５つのサンプルの平均を、種々の時点で取った。サンプルを即座に解凍し、そしてトリパンブルーを用いて生存率を決定した。図３において、それぞれの細胞バンクの５つのサンプルの平均を、種々の時点で取った。サンプルを即座に解凍し、そしてＴフラスコに置いた。定期的に細胞を計数して、回復倍加時間を決定した。１年間液体窒素中に保存した後に、全ての細胞バンクは９０％を超える生存率を有した。１０％ＤＭＳＯのみの細胞バンク、および０．１％のメチルセルロースの細胞バンクは、１５ヶ月において８０％未満まで落ちた。メチルセルロースのバンクの回復が、他の細胞バンクの４５時間〜５０時間の倍加時間と比較して、１００時間を越える倍加時間を有して、極めて悪いこともまた見受けられた。Ｈｙ−Ｓｏｙ、ＨｙＰｅｐ  ＲｉｃｅおよびＨｙＰｅｐ  Ｗｈｅａｔは全て、コントロールの細胞バンク（ＦＢＳ含有バンク）にて見られた倍加時間および生存率を有していた。これらのデータに基づき、１００バイアル、２００バイアル、および４００バイアルの大規模な細胞バンクを、Ｈｙ−ＳｏｙおよびＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅを凍結安定剤として用いて作製した。
【００３８】
（大規模細胞バンク（図４および図５を参照のこと））
図４において、それぞれの細胞バンクの５つのサンプルの平均を、種々の時点で取った。サンプルを即座に解凍し、そしてＴフラスコに置いた。定期的に細胞を計数して、回復倍加時間を決定した。図５において、それぞれの細胞バンクの５つのサンプルの平均を、種々の時点で取った。サンプルを即座に解凍し、そしてトリパンブルーを用いて生存率を決定した。１００バイアルのＨｙ−Ｓｏｙ含有細胞バンクおよびＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅ含有細胞バンクの生存率は、９ヶ月間で、８０％を超えたままだった。細胞の回復もまた、一貫して４５〜６０時間の間の倍加時間のままであった。これらの結果は、血清含有細胞バンクと一致する（図２および図３を参照のこと）。２００バイアルのＨｙ−Ｓｏｙバンクおよび４００バイアルのＨｙ−Ｓｏｙバンクもまた、１２ヶ月間を超えて、８０％を超える生存率、および４０時間〜６０時間の間の回復倍加時間を示した。Ｈｙ−ＳｏｙおよびＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅの大規模な細胞バンクは、全て、ＦＢＳ含有細胞バンクに匹敵する。上記の実験結果から、２ｇ／ＬのＨｙ−Ｓｏｙまたは２ｇ／ＬのＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅのいずれかを用いる無血清細胞バンクは、１年間まで安定であると結論付け得る。
【００３９】
本発明は、直接的な記載および実施例によって記載されている。上に注記したように、実施例は単に例であることのみを意味し、いかなる意味の方法においても、本発明を限定することを意味しない。さらに、添付の明細書および特許請求の範囲を見直す上で、本発明が属する分野の当業者は、本発明の特許請求される局面に等価なものが存在することを理解する。本発明者らは、これらの等価物を、特許請求される本発明の適切な範囲内に包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、１００バイアルの細胞バンクのためのスケールアップした計画である。２００バイアルおよび４００バイアルの細胞バンクは、それぞれ、２つのセルファクトリー、および４つのセルファクトリーを用いて、同じ計画に従う。
【図２】図２は、植物由来の凍結安定剤を含む、１０バイアルの無血清細胞バンクの細胞生存率を、ＦＢＳ含有細胞バンクの細胞生存率と比較するグラフである。
【図３】図３は、植物由来の凍結安定剤を含む、１０バイアルの無血清細胞バンクの回復倍加時間を、ＦＢＳ含有細胞バンクの回復倍加時間と比較するグラフである。
【図４】図４は、大規模細胞バンク（１００バイアル、２００バイアル、および４００バイアル）の細胞生存率を比較するグラフであり、これは、凍結安定剤としてＨｙ−Ｓｏｙ（登録商標）およびＨｙＰｅｐ（登録商標）Ｒｉｃｅを用いてなされた。
【図５】図５は、大規模細胞バンク（１００バイアル、２００バイアル、および４００バイアル）の回復倍加時間を比較するグラフであり、これは、凍結安定剤としてＨｙ−ＳｏｙおよびＨｙＰｅｐ  Ｒｉｃｅを用いてなされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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