(57)【要約】  本発明はモナチンを含有する新規な甘味料組成物およびそうした組成物を製造する方法に関する。本発はまた、特定のモナチン立体異性体、特定のモナチン立体異性体ブレンドおよび／またはインビボ（例えば細胞内）またはインビトロの生合成経路で生産されるモナチンを含有する甘味料組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モナチンまたはその塩を含有し、約０．９〜約９．０グラムのグラニュー糖に匹敵する（comparable to）甘味を呈することを特徴とする卓上甘味料組成物。
【請求項２】
１グラムの分量でグラニュー糖小さじ２杯分に匹敵する甘味を呈する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項３】
１グラム中のカロリーおよび糖質が約１グラムのグラニュー糖の場合よりも少ない請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項４】
１グラム中に約０〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項５】
１グラム中に約３〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項６】
１グラム中に約０〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約３〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項７】
１グラム中に約２００ｍｇ以下のＳ，Ｓモナチンまたはその塩を含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物であって、該モナチンまたは塩がＲ，Ｒ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まないことを特徴とする請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項８】
１グラム中に約５ｍｇ以下のＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物であって、該モナチンまたは塩がＳ，Ｓ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まないことを特徴とする請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項９】
増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤および易流動（free−flow）剤から選択される少なくとも１つの成分を更に含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１０】
エリトリトールを更に含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１１】
エリトリトールを最高９９．７％含有する請求項１０に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１２】
トレハロースを更に含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１３】
シクラミン酸塩を更に含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１４】
マルトデキストリンを加えた造粒デキストロースを更に含有する請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１５】
モナチンまたはその塩は基本的にＲ，Ｒモナチンまたはその塩からなることを特徴とする請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１６】
モナチンまたはその塩は基本的にＳ，Ｓモナチンまたはその塩からなることを特徴とする請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１７】
モナチンまたはその塩は立体異性体濃縮型のＲ，Ｒモナチンまたはその塩であることを特徴とする請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１８】
モナチンまたはその塩は立体異性体濃縮型のＳ，Ｓモナチンまたはその塩であることを特徴とする請求項１に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項１９】
モナチンまたはその塩は少なくとも９５％のＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有することを特徴とする請求項１７に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項２０】
甘味は生合成経路で生産されるモナチンまたはその塩に由来する、請求項２に記載の卓上甘味料組成物。
【請求項２１】
モナチンまたはその塩を含有する即使用可能な（ready-to-use）甘味料組成物であって、該組成物の一分量は同分量のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈することを特徴とする即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２２】
小さじ１杯分に含まれるカロリーおよび糖質が約小さじ１杯分のグラニュー糖の場合よりも少ない請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２３】
１グラム中に約３〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有する請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２４】
モナチンまたはその塩が基本的にＳ，Ｓモナチンまたはその塩もしくはＲ，Ｒモナチンまたはその塩からなる請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２５】
１グラム中に約５〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩を含有する請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２６】
１グラム中に約０．４〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有する請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物であって、該モナチンまたは塩がＳ，Ｓ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まないことを特徴とする請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２７】
１グラム中に約０．５〜約１ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有する請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物であって、該モナチンまたは塩がＳ，Ｓ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まないことを特徴とする請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２８】
エリトリトールを更に含有する請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項２９】
エリトリトールを最高９９．７％含有する請求項２８に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項３０】
トレハロースを更に含有する請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項３１】
シクラミン酸塩を更に含有する請求項２１に記載の即使用可能な甘味料組成物。
【請求項３２】
立体異性体濃縮型モナチン混合物を含有する甘味料組成物であって、該モナチン混合物が生合成経路で生産されることを特徴とする甘味料組成物。
【請求項３３】
生合成経路はマルチステップ経路であり、マルチステップ経路の少なくとも１つのステップは化学変換ステップであることを特徴とする請求項３２に記載の甘味料組成物。
【請求項３４】
混合物は主にＲ，Ｒモナチンまたはその塩である請求項３３に記載の甘味料組成物。
【請求項３５】
モナチンまたはその塩を含有する均一な卓上甘味料組成物であって、該組成物のサンプルは２ｍｇ超〜約２００ｍｇの範囲の量のモナチンまたはその塩を含有し、該サンプル中のモナチンまたはその塩は約０．９〜９．０グラムのグラニュー糖に匹敵する甘味を呈することを特徴とする卓上甘味料組成物。
【請求項３６】
サンプル中のモナチンまたはその塩は小さじ２杯分のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈することを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
サンプルは重量が約１グラムである請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
サンプルは２ｍｇ超〜約５ｍｇの範囲の量のモナチンまたはその塩を含有する請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
組成物はＳ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含有しないことを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
組成物はＲ，Ｒモナチンまたはその塩を実質的に含有しないことを特徴とする請求項３５に記載の卓上甘味料。
【請求項４１】
モナチンまたはその塩を含有する卓上甘味料組成物であって、該組成物のサンプルは２ｍｇ超〜約１０５ｍｇの範囲の量のモナチンまたはその塩を含有し、該サンプル中のモナチンまたはその塩は小さじ１杯分のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈することを特徴とする卓上甘味料組成物。
【請求項４２】
サンプルは容量が約０．３５ｍｌである請求項３５または４１に記載の組成物。
【請求項４３】
サンプルは粒状物からなる立方体である請求項３５または４１に記載の組成物。
【請求項４４】
生合成経路で生産されるモナチン組成物を含有する卓上甘味料組成物であって、該モナチン組成物は石油化学系の、有毒な、または有害な不純物を含まないことを特徴とする卓上甘味料組成物。
【請求項４５】
モナチンまたはその塩を含有する卓上甘味料組成物であって、該モナチンまたはその塩は生合成経路で生産されて遺伝子組み換え細胞から分離され、また該遺伝子組み換え細胞は石油化学系の、有毒な、または有害な不純物を含まないことを特徴とする卓上甘味料組成物。
【請求項４６】
モナチンまたはその塩を含有する甘味料組成物を製造する方法であって、ブドウ糖、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルビン酸およびモナチン前駆体から選択される少なくとも１つの基質からモナチンまたはその塩を生産するステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４７】
モナチンまたはその塩をエリトリトールと混合するステップを更に含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
モナチンまたはその塩をトレハロースと混合するステップを更に含む請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
モナチンまたはその塩をシクラミン酸塩と混合するステップを更に含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
モナチンまたはその塩を、モナチンまたはその塩とは異なる少なくとも１つの他成分と混合するステップを更に含む請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの他成分は増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤、易流動剤、およびそれらの任意の組み合わせから選択されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つの他成分はマルトデキストリン、デキストロース、エリトリトールおよび繊維から選択されることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
甘味料組成物の分量約１グラムは約０ｍｇ〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０ｍｇ〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有し、該分量は小さじ２杯分のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
甘味料組成物１グラムは約０ｍｇ〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０ｍｇ〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有し、該組成物の一分量は同分量のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
組成物１グラムは約０〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有し、該組成物１グラムは約０．９〜９．０グラムのグラニュー糖に匹敵する甘味を呈することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
Ｓ，Ｓモナチンまたはその塩の含量は組成物１グラムにつき約５ｍｇ〜約２００ｍｇであることを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
方法はＳ，Ｓモナチンまたはその塩を、増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤、易流動剤、およびそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの他成分と混合するステップを更に含み、該モナチンまたはその塩の含量は組成物１グラムにつき約３ｍｇ〜約２００ｍｇであることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
方法はＲ，Ｒモナチンまたはその塩を、増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤、易流動剤、およびそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの他成分と混合するステップを更に含み、またＲ，Ｒモナチンまたはその塩の含量は組成物１グラムにつき約３ｍｇ〜約５ｍｇであることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
モナチンまたはその塩は組成物１グラムにつき約０．４〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有することを特徴とする請求項５０に記載の方法。
【請求項６０】
方法はモナチンまたはその塩を、マルトデキストリンとデキストロースから選択される少なくとも１つの他増量剤と混合するステップを更に含み、また該モナチンまたはその塩は組成物１グラムにつき約０．５ｍｇ〜約１ｍｇ  のＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含むことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
方法はモナチンまたはその塩をマルトデキストリンと混合するステップを更に含み、また該モナチンまたはその塩は組成物１グラムにつき約０．５ｍｇ〜約１ｍｇ  のＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含むことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
モナチン組成物を含有する甘味料組成物を製造する方法であって、該方法は（ａ）モナチンまたはその塩を遺伝子組み換え細胞において生合成経路で生産するステップ；（ｂ）モナチン組成物を該遺伝子組み換え細胞から分離するステップを含み、また該モナチン組成物はモナチンまたはその塩、および食用または飲用に適した他物質からなることを特徴とする方法。
【請求項６３】
モナチンとエリトリトールとを含有するモナチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスリファレンス
本願は２００３年８月１日提出の米国仮特許出願第６０／４９２，０１４号の優先権を主張する。なお同願明細書は参照をもってその全体がここに開示される。
【０００２】
本発明はモナチンを含有する新規な甘味料組成物およびそうした組成物の製造方法に関する。本発明はまた、特定のモナチン立体異性体、特定のモナチン立体異性体ブレンド、および／またはインビボ（in vivo；例えば細胞内）またはインビトロ（in vitro）で生合成経路により生産されるモナチンを含有する甘味料組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
小児肥満、ＩＩ型糖尿病、および関連疾病への健康上の懸念を反映してノンカロリー高甘味度甘味料の使用がふえている。従って、グラニュー糖（ショ糖）などのような普通の甘味料よりも甘味が著しく強い甘味料が求められる。高甘味度甘味料は不快な異臭をおびたり、予想外の、期待はずれの甘味プロファイルを示したりするものも多い。これらの問題を克服するために業界は苦味抑制剤、異臭マスキング技術、およびショ糖並みの甘味プロファイルを実現するための甘味料ブレンドなどの研究を続けている。
【０００４】
モナチン（２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸）は、南アフリカのトランスバール地域で発見された植物Sclerochiton ilicifoliusから分離される天然の、高甘味度甘味料である。モナチンはショ糖または他の同等甘味度の栄養性甘味料と違って炭水化物または糖質を含まず、ノーカロリーに近い。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、次の式で示されるモナチンすなわち２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−アミノグルタル酸、別名４−アミノ−２−ヒドロキシ−２−（１Ｈ−インドール−３−イルメチル）−ペンタン二酸、または別の位置番号付与システムにより４−ヒドロキシ−４−（３−インドリルメチル）−グルタミン酸を含有する甘味料組成物に関する：
【化１】
2007501004.tif 000002
モナチンは天然の高甘味度甘味料である。モナチンには次の４立体異性体がある：２Ｒ，４Ｒ型（Ｒ，Ｒ立体異性体またはＲ，Ｒモナチン）、２Ｓ，４Ｓ型（Ｓ，Ｓ立体異性体またはＳ，Ｓモナチン）、２Ｒ，４Ｓ型（Ｒ，Ｓ立体異性体またはＲ，Ｓモナチン）および２Ｓ，４Ｒ型（Ｓ，Ｒ立体異性体またはＳ，Ｒモナチン）。モナチンは本明細書では特に断らない限り、モナチンの４立体異性体すべてとモナチン立体異性体の任意の組み合わせからなるブレンド（例えばＲ，Ｒ型およびＳ，Ｓ型モナチン立体異性体のブレンド）をいう。
【０００６】
モナチンは卓越した甘味質を有する。モナチンの風味プロファイルは他の既知高甘味度甘味料に優るとも劣らないほどすっきりしている。その用量反応曲線はサッカリンなどのような他の高甘味度甘味料よりももっと線形であり、従ってショ糖のそれに近い。モナチンはその卓越した甘味プロファイル故に卓上甘味料、食品、飲料、その他製品への使用に好適である。
【０００７】
種々のモナチン立体異性体はＲ，Ｒ型やＳ，Ｓ型を含めて甘味料業界で別個の成分として、またはブレンドとして、使用される可能性がある。モナチンは、またモナチン立体異性体と他甘味料とのブレンドも、他の高甘味度甘味料に匹敵する優れた食味特性および／または物性をもつと考えられる。例えば、モナチンはEqual（登録商標）またはNutraSweet（登録商標）（アスパルテーム、ＡＳＭともいう）よりも安定性が高く、食味がSweet N’ Low（登録商標）（サッカリン）よりもすっきりしており、またSplenda（登録商標）（スクラロース）よりも甘味が強い。同様に、モナチン甘味料はサッカリン特有の苦い後味がなく、また他のある種の高力価甘味料に特有の舌を刺すような、酸っぱい、渋い、またはのどがぴりぴりするような後味もない。加えて、モナチン甘味料はステビオシドやグリチルリチンなどのようなある種の天然甘味料に特有の甘草の後味も示さない。更にモナチン甘味料は、アスパルテーム甘味料と違って、フェニルアラニンを含むという警告文が不要である。特にＲ，Ｒ型立体異性体はその強烈な甘さのために、他の高甘味度甘味料に対し経済競争力をもつはずである。
【０００８】
本発明は一態様で、Ｒ，Ｒモナチンおよび／またはＳ，Ｓモナチンを含有する甘味料組成物を提供する。そうした組成物は例えばグラニュー糖（ショ糖）に匹敵する甘味を示すので、スプーン単位またはカップ単位で砂糖の１対１代替品として使用可能である。「匹敵する甘味」は、経験豊かな官能評価員の平均的な判定によれば第１組成物の甘さが第２組成物の甘さの８０％〜１２０％の範囲内にあることを意味する。「匹敵する甘味」は、２〜１０％の範囲のショ糖等価濃度を有する組成物（例えば溶液）を用いて行われる後述のような甘味マッチング試験で５人以上の経験豊かな官能評価員によって確認される判定に関する。従って、例えばモナチンを含有する組成物１００ｍｇ／ｍＬは、該モナチン組成物の甘さがショ糖８０〜１２０ｍｇ／ｍＬの範囲内の甘さであれば、ショ糖１００ｍｇ／ｍＬに「匹敵する甘味」を呈することになる。
【０００９】
ショ糖との比較による甘味料の相対的な甘味評価は、甘味評価試験の訓練を受け、経験を積んだ官能評価員のパネルを使用して行う。サンプルはすべて（バッファーに溶かして）２２℃±１℃の温度で２回、試験に供する。試験溶液は３桁の乱数コードを付してあり、パネリストに対し個別に、無作為順に供する。濃度が０．５％（ｗ／ｖ）刻みで上昇する４．０〜１０．０％（ｗ／ｖ）の範囲内のショ糖標準品もまた供する。パネリストは試験溶液をショ糖標準品と比較して甘味を評価するよう求められる。これは試験溶液を３口、水を１口、ショ糖標準品を３口、水を１口順次飲むといった手順で行う。パネリストは甘味を小数第１位まで、例えば６．８、８．５というように判定する。試験溶液の評価は５分間の休憩時間を間に挟んで行う。パネリストはまた、口を充分にすすぎ、クラッカー１個を食べて、潜在的な持ち越し効果を小さくするよう求められる。パネリストから得た情報を基にして、用量反応曲線の特定ポイントにおける％モナチンでショ糖等価濃度（ＳＥＶ）（例えば％ショ糖）を割って甘味の強度または力価を計算する。
【００１０】
実施態様により、組成物は基本的にＳ，ＳまたはＲ，Ｒモナチンからなるモナチンを含有する場合もあれば、主にＳ，ＳまたはＲ，Ｒモナチンを含有する場合もある。「主に」は、組成物中のモナチン立体異性体のうち特定の立体異性体の含量が９０％を超えることを意味する。実施態様によっては、組成物はＳ，ＳまたはＲ，Ｒモナチンを実質的に含まない。「実質的に含まない」は組成物中のモナチン立体異性体のうち特定の立体異性体の含量が２％未満であることを意味する。加えてまたは代りに、「実質的に含まない」は、生合成経路で生産されるモナチンの記述に用いられる場合には、キラル特異的酵素（例えばＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼまたはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）および／またはキラル特異的基質（例えばＲ−立体配置に炭素を有する基質）を使用して特定の立体異性体（例えばＲ，Ｒモナチン）を生産しようとする生合成経路で副生物として生産される別の立体異性体（例えばＳ，Ｓモナチン）の量についてもいう。
【００１１】
本発明の別の態様では、生合成経路で生産される立体異性体濃縮型モナチン混合物を含む甘味料組成物が提供される。「立体異性体濃縮型モナチン混合物」は、該混合物が複数のモナチン立体異性体を含有し、かつＲ，Ｒ型、Ｓ，Ｓ型、Ｓ，Ｒ型またはＲ，Ｓ型といった特定のモナチン立体異性体を少なくとも６０％含むことを意味する。他の実施態様では、該混合物は特定のモナチン立体異性体を６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％超含有する。別の実施態様では、甘味料組成物は立体異性体濃縮型Ｒ，ＲまたはＳ，Ｓモナチンを含有する。「立体異性体濃縮型」Ｒ，Ｒモナチンは、Ｒ，Ｒモナチン含量が少なくとも６０％であるモナチンを意味する。「立体異性体濃縮型」Ｓ，Ｓモナチンは、Ｓ，Ｓモナチン含量が少なくとも６０％であるモナチンを意味する。他の実施態様では、立体異性体濃縮型モナチンはＲ，ＲまたはＳ，Ｓモナチンを６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％超含有する。
【００１２】
別の態様では、本発明はやはり、Ｒ，ＲまたはＳ，Ｓ型モナチンを含有する甘味料組成物を、例えば分割包装または即使用可能タイプの調製品の形で提供する。例えば使いきり個包装タイプの調製品（通常は約１グラム）はグラニュー糖（ショ糖）小さじ２杯分に匹敵する甘味を呈しうる。技術上周知のように、ショ糖の場合小さじ１杯は約４グラムに相当する。あるいは、即使用可能タイプの調製品の分量は同分量のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈しうる。あるいは、使いきり個包装タイプのモナチン組成物（例えば１グラム）はグラニュー糖約０．９グラム〜９．０グラムに匹敵する甘味を呈しうる。用語「約」は計測に付き物の実験誤差の範囲を包摂する。特に断らない限り、諸々の計測値は数値の前に用語「約」を、たとえ明示に使用されていない場合でも、伴うものとする。
【００１３】
別の態様では、本発明はモナチンを含有する均一な卓上甘味料を提供する。「均一な」組成物は一様な組成物をいう。例えば「均一な」卓上甘味料組成物（例えば液体）は組成物の全体にわたり同一濃度のモナチンを含有する（すなわち該組成物に由来する任意のサンプルはその濃度になる）であろう。
【００１４】
本発明は別の態様で、甘味料組成物の製造方法を提供する。該方法はインビボまたはインビトロでの生合成経路によるモナチンの生産を含む。「生合成経路」は少なくとも１つの生物変換ステップを含む。実施態様によっては、生合成経路はマルチステップ過程であり、そのうちの少なくとも１つが生物変換ステップである。他の実施態様では、生合成経路は生物変換、化学変換の両ステップを含むマルチステップ過程である。実施態様によっては、生産されるモナチンは立体異性体濃縮型のモナチン混合物である。
【００１５】
本発明の別の態様では、ブドウ糖、トリプトファン、インドール−３−乳酸、更にはインドール−３−ピルビン酸および２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（モナチン前駆体、ＭＰ、またはアルファケト体モナチンともいう）から選択される基質からモナチンを製造するためのいくつかの生合成経路が存在する。モナチンまたはその中間体を製造または生産するための生合成経路の例は図１〜３および１１〜１３で開示するが、図中の囲みは潜在的な中間体および最終生成物を示す。これらの生合成経路では、例えばブドウ糖からトリプトファンへの、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸への、インドール−３−ピルビン酸からＭＰへの、ＭＰからモナチンへの、またはインドール−３−乳酸からインドール−３−ピルビン酸への変換といった、ある生成物から別の生成物への変換が起こる。
【００１６】
生合成経路内のこれらの変換は化学変換および／または生物変換によって促進することができる。用語「変換する」は、反応に少なくとも１つのポリペプチドを使用して第１中間体を第２中間体に変化させることをいう。変換はインビボ、インビトロのいずれで起きてもよい。用語「化学変換」はポリペプチドによる積極的な促進を受けない反応をいう。用語「生物変換」は１つまたは複数のポリペプチドによる積極的な促進を受ける反応をいう。生物変換を使用するときは、ポリペプチドおよび／または細胞を担体上に、高分子担体上への化学結合などにより、固定化することができる。変換には技術上周知の任意のリアクター例えばバッチ式または連続式のリアクターを使用することができる。
【００１７】
生物変換への使用が可能なポリペプチドおよびそのコード配列の例は図１〜３および１１〜１３に示すとおりである。ポリペプチドの基質特異性および／または活性の改変を可能にするような点突然変異を１つまたは複数含むポリペプチドはモナチンの製造に使用することができる。そうしたポリペプチドを発現する単離および遺伝子組み換え細胞はモナチンの生産に使用することができる。これらの細胞は任意の細胞例えば植物、動物、酵母、藻類、古細菌または真菌の細胞などでよい。
【００１８】
例えばモナチン生産細胞は次のうち１つまたは複数（例えば２つ以上または３つ以上）の活性を含むことができる：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１９）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２，１．４．１．３，１．４．１．４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２８）、多基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ（酵素番号なし；Hadar et al., J. Bacteriol １２５：１０９６−１１０４，１９７６およびFuruya et al.， Biosci Biotechnol Biochem  ６４：１４８６−９３，２０００）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（Kohiba and Mito， Proceedings of the ８ｔｈ International Symposium on Vitamin Ｂ６ and Carbonyl Catalysis， Osaka, Japan  １９９０）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．３）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２１）、シンターゼ／リアーゼ（ＥＣ  ４．１．３．−）例えば４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．１６）または４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．１７）など、および／またはシンターゼ／リアーゼ（４．１．２−）。
【００１９】
別の例では、細胞は次のうち１つまたは複数（例えば２つ以上または３つ以上）の活性を含むことができる：インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．２３７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１２７，１．１．１．２８，１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１１）、乳酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．３．−）例えば４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．１６）または４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．１７）など、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２−）、トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１９）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２，１．４．１．３，１．４．１．４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２８）、多重基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．９９．１）、および／またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２１）。
【００２０】
加えて、細胞は次のうち１つまたは複数（例えば２つ以上または３つ以上）の活性を含むことができる：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２７）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１９）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２，１．４．１．３，１．４．１．４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２８）、多重基質アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．−）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．２）、トリプトファンオキシダーゼ、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．９９．１）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．３）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２１）、インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１０）、Ｒ−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２２２）、３−（４）−ヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．２３７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１２７，１．１．１．２８，１．１．２．３）、（３−イミダゾール−５−イル）乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１１）、乳酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．１．３．−）、シンターゼ／リアーゼ（４．１．３．−）例えば４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．１６）または４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．１７）など、シンターゼ／リアーゼ（４．１．２−）。
【００２１】
さらなる例として、細胞は次のうち１つまたは複数のアルドラーゼ活性を含むことができる：ＫＨＧアルドラーゼ、ＰｒｏＡアルドラーゼ、ＫＤＰＧアルドラーゼおよび／または関連ポリペプチド（ＫＤＰＨ）、トランスカルボニルベンザルピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ、４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブタ−３−エノアート＝アルドラーゼ、トランス−Ｏ−ヒドロキシベンジリデンピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ、３−ヒドロキシアスパラギン酸アルドラーゼ、ベンゾインアルドラーゼ、ジヒドロネオプテリンアルドラーゼ、Ｌ−トレオ−３−フェニルセリン＝ベンズアルデヒド−リアーゼ（フェニルセリンアルドラーゼ）、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ、１，２−ジヒドロキシベンジルピルビン酸アルドラーゼ、および／または２−ヒドロキシベンザルピルビン酸アルドラーゼ。
【００２２】
モナチンは、トリプトファンおよび／またはインドール−３−乳酸を第１ポリペプチドと接触させ、該第１ポリペプチドの働きでトリプトファンおよび／またはインドール−３−乳酸をインドール−３−ピルビン酸へと変換するステップ（Ｄ−型またはＬ−型のトリプトファンおよび／またはインドール−３−乳酸はインドール−３−ピルビン酸へと変換される基質として使用することができる；このステップに使用するポリペプチドは、当業者には自明であろうが、適切な特異性を示すのが理想である）、生成したインドール−３−ピルビン酸を第２ポリペプチドと接触させ、該第２ポリペプチドの働きでインドール−３−ピルビン酸を２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）へと変換するステップ、およびＭＰを第３ポリペプチドと接触させ、該第３ポリペプチドの働きでＭＰをモナチンへと変換するステップを含む方法によって生産することができる。これらの変換に使用することができる例示的なポリペプチドは図２および３に示す。
【００２３】
生合成経路での、１つまたは複数の生物変換によるモナチンの生産にはある種の利点がある。例えば生合成経路で特異的ポリペプチドおよび／またはある種の基質を使用することにより、特定の立体異性体を濃縮した混合物を、および／または１つまたは複数の立体異性体を実質的に含まないモナチン混合物を、生産することができる。
【００２４】
モナチン組成物はモナチン合成に使用した方法の結果としての不純物を含むかもしれない。純粋に合成的な（すなわち少なくとも１つの生物変換を伴わない）手段によって生産されるモナチン組成物は、生合成経路によって生産されるモナチン組成物とは異なる不純物を含もう。例えば、純粋に合成的な手段で生産されるモナチン組成物は使用原料次第で人間による消費には不適切な石油化学系の、有毒な、および／または他の有害な不純物を含むかもしれない。そうした不純物の例はＬＤＡ、水素−Ｐｄ／Ｃ、ジアゾメタン、ＫＣＮ、グリニャール試薬およびＮａ／Ｈｇなどのような有害化学物質である。他方、生合成経路で生産されるモナチン組成物は食用または飲用に適した不純物を含む場合もあるが、石油化学系の、有毒な、および／または他の有害な不純物を含むことはないと見られる。
【００２５】
生合成経路で１つまたは複数の生物変換によりモナチンを生産する方法では純粋に合成的な手段と比較して、有毒または有害不純物の生成が少ない、および／または特定立体異性体の濃度を高くすることが可能である、と見込まれる。例えばＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ、Ｄ−アラニン（アスパラギン酸）アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−芳香族アミノトランスフェラーゼまたはＤ−メチオニンアミノトランスフェラーゼを使用してモナチンを製造するときは、少なくとも６０％のＲ，Ｒモナチンと４０％未満のＳ，Ｓ、Ｓ，Ｒおよび／またはＲ，Ｓモナチンが得られると見込まれる。また、例えば前述のＤ−型酵素の他にＲ−立体配置に１個の炭素を有する少なくとも１つの基質（例えばモナチン前駆体）と使用してモナチンを製造するときは、少なくとも９５％のＲ，Ｒモナチンと５％未満のＳ，Ｓ、Ｓ，Ｒおよび／またはＲ，Ｓモナチンが得られると見込まれる。それに対して、純粋に合成的な手段でモナチンを製造するときは、得られる所期立体異性体の濃度は約２５％〜５０％と見込まれる。
【００２６】
一実施態様では、生合成経路でモナチンを生産する方法は、例えば１つまたは複数の生物変換を伴うが、石油化学系の、有毒な、または他の有害な不純物を生成しない。「石油化学系の、有毒な、または他の有害な不純物」は原料として供給された物質または純粋に合成的な手段でモナチンを製造する際に生成した物質を含めて、石油化学系の、有毒な、および／または他の意味で人間による消費には不適切な、任意の物質を意味する。別の実施態様では、生合成経路でモナチンを生産する方法は、例えば１つまたは複数の生物変換を伴うが、食用または飲用に適した物質だけを生成する。「食用または飲用に適した物質」は、人間による飲食に適した、または他の意味で人間が消費しても安全である、１つまたは複数の化合物または物質をいう。食用または飲用に適した物質の例はモナチン、トリプトファン、ピルビン酸、グルタミン酸、または他のアミノ酸、それに人体内に天然に存在する他の化合物または物質などである。
【００２７】
ある種の実施態様では、モナチン甘味料組成物の例は卓上分割包装および立方体タイプの甘味料、それに容量ベースでショ糖（砂糖）とほぼ同じ甘さを有し卓上グラニュー糖の代用となりうる即使用可能タイプの卓上代用甘味料などである。そうした卓上甘味料は（ホットおよびアイス）コーヒー／紅茶やシリアル食品、フルーツおよび家庭用焼き菓子（クッキー、マフィン、ケーキなど）、デザートを甘くするために使用される。
【００２８】
一実施態様では、卓上甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、約０．９〜約９．０グラムのグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。別の実施態様では、１グラム分量のモナチン卓上甘味料は小さじ２杯分のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。別の実施態様では、１グラム分量のモナチン卓上甘味料は約０．９〜約９．０グラムのグラニュー糖に匹敵する甘さをもたらし、また約１グラムのグラニュー糖よりも低カロリー、低糖質である。
【００２９】
別の実施態様では、モナチンまたはその塩を含有する卓上甘味料組成物は約０〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有してよい。例えば１グラムの卓上甘味料組成物は約３〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有してよい。あるいは、例えば１グラムの卓上甘味料組成物は約０〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有してよい。
【００３０】
別の実施態様では、１グラムのモナチン卓上甘味料組成物は約２００ｍｇ以下のＳ，Ｓモナチンまたはその塩を含有し、かつＲ，Ｒ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まない。別の実施態様では、１グラムのモナチン卓上甘味料組成物は約５ｍｇ以下のＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有し、かつＳ，Ｓ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まない。
【００３１】
別の実施態様では、モナチンまたはその塩を含有する組成物は、増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤および易流動剤から選択される少なくとも１つの成分を更に含有する。例えばモナチン卓上甘味料組成物はマルトデキストリンを加えた造粒デキストロースを更に含有してもよい。
【００３２】
一実施態様では、甘味料組成物はモナチンとエリトリトールを含有する。他の実施態様ではモナチン組成物はエリトリトールを含有する。一実施態様ではモナチン組成物はエリトリトールを最高９９．７％含有する。別の実施態様ではモナチン組成物はトレハロースを含有する。別の実施態様ではモナチン組成物はチクロ（シクラミン酸塩）を含有する。
【００３３】
他の実施態様では、卓上甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、該モナチンまたはその塩は基本的にＲ，Ｒモナチンまたはその塩からなる。あるいは、卓上甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、該モナチンまたはその塩は基本的にＳ，Ｓモナチンまたはその塩からなる。他の実施態様では、卓上甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、該モナチンまたはその塩は立体異性体濃縮型のＲ，ＲまたはＳ，Ｓモナチンまたはその塩である。例えばモナチン卓上甘味料組成物は少なくとも９５％のＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有してもよい。
【００３４】
他の実施態様では、卓上甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、その甘さは生合成経路で生産されるモナチンまたはその塩によってもたらされる。
【００３５】
他の実施態様では、即使用可能タイプの甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、該組成物のある分量は同分量のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。別の実施態様では、小さじ１杯の即使用可能タイプの甘味料組成物は約小さじ１杯のグラニュー糖よりも低カロリーおよび低糖質である。
【００３６】
他の実施態様では、即使用可能タイプの甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、該組成物１グラムは約３〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒ  Ｓ，Ｓモナチンまたはその塩を含有する。あるいは、例えば即使用可能タイプのモナチン甘味料は基本的にＳ，Ｓモナチンまたはその塩、またはＲ，Ｒモナチンまたはその塩からなる。他の実施例では、即使用可能タイプのモナチン甘味料組成物１グラムは約５〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩を含有する。あるいは、例えば即使用可能タイプのモナチン甘味料組成物１グラムは約０．４〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有し、かつＳ，Ｓ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まない。あるいは、例えば即使用可能タイプのモナチン甘味料組成物１グラムは約０．５〜約１ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有し、かつＳ，Ｓ、Ｓ，ＲまたはＲ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まない。
【００３７】
他の実施態様では、甘味料組成物は立体異性体濃縮型モナチン混合物を含有し、該モナチン混合物は生合成経路で生産される。一実施態様では、該生合成経路はマルチステップ経路であり、そのうちの少なくとも１つのステップは化学変換ステップである。別の実施態様では、立体異性体濃縮型モナチン混合物は主にＲ，Ｒモナチンまたはその塩である。
【００３８】
他の実施態様では、均一な卓上甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、該組成物のサンプルは２ｍｇ超〜約２００ｍｇの範囲の量のモナチンまたはその塩を含有し、また該サンプル中のモナチンまたはその塩は約０．９〜９．０グラムのグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。例えば均一な卓上甘味料組成物は小さじ２杯分のグラニュー糖に匹敵する甘さをもたらしてもよい。別の実施態様では、均一な卓上甘味料組成物のサンプルは重量が約１グラム、または容量が約０．３５ｍＬである。別の実施態様では、均一な卓上甘味料組成物のサンプルは２ｍｇ超〜約５ｍｇの範囲の量のモナチンまたはその塩を含有する。別の実施態様では、均一な卓上甘味料組成物はＳ，Ｓモナチンまたはその塩を実質的に含まない、またはＲ，Ｒモナチンまたはその塩を実質的に含まない。
【００３９】
他の実施態様では、卓上甘味料組成物はモナチンまたはその塩を含有し、該組成物のサンプルは２ｍｇ超〜約１０５ｍｇの範囲の量のモナチンまたはその塩を含有し、また該サンプル中のモナチンまたはその塩は小さじ１杯分のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。別の実施態様では、均一な卓上甘味料組成物のサンプルは容量が約０．３５ｍＬであるか、または粒状物からなる立方体である。
【００４０】
他の実施態様では、卓上甘味料組成物は生合成経路で生産されるモナチン組成物を含有し、該モナチン組成物は石油化学系の、有毒な、または有害な不純物を含まない。モナチンまたはその塩を含有するモナチン卓上甘味料組成物は例えば、石油化学系の、有毒な、または有害な不純物を含まない遺伝子組み換え細胞から生合成経路で産生させ、分離するようにしてもよい。
【００４１】
他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法はモナチンまたはその塩を含有し、該方法はブドウ糖、トリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルビン酸およびモナチン前駆体から選択される少なくとも１つの基質からモナチンまたはその塩を生産するステップを含む。他の実施態様では、該方法はモナチンまたはその塩をエリトリトールと混合するステップを更に含む。他の実施態様では、該方法はモナチンまたはその塩をトレハロースと混合するステップを更に含む。他の実施態様では、該方法はモナチンまたはその塩をチクロと混合するステップを更に含む。他の実施態様では、該方法はモナチンまたはその塩を、モナチンでもその塩でもない少なくとも１つの他成分と混合するステップを更に含む。そうした成分の例は増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤、易流動剤、およびそれらの任意の組み合わせである。一実施態様では、少なくとも１つの他成分はマルトデキストリン、デキストロース、エリトリトールおよび繊維から選択される。
【００４２】
他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法において、該甘味料組成物の分量約１グラムは約０ｍｇ〜約２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０ｍｇ〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有し、該分量は小さじ２杯分のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。
【００４３】
他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法において、該甘味料組成物１グラムは約０ｍｇ〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０ｍｇ〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有し、該組成物のある分量は同分量のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。あるいは、甘味料組成物を製造する方法において、該組成物１グラムは約０〜約２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンまたはその塩と約０〜約０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩とを含有し、該組成物１グラムは約０．９〜９．０グラムのグラニュー糖に匹敵する甘味を呈する。あるいは、甘味料組成物を製造する方法において、Ｓ，Ｓモナチンまたはその塩の含量は該組成物１グラムにつき約５ｍｇ〜約２００ｍｇである。
【００４４】
他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法はＳ，Ｓモナチンまたはその塩を、増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤、易流動剤、およびそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの他成分と混合するステップを更に含み、モナチンまたはその塩の含量は該組成物１グラムにつき約３ｍｇ〜約２００ｍｇである。他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法はＲ，Ｒモナチンまたはその塩を、増量剤、キャリアー、繊維、糖アルコール、オリゴ糖、糖質、非モナチン高甘味度甘味料、栄養性甘味料、香料、風味増進剤、風味安定剤、酸味料、固結防止剤、易流動剤、およびそれらの任意の組み合わせから選択される少なくとも１つの他成分と混合するステップを更に含み、Ｒ，Ｒモナチンまたはその塩の含量は該組成物１グラムにつき約３ｍｇ〜約５ｍｇである。他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法は該組成物１グラムにつき約０．４〜約５ｍｇのＲ，Ｒモナチンまたはその塩を含有する。
【００４５】
他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法はモナチンまたはその塩を、デキストロースとマルトデキストリンから選択される少なくとも１つの増量剤と混合するステップを更に含み、モナチンまたはその塩の含量は該組成物１グラムにつき約５ｍｇのＲ，Ｒまたはその塩である。他の実施態様では、甘味料組成物を製造する方法はモナチンまたはその塩をマルトデキストリンと混合するステップを更に含み、モナチンまたはその塩の含量は該組成物１グラムにつき約０．５〜約１ｍｇのＲ，Ｒまたはその塩である。
【００４６】
他の実施態様では、モナチン組成物を含有する甘味料組成物の製造方法において、該方法は該モナチン組成物を生合成経路で生産するステップを含み、また該モナチン組成物は石油化学系の、有毒な、または有害な不純物を含まない。または、該方法は該モナチン組成物をマルチステップ経路で基質から生産するステップを含み、該マルチステップ経路中の１つまたは複数のステップは生物変換ステップであり、また該モナチン組成物は石油化学系の、有毒な、または有害な不純物を含まない。
【００４７】
他の実施態様では、モナチン組成物を含有する甘味料組成物の製造方法において、該方法は該モナチン組成物を生合成経路で生産するステップを含み、また該モナチン組成物はモナチンまたはその塩および他の食用または飲用に適した物質からなる。または、該方法は該モナチン組成物をマルチステップ経路で基質から生産するステップを含み、該マルチステップ経路中の１つまたは複数のステップは生物変換ステップであり、また該モナチン組成物はモナチンまたはその塩および他の食用または飲用に適した物質からなる。
【００４８】
他の実施態様では、モナチン組成物を含有する甘味料組成物の製造方法において、該方法は：（ａ）遺伝子組み換え細胞において生合成経路でモナチンまたはその塩を産生させるステップ；（ｂ）該遺伝子組み換え細胞から該モナチン組成物を分離するステップを含み、該モナチン組成物はモナチンまたはその塩および他の食用または飲用に適した物質からなる。
【００４９】
本明細書中の教示から、本発明の具体的な実施態様を前記態様の、更には他態様の、１つまたは組み合わせに向けてもよいことは、当業者には自明であろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５０】
［モナチン生産のための生合成経路の概要］
以下の用語と方法の説明は、本発明を更に充分に開示し、本発明の実施へと当業者を導くことが狙いである。本明細書では、用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含む、含有する、具備する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味する。更に、単数形の表記は文脈上明白な矛盾が見られない限り、複数形の表記を包含する。
【００５１】
図１−３および図１１−１３に示すように、モナチンまたはその中間体（インドール−３−ピルビン酸またはＭＰなど）の生産には多数の生合成経路を使用することができる。各基質（例えばブドウ糖やトリプトファン、インドール−３−乳酸、インドール−３−ピルビン酸、ＭＰなど）の各生成物（例えばトリプトファンやインドール−３−ピルビン酸、ＭＰ、モナチンなど）への変換には、数種のポリペプチドを使用することができる。更に、そうした変換はインビトロ、インビボ、またはインビボ  ＋  インビトロ反応で、例えば非酵素的化学反応を含むインビトロ反応で、行うことができる。従って図１−３および図１１−１３は例示であり、所期生成物を獲得するために使用しうる複数の異なる経路を示す。
【００５２】
ブドウ糖→トリプトファン
多くの生物はブドウ糖からトリプトファンを合成することができる。そうした生物には、ブドウ糖および／またはトリプトファンからモナチン、ＭＰおよび／またはインドール−３−ピルビン酸を産生させるための必要な遺伝子を含むコンストラクトをクローニングすることができる。ここでは、トリプトファンはモナチンへと変換されうることが示される。
【００５３】
他の例では、公知のポリペプチドを使用して生物を改造し、トリプトファンを産生させる、またはトリプトファンを過剰に産生させることができる。例えば米国特許第４，３７１，６１４号明細書は、野生型トリプトファンオペロンを含むプラスミドで形質転換させたＥ．  ｃｏｌｉ株を開示している。
【００５４】
米国特許第４，３７１，６１４号明細書で開示されているトリプトファンの最大力価は約２３０ｐｐｍである。同様に、国際公開第ＷＯ  ８７０１１３０号明細書はトリプトファンを産生するように遺伝子組み換えしたＥ．  ｃｏｌｉ株を開示し、発酵法によるＬ−トリプトファンの増産を論じている。ブドウ糖からトリプトファンを合成しうる生物はブドウ糖またはフルクトース６−リン酸への変換が可能な他の炭素およびエネルギー源を利用して同様の結果をもたらしうることも、当業者には自明であろう。そうした炭素およびエネルギー源の非限定的な例はショ糖、果糖、でんぷん、セルロースまたはグリセロールである。
【００５５】
トリプトファン→インドール−３−ピルビン酸
数種のポリペプチドがトリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換に使用可能である。そうしたポリペプチドの非限定的な例は酵素番号（ＥＣ）２．６．１．２７、１．４．１．１９、１．４．９９．１、２．６．１．２８、１．４．３．２、１．４．３．３、２．６．１．５、２．６．１．−、２．６．１．１および２．６．１．２１などのクラスの酵素である。これらのクラスに含まれる酵素の非限定的な例は、次のような名称のポリペプチド類である：Ｌ−トリプトファンおよび２−オキソグルタル酸をインドール−３−ピルビン酸およびＬ−グルタミン酸へと変換するトリプトファンアミノトランスフェラーゼ（別名：Ｌ−フェニルアラニン−２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、トリプトファントランスアミナーゼ、５−ヒドロキシトリプトファン−ケトグルタル酸トランスアミナーゼ、ヒドロキシトリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−トリプトファントランスアミナーゼ、およびＬ−トリプトファン−２−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ）；Ｄ−トリプトファンと２−オキソ酸をインドール−３−ピルビン酸とアミノ酸へと変換するＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ；トリプトファンデヒドロゲナーゼ（別名：ＮＡＤ（Ｐ）−Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−トリプトファンデヒドロゲナーゼ、Ｌ−Ｔｒｐ−デヒドロゲナーゼ、ＴＤＨおよびＮＡＤ（Ｐ）オキシドレダクターゼ（脱アミノ基））；Ｄ−アミノ酸とＦＡＤをインドール−３−ピルビン酸、ＮＨ３、ＦＡＤＨ２へと変換するＤ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ；Ｌ−トリプトファンとフェニルピルビン酸をインドール−３−ピルビン酸とＬ−フェニルアラニンへと変換するトリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（別名：Ｌ−トリプトファン−α−ケトイソカプロン酸アミノトランスフェラーゼおよびＬ−トリプトファン：フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ）；Ｌ−アミノ酸、Ｈ２ＯおよびＯ２を２−オキソ酸、ＮＨ３、Ｈ２Ｏ２へと変換するＬ−アミノ酸オキシダーゼ（別名：オフィオアミノ酸オキシダーゼおよびＬ−アミノ酸：酸素オキシドレダクターゼ（脱アミノ基））；Ｄ−アミノ酸、Ｈ２ＯおよびＯ２を２−オキソ酸、ＮＨ３、Ｈ２Ｏ２へと変換するＤ−アミノ酸オキシダーゼ（別名：オフィオアミノ酸オキシダーゼおよびＤ−アミノ酸：酸素オキシドレダクターゼ（脱アミノ基））；Ｌ−トリプトファン、Ｈ２ＯおよびＯ２をインドール−３−ピルビン酸、ＮＨ３、Ｈ２Ｏ２へと変換するおよびトリプトファンオキシダーゼ。これらのクラスにはチロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｄ−アミノ酸（またはＤ−アラニン）アミノトランスフェラーゼ、および多重アミノトランスフェラーゼ活性をもつ広基質特異性（多基質）アミノトランスフェラーゼも含まれ、そのうちのいくつかトリプトファンと２−オキソ酸をインドール−３−ピルビン酸とアミノ酸に変換することができる。
【００５６】
そうした活性をもつアミノトランスフェラーゼ・クラスの１１メンバーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２で示される新規なアミノトランスフェラーゼを含めて、実施例１で開示する。従って、本発明はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２でそれぞれ示される配列に対する相同性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、更には少なくとも９９％である単離核酸およびアミノ酸配列を提供する。本発明には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２で示される配列のうち、アミノトランスフェラーゼ活性を有するまたはアミノトランスフェラーゼ活性を保持する断片および融合もまた包摂される。そうした断片の非限定的な例はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００または１０００連続ヌクレオチド、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２の少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００または３５０連続アミノ酸である。開示の配列（およびその変異形、断片、および融合）はベクターの一部でもよい。該ベクターは宿主細胞の形質転換に使用して、トリプトファンからインドール−３−ピルビン酸を、またいくつかの例ではＭＰおよび／またはモナチンを、生産しうるような、遺伝子組み換え細胞を生み出すことができる。
【００５７】
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．２）は公知であり、次のような数種の源泉から単離することができる：Vipera lebetine（東方クサリヘビ）（ｓｐＰ８１３７５）、Ophiophagus hannah（キングコブラ）（ｓｐＰ８１３８３）、Agkistrodon rhodostoma（マレーマムシ）（ｓｐＰ８１３８２）、Crotalus atrox（ニシタセイヤガラガラヘビ）（ｓｐＰ５６７４２）、Burkholderia cepacia（セパシア菌）、Arabidopsis thaliana（シロイヌナズナ）、Caulobacter cresentus（カウロバクター属細菌）、Chlamydomonas reinhardtii（コナミドリムシ）、Mus musculus（マウス）、Pseudomonas syringae（植物病原菌群）およびRhodococcus str．（ロドコッカス属細菌株）。  加えて、トリプトファンオキシダーゼも文献で開示されており、また例えばヒトヨタケの一種（Coprinus sp.  ＳＦ−１）、根こぶ病の白菜、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、および哺乳動物の肝臓などから単離することができる。トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸へと変換することができるＬ−アミノ酸オキシダーゼの１つは、分子クローニング用の代替源としても、実施例３で取り上げる。多数のＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子が分子クローニング用としてデータベースで閲覧できる。
【００５８】
トリプトファンデヒドロゲナーゼは公知であり、また例えばホウレンソウ、Pisum sativum（エンドウマメ）、Prosopis juliflora（ジュリフロラ）、マメ、メスキート、コムギ、トウモロコシ、トマト、タバコ、Chromobacterium violaceum（クロモバクテリウム・ビオラセウム）、およびLactobacilli（乳酸菌）などから単離することができる。数多くのＤ−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の配列は周知である。
【００５９】
図１１−１３に示すように、トリプトファンオキシダーゼなどのようなアミノ酸オキシダーゼがトリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換に使用される場合には、過酸化水素の含量を減らすかまたは存在を一掃するためにカタラーゼを加えることができる。
【００６０】
インドール−３−乳酸→インドール−３−ピルビン酸
インドール−３−乳酸をインドール−３−ピルビン酸へと変換する反応はＥＣ  １．１．１．１１０、１．１．１．２７、１．１．１．２８、１．１．２．３、１．１．１．２２２、１．１．１．２３７、１．１．３．−または１．１．１．１１１クラスのポリペプチドなど種々のポリペプチドによって触媒することができる。ＥＣ  １．１．１．１１０クラスのポリペプチドはインドール乳酸デヒドロゲナーゼ（別名：インドール乳酸：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ）を含む。ＥＣ  １．１．１．２７、１．１．１．２８および１．１．２．３クラスは乳酸（lactate）デヒドロゲナーゼ（別名：乳酸（lactic acid）デヒドロゲナーゼ、乳酸：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ）を含む。ＥＣ  １．１．１．２２０クラスは（Ｒ）−４−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（別名：Ｄ−芳香族乳酸デヒドロゲナーゼ、Ｒ−芳香族乳酸デヒドロゲナーゼ、および（Ｒ）−３−（４−ヒドロキシフェニル）乳酸：ＮＡＤ（Ｐ）＋２−オキシドレダクターゼ）を含み、またＥＣ  １．１．１．２３７クラスは３−（４−ヒドロキシフェニルピルビン酸）レダクターゼ（別名：ドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼおよび４−ヒドロキシフェニル乳酸：ＮＡＤ＋オキシドレダクターゼ）を含む。ＥＣ  １．１．３．−クラスは乳酸オキシダーゼを含み、またＥＣ  １．１．１．１１１クラスは（３−イミダゾール−５−イル）乳酸デヒドロゲナーゼ（別名：（Ｓ）−３−（イミダゾール−５−イル）乳酸：ＮＡＤ（Ｐ）＋２−オキシドレダクターゼ）を含む。これらのクラスのいくつかのポリペプチドはおそらくインドール−３−乳酸からのインドール−３−ピルビン酸の生産を可能にしよう。この変換の例は実施例２で示す。
【００６１】
インドール−３−乳酸からインドール−３−ピルビン酸への変換には化学反応を使用することもできる。そうした化学反応はいくつかの方法の使用によって実現しうる酸化ステップ例えばＢ２触媒（Ｃｈｉｎａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ，ｖｏｌ．  １３，ｎｏ．  ２８，ｐ．１８（１），２００２）、希釈過マンガン酸塩および過塩素酸塩、または金属触媒の存在下の過酸化水素の使用による空気酸化を含む。
【００６２】
インドール−３−ピルビン酸→２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸（ＭＰ）
【００６３】
インドール−３−ピルビン酸のＭＰへの変換にはいくつかの公知ポリペプチドを使用することができる。そうしたポリペプチドのクラスはＥＣ  ４．１．３．−、４．１．３．１６、４．１．３．１７および４．１．２．−などである。これらのクラスは２つのカルボン酸基質の縮合を触媒するアルドラーゼなどのような炭素−炭素結合シンターゼ／リアーゼを含む。ポリペプチド・クラスＥＣ  ４．１．３．−はオキソ酸基質（インドール−３−ピルビン酸など）を求電子試薬として利用して炭素−炭素結合を形成するシンターゼ／リアーゼであり、ＥＣ  ４．１．２．−はアルデヒド基質（ベンズアルデヒドなど）を求電子試薬として利用して炭素−炭素結合を形成するシンターゼ／リアーゼである。
【００６４】
例えば欧州特許第ＥＰ  １０４５−０２９号明細書で開示されているポリペプチド（ＥＣ  ４．１．３．１６、４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸−リアーゼ、別名：４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ、２−オキソ−４−ヒドロキシグルタル酸アルドラーゼまたはＫＨＧアルドラーゼ）はグリオキシル酸およびピルビン酸を４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸へと変換し、またポリペプチド４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（ＥＣ  ４．１．３．１７、別名４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸−リアーゼまたはＰｒｏＡアルドラーゼ）は２個のケト酸例えば２個のピルビン酸を縮合して４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸とする。これらのリアーゼを利用する反応は本明細書で開示する。
【００６５】
図１−２および１１−１３はこれらの反応の図解であり、そこでは３個の炭素を有する（Ｃ３）分子がインドール−３−ピルビン酸と結合される。ＥＣ  ４．１．２．−および４．１．３．−クラスのメンバー特にＰＬＰ利用ポリペプチドは、セリン、システインおよびアラニン、またはそれらの誘導体などのようなアミノ酸であるＣ３分子を利用することができる。ＥＣ  ４．１．２．−  および４．１．３．−クラスの代表的メンバーによって触媒されるアルドール縮合は、この経路のＣ３分子がピルビン酸またはピルビン酸誘導体であることを要求する。しかし他化合物もＣ３炭素源として機能し、ピルビン酸へと変換されうる。アラニンは前記のものを含めた多数のＰＬＰ利用トランスアミナーゼのアミノ基転移作用を受けてピルビン酸を生成する。ピルビン酸とアンモニアはＬ−セリン、Ｌ−システイン、およびセリン／ステイン誘導体の、充分な脱離基例えばＯ−メルチ−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、Ｏ−アシル−Ｌ−セリン、および３−クロロ−Ｌ−アラニンとの、ベータ脱離反応によって得られる。アスパラギン酸はＰＬＰ仲介ベータ−リアーゼ反応例えばトリプトファナーゼ（ＥＣ  ４．１．９９．１）および／またはβ−チロシナーゼ（ＥＣ  ４．１．９９．２、別名：チロシン−フェノールリアーゼ）によって触媒される反応でピルビン酸源として機能しうる。ベータリアーゼ反応の速度はMouratou et al．（J. Biol. Chem  ２７４：１３２０−５，１９９９）により、また実施例８で、開示されているように、（ＥＣ  ４．１．９９．１−２）ポリペプチドに対する部位指定突然変異誘発の実行によって高めることができる。これらの修飾は該ポリペプチドによるジカルボン酸アミノ酸基質の受容を可能にする。乳酸もピルビン酸源として機能しうる。すなわち乳酸は乳酸デヒドロゲナーゼと酸化補因子の添加、または乳酸オキシダーゼと酸素の添加により、ピルビン酸へと酸化される。これらの反応例は以下で開示する。例えば図２および図１１−１３に示すように、ピルビン酸をＣ３分子として使用するときは、ＰｒｏＡアルドラーゼをインドール−３−ピルビン酸と接触させることができる。
【００６６】
ＭＰは実施例５で開示するアルドール縮合などのような化学反応を利用して生成させることもできる。
【００６７】
ＭＰ→モナチン
ＭＰのモナチンへの変換は次のうち１つまたは複数の酵素で触媒することができる：トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２７）、トリプトファンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．１９）、Ｄ−アミノ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．９９．１）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２−４）、フェニルアラニンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．４．１．２０）、トリプトファン−フェニルピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２８）、またはもっと一般的にはアミノトランスフェラーゼ・ファミリー（ＥＣ  ２．６．１．−）のメンバー例えばアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１）、チロシン（芳香族）アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．５）、Ｄ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ、またはＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２１）（図２）。このアミノトランスフェラーゼ・クラスの１１メンバーは以下（実施例１）で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２で示す新規なメンバーを含めて、開示するし、またアミノトランスフェラーゼおよびデヒドロゲナーゼ酵素の活性を明示する反応は実施例７で開示する。
【００６８】
この反応は化学反応でも行うことができる。ケト酸（ＭＰ）のアミノ化はアンモニアとシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する還元的アミノ化によって行うことができる。
【００６９】
図１１−１３はＭＰのモナチンへの変換に、更にはインドール−３−ピルビン酸またはトリプトファンからのモナチンの収量増の実現に、使用することができる追加のポリペプチド類を示す。例えばアスパラギン酸をアミノ基供与体として使用する場合には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを使用してアスパラギン酸をオキサロ酢酸へと変換することができる（図１１）。オキサロ酢酸はデカルボキシラーゼ（オキサロ酢酸デカルボキシラーゼなど）によりピルビン酸および二酸化炭素への変換される（図１１）。更に、リシンをアミノ基供与体として使用する場合には、リシンε−アミノトランスフェラーゼを使用してリシンをアリシンへと変換することができる（図１２）。アリシンは自然に１−ピペリジン６−カルボン酸へと変換される（図１２）。還元的アミノ化反応を触媒しうるポリペプチド（例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼ）を使用してＭＰをモナチンへと変換する場合には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈをリサイクルしうるおよび／または揮発性生成物を生成しうるポリペプチド（図１３）例えばギ酸デヒドロゲナーゼを使用することができる。
【００７０】
生合成経路の設計における追加の検討事項
インドール−３−ピルビン酸、ＭＰおよび／またはモナチンの生成に使用するポリペプチド次第で、生産細胞に補因子、基質および／または追加のポリペプチドをもたらし、以って生成物の形成を増進することができる。加えて、遺伝子組み換えによりインドール−３−ピルビン酸、ＭＰおよび／またはモナチンの増産を図ることもできる。同様に、モナチンの生産に使用する宿主細胞を最適化することもできる。
【００７１】
過酸化水素の除去
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、万一生成すれば、生産細胞、ポリペプチドまたは生産される生成物（例えば中間体）に損傷を及ぼしかねない。前記のＬ−アミノ酸オキシダーゼはＨ２Ｏ２を生成物として生成する。従って、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼを使用する場合には、生成するＨ２Ｏ２を除去するかまたはその濃度を低下させるかすれば、細胞または生成物に対する潜在的な損傷を少なくすることができる。
【００７２】
細胞中のＨ２Ｏ２濃度の引き下げにはカタラーゼを使用することができる（図１１−１３）。生産細胞は、Ｈ２Ｏ２のＨ２ＯとＯ２への分解を触媒するカタラーゼ（ＥＣ  １．１１．１．６）をコードする遺伝子またはｃＤＮＡ配列を発現することができる。例えばカタラーゼは生産細胞に導入したベクターから発現させることができる。使用可能カタラーゼの非限定的な例はｔｒ｜Ｑ９ＥＶ５０  （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｕｓ）、ｔｒ｜Ｑ９ＫＢ８Ｅ  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、ｔｒ｜Ｑ９ＵＲＪ７  （Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ｔｒ｜Ｐ７７９４８（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ｔｒ｜Ｑ９ＲＢＪ５（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．）などである。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼまたはトリプトファンオキシダーゼを使用する生体触媒リアクターはカタラーゼポリペプチドをも含むことができる。
【００７３】
ピリドキサル−５’−リン酸（ＰＬＰ）アベイラビリティーの調節
図１に示すように、ＰＬＰは本明細書で開示の１つまたは複数の生合成ステップに使用しうる。ＰＬＰは総合的な反応効率への制限にならないよう、その濃度を補うことができる。
【００７４】
ビタミンＢ６（ＰＬＰの前駆体）の生合成経路はこれまでにＥ．  ｃｏｌｉで研究し尽くされており、すでに結晶化されているタンパク質もある（Ｌａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４９：４５−８，１９９９）。関係遺伝子のうちの２つ（ｅｐｄまたはｇａｐＢとｓｅｒＣ）は他の代謝経路でも必要とされるが、３つの遺伝子（ｐｄｘＡ、ｐｄｘＢ、およびｐｄｘＪ）はピリドキサルリン酸の生合成に特有である。Ｅ．  ｃｏｌｉ経路での出発物の１つは１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸（ＤＸＰ）である。この前駆体の、一般的なＣ２またはＣ３中央代謝物からの合成は、ポリペプチド１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）が触媒する。他の前駆体は四炭糖のＤ−エリトロース４−リン酸から形成されるトレオニン誘導体である。ホスホ−４−ヒドロキシル−Ｌ−トレオニン（ＨＴＰ）への変換に必要とされる遺伝子はｅｐｄ、ｐｄｘＢおよびｓｅｒＣである。ＰＬＰ形成の最終反応はｐｄｘＡとｐｄｘＪの遺伝子産物によって触媒される、ＤＸＰとＨＴＰの間の複雑な分子間縮合および閉環反応である。
【００７５】
ＰＬＰがモナチン生産のための発酵に際して制限的栄養物質となる場合には、生産宿主細胞における１つまたは複数の経路遺伝子の発現の増大を利用してモナチン収量を高めることができる。宿主生物は固有経路遺伝子の多数のコピーを含むことができるか、または該生物のゲノム中に外来経路遺伝子のコピーを組み込むことができる。加えて、サルベージ経路遺伝子の多数のコピーを宿主生物中にクローニングすることができる。
【００７６】
あらゆる生物に保存されている一サルベージ経路は種々のビタミンＢ６誘導体を活性ＰＬＰ体に再生する。この経路に関与するポリペプチドはｐｄｘＫキナーゼ、ｐｄｘＨオキシダーゼおよびｐｄｘＹキナーゼである。これらの遺伝子の１つまたは複数の過剰発現はＰＬＰアベイラビリティーを高めることができる。
【００７７】
ビタミンＢ６の濃度は、宿主生物における固有生合成経路遺伝子の代謝調節の廃止または抑制によって高めることができる。細菌Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．  ２３８−７株ではＰＬＰは前駆体トレオニン誘導体の生合成に関与するポリペプチドを抑制する。代謝調節を受けなくしたこの菌株はピリドキサル誘導体を過剰に産生し、また最高２０ｍｇ／ＬのＰＬＰを分泌することができる。モナチンを産生する宿主細胞の同様の遺伝子組み換えは、生合成経路遺伝子の過剰発現を伴わずにＰＬＰ産生の増大を可能にしよう。
【００７８】
アンモニウムの利用
トリプトファナーゼ反応はアンモニア・アベイラビリティーの向上により、また脱水により、合成（インドールからのトリプトファンの生産）方向へと促進することができる。グルタミン酸デヒドロゲナーゼによって触媒されるものなどを含む還元的アミノ化反応もまた、過剰アンモニウムにより促進することができる。
【００７９】
アンモニアは炭酸またはリン酸緩衝系では炭酸アンモニウムまたはリン酸アンモニウム塩として利用可能にしうる。アンモニアはピルビン酸アンモニウムまたはギ酸アンモニウムとして供給することもできる。あるいは、アンモニアを生成する反応例えばグルタミン酸デヒドロゲナーゼまたはトリプトファンデヒドロゲナーゼ反応と組み合わせた反応にすることでアンモニアを供給することも可能である。アンモニアは、フェノールまたはインドール、ピルビン酸およびＮＨ３へと加水分解するＥＣ  ４．１．９９．−（チロシンまたはトリプトファン）の天然基質の添加によって、生成させることができる。これもまた、該酵素による特異的基質の加水分解を可能にすることにより通常の平衡量を上回る合成物の収量を実現可能にしよう。
【００８０】
生成物と副生成物の除去
トリプトファンアミノトランスフェラーゼによるトリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換はインドール−３−ピルビン酸の生産速度に悪影響を及ぼしかねない。というのは、この反応はグルタミン酸を生成し、補基質の２−オキソグルタル酸（α−ケトグルタル酸）を必要とするからである。グルタミン酸はアミノトランスフェラーゼの阻害を引き起こす可能性があり、またこの反応は大量の補基質を消費する可能性がある。また、高グルタミン酸濃度は後の分離工程に悪影響をもたらしかねない。
【００８１】
ポリペプチドのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＬＤＨ）はグルタミン酸を２−オキソグルタル酸へと変換し、もってこの補基質が、トリプトファンアミノトランスフェラーゼによって触媒される反応で再利用されるようにする。ＧＬＤＨはまた、好気性条件下で細胞用のエネルギー（ＡＴＰ）を発生させるために使用される還元性の等価物（ＮＡＤＨまたはＮＡＰＰＨ）を生成する。ＧＬＤＨによるグルタミン酸の利用は副生物の形成を減らす効果もある。加えて、この反応で発生するアンモニアは細胞用の窒素源として、または図１に示す最終ステップのための還元的アミノ化での基質として、役立ちうる。従って、ＧＬＤＨポリペプチドを過剰発現する生産細胞を使用すれば、収量の増強と培地および／または分離工程のコストダウンを図ることができる。
【００８２】
トリプトファン→モナチン経路では、適切な酵素クラスのアミノトランスフェラーゼを使用すれば、テップ３のアミノ基供与体（グルタミン酸またはアスパラギン酸など）はステップ１で必要とされるアミノ基受容体（２−オキソグルタル酸またはオキサロ酢酸）への再変換が可能である。この経路で２つの別々のトランスアミナーゼを、一方のトランスアミナーゼの基質が他方のトランスアミナーゼの活性を競合的に阻害しないように、使用するとこの経路の効率を高めることができる。
【００８３】
開示の経路における反応の多くは可逆的であり、従って基質と生成物の間で平衡に達しうる。経路の収率はポリペプチドからの生成物の連続的除去により高めることができる。例えばパーミアーゼまたは他輸送タンパク質の使用による発酵液中へのモナチンの分泌、またはバイオリアクターのストリームからのモナチンの選択的結晶化と同時的な基質の再利用は反応収率を高めよう。
【００８４】
追加の酵素的反応による、またはアミノ基供与体残基の置換による副生物の除去もまた反応収率を高める方法である。数例を実施例１３で説明し、図１１−１３に示す。例えば副生物を、相変化（気化）により、または二酸化炭素などのような非反応性の最終生成物への自然変換により、逆方向の反応には利用できなくなるように、生成させることが可能である。
【００８５】
基質プールの調節
インドールプールは、トリプトファンの生産を多くすることにより、および／またはインドール−３−ピルビン酸および／またはトリプトファンが関与する代謝経路を変化させることにより、調節することができる。例えばインドール−３−ピルビン酸からのインドール−３−酢酸の生産は、宿主細胞中のＥＣ  ４．１．１．７４対応遺伝子を機能的に除去することにより、減らすまたは廃止することができる。トリプトファンからのインドールの生産は、宿主細胞中のＥＣ  ４．１．９９．１対応遺伝子を機能的に除去することにより、減らすまたは廃止することができる。あるいは、過剰インドールをインビトロまたはインビボ法で基質として利用すると同時に、ＥＣ  ４．１．９９．１対応遺伝子の量を多くすることもできる（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｆｅｒｍ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．，８２：６０４−６，１９９６）。更に、遺伝子組み換えによりＤ−エリトロース−４−リン酸およびコリスミ酸などのような中間体の濃度を高めるようにすることも可能である。
【００８６】
ほとんどの生物ではトリプトファンの生産が調節を受ける。１つのメカニズムは経路内の特定酵素のフィードバック阻害によるものであり、それによればトリプトファン濃度が高まるとトリプトファン生産速度が低下する。従って、トリプトファン経由でモナチンを産生するように遺伝子組み換えした宿主細胞を使用するときは、トリプトファン濃度に対して非感受性の生物を使用することができる。例えば、種々のトリプトファンアナログによる増殖阻害に対して耐性のあるＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ  ｒｏｓｅｕｓ株が、高濃度の５−メチルトリプトファンへの反復暴露にから選択されている（Ｓｃｈａｌｌｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｌｉｎ，Ｚ  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ３４：５４１−５，１９７９）。得られた同株のトリプトファンシンターゼ活性は生成物阻害の影響を受けにくかったが、これは遺伝子の変異に起因するとみられる。同様にして、モナチン生産に使用される宿主細胞の最適化も可能である。
【００８７】
トリプトファンの生産は、生成物阻害への感受性が低いポリペプチドを進化させるための定方向進化法の使用によって最適化することができる。スクリーニングは、例えば培地中にトリプトファンを含まないが高濃度の非代謝性トリプトファンアナログを含むプレートで行うことができる。米国特許第５，７５６，３４５号、第４，７４２，００７号および第４，３７１，６１４号の各明細書は発酵生物のトリプトファン生産性を高めるための方法を開示している。トリプトファン生合成の最終ステップはインドールへのセリンの付加である。従ってセリンのアベイラビリティーを高めればトリプトファンの増産を図ることができる。
【００８８】
発酵生物によるモナチンの生産量は該宿主生物によるピルビン酸の生産量をふやすことによって伸ばすことができる。ある種の酵母例えばＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｃｕｔａｎｅｕｍ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３５：３３８−４２，２００２）およびＴｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ  （Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５７：４５１−９，２００１）はピルビン酸を過剰生産するので、本明細書で開示の方法を実施するために使用できる。加えて、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５ｌｉｐ２株の場合（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｆｅｒｍ．  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ８２：６０４−６，１９９６）のように、生物に対しピルビン酸の生産を促進させるための遺伝子組み換えを行うこともできる。
【００８９】
キラリティーの制御
モナチンの味質プロファイルはその立体化学（キラリティー）を制御することにより変化させることができる。例えば種々の食品系には種々のモナチン異性体を種々の濃度でブレンドするのが好ましいかもしれない。キラリティーはｐＨとポリペプチドの組み合わせによって制御することができる。
【化２】
2007501004.tif 000003
モナチン（上記の位置番号付き分子式を参照）のＣ−４位のラセミ化はα炭素の脱プロトン化と再プロトン化によって起こりうるが、脱／再プロトン化の引き金となるのはｐＨシフト、または溶液中のラセマーゼなどの酵素に結合したまたは遊離の補因子ＰＬＰとの反応である。微生物ではラセミ化を引き起こすに足るようなｐＨシフトは起こりそうもないが、ＰＬＰは豊富である。ポリペプチドによってキラリティーを制御する方法は、モナチン生産に利用する生合成経路次第である。
【００９０】
図２に示す経路でモナチンが形成されるときは、次の点を考慮することができる。バイオリアクターによる反応では、Ｃ−２のキラリティーはインドール−３−ピルビン酸をＭＰへと変換する酵素によって決定することができる。多数の（例えばＥＣ  ４．１．２．−および４．１．３．−の）酵素がインドール−３−ピルビン酸をＭＰへと変換しうるので、所期の異性体を形成する酵素をその中から選ぶことができる。あるいは、インドール−３−ピルビン酸をＭＰへと変換する酵素のエナンチオ特異性を、定方向進化法の使用によって改変してもよいし、所期の反応を触媒するような抗体触媒を作り出してもよい。
【００９１】
ＭＰが（酵素的に、または化学的縮合により）生産され次第、トランスアミナーゼ例えば本明細書で開示するものなどを使用してアミノ基を立体異性的に付加することができる。Ｄ型、Ｌ型いずれかのアミノ酸のアミノトランスフェラーゼを使用するかにより、Ｃ−４のＲ型、Ｓ型いずれかの立体配置を生成することができる。ほとんどのアミノトランスフェラーゼはＬ−異性体に対して特異的であるが、ある種の植物にはＤ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼが存在する（Ｋｏｈｉｂａ  ａｎｄ  Ｍｉｔｏ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｂ６  ａｎｄ  Ｃａｒｂｏｎｙｌ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ  １９９０）。更に、Ｄ−アラニンアミノトランスファラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２１）、Ｄ−メチオニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．４１）、および（Ｒ）−３−アミノ−２−メチルプロパン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．６１）と（Ｓ）−３−アミノ−２−メチルプロパン酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．２２）の両方が同定されている。ある種のアミノトランスフェラーゼはＣ−２炭素に特定立体配置を有する基質だけをこの反応用に受容するであろう。従って、たとえＭＰへの変換が立体特異的でないとしても、最終生成物の立体化学は適切なトランスアミナーゼの選択により制御することができる。これらの反応は可逆的であるため、未反応ＭＰ（非所期異性体）はその成分へと再生し、ＭＰのラセミ体を再形成させることができる。
【００９２】
基質の活性化
本明細書で開示される反応にはホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）などのようなリン酸化基質を使用することができる。リン酸化基質はエネルギー的により有利であり、従って反応速度および／または収量の向上に使用することができる。アルドール縮合では、リン酸基の付加は該求核基質のエノール型互変異性体を安定させ、その反応性を高める。他の反応では、リン酸化基質はより優れた脱離基をもたらすことができる。同様にして種々の基質はＣｏＡ誘導体またはピロリン酸誘導体への変換によって活性化することもできる。
【００９３】
［甘味料組成物へのモナチンの使用］
重量ベースでは、モナチンのＳ，Ｓ立体異性体はショ糖の約５０〜１００倍も甘く、Ｒ，Ｒ異性体はショ糖の約２０００〜２４００倍も甘い。前述のように、モナチンの甘味は経験豊かな官能評価員を使用して、試験甘味料溶液を一連の標準溶液のうちの１つとマッチングして甘味を求めるという甘味比較法によって計算する。これらの溶液は例えば０．１６％（ｖ／ｗ）クエン酸と０．０２％（ｖ／ｗ）クエン酸ナトリウムとを含むバッファー（〜ｐＨ  ３．０）を使用して調製する。甘味は用量反応曲線の勾配すなわち％ショ糖／％モナチンとして計算する。例えば図１５（Ｒ，Ｒ／Ｓ，Ｓモナチン用量反応曲線）および図１４（Ｒ，Ｒモナチン用量反応曲線）を参照。ショ糖の甘味と比較した場合の前述のモナチンの甘味は８％ショ糖等価濃度（ＳＥＶ）での勾配の測定によって求めている。
【００９４】
モナチンは水溶液に溶かして消費に適した濃度としやすい。ある種のマトリックス中では、または他甘味料とのブレンディングでは、モナチン立体異性体の様々なブレンドのほうが質的に優るかもしれない。モナチンの他甘味料とのブレンドは、甘味および／または甘味プロファイルを最大化し、またコストを最小化するために使用してもよい。モナチンは、ショ糖に似た時間的プロファイルを生み出すために、または他の利益のために、他甘味料および／または他成分と混合して使用してもよい。
【００９５】
例えばモナチンは他の栄養性および非栄養性甘味料とブレンドして、特定の風味プロファイルまたはカロリー目標を達成するようにしてもよい。従って、甘味料組成物はモナチンと以下の甘味料１種または複数種との混合物を含んでよい：（１）糖アルコール（エリトリトール、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトール、キシリトール、イソマルト、低血糖性シロップなど）；（２）他の高甘味度甘味料（アスパルテーム、スクラロース、アセサルファム−Ｋ、ステビオシド、チクロ、ネオテーム、タウマチン、アリテーム、ジヒドロカルコン、モネリン、グリチルリチン、モグロシド、フィロズルチン、マビンリン、ブラゼイン、サークリン、ペンタジンなど）；および（３）栄養性甘味料（ショ糖、タガトース、転化糖、果糖、コーンシロップ、高果糖コーンシロップ（ＨＦＣＳ）、ブドウ糖／デキストロース、トレハロース、イソマルツロースなど）。モナチンはそうしたブレンドに味覚修飾物質として使用して、後味の抑制、他の風味（レモン風味など）の増強、または時間的風味プロファイルの改善を図るようにしてもよい。データでは、モナチンは（欧州で使用されている）チクロとの量的相乗効果があるが、アスパルテーム、サッカリン、アセサルファム−Ｋ、スクラロース、または糖質甘味料とは有意の量的相乗効果は指摘されなかった。モナチンは糖質ではないので、糖質系甘味料に部分的または全面的に代用しうる。
【００９６】
モナチンは乾燥状態で安定であり、単味で、または糖質と混合したときに、所期の味質プロファイルを示す。不可逆的に分解するようには見えず、むしろ低ｐＨ（の水性バッファー中）でラクトンおよび／またはラクタムを形成し、平衡に達する。モナチンは溶液中でゆっくりと時間をかけて、４位でラセミ化しうるが、これは一般に高ｐＨで起こる。一般にモナチンの安定性はアスパルテーム（Ｅｑｕａｌ（登録商標））に匹敵するかまたは優るし、またモナチンの味質プロファイルはアスパルテーム（Ｅｑｕａｌ（登録商標））、アリテームおよびスクラロース（Ｓｐｌｅｎｄａ（登録商標））などのような他の高級甘味料に匹敵する。モナチンにはサッカリンやステビオシドなどのような他の一部の高甘味度甘味料に付随する好ましくない後味もない。
【００９７】
モナチン甘味料の調製品は卓上砂糖代替品として使用してもよい。一般に、卓上砂糖代替品を製造するときは、モナチンを希釈し計量し易くするための増量剤および／またはキャリアーをも使用する。
【００９８】
一実施態様では、グラニュー糖小さじ２杯分（〜８グラム）に匹敵する甘味をもたらすよう調合した使いきり個包装を調製してもよい。Ｓ，Ｓの甘味はショ糖の５０−２００倍であるため、グラニュー糖８グラムに匹敵する甘味をもたらすＳ，Ｓモナチンの量は４０−１６０ｍｇとなる。従って一実施態様では、±２５％の甘味最適化を見込んで、使いきり個包装タイプのモナチン調製品１グラムは約４０−２００ｍｇのＳ，Ｓモナチンを含有してよい。
【００９９】
同様にして、Ｒ，Ｒの甘味はショ糖の２０００−２４００倍であるため、グラニュー糖８グラムに匹敵する甘味をもたらすＲ，Ｒモナチンの量は約３．３−５．０ｍｇとなる。別の実施態様では、個包装タイプのモナチン調製品は約４０−２００ｍｇのＳ，Ｓモナチン、３．３−５．０ｍｇのＲ，Ｒモナチン、または全量ｇあたり同量以下の両異性体の混合物を含有し、以ってグラニュー糖小さじ２杯分に匹敵する甘味をもたらすようしてもよい。
【０１００】
個包装タイプの卓上甘味料はしばしば全量が１グラムであり、高甘味度甘味料と１つまたは複数の増量剤またはキャリアーとの混合物を含む。該調製品の調製には多数の増量剤または増量剤の混合物を使用してもよい。例えば実施態様によってはモナチンをマルトデキストリンおよび／またはデキストロースと共に噴霧乾燥することができる。例えばデキストロースは密度を大きくしながらも、個包装１個（〜１ｇ）分の甘味料を１回分当たり端数切捨てでゼロカロリーにする効果がある。
【０１０１】
一実施態様では、個包装（全１ｇ）用の含モナチン調製品は次の成分を含有する：
デキストロース（栄養性）０−９９．７ｗｔ％
マルトデキストリン  ０−９９．７ｗｔ％
Ｒ，Ｒモナチン３．３−５．０ｍｇ、Ｓ，Ｓモナチン４０−２００ｍｇ、または同量以下の両異性体の混合物。
【０１０２】
他の実施態様では、即使用可能タイプの卓上甘味料調製品がグラニュー糖（ショ糖）に匹敵する甘味および分量となるように設計される。そうした調製品はスプーン単位でグラニュー糖の１：１代替品として使えるので、ベーキングレシピに特に有用である。即使用可能タイプの１：１代替調製品は個包装タイプ（〜１ｇ）の調製品と比べて一般に増量剤および／またはキャリアーなどのような希釈剤の含量が多く、小さじ、大さじ、カップなどによる家庭での通常の計量になじみやすい。これらの調製品は一般に個包装タイプよりも低密度、低粒状である。従って、即使用可能タイプの１：１代替調製品は密度を下げ、砂糖の１：１代替品として使えるようにするための異なる成分を含んでもよい。
【０１０３】
即使用可能タイプの１：１代替調製品の調製では、例えばデキストロースは高密度なので、マルトデキストリンだけを使用したいという場合もあろう。マルトデキストリンは低密度なので、それを含む甘味料調製品を砂糖と等量使用しても同（高）レベルのカロリーが蓄積することはない。このアプローチは、ベーキングの場合のようにモナチン甘味料をさじ単位またはカップ単位で使用するときには、特に有用である。
【０１０４】
Ｓ，Ｓの甘味はショ糖の５０−２００倍であるため、５−２０ｍｇのＳ，Ｓモナチンはグラニュー糖１グラムに匹敵する甘味をもたらす。従って一実施態様では、±２５％の甘味最適化を見込んで、即使用可能タイプの１：１代替調製品は全量グラムあたり約５−２５ｍｇのＳ，Ｓモナチンを含有してよい。同様にして、Ｒ，Ｒの甘味はショ糖の２０００−２４００倍であるため、０．４−０．５ｍｇのＲ，Ｒモナチンは砂糖１グラムに匹敵する甘味をもたらす。従って、別の実施態様では、±２５％の甘味最適化を見込んで、即使用可能タイプの１：１代替調製品は約０．４−０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチンを含有してよい。別の実施態様では、即使用可能タイプの１：１代替調製品は約５−２５ｍｇのＳ，Ｓモナチン、０．４−０．６２５ｍｇのＲ，Ｒモナチン、または全量ｇあたり同量以下の両異性体の混合物を含有し、以ってグラニュー糖に匹敵する甘味をもたらすようしてもよい。
【０１０５】
別の実施態様では、即使用可能タイプの甘味料調製品は使いきり量半グラムあたり約０．２−１３ｍｇのモナチンを、約５００ｍｇのマルトデキストリンの表面上に噴霧乾燥させて含む。
【０１０６】
他の実施態様では、例えば飲食店向けの立方体タイプのモナチン組成物を製造することができる。該立方体は重量が約８グラムであり、サイズは標準的な角砂糖と同じ２．２ｃｍ×２．２ｃｍ×１ｃｍである。これらの立方体タイプの調製品は即使用可能タイプの調製品に関する前述の含量と同様のモナチンを含有し、その甘味は標準的な角砂糖のそれに匹敵する。あるいは１／２サイズの立方体（４グラム、１．１ｃｍ×２．２ｃｍ×１ｃｍ）としてもよい。これらの調製品は標準的な角砂糖のそれに匹敵する甘味を呈するように、（従って重量ベースではショ糖の約２倍の甘味を呈するように）調製してもよい。
【０１０７】
個包装タイプまたは即使用可能タイプの調製品などのような卓上モナチン調製品は更に他の増量剤またはキャリアーを含んでもよい。例えば該調製品はイヌリン、アラビノガラクタン、加水分解グアールガム、ポリデキストロース、微結晶セルロース、粉末セルロース（ｓｏｌｋａ  ｆｌｏｃ）、でんぷん、加工でんぷん、レジスタントスターチ、耐性マルトデキストリンなどのような食物繊維を１つまたは複数含んでもよい。多くの食物繊維は水易溶性、低粘性、無味である。食物繊維は他の増量剤よりも低カロリーなので、増量剤として特に有用である。
【０１０８】
例えばイヌリンはグラムあたり１．３カロリーにしかならないが、デキストロースはグラムあたり４カロリーになる。脱糖イヌリンは＜２％の単糖および二糖を含むが、グラムあたり１．１カロリーにしかならないので、特に好適である。イヌリンなどのようなある種の食物繊維は、カップ単位で砂糖の１：１代替品として使用されるのが普通であるマルトデキストリンよりも、調製品に対し、よりグラニュー糖様の外観を付与する可能性を秘めている。食物繊維はまた食物繊維の強化、消化管の健康改善、およびカルシウム吸収の促進といった追加の効用ももたらす。食物繊維またはレジスタントスターチ誘導体などのような非消化性糖質の使用は血糖調節に不安のある人々（糖尿病患者など）には糖分の減少にもなる。例えば低カロリー、低血糖および低インスリン分泌性のキャリアーまたは希釈剤としてレジスタントスターチ、耐性マルトデキストリンおよびイヌリンを使用してもよい。
【０１０９】
同様にして、モナチン調製品はエリトリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、マンニトール、ラクチトールなどのような糖アルコールを１つまたは複数含んでもよい。一実施態様ではエリトリトールを他のキャリアーまたは増量剤の代わりに使用してもよい。エリトリトールにはデキストロースまたはマルトデキストリンをしのぐ長所がある。例えばエリトリトールはデキストロースまたはマルトデキストリンと比べるとゼロ・カロリーに近く、そのグラムあたりカロリーは０−０．２であるが、デキストロース、マルトデキストリンのグラムあたりカロリーはそれぞれ４、２．８−３．２である。ＡＬＴＥＲＮＡＴＩＶＥ  ＳＷＥＥＴＮＥＲＳ，３ｒｄ  Ｅｄ．，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｙｎ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｎａｂｏｒｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  “Ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ”  ｂｙ  Ｍ．Ｅ．  Ｅｍｂｕｓｃａｄｏ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋ．  Ｐａｔｉｌ  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）を参照。また、マルトデキストリンは噴霧乾燥するとグラニュー糖というよりも粉のようにみえるが、エリトルトールの場合は単結晶となるので砂糖に似てみえる。従って、エリトリトールの表面に直接モナチンを付加することができる。
【０１１０】
加えて、モナチン調製品はオリゴ糖類例えばフラクトオリゴ糖やマルトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ラクトオリゴ糖などを含んでもよい。該調製品はまた糖類例えばショ糖や転化糖、トレハロース、異性化糖、ブドウ糖、果糖、乳糖、麦芽糖、Ｄ−キシロース、異性化乳糖など含んでもよい。錠剤型の調製品を製造するときは、増量、賦形を目的に乳糖を加えることができる。
【０１１１】
モナチンと増量剤との混合調製品は、乾式混合法、同時噴霧乾燥法、同時凍結乾燥法、造粒法、ブレンド法、同時乾燥法、押出成形法など任意の手段で生産してよい。
【０１１２】
該混合調製品にはタルタルクリームなどのような香味料および酸味料を添加して風味、安定性および／またはベーキング性能の改善を図るようにしてもよい。更にＳｕｃｒａｍａｓｋ（登録商標）などのような風味増進剤または安定剤を添加してもよい。
【０１１３】
該調製品は二酸化ケイ素（シリカ）、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、炭酸カルシウム、アルミノケイ酸ナトリウム、アルミノケイ酸カルシウム、アルミノケイ酸カリウム、リン酸一カルシウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、タルク、マンニトールなどのような固結防止剤または易流動剤を含んでもよい。
【０１１４】
実施態様によっては、モナチンはベーキングに使用する。実施態様しだいで、ベーキングレシピに蜂蜜または糖蜜を加えて褐変やテクスチャーの改善を図る。例えばレシピによっては大さじ１杯の糖蜜を加えて砂糖の通常の褐変による着色を模すようにしてもよい。
【０１１５】
別の実施態様では、現在キャンディーや他の無糖食品に使用されているポリオールの多くに代ってモナチンが使用される。これらのポリオールは便をゆるくする作用があり、またエリトリトールの場合には体を冷やす作用もある。エリトリトールの場合、便をゆるくする作用は他のポリオールよりもずっと小さいが、体を冷やす作用は他のポリオール並みである。エリトリトールはマルチトールなどのような従来型ポリオールに比べて低カロリー、低血糖インデックスである。モナチンではカロリー、血糖インデックスが更に低くなるが、発がん性の有意の上昇を伴うことはない。しかし、ポリオールまたは他の高甘味度甘味料の代用とするときは、製品の分量と口当たりの両方を維持するために増量剤が必要となる。最も一般的な増量剤はイヌリン、マルトデキストリン、ポリデキストロース、ソルビトールなどである。イヌリンには食事性カルシウムの体内吸収を高める働きもある。レジスタントスターチと緩消化性でんぷんもまた高甘味度甘味料の増量剤または希釈剤として使用することができる。モナチンは多数の甘味料、糖質および増量剤と組み合わせて使用することができる。
【０１１６】
卓上モナチンブレンドは他甘味料と比較して賞味期限が長く、耐熱・耐酸性が大きく、味質に優れ、マーケティングに有利であると見込まれる。
【実施例】
【０１１７】
［実施例１］
トリプトファンアミノトランスフェラーゼのクローニングと発現
この実施例では、トリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換に使用しうるトリプトファンアミノトランスフェラーゼのクローニングに使用した方法を開示する。
【０１１８】
実験の概要
アミノトランスフェラーゼをコードする１１の遺伝子をＥ．  ｃｏｌｉ中にクローニングした。これらの遺伝子は次のとおりであった：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｙ１４０８２．１，ｂｐ  ２８６２２−２９４７０、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＮＰ＿３８８８４８．１）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ（別名Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ）チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔａｔＡ、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１および２）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１株チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔａｔＡ、相同性により断定、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３および４）、Ｒ．  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ３５０５３チロシンアミノトランスフェラーゼ（相同性により断定、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：５および６）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ広基質特異性アミノトランスフェラーゼ（ｂｓａｔ、Ｌ．  ｍｅｘｉｃａｎａ由来のペプチド断片との相同性により断定、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：７および８）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ、相同性により断定、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：９および１０）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ芳香族アミノトランスフェラーゼ（ａｒａＴ、相同性により断定、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１１および１２）、Ｒ．  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ３５０５３多重基質アミノトランスフェラーゼ（相同性により断定、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１３および１４）、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ２．４．１株多基質アミノトランスフェラーゼ（ｍｓａ、相同性により断定、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＡＡＥ０１００００９３．１，ｂｐ  １４７４３−１６１５５およびＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＺＰ００００５０８２．１）、Ｅ．  ｃｏｌｉアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＥ０００１９５．１，ｂｐ  ２７５５−１５６５およびＧｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＡＣ７４０１４．１）、およびＥ．  ｃｏｌｉチロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ、核酸配列とアミノ酸配列はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３１および３２）。
【０１１９】
これらの遺伝子をクローニングし、発現させ、トリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換活性を、市販酵素と並行的に試験した。１１遺伝子はいずれも活性をもっていた。
【０１２０】
所期の活性をもつポリペプチドを含みうる菌株の同定
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）データベースにはトリプトファンアミノトランスフェラーゼと命名されている遺伝子はなかった。しかし、この酵素活性をもつ生物はすでに同定されている。Ｌ−トリプトファンアミノトランスフェラーゼ（ＴＡＴ）の活性は次の源泉に由来する細胞抽出物または精製タンパク質で測定した：Ｆｅｓｔｕｃａ  ｏｃｔｏｆｌｏｒａ由来の根圏微生物分離株、エンドウマメのミトコンドリアおよびサイトゾル、ヒマワリのクラウンゴール細胞、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ  ｂｉｏｖａｒ  ｔｒｉｆｏｌｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ  ｐｖ  ｇｙｐｓｏｐｈｉｌａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．  ｓａｖａｓｔａｎｏｉ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｌｉｐｆｅｒｕｍ  ＆  ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｅｌｋａｎｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、ラット脳、ラット肝、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＣＨＡ０、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、コムギ苗、オオムギ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  （マング・ビーン）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ  （ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐ．、トウモロコシ、トマト芽、エンドウマメ植物体、タバコ、ブタ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ。
【０１２１】
［実施例２］
インドール−３−乳酸のインドール−３−ピルビン酸への変換
図１および３に示すように、インドール−３−乳酸を使用してインドール−３−ピルビン酸を生産することができる。乳酸とピルビン酸の間の変換は可逆反応であり、インドール−３−ピルビン酸とインドール−３−乳酸の間の変換も同様である。一般にインドール乳酸の酸化が後に続いたが、これはインドール−３−ピルビン酸に由来する３４０ｎｍでの大きなバックグラウンドに起因した。
【０１２２】
標準アッセイ混合液は０．１ｍＬ  中に１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ  ８．０、０．３ｍＭ  ＮＡＤ＋、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）（Ｓｉｇｍａ−Ｌ２３９５，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）７単位、および２ｍＭ基質を含んだ。アッセイはＵＶ−透過性マイクロタイタープレートにより２連で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーを使用して行った。ポリペプチドとバッファーを混ぜて、インドール−３−乳酸とＮＡＤ＋を入れたウェルにピペットで分注し、ざっと混合した後、９０秒間隔で各ウェルの３４０ｎｍでの吸光度を読み取った。反応液は５分間、２５℃に保持した。ＮＡＤ＋からＮＡＤＨが生産されると３４０ｎｍでの吸光度が上昇する。別個に陰性対照アッセイをＮＡＤ＋無しおよび基質無しで行った。Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ由来Ｄ−ＬＤＨ  （Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ２３９５）はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来Ｌ−ＬＤＨ  （Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｌ５２７５）よりもインドール誘導体基質に対し、大きな活性を示したようである。
【０１２３】
同様の方法をＤ−ＬＤＨポリペプチドの天然基質であるＤ−乳酸とＮＡＤ＋またはＮＡＤＨとピルビン酸でも用いた。ピルビン酸還元のＶｍａｘは乳酸酸化のＶｍａｘの１００−１０００倍であった。インドール−３−乳酸のＤ−ＬＤＨによる酸化反応のＶｍａｘは乳酸のそれの約５分の１であった。インドール−３−ピルビン酸の存在量も、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡと０．５ｍＭヒ酸ナトリウムとを含有する５０ｍＭホウ酸ナトリウムバッファーを使用して３２７（エノール−ホウ酸塩誘導体）での吸光度の変化を追跡することにより、測定した。Ｌ−型、Ｄ−型の両ＬＤＨポリペプチドに関して、陰性対照との比較により、小幅ながらも反復的な吸光度変化が観測された。
【０１２４】
また、インドール−３−乳酸からインドール−３−ピルビン酸を生産するために、広特異性乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２７、ＥＣ  １．１．１．２８および／またはＥＣ  １．１．２．３に関連する活性をもつ酵素）をクローニングし、使用することもできる。広特異性乳酸デヒドロゲナーゼの源泉にはＥ．  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、およびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍなどがある。
【０１２５】
またはインドール−３−乳酸を次の細胞抽出物と接触させてインドール−３−ピルビン酸を生産してもよい：インドール乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１０）を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ由来の細胞抽出物；またはインドール−３−ピルビン酸に対する活性をもつことが知られているｐ−ヒドロキシフェニル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２２２）を含むＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ  ｅｐｉｍａｓｔｉｇｏｔｅｓ細胞抽出物；またはイミダゾール−５−イル乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．１１１）を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓまたはＥ．  ｃｏｌｉ細胞抽出物；またはヒドロキシフェニルピルビン酸レダクターゼ（ＥＣ  １．１．１．２３７）を含むＣｏｌｅｕｓ  ｂｌｕｍｅｉ；またはＤ−芳香族乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．１．１．２２２）を含むＣａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ。そうした活性を開示している参考資料の例はＮｏｗｉｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  ７１：１１９−２４，１９９２）、Ｊｅａｎ  ａｎｄ  ＤｅＭｏｓｓ（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４，１９６４）、Ｃｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｈａｓｓａｌｌ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  １１１：２３７−９，１９６９）、Ｃｏｒｔｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｃ．Ｒ．  Ｓｅａｎｃｅｓ  Ｓｏｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｆｉｌ．１６２  ３９０−５，１９６８）、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ａｌｆｅｒｍａｎｎ  （Ｚ．  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ，Ｃ；Ｂｉｏｓｃｉ．  ４３  ５０１−４，１９８８）、およびＢｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １３５：３５３−６０，１９８９）などである。加えて、インドール−３−乳酸のインドール−３−ピルビン酸への酸化には乳酸オキシダーゼ例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．に由来するもの（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ：１８：２９９−３０５，２００２）などを使用することもできる。
【０１２６】
［実施例３］
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの使用によるＬ−トリプトファンのインドール−３−ピルビン酸への変換
【０１２７】
この実施例では、実施例１で開示したトリプトファンアミノトランスフェラーゼの代りにオキシダーゼ（ＥＣ  １．４．３．２）を使用してＬ−トリプトファンをインドール−３−ピルビン酸へと変換する方法を開示する。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼはＣｒｏｔａｌｕｓ  ｄｕｒｉｓｓｕｓから精製した（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号Ａ−２８０５）。分子クローニング用Ｌ−アミノ酸オキシダーゼのアクセッション番号はＣＡＤ２１３２５．１，ＡＡＬ１４８３１，ＮＰ＿４９０２７５，ＰＡＢ７８２５３，Ａ３８３１４，ＣＡＢ７１１３６，ＪＥ０２６６，Ｔ０８２０２，Ｓ４８６４４，ＣＡＣ００４９９，Ｐ５６７４２，Ｐ８１３８３，Ｏ９３３６４，Ｐ８１３８２，Ｐ８１３７５，Ｓ６２６９２，Ｐ２３６２３，ＡＡＤ４５２００，ＡＡＣ３２２６７，ＣＡＡ８８４５２，ＡＰ００３６００およびＺ４８５６５などである。
【０１２８】
反応は全容積１ｍＬのマイクロ遠心チューブ中で、３７℃で振とうしながら１０分間インキュベートするという形で行った。反応混合液は５ｍＭ  Ｌ−トリプトファン、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ  ６．６、０．５ｍＭヒ酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５ｍＭ四ホウ酸ナトリウム、カタラーゼ０．０１６ｍｇ  （８３Ｕ，Ｓｉｇｍａ  Ｃ−３５１５）、ＦＡＤ（Ｓｉｇｍａ）０．００８ｍｇ、およびＬ−アミノ酸０．００５−０．１２５単位を含んだ。陰性対照はトリプトファンを除く全成分を含み、またブランクはオキシダーゼを除く全成分を含んだ。カタラーゼは酸化的脱アミノ反応で形成される過酸化水素を除去するために使用した。四ホウ酸ナトリウムとヒ酸ナトリウムは、３２７ｎｍで最大吸光度を示すエノール−ホウ酸塩体のインドール−３−ピルビン酸を安定させるために使用した。インドール−３−ピルビン酸の標準品を、反応混合液を使用して０．１−１ｍＭの濃度で調製した。
【０１２９】
購買Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは非活性が５４０μｇ−インドール−３−ピルビン酸形成量／分／ｍｇ−タンパク質であった。これはトリプトファンアミノトランスフェラーゼ酵素の比活性とほぼ同じである。
【０１３０】
［実施例４］
アルドラーゼによるインドール−３−ピルビン酸の２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタミン酸への変換
【０１３１】
この実施例では、アルドラーゼ（リアーゼ）を使用してインドール−３−ピルビン酸をＭＰへと変換するための方法を開示する（図２）。アルドール縮合はアルデヒドまたはケトンのβ炭素と別のアルデヒドまたはケトンのカルボニル炭素との間に炭素−炭素結合を形成する反応である。第１基質のカルボニル基に隣接する炭素上にカルボアニオンが形成され、第２基質のカルボニル炭素（求電子性炭素）を攻撃する求核試薬として働く。最も一般的には、求電子性基質はアルデヒドであるため、ほとんどのアルドラーゼはＥＣ．  ４．１．２．−に分類される。実にしばしば求電子性基質はピルビン酸である。アルドラーゼが２ケト酸間または２アルデヒド間の縮合反応を触媒するのはあまり一般的ではない。
【０１３２】
しかし、２カルボン酸間の縮合反応を触媒するアルドラーゼはすでに同定されている。例えば欧州特許第１０４５−０２９号明細書はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌培養（ＥＣ  ４．１．３．．１６）の使用によるグリオキシル酸とピルビン酸からのＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生産を開示している。更に、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸アルドラーゼ（４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ、ＥＣ  ４．１．３．１７）は２ケト酸間の縮合反応を触媒することができる。そこで類似のアルドラーゼポリペプチドを使用して、インドール−３−ピルビン酸とピルピン酸の縮合反応を触媒させるようにした。
【０１３３】
クローニング
４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ（ＰｒｏＡアルドラーゼ、ＥＣ  ４．１．３．１７）および４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸リアーゼ（ＫＨＧアルドラーゼ、ＥＣ  ４．１．３．１６）は図２のアルドラーゼ反応と非常によく似た反応を触媒する。プライマーはオーバーハングをｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）用に適合させて設計した。
【０１３４】
ｐｒｏＡ遺伝子産物の活性試験結果
Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ｐｒｏＡ、Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ＳＭｃ００５０２両遺伝子コンストラクトはＩＰＴＧで誘導すると高発現レベルとなった。これらの組み換えタンパク質は全タンパク質および細胞抽出物サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果によれば可溶性であった。Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ遺伝子産物は純度＞９５％まで精製した。Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ遺伝子産物はＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジ使用のアフィニティー精製後の収率がきわめて低かったので、酵素活性試験には細胞抽出物を使用した。
【０１３５】
どちらの組み換えアルドラーゼもインドール−３−ピルビン酸およびピルビン酸からＭＰの形成を触媒した。酵素活性には２価マグネシウムとリン酸カリウムの両方の存在が必要であった。インドール−３−ピルビン酸、ピルビン酸またはリン酸カリウムの不存在下では生成物は出現しなかった。酵素の不存在下でも少量の（一般に酵素の存在下と比べて１桁少ない）生成物が形成された。
【０１３６】
逆相Ｃ１８カラムからの溶出画分のピークはインドール−３−ピルビン酸標準品のやや後に現れた。このピークの質量スペクトルは衝突誘起解離で生じた２９２．１の親イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）であることを示しており、該親イオンは生成物のＭＰで見込まれた。質量スペクトル中に存在する主要な娘イオンはｍ／ｚ＝１５８（１Ｈ−インドール−３−カルバルデヒドのカルボニウムイオン）、１６８（３−ブタ−１，３−ジエニル−１Ｈ−インドールのカルボニウムイオン）、２７４（２９２−Ｈ２Ｏ）、２５６（２９２−２Ｈ２Ｏ）、２３８（２９２−３  Ｈ２Ｏ）、２２８（２９２−ＣＨ４Ｏ３）および２０４（ピルビン酸の消失）などであった。生成物はトリプトファンなどのようなインドール基をもつ他化合物のＵＶスペクトルをも示し、該スペクトルはλｍａｘが２７９−２８０ｎｍに、またショルダーが２９０ｎｍ付近にあった。
【０１３７】
Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉアルドラーゼによるＭＰ生産量は反応温度の室温から３７℃への上昇、基質量およびマグネシウム量の増加に伴って増加した。酵素の合成活性はｐＨの上昇に伴い低下し、最高収率はｐＨ  ７で観測された。トリプトファン標準品に基づくと、精製タンパク質２０μｇを使用する標準試験でのＭＰ生産量は反応液ｍＬあたり約１０−４０μｇであった。
【０１３８】
Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉおよびＣ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＰｒｏＡアルドラーゼをコードする配列は前述の他遺伝子との相同性が高いため、組み換え遺伝子産物はどれもこの反応を触媒しうるものと見込まれる。更に、アルドラーゼは（Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ付番方式による）位置５９および８７にトレオニン（Ｔ）を、１１９にアルギニン（Ｒ）を、１２０にアスパラギン酸（Ｄ）を、また３１と７１にヒスチジン（Ｈ）をそれぞれ有するときは、類似の活性を示すものと見込まれる。
【０１３９】
ｋｈｇ遺伝子産物による活性試験結果
Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．  ｃｏｌｉ両ｋｈｇ遺伝子コンストラクトはＩＰＴＧで誘導するとタンパク質を高レベルで発現したが、Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  のｋｈｇは発現レベルが低かった。これらの組み換えタンパク質は全タンパク質および細胞抽出物サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果によれば可溶性であった。Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．  ｃｏｌｉ両ｋｈｇ遺伝子産物は純度＞９５％まで精製した。Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ遺伝子産物はＨｉｓ−Ｂｉｎｄカートリッジ使用のアフィニティー精製後の収率がそれほど高くなかった。
【０１４０】
この酵素の活性にはマグネシウムとリン酸塩が必要であるとの証拠は存在しない。しかし、文献ではリン酸ナトリウムバッファー中での試験の実行が報告されており、それによれば該酵素は二官能性であり、また２−ケト−３−デオキシ−６−ホスホグルコン酸（ＫＤＰＧ）などのようなリン酸化基質に作用する。酵素活性試験は前述の要領で行ったが、場合によりリン酸塩を割愛した。その結果は、組み換えＫＨＧアルドラーゼはＭＰを生産するものの、ＰｒｏＡアルドラーゼほどの活性はないことを示している。ＫＨＧによるＭＰ生産量はマグネシウムおよびリン酸塩による生産量とほぼ等しいという場合もあった。リン酸塩はＫＨＧ活性を高めなかった模様である。Ｂａｃｉｌｌｕｓ酵素は最も活性が高く、ＳＲＭ（実施例１０を参照）による測定では、マグネシウムまたはリン酸塩単体の場合よりも約２０−２５％高活性であった。活性が最も小さいのはＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ酵素であったが、それは発現時の折りたたみおよび溶解度の問題と関連付けることができる。３酵素はいずれも活性部位アミノ酸残基としてグルタミン酸を（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ付番方式で位置４３に）有し、またピルビン酸とのシッフ塩基の形成に必要なリシンを（位置１３０に）有する。しかし、Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素は位置４７に活性部位アミノ酸残基としてアルギニンではなくトレオニンを含む。このＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＨＧは活性部位にトレオニンをもつ他のＳ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉおよびＥ．  ｃｏｌｉ酵素よりも小さく、また両酵素とは異なるクラスターに属する模様である。Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素の高活性は活性部位の差異に起因するかもしない。
【０１４１】
アルドラーゼ活性の向上
抗体触媒は天然アドラーゼと同程度に効率的であり、広範囲の基質を受容するし、また図２に示すような反応の触媒に使用することができる。
【０１４２】
アルドラーゼは定方向進化法によって、例えばＤＮＡシャッフリングおよびエラープローンＰＣＲ法によってリン酸塩の必要性をなくしたりエナンチオ選択性を逆転させたりする方向へ進化させられた（前述のＫＨＧとの相同性が高い）ＫＤＰＧアルドラーゼ関する前述の要領で、改変することができる。ＫＤＰＧアルドラーゼは供与体基質（この場合はピルビン酸）に対する特異性が高いのに、受容体基質（すなわちインドール−３−ピルビン酸）との関係は比較的柔軟であるため、生化学反応に有用である（Ｋｏｅｌｌｅｒ  ＆  Ｗｏｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：２３２−９，２００１）。ＫＨＧアルドラーゼはピルビン酸の多数のカルボン酸との縮合反応に対する活性を有する。哺乳動物のＫＨＧアルドラーゼは細菌のＫＨＧアルドラーゼと比べると、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸に対するより高い活性および４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の両立体異性体の受容を含めて、特異性が広いと考えられる。源泉細菌はＲ異性体に対し１０倍の選好性があるように見受けられる。ゲノムデータベースでは１００近いＫＨＧホモログが閲覧可能であり、その活性はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｅ．  ｃｏｌｉ、および哺乳動物組織で実証済みである。これらの酵素はモナチン生産に望まれるエナンチオ特異性を調整するための出発点として使用することができる。
【０１４３】
ピルビン酸および別の（ケト酸であるおよび／またはインドール基などのような大きな疎水基をもつ）基質を利用するアルドラーゼは該ポリペプチドの特異性、反応速度、選択性を調整する方向へと「進化」させることができる。これらの酵素の比限定的な例は、本明細書で示したＫＨＧおよびＰｒｏＡアルドラーゼ以外では、次のとおりである：ＫＤＰＧアルドラーゼおよび関連ポリペプチド（ＫＤＰＨ）；Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ  ｓｔ由来のトランスカルボキシベンザルピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ；ピルビン酸と２−カルボキシベンズアルデヒド（芳香環をもつ基質）を縮合する４−（２−カルボキシフェニル）−２−オキソブタ−３−エノアート＝アルドラーゼ（２’−カルボキシベンザルピルビン酸アドラーゼ）；やはりピルビン酸と含芳香環アルデヒドとを基質として利用する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａおよびＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ由来のトランス−Ｏ−ヒドロキシベンジリデンピルビン酸ヒドラターゼ−アルドラーゼ；２−オキソ酸を基質として使用し、また生物Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中に存在すると考えられる３−ヒドロキシアスパラギン酸アルドラーゼ（エリトロ−３−ヒドロキシ−Ｌ−アスパラギン酸グリオキシル酸リアーゼ）；ベンジル基を含む基質使用するベンゾインアルドラーゼ（ベンズアルデヒドリアーゼ）；グリシンをベンズアルデヒドと縮合させるＬ−トレオ−３−フェニルセリンベンズアルデヒド−リアーゼ（フェニルセリンアルドラーゼ）；４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ；１，２−ジヒドロキシベンジルピルビン酸アルドラーゼ；および２−ヒドロキシベンザルピルビン酸アルドラーゼ。
【０１４４】
所期の活性を有するポリペプチドは次の方法を用いた関心クローンのスクリーニングにから選択することができる。トリプトファン要求株に、関心クローンを発現カセット上に収めたベクターを導入し、少量のモナチンまたはＭＰを含む培地上で増殖させる。アミノトランスフェラーゼおよびアルドラーゼ反応は可逆的であるため、細胞はラセミ体のモナチンからトリプトファンを生産することができる。同様にして、炭素／エネルギー源としてのモナチンまたはＭＰ利用能によって（組み換え型と野生型の両方の）生物をスクリーニングすることもできる。標的アルドラーゼの一源泉は種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ菌および根圏微生物株の発現ライブラリーである。シュードモナス菌は芳香族分子の分解のための特異な異化経路を多数もち、また多数のアルドラーゼを含む。一方、根圏微生物はアルドラーゼを含み植物の根圏内で増殖することが知られており、またモナチン生合成経路の構築用とされる遺伝子を多数もっている。
【０１４５】
［実施例５］
モナチン前駆体の化学合成
実施例４ではアルドラーゼを使用してインドール−３−ピルビン酸をＭＰに変換する方法を開示した。本実施例ではＭＰの化学合成という代替方法を開示する。ＭＰは一般的なアルドール型縮合反応を用いて形成することができる（図４）。アルドール型反応は簡単にいえば、ＬＤＡ（リチウムジイソプロピルアミド）、リチウムヘキサメチルジシラザンまたはブチルリチウムなどのような強塩基の使用によるピルビン酸エステルのカルボアニオンの生成を伴う。生成するカルボアニオンはインドール−ピルビン酸と反応してカップリング生成物を形成する。
【０１４６】
インドール窒素の保護に使用しうる保護基の比限定的な例はｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）やベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などである。カルボン酸用ブロック基の比限定的な例はアルキル（例えばメチル、エチル、ベンジル）エステルなどである。そうした保護基を使用するときは、形成される生成物の立体化学の制御は不可能である。しかし、Ｒ２および／またはＲ３が（Ｓ）−２−ブタノール、メタノールまたはキラルアミンなどのようなキラル保護基であるとすれば（図４）、あるＭＰ鏡像異性体は他の鏡像異性体よりも有利に形成しうることになる。
【０１４７】
［実施例６］
トリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸のモナチンへの変換
アミノトランスフェラーゼとアルドラーゼという２つの酵素を使用するインビトロ法により、トリプトファンとピルビン酸からモナチンを生産した。第１ステップでは、アミノ基転移反応でα−ケトグルタル酸がトリプトファンからアミノ基を受け取りインドール−３−ピルビン酸とグルタミン酸を生成した。アルドラーゼは第２の反応を触媒したが、そこではピルビン酸がＭｇ２＋とリン酸塩の存在下にインドール−３−ピルビン酸と反応してモナチンのα−ケト誘導体（ＭＰ）、２−ヒドロキシ−２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸を生成した。第１の反応で生成したグルタミン酸からのアミノ基の転移により所期の生成物モナチンが生産された。生成物の精製と特性解析により、形成された異性体はＳ，Ｓモナチンであることが明らかになった。以下では、この方法の改良だけでなく、代替基質、酵素および条件も開示する。
【０１４８】
酵素
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ由来のアルドラーゼ、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−オキソグルタル酸ピルビン酸リアーゼ（ＰｒｏＡアルドラーゼ、ｐｒｏＡ遺伝子）（ＥＣ  ４．１．３．１７）を実施例４の要領でクローニングし、発現させ、生成した。Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．  ｃｏｌｉおよびＳ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来の４−ヒドロキシ−２−オキソグルタル酸グリオキシル酸リアーゼ（ＫＨＧアルドラーゼ）（ＥＣ  ４．１．３．１６）を実施例４の要領でクローニングし、発現させ、生成した。
【０１４９】
モナチンを生産するためにアルドラーゼと共に使用したアミノトランスフェラーゼはＥ．  ｃｏｌｉ  ａｓｐＣ遺伝子がコードするＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｔｙｐＢ遺伝子がコードするチロシンアミノトランスフェラーゼ、Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ＴａｔＡ酵素、Ｌ．  ｍａｊｏｒ  ｂｓａｔ遺伝子がコードする広基質アミノトランスフェラーゼ、またはブタ心臓由来のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（タイプＩＩａ）であった。これらの非哺乳動物タンパク質のクローニング、発現および精製は実施例１で開示している。ブタ心臓由来のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（タイプＩＩａ）はＳｉｇｍａ（＃Ｇ７００５）から入手した。
【０１５０】
ＰｒｏＡアルドラーゼとＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを使用する方法
反応混合液は５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ  ８．０、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭリン酸カリウム、０．０５ｍＭピリドキサルリン酸、１００ｍＭピルビン酸アンモニウム、５０ｍＭトリプトファン、１０ｍＭ  α−ケトグルタル酸、組み換えＣ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＰｒｏＡアルドラーゼ（非精製細胞抽出物、〜３０％アルドラーゼ）１６０ｍｇ、組み換えＥ．  ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（非精製細胞抽出物、〜４０％アルドラーゼ）２３３  ｍｇを１リットル中に含む。酵素類を除くすべての成分を一緒に混合して３０℃で、トリプトファンが分解するまで、インキュベートした。次いで酵素類を加え、反応溶液を３０℃で、穏やかに振とうしながら３．５時間インキュベートした。酵素添加の０．５時間後と１時間後に一定分量（各５０ｍｍｏｌ）の固体トリプトファンを反応溶液に添加した。添加したトリプトファンは全量が溶解したわけではないが、その濃度は５０ｍＭ以上に維持された。３．５時間後に、固体トリプトファンをろ去した。規定量のトリプトファンを標準として使用して反応混合液をＬＣ／ＭＳで分析すると、溶液中のトリプトファン濃度は６０．５ｍＭであり、モナチン濃度は５．８１ｍＭ  （１．０５ｇ）であると判明した。
【０１５１】
最終生成物の精製には次の方法を使用した。ＢｉｏＲａｄ  ＡＧ５０Ｗ−Ｘ８レジンカラム（２２５ｍＬ；吸着容量１．７  ｍｅｑ／ｍＬ）に透明溶液９０％を添加した。カラムを水で洗い、２８０ｎｍの吸光度が第１フロースルー画分の＜５％となるまで、３００ｍＬの画分を回収した。次いでカラムを１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ  ８．４で溶出し、４  ３００  ｍＬの画分を回収した。４画分ともモナチンを含んでおり、ロータリーエバポレーター＋微温浴で１０５ｍＬまで濃縮した。この濃縮過程にわたり濃縮に伴って生じた沈殿をろ別した。
【０１５２】
カラム画分のＬＣ／ＭＳ分析から、トリプトファンとモナチンの９９％はカラムに吸着したことが明らかになった。濃縮工程で生じた沈殿は＞９７％のトリプトファンと＜２％のモナチンを含んでいた。上清中のトリプトファン：生成物比は約２：１であった。
【０１５３】
１００ｍＬ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムに上清（７ｍｌ）を添加した。カラムは０．５Ｌの１Ｍ  ＮａＯＨ、０．２Ｌの水、１．０Ｌの１．０Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ  ８．４および０．５Ｌの水で洗浄することにより、予め酢酸塩型に転換しておいた。上清の添加は＜２ｍＬ／分で行い、カラムは２８０ｎｍでの吸光度が〜０となるまで、水（３−４ｍＬ／分）で洗った。モナチンは１００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ  ８．４で溶出し、４  １００ｍＬ画分を回収した。
【０１５４】
画分の分析により、フロースルー画分中のトリプトファン：モナチン比は８５：１５であり、また溶出画分中の比は７：９３であることが明らかとなった。モナチンの２８０ｎｍでの吸光係数がトリプトファンと同じであると仮定すると、溶出画分は０．１４６ｍｍｏｌを含んでいた。全１Ｌの反応溶液に外挿すると〜２．４ｍｍｏｌ（〜７１０ｍｇ）のモナチンが生成し、６８％が回収されることになろう。
【０１５５】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出画分を＜２０ｍＬに濃縮した。一定分量の生成物をＣ８分取用逆相カラムに添加して、実施例１０で分析用クロマトグラフィー開示したものと同じ条件を使用して更に精製した。Ｗａｔｅｒｓ  Ｆｒａｃｔｉｏｎｌｙｎｘ（登録商標）ソフトウェアを使用して、ｍ／ｚ＝２９３イオンの検出に基づいて自動モナチン画分回収を開始するようにした。モナチンに対応するプロトン化分子イオンを含むＣ８カラム画分を回収し、蒸発乾固させ、次いで少量の水に溶解した。この画分を生成物の特性解析に使用した。
【０１５６】
生成物の特性解析は次の方法を用いて行った。
ＵＶ／可視光分光法：酵素的に生産したモナチンのＵＶ／可視光分光計測はＣａｒｙ  １００  Ｂｉｏ  ＵＶ／ｖｉｓｉｂｌｅ分光光度計を用いて行った。水に溶解した精製生成物は２８０ｎｍで吸光度のピークを、また２８８ｎｍでショルダーを示したが、これはインドール基を含む化合物に特有の性質である。
【０１５７】
ＬＣ／ＭＳ分析：インビトロ生化学反応に由来する混合液を対象とするモナチン分析は実施例１０の要領で行った。インビトロ酵素的合成反応混合液中のモナチンの一般的なＬＣ／ＭＳ分析結果を図５に例示する。図５の下パネルはｍ／ｚ＝２９３でのモナチンのプロトン化分子イオンに対応する特定イオンクロマトグラムである。この混合液中のモナチンの同定は図６に示す質量スペクトルによって裏付けられた。精製生成物のＬＣ／ＭＳ分析結果から、２９３の分子イオンの単一ピークと２８０ｎｍでの吸光度が判明した。質量スペクトルは図６に示すものと同じであった。
【０１５８】
ＭＳ／ＭＳ分析：モナチンを対象に実施例１０で開示するようなＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン実験も行った。モナチンの娘イオン質量スペクトルを図７に示す。図７で標示したすべてのフラグメントイオンについて暫定的な構造帰属を行った。これらには次のフラグメントイオンが含まれた：ｍ／ｚ＝２７５（１９３−Ｈ２Ｏ）、２５７（２９３−２×Ｈ２Ｏ）、２３０（２７５−ＣＯＯＨ）、２１２（２５７−ＣＯＯＨ）、１６８（３−ブタ−１，３−ジエニル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１５８（１Ｈ−インドール−３−カルボアルデヒドカルボニウムイオン）、１４４（３−エチル−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１３０（３−メチレン−１Ｈ−インドールカルボニウムイオン）、１１８（インドールカルボニウムイオン）。これらのイオンの多くは、モナチンのインドール部分から派生している場合には予想どおり、ＭＰで得られるもの（実施例４）と同じである。ケトンの代わりにアミノ基が存在するため、ＭＰで見られるイオンよりも１質量単位上回るイオンもある。
【０１５９】
モナチンの精密質量測定：図８はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｑ−Ｓｔａｒハイブリッド四極／飛行時間型質量分析計を使用して得られた精製モナチンの質量スペクトルを示す。内部質量校正標準としてのトリプトファンの使用によるプロトン化モナチンの実測質量は２９３．１１４４であった。プロトン化モナチンの計算質量は元素組成Ｃ１４Ｈ１７Ｎ２Ｏ５を基にすると２９３．１１３７であった。これは２  ｐｐｍ（百万分の一）未満の質量計測誤差であり、酵素的に生産されたモナチンの元素組成の確証となる。
【０１６０】
ＮＭＲ分光法：Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ５００  ＭＨｚ装置を使用してＮＭＲ実験を行った。モナチンのサンプル（〜３ｍｇ）を０．５ｍｌのＤ２Ｏに溶解した。まず、溶媒（Ｄ２Ｏ）を４．７５ｐｐｍに吸収線をもつ内部標準として使用した。水のピークは大きいので、水のピークを抑えて１Ｈ−ＮＭＲを実行した。次に、水のピークが幅広であるため、モナチンのＣ−２プロトンを標準ピークとして使用し、公表値の７．１９２ｐｐｍにセットした。
【０１６１】
１３Ｃ−ＮＭＲでは、最初の数百スキャンの実行によりサンプルが希釈しすぎて割り当て時間内には充分な１３Ｃスペクトルを得られないことが判明した。そこで、ＨＭＱＣ  （ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ）法を行ったが、これは水素と炭素の、それらの結合相手との相関関係の解明を可能にし、また炭素の化学シフトに関する情報をもたらしてくれた。
【０１６２】
１ＨおよびＨＭＱＣデータのまとめを表２および３に示す。公表値との比較から、該ＮＭＲデータは酵素的に生産されたモナチンが（Ｓ，Ｓ）、（Ｒ，Ｒ）または両者の混合物のいずれかであること示した。
【０１６３】
キラルＬＣ／ＭＳ分析：インビトロで生産されたモナチンは１つの異性体であって、（Ｒ，Ｒ）および（Ｓ，Ｓ）鏡像異性体の混合物ではないことを明確にするために、実施例１０で開示の機器を使用してキラルＬＣ／ＭＳ分析を行った。
【０１６４】
Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔ  （Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）キラルクロマトグラフィーカラムを室温で使用してキラルＬＣ分離を行った。供給元の公開プロトコールに基づく分離と検出は、トリプトファンのＲ−（Ｄ）およびＳ−（Ｌ）異性体で最適化した。ＬＣ移動相はＡ）水＋０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸；Ｂ）メタノール＋０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸からなった。溶離は７０％Ａ、３０％Ｂでの均一濃度溶離であった。送液量は１．０ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸光度を２００ｎｍから４００ｎｍまでモニターした。トリプトファンとモナチンのキラルＬＣ／ＭＳ分析に使用した装置条件は実施例１０のＬＣ／ＭＳ分析の場合と同じである。ｍ／ｚ  １５０−４００領域の質量スペクトルを利用した。プロトン化分子イオンに関する特定イオンクロマトグラム（Ｒ−、Ｓ−両トリプトファンは［Ｍ＋Ｈ］＋＝２０５、モナチンは［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３）は、混合液中のこれらの分析対象物の直接的な同定を可能にした。
【０１６５】
キラルクロマトグラフィーによって分離され、ＭＳによってモニターされたＲ−およびＳ−トリプトファンそれにモナチンのクロマトグラムは図９に示す。モナチンのクロマトグラム中の単一ピークは、該化合物が１つの異性体であり、保持時間はＳ−トリプトファンとほぼ同じであることを示している。
【０１６６】
【化３】
2007501004.tif 000004
【０１６７】
表２  １Ｈ−ＮＭＲデータ
【表１】
2007501004.tif 000005
【０１６８】
１  Ｖｌｅｇｇａａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．Ｓ．Ｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １：３０９５−８，１９９２）．
【０１６９】
２  Ｔａｋｅｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓｈｕｎｓｕｋｅ  （ＪＰ２０００２０６０３８２，２００２−０２−２６）
【０１７０】
表３  １Ｈ−ＮＭＲデータ（ＨＭＱＣスペクトルより）
【表２】
2007501004.tif 000006
１  Ｖｌｅｇｇａａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．Ｓ．Ｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １：３０９５−８，１９９２）．
【０１７１】
偏光分析法：旋光度はＲｕｄｏｌｐｈ  Ａｕｔｏｐｏｌ  ＩＩＩ  偏光計で測定した。モナチンは１４．６ｍｇ／ｍＬ水溶液として調製した。Ｓ，Ｓモナチン（塩形態）の比旋光度（［α］Ｄ２０）の期待値は１ｇ／ｍＬ水溶液なら−４９．６である（Ｖｌｅｇｇａａｒ  ｅｔ  ａｌ．）。酵素的に生産された、精製後のモナチンの実測［α］Ｄ２０は−２８．１であったが、これは該モナチンがＳ，Ｓ異性体であることを示唆する。
【０１７２】
改良
試薬および酵素濃度を含む反応条件を最適化して、次の試薬混合物を使用して５−１０ｍｇ／ｍＬの収量を実現した：５０ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ  ８．３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭピルビン酸（ナトリウムまたはアンモニウム塩）、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸（ナトリウム塩）、０．０５ｍＭピリドキサルリン酸、酵素類添加後の最終容量を１ｍＬとする量の脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、組み換えＰｒｏＡアルドラーゼ５０μｇ／ｍＬ（細胞抽出物；全タンパク質濃度１６７  μｇ／ｍＬ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ａｓｐＣ遺伝子がコードするＬ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ１０００μｇ／ｍＬ（細胞抽出物；全タンパク質濃度２５００  μｇ／ｍＬ）、および濃度を＞６０ｍＭ（飽和；一部は反応時も終始未溶解）とする量の固体トリプトファン。この混合物を３０℃で４時間、穏やかに撹拌または混合しながらインキュベートした。
【０１７３】
代用
α−ケトグルタル酸の濃度を１ｍＭに引き下げ、９ｍＭのアスパラギン酸で補っても、同等のモナチン収量が実現する。第１ステップでは、オキサロ酢酸などのような代替アミノ酸受容体を使用してもよい。
【０１７４】
組み換えＬ．  ｍａｊｏｒ広基質アミノトランスフェラーゼをＥ．  ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの代わりに使用しても、同様のモナチン収量が実現した。しかしＬＣ／ＭＳでは、分子質量２９２の未確認の第２生成物（主生成物の３−１０％）も検出された。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｔｙｒＢコード化酵素、Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ｔａｔＡコード化酵素またはブタ心臓由来グルタミン酸−オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（タイプＩＩａ）をアミノトランスフェラーゼとして添加すると、０．１−０．５  ｍｇ／ｍＬ濃度のモナチンが生産された。反応をインドール−３−ピルビン酸から出発させるときは、（実施例７の要領により）第１ステップでグルタミン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤＨにより還元的アミノ化を行うことができる。
【０１７５】
モナチンの酵素的生産ではＥ．  ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．  ｃｏｌｉおよびＳ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉに由来するＫＨＧアルドラーゼとも併用した。使用した反応条件は次のとおりである：５０ｍＭ  ＮＨ４−ＯＡｃ  ｐＨ  ８．３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭピルビン酸、５ｍＭグルタミン酸、０．０５ｍＭピリドキサルリン酸、酵素類添加後の最終容量を０．５ｍＬとする量の脱気水、３ｍＭリン酸カリウム、組み換えＢ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＫＨＧアルドラーゼ（精製）２０μｇ／ｍＬ、Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）約４００μｇ／ｍＬ（細胞抽出物から未精製）、および１２ｍＭインドール−３−ピルビン酸。反応混合物を３０℃で３０分間、振とうしながらインキュベートした。Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素の使用によるモナチン生産量は８０ｎｇ／ｍＬであり、アルドラーゼ量の増加に応じて伸びた。インドール−３−ピルビン酸とピルビン酸を飽和量のトリプトファンと５ｍＭ  α−ケトグルタル酸で代替すると、モナチン生産量は３６０ｎｇ／ｍＬに伸びた。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．３に溶解した３種のＫＨＧアルドラーゼ各々３０μｇ／ｍＬ、および飽和量のトリプトファンを使用して反応を繰り返し、１時間進行させて、検出量を増大させるようにした。Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ酵素は実施例４の場合と同様に、活性が最も高く、約４０００ｎｇ／ｍＬのモナチンを生産した。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＫＨＧ、Ｓ．  ｍｅｌｉｌｏｔｉ  ＫＨＧのモナチン生産量はそれぞれ３０００ｎｇ／ｍＬ、２３００ｎｇ／ｍＬであった。
【０１７６】
［実施例７］
ＭＰとモナチンの間の相互変換
ＭＰのアミノ化によるモナチンの形成は実施例１および６で特定したようなアミノトランスフェラーゼによって、またはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨなどのような還元性補因子を必要とするデヒドロゲナーゼによって、触媒することができる。これらの反応は可逆的であり、いずれの方向でも計測可能である。この方向性は、デヒドロゲナーゼ酵素を使用するときは、アンモニウム塩濃度によって大体制御することができる。
【０１７７】
デヒドロゲナーゼ活性：モナチンの酸化的脱アミノ化は、ＮＡＤ（Ｐ）＋の高発色性ＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの変換に伴う３４０ｎｍでの吸光度の上昇を追跡することによりモニターした。モナチンは実施例６の要領で酵素的に生産し、精製した。
【０１７８】
代表的なアッセイ混合液は０．２ｍＬ中に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．０−８．９、０．３３ｍＭ  ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋、２−２２単位のグルタミン酸（Ｓｉｇｍａ）、および１０−１５ｍＭ基質を含んでいた。アッセイは２連で、ＵＶ透過性マイクロタイタープレートとＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーを使用して行った。酵素、バッファーおよびＮＡＤ（Ｐ）＋の混合物を、基質を入れたウェルに分注し、ざっと混合後に３４０ｎｍでの吸光度を１０秒間隔でモニターした。反応混合物は２５℃で１０分間インキュベートした。陰性対照アッセイは基質を添加せずに行い、また陽性対照にはグルタミン酸を使用した。ウシ肝臓由来のタイプＩＩＩ  グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  ＃  Ｇ−７８８２）は、グルタミン酸のα−ケトグルタル酸への変換速度の約１００分の１の変換速度でのモナチンのモナチン前駆体への変換を触媒した。
【０１７９】
アミノ基転移活性：モナチン・アミノトランスフェラーゼ・アッセイをＥ．  ｃｏｌｉ由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）、Ｌ．  ｍａｊｏｒ由来の広基質アミノトランスフェラーゼ（ＢＳＡＴ）、および実施例１で開示した２つの市販（ブタ由来）グルタミン酸−オキサロ酢酸アミノトランスフェラーゼで行った。アミノ基受容体としてはオキサロ酢酸とα−ケトグルタル酸の両方を試験した。アッセイ混合物は（０．５ｍＬ中に）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、５ｍＭアミノ基受容体、５ｍＭモナチン、およびアミノトランスフェラーゼ２５μｇを含んでいた。アッセイ混合物を３０℃で３０分間インキュベートし、０．５ｍＬのイソプロピルアルコールを添加して反応を止めた。モナチン消失量をＬＣ／ＭＳでモニターした（実施例１０）。最高の活性量が認められたのはオキサロ酢酸をアミノ基受容体とするＬ．  ｍａｊｏｒ  ＢＳＡＴであり、それに続くのはα−ケトグルタル酸をアミノ基受容体とする同じ酵素であった。オキサロ酢酸をアミノ基受容体とするときの相対活性はＢＳＴＡ＞ＡｓｐＣ＞ブタ・タイプＩＩａ＞ブタ・タイプＩ＝ＴｙｒＢであった。α−ケトグルタル酸をアミノ基受容体とするときの相対活性はＢＳＴＡ＞ＡｓｐＣ＞ブタ・タイプＩ＞ブタ・タイプＩＩａ＝ＴｙｒＢであった。
【０１８０】
［実施例８］
トリプトファンからの、およびピルビン酸以外のＣ３源からのモナチンの生産
実施例で述べたように、インドール−３−ピルビン酸またはトリプトファンは、ピルビン酸をＣ３分子として使用すれば、モナチンへと変換することができる。しかし、ピルビン酸が望ましい原料ではない場合もあろう。例えばピルビン酸は他のＣ３炭素源よりも高価であるかもしれないし、また培地に添加すると発酵に悪影響を及ぼすかもしれない。アラニンは多数のＰＬＰ酵素によってアミノ基転移作用を受け、ピルビン酸を生成させることができる。
【０１８１】
トリプトファナーゼ様酵素はアミノトランスフェラーゼなどのような他のＰＬＰ酵素よりも高速でベータ脱離反応を起こす。このクラス（ＥＣ  ４．１．９９．−）に属する酵素はＬ−セリン、Ｌ−システインおよび優れた脱離基をもつセリン／システイン誘導体（例えばＯ−メチル−Ｌ−セリン、Ｏ−ベンジル−Ｌ−セリン、Ｓ−メチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステイン、Ｓ−アルキル−Ｌ−システイン、Ｏ−アシル−Ｌ−セリン、３−クロロ−Ｌ−アラニン）などのようなアミノ酸からアンモニアピルビン酸を生成することができる。
【０１８２】
ＥＣ  ４．１．９９．−ポリペプチドの使用によるモナチン生産法はβ−チロシナーゼ（ＴＰＬ）またはトリプトファナーゼをＭｏｕｒａｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：１３２０−５，１９９９）の方法に従って変異させることにより改良することができる。Ｍｏｕｒａｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．はβ−チロシナーゼを自然界に存在するとの報告はまだないジカルボン酸型アミノ酸β−リアーゼへと変換する能力を開示している。こうした特異性の変化はバリン（Ｖ）２８３をアルギニン（Ｒ）に、またアルギニン（Ｒ）１００をトレオニン（Ｔ）に、それぞれ変換することによって実現された。これらのアミノ酸変化は該リアーゼがジカルボン酸型アミノ酸（アスパラギン酸など）を受容して加水分解による脱アミノ化反応を起こすことを可能にする。従ってアスパラギン酸もまた後続のアルドール縮合反応のためのピルビン酸源として使用することができる。
【０１８３】
更に、細胞または酵素リアクターには乳酸や、乳酸またはピルビン酸を変換する酵素を供給することができる。この反応を触媒しうる酵素の例は乳酸デヒドロゲナーゼや乳酸オキシダーゼなどである。
【０１８４】
反応混合物は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．３、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｍＭ  Ｃ３炭素源、５ｍＭ  α−ケトグルタル酸、ナトリウム塩、０．０５ｍＭピリドキサルリン酸、酵素類添加後の最終容量を３ｍＬとする量の脱気水、３ｍＭリン酸カリウム  ｐＨ  ７．５、実施例４で調製したような粗製組み換えＣ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＰｒｏＡアルドラーゼ２５μｇ、実施例１で調製したような粗製Ｌ−アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）５００μｇ、および濃度を＞６０ｍＭ（飽和；一部は反応時も終始未溶解）とする量の固体トリプトファン。この混合物を３０℃で３０分間、混合しながらインキュベートした。セリン、アラニンおよびアスパラギン酸をＣ３炭素源として供給した。アッセイは、β−脱離およびβ−リアーゼ反応を行いうる第２  の（精製物）ＰＬＰ酵素（トリプトファナーゼ（ＴＮＡ）、二重変異型トリプトファン、β−チロシナーゼ（ＴＰＬ））を添加して、また添加せずに、行った。結果を表４に示す。
【０１８５】
表４  代替Ｃ３炭素源の使用によるモナチン生産
【表３】
2007501004.tif 000007
【０１８６】
Ｃ３炭素源としてのアラニンおよびセリンから生産したモナチンはＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘スキャン分析によって確認したが、実施例６で生産した特性解析済みモナチンと同じであった。アラニンは試験した中では最良の代替原料であり、ＡｓｐＣ酵素のアミノ基転移作用を受けた。モナチン生産量は、二次活性としてアミノ基転移作用をもつトリプトファナーゼの添加により増加した。セリンを炭素源としたときのモナチン生産量はトリプトファナーゼ酵素の添加により、それがアミノトランスフェラーゼのわずか５分の１の添加量にもかかわらず、倍近くも増加した。ＡｓｐＣは単独で、ある程度のβ−脱離活性を示すことができる。アスパラギン酸を使用した場合の結果は、アスパラギン酸に対するトリプトファナーゼ活性がβ−チロシナーゼに関して前に指摘したような部位指定突然変異を以ってしても向上しないことを示唆している。変異型β−チロシナーゼはモナチン生産のための活性がもっと高くなると見込まれる。
【０１８７】
［実施例９］
モナチンの化学合成
インドール−３−ピルビン酸にアラニンを添加するとモナチンが生成するが、この反応はグリニャール試薬または有機リチウム試薬によって合成的に行うことができる。
【０１８８】
例えばカルボキシル基とアミノ基を適切にブロッキング処理した３−クロロ（または３−ブロモ）アラニンに無水条件下、マグネシウムを添加する。次いで（適切にブロッキングした）インドール−３−ピルビン酸を加えてカップリング生成物を形成させ、その後に保護基を除去してモナチンを形成させる。特に有用な保護基は着脱し易いＴＨＰ（テトラヒドロピラニルエーテル）などである。
【０１８９】
［実施例１０］
トリプトファン、モナチンおよびＭＰの検出
この実施例ではモナチンまたはその前駆体２−ヒドロキシ２−（インドール−３−イルメチル）−４−ケトグルタル酸の存在を検出する方法を開示する。
【０１９０】
ＬＣ／ＭＳ分析
インビトロまたはインビボ生化学反応に由来するモナチン、ＭＰおよび／またはトリプトファンを検出するための混合物分析は、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）システムを使用して行った。これにはＷａｔｅｒｓ  ２６９０液体クロマトグラフとＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｕｌｔｉｍａ三連四重極質量分析計、それに両者の間に直列に設けたＷａｔｅｒｓ  ９９６  Ｐｈｏｔｏ−Ｄｉｏｄｅ  Ａｒｒａｙ  （ＰＤＡ）吸光度モニターが含まれていた。ＬＣ分離はＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８逆相クロマトグラフィーカラム２．１ｍｍ×１５０ｍｍまたはＸｔｅｒｒａ  ＭＣ  Ｃ８逆相クロマトグラフィーカラム２．１ｍｍ×２５０ｍｍを使用して室温で行った。ＬＣ移動相はＡ）水＋０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸およびＢ）メタノール＋０．０５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸からなった。
【０１９１】
グラジエント溶離はリニア５％Ｂ→３５％Ｂ  （０−９分）、リニア３５％Ｂ→９０％Ｂ  （９−１６分）、均一濃度９０％Ｂ  （１６−２０分）、リニア９０％Ｂ→５％Ｂ  （２０−２２分）であり、各グラジエント溶離間には１０分の再平衡化時間をおいた。送液量は０．２５ｍＬ／分であり、ＰＤＡ吸光度は２００ｎｍ〜４００ｎｍの範囲内でモニターした。ＥＳＩ−ＭＳ装置条件はどれも関心被分析物のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）の発生と特徴的なフラグメントイオンの生成を基に最適化し、選定した。
【０１９２】
モナチンのＬＣ／ＭＳ分析には次の装置条件を使用した：キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン：４０Ｖ；Ｈｅｘ  １：２０Ｖ；アパーチャ：０Ｖ；Ｈｅｘ  ２：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス流量：５００Ｌ／ｈ；コーンガス流量：５０Ｌ／ｈ；低質量分解能（Ｑ１）：１５．０；高質量分解能（Ｑ１）：１５．０；イオンエネルギー：０．２；入口：５０Ｖ；衝突エネルギー：２；出口：５０Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１５；高質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．５；倍増管：６５０。質量／電荷比（ｍ／ｚ）および分子質量の報告値に関する不確実性は±０．０１％である。
【０１９３】
混合物中のα−ケト酸型モナチン（ＭＰ）およびモナチンの初期検出はｍ／ｚ  １４０−４００領域内の質量スペクトルの収集を伴うＬＣ／ＭＳモニタリングで行った。プロトン化分子イオンの特定イオンクロマトグラム（ＭＰは［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９２、モナチンは［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３）は混合物中のこれらの被分析物の直接的な確認を可能にした。
【０１９４】
ＭＳ／ＭＳ分析
モナチンを対象とするＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン実験を次の要領で行った。娘イオン分析では関心親イオン（例えばモナチンではｍ／ｚ＝２９３）を質量分析計の第１質量分析部（Ｑ１）から衝突セルへと透過させ、そこにアルゴンを導入して親イオンをフラグメント（娘）イオンへと化学的に解離させる。これらのフラグメントイオンは第２分析部（Ｑ２）で検出されるが、親イオンの構造帰属の裏付けに使用することができる。同様に、トリプトファンの特性解析と定量もｍ／ｚ＝２０５の透過とフラグメンテーションによって行うことができる。
【０１９５】
モナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析には次の装置条件を使用した：キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン：４０Ｖ；Ｈｅｘ  １：２０Ｖ；アパーチャ：０Ｖ；Ｈｅｘ  ２：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス流量：５００Ｌ／ｈ；コーンガス流量：５０Ｌ／ｈ；低質量分解能（Ｑ１）：１３．０；高質量分解能（Ｑ１）：１３．０；イオンエネルギー：０．２；入口：−５Ｖ；衝突エネルギー：１４；出口：１Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１５；高質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：３．５；倍増管：６５０。
【０１９６】
モナチンおよびトリプトファンの高速検出
インビトロまたはインビボ反応に由来するモナチンおよびトリプトファンを検出するための高速混合物分析は、前述の装置を使用して、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの場合と同じ装置条件で行った。ＬＣ分離は４．６ｍｍ×５０ｍｍ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔカラムを使用して、室温で行った。ＬＣ移動相はＡ）水＋０．２５％酢酸およびＢ）メタノール＋０．０．２５％酢酸からなった。均一濃度溶離は５０％Ｂで、０−５分であった。送液量は０．６ｍＬ／分であった。ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ装置条件はどれも、トリプトファンおよび内部標準２Ｈ５−トリプトファンのプロトン化分子イオンの生成とＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、多重反応検出）法用のアミノ酸特異的フラグメントイオンの衝突誘起生成のための最適化イオン源を基に最適化し、選定した。正イオンＭＲＭモードでのＬＣ／ＭＳ／ＭＳモナチンおよびトリプトファン分析には継ぎの装置条件を使用した：キャピラリー：３．５ｋＶ；コーン：２０Ｖ；Ｈｅｘ  １：１５Ｖ；アパーチャ：１Ｖ；Ｈｅｘ  ２：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度：３５０℃；脱溶媒ガス流量：５００Ｌ／ｈ；コーンガス流量：４０Ｌ／ｈ；低質量分解能（Ｑ１）：１２．０；高質量分解能（Ｑ１）：１２．０；イオンエネルギー：０．２；入口：−５Ｖ；衝突エネルギー：１４；出口：１Ｖ；低質量分解能（Ｑ２）：１５；高質量分解能（Ｑ２）：１５；イオンエネルギー（Ｑ２）：０．５；倍増管：６５０。ＭＲＭ条件：チャンネル間遅延：０．０３  ｓ；スキャン間遅延：０．０３  ｓ；ドウェルタイム：０．０５  ｓ。
【０１９７】
モナチンの精密質量測定
Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｑ−Ｓｔａｒハイブリッド四極／飛行時間型質量分析計を使用して高分解能ＭＳ分析を行った。得られた精製モナチンの質量スペクトルを示す。プロトン化モナチンの実測質量  内部質量校正標準としてトリプトファンを使用した。プロトン化モナチンの計算質量は元素組成Ｃ１４Ｈ１７Ｎ２Ｏ５を基にすると２９３．１１３７であった。実施例Ａで開示した生体触媒法を使用して生産したモナチンの実測質量は２９３．１１４４であった。これは２  ｐｐｍ（百万分の一）未満の質量計測誤差であり、酵素的に生産されたモナチンの元素組成の確証となる。
【０１９８】
［実施例１１］
細菌によるモナチンの生産
この実施例ではＥ．  ｃｏｌｉ細胞内でのモナチン生産に使用する方法を開示する。類似の方法が細菌細胞内でのモナチン生産にも使用しうることは当業者には自明であろう。加えて、モナチン合成経路（図２）内の他遺伝子を入れたベクターを使用することもできる。
【０１９９】
ｔｒｐ−１＋ブドウ糖培地、すなわちＥ．  ｃｏｌｉ細胞内でのトリプトファン生産の増大に使用されてきた最少培地（Ｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３５：２００−４，１９９０）を次の要領で調製した。ナノピュア水７００ｍＬに次の試薬を加えた：（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  １３．６ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、およびＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．５ｍｇ。ｐＨを７．０に調整し、容量を８５０ｍＬに増やし、培地をオートクレーブ処理した。５０％ブドウ糖溶液を別個に調製し、フィルター滅菌した。４０ｍＬを基本培地（８５０ｍＬ）に加えて、最終容量を１Ｌとした。
【０２００】
１０ｇ／ＬのＬ−トリプトファン溶液を０．１Ｍリン酸ナトリウムｐＨ  ７で調製し、フィルター滅菌した。一般に１０分の１の容量を後述のように培養液に加えた。１０％ピルビン酸ナトリウム溶液も調製し、フィルター滅菌した。これは一般に培養液１リットルあたり１０ｍＬ使用した。アンピシリン、カナマイシンおよびＩＰＴＧの各ストック液（それぞれ１００ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、８４０  ｍＭ）を調製し、フィルター滅菌し、使用前に−２０℃で保存した。Ｔｗｅｅｎ  ２０（ポリオキシエチレン２０−ソルビタンモノラウレート）は終濃度０．２％（ｖ／ｖ）で使用した。アンピシリンは非致死濃度で、一般に１−１０μｇ／ｍＬの終濃度で使用した。
【０２０１】
５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したＬＢ培地でＥ．  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  （ＤＥ３）：：Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ｐｒｏＡ／ｐＥＴ  ３０Ｘａ／ＬＩＣ（実施例４で開示）の新鮮な平板培地を調製した。終夜培養液を単一コロニーからカナマイシン添加ＬＢ培地に接種し、３０℃で増殖させた。一般にｔｒｐ−１＋ブドウ糖培地内での誘導には５０倍希釈の接種菌液を使用した。新鮮な抗生物質を加えて終濃度を５０ｍｇ／Ｌとした。誘導前に振とうフラスコにより３７℃で増殖させた。
【０２０２】
細胞はＯＤ６００＝０．３５〜０．８になるまで１時間ごとにサンプル採取した。次いで細胞を０．１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、温度を３４℃に下げた。誘導前（ゼロ時点）にサンプル（１ｍＬ）を採取し、５０００×ｇで遠心分離した。上清をＬＣ／ＭＳ分析用に−２０℃で凍結させた。導入４時間後、更に１ｍＬのサンプルを採取し、培養液を細胞ペレットから遠心分離した。トリプトファン、ピルビン酸ナトリウム、アンピシリン、およびＴｗｅｅｎを前述のようにして添加した。
【０２０３】
細胞を誘導後４８時間増殖させ、更に１ｍＬのサンプルを採取し、前述のように処理した。４８時間に、追加分量のトリプトファンとピルビン酸を加えた。（誘導後）約７０時間増殖した後に全培養物を、２０分間、４℃、３５００ｒｐｍで遠心処理した。上清をデカントし、培養液と細胞の両方を−８０℃で凍結させた。培養液画分はろ過し、ＬＣ／ＭＳで分析した。［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３ピークの高さと面積を実施例１０で開示した要領でモニターした。培地のバックグラウンドレベルは差し引いた。データは、［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３ピークの高さを培養液のＯＤ６００で割ってプロットすることにより、細胞増殖についての正規化も行った。
【０２０４】
ピルビン酸、アンピシリンおよびＴｗｅｅｎを誘導時ではなく誘導４時間後に添加すると、モナチンレベルが高くなった。他の添加物例えばＰＬＰ、追加のリン酸、または追加のＭｇＣｌ２はモナチンの生産を増やさなかった。インドール−３−ピルビン酸の代わりにトリプトファンを使用すると、またトリプトファン添加を接種時または誘導時ではなく誘導後に行うと、より高い力価のモナチンが得られた。誘導前と誘導４時間後（基質添加時）には、発酵液にも細胞抽出物にも検出可能レベルのモナチンは一般に存在しなかった。ｐＥＴ３０ａベクターだけを入れた細胞で、またトリプトファンとピルビン酸を添加しない培養液で、陰性対照実験も行った。  （ｍ＋１）／ｚ＝２９３の化合物が更に大きな分子に由来するものではないことが親イオンＭＳスキャンにより明らかになったし、また（実施例１０で実行した）娘イオンスキャンはインビトロで生産されたモナチンに類似していた。
【０２０５】
Ｔｗｅｅｎの効果は終濃度０％、０．２％（ｖ／ｖ）および０．６％のＴｗｅｅｎ  ２０を使用して調べた。振とうフラスコ法によるモナチン生産量が最高となったのは０．２％  Ｔｗｅｅｎのときであった。アンピシリン濃度は０〜１０μｇ／ｍＬの間で変化させた。細胞培養液中のモナチン量は０〜１μｇ／ｍＬの間で急増（２．５倍）し、またアンピシリン濃度を１〜１０μｇ／ｍＬへと高めると１．３倍増加した。
【０２０６】
経時変動実験の代表的な結果を図１０に示す。細胞培養液中へのモナチン分泌量は、数値を細胞増殖について正規化した場合でも、増加した。トリプトファンのモル吸光係数を用いることにより、培養液中のモナチン量を１０μｇ／ｍＬ未満と推定した。同じ実験を、ｐｒｏＡインサートを欠くベクターを入れた細胞でも繰り返した。マイナスとなった数値も多いが、それはこれらの培養液ではｍ／ｚ＝２９３でのピーク高さが培地だけの場合を下回ることを示す（図１０）。トリプトファンとピルビン酸を欠くときは数値が一貫して低くなったが、それはモナチンの生産がアルドラーゼ酵素によって触媒される酵素反応の結果であることを示す。
【０２０７】
モナチンの細菌細胞内でのインビボ生産を８００ｍＬ振とうフラスコ実験および発酵槽で繰り返した。２５０ｍＬのモナチン／無細胞培養液サンプルを陰イオン交換クロマトグラフィーと分取用逆相液体クロマトグラフィーで精製した。このサンプルを濃縮し、（実施例６で開示の）高分解能質量分析にかけた。高分解能ＭＳは生産中の代謝産物がモナチンであることを示した。
【０２０８】
インビトロアッセイは、アミノトランスフェラーゼをアルドラーゼよりも高濃度で存在させる必要がある（実施例６）ことを示しているので、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼをアルドラーゼ遺伝子と組み合わせて過剰発現させ、モナチン生産量を増やすようにした。ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣによってＣ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ｐｒｏＡをオペロン中に導入するためのプライマーを、次のように設計した：５’プライマー：ＡＣＴ  ＣＧＧ  ＡＴＣ  ＣＧＡ  ＡＧＧ  ＡＧＡ  ＴＡＴ  ＡＣＡ  ＴＡＴ  ＧＴＡ  ＣＧＡ  ＡＣＴ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）；３’プライマー：ＣＧＧ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＡＧＴ  ＣＡＡ  ＴＡＴ  ＡＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）。５’プライマーはＢａｍＨＩ部位を、また３’プライマーはＳａｌＩ部位を、それぞれクローニング用に含む。ＰＣＲは実施例４に記載の要領で行い、ゲルを精製した。ａｓｐＣ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣコンストラクトをＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、ＰＣＲ産物も同様にした。Ｑｉａｇｅｎスピンカラムを使用して消化産物を精製した。Ｒｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキットを使用して添付説明書に従って、ｐｒｏＡ  ＰＣＲ産物をベクターにライゲートした。実施例１に記載の要領で、Ｎｏｖａｂｌｕｅｓ  Ｓｉｎｇｌｅｓ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して化学的形質転換を行った。５０ｍｇ／Ｌカナマイシン添加ＬＢ培地中でコロニーを増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用してプラスミドＤＮＡを精製した。制限酵素消化産物の分析によりクローンをスクリーニングし、配列をＳｅｑｗｒｉｔｅ（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）で確認した。コンストラクトをＢＬＲ（ＤＥ３）、ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ＢＬ２１（ＤＥ３）およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）にサブクローニングした。ｐｒｏＡ／ｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣコンストラクトもまたＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入した。
【０２０９】
前述の標準条件下でのＢＬＲ（ＤＥ３）振とうフラスコ法サンプルの当初比較から、第２遺伝子（ａｓｐＣ）の追加によりモナチン生産量が７倍も伸びたことが明らかになった。増殖を速めるためにＢＬ２１（ＤＥ３）由来の宿主株を使用した。ｐｒｏＡクローンと２つの遺伝子オペロン・クローンを前述のようにＴｒｐ−１培地中で誘導し、ｐＬｙｓＳ宿主では培地にクロラムフェニコール（３４ｍｇ／Ｌ）も添加した。振とうフラスコ実験は０．２％  Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍｇ／Ｌアンピシリン添加および無添加で行った。培養液中のモナチン量はインビトロで生産した精製モナチンを標準として使用して計算した。ＳＲＭ分析を実施例１０に記載の要領で行った。細胞のサンプリングは増殖０時間、４時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の各時点で行った。
【０２１０】
その結果を表５に培養液中の最大生産量として示す。ほとんどの場合、２遺伝子コンストラクトのほうがｐｒｏＡ単独コンストラクトよりも高い値となった。ｐＬｙｓＳ株は漏れやすい細胞外被をもつはずであり、増殖速度は一般に低いにもかかわらずモナチン分泌量は多かった。Ｔｗｅｅｎとアンピシリンの添加は有効であった。
【０２１１】
表５  Ｅ．  ｃｏｌｉによるモナチン生産量
【表４】
2007501004.tif 000008
【０２１２】
［実施例１２］
酵母によるモナチン生産
この実施例では真核細胞内でのモナチン生産に使用される方法を開示する。類似の方法が任意の関心細胞内でのモナチン生産にも使用しうることは当業者には自明であろう。加えて、この実施例で開示する遺伝子に加えて、または代りに、他の遺伝子（図２に記載のものなど）を使用することもできる。
【０２１３】
ｐＥＳＣ酵母エピトープ標識ベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してＥ．  ｃｏｌｉ  ａｓｐＣおよびＣ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ｐｒｏＡ遺伝子をＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）にクローニングし発現させた。このｐＥＳＣベクターは対向鎖上のＧＡＬ１、ＧＡＬ１０両プロモーターを、２つのマルチクローニング部位と共に含んでおり、２つの遺伝子の同時発現を可能にする。ｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクターは、宿主（ＹＰＨ５００）のヒスチジン要求性の相補性遺伝子であるＨｉｓ３遺伝子を更に含む。ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターはブドウ糖によって抑制され、ガラクトースによって誘導されるが、酵母中での最適発現にはＫｏｚａｋ配列が使用される。ｐＥＳＣプラスミドはシャトルベクターであり、当初のコンストラクトをＥ．  ｃｏｌｉ中で（選択用のｂｌａ遺伝子を組み込んで）作製することを可能にする。しかし、マルチクローニング部位には細菌リボソーム結合部位は存在しない。
【０２１４】
ｐＥＳＣ−Ｈｉｓへのクローニング用に次のプライマーを設計した（制限酵素認識部位は下線で、またＫｏｚａｋ配列は太字で、それぞれ示す）：ａｓｐＣ  （ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ），ＧＡＬ１：５’−ＣＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  Ｇ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９）および５’−ＡＣＧ  ＣＧＴ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＴＣＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）。ｐｒｏＡ  （ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ），ＧＡＬ１０：ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＡＴＡ  ＡＴＧ  ＧＴＣ  ＧＡＡ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＧＴ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１）および５’−ＧＡＡ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＴＴＡ  ＧＴＣ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＧＣＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）。
【０２１５】
両成熟タンパク質に対応する第２コドンはＫｏｚａｋ配列の導入により芳香族アミノ酸からバリンに変化した。関心遺伝子は実施例１および実施例４に記載のクローンに由来するｐＥＴ３０  Ｘａ／ＬＩＣミニプレップＤＮＡを鋳型として使用して増幅した。ＰＣＲはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒサイクラーグラジエントサーモサイクラーおよび５０μＬ反応に関する次のプロトコールを使用して行った：１．０μＬ鋳型、１．０μＭの各プライマー、０．４ｍＭ各ｄＮＴＰ、３．５Ｕ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、および１×Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）バッファー＋  Ｍｇ。使用したサーモサイクラープログラムは９４℃、５分間のホットスタート、それに続く次のステップの２９回反復：９４℃３０秒、５０℃１分４５秒、および７２℃２分１５秒。２９回反復後に、サンプルを７２℃に１０分保持し、次いで４℃で保存した。ＰＣＲ産物は１％ＴＡＥ−アガロースゲルによる分離精製後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）使用して回収した。
【０２１６】
ｐＥＳＣ−ＨｉｓベクターＤＮＡ（２．７μｇ）を前述の要領でＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、ゲル精製した。ａｓｐＣ  ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎで精製した。ライゲーションはＲｏｃｈｅ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用し、同社のプロトコールに従って行った。脱塩後のライゲーション産物はエレクトロポレーションにより、Ｂｉｏｒａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩ＋パルスコントローラーを使用し同社の説明書に従って、０．２ｃｍ  Ｂｉｏｒａｄディスポーザブルキュベットに入れた４０μｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ  ＤＨ１０Ｂコンピテントセル（インビトロｇｅｎ）に導入した。１ｍＬのＳＯＣ培地に回収して１時間後、形質転換体を１００μｇ／ｍＬ添加ＬＢ培地にプレーティングした。クローン用のプラスミドＤＮＡ調製はＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用して行った。プラスミドＤＮＡを制限消化によってスクリーニングし、配列を解析し（Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ）、前記ベクター向けに設計されたプライマーを使用して確認した。
【０２１７】
ａｓｐＣ／ｐＥＳＣ−ＨｉｓクローンはｐｒｏＡ  ＰＣＲ産物と同様に、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化した。ＤＮＡを前述のように精製し、やはり前述のようにライゲートした。この２遺伝子コンストラクトをＤＨ１０Ｂ細胞に導入し、制限消化とＤＮＡ配列解析によってスクリーニングした。
【０２１８】
Ｓ．ｃ．ＥａｓｙＣｏｍｐ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （インビトロｇｅｎ）を使用して該コンストラクトをＳ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＹＰＨ５００株に次の要領で導入した。同キットに従い、遺伝子導入反応液を２％ブドウ糖添加ＳＣ−Ｈｉｓ最少培地（インビトロｇｅｎ  ｐＹＥＳ２マニュアル）にプレーティングした。前述のＰＣＲプライマーを使用するコロニーＰＣＲ法により、個別酵母コロニーをｐｒｏＡおよびａｓｐＣ遺伝子スクリーニングにかけた。細胞ペレット（２μｌ）を酵母溶解酵素（ｚｙｍｏｌａｓｅ）１μｌ  添加Ｙ−Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  （Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０μｌ中に懸濁させ、３７℃に１０分間保った。次いでこの懸濁液４μｌを、前述のＰＣＲ反応混合物とプログラムとを使用する５０μｌ  ＰＣＲ反応に使用した。
【０２１９】
５ｍＬの培養物をＳＣ−Ｈｉｓ＋ブドウ糖培地により３０℃、２２５ｒｐｍで終夜増殖させた。細胞をラフィノースによる増殖に徐々に適応させ、ガラクトースによる誘導前のラグ時間を最小限に抑えるようにした。約１２時間の増殖後、６００ｎｍでの吸光度を測定し、適量の細胞を遠沈し、再懸濁させて新鮮ＳＣ−Ｈｉｓ培地をＯＤ＝０．４となるようにした。以下の炭素源を順次使用した：１％ラフィノース＋１％ブドウ糖、０．５％ブドウ糖＋１．５％ラフィノース、２％ラフィノース、最後に誘導用の１％ラフィノース＋２％ガラクトース。
【０２２０】
誘導培地で約１６時間の増殖後、５０ｍＬの培養物を２５ｍＬ×２に等分し、等分培養物の一方に次のものを添加した：（終濃度）１ｇ／Ｌ  Ｌ−トリプトファン、５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ７．１、１ｇ／Ｌピルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２。陰性対照として、非誘導培地に由来する、およびモナチン合成経路用基質の添加前１６時間の培養物に由来する、培養液と細胞ペレットのサンプルを保存した。更に、機能的ａｓｐＣ遺伝子（および短縮型ｐｒｏＡ遺伝子）だけを含むコンストラクトももう１つの陰性対照として使用した。細胞は誘導後合計６９時間増殖させた。酵母細胞をもっと低いＯＤで誘導し、わずか４時間増殖させた後にトリプトファンおよびピルビン酸を添加した場合もある。しかし、これらのモナチン基質は増殖を抑制する模様であり、高ＯＤでの添加のほうがより効果的であった。
【０２２１】
培養物に由来する細胞ペレットは、ＹｅａｓｔＢｕｓｔｅｒ（登録商標）５ｍＬ  ＋  ５０μｌ  ＴＨＰ  （Ｎｏｖａｇｅｎ）／グラム（湿重量）−細胞によりメーカーのプロトコールに従って、従前の実施例で開示されているようにプロテアーゼインヒビターおよびベンゾナーゼ・ヌクレアーゼを添加して、溶解した。培養物に由来する培養液と細胞ペレットはろ過し、実施例１０に記載の要領でＳＲＭにより分析した。この方法を使用すると、培養液サンプルではモナチンは検出されなかった。これは、これらの条件下では細胞がモナチンを分泌できなかったことを示唆する。これらの条件下ではプロトン駆動力が足りないのか、あるいは一般的なアミノ酸輸送体がトリプトファンで飽和するのかもしれない。タンパク質の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用による変化の検出を可能にするほどのレベルではなかった。
【０２２２】
２機能遺伝子を使用した培養物の細胞抽出物では、培地にトリプトファンとピルビン酸を添加したときに、一時的にモナチンが（約６０ｎｇ／ｍＬ）検出された。陰性対照の細胞抽出物ではいずれの場合もモナチンは検出されなかった。インビトロモナチン・アッセイを、２連で、全タンパク質濃度を４．４ｍｇ／ｍＬ  （Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞抽出物で一般に使用される濃度の約２倍）として、実施例６に記載の最適化アッセイ法を使用して、行った。他のアッセイも、Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＰｒｏＡアルドラーゼ３２μｇ／ｍＬまたは４００μｇ／ｍＬ  ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼを添加して行い、細胞抽出物ではどちらが律速酵素となっているかを調べるようにした。陰性対照アッセイは酵素を添加しないで、またはＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼだけを添加して、行った（アルドール縮合は酵素がなくてもある程度起こりうる）。陽性対照アッセイはある程度（３０−４０％）純粋な酵素により、１６μｇ／ｍＬアルドラーゼまたは４００μｇ／ｍＬアミノトランスフェラーゼを使用して行った。
【０２２３】
インビトロ結果をＳＲＭで分析した。細胞抽出物を分析すると、トリプトファンを誘導後に培地に添加すると細胞内に効果的に輸送され、追加的なトリプトファンの添加がない場合と比較して２桁も高いトリプトファン濃度となることが判明した。インビトロモナチン分析の結果を表６に示す（数字の単位はｎｇ／ｍＬ）。
【０２２４】
表６  酵母細胞抽出物によるモナチン生産
【表５】
2007501004.tif 000009
【０２２５】
完全２遺伝子コンストラクトの細胞抽出物では増殖培地に基質を添加してもしなくても、良い結果が得られた。これらの結果は、陽性対象と比較すると、酵素が酵母中の全タンパク質の１％近いレベルで発現したことを示す。ａｓｐＣコンストラクト（＋短縮型ｐｒｏＡ）の細胞抽出物を、アルドラーゼを加えてアッセイしたときのモナチン生産量は抽出細胞を単独でアッセイしたときよりも有意に高かったが、これは組み換えＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼが約１−２％の酵母全タンパク質を含むことを示唆している。非誘発培養物の細胞抽出物はアルドラーゼを加えてアッセイしたときは、細胞中に天然アミノトランスフェラーゼが存在するために低活性量となった。ＡｓｐＣアミノトランスフェラーゼを加えてアッセイすると、非誘導細胞からの抽出物の活性はＡｓｐＣ添加陰性対照によるモナチン生産量まで増大した（約２００  ｎｇ／ｍＬ）。対照的に、２遺伝子コンストラクト細胞抽出物をアッセイしたときの実測活性はアミノトランスフェラーゼを補充するときのほうがアルドラーゼを添加するときよりも、高くなる。両遺伝子は同レベルで発現するはずであるから、これはアミノトランスフェラーゼがアルドラーゼよりも高レベルのときにモナチン生産量が極大化することを示唆しており、実施例６の結果とも符合する。
【０２２６】
ピルビン酸およびトリプトファンの添加は細胞増殖を阻害するだけでなく、タンパク質の発現をも阻害するように見受けられる。ｐＥＳＣ−Ｔｒｐプラスミドの添加はＹＰＨ５００宿主細胞のトリプトファン要求性の補正に使用して、増殖、発現および分泌に対するトリプトファンの作用を少なくする手段をもたらすことができる。
【０２２７】
［実施例１３］
共役反応の使用による酵素法の改良
理論的には、基質または中間体の副反応または分解が起きないと仮定すれば、図１１に示す酵素反応から形成される生成物の最大量は各反応の平衡定数に、またトリプトファンおよびピルビン酸の濃度に、正比例する。トリプトファンは高溶解性の基質ではないし、また２００ｍＭを超えるピルビン酸濃度は収量にマイナスの影響を及ぼす模様である（実施例６を参照）。
【０２２８】
理想的には、モナチン濃度を基質に対して極大化し、分離コストを引き下げるようにするのがよい。物理的な分離により、反応混合物からモナチンを除去して、逆反応が起こるのを防止するようにすることは可能である。その場合には原料と触媒は再生することができる。モナチンはいくつかの試薬および中間体とサイズ、電荷および疎水性が類似するため、（アフィニティークロマトグラフィー法などのように）モナチンに対する強力なアフィニティーが存在しない限り、物理的分離は困難であろう。しかし、モナチン反応を他の反応と共役させて、系の平衡をモナチン生産の側へとシフトさせることはできる。以下は、トリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から得られるモナチンの収量を高める方法の例である。
【０２２９】
オキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３）を使用する共役反応
図１１はこの反応の図解である。トリプトファンオキシダーゼおよびカタラーゼを使用して反応をインドール−３−ピルビン酸生産の方向へ導く。カタラーゼは過剰に使用して、過酸化水素が逆方向の反応に、または酵素または中間体の破壊に、利用されないようにする。カタラーゼ反応時には酸素が再生される。あるいはインドール−３−ピルビン酸を基質として使用することができる。
【０２３０】
ＭＰのアミノ化ではアスパラギン酸をアミノ基供与体として使用し、またアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを利用する。理想的には、ＭＰ→モナチン反応よりもトリプトファン／インドール−３−ピルビン酸反応に対する特異性が低いアミノトランスフェラーゼを使用して、アスパラギン酸がインドール−３−ピルビン酸の再アミノ化に利用されないようにする。オキサロ酢酸のピルビン酸と二酸化炭素への変換にはオキサロ酢酸デカルボキシラーゼ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．由来）を添加することができる。ＣＯ２は揮発性であるため、酵素との反応には利用されず、逆反応を減らし、場合によって防止する。このステップで生産されるピルビン酸はアルドール縮合反応に利用することができる。他のデカルボキシラーゼ酵素を使用することもできるし、また以下の生物ではホモログの存在が知られている：Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ属の数種、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｅｍ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ  ＭＣ−１、Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ  ＫＴ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ  Ｐｍ７０、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｉｏｔｈｅｒｍａ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の数種、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属の数種、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の数種、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ族の数種、Ｔｈｅｒｍｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ  ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、およびＶｉｂｒｉｏ属の数種。
【０２３１】
トリプトファンアミノトランスフェラーゼ・アッセイを、実施例１で開示したようなＥ．  ｃｏｌｉ由来のアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡｓｐＣ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のチロシンアミノトランスフェラーゼ（ＴｙｒＢ）、Ｌ．  ｍａｊｏｒ由来の広基質アミノトランスフェラーゼ（ＢＳＡＴ）、およびブタ心臓由来の２つのグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼを使用して行った。オキサロ酢酸とα−ケトグルタル酸は共にアミノ基受容体として試験した。モナチン使用の場合の活性（実施例７）とトリプトファン使用の場合の活性の比を比較して、モナチンアミノトランスフェラーゼ反応に対する特異性が最も高い酵素はどれかを調べた。これらの結果から、トリプトファン反応との対比でモナチン反応に対する特異性が最も高い酵素はブタｔｙｐｅＩＩ−Ａグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼＧＯＡＴ  （Ｓｉｇｍａ  Ｇ７００５）であると判明した。この特異性は使用アミノ基受容体の種類とは無関係であった。従って、オキサロ酢酸デカルボキシラーゼとの共役反応にはこの酵素を使用した。
【０２３２】
インドール−３−ピルビン酸から出発する代表的な反応系は（終濃度）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．３、６ｍＭインドール−３−ピルビン酸、６ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、６ｍＭアスパラギン酸、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、３ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬ  アミノトランスフェラーゼ、５０μｇ／ｍＬ  Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ  ＰｒｏＡアルドラーゼ、および３  Ｕ／ｍＬデカルボキシラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｏ４８７８）を含んだ。反応は２６℃で１時間進行させた。場合によってはデカルボキシラーゼを省いたか、またはアスパラギン酸の代りにα−ケトグルタル酸を（陰性対照として）使用した。前述のアミノトランスフェラーゼ酵素もまた、ＧＯＡＴの代りに試験して、当初の特異性実験を確認するようにした。サンプルは実施例１０に記載の要領でろ過し、ＬＣ／ＭＳで分析した。その結果から、ＧＯＡＴ酵素は最大量のモナチン／ｍｇ−タンパク質を生産し、最小量のトリプトファンを副生物として生産することが明らかとなった。加えて、デカルボキシラーゼ酵素の添加には２〜３倍の利益があった。Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＡｓｐＣ酵素もまた他アミノトランスフェラーゼと比較して大量のモナチンを生産した。
【０２３３】
モナチン生産は次の方法によって増大した：１）追加量の２ｍＭインドール−３−ピルビン酸、ピルビン酸およびアスパラギン酸の周期的な（半時間または１時間ごとの）添加、２）嫌気性環境または脱気バッファー中での反応の実行、３）終夜反応進行の許容、および凍結融解を何度も繰り返していない調製し立てのデカルボキシラーゼの使用。デカルボキシラーゼは１２ｍＭ超の濃度のピルビン酸によって抑制された。４ｍＭ超のインドール−３−ピルビン酸濃度では、インドール−３−ピルビン酸との副反応が速まった。反応系へのインドール−３−ピルビン酸の使用量は、アルドラーゼの使用量を増やす限りで、増やすことができよう。高濃度のリン酸（５０ｍＭ）およびアスパラギン酸（５０ｍＭ）はデカルボキシラーゼ酵素に対し抑制作用を及ぼすことが判明した。デカルボキシラーゼ添加量は０．５Ｕ／ｍＬに引き下げても、１時間の反応ではモナチン生産量の低下を招かなかった。温度を２６℃から３０℃へと、また３０℃から３７℃へと、高めるとモナチン生産量が増加したが、３７℃ではインドール−３−ピルビン酸との副反応も速まった。モナチン生産量はｐＨを７から７．３に高めると増加し、ｐＨ  ７．３−８．３では比較的安定した。
【０２３４】
トリプトファンから出発する代表的な反応系は（終濃度）５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．３、２０ｍＭトリプトファン、６ｍＭアスパラギン酸、６ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、３ｍＭリン酸カリウム、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬ  アミノトランスフェラーゼ、５０μｇ／ｍＬ  Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ＰｒｏＡアルドラーゼ、４  Ｕ／ｍＬデカルボキシラーゼ、５−２００ｍＵ／ｍＬ  Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ−２８０５）、１６８Ｕ／ｍＬカタラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｃ−３５１５）、および０．００８  ｍｇ  ＦＡＤを含んだ。反応は３０℃で３０分間進行させた。デカルボキシラーゼを添加すると改善が認められた。最高量のモナチンが生産されたのは５０ｍＵ／ｍＬのオキシダーゼを使用したときであった。インドール−３−ピルビン酸を基質として使用したときも同様の改善が認められた。更に、モナチン生産量は次の場合も増加した：１）トリプトファン濃度が低い（すなわちアミノトランスフェラーゼ酵素のＫｍを下回り、従って活性部位においてＭＰと対抗しえない）、および２）オキシダーゼのアルドラーゼおよびアミノトランスフェラーゼに対する比が、インドール−３−ピルビン酸の蓄積を不可能にするようなレベルに維持される。
【０２３５】
インドール−３−ピルビン酸、トリプトファンのいずれから出発しようが、１−２時間のインキュベーションによるアッセイでのモナチン生産量は、酵素比を同じに保ったまま諸々の酵素の使用量を２−４倍にすると、増加した。いずれの基質を使用しても、約１ｍｇ／ｍＬのモナチン濃度が達成された。インドール−３−ピルビン酸から出発する場合にはトリプトファン生産量は生成物の生産量の２０％未満が一般的であったが、それは共役反応を使用することが有利であることを示す。中間体濃度および副反応のさらなる最適化と制御により、生産性と収量を大幅に改善することが可能である。
【０２３６】
リシンεアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．３６）を使用する共役反応
リシンεアミノトランスフェラーゼ（Ｌ−リシン６−トランスアミナーゼ）は数種の生物例えばＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどで発見されている。生物はこの酵素をある種のβ−ラクタム抗体の産生で第１ステップとして利用している（Ｒｉｕｓ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｉｎ，Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７：９５−１００，１９９７）。この酵素はリシンのＣ−６のＰＬＰ依存性アミノ基転移反応により、α−ケトグルタル酸をアミノ基受容体として使用して、リシンをＬ−２−アミノアジピン酸６−セミアルデヒド（アリシン）へと変換する。アリシンは不安定であり、自然に分子内脱水を起こして１−ピペリジン６−カルボン酸という環状分子を形成する。これは逆反応の発生を効果的に抑制する。反応スキームは図１２のとおりである。代替酵素として、リシン−ピルビン酸６−トランスアミナーゼ（ＥＣ  ２．６．１．７１）を使用することもできる。
【０２３７】
代表的な反応系は１ｍＬ中に５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．３、２０ｍＭインドール−３−ピルビン酸、０．０５ｍＭ  ＰＬＰ、６ｍＭリン酸カリウムｐＨ  ８、２−５０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭリシン、１００μｇアミノトランスフェラーゼ（リシンεアミノトランスフェラーゼＬＡＴ−１０１；ＢｉｏＣａｔａｌｙｔｉｃｓ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）、および２００μｇ  Ｃ．  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ  ＰｒｏＡアルドラーゼ含んだ。モナチン生産量はピルビン酸濃度の上昇に伴って増加した。これらの反応条件（ピルビン酸濃度５０ｍＭ）による最大生産量はオキサロ酢酸デカルボキシラーゼを使用する共役反応の場合の１０分の１（約０．１ｍｇ／ｍＬ）であった。
【０２３８】
［Ｍ＋Ｈ］＋＝２９３のピークはモナチンに関する予期時点で溶出し、またその質量スペクトルは他の酵素法で観測されたものと同じフラグメントをいくつか含んでいた。正確な質量／電荷比（２９３）をもつ第２ピークは実施例６で生産されたＳ，Ｓモナチンの場合に一般的に観測されるよりもやや早めに溶出したが、もう１つのモナチン異性体の存在を示唆するかもしれない。この酵素ではトリプトファンはほとんど生産されなかった。しかし、ピルビン酸に対するなんらかの活性は存在しそうである（アラニンを副生物として生産）。また、この酵素は不安定であることが知られている。定方向進化実験により、安定性を高め、ピルビン酸に対する活性を低くし、ＭＰに対する活性を高めるなどの改善を図ることができよう。これらの反応は前述のようにＬ−アミノ酸オキシダーゼ／カタラーゼと共役させることもできる。
【０２３９】
他の共役反応
トリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から生産されるモナチンの収量を高めることができるもう１つの共役反応を図１３に示す。ギ酸デヒドロゲナーゼ  （ＥＣ  １．２．１．２または１．２．１．４３）は一般的な酵素であり、ＮＡＤＨを必要とするものもあれば、ＮＡＤＰＨを利用するものもある。グルタミン酸デヒドロゲナーゼはアンモニウム系バッファーを使用してモナチン前駆体とモナチンの間の相互変換を触媒した。ギ酸アンモニウムとギ酸デヒドロゲナーゼの存在は効率的な補因子再生系であり、二酸化炭素の生産は逆反応速度を低下させる効率的な方法である（Ｂｏｍｍａｒｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  １０：３７，１９９４；Ｇａｌｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６３：４６５１−６，１９９７）。更に、大量のギ酸アンモニウムが該反応バッファー中に溶解可能である。グルタミン酸デヒドロゲナーゼ反応（または類似の還元的アミノ化反応）によって生産されるモナチンの収量はギ酸デヒドロゲナーゼおよびギ酸アンモニウムの添加によって高めることができる。
【０２４０】
他の方法も平衡をモナチン生産の方向へシフトするために使用しうる。例えば、米国特許第５，３６０，７２４号および５，３００，４３７号明細書で開示されているものなどのようなω−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１８）によるＭＰ→モナチン変換でアミノプロパンをアミノ基供与体として利用する場合には、生成物の１つはアセトンであろうが、これは基質のアミノプロパンよりも更に揮発性である。温度を周期的に短時間上昇させればアセトンを瞬時に留去し、以って平衡の緩和を図ることができる。アセトンは沸点が４７℃であり、この温度なら短時間使用しても中間体を分解する可能性はない。α−ケトグルタル酸に対して活性をもつほとんどのアミノトランスフェラーゼはモナチン前駆体に対しても活性をもつ。同様に、グリオキシル酸／アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．６０）をアミノ基供与体としてのグリシンと併用する場合には、グリシル酸が生成されるが、それは比較的不安定で、沸点がグリシンよりもずっと低い。
【０２４１】
［実施例１４］
モナチンを含有する個包装調製品
モナチンを含有する個包装調製品は、砂糖小さじ約２杯分（約８ｍｇ）の甘味をもたらすように調製する。
【０２４２】
Ａ．    Ｓ，Ｓモナチン個包装調製品（含有量／グラム）
デキストロース                                ７８７ｍｇ
Ｓ，Ｓモナチン                                ２００ｍｇ
タルタルクリーム                                １０ｍｇ
ケイ酸カルシウム                                  ３ｍｇ
Ｂ．    Ｒ，Ｒ／Ｓ，Ｓモナチン個包装調製品（含有量／グラム）
デキストロース                                ７００ｍｇ
マルトデキストリン                            ２９２ｍｇ
Ｓ，Ｓモナチン                                    ４ｍｇ
Ｒ，Ｒモナチン                                    ４ｍｇ
Ｃ．    Ｒ，Ｒ／Ｓ，Ｓモナチン個包装調製品（含有量／グラム）
マルトデキストリン添加造粒デキストロース＊    ９９２ｍｇ
【０２４３】
Ｓ，Ｓモナチン                                    ４ｍｇ
Ｒ，Ｒモナチン                                    ４ｍｇ
＊  例えばＣＰＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．のＵｎｉｄｅｘ（登録商標）Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ０２５４０（２０３４）。
【０２４４】
Ｄ．    Ｒ，Ｒモナチン個包装調製品（含有量／グラム）
デキストロース                                ５００ｍｇ
マルトデキストリン                            ４９５ｍｇ
Ｒ，Ｒモナチン                                    ５ｍｇ
Ｅ．  Ｒ，Ｒモナチンのハーフサイズ立方体（含有量／グラム）
マルトデキストリン                            ９９９ｍｇ
Ｒ，Ｒモナチン                                    １ｍｇ
［実施例１５］
モナチン使用の個包装調製品のためのレシピ
以下は前述のようなモナチン個包装調製品を砂糖代替品としてベーキング等のレシピに使用するための例である。以下のレシピに従って作られる含モナチン飲食品は満足な仕上がりになり、また砂糖を使用して作られる同飲食品に匹敵する品質を備えることが目指される。
【０２４５】
レモネード：
レモン果汁大さじ２杯とモナチン個包装調製品３個（３ｇ）を背の高いグラスに入れ、水カップ３／４と混ぜる。氷を加える。このモナチン甘味レモネードは、小さじ６分（２４ｇ）のショ糖で甘味を付与したレモネードに比して、ほぼ同等の甘味を呈し同等に好まれようし、また著しく低カロリーであろう（９６カロリー対約０カロリー）。
【０２４６】
ホイップクリーム：
冷水                      カップ１／３
レモン果汁                小さじ１＋１／４
バニラ                    小さじ１／２
脱脂粉乳粉末              カップ１／３
個包装モナチン砂糖代替品３個（前記Ｃ例による）
水、レモン果汁、バニラを混ぜる。かき混ぜながら脱脂粉乳の粉末を入れる。１０分間または固まるまで激しくかき混ぜる。モナチン砂糖代替品を加えて２分間激しくかき混ぜる。
【０２４７】
無ショ糖スポンジケーキのデータシート：
材料                              ％ｗ／ｗ
薄力粉                            ２０．４２
水                                １８．６２
全卵                              １８．２
ポリデキストロース                １７．２３
ハイレシオショートニング          １３．４４
ソルビトール粉末                    ８．６２
スキムミルク粉末                    １．６６
ベーキングパウダー                  １．２４
塩                                  ０．３１
Ｒ，Ｒモナチン（好みにより）    ０．０１０−０．０４０
ケーキ１００ｇにつき（例えば個包装の卓上モナチン甘味料３−１０個分に相当する）１０−４０ｍｇのＲ，Ｒモナチンが使用される。
【０２４８】
［実施例１６］
モナチンを含有する即使用可能調製品
１対１代替タイプの即使用可能調製品はグラニュー糖の代用となる。モナチン調製品は砂糖と同じ容量にもなるため、グラニュー糖の直接同等代替品としてそのまま飲食品に添加し、またはベーキングにそのまま使用してもよい。
【０２４９】
Ａ．    Ｓ，Ｓモナチンの即使用可能調製品（含有量／グラム）
加水分解でんぷん                              １８８ｍｇ
マルトデキストリン                            ８００ｍｇ
Ｓ，Ｓモナチン                                  １０ｍｇ
グルコン酸ナトリウム                              ２ｍｇ
Ｂ．    Ｒ，Ｒモナチンの即使用可能調製品（含有量／グラム）
マルトデキストリン                        ９９９．５ｍｇ
Ｒ，Ｒモナチン                                ０．５ｍｇ
Ｃ．    Ｒ，Ｒ／Ｓ，Ｓブレンドの即使用可能調製品（含有量／グラム）
マルトデキストリン                        ９７２．５ｍｇ
タルタルクリーム                                ２０ｍｇ
ケイ酸カルシウム                                  ４ｍｇ
Ｓ，Ｓモナチン                                ３．１ｍｇ
Ｒ，Ｒモナチン                                ０．４ｍｇ
［実施例１７］
モナチンを含有する即使用可能調製品のためのレシピ
以下は前述のような１対１代替タイプのモナチン即使用可能調製品を砂糖代替品としてベーキング等のレシピに使用するための例である。以下のレシピに従って作られる含モナチン飲食品は満足な仕上がりになり、また砂糖を使用して作られる同飲食品に匹敵する品質を備えることが目指される。
【０２５０】
フレンチシルクパイ：
パイの皮
砕いたグラハムクラッカー              カップ１
粗刻みのペカン                        カップ１
スティックバター                      １本
以上のパイ皮材料を混ぜて、９インチのパイ皿に敷く。３００℃で３０分間焼く。
パイの詰め物
無糖チョコレート                      ２かけ
スティックバター                      ２本
モナチン即使用可能調製品              カップ１＋１／２（実施例１６−Ｂ）
バニラ                                小さじ２
低温殺菌ずみ生卵                      ４個
無糖チョコレートを溶かし、室温に冷ます。バターと砂糖代替モナチンをクリーム状にする。クリーム状混合物にバニラと溶かしたチョコレートを加える。卵を１度に１個加え、各４分ずつ激しくかき混ぜる。冷えたパイ皮の上に流し込み、一晩冷蔵する。
【０２５１】
ブルーベリーマフィン：
注：砂糖は焼成食品には甘味の付与はもちろんテクスチャーや褐変でも重要である。このレシピでは砂糖の代りに少量の蜂蜜を使用して褐変と満足なテクスチャーを促進する。
【０２５２】
中力粉                                カップ２
ベーキングパウダー                    小さじ２
塩                                    小さじ３／４
ライトマーガリン（柔らかくしたもの）  カップ１／２
モナチン即使用可能調製品              カップ１
蜂蜜                                  カップ１／４
大玉全卵                              ２個
バニラ                                小さじ１
スキムミルク                          カップ１／２
ブルーベリー（生鮮または冷凍）        カップ１
オーブンを３５０°Ｆに予熱する。マフィンカップ×１０の内側にペーパーライナー入れる。別に、小麦粉、ベーキングパウダーおよび塩を一緒にふるいにかけておく。電動泡立て器でマーガリン、モナチン甘味料および蜂蜜を一緒に激しくかき混ぜ、軽くふわふわするまで泡立てる。卵を１個ずつ加えて、そのつど充分に泡立てる。バニラを加えてよくかき混ぜる。あるいは小麦粉ミックスとミルクを加えてかき混ぜるが、最初と最後には小麦粉ミックスがくるようにする。ブルーベリーを混ぜ入れる。ペーパーライナーを入れたマフィンカップに衣用生地をスプーンで入れ、２５〜３０分ほど焼く。表面がキツネ色になるか、また爪楊枝を中心まで差し込んで抜き取ったときに付着物が見られなくなれば焼き上がり。型に入れたまま、１０分間、ワイヤーラック上で冷ます。マフィンを型から取り出す。ワイヤーラック上で完全に冷ます。マフィン１０個の出来上がり。
【０２５３】
イチゴバナナスムージー：
オレンジ果汁                          カップ１
無脂肪プレーンヨーグルト              カップ１
冷凍バナナ                            １本
冷凍イチゴ                            カップ１
個包装モナチン調製品                  ６個（または
モナチン即使用可能調製品              カップ１／４）
材料をすべてミキサーに入れ、滑らかになるまで混合する。これで２人前になる。このスムージーは同じレシピで甘味料を砂糖カップ１／４に代えて作った場合よりも約３３％低カロリーである。
【０２５４】
パイナップルオレンジシャーベット：
潰したパイナップル                    １＋１／４オンス缶×１
冷凍濃縮オレンジ果汁、解凍済み        ６オンス缶×１
スキムミルク                          カップ３
濃縮スキムミルク                      カップ３／４
モナチン即使用可能調製品（例Ｂによる）カップ１／３
バニラ                                小さじ１／２
スキムミルク、水切りしていないパイナップル、濃縮スキムミルク、濃縮オレンジ果汁、モナチン砂糖代替品、およびバニラを大きなボウルに入れて、モナチン砂糖代替品が溶けるまでかき混ぜる。容量４−または５−クォートのアイスクリームフリーザーに入れて、メーカーの説明書に従って凍らせる。１５人前（カップ１／２）になる。
【０２５５】
レモンムース：
エバミルク                            １２オンス缶×１
すりおろしたレモンの皮                大さじ２
レモン果汁                            ２個分
モナチン即使用可能調製品（例Ａによる）カップ１
砕いたグラハムクラッカー              １２枚分
ゼリーロール鍋にミルクを流し込み、フリーザーに入れて薄い氷が張るまで、約２時間冷やす。ミルクを冷やしたボウルに移し、泡立てる。レモンの皮と果汁を、かき混ぜながら徐々に加える。モナチン調製品を加え、柔らかい角が立つまで泡立て続ける。盛り付け用の器に移し、砕いたグラハムクラッカーをまぶす。冷やすか冷凍して出してもよい。
【０２５６】
［実施例１８］
モナチンを使用したデザートおよび菓子類
即使用可能モナチン組成物は業務用として、加工飲食品の生産に使用してもよい。
インスタントチョコレートプリンのデータシート
材料                                          ％ｗ／ｗ
低温膨潤性でんぷん（Ｕｌｔｒａｔｅｘ  ４）    ５．００
脱脂粉乳                                    １４．００
ココア粉                                      ２．５
マルトデキストリン                            ３．５
チョコレート香料                              ０．４
キサンタンガム                                ０．２０
塩                                            ０．１５
レシチン粉末                                  ０．２５
リン酸二ナトリウム                            ０．１７
Ｒ，Ｒモナチン（好みにより）            ０．００５−０．０１０
水  （加えて全体で）                      １００（％となる量）
これはプリン１００ｇにつき（例えば個包装タイプの卓上モナチン甘味料２−３個分に当たる）５−１０ｍｇのＲ，Ｒモナチンに相当する。
【０２５７】
無糖チョコレートコーティング：
材料：
牛乳固形分                                ４．０−１０％
チョコレート香料またはチョコレートリキュール
１５．０−２０％
ココアバター                                  ０−１０％
ココア                                        ０−２％
マンニトール                                  ５−１０％
レシチン                                  ０．３−０．５％
ポリデキストロース（ポリデキストロースＫなど）
１２−２５％
Ｓ，Ｓモナチン０．１０−０．５％  またはＲ，Ｒモナチン０．００７−０．０１５％または両者のブレンド
【０２５８】
植物性油                                    ２０−６０％
これはコーティング１００ｍｇにつき、個包装タイプの卓上モナチン甘味料２−４個分の使用量に当たる。
【０２５９】
無糖チョコレート：
材料：
ココア                                            大さじ２−３
バター（代用品は不可）                            大さじ２
生クリーム                                        大さじ２
バニラエッセンス                                  小さじ１／４
ピーナッツバター（ｃｒｕｎｃｈｙ／ｃｒｅａｍｙ）  大さじ１
個包装タイプの卓上モナチン                        ６個
［実施例１９］
卓上甘味料としてのモナチンの評価
Ｒ，ＲモナチンまたはＲ，Ｒモナチン／エリトリトールを含有する卓上モナチン調製品を、コーヒーとアイスティーに使用した場合で、他の公知甘味料（アスパルテームとスクラロース）と比較して評価した。評価対象の主要官能パラメーターは甘味の質、後味、苦味とその後味などである。定性的評価はすでに行われている。
【０２６０】
飲料の調製
（ｉ）コーヒー
標準コーヒーを使用して甘味料の性能を評価した（表７）。
【０２６１】
表７  コーヒー飲料
【表６】
2007501004.tif 000010
【０２６２】
コーヒーに添加した甘味料の濃度は次のとおりである：
アスパルテーム            ０．０２５％（ｗ／ｖ）
スクラロース              ０．００８２％（ｗ／ｖ）
Ｒ，Ｒモナチン            ０．００２０，０．００２５，０．００３０％（ｗ／ｖ）
【０２６３】
＋  マルトデキストリン１ｇ
Ｒ，Ｒモナチン／エリトリトール  ０．００２０，０．００２５，０．００３０％（ｗ／ｖ）
【０２６４】
＋  エリトリトール
（ｉｉ）アイスティー飲料
アイスティーを調製して甘味料の性能を評価した（表８）：
【０２６５】
表８  アイスティー飲料
【表７】
2007501004.tif 000011
【０２６６】
アイスティーに添加した甘味料の濃度は次のとおりである：
アスパルテーム            ０．０４５０％（ｗ／ｖ）
スクラロース              ０．０１７０％（ｗ／ｖ）
Ｒ，Ｒモナチン            ０．００３０，０．００３５，０．００４０％（ｗ／ｖ）
【０２６７】
＋  マルトデキストリン１ｇ
Ｒ，Ｒモナチン／エリトリトール  ０．００３０，０．００３５，０．００４０％（ｗ／ｖ）
【０２６８】
＋  エリトリトール
官能評価
これらのコーヒー、アイスティー飲料の評価は経験を積んだ官能評価員の小規模（ｎ＝６）パネルによって、それぞれ試飲の機会を分けて行われた。評価結果を表９にまとめる。
【０２６９】
表９  コーヒーとアイスティー（１人前各２００ｍｌ）の官能評価
【表８】
2007501004.tif 000012
【０２７０】
考察
モナチンは卓上甘味料調製品にすると、明確な官能面の利点を含めて、意外な性能面の利点をもたらす。コーヒーに加える卓上調製品に使用すると、コーヒーの風味が明らかに引き立つ。こうした利点は低濃度のエリトリトールを加えると更に強まる。このエリトリトールは風味をバランス良くし、まろやかにし、また甘味の到来を速める。アイスティー特に（レモンで）酸味を加えた酸性のアイスティーでは、モナチンはレモンの香りを引き立てる。この場合もモナチンにエリトリトールを混ぜると風味が更に引き立つ。
【０２７１】
モナチンは官能特性の改善（すなわち後味の抑制、味・香りの変化の抑制）および／または溶解度や安定性の向上をもたらす。
【０２７２】
モナチンで甘味を付与したコーヒーは０カロリーに近いが、ショ糖小さじ２杯（〜８ｇ）で甘くしたコーヒーは３２カロリーになる。
【０２７３】
［実施例２０］
モナチンとサッカリンの甘味の用量反応曲線
訓練を積んだ官能評価員２０人を使用して、２回判定してもらうことで、モナチンとサッカリンの甘味を評価した。クエン酸／クエン酸塩バッファーｐＨ  ３．２を使用して試験溶液と標準溶液を調製した。図１６を参照。反応曲線はサッカリンと比べてＲ，Ｒ／Ｓ，Ｓモナチンのほうが直線的であり、これは、より砂糖に近い味質特性を示すことを反映している。１０％ＳＥＶの上の高原横ばいは、味・香りの変化および後味「抑制混合物」の不存在／低濃度を示唆する。モナチンの用量反応曲線の形状はアスパルテーム、スクラロースおよびアリテームのそれに類似するが、それらはいずれも「高級」甘味料である。
【０２７４】
Ｒ，Ｒ／Ｓ，Ｓモナチンをモデル系（ｐＨ  ３．２）の単一甘味料とした場合、風味付けしていない系で次のような特性が観測された：（１）甘味到来のわずかな遅延；（２）甘味消失がきわめて急速；（３）かすかな「アスパルテーム様」後味、かすかに甘い後味、苦味を伴わない後味；および（４）口中に残る清涼感。
【０２７５】
［実施例２１］
ｐＨ  ３で温度を高くした場合のモナチンの安定性
合成モナチンのサンプルについてｐＨ  ３のまま、温度を２５℃、５０℃および１００℃にした場合の変化を調べた。室温では、４８時間でモナチンが１４％消失した。この消失はラクトンの形成に起因した。５０℃では４８時間で２３％のモナチンの消失が観測された。この消失はラクトンの形成と約１５．５分後の未知化合物の蓄積に起因した。１００℃では、モナチンは２４時間後にほぼすべて消失した。検出可能な主要化合物は１５．５分後の未知化合物であった。
【０２７６】
［実施例２２］
４０℃でｐＨ  ２．５、３．０、４．０の場合のモナチンとアスパルテームの官能安定性
ｐＨ  ２．５、３．０および４．０で調製し、４０℃で保存したモナチン溶液の官能安定性を１００日間モニターした。これらの溶液からの甘味の消失を同じ条件で調製し保存したアスパルテーム溶液からの甘味の消失と比較した。
【０２７７】
ｐＨ  ２．５、３．０および４．０のリン酸／クエン酸バッファーで調製したモナチン（８％ＳＥＶ、〜５５ｐｐｍ、２Ｒ，４Ｒ／２Ｓ，４Ｓ鏡像異性体ペア約９６％と２Ｒ，４Ｓ／２Ｓ，４Ｒ鏡像異性体ペア約４％を含有する合成ブレンド）溶液の官能安定性を４０℃で保存して調べた。その安定性を同じバッファーを使用して調製したアスパルテーム溶液（４００ｐｐｍ）の安定性と比較した。３種類のショ糖標準溶液を、モナチン溶液、アスパルテーム溶液の場合と同じバッファーを使用して調製した。調製した溶液はすべて暗所に保存した。
【０２７８】
バッファー組成：
ｐＨ  ２．５        リン酸（７５％溶液）０．１２７％（ｗ／ｖ）
クエン酸三ナトリウム一水和物０．００５％（ｗ／ｖ）
ｐＨ  ３．０        リン酸（７５％溶液）０．０９２％（ｗ／ｖ）
クエン酸三ナトリウム一水和物０．０３１％（ｗ／ｖ）
ｐＨ  ４．０        リン酸（７５％溶液）０．０７１％（ｗ／ｖ）
クエン酸三ナトリウム一水和物０．０４７％（ｗ／ｖ）
ショ糖と比較した場合の各甘味料の甘味を、甘味評価法の訓練を受け経験を積んだ官能評価員の小パネル（ｎ＝８）に２回評価させた。サンプルはすべて（バッファーに溶かして）２２℃±１℃の温度で２回、試験に供した。モナチン（試験）溶液は３桁の乱数コードを付し、パネリストに対し個別に、無作為順に供した。濃度が０．５％（ｗ／ｖ）刻みで上昇する４．０〜１０．０％（ｗ／ｖ）の範囲内のショ糖標準品もまた供した。パネリストは試験溶液をショ糖標準品と比較して甘味を評価するよう求められた。これは試験溶液を３口、水を１口、ショ糖標準品を３口、水を１口順次飲むといった手順で行った。パネリストは甘味を小数第１位まで、例えば６．８、８．５というように判定するよう求められた。試験溶液の評価は５分間の休憩時間を間に挟んで行う。パネリストはまた、口を充分にすすぎ、クラッカー１個を食べて、潜在的な持ち越し効果を小さくするよう求められた。
【０２７９】
表１０および１１はクエン酸リン酸バッファーを使用した安定性試験の結果である。どのｐＨでも暗所に４０℃で１００日保存後は、モナチンの甘味維持率のほうがアスパルテームの甘味維持率よりも高かった。ｐＨ  ４．０では、１７日目〜１００日目の間では甘味の評価値にほとんど変化がなかったので、モナチン溶液の甘味の消失はほぼ横ばいだった模様である。
【０２８０】
表１０  モナチンの官能安定性：４０℃で１００日保存後の甘味
【表９】
2007501004.tif 000013
【０２８１】
Ａ：ｐＨ  ２．５
Ｂ：ｐＨ  ３．０
Ｃ：ｐＨ  ４．０
【０２８２】
表１１  安定性：表示ｐＨ、４０℃で１００日保存後の甘味維持率
【表１０】
2007501004.tif 000014
【０２８３】
表１２に見られるように、各バッファーはｐＨの維持に有効であった。
【０２８４】
表１２
【表１１】
2007501004.tif 000015
【０２８５】
擬一次分解反応を想定すると、ｌｏｇｎ維持率対時間（ｌｏｇｎ  ％ＲＴＮｖ．ｔ）のグラフから任意の設定条件下での甘味消失の半減期（ｔ1/2）と速度定数（ｋ）を推定することができる。そうすると、モナチンとアスパルテームの甘味消失の速度論は表１３のようにまとめられよう。
【０２８６】
表１３
【表１２】
2007501004.tif 000016
【０２８７】
どのｐＨでも４０℃で１００日保存後は、モナチンの甘味維持率のほうがアスパルテームの甘味維持率よりも高い。ｐＨ  ４．０では、１７日目〜１００日目の間で甘味の評価値にほとんど変化がなかったので、モナチン溶液の甘味消失はほぼ横ばいだった模様である。一方、アスパルテーム溶液では甘味の消失が続く。
【０２８８】
モナチンとアスパルテームの半減期の推定値は、モナチンに由来する甘味のほうがアスパルテームに由来する甘味よりも消失速度が遅いことを示す。ｐＨ  ２．５、３．０および４．０でのモナチンの推定半減期はそれぞれ６５日、１１５日および２３０日であった。同じ条件下でのアスパルテームの推定半減期はそれぞれ５５日、７５日および１４０日であった。
【０２８９】
従って酸性条件下、４０℃での保存では、モナチンはアスパルテームよりもより安定した甘味を呈する。
【０２９０】
［実施例２３］
エリトリトール／モナチン粉の生産
小タンクを使用してエリトリトール２０００ｇ、Ｒ，Ｒモナチン１６ｇおよび水５Ｌの溶液を４０℃で調製する。エリトリトール５８ｋｇを流動床のバスケットに入れる。流動床の空気温度は６５℃に設定する。モナチン／エリトリトール溶液を流動床上に２５ｋｇ／時で１７分間噴霧する。粉末の乾燥には更に２０分の加熱が必要である。生成物を１２５０ｍｍの篩にかけて篩い分ける。欧州特許第０３２５７９１Ｂ１号明細書（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ，Ｎｉｋｋｅｎ  １９９３）を参照。モナチン／エリトリトール生成物の（ショ糖と比較した場合の）相対甘味計算値は約１．１０である。２つのモナチン／エリトリトール・サンプルと１つのモナチン／マルトデキストリン・サンプルとで３点比較法を行う。３点比較法は技術上周知である。即使用可能タイプの立方体状モナチン／エリトリトールはショ糖に酷似する色および結晶性を有するものと期待される。
【０２９１】
［実施例２４］
モナチン立体異性体のクロマトグラフィー
サンプルの調製−凍結乾燥品約５０−７５μｇをマイクロ遠心チューブに入れた。これにＨＰＬＣ用メタノール１．０ｍＬを加えた。この溶液を３０分間ボルテックスし、遠心分離し、上清を分析用に分取した。
【０２９２】
逆相ＨＰＬＣ−２．１×２５０ｍｍ  Ｘｔｅｒｒａ（登録商標）ＭＳ  Ｃ８  ５μｍ  （Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ＨＰＬＣカラムを使用して２つの特徴あるジアステレオマー・ピークのクロマトグラフィーを行った。検出はＵｌｔｉｍａ（登録商標）三連四重極質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を使用して行った。移動相には次のグラジエントを用いた：
【０２９３】
時間（分）                    ０    ９    １６    ２０    ２１
０．０５％ＴＦＡ                Ａ％    ９５    ６５    １０    １０    ９５
【０２９４】
メタノール、０．０５％ＴＦＡ  Ｂ％    ５    ３５    ９０    ９０    ５
送液量、ｍＬ／分              ０．２５  ０．２５  ０．２５  ０．２５  ０．２５
キラルＨＰＬＣ−２５０×４．６ｍｍ  Ｃｈｉｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｔ  （Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）ＨＰＬＣカラムを使用して２つの特徴ある立体異性体のクロマトグラフィーを行った。検出はＵｌｔｉｍａ（登録商標）三連四重極質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）を使用して行った。移動相はメタノール（０．２％酢酸と０．０５％水酸化アンモニウムとを添加）からなった。
【０２９５】
質量分析（ＭＳ／ＭＳ）−モナチンの存在はＳＲＭ（ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ、選択反応検出）法で検出した。モナチンのプロトン化分子イオンはｍ／ｚ＝２９３．３である。この分子イオンのフラグメンテーションにより、分子イオンの多重脱水に由来する主要イオンがｍ／ｚ＝２５７．３に生成する。この遷移はモナチンにきわめて特異的であることがすでに示されており、ＳＲＭ法での検出のための遷移（２９３．３→２５７．４）に選択された。この検出法はモナチンの逆相分離とキラル分離の両方に使用した。
【０２９６】
結果−Ｒ，Ｓ／Ｓ，ＲおよびＳ，Ｓ／Ｒ，Ｒモナチンの標準サンプルを逆相ＨＰＬＣで評価した。サンプルは誘導体化と酵素的光学分割により調製した。標準溶液のクロマトグラムを図１７に示す。逆相分析に続いて、キラルクロマトグラフィーを行ってサンプル中の特定の異性体を評価した。標準Ｓ，ＳおよびＲ，Ｒモナチン溶液のキラルクロマトグラフィーを図１８に示す。
【０２９７】
［実施例２５］
高温（８０℃）および中性ｐＨでのモナチンの安定性
７５ｐｐｍモナチンの１００ｍＬ溶液ｐＨ  ７をストック液として使用した。合成モナチンサンプルは約９６％の２Ｒ，４Ｒ／２Ｓ，４Ｓエナンチオマー対と４％の２Ｒ，４Ｓ／２Ｓ，４Ｒエナンチオマー対を含んだ。サンプルは実験期間中、８０℃、ｐＨ  ７にインキュベートし、サンプル採取を０、１、２、３、４時間目、および１、２、４、７、１４、２１、３５日目の各時点に行った。諸々の実験条件を２回繰り返した。
【０２９８】
逆相クロマトグラフィー使用のＬＣ−ＭＳによる分離と定量−合成モナチンの両ジアステレオマーピークについて反応曲線を確定した。５−１５０  ｐｐｍの範囲を一括し、合成モナチン標準品は脱イオン水に溶解した。２つのジアステレオマーピークの分離は３．９×１５０ｍｍ  Ｎｏｖａｐａｋ  Ｃ１８  （Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）ＨＰＬＣカラムを使用して行った。検出と定量には紫外−可視（ＵＶ）分光光度計および質量分析計（ＭＳ）の各検出部を直列に使用した。モナチンとそのラクトンの各ピークは２７９ｎｍにＵＶｍａｘを有し、それが精密検出に役立った。定量は正イオンエレクトロスプレー法で２９３．３ｍ／ｚおよび２７５．３ｍ／ｚの選択イオン検出（ＳＩＭ）スキャンによって行った。
【０２９９】
結果−中性ｐＨ（ベーキングやデザートでは一般的）では、モナチンの分解度は７−３５日後でもわずかであると判明した。モナチンの経時的消失は、主要な副生物が環化反応とおそらくごく低レベルのラセミ化反応であるため、ｐＨに大きく左右される。８０℃、ｐＨ  ７での実験中、ラセミ体ＲＲ／ＳＳモナチンまたはそのラクトンの濃度変化は、定量に使用したＬＣ−ＭＳの精度限界内では、検出されなかった。このデータによれば、高温度、中性ｐＨでのモナチンの安定性はベーキング条件に適うものと見込まれる。
【０３００】
本発明の原理を適用しうる多数の可能な実施態様を考えると、例示の実施態様は本発明の具体例の一端にすぎないことは自明であり、本発明の範囲を限定するものと解されてはならない。例えば本明細書の開示から、モナチン甘味料組成物を固体形態ではなく濃縮液形態で製造し、特定の容量例えば１ｍＬまたは０．３５ｍＬの該濃縮液が特定量例えば小さじ２杯分のグラニュー糖に匹敵する甘味を呈するようにもなしうることは当業者には自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【０３０１】
【図１】図１はモナチンおよび／またはインドール−３−ピルビン酸の生産に使用される生合成経路を示す。一経路ではトリプトファン経由でインドール−３−ピルビン酸が生産され、別の経路ではインドール−３−乳酸経由でインドール−３−ピルビン酸が生産される。最後にはモナチンがＭＰ中間体を経由して生産される。
【０３０２】
囲みの中の化合物は基質および生合成経路で生産される生成物である。矢印の横に記した組成物は基質の生成物への変換に際して使用しうる補因子または試薬である。使用補因子または試薬は、生合成経路の特定ステップで使用されるポリペプチド次第であろう。補因子ＰＬＰ（ピリドキサル５’−リン酸）はポリペプチドとは無関係に反応を触媒しうるので、ＰＬＰを用意するだけで基質から生成物への進行を可能にすることができる。
【図２】図２はＭＰ中間体を利用する生合成経路の更に詳細な図解である。該経路中の各ステップに対応する基質は囲みで示す。基質間の変換を可能にするポリペプチドは基質間の矢印の横に記す。各ポリペプチドは一般名と酵素（ＥＣ）番号で示す。
【図３】図３はインドール−３−乳酸のインドール−３−ピルビン酸への変換という生合成経路の更に詳細な図解である。該経路中の各ステップに対応する基質は囲みで示す。基質間の変換を可能にするポリペプチドは基質間の矢印の横に記す。各ポリペプチドは一般名と酵素（ＥＣ）番号で示す。
【図４】図４は化学的手段でＭＰを製造するための可能な反応の１つを示す。
【図５Ａ】図５Ａは酵素的に生産したモナチンのＬＣ／ＭＳ同定を示すクロマトグラムである。
【図５Ｂ】図５Ｂは酵素的に生産したモナチンのＬＣ／ＭＳ同定を示すクロマトグラムである。
【図６】図６は酵素的に合成したモナチンのエレクトロスプレー質量スペクトルである。
【図７Ａ】図７Ａは酵素混合物中で生産されたモナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン解析のクロマトグラムである。
【図７Ｂ】７Ｂは酵素混合物中で生産されたモナチンのＬＣ／ＭＳ／ＭＳ娘イオン解析のクロマトグラムである。
【図８】図８は酵素的に生産したモナチンの高分解能質量測定を示すクロマトグラムである。
【図９Ａ】図９ＡはＲ−トリプトファン（Ａ）のキラル分割を示すクロマトグラムである。
【図９Ｂ】図９ＢはＳ−トリプトファン（Ｂ）のキラル分割を示すクロマトグラムである。
【図９Ｃ】図９Ｃは酵素的に生産したモナチン（Ｃ）のキラル分割を示すクロマトグラムである。
【図１０】図１０はＩＰＴＧ誘導後に細菌細胞中で生産されたモナチンの相対量を示す棒グラフである。（−）は基質添加の欠如（トリプトファンまたはピルビン酸が添加されなかったこと）を示す。
【図１１】図１１はトリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から生産されるモナチンの収率を高めるために用いた経路の図解である。
【図１２】図１２はトリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から生産されるモナチンの収率を高めるために用いた経路の図解である。
【図１３】図１３はトリプトファンまたはインドール−３−ピルビン酸から生産されるモナチンの収率を高めるために用いることができる経路の図解である。
【図１４】図１４はＲ，Ｒ立体異性体のモナチンで得られた用量反応曲線である。
【図１５】図１５はＲ，Ｒ／Ｓ，Ｓ立体異性体混合物のモナチンで得られた用量反応曲線である。
【図１６】図１６はＲ，Ｒ／Ｓ，Ｓ立体異性体混合物のモナチンで得られた用量反応曲線とサッカリンで得られた用量反応曲線の比較である。
【図１７】図１７は合成モナチン標準品の逆相クロマトグラフィーを示す。
【図１８】図１８はモナチン標準品のキラルクロマトグラフィーを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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