(57)【要約】  本発明はホスファチジルセリンを有効成分として含有する組成物に係り、さらに詳しくは、ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚保護・改善用、皮膚バリア機能強化用、炎症反応抑制・緩和用、アトピー性皮膚の治療・改善用、ＰＰＡＲαの活性化用、皮膚の分化の促進・保護用、皮膚老化およびシワ防止・改善用の組成物に関する。本発明に係る前記組成物は、ホスファチジルセリンが皮膚内の組織細胞のＰＰＡＲαを活性化させて皮膚の外部刺激による皮膚の炎症反応を抑制・緩和し、皮膚のバリア機能を強化して皮膚バリア機能が弱いアトピー性皮膚を治療・改善する他、皮膚内の組織細胞のＰＰＡＲαを活性化させて皮膚角質細胞の分化を促進し、紫外線あるいは活性酸素種から皮膚角質細胞を保護して皮膚の分化を促進・保護し、さらに、紫外線による皮膚老化及びシワを防止・改善する効果がある。よって、このような組成物を用いることにより、紫外線または化学物質などの皮膚の外部刺激による損傷から皮膚を保護・改善し、皮膚バリア機能を堅牢化させて全体としての皮膚の状態を改善することができる。
2007522259.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚保護・改善用の組成物。
【請求項２】
ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚バリア機能強化用の組成物。
【請求項３】
ホスファチジルセリンを有効成分として含有する炎症反応抑制・緩和用の組成物。
【請求項４】
ホスファチジルセリンを有効成分として含有するアトピー性皮膚の治療・改善用の組成物。
【請求項５】
ホスファチジルセリンを有効成分として含有するＰＰＡＲαの活性化用の組成物。
【請求項６】
ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚の分化促進・保護用の組成物。
【請求項７】
ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚老化およびシワ防止・改善用の組成物。
【請求項８】
ホスファチジルセリンがＰＰＡＲαを活性化することにより皮膚の外部刺激による炎症反応を抑制・緩和することを特徴とする請求項３に記載の炎症反応抑制・緩和用の組成物。
【請求項９】
ホスファチジルセリンが皮膚のバリア機能を強化することにより、皮膚バリア機能が弱いアトピー性皮膚を治療・改善することを特徴とする請求項４に記載のアトピー性皮膚の治療・改善用の組成物。
【請求項１０】
ホスファチジルセリンがＰＰＡＲαを活性化することにより、皮膚角質細胞の分化を促進することを特徴とする請求項６に記載の皮膚の分化の促進・保護用の組成物。
【請求項１１】
ホスファチジルセリンが紫外線または活性酸素種から皮膚角質細胞を保護することを特徴とする請求項６に記載の皮膚分化の促進・保護用の組成物。
【請求項１２】
前記皮膚老化およびシワは、紫外線によるものであることを特徴とする請求項７に記載の皮膚老化およびシワ防止・改善用の組成物。
【請求項１３】
前記ホスファチジルセリンは大豆、トウモロコシなどの植物性由来のレシチン、卵黄、魚油などの動物性油脂、動物の脳、あるいは牛乳から抽出されたものであるか、あるいは、抽出されたレシチンのホスホリパーゼＤ転移反応で得られたものであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記ホスファチジルセリンは、水素添加型のものであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
油脂をさらに含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記組成物は、経皮投与用のものであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、経口投与用のものであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホスファチジルセリンを有効成分として含有する組成物に係り、さらに詳しくは、ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚保護・改善用、皮膚バリア機能強化用、炎症反応抑制・緩和用、アトピー性皮膚の治療・改善用、皮膚の分化の促進・保護用、皮膚老化およびシワ防止・改善用の組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほ乳動物の皮膚の表皮は各種の細胞を含むことにより、種々なる機能を行うと共に、各種の化学的な組成物を有している。これらの相異なる皮膚層間には、各種の脂質が種々なる濃度をもって存在している。具体的に、皮膚の真皮は、主としてコラーゲンとその他の蛋白質を生成し、極めて少量の脂質分を生成する線維芽細胞により構成されている。これとは反対に、表皮は、脂質を生成し、実質的にはコラーゲンは実質的に生成しない角質細胞を含んでいる。線維芽細胞により生成されたコラーゲンは皮膚に張りを与えるのに対し、角質細胞により生成された脂質は生組織と外部との遮断層を形成して、皮膚バリアの機能を果たすことになる。
【０００３】
皮膚内の脂質成分としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、トリグリセリド、グルコシルセラミド、セラミド、コレステロール、コレステロールサルフェート、遊離脂肪酸などが挙げられる。中でも、リン脂質としてのホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトールなどは真皮側に、そしてセラミド系の物質は表皮側に主として分布している。これらの組成物の分布比と脂質量は皮膚バリアの恒常性に寄与し、外部からの物理的・化学的な損傷に対して早い修復力を与える。
【０００４】
老化過程中の表皮脂質は、そうでない表皮の組織とは異なって全体的に減り、これに伴い、皮膚バリアの機能が低下する。さらに、表皮脂質の総量は青年層の３０％程度まで減っているとはいえ、それぞれの脂質の含量比は保たれる。これは、皮膚角質の脂質が脂質の生合成経路とセラミドの生合成経路を通じて形成されるということを裏付けることであり、実際に、皮膚角質の脂質は真皮のリン脂質と遊離脂肪酸から由来したものであることが文献に開示されている［Hamanaka et al., J. Invsti. Dermatol., 119, pp 416-423, 2002］。また、遊離脂肪酸の割合が変化するに伴い、老化性の皮膚に進行する可能性があるということが知られている［Rogers et al., Arch. Dermatol. Res., 288, pp 765-770, 1996］。
【０００５】
ホスファチジルセリンは天然に存在する脂肪質の一種であり、セリン基、リン酸基、グリセロール及び２つの脂肪酸基が結合されている物質である。人間の脳の重量中は、乾燥重量を基準としてレシチンが占める重量が約半分ほどに達しているが、このようなレシチンのほとんどは、神経細胞膜を形成している。ホスファチジルセリンは細胞膜の重要な成分としてのレシチン誘導体の一種であり、特に、脳に多量存在している物質であるが、神経細胞膜において生命維持の活動のためのエネルギーの出入、神経伝達物質の放出やシナプスの活動などの情報伝達など神経細胞の機能の発現に深く関与していると考えられる。しかしながら、ホスファチジルセリンは動物の脳に多量存在しているが、動物の脳以外の由来のものにおいては０．１％未満の濃度にて存在するため、天然の原料から多量のホスファチジルセリンを得ることは困難である。
【０００６】
近年、皮膚の構成細胞に全般的に存在するＰＰＡＲ（Peroxisome proliferators activated receptors）が知られているが、ＰＰＡＲは皮膚のバリアの修復及び炎症の治癒過程の発現に重要な役割を果たすということが明らかになっている。
【０００７】
すなわち、ＰＰＡＲはエネルギーの恒常性を調節する因子であり、特に、ＰＰＡＲが各種のメカニズムを通じて皮膚バリアの透過性の調節、表皮層の増殖抑制、表皮層の分化誘起などの皮膚状態の調節に関与するということが知られている。これらの特徴により、ＰＰＡＲは、炎症による皮膚疾患だけではなく、表皮層の過増殖による乾癬、傷の治癒、ニキビなど各種の皮膚疾患の革新的な調節子として働くことになる。
【０００８】
このため、皮膚の恒常性に寄与する物質の信号伝達の詳細が広く知られてはいないとはいえ、近年知られているＰＰＡＲと関連するリン脂質の機能についての具体的な研究が進んでいる。ＰＰＡＲは、３つのサブタイプのものがあると報告されているが、これらの中でＰＰＡＲαがホスファチジルセリンの受容体としての可能性を有しているということが明らかになっている［Michalik et al., The journal of Cell Biology, 154, pp 799-814, 2001］。
【０００９】
実際に、既知のＰＰＡＲαのアゴニストであるクロフィブレート、ＷＹ１４６４３などを皮膚に塗布したとき、皮膚の刺激物質による炎症が減っていることが認められている［Sheu et al.,The Journal of investigative Dermatology, 118, pp 94-101, 2002］。
これまで、グルココルチコイドなどの物質が抗炎症剤として用いられてきているが、これは、持続的な投与や処理を行うと、慢性的な副作用を示して主として免疫反応の低下を招き、その結果、治療の限界にぶつかることになる。このため、ＰＰＡＲαのアゴニストがグルココルチコイドに比べて局所的且つ効果的な治療方法であるとされるようになった。
【００１０】
さらに、皮膚の老化は、紫外線に長期間露出された皮膚から見られる光老化と、紫外線に露出されていない皮膚から見られる内因性の老化と、に大別できる。光老化と内因性の老化においては、臨床的に皮膚が薄くなり、張りがなくなって皮膚にシワができる。シワの主因として、真皮内の細胞からの基質タンパク質の欠乏が重要なものとして挙げられている。皮膚における基質タンパク質には、膠原質（コラーゲン）が９０％以上を占め、弾力質（エラスチン）が３−４％程度を占めている。通常、シワの生成は、皮膚組織のコラーゲンの減少とプロテアーゼの一種である基質金属タンパク質の分解酵素（Matrix metalo proteinase；ＭＭＰ）の発現の増加と深い関連性があり、これは、真皮組織にある線維芽細胞の活性と深い関連性がある。紫外線によるコラーゲンの減少とＭＭＰの増加についての多くの研究結果とそのメカニズムについての報告がなされているが、これまで知られている正確なメカニズムは、ない。最も広く知られているメカニズムとしては、紫外線によるＡＰ−１（activator protein）の活性化と、コラーゲンの合成に重要とされるＴＧＦ−β／ｓｍａｄとのｐ３００に対する競争が挙げられる。ＡＰ−１とＳＢＥ（smad binding element）は、転写因子として働く上でｐ３００が要される。細胞内に存在するｐ３００の量には限りがあるため、一方の転写因子が活性化すると、他方の転写因子が阻害される。このため、紫外線によるＡＰ−１の活性化はＭＭＰの発現を高め、このようなＭＭＰの向上に起因してコラーゲンの合成は減る。それ故、膠原質量を増やして基質タンパク質の分解酵素の発現を阻害させ、その結果、皮膚老化の抑制効果を期待することができる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明は上述の課題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ホスファチジルセリンの各種の効能についての調査を行い、ホスファチジルセリンが皮膚内の組織細胞のＰＰＡＲαを活性化させることにより、紫外線及び化学物質による皮膚の炎症反応を抑制・緩和させ、皮膚角質の細胞の分化を促進するということを見出した。併せて、皮膚の角質細胞を紫外線あるいは活性酸素種（Reactive Oxygen Species；ＲＯＳ）から保護し、紫外線による皮膚の老化およびシワの防止にも効くということを知見した。本発明は、これらの知見に基づいて完成されたものである。
【００１３】
本発明の目的は、ホスファチジルセリンを含有する皮膚保護・改善用、皮膚バリア機能の強化用、炎症反応の抑制・緩和用、アトピー性皮膚の治療・改善用、ＰＰＡＲαの活性化用、皮膚の分化の促進・保護用、皮膚老化およびシワの防止・改善用の組成物を提供するところにある。
【００１４】
本発明は、ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚保護・改善用の組成物を提供する。
【００１５】
また、本発明は、ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚バリア機能強化用の組成物を提供する。
【００１６】
さらに、本発明は、ホスファチジルセリンを有効成分として含有する炎症反応抑制・緩和用の組成物を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、ホスファチジルセリンを有効成分として含有するアトピー性皮膚の治療・改善用の組成物を提供する。
【００１８】
さらに、本発明は、ホスファチジルセリンを有効成分として含有するＰＰＡＲαの活性化用の組成物を提供する。
【００１９】
さらに、本発明は、ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚の分化の促進・保護用の組成物を提供する。
【００２０】
さらに、本発明は、ホスファチジルセリンを有効成分として含有する皮膚老化およびシワ防止・改善用の組成物を提供する。
【００２１】
前記炎症反応抑制・緩和用の組成物において、ホスファチジルセリンが、ＰＰＡＲαを活性化させることにより皮膚の外部刺激による炎症反応を抑制・緩和することを特徴とする。
【００２２】
前記アトピー性皮膚の治療・改善用の組成物において、ホスファチジルセリンが皮膚のバリア機能を強化することにより、皮膚バリア機能が弱いアトピー性皮膚を治療・改善することを特徴とする。
【００２３】
前記皮膚の分化の促進・保護用の組成物において、ホスファチジルセリンがＰＰＡＲαを活性化させることにより、皮膚角質細胞の分化を促進することを特徴とする。
前記皮膚の分化の促進・保護用の組成物において、ホスファチジルセリンが紫外線または活性酸素種から皮膚角質細胞を保護することを特徴とする。
【００２４】
前記皮膚老化およびシワ防止・改善用の組成物において、前記皮膚老化とシワは、紫外線によるものであることを特徴とする。
【００２５】
前記組成物において、前記ホスファチジルセリンは大豆、トウモロコシなどの植物性由来のレシチン、卵黄、魚油などの動物性油脂、動物の脳、あるいは牛乳から抽出されたものであるか、あるいは、抽出されたレシチンをホスホリパーゼＤ転移反応して得られたものであることを特徴とする。
【００２６】
前記組成物において、前記ホスファチジルセリンは、水素添加型のものであることを特徴とする。
【００２７】
前記組成物は油脂をさらに含むことを特徴とする。
【００２８】
前記組成物は経皮投与用、あるいは、経口投与用のものであることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２９】
本発明に係るホスファチジルセリンを含有する組成物は、ホスファチジルセリンが皮膚内の組織細胞のＰＰＡＲαを活性化させて皮膚の外部刺激による皮膚の炎症反応を抑制・緩和し、皮膚のバリア機能を強化して皮膚バリア機能が弱いアトピー性皮膚を治療・改善する他、皮膚内の組織細胞のＰＰＡＲαを活性化させて皮膚角質細胞の分化を促進し、紫外線あるいは活性酸素種から皮膚角質細胞を保護して皮膚の分化を促進・保護し、さらに、紫外線による皮膚老化及びシワを防止・改善する効果がある。よって、このような組成物を用いることにより、紫外線または化学物質などの皮膚の外部刺激による損傷から皮膚を保護・改善し、皮膚バリア機能を堅牢化させて全体としての皮膚の状態を改善することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明をさらに詳述する。
【００３１】
本発明に係る組成物は薬学組成物であっても良い。本発明に係る薬学組成物は、経口、非経口、直腸、膣、局所、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下などを通じて投与しても良い。最も好ましい投与経路は、経口投与および経皮投与である。もちろん、活性化合物の投与量は、治療を受ける対象、治療の対象となる特定の疾患あるいは病態、疾患または病態の深刻度、投与の経路、および処方者の判断により変わる。これらの因子に基づく投与量の決定は、当業者のレベル内にある。通常、投与量は、概ね０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜概ね１０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であっても良い。好ましくは、投与量は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００３２】
本発明に係る薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体と一緒に薬学組成物に剤型化可能である。文献［参照：Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, by E. W. Martin(Merck Publ. Co., Easton, PA］には、典型的な担体と、本発明の組成物を製造する上で用いられる通常の薬学組成物の製造方法が開示されている。本発明の化合物は、その他の薬剤と一緒に投与されても良い。また、本発明に係る薬学組成物は、疾患の治療のための他の組成物とともにおよび他の処置とともに投与されても良い。例えば、本発明に係る薬学組成物の投与と一緒に手術、レーザーまたは化学療法が併行可能である。
【００３３】
意図された投与の方式によって、薬学組成物は、固体、半固体、または液体投与の形を取っても良い。投与形態は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル、座剤、小袋、顆粒、粉末、クリーム、ローション、軟膏、ばん創膏、液体溶液、懸濁液、および分散液、エマルジョン、シロップなどを含むが、これらに限定されることはない。活性成分は、リポソーム、微粒子、またはマイクロカプセルなどにカプセル化されても良い。しかしながら、最も好ましい剤型は、クリーム、ローション、軟膏、液体溶液、懸濁液、分散液またはエマルジョンなどの経皮投与用の剤型である。
【００３４】
さらに、本発明に係る組成物は、機能性化粧品の組成物であっても良い。化粧品組成物の剤型としては、柔軟化粧水、収斂化粧水、ローション、クリーム、エッセンス、カプセル、粉末など各種の剤型が挙げられる。化粧品の剤型は、当業界における通常の製造方法に従い製造される。
【００３５】
さらに、本発明は、前記化合物および食品学的に許容可能な食品補助添加剤を含む健康機能食品を提供する。前記化合物を添加可能な食品としては、例えば、各種の食品類、飲み物、ガム、茶、ビタミン複合剤、健康機能性食品類などがある。
【００３６】
このとき、食品または飲み物中における前記化合物の量は、全食品重量の０．００１〜９９重量％であり、健康飲み物組成物は、１００ｍｌを基準として０．００１〜０．１ｇ、好ましくは、０．０５〜０．１ｇの割合である。
【００３７】
本発明の健康機能性の飲み物組成物は、指示された割合にて前記化合物を必須成分として含有する以外は、他の成分には特に制限がなく、通常の飲み物のように種々なる香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。
【００３８】
これら以外に、本発明の組成物は、各種の栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲み物に用いられる炭酸化剤などを含有することができる。その他に、本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュースなどの飲み物および野菜の飲み物の製造のための果肉を含有することができる。これらの成分は単独で用いても、複数種組み合わせて用いても良い。このような添加剤の割合は、あまり重要なものではないが、通常本発明の組成物１００重量部当たり約０〜２０    重量部の範囲において選ばれる。
【００３９】
一方、本発明のホスファチジルセリンは深刻な毒性および副作用は報告されていないため、予防を目指して長期間使用するときにも安心して用いることが可能である。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明の好適な実施の形態を挙げて本発明をさらに詳述するが、本発明の権利範囲がこれらに限定されることはない。
【００４１】
＜実施例１：紫外線の照射による皮膚刺激（炎症反応）の抑制実験＞
本発明のホスファチジルセリンが紫外線の照射による皮膚刺激（炎症反応）を抑える効果を有するかどうかを調べてみるために、下記のようにして実験を行った。このとき、紫外線の照射によって起こる皮膚刺激（炎症反応）は、紅斑形成により測定した。
【００４２】
先ず、被検者（２８才以上、男女各１０名）の腕の内側部分のＭＥＤ（minimal erythma dosage）を測定し、予め被検者の腕の内側部分にホスファチジルセリン０．５％を含む水溶液（ＰＥＧ３００を５％を含む水溶液相；ＰＥＧ３００、Ｓｉｇｍａ、米国）を１ｃｍ２当たり３０ｕｌを塗布し、ＵＶＢ（Sankyo Denki Ｇ１５Ｔ８Ｅ sunlamps ＵＶ−Ｂ、日本）を２ＭＥＤ（７８ｍｊ／ｃｍ２）、３ＭＥＤ（１１７ｍｊ／ｃｍ２）、４ＭＥＤ（１５６ｍｊ／ｃｍ２）照射した後、紅斑形成の抑制の程度を測定した。このとき、対照群としては、ホスファチジルセリンの無処理群を用いた。
【００４３】
その結果、図１に示すように、ホスファチジルセリンを処理した群においては、対照群に比べて、紅斑の形成が大幅に抑えられていることが確認された。
【００４４】
＜実施例２：12-0-テトラデカノイルホルボール-13-アセテート（ＴＰＡ）による皮膚刺激（炎症反応）の緩和実験＞
本発明のホスファチジルセリンの皮膚刺激物質による皮膚刺激（炎症反応）の緩和効果を確かめるために、Ｓｈｅｕら（The journal of Investigative Dermatology, １１８, ｐｐ ９４−１０１, ２００２）が用いた方法に従い、下記のようにして実験を行った。
【００４５】
まず、実験対象としては、６−８週齢の雄マウス及び雌マウスとしてのＣＤ−１マウス（Charles River、米国）を用いた。なお、刺激物質としては、アセトン中にＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）が０．０３ｗｔ／ｖｏｌ％分含まれている溶液１０μｌを前記実験動物の両耳の内側と外側に処理した。処理物質により耳が厚くなりながら、炎症反応が起きた。陽性対照群として公知のＰＰＡＲαアゴニストであるクロフィブラート（１ｍＭ）及びＷｙ１４６４３（１ｍＭ）、試験物質として前記実施例１において用いられたものと同じホスファチジルセリン０．５％含有した水溶液のそれぞれを、炎症誘発後４５分間、４時間おきに耳の両面に1ｃｍ２当たり３０ｕｌを処理した。次いで、耳の処理部位を生検して、４％のホルムアルデヒドに固定した後、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。その後、Ｈ＆Ｅ染色を施した組織スライドを１００倍拡大した写真から炎症の緩和を確認した。
【００４６】
その結果、図２に示すように、ＴＰＡのみを処理した対照群において、組織がかなり肥大化していることが確認でき、ホスファチジルセリン処理群において炎症が緩和されていることを確認した。また、陽性対照群のＰＰＡＲαのアゴニストであるクロフィブラート処理群、Ｗｙ１４６４３処理群において炎症が緩和されていることが確認された。
【００４７】
＜実施例３：皮膚角質細胞における、紫外線の照射による炎症反応の減少実験＞
本発明のホスファチジルセリンについて、皮膚角質細胞における紫外線の照射による炎症反応の減少効果を確めるために、ステファンら（The journal of Investigative Dermatology, １１７, ｐｐ １４３０−１４３６, ２００１）が発表した論文による方法に従い、下記のようにして実験を行った。
【００４８】
まず、皮膚角質細胞株（ＨａＣａＴ、Yonsei univeritym（韓国）寄贈）を３×１０５細胞／ディッシュの量にて３５ｍｍ２細胞培養皿に接種した後、一晩培養した。翌日に培地を除去し、１×リン酸バッファ生理食塩水（Phosphate-buffered saline；ＰＢＳ）を用いて洗浄した後、７００ｕｌの１×ＰＢＳを各ディッシュに加えた。その後、２５ｍＪ／ｃｍ２にてＵＶＢを照射した後、ＰＢＳを除去し、２０ｕＭ、４０ｕＭのホスファチジルセリン水溶液（ＰＳ；ＤｏｏｓａｎＢｉｏｔｅｃｈ、韓国）、２００ｕＭのＷＹ−１４６４３（Ｓｉｇｍａ、米国）（陽性対照群）を加えたＤＭＥＭ培地（Hyclone、米国）を加え、２４時間培養した。翌日、培地を回収してそれぞれの炎症サイトカインとして知られているＴＮＦ−α、ＩＬ−６の量をＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent assay）法により測定した。また、実際に正常人の角質細胞においても類似した炎症反応の減少効果が得られるかどうかを確かめるために、ＨａＣａＴ細胞株の代わりに、正常人の皮膚角質細胞（東国大学より寄贈）を用い、前記の方法と同様にして実験を行った後、培地に分泌されたＩＬ−１αの量をＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を図３に示す。
【００４９】
図３から明らかなように、皮膚角質細胞において紫外線の照射により増えていた炎症反応が、陽性対照群であるＷＹ１４６４３処理群でのように、ホスファチジルセリン処理群においてもかなり緩和されていることを確認した。
【００５０】
＜実施例４：紫外線損傷に対する皮膚角質細胞の保護実験＞
本発明のホスファチジルセリンの紫外線損傷に対する皮膚角質細胞の保護効果を確めるために、実施例３の方法と同様にして実験を行った。最後の日に、顕微鏡に取り付けられているデジタルカメラを用いて細胞の写真を撮り、3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイにより細胞の生存率を確認した。
【００５１】
その結果、図４に示すように、既知のＰＰＡＲαアゴニストとしてのＷＹ１４６４３とほとんど同じ程度にて、ホスファチジルセリンが紫外線の損傷に対して皮膚角質細胞を保護していることを確認した。
【００５２】
＜実施例５：皮膚角質細胞における分化の促進効果の確認＞
本発明のホスファチジルセリンの皮膚角質細胞の分化の促進効果を確めるために、下記のようにして実験を行った。
【００５３】
まず、ＫＳＦＭ（ケラチノサイト−ＳＦＭ；Gibco ＢＲＬ／Life Technologies、米国）に培養した正常人の皮膚角質細胞（東国大学より寄贈）を１．５×１０５細胞／ディッシュの量にて３５ｍｍ２細胞培養皿に接種した後、一晩培養した。翌日、培地を除去し、２０ｕＭ、４０ｕＭのホスファチジルセリン水溶液、１．２ｍＭのカルシウム水溶液、２００ｕＭ、４００ｕＭのクロフィブレート（Ｓｉｇｍａ、米国）が加えられている新しい培地を加え、２４時間培養した。翌日、角質細胞の分化を確めるために細胞のモルフォロジの変化を位相差顕微鏡（日本ニコン社製）により確認し、これを顕微鏡に取り付けられているデジタルカメラを用いて写真を撮った。
【００５４】
さらに、角質特異的な角質細胞の分化蛋白質マーカーとして知られているインボルクリンとトランスグルタミナーゼの蛋白質の発現量を確めるために、ウェスターンブロットを行った。細胞は２％のＳＤＳ（Sodium dodecyl sulfate）入り溶解バッファ液５００ｕｌを加え、セルスクラッパにより掻き取り、細胞溶解物だけを得た。ウェスターンサンプルを製造して、７．５％のゲルにランニングした後、メンブレインに移して適切な１次抗体と２次抗体を付着させ、最終的に蛋白質帯を確認した。
【００５５】
その結果、図５に示すように、高濃度のカルシウムが2つの蛋白質の発現を増大させ、既知のＰＰＡＲαアゴニストであるクロフィブレートもまたその発現を増大させた。ホスファチジルセリンもまた急激な蛋白質の発現の増加を成し遂げ、その量は濃度依存的に増えていることが分かった。
【００５６】
＜実施例６：マウスにおける皮膚分化の促進実験＞
本発明のマウスモデルにおける皮膚の分化の促進を確めるために、下記のようにして実験を行った。
【００５７】
まず、６−８週齢の雄マウス及び雌マウスとしてのＣＤ−１マウス（Charles River、米国）背部位の皮膚に０．５％のホスファチジルセリン水溶液を５０ｕｌずつ一日につき２回ずつ２週間塗布した後、処理部位の皮膚組織を生検し、４％のホルムアルデヒドに固定してスライド化した。その後、インボルクリンとローリクリンに対する抗体を付着して蛋白質の発現量を確認した。
【００５８】
その結果、図６に示すように、陰性対照群（ブランク塗布群）と比較して０．５％のホスファチジルセリン塗布群において２つの蛋白質の発現量が大幅に増えているということが分かった。
【００５９】
＜実施例７：ＨｅＬａ細胞株におけるＰＰＡＲαの活性化実験＞
本発明のホスファチジルセリンのＰＰＡＲαの活性化能を確めるために、下記のようにして実験を行った。このとき、保有しているＰＰＡＲαとＰＰＡＲγに対する活性度を確認した。
【００６０】
まず、ＨｅＬａ（Human epithelial carcinoma）（ＫＣＬＢ（韓国細胞株寄託）Ｎｏ．１０００２）細胞株を２×１０４細胞／ウェルの量にて２４ウェルプレートに接種して、一晩培養した。翌日、細胞トランスフェクションを行うためにＰＰＡＲα過発現ベクター２００ｎｇ、ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲα特異的）−ルシフェラーゼリポーターベクター（プロメガ、米国）２００ｎｇ、細胞内の対照群として用いられたレニラールシフェラーゼベクター（内部対照群、すなわち、トランスフェクション効率を確めるために用いられる）４０ｎｇをＯＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、米国）培地に混合し、リポフェクタミン（インビトロジェン、米国）を用いて細胞にトランスフェクションした。４時間後に、１０％のＦＢＳになるように培地を加えて一晩培養し、翌日、ＰＰＡＲαの活性度を測定するためにホスファチジルセリンを２０ｕＭ、４０ｕＭ処理し、陽性対照群としてクロフィブレートを４００ｕＭ処理した後に８時間培養し、デュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Dual luciferase assay system）（プロメガ、米国）を用いてルシフェラーゼ活性度を照度計を用いて測定した。ＰＰＡＲγの場合にも同じ方法により行い、活性度を測定した。このとき、ＰＰＡＲγの活性度を測定する場合、ホスファチジルセリンを１０ｕＭ、５０ｕＭ処理し、陽性対照群においてサイグリタゾーン（Sigma、米国）を５０ｕＭ処理した。なお、ＰＰＡＲαの活性度を測定した結果を第１のグラフに、ＰＰＡＲγの活性度を測定した結果を第２のグラフに示す。
【００６１】
その結果、図７から明らかなように、ホスファチジルセリンはＰＰＡＲαを活性化させているのに対し、ＰＰＡＲγに対しては影響がなかった。
【００６２】
＜実施例８：皮膚角質細胞におけるＲＯＳからの皮膚保護効果の測定＞
本発明のホスファチジルセリンについて、皮膚角質細胞において活性酸素種から皮膚を保護する効果を測定するために、下記のようにして実験を行った。
【００６３】
まず、２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルの皮膚角質細胞を接種した後、翌日２５ｕＭのホスファチジルセリン水溶液（ＤｏｏｓａｎＢｉｏｔｅｃｈ、韓国）（ホスファチジルセリン処理群）と陽性対照群として１００ｕＭのビタミンＣ（アスコルビン酸処理群）、１００ｕＭのビタミンＥ（α−トコフェロール処理群）を処理して２４時間培養した。その後、その翌日に１ｍＭの過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を処理して約１−１．５時間培養した後、ＭＴＴアッセイにより細胞生育力を確認した。
【００６４】
その結果、図８に示すように、ホスファチジルセリン処理群、アスコルビン酸処理群およびα−トコフェロール処理群においていずれも活性酸素種からの保護効果を示すことを確認したが、中でもホスファチジルセリンは少量をもっても同じ保護効果を示すことが分かった。これより、ホスファチジルセリンが皮膚角質細胞を活性酸素種から保護し、結果的に活性酸素種から皮膚を保護することが分かった。
【００６５】
＜実施例９：ホスファチジルセリンの皮膚バリア機能修復の強化効果＞
この実施例９は、無毛マウスモデルを用い、ホスファチジルセリンを服用した群と、服用しなかった群における水分損失量の修復度がいかなる違いを示すかを確めることにより、ホスファチジルセリンが皮膚バリア機能の修復強化に及ぼす効果を調べてみるために行われた。
【００６６】
まず、試験物質としてはホスファチジルセリン（ＤＳ−ＰＳ９５、斗山）を４００ｍｇ／１００ｍｌの濃度にて３次蒸留水に分散させた溶液を用いた。また、生後８−１２週齢の無毛誘導マウス（ＪａｐａｎＳＬＣ Ｉｎｃ.（静岡、日本））１０匹のうち５匹には前記溶液をマウス一匹当たりホスファチジルセリンの摂取量が毎日１回につき０．８ｍｇになるように経口投与し、他の５匹には３次蒸留水を経口投与した。このとき、服用期間は合計３週間であった。その後、これらの無毛誘導マウスの背両側の水分蒸発量をＴＥＷＬ装置［ＴＥＷＬＡＭＥＴＥＲ、ＴＷ２１０、ドイツ］を用いて測定した後（正常皮膚約１０±２ｇ／ｈｍ２）、同じ位置に接着テープを貼り付けてから外し、さらに貼り付けることを１５−２０回程度水分蒸発量が４０−５０ｇ／ｈｍ２程度に達するまで繰り返し行った。その後、それぞれ損傷前、損傷直後、６時間後、９時間後、２４時間後の時間経過により（すなわち、損傷前、損傷直後、６時間経過後、９時間経過後、２４時間経過後）水分の蒸発量を測定して、皮膚バリアの修復の程度を確認し、その結果を図９に示す。
【００６７】
図９から明らかなように、ホスファチジルセリンを服用したマウスはホスファチジルセリンを服用しなかったマウスと比較した場合、皮膚バリア機能の修復率が一層高かった。これより、ホスファチジルセリンが皮膚バリア機能を強める効果を示すということが分かった。
【００６８】
＜実施例１０：ホスファチジルセリンによるコラーゲン前駆体および基質金属蛋白質の分解酵素の発現の測定＞
本発明のホスファチジルセリンの皮膚老化の抑制能を確めるためにコラーゲン前駆物および基質金属蛋白質の分解酵素（Matrix metaloprotease；ＭＭＰ）の発現量を定量した。定量法として電気泳動による蛋白質−抗体反応法を試み、その方法により線維芽細胞（ソウル大学、寄贈）に紫外線を当てる場合とそうではない場合に分けて培養した後、ホスファチジルセリンを処理（２０ｕＭ）して細胞を得、蛋白質部分を抽出してＳＤＳにより溶解した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上において電気泳動を行った。次いで、電気泳動を終えたゲル内の蛋白質をニトロセルロース紙に移した後、コラーゲン前駆物およびＭＭＰ−１（コラゲナーゼ；コラーゲンの分解酵素）の抗体として反応し、発色させて該当蛋白質の量を測定した。
【００６９】
その結果、図１０に示すように、ホスファチジルセリンは紫外線の照射や未照射を問わずに、コラーゲン前駆物質を増大させ、ＭＭＰ−１の発現量を減らすということを確認した。これより、ホスファチジルセリンは皮膚の老化抑制の機能を有していることを確認した。
【００７０】
下記に前記組成物の製剤例を挙げるが、本発明はこれらに限定されるものではなく、単に本発明を具体的に説明するためのものである。
【００７１】
（製剤例１．石鹸の製造）
ホスファチジルセリン          １．００（％）
油脂                          適量
水酸化ナトリウム              適量
塩化ナトリウム                適量
香料                          小量
精製水                              残量
合計                          １００
上記の配合比によって石鹸を製造した。
【００７２】
（製剤例２．ローションの製造）
ホスファチジルセリン                            ３.００（％）
Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩    １．００
水溶性コラーゲン（１％水溶液）                  １．００
クエン酸ナトリウム                              ０．１０
クエン酸                                        ０．０５
甘草エキス                                      ０．２０
１,３−ブチレングリコール                       ３．００
油脂                                            ２．００
セリン                                          １．００
精製水                                          残量
合計                                            １００
上記の配合比（％）によりローションを製造した。
【００７３】
（製剤例３．クリームの製造）
ホスファチジルセリン                            １．００（％）
ポリエチレングリコールモノステアレート          ２．００
自己乳化型モノステアル酸グリセリン              ５．００
セチルアルコール                                ４．００
スクアレン                                      ６．００
トリ２−エチルヘキサングリセリル                ６．００
スフィンゴ糖脂質                                １．００
１．３−ブチレングリコール                      ７．００
ビタミンＣ                                      １．００
精製水                                          残量
合計                                            １００
上記の配合比（％）によりクリームを製造した。
【００７４】
（製剤例４．パックの製造）
ホスファチジルセリン                            ５．００（％）
ポリビニールアルコール                          １３．００
Ｌ−アスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩    １．００
ラウロイリヒドロキシプロリン                    １．００
水溶性コラーゲン（１％水溶液）                  ２．００
１,３−ブチレングリコール                       ３．００
エタノール                                      ５．００
セリン                                          １．００
精製水                                          残量
合計                                            １００
上記の配合比（％）によりパックを製造した。
【００７５】
（製剤例５．美容液の製造）
ホスファチジルセリン                            ２．００（％）
ヒドロキシエチレンセルロース（２％水溶液）      １２．００
キサンタンガム（２％水溶液）                    ２．００
１,３−ブチレングリコール                       ６．００
濃いグリセリン                                  ４．００
ヒアルロン酸ナトリウム（１％水溶液）            ５．００
油脂                                            ２．００
セリン                                          １．００
ビタミンＣ                                      １．００
精製水                                          残量
合計                                            １００
上記の配合比（％）により美容液を製造した。
【００７６】
（製剤例６．パウダーの製造）
ホスファチジルセリン                            １００ｍｇ
乳糖                                            １００ｍｇ
タルク                                          １０ｍｇ
油脂                                            ５ｍｇ
上記の成分を混合して気密布に詰め、パウダーを製造する。
【００７７】
（製剤例７．錠剤の製造）
ホスファチジルセリン                            ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉                                １００ｍｇ
乳糖                                            １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                        ２ｍｇ
ビタミンＣ                                      ５０ｍｇ
上記の成分を混合した後、通常の精製の製造方法に従い打錠して錠剤を製造する。
【００７８】
（製剤例８．カプセル剤の製造）
ホスファチジルセリン                      ５０ｍｇ
トウモロコシ澱粉                          １００ｍｇ
乳糖                                      １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                  ２ｍｇ
ビタミンＣ                                ５０ｍｇ
セリン                                    ５０ｍｇ
通常のカプセル剤の製造方法に従い前記の成分を混合してゼラチンカプセルに詰め、カプセル剤を製造する。
【００７９】
（製剤例９．注射剤の製造）
ホスファチジルセリン                            ５０ｍｇ
注射用の滅菌蒸留水                              適量
ｐＨ調節剤                                      適量
通常の注射剤の製造方法に従い１アンプル当たり（２ｍｌ）上記の成分含有量にて製造する。
【００８０】
（製剤例１０．液剤の製造）
ホスファチジルセリン                      １００ｍｇ
異性化糖                                  １０ｇ
マンニトール                              ５ｇ
ビタミンＣ                                ５０ｍｇ
セリン                                    ５０ｍｇ
油脂                                      適量
精製水                                    適量
通常の液剤の製造方法に従い精製水にそれぞれの成分を加えて溶解させ、レモンの香りを適量加えた後、前記の成分を混合した。次いで、ここに精製水を加えて、全体を１００ｍｌに調節した後、茶色の瓶に詰め、滅菌して液剤を製造した。
【００８１】
（製剤例１１．健康食品の製造）
ホスファチジルセリン                      １０００ｍｇ
ビタミン混合物
ビタミンＡアセテート                ７０μｇ
ビタミンＥ                          １．０ｍｇ
ビタミンＢ１                              ０．１３ｍｇ
ビタミンＢ２                              ０．１５ｍｇ
ビタミンＢ６                              ０．５ｍｇ
ビタミンＢ１２                      ０．２μｇ
ビタミンＣ                          １０ｍｇ
ビオチン                            １０μｇ
ニコチン酸                          １．７ｍｇ
葉酸                                ５０μｇ
パントテン酸                        ０．５ｍｇ
無機質混合物
硫酸第１鉄                          １．７５ｍｇ
酸化亜鉛                            ０．８２ｍｇ
炭酸マグネシウム                    ２５．３ｍｇ
第１リン酸カリウム                  １５ｍｇ
第２リン酸カルシウム                ５５ｍｇ
クエン酸カリウム                    ９０ｍｇ
炭酸カルシウム                      １００ｍｇ
塩化マグネシウム                    ２４．８ｍｇ
上記のビタミンおよびミネラル混合物の組成比は、比較的に健康食品に適した成分を好ましい実施例により混合して求めたが、その配合比を任意に変えても構わない。なお、通常の健康食品の製造方法に従い上記の成分を混合した後、顆粒を製造し、通常の方法に従い健康食品の組成物の製造に用いても良い。
【００８２】
（製剤例１２．健康飲み物の製造）
ホスファチジルセリン                      １０００ｍｇ
クエン酸                                  １０００ｍｇ
オリゴ糖                                  １００ｇ
梅の実の濃縮液                            ２ｇ
タウリン                                  １ｇ
精製水                                    残量
――――――――――――――――――――――――――――――
合計                                      ９００ｍｌ
通常の健康飲み物の製造方法に従い前記の成分を混合した後、約１時間中に８５℃において撹はん加熱した後、得られた溶液をろ過して、滅菌された２ｌの容器に取り、密封滅菌した。次いで、冷蔵保管した後、本発明の健康飲み物の組成物の製造に用いる。
上記においては、比較的に嗜好飲料に適した実施例に基づいて各成分を混合したが、需要階層や需要国、使用用途など地域的、民族的な嗜好度に応じてその配合比を任意に変えても構わない。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
以上述べたように、本発明に係るホスファチジルセリンを含有する組成物は、ホスファチジルセリンが皮膚内の組織細胞のＰＰＡＲαを活性化させて皮膚の外部刺激による皮膚の炎症反応を抑制・緩和し、皮膚のバリア機能を強化して皮膚バリア機能が弱いアトピー性皮膚を治療・改善する他、皮膚内の組織細胞のＰＰＡＲαを活性化させて皮膚角質細胞の分化を促進し、紫外線あるいは活性酸素種から皮膚角質細胞を保護して皮膚の分化を促進・保護し、さらに、紫外線による皮膚老化及びシワを防止・改善する効果がある。よって、このような組成物を用いることにより、紫外線または化学物質などの皮膚の外部刺激による損傷から皮膚を保護・改善し、皮膚バリア機能を堅牢化させて全体としての皮膚の状態を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】ホスファチジルセリンの紫外線の照射による皮膚刺激（炎症反応）の抑制効果を測定した結果を示す。
【図２】ホスファチジルセリンのＴＰＡによる皮膚刺激（炎症反応）の緩和効果を測定した結果を示す。
【図３】ホスファチジルセリンの紫外線の照射による皮膚角質細胞の損傷緩和及び炎症反応の緩和効果を測定した結果を示すグラフ。
【図４】ホスファチジルセリンの紫外線損傷に対する皮膚角質細胞の保護効果を測定した結果を示すグラフ。
【図５】ホスファチジルセリンの皮膚角質細胞における分化の促進効果を測定した結果を示す。
【図６】ホスファチジルセリンのマウスにおける皮膚の分化の促進効果を測定した結果を示す。
【図７】ホスファチジルセリンのＰＰＡＲαの活性化効果を証明した結果を示すグラフ。
【図８】ホスファチジルセリンの皮膚角質細胞における活性酸素種（Reactive Oxygen Species；ＲＯＳ）からの皮膚角質細胞の保護効果を測定した結果を示すグラフ。
【図９】ホスファチジルセリンの経口投与を通じて皮膚バリア機能を強化する効果を証明する実験の結果であり、ホスファチジルセリンを３週間服用しなかったマウスと、３週間服用したマウスに対して皮膚の皮脂膜を損傷させた後、経時によるＴＥＷＬ（Transepidermal water loss）の修復率を示すグラフ。
【図１０】ホスファチジルセリンによるコラーゲン前駆体および基質金属蛋白質の分解酵素の発現を測定した結果を示す。
【図３】
2007522259.tif 000003
【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
2007522259.tif 000010
【図６】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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2007522259.tif 000014