(57)【要約】高分子上の結合部位を同定するための方法が、提供される。この方法は、（ａ）少なくとも１つの有機フラグメント（「ＯＲＦ」）に関して、パラメータＢの別個の値において、そのＯＲＦを、挿入された溶媒として使用する化学ポテンシャル計算の２回以上のシミュレーテッドアニーリングを実行する工程；および（ｂ）工程（ａ）からの収束解を比較して、その関連するＯＲＦが強力に結合される第一の位置を同定し、それによって、リガンド分子に結合するための候補部位を同定する工程；を包含する。好ましい一局面において、この方法は、（ｃ）ＯＲＦに強力に結合する部位のクラスターを同定する工程、をさらに包含する。好ましい別の局面において、この方法は、（ｄ）工程（ａ）および工程（ｂ）を、２つ以上のＯＲＦのうちの各々について実行し、２つ以上の別個のＯＲＦが結合するクラスターを同定する工程、をさらに包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子と複数の有機フラグメントの間の相互作用をモデリングするための
コンピュータに実装された方法であって、
（ａ）該高分子上の接触可能部位において該複数の有機フラグメントを位置付ける工程；および
（ｂ）該高分子上の接触可能部位の各々において各々のフラグメントの位置空間をサンプリングする工程；
を包含し、ここで、工程（ｂ）が、複数の化学ポテンシャル値で実施される、
方法。
【請求項２】
前記サンプリングする工程が、メトロポリスサンプリング基準を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプリングする工程が、グランドカノニカルアンサンブル確率密度関数を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高分子の接触可能部位が、フラグメントを適合させるのに十分な体積を有する、外部部位、内部部位およびバルク部位として規定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
接触可能なサンプリング部位の座標が、グリッドを前記高分子についての溶媒和した結晶構造体に重ね合わせることによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記グリッドが、約１／２Å〜約１Åの間隔を有している、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記グリッドの間隔が、前記フラグメントの最小断面積よりも小さい、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
グリッドの交差点によって、サンプリング部位の候補が規定される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記グリッドが交差しない点が、サンプリング部位の候補を規定する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記化学ポテンシャルが連続的に減少するに従い、前記有機フラグメントが、相転移を受け、ここで、該相転移を受ける際に、主要な有機フラグメントが前記高分子における接触部位から取り除かれ、該相転移の後に、該有機フラグメントが、該高分子上の可能なリガンド結合部位を占める、方法。
【請求項１１】
前記高分子のリガンド結合部位を決定するコンピュータに実装された方法であって、該方法は、
（ａ）複数の型の有機フラグメントについて請求項１０にしたがって複数のシミュレーションを実施する工程であって、可能なリガンド結合部位を、フラグメントのクラスターが結合するその高分子の部位として規定する、工程；
および／または
（ｂ）水分子が結合する高分子部位を同定して、リガンド結合部位としてそれらの部位を排除する工程；
を包含し、水分子結合部位を排除した残りの部位がリガンド結合部位である、方法。
【請求項１２】
リガンドを設計するためのコンピュータに実装された方法であって、
（ａ）請求項１１で同定される前記リガンド結合部位において結合するフラグメントを同定する工程；および
（ｂ）立体的かつ化学的に適合性のある（ａ）におけるそれらのフラグメントを結びつける工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記有機フラグメントが、アセトン、アルデヒド、アミド、アンモニア、ベンゼン、カルボン酸、１，４−ジアジン、エステル、エーテル、ホルムアルデヒド、フラン、イミダゾール、メタノール、リン酸（ｐｈｏｓｈｏ−ａｃｉｄ）、ピリジン、ピリミジン、ピロール、チオール、およびチオフェンからなる群より選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質上の結合部位を同定するための方法、タンパク質を結合するために適切な種類（クラス）の化合物を同定するための方法、およびタンパク質と相互作用して生物学的プロセスに影響を与える化合物を同定するための実験を実行するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質構造の決定は、目的とするタンパク質の結晶を単離すること、およびＸ線結晶学によって構造を分析することによって、現在まで実行されている。代表的には、そのタンパク質は、重金属成分とともに共結晶化されているか、またはその重金属成分との多数回の共結晶化に供されて、結晶学的データを解析するための基準を提供する。
タンパク質構造の決定または重要な三次構造を有する別の高分子（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）の構造の決定に関して、研究者らは、しばしば、生物学的プロセスにとって重要であるかまたは重要であり得る結合部位（例えば、酵素活性部位、または別の高分子もしくはそれ自体と相互作用するための部位）を同定することを探求する。コンピュータによる試みは、公知の結合因子と良好に適合することが見出される分子表面をサンプリングする試みに焦点が合わされている。これらの方法は、僅かな成功しか収めておらず、（ａ）良好な結合因子の構造についての知識、そしてしばしば（ｂ）そのタンパク質の機能についての知識に、依存する。さらに従来型のアプローチでは、結合物質を上記の高分子とともに共結晶化して結合部位を同定することを探求している。上記の結合部位が同定されると、その部位に結合し得る新規分子に関して、知見に基づいた推測がなされ得る。これらの知識に基づいた推測は、新規分子を生成および試験するための合成方法（コンビナトリアル化学方法を含む）を導き得る。そのような予期される結合因子が、有効な結合因子であると証明され、そしてまたことによると、適切な生物学的モデルにおいて有効であると見出された場合には、それらの結果から得られる構造的相関は、その結合部位に関する情報と関連付けられて、生物学的機能にとって重要な構造に関するなおさらなる推測を生じ得る。この共結晶化アプローチは、活性因子についての初期の知識に依存し、このアプローチは、実験上困難でありかつ時間がかかる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明者らは、高分子の三次元構造解析から、分子に関する結合部位を同定するための方法を見出した。この方法の基礎として使用される構造解析は、結晶学、分光分析（例えば、ＮＭＲ）、計算機による導出、または高分子構造を決定するための他の任意の方法から、誘導され得る。この方法は、その高分子の機能に関する情報を必要とせず、代表的には使用することもない。なぜなら、この方法は、主観的偏見を回避し、代わりに、純粋に物理的パラメータに依存するからである。さらに、この方法は、精緻化され得て、結合部位についての可能な選択肢をさらに狭め得、そして上記結合部位と有効に相互作用する官能基（すなわち、有機フラグメント、すなわち「ＯＲＦ」）を同定し得る。ＯＲＦに関して得られたデータは、候補結合因子中で有用な官能基の配向をさらに同定し、それによって、候補結合因子を同定するために化学物質データベースを探索（サーチ）するためのツールを提供する。本明細書中に記載される方法が、１個よりも多い潜在的結合因子を同定する場合、これらの方法を通じて生成されたデータが使用され得、それらの結合因子を精力的にランク付けし得、それによって、より強力に分子に結合する能力をどの部位が有するかを定量的に決定し得る。
【０００４】
本明細書中に記載されるコンピュータによる方法は、従来の方法により生成されるデータを編集することによって生成されるマップとほぼ同一である、結合部位優先度のマップを生成するが、１つ重要な違いを有する。その違いは、それらの実験的に生成されたデータは、生成するために多くの年月を費やしたが、一方、本明細書中に記載されるようにして生成されるデータは、数週間以下で生成され得る。本発明は、生物学的高分子に結合してその高分子の機能に影響を与える因子の特徴を予測するための、偏見のないシミュレーション方法における重要な発展を提供する。
【０００５】
（発明の要旨）
一実施形態において、高分子上の結合部位を同定するための方法が、提供される。この方法は、（ａ）少なくとも１つの有機フラグメント（「ＯＲＦ」）に関して、パラメータＢの別個の値において、そのＯＲＦを、挿入された溶媒として使用する化学ポテンシャル計算の２回以上のシミュレーテッドアニーリングを実行する工程；および（ｂ）工程（ａ）からの収束解を比較して、その関連するＯＲＦが強力に結合される第一の位置を同定し、それによって、リガンド分子に結合するための候補部位を同定する工程；を包含する。好ましい一局面において、この方法は、（ｃ）ＯＲＦに強力に結合する部位のクラスターを同定する工程、をさらに包含する。好ましい別の局面において、この方法は、（ｄ）工程（ａ）および工程（ｂ）を、２つ以上のＯＲＦのうちの各々について実行し、２つ以上の別個のＯＲＦが結合するクラスターを同定する工程、をさらに包含する。好ましくは、３つ以上の別個のＯＲＦに結合するクラスターが、同定される。この方法は、クラスターの近傍における結合の厳密度を低減して、生物活性因子の結合に寄与する元素をさらに同定することによって、生物活性因子の結合に寄与するさらなる官能基を同定し得る。
【０００６】
別の好ましい局面において、この方法は、（ｅ）化学ポテンシャル尺度の別個の値において、水を、挿入された溶媒として使用する化学ポテンシャル計算の２回以上のシミュレーテッドアニーリングを実行する工程；（ｆ）工程（ｃ）からの収束解を比較して、水が強力に結合される位置を同定し、それによって、そのタンパク質上における、リガンド分子を結合するための候補部位ではない位置を同定する工程；および（ｆ）水の位置ではない第一の位置を同定する工程；をさらに包含する。
なお別の好ましい局面において、上記の化学ポテンシャル計算のシミュレーテッドアニーリングは、複数のサンプリング工程を包含し、その多数のサンプリング工程において、上記ＯＲＦの位置は、少量だけ変化され、生じる新たな位置は、企図された変化の結果としてのエネルギー変化に基づいて、許容されるかまたは棄却される。
さらに、高分子に結合する化合物の化学的特徴を同定するための方法が、提供される。この方法は、上記で概説された結合部位同定方法に従ってクラスター中で見出されるＯＲＦの官能基および相対的配向を調べる工程を包含する。
また、高分子と相互作用する化合物を同定するためにコンビナトリアル化学を実行するための方法が、提供される。この方法は、（ａ）上記される高分子の結合部位同定方法に従ってクラスター中で見出されるＯＲＦの官能基によってモデリングされる種類の反応物質を同定する工程；（ｂ）工程（ａ）において同定される種類のうちの少なくとも２つの試薬と反応する２つ以上の合成手順を必要とする、コンビナトリアル合成プロトコルを設計する工程；および（ｃ）そのコンビナトリアル合成プロトコルを実行して、候補結合分子を作製する工程；を包含する。
【０００７】
さらに、生物活性因子発見プロセスを実行する方法が、提供される。この方法は、（ａ）確立された一群のコンビナトリアル合成プロトコルまたは化合物コレクションまたは化合物プールから、上記の高分子の結合部位同定方法から同定される高分子選択基準を満たす化合物を高密度で提供する、上記の群のメンバーを同定する工程；および（ｂ）結合アッセイまたは機能アッセイを実行して、上記高分子に結合するかまたはその高分子の機能に影響を与える化合物（上記で同定されたコレクションまたはプロトコルから得られる）を同定する工程；を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（用語集）
以下の用語は、本願の目的で、以下に記載される代表的な意味を有する。
【０００９】
「生物活性因子」とは、細胞、ウイルス、器官または生物に対して作用して、その細胞、ウイルス、器官または生物の機能の変化を生じ得る、化学物質のような物質をいい、薬物（すなわち、医薬品）が挙げられるが、これに限定されない。本発明の好ましい実施形態において、本発明の生物活性因子を同定するための方法は、約６００以下の分子量を有する有機分子、またはポリマー種（例えば、ペプチド、タンパク質、核酸、プロテオグリカンなど）に適用される。生物活性因子は、医薬品（すなわち、動物、好ましくはヒトの治療において使用される物質）であり得る。
【００１０】
「フリーグリッド点のクラスタ」とは、ＯＲＦがクラスタに挿入され得るのに妥当である確率を可能にするのに十分な数の、近接または隣接するフリーグリッド点が存在するという点で、所定のＯＲＦに対して「クラスタ」内にあるフリーグリッド点のことをいう。従って、全ての適切な体積がシミュレーションプロセスにおいてサンプリングされることを保証するために必要とされるので、選択基準は、Ｈ２Ｏを受け入れないいくらかの体積を、誤って同定するが、Ｈ２Ｏに対するフリーグリッド点のクラスタは、Ｈ２Ｏを受け入れ得る高分子の表面または内部の全ての体積を同定するように、規定されなければならない。フリーグリッド点のクラスタは、ＯＲＦの大きさ（例えば、Ｈ２Ｏとベンゼンとを比較のこと）およびグリッドの間隔に依存して異なるように規定されている。
【００１１】
「ＯＦＲ結合部位のクラスタ」とは、代表的に、さらなる考慮に値するために十分な親和性でＯＲＦを結合する、近くに位置する部位または重なる位置のパターンをいう。
【００１２】
「化合物のコレクション」とは、（例えば、直接的に測定されるか、または生物学的活性の代用（例えば、例えば、高分子への結合または高分子の機能の妨害）を介して測定される生物学的活性を有する）生物活性因子を同定するために試験され得ることを意図して収集または組織化された化合物の任意のコレクションをいう。このコレクションは、単純な分子（これは、支持体に結合し得る）のコレクションから、多様な化学物質の生成のために設計された化学スキームによって、調製され得る。この後者の型のコレクションは、しばしば、「コンビナトリアルライブラリー」と称される。
【００１３】
「フリーグリッド点」とは、所定の認容された原子半径の定義について、グリッド点が、関連する高分子のマッピングされた原子の原子半径内に入らないという意味で「フリー」であるグリッド点（これらは、以下で議論される）をいう。
【００１４】
「高分子」とは、時間で平均された三次構造を有する、分子または分子のコレクションをいう。従って、この用語は、代表的に、タンパク質、リボ核酸、核酸とタンパク質との両方から形成される構造体、炭水化物、上記のものの２つ以上から形成される構造体などをいうが、この用語はまた、他の分子（脂質が挙げられる）で形成された構造体をいい得る。高分子は、本明細書中に記載される方法において、それらの三次構造のマップを参照して使用される。このようなマップは、代表的に、Ｘ線回折研究によって作成され、この研究は、何千もの高分子のマップを作成した。しかし、マップは、他の方法（例えば、計算機による方法、または他のデータ（例えば、ＮＭＲデータ）により補完された計算機による方法）によって、作成され得る。計算機による方法は、利用において困難があったが、最近の研究では、いくらかの成功が達成されているようである。
【００１５】
「有機フラグメント」または「ＯＲＦ」とは、高分子との１つ以上の相互作用の様式（例えば、カルボニル、ヒドロキシル、アミド、炭化水素などの相互作用）をモデリングするために使用され得る、分子または分子フラグメントである。
【００１６】
「水の位置」とは、水が強く結合している位置であり、１つの実施形態において、この「水の位置」は、例えば、水分子が高分子によって強く影響を受けていることを示す転移点についてのＢ値以下であるＢ値においてシミュレーションが実施される場合に、水が結合したままであることをこのシミュレーションによって示される位置を意味する。図７には、Ｂ値（以下でさらに記載されるパラメータ）が次第に減少して、シミュレートした結合水分子の滴定の概念化が図示される。転移点とは、高分子によって強く影響を受けている水分子を示す。転移点の値以下のＢ値は、図中の点ＳＢによって示されるような、別の分子による競合的結合を起こりにくくするために十分な強度の水の結合を規定するように、指定され得る。代表的には、水溶性タンパク質について、この点ＳＢは、約１００〜約５０個の水分子が５０ｋｄのタンパク質に結合したままであるように選択される。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明のシミュレーションプロセスは、所定のＯＲＦを、高分子構造の表面または内部の、このようなＯＲＦが実際的な問題として存在する全ての部位に、偏らない（バイアスのない）サンプリングにおいて人工的に挿入することによって、機能する。これらの部位は、「サンプリング部位」と称され得る。代表的に、多数のＯＲＦの各々についてのシミュレーションのスケジュールが実施され、各シミュレーションは、別個の値のパラメータＢにおいて実施され、このパラメータＢは、過剰化学ポテンシャルに関連する。このスケジュールは、多数のＢ値の各々（代表的に、１０〜約−１５の範囲）において実施されるシミュレーションを提供する。所定のＢ値における各シミュレーションにおいて、このシミュレーションは、シミュレーションの各工程において、所定の部位におけるＯＲＦの挿入が認容されるか棄却されるかを、グランドカノニカルアンサンブル確率密度関数に基づく評価を用いて、評価する。シミュレーションの各工程において、このアルゴリズムは、その部位におけるＯＲＦの挿入をモデリングする。バイアスを強制的にかけたカノニカル確率密度関数は、小さいステップ（例えば、±０．２Å、±３０°）でＯＲＦを、並進および回転させて、シミュレーション工程の時点で適切なシミュレーションパラメータを考慮して、エネルギーが最小の挿入を同定するために使用される。次いで、挿入の確率が、グランドカノニカルアンサンブル確率密度関数から決定され、そしてＯＲＦが、その確率値に対して重み付けされたランダム数発生プロトコルによって、その部位に存在することが表現され得る。この表現を行うために選択するための代替的な方法（例えば、挿入を表現する場合または表現しない場合についてのカットオフ値の適用）もまた、適用され得るが、さほど好ましくない。代表的に、首尾よい挿入に続いて、引き続く削除の試みは、その部位において、先に同定された、並進および回転されたＯＲＦを用い、そしてこの並進および回転されたＯＲＦは、削除の試みが成功するまで使用される。このシミュレーションは、代表的に、多数のステップ（例えば、２×１０６ステップ）について実施され、そのステップの大部分（例えば、１．５×１０６）は、認容された挿入の数が、平均して、削除の数と等しくなるように、このシミュレーションを「平衡化」するために必要とされる。
【００１８】
バイアスがかかっていない多くのサンプリングを、シミュレーションの後の過程にわたって、各サンプリング部位において行うことによって、例えば、平衡が達成された後の２００ステップのイテレーションごとの挿入後に、そのサンプリング部位において、所定のＢの値で存在するＯＲＦの占有確率が、評価され得る。次いで、この占有は、この方法の全体的な結果として、その確率に基づいて、例えば、その確率に基づいた表現を行う乱数プロトコルを用いて決定され得る。ＯＲＦが並進または回転された範囲もまた、このような並進および回転の確率に基づいて、表現され得る。
【００１９】
各ＯＲＦに対して、シミュレーションが、過剰化学ポテンシャル（例えば、Ｂ）の多くの基準値の各々において、実行される。従って、この値が低くなるときに、所定のサンプリング部位におけるＯＲＦの保持されることは、相対結合親和性が高いということの指標である。
【００２０】
これらのサンプリング部位は、代表的には、図１に例示されるようなグリッドを作成することによって、達成される。図１は、グリッドが重ねられた（図１Ｂ）、解かれた結晶構造（図１Ａ）を図示する。例えば、このグリッドは、約１／２Åから約１Åの間隔を有し得、このグリッドの交差点は、サンプリング部位の候補を規定する。このグリッドの間隔は、好ましくは、ＯＲＦの最小の断面より小さくなるように選択される。この間隔は、代表的に、ＯＲＦの大きさに関して十分に小さくなるように選択され、その結果、フリーグリッド点クラスタを規定する自由体積が有用なサンプリングを可能にするのに十分なフリーグリッド点を有する確率が以下に示すようになる。このような比較的小さい間隔は、どのようにグリッドを配向するかという選択が、特定のＯＲＦ結合優先度を同定することに対してそのアルゴリズムを偏らせる機会を最小にする。サンプリング部位は、高分子によって占有されていない部位から選択される（図１Ｂ）。「グリッドにおけるバイアス（偏り）」を最終的な排除は、試験挿入点を、以下に記載されるように、グリッド点における厳密な初期挿入から離して変化させることによって、達成される。
【００２１】
これらのサンプリング部位は、ＯＲＦが挿入されることを可能にする、高分子がない十分な隣接体積を有する部位に限定される。例えば、サンプリング部位は、少なくとも約２Å×２Å×２Å（＝８Å３、すなわち０．００８ｎｍ３）。または約２．５Å×２．５Å×２．５Å（＝１５．６Å３、すなわち０．０１５６ｎｍ３）、あるいは水については、２．８Å×２．８Å×２．８Åの空いている領域内のグリッド点に限定され得る。これらのグリッド点は、ＯＲＦの大きさおよびグリッドの間隔に依存して、フリーグリッドポイントのクラスタ（例えば、３個、４個、５個、６個、７個、８個、またはそれより多くのフリーグリッド点のクラスタ））の内部にあるフリーグリッド点について選択され得る。
【００２２】
１つの好ましい実施形態において、ＯＲＦは、必ずしも、最初にそのグリッド点に正確に挿入されず、そのグリッド点から近距離にある挿入点（例えば、そのグリッド点を中心とし、そしてそのグリッド間隔のおよそ数パーセント（例えば、１０％）の直径を有する球形状の内部、あるいは、グリッド点を中心として、およそ、そのグリッド間距離の数パーセントの幅、長さおよび高さを有する、箱形状の内部点）のランダムなサンプリングで挿入される。上で議論されたように、初期の挿入点におけるこの「ゆらぎ」によって、グリッドの配置により所定の空いている体積が効率的にサンプリングされる機会を減少させるてしまうグリッドにおけるバイアス（偏り）が取り除かれる。
【００２３】
エラスターゼの結晶学的解（具体的には、Ｂｒａｎｄｅｉｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＧ．Ａ．Ｐｅｔｓｋｏにより解かれたブタパンクリアーゼエラスターゼの構造）を使用して、この方法は、メタノールをＯＲＦとして使用して、例示され得る。図２Ａは、比較的高いＢ値（例えば、Ｂ＝１０）を使用した、最終解を示す。図２Ｂは、中程度の値（例えば、Ｂ＝６または７）を使用した、最終解を示す。図２Ｃは、より低い中程度の値（例えば、Ｂ＝０または−２または−４）を使用した、最終解を示す。図２Ｄは、限定的な値（例えば、Ｂ＝−１４）を使用した、最終解を示す。図示されるように、Ｂの値が低いほど、結合しているメタノール分子は少なくなる。これらの残っているメタノールフラグメントは、比較的高い親和性で結合するメタノールを示す。
【００２４】
このプロセスの次の工程は、さらなるＯＲＦを用いてシミュレーションを実行すること、および比較的高い親和性のＯＲＦ結合部位のクラスタを同定することである。従って、例えば、再度エラスターゼを使用して、シミュレーションが実施され、アンモニア、メタノール、ケトンおよびアミンに関して、ＯＲＦについての結合が決定され得る。比較的低いＢ値における組み合わせた結果が、図３Ａに図示される。ＯＲＦ結合部位のクラスタが、図３Ｂに図示される。本発明の方法は、ＯＲＦ結合部位のクラスタを同定することを求め、ここで、このクラスタは、１つのみの型のＯＲＦから構成され得る。しかし、好ましくは、クラスタは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、またはそれより多くの異なるＯＲＦについての結合部位を含む。
【００２５】
有用なＯＲＦの例としては、以下が挙げられる：
【００２６】
【表１】
2007536618.tif 000002
【００２７】
【表２】
2007536618.tif 000003
【００２８】
好ましくは、選択されるＯＲＦは、薬剤または他の生理活性化学物質の設計において有用であることが分かっている、化学的特徴の例である。
【００２９】
従って、分析の第１のモードにおいて、プロセスの重要な部分は、数個のＯＲＦを用いてシミュレーションを実行し、比較的高い親和性で複数のＯＲＦに結合する部位のクラスタを同定することである。これらのクラスタは、リガンド結合部位についての強力な候補部位である。さらに、ＯＲＦの相対的な位置付けは、良好な結合因子の特徴の指標である。例えば、以下に記載される方法によってエラスターゼ上で同定された結合部位において、２つのベンゼン環を有し、その間にアミドが挿入されたクラスタは、大規模調査プログラムに由来する最も強力なエラスターゼインヒビターのいくつかのモデルとなる。このインヒビターは、シミュレーションの炭素ベースのアミドの位置にスルホンアミドを有する。Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１４：１２７−１９４（１９９４）の表ＸＸＩＩＩおよびＸＸＶを参照のこと。
【００３０】
本発明の実装のいくつかにおいて、ＯＲＦ結合部位のクラスタのみで、リガンドが所定のタンパク質と相互作用する部位についての選択範囲を同定、または実質的に狭める。しかし、本発明のいくつかの実施形態において、水に強力に結合する部位が同定され、そして、強力な水結合部位と相互作用するクラスタが差し引かれる。従って、エラスターゼの例において、図３Ｂの候補リガンド結合部位は、図３Ｃに例示されるように、水結合部位を除くことによって狭められる。分析が、図３Ｄに例示されるように、５つのＯＲＦまで拡張される場合、単一の候補部位が残る。図３Ｅは、図３Ｄに例示されるのと同じ部位の、わずかに異なる斜視図を示す。この図では、６つのＯＲＦまで分析が拡張されている。図３Ｆは、候補部位（左パネル）が、いかに十分に、リガンドのトリフルオロアセチル−リシル−プロピル−ｐ−イソプロピルアニリドを含む共結晶の構造と一致するかを示す。
【００３１】
従って、分析の第２のモードにおいて、プロセスの任意の工程は、比較的強い水結合部位と相互作用するＯＲＦクラスタを除くことにより、リガンド結合部位についての選択を狭めることである。
【００３２】
ＯＲＦのクラスタは、代表的に、比較的低いＢ値において同定され、それにより、リガンドについての予測される結合部位を同定することを助けることに注意すべきである。しかし、予測される結合部位についての追加情報は、予測される結合部位の近傍に、より弱く結合するＯＲＦを調べることによって収集され得る。この情報値は、より弱く結合するＯＲＦの予測から生じ、リガンド相互作用をモデリングし、これは、単離の際には弱いが、全体として生体活性因子のリガンド結合親和性への実際の寄与をモデリングする。図４Ａには、エラスターゼおよび公知のリガンドを用いる、６つの共結晶実験のデータから抽出された、アニリン結合部位が図示される。図４Ｂには、シミュレーションによって決定された、最も高い親和性のアミド結合部位のクラスタが図示される。図４Ｃには、図４ＢのアミドＯＲＦに加えて、このクラスタの近隣にあるが２番目に高い親和性値でのシミュレーションにおいて現れるアミドが図示される。図示されるように、隣接する低親和性のＯＲＦ結合部位を見ることによって、結果を拡張する、この最後の工程は、共結晶学的方法において見れる結果をより良好にモデリングすることを補助する。具体的には、クラスタ結果は、アミド結合部位の大部分が、結晶学的方法において見られる部位を同定するが、膨張は、アミドが実験的に位置決めされたエラスターゼにおける別の割れ目まで、結果を拡張する。さらに、この拡張によって、リガンド相互作用が見られる別の割れ目（他の図に図示されるような）の一部分が同定される。
【００３３】
従って、分析の第３のモードにおいて、分析の他のモードにより示されたリガンド結合部位の特徴は、ＯＲＦクラスタの近傍において、ストリンジェントの低いシミュレーション結果に目を向けることにより、拡張される。上記の例示は、１つの型のＯＲＦクラスタに焦点を当てたが、これは、多くの型のＯＲＦクラスタと適用可能であり、ここで、この拡張は、１つの型のＯＲＦまたは複数の型のＯＲＦに限定され得る。
【００３４】
図４Ａ〜４Ｃのデータは、重要な概念を例示する。実際のリガンド結合およびシミュレーションの両方において、所定の型の部分についての複数の有効結合位置および配向は、重なっていることが見出され得る。これは、複数の局所エネルギー最小値の存在を反映する。現実世界の作用において、結晶学的方法により得られる低温平均化ではなく、結合相互作用が、このような局所最小値の範囲を反映する。
【００３５】
図５Ａおよび５Ｂにおいて、エラスターゼインヒビターの共結晶を用いて得られる解が、本明細書中に記載される方法により得られたデータと比較される。図５Ａにおいて、６つの共結晶化インヒビターが示され、このインヒビター分子は、互いにオーバーレイされている（非空間充填表示、エラスターゼセグメントは、空間充填図により表示される）。これらのインヒビターは、トリフルオロアセチル−１−リシル−１−プロピル−ｐ−イソプロピルアニリド（結晶解析結果：Ｍａｔｔｏｓら、１９９４年４月３０日投稿）、トリフルオロアセチル−１−リシル−１−ロイシル−ｐ−イソプロピルアニリド（結晶解析結果：Ｍａｔｔｏｓら、１９９４年６月２２日投稿）、トリフルオロアセチル−１−フェニルアラニル−ｐ−イソプロピルアニリド（結晶解析結果：Ｍａｔｔｏｓら、１９９４年４月３０日投稿）、トリフルオロアセチル−１−フェニルアラニル−１−アラニル−ｐ−トリフルオロメチルアニリド（結晶解析結果：Ｍａｔｔｏｓら、１９９５年２月１４日投稿）、トリフルオロアセチル−１−バリル−１−アラニル−ｐ−トリフルオロメチルアニリド（結晶解析結果：Ｍａｔｔｏｓら、１９９５年２月１４日投稿）およびｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−アラニル−アラニル）−ｏ−（ｐ−ニトロベンゾイル）ヒドロキシルアミン（結晶解析結果：Ｄｉｎｇら、１９９５年７月１０日投稿）である。図５Ｂにおいて、そのそれぞれが高親和性のタンパク質結合状態にある、約１０のＯＲＦについての解が、オーバーレイされている。両方の方法が、芳香族部分の結合を好む領域を同定する。シミュレーションプロセスは、結晶学の結果と約９０％の三次元幾何学的な同一性を達成する。
【００３６】
図６Ａおよび６Ｂは、結晶学的方法のデータにより示される、リガンド結合に関与するエラスターゼの領域を示し（図６Ａ）、そして、本明細書中に記載されるコンピュータの方法から得られる解により示される、リガンド結合に関与するエラスターゼの領域を示す（図６Ｂ）。
【００３７】
本発明のシミュレーションは、モンテカルロアルゴリズムを利用する。本発明において有用なモンテカルロシミュレーションの形態は、Ｆｒｅｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔ，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ：  Ｆｒｏｍ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９６）に記載されている。本シミュレーション法は、以下を包含し得る：
・周期的セルにおいて数値表現体位置づける；
・そのセル内での高分子の位置を最適化する；
・その高分子内の全てのキャビティを、内部キャビティまたは表面キャビティであるか位置づける；
・これらのキャビティにおいて、ＯＲＦ（水を含む）を挿入するか、または消去する；
・グランドカノニカルアンサンブル確率密度関数を使用して、ＯＲＦの占有確率を計算する；
・化学ポテンシャルを変化させて、結合の相対自由エネルギーを得る；
この方法論、つまり、グランドカノニカルアンサンブルシミュレーションは、以下のように導入され得る：
（グランドカノニカルアンサンブルシミュレーション）
グランドカノニカルアンサンブルにおけるシミュレーションの際立った特徴は、そのシミュレーションの間に、その系における分子（ＯＲＦ）の数が変化するということである。換言すると、そのサンプリングは、所定の寸法のコンフィギュレーション空間に限定されることなく、コンフィギュレーション空間の集合に拡張される。これらの分子数を変化させ、その結果得られる質量が変化することを許容するという複雑性にもかかわらず、この質量が変化させることによって、そのシミュレーションを、計算上、非常に効率よいものとなったことを出願人らは、思いがけず発見した。その分子数の変化は、グランドカノニカル分配関数
【００３８】
【数１】
2007536618.tif 000004
【００３９】
が、異なる数（Ｎ）の分子のその対応するカノニカル分配関数Ｑの線形結合であり、つまり、以下：
【００４０】
【数２】
2007536618.tif 000005
【００４１】
であるこという事実に対応する。ここで、Ｔは、絶対温度であり、μは、化学ポテンシャルであり、ｋは、ボルツマン定数であり、そして、Ｑ（Ｔ，Ｖ，Ｎ）は、
以下：
【００４２】
【数３】
2007536618.tif 000006
【００４３】
によって、定義される。ｑは、分子分配関数である。
【００４４】
Ｎ個の分子（ＯＲＦ）のコンフィギュレーション空間のサンプリングは、メトロポリスモンテカルロ法を使用して実行可能であることが示された。ここで、そのサンプリング工程の各々において、分子（ＯＲＦ）の位置は、少量ずつ変化され、そして、その得られる新規のコンフォメーションは、変化の結果として期待されるそのエネルギー変化ΔＥに基づいて許容または棄却される。この位置の移動は、その好ましい位置づけを同定するためのＯＲＦの「揺動（シェイキング；ｓｈａｋｉｎｇ）」与えることとして考えられる。そして、この「揺動」方法論は、力の方向にバイアスが与えられ得、これは、付勢バイアスモンテカルロ（ｆｏｒｃｅｄ  ｂｉａｓ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ）と呼称され得る。この揺動が適用されると、このシミュレーションは、高い確率の方向性（ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｓ）を反映する。したが
って、
【００４５】
【数４】
2007536618.tif 000007
【００４６】
である。
【００４７】
その温度（シミュレーションの間は一定に保たれている）が、エネルギー変化のスケーリング係数としてその判定式（ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｆｏｒｍｕｌａ）に入っていることに留意のこと。
【００４８】
カノニカルアンサンブルメトロポリス法を、グランドカノニカルアンサンブルにおけるシミュレーションに一般化することは、分子（ＯＲＦ）の数が変化する工程を必要とする。操作上、存在する分子の消去または新たな分子の「生成」、挿入のいずれかを必要とする。消去された分子が、無作為に選択されると、その消去は、以下の確率；
【００４９】
【数５】
2007536618.tif 000008
【００５０】
を伴って許容されることが示された。
ここで、μ’は、過剰化学ポテンシャルであり、Ｎは、分子（ＯＲＦ）の数であり、＜Ｎ＞は、そのボルツマン平均であり、そして、Ｖは、その系の体積（これは、そのシミュレーションの間一定である）である。ランダムな位置に分子（ＯＲＦ）を挿入するこころみは、以下の確率；
【００５１】
【数６】
2007536618.tif 000009
【００５２】
をもって、許容される。ここで、その化学ポテンシャルの効果は、Ｂパラメータを介してその判定式に導入される。係数ＶおよびＮの存在は、そのカノニカル分配関数とグランドカノニカル分配関数との間の関係に、従う。すなわち、分子（ＯＲＦ）は、この系から取り除かれ、その座標（ＱＮ）における積分によって、Ｖ因子が生じ、そして、Ｎは、Ｎ！の最後の因数である。これらは、確率論的な解釈が与えられえる：挿入部位は、確率１／Ｖで選択され、そして消去されるべき分子（ＯＲＦ）は、確率１／Ｎをもって選択される。
【００５３】
このシミュレーションは、分子（ＯＲＦ）を移動、挿入、消去し、かつ、それらが、上記の式（３）〜（５）に定義されるように、確率
【００５４】
【数７】
2007536618.tif 000010
【００５５】
をもって、許容されるという代替的試みによって、進行する。十分に長い実行の後に、その分子（ＯＲＦ）の数であるＮは、そのボルツマン平均の周りで揺らぐ。所定の密度がシュミレートされると、一般に、様々なＢを試みる必要がある。これに関して、以下の関係：
【００５６】
【数８】
2007536618.tif 000011
【００５７】
に留意することが有用である。
【００５８】
本方法は、分子流体を適度な密度でシュミレートするのに有用であるが、室温の液体がシミュレートされたときに困難にいたることがわかっている。その困難性は、その殆どの挿入の試みが、分子（例えば、解かれたタンパク質の構造）が存在する位置であり、それによって、大きなΔＥが生じ、そして、その試みが棄却される可能性があるという事実に起因する。
【００５９】
その挿入の試みの効力を増大させるために、キャビティバイアス挿入技術（ｃａｖｉｔｙ−ｂｉａｓｅｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）が導入される。挿入は、適切なサイズのキャビティが存在する場所のみで試みられ、それによって、無視し得ない許容する確率を確保し得る。しかし、それによって改変されたシミュレーションがその必要とされるボルツマン分布を生成することを確実にするために、挿入許容確率および消去許容確率の両方が、改変される必要がある。この改変された式は、Ｎ個の分子（ＯＲＦ）が存在する場合、キャビティを見出す確率
【００６０】
【数９】
2007536618.tif 000012
【００６１】
を含み、これは、以下：
【００６２】
【数１０】
2007536618.tif 000013
【００６３】
に従う。
【００６４】
この式８および９において、
【００６５】
【数１１】
2007536618.tif 000014
【００６６】
は、適切なサイズのキャビティを含む系の領域の体積を表す。このキャビティバイアス法の効率性は、そのキャビティをサーチするアルゴリズムによって、
【００６７】
【数１２】
2007536618.tif 000015
【００６８】
を、さらなる工程を必要とせずにもたされることによる。種々の流体（水、ベンゼン）が、ＯＲＦを定義し、これらの種々の流体について計算することによって、そのキャビティバイアス法が、挿入試行の効率を増大させて、改良なくしては実行が不能とされてきた密度のモデリングを可能にしたことを確認した。
【００６９】
（水の結合）
本発明に使用されるシミュレーションの局面は、合成ポリペプチドに対する水の結合の強度を決定するように使用する計算で、例示され得る１。この例示は、以下ように記載され得る：
この本文は、化学ポテンシャルのシミュレーテッドアニーリングの方法によって、バルク水が結合水から区別されるようになり、そして、異なった結合をする水がそれらの反応化学ポテンシャルに基づいて互いに区別され得ることが可能になる。このことは、荷電したＤＮＡドデカマーの主溝よりもその副溝から脱溶媒和させるのに、より多くの自由エネルギーがかかることを示すことによって例示される。
【００７０】
グランドカノニカルアンサンブルシミュレーションは、一般に、分子を周期的なシミュレーションセルに入れ、パラメータＢ（これは、自由エネルギーを示す）を、実験的に決定された密度を達成するような様式で設定し、キャビティバイアス法２，３のような技術を使用して、シミュレーションセルに水分子を挿入するか、またはこのセルから水分子を削除することによって、この分子の周りの潜在的な水和位置をサンプリングし、そしてその試みを、グランドカノニカルアンサンブル確率関数５を使用して、メトロポリスモンテカルロ４基準に基づいて認容または棄却することによって、実施される。パラメータＢは、以下の式、すなわち、Ｂ＝μ’／ｋＴ＋ｌｎ＜Ｎ＞のように、過剰化学ポテンシャルμ’に関連する。ここで、ｋは、ボルツマン定数であり、Ｔは、絶対温度であり、そして＜Ｎ＞は、ＯＲＦの分子（これは、ここでは、Ｈ２Ｏである）の平均数である。シミュレートされた化学ポテンシャルのアニーリングの方法において、このシミュレーションは、大きい初期Ｂ値で開始され、その結果、より高い率の水の挿入の試みが、認容される。これによって、シミュレーションセルは、水分子で満たされる。高い過剰化学ポテンシャルにおいて、このグランドカノニカルアンサンブルシミュレーションが平衡化された後に、引き続くシミュレーションが、連続的に低下するＢ値で実施される。このようにＢ値を連続的に低下させることによって、シミュレーションセルからバルクの水分子が徐々に除かれる。化学ポテンシャルがさらに「アニーリング」されるので、水分子が容易にセルを離れない点に到達し、これによって、ＤＮＡにより強く影響される水分子（いわゆる「結合水分子」）を同定する。過剰化学ポテンシャルが再び下げられると、最終的に、これらの結合水のいずれかがこのセルを離れ始める。化学ポテンシャルは自由エネルギーであるので、この化学ポテンシャルのシミュレーテッドアニーリングは、異なる結合水分子の結合の自由エネルギー差の推定値を与える。用語「アニーリング」についての本発明者ら使用するということは、化学ポテンシャルの値に厳密に適用されること、そして温度が全てのシミュレーションにおいて一定（例えば、２９８Ｋ）に維持されることが強調されなければならない。全てのシミュレーションにおいて、ＤＮＡが固定されて維持され、水分子がセルの全ての部位の全体にわたって生成および消去され、拡張カノニカルモンテカルロが、許容されたグランドカノニカルモンテカルロ工程の間で実行され、そして周期的境界条件が使用された。
【００７１】
この方法の例示として、ｄ（ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ）２についての化学ポテンシャルのシミュレーテッドアニーリングを実行し、Ｂ＝１．０で初めて、−２６まで３７の増分で下げ、２，０００，０００ステップのキャビティのバイアスグランドカノニカルアンサンブルモンテカルロを各Ｂ値について実行した。Ｂ＝−６でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、１１２０個の結合水分子を有する。Ｂ＝−８でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、５３３個の水分子を結合した。Ｂ＝−９でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、３９０個の結合水分子を有する。Ｂ＝１１でのシミュレーションの最終コンフィギュレーションは、２１５個の結合水分子を有する。この進行の最も際立った特徴は、ＤＮＡの主溝および副溝の水和に差があることである。Ｂ＝６のシミュレーションは、ＤＮＡが本質的に不均一に溶媒和していることを示す。Ｂ＝−８でのシミュレーションは、２Ｂ単位で化学ポテンシャルを下げると、非バルク抽出水の大部分が、主溝に由来するが一方、副溝は、ほとんど影響を受けないままである。化学ポテンシャルをアニーリングするとさらに（Ｂ＝−９）、依然として、副溝を十分に水和させたままであるが、他方、主溝は、ほとんどはぎ取られる。Ｂをなおさらに低下させる（Ｂ＝−１１）と、主溝および副溝の両方からほとんど全ての水分子が除去される。化学ポテンシャルの関数としてのＤＮＡの水和の定量は、近似分析によって計算された６，７。結果を表１に示す：
【００７２】
【表３】
2007536618.tif 000016
【００７３】
Ｂ＝−６とすると、主溝および副溝の第１水和殻（動径分布関数の第１の極小値の位置によって規定される）は、匹敵する密度を有する（それぞれ、０．０１２および０．０１３）。その一方で、副溝の第２水和殻は、主溝の密度の２倍を有する。Ｂ＝−８とすると、その水和の差は、副溝で極めて顕著になる（第１殻および第２殻の水和密度は、それぞれ、主溝の２．５倍以上および５倍以上である）。Ｂ＝−１１とすると、その主溝および副溝の水和密度は、再び等しくなる。なぜなら、過剰な化学ポテンシャルのこの値では、両方の溝において、本質的に取り除かれて露出される。
【００７４】
ＤＮＡの主溝および副溝の差次的水和傾向を例示することは、化学ポテンシャルのシュミレーテッドアニーリングを使用すると計算機的にはそれほど要求が高いものではない（ＳＧＩ  Ｐｏｗｅｒ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ上で、１回のアニーリングスケジュールを実行するためのＣＰＵ時間が３日であり、そして、１回の近接分析（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）７を実行するためのＣＰＵ時間が３日である）。なぜならば、その化学ポテンシャルの粗い「冷却」過程のみが必要だからである。その化学ポテンシャルは、自由エネルギーであるので、非常に細かい冷却スケジュールが、そのＤＮＡの２つの異なる官能基またはさらに２つの異なる原子の水和自由エネルギー差を定量的に予測するために使用され得る。同じＢ値で脱溶媒和化（ｄｅｓｏｌｖａｔｅ）する２つの原子は、類似の溶媒和自由エネルギーを有するか、または代わりに、より細かい冷却スケジュールがその差異を解明することを要する。本明細書で使用されるモデル系は、２２の負電荷を有し、ナトリウム対イオンを有さないイオン性ＤＮＡからなることに注意すべきである。その副溝への選択的な水和について本明細書で示される知見は、Ｘ線結晶学的研究およびＮＭＲ研究からの結果に非常によく対応する。副溝において水分子がより強く結合する理由のうち可能性があるものとしては、リン酸基の電荷列が高密度であること、立体障害的拘束、および特異的な水−水相互作用、水−ＤＮＡ相互作用以下が挙げられ得る。
【００７５】
タンパク質上にある、水に対して強く結合する領域は、ＯＲＦ結合から排除されている領域である。従って、水によって占有されていないそのタンパク質上の残りの部位は、良好なＯＲＦ結合のための候補である。
【００７６】
（アンタゴニストおよびアゴニスト−アッセイおよび分子）
本発明の方法によって同定される候補生物活性因子は、課題とする高分子へのそれらの結合を評価するために試験され得る。その高分子が多くの生物学的機能（疾患状態を含む）を担う場合、その高分子の機能を刺激または阻害する化合物を同定するスクリーニング法を考案することは、それ故に望ましい。従って、さらなる局面において、本発明は、このような高分子の機能を刺激または阻害する化合物を同定する、化合物スクリーニングの方法を提供する。一般に、アゴニストまたはアンタゴニストは、疾患について治療目的および予防目的で使用され得る。化合物は、種々の供給源（例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、および天然生成物の混合物）から同定され得る。
【００７７】
スクリーニング法は、その高分子への、またはその高分子を有する細胞もしくは膜への候補化合物の結合を簡単に測定し得る。その高分子は、シミュレーション方法において使用される高分子の改変体（例えば、そのシミュレーションにおいて同定された結合部位を保持するフラグメントまたは組換え合成方法をより実践的にするために使用される融合タンパク質）であり得る。そのスクリーニング法は、標識された競合因子（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）との競合を包含し得る。さらに、これらのスクリーニング法は、その候補化合物が、その高分子の活性化または阻害によって生成されるシグナルを生じるか否かを、その高分子を含む細胞に適した検出系を使用して試験し得る。活性化のインヒビターは、一般に、既知のアゴニストの存在下でアッセイされ、その候補化合物の存在がアゴニストによる活性化に対して与える効果が観察される。さらに、そのスクリーニング法は、簡便なことには、候補化合物と、高分子を含む溶液とを混合する工程、その混合物中の高分子活性を測定する工程、およびその混合物の活性を、標準物質に対して比較する工程を包含し得る。
【００７８】
本発明はまた、高分子の作用（高分子のそれ自体との会合または別の高分子との会合を含む）を増強する化合物（アゴニスト）またはブロックする化合物（アンタゴニスト）を同定する、化合物スクリーニングの方法を提供する。そのスクリーニング法は、ハイスループット技術を包含し得る。例えば、アゴニストまたはアンタゴニストをスクリーニングするために、合成反応混合物、細胞区画（例えば、膜、細胞エンベロープ（ｃｅｌｌ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ）または細胞壁）、またはこれらのいずれかの調製物（これらは、高分子および標識された基質またはこのようなポリペプチドのリガンドを含む）は、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る候補分子の非存在下または存在下でインキュベートされる。その候補分子がその高分子を作動する能力またはその高分子と拮抗する能力は、標識されたリガンドの結合の減少または基質からの生成物の生成の減少において示される。必要なく結合する（すなわち、高分子の効果を誘導することがない）分子は、良好なアンタゴニストである可能性が最も高い。十分に結合し、場合に応じて、例えば、基質からの生成物生成速度を増大するか、シグナル伝達を増大するか、または化学物質チャネル活性を増大するは、アゴニストである。基質からの（場合に応じて）生成物の生成速度または生成レベル、シグナル伝達、または化学物質チャネル活性の検出は、レセプター系を使用して高められ得る。この点に関して有用であり得るレセプター系としては、生成物に変換される比色標識基質、高分子活性の変化に応答性のレポーター遺伝子、および当該分野で公知の結合アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
（参考文献）
本明細書中で引用される全ての刊行物および参考文献（特許および特許出願が挙げられるが、これらに限定されない）は、各個々の刊行物または参考文献が、十分に示されているとして、本明細書中に参考として援用されることが具体的かつ個々に示されるかのように、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。本願で優先権主張している任意の特許出願はまた、刊行物および参考文献に関して上記で記載される様式で、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【数１】
2007536618.tif 000017
【００８０】
本発明は、好ましい実施形態に重きが置かれて記載されているものの、好ましいデバイスおよび方法における変形例が使用され得ること、ならびに本発明が、本明細書に具体的に記載されたものとは別なように実施され得ると解釈されることは、当業者に明らかである。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の趣旨および範囲内に包含される全ての改変を含む。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１Ａは、解かれた結晶構造を示す。他方、図１Ｂは、配置されたグリッドとともにその構造を表示した。
【図２】図２Ａ〜２Ｄは、エラスターゼの結晶学的な解析結果に適用した本発明の方法を表示する。この方法は、そのＯＲＦとしてメタノールを使用して例示され得る。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、相対的に低いＢ値でのシミュレーションの後でエラスターゼに結合している数個のＯＲＦについての結果の合わせたものを示す。ここで、図３Ｂにおける結果は、これらの結合したＯＲＦのクラスタを同定するためにより分けたものである。図３Ｃは、強力な水結合部位を取り除いた後に残った図３Ｂの２つのクラスタを示す。そして、図３Ｄは、別のＯＲＦまでその分析を拡張した後に残った１つのクラスタを示す。図３Ｅは、なおさらなるＯＲＦまで拡張した分析を示す。図３Ｆのパネルでは、共結晶の結果に対してシミュレーションの結果を比較する。
【図４】図４Ａには、エラスターゼおよび既知のリガンドを用いた６つの共結晶実験のデータから抽出したアミド結合部位が示される。図４Ｂには、本発明のシミュレーション法によって決定された最も親和性の高いアミド結合部位のクラスタである。図４Ｃには、図４ＢのアミドＯＲＦとともにそのクラスタの近傍にあるが２番目に高い親和性結合値でシミュレーションに現れるアミドを加えたものである。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂにおいて、エラスターゼインヒビターの共結晶が、本明細書に記載の方法によって得られたデータと比較される。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、結晶学的データによって示されるような（図６Ａ）リガンドへの結合に関与するエラスターゼの表面、および本明細書中に記載される方法を用いて得られる解によって示されるような（図６Ｂ）リガンドへの結合に関与するエラスターゼの表面を示す。
【図７】図７は、相対的に強い水の結合を同定することを補助するために使用され得る、水が高分子に結合するタイプの滴定の概略図を示す。
【図１Ａ】
2007536618.tif 000018
【図１Ｂ】
2007536618.tif 000019
【図２Ａ】
2007536618.tif 000020
【図２Ｂ】
2007536618.tif 000021
【図２Ｃ】
2007536618.tif 000022
【図２Ｄ】
2007536618.tif 000023
【図３Ａ】
2007536618.tif 000024
【図３Ｂ】
2007536618.tif 000025
【図３Ｃ】
2007536618.tif 000026
【図３Ｄ】
2007536618.tif 000027
【図３Ｅ】
2007536618.tif 000028
【図３Ｆ】
2007536618.tif 000029
【図４Ａ】
2007536618.tif 000030
【図４Ｂ】
2007536618.tif 000031
【図４Ｃ】
2007536618.tif 000032
【図５Ａ】
2007536618.tif 000033
【図５Ｂ】
2007536618.tif 000034
【図６Ａ】
2007536618.tif 000035
【図６Ｂ】
2007536618.tif 000036
【図７】
2007536618.tif 000037
【国際調査報告】
2007536618.tif 000038