(57)【要約】  本発明は、単一のポリエチレングリコール部分をＮ末端に結合させることによって調製された、化学修飾されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）受容体アンタゴニストを提供する。本発明による化学修飾されたタンパク質では、ペグ化の不均一性が減少しており、さらに結合親和性も増大している可能性がある。【図１】2007522198.tif 000009
2007522198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ末端モノペグ化ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体。
【請求項２】
式
【化１】
2007522198.tif 000007
の構造を有し、
式中、ｎが１〜１０の整数であり、
ｍが１〜１０の整数であり、
Ｒがヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである、
請求項１に記載のアミノ末端モノペグ化結合体。
【請求項３】
式
【化２】
2007522198.tif 000008
の構造を有し、
式中、Ｒがヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである、請求項２に記載のＰＥＧ結合体。
【請求項４】
前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、または３に記載の結合体。
【請求項５】
前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項１、２、または３に記載の結合体。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールの９０％超が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端フェニルアラニンに結合している、請求項４に記載のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールの９５％超が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端フェニルアラニンに結合している、請求項４に記載のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体。
【請求項８】
請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体と、少なくとも１つの薬学的に許容できる担体とを含む組成物。
【請求項９】
成長障害または発生障害を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記成長障害または発生障害が巨人症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記成長障害または発生障害が先端肥大症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記成長障害または発生障害が糖尿病性網膜症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記成長障害または発生障害が糖尿病性腎症である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ＧＨ反応性の悪性腫瘍を有する患者を治療する方法であって、治療有効量の請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項１５】
変種が結合する受容体を発現する細胞の成長を抑制する方法であって、治療有効量の請求項１、２、３、４、５、６、または７に記載のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体を、それを必要とする患者に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、参照によりその全体を本明細書に記載されているのと同様に援用する、２００４年２月９日出願の米国特許出願第６０／５４３０７８号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、成長ホルモン受容体アンタゴニストの化学特性および／または生理特性をそれによって改変できる、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの化学修飾に関する。この修飾された成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ペグ化の不均一性が低下しており、さらに、血漿中滞在時間の短縮、クリアランス速度の低下、安定性の改善、抗原性の低下、結合親和性の増大、効力の増大、またはこれらの組合せも有する可能性がある。本発明は、成長ホルモン受容体アンタゴニストを作製および修飾する方法にも関する。加えて、本発明は、修飾された成長ホルモン受容体アンタゴニストを含む医薬組成物にも関する。さらなる実施形態は、成長障害および発達障害を治療するための修飾された成長ホルモン受容体アンタゴニストの使用である。
【背景技術】
【０００３】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、２本のジスルフィド架橋によって架橋された１９１アミノ酸の単一鎖を含むタンパク質であり、単量体型は２２ｋＤａの分子量を有する。
【０００４】
一価ファージディスプレイ（Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、８：３０９−３１４［１９９０年］）を使用して、ｈＧＨ中の部位１の、ｈＧＨｂｐに対する親和性を改善できることが以前に示されている。Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０８３２−１０８３８（１９９１年）。部位１における４つの異なったコドンにそれぞれが変異を有する３つの独立したライブラリーを選別することによって、結合親和性の中程度の改善（野生型ｈＧＨより３〜８倍強い）が得られた。部位１に対する結合親和性がわずかに強化され、かつ部位２へのその結合能が遮断されているｈＧＨ変異体は、部位２のみの変異体より、ｈＧＨ受容体の良いアンタゴニストであった。Ｆｕｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５６：１６７７−１６８０（１９９２年）。
【０００５】
ソマトトロピン受容体とのｈＧＨおよびｂＧＨの相互作用に、ｈＧＨおよびｂＧＨのリジン残基が関与していることが、４１、６４、７０、および１１５位のリジンまたはアルギニン残基の関与を特に示す構造機能相関と共に開示されている。Ｍａｒｔａｌら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１８０：２９５−２９９（１９８５年）。メチル化、エチル化、グアニジン化、およびアセトアミジン化（ａｃｅｔｉｍｉｄｉｎａｔｉｏｎ）によってリジン残基が化学修飾され、その結果、放射性受容体アッセイにおける活性が低下した。
【０００６】
１ライブラリーあたり、さらに多くの残基に変異導入することによって、部位１の親和性のさらなる改善が得られて、先端肥大症など、ＧＨ過剰の状態を治療するのに有用となりうる、なおさらに良いアンタゴニストが得られた。部位ＩＩの修飾によってアンタゴニストを生成することができるが、こうした分子は、血中半減期が短いために有用性が制限されている。
【０００７】
一般的な観察では、体内に投与された生理的に活性なタンパク質は、体内でのそのクリアランス速度が高いため、それらの薬理活性を短期間しか示すことができない。さらに、こうしたタンパク質の安定性および／または溶解性は、その相対的疎水性度によって制限される場合がある。
【０００８】
クリアランス速度を低下させるか、安定性を改善するか、または治療用タンパク質の抗原性を消失させることを目的として、いくつかの方法が提案されており、それらの方法では、タンパク質が水溶性ポリマーで化学修飾される。このタイプの化学修飾は、タンパク質分解酵素がタンパク質の骨格自体と物理的に接触するのを効果的に遮断することがあり、それによって分解が妨げられる。特定の水溶性ポリマーを化学的に結合させると、その分子の水力学的体積が増大するために、腎クリアランスが効果的に低減されることがある。追加の利点には、特定の状況下で、治療用タンパク質の安定性および循環時間の増大、溶解性の増大、および免疫原性の低下が含まれる。ポリ（アルキレンオキシド）、特にポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、治療用タンパク質産物の調製に使用されているそのような化学的部分の１つである（「ペグ化する」という動詞は、少なくとも１分子のＰＥＧ分子を結合させることを意味する）。ポリ（エチレングリコール）の結合によって、タンパク質分解から保護されることが示されており、Ｓａｄａら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７１：１３７−１３９（１９９１）、特定のポリ（エチレングリコール）部分を結合させる方法が利用可能となっている。Ｄａｖｉｓらの１９７９年１２月１８日交付の米国特許第４１７９３３７号「Ｎｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」、およびＲｏｙｅｒの１９７７年１月１１日交付の米国特許第４００２５３１号「Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｔｈｅｒｅｂｙ」を参照のこと。概説には、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、「Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ」（Ｊ．Ｓ．ＨｏｌｃｅｒｂｅｒｇおよびＪ．Ｒｏｂｅｒｔｓ編集、３６７−３８３頁（１９８１年））を参照のこと。
【０００９】
エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（−１、３−ジオキソラン）、ポリ（−１、３、６−トリオキサン）、エチレン／マレイン酸無水物共重合体、ポリ−アミノ酸（ホモポリマーまたはランダム共重合体のいずれか）などの他の水溶性ポリマーも使用されている。
【００１０】
ペグ化された治療用タンパク質の多数の例がこれまで記載されている。アデノシンデアミナーゼのペグ化製剤（ＡＤＡＧＥＮ（登録商標））は重症複合免疫不全症の治療用に認可されている。ペグ化Ｌ−アスパラギナーゼ（ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標））は過敏性ＡＬＬ患者の治療用に認可されている。ペグ化スーパーオキシドジスムターゼは頭部損傷の治療用に臨床試験が行われている。ペグ化α−インターフェロン（米国特許第５７３８８４６号、第５３８２６５７号）は肝炎の治療用に認可されており；ペグ化グルコセレブロシダーゼおよびペグ化ヘモグロビンは前臨床試験中であると報告されている。別の例は、ペグ化ＩＬ−６、「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈＩＬ−６」という名称の欧州特許第０４４２７２４号であり、これは、ＩＬ−６に付加されたポリ（エチレングリコール）分子を開示する。
【００１１】
化学修飾された特定の治療用タンパク質の別のものが、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。Ｇ−ＣＳＦは、好中球様顆粒球の急速な増殖と、血流への放出とを誘導し、それによって、感染との戦いに治療効果がもたらされる。１９９０年１２月１２日交付の「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ」という名称の欧州特許第０４０１３８４号は、ポリ（エチレングリコール）分子が付加されたＧ−ＣＳＦを調製するための材料および方法を記載する。修飾されたＧ−ＣＳＦおよびその類似体は１９９２年３月４日交付の「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ａ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｔｏ  Ａ  Ｗａｔｅｒ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ」という名称の欧州特許第０４７３２６８号でも報告されおり、これは、様々なＧ−ＣＳＦ、およびポリ（エチレングリコール）などの水溶性粒子ポリマーに共有結合した誘導体の使用を記述している。ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する修飾されたポリペプチドが、１９８９年１０月４日交付の欧州特許第０３３５４２３号で報告されている。米国特許第５８２４７８４号で、タンパク質またはその類似体をＮ末端で修飾する方法およびその結果得られる、Ｎ末端で化学修飾された新規のＧ−ＣＳＦ組成物を含めた組成物が提供されている。米国特許第５８２４７７８号は、化学修飾されたＧ−ＣＳＦを開示する。
【００１２】
ポリ（エチレングリコール）に関しては、ポリ（エチレングリコール）分子をタンパク質に付加するのに、様々な方法が使用されてきた。通常、ポリ（エチレングリコール）分子は、タンパク質上に見られる反応性基を介してタンパク質に連結する。
【００１３】
リジン残基またはＮ末端にあるものなどのアミノ基は、そのような結合に好都合である。例えば、Ｒｏｙｅｒ（米国特許第４００２５３１号、同上）には、酵素へのポリ（エチレングリコール）分子の結合に、還元アルキル化が使用されたことが記述されている。１９９３年４月２８日交付のＷｒｉｇｈｔの欧州特許第０５３９１６７号「Ｐｅｇ  Ｉｍｉｄａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」には、遊離アミノ基を有するペプチドおよび有機化合物は、ＰＥＧのイミド酸誘導体または関連の水溶性有機ポリマーによって修飾されることが記述されている。Ｃｈａｍｏｗら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ５：１３３−１４０（１９９４年）には、還元アルキル化を介した、モノメトキシポリ（エチレングリコール）アルデヒドによるＣＤ４イムノアドヘシンの修飾が報告されている。その著者らは、ペグ化の程度の制御を可能にする条件下で、ＣＤ４−Ｉｇの５０％がＭｅＰＥＧによって修飾されたと報告している。同上、１３７頁。その著者らはまた、修飾されたＣＤ４−Ｉｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合能（タンパク質ｇｐ１２０に対する）が、上記のＭｅＰＥＧ化の程度に相関した割合で低下したと報告している。１９９０年２月２７日交付のＳｈａｗの米国特許第４９０４５８４号は、反応性アミン基を介してポリ（エチレングリコール）分子を結合するためにタンパク質中のリジン残基の数を改変することに関する。
【００１４】
タンパク質にポリマーを結合させる多くの方法は、結合基として作用する部分を使用することを含む。しかし、そのような部分は、抗原性のものでもよい。結合基を用いないトレシルクロリド法（ｔｒｅｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｍｅｔｈｏｄ）も利用できるが、この方法は、トレシルクロリドの使用によって有毒な副産物が生成されることがあるので、治療薬を生成させるのに用いるのが困難である場合がある。Ｆｒａｎｃｉｓら、「Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ」（Ａｈｅｒｎ，Ｔ．およびＭａｎｎｉｎｇ，Ｍ．Ｃ．編集、Ｐｌｅｎｕｍ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年）を参照のこと。また、「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｆｉｓｈｅｒら編集、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ社、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８９年、２１１−２１３頁における、Ｄｅｌｇａｄｏら、「Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ＰＥＧ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｙ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｔｒｅｓｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ」も参照のこと。
【００１５】
Ｒｏｓｅら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２：１５４−１５９（１９９１年）も参照のこと。これは、タンパク質基質（インシュリン）のＣ末端カルボキシル基への、リンカー基であるカルボヒドラジドの選択的な結合を報告する。
【００１６】
国際公開第９７／１１１７８号は、複数の部位（２〜７）の第１級アミノ基がＰＥＧで修飾されたｈＧＨ受容体アンタゴニストに関する。Ｏｌｓｏｎら、「Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＨａｒｒｉｓおよびＺａｌｉｐｓｋｙ編集、１９９７年に記載の通り、そのようなｈＧＨ受容体アンタゴニストの１つであるペグビソマント（登録商標）では、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＢ２０３６（Ｂ２０３６は、部位Ｉ結合を強化するように８つの残基が改変され、さらに、残基１２０がリジンに改変されているＧＨである）に、５ＫのＰＥＧ部分が平均５つ結合している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかし、ペグ化の不均一性が減少したモノペグ化ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体を有することが依然として望ましく、さらに、この結合体は、受容体親和性も増強されている可能性がある。本発明は、単一の化学修飾をＮ末端に有するヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体を提供するものであり、この結合体は、その受容体に対する親和性も増強されている可能性があり、さらに、クリアランス速度の低下、血漿中滞在時間の増大、溶解性の改善、安定性の増大、抗原性の低下、効力の増大、またはこれらの組合せも有する可能性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ペグ化の不均一性が減少した化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに関するものであり、このアンタゴニストは、結合親和性も増強されている可能性があり、さらに、限定されるものではないが、クリアランス速度の低下、血漿中滞在時間の増大、安定性の増大、溶解性の改善、および抗原性の低下から選択される、化学特性または生理特性の改善を有する可能性がある。したがって、以下により詳細に記載する通り、本発明は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの化学修飾、ならびに様々なブチルアルデヒドポリ（エチレングリコール）部分を用いた特異的な修飾に関する多くの態様を有する。
【００１９】
本発明は、化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを生成する方法に関する。
【００２０】
本発明は、化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを含む組成物にも関する。
【００２１】
本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ＧＨ作用の阻害が望ましい状態を治療するのに有用である。化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを用いた治療に特に適しているのは、ＧＨ、またはＩＧＦ−Ｉなど、ＧＨ作用の媒介因子の血中レベルを低下させることによって治療効果が得られる状態である。そのような状態には、例えば、巨人症および先端肥大症などのＧＨ過剰の状態が含まれる。巨人症は、長骨成長がまだ可能である思春期前のＧＨ過剰によって起こる。先端肥大症は、長骨がすでに融合している、思春期に入った後のＧＨ過剰によって起こる。先端肥大症は、骨の過成長および軟組織の腫張、ならびに内臓、特に心臓の肥大によって特徴付けられる。先端肥大症は通常、ＧＨを分泌する下垂体腫瘍によって引き起こされる。この疾患の特徴は、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの血中レベルが高いことにある。本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ＧＨ作用を抑制することによって顕著な治療効果を提供すると現在考えられている。
【００２２】
化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ＧＨ作用の抑制によって治療効果が得られる他の状態を治療するのにも有用である。その例には、糖尿病およびその合併症、例えば、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症などが含まれる。糖尿病性網膜症は、網膜血管を形成する細胞の増殖、網膜上の新生血管の成長（新生血管形成）、毛細血管瘤の発生、および周囲の網膜組織への体液の漏出によって特徴付けられる。糖尿病性腎症の初期の特徴は、腎肥大および濾過過剰である。疾患が進歩するにつれて、メサンギウム細胞（腎臓の濾過装置を支持する）の拡散性の膨大が観察されるようになり、これにメサンギウム細胞数の絶対的な増加が伴う。
【００２３】
糖尿病性網膜症など、増殖性の新生血管形成が関与する血管性眼病も、アンタゴニストヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを用いた治療に適していると考えられる。これらの例には、未熟児網膜症、鎌状赤血球貧血を伴う網膜症、および５５才を超えた人の視力喪失の最も一般的な原因である加齢性黄斑変性症が含まれる。
【００２４】
ＧＨレベルの低下によって治療効果が得られると現在考えられている他の状態には、ＧＨ、またはＧＨ作用の媒介因子（ＩＧＦ−１など）に対して、増殖することによって応答する悪性腫瘍（以下では「ＧＨ反応性悪性腫瘍」）が含まれる。ＧＨ反応性悪性腫瘍の例には、ウィルムス腫瘍、様々な肉腫（例えば、骨原性肉腫）、乳房、大腸、前立腺、および甲状腺の癌が含まれる。
【００２５】
本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、これらの変種が結合する受容体を発現する細胞の成長を抑制する。様々な組織がこのような受容体を発現している。例えば、ＧＨ受容体ｍＲＮＡは、正常な胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網膜、およびリンパ節に由来する細胞系、ならびにバーキットリンパ腫、結腸直腸癌、肺癌、リンパ芽球性白血病、および黒色腫に由来する細胞系で発現される。したがって、本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、これらの変種が結合する受容体を発現する癌の治療に概ね有用であると考えられている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、組み換え体タンパク質ファミリーのメンバーであり、米国特許第５８４９５３５号、第５５３４６１７号、第６１４３５２３号、第６０２２７１１号、第５８３４５９８号、および第５６８８６６６号に記載されているが、これらの開示は、その組換え体産生および使用方法も記載している。
【００２７】
遺伝子組換え技術を用いることによって形質転換または形質移入された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および動物細胞などの宿主細胞によって産生される、精製および単離されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストならばいかなるものも、本発明に用いることができる。別のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが米国特許第４８７１８３５号に記載されている。それらの中でも、形質転換された大腸菌によって産生されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが特に好ましい。そのようなヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、高純度かつ均質なものを大量に得ることができる。例えば、米国特許第４３４２８３２号、第４６０１９８０号；第４８９８８３０号；第５４２４１９９；第５７９５７４５号、第５８４９５３５号、第５５３４６１７号、第６１４３５２３号、第６０２２７１１号、第５８３４５９８号、および第５６８８６６６号に開示された方法に従って、上記のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを調製することができる。「以下のアミノ酸配列を実質的に有する」という用語は、１つまたは複数のアミノ酸変化（欠失、付加、挿入、または置換）を、そのような変化が不利益な機能上の非類似性をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに生じさせない限り、上記のアミノ酸配列が含みうることを意味する。リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、対になっていないシステイン残基、Ｎ末端遊離αアミノ基、またはＣ末端遊離カルボキシル基のうちの少なくとも１つがその中に含まれているアミノ酸配列を実質的に有するヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを用いるのがより好ましい。
【００２８】
「ｈＧＨ受容体アンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用する場合、ｈＧＨ受容体のアンタゴニストであることを特徴とするすべてのヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト、ならびにそれらの変種、誘導体、および断片を包含する。そのようなｈＧＨ受容体アンタゴニストのアミノ酸配列を限定するのではなく、例示する実例が下記に論じられており、また、Ｇｅｎｓｅｑ、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ、Ｇｅｎｂａｎｋ、Ｅｍｂｌ、およびＰＩＲなどの配列データベース中にも存在する。
【００２９】
好ましくは、「ｈＧＨ受容体アンタゴニスト」という用語が配列番号１のｈＧＨ受容体アンタゴニスト、ならびに本質的に同一の生物活性を示すその変種、相同体、および誘導体を指し、より好ましくは、「ｈＧＨ受容体アンタゴニスト」という用語が配列番号１のポリペプチドを指す。
【００３０】
「ｈＧＨ受容体アンタゴニスト変種」という用語は、本明細書で使用する場合、同一の種に由来するが、参照ｈＧＨ受容体アンタゴニストとは異なるポリペプチドを指す。通常、相違は限定的であり、したがって、参照と変種とのアミノ酸配列は全体的には密接に類似しており、多くの領域で同一である。ｈＧＨ受容体アンタゴニストは、参照ｈＧＨ受容体アンタゴニスト（好ましくは配列番号１のｈＧＨ受容体アンタゴニスト）に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であることが好ましい。あるクエリーアミノ酸配列に、例えば少なくとも９５％「同一」なアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、クエリーアミノ酸配列の各１００アミノ酸あたり最大５つのアミノ酸改変を、対象のポリペプチド配列が含みうるといことを除いて、対象のポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列に同一であることを意図するものである。参照配列のこうした改変は、参照アミノ酸配列のアミノ末端の位置でも、カルボキシ末端の位置でも、それらの末端の位置の間のいかなるところに生じてもよく、参照配列中の残基の間に個々に点在してもよく、あるいは参照配列中の１つまたは複数の連続した集団となっていてもよい。クエリー配列は、参照配列のアミノ酸配列全体でも、本明細書に記載の通りに特定された断片のいかなるものでもよい。
【００３１】
生物機能の実質的な減失なしに生理活性ペプチドまたはタンパク質のＮ末端またはＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を除去しうることが当技術分野で知られている（例えば、Ｒｏｎら（１９９３年）、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、２６８  ２９８４−２９８８；この開示の全体を参照により本明細書に援用する）。
【００３２】
ｈＧＨ受容体アンタゴニストのいくつかのアミノ酸配列を、このタンパク質の構造または機能に有意な影響を与えずに変えることができることも、当業者ならば認識するであろう。そのような変異体には、活性にほとんど影響を与えないように、当技術分野で知られている慣行に従って選択される欠失、挿入、反転、反復、および置換が含まれる。例えば、表現型に変化を与えないアミノ酸置換をいかに作製するかに関する教導が、Ｂｏｗｉｅら（１９９０年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０に提供されており、参照により全体を本明細書に援用する。その中で、著者らは、改変に対するアミノ酸配列の許容度を研究する２つの主なアプローチがあることを指摘している。
【００３３】
保存的置換と通常考えられているのは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＰｈｅの間でのあるものから別のものへの置換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒとＴｈｒとの交換、酸性残基であるＡｓｐとＧｌｕとの交換、アミド残基であるＡｓｎとＧｌｎとの間での置換、塩基性残基であるＬｙｓとＡｒｇとの交換、ならびに芳香族残基であるＰｈｅとＴｙｒとの間での置換である。加えて、以下のグループのアミノ酸は、概ね同等の変化を表す。すなわち、（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ  Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ  Ｔｒｐ、Ｈｉｓである。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「ｈＧＨ受容体アンタゴニスト断片」という用語は、ｈＧＨ受容体アンタゴニストのアミノ酸配列、好ましくは配列番号１のポリペプチドの一部である連続的な領域を含むいかなるペプチドまたはポリペプチドも指す。
【００３５】
より詳細には、ｈＧＨ受容体アンタゴニスト断片は、本発明によるｈＧＨ受容体アンタゴニストの連続した少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または１９１アミノ酸を含む。加えて、ｈＧＨ受容体アンタゴニスト断片は、少なくとも６アミノ酸を含むｈＧＨ受容体アンタゴニストの下位概念として記載でき、「少なくとも６」とは、６と、配列番号１のポリペプチドを含めたｈＧＨ受容体アンタゴニストのＣ末端アミノ酸を表す整数との間の任意の整数と定義される。それらのＮ末端およびＣ末端の位置によってさらに特定された、上述の通りに長さが少なくとも６アミノ酸であるｈＧＨ受容体アンタゴニスト断片種もさらに含まれる。「ｈＧＨ受容体アンタゴニスト断片」という用語によって、Ｎ末端およびＣ末端の位置によって具体的に特定されうる上述の通りに長さが少なくとも６アミノ酸であるｈＧＨ受容体アンタゴニスト断片も、個別の種として包含される。すなわち、配列表または本発明における任意の所与のアミノ酸配列上で、連続した長さが少なくとも６アミノ酸残基の断片が占有できるであろうＮ末端およびＣ末端の位置のあらゆる組合せが、本発明に含まれる。
【００３６】
「ｈＧＨ受容体アンタゴニスト断片」という用語によって、ｈＧＨ受容体アンタゴニストのドメインも包含される。そのようなドメインは、最終的に、限定されるものではないが、ロイシンジッパー、ヘリックスターンヘリックスモチーフ、グリコシル化部位などの翻訳後修飾部位、ユビキチン結合部位、αへリックスおよびベータシート、コードされているタンパク質の分泌を指示するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックスおよび酸性領域（ｓｔｒｅｔｃｈ）などの転写調節に関係づけられている配列、酵素活性部位、基質結合部位、ならびに酵素的切断部位を含めた線形的または構造的なモチーフおよびシグネチャーを含む。そのようなドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの結合、タンパク質分泌、転写調節、酵素活性、および基質結合活性などの特定の生物活性を表すものでありうる。
【００３７】
ドメインは、サイズが通常３〜１９１アミノ酸からなる。好ましい実施形態では、ドメインは、６〜１９１の任意の整数である多数のアミノ酸を含む。本明細書で開示された、抗体を生成するためにｈＧＨ受容体アンタゴニストを調製する方法を含めて、当業者に知られている任意の方法を用いて、ドメインを合成できる。特定の生物活性を有するドメインを構成するアミノ酸を決定する方法には、試験される生物活性を決定する変異導入研究およびアッセイが含まれる。
【００３８】
同一性パーセントは、比較ウインドウ全体にかけて２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の最適アラインメントを行った後に決定し、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、配列アラインメントを最適化するために１つまたは複数の残基の付加または欠失を含みうる。比較ウインドウは、特定の数の位置（残基の挿入／欠失に対応する残基またはギャップのいずれか）を含有し、この位置の数は、ウインドウサイズに相当する。各ウインドウ位置は、以下の状況のうちの１つを表すものでありうる。すなわち、
１°／ある残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）が第１の整列された配列におけるこの位置に存在し、異なった残基が第２の整列された配列における同じ位置に存在する。換言すれば、第２の配列は、第１の配列と比較して、この位置に置換された残基を有する。
２°／ある残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）が第１の整列された配列におけるこの位置に存在し、同じ残基が第２の整列された配列における同じ位置に存在する。
３°／ある残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）が第１の整列された配列におけるこの位置に存在し、第２の整列された配列における同じ位置にはいかなる残基も存在しない。換言すれば、第２の配列は、第１の配列と比較して、この位置に欠失を示す。
上記に定義した第１の範疇に属する、比較ウインドウ内の位置の数をＲ１と称する。
上記に定義した第２の範疇に属する、比較ウインドウ内の位置の数をＲ２と称する。
上記に定義した第３の範疇に属する、比較ウインドウ内の位置の数をＲ３と称する。
【００３９】
同一性パーセント（％ｉｄ）は以下の式のいずれかによって計算することができる。すなわち、
％ｉｄ＝Ｒ２／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）×１００、または
％ｉｄ＝（Ｒ２＋Ｒ３）／（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ３）×１００
である。
【００４０】
比較する配列のアラインメントは、当技術分野で知られている様々な配列比較アルゴリズムおよびプログラムのうち任意のものを用いて行うことができる。限定されるものではないが、そのようなアルゴリズムおよびプログラムには、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＤＢ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが含まれ（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、（１９８８年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３年）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７年）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４年）、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９９６年）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２；Ｂｒｕｔｌａｇら（１９９０年）、Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７−２４５；ＪｏｎｅｓおよびＳｗｉｎｄｅｌｌｓ（２００２年）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ２７：１６１−４；Ｏｌｓｅｎら（１９９９年）、Ｐａｃ  Ｓｙｍｐ  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ：３０２−１３）、これらの開示の全体を参照により本明細書に援用する。
【００４１】
特定の実施形態では、ＰＡＭ、ＰＡＭ２５０などのスコアリングマトリックスまたは好ましくはＢＬＯＳＵＭ６０もしくはＢＬＯＳＵＭ６２などのＢＬＯＳＵＭマトリックスと、デフォルトパラメータ（ギャップ形成ペナルティ（Ｇａｐ  Ｏｐｅｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝１０およびギャップ伸長ペナルティ（Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝１）、または好ましくはデフォルトパラメータより優れたユーザ指定のパラメータとを用いたＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ法を使用する。
【００４２】
別の特定の実施形態では、タンパク質配列および核酸配列のアラインメントを、デフォルトパラメータ、またはユーザ提供の改変パラメータを用いた基本的局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（「ＢＬＡＳＴ」）プログラムを使用して行う。使用されるスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスが好ましい（Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３−１４４５；ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ、（１９９３年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：４９−６１、これらの開示の全体を参照により本明細書に援用する）。それより好ましくないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（例えば、ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ編集（１９７８年）、「Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、この開示の全体を参照により本明細書に援用する）。
【００４３】
さらに別の特定の実施形態では、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のアラインエメントを、Ｂｒｕｔｌａｇら（１９９０年）、同上のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて行う。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアラインメントで使用する好ましいパラメータは、マトリックス＝単一（Ｕｎｉｔａｒｙ）、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝３０、無作為化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア＝１、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのうち短い方である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用する好ましいパラメータは、マトリックス＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、結合ペナルティ＝２０、無作為化グループ２５長＝０、カットオフスコア＝１、ウインドウサイズ＝配列長、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのうち短い方である。
【００４４】
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの例は、４１位のリジンおよび４５位のロイシンのうち少なくとも１つにアミノ酸置換を有するヒト成長ホルモン変種、詳細には、４１位にイソロイシンまたはアルギニン、そして４５位にトリプトファンを有するヒト成長ホルモン変種である（米国特許第５５３４６１７号）。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのさらに他の例は、５４、５６、５８、６４位に少なくとも２つのアミノ酸置換を有するヒト成長ホルモン変種、詳細には、５４Ｐ  ５６Ｄ、５８Ｔ  ６４Ｋ、５４Ｐ  ５６Ｗ  ５８Ｔ  ６４Ｋ、および５４Ｐ  ６４Ｋを有するヒト成長ホルモン変種である（米国特許第５５３４６１７号）。
【００４５】
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの追加の例は、成長ホルモン受容体の部位Ｉに対する親和性がさらに大きいヒト成長ホルモン変種である（米国特許第６０２２７１１号）。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの具体例は、
Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ；
Ｈ１８Ｄ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ｓ；
Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ｓ；
Ｈ１８Ｄ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａ
のアミノ酸置換を有するヒト成長ホルモン変種である（米国特許第６０２２７１１号）。
【００４６】
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの追加の例は、１０、１４、１８、および２１位にアミノ酸置換を有するヒト成長ホルモン変種である。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの具体例は、１０Ｈ、１４Ｇ、１８Ｎ、２１Ｎ；１０Ａ、１４Ｗ、１８Ｄ、２１Ｎ；１０Ｙ、１４Ｔ、１８Ｖ、２１Ｎ；１０Ｉ、１４Ｎ、１８Ｉ、２１Ｎのアミノ酸置換を有するヒト成長ホルモン変種である（米国特許第５８３４５９８号）。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのさらに他の例は、アミノ酸置換１７４Ｓおよび１７６Ｙと、１０、１４、１８、２１、１６７、１７１、１７５、および１７９位に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するヒト成長ホルモン変種である。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのさらに他の例は、天然に存在するｈＧＨにおけるＦ１０、Ｍ１４、Ｈ１８、Ｈ２１、Ｒ１６７、Ｄ１７１、Ｔ１７５、およびＩ１７９の８つのアミノ酸が、それぞれ、
Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；
Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ、Ｔ；
Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｉ；
Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｔ．
Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｎ；
Ａ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｎ；
Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｈ、Ｑ、Ｔ、Ｓ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｓ；
Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ；
Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｔ；
Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ｑ、Ｙ、Ｎ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ｆ、Ｌ、Ｓ、Ｓ、Ｋ、Ｎ、Ｔ、Ｖ；
Ｗ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ａ、Ｎ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｐ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ｈ、Ｇ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｔ、Ｓ；
Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ｍ、Ｔ、Ｓ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｓ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ；
Ｍ、Ｑ、Ｍ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｈ、Ｙ、Ｄ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｔ；
Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ｌ、Ｎ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ａ、Ｔ、Ｔ；
Ｆ、Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ；
Ｉ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ｆ、Ｓ、Ｌ、Ａ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｖ；
Ｆ、Ｓ、Ｆ、Ｌ、Ｋ、Ｄ、Ｔ、Ｔ；
Ｍ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｔ；
Ａ、Ｗ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｓ、Ｖ、Ｔ；および
Ｈ、Ｑ、Ｙ、Ｓ、Ｒ、Ｄ、Ｔ、Ｉ
からなる群から逐次的に選択された対応するアミノ酸で、一群として置換されたヒト成長ホルモン変種である（米国特許第５８３４５９８号）。
【００４７】
異なったアミノ酸によるＧ１２０の置換は、部位２結合を破壊する改変の１つである。したがって、Ｇ１２０におけるアミノ酸置換を含有するｈＧＨ変種はｈＧＨアンタゴニストとして作用する。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの残基１２０をグリシンから、それより嵩高いアミノ酸に改変することができよう。残基１２０の特定の置換は、リジンおよびシステインである。特定の実施形態は、Ｇ１２０アミノ酸置換と部位１アミノ酸置換のセットとを併せもつヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである。（米国特許第５８４９５３５号）。したがって、一実施形態では、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、以下のセットのアミノ酸置換、すなわち、
Ｈ１８Ｄ、Ｈ２１Ｎ、Ｇ１２０Ｋ、Ｒ１６７Ｎ、Ｋ１６８Ａ、Ｄ１７１Ｓ、Ｋ１７２Ｒ、Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ
を含有する（以下では「Ｂ２０３６変種」）。
【００４８】
別の実施形態では、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、以下のセットのアミノ酸置換、すなわち、
Ｈ１８Ａ、Ｑ２２Ａ、Ｆ２５Ａ、Ｄ２６Ａ、Ｑ２９Ａ、Ｅ６５Ａ、Ｇ１２０Ｋ、Ｋ１６８Ａ、Ｅ１７４Ａ
を含有する（以下では「Ｂ２０２４変種」）。
【００４９】
本発明によれば、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのアミノ酸残基を介してポリ（エチレングリコール）が共有結合される。アミノ酸残基は、活性化されたポリ（エチレングリコール）の末端反応性基が結合しうる、例えば、遊離のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル（チオール）基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、またはイミダゾイル基を有する任意の反応性アミノ残基でよい。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リジン残基および／またはＮ末端アミノ酸残基を含めることができ、遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基には、アスパラギン酸、グルタミン酸および／またはＣ末端アミノ酸残基を含めることができ、遊離スルフヒドリル（チオール）を有するアミノ酸残基には、システインなどを、遊離ヒドロキシルを有するアミノ酸残基には、セリンまたはチロシンなどを、遊離グアニジニルを有するアミノ酸残基には、アルギニンなどを、また遊離イミダゾイルを有するアミノ酸残基には、ヒスチジンなどを含めることができる。
【００５０】
別の実施形態では、Ｎ末端セリン残基を標的とするのにオキシム化学（ＬｅｍｉｅｕｘおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ、Ｔｉｂ  Ｔｅｃｈ  １６：５０６−５１３、１９９８年）を用いる。
【００５１】
本発明で使用されるポリ（エチレングリコール）は、いかなる特定の形態にも、分子量の範囲にも限定されない。ポリ（エチレングリコール）の分子量は、約５００〜約１０００００ドルトンでよい。「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、一部の分子は示されている分子量より重量が大きく、一部の分子はそれより小さくなることを示し、示される分子量は平均分子量を指す。ポリ（エチレングリコール）などの重合体には、ある程度の多分散性が伴うと理解されている。多分散性の低いＰＥＧを用いるのが好ましい。通常は、約５００〜約６００００の分子量のＰＥＧが使用される。本発明における特定のＰＥＧの分子量範囲は、約１０００〜約４００００である。別の特定の実施形態では、ＰＥＧ分子量は、約５０００〜約４００００を超える。別の特定の実施形態では、ＰＥＧ分子量は、約２００００〜約４００００である。他の大きさのものも、所望の治療プロフィール（例えば、所望の持続放出の時間、もしあるならば生物活性に対する影響、抗原性の程度または有無、および治療用タンパク質に対するポリエチレンの既知の他の影響）に応じて使用できる。例えば、ポリエチレングリコールは、約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ドルトンの平均分子量を有するものでありうる。ポリ（エチレングリコール）は、米国特許第５９３２４６２号、第５３４２９４０号、第５６４３５７５号、第５９１９４５５号、第６１１３９０６号、および第５１８３６６０号に記載の通り、分岐したＰＥＧでもよい。
【００５２】
ポリ（アルキレンオキシド）、とりわけポリ（エチレングリコール）は、末端の反応性基を介してヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに結合され、それらの反応性基は、ＰＥＧとタンパク質との間に連結部分（スペーサ）を残す場合も、残さない場合もある。本発明のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体を形成するために、ポリ（アルキレンオキシド）などの重合体を、そのような用語が当業者に知られている活性形に変換する。反応性基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、またはチオール基など、タンパク質上の化学部分と、ポリ（エチレングリコール）との間の結合を媒介する末端の反応性基である。通常、重合体末端のヒドロキシル末端基の一方または両方（すなわち、アルファおよびオメガ末端ヒドロキシル基）を、共有結合を可能にする反応性官能基に変換する。この過程は「活性化」と呼ばれることが多く、反応性基を有するポリ（エチレングリコール）産物を以下「活性ポリ（エチレングリコール）」と呼ぶ。αおよびω結合基の両方を含有する重合体を、「二重活性化ポリ（アルキレンオキシド）」と呼び、また「二機能性」と呼ぶ。αおよびω末端ヒドロキシルに同じ反応性基を含有する重合体を「ホモ二機能性」または「ホモ二重活性化」と呼ぶこともある。αおよびω末端ヒドロキシルに異なる反応性基を含有する重合体を「ヘテロ二機能性」または「ヘテロ二重活性化」と呼ぶこともある。単一の反応性基を含有する重合体を「モノ活性化」ポリアルキレン酸化物または「一官能性」と呼ぶ。実質的に抗原性のない他の重合体も同様に「活性化」または「官能基化」される。
【００５３】
したがって、活性重合体は、αもしくはε−アミノ基、カルボキシル基、またはチオール基などの、タンパク質上の化学部分と、ポリ（エチレングリコール）との間の結合を媒介するのに適している。二重活性化重合体を、この方法で２つのタンパク質分子、または１つのタンパク質分子および別の実施形態の反応性小分子と反応させて、タンパク質重合体またはタンパク質−小分子結合体を、架橋を介して効果的に形成させることができる。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに存在する、アミノ末端のα−アミノ基またはリジンのε−アミノ基と反応できる官能基には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ｐ−ニトロフェニールなどのカルボネート、またはサクシニミジル；カルボニルイミダゾール；アズラクトン；環状イミドチオン；イソシアン酸またはイソチオシアン酸；塩化トレシル（欧州特許第７１４４０２号、第４３９５０８号）；およびアルデヒドが含まれる。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト上のカルボン酸基、反応性カルボニル基、および酸化炭化水素部分と反応できる官能基には、第一アミン；ならびにアシルヒドラジド、カルバジン酸、セミカルバジン酸、チオカルバジン酸などのヒドラジンおよびヒドラジド官能基が含まれる。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト上で利用可能である場合には、メルカプト基も、適切に活性化された重合体を、チオール；マレイミド、スルホン、およびフェニルグリオキサールなどの反応性基と結合させるための部位として使用できる。例えば米国特許第５０９３５３１号を参照のこと。この開示を参照により本明細書に援用する。求電子中心と反応できる他の求核試薬には、例えばヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール、活性メチレン、および同様のものが含まれるが、これらに限定されない。
【００５４】
米国特許第５３５９０３０号および第５６８１８１１号；第５４３８０４０号；ならびに第５３５９０３０号に開示の親油性部分および親水性部分を含有する重合体も含まれる。
【００５５】
本発明の好ましい一実施形態では、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのＮ末端α−アミノ基またはリジンのε−アミノ基と、活性ＰＥＧとを用いて、第二級アミンまたはアミド連結を形成させる。本発明の別の好ましい態様では、Ｃｈａｍｏｗら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１３３−１４０（１９９４年）および米国特許第５８２４７８４号に記載の通り、ＮａＣＮＢＨ３、ＮａＢＨ３、ピリジンボランなどの適当な還元剤を用いた還元によって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのＮ末端一級α−アミノ基またはε−アミノ基と、単一鎖または分枝鎖ＰＥＧアルデヒドとの間に第二級アミン連結を形成させる。
【００５６】
本発明の別の好ましい実施形態では、スクシンイミジルエステル、環状イミドチオン、または同様のものなどのアミド形成リンカーで活性化された重合体を用いて、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストと、その重合体とを連結する。例えば、米国特許第５３４９００１号；第５４０５８７７号；および、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７：１０１−１６１、２０００年を参照のこと。これらを参照により本明細書に援用する。好ましい活性化ポリ（エチレングリコール）の１つは、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの遊離アミノ基に結合でき、かつ、単一鎖または分岐鎖のＮ−ヒドロキシスクシニリミドポリ（エチレングリコール）を含むものであるが、Ｎ−ヒドロキシスクシニリミドを用いてポリ（エチレングリコール）のコハク酸エステルを活性化することによって調製できる。
【００５７】
本発明の他の好ましい実施形態は、他の活性重合体を用いて、その重合体をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストと、ε−アミノ基または他の基を介して共有結合を形成させることを含む。例えば、末端を活性化された、イソシアン酸塩またはイソチオシアン酸塩形態の重合体を用いて、リジンのアミノ基と、尿素またはチオ尿素ベースの連結を形成させることができる。
【００５８】
本発明の別の好ましい態様では、参照により本明細書に援用する米国特許第５１２２６１４号、第５３２４８４４号、および第５６１２６４０号に記載の通り、タンパク質アミノ基とのカルバミン酸（ウレタン）連結を形成させる。それらの例には、Ｎ−サクシニミジルカルボネート、パラーニトロフェニールカルボネート、およびカルボニルイミダゾールで活性化された重合体が含まれる。本発明の別の好ましい実施形態では、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカルボネート誘導体をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのアミノ基に連結する。
【００５９】
本発明の別の態様は、酵素またはｐＨで誘導された加水分解によって予測通りに分解され、それによって遊離したヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストまたは他のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト誘導体を放出できる機能的リンカーによってヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト分子に結合したポリ（エチレングリコール）などの水溶性重合体からなるヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのプロドラッグ形または持続放出形を表す。プロドラッグは、一連の不顕化（ｌａｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を用いた「二重プロドラッグ」でもよい（Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３：３９−６５、１９８９年）。そのようなシステムでは、加水分解反応が、酵素またはｐＨによって誘導される律速的な（遅い）第１のステップで行われ、第２のステップでは、第１のステップが行われた後でのみ起こる非酵素性の急速な分解が行われる。そのような遊離可能な重合体は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを持続的に放出するタンパク質複合体を提供し、このタンパク質複合体は、非永続的であり、貯蔵器として機能できるであろう。そのような機能的リンカーは、米国特許第５６１４５４９号；第５８４０９００号；第５８８０１３１号；第５９６５１１９号；第６０１１０４２号；第６１８００９５号；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２；３６５７−３６６７、１９９９年；Ｌｅｅ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１２：１６３−１６９、２００１年；Ｇａｒｍａｎ  Ａ．Ｊ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２２３：３６１−３６５、１９８７年；Ｗｏｇｈｉｒｅｎ  Ｃ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｃａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：３１４−３１８、１９９３年；Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｍ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７；１４４０−１４４５、１９９８年；Ｚｈａｏ  Ｘ．、Ｎｉｎｔｈ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔ．１９９；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：４７５−４８７、２０００年；および、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ  Ｒ．Ｂ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．１７：１０１−１６１、２０００年に記載されている。
【００６０】
本発明は、アルデヒド化学を用いて、ＰＥＧ部分を、ブチリルアルデヒドリンカー部分を介してＮ末端に選択的に付加する方法に関する。
【００６１】
本発明の一実施形態は、化学式Ｉおよび化学式ＩＩの構造を有するヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体である。
【００６２】
【化１】
2007522198.tif 000003
式中、
ｎは１〜１０の整数であり；
ｍは１〜１０の整数であり；
Ｒはヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである。
【００６３】
特定の実施形態では、ｎが１〜５であり、ｍが１〜５である。
【００６４】
化学式Ｉの特定の実施形態では、ｎが１かつｍが１であり；ｎが１かつｍが２であり；ｎが１かつｍが３であり；ｎが１かつｍが４であり；ｎが１かつｍが５であり；ｎが１かつｍが６であり；ｎが１かつｍが７であり；ｎが１かつｍが８であり；ｎが１かつｍが９であり；ｎが１かつｍが１０であり；ｎが２かつｍが１であり；ｎが２かつｍが２であり；ｎが２かつｍが３であり；ｎが２かつｍが４であり；ｎが２かつｍが５であり；ｎが２かつｍが６であり；ｎが２かつｍが７であり；ｎが２かつｍが８であり；ｎが２かつｍが９であり；ｎが２かつｍが１０であり；ｎが３かつｍが１であり；ｎが３かつｍが２であり；ｎが３かつｍが３であり；ｎが３かつｍが４であり；ｎが３かつｍが５であり；ｎが３かつｍが６であり；ｎが３かつｍが７であり；ｎが３かつｍが８であり；ｎが３かつｍが９であり；ｎが３かつｍが１０であり；ｎが４かつｍが１であり；ｎが４かつｍが２であり；ｎが４かつｍが３であり；ｎが４かつｍが４であり；ｎが４かつｍが５であり；ｎが４かつｍが６であり；ｎが４かつｍが７であり；ｎが４かつｍが８であり；ｎが４かつｍが９であり；ｎが４かつｍが１０であり；ｎが５かつｍが１であり；ｎが５かつｍが２であり；ｎが５かつｍが３であり；ｎが５かつｍが４であり；ｎが５かつｍが５であり；ｎが５かつｍが６であり；ｎが５かつｍが７であり；ｎが５かつｍが８であり；ｎが５かつｍが９であり；ｎが５かつｍが１０であり；ｎが６かつｍが１であり；ｎが６かつｍが２であり；ｎが６かつｍが３であり；ｎが６かつｍが４であり；ｎが６かつｍが５であり；ｎが６かつｍが６であり；ｎが６かつｍが７であり；ｎが６かつｍが８であり；ｎが６かつｍが９であり；ｎが６かつｍが１０であり；ｎが７かつｍが１であり；ｎが７かつｍが２であり；ｎが７かつｍが３であり；ｎが７かつｍが４であり；ｎが７かつｍが５であり；ｎが７かつｍが６であり；ｎが７かつｍが７であり；ｎが７かつｍが８であり；ｎが７かつｍが９であり；ｎが７かつｍが１０であり；ｎが８かつｍが１であり；ｎが８かつｍが２であり；ｎが８かつｍが３であり；ｎが８かつｍが４であり；ｎが８かつｍが５であり；ｎが８かつｍが６であり；ｎが８かつｍが７であり；ｎが８かつｍが８であり；ｎが８かつｍが９であり；ｎが８かつｍが１０であり；ｎが９かつｍが１であり；ｎが９かつｍが２であり；ｎが９かつｍが３であり；ｎが９かつｍが４であり；ｎが９かつｍが５であり；ｎが９かつｍが６であり；ｎが９かつｍが７であり；ｎが９かつｍが８であり；ｎが９かつｍが９であり；ｎが９かつｍが１０であり；ｎが１０かつｍが１であり；ｎが１０かつｍが２であり；ｎが１０かつｍが３であり；ｎが１０かつｍが４であり；ｎが１０かつｍが５であり；ｎが１０かつｍが６であり；ｎが１０かつｍが７であり；ｎが１０かつｍが８であり；ｎが１０かつｍが９であり；ｎが１０かつｍが１０である。
【００６５】
特定の実施形態は、次の化学式の構造を有するヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ結合体である。
【００６６】
【化２】
2007522198.tif 000004
式中、Ｒはヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである。
【００６７】
特定の実施形態では、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストがＢ２０３６変種（配列番号１）である。
【００６８】
本発明の特定の実施形態はヒト成長ホルモンＰＥＧ結合体であり、このポリエチレングリコールの８０％超、より好ましくは８１％、より好ましくは８２％、より好ましくは８３％、より好ましくは８４％、より好ましくは８５％、より好ましくは８６％、より好ましくは８７％、より好ましくは８８％、より好ましくは８９％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端フェニルアラニンに結合している。
【００６９】
本発明の別の特定の実施形態はヒト成長ホルモンＰＥＧ結合体であり、このポリエチレングリコールの９０％超が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端フェニルアラニンに結合している。
【００７０】
本発明の別の特定の実施形態はヒト成長ホルモンＰＥＧ結合体であり、このポリエチレングリコールの９５％超が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端フェニルアラニンに結合している。
【００７１】
本発明の別の特定の実施形態はヒト成長ホルモンＰＥＧ結合体であり、このポリエチレングリコールの９８％超が配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端フェニルアラニンに結合している。
【００７２】
ペグ化反応と呼ばれる抱合反応は従来、重合体がタンパク質のどこに結合するかに関係なく、溶液中でモル過剰の重合体を用いて行われていた。しかし、そのような一般的な技法は通常、十分な生理活性を保有しながら、生理活性タンパク質を抗原性でない重合体に結合するのには適切でないことが実証されている。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの生理活性を維持するための１つの方法は、重合体結合過程で、それらのヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストにおける、受容体結合部位に関連した反応性基の結合を実質的に回避することである。本発明の別の態様は、ポリ（エチレングリコール）をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに、保持する活性を高レベルに維持しながら結合する方法を提供することである。
【００７３】
共有結合による化学修飾は、活性化されたポリ（エチレングリコール）との、生理活性物質の反応で一般的に採用される任意の適当な条件下で行うことができる。抱合反応は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの不活性化を回避するために比較的穏和な条件下で行われる。穏和な条件には、反応液のｐＨを３〜１０の範囲に、反応温度を約０℃〜３７℃の範囲に維持することが含まれる。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト中の反応性アミノ酸残基が遊離アミノ基を有する場合、上記の修飾は、リン酸、ＭＥＳ、クエン酸、酢酸、コハク酸、またはＨＥＰＥＳを含む非限定的なリストの中にある適当な緩衝液（ｐＨ３〜１０）中、４℃〜３７℃で、１〜４８時間行うことが好ましい。ＰＥＧアルデヒドなどの試薬を用いてＮ末端アミノ基を標的とする場合には、ｐＨ４〜７に維持することが好ましい。活性化されたポリ（エチレングリコール）は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストにおける遊離アミノ基の数の約０．０５〜１００倍、好ましくは約０．０５〜２．５倍のモル量で使用できる。他方で、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストにおける反応性アミノ酸残基が遊離カルボキシル基を有する場合、上記の修飾は、ｐＨ約３．５〜約５．５で行うのが好ましく、例えば、ポリ（オキシエチレンジアミン）による修飾は、カルボジイミド（ｐＨ４〜５）の存在下に、４℃〜３７℃で１〜２４時間行う。活性化されたポリ（エチレングリコール）は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストにおける遊離カルボキシル基の数の０．０５〜３００倍のモル量で使用できる。
【００７４】
別々の実施形態で、抱合反応に含める重合体の量の上限はほぼ１：１超から、有意な量の高分子量分子種を形成しない、すなわち約２０％超の結合体がヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト１分子あたり、約１ストランド超の重合体を含有することなく、活性された重合体とヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストとの反応を可能にする程度までである。例えば、本発明のこの態様では、有意な量の所望の結合体を形成するために最大約６：１の比率が使用でき、その後この結合体をいかなる高分子量分子種からも単離できると企図される。
【００７５】
本発明の別の態様では、複数のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト分子がＰＥＧを介してその中で架橋されている重合体ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−ＰＥＧ分子を生成するのに、二機能性に活性化されたＰＥＧ誘導体を使用できる。本明細書に記載の反応条件を用いた結果、有意な量の無修飾のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが生じることもあるが、無修飾のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、将来における追加の抱合反応のためのバッチに容易にリサイクルすることができる。本発明の方法は、驚いたことに、高分子量分子種、およびヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストあたり複数の重合体ストランドを含有する分子種をほとんど生成しない、すなわち約３０％未満、より好ましくは約１０％未満しか生成しない。これらの反応条件は、重合体抱合反応に通常使用される条件と対比するべきものであり、後者では、活性化された重合体が標的に対して数倍のモル過剰で存在する。本発明の他の態様では、重合体が、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト１当量あたり約０．１〜約５０当量の量で存在する。本発明の他の態様では、重合体が、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト１当量あたり約１〜約１０当量の量で存在する。
【００７６】
本発明の抱合反応は、まず、モノもしくはジ−ＰＥＧ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体を含有する反応混合物またはプールと、未反応のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストと、未反応の重合体と、通常約２０％未満の高分子量分子種とを提供する。高分子量分子種には、複数の重合体ストランドを含有する結合体、および／または重合体ＰＥＧ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト分子種が含まれる。未反応分子種および高分子量分子種を除去した後、モノおよびジ−重合体−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体を主に含有する組成物を回収する。これらの結合体の大部分が単一鎖の重合体を含有しているという事実を考慮すると、これら結合体は実質的に均質である。これらの修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、標準的なＦＤＣ−Ｐ１細胞増殖アッセイ（Ｃｌａｒｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７、１９９６年）、受容体結合性アッセイ（米国特許第５０５７４１７号）、または下垂体切除されたラットの成長（Ｃｌａｒｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７１：２１９６９−２１９７７、１９９６年）を用いた測定で、天然または無修飾のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに付随するｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の少なくとも約０．１％を有する。しかし、本発明の好ましい態様では、修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の約２５％を有し、より好ましくは、修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の約５０％を有し、より好ましくは、修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストはｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性の約７５％を有し、最も好ましくは、修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは同等か、または改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有する。
【００７７】
本発明の方法は、重合体対ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの比率がむしろ限定されているものを含むことが好ましい。したがって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体は、重合体を１ストランドのみ含有する分子種に主に限定されることが判明している。さらに、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの反応性基に対する重合体の結合は、大幅にモル過剰の重合体リンカーを用いた場合より実質的に無作為性が低い。抱合反応を沈静化させた後、反応プール中に存在する無修飾のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを、イオン交換もしくはサイズ排除クロマトグラフィー、または同様の分離技法を用いて、後の反応の中にリサイクルすることができる。
【００７８】
ポリ（エチレングリコール）で修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト、すなわち本発明に記載の化学修飾されたタンパク質は、透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲルクロマトグラフィー、および電気泳働など、タンパク質精製に使用されている従来の方法によって反応混合物から精製することができる。イオン交換クロマトグラフィーは、未反応のポリ（エチレングリコール）およびヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを除去するのに特に効果的である。本発明の別の実施形態では、モノおよびジ−重合体−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト分子種を反応混合物から単離して、高分子量分子種、および無修飾のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを除去する。単離は、約０．５〜１０ｍｇ／ｍＬのヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−重合体結合体を含有する緩衝溶液中に混合分子種を入れることによって行う。適当な溶液は約４〜約１０のｐＨを有する。溶液は、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、およびＮａＯＨから選択される１つまたは複数の緩衝塩を含有することが好ましい。
【００７９】
最初に、いかなる未反応重合体も除去するために、反応緩衝液によっては、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト重合体結合体溶液の緩衝液交換／限外濾過を行わなければならないことがある。例えば、未反応の重合体、存在する場合には界面活性剤、または同様のものなど、ほとんどの不用物質を除去するために低分子量カットオフ（１００００から３００００ドルトン）の膜を通して、ＰＥＧ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体溶液を限外濾過することができる。
【００８０】
イオン交換クロマトグラフィー媒体を用いて、結合体を所望の分子種を含有するプールに分画するのが好ましい。そのような媒体は、電荷の相違を介してＰＥＧ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体に選択的に結合することができ、電荷の相違は、ある程度予測可能な様式で生じる。例えば、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの表面荷電は、このタンパク質の表面で利用可能な荷電基の数によって決まる。これらの荷電基は通常、ポリ（アルキレンオキシド）重合体の潜在的結合点として働く。したがって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト結合体が他の分子種とは異なった電荷量を有することによって、選択的な単離が可能となるであろう。
【００８１】
それぞれ、第四アミンまたはスルフォプロピル樹脂など極性の強い陰イオンまたは陽イオン交換樹脂を、本発明の方法で用いることができる。特にイオン交換樹脂が好ましい。本発明に使用するのに適した市販の陽イオン交換樹脂の非限定的なリストは、ＳＰ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）、およびＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを含む。他の適当な陽イオン交換樹脂、例えば、ＳおよびＣＭ樹脂を用いることもできる。市販の陰イオン交換樹脂を含めた、本発明を用いた使用に適した陰イオン交換樹脂の非限定的なリストは、Ｑ−ｈｉｔｒａｐ（登録商標）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ（登録商標）、およびＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ｆａｓｔ  ｆｌｏｗである。他の適当な陰イオン交換樹脂、例えば、ＤＥＡＥ樹脂を用いることもできる。
【００８２】
例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂を、カラムに充填して、従来の方法で平衡化する。重合体結合ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト溶液と同じｐＨおよび浸透圧を有する緩衝液が使用される。溶出緩衝液は、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、および（ＮＨ４）２ＣＯ３から選択される１つまたは複数の塩を含有することが好ましい。その後、結合体を含有する溶液をカラムに吸着させるが、未反応の重合体および一部の高分子量分子種は保持されない。試料添加を終えたときに、塩濃度が増大する溶出緩衝液の勾配流をカラムに加えて、ポリアルキレンオキサイド結合のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの所望の画分を溶出する。溶出されたものをプールした画分は、陽イオンまたは陰イオン交換分離ステップの後には、均一の重合体結合体に限定されていることが好ましい。その後、結合しなかったいかなるヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト分子種も、従来の技法によってカラムから逆洗することができる。必要に応じて、追加のイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーを介して、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのモノペグ化分子種および多重ペグ化分子種を相互からさらに分離することができる。
【００８３】
複数の定組成ステップを、濃度を増大させながら用いる技法も使用できる。複数の定組成溶離ステップを、濃度を増大させながら用いることによって、逐次的に、まずジ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−重合体結合体が溶出され、次いでモノ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト−重合体結合体が溶出されるであろう。
【００８４】
溶出のための温度範囲は、約４℃と約２５℃との間である。溶出は、約４℃から約２２℃までの温度で行うのが好ましい。例えば、ＰＥＧ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト画分の溶出は２８０ｎｍのＵＶ吸光度によって検出される。画分の収集は、単純な時間溶出プロフィールを介して実現できる。
【００８５】
ポリ（エチレングリコール）重合体をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト部分と結合させる過程で界面活性剤を用いることができる。適当な界面活性剤には、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などのイオン型の物質が含まれる。ドデシル硫酸リチウム、第四アンモニウム化合物、タウロコール酸、カプリル酸、デカンスルホン酸などの他のイオン界面活性剤も用いることができる。非イオン性界面活性剤も用いることができる。例えば、ポリ（オキシエチレン）ソルビタン（トゥイーン）、ポリ（オキシエチレン）エーテル（トリトン）などの物質を用いることができる。Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ、「Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（１９９２年）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．社も参照のこと。本発明の方法で使用される界面活性剤に関する唯一の制限は、それらが、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの実質的かつ不可逆的な変性を引き起こすことがなく、かつ、重合体結合を完全に阻害しない条件および濃度で使用されるということである。界面活性剤は、反応混合物中に、約０．０１〜０．５％、好ましくは０．０５〜０．５％、そして、最も好ましくは、約０．０７５〜０．２５％の量で存在する。界面活性剤の混合物も企図される。
【００８６】
界面活性剤は、重合体結合過程の間、一時的かつ可逆的な保護システムを提供すると考えられている。界面活性剤は、一方でリジンベースまたはアミノ末端ベースの結合を進行させながら、重合体結合を選択的に抑制するのに効果的であることが示されている。
【００８７】
本発明のポリ（エチレングリコール）修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、より永続的な薬理効果を有し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける半減期の延長に起因するものかもしれない。
【００８８】
本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ＧＨ作用の抑制が望ましい状態の治療に有用である。化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを用いた治療に特に適しているのは、ＧＨ、またはＩＧＦ−Ｉなど、ＧＨ作用の媒介因子の血中レベルを低下させることによって治療効果が得られる状態である。そのような状態には、例えば、巨人症および先端肥大症などのＧＨ過剰の状態が含まれる。巨人症は、長骨成長がまだ可能である思春期前のＧＨ過剰によって生じる。先端肥大症は、長骨がすでに融合している、思春期に入った後のＧＨ過剰によって生じる。先端肥大症は、骨の過成長および軟組織の腫張、ならびに内臓、特に心臓の肥大によって特徴付けられる。先端肥大症は通常、ＧＨを分泌する下垂体腫瘍によって引き起こされる。この疾患の特徴は、ＧＨおよびＩＧＦ−Ｉの血中レベルが高いことにある。本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ＧＨ作用を抑制することによって顕著な治療効果を提供すると現在考えられている。
【００８９】
化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ＧＨ作用の抑制によって治療効果が得られる他の状態を治療するのにも有用である。その例には、糖尿病およびその合併症、例えば、糖尿病性網膜症および糖尿病性腎症などが含まれる。糖尿病性網膜症は、網膜血管を形成する細胞の増殖、網膜上の新生血管の成長（新生血管形成）、毛細血管瘤の発生、および周囲の網膜組織への体液の漏出によって特徴付けられる。糖尿病性腎症の初期の特徴は、腎肥大および濾過過剰である。疾患が進歩するにつれて、メサンギウム細胞（腎臓の濾過装置を支持する）の拡散性の膨大が観察されるようになり、これにメサンギウム細胞数の絶対的な増加が伴う。
【００９０】
糖尿病性網膜症など、増殖性の新生血管形成が関与する血管性眼病も、アンタゴニストヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを用いた治療に適していると考えられる。これらの例には、未熟児網膜症、鎌状赤血球貧血を伴う網膜症、および５５才を超えた人の視力喪失の最も一般的な原因である加齢性黄斑変性症が含まれる。
【００９１】
ＧＨレベルの低下によって治療効果が得られると現在考えられている他の状態には、ＧＨ、またはＧＨ作用の媒介因子（ＩＧＦ−１など）に対して、増殖することによって応答する悪性腫瘍（以下では「ＧＨ反応性悪性腫瘍」）が含まれる。ＧＨ反応性悪性腫瘍の例には、ウィルムス腫瘍、様々な肉腫（例えば、骨原性肉腫）、ならびに、乳房、大腸、前立腺、および甲状腺の癌が含まれる。
【００９２】
本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、これらの変種が結合する受容体を発現する細胞の成長を抑制する。様々な組織がこのような受容体を発現している。例えば、ＧＨ受容体ｍＲＮＡは、正常な胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網膜、およびリンパ節に由来する細胞系ならびに、バーキットリンパ腫、結腸直腸癌、肺癌、リンパ芽球性白血病、および黒色腫に由来する細胞系で発現される。したがって、本発明の化学修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、これらの変種が結合する受容体を発現する癌の治療に概ね有用であると考えられている。
【００９３】
本発明のポリ（エチレングリコール）修飾されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、それらを患者に投与するために、薬学的に許容できる希釈剤、等張溶液を調製する物質、ｐＨ調整剤および同様のものも含有する医薬品に処方することができる。
【００９４】
上記医薬品は、治療の目的に応じて、皮下、筋肉内、静脈内、肺、皮内、または経口投与できる。用量も、治療される患者の障害の種類および状態に基づく場合があり、大人１人あたり、通常、注射では０．１ｍｇ〜５ｍｇ、また経口投与では０．１ｍｇ〜５０ｍｇである。
【００９５】
含有される重合体物質も、室温で水溶性であることが好ましい。そのような重合体の非限定的なリストには、ポリ（エチレングリコール）またはポリ（プロピレングリコール）などのポリ（アルキレンオキシド）ホモ重合体、ポリ（オキシエチレン化ポリオール）、これらの共重合体、および、ブロック共重合体の水溶性が維持されるという条件で、これらのブロック共重合体が含まれる。
【００９６】
ＰＥＧベースの重合体の代替物として、デキストラン、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（ビニルアルコール）、糖質ベースの重合体、および同様のものなど、事実上非抗原性の物質を用いることもできる。事実、これらの重合体物質のαおよびω−末端基の活性化は、ポリ（アルキレンオキシド）の変換に用いられたのと同様の方法で行うことができ、したがって、当業者には明らかであるであろう。当業者ならば、上記のリストが単に例示的なものであり、本明細書に記載の特性を有するすべての重合体材料が企図されることを認識するであろう。本発明の意図するところでは、「事実上非抗原性」とは、当技術分野で、非毒性であり、かつ、感知されるほどの免疫原性反応を哺乳類で誘発しない物質として認識されているすべての物質を意味する。
【００９７】
定義
以下は、本明細書で互換性をもって使用される略語、およびそれらに対応する意味のリストである。
ｇ                グラム
ｍｇ              ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ    ミリリットル
ＲＴ              室温
ＰＥＧ            ポリ（エチレングリコール）
【００９８】
この開示で引用されたすべての刊行物、特許、および特許出願の全内容を、個々の刊行物、特許、または特許出願のそれぞれを参照により援用すると明確かつ個別に示したのと同じように、参照により本明細書に援用する。
【００９９】
明快な理解を目的とし、例示および例を用いて上記の発明をある程度詳細に説明したが、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに改変および修正を行えることは、本発明の教示に照らして当業者には容易に明らかとなろう。以下の実施例は、例示のみを目的として示すものであり、上記に広義語で説明した本発明の範囲を限定するものではない。
【０１００】
以下の実施例では、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは配列番号１のものである。ポリペプチドのヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストファミリーの他のメンバーも、これに続く実施例で例示するのと同様の方法でペグ化できるであろうと理解されている。
【０１０１】
本明細書に引用されたすべての参照、特許、または特許出願全体を、本明細書に書かれているのと同じように、参照により本明細書に援用する。
【０１０２】
本発明は、下記の実施例を参照することによって、さらに例示されるであろうが、それらは、本発明の範囲を制限するものと理解するべきではない。
【実施例】
【０１０３】
（実施例１）
分岐鎖４００００ＭＷ  ＰＥＧ−ＡＬＤヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト
【０１０４】
【化３】
2007522198.tif 000005
【０１０５】
この実施例は、Ｎ−末端でモノペグ化されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストの実質的に均質な調製物を還元アルキル化によって作製する方法を実証する。
【０１０６】
リジン残基のε−アミノ位置における第一アミンのｐＫａ値に対する、Ｎ末端の第一アミンの相対的ｐＫａ値の相違を利用することによって、メトキシ分枝した４００００ＭＷのＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ２  ＡＬＤ）試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．社）を、還元的アミノ化によってヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのＮ末端に選択的に結合させた。メトキシ分枝した４００００ＭＷのＰＥＧ−アルデヒドの添加によって、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）ｐＨ７．１の中に、１０ｍｇ／ｍＬに溶解したヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストタンパク質を、メトキシ分枝した４００００ＭＷのＰＥＧ−アルデヒド（ＰＥＧ２−ＡＬＤ）と反応させ、その結果、相対的ＰＥＧ：ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストモル比４：１の結合体が産生した。Ｈ２Ｏまたはピリジンボラン複合体に溶解した１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ４原液（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を最終濃度１０〜５０ｍＭに添加して、反応を触媒させた。反応は２５℃で１８〜４８時間行った。
【０１０７】
（実施例２）
メトキシ２００００ＭＷ  ＰＥＧアルデヒド
実施例１のために記載した操作法を用いて、メトキシ２００００ＭＷ  ＰＥＧアルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに結合させた。
【０１０８】
（実施例３）
メトキシ３００００ＭＷ  ＰＥＧアルデヒド
実施例１のために記載した操作法を用いて、メトキシ３００００ＭＷ  ＰＥＧアルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに結合させた。
【０１０９】
（実施例４）
メトキシ分枝した４００００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチルアルデヒド（ＰＥＧ２−Ｂｕｔ  ＡＬＤ）
【０１１０】
【化４】
2007522198.tif 000006
【０１１１】
実施例１のために記載した操作法を用いて、メトキシ分枝した４００００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチルアルデヒド（ＰＥＧ２−Ｂｕｔ  ＡＬＤ）試薬（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストのＮ末端に結合させた。
【０１１２】
（実施例５）
分岐した４００００ＭＷ  ＰＥＧ２  ＮＨＳ−ＰＥＧ−ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト
実施例１のために記載した操作法を用いて、分枝した４００００ＭＷ  ＰＥＧ２−ＮＨＳ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに結合させた。
【０１１３】
（実施例６）
ペグ化されたｈＧＨ受容体アンタゴニストの精製
ペグ化されたｈＧＨ受容体アンタゴニスト分子種を、単一のイオン交換クロマトグラフィーステップを用いて反応混合物から＞９５％（ＳＥＣ分析）まで精製した。一例として、メトキシ分枝した４００００ＭＷ  ＰＥＧ−アルデヒドをＢ２０３６に結合させた。反応は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中で、４：１のＰＥＧ：タンパク質モル比を用いて、ｐＨ７．１、タンパク質濃度１０ｍｇ／ｍＬ、２５℃で、６０分間行った。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．３で平衡化したＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムと、直線ＮａＣｌ勾配とを用いて、モノペグ化されたヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを反応混合物から精製した。
【０１１４】
陰イオン交換クロマトグラフィー
単一の陰イオン交換クロマトグラフィーステップを用いて、モノペグ化された３０Ｋ  ＰＥＧ−アルデヒド、２０Ｋ  ＰＥＧアルデヒド、４０Ｋ  ＰＥＧ  ＮＨＳ、および分岐した４０Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨ受容体アンタゴニスト分子種を、反応混合物から＞９５％（ＳＥＣ分析）まで精製した。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて、モノペグ化されたｈＧＨ受容体アンタゴニストを、無修飾の受容体アンタゴニストおよび多重ペグ化されたｈＧＨ受容体アンタゴニスト分子種から精製した。メトキシ分枝した４００００ＭＷ  ＰＥＧ−アルデヒドおよびｈＧＨ受容体アンタゴニスト反応混合物（５〜１００ｍｇタンパク質）は、通常、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．１（緩衝液Ａ）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｔｒａｐカラム（１ｍＬまたは５ｍＬ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、またはＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラム（２６／２０、７０ｍＬベッド容積）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて上述の通り精製した。反応混合物を緩衝液Ａで５〜１０倍に希釈し、流速２．５ｍＬ／分でカラムに添加した。８カラム容積の緩衝液Ａでカラムを洗浄した。続いて、様々なｈＧＨ分子種を、８０〜１００カラム容積の緩衝液Ａおよび０〜２００ｍＭの直線ＮａＣｌ勾配中にカラムから溶出させた。溶出液を２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０）でモニターし、画分を収集した。ペグ化の程度、例えば、モノ、ジに従って画分をプールした。その後、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｎｏｒｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）中でプールを０．５〜５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。プールのタンパク質濃度は、消衰係数０．７８を用いて、Ａ２８０によって測定した。この過程からの精製されたモノ分岐４００００ＭＷ  ＰＥＧ−アルデヒドの総収率は４４％であった。
【０１１５】
陽イオン交換クロマトグラフィー
陽イオン交換クロマトグラフィーは、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０（緩衝液Ｂ）で平衡化した、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ高性能カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ＸＫ２６／２０、７０ｍｌベッド容積））で行った。反応混合物を緩衝液Ｂで１０倍に希釈し、流速５ｍＬ／分でカラムに添加した。次に、カラムを、５カラム容積の緩衝液Ｂで、それに続いて５カラム容積の１２％緩衝液Ｃ（１０ｍＭ酢酸ｐＨ４．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。続いて、１２〜２７％の直線勾配を有する２０カラム容積の緩衝液Ｃで、ＰＥＧ−ｈＧＨ分子種をカラムから溶出する。溶出液を２８０ｎｍでモニターし、１０ｍＬの画分を収集した。ペグ化の程度（モノ、ジ、トリなど）に従って画分をプールし、１０ｍＭ酢酸ｐＨ４．５緩衝液で交換し、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜を装着した撹拌セルの中で１〜５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。プールのタンパク質濃度は、消衰係数０．７８を用いてＡ２８０ｎｍによって測定する。
【０１１６】
（実施例７）
生化学的特徴付け
精製されたペグ化ｈＧＨ受容体アンタゴニスト結合体の特徴付けを、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、未変性サイズ排除クロマトグラフィー、分析的陰イオン交換クロマトグラフィー、Ｎ末端シーケンシング、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ならびに逆相ＨＰＬＣによって行った。
【０１１７】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
未変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ
ｈＧＨ受容体アンタゴニスト、陰イオン交換精製プール、および最終精製産物を用いた、様々な大きさおよび形状の反応の評価を、未変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて行った。分析的未変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを、Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｇ４０００ＰＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、７．８ｍｍ×３０ｃｍを用いて、２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中、流速０．５ｍＬ／分で行った。ペグ化によってタンパク質の水力学的体積が大きく増大し、その結果、保持時間が短い方にシフトする。ＰＥＧメトキシ分枝４００００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチルアルデヒドｈＧＨ受容体アンタゴニスト反応混合物中に、無修飾のｈＧＨ受容体アンタゴニストと共に新しい分子種が観察された。これらのペグ化および非ペグ化分子種を、Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーで分離し、続いて、この結果得られた精製されたモノ分岐４００００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチルアルデヒドｈＧＨ受容体アンタゴニスト分子種が、未変性ＳＥＣで単一ピークとして溶出する（＞９５％純度）ことを示した（図２ｂ）。Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーステップによって、遊離のＰＥＧ、ｈＧＨ受容体アンタゴニスト、およびジペグ化ｈＧＨ受容体アンタゴニスト分子種が、モノペグ化ｈＧＨ受容体アンタゴニストから効果的に除去された（図２ａ）。未変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、様々なペグ化−ｈＧＨ受容体アンタゴニストの実際のサイズが、それらそれぞれの理論上の分子量よりはるかに大きいことを実証した。
【０１１８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用いて、ｈＧＨ受容体アンタゴニストとの分岐４００００ＭＷ  ＰＥＧ−アルデヒドの反応、および精製最終産物を評価した（データは示されていない）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、厚さ１ｍｍの１０〜２０％トリス−トリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、還元条件および非還元条件下で行い、Ｎｏｖｅｘ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標）Ｇ−２５０染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて染色した。精製されたモノ分岐ＰＥＧ−アルデヒドｈＧＨ分子種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで１本の主要バンドとして移動する。
【０１１９】
分析的陰イオン交換ＨＰＬＣ
メトキシ分枝した４００００ＭＷ  ＰＥＧ−アルデヒドの、ｈＧＨ受容体アンタゴニストとの反応、陰イオン交換精製画分、および最終精製産物の評価を、分析的陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて行った。分析的陰イオン交換ＨＰＬＣは、Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｑ５ＰＷまたはＤＥＡＥ−ＰＷ陰イオン交換カラム（Ｔｏｓｏｈａａｓ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、７．５ｍｍ×７５ｍｍを用いて、５０ｍＭトリス、ｐｈ８．６中、流速１ｍＬ／分で行った。試料は５〜２００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配で溶出した。
【０１２０】
Ｎ末端配列およびペプチドマッピング
ＮＨ２末端タンパク質配列を決定するために、自動エドマン分解化学を用いた。この分解に、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４９４型Ｐｒｏｃｉｓｅシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ、ＭＡ）を用いた。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｂｒｏｗｎｌｅｅ内径２．１ｍｍ  ＰＴＨ−Ｃ１８カラムを装着したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  １４０Ｃ型ＰＴＨ分析器を用いたオンライン方式の逆相ＨＰＬＣ分析によって各ＰＴＨ−ＡＡ誘導体を同定した。ＰＶＤＦ膜に転写された分岐４００００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチルアルデヒドヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストバンド、または精製された２０Ｋ線状およびメトキシ分枝４００００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチルアルデヒドｈＧＨ受容体アンタゴニスト結合体の溶液の配列を決定した。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】ｈＧＨ受容体アンタゴニストＢ２０３６のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】分岐した４０ｋ  ＡＬＤ−Ｂ２０３６結合体のサイズ排除クロマトグラムである。図ａは、反応混合物のクロマトグラムである。保持時間１９．８８３のピーク２は、ジペグ化産物である。保持時間３３．８８３のピーク４は、未反応Ｂ２０３６タンパク質である。図ｂは、精製されたモノペグ化産物のクロマトグラムであり、保持時間２２．７００の単一ピークを示している。
【図３】Ｎ末端でモノペグ化された３０Ｋ  ＡＬＤ−Ｂ２０３６結合体を１回、皮下投与（０．３ｍｐｋまたは１．０ｍｐｋ）した後の、マカクザルのＩＧＦ−１レベルを示す図である。
【図１】
2007522198.tif 000010
【図２】
2007522198.tif 000011
【図３】
2007522198.tif 000012
【配列表】
2007522198000001.xml
【国際調査報告】
2007522198.tif 000015
2007522198.tif 000016
2007522198.tif 000017
2007522198.tif 000018
2007522198.tif 000019
2007522198.tif 000020
2007522198.tif 000021