(57)【要約】  本発明は、エアロゾール伝達方式で遺伝子を伝達するための生体高分子／遺伝子複合体に関する。本発明に係る生体高分子／遺伝子複合体は、一次アミノ酸の一部が糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み、前記ポリエチレンイミンの含量が前記所定の遺伝子の含量の２乃至４倍である。本発明に係るエアロゾール伝達用肺癌治療剤は、３０〜４０モル％の一次アミノ酸が葡萄糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びＰＴＥＮをコーディングする遺伝子を含む生体高分子／遺伝子複合体を含み、前記生体高分子／遺伝子複合体において前記ポリエチレンイミンの含量が前記遺伝子の含量の２乃至４倍である。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の遺伝子をエアロゾール伝達方式で伝達するための生体高分子／遺伝子複合体において、
前記生体高分子が、
一次アミノ酸の一部以上が糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み、
前記ポリエチレンイミンの含量が前記所定の遺伝子の含量の２乃至４倍であることを特徴とする生体高分子／遺伝子複合体。
【請求項２】
前記ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に含まれる一次アミノ酸の３０〜４０モル％が糖に置換されたことを特徴とする請求項１に記載の生体高分子／遺伝子複合体。
【請求項３】
前記一次アミノ酸が葡萄糖または葡萄糖類似体に置換されることを特徴とする請求項１又は２に記載の生体高分子／遺伝子複合体。
【請求項４】
前記一次アミノ酸が１８Ｆ-ＦＤＧに置換されることを特徴とする請求項３に記載の生体高分子／遺伝子複合体。
【請求項５】
前記遺伝子がＰＴＥＮをコーディングする遺伝子を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の生体高分子／遺伝子複合体。
【請求項６】
３０〜４０モル％の一次アミノ酸が葡萄糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、及び
ＰＴＥＮをコーディングする遺伝子を含む生体高分子／遺伝子複合体を含み、
前記生体高分子／遺伝子複合体において前記ポリエチレンイミンの含量が前記遺伝子の含量の２乃至４倍であることを特徴とする遺伝子エアロゾール伝達用肺癌治療剤。
【請求項７】
所定の遺伝子をエアロゾール伝達方式で伝達するための生体高分子／遺伝子複合体の製造方法において、
前記生体高分子に、一次アミノ酸の一部以上が糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むようにし、
前記ポリエチレンイミンの含量を前記所定の遺伝子の含量の２乃至４倍となるようにし、
前記生体高分子と前記遺伝子とを結合させることを含むことを特徴とする生体高分子／遺伝子複合体の製造方法。
【請求項８】
前記ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に含まれる一次アミノ酸の３０〜４０モル％が糖に置換されるようにすることを特徴とする請求項７に記載の生体高分子／遺伝子複合体の製造方法。
【請求項９】
前記一次アミノ酸が葡萄糖または葡萄糖の類似体に置換されるようにすることを特徴とする請求項７に記載の生体高分子／遺伝子複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記一次アミノ酸が葡萄糖または葡萄糖の類似体に置換されるようにすることを特徴とする請求項７又は８に記載の生体高分子／遺伝子複合体の製造方法。
【請求項１１】
前記一次アミノ酸が１８Ｆ-ＦＤＧに置換されるようにすることを特徴とする請求項１０に記載の生体高分子／遺伝子複合体の製造方法。
【請求項１２】
前記遺伝子がＰＴＥＮをコーディングする遺伝子を含むようにすることを特徴とする請求項７又は８に記載の生体高分子／遺伝子複合体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子／遺伝子複合体に関し、より詳細には、遺伝子をエアロゾール方式で伝達するための生体高分子／遺伝子複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
人体腫瘍の約３０％において、ｒａｓ遺伝子の突然変異が発見されている。この遺伝子群には、Ｋ-ｒａｓ、Ｎ-ｒａｓ、及びＨ-ｒａｓなどの３つの遺伝子が存在するが、Ｋ-ｒａｓ突然変異は、肺の悪性線種において最も頻繁に発見される。このような突然変異を有しているマウスには、最もありふれた非小細胞肺癌の組織病変が現れ、短い潜伏期と高い浸透率を示す。
【０００３】
ホスファチジルイノシトール（３，４，５）-トリホスフェートの第３番のイノシトールリングのリン酸化を特異的に触媒する第１０番の染色体上のホスファターゼ及びテンシン同族体結実（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome １０；以下、「ＰＴＥＮ」という）は、Ａｋｔ信号伝達経路を抑制し、細胞成長と生存を調節することによって、抗癌遺伝子としての役割をすることが知られている。
【０００４】
Ａｋｔは、Ｒａｓ遺伝子の成長要素を活性化させたり、ＰＴＥＮを不活性化させることによって、癌細胞において活性化されるという事実が知られている。
【０００５】
最近の報告では、非小細胞肺癌の約９０％がＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の持続的な活性化と関連しており、このようなＡｋｔの活性化は、細胞の生存や、化学療法又はγ照射に対する抵抗性を増加させるという事実が発表された。
【０００６】
しかも、Ｋ-ｒａｓ突然変異は、Ａｋｔの活性化により肺の悪性線種の活動性を増加させることができる。
【０００７】
上述のような事実から、肺癌治療のために、Ａｋｔ信号伝達を調節する方法が求められている。
【０００８】
一方、肺癌治療のために、吸入により遺伝子を伝達する方法が知られている。
【０００９】
組換えアデノウイルスベクトル（adenoviral vector）は、気道上皮への高い親和性と、肺細胞への効率的な伝達性を有することから、効果的な遺伝子伝達体として使われている。
【００１０】
しかし、組換えアデノウイルスのような組換えウイルスベクトルは、その毒性、反復投与による免疫反応、大量生産の困難性に起因して、実際的な適用には限界があった。
【００１１】
非-ウイルスベクトル（non-viral vector）は、ウイルスベクトルに比べて使用しやすく、免疫反応をあまり引き起こさないという利点を有する。また、これらは、高い分子量のＤＮＡ分子をも伝達できる能力を含む。
【００１２】
最近、いくつかの研究は、ポリリシン（polylysine）、ポリエチレンイミン（polyethylenimine（ＰＥＩ））、プロタミン（protamine）、及びヒストン（histone）のようなカチオンを有するポリペプチド（polypeptide）とＤＮＡの結合が、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方において有用な遺伝子伝達方法となることができると開示している。
このようなポリペプチドのうち、ＰＥＩは、エアロゾール（aerosol）方式に安定しているという長所を有するため、遺伝子伝達のための伝達体として注目されている。しかし、ＰＥＩの使用は、ポリカチオン（poly-cation）の特徴的な蓄積による強い毒性に留意しなければならない。
【００１３】
多くの研究者は、噴霧（nebulization）によって肺と肺リンパ節に直接的な、多様な治療剤の伝達に対する可能性を研究してき、ＰＥＩを遺伝子治療伝達剤としての使用を試みているが、ＰＥＩは、蓄積されて潜在的毒性を誘発することが報告されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、遺伝子伝達体としてのポリペプチドを使用するために、細胞面に対する付着、エンドサイトシス（endocytosis）、エンドソマルリソソマルネットワーキング（endosomal lysosomal network）からの分離、細胞核内への移動、ベクトル-アンパッキング（vector-unpacking）などが必ず要求される。
【００１５】
したがって、このような要件を満足する効率的で且つ安定性を有するエアロゾール遺伝子伝達体の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、生体高分子／遺伝子複合体を提供する。
【００１７】
また、本発明は、生体高分子／遺伝子複合体を用いて所望の遺伝子を伝達する方法を提供する。
【００１８】
また、本発明は、効果的なエアロゾール伝達を達成することができ、且つ毒性を減少させた生体高分子／遺伝子複合体を提供する。
【００１９】
また、本発明は、生体高分子／遺伝子複合体を用いて癌抑制遺伝子をエアロゾール伝達方式で伝達する方法を提供する。
【００２０】
上記技術的課題を解決するために、本発明の一態様に係る生体高分子／遺伝子複合体は、一次アミノ酸の一部が糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含み、前記所定の遺伝子の含量の２乃至４倍のポリエチレンイミンの含量を含む。
【００２１】
本発明の他の態様に係るエアロゾール伝達用肺癌治療剤は、３０〜４０モル％の一次アミノ酸が葡萄糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びＰＴＥＮをコーディングする遺伝子を含む生体高分子／遺伝子複合体を含み、前記所定の遺伝子の含量の２乃至４倍のポリエチレンイミンの含量を含む。
【００２２】
本発明のさらに他の態様に係る所定の遺伝子をエアロゾール伝達方式で伝達するための生体高分子／遺伝子複合体の製造方法は、生体高分子に一次アミノ酸の一部以上が糖に置換されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含むようにし、前記ポリエチレンイミンの含量を前記所定の遺伝子の含量の２乃至４倍となるようにし、前記生体高分子と前記遺伝子とを結合させることを含む。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、高分子に糖を適切に結合させることによって、細胞への伝達効率性と安定性を増加させた、遺伝子のエアロゾール伝達方法を提供することができる。
【００２４】
本発明の生体高分子／遺伝子複合体のエアロゾール伝達によるＰＴＥＮの伝達がＰＤＫ１を抑圧して、Ａｋｔキナーゼ活性を抑制することができ、結局窮極的に、腫瘍活性を抑制することができるという効果を達成することができる。
本発明の生体高分子／遺伝子複合体のエアロゾール伝達によるＰＴＥＮの伝達が、ｍＴＯＲを含むＡｋｔ経路だけでなく、ｍＴＯＲに依存したｅＩＦ４Ｅ-ＢＰ１にも影響を与えることによって、肺癌増殖を效果的に抑制することができるという効果を達成することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
目標遺伝子の伝達方法の１つであるエアロゾール伝達方法は、遺伝子を広範囲な表面に適用することができ、他の経路の投与方法で発生し得る潜在的危険性を避けることができるという点から、目標遺伝子の伝達のための効率的で且つ非浸透的な方法であると知られている。
【００２６】
本発明は、特定の遺伝子を效果的にエアロゾール伝達方法に適用するための生体高分子／遺伝子複合体を提供する。特に、本発明の実施例に係る生体高分子／遺伝子複合体は、肺癌治療に有効であることが確認された。
【００２７】
本発明の実施例に係る生体高分子／遺伝子複合体において、生体高分子として、糖質化生体高分子及び遺伝子としてＰＴＥＮをコーディングする遺伝子を含むことができる。
【００２８】
したがって、本発明の実施例に係る生体高分子／遺伝子複合体の一具現例として、糖質化ポリエチレンイミン（以下、「ＧＰＥＩ」という）にＰＴＥＮをコーディングする遺伝子が結合されたＧＰＥＩ／ＰＴＥＮ複合体が挙げられる。
【００２９】
一般的に、ＰＥＩの細胞毒性は、主として、構成１次アミノ酸から誘発されると思われるが、これらは、全体アミノ酸の約３０％を占める。
【００３０】
ＧＰＥＩは、ＰＥＩの毒性を克服するために、ＰＥＩを構成する１次アミノ酸の特定部位を葡萄糖部分（moiety）に置換し、ＰＥＩの親水性を増加させて、ＰＥＩの潜在的毒性を減少させたＰＥＩ誘導体である。
【００３１】
本発明の実施例に係るＧＰＥＩは、本発明の効果を達成できるものなら、糖質化程度に特別な制限がないが、好ましくは、糖置換率が３０〜４０モル％であり、最も好ましくは、糖置換率が約３６モル％である。
【００３２】
また、本発明の実施例において、生体高分子及び遺伝子の結合比率は、本発明の効果を達成できるものなら、特別な制限がないが、ＧＰＥＩ／遺伝子複合体は、好ましくは、ＧＰＥＩと遺伝子が２〜４：１の割合で結合されたものを含む。
【００３３】
肺癌治療のための本発明の一具現例は、ＧＰＥＩに肺癌を抑制する遺伝子を結合して、ＧＰＥＩ／肺癌抑制遺伝子の複合体を製造し、エアロゾール伝達方式で伝達することを含むことができる。この際、肺癌抑制遺伝子としてＰＴＥＮを使用することができる。
【００３４】
また、本発明の実施例に係るＧＰＥＩは、共に結合される遺伝子の伝達活性を強化させることができる。
【００３５】
このようなＧＰＥＩの強化は、一層効果的なポリプレックスアンパッキング（polyplex unpackaging）、変更されたトラフィッキング（trafficking）と、肺細胞大食細胞の攻撃から避難に起因するものと思われる。しかも、代替された葡萄糖分子は、肺腫瘍細胞にＧＰＥＩ／ＰＴＥＮ複合体が選択的に吸収されるように促進する役割をするものと思われる。ＰＥＴは、葡萄糖の類似体である１８Ｆ-ＦＤＧ（fluorine 18 fluorodeoxyglucose）分布のイメージで構成されていて、この物質は、正常組織よりは大部分の腫瘍において多量で蓄積される。
【００３６】
一方、Ａｋｔは、セリン／トレオニンキナーゼ（serine/threonine kinase）で、細胞生存と増殖を起こす信号経路に重要な媒介体として作用する。Ａｋｔは、完全な活性のために、Ｔｈｒ３０８とＳｅｒ４７３のリン酸化を要求する。図３から分かるように、本発明の一実施例に係るＧＥＩ／ＰＴＥＮのエアロゾール伝達結果から分かるように、Ｔｈｒ３０８リン酸化は、Ａｋｔの発現水準を大いに抑制するが、Ｓｅｒ４７３リン酸化は、Ａｋｔの発現水準に影響を与えないものと思われる。
【００３７】
Ａｋｔのアップストリームキナーゼ（upstream kinase）であるＰＤＫ１は、Ｔｈｒ３０８をリン酸化すると知られている。しかし、Ｓｅｒ４７３リン酸化を担当するキナーゼの正体は、未だ正確に知られていない。いくつかの実験結果から、ホスファチジルイノシトール３，４，５-トリホスフェート結合（phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate binding）がＰＤＫ１の膜位置（membranelocalization）とキナーゼ活性に重要であることを推測することができる。
【００３８】
一方、Ａｋｔダウンストリームターゲットの蛋白質水準、すなわち、４ＥＢＰ１及びｐ７０Ｓ６ＫがＰＴＥＮ伝達により影響される。このような結果から分かるように、Ｔｈｒ３０８リン酸化の抑制がＡｋｔダウンストリームターゲットを調節できることを示唆する。最近の報告によれば、ＰＤＫ１は、細胞質-核間の循環蛋白質であり、核内の移動は、ＰＩ３Ｋ経路により調節される。ＰＤＫ１の核内の位置化は、ＰＴＥＮ-欠乏細胞において増加するが、このような事実は、ＰＴＥＮ遺伝子伝達がＡｋｔ信号経路の機能に絶対的に影響を及ぼすことができることを裏付ける。
【００３９】
ＰＤＫ１は、Ａｋｔのリン酸化により抗-細胞自殺（antiapoptosis）に寄与することが知られている。Ａｋｔ活性の抑制が、広範囲なほ乳動物細胞において細胞自殺（apoptosis）を誘導することが報告されている。
【００４０】
また、Ａｋｔは、抗-細胞自殺信号と増殖の活性化だけでなく、細胞浸潤と血管生成の促進により腫瘍の進行に貢献することが知られている。
【００４１】
このような事実から、本発明の実施例に係る生体高分子／遺伝子複合体のエアロゾール伝達によるＰＴＥＮの伝達が、ＰＤＫ１を抑圧して、Ａｋｔキナーゼ活性を抑制し、結局窮極的に、腫瘍活性を抑制できる効果を達成できることを期待することができる。
【００４２】
一方、ＰＩ３ＫのようなＰＴＥＮのダウンストリーム作用基（downstream effectors)は、細胞自殺、浸湿、移動と成長を含む多様な細胞過程を引き起こす多くのダウンストリーム経路を調節することが知られている。
【００４３】
マウスの肺において、ＰＴＥＮ関連蛋白質の増加は、多くの機能的な結果を引き起こす。具体的に、癌細胞においてＰＴＥＮの過発現は、ＰＩ３Ｋの抑制による細胞周期の停止と細胞死滅を引き起こす。
【００４４】
また、ＰＩ３Ｋの抑制が膀胱癌の浸透能を高い水準に減少させるという事実が知られている。
【００４５】
ＰＴＥＮの他の潜在的なダウンストリームターゲットは、翻訳調節に関連した群である４Ｅ-ＢＰ’ｓである。この蛋白質は、これらが結合するｅＩＦ４Ｅに対する親和度を減少させるｍＴＯＲのリン酸化により成長と細胞ストレスに関連した信号伝達経路の作用基（effectors）として活性を有する。
【００４６】
最近、ｍＴＯＲは、細胞調節因子であるＳ６Ｋ１と４Ｅ-ＢＰ１／ｅＩＦ４Ｅによる細胞周期増加を調節し、これは、増加したＰＴＥＮがＫ-ｒａｓ無標識（null）マウス肺癌モデルにおいて細胞増加を変化させることと関連した他の機作を提示できることが知られている。
【００４７】
このような事実から、本発明の実施例に係る生体高分子／遺伝子複合体のエアロゾール伝達によるＰＴＥＮの伝達が、ｍＴＯＲを含むＡｋｔ経路だけでなく、ｍＴＯＲに依存したｅＩＦ４Ｅ-ＢＰ１にも影響を与えることによって、肺癌増殖を效果的に抑制できる効果を達成できることを期待することができる。
【００４８】
以下では、本発明の実施例について、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように、詳細に説明する。しかし、本発明は、いろいろな形態で具現されることができ、ここで説明する実施例に限定されない。
【００４９】
本発明の実施例において使われる抗-ｅＩＦ４Ｅは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）から購入し、抗-ＰＤＫ１は、Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。抗-ＰＴＥＮ、抗-ホスホ-ｍＴＯＲ、及び抗-４Ｅ-ＢＰ１は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ウェスタンブロット分析と免疫組織化学に使われた他の抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。
【００５０】
下記の実施例において、ウェスタンブロット分析の定量化は、Ｍｕｌｔｉ  Ｇａｕｇｅ  ｖｅｒ２．０２  ｐｒｏｇｒａｍ（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ）を使用して行った。ウェスタンブロットの結果に基づいて算出したアクチン（actin）で標準化したリン酸化-Ａｋｔ／全体Ａｋｔ比率は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ-ｔｅｓｔを使用して比較した。
【００５１】
実施例１：ＧＰＥＩ及びＧＰＥＩ／ＤＮＡ複合体製造
ＧＰＥＩは、シアノボロハイドリド（cyanoborohydride）を使用してＰＥＩ（Ｍ．Ｗ．２５Ｋ）とセロバイアス（cellobiose）との反応で製造した。
【００５２】
ＧＰＥＩ内において最適のグルコース置換値を求めるために、多様な濃度の糖置換率（モル％）に対するＡ５４９細胞においてＭＴＴ細胞毒性分析を用いて細胞生存率を調べた。これにより、最適のグルコース置換値に置換されたＧＰＥＩを収得した。
【００５３】
図１は、多様な濃度の糖置換率（モル％）に対するＭＴＴ生体内の（in vivo）細胞毒性試験結果を示す。
【００５４】
図１から、ＰＥＩのほぼ全てのアミノ酸群が還元性アミン化反応によって２次アミノ酸群に変形されたＧＰＥＩが、低い細胞毒性を示すことが分かり、それらのうち３６モル％ＧＰＥＩが最も低い毒性を示すので、本実施例のエアロゾール遺伝子伝達には、３６モル％ＧＰＥＩを使用した。
【００５５】
蒸溜水に１ｍｇのＤＮＡを溶解させ、弱く攪拌しながら、ＧＰＥＩ伝達体を少しずつ点滴して、ＤＮＡとＧＰＥＩ伝達体を１：２．６７の結合割合で混合し、最終体積が５０ｍＬとなるように蒸溜水を補充した。
【００５６】
その後、混合物を室温で３０分間反応させて、ＧＰＥＩ／ＤＮＡ複合体を製造した。ＤＮＡとして、本発明の実施例１で使われるｐｃＤＮＡ３．１-ＧＦＰは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入し、ｐｃＤＮＡ３．０-ＰＴＥＮは、Ｄｒ．Ｗｈａｎｇ（ＵＮＣ  ａｔ  Ｃｈａｐｅｌ  Ｈｉｌｌ）から寄贈された。
【００５７】
その後、ＧＰＥＩ／ＤＮＡ複合体のエアロゾール伝達効率を確認するために、ＧＰＥＩ／ＧＦＰプラスミドＤＮＡに露出された肺組織において免疫組織化学染色を実施した。
【００５８】
図２は、本発明の生体高分子／遺伝子複合体がマウス特異的な大食細胞及び単核細胞に対する免疫組織化学染色分析結果を示す。
【００５９】
図２のａ及びｂにおいて、肺に伝達された本発明の生体高分子／遺伝子複合体は、ＧＰＥＩ／ｐｃＤＮＡ３．１-ＧＦＰであり、図２のｃ及びｄにおいて、伝達された本発明の生体高分子／遺伝子複合体は、ＧＰＥＩ／ｐｃＤＮＡ３．１である。図２のａ及びｃにおいて、標識は、肺細胞の大食細胞と単核細胞により食われたＧＦＰの一部を示し、図２のｂにおいて、標識は、肺細胞内に伝達された大部分のＧＦＰを示す。
【００６０】
図２のように、免疫組織化学染色で観察した結果、一部の少量は、大食細胞や単核区により食われたが、大部分のＧＰＥＩ／ＧＦＰ  ＤＮＡ複合体は、肺細胞内に十分に伝達された。
【００６１】
このような図２から、本発明の実施例に係る生体高分子／遺伝子複合体のエアロゾール伝達方法が效率的に作用したことが分かる。
【００６２】
実施例２：エアロゾール伝達方式を用いたＧＰＥＩ／ＤＮＡ複合体の生体内の伝達
１５週齢の雄性Ｋ-ｒａｓ無標識マウスをＨｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ-ＮＣＩ社（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）から購入し、温度は、２３±２℃に、相対湿度は、５０±２０％に、光照量１２時間に設定して飼育した。マウスをｎｏｓｅ-ｏｎｌｙ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｃｈａｍｂｅｒ（Ｄｕｓｔｕｒｂｏ、Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）（以下、「ＮＯＥＣ」という）に入れて、前記実施例１の複合体をエアロゾール方式でマウスに約３０分間投与した。エアロゾールは、ネブライザ（nebulizer）（＃２０３０４９６４、Ｄｕｓｔｕｒｂｏ）を使用して発生させた。本実施例では、実施例１の方法によって１ｍｇのｐｃＤＮＡ３．０-ＰＴＥＮプラスミドＤＮＡを含む複合体を使用した。エアロゾールにマウスを露出してから２日後、マウスの肺試料を採取した。
【００６３】
実施例３：ウェスタンブロット分析
ＧＰＥＩ／ＰＴＥＮ複合体に露出されたＫ-ｒａｓ無標識マウスにおいてＡｋｔ-関連信号伝達経路の構成要素であるＰＤＫ１、Ａｋｔ１、ＰＴＥＮ、ｍＴＯＲ、４Ｅ-ＢＰ１、及びｐ７０Ｓ６Ｋのような蛋白質発現の変化を調べるために、ウェスタンブロットで分析した。
【００６４】
実施例２から得られた肺試料を溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて均質化し、採取された蛋白質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ-Ｒａｄ社，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて定量した。同量の蛋白質をＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースメンブレイン（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）へ移動させた。その後、メンブレインを１時間ブロッキング（blocking）させた後、室温で２時間特定の抗体と反応させた。洗浄後、メンブレインをＨＲＰが標識されている二次抗体と反応させて、Ｗｅｓｔｚｏｌ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｉｎｔｒｏｎ社，Ｓｕｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）を用いて反応させた。発光されたバンドは、ＬＡＳ-３０００（ＦＵＪＩ  ＦＩＬＭ社、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて確認した。
【００６５】
図３は、本発明の生体高分子／遺伝子複合体を介してＰＴＥＮを伝達した後、Ａｋｔ蛋白質をウェスタンブロット分析した結果を示す。
【００６６】
図３の（ａ）は、ＰＴＥＮが伝達された肺細胞においてウェスタンブロットでＰＴＥＮ、ＰＤＫ１、Ａｋｔ１、Ｔｈｒ３０８リン酸化Ａｋｔ、Ｓｅｒ４７３リン酸化Ａｋｔ、及びＳｅｒ２４４８リン酸化−ｍＴＯＲの蛋白質発現水準分析結果を示す。図３の（ａ）から、ＰＴＥＮ蛋白質の発現水準が、ＰＴＥＮを伝達したマウスにおいて増加することが分かる。図３の（ａ）で、Ｃは、コントロールを、Ｖは、ベクトルコントロールを、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮが伝達された肺を示す。
【００６７】
図３の（ａ）に示すように、肺細胞においてＰＴＥＮの発現は、ＰＴＥＮが伝達されないＫ-ｒａｓとベクトルコントロールに比べて非常に高く増加した。これに対し、図３の（ａ）に示すように、ＰＴＥＮ遺伝子伝達は、ＰＤＫ１、Ａｋｔ１、Ｔｈｒ３０８  ｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔ、及びＳｅｒ２４４８  ｐｈｏｓｐｈｏ-ｍＴＯＲ蛋白質の発現を減少させたが、Ｓｅｒ４７３  ｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔは、何らの変化も認められなかった。
【００６８】
Ａｋｔリン酸化の変化を調べるために、Ａｋｔとｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔ蛋白質の比率を計算した。
【００６９】
図３の（ｂ）は、全体Ａｋｔに対して、リン酸化したＰＴＥＮでのＡｋｔの発現度を示す。図３の（ｂ）に示すように、Ａｋｔ、図３の（ｃ）でリン酸化したＴｈｒ３０８蛋白質の発現水準は、ＰＴＥＮを伝達した肺において有意的に減少することが分かる。しかし、図３の（ｄ）に示すように、リン酸化したＳｅｒ４７３の蛋白質発現水準は変わらないことが分かる。
【００７０】
図３の（ｂ）及び（ｃ）に示すように、全体ＡｋｔとＴｈｒ３０８  ｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔ発現水準は、ＰＴＥＮが伝達された肺においてｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｇｒｏｕｐに比べて有意的に減少した。しかし、図３の（ｄ）に示すように、Ｓｅｒ４７３  ｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔの場合には、ベクトルコントロールとＰＴＥＮが伝達された群との間において有意的な変化が観察されなかった。
【００７１】
結局、ＰＤＫ１、ＡｋｔとＴｈｒ３０８リン酸化Ａｋｔの発現減少が、ＰＴＥＮが伝達された肺において観察されるところ、これからＰＴＥＮがＡｋｔを直接的に調節することが分かる。
【００７２】
図４は、Ａｋｔ信号伝達経路に関与する成分の調節結果を示す。
【００７３】
図４から、本発明の実施例に係る生体高分子／遺伝子複合体によりＰＴＥＮがエアロゾール伝達方式で伝達されたマウスの肺において、４Ｅ-ＢＰ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、及びｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１の発現水準が減少することが分かる。図４において、Ｃは、コントロールを、Ｖは、ベクトルコントロールを、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮが伝達された肺を意味する。
【００７４】
図４に示すように、エアロゾールＰＴＥＮ遺伝子伝達は、コントロールに比べてｐ７０Ｓ６Ｋとｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１蛋白質の発現水準を非常に減少させ、４ＥＢＰ１は、ｃｏｎｔｒｏｌに比べて若干減少させた。
【００７５】
以上より、本発明の実施例に係るエアロゾール伝達システムがＰＴＥＮ蛋白質発現水準の増加を引き起こし、このような増加がＡｋｔ信号伝達に関連した蛋白質の活性減少と関連があるという事実を提示する。
【００７６】
実施例４：免疫沈殿及びキナーゼ分析
ＡｋｔまたはｍＴＯＲのリン酸化減少は、通常、キナーゼ（kinase）活性の減少に関連している。このような事実が、増加されたＰＴＥＮに対する反応に起因する場合なのか否かを確認するために、マウスの肺組織においてｍＴＯＲとＡｋｔを免疫沈殿させて、各々の基質であるＰＨＡＳ  ＩとＧＳＫを用いてｋｉｎａｓｅ活性を調べた。
【００７７】
実施例２で得られた肺試料に対してＳｅｉｚｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてｍＴＯＲの免疫沈殿を実施した。ｍＴＯＲキナーゼ分析は、３００μＭのＡＴＰと１μｇのＰＨＡＳ  Ｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて３０分間３０℃で実施した。５倍サンプルバッファを追加して沸かすことによって、反応を停止させた。試料は、１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分析した。
【００７８】
Ａｋｔのキナーゼ活性は、製造社の指示に応じてＡｋｔキナーゼ分析キット（Cell Signaling Technology）で分析した。
【００７９】
図５は、ｐ-ＧＳＫ、Ａｋｔ、ｐ-４ＥＢＰ１及びｍＴＯＲのキナーゼ活性分析の結果を示す。
【００８０】
図５から、ＰＴＥＮが伝達されたマウスの肺において蛋白質のキナーゼ活性がコントロールに比べて減少することが分かる。図５において、Ｃは、コントロールを、Ｖは、ベクトルコントロールを、ＰＴＥＮは、ＰＴＥＮが伝達された肺を意味する。
【００８１】
その結果、図５に示すように、Ａｋｔの活性は、ＰＴＥＮが伝達されたマウスの肺において極めて減少したが、ｍＴＯＲの活性は、若干減少したことが分かる。
【００８２】
実施例５：免疫組織化学分析
肺でのＡｋｔとｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔ（Ｔｈｒ  ａｎｄ  Ｓｅｒ）の発現水準を確認するために、免疫組織化学分析を実施した。
【００８３】
実施例２で得られた肺試料を直ちに氷に冷却させた４％ホスフェートバッファホルムアルデヒドで貫流固定させた後、室温で固定させた。その後、肺試料を室温で３０％スクロースに入れて一夜脱水させた後、Ｔｉｓｓｕｅ-Ｔｅｋ  ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ社，Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で埋め込み（embedding）した。Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ（Ｌｅｉｃａ社，Ｎｕｓｓｌｏｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて５マイクロメーターで肺試料組織を切断した後、正電荷でチャージされたスライド（Ｆｉｓｈｅｒ社，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に載置した。肺試料の凍結切片から内在性過酸化酵素の活性を除去するために、０．３％過酸化水素（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ社，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で３０分間反応させた。
【００８４】
エアロゾール方式の遺伝子伝達の効率を測定するための免疫蛍光染色のために、スライドを室温で１時間ブロッキングし、非特異的な結合部位を遮断した。
【００８５】
４℃でｒａｔ抗-マウス大食細胞／単核区抗体（ＭＯＭＡ，ＳｅｒｏＴｅｃ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）を組織セクションに一夜反応させた。翌日、組織セクションを洗浄し、暗室で抗-ｒａｔ  ＩｇＧテトラメチロダミン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）イソチオシアネート複合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と１時間室温で反応させた。
【００８６】
洗浄後、ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（ＢＤＨ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）を用いてカバースリップ（coverslips）をマウントし、蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）下で観察した。Ａｋｔとｐ-Ａｋｔの免疫組織化学染色のために、スライドを室温で１時間間ブロッキングして非特異的な結合部位を遮断した。４℃で１次抗体を組織セクションと１夜反応させた。
【００８７】
翌日、組織セクションを洗浄し、二次ＨＲＰ-複合抗体と１時間室温で反応させた。洗浄後、ＤＡＢ溶液［０．０５％３，３’-ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（Ｂｉｏｓｅｓａｎｇ，Ｓｕｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）と０．０３％過酸化水素］で５〜１０分間反応させた。核を標識するために、組織セクションをＤＡＫＯＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ，Ｍａｙｅｒ’ｓ（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で反対染色した後、キシレンで洗浄した。Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてカバースリップをマウントし、光学顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）下で観察した。
【００８８】
図６は、Ａｋｔのリン酸化に対する免疫組織化学分析の結果を示す。
【００８９】
図６において、反応による標識は、褐色に現れ、ＡｋｔとＴｈｒ３０８ｐｈｏｓｐｈｏ-Ａｋｔは、ＰＴＥＮが伝達されたマウスの肺（Ｂ及びＤ）に比べて、ベクトルコントロールマウスが肺（Ａ及びＣ）において高く発現された。しかし、Ｓｅｒ４７３がリン酸化したＡｋｔの場合には、２つの群の差異が現れなかった（Ｅ及びＦ）。
【００９０】
実施例６：細胞自殺の分析
Ａｋｔ経路の阻害に起因する潜在的な影響の１つは、細胞自殺（apoptosis）の誘導である。本発明の実施例１に係るエアロゾール伝達複合体を介して伝達されたＰＴＥＮが細胞自殺を誘導するか否かを確認するために、ベクトルコントロールとＰＴＥＮ遺伝子を伝達した肺細胞を固定し、ＴＵＮＥＬ  ａｓｓａｙを実施した。
【００９１】
実施例２で得られた肺試料組織をスライド上に位置させ、固定液（４％ＰＢＳ中、パラホルムアルデヒド、ｐＨ７．４）で固定した後、ＰＢＳで洗浄した。その後、肺試料組織を氷上で２分間０．１％トリトンＸ-１００（０．１％ＰＢＳ中、ソジウムシトレート）で透過化（permeabilization）させた。その後、スライドをＰＢＳで洗浄し、絶たれたＤＮＡ末端を製造社の指示に応じてｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙ-Ｕ  ｎｉｃｋ  ｅｎｄ  ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）方法で標識した。最後に、組織セクションをメチルグリーン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で対照染色した。
【００９２】
図７は、ＴＵＮＥＬ分析結果を示す。
【００９３】
図７に示すように、細胞自殺信号（暗褐色）がベクトルコントロール（Ａ）に比べて、エアロゾール伝達方式によりＰＴＥＮが伝達された肺（Ｂ）において明確に観察された。
【００９４】
以上より、エアロゾール伝達複合体を介して伝達されたＧＰＥＩ／ＰＴＥＮによるｉｎ  ｖｉｖｏ上での細胞自殺が誘導される機能は、このような遺伝子伝達方式が細胞機能を変化させることができるという事実を提示した。
【００９５】
以上のように、上記実施の形態を参照して詳細に説明され図示されたが、本発明は、これに限定されるものでなく、このような本発明の基本的な技術的思想を逸脱しない範囲内で、当業界の通常の知識を有する者にとっては、他の多くの変更が可能であろう。また、本発明は、添付の特許請求の範囲により解釈されるべきであることは言うまでもない。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】多様な濃度の糖置換率（モル％）に対するＭＴＴ生体内の細胞毒性試験結果を示す。
【図２】生体高分子／遺伝子複合体に対するマウス特異的大食細胞及び単核細胞に対する免疫組織化学染色分析結果を示す。
【図３】生体高分子／遺伝子複合体を介してＰＴＥＮを細胞組織に伝達した後、細胞組織のＡｋｔ蛋白質をウェスタンブロット分析した結果である。
【図４】Ａｋｔ信号伝達経路に関与する成分の調節結果を示す。
【図５】ｐ-ＧＳＫ、Ａｋｔ、ｐ-４ＥＢＰ１及びｍＴＯＲのキナーゼ活性分析の結果を示す。
【図６】Ａｋｔのリン酸化に対する免疫組織化学分析結果を示す。
【図７】ＴＵＮＥＬ分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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