(57)【要約】  本発明は、ＣＤ２３に結合可能な新規のそして有用なペプチドおよびペプチド模倣体を含む化合物を記載する。これらは、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー、および哺乳動物免疫系に仲介されるものなどの他の炎症状態に関連する炎症反応を減少させることが可能である。本発明の化合物は、ＣＤ２３結合性ペプチドであって、前記ペプチドが、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8のアミノ酸配列（式中、Ｘ1は、Ｐｈｅであるか、または存在せず；Ｘ2は、ＨｉｓまたはＡｌａであり；Ｘ3は、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＣｙｓであり；Ｘ4は、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＡｌａであり；Ｘ5は、Ｔｒｐであり；Ｘ6は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＬｙｓであり；Ｘ7は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎであるか、または存在せず；そしてＸ8は、Ｐｈｅ、Ｇｌｙであるか、または存在しない）を含む、前記ペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２３結合性ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8のアミノ酸配列：
式中、
Ｘ1は、Ｐｈｅであるか、または存在せず；
Ｘ2は、ＨｉｓまたはＡｌａであり；
Ｘ3は、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＣｙｓであり；
Ｘ4は、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＡｌａであり；
Ｘ5は、Ｔｒｐであり；
Ｘ6は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＬｙｓであり；
Ｘ7は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎであるか、または存在せず；そして
Ｘ8は、Ｐｈｅ、Ｇｌｙであるか、または存在しない
を含む、前記化合物。
【請求項２】
Ｘ1がＰｈｅであり、Ｘ2がＨｉｓであり、Ｘ6がＰｒｏであり、そしてＸ8が存在しない、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号２）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ（配列番号３）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号４）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号５）；および
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号６）
からなる群より選択される、請求項２記載のペプチド。
【請求項４】
Ｘ1が存在せず、Ｘ2がＨｉｓであり、Ｘ4がＡｓｎであり、Ｘ6がＰｒｏであり、そしてＸ7がＳｅｒである、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8
Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号７）；
Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号８）；および
Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号９）
からなる群より選択される、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１０）
である、請求項１記載のペプチド。
【請求項７】
Ｎ末端を含み、そして前記Ｎ末端がアシル化されている、請求項１〜６記載のペプチド。
【請求項８】
前記Ｎ末端がアセチル化されている、請求項７記載のペプチド。
【請求項９】
Ｃ末端を含み、そして前記Ｃ末端がアミド化されている、請求項１〜６記載のペプチド。
【請求項１０】
請求項１〜６記載のペプチドを含むポリペプチドであって、約６〜約１００アミノ酸を含む、前記ポリペプチド。
【請求項１１】
約６〜約７０アミノ酸を含む、請求項１０記載のポリペプチド。
【請求項１２】
約６〜約１５アミノ酸を含む、請求項１１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
少なくとも約１０-6Ｍの、ＣＤ２３に対する特異的結合を有する、請求項１〜６および１０記載の化合物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項記載の少なくとも１つの化合物、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
【請求項１５】
ＣＤ２３の生物学的活性に関連する疾患または障害の治療または予防のための薬剤製造法であって、前記薬剤の製造に、請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物を取り込むことを含む、前記方法。
【請求項１６】
疾患または障害が、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患およびアレルギーからなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患または障害が、関節炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、糖尿病、ブドウ膜炎、皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、アレルギー、アレルギー性喘息、内因性喘息、急性喘息再燃、鼻炎、湿疹、子宮内膜症、移植片対宿主病（ＧＶＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵島炎、気管支炎（特に慢性気管支炎）、糖尿病（特に１型糖尿病）、Ｂ−ＣＬＬおよび他のＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞機能不全に関連する疾患、並びにパーキンソン病からなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
ＣＤ２３の生物学的活性に関連する疾患または障害の治療法または予防法であって、前記疾患または障害を有する被験者を提供し、そして請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物で前記被験者を治療する、前記方法。
【請求項１９】
疾患または障害が、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患およびアレルギーからなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患または障害が、関節炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、糖尿病、ブドウ膜炎、皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、アレルギー、アレルギー性喘息、内因性喘息、急性喘息再燃、鼻炎、湿疹、子宮内膜症、移植片対宿主病（ＧＶＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵島炎、気管支炎（特に慢性気管支炎）、糖尿病（特に１型糖尿病）、Ｂ−ＣＬＬおよび他のＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞機能不全に関連する疾患、並びにパーキンソン病からなる群より選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ａ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｂ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列に、少なくとも約８３％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
ｃ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片；および
ｄ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項２１のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号１１〜２０の配列を有する、請求項２２の単離ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項２３のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４の組換えポリヌクレオチドで形質転換された、細胞。
【請求項２６】
請求項２４の組換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック生物。
【請求項２７】
請求項２１のポリペプチドを産生する方法であって：
ａ）組換えポリヌクレオチドで細胞を形質転換し、ここで前記組換えポリヌクレオチドは請求項２１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたプロモーター配列を含む；
ｂ）ポリペプチドの発現に適した条件下で、前記細胞を培養し；そして
ｃ）こうして発現されたポリペプチドを回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項２８】
ａ）配列番号１１〜２０のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）ａ）のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチド；および
ｃ）ａ）またはｂ）のＲＮＡ同等物
からなる群より選択される配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
ＣＤ２３の生物学的活性に関連する状態または疾患に関する、生物学的試料における診断試験であって：
ａ）請求項２１のポリペプチドと生物学的試料を、該ポリペプチドがＣＤ２３に結合し、そして複合体を形成するのに適した条件下で合わせ；そして
ｂ）複合体を検出する、ここで複合体の存在は、生物学的試料におけるＣＤ２３の存在と相関する
工程を含む、前記方法。
【請求項３０】
請求項２２記載の配列を含む発現ベクターであって、前記ポリヌクレオチドを発現可能である、前記ベクター。
【請求項３１】
請求項２２記載の発現ベクターおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
【請求項３２】
検出可能マーカーで標識されている、請求項２１のポリペプチド。
【請求項３３】
ＣＤ２３の検出法であって：
ｂ）請求項３２のポリペプチドで前記試料を処理し；そして
ｄ）前記試料に結合した前記ポリペプチドの量を検出する
ことを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記試料が細胞を含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
請求項１〜６記載のペプチドのペプチド模倣体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）。
【請求項３６】
Ｄ−異性体である少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項３５記載のペプチド模倣体。
【請求項３７】
逆反転（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｔｅｄ）ペプチドである、請求項３５記載のペプチド模倣体。
【請求項３８】
Ｄ−アミノ酸配列：ｓｐｗｎｅｈを含む、請求項３７記載のペプチド模倣体。
【請求項３９】
環状である、請求項３５のペプチド模倣体。
【請求項４０】
少なくとも約１０-6Ｍの、ＣＤ２３に対する特異的結合を有する、請求項３５記載の化合物。
【請求項４１】
請求項３５記載の少なくとも１つの化合物、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
【請求項４２】
ＣＤ２３の生物学的活性に関連する疾患または障害の治療または予防のための薬剤製造法であって、前記薬剤の製造に、請求項３５記載の化合物を取り込むことを含む、前記方法。
【請求項４３】
疾患または障害が、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患およびアレルギーからなる群より選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患または障害が、関節炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、糖尿病、ブドウ膜炎、皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、アレルギー、アレルギー性喘息、内因性喘息、急性喘息再燃、鼻炎、湿疹、子宮内膜症、移植片対宿主病（ＧＶＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵島炎、気管支炎（特に慢性気管支炎）、糖尿病（特に１型糖尿病）、Ｂ−ＣＬＬおよび他のＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞機能不全に関連する疾患、並びにパーキンソン病からなる群より選択される、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
ＣＤ２３の生物学的活性に関連する疾患または障害の治療法または予防法であって、前記疾患または障害を有する被験者を提供し、そして請求項３５記載の化合物で前記被験者を治療する、前記方法。
【請求項４６】
疾患または障害が、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患およびアレルギーからなる群より選択される、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患または障害が、関節炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、糖尿病、ブドウ膜炎、皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、アレルギー、アレルギー性喘息、内因性喘息、急性喘息再燃、鼻炎、湿疹、子宮内膜症、移植片対宿主病（ＧＶＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵島炎、気管支炎（特に慢性気管支炎）、糖尿病（特に１型糖尿病）、Ｂ−ＣＬＬおよび他のＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞機能不全に関連する疾患、並びにパーキンソン病からなる群より選択される、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
ＣＤ２３の生物学的活性に関連する状態または疾患に関する、生物学的試料における診断試験であって：
ａ）請求項３４のペプチド模倣体と生物学的試料を、該ペプチド模倣体がＣＤ２３に結合し、そして複合体を形成するのに適した条件下で合わせ；そして
ｂ）複合体を検出する、ここで複合体の存在は、生物学的試料におけるＣＤ２３の存在と相関する
工程を含む、前記方法。
【請求項４９】
検出可能マーカーで標識されている、請求項３５のペプチド模倣体。
【請求項５０】
ＣＤ２３の検出法であって：
ａ）試料を提供し；
ｂ）請求項４９のペプチド模倣体で前記試料を処理し；
ｃ）前記試料に結合していない前記ペプチド模倣体を除去し；そして
ｄ）前記試料に結合した前記ペプチド模倣体の量を検出する
ことを含む、前記方法。
【請求項５１】
表１および表２に列挙されるペプチドおよびペプチド模倣体からなる群より選択される、単離ポリペプチドまたはペプチド模倣体。
【請求項５２】
構造
Ａｃ−ｗ−ｎ−ＣＯ2Ｈ
を含む、請求項５１記載のペプチド模倣体。
【請求項５３】
請求項５１のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項５４】
請求項５３のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたプロモーター配列を含む、組換えポリヌクレオチド。
【請求項５５】
請求項５４の組換えポリヌクレオチドで形質転換された、細胞。
【請求項５６】
請求項５１記載の少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチド模倣体、および薬学的に許容しうるキャリアーを含む、薬剤組成物。
【請求項５７】
ＣＤ２３の生物学的活性に関連する疾患または障害の治療または予防のための薬剤製造法であって、前記薬剤の製造に、請求項５１記載のポリペプチドまたはペプチド模倣体を取り込むことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＣＤ２３（ＦＣεＲＩＩ）分子に結合する新規ペプチドおよびペプチド模倣体、こうしたペプチドおよびペプチド模倣体を含有する薬剤組成物、並びに療法におけるその使用に関する。
報告されている成果
ＣＤ２３は、最初は、ＩｇＥに対する、Ｂリンパ球上の低親和性受容体（ＦＣεＲＩＩ）と記載され、続いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ活性化に際して、単球／マクロファージ、好酸球、血小板、Ｔ細胞、並びに上皮細胞のサブセット上で見出された。ＣＤ２３は、Ｃ型レクチンファミリーのＩＩ型分子である。可溶性ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）分子は、膜貫通受容体のタンパク質分解的切断によって形成される。ＣＤ２３は、細胞接着の仲介、ＩｇＥおよびヒスタミン放出の制御、アポトーシスからのＢ細胞の救出、並びに骨髄細胞およびリンパ球増殖の制御を含む、多面的活性を有する。これらの機能的活性は、細胞に会合したＣＤ２３またはｓＣＤ２３が特異的リガンドに結合することを通じて仲介され、後者はサイトカイン様の方式で作用する。ＩｇＥに加えて、ＣＤ２３は、ＣＤ２１、ＣＤ１１ｂ／ｃ、インテグリン、ＣＤ４７／ビトロネクチン、およびそのレクチンドメインを誘発する糖タンパク質などの多様な生物学的リガンドに結合する能力を有する。ＣＤ２３は、ヒト染色体１９上に位置する単一の遺伝子にコードされる。この遺伝子は、約１３ｋｂを有し、そして１１のエクソンからなる。６アミノ酸異なる２つの異性体、ＣＤ２３ａおよびＣＤ２３ｂがヒトＣＤ２３遺伝子にコードされる。ＣＤ２３ａは、Ｂ細胞系譜から発現され、一方、ＣＤ２３ｂは、Ｂ細胞および他のヒト細胞上に見られる。
【０００２】
大部分のヒト炎症性疾患は、直接または間接的に、多様な仲介因子を産生する能力を通じて、マクロファージ活性化を伴う。大部分の抗炎症療法は、これらの細胞の機能を阻害するか、またはその産物の１つを阻害するように確立された。感染性病原体、腫瘍細胞、サイトカイン、細胞溶解物を含む、いくつかの因子が、マクロファージを活性化する。マクロファージはまた、他の細胞または細胞外分子によって、ＣＤ２３などの表面受容体が連結された後に活性化されることも可能である。ＣＤ２３は、多様な臓器特異的マクロファージ性細胞（例えばクッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞）を含む、ほぼすべてのマクロファージによって発現される。活性化マクロファージ、好酸球およびヒト上皮細胞表面上のＣＤ２３が高密度であることによって、多様な生理学的リガンドがこれらの分子を架橋し、そしてターゲット細胞の炎症機能を活性化することが可能になる。この現象は、ヒト・マクロファージによる細胞内および細胞外の寄生虫の除去を仲介することが示されてきている。ＣＤ２３刺激はまた、ヒト・マクロファージ、好酸球、上皮細胞およびラット・マクロファージによる、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ロイコトリエン、酸素由来種および一酸化窒素（ＮＯ）の生成も促進する。タンパク質分解後、ｉｎ  ｖｉｖｏで可溶性ＣＤ２３が放出され、そして正常ヒト血清中で検出される。ＣＤ２３のこの型もまた、マクロファージおよびＢ細胞上の対構造に連結した後、これらの細胞の活性化を含む、多様な免疫応答を誘導することも示されている。表面ＣＤ２３および可溶性ＣＤ２３はどちらも、炎症中に非常に重大な役割を有する。ＣＤ２３またはその可溶性型の高発現は、多様なアレルギー、自己免疫、感染性疾患および他の炎症性疾患の共通のマーカーである（Ａｕｂｒｙ  Ｊ．−Ｐ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５８，  ５０５−５０７（１９９２）；Ｂｏｎｎｅｆｏｙ  Ｊ．−Ｙ．ら，  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６，  １１３−１２８（１９９７）；Ｈｅｒｍａｎｎ  Ｐ．ら  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １４４，  ７６７−７７５（１９９９）；Ｍｏｓｓａｌａｙｉら，  Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６，  １２９−１４６（１９９７））。
【０００３】
ＣＤ２３は、関節リウマチ（Ｐｌａｔｅｒ−ＺｙｂｅｒｋおよびＢｏｎｎｅｆｏｙ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ｖｏｌ．１，  ８，  ７８１−７８５（１９９５））、アレルギー反応（Ｋｌｅｉｎａｕ  Ｓ．ら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １６２，  ４２６６−４２７０（１９９９））、およびＩｇＥ合成の制御（Ｌ．  Ｆｌｏｒｅｓ−Ｒｏｍｏら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６１，  １０３８−１０４１（１９９３）；Ａｕｂｒｙ  Ｊ．−Ｐ．ら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５８，  ５０５−５０７（１９９２））に非常に重大な役割を果たす。サイトカイン／ＣＤ２３依存性活性化経路は、グリア細胞において、一酸化窒素シンターゼの誘導および炎症促進性仲介因子の発現に影響を及ぼす。ＣＤ２３発現はまた、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）細胞生存にも必要であり（ＭａｖｒｏｍａｔｉｓおよびＣｈｅｓｏｎ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ．  ２１：１８７４−１８８１，（２００３））、そしてパーキンソン病において役割を果たす（Ｈｕｎｏｔ  Ｓ．ら，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  １９（９），  ３４４０−３４４７（１９９９））。
発明の概要
本発明は、ＣＤ２３結合性ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8のアミノ酸配列：
式中、
Ｘ1は、Ｐｈｅであるか、または存在せず；
Ｘ2は、ＨｉｓまたはＡｌａであり；
Ｘ3は、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＣｙｓであり；
Ｘ4は、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＡｌａであり；
Ｘ5は、Ｔｒｐであり；
Ｘ6は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＬｙｓであり；
Ｘ7は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎであるか、または存在せず；そして
Ｘ8は、Ｐｈｅ、Ｇｌｙであるか、または存在しない
を含む、前記化合物に関する。
【０００４】
本発明はまた、上述のＣＤ２３結合性ペプチドの化学的に修飾されたペプチドおよびペプチド模倣体にも関する。
発明の詳細な説明
本発明は、自己免疫疾患、急性および慢性炎症性疾患、アレルギー、並びにＢ−ＣＬＬの予防および治療に選択的に向けられる化合物を提供する。本発明は、部分的に、ＣＤ２３に結合し、そしてＣＤ２３がその天然リガンドに結合するのを阻害する、化合物の発見に基づく。ＣＤ２３は、活性化マクロファージまたは上皮細胞上で発現され、そして可溶性ＣＤ２３は、自己免疫疾患、炎症性慢性疾患およびアレルギーに関与するため、これらの疾患の治療および予防に、こうした化合物を使用することも可能であると考えられる。しかし、ＣＤ２３の遮断は、他の受容体を通じたマクロファージの活性化を妨げない。したがって、この戦略は、現在の商業的な抗炎症性治療とは対照的に、免疫応答の全般的な阻害を生じない。本発明の主題である化合物はまた、可溶性ＣＤ２３に結合するようにも設計されており、したがって、ｓＣＤ２３によるマクロファージの活性化もまた阻害される。
【０００５】
ＣＤ２３に対する抗体、その断片および誘導体、並びに炎症性疾患、自己免疫疾患またはアレルギー性疾患の治療における、その使用は、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／１２７４１およびＷＯ９９／５８６７９に記載されてきている。しかし、調製が容易で、そして化学的経路を使用することによって産生可能であり、したがって生体混入物質の存在を回避する化合物に対する必要性が依然としてある。抗体は、免疫系を遮断し、そしてそのほとんどが免疫原性であり、こうした機構に関連する副作用を有する。したがって、免疫応答を調節可能な化合物に対する必要性が依然としてある。
【０００６】
多くても２つのアミノ酸を含む、アミノ酸誘導体およびペプチド誘導体を含む化合物、並びにヒト可溶性ＣＤ２３放出の阻害剤としての使用が、ＰＣＴ出願ＷＯ９６／０２２４０に記載される。こうした化合物は、過剰なＣＤ２３が関連する、アレルギーおよび自己免疫疾患などの状態の治療および予防に有用である。ＰＣＴ出願ＷＯ９７／４３２４９、ＷＯ０１／４９６５７、ＷＯ０１／６２７１５、ＷＯ０１／８５７２１、ＷＯ０１／９０１００もまた、可溶性ＣＤ２３形成の阻害剤、並びに自己免疫疾患、炎症およびアレルギーなどの、可溶性ＣＤ２３産生と関連する状態の治療におけるその使用も開示する。しかし、これらの分子のターゲットは、本発明記載の化合物のターゲットとは異なり、そしてこれらの分子は、本発明記載の化合物とは構造が異なる。
【０００７】
抗炎症性ペプチドが過去に記載されてきている。免疫グロブリン断片を模倣し、そしてＦｃ受容体への関連免疫グロブリンの結合を遮断可能なペプチドが記載されてきている：ＲａｔｃｌｉｆｆｅおよびＳｔａｎｗｏｒｔｈ，  （Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．，  ４，  ２１５（１９８２））は、ＩｇＧ  ａａ  ２１５−３０１と同一であるペプチド（Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ）が、ヒト単球ＩｇＧ  Ｆｃ受容体へのＩｇＧ結合をわずかに遮断しうることを立証している。Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １８９，  ３８９（１９７５）；ＵＳ  ４，１７１，２９９；ＵＳ  ４，１６１，５２２）は、ヒトＩｇＥ  Ｃε３  ａａ  ３２０−３２４由来の配列を持つペンタペプチド（Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）が、局所皮膚アレルギー反応をおよそ９０％阻害しうることを報告している。このペプチドは、続いて、ヒトにおいて、全身性アレルギー疾患を阻害することが示されている。このペプチドが、ＩｇＥ  Ｆｃ受容体に有意な親和性を有することもまた、立証されている（Ｐｌｕｍｍｅｒら，  Ｆｅｄ．  Ｐｒｏｃ．，  ４２，  ７１３（１９８３）；Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，  Ａｄｖ．  Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ５９１−５９３（１９８０））。ＩｇＥ  Ｃε４  ａａ  ４７６−４８１由来のヘキサペプチドが、ＩｇＥ  Ｆｃ受容体へのＩｇＥ結合を遮断することが報告されてきている（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ３８，  ７８１（１９７９）；ＵＳ  ４，１６１，５２２）。ＩｇＥ  ＦｃおよびＩｇＥ  Ｆｃ受容体へのＩｇＧおよびＩｇＥ免疫複合体の結合を遮断しうるペプチドが、ＵＳ  ４，５７９，８４０に記載されている。ヒトＩｇＥのＣε３  ａａ  ３２０−３２４部分に構造的類似性を持つペプチドが、アラキドン酸が仲介する炎症経路に直接相互作用し、そしてこうした炎症を減少させることが立証されている（ＵＳ  ４，８１６，４４９）。
【０００８】
しかし、これらのペプチドは、本発明記載のものとは構造が異なり、そしてこれらのペプチドはいずれも、ＣＤ２３に親和性を有するとは記載されていない。
本発明は、ＣＤ２３に結合可能な新規のそして有用なペプチドの配列を記載する。これらは、自己免疫疾患、慢性炎症性疾患、アレルギー、および哺乳動物免疫系に仲介されるものなどの他の炎症状態に関連する炎症反応を減少させることが可能である。本発明記載のペプチドは、細胞の免疫応答を調節することが可能である。これらは、抗体より免疫原性でなく、合成産物として入手可能であり、したがって、生体混入物質を含まない。
【０００９】
ペプチドに取り込み可能なアミノ酸には、一般的に存在するアミノ酸すべてが含まれる。当該技術分野で一般的な慣例と同様、本出願全体で、アミノ酸の２つの名称が交換可能に用いられる：アラニン＝Ａｌａ（Ａ）；アルギニン＝Ａｒｇ（Ｒ）；アスパラギン酸＝Ａｓｐ（Ｄ）；アスパラギン＝Ａｓｎ（Ｎ）；システイン＝Ｃｙｓ（Ｃ）；グルタミン酸＝Ｇｌｕ（Ｅ）；グルタミン＝Ｇｌｎ（Ｑ）；グリシン＝Ｇｌｙ（Ｇ）；ヒスチジン＝Ｈｉｓ（Ｈ）；イソロイシン＝Ｉｌｅ（Ｉ）；ロイシン＝Ｌｅｕ（Ｌ）；リジン＝Ｌｙｓ（Ｋ）；メチオニン＝Ｍｅｔ（Ｍ）；フェニルアラニン＝Ｐｈｅ（Ｆ）；プロリン＝Ｐｒｏ（Ｐ）；セリン＝Ｓｅｒ（Ｓ）；トレオニン＝Ｔｈｒ（Ｔ）；トリプトファン＝Ｔｒｐ（Ｗ）；チロシン＝Ｔｙｒ（Ｙ）；バリン＝Ｖａｌ（Ｖ）。
【００１０】
いわゆる稀なまたは修飾されたアミノ酸のいずれもまた、本発明に取り込むことも可能であり、これらには、限定されるわけではないが、以下が含まれる：２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ベータ−アラニン（ベータ−アミノプロピオン酸）、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸（ピペリジン酸）、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２'−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン（ザルコシン）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、２−ナフチルアラニン、トレオニノール、テトラヒドロイソキノリン３−カルボン酸、４−インドイルアラニン、ベータ−トリプトファン、シクロ−ロイシン。
【００１１】
本発明の組成物は、生物学的に保護されるように修飾されたペプチドを含むことも可能である。生物学的に保護されたペプチドは、ヒト被験者に投与された際、保護されていないペプチドに勝る、特定の利点を有し、そしてＵＳ  ５，０２８，５９２（本明細書に援用される）に開示されるように、保護されたペプチドはしばしば、薬理活性の増加を示し、本発明の場合もこれが当てはまることが見出された。
【００１２】
したがって、本発明はまた、単数または複数のアシル化ペプチド、および好ましくはＮ末端でアシル化されたペプチドを含む組成物も含む。これに関連して、実質的に、いかなるアシル基も使用可能であるが、所定のペプチドのＮ末端にアセチル基（Ａｃ）を付加することが好ましい。阻害性ペプチド組成物はまた、Ｃ末端でアミド化された、すなわちＮＨ2基が付加されたペプチド（単数または複数）を含むことも可能である。特に好ましい態様において、アシル化Ｎ末端およびアミド化Ｃ末端残基両方を有するペプチドが好ましい。本発明記載のペプチドの適切な化学的誘導体には、ＲＣＯ−型のＮ−アルファアシル置換基である、デス−アルファ・アミノペプチド（式中、Ｒは、１〜５０、優先的には１〜８の炭素原子を含む、直鎖、分枝または環状のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル基である）が含まれる。Ｒはまた、ポリオースまたはタンパク質の残基であることも可能である。好ましいＮ−アルファ・アシル置換基はアセチル基である。こうしたアミノ末端置換基は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境において、ペプチドの酵素分解経過を防止するかまたは遅延させることによって、ペプチド活性を増加させうる。
【００１３】
本発明のペプチドの他の化学的誘導体には、Ｃ末端アルキルオキシ、アルキルチオ、またはアルキルアミノ置換基が含まれ、ここでカルボキシル基は、−ＣＯＯＲ、−ＣＯＳＲ、−ＣＯＮＨ2、−ＣＯＮＨＲ（式中、Ｒはペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ浸透を促進し、そしてターゲットへの到達を促進するように選択される基である）に置き換えられる。例えば、Ｒは、１〜５０、好ましくは８〜５０の炭素原子を含む、直鎖、分枝または環状の長鎖アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキル基であることも可能であり、Ｒはまた、ポリオースまたはタンパク質の残基であることも可能である。
【００１４】
本発明のペプチドのさらなる化学的誘導体には、ペプチドの検出を可能にする置換基、特に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光基を所持するものが含まれる（ＤａｌｙおよびＭｃＧｒａｔｈ，  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  １００：１０１−１１８，  （２００３））。
【００１５】
優先的には、本発明にしたがって、ペプチドが作成されているアミノ酸は、Ｌ−鏡像異性体である。しかし、配列の１以上のアミノ酸が、活性調節を伴わずにそのＤ−鏡像異性体で置き換えられることも可能である。これもまた、酵素分解を防止するかまたは減少させるであろう。
【００１６】
本発明は、ＣＤ２３結合性ペプチドを含む化合物であって、前記ペプチドが、Ｘ1−Ｘ2−Ｘ3−Ｘ4−Ｘ5−Ｘ6−Ｘ7−Ｘ8のアミノ酸配列：
式中、
Ｘ1は、Ｐｈｅであるか、または存在せず；
Ｘ2は、ＨｉｓまたはＡｌａであり；
Ｘ3は、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、またはＣｙｓであり；
Ｘ4は、Ａｓｎ、Ｐｈｅ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、またはＡｌａであり；
Ｘ5は、Ｔｒｐであり；
Ｘ6は、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、またはＬｙｓであり；
Ｘ7は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ａｓｎであるか、または存在せず；そして
Ｘ8は、Ｐｈｅ、Ｇｌｙであるか、または存在しない
を含む、前記化合物に関する。
【００１７】
好ましい態様において、ＣＤ２３結合性ペプチドは、配列番号１〜１０からなる群より選択される。
本明細書において、用語、アミノ酸は、天然存在アミノ酸、並びに非天然存在アミノ酸を意味する、最も広い意味で用いられ、アミノ酸類似体を含む。したがって、アミノ酸に対する言及には、（Ｌ）−アミノ酸、並びに（Ｄ）−アミノ酸、化学的修飾アミノ酸、天然に存在する非タンパク新生アミノ酸、例えばノルロイシン、ホモアルギニン、オルニチン、２’ナフチルアラニン、テトラヒドロイソキノリン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｌｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）−３−カルボン酸、４’インドリルアラニン、トレオニノール、（Ｓ）３−アミノ４−（３−インドイル）酪酸、１−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸、ベータアラニン、ホモプロリン、テトラヒドロノルハルマン（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎｏｒｈａｒｍａｎ）−３−カルボン酸、シトルリン、２，３−ジアミノプロピオン酸、４’チアゾイルアラニン、３−（イマダゾール−４−イル）プロピオン酸、１−Ｎ−メチルヒスチジン、Ｎ−メチルグリシン、１−（アミノメチル）シクロペンタン−１−カルボン酸、およびアミノ酸に特徴的であることが当該技術分野に知られる特性を有する化学的合成化合物が含まれる。本明細書において、用語、タンパク新生は、細胞において、代謝経路を通じて、アミノ酸がタンパク質に取り込まれうることを示す。本発明にしたがって使用可能な化学的修飾アミノ酸の中には、例えば、ペプチドまたはアミノ酸の検出を可能にするであろう蛍光基を所持するアミノ酸（例えばＧＦＰ）、および中央のＣがＳｉ原子またはＳｎ原子に置き換えられているアミノ酸が含まれる。
【００１８】
本発明はまた、１以上の保存的アミノ酸置換を含有することを除いて、上記アミノ酸配列（単数または複数）を含むペプチドにも関する。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸ファミリーが当該技術分野に定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分枝側鎖を持つアミノ酸（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、配列番号１〜１０のアミノ酸配列に少なくとも約８３％同一（すなわち６アミノ酸のうち５が同一）であるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明の範囲内である。
【００１９】
本発明はまた、上記ペプチドのペプチド模倣体にも関する。「ペプチド模倣体」は、ペプチドの生物学的活性を模倣するが、化学的性質がもはやペプチド性ではない化合物である。ペプチド模倣体はもはやいかなるペプチド結合（すなわちアミノ酸間のアミド結合）も含有しなくてもよい化合物である。用語、ペプチド模倣体は、本明細書において、性質がもはや完全にはペプチド性でない化合物をその意味に含み、例えばシュードペプチド、セミペプチド、およびペプトイドを含む。完全にまたは部分的に非ペプチドであっても、本発明記載のペプチド模倣体は、ペプチド模倣体の基となったペプチド中の活性基の三次元配置を緊密に近似する反応性化学部分の空間配置を提供する。この類似の活性部位配置（ｇｅｏｍｅｔｒｙ）の結果、ペプチド模倣体は、生物学的系に対して、ペプチドの生物学的活性に類似の影響を有する。
【００２０】
本発明は、本発明記載の生物学的活性ペプチドの活性を模倣する類似体であるペプチド模倣体組成物を含み、すなわち該ペプチド模倣体はＣＤ２３に結合可能である。本発明のペプチド模倣体は、好ましくは、三次元形状および生物学的活性の両方が、上記ペプチドに実質的に類似である。実質的類似性は、ＣＤ２３と相互作用するペプチド中の基の配置関係が保存され、そして同時に、該ペプチド模倣体が、ＣＤ２３分子への他の分子の結合に干渉するであろうことを意味する。
【００２１】
ペプチド自体よりもペプチド模倣体を用いる利点があり、これはいくつかのペプチドが２つの望ましくない特性：（１）劣った生物学的利用能；および（２）短い作用期間を示すためである。関与する化合物が経口活性であり、そしてかつ長い作用期間を有するのに十分に小さいため、ペプチド模倣体は、これらの２つの大きな障害を克服する手段を提供する。ペプチドを非経口投与するのに比較して、ペプチド模倣体は経口投与可能であるため、かなりのコスト節約および患者コンプライアンスの改善もまた伴う。さらに、ペプチド模倣体は、ペプチドよりも産生するのにはるかに安価である。最後に、ペプチドには、ペプチド模倣体では経験することのない、安定性、保存および免疫反応性に関連する問題がある。
【００２２】
したがって、上記ペプチドは、類似の生物学的活性を持ち、そしてしたがって類似の療法的有用性を持つこうした小さい化学的化合物の開発に有用性を有する。ペプチド模倣体を開発する技術は、慣用的である。したがって、ペプチド模倣体が元来のペプチドに類似の構造、そしてしたがって類似の生物学的活性を採用するのを可能にする、非ペプチド結合で、ペプチド結合を置き換えることも可能である。アミノ酸の化学基を、類似の構造の他の化学基で置き換えることによって、さらなる修飾を行うこともまた可能である。未結合であるかまたはＣＤ２３に結合したかいずれかの、元来のペプチドの三次構造を、ＮＭＲ分光分析、結晶学、および／またはコンピュータ補助分子モデリングにより、決定することによって、ペプチド模倣体の開発を補助することも可能である。これらの技術は、元来のペプチドより高い効能および／または優れた生物学的利用能および／または優れた安定性を持つ新規組成物の開発を補助する（すべて本明細書に援用される、Ｄｅａｎ，  ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，  １６：６８３−６８７（１９９４）；ＣｏｈｅｎおよびＳｈａｔｚｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｇｒａｐｈ．，  １１：１６６−１７３（１９９３）；ＷｉｌｅｙおよびＲｉｃｈ，  Ｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．，  １３：３２７−３８４（１９９３）；Ｍｏｏｒｅ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．，  １５：１２４−１２９（１９９４）；Ｈｒｕｂｙ，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ３３：１０７３−１０８２（１９９３）；Ｂｕｇｇら，  Ｓｃｉ．  Ａｍ．，  ２６９：９２−９８（１９９３））。潜在的なペプチド模倣体化合物が同定されたならば、該化合物を合成し、そして本明細書記載の方法、またはＣＤ２３活性を評価するのに適した別のＣＤ２３結合アッセイを用いて、アッセイすることも可能である。
【００２３】
本発明記載のペプチド模倣体において、１以上のアミド連結（−ＣＯ−ＮＨ−）を：−ＣＨ2ＮＨ−、ＣＨ2Ｓ−、−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ2−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2−および−ＣＨ2ＳＯ−などの、アイソスター（ｉｓｏｓｔｅｒｅ）である別の連結で置き換えることも可能である。当該技術分野に知られる方法によって、この置換を行うことも可能である（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，  Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ，  Ｖｏｌ．１，  第３刷（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ監修，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．２６７（１９８３）；Ｍｏｒｌｅｙ．  Ｊ．−Ｓ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉ．，  ４６３−４６８（１９８０）；Ｈｕｄｓｏｎら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔ．  Ｒｅｓ．  １４，  １７７−１８５  （１９７９）；Ｓｐａｔｏｌａら，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，  ３８，  １２４３−１２４９（１９８６）；Ｈａｎｎ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  Ｉ  ３０７−３１４（１９８２）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ２３，  １３９２−１３９８（１９８０）；Ｈｏｌｌａｄａｙら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２４，  ４４０１−４４０４（１９８３）；およびＨｒｕｂｙら，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ３１，  １８９−１９９（１９８２）を参照されたい）。
【００２４】
したがって、上記方法の使用を通じて、本発明は、これらのペプチド模倣体化合物の基となったペプチドに比較して、療法活性増進を示すペプチド模倣体化合物を提供する。ペプチドの生物学的活性および類似の三次元構造を有するペプチド模倣体化合物が、本発明に含まれる。当業者には、修飾ペプチドいずれかから、または先のセクションに記載する修飾を１より多く持つペプチドから、ペプチド模倣体を生成可能であることが容易に明らかであろう。さらに、療法化合物としての有用性に加えて、本発明のペプチド模倣体を、さらにより強力な非ペプチド性化合物の開発にさらに使用してもよいことが明らかであろう。好ましい態様において、本発明は、表１または表２に列挙するペプチドまたはペプチド模倣体からなる群より選択されるペプチドまたはペプチド模倣体を提供する。特に好ましい態様において、本発明は、構造Ａｃ−ｗ−ｎ−ＣＯ2Ｈを含むペプチド模倣体を提供する。
【００２５】
先のセクションに記載するペプチド由来のペプチド模倣体の特定の例を、以下の表１および表２に提示する。これらの例は例示であり、そして他の修飾またはさらなる修飾に関して限定しない。
還元アイソスター・シュードペプチド結合を持つペプチド
プロテアーゼは、ペプチド結合に作用する。したがって、シュードペプチド結合によってペプチド結合を置換すると、タンパク質分解に対する抵抗性が与えられることになる。一般的にペプチド構造および生物学的活性に影響を与えない、いくつかのシュードペプチド結合が記載されてきている。還元アイソスター・シュードペプチド結合は、酵素切断に対する安定性を増進させ、生物学的活性の損失がまったくまたはほとんどないことが知られる、適切なシュードペプチド結合である（本明細書に援用される、Ｃｏｕｄｅｒら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ４１：１８１−１８４（１９９３））。したがって、これらのペプチドのアミノ酸配列は、１以上のペプチド結合が、アイソスター・シュードペプチド結合に置換されていることを除いて、上述のＬ−アミノ酸ペプチドの配列と同一であることも可能である。好ましくは、最もＮ末端のペプチド結合が置換されるが、これはこうした置換が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を与えるためである。１以上の還元アイソスター・シュードペプチド結合を含むペプチドの合成が当該技術分野に知られる（本明細書に援用される、Ｃｏｕｄｅｒら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ４１：１８１−１８４（１９９３））。
逆反転（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）シュードペプチド結合を持つペプチド
ポリペプチドの立体化学を、ポリペプチド主鎖に関するアミノ酸残基の側鎖のトポケミカル配置に関して記載することも可能であり、これは、アミノ酸残基および結合する残基のａ−炭素原子の間のペプチド結合によって定義される。さらに、ポリペプチド主鎖は、異なる末端およびしたがって方向を有する。
【００２６】
大部分の天然存在アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。天然存在ポリペプチドは、大部分、Ｌ−アミノ酸で構成される。
Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸の鏡像異性体であり、そして本明細書において、反転ペプチド（ｉｎｖｅｒｓｏ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）と称されるペプチド、すなわち天然ペプチドのＮ末端からＣ末端の配列に対応するが、Ｌ−アミノ酸でなく、Ｄ−アミノ酸で構成されているペプチドである。部分的反転ペプチドは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の両方で構成されているものである。
【００２７】
逆ペプチド（ｒｅｔｒｏ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）はＬ−アミノ酸で構成され、アミノ酸残基は天然ペプチド配列と正反対（ｏｐｐｏｓｉｔｅ）の方向で集合している。
天然存在ポリペプチドの逆反転修飾は、対応するＬ−アミノ酸のものと正反対のａ−炭素立体化学を持つアミノ酸、すなわち天然ペプチド配列に対して逆転した（ｒｅｖｅｒｓｅ）順序のＤ−またはＤ−アロ−アミノ酸の合成集合を伴う。したがって、逆反転類似体は、逆転した末端および逆転した方向のペプチド結合を有し、一方、天然ペプチド配列におけるような側鎖のトポロジーをほぼ維持する。
【００２８】
部分的逆反転ペプチド類似体は、配列の一部のみが逆転し、そして鏡像異性アミノ酸残基で置換されている、ポリペプチドである。こうした類似体の逆反転部分は、逆転したアミノ末端およびカルボキシル末端を有し、逆反転部分に隣接するアミノ酸残基は、それぞれ、側鎖類似置換ジェミナル・ジアミノメタンおよびマロネートで置換されている。
【００２９】
逆反転ペプチド類似体の合成法が記載されてきている（Ｂｏｎｅｌｌｉ，  Ｆ．，  Ｐｅｓｓｉ，  Ａ．  ＆  Ｖｅｒｄｉｎｉ，  Ａ．  Ｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  ２４，  ５５３−５５６（１９８４）；Ｖｅｒｄｉｎｉ，  Ａ．  Ｓ．  ＆  Ｖｉｓｃｏｍｉ，  Ｇ．  Ｃ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  Ｉ，  ６９７−７０１（１９８５））。部分的逆反転ペプチド類似体の固相合成法もまた、知られる（Ｐｅｓｓｉ，  Ａ．，  Ｐｉｎｏｒｉ，  Ｍ．，  Ｖｅｒｄｉｎｉ，  Ａ．  Ｓ．  ＆  Ｖｉｓｃｏｍｉ，  Ｇ．  Ｃ．  欧州特許９７９９４−Ｂ，  １９８７年９月３０日（８７３９））。
【００３０】
したがって、本発明で使用する組成物は、すべてがＬ−アミノ酸であるか、すべてがＤ−アミノ酸であるか、またはその混合物を含むペプチドを含むことも可能である。完全にＤ−アミノ酸で構成されるペプチドが、強力な阻害活性を有するという知見は、こうしたペプチドが、ヒト体内で天然に見られるプロテアーゼに対して抵抗性であることが知られ、そしてより免疫原性でなく、そしてしたがってより長い生物学的半減期を有すると期待されうることから、特に重要である。この修飾にしたがって、１以上のアミノ酸残基がＤ−鏡像異性体アミノ酸で置換されていることを除いて、ペプチドのアミノ酸配列は、上述のＬ−アミノ酸ペプチドの配列（例えば配列番号１〜１０）に同一であることも可能である。例えば、最もＮ末端のペプチド結合が、反転または逆反転していることも可能であり、これはこの結合の反転または逆反転が、Ｎ末端に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する抵抗性を増加させるであろうためである。さらに、すべてがＬ−鏡像異性体（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒ）である、開示するペプチドいずれかの逆反転型（すべてがＤ−鏡像異性体であるもの）は、逆転したＮ末端およびＣ末端を有するであろう。例えば、すべてがＬ−鏡像異性体であるペプチド、ＮＨ2−ＨＥＮＷＰＳ−ＣＯＯＨの逆反転型は、ＮＨ2−ｓｐｗｎｅｈ−ＣＯＯＨ（当該技術分野で一般的な慣例と同様、アミノ酸のＤ−鏡像異性体を小文字で示す）であろう。１以上の還元逆反転シュードペプチド結合を持つペプチドの合成が当該技術分野に知られる（Ｄａｌｐｏｚｚｏら  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  ４１（６）：５６１−６（１９９３））。
ペプトイド誘導体
ペプチドのペプトイド誘導体は、生物学的活性にとって重要な構造決定基を保持しつつ、なおペプチド結合を除去し、それによってタンパク質分解に対する抵抗性を与える、修飾ペプチドの別の型に相当する（本明細書に援用される、Ｓｉｍｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：９３６７−９３７１（１９９２））。ペプトイドは、Ｎ置換グリシンのオリゴマーである。各々、天然アミノ酸の側鎖に対応する、いくつかのＮ−アルキル基が記載されてきている（Ｓｉｍｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：９３６７−９３７１（１９９２））。さらに、すべてのアミノ酸を置換しなければならないのではない。例えば、Ｎ末端残基が置換される唯一のものであることも可能であるし、またいくつかのアミノ酸を、対応するＮ置換グリシンで置換することも可能である。
【００３１】
本発明の配列を含み、そしてＣＤ２３分子に結合可能な、より長いペプチドもまた、本発明の範囲内に含まれる。より長いペプチドは、配列番号１〜１０を含む、本発明のペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれか、あるいは両方に結合する、いかなるアミノ酸配列を含むことも可能である。優先的には、これらは、全部で、約１００以下のアミノ酸、より適切には約７０以下のアミノ酸、好ましくは約５０以下のアミノ酸、より好ましくは約３０以下のアミノ酸、そしてさらにより好ましくは約１５以下のアミノ酸を有する。上述のように、最低の長さは約６である。
【００３２】
本発明記載のペプチドまたはペプチド模倣体化合物が、ＣＤ２３に結合する能力を、実施例４〜７に詳細に記載する試験によって、評価することも可能である。しかし、ペプチドまたはペプチド模倣体化合物は、ほぼ１０-6Ｍ未満、好ましくは１０-6〜１０-11Ｍの間のＫdの特異的結合活性を有するならば、本発明にしたがって、ＣＤ２３に結合すると見なされる。
【００３３】
本発明記載の好ましいペプチド化合物は、配列番号１〜１０：
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号１）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号２）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ（配列番号３）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ（配列番号４）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ（配列番号５）；
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号６）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号７）；
Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（配列番号８）；
Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ（配列番号９）；および
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ（配列番号１０）
に対応するものである。
【００３４】
やはり本発明の範囲内に含まれるのは、ＣＤ２３分子に結合可能であるという条件で、その薬学的に許容しうる塩、これらのペプチドの機能する断片、配列番号１〜１０のペプチドとの化学的相同性を持つペプチド、およびこれらのペプチドの他の化学的誘導体である。
【００３５】
別の態様において、本発明のペプチドおよびペプチド模倣体は、環状である。環状ペプチドまたはペプチド模倣体は、本明細書において、１つのアミノ酸残基上の置換基が、ペプチド断片の別のアミノ酸残基上の置換基に連結されている、ペプチドまたはペプチド模倣体と定義される。連結は、ペプチド／ペプチド模倣体中の２つのアミノ酸残基の側鎖間、ペプチド／ペプチド模倣体の側鎖およびＮ末端間、ペプチド／ペプチド模倣体の側鎖およびＣ末端間、またはペプチド／ペプチド模倣体のＮ末端およびＣ末端間のいずれかである。したがって、アミド結合は、残基のカルボキシル基および別の残基のアミノ基間で形成され；エステル結合は、残基のカルボキシル基およびヒドロキシル含有残基のヒドロキシル基間で形成され；ジスルフィドは、スルフィドリル基含有アミノ酸残基から形成され；そしてランチオニン架橋は、対応するジスルフィドの脱硫によって形成される。
【００３６】
上述のように形成されるアミド、エステル、ジスルフィドまたはランチオニン結合から生じる架橋中の原子の数は、側鎖の長さおよび結合の種類（すなわちアミド、エステル、ジスルフィドまたはランチオニン）に応じて多様であろう。架橋は、好ましくは、２〜９原子、より好ましくは２〜４原子を含む。架橋中に含有される原子の最も好ましい数は４であり、この架橋は、好ましくはグルタミン酸の側鎖カルボン酸およびＮ末端残基間のアミド結合を含む。
【００３７】
本発明の範囲内にやはり含まれるのは、配列番号１〜１０記載のペプチドの薬学的に許容しうる塩、これらのペプチドの機能する（すなわちＣＤ２３結合性）断片、配列番号１〜１０記載のペプチドと化学的相同性を持つペプチド、およびこれらのペプチドの機能する化学的誘導体であり、特にその類似体は、Ｃ末端アミノ酸がアミド化されて、−ＣＯＯＨの代わりにＣＯＮＨ2基を提供するものである。
【００３８】
本明細書において、用語、塩は、ペプチド鎖のカルボキシル基の塩、並びにポリペプチド鎖のアミノ基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、無機塩基または有機塩基いずれを用いて形成されることも可能である。無機塩には、例えば、ナトリウム、カリウムおよびリチウム塩などのアルカリ金属塩；例えばカルシウム、バリウムおよびマグネシウム塩などのアルカリ土類塩；並びにアンモニウム、第一鉄、第二鉄、亜鉛、亜マンガン、アルミニウム、マンガン塩などが含まれる。有機アミンを用いた塩には、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、カフェイン、プロカイン等で形成されるものが含まれる。
【００３９】
酸付加塩には、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸等の無機酸を用いた塩；および例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸等の有機酸を用いた塩が含まれる。
【００４０】
本発明記載のペプチドの機能する断片は、配列番号１〜１０のアミノ酸の１以上が欠失され、なおＣＤ２３分子に結合する能力を保持している、配列番号１〜１０に対応するペプチドである。本発明記載のペプチドの好ましい機能する断片は、最大２アミノ酸が欠失されているものである。さらにより好ましいのは、１つのアミノ酸のみが欠失している、そして特にＸ1が欠失しているものである。本発明の範囲にやはり含まれるのは、配列番号１〜１０記載のペプチドの相同体であるペプチドである。用語、相同体は、本明細書において、ＣＤ２３に結合するという条件で、配列番号１〜１０記載の配列と共通のアミノ酸を有するペプチドを指す。
【００４１】
本発明の範囲にやはり含まれるのは、
ａ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｂ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列に、少なくとも約８３％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
ｃ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および
ｄ）配列番号１〜１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチドである。
【００４２】
本発明記載のペプチドは、例えば固相ペプチド合成を含む、当該技術分野に周知の方法によって、化学的に合成可能である。これらはまた、ペプチドをコードする組換え核酸分子から発現されることも可能である。したがって、本発明はまた、上述のような配列番号１〜１０に対応するペプチド、これらのペプチドの機能する断片、配列番号１〜１０記載のペプチドと化学的相同性を持つペプチド、並びに配列番号１〜１０記載のペプチド配列を含むペプチドおよびタンパク質をコードする、単離核酸分子も提供する。
【００４３】
本発明記載の、ＣＤ２３に結合するであろうペプチドは、ＣＤ２３に仲介される障害の治療または予防のための薬剤製造に使用可能である。こうした障害には、限定されるわけではないが、関節炎、紅斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、糖尿病、ブドウ膜炎、皮膚炎、乾癬、蕁麻疹、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、アレルギー、アレルギー性喘息、内因性喘息、急性喘息再燃、鼻炎、湿疹、子宮内膜症、移植片対宿主病（ＧＶＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、膵島炎、気管支炎（特に慢性気管支炎）、糖尿病（特に１型糖尿病）、Ｂ−ＣＬＬおよび他のＢ細胞悪性腫瘍、Ｂ細胞機能不全に関連する疾患、並びにパーキンソン病が含まれる。
【００４４】
本発明記載の、ＣＤ２３に結合する、１つまたはいくつかのペプチドを含有する薬剤組成物もまた、本発明の範囲内に含まれる。こうした薬剤組成物はまた、他の抗炎症性分子を含む、他の療法活性剤も含むことも可能である。ＣＤ２３結合性ペプチドは、通常、無菌の薬学的に許容しうる組成物の一部として供給されるであろう。この薬剤組成物は、患者に投与する所望の方法に応じて、適切な型いずれであることも可能である。本発明記載の組成物は、非経口的に、例えば静脈内、筋内、直腸内、膣内、または皮下投与することも可能であるし、スプレーによって、液滴または座薬として、経口投与または鼻投与することも可能である。これらを水または油中の溶液として、あるいはエマルジョン中に配合することも可能である。迅速なペプチド分解を防止する配合が好ましい。こうした配合には、すべての型の被包が含まれ、そして：微小球体およびリポソームに限定されない。投与様式およびペプチド安定性と適合するという条件で、適切なキャリアーまたは希釈剤いずれを使用することも可能である。賦形剤には：水、アルコール、ポリオール、グリセリン、植物油、保存剤、安定化剤、可溶化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、着臭剤、塩、緩衝剤、コーティング剤または酸化防止剤が含まれる。
【００４５】
本発明記載のＣＤ２３結合性ペプチドの適切な投薬量は、治療しようとする疾患または障害、投与経路、並びに治療しようとする個体の年齢および体重などの要因に応じて、多様であろう。
【００４６】
本発明の組成物に用いる化合物の実際の投薬量は、用いる特定の複合体、配合する特定の組成物、投与様式、並びに治療しようとする特定の部位、宿主および疾患に応じて多様であろう。剤の実験データを考慮し、慣用法を用いて、当業者が、所定の条件セットに対する最適な投薬量を決定することも可能である。経口投与には、一般的に使用される典型的な１日用量は、約０．００１〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、適切な間隔で治療単位を反復する。プロドラッグの投与は、典型的には、完全に活性な型の重量レベルと化学的に同等な重量レベルで投薬する。
【００４７】
薬剤組成物を調製するために一般的に知られる方法を用いて、例えば、混合、溶解、整粒、ドラジェー作成、粉末化（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、被包化、捕捉または凍結乾燥などの慣用的技術を用いて、本発明の組成物を製造することも可能である。１以上の生理学的に許容しうるキャリアーを用いて、慣用的な方式で薬剤組成物を配合することも可能である。用語、キャリアーは、媒体、原体（ｂｕｌｋ）および／または薬剤組成物に使用可能な型を提供する、薬剤組成物配合中に用いる非毒性物質を意味する。キャリアーは、賦形剤、安定化剤、または水性ｐＨ緩衝溶液などの物質を１以上含むことも可能である。生理学的に許容しうるキャリアーの例には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸を含む水性または固体緩衝成分；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮTM、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳTMなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００４８】
本発明は、その範囲内に、生物学的試料中のＣＤ２３を検出するためのアッセイおよびアッセイキットを含み、該アッセイは以下の：
ａ）本発明のポリペプチドで試料を処理し；そして
ｂ）試料に結合したポリペプチドの量を検出する
工程を含む。
【００４９】
結合したポリペプチドを検出する前に、未結合ポリペプチドをまず除去することによって、上記工程（ｂ）を促進することも可能であるが、未結合ポリペプチドの除去は、結合したポリペプチドの量を決定するのに必要な必須条件ではない。
【００５０】
生物学的試料には、限定されるわけではないが、生物学的液体、組織抽出物、Ｂリンパ球、単球／マクロファージ、好酸球、血小板、Ｔ細胞、上皮細胞などの新鮮に採取した細胞が含まれる。ペプチドおよびペプチド模倣体のＣＤ２３に対する親和性が高いため、ペプチドおよびペプチド模倣体を、ＥＬＩＳＡによるＣＤ２３検出、または例えば吸収カラム上での透析による血清ｓＣＤ２３クリアランスに用いることも可能である。
【００５１】
ニトロセルロースなどの固相支持体、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定可能な他の固体支持体で、生物学的試料を処理することも可能である。周知の支持体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、ガブロ（ｇａｂｂｒｏｓ）および磁鉄鉱が含まれる。支持体材料は、カップリングした分子が、ポリペプチドに結合可能である限り、実質的にいかなる可能な構造立体配置を有することも可能である。したがって、支持体またはキャリアー立体配置は、ビーズにおけるように球状であるか、試験管内部表面または棒の外表面におけるように筒状であることも可能である。あるいは、表面は、シート、試験片等のように平面であることも可能である。当業者は、抗体または抗原結合に適した多くの他のキャリアーを知っているであろうし、また日常的な実験を用いることによって、これらを確かめることも可能であろう。
【００５２】
１つの態様において、試料は細胞または細胞溶解物を含む。
結合を検出する方法は、例えば、標識ＣＤ２３結合性ペプチドまたはリガンドの使用および固相プレートアッセイなどの検出技術；免疫沈降；ウェスタンブロッティング、および蛍光アッセイの使用を含むことも可能である。こうした技術はよく確立されており、そして一般の当業者の技術的専門知識の範囲内である。検出可能なマーカーをポリペプチドに共有結合させることによって、ポリペプチドを標識する。こうしたマーカーには、限定されるわけではないが、蛍光部分、ビオチン部分、放射性部分、および発光部分が含まれる。これに関連して、本発明は、ポリペプチドが検出可能マーカーで標識されている、本発明のポリペプチドを含む。
【００５３】
本発明はまた、その範囲内に、生物学的試料における、ＣＤ２３に関連する状態または疾患に関する診断試験であって：
ａ）本発明のポリペプチドと生物学的試料を、該ポリペプチドがＣＤ２３に結合し、そして複合体を形成するのに適した条件下で合わせ；そして
ｂ）複合体を検出する、ここで複合体の存在は、生物学的試料におけるＣＤ２３の存在と相関する
工程を含む、前記方法も含む。
【００５４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドも含む。好ましい態様において、単離ポリヌクレオチドは、配列番号１１〜２０の配列：
配列番号１１  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ−３’
配列番号１２  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＡＣＣ−３’
配列番号１３  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＴＣＧ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＡＡＣ−３’
配列番号１４  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ−３’
配列番号１５  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＡＣＣ−３’
配列番号１６  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ−３’
配列番号１７  ５’−ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ−３’
配列番号１８  ５’−ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ−３’
配列番号１９  ５’−ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＴＴＴ−３’
配列番号２０  ５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＣＣ−３’
を有する。
【００５５】
本発明の範囲内にやはり含まれるのは、配列番号１１〜２０のポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列である。
配列番号１１〜２０は、配列番号１〜１０のアミノ酸配列をコードする核酸配列の代表である。こうした核酸配列がＲＮＡ、ＤＮＡまたはどちらかのハイブリッドであることも可能であることが本発明の範囲内である。さらに、遺伝暗号が縮重している、すなわちアミノ酸が１より多いコドンによってコードされることも可能であることがよく認識される。縮重コドンは、同じアミノ酸残基をコードするが、異なるヌクレオチド・トリプレットを含有する。したがって、本発明のアミノ酸配列をコードする所定のポリヌクレオチド配列に関して、調節剤をコードする多くの縮重ポリヌクレオチド配列があるであろう。これらの縮重ポリヌクレオチド配列は、本発明の範囲内と見なされる。
【００５６】
さらに、当業者は、異なる生物、細胞、および細胞区画が、異なる遺伝暗号を利用可能であることも認識するであろう。したがって、単一のポリヌクレオチド配列は、細胞背景に応じて、異なるポリペプチドをコードすることも可能である。したがって、標準的遺伝暗号に加えて、非標準遺伝暗号にコードされるポリペプチドもまた、本発明の範囲内と見なされる。これらの非標準遺伝暗号には、限定されるわけではないが、脊椎動物ミトコンドリア暗号、酵母ミトコンドリア暗号、カビ、原生動物、および腔腸動物のミトコンドリア暗号、マイコプラズマ／スピロプラズマ暗号、無脊椎動物ミトコンドリア暗号、繊毛虫、ダシクラダシアン（ｄａｓｙｃｌａｄａｃｅａｎ）およびヘキサミタ（ｈｅｘａｍｉｔａ）核暗号、棘皮動物ミトコンドリア暗号、ユープロチド（ｅｕｐｌｏｔｉｄ）核暗号、細菌および植物のプラスチド暗号、代替酵母核暗号、ホヤ類ミトコンドリア暗号、扁形動物ミトコンドリア暗号、ブレファリスマ（ｂｌｅｐｈａｒｉｓｍａ）核暗号、クロロフィセアン（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｎ）ミトコンドリア暗号、吸虫ミトコンドリア暗号、セネデスムス・オブリクス（ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ  ｏｂｌｉｑｕｕｓ）ミトコンドリア暗号、およびトラウストキトリウム（ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ミトコンドリア暗号が含まれる。
【００５７】
本発明の範囲内にやはり含まれるのは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドである。機能可能であるように連結された、は、機能的関連を有するように配置されることを意味する。
【００５８】
発現ベクターに関しては、用語、機能的に連結された、は、単数または複数の所望の遺伝子が、該遺伝子（単数または複数）の十分な発現を提供するように、転写および翻訳を調節するシグナルに関して適切に配置されるように、こうした遺伝子が挿入されることを意味する。発現ベクターは、この中に所望の遺伝子を挿入可能であり、そして宿主細胞において、挿入された遺伝子の発現を指示する転写および翻訳シグナルを含有する、人工的ＤＮＡ配列、または人工的に修飾されている天然存在ＤＮＡ配列である。
【００５９】
本発明の範囲内にやはり含まれるのは、本発明の組換えポリヌクレオチドで形質転換された細胞である。
本発明の範囲内にやはり含まれるのは、本発明の組換えポリヌクレオチドを含むトランスジェニック生物である。トランスジェニック動物は、ヒトの操作によって、動物に対して天然ではない１以上の遺伝子が導入されている動物である。
【００６０】
本発明の範囲内にやはり含まれるのは、本発明のポリペプチドを産生するための方法であって：
ａ）組換えポリヌクレオチドで細胞を形質転換し、そして該組換えポリヌクレオチドは本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能可能であるように連結されたプロモーター配列を含み、そして
ｂ）ポリペプチドの発現に適した条件下で、該細胞を培養し、そして
ｃ）こうして発現されたポリペプチドを回収する
ことを含む、前記方法である。
【００６１】
１つの態様において、ポリペプチドは、配列番号１〜１０の配列を含む。
本発明のポリペプチドは、組換え技術法によって調製されるか、天然供給源から単離されるか、または合成的に調製されることも可能であり、そして原核または真核起源であることも可能である。本発明のポリペプチドは、非グリコシル化型であることも、また翻訳に続いて修飾されることも可能である。こうした修飾には、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリストイル化、メチル化、イソプレニル化、およびパルミトイル化が含まれる。グリコシル化ポリペプチドは、哺乳動物細胞において産生される。組換えＤＮＡ技術を用いて、ポリペプチドをコードする核酸を適切なベクターに挿入し、これを適切な宿主細胞に挿入する。生じた宿主細胞から産生されるポリペプチドを回収し、そして精製する。ポリペプチドは、アミノ酸組成および配列、並びに生物学的活性によって特徴付けられる。
【００６２】
上に引用する特許および刊行物はすべて、本明細書に援用される。
（実施例１）
ファージディスプレイ
ファージディスプレイは、ペプチドまたはタンパク質が、バクテリオファージのコートタンパク質との融合体として発現され、ファージビリオンの外表面上に、融合されたタンパク質のディスプレイを生じ、一方、融合体をコードするＤＮＡはビリオン内に宿する、選択技術を記載する。ファージディスプレイは、ランダムペプチド配列の膨大なライブラリーと、各配列をコードするＤＮＡの間に物理的連結を生成し、パニングと呼ばれるｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択法によって、多様なターゲット分子（抗体、酵素、細胞表面受容体など）に対するペプチドリガンドの迅速な同定を可能にするため、用いられてきた。最も単純な型では、ターゲットでコーティングされたプレート（またはビーズ）と、ファージディスプレイされたペプチドのライブラリーをインキュベーションし、未結合ファージを洗い流し、そして特異的に結合したファージを溶出することによって、パニングを行う。（あるいは、ファージを溶液中でターゲットと反応させ、その後、ターゲットに特異的に結合するプレートまたはビーズ上で、ファージ−ターゲット複合体を親和性捕捉することも可能である。）次いで、溶出されたファージを増幅し、そしてパニングおよび増幅のさらなる周期を通じて、最も堅固に結合する配列を支持するファージプールを続いて濃縮する。３〜４周期後、ＤＮＡ配列決定およびＥＬＩＳＡによって、個々のクローンを性質決定する。
【００６３】
この実験では、野生型Ｍ１３ファージの誘導体（Ｐｈ．Ｄ．−７TMファージディスプレイペプチドライブラリーキット、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、＃Ｅ８１００Ｓ）を用いる。これは、２．０ｘ１０9の独立クローンを含有する、直鎖７量体ライブラリーである。
【００６４】
供給されたファージ１０μｌ中で各配列約１００コピーを用いて、各パニング実験を行うように、ライブラリーを１回増幅する。プラスミドではなくファージとしてのライブラリーは増殖が単純であるため、抗生物質選択および別個のヘルパーファージの必要性が排除される。ファージ増幅のため、細菌株ＸＬ１Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、遺伝子型ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｇｙｒＡ９６  ｔｈｉ−１  ｈｓｄＲ１７  ｓｕｐＥ４４  ｒｅｌＡ１  ｌａｃ  ［Ｆ’ｐｒｏＡＢ  ｌａｃμＺ  ΔＭ１５  Ｔｎ１０（Ｔｅｔｒ）］）を用いる。
【００６５】
（実施例２）
ＣＤ２３タンパク質および定量化
ＣＤ２３コードｃＤＮＡをヒトＢリンパ芽球細胞株ＲＰＭＩ８８６６から得る。このｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、３２１アミノ酸および分子量３６ｋＤのポリペプチドを予測する。ＩｇＥに結合可能な機能するＣＤ２３が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で発現された（Ｌｕｄｉｎ  Ｃら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：１０９−１１４（１９８７））。
【００６６】
ＣＨＯトランスフェクション細胞（Ｎｏｖａｒｔｉｓ、スイス・バーゼルから寛大な寄贈）からＣＤ２３（２ｇ）を均質に精製する。ＣＤ２３の存在を、マウス・モノクローナル抗ヒトＣＤ２３抗体（クローン１３５、ＩｇＧ1κアイソタイプ）を用いて開発された特異的ＥＬＩＳＡによって管理する。ＣＤ２３−ＭｏＡｂ（１３５）をプラスチック表面に適用し、ＣＤ２３と反応させた後、ＣＤ２３定量化に、別の抗ＣＤ２３−ＭｏＡｂ（クローン２５）−ＦＩＴＣを用いる。
【００６７】
（実施例３）
「バイオパニング」によるファージ選択およびＣＤ２３相互作用
精製ＣＤ２３タンパク質を、無菌ポリスチレン・ペトリ皿上に適用し、一方、炭酸緩衝液を陰性対照としていくつかのペトリ皿に適用する。洗浄し、そして表面を満たした後、２．０ｘ１０11の組換えファージを各ペトリ皿に添加し、そして穏やかに攪拌しながら室温で１時間インキュベーションする。これによって、ファージ由来ペプチドが、ペトリ皿にコーティングされた分子に接触し、そして固定されることが可能になる。続く洗浄によって、非結合性ファージまたは低親和性ファージの除去を可能にする。「バイオパニング」後、前記緩衝液を用いてファージを溶出し、計数し、そして細菌培養物上で増幅する。
【００６８】
ＣＤ２３でコーティングしたペトリ皿を用いて、溶出ファージに対して、さらに２回のバイオパニング法を適用する。これらの方法は、ＣＤ２３特異的ファージの濃縮を可能にする。
【００６９】
増幅後、各ファージクローンからＤＮＡを抽出し、そして配列を決定する。自動化配列決定装置Ｌｉ−ｃｏｒ  ４０００を用いて、配列決定を行う。ファージのヌクレオチド配列の分析によって、対応するペプチドの同定および化学的合成が可能になる。バイオパニング後、ファージの配列決定によって、ＣＤ２３に結合するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列が明らかになり、例えば１つのバイオパニング法は、以下の配列：
５’−ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＡＡＴ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＴＣＧ−３’（配列番号１１）
を同定した。
【００７０】
この配列は、以下のアミノ酸配列：
Ｐｈｅ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｔｒｐ  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ（配列番号１；ｐ３０Ａ）
をコードする。
【００７１】
配列ＦＨＥＮＷＰＳ（配列番号１；ｐ３０Ａ）が、最も頻繁に選択されるペプチドである。以下の配列はより頻繁でなく選択された：
ＦＨＥＳＷＰＰ（配列番号２１；ｐ３０Ｂ）
ＦＨＥＦＷＰＬ（配列番号２２；ｐ３０Ｃ）
ＦＨＥＦＷＰＴ（配列番号２；ｐ３０Ｄ）
ＦＨＳＱＷＰＮ（配列番号３；ｐ３０Ｅ）
ＦＨＳＱＷＰＧ（配列番号２３；ｐ３０Ｆ）
リードＣＤ２３結合性化合物として、ＦＨＥＮＷＰＳ（配列番号１；ｐ３０Ａ）を選択した。環状化、および逆反転などのペプチドに対する修飾を含めて、この配列に基づいて、ペプチドおよびペプチド模倣体を合成した。表１は、これらの配列のいくつかを示す。「活性」は、特定のペプチドまたはペプチド模倣体が、抗ＣＤ２３−ＦＩＴＣモノクローナル抗体がＣＤ２３＋細胞に結合するのを阻害する能力を指す。標準的一文字アミノ酸指定に加えて、以下の略語を用いる：
２Ｎａｌ＝２’ナフチルアラニン
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
４インドイルＡ＝４’インドイルアラニン
ベータＷ＝（Ｓ）３−アミノ４−（３−インドイル）酪酸
シクロＬ＝１−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸
ベータＡ＝ベータアラニン
ｈｏ  Ｐｒｏ＝ホモプロリン
ｔｐｉ＝テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸
ｃｉｔ＝シトルリン
Ｄａｐ＝２，３−ジアミノプロピオン酸
チアゾイル＝４’チアゾイルアラニン
デスアミノＨ＝３−（イマダゾール−４−イル）プロピオン酸
１  Ｍｅ  Ｈｉｓ＝１−Ｎ−メチルヒスチジン
Ｓａｒ＝Ｎ−メチルグリシン
ＣＣｐｍａ＝１−（アミノメチル）シクロペンタン−１−カルボン酸
Ｏｒｎ＝オルニチン
ＣＧＧ＝蛍光標識の基質
ＧＧＣ＝蛍光標識の基質
環状Ｈ２Ｔ＝Ｃ末端カルボキシル基へのＮ末端アミノ基の連結
環状Ｈ２Ｅ＝６位Ｇｌｕガンマ（側鎖）カルボキシル基へのＮ末端アミノ基の連結
環状Ｏｒｎ２Ｔ＝Ｃ末端カルボキシル基へのオルニチンのデルタ（側鎖）アミノ基の連結
環状Ｅ２Ｋ＝Ｌｙｓイプシロン（側鎖）アミノ基へのＧｌｕアルファカルボキシル基の連結
Ａｃ＝アセチル
Ｅ*＝Ｇｌｕおよび次のアミノ酸間のペプチド連結が、アルファカルボキシル基でなく、Ｇｌｕのガンマ（側鎖）カルボキシル基を通じて起こる
アリル−＝  −ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2
アリル側鎖メタセシス＝  −ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ2−連結を形成する、２つのアリル基の反応
小文字はアミノ酸のＤ−鏡像異性体を示す。例えば、以下の化合物２５０の配列は、ｓｐｗｎｅｈであり、これは、化合物２４４（ＨＥＮＷＰＳ；配列番号７）の逆反転ペプチドである。
【００７２】
表１
【００７３】
【表１ａ】
2007531536.tif 000002
【００７４】
【表１ｂ】
2007531536.tif 000003
【００７５】
（実施例４）
細胞培養
正常ヒト末梢血から単球を単離する。血液バンクによって、正常ボランティア（２０〜５０歳）から試料を収集する。これらはすべて、使用前に、ＨＩＶまたはＨＢＶ混入がないことに関して試験される。末梢血白血球のＦｉｃｏｌｌ（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、Ｓｉｇｍａ）勾配分離によって、ヒト正常単核細胞を得る。記載するように、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）でコーティングしたプラスチックプレートへの接着によって、リンパ球から単球を分離する（Ｖｏｕｌｄｏｕｋｉｓ  Ｉ．ら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９２：７８０４−７８０８  １９９５）。この方法の後で、＞９０％の細胞がＣＤ１４抗原を発現し、そして単球の細胞化学特性を示す。次いで、Ｌ−非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、および１０％ＦＣＳを補ったＤＭＥＭ（すべてＧｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で、細胞をインキュベーションする。上記培地、化学薬品、およびＦＣＳは、ヒト単球に対する直接活性化効果を持たないことが試験されている（活性化マーカーとして、ＣＤ２３発現およびＴＮＦ−α産生）。２４〜４８時間、培養フラスコに接着させた後、これらの細胞は、マクロファージ様細胞に分化し、フッ化ナトリウムに阻害される、非特異的エステラーゼ活性を示す。
【００７６】
正常ヒトドナー由来接着細胞は、あるとしても低い表面ＣＤ２３発現しか持たず、そして本研究ではマクロファージと称される。組換えヒト・インターロイキン４（１０ｎｇ／ｍｌ）で細胞をインキュベーションした後、ＣＤ２３発現を得る。しかし、炎症性疾患（例えば関節炎）の患者では、末梢血由来単球は、ＣＤ２３を発現することも可能であり、そしてＩＬ−４を必要としない。組織由来マクロファージは、大部分、ＣＤ２３+である。
【００７７】
いくつかの実験では、ＥＢＶ形質転換ＣＤ２３+ヒトＢ細胞株をＣＤ２３結合アッセイに用いる。これらの細胞は、Ｂリンパ球が、マクロファージの炎症性仲介因子を欠くため、機能アッセイには適切でない。
【００７８】
（実施例５）
ヒト・マクロファージにおける炎症反応の活性化
適切なＭｏＡｂ（２０μｇ／ｍｌ、クローン１３５、ＩｇＧ1κアイソタイプ）によって、またはヒトＩｇＥ／抗ＩｇＥ複合体（ＩｇＥ、Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅ、フランス・パリ；ヤギ抗ヒトＩｇＥ、Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、オランダ・ティルブルフ）によって、ＣＤ２３表面分子の架橋を通じて、単球由来マクロファージ（ＣＤ２３+）を活性化する。この活性化経路は、ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡ転写の活性化、並びに一酸化窒素（ＮＯ）、ＴＮＦ−α、反応性酸素ラジカル、ＩＬ−１、およびＩＬ−６などの多様な炎症性仲介因子の、マクロファージによる生成を促進する（概説には：Ｄｕｇａｓ  Ｂら，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ，  １６：５７４−５８０（１９９５）を参照されたい）。
【００７９】
（実施例６）
炎症反応の定量化
加湿大気中、３７℃、５％ＣＯ2で１〜３日インキュベーションした後、以下のように、炎症反応に関して、マクロファージを分析する：
２４時間インキュベーション：ＲＴ−ＰＣＲによるｉＮＯＳ−ｍＲＮＡの検出；
３６〜４８時間インキュベーション：二酢酸ジアミノフルオレセイン（ＤＡＦ）蛍光検出装置による、細胞内ＮＯの検出；
４８〜９６時間インキュベーション：サイトカインおよび亜硝酸塩検出のための上清収集。亜硝酸塩を、Ｇｒｅｉｓｓ法（Ｄａｖｉｅｓら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２２５：３０５−３２０，  ２００３）によって定量化し、一方、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αを、商業的ＥＬＩＳＡキットを用いて定量化した。以下の抗体および試薬を利用した：
組換えヒトＩＬ−４（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ、フランス・ダーディリーより寄贈）；
ヒトＩｇＥ（Ｓｔａｌｌｅｒｇｅｎｅ、フランス・パリ）；
ヤギ抗ヒトＩｇＥ（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、オランダ・ティルブルフ）；
Ｌ−ＮＩＬ（ＳＮＡＰ、Ａｌｅｘｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、スイス・ロイフェルフィンゲン）、
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（すべて、Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）
ＣＤ２３−ＭｏＡｂ（クローン２５）（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、フランス・マルセイユ・ルミニー）。
【００８０】
亜硝酸塩の定量化後、対照に比較した阻害パーセントを計算する。ｉＮＯＳ産生の阻害を立証する、以下の結果を得た：
表２
【００８１】
【表２】
2007531536.tif 000004
【００８２】
（実施例７）
ＣＤ２３特異的結合の分析
３つの方法を用いて、多様な化合物が、特異的ＭｏＡｂまたはＩｇＥ／抗ＩｇＥ免疫複合体によるＣＤ２３認識を遮断する能力をアッセイする：
ａ）ＣＤ２３でコーティングした表面への結合の阻害：ＥＬＩＳＡ法により検出；
ｂ）ＣＤ２３＋細胞（マクロファージまたはＢ細胞株）への抗ＣＤ２３−ＦＩＴＣ結合の阻害；
ｃ）ＣＤ２３＋細胞へのＩｇＥ／抗ＩｇＥ−ＦＩＴＣ結合の阻害。
【００８３】
ＦＩＴＣコンジュゲート化リガンドを添加する前に、コーティング表面または細胞を、ＣＤ２３対構造と１〜４時間インキュベーションする。
炎症機能に関しては、ＣＤ２３−ＭｏＡｂまたはＩｇＥ／抗ＩｇＥ複合体とインキュベーションする前に、ＣＤ２３対構造と細胞を４時間プレインキュベーションする。２〜４日後、細胞上清を収集し、そして多様な仲介因子における、その含量を試験する。
【００８４】
（以下は、多様なペプチド試験の分析によって追跡した生物学的活性の結果である）
１．特異的ペプチドによるＣＤ２３結合の遮断
ＣＤ２３+細胞を、阻害性ペプチド（ｐ３０Ａ）または非関連対照ペプチド（ｐＮｕ）の存在下でインキュベーションする。細胞蛍光測定装置によって、蛍光強度を定量化した。以下は、培地のみでインキュベーションした細胞に比較した、ＣＤ２３ペプチドまたは対照ペプチドと細胞をプレインキュベーションした後に回収された蛍光強度の割合である。
【００８５】
【表３】
2007531536.tif 000005
【００８６】
ＣＤ２３リガンドとして、ＩｇＥ／抗ＩｇＥ−ＦＩＴＣを用いて、類似のデータを得た。
【００８７】
【表４】
2007531536.tif 000006
【００８８】
２．特異的ペプチドによる、活性化マクロファージからのＮＯ生成の阻害
ヒト・マクロファージの炎症反応は、これらの細胞による一酸化窒素のｉｎ  ｖｉｖｏ生成とほぼ相関した。我々はこの炎症性仲介因子を、細胞活性化のマーカーとして用いる。
【００８９】
ＣＤ２３+細胞を、阻害性ペプチド（ｐ３０Ａ）の存在下または非存在下で、４時間インキュベーションする。ＣＤ２３−ＭｏＡｂまたはＩｇＥ／抗ＩｇＥ免疫複合体を添加する。３〜５日間インキュベーションした後、細胞上清を採取し、そしてＧｒｅｉｓｓ反応によって、亜硝酸塩レベルを定量化する（Ｄａｖｉｅｓら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２２５：３０５−３２０，  ２００３）。
【００９０】
【表５】
2007531536.tif 000007
【００９１】
*［ＮＯ2−］のμＭ
関節リウマチ患者の滑液由来のマクロファージの炎症機能に対する、ＣＤ２３−ペプチドまたは陰性対照の影響もまた、調べる。
【００９２】
【表６】
2007531536.tif 000008
【００９３】
*［ＮＯ2−］のμＭ
ラット腹腔マクロファージおよびラット末梢マクロファージからのＮＯ産生もまた測定する。腹腔マクロファージは非常にＣＤ２３+であり、そして末梢血由来細胞に比較して、はるかに多量の炎症促進性仲介因子を産生する。ＣＤ２３+細胞を、阻害性ペプチド（ｐ３０Ａ）の存在下または非存在下で４時間インキュベーションする。ＩｇＥ／ＤＮＰ−ＢＳＡを添加して、ＣＤ２３架橋を誘導する。Ｌ−ＮＩＬは、ＮＯＳ−ＩＩの特異的阻害剤である。Ｐｅｐ−は陰性対照ペプチドである。３〜５日間インキュベーションした後、細胞上清を採取し、そしてＧｒｅｉｓｓ反応によって、亜硝酸塩レベルを定量化する（Ｄａｖｉｅｓら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２２５：３０５−３２０，  ２００３）。図２は、ｐ３０Ａを添加すると、マクロファージによるＩｇＥ／ＤＮＰ−ＢＳＡ誘導性ＮＯ産生が阻害されることを示す。
【００９４】
３．特異的ペプチドによる、活性化マクロファージからのＴＮＦ−α生成の阻害
ＮＯに加えて、炎症性疾患中のよく立証されたエフェクター因子である、ＴＮＦ−αの産生に対するペプチドの影響もまた試験する。
【００９５】
ＣＤ２３+細胞を、阻害性ペプチド（ｐ３０Ａ）の存在下または非存在下で４時間インキュベーションする。ＣＤ２３−ＭｏＡｂまたはＩｇＥ／抗ＩｇＥ免疫複合体を添加する。３〜５日間インキュベーションした後、細胞上清を採取し、そしてＴＮＦ−αのレベルを、特異的ＥＬＩＳＡによって定量化する。
【００９６】
【表７】
2007531536.tif 000009
【００９７】
*ｐｇ  ＴＮＦ−α／ｍｌ
関節リウマチ患者の末梢血または滑液由来のマクロファージの炎症機能に対するＣＤ２３−ペプチドまたは陰性対照の影響もまた調べる。
【００９８】
【表８】
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【００９９】
*ｐｇ  ＴＮＦ−α／ｍｌ
４．関節炎ラットの治療
第０日、体重１４５〜１５５ｇの６週齢雌ルイス・ラットに、関節炎誘導エマルジョンを皮下注射する。ラットに：
２ｍｇ／ラットの熱不活化ミコバクテリウム・ブチリクム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ）、以下で希釈；
２４０μｌのワセリン；
３０μｌのＴｗｅｅｎ−２０；および
３０μｌのＰＢＳ
を含有するエマルジョン３００μｌを注射する。
【０１００】
免疫工程を第７日に繰り返す。ラットは第１５日〜第２１日までに、関節炎の徴候を示す。関節炎の徴候に、臨床スコア（１〜４）を割り当てる。第４０日までに、臨床スコアは、１から、３または４に上昇する。免疫ラットでは、より遅い体重増加もまた、観察される（図１ａ）。
【０１０１】
第０日の阻害性ペプチドｐ３０Ａのユニークな注射（腹腔内または皮下）は、関節炎外見にまったく影響を持たない。しかし、臨床的徴候の出現後、５ｍｇのｐ３０Ａを皮下注射すると、ラットの５０％で関節炎症状の完全寛解（図１ｂ）が生じるとともに、残りの２５％のラットで臨床スコアの減少が生じた。
【０１０２】
ｐ３０Ａの皮下注射を用いた結果は、腹腔内注射または静脈内治療を用いて得た、関節炎状態の寛解を誘導しない結果と対照的である。
（実施例８）
ｐ３０Ａを用いた、ラットのｉｎ  ｖｉｖｏ予防および治療
予防的効能を立証するため、ラットを免疫と同時に治療する。さらに、療法効能を立証するため、別の群のラットを、免疫後、臨床症状の出現の第１日に同時に治療する。各動物群は、８匹のラットを含む。雌ルイス・ラット（Ｊａｎｖｉｅｒ、フランス・ルジェネサンイスル）を標準的実験室条件下で飼育し、そして動物を食物および水に自由にアクセスさせる。温度は、２２±２℃に維持し、そして１２時間明暗スケジュールを維持する。欧州経済共同体「８６／６０９」に公表されたガイドラインに厳密にしたがって、すべての動物処置を行う。８ｍｌワセリン、１ｍｌポリソルベート８０、および１ｍｌ  ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、メリーランド州ウォーカーズビル）のエマルジョンに希釈した不活化ミコバクテリウム・ブチリクム（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ミシガン州デトロイト）３００μｌ（１．８ｍｇ）を尾の付け根に皮下注射することによって、６週齢の動物において、アジュバント関節炎（ＡＡ）を誘導する。１週間後、同じ用量の抗原でラットに追加免疫し、そして関節炎の臨床症状に関して、最長で免疫５０日後まで観察する。治療プロトコルをまったく知らない２人の独立の観察者によって、ＡＡ重症度の評価を行う。以下のような０〜２の臨床スコア測定によって、各足のＡＡの重症度を毎日定量化する：炎症の徴候なし（０）；１つの足の腫脹のみ（足直径が＞２倍）（０．５）または腫脹／不動（１．０）；２つの足の腫脹（１．５）または腫脹／不動（２．０）。動物の体重評価を毎日測定する。炎症開始中（予防的）、または炎症徴候の出現後、２日ごとに（第０日、第２日、第４日、第６日、および第８日）、ペプチドまたはペプチド模倣体（０．１％ＤＭＳＯに溶解）をラットにＩ．Ｃ．注射する。陰性対照として、ラットに生理食塩水を注射する。
【０１０３】
臨床スコアを、上述のように決定し、そして累積臨床スコアを、免疫後の日数に対してプロットする（図２、３、および４）。
図２、３、および４の各々において、ｘ軸の下の矢印は、ＩＣ注射を投与した日を示す。図２に示すように、２つの異なる投薬措置のｐ３０Ａで治療したラットは、対照ラットに比較して、明らかに優れた臨床スコアを示し、ｐ３０Ａの予防的効果と一致する。図３に示すように、症状が最初に現れた日に、ｐ３０Ａで治療したラットは、３つの異なる投薬措置で、ｐ３０Ａ治療を受けなかった対照ラットに対して、明らかに臨床的効果を示す。図４に示すように、関節炎症状を持つラットにｐ３０Ａを投与すると、こうした治療を受けなかったラットを超える体重増加が生じ、そしてこうした体重増加は、関節炎症状を持たない対照ラットのものに近づいた。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】（ａ）熱不活化ミコバクテリウム・ブチリクムでの免疫後、ラットは、第１５〜２１日までに、関節炎を示す。（ｂ）５ｍｇのＦＨＥＮＷＰＳペプチド（配列番号１；ｐ３０Ａ）の皮下注射によって、寛解が生じる。
【図２】ｐ３０Ａでのラットの治療の予防的効果。
【図３】ｐ３０Ａでのラットの治療の療法的効果。
【図４】対照ラット、ｐ３０Ａで治療した関節リウマチ（ＲＡ）ラット、および未治療で放置したＲＡラットの体重増加。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
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【配列表】
2007531536000001.xml
【国際調査報告】
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2007531536.tif 000029
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