(57)【要約】  本発明は、１個またはそれ以上のＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３またはＳ１Ｐ５受容体よりもＳ１Ｐ４受容体に対して少なくとも１０倍選択性の、特に、遊離型または塩形態の構造（Ｉ）【化１】2007518766.tif 000013［式中、Ｒ１は、フェニルまたはナフチルであり、ここでフェニルは、１個または２個のハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシまたはフェニルＣ１−６アルキルにより置換され；そしてＲ２は、水素またはＣ１−６アルキルである］で示される新規のインドール−アラニン誘導体であるＳ１Ｐ４受容体アゴニスト、それらの製造方法、特に移植術におけるそれらの使用、およびそれらを含む医薬組成物に関する。
2007518766.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離型または薬学的に許容される塩形態の、Ｓ１Ｐ４受容体アゴニストである化合物であって、Ｓ１Ｐ４受容体に対する化合物のＥＣ５０とＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３またはＳ１Ｐ５受容体に対する化合物のＥＣ５０の比により測定して、１個またはそれ以上のＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３またはＳ１Ｐ５受容体よりもＳ１Ｐ４受容体に対して少なくとも１０倍の選択性を有する化合物。
【請求項２】
遊離型、水和物または塩形態の、式Ｉ
【化１】
2007518766.tif 000011
［式中、
Ｒ１は、フェニルまたはナフチルであり、ここでフェニルは、１個または２個のハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシまたはフェニルＣ１−６アルキルにより置換されており；そして
Ｒ２は、水素またはＣ１−６アルキルである］
で示される化合物。
【請求項３】
３−（４−（２−エチルフェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニン、  ３−（４−（２−ベンジル−フェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニン、３−（４−（ナフタレン−２−イル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニン、３−（４−（ナフタレン−１−イル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニン、３−（４−（２−ブトキシ−フェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニン、３−（４−（２−プロピル−フェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニン、３−（４−（２−イソプロピル−フェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニンおよび３−（４−（２，４−ジクロロ−フェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−アラニンから選択される、請求項１または２に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
【請求項４】
遊離型または薬学的に許容される塩形態の、３−（４−（２−エチルフェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−Ｄ−アラニンである請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
医薬としての使用のための、遊離型または薬学的に許容される塩形態の請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
遊離型または薬学的に許容される塩形態の請求項１から４のいずれか一項に定義の化合物を、その薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む医薬組成物。
【請求項７】
リンパ球が介在する障害または疾患、急性または慢性移植片拒絶、Ｔ細胞介在性炎症性疾患または自己免疫疾患、糖尿病、アレルギー性疾患、心筋炎、肝炎、虚血／再潅流傷害、腎不全、出血性ショック、外傷性ショック、癌または感染症の処置または予防のための医薬の製造における、遊離型または薬学的に許容される塩形態の請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、または請求項４に記載の医薬組成物の使用。
【請求項８】
遊離型または薬学的に許容される塩形態の請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、ならびに免疫抑制剤、免疫調節剤、抗炎症剤および化学療法剤から選択されるさらなる薬剤を包含する薬学的組合せ剤。
【請求項９】
式ＩＩ
【化２】
2007518766.tif 000012
［式中、Ｒ１およびＲ２は、請求項２に定義の通りであり、
Ｒ６は、Ｃ１−６アルキルまたはベンジルであり、
Ｒ７は、アミノ保護基である］
で示される化合物を脱保護すること、および所望により遊離型で得られる式Ｉの化合物を塩形態に変換すること、もしくはその逆を含む、請求項２に記載の化合物の製造方法。
【請求項１０】
処置の必要な対象において、リンパ球が介在する障害または疾患、急性または慢性移植片拒絶、Ｔ細胞介在性炎症性疾患または自己免疫疾患、糖尿病、アレルギー性疾患、心筋炎、肝炎、虚血／再潅流傷害、腎不全、出血性ショック、外傷性ショック、癌または感染症の処置または予防のための方法であって、有効量の請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を該対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、有機化合物、それらの製造方法およびそれらを含む医薬組成物に関する。
【０００２】
１つの局面において、本発明は、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ４）受容体アゴニストである化合物であって、１個またはそれ以上のＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３またはＳ１Ｐ５受容体よりもＳ１Ｐ４受容体に対して選択性を有する化合物を提供する。Ｓ１Ｐ受容体は、例えばＷＯ０３／０６１５６７に記載されている。好ましくは前記化合物は、上記の各Ｓ１Ｐ受容体よりもＳ１Ｐ４受容体に対して選択性である。前記化合物は、好ましくは、１個またはそれ以上の上記のＳ１Ｐ受容体よりもＳ１Ｐ４受容体に対して少なくとも１０倍、より好ましくは２０倍、最も好ましくは１００倍の選択性を示す。選択性は、Ｓ１Ｐ４受容体に対する化合物のＥＣ５０とＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３またはＳ１Ｐ５受容体に対する化合物のＥＣ５０の比を決定することにより測定される。ＥＣ５０値は、例えば下記のＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイまたはカルシウム動員アッセイにより得られる。さらなる好ましい態様において、前記化合物はまた、ＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイまたはカルシウム動員アッセイにおいて１μＭまたはそれ以下のＳ１Ｐ４受容体に対するＥＣ５０値を示す。
【０００３】
好ましい態様において、本発明は、遊離型または塩形態の式Ｉ
【化１】
2007518766.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、フェニルまたはナフチルであり、ここでフェニルは、１個または２個のハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシまたはフェニルＣ１−６アルキルにより置換されており；そして
Ｒ２は、水素またはＣ１−６アルキルである］
で示される化合物に関する。
【０００４】
全てのアルキル基は、直鎖または分岐鎖であり得る。Ｃ１−６アルキルは、好ましくはＣ１−４アルキルである。Ｃ１−６アルコキシは、好ましくはＣ１−４アルコキシである。
ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり得る。
【０００５】
Ｒ１は、好ましくは式Ｉａ：
【化２】
2007518766.tif 000004
［式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１個または２個は、水素であり；そして
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５のうち１個または２個は、ハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシまたはフェニルＣ１−６アルキルであるか；
または、Ｒ３およびＲ４、またはＲ４およびＲ５は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、ベンゼン環を形成する］
で示される基である。
【０００６】
式ＩおよびＩａにおいて、以下の意味は、好ましくは、独立して、一緒にまたはいずれかの組合せもしくは下位の組合せである：
ａ）Ｒ４またはＲ５の一方が、水素以外であり、より好ましくはＲ５が水素以外であり、そしてＲ４が水素である；
ｂ）Ｒ４またはＲ５が、ベンジル、エチル、ブトキシ、プロピル、イソプロピルまたはクロロであり、より好ましくはＲ５が、上記の基のうちの１個であり、そしてＲ４が水素である；
ｂ）Ｒ３は、水素またはクロロであり、より好ましくは水素である；
ｃ）Ｒ２は、水素またはメチルである。
【０００７】
式Ｉの化合物は、無機酸または有機酸、例えば塩酸、臭化水素酸またはマレイン酸との酸付加塩も形成し得る。式Ｉの化合物は、カルボキシ基から誘導される陽イオン性塩、よりとりわけ、アルカリまたはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム、カリウム、カルシウムまたはマグネシウム塩、およびアンモニアまたは有機アミンから誘導されるアンモニウム塩を形成し得る。
【０００８】
式Ｉの化合物は、一級アミノ基を有する炭素原子でのキラル中心を含む。それ故に、式Ｉの化合物は、２個のエナンチオマー形態で存在する。本発明には、式Ｉのラセミ体および全てのエナンチオマー形態が包含されることが理解されるべきである。
【０００９】
式Ｉの化合物は、それらの水和物の形態でも得られる。水和物はまた、本発明の一部である。
【００１０】
本発明はまた、式ＩＩ
【化３】
2007518766.tif 000005
［式中、Ｒ１およびＲ２は、上記に定義の通りであり、
Ｒ６は、Ｃ１−６アルキルまたはベンジルであり、そして
Ｒ７は、アミノ保護基である］
で示される化合物を脱保護すること、および要すれば式Ｉの化合物をその塩に変換することを含む、式Ｉの化合物の製造方法を提供する。
【００１１】
前記方法は、常套方法を用いて実行可能である。好適なアミノ保護基の例は、例えば「Protective Groups in Organic Synthesis」T.W. Greene, J.Wiley ＆ Sons NY、2nd ed., chapter 7, 1991、およびその中の文献に開示されており、例えばアシル、例えばｔｅｒｔ．ブチルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、トリフルオロアセチル、トリメチルシリルエタンスルホニルなどである。脱保護は、Ｒ７がベンジルオキシカルボニルであり、およびＲ６がベンジルであるとき、例えば加水分解により行われ得る。その反応は、そのとき、触媒としてパラジウム活性炭を用いて室温にてテトラヒドロフラン、塩化メチレンまたはジオキサンのような有機溶媒中で行われ得る。Ｒ６がＣ１−６アルキルであるとき、その方法は、２段階で都合良く行われる。第一段階において、式ＩＩの化合物のカルボキシ基を、室温にてテトラヒドロフラン、ジオキサン、メタノールまたはエタノールのような有機溶媒中、例えばＮａＯＨ水溶液または塩基性イオン交換樹脂を用いた弱い加水分解により保護することができる。第二段階において、アミノ基を塩化メチレン中、例えばヨードトリメチルシランを用いて脱保護する。Ｒ７がベンジルオキシカルボニルであるとき、水素化分解を行うことができる。前記２段階方法は、Ｒ３からＲ５のうち１個または２個がハロゲンであるとき、好適に用いられる。
【００１２】
塩の任意の形成は、常套的に行われ得る。
【００１３】
式Ｉの化合物のラセミ混合物は、公知の方法で、例えば分解剤（resolving agent）として光学活性酸を用いて分解され得る。あるいは、純粋なエナンチオマー形態を、光学活性出発物質を利用して製造することができる。
【００１４】
出発物質として用いる式ＩＩの化合物を、例えば、式ＩＩＩ
【化４】
2007518766.tif 000006
［式中、Ｒ６およびＲ７は上記に定義の通りである］
で示される化合物を、式ＩＶ
【化５】
2007518766.tif 000007
［式中、Ｒ１およびＲ２は、上記に定義の通りであり、そしてＸは脱離基である］
で示される化合物と反応させることにより、製造することができる。
【００１５】
反応を、常套方法を用いて行うことができる。例えば、反応を、−１５℃から２５℃の温度にて塩化メチレンのような有機溶媒中で行うことができる。脱離基Ｘは、例えばハロゲン、とりわけ塩素またはヒドロキシである。
【００１６】
都合良くは、酸結合剤、例えばピリジンのような三級アミンが存在する。
【００１７】
上記の方法の出発物質の製造が特に記載されない場合、これらは、公知の化合物とまたは本明細書に記載の方法と同様の方法で製造可能である。
【００１８】
下記の実施例において、全ての温度は摂氏温度で記載され、かつ修正されていない。［α］Ｄ２０値も修正されていない。
【００１９】
実施例１：
３−（４−（２−エチルフェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−Ｄ−アラニン  ａ）４−（２−エチルフェニル）−インドール−２−カルボン酸
１１ｍｌのトルエンおよび２ｍｌの２Ｍ  ソーダ中、０．２８ｇの４−ブロモ−インドール−２−カルボン酸および０．０６９ｇのテトラキストリフェニルホスフィンパラジウムの混合物に、３ｍｌのエタノール中０．３００ｇの２−エチルフェニルボロン酸の溶液を加える。この混合物を、１６時間還流し、ろ過し、そして水相を２Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、酢酸エチルで抽出する。有機相の濃縮により、次の段階用に十分純粋な、褐色がかった粉末として産物を得る（融点２３０−２３３℃）。
【００２０】
ｂ）３−（４−（２−エチルフェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−Ｎ（２）−Ｚ−Ｄ−アラニンメチルエステル
３２ｍｌのピリジン中、２．１１ｇの４−（２−エチルフェニル）−インドール−２−カルボン酸の溶液に、１．４１ｇのカルボニルジイミダゾールを加える。ガス発生の終了後、２．２９ｇのメチル Ｎ（２）−Ｚ−Ｄ−２，３−ジアミノプロピオネートを加え、そして混合物を室温で４日間撹拌する。溶媒を蒸発後、残渣を水／酢酸エチルで抽出し、有機相を乾燥させ、濃縮し、そして粗産物を酢酸イソプロピル／トルエン  ４：１を用いてシリカのクロマトグラフィーを行い、黄色の非結晶性粉末として所望の化合物を得る。
【００２１】
ｃ）３−（４−（２−エチルフェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−Ｄ−アラニン
２．０３ｇの３−（４−（２−エチルフェニル）−２−カルボキサミド−インドール）−Ｎ（２）−Ｚ−Ｄ−アラニンメチルエステル、４．１ｍｌの２Ｎ  ＮａＯＨおよび１０ｍｌのジオキサンの混合物を、室温で２時間撹拌する。常套方法での後処理後、得られる酸を２２ｍｌの塩化メチレン中に溶解し、１．０３ｍｌのヨードトリメチルシランで０℃にて処理する。５０分間撹拌後、混合物を乾燥濃縮し、残渣を水中に取り込む。粗産物が析出し、ろ過により集め、水で洗浄し、そして０．２Ｎ  ＮａＯＨの添加によりｐＨを６に調整の下、水／イソプロパノールから再結晶し、表題化合物を白色粉末として得る（融点、２５８−２６５℃）。
【００２２】
式Ｉの化合物（ここで、Ｒ１およびＲ２は表１に定義の通りである）は、適当な出発物質を用いて、上記の方法のうちの１方法に従い製造され得る。
【００２３】
【表１】
2007518766.tif 000008
【００２４】
遊離型または薬学的に許容される塩形態の、Ｓ１Ｐ４受容体アゴニスト（以降、本発明の化合物として称される）に選択性である本明細書に開示される化合物、例えば式Ｉの化合物は、有用な薬理学的特性、例えばインビトロおよびインビボ試験で示される通りの、例えばリンパ球再循環調節特性を示し、それ故に、治療に用いられる。特に、本発明の化合物は、以下のアッセイにて証明されるように、ヒトＳ１Ｐ４（ＥＤＧ６）受容体の機能的アゴニストとして有用である。
【００２５】
Ｓ１Ｐ４化合物のインビトロ薬理作用を決定するためのアッセイ
ａ）ヒトＳ１Ｐ受容体をコードする発現ベクター
Ｃ末端でｃ−ｍｙｃペプチドタグと融合したヒトＳ１Ｐ４遺伝子（ＨＳＥＤＧ４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０００４７９）の発現ベクターを、Van Brocklynらの、2000, Blood 95(8), 2624に記載の通りに得る。Ｓ１Ｐ４−ｍｙｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ（Invitrogen）中にクローニングし、それは安定した哺乳動物細胞を選択するためのＧ４１８耐性を有する。Ｓ１Ｐ４挿入物のＤＮＡ配列を、両方の鎖で決定する。ＨＳＥＤＧ４のＧｅｎＢａｎｋ登録と比較してアミノ酸変化を導くであろうヌクレオチドの相違は、発見されていない。Ｓ１Ｐ４−ｍｙｃ  ｃＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩを用いてｐＲｃ／ＣＭＶベクター中に挿入する。
【００２６】
下記のベクターを用いる。
ヒトＳ１Ｐ１およびＳ１Ｐ３配列の前のｍｙｃ配列を含むヒトＳ１Ｐ１（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託番号Ｍ３１２１０）およびＳ１Ｐ３（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託番号Ｘ８３８６４）ｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ  ３．１ベクター中に挿入する。前記ベクターを、構築物の正確性を確認するために配列決定して完了する。ヒトＳ１Ｐ２（ＧＩ：４０９０９５５、ＴＲＥＭＢＬ：０１９５１３６）を、ＰＣＲに基づく方法によりクローン化する。肺ｃＤＮＡ（マラソンｃＤＮＡ）を得る（BD Biosciences Chontech, Palo Alto, CA 94303, USA）。下記のオリゴヌクレオチド：フォワードプライマー：ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＡ  ＣＴＣ  ＧＧＡ  ＧＴＡ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＣＡＡ  ＣＡＡ  ＧＧＴ  ＣＣＡ  Ｇ（１から４５、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託番号ＡＦ０３４７８０）およびリバースプライマー：５’−ＧＡＴ  ＴＣＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  ＣＡＧ（１０６２から１０３９、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託番号ＡＦ０３４７８０）を、ＰＣＲ反応に用いる（翻訳開始配列（ＡＴＧ）およびストップコドンに下線を引く）。ＰＣＲを、０．２−０．４μｇのｃＤＮＡ、１×反応緩衝液（１０ｘＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA）、０．５μＭのプライマー、０．２５ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５ユニットのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）の存在下にて、第一段階を９５℃で２分間、（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で９０秒）を３０サイクル、そして７２℃で１０分間の最終段階で行う。増幅した約１１００ｂｐの産物を、標準アガロースゲル電気泳動により分析する。ｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｔｏｐｏ  Ｖ（Invitrogen Corporation）中にＰＣＲ産物をクローニング後、異なる細菌コロニーからのＤＮＡ挿入を配列決定する。最終的な配列を、両方向で配列決定されている３個の独立したプラスミド調製物から組み立てる。
【００２７】
ヒトＳ１Ｐ５（ＧＩ：３０１７１３３２またはＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託番号ＡＹ２６２６８９、ＴＲＥＭＢＬ：Ｑ９Ｈ２２８）を、ＰＣＲに基づく方法によりクローニングする。肺および脾臓ｃＤＮＡ（マラソンｃＤＮＡ）を、BD Biosciences Chlontech社から入手する(BD Biosciences Chlontech, Palo Alto, CA 94303, USA);ゲノムＤＮＡを、標準的方法を用いてＨｅＬａ細胞から単離する。下記のオリゴヌクレオチド：フォワードプラオマーＣＡＣ  ＣＡＴ ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＧＣＧ（−４から２０、ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受託番号ＡＹ２６２６８９）およびリバースプライマー５‘−ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＴＴＣ  ＴＧＡ  ＴＡＣ  ＣＡＧ  ＡＧＴ  Ｃ（１１９７から１１３１、ＡＹ２６２６８９）を、ＰＣＲ反応に用いる（翻訳開始配列（ＡＴＧ）およびストップコドンに下線を引く）。ＰＣＲを、０．５μＭのプライマー、０．２５ｍＭのｄＮＴＰおよび２．５ユニットのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）の存在下にて、第一段階を９５℃で２分間、（９５℃で３０秒、６０℃で３０秒および７２℃で９０秒）を３０サイクル、そして７２℃で１０分間の最終段階で行う。増幅した約１１００ｂｐの産物を、標準アガロースゲル電気泳動により分析する。ｐｃＤＮＡ  ３．１  Ｔｏｐｏ  Ｖ（Invitrogen Corporation）中にＰＣＲ産物をクローニング後、異なる細菌コロニーからのＤＮＡ挿入を配列決定する。最終的な配列を、両方向で配列決定されている３個の独立したプラスミド調製物から組み立てる。
【００２８】
ｂ）Ｓ１Ｐ４を安定に発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞株の構築
ｃ−ｍｙｃ標識したＳ１Ｐ４受容体を発現する安定な細胞株を構築するために、５μｇのプラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ  ｍｙｃ−Ｓ１Ｐ４を、プラスミドを１箇所で切断する、制限エンドヌクレアーゼＰｖｕＩを用いて切断する。その後、線状化プラスミドを終濃度０．３Ｍの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０および６６％エタノールを用いて沈殿させる。遠心および洗浄後、ＤＮＡペレットを３０μｌの水に溶解する。トランスフェクションについては、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ−６１）細胞を、１００ｍｍの細胞培養ディッシュ（Falcon）に１ウェルあたり１ｘ１０６細胞の細胞密度でトランスフェクションする前日に、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を含むＭＥＭα培地（α修飾型最小必須培地）中に播種し、２４時間３７℃で５％ＣＯ２中でインキュベートする。トランスフェクションの日に、５μｇの線状化ｐＲＣ／ＣＭＶ  ｍｙｃ−Ｓ１Ｐ４プラスミドを２７０μｌのＲＰＭＩ培地に加える。６０μｌのＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Qiagen）をＤＮＡ溶液に添加し、１０秒間混合後、試料を１０分間インキュベートし、複合体を形成させる。ＤＮＡ−ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ複合体を、さらに３ｍｌのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを添加しながら混合し、その後、細胞の単層に移す。３時間インキュベート後、トランスフェクション培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄する。１０％ＦＣＳを添加された新鮮なＲＰＭＩ培地を加え、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートする。安定に形質転換されたクローンの選択を、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Lifetechnologies）の添加後に行う。約１２−１４日後、細胞クローンを、それらの前方および横方向へ分散する特性に従い、ＦＡＣＳｔａｒ  Ｐｌｕｓ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ（BectonDickinson）を用いて９６ウェル細胞培養プレートの個々のウェル中に単一細胞を選別することにより得る。選別および選択法の後に増殖した個々のコロニーを増大させ、１個のクローンを、ＴａｑＭａｎ定量ＰＣＲ分析により決定されるＳ１Ｐ４  ｍＲＮＡ発現のレベルを基に最終的に選択する。
【００２９】
ｃ）細胞培養維持
親ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ＦＢＳおよび１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Lifetechnologies）を添加されたＲＰＭＩ培地（Lifetechnologies）中で維持する。１個の最終的に選択されたクローンを含む、Ｓ１Ｐ４／ｍｙｃをトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％ＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Lifetechnologies）を添加されたＭＥＭα培地中で維持する。
【００３０】
ｄ）安定なＣＨＯクローンにおけるＳ１Ｐ４転写レベルの決定
細胞からの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して単離する。培養ディッシュ（１つには、３５ｍｍディッシュ、３５０μｌの緩衝液を用い、Ｑｉａｇｅｎのプロトコルに従い調整した）中に直接（単層に増殖した）細胞の破壊後、溶解物をスピンカラムにピペットで採取り出し、２１０００×ｇで２分間遠心する。３５０μｌの７０％エタノールを貫流液(flow-through)に加え、ウェルを混合し、ＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉカラムに適用し、そして１０’０００×ｇで１５秒間遠心する。貫流液を捨て、７００μｌのＲＷ１緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）をＲＮｅａｓｙカラムに加え、１５秒間遠心し、カラムを洗浄する。カラムを、５００μｌのＲＰＥ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ）を加えてさらに２度洗浄し、そして１００００×ｇで１５秒間遠心する。ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙカラムに直接３０−５０μｌの無ＲＮＡｓｅ水を添加することにより溶出し、１０’０００×ｇで１分間遠心する。
【００３１】
ＲＮＡを、ＱｉａｇｅｎのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて逆転写する。約２μｇのＲＮＡを、２μｌの１０×緩衝液、２μｌのｄＮＴＰ混合物、１μｌのＲＮａｓｅ阻害剤（１０ユニット／μｌ）、０．５μｇのランダムヘキサマー、１μｌのＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素および無ＲＮａｓｅ水と共に混合して最終容量を２０μｌとし、そして３７℃で６０分間インキュベートし、さらに３０分間４２℃でインキュベートする。反応を、９３℃で５分間で不活化し、氷上で冷却して、用いるまで−２０℃で保存する。
【００３２】
選択されたクローンにおけるＳ１Ｐ４  ｍＲＮＡの相対的転写レベルを決定するために、リアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）分析を行う。最適なプライマーおよびオプローブ濃度を、テンプレートとしてプラスミドを含むヒトＳ１Ｐ４を用いてＰＥ（Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ）Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社により提供される使用説明書に記載の通りに決定する。ヒトＳ１Ｐ４オリゴヌクレオチド、ならびにリアルタイムＰＣＲに最適なそれらの濃度を、下記に記載する（ＨＳＥＤＧ４；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ０００４７９に基づく）：
【００３３】
【表２】
2007518766.tif 000009
【００３４】
その後、第一鎖のｃＤＮＡを、ＡＢＩ７７００  ＴａｑＭａｎ器（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）での定量ＰＣＲに用いる。各試料中に存在するＲＮＡの量の内部対照として、１８ＳリボソームＲＮＡを、ＴａｑＭａｎ  Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌ試薬（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐ／Ｎ４３０８３１０、ＶＩＣ標識プローブ）を用いて同チューブ中で、Ｓ１Ｐ４  ＰＣＲ反応とリボソームＲＮＡ  ＰＣＲ反応を多重に行うことにより用いる。Ｓ１Ｐ４およびリボソームＲＮＡについての２個の独立した増幅物の同じ効率は形式上測定されないが、異なる細胞クローンでのＳ１Ｐ４転写レベルの半定量測定は、機能分析にてさらに特徴付けられる細胞クローンの選択には十分である。
【００３５】
ｅ）膜の製造
膜タンパク質を、野生型ＣＨＯ−Ｋ１およびヒトＳ１Ｐ４を発現するＣＨＯ細胞クローンから製造する。１０−３０ｍｇの膜タンパク質を得るために、細胞を、細胞クローンあたり１個の大きな培養ディッシュ（５００ｃｍ２）８０および９０％コンフルエンスまで増殖させる。培養培地を除去し、０．１％の無脂肪酸ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（５０ｍｌあたり１錠、Roche Diagnostics, Rotkreuz）を添加した２０ｍｌの冷ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ（ｐＨ７．５）中に剥離することにより、細胞をディッシュから氷上に集める。細胞を、７５０×ｇで１０分間４℃にて遠心し、１０ｍｌの冷膜緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４；１００ｍＭ  ＮａＣｌ；１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．１％  ＢＳＡおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル）中に再懸濁する。細胞懸濁物を、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを用いて２５０００ｒｐｍで各２０秒間隔にて３回、氷上でホモジナイズする。ホモジネートを、２６’９００×ｇで３０分間、４℃にて遠心し、膜タンパク質ペレットをボルテックスすることにより２ｍｌの冷膜緩衝液中に再懸濁する。タンパク質濃度を、Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙを用い、標準としてヒトＩｇＧを用いて測定する。膜タンパク質懸濁物の容量を、２から３ｍｇのタンパク質／ｍｌの最終濃度になるように調整する。その後、溶液を氷上で２５０００ｒｐｍにて２０秒間、再びホモジナイズ（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）し、その後０．８−１ｍｌの容量でエッペンドルフチューブ中に分注する。
【００３６】
ｆ）ｈＳ１Ｐ４を発現する細胞の活性測定：
ｆ１）ＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイ
ＧＴＰγＳ分析で試験すべきクローンの選択は、リアルタイムＰＣＲアッセイに基づく。大量のヒトＳ１Ｐ４を発現するＣＨＯクローンを、これらの実験に用いる。膜タンパク質を上記の通りに製造する。用いるＧＴＰγ３５Ｓ結合アッセイの基本的プロトコルは、最近の刊行物（Brinkmann et al. 2002, J.Biol. Chem, 277, 21453）に記載されており、下記の修飾を付す。Ｓ１Ｐを発現するＣＨＯからの膜タンパク質へのＧＴＰγ３５Ｓの結合を特徴付けるために、ＷＧＡでコーティングされたＰＶＴビーズ（ＳＰＡ−ビーズ、Amersham Biosciences）を用いる。ＧＴＰγ３５Ｓのβ線が、水溶液中で顕著な透過性を有するため、プレートを、非結合ＧＴＰγ３５Ｓによる非特異的な効果を最小にするために遠心する。アッセイを、２２５μｌ／ウェルの最終容量で９６−ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅ（Packard、カタログ番号６００５１９０）中で行う。短いホモジナイゼーションの後、膜タンパク質を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０μｇ／ｍｌ  サポニン（Riedel-de-Haen：カタログ番号１６１０９）、０．１％無脂肪ＢＳＡ（Sigma  カタログ番号Ａ０２８１）、ｐＨ７．４中に、異なる濃度（２５から１５０μｇ／ｍｌの間）で再懸濁する。膜タンパク質を、１ｍｇ／ウェルのＳＰＡ−ビーズ、１０μＭ  ＧＤＰ、異なる濃度のアゴニストと共に混合し、１０−１５分間ＲＴ（室温）でインキュベートする。ＧＴＰγ３５Ｓ結合反応を、２００ｐＭ  ＧＴＰγ３５Ｓ（Amersham、カタログ番号ＳＪ１３０８、＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の付加により開始する。前記Ｏｐｔｉｐｌａｔｅを密封し、一定に振とうしながら１１０−１２０分間ＲＴでインキュベートする。その後、プレートを１０分間２０００ｒｐｍで遠心し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ計器（Packard）で計測する。ＥＣ５０値の計算を、Ｏｒｉｇｉｎ  ７  ＲＳ２ソフトウェアパッケージ（Origin Lab Corporation, One Roundhouse Plaza, Northampton, MA 01060, USA）で利用可能な非線形回帰フィットプログラムを用いて行う。
【００３７】
ｆ２）カルシウム動員アッセイ
ＣＨＯ細胞を、ＦＣＳ添加αＭＥＭ中、黒色Ｃｏｓｔａｒプレート（９６または３８４ウェル、それぞれ５０’０００細胞または１２．５００細胞）に播種し、ＣＯ２インキュベーター中で２０−２４時間３７℃にて培養する。培養培地を除去後、細胞を２μＭ  Ｆｌｕｏ４ＡＭ（分子プローブ、カタログ番号Ｆ−１２４１；ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌの貯蔵溶液）、５ｍＭ  プロベネシド（probenicid）を含むＨＢＳＳ培地中で１時間３７℃にてインキュベートし、ＨＢＳＳ緩衝液、２．５ｍＭ  プロベネシドで洗浄し、そして同じ培地を重層する（９６−ウェルプレートあたり７５μｌ、３８４プレートあたり５０μｌ）。プレートをＦＬＩＰＲに移す。４０秒間ベースラインを測定後、ＨＢＳＳ中のアゴニストを加え、蛍光を、３から５分間、２秒間隔で測定する。いくつかの場合に、細胞を、５０ｎｇ／ｍｌの百日咳毒素（Sigma、カタログ番号Ｐ２９８０）で５時間予め処理する。５０μＭおよび／または１５０μＭで小胞体からのカルシウムの放出を阻害する（Ascher-Landsberg et al., 1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 264, 979）２−アミノエトキシジフェニルボレイト（２−ＡＰＢ、Calbiochem, Juro Supply, Bleicherstr. 11, Lucerne, Switzerland、カタログ番号100065）を、測定の２０−４０分前に、細胞培地に直接加える。ＥＣ５０の計算を、Ｎｏｖａｒｔｉｓから入手可能なＯｒｉｇｉｎ  ７  ＲＳ２ソフトウェアパッケージ（Origin Lab Corporation）で提供される非線形回帰フィットプログラムを用いて行う。
【００３８】
Ｓ１Ｐ４アゴニストの特異性および選択性のインビトロ決定：
本出願に記載の化合物を、特異性、例えばＳ１Ｐ４  ｃＤＮＡで形質転換する前に親細胞株が有する活性について、およびＳ１Ｐ１、Ｓ１Ｐ２、Ｓ１Ｐ３、およびＳ１Ｐ５で形質転換されたＣＨＯ細胞株の選択性について試験する。他のＳ１Ｐ受容体に関して安定な細胞株の作製を、上記の公開されたヒトｃＤＮＡ配列を用いて、Ｓ１Ｐ４について記載の通りに行う。好ましくは、１００×の選択性および特異性を有する化合物が選択される。例えば、Ｓ１Ｐ４に特異性および選択性の化合物は、野生型ＣＨＯ細胞または他の４個のＳ１Ｐ受容体のいずれかを発現する細胞において測定されるよりも１０倍、好ましくは１００倍低い、Ｓ１Ｐ４で測定されたＥＣ５０（推定ＥＣ５０）を有し得る。例えば、２００ｎＭのＥＣ５０がＳ１Ｐ４について測定されるとき、ＣＨＯ細胞またはＳ１Ｐ１、２、３、５を発現するＣＨＯ細胞のＥＣ５０は、好ましくは≧２０μＭである。実施例１の化合物は、本アッセイにおいてＳ１Ｐ４について４３２ｎＭのＥＣ５０を有する。
【００３９】
ＣＨＯ細胞または様々なＳ１Ｐ受容体を発現するＣＨＯ細胞における実施例２の化合物についてのＥＣ５０値（μＭ）を、下記の表２に示す：
【表３】
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【００４０】
本発明の化合物は、従って、リンパ球相互作用が介在する疾患または障害、例えば移植術において、細胞、組織または臓器の同種もしくは異種移植片の急性または慢性拒絶、または移植片機能の遅延、移植片対宿主疾患のようなもの、自己免疫疾患、例えばリウマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症筋無力症、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、およびそれらの合併症、脈管炎、悪性貧血、シェーグレン症候群、ブドウ膜炎、乾癬、グレーブス眼症、円形脱毛症およびその他、アレルギー性疾患、例えば、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎／結膜炎、アレルギー性接触性皮膚炎、所望により根底に異常反応を伴っていてもよい炎症疾患、例えば、炎症性腸疾患、クローン病または潰瘍性大腸炎、内因性喘息、炎症性肺損傷、炎症性肝臓損傷、炎症性糸球体損傷、アテローム性動脈硬化症、骨関節症、刺激性接触性皮膚炎およびさらなる湿疹性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、免疫学介在性の疾患の皮膚症状、炎症性眼疾患、角結膜炎、心筋炎または肝炎、虚血／再潅流傷害、例えば心筋梗塞、卒中、腸虚血、腎不全または出血性ショック、外傷性ショック、その他、癌、例えばＴ細胞リンパ腫またはＴ細胞白血病、感染症、例えば、毒素ショック(例えば超抗原誘発)、敗血症性ショック、成人呼吸窮迫症候群またはウイルス感染、例えばＡＩＤＳ、ウイルス性肝炎、慢性細菌感染、または老人性認知症の処置および／または予防に有用である。細胞、組織または固形臓器移植の例には、例えば膵臓島、幹細胞、骨髄、角膜組織、神経組織、心臓、肺、複合心臓−肺、腎臓、肝臓、腸、膵臓、気管または食道が含まれる。
【００４１】
上記使用のために、必要な投与量はもちろん、投与の形態、処置すべき特定の状態および望む効果に依存して変化するだろう。一般に、十分な結果が、体重１ｋｇあたり約０．０３から２．５ｍｇの１日投与量で、全身的に得られることが示される。大型哺乳動物、例えばヒトへの指示される１日投与量は、約０．５ｍｇから約１００ｍｇの範囲であり、簡便には、例えば、１日４回までの分割用量でまたは徐放形態で投与する。経口投与用の好適な単位投与形態は、約１から５０ｍｇの活性成分を含む。
【００４２】
本発明の化合物は、任意の慣用の経路で、特に経腸的に、例えば経口で、例えば錠剤またはカプセルの形で、または非経腸的に、例えば、注射用溶液または懸濁液の形で、局所的に、例えばローション、ジェル、軟膏またはクリームの形で、または経鼻または坐薬形で投与できる。遊離型または薬学的に許容される塩形態の本発明の化合物を、少なくとも１個の薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤との混合による常套法で製造できる。
【００４３】
本発明の化合物は、例えば上記の通り、遊離型または薬学的に許容される塩形で投与できる。このような塩は常套法で製造でき、遊離化合物と同程度の活性を示す。
【００４４】
前記により、本発明はさらに下記を提供する：
１．１  処置を必要とする対象における、例えば上記のような、リンパ球が介在する障害または疾患を予防または処置する方法であって、該対象に有効量の本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法；
【００４５】
１．２  処置を必要とする対象における、例えば上記のような、急性または慢性移植片拒絶またはＴ細胞介在性炎症性疾患または自己免疫疾患を予防または処置する方法であって、該対象に有効量の本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法；
【００４６】
２．  例えば、上記の１．１または１．２に示された方法のいずれかにおいて、医薬としての使用のための遊離型または薬学的に許容される塩形態の本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物。
【００４７】
３．  遊離型または薬学的に許容される塩形態の本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物をその薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む、例えば上記１．１または１．２に記載の方法のいずれかにおいて使用するための、医薬組成物。
【００４８】
本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物は、唯一の活性成分として、または、例えばアジュバントとして、他の薬剤、例えば同種または異種移植片急性または慢性拒絶、または炎症性もしくは自己免疫疾患の処置または予防のために、例えば免疫抑制剤または免疫調節剤または他の抗炎症剤と、または化学療法剤、例えば悪性細胞抗増殖性剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本発明の化合物を、カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン、４０−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−ラパマイシン、ＣＣＩ７７９またはＡＢＴ５７８；免疫抑制作用を有するアスコマイシン、例えばＡＢＴ−２８１、ＡＳＭ９８１など；コロチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプリン；メトトレキサート；レフルノミド；ミゾリビン；ミコフェノール酸；ミコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルグアリンまたはその免疫抑制相同体、類似体または誘導体；免疫抑制性モノクローナル抗体、例えばＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはそれらのリガンドに対するモノクローナル抗体；他の免疫調節性化合物、例えば、ＣＴＬＡ４細胞外ドメインの少なくとも一部またはその変異体を有する、例えば非ＣＴＬＡ４タンパク質配列と結合した、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの少なくとも一部またはその変異体を有する、組換え結合分子、例えば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（例えば、ＡＴＣＣ６８６２９と称される）またはその変異体、例えば、ＬＥＡ２９Ｙ；接着分子阻害剤、例えば、ＬＦＡ−１アンタゴニスト、ＩＣＡＭ−１または−３アンタゴニスト、ＶＣＡＭ−４アンタゴニストまたはＶＬＡ−４アンタゴニスト；または化学療法剤、例えば、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチウム（cisplatinum）、ドキソルビシンまたは５−フルオロウラシルと組み合わせて使用できる。
【００４９】
本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物を、他の免疫抑制剤／免疫調節剤、抗炎症剤または化学療法剤と併用して投与するとき、併用投与される免疫抑制剤、免疫調節剤、抗炎症剤または化学療法性化合物の投与量は、用いる併用剤のタイプ、例えばそれがステロイドであるかまたはカルシニューリン阻害剤であるか、用いる特定の薬剤、処置すべき状態などに依存してもちろん変化するだろう。前記により、本発明はさらに別の局面を提供する：
【００５０】
４．  治療的に有効な非毒性量の本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物、および少なくとも第二の製剤物質、例えば上記の通りの、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗炎症剤または化学治療薬などを、例えば同時または連続して併用投与することを含む、上記で定義の方法。
【００５１】
５．  ａ）本明細書に開示の通りの、遊離型または薬学的に許容される塩形態の、本発明の化合物、例えば式Ｉの化合物である第一剤、およびｂ）例えば、免疫抑制剤、免疫調節剤、抗炎症剤または化学療法剤などの少なくとも１個の併用剤を含む、薬学的組合せ剤、例えばキット。前記キットは、その投与のための取扱説明書を含んでいてよい。
【００５２】
本明細書で用いる用語“併用投与”または“組合せ投与”などは、選択した治療剤を単独の患者に投与することを包含することを意味し、薬剤を必ずしも同じ投与経路でまたは同時に投与するものではない処置レジメンを含むことを意図する。
【００５３】
本明細書で用いる用語“薬学的組合せ剤”は、２個以上の活性成分の混合または組合せによりもたらされる製品を意味し、活性成分の固定されたおよび固定されていない組合せの両方を含む。用語“固定された組合せ”は、活性成分、例えば本発明の化合物および併用剤を、患者に両方とも同時に１個の物または投与薬の形態で投与することを意味する。用語“固定されていない組合せ”は、活性成分、例えば本発明の化合物および併用剤を、患者に個別の物として、同時に、一緒にまたは時間的制限なしに連続して投与することを意味し、ここでかかる投与が、患者の体内で２個の化合物の治療的有効レベルを提供する。後者はまた、カクテル療法、例えば、３個またはそれ以上の活性成分の投与にも適用される。
【国際調査報告】
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