(57)【要約】  本発明は、活性化PC/PCの内皮受容体(EPCR)に対する高水準の抗体の存在を検出する方法に関する。本発明は、試料中の抗EPCR抗体のイン・ビトロでの検出および定量を含んでなることを特徴とする。
2007520713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の内皮ＰＣ／活性化ＰＣ受容体（ＥＰＣＲ）に対する高水準の自己抗体の存在を評価する方法であって、被験者由来の前記試料中のＥＰＣＲに対する自己抗体のイン・ビトロでの定量を含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記ＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在が、自己免疫疾患、脈管疾患および産科的合併症から選択される病状と関連していることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記自己免疫疾患が、抗リン脂質症候群、全身性エリテマトーデス、関節リウマチおよび自己免疫脈管炎から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記脈管疾患が、動脈疾患、静脈疾患、および微小循環の血栓症から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記脈管疾患が、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳血管障害、四肢虚血、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、血栓症、皮静脈血栓症、深静脈血栓症、および肺塞栓症から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記産科的合併症が、流産、胎児死亡、早産、子宮内発育遅延、子癇および前子癇(pre-eclampsia)から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が血清または血漿の試料であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記被験者がヒトであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗ＥＰＣＲ自己抗体の定量を、マーカーとカップリングしたイムノアッセイによって行うことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＥＰＣＲ自己抗体の定量を、
ａ）  ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片を固形支持体に固定し、
ｂ）  固定したポリペプチドと、被験者から得た抗ＥＰＣＲ自己抗体を含むと思われる試料とを十分な時間インキュベーションして抗体を固定したポリペプチドに結合させ、ポリペプチド−抗ＥＰＣＲ自己抗体複合体を形成し、
ｃ）  固定したポリペプチドに結合していない残りの試料を除去し、
ｄ）  ポリペプチド−抗ＥＰＣＲ自己抗体複合体と、酵素に接合した第二の抗体とをインキュベーションし、前記第二の抗体が前記抗ＥＰＣＲ自己抗体に結合することができること
を含んでなるＥＬＩＳＡ試験によって行うことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、
ａ）  完全長のＥＰＣＲのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、および
ｂ）  抗ＥＰＣＲ抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むＥＰＣＲの断片のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド
から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質であって、
ａ）  ＥＰＣＲアミノ酸配列を含むポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片から構成される領域Ａ、および
ｂ）  前記融合タンパク質を単離しまたは精製するのに用いるアミノ酸配列、および／または前記融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列を含むポリペプチドから構成される領域Ｂ
を含んでなる融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記領域Ｂが領域Ａのアミノ末端に結合していることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記領域Ｂが領域Ａのカルボキシル末端に結合していることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記領域ＡがヒトＥＰＣＲの可溶性部分のアミノ酸配列を含んでなることを特徴とする、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
領域Ｂに存在する、前記融合タンパク質を単離しまたは精製するのに用いるアミノ酸配列、および／または前記融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列が、Ａｒｇタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、抗体によって認識することができるエピトープ、ＳＢＰタグ、Ｓタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡ、ＤｓｂＡ、Ａｖｉタグ、Ala-His-Gly-His-Arg-Pro（配列番号：４）（２、４および８コピー）、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser（配列番号：５）、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys（配列番号：６）（６回反復）、β−ガラクトシダーゼおよびＶＳＶ−糖タンパク質から選択されるアミノ酸の配列を含んでなる、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記領域Ｂが、抗−ｃ−ｍｙｃ抗体によって認識することができるｃ−ｍｙｃエピトープおよびヒスチジンの尾部（Ｈｉｓタグ）を含んでなるポリペプチドから構成されていることを特徴とする、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、ヒトＥＰＣＲの可溶性部分のアミノ酸の配列と、ｃ−ｍｙｃエピトープに対応するアミノ酸の配列と、ヒスチジンの尾部（ヒスチジンタグ）とを含んでなる融合タンパク質であることを特徴とする、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質であって、アミノ酸配列が配列番号３に示されるものであることを特徴とする、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二の抗体が、試料を試験している被験者の種とは異なる種に由来する免疫グロブリンアイソタイプ特異抗体であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二の免疫グロブリンアイソタイプ特異抗体が、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体およびそれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項１０または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第二の抗体が、ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのうちから選択される酵素に接合していることを特徴とする、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
被験者からの試料で測定した抗ＥＰＣＲ自己抗体水準と正常水準とを比較することをさらに含んでなることを特徴とする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
一定時間における抗ＥＰＣＲ自己抗体水準の変化を測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、以前に自己抗体または脈管疾患と診断された、または産科合併症に罹ったことがあり、かつ治療処置を受けている被験者に由来することを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
試料中のＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在を評価する方法における、ＥＰＣＲに対する自己抗体の使用。
【請求項２７】
試料中のＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在が、自己免疫疾患、脈管疾患、および産科合併症から選択される病状と関連していることを特徴とする、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片の、試料中のＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在に対する方法における使用であって、前記試料中のＥＰＣＲに対する自己抗体のイン・ビトロでの定量を含んでなることを特徴とする、使用。
【請求項２９】
前記ＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在に関係している病状が、自己免疫疾患、脈管疾患および産科合併症から選択されることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質であって、
ａ）  ＥＰＣＲアミノ酸配列を含むポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片から構成される領域Ａ、および
ｂ）  融合タンパク質を単離しまたは精製するのに用いるアミノ酸配列、および／または前記融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列を含むポリペプチドから構成される領域Ｂ
を含んでなる融合タンパク質であることを特徴とする、請求項２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記領域ＡがヒトＥＰＣＲの可溶性部分のアミノ酸配列を含んでなる、請求項３０に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、ヒトＥＰＣＲの可溶性部分のアミノ酸の配列と、ｃ−ｍｙｃエピトープに対応するアミノ酸の配列と、ヒスチジンの尾部（ヒスチジンタグ）とを含んでなる融合タンパク質であることを特徴とする、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片を含んでなることを特徴とする、試料中のＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在をイン・ビトロで評価するためのキット。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、融合タンパク質であって、
ｉ）  ＥＰＣＲアミノ酸配列を含むポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片から構成される領域Ａ、および
ii）  前記融合タンパク質を単離しまたは精製するのに用いるアミノ酸配列、および／または前記融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列を含むポリペプチドから構成される領域Ｂ
を含んでなる融合タンパク質であることを特徴とする、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記領域Ａが、ヒトＥＰＣＲの可溶性部分のアミノ酸を含んでなることを特徴とする、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ポリペプチドが、ヒトＥＰＣＲの可溶性部分のアミノ酸配列、ｃ−ｍｙｃエピトープに対応するアミノ酸配列およびヒスチジンの尾部（Ｈｉｓタグ）を含んでなる融合タンパク質であることを特徴とする、請求項３５または３６に記載のキット。
【請求項３８】
ポリペプチドが、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する融合タンパク質であることを特徴とする、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、試料中の内皮タンパク質Ｃ／活性化タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）に対する高水準の自己抗体をその検出およびイン・ビトロ定量によって検出する方法に関する。
【０００２】
背景技術
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、宿主組織に対する免疫反応とこの組織を攻撃する異常抗体（自己抗体）の産生とを誘発する、免疫反応の存在を特徴とする。これらの自己免疫疾患としては、一般に、抗リン脂質症候群（ＡＰＬＳ）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫脈管炎などの障害が挙げられる。
【０００３】
ＡＰＬＳは、血管血栓症（静脈、動脈または微小血管性）および抗リン脂質抗体の存在と関連した妊娠中の合併症（胎児死亡、早産または多発性自然流産）を特徴とする。これらの抗体は異質性であり、リン脂質、リン脂質結合タンパク質、または両方の様々な組合せを認識する。最も普通に検出される抗リン脂質抗体サブグループは、いわゆるループス性抗凝固因子抗体（ＡＣＬ）、抗カルジオリピン抗体、および抗糖タンパク質Ｉβ２抗体を含んでなる。古典的な研究基準には包含されない他の抗リン脂質抗体が、現在研究されている。このような抗体は、ホスファチジルエタノールアミンのようなカルジオリピン以外のリン脂質、またはアネキシンＶおよびプロテインＳのようなリン脂質結合タンパク質を標的としている。しかしながら、血管血栓症および流産に対する抗リン脂質抗体の存在に関する機構についてはほとんど知られていない。
【０００４】
脈管疾患
脈管疾患には、関与する血管の種類（動脈、静脈、または微小循環の小口径脈管）による３つの主要な型がある。動脈血管疾患の場合には、壁側硬化症により血管腔中の血流が減少し、従って損傷した血管によって湿った部分の血液供給が慢性的に減少する。このアテローム性動脈硬化症は、合併症を引き起こし、動脈内に血栓を生じ、動脈を完全に閉塞し、血流を完全に遮断する可能性がある。この場合には、組織梗塞が起こる。この現象の最も頻繁に見られる例は、血栓症が冠動脈を冒すときには心筋梗塞であり、または冒される血管が脳動脈であるときには脳卒中である。静脈血管疾患の場合には、血栓症が心臓への回帰血流を悪化させる。血栓性静脈壁の血栓の断片が剥離すると、それが肺静脈循環中に至るまで血流中を移動し、急性肺不全（肺塞栓症として知られる状態）を引き起こす。微小循環の疾患は、様々な臓器における微小循環の血管の炎症および／または血栓症に対して二次的に発現し、微小循環が損傷している臓器不全として現れる。脈管疾患は、西欧諸国における罹患率および死亡率の重要な原因である。特に、２０００年に対応するInstituto Nacional de Estadistica(INE)（国立統計学研究所）のデーターによれば、循環器疾患はスペインにおける死亡の第一原因（全死亡率の約３５．０％）である。最も頻繁に見られる循環器障害の中でも、心臓の血管または血栓性動脈疾患（主として、急性心筋梗塞）が死亡の第一原因となっている。現在のところ、幾人かの患者における血栓症の存在を識別することができる多数の分子危険因子が同定されている。このような危険因子の一つは、いわゆる抗リン脂質抗体の存在である。当初、これらの自己抗体はアニオン性リン脂質を標的としていると信じられていたが、その後、これらの自己抗体の多くは、糖タンパク質Ｉβ２またはプロトロンビンのようなタンパク質と、リン脂質との間に形成された複合体を標的としていることが示された。更に近年、プロテインＣ（ＰＣ）、プロテインＳ、トロンボモジュリンまたはアネキシンＶのような抗凝固薬の役割を有する他のタンパク質も関与しており、これらの自己抗体の存在により血栓症に罹患しやすくなる理由が説明されている。
【０００５】
産科的合併症
産科的合併症は、基本的には妊娠１０週後の胎児死亡、未熟児の誕生、妊娠１０週以前の自然流産、子宮内発育遅延、子癇、および前子癇(pre-eclampsia)を含んでなる。
【０００６】
ＥＰＣＲ
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）は、主要な凝固カスケード調節タンパク質の一つである。ＡＰＣのチモーゲンであるＰＣは、内皮細胞表面のトロンボモジュリンに結合したトロンビンによって活性化される。ＡＰＣは、プロテインＳ（その非酵素的補助因子）と共同して、活性化因子ＶおよびＶIIIのタンパク質分解を介してその抗凝固薬としての役割を発揮する。トロンボモジュリンでの遺伝的および後天的欠損においては、ＰＣおよびプロテインＳが静脈および／または動脈血栓症の患者に検出されてきた。内皮ＰＣ／活性化ＰＣ受容体（ＥＰＣＲ）は、内皮細胞の膜上で発現した糖タンパク質であり、特異的かつ高親和性でＰＣおよびＡＰＣと結合するものである。ＥＰＣＲが機能性であるためには、その三次元構造を安定化するリン脂質分子に結合しなければならない。ＰＣのＥＰＣＲへの結合は、内皮細胞表面におけるトロンビン−トロンボモジュリン複合体により、その活性化を著しく増加する。ＥＰＣＲの使命は、内皮細胞上のＰＣを濃縮し、それをトロンビン−トロンボモジュリン複合体に提示することによって、効率的なＰＣ活性化を助けることである。ＥＰＣＲは、イン・ビボで内皮細胞表面のＰＣ活性化指数の増加を約９倍誘発し、その結果として、ＡＰＣの循環水準の９０％に関与する。さらに、ＡＰＣがＥＰＣＲに結合しているときにのみ、それはプロテアーゼ活性化受容体−１を活性化することができ、これが「細胞防御的」細胞シグナルを生じ、アポトーシスをブロックするのである。
【０００７】
ＥＰＣＲは、主として静脈および動脈の内皮、特に大および中口径のものによって発現される。さらに、これは、合胞体栄養細胞層によって強く発現される。これらの位置において、ＥＰＣＲは血栓症を予防し、内皮および合胞体栄養細胞層のいずれの細胞機能をも良好に支持する。ノックアウトマウスでのＥＰＣＲ遺伝子の欠失によりこれらマウスにおける胎盤血栓症および早期胎児死亡が引き起こされることに続いて、ＥＰＣＲは妊娠の維持に役割を果たしていることを示唆するしっかりした証拠が増えてきている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、被験者の試料における抗ＥＰＣＲ自己抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ）を測定する方法に関する。一方、これらの自己抗体は、自己免疫疾患（ＡＰＬＳおよび播種状エリテマトーデス）と診断された患者、血管性疾患（静脈および動脈血栓症の患者、および産科的合併症の女性患者に存在することが明らかにされている。本明細書の説明に伴う実施例は、とりわけ血清または血漿における抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在が、自己免疫疾患の患者（ＡＰＬＳまたは播種状エリテマトーデスの患者で測定）、動脈血栓症、例えば、心筋梗塞（ＡＰＬＳの患者およびＡＰＬＳのない患者の両方で測定）、虚血性発作（ＡＰＬＳの患者で測定）、または静脈血栓症（ＡＰＬＳの患者で測定）の患者、並びに胎児死亡（ＡＰＬＳの婦人およびＡＰＬＳのない婦人の両方で測定）または多発性流産（ＡＰＬＳの患者で測定）のような産科的合併症の患者で増加するという事実を説明している。
【０００９】
本発明者らは、自己免疫疾患の患者、および／または血管疾患の患者、および／または産科的合併症の患者の血清または血漿中の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在量が、上記疾患に冒されていない健康な被験者の試料と比較して増加することを見出した。これらの証拠により、上記の抗ＥＰＣＲ自己抗体は、自己免疫疾患、血管疾患、または産科的合併症のようなＥＰＣＲに対して高水準の自己抗体の存在と関連した疾患を発現する被験者の危険性および感受性についてイン・ビトロ評価を行うための有用なマーカーとされる。
【００１０】
ＡＰＬＳの患者における抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在およびそれらと胎児死亡との関係について研究が行われてきた。内皮表面上のＡＰＣの生成に対するこれらの自己抗体の効果も、評価されてきた。その後、患者−対照組合せ研究における胎児死亡に対する抗ＥＰＣＲ自己抗体の関連性が、研究されてきた。得られた結果は、抗ＥＰＣＲ自己抗体が胎児死亡の危険因子であることを支持している。ＥＰＣＲを発現する細胞表面上のＰＣの活性化を防止することは、これらの自己抗体がその病理学的効果を発揮する１機構であり得る。
【発明の具体的説明】
【００１１】
定義
本発明出願明細書の理解を容易にするため、本発明に関して用いる幾つかの用語および表現の意味を下記に説明する。
【００１２】
「被験者」という用語は、哺乳類の種の一員を指すものであり、飼い慣らされた愛玩動物、霊長類およびヒトが挙げられるが、これらに限定されず、被験者は好ましくは任意の年齢または人種のヒト（男性または女性）である。
【００１３】
「自己免疫疾患」という表現は、免疫系が宿主組織に対して反応して、広汎な障害を生じる疾患を指す。例えば、これらの疾患としては、（特に）ＡＰＬＳ、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫脈管炎などが挙げられる。
【００１４】
「脈管疾患」という表現は、血管を冒す障害を指す。動脈が関与するときには、その血管によって灌注される補助的領域は灌流が不足する。この状態は通常、壁のアテローム性動脈硬化症の病巣に起因する動脈梗塞、または血栓症、または両方同時のものに対して二次的なものである。静脈の関与もまた、冒された末梢部位から心臓への血液還流の合併症によって定義され、通常は静脈血栓が形成される結果血管閉塞を生じる。これらが微小循環を冒す場合、臓器の障害であってその機能を行うための微小循環が冒されているものによって特徴付けられる。例えば、このような疾患としては、（とりわけ）心筋梗塞、脳卒中、一過性の脳血管障害、四肢虚血（ischemia of limbs）、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤などのような動脈血管傷害、並びに皮および深静脈血栓症、肺動脈塞栓症などのような静脈血管疾患、および感染中または自己免疫疾患に関して見られる臓器不全の形態での微小循環病理学（血栓症）が挙げられる。
【００１５】
「産科的合併症」という表現は、懐妊母体および胚または胎児の両方に関連するように、妊娠の発生に影響する障害を指す。例としては、流産、胎児死亡、早産、子宮内発育遅延、子癇、および前子癇(pre-eclampsia)が挙げられる。
【００１６】
「自己抗体」という用語は、被験者によって産生されかつ自身の産生物における宿主構造および組織に向けられた（または特異的な）抗体、例えば、抗血小板自己抗体、抗甲状腺自己抗体、赤血球に対する自己抗体などを指す。この意味において、「抗ＥＰＣＲ自己抗体」という用語は、被験者によって産生されかつ彼または彼女自身の組織のＥＰＣＲに特異的に向けられた免疫グロブリンまたは抗体を指す。
【００１７】
本発明で用いられる「エピトープ」という用語は、タンパク質の抗原決定基、例えば、そのアミノ酸配列であって、問題の抗体によって認識されるものを指す。
【００１８】
「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、タンパク質断片を表すアミノ酸の分子鎖を指す。「タンパク質」と「ペプチド」という用語は、区別せずに用いられる。
【００１９】
本発明は、自己免疫疾患の患者、および／または血管疾患の患者、および／または産科的合併症の患者の抗ＥＰＣＲ自己抗体の産生が、これらの疾患に罹っていない健康な被験者からの試料と比較して増加するという観察に基づいている。この証拠により、このような抗ＥＰＣＲ自己抗体は、ＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在と関連した病変を発現する所定の被験者の危険性および感受性のイン・ビトロ評価を行うための有用なマーカーであると定義される。
【００２０】
本明細書の説明において用いられる「高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体」という表現は、正常個体群の５０百分位数（percentile）以上のＡＵ（任意単位）の水準を指し、例えば、正常個体群の６０百分位数以上、正常個体群の７０百分位数以上、正常個体群の８０百分位数以上、正常個体群の９０百分位数以上、および正常個体群の９５百分位数以上のＡＵの水準が挙げられる。被験者間の変動性（例えば、人種などに関する側面）のため、総ての被験者に適用可能な高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体を示す絶対値を確立することは（実際上不可能ではないにしても）極めて困難である。上記のような百分位数は、正常被験者（すなわち、試験の時点で自己免疫疾患と診断されていない、または血管疾患または産科的合併症の前歴を持たないヒト）の群の抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準の試験を含む通常の手順によって容易に計算することができる。抗ＥＰＣＲ自己抗体の測定は、任意の通常の方法、例えば、「材料および方法」（実施例１）に記載のＥＬＩＳＡを用いて行うことができる。論理上は、それぞれの被験者はある程度の水準（ＡＵ）の抗ＥＰＣＲ自己抗体を提示し、具体的な抗ＥＰＣＲ自己抗体水準は、分析が行われる個体群のうち５０％が検出される水準を上回るものと同定される。この値は、５０百分位数である。試験を受ける正常被験者のうち４０％を検出することができる水準を上回る値（ＡＵ）も存在し、この値は６０百分位数に対応する。次に、試験を受ける正常被験者のうち３０％、２０％、１０％、および５％を検出することができる水準を上回る他の値を定義することもでき、それぞれ７０、８０、９０および９５百分位数に対応する。
【００２１】
本発明は、試料中の内皮タンパク質Ｃ／活性化タンパク質Ｃ受容体（ＥＰＣＲ）に対する高水準の自己抗体の存在を評価する方法であって、被験者由来の上記試料中のＥＰＣＲに対する自己抗体のイン・ビトロでの定量を含んでなることを特徴とする方法を提供する。これらの高水準の自己抗体は、自己免疫疾患（例えば、ＡＰＬＳ、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫脈管炎など）、脈管疾患（例えば、心筋梗塞、脳卒中(stroke)、一過性脳血管障害、四肢虚血、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、血栓症などのような動脈疾患、または皮または深静脈血栓症、および肺塞栓症などのような静脈疾患、または微小循環の血管疾患）、および産科的合併症（例えば、流産、胎児死亡、早産、子宮内発育遅延(delayed intrauterine growth)、子癇、および前子癇(pre-eclampsia)など）から選択される病状に関連している。従って本発明の主題であるこの方法は、所定の時間にわたる抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準の変動の測定に応用することができる。本発明の目的であるこのような測定は、それらを正常水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体と比較することによって行うことができる。
【００２２】
上記の方法は、任意の通常の方法、例えば、血液採取によって得ることができる、血清または血漿の試料などの試料を被験者から採取する工程を含んでなる。
【００２３】
これらの試料は、自己免疫疾患、または血管疾患、または産科的合併症と以前に診断されたまたは診断されていない被験者から得ることができる。それらは、治療を受けているまたは上記疾患または合併症について以前治療を受けたことがある被験者から得ることもできる。
【００２４】
本発明の方法の性質を考慮すれば、これらの抗ＥＰＣＲ自己抗体の検出および定量は、特異的抗原−抗体複合体の形成を検出および定量することができるマーカーとカップリングした(coupled to)免疫試験、例えば、免疫クロマトグラフィー試験（ラテックス、コロイド状金など）、マーカーが蛍光性であるか、同位体、重金属、酵素、発光マーカー、化学発光マーカー、色原体などである免疫試験によって行われる。
【００２５】
非標識抗体（一次抗体）および標識抗体（二次抗体）の使用を含む広汎な周知の試験を、本発明で用いることができる。これらの手法としては、ウェスタンブロット法またはウェスタン転移、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などが挙げられる。
【００２６】
特定の態様によれば、これらの抗ＥＰＣＲ自己抗体の検出および／または定量を行うことができる本発明の方法における好ましい免疫試験は、ＥＬＩＳＡ試験であって、
ａ）  ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片を固形支持体に固定し、
ｂ）  上記固定したポリペプチドと、上記被験者から得た抗ＥＰＣＲ自己抗体を含むと思われる試料とを十分な時間インキュベーションして抗体を固定したポリペプチドに結合させ、ポリペプチド−抗ＥＰＣＲ自己抗体複合体を形成し、
ｃ）  固定したポリペプチドに結合していない残りの試料を除去し、
ｄ）  ポリペプチド−抗ＥＰＣＲ自己抗体複合体と、酵素に接合した第二の抗体とをインキュベーションし、第二の抗体が上記抗ＥＰＣＲ自己抗体に結合することができること
を含んでなるＥＬＩＳＡ試験である。
【００２７】
ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなるこのポリペプチドまたは抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片は、完全長のＥＰＣＲのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、またはＥＰＣＲの断片のアミノ酸配列を含んでなりかつ抗ＥＰＣＲ抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドであることができる。特定の態様によれば、上記ポリペプチドは、融合タンパク質であって、
ｉ）  ＥＰＣＲアミノ酸配列を含むポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片から構成される領域Ａ、および
ｉｉ）  融合タンパク質を単離しまたは精製するのに用いるアミノ酸配列、および／または上記融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列を含むポリペプチドから構成される領域Ｂ
を含んでなる上記融合タンパク質である。
この領域Ｂは、領域Ａのアミノ末端または領域Ａのカルボキシル末端に結合することができる。
特定の態様によれば、領域ＡはヒトＥＰＣＲの可溶性部分のアミノ酸配列を含んでなる。
【００２８】
領域Ｂは、上記で定義した融合タンパク質の単離または精製に用いるアミノ酸配列、および／または上記融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列を含んでなる。実際には、融合タンパク質を単離または精製するのに用いることができる任意のアミノ酸配列（一般に「タグ」ペプチドと呼ばれる）、および／または融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いることができる任意のアミノ酸配列が、領域Ｂに存在することができる。場合によっては、融合タンパク質の単離または精製に用いるアミノ酸配列は、上記の融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列として作用することもでき、またその逆もまた同様である。特定の態様によれば、領域Ｂは、融合タンパク質の単離または精製に用いるアミノ酸配列と融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列を含んでなる。
【００２９】
一例として、融合タンパク質を単離しまたは精製するのに用いるアミノ酸配列、および／または融合タンパク質を固形支持体に固定するのに用いるアミノ酸配列が、Ａｒｇタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ｃ−ｍｙｃ−タグのような抗体によって認識することができるエピトープ、ＳＢＰタグ、Ｓタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡ、ＤｓｂＡ、Ａｖｉタグなど(Terpe K., Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), 60:523-525)、Ala-His-Gly-His-Arg-Pro（配列番号：４）（２、４および８コピー）、Pro-Ile-His-Asp-His-Asp-His-Pro-His-Leu-Val-Ile-His-Ser（配列番号５）、Gly-Met-Thr-Cys-X-X-Cys（配列番号６）（６回反復）、β−ガラクトシダーゼ、ＶＳＶ−糖タンパク質(YTDIEMNRLGK)などのようなアミノ酸配列であることができる。
【００３０】
特定の態様によれば、上記領域Ｂは、抗体によって認識することができるエピトープ（例えば、ｃ−ｍｙｃエピトープ、抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって認識される）およびヒスチジンの尾部（a tail of histidines、 Ｈｉｓタグ）を含んでなるポリペプチドからなっている。
【００３１】
本明細書の説明に伴う実施例では、ｒｈｓＥＰＣＲと呼ばれるポリペプチドであって、ヒトＥＰＣＲの可溶性部分（ｈｓＥＰＣＲ）のアミノ酸配列、ｃ−ｍｙｃエピトープに対応するアミノ酸配列、およびヒスチジンの尾部（このアミノ酸配列は配列番号３に示されている）を含む融合タンパク質からなるポリペプチドの産生が開示される。
【００３２】
本発明の方法に用いられるポリペプチドは、通常の方法によって、例えば、適当な発現系における発現によって得ることができる。
【００３３】
上記のＥＬＩＳＡ試験で用いられる第二の抗体は、検討を行う被験者の種とは異なる種に由来する免疫グロブリンアイソタイプ特異抗体であり、これにより抗ＥＰＣＲ自己抗体のアイソタイプを特性決定することができる。例えば、所定の免疫グロブリンアイソタイプに特異的なこの第二の抗体は、抗ヒトＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＭ抗体、抗ヒトＩｇＡ抗体、およびそれらの混合物から選択される。特定の態様によれば、第二の抗体は、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）のような複合体を検出することができるマーカーに接合している。
【００３４】
他の態様によれば、本発明は、被験者における高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在に関係した病状を発生する上記被験者の危険性および感受性を評価する方法であって、上記被験者由来の試料におけるＥＰＣＲに対する自己抗体のイン・ビトロ定量を含んでなる、方法を提供する。
【００３５】
特定の態様によれば、被験者におけるＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在に関係した病状は、ＡＰＬＳ、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、自己免疫脈管炎などのような自己免疫疾患、血管疾患（動脈疾患、例えば、心筋梗塞、脳卒中、一過性脳血管障害、四肢虚血、アテローム性動脈硬化症、動脈瘤、血栓症など、または例えば、皮または深静脈血栓症（superficial or deep venous thrombosis）、および肺塞栓症などのような静脈疾患、または微小循環血栓症、感染症または自己免疫疾患中に起こる臓器不全などのような微小循環血管疾患など）、および産科的合併症、例えば、流産、胎児死亡、早産、子宮内発育遅延、子癇および前子癇(pre-eclampsia)などから選択される。
【００３６】
本発明によって提供される方法は、自己免疫または血管疾患、または産科的合併症と診断された被験者は、このような疾患または産科的合併症の臨床的履歴を持たない被験者における対応する水準と比較して高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体を有するという事実に基づいている。
【００３７】
本発明によって提供される高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在に関する病状を発生する被験者の危険性および感受性を評価するのに用いられる方法は、（「高水準」という表現の定義に関連して、正常被験者の個体群で見られるものとして上記したように定義されている）正常水準の検討被験者試料で測定した自己抗体水準を比較することによって完成される。上記方法は、この節で上記した免疫学的検定法に基づいている。
【００３８】
他の態様によれば、本発明は、高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在に関する病状を提示する被験者へ適用される療法の効果をイン・ビトロで観察する方法であって、観察される被験者の試料における上記抗ＥＰＣＲ自己抗体のイン・ビトロ定量を含んでなる方法に関する。この方法は上記の通りに行われるが、この場合には、試料は、治療を行っている被検者であって、自己免疫または血管疾患と以前に診断されたまたは産科的合併症を提示する被験者に由来する。この方法によって、（例えば）治療を維持しまたはそれを改良する目的で、治療を受けている被験者に応用される治療の効果、すなわちその効力および有効性を評価することができる。
【００３９】
他の態様によれば、本発明は、被験者由来の試料中のＥＰＣＲに対する高水準の自己抗体の存在を評価する方法における抗ＥＰＣＲ自己抗体の使用に関する。特定の態様によれば、上記の病状に関する高水準の自己抗体の存在は、自己免疫疾患、血管疾患、および産科的合併症から選択される。被験者における抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準の増加は、自己免疫疾患、血管疾患、および／または産科的合併症のような高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在と関係した病状を発生する危険性または感受性(susceptibility)の増加と関連している。
【００４０】
他の態様によれば、本発明は、試料中の内皮受容体ＥＰＣＲに対する自己抗体の存在を評価する方法において、ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片の使用に関する。上記の方法は、上記試料中の自己抗体である抗ＥＰＣＲの検出およびイン・ビトロ定量を含んでなる。特定の態様によれば、高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在に関するこの病状は、自己免疫疾患、血管疾患および産科的合併症から選択された。
【００４１】
特定の態様によれば、ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなる上記ポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片は、抗ＥＰＣＲ自己抗体の検出および／または定量のためのＥＬＩＳＡ試験の記載において定義したようなポリペプチドである。特定の態様によれば、このポリペプチドはいわゆるｒｈｓＥＰＣＲ（実施例参照）であり、ヒトＥＰＣＲの可溶性部分（ｈｓＥＰＣＲ）のアミノ酸配列、ｃ−ｍｙｃエピトープに対応するアミノ酸配列、およびヒスチジンの尾部（このアミノ酸配列は配列番号３に示されている）を含んでなる融合タンパク質からなる。
【００４２】
他の態様によれば、本発明は、高水準の自己抗体をイン・ビトロで評価するためにデザインされたキットであって、ＥＰＣＲアミノ酸配列を有するポリペプチド、または抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片を含んでなるポリペプチドを含んでなる、上記キットに関する。特定の態様によれば、ＥＰＣＲアミノ酸配列を含んでなるこのポリペプチドまたは抗ＥＰＣＲ自己抗体によって認識することができる少なくとも１つのエピトープを含むその断片は、抗ＥＰＣＲ自己抗体を検出および／または定量するためのＥＬＩＳＡ試験の記載において、上記で定義されたようなポリペプチドである。特定の態様によれば、このポリペプチドは、いわゆるｒｈｓＥＰＣＲ（実施例参照）であり、ヒトＥＰＣＲの可溶性部分（ｈｓＥＰＣＲ）のアミノ酸配列、ｃ−ｍｙｃエピトープに対応するアミノ酸配列、およびヒスチジンの尾部（このアミノ酸配列は配列番号３に示されている）を含んでなる融合タンパク質からなる。
【００４３】
他の態様によれば、上記キットは、自己免疫疾患、血管疾患、または産科的合併症から選択される高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在と関連した疾患を発現する被験者の危険性および感受性をイン・ビトロで評価するのに用いられる。
【実施例】
【００４４】
下記の実施例により、本発明を例示する。
実施例１
高水準の自己抗体の存在に関連した疾患を発現する被験者の危険性および感受性のマーカーとしての上記抗ＥＰＣＲ自己抗体の使用
Ｉ．  材料および方法
患者
１．  ＡＰＬＳの患者および対照
この研究は、１９９８年２月から２００２年３月までの間の国際診断基準[Wilson WA, Gharavi AE, Koike T. Lockshin MD, Branch DW, Piette JC, Brey R, Derksen R, Harris EN, Hughes GR, Triplett DA, Khamashta MA. 「明確な抗リン脂質症候群の予備的分類基準についての国際合意声明：国際研究集会報告(International consensus statement on preliminary classification criteria for definite antiphospholipid syndrome: report of an international workshop)」Arthritis Rheum. 1999; 42:1309-11; Brandt JT, Barna LK, Triplett DA. 「ループス性抗凝固因子の実験室的同定：  ループス性抗凝固因子の同定のための第二回国際研究集会の成果。ＩＳＴＨのループス性抗凝固因子／抗リン脂質抗体についての小委員会を代表して(Laboratory identification of lupus anticoagulants: results of the Second International Workshop for Identification of Lupus Anticoagulants. On behalf of the Subcommittee on Lupus Anticoagulants/Antiphospholipid Antibodies of the ISTH)」Thromb Haemost. 1995; 74:1597-603]により抗リン脂質症候群（ＡＰＬＳ）と診断された総数４３名の患者［年齢４４±１１歳（平均値±標準偏差（ＳＤ））、３９名の女性および４名の男性］から構成された。総ての患者は、抗凝固ループス抗体（ＡＣＬ）と、個人履歴において、静脈性血栓症（ｎ＝１７）、動脈性血栓症（ｎ＝１３、そのうち、４名は急性心筋梗塞（ＡＭＩ）と見なされ、７名は脳血管血栓性疾患（ＣＶＴＤ）を示し、２名は他の領域の疾患を示した）、またはその両方［ｎ＝１３、いずれも深静脈血栓症とＣＶＴＤ  （ｎ＝８）、ＡＭＩ  （ｎ＝１）、ＣＶＴＤとＡＭＩ  （ｎ＝３）、または腸間膜領域における動脈血栓症（ｎ＝１）を示した］を示すことによって特定された。これらの患者の２７名は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）と診断された。血清試料を、ＡＣＬが陽性である期間中および最後の血栓性症状発現の少なくとも３ヶ月後に採取した。試料は、抗ＥＰＣＲ自己抗体の検出のために加工処理するまで−８０℃で保管した。
【００４５】
対照群は、血栓症またはＡＣＬの履歴のない４３名の健康な志願者から構成された。総ての患者と対照志願者からは、この研究への参加に対してインフォームド・コンセントを得た。
【００４６】
２．  胎児死亡の女性および対照
胎児死亡の患者−対照の組合せ研究を行った。無月経の第１０週およびその最後の妊娠に起こる胎児死亡における最初の症状発現のため、１９９６年９月から２００２年９月までの間、１９歳から３１歳まで（平均２７歳）の総数８７名の女性について研究を行った。血栓症の経歴、慢性感染症または何らかの既知の全身性疾患、糖尿病の経歴を有する、または他の種類の妊娠病理学（自然流産、子癇、子宮内胎児成長の静止）、並びに核型に影響を及ぼす何らかの染色体異常または胎児の形態学的奇形による胎児死亡の症例を有する婦人は、研究から除外した。胎児死亡は、５８名の婦人では最初の妊娠中に、２１名の婦人では２回目の妊娠中に、残りの８名の婦人では３回目の妊娠中に起こり、７５名の婦人では第１０−２２週にその事故が起こり、残りの１２名の婦人では胎児死亡は第２２−３６週目（平均１７週）に起きた。
【００４７】
８７名の健康な母体の対照群を設定し、年齢、妊娠回数および最後の妊娠からの経過時間によって分類したところ、いずれも、胎児死亡の婦人の群に適用された除外基準を満たしていた。対照は、系統的な医学検診の目的で同一病院の婦人科部門に外来患者として検診を受けた婦人から同一期間中に同時に補充した。
【００４８】
この研究は、本発明者らの研究期間の倫理委員会によって承認され、インフォームド・コンセントを総ての被験者から得た。患者および対照の採入、インフォームド・コンセント、および血液試料の採取は、胎児死亡の少なくとも６ヶ月（範囲：６−１２ヶ月）後に行った。血液試料は、通常の手順に従って採取し、処理し、−８０℃で保管した。試料採取プロトコールは、総ての患者および対照で同一であった。
【００４９】
組換えヒト可溶性ＥＰＣＲの発現
可溶性形態のヒト組換えＥＰＣＲ（ｒｈｓＥＰＣＲ）の発現のため、鋳型としての内皮細胞由来のｃＤＮＡを用いて、それぞれ５’および３’末端にＣｌａＩ制限部位および他方のＮｏｔＩ部位を付加するプライマー
配列番号１、および
配列番号２
を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、シグナルペプチドを持たない細胞外ドメイン、または膜貫通および細胞内ドメイン(Entrez-Protein 21730830、残基１−１９３、番号はシグナルペプチドの処理後のタンパク質の成熟形態に対応する）を含んでなる、ヒト可溶性ＥＰＣＲ（ｈｓＥＰＣＲ）配列の増幅を行った。これらの修飾により、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子の分泌シグナルに続いて、プラスミドｐＰＩＣＺαＣ（Stratagene, ラ・ホヤ，カリフォルニア）のＣｌａＩおよびＮｏｔＩ部位にｒｈｓＥＰＣＲ配列を結合させ、酵母細胞の内部から細胞外培地に多数のタンパク質を効率的に分泌することができた。
【００５０】
ｃ−ｍｙｃエピトープおよびｐＰＩＣＺαＣベクターに存在する６−ヒスチジンタグを用いて、読み取り期にインサートをクローニングした。このクローニング工程のため、セリン残基およびイソロイシン残基をｒｈｓＥＰＣＲのアミノ末端に付加し、これを発現させて、そのカルボキシ末端のｃ−ｍｙｃエピトープと６個のヒスチジンを含む尾部またはタグに融合し、ｒｈｓＥＰＣＲの精製と抗ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体を介するマイクロプレートウェルの底への固定を促進した。直接シークエンシングによって、インサートおよびベクター配列が正確であることを確かめた。配列番号３は、ＤＮＡ配列に由来する、このようにして得られたｒｈｓＥＰＣＲの配列であって、用いたクローニング手法によって付加した残基、ヒトｒｈｓＥＰＣＲの細胞外領域の残基、ｃ−ｍｙｃエピトープ、および６個のヒスチジンのタグを含んでなるものを示している。
【００５１】
予め調製した発現ベクターを用いて、これを制限酵素ＰｍｅＩで線形化した後、Pichia pastoris細胞を化学的方法(Easy Comp, Invitrogen)によって形質転換し、メタノール応答内因性プロモーターにおけるｒｈｓＥＰＣＲをコードする配列を相同組換えによって組込んだ。形質転換産物をゼオシンの存在下で培養し、ｒｈｓＥＰＣＲコード配列を含むベクターであって、ゼオシンに対する耐性をコードする遺伝子をも含むベクターで形質転換したP. pastorisのコロイドを選択した。簡単に説明すれば、形質転換酵母を、グリセロール（ＢＭＧＹ）１％（ｖ／ｖ）を補足したＢＭＹ培地［酵母抽出物１％（ｗ／ｖ）、ペプトン２％（ｗ／ｖ）、１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）、硫酸アンモニウムを含む酵母窒素源１．３４％（ｗ／ｖ）、ビオチン４ｘ１０−５％（ｗ／ｖ）］４ｍｌ中で培養し、２８−３０℃で攪拌しながら約１８時間インキュベーションした。細胞を、室温で２０００ｇにて５分間遠心分離することによって回収した。上清を廃棄し、ｒｈｓＥＰＣＲの発現を１％メタノールで１８時間誘導した。この趣旨で、細胞をメタノール０．５％（ｗ／ｖ）を補足したＢＭＹ  ３ｍｌに再懸濁した後、激しく攪拌しながら約２８−３０℃で１８時間インキュベーションした。誘導の後、コンディショニングした培地からの試料を１２％ NuPAGE Bis-Trisゲル(Invitrogen, カールスバット，  カリフォルニア）上に装填し、ｒｈｓＥＰＣＲを抗ｍｙｃモノクローナル抗体(Invitrogen)を用いてウェスタンブロット法によって検出した。大規模生産には、最高濃度のｒｈｓＥＰＣＲを分泌するコロニーを選択した。ｒｈｓＥＰＣＲを多量に産生することに基づいて選択したコロニーにより、コロニーのメタノール代謝（迅速または低速メタボライザー）を検討することによって、最適コロニーの最適発現条件を定義した。培養条件の最適化およびメタノールによる誘導の後、多量のｒｈｓＥＰＣＲを産生する目的で規模を拡大した。
【００５２】
組換えｓＥＰＣＲの精製
P. pastorisは極めて僅かなタンパク質しか培地に分泌しないので、培地に見出される高比率のタンパク質はｒｈｓＥＰＣＲに対応しており、その精製はかなり簡単になる。すなわち、ｒｈｓＥＰＣＲは、金属アフィニティークロマトグラフィー、アニオン交換およびゲル濾過クロマトグラフィーを含んでなる三段階精製工程によって酵母培養物の上清から精製した。この趣旨で、培養物の上清を濃縮し、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．６に対して透析した後、銅を装填した５ｍｌ  Ｈｉｔｒａｐカラム(Amersham Biosciences, リトル・チャルフォント，英国）で金属アフィニティークロマトグラフィーを行った。カラムに結合した画分は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む緩衝液で溶出し、ＮａＣｌを含まない２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）に対して透析した。次に、アニオン交換クロマトグラフィーをＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム(Amersham Biosciences)中で行い、２０カラムと同等の容積中で０．０−３００ｍＭのＮａＣｌグラディエントで溶出を行った。ｒｈｓＥＰＣＲを含む溶出画分をプールし、遠心分離−限外濾過によって濃縮した後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５−ＨＲ１０／３０カラム(Amersham Biosciences)上に装填して、ゲル濾過を行った。精製タンパク質の濃度は、ＢＣＡ総タンパク質試験（Pierre, ロックフォード，イリノイ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の標準品を用いて測定した。精製ｒｈｓＥＰＣＲの検出のため、試料を１２％  ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen, カールスバット，カリフォルニア）上に装填し、還元条件下で電気泳動を行った後、クーマシーブルーで染色した。１個の電気泳動ゲルに電気泳動的転写(electroblotting)を施し、ｒｈｓＥＰＣＲを抗ｍｙｃモノクローナル抗体(Invitrogen)で検出した。ｒｈｓＥＰＣＲの分子量を概算するため、それぞれの電気泳動ゲルに含まれる分子量標準品を用いた。
【００５３】
血清または血漿中の抗ＥＰＣＲ自己抗体の測定のためのＥＬＩＳＡ
アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭに対応する抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準を個別に測定したが、これらは自己免疫変質の患者で極めて頻繁に見られる形態であるからであり、宿主構造の一部に向けられた抗体が検出される（自己抗体）。
【００５４】
３症例総てにおいて、９６穴マイクロプレート（Costar, アクトン，マサチューセッツ，米国）を、Ｎａ２ＣＯ３（１００ミリモル／ｌ），ｐＨ９．６の溶液中１．５μｇ／ｍｌの濃度の抗ｍｙｃモノクローナル抗体（Invitrogen, 米国）１００μｌ／ウェルで４℃の温度で一晩コーティングした。この抗体を捕捉抗体として用いて、ｒｈｓＥＰＣＲに存在する付加したｃ−ｍｙｃタグにターゲッティングする。この方法で、ｒｈｓＥＰＣＲをウェルに固定して、その細胞外エピトープを保存する。ＴＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７．４）で洗浄した後、非特異的結合部位を、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＴＢで室温（ＲＴ）にて４．５時間ブロックした。次いで、１％  ＢＳＡを補足したＴＢ（ＴＢ１）中にｒｈｓＥＰＣＲ  ３μｇ／ｍｌを含む溶液１００μｌ／ウェルを加えた後、緩やかに攪拌しながら室温にて２時間インキュベーションした。平行して、ブランクウェルを、ｒｈｓＥＰＣＲの非存在下にてＴＢ１と共にインキュベーションした。ＴＢで洗浄した後、ＴＢ１中の試料を１：１００（血漿または血清）に希釈したもの１００μｌをそれぞれのウェルに加えた後、４℃にて一晩インキュベーションした。次に、ウェルをＴＢで洗浄し、ウェルの底に結合して残っている抗ＥＰＣＲ自己抗体を、ペルオキシダーゼに接合したネズミ抗ヒトＩｇＡポリクローナル抗体（Biotrend）、ペルオキシダーゼに接合したネズミ抗ヒトＩｇＭポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）、またはアルカリホスファターゼに接合したネズミ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ）を用いて検出した。緩やかに攪拌しながら室温にて２時間インキュベーションした後、洗浄を行った。
【００５５】
ＩｇＡまたはＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準を測定するため、０．０７Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０４Ｍクエン酸ナトリウムおよび０．０２％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２，ｐＨ５．０を含む−フェニレンジアミン（Ｋｏｄａｋ）の溶液（０．４ｍｇ／ｍｌ）を１００μｌ加えた。それぞれＩｇＡおよびＩｇＭについて暗所で５および８分間の顕色時間の後、マイクロプレートリーダー（iEMS REader, Labsystems, フィンランド）中で４９２ｎｍでの吸光度を５分後に読み取った。
【００５６】
ＩｇＧアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の検定に用いたプレートに、０．１Ｍジエタノールアミン，ｐＨ１０．３に４−ニトロフェニルホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を溶解したもの（１ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを加えた。１５分後、１Ｍ  ＮａＯＨ  １００μｌで反応を停止し、色が安定した後マイクロプレートリーダー（iEMS REader）中で４０５ｎｍでの吸光度を記録した。総ての試料は、異なる試験で少なくとも２回分析した。
【００５７】
それぞれのプレートで測定した総ての吸光度は直線範囲に対応することを確かめるため、それぞれのアイソタイプについて、吸光度の最大値が記録された試料の連続希釈を用いて曲線を構築した。プレート同士を比較するため、それぞれのプレートでの試験に１試料を選択し（標準試料）、これにより補正係数を導入することができた。任意単位（ＡＵ）は、下記のようにして定義した。それぞれの患者試料（検討試料）について、ブランクウェルの吸光度を差し引いた後、１０００を掛け、かつ所定のプレート（参照プレート）と検討試料を試験したプレートとの間の標準試料の比吸光度（specific absorbance）の比に対応する補正係数を掛けることによって比吸光度（specific absorbance）を計算した。試験間および試験内変動係数（ＣＶ）を５つの試料を用いて評価し、試験間変動係数について５回試験し（５％未満）かつ試験内変動係数の計算について３つの異なる時点で試験した（１０％未満）。
【００５８】
培養内皮細胞におけるＡＰＣの生成
用いた細胞系は、トロンボモジュリンとＥＰＣＲを発現する能力を保持している形質転換したヒト内皮細胞の１系列であるＥＡ．ｈｙ９２６であった（Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica JS, Ferrell GL, Esmon CT, 「内皮細胞プロテインＣ受容体はトロンビン−トロンボモジュリン複合体によってプロテインＣの活性化を増加させる（The endothelial cell protein C receptor augments protein C activation by the thrombin-thrombomodulin complex）」Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93: 10212-6)。５ｘ１０４個の細胞／ウェルを、０．１７ｎＭトロンビン（ＥＲＬ，スワンシー，英国）０．０２Ｕ／ｍｌ、および１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％ＢＳＡ、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ−２０および０．０２％  ＮａＮ３を補足した２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液，ｐＨ７．４中５０−１０００ｎＭの増加濃度のＰＣ（Ｂａｘｔｅｒ，ディアフィールド，イリノイ，米国）と共に９６穴プレートでインキュベーションした。室温で４５分後、レピルジン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  ＡＧ，ベルリン，ドイツ）を０．２μＭ／ｌの最終濃度で加えてトロンビンを阻害し、３−４分後に発色性物質Ｓ−２３６６（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ，ミラノ，イタリア）を０．４ｍＭの最終濃度で加え、ＡＰＣによるタンパク質分解を観察した。４０５ｎｍでの吸光度の増加を、マイクロプレートリーダー（iEMS REader, Labsystems, フィンランド）で速度論的に記録した。ミカエリス−メンテンの式に当てはまる曲線データーをＥｎｚｆｉｔｔｅｒプログラム（Ｂｉｏｓｏｆｔ，ケンブリッジ，英国）を用いて実行して、これらの条件下でのＰＣ活性化のＫｍを計算した。必要ならば、患者由来の精製した抗ＥＰＣＲ自己抗体４５μｇ／ｍｌを、トロンビンとＰＣと同時に加えた（下記参照）。このようにして、抗ＥＰＣＲ自己抗体のＰＣ活性化に対する効果を分析することができた。
【００５９】
抗ＥＰＣＲ抗体の精製
１．  ＩｇＭ抗体の精製
抗ＥＰＣＲ自己抗体を含む血清の１ｍｌ試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１００ｍＭリン酸ナトリウム，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で希釈し、細孔径が０．４５μｍのフィルターで濾過した。濾液を、ネズミ抗ヒトＩｇＭポリクローナル抗体を予め固定しておいたＮＨＳ  ＨＰ（Amersham Biosciences）によって活性化したＨｉｔＴｒａｐカラムに加えた（Maruyama S,Kubagawa H,Cooper MD.「ヒトＢ細胞の活性化およびモノクローナル抗ネズミ抗体によるそれらの末端分化の阻害（Activation of human B cells and inhibition of their terminal differentiation by monoclonal anti-murine antibodies)」， J Immunol. 1985: 135: 192-9）。ヒトＩｇＭは０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）５ｍｌで溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）１００μｌに回収した。ヒトＩｇＭを含む画分を濃縮し、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４を補足したＴＢに対して透析した。
【００６０】
２．  ＩｇＡ抗体の精製
血清の１ｍｌ試料をＰＢＳで希釈し、ジャカリンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に加えた。吸着画分は０．１Ｍメリビオース／ＰＢＳ  ２ｍｌで溶出した後、ＰＢＳに対して透析した。後の精製工程が必要とされるので、試料をHiTrap Protein G HPアフィニティーカラム（Amersham Biosciences）に加え、混入ＩｇＧを除去した。ＩｇＡ画分を含む未結合生成物を５０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０に対して透析し、最後にHiTrap Blue HPアフィニティーカラム（Amersham Pharmacia Biotech）に加えて、アルブミンを除去した。次に、精製ＩｇＡ画分を含む未結合材料を回収して、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４を補足したＴＢ緩衝液に対して透析した。
【００６１】
３．  ＩｇＧ抗体の精製
抗ＥＰＣＲ自己抗体を含む血清の１ｍｌ試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１００ｍＭリン酸ナトリウム，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で希釈し、細孔径が０．４５μｍのフィルターで濾過した。濾液を、HitTrap Protein G HPカラムに加えた（Amersham Biosciences）。ヒトＩｇＧは０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．５）５ｍｌで溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）１００μｌに回収した。ヒトＩｇＭを含む画分を濃縮し、５ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．４を補足したＴＢに対して透析した。
【００６２】
ｒｈｓＥＰＣＲアフィニティーカラムの調製
ｒｈｓＥＰＣＲ（１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）３ｍｌ中２ｍｇ）を、製造業者の取扱説明書に従ってＨｉｔＴｒａｐ  ＮＨＳ活性化ＨＰアフィニティーカラム（Amersham Biosciences）に結合させた。反応を０．１Ｍグリシンで停止させた後、ｒｈｓＥＰＣＲカラムを２Ｍ  ＮａＣｌで十分に洗浄した。この方法でのｒｈｓＥＰＣＲカラムは、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を補足したＴＢＳ，ｐＨ７．４中でＰＣに結合することができた。ＰＣは、ＥＤＴＡを補足したＴＢＳでカラムから溶出することができた（データーは示さず）。カラムに結合したｒｈｓＥＰＣＲはＰＣと結合するその能力を保持しているので、自己抗体によって認識される本来のコンホメーションとエピトープを確実に保持することができた。従って、このようにして調製されたカラムは、血清または血漿の試料から抗ＥＰＣＲ自己抗体を除去するのに適していた。
【００６３】
統計学的方法
ＡＰＬＳ患者および対照の検討において、高水準の抗ＥＰＣＲ  ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体の頻度についての患者（症例）と対照との比較は、カイ二乗検定を用いて行った。確率比（ＯＲ）（Martinez-Gonzalez MA, de Irala-Estevez J & Guillen Grima F, (1999),「確率比とは何か（Que es una odds ratio ?)」，Medicina Clinica, 112, 11: 416-422）および９５％信頼区間（９５％ＣＩ）は、ＡＰＬＳと抗ＥＰＣＲ自己抗体との関連の尺度として計算した。
【００６４】
胎児死亡についての患者−対照の組合せ研究では、連続変数についておよびカテゴリー毎の患者と対照との比較は、対試料についてのｔ検定によりおよびＭｃＮｅｍａｒ検定によりそれぞれ行った。アイソタイプＩｇＧおよびＩｇＭに対応する抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準と、ＡＣＬとの関連およびＩｇＭアイソタイプの抗カルジオリピン抗体との関連を、連続変数についての相関係数およびカテゴリー毎の変数についてのMann-Whitney検定に基づいて評価した。
【００６５】
ＩｇＧおよびＩｇＭアイソタイプの高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体と関連した胎児死亡の危険性を評価するため、患者−対照の組合せでは多重回帰分析を用いた。主要な独立変数は、、カテゴリー毎のＩｇＧおよびＩｇＭの免疫グロブリンに対応する抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準であって、これら免疫グロブリンの対照における分布に準じている。異なるカットオフ点を用いて、より高い危険性に関連した水準を決定した。既知の胎児死亡の危険因子に適する単一および多変量分析を行った。完全モデルに第Ｖ因子レイデン（factors V Leiden; FVL）およびＡＣＬを包含することはできなかったので、抗ＥＰＣＲ自己抗体の効果を試験する目的で２つのモデルを考えた：
（１）  アイソタイプＩｇＭおよびＩｇＧに対応する抗ＥＰＣＲ自己抗体、ＩｇＭアイソタイプの抗カルジオリピン抗体、ＡＣＬおよびプロトロンビンＧ２０２１０Ａの水準を同時に導入、および
（２）  ＡＣＬの代わりにＦＶＬの存在／非存在について調製することを除き、モデル１と同じ。
【００６６】
モデル（１）を用いて、抗カルジオリピン抗体とＡＣＬが病因因子よりはむしろマーカーであり、抗ＥＰＣＲ自己抗体によって引き起こされるプロトロンビン状態を示すという仮定を評価した。総ての計算は、ＳＰＳＳ，第１０．０版統計パッケージ（SPSS Inc.）を用いて行った。
【００６７】
II．  結果
血漿および血清中の抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在を検討する目的で、ｒｈｓＥＰＣＲを酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの発現系を用いて最初に産生した。報告されているプロトコールに基づいて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓからｒｈｓＥＰＣＲ５ｍｇを上回る量を精製することができた。ドデシル硫酸ナトリウムを含むポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）での電気泳動および抗ｍｙｃモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析を用いると、ｒｈｓＥＰＣＲは単一かつ若干不均一なバンドとして現れ、以前に報告されているように様々な程度のグリコシル化を反映していた（Fukudome K, Kurosawa S, Stearns-Kurosawa DJ, He X, Rezaie AR, Esmon CT.「内皮細胞プロテインＣ受容体。可溶性受容体による細胞表面発現および直接リガンド結合（The endothelial cell protein C receptor. Cell surface expression and direct ligand binding by the soluble receptor)」， J Biol Chem. 1996; 271: 17491-9）［図１参照］。
【００６８】
ｒｈｓＥＰＣＲは、以前に報告されているように凝固試験においてＡＰＣの抗凝固活性を阻害することができた（Regan LM, Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica J, Fukudome K, Esmon CT.「内皮細胞プロテインＣ受容体。プロテイナーゼ阻害薬との反応の調整なしの活性化プロテインＣ抗凝固薬機能の阻害（The endothelial cell protein C receptor. Inhibition of activated protein C anticoagulant function without modulation of reaction with proteinase inhibitors.)」， J Biol Chem. 1996; 271; 17499-503)（データーは示さず）。予想アフィニティーでのＰＣの結合の他に（下記参照）、内皮細胞表面上のトロンビンによるＰＣの活性化は、Ｋｍが５１±１０ｎＭであることを特徴としていた。活性化は、２μＭ  ｒｈｓＥＰＣＲ（Ｋｍ＝約１００ｎＭ）の存在下ではかなり減少し、Ｋｉが約７０ｎＭであることを示し、以前に報告されているようにｒｈｓＥＰＣＲは本来のＥＰＣＲと同様の効力でＰＣと結合することを示唆していた（Fukudome K, Kurosawa S, Stearns-Kurosawa DJ, He X, Rezaie AR, Esmon CT.「内皮細胞プロテインＣ受容体。可溶性受容体による細胞表面での発現および直接リガンド結合（The endothelial cell protein C receptor. Cell surface expression and direct ligand binding by the soluble receptor.)」， J Biol Chem. 1996; 271; 17491-8; Regan LM, Stearns-Kurosawa DJ, Kurosawa S, Mollica J, Fukudome K, Esmon CT.「内皮細胞プロテインＣ受容体。プロテイナーゼ阻害薬との反応の調整なしの活性化プロテインＣ抗凝固薬機能の阻害（The endothelial cell protein C receptor. Inhibition of activated protein C anticoagulant function without modulation of reaction with proteinase inhibitors.)」, J Biol Chem. 1996; 271; 17499-503）。これらの証拠は、正確なｒｈｓＥＰＣＲ活性とコンホメーションを示唆し、従ってヒトＥＰＣＲに対する抗体の検出に用いることができることを強く示唆している。
【００６９】
ＡＰＬＳの患者における抗ＥＰＣＲ自己抗体
それぞれの対照群について９７百分位数を上回る水準となるように水準を高くすると、アイソタイプＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＧに対応する高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体がＡＰＬＳと関連していた［ＯＲ＝４．４７；９５％ＣＩ：１．１５−１７．４０］（表１参照）。極めて高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体（図２参照）は、ＡＰＬＳと診断された被験者でのみ検出されており、３名の患者はＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体を極めて高水準で示し（患者Ａ＝４０７ＡＵ，患者Ｂ＝３０１ＡＵ，および患者Ｃ＝２９３ＡＵ）、２名のＡＰＬＳ患者はＩｇＡアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体を極めて高水準で示し（患者Ｄ＝７９５ＡＵ、およびＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体をも高水準で示した患者Ｂ＝４７５ＡＵ）、２名の患者はＩｇＧアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体を高水準で提示した（患者Ｅ＝２３０ＡＵおよび患者Ｆ＝２２０ＡＵ）。６名の患者は血栓症の前歴（これが選択基準の一つであった）がある婦人であった（患者Ａ、Ｃ、ＤおよびＦでは脳卒中、患者Ｅでは循環器疾患、患者Ａ、Ｂ、ＤおよびＦでは静脈血栓症）。極めて興味深い観察は、アイソタイプＩｇＭおよびＩｇＡの抗ＥＰＣＲ自己抗体を示す総ての婦人（評価ができなかった患者Ｂを除く）が胎児死亡の多発歴を示したことである。
【００７０】
この知見を考慮して、抗ＥＰＣＲ自己抗体と胎児死亡との関連性が可能であるかどうかについて分析を行った。
【００７１】
【表１】
2007520713.tif 000003
【００７２】
抗ＥＰＣＲ自己抗体の生化学的特性決定
極めて高水準の患者からのアイソタイプＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＧの抗ＥＰＣＲ自己抗体の画分を、血清１ｍｌから精製した。患者ＣのＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の画分は、トロンビンの存在下で培養内皮細胞によってＡＰＣの生成を減少させることができた（ＰＣ活性化の残存能力の２０％，ｐ＝０．０２）。阻害効果は、容量依存性であった。ＡＰＬＳの患者におけるＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の画分のこの効果がＥＰＣＲに対する特異抗体によるものであることを示すため、試料から特異抗ＥＰＣＲ自己抗体を完全に除き、ｒｈｓＥＰＣＲを固定したアフィニティーカラムに加えた。このようにして得た画分はＡＰＣ生成に対する阻害作用を喪失し（ＰＣ生成の８７．６％）、この現象に関与する薬剤は特異抗ＥＰＣＲ自己抗体でなければならないことを示唆している。ＡＰＬＳの患者から精製した他の画分はいずれも、内皮細胞がＡＰＣを生成する能力を変更することはできなかった（図３）。
【００７３】
胎児死亡の婦人における抗ＥＰＣＲ自己抗体
患者と対照の群における、胎児死亡に以前に関連させた危険因子および抗ＥＰＣＲ自己抗体の度数を、表２に示す。
【００７４】
【表２】
2007520713.tif 000004
【００７５】
対照群におけるＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準の９５％の百分位数は、９９ＡＵであった。８７名の患者の中、１６名（１８％）がこのカットオフ点を超える値を示したのに対して、対照群（ｎ＝８７）では３名の被験者がその値を示した。低めの値を示すものと比較した、百分位数９５を超過するＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準を有する患者における胎児死亡の未調整ＯＲは、１４であった（９５％信頼区間（ＣＩ）：１．８−１０６．４）。カットオフ点を９０％百分位数（８３ＡＵ）に設定すると、ＯＲは５．２（９５％ＣＩ：１．８−１５．３）となった。
【００７６】
対照群におけるＩｇＧアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準の百分位数９５は、９４ＡＵであった。８７名の患者の中、１３名（１５％）がこのカットオフ点を超える値を示したのに対して、対照群（ｎ＝８７）では４名の被験者がその値を示した。百分位数９５％を超過するＩｇＧアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の患者における胎児死亡の未調整ＯＲは、４．３であった（９５％信頼区間（ＣＩ）：１．２−１５．２）。カットオフ点を９０％（８８．４ＡＵ）に設定すると、ＯＲは２．３（９５％ＣＩ：０．９−５．６）となった。
【００７７】
さらに、混同する可能性のある因子を調整する多変量分析を行った。上記のように、同一多変量モデルにＦＶＬとＡＣＬを包含することはできなかったので、その結果、二つの異なるモデル、すなわち抗リン脂質抗体（すなわち、ＡＣＬおよび抗カルジオリピン抗体）とプロトロンビンＧ２０２１０Ａについて調整したモデル（１）と、ＦＶＬを包含するがＡＣＬを包含しないモデル（２）とを考えた。モデル（１）における百分位数９５を超過するＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体と関連したＯＲは２３．１（９５％  ＣＩ：２−２６６．３）であり、一方、モデル（２）では、その値は３１．０（９５％  ＣＩ：２−３８４．３）であった。モデル（１）における百分位数９５を超過するＩｇＧアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体と関連したＯＲは６．８（９５％  ＣＩ：１．２−３８．４）であった。ＡＣＬの代わりに第Ｖ因子レイデンを包含するモデル（２）によれば、百分位数９５を超過するＩｇＧアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体と関連したＯＲは１１．０（９５％ＣＩ：１．６−７３．５）であった。結果を、表３に示す。
【００７８】
【表３】
2007520713.tif 000005
【００７９】
これらの結果は、アイソタイプＩｇＭおよびＩｇＧの抗ＥＰＣＲ自己抗体が胎児死亡について独立した危険因子であることを示している。しかしながら、高水準のＩｇＡは、この群の婦人における胎児死亡には有意に関連していなかった。
【００８０】
III．  論考
ヒトＥＰＣＲに対する自己抗体の存在を検出することができる方法（特に、ＥＬＩＳＡ試験）を実行してきた。この系を用いて、血栓症およびＡＣＬを特徴とするＡＰＬＳの患者の群の検討を行い、（ヒト病理学において初めて）アイソタイプＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡの特異抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在を明らかにした。検討はＡＰＬＳおよびＡＣＬの患者のサブグループを中心に行ったが、これらの患者は血栓症の危険増加と関連しており、従ってこれらの被験者は臨床的発現に直接関係した自己抗体を提示しそうであるからである。実際に、多くの患者は、極めて高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体を有することが見出された。
【００８１】
これらの自己抗体により、ＡＰＬＳの患者で見られる血栓症および流産を説明することができた。最初に、ＥＰＣＲは、大血管およびトロホブラスト(trophoblast)の内皮上に発現する分子である。ＩｇＭおよびＩｇＧ免疫グロブリンは補体に結合して活性化することができ、これらの抗体がＥＰＣＲに向けられている場合には、それらは内皮上の補体を活性化して後者を損傷し、このようにしてこの水準で血栓症を促進することができる。第二に、ＩｇＭアイソタイプの高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体を有する患者のＩｇＭ画分は、トロンビンの存在下において内皮細胞によるＡＰＣの生成を大幅に減少させることができることが示された。この阻害効果は、ＥＰＣＲアフィニティーカラム中をＩｇＭ画分を一緒に通過させることによってＥＰＣＲに向けられたＩｇＭを特異的に除去した後に消失し、これは、阻害効果がＩｇＭアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体によるものであることを意味している。この抗体は、イン・ビボで低水準のＡＰＣを生じ、血栓症の有力な危険因子を本質的に構成する状況を生じると思われる。
【００８２】
静脈および／または動脈血栓症の基準に従って患者を選定する場合には、抗ＥＰＣＲ自己抗体と関連した血栓症の危険を評価することはできなかった。対照的に、抗ＥＰＣＲ自己抗体、特にＩｇＭアイソタイプの水準増加が、胎児死亡の経歴のない婦人と比較してこのような前歴を有する婦人で検出された。予備研究でのこれらの結果を考慮して、患者−対照の組合せ研究を行って、抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在と関連した婦人の一般的個体群における説明できない胎児死亡の第一の発症(episode)の危険を評価する決定をした。ＩｇＭアイソタイプの高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体（対照被験者における数値分布百分位数９５を超過する値として定義される）は、胎児死亡の第一の発症についての強力な危険因子を構成し、低水準と比較して２３または３１の相対危険度を有していた。ＩｇＧアイソタイプの高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体も強力な危険因子を構成したが、ＩｇＭアイソタイプの場合より小さく、相対危険度は用いた数学的モデルによって７または１１であった。単一変量分析では、ＡＣＬおよびＩｇＭアイソタイプの抗カルジオリピン抗体を胎児死亡の危険増加と関連させたが、この関連性は多変量モデルでは減衰した。これは、古典的抗リン脂質抗体によって与えられる情報が、関連した抗ＥＰＣＲ自己抗体に起因するものであり、単純な危険マーカーよりはむしろ胎児死亡の病因因子であると考え得るからであると思われる。同様に、後期胎児死亡の危険増加と最近関連付けられてきたＦＶＬおよびプロトロンビンＧ２０２１０Ａの存在について検討を行い、危険増加はこのような多形と関連して単一変量および多変量分析のいずれでも同定されている。この危険性は、統計学的には有意ではなかったが、検討に含まれる患者の数によるものと思われる。
【００８３】
結論として、この研究により、ＡＰＬＳおよび血栓症の患者における抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在が初めて明らかにされている。ＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプの抗ＥＰＣＲ自己抗体の存在は、胎児死亡の第一の発症の危険性を増加する。これらの自己抗体は、ＡＰＬＳの患者および一般的個体群における血栓症および胎児死亡に本質的に寄与する可能性がある。
【００８４】
実施例２
心筋梗塞の婦人における抗ＥＰＣＲ自己抗体の検出
研究群：  １４２名の心筋梗塞の婦人（年齢３９±５歳、平均±標準偏差）、および１４２名の健康な婦人（年齢３９±５歳）、年齢および地理的出所によって組み合わせた。古典的心筋梗塞の危険因子（高血圧、高コレステロール血症、糖尿病、喫煙、および経口避妊薬）について検討した。「材料および方法」（実施例１）に記載のＥＬＩＳＡ試験プロトコールの後、血漿の試料中の抗ＥＰＣＲ自己抗体ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの分析を行った。
【００８５】
結果：  対照群における抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準分布の百分位数９３を超過する値によって定義される高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体を、心筋梗塞の危険増加に関連させた。多変量分析では、高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体をＩｇＡについては調整した確率比（ＯＲ）３．５および９５％信頼区間（９５％ＣＩ）１．４−８．９と関連させたが、ＩｇＭの場合には、これら数値はＯＲ＝３．０；９５％ＣＩ：１．２−７．５であった。
【００８６】
結論：  高水準の抗ＥＰＣＲ自己抗体は、婦人の心筋梗塞の独立した危険因子を構成する。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】Pichia pastorisにおけるｒｈｓＥＰＣＲの発現を示す。ｒｈｓＥＰＣＲは、材料および方法（実施例参照）に関する節に記載したように、安定に形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞の上清から精製した。ｒｈｓＥＰＣＲを含む３個の画分のそれぞれ１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、タンパク質をＧＥＬＣＯＤＥ  Ｂｌｕｅを用いて（Ａ）またはモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（Invitrogen）を用いるウェスタンブロット法によって（Ｂ）検出した。
【図２】ＡＰＬＳと診断された患者および対照における抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準を比較するものである。抗ＥＰＣＲ自己抗体の水準を示す。ＩｇＭアイソタイプの抗体：対照（メジアン＝４５  ＡＵ（任意単位）、患者（メジアン＝５７  ＡＵ）；ＩｇＡアイソタイプの抗体：  対照（メジアン＝３１  ＡＵ）、患者（メジアン＝３９  ＡＵ）；およびＩｇＧアイソタイプの抗体（メジアン＝７２  ＡＵ）、患者（メジアン＝７５  ＡＵ）。
【図３】内皮細胞によるＡＰＣの発生に対する抗ＥＰＣＲ自己抗体の効果を示す。抗ＥＰＣＲ自己抗体のアイソタイプＭの存在下でのＡＰＣの発生は患者Ｃで観察することができ、抗体の非存在下および非阻害抗体の存在下でのＡＰＣの発生と比較される。それぞれの条件について、２−４の独立した実験を行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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