(57)【要約】【課題】本発明は、未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法と、未分化の哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する化合物を同定する方法とを提供する。加えて、本発明は、ポリヌクレオチド及びベクターを提供し、そして平均骨密度の全身的あるいは部分的な減少に伴って生じる疾患を治療するための薬剤としてのそれらの使用法を提供する。さらに、本発明は、骨組織、骨芽細胞の試験管内での培養方法と、骨密度の全身的あるいは部分的な減少、又はコンディションへの影響に伴って生じる病的状態を診断するための方法を提供する。【選択図】図１
2007516714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表４にリストしたポリペプチド群のいずれか、及び／又は前記ポリペプチド群の断片及び／又は誘導体の阻害剤を持った未分化細胞を接触させることを特徴とする未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項２】
分子が、前記ポリペプチドを符号化したポリリボヌクレオチドの表示又は変換を抑制する表示又は変換阻害剤である請求項１に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項３】
前記阻害剤が、前記ポリペプチドを符号化したポリリボヌクレオチドの表示又は変換を抑制する表示又は変換阻害剤を示す核酸である請求項１に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項４】
前記核酸がベクターに誘導されるようになっている請求項３に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項５】
前記ベクターは、アデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルス、レンチウィルス、センダイウィルスベクターのいずれかである請求項４に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、アンチセンス型RNA、ポリリボヌクレオチドから派生したリボチーム、アンチセンス型オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）及び小妨害型ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で成るグループから選択され、ポリリボヌクレオチドや前記小妨害型ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は前記ポリペプチドの生成を引き起こすポリリボヌクレオチドを抑制することができるものであり、前記ポリリボヌクレオチドの一部と同族である請求項１乃至５のいずれかに記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項７】
前記阻害剤がｓｕＲＮＡであり、表４でリストアップされた目標遺伝子から選択されたヌクレオチド配列に対して同族の１７〜２３個の配列を持つヌクレオチド群の第１のヌクレオチド配列と、前記第１のヌクレオチド配列に対称な１７〜２３個の配列を持つヌクレオチド群の第２のヌクレオチド配列とで成っている請求項６に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項８】
前記阻害剤がｓｉＲＮＡであり、表４及び表５中のＩＤ番号１〜１２０番及び２４７〜３３３番によって特定されるヌクレオチド配列から選択された１７〜２３個の配列を持つヌクレオチド群の第１のヌクレオチド配列と、前記第１のヌクレオチド配列に対称な１７〜２３個の配列を持つヌクレオチド群の第２のヌクレオチド配列とで成っている請求項６に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項９】
前記ｓｉＲＮＡが前記第１及び第２のヌクレオチド配列と接合している第３のヌクレオチド配列を更に含み、前記ｓｉＲＮＡの中ではステムループ構造が形成されている請求項７又は８に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項１０】
前記第３のヌクレオチド配列はＩＤ番号３３４番のヌクレオチド配列で定義されるヌクレオチド配列で成っている請求項９に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法。
【請求項１１】
（ａ）表４にリストアップされ、表４にリストアップされた遺伝子のいくつかによって、符号化されたポリペプチドを持つ1又は２以上の化合物、及び／又は前記ポリペプチドの断片及び／又は誘導体を接合する工程と、
（ｂ）前記ポリペプチドに対する前記化合物の結合親和力を決定する工程と、
（ｃ）少なくとも１０μモル濃度中での結合親和力が示された化合物と未分化された哺乳類の細胞の固体群を接合する工程と、
（ｄ）未分化哺乳類の細胞の分化を誘導する化合物を同定する工程と、
で成ることを特徴とする未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導した化合物の同定方法。
【請求項１２】
（ａ）表４にリストアップされ、表４にリストアップされた遺伝子のいくつかによって、符号化されたポリペプチドを発現する未分化哺乳類の細胞の集団及び／又は前記ポリペプチドの断片及び／又は誘導体を培養する工程と、
（ｂ）前記化合物群の化合物又は混合物に対して前記細胞集団を曝す工程と、
（ｃ）未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導した化合物又は混合物を選択する工程と、
で成ることを特徴とする未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導した化合物又は混合物の同定方法。
【請求項１３】
前記化合物群は低分子化合物、ペプチド、脂質、天然物及び生理活性物質のグループから選択された化合物群である請求項１１又は１２に記載の未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導した化合物の同定方法。
【請求項１４】
表４中にリストアップされている目的遺伝子のいくつかから選択されたヌクレオチド配列に同族の１７〜２３個のヌクレオチド群の配列、及びその変体及び／又は逆配列で成ることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項１５】
表４及び５のＩＤ番号１〜２２０番及び２４７〜３３３番の配列によって同定されるヌクレオチド配列群から選択されたヌクレオチド配列を有している請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
表４及び５のＩＤ番号１〜２２０番及び２４７〜３３３番の配列によって同定されるヌクレオチド配列群から選択されたヌクレオチド配列の逆成分を有している請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
薬剤として用いられる請求項１４乃至１６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
平均骨密度の全身的又は局所的低下を含む病気の処置のための薬剤の製造における請求項１４乃至１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１９】
請求項１４乃至１７のいずれかに記載のポリペプチドで成るベクター。
【請求項２０】
薬剤として用いられる請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ベクターはアデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルス、レンチウィルス又はセンダイウィルスベクターである請求項１９又は２０に記載のベクター。
【請求項２２】
平均骨密度の全身的又は局所的低下を含む病気の処置のための薬剤の製造における請求項１９乃至２１のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項２３】
（ａ）細胞基質を形成するために基質上に未分化哺乳類の細胞を付与する工程と、
（ｂ）連続的な骨のマトリックスを形成するために未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化するとき、請求項１４乃至１７のいずれかに記載のポリヌクレオチド又は前記のベクターを誘導する工程と、
で成ることを特徴とする試験管内で骨組織を生成する方法。
【請求項２４】
（ａ）被験者から採取した生理学的サンプル中で、表４にリストアップされた目標遺伝子によって符号化されたポリヌクレオチドの表示程度を決定する工程と、
（ｂ）健康体の被験者から採取したサンプル中のポリヌクレオチド群の表示程度を前記表示程度と比較する工程と、
で成り、
前記健康体の被験者のサンプルと比較される被験者のサンプルにおけるポリヌクレオチドの量の増加が、感じやすい状態を示していることを特徴とする平均骨密度の全身的又は局所的減少又は被験者の状態に対する感受性を含む病理状態を診断する方法。
【請求項２５】
（ａ）被験者から採取した生理学的サンプル中で、表４にリストアップされた目標遺伝子によって符号化されたポリペプチドの量を決定する工程と、
（ｂ）健康体の被験者から採取したサンプル中のポリペプチド群の量を前記量と比較する工程と、
で成り、
前記健康体の被験者のサンプルと比較される被験者のサンプルにおけるポリペプチドの量の増加が、感じやすい状態を示していることを特徴とする平均骨密度の全身的又は局所的減少又は被験者の状態に対する感受性を含む病理状態を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法に関する。本発明は更に、分化を誘導するための化合物そのものと共に、分化を誘導する１又は２以上の化合物を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨には２種類の細胞、即ち骨形成細胞（例えば骨芽細胞）と骨再吸収細胞（例えば破骨細胞）とがある。これらの骨芽細胞と破骨細胞との間の複雑な相互作用によって破壊されたり、再吸収、再形成される動的組織である。破骨細胞に関して、先駆細胞から機能的な破骨細胞への発達に関連した種々の転写因子と成長因子はよく立証されている。対照的に、骨芽細胞に関しては少数、解明されているのみである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
骨芽細胞は、間充織祖先細胞（ＭＰＣ）の分化で起こる。骨芽細胞のアルカリ性ホスファターゼ活性（ＢＡＰ）への分化中に、発現上昇が起こる。生体中の骨形成は図１に示すような軟骨内又は膜間骨化のような胚成長中の２つの別個な方法によって起こる。この図１に示されるように、間充織祖先細胞又は幹細胞は、両方の骨組成の形成の出発点を示している。膜形成性骨化では、頭蓋骨又は鎖骨のような平坦な骨は間充織細胞の凝縮によって直接的に形成される。手足の骨のような長い骨の間充織細胞の凝縮は、はじめ、エンドシリアル細胞によって広がる軟骨中間体と、骨芽細胞及び骨細胞に分化する破骨細胞及び間充織細胞とによって導かれる（中島とド・クロンブリュッゲ（ｄｅ  Ｃｒｏｍｂｒｕｇｇｈｅ）の２００３年の報告）。
【０００４】
多くの疾患は、骨受容と骨再生との間の精巧な調整バランスの妨害によって引き起こされることが分かっている。かかる骨の疾患を持つ患者が増えている。即ち、悪性の過カルシウム血症、パゲット症、リューマチや歯周病等の骨の炎症であり、それらの症状は、また骨格変性やクローゾン症候群、くる病、成熟遅延骨異形成症、濃化異骨症（トゥールーズ−ロートレック変性）、骨髄遺伝子不全症に焦点を合わせているが、骨の疾患で最も重要なのは骨粗鬆症である。
【０００５】
骨粗鬆症は、５０歳以上の５人に一人の女性と、５０歳以上の２０人に一人の男性がかかりやすい。骨再吸収という多くの治療法が患者に役立っている。これらは主に骨再吸収、つまり、ホルモン交替治療（ＨＲＴ）、選択的エストロゲンレセプタ変調法（ＳＥＲＭ）、ビスホスホン酸塩或いはビスホスホン酸エステル、カルシトニンの本当の増加となっている。
【０００６】
以上の処置方法が骨の再吸収を遅くすると、欠損した骨は十分に成分を補給されないので骨折を治癒することができない。骨折を唯一食い止めるのは、骨の成分を十分に増量したときである。それゆえ、同定骨髄遺伝子方法に与える骨の同化を伴った治癒力干渉には興味がある。今のところ、単一骨同化治療は骨粗鬆症の部位に触れているだけである。例えば骨粗鬆症部位に効く骨同一化治療法には、パラチロイドホルモン（ＰＴＨ）１〜３４番を用いる。ＰＴＨは断続的に投与した時の骨同一化効果を表す。その扱いは、薬を患者に毎日投与する必要があるため、とても厄介である。更に、腫瘍の形態を、薬剤を多く投与した動物の実験で見る必要がある。しかも、高いコストの実験である。
【０００７】
別の骨同一化方法には、骨モルホジェニックタンパク質（ＢＭＰ）を用いることがあるが、それは骨の隙間にのみ作用する。これらは、骨治癒効果量の増加を必要とする患者には不都合である。骨モルホジェニックタンパク質のレセプタを多くの組織で同定し、ＢＭＰ自体を特殊な時空間パターン組織の多くの種類として発現する。このことは、ＢＭＰが骨の多くの組織よりも効果を持っていること、患者に対して系統的に投与した場合に発現されることを示唆している。１又はそれ以上の上記同一化の欠点を解消する新規な同一化体が必要とされている。
【０００８】
本発明の目的は、未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
この目的では、未分化の細胞を表４に示す阻害剤としてのポリペプチド、及び／又は前記ポリペプチドの断片及び／又は誘導体とのコンタクトする方法である、未分化哺乳類の細胞を分化して誘導する方法によって達成される。即ち、表４にリストアップしたポリペプチドのいずれか、及び／又はポリペプチド群の断片及び／又は誘導体の阻害剤を持った未分化細胞を接触させる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、人工的な膝関節、指関節、股関節のような関節部分並びに歯科インプラントのような顎への移植を含み、それが軸受移植の対策となっている。また、骨自体のダメージをなくし、欠損部分を増加するための骨フィルタやスペーサとして特殊な外科手術に用いられる。骨の形成は、誘発的伝導的工程の両面からのミネラル分補給の変形によって最適化される。また、適当な未分化細胞は骨の骨髄細胞であり、血液細胞や特定の間質細胞も含んでいる。骨髄細胞や特に間質細胞は個々の環境に対応したとき、骨を生成する効果がよく発揮される。未分化の細胞は、直接的に基質へ適用することができるか、或いは基質に適用される前の基質の不存在のときに効果的に繁殖される。後半のモードでは、細胞は繁殖後でも未分化であることが多く、本発明の目標としては未分化として参照される。その後、細胞は分化を許容される。更に、このような未分化型細胞はしばしば多量に得られ、成熟した骨細胞を用いるより簡便であり、病気の回復をより低い力で達成できる。更に未分化型細胞は、移植を考えている患者から得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明によるポリペプチド阻害剤は、例えばポリペプチドの生理活性をポリペプチドの発現及び／又は変換を抑制することによって、或いはポリペプチド自体を抑制することによって低下させる多くの分子に関連することに留意すべきである。
【００１２】
未分化の細胞は分化の早い段階、つまり未だに最終機能を持っておらず、かつ複数の種類の細胞へ誘導できない多能性幹細胞である。特に、これらの細胞は例えば破骨細胞と骨芽細胞を識別していない。このような細胞の例には、血液細胞と骨髄細胞或いはアジポース細胞から運搬された細胞がある。更に、本発明では、間充織細胞前駆体細胞に分化した細胞、例えば胚細胞のような全能性幹細胞を観察する。
【００１３】
骨芽細胞の分化は、アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）、１型コラーゲン、オステオカルシン、オステオポンチンのような分化過程を発現する酵素のレベルを測定することによって同定することができる。アルカリ性ホスファターゼ活性は、細胞に４−メチルウンベリフェリル七リン酸（ＭＵＰ）溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を添加することによって測定できる。ＡＰ活性のＭＵＰが添加された蛍光遺伝子は、蛍光プレート読取器（フルオスター（Ｆｌｕｏｓｔａｒ），ビーエムジー（ＢＭＧ）社）で測定される。
【００１４】
本発明を実施するための最良の形態は、阻害剤がポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドの表示又は変換を阻害することである。
【００１５】
また別の形態は、阻害剤がポリペプチドを符号化するポリヌクレオチドの表示又は変換を阻害することができる核酸であることである。
【００１６】
好ましくは、核酸はベクターの中に包括される。更に好ましくは、ベクターはアデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルス、レンチウィルス、センダイウィルスベクターのいずれかである。
【００１７】
核酸の阻害剤として次のようなものが挙げられる。例えばアンチセンスＲＮＡ、リボチーム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及び／又はｓｉＲＮＡである。このようにベクター及びウィルスベクターは、前記阻害剤を連続的に生産するのに有用である。ベクターはプラスミドやウィルスを包括する。ベクター中では、核酸配列がＣＭＶ，ＨＳＶ，ＴＫ，ＳＶ４０、又はそれらを長くしたような因子などのような適切なプロモータの制御下で形成される。阻害剤の入門的な産出はより長い抑制能を与えると共に、より少ない転送能を与えることが必要である。
【００１８】
ある特定の好ましい形態では、阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、ポリリボヌクレオチドを裂くリボチーム、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、及び小さな妨害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で成るグループから選択され、ｓｉＲＮＡはポリペプチドの生産を引き起こすポリリボヌクレオチドを抑制することができるように、ポリリボヌクレオチドの一部に同一源となっている。
【００１９】
本発明で用いられる阻害剤の化学変形物は、それらの安定性を増加させるように変形された阻害剤に関連している。この結果、阻害剤は例えば変形されたヌクレオシド間相互作用、変形された核酸塩基及び／又は糖等のような核分解に抵抗を与える変形物で成る。本発明におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、細胞分割又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの活性を上げるためのオリゴヌクレオチド部位又は共役体と結合させることによって化学に変質するということが可能である。このような部位で成るもの又は共役体は、脂質、例えばコレステロール、コール酸、チオエステル、脂肪族炭素鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチン酸誘導体に対して制限があるわけではない。他の化学的変質物の形成は、例えば２′−Ｏ−メチル体、リン酸メチル体、逆変換されたエンド変質物（３′−３′結合体）などでも可能である。
【００２０】
表示−抑制因子の１つの型として、表４に示されるような遺伝子で成るアンチセンス型の核酸がある。例えば、ＤＮＡのようなアンチセンス型核酸は試験管スケールで生産されたり、生体内で形成されたりまた表４に示されている遺伝子で成る核酸の細胞発現を抑制する遺伝子治療にも用いられる。アンチセンス核酸は、誘導された遺伝子の発現のような目標の発現に含まれる特殊で補完的な核酸配列を持つ塩基対を介して相互作用するヌクレオチド配列を持つ核酸を意味している。好ましくは、遺伝子の発現に含まれる特殊で補完的な核酸配列は、遺伝子を符号化するゲノムＤＮＡ分子又はｍＲＮＡ分子である。このゲノムＤＮＡ分子は、遺伝子の通常部位又は成熟した遺伝子の符号化配列で成っている。
【００２１】
アンチセンス型核酸は好ましくは大体１７〜１００通りの配列で成り、さらに好ましくは大体１８〜３０種類のヌクレオチドで成る。本発明の抗センス型核酸は好ましくは表４にリストアップされた遺伝子の幾つかによって符号化された核酸の全て又は一部と特殊にハイブリッド化できる核酸断片、又はメッセンジャＲＮＡに対応化できる核酸断片であり、或いは細胞の発現は表４にリストアップされた遺伝子の幾つかによって符号化されたｍＲＮＡコンプライジング核酸配列の全て又は一部に補完的にＲＮＡを生産するＤＮＡ配列である。抗センス型核酸は表４にあげるような遺伝子のいずれかを符号化した核酸群の全て又は一部分の発現によって、反対方向において用意される。好ましくは、抗センス型核酸はＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２６番及び２４７〜３３３番の配列で成るグループから選択された配列の発現によって、反対方向に用意される。好ましくは、抗センスの配列は少なくとも大体１７個のヌクレオチドの長さである。
【００２２】
抗センス核酸の背景におけるヌクレオチド配列に対する期限的補完及び方法は、細胞の配列、つまり生理的状態の下にハイブリッド化できる配列のように十分補完的であることを意味している。
【００２３】
本発明による発現−抑制の別の形態は、ＲＮＡ分子の分裂を触媒することのできる核酸のことである。リボチームは、特定の配列において他のＲＮＡのリン酸エステル結合を分解させる触媒的ＲＮＡ分子のことを意味する。分裂された目標配列の加水分解は、リボチームと基質ＲＮＡで成る活性錯体を形成することによって始まる。リン酸エステル結合を分裂させるような全てのリボチーム類は、分子間的に切断するので本発明の目標にふさわしい。
【００２４】
また発現−抑制の別の形態はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のことである。ＲＮＡｉは、動植物について観察される同一の静的ＲＮＡである二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって静的に調停される遺伝子の書き換え後の工程のことである。
【００２５】
このことに関連する本発明の最良の形態によれば、阻害剤はｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡは、表４にリストアップされた目標遺伝子のいずれかから選択されたヌクレオチド配列に同族の１７〜２３種のヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列と、第１のヌクレオチド配列に対称的な１７〜２３種のヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列とで構成されている。好ましくは、阻害剤はｓｉＲＮＡであり、このｓｉＲＮＡは、表４及び表５のＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番及び２４７〜３３３番で同定されるヌクレオチド配列から選択される１７〜２３種のヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列と、第１のヌクレオチド配列に対称的な１７〜２３種のヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列とで構成されている。
【００２６】
他の形態としてｓｉＲＮＡは、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列に接続される第３のヌクレオチド配列で成り、ｓｉＲＮＡ内部でステムループ構造を形成することができる。
【００２７】
本発明によるこのような自己補完型単鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは少なくとも第１のガイド配列と、第１のガイド配列に寄与する第２のガイド配列と、第２のガイド配列内にステム−ループ構造を形成する第３のガイド配列とで構成され、第３のガイド配列は第１のガイド配列の末端と第２のガイド配列の中央端に結合されている。第１及び第２の配列を持つ全てのヌクレオチドは塩基対となっているか、又は第１の配列と第２の配列の間で不整合を生じている。そのヌクレオチドの配列は、好ましくは１７〜２３個と同じ長さである。好ましくは第１又は第２の配列は表４に示されている遺伝子のポリヌクレオチド配列から１７番目と２３番目の間のオリゴヌクレオチド配列である。このようなループを伴ったｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは自己補完型であり、安定なヘアピン構造をとることができる。ヘアピン構造は通常のｄｓＲＮＡより安定である。更にそれらはベクターを作るよりも簡単である。
【００２８】
更に好ましくは第１又は第２の配列のヌクレオチドは、ＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番の情報をもつヌクレオチドで成る。そのＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番の情報を持つヌクレオチド配列は、ｓｉＲＮＡの設計ルールに則っていないヌクレオチド配列と比較される目標配列の誘導を促進するｓｉＲＮＡの設計ルールに従って選択される（国際公開第２００４／０９４６３６号パンフレット参照）。
【００２９】
好ましくは、第３のヌクレオチド配列は４〜３０個のヌクレオチド長であり更に好ましくは５〜１５個分のヌクレオチド長であり、最適なのは８個長である。最適な形態において、ヌクレオチド配列はＵＵＧＣＵＡＵＡである（ＳＥＱのＩＤ番号：３４４）。
【００３０】
本発明は未分化の哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導し、化合物を同定する方法に関連している。以下の（ａ）〜（ｄ）で構成される。
（ａ）表４にリストアップされ、表４にリストアップされた遺伝子の幾つかによって符号化されたポリペプチド、及び／又は前記ポリペプチドの断片及び／又は誘導体を１又はそれ以上の化合物と接触させる工程；
（ｂ）結合親和力を決定する工程；
（ｃ）未分化哺乳類の細胞を少なくとも１０μモル濃度で結合させる工程；
（ｄ）未分化哺乳類の細胞の分化を誘導する化合物を同定する工程。
【００３１】
本発明で用いるポリペプチド又はポリヌクレオチドは溶液中でフリーであり、固相担持され、細胞表面に位置される。
【００３２】
その方法を実施するために、本発明で用いているポリペプチド又は合成されていないポリペプチドから分離を有用化する合成物のいずれかを固定し、同様に分析の自動化を適合化させる。本発明のポリペプチド合成物との相互作用は、試験管スケールで実験できる。例えばミクロ滴定プレートや試験管などといった機材である。１つの形態において、融解タンパク質がマトリクスに縛られるポリペプチドを許容する領域を付加するように供される。例えば本発明におけるポリペプチドはヒスチジン（Ｈｉｓ）と相性がよく、Ｎｉ−ＮＴＡミクロ力価プレート上に吸収させたり、或いは本発明のポリペプチドと共に融解タンパク質（ＰｒｏｔＡ）をＩｇＧに吸収させたりして、それらを細胞リセーツ（分子量３５の硫黄で標識した）及び予備合成物と結合させ、合成物は錯体構造／塩及びｐＨの生理状態に適した生理条件の下にインキュベーションされる。インキュベーション後に、そのプレーは、未結合のラベルを取り除いて洗浄し、そのマトリクスを固定する。放射性活性化物の量は直接的或いは錯体を分離した後に決定される。代わりに、錯体をマトリクスから分離でき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、電気泳動用ゲル内で束ねた本発明のタンパク質のレベルから分離する。
【００３３】
マトリクス上のタンパク質固定の別の技術は、化合物の同定する方法に用いることができる。例えば本発明のポリペプチド又は化合物は、ビオチン及びストレプタビジンとの結合を固定できる。本発明のビオチン化したタンパク質分子は、公知の技術（例えばビオチン化キット、ピエルスケミカル社、ロックホード社、イル）を用いてビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシイミド）から誘導でき、またストレプタビチジンを層設された９６ウェルプレート（ピエルスケミカル社）のウェルに固定される。代わりに、本発明のポリペプチドで反応するが、化合物に対してポリペプチドの結合を妨げない抗体はプレートのウェルに誘導することができ、本発明のポリペプチドは抗体結合によってウェルに閉じ込めることができる。上述のように、予備化合物の標識の準備は本発明のポリペプチドがプレート上のウェルで成長し、溝にトラップされる錯体の量を定量できる。
【００３４】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドと化合物との結合親和力は、表面プラズマ共振型バイオセンサ（バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ））のような公知技術を用いて測定することができる。表面プラズマ共振型バイオセンサとしては、置換反応を介した標識化合物を用いた飽和結合分析によるもの（例えばスカッチャードとリンドモの分析）、差動式紫外吸収スペクトル法、蛍光極性分析によるもの、蛍光イメージプレート読取器（ＦＬＩＰＲ（登録商標））、蛍光共鳴エネルギー変換や生物蛍光共鳴エネルギー変換がある。その化合物の結合親和力は、解離定数（Ｋｄ）で、或いはＩＣ５０又はＥＣ５０として示される。ＩＣ５０は、ポリペプチドの別の配位子が５０％結合を阻害されたときの化合物の濃度を示す。ＥＣ５０は、試験管内での５０％分の最大効果を得るために要求される濃度を表す。解離定数Ｋｄを用いることで配位結合がポリペプチドで起こる状態を測定することができ、ポリペプチド中の結合サイトの半分を正確に抽出し飽和化する配位子濃度と等価である。高結合親和力の化合物は、Ｋｄ、ＩＣ５０及びＥＣ５０が低い。即ち１００ｎＭ〜１ｐＭの範囲では、低い結合親和力に対するモデレートが、高いＫｄ、ＩＣ５０及びＥＣ５０とマイクログラム分子の領域で関連している。
【００３５】
高い処理量の目標のために、化合物のライブラリーは、ペプチドライブラリー（例えばＬＯＰＡＰ（商標），シグマアルドリッチ社）、脂質ライブラリー（バイオモル（ＢｉｏＭｏｌ）社）、合成化合物ライブラリー（例えばＬＯＰＡＣ（商標），シグマアルドリッチ社）又は天然物ライブラリー（スペクッス（Ｓｐｅｃｓ），タイムテック（ＴｉｍＴｅｃ）社）を使用することができる。
【００３６】
本発明はまた、単一化合物或いは未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導した化合物の混合物を同定する方法に関し、以下の工程で構成されている。
（ａ）表４のポリペプチドとして表記され、表４にリストアップされた遺伝子によって符号化された未分化哺乳類の細胞、及び／又は前記ポリペプチドの断片及び又は誘導物を培養させる工程；
（ｂ）前記化合物の細胞又は化合物の混合物をさらす工程；
（ｃ）未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導する単一化合物又は化合物の混合物を選択する工程。
【００３７】
上記方法で同定された単一化合物又は混合物は、未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導することに適用できる。
【００３８】
好ましくは、本発明の方法で同定するのは、低分子化合物についてである。低分子化合物、つまり５００ダルトン若しくはそれ以下の分子重量を持つ化合物は生物化学上の透過や吸収があり、約５００ダルトンの分子重量を持つ薬剤模倣体として使われている（リピンスキー他、２００１年）。
【００３９】
別の実施形態によれば、化合物群がペプチドである。ペプチドは良質な薬剤模倣体であり、また良質なホルモン及び血小板凝塊形成（抗血栓剤）のような市場で価値を有するペプチドの多様的な例である。
【００４０】
また、別の実施形態では天然物化合物である。天然物化合物は、植物などの天然資源から抽出される。抽出された天然物を用いることは、多種の分子を抽出するのに好都合である。天然物化合物には種々の分子がある。合成化合物はこのような膨大な数ではない。他の化合物は、炭水化物とグリコシル化したポリペプチドから選択される。
【００４１】
更に本発明では、表４に示される目標遺伝子のいずれかから選んだヌクレオチド配列に対する１７〜２３種のヌクレオチド同族の配列と、その変形物及び／又は逆のコンプリメンツとで成るポリヌクレオチドに関連する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは表４と表５中のＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番によって同定されるヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列を有する、或いは表４及び表５のＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番及び２４７〜３３３番によって同定されるヌクレオチド配列から選択されたヌクレオチド配列の逆のコンプリメンツを有する。本発明のヌクレオチドは骨芽細胞の分化の増加を示している。
【００４２】
本発明はまた、ポリヌクレオチドを薬剤として用いる場合にも関連している。
【００４３】
更に、本発明は前記ポリヌクレオチドを体全体の疾患を処置したり、或いは骨密度減少疾患の薬剤を製造することに関連している。
【００４４】
最初に示されているように、本発明では、表４に示されているグループから選択されたアミノ酸配列で成るポリペプチドが未分化の哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化することに包含され、本発明の形態では化合物は公知であるか、或いは表４中のグループから選択されたアミノ酸配列で成るポリペプチドのいずれかの活性を阻害することが知られており、これらの化合物が未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化して誘導することに使用される。それ故に、本発明はまた、表４中のグループから選択されたアミノ酸配列で成るポリペプチドのいずれかの活性を阻害することが知られている化合物を薬として使用することに関連している。更に、本発明は表４中のグループから選択されたアミノ酸配列で成るポリペプチドのいずれかの活性を阻害することが知られている化合物を、全身の疾患処置又は骨密度の部分的疾患のための薬剤として使用することに関連している。
【００４５】
本発明で前述したポリヌクレオチドで成るベクターに関連し、更にベクターを薬剤として用いられていることにも関連している。
【００４６】
また好ましい例では、ベクターにはアデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルス、レンチウィルス又はセンダイウィルスなどがある。好ましくは、ベクターはＳＥＱのＩＤ番号：１〜２２０番と２４７〜３３３番で成るグループから選択されたヌクレオチドの配列で成るｓｉＲＮＡを符号化する。
【００４７】
本発明は更に、全身疾患又は骨密度の部分的減少を処置する薬剤の生産にベクターを用いることにも関連している。また本発明の好ましい例では、疾病群として骨化症、悪性のカルシウム過多血症、多発性骨髄腫、副甲状腺機能亢進症及び甲状腺機能亢進症が挙げられる。
【００４８】
組み換えウィルスは一般的に遺伝子交換に用いられる。ここで、遺伝子組み換えで使われる主要な３種類のウィルスはアデノウィルス、レトロウィルス、アデノアソシエイトウィルスである。最近では、レンチウィルス、レトロウィルス群のサブグループやセンダイウィルスが用いられている。アデノウィルスは分割細胞と非分割細胞の両方に変換でき、高いウィルス滴定が可能である。レトロウィルスは分割細胞のみを汚染でき、ホストクロモソームの中にゲノムを集約できる。集約は、長い周期の遺伝子発現を纏め上げる。レトロウィルスの仲間であるレンチウィルスは、レトロウィルスの標準的な性質を全て持ち合わせているが、非分割細胞を変換する能力もある。アデノアソシエイトウィルス（ＡＡＶ）は小さく、非病原性の単純標準的ＤＮＡのウィルスである。アデノアソシエイトウィルスは、ヘルパウィルス（アデノウィルス又はヘルペスウィルス）の動きを助長する作用がある。ヘルパウィルスが存在しない場合、野生型ＡＡＶが位置選択的にホストゲノムへ集約している。レトロウィルスと同様に、集約は長い周期の遺伝子の発現に有用である。ＡＡＶは非分割細胞及び分割細胞の両方を汚染する。センダイウィルスはパラミクソウィルスの１つであり、分割細胞及び非分割細胞の両方に変換できる単一標準的なＲＮＡウィルスである。センダイウィルスの細胞への注入方法は、多くの細胞の型に共通するシアル酸とコレステロールを用いる。センダイウィルスの遺伝子発現と複製は核に入るのに多数のウィルスと比較して、シトプラズム中に局在化する。
【００４９】
さらに、本発明は骨組織を試験管内で生産する方法に関し、以下の工程で構成される。
（ａ）細胞基質を形成する基質上に未分化哺乳類の細胞を付与する工程；
（ｂ）未分化哺乳類の細胞を骨芽細胞に分化する間、ポリヌクレオチド或いはポリヌクレオチドで成るベクターのどれかを誘導し、それによって連続的な骨のマトリクスを生産する工程。好ましくは連続的な骨のマトリクスは、基質の表面において少なくとも０．５μｍの厚さを有している。
【００５０】
本発明はこのようにマトリクス成長を伴った基質の生産方法を提供し、人工的な膝関節、指関節、股関節のような関節部分並びに歯科インプラントのような顎への移植を含み、それが軸受移植の対策となっている。また、骨自体のダメージをなくし、欠損部分を増加するための骨フィルタやスペーサとして特殊な外科手術に用いられる。骨の形成は、誘発的伝導的工程の両面からのミネラル分補給の変形によって最適化される。
【００５１】
マトリクスで成る骨フィルタを持った軸受移植（好ましくは上述のようにマトリクスが層設されている）の対策は、本発明では有利な構成となっている。
【００５２】
本発明の手段はまた、前の外科装置が置き換えられるときなど、外科的処置にも最適である。
【００５３】
適当な未分化細胞は骨の骨髄細胞であり、血液細胞や特定の間質細胞も含んでいる。骨髄細胞や特に間質細胞は個々の環境に対応したとき、骨を生成する効果がよく発揮される。未分化の細胞は、直接的に基質へ適用することができるか、或いは基質に適用される前の基質の不存在のときに効果的に繁殖される。後半のモードでは、細胞は繁殖後でも未分化であることが多く、本発明の目標としては未分化として参照される。その後、細胞は分化を許容される。分化はグルココルチコイドのような適切な誘発剤や抗炎症剤によって、誘発又は増加される。特に分化の適切な誘発剤は、本発明の阻害能の発現にある。
【００５４】
未分化細胞の使用はいくつかの利点を示している。第一に、より低い分化はより高い増殖率を意味し、一層直接的で制御された不自由さを許容している。更に、これらの細胞は有機質及び無機質の成分で成る骨のマトリクスを生産するだけでなく、培地媒体やマトリクス中で生きている組織への助長、そして成長している組織を取り扱うためのいくつかの因子を示している。また、培地媒体は移植過程において用いられるとき、成長因子のような活性因子の源となる。更に、このような未分化型細胞はしばしば多量に得られ、成熟した骨細胞を用いるより簡便であり、病気の回復をより低い力で達成できる。更に未分化型細胞は、移植を考えている患者から得ることができる。これらの細胞から作られた骨は、患者の体内で自動複製され異常がなくなる。１００μｍの厚さのマトリクスは、結果として未分化型細胞から生産することができる。
【００５５】
未分化型細胞が培養される培地基質はチタンやコバルトクロム合金或いはステンレス鋼などの金属や、リン酸カルシウムのような生理活性表面、ポリエチレンのようなポリマー表面などが使われる。わずかな例であるが、ガラス陶器のようなケイ素物質も基質として使われている。最も適しているのは金属ではチタン、リン酸カルシウムである。ただしリン酸カルシウムは基質に不可欠な成分というわけではない。基質は極性又は非極性である。細胞群は１ｃｍ２当たり１０３〜１０６個、その中でも１０４〜２×１０５個が特に好ましい。
【００５６】
本発明で使われる培地媒体は、ＭＥＭ（最小限の要素を備えた培地）のような一般的に知られた培地である。有用に用いるには、媒体は条件の整ったものを使う。この背景には整えられた培地は、類似の細胞が以前に熟考され、ポリペプチドのような因子を含んでいる培地の基であったり、細胞成長と細胞分化が重要な細胞によって秘密になっていることが理解される。
【００５７】
細胞群は、例えば少なくとも０．５μｍの厚さで、特に１μｍ以上１００μｍ以下、さらにいえば１０〜５０μｍ以内のマトリクス層で十分な時間で培養される。細胞を培地に培養するには２〜１５週間が必要とされ、特に４〜１０週間が望ましい。
【００５８】
マトリクスの生産で、基質に対して表面の少なくとも５０％、特に表面の８０％で連続的若しくは擬似連続的に融和するという結果がある。
【００５９】
本発明の他の例は本発明の方法で得られる骨芽細胞を提供することにある。
【００６０】
本発明の更に他の例では、例えば骨組織の生産を試験管培養物で行う。
【００６１】
また、さらに本発明では病気が引き起こす骨密度の全身的又は局所的な減少を診断したり、患者の状態を究明したりする方法に関し、以下の工程で構成される。
（ａ）前記患者から集めた生理学的サンプルを、表４に示されている目標遺伝子のいずれかによって符号化されたポリヌクレオチドの表示レベルを決定する工程；
（ｂ）健康体の被験者から集めたサンプルのポリヌクレオチドの発現レベルで発現レベルを比較する工程。健康体の被験者のサンプルを含む患者のヌクレオチド量の増加は、この場合、病的な条件に誘導される。
【００６２】
更に、本発明は、病気が引き起こす骨密度の全身的又は局所的な減少を診断したり、患者の状態を究明したりする方法に関し、以下の工程で構成されている。
（ａ）前記患者から集めた生理学的サンプルを、表４中に示されている目標遺伝子を符号化したポリペプチドの量から決定する工程；
（ｂ）健康体の被験者から集めたサンプルにおけるポリペプチドの量から比較する工程；
健康体の被験者のサンプルで成る患者のポリペプチド量の増加も、この場合の病的なコンディションに誘導される。好ましくは、この場合の病的な条件というのは骨粗鬆症、悪性のカルシウム過多血症、多発性骨髄腫、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症に起因している。
【００６３】
本発明では、用語「ポリペプチドの誘導体」はタンパク質、タンパク質分子、タンパク質断片、ペプチド、ポリペプチドが途中で切れて伸びきったようなアミノ酸残基を含み、タンパク質の生理活性を保つオリゴペプチドに関連する。例えば、タンパク質の１つであるポリペプチドは、自然に生じた形態のアミノ酸配列と比較してアミノ酸変異を有している。ここでの誘導体は自然派生型変形でグリコシル化、アシル化したアミノ酸残基、或いはポリペプチド自然派生型形態のアミノ酸残基と比較される非天然型のアミノ酸残基で成っている。また、その誘導体は、自然派生型のポリペプチドのアミノ酸残基と比較される１又はそれ以上の非アミノ酸基質で成る。例えば、レポータ分子又はアミノ酸配列と共有又は非共有する別の配位子である。
【００６４】
用語「ポリペプチドの断片」は、伸びきったアミノ酸残基で成り、必要な同一性、完全配列の機能的活性ばかりでなく、実質的に類似性を示すペプチド、オリゴペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、酵素に関連する。
【００６５】
用語「ポリヌクレオチド」は、二重鎖又は一本鎖ＤＮＡや（メッセンジャ）ＲＮＡに関連し、オリゴヌクレオチドの全形に関連する。また、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ポリシロキサン、２′−Ｏ−（２−メトキシ）エチルチオリン酸のような変形体を含んだ核酸を含んでいる。
【００６６】
用語「ポリヌクレオチドの誘導体」は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、そしてポリヌクレオチド中の伸びきった核酸残基で成るオリゴヌクレオチドに関連する。例えば、核酸に変形が生じたポリヌクレオチドと自然に生じたポリヌクレオチドの核酸配列を比較するということである。ここでいう誘導体はペプチド核酸、ポリシロキサン、２′−Ｏ−（２−メトキシ）エチルチオリン酸のような変形体を含んだ核酸と、非天然型の核酸残基、或いは１又はそれ以上の核酸の置換基を変換したもの、例えばメチル基、チオ、硫酸エステル、ベンゾイル基、フェニル基、アミノ基、プロピル基、クロロ基、そしてメタノカルバヌクレオシド、或いは方向を有効化するレポータ分子とで成っている。
【００６７】
用語「ポリヌクレオチド断片」は、必要な同一性、完全な配列としての活性ばかりでなく、実質的に類似性を示し、伸びきった核酸残基で成るオリゴヌクレオチドに関連する。
【００６８】
核酸配列又はアミノ酸配列における「同一配列」は、親配列における同一的又は実質的同一性の配列に制限され、親配列として同様な生物的性質を持つものをいう。この用語は、自然発生的な親配列の突然変異を示している。親配列は表４〜表６に示されているものか、これらの表の中でさらに遺伝子銀行にアクセスしたもののいずれかである。一般的に、同一配列というのは親配列と少なくとも９５％同様の配列をしたものを指す。しかしながら、２つ以上の不適切な配列というのは、同一配列が親配列として対応する遺伝子の類似の下位規則に通じれば、１７〜２１個のｓｉＲＮＡ配列では許容される。
【実施例】
【００６９】
［実施例１］内生アルカリ性ホスファターゼ探知法による高処理スクリーニング法の開発
＜試験片の組成＞
間充織原型細胞（ＭＰＣｓ）は、例えばＢＭＰ２のような適切な因子で骨芽細胞への分化を決定される。このような因子を検査した試験片は、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）の活性、骨芽細胞分化プログラム中の早生マーカをモニタリングすることによって伝達される。ＭＰＣｓは３８４種類のウェルプレートに植えつけ、その１日後にＳｉｌｅｎｃｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）コレクションからヒトコクサッキーと、アデノウィルスレセプタ  （ｈＣＡＲ；Ａｄ−ｈＣＡＲ）と、不可分ｓｉＲＮＡアデノウィルスとを符号化したアデノウィルス（Ａｄ−ｓｉＲＮＡ）を感染させた。ＡｄＣ１５‐ｈＣＡＲ／ＡｄＣ２０‐ｈＣＡＲの相互注入は、ＡｄＣ０１−ｓｉＲＮＡの注入効率を向上させる。細胞のＡＰ活性は、注入（１３ｄｐｉ）から１３日後に決定された。図２は試験片の組成を図示している。
【００７０】
＜試験片の伝達＞
ＭＰＣｓは、事前説明後に健康なボランティアの骨髄から採取した（ベルギー，キャンブレックス／ビオウィッタッカー（Ｃａｍｂｒｅｘ／Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ），ヴェルヴィエールズ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ）社）。
【００７１】
この実験では、３８４枚のプレートをいくつかのパラメータに分けて検査した。即ち、細胞を注入したときの密度、ウィルス（Ａｄ−ＢＭＰ２又はＡｄ−ｅＧＦＰ）制御の感染多様性（ＭＯＩ）、Ａｄ−ｈＣＡＲのＭＯＩ、感染の継続時間、毒性、感染率（Ａｄ−ｅＧＦＰを使用）、及び解読の日数である。
【００７２】
試験片伝達のポジティブコントロールにＡｄ−ＢＭＰ２（ＢＭＰ２の過剰遺伝子発現）を使用したとき、以下のプロトコルは、バックグラウンド信号上で一番低い偏差の試験片に対して最も高い動的領域を決定する。即ち、ＭＰＣｓは１枚当たり５００個の細胞を３８４枚のプレートに流し入れ、１日後に、Ａｄ‐ｈＣＡＲ（５μｌのＡｄ−ｈＣＡＲ溶液で合計ＭＯＩ＝１５５．７）と１μｌのＡｄ制御ウィルス（理論ＭＯＩが５０００に相当するＡｄ−ＢＭＰ２又はＡｄ−ｅＧＦＰ）の混合物を注入した。５日後、培地のウィルスを、ウィルスの存在した清浄な別の培地に移した。アルカリ性ホスファターゼの発現上昇は、１３ｄｐｉで解読される。即ち、１５μｌの４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ，シグマ社製）をおのおののウェルに添加し、そのプレートを３７℃、１５分間おき、蛍光プレート読取器（フルオスター（Ｆｌｕｏｓｔａｒ），ビーエムジー（ＢＭＧ）社）を用いてＡＰ活性を観察した。
【００７３】
この試験片の最適化後、小試験スクリーンは自動装置（スイス、テキャン  エージー（Ｔｅｃａｎ  ＡＧ）社製、ＴｅＭＯ９６，ＴｅＭＯ３８４，ＲｏＭａ装備のテキャンフリーダム（Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ）２００の９６／３８４チャンネル解読器）を用いることで、（１０３個の違ったＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルスに）分けられた。このスクリーンでのヒットは同じ試験片を訂正及び再試験をすることである。最も強く付けられる２種のＡｄ−ｓｉＲＮＡ（Ｈ９＝Ｈ２４−０１０；Ｈ１０＝Ｈ２４−０１１）は、Ａｄ−ｓｉＲＮＡを含んだ制御プレート（ノックダウン式（ＫＤ）制御プレート）を生成するのに用いられる。３陰極（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）と３陽極（Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３）を含んだ９６枚のプレートがウィルスを制御している制御プレートは、図３に示されている。このノックダウン式制御プレートは、ポジティブコントロール用のＡｄ−Ｈ９（Ｈ２４−０１０）及びＡｄ−Ｈ１０（Ｈ２４−０１１）を含み、汚染制御用のＡｄ−ｅＧＦＰ（ノック−イン  ウィルス）を含み、ネガティブコントロール用のＡｄ−ｅＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ、Ａｄ−Ｍ６ＰＲ−ｓｉＲＮＡ及びＡｄ−Ｌｕｃ−ｓｉＲＮＡ（この３種全てのウィルスはノック−ダウンウィルスである）を含んでいる。
【００７４】
制御ウィルスを、９６枚のＫＤ制御プレートから３８４枚プレートに自動装置を用いて滴下した。３８４枚のプレートの最終的なレイアウトを図４に示す。
【００７５】
図５はＫＤ制御プレートを用いたときの自動的スクリーニング工程図の結果を示している。ＫＤネガティブコントロール（Ｎ１−Ｎ３）の平均値及び標準偏差は、ヒット分析のカットオフ値を計算するのに用い、カットオフ値はＮ１，Ｎ２，Ｎ３（‘全て陰極’）の平均値に‘全陰極’の標準偏差の３倍を足したものにセットした。ポジティブコントロール（Ｐ１及びＰ２）は、汚染されたウェルの９５％以上の点がつけられた。ネガティブコントロールウィルスは汚染ウェルの５％以下の点になった。
【００７６】
［実施例２］骨芽細胞片中の７９８０種Ａｄ−ｓｉＲＮＡアデノウィルスのスクリーニング法
ＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔライブラリーのスクリーニングの最適化は、次の方法で行った。ＭＰＣを、１プレート当たり５００個の細胞がつくように６０μｌの培地に混ぜ、下部が透明なウェルプレート（コースタ型又はヌンク型）３８４枚に流し込んだ。１日後、３８４枚のウェルプレート（ｍｌ当たり２．５×１０９個のウィルス部分の換算力価）及び５μｌのＡｄ−ｈＣＡＲ溶液（計ＭＯＩ＝１５５）に入れられ、９６枚のＶ字型ウェルプレートに分配されたＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔ（商標）のコレクションから採取した１μｌのＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルスを、Ａｄ−ｈＣＡＲ溶液を含む９６枚のウェルプレートのウェルから、ＭＰＣｓを含む３８４枚のウェルプレートの各ウェルに、９６／３８４チャンネル分配器（スイス、テキャン  エージー（Ｔｅｃａｎ  ＡＧ）社製、ＴｅＭＯ９６，ＴｅＭＯ３８４及びＲｏＭａを装備したテキャンフリーダム（Ｔｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ）２００）を用いて変換した。ＫＤ制御プレートは、同様の条件でＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔコレクションからのアリコートプレートとして用いた。全てのＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルスを、違った各個のＭＰＣプレート上で同じようにスクリーニングした。プレートを３７℃に保った。それから４日間、アデノウィルスが繁殖するのを待った。１３日後の感染では、ＡＰ活性が解読された。その３８４枚のスクリーニングプレートの様子を図６に示す。そして関係蛍光ユニット（ＲＦＵ）は、３８４枚のそれぞれの点がＹ軸方向にプロットされると共に、対応してＸ軸方向にもプロットされている。
【００７７】
この複製スクリーンを２回行い、全ての４点データをヒットコーリングとして用いた（実施例３参照）。
【００７８】
［実施例３］ＡＰ試験片の目標同定
これら２つのスクリーンを実行した後に、ＡＰ活性を測定して得られたデータは以下の通り分析された。即ち、バックグラウンドは、制御プレート以外の全てのプレートから得られたデータ点の平均値で計算する。ヒットコーリングのカットオフ値は、制御プレートを除いて全データの３倍の標準偏差で計算した。各データ点はカットオフ値の上下スコアで分析した。カットオフ値以上のＡＰ活性レベルを標識符号化したＡｄ−ｓｉＲＮＡのみに関心がある。ヒット理論は１つ又は両方のスクリーン中で、単一又は複数の点数に優先された。データは、４０９１個の独立した遺伝子を示す７９８０種のＡｄ−ｓｉＲＮＡウィルス中に集約した。その構成は表４に示されている。
【００７９】
同定されたヒットの１つは、試験片に認められた骨同一化因子を示している。
【００８０】
＜Ｈ２４−０３４：ＳＲＣ＞
マーツィア（Ｍａｒｚｉａ）らの報告（２０００）では、骨の組成は野生のマウスに比べてサーク型マウスの方が増加していると示されている。この研究の最も適切なところは、サーク型マウスから抽出した骨芽細胞、或いはサークアンチセンスオリゴヌクレオチドを除いた野生のマウスから抽出した骨芽細胞は、試験管内ではＡＰ活性が増加していると示していることである。
【００８１】
このスクリーン中で同定された８個の遺伝子を２つのＡｄ−ｓｉＲＮＡｓの対象とした。これらの遺伝子は表４中の“ＡＶＰＲ１Ｂ，ＦＬＪ２２９５５，ＩＬ１Ｆ８，ＰＰＩＡ，ＵＳＰ３８，Ｃ９，ＬＯＣ２５４３７８及びＢＲＳ３”である（表４参照）。
【００８２】
［実施例４］目標Ａｄ‐ｓｉＲＮＡｓの性質制御
この後の目標として言及されるＡｄ−ｓｉＲＮＡヒットは、骨同一化因子としての治療方法を確立するための分析方法として議論される。第一段階は、更なる分析のために選択されたＡｄ−ｓｉＲＮＡの性質制御を伴っている（本実施例）。他の有効化ステップはｍＲＮＡ標識の目標物有効化であり（実施例５）、石灰化した断片のような骨形成断片の目標物スクリーニングであり（実施例６）、同定された遺伝子をターゲットにした付加的Ａｄ−ｓｉＲＮＡｓの伝達である（実施例９）。これらの有効断片の後に重要性が残されているようなターゲットは、薬剤の発見へと検討される。即ち、断片をターゲットＡｄ−ｓｉＲＮＡｓの骨同一化作用に似せた化合物の発見と最適化を発展させた（実施例７）。更に、同定されたＡｄ−ｓｉＲＮＡｓの非再吸収活性は破骨細胞の有効化である（実施例８）。
【００８３】
＜目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡｓの性質制御＞
目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡｓを、最初の断片中の数種のＭＯＩのウィルスを再スクリーニングすることにより（実施例１参照）、及び目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡウィルスを符号化したｓｉＲＮＡを配列することにより、９６種のプレート版にＰｅｒＣ６（オランダのクルーセル（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、レイデン（Ｌｅｉｄｅｎ））細胞を繁殖させた。
【００８４】
ＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ細胞は、１８０μｌのＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ培地の１ウェル当たり４０，０００個細胞密度の９６個のプレートにあることになる。これらの細胞を、１０％の二酸化炭素を充填した３９℃の恒温槽に一晩中静置した。１日後、細胞を、目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡを含んだＳｉｌｅｎｃｅＳｅｌｅｃｔの蓄積からの粗細胞溶菌液１μｌに感染させた。１０％の二酸化炭素を充填した３４℃の恒温槽に細胞変性効果が現れるまで、細胞を静置した（大体７日位すると、細胞特有の臭いが立ち込めてくる）。その上澄み液を採取し、その粗細胞溶菌液をプロテナーゼＫを用いて処理した。即ち、先ず４μｌの溶菌緩衝溶液（１ｘ拡張高忠実緩衝液に塩化マグネシウムを添加したもの（ロチェ分子バイオケミカル社、カタログＮｏ．１３３２４６５））に１２μｌの溶菌液を加え、１ｍｇ／ｍｌのプロテナーゼＫ（ロチェ分子バイオケミカル社、カタログＮｏ．７４５７２３）と０．４５％のＴｗｅｅｎ‐２０（ロチェ分子バイオケミカル社、カタログＮｏ．１３３５４６５）をＰＣＲ管の中で混合させた。そのＰＣＲ管を５５℃で２時間反応させ、１５分間かけて９５℃で活動を不活性化させた。そのＰＣＲ管反応では１μｌの溶菌液を１０倍に薄め、塩化マグネシウムを添加した緩衝溶液５μｌ、０．５μｌのｄＮＴＰ（各ｄＮＴＰについて１０ｍＭ）混合物、１μｌの前駆型プライマ（１０ｍＭ溶液、塩基配列は５′ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  Ｃ，ＳＥＱのＩＤ番号：２４５）、１μｌの逆型プライマ（１０ｍＭ溶液、塩基配列は５’ＣＣＣ  ＣＣＡ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  ＡＴＡ  ＴＡＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  Ｃ，ＳＥＱのＩＤ番号：２４６）、拡張高忠実ＤＮＡポリメラーゼ０．２μｌ（３．５Ｕ／μｌ、ロチェ分子バイオケミカル社）と４１．３μｌの水を加えた。ＰＣＲ管は、ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で以下のように行った。ＰＣＲ管中の５０μｌの反応溶液は９５℃で５分間静置後、９５℃で１５秒、５５℃で３０秒、６８℃で４分、それぞれ３５回転させた。最終的には６８℃で７分間静置した。その後、反応液の５μｌは６倍に希釈したゲル状の緩衝溶液２μｌと混ぜ、拡大生成物を分解させるために臭化エチジウム０．５μｇ／μｌで成る０．８％のアガロースゲルに注ぎ込んだ。拡大生成物の大きさは、同じようなゲル中の一重鎖はしご型ＤＮＡを軸に算出した。その予測される大きさは、〜５００ｂｐまでであった。
【００８５】
配列分析は、標識アデノウィルスより符号化されたｓｉＲＮＡをｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６−Ｕ６プラスミドのＳｐａＩサイトに横付けしたベクター配列に、プライマを用いたＰＣＲによって拡大される。ＰＣＲのフラグメントの配列を決定し、予測した配列と比較した。
【００８６】
＜多様化ＭＯＩ再スクリーニング＞
繁殖させた目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡをＡＰ活性を持つ数種のＭＯＩで再スクリーニング化した（実施例１参照）。Ａｄ−ｓｉＲＮＡは、性質制御工程を通過した少なくとも１つのＭＯＩの二重鎖に点数を数えなくてはならなかった。
【００８７】
表４に示されている全てのヒットはこの性質制御を次のように達成した。
ａ）ＰＣＲフラグメントの正確な長さを示す。
ｂ）ＰＣＲフラグメントの正確な配列を示す。
ｃ）少なくとも１つのＭＯＩの二重鎖ＡＰ活性を誘発させる。
【００８８】
［実施例５］同定目標物のｍＲＮＡ有効化実験
目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡの初期有効化は、感染したＭＰＣから分離されたＲＮＡについて実行した。最初に、目標物の発現を、初期型ヒトＭＰＣとヒト骨芽細胞（ｈＯＢｓ）のいくつかの異性体から分析した。次に、Ａｄ−ｓｉＲＮＡによって目標遺伝子発現のノックダウンを、ｍＲＮＡレベルにおいて証明した。三番目に、符号化された骨のＡＰ  ｍＲＮＡの調節向上と胎盤或いは腸ＡＰ  ｍＲＮＡの調節向上を比較分析した。
【００８９】
＜ＭＰＣと目標プロファイルのための骨芽細胞発現分析＞
目標遺伝子の発現レベルを、４種のＭＰＣ異性体と２種のｈＯＢ異性体で決定した。ＭＰＣとｈＯＢ（ベルギー，キャンブレックス／ビオウィッタッカー（Ｃａｍｂｒｅｘ／Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ），ヴェルヴィエールズ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ）社より提供）はＴ１８０型フラスコに１ｃｍ２当たり５０００個の細胞を３０００倍にした場合、８０％に届くまで培養した。培養した細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、１０５０μｌのＳＶ  ＲＮＡ緩衝溶液をＴ１８０型フラスコに入れて採取した。集めたＲＮＡをＳＶ総合ＲＮＡ分離システム（プロメガ社製、カタログ番号Ｚ３１００）を用いて調整した。集めたＲＮＡの濃度はリボグリーンＲＮＡ定量キット（オランダ、ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）のモルキュラーｐローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）社のカタログ番号Ｒ−１１４９０）で測定する。ｃＤＮＡ合成は、１反応当たり４０ｎｇのＲＮＡを使ってタックマン（ＴａｑＭａｎ）ユニバーサルＰＣＲ、Ｎｏ  ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧ、キット（英国ワーリントンのアップライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社、部品番号４３２４０１８）を用いて行った。各ＲＴ反応は陰極ＲＴ反応（ネガティブコントロール：この反応における酵素はない）で行った。
【００９０】
リアルタイム逆転写酵素（ｒｔＲＴ）−ＰＣＲ反応を、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（英国ワーリントンのアップライドバイオシステムズ社、部品番号４３０９１５５）中で、ｃＤＮＡ及び陰性逆転写酵素の両方に関連する遺伝子特殊プライマを用いて行った。発現レベルの普遍化では、ＲＴ−ＰＣＲ反応をヒトβ−アクチンキット（英国ワーリントンのアップライドバイオシステムズ社、部品番号４３１０８８１Ｅ）を用いたヒトβ−アクチンについて行った。その後のプログラムではリアルタイムＰＣＲ装置（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出システム）で、２５℃で１０分、４８℃で３０分、９５℃で５分の条件で行った。図７（Ａ）と図８において、１０個の遺伝子の発現レベルがＭＰＣとｈＯＢの分離の異性体のそれぞれについて示されている。図７（Ａ）のデータでは、合計されたＲＮＡを４種のＭＰＣ異性体から抽出し、目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡを経て同定された目標遺伝子の発現レベルを分析するのに用いた。ｒｔＲＴ−ＰＣＲ共用プライマセットを１０個の遺伝子に伝達し、β−反応の発現レベルと比較した。データはＹ軸について−ｌｏｇ（β−アクチンの微分値）として示されている。図８に示したデータは２種の別個のｈＯＢ異性化体から抽出した。
【００９１】
＜Ａｄ‐ｓｉＲＮＡによる目標遺伝子発現のノックダウン分析のｍＲＮＡのレベルでの証明＞
目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡが対応する遺伝子からノックダウンの発現の結果を決定するために、合計ＲＮＡをＭＰＣに感染したＡｄ−ｓｉＲＮＡから採取し、遺伝子の発現が遺伝子特有のプライマを用いて分析した。
【００９２】
ＭＰＣを、２４枚のウェルプレートに１枚当たり２５０００個となるように注入した。２４時間後、ノックダウンヒットウィルス、或いは骨遺伝子に関連しない発光酵素とＰＰＡＲγ（４つの公知のスプライス変形物）の発現を停止させたネガティブコントロールウィルスのＡｄ−ｇＰＰＡＲｇ及びＡｄ−ＧＬ２．２に細胞を感染した。Ａｄ−ｓｉＲＮＡにおいては、Ａｄ−ｈＣＡＲとＡｄ−ｓｉＲＮＡの混合溶菌液（ＭＯＩ  Ａｄ−ｈＣＡＲ：７５０；４０，１０，３．３μｌのウィルスでそれぞれ１ｍｌ換算にして２．５×１０９個のウィルスを含んでいる）で、細胞を汚染した。５ｄｐｉで培地を清浄化し、１４ｄｐｉで細胞溶菌液を作った。前項で記述したｍＲＮＡ分析で、細胞群を処理した。特定遺伝子のｍＲＮＡレベルをβ−アクチンレベルで標準化し、ネガティブコントロール型Ａｄ−ｓｉＲＮＡの測定レベルと比較した。３種の分析例を図７Ｂに示した。結果をβ−アクチン発現レベルで標準化し、ネガティブコントロールしたウィルスを感染させたＭＰＣの符号化遺伝子発現レベルと比較した（Ｙ軸：符号化遺伝子の遺伝発現率。１００％＝ネガティブコントロール化試料に存在する符号化遺伝ｍＲＮＡレベル）。
【００９３】
＜内生骨のＡＰ  ｍＲＮＡ対胎盤又は腸由来のＡＰ  ｍＲＮＡの発現上昇比較分析＞
ＢＡＰは、骨組成に関連する物理的に妥当なＡＰである。測定されたＡＰ活性がＢＡＰ発現或いは別のＡＰ遺伝子生成物に基づいて規格向上するかを決定するために、全てのＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルを感染したＭＰＣについて分析した。ｍＲＮＡレベルは前項で説明されている。その違いはプライマセットにある（表２参照）。即ち、ＢＡＰ  ＡＬＰＬ（ヒトアルカリ性ホスファターゼ（肝臓、骨、腎臓由来））のｍＲＮＡ発現を検出している。また、他のセットは３種の遺伝子、つまりＡＰ遺伝子（ＡＬＰＩ（腸由来のヒトアルカリ性ホスファターゼ），ＡＬＰＰ（胎盤由来のヒトアルカリ性ホスファターゼ（ＰＬＡＰ））、ＡＬＰＰＬ２（擬似胎盤型ヒトアルカリ性ホスファターゼ））である。ＡＬＰＩ、ＡＬＰＰ及びＡＬＰＰＬ２はヌクレオチドレベルに近接しており、プライマ対を用いることで拡充できる。
【００９４】
始めに、Ａｄ−ｅＧＦＰ及びＡｄ−ＢＭＰ２で感染させたＭＰＣから分離されたＲＮＡについてプライマ対を有効化した。図９は、Ａｄ−ＢＭＰ２によるＢＡＰ型ｍＲＮＡの強い発現上昇と、他のＡＰ遺伝子発現の発現上昇性の欠損とを示している。Ａｄ−ｅＧＦＰ（ネガティブコントロール）又は骨ジェニックＡｄ−ＢＭＰ２を用いて、２４枚のウェルプレートにＭＰＣを感染させた。細胞を採取し、他の３種のＡＰ遺伝子（ＰＬＡＰ／ＩＡＰ）から派生したＢＡＰ  ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡを拡充するプライマセットを使用してＲＮＡｒｔＲＴ−ＰＣＲに調整した。Ａｄ−ＢＭＰ２は強くＢＡＰ  ｍＲＮＡレベルを上げたが、ほか３種のＡＰ遺伝子のｍＲＮＡレベルは上がらなかった。
【００９５】
両プライマセットとも、ＭＰＣに感染したＡｄ−ｓｉＲＮＡから分離したＲＮＡ中のＡＰ遺伝子全てのｍＲＮＡの測定レベルで使用した。
【００９６】
［実施例６］石灰化
骨遺伝子の工程は、数種の連続した事象から成り立つ。骨遺伝子の開始面では、骨アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）が発現上昇することである。石灰化のような骨遺伝子の後のステージで発生する特別の事象を観測することは重要である。
【００９７】
＜試験片の準備＞
骨遺伝子の工程は、数種の連続した事象から成り立つ。骨遺伝子の開始面の間、骨アルカリ性ホスファターゼ（ＢＡＰ）は発現上昇する。その後、分化の間、石灰化した骨を形成するために、主成分がコラーゲンIのマトリクスに（ハイドロキシ）アパタイト（リン酸カルシウムの沈殿物）を堆積した。石灰化した骨細胞の試験片（ＢＭ片）において、骨髄代替品としてＢＭＰ２（再結合物又はアデノウィルス変換による派生物）を用いて石灰化骨芽細胞に試験管スケールで初期型ヒトＭＰＣを注入した。石灰化は、カルシウムに対し高い親和力を示す染料であるアリザリンレッドに間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を着色することで視覚化した（図１０参照）。
＜スクリーニング及びヒットコーリング＞
以下の最適化プロトコルは最初の試験片を同定したＡｄ−ｓｉＲＮＡ及びＡｄ−ｃＤＮＡの目標物をスクリーニングすることに使用される。
【００９８】
１０％のＦＣＳを含んだ２ｍｌのＭＳＣ培地中に、１枚当たり１００，０００個のＭＰＣを６枚用意する。次の日、それらを１０％の二酸化炭素を充填した３７℃の恒温槽に１日静置した後、それぞれにＡｄＣ１５−ｈＣＡＲ（最終ＭＯＩが７５０），ＡＤ−ｓｉＲＮＡ，Ａｄ−ｃＤＮＡ，或いは最終ＭＯＩが１２５０，２５００，５０００の制御ウィルスを感染させた。そして、１０％の二酸化炭素を充填した３７℃の恒温槽に更に６日間以上静置した。２ｍｌの新しいＭＳＣ培地にウィルスを移した。２２日間の内で、培地を２週間で３回新しくした。他の時間に培地を半分又は完全に新しくした。実験を始めて２８日後、条件の整った培地を取り除き、細胞を１０％のパラホルムアルデヒドを用いて固定処理し、処理した単層を逆浸透水（ｐＨ＝４．２）に溶かした１ｍＬ、〜１％までのアリザリンレッド水溶液（シグマ社、カタログ番号Ａ５５３３）で着色した。伝染率を評価したＡｄ−ｅＧＦＰ、強い骨遺伝誘導因子であるＡｄ−ＢＭＰ２、弱い骨遺伝誘導因子であるＡｄ−Ｈ４−２を、それぞれネガティブ及びポジティブコントロール実験で補足した。いずれの実験もＡｄ−Ｈ４−２が石灰化を誘発せず、完全にその実験が繰り返された。
【００９９】
Ａｄ−ｓｈＲＮＡについても同様の石灰化実験を行い、その結果を表６に示した。
【０１００】
［実施例７］同定した目標物に対する薬の発見
本発明で使用したポリペプチドで化合物をスクリーニングした。ポリペプチドに対する化合物の親和力は、置き換え実験で決定される。このような置き換え実験は当業者に良く知られており、ポリペプチドの同定法においても共通している。
【０１０１】
要約すると、本発明で用いたポリペプチドは、標識（放射線標識、蛍光又は他の認識可能な標識）配位子（ｌｉｇａｎｄ）と一緒に培養させているが、標識配位子はそのポリペプチドを結合する物として知られ標識のない化合物と更に培養される。
【０１０２】
ポリペプチドからの標識された配位子の置き換えは、ポリペプチドと関連している標識配位子の量を測定することによって決定される。ペプチドに関連する標識された配位子の量は非標識化合物の親和力の指標となる。
【０１０３】
ポリペプチドに関連している標識配位子の量は、ＩＣ５０値を算出する未標識化合物の濃度をプロットして得られる。この値は目標、つまり本発明のポリペプチドに対する未標識化合物の結合親和力を表す。
【０１０４】
化合物は、ＩＣ５０がナノグラム分子又はピコグラム分子単位のとき強い接合能となる。ＩＣ５０が少なくとも１０μモル或いは良くてもナノモル又はピコモルの範囲の化合物は、ＢＡＰ及び／又は骨芽細胞マーカ及び骨芽細胞機能を誘導する効果を決定する試験片のいずれかに適応される。ＩＣ５０がより低いときの化合物は、一般的に重要性が低い。本発明のポリペプチドは、細胞や細胞断片、或いは生理学的に純粋なタンパク質に依存する。このような調整法は、別の違った試験方法として当業者に公知である。
【０１０５】
［実施例８］破骨細胞片；同定目標物の反再吸収活性の検査
生命の始めから終わりまで、骨格は常に再生の繰り返しである。骨について重要な作用は分裂した骨髄による再吸収であり、骨芽細胞を鋳型とした骨で再生することである。骨粗鬆症を治療する方法は、分裂仲介している骨の再吸収を増加させることで、破骨細胞と骨芽細胞の間のバランスを最小化することである。
【０１０６】
破骨細胞は細胞の単一サイト又はマクロファージから広がっていく。生体内では、破骨細胞前駆体の分化は、ストラーマ細胞（ＭＰＣｓ）によって発現された２つの中心因子によって制御されている。即ち、ＮＦκＢ配位子（ＲＡＮＫＬ）のレセプタ活性化体と骨プロテゲリン（ＯＰＧ）とである。ＲＡＮＫＬは、破骨細胞の分化を促すＭＰＣの界面に発現された膜の配位子である。ＯＰＧは、活性化ＲＡＮＫＬを捕捉して破骨細胞の分化を阻害するＲＡＮＫＬに溶解したおとり型レセプタである。ＭＰＣによるＲＡＮＫＬとＯＰＧの発現のバランスは破骨細胞の分化のレベルを決定する。
【０１０７】
ＭＰＣが破骨細胞の分化を制御するとき、破骨細胞の分化又は活性における目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡの同定の効果を知ることが重要である。破骨細胞の分化と活性が減少した目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡは非常に価値があり、これらは２つの機構によって骨の付加の増加を予測している。即ち、骨芽細胞の分化及び活性の増加と、破骨細胞の活性の低下である。そのことは、論文（スィルナヴカラス（Ｔｈｉｒｕｎａｖｕｋｋａｒａｓｕ）ら、２０００年「バイオロジカル  ケミストリ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」誌２７５巻２５１６３‐２５１７２ページ；山田ら、２００３年「血液学」１０１巻２２２７〜２２３４ページ）に掲載されており、分裂因子の効果は予測可能である。
＜破骨細胞分化片＞
破骨細胞の分裂因子の効果を２タイプの試験片によって評価する。
【０１０８】
試験片の最初の準備として、ＭＰＣと初期型ヒト分子細胞を共に混合した培地を用意した。破骨細胞遺伝子を手助けするノックダウンウィルスに汚染されたＭＰＣ単層の効果を評価する。期待している効果は、次のような効果である。即ち、ＭＰＣ中におけるＡｄ−ｓｉＲＮＡ目標遺伝子発現のノックダウンが、例えば１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２ｖｉｔＤ３と５０ｎＭのＭ−ＣＳＦの混合物が引き起こす物理的な誘引によって稼動された破骨細胞の分化を阻害することである。使用されたモノサイトを、骨髄又は末梢血液から導入することができる。本例では、分子細胞（ＰＢＭＣ）を導入する末梢血液を基盤とした分化実験を説明する。ＭＰＣ（ベルギー、キャンブレックス／ビオウィッタッカー（Ｃａｍｂｒｅｘ／Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｃｋｅｒ）社、ヴェルヴィエールズ（Ｖｅｒｖｉｅｒｓ））を、１０％のＦＢＳを与えたα−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ−ＬＩＦＥ  テクノロジー社）中の９６枚のウェルプレート（１ウェル当たり１０００個の細胞）に注入した。１日後これらを目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡに感染させた。少なくとも３日後、プレート１枚当たり１００００個のＰＢＭＣをＭ‐ＣＳＦ（アール  アンド  ディー（Ｒ＆Ｄ）システムズ社、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ）と共に注入した。培地の半分の量を、１週間２回にわたって５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと１０ｎＭの１．２５（ＯＨ）２ｖｉｔＤ３で清浄にした。培養地にＰＢＭＣを添加してから１４日後に解読を行った。物理的誘引関連混合物による自発的破骨細胞の分化は、多面的な解読によって評価される。ウェル当たりの多核細胞ＴＲＡＰポジティブ数の微視的評価を、破骨細胞分化のレベルで測定する。「ＴＲＡＰポジティブ」は、細胞が酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を持ち合わせていることを意味している。これを評価することは、この共培養が酸ホスファターゼ検出キット（シグマ社製、３８６−Ａ）によって生体内ＴＲＡＰ着色が説明される。正極細胞は、処理すると紫色になる。代替で解読するときには、熟した破骨細胞のマーカ特異性を以下のようなもので識別する。例えばＴＲＡＣＰ５ｂ（酒石酸耐性酸性ホスファターゼ５ｂタイプ）、カルシトニンレセプタ（ＣＴＲ）又はキャセプシンＫ（ＣＴＳＫ）である。超自然的に共培養した破骨細胞運搬型酒石酸耐性酸性ホスファターゼタンパク質（ＴＲＡＣＰ５ｂ）の量測定を、市場で価値あるＥＬＩＳＡ（骨ＴＲＡＰ断片、フィンランド、ツルクのスバ  サイエンシズ（Ｓｂａ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社）で行った。ＣＴＲ又はＣＴＳＫは、以下の一般的なプロトコルの応用に基づく免疫細胞化学によって検知した。培地を動かし、共培養体を４％のパラホルムアルデヒドと０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で４℃、３０分間なじませ、ブロッキング緩衝溶液（ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した後、少なくとも４時間反応させた。ブロッキング緩衝溶液を取り除き、キャセプチンＫ（発ガン遺伝子ＩＭ５５Ｌ）或いはカルシトニンレセプタを別の緩衝溶液（例えば０．０５Ｍトリス塩酸塩水溶液、ｐＨ７．４、１％ＢＳＡ含有）に溶かしたものに対する初期抗体をウェルに補足した。４℃で一晩中静置した。混合物を取り除く際、細胞をＰＢＳと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の混合液で洗浄し、第一抗体を同じ緩衝溶液で薄めた第二抗体の共役体であるＨＲＰを単離し、加えた。少なくとも４時間静置の後、ＰＢＳと０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の混合液で洗浄し、ルミノール（蛍光信号を与えるＨＲＲ用基質。ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質［ＰＯＤ］（ルミノール）、ローチェ  ダイアグノスティック（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）社、カタログ番号１５８２９５０）を加えた。５分間の静置後、ルミノメータ（ルミノスカン上昇、ラブシステム（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ）社）で解読を行った。説明した２つの試験片（多核細胞の量の評価と破骨細胞特殊マーカ検知のための免疫化学）は、骨髄分裂前の単核細胞分化の評価が許諾されたものであるが、破骨細胞の骨再吸収活性については認められない。
【０１０９】
破骨細胞の活性をくぼんだ形の試験片で測定した。この実験の目的は、共培養と細胞の感染を、骨擬似基質が、共培養が実施されるウェルの底部に存在する差異をもって記述されている試験片のために行うことにある。この骨擬似基質は象牙質（例えばカミヤ製薬製）、或いは試験的に得られたそれ相当の物質（炭酸カルシウム被膜、ＯＡＡＳ（商標）、ゲンタウアー（Ｇｅｎｔａｕｒ）社；バイオコート（商標）、オステオロジック（商標）、ビーディー  バイオサイエンス社）である。共培養を、その骨擬似基質で少なくとも１４日間行う。細胞を次亜塩素酸ナトリウムで処理し、破骨細胞（再吸収ピット）を再吸収した範囲は微視的に認められる。このことは、象牙質がトルイジンブルーに着色することで判明する。
【０１１０】
第二の実験は破骨細胞に向かう分化の可能性があるヒットウィルスを伴った破骨細胞前駆体細胞（ＰＢＭＣ又はＢＭＭＣ）の汚染効果を単一培地で測定することである。この目標のために、モノサイト（ＰＢＭＣ又はＢＭＭＣ）を、１０％の血清と２５ｎｇ／ｍｌの再生Ｍ−ＣＳＦ（アール  アンド  ディー  システムズ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）社）を加えたα−ＭＥＭ培地中の３８４枚のウェルプレートに植え付けた。１日後、細胞を目標Ａｄ−ｓｉＲＮＡに感染させた。感染４日後、再生ＲＡＮＫＬをウェル（２５ｎｇ／ｍｌ、アール  アンド  ディー  システムズ社）に加えた。培地を１週間に２回清浄化した。ＲＡＮＫＬを加えて１４日後、破骨細胞への分化を第一実験の試験片同様に解読した。この実験は、Ｍ−ＣＳＦ又はＲＡＮＫＬに対する破骨細胞前駆体細胞の応答の必要性をもつ因子の同定法を示すものである。
＜ＰＢＭＣ分離＞
以下のプロトコルに事前説明済みの患者から得た末梢血液からＰＢＭＣを取り出す。血液を無菌状態で５０ｍｌのファルコンチューブに注ぎ、２５℃１０分間で３０００回転させた。その緩衝被覆を集め、緩衝被覆と同量のＰＢＳで薄めた。その緩衝被覆を５０ｍｌのファルコンチューブにリンパ液（シグマ社）を２０ｍｌ注いだ。遠心分離（２５℃で３５分４００回転）を行い、リンパ液上の単核細胞の白い層を集めてＰＢＳ（２５℃で１０分間２００回転）で２回洗浄し、７ｍｌのＰＢＳで薄めた。この溶液を１５ｍｌのファルコンチューブで成る超浸透濾過勾配に７ｍｌ注ぎ、２５℃、３５分間４００回転で遠心分離を行った。超浸透濾過勾配は、以下のようにして作成される。即ち、１．５Ｍの塩化ナトリウム溶液を１として、９倍のパーコール（ファーマシア製、ｄ＝１．１３０ｇ／ｍｌ）を混合する。この混合物と１：１になるように、ＰＢＳ／クエン酸緩衝溶液（リン酸二水素ナトリウム１．４９ｍＭ，リン酸水素ナトリウム９．１５ｍＭ，クエン酸ナトリウム１３ｍＭ，ｐＨ７．２）を加える。遠心分離後、単核細胞はこのプローブでは球に形成される。細胞は実験片の中で用い始める。
【０１１１】
［実施例９］停止目標物のノックダウン効果の分析
ｓｉＲＮＡは、近年の発見や機構の理解を介して遺伝子発現のノックダウン効果を使っている。ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの配列の特定アニーリング法が遺伝子特定‘オンターゲット’ノックダウンに対して応答可能であることは、一般的に受け入れられている。しかしながら、ｓｉＲＮＡと別のｍＲＮＡの間の制限されたミスマッチが、遺伝子発現の‘オフターゲット’を誘発するということは得るものではない。
【０１１２】
‘オフターゲット’ｍＲＮＡのノックダウンが破骨細胞効果を観測可能に応答することを排除するために、厳格な尺度を用いて石灰化（実施例６）を誘発する３８個のターゲットのために付加的なｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡを設計した。付加的なｓｈＲＮＡをＢＡＰ試験片中で検査した。
【０１１３】
可能なオフターゲット効果の問題に取り組むために、付加的なｓｉＲＮＡが元のｓｉＲＮＡによってターゲットとされたｍＲＮＡを完璧に整列させるように設計した。好ましいｓｉＲＮＡの配列は、別のｍＲＮＡを整列させない。しかしながら、ｓｉＲＮＡのみのいくつかの事例を、ｍＲＮＡとオーバーラップさせる設計は可能である。ｓｉＲＮＡが‘オフターゲット’ｍＲＮＡ（１９ｍｅｒのポジションごとにチェックされた２塩基対の非同一性最大値）の最小値を整理するには、以下の規則が適用される。即ち、噂の‘オフターゲット’ｍＲＮＡは原型ｍＲＮＡから同定されたものは、一線を画し、また噂の‘オフターゲット’ｍＲＮＡは全て原型の目標ｓｉＲＮＡから同定されたものは、一線を画す。この規則の例外は、ＰＰＩＡから設計されたｓｉＲＮＡについてである。
【０１１４】
３８種の選択された目標遺伝子のそれぞれについては、再構成するアデノウィルスを運ぶために７種の付加的なｓｉＲＮＡを設計して調整した。全てのｓｉＲＮＡを同定の証明をしたり、オリゴヌクレオチドの合成をエラーから守ったりするためにクローニング配列した。
【０１１５】
２６１種のＡｄ−ｓｈＲＮＡを定量的に発生させ、原型３８種Ａｄ−ｓｈＲＮＡと平行して、２つの独立した実験中の３ＭＯＩのＢＡＰ試験片中で試験した。
【０１１６】
設計ｓｈＲＮＡ（Ａｄ−ｓｈＲＮＡ）を符号化した再生アデノウィルスを生産し、圧力をかけ、９６枚のプレートを分割し、−８０℃で保管した。これらのプレートを、次のように初期型ＢＡＰ試験片として用いた。
【０１１７】
ＭＰＣ細胞を１枚当たり５００個の細胞が入るようにマルチドロップ３８４（ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）社）と黒で下部が透明の３８４枚のウェルプレート（コースタ型又はヌンク型）に、１０％の牛の胎児血清（オランダ、プロゲンティックス（Ｐｒｏｇｅｎｔｉｘ）社）を含んだＭＳＣ培地６０μｌと一緒に注入した。１日後、そのうちの分割したＡｄ−ｓｈＲＮＡで成る９６枚のプレートと正負極の制御ウィルスを修復し、ウィルス分割はＭＰＣプレートによって変換した。制御プレートにおいて、１μｌのウィルスストック（１ｍｌ換算で２×１０９個のウィルスを平均力価とする）を３８４種のスクリーニング版に移した。制御プレート上で（図３参照）、負極（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３）と正極（Ｐ１，Ｐ２）の制御ウィルスを散布した。ここで、Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３は、おのおのｅＧＦＰを目標としたＡｄ−ｓｉＲＮＡ、マンノース−６−リン酸レセプタ、発光酵素のｍＲＮＡを示す。また、Ｐ１，Ｐ２はおのおのＰＲＫＣＮ（Ｈ２４−０１０）を目標としたＡｄ−ｓｉＲＮＡ、ＭＰＰ６（Ｈ２４−０１１）である。Ｐ３はｅＧＦＰの過表示をしたＡｄ−ｅＧＦＰである。
【０１１８】
Ａｄ−ｓｈＲＮＡを１２０００、４０００、１３３３の３種のＭＯＩにスクリーニングした。Ａｄ−ｓｈＲＮＡを９６種のプレートに１．５×１０９／４μｌの力価とその１／３，１／９に薄めたものを分割した（図１１）。結果が出た３つのプレートにＭＳＣを注入した３×３８４種のプレートに感染させるために用いた。制御プレートから発生したウィルスをＡ２とＢ１の位置に滴下した。
【０１１９】
次に、ヒトコクサッキーウィルスを発現したアデノウィルスとアデノウィルスレセプタ（ｈＣＡＲ）の混合物５μｌを９６個のＶ型プレートから１５５の最終ＭＯＩを持つプレートに移し変えた。
【０１２０】
そのプレートを、１０％二酸化炭素を充填した３７℃の恒温槽で４日間静置した。４日後、アデノウィルスを含んだ培地を、新鮮な無菌の１０％ＦＣＳを含むＭＳＣ培地６０μｌに移した。それから９日後、培地を取り除き、４−メチルウンベリフェリルリン酸（シグマ社、カタログ番号．Ｍ３１６８）１５μｌをおのおののウェルにいれ、ＡＰ活性によって自由になった４−メチルウンベリフェロンの蛍光を蛍光度計（極大波長３６０ｎｍ、発光波長４４０ｎｍ）で３７℃１５分間静置して測定した。
【０１２１】
全てのＡｄ−ｓｈＲＮＡウィルスを、２つの独立したスクリーンに３種のＭＯＩに重複させてスクリーニングした。しきい値は全てのネガティブコントロールがスクリーニング球（‘ｇｌｏｂａｌ’全体的な分析）、或いはスクリーニングプレート（‘ｌｏｃａｌ’局所的な分析）のいずれかを用いてヒット衝動で計算した。しきい値はネガティブコントロールの標準偏差の３倍平均値よりも高い値のＢＡＰシグナルに設定した。このバッチにおけるおのおののウィルスの２点は依存されずに分析された。ヒットはＡｄ−ｓｈＲＮＡがしきい値より上の２スクリーンの１つに少なくとも１つのＭＯＩが重複してプレートならば選択される（表３参照）。
【０１２２】
６１種のｓｉＲＮＡの標識した３２中心を同定したデータの全体的な分析と、８４種のｓｉＲＮＡの標識した３５中心を同定したデータの局所的な分析である。３８種の選択した遺伝子の正体をＢＡＰ試験片に打ち込んだｓｉＲＮＡの最終数と共に表１に示す。表１ではその数が原型の３８種のｓｉＲＮＡを含んだＢＡＰ試験片を点数付けした全てのｓｉＲＮＡを示している。全体的又は局所的な分析の基盤となっているのは、２．６１と３．２１の構成物の平均値が３８種の有効化目標物おのおのに最終的に同定される。
【０１２３】
全ての３８種の原型ｓｉＲＮＡは全体的と局所的の両方の分析を基盤としてＢＡＰ試験片を点数付ける。
【０１２４】
結果として、３８種の選択されたターゲットを目標化した付加的Ａｄ−ｓｈＲＮＡを設計し組み立てた。制御版で考慮中のネガティブコントロールをヒット衝動のカットオフで決定するのにプレート（局所的）とバッチしたプレート（全体的）を用いた。
【０１２５】
全体的な分析は、３８種の認証ターゲットの３２種のＢＡＰ試験片の正極にスコアした６１種のウィルスが導き出された。局所的な分析は、３８種の認証ターゲットの３５種のＢＡＰ試験片の正極にスコアした８４種のウィルスが導き出された。３８種の原型Ａｄ−ｓｈＲＮＡウィルスの全てをＢＡＰ試験片で順番つけたのは、全体的又は局所的な分析法を用いたときである。ターゲットＬＯＣ１６０６６２とＰＰＩＡとＳＬＣ３９Ａ４は局所的な分析のみで同定される。
【０１２６】
【表１】
2007516714.tif 000003
表１の左側の列は遺伝子特有のプライマを示す。２番目はそのプライマがセンス（Ｆｏｒと示す）型かアンチセンス（Ｒｅｖと示す）型かを示している。３列目はプライマの核酸塩基配列である。
【０１２７】
【表２】
2007516714.tif 000004
【０１２８】
【表３】
2007516714.tif 000005
【０１２９】
【表４】
2007516714.tif 000006
2007516714.tif 000007
2007516714.tif 000008
2007516714.tif 000009
2007516714.tif 000010
2007516714.tif 000011
2007516714.tif 000012
2007516714.tif 000013
2007516714.tif 000014
【０１３０】
【表５】
2007516714.tif 000015
2007516714.tif 000016
2007516714.tif 000017
2007516714.tif 000018
【０１３１】
【表６】
2007516714.tif 000019
2007516714.tif 000020
2007516714.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】膜内部と軟骨内部の骨化を示す図である。
【図２】骨芽細胞の分化試験の原理を示す図である。
【図３】９６種のノックダウン制御プレートのレイアウト図である。
【図４】３８４種の制御プレートのレイアウト図である。
【図５】ＡＰ試験中のノックダウン制御プレートの挙動を示す図である。
【図６】静的スクリーニングの列データを示すプロット図である。
【図７】ＭＰＣの目標表示の輪郭（Ａ）とＡｄ−ｓｉＲＮＡによる遺伝子表示の分解（Ｂ）を示す図である。
【図８】初期型ヒト骨芽細胞の目標表示の輪郭を示す図である。
【図９】ＢＡＰ−ｍＲＮＡ対ＰＬＡＰ又はＩＡＰ−ｍＲＮＡの発現上昇の解析図である。
【図１０】石灰化試験の結果を示す図である。
【図１１】３種のＭＯＩにおけるＡｄ−ｓｈＲＮＡをスクリーニングするための滴下試験を示す図である。
【図１】
2007516714.tif 000022
【図２】
2007516714.tif 000023
【図３】
2007516714.tif 000024
【図４】
2007516714.tif 000025
【図５】
2007516714.tif 000026
【図６】
2007516714.tif 000027
【図７Ａ】
2007516714.tif 000028
【図７Ｂ】
2007516714.tif 000029
【図８】
2007516714.tif 000030
【図９】
2007516714.tif 000031
【図１０】
2007516714.tif 000032
【図１１】
2007516714.tif 000033
【国際調査報告】
2007516714.tif 000034
2007516714.tif 000035
2007516714.tif 000036
2007516714.tif 000037
2007516714.tif 000038
2007516714.tif 000039