(57)【要約】  本発明は、慢性リンパ球性白血病を治療する医薬品の調製における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
慢性リンパ球性白血病を治療する医薬品の調製における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用。
【請求項２】
慢性リンパ球性白血病が、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
慢性リンパ球性白血病が、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）である請求項１に記載の使用。
【請求項４】
慢性リンパ球性白血病が、突然変異ＡＴＭに関連する請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
慢性リンパ球性白血病が、突然変異ＴＰ５３に関連する請求項１から４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
ロスコビチンが、抗アポトーシス遺伝子の発現をダウンレギュレートする請求項１から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
抗アポトーシス遺伝子が、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２及びＭａｄ３からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含む請求項６に記載の使用。
【請求項８】
ロスコビチンが、ＤＮＡ修復遺伝子の発現をダウンレギュレートする請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
ＤＮＡ修復遺伝子が、ＰＣＮＡ又はＸＰＡを含む請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
ロスコビチンが、転写調節に関与する遺伝子の発現をダウンレギュレートする請求項１から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
転写調節に関与する遺伝子が、ＰｏｌII、ｅＩＦ−２、４ｅ及びＥ２Ｆからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含む請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩が、Ｍｃｌ−１の発現をダウンレギュレートするのに十分な量である請求項１から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
ロスコビチンが、薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わせて投与される請求項１から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
ロスコビチンが、１種又は複数のその他の抗増殖剤と組み合わせて投与される請求項１から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
ロスコビチンが、少なくとも１種のＣＤＫ酵素を阻害するのに十分な量で投与される請求項１から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
ＣＤＫ酵素が、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９から選択される請求項１から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
ＣＤＫ酵素が、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２から選択される請求項１５又は請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ＣＤＫ酵素が、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９から選択される請求項１５又は請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
治療有効量のロスコビチン又は薬剤として有効なその塩を投与することを含む、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）に罹患している患者を治療する方法。
【請求項２０】
ロスコビチンが、抗アポトーシス遺伝子の発現をダウンレギュレートする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗アポトーシス遺伝子が、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２及びＭａｄ３からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ロスコビチンが、ＤＮＡ修復遺伝子の発現をダウンレギュレートする請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ修復遺伝子が、ＰＣＮＡ又はＸＰＡを含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ロスコビチンが、転写調節に関与する遺伝子の発現をダウンレギュレートする請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
転写調節に関与する遺伝子が、ＰｏｌII、ｅＩＦ−２、４ｅ及びＥ２Ｆからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
慢性リンパ球性白血病細胞の抗アポトーシス遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、その細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法。
【請求項２７】
対象の慢性リンパ球性白血病を治療する方法であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、対象の抗アポトーシス遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項２８】
抗アポトーシス遺伝子が、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２又はＭａｄ３を含む請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
慢性リンパ球性白血病細胞のＤＮＡ修復遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、その細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法。
【請求項３０】
対象の慢性リンパ球性白血病を治療する方法であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、対象のＤＮＡ修復遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項３１】
ＤＮＡ修復遺伝子が、ＰＣＮＡ又はＸＰＡを含む請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
慢性リンパ球性白血病細胞の転写調節に関与する遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、その細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法。
【請求項３３】
対象の慢性リンパ球性白血病を治療する方法であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、対象の転写の調節に関与する遺伝子をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項３４】
転写の調節に関与する遺伝子が、ＲＮＡ  ＰｏｌII、ｅＩＦ−２、４ｅ及びＥ２Ｆからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子である請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
慢性リンパ球性白血病が、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）である請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
慢性リンパ球性白血病が、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）である請求項１９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
慢性リンパ球性白血病が、突然変異ＡＴＭに関連する請求項１９から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
慢性リンパ球性白血病が、突然変異ＴＰ５３に関連する請求項１９から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ロスコビチンが、少なくとも１種のＣＤＫ酵素を阻害するのに十分な量で投与される請求項１９から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
ＣＤＫ酵素が、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９から選択される請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＣＤＫ酵素が、ＣＤＫ１及びＣＤＫ２から選択される請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＣＤＫ酵素が、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９から選択される請求項３９又は請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ロスコビチンが、薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤からなる群から選択される少なくとも１種の添加剤と組み合わせて投与される請求項１９から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ロスコビチンが、少なくとも１種の抗増殖剤と組み合わせて投与される請求項１９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩、及び薬剤として許容される担体を含む、慢性リンパ球性白血病の治療で使用する薬剤組成物。
【請求項４６】
慢性リンパ球性白血病が、Ｔ細胞前リンパ球性白血病である請求項４５に記載の薬剤組成物。
【請求項４７】
慢性リンパ球性白血病が、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病である請求項４５に記載の薬剤組成物。
【請求項４８】
希釈剤又は賦形剤をさらに含む請求項４５から４７のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
【請求項４９】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病細胞でのＭｃｌ−１の発現をダウンレギュレートする方法であって、前記細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法。
【請求項５０】
対象のＢ細胞慢性リンパ球性白血病を治療する方法であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、前記対象のＭｃｌ−１の発現をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む方法。
【請求項５１】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病を治療する医薬品の調製における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩が、Ｍｃｌ−１の発現をダウンレギュレートするのに十分な量である使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリン及び薬剤として許容されるその塩の治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期において決定的な調節の役割を果たすセリン／スレオニンキナーゼである。ＣＤＫは、転写因子及び腫瘍抑制タンパク質を含む、ＤＮＡ複製及び細胞分裂に関与する種々のタンパク質のリン酸化によって細胞周期の進行を調節する５。あるＣＤＫはまた、ＲＮＡポリメラーゼII（ｐｏｌII）の最大サブユニットのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）のリン酸化に関与することによってＲＮＡ合成の調節において役割を果たす。したがって、ＣＤＫが魅力的な治療標的となったことは当然である。その結果、ＡＴＰ結合部位のために競合することによってＣＤＫの活性を妨げることが可能な多くの新規な薬理学的な薬剤が、臨床試験で現在試験されている６。
【０００３】
従来技術は、サイクリン依存性キナーゼを阻害することによって細胞周期を調節することが可能ないくつかの化合物を記載している。これらの化合物には、ブチロラクトン、フラボピリドール及び２−（２−ヒドロキシエチルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−メチルプリン（オロモウシン）がある。オロモウシン及び関連の化合物は、ｃｄｃ２の阻害剤であることが示されている。ｃｄｃ２（ｃｄｋ１としても知られる）は、細胞周期の調節に関与するサイクリン依存性キナーゼのファミリーの酵素サブユニットである。
【０００４】
これらのキナーゼは、少なくとも２つのサブユニット、即ち酵素サブユニット（このｃｄｃ２はプロトタイプである）及び調節サブユニット（サイクリン）を含む。ｃｄｋは、サイクリンファミリー：サイクリンＡ（ｃｄｃ２、ＣＤＫ２）、サイクリンＢ１〜Ｂ３（ｃｄｃ２）、サイクリンＣ（ＣＤＫ８）、サイクリンＤ１〜Ｄ３（ＣＤＫ２−ＣＤＫ４−ＣＤＫ５−ＣＤＫ６）、サイクリンＥ（ＣＤＫ２）、サイクリンＨ（ＣＤＫ７）のメンバーと一過性に会合することによって調節される。
【０００５】
これらの複合体のそれぞれは、細胞周期のある期に関与している。ＣＤＫ活性は、翻訳後の修飾、他のタンパク質との一過性の会合、及びそれらの細胞内局在化の改変により調節される。ＣＤＫ調節因子は、活性化物質（サイクリン、ＣＤＫ７／サイクリンＨ、ｃｄｃ２５ホスファターゼ）、ｐ９ＣＫＳ及びｐ１５ＣＤＫ−ＢＰサブユニット、及び阻害タンパク質（ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、ｐ１５ＩＮＫ４Ｂ、ｐ２１Ｃｉｐ１、ｐ１８，ｐ２７Ｋｉｐ１）を含む。
【０００６】
現在、ＣＤＫ及びそれらの調節タンパク質がヒトの腫瘍の発生において重大な役割を果たしているという仮説には、文献にかなりの支持がある。したがって、多くの腫瘍では、サイクリン依存性キナーゼの一時的な異常発現及びタンパク質阻害剤の主要な調節解除（突然変異、欠失）が観察されている。
【０００７】
ロスコビチンは、サイクリン依存性キナーゼ酵素、特にＣＤＫ２の強力な阻害剤であることが立証されている。ＣＤＫ阻害剤は、細胞周期のＧ１／Ｓ及びＧ２／Ｍ期から細胞が通過するのを阻止すると理解される。ロスコビチンの純粋なＲ−エナンチオマー、ＣＹＣ２０２（Ｒ−ロスコビチン）は、種々の腫瘍細胞におけるアポトーシスの強力な誘発物質として最近出現し７、既に、乳癌及び非小細胞肺癌を治療するための臨床試験中である６。ロスコビチンはまた、網膜芽細胞腫リン酸化の阻害剤であることが示されており、したがってＲｂ陽性腫瘍により強力に作用すると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
今回、ロスコビチンは、これまで治療が特に難しかったある種の増殖性障害の処置における治療用途を有することが認められた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様は、慢性リンパ球性白血病を治療する医薬品の調製における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。
【００１０】
本発明の第２の態様は、治療有効量のロスコビチン又は薬剤として有効なその塩を投与することを含む、慢性リンパ球性白血病に罹患している患者を治療する方法に関する。
【００１１】
本発明の第３の態様は、慢性リンパ球性白血病細胞の抗アポトーシス遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、その細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法に関する。
【００１２】
本発明の第４の態様は、対象の慢性リンパ球性白血病を治療する方法であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、対象の抗アポトーシス遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む方法に関する。
【００１３】
本発明の第５の態様は、慢性リンパ球性白血病細胞のＤＮＡ修復遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、その細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法に関する。
【００１４】
本発明の第６の態様は、対象の慢性リンパ球性白血病を治療する方法であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、対象のＤＮＡ修復遺伝子の発現をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む方法に関する。
【００１５】
本発明の第７の態様は、慢性リンパ球性白血病細胞の転写調節に関与する遺伝子の発現をダウンレギュレートする方法であって、その細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む方法に関する。
【００１６】
本発明の第８の態様は、対象の慢性リンパ球性白血病を治療する方法であって、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、対象の転写の調節に関与する遺伝子をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む方法に関する。
【００１７】
本発明の第９の態様は、（ｉ）ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩；及び場合により（ii）薬剤として許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、慢性リンパ球性白血病の治療で使用する薬剤組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上記の通り、本発明は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の治療におけるロスコビチンの使用に関する。
【００１９】
ロスコビチン又は２−［（１−エチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンは、２−（１−Ｄ，Ｌ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミン−９−イソプロピルプリンとしても記載されている。本明細書の使用では、用語「ロスコビチン」は、分割したＲ及びＳエナンチオマー、その混合物及びそのラセミ化合物を包含する。
【００２０】
本明細書の使用では、用語「ＣＹＣ２０２」は、ロスコビチンのＲエナンチオマー、即ち２−（１−Ｒ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリンを指し、その構造を以下に示す。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
ロスコビチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を以下に示す。
【００２３】
［表］
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【００２４】
抗増殖剤としてのロスコビチンの使用は当技術分野で知られているが、治療が特に難しいことが知られ、従来の治療に対してしばしば抵抗性のＣＬＬの治療に有効であろうという示唆はこれまでなかった。
【００２５】
治療活性
本発明の実施形態すべてについて、ロスコビチンは、Ｒエナンチオマーの形態、即ち２−（１−Ｒ−ヒドロキシメチルプロピルアミノ）−６−ベンジルアミノ−９−イソプロピルプリン（以下、「ＣＹＣ２０２」と呼ぶ）であることが好ましい。
【００２６】
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）
慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）は、障害の攻撃性に関連する、Ｂ細胞及びＴ細胞の異なる成熟状態を特徴とする不均質な疾患の群である。この障害は、免疫学的に未熟で機能的に不全な小リンパ球のクローン増殖を特徴とする。ＣＬＬは、独立した種類に通常分類され、典型的な及び混合タイプのＢ細胞慢性リンパ球性白血病、Ｂ細胞及びＴ細胞前リンパ球性白血病、有毛状細胞性白血病及び有毛状細胞性変異型、循環する絨毛リンパ球を有する脾リンパ腫、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫症候群、並びにＢ細胞及びＴ細胞両方の悪性リンパ腫の白血病相がある。
【００２７】
ＣＬＬの治療は一般に個別化されている。疾患の進行が遅い老年の患者には、特別な治療は不要である。しかし、疾患がより進行した又は疾患の経過がより速いその他の患者の生存率の中央値は２年未満である。したがって、何らかの治療をすべきである。患者の大部分は中間の予後を有し、数年は治療なしで適度にうまく生活するが、いずれは何らかの治療が必要である。
【００２８】
今日まで、ＣＬＬの典型的な治療には、クロラムブシル、化学療法剤の投与が伴ってきた。併用化学療法は一般に、進行した症例にのみ使用されている。放射線療法は、特に脾臓肥大が存在し、骨髄移植が若い患者で成功した場合に効果的に使用されてきた［Foon et al., Leukemia 6 (Supp. 4):26-32, 1992]。米国特許第５４５５２８０号は、治療有効量のβカロテンを使用するＣＬＬの治療方法を提案している。より最近では、ヌクレオシドフルダラビン、フッ素化アデニン類似体及び２−クロロデオキシアデノシン、デオキシアデノシン類似体が有効であることが分かった。この類似体は両方とも脱アミノ化に抵抗性である［Keating et al., Leukemia 6 (Supp. 4):140-141, 1992］。これらの療法はすべて、悪性細胞の除去（移植の場合、置換）に焦点をあてている。しかし、ＣＬＬは、依然として治療が特に難しい障害である。
【００２９】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）
好ましい一実施形態では、本発明は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病の治療における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。
【００３０】
Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）は、西洋社会で最も普通の白血病であり、今日まで不治である。この疾患の経過は様々であり、ある割合のＢ−ＣＬＬは、共通のＤＮＡ損傷反応経路で機能するＡＴＭ又はＴＰ５３遺伝子のいずれかの突然変異のために悪い臨床転帰を有する。
【００３１】
Ｂ−ＣＬＬは、形態学的には成熟しているが、生物学的には未成熟と思われるＢリンパ球の増殖及び蓄積を特徴とする。ＢＣＬＬは通常、進行が遅い新生物であり、数年の生存率が期待できる。Ｂ−ＣＬＬは通常、５０歳を超えた人に発症する。この障害は西洋諸国の白血病の３０％を占め、米国だけで年間１００００人の新たな症例が診断されている。
【００３２】
Ｂ−ＣＬＬ細胞の特有の表現型は、ＣＤ５の発現、疾患を診断するマーカー、及び少なくとも１種のその他のＢ細胞マーカー（ＣＤ１９、ＣＤ２０又はＣＤ２３）、並びに表面免疫グロブリンの低発現を含み１、これは臓器浸潤すると、リンパ節の腫脹及び肝脾腫大を引き起こす。疾患の進行した段階では、異常なリンパ球で骨髄が占領されると、骨髄不全を引き起こし、貧血及び血小板減少につながる。
【００３３】
ＣＬＬのＢ細胞は、マウス赤血球の受容体、未熟Ｂ細胞のマーカーを有する。この障害では、Ｔ細胞の数の増大及びＴサプレッサー細胞の数の増大が報告されている。典型的には、Ｔヘルパー／サプレッサー比が復元し、サプレッサーＴ細胞が増加し、ヘルパーＴ細胞が減少する。ナチュラルキラー細胞の絶対数も増大していることがある。染色体を分析すると、Ｂ−ＣＬＬを有する患者の臨床データによって供給された情報に加えて、総生存率に関する予後情報が得られる。
【００３４】
この疾患の臨床経過は非常に異なるので、一部の患者では長期間安定であるが、その他の患者では、進行はずっと速い。Ｂ−ＣＬＬの標準的な治療は、クロラムブシルを含み、より最近ではプリン類似体のフルダラビンを含む。しかし、フルダラビンの導入後に総生存率の明らかな増大は観察されておらず、フルダラビンで治療した患者の殆どすべてが結局は再発している２。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、ロスコビチンの細胞障害作用は、正常リンパ球よりもＢ−ＣＬＬ細胞に対して選択的である。
【００３６】
本出願人による研究により、同濃度のＣＹＣ２０２で処置した正常リンパ球も、この薬物の細胞傷害作用に感受性であることが示された。しかし、これらの細胞は、低い細胞傷害反応を示し、これはまた時間の経過と共に遅くなった。したがって、ＣＹＣ２０２は、正常Ｂ細胞と比較して、Ｂ−ＣＬＬ細胞に対して選択的細胞傷害性を示す。ＣＹＣ２０２とのインキュベーション最低６時間後にＢ−ＣＬＬ細胞のアポトーシスが誘発される事実を考慮すれば、用量及びＣＹＣ２０２のｉｎ  ｖｉｖｏ投与の間隔を操作することにより、Ｂ−ＣＬＬ細胞と正常リンパ球との間の反応をさらに区別できよう。実際に、この概念の裏付けとして、ＣＹＣ２０２の低毒性が臨床で既に報告されている７。
【００３７】
Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病
別の好ましい実施形態では、本発明は、Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病の治療における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。
【００３８】
Ｔ細胞慢性リンパ球性白血病（Ｔ−ＣＬＬ）は、ＣＬＬの全症例の５％未満であり、２種類ある。１つの種類は、免疫表現型ＣＤ３＋、ＣＤ４−、ＣＤ８＋、ＨＮＫ−１Ｔを有し、大顆粒リンパ球増加症として知られる。Ｔ−ＣＬＬの第２の形態は、表現型ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８−を有する[Pathology, Second Edition, Emanual Rubin, John L. Farber, p1067]。
【００３９】
大顆粒リンパ球増加症では、腫瘍細胞は大きく、多数のアズール顆粒を有する中程度の量の細胞質を有する。これらのリンパ球はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞集団に関係していると考えられる。症例の８５％では、大顆粒リンパ球増加症は進行が遅く慢性の障害であるが、攻撃的な臨床障害を有するものが少数ある。この疾患は、循環する大顆粒リンパ球の持続性の増加、脾腫及び好中球減少症（その結果の反復性感染症を伴う）を特徴とし、しばしば関節リウマチを伴う。
【００４０】
ＣＤ４＋  Ｔ−ＣＬＬは、若い成人男性で最も多く、末梢血リンパ球数の著しい増加を特徴とする。腫瘍性Ｔヘルパー細胞は、Ｂ−ＣＬＬリンパ球と形態学的に区別できないが、核の輪郭は不規則又は脳状であることがある。皮膚の関与（皮膚向性）は共通しており、通常、顕著な肝脾腫大症がある。骨髄及び中枢神経系への浸潤が特徴である。ＣＤ４＋  Ｔ−ＣＬＬは攻撃的であり、平均生存率はわずか１年である。
【００４１】
前リンパ球性白血病
別の好ましい実施形態では、本発明は、前リンパ球性白血病の治療における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。
【００４２】
前リンパ球性白血病は、症例の８０％がＢ−ＣＬＬの、２０％がＴ−ＣＬＬの特徴的な変形である。腫瘍性Ｂ前リンパ球は、Ｂ−ＣＬＬ細胞よりも多くの表面膜免疫グロブリンを発現し、免疫学的に未熟と思われる。前リンパ球性白血病は、大きな脾腫及び白血球数の著しい増加（５０％を超える前リンパ球）を臨床的に特徴とする。
【００４３】
リンパ節症はＢ細胞前リンパ球性白血病において目立たないが、中程度のリンパ節症はＴ細胞前リンパ球性白血病においてしばしば認められる。前リンパ球性白血病は、老年男性で最も多い（４：１男性優勢）。これは攻撃的な疾患であり、平均生存率は２から３年である[Pathology, Second Edition, Emanual Rubin, John L. Farber, p1067]。
【００４４】
Ｔ細胞前リンパ球性白血病
特に好ましい一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）の治療における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用に関する。
【００４５】
Ｔ−ＰＬＬは、成熟Ｔ細胞に影響を与える珍しい慢性のリンパ球増殖性障害である。この疾患は高齢、典型的には７０歳代又は８０歳代で発症し、わずかに男性が優勢である。患者はＢ−ＰＬＬと同様の初期症状を示すが、Ｔ−ＰＬＬは現在、潜行性の発症と不良な転帰を特徴とする、明確な臨床及び検査上の特徴を有する、本来、悪性疾患であると理解されている。Ｔ−ＰＬＬは、成熟Ｂ及びＴ細胞白血病のわずか３％であるが、前リンパ球性白血病の約２０％である。Ｔ−ＰＬＬ症例の２０％では、細胞は小さく、電子顕微鏡でのみ確認できる目立たない核を有する。これらの症例は、Ｔ−ＰＬＬの小細胞変形とされる。
【００４６】
Ｔ前リンパ球は、成熟後胸腺リンパ球の以下の表現型を有する：ＣＤ１ａ−、末端デオキシヌクレオチジル転移酵素−ＴｄＴ−、ＣＤ２＋、ＣＤ３＋、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋。ＣＤ４及びＣＤ８発現について、最も多い表現型はＣＤ４＋／ＣＤ８−である。ＣＤ４とＣＤ８の同時発現（二重陽性表現型）は、症例の約２５％で見られる。
【００４７】
この疾患は攻撃的であり、急速に進行する。臨床経験では、Ｔ−ＰＬＬの治療に有効な治療剤の数は限られていることが示されている。生存率は７カ月（治療していない患者）から１７．５カ月（治療患者で）まで変化する。今日まで、治療は、クロラムブシル、シクロホスファミド、ドキソルビシン及びビンクリスチンなどの薬剤の投与が中心であり、これは一部成功している。２−デオキシコホルマイシン及びＣＤ５２抗体（ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）である程度の成功は認められるが、治療は依然として臨床的に問題であり、より効果的な治療手段が求められている。
【００４８】
ＣＤＫの阻害
好ましい一実施形態では、ロスコビチンは少なくとも１種のＣＤＫ酵素を阻害するのに十分な量で投与する。
【００４９】
好ましくは、ＣＤＫ酵素は、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＤＫ７及びＣＤＫ９から選択される。
【００５０】
特に好ましい一実施形態では、ＣＤＫ酵素はＣＤＫ２である。
【００５１】
別の特に好ましい実施形態では、ＣＤＫ酵素はＣＤＫ７及びＣＤＫ９から選択される。
【００５２】
突然変異ＡＴＭ及び突然変異ＴＰ５３腫瘍
以前の研究によれば、Ｂ−ＣＬＬの最大３０％が、ＡＴＭ遺伝子又はＴＰ５３遺伝子のいずれかの突然変異から生じたＤＮＡ損傷後のアポトーシスの誘発に関与するｐ５３経路の欠陥による不良な臨床転帰を有することが示されている３、４、２２。殆どの現在の抗癌治療は、その作用をｐ５３依存性アポトーシス経路の活性化を介して発揮しているので、そのような突然変異は薬物低抗性の重大な原因である。よって、この重要な遺伝的欠陥を回避することが可能な新規な治療に明らかな関心がもたれており、即ちＡＴＭ及びＴＰ５３突然変異Ｂ−ＣＬＬ腫瘍に対する新規な治療が緊急に求められている。
【００５３】
本発明の好ましい一実施形態では、慢性リンパ球性白血病は突然変異ＡＴＭと関係している。
【００５４】
より好ましくは、慢性リンパ球性白血病は突然変異ＡＴＭと関係しているＢ−ＣＬＬである。
【００５５】
本発明の別の好ましい実施形態では、慢性リンパ球性白血病は突然変異ＴＰ５３と関係している。
【００５６】
より好ましくは、慢性リンパ球性白血病は突然変異ＴＰ５３と関係しているＢ−ＣＬＬである。
【００５７】
本出願人による研究では、ＡＴＭ及びＴＰ５３突然変異腫瘍の一部を含む、計２６例のＢ−ＣＬＬに対するＣＹＣ２０２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を調べた。その結果は、イオン化放射線（ＩＲ）及びフルダラビンによって誘発された細胞傷害性活性と比較した。
【００５８】
５μｇ／ｍｌ以上の濃度のＣＹＣ２０２で処置したＢ−ＣＬＬ細胞は、ＡＴＭ又はＴＰ５３遺伝子の状態に関わらず、処置の２４時間以内で高レベルのアポトーシスを示した。よって、驚くべきことに、ＡＴＭ突然変異体、ＴＰ５３及び野生型Ｂ−ＣＬＬ腫瘍はＣＹＣ２０２に対する応答が同等である。
【００５９】
これは、応答が遅く且つかなり低く、非応答性であると思われる、即ちフルダラビン誘発性アポトーシスに対して著しいｉｎ  ｖｉｖｏ抵抗性を示唆しているＡＴＭ突然変異腫瘍をある割合含むフルダラビン処置とは対照的である。この結果は、ＡＴＭ及びＴＰ５３突然変異体の両方が細胞殺傷性において明らかな欠陥を示したＩＲ誘発性アポトーシスとも対照的である８。したがって、ＣＹＣ２０２は、ｐ５３経路の完全性に関わらず、Ｂ−ＣＬＬ腫瘍細胞試料のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置の２４時間以内にアポトーシスを効果的に誘発することが可能である。
【００６０】
作用の様式
本発明の好ましい一実施形態では、ロスコビチンは、抗アポトーシス遺伝子の発現をダウンレギュレートする。
【００６１】
好ましくは、抗アポトーシス遺伝子は、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２及びＭａｄ３からなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含む。
【００６２】
本発明の別の好ましい実施形態では、ロスコビチンは、ＤＮＡ修復遺伝子の発現をダウンレギュレートする。
【００６３】
好ましくは、ＤＮＡ修復遺伝子はＰＣＮＡ又はＸＰＡを含む。
【００６４】
本発明のさらに別の好ましい実施形態では、ロスコビチンは、転写調節に関与する遺伝子の発現をダウンレギュレートする。
【００６５】
好ましくは、転写調節に関与する遺伝子は、ＰｏｌII、ｅＩＦ−２、４ｅ及びＥ２Ｆからなる群から選択される少なくとも１種の遺伝子を含む。
【００６６】
本発明の特に好ましい一実施形態では、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩は、Ｍｃｌ−１の発現をダウンレギュレートするのに十分な量である。
【００６７】
本発明の一態様は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病細胞でのＭｃｌ−１発現をダウンレギュレートする方法に関し、この方法は、前記細胞をロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩と接触させることを含む。
【００６８】
本発明の別の態様は、対象のＢ細胞慢性リンパ球性白血病を治療する方法に関し、前記方法は、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩を対象に、前記対象のＭｃｌ−１の発現をダウンレギュレートするのに十分な量で投与することを含む。
【００６９】
本発明のさらに別の態様は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病を治療する医薬品の調製における、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩の使用に関し、ここで、ロスコビチン又は薬剤として許容されるその塩は、Ｍｃｌ−１の発現をダウンレギュレートするのに十分な量である。
【００７０】
本出願人による研究により、ＣＹＣ２０２のＢ−ＣＬＬ細胞に対する作用はフルダラビンによって誘発される作用よりも少なくとも２４時間先行し、はるかに顕著であったことが示された。フルダラビンは、ｐ５３のＤＮＡ損傷誘発アップレギュレーション及びｐ５３経路の活性化を介して細胞死を誘発すると考えられる。しかし、現在の研究における、ｐ５３突然変異Ｂ−ＣＬＬ腫瘍がフルダラビンにｉｎ  ｖｉｔｒｏで反応しやすいという事実は、フルダラビンがｐ５３非依存性殺傷を示し得るという概念を支持する。実際に、Pettittら１５は、ｐ５３機能不全を伴うＢ−ＣＬＬでのフルダラビンに対する応答を報告した。さらに、フルダラビンの作用機序のいくつかはＡＴＭ依存性であることが可能である。というのは、フルダラビンに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで抵抗性の６つの腫瘍のうち４つはＡＴＭ突然変異体であることが分かったからである。対照的に、ＣＹＣ２０２は、ＡＴＭ及びＴＰ５３突然変異Ｂ−ＣＬＬ腫瘍の両方に対して強い殺傷作用を示し、これは、殺傷機序がＡＴＭ及びｐ５３機能の両方に非依存性であることを暗示している。
【００７１】
ＣＹＣ２０２は、細胞がＳ期に進むために必要なＣＤＫ２−サイクリンＥに対して強い阻害作用を示すことが以前に示されている７。しかし、Ｂ−ＣＬＬ細胞の主に分裂しない性質は、この薬物の作用の追加的な機序を強く示唆している。本出願人の研究により、多くの遺伝子はＣＹＣ２０２での処置に反応してダウンレギュレートされ、それには、転写及び翻訳調節に関与する遺伝子（ＲＮＡ  ｐｏｌ  II、ＲＮＡ  ｐｏｌ  III）、抗アポトーシスタンパク質（Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２）、並びにＤＮＡ修復タンパク質（ＸＰＡ）が含まれることが分かった。したがって、転写のダウンレギュレーションは、ＣＹＣ２０２によるＢ−ＣＬＬ殺傷の予想される機序として出現した。
【００７２】
転写中、ＰＴＥＦ−ｂ（ＣＤＫ９／サイクリンＴ１）及びＴＦIIＨ（ＣＤＫ７／サイクリンＨ）は、ＲＮＡポリメラーゼIIのカルボキシ末端ドメイン（ＣＴＤ）をセリン２を含む特異的標的残基１６でリン酸化し、このリン酸化は転写伸長の開始に先立って生じる１７。ＣＤＫ９及びＣＤＫ７キナーゼのリン酸化、並びにＲＮＡ  ｐｏｌ  II  ＣＴＤのリン酸化を阻害する薬剤は、転写リプレッサーとして作用していることが示唆されている１８。ＣＹＣ２０２の転写リプレッサーとしての役割と合致して、この薬物で処置したＢ−ＣＬＬ細胞において、ＲＮＡ  ｐｏｌ  IIのセリン２のリン酸化が急速に減少するのが認められた。さらに、この修飾は転写の全ダウンレギュレーションと共に、Ｂ−ＣＬＬ腫瘍細胞すべてにおけるアポトーシスの誘発に先行することが分かった。
【００７３】
ＣＹＣ２０２が仲介した転写の減少の結果の１つには、Ｂｃｌ−２ファミリーのメンバー、Ｍｃｌ−１のダウンレギュレーションがある。本出願人の研究により、Ｂｃｌ−２タンパク質ではなくＭｃｌ−１のレベルの低下は、ＣＹＣ２０２処置後のアポトーシスの開始と同時に起こることが分かった。さらに、ＣＹＣ２０２が誘発したＭｃｌ−１の消失は、カスパーゼ３及び７の活性化に時間的に先行しており、これは、Ｍｃｌ−１ダウンレギュレーションが、Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるミトコンドリア経路を介したアポトーシスの誘発にとって重要な事象であり得ることを示唆している。したがって、総合すれば、ＣＹＣ２０２とのＢ−ＣＬＬ細胞のインキュベーション後の事象の考えられる順序は、以下の通りであろう：ａ）ＲＮＡ  ｐｏｌ  IIのリン酸化及び転写調節遺伝子の両方のダウンレギュレーションによる転写の阻害、ｂ）Ｍｃｌ−１及びおそらくその他の生存促進因子などの短命のタンパク質の消失、ｃ）ミトコンドリアの活性化及びシトクロームｃの放出、ｄ）エフェクターカスパーゼの活性化及びアポトーシスの開始。
【００７４】
要約すれば、ＡＴＭ及びＴＰ５３突然変異Ｂ−ＣＬＬ腫瘍は、一般により不良な予後と結び付いており、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＤＮＡ損傷誘発性アポトーシスの不在を示し、これは、ＴＰ５３突然変異腫瘍の場合、アポトーシスシグナルの減少、並びに損傷誘発性生存促進応答の増大の両方の結果と思われることは以前に示されていた８。本明細書で記載の研究により、ＣＹＣ２０２は、ＡＴＭ又はＴＰ５３突然変異を有するものを含むＢ−ＣＬＬ細胞におけるアポトーシスの強力な誘導物質であり、転写リプレッサー及び生存シグナルとして働くことが示された。さらに、Ｂ−ＣＬＬ細胞の全体的な遺伝子発現分析により、転写及び翻訳調節に関与する遺伝子のかなりのダウンレギュレーション及びアポトーシスの阻害、並びにＤＮＡ修復が示された。さらに、ＣＹＣ２０２は、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でアポトーシスの誘発の前に、ＲＮＡポリメラーゼIIのリン酸化の阻害を引き起こし、生存促進因子Ｍｃｌ−１の急速な消失につながった。
【００７５】
したがって、ＣＹＣ２０２は、ｐ５３経路の機能的状況に関わらず、Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるアポトーシスの強力な誘導物質であると結論することができる。これを考慮し、且つその低い毒性に照らして、ＣＹＣ２０２は、抵抗性Ｂ−ＣＬＬの転帰を向上させ、攻撃的な腫瘍の治療をかなり向上させる強力な治療剤として使用できよう。
【００７６】
薬剤組成物
ロスコビチン（又は薬剤として許容されるその塩、エステル、又は薬剤として許容されるその溶媒和物）は、単独で投与できるが、ヒトの治療の場合、一般に薬剤担体、賦形剤又は希釈剤と混合して投与される。
【００７７】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、薬剤として許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせたロスコビチンの投与に関する。
【００７８】
本明細書で記載した種々の異なる形態の薬剤組成物用のそのような適切な賦形剤の例は、Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Wellerに見い出すことができる。
【００７９】
治療上の使用に許容される担体又は希釈剤は製薬分野でよく知られており、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。適切な担体としては、ラクトース、澱粉、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどがある。適切な希釈剤としては、エタノール、グリセロール及び水がある。
【００８０】
薬剤担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図する投与経路及び標準的な薬学的慣行に関して選択することができる。薬剤組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として、又はそれらに加えて、任意の適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、被覆剤、可溶化剤を含んでもよい。
【００８１】
適切な結合剤には、澱粉、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、βラクトース、とうもろこし甘味料、天然及び合成ガム、例えばアカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシルメチルセルロース及びポリエチレングリコールがある。
【００８２】
適切な潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどがある。
【００８３】
保存料、安定化剤、色素及び香味剤も薬剤組成物に入れてよい。保存料としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルがある。抗酸化剤及び懸濁化剤も使用してよい。
【００８４】
塩／エステル
本発明の活性剤は、塩又はエステル、特に薬剤として許容される塩又はエステルの形態で存在できる。
【００８５】
本発明の活性剤の薬剤として許容される塩としては、適切なその酸付加塩又は塩基性塩がある。適切な薬用塩の概説は、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)に見い出すことができる。塩は、例えば鉱酸などの強い無機酸、例えば硫酸、リン酸又はハロゲン化水素酸；置換されていないか置換されている（例えばハロゲンで）炭素原子１から４個のアルカンカルボン酸などの強い有機カルボン酸、例えば酢酸；飽和又は不飽和のジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸；アミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸；安息香酸；或いは置換されていないか置換されている（例えばハロゲンで）（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル−又はアリール−スルホン酸などの有機スルホン酸、例えばメタンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸と形成される。
【００８６】
エステルは、エステル化される官能基に依存して、有機酸又はアルコール／水酸化物のいずれかを使用して形成される。有機酸としては、置換されていないか置換されている（例えばハロゲンで）炭素原子１から１２個のアルカンカルボン酸などのカルボン酸、例えば酢酸；飽和又は不飽和のジカルボン酸、例えばシュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はテトラフタル酸；ヒドロキシカルボン酸、例えばアスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸；アミノ酸、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸；安息香酸；或いは置換されていないか置換されている（例えばハロゲンで）（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキル−又はアリール−スルホン酸などの有機スルホン酸、例えばメタンスルホン酸又はｐ−トルエンスルホン酸がある。適切な水酸化物としては、無機水酸化物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウムがある。アルコールとしては、置換されていないか置換されていてよい（例えばハロゲンで）炭素原子１から１２個のアルカンアルコールがある。
【００８７】
エナンチオマー／互変異性体
本発明はまた、適切な場合は、活性剤のエナンチオマー及び互変異性体のすべてを含む。当業者は、光学的性質（１個又は複数のキラル炭素原子）又は互変異性の特徴を有する化合物が分かるであろう。対応するエナンチオマー及び／又は互変異性体は、当技術分野で知られた方法により単離／調製できる。
【００８８】
立体異性体及び幾何異性体
本発明の活性剤は、異なる立体異性体及び／又は幾何異性体の形態で存在してもよく、例えば１個又は複数の非対称及び／又は幾何学的中心を有していてもよく、したがって２種以上の立体異性体及び／又は幾何異性体の形態で存在してもよい。本発明は、薬剤の個々の立体異性体及び幾何異性体すべて、並びにそれらの混合物の使用を意図する。特許請求の範囲で使用した用語はこれらの形態を含み、但し、前記形態は（必ずしも同程度ではないが）適切な機能活性を保持している。
【００８９】
本発明はまた、活性剤又は薬剤として許容されるその塩の適切な等方変形すべてを含む。本発明の薬剤又は薬剤として許容されるその塩の等方変形は、少なくとも１個の原子が、同じ原子数を有するが天然に通常見られる原子質量とは異なる原子質量を有する原子で置換されているものと定義する。薬剤及び薬剤として許容されるその塩に入れることができる同位体としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、イオウ、フッ素及び塩素の同位体、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ及び３６Ｃｌがある。薬剤及び薬剤として許容されるその塩のある種の等方変形、例えば３Ｈ又は１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれているものは、薬剤及び／又は基質の組織分布の研究において有用である。トリチウム、即ち３Ｈ、及び炭素１４、即ち１４Ｃ同位体が、その調製の容易さ及び検出性のために特に好ましい。さらに、重水素、即ち２Ｈなどの同位体での置換により、より大きな代謝安定性、例えば増大したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期又は低減した必要用量の結果としてのある種の治療上の利点が得られ、したがってある状況で好ましい場合がある。本発明の薬剤及び薬剤として許容されるその塩の等方変形は一般に、従来の手順で適切な試薬の適切な等方変形を使用して調製することができる。
【００９０】
溶媒和物
本発明はまた、本発明の活性剤の溶媒和物形態を含む。特許請求の範囲で使用した用語はこれらの形態を包含する。
【００９１】
多形
さらに、本発明は、活性剤の種々の結晶形態、多形形態及び（無）水和形態に関する。化合物が、化合物の合成調製で使用する溶媒から、精製及び／又は単離する方法をわずかに変化させることによって任意のそのような形態で単離できることは、製薬産業でよく確立されている。
【００９２】
プロドラッグ
本発明はさらに、プロドラッグ形態の本発明の活性剤を含む。そのようなプロドラッグは一般に、１個又は複数の適切な基が、ヒト又は哺乳動物対象に投与すると復元するように修飾されている化合物である。そのような復元はそのような対象に天然に存在する酵素によって通常行われるが、復元をｉｎ  ｖｉｖｏで行うために、そのようなプロドラッグと一緒に第２の薬剤を投与することも可能である。そのような修飾としては、エステル（例えば上記で記載されているもののいずれか）があり、その場合、復元はエステラーゼなどで行われてもよい。その他のそのような系は、当業者によく知られているであろう。
【００９３】
投与
本発明の薬剤組成物は、経口、直腸、膣、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、鞘内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、鼻、口腔内又は舌下投与経路に適合させることができる。
【００９４】
経口投与では、圧縮錠剤、丸剤、錠剤、顆粒剤、ドロップ剤及びカプセル剤が特に使用される。好ましくは、これらの組成物は、１用量当たり活性成分を１から２０００ｍｇ、より好ましくは５０〜１０００ｍｇ含有する。
【００９５】
その他の投与形態としては、静脈内、動脈内、鞘内、皮下、皮内、腹腔内又は筋肉内注射することができ、滅菌溶液又は滅菌可能な溶液から調製された溶液又はエマルジョンがある。本発明の薬剤組成物はまた、坐薬、ペッサリー、懸濁液、エマルジョン、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液又は散布剤の形態であってもよい。
【００９６】
経皮投与の代替手段は、皮膚パッチの使用である。例えば、ポリエチレングリコール又は流動パラフィンの水性エマルジョンからなるクリームに活性成分を入れることができる。活性成分はまた、１から１０重量％の濃度で、白ろう又は白軟パラフィン基剤、必要によりその安定化剤及び保存料と共になる軟膏に入れることができる。
【００９７】
注射形態は、１用量当たり活性成分１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜５００ｍｇ含むことができる。
【００９８】
組成物は、単位剤形、即ち単位用量、又は単位用量の複数単位若しくは部分単位を含有する別個の分量の形態に製剤してもよい。
【００９９】
特に好ましい実施形態では、本発明の組合せ又は薬剤組成物は静脈内投与する。
【０１００】
用量
当業者ならば、不当な実験をすることなく、対象に投与する本発明組成物の１種の適切な用量を容易に決定できる。通常、医師は患者個人に最も適する実際量を決定し、それは、活性剤の活性、薬剤の作用の代謝安定性及び長さ、年齢、体重、全般的健康、性別、食事、投与の様式及び時間、排泄率、複合薬、特定の状態の重篤度、並びに個々に受けている療法を含む種々の要因に依存する。施用の用量及び頻度は通常、患者の全般的な病状、及び引き起こされる副作用の重篤度、特に造血系、肝臓系及び腎臓系に引き起こされる副作用の重篤度に適合させる。本明細書で開示した用量は、平均的な症例の例である。当然のことながら、より高い又はより低い用量範囲が有利な個々の場合があり、それは本発明の範囲内である。
【０１０１】
必要に応じ、薬剤は体重１ｋｇ当たり０．１から３０ｍｇ、又は体重１ｋｇ当たり２から２０ｍｇの用量で投与してもよい。より好ましくは、薬剤は、体重１ｋｇ当たり０．１から１ｍｇの用量で投与してもよい。
【０１０２】
上記の通り、ロスコビチンは好ましくは、治療有効量で、好ましくは薬剤として許容される量の形態で投与される。この量は当業者にはよく知られている。指針の目的で、ロスコビチンは通常、経口又は静脈内で、約０．０５から約５ｇ／日、好ましくは約０．５から約５ｇ／日又は１から約５ｇ／日、さらにより好ましくは、約１から約３ｇ／日投与される。ロスコビチンは好ましくは、錠剤又はカプセル剤で経口投与される。ロスコビチンの総１日量は、１日当たり１回で投与することも、２、３又は４回に分けた用量で投与することもできる。
【０１０３】
組合せ
本発明の好ましい一実施形態では、ロスコビチンは１種又は複数のその他の抗増殖剤と組み合わせて投与する。そのような場合、本発明の化合物は、連続的に、同時に又は逐次的に１種又は複数のその他の抗増殖剤と共に投与してもよい。
【０１０４】
当技術分野では、多くの薬物は、組み合わせて使用した場合により効果的であることが知られている。特に、併用療法は、大きな毒性、作用機序及び抵抗性機序の重複を回避するために望ましい。さらにまた、殆どの薬物は、最大耐容量で、そのような投与間の最小時間間隔で投与するのが望ましい。薬物を組み合わせる主要な利点は、生化学的相互作用を介して追加的な又は可能性のある相乗効果を高め、またそうしなければ単一剤での最初の治療に対して応答したであろう薬物低抗性の出現を低減し得ることである。
【０１０５】
有益な組合せは、特定の障害の治療において価値があることが分かっている又は価値があることが予想される薬剤と一緒の試験化合物の活性を研究することによって示唆されるであろう。この手順はまた、薬剤の投与の順序、即ち送達の前、同時又は後を決定するのにも使用できる。本発明を実施例により、また以下の図を参照してさらに説明する。図のさらなる詳細は実施例の節にある。
［実施例］
【０１０６】
別段の定義がない限り、本書で使用される、すべての専門用語及び科学用語は、（例えば、細胞培養液、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリッド形成法及び生化学において）当業者によって通常理解されるものと同様の意味を有する。標準的な技術が、分子的、遺伝的及び生化学的方法のために使用される。通常、以下を参照のこと、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.。また、以下も参照のこと、Guthrie et al., Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Vol. 194, Academic Press, Inc., (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, et al. 1990 Academic Press, San Diego, Calif.), McPherson et al., PCR Volume 1, Oxford University Press, (1991), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2nd Ed. (R. I. Freshney. 1987. Liss, Inc. New York, N.Y.), and Gene Transfer and Expression Protocols, pp. 109-128, ed. E. J. Murray, The Humana Press Inc., Clifton, N.J.)。これらの文献は、本願明細書に援用する。
【０１０７】
ロスコビチンの調製
ＣＹＣ２０２を、ＥＰ０８７４８４７Ｂ（ＣＮＲＳ）で開示の方法により調製した。
【実施例１】
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＢ−ＣＬＬ細胞に対するロスコビチンの活性
実験は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病において、ロスコビチンがｐ５３依存アポトーシス経路の欠陥を克服することが可能なことを実証するために実施した。
【０１０９】
Ｂ−ＣＬＬは依然として不治であり、新しい治療が緊急に必要とされている。大部分の現行の抗癌治療は、ｐ５３依存アポトーシス経路の活性化を通して効果を発揮する。しかし、Ｂ−ＣＬＬ腫瘍の５〜１０％は、ＴＰ５３遺伝子に突然変異を有し、さらに２０〜２５％はＡＴＭ遺伝子に突然変異を有する。ＡＴＭは、ＤＮＡ二本鎖切断によって活性化され、リン酸化によりｐ５３を活性化する。ＴＰ５３遺伝子又はＡＴＭ遺伝子における突然変異は、ｐ５３依存アポトーシス障害につながり、不良な臨床転帰に関連する。
【０１１０】
Ｂ−ＣＬＬ細胞に対して、ロスコビチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性を検査した。試験は、ロスコビチンがＣＤＫ１及びＣＤＫ２を調節する細胞周期、並びにＣＤＫ７及びＣＤＫ９を調節する転写を阻害することを示している。それは、多くの充実性腫瘍細胞系でアポトーシスの原因となり、単剤として、又は化学療法と併用で、異種移植片において腫瘍退縮を誘発する。癌患者を対象とした第Ｉ〜II相試験が進行中である。
【０１１１】
患者８例はＡＴＭ突然変異体（７例はＡＴＭタンパク質の発現はなく、１例は残余タンパク質を発現した）で、１０例はＡＴＭ／ＴＰ５３野生型であった。ロスコビチンを１〜２５μｇ／ｍＬの範囲で使用した。アネキシンＶ測定（アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム染色法キット、Becton Dickinson Biosciences社製、米国）は、アポトーシスの最初の徴候が、処置の８時間以内に生じることを示した。１６時間までに、ＡＴＭの状態に関わりなく、早期のアポトーシスで生存度が劇的に減少し、Ｂ−ＣＬＬ細胞の割合が増加したのは明らかであった。すべての患者の細胞は、生存度が少なくとも７５％減少した。５μｇ／ｍＬを超えると、この濃度では、ロスコビチンの効果は既に目ざましかったので、用量依存性はほとんど観察されなかった。ＡＴＭ突然変異腫瘍及び野生型腫瘍は、照射に対する反応で明らかな相違を示したが、ロスコビチンに対する反応は同等であった。正常なリンパ球は、２４時間後、ロスコビチン５μｇ／ｍＬに対する反応において、毒性が遅延及び減少した。
【０１１２】
ロスコビチンの作用機序を調査するために、ウエスタンブロット法［Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.;］を、数種のアポトーシス関連タンパク質に対して実施した。抗アポトーシスタンパク質のＭｃｌ−１［J. Biol. Chem., 274: 1801-1813, 1999; J. Cell Biol.,128(6): 1173-1187, 1995; Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90: 3516-3520, 1993］は、ロスコビチン５μｇ／ｍＬで処置した細胞においてダウンレギュレートされた。アポトーシスの指標であるＰＡＲＰの開裂［FASEB Journal 10: 587-597, 1996; Science, 267: 1456-1462, 1995; Biochim. Biophys. Acta, 950:147-160, 1988; J. Biol. Chem, 271(9): 4961-4965, 1996; Nature, 371: 346-347, 1994］が、処置の２時間後に起こった。興味深いことに、ｐ５３依存的前アポトーシスタンパク質ＰＵＭＡ［Mol Cell. 2001 Mar; 7(3): 673-82］も、ダウンレギュレートされた。ロスコビチンは、ｐ５３経路の機能的状態に関係なく、Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるアポトーシスの強力な誘導物質であると結論づける。
【０１１３】
より詳細な試験については、下記の実施例２において述べる。
【実施例２】
【０１１４】
材料及び方法
Ｂ−ＣＬＬ患者
試料を年齢範囲が５２〜９３歳の患者から得た。患者２例が病期Ａｏと診断され、患者８例が病期Ａ、患者５例が病期Ｂ、患者２例がＢ／Ｃであったが、患者１０例は病期Ｃと確認された。すべての患者の以前及び現在の治療と、ＡＴＭ／ＴＰ５３突然変異状態、フルダラビン及びＣＹＣ２０２に対する反応を表２に示す。
【０１１５】
Ｂ−ＣＬＬ細胞
ＡＴＭ又はＴＰ５３によって特徴づけられるＢ−ＣＬＬ患者２６例から得られた試料を検査した。７つの腫瘍はＡＴＭ突然変異体（６例はＡＴＭタンパク質の発現はなく、１例は残余ＡＴＭタンパク質を発現した）で、１５つの腫瘍はＡＴＭ／ＴＰ５３野生型で、４つの腫瘍はＴＰ５３突然変異体であった８。単核細胞を、Ｂ−ＣＬＬ患者から得られた全血の密度遠心によって分離し、９０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で生存可能な状態で冷凍した。実験のために、細胞を解凍し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma社製、英国ジリンガム）及びグルタミンを含む予熱ＲＰＭＩで洗浄し、１×１０６細胞／ｍＬの密度で最低３時間培養した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの感受性試験では、細胞を、２４ウェルプレートを用いて約１×１０６細胞／ｍＬで、ＲＰＭＩ−１％ＢＳＡ／グルタミンによって平板培養した。
【０１１６】
正常なＢ細胞の分離
正常なドナーからの単核細胞（ＭＮＣ）を、前述のように密度遠心により得た。全血を、RosetteSepB細胞強化抗体カクテル（StemCell Technologies社製、英国ロンドン）と混合し、室温で２０分間培養し、ＰＢＳ−２％ＦＢＳと１：１で希釈し、Lymphoprepの上に重ねて、遠心した。Ｂ細胞を洗浄し、計数し、実験のために平板培養した。
【０１１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアポトーシス誘導
薬剤
ＣＹＣ２０２を、ＤＭＳＯで再懸濁し、ろ過滅菌し、−２０℃で一定分量を冷凍した。実験のために、一定分量を解凍し、培養液で１：１０に希釈し、ウェルに加えた。フルダラビンを滅菌水で再懸濁し、４℃に保った。感受性試験のために、各腫瘍試料を２つの一定分量に分け、半分を５Ｇｙで照射し、何の薬剤も加えず培養するか、２つの薬剤のいずれかを別々に加えるか、２つを混合して加えて培養し（使用した濃度は、すべての試料で、フルダラビンが２０μＭ、ＣＹＣ２０２が５、１０及び２５μｇ／ｍＬ）、もう一方の一定量は、照射せず、同様な方法で薬剤なしか、薬剤を加えて処置を行った。洗浄（洗い落とす）試験では、細胞をＣＹＣ２０２の存在下、異なる時間で培養し、洗浄し、新鮮な培地で再び平板培養し、２４時間及び４８時間後に細胞の生存度を測定した。
【０１１８】
照射
腫瘍試料をＲＰＭＩ−１％ＢＳＡで再懸濁し、γ線を放射するPrecisa217線源を使用して（Pantatron Ltd社製、英国ハンプシャー、ゴスポート）５グレイ（Ｇｙ）で照射した。
【０１１９】
アポトーシス測定
アネキシンＶアポトーシスキット（BD Pharimingen社製、英国オックスフォード）を使用して、細胞集団のアポトーシスを測定した。以前に「Ｂ−ＣＬＬ細胞」で記載したように、細胞を平板培養した。Ｂ−ＣＬＬ細胞及び対照細胞を、薬剤で０、４、８、１６、２４、４８、７２及び９６時間処置した後、採集し、冷却ＰＢＳで洗浄した。細胞ペレットを再懸濁し、製造業者より提供された１×緩衝液１００μＬを各試験管に添加した。次に、アネキシンＶ５μＬとヨウ化プロピジウム（ＰＩ）５μＬを、対照を除くすべての試験管に添加した。軽く混合した後、試験管を遮光下で１５〜４５分保存し、その後１×緩衝液５００μＬを添加し、Coulter Epics XL-MCLフローサイトメーター（Beckman Coulter社製、米国カリフォルニア）を使用して分析した。
【０１２０】
ウエスタンブロット法
ＲＰＭＩ−１％ＢＳＡ＋グルタミン入りの無組織培養用処置６ウェルプレートで、細胞を平板培養し、３時間以上培養液で回復させてから、ＣＹＣ２０２を添加した。ＣＹＣ２０２（又は対照としてＤＭＳＯ）の添加に続いて、プレートを軽く撹拌し、インキュベーターに戻した。指定した時間で、細胞を収集し、冷却ＰＢＳで洗浄し、細胞のペレットを液体窒素で瞬間冷凍し、−８０℃で保存した。解凍した細胞ペレットは、プロテイナーゼ阻害剤（ＤＴＴ、ＶＯ４、ＮａＦ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチン）を含む１００〜１５０μＬのＴＧＮ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２％ＮＰ−４０及び５０ｍＭβ−グリセロリン酸）で氷上で溶解した。溶解物を１５，０００ｒｐｍ、４℃で、２０分間遠心し、上澄みを収集し、一定分量で瞬間冷凍した。タンパク量をブラッドフォード試薬（Bio Rad社製、英国ヘメルヘムステッド）を使用して試薬ごとに測定した。等量のタンパク質を８、１０又は１２％のアクリルアミドゲル（Bio Rad社製）に広げて、標準ウエスタンブロット法の操作を実施した。Ｍｃｌ−１及びＸＰＡに対する主要な抗体はBD Pharmingen社（英国オックスフォード）から購入し、Ｂｃｌ−２、ＰＡＲＰ  ｎ２０及びＭａｄ３に対する抗体はSanta Cruz（Autogen Bioclear社製、英国カルン）から、アクチンに対する抗体はSigma-Aldrich社（英国ドーセット）から購入した。抗ＲＮＡポリメラーゼII及び抗ＲＮＡポリメラーゼIIセリン２はCovance Research Products（Cambridge Bioscience Ltd社製、英国ケンブリッジ）から入手した。二次抗体抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ複合物及び抗ヤギＩｇＧペルオキシダーゼ複合物は、Sigma-Aldrich社から購入した。抗ウサギのＨＲＰは、ＤＡＫＯ社（英国イーリー）から購入した。固定された抗原を、ＥＣＬウエスタンブロット検出システム（Amersham Biosciences社製、英国チャルフォントセントジャイルズ）を使用して検出し、Ｘ線フィルム（Hyperfilm（商標）、Amersham Biosciences社製）に露光させた。
【０１２１】
フローサイトメトリー
ＣＤ５−ＰＥ（Ｔ１−ＲＤ１）抗体及びＣＤ１９−ＦＩＴＣ（Ｂ４−ＦＩＴＣ）抗体は、Coulter Clone社（英国ハイウィコム）から入手した。染色のために、細胞を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳにおいて室温で２０分間培養し、次に洗浄し、ＰＢＳ−１０％ＦＢＳで再懸濁し、遮光下の室温で３０分間染色した。培養後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ−１％ＦＢＳで再懸濁し、Coulter Epics XL-MCLフローサイトメトリーで分析した。
【０１２２】
マイクロアレイ分析
５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２による培養前と培養の４時間後に、５つのＢ−ＣＬＬ腫瘍、２つのＡＴＭ突然変異体及び３つのＡＴＭ／ＴＰ５３野生型について、マイクロアレイ分析を実施した。さらに２０時間をかけて長時間培養した後、各試料の一定分量をＣＤ５及びＣＤ１９について染色し、もう１つはアネキシンＶ染色を使用して、アポトーシスについて検査した。マイクロアレイ分析では、総ＲＮＡの抽出、第１鎖及び第２鎖のｃＤＮＡ合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写、並びにチップハイブリッド形成法を、前述のように実施した８。培養後、チップを洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリトリンで標識して、得られたシグナルを２回目の染色によって増幅した。洗浄と染色の工程は、流体素子ステーション（Affymetrix社製、ハイウィコム）を使用して実施した。チップは、共焦点アルゴンイオンレーザー（Agilent Technologies社製、米国カリフォルニア）で走査した。
【０１２３】
データ収集、規格化、ふるい分け及び統計分析
Affymetrix Microarray Suite 5.0ソフトウェアを使用して、１０のハイブリッド形成すべてに対して発現値を得た。データの質は、MAS5.0レポートファイル及びGenespring 5.1 （Silicon Genetics社製、米国サンカルロス）を使用して評価した。GeneSpring 5.1ソフトウェアによる解析では、生データをMAS5.0からエクスポートし、値をアレイごとにシグナル値の中央値へ規準化した。薬物反応を基にした比較では、無処置の試料における遺伝子発現の平均レベルへの更なる基準化を実施した。U95Av2 GeneChipは、対照細菌の遺伝子を含む１２，６２７の転写物を含む。有益な遺伝子のリストを作成するために、Genespring 5.1を使用して、ＣＹＣ２０２への曝露前後の腫瘍を比較する実験的解釈を行った。全例において、複製に基づく総合誤差モデルを使用して、分散を判定した。シグナルの強さがバックグラウンド値を有意に超えなかった遺伝子、及び発現が信頼できる検出（Affymetrix MAS5.0の検出値ｐ≦０．１の確率を基にして）で閾値に達しなかった遺伝子を、５つのＢ−ＣＬＬ複製のうち少なくとも３つの試料で除外した。最後に、薬剤に対する反応における発現レベルが１．５倍を超えてばらつきのなかった遺伝子も除外した。残る遺伝子は有益と見なし、複製から推察した分散統計による総合誤差モデルを使用して、２つの条件（無処置細胞及び処置細胞）間でパラメトリック（Ｗｅｌｃｈ）ｔ−検定を実施した。最後に、偽の差異遺伝子発現の発見を減少させるために、Benjamin-Hochbergの複数検査補正フィルタリング（multiple testing correction filtering）を適用した。
【０１２４】
代替法として、マイクロアレイチップの走査像を総分位点の規準化によって分析した９。引き続いて、生ＣＥＬファイルに関する頑健な複数アレイ分析１０を、Bioconductor（http://www.biocondutor.org）プロジェクトのAffymetrixパッケージを使用して実施した。差別的に発現したプローブを、ＳＡＭ１１，１２を使用して同定した。最後に、遺伝子の階層的クラスター分析を、ＤＮＡ−チップ分析器及びデフォルト設定を使用して実施した（ｄＣｈｉｐ; Wong Lab, Dept of Biostatistics, Harvard School of Public Health, Dept. of Biostatistical Science, Dana-Farber Cancer Institute; http://www.dchip.org）。
【０１２５】
両方のアプローチにより同定されたＣＹＣ２０２反応遺伝子を、さらに考慮に入れた。さらに、ＣＹＣ２０２特異的前アポトーシス反応を同定するために、ＣＹＣ２０２反応遺伝子のリストを同じ腫瘍試料から得たＩＲ（照射）反応遺伝子のリストと比較した８。
【０１２６】
結果
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、ＣＹＣ２０２は、Ｂ−ＣＬＬ腫瘍におけるアポトーシスの強力な誘導物質である
Ｂ−ＣＬＬ細胞における、毒性誘発のための最適なＣＹＣ２０２量及び培養期間を確立するために、典型的なＢ−ＣＬＬ腫瘍試料（１種がＡＴＭ野生型で、１種がＡＴＭ突然変異体）を、最初にＣＹＣ２０２量を増加し、培養の４、８、１６、２４、４８及び７２時間後にアポトーシスを評価した。図１１ａが示すように、すべての試料で、１μｇ／ｍＬの処置は、細胞生存度又はアポトーシス誘発に影響をほとんど及ぼさなかったか、まったく及ぼさなかった一方、２．５μｇ／ｍＬの処置は、Ｂ−ＣＬＬのすべての試料には影響は及ぼさなかったものの、一部の試料に影響を及ぼした（図１１ａ）。しかし、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２による２４時間以内の処置で、生存可能なＢ−ＣＬＬ細胞が劇的に減少し、４８時間の処置によって大部分の細胞がアポトーシスを起こした。５μｇ／ｍＬより上の濃度では、用量依存性はほとんど認められなかった（結果の提示なし）。また、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２による４〜８時間の処置で、最初のアポトーシスの徴候が検出可能で、１６時間までに、これら早期の効果が、さらにいっそう顕著になり、生存細胞の割合が非常に減少することが認められた（データに示さず）。
【０１２７】
異なる時間でＣＹＣ２０２処置したＢ−ＣＬＬ細胞を、薬剤に曝露後、薬剤が含まれない培地で回復させると、薬剤の作用から逃れることができるか確認するために、洗浄試験を実施した。３種の腫瘍の細胞を、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で、０．５、１、２、３、４、６及び８時間処置した。次に、薬剤を洗浄し、さらに、細胞を２４時間培養した。次に、培養物の生存度を、アネキシンＶ／ＰＩ染色法により検査した。ＣＹＣ２０２に６時間未満曝露し、続いて培養により回復させることで、測定可能な細胞傷害作用は誘発されなかったが、６時間以上曝露した場合、曝露後の回復時間に関わらず、生存度が大きく低下した。これらの結果は、一貫しており、最低８時間処置したＢ−ＣＬＬ培養物をアネキシンＶによって測定することにより、早期のアポトーシス細胞の出現が観察され、このことは本剤への最低時間の曝露が、細胞のアポトーシス機構を不可逆的に引き起こすために必要であることを示している。また、Ｂ−ＣＬＬ試料（１５のＡＴＭ野生型腫瘍、７つのＡＴＭ突然変異腫瘍、４つのＴＰ５３突然変異腫瘍）を、ＣＹＣ２０２と共に培養した２４、４８及び７２時間後にアネキシンＶ測定によって検査し、電離放射線及びフルダラビンによる同じ殺腫瘍作用の結果と比較した。これらの比較結果は、図１１ｂ（ＡＴＭ野生型腫瘍）、図１１ｃ（ＡＴＭ突然変異腫瘍）及び図１１ｄ（ＴＰ５３突然変異腫瘍）に示す。
【０１２８】
２６のＢ−ＣＬＬを合わせて見てみると、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で処置後、平均８３．６％の生存度の減少が観察されたが（範囲５３〜９７％、＋／−１０．１％、図１２ａ）、無処置のＢ−ＣＬＬ細胞では、生存度の減少はわずか８．０％（＋／−８．５％）であった。Ｂ−ＣＬＬを遺伝子型で分けてみると、１５のＡＴＭ野生型腫瘍は、平均８３．５％（＋／−１１．７％）の生存度の減少を示しているが（図１２ｂ）、ＡＴＭ突然変異腫瘍は８３．９％（＋／−７．４％、図１２ｂ）、ＴＰ５３突然変異腫瘍は８５．８％（＋／−９．７％、図１２ｂ）の生存度の減少を示した。したがって、３つの遺伝子型とも５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２に対して抵抗性はなく、３群すべてが本剤に対して同等な反応を示した。
【０１２９】
注目すべきことに、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２と比べて、２０μＭのフルダラビンで処置した細胞は、サブタイプに関わらず、生存度の減少が少なくなり、アポトーシスの増加が減少する（図１１ｂ、図１１ｃ及び図１１ｄ）。この相違は、処置の最初の２４時間以内に、上記の自発的アポトーシスの濃度で、細胞において生存度の減少が増加しなかった、ＡＴＭ突然変異体サブタイプとＴＰ５３突然変異体サブタイプで最も顕著であった（図１１ｃ及び図１１ｄ）。フルダラビンは、すべての腫瘍遺伝子型を合計して、処置の２４時間後に生存度が全体的に１３．３％（＋／−１２．１、図１２ａ）減少した。同じ時点での生存度の減少は、ＡＴＭ野生型腫瘍単独では、１４．９％（＋／−１２．７％、図１２ｂ）であり、これに比べてＡＴＭ突然変異腫瘍では７．９％（＋／−７．２％、図１２ｂ）、４つのＴＰ５３突然変異腫瘍では１６．７％（＋／−１６．０％、図１２ｂ）であった。フルダラビン処置の４８時間後でさえ、生存度の減少は、ＣＹＣ２０２を添加し２４時間培養した後に比べて、有意に低かった。全体として、フルダラビン誘発のアポトーシスは、同じ処置時間におけるＣＹＣ２０２誘発のアポトーシスと比べて非常に少なかった（表１の下の部分にて要約）。興味深いことに、６／２３の腫瘍はフルダラビンに対して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抵抗性を示し、このうち６７％（４／６）がＡＴＭ突然変異体であった。フルダラビン感受性腫瘍の中で、１３はＡＴＭ野生型であり、３つ（１９％）はＡＴＭ突然変異体であった。特に、４つのＴＰ５３突然変異腫瘍の試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、いずれもフルダラビンに対して抵抗性は示さなかったが（表２に要約）、本剤に対する反応は、野生型腫瘍と比べて遅かった。
【０１３０】
まとめると、ＣＹＣ２０２は、フルダラビンと異なり、照射誘発のアポトーシスにおいて欠陥があることが示されたＢ−ＣＬＬ試料も含むすべてのＢ−ＣＬＬ試料で高レベルのアポトーシスを誘発することができる。したがって、ＡＴＭ／ＴＰ５３遺伝子の状態に関わらず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＹＣ２０２は、フルダラビンよりはるかに有効なＢ−ＣＬＬ細胞に対する殺作用を有する。
【０１３１】
ＣＹＣ２０２の効果と対照的に、以前の観察と一致して、野生型、ＡＴＭ突然変異体及びＴＰ５３突然変異体の腫瘍は、ＩＲの２４時間後にアポトーシスをほとんど示さないか、まったく示さなかった（図１１ｃ、図１１ｄ及び図１２ｂ）。ＩＲ誘発アポトーシスは、ＩＲに曝露した７２時間後に明白になったが、ＡＴＭ／ＴＰ５３野生型配列を有する腫瘍に限られた（図１１ｂ）。
【０１３２】
３種類の治療法におけるアポトーシス誘発の相乗作用を分析するために、２６の腫瘍のうちの２５の腫瘍に、ＩＲ＋フルダラビン、ＩＲ＋ＣＹＣ２０２又はフルダラビン＋ＣＹＣ２０２を含む併用処置を行った。１つの腫瘍は、薬剤を併用して処置したが、照射は行わなかった。フルダラビン及びＩＲによる異なる殺腫瘍メカニズムが一致して、照射に対する反応率の増加が、２４時間以上フルダラビンで処置した２５の腫瘍のうちの２０の腫瘍において観察された。対照的に、ＣＹＣ２０２処置試料への照射は、細胞傷害性を増加せず、このことはＢ−ＣＬＬを死滅させることにおいて、本剤は単剤として最大の有効性を有することを示唆している。同様に、ＣＹＣ２０２処置培養物へのフルダラビンの添加により、ＣＹＣ２０２単独で誘発される殺腫瘍レベルを超えるアポトーシスの増加は見られなかった。したがって、フルダラビンの作用は、ＣＹＣ２０２の非常に大きな細胞傷害性によって消されてしまった可能性がある。
【０１３３】
正常Ｂリンパ球におけるＣＹＣ２０２のアポトーシス誘発に及ぼす作用
ＣＹＣ２０２処置の非白血性Ｂリンパ球に及ぼす作用を判定するために、対照者５例の細胞を分離し、１〜２０μｇ／ｍＬの濃度範囲で本剤によって処置した。ＣＹＣ２０２のＢ−ＣＬＬ細胞に及ぼす作用とは対照的に、正常Ｂ細胞は、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２に対する毒性が遅延及び減少した。対照者由来の無処置Ｂ細胞は、２４時間以上で生存度が平均４．４％（＋／−１．９％）減少したが、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で処置したＢ細胞の生存度は、同じ時間で３１．４％（＋／−１７．１％）減少した。このことは、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で２４時間処置したＢ−ＣＬＬ腫瘍における８３．６％（＋／−１０．１％）の生存度のより大きな減少とは対照的である（図１３）。４８時間後、無処置Ｂ細胞の生存度は２６．５％（＋／−１９．３％）減少し、ＣＹＣ２０２処置したＢ細胞の生存度は４７．４％（＋／−１７．２％）減少し、Ｂ−ＣＬＬ腫瘍の生存度は８８．３％（＋／−８．１％）減少した。唯一、正常Ｂ細胞に対するＣＹＣ２０２の細胞傷害性だけが、２０μｇ／ｍＬを使用したときに、Ｂ−ＣＬＬで観察されたレベルに匹敵しするレベルに達した。したがって、これらのデータから、ＣＹＣ２０２が５μｇ／ｍＬの濃度でＢ−ＣＬＬ細胞に対して有意な選択的細胞傷害性を示すと思われる。
【０１３４】
ＣＹＣ２０２による殺Ｂ−ＣＬＬ作用のメカニズム
ａ）ＣＹＣ２０２のアポトーシス経路及びエフェクターカスパーゼに及ぼす作用
Ｂ−ＣＬＬは、ゆっくりと循環するリンパ細胞の腫瘍である。ＣＹＣ２０２と共に２４時間培養する間の、欠陥のあるｐ５３経路も含む全てのＢ−ＣＬＬ腫瘍に対する有効な殺腫瘍作用を考慮すると、ＣＹＣ２０２による殺Ｂ−ＣＬＬ作用は、細胞周期阻害又はｐ５３依存的転写の活性化以外のメカニズムを伴うという理由は妥当と思われる。実際、ウエスタンブロット法は、ＣＹＣ２０２を添加し培養した後、ｐ５３活性化がないことを示した（図１４ａ）。ＡＴＭ野生型Ｂ−ＣＬＬにおいて、ＣＹＣ２０２による処置の３〜６時間後にｐ５３の濃度が多少増加したが、ｐ５３反応タンパク質ｐ２１のアップレギュレーションの証拠は見られなかった（図１４ａ）。同様に、また予想通りに、ＡＴＭ又はＴＰ５３に突然変異を有する腫瘍において、ｐ５３及びｐ２１のＣＹＣ２０２誘発アップレギュレーションの証拠は見られなかった。むしろ、これら２種類の腫瘍は、ｐ５３タンパク質の濃度が時間の経過と共に減少し、ＣＹＣ２０２と共に１８〜２４時間培養することで、ほとんど検出できなくなった（図１４ａ）。
【０１３５】
下流のアポトーシス経路の活性化について分析した。アポトーシスの誘発と一致して、活性化エフェクターカスパーゼ−３の分解の標的であるＰＡＲＰ１は、３種類のＢ−ＣＬＬサブタイプすべての代表的な腫瘍において、６〜２４時間のＣＹＣ２０２処置により開裂（分割）した（図１４ｂ）。さらに、直接のカスパーゼ−３活性が、３種類のＢ−ＣＬＬサブタイプのすべてで、プロカスパーゼ−３の開裂及び同時に生じた活性（開裂）カスパーゼ−３の出現によって確認されたのに対して、プロカスパーゼ−７の開裂及び消失はカスパーゼ−７の活性化を示していた（図１４ｂ）。ＣＹＣ２０２誘発の殺作用は、ｐ５３の下流のアポトーシス経路の活性化を含むと結論づけることができる。
【０１３６】
ｂ）ＣＹＣ２０２の転写に及ぼす作用
Ｂ−ＣＬＬ細胞におけるＣＹＣ２０２の転写に及ぼす影響を調査するために、全体的遺伝子発現プロファイリングを、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２への曝露前と曝露の４時間後に、５種類の代表的試料（３種類のＡＴＭ／ＴＰ５３野生型及び２種類のＡＴＭ突然変異体）で、U95A Affymetrixマイクロアレイチップにより実施した。材料及び方法で記載したように、細胞を収集して、マイクロアレイ分析のために処置した。また、処置した細胞の一定量を、ＣＹＣ２０２と共に２４時間培養した後に、アネキシンＶ測定分析によって検査し、アポトーシスが、すべての細胞で誘発されていることを確認した。ＣＹＣ２０２処置試料の遺伝子発現の結果を、対応する無処置試料のベースラインの遺伝子発現と比較した。情報価値のない遺伝子のフィルトレーション及び複数検査補正を含む統計的検査後、ＣＹＣ２０２への曝露後、１．５倍以上、ダウンレギュレートされた５４７の遺伝子及び１．５倍以上、アップレギュレートされた１３５の遺伝子を同定した。アップレギュレートされた遺伝子は、多様な細胞間シグナルを示し、ダウンレギュレートされた遺伝子は、Ｂ−ＣＬＬにおけるＣＹＣ２０２の前アポトーシス活性を説明することが可能ないくつかの細胞経路を明らかに示した。最初に、ＴＦIIＢ、ＴＦIIＤ、ＴＦIIＳ、ＴＦIIＥβ、ＲＮＡポリメラーゼII及びIII、伸長開始因子ｅｉＦ−２α、γ及びｅｉＦ−４など、転写及び翻訳の開始に関わるタンパク質をコードする遺伝子のスペクトルは、ＣＹＣ２０２への曝露後に明らかにダウンレギュレートされた（図１５ａ）。さらに、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２（図１５ａ）、Ｍａｄ３、ＮＦｋＢサブユニット、タンパク質の熱ショックファミリーのいくつかの要素、インターフェロンサイトカイン及び受容体のファミリーなど、細胞の生存を支援する抗アポトーシス特性を有する遺伝子も、ＣＹＣ２０２に反応してダウンレギュレートされた。最後に、ＰＣＮＡ、ＸＰ−Ｃ及びＥＲＣＣ４を含む多くの修復遺伝子の発現が、本剤への曝露の４時間後に減少した（図１５ａ）。他の重要なダウンレギュレーション経路は、ＭＡＰキナーゼ及びこれらのダウンレギュレーションエフェクターを含む。
【０１３７】
ＣＹＣ２０２の転写反応のプロフィールは、以前に、Ｂ−ＣＬＬ腫瘍の同じ設定でＩＲ後に観察されたものとは著しく異なっていた８。ＩＲ誘発シグナルと対照的且つＣＹＣ２０２転写反応のｐ５３独立特性と一致して、ＣＹＣ２０２は、ＡＴＭ／ＴＰ５３野生型腫瘍のｐ２１（図１５ａ）及びＰｕｍａなどのｐ５３反応遺伝子のｍＲＮＡレベルに有意な変化を誘発しなかった。さらに、前生存因子Ｍｃｌ−１（図１５ａ）、熱ショックタンパク質及びＮＦｋＢ遺伝子のダウンレギュレーションは、これら遺伝子が、野生型Ｂ−ＣＬＬ腫瘍ではＩＲ後にアップレギュレートされることが認められていないので、ＣＹＣ２０２作用に対して完全に特異的であると思われた。
【０１３８】
ウエスタンブロット法は、ＣＹＣ２０２に対する主要な反応因子の異なる発現を確認するために使用した。Ｍｃｌ−１は、リンパ細胞でのアポトーシスの調節にとって重要なＢｃｌ−２ファミリーの前生存遺伝子である１３。ＡＴＭ野生型腫瘍、ＡＴＭ突然変異腫瘍及びＴＰ５３突然変異腫瘍において、タンパク質レベルでのＭｃｌ−１発現を、ＣＹＣ２０２と共に培養した後、様々な時点で調査した。Ｍｃｌ−１タンパク質濃度の最初の減少が、すべての腫瘍サブタイプにおいて、５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２を添加し２時間培養した後観察され、さらに６時間のＣＹＣ２０２処置により劇的なダウンレギュレーションが認められ、このタンパク質が完全に消失した（図１５ｂ）。興味深いことに、ｍＲＮＡが同様にＣＹＣ２０２に反応してダウンレギュレートされる、もう１つの前生存タンパク質Ｂｃｌ−２の濃度の減少は、Ｍｃｌ−１に比べて非常にゆるやかに起こる。理論に縛られることは望まないが、このことは、これらタンパク質の半減期の差に反映している可能性があり（Ｍｃｌ−１の０．５〜３時間に対して、Ｂｃｌ−２は１０〜１４時間）、アポトーシスがＢｃｌ−２タンパク質の存在下ですら生じる可能性があることを示唆している１４。
【０１３９】
全体的なｍＲＮＡ及びタンパク質合成のダウンレギュレーション作用に関する証拠として、ＤＮＡ修復に関与するタンパク質（ＰＣＮＡ及びＸＰ−Ｃ）の濃度に加えて、アクチンの濃度も２４時間までに減少する。対照的に、対照としてのＤＭＳＯによる腫瘍の処置では、Ｍｃｌ−１タンパク質の発現に作用を及ぼすことはなく、ＰＡＲＰ１（図１５ｃ）の開裂を誘発することもなかったが、このことは培養条件単独では、これらタンパク質のダウンレギュレーションを誘発しないことを示している。
【０１４０】
ＣＹＣ２０２が転写を包括的にダウンレギュレートするメカニズムを立証するために試験を実施して、ＣＹＣ２０２がＲＮＡポリメラーゼIIの濃度だけでなく、活性化にも影響を及ぼすかどうかを確認した。総ＲＮＡポリメラーゼIIタンパク質の濃度を、転写の伸長期と関連する部位のセリン２でリン酸化するＲＮＡポリメラーゼIIの濃度と共に分析した。注目すべきことに、Ｂ−ＣＬＬ腫瘍試料において、リン酸化タンパク質の濃度が、８時間のＣＹＣ２０２処置により有意に減少したが（図１６ａ）、ＲＮＡポリメラーゼII総タンパク質量は、同様に劇的には減少しなかった（図１６ｂ）。したがって、この結果は、ＣＹＣ２０２による転写のダウンレギュレーションが、ＲＮＡポリメラーゼIIタンパク質のリン酸化の原因であるキナーゼのサイクリン９及びサイクリン７の直接抑制に関わる可能性があることを示唆している。
【実施例３】
【０１４１】
ロスコビチンのヒトＴ前リンパ球性白血病細胞に及ぼす作用
臨床症例研究
症例は６６歳の女性患者で、定期的な血液検査で白血球増加が認められたため外来に来院した。末梢血細胞について免疫表現型決定（immunophenotyping）を行い、９７％の単核細胞が二重陽性Ｔリンパ球（ＴｃＲα／β＋／ＴｃＲγ／δ−、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ２＋、ＣＤ５＋及びＣＤ７＋）で、部分的に活性化し（ＣＤ２５＋、ＣＤ３０−、ＣＤ３８＋、ＣＤ４５ＲＡ−、ＣＤ４５ＲＯＣＤ６９−ＣＤ７１−、ＨＬＡ−ＤＲ−）、多数の接着分子（ＣＤ１１ａ＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１８＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ８６−）を発現したが、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１１７、又はＢ細胞若しくはＮＫ細胞マーカーの発現はなかった。本細胞は、胸腺後成熟の起源が確認されたＣＤ１ａ及びＴｄＴを発現しなかった。Ｔ細胞受容体（ＴｃＲ）遺伝子分析では、クローンＴｃＲγ鎖の転位が認められた。また、ＴｃＲα／β＋が表面に発現するのが検出された。本細胞は、ヒト白血球抗原Ｂ２７（ＨＬＡ−Ｂ２７）陽性として型を決めたが、自己免疫疾患の特徴は認められなかった。
【０１４２】
図１は、ＴＰＬＬ−１細胞（Ａ）及びＨＬＡ−Ｂ２７ヒストグラム（Ｂ）のＣＤ８＋／ＣＤ４＋二重陽性免疫表現型を示す。末梢血のフローサイトメトリー分析を、ＣＤ４のＦＩＴＣ及びＣＤ８のフィコエリトリンに接合するモノクローナル抗体によるＦＡＣＳｃａｎのフローサイトメーター（Becton Dickinson社製、米国）で実施した（Ａ）。ＨＬＡ−Ｂ２７ヒストグラムの左側の矢印は、カットオフ位置を示す（Ｂ）。計測器較正は、ＨＬＡ−Ｂ２７キット（Becton Dickinson Biosciensies社製、米国）に含まれる較正用ビーズを使用して実施した。右側の矢印は、ＨＬＡ−Ｂ２７陽性を示す、患者の試料におけるチャネル値の中央値に相当する。
【０１４３】
ＴＰＬＬ−１をコードする細胞を、Ficoll Paque密度勾配に対する遠心によって分離した。これにより、Ｔ−ＰＬＬの小細胞形態突然変異体のＣＤ８＋／ＣＤ４＋二重陽性細胞が９８％以上を占める単核細胞集団が得られた。細胞遺伝学的試験を、分裂促進因子（植物性血球凝集素、アメリカヤマゴボウマイトジェン及びホルボールエステル）による刺激の後に実施したが、分裂中期は確認できなかった。比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）分析は、ＴＰＬＬの症例において普通に見られた（５５％）８つの染色体の遺伝子上の過剰を明らかにした。再配列のないｃ−ｍｙｃ癌原遺伝子の３つの複製及びセントロメア８の２つの複製を、間期核の二色蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）によって検出した。
【０１４４】
比較ゲノムハイブリッド形成法
腫瘍ＤＮＡのハイブリッド形成をＦＩＴＣによって検出し、参照のＤＮＡハイブリッド形成をＴＲＩＴＣによって検出した（図２）。参照蛍光強度比に対する緑を基にしたコピー数差の定量化をＩＳＩＳ（Metasystems社製）によって実施した。遺伝子上の不足が６ｃｅｎ−ｑ２１、６ｑ２６及び１１ｑ１３−ｑ２３ｑで発見され、一方、遺伝子上の過剰が６ｐ２１−ｐ２５、７ｐ１５−ｐ２２、８ｐ、８ｑ、２２ｑ１３で発見された。これらの結果は、Ｔ−ＰＬＬで高いゲノムの不安定性を実証した以前のデータと一致していた［Soulier et al, Genes Chromosomes Cancer. 2001 Jul; 31(3): 248-54］。
【０１４５】
図３は、ＴＰＬＬ−１細胞でのｃ−ｍｙｃの蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）分析を示す。２セットでなく３セットの共存シグナルを検出し、このことは更なるｃ−ｍｙｃ座の存在を示していた。或いは、標識した（赤又は緑）ｃ−ｍｙｃフランキング領域プルーブ（flanking probes）をＦＩＳＨ分離測定に使用した。共存する緑及び赤のシグナルだけが、遺伝子再配列なしに完全なｃ−ｍｙｃ座を示すすべての細胞で同定された。ハイブリッド形成シグナルを、形態学的に完全な２００の核で数えた。
【０１４６】
図４は、遺伝子のrodamine検出（赤）及びＤ８Ｚ１染色体８の動原体周囲古典的付随体のＦＩＴＣ検出（緑）からなる二色ＦＩＳＨによるｃ−ｍｙｃの３つの複製の検出を示す。
【０１４７】
ＴＰＬＬ−１細胞を、様々なキナーゼ阻害剤（ＰＫＣアイソフォーム、ＭＡＰＫ及びＰＩ−３Ｋに対して選択的なものを含む）で処置したが、細胞生存度に対する作用は見られなかった（示さず）。ＴＰＬＬ−１細胞を１０μＭロスコビチンと共に異なる時間間隔で培養し、アポトーシス細胞の割合をＦＡＣＳｃａｎにより計数した。
【０１４８】
図５は、５時間の培養によって、ホルボールエステルにより阻害されなかった、ＴＰＬＬ−１細胞の９６％にアポトーシスを生じたことを示す。ロスコビチンを添加し５時間培養すると、ホルボールエステルにより阻害されなかったＴＰＬＬ−１細胞の９６％にアポトーシスを生じた（１０ｎＭ  ＴＰＡ）。
【０１４９】
図６は、１０μＭのロスコビチンを添加し、１８時間培養した結果を示す。大部分の細胞は溶解した。わずかに残るのは、後期のアポトーシスの細胞であった。
【０１５０】
サイクリンＡ、Ｂ１、Ｄ１及びＥ発現に関して、ＴＰＬＬ−１細胞を検査した（図７）。サイクリンＥ発現だけが、抗体ＨＥ１２（Santa Cruz Biotechnology社製）による免疫ブロットにより検出された。矢印は、ＭＷマーカータンパク質（Gibco社製）の位置を示す。
【０１５１】
図８は、ＴＰＬＬ−１細胞でのアポトーシスの阻害因子Ｂｃｌ−２の発現を示す。ｃ−ｍｙｃ  ＡＳＯ処置及びロスコビチンの両方は、Ｂｃｌ−２の発現を阻害しなかった。前アポトーシスタンパク質Ｂａｘの発現は検出されなかった（示さず）。
レーン１：対照
レーン２：１８時間ＡＳＯ処置
レーン３：２０分間１０μＭロスコビチン
レーン４：５時間１０μＭロスコビチン
【０１５２】
ロスコビチンは、ＴＰＬＬ−１細胞でアポトーシスを選択的に誘発した。ロスコビチン作用には、少なくとも２つの異なるメカニズムがあると考えられている。第１に、Ｃｄｋ２／サイクリンＥの阻害で、次に、ＰＩ−３Ｋ経路の活性化である。ＴＰＬＬ−１細胞におけるストレスシグナル伝達メカニズム及びＰＩ−３Ｋ経路に及ぼすロスコビチンの潜在的作用について調査する研究がなされた。
【０１５３】
図９は、ＴＰＬＬ−１の細胞内ストレスシグナル経路に及ぼす１０μＭのロスコビチンの作用を示す。ｐ３８  Ｓ５１−リン酸化のピークは、２０分間の培養で検出した。免疫ブロットを、Stress Signal Sample Pack（BIOSOURCE Int.社製）を使用して実施した。
【０１５４】
図１０は、ロスコビチンがＴＰＬＬ−１細胞でＰＩ−３Ｋ経路を活性化しなかったことを示す。結果は、Ａｋｔ／ＰＫＢ（Ｓｅｒ−４７３）及びＲａｆ−１（Ｓｅｒ−３３８）のＰＩ−３Ｋ依存的部位によってリン酸化されることに特異的な抗体による免疫ブロットを示している。また、ロスコビチンを添加して培養した後のＴｙｒ−５０８のＰＩ−３Ｋリン酸化は検出されなかった（示さず）。
【０１５５】
結論として、ロスコビチンはヒトＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ−ＰＬＬ細胞のアポトーシスを誘発する。ロスコビチンは、ＰＫＣ−依存的経路によりアポトーシスを誘発する。その作用は、非常に迅速で、Ｔ−ＰＬＬ細胞に対して選択的である。これらの知見についての可能な説明は、Ｔ−ＰＬＬ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖しないが、Ｃｄｋ２／サイクリンＥ活性がその生存度に対して、重要な役割を果たすというものである。また、不明なメカニズムによるｐ３８キナーゼの活性化も、ロスコビチン誘発アポトーシスに関与する可能性がある。したがって、ロスコビチンは、Ｔ−ＰＬＬ処置で、新しい治療のアプローチを提供する。
【０１５６】
本発明の範囲及び意図から逸脱しない本発明の様々の修正及び変更は、当業者には明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態と関連して記載しているが、請求される本発明は、そのような実施形態に過度に制限されるべきではないことを理解すべきである。実際に、当業者には明らかな、本発明を実施するために記載した方法の様々な変更は、本発明の範囲に含まれることを意味する。
【０１５７】
［参考文献］
1. Pangalis GA, Vassilakopoulos TP, Dimopoulou MN, Siakantaris MP, Kontopidou F, Angelopoulou MK. B-Chronic lymphocytic leukemia: practical aspects. Hematol Oncol. 2002; 20: 103-146. 
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3. Pettitt AR,Sherrington PD, Stewart G, Cawley JC, Taylor AMR, Stankovic T. p53 dysfunction in B-cell chronic lymphocytic leukemia: inactivation of ATM as an alternative toTP53 mutation. Blood.2001 ; 98 :814-822. 
4. Stankovic T, Stewart GS, Fegan C, et al. Ataxia telangiectasia mutateddeficient B-cell chronic lymphocytic leukemia occurs inpregerminal center cells and results in defective damage response and unrepaired chromosome damage. Blood. 
2002; 99: 300-309. 
5.Senderowicz, AM. Small-molecule cyclin-dependent kinase modulators. 
Oncogene. 2003; 22: 6609-6620. 
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7. McClue SJ, Blake D, Clarke R, et al. In vitro and in vivo antitumor properties of the cyclin dependent kinase inhibitor CYC202 (R-Roscovitine). Int J Cancer. 2002; 102: 463-468. 
8. Stankovic T, Hubank M, Cronin D, et al. Microarray analysis reveals thatTP53 and ATM mutant B-CLLs share a defect in activation of pro-apoptotic responses
【０１５８】
【表１】
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【０１５９】
【表２】
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【０１６０】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】ＴＰＬＬ−１細胞（Ａ）及びＨＬＡ−Ｂ２７ヒストグラム（Ｂ）のＣＤ８＋／ＣＤ４＋二重陽性免疫表現型を示す図である。
【図２】比較ゲノムハイブリッド形成（ＣＧＨ）を示す図である。腫瘍ＤＮＡのハイブリッド形成をＦＩＴＣで、参照ＤＮＡのハイブリッド形成をＴＲＩＴＣで検出した。
【図３】ＴＰＬＬ−１細胞でのｃ−ｍｙｃの蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）分析を示す図である。
【図４】二色ＦＩＳＨによるｃ−ｍｙｃの３つの複製の検出を示す図である。
【図５】５時間、ロスコビチン（ＣＹＣ−２０２）を添加して培養することによって、ホルボールエステルにより阻害されなかった（１０ｎＭ  ＴＰＡ）、ＴＰＬＬ−１細胞の９６％がアポトーシスを生じたことを示す図である。
【図６】１０μＭのロスコビチンを添加し、１８時間培養した結果を示す図である。
【図７】ＴＰＬＬ−１細胞のサイクリンＡ、Ｂ１、Ｄ１及びＥの発現に関して検査した結果を示す図である。
【図８】ＴＰＬＬ−１細胞でのアポトーシスの阻害因子（遺伝子）Ｂｃｌ−２の発現を示す図である。
【図９】ＴＰＬＬ−１の細胞内ストレスシグナル経路に及ぼす１０μＭのロスコビチンの作用を示す図である。
【図１０】Ａｋｔ／ＰＫＢ（Ｓｅｒ−４７３）及びＲａｆ−１（Ｓｅｒ−３３８）のＰＩ−３Ｋ依存的部位によってリン酸化されることに特異的な抗体による免疫ブロットの結果を示す図である。
【図１１】無処置、照射又は薬剤によるＢ−ＣＬＬ腫瘍の時間に伴う細胞生存度を示す図である。ａ）無処置の２６腫瘍中２６腫瘍の生存細胞の割合、１μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で処置した２６腫瘍中２４腫瘍の生存細胞の割合、２．５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で処置した２６腫瘍中１９腫瘍の生存細胞の割合及び５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で処置した２６腫瘍中２６腫瘍の生存細胞の割合によって示されるＢ−ＣＬＬ腫瘍のＣＹＣ２０２に対する用量反応。細胞の生存度及びアポトーシスは、アネキシンＶ測定により測定した。ｂ）からｄ）Ｂ−ＣＬＬを遺伝子型から見た。ｂ）無治療、又は５グレイの照射、２０μＭのフルタラビン若しくは５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２によって処置した１５のＡＴＭ野生型腫瘍。細胞は、ａ）のようにアネキシンＶ測定により分析した。ｃ）７つのＡＴＭ突然変異腫瘍。ｄ）４つのＴＰ５３突然変異腫瘍。細胞の生存度及びアポトーシスは、アネキシンＶ測定により測定した。
【図１２】ａ）５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２、２０μＭのフルダラビン、５グレイの照射に曝露、又は無処置の場合の２４時間にわたる生存可能なＢ−ＣＬＬ細胞の割合の減少（全サブタイプを併せて）の比較、ｂ）５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２、２０μＭのフルダラビン、５グレイの照射に曝露、又は無処置の場合のサブタイプごとのＢ−ＣＬＬ細胞における生存度の減少を示す図である。
【図１３】ａ）５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２を添加して培養したときの、２４、４８及び７２時間後のアネキシンＶの分析による、正常Ｂ細胞（実線）及びＢ−ＣＬＬ細胞（点線）の生存度に及ぼす影響、及びｂ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＹＣ２０２（５μｇ／ｍＬ）に対する正常細胞の反応とＢ−ＣＬＬ細胞の反応の比較を示す図である。正常な末梢Ｂ細胞において、生存度の減少は著しくなく、ＣＹＣ２０２による処置後のアポトーシスの増加は、Ｂ−ＣＬＬ細胞の８０％超に比べて、６０％未満であった。
【図１４】５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２を添加してＢ−ＣＬＬを培養したときの、ａ）ｐ５３及びｐ２１タンパク質の発現、及びｂ）ＰＡＲＰ１、プロカスパーゼ−３及びプロカスパーゼ−７の開裂の発現に及ぼす影響を示す図である。ＡＴＭ野生型細胞を０、１、２、３、４、５、６及び２４時間処置し、ＡＴＭ突然変異体細胞を０、２、１０及び１８時間処置し、ＴＰ５３突然変異体細胞を０、２、４、６、８、１０及び２４時間処置し、タンパク質を抽出してｐ５３及びｐ２１の発現に関してウエスタンブロット法により分析した。アクチンを添加対照として使用した。
【図１５】ａ）５μｇ／ｍＬのＣＹＣ２０２で４時間処置した５つのＢ−ＣＬＬ腫瘍における、無処置の同じ腫瘍と比べた、ダウンレギュレートされた代表的遺伝子を示すマイクロアレイ分析、ｂ）ウエスタンブロット法による、３種すべてのＢ−ＣＬＬサブタイプのうちのＭｃｌ−１及びＢｃｌ−２の２種の抗アポトーシスタンパク質の発現減少の確認、ｃ）最長２４時間培養したＡＴＭ野生型Ｂ−ＣＬＬにおけるＭｃｌ−１及びＰＡＲＰ１開裂のダウンレギュレーションの欠如、ｄ）ウエスタンブロット法による、Ｂ−ＣＬＬにおけるＰＣＮＡの発現減少の確認、ｅ）ＣＹＣ２０２による処置の前後のＢ−ＣＬＬに関するマイクロアレイ分析を示す図である。
【図１６】ａ）ＲＮＡポリメラーゼIIのセリン２に対するリン酸特異的抗体によるウエスタンブロット法で示す、２種のＡＴＭ野生型Ｂ−ＣＬＬに対するＣＹＣ２０２処置後のＲＮＡポリメラーゼIIリン酸化のダウンレギュレーション、ｂ）２４時間のＣＹＣ２０２処置による総ＲＮＡポリメラーゼIIタンパク質濃度のダウンレギュレーションを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ−ｂ】
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【図１１ｃ−ｄ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ−ｄ】
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【図１５ｅ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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