(57)【要約】  本発明は、Ａｂ１ＫＤ及びバリアント、並びに結合ポケットを含むそのサブセットの３次元分子構造座標を記録された機械が読み取り可能な媒体を提供し、阻害剤及び活性剤を含むアフェクターを同定及び設計するために当該構造を使用する方法、並びにＡｂ１ＫＤ結晶、及びＡｂ１活性に影響する化合物及び組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶形態のＡｂ１又はＡｂ１ＫＤタンパク質、或いは機能性Ａｂ１ＫＤタンパク質サブユニット。
【請求項２】
前記結晶が重原子誘導体結晶である、請求項１に記載の結晶タンパク質又は機能性タンパク質サブユニット。
【請求項３】
Ａｂ１ＫＤタンパク質が突然変異体である、請求項２に記載の結晶タンパク質又は機能性タンパク質サブユニット。
【請求項４】
図３、４、５、又は６の構造座標のセットに実質的に類似する構造座標のセットにより特徴付けられる、請求項３に記載の結晶タンパク質。
【請求項５】
Ａｂ１ＫＤタンパク質及びリガンドを含む結晶。
【請求項６】
Ａｂ１ＫＤタンパク質に結合するリガンドの同定方法であって、以下の：
ａ）  試験リガンドとＡｂ１ＫＤタンパク質の共結晶を形成し；
ｂ）  Ｘ線結晶学を使用して当該共結晶を分析し；そして
ｃ）  当該分析を使用して、当該試験リガンドがＡｂ１ＫＤタンパク質に結合するかを決定する
を含む、前記方法。
【請求項７】
前記試験リガンドを含む溶液中にＡｂ１ＫＤタンパク質結晶を浸すことにより、前記共結晶が得られる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記共結晶が、前記試験リガンドの存在下でＡｂ１ＫＤタンパク質を共結晶化することにより得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の結晶タンパク質の３次元構造表示に相当する情報を記録された機械が読み取り可能な媒体。
【請求項１０】
図３、４、５、又は６の分子構造座標、或いはその少なくとも５０％の構造座標を記録された、請求項９に記載される機械が読み取り可能な媒体。
【請求項１１】
図３、４、５、又は６の分子構造座標、或いはその少なくとも８０％の座標を記録された、請求項９に記載される機械が読み取り可能な媒体。
【請求項１２】
Ａｂ１ＫＤタンパク質結合ポケットを含むタンパク質分子の分子構造座標を記録された請求項９に記載される機械が読み取り可能な媒体であって、ここで、当該結合ポケットが、図３、４、５、又は６の構造座標を有するＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５若しくはＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３のアミノ酸を含むAb1KDタンパク質結合ポケット、或いは当該結合ポケットとその結合ポケットホモログとのアミノ酸残基の骨格原子の標準偏差が、２．０Å未満である結合ポケットホモログの構造座標によるAb1KDタンパク質結合ポケットを含むタンパク質分子の分子構造座標で記録される、前記媒体。
【請求項１３】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいて、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５若しくはＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項１２に記載の機械が読み取り可能な媒体。
【請求項１４】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいて、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項１３に記載の機械が読み取り可能な媒体。
【請求項１５】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいて、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２をさらに含む、請求項１３に記載の機械が読み取り可能な媒体。
【請求項１６】
請求項９に記載される機械が読み取り可能な媒体中に記録される情報の全て又は一部を電気的に伝達する方法。
【請求項１７】
Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの３次元分子構造座標を含むコンピューター読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、当該方法が以下の：
ａ）  当該タンパク質の結晶から、当該タンパク質又は当該タンパク質の結合ポケットを規定する３次元構造座標を取得し；そして
ｂ）  当該構造座標を、コンピューター中に導入して、当該タンパク質又はその結合ポケットの分子構造座標を含むデーターベースを作成する
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記タンパク質の結合ポケットが、少なくとも１のリガンドとの共複合体の一部である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記結合ポケットが、アミノ酸Ｌｅｕ、Ｔｈｒ又はＩｌｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記コンピューターが、前記構造座標を使用して、前記結合ポケットを含む３次元分子構造を利用又は表示できる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合ポケットが、さらにＧｌｕ、Ａｓｎ、及びＡｓｐに対応するアミノ酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合ポケットが、さらにＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、及びＰｈｅに対応するアミノ酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合ポケットが、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸の構造座標により規定される結合ポケットを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいてＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ってＧｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ってＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記結合ポケットが、活性部位を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１７により作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース。
【請求項２９】
請求項１７により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を、電子的に伝達することを含む方法。
【請求項３０】
Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに結合できる化合物を表示することを含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースの作成方法であって、当該方法が以下の：
ａ）  請求項１７により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースをコンピューター・プログラム中に導入し、
ｂ）  当該コンピューター・プログラム中で、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの３次元表示を作成し、
ｃ）  少なくとも１の結合試験化合物の３次元モデルを、当該結合ポケットの表示上に重ね合わせ、
ｄ）  当該試験化合物モデルが、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケット中に空間的に適合するかを評価し、そして
ｅ）  結合ポケット中に適合する化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む、前記方法。
【請求項３１】
前記ｅ）において、前記表示が、請求項１７により作成されたデーターベース中に記憶される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記表示が、化合物名、化合物の化学式若しくは分子式、化合物の化学構造、化合物の識別情報、及び化合物の３次元分子構造座標からなる群から選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記結合ポケットの３次元表示の作成が、図３、４、５、又は６に従った対応する残基の構造座標から、少なくとも２.０Å未満の結合ポケットのアミノ酸残基の骨格原子の標準偏差を有する構造座標の使用を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１の結合試験化合物が、以下の：
（ｉ）  低分子データーベースから化合物を選択し、
（ii）  Ａｂ１ＫＤの既知の阻害剤、基質、反応中間体、又は反応産物、或いはその一部を改変し、
（iii）  化学断片又は化学基を、化合物に組み立て、
（iv）  当該化合物の新規のリガンドを設計する
から選ばれる方法により選ばれる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
試験化合物モデルが適合するかの前記評価が、当該モデルを、前記Ａｂ１ＫＤ結合ポケットの表示にドッキングし、及び／又はエネルギーの最小化を行うことによる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
以下の：
ｆ）  前記コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に表される結合試験化合物を製造し、
ｇ）  結合アッセイにおいて、当該化合物を、前記Ａｂ１ＫＤタンパク質結合ポケットを含むタンパク質と接触し；
ｈ）  該試験化合物が、当該アッセイにおける該タンパク質に結合するかを決定し；そして
ｉ）  当該アッセイにおいて当該タンパク質に結合する化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に導入する
をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｉ）において、前記表示が、前記データーベース中に記憶される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記表示が、化合物名、化合物の化学式、化合物の化学構造、化合物の識別情報、及び化合物の３次元分子構造座標からなる群から選ばれる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
化合物との共結晶状態のＡｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの表示を含む、コンピューターが読み取り可能データーベースを作成する方法であって、当該方法が以下の：
ａ）  請求項３０により提供されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に表される結合試験化合物を製造し、
ｂ）  当該化合物とＡｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットを含むタンパク質との共結晶を形成し；
ｃ）  当該共結晶状態の当該結合ポケットの構造座標を取得し、そして
ｄ）  当該結合ポケット又は当該共結晶の構造座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベースに導入する
を含む方法。
【請求項４０】
前記共結晶状態の前記化合物の構造座標を、前記データーベース中に導入することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記結合ポケットが、アミノ酸、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ又はＩｌｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記コンピューターが、前記構造座標を使用して前記結合ポケットの３次元分子構造を利用又は表示できる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記結合ポケットが、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＡｓｐに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記結合ポケットが、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、及びＰｈｅに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記結合ポケットが、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸の構造座標により定義される結合ポケットを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＧｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記結合ポケットが活性部位を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項５０】
制球項３０により作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース。
【請求項５１】
請求項１７に記載の方法を使用して、作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を電子的に伝達する方法。
【請求項５２】
前記Ａｂ１ＫＤを化合物と接触させることを含む、Ａｂ１ＫＤタンパク質活性の調節方法であって、当該化合物が、請求項３０に記載の方法により作成されたデーターベース中に表される、前記方法。
【請求項５３】
請求項３０により作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に含まれる座標により表示される３次元分子構造を含む化合物の作成方法であって、当該化合物を合成することを含み、ここで当該化合物がＡｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに結合する、前記方法。
【請求項５４】
Ａｂ１ＫＤタンパク質活性の調節方法であって、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質を、請求項５３により作成された化合物と接触することを含む、前記方法。
【請求項５５】
Ａｂ１ＫＤ活性部位又は結合ポケットを含むタンパク質の活性化剤又は阻害剤を同定する方法であって、以下の：
ａ）  請求項５３に記載される化合物を作成し
ｂ）  当該化合物を、Ａｂ１ＫＤ活性部位又は結合ポケットを含むタンパク質と接触し；そして
ｃ）  当該潜在的な調節薬が、当該タンパク質の活性部位を活性化するか又は阻害するかを決定する
を含む、前記方法。
【請求項５６】
請求項５５により同定される活性剤又は阻害剤を作成する方法。
【請求項５７】
Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに結合できるように合理的に設計された化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、以下の：
ａ）  請求項１７により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースをコンピューター・プログラムに導入し、
ｂ）  当該コンピューター・プログラム中に当該Ａｂ１ＫＤタンパク質又はその結合ポケットの3次元表示を作成し；
ｃ）  当該表示の結合ポケットのアミノ酸と非共有結合を形成する化合物の３次元モデルを設計し；そして
ｄ）  当該化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む、前記方法。
【請求項５８】
前記表示が、化合物名、当該化合物の化学式又は分子式、化合物の化学構造、化合物の識別情報、及び化合物の３次元構造情報からなる群から選ばれる、請求項５８に記載の方法。
【請求項５９】
以下の：
ｅ）  前記コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に含まれる構造座標により表される３次元分子構造を含む、結合試験化合物を製造し；
ｆ）  当該化合物を、Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットを含むタンパク質と、結合アッセイにおいて接触させ、
ｇ）  当該試験化合物が、当該アッセイにおけるタンパク質に結合するかを決定し；そして
ｈ）  当該アッセイにおけるタンパク質に結合する化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベースに導入する
をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記表示が、化合物名、当該化合物の化学式又は分子式、化合物の化学構造、化合物の識別情報、及び化合物の３次元構造情報からなる群から選ばれる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記結合ポケットを結合できるように合理的に設計された化合物との共結晶状態のＡｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、当該方法が以下の；
ａ）  請求項５７により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に表される結合試験化合物を製造し、
ｂ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットを含むタンパク質との当該化合物の共結晶を形成し、
ｃ）  当該共結晶における当該結合ポケットの構造座標を取得し；そして
ｄ）  当該結合ポケット又は当該共結晶の構造座標をコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に導入する
を含む、前記方法。
【請求項６２】
前記共結晶状態の前記化合物の構造座標を、前記データーベースに導入することをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記結合ポケットが、アミノ酸、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ又はＩｌｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
前記結合ポケットが、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＡｓｐに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記結合ポケットが、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、及びＰｈｅに対応するアミノ酸をさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記結合ポケットが、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸の構造座標により規定される結合ポケットを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＧｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記結合ポケットが活性部位を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項７１】
請求項５７に記載される方法を使用して作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース。
【請求項７２】
請求項５７に記載される方法を使用して作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を電子的に伝達することを含む方法。
【請求項７３】
未知の構造の分子又は分子複合体についての構造情報を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、以下の：
ａ）  当該分子又は分子複合体の結晶化形態からのＸ線回折パターンを作成し；
ｂ）  分子置換法を使用して、前記分子の構造を解明し、ここで、当該分子置換法が、請求項１の結晶タンパク質の構造座標、又は図３、４、５、若しくは６、又は結合ポケットを含むそのサブセットの構造座標、図３、４、５、又は６の結合ポケットの構造座標、或いは上記構造座標のα炭素原子について約２.０Å未満の標準偏差を有する構造座標を使用し、そして
ｃ）  得られた構造の座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む、前記方法。
【請求項７４】
前記結合ポケットが、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸の構造座標により規定される結合ポケットを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＧｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に基づいたＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記結合ポケットが活性部位を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
請求項７３に記載される方法を使用して作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース。
【請求項８０】
請求項７３により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を電子的に伝達することを含む方法。
【請求項８１】
Ａｂ１ＫＤタンパク質ホモログの構造のホモロジーモデリング方法であって、以下の：
ａ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質ホモログのアミノ酸配列を、Ａｂ１ＫＤタンパク質のアミノ酸配列と配列比較をし、
ｂ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質の構造のモデル中にＡｂ１ＫＤタンパク質ホモログの配列を取り込み、ここで該モデルは、請求項１に記載の結晶タンパク質の構造座標又は図３、４、５、６の構造座標と同じ構造座標を有するか、又はここで当該モデルのα炭素原子の構造座標が、図３、４、５、又は６の構造座標から２.０Å未満の標準偏差を有して、該ホモログの予備的モデルを産生し、
ｃ）  該予備的モデルを、エネルギー最小化にかけて、エネルギー最小化モデルを産生し；そして
ｄ）  立体化学の制約が破られるエネルギー最小化モデルの領域を再構築して、上記ホモログの最終モデルを作り出す
を含む、前記方法。
【請求項８２】
Ａｂ１ＫＤタンパク質に結合する化合物の同定方法であって、以下の
ａ）  コンピューター・モデリング・プログラムに、請求項１に記載の結晶タンパク質の結合ポケット又はそのホモログを含む分子の構造座標セット又は３次元立体構造を提供し
ｂ）  当該コンピューターモデリング・プログラムに、化学物質の構造座標のセットを提供し、
ｃ）  当該コンピューター・モデリング・プログラムを使用して、当該化学物質と当該結合ポケットとの間の潜在的な結合又は妨害相互作用を評価し、
ｄ）  当該化学物質が、潜在的に当該タンパク質又はホモログと結合又は妨害するかを決定する、
を含む前記方法。
【請求項８３】
以下のステップ：
ｅ）  前記化学物質の構造座標又は３次元立体構造をコンピューターにより改変して、当該結合ポケットへの結合の可能性を改良し；そして
ｂ）  当該改変された化学物質が、潜在的に前記タンパク質又はホモログに結合又は妨害するかを決定する
をさらに含む請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記化学物質が前記分子に潜在的に結合するかの決定が、当該化学物質と前記タンパク質又はホモログの結合ポケットとの間の適合操作を行うこと、並びに適合操作の結果をコンピューターにより分析して、当該化学物質と結合ポケットとの間の会合又は妨害を定量することを含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
化学物質の構造座標のライブラリーが、結合する化合物を同定するために使用される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
Ａｂ１ＫＤタンパク質に結合する化合物の設計方法であって、
ａ）  コンピューター・モデリング・プログラムに、請求項１に記載される結晶タンパク質又はそのホモログの結合ポケットの構造座標を含む結合ポケットを含む分子についての構造座標のセット、或いはそこから派生される３次元立体構造を提供し；
ｂ）  構造座標のセットにより表される化学物質をコンピューターにより構築し；そして
ｃ）  当該化学物質が上記分子と結合が予期されるかを決定する
を含む、前記方法。
【請求項８７】
前記化学物質が、前記分子に潜在的に結合するかを決定することが、
当該化学物質と当該分子の結合ポケットとの間の適合操作を行い；そして
適合操作の結果をコンピューターにより分析して、当該化学物質と当該結合ポケットとの間の会合を定量するためにする
を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記結合ポケットが、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸の構造座標により規定される結合ポケットを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＧｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２をさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記結合ポケットが活性部位を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
Ａｂ１ＫＤタンパク質に関して改変された性質を有する突然変異Ａｂ１ＫＤタンパク質を作成する方法であって、以下の：
ａ）  請求項１に記載の結晶タンパク質の構造座標、図３、４、５、又は６の構造座標、及び図３、４、５、又は６の構造座標に比較したとき、２.０Å未満の当該タンパク質のα炭素原子の標準偏差を有するタンパク質の構造座標からなる群から選ばれる構造座標を有するＡｂ１ＫＤタンパク質の３次元構造を構築し、
ｂ）  モデリング法を使用して、構造部分における変化が前記変化された性質をもたらすと予期されるＡｂ１ＫＤタンパク質分子の少なくとも１の構造部分を３次元構造において同定し、
ｃ）  改変された配列であって、当該構造部分に対応する位置で１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換をコードする配列を有するＡｂ１ＫＤ突然変異タンパク質をコードする核酸分子を提供し、
ｄ）  当該核酸分子を発現して、上記突然変異体を産生する
を含み、ここで当該突然変異体が、親タンパク質に対して少なくとも１の改変された性質を有する、前記方法。
【請求項９４】
Ａｂ１ＫＤタンパク質に対して改変された性質を有する突然変異Ａｂ１ＫＤタンパク質の作成方法であって、以下の：
ａ）  結合ポケットを含む分子の３次元構造を構築し、ここで当該結合ポケットは、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２であって、請求項１に記載の結晶タンパク質の構造座標、図３、４、５、又は６の構造座標又は結合ポケットホモログの構造座標、ここで当該結合ポケット及び結合ポケットホモログのアミノ酸残基の骨格原子の標準偏差が２.０Å未満である、を有するものからなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸を含み
ｂ）  モデリング法を使用して、当該結合ポケットの少なくとも１部であって、当該部分の変化が当該改変された性質をもたらすことが予期され部分の３次元構造を同定し、
ｃ）  当該タンパク質に対応する部分での１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換をコードする改変された配列を有する突然変異体Ａｂ１ＫＤタンパク質をコードする核酸分子を提供し；そして
ｄ）  当該核酸分子を発現して、上記突然変異を提供する
を含み、ここで当該突然変異が、親タンパク質に対して少なくとも１の改変された性質を有する、前記方法。
【請求項９５】
タンパク質分子の活性部位又は結合ポケットに結合できる化合物の３次元分子構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、当該方法は以下の：
ａ）  コンピューター・プログラムに、請求項１７により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースを導入し；
ｂ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質の活性部位又は結合ポケットの３次元表示を、当該コンピューター・プログラム中で作成し；
ｃ）  当該活性部位又は結合ポケットの当該表示上に少なくとも１の結合試験化合物の３次元モデルを重ね合わせ、
ｄ）  前記試験化合物モデルが、空間的に当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の活性部位又は結合ポケットに適合するかを評価し；
ｅ）  適合する化合物が、別のタンパク質の３次元モデルであって、その構造座標がまた、前記コンピューター・プログラム中に導入され、そして他のタンパク質の３次元表示を作るために使用されるモデルに適合するかを評価し、
ｆ）  他のタンパク質に適合しないモデルの３次元分子構造座標を、コンピューターが読み取ることができるデーターベース中に記憶する
を含む、前記方法。
【請求項９６】
化合物が、Ａｂ１ＫＤタンパク質に結合するかを測定する方法であって、以下の：
ａ）  コンピューター・モデリング・プログラムに、請求項１に記載の結晶タンパク質、Ａｂ１ＫＤタンパク質、又はそのホモログを含む分子の構造座標のセット又は３次元立体構造を提供し；
ｂ）  当該コンピューター・モデリング・プログラムに、化学物質の構造座標のセットを提供し；
ｃ）  当該コンピューター・モデリング・プログラムを使用して、当該化学物質と当該結合ポケットとの間の潜在的な結合又は妨害相互作用を評価し；そして
ｄ）  当該化学物質が、潜在的に上記タンパク質又はホモログと結合するか又は妨害するかを決定する
を含む、前記方法。
【請求項９７】
Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに結合できる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、以下の：
ａ）  請求項１７により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラムに導入し；
ｂ）  当該結合ポケット内に適合するファーマコフォアを決定し；
ｃ）  複数の化合物をコンピューターによりスクリーニングして、どの化合物（単数又は複数）又はその部分（単数又は複数）が、当該ファーマコフォアに適合するかを決定し；
ｄ）  当該化合物（単数又は複数）又はその部分（単数又は複数）の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む、前記方法。
【請求項９８】
前記表示が、化合物名、化合物の化学式又は分子式、化合物の化学構造、化合物の識別表示、及び化合物の３次元分子構造座標からなる群から選ばれる、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記結合ポケットが、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸の構造座標により規定される結合ポケットを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＧｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２をさらに含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
前記結合ポケットが活性部位を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項９７に記載の方法を使用して作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース。
【請求項１０５】
請求項９７に記載の方法を使用して作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を電気的に伝達することを含む方法。
【請求項１０６】
Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットを結合できる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、以下の：
ａ）  請求項１７に作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラム中に導入し：
ｂ）  当該結合ポケットと相互作用する化学物質を決定し；
ｃ）  複数の化合物をコンピューターによりスクリーニングして、どの化合物（単数又は複数）が、当該化合物（単数又は複数）の部分構造としての部分を含むかを決定し；そして、
ｄ）  当該部分構造を含む化合物（単数又は複数）の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む、前記方法。
【請求項１０７】
前記表示が、化合物名、化合物の化学式又は分子式、化合物の化学構造、化合物の識別表示、及び化合物の３次元分子構造座標からなる群から選ばれる、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記結合ポケットが、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸の構造座標により規定される結合ポケットを含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＬｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＧｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１をさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記結合ポケットが、図３、４、５、又は６の配列に従ったＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２をさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記結合ポケットが活性部位を含む、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１３】
請求項１０６に記載される方法を使用して、作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース。
【請求項１１４】
請求項１０６に記載される方法を使用して、作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を電子的に伝達することを含む方法。
【請求項１１５】
結晶化できるＡｂ１ＫＤタンパク質。
【請求項１１６】
ヒスチジンタグに結合されたＡｂ１タンパク質の製造方法であって、以下の：
ａ）  Ａｂ１タンパク質についてのコード配列であって、ヒスチジンタグに結合された配列を含む翻訳ベクターを取得し 
ｂ）  サイズ排除クロマトグラフィーを行い；そして
ｃ）  ニッケル・キレート・カラム・クロマトグラフィーを行う
を含む、前記方法。
【請求項１１７】
精製されたＡｂ１ＫＤ又はＡｂ１ＫＤバリアント・ポリペプチド。
【請求項１１８】
前記ポリペプチドが、９８％の純度である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記ポリペプチドが、リン酸化されていない、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
Ａｂ１ポリペプチドの精製方法であって、以下：
Ａｂ１を昆虫細胞中で発現させ；
当該昆虫細胞から可溶性タンパク質画分を取得し；
２回のカラム・クロマトグラフィー手順を使用押して、精製されたＡｂ１を取得する
を含む、前記方法。
【請求項１２１】
Ｔ３１５Ｉ及びＹ３９３Ｆからなる群から選ばれる、結晶可能なＡｂ１ＫＤバリアント・タンパク質。
【請求項１２２】
前記Ａｂ１ＫＤタンパク質が、Ａｂ１ＫＤ  Ｔ３１５Ｉ又はＡｂ１ＫＤＹ３９３Ｆである、請求項５に記載の結晶。
【請求項１２３】
薬剤発見のための、請求項６〜１２２のいずれか１項に記載される方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0002]  本発明は、ｃ-Ａｂ１チロシン・キナーゼ・バリアントを含むｃ-Ａｂ１チロシン・キナーゼのキナーゼ・ドメイン（ｃ-Ａｂ１ ＫＤ）に相当するポリペプチドの結晶形態、そうした結晶の取得方法、及び高解像度Ｘ線回折構造及びそれから得られる分子構造座標に関する。本発明の結晶及びそこから得られる原子構造の情報は、例えば関連及び非関連タンパク質の結晶構造及び溶液構造を解くために有用であり、タンパク質アナログ及び改変タンパク質を同定及び/又は設計するためのスクリーニングに有用であり、そしてｃ-Ａｂ１に結合し及び/又はｃ-Ａｂ１の生物学的活性を調節する化合物、例えばｃ-Ａｂ１の阻害剤及び活性剤を同定及び/又は設計するためのスクリーニングに有用である。
【０００２】
[0001]  本出願は、ｃ-Ａｂ１チロシン・キナーゼ・ドメインの結晶及び構造と題名を付けられた２００３年５月２２日に出願された米国特許出願第60/472,870号に優先権を主張し、当該文献はその全てを本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  アベルソン非受容体型チロシン・キナーゼ（ｃ-Ａｂ１）は、その基質タンパク質をリン酸化することを介してシグナル伝達に関与する。細胞内において、ｃ-Ａｂ１は細胞質と核との間を往復し、そしてその活性は多様なメカニズムを通して、通常幻覚に制御されている。ｃ-Ａｂ１は、成長因子及びインテグリン・シグナル、細胞周期、細胞分化及び神経形成、アポトーシス、細胞接着、細胞骨格構造、及びＤＮＡ損傷及び酸化ストレスへの応答の制御に関与した。ｃ-Ａｂ１タンパク質は、およそ１１５０アミノ酸残基を含み、Ｎ-末端キャップ領域、ＳＨ３及びＳＨ２ドメイン、チロシン・キナーゼ・ドメイン、核移行配列、ＤＮＡ結合ドメイン、並びにアクチン結合ドメインから構成される。ｃ-Ａｂ１の１の重要な制御メカニズムは、少なくとも２の特定のアミノ酸残基でのリン酸化である。キナーゼ・ドメインの前のリンカー内に位置するＴｙｒ２２６のリン酸化は、ｃ-Ａｂ１タンパク質の会合状態又は自己阻害状態における当該ドメインとＳＨ３ドメインとの間の分子間相互作用を妨げると考えられている。別の主要な制御部位、Ｔｙｒ３９３は、活性部位の裂け目に隣接するキナーゼ・ドメインの活性化ループ内に現れる。Ｔｙｒ３９３のリン酸化は、活性化ループの開かれた立体構造を誘導すると考えられており、この状態では該基質結合部位が露出され、そして活性化ループの基部におけるＡｓｐ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ断片は、触媒能力を持つ立体構造を取ることができる。活性化ループ内におけるこれらの立体構造の変化は、非リン酸化ｃ-Ａｂ１の種々の形態と関連するチロシン・キナーゼ、Ｌｃｋのリン酸化形態との構造比較から主に推定された。Ａｂ１の非リン酸化構造は、ＰＤＢ内に、１ＩＥＰ （Schindler T, et al., Science. 2000 Sep 15; 289 （5486） : 1938-42 MMDB# 16291）;１Ｍ５２ （Nagar, B. , et al. , Cancer Res. 2002 Aug 1; 62 （15）: 4236-43） MMDB#20693）;１ＯＰＪ及び１ＯＰＫ（Nagar B, et al., Cell. 2003 Mar 21; 112 （6）: 859-71）として配置された。
【０００４】
[0004]  慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、９番染色体と２２番染色体との間のフィラデルフィア染色体転座と関係する。当該転座は、Ｂｅｒ遺伝子とｃ-Ａｂ１をコードする遺伝子との間の異常融合を作り出す。得られたＢｃｒ-Ａｂ１融合タンパク質は、構成的に活性なチロシン・キナーゼ活性を有する。当該増大されたキナーゼ活性は、ＣＭＬの第一原因因子であると報告されており、そして細胞の形質転換、成長因子依存性の喪失、及び細胞増殖に関与する。
【０００５】
[0005]  ２-フェニルアミノピリミジン化合物であるイマチニブ（ＳｔＩ-５７１、ＣＧＰ５７１４８、又はグリベックとも呼ばれる）は、Ｂｃｒ-Ａｂ１、ならびに２個のほかのチロシン・キナーゼ、つまりｃ-ｋｉｔ及び血小板由来成長因子受容体の特異的かつ強力な阻害剤として同定されてきた。イマチニブは、これらのタンパク質のチロシン-キナーゼ活性を妨害する。ｃ-Ａｂ１のキナーゼドメインに結合するイマチニブの結晶構造により、当該化合物がｃ-Ａｂ１タンパク質内の広範な結合部位を占めるということが示された。とりわけ、当該広範な結合部位は、ｃ-Ａｂ１の不活性化状態と似ている特異的立体構造があって初めて存在し；ｃ-Ａｂ１の活性化状態において、活性化ループのＡｓｐ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ断片は、当該結合部位の一部を占め、こうしてイマチニブによる占有を妨害する。さらに、イマチニブの結合は、タンパク質内、特にＰ-ループにおけるさらなる立体構造の変化を誘導するようである。イマチニブは、ＣＭＬの全ての段階を治療する効果的な治療薬であると証明されてきた。しかしながら、かなり進行した段階の又は急性転化ＣＭＬを患う患者の大部分は、薬剤への抵抗性を発達させるため、継続されたイマチニブ治療にもかかわらず再発を生じる。当該抵抗性の分子的原理は、高い頻度で、Ｂｃｒ-Ａｂ１のキナーゼドメインのイマチニブ抵抗性バリアントの出現である。当該バリアントにおいて一般的に観測される目だったアミノ酸置換は、Ｇｌｕ２５５Ｌｙｓ、Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅ、Ｍｅｔ３５１Ｔｈｒ、及びＴｙｒ３９３Ｐｈｅである。Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅの場合、Ｉｌｅ側鎖は、イマチニブ結合を立体的に直接妨げうるが、ある他のアミノ酸置換の結果は、イマチニブを結合できるｃ-Ａｂ１タンパク質の立体構造の不安定化、又は代わりの形態、特に活性化形態の安定化であると提案される。
【０００６】
[0006]  本発明は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤバリアント、例えばＴ３１５Ｉ及びＹ３９３Ｆを含むｃ-Ａｂ１ ＫＤのキナーゼ・ドメインの３次元構造を提供する。ｃ-Ａｂ１の３次元構造は、例えばタンパク質キナーゼ活性を調節できる新規治療用化合物であり、かつ癌、例えば白血病、例えば急性白血病、及び腫瘍、例えば消化管間質腫瘍；白髪；神経編成性疾患；代謝性疾患；及び心血管疾患などのヒト・シグナル伝達キナーゼ活性により媒介される病気の治療のための新規治療用化合物を同定するため有用でありうる。
【０００７】
[0007]  標的タンパク質の３次元構造の知識は、リガンドの相補的表面及びそのタンパク質表面のトポグラフィーを定義することによって、ドラッグ・デザインのための構造に基づくアプローチの重要な基礎を提供する。それゆえ、本発明において記載されるｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質の構造の知識は、タンパク質キナーゼ活性の新規かつ特異的調節薬、並びに異常なｃ-Ａｂ１発現又は活性に関与する疾患に有用な診断化合物及び医薬化合物の同定、設計、又は開発に有用でありうる。当該構造の知識はまた、遺伝子治療に有用でありうる。例えば、当該構造座標は、より安定なｃ-Ａｂ１又はｃ-Ａｂ１の他の改変形態を作るために有用でありうる。ｃ-Ａｂ１ ＫＤのリン酸化形態の分子構造座標を得る能力は、以前には認識されていなかった。当該構造の知識はまた、例えばグリーベック抵抗性などのｃ-Ａｂ１阻害剤に対する抵抗性の様式を理解するために有用でありうる。野生型Ａｂ１の構造は、例えばＡｂ１の抵抗性形態の構造を設計するために使用されうる。
【０００８】
[0008]  本明細書中における文献の引用は、全ての文献が関連のある従来技術であるということを認めるものとして意図されない。今日までの全ての記述又は文献の内容についての説明は、出願人に利用できる情報に基づいており、そして当該文献の日付又は内容の正確性を認めるものではない。
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約
[0009]  本発明は、リン酸化ｃ-Ａｂ１ ＫＤ及びｃＡｂ１ＫＤバリアントを含むｃ-Ａｂ１ ＫＤの結晶、例えばリン酸化形態におけるＴｈｒ３１５Ｉｌｅ及びＴｙｒ３９３Ｐｈｅ、並びにＴｈｒ３１８Ｉｌｅ及びＴｙｒ３９３Ｐｈｅ・Ａｂ１ＫＤ、原子の詳細におけるその分子構造、該構造のホモログ及び突然変異体の結晶、ｃ-ＡＢ１の活性を調節する化合物を同定及び設計するために当該構造を使用する方法、同定された及び／又は設計された化合物の製造方法、ｃ-Ａｂ１活性を調節することによる細胞成長及び／又は生存度に影響を与え、そうして疾患又は病気を治療する方法、並びに突然変異ｃ-Ａｂｌを同定及び設計する方法を提供する。ｃ-Ａｂ１ ＫＤの知識は、細胞増殖、成長因子及びインテグリンのシグナル、細胞周期、細胞分化及び神経形成、アポトーシス、細胞接着、細胞骨格構造、ＤＮＡ損傷への応答及び酸化ストレス、細胞の遊走、分化、細胞骨格組織化、遺伝子発現、細胞周期の進行、及び細胞死を制御する新規の化合物の開発において有用でありうる。ｃ-Ａｂ１ ＫＤの構造の知識は、関連するリガンド結合部位を有するキナーゼ、例えばｓｒｃ、及び他のチロシンキナーゼ、例えばｃ-ｋｉｔ及び血小板由来成長因子受容体の構造をモデル化するために使用されうる。
【００１０】
[0010]  「ｃ-Ａｂ１活性」は、ｃ-Ａｂ１タンパク質又はｃ-Ａｂ１キナーゼドメインのみのｃ-Ａｂ１キナーゼ活性、結合活性、免疫原性、又は酵素活性のいずれか、を意味する。こうして、ｃ-Ａｂ１活性は、適切な場合、全ｃ-Ａｂ１分子の全て又は一部を使用してアッセイされてもよい。例えば、ｃ-Ａｂ１キナーゼ・ドメインのみは、キナーゼ活性、結合活性、免疫原性、又は他のｃ-Ａｂ１の酵素的活性において使用されてもよい。同様に、ｃ-Ａｂ１タンパク質の調節薬、阻害剤、又は活性剤はまた、ｃ-Ａｂ１キナーゼドメインの調節薬、阻害剤、又は活性剤であることがあり、そしてｃ-Ａｂ１活性の調節、阻害、又は活性化は、ｃ-Ａｂ１キナーゼドメインの活性を調節、阻害、又は活性化をアッセイすることにより評価されうる。また、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ活性がアッセイされる場合、ｃ-Ａｂ１ ＫＤに加えて、ｃ-Ａｂ１分子の一部が、アッセイにおいて使用されうる。こうして、例えば本発明が、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの調節、阻害、又は活性化をアッセイすることを記載する場合、代わりにアッセイは、ｃ-Ａｂ１の調節、阻害、活性化を決定するために行われ得る。
【００１１】
[0011]  こうして、一の態様では、本発明は、精製されたｃ-Ａｂ１ ＫＤ、及びｃ-Ａｂ１ ＫＤの精製方法を提供する。回折品質の結晶を製造するために使用されるように、ｃ-Ａｂ１ ＫＤは十分に純粋でありうる。回折品質の結晶を得る容易さのため、精製されたｃ-Ａｂ１ ＫＤは、主に、又は完全にリン酸化状態であってもよい。
【００１２】
[0012]  こうして、一の態様では、本発明は、好ましい結晶形態におけるｃ-Ａｂ１又はｃ-Ａｂ１ ＫＤペプチドを含む結晶を提供する。本発明の幾つかの実施態様では、当該結晶は、回折品質である。本発明の結晶は、例えば、野生型ｃ-Ａｂ１ ＫＤの結晶、変異型ｃ-Ａｂ１ ＫＤの結晶、自然結晶、重原子誘導体結晶、及びｃ-Ａｂ１ ＫＤホモログの結晶又はｃ-Ａｂ１ ＫＤ突然変異体、例えば非限定的に、セレノメチオニン又はセレノシステイン突然変異体、アミノ酸残基の保存的変異を含む突然変異体、及び切り詰め又は延長突然変異体などの結晶を含む。
【００１３】
[0013]  本発明の結晶はまた、共結晶を含み、ここで結晶化されたｃ-Ａｂ１ ＫＤは、１以上の化合物、例えば非限定的に、コファクター、リガンド、基質、基質アナログ、阻害剤、活性剤、アゴニスト、アンタゴニスト、調節薬、アロステリック・エフェクターなどと会合して、結晶共複合体を形成する。そうした化合物は、結晶内におけるｃ-Ａｂ１ ＫＤの触媒部位又は活性部位に結合してもよいし、しなくてもよい。或いは、そうした化合物は、結晶内のｃ-Ａｂ１ ＫＤの別の結合ポケットと安定して相互作用する。共結晶は、自然の共結晶でありうる。ここで該結晶は、実質的に純粋であるか、又は該結晶は、重原子誘導体の共結晶であってもよい。ここで共複合体は、１以上の重金属原子、好ましくは異常分散を促進する重金属原子を付随する。
【００１４】
[0014]  他の実施態様では、本発明の結晶は、結晶ポリペプチドの高解像度、例えば３Åよりよい解像度、又は少なくとも１Å〜約３Å、及びより典型的には１.５Å〜２Å又は約２Å或いは２.５Å又は約２.５Åの解像度の３次元Ｘ線回折構造を決定することを許容するために十分な品質である。
【００１５】
[0015]  幾つかの実施態様では、結晶は、以下のａ＝８５.３Å＋／-２％、ｂ＝８５.３Å＋／-２％、ｃ＝２３０.５Å＋／-２％、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°、及びＰ４１ ２１ ２の空間群；又はａ＝１０６.６Å＋／-２％、ｂ＝１３１.４Å＋／-２％、ｃ＝５６.３Å＋／-２％、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°、及びＰ４１ ２１ ２の空間群；又はａ＝１０６.１Å＋／-２％、ｂ＝１３２.７Å＋／-２％、ｃ＝５６.５Å＋／-２％、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°、及びＰ２１ ２１ ２の空間群；又はａ＝１０５.６Å、ｂ＝１３１.３Å、ｃ＝５７Å、ａ＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°、及びＰ２１ ２１ ２の空間群で表される単位セルにより特徴付けられる。
【００１６】
[0016]  本発明はまた、本発明の結晶の製造方法を提供する。一般的に、本発明の結晶は、実質的に純粋なポリペプチドを、該ポリペプチドを沈殿させるために必要な濃度より少し低い濃度で沈殿物を含む緩衝水溶液中に溶解することによって成長させる。沈殿条件を作り出すために、次に水を制御された蒸発により取り除き、これを、結晶が形成し、そして結晶の大きさが適切な大きさになるまで維持した。
【００１７】
[0017]  本発明の共結晶は、上記方法に従って製造された自然結晶を、所望の共複合体の化合物を含む液体中に浸すことにより製造される。或いは、共結晶は、上記される方法に従って化合物の存在下でポリペプチドを共結晶化することにより製造されてもよい。
【００１８】
[0018]  本発明の重原子誘導体結晶は、重原子の塩又は有機金属化合物を含む溶液中に自然結晶又は上記方法に従って製造された共結晶を浸すことにより製造されうる。或いは、重原子誘導体結晶は、自然結晶を製造するための上記方法に従って、改変アミノ酸、例えばセレノメチオニン及び／又はセレのシステイン残基を含むポリペプチドを結晶化することにより製造されてもよい。
【００１９】
[0019]  本発明のさらに別の実施態様では、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ結晶の３次元構造を決定する方法であって、本発明の結晶を製造するステップ；及び該結晶をＸ線回折により分析して、３次元構造を決定するステップを含む方法が提供される。言い換えると、本発明は、３次元構造情報（又は「データー」）を、本発明の結晶から与える。そうした情報は、結晶及び／又は共結晶のｃ-Ａｂ１ ＫＤの３次元構造を規定する構造座標の形でありうる。或いは、当該構造座標は、結晶中のｃ-Ａｂ１ ＫＤの部分の３次元構造を規定してもよい。ｃ-Ａｂ１ ＫＤの一部の非限定的な例は、触媒部位又は活性部位、及び結合ポケットを含む。構造座標情報は、他の構造情報、例えば分子構造座標のベクトル表示などを含んでもよいし、そして場合により電子形態のデーターベースの形態で貯蔵又はコンパイルされうる。
【００２０】
[0020]  本発明はこうして、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの結合ポケットの３次元分子構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、ｃ-Ａｂ１ ＫＤを定義する３次元構造座標を、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの結晶から取得し；そして当該構造座標を、コンピューター中に導入して、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ又は該結合ポケットの分子構造座標を含むデーターベースを作成することを含む方法を提供する。本発明はまた、そうした方法により作成されたデーターベースを提供する。
【００２１】
[0021]  代わりの実施態様では、本発明は、実際の構造情報の全て又は一部は存在する必要がないように、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの３次元構造を規定する情報の全て又は一部になる構造情報の識別名の使用を提供する。例えば、及び発明を制限することなく、３次元構造、部分構造、又は形状を規定する構造座標を参照する識別名は、実際の座標情報の代わりに使用されてもよい。そうした参照構造情報は場合により、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの３次元構造を規定するために使用される識別名から分離して貯蔵される。非限定的な例は、αへリックス構造の識別名を、ラセン状構造の座標の代わりに使用することである。
【００２２】
[0022]  別の態様では、本発明は、本発明の結晶、又は一部若しくはその基質から得られる３次元構造情報を記憶したコンピューター機械が読み取り可能な媒体を提供する。本発明はまた、構造情報を、コンピューターが読み取り可能な媒体に、場合によりコンピューターが読み取り可能なデーター・ベースに導く方法を提供する。機械又はコンピューターが読み取り可能な媒体であって、その中に構造情報が記憶される媒体の類型は、典型的に磁気テープ、フロッピー（登録商標）ディスク（登録商標）、ハードディスク記録媒体、光学ディスク、ＣＤ-ＲＯＭ、電気的記録媒体、例えばＲＡＭ又はＲＯＭ、及びこれらの記録媒体のいずれかのハイブリッドを含む。そうした媒体は、スキャン装置により読まれ、そして例えば光学文字認識（ＯＣＲ）ソフトウェアで３次元構造へと変換されうる紙をさらに含む。一の例では、紙のシートは、ＯＣＲソフトウェアにより集計表へと変換される本発明の結晶ポリペプチドの分子構造座標を表す。本発明の当該機械が見取り可能な媒体は、さらに３次元構造の表示に有用である更なる情報、例えば非限定的に、熱パラメーター、鎖識別名、及び接続性情報を含む。
【００２３】
[0023]  種々の機械が読み取り可能な媒体は、本発明中に提供される。一の態様では、機械が読み取り可能な媒体は、本発明の結晶、又はその断片又は一部のいずれかの３次元構造表示を規定する情報を記憶された媒体として提供される。本発明は、分子構造座標、例えば図３、４、５、又は６の座標の形態であってよい。代わりに、本発明は、特定の３次元構造、基質、又は形状を参照するために使用される識別名を含んでもよい。機械が読み取り可能な媒体は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ活性部位、活性部位ホモログ、結合ポケット、又は結合ポケット・ホモログを含むタンパク質分子の分子構造座標を記憶されうる。種々の機械が読み取り可能な本発明の媒体は、タンパク質に結合する化合物又は分子と会合するｃ-Ａｂ１ ＫＤ結合ポケット又は結合ポケット・ホモログを含む分子の、例えば共結晶における対応するデーターを含んでもよい。
【００２４】
[0024]  分子構造座標及び機械が読み取り可能な本発明の媒体は、様々な使用法を有する。例えば、当該座標は、他のタンパク質、例えば突然変異ｃ-Ａｂ１ ＫＤ、ｃ-Ａｂ１ ＫＤを含む共複合体、及び非関連タンパク質の３次元Ｘ線回折及び／又は溶液構造を高い解像度で解くために有用である。構造情報は、種々の分子モデリング及びコンピューターに基づいたスクリーニング適用において使用されて、例えば該結晶化ｃ-Ａｂ１ ＫＤの生物学的活性を変化させた突然変異体を理知的に設計し、そしてコンピューターにより該ポリペプチド又は該ポリペプチドの一部若しくは断片、例えばサブユニット、ドメイン、又は活性部位に結合する化合物を設計及び同定しうる。そうした化合物は、直接的に使用されうるか、医薬分野におけるリード化合物として使用されて、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ活性に影響を与える化合物を同定する。ポリペプチド、又はその一部又は断片に結合する化合物は、例えば抗菌剤として使用されてもよい。
【００２５】
[0025]  本発明はさらに、Ａｂ１ＫＤの結合ポケットを結合することができる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
Ａｂ１ＫＤの３次元表示を作り出すために使用されうる構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラムに導入し、
当該コンピューター/プログラムにおいてＡｂ１ＫＤの結合ポケットの３次元表示を作成し、
少なくとも１の結合試験化合物の３次元モデルを、上記結合ポケットの表示に重ね合わせ、
当該試験化合物モデルが、Ａｂ１ＫＤの結合ポケット中に空間的に適合するか評価し、そして
当該結合ポケットに適合する化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベースに記憶する
ことを含む方法が提供される。化合物の表示を記憶するために使用されるデーターベースは、Ａｂ１ ＫＤの構造座標を記憶するために使用されるのと同じ又は異なる形態でありうる。本発明はさらに、非限定的な例として電話による手段、コンピューターによる実現される手段、電磁波に媒介される手段、及び衛星に媒介される手段により、本発明の実施から得られる構造情報の全てを電子的に伝達することを提供する。
【００２６】
[0026]  上で記載されるように、分子構造座標及び／又はＡｂ１ＫＤ構造と関連する機械が読み取り可能な媒体は、Ａｂ１Ｋｄに結合できる化合物の３次元構造情報（又は「データー」）の作成に使用されうる。そうした情報は、場合によりＡｂ１ＫＤの構造要素と組み合わせて又はは該構造要素に関して、化合物の３次元構造を規定する構造座標の形態であってよい。幾つかの実施態様では、当該化合物構造座標は、当該タンパク質の構造座標に対して決定及び提示（又は表示）される。或いは、構造情報の識別名は、実際の構造情報の全部又は一部は、存在する必要がないように、化合物の３次元構造を規定する情報の全て又は一部を表すために使用される。例えば、そして本発明を制限することなく、化合物の構造情報が、ピロホスフェート（又はピロホスフェート・ミメティクス）部分を規定する領域を含む場合、ピロホスフェートの構造座標は、ピロホスフェートの構造を表す識別情報、例えばその名前、化学式、又は他の化学表示により置換されてもよい。Ａｂ１ＫＤに結合できる化合物のいずれかは、化学名、化学式又は分子式、化学構造、及び／又は他の同定情報により表示されてもよい。非限定的な例として、化合物ＣＨ3ＣＨ2ＯＨは、エタノール又はエチルアルコールなどの名前、ＥｔＯＨなどの短縮名、ＣＨ3ＣＨ2ＯＨ又はＣ2Ｈ5ＯＨ、又はＣ2Ｈ6Ｏなどの化学式又は分子式により表されてもよく、及び／又は２又は３次元における構造表示により表されてもよい。後者の非限定的な例は、フィッシャーの投影図、電子密度マップ及び表示、空間重点モデル、及び以下：
【化１】
2007522792.tif 000002
【化２】
2007522792.tif 000003
を含む。
【００２７】
[0027]  他の識別情報の非限定的な例は、化学情報検索サービス機関（CAS）の登録番号及び化合物を指し示す物理学的又は化学的性質（例えば、非限定的にＮＭＲスペクトル、ＩＲスペクトル、ＭＳスペクトル、ＧＣプロファイル、及び融点）を含む。当然、化合物の一部の構造（例えば、部分構造）は、全体としての化合物を同定するために使用される上記のいずれかを参照することにより同様に同定されうる。
【００２８】
[0028]  Ａｂ１ＫＤを結合できる化合物の構造情報を作成するために、本発明は、以下の：
ａ）Ａｂ１ＫＤ又はその一部の構造上に既知の化合物の構造を重ね合わせ、
ｂ）Ａｂ１ＫＤに結合する「ファーマコフォア」構造を決定し、
ｃ）化合物の部分構造（単数又は複数）を決定すること、ここで該部分構造（単数又は複数）が、Ａｂ１ＫＤと相互作用する
を含む、種々の方法を使用することを提供する。構造座標情報は、他の構造情報、例えば分子構造座標のベクトル表示などを含んでもよいし、そしてデーターベースの形態で、場合により電子的形態で記憶又はコンパイルされる。ａ）に関して、本発明は、Ａｂ１ＫＤ又はその一部、或いはＡｂ１ＫＤ結合ポケット又は結合ポケット・ホモログを含む分子の３次元構造表示を、複数の化学化合物及び化学物質でコンピューター・スクリーニングすることを含む。或いは、本発明は、Ａｂ１ＫＤに強力に結合する少なくとも１の化合物を同定する方法であって、
Ａｂ１ＫＤ結合ポケット又は結合ポケット・ホモログを含むタンパク質分子の３次元構造を構築し、又は
Ａｂ１ＫＤ結合ポケットを含む分子の３次元構造を構築し、そして
構築された構造を使用して複数の化合物をコンピューターによりスクリーニングし、そして
該構造にコンピューター上で結合する少なくとも１の化合物を同定すること
を含む方法を提供する。一の態様では、当該方法は、さらに当該化合物がＡｂ１ＫＤに結合するかを決定することを含む。
【００２９】
[0029]  ｂ）に関して、本発明は、どの化合物（単数又は複数）又はその部分（単数又は複数）が、Ａｂ１ＫＤ結合ポケット内に適合するものとして決定されたファーマコフォアに適合するかを決定する事をコンピューターによりスクリーニングすることを含む。言い換えると、化学化合物の構造は、どの化合物（単数又は複数）又はその部分（単数又は複数）が、同定されたファーマコフォアのパラメーターにより含まれるかを同定するためにスクリーニングされうる。本明細書中に使用されるとき、「ファーマコフォア」は、化学部分が、Ａｂ１ＫＤ結合ポケットに適合又は結合するために必要とされるものとして決定される構造特性を指す。これらの特性は、ファーマコフォアの基底及び励起波動関数の表示であってよく、そうした関数の既知の拡大の仕様を含む。ファーマコフォアの表示は、ファーマコフォア内に化学部分及び／又はその原子を含み、並びにその電子特性及びその３次元空間配置を含む。他の表示が使用されてもよい。なぜなら、異なる化学部分が同様の特性を有することがあるからである。非限定的な例は、同じ位置での-ＯＨ部分に類似の特性を有する、特定の位置におけるＳＨ部分の場合に見られる。ファーマコフォア内で互いに置換されてもよい化学部分は、「ホモログ」と呼ばれる。 
【００３０】
[0030]  本発明はこうして、Ａｂ１ＫＤの結合ポケットに結合できる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
コンピューター・プログラムに、当該結合ポケット内に適合するファーマコフォアを決定するＡｂ１ＫＤの３次元表示を作り出すために使用されうる構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターペースを導入し、
コンピューターにより複数の化合物をスクリーニングして、どの化合物（単数又は複数）又はその部分（単数又は複数）が、当該ファーマコフォアに適合するかを測定し、そして
当該化合物（単数又は複数）又はその部分（単数又は複数）の表示をコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶すること
を含む方法を提供する。当該データーベースは、Ａｂ１ＫＤの構造座標を記憶するために使用されるデーターベースと同じであっても又は異なってもよい。適合するファーマコフォアの決定は、当該技術分野に周知である方法のいずれかにより行われてもよい。
【００３１】
[0031]  ｃ）に関して、本発明は、どの化合物がＡｂ１ＫＤと相互作用する部分構造を含むかを決定するために、複数の化合物をコンピューターによりスクリーニングすることを含む。本発明はこうして、Ａｂ１ＫＤの結合ポケットに結合できる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作り出す方法であって、
当該結合ポケットと相互作用する化学部分を決定するＡｂ１ＫＤの３次元表示を作り出すために使用されうる構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラム中に導入し、
複数の化合物をコンピューターによりスクリーニングし、どの化合物（単数又は複数）が当該化合物（単数又は複数）の部分構造として当該部分を含むかを決定し；そして
当該化合物（単数又は複数）及び／又は当該部分の表示を、Ａｂ１ＫＤの構造座標をッ記憶するために使用されたデーターベースと同じか又は異なるコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶すること
を含む方法を提供する。
【００３２】
[0032]  本発明の１の実施態様では、本発明の他の実施態様と組み合わせて使用されうる事項では、Ａｂ１ＫＤに潜在的に結合できる少なくとも１の化合物を選別することにより、Ａｂ１ＫＤと結合できる化合物の構造情報を作成するための方法が提供される。当該方法は、本発明の結晶構造座標、図３、４、５、又は６の構造座標、及び図３、４、５、又は６の構造座標又はその一部と比較した際、約１.５Å以下、好ましくは約１.２５Å以下、好ましくは約１Å以下、好ましくは約０.７５Å以下、好ましくは約０.５Å以下、及び好ましくは約０.２５Å以下の標準偏差のα炭素原子を有するタンパク質の構造座標からなる群から選ばれる構造座標を有するＡｂ１ＫＤの３次元構造を構築するか、又はＡｂ１ＫＤ結合ポケット又は結合ポケット・ホモログを含む分子の３次元構造を構築し；そしてＡｂ１ＫＤに潜在的にに結合する少なくとも１の化合物を選択することを含む。ここで当該選択は、Ａｂ１ＫＤの構築された構造を活用して行われる。
【００３３】
[0033]  幾つかの場合、化合物を結合する際、タンパク質の立体構造が変化し得るということが予期される。有用な化合物は、当該変化した立体構造形態に結合しうる。こうして、Ａｂ１分子又はホモログに潜在的に結合する化合物を選択することにより、Ａｂ１に結合できる化合物の構造情報を与える方法が、本発明の範囲内に含まれる。ここで当該分子又はホモログは、例えばＰＳＩ・ＢＬＡＳＴサーチ、例えば非限定的にバージョン２.２.２（Altschul, S. F., et al. , Nuc. Acids Rec. 25: 3389-3402, 1997）を使用して、図２、７、又は８のアミノ酸配列に少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、そしてより好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸を含む。当該配列の好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％が当該分析において配列比較され、そしてここで当該分子又はホモログのアミノ酸の少なくとも５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、そして最も好ましくは９０％のアミノ酸は、本発明の結晶の構造座標、図３、４、５、又は６の構造座標、及び図３、４、５、又は６の構造座標と比較する際、約１.５Å以下、好ましくは約１.２５Å以下、好ましくは約１Å以下、好ましくは約０.７５以下、好ましくは０.５Å以下、及び好ましくは約０.２５Å以下の標準偏差のα炭素原子を有するタンパク質の構造座標からなる群から選ばれる構造座標を有する。或いはＡｂ１結合ポケット又は結合ポケットホモログを含む分子の３次元構造の構築し；そしてＡｂ１に強力に結合する少なくとも１の化合物の選択することを含む方法が提供される。ここで該選択は、構築された構造を活用して行われる。該選別された化合物は、Ａｂ１に結合する化合物の構造に関する情報を提供する。
【００３４】
[0034]  ひとたび作成されると、Ａｂ１に結合できる化合物の構造情報は、上でＡｂ１の構造情報について記載されるように機械が読み取り可能な形態で貯蔵されうる。
【００３５】
[0035]  本発明のさらに別の態様では、理論的ドラッグ・デザインによりＡｂＩの調節薬を同定する方法が提供され、以下：
本発明の結晶の分子構造座標に基づいて、又はＡｂ１結合ポケット又は結合ポケットホモログを含む分子の分子構造座標に基づいて、Ａｂ１の結合ポケットにおいて、アミノ酸と共有結合又は非共有結合を形成するＡｂ１の潜在的な調節薬を設計し；
当該調節薬を合成し；そして
当該潜在的な調節薬が、Ａｂ１の活性に影響を与えるかを決定すること
を含む。結合ポケットは、例えばＡｂ１の活性部位を含んでもよい。当該結合ポケットは、かわりにＡｂ１のアロステリック結合ポケットを含んでもよい。調節薬は、例えば阻害剤、活性剤、又はＡｂ１のアロステリック調節薬であってもよい。
【００３６】
[0036]  Ａｂ１の調節薬を設計する他の方法は、例えばＡｂ１活性の調節薬を同定する方法であって：
Ａｂ１の結合ポケット又は結合ポケット・ホモログを含む分子の３次元立体構造を、コンピューター・モデリング・プログラムに提供し、
当該コンピューター・モデリング・プログラムに、化学物質の構造座標のセットを提供し：
当該コンピューター・モデリング・プログラムを使用して、化学物質と当該結合ポケット又は結合ポケット・ホモログとの間の潜在的な結合又は妨害相互作用を評価し、そして
当該化学物質が、潜在的に当該分子と結合するか又は相互作用するかを決定する
ことを含む方法を含む。ここで、分子への結合は、例えばＡｂ１活性を阻害することを含む調節の可能性を指し示す。
【００３７】
[0037]  別の実施態様では、Ａｂ１活性の調節薬を設計するための方法であって：
Ａｂ１の結合ポケット又は結合ポケット・ホモログを含む分子について、構造座標のセット、又はそこから派生された３次元構造を、コンピューター・モデリング・プログラムに提供し、
当該化学物質の構造座標のセット、又はそこから派生された３次元構造を、当該コンピューター・モデリング・プログラムに提供し；
当該コンピューター・モデリング・プログラムを使用して、当該化学物質と当該結合ポケット又は結合ポケット・ホモログとの間の潜在的な結合又は妨害相互作用評価し；
当該化学物質の構造座標又は３次元立体構造をコンピューターにより改変し；そして
当該改変された化学物質が、当該分子と潜在的に結合するか又は相互作用するかを決定すること
を含む方法が提供される。ここで、当該分子への結合は、Ａｂ１活性を調節する可能性を指し示す。
【００３８】
[0038]  別の態様では、化学物質が、潜在的に上記分子に結合するかを決定することは、化学物質と、分子又は分子複合体の結合ポケット又は結合ポケット・ホモログとの間の適合操作を行い；そしてコンピューターにより適合操作の結果を分析して、化学物質と結合ポケット又は結合ポケット・ホモログとの間の会合又は妨害を定量することを含む。さらなる実施態様では、本方法はさらに、化学物質ライブラリーをスクリーニングすることを含む。
【００３９】
[0039]  Ａｂ１超節約はまた、新規に設計されうる。こうして、本発明はまた、Ａｂ１の調節薬を設計する方法であって、
Ａｂ１ＫＤの結合ポケット又は結合ポケットホモログの構造座標を有する結合ポケットを含む分子について、構造座標又はそこから派生された３次元立体構造を、コンピューター・モデリング・プログラムに提供し；
構造座標のセットにより表される化学物質をコンピューターにより構築し；そして
当該分子に結合又は当該分子を妨害することを予期された調節薬であるかを決定すること
を含む方法を提供する。ここで当該分子への結合は、Ａｂ１活性の潜在的な調節を指し示す。別の実施態様では、当該化学物質が、潜在的に当該分子に結合するかを決定することは、化学物質と分子又は分子複合体の結合ポケットとの間の適合操作を行い；そして適合操作の結果をコンピューターにより分析して、化学物質と結合ポケット又は結合ポケット・ホモログとの間の会合又は妨害を定量することを含む。
【００４０】
[0040]  さらに別の実施態様では、ひとたび調節薬が、コンピューターにより設計又は同定されると、潜在的な調節薬が供給又は合成されてもよく、次にアッセイされてＡｂ１活性を阻害するかを決定する。分子構造座標、及び／又はＡｂ１ＫＤ構造及び／又はＡｂ１ＫＤに結合できる化合物に関する機械が読み込みできる媒体は、Ａｂ１に結合できる化合物の作成に使用されうる。そうした化合物の作成方法は、Ａｂ１ＫＤ及び／又はＡｂ１ＫＤに結合できる化合物の分子構造座標に基づいたＡｂ１ＫＤの残基に結合又は相互作用しそうな化学基を含む開始化合物を製造することを含む。そうした開始化合物は、Ａｂ１残基と結合又は相互作用できる１以上の反応性部分（化学基）を含む骨格として見られうる。開始化合物は、さらにＡｂ１ＫＤ残基との増大された相互作用のため、さらなる化学基を導入することにより、Ａｂ１への結合をさらに最適化されうる。開始化合物は、こうして１以上のさらなる化学基を化合物へと導入するために使用される反応性の基を含んでもよい。さらなる基は、Ａｂ１残基との相互作用をもたらさないが、化合物のほかの特性、例えば非限定的に分解、取扱、又は貯蔵に対する安定性、親水性及び疎水性環境における可溶性、並びに化合物の総荷電量を改良する開始化合物の位置で導入される。
【００４１】
[0041]  本発明はまた、本発明の方法のいずれかに従って同定、設計、又は製造されるＡｂＩ活性の調節薬、並びにそうした調節薬を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、塩の形態であってもよく、そしてさらに医薬として許容される担体を含んでもよい。調節薬は、Ａｂ１活性部位又は結合ポケットを含むタンパク質を、当該調節薬と接触させ、そしてタンパク質の活性を活性化又は阻害するかを決定することにより、活性剤又は阻害剤として同定又は確認されうる。当該活性は、Ａｂ１活性でありうる。天然Ａｂ１タンパク質は、そうした方法において使用されうる。
【００４２】
[0042]  Ａｂ１活性の調節方法であって、Ａｂ１を本発明に従って設計又は同定された調節薬と接触させることを含む方法が、本発明中に提供される。不適切なＡｂ１活性に関する疾患又は病気を治療する方法であって、例えば個人の細胞を、本発明に従って設計又は同定されたＡｂ１調節薬と接触することにより投与する方法を含む。「不適切な活性化」という用語は、通常細胞における活性よりも高いか又は低いＡｂ１活性を指す。
【００４３】
[0043]  本発明の分子構造座標及び／又は機械が読み取り可能な媒体は、Ａｂ１ＫＤの活性部位及び結合ポケットを同定する際に使用されてもよい。そうした部位及びポケットを同定するための方法は、当該技術分野に知られている。異なるＡｂ１ＫＤの形態間の保存された構造を定義する保存された置換又はホモロジーの領域を同定するために、当該技術は、配列比較を使用することを含む。該技術は、活性部位及び結合ポケットの構造要素（例えば、アミノ酸残基及び／又はその３次元配列）を同定するために、構造を、Ａｂ１と同じ活性を有する他のタンパク質と比較することを含んでもよい。
【００４４】
[0044]  本発明の別の実施態様では、Ａｂ１に対して変えられた性質を有するＡｂ１の突然変異体を作成するための方法であって、
ａ）  本発明の結晶構造座標、図３、４、５、又は６の構造座標、及び図３、４、５、又は６の構造座標と比較される際に、約１.５Å以下、好ましくは約１.２５Å以下、好ましくは約１Å以下、好ましくは約０.７５Å以下、好ましくは約０.５Å以下、及び好ましくは約０.２５Å以下の標準偏差のタンパク質のα炭素原子を有するタンパク質の構造座標からなる群から選ばれる構造座標を有するＡｂ１ＫＤの３次元構造を構築し；
ｂ）  モデリング方法を使用して、構造部分の変化が性質の変化をもたらすことが予測されるＡｂ１ＫＤ分子の少なくとも１の構造部分で、３次元構造を同定し；
ｃ）  当該構造部分に対応する位置での１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換をコードする改変された配列を有する核酸分子を提供し；そして
ｄ）  核酸分子を発現させて、突然変異体を産生することを含む方法が提供される。ここで、該突然変異体は、親タンパク質に対して少なくとも１の変化された性質を有する。当該突然変異は、例えば変化されたＡｂ１活性を有してもよい。変化されたＡｂ１活性は、例えば、結合活性の変化、酵素活性の変化、及び免疫原性の変化、例えばここで突然変異のためタンパク質のエピトープが変化される、であってもよい。エピトープを変化させる突然変異は、例えばエピトープを含むタンパク質の領域内であってもよい。或いは、突然変異は、例えばエピトープ領域の外側の部位であるが、エピトープ領域における立体構造の変化を引き起こす部位であってもよい。当業者は、エピトープを含む領域が、連続又は非連続アミノ酸のいずれかを含んでもよいということを認識するであろう。
【００４５】
[0045]  未知構造の分子又は分子複合体についての構造情報を得るための方法であって；
分子又は分子複合体を結晶化し；
結晶化された分子又は分子複合体からＸ線回折パターンを作成し；そして
分子置換方法を使用して、当該分子の構造を解釈する
方法が本発明中に提供される。ここで当該分子置換法は、図３、４、５、又は６の構造座標、又は約２.０Å以下、好ましくは約１.７５Å以下、好ましくは約１.５Å以下、好ましくは約１.２５Å以下、好ましくは約１.０Å以下、好ましくは約０.７５Å以下の前記構造座標のα炭素原子に対する標準偏差を有する構造座標、図３、４、５、又は６の結合ポケット又は結合ポケット・ホモログの構造座標を使用する。得られた構造の座標は、本明細書中に記載されるように、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶される。
【００４６】
[0046]  本発明の別の態様では、Ａｂ１ＫＤ構造座標、或いはＡｂ１ＫＤ結合部位、活性部位、又は近接結合部位の構造座標を、理論的ドラッグ・デリバリーにおけるアンチ-ターゲットとして使用する方法が提供される。あるタンパク質標的の活性を調節する化合物を設計する際、標的の特異性を増大し、かつ副作用を低減することが所望されることが多い。該タンパク質構造情報は、該タンパク質に結合せず、該タンパク質と相互作用せず、又は該タンパク質の活性を調節しない化合物を設計するために有用である。こうして、本発明の１の態様は、標的を調節するが、Ａｂ１を調節しないか又は有害な副作用を引き起こすために十分な量においてＡｂ１を調節しない化合物の選択を手助けするために、抗標的構造の使用を含む。
【００４７】
[0047]  こうして、本発明の１の態様では、標的タンパク質の活性を調節する化合物を同定する方法であって、
ａ）  ３次元構造決定に基づいた標的タンパク質分子の活性部位の立体構造を規定する構造座標から派生される情報を、コンピューター・プログラムへと導入し；ここで該プログラムは、その３次元構造を利用又は表示し；
ｂ）  当該コンピューター・プログラム中で、上記標的タンパク質の活性部位の窪みの３次元表示を作成し；
ｃ）  当該標的タンパク質の活性部位のモデル上に、試験化合物のモデルを重ね合わせ；
ｄ）  当該試験化合物モデルが、当該標的タンパク質の活性部位中に空間的に適合するかを評価し；
ｅ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの３次元表示を、コンピューター・プログラム中に作成し；
ｆ）  当該試験化合物のモデルを、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットのモデル上に重ね合わせ；そして
ｇ）  当該試験化合物モデルが、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケット内に空間的に適合するかを評価する
を含む方法が提供される。
【００４８】
[0048]  Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットは、活性部位又は近接結合部位でありうる。当該標的タンパク質は、キナーゼでありうる。試験化合物モデルは、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケット内に空間的に適合されても又はされなくてもよい。当該方法はさらに、試験化合物とＡｂ１ＫＤタンパク質との間の会合をコンピューターにより分析する適合操作を行うことを含む。当該試験化合物は、Ａｂ１ＫＤタンパク質に比べて標的タンパク質に対して大きい効力で結合しうる。当該試験化合物は、Ａｂ１ＫＤタンパク質に結合しないようである。
【００４９】
[0049]  本発明のさらに別の態様では、Ａｂ１ＫＤホモログのホモロジー・モデリングのための方法であって；
Ａｂ１ＫＤホモログのアミノ酸配列を、Ａｂ１ＫＤのアミノ酸配列と配列比較し；
当該Ａｂ１ＫＤホモログの配列を、Ａｂ１ＫＤの構造モデル中に取り込み、ここで該モデルが、図３、４、５、又は６の構造座標と同じ構造座標を有するか、又は当該モデルのα-炭素原子の構造座標が、図３、４、５、又は６の構造座標から、約２.０Å以下の、好ましくは約１.７５Å以下の、好ましくは約１.５Å以下の、好ましくは約１.２５以下の、好ましくは約１.０Å以下の、及び好ましくは約０.７５以下の標準偏差を有して、当該ホモログの予備モデルを産生する；  
当該予備モデルをエネルギー最小化にかけて、エネルギーを最小化されたモデルを産生し；そして
立体化学の制約が破られるエネルギーを最小化されたモデルの領域を再構築して、当該ホモログの最終モデルを産生する
方法が提供される。
【００５０】
[0050]  本発明はまた、結晶形態におけるＡｂ１ＫＤ、並びにコンピューター又は機械が読み取り可能な媒体であって、そうした結晶及び/又はＡｂ１ＫＤと相互作用する化合物の三次元構造を反映する情報を含む媒体を提供する。Ａｂ１ＫＤの活性部位又は結合ポケットに結合できるが、他のタンパク質分子に結合できない化合物の３次元分子構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法が提供される。そうした方法は、
ａ）  Ａｂ１ＫＤの構造に関する情報をコンピューター・プログラムに導入し；
ｂ）  当該コンピューター・プログラム中でＡｂ１ＫＤの活性部位又は結合ポケットの３次元表示を作り出し；
ｃ）  上記活性部位又は結合ポケットの上記表示上に少なくとも１の結合試験化合物の３次元モデルを重ね合わせ；
ｄ）  当該試験化合物モデルが、Ａｂ１ＫＤの活性部位又は結合ポケット中に空間的に適合するかを評価し；
ｅ）  適合する化合物が、他のタンパク質の3次元モデルであって、ここでその構造座標が上記プログラム中に導入され、そして他のタンパク質の３次元表示を作り出すために使用される３次元モデルに適合するかを評価し；そして
ｆ）  他のタンパク質に適合しないモデルの３次元分子構造座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む。そうした方法の代わりの形態は、Ａｂ１ＫＤの活性部位又は結合ポケットに特異的に結合できる化合物の３次元分子構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成し、ここで当該方法は、
Ａｂ１ＫＤの構造座標を含むコンピューターが読み取り可能データーベースを、コンピューター・プログラム中に導入し、
当該コンピューター・プログラム中でＡｂ１ＫＤの活性部位又は結合ポケットの３次元表示を作成し、
当該活性部位又は結合ポケットの当該表示上に、少なくとも１の結合している試験化合物の３次元モデルを重ね合わせ、
上記試験化合物モデルが、Ａｂ１ＫＤの活性部位又は結合ポケット中に空間的に適合するかを評価し、
適合する化合物が、他のタンパク質の３次元モデルであって、ここで該他のタンパク質の構造座標が、上記コンピューター・プログラム中に導入され、そして該他のタンパク質の３次元表示を作り出すために使用される３次元モデルに適合するかを評価し、そして
他のタンパク質に適合しないモデルの3次元分子構造座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶すること
を含む。逆に、そうした方法は、他のタンパク質に結合するとして同定される化合物が、Ａｂ１ＫＤに結合しないということを決定するために使用されうる。そうした方法は、Ａｂ１ＫＤを、Ａｂ１ＫＤに結合しない化合物を同定するために、アンチ-ターゲットとして使用してもよい。
【００５１】
[0051]  本発明はまた、化合物とＡｂ１ＫＤの共結晶の作成を含む方法も提供する。そうした共結晶は、種々の方法で使用されても良く、例えば当該化合物及び／又はＡｂ１ＫＤ、又はその結合ポケットの構造座標を、共結晶中で決定することを含む。そうした座標は、本発明に従って、更なる用途のため、コンピューターが読み取り出来るデーターベース中に導入及び／又は記憶されうる。本発明は、化合物との共結晶中のＡｂ１ＫＤの結合ポケットを表示することを含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
本明細書中に記載された方法のいずれかにより作成されるコンピューターが読み取り可能なデーターベース中において表される結合試験化合物を製造し、
当該化合物とＡｂ１ＫＤの結合ポケットを含むタンパク質との共結晶を形成し、
当該共結晶中の上記結合ポケットの構造座標を取得し、そして
当該結合ポケット又は当該共結晶の構造座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に導入する
ことを含む方法が提供される。本発明はさらに、当該結合ポケットに結合できるように合理的に設計された化合物との共結晶におけるＡｂ１ＫＤの結合ポケットの表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作り出す方法を提供することにより、合理的な化合物デザインと、そうした方法との組合せをさらに提供する。ここで該方法は、
本明細書中で記載された方法のいずれかにより作成されたコンピューターが読み取り出来るデーターベース中に表された結合試験化合物を製造し、
当該化合物と、Ａｂ１ＫＤの結合ポケットを含むタンパク質との共結晶を形成し、
当該共結晶中の当該結合ポケットの構造座標を取得し、そして
当該結合ポケット又は当該共結晶の構造座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に導入すること
を含む。
【００５２】
[0052]  こうして、幾つかの実施態様では、本発明はＡｂ１又はＡｂ１ＫＤタンパク質、或いは機能性Ａｂ１ＫＤタンパク質サブユニットを結晶形態で提供する。該タンパク質は、重原子誘導体結晶であってもよく、；該タンパク質は、突然変異体であってもよい。幾つかの態様では、結晶タンパク質は、図３、４、５、又は６の構造座標のッセットに実質的に類似する構造座標のセットにより特徴付けられる。いくつかの態様では、本発明は、Ａｂ１ＫＤタンパク質及びリガンドを含む結晶を提供する。
【００５３】
[0053]  Ａｂ１タンパク質に結合するリガンドを同定する方法であって、以下の；
ａ）試験リガンドとＡｂ１ＫＤタンパク質の共結晶を形成し；
ｂ）Ｘ線結晶学を使用して当該共結晶を分析し；そして当該分析を使用して、当該試験リガンドがＡｂ１タンパク質に結合するかを決定することを含む
を含む方法も本発明中に提供される。
【００５４】
[0054]  共結晶は、Ａｂ１ＫＤタンパク質結晶を、当該試験リガンドを含む溶液中に浸すことにより得られうる。
【００５５】
[0055]  共結晶は、Ａｂ１ＫＤタンパク質を、当該試験リガンドの存在下で共結晶化することにより得られうる。
【００５６】
[0056]  本発明の結晶タンパク質の３次元構造表示に相当する情報を記録された機械が読み取り可能な媒体も、本発明中に提供される。
【００５７】
[0057]  当該機械が読み取り可能な媒体は、図３、４、５、又は６の分子構造座標、或いは当該座標の少なくとも５０％を記憶されてもよい。
【００５８】
[0058]  当該機械が読み取り可能な媒体は、図３、４、５、又は６の分子構造座標、或いは当該座標の少なくとも８０％で記録されてもよい。
【００５９】
[0059]  当該機械が読み取り可能な媒体は、Ａｂ１ＫＤタンパク質結合ポケットを含むタンパク質分子の分子構造座標を記録されてもよい。当該結合ポケットは、例えば、活性部位又は近接結合部位を含んでもよい。
【００６０】
[0060]  本発明の結合ポケットは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ又はＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、及びＰｈｅからなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸をみうる。結合ポケットは、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ又はＩｌｅ、Ｍｅｔ、及びＬｅｕを含んでもよい。結合ポケットはさらに、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＡｓｐ、又はＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、及びＰｈｅに一致するアミノ酸をさらにふくんでもよい。
【００６１】
[0061]  本発明の結合ポケットは、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、Ｌｅｕ３７０、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、Ａｓｐ３８１、Ｔｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸を含みうるか、図３、４、５、又は６の構造座標を有するか、又は該結合ポケットと結合ポケットのホモログのアミノ酸残基の骨格原子の標準偏差が２.０Å未満である、結合ポケット・ホモログの構造座標により表される構造座標を有する。
【００６２】
[0062]  結合ポケットは、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５又はＩｌｅ３１５、Ｍｅｔ３１８、及びＬｅｕ３７０を含んでもよい。当該結合ポケットは、さらに少なくとも１、少なくとも２、又は少なくとも３のアミノ酸であって、Ｇｌｕ３１６、Ａｓｎ３２２、及びＡｓｐ３８１に対応するアミノ酸を含んでもよいか、又はさらに少なくとも１、少なくとも２、又は少なくとも３のアミノ酸であって、図３、４、５、又は６の配列に従ったＴｙｒ２５３、Ｐｈｅ３１７、Ｇｌｙ３２１、及びＰｈｅ３８２に対応するアミノ酸を含んでもよい。
【００６３】
[0063]  当該結合ポケットは、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、及びＳｅｒからなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸を含んでもよい。
【００６４】
[0064]  当該結合ポケットは、Ａｌａ３３７、Ｌｅｕ３４０、Ｌｅｕ３４１、Ａｌａ３４４、Ｌｅｕ４２９、Ｉｌｅ４３２、Ａｌａ４３３、Ｇｌｙ４６３、Ｃｙｓ４６４、Ｐｒｏ４６５、Ｌｙｓ４６７、Ｖａｌ４６８、Ｍｅｔ４７２、Ｐｈｅ４９３、Ｍｅｔ４９６、Ｇｌｙ４９９、及びＳｅｒ５００からなる群から選ばれる少なくとも３個のアミノ酸を含んでもよい。
【００６５】
[0065]  そうした機械が読み取り可能な媒体中に記憶された情報の全て又は一部を電気的に伝達する方法も提供される。
【００６６】
[0066]  本発明はまた、Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの３次元分子構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
ａ）  当該タンパク質又は当該タンパク質の結合ポケットを規定する３次元構造座標を、当該タンパク質の結晶から取得し、そして
ｂ）  当該構造座標を、コンピューター中に導入して、当該タンパク質又は結合ポケットの分子構造座標をふくむデーターベースを作成すること
を含む方法を提供する。
【００６７】
[0067]  当該タンパク質の結合ポケットは、少なくとも１のリガンドとの共複合体の一部であってもよい。
【００６８】
[0068]  当該コンピューターは、当該構造座標を使用して、当該結合ポケットを含む３次元分子構造を利用又は表示できてもよい。
【００６９】
[0069]  そうした方法、並びにそうしたコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を電子的に伝達することを含む方法により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースも提供される。
【００７０】
[0070]  本発明はまた、Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに結合できる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
ａ）  本発明の方法により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラム中に導入し；
ｂ）当該コンピューター・プログラム中に当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの３次元表示を作成し；
ｃ）  当該結合ポケットの当該表示上に、少なくとも２個の結合試験化合物の３次元モデルを重ね合わせ；
ｄ）  当該試験化合物モデルが、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに空間的に適合するかを評価し；そして
ｅ）  結合ポケットに適合する化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む方法を提供する。
【００７１】
[0071]  本方法はさらに、
ｆ）  当該コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に表された結合試験化合物を製造し；
ｇ）  結合アッセイにおいて、当該化合物を、Ａｂ１ＫＤタンパク質結合ポケットを含むタンパク質と接触させ；
ｈ）  当該アッセイにおいて、当該試験化合物が、当該タンパク質に結合するかを決定し；そして
ｉ）  当該アッセイにおいて当該タンパク質に結合する化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベースに導入する
を含んでもよい。いくつかの方法では、ｉ）において、当該表示を当該データーベースに記憶する。
【００７２】
[0072]  本発明の化合物の表示は、例えば、当該化合物の化合物名、当該化合物の化学式又は分子式、当該化合物の化学構造、当該化合物の識別名、及び当該化合物の３次元分子構造座標からなる群から選ばれてもよい。
【００７３】
[0073]  結合ポケットの３次元表示の作成は、図３、４、５、又は６に記載される対応残基の構造座標から、２.０Å未満である結合ポケットのアミノ酸残基の骨格原子の標準偏差を有する構造座標の使用を含んでもよい。
【００７４】
[0074]  幾つかの態様では、当該少なくとも１の結合試験化合物は、以下の：
ｉ）  低分子データーベースから化合物を選択し、
ii）  Ａｂ１ＫＤの既知の阻害剤、基質、反応中間体、又は反応生成物若しくはその一部を改変し、
iii）  当該化合物に化学断片又は化学基を構築し、そして
iv）  当該化合物の新規のリガンドを設計する
から選ばれる方法により選ばれる。
【００７５】
[0075]  幾つかの態様では、試験化合物モデルが適合するかの評価は、当該モデルを、Ａｂ１ＫＤ結合ポケットのモデルに結合させ、及び／又はエネルギーの最小化を行うことによる。
【００７６】
[0076]  本発明の別の方法は、化合物と共結晶化されたＡｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、    
ａ）コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に表される結合試験化合物を製造し：
ｂ）当該化合物とＡｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットを含むタンパク質との共結晶を形成し；
ｃ）共結晶中の当該結合ポケットの構造座標を取得し；そして
ｄ）当該結合ポケット又は当該共結晶の構造座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に導入する
を含む方法が提供される。
【００７７】
[0077]  当該方法は、当該共結晶における化合物の構造座標を、当該データーベース中に導入することをさらに含んでもよい。
【００７８】
[0078]  当該コンピューターは、当該構造座標を使用して、当該結合ポケットの３次元構造を利用又は表示することができうる。
【００７９】
[0079]  本発明は、当該Ａｂ１ＫＤを、化合物と接触することを含むＡｂ１ＫＤタンパク質活性を調節する方法を提供し、ここで該化合物は、本発明の方法により作成されたデーターベース中に表される。
【００８０】
[0080]  本発明により作成されたコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に含まれる座標により表される３次元分子構造を含む化合物を作成する方法であって、Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケット内に稀有号する当該化合物を合成する方法、並びにＡｂ１ＫＤタンパク質活性を調節する方法であって、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質を、そうした化合物と接触することを含む方法が提供される。
【００８１】
[0081]   当該方法は、Ａｂ１ＫＤ活性部位又は結合ポケットを含むタンパク質の活性化剤又は阻害剤を同定するために使用され、該方法は、
ａ）  本発明の化合物を作成し；
ｂ）  Ａｂ１ＫＤ活性部位又は結合ポケットを含むタンパク質と当該化合物を接触し、そして
ｃ）  潜在的な調節因子が、当該タンパク質の活性を活性化するか又は阻害するかを決定する
を含む。そうした化合物は、例えば活性化剤又は阻害剤であってもよい。
【００８２】
[0082]  Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットを結合できるよう合理的に設計された化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
ａ）  本発明のタンパク質構造座標のコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラム中に導入し；
ｂ）  当該コンピューター・プログラム中に、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質又はその結合ポケットの３次元表示を作成し；
ｃ）  当該表示の結合ポケットのアミノ酸と非共有結合を形成する化合物の３次元モデルを設計し；
ｄ）  当該化合物を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む方法が、本発明中に提供される。
【００８３】
[0083]  当該方法は、さらに
ｅ）  当該コンピューターが読み取り可能なデーターベース内に含まれる座標により表される３次元分子構造を含む結合試験化合物を製造し；
ｆ）  結合アッセイにおいて、当該化合物を、Ａｂ１ＫＤタンパク質の当該結合ポケットを含むタンパク質と接触し；
ｇ）  当該アッセイにおいて、当該化合物が当該タンパク質に結合するかを決定し；そして
ｈ）  当該アッセイにおいて当該タンパク質に結合する化合物の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に導入する
を含んでもよい。   
【００８４】
[0084]  当該結合ポケットに結合できるために合理的に設計された化合物と共結晶を作るＡｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットの表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
ａ）  本発明のコンピューターが読み取り可能なデーターベース中に表示される結合試験化合物を製造し；
ｂ）  当該化合物と、Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットを含むタンパク質との共結晶を形成し；
ｃ）  当該共結晶における当該結合ポケットの構造座標を取得し；そして
ｄ）  当該結合ポケット又は当該共結晶の結合座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に導入する
を含む方法も提供される。
【００８５】
[0085]  本方法は、当該共結晶内の当該化合物の構造座標を、当該データーベース中に導入することをさらに含んでもよい。
【００８６】
[0086]  そうしたコンピューターが読み取り可能なデーターベースの全て又は一部を、電子的に伝達する方法も提供される。
【００８７】
[0087]  本発明はまた、未知の構造の分子又は分子複合体についての構造情報を含むコンピューターが読み取り可能なデーターを作成する方法であって、
ａ）  当該分子又は分子複合体の結晶形態からのＸ線回折パターンを作成し；
ｂ）  分子置換方法を使用して、当該分子の構造を解明し；ここで当該分子置換法は、Ａｂ１の結晶タンパク質又は図３、４、５、又は６の構造座標、或いはそのサブセットであって結合ポケットを含むもの、図３、４、５、又は６の結合ポケットの構造座標、或いは当該構造座標のα炭素原子に対して２.０Å未満の標準偏差を有する構造座標を使用する；そして
ｃ）  得られた構造の座標をコンピューターが読み取り可能なデーターベース内に記憶する
を含む方法を提供する。
【００８８】
[0088]  Ａｂ１ＫＤタンパク質ホモログの構造をホモロジー・モデリングする方法であって、
ａ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質ホモログのアミノ酸配列を、Ａｂ１ＫＤタンパク質のアミノ酸配列と配列比較し；
ｂ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質ホモログの配列を、Ａｂ１ＫＤタンパク質の構造モデルであって、ここで当該モデルは、Ａｂ１の結晶タンパク質の構造座標、又は図３、４、５、又は６の構造座標と同じ構造座標を有するか、又は当該モデルのα炭素原子の構造座標が図３、４、５、又は６の構造座標から２.０Å未満の標準偏差を有する構造モデル中に組み込み、当該ホモログの予備モデルを産生し；
ｃ）  当該予備モデルをエネルギーの最小化にかけて、エネルギー最小化モデルをもたらし；そして
ｄ）  立体化学の制約が破られたエネルギー最小化モデルの領域を再構築して、当該モデルの最終モデルを産生する
を含む方法が提供される。
【００８９】
[0089]  本発明の別の態様では、Ａｂ１ＫＤタンパク質に結合する化合物を同定する方法であって、以下の：
ａ）  Ａｂ１の結晶タンパク質の結合ポケット、又はそのホモログを含む分子の構造座標又は３次元立体配置のセットを、コンピューター・プログラムに提供し；
ｂ）  化学物質の構造座標のセットを、当該コンピューター・モデリング・プログラムに提供し；
ｃ）  当該コンピューター・モデリング・プログラムを使用して、当該化学物質と当該結合ポケットとの間の潜在的な結合作用又は妨害作用を評価し；そして
ｄ）  当該化学物質が、潜在的に当該タンパク質又はホモログに結合又相互作用するかを決定する
を含む方法が提供される。
【００９０】
[0090]  当該方法は、さらに以下のステップ：
ｅ）  当該化学物質の３次元立体構造又は構造座標をコンピューターにより改変して、当該結合ポケットに結合する可能性を改良し；そして
ｂ）  当該改変された化学物質が、潜在的に当該タンパク質又はホモログに結合又は相互作用するかを決定する
をさらに含んでもよい。
【００９１】
[0091]  当該化学物質が、潜在的に当該分子に結合するかを決定する事は、例えば、
化学物質と当該タンパク質又はホモログの結合ポケットとの間の適合操作を行うこと、及びタンパク質又はホモログのポケットを結合し；そして
適合操作の結果をコンピューターにより分析して、化学物質と結合ポケットとの間の会合又は妨害を定量する
を含んでもよい。
【００９２】
[0092]  幾つかの方法では、化学物質の構造座標のライブラリーは、結合する化合物を同定するために使用されてもよい。
【００９３】
[0093]  Ａｂ１ＫＤタンパク質に結合する化合物を設計するための方法が提供され、該方法は、
ａ）  Ａｂ１、そのホモログの結晶タンパク質の結合ポケットの構造座標を含む結合ポケットを含む分子についての構造座標のセット、又はそれから派生される３次元立体構造を、コンピューター・モデリング・プログラムに提供し、；
ｂ）  構造座標のセットにより表される化学物質をコンピューターにより構築し；そして
ｃ）  当該化学物質が、当該分子に結合することが予期されるかを決定する
を含む方法が提供される。
【００９４】
[0094]  当該化学物質が、当該分子に潜在的に結合するかを決定する上記決定は、例えば、化学物質と当該分子の結合ポケットとの間の適合操作を行い、そして適合操作の結果をコンピューターにより分析して、化学物質と当該結合ポケットとの間の会合を定量することを含んでもよい。
【００９５】
[0095]  Ａｂ１ＫＤタンパク質に対して変化させられた性質を有する突然変異Ａｂ１ＫＤタンパク質を作成する方法であって、
ａ）  Ａｂ１ＫＤの結晶タンパク質の構造座標、図３、４、５、又は６の構造座標、及び図３、４、５、又は６の構造座標に比較した際に２.０Å未満の当該タンパク質のα炭素原子の標準偏差を有するタンパク質の構造座標からなる群から選ばれる構造座標を有するＡｂ１ＫＤタンパク質の３次元構造を構築し、
ｂ）  モデリング方法を使用して、３次元構造において、Ａｂ１ＫＤタンパク質分子の構造部分の少なくとも１の構造部分を同定し、ここで当該構造部分における変動は、当該変えられた性質をもたらすことを予期される；
ｃ）  当該構造部分に対応する位置において、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換をコードする改変配列を有するＡｂ１ＫＤ突然変異タンパク質をコードする核酸分子を提供し；そして
ｄ）  当該突然変異体を提供するための核酸分子を発現し；ここで当該突然変異体が親タンパク質に比べて少なくとも１の改変された性質を有する；
を含む方法が提供される。
【００９６】
[0096]  Ａｂ１ＫＤタンパク質に比べて、改変された性質を有する突然変異Ａｂ１ＫＤタンパク質を作成する方法であって、
ａ）  Ａｂ１の結晶タンパク質の構造座標、図３、４、５、又は６の構造座標、又は当該結合ポケットと結合ポケットホモログのアミノ酸残基の骨格原子の標準偏差が、２.０Å未満である、結合ポケット・ホモログの構造座標を有する結合ポケットを含む分子の３次元構造を構築し；
ｂ）  モデリング方法を使用して、当該部分における変化が、当該改変された性質をもたらすことが予期される当該結合ポケットの少なくとも１の部分を３次元構造において同定し；
ｃ）  当該部分に対応する位置で、１以上のアミノ酸の欠失、挿入、又は置換をコードする改変配列を有する突然変異Ａｂ１ＫＤタンパク質をコードする核酸分子を提供し；そして
ｄ）  当該核酸分子を発現して、親タンパク質に比べて少なくとも１の改変された性質を有する当該突然変異体を産生する
を含む方法が提供される。
【００９７】
[0097]  タンパク質分子の活性部位又は結合ポケットに結合できる化合物の３次元分子構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
ａ）  Ａｂ１又はＡｂ１ＫＤの構造座標のコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラムに導入し；
ｂ）  当該コンピューター・プログラム中で、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の活性部位又は結合ポケットの３次元表示を作成し；
ｃ）  当該活性部位又は結合ポケットの当該表示上に、少なくとも１の結合試験化合物の３次元モデルを重ね合わせ、
ｄ）  当該試験化合物モデルが、当該Ａｂ１ＫＤタンパク質の活性部位又は結合ポケット中に空間的に適合するかを評価し；
ｅ）  適合する化合物が、別のタンパク質の３次元モデルに適合するかを評価し、その構造座標はまた、当該コンピューター・プログラム中に導入され、そして他のタンパク質の３次元表示を作成するために使用され；そして
ｆ）  他のタンパク質に適合しないモデルの３次元分子構造座標を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む方法が提供される。
【００９８】
[0098]  化合物がＡｂ１ＫＤタンパク質に結合するかを決定するために提供される方法であって、
ａ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質の結晶タンパク質、そのホモログの結合ポケットを含む分子の３次元立体構造又は構造座標のセットを、コンピューター・モデリング・プログラムを提供し；
ｂ）  化学物質の構造座標のセットを、当該コンピューター・モデリング・プログラムに提供し；
ｃ）  当該コンピューター・モデリング・プログラムを使用して、化学物質と当該結合ポケットとの間の潜在的な結合又は妨害相互作用を評価し；そして
ｄ）  当該化学物質が、潜在的に当該タンパク質又はホモログと結合するか又は妨害するかを決定する
を含む方法が提供される。
【００９９】
[0099]  Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに結合できる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法であって、
ａ）  Ａｂ１ＫＤの構造座標のコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラムに導入し；
ｂ）  当該結合・ポケット内に適合するファーマコフォアを決定し；
ｃ）  複数の化合物をコンピューターによりスクリーニングして、どの化合物（単数又は複数）又は部分（単数又は複数）が当該ファーマコフォアに適合するかを決定し；そして
ｄ）  当該化合物（単数又は複数）又は部分（単数又は複数）の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む方法が提供される。
【０１００】
[0100]  Ａｂ１ＫＤタンパク質の結合ポケットに結合できる化合物の表示を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを製造する方法であって、
ａ）  Ａｂ１ＫＤ構造座標のコンピューターが読み取り可能なデーターベースを、コンピューター・プログラム中に導入し；
ｂ）  当該結合ポケットと相互作用する化学部分を決定し；
ｃ）  複数の化合物をコンピューターによりスクリーニングして、どの化合物（単数又は複数）が、当該部分を、当該化合物（単数又は複数）の部分構造として含むかを決定すし；そして
ｄ）  当該部分構造を含む当該化合物（単数又は複数）の表示を、コンピューターが読み取り可能なデーターベース中に記憶する
を含む方法が提供される。
【０１０１】
[0101]  結晶化されたＡｂ１ＫＤタンパク質、並びにヒスチジン・タグに結合されたＡｂ１ＫＤタンパク質を精製する方法であって：
ａ）  Ａｂ１ＫＤタンパク質のコード配列を含むトランスレーション・ベクターであって、ヒスチジン・タグに結合されたベクターを取得し；
ｂ）  サイズ排除クロマトグラフィーを行い；そして
ｃ）  ニッケル・キレート・カラム・クロマトグラフィーを行う
を含む方法はまた、本明細書中に提供される。
【０１０２】
[0102]  本発明は、例えば純度９８％であり、又は例えばリン酸化されていない精製されたＡｂ１ＫＤポリペプチドを提供する。
【０１０３】
[0103]  Ａｂ１ＫＤポリペプチドの精製方法であって、Ａｂ１を宿主細胞で発現し；当該宿主細胞からの可溶性タンパク質分画を取得し；２のカラム・クロマトグラフィー処置を行って、精製されたＡｂ１ＫＤを取得する方法が提供される。
【０１０４】
[0104]  Ａｂ１ＫＤを発現できる宿主細胞が提供される。当該宿主細胞は、ベクターを含んでもよく、ここで当該ベクターは、Ａｂ１をコードする核酸配列を含む。
【０１０５】
[0105]  本発明の方法及び組成物は、例えば薬剤発見用に使用されうる。
【０１０６】
[0106]  本発明は、本出願を経て記載され、例えば実施例は、Ａｂ１ＫＤの精製及び結晶化を示し、結晶の特徴づけ、回折データーの収集、及びＡｂ１ＫＤの３次元構造の決定及び分析を含む。本発明は、本出願を経て説明されており、Ａｂ１ＫＤバリアントを含むＡｂ１ＫＤの精製及び結晶化、結晶の特徴づけ、回折データーの収集、及びＡｂ１ＫＤの３次元構造の決定及び分析を示す実施例を含む。
【０１０７】
[0115]  以下の省略は、図３、４、５、及び６において使用される。
【０１０８】
[0116]  「原子型（Ａｔｏｍ Ｔｙｐｅ）」及び「原子（Ａｔｏｍ）」は、その構造座標が与えられた個々の原子を指し、「原子型」は、アミノ酸残基における原子の位置を指し示し、「原子」は指し示さない。列における最初の一字は、元素を指す。
【０１０９】
[0117]  ＨＥＴＡＴＭは、座標が与えられる非標準ＨＥＴ群、例えば、補欠分子族、阻害剤、溶媒分子、及び阻害剤、溶媒分子、及びイオンにおける原子座標を指す。ＨＥＴＡＭＳは、ａ）標準アミノ酸の１つではないもの、例えばＳｅＭｅｔ及びＳｅＣｙｓであり、ｂ）核酸（Ｃ、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｕ、及びＩ）のうちの１つではないもの、ｃ）核酸の改変体（＋Ｃ、＋Ｇ、＋Ａ、＋Ｔ、＋Ｕ、及び＋Ｉ）のうちの１つではないもの、及びｄ）ＵＮＫが、未知の残基名を指示すために使用される未知のアミノ酸又は核酸ではないものである残基を含む。
【０１１０】
[0118]  「残基」は、アミノ酸残基を表す。
[0119]  「#」は、Ｎ末端から開始した残基の数を指す。各アミノ酸残基の番号付けは、発現されたタンパク質において予想された位置を反映し、Ｈｉｓタグ、及び開始メチオニンを含む。
【０１１１】
[0120]  「Ｘ、Ｙ、及びＺ」は、原子のデカルト座標を提供する。
【０１１２】
[0121]  「Ｂ」は、原子中心の周囲の移動を計測する熱因子である。
[0122]  「ＯＣＣ」は、占有期間を指し、原子型（atom type）が特定の座標を占める時間の割合を表す。ＯＣＣ値は、０〜１であり、１では１００％である。
【０１１３】
[0123]  図３、４、５、又は６に記載されるＡｂ１ＫＤについての構造座標は、数学的操作により改変されてもよい。そうした操作は、非限定的に、元の構造座標の結晶学的置換、元の構造座標の断片化、元の構造座標のセットに対して整数を加えるか又は減じること、元の構造座標を反転すること、及び上記の組合せのいずれかを含む。
【０１１４】
略語
[0124]  ２０の遺伝学的にコードされたアミノ酸について、本明細書中で使用されるアミノ酸表記は、以下である。
【０１１５】
【表１】
2007522792.tif 000004
【０１１６】
[0125]  本明細書中で使用するとき、他に特に記載がない限り、３文字表記のアミノ酸略記は、Ｌ体のアミノ酸を指す。Ｄ体のアミノ酸は、「Ｄ-」が頭に記載される。例えば、Ａｒｇは、Ｌ-アルギニンを指し、そしてＤ-ＡｒｇはＤ-アルギニンを指す。同様に、大文字の一文字略記は、Ｌ体のアミノ酸を指す。小文字の１文字略記はＤ-体のアミノ酸を指す。例えば、「Ｒ」は、Ｌ-アルギニンを指し、そして「ｒ」はＤ-アルギニンを指す。
【０１１７】
[0126]  他に注記がない限り、ポリペプチド配列が、１文字及び/又は３文字略記の連続として提示される場合、当該配列は慣行に従ってＮ→Ｃの方向で表される。
【０１１８】
定義
[0127]  本明細書中に使用されるとき、以下の用語は、以下の意味を有する。
【０１１９】
[0128]  「遺伝的にコードされたアミノ酸」は、遺伝子コドンにより定義される２０個のアミノ酸を指す。一般的にコードされるアミノ酸は、グリシン、及びＬ-異性体のアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスバラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、及びリジンである。
【０１２０】
[0129]  「遺伝的にコードされないアミノ酸」は、遺伝子コドンにより定義されないアミノ酸を指す。遺伝的にコードされないアミノ酸は、遺伝的にコードされたアミノ酸の誘導体またはアナログであって、慣用の発現系を使用して新性ポリペプチド中に酵素により取り込まれるもの、例えばセレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）及びセレノシステイン（ＳｅＣｙｓ）；遺伝的にコードされるアミノ酸の異性体であって、慣用の発現系を使用して新性ポリペプチド中に酵素的に取り込まれないもの、例えば遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ-異性体；遺伝子コドンにより定義されない天然α-アミノ酸のＬ-及びＤ-異性体、例えばαアミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；遺伝子コドンにより定義されない合成α-アミノ酸のＬ-及びＤ-異性体；及び他のアミノ酸、例えばβ-アミノ酸、γ-アミノ酸などを含む。遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ異性体に加えて、一般的な遺伝的にコードされないアミノ酸は、非限定的に、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、Ｎ-メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ホモシステイン（ｈＣｙｓ）、ホモセリン（ｈＳｅｒ）、２,３-ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）を含む。遺伝的にコードされないアミノ酸の更なる例は、例えば、Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, Fasman著、CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, pp. 3-76,1989、及びそこで引用される種々の参考文献で見つけられる。
【０１２１】
[0130]  「親水性アミノ酸」は、Eisenberg et al.、 J. Mol. Biol. 179: 125-42, 1984の規格化されたコンセンサス疎水性スケールに従って約０以下の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸を指す。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、及びＡｒｇ（Ｒ）を含む。遺伝的にコードされない親水性アミノ酸は、上で挙げた遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ-異性体、オルニチン（Orn）、２,３-ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、及びホモセリン（ｈＳｅｒ）を含む。
【０１２２】
[0131]  「酸性アミノ酸」は、生理条件下で約７以下のｐＫ値の側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸は、水素イオンを失うため生理的ｐＨで負に荷電された側鎖を典型的に有する。遺伝的にコードされた酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）を含む。遺伝的にコードされない酸性アミノ酸は、Ｄ-Ｇｌｕ（ｅ）及びＤ-Ａｓｐ（ｄ）を含む。
【０１２３】
[0132]  「塩基性アミノ酸」は、生理条件下で７超のｐＫ値の側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。塩基性アミノ酸は、ヒドロニウム・イオンの会合のため、生理的ｐＨで正に荷電された側鎖を典型的に有する。遺伝的にコードされた塩基性アミノ酸は、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、及びＬｙｓ（Ｋ）を含む。遺伝的にコードされない塩基性アミノ酸は、上に挙げた遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ-異性体、オルニチン（Ｏｒｎ）、及び２,３-ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）を含む。
【０１２４】
[0133]  「極性アミノ酸」は、生理的ｐＨで荷電していないが、少なくとも１の共有結合を有する側鎖であって、２個の原子により通常共有される電子対が、１の原子によってより近接して保持される側鎖を有する親水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされる極性アミノ酸は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、及びＴｈｒ（Ｔ）を含む。遺伝的にコードされない極性アミノ酸は、上で挙げた遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ異性体、及びホモセリン（ｈＳｅｒ）を含む。
【０１２５】
[0134]  「疎水性アミノ酸」は、Eisenberg et al.、J. Mol. Biol. 179: 125-42,1984に規定化されたコンセンサス疎水性スケールに従って、０を超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸を指す。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸は、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及びＴｙｒ（Ｙ）を含む。遺伝的にコードされない疎水性アミノ酸は、上で挙げた遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ-異性体、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、及びＮ-メチル・バリン（ＭｅＶａｌ）を含む。
【０１２６】
[0135]  「芳香族アミノ酸」は、少なくとも１の芳香環又は複素環を含む側鎖を有する疎水性アミノ酸を指す。芳香環又は複素環は、-ＯＨ、-ＳＨ、-ＣＮ、-Ｆ、-Ｃｌ、-Ｂｒ、-Ｉ、-ＮＯ2、-ＮＯ、-ＮＨ2、-ＮＨＲ、-ＮＲＲ、-Ｃ（Ｏ）Ｒ、-Ｃ（Ｏ）ＯＨ、-Ｃ（Ｏ）ＯＲ、-Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、-Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ、-Ｃ（Ｏ）ＮＲＲなどの１以上の置換基を含んでもよい。ここで各Ｒは独立して（Ｃ1-Ｃ6）アルキル、（Ｃ1-Ｃ6）アルケニル、又は（Ｃ1-Ｃ6）アルキニルである。遺伝的にコードされる芳香環アミノ酸は、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、及びＨｉｓ（Ｈ）を含む。遺伝的にコードされない芳香環アミノ酸は、上で挙げた遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ-異性体を含む。
【０１２７】
[0136]  「非極性アミノ酸」は、生理的ｐＨで荷電を持たない側鎖であって、２個の原子により通常共有される電子対が一般的に２個の原子の各々により均等に持たれる結合を有する側鎖（つまり、当該側鎖は極性がない）を有する疎水性アミノ酸を指す。遺伝的にコードされた非極性アミノ酸は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及びＡｌａ（Ａ）を含む。遺伝的にコードされない極性アミノ酸は、上に挙げられる遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ異性体、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、及びＮ-メチル・バリン（ＭｅＶａｌ）を含む。
【０１２８】
[0137]  「脂肪族アミノ酸」は、脂肪族炭化水素を有する脂肪族アミノ酸を指す。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、及びＩｌｅ（Ｉ）を含む。遺伝的にコードされない脂肪族アミノ酸は、上で挙げられた遺伝的にコードされたアミノ酸のＤ-異性体、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、及びＮ-メチル・バリン（ＭｅＶａｌ）を含む。
【０１２９】
[0138]  「ヘリックス破壊アミノ酸」は、へリックスの内部の位置に含まれるとき、α-へリックスの構造を乱す性質を有するアミノ酸を指す。へリックス破壊性質を示すアミノ酸残基は、当該技術分野に周知であり（例えば、Chou & Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-76,1978を参照のこと）、そしてＰｒｏ（Ｐ）、Ｄ-Ｐｒｏ（ｐ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、及び（Ｌ-ポリペプチド中に含まれる場合）潜在的に全てのＤ-アミノ酸を含む（逆に、Ｄ-ポリペプチド中に含まれる場合、Ｌアミノ酸はヘリックス構造を乱す）。
【０１３０】
[0139]  「システイン様アミノ酸」は、ジスルフィド結合に加わることができる側鎖を有するアミノ酸を指す。こうして、システイン様アミノ酸は、一般的に少なくとも１のチオール（-ＳＨ）基を含む側鎖を有する。システイン様アミノ酸は、他のシステイン様アミノ酸とジスルフィド結合を形成できる点で通常とは異なる。還元型遊離-ＳＨ又は酸化型ジスルフィド結合形態のいずれかでポリペプチド中に存在するＣｙｓ（Ｃ）残基及び他のシステイン様アミノ酸の能力は、全体の疎水性又は親水性をポリペプチドに与えるかに影響する。こうして、Ｃｙｓ（Ｃ）が、Eisenbergのコンセンサス・スケール（上記Eisenberg, 1984）に従って０.２９の疎水性を示す一方、本発明の目的のために、Cys（C）は、上記の一般的分類に関わらず極性親水性アミノ酸であるということが理解されるべきである。他のシステイン様アミノ酸は、同様に極性親水性アミノ酸として同様に分類される。典型的なシステイン様残基は、例えばペニシラミン（Ｐｅｎ）、ホモシステイン（ｈＣｙｓ）などを含む。
【０１３１】
[0140]  当業者により評価されることであるが、上記分類、又はカテゴリーは、相互排他的ではない。こうして、２以上の物理化学的性質を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに含められてもよい。例えば、極性置換基でさらに置換される芳香基を有するアミノ酸側鎖、例えばＴｙｒ（Ｙ）は、芳香族疎水性性質及び極性又は親水性性質の両方を示しうるし、そして芳香族及び極性カテゴリー中に含められうる。典型的に、アミノ酸は、その全体の物理化学性質を最も密接に規定するクラス（単数又は複数）に分類されるであろう。いずれののアミノ酸の適切な分類は、当業者に明らかであろう。
【０１３２】
[0141]  本明細書中で特異的に記載されない他のアミノ酸残基は、本明細書中に与えられた定義の範囲内で観測された物理及び化学的性質に基づいて容易に分類されうる。
【０１３３】
[0142]  「野生型Ａｂ１ＫＤ］は、天然Ａｂ１ＫＤのアミノ酸配列と一致するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ここで、当該ポリペプチドは、Ａｂ１ＫＤと比較すると、２Å未満の骨格原子のＲＭＳＤを有する。
【０１３４】
[0143]  「ムス・ムスクルス（Mus musculus）Ａｂ１ＫＤ」は、ムス・ムスクルス由来の野生型Ａｂ１ＫＤと完全に一致するアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
[0144]  「又は」は、あるメンバー、ある群の別のメンバー、又は１より多いメンバーを意味する。例えば、Ａ,Ｂ、又はＣは、以下：Ａのみ；Ｂのみ；Ｃのみ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ及びＣ；Ａ、Ｂ、及びＣのいずれを指してもよい。
【０１３６】
[0145]  「会合」は、互いに近接する２以上の分子の状態を指す。当該２個の分子は、非共有的に、例えば水素結合、ファンデルワールス力、静電気的引力又は疎水性相互作用、或いは供給結合により会合されてもよい。
【０１３７】
[0146]  「共-複合体」は、１以上の化合物と会合するポリペプチドを指す。当該会合は、例えば共有又は非共有結合であってもよい。「Ａｂ１ＫＤ共複合体」は、１以上の化合物と会合するＡｂ１ＫＤ又は機能的サブユニット又はその断片を指す。そうした化合物は、例えば及び非限定的に、コファクター、リガンド、基質、基質アナログ、阻害剤、アロステリック・アフェクターなどを含む。Ａｂ１阻害剤を設計するためのリード化合物は、非限定的にＡＴＰ；β-アミドＡＴＰ；イマチニブ、キナゾリン、ピリド-[２,３-ｄ]ピリミジン、本発明の実施例のリガンド、及びその誘導体及びアナログを含む。共複合体は、コンピューターにより表された、又はイン・シリカで作成されたペプチドと化合物との間の会合を指してもよい。タンパク質構造の「リガンドなし」の形態又はその構造座標は、タンパク質構造の元の形態、又はアポストラクチャー、共複合体ではない形態の座標を指す。「リガンドあり」の形態は、共複合体の一部であるタンパク質又はペプチドの座標をさす。リガンドなしの形態は、種々のイオン、例えばマンガン、亜鉛、及びマグネシウム、並びに水と会合されたタンパク質及びペプチドを含む。リガンドは、天然基質、非天然基質、阻害剤、基質アナログ、アゴニスト又はアンタゴニスト、タンパク質、コファクター低分子、試験化合物、及び試験化合物の断片、並びに場合によりさらに種々のイオン又は水を含む。
【０１３８】
[0147]  「突然変異体」は、野生型配列の少なくとも１のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基と置換すること及び/又は野生型配列に１以上のアミノ酸残基を追加及び/又は欠失することにより野生型とは異なるアミノ酸配列によって特徴付けられるポリペプチドを指す。追加及び/又は欠失は、野生型配列の内部領域由来であってもよいし、及び/又はＮ-又はＣ-末端のいずれか又は両者であってもよい。突然変異ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドと実質的に同じ３次元構造を有してもよい。突然変異体は、Ａｂ１活性を持ってもよいが、持つ必要はない。突然変異体は、野生型Ａｂ１ＫＤの活性に実質的に類似する生物学的活性を示してもよい。ポリペプチドの特定のクラスについて当業者に知られるアッセイを使用すると、突然変異体が、野生型の生物活性の１％〜１００００％の範囲内、例えば野生型の生物学的活性の２５％〜５０００％、及び例えば５０％〜５００％、又は７５％〜２００％の範囲内であるということが「実質的に類似の生物学的活性」により意味される。突然変異体はまた、Ａｂ１ＫＤ活性を低減するか又は削除しうる。突然変異体は、当業者に知られる方法のいずれかに従って合成され、例えば非限定的に本明細書中に記載されるＡｂ１ＫＤ分子を発現する方法を含む。
【０１３９】
[0148]  「バリアント」は、患者又は他の個人から由来されるＡｂ１の突然変異形態、或いは患者又は他の個人において見られるのと同じ突然変異を有するＡｂ１の突然変異体形態である。
【０１４０】
[0149]  「活性部位」は、Ａｂ１ＫＤにおける部位であって、Ａｂ１活性の基質と会合する部位である。当該部位は、例えば触媒作用に関与する残基、並びに基質の結合に関与する残基を含んでもよい。阻害剤は、該活性部位の残基に結合しうる。ｃ-Ａｂ１ ＫＤでは、活性部位は、以下のアミノ酸残基：Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５、Ｇｌｕ３１６、Ｍｅｔ３１８、Ａｓｎ３２２、Ｌｅｕ３７０、及びＡｓｐ３８１の一以上を含む。好ましくは当該活性部位は、Ｌｅｕ２４８、Ｔｈｒ３１５、Ｇｌｕ３１６、Ｍｅｔ３１８、Ａｓｎ３２２、及びＬｅｕ３７０を含み、好ましくはさらにＡｓｐ３８１を含む。Ａｂ１がＴ３１５Ｉ突然変異体である場合、上に挙げられた活性部位は、Ｔｈｒ３１５の代わりにＩｌｅ３１５を含んでもよい。当該活性部位は、例えば以下のアミノ酸残基：Ｌｅｕ２４８、Ｔｙｒ２５３、Ｉｌｅ３１５、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｇｌｙ３２１、Ｌｅｕ３７０、及びＰｈｅ３８２；又はＬｅｕ２４８、Ｔｙｒ２５３、Ｔｈｒ３１５、Ｐｈｅ３１７、Ｍｅｔ３１８、Ｇｌｙ３２１、Ｌｅｕ３７０、及びＰｈｅ３８２の１以上を含む。基質は、アミノ酸残基の側鎖原子又は主鎖原子と会合してもよい。例えば、基質がＭｅｔ３１８又はＧｌｕ３１６と会合する場合、当該会合は、主鎖原子で生じうる。本発明の当該活性部位及び近接結合部位は、個々のアミノ酸残基で、例えば３１５位でＩｌｅをＴｈｒに置換することをその範囲内に含む。本明細書中に示されるアミノ酸残基数は、図３、４、５、又は６の配列を必要に応じて指す。
【０１４１】
[0150]  「結合ポケット」は、リガンド、例えば天然基質、非天然基質、阻害剤、基質アナログ、アゴニスト又はアンタゴニスト、タンパク質、コファクター、又は低分子、並びに場合によりさらに種々のイオン又は水と会合し、及び/又は低分子に結合するために十分な内部腔を有するＡｂ１の領域を指し、そして結合薬剤の標的として使用されうる。当該用語は、活性部位を含むが、それにより制限されることはない。
【０１４２】
[0151]  「近接活性ポケット」は、「活性部位」の結合ポケット以外のＡｂ１ＫＤの結合ポケットを指す。例えば、近接結合部位、例えばミリスチン酸結合部位は、例えば３以上、５以上、６以上、８以上、又は１０以上の下記のアミノ酸残基：Ａｌａ３３７、Ｌｅｕ３４０、Ｌｅｕ３４１、Ａｌａ３４４、Ｌｅｕ４２９、Ｉｌｅ４３２、Ａｌａ４３３、Ｇｌｙ４６３、Ｃｙｓ４６４、Ｐｒｏ４６５、Ｌｙｓ４６７、Ｖａｌ４６８、Ｍｅｔ４７２、Ｐｈｅ４９３、Ｍｅｔ４９６、Ｇｌｙ４９９、及びＳｅｒ５００を含んでもよい。  
【０１４３】
[0152]  「保存性突然変異」は、野生型配列からの少なくとも１のアミノ酸残基が、類似の物理及び化学的性質を有する異なるアミノ酸残基、つまり上で定義されるように同じクラス又はカテゴリーのメンバーであるアミノ酸残基と置換される突然変異を指す。例えば幾つかの場合、保存突然変異は、特異的芳香族Ｐｈｅ（Ｆ）残基を芳香族Ｔｙｒ（Ｙ）又はＴｒｐ（Ｗ）残基と置換することにより、アミノ酸配列の点で野生型配列から異なるポリペプチドであってもよい。
【０１４４】
[0153]  「非保存性突然変異」は、野生型配列からの少なくとも１のアミノ酸残基が、似ていない物理及び/又は化学性質を有する異なるアミノ酸残基、つまり上で定義されるように異なるクラス又はカテゴリーのメンバーであるアミノ酸残基と置換される突然変異を指す。例えば、非保存性突然変異は、酸性Ｇｌｕ（Ｅ）残基を、塩基性Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、又はＯｒｎ残基と置換することにより、アミノ酸配列の点で野生型配列から異なるポリペプチドでありうる。
【０１４５】
[0154]  「欠失突然変異」は、野生型配列からの１以上のアミノ酸残基を欠失することにより、野生型配列と異なるアミノ酸配列を有する突然変異を指す。当該残基は、野生型配列の内部領域から欠失されうるか、及び/又は１又は両方の末端から欠失されうる。
【０１４６】
[0155]  「切り詰め突然変異」は、欠失された残基が野生型の配列のＮ末端及び/又はＣ末端に位置する欠失突然変異を指す。
【０１４７】
[0156]  「延長突然変異」は、追加残基が、野生型配列のＮ末端及び/又はＣ末端に加えられる突然変異を指す。
【０１４８】
[0157]  「メチオニン突然変異」は、（１）野生型配列の少なくとも１のメチオニン残基が、他の残基、例えばＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、又はＩｌｅ（Ｉ）残基などの脂肪族残基と置き換えられる突然変異を指すか；又は（２）野生型配列の非メチオニン残基、例えばＡｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、又はＩｌｅ（Ｉ）残基などの脂肪族残基などの非メチオニン残基が、メチオニン残基で置換される突然変異を指す。
【０１４９】
[0158]  「セレノメチオニン突然変異」は、（１）典型的に野生型配列のＭｅｔ残基をセレノメチオニン（ＳｅＭｅｔ）残基と置換するか、又は１又は両方の末端に１以上のＳｅＭｅｔを加えることにより、少なくとも１のＳｅＭｅｔ残基を含む突然変異、或いは（２）少なくとも１のＭｅｔ残基が、ＳｅＭｅｔ残基と置換されるメチオニン突然変異を指す。幾つかの実施態様では、各Ｍｅｔ残基が、ＳｅＭｅｔ残基と置換される。
【０１５０】
[0159]  「システイン突然変異」は、野生型配列の少なくとも１のシステイン残基が、他の残基、例えばＳｅｒ（Ｓ）残基と置換される突然変異を指す。
【０１５１】
[0160]  「セリン突然変異」は、野生型の少なくとも１のセリン残基が、別の残基、例えばシステイン残基と置換される突然変異を指す。
【０１５２】
[0161]  「セレノシステイン突然変異」は、（１）典型的には野生型配列のＣｙｓ残基をセレノシステイン（ＳｅＣｙｓ）残基と置換するか、又は１以上のＳｅＣｙｓ残基を１又は両方の末端に加えることにより、少なくとも１のＳｅＣｙｓ残基を含む突然変異、又は（２）少なくとも１のＣｙｓ残基が、ＳｅＣｙｓ残基と置換されるシステイン突然変異を指す。幾つかの実施態様では、ＳｅＣｙｓ突然変異は、各Ｃｙｓ残基がＳｅＣｙｓ残基と置換される突然変異である。
【０１５３】
[0162]  「ホモログ」は、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを有するか、又はＡｂ１ＫＤ又はＡｂ１ＫＤの機能性ドメインのいずれかと、少なくとも１００アミノ酸に渡って１×１０-6のＢＬＡＳＴ・Ｅ値（Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-402, 1997）を有するポリペプチドを指す。
【０１５４】
[0163]  「結晶」は、結晶形態のポリペプチドを含む組成物を指す。「結晶」という用語は、本明細書中に定義される未変性結晶、重原子誘導体結晶、及び共結晶を含む。
【０１５５】
[0164]  「未変性結晶」は、ポリペプチドが実質的に純粋である結晶を指す。本明細書中に使用されるとき、未変性結晶は、重原子で改変されるアミノ酸を含むポリペプチドの結晶、例えばセレノメチオニン、セレノシステイン突然変異体の結晶を含まない。
【０１５６】
[0165]  「重原子誘導体結晶」は、ポリペプチドが、１以上の重金属原子と会合する結晶を指す。本明細書中で使用されるとき、重原子誘導体結晶は、重金属原子を浸した未変性結晶、並びにセレノメチオニン突然変異体及びセレノシステイン突然変異体の結晶を含む。
【０１５７】
[0166]  「共結晶」は、共複合体の結晶形態を指す。
[0167]  「アポ結晶」は、ポリペプチドが実質的に純粋であり、そしてポリペプチドとの共複合体を形成する化合物、例えばコファクター、リガンド、基質、基質アナログ、阻害剤、アロステリック・アフェクターなどとを実質的に含まない結晶を指す。
【０１５８】
[0168]  「回折品質結晶」は、秩序だっておりかつ十分な大きさ、つまりその最小の寸法が少なくとも１０μｍ、少なくとも５０μｍ、又は少なくとも１００μｍであり、その結果該結晶が少なくとも３Åの解像度、好ましくは少なくとも２Åの解像度、及び好ましくは少なくとも１.５Åの解像度、又はそれ以下への計測できる回折を与える結晶を指す。回折品質結晶は、未変性結晶、重原子誘導体結晶、及び共結晶を含む。
【０１５９】
[0169]  「単位格子」は、完全に結晶のユニット又はパターンを表す結晶の最小かつ最も単純な体積エレメント（つまり、平行６面体の塊）を指し、その結果、結晶全体は、単位格子を変形することにより作成されうる。単位格子の寸法は、６個の値：寸法ａ、ｂ、及びｃ、並びにα、β、及びγとして定義される角度により定義される（Blundell et al., Protein Crystallography, 83-84, Academic Press. 1976）。結晶は、多くの単位格子の効率よく詰められた配置である。
【０１６０】
[0170]  「三斜晶系単位格子」は、ａ≠ｂ≠ｃ及びα≠β≠γである単位格子を指す。
[0171]  「単斜晶系単位格子」は、ａ≠ｂ≠ｃ及びα＝γ＝９０°；かつβ＞９０°である単位格子を指す。
[0172]  「六方晶系単位格子」は、ａ＝ｂ≠ｃ；α＝β＝９０°；かつγ＝１２０°である単位格子を指す。
[0173]  「斜方晶系単位格子」は、ａ≠ｂ≠ｃ；かつα＝β＝γ＝９０°である単位格子を指す。
【０１６１】
[0174]  「正方晶系単位格子」は、ａ＝ｂ≠ｃ；かつα＝β＝γ＝９０°である単位格子を指す。
[0175]  「三方/菱面体晶系単位格子」は、ａ＝ｂ＝ｃ；かつα＝β＝γ≠９０°である単位格子を指す。
[0176]  「三方/六方晶系単位格子」は、ａ＝ｂ≠ｃ；及びα＝β＝９０°；及びγ＝１２０°である単位格子を指す。
【０１６２】
[0177]  「立方晶系単位格子」は、ａ＝ｂ＝ｃ；及びα＝β＝γ＝９０°である単位格子を指す。
[0178]  「結晶格子」は、密になった単位格子の頂点により規定される点の列を指す。
【０１６３】
[0179]  「空間群」は、単位格子の対称操作のセットを指す。空間群の指定（例えばＣ２）において、大文字は格子形を指し、そして残りの文字は、その外観を変化させることなく単位格子において行われ得る対称操作を表す。
【０１６４】
[0180]  「非対称単位」は、空間群対称の一部である非対称要素を有するが、対称操作により理想的な他の実体上に並列されうる単位格子における分子の最大凝集を指す。
【０１６５】
[0181]  「結晶学に関連するダイマー（又はオリゴマー）」は、２（以上の）分子のダイマー（又はオリゴマー、例えば、トリマー又はテトラマー）であって、ここでダイマー（又はオリゴマー）を含む２（以上の）分子に関する対称軸又は対称面は、結晶格子の対称軸又は対称面と一致するダイマー（又はオリゴマー）を指す。
【０１６６】
[0182]  「結晶学に関連しないダイマー」は、２（以上の）分子のダイマー（又はオリゴマー、例えば、トリマー又はテトラマー）であって、ここでダイマー（又はオリゴマー）を含む２（以上の）分子に関する対称軸又は対称面は、結晶格子の対称軸又は対称面と一致しないダイマー（又はオリゴマー）を指す。
【０１６７】
[0183]  「同形置換」は、重原子誘導体結晶を使用して、結晶化されたポリペプチドの３次元構造を解明するために必要な位相情報を得る方法に関する（Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, esp. pp. 151-64,1976 ; Methods in Enzymology 276: 361-557, Academic Press, 1997）。「重原子誘導体化」という用語は、「同形置換」と同義である。
【０１６８】
[0184]  「多波長異常分散、つまりＭＡＤ」は、単一の重原子誘導体結晶から、幾つかの異なる波長で集めたＸ線回折結晶学技術を指し、ここで当該重原子は、入射Ｘ線放射のエネルギー付近の吸収限界を有する。Ｘ線と電子軌道との間の共鳴は、（異常散乱として知られる）Ｘ線の吸収とのＸ線の散乱における違いを導き、そして同定されるべき重原子の位置を許容し、次にポリペプチドの結晶についての位相情報を提供する。ＭＡＤ分析の詳細な記載は、Hendrickson, Trans. Am. Crystallogr. Assoc., 21: 11, 1985; Hendrickson et al., EMBO J. 9: 1665,1990 ; 及びHendrickson, Science, 254: 51-58, 1991において見られる。
【０１６９】
[0185]  「単一波長異常分散、つまりＳＡＤ」は、Ｘ線回折データーが、単一の未変性結晶又は重原子誘導体結晶から、単一波長で集めたＸ線回折結晶学技術を指し、そして位相情報は、未変性結晶における硫黄又は塩素などの原子から、又は重原子誘導体結晶における重原子から異常分散情報を使用して抽出される。当該位相技術のためのデーターを収集するために使用されるＸ線の波長は、異常分散の吸収限界に近いことが必要である。ＳＡＤ分析の詳細な記載は、Brodersen, et al、Acta Cryst.,D56:431-41,2000において見られる。
【０１７０】
[0186]  「異常分散との単一の同形置換、つまりＳＩＲＡＳ」は、同形置換と異常分散技術とを組み合わせて、ポリペプチドの結晶についての位相情報を提供する結晶学技術を指す。Ｘ線回折データーは、単一波長で、通常単一重原子誘導体結晶から収集される。単一重原子誘導体結晶における重原子の位置からのみ得られた位相情報は、位相角度においてあいまいさを導き、これは、重原子からの異常散乱使用して解像される。位相情報はそれゆえ、重原子の位置と、重原子の異常分散から抽出される。ＳＩＲＡＳ分析の詳細な記載は、North, Acta Cryst. 18: 212-16, 1965 ; Matthews, Acta Cryst., 20: 82-86,1966において見られる。
【０１７１】
[0187]  「分子置換」は、既知のポリペプチドの構造座標を使用して、構造座標が未知であるポリペプチドの新たな結晶についての初期位相を計算する方法に関する。当該方法、その構造座標が新たな結晶の単位格子において知られているポリペプチドを配向及び位置付けすることにより行われる。位相は、次に配向された及び位置付けされたポリペプチドから計算され、そして観測された振幅と併せて、新たな結晶を構築するポリペプチドの構造の近接フーリエ合成を提供した。当該モデルを次に精密化して、新たな結晶についての精密化された構造座標を与えた（Lattman, Methods in Enzymology, 115: 55-77,1985 ; Rossmann,"The Molecular Replacement Method,"Int. Sci. Rev. Ser. No. 13, Gordon & Breach, New York, 1972; Methods in Enzymology, Vols. 276,277 （Academic Press, San Diego 1997））。分子置換は、例えば、Ａｂ１ＫＤの構造座標を使用して、Ａｂ１ＫＤの結晶突然変異又はホモログの構造座標を決定するために使用されうる。
【０１７２】
[0188]  「構造座標」は、結晶形態におけるＡｂ１ＫＤの原子（分散中心）により、Ｘ線の単色ビームの回折に基づいて得られるパターンに関する数学的方程式から算出された数学的座標に関する。回折データーは、結晶単位を繰り返す電子密度マップを計算するために使用される。電子密度マップは、結晶の単位格子内の個々の原子の位置を定めるために使用される。 
【０１７３】
[0189]  「実質的に同じ３次元構造を有する」は、少なくとも５０〜１００％のＣ-α原子の座標が重なりに含まれるとき、図３、４、５、又は６の分子構造座標に重ね合わせる場合、約１.５Å以下、好ましくは１.２５Å、好ましくは１Å、及び好ましくは０.５Å、及び好ましくは０.２５Å以下の標準偏差（ｒ.ｍ.ｓ.ｄ）を有する分子構造座標のセットにより特徴付けられるポリペプチドを指す。ＭＯＥプログラムは、２個の構造を比較するために使用されてもよい（Chemical Computing Group, Inc. , Montreal, Canada）.。構造座標が、特定のアミノ酸残基（単数又は複数）に利用できない場合、これらの座標は計算中に含まれない。
【０１７４】
[0190]  「α-Ｃ」又は「α-炭素」又は「ＣＡ」が本明細書中で使用される際、「α-Ｃ」又は「α炭素」は、アミノ酸残基のα炭素を指す。
【０１７５】
[0191]  「α-へリックス」は、水素結合により安定化されたアミノ酸のラセン状の鎖形態であるポリペプチド鎖の構造を指す。
[0192]  「β-シート」は、広がったジグザグ立体構造に延びたポリペプチド鎖の立体構造を指す。「平行」に走るポリペプチド鎖の部分は、すべて同じ方向に走っている。ポリペプチド鎖が、「逆平行」出る場合、隣の鎖は、互いに逆の方向に走っている。「走る」という用語は、ポリペプチド鎖のＮからＣＯＯＨの方向のことを指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１７６】
発明の詳細な説明
結晶Ａｂ１
[0193]  未変性及び重原子誘導体結晶、例えばセレニウム・メチオニン誘導体Ａｂ１ＫＤから得られる結晶の両方は、本発明の分子構造座標を取得するために使用されうる。
【０１７７】
[0194]  本発明の結晶を含むＡｂ１ＫＤは、Ａｂ１が存在する細菌、植物、又は動物源から単離されうる。いずれかの生物界から由来されるＡｂ１ＫＤに類似するタンパク質は、本発明の範囲内である。Ａｂ１ＫＤは、哺乳動物源、例えばホモ・サピエンスから由来され得る。結晶は、野生型Ａｂ１ＫＤ又は野生型Ａｂ１ＫＤの突然変異体を含んでもよい。野生型Ａｂ１ＫＤの突然変異体は、野生型Ａｂ１ＫＤの配列における少なくとも１のアミノ酸残基を、異なるアミノ酸残基と置換することにより、或いは野生型配列内及び／又は野生型Ａｂ１ＫＤのＮ末端及び／又はＣ末端で、１以上のアミノ酸残基を追加及び／又は欠失することにより、取得される。突然変異体は、非限定的に、野生型Ａｂ１ＫＤを結晶化するために使用される条件と実質的に類似である結晶化条件下で結晶化しうる。
【０１７８】
[0195]  本発明により考慮される突然変異の型は、非限定的に、保存性突然変異、非保存性突然変異、欠失突然変異、切り詰め突然変異、伸張突然変異、メチオニン突然変異、セレノメチオニン突然変異、システイン突然変異、及びセレノシステイン突然変異を含む。突然変異はＡｂ１活性を有してもよいが、該活性を示す必要はない。突然変異体は、例えば野生型ポリペプチドの活性と実質的に類似する生物学的活性を示してもよい。メチオニン、セレノメチオニン、システイン、及びセレノシステイン突然変異体は、以下に詳細に記載されるように、重原子誘導体結晶を製造するために特に有用である。
【０１７９】
[0196]  本明細書中に考慮される突然変異の型は、相互排他的ではないということ；つまり例えば、１のアミノ酸で保存性突然変異を有するポリペプチドはさらに、Ｎ末端の切り詰め、及び幾つかのＡｌａＬｅｕ、又はＩｌｅ→Ｍｅｔ突然変異を有してもよいということは、当業者により理解されるであろう。
【０１８０】
[0197]  タンパク質ファミリー又は相同ポリペプチド・ドメインの配列比較は、ポリペプチド配列における潜在的なアミノ酸残基であって、突然変異の候補となる残基を同定するために使用されうる。Ａｂ１ＫＤの３次元構造を有意に妨げず、及び／又は有害に作用せず、そしてＡｂ１ＫＤの活性をさらに亢進しうる突然変異を同定することは、一部において、突然変異が生じる領域に左右されるであろう。分子の高度に可変性である領域において、非保存性置換並びに保存性置換は、分子の折りたたみ、３次元構造、及び／又は生物活性を有意に乱すことなく許容されうる。高度に保存された領域、又は重要な二次構造を含む領域において、保存的アミノ酸置換は許容されうる。
【０１８１】
[0198]  保存的アミノ酸置換は、当該技術分野に周知であり、そして関与するアミノ酸残基の側鎖の極性、荷電、溶解性、親水性及び／又は疎水性の基準に基づいた置換を含む。典型的な保存性置換は、アミノ酸が本明細書中で定義されたクラスと同じクラス又はカテゴリーのメンバーである異なるアミノ酸と置換される置換を含む。こうして、典型的な保存性置換は、芳香族から芳香族、非極性から非極性、脂肪族から脂肪族、酸性から酸性、塩基性から塩基性、極性から極性などの置換を含む。他の保存性アミノ酸置換は、当該技術分野に周知である。一般的に、２０％以下、典型的には１０％以下、最も一般的に５％以下の野生型ポリペプチド配列におけるアミノ酸は、当該分子の生物学的活性、折りたたみ、及び／又は３次元構造に有害な影響を与えることなく、他のアミノ酸と保存的に置換されてもよい。但し、そうした置換は、活性に致命的な残基、例えば致命的な結合ポケット残基を含まない。
【０１８２】
[0199]  幾つかの実施態様では、タンパク質の活性を低減するか又は完全に取り除くために、タンパク質の活性部位において、突然変異を作ることが望ましいこともある。例えば、プロテアーゼの活性を低減又は除去するために、そして溶液又は結晶における自己溶解を避けるために、プロテアーゼの活性部位において重要な残基に突然変異を加えることが所望されることもある。こうして、例えば、アスパルチル・プロテアーゼでは、活性部位のＡｓｐ残基は、プロテアーゼ活性を低減するためにＡｌａ又はＡｓｎ残基へと突然変異されうる。セリン・プロテアーゼにおける活性部位のＳｅｒ残基は、プロテアーゼ活性を低減又は除去するためにＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｔｈｒ残基へと突然変異されうる。同様に、システイン・プロテアーゼの活性は、活性部位のＣｙｓ残基をＡｌａ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒ残基へと突然変異させることにより、低減又は取り除かれうる。特定のタンパク質の活性を取り除くか、又は完全に除去する他の突然変異は、当業者に明らかであるであろう。
【０１８３】
[0200]  アミノ酸残基であるＣｙｓ（Ｃ）は、他のＣｙｓ（Ｃ）残基又は他のスルフヒドリル基、例えばスルフヒドリルを含むアミノ酸（「システイン様アミノ酸」）とジスルフィド結合を形成できるという点で、普通とは異なっている。ポリペプチド中において、還元された遊離-ＳＨ又は酸化型ジスルフィド結合形態のいずれかで存在できるＣｙｓ（Ｃ）残基及び他のシステイン様アミノ酸の能力は、Ｃｙｓ（Ｃ）残基が、疎水性特性をポリペプチドに与えるか、又は親水性特性をポリペプチドに与えるかに影響する。Eisenbergのコンセンサス・スケール（Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179: 125-42,1984）に従うと、Ｃｙｓは０.２９の疎水性を示す一方で、本発明の目的では、上で規定された一般的分類にも関わらず、Ｃｙｓ（Ｃ）は、極性親水性アミノ酸として分類されるということが理解される。例えば、ジスルフィド結合に加わると知られているＣｙｓ残基は置換されないか、又は当該残基がジスルフィド結合に加わることができるように、他のシステイン様アミノ酸で保存的に置換される。典型的には、システイン様残基は、例えばＰｅｎ、ｈＣｙｓなどを含む。結晶化を妨げるＣｙｓ残基の置換は、以下に記載される。
【０１８４】
[0201]  結合ポケット及び／又はタンパク質の構造座標は、例えば、新たな分子を作成するために使用されてもよい。これらの新たな分子は、例えば遺伝子トランスフォーメーションを使用して、細胞、例えば植物細胞中で発現されて、作物の栄養収率を改良するか、又は植物を使用して新たな分子を作成する。
【０１８５】
[0202]  多くの例では、Ａｂ１ＫＤのアミノ酸が、遺伝的にコードされるアミノ酸で置換される一方で、ある場合では、突然変異体は、遺伝的にコードされないアミノ酸を含んでもよい。例えば、あるコードされるアミノ酸のコードされない誘導体、例えばＳｅＭｅｔ及び／又はＳｅＣｙｓは、生物学的発現系を使用してポリペプチド鎖中に取り込まれうる（そうしたＳｅＭｅｔ及びＳｅＣｙｓ突然変異は、以下により詳細に記載される）。
【０１８６】
[0203]  或いは、化学合成により突然変異が全体又は一部において合成される場合、遺伝的にコードされるアミノ酸のＤ異性体から非コード天然アミノ酸及び合成アミノ酸に及ぶ実質的に全ての非コードアミノ酸が使用される。
【０１８７】
[0204]  遺伝的にコードされないアミノ酸の多くへの保存性アミノ酸置換は、当該技術分野に周知である。他の非コードアミノ酸への保存的置換は、遺伝的にコードされるアミノ酸の性質と比べた物理的性質に基づいて決定されうる。
【０１８８】
[0205]  Ａｂ１ＫＤの３次元構造を実質的に変えず、かつ例えば本出願で論じられるＡｂ１ＫＤの結合ポケット（単数又は複数）の３次元構造を実質的に変えない置換、追加、及び／又は欠失が、本発明の範囲内であるということを認識するであろう。そうした置換、追加、及び／又は欠失は、例えば、その精製を助けるか又は結晶の獲得を助けることを目的としてＡｂ１ＫＤをコードするｃＤＮＡ中に慣用のクローニング部位を提供するために有用でありうる。
【０１８９】
[0206]  これらの置換、欠失、及び／又は追加は、非限定的にＨｉｓタグ、インテイン含有自己切断タグ、マルトース結合タンパク質融合、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ・タンパク質融合、抗体融合、緑蛍光タンパク質融合、シグナル・ペプチド融合、ビオチン受容ペプチド融合、プロテアーゼ切断部位を含むタグなどを含む。結晶化を妨げるシステイン残基などの残基が存在する場合、突然変異はポリペプチド配列中に導入されうる。これらのシステイン残基は、結晶化条件下で他のアミノ酸残基と容易に共有結合を形成しない適切なアミノ酸で置換されうる；例えば、システインをＡｌａ、Ｓｅｒ、又はＧｌｙで置換することによる。二次構造の配置に基づいて非へリックス中に位置するか又は非ストランド断片中に位置するシステインは全て、置換のよい候補となる。
【０１９０】
[0207]  本発明の範囲内の突然変異は、Ａｂ１活性を有してもよいし有さなくてもよい。Ａｂ１活性を変えるか又は阻害するアミノ酸置換、追加、及び／又は欠失は、本発明の範囲内である。これらの突然変異は、例えばＡｂ１ＫＤ構造を決定するために及び／又は他の関連又は非関連結晶ポリペプチドの３次元Ｘ線構造の決定を助ける位相情報を提供するために、結晶形態で使用されるか、そこから得られた分子構造座標で使用される。
【０１９１】
[0208]  本発明の分子構造座標が取得される重原子誘導体結晶は、一般的に１以上の重原子、例えばＸｅ、Ｋｒ、Ｂｒ、Ｉ、又は重金属原子と会合する結晶のＡｂ１ＫＤポリペプチドを含む。該ポリペプチドは、前部で記載されたように、場合により１以上の分子と共複合体状態である野生型又は突然変異Ａｂ１ＫＤに相当しうる。種々のタイプの重原子誘導体のポリペプチド：
タンパク質を溶液中で重原子に晒すことから得られ、ここで結晶は重原子を含む溶媒中で成長する重原子誘導体、又は
タンパク質を結晶形態で重原子に晒すことから得られ、ここで重原子は結晶中に拡散する重原子誘導体、
ポリペプチドが重原子含有アミノ酸、例えばセレノメチオニン及び／又はセレノシステインを含む重原子誘導体、及び
キセノンチャンバーなどの中で加圧下で重原子が強制的に与えられた重原子誘導体
が存在する。
【０１９２】
[0209]  慣用的に、第一のタイプの重原子誘導体は、未変性の結晶を、重金属原子塩又は有機金属化合物、例えば塩化鉛、金チオマレート、エチル水銀チオサリチル酸ナトリウム塩（チメロサール）、酢酸ウラニル、四塩化白金、四酸化オスミウム、硫酸亜鉛、及びコバルト・ヘキサミンを含む溶液中に浸すことにより形成されうる。該重金属塩は、結晶を通して拡散し、そして結晶ポリペプチドに結合できる。
【０１９３】
[0210]  このタイプの重原子誘導体は、結晶化されるポリペプチドを含む結晶化溶液に、ある量の重金属原子塩を添加することにより形成され得る。該重金属原子は、タンパク質と会合し、そして結晶中に取り込まれうる。結合された重金属原子の位置は、結晶のＸ線回折分析により決定されうる。本情報は、次にタンパク質の３次元構造を構築するために必要とされる位相情報を作成するために使用される。
【０１９４】
[0211]  重原子誘導体結晶は、１以上のＳｅＭｅｔ及び／又はＳｅＣｙｓ残基（ＳｅＭｅｔ及び／又はＳｅＣｙｓ突然変異）を含むポリペプチドから製造されてもよい。そうしたセレノシステイン又はセレノメチオニン突然変異は、栄養要求性イー・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ）株においてＡｂ１ＫＤをコードするｃＤＮＡを発現することにより野生型又は突然変異Ａｂ１ＫＤから作られうる （Hendrickson et al., EMBO J. 9 （5）: 1665-72,1990）。この方法では、天然システイン又はメチオニン（又は両方）を欠失しているが、セレノシステイン又はセレノメチオニン（又は両方）に富んだ成長培地において、野生型又は突然変異Ａｂ１ＫＤｃＤＮＡが宿主生物中で発現されうる。或いは、セレノシステイン又はセレノメチオニン突然変異体は、非栄養要求性イー・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ）株を使用して、例えば当該株におけるメチオニン生合成を高濃度のＩｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＴｈｒで阻害し、そして次にセレノメチオニンを培地中に提供することによって作られうる （Doublie, Methods in Enzymology, 276: 523-30,1997）。さらに、セレノシステインは、Leonard et alに対する米国特許第5,700,660号（1995年6月７日出願）において記載されるように、ある特定のクラスのタンパク質中にセレノシステインを取り込む原核生物及び真核生物のメカニズムを利用することにより、セレノシステインは、選択的にポリペプチド中に取り込まれうる。ジスルフィド結合は、タンパク質の３次構造を維持するために重要であり、そして例えば除くことが出来ないので、セレノシステインは、ジスルフィド結合を形成するシステイン残基の代わりに取り込まれることはないということは、当業者により認識されるであろう。当業者はさらに、正確な位相情報を取得するために、１のセレニウム原子はポリペプチド鎖の１４０アミノ酸残基毎に取り込まれるべきであるということを認識する。ポリペプチド鎖中に取り込まれるセレニウム原子の数は、以下により十分に記載されるように、Ｍｅｔ及び／又はＣｙｓ残基の適切な数を有するＭｅｔ又はＣｙｓ突然変異体を設計することにより都合よく制御されうる。
【０１９５】
[0212]  幾つかの場合では、結晶化されるポリペプチドは、システイン又はメチオニン残基を含まなくてもよい。それゆえ、セレノメチオニン及び／又はセレノシステイン突然変異が、重原子誘導体結晶を取得するために使用されるならば、メチオニン及び／又はシステイン残基は、ポリペプチド鎖に導入されうる。同様に、システイン結合性重金属、例えば水銀の使用が、重原子誘導体結晶の作成に意図されるならば、Ｃｙｓ残基は、ポリペプチド鎖に導入されなければならない。
【０１９６】
[0213]  そうした突然変異は、例えば、全体のタンパク質の折りたたみを乱さない部位で、ポリペプチド配列中に取り込まれる。例えば、タンパク質ファミリーの多くのメンバーの間で保存される残基、又は例えば配列比較により決定されるとき、その活性又は構造の完全性の維持に関与すると考えられる残基は、Ｍｅｔ又はＣｙｓに突然変異されるべきではない。加えて、保存性突然変異、例えばＳｅｒからＣｙｓ、又はＬｅｕ若しくはＩｌｅからＭｅｔへの変異が導入されうる。重原子誘導体結晶が構造決定のための位相情報を提供するために、結晶単位格子における重原子（単数又は複数）の位置は、決定的でなければならず、そして位相情報を与えなければならないということがさらに考慮される。それゆえ、可動性でありうるタンパク質の部分、例えばＮ末端及びＣ末端、又はループ内の１〜５残基に又は１〜５残基内に突然変異は導入されない。
【０１９７】
[0214]  逆に、あまりに多くのメチオニン及び／又はシステイン残基がポリペプチド配列中に存在する場合、セレン含有側鎖の過度の取り込みは、該ポリペプチドの折りたたみ及び／又は結晶化をできなくしうるし、そして結晶構造を解明する際に複雑な状態を導く可能性がある。この場合、メチオニン及び／又はシステイン突然変異体は、１以上のこれらのＭｅｔ及び／又はＣｙｓ残基を、他の残基と置換することにより製造される。これらの置換を考慮することは、ポリペプチド中にメチオニン及び／又はシステイン残基を導入する突然変異についての上記考慮と同じである。特異的に、Ｍｅｔ及び／又はＣｙｓ残基は、例えばそれぞれＬｅｕ／Ｉｌｅ及びＳｅｒで保存的に置換される。
【０１９８】
[0215]  システイン及びメチオニン突然変異体をコードするＤＮＡが、ＳｅＣｙｓ及びＳｅＭｅｔ重原子誘導体結晶を取得するために上で記載された方法において使用されるとき、Ｃｙｓ又はＭｅｔ突然変異体は、例えば１４０個のアミノ酸毎に１のＣｙｓ又はＭｅｔ残基を有しうる。
【０１９９】
ポリペプチドの作成
[0216]  未変性の及び突然変異されたＡｂ１ＫＤ又は本明細書中に記載されるＡｂ１ポリペプチドは、当該技術分野に周知である技術を使用して化学的に全合成又は一部合成されうる（例えば、Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., NY, 1983を参照のこと）。
【０２００】
[0217]  遺伝子発現系は、未変性の及び突然変異されたポリペプチドの合成のために使用されうる。未変性又は突然変異されたポリペプチドをコードする配列及び当業者に知られている適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターが構築されうる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ組換え／遺伝子組換えを含む。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989に記載される技術を参照のこと。
【０２０１】
[0218]  宿主発現ベクター・システムは、Ａｂ１ＫＤ又はＡｂ１を発現するために使用されうる。これらは、非限定的に、微生物、例えばコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌； コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス、ＣａＭＶ；タバコ・モザイク・ウイルス、ＴＭＦ）で感染されるか、又はコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系を含む。タンパク質は、ヒト遺伝子治療システムにおいて発現されうる。例えば個人においてタンパク質の量を増大するため、又は設計された治療タンパク質を発現するためタンパク質を発現することを含む。これらのシステムの発現要素は、その強さ及び特異性において変化する。
【０２０２】
[0219]  特異的に設計されたベクターは、細菌-酵母又は細菌-動物細胞などの宿主間でＤＮＡを運ぶことを可能にする。適切に構築された発現ベクターは、以下の：宿主細胞における自己複製のための複製開始点、１以上の選別可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、及び活性プロモーターを含みうる。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡに結合し、そしてＲＮＡ合成を開始するようにしむけるＤＮＡ配列として定義される。
【０２０３】
[0220]  発現ベクターは、転写及び翻訳に影響を与える種々の要素を含んでもよく、例えば、構成的プロモーター及び誘導プロモーターを含む。これらの要素は、宿主及び／又はベクター依存性である。例えば、細菌系にクローニングされた場合、Ｔ７プロモーター、バクテリオファージλのｐＬ,ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ-ｌａｃハイブリッド・プロモーター）などが使用されてもよい。昆虫細胞系にクローニングされる場合、バキュロウイルス・ポリへドリン・プロモーターなどのプロモーターが使用されうるし、植物細胞系にクローニングされる場合、植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質についてのプロモーター）、又は植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ・ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が使用されうるし；哺乳動物細胞系にクローニングされる場合、哺乳動物プロモーター（例えば、メタロチオネイン・プロモーター）又は哺乳動物ウイルス・プロモーター、（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニア・ウイルス７.５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ウシ・パピローマ・ウイルス・プロモーター；及びエプシュタイン・バー・ウイルス・プロモーター）が使用されても良い。
【０２０４】
[0221]  ベクターを宿主細胞に導入するための種々の方法、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、原形質融合、及び電気穿孔が使用されてもよい。発現ベクターを含む細胞は、適切なポリペプチドを産生するかを決定するために１クローンから増殖され、そして個別に分析される。例えば抗生物質耐性を含む種々の選別方法は、形質転換された宿主細胞を同定するために使用されうる。ポリペプチドを発現する宿主細胞クローンの同定は、幾つかの手段により行われ、非限定的に抗Ａｂ１ＫＤ又はＡｂ１抗体との免疫学的反応性、及び宿主細胞内活性の存在を含む。
【０２０５】
[0222]  ｃＤＮＡの発現はまた、インビトロで作成された合成ｍＲＮＡを使用して行われてもよい。合成ｍＲＮＡは、種々の無細胞系で効率的に翻訳されてもよく、非限定的に小麦胚芽抽出液及び網状赤血球抽出液を含み、並びに細胞系で効率よく翻訳されてもよく、非限定手的にカエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションを含む。
【０２０６】
[0223]  最適レベルの活性及び／又はタンパク質を産生するｃＤＮＡを決定するために、改変ｃＤＮＡ分子が構築される。改変ｃＤＮＡの非限定的な例は、ｃＤＮＡにおけるコドンの使用が、ｃＤＮＡが発現される宿主細胞について最適化された場合である。宿主細胞は、ｃＤＮＡ分子で形質転換され、そしてＡｂ１ＫＤ又はＡｂ１ＲＮＡのレベル、及び／又はタンパク質が計測される。
【０２０７】
[0224]  宿主細胞におけるＡｂ１又はＡｂ１ＫＤタンパク質レベルは、免疫親和性及び／又はリガンド親和性技術などの種々の方法により定量され、Ａｂ１又はＡｂ１ＫＤ特異的親和性ビーズ又は特異的抗体は、35Ｓメチオニン標識又は非標識タンパク質を単離するために使用される。標識又は非標識タンパク質は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析される。非標識タンパク質は、特異的抗体を使用するウエスタン・ブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又はＲＩＡにより検出される。
【０２０８】
[0225]  組換え宿主細胞内でＡｂ１又はＡｂ１ＫＤの発現をした後に、タンパク質を活性形態で与えるために、ポリペプチドが回収されうる。幾つかの精製方法が利用でき、そして使用するために適切である。組換えＡｂ１又はＡｂ１ＫＤは、当該技術分野に知られている分画又はクロマトグラフィー・ステップの様々な組合せ又は個々に適用することにより、細胞ライセートから又は培養上清から精製されうる。
【０２０９】
[0226]  全長の新性タンパク質又はそのポリペプチド断片に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体で作られた免疫免疫親和性カラムを使用することにより、組換えＡｂ１又はＡｂ１ＫＤは、他の細胞内タンパク質から分離されうる。
【０２１０】
[0227]  或いは、ポリペプチドは、宿主細胞から、折りたたまれていない不活性形態で、例えば細菌の封入体から回収されうる。この形態で回収されたタンパク質は、変性剤、例えば塩酸グアニジウムを使用して可溶化され、そして次に当業者に知られている方法、例えば透析を使用して、活性化形態に折りたたんだ。
【０２１１】
ポリペプチドの結晶化及び結晶の特徴づけ
[0228]  当該技術分野に知られている種々の方法を使用して、本発明の未変性の及び重原子誘導体結晶を作成しうる。当該方法は、非限定的に、バッチ、液体架橋、透析、及び蒸気拡散を含む（例えば、McPherson, Crystallization of Biological Macromolecules, Cold Spring Harbor Press, New York, 1998; McPherson, Eur. J. Biochem. 189: 1-23,1990 ; Weber, Adv. Protein Chem. 41: 1-36, 1991 ; Methods in Enzymology 276: 13-22,100-110 ; 131-143, Academic Press, San Diego, 1997）を参照のこと。
【０２１２】
[0229]  一般的に、未変性の結晶は、タンパク質を沈殿するために必要とされる丁度それ以下の濃度で沈殿剤を含む緩衝水溶液中に、実質的に純粋なポリペプチドを溶解することにより成長する。沈殿剤の例は、非限定的に、ポリエチレン・グリコール、硫酸アンモニウム、２-メチル２,４-ペンタンジオール、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、グリセロール、イソプロパノール、硫酸リチウム、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム・カリウム、エタノール、ヘキサンジオール、エチレングリコール、ジオキサン、ｔ-ブタノール、及びそれらの組合せを含む。制御された蒸発で水を取り除いて沈殿条件を作り出し、当該条件は結晶成長が止まるまで維持される。
【０２１３】
[0230]  一の実施態様では、未変性の結晶は、ハンギングドロップ（吊り下げられた液滴）又はシッティングドロップ（静置された液滴）中で蒸発核酸することにより成長する（McPherson, Preparation and Analysis of Protein Crystals, John Wiley, New York, 1982; McPherson, Eur. J. Biochem. 189: 1-23,1990）。一般的に、約２５μｌ、又は約５μｌ、３μｌ、又は２μｌの実質的に純粋なポリペプチド溶液は、ある量のリサーバー溶液と混合される。比率は、生物物理学的条件に従って変化しうる。例えば、ドロップにおけるタンパク質体積：リザーバー体積の比は、１：１であり、結晶化に必要とされる約半分の沈殿濃度を与える。ドロップ及びリザーバー体積が、特定の生物物理学的条件内で変化しされても結晶化を許容することが当業者により認識される。シッティングドロップ法では、ポリペプチド／沈殿剤溶液は、密閉コンテナ中で、結晶を作成するために最適な沈殿剤濃度を有する多量の水性リザーバーと平衡化される。ハンギング・ドロップ法では、リザーバー溶液と混合されたポリペプチド溶液は、例えばリザーバーの上部に密閉される蓋の下面の液滴中に懸濁される。両方の方法において、密封された容器は、通常例えば、２〜６週間、結晶が成長するまで静置される。該液滴は、結晶が形成されたかを定期的に確認される。液滴を観察する方法の１つ、例えば顕微鏡が使用される。ハイスループットの目的で、液滴を確認する方法は、例えば、２００１年１０月１８日に出願され、「Apparatus and Method for Identification of Crystals By In-situ X-Ray Diffraction.」という名称の米国一般特許出願第10/042,929号に見られうる。そうした方法は、例えば、結晶成長インキュベーターを含む自動化装置、結晶成長インキュベーターに接続されたＸ線源、及びインキュベーター内で成長する結晶物質からの回折Ｘ線の存在を検出するために構成されたＸ線検出器を含む。ここで、該Ｘ線源は、結晶成長インキュベーター内で成長した結晶物質に放射するように構成される。幾つかの実施例において、電荷結合素子ビデオカメラは、当該検出システム中に含まれる。
【０２１４】
[0231]  上記結晶化条件は変化しうるということを当業者は認識するであろう。そうした変化は単独又は組み合わせて使用され、そして様々な体積の当業者に知られているタンパク質溶液及びリザーバー溶液を含んでもよい。他の緩衝溶液は、所望されるｐＨ範囲が維持される限り、例えばＴｒｉｓ、イミダゾール、又はＭＯＰＳ緩衝液などが使用されてよく、そして緩衝液の化学組成物は、結晶形成と相性がよいものである。化合物又は他のリガンドは、共結晶を得るために、結晶化溶液に加えられうる。
【０２１５】
[0232]  重原子誘導体結晶は、未変性の結晶を、重金属原子を含む母液中に浸すことにより取得されうるし、そして未変性結晶に対して上で記載されるようにＳｅＭｅｔ及び／又はＳｅＣｙｓ突然変異体から取得されうる。
【０２１６】
[0233]  突然変異タンパク質は、野生型タンパク質の条件とはすこし異なる結晶化条件下で結晶化されるか、又は突然変異の性質及びそのタンパク質での位置に応じて、かなり異なる結晶化条件下で結晶化されてもよい。例えば、非保存的突然変異は、突然変異体の親水性の変化をもたらし、これは次に、突然変異タンパク質を野生型タンパク質よりも可溶性にするか、又は可溶性を低下させる。典型的に、突然変異の結果として、タンパク質がより親水性になるならば、該タンパク質は、水溶液中で野生型のタンパク質より溶解性が高く、そして結晶化を引き起こすために、より高い沈殿剤濃度が必要とされるであろう。逆に、突然変異の結果としてタンパク質の溶解性が低くなれば、該タンパク質は水溶液により溶解しにくくなり、そしてタンパク質の結晶化を引き起こすために、低濃度の沈殿剤が必要とされるであろう。結晶格子の接触に関与するタンパク質の領域内に突然変異が起こるならば、結晶化条件は、より予想できない様式で影響され得る。
【０２１７】
結晶の特徴づけ
[0234]  結晶の単位格子の寸法は、６個の数字、つまり３の固有の辺、ａ、ｂ、及びｃ、並びに３の固有の角度α、β、及びγにより定義される。結晶を構成する単位格子のタイプは、上記されるように、これらの変数の値に左右される。
【０２１８】
[0235]  結晶がＸ線に晒されると、結晶中の分子の電子はビームを回折し、その結果、結晶の周囲に回折されたＸ線の領域が存在する。回折ビームが結晶から出現する角度は、回折を処理することにより、該角度が、結晶中の等価なセット、平行面から反射するかのように計算されうる（Bragg則）。結晶格子における最も明確な面の一組は、単位格子面に平行である面である。これらの及び他の面のセットは、格子点を通して描かれてもよい。面の各セットは、３個のインデックス、ｈｋｌにより同定される。ｈインデックスは、単位格子のa辺がｈｋｌ面のセットにより切断される部分の数を与え、ｋインデックスは、単位格子のｂ辺がｈｋｌ面のセットにより切断される部分の数を与え、そしてｌインデックスは、単位格子のｃ辺がｈｋｌ面のセットにより切断される部分の数を与える。こうして、例えば、２３５の面が、各単位格子のａ辺を半分に切断し、各単位格子のｂ辺を３個に切断し、そして各単位格子のｃ辺を５個に切断する。単位格子のｂｃ面に平行である面は、１００面であり；単位格子のａｃ面に平行である面は、０１０面であり；そして単位格子のａｂ面に平行である面は、００１面である。
【０２１９】
[0236]  検出器が、回折Ｘ線の経路に配置されるとき、回折の球中に効果的に干渉する際に、スポットの数、又は反射は、静止結晶（回転なし）について記録されて、「静止」した回折パターンを作り出す。各反射は、平行面の１セットから反射するＸ線の結果であり、そして、単位格子における分子の配置に関する強度、及び当該スポットを作り出すビームが反射元の平行面に対応するｈｋｌインデックスにより特徴付けられる。結晶がＸ線ビームに対し直交軸で回転される場合、多くの反射は検出器で記録され回折パターンをもたらす。
【０２２０】
[0237]  結晶の単位格子の寸法及び空間群は、回折パターンから決定されうる。第一に、反射の間隔は、単位格子の辺の長さに反比例する。それゆえ、Ｘ線ビームが、単位格子の面に垂直に当たるとき回折パターンが記録される場合、２個の単位格子寸法は、検出器のＸ-Ｙ方向における反射の間隔、結晶から検出装置の距離、及びＸ線の波長から推定され得る。当業者は、全ての３の単位格子寸法を得るために、Ｘ線ビームが単位格子の別の面に垂直に当たるように、結晶は回転されなければならないということを認める。第二に、単位格子の角度は、回折パターンのスポットの線の間の角度により決定されうる。第三に、視覚による観察により証拠づけられる、ある反射がないこと及び回折パターンの性質がないことは、結晶の内部対称又は空間群を指示す。それゆえ、結晶は、単位格子及び空間群により、並びにその回折パターンにより特徴づけられうる。
【０２２１】
[0238]  ひとたび単位格子の寸法が決定されると、非対称格子におけるポリペプチドの数が、ポリペプチドの大きさ、平均タンパク質の密度、及びタンパク質結晶の典型的な溶媒含量から推定され得る。当該含量は、通常単位格子体積の30〜70%の範囲である(Matthews, J. Mol. Biol. 33(2):491-97,1968)。
【０２２２】
データー収集及び構造解の決定
[0239]  回折パターンは、フーリエ変換により、分子の３次元の形状に関連する。解の決定のプロセスは、基本的に回折されたＸ線を再焦点化して、結晶における分子の３次元イメージを作成する。Ｘ線の再焦点化は、現在ではレンズで行うことができないので、数学的手法を会して行われる。
[0240]  回折球は、結晶内部の対称性に依存して対象性を有し、このことは、結晶の配向の作成は、同じ反射セットを作り出すということを意味する。こうして、高対象性を有する結晶は、より繰り返しの回折パターンを有し、そして回折の完全な表示を有するために記録される必要がある固有の反射はより少ない。データー収集、データーセットのゴールは、できるだけ多くの反射についての一貫して計測され、インデックスをつけられた強度のセットである。完全なデーターセットは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の固有反射が記録される場合に回収される。１の実施態様では、完全なデーターセットは、１の結晶を使用して回収される。別の実施態様では、完全なデーターセットは、同じタイプの結晶の１以上を使用して回収される。 
【０２２３】
[0241]  Ｘ線源は、非限定的に回転陽極Ｘ線発生機、例えばリガク（Ｒｉｇａｋｕ）ＲＵ-２００、マイクロ・ソース又はミニ・ソース、密閉ビーム・ソース、又はシンクロトロン光源でのビーム・ライン、例えばArgone National Laboratoyのアドバンスド・フォトン・ソース（Advanced Photon Source）などを含む。回折パターンを記録する適切な検出器は、非限定的にＸ線感光フィルム、マルチワイヤー領域検出器、リンで被膜されたプレート、及びＣＣＤカメラを含む。典型的に、検出器及びＸ線ビームは、固定されており、その結果、結晶の回折球の異なるパターンからの回折を記録するために、結晶自身がゴニオスタットと呼ばれる可動性の環の自動化システムを介して移動される。
【０２２４】
[0242]  データー収集において、特に溶媒を多く含む巨大分子結晶から生じる最も重大な問題の１つは、Ｘ銭ビームによる結晶の急速な劣化である。劣化を遅くするために、データーは、液体窒素の温度で結晶から収集されることが多い。結晶が、液体窒素への最初の暴露から生き残るために、結晶中の氷の形成は、抗凍結剤を使用することによって防がれうる。適切な抗凍結剤は、非限定的に低分子量ポリエチレン・グリコール、エチレン・グリコール、スクロース、グリセロール、キシリトール、及びそれらの組合せである。結晶は、液体窒素に晒される前に１以上の抗凍結材を含む溶液中に浸されるか、又は１以上の抗凍結材は結晶化溶液中に加えられてもよい。液体窒素の温度でのデーター収集は、１の結晶から全てのデーターセットを収集を可能にする。
【０２２５】
[0243]  ひとたびデーターセットが集められると、当該情報は、結晶中の分子の３次元構造を決定するために使用される。当該位相情報は、回折パターンについてフーリエ変換を行って、結晶中の分子の３次元構造を取得するために、以下に記載される方法により獲得されてもよい。実質的にＸ線を再焦点化して分子のイメージを作成することが、位相情報の決定である。
【０２２６】
[0244]  位相情報を取得する１の方法は、重原子誘導体結晶が使用される同形置換による。この方法では、重原子誘導体結晶において分子が結合している重原子の位置が決定され、そして該情報は次に、未変性結晶の３次元構造を解明するために必要な位相情報を得るために使用される（Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press, 1976）。 
【０２２７】
[0245]  位相情報を取得する別の方法は、分子置換による。分子置換は、その構造座標が知られているポリペプチドを、新たな結晶の単位格子中に配向及び配置して、新たな結晶の観測された回折パターンを最もよく説明することにより、その立体構造座標が未知であるポリペプチドの新たな結晶について初期位相を計算する方法である。次に位相は、配向され、そして位置付けされたポリペプチドから計算され、そして観察された振幅と併せて、新たな結晶を構成する分子構造のおおよそのフーリエ合成を提供するために観察された振幅と組み合わせられる（Lattman, Methods in Enzymology 115: 55-77,1985 ; Rossmann,"The Molecular Replacement Method, "Int. Sci. Rev. Ser. No. 13, Gordon & Breach, New York, 1972）。
【０２２８】
[0246]  位相決定の第三の方法は、多波長変則回折、つまりＭＡＤである。この方法では、Ｘ線回折データーは、少なくとも１の重原子を含む１の結晶から、入来Ｘ線放射のエネルギー付近の吸収限界で、幾つかの異なる波長で収集される。Ｘ線と電子軌道との間の共鳴は、Ｘ線分散の違いを導き、当該違いは重原子の位置が同定を可能にする。これは次にポリペプチドの結晶の位相情報を提供する。ＭＡＤ分析の詳細な議論は、Hendrickson, Trans. Am. Crystallogr. Assoc., 21: 11, 1985 ; Hendrickson et al., EMBO J. 9: 1665,1990 ; 及びHendrickson, Science, 254: 51-58, 1991）において見られうる。
【０２２９】
[0247]  位相情報を決定する第４の方法は、短波長異常分散、つまりＳＡＤである。この技術では、Ｘ線回折データーは、単一の未変性又は重原子誘導体結晶から単一波長で収集され、そして位相情報は、未変性の結晶における硫黄又は塩素などの原子からの異常分散情報を使用して抽出されるか、又は重原子誘導体結晶における重原子からの異常分散情報を使用して抽出される。当該位相技術についてデーターを収集するために使用されるＸ線の波長は、異常分散の吸収限界に近いことを必要としない。ＳＡＤ分析の詳細な記載は、Brodersen, et al.、Acta Cryst. , D56: 431-41,2000.に見られうる。
【０２３０】
[0248]  位相情報を決定する第５の方法は、異常分散効果を利用した単一重原子同形置換法、つまりＳＩＲＡＳである。ＳＩＲＡＳは、同形置換と異常分散技術とを合わせて、ポリペプチドの結晶の位相情報を提供する技術である。単一波長で、未変性及び単一重原子誘導体結晶の両方から、Ｘ線回折データーを取得する。単一重原子誘導体結晶における重原子の位置からのみ得られる位相情報は、位相角度を不明確にし、位相角度は、重原子からの異常分散を使用して解かれる。位相情報は、重原子の位置と重原子異常分散の両方から抽出される。ＳＩＲＡＳ分析の詳細な記載は、North, Acta Cryst. 18: 212-16,1965 ; Matthews, Acta Cryst. 20: 82-86,1966 ; Methods in Enzymology 276: 530-37,1997において見られる。
【０２３１】
[0249]  位相情報が取得されると、位相情報は回折データーと合わせられて、電子密度マップ、単位格子における分子を構成する原子を取り囲む電子雲のイメージを与える。データーの解像度が高くなればなるほど、電子密度マップの形がより区別可能なものとなる。なぜなら互いに近い原子が、解像できるからである。巨大分子のモデルは、次にコンピューターの助けを借りて、全ての利用可能な情報、例えばポリペプチド配列、分子構造及び立体化学の確立規則などをガイドとして使用して、電子密度マップに組み込まれる。電子密度マップの解釈は、当該マップに正確に適合する化学的に妥当な立体構造を見つける方法である。
【０２３２】
[0250]  モデルが作成された後に、構造を精密化する。精密化は、関数φを最小化する方法である。該関数φは、（Ｒ因子により測定される）計測された強度値と計算された強度値との間の違いであり、そして位置、温度因子、及び当該モデルにおける非水素原子の各々の占有率の関数である。これは、通常、実際の空間精密化の代わりのサイクル、つまり電子密度マップを計算すること、モデルを作ること、並びに逆空間精密化、つまり元の強度データーとうまくいった各モデルから作成された強度データーとの間の一致を改良するコンピューターによる試みに関する。関数φが最小値に収束した際に、精密化は終了する。ここで該モデルは、電子密度マップに適合し、そして立体化学的及び立体構造的に妥当である。精密化の最終ステージの間、秩序だった溶媒分子が当該構造に加えられる。
【０２３３】
Ａｂ１ＫＤの構造
[0251]  本発明は、最初に、Ｘ線結晶学により決定されたＡｂ１ＫＤ結晶の高解像度３次元構造及び分子構造を提供する。
【０２３４】
[0252]  未変性結晶、重原子誘導体結晶、又は共結晶であろうと、Ａｂ１ＫＤの結晶について得られた構造座標のいずれかのセットであって、骨格原子（Ｎ、Ｃ-α、Ｃ、及びＯ）を使用して、又はＣ-α原子を使用して、図３、４、５、又は６に記載される構造座標上に重ね合わせた場合、少なくとも５０％〜１００％のＡｂ１ＫＤの骨格原子が重ねあわせに含まれる際に、約１.５Å、好ましくは１.２５Å、好ましくは１Å、好ましくは１.７５Å、及び好ましくは０.５Å以下の標準偏差を有するセットは、本発明の範囲内であると考えられる。図３、４、５、又は６におけるアミノ酸の数が、本発明の結晶を取得するために使用される発現タンパク質中でのアミノ酸の位置を表す。所望されるならば、アミノ酸残基数と相関させるために、当該配列を、他のＡｂ１ＫＤ配列と配列比較しうる。こうして、「図３、４、５、又は６の配列」は、アミノ酸配列に対するアミノ酸番号に関し、そして非特異的に図３、４、５、又は６の構造座標に関する。
【０２３５】
構造座標
[0253]  分子構造座標は、以下により十分に記載されるように、分子モデリング及び分子設計において使用されうる。本発明は、構造座標及び他の情報、例えばアミノ酸配列、結合表、ベクターに基づく表示、温度因子などを含み、以下に記載されるソフトウェアプログラム及び他のソフトウェアプログラムにおいて使用するためのポリペプチドの３次元構造を作成するために使用される。
【０２３６】
[0254]  本発明は、特定の分子の３次元分子構造座標、例えばＡｂ１ＫＤ構造座標、Ａｂ１ＫＤの結合ポケット又は活性部位の構造座標、又はＡｂ１ＫＤに結合できる化合物の構造座標を含むコンピューターが読み取り可能なデーターベースを作成する方法を含む。本発明のデーターベースは、かなり多数の分子に対する分子構造座標のセットをいくらでも含んでもよく、例えば１分子の構造座標を含む。他の実施態様では、本発明のデーターベースは、仮想のスクリーニングによりＡｂ１結合ポケットに結合すると同定された化合物（単数又は複数）の構造座標、又はそうした化合物の他の表示、例えば画面表示又は名前などを含んでもよい。「データーベース」は、検索可能なデーターの集合を意味する。本発明は、結晶ポリペプチド及び／又はモデル、例えば本明細書中に記載され、そのリガンドが結合された状態又はリガンドが結合されない状態である分子の構造座標、又はサブユニット、ドメイン、及び／又は例えば活性部位、近接結合部位、及び／又は結合ポケットを含む部分に関する３次元構造に関する情報を含むか、又は記憶される機械が読み取り可能な媒体を含む。或いは、タンパク質中で見つかった特異的構造を表す識別の情報でありうる。本明細書中で使用されるとき「機械が読み取り可能な媒体」は、コンピューター又はスキャナにより直接読まれるか及びアクセスされうる媒体のいずれかを指す。そうした媒体は、多くの形態をとり、例えば非限定的に、不揮発性、揮発性、及び伝達性媒体を含む形態をとりうる。不揮発性媒体、つまり電力がない状態で情報を保持することができる媒体は、ＲＯＭを含む。揮発性媒体、つまり電力がない状態で情報を保持できない媒体は、メイン・メモリーを含む。伝達媒体は、同軸ケーブル、銅線及び光ファイバーを含み、バスを含むワイヤを含む。伝達媒体は、搬送波の形態：つまり、振動数、振幅、又は位相の点で改変されて、情報シグナルを伝達する電磁波の形態をとりうる。さらに、伝達媒体は、音波又は光波、例えば電波の及び赤外線データー通信の発生される光波の形態をとりうる。
【０２３７】
[0255]  そうした媒体は、非限定的に：磁気記憶媒体、例えばフロッピー（登録商標）ディクス（登録商標）、フレキシブルディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープ；光学記憶媒体、例えば光学ディスク又はＣＤ-ＲＯＭ；電気的記憶媒体、例えばＲＡＭ又はＲＯＭ、ＰＲＯＭ（つまり、プログラム可能読取専用メモリ）、ＥＰＲＯＭ（つまり、消去可能プログラム可能読取専用メモリ）、例えばＦＬＡＳＨ-ＥＰＲＯＭ、他のメモリチップ若しくはカートリッジ、搬送波、又はプロセッサが情報を取り出すことができる他の媒体、及びそれらのカテゴリーの組合せ、例えば磁気／光学記憶媒体を含む。そうした媒体は、記録された分子構造座標の表示、並びにスキャン装置により読まれ、そしてコンピューターにより又は本明細書中に記載されるソフトウェアプログラム、例えば光学文字認識（ＯＣＲ）ソフトウェアにより用意にアクセスされるフォーマットに変更されうるデカルト座標をさらに含む。そうした媒体はまた、穴のパターンを有する物理的媒体、例えばパンチカード、及び紙テープなども含む。
【０２３８】
[0256]  種々のデーター記憶構造は、本発明の分子構造座標又はその一部、及び／又はＸ線回折データーを記録されたコンピューターが読み取り可能な媒体を作ることができる。データー記憶構造の選択は、一般的に記憶された情報にアクセスするために選ばれる手段に基づくであろう。さらに、種々のデーター・プロセッサ・プログラム及びフォーマットは、配列及びＸ線データー情報をコンピューター読取可能媒体に記憶するために使用されうる。そうしたフォーマットは、非限定的に巨大分子結晶情報ファイル（「ｍｍＣＩＦ］）及びタンパク質データーバンク（「ＰＤＢ」）フォーマット（Research Collaboratory for Structural Bioinfonnatics ; www.rcsb.org; Cambridge Crystallographic Data Centre format （www.ccdc.can.ac.uk/support/csd_doc/volume3/z323.html） ; 構造データー（"SD"）ファイルフォーマット（MDL Information Systems, Inc. ; Dalby, et al., J. Chem. Inf. Comp. Sci. , 32: 244- 55,1992）;及びライン-ノーテーション、例えばＳＭＩＬＥＳ（Weininger, J. Chem. Inf. Comp. Sci. 28: 31-36,1988）で使用される。異なるコンピューター・ソフトウェアにより読まれた種々のフォーマット間の変換方法は、当業者に用意に明らかであろう。例えば、ＢＡＢＥＬ（v.1.06、Walters & Stahl,コピーライト1992、1993、1994; www.brunel.ac.uk/departments/chem/babel.htm）である。全てのフォーマットは、本明細書中に記載されるポリペプチド座標、又はその一部は、本発明により考慮される。そこに本発明の原子座標を記憶したコンピューターが読み取り可能な媒体を提供することにより、当業者は、日常的に本発明の原子座標、又はその一部、及び以下に詳細に記載されるモデリング及び設計プログラムに使用するための関連情報にアクセスできる。
【０２３９】
[0257]  コンピューターは、本発明のリガンドが結合されたか又は結合されない形態のタンパク質若しくはペプチド構造、或いはその一部、例えば活性部位、近接結合部位、及び／又は結合ポケットを含む部位の構造座標又は３次元表示を表すために使用されうる。「コンピューター」という用語は、非限定的に、メインフレーム・コンピューター、パーソナル・コンピューター、ポータブル・ラップトップ・コンピューター、及びパーソナル・データー・アシスタンス（ＰＤＡ）であって、データーを記憶ことができ、そして独立して１以上のアプリケーション、つまりプログラムを走らすことができるものを含む。当該コンピューターは、例えば本発明の機械が読取可能な記憶媒体、機械が読み取り可能な貯蔵媒体中にコードされた機械が読み取り可能なデーターを処理する指示を記憶するための作動メモリ、作動メモリー及び機械が読み取り可能な情報を処理するための機械が読み取り可能な記憶媒体に作動可能なように結合された中央演算処理装置、並びに構造座標又は3次元表示を表示するために中央演算処理装置に作動可能なように結合されたディスプレイを含んでもよい。機械が読み取り可能な媒体に含まれる情報は、例えば、Ｘ線回折データー、構造座標、電子密度マップ、又はリボン構造の構造でありうる。情報は、本発明の化合物とタンパク質又はペプチドとの間の共複合体のデーターを含んでもよい。
【０２４０】
[0258]  本発明のコンピューターはまた、例えば中心演算処理装置、例えばランダム・アクセス・メモリ（ＲＡＭ）又は「中心メモリ」、マス記憶メモリ（例えば、１以上のディスク装置、又はＣＤ-ＲＯＭ装置）、１以上のブラウン管（ＣＲＴ）ディスプレイ末端又は１以上のＬＣＤディスプレイ、１以上のキーボード、１以上の入力ライン、及び１以上の出力ラインでありうる。これら全ては、慣用の双方向システムバスにより繋がれている。本発明の機械が読み取り可能なデーターは、モデム又は電話線により又は専用データーライン（そのどちらも、例えばワイヤレス通信モードを含んでもよい）により繋がれるモデムを通して入出力されうる。インプット・ハードウェアはまた、ＣＤ-ＲＯＭドライブ又はディスク装置を含んでもよい。他の入力装置の例はキーボード、マウス、トラックボール、フィンガーパッド、又はカーソル指示キーである。出力ハードウェアは、慣用の装置に使用されうる。例えば、出力ハードウェアは、ＣＲＴ、又は他のディスプレイ端末、プリンター又はディスクドライブを含んでもよい。ＣＰＵは、種々のインプット及びアウトプット装置の使用を調整し、マスストレージからのアクセス、及び作動メモリへの及びからのデーターアクセスを調整し、そしてデーター処理ステップの順番を決定する。コンピューターは、種々のソフトウェア・プログラムを使用して、本発明のデーターを処理する。このタイプのソフトウェアの多くの例は、本出願を通して論じられる。
【０２４１】
[0259]  構造座標のセットが、３次元における形を規定する点の相対セットであるということが、当業者により認識される。それゆえ、２の異なる座標セットは、同一又は類似の形を規定しうる。個々の座標における軽微な変化は、ペプチドの形にはほとんど影響を与えない。全体構造における軽微な変化は、例えば結合ポケット状に皆無かそれに近い影響しか与えず、そして結合ポケットと会合する化合物の性質を有意に変化させることは予期されない。
【０２４２】
[0260]  しかしながら、デカルト座標は、ポリペプチドの３次元構造の重要かつ慣用の表示であるが、他の構造表示もまた有用である。それゆえ、本明細書中で記載されるポリペプチドの３次元構造は、デカルト座標表示だけではなく、原子の３次元配置の代わりの表示の全てを含む。例えば、原子座標は、Ｚ-マトリックスとして表示され得る。ここでタンパク質の第一原子が選択され、第二原子は、第一原子から規定された距離で配置され、そして第三原子は、第二原子から規定された距離で配置され、その結果第一原子との規定された角度を作り出す。後に続く各原子は、前に配置された原子からの規定された距離と、第三の原子にたいする規定の角度、及び第四原子に対する規定のねじれ角で配置される。原子座標はまた、パターソン関数として表されてもよい。ここで全ての原子間ベクトルが引かれ、そしてその尻尾を開始点に位置される。当該表示は、単位格子における重原子の配置に特に有用である。加えて、原子座標は、大きさ及び方向を有する一連のベクトルとして表示され、ポリペプチド構造において、選択された開始点から各原子へ引かれる。さらに、３次元構造における原子位置は、単位格子の割合（分率座標）として、又は球面極座標で表される。
【０２４３】
[0261]  さらなる情報、例えば、構造における各原子の動きを計測する熱パラメーター、原子が配置される多鎖タンパク質の特定の鎖を同定する鎖の識別名、及び特定の原子が結合される原子を指示する接続情報が、３次元分子構造を表すために有用である。
【０２４４】
[0262]  本発明のＡｂ１ＫＤに結合する化合物の構造情報は、Ａｂ１ＫＤの構造座標について上記されるように同様に記録されそして伝達されうる。
【０２４５】
分子構造座標の使用
[0263]   典型的には分子構造座標の形態の構造座標は、結晶化ポリペプチド又はその部分又は断片に結合する化合物を設計、選別、及び／又は同定するための、或いは生物学的性質を変えられた突然変異を理知的に設計するためのコンピューターによる又はコンピューターに基づいた種々の方法で使用されうる。
【０２４６】
[0264]  あるタンパク質と会合しうる化合物を設計又は同定する時、結合ポケットが分析されることが多い。「結合ポケット」は、その形のため、化学物質又は化合物と相互作用しうるタンパク質の領域を指す。結合ポケットは、活性部位と同じであってもよい。タンパク質の結合ポケットは、通常タンパク質の天然リガンド又は基質との会合に関与し、そしてタンパク質活性の基礎であることが多い。結合ポケットは、活性部位を指しうる。多くの薬剤は、タンパク質の結合ポケットと会合することにより作用する。結合ポケットは、ポケットの裂け目に並ぶアミノ酸残基をふくみうる。Ａｂ１ＫＤの他の異性体に使用される番号付けシステムは異なりうるが、対応するアミノ酸が当業者に知られているホモロジー・ソフトウェアプログラムで決定されうるということが、当業者により認識されるであろう。結合ポケット・ホモログは、図３、４、５、又は６に示される構造座標から、約１.５Å以下、好ましくは約１.２５Å以下、好ましくは約１Å以下、好ましくは約０.７５Å以下、好ましくは約０.５Å以下、及び好ましくは約０.２５Å以下の標準偏差を有する構造座標を有するアミノ酸を含む。
【０２４７】
[0265]  結合ポケット又は制御部位が、特定の構造座標を有するアミノ酸を含むといわれている場合、該アミノ酸は、同じアミノ酸残基を含むか、又は例えば表１に示されるように類似の性質を有するアミノ酸を含み、そして図３、４、５、又は６と同じ相対３次元構造座標を有し、又は図３、４、５、又は６の構造座標の１.５Å、好ましくは１.２５Å、好ましくは１Å、好ましくは０.７５Å、好ましくは０.５Å、及び好ましくは０.２５Å内のＲＭＳＤを有する結合ポケットの部分として名付けられるアミノ酸の群を含む。好ましくは、アミノ酸残基の骨格原子の構造座標を含む場合、ＲＭＳＤは、１.５Å、好ましくは１.２５Å、好ましくは１Å、好ましくは０.７５Å、好ましくは０.５Å、及びより好ましくは０.２５Å内である。
【０２４８】
[0266]  ソフトウェア・アプリケーションは、構造、又はその一部を比較するために、本発明の構造に十分類似するかを決定するために利用できる。例えば、ＤＡＬＩ（Holm and Sander, J : Mol. Biol. 233: 123-38,1993 ; （ヨーロッパ・バイオインフォマティクス・機関のサイト： www.ebi.ac.uk/を参照のこと） ; ＭＯＥ（Chemical Computing Group, Inc. Montreal, Quebec, Canada）; 及びＤＥＪＡＶＵ（Uppsala Software Factory; Kleywegt, G. S. & Jones, T. A., "Detecting Folding Motifs and Similarities in Protein Structure,"Methods in Enzymology, 277: 525-45,1997）である。 
【０２４９】
[0267]  そこから得られた結晶及び構造座標は、新たな治療薬の開発にむけられたアプローチとして、Ａｂ１に結合する化合物を同定及び／又は設計するための合理的な薬剤設計のために使用されうる。例えば、溶媒で飽和された結晶化タンパク質の高解像度Ｘ線構造は、タンパク質の周囲に、及び特にタンパク質の推定の結合ポケットにて並んだ溶媒分子の位置を示すことが多い。この情報は、これらの部位に結合する分子を設計するために使用されうる。当該化合物は合成され、そして生物学的アッセイにおいて結合について試験される（Travis, Science, 262: 1374,1993）。
【０２５０】
[0268]  当該構造は、種々の部位にて複数の分子でコンピューターによりスクリーニングされて、Ａｂ１ＫＤに結合する能力を決定された。そうした化合物は、例えば治療において重要である可能性のある阻害剤を同定するための医化学の取り組みにおいて、標的化合物又はリード化合物として使用されうる（Travis, Science, 262: 1374,1993）。そうした化合物の３次元構造は、Ａｂ１ＫＤの３次元表示又はその活性部位若しくは結合ポケット状に重ね合わせて、化合物が空間的に当該表示、及び従ってタンパク質に適合するかを評価する。そうした方法により、及び適合する化合物（又はそうした化合物の適合部分）を考慮することにより作成される構造座標は、機械が読み取り可能な媒体中に記憶されうる。或いは、適合する化合物の１以上の識別情報、又はその適合部分は、機械が読み取り可能な媒体中に記憶されうる。識別情報の例は、化学名又は略語、化学又は分子式、化学構造、及び／又は他の同定情報を含む。非限定的な例として、フェノールの３次元構造が、Ａｂ１ＫＤの活性部位に適合することが発見されたならば、フェノールの構造情報又は適合するその一部は、さらに使用するために記録されうる。或いは、フェノール又は適合する部分、例えば-ＯＨ基の識別情報は、さらに使用するために記録されうる。フェノールに対する他の識別情報は、フェノールを表すために使用されうる。適合する化合物に関する情報の記録の全ては、場合によりＡｂ１ＫＤに関する１以上の情報と組み合わせられてもよい。
【０２５１】
[0269]  類似の様式で、Ａｂ１ＫＤ、又はその活性部位若しくは結合ポケットの構造は、Ａｂ１に対して全体又は一部に結合できる化合物又は化学物質の低分子データーベースをコンピューターにより選別するために使用されうる。このスクリーニングでは、そうした物質又は化合物の結合ポケットへの適合性質は、相補性の形又は見積もられた相互作用エネルギーにより判断されうる（Meng, et al., J Comp. Chem. 13: 505-24,1992）。
【０２５２】
[0270]  さらに別の実施態様では、Ａｂ１の天然基質、反応中間体、又は反応産物のアナログが開発されうる。Ａｂ１の反応中間体は、基質、Ａｂ１ＫＤとの共複合体における反応産物から推定されうる。基質、反応中間体、及び反応産物の結合は、結合ポケットの立体構造を変化させ、潜在的なリガンド、活性化剤、阻害剤などの結合パターンに関する追加の情報を提供する。そうした情報はまた、既知のＡｂ１阻害剤の改良されたアナログを設計するために、又はＡｂ１ＫＤの基質、反応中間体、及び反応産物、並びにＡｂ１ＫＤ阻害剤共複合体に基づく阻害剤の新規クラスを設計するために有用である。これは、高特異性及び安定性を備えるＡｂ１ＫＤ阻害剤を設計する新規の経路を提供する。
【０２５３】
[0271]  結合ポケットと会合する化合物を選別又は設計する別の方法は、例えば、結合ポケットのネガティブ・イメージをコンピューターにより設計することを含む。当該ネガティブ・イメージは、ファーマコフォアのセットを同定するために使用されてもよい。ファーマコフォアは、官能基の記載でありうるし、そしてどのように３次元空間において互いに関係するかでありうる。ファーマコフォアのセットは、化合物を設計するために使用されうるし、そしてファーマコフォア（単数又は複数）と適合する化合物について化学データーベースを選別し、化合物を設計するために使用されうる。当該方法により同定される化合物は、さらに結合活性についてコンピューターにより又は実験的に評価され得る。種々のコンピューター・プログラムは、結合ポケットのネガティブ・イメージを作成するために使用されうる。例えばＧＲＩＤ （Goodford, J. Med. Chem. 28: 849-57, 1985 ; GRIDは、オックスフォード大学、Oxford, UKから利用できる。）; ＭＣＳＳ （Miranker & Karplus, Proteins: Structure, Function and Genetics 11: 29-34, 1991 ; ＭＣＳＳは、Accelrys, Inc., San Diego, CAから市販される）; ＬＵＤＩ（Bohm, J. Comp. Aid. Molec. Design 6: 61-78,1992 ; ＬＵＤＩは、Accelrys, Inc., San Diego, CAからし反されている）;ＤＯＣＫ（Kuntz et al.; J Mol. Biol. 161: 269-88, 1982 ; DOCKは、カルフォルニア大学、San Francisco, CAから利用できる）; ＤＯＣＫＩＴ （Metaphorics, Mission Viejo, CA）、及びＭＯＥである。他の適切なプログラムは、例えばHalperin, et al. , Proteins 47 （4）: 409-43 （2002）に記載される。
【０２５４】
[0272]  本発明の種々の実施態様の中に、Ａｂ１ＫＤ結合ポケットと会合する化合物を同定、選別、及び設計する方法が存在する。
【０２５５】
[0273]  Ａｂ１に結合するか及び/又はＡｂ１を調節する化合物、例えば、本発明に従ってＡｂ１を阻害するか又は活性化する化合物の設計は、一般的に２個の因子を考慮することを含む。第一に、当該化合物は、Ａｂ１と共有結合により又は非共有結合により物理的及び構造的に会合できなければならない。例えば、共有相互作用は、タンパク質の不可逆性又は自殺型阻害剤を設計するために重要でありうる。Ａｂ１と化合物との会合において重要な非共有結合性分子間相互作用は、水素結合、イオン性相互作用、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用を含む。第二に、当該化合物は、Ａｂ１との相互作用を可能にする結合ポケットに関する立体構造及び配向を想定することができなければならない。しかしながら、化合物のある部分は、Ａｂ１との相互作用に直接加わらないが、これらの部分はまた、分子全体の立体構造に影響し、そして強度について重要な影響を有しうる。立体構造の要求は、３次元構造全て、並びに結合ポケットの全て又は一部に関して化学基又は化合物の配置すること、或いはＡｂ１と直接相互作用する化学基の幾つかを含む化合物の官能基間に間隔をあけること含む。
【０２５６】
[0274]  
標的タンパク質の結合部位に適合し得る化合物又は化合物の断片をコンピューターにより選別するために、種々の方法が使用されうる。リニアーライブラリーを選別するために、エネルギー的に好ましい配座異性体が、仮想ライブラリーの各化合物又は断片について作成される。各配座異性体は、所望されるタンパク質結合部位における結晶学的に決定された化合物又は断片の位置を決定され、そしてエネルギー最小化をかけられる。好ましくない立体構造は取り除かれ、そしてトップスコアの置換基が、ＭＭ/ＰＢＳＡ結合自由エネルギーを使用して選ばれる（P. A. Kollman, et al., Calculating Structures and Free Energies of Complex Molecules: Combining Molecular Mechanics and Continuum Models. Accts. Chem. Res. 33, 889-897 （2000））を参照のこと）。
【０２５７】
[0275]  １の例では、化合物又は断片がひとたび選ばれると、さらなる仮想のライブラリーを設計するために、該化合物又は断片はインシリコ反応にかけられうる。当該仮想のライブラリーは、更なるスクリーニングのために合成されうるライブラリーを選別するために使用されうる。立体的にアクセス可能な及び/又はエネルギー的に好ましい配座異性体が、例えば、ＯＭＥＧＡ（OpenEye）、Ｃａｔａｌｙｓｔ（Accelrys）、ＭＯＥ（CCG） 、及びＳＹＢＹＬ（Tripos）を使用して、結晶学的に決定された化合物又は断片の位置については、例えばＭＯＥ（CCG）及びＤＯＣＫを使用して作成される。配座異性体/結合部位の組合せは、例えばＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Accelrys）、ＭＯＥ（CCG）、ＳＹＢＹＬ（Tripos）、及びＡＭＢＥＲを使用するエネルギー最小化にかけられ、そして好ましくない立体構造、例えば高い分子内エネルギー、例えば、約５.０ｋｃａｌ/ｍｏｌを超える分子内エネルギーを有する分子が除かれる。残っている立体構造からのトップスコア置換基が、ＭＭ/ＰＢＳＡで選択され、そしてさらなる分析のため合成される。
【０２５８】
[0276]  他のコンピューター化学方法は、化合物又は断片ライブラリーの要素を選別するために使用されうる。これらのプログラムはまた、リード化合物を作成するために、化合物又は断片の改良を設計するために使用されうる。
【０２５９】
[0277]  コンピューター・モデリング技術は、Ａｂ１ＫＤへの化学化合物の潜在的な調節又は結合効果を評価するために使用されうる。コンピューター・モデリングが、強い相互作用を示すならば、当該分子は次に合成され、そしてそのＡｂ１への結合能力及び（阻害又は活性化による）その活性へ影響する能力について試験された。
【０２６０】
[0278]  Ａｂ１の調節又は他の結合化合物は、一連のステップによって、コンピューターにより評価及び設計され得る。当該ステップでは、化学基又は断片が、個々の結合ポケット又は他のＡｂ１の領域と相互作用する能力について選別及び選択される。いくつかの方法は、Ａｂ１と相互作用する能力について、化学基または断片を選別するために利用される。当該方法は、例えば、Ａｂ１ＫＤ座標に基づくコンピューター選別上の活性部位を視覚により検査することにより始まりうる。選択された断片又は化学基は、次に種々の配向で位置されるか、又はＡｂ１ＫＤの個々の結合ポケット内にドッキングしうる（Blaney, J. M. and Dixon, J.S., Perspectives in Drug Discovery and Design, 1: 301, 1993）。手動によるドッキングは、例えＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ（Accelrys, San Diego, CA）ＭＯＥ;ＣＥ（Shindyalov, IN, Bourne, PE, "Protein Structure Alignment by Incremental Combinatorial Extension （CE） of the Optimal Path,"Protein Engineering, 11: 739-47, 1998）; 及びＳＹＢＹＬ（Molecular Modeling Software, Tripos Associates, Inc., St. Louis, MO, 1992）を使用し、次にエネルギー最小化及び標準分子機械的力場での分子ダイナミクス、例えばCHARMM （Brooks, et al., J. Coinp. Chem.4: 187-217, 1983）を使用して達成されうる。より自動化された配置法は、例えばＤＯＣＫなどのプログラムを使用することにより達成されうる（Kuntz et al., J : Mol. Biol., 161: 269-88, 1982; ＤＯＣＫは、カリフォルニア大学、San Francisco, CAから利用できる）;ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Goodsell & Olsen, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8: 195-202,1990; ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Scripps Research Institute, La Jolla, CAから市販される）; ＧＯＬＤ（Cambridge Crystallographic Data Centre （CCDC）; Jones et al., J. Mol. Biol. 245: 43-53,1995） ;及びＦＬＥＸＸ（Tripos, St. Louis, MO; Rarey, M., et al., J ; Mol. Biol. 261: 470-89, 1996）;ＡＭＢＥＲ （Weiner, et al., J. Ana. Claem. Soc. 106: 765-84, 1984） 及びＣ２ ＮＭＦＦ（Merck Molecular Force Field; Accelrys, San Diego, CA）。他の適切なプログラムは、例えばＨａｌｐｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ.により記載される。
【０２６１】
[0279]  特殊化されたコンピューター・プログラムはまた、断片又は化学基を選別する方法を手助けしうる。これらは、ＤＯＣＫ; ＧＯＬＤ; ＬＵＤＩ; ＦＬＥＸＸ （Tripos, St. Louis, MO; Rarey, M., et al., J : Mol. Biol. 261: 470-89,1996） ; 及びＧＬＩＤＥ（Eldridge, et al., J. Comput. Aided Mol. Des. 11: 425-45, 1997 ; Schroedinger, Inc., New York）を含む。他の適切なプログラムは、例えばHalperin, et al.（Portland, OR）により記載される。
【０２６２】
[0280]  適切な化学基又は断片がひとたび選別されると、それらは、１の化合物又は阻害剤に組み立てられうる。組み立ては、Ａｂ１ＫＤの構造座標に関して、コンピュータースクリーン上に表示された３次元イメージにおいて、互いの断片の関係を視覚的に調べることにより行われる。この次に、ＳＹＢＹＬ（Tripos, St. Louis, MO）; Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ （Accelrys, San Diego, CA）; 及びＭＯＥ （Chemical Computing Group, Inc. , Montreal, Canada） などを使用して手動のモデル構築が行われる。他の適切なプログラムは、例えばHalperin, et alにより記載される。
【０２６３】
[0281]  個々の化学基または断片を接続する際に、当業者の助けとなるプログラムは、例えば以下を含む。
1. ＣＡＶＥＡＴ（Bartlett et al.,  ＣＡＶＥＡＴ: 生物学的に活性な分子の構造に派生されたデザインを亢進するプログラム、特別出版、 Royal Chem. Soc. 78 : 182-96, 1989））。ＣＡＶＥＡＴは、カルフォルニア大学、Berkeley, CAからりようできる。
２.  ＩＳＩＳ又はＭＡＣＣＳ-３Ｄなどの３Ｄデーターベース（ＭＤＬ情報システム、 San Leandro, Calif.）。この領域は、Martin, J. Med. Cheer. 35: 2145-54,1992により総説される。
３.  ＨＯＯＫ（Eisen et al., Proteins: Struct., Funct., Genet., 19: 199-221,1994） 、Accelrys, Inc, San Diego, CAから市販される。
４.  ＬＵＤＩ（Bohm, J. Comp. Aid. Molec. Design 6: 61-78,1992）。ＬＵＤＩは、Accelrys, Inc., San Diego, CA.から市販される。
【０２６４】
[0282]  上で記載されるように、同時に１の断片又は化学基についてＡｂ１阻害剤を段階的な様式で構築を進行する代わりに、Ａｂ１結合化合物は、既知の阻害剤（単数又は複数）の幾つかの部分（単数又は複数）を場合により含むからの活性部位を使用して、全体として又は新規に設計されうる。これらの方法は、例えば以下を含む。
１. ＬＵＤＩ（Bohm, J. Comp. Aid. Molec. Design 6: 61-78,1992）。ＬＵＤＩは、Accelrys, Inc., San Diego, CA.から市販される。
２.  ＬＥＧＥＮＤ（Nishibata & Itai, Tetrahedron, 47: 8985, 1991）。ＬＥＧＥＮＤは、Accelrys, Inc., San Diego, CA.から市販される。
３.  ＬｅａｐＦｒｏｇ（Tripos, Inc., St. Louis, Mo. から市販される）。
４.  ＳＰＲＯＵＴ（Gillet et al., J. Comput. Aided Mol. Design 7: 127-53,1993） （リード大学、U.K.から利用できる）。
５.  ＧｅｎＳｔａｒ（Murcko, M. A.及びRotstein, S.H. J. Comput. Aided Mol. Des. 7: 23-43,1993）。
６.  ＧｒｏｕｐＢｕｉｌｄ（Rotstein, S. H.,及びMurcko, M. A., J. Med. Chem. 36: 1700, 1993）。
７.  ＧｒｏｗＭｏｌ（Rich, D. H. et al., Chimia, 51: 45,1997）。
８.  Ｇｒｏｗ（UpJohn ; Moon J, Howe W, Proteins, 11: 314-28, 1991）。
９.  ＳｍｏＧ（DeWitte, R. S., Abstr. Pap Am Chem. S. 214: 6-Comp Part 1, Sept. 7,1997 ; DeWitte, R. S. & Shakhnovich, E. I., J. Am. Chem. Soc. 118: 11733-44,1996）。
１０.  ＬｉｇＢｕｉｌｄｅｒ（PDB（www.rcsb.org/pdb）; Wang R, Ying G, Lai L, J
Mol. Model. 6: 498-516,1998）。
【０２６５】
[0283]  他の分子モデリング技術はまた、本発明に従って使用されうる。例えば、Cohen et al., J. Med. Chem. 33: 883-94, 1990を参照のこと。また、Navia & Murcko, Current Opinions in Structural Biology 2: 202-10,1992 ; Balbes et al., Reviews in Computational Chemistry, 5: 337-80,1994, （Lipkowitz及びBoyd, 共著） （VCH, New York）; Guida, Curr. Opin. Struct. Biol. 4: 777-81,1994.を参照のこと。
【０２６６】
[0284]  上記方法による化合物の設計及び選別の間、化合物がＡｂ１ＫＤに結合し得る効力がコンピューターによる評価により試験され、そして最適化されうる。例えば、Ａｂ１阻害剤として機能するように設計又は選別された化合物は、未変性の基質が結合される時、活性部位により占められる体積と重なる体積を占めないが、しかしながらいくらかの柔軟性があり、主鎖及び側鎖の再構成が可能にすることが当業者により認識されるであろう。さらに、当業者は、結合した際にタンパク質再構成を使用することができる化合物、例えば、導入された適合をもたらす化合物を設計してもよい。有効なＡｂ１阻害剤は、その結合と遊離状態との間の比較的小さなエネルギーの差を示しうる（つまり、結合した際の少ない変形エネルギー及び/又は結合した際の立体構造の少ないひずみを有さなければならない）。こうして、最も有効なＡｂ１阻害剤は、例えば１０ｋｃａｌ/ｍｏｌ以下、例えば７ｋｃａｌ/ｍｏｌ以下、例えば５ｋｃａｌ/ｍｏｌ以下、及び例えば２ｋｃａｌ/ｍｏｌ以下の結合の変形エネルギーで設計されるべきである。Ａｂ１阻害剤は、全体の結合エネルギーの点で等しい１超の立体構造において、タンパク質と相互作用してもよい。この場合、結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーと、阻害剤が酵素に結合する時に観察される立体構造の平均エネルギーとの間の差から得られる。
【０２６７】
[0285]  エネルギーを計算する方法は、当業者に知られており、そして例えば、ＭＭＦＦ９４を使用する化学コンピューターグループ、又はＭＭＦ９４ｓを使用するOpen Eyeソフトウェアを含む。ＭＭＦＦ９４とＭＭＦＦ９４ｓ （Merck Molecular Mechanics Force Field）は、例えばHalgren, J. Comput. Chem., 17,490-519 （1996）; Halgren, J. Comput. Chem., 17,520-552 （1996）; Halgren, J. Comput. Chem., 17, 553-586 （1996）; Halgren and Nachbar, J : Comput. Chem., 17,587- 615 （1996）; Halgren, J. Comput. Chem., 17,616-641 （1996） ; Halgren, J. Comput. Chem., 20,720-729 （1999）; and Halgren, J. Comput. Chem., 20,730-748 （1999）において記載される。
【０２６８】
[0286]  Ａｂ１ＫＤへの結合用に選択又は設計された化合物は、結合状態が例えば標的タンパク質との斥力電気的相互作用を欠くようにさらにコンピューターにより最適化される。非相補的電気的相互作用は、反発性の電荷-電荷、双極子-双極子、及び電荷-双極子相互作用を含む。特異的に、阻害剤とタンパク質間の全ての電気的相互作用の合計は、阻害剤がタンパク質に結合する時、結合エンタルピーに中性又は有利な貢献を与えうる。
【０２６９】
[0287]  特異的なコンピューターソフトウェアは、化合物の変形エネルギー及び電気的相互作用を評価するために当該技術分野で利用できる。そうした使用のために設計されたプログラムの例は:Ｇａｕｓｓｉａｎ ９４、ｒｅｖｉｓｉｏｎ Ｃ（Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA. 01995） ; ＡＭＢＥＲ、バージョン7 （Kollman, カルフォルニア大学、San Francisco, 02002） ; ＱＵＡＮＴＡ/ＣＨＡＲＭＭ（Accelrys, Inc., San Diego, CA, 01995） ; ＩＮＳ（登録商標）ＩＧＨＴ II/Ｄｉｓｃｏｖｅｒ （Accelrys, Inc., San Diego, CA, 01995） ; ＤｅｌＰｈｉ （Accelrys, Inc., San Diego, CA, 01995） ;及びＡＭＳＯＬ（ミネソタ大学） （Quantum Chemistry Program Exchange,インディアナ大学）を含む。これらのプログラムは、例えば当該技術分野に周知であるコンピューター・ワークステーション、例えばＬＩＮＵＸ、ＳＧＩ、又はＳＵＮワークステーションを使用して、実行され得る。他のハードウェアシステム及びソフトウェア・パッケージは当業者に知られているであろう。
【０２７０】
[0288]  上に記載されるようにＡｂ１ＫＤ結合化合物がひとたび最適に選別又は設計されたなら、その結合性質を改良又は改変するために、原子又は化学基の幾つかに於いて置換がなされうる。一般的に、最初の置換は、保存的、つまり置換基は、元の基とおおよそ同じ大きさ、形、疎水性、及び電荷を有するであろう。立体構造を変化することが当該技術分野に知られている置換基は避けるべきであるということが、当業者により理解するであろう。そうした変化された化学化合物は、次に上で詳細に記載されるのと同じコンピューター方法により、Ａｂ１ＫＤへの結合効力について分析される。構造に基づくドラッグ・デザインの方法は、例えば、Klebe, G. , J.  Mol.  Med.  78: 269-81, 2000）; Hol. W. G.  J.  , Angewandte Chemie （英語の国際版） 25: 767-852, 1986 ; and Gane, P.  J.  and Dean, P.  M. , Current Opinion in Structural Biology, 10: 401-04,2000.に記載される。
【０２７１】
[0289]  本発明はまた、上で記載されるように、その構造がＡｂ１ＫＤ又はそれらの活性部位又は結合ポケットに結合すると同定又は設計された化合物の製造方法を提供する。化合物が、既に知られているか又は設計されている場合、その合成は、当該技術分野に知られている方法により容易に進行してもよい。或いは、上で記載されるように１以上のファーマコフォアの構造に適合する化合物は、当該技術分野に知られている方法により製造されてもよい。代わりの実施態様では、Ａｂ１ＫＤ、又はその活性部位若しくは結合ポケットに結合し、かつ１以上の所望の化学基を結合するための１以上の化学成分を有するか又は含むように改変された開始化合物に、結合により１以上の所望の化学基を導入することによって、化合物の産生が進行する。開始化合物は、Ａｂ１ＫＤ、又はその活性部位若しくは結合ポケットの１以上の残基と結合又は会合できる少なくとも１の成分を含む「足場」として見られうる。
【０２７２】
[0290]  開始化合物は、場合によりさらなる化学成分を導入するためのリンカーを含む柔軟性がある又は柔軟性がない「足場」でありうる。種々の足場化合物が使用され、非限定的に脂肪族炭素鎖、ピロリドン、スルホンアミドピロリドン、シクロアルカノンジエン、例えばシクロペンタノンジエン、シクロヘキサノンジエン、及びシクロフェプタノンジエン、カルバゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、ピリジン、イソキサゾール、イソキサゾリン、ベンゾキサジオン、ベンズアミジン、ピリジオン、及びそれらの誘導体を含む。他の足場は、例えば Klebe, G., J. Mol. Med. 78 : 269-281 （2000）; Magnan, S. and Mikol, V., Curr. Top. Med. Chem. 1: 161-174 （2001）;及びBemis  et  al.に対する米国特許第5,756,466号に記載される。使用される足場化合物は、Ab1KD、又はその活性部位若しくは結合ポケットの１以上と結合又は会合できる少なくとも１の成分を含む化合物でありうる。
【０２７３】
[0291]  １以上の所望の官能化学基の結合を許容する足場化合物上の化学部分は、カップリング、置換、及び求電子又は求核置換による慣用の反応を受けうる。例えば、該部分は、化合物上にすでに存在するか又はすでに導入された部分であってもよい。或いは、当該部分を含む足場化合物のバリアントは、最初に使用されうる。非限定的な例として、当該部分は、足場化合物から容易に取り除くことができる脱離基であってもよい。種々の部分が使用され、例えば非限定的にピロホスフェート、アセテート、水酸基、アルコキシ基、トシレート、ブロシレート、ハロゲンなどを含む。本発明の別の実施態様では、骨格化合物は、慣用技術を使用して、容易に利用できる開始物質から合成される（例えば、一般的な合成方法について米国特許第5,756,466号を参照のこと）。化学基は次に、Ａｂ１ＫＤ、又はその活性部位若しくは結合ポケットの１以上の残基と相互作用する数を増加するために、足場化合物中に導入される。
【０２７４】
[0292]  Ａｂ１ＫＤは、１以上の結晶形態で結晶化するので、Ａｂ１ＫＤの構造座標又はそのたんぱく質は、Ａｂ１ＫＤの他の結晶形態の構造を解くために特に有用である。該構造座標は、Ａｂ１ＫＤ突然変異体、Ａｂ１ＫＤ共複合体、又は他のタンパク質からの結晶構造であって、Ａｂ１ＫＤの機能的ドメインのいずれかに対する有意なアミノ酸配列ホモロジーを有するタンパク質の構造を解くために使用されてもよい。
【０２７５】
[0293]  Ａｂ１ＫＤのホモログ又は突然変異は、例えば、図２、７、又は８のムス・ムスクルス（Mus musculus）アミノ酸配列に対して６０％を超えるアミノ酸配列ホモロジーを有し、より好ましいタンパク質は７０％を超える配列ホモロジーを有し、より好ましいタンパク質は８０％を超える配列ホモロジーを有し、より好ましいタンパク質は９０％を超える配列ホモロジーを有し、そして最も好ましいタンパク質は、９５％を超える配列ホモロジーを有する。タンパク質ドメイン、領域、又は結合ポケットは、図２、７、又は８に記載のムス・ムスクルス（Mus musculus）の対応するドメイン、領域、又は結合ポケットのアミノ酸配列に対して６０％を超えるアミノ酸配列ホモロジーのレベルを有し、より好ましいタンパク質は７０％を超える配列ホモロジーを有し、より好ましいタンパク質は８０％を超える配列ホモロジーを有し、より好ましいタンパク質は９０％を超える配列ホモロジーを有し、そして最も好ましいタンパク質は９５％を超える配列ホモロジーを有する。本発明は、例えばＰＳＩ  ＢＬＡＳＴサーチ、例えば非限定的にバージョン２.１.２を使用して決定されうる （Altschul, S. F. , et al. , Nuc. Acids Rec. 25: 3389-3402,1997）。
【０２７６】
[0294]  本目的に使用されうる１の方法は、分子置換である。本方法では、Ａｂ１ＫＤ、Ａｂ１ＫＤ突然変異体、又はＡｂ１ＫＤ共結晶の別の結晶形態であるか、又はＡｂ１ＫＤの機能的ドメインのいずれかに対しかなりのアミノ酸配列ホモロジーを有するいくつかの他のタンパク質の結晶であろうと、未知の結晶構造は、Ａｂ１ＫＤ構造座標の位相情報を使用して決定されてもよい。本方法は、新たな結晶の未知タンパク質の正確な３次元構造を、そうした情報を最初から決定する試みより早くかつ効率的に提供しうる。加えて、本発明にしたがって、Ａｂ１ＫＤ突然変異体は、既知のＡｂ１ＫＤ阻害剤との共複合体で結晶化されうる。そうした複合体の一連の結晶構造は、分子置換により解かれうるし、そして野生型Ａｂ１ＫＤの結晶構造と比較されうる。本タンパク質の種々の結合ポケット内の改変のための潜在的な部位がさらに同定されうる。例えば、標的タンパク質の結晶形態を、少なくとも１のリガンドの存在中に浸すことにより、共結晶が得られうる。或いは、共結晶は、例えば、共複合体を共結晶化することにより、標的タンパク質及びリガンドを含む溶液を調整することにより、そして次に適切な結晶化方法に従うことにより取得されうる。リガンドは、母液中に存在してもよく、またリガンドが母液中に不溶性であるならば、例えばＤＭＳＯ中に最も高い濃度で溶解されてもよい。
【０２７７】
[0295]  当該情報は、Ａｂ１ＫＤと化学基もしくは化合物との間の最も有効な結合相互作用、例えば増大された疎水性相互作用を決定するためにさらなるツールを提供する。
【０２７８】
[0296]  未知の結晶形態が、同じ空間群を有し、そして既知のＡｂ１ＫＤ結晶形態に対する類似の格子寸法を有する場合、既知の結晶形態から派生される相は、未知の結晶形態に直接適用されうるし、次に未知の結晶形態に対する電子密度マップが計算されうる。電子密度マップの差が、未知の結晶形態と既知の結晶形態との差を試験するために使用されうる。電子密度マップの差は、一の電子密度マップを引くことであって、例えば、既知の結晶形態から、別の電子密度マップから派生され、例えば未知の結晶形態から派生される。それゆえ、二個の電子密度マップの類似する特徴は、引き算により取り除かれ、そして２個の構造の差のみが残る。例えば、未知の結晶形態が、Ａｂ１ＫＤ共複合体の形態であるならば、次に当該マップと未変性、未複合体の結晶から派生されるマップとの間の電子密度マップの差は、リガンドの電子密度のみを理想的に示すであろう。同様に、アミノ酸側鎖が、２個の結晶形態における異なる立体構造を有するならば、次にこれらの差は、ピーク（正の電子密度）及び谷（負の電子密度）により明示され、２個の結晶形態の間の差を簡単に検出できるようにする。しかしながら、空間群及び／又は２個の結晶形態の格子寸法が異なるならば、当該アプローチは働かず、そして未知の結晶形態の位相をもたらすために、分子置換が使用されなければならない。
【０２７９】
[0297]  上記複合体の全ては、既知のＸ線回折技術を使用して研究されうるし、そして５００Å〜少なくとも３.０Å又は１.５Åに渡り広がるデーターに対して、当業者に認められる限界、例えば非限定的にＲ＝０.２、Ｒｆｒｅｅ＝０.２５に収束するまで精密化されうる。これは、コンピューターソフトウェア、例えば、 X-PLOR、CNX、又は refmac （ＣＣＰ４スーツの一部； Collaborative Computational Project, Number 4, "The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography, "Acta Cryst. D50,760-63, 1994）などを使用して決定されうる。例えば、Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press; Methods in Enzymology, Vols. 114 & 115, 1976 ; Wyckoff et al., eds., Academic Press, 1985; Methods in Enzymology, Vols. 276 and 277 （Carter & Sweet共著, Academic Press 1997）;"Application of Maximum Likelihood Refinement"G. Murshudov, A. Vagin and E. Dodson, （1996） in the Refinement of Protein Structures, Proceedings of Daresbury Study Weekend; G. N. Murshudov, A. A. Vagin and E. J. Dodson, Acta Cryst. D53,240-55, 1997; G. N. Murshudov, A. Lebedev, A. A. Vagin, K. S. Wilson and E. J. Dodson, Acta Cryst. Section D55,247-55, 1999を参照のこと。例えば、 Blundell et al., Protein Crystallography, Academic Press; Methodsin Enzymology, Vols. 114 & 115, 1976; Wyckoff共著、Academic Press, Methods in Enzymology, Vols. 276 and 277, 1985 （Carter & Sweet、共著、Academic Press 1997）を参照のこと。当該情報は、Ａｂ１阻害剤の基地のクラスを最適化するために使用されうるし、そしてより重要なことに、Ａｂ１阻害剤の新規のクラスを設計及び合成するために使用されうる。
【０２８０】
[0298]  Ａｂ１ＫＤ突然変異の構造座標はまた、関連タンパク質又は機能、構造、又はその両方の点でＡｂ１に類似な酵素の同定を促進し、それにより、さらにＡｂ１活性が関与する疾患又は障害を治療又は予防する新規の治療モードをさらに導く。
【０２８１】
[0299]  分子構造座標のサブセットは、上記方法のいずれかにおいて使用されうる。特に有用な座標のサブセットは、非限定的に単一ドメインの座表、活性部位又は結合ポケットを裏打ちする残基の座標、接触面での重要なタンパク質-タンパク質接触接触に加わる残基の座標、及びアルファ炭素座標を含む。例えば、活性部位を含むタンパク質のドメインの座標は、その部位に結合する阻害剤を設計するために使用されうるが、そうであっても、タンパク質は、原子座標のより多いセットにより十分に記載される。それゆえ、全体のポリペプチド鎖を規定する原子座標のセットは、多くのアプリケーションに有用ではあるが、本明細書中に記載されるほう穂うに使用するためには必ずしも必要ではない。
【実施例】
【０２８２】
実施例１：ｃ-Ａｂ１ ＫＤ構造の決定
[0300]  以下の節は、ムス・ムスクルスｃ-Ａｂ１ ＫＤを含むポリペプチドの産生を記載し、そして回折性質の結晶及び重原子誘導体結晶の調製及び特徴づけを含む。
【０２８３】
実施例１.１：ｃ-Ａｂ１ ＫＤ結晶の調製
実施例１.１ａ：ラムダ・ホスファターゼ共発現プラスミドの構築
[0301]  オーロラキナーゼのオープンリーディング・フレームは、以下のプライマー：
【化３】
2007522792.tif 000005
を使用するポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）により、ホモサピエンス（ヒト）ＨｅｐＧ２・ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ  ＨＢ-８０６５）から増幅された。
【０２８４】
[0302]  ＰＣＲ産物（７９５塩基対が予想される）を以下のようにゲル精製した。ＰＣＲ産物を、ＴＥＡ緩衝液中の１％アガロース上で電気泳動し、そして適切な大きさのバンドをゲルから切り出し、そして標準ゲル抽出キットを使用して溶出した。溶出されたＤＮＡを、室温で５分間、トポイソメラーゼでｐＳＢ２-ＴＯＰＯにライゲーションした。ベクターｐＳＢ２-ＴＯＰＯは、ｐＥＴ２６ｂのトポイソメラーゼにより活性された改変バージョン（Novagen, Madison, Wisconsin）であり、ここで以下の配列：
【化４】
2007522792.tif 000006
が、ＮｄｅＩサイトに挿入され、そして以下の配列：
【化５】
2007522792.tif 000007
がＢａｍＨ１サイトに挿入されている。
得られたプラスミドの、シャインーダルガノ配列から「元の」ＮｄｅＩサイト、ストップサイト、及び元のＢａｍＨＩサイトまでの配列は、以下：
[0303]  
【化６】
2007522792.tif 000008
である。このベクターを使用して発現されるオーロラキナーゼは、Ｎ末端に加えられた１４個のアミノ酸（ＭｅｔＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＧｌｙＧｌｙＨｉｓＭｅｔＳｅｒＬｅｕ）と、Ｃ末端に加えられた４個のアミノ酸（ＧｌｕＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）を有する。
【０２８５】
[0304]  次にラムダ・バクテリオファージからのホスファターゼ遺伝子を上記プラスミドに挿入することにより、ホスファターゼ共発現プラスミドを作成した（Matsui T, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001,284 : 798-807）。ホスファターゼ遺伝子を、テンプレート・ラムダ・バクテリオファージＤＮＡ（HinDIII切断, New England Biolabs）から、以下のオリゴヌクレオチドプライマー：
【化７】
2007522792.tif 000009
を使用するＰＣＲを使用して増幅した。
【０２８６】
[0305]  ＰＣＲ産物（７４４塩基対が予想される）をゲル精製した。精製されたＤＮＡ及び非共発現プラスミドＤＮＡを、次にＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で切断した。切断されたプラスミド及びＰＣＲ産物の両方は、次にゲル精製し、そしてともに８時間１６度にて、Ｔ４ＤＮＡライゲースでライゲーションし、そして標準方法を使用してＴｏｐ１０細胞中に形質転換した。ホスフェート遺伝子が、共発現プラスミド中に存在することは、シーケンスにより確認した。本明細書中に記載される標準分子生物学的プロトコルのために、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989に記載される技術を参照のこと。
【０２８７】
[0306]  共発現プラスミドは、Ｌａｃプロモーターの制御下で、オーロラキナーゼ及びラムダホスファターゼ遺伝子、ここで各々はその独自のリボソーム結合部位を有する、の両方を含む遺伝子を含む。ホスファターゼを、マルチ・クローニングサイトの途中、標的遺伝子の下流にクローニングすることにより、使い勝手のよい制限酵素部位が、ホスファターゼを他のプラスミドにサブクローニングするために利用できる。これらのサイトは、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、及びＥｃｏＲＩを、キナーゼとホスファターゼの間に、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、及びＸｈｏＩをホスファターゼの下流に含む。
【０２８８】
実施例１.１ｂ：ｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質の発現
[0307]  ｃ-Ａｂ１ ＫＤのオープンリーディング・フレームを、市販のキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して新たに得たマウス肝臓から調製したムス・ムスクルス（マウス）ｃＤＮＡライブラリーから、以下のプライマー：
【化８】
2007522792.tif 000010
を使用してＰＣＲにより増幅した。
【０２８９】
[0308]  ＰＣＲ産物（８４６塩基が予期される）を、ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ反応混合液から精製した。精製されたＤＮＡを５分間、室温にてトポイソメラーゼで、ｐＳＧＸ３-ＴＯＰＯ中にライゲーションした。ｐＳＧＸ３-ＴＯＰＯベクターは、トポイソメラーゼ活性され、改変されたバージョンのｐＥＴ２６ｂ（Novagen, Madison, Wisconsin）であり、ここで以下の配列： 
【化９】
2007522792.tif 000011
が、ＮｄｅＩサイト中に挿入され、そして以下の配列：
【化１０】
2007522792.tif 000012
がＢａｍＨＩサイトに挿入された。得られたプラスミドの、シャイン-ダルガノ配列からストップ部位及びＢａｍＨＩサイトまでの配列は、以下： 
【化１１】
2007522792.tif 000013
である。このベクターを使用して発現されたｃ-Ａｂ１ ＫＤは、そのＮ末端に加えられた３個のアミノ酸 （Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ）を有し、そしてそのＣ末端に加えられた８個のアミノ酸（ＧｌｕＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓ）を有した。
【０２９０】
[0309]  ｃ-Ａｂ１ ＫＤ／ホスファターゼ共発現プラスミドを次に、オーロラ共発現プラスミドからホスファターゼを、上記プラスミドにサブクローニングすることにより作成した。オーロラ共発現プラスミド及びＡｂ１非共発現プラスミドの両方を、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で３時間切断した。ＤＮＡ断片を、ゲル精製し、そしてオーロラ・プラスミドからのホスファターゼ遺伝子を、切断されたｃＡｂ１ＫＤプラスミドで16度で８時間切断し、そしてＴｏｐ１０細胞に形質転換した。得られた構築物におけるホスファターゼ遺伝子を、制限酵素切断分析により確認した。
【０２９１】
[0310]  当該プラスミドは、ｃ-Ａｂ１ ＫＤとラムダホスファターゼの共発現をコードする。他の標的タンパク質を、ホスファターゼ共発現プラスミド中にサブクローニングするために使用できる、標的遺伝子の上流の２個の固有の制限酵素切断部位、ＸｂａＩ及びＮｄｅＩは、更なる利点を有する。
【０２９２】
[0311]  ホスファターゼ共発現プラスミド由来のタンパク質を、以下のように精製した。非共発現プラスミドを、科学的に形質転換受容性ＢＬ２１（ＤＥ３）コドン＋ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）細胞中に形質転換し、そして共発現プラスミドを、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＳＡ０１４５（ラムダファージの溶菌性の遺伝子を発現し、そして凍結及び融解の際に溶菌する株 （Crabtree S, Cronan JE Jr. J Bacteriol 1984 Apr; 158 （1） : 354-6））に形質転換し、そしてカナマイシン含有ＬＢアガーを入れたペトリ皿上に撒いた。単離された、単一コロニーを、対数期の中間まで成長させ、そしてー８０℃で１５％グリセロール含有ＬＢ中で貯蔵した。 当該グリセロール・ストックを、カナマイシン含有ＬＢアガー・プレート上にストリークし、そして単一コロニーを使用して、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有ＬＢ培養液１０ｍｌ中に播種し、それを３０℃で一晩攪拌してインキュベーションした。当該培養液を使用して、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有ＬＢ５００ｍｌを含む２ｌのフラスコに播種するために使用し、それを３７℃で中期対数期まで成長させ、終濃度０.５ｍＭになるまでＩＰＴＧを加えることにより、誘導した。誘導後に、フラスコを２１℃で１８時間攪拌しながらインキュベーションした。
【０２９３】
[0312]  ｃ-Ａｂ１ ＫＤを以下の様に精製した。細胞を遠心により回収し、希釈されたクラッキング緩衝液（５０ｍＭ・ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７.５、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０、２０ｍＭイミダゾール）中で、超音波処理をするか又はせずに溶解し、そして遠心して細胞残骸を除いた。可溶性の分画をニッケルで充填されたＩＭＡＣカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）を通して精製し、そして５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.８、５００ｍＭ・ＮａＣｌ、１０ｍＭメチオニン、１０％グリセロール中の２０ｍＭ〜５００ｍＭのイミダゾールの勾配の変性条件下で溶出した。タンパク質を、ＡＩＥＸ２Ａ+５００ｍＭＮａＣｌ緩衝液（５０ｍＭ・１-メチル-ピペラジン、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１０ｍＭメチオニン）に緩衝液置換し、そしてヒドロキシアパタイトを通過させた（通過物を回収する）。別の方法では、モノＱカラムを、ヒドロキシアパタトカラムの変わりに使用してもよい。モノＱ精製では、５００ｍＭ・ＮａＣｌを、置換緩衝液から除いた。当該タンパク質を、モノＱカラムから溶出し、そして約６０のカラム体積にわたる５０ｍＭ〜１２０ｍＭ・ＮａＣｌ勾配で溶出してもよい、タンパク質をさらに、スーパーデックス２００分取用品質のカラムであって、ＧＦ４緩衝液（１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.５、１０ｍＭメチオニン、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＤＴＴ、及び１０％グリセロール）中で平衡化されたカラムを使用して、ゲルろ過により精製した。精製されたｃ-Ａｂ１ ＫＤを含む分画を貯めておき、３０ｍｇ/ｍｌまで濃縮し、そして４℃で貯蔵した。得られたタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上の電気泳動により判定すると、９８％の純度であった。精製されたタンパク質の質量分光分析により、大部分が１箇所リン酸化されているということが示された。
【０２９４】
[0313]  本発明の分子構造座標が獲得されるムス・ムスクルスｃ-Ａｂ１ ＫＤの結晶について、１.０μｌのｃ-Ａｂ１ ＫＤポリペプチド、４０ｍｇ/ｍｌを１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ・ｐＨ７.５、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＤＴＴ、１０ｍＭメチオニン、１０％グリセロール（ｖ/ｖ）及び１.０μｌリザーバー溶液（１.６Ｍクエン酸アンモニウム、２０ｍＭジチオスレイトール、５ｍＭ・ＡＭＰＰＮＰ、１０ｍＭ・ＭｇＣｌ2、ｐＨ７）を含む吊下がった液滴（ハンギング・ドロップ）であって、１ｍｌのリザーバー溶液を含む密閉容器内で１〜３日間２０℃にてインキュベートされた液滴は、回折品質の結晶を与えたということが発見された。
【０２９５】
[0314]  他の結晶を取得する方法は、以下のステップ：
（ａ）ｃ-Ａｂ１ ＫＤを含むある体積の溶液を、沈殿剤、例えばポリエチレングリコールを含むリザーバー溶液のある体積と混合し；そして
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合液を、密閉容器内で結晶化に適した条件下でリザーバー溶液上で、結晶が形成するまでインキュベーションする
を含む。少なくとも１Ｍのクエン酸アンモニウムは、リザーバー溶液中に存在する。クエン酸アンモニウムは、好ましくは約２Ｍ以下で存在する。最も好ましくは、クエン酸アンモニウムの濃度は、１.６Ｍである。好ましい結晶化条件では、リザーバー溶液は、少なくとも６.５のｐＨを有する。好ましくは、リザーバー溶液は、約７.５以下のｐＨを有する。最も好ましくはｐＨは約７でる。約２０ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭ・ＡＭＰＰＮＰ、及び１０ｍＭ・ＭｇＣｌ2が存在してもよい。好ましい結晶化条件では、温度は少なくとも４℃である。温度が約３０℃以下であることが好ましい。最も好ましくは温度は２０℃である。
【０２９６】
[0315]  液滴及びリザーバーの体積は、特定の生物物理的条件内、例えば本明細書中に記載される条件のどちらの方向であっても５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％の範囲内で変わってもよく、それでも結晶化しうるということが、当業者により認識される。
【０２９７】
実施例１.２：結晶回折データー収集
[0316]  結晶を個々にトレーから回収し、そしてリザーバー溶液+１５％エリトリトールからなる抗凍結剤に移した。約２分後、結晶を回収し、そして液体窒素中に移した。液体窒素中の結晶を次にAdvanced Photon Source （Argonne National Laboratory）に移し、ここで未変性のデーターセットを回収した。
【０２９８】
実施例１.３：構造決定
[0317]  Ｘ線回折データーを、プログラム・ＭＯＳＦＬＭ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用してインデックスをつけそして統合し、そして次にプログラムＳＣＡＬＡ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して重ねあわせをした。その後、データー強度を構造因子の振幅に変換することを、プログラムＴＲＵＮＣＡＴＥ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-763, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して行った。ｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質の初期位相をＭＯＬＲＥＰ（CCP4; A.Vagin, A.Teplyakov, MOLREP: an automated program for molecular replacement.J.Appl. Cryst. （1997） 30, 1022-1025） プログラム及びＰＤＢからの１ＩＥＰサーチモデルを使用して分子置換により取得した。初期タンパク質モデルを、ＸＴＡＬＶＩＥＷ/ＸＦＩＴプログラム（McRee, D. E. J. Structural Biology, 125: 156-65,1993 ; CCMS（San Diego Super Computer Center） CCMS-request@sdsc.eduから利用できる）を使用して、得られたマップ中に組み込んだ。当該モデルをプログラムＣＮＸ（CNX（Brunger, A. T., et al., Acta Cryst. D54,905-921, 1998, available from Accelrys, San Diego） を使用して精密化を行い、プログラムXTALVIEW/XFIT （McRee, D. E. R Structural Biology, 125: 156-65,1993 ; CCMS （San Diego Super Computer Center） CCMS-request&commat;sdsc.eduから利用できる）を使用して相互作用の再適合を行った。原子モデルの立体化学性質を、ＰＲＯＣＨＥＣＫ （Laskowski et al., J Appl. Cryst. 26, 283-91,1993）を使用してモニターし、そしてモデルをＸ線データーと適合することを、ＳＦＣＨＥＣＫ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994）; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して分析した。
【０２９９】
【表２】
2007522792.tif 000014
【０３００】
【表３】
2007522792.tif 000015
【０３０１】
実施例１.４：構造分析
[0318]  原子の重ね合わせをＭＯＥで行った（Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Quebec, Canadaから利用できる）。溶媒が近接可能な表面の残基毎の計算をＧＲＡＳＰ（Nicholls et al.、"Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons," Proteins, 11: 281-96, 1991）で行った。静電気的表面を、１.４Åのプローブ半径を使用して計算した。
【０３０２】
[0319]  ｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質は、２個の主要構造ドメインを形成する。Ｎ-末端ドメインを、ストランド・トポロジー（+１、-２、+３、-５、+４）を有し、及びストランド３及びストランド４をつなぐ１のαへリックスを有するβ-シートの周囲に編成した。このドメインは、アデノシン三リン酸基質を結合する責任のあるタンパク質基の大部分を提供し、たとえば三リン酸部分と相互作用するストランド１と２との間のＰループを含む。ＡＴＰ基質アナログＡＭＰＰＮＰと複合体を作るｃ-Ａｂ１ ＫＤの構造において、アデニン環は、２個のロイシン側鎖、Ｌｅｕ２４８とＬｅｕ３７０との間に詰め込まれ、そしてＴｈｒ３１５の側鎖、並びにＧｌｕ３１６及びＭｅｔ３１８の骨格の基と水素結合を形成し；そしてリボース部分の水酸基は、Ａｓｎ３２２の主鎖及び側鎖の基と水素結合した。残基２４９〜２５６にわたるＰ-ループは、基質の三リン酸部分にわたり蓋を形成する。注意すべきことに、前に報告されたｃ-Ａｂ１ ＫＤの構造であって、低分子阻害剤との複合体を形成する構造において、ＡＭＰＰＮＰの存在下で観察される拡大された立体構造のかわりに、Ｐループの立体構造は、基質結合部位へと折りたたまれ、ループの先端がＡＭＰＰＮＰのリボース環の位置を占める。
【０３０３】
[0320]  ドメイン２は、大部分がαへリックスであり、そしてＡＴＰγホスフェートを、基質分子上の水酸基に移すことを促進する触媒基に寄与する。基質ペプチドは、２のドメイン環の裂け目に拘束される。ドメイン２は、構造的に柔軟なループを有し、特異的アミノ酸残基Ｔｙｒ３９３がリン酸化した際に、典型的に広範な立体構造の変化をおこす。当該ループは、広がった立体構造を導入し、Ｔｙｒ３９３のリン酸基が、Ａｒｇ３６２、Ａｒｇ３８６、及びＨｉｓ３９６の側鎖と水素結合相互作用を形成する。リン酸化依存性構造変化は、基質結合性の裂け目の露出を伴い、そして活性化ループの元のＡｓｐ３８１-Ｐｈｅ３８２-Ｇｌｙ３８３断片を再構成し、その結果Ａｓｐ３８１側鎖は、ＡＴＰ（ＡＭＰＰＮＰ）のα及びβホスフェートと相互作用できる。
【０３０４】
[0321]  ｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質の結晶形態が、対称ユニットあたりの２個の分子を含むが、結晶性及び非結晶性の、ｃ-Ａｂ１ ＫＤモノマーのペアダイマー配置が観測される。それゆえ、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ分子の好ましいダイマー性の会合が示されない。
【０３０５】
[0322]  本発明は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの構造分析を提供する。実施例１のｃ-Ａｂ１ ＫＤは、Ｔｙｒ３９３でリン酸化される。本明細書中で観測されたｃ-Ａｂ１ ＫＤポリペプチド鎖の構造は、一般的に以前に報告された構造とかなり類似である。しかしながら、Ｐループ及び活性化ループにおける構造の差異が観察される。重要なことは、当該ループの目立ったこれらのループの目立った立体構造は、明らかに多くの因子に左右され、特に活性化ループ内のｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質のリン酸化状態、及び活性化部位の裂け目内に結合された低分子の同定に左右される。イマチニブがｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質の１の特異的な立体構造に選択的に結合するので、本発明はイマチニブとは異なった阻害剤の設計であって構造に導かれた設計について固有の機会を提供する。イマチニブとの組合せて使用されるＡｂ１の第二世代阻害剤は、ＣＭＬの治療においてイマチニブ抵抗性の出現を抑止しうる。 
【０３０６】
実施例２：Ａｂ１ＫＤ構造の決定
[0323]  以下の項目は、ムス・ムスクルスＡｂ１ＫＤを含むポリペプチドの製造、並びに回折品質結晶及び重原子誘導体結晶の製造及び特徴づけを記載する。Ａｂ１のチロシンキナーゼドメイン内に多くのアミノ酸置換は、慢性骨髄性白血病の患者においてイマチニブ抵抗性を生じると知られている。Ｔｈｒ３１５Ｉｌｅは、そうした突然変異の最も頻繁に観察される突然変異であり、そしてこのＡｂ１の突然変異形態が、実質的に他の既知のキナーゼ阻害剤により実質的に阻害されないということがさらに注目される。残基３１５の側鎖は、Ａｂ１キナーゼ・ドメインのＡＴＰ結合性の裂け目内に存在する。イマチニブ/Ａｂ１複合体では、Ｔｈｒ３１５側鎖は、イマチニブとの直接的な水素結合を形成する。
【０３０７】
実施例２.１：Ａｂ１ＫＤ結晶の製造
[0324]  Ａｂ１ＫＤのオープン・リーディング・フレームを、プルーフリーディング・ポリメラーゼ（例えば、Ｐｆｘ）及び以下のプライマー：
【化１２】
2007522792.tif 000016
を使用するポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により、ムス・ムスクルス・ゲノムＤＮＡ（ＭｍＬｉｖｅｒ）から増幅した。
【０３０８】
[0325]  ＰＣＲ産物（８４６塩基対が予測される）は、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロース・ゲル上で電気泳動され、そして適切な大きさのバンドをゲルから切り出し、そして標準ゲル抽出キットを使用して溶出した。溶出されたＤＮＡを室温にて５分間、トポイソメラーゼでｐＳＧＸ-ＴＯＰＯ中にライゲーションした。ベクターｐＳＧＸ３-ＴＯＰＯは、ｐＥＴ２６ｂのトポイソメラーゼ活性型、改変されたバージョン（Novagen, Madison, Wisconsin）であり、ここで以下の配列：
【化１３】
2007522792.tif 000017
は、ＮｄｅＩサイト中に挿入され、そして以下の配列：
【化１４】
2007522792.tif 000018
は、ＢａｑｍＨＩサイトに挿入される。ベクター内にライゲーションされた後の得られた遺伝子の配列であって、シャイン-ダルガノ配列からストップ・サイト及びＢａｍＨＩのサイトまでの配列は以下：
【化１５】
2007522792.tif 000019
である。当該ベクターを使用して発現されたＡｂＩＫＤは、そのＮ末端に加えられた３個のアミノ酸（ＭｅｔＳｅｒＬｅｕ）を有し、そしてＣ末端に加えられた８のアミノ酸（ＧｌｕＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓ）を有した。
【０３０９】
[0326]  Ａｂ１ＫＤのコード配列は、以下のプライマー
【化１６】
2007522792.tif 000020
を使用して、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により、ムス・ムスクルス・ゲノムＤＮＡから増幅され得る。
【０３１０】
[0327]  ＰＣＲ産物は、製品説明書に従ってＮｄｅＩ及びＢａｍＩで切断され、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で電気泳動し、そして適切な大きさのバンドを、ゲルから切り出し、そして標準のゲル抽出キットを使用して溶出した。溶出されたＤＮＡは、一晩Ｔ４ＤＮＡライゲースで１６℃にて、前もってＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断されたｐＥＴ２６ｂ（Novagen, Madison, Wisconsin）中にライゲーションした。ベクター中にライゲーションされた後の遺伝子の得られた配列であって、シャイン-ダルガノ配列からストップ・サイト及びＢａｍＨＩサイトまでの配列は、以下：
【化１７】
2007522792.tif 000021
である。当該ベクターを使用して発現されるＡｂ１ＫＤは、Ｎ-末端に加えられた３個のアミノ酸（ＭｅｔＳｅｒＬｅｕ）及びＣ末端に加えられる８個のアミノ酸（ＧｌｕＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓ）を有した。
【０３１１】
[0328]  ライゲーションされたインサートを含むプラスミドは、化学的に形質転換受容性であるＴｏｐ１０細胞中に形質転換される。正しい配向にあるインサートについてスクリーニングされ、そして、製品説明書にしたがって標準キットを使用する「ミニプレップ法」を使用して、少量のＤＮＡを、２ｍｌの培養物から精製した。以下に記載される標準分子生物学的プロトコルについては、例えば、the techniques described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989に記載される技術を参照のこと。 
【０３１２】
[0329]  ホスファターゼを共発現するプラスミドを、ラムダ・バクテリオファージ由来のホスファターゼ遺伝子を、上記プラスミド中に挿入することにより作成した（Matsui T, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2001, 284 : 798-807）。ホスファターゼ遺伝子を、テンプレートのラムダ・バクテリオファージＤＮＡ（ＨｉｎＤＩＩＩ切断、New England Biolabs）から、以下のオリゴヌクレオチド・プライマー：
【化１８】
2007522792.tif 000022
を使用して増幅した。
【０３１３】
[0330]  ＰＣＲ産物（７４４塩基対が予測される]をゲル精製した。精製されたＤＮＡ及び非共発現プラスミドＤＮＡを次にＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で切断した。切断されたプラスミド及びＰＣＲ断片の両方は、次にゲル精製され、そしてともにＴ４ＤＮＡライゲースで８時間ライゲーションされ、そして標準方法を使用してＴｏｐ１０細胞中に形質転換された。共発現プラスミドにおけるホスファターゼ遺伝子の存在を、シーケンスにより確認した。以下に記載される標準分子生物学的プロトコルについては、例えば Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989に記載される技術を参照のこと。Ｔ３１５Ｉ突然変異を、以下のオリゴヌクレオチド：
【化１９】
2007522792.tif 000023
と標準プロトコルを使用して作成した。
【０３１４】
[0331]  ミニプレップされたＤＮＡを、ＢＬ２１（ＤＥ）-コドン+ＲＩＬ細胞中に形質転換し、そして３０μｇ・ｍｌのカナマイシン及び３４μｇ/ｍｌのクロラムフェにコールを含むＬＢを入れたペトリディッシュ上に撒いた。単離された１のコロニーを、対数増殖期の中期まで成長させ、そして１５％グリセロールを含有するＬＢ中で-８０℃にて貯蔵した。
【０３１５】
[0332]  Ａｂ１ＫＤタンパク質は、以下の様にイー・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ）中で課発現される。グリセロールストックを、３０μｇ/ｍｌカナマイシン及び３４μｇ/ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ（１０ｇ/Ｌトリプトン、５ｇ/ｌ酵母抽出物、１０ｇ/ｌＮａＣｌ）中で成長させた。培養物を、０.６〜１.０のＯＤ６００になるまで成長させ、次にＩＰＴＧを０.４ｍＭ終濃度で加えた。培養物を１６時間２０℃で発酵させた。
【０３１６】
[0333]  細胞を、遠心により回収し、そしてペレットを-８０℃で貯蔵した。室温で融解した後に、細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ７.５、５００ｍＭ・ＫＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０、１：１０００プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma; 4-（2-アミノ-エチル） ベンゼン・スルホニル・フルオリド（ＡＥＢＳＦ）、ベスタチン、ペプスタチンＡ、Ｅ-６４、ホスホタミドン）、及び１:１００００ ベンゾナーゼ（Novagen））で最大出力で超音波処理することにより溶解し、そして細胞残骸を遠心して取り除いた。ＡｂＩＫＤを以下の様に精製した。可溶性分画をニッケル充填ＩＭＡＣカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）で精製し、そして５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.８、１０ｍＭメチオニン、１０％グリセロール中で２０ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾールの段階的勾配で、未変性条件下で溶出した。ＧＦ５緩衝液（１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭメチオニン、５００ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＤＴＴ、及び１０％グリセロール）中で平衡化されたスーパーデックス２００分取用品質カラムを使用して、ゲルろ過によりＡｂ１ＫＤをさらに精製した。精製さらたＡｂ１ＫＤキナーゼ・ドメインを含む分画を貯蔵し、２.０ｍｇ/ｍｌまで濃縮し、そして急速凍結して、そして-８０℃で貯蔵した。得られたタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動することにより判定すると９５％の純度であった。精製されたタンパク質の質量分光分析により、主に一箇所でリン酸化されているということが示された。
【０３１７】
[0334]  本発明の分子構造座標が取得されるムス・ムスクルスＡｂ１ＫＤの結晶では、１μｌのＡｂ１ＫＤポリペプチド２０ｍｇ/ｍｌを１０ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭメチオニン、１ｍＭフラン-２-カルボン酸（６-メトキシ-ベンゾチアゾール-２-イル）-アミド、及び１μｌのリザーバー溶液（２０〜２５％ポリエチレングリコール３３５０（ｗ/ｖ）、及び１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３.５〜５.０を、５００μＬリザーバー溶液を含む密閉容器中に含み、２日間４℃にてインキュベーションされた溶液は、回折品質の結晶を提供する。
【０３１８】
[0335]  結晶を取得するほかの方法は、以下のステップ：
（ａ）  Ａｂ１ＫＤを含むある量の溶液を、沈殿剤、例えばポリエチレン・グリコールを含むリザーバー溶液のある量と混合すること；並びに
（ｂ）  ステップ（ａ）で取得される混合液を、結晶が形成するまで結晶化に適した条件下で、密閉容器中のリザーバー溶液上でインキュベーションする
を含む。  少なくとも１０％のポリエチレン・グリコール３３５０（ｗ/ｖ）がリザーバー溶液中に存在する。ＰＥＧ３３５０は、例えば約３５％以下の濃度で存在する。別の例では、ＰＥＧ３３５０の濃度は、約２０〜約２５％である。ナトリウムＨＥＰＥＳの濃度は、例えば少なくとも５ｍＭである。ナトリウムＨＥＰＥＳの濃度は、例えば、約２０ｍＭ以下である。別の例では、ナトリウムＨＥＰＥＳの濃度は１０ｍＭである。塩化ナトリウムの濃度は、例えば、少なくとも７５ｍＭである。塩化ナトリウムの濃度は、例えば約２５０ｍＭ以下である。別の例では、塩化ナトリウムの濃度は、１５０ｍＭである。リザーバー溶液は、例えばｐＨ７を有する。当該リザーバー溶液は、例えば約８以下のｐＨを有する。別の実施例では、ｐＨは、約７.５である。温度は、例えば少なくとも４℃である。温度は、例えば約３０℃以下であってもよい。別の例では、温度は４℃である。
【０３１９】
[0336]  液滴及びリザーバーの体積は、特定の生物物理的条件の範囲内で変わりうるし、そして結晶化を許容する。
【０３２０】
実施例２.２：結晶回折データー収集
[0337]  結晶をここにトレーから回収し、そして１０％エチレングリコール及び１０％ＰＥＧ４００を含むリザーバー溶液からなる抗凍結剤に移した。約２分後、結晶を回収し、そして液体窒素中に移した。結晶を、Advanced Photon Source（Argonne National Laboratory）の液体窒素中に移し、ここで未変性データーセットを回収した。
【０３２１】
実施例２.３：構造決定
[0338]  Ｘ線回折データーを、プログラム・ＭＯＳＦＬＭ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用してインデックスをつけそして統合し、そして次にプログラムＳＣＡＬＡ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して重ねあわせをした。その後、データー強度を構造因子の振幅に変換することを、プログラムＴＲＵＮＣＡＴＥ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-763, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して行った。ｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質の初期位相をＭＯＬＲＥＰプログラム及びＰＤＢからの１ＩＥＰサーチモデルを使用して分子置換により取得した。初期タンパク質モデルを、ＸＴＡＬＶＩＥＷ/ＸＦＩＴプログラム（McRee, D. E. J. Structural Biology, 125: 156-65,1993 ; CCMS（San Diego Super Computer Center） CCMS-request@sdsc.eduから利用できる）を使用して、得られたマップ中に組み込んだ。当該モデルをプログラムＣＸＮ（CNX（Brunger, A. T., et al., Acta Cryst. D54,905-921, 1998, available from Accelrys, San Diego） を使用して精密化を行い、プログラムXTALVIEW/XFIT （McRee, D. E. R Structural Biology, 125: 156-65,1993 ; CCMS （San Diego Super Computer Center） CCMS-request&commat;sdsc.eduから利用できる）を使用して相互作用の最適合を行った。原子モデルの立体化学性質を、ＰＲＯＣＨＥＣＫ （Laskowski et al., J Appl. Cryst. 26, 283-91,1993）を使用してモニターし、そしてモデルをＸ線データーと適合することを、ＳＦＣＨＥＣＫ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994）; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して分析した。
【０３２２】
【表４】
2007522792.tif 000024
【０３２３】
【表５】
2007522792.tif 000025
【０３２４】
[0339]  原子の重ね合わせをＭＯＥで行った（Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Quebec, Canadaから利用できる）。溶媒が近接可能な表面の残基毎の計算をＧＲＡＳＰ（Nicholls et al.、"Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons," Proteins, 11: 281-96, 1991）で行った。静電気的表面を、１.４Åのプローブ半径を使用して計算した。
【０３２５】
[0340]  以下の項目は、ムス・ムスクルスＡｂ１ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントを含むポリペプチドの製造、並びに回折品質結晶及び重原子誘導体結晶の製造及び特徴づけを記載する。
【０３２６】
実施例３.１：Ａｂ１ＫＤ結晶の製造
[0341]  ヒト肝臓ｃＤＮＡを、製品説明書に従って標準ｃＤＮＡ合成キットを使用して合成した。ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートは、標準ＲＮＡ単離キットを使用してムス・ムスクルス細胞から単離されたｍＲＮＡであった。Ａｂ１ＫＤのオープン・リーディング・フレームは、以下のプライマー：
【化２０】
2007522792.tif 000026
を使用してヒト肝臓ｃＤＮＡから、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により増幅される。
【０３２７】
[0342]  ＰＣＲ産物（８１６塩基が予期される）は、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で電気泳動され、そして適切な大きさのバンドをゲルから切り出し、そして標準ゲル抽出キットを使用して溶出される。
【０３２８】
[0343]  溶出されたＤＮＡを、室温でトポイソメラーゼで５分間ｐＳＧＸ６中にライゲーションした。ベクターｐＳＧＸ６は、ｐＥＴ２６ｂ（Novagen, Madison, Wisconsin）のトポイソメラーゼ活性型改変バージョンであり、ここでアミノ酸１〜１２１のｓｍｔ３のコード配列（Genbank受諾番号U２７２３３）は、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩサイトの間に挿入された（Bernier-Villamor, V., et al., Cell 108: 345-356, 2002）。さらに、ｐＳＧＸ６ベクターは、ラムダ・ホスファターゼの遺伝子コードを含む。
【０３２９】
[0344]  ホスファターゼ共発現プラスミドを、ラムダ・バクテリオファージ由来のホスファターゼを、上記プラスミド中に挿入することにより作成した（Matsui T, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 284 : 798-807）。 ホスファターゼ遺伝子を、以下のオリゴヌクレオチド：
【化２１】
2007522792.tif 000027
を使用し、テンプレート・ラムダ・バクテリオファージＤＮＡ（ＨｉｎＤＩＩＩ切断、New England Biolabs）からＰＣＲを使用して増幅した。
【０３３０】
[0345]  ＰＣＲ産物（７４４塩基対が予想される）を、ゲル精製した。次に精製されたＤＮＡ及び非共発現プラスミドＤＮＡを、ＳａｃＩとＸｈｏＩ制限酵素で切断した。次に切断されたプラスミドとＰＣＲ産物を、ゲル精製し、そして供に１６℃で８時間、Ｔ４ライゲースでライゲーションし、そして標準方法を使用してＴｏｐ１０細胞中に形質転換した。共発現プラスミドにおけるホスファターゼ遺伝子の存在を、シーケンスにより確認した。以下に記載される標準分子生物学的プロトコルについて、例えば Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989に記載される技術を参照のこと。
【０３３１】
[0346]  ラムダ・ホスファターゼ/Ａｂ１ｋＤ共発現プラスミドは、ｌａｃプロモーターの制御下のＡｂ１ＫＤ及びラムダ・ホスファターゼ配列の両者を含み、それぞれ自身のリボソーム結合部位を有する。ホスファターゼを、マルチクローニングサイト、下流の標的遺伝子の間にクローニングすることにより、慣用の制限酵素部位は、ホスファターゼをほかのプラスミドにサブクローニングするために利用できる。これらの部位は、キナーゼとホスファターゼとの間にＳａｃＩ、ＳａｌＩ、及びＥｃｏＲＩ、そしてホスファターゼの下流にＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、及びＸｈｏＩを含む。
【０３３２】
[0347]  ベクターにライゲーションされた後のＡｂ１ＫＤ遺伝子の得られた配列であって、シャインダルガノ配列からストップ・サイト及び「元の」ＨｉｎｄＩＩＩ部位までの配列は、以下：
【化２２】
2007522792.tif 000028
である。当該ベクターを使用して発現されるＡｂ１ＫＤは、Ｎ-末端メチオニンを有し、次に６×Ｈｉｓタグ、続いてｓｍｔ３融合タンパク質、続いてＡｂ１のキナーゼドメインを有する。
【０３３３】
[0348]  ライゲーションされたインサートを含むプラスミドを、化学的に形質転換受容性であるＴＯＰ１０細胞中に形質転換した。正しい向きであるインサートについてコロニーをスクリーニングし、そして少量のＤＮＡを、製品説明書に従って標準キットを使用してミニプレップ方法を使用して、２ｍｌの培養物から精製した。以下に記載される標準分子生物学プロトコルについては、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989において記載される技術を参照のこと。
【０３３４】
[0349]  ミニプレップされたＤＮＡを、ＢＬ２１（ＤＥ３）-コドン+ＲＩＬ細胞中に形質転換し、そして３０μｇ/ｍｌのカナマイシン及び３４μｇ/ｍｌのクロラムフェニコールを有するＬＢアガーを含むペトリ皿上に撒いた。単離された、単一コロニーを対数増殖期の中期まで成長させ、そして-８０℃で、１５％グリセロールを含むＬＢ中に貯蔵した。
【０３３５】
[0350]  Ａｂ１ＫＤ融合タンパク質を、以下の様にイー・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ）コリ中で過発現した。グリセロールストックを、３０μｇ/ｍｌのカナマイシン及び３４μｇ/ｍｌクロラムフェニコールを有するＬＢ（１０ｇ/Ｌトリプトン、５ｇ/ｌ酵母抽出物、１０ｇ/ｌ・ＮａＣｌ）中で成長させた。培養物を、ＯＤ６００で０.６〜１.０に成長させ、次にＩＰＴＧを０.４ｍＭ終濃度で加えた。培養物を１６時間２０℃で発酵させた。
【０３３６】
[0351]  細胞を、遠心により回収し、そしてペレットを-８０℃で貯蔵した。室温で溶解した後に、細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ・ｐＨ７.５、５００ｍＭ・ＫＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０、１：１０００プロテアーゼ阻害剤カクテル、及び１：１００００ベンゾナーゼ）中で最大出力で超音波処理することにより溶解し、そして遠心して、細胞残骸を取り除いた。Ａｂ１ＫＤを以下の様に精製した。溶解可能分画を、ニッケル充填ＩＭＡＣカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）で精製し、そして未変性条件下で、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.８、１０ｍＭメチオニン、１０％グリセロール中の２０ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾールの段階的勾配で溶出した。次に、Ａｂ１ＫＤ融合タンパク質を、Ｕｌｐ１プロテアーゼで、１：１００００の濃度で溶出緩衝液中に混合し、そして一晩４℃でインキュベーションした （Bemier-Villainor, V.
, et al., Cell, 108: 345-56,2002 ; Mossessova, E., and Lima, C. D., Mol. Cell 5: 865-76,2000）。切断された融合タンパク質を、５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.８、２０ｍＭ・イミダゾール、１０ｍＭメチオニン、１０％グリセロール中に緩衝液中に溶媒置換し、そしてニッケル充填ＩＭＡＣカラム上を２度通過させた。Ａｂ１ＫＤを、フロースローから回収し、一方Ｓｍｔ-融合パートナー、未切断のタンパク質、及びＨｉｓタグのついたＵｌｐプロテアーゼは、カラムへ結合したままであった。タグがついていないＡｂ１ＫＤを次に、ＧＦ５緩衝液（１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭメチオニン、５００ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＤＴＴ、及び１０％グリセロール）中で平衡化されたスーパーデックス２００分取用品質のカラムを使用して、ゲルろ過によりさらに精製された。精製されたＡｂ１キナーゼ・ドメインを含む分画を貯蔵し、２ｍｇ/ｍｌに濃縮し、急速凍結し、そして-８０℃で貯蔵した。得られたタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動することにより判定すると、９５％の純度である。精製されたタンパク質の質量分光分析により、主に一箇所でリン酸化されたことが示された。
【０３３７】
[0352]  本発明の分子構造座標が取得されるムス・ムスクルスＡｂ１ＫＤの結晶では、１μｌのＡｂ１ＫＤポリペプチド１０ｍｇ/ｍｌを１０ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭフラン-２-カルボン酸（６-メトキシ-ベンゾチアゾール-２-イル）-アミド、及び１０ｍＭメチオニン、及び１μｌのリザーバー溶液（１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５.５、及び２.０Ｍ硫酸アンモニウムを、５００μＬのリザーバー溶液を含む密閉容器中に含み、３日間４℃にてインキュベーションされた溶液は、回折品質の結晶を提供する。
【０３３８】
[0353]  結晶を取得するほかの方法は、以下のステップ：
（ａ）  Ａｂ１ＫＤを含むある量の溶液を、沈殿剤、例えばポリエチレン・グリコールを含むリザーバー溶液のある量と混合すること；並びに
（ｂ）  ステップ（ａ）で取得される混合液を、結晶が形成するまで結晶化に適した条件下で、密閉容器中のリザーバー溶液上でインキュベーションする
を含む。  少なくとも１.０Ｍ硫酸アンモニウムが、リザーバー溶液中に存在する。硫酸アンモニウムは、例えば約３Ｍ以下の濃度で存在する。別の例では、硫酸アンモニウムの濃度は、例えば約１５０ｍＭ以下である。別の例では、クエン酸ナトリウムの濃度は１００ｍＭである。リザーバー溶液は、例えばｐＨ５を有する。当該リザーバー溶液は、例えば約６以下のｐＨを有する。別の例では、ｐＨは、約５.５である。温度は、例えば少なくとも４℃である。温度は、例えば約３０℃以下であってもよい。別の例では、温度は４℃である。
【０３３９】
[0354]  液滴及びリザーバーの体積が、特定の生物物理的条件の範囲内で変わりうるし、そして結晶化を許容するということが当業者により認識される。
【０３４０】
実施例３.２：結晶回折データー収集
[0355]  結晶を個々にトレーから回収し、そして２５％グリセロールを含むリザーバー溶液からなる抗凍結剤に移した。約２分後、結晶を回収し、そして液体窒素中に移した。液体窒素中の結晶を次にAdvanced Photon Source （Argonne National Laboratory）に移し、ここで未変性のデーターセットを回収した。
【０３４１】
実施例１.３：構造決定
[0356]  Ｘ線回折データーを、プログラム・ＭＯＳＦＬＭ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用してインデックスをつけそして統合し、そして次にプログラムＳＣＡＬＡ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して重ねあわせをした。その後、データー強度を構造因子の振幅に変換することを、プログラムＴＲＵＮＣＡＴＥ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-763, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して行った。初期タンパク質モデルを、ＸＴＡＬＶＩＥＷ/ＸＦＩＴプログラム（McRee, D. E. J. Structural Biology, 125: 156-65,1993 ; CCMS（San Diego Super Computer Center） CCMS-request@sdsc.eduから利用できる）を、同形構造、例えば参照モデルとして使用される実施例２の構造から派生された構造、又は実施例２の構造と使用して、得られたマップ中に組み込んだ。当該モデルをプログラムＣＮＸ（CNX（Brunger, A. T., et al., Acta Cryst. D54,905-921, 1998, available from Accelrys, San Diego） を使用して精密化を行い、プログラムXTALVIEW/XFIT （McRee, D. E. R Structural Biology, 125: 156-65,1993 ; CCMS （San Diego Super Computer Center） CCMS-request&commat;sdsc.eduから利用できる）を使用して相互作用の最適合を行った。原子モデルの立体化学性質を、ＰＲＯＣＨＥＣＫ （Laskowski et al., J Appl. Cryst. 26, 283-91,1993）を使用してモニターし、そしてモデルをＸ線データーと適合することを、ＳＦＣＨＥＣＫ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994）; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して分析した。
【０３４２】
【表６】
2007522792.tif 000029
【０３４３】
【表７】
2007522792.tif 000030
【０３４４】
実施例３.４：構造分析
[0357]  原子の重ね合わせをＭＯＥで行った（Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Quebec, Canadaから利用できる）。溶媒が近接可能な表面の残基毎の計算をＧＲＡＳＰ（Nicholls et al.、"Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons," Proteins, 11: 281-96, 1991）で行った。静電気的表面を、１.４Åのプローブ半径を使用して計算した。
【０３４５】
実施例４：Ｙ３９３ＦのＡｂ１ＫＤ構造の決定
[0358]  以下の項目は、ムス・ムスクルスＡｂ１ＫＤＹ３９３Ｆバリアントを含むポリペプチドの製造、並びに回折品質結晶及び重原子誘導体結晶の製造及び特徴づけを記載する。
【０３４６】
実施例４.１：Ａｂ１ＫＤ結晶の製造
[0359]  Ａｂ１ＫＤのオープン・リーディング・フレームを、プルーフリーディング・ポリメラーゼ（つまり、Ｐｆｘ）及び以下のプライマー：
【化２３】
2007522792.tif 000031
を使用するポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により、ムス・ムスクルス・ゲノムＤＮＡ（ＭｍＬｉｖｅｒ）から増幅した。
【０３４７】
[0360]  ＰＣＲ産物（８４６塩基対が予測される）は、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロース・ゲル上で電気泳動され、そして適切な大きさのバンドをゲルから切り出し、そして標準ゲル抽出キットを使用して溶出した。溶出されたＤＮＡを室温にて５分間、トポイソメラーゼでｐＳＧＸ-ＴＯＰＯ中にライゲーションした。ベクターｐＳＧＸ３-ＴＯＰＯは、ｐＥＴ２６ｂのトポイソメラーゼ活性型、改変されたバージョン（Novagen, Madison, Wisconsin）であり、ここで以下の配列：
【化２４】
2007522792.tif 000032
は、ＮｄｅＩサイト中に挿入され、そして以下の配列：
【化２５】
2007522792.tif 000033
は、ＢａｑｍＨＩサイトに挿入される。ベクター内にライゲーションされた後の得られた遺伝子の配列であって、シャイン-ダルガノ配列からストップ・サイト及びＢａｍＨＩのサイトまでの配列は以下：
【化２６】
2007522792.tif 000034
である。当該ベクターを使用して発現されたＡｂＩＫＤは、そのＮ末端に加えられた３個のアミノ酸（ＭｅｔＳｅｒＬｅｕ）を有し、そしてＣ末端に加えられた８のアミノ酸（ＧｌｕＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓ）を有した。
【０３４８】
[0361]  Ａｂ１ＫＤのコード配列は、以下のプライマー
【化２７】
2007522792.tif 000035
を使用して、ポリメラーゼ・チェーン反応（ＰＣＲ）により、ムス・ムスクルス・ゲノムＤＮＡから増幅され得る。
【０３４９】
[0362]  ＰＣＲ産物は、製品説明書に従ってＮｄｅＩ及びＢａｍＩで切断され、ＴＢＥ緩衝液中の１％アガロースゲル上で電気泳動し、そして適切な大きさのバンドを、ゲルから切り出し、そして標準のゲル抽出キットを使用して溶出した。溶出されたＤＮＡは、一晩Ｔ４ＤＮＡライゲースで１６℃にて、前もってＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで切断されたｐＥＴ２６ｂ（Novagen, Madison, Wisconsin）中にライゲーションした。ベクター中にライゲーションされた後の遺伝子の得られた配列であって、シャイン-ダルガノ配列からストップ・サイト及びＢａｍＨＩサイトまでの配列は、以下：
【化２８】
2007522792.tif 000036
である。当該ベクターを使用して発現されるＡｂ１ＫＤは、Ｎ-末端に加えられた３個のアミノ酸（ＭｅｔＳｅｒＬｅｕ）及びＣ末端に加えられる８個のアミノ酸（ＧｌｕＧｌｙＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓＨｉｓ）を有した。ライゲーションされたインサートを含むプラスミドは、化学的に形質転換受容性であるＴｏｐ１０細胞中に形質転換される。正しい配向にあるインサートについてスクリーニングされ、そして、製品説明書にしたがって標準キットを使用する「ミニプレップ法」を使用して、少量のＤＮＡを、２ｍｌの培養物から精製した。以下に記載される標準分子生物学的プロトコルについては、例えば、the techniques described in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989に記載される技術を参照のこと。 
【０３５０】
[0363]  ホスファターゼを共発現するプラスミドを、ラムダ・バクテリオファージ由来のホスファターゼ遺伝子を、上記プラスミド中に挿入することにより作成した（Matsui T, et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2001, 284 : 798-807）。ホスファターゼ遺伝子を、テンプレートのラムダ・バクテリオファージＤＮＡ（ＨｉｎＤＩＩＩ切断、New England Biolabs）から、以下のオリゴヌクレオチド・プライマー：
【化２９】
2007522792.tif 000037
を使用して増幅した。
【０３５１】
[0364]  ＰＣＲ産物（７４４塩基対が予測される]をゲル精製した。精製されたＤＮＡ及び非共発現プラスミドＤＮＡを次にＳａｃＩ及びＸｈｏＩ制限酵素で切断した。切断されたプラスミド及びＰＣＲ断片の両方は、次にゲル精製され、そしてともにＴ４ＤＮＡライゲースで８時間ライゲーションされ、そして標準方法を使用してＴｏｐ１０細胞中に形質転換された。共発現プラスミドにおけるホスファターゼ遺伝子の存在を、シーケンスにより確認した。以下に記載される標準分子生物学的プロトコルについては、例えば Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 2001, and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, 1989に記載される技術を参照のこと。
【０３５２】
[0365]  Ｙ３９３Ｆ突然変異を、以下のオリゴヌクレオチド：
【化３０】
2007522792.tif 000038
と標準プロトコルを使用して作成した。
【０３５３】
[0366]  ミニプレップされたＤＮＡを、ＢＬ２１（ＤＥ）-コドン+ＲＩＬ細胞中に形質転換し、そして３０μｇ・ｍｌのカナマイシン及び３４μｇ/ｍｌのクロラムフェにコールを含むＬＢを入れたペトリディッシュ上に撒いた。単離された１のコロニーを、対数増殖期の中期まで成長させ、そして１５％グリセロールを含有するＬＢ中で-８０℃にて貯蔵した。
【０３５４】
[0367]  Ａｂ１ＫＤタンパク質は、以下の様にイー・コリ（Ｅ. ｃｏｌｉ）中で課発現される。グリセロールストックを、３０μｇ/ｍｌカナマイシン及び３４μｇ/ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ（１０ｇ/Ｌトリプトン、５ｇ/ｌ酵母抽出物、１０ｇ/ｌＮａＣｌ）中で成長させた。培養物を、０.６〜１.０のＯＤ６００になるまで成長させ、次にＩＰＴＧを０.４ｍＭ終濃度で加えた。培養物を１６時間２０℃で発酵させた。
【０３５５】
[0368]  細胞を、遠心により回収し、そしてペレットを-８０℃で貯蔵した。室温で融解した後に、細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ-ＨＣｌｐＨ７.５、２０ｍＭイミダゾール、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０、１：１０００プロテアーゼ阻害剤カクテル、及び１:１００００ ベンゾナーゼ）で最大出力で超音波処理することにより溶解し、そして細胞残骸を遠心して取り除いた。ＡｂＩＫＤを以下の様に精製した。可溶性分画をニッケル充填ＩＭＡＣカラム（Pharmacia, Uppsala, Sweden）で精製し、そして５０ｍＭ・Ｔｒｉｓ、ｐＨ７.８、１０ｍＭメチオニン、１０％グリセロール中で２０ｍＭ〜５００ｍＭイミダゾールの段階的勾配で、未変性条件下で溶出した。ＧＦ４緩衝液（１０ｍＭ・ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭメチオニン、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、５ｍＭ・ＤＴＴ、及び１０％グリセロール）中で平衡化されたスーパーデックス２００分取用品質カラムを使用して、ゲルろ過によりＡｂ１ＫＤタンパク質をさらに精製した。精製さらたＡｂ１ＫＤキナーゼ・ドメインを含む分画を貯蔵し、３０.０ｍｇ/ｍｌまで濃縮し、そして急速凍結して、そして-８０℃で貯蔵した。得られたタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動することにより判定すると９５％の純度であった。精製されたタンパク質の質量分光分析により、主にリン酸化されていないということが示された。
【０３５６】
[0369]  本発明の分子構造座標が取得されるムス・ムスクルスＡｂ１ＫＤの結晶では、１μｌのＡｂ１ＫＤポリペプチド２０ｍｇ/ｍｌを１０ｍＭのＨＥＰＥＳナトリウム、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭメチオニン、１ｍＭフラン-２-カルボン酸（６-メトキシ-ベンゾチアゾール-２-イル）-アミド、及び１μｌのリザーバー溶液（２０〜２５％ポリエチレングリコール３３５０（ｗ/ｖ）、及び１００ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ３.５〜５.０を、５００μＬリザーバー溶液を含む密閉容器中に含み、２日間４℃にてインキュベーションされた溶液は、回折品質の結晶を提供する。
【０３５７】
[0370]  結晶を取得するほかの方法は、以下のステップ：
（ａ）  Ａｂ１ＫＤを含むある量の溶液を、沈殿剤、例えばポリエチレン・グリコールを含むリザーバー溶液のある量と混合すること；並びに
（ｂ）  ステップ（ａ）で取得される混合液を、結晶が形成するまで結晶化に適した条件下で、密閉容器中のリザーバー溶液上でインキュベーションする
を含む。  少なくとも１％（ｗ/ｖ）ＰＥＧ３３５０がリザーバー溶液中に存在する。ＰＥＧ３３５０は、例えば約１０％（ｗ/ｖ）以下の濃度で存在する。別の例では、ＰＥＧ３３５０の濃度は、５％（ｗ/ｖ）である。クエン酸の濃度は、１００ｍＭである。リザーバー溶液は、少なくとも４のｐＨを有する。リザーバー溶液は、例えば約５以下のｐＨを有する。別の例では、ｐＨは約4.5である。温度は、例えば少なくとも４℃である。温度は、例えば約３０℃以下であってもよい。別の例では、温度は４℃である。
【０３５８】
[0371]  液滴及びリザーバーの体積は、特定の生物物理的条件の範囲内で変わりうるし、そして結晶化を許容する。
【０３５９】
実施例４.２：結晶回折データー収集
[0372]  結晶は、個々にそのトレーから回収され、そして１５％エチレン・グリコール及び１５％ＰＥＧ４００を含むリザーバー溶液からなる抗凍結剤に移された。約２分後、結晶を回収し、そして液体窒素中に移した。結晶を、未変性のデーターセットを収集するAdvanced Proton Source（Argonne National Laboratory）の液体窒素中に移した。
【０３６０】
[0373]  Ｘ線回折データーを、ＤＥＮＺＯプログラムを使用して（Otwinowski, Z. & Minor, M. （1997） Methods Enzymol. 276, 307-436 ; http://www.hkl-xray.com/）インデックスをつけ、そして統合し、 そしてＳＣＡＬＥＰＡＣＫプログラム（CCP4 package, Acta.Cryst. （1994） D50, 760-63; available from Daresbury Laboratory, and Council for the Central Laboratory of the Research Councils, United Kingdom; ftp/ccp4a.dl.ac.uk/pub/ccp4/licence/txt） を使用して重ね合わせた。強度データーの次の構造因子振幅への変換は、プログラムＴＲＵＮＣＡＴＥ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-763, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して行った。ｃ-Ａｂ１ ＫＤタンパク質の初期位相を、ＥＰＭＲプログラム（Kissinger, CR, et al., Acta Cryst., D55, 484-491, 1999）及び標的構造、例えば実施例２又は３の構造を使用して分子置換をすることにより取得した。開始タンパク質モデルを、ＸＴＡＬＶＩＥＷ/ＸＦＩＴ（McRee, D. E. J. Structural Biology, 125: 156-65,1993 ; CCMS （San Diego Super Computer Center） CCMS-request@sdsc.eduから利用できる）を使用して、得られたマップに構築した。当該モデルを、ＲＥＦＭＡＣプログラム（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-763, 1994; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して精密化し、ＸＴＡＬＶＩＥＷ/ＸＦＩＴプログラム（McRee, D. E. J. Structural Biology, 125: 156-65,1993 ;CCMS （San Diego Super Computer Center） CCMS-request@sdsc.eduから利用できる）を使用して、相互作用の際精密化を行った。原子モデルの立体化学の性質は、ＰＲＯＣＨＥＣＫ（Laskowski et al., J. Appl. Cryst. 26, 283-91, 1993）を使用してモニターし、そして該モデルとＸ線データーの一致を、ＳＦＣＨＥＣＫ（Collaborative Computational Project, Number 4, Acta. Cryst. D50,760-63, 1994）; www.ccp4.ac.uk/main.html）を使用して分析した。
【０３６１】
【表８】
2007522792.tif 000039
【０３６２】
【表９】
2007522792.tif 000040
【０３６３】
実施例４.４：構造分析
[0318]  原子の重ね合わせをＭＯＥ（Chemical Computing Group, Inc., Montreal, Quebec, Canadaから利用できる）で行った。溶媒が近接可能な表面の残基毎の計算をＧＲＡＳＰ（Nicholls et al.、"Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons," Proteins, 11: 281-96, 1991）で行った。静電気的表面を、１.４Åのプローブ半径を使用して計算した。
【０３６４】
実施例５：阻害剤設計についてのＡｂ１ＫＤ座標の使用
[0375]  本発明の座標、例えば図３、４、５、又は６の結合ポケット残基を含む分子の座標、並びに図３、４、５、又は６の座標から、好ましくは１.５Å未満、より好ましくは１.２５Å未満、より好ましくは１Å未満、より好ましくは０.７５Å未満、そしてより好ましくは０.５Å未満の骨格座標のＲＭＳＤを有するホモログの座標は、Ａｂ１又はＡｂ１ホモログと会合する化合物、例えば阻害性化合物を設計するために使用される。そうした化合物は、結合ポケットにおける、近接結合ポケット、又は両方の領域の一部又は全てにおいて、活性部位でＡｂ１と会合してもよい。
【０３６５】
[0376]  コンピューターが読み取り可能なデーターベースを含むコンピューターを使用することにより、該方法は助けられてもよい。コンピューターは、例えば、機械が実行可能な指示のセットでプログラムされうる。ここで該記録された指示は、Ａｂ１、その部分の３次元表示を表示することができる。該コンピューターは、本明細書中に記載される方法に従って使用されて、Ａｂ１と、例えば活性部位で、又は結合ポケットで会合する化合物を設計することを記載した。
【０３６６】
[0377]  化学化合物ライブラリーが取得される。当該ライブラリーは、公的に利用できるソース又は市販の供給元、例えば、ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ、ＬＡＮＣＡＳＴＥＲ、ＦＬＵＫＡ、ＡＣＲＯＳ、ＭＡＹＢＲＩＤＧＥ、ＣＨＥＭＢＲＩＤＧＥ （San Diego, California, www.chembridge.com）、Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ、又はＡｓｉｎｅｘ（Moscow 123182, Russia, www.asinex.com）から購入されてもよい。フィルターを使用して、リピンスキーの「５の法則」を満たすライブラリー中の化合物を保持した。リピンスキーの５の法則は、以下の判定基準：５以下の水素結合ドナー、１０以下の水素結合のアクセプター、５００以下の分子量、及び５以下の計算されたｌｏｇＰに適合すれば、該化合物が生物システムにおいてよい吸収性及び透過性を有するということを主張する（Lipinski, C. A. , et al. , Advanced Drug Delivery Reviews 23 3-25 （1996））。
【０３６７】
[0378]  当該フィルターは、本発明の構造に対して選別するために使用される化合物ライブラリーの大きさを低減する。本明細書中に記載されるプログラム、例えばＤＯＣＫ又はＧＯＬＤを組み合わせることは、活性部位及び/又は結合ポケットに結合する化合物を同定するために使用される。タンパク質構造の１超の結合ポケット、又は１超の同じタンパク質の座標のセットに対してスクリーニングされて、タンパク質の異なる分子動態立体構造を説明する。コンセンサス・スコアリングは、タンパク質に最適に適合する化合物を同定するために使用された （Charifson, P. S. et al. , J. Med. Chem. 42: 5100-9 （1999）） 。１超のタンパク質分子構造から得られるデーターは、Klingler et alの２００２年５月３日に出願された、"Computer Systems and Methods for Virtual Screening of Compounds.”という題名の特許出願に記載される方法に従ってスコア付けされてもよい。 最適適合を有する化合物は、次に化学ライブラリーの供給元から取得され、又は合成され、そして結合アッセイ及び生物アッセイにおいて使用される。
【０３６８】
[0379]  本発明の座標はまた、ファーマコフォアを決定するために使用されてもよい。これらのファーマコフォアは、ドッキングプログラムの使用からの結果を再検討した後に設計されて、Ａｂ１ファーマコフォアの形を決定する。或いは、ＧＲＩＤなどのプログラムは、ファーマコフォアの性質を計算するために使用される。ひとたびファーマコフォアが決定されると、ファーマコフォア内に適合する化合物について化学ライブラリーをスクリーニングするために使用されてもよい。 
【０３６９】
[0380]  本発明の座標はまた、使用されて、Ａｂ１の活性部位又は結合ポケットの種々の部分と相互作用する部分構造を同定するために使用される。ひとたび部分構造、又は部分構造のセットが決定されると、部分構造又は部分構造のセットを含む化合物について化学ライブラリーをスクリーニングするために使用される。同定された化合物は、次に例えば活性部位又は結合ポケットにドッキングされる。
【０３７０】
実施例６：生物アッセイ
[0381]  当該アッセイは、ｃ-Ａｂ１の種々の形態、例えばｃ-Ａｂ１、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ、又はその活性部分を使用してもよい。
【０３７１】
【表１０】
2007522792.tif 000041
【０３７２】
[0382]  化合物及び/又はコントロールは、アッセイウェルあたり２.５μＬを加え、そして混合しなかった。試薬の調製が変化しうること、及びある試薬の量が、過度の実験をせずに、滴定を必要とすることが当業者により認識される。
【０３７３】
アッセイの進行計測
[0383]  活性を、吸光光度計の３４０ｎｍにより、ＮＡＤＨの時間依存的な減少に従って、活性を計測した。得られたプログレス曲線の線形部分を、次に直線回帰により分析して、吸収ユニット/時間において活性を得て、そして最適直線の勾配として報告した（モル/単位時間は、３４０んｍでのＮＡＤＨに対するモル吸光係数、６２５０Ｍ-1ｃｍ-1を使用することから計算されうる。）
【０３７４】
[0384]  １の例では、１０μｌＡＴＰを時間ｔ＝０で加えて、酵素反応を開始した。Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓを使用して、アッセイを行い、そしてＡＴＰの添加の前にアッセイの準備をすべきである。ウェル中に泡が得られた場合、１０００ｒｐｍでスピンし、次に即座に減速することにより、泡を減らすこともある。泡が消えない場合、Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓセットアップの際に５秒間のオービタル・シェイクにかけることは、泡の低減を手助けしうる。
【０３７５】
【表１１】
2007522792.tif 000042
【０３７６】
[0385]  ｃ-Ａｂ１ ＫＤの調節、活性化、又は阻害をを計測するために、試験化合物を、濃度範囲でアッセイに加えた。阻害剤は、ナノモル範囲で、例えばナノモル以下の範囲で、ＩＣ50でｃ-Ａｂ１ ＫＤ活性を阻害しうる。
【０３７７】
実施例７：製剤及び投与
[0386]  Ａｂ１調節因子、例えば阻害剤を含む医薬組成物は、例えばＡｂ１活性に関する疾患及び障害を治療するために有用であり、例えば慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、ＧＩＳＴ、及び他の本明細書中に記載される疾患又は障害に関する。ｃ-Ａｂ１エフェクターを含む医薬組成物は、ｃ-Ａｂ１のヒトホモログの活性を調節するために使用されてもよい。
【０３７８】
[0387]  これらは、例えば、標的タンパク質調節因子、例えば、抗菌剤として、抗ウイルス剤として、タンパク質キナーゼ活性を調節するため、ヒト・シグナル伝達キナーゼ活性により媒介される病気、例えば癌、神経編成性疾患、並びに異常な細胞骨格再構成、神経細胞分化、及び細胞周期の進行と関係する疾患などのの治療に有効である阻害剤でありうる。本発明の医薬製剤はまた、化合物の放射性同位体誘導体、例えば19Ｆ、11Ｏ、及び12Ｃを使用して、ＰＥＴ研究で有用である。 
【０３７９】
[0388]  本発明の化合物が、典型的にヒト患者の治療に使用される一方、当該化合物は、類似又は同一の疾患を治療するため獣医薬において使用されてもよく、そして例えば除草剤、殺菌剤、又は殺虫剤として、農業用の薬剤として使用されてもよい。標的タンパク質アフェクターを含む医薬組成物は、標的タンパク質のホモロジーの活性を調節するために使用されてもよい。本発明の化合物は、幾何異性体及び光学異性体を含む。 
【０３８０】
[0389]  治療及び/又は診断適用では、本発明の化合物は、種々の投与モード用に剤形され、全身及び局所的又は限局的投与を含む。技術及び製剤は、一般的にRemington: The Science and Practice of Pharmacy （第２０版） Lippincott, Williams & Wilkins （2000）において見られる。
【０３８１】
[0390]  本発明に記載された化合物は、幅広用量範囲で有効である。例えば、成人の治療において、一日あたり０.０１〜１０００ｍｇ、０.５〜１００ｍｇ、及び１〜５０ｍｇ、５〜４０ｍｇの用量は、使用されうる用量の例である。用量の１の例は、一日あたり１０〜３０ｍｇである。正確な用量は、投与経路、化合物が投与される形態、治療される対象、治療される対象の体重、及び主治医の選択及び経験に左右されるであろう。
【０３８２】
[0391]  当業者に広く周知となっている医薬として許容される塩は、例として非限定的に、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベシレート、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、ブロミド、カルシウム・エデテート、カーンシレート（carnsylate）、炭酸塩、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプタート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸、ヘキシルレソルシネート（hexylresorcinate）、ヒドラバミン（hydrabamine）、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物塩、イソチオネート、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、ムケート（mucate）、ナプシレート、ニトレート、パモ酸塩（エンボネート）、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、又はテオクラートを含みうる。他の医薬として許容される塩は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy （第２０版） Lippincott, Williams & Wilkins （2000）に記載される。好ましい医薬として許容される塩は、非限定的に酢酸塩、安息香酸塩、臭化物塩、炭酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、マレイン酸、ナプシレート、パモ酸塩（エンボネート）、リン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、又は酒石酸塩を含む。
【０３８３】
[0392]  治療される特定の棒機に左右されて、そうした薬剤は、液体又は固体投与形態に剤形されうるし、そして全身又は局所投与されうる。デリバリーされうる薬剤は、例えば、当業者に知られている次元又は維持された低放出形態でデリバリーされうる。剤形技術及び投与技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy （20th ed.） Lippincott, Williams & Wilkins （2000）に見られうる。適切な経路は、経口、経頬、舌下、経直腸、経皮、経粘膜、経鼻、又は経腸投与；非経口デリバリー、例えば筋肉内、皮下、脊髄内注射、並びに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、又は眼球内注射を含む。
【０３８４】
[0393]  注射用に、本発明の薬剤は、水溶液、例えば生理的に適合性のある緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理緩衝食塩水中に剤形されうる。そうした経粘膜投与では、経粘膜投与では、浸透の障壁に適した浸透剤を、製剤中に使用した。そうした浸透剤は、一般的に当業者に知られている。本発明を実行するため、本明細書中に開示された化合物を、全身投与に適した用量に剤形するための医薬として許容される担体は、本発明の範囲内である。担体及び適切な製造訓練の正確な選択に関して、本発明の組成物、特に溶液として剤形された組成物は、非経口的に、例えば静脈内注射により投与され得る。当該技術分野に周知の医薬として許容される担体を、経口投与に適した用量形態に容易に剤形されうる。そうした担体は、本発明の化合物を、治療される患者により経口摂取される錠剤、ピル、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして剤形されることを可能にした。
【０３８５】
[0394]  本発明に使用するために適した医薬組成物は、活性成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含まれた組成物を含む。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内であり、特に本明細書中に与えられる詳細な開示の範囲内である。
【０３８６】
[0395]  活性成分に加えて、これらの医薬組成物は、活性化合物を医薬として使用されうる製剤へ加工することを容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な医薬として許容される担体を含んでもよい。経口投与のために剤形された製剤は、錠剤、糖衣錠、カプセル、又は溶液の形態であってもよい。
【０３８７】
[0396]  経口で使用するための医薬製剤は、活性成分を固体賦形剤と混合することによって、場合により得られた混合体を粉砕し、そして所望されるならば適切な補助剤を加えた後に顆粒の混合体を加工して、錠剤又は糖衣錠の中心を得ることにより取得されうる。適切な賦形剤は、特に、糖、例えばスクロース、マンニトール、又はソルビトール；植物性物質、例えばトウモロコシ・スターチ、小麦スターチ、米スターチ、イモスターチ、ゼラチン、トラガカント・ガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、ナトリウム・カルボキシメチル-セルロース（CMC）、及び／又はポリビニルピロリドン（PVP：ポビドン）などのフィラーである。所望されるならば、崩壊剤、例えば架橋されたポリビニルピロリドン、アガー、又はアルギン酸若しくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムが加えられてもよい。
【０３８８】
[0397]  糖衣錠の中心には、適切な被膜が与えられる。この目的では、濃縮された糖溶液が使用されてもよく、該溶液は、場合によりアラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポール・ゲル、ポリエチレン・グリコール（PEG）、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機性溶媒又は溶媒混合体を含んでもよい。染料又は色素は、活性化合物の投与量の異なる組合せを同定又は特徴づけするための、錠剤又は糖衣被膜に加えられてもよい。
【０３８９】
[0398]  経口で使用されうる医薬製剤は、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、並びにゼラチン、及びグリセロール又はソルビトールなどの可塑剤で作られたソフト、密閉カプセルを含む。当該押し込み型のカプセルは、ラクトース、結合剤、例えばスターチ、及び／又は潤滑剤、例えば滑石又はステアリン酸マグネシウム、及び場合により安定化剤との混合体中に活性成分を含み得うる。ソフトカプセルでは、活性化合物を適切な液体、例えば脂肪油、液体パラフィン、又は液体ポリエチレン・グリコール（PEG）中に溶解又は懸濁されうる。加えて、安定化剤が加えられうる。
【０３９０】
[0399]  本発明は、例示された実施態様による範囲に限定されるべきではない。当該範囲は、本発明の１の態様である例示として意図される。実際、本発明は、前述の記載及び添付された図面に基づいてさらに変形することができるということが理解されるであろう。当該出願は、本発明の原理に一般的に従った本発明の変動、使用、又は適用の全てをカバーすることが意図され、そして本開示からの逸脱であって、本発明が関与する技術分野の範囲内の既知又は通常の慣行の範囲内であり、かつ本明細書の前部で記載された本質的特徴に適用されるような逸脱を含む。本出願を通して引用された参考文献は、当該技術分野のレベルの例であり、前に特異的に援用されていようがされていまいが、それらの全ては本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３９１】
【図１】[0107]  図１は、Ａｂ１ＫＤの構造のリボン図を与える。
【図２】[0108]  図２は、本発明の結晶及び構造座標を取得するために使用されたＡｂ１ＫＤの発現されたタンパク質の予想されたアミノ酸配列を提供する。当該アミノ酸配列は、ＯＲＦによりコードされるアミノ酸並びに発現ベクターによりコードされる他のアミノ酸を含んでもよいということに留意すべきである。
【図３Ａ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｂ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｃ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｄ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｅ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｆ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｇ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｈ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｉ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｊ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｋ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｌ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｍ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｎ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｏ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｐ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｑ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｒ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｓ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｔ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｕ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｖ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｗ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｘ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｙ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３Ｚ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＡＡ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＢＢ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＣＣ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＤＤ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＥＥ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＦＦ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＧＧ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＨＨ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＩＩ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＪＪ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＫＫ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＬＬ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＭＭ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＮＮ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＯＯ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＰＰ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＱＱ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＲＲ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＳＳ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＴＴ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＵＵ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＶＶ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＷＷ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＸＸ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＹＹ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＺＺ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＡＡＡ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＢＢＢ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＣＣＣ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＤＤＤ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＥＥＥ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＦＦＦ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＧＧＧ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＨＨＨ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＩＩＩ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＪＪＪ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＫＫＫ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＬＬＬ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＭＭＭ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＮＮＮ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＯＯＯ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＰＰＰ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＱＱＱ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＲＲＲ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＳＳＳ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図３ＴＴＴ】[0109]  図３（Ａ-ＴＴＴ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤの分子構造座標を提供する。
【図４Ａ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｂ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｃ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｄ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｅ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｆ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｇ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｈ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｉ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｊ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｋ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｌ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｍ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｎ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｏ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｐ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｑ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｒ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｓ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｔ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｕ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｖ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｗ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｘ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｙ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４Ｚ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＡＡ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＢＢ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＣＣ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＤＤ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＥＥ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＦＦ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＧＧ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＨＨ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＩＩ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＪＪ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＫＫ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＬＬ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＭＭ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＮＮ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＯＯ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＰＰ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＱＱ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＲＲ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＳＳ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＴＴ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＵＵ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＶＶ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＷＷ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＸＸ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＹＹ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＺＺ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＡＡＡ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＢＢＢ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＣＣＣ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＤＤＤ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＥＥＥ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＦＦＦ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＧＧＧ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＨＨＨ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＩＩＩ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＪＪＪ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＫＫＫ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＬＬＬ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＭＭＭ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＮＮＮ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＯＯＯ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＰＰＰ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＱＱＱ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＲＲＲ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＳＳＳ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＴＴＴ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＵＵＵ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＶＶＶ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＷＷＷ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図４ＸＸＸ】[0110]  図４（Ａ-ＸＸＸ）は、ｃ-Ａｂ１ ＫＤ・Ｔ３１５Ｉバリアントの分子構造座標を提供する。
【図５Ａ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｂ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｃ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｄ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｅ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｆ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｇ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｈ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｉ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｊ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｋ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｌ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｍ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｎ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｏ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｐ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｑ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｒ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｓ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｔ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｕ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｖ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｗ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｘ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｙ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５Ｚ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＡＡ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＢＢ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＣＣ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＤＤ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＥＥ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＦＦ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＧＧ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＨＨ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＩＩ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＪＪ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＫＫ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＬＬ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＭＭ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＮＮ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＯＯ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＰＰ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＱＱ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＲＲ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＳＳ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＴＴ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＵＵ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＶＶ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＷＷ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＸＸ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＹＹ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＺＺ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＡＡＡ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＢＢＢ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＣＣＣ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＤＤＤ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＥＥＥ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＦＦＦ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＧＧＧ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＨＨＨ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＩＩＩ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＪＪＪ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＫＫＫ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＬＬＬ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＭＭＭ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＮＮＮ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＯＯＯ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＰＰＰ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＱＱＱ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＲＲＲ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＳＳＳ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＴＴＴ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＵＵＵ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＶＶＶ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＷＷＷ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＸＸＸ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＹＹＹ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＺＺＺ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＡＡＡＡ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＢＢＢＢ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図５ＣＣＣＣ】[0111]  図５（Ａ-ＣＣＣＣ）は、ｃ-Ａｂ１  ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントの構造座標を提供する。
【図６Ａ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｂ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｃ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｄ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｅ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｆ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｇ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｈ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｉ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｊ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｋ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｌ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｍ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｎ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｏ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｐ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｑ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｒ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｓ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｔ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｕ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｖ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｗ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｘ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｙ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６Ｚ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＡＡ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＢＢ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＣＣ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＤＤ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＥＥ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＦＦ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＧＧ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＨＨ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＩＩ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＪＪ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＫＫ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＬＬ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＭＭ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＮＮ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＯＯ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＰＰ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＱＱ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＲＲ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＳＳ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＴＴ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＵＵ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＶＶ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＷＷ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＸＸ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＹＹ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＺＺ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＡＡＡ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＢＢＢ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＣＣＣ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＤＤＤ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＥＥＥ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＦＦＦ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＧＧＧ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＨＨＨ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＩＩＩ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＪＪＪ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＫＫＫ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＬＬＬ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＭＭＭ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＮＮＮ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＯＯＯ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＰＰＰ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＱＱＱ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＲＲＲ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＳＳＳ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＴＴＴ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＵＵＵ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＶＶＶ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図６ＷＷＷ】[0112]  図６（Ａ-ＷＷＷ）は、ｃ-Ａｂｌ  ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントの分子構造座標を提供する。
【図７】[0113]  図７は、本発明の結晶及び構造座標を取得するために使用される発現されたＡｂ１ＫＤ  Ｔ３１５Ｉバリアントのタンパク質の予想されたアミノ酸配列を提供する。当該アミノ酸配列は、ＯＲＦによりコードされるアミノ酸並びに発現ベクターによりコードされる他のアミノ酸を含んでもよいということに留意すべきである。
【図８】[0114]   図８は、本発明の結晶及び構造座標を取得するために使用される発現されたＡｂ１ＫＤ  Ｙ３９３Ｆバリアントのタンパク質の予想されたアミノ酸配列を提供する。当該アミノ酸配列は、ＯＲＦによりコードされるアミノ酸並びに発現ベクターによりコードされる他のアミノ酸を含んでもよいということに留意すべきである。
【図１】
2007522792.tif 000043
【図２】
2007522792.tif 000044
【図３Ａ】
2007522792.tif 000045
【図３Ｂ】
2007522792.tif 000046
【図３Ｃ】
2007522792.tif 000047
【図３Ｄ】
2007522792.tif 000048
【図３Ｅ】
2007522792.tif 000049
【図３Ｆ】
2007522792.tif 000050
【図３Ｇ】
2007522792.tif 000051
【図３Ｈ】
2007522792.tif 000052
【図３Ｉ】
2007522792.tif 000053
【図３Ｊ】
2007522792.tif 000054
【図３Ｋ】
2007522792.tif 000055
【図３Ｌ】
2007522792.tif 000056
【図３Ｍ】
2007522792.tif 000057
【図３Ｎ】
2007522792.tif 000058
【図３Ｏ】
2007522792.tif 000059
【図３Ｐ】
2007522792.tif 000060
【図３Ｑ】
2007522792.tif 000061
【図３Ｒ】
2007522792.tif 000062
【図３Ｓ】
2007522792.tif 000063
【図３Ｔ】
2007522792.tif 000064
【図３Ｕ】
2007522792.tif 000065
【図３Ｖ】
2007522792.tif 000066
【図３Ｗ】
2007522792.tif 000067
【図３Ｘ】
2007522792.tif 000068
【図３Ｙ】
2007522792.tif 000069
【図３Ｚ】
2007522792.tif 000070
【図３ＡＡ】
2007522792.tif 000071
【図３ＢＢ】
2007522792.tif 000072
【図３ＣＣ】
2007522792.tif 000073
【図３ＤＤ】
2007522792.tif 000074
【図３ＥＥ】
2007522792.tif 000075
【図３ＦＦ】
2007522792.tif 000076
【図３ＧＧ】
2007522792.tif 000077
【図３ＨＨ】
2007522792.tif 000078
【図３ＩＩ】
2007522792.tif 000079
【図３ＪＪ】
2007522792.tif 000080
【図３ＫＫ】
2007522792.tif 000081
【図３ＬＬ】
2007522792.tif 000082
【図３ＭＭ】
2007522792.tif 000083
【図３ＮＮ】
2007522792.tif 000084
【図３ＯＯ】
2007522792.tif 000085
【図３ＰＰ】
2007522792.tif 000086
【図３ＱＱ】
2007522792.tif 000087
【図３ＲＲ】
2007522792.tif 000088
【図３ＳＳ】
2007522792.tif 000089
【図３ＴＴ】
2007522792.tif 000090
【図３ＵＵ】
2007522792.tif 000091
【図３ＶＶ】
2007522792.tif 000092
【図３ＷＷ】
2007522792.tif 000093
【図３ＸＸ】
2007522792.tif 000094
【図３ＹＹ】
2007522792.tif 000095
【図３ＺＺ】
2007522792.tif 000096
【図３ＡＡＡ】
2007522792.tif 000097
【図３ＢＢＢ】
2007522792.tif 000098
【図３ＣＣＣ】
2007522792.tif 000099
【図３ＤＤＤ】
2007522792.tif 000100
【図３ＥＥＥ】
2007522792.tif 000101
【図３ＦＦＦ】
2007522792.tif 000102
【図３ＧＧＧ】
2007522792.tif 000103
【図３ＨＨＨ】
2007522792.tif 000104
【図３ＩＩＩ】
2007522792.tif 000105
【図３ＪＪＪ】
2007522792.tif 000106
【図３ＫＫＫ】
2007522792.tif 000107
【図３ＬＬＬ】
2007522792.tif 000108
【図３ＭＭＭ】
2007522792.tif 000109
【図３ＮＮＮ】
2007522792.tif 000110
【図３ＯＯＯ】
2007522792.tif 000111
【図３ＰＰＰ】
2007522792.tif 000112
【図３ＱＱＱ】
2007522792.tif 000113
【図３ＲＲＲ】
2007522792.tif 000114
【図３ＳＳＳ】
2007522792.tif 000115
【図３ＴＴＴ】
2007522792.tif 000116
【図４Ａ】
2007522792.tif 000117
【図４Ｂ】
2007522792.tif 000118
【図４Ｃ】
2007522792.tif 000119
【図４Ｄ】
2007522792.tif 000120
【図４Ｅ】
2007522792.tif 000121
【図４Ｆ】
2007522792.tif 000122
【図４Ｇ】
2007522792.tif 000123
【図４Ｈ】
2007522792.tif 000124
【図４Ｉ】
2007522792.tif 000125
【図４Ｊ】
2007522792.tif 000126
【図４Ｋ】
2007522792.tif 000127
【図４Ｌ】
2007522792.tif 000128
【図４Ｍ】
2007522792.tif 000129
【図４Ｎ】
2007522792.tif 000130
【図４Ｏ】
2007522792.tif 000131
【図４Ｐ】
2007522792.tif 000132
【図４Ｑ】
2007522792.tif 000133
【図４Ｒ】
2007522792.tif 000134
【図４Ｓ】
2007522792.tif 000135
【図４Ｔ】
2007522792.tif 000136
【図４Ｕ】
2007522792.tif 000137
【図４Ｖ】
2007522792.tif 000138
【図４Ｗ】
2007522792.tif 000139
【図４Ｘ】
2007522792.tif 000140
【図４Ｙ】
2007522792.tif 000141
【図４Ｚ】
2007522792.tif 000142
【図４ＡＡ】
2007522792.tif 000143
【図４ＢＢ】
2007522792.tif 000144
【図４ＣＣ】
2007522792.tif 000145
【図４ＤＤ】
2007522792.tif 000146
【図４ＥＥ】
2007522792.tif 000147
【図４ＦＦ】
2007522792.tif 000148
【図４ＧＧ】
2007522792.tif 000149
【図４ＨＨ】
2007522792.tif 000150
【図４ＩＩ】
2007522792.tif 000151
【図４ＪＪ】
2007522792.tif 000152
【図４ＫＫ】
2007522792.tif 000153
【図４ＬＬ】
2007522792.tif 000154
【図４ＭＭ】
2007522792.tif 000155
【図４ＮＮ】
2007522792.tif 000156
【図４ＯＯ】
2007522792.tif 000157
【図４ＰＰ】
2007522792.tif 000158
【図４ＱＱ】
2007522792.tif 000159
【図４ＲＲ】
2007522792.tif 000160
【図４ＳＳ】
2007522792.tif 000161
【図４ＴＴ】
2007522792.tif 000162
【図４ＵＵ】
2007522792.tif 000163
【図４ＶＶ】
2007522792.tif 000164
【図４ＷＷ】
2007522792.tif 000165
【図４ＸＸ】
2007522792.tif 000166
【図４ＹＹ】
2007522792.tif 000167
【図４ＺＺ】
2007522792.tif 000168
【図４ＡＡＡ】
2007522792.tif 000169
【図４ＢＢＢ】
2007522792.tif 000170
【図４ＣＣＣ】
2007522792.tif 000171
【図４ＤＤＤ】
2007522792.tif 000172
【図４ＥＥＥ】
2007522792.tif 000173
【図４ＦＦＦ】
2007522792.tif 000174
【図４ＧＧＧ】
2007522792.tif 000175
【図４ＨＨＨ】
2007522792.tif 000176
【図４ＩＩＩ】
2007522792.tif 000177
【図４ＪＪＪ】
2007522792.tif 000178
【図４ＫＫＫ】
2007522792.tif 000179
【図４ＬＬＬ】
2007522792.tif 000180
【図４ＭＭＭ】
2007522792.tif 000181
【図４ＮＮＮ】
2007522792.tif 000182
【図４ＯＯＯ】
2007522792.tif 000183
【図４ＰＰＰ】
2007522792.tif 000184
【図４ＱＱＱ】
2007522792.tif 000185
【図４ＲＲＲ】
2007522792.tif 000186
【図４ＳＳＳ】
2007522792.tif 000187
【図４ＴＴＴ】
2007522792.tif 000188
【図４ＵＵＵ】
2007522792.tif 000189
【図４ＶＶＶ】
2007522792.tif 000190
【図４ＷＷＷ】
2007522792.tif 000191
【図４ＸＸＸ】
2007522792.tif 000192
【図５Ａ】
2007522792.tif 000193
【図５Ｂ】
2007522792.tif 000194
【図５Ｃ】
2007522792.tif 000195
【図５Ｄ】
2007522792.tif 000196
【図５Ｅ】
2007522792.tif 000197
【図５Ｆ】
2007522792.tif 000198
【図５Ｇ】
2007522792.tif 000199
【図５Ｈ】
2007522792.tif 000200
【図５Ｉ】
2007522792.tif 000201
【図５Ｊ】
2007522792.tif 000202
【図５Ｋ】
2007522792.tif 000203
【図５Ｌ】
2007522792.tif 000204
【図５Ｍ】
2007522792.tif 000205
【図５Ｎ】
2007522792.tif 000206
【図５Ｏ】
2007522792.tif 000207
【図５Ｐ】
2007522792.tif 000208
【図５Ｑ】
2007522792.tif 000209
【図５Ｒ】
2007522792.tif 000210
【図５Ｓ】
2007522792.tif 000211
【図５Ｔ】
2007522792.tif 000212
【図５Ｕ】
2007522792.tif 000213
【図５Ｖ】
2007522792.tif 000214
【図５Ｗ】
2007522792.tif 000215
【図５Ｘ】
2007522792.tif 000216
【図５Ｙ】
2007522792.tif 000217
【図５Ｚ】
2007522792.tif 000218
【図５ＡＡ】
2007522792.tif 000219
【図５ＢＢ】
2007522792.tif 000220
【図５ＣＣ】
2007522792.tif 000221
【図５ＤＤ】
2007522792.tif 000222
【図５ＥＥ】
2007522792.tif 000223
【図５ＦＦ】
2007522792.tif 000224
【図５ＧＧ】
2007522792.tif 000225
【図５ＨＨ】
2007522792.tif 000226
【図５ＩＩ】
2007522792.tif 000227
【図５ＪＪ】
2007522792.tif 000228
【図５ＫＫ】
2007522792.tif 000229
【図５ＬＬ】
2007522792.tif 000230
【図５ＭＭ】
2007522792.tif 000231
【図５ＮＮ】
2007522792.tif 000232
【図５ＯＯ】
2007522792.tif 000233
【図５ＰＰ】
2007522792.tif 000234
【図５ＱＱ】
2007522792.tif 000235
【図５ＲＲ】
2007522792.tif 000236
【図５ＳＳ】
2007522792.tif 000237
【図５ＴＴ】
2007522792.tif 000238
【図５ＵＵ】
2007522792.tif 000239
【図５ＶＶ】
2007522792.tif 000240
【図５ＷＷ】
2007522792.tif 000241
【図５ＸＸ】
2007522792.tif 000242
【図５ＹＹ】
2007522792.tif 000243
【図５ＺＺ】
2007522792.tif 000244
【図５ＡＡＡ】
2007522792.tif 000245
【図５ＢＢＢ】
2007522792.tif 000246
【図５ＣＣＣ】
2007522792.tif 000247
【図５ＤＤＤ】
2007522792.tif 000248
【図５ＥＥＥ】
2007522792.tif 000249
【図５ＦＦＦ】
2007522792.tif 000250
【図５ＧＧＧ】
2007522792.tif 000251
【図５ＨＨＨ】
2007522792.tif 000252
【図５ＩＩＩ】
2007522792.tif 000253
【図５ＪＪＪ】
2007522792.tif 000254
【図５ＫＫＫ】
2007522792.tif 000255
【図５ＬＬＬ】
2007522792.tif 000256
【図５ＭＭＭ】
2007522792.tif 000257
【図５ＮＮＮ】
2007522792.tif 000258
【図５ＯＯＯ】
2007522792.tif 000259
【図５ＰＰＰ】
2007522792.tif 000260
【図５ＱＱＱ】
2007522792.tif 000261
【図５ＲＲＲ】
2007522792.tif 000262
【図５ＳＳＳ】
2007522792.tif 000263
【図５ＴＴＴ】
2007522792.tif 000264
【図５ＵＵＵ】
2007522792.tif 000265
【図５ＶＶＶ】
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【図５ＷＷＷ】
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【図５ＸＸＸ】
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【図５ＹＹＹ】
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【図５ＺＺＺ】
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【図５ＡＡＡＡ】
2007522792.tif 000271
【図５ＢＢＢＢ】
2007522792.tif 000272
【図５ＣＣＣＣ】
2007522792.tif 000273
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
2007522792.tif 000285
【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図６Ｏ】
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【図６Ｐ】
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【図６Ｑ】
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【図６Ｒ】
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【図６Ｓ】
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【図６Ｔ】
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【図６Ｕ】
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【図６Ｖ】
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【図６Ｗ】
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【図６Ｘ】
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【図６Ｙ】
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【図６Ｚ】
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【図６ＡＡ】
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【図６ＢＢ】
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【図６ＣＣ】
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【図６ＤＤ】
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【図６ＥＥ】
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【図６ＦＦ】
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【図６ＧＧ】
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【図６ＨＨ】
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【図６ＩＩ】
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【図６ＪＪ】
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【図６ＫＫ】
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【図６ＬＬ】
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【図６ＭＭ】
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【図６ＮＮ】
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【図６ＯＯ】
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【図６ＰＰ】
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【図６ＱＱ】
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【図６ＲＲ】
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【図６ＳＳ】
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【図６ＴＴ】
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【図６ＵＵ】
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【図６ＶＶ】
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【図６ＷＷ】
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【図６ＸＸ】
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【図６ＹＹ】
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【図６ＺＺ】
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【図６ＡＡＡ】
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【図６ＢＢＢ】
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【図６ＣＣＣ】
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【図６ＤＤＤ】
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【図６ＥＥＥ】
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【図６ＦＦＦ】
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【図６ＧＧＧ】
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【図６ＨＨＨ】
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【図６ＩＩＩ】
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【図６ＪＪＪ】
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【図６ＫＫＫ】
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【図６ＬＬＬ】
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【図６ＭＭＭ】
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【図６ＮＮＮ】
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【図６ＯＯＯ】
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【図６ＰＰＰ】
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【図６ＱＱＱ】
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【図６ＲＲＲ】
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【図６ＳＳＳ】
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【図６ＴＴＴ】
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【図６ＵＵＵ】
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【図６ＶＶＶ】
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【図６ＷＷＷ】
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【図７】
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【図８】
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