(57)【要約】  細胞に対する薬物の局所的な送達を高める薬物製剤が記載される。疎水性部位の加水分解的に易変性な付加により薬物の疎水性を可逆的に高める方法と、細胞に対して修飾された薬物を送達するための方法が記載される。疎水性修飾は薬物送達を高め、一方で、易変性は標的でない細胞に対して薬物が入り込むことを最小限にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の易変性結合を介して、一つ以上の疎水性部位に共有結合した薬物よりなる修飾された薬物。
【請求項２】
前記疎水基は、４乃至３０の炭素原子のアルキル鎖、アルキル鎖及びアルキル環を含むアルキル基、並びにステロイドから構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項１に記載の修飾された薬物。
【請求項３】
前記修飾された薬物は、有機溶媒に可溶であることを特徴とする請求項２に記載された薬物。
【請求項４】
前記易変性の結合は、加水分解的な易変性結合から構成されることを特徴とする請求項３に記載の修飾された薬物。
【請求項５】
前記加水分解的に易変性な結合は、シラザンまたはマレアミド酸から構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項４に記載の修飾された薬物。
【請求項６】
前記修飾された薬物は、細胞膜透過性であることを特徴とする請求項１に記載の修飾された薬物。
【請求項７】
（ａ）プロドラッグを形成するために易変性結合を介して、薬物に対して疎水基を付加するステップと、
（ｂ）プロドラッグのキャリア溶媒にプロドラッグを溶解するステップと、
（ｃ）送達溶液を形成するために水溶性のキャリア溶液と前記溶媒とを混合するステップと、
（ｄ）前記送達溶液と前記細胞を接触するステップと、
を有する細胞に対して薬物を送達するための方法。
【請求項８】
前記易変性結合は加水分解的な易変性結合から構成されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記加水分解的な易変性結合は、シラザンとマレアミド酸から構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記易変性結合は、前記水溶性のキャリア溶液の構成成分によって切断される結合から構成されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記易変性結合は、前記細胞の構成成分によって切断される結合から構成されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記疎水基は、４乃至３０の炭素原子のアルキル鎖、アルキル鎖及びアルキル環を含むアルキル基、並びにステロイドから構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロドラッグは有機溶媒に可溶性であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プロドラッグは、細胞膜透過性であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
細胞に対して疎水性化合物を送達するための方法であって、
（ａ）有機溶媒中で疎水性化合物を溶解するステップと、
（ｂ）送達溶液を形成するために前記有機溶媒と水性キャリア溶液を混合するステップと、
（ｃ）前記細胞に対して前記送達溶液を投与するステップと、
を有する前記疎水性化合物が前記細胞と関連することを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記疎水性化合物は、易変性結合を介して疎水基にリンクされる分子を含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記易変性結合は、加水分解的な易変性結合から構成されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記加水分解的な易変性結合は、シラザン、マレアミド酸から構成される群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記易変性結合は、前記水溶性キャリア溶液の構成成分によって切断されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記易変性結合は、前記細胞の構成成分によって切断されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記疎水基は、４乃至３０の炭素原子のアルキル鎖、アルキル鎖及びアルキル環を含むアルキル基、並びにステロイドから構成されるリストから選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物の易変性の疎水性修飾により改善された送達に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物をその作用部位に送達するために、投与の様々な方法およびルートが開発されてきた。薬物送達に関連する一般的な問題は、水での可溶性を有する細胞膜を交差させる釣り合い能力である。薬物があまりにも親水性である場合、脂質細胞膜の疎水性環境を通過することができない。薬剤があまりにも親油性である場合、水性環境で可溶性が不十分となり、薬物が細胞に到達する際、それはおそらく細胞膜に留まる。したがって、ほとんどの薬剤は両親媒性であり、分子の荷電部と未荷電部との間のバランスのとれた親水性と疎水性の両特性を含み、薬物の送達を援助する賦形剤を伴って製剤とされる。
【０００３】
従来の可溶性薬剤による細胞性薬物送達は、投与ルートに関係なく、下記の３つの障害によって制限される。それらは、ａ）細胞脂質膜による低分割、ｂ）循環による投与部位からの迅速な一掃、ｃ）潜在的に不必要な組織での蓄積および全身毒性を導く全身体にわたる再分配、である。薬物の服用を増やすことによって最初の2つの障害を克服する試みは、全身毒性を高める。それらの問題を解決するために、部分的な送達の使用が提案されている。そのような送達方法は、低い全身毒性で目標部位において高い薬物濃度を得る利点を有するために提案される。この方法の理論的根拠は、高い初回通過（first-pass）摘出の薬物動態学的原則に基づく（Young 1999; Ensminger
WD 1978）。しかしながら、親水性の薬物（高濃度において局所的にさえ分配する）は、脂質膜によって低分割することを呈して、迅速に適用部位から消える（Morgan 2003）。
【０００４】
疾患の幾つかのタイプ、特に癌の幾つかのタイプは、局所的な処理レジメント（regiment）で処置される。例えば、肝ガンの局所的な処置が調査されている。肝臓は、結腸直腸癌、黒色腫および神経芽細胞腫を含む種々の腫瘍源からの転移性疾患進行の支配的な部位であって、肝臓癌（ＨＣＣ）および胆管癌の主要な場所である（Alexander 2002）。全身化学療法は、弱い抗腫瘍性および生存の重要でない増加だけを示す。切除および移植は、進行性の肝疾患患者のための唯一の治癒的な選択である（Iwatsuki 1999; Yamamoto 1999）。
【０００５】
肝臓新生物が成長するにつれて、５乃至７ｍｍの直径に達する腫瘍は、血管新生された肝臓脈管のルートによって、主に注がれる（Archer 1989; Laffer 1995）。しかしながら、通常の肝実質は、門脈から主に供給される（７５％）。この違いの開発は、局所の処理戦略（例えば、直接の肝動脈注入（HAI）など）の開発を動機づけた。しかしながら、マルチセンターのランダム化されたトライアルの分析は、HAIと全身化学療法投与との間の全体の生存における違いを示さず、臨床試験の範囲外で、不連続のHAI有用性を推奨した（Kerr 2003）。他の局所治療は、任意に塞栓形成（TACE）と結合されて、大腿動脈（大量瞬時投与）を経てトランス・カテーテル肝動脈化学療法（TAC）を含んで開発された。しかしながら、従来の薬物を用いて、ＴＡＣＥは一次的及び二次的な肝臓悪性における適度な患者の利点だけを示した。
【０００６】
加えて、卵巣がんの局所治療が調査されている。卵巣がんは、２番目に多い一般的な骨盤腫瘍であり、婦人科における悪性の主要な死因である。初期段階の兆候を見逃すために、患者の三分の二は、進行した末期段階の症状を呈する。外科的な腫瘍学、化学療法および分子生物学の進歩にもかかわらず、5年間を通した生存率は、未だに低い（ほぼ30%）。
【０００７】
腹膜内化学療法（ＩＰＣ）は、腹膜露出した腫瘍表面に高水準の化学療法を導くために、腹膜の隠れた疾患のために導入された。この処置レジメ（regime）は、腹膜内潅流化学療法（IPPC）として追加的に修正された。IPPCは、全身毒性を減少させて、化学療法薬のより多量の投与を可能にするために、腹膜空腔から未吸収の薬を除去する。しかしながら、疾患緩解および患者生存における適度の利点だけは、ＩＰＣかＩＰＰＣにおいて達成された。
【０００８】
非効率的な薬物は全身および局所の毒性と組み合わさって取り込み、このように、狭い治療指数は、大きな腫瘍の拡散を有効に制御する、これらと他の化学療法を不可能にし、患者に対して生存性を提供する。
【０００９】
細胞毒性活性を仲裁する化学療法の性能は、標的細胞の充分な細胞内薬物の蓄積に依存している。細胞内薬物レベルは、受動的な膜拡散および能動または容易な流入および薬物の流出で測定される。全ての薬物取り込みのほぼ半分が受動的な拡散によって起こり、他の半分が容易な輸送によって起こることが提案されている（Gately 1993）。
【００１０】
直接的に薬物の細胞障害性効果に影響する、抗腫瘍薬の細胞内レベルは、細胞内で輸送される薬物量（流入）および細胞から放出される薬物量（流出）の機能である。薬物の取り込みは、受動的な拡散および／またはエネルギーに依存する能動輸送の十分に確定されていないメカニズムによって生じる、膜輸送によって決定される。受動的な拡散および活発な薬物輸送は、細胞膜脂質の二層構成要素と薬物分子との間の互換性の相互作用に依存する。概して、従来の薬物製剤は、溶解性の問題を解決するために親水性の特質を表して（またはＣｒｅｍｐｈｏｒなどの処方集の賦形剤を有する）、脂質膜による低分割により、局所的に高濃度で送達された場合でも劣った細胞の取り込みを呈する。脂質膜が親水性薬物動態におけるバリアを表すが、疎水性薬物におけるバリアではないと考えられている。
【００１１】
リポソーム技術がより良好な親水性薬物の取り込みを容易にしたにもかかわらず、細網内皮系およびミセル凝縮形成のリポソーム蓄積に関する懸念は全体の有効性に疑問をもった。代替方法は、ペアレントドラッグ（parent drug）の化学的な修正による、この種の親水性薬物の疎水性を修飾することである。これまでに多数の開発中に修飾された薬物送達システムについては、ペアレントドラッグの修飾のこの考えは、多くの関心を近年で発見した。化学療法の細胞内蓄積が流入および流出のバランスにきわめて依存しているので、充分な親油性を与えることができて、取り込みを強化した薬物設計の修飾は、細胞内のより高い薬剤濃度に結果としてなり、明らかに抗腫瘍反応に影響を及ぼさなければならない。加えて、細胞内の高まった濃度は、腫瘍細胞の薬剤耐性を軽減するのを助け、しばしば、薬物の不十分な投与として、この薬剤耐性を開始する。
【００１２】
疎水基の付加、ハイドロフォビケーション（hydrophobation）またはリピダイゼーション（lipidization）は、薬物およびペプチド／タンパク質送達の領域で調査されている（Wang et al. 2003; Tallen et al. 2000; Storch et al. 1996; Schreier
et al. 2000; Kamyshny et al. 1997; Storch et al. 2002; Baszkin et al. 2001）。これらの効果は、通常は、比較的安定であるかゆっくりと切断された修飾の展開に依存している。ハイドロフォビケーションは細胞膜との相互作用を高めることを示し（Wender et al. 2000; Yaroslavov et al. 1996; Gaede et al. 2003）、改善された細胞の取り込みと低いＩＣ５０決定に対して直接相関した（McKeage et al. 2000; Garnier-Suillerot et al. 2001）。シスプラチンの疎水性誘導体は、化合物の疎水性に対応する細胞毒性に違いがあることを示した（Tallen 2000）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
局所的な薬物送達を標的細胞に高める薬物製剤が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
薬物は、疎水性を高め、したがって膜透過性を高めるために、易変性結合を介して修飾される。適切な溶媒において安定であるが、適切なキャリア溶液において不安定なプロドラッグとなる。細胞に対してプロドラッグを投与する直前に、プロドラッグはキャリア溶液と混合される。送達溶液中でのプロドラッグの易変性は、非標的細胞に対する薬物の入り込みを最小限にする。
【００１５】
好ましい実施態様において、我々は、初回通過（first-pass）送達を経て細胞への送達のためのプロドラッグに、薬物の一時的な疎水性変換を説明する。疎水性変換は、プロドラッグの膜透過性を高める。薬物に対する疎水性部位の付加の易変性は、膜透過性の限られた期間を提供する。細胞とプロドラッグとの関連後、疎水性部位の裂開は、細胞構成要素と未修飾の薬物との相互作用を可能にさせる。細胞外での疎水性部位の裂開は、細胞に入り込む薬物性能を減少し、したがって、非標的、つまり非初回通過（non-first-pass）の細胞で毒性などの薬物の望ましくない影響を減少する。好ましい疎水性部位は、シラザンを含む。他の好ましい疎水性部位は、マレアミド酸を含む。
【００１６】
好ましい実施態様において、我々は、疎水性薬物またはプロドラッグを細胞に送達する方法を記載する。その方法は、有機溶媒で可溶なプロドラッグを提供することと、細胞に対する組み合わせた送達溶液の送達の直前に、水性のキャリア溶液と有機溶媒を混合するために設計された適切な混合チャンバーに有機溶媒中のプロドラッグを注入することからなる。適切な混合チャンバーは、有機と水性溶媒の層流を発生せずに、迅速に有機溶媒と水性のキャリア溶液を混合する。
【００１７】
好ましい実施態様において、我々は、有機溶媒に溶解する易変性の疎水的に修飾されたプロドラッグを含む合成物を記載する。疎水的な修飾は、細胞内部への薬物伝達を高める。易変性は、未修飾の薬物の急速な再生に結果としてなる。細胞、細胞コンテナ（cell container）または組織に対してプロドラッグを投与する直前に、十分量の水性キャリアを含む有機溶媒において、疎水性のプロドラッグは、薬物を混合することによって細胞に伝達できる。好ましい疎水性のプロドラッグは、シラザン修飾の薬物を含む。別の好ましい疎水性のプロドラッグは、マレアミド酸を含む。
【００１８】
好ましい実施態様において、疎水基の加水分解的に易変性の付加を経て疎水的に薬物を修飾すること、伝達の直前に混合チャンバーにより溶液を注入することによって、キャリア溶液を有するプロドラッグを含んでいる溶液を混合すること、腫瘍細胞で、又はその近くで、混合した溶液を投与することを含む腫瘍細胞に対して薬物の伝達を高めるための方法を記載する。
【００１９】
他の好ましい実施態様において、我々は、薬物に対する疎水基の加水分解的に易変性の付加と、このプロドラッグ・ライブラリの細胞に対する伝達を介して、薬物（ドラッグライブラリ）の混合の疎水性修飾のための方法を記載する。疎水性のプロドラッグ・ライブラリは、細胞、細胞コンテナまたは組織に対してプロドラッグを投与する直前に、十分量の水性キャリアを含む有機溶媒において、薬物を混合することによって細胞に伝達できる。
【００２０】
また他の好ましい実施態様において、我々は、薬物に対して易変性疎水基の付加を介して、薬物または薬物の混合の疎水性の修飾のための方法を記載し、この方法において、疎水基は作用剤による反応と、このプロドラッグ（複数可）の細胞への伝達に応答して変化し易い。これらの疎水性のプロドラッグ（複数可）は、細胞、細胞コンテナまたは組織に対してプロドラッグを投与する直前に、十分量の水性キャリア溶液を含む有機溶媒において、薬物を混合することによって細胞に伝達できる。作用剤は、細胞の天然の組成物であるか、細胞の環境であるか、キャリア溶液に添加される作用剤である。
【００２１】
本発明のさらなる目的、特徴および利点は、添付図を参照して下記の詳細な記載から明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
我々は、可逆的にプロドラッグを形成するために著しい易変性結合を経て一つ以上の疎水性部位を薬物に付加して、細胞と接触して修飾された薬物をもたらすことからなる、初回通過効果を介して細胞に薬物を送達するための薬物製剤および方法を記載する。疎水性の付加は薬物に膜透過性を与える。それによって、薬物が細胞に入ることができる。疎水性付加の半減期は、一回の大量瞬時投与後の初回通過送達に必要な時間と、局所的な処方後の薬物拡散のために必要な時間と同等である。このように、プロドラッグは、単に限られた期間において、標的細胞の細胞膜に浸透することができる。一つの実施態様において、疎水基を薬物に付加する結合は、互換性を有する有機溶媒において安定しているが、水性の環境において加水分解的に不安定である。別の実施態様において、疎水基を薬物に付加する結合は、塩基性の環境では、より安定である（長い半減期）が、ｐＨが低くなるにつれて不安定になる。疎水性修飾の不安定さにより、迅速にプロドラッグとして細胞に入る薬物は、後にターゲット分子と自由に作用する、元来の薬物分子に戻る。初回通過の間、細胞膜と相互作用しないプロドラッグは、疎水性部位の損失による膜に対して不透過性の薬物に迅速に戻る。転換は、下流の細胞に対する薬物の送達を制限し、このように全身毒性を制限する。
【００２３】
全身毒性を減少させると共に、記載されている薬物修飾及び方法は、腫瘍組織の化学療法剤の細胞蓄積を増強するために用いることができる。化学療法剤または抗悪性腫瘍剤は、薬物に対する疎水性部位の易変性の化学結合を経て、脂肪親和性のプロドラッグへと一時的に変化する。プロドラッグに対する薬物の変換は、細胞膜との多大な相互作用を促進する。生理条件下の化学結合の迅速な加水分解は、ペアレントドラッグと関連する、多大な膜不透過性状態に薬物を戻す。一時的な脂肪親和性変換は、初回通過送達の間、腫瘍組織と次の抗腫瘍の効能によって、増幅した薬物の取り込みを容易にする。その一方で、全身性曝露の前にペアレントドラッグへの転換によって、低い全身毒性を保存する。
【００２４】
プロドラッグ製剤において利用される疎水性修飾は非常に易変性であり、細胞の中で活発な薬物の安易な再生をさせる。初回通過送達がより多くの薬物を局所の標的細胞（例えば、腫瘍細胞）に対して送達するのに役立つので、薬物の全体的な投与の低下は可能である。迅速に易変するプロドラッグ（初回通過設定において細胞浸透性が高い）は、疎水性部位の迅速な加水分解による放出部位から更なる対象外の細胞に入るのを防止する。初回通過の間に抽出されないプロドラッグは、比較的、膜不透過性の薬物に転換する。このように、対象外の細胞は、細胞浸透性のプロドラッグに曝露されない。結果は、低い全身毒性を維持すると共に、従来の化学療法の治療的指数を一時的に高めることである。
【００２５】
細胞相互作用を高める化学療法剤の疎水性修飾が従来技術に記載されるが、活性な薬物に対する対象外の組織の全身性曝露を最小化すると共に、非常に加水分解的に易変性の疎水性修飾の使用が、単一の大量瞬時投与の結果として、修飾された薬物のさらなる局所の細胞取り込みを有する独特な処理シナリオを可能にすることを示す。対象外の細胞に対する薬物の曝露が制限される一方、それらの修飾はまた、対象細胞の局所処理に有用である。対象外の細胞との相互作用を制限する一方で、所望の組織または器官に対する化合物の目標設定ができる、可逆的な疎水性修飾と特定の送達を用いる新規な薬物製剤を摂家するアプローチを提案する。さらに、記載した化学と送達方法は、より疎水性で、良好な細胞への取り込みと腫瘍への侵襲を導く、プロドラッグの製薬を可能にする。細胞送達を達成するために必要な疎水性の度合いは、プロドラッグが可溶性を維持することを必要としないで使用できる。
【００２６】
プロドラッグの脂肪親和性、このように膜相互作用のそのレベルは、付加した官能基の数との疎水性に依存する。十分な疎水性は、細胞に対する最終的なプロドラッグの送達を高めるために、薬物に付加される。疎水基は、化学的な部位が水を避ける特質を示す。概して、そのような化学基は不溶性であり、水素結合の傾向がない。炭化水素は、疎水基である。疎水基がアルカリ鎖を含む場合、アルカリ基の長さは、その官能基の疎水性に影響を及ぼす。本発明と互換性がある疎水基は、不飽和部位を含み得る４乃至３０の炭素原子のアルキル鎖、アルキル鎖及びアルキル環（芳香性および／または非芳香性）を含むアルキル基、並びにステロイドよりなる官能基から選択されてよい。生体外および生体内でプロドラッグの安定性に影響するために、異なる易変率を有するように結合をデザインできる。薬物修飾の制限された安定性は、初回通過領域で細胞に侵入できる、修飾された薬物の局所的な高濃度を可能にさせる。相当に迅速な半減期は、非効率な対象細胞への取り込みの結果である。逆に、あまりにも長いプロドラッグの半減期は、対象外の細胞および組織に対する薬物送達を高め、一時的に全身毒性を導く。ここに記載した結合の易変性は、薬学的に許容可能なキャリア溶液の選択により、一時的に制御可能である。例えば、キャリア溶液のｐＨは、プロドラッグの半減期を制御するために、適切なバッファーの使用で調節できる。複数の疎水基が修飾できる薬物において、追加的な官能基の付加は、薬物の疎水性を高めるだけでなく、完全な加水分解に必要とされる時間を効果的に高めることができる。キャリア溶液との初期の混合と、細胞との初期の接触との間の薬物のインキュベーション時間の制御は、脂肪親和性プロドラッグが細胞で存在する時間に影響するために用いることができる。プロドラッグの加水分解率は、細胞膜との相互作用に依存して引き延ばしてよい。最適な送達に必要な移動性の易変性は、薬学的に許容できるキャリア溶液、注射量、注射されたプロドラッグの濃度、及び送達されたプロドラッグの総量の温度または構成により制御できる。
【００２７】
我々は、２つの異なる化学結合を介するアミンを含有する薬物の疎水性修飾を例示する。アミンを含有する薬物は、修飾を受ける分子に窒素原子を有する。アミンは、第一級、第二級、第三級アミンあるいはアニリンなど他の窒素誘導体であり得る。
【００２８】
アミンを含有する薬物は、シラザンで修飾できる。例えば、疎水性のプロドラッグとしてのジメチルオクタデシルシラザン誘導体を生じるために、クロロジメチルオクタデシルシラザン（ＤＭＯＤＳｉＣｌ）での薬物の修飾を示す（例えば、実施例１に示す）。この官能基の機能は、薬物分子に対して疎水基を一時的に付加することである。本発明は、他のシラザン誘導体を含むことを意味する。一過的な疎水性を与える（例えば、下記に制限されないが、トリメチルシリルおよびtert-ブチル−ジメチルシリル基を含む）ために、様々なシラザンが採用できることを当業者は容易に認識する。
【００２９】
アミンとクロロシランとの間の反応は、既知の化学的修飾であり、シラザン（またはシリルアミン）を形成する。シラザンは、本来のアミンとシラノールまたはジシリルエーテルを生じるために水の存在下で迅速に加水分解することが知られている（Jiang et al. 2002; Jiang et al. 2002b; Lucke et al. 1997; March
1992; Greene et al. 1999; Kulpinski et al. 1992; Prout et al. 1994）。一般的に、シラザンは、セラミック分野で活用されるか、または、他の官能基（特に、顕著には、ヒドロキシル基）のシリル化のための試薬として有機合成分野で活用される。シラザンの易変性により、この修飾は生物学的な応用には使用価値を見出していなかった。しかしながら、より安定なヘテロシランは、プロドラッグとして採用されている。テストステロンのトリメチルシリルエーテル、シラボリン、ドーパミンの過トリメチルシリル化誘導体、カルボシラン薬物、送達システムの一部として使用されるシリコンが例として挙げられる（Brook 2000; Brahim et al. 2003; Nouvel et al. 2003; Nouvel et al.
2002; Bom et al. 2001; Perkins et al. 1994; Kratz et al. 1999）。これらの例は、安定した結合（炭素−シリコン）または穏やかに加水分解した結合（シリコン−酸素）を用い、シラザンで見られるような迅速に加水分解された結合は用いない。シリルエーテルは、有機合成で除去可能な保護基として長い期間にわたって利用されてきた。結合は、アルコールとシラノールまたはジシリルエーテルを生じるために、酸性条件下で加水分解的に易変性である。数多の要因がシリルエーテルの加水分解率を制御し、例えば、それら要因は、シリコン原子の立体化学（つまり、シリコンに付加する官能基のバルク（bulk））、溶液のｐＨである。シリルザン（既知の安定な変異体を除く）は、類似の酸素変異体（シリルエーテル）よりも、非常に容易に加水分解する。
【００３０】
幾つかの薬物において、直接的なシリル化は非効率性を証明する。そのような場合、プロドラッグを形成するために、他のアプローチを用いることができる（Ohya, 2001; Reedijk, 1999; Tallen, 2000; Alvarez-Valdes, 2002）。例えば、シスプラチンの場合、ジメチルオクタデシルシリル−メチルアミンを形成するために、ＤＭＯＤＳｉＣｌがメチルアミンと反応できる。次いで、このシラザンは、易変性のシスプラチン誘導体を生じるために、シスプラチンまたはＰｔ（ＤＭＳＯ）２−１，１−シクロブタンジカルボキシラートに添加できる。また、ヘテロな環状窒素原子のシリル化が可能である。
【００３１】
アミンを含有する薬物は、疎水基を有する無水マレイン酸で修飾できる。実施例として、類似の疎水性プロドラッグを生じるように、２−（ドデシル）−プロピオンアミド−３−無水メチルマレイン酸との薬物の修飾を示す（図２に示される実施例）。無水マレイン酸は、可逆的なアミン修飾において既に利用されている（Naganawa, 1994; Reddy, 2000; Dinand, 2002; Hermanson, 1996）。生じるマレアミド酸は、塩基条件下で安定であり、酸性条件下では迅速に加水分解することが知られている。例えば、２−プロピオン−３−無水メチルマレイン酸（カルボキシル酸誘導体）は、グリシニルアラニンで試験されている。生じるマレアミド酸は、ｐＨ５で２分間の半減期（k＝0.3 min &#8211;1）を有することが示される（Rozema, 2003）。芳香環でのデローカライゼーション（delocalization）により、概して、アニリンの窒素がアミンよりも反応性が低く、アニリン誘導体のマレアミド酸の易変性は第一級アミンから派生したマレアミド酸の易変性よりも高いことが予期された。シラザンにより、無水マレイン酸の目的は、薬物分子に対して疎水基を一時的に付加することである。一時的に疎水性を与えるために、様々な無水マレイン酸が用いられることを当業者は容易に認識する。
【００３２】
多数の易変性結合は、当業者にとって知られており、疎水基または部位を薬物分子に付加するように活用される。本発明はまた、派生されたプロドラッグが本発明に記載の送達方法を解して送達される場合、加水分解的な易変性結合の別のタイプで疎水性の薬物修飾の使用を包含することを意味する。疎水性部位を薬物に対して付加するように使用されてよい追加的な易変性結合の例は、下記に限定されないが、イミン、オルトエステル、アセタール、アミナル、シリルエステル、ホスホシリルエステルを含む。キャリア溶液のｐＨは、プロドラッグ製剤の半減期に影響するために調節できる。好ましくは、本発明は、疎水性に修飾される薬物製剤を包含し、修飾の半減期は送達溶液において５分未満か５分間である。１分未満、３０秒未満、または２０秒未満の送達溶液での半減期が短い疎水性薬物修飾が好ましい。
【００３３】
また、本明細書に記載された方法は、潅流技術と互換性がある。本明細書において、潅流は組織に対する流れの計画的な導入を意味する。流体は、脈管、組織ルーメン、腹膜空腔または生体外細胞コンテナ（in vitro cell container）などの身体の孔に導入できる。より詳細には、分離した潅流において、導入された流体が対象外組織に到達しないようにして潅流組織は分離される。分離した組織は、組織または領域から身体の流体若しくは導入された流体を除去するために、潅流の前後で洗浄できる。潅流は、循環するバイパス機械を用いて、血管、器官の組織（肝臓または肺）や身体領域（通常は腕や脚）に対して抗腫瘍剤を送達するために使用される。このような手順は、拡散するが、身体の器官や領域に限定される腫瘍を処置するために実行される。本発明の開示において、プロドラッグ（薬物キャリア溶媒に溶解された）は、混合チャンバーで水性キャリア溶液と混合され、潅流される組織に送達される。流出線は、プロドラッグ送達溶液を流出線による空腔および出口によって潅流させる。プロドラッグ及び薬物（疎水基の損失から生じる）が組織から取り除かれるので、送達後に物質が取り除かれない場合よりも長い半減期でプロドラッグを活用できる。プロドラッグ−薬物が取り除かれない場合、下流の細胞を細胞浸透性の高いプロドラッグから保護するために、短い半減期のプロドラッグを有することが好ましい。分離された潅流の場合、プロドラッグは関心がある領域から除去され、それによって、対象領域外の細胞を保護する。
【００３４】
記載のプロドラッグは有機または他の適切な溶媒で合成される。また、記載のプロドラッグはそれらの溶媒では安定であるが、水性溶液などのキャリアまたは送達溶液では加水分解的に不安定である。修飾薬物を形成する反応は様々な溶媒で実行されるが、しかしながら、注射可能な溶媒が好ましい。さらに、プロドラッグの精製を容易にするために、修飾薬物が修飾反応の他の構成成分（例えば、加水分解した疎水基、乾燥剤、および塩基）から精製できる溶媒が好ましい。
【００３５】
本発明にしたがって、様々な薬物が修飾できる。好ましくは、薬物は、薬物のアミン基により修飾され得る。それらの薬物は、化学療法、抗悪性腫瘍薬、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン（シスジアミンジクロロプラチナム（ＩＩ））、メルファラン、チュービュリン重合剤パクリタキセルからなるリストから選択されてよい。修飾できる追加的な官能基は、アルコール、チオール、リン酸塩およびカルボン酸塩を含む。ペアレントドラッグの活性な誘導体は、修飾に最適な官能基を含み、使用されてよい。修飾薬物の例は、ヘテロな環状窒素を含有するシスプラチン誘導体、ドキソルビシンのアンセラシクリン誘導体、およびアミノまたはフラノシル置換された５−フルオロウラシルを含む。
【００３６】
さらに、混合チャンバーにより水性のキャリア溶液を伴う、有機または他の適切な溶媒（薬物キャリア溶媒）でのプロドラッグの共同注射（co-injecting）からなる易変性のプロドラッグを送達するための方法を記載する。本明細書に記載の多数の修飾薬物は、有機溶媒での合成と保存を必要とする、著しく加水分解的な反応性の結合によって付加される疎水基を有する。しかしながら、毒性の懸念は、純粋な有機溶媒の細胞に対する薬物の直接の送達を禁止する。したがって、混合チャンバーを通過する共同注射による送達の直前に薬学的に許容可能な水性のキャリア溶液と有機溶媒との混合が実行される。
【００３７】
最適な混合チャンバーの重要な構成は、薬物キャリア溶媒および水性キャリア溶液の所定量を正確に送達することによる手段と、薬物キャリア溶媒および水性キャリア溶液を迅速で親密に混合する手段と、混合した液体（送達溶液）を細胞に送達する手段を含む。キャリア溶液と薬物キャリア溶媒との効果的な混合なしで、幾つかの市販の混合チャンバーは、層流に結果としてなることができる。薬物キャリア溶媒が有機溶媒である場合、不完全な混合は、膜の損傷を導く有機溶媒の非常に高い濃度に対する幾らかの細胞の曝露に結果としてなる。混合があまりにも遅い場合、プロドラッグは細胞との接触の前に切断されることができる。薬物キャリア溶媒と水性キャリア溶液との十分で迅速な混合を提供するいかなる混合チャンバーは、本発明の用途に適している。
【００３８】
適切な混合チャンバーの例は、図３に示される衝突流を混合するマイクロチャンバーである。水性キャリア溶液と薬物キャリア溶媒は、それぞれの導管（Ａ）と（Ｂ）により混合チャンバー（Ｃ）に注入される。チャンバー（Ｃ）への薬物キャリア溶媒の流れ（ｂ）は、チャンバー（Ｃ）への水性キャリア溶液の流れの反対方向であり、２つの液体の混合を容易にする。混合された送達溶液は、脈管導管（Ｄ）と滴下ポート（Ｅ）により細胞に送達される。概して、薬物キャリア溶媒の量は、キャリア溶液量よりもかなり少ない。ある型式の混合チャンバーにおいて、チャンバーに対してわずかな少量を正確に送達するために、１００μｌのHamiltonシリンジを備えるHarvard Pump PHD ２０００と１ｍｌのBecton Dickinsonシリンジを備えるHarvard Pump PHD ２０００とが使用された。導管（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｄ）は強固でも柔軟でもよく、それぞれの溶液と薬物を伝えるために最適な任意の物質から成ってよい。導管（Ｄ）の長さは、プロドラッグが細胞に対する送達前の水性キャリア溶液においてある時間量を変えるために長さにおいて変化してよい。このように、細胞が存在する場合に、プロドラッグの半減期を調整する。より長い送達ルートはインキュベーション時間を長くし、したがって、動物および／または細胞での接触で脂肪親和性の修飾された薬物の半減期が減少する。適切な滴下ポート（Ｅ）は、シリンジ針とカテーテルからなるリストから選択されてよい。
【００３９】
下記の実施例の詳細な混合は、１倍量の水性キャリア溶液（限定しないが、リンゲル溶液またはアイソトニックグルコース（ＩＴＧ）など）と混合した１０分の１倍量の有機溶媒を含む。送達されるプロドラッグを含有する総量は、溶媒から毒性を引き起こす場合の量よりも少なくするべきである。キャリア溶液量は、対象領域における適切な総量を提供し、プロドラッグを含有する溶媒の適切な希釈を提供するように選択されるべきである。大型動物、対象領域または細胞コンテナにおいて、増量が適切である。組み合わされた送達溶液の注射量と注射率は、圧力のみで細胞に対して重大な損傷を引き起こす場合の注射量と注射率よりも少なくするべきである。
【００４０】
プロドラッグの膜浸透性の易変性（つまり、修飾薬物の半減期）は、リポソームによるプロドラッグの取り込みをモニタリングすることによって測定できる。適切な混合チャンバーからの溶出は、構成が標的細胞の原形質膜を接合するリポソームを含有する溶液に送達できる。次いで、リポソームは精製されて、リポソームでの薬物レベルが測定される。ＤＮＡをインターカレートする薬物において、リポソームは薬物の取り込みの決定を容易にするＤＮＡを含むことができる。
【００４１】
本明細書のプロセス及びプロドラッグは、局所の肝動脈注入（HAI）治療、腹膜内化学療法（ＩＰＣ）、腹膜内潅流化学療法（IPPC）、トランス・カテーテル肝動脈化学療法（TAC）、塞栓形成（TACE）および単離された器官によるトランス・カテーテル肝動脈化学療法または組織潅流などの周知の技術と容易に互換性がある。単離された潅流の適用において、未吸収の加水分解された薬物が組織による通常の流体の流れの回復前に単離された組織（例えば、腹膜空腔）から洗浄されるので、薬物の潜在的な全身毒性はさらに減少する。また、本明細書のプロセス及びプロドラッグは、薬物の局所送達と互換性がある。
【００４２】
本プロセスがプロドラッグの単一の大量瞬時投与送達として記述される一方で、本プロセスは単一の投与に限定されない。本プロセスは、薬物送達の増加したレベルを提供するために繰り返されてよい。用語として単一の大量瞬時投与送達は、プロドラッグの所定量の注射／適用に従っている薬物の初回通過送達を記述することを意味する。
【００４３】
本明細書に記載のプロドラッグ及び方法は、下記に限定されないが、肝臓癌、大腸癌、黒色腫、卵巣癌および神経芽細胞腫を含む、一次的及び二次的の様々な腫瘍に対する抗腫瘍反応を生じるために使用できる。一回の大量瞬時投与送出の有用性は、新生物形成組織に対して優先して曝露され、初回通過の送達の間に腫瘍細胞膜を透過するように、薬物製剤の性能に依存する。親水性部位の易変性の付加による抗ガン剤の修飾は、比較的膜不浸透性の薬物を、細胞内薬物濃度の高まりと、抗癌性の反応の強化を促進する、脂肪親和性プロドラッグに変える。
【００４４】
幾つかの癌、例えば腹膜癌において、癌細胞およびわずかな腫瘍は、検出可能で手術可能な転移と共に、常に存在する。初期・二次的悪性からのそれらの存在および連続デフォリエーション（continuous defoliation）は、癌、例えば、腹膜に広がった卵巣がんの成功治療にとっての主な障害のうちの1つを表す。開示されたプロドラッグ製剤は全ての曝露された細胞、単細胞、微細な浸透物、微細な腫瘍、より大きな腹膜腫瘍の表層細胞、腹膜空腔の中に浮遊されるか、または器官若しくは組織に付着されるか侵入されている腫瘍細胞を対象とする。また、本明細書に記載のプロドラッグは、従来の薬物と比較して、腫瘍に対する薬物の増大した浸透を表す。我々は、数秒で500μｍ（約２５の細胞層）までの薬物浸透を観察した。したがって、本明細書に記載の製剤は、様々な状態の癌細胞に対する制ガン剤の改良された送達を提供する。したがって、本明細書に記載の本発明は、腫瘍の再来を遅らすか、または最小化するために、細胞を縮小する手術に続いて利用されることができ得る。
【００４５】
利用した送達方法のタイプに依存して、様々なタイプの組織は、本明細書に記載されている本発明を使用して、目標とすることができる。例えば、肝細胞は、門脈（閉塞された血流）に対して、単一の大量瞬時投与によって目標とされる。通常のマウス肝臓の肝動脈への単一の大量瞬時投与後、ターゲティングは、内皮肝動脈および平滑筋細胞において、および、幾つかの隣接した肝細胞およびシヌソイド細胞において明らかであった。全ての胆汁および胆嚢動脈は、膀胱上皮と同様に目標とされた。若干の肝細胞を伴う胆管細胞は、胆管に単一の大量瞬時投与に続いて目標とされる。尿路細胞は、尿管に対する単一の大量瞬時投与に続いて、目標とされる（初期の腎盂を含む尿管移行性上皮核、腎盂移行性上皮核、すなわち移行上皮癌および大多数の集合管および他の上皮部分における源）。通常のマウスの頸動脈への単一の大量瞬時投与は、脳内皮細胞と、神経細胞および膠細胞の両細胞の目標に帰着した。プロドラッグの局所投与は、プロドラッグが直接適用される細胞への送達となる。例えば、角膜に対する、または皮膜に対する、または腸のルーメンへの局所の適用は、それぞれ、角膜上皮に対する、または表皮に対する、あるいは小腸上皮細胞に対する薬物送達に結果としてなる。
【００４６】
細胞に対する薬物の送達をさらに高めるために、本明細書に記載の製剤と処方は、薬物の流出ポンプ効率を調整するために、公知の化合物の共同送達と組み合わせることができる。この共同送達は、細胞での薬物保持を高めるために役立つ。
【００４７】
本発明はまた、薬物の混合物の細胞に対する修飾および送達に適用でき、また、薬物ライブラリとして周知である。ほとんどの薬物は、水溶液での薬物の可溶性を支援する分子内に、窒素または酸素原子を含む。これらの原子は、本明細書で概説される手順に従ってハイドロフォバイズ（hydrophobized）されることができる。薬物ライブラリは、DMFまたはDMSOのような適当な有機溶媒において取り込むことができて、例えば、単一化合物において概説される疎水性修飾を受ける。次いで、送達されたプロドラッグのライブラリは、単一のプロドラッグにおいて概説されるように、細胞に適用されることができる。
【００４８】
本発明は、また、薬物に対する易変性の疎水基の付加を介して薬物または薬物の混合の疎水性修飾のための方法に適用可能であり、疎水基は薬剤の反応に応答して変化しやすい。例えば、疎水基は、細胞に入り込み、細胞性のグルタチオンによって分解される、ジスルフィド結合を含むことができる。本明細書に記載の本発明と互換性を有する疎水基は、グルタチオンによる減少に影響されやすい薬物分子に、官能基の付加位置の4つの炭素原子で、またはその範囲内で、ジスルフィド結合を含む。ジスルフィド系はまた、不飽和部位を含むことができる４乃至３０の炭素原子のアルキル鎖、アルキル鎖とアルキル環（芳香／非芳香）を含むアルキル基、ステロイドからなる群から選択されるジスルフィド結合の一方の側に疎水基を有する。生体内と生体外でプロドラッグの安定性に影響するために、異なる易変率を有するようにして、リンケージがデザインできる。
【００４９】
本発明での用語「薬物」は、薬物の薬学的に許容できる塩を含むことを意味する。薬学的に許容可能な塩は、酸と塩基の両者の追加塩類を意味する。薬学的に許容可能な追加塩は、生物学的効果および遊離塩基の特性を保持する塩であって、生物学上または別に望ましくなく、塩酸、臭化水素酸、硫酸、窒素酸、リン酸などの無機塩、および酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンダリン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、トリフルオロ酢酸、などの有機酸で形成される。薬学的に許容可能な塩基の追加塩は、生物学的効果および遊離酸の特性を保持する塩であって、生物学上または別に望ましくなく、遊離酸に対する無機または有機塩基の追加から調製される塩である。無機塩基から派生する塩類は、限定しないが、ナトリウム、カリウム、カルシウム、リチウム、アンモニウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム塩類などである。有機塩基から派生する塩類は、限定しないが、メチルアミン、トリエチルアミンなどの第一級、第二級及び第三級アミンの塩類などである。
【００５０】
易変性結合は、選択的に破壊することができる共有結合である。すなわち、易変性結合は、他の共有結合の破壊を伴わずに、別の共有結合の存在下において破壊される。例えば、ジスルフィド結合は、分子中に存在する炭素と炭素の結合、炭素と酸素の結合、炭素と硫黄の結合、炭素と窒素の結合など他の結合の切断を伴わないで、チオールの存在下で破壊できる。易変性はまた、切断可能を意味する。
【００５１】
易変性リンケージは、易変性結合を含み、別の２つの基との間のリンク又はスペーサーを提供する化学的な化合物である。リンクされる基は、化合物（例えば、生物学上活性な化合物、膜活性化合物、膜活性を阻害する化合物、機能的な反応性基、モノマーおよび細胞標的シグナル）から選択される。スペーサー基は、アルカン、アルケン、エステル類、エーテル、グリセロール、アミド、糖類、多糖類およびヘテロ原子（例えば、酸素、硫黄または窒素）を含む群から選択される化学部位を含むことができる。スペーサーは電子的に中性でもよいし、正または負の電荷を有してよく、または、全体の電荷が中性、正、あるいは負で正と負の電荷を共に有してもよい。
【実施例】
【００５２】
実施例１．ヨウ化プロピジウムの易変性な疎水性修飾。ヨウ化プロピジウムは、典型的なレポーター薬物として活用された。通常、この膜不透過性のレポーター薬物が、コンプロマイズした膜（compromised membranes）を有する細胞を視覚的に識別するために、蛍光試薬として使用される。完全な細胞膜を有する細胞は、効果的にヨウ化プロピジウムを除外する。ヨウ化プロピジウムはDNAへのインターカレーションに応じて２０乃至３０倍の増強した蛍光を呈し、ヨウ化プロピジウムのポジティブ（PI+）細胞の検出を容易にする。ヨウ化プロピジウムに対する疎水基の安定した付加（臭化ドデシルを有するアニリンのアルキル化によって）は、ヨウ化プロピジウムのインターカレーションおよび染色を防ぐ。蛍光試験薬を腫瘍に送達する性能は、多くの実験的なパラメーターを評価する際の有益な視覚的なツールを提供する。
【００５３】
ビス−（ジメチルオクタデシルシリル）−ヨウ化プロピジウム（BDMODS-PI）及びビス−マレアミド酸誘導体（CDMC12-PI）を形成するクロロジメチルオクタデシルシラン（DMODSiCl）及び2−（ドデシル）プロピオンアミド-3-メチル無水マレイン酸（CDMC12）とヨウ化プロピジウムの修飾、並びにビス−（ジメチルオクタデシルシリル）−シスプラチン（BDMODS-ＣＰ）を形成するDMODSiClとシスプラチンの修飾（図２）。
【００５４】
Ａ．BDMODS-PIの合成。BDMODS-PIを形成するために、ヨウ化プロピジウム（95%, Aldrich Chemical Company）の易変性の疎水性修飾は、無水N,N-ジメチルホルムアミド（DMF、アルドリッチ）のDMODSiCl（6モルの等価物、アルドリッチ）の過剰または、ジメチルスルホキシド（DMSO、アルドリッチ）と、塩基としてのK2CO3と、水のスカベンジャーとして存在する活性化されて３Åの分子篩（sieves）とでヨウ化プロピジウムを処理することによって達成された（図2A）。使用に先立ち、BDMODS-PIは、固形分とDMODSiCl（ＤＭＦに不可溶）の加水分解物を除去する、０．２０μｍの無菌のナイロンフィルターによって濾過される。ＤＭＦと他のアミドがクロロシランと反応することが知られているが、それらの反応条件下においてイミダイト（imidate）（または、イミダイトから生じる産物）の証明は観察されない（７９−８２）。構造的な研究を実証するために、さらに幾つかの追加的な制御（アニリン及び３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジンを含む）は、関連するアニリンの環状システムにおいて実行された。全ての産物は１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、Ｍ，Ｎ−ジメチルホルムアミド−ｄ７）によって解析され、構造的な研究をサポートする。ＮＭＲは、2つのアニリン陽子の統合と対応する損失に基づくＰＩに対する２つのアルキルシラン基の付加を示す。BDMODS-PIの加水分解の効果的な比率は、NMRによって試験されるにはあまりに迅速であった。
【００５５】
移動性分析−BDMODS-PIの関連するアニリニウム塩（anilinium salt）は、移動性測定において分析された。アニリニウム塩のＤＭＦ溶液に対するH2Oの付加は迅速な減少となり、６４５ｎｍから６５５ｎｍ（Ｅｘ５００ｎｍ）へと最大蛍光にシフトした。反応におけるｔ１／２は、方程式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋに基づき、ｋ＝０．０１６秒−１の反応において定率を可能にする、ほぼ４３秒として測定できる。これらのデータから、純粋中のシラザンの概算の半減期は、０．４秒と推定することができる。加水分解が非常に迅速であるが、これはアニリン窒素上の正電荷によるBDMODS-PIにおいて予想され得る場合よりも速い加水分解であることが予期され、BDMODS-PIにおけるわずかに遅い加水分解率の我々の評価に至る。トレースジメチルアミン（DMFに存在する）が分析のためのサンプルの希釈に応じてBDMODS-PIの迅速な加水分解を生じ、BDMODS-PIとPIとの見かけの違いはほとんどない結果となることが可能である。溶媒としてDMSOでの試験は、BDMODS-PIの加水分解分析の直接的なモニタリングを考慮に入れた。ＤＭＳＯ中のＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ（Ｅｘ４９３ｎｍ、Ｅｍ６４７ｎｍ）に対するバッファー（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．５及び７．２  ２５μＬ、５０μＬ、及び１００μＬ）の添加は、シリル基の損失と６４７ｎｍでの蛍光の見た目に帰着する。反応におけるｔ１／２に基づき、ｋapparent=0.103 sec-1 (ｐＨ８．５のHepesバッファー)の反応において定率は近似することができ、純粋なバッファー中のBDMODS-PIの半減期は方程式ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋによる6.7秒であると推定されることができる。溶液のpHがpH７．２まで下がったので、BDMODS-PIの加水分解の易変性は非常に急速であった。ｐＨ７．２のＨｅｐｅｓバッファーでの反応におけるｔ１／２に基づき、ｋapparent=０．４７８sec-1の反応において定率は近似することができ、純粋なバッファー中のBDMODS-PIの半減期は１．５秒であると推定されることができる。ペアレントドラッグ製剤への修飾された化合物の迅速な加水分解は、腫瘍に対する初回通過送達の状況におけるこれらのアルキル化の化学療法の治療指数を高めることにとって重要である。
【００５６】
溶液の混合におけるミセルまたは粒子形成。薬物／ＤＭＦ溶液がITGキャリア溶液と混合される場合、BDMODS-PIがミセラー（micellar）タイプの粒子を形成することは、もっともなことである。この可能性を調査するために、粒子のサイジング実験は行われ、（ZetaPlus Particle Sizer、Brookhaven Instrument Corporation）、それは現在の修飾化学がチャンバーでのITGとの混合に続いて、粒子形成を促進しないことを示した。
【００５７】
Ｂ．ＣＤＭＣ１２−ＰＩの合成。また、ヨウ化プロピジウムは、ビス−マレアミド酸誘導体（CDMC12-PI）を形成するために環状の無水物ＣＤＭＣ１２で修飾された（図２Ａ）。マレイン酸無水物とアミンの反応は可逆的な反応であり、塩基状態の下でアシル化（マレアミド酸）が好ましい。酸性化に応じて、マレアミド酸は、最初のアミンおよび最初の無水物を産生するために閉環を受けることが知られている。通常、このマレアミド酸の閉環反応は、中性において穏やかである。しかしながら、ヨウ化プロピジウムで見られるようなアニリン様の窒素の場合、結合の疎水的易変性は、通常のアミンで見られる場合よりも、中性条件下でより促進する。概して、アニリン窒素は、芳香環を有する電子密度の局在化により、他のアミンよりも反応性が低い（および低いｐＫａ’ｓを有する）。
【００５８】
ヨウ化プロピジウムでの現行の修飾反応（最適化されていない）において、ＣＤＭＣ１２（３ｅｑ）はＤＭＦまたはＤＭＳＯにＫ２ＣＯ３と共に６０℃で添加される。１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、Ｍ，Ｎ−ジメチルホルムアミド−ｄ７）による反応の分析は、ヨウ化プロピジウムのアミン陽子の損失とビス−マレアミド酸からのアミド陽子の外観を示す。コントロール反応は、構造的な試験を検査するために、アニリンおよび３，８−ジアミノ−６−フェニルフェナントリジンの両者で導かれた。
【００５９】
ＣＤＭＣ１２−ＰＩの加水分解分析の分析は、ＤＭＳＯの蛍光分光（Ｅｘ４９３ｎｍ、Ｅｍ６４７ｎｍ）によって達成された。これらのデータから、ｋapparent=０．０８６sec-1(ｐＨ８．５のHepesバッファー)の反応において定率は近似することができ、純粋なバッファー中のＣＤＭＣ１２−ＰＩの半減期は８．１秒であると予測できる。塩基性のｐＨであっても、マレアミド酸の半減期は、ＰＩのアニリンタイプの窒素の低ｐＫａによって短い。予測されるように、溶液のｐＨがｐＨ７．２まで低下するにつれて、ＣＤＭＣ１２−ＰＩの加水分解の易変性は高まった。ｐＨ７．２のHepesバッファーでの反応におけるｔ１／２に基づき、ｋapparent=０．１１３sec-1の反応において定率は近似することができ、純粋なバッファー中のＣＤＭＣ１２−ＰＩの半減期は約６．１秒であると予測できる。
【００６０】
実施例２．化学療法の易変性の疎水性修飾：
Ａ．シスプラチンの易変性の疎水性修飾、ＢＤＭＯＤＳ−ＣＰの合成。シスプラチンは典型的な従来の化学療法として活用される。Cl2Pt(NH2Si(CH3)2C18H37)2
(BDMODS-CP)を生じるために、類似した一連のシリル化反応は、シスプラチン、広く使われているプラチナに基づく化学療法薬で実行された。（cis-diamminedichloro-platinum(II); Fuertes, 2003; Reedijk, 1999; Siddik,
2003）。より安定な疎水性修飾は、活性と毒性を変更するために、通常、置換アミンで分子のアミン部位の置換によるシスプラチンで既に調査されている（Tallen et al. 2000; Alvarez-Valdes et al. 2002）。１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ、Ｍ，Ｎ−ジメチルホルムアミド−ｄ７）シスプラチンとＤＭＯＤＳｉＣｌの反応（最適化されていない）分析は、δ4.2（TMSと関連して）での幅広いアミンシグナルの損失と、クロロシランでの反応からのアルキル基の外観を示した。相対的なシグナル統合は、シスプラチン分子につき１．７のアルキル基を示した。この物質は、０．２０μｍの無菌のナイロンフィルターをろ過した。
【００６１】
Ｂ．ＤＭＯＤＳ−メルファラン及びＣＤＭＣ１２−メルファランの合成。類似した一連の修飾は化学療法メルファランで行われ、BDMODS-Melphalanおよびマレアミド酸誘導体CDMC12-Melphalanを形成するためにDMODSiClおよびCDMC12を利用した（図３）。反応（最適化されていない）は、K2CO3と水のスカベンジャーとして活性化された３Åの分子篩（sieves）の存在下のわずかな余剰の修飾試薬を活用して、ＤＭＦまたはＤＭＳＯのいずれかで行なわれた。官能基の違いがメルファランにおいて現れると仮定すると、異なる易変性の修飾が可能である。例えば、メルファランは三次アミン、一次アミン及びカルボン酸である。DMODSiClの反応性を与えられて、2つの修飾は生じるものと思われ、一つは一次アミンであり、２つ目はシリルエステルを形成するためにカルボン酸で生じる。マレアミド酸を形成する２−（ドデシル）プロピオンアミド−３−メチル無水マレイン酸とのアシル化反応は、単にメルファランの一次窒素に生じる。記載されるように、１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ（Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド-ｄ７）による反応の分析法はメルファランの修飾を支持した。
【００６２】
Ｃ．ＤＭＯＤＳ−Ｄｏｘ及びＣＤＭＣ１２−Ｄｏｘの合成。ＤＭＯＤＳｉＣｌ及びＣＤＭＣ１２を活用するドキソルビシンの予備（最適化されていない）修飾は、ＤＭＯＤＳ−Ｄｏｘとマレアミド酸誘導体ＣＤＭＣ１２−Ｄｏｘを形成するために開始された（図３）。ドキソルビシン塩酸（９８％、アルドリッチ）は、塩基の存在下でＤＭＦのＤＭＯＤＳｉＣｌ又はＣＤＭＣ１２の１乃至４の等価物と反応した。修飾した薬物は、リポソームの取り込み及び細胞毒性分析によって質的に検査され、それは修飾剤の相当物の数が増加すると、より多くのドキソルビシンがリポソームに没収されて、生体外でHepa1-6細胞に適用される際に、それらのリポソームが多大な細胞毒性を与えたことを示した。コントロール実験も、プロドラッグ製剤自体（非リポソームの）がドキソルビシン（示されないデータ）と比較して細胞実験で増強された細胞毒性を実証することを示した。
【００６３】
実施例３．BDMODS-PIおよびCDMC12-PIの生細胞目標の染色。我々は生細胞（腫瘍細胞とリンパ球）を染色するためにBDMODS-PIとCDMC12-PIの能力を試験した。成功したヨウ化プロピジウムのプロドラッグの取り込み、機能的なヨウ化プロピジウムの細胞内放出及びＤＮＡインターカレーションを示した。ＳＫ−ＯＶ−３（人間の卵巣の癌（図４）、Ｊｕｒｋａｔ（人間のＴリンパ球、図５、ウェルのポリリジンでコーティングされたカバースリップにプレートされた）、Ｈｅｐａ１−６、ＭＣ３８（マウスの肝癌、大腸癌、示されないデータ）細胞は、培地の除去及び薬物又はプロドラッグの追加の２４時間前に６ウェルプレートにおいて０．２５ｘ１０６細胞／ウェルに培養された。未修飾のヨウ化プロピジウム（図４、パネル１Ａ及び１Ｂ）、ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ（図４、パネル２Ａ及び２Ｂ）、ＣＤＭＣ１２−ＰＩ（図４、パネル３Ａ及び３Ｂ）、並びにＩＴＧで５分間プレミックスされたＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ（図４、パネル４Ａ及び４Ｂ）は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞に添加された。すべての薬物濃度は、２０μＬＤＭＦ／２００μＬアイソトニックグルコースキャリア溶液中１００μｇヨウ化プロピジウムで一定であり、記載されたミッシングチャンバーを用いて送達された。３０秒後、薬物溶液は吸引されて、２ｍＬの新鮮な倍地が加えられた。各々の条件が３ウェルにおいて繰り返された。
【００６４】
細胞は、Axiovert S100 蛍光顕微鏡で直ちに試験された。未修飾のヨウ化プロピジウムは極めて少ない細胞を染色し、（図4、パネル１）、通常起こっている死細胞を表す。BDMODS-PIおよびCDMC12-PIは６０乃至８０％の細胞を染色し（図4、パネル２乃至３）、疎水的に修飾されたプロドラッグが、活発で自由なヨウ化プロピジウムの成功した細胞内形成を有する、生きているヒト卵巣の癌細胞に効率的に入り込むことを証明した。易変性なリンケージの加水分解とヨウ化プロピジウムの放出を可能にする、ＩＴＧ中でのＢＤＭＯＤＳ−ＰＩのプレミックスは、ＰＩポジティブの染色を示さなかった（図４、パネル４Ｂ）。また、同様の結果がＨｅｐａ１−６細胞を用いた取り込み実験から得られた。Jurkat細胞（ヒトのＴリンパ球）の場合、ヨウ化プロピジウムおよびＣＤＭＣ１２−ＰＩは、複製してウェルに加えられた。３分後、薬物溶液は２ｍｌの新鮮な培地を添加することによって希釈された。未修飾のヨウ化プロピジウムは極めて少ない細胞を染色し、一方で、ＣＤＭＣ１２−ＰＩは強力な細胞の取り込みと染色を表した（基本的には、１００％の細胞、図５）。同様の実験は、MC38（マウスの大腸癌）、B16（マウス黒色腫）、SK-OV3（人間の卵巣の癌）およびHeLa（人間の頸部癌）を含む多数の細胞系で実行されて、ＰＩの取り込みを表す６０乃至８０％細胞に結果としてなった。
【００６５】
実施例４．疎水性に修飾されたシスプラチンおよびメルファランの増強された耐増幅／細胞障害性作用。疎水的に修飾された薬物が増強された耐腫瘍活性を実証するかどうかを決定するために、我々はB16ネズミ・メラノーマ細胞およびMC38大腸癌細胞に対して生体外細胞毒性試験を行った。薬物送達のデュアル・ポンプのコロイディンフローのミキシングチャンバー送達システムを使用して、我々は、CellTiter-Glo発光の細胞生存度分析（図6）を使用して、B16細胞上のヨウ化プロピジウム、BDMODS-PI、シスプラチンおよびBDMODS-ＣＰの効果を評価した。細胞は、０日において１００μｌの９６ウェルプレートに１ｘ１０４細胞／ウェルで播かれ、薬物の追加に先立って２４時間培養された。培地の除去に続いて、薬物溶液は、１：１１ＤＭＦ／ＩＴＧ溶液の比率でデュアルミキシングチャンバーを用いて４倍のウェルに滴下（７、２４および１１２μｌのそれぞれ効果的な送達の１、４または１６ドロップの溶液）された。１０分間の薬物溶液の曝露に続いて、１００μｌの新鮮な培地は各ウェルに添加され、３時間インキュベーションされた。薬物を含有する培地は、１００μｌの新鮮な培地と置き換えられ、さらに２４時間培養された。データは、４倍ウェル＋Ｓ．Ｄ．の平均のＲＬＵ値を表した。薬物濃度を評価し、シスプラチン（２．５μｇ／μｌＤＭＦ）、ヨウ化プロピジウム（５．０μｇ／μｌＤＭＦ）。
【００６６】
培地だけのコントロールと比較する場合、ITGキャリア溶液は、DMFと同様に、B16細胞に対してごくわずかな反増殖的な効果を呈した。試験した薬物の最も高い濃度の最大限の効果（ウェルにつき１１２μｌのDMF／ITG送達溶液中24μgの薬物）で、シスプラチンは、穏やかに服用に依存する反増殖的な反応を示した。対照的に、修飾されたシスプラチンのプロドラッグは、薬物の反増殖的および／または細胞障害性の活性を著しく増大した。試験された最も高いレベルにおいて、ＢＤＭＯＤＳ−ＣＰは、ＲＬＵレベルを空のウェル（Ｂ１６細胞がない培地だけのウェル）で観察されるレベルまで下げ、Ｂ１６腫瘍細胞に対する完全な細胞障害性効果を示す。
【００６７】
ＣＤＭＣ１２−メルファランはまた、ＭＣ３８ネズミ大腸癌細胞に対して、強化された反増殖的／細胞障害性活性を示した。図６に示されるように、DMFは、培地だけのコントロールと比較して、MC38細胞の成長に対するごくわずかな効果を呈した。同様の反増殖的な効果を有する１．９および５．８μgの服用で、メルファランは、服用に依存する成長抑制を誘発した。ＣＤＭＣ１２−メルファランは、メルファランと同様の成長抑制を示した。５．８μｇ投与において、ＣＤＭＣ１２−メルファランは、メルファランの同じ投与（それぞれ、１８７４００と６８５５４３の平均のＲＬＵ値）と比較して、著しく（Ｐ＝０．０００８６）高い成長抑制を示した。
【００６８】
これらの結果は、シスプラチンとメルファランの疎水性修飾が生体外でメラノーマおよび大腸カルチノーマ細胞に対して増大した抗腫瘍効果を促進することを明らかに示す。
【００６９】
実施例５．BDMODS-PIおよびCDMC12-PIは、IPアプリケーションによる表層組織によって、増大された薬物の取り込みを示す。すべての生体内手順は、半無菌状況のアイソフルラン（Isoflurane）吸入麻酔をうけて実行された。腹膜の露出した組織に対するプロドラッグ送達の評価のために、我々は、通常のマウスと散在性の腹膜卵巣がんのマウスモデルの両者に対するヨウ化プロピジウム、BDMSODS-PIおよびCDMC12-PIのIPアプリケーションを試験した。すべての手順は、アイソフルラン（Isoflurane）吸入麻酔をうけて実行された。通常のマウスにおいて、腹腔は切開されて、薬物混合は腹部器官に直接適用された（３０秒間にわたる２２０μＬの薬物−ＯＳ／ＩＴＧ）か、または、薬物混合は腹壁によって注入された（1分にわたる1mLの薬物−ＯＳ／ＩＴＧ）。両者の送達プロトコールにおいて、デュアルポンプミキシングチャンバーが使用された。１０乃至６０分後、動物は安楽死され、組織は収集され、凍結され、切断されて、ToPro-3およびPhalloidin Alexa 488によって染色されて、レーザー共焦点顕微鏡によって調べられた。通常のマウスのヨウ化プロピジウムの使用は極めて珍しい核標識（示されないデータ）に結果としてなった。その一方で、BDMODS-PIおよびCDMC12-PIの両者のアプリケーションは腹膜空腔にさらされる細胞の近い排他的なPIポジティブ染色に結果としてなった。組織のより深くある細胞は、非常に低強度で標識されるか、または全く標識されないように見えた（図７）。
【００７０】
実施例６．ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩおよびＣＤＭＣ１２−ＰＩは、マウス腫瘍モデルのIPおよびIPPCアプリケーション後の表層組織およびマイクロ腫瘍によって増強された薬物の取り込みを示す。癌モデルの確立のために、２ｘ１０６のＳＫ−ＯＶ−３細胞は、ヌードマウスへの注入されたIPであった。マウスは細胞の接種後２週間において試験されるか、または、腹水の第1の徴候（約４乃至５週）で検査された。組織サンプルは10%のNBFにおいて固定されて、通常通りに処理されて、H&E染色液で染色されて、組織病理学的分析を受けた。顕微鏡検査は、ＳＫ−ＯＶ−３細胞接種の２週間後に、多数のマイクロ腫瘍（約1mm）が腹膜空腔の全体にわたって存在し、腸間膜に最も顕著だったことを示した。ＳＫ−ＯＶ−３細胞接種の４乃至５週後に、最大腫瘍サイズは、約０．１乃至約１mmのマイクロ腫瘍として存在する癌の進行の大半を有する５乃至７ｍｍまで増加した（図８）。５週に、大部分の腹膜表層は発達する癌細胞によって影響を受け、内臓と体壁の腹膜（例えば、肝臓、膵臓および隔膜）を被覆した。このように、組織病理学的分析は、ＳＫ−ＯＶ−３マウスモデルと臨床卵巣ガンにおいて、腹膜永続化および散在の強い類似点を示した。
【００７１】
細胞接種の２週間後、腹腔は切開されて、薬物混合は十二指腸および卵巣/子宮/卵管に直接適用された（30秒にわたる２２０μＬの薬物-OS/ITG）。あるいは、薬物混合は、前述したように腹壁によって注入された（30秒にわたる1mLの薬-OS/ITG）。両方の送達ルートは、記載されているミキシングチャンバーを利用した。１０乃至６０分後、動物は安楽死され、組織は収集され、凍結され、切断されて、ToPro-3およびPhalloidin Alexa 488によって染色されて、レーザー共焦点顕微鏡によって調べられた。BDMODS-PIおよびCDMC12-PIの両者の直接適用およびIP注射は、類似した観察に結果としてなった。プロドラッグの細胞取り込みは、転移の表層でより強いだけでなく、小さな腫瘍の中心部で容易に検出可能であった（腫瘍のサイズは約０．５乃至約１ｍｍ；図９参照）。比較的大きな腫瘍に標識することに加えて、内臓の腹膜および腸間膜に成長する、より小さい腫瘍（断面で約２５乃至１００細胞）もまた、強烈にBDMODS-PIとCDMC12-PIで標識された。腹膜空腔およびプロドラッグ溶液（例えば、肝臓）に曝露される大部分の通常の組織の細胞の外側の層のように、隣接した腸間膜細胞は、プロドラッグの取り込みおよび染色を示した。しかしながら、腫瘍病変はプロドラッグ取り込みに対して、より影響されやすく見え、非悪性組織と比較して、より多大な組織浸透および強度のPIポジティブ染色を示した。広範囲の区分および分析は、いかなるサイズもの腫瘍が効果的に目標とされる（腫瘍面からの最高500μmまで）ことを示した。ヨウ化プロピジウム染色のない腫瘍は、観察されなかった。通常のマウスのコントロールにおいて、同様の分析は、腹膜空腔にさらされる外側の細胞のほとんど排他的なPIポジティブ染色を示した。組織に深く存在する細胞は、かなり低強度で標識されたか、または全く標識されなかった（図７）。
【００７２】
別々の実験において、卵巣がんの進行は、腹水の（４乃至５週）の徴候まで監視された。この場合、試験IPPC注射は、腹膜潅流のために典型的に使用する方法論を適応させることによって、CDMC12-PIによって実行された。要約すると、多数の穿孔を有する2つの23G  Abbocath-T廃水カテーテルは、腹膜空腔に嵌入されて、脊椎骨の両側上の卵巣の領域へ挿入された。腹水は、最小の負の圧力によってゆっくり吸引された。次いで、さらに23Gの穿孔されたカテーテルは、腹部に嵌入されて、腹部器官上に配置された。1mLの薬物／DMF／ITG溶液は1分以上注入されて、繰り返して穏やかなマッサージが続いた。５乃至７分後の投与の腹膜流体は再び吸引されて、下部の二つカテーテルを経た同時吸引と共に、腹膜空腔は一番上のカテーテルを経て10mLのPBSによって注がれた。処理中、特別な手当てが高い腹圧を回避するためになされた。生き残った潅流が良好な全ての動物は、３乃至５時間後に犠牲にされた。卵巣の腫瘍を含み、腹膜空腔にさらした全ての外側の細胞の強度のヨウ化プロピジウムの核標識によって、以前に観察されるように、共焦顕微鏡検査は類似した染色パターンを示した。大きな腫瘍（５乃至７ｍｍ）は約５００ミクロンの深さで標識されて（図１０Ａ）、その一方で、マイクロ腫瘍（０．１乃至１ｍｍ）の全ての腫瘍細胞は腫瘍の全体にわたって濃く標識された（図１０Ｂ）。腹膜空腔に、そして、このことによりプロドラッグ溶液にさらされる全ての細胞は、プロドラッグの取り込みと、腸間膜細胞、腹部器官の細胞の外側の層、および散在性の腹膜卵巣の腫瘍を含む染色を示した。病変はまた、濃いＰＩポジティブの腸間膜を除く、通常の腹部組織と比較して、より多大な組織浸透および強度のＰＩポジティブ染色を示し、薬物の取り込みに対して影響されやすいように見える。
【００７３】
通常、小さい分子量の薬物の組織浸透は、達成するのが困難である。いくつかの研究は、５０乃至５００μm浸透のために数時間から数日かけて種々の抗悪性腫瘍薬における組織浸透深さ（多くの腫瘍タイプ）を示した。対照的に、我々のプロドラッグは、10分以内で５００μｍの浸透深さに結果としてなった。これは、横方向の拡散として文献に記載されていることと同様に、細胞膜との疎水性プロドラッグのより効果的な相互作用の結果となり得た。
【００７４】
急速に加水分解できるプロドラッグがこの実験のために用いられたにもかかわらず、よりゆっくりと加水分解できるプロドラッグが、全身毒性を増やすことのない単離された潅流送達方法によって用いられることができる。
【００７５】
実施例７．一回の大量瞬時投与後の肝臓転移による強化されたプロドラッグの取り込み。肝動脈機械の損傷および術後の収縮を回避するために、我々は、臨床手順（ケメーニュ、2001）と同様の方法で、肝動脈に対して逆行的な一回の大量瞬時投与注入のための右の胃十二指腸動脈を使用した。胃十二指腸動脈は周囲組織から放されて、総肝動脈および／または腹腔はクランプされて、血流は遮断された。胃十二指腸動脈の末梢部は縫合され、35Gの針は胃十二指腸動脈に嵌入されて、一回の大量瞬時投与の間、固定された。注射後、針は格納され、胃十二指腸動脈の近位の部分は縫合されて、肝動脈の流れは回復された。あるいは、腹腔トランクは大動脈の近くに固定されて、35Gの針はクランプより上に嵌入された。左の胃、脾臓、胃十二指腸動脈は、肝臓に薬液の全てを向けるためにクランプされた。この後者の方法は、肝動脈を含む解剖学的バリエーションの理由のために、C57BLマウスモデルにおいて有利だった。
【００７６】
肝腫瘍に対する薬物送達の評価のために、ネズミ大腸癌細胞系MC38が使われた。C57BLマウスは門脈を経て１０４のMC38細胞を接種されて、腫瘍形成は3週間にわたって成長させた。プロドラッグまたはコントロールは、記載されているミキシングチャンバーを使用して大量瞬時投与によって送達された。３０秒間にわたって２２０μｌの総量を送達するために、ＤＭＦ１ｍｌあたり５ｍｇのヨウ化プロピジウムでのＤＭＦ中に１００μｇのＢＤＭＯＤＳ−ＰＩは、１秒間に６．７μｌのＩＴＧにつき０．６７μｌＤＭＦの流率で、ＩＴＧと混合された。肝臓は、薬物送達に続いて、５分間収集された。図１１Ａ及びＢの左パネルに示されるように、BDMODS-PIの送達はMC38肝転移の強度でほとんど排他的なＰＩ染色に結果としてなり、その一方で、通常の実質細胞はＰＩ染色が比較的ないようにみえた。
【００７７】
また、実質−転移の界面でのわずかな細胞として肝動脈および若干の補助細胞（adjunct cells）は標識された。残存するＰＩポジティブ細胞は、ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ治療をうけている動物の肝臓の下流のいかなる器官において観察されなかった。予測されるように、未修飾ＰＩまたは事前に加水分解されたＢＤＭＯＤＳ−Ｐが大量瞬時投与によって送達された場合、ＰＩで染色された非常にわずかな細胞（約１％）となるか、あるいはＭＣ３８転移となり、または腫瘍組織に遠位もしくは近位の実質に結果としてなった（図１１Ｃ、左パネル）。追加的なコントロールとして、同量の修飾されたＰＩは、腫瘍をもったマウスに維持された門脈流（portal flow）で門脈に注射された。取り込みを示しているわずかな肝細胞については、全ての転移はＰＩ陰性だった（図１１Ｄ、左パネル）。門脈内送達がクランプされた門脈で再び実行される場合、転移以外で、一時的に閉塞している血流、門脈構造と補助細胞の顕著な標識は、強調された。図１１のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの右パネルは、緑色のチャネルで同じ領域の自動染色を表す。
【００７８】
LABC治療後のサンプルの共焦画像は、3つの異なる区画のＰＩポジティブの細胞数に近くなるように用い、それら３つの異なる区画は、ＭＣ３８転移、肝臓の門脈領域、シヌソイド脈管構造を有する肝実質である（図１２）。5つの画像（各０．２６２ｍ２）はＭＣ38腫瘍を有するローブ（lobe）から各々の区画において得られ、核（ToPro-3のポジティブ染色）およびＰＩポジティブの核の総数が決定された。ＭＣ３８転移でのＰＩポジティブ細胞の平均パーセントは９４％であった。さらに分析は、門脈領域での細胞の２３％がＰＩポジティブであったことを示した。これらの細胞は、大部分は肝細胞および胆管細胞に隣接している一部を伴う動脈の細胞であった（その全ては、注射の間、ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩに潜在的にさらされた）。門脈領域が肝臓の５乃至７％未満を含むものとすると、ＰＩポジティブ細胞の実際の数は、転移のポジティブ細胞と比較して、非常に少ない。最後に、肝実質の細胞の約１％の全体はＰＩポジティブであることを分析は示した。これらのデータから、肝臓のポジティブな非腫瘍細胞の数の全体の評価は、２乃至３％である。
【００７９】
我々はまた、ＭＣ３８腫瘍をもつ動物でＢＤＭＯＤＳ−ＰＩの門脈内送達を評価した。門脈の血流が注射の間で維持される場合、転移と通常の実質組織のまれな単細胞標識に結果としてなった。しかしながら、門脈内送達がクランプされた門脈で実行された場合、転移以外で、一時的に閉塞している血流、門脈構造と補助細胞の顕著な標識は、強調された。
【００８０】
ＭＣ３８結腸癌モデルに加えて、我々はまた、Hepa1-6（肝癌）、B16（黒色腫）およびNXS2（神経芽細胞腫）を含む、他の関連した合成遺伝子のネズミ肝転移モデルでＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ送達の予備試験を実行した。この新規な薬物送達システムの有用性が特定のタイプ転移性肝疾患に制限されないことを明らかに示して、肝臓転移組織の優先染色および実質の非常に最小の関与については、ＰＩ染色の同様のパターンが観察された。加えて、ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ治療をうけている動物の肺または心臓のいずれにおいても、我々は、いかなる残存のＰＩポジティブ細胞を観察しなかった（データは示されない）。
【００８１】
実施例８．生体内で肝細胞によるＢＤＭＯＤＳ−ＰＩの取り込み。生体内で細胞に入るＰＩ量を数量化するために、我々は、肝細胞を目標として、門脈内に未修飾のＰＩまたはＢＤＭＯＤＳ−ＰＩを肝臓に送達した。麻酔をうけて、門脈および肝動脈の流れはクランプされて、肝臓の血液は門脈を経て１ｍｌのITGで洗浄された。次いで、２００μｇのＰＩまたは４０μｌのＤＭＦ中のＢＤＭＯＤＳ−ＰＩは、４００μｌのＩＴＧと（マイクロチャンバーを経て）混合されて、門脈内に送達された。注射の5分後に、肝臓は脈管に残存するいかなる薬物も洗浄するために3mlのITGによって注がれて、肝細胞は分離された。細胞の懸濁からのスメア（smears）は調製されて、蛍光顕微鏡検査によって調べられた。スメアの分析は、約１％の細胞がＰＩ標識され、その一方で、約７０％の細胞がＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ標識されることを示した。細胞の懸濁は10mMのHEPES pH 7.5のオクチルグルコシドの０．５％溶液において溶解された。
【００８２】
ＰＩ蛍光周波数域は、５３０ナノメートルの励起波長を用いる島津RF 1501 Spectrofluorimeterにモニターされた。各サンプルのＰＩ量は、ＰＩの増加している量を各々のサンプルに加えることによって発生するＰＩ校正曲線にしたがって推定された。直線の標準曲線が得られ、ＤＮＡと結合しているＰＩが飽和しなかったことを示し、したがって、サンプルに存在するＰＩ量の正確な測定がされる。次いで、ＰＩ取り込み効率は、下記式にしたがって計算された。Ef(%) = 100 × PIs / PIi、式中、PIsは細胞懸濁液中のＰＩ量であり、PIiは注入されたＰＩまたはＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ量（全体の肝臓に関してサンプル・サイズに修正された）である。これらの結果は、ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩにおける１３．５％と比較して、注入された通常のＰＩの１．２％が肝臓ＤＮＡに結合されたことを示す。
【００８３】
実施例９．様々な標的細胞に対するヨウ化プロピジウムの送達。ヨウ化プロピジウムは上述したように疎水的に修飾され、下記に詳述するようにミキシングチャンバーを用いて注射または局所投与を介して送達された。
【００８４】
Ａ．通常のマウス肝臓の肝動脈への注射：通常の肝臓のすべての脈管または胆管に対する未修飾のヨウ化プロピジウムの注射は、結果として、ほとんど核染色にならなかった。通常のマウス肝臓の肝動脈に対する修飾されたヨウ化プロピジウムの注射は、内皮肝動脈および平滑筋細胞（図１３Ａ）の強い核染色に結果としてなって、わずかな隣接した肝細胞およびシヌソイド細胞を染色した。また、膀胱上皮と同様に、全ての胆汁および胆嚢動脈が染色された（図１３Ｂ）。上述した技術が活用された。
【００８５】
Ｂ．通常のマウス肝臓の胆管への注射：通常のマウス肝臓の胆管に対する修飾されたヨウ化プロピジウムの注射は、胆管の近くの肝細胞の染色と同様に、全ての胆管上皮細胞の強い核染色に結果としてなった（図１３Ｃ）。
【００８６】
Ｃ．通常のマウス肝臓の門脈への注射：通常のマウスの維持された血流でクランプを外された肝臓門脈に対する修飾されたヨウ化プロピジウムの注射は、単に門脈細胞だけで強い核染色に結果としてなった。門脈が注射の間にクランプされる場合、ヨウ化プロピジウムの染色は大多数の肝細胞において観察された（図１３Ｄ）。
【００８７】
Ｅ．通常のマウスの右の頸動脈への注射：35Gの針は右の共通の頸動脈に嵌入され、次いで、内部頸動脈に挿入された。注射の間、共通の頸動脈は、一時的に塞がれた。注射後、血流は回復されて、動物は５分後に犠牲にされた。通常のマウスの右の頸動脈に対する修飾されたヨウ化プロピジウムの注射は、脳内皮細胞の強い染色となり、神経および膠核の強い染色に結果としてなった（図１３Ｅ）。
【００８８】
Ｄ．癌転移を有するマウス肝臓の肝動脈への注射：癌転移を有するマウス肝臓の肝動脈に対する未修飾のヨウ化プロピジウムの注射は、いかなる構造もの核染色に、結果としてならなかった（図１３Ｆ）。しかしながら、癌転移を有するマウス肝臓の肝動脈に対する修飾されたヨウ化プロピジウムの注射は、内皮肝動脈および平滑筋細胞の強い核染色、さらに、転移の強い核染色に結果としてなった（図１３Ｇ）。
【００８９】
Ｆ．通常のマウスの尿管および膀胱への注射：通常のマウスの尿管に対する修飾されたヨウ化プロピジウムの注射は、尿管移行性上皮核（図１３Ｈ）、腎盂移行性上皮核（図１３Ｉ）、腎盂の開始を含み（図１３Ｊ）、大多数の集合管（図１３Ｋ）の強い染色に結果としてなった。注射は、膀胱近くの右の尿管に類似した３５Ｇの針を使用して実行された。空にされた膀胱への注射は、膀胱移行性上皮で強く染色された結果になった。
【００９０】
Ｇ．通常のマウスの右の角膜への適用：上記した技術を使用して、通常のマウスの角膜に対する局所用処方は、角膜上皮だけの強い核染色に結果としてなった（図１３Ｌ）。
【００９１】
Ｈ．通常のマウスの皮膚表面への適用：上記した技術を使用して、通常のマウスの皮膜に対する局所用処方は、主に表皮の強い核染色に結果としてなった（データは示されない）。
【００９２】
Ｉ．ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩの腸内ルーメンへの適用：約２５ｍｍの十二指腸と空腸は近位と遠位にクランプされて、次いで、２０μｌのＤＭＦ中の１００μｇのＰＩまたはＢＤＭＯＤＳ−ＰＩは、２００μｌのＩＴＧと混合されて、上述した技術を用いて３０秒間にわたってルーメンに注入された。次いで、クランプは外されて、５分後に動物は犠牲にされた。腸ルーメンは、１ｍｌのＩＴＧで洗浄されて、上記の通りに分析された。ＰＩ染色がわずかな腸の絨毛細胞（おそらくアポトーシス細胞）において観察される一方で、ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩの適用は、小腸上皮細胞の近くで全ての小腸上皮細胞核および間葉細胞の有意部分の強度の標識に結果としてなった（データは示されない）。
【００９３】
前述は、本発明の原理だけを例示するものとして考慮される。さらに、多数の変更態様と改変が当業者に容易であり、本発明を図面と共に記載される正確な構造および作用に制限することを要求するものではない。従って、全ての適切な変更態様および等価物は、本発明の範囲内になる。
【００９４】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年９月８日付け出願の米国仮（特許）出願第６０／５０１，１８９、２００３年１１月１４日付け出願の米国仮（特許）出願第６０／５２０，４２６、２００３年１０月２３日付け出願の米国仮（特許）出願第６０／５１３，７０７及び２００４年４月１日付け出願の米国仮（特許）出願第６０／５５８，７５３の利益を主張する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】クロロジメチル−オクタデシルシラン（ＤＭＯＤＳｉＣｌ）と２−（ドデシル）プロピオンアミド−３−メチルマレイン酸無水物（ＣＤＭＣ１２）による、ヨウ化プロピジウムの疎水性修飾を例示する図である。
【図２】Melphalan、BDMODS-Melphalan、マレアミド酸誘導体CDMC12-Melphalan、Doxarubicin、DMODS-Doxおよびマレアミド酸誘導体CDMC12-Doxの化学構造を例示する図である。
【図３】図３は、混合チャンバー（図３において、Ａは、続くＢに移動する。あるいは、図１に示されるような一般的な送達ダイアグラムを含む。）を例示する図である。
【図４】１ａと１ｂの未修飾のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、２ａと２ｂのＢＤＭＯＤＳ−ＰＩ、３ａと３ｂのＣＤＭＣ１２−ＰＩ、４ａと４ｂの予め加水分解されたＢＤＭＯＤＳ−ＰＩで処理されたＳＫ−ＯＶ−３細胞の画像であり、１ａ乃至４ａは、位相対照イルミネーションにおける画像であり、１ｂ乃至４ｂは、ローダミンフィルターでの蛍光イルミネーションにおける同一領域の画像である。
【図５】（Ｂ）ＣＤＭＣ１２−ＰＩの（Ａ）ヨウ化プロピジウムで処理したＪｕｒｋａｔ細胞の画像であり、上段パネルは、位相対照イルミネーションにおける細胞を示し、下段パネルは、ローダミンフィルターでの蛍光イルミネーションにおける同一領域を示す図である。
【図６】CellTiter-Glo発光細胞生存度分析によって測定されるように、B16哺乳動物細胞上でプロドラッグの耐増殖／細胞毒性作用を例示している棒グラフを示す。
【図７】生体内で(A) BDMODS-PIおよび（B）CDMC12-PIの処理に続き、ヨウ化プロピジウムの細胞への送達を例示する共焦点画像を示し、(A)はファローピウス管、（B）は大腸壁であり、ヨウ化プロピジウム（ＡとＢの左上パネル）、ＴｏＰｒｏ−３核染色（ＡとＢの左下パネル）、Phalloidin Alexa 488でのアクチン染色（AとBの右上パネル）の画像である。
【図８】ヌードマウスへの接種５週間後のＳＫ−ＯＶ−３腫瘍細胞の成長を例示する光学顕微鏡の画像であり、（Ａ）十二指腸腸間膜上の小結節性の成長（x100）、（Ｂ）膵臓および十二指腸上の腫瘍細胞形成（x200）、（Ｃ）肝臓の表面を覆っている腫瘍細胞（x200）、（Ｄ）隔膜の腹部表面を覆い、且つ侵入している腫瘍細胞（x200）であり、矢印は、腫瘍成長の領域を示し、パネルは、腫瘍に対する表層腫瘍細胞の緩やかな付着を例示し、ヘマトキシリン・エオシン染色の画像である。
【図９】腹膜卵巣の腫瘍による(A) BDMODS-PIおよび（B）CDMC12-PI取り込みの共焦点画像を示し、（Ａ）空腸の近くで腹膜に成長している小さい卵巣腫瘍（x630）、（Ｂ）大腸面に成長し、且つ侵襲している卵巣腫瘍（x400）であり、ヨウ化プロピジウム（ＡとＢの左上パネル）、ＴｏＰｒｏ−３核染色（ＡとＢの左下パネル）、Phalloidin Alexa 488でのアクチン染色（AとBの右上パネル）の画像である。
【図１０】ＣＤＭＣ１２−ＰＩのＩＰＰＣ後の共焦点画像であり、（Ａ）大きな腹膜腫瘍の表面、（Ｂ）大腸表層上の小さな卵巣腫瘍（x630）、接種後、５週間のＳＫ−ＯＶ３細胞、ヨウ化プロピジウム（ＡとＢの左上パネル）、ＴｏＰｒｏ−３核染色（ＡとＢの左下パネル）、Phalloidin Alexa 488でのアクチン染色（AとBの右上パネル）の画像である。
【図１１】修飾されたヨウ化プロピジウムの注射後の肝臓部位での蛍光画像（BDMODS-PI；Ａ、Ｂ、Ｄ）または未修飾のヨウ化プロピジウムの注射後の肝臓部位での蛍光画像（Ｃ）を示し、Ａ及びＢ−動脈および肝動脈送達後の若干の補助細胞と同様に、MC38転移の核は、強固にPIでラベルされて、Ｃ−わずかなＭＣ３８転移のラベルであり、Ｄ−ＢＤＭＯＤＳ−ＰＩの門脈注射後のＭＣ３８転移に標識細胞はないものであり、左側の画像は、ヨウ化プロピジウム蛍光を示し、右側の画像は、細胞の自動蛍光を示し、ＣとＤでの矢印の先端は、腫瘍の境界を示し、図中、ＨＶは肝静脈であり、Ａは１００倍、Ｂ、Ｃ、Ｄは２００倍であり、左パネルは赤いチャネル（ＰＩ）、右パネルは緑のチャネル（自動蛍光）を示す画像である。
【図１２】大腸転移を有するマウス肝臓に対するBDMODS-PIの送達を示し、左の写真は、大腸癌腫瘍を有する肝臓の４００倍の共焦点画像、矢印は標識された動脈を有する門脈路を示し、矢印の先端は標識された多数の細胞を有する肝転移を示し、右の写真は、転移の中心から撮られた６３０倍の共焦点画像であり、報告された薬物で標識された殆ど全ての細胞を示し、左上パネル−ヨウ化プロピジウムシグナル、右上パネル−Ａｌｅｘａ４８８でのアクチン染色、左下パネル−ＴｏＰｒｏ３核染色の画像である。
【図１３Ａ】肝動脈内皮およびなめらかな筋細胞に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｂ】ガル膀胱脈管および上皮細胞に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｃ】胆管上皮および近傍の肝細胞に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｄ】肝細胞に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｅ】内皮細胞および神経単位に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｆ】肝動脈に未修飾ヨウ化プロピジウムを注射した後の肝臓（コントロール）に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｇ】修飾されたヨウ化プロピジウムで染色された肝動脈内皮、平滑筋細胞および腫瘍細胞に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｈ】尿管移行上皮に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｉ】腎盂移行上皮に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｊ】初期の腎盂上皮に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｋ】集合細管に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１３Ｌ】角膜上皮に対する易変性の疎水性薬物の初回通過送達を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３（ｃｏｎｔ．）】
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【国際調査報告】
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