(57)【要約】  本発明は、サンプルからのタンパク質の精製を最適化する自動クロマトグラフィーシステム、並びに該自動システムを制御するソフトウェアに関する。ソフトウェアは、システム内の検出器からの信号をモニターし、２つの信号パラメータを決定し、かつ２つの信号パラメータの実際の値に応じてシステムの諸コンポーネントを制御するのに適合している。【選択図】  図２
2007514153.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質精製用の自動クロマトグラフィーシステムであって、複数のクロマトグラフィーカラムと、複数のコンピューター制御弁と、ポンプと、流体保存用の１以上のループと、検出器を通過する流体の組成を表す出力信号を生成できる検出器と、上記の弁、ポンプ及び検出器を制御するソフトウェアを備えかつその実行に適合したコンピューターとを備えており、該ソフトウェアが検出器の出力信号を処理して２つの信号パラメータを識別することができる、システム。
【請求項２】
前記２つの信号パラメータが信号レベル及び信号レベルの変化率であることを特徴とする請求項１記載の自動クロマトグラフィーシステム。
【請求項３】
前記ソフトウェアが、２つの信号パラメータについて所定の条件が同時に満たされたときに所定のアクションを実行するのに適合していることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の自動クロマトグラフィーシステム。
【請求項４】
前記ソフトウェアが、２つの信号パラメータのいずれかについて所定の条件が満たされたときに所定のアクションを実行するのに適合していることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の自動クロマトグラフィーシステム。
【請求項５】
２つの信号パラメータについての所定の条件がデフォルト条件又はオペレーターの選択した条件であることを特徴とする、請求項３又は請求項４記載の自動クロマトグラフィーシステム。
【請求項６】
自動クロマトグラフィーシステムを制御するためのソフトウェアであって、検出器からの出力信号を受け取って、検出器の出力信号を処理して２つの信号パラメータを識別することができることを特徴とする、自動クロマトグラフィーシステムを制御するソフトウェア。
【請求項７】
当該ソフトウェアが信号レベル及び信号レベルの変化率を識別するのに適合していることを特徴とする、請求項６記載のソフトウェア。
【請求項８】
当該ソフトウェアが、２つの信号パラメータについて所定の条件が同時に満たされたときに所定のアクションを実行するのに適合していることを特徴とする、請求項６又は請求項７記載のソフトウェア。
【請求項９】
当該ソフトウェアが、２つの信号パラメータのいずれかについて所定の条件が満たされたときに所定のアクションを実行するのに適合していることを特徴とする、請求項６又は請求項７記載のソフトウェア。
【請求項１０】
当該ソフトウェアが、２つの信号パラメータについてオペレーターが所定のデフォルト条件を選択するか或いはオペレーターの選択した所定の条件を入力するのに適合していることを特徴とする、請求項８又は請求項９記載のソフトウェア。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の精製のためのクロマトグラフィー法、システム及びソフトウェアに関する。
【背景技術】
【０００２】
目的タンパク質と１種以上の夾雑物とを含有する溶液から目的タンパク質を分離するのにクロマトグラフィー分離が多用されている。通例、クロマトグラフィーによるタンパク質精製システムは特性の種々異なる複数のクロマトグラフィーカラムを含んでおり、溶液を特定の順序でそれらのカラムに流す。例えば、タンパク質精製システムは、アフィニティカラム、脱塩カラム、イオン交換カラム及びゲルろ過カラムの４種類のカラムの一部又は全部を順次使用することがある。かかるシステムは、適切なソフトウェアを備えたコンピューター又はマイクロプロセッサーで制御することができる。
【０００３】
目的タンパク質を含むサンプルを精製するため、オペレーターはそのタンパク質が特異的（ただし可逆的）に結合するリガンドを付けた媒体を収容したアフィニティカラムを選択するであろう。目的タンパク質を含むサンプルは、目的タンパク質のリガンドへの結合を促進する条件下でカラムにかける。タンパク質含有サンプルがすべて媒体を通過し終わったら、カラムから非結合材料を洗い流し、次いで、カラムに流す緩衝液を、例えば、目的タンパク質とリガンドとの結合を壊す高塩濃度の緩衝液に交換することによって、目的タンパク質を媒体から溶出させる。カラムから溶出した緩衝液中のタンパク質の存在は、カラムを出た溶出緩衝液における特定の波長（例えば２８０ｎｍ又は２５４ｎｍ）でのＵＶ吸光度の変化を検出するＵＶ検出器などの検出器で検出され、吸光度は所与のフラクション中に溶出した全タンパク質の大まかな測定値を与える。カラムから溶出した流体はフラクションコレクターで回収される。ソフトウェアで、目的タンパク質を含めたタンパク質がいつカラムから溶出されたかを示すＵＶ検出器の出力をモニターし、これがどのフラクションに対応するかをメモリーに記録する。最初のカラムでのランが完了したら、オペレーターはＵＶ曲線をチェックしてタンパク質含有フラクションを手作業で回収する。手作業で回収したフラクションは、手作業でプールされ、次のカラムに移される。高塩濃度の溶出緩衝液を用いた場合には、目的タンパク質を含有する溶出緩衝液を脱塩カラムに通して脱塩すればよい。脱塩カラムからの溶出液は、検出器（例えばＵＶ検出器）でモニターされ、脱塩カラムを出た目的タンパク質含有脱塩溶液の画分はフラクションコレクターへと送られる。オペレーターはフラクションを手作業でプールし、プールしたフラクションを次のカラムに移す。この脱塩溶液画分は夾雑物を依然として含んでいることがあり、その一部を除去するためイオン交換カラムの使用が必要になることがある。その場合、オペレーターは、目的タンパク質を含有する脱塩溶液の画分を、目的タンパク質が結合できる媒体を収容したイオン交換クロマトグラフィーカラムに流す。目的タンパク質を含有する脱塩サンプルの画分をカラムに流し、タンパク質がカラム媒体に可逆的に結合したら、カラムを洗浄して非結合物質を除去すればよい。次いで、目的タンパク質とおそらくは若干の夾雑物を含む結合物質を、目的タンパク質のイオン結合に適さない溶出条件に変更することによって媒体から取り出すことができる。イオン交換カラムからの溶出液は、検出器（例えばＵＶ検出器）でモニターされ、イオン交換カラムから出た目的タンパク質を含有する溶出液の画分はフラクションコレクターで回収される。イオン交換した溶液のこの画分は夾雑物（例えばタンパク質分子の凝集体）を依然として含んでいることがあり、その一部を除去するためゲルろ過カラムの使用が必要になることがある。その場合、オペレーターは、イオン交換液の目的タンパク質を含有する画分をゲルろ過カラムに通す。ゲルろ過からの溶液はフラクションコレクターで回収される。各カラムにおいて溶液からの目的タンパク質の分離を促進する媒体及び溶出条件を正しく選択すれば、この時点までに目的タンパク質はゲルろ過カラムに通したイオン交換液の画分中で最高濃度の物質となるはずである。
【０００４】
以上のタンパク質精製法は、時間がかかり、面倒である。また、各カラムからの結果の評価、カラムからカラムへの溶出液のフラクションの移動など、オペレーターの頻繁な作業が必要とされる。
【０００５】
これらの問題を軽減するため、検出器信号をコンピューターでモニターし、検出器信号が特定の値を上回った（検出器を通過する溶液中のタンパク質濃度が閾値を超えることに相当）ときにフラクションの回収を開始し、検出器信号が特定の値未満に下がった（検出器を通過する溶液中のタンパク質濃度が閾値を下回ることに相当）ときにフラクションの回収を停止する自動システムが製造されている。これを達成するため、ソフトウェアは、ＵＶ検出器で検出された吸光度がオペレーターの設定した閾値を超えると特定のアクションを開始する「監視機能」と呼ばれるモニタリングサブルーチンを備える。「Ｘ１超のレベル」監視機能は、ＵＶ検出器で検出される吸光度レベルに対応する検出器パラメータの信号が値Ｘ１を超えると、コンピューターに、ＵＶ検出器を通過する流れをフラクションコレクター内の新しい容器へと転換させ、流体の回収先のフラクションコレクターの番号を指摘する。併せて、「Ｙ１未満のレベル」監視機能も始動させる。「Ｙ１未満のレベル」監視機能は、ＵＶ検出器で検出される吸光度がレベルＹ１を下回ると、コンピューターに、ＵＶ検出器を通過する流れをフラクションコレクター内の現在の容器から新しい容器（又は廃液溜め）へと転換させ、「Ｘ１超のレベル」監視機能を再始動させる。これらの自動システムは、オペレーターエラーに起因する問題の一部を解決するが、フラクションの回収の開始／終了のためのコンピューターが守るべき規則はこれまで洗練されてきてはいない。例えば、検出器信号が第一の閾値を上回ると回収を開始し、検出器信号が第二の閾値を下回ると回収を停止するという規則は、ソフトウェアが認識すべき様々なピーク形状のすべてを適切に収集できるほど十分にロバストなものではない。図１に、カラムから出るタンパク質が生じる可能性のあるＵＶ吸光度曲線の例を幾つか示す。図１のＡは単一ピークの曲線を示し、カラムから単一タンパク質が溶出する場合が代表例として挙げられる。図１のＢは２つの重なり合ったピークからなり、ピーク間にトラフもしくは谷をもつ複合曲線を示し、カラムから２種類の類似したタンパク質が溶出する場合が代表例として挙げられる。ここでは、谷の最低点での検出器レベルは、第一のピークの最大値の半分よりも大きい。これら２つのピークを１つのフラクションとして回収することが望まれることもある。図１のＣは２つの重なり合ったピークからなる別の複合曲線を示し、ピーク間の谷はさらに深くて第一のピークの最大値の半分よりも小さく、カラムから２種類の類似性に欠けるタンパク質が溶出する場合が代表例として挙げられる。これら２つのピークは別個のフラクションとして回収するのが望ましいことが多い。図１のＤは、２つのピークからなる別の複合曲線を示し、第一のタンパク質の量が第二のタンパク質ほど多くない２種類の類似したタンパク質が代表例として挙げられる。図１のＥは、ピークの後に安定プラトーが続く例を示す。ピークとプラトーは別個のフラクションとして回収するのが望ましいことが多い。「Ｘ１超のレベル」と「Ｙ１未満のレベル」を用いる従来技術のシステムは、図１のＢ〜Ｅに示すピークの分離に問題を抱えていることがある。
【０００６】
さらに、ＵＶ検出器のノイズ並びに機器の経時的ドリフトのような不安定性のためスプリアス出力信号が生じて、誤って「Ｘ１超のレベル」機能を賦活する可能性もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
こうしたロバスト性の欠如は、夾雑物から目的タンパク質を分離する際に手作業での介入が依然として必要であることを意味する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、先行技術に関する問題の少なくとも一部は、請求項１の特徴的部分に存在する特徴をもつクロマトグラフィーシステムによって解決される。本発明の方法を実行するソフトウェアは、請求項５に記載の特徴を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
図２は、本発明に係るタンパク質精製用の自動クロマトグラフィーシステム１の第一の実施形態の概略を示す。システム１は複数のクロマトグラフィーカラムを含む。本発明のこの実施形態では、各々種類の異なる分離媒体を収容した５つのカラムＣ１〜Ｃ５が存在する。各カラムは入口端と出口端を有する。本発明のこの実施形態では、カラムＣ１及びＣ２は、目的タンパク質が特異的（ただし可逆的）に結合するリガンドを付けた媒体を各々収容したアフィニティカラムである。カラムＣ３は、目的タンパク質を含有する緩衝液の脱塩に適した媒体を収容した脱塩カラムである。カラムＣ４は、タンパク質が可逆的に結合できる媒体を収容したイオン交換カラムである。カラムＣ５は、分子の大きさの異なる他のタンパク質からの目的タンパク質の分離に適したゲルろ過カラムである。
【００１０】
サンプルリザーバＳ１〜Ｓ４は、各々、目的タンパク質が溶解した体積Ｖｓｔａｒｔのサンプル液を収容でき、コンピューター制御マルチパス入口弁１３に接続可能である。また、各々緩衝液又は溶出液を収容した他のリザーバＡ１〜Ａ８、Ｂ１及びＢ２も入口弁１３に接続可能である。入口弁１３は、リザーバＳ１〜Ｓ４、Ａ１〜Ａ８及びＢ１〜Ｂ２のいずれかからの流れが、ミキサーＭ、コンピューター制御マルチパス注入弁１６及び別のコンピューター制御マルチパスカラム弁１７を経由してカラムＣ１〜Ｃ５の入口端のいずれかに選択的に送られるようにコンピューター１４で制御できる。注入弁１６は、カラム弁１７に接続可能なだけでなく、流体を手動注入するための手動操作可能な注入手段１８並びにループ弁２９にも接続可能である。また、カラムＣ１〜Ｃ５の出口端もコンピューター制御マルチパスカラム弁１７に接続可能である。カラムＣ１〜Ｃ５を出た液体がＵＶ検出器１９Ａ及び／又は導電率検出器１９Ｂのような検出器を通過するように、カラム弁１７からの出口は検出器の流体入口に接続可能である。ＵＶ検出器１９Ａは検出器を通過する液体によって吸収されるＵＶ光量に応じて強度の変化する出力電気信号を発生し、この信号はコンピューター１６に伝送される。導電率検出器１９Ｂは検出器を通過する液体の導電率に応じて強度の変化する出力電気信号を発生し、この信号はコンピューター１６に伝送される。（１以上の）検出器を出た流体はコンピューター制御マルチパス出口弁２１へと流れる。出口弁２１は、注入弁１６、廃液溜め２５、フラクションコレクター２７、複数のフラクション貯蔵リザーバＦ３〜ＦＮに接続可能であり、また、コンピューター制御マルチパスループ弁２９を介して複数の貯蔵ループＬ１〜Ｌ５の入口端に接続可能である。出口弁２１は、検出器を出た液体が注入弁１６、フラクション貯蔵リザーバＦ１〜ＦＮ、廃液溜め２５及びフラクションコレクター２７のいずれかへと選択的に送られるようにコンピューター１６で制御できる。ループ弁２９は流入した液体を複数のループＬ１〜Ｌ５のいずれか又は廃液溜め２６に送るか、或いは注入弁１６に戻すようにコンピューター制御できる。各ループＬ１〜Ｌ５は、その内容積がサンプル体積Ｖｓｔａｒｔの１％〜１００％となる長さのチューブ材料を含む。ループＬ１〜Ｌ５の各出口端はループ弁２９の別々の入口に接続可能である。ループ弁２９は、注入弁１６を介してカラム弁１７に接続可能な出口を有しており、ループＬ１〜Ｌ５のいずれかの出口端をカラム弁１７に接続するように制御できる。フラクションコレクター２７は移動可能であり、固定出口管３３を備える。フラクションコレクター２７は、３３がフラクション回収リザーバの上方、例えばマイクロタイタープレート３７内のウェル３５の上方に位置すれるように、コンピューター１６の制御下で移動できる。システム内の液体が流れるように、システムは、ポンプ３９を備えており、ポンプ吐出量及び方向はコンピューター１４の制御下にある。好ましくは、ポンプ、弁、カラム、ループ、検出器及びフラクションコレクターがすべて単一ユニットを形成するように、ハウジング４３（破線で示す）内／上に据え付けられる。かかるユニットは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）からＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ（商標）として市販されている。
【００１１】
コンピューター１４は、ポンプ、弁及びフラクションコレクターの動作を制御し、検出器１９Ａ、１９Ｂからの出力信号を処理するソフトウェアを格納したメモリー４５を備える。適切なソフトウェアプログラムは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）から市販されており、Ｕｎｉｃｏｒｎ（商標）バージョン５．００と呼ばれている。
【００１２】
弁及びポンプの適切な制御によって、上述の構成は、精確な体積の液体をサンプルリザーバ１１からシステムの他のいずれかの部分へと移動させることができる。例えば、目的タンパク質が最大成分で、残りの成分が不要成分であるようなタンパク質混合物を含有する部分精製タンパク質溶液がサンプルであうと仮定する。さらに、サンプル溶液を適切なアフィニティカラム、脱塩カラム、イオン交換カラム及びゲルろ過カラムに順に通すことによって夾雑物から目的タンパク質を分離できることをオペレーターが知っていると仮定する。精製を開始する前に、システムのオペレーターは、適切なクロマトグラフィーカラムＣ１〜Ｃ５をユニット４３に接続し、目的タンパク質を含有するサンプルをサンプルリザーバ１１に入れるはずである。次いで、オペレーターは、サンプル溶液をクロマトグラフィーカラムＣ１〜Ｃ５に供給する順序を選択し、さらにプログラムが特定のアクションを実行する検出器信号閾値を設定するか或いは製造業者の設定したデフォルト検出器信号閾値設定を選択することによって、精製を実行するソフトウェアをプログラミングする。ソフトウェアは、次のカラムに移すべきピークを選択する機能、選択したピークを次のカラムに再注入する機能、検出器信号が特定の条件を満たすときに重なり合った１対のピークを別個の２つのフラクションに回収する機能、ピークの後にプラトーが続く場合、検出器信号が特定の条件を満たすときにピークを含むフラクションとプラトーを含む第二のフラクションとに分離する機能を実行できる。
【００１３】
ソフトウェアは、まず、サンプルリザーバ１１から目的タンパク質含有サンプル溶液を３９で吸い上げて、その溶液をアフィニティカラムＣ１に送り該カラムＣ１に流すことができるように、弁１３にサンプルリザーバ１１を注入器弁１６を介してカラムＣ１の入口に接続するように命令する。目的タンパク質と他の類似夾雑タンパク質はカラムＣ１内の媒体のリガンドに結合するが、他の夾雑物はカラムＣ１を通過する。これらの夾雑物は出口弁２１を介してリザーバＦ３〜ＦＮのいずれかに送ることができる。サンプル溶液がアフィニティカラムＣ１にロードされたら、ソフトウェアは、リザーバＡ１〜Ａ８、Ｂ１〜Ｂ２のいずれかから洗浄液をカラムに流してカラムから非結合夾雑物を洗い流す。また、材料が失われないように安全予防対策として洗浄液をリザーバＦ３〜ＦＮのいずれかに送ることもできる。アフィニティ媒体から結合タンパク質を解離させるため、リザーバＡ１〜Ａ８、Ｂ１〜Ｂ２の別のリザーバから例えば所定濃度の第二の成分（塩など）を含む緩衝液をカラムＣ１に流して、溶出緩衝液グラジエントでカラムを溶出する必要がある。この溶出緩衝液は、目的タンパク質とアフィニティクロマトグラフィー媒体との結合を壊すことができ、目的タンパク質は溶出緩衝液でカラムＣ１から運び出される。排出された溶出緩衝液は、溶出緩衝液透過後のＵＶ光強度を測定するように構成されたＵＶ検出器１９Ａを通過する。ＵＶ検出器１９Ａは、溶出緩衝液中のＵＶ光吸収材料の量に応じて異なる検出信号を生成し、この信号はコンピューター１４に伝送される。ソフトウェアは検出信号を監視し、信号を処理して２つの信号パラメータ、すなわち現時点での信号レベル及び現時点での信号レベルの変化率（「傾き」）を識別する。信号が「超」閾値信号強度を超え、溶出液中のタンパク質の存在を示したら、ソフトウェアは、溶出した流体がカラムから第一のループＬ１〜Ｌ５に送られるように弁２１を制御する。同時に、タイマーを始動してもよい。ポンプからの流量ｍｌ／分はコンピューター１４で制御可能で既知であるので、コンピューター１４は第一のループＬ１に流入する液体の体積を計算できる。ループＬ１の体積が既知であるので、目的タンパク質を含有する液体の体積が第一のループＬ１の体積を超える場合には、コンピューター１４は目的タンパク質を含有する液体を第一ループＬ１から第二ループ（例えばＬ２）へと切り替えることができる。信号が「未満」閾値信号強度を下回り、溶出体中にタンパク質が存在しないことを示したら、コンピューター１４は弁２９に指示して溶出液をカラムＣ１から廃液溜め２６へと送る。コンピューターは、溶出緩衝液をどのループに入れたか、及びループ内に蓄えられた溶出緩衝液の体積をメモリー４５に格納する。信号強度が再び「超」閾値信号強度を超えると、ソフトウェアは、溶出液がカラムから別のループ（例えばＬ３）に送られるように弁２９を制御し、そのループに溶出液が回収される。これは、信号強度が再び「未満」閾値信号強度を下回り、溶出液中にタンパク質が存在しないことを示すまで継続され、その時点でコンピューターは溶出液をカラムＣ１から廃液溜め２６へと送るように弁２９に指示する。溶出液がループに回収される間、ソフトウェアは、最大吸光度値を記録及び／又は吸光度信号の積分を実行する。吸光度信号の積分は、ループに回収されたタンパク質の総量の指標を与える。所定の体積の溶出緩衝液がアフィニティカラムＣ１を通過し終えるまで、コンピューターは溶出緩衝液をポンプでカラムＣ１内に送り続ける。この段階で、ループＬ１〜Ｌ５の少なくとも１つは、ある体積の溶出した目的タンパク質含有緩衝液を含む。ソフトウェアはメモリーを検査して、ループＬ１〜Ｌ５のどれが吸光度信号の最大積分値又は溶出した緩衝液の最高吸光度値を含んでいるかを決定する。吸光度信号の最大積分値の検査又は最高吸光度値の検査のいずれを選択するかは、ソフトウェア製作者が予めプログラミングすることもできるし、ユーザが選択できるようにしてもよいし、或いはソフトウェアによって記録された値に基づいて選択することもできる。例えば、吸光度信号の積分値がほぼ同じ２つのループが存在する場合、ソフトウェアは、２つのループのどちらが最高吸光度値を有するかを検査してループを選択することができる。このループ（例えばループＬ１）は（目的タンパク質が結合するアフィニティ媒体が選択されているので）目的タンパク質を含むと考えられ、ソフトウェアは、ループＬ１内の溶出した緩衝液の体積が脱塩カラムＣ３に送られるように弁１３、１７、２１及び２９を操作する。また、吸光度信号の最大積分値又は溶出した緩衝液の最高吸光度値を含むループに目的タンパク質が存在せず、別のループ内に存在することが判明した場合には、タンパク質を含有する別のループ内の緩衝液をリザーバの１つに保存してもよい。目的タンパク質を含有すると推定される脱塩した緩衝液は、カラムＣ３からＵＶ検出器１９Ａに排出される。ＵＶ検出器からの信号強度をソフトウェアで上述の通り使用して、脱塩した緩衝液中のタンパク質のピークがいつＵＶ検出器を通過するかを決定し、脱塩した緩衝液の体積を１以上のループに供給する。溶出した緩衝液の選択された体積すべてが脱塩されたら、ソフトウェアは、どのループが吸光度信号の最大積分値又は脱塩した緩衝液の最高吸光度値を含むかを決定し、このループが目的タンパク質を含むものと推定する。このループ（例えばＬ３）内の脱塩した緩衝液の体積は次にイオン交換カラムＣ４に供給される。また、吸光度信号の最大積分値又は溶出した緩衝液の最高吸光度値を含むループ内に目的タンパク質が存在せず、別のループ内に存在することが判明した場合、タンパク質を含有する別のループ内の緩衝液をリザーバの１つに保存してもよい。目的タンパク質を含有するイオン交換した緩衝液は、イオン交換カラムＣ４からＵＶ検出器１９Ａに排出される。ＵＶ検出器１９Ａからの信号強度をソフトウェアで上述の通り使用して、イオン交換した緩衝液中のタンパク質のピークがいつＵＶ検出器１９Ａを通るかを決定し、イオン交換した緩衝液の体積を１以上のループＬ１〜Ｌ２、Ｌ４〜Ｌ５に供給する。ループからの脱塩した緩衝液の体積すべてがイオン交換されたら、ソフトウェアは、どのループが吸光度信号の最大積分値又はイオン交換した緩衝液の最高吸光度値を含むかを決定し、このループ（例えばＬ４）が目的タンパク質を含むものと推定する。次いで、このループ、例えばＬ４内のイオン交換した緩衝液の体積は、ゲルろ過カラムＣ５に供給される。また、吸光度信号の最大積分値又は溶出した緩衝液の最高吸光度値を含むループ内に目的タンパク質が存在せず、別のループ内に存在することが判明した場合、タンパク質を含有する別のループ内の緩衝液をリザーバの１つに保存してもよい。目的タンパク質を含有するろ過した緩衝液は、ゲルろ過カラムＣ５からＵＶ検出器１９Ａに排出される。ＵＶ検出器１９Ａからの信号強度をソフトウェアで上述の通り使用して、ろ過した緩衝液中のタンパク質のピークがいつＵＶ検出器１９Ａを通るかを決定し、ゲルろ過した緩衝液の体積をフラクションコレクター２７に供給し、１種以上のウェル３５でピークを回収する。次いでそれを試験して、正しいタンパク質が精製されたことを確認することができる。ソフトウェアは、カラムからのすべてのピークがどこに蓄えられているかを追跡する。これは、間違ったタンパク質が回収された場合に、別のループから保存ピークを含む流体を使用して精製を再度行うことができるので、有用である。
【００１４】
「Ｘ１超のレベル」及び「Ｙ１未満のレベル」監視機能に加えて、本発明の第一の実施形態に係るデバイス及び方法は、「Ｘ２超の傾き」及び「Ｙ２未満の傾き」監視機能を備える。「Ｘ２超の傾き」監視機能は、ＵＶ検出器で検出される吸光度レベルの増加率がＸ２  ｍＡＵ／分を超えると、ソフトウェアにＵＶ検出器を出た流体を新しいフラクションコレクター容器に転換させる。変化率パラメータは信号の「傾き」と呼ぶことができる。同様に、「Ｙ２未満の傾き」は、ＵＶ検出器で検出される吸光度レベルの減少率がＹ２  ｍＡＵ／分を下回ると、ソフトウェアにＵＶ検出器を出た流体を新しいフラクションコレクター容器に転換させる。ソフトウェアは、２つの監視機能（例えば「Ｘ１超のレベル」と「Ｘ２超の傾き」）を同時に監視できて、しかも両機能を賦活させるための条件が存在する（すなわち、レベルがＸ１を超え、かつ傾きがＸ２を超える）場合だけアクションを起こすことができるように構成される。
【００１５】
以上の監視機能に加えて、本発明の他の実施形態に係るデバイス及び方法は、「ピーク最大値の係数Ｚ１倍（Ｐｅａｋ  Ｍａｘｉｍｕｍ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｚ１）」機能も備えており、Ｚ１は最大ピーク高さの１未満の係数である。例えば、ピークの最大吸光度レベルが２０００ｍＡＵと検出され、Ｚ１が０．５に設定されている場合、監視機能「ピーク最大値の係数０．５倍」は、検出器レベルが１０００ｍＡＵを下回るとアクションを起こす。このアクションは、ループ内の流体保存の停止、及び／又はピーク終了の提示、及び／又は異なる監視機能の開始とすることができる。
【００１６】
以上の監視機能に加えて、本発明の他の実施形態に係るデバイス及び方法は、「谷」及び「安定プラトー」監視機能も備えている。谷は２つの重複ピーク間に形成される（例えば、図Ｂ及び図Ｃ参照）。これは、ソフトウェアでは、検出器信号が特定のレベル（例えばＸ１）よりも大きく、かつ極小が存在（すなわち、検出信号の傾きが下降信号から上昇信号へと変化）するときに起こると定義できる。安定プラトーは図１のＥに示すものである。ソフトウェアでは、これは、検出器信号が所定時間一定値（ある許容変動幅をもつ）にとどまるときに起こると定義される。ソフトウェアは、３以上の監視機能を同時に監視できるように適合化できる。例えば、図１のＢに示すような２つの近接した重複ピークを１つのフラクションに保存し、図１のＣに示すような２つのあまり近接していない重複ピークを２つのフラクションに保存するには、「Ｘ１超のレベル」及び「Ｘ２超の傾き」を監視するようにソフトウェアを構成すればよい。レベル値と傾きがそれぞれＸ１及びＸ２を上回ったら、ソフトウェアはピークの始点を記録し、流体をループへと切り替え、タイマーを始動してループの充填度を測定し、監視機能「ピーク最大値の係数０．５倍」を始動する。これは、コンピューターに最大検出器レベル信号を記録し、信号レベルが最大レベルの０．５倍に下がると追加のアクションを起こさせる。この追加のアクションとしては、「Ｙ１未満のレベル又は谷もしくは安定プラトー」の監視とすることができる。図１のＢに示すように、ピーク間の谷の最低値が第一のピークの最大値の０．５倍を上回る場合には、「ピーク最大値の係数０．５倍」のもとでこのアクションを起こす状況は、両ピークが１つのフラクションとして回収された後でしか起こらない。谷の最低値が第一のピークの最大値の０．５倍を下回る場合には、以下の３つの異なる事象が起こり得る。
ａ）信号レベルが下降し続けて、閾値Ｙ１未満に達する。これは図１のＡに示すような単純なピークに相当する。この場合、ソフトウェアは、現在のループでの流体の回収を停止し、後続の流体を廃液溜めへと送り、「Ｘ１超のレベル」及び「Ｘ２超の傾き」監視コマンドをリセットする。
ｂ）図１のＣに示す重複ピークにみられるように、信号レベルが再び上昇し始める。この場合、ソフトウェアは、現ループでの流体の回収を停止し、後続の流体を新しいループに送り、「Ｘ１超のレベル」及び「Ｘ２超の傾き」監視コマンドをリセットする。
ｃ）信号が一定のままで、図１のＥに示すようなプラトーを示す。この場合、ソフトウェアは、現ループでの流体の回収を停止し、後続の流体を異なるループに送り、（「Ｘ１超のレベル」及び「Ｘ２超の傾き」）又は（「Ｙ１未満のレベル」及び「Ｙ２未満の傾き」）監視を賦活させる。
【００１７】
以上の監視機能に加えて、本発明の他の実施形態に係るデバイス及び方法は、以下の監視機能のいずれか１以上を備えていてもよい。
【００１８】
（「Ｘ１超のレベル」又は「Ｙ１超の傾き」）。これは、検出器信号がレベル条件又は傾き条件のいずれかを満たすときに、ソフトウェアにアクションを起こさせる。
【００１９】
（「Ｙ２未満の傾き」及び「ピーク最大値の係数Ｚ１倍」）。これは、検出器信号変化率がＹ２モニター単位／分（例えばｍＡＵ／分）を下回り、かつレベルが最新のピーク最大値の所定の分率「係数Ｚ１」に低下したときに、ソフトウェアにアクションを起こさせる。
【００２０】
（「Ｘ２未満のレベル」並びに（「Ｙ２未満の傾き」及び「ピーク最大値の係数Ｚ１倍」））。これは、検出器信号がレベルＸ２を下回り、同時に、信号変化率がＹ２モニター単位／分未満を下回り、かつレベルが最新のピーク最大値の所定の分率「係数Ｚ１」に低下したときに、ソフトウェアにアクションを起こさせる。
【００２１】
（「Ｘ２未満のレベル」又は（「Ｙ２未満の傾き」及び「ピーク最大値の係数Ｚ１倍」））。これは、検出器信号がレベルＸ２を下回るとき、或いは信号変化率がＹ２モニター単位／分を下回り、かつレベルが最新のピーク最大値の所定の分率「係数Ｚ１」に低下したときに、ソフトウェアにアクションを起こさせる。
【００２２】
（「安定プラトー」又は（「Ｙ２未満の傾き」及び「ピーク最大値の係数Ｚ１倍」））。これは、検出器信号が所定時間所定の限界値にとどまるとき、或いは信号変化率がＹ２モニター単位／分を下回り、かつレベルが最新のピーク最大値の所定の分率「係数Ｚ１」に低下したときに、ソフトウェアにアクションを起こさせる。
【００２３】
本発明の一実施形態では、ソフトウェアは「セットアップウィザード」を備える。これは、オペレーターがシステムに用いるカラムの名前を入力でき、次いで、画面のようなユーザインターフェース上に表示されるソフトウェアの推奨デフォルト監視機能閾値を選択又はオペレーター独自の閾値を入力できるプログラムである。デフォルト値はコンピューターメモリーに格納され、システム製造業者及び／又はカラム製造業者の入力した値である。デフォルト値は、カラムで試験され、標的タンパク質を十分に分離することが実証された値である。表１は、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）から市販のＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）ゲルろ過カラム、ＨｉＰｒｅｐ（商標）脱塩カラム、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ（商標）、ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｓ（商標）、ＨＩＴｒａｐ  Ｑ（商標）、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ（商標）及びＭｏｎｏ  Ｑ（商標）イオン交換カラム、並びにＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（商標）、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ（商標）、ＧＳＴｒａｐ（商標）アフィニティカラムに関するデフォルト値のリストを示す。かかるデフォルト値を用意しておくことで、オペレーターが独自に最適閾値レベルを見いだすための一連の実験を行う必要がなくなり、オペレーターの時間を大幅に節約できる。オペレーターが独自の閾値での実験を望む場合、ソフトウェアがユーザに推奨デフォルト値を表示できることで、実験を導くベースラインをユーザに与え、最適閾値を見いだすのに必要な実験の数を減らすことができる。
【００２４】
図３ａ〜３ｄは、Ｕｎｉｃｏｒｎ（商標）バージョン５．００ソフトウェアを使用したＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ（商標）での大腸菌溶菌液サンプルの４段階タンパク質精製の一例を示しており、ユーザはセットアップウィザードを用いてカラムの種類を入力し、表１に示すレベル及び傾き監視機能閾値のデフォルト値を用いている。標的タンパク質は（Ｈｉｓ）６タグ融合タンパク質とした。使用したカラムは次の通りであった。アフィニティ：ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰ  ５ｍｌ、脱塩：ＨｉＰｒｅｐ  ２６／１０Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ、イオン交換：ＲＥＳＯＵＲＣＥ  Ｑ  ６ｍｌ、ゲルろ過：ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅ。ソフトウェアは次の監視機能：（「Ｘ１超のレベル」及び「Ｘ２超の傾き」）、（「Ｙ１未満のレベル」又は「谷」もしくは「安定プラトー」）、並びに「ピーク最大値の係数Ｚ１倍」としてアフィニティカラムでは係数（Ｚ１）０．２、イオン交換カラム及び脱塩カラムでは０．５を使用した。
【００２５】
図３ａ〜３ｄでは、ＵＶ検出器からの信号ＵＶ及び導電率検出器からの信号Ｃを、検出器を通過する流体のｍｌに対してプロットした。図では、ピーク開始をＳで、ピーク終了をＥで示す。サンプルはアフィニティカラムにかけ、アフィニティピークＡ（図３ｂに詳細を示す）をまずループに回収した後、脱塩カラムにかける。脱塩カラムから溶出したピークＤ（図３ｂに詳細を示す）をループに回収した後、イオン交換カラムにかける。イオン交換カラムから溶出したピークＩ（図３ｃに詳細を示す）をループに回収した後、ゲルろ過カラムにかける。ゲルろ過カラムからのピーク溶出Ｇ（図３ｄに詳細を示す）をフラクションコレクター内のウェルＡ１〜Ａ７に回収する。
【００２６】
Ｕｎｉｃｏｒｎ（商標）バージョン５．００ソフトウェアを実行するコンピューターを用いてＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ（商標）ユニットで１種類のタンパク質を精製するシステムの一例によって本発明を例示してきたが、同一のコンピューター及びＵｎｉｃｏｒｎ（商標）バージョン５．００ソフトウェアを使用して、複数のＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ（商標）ユニットを同時に制御し、各ＡｋｔａＸｐｒｅｓｓ（商標）ユニットで２種類以上のタンパク質を精製することも想定される。
【００２７】
以上の実施形態は本発明の例示を目的としたものであり、特許請求の範囲に記載された保護範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】クロマトグラフィーから溶出されるタンパク質について考えられる検出器信号ピーク形状の例を示す図。
【図２】本発明のクロマトグラフィー装置の第一の実施形態の概略図。
【図３ａ】本発明の方法を用いたタンパク質含有サンプルの溶出結果を示す図。
【図３ｂ】本発明の方法を用いたタンパク質含有サンプルの溶出結果を示す図。
【図３ｃ】本発明の方法を用いたタンパク質含有サンプルの溶出結果を示す図。
【図３ｄ】本発明の方法を用いたタンパク質含有サンプルの溶出結果を示す図。
【図４】一群のクロマトグラフィーカラムに関するデフォルトパラメータ値を示す表。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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