(57)【要約】ウイルスベクターおよびこのようなベクターを作製する方法が記載される。このようなベクターは、新生物細胞を優先的に死滅させるが、正常細胞は死滅させない。好ましいベクターは、Ｅ１Ａ領域および／またはＥ４領域における内因性プロモーターが、腫瘍特異的プロモーター（好ましくは、Ｅ２Ｆ応答性である）で置換されたアデノウイルスである。本発明は、アデノウイルスベクターと、そのベクターの作製方法と使用方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、改良したアデノウイルスベクターに関連し、そのベクターは、Ｅ１Ａ領域および／またはＥ４領域のプロモーター中に変異と置換を含み、そのプロモーターは、実質的な、腫瘍細胞に特異的な腫瘍崩壊性の活性を与える。
2007522797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス遺伝子の発現を制御する、Ｅ２Ｆ応答性転写ヌクレオチド調節部位を含む、ウイルスベクター。
【請求項２】
前記ウイルス遺伝子は、最初期遺伝子である、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項３】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスである、請求項２に記載のウイルスベクター。
【請求項４】
前記転写ヌクレオチド調節部位は、プロモーターである、請求項３に記載のウイルスベクター。
【請求項５】
前記Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、内在性のアデノウイルスＥ１ａプロモーターと置換されている、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項６】
前記Ｅ２Ｆ応答性プロモーターは、内在性のアデノウイルスＥ４プロモーターと置換されている、請求項４に記載のウイルスベクター。
【請求項７】
Ｓｐ１、ＡＴＦ、ＮＦ１、およびＮＦＩＩＩ／Ｏｃｔ−１を含む、ウイルスの複製を実質的に容易にするヌクレオチド調節部位を、前記ウイルスベクターがさらに含む、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
ウイルス遺伝子の発現を制御するウイルス転写ヌクレオチド調節部位を含む、ウイルスベクターであって、ここで該部位は、Ｅ２Ｆ応答性転写ヌクレオチド調節部位の挿入によって不活性化され、その結果該Ｅ２Ｆ応答性転写ヌクレオチド調節部位は、ウイルス遺伝子の発現を制御する、ウイルスベクター。
【請求項９】
前記ウイルス遺伝子は、最初期遺伝子である、請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスである、請求項９に記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
前記不活性化転写ヌクレオチド調節部位は、プロモーターである、請求項１０に記載のウイルスベクター。
【請求項１２】
前記不活性化転写ヌクレオチド調節部位は、内在性アデノウイルスＥ１ａプロモーターである、請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１３】
前記不活性化転写ヌクレオチド調節部位は、内在性アデノウイルスＥ４プロモーターである、請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１４】
前記不活性化転写ヌクレオチド調節部位は、内在性アデノウイルスＥ１ａプロモーターおよびＥ４プロモーターの両方を含む、請求項１１に記載のウイルスベクター。
【請求項１５】
Ｅ２Ｆ応答性である前記転写ヌクレオチド配列は、ヒトＥ２Ｆ−１である、請求項１または請求項８に記載のウイルスベクター。
【請求項１６】
腫瘍細胞および正常細胞の集団において、癌細胞を死滅させて、正常細胞は実質的に死滅させないため方法であって、以下：
感染する条件の下、
（１）請求項１または請求項８に記載のウイルスベクター、と（２）該癌細胞および正常細胞を含む細胞集団、とを接触する工程、ならびに前記ウイルスが該細胞集団に感染するために充分な時間を与える工程、を包含する、方法。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであって、さらに異種遺伝子を含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項１８】
前記異種遺伝子は、前記ウイルスベクターの複製期の間における後期に発現されるアデノウイルスゲノムの領域に挿入される、請求項１７に記載のウイルスベクター。
【請求項１９】
前記異種遺伝子は、前記ウイルスのＥ３ｂ領域に挿入される、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
前記異種遺伝子の発現は、アデノウイルス内在性遺伝子発現機構の制御下にある、請求項１９に記載のウイルスベクター。
【請求項２１】
治療を必要とする患者の癌を治療するための方法であって、該患者に対して請求項２０に記載のウイルスベクターを投与する工程を包含する、方法。
【請求項２２】
前記異種遺伝子は、抗ガン活性を有するタンパク質をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記異種遺伝子は、免疫調節性、プロドラッグ活性化、アポトーシス誘導または走化性からなる生物学的活性を有する群より選択されるタンパク質をコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
アデノウイルスベクターから異種遺伝子を持続的に発現するための方法であって、該方法は、癌細胞と、該アデノウイルスベクターとを接触させる工程を包含し、ここで該アデノウイルスベクターは、該異種遺伝子を該アデノウイルス複製サイクルの間において後期に発現する、方法。
【請求項２５】
前記後期異種遺伝子の発現は、アデノウイルス内在性遺伝子発現機構の制御の下におかれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記後期異種遺伝子の発現が、アデノウイルスのＥ３領域の内在性遺伝子発現機構の制御の下におかれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アデノウイルス初期遺伝子の発現を調節するヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列は、該初期遺伝子の発現を正常に制御する内在性アデノウイルスプロモーターに挿入されるかもしくは置換されたＥ２Ｆ応答性転写ヌクレオチド調節部位を含み、その結果、該内在性アデノウイルスプロモーターは、もはや該アデノウイルス初期遺伝子の発現を制御しない、ヌクレオチド配列。
【請求項２８】
１つより多いウイルスパッケージング配列をさらに含む、請求項１に記載のウイルスベクター。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、請求項２８に記載のウイルスベクター。
【請求項３０】
前記アデノウイルスベクターは、Ｒ１体である、請求項２９に記載のウイルスベクター。
【請求項３１】
前記アデノウイルスベクターは、Ｒ２体である、請求項２９に記載のウイルスベクター。
【請求項３２】
前記アデノウイルスベクターは、Ｒ３体である、請求項２９に記載のウイルスベクター。
【請求項３３】
腫瘍細胞と、請求項２８に記載のウイルスベクターとを接触させる工程を包含する、腫瘍細胞を死滅させるための方法。
【請求項３４】
１つより多いパッケージング配列を含む、ウイルスベクター。
【請求項３５】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、請求項３４に記載のウイルスベクター。
【請求項３６】
腫瘍細胞と、請求項３５に記載のアデノウイルスベクターとを接触させる工程を包含する、腫瘍細胞を死滅させるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、アデノウイルスベクターと、そのベクターの作製方法と使用方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、改良したアデノウイルスベクターに関連し、そのベクターは、Ｅ１Ａ領域および／またはＥ４領域のプロモーター中に変異と置換を含み、そのプロモーターは、実質的な、腫瘍細胞に特異的な腫瘍崩壊性の活性を与える。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
今世紀初頭から、ウイルスは癌を治療するために使われてきた。この取り組みは２重である；第１には、新生物細胞の中で選択的に複製して、新生物細胞を死滅させるが、正常細胞には損傷を与えない腫瘍崩壊性ウイルスを単離または創生することである。研究者は、初め、野生型のウイルスを使用し、この取り組みはいくつかの限られた成功しか得られなかった。腫瘍の崩壊および腫瘍の発育の遅延が、正常組織にはほとんどまたはまったく損傷を与えずに起こった一方、この疾患の過程で、有意な変化はなかった。非特許文献１：Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ９：１２１１−１２１８（１９５６）、非特許文献２：Ｃａｓｓｅｌ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １８：８６３−８６８（１９６５）、非特許文献３：Ｗｅｂｂ，Ｈ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １：１２０６−１２０９（１９６６）を参照。非特許文献４：Ｋｅｎｎｙ，Ｓ  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，ｖｏｌ．８６，ｎｏ．１６，ｐ．１１８５（１９９４）も参照。
【０００３】
さらに最近、野生型ウイルスの使用による制限された効率に関連した疾患の再発のために、研究者は、高投与量で送達し得、かつ正常細胞ではなく新生物細胞の中で複製能のある組換えウイルスの使用に頼っていた。そのようなウイルスは、それら自体、有効な腫瘍崩壊性薬剤であり、さらに、そのウイルスの抗腫瘍活性を促進する導入遺伝子を保有および発現するように操作され得る。この部類のウイルスの例は、ウイルスゲノムのＥ１Ｂ領域に変異を有するアデノウイルスである。特許文献１：米国特許第５，６７７，１７８号と非特許文献５：Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．，Ｄ．Ｈ．Ｋｉｒｎ，Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｈｅｉｓｅ，Ｓ．Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｍｕｎａ，Ｌ．Ｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｎｙｅ，Ａ．Ｓａｍｐｓｏｎ−Ｊｏｈａｎｎｅｓ，Ａ．Ｆａｔｔａｅｙ，ａｎｄ  Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ．１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：３７３−６を参照。
【０００４】
癌を処置するための導入遺伝子有りまたは無しで複製能のあるウイルスの使用と、研究者が用いた、導入遺伝子を発現する複製しないウイルスである２つ目の取り組みとを区別することは重要である。そこで、そのウイルスを、導入遺伝子を送達する単なるビヒクルとして使用する。この導入遺伝子は、直接的または間接的に新生物細胞を死滅させる原因となる。この取り組みは、癌を処置するためにウイルスを使用する有力な取り組みとなり続けている。しかし、それは、限られた成功しか得られず、ウイルスの複製に比べて、効果的ではないようである。それにも関わらず、外来遺伝子が、Ｅ１領域に（非特許文献６：ＭｃＧｒｏｒｙ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：６１４−１７（１９８８）を参照）およびＥ３領域に（非特許文献７：Ｈａｎｋｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７：４３７−４４（１９９０）、および非特許文献８：Ｂｅｔｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−２１（１９９３）を参照）またはＥ１を欠失したベクターのＥ３領域に挿入されてきた。
【０００５】
上記のように、高投与量のウイルス治療に起因する正常細胞への損傷を回避するため、そのウイルスは、そのウイルスの複製を容易にし、よって腫瘍細胞内での腫瘍崩壊性活性を促進するが、そのウイルスが正常細胞に対して基本的に損傷を与えない変異を有することが好ましい。この取り組みは、以下の知見を活用している。その知見とは、正常細胞の増殖を制御している細胞増殖制御機構の多くが新生物細胞では失活または欠失していることと、それらの同じ増殖制御機構がウイルスの複製を容易にするためにウイルスによって失活されることである。したがって、特定の正常細胞の増殖制御機構を不活性化するウイルス遺伝子の欠失もしくは不活性化によって、そのウイルスは正常細胞内での複製を阻止される。しかし、そのようなウイルスは、特定の増殖制御活性を欠失している新生物細胞の中で複製し、新生物細胞を死滅させる。
【０００６】
例えば、正常な分裂細胞は一過的に、増殖制御機構である網膜芽細胞腫の腫瘍サプレッサーを欠失する。その網膜芽細胞腫の腫瘍サプレッサーは、特定の新生物細胞の中で欠失し、その癌細胞の中での無制限な増殖に関連する。網膜芽細胞腫の腫瘍サプレッサー遺伝子（ＲＢ）の遺伝子機能の欠失は、腫瘍の様々な型の病因に関連している。この腫瘍サプレッサー遺伝子産物である、ｐＲＢまたはｐ１０５とよばれる１０５キロダルトンのポリペプチドは、細胞周期調節タンパク質である。そのｐＲＢポリペプチドは、細胞周期のＧ１期で細胞を停止させることにより、細胞増殖を阻害する。そのｐＲＢタンパク質は、アデノウイルスＥ１ａ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、およびパピローマウイルスＥ７を含む、いくつかのＤＮＡウイルス腫瘍タンパク質の主要な標的である。これらのウイルスタンパク質は、ｐＲＢと結合し、ｐＲＢを不活性化する。ｐＲＢを不活性化するその機能は、ウイルスの複製を容易にすることにおいて重要である。そのｐＲＢタンパク質は、Ｅ２Ｆ転写因子と相互作用する。その転写因子は、アデノウイルスＥ２遺伝子といくつかの細胞性遺伝子の発現に関与し、この転写因子の活性を阻害する（非特許文献９：Ｂａｇｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５：１０６３；非特許文献１０：Ｂａｎｄａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４９４；非特許文献１１：Ｃｈｅｌｌａｐｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：４５４９）。
【０００７】
アデノウイルスの腫瘍タンパク質Ｅ１ａは、Ｅ２Ｆの活性化を生じるｐＲＢ／Ｅ２Ｆ複合体を破壊する。しかし、Ｅ２Ｆと複合体をつくるために十分機能的なｐＲＢを欠失している新生物細胞または正常な分裂細胞は、転写活性のあるＥ２Ｆを保有するために、Ｅ１ａのような機能的な腫瘍タンパク質の存在を必要としない。したがって、複製欠損アデノウイルス種は、ＲＢと複合体を形成する能力を欠損し、しかし複製するために不可欠な他の機能は実質的に保有し、ＲＢの機能が欠損している細胞（例えば、正常な分裂している細胞、または実質的に欠失したＲＢ対立遺伝子に関して同型接合または異型接合である細胞、基本的に機能のない変異ＲＢタンパク質をコードするＲＢ対立遺伝子を含む細胞、ＲＢタンパク質の機能の欠失を生じる変異を含む細胞）の中で複製の表現型を示すが、複製しない非新生物細胞において複製の表現型を実質的に示さないと考えられる。そのような複製欠損アデノウイルス種を、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠損アデノウイルスとよぶ。
【０００８】
ある細胞集団（混合した細胞培養物またはヒトの癌患者など）は、新生物細胞と正常な分裂細胞（ともに、ＲＢ機能を欠失している）の亜集団と、正常なＲＢ機能を基本的に発現する分裂していない非新生物細胞の亜集団を包含する。その細胞集団を、感染性の条件（つまり、その細胞集団のアデノウイルス感染に適切な条件、代表的には生理的条件）の下で、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠損アデノウイルスの感染を示す投与量を含む組成物と、接触させ得る。これは結果として、Ｅ１ａ−ＲＢ（−）複製欠損アデノウイルスをその細胞集団に感染させることになる。この感染によって、細胞（ＲＢ機能を欠失した新生物細胞および正常な分裂細胞（ＲＢ−細胞）の亜集団を含む）の有意な画分において、複製の表現型の発現を優先的に生じるが、その感染によって、正常なＲＢ機能を基本的に有する分裂してない新生物細胞の亜集団において、複製の表現型の実質的な発現を生じない。感染したＲＢ（−）細胞（新生物細胞または正常な分裂細胞）における複製の表現型の発現の結果として、細胞変性効果（ＣＰＥ）、細胞溶解、アポトーシスなどによる細胞死を生じ、このことによって、細胞集団からそのようなＲＢ（−）細胞の選択的な除去を生じる。特許文献２：米国特許第５，８０１，０２９号と特許文献３：同第５，９７２，７０６号を参照。
【０００９】
代表的に、ＲＢ（−）新生物細胞を選択的に死滅させることに適するＥ１ａ−ＲＢ（−）複製欠損アデノウイルス構造物は、ＲＢタンパク質と効率的に結合するためのＥ１ａポリペプチドの能力を不活性化する変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を包含する。そのような不活性化変異は、代表的に、Ｅ１ａのＣＲ１ドメイン（Ａｄ５におけるアミノ酸３０−８５；ヌクレオチド６９７位からヌクレオチド７９０位）および／またはＣＲ２ドメイン（Ａｄ５におけるアミノ酸１２０―１３９；ヌクレオチド９２０位からヌクレオチド９６７位）の中で起こる。それらドメインは、ｐ１０５ＲＢタンパク質とｐ１０７タンパク質の結合に関与する。好ましくは、ＣＲ３ドメイン（アミノ酸１５０−１８６に及ぶ）が残存し、トランケートされたｐ２８９Ｒのポリペプチドとして発現され、アデノウイルス初期遺伝子のトランス活性化において機能的である。図１に、Ｅ１ａ−２８９Ｒポリペプチドのドメイン構造を模式的に記す。
【００１０】
アデノウイルスのＥ１ａ領域の中の改変に加え、転写活性化Ｅ２Ｆの制御下、重要な複製機能を有するウイルスを構築することによって、ＲＢ機能を欠失した新生物細胞のウイルス特異的な死滅を促進させることは望ましい。アデノウイルスの複製周期は、２段階を有する：４つの転写ユニットであるＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４が発現する間の初期と、後期転写物が主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から最初に発現されるときのウイルスＤＮＡの合成の開始後に起きる後期である。後期メッセンジャーはウイルスの構造タンパク質のほとんどをコードしている。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４の３つの遺伝子産物は、転写活性化、細胞トランスフォーメーション、ウイルスＤＮＡ複製、および他のウイルス機能を担い、ウイルスの増殖に必要である。非特許文献１２：Ｈａｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：２５０−７を参照。
【００１１】
ウイルス複製に関わるアデノウイルスの領域を、Ｅ２Ｆ応答性転写ユニットを経由してＥ２Ｆの制御下に置くことができる場合、このことにより、正常細胞ではなく、ＲＢ機能を欠損した新生物細胞を選択的に死滅させる、増強したアデノウイルスが与えられる。
【００１２】
背景として、以下の参考文献は、Ｅ４領域を含む、ウイルスの複製に関わる領域とＥ２Ｆ応答性プロモーターにおける改変を伴うアデノウイルスベクターに関連していることを示す。
【００１３】
発明者Ｂｒａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．特許文献４：ＷＯ９８／０９１５６３は、細胞死を誘導するためにアデノウイルスＥ４タンパク質を用いるための方法と組成物を示している。
【００１４】
Ｇａｏ，Ｇ−Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．は、肝臓指向性遺伝子治療について、Ｅ１とＥ４が欠失したアデノウイルスベクターの使用を記載する。非特許文献１３：Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ．１９９６，ｐ．８９３４−８９４３を参照。
【００１５】
特許文献５：ＷＯ９８／４６７７９は、改変されたＥ４領域を含むＥ４ｏｒｆ３を保持している以外は導入遺伝子の発現を可能とする、あるアデノウイルスベクターを記載している。
【００１６】
Ｙｅｈ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．は、２９３細胞の中の最低限のＥ４機能的ユニットの発現を記載し、その細胞は、アデノウイルスのＥ１領域とＥ４領域の２つの効果的なトランス相補を可能にする。非特許文献１４：Ｙｅｈ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ．１９９６．ｐａｇｅｓ  ５５９−５６５を参照。
【００１７】
特許文献６：米国特許第５，８８５，８３３号には、アクチベーター配列、プロモーターモジュール、および構造遺伝子を含む核酸の構築物が記載されている。プロモーターモジュールは、ＣＨＲ領域と、Ｅ２Ｆファミリーのタンパク質と結合する核酸配列を包含する。
【００１８】
非特許文献１５：Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：７７５−８３（１９９５）は、Ｅ１領域および／またはＥ４領域を欠失している組換えアデノウイルスのベクターの増殖のための２９３パッケージング細胞株を記載する。２９３親細胞の中のＥ１Ａ遺伝子産物のトランス活性化およびＥ４遺伝子の過剰発現を避けるために、Ｅ４プロモーターを、細胞性誘導ホルモン遺伝子プロモーターであるマウスアルファインヒビンプロモーターに置換した。
【００１９】
ＫｒｏｕｇｌｉａｋとＧｒａｈａｍは、アデノウイルス５型のＥ１遺伝子、Ｅ４遺伝子、ｐＩＸ遺伝子を発現し、したがって、それら遺伝子の領域それぞれが欠損しているアデノウイルス変異体の複製を相補することができる細胞株の開発について記載している。非特許文献１６：Ｋｒｏｕｇｌｉａｋ，Ｖ．ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．６：ｐ．１５７５−１５８６，１９９５を参照。
【００２０】
Ｆａｎｇ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．非特許文献１７：Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４７９８−８０３（１９９７）は、弱毒化した、複製能のないアデノウイルスベクターについて記載している。そのベクターは、合成したＧＡＬＡ／ＶＰ１６プロモーターと置換されたＥ４プロモーターを有し、そのＥ４プロモーターは、ＧＡＬ４／ＶＰ１６トランスアクチベーターを安定に発現する２９３細胞の中で、アデノウイルスベクターのパッケージングを容易にする。そのウイルスは、そのＥ１領域の欠失により、複製能がなくなった。
【００２１】
特許文献７：米国特許第５，６７０，４８８号に、Ｅ４オープンリーディングフレームのうちの１以上が欠失したアデノウイルスベクターが記載されている。そのベクターは、インビトロでウイルスの複製を促進するために十分なＥ４配列を保持するが、興味あるＤＮＡ配列を発現制御配列に繋げられ、アデノウイルスゲノムの中に挿入されている。
【００２２】
特許文献８：米国特許第５，８８２，８７７号に、アデノウイルスゲノムのＥ１領域、Ｅ２領域、Ｅ３領域、およびＥ４領域と後期遺伝子が欠失し、かつ発現制御配列に作動可能に連結された目的の核酸をさらに含むアデノウイルスベクターが記載されている。
【００２３】
特許文献９：ＷＯ９８／１３５０８に、目的の導入遺伝子に作動可能に連結されたＥ２Ｆ応答性プロモーターを用いて、選択的に悪性腫瘍細胞を標的にすることが記載されている。
【００２４】
Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．は、Ｅ２Ｆ−１遺伝子の転写が、Ｅ２Ｆ−１のプロモーターの中のＥ２Ｆ−ＤＮＡ結合部位によって細胞周期依存性にされることを示す。非特許文献１８：Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４６６０（１９９５）を参照。Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．はまた、ヒトＥ２Ｆ１遺伝子の構造と部分的なゲノム配列を示す。非特許文献１９：Ｇｅｎｅ．１７３：１６３−９（１９９６）を参照。
【００２５】
Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．は、インビボの腫瘍選択的導入遺伝子発現がＥ２Ｆ応答性アデノウイルスベクターに媒介されることを示す。非特許文献２０：Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５−９（１９９６）を参照。
【００２６】
Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．は、Ｅ２Ｆによる転写制御を示す。非特許文献２１：Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：９９−１０８（１９９５）を参照。
【００２７】
Ｈａｌｌｅｎｂｅｃｋ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．は、組織特異的に複製するベクターについて記載している。そのようなベクターの１つが、アデノウイルスである。このアデノウイルスは、ベクターそれ自体から、またはベクターから発現した異種遺伝子産物から、治療の恩恵を与えるために、標的組織の中で、選択的に複製すると述べられている。ベクターそれ自体からの例において、組織特異的な転写制御配列は、ベクターの複製に必須な遺伝子のコード領域に作動可能に連結される。いくつかのコード領域が、Ｅ１ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、およびＥ４を含むことを、特許文献１０：ＷＯ９６／１７０５３と特許文献１１：ＷＯ９６／１７０５３を参照のこと。
【００２８】
特許文献１２：米国特許第５，６９８，４４３号において、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．は、前立腺細胞に特異的な応答性要素の転写制御の下で、Ｅ１Ａ遺伝子、Ｅ１Ｂ遺伝子またはＥ４遺伝子のうちの少なくとも１つを有するアデノウイルスベクターを示す。
【００２９】
ウイルスが、癌を処置するためのもう１つの手段を提供することは明らかである。したがって、新生物細胞の中で選択的に複製し、それを死滅させるウイルスは、癌と闘う医師の蓄積した選択肢（ａｒｓｅｎａｌ）の中でも計り知れない武器になるだろう。
【特許文献１】米国特許第５，６７７，１７８号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８０１，０２９号明細書
【特許文献３】米国特許第５，９７２，７０６号明細書
【特許文献４】国際公開第９８／０９１５６３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９８／４６７７９号パンフレット
【特許文献６】米国特許第５，８８５，８３３号明細書
【特許文献７】米国特許第５，６７０，４８８号明細書
【特許文献８】米国特許第５，８８２，８７７号明細書
【特許文献９】国際公開第９８／１３５０８号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第９６／１７０５３号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第９６／１７０５３号パンフレット
【特許文献１２】米国特許第５，６９８，４４３号明細書
【非特許文献１】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ９：１２１１−１２１８（１９５６）
【非特許文献２】Ｃａｓｓｅｌ，Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  １８：８６３−８６８（１９６５）
【非特許文献３】Ｗｅｂｂ，Ｈ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １：１２０６−１２０９（１９６６）
【非特許文献４】Ｋｅｎｎｙ，Ｓ  ａｎｄ  Ｐａｇａｎｏ，Ｊ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，ｖｏｌ．８６，ｎｏ．１６，ｐ．１１８５（１９９４）
【非特許文献５】Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｊ．Ｒ．，Ｄ．Ｈ．Ｋｉｒｎ，Ａ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｃ．Ｈｅｉｓｅ，Ｓ．Ｈｏｒｎ，Ｍ．Ｍｕｎａ，Ｌ．Ｎｇ，Ｊ．Ａ．Ｎｙｅ，Ａ．Ｓａｍｐｓｏｎ−Ｊｏｈａｎｎｅｓ，Ａ．Ｆａｔｔａｅｙ，ａｎｄ  Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ．１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２７４：３７６−６
【非特許文献６】ＭｃＧｒｏｒｙ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６３：６１４−１７（１９８８）
【非特許文献７】Ｈａｎｋｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７７：４３７−４４（１９９０）
【非特許文献８】Ｂｅｔｔ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−２１（１９９３）
【非特許文献９】Ｂａｇｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６５：１０６３
【非特許文献１０】Ｂａｎｄａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４９４
【非特許文献１１】Ｃｈｅｌｌａｐｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８９：４５４９
【非特許文献１２】Ｈａｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：２５０−７
【非特許文献１３】Ｇａｏ，Ｇ−Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｄｅｃ．１９９６，ｐ．８９３４−８９４３
【非特許文献１４】Ｙｅｈ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊａｎ．１９９６．ｐａｇｅｓ  ５５９−５６５
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：７７５−８３（１９９５）
【非特許文献１６】Ｋｒｏｕｇｌｉｃｋ，Ｖ．ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．６：ｐ．１５７５−１５８６，１９９５
【非特許文献１７】Ｆａｎｇ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４７９８−８０３（１９９７）
【非特許文献１８】Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４６６０（１９９５）
【非特許文献１９】Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ．１７３：１６３−９（１９９６）
【非特許文献２０】Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３：１１４５−９（１９９６）
【非特許文献２１】Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：９９−１０８（１９９５）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
（発明の要旨）
本明細書に記載の本発明は、組換えアデノウイルスベクターならびにこのベクター（好ましくは、複製能のあるアデノウイルスベクター）を構築するための方法および組成物を提供する。複製能のあるアデノウイルスベクターは、最初期遺伝子の発現を制御するアデノウイルスプロモーター領域を少なくとも１つ、好ましくは２つ有する非新生物細胞をほとんど、またはまったく死滅させることなく、実質的かつ選択的に新生物細胞を死滅させるこのアデノウイルスプロモーター領域は、特定の転写ヌクレオチド調節開始部位が取り除かれるかまたは別の方法で不活性化されると同時に、必要とされるかもしくは実質的にウイルスの複製を容易にする部位を保持して、このようなヌクレオチド調節開始部位の除去の代わりになるように改変され、そして、腫瘍細胞特異的転写ユニット、および必要に応じて抗新生物細胞活性を有する異種遺伝子が、欠失したウイルス遺伝子の代わりとなるように改変される。
【００３１】
本発明はさらに、組換えウイルスベクターと上記の方法を提供する。ここで、このアデノウイルスプロモーター領域は、好ましくはＥ１ａおよび／またはＥ４であり、異種遺伝子はウイルス複製サイクルの後期に発現され、その異種遺伝子は、アデノウイルス内在性遺伝子発現機構の制御下におかれる。
【００３２】
もう１つの局面において、特定のＥ１ａプロモーターとＥ４プロモーター転写ヌクレオチド開始部位が除去または別の方法で不活性化され、したがって腫瘍細胞特異的転写ユニットに置換されている、非新生物細胞をほとんど、またはまったく死滅させることなく実質的かつ選択的に癌細胞を死滅させるアデノウイルスベクターを、本発明は提供する。
【００３３】
もう１つの局面において、少なくとも特定のＥ４プロモーター転写ヌクレオチド開始部位を除去または別の方法で不活性化させると同時に、ウイルスの複製を容易にし、特定のＳｐ１、ＡＴＦ、ＮＦ１、ＮＦＩＩＩ／Ｏｃｔ−１結合部位を含み、かつＥ４プロモーターヌクレオチド開始部位の代わりに腫瘍細胞特異的転写ユニットを用いる、非新生物細胞をほとんど、またはまったく死滅させることなく実質的かつ選択的に癌細胞を死滅させるアデノウイルスベクターを、本発明は提供する。
【００３４】
本発明の目的は、Ｅ１ａおよび／Ｅ４プロモーター転写ヌクレオチド開始部位を除去して、結果（腫瘍細胞特異的転写ユニットに置き換った）、上記アデノウイルスベクターについて記述することである。そこでそのようなアデノウイルスベクターはさらに、Ｅ１ａポリペプチドのＲＢタンパク質と有効に結合する能力を不活化させる変異（例えば、欠失、置換、フレームシフト）を示す。
【００３５】
本発明のさらなる特徴は、上記で言及されるＥ１ａおよび／Ｅ４プロモーターヌクレオチド開始配列を腫瘍細胞特異的転写ユニット（ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ−１／−２／−３、Ｇ１サイクリン／ｃｄｋ複合体を含む、ｐＲｂシグナル伝達経路に応答性のユニット）で置き換えることからなる。そのプロモーターはＥ２Ｆ応答性が好ましい。
【００３６】
本発明はまた、本明細書に記載のアデノウイルスベクター単独、または抗癌剤との併用を用いて、疾患、好ましくは、新生物疾患を含む、過剰増殖性の細胞増殖に起因する疾患の予防または処置のための方法を提供する。
【００３７】
本発明のさらにもう一つの特徴は、上記のアデノウイルスベクターを使用して、新生物疾患を処置するための方法である。このアデノウイルス中で、欠失したウイルス遺伝子と置き換わった異種遺伝子は、ウイルス複製サイクルの後期に発現して、アデノウイルスベクターの抗新生物活性を促進する。
【００３８】
本発明の上記局面および上記にない他の局面は、本発明の完全な考察によって明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
(発明の詳細な説明)  
特許および特許出願を含め、本明細書で言及される全ての刊行物は、各個々の刊行物の全てが、完全に参考として援用されていることが具体的にそして個々に示されているかのような程度に、参考として援用される。
【００４０】
さらに、本発明のアデノウイルスベクターの腫瘍崩壊性活性は、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター制御下でウイルス遺伝子の発現に影響を与えるｐＲｂ経路に関わる分子を含む作用機構に基づくが、本発明はその機構によって制限されるとは解釈されるべきでないことが重要である。むしろ、本発明のアデノウイルスベクターの腫瘍崩壊性活性は、その構造的要素（そのｐＲｂ経路を介して腫瘍崩壊性を及ぼすと考えられるが、そうでないかもしれない）の機能であることが、理解される。したがって、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｅ１ａ遺伝子発現またはＥ４遺伝子発現のどちらかを駆動する少なくとも１つのＥ２Ｆ応答性プロモーターを有することによって、腫瘍細胞対正常細胞の選択的死滅を得る。以下のように、好ましいアデノウイルスベクターは、１つがＥ２Ｆ応答性プロモーターを２つ有するベクター、もう１つがＥ１ａプロモーターが置換されたベクター、残りがＥ４プロモーターが置換されたベクターである。
【００４１】
（定義）
別の方法で定義しなければ、本明細書で使われている全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者より一般に理解されているものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書で用いられている名称と以下の実験手順は、周知のものであり、当該分野において一般に使用されている。
【００４２】
組換え核酸法、ポリヌクレオチド合成、そして細菌の培養と形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）については、標準的な技術が用いられる。一般的に、酵素反応と精製工程は、製造者の仕様書に従って行う。その技術と手順は、一般に、当該分野における従来方法と、本明細書全体を通して提供される一般的な様々な参考文献（一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）に従い、行う。本明細書で用いられる名称と、以下の分析化学、有機合成化学、薬剤の処方における実験手順は、周知のものであり、当該分野において一般に使用されている。標準的な技術は、化学合成、化学分析、薬剤の処方と送達、患者への治療に使われている。
【００４３】
語句「内在性遺伝子発現機構」とは、遺伝子発現を担う内在性ウイルス要素（例として、プロモーター、エンハンサー、選択的スプライシング部位、選択的翻訳開始部位、ポリアデニル化シグナルなどを包含するヌクレオチド配列が挙げられる）に言及する。
【００４４】
当業者はまた、本発明のＥ１Ａおよび／またはＥ４シャトルベクターを産生するために本発明のアデノウイルスの遺伝的操作を容易にする刊行物を認識する。そのような刊行物として、Ｈｉｔｔ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．の、Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ；Ｊ．Ｃｅｌｉｓ（Ｅｄ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９６）；Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖａｃｃｉｎｅｓ、Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ．Ｒ．Ｗ．Ｅｌｌｉｓ（ｅｄ）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ．Ｐｐ．３６３−３９０；およびＧｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｃ，Ｌ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（ｅｄｓ）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．ｐｐ１０９−１２８，１９９１の研究を参照。これら論文に記述の材料と方法は以下に用いられるかまたは用いることができた。
【００４５】
本発明の選択的な具体的な実施形態を表す慣用表現の中で、しばしば具体的に示されていないが、アミノ末端とカルボキシ末端の基は、別段特定されなければ、生理的ｐＨ値でとる形態で存在すると理解される。本明細書で記述されているアミノ酸残基は、「Ｌ」異性体として存在することが望ましい。従来の２０個のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、ａ，ａ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ（分布の）アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸や他の従来型でないアミノ酸などの非天然のアミノ酸もまた、望ましい機能特性を本発明のポリペプチドが保持している限りは、本発明のポリペプチドの適切な成分であり得る。示されたペプチドに関して、それぞれのコードされた残基は、適切であれば、３文字表示として表記され、その表記は、従来のアミノ酸の普通の名称に対応し、標準的なポリペプチドの名称と一致している（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９）に記述され、３７  ＣＦＲ  §１．８２２（ｂ）（２）で採用されている）。
【００４６】
この開示をとおして使用している場合、以下の用語は、別途示されなければ、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００４７】
「アデノウイルスの転写における核酸の制御部位」配列に適用される「不活性化」という用語は、変異により機能がない配列にするという意味で、その配列の全部または一部を欠失する、またはアデノウイルスの転写における核酸の配列に他の配列を挿入し、その結果、機能がない配列にするという意味も含む。
【００４８】
本明細書で言及される“アデノウイルス”という用語は、ヒトから単離された４７を超えるサブタイプを示し、他の動物や鳥から単離されたサブタイプもヒトと同じくらい多い。Ｓｔｒａｕｓｓ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ”，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，ｅｄ．，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．４５１−５９６（１９８４）を参照。その用語は、好ましくは２つのヒト血清型である、Ａｄ２とＡｄ５に適用する。
【００４９】
本明細書で言及されている「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのどちらか、またはどちらかの型のヌクレオチドの改変体）の重合体を意味する。この用語は、ＤＮＡの一本鎖と二本鎖を含む。
【００５０】
本明細書で言及されている「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する、および改変されたヌクレオチドが、自然発生的および非自然発生的なオリゴヌクレオチド重合により、互いに結合することを含む。オリゴヌクレオチドは、２００塩基以下の長さのポリヌクレオチドの部分集合である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば、プローブに関しては通常、一本鎖である；、しかし例えば、遺伝子の変異体の構築における使用に関しては、オリゴヌクレオチドは二本鎖として存在してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖のどちらかであり得る。
【００５１】
本明細書で使われる「標識」または「標識された」という用語は、検出可能なマーカーの取り込みを言及する。例えば、放射性標識されたアミノ酸の取り込み、あるいは標識されたアビジン（例えば、視覚的または比色分析法により検出され得る、蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチン化部分の、ポリペプチドへの付加による。標識したポリペプチドと糖タンパク質を検出する様々な方法が、当該分野において公知であり、使用され得る。
【００５２】
本発明のアデノウイルスの死滅の選択性に適用される語句「腫瘍細胞特異的」は、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターに作動可能に連結されるウイルス遺伝子の発現によって死滅させられる腫瘍細胞を意味する。Ｅ２Ｆが正常細胞、特に正常な分裂細胞によって発現されることを考えると、本発明のアデノウイルスは、正常な分裂細胞も死滅させるとしても、腫瘍細胞よりその度合いは少ないことが予測される。
【００５３】
本明細書で言及されている「配列相同性」という用語は、２つの核酸配列間で塩基がマッチする割合、または２つのアミノ酸配列間でアミノ酸がマッチする割合を記述する。配列相同性が、例えば５０％の百分率として表されているとき、その百分率は、いくつかの他の配列と比較されている配列の長さに対してマッチする割合を意味する。ギャップ（２つの配列のどちらにもある）は、マッチを最大限にするために許容される；１５塩基以下のギャップの長さが、通常使われ、６塩基以下が好ましく、２塩基以下がより望ましい。
【００５４】
本明細書で使われる「に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が、あるポリヌクレオチド参照配列全部または一部に相同性がある（すなわち、同一であって、厳密に進化的な関連はない）か、またはあるポリペプチド配列が、ある参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。それと対比して、「に相補的である」という用語は、相補的な配列が、ある参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部と相同性があるという意味するために本明細書で使われ、例として、「ＴＡＴＡＣ」というヌクレオチド配列は、「ＴＡＴＡＣ」という参照配列に対応しており、「ＧＴＡＴＡ」という参照配列と相補的である。
【００５５】
以下の用語は、２以上のポリヌクレオチド間の配列関係を記述するために使用される：「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」、「実質的な同一性」。「参照配列」は、配列の比較のための基本として使用される、定義された配列である；例えば、配列表にある全長のｃＤＮＡまたは遺伝子配列の断片が、完全長のｃＤＮＡまたは遺伝子配列を構成するように、参照配列は、より大きな配列の部分集合であり得る。一般的に、参照配列は少なくとも２０ヌクレオチドの長さがあり、しばしば、少なくとも２５ヌクレオチドの長さをいい、多くの場合、少なくとも５０ヌクレオチドの長さがある。２つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似している配列（例えば、完全長のポリヌクレオチド配列の一部）を含み得、（２）さらにこの２つのポリヌクレオチド間で相違する配列を含み得るので、２（以上）のポリヌクレオチド間での比較配列は、代表的には、配列類似性の局所的な領域を同定および比較するための「比較ウインドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって実行される。本明細書で用いられ得る「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列が少なくとも２０の連続したヌクレオチドの参照配列と比較され得、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部が、２配列の最適なアラインメンとの参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０％以下の付加または欠失（言い換えると、ギャップ）を含み得る、少なくとも２０の連続したヌクレオチド位置の概念的な断片を言及している。比較ウインドウに整列させるための最適な配列アラインメントは、以下によって導かれ得る。Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎの局所的な相同性アルゴリズム（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、および、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、および、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎの類似性に検索（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４、および、これらのアルゴリズム（ｔｈｅ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ処理による実行、または、検討、および様々な方法によって行われる最も良いアラインメント（つまり比較ウインドウにより相同性の百分率が最も高いという結果になる）を選択する。「配列同一性」という用語は、比較ウインドウにわたって２つのポリヌクレオチド配列が同一であること（つまり、１ヌクレオチド毎を基に）を意味する。「配列同一性の百分率」という用語は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較し、それは、同一の核酸塩基（つまり、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が両配列において存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、比較ウインドウ（つまり、ウインドウの大きさ）おける位置の全数でマッチした位置の数を���り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得ることによって算出する。この中で使われる「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を意味する。ここで少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウインドウにわたって、しばしば少なくとも２５〜５０個のヌクレオチド位置の比較ウインドウにわたって参照配列と比較した場合、そのポリヌクレオチドは、少なくとも８５％の配列同一性をもち、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性を有し、より通常には、少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を包含し、ここで配列同一性の百分率は、比較ウインドウにわたって、参照配列の２０％以下占める欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と、参照配列とを比較することによって算出される。参照配列は、より大きな配列の部分集合であり得る。
【００５６】
本発明の好ましい実施形態は、ヒトＥ２Ｆプロモーターの組み込みであるが、「実質的な同一性」であるプロモーターが、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターの定義内に入ることを意味することに注意することは重要である。
【００５７】
本明細書で用いる「実質的に純粋」は、ある目的の種が、優勢に存在する種である（つまり、モル濃度で、この種が、その組成物の中のいかなる他の個々の種よりも大量にある）ことを意味し、好ましくは実質的に精製された画分は、目的の種が存在する全ての高分子量種の中で（モル濃度で）少なくとも約５０％を構成する組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、その組成物中に存在する全ての高分子種の８０％より多く、さらに好ましくは、約８５％、９０％、９５％、そして９９％より多くを構成する。もっとも好ましくは、その目的の種は、本質的に均一になる（この組成物が、単一の高分子種から本質的になる）まで精製される（従来の検出法で、その組成物中で夾雑する種を検出できない）。
【００５８】
本明細書で使われている「ポリペプチド断片」または「ペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端が欠失しているが、残されたアミノ酸配列が、例えば、完全長のｃＤＮＡ配列から推測される、天然に存在する配列の中の対応する位置と同一である。断片は、代表的には、８〜１０アミノ酸の長さであり、好ましくは、少なくとも１０〜２０アミノ酸の長さであり、さらに好ましくは、２０〜７０アミノ酸の長さである。
【００５９】
語句「ｐＲｂ経路」または「ｐＲｂシグナル伝達経路」は、ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ−１／―２／−３、Ｇ１サイクリン／ｃｄｋ複合体を含むｐＲｂ活性に影響を与える分子を、少なくとも一部、意味する。現在既知でない分子も、この定義内に入ると認識される。これらの分子は、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターをとおして転写のレベルにおいて少なくとも一部、その生物学的な効果を媒介する。
【００６０】
本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（ｅｄ．Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．，１９８５）、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（これらは、本明細書中に参考として援用される）により例示されるように、当該分野において従来の使用法にしたがって使われる。
【００６１】
遺伝子操作によってクローン化された遺伝子からのタンパク質産物は、周知である。例えば、米国特許第４，７６１，３７１号（Ｂｅｌｌら）の第６欄の３行から第９欄の６５行までを参照。以下の考察は、結果的にこの分野の概要として意図され、当該分野の完全な技術水準を反映する意図はない。
【００６２】
本開示を考慮すると、化学合成、適切な細胞または細胞株培養物からのｍＲＮＡの逆転写産物のスクリーニング、適切な細胞からのゲノムライブラリーのスクリーニング、またはこれらの手順の組み合わせ（以下に図示する）によって、タンパク質をコードするＤＮＡは、本発明のＥ１Ａおよび／またはＥ４アデノウイルス構築物に挿入され得る。例えば、本発明の１つの実施形態は、プロドラッグ活性酵素をコードする遺伝子（ここでそのような遺伝子は、本発明のアデノウイルスの、複製能に影響を与えない領域に組み込まれる）の発現である。ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのスクリーニングは、既知の遺伝子配列情報から生成されたオリゴヌクレオチドプローブで実行され得る。プローブは、検出可能な基で標識され得る。
【００６３】
代案として、遺伝子配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順によって回収し得る。米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓら）と同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）を参照。
【００６４】
ベクターは、複製可能なＤＮＡ構造であり、望ましいタンパク質をコードするＤＮＡを増幅し、そして／またはこのタンパク質をコードするＤＮＡを発現するために使用される。発現ベクターは、複製可能なＤＮＡ構築物であり、この構築物中で、目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適切な宿主の中でタンパク質の発現をもたらし得る適切な制御配列に作動可能に連結される。そのような制御配列の必要性は、選択した宿主と選択した形質転換法に依存して、変わる。一般的に、制御配列は、転写プロモーター、転写を制御する任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、転写と翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。増幅ベクターは、発現制御ドメインを必要としない。必要とされる全ては、宿主の中で複製する能力（この能力は、通常、複製起点によって付与される）および形質転換株の認識を容易にする選択遺伝子である。
【００６５】
ＤＮＡ領域は、それらが互いに機能的に関連しているときに、作動可能に連結される。例えば：プロモーターは、コード配列の転写を制御する場合、その配列に作動可能に連結される；リボソーム結合部位は、翻訳を可能にする位置にある場合、コード配列に作動可能に連結される。一般的に、作動可能に連結されるとは、近接していることを意味し、リーダー配列の場合は、近接して、かつリーディングフレーム内にあることを意味する。内在性のアデノウイルスのＥ１ａ領域および／またはＥ４領域のプロモーター転写ヌクレオチド制御開始部位が除去された場合において、本発明の好ましい実施形態のプロモーターは、腫瘍細胞特異的プロモーターと置換されている。その腫瘍細胞特異的プロモーターは、直接的または間接的に、タンパク質ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ−１／―２／―３、Ｇ１サイクリン／ｃｄｋ複合体を含むｐＲｂシグナル伝達経路における分子に応答性であるものであり、好ましくは、そのプロモーターは、Ｅ２Ｆ応答性であり、より好ましくは、そのプロモーターは、ヒトＥ２Ｆ−１である。
【００６６】
ｐＲｂシグナル伝達経路における分子に応答性であるとは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターの制御下で、ウイルスの遺伝子の発現によって引き起こされる腫瘍細胞の死滅を意味する。本発明で使用するために適切な宿主細胞としては、原核生物、酵母細胞、または
高等真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、Ｅｓｃｈｅｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢａｃｉｌｌｉ）が挙げられる。高等真核生物細胞としては、以下に示すように、哺乳動物起源の樹立細胞株が挙げられる。例示的な宿主細胞は、ＤＨ５ａ、Ｅｓｃｈｅｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ番号３１，４４６）が挙げられる。
【００６７】
多細胞生物由来の細胞の培養物は、組換えタンパク質合成にとって好ましい宿主である。原則的に、脊椎動物由来の培養物であっても無脊椎動物からの培養物であっても、任意の高等真核生物細胞の培養物が機能し得る。しかし、哺乳動物細胞が好ましい。細胞培養におけるそのような細胞の増殖は、慣用的な手順になっている。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）を参照。有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＦＬ５．１２細胞株、ＷＩ１３８細胞株、ＢＨＫ細胞株、ＣＯＳ−７細胞株、ＣＶ細胞株、およびＭＤＣＫ細胞株である。そのような細胞に対する発現ベクターは普通、複製起点、発現される遺伝子から上流に位置するプロモーター、これとともにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位（イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いる場合）、ポリアデニル化部位、および転写終結配列を（必要な場合）含む。
【００６８】
本明細書で使われている「複製欠損ウイルス」という用語は、ウイルス複製の表現型の発現を支持する所定の細胞集団（例えば、ｐＲｂシグナル伝達経路における分子に応答性の腫瘍細胞）において、細胞の増殖を優先的に阻害するか、細胞溶解を引き起こすか、またはアポトーシスを誘導し（まとめて死滅と考えられる）、かつ複製も形質転換もしていない細胞では、細胞増殖を阻害することも、細胞溶解を引き起こすことも、アポトーシスを誘導することも実質的にできないウイルスをいう。
【００６９】
「ＲＢの機能」という用語は、ＲＢ遺伝子にコードされているポリペプチドの基本的に標準な（つまり、組織学的に同じ型の非新生物細胞に対する）レベルを有する性質に言及する。ここでＲＢポリペプチドは、野生型アデノウイルス２型または５型のＥ１ａタンパク質に結合できる。例えば、ＲＢの不活性（つまり、変異）体の産生または、ｐＲＢポリペプチド発現の実質的な減少もしくは完全な喪失、またはｐＲｂレベルをもたらすｐＲｂ経路に存在する分枝の内の１以上の改変などによって、ＲＢの機能が失われ得る。代わりに、「ＲＢの機能」は、発現する時期と発現するタンパク質量の点から、Ｅ２Ｆ応答性のｐＲｂ経路感受性プロモーターの制御の下にある遺伝子の標準的な転写活性に言及する。
【００７０】
ＲＢの機能は、野生型ＲＢタンパク質をコードするＲＢ対立遺伝子を含む新生物細胞内では実質的に存在しない。例えば、細胞下の異常なプロセッシングもしくはＲＢの局在化に起因する変異、またはｐＲＢ経路にある分子のような、ＲＢ座の外側の遺伝的変化は、ＲＢの機能の欠失に起因する。
【００７１】
「複製の表現型」という用語は、複製欠損アデノウイルスのようなウイルスに感染した細胞が示す、１以上の、以下のような表現型の特徴に言及する：（１）キャプシドタンパク質のような後期遺伝子産物、または後期発現プロフィールを示す異種遺伝子、またはウイルスの後期遺伝子プロモーターから開始されるＲＮＡ転写産物の実質的な発現、（２）ウイルスゲノムの複製、または複製中間体の形成、（３）ウイルスのキャプシドの集合、またはパッケージされたウイルス粒子、（４）感染した細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現、（５）ウイルスの溶解周期の完了、および（６）機能的な新生物タンパク質をコードする、野生型の複製能のあるＤＮＡウイルスに感染した非新生物細胞における、代表的にＲＢ機能の抑止に付随する、他の表現型の変化。複製の表現型は、上記表現型の特徴を少なくとも１つ含み、好ましくは、その表現型の特徴の１つより多くを含む。
【００７２】
「抗新生物の複製欠損ウイルス」という用語は、その細胞の死滅は、同じ組織学的細胞型の、複製しない新生物でない、ウイルスに感染した細胞と比較して、ウイルスに感染した新生物細胞の溶解またはアポトーシスのいずれにせよ、優先的な細胞の死滅によって、ヒトにおける新生物の発生または進行を阻害する機能的特性を有する組換えウイルスに言及するために使用される。
【００７３】
本明細書で使用される「新生物細胞」と「新形成」は、相対的に自立的成長を示し、よって細胞増殖の制御の重大な欠失を特徴とする、異常な成長の表現型を示す細胞に言及する。新生物細胞は、活発に複製しているか、または一時的に複製しない休止状態（Ｇ１またはＧ０）の中にあり得る細胞を含む；同様に、新生物細胞は、十分に分化した表現型、ほとんど分化していない表現型の細胞、または両方の型の細胞の混合物を含む。したがって、全ての新生物細胞が、必ずしも、所定の時点で複製している細胞であるわけではない。新生物細胞として定義されるひとまとまりのものは、良性新生物の細胞と悪性（または明白な）新生物の細胞からなる。率直に、新生物細胞はしばしば、腫瘍細胞または癌細胞として言及され、代表的に、組織学的に内胚葉もしくは外肺葉が起源の細胞に由来する場合に癌腫、中胚葉に由来する細胞型に起源があるものが肉腫といわれる。
【００７４】
本明細書で使われる「生理学的条件（生理的条件）」とは、完全な哺乳動物細胞または生きている哺乳動物の組織空間もしくは器官における条件に実質的に類似したイオン強度、ｐＨ、温度を有する水性の環境をいう。代表的には、生理的条件は、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（または任意にＫＣｌ）、ｐＨ６．５〜８．１、約２０〜４５℃の温度を有する水溶液を含む。一般的に、生理的条件は、生物学的高分子が分子間会合するために適切な結合条件である。例えば、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、３７℃の生理的条件が一般的に適切である。
【００７５】
（発明の実施形態）
アデノウイルスのＥ１ａとＥ４領域は、ヒトの細胞に効率的、増殖的に感染するために必須である。Ｅ１ａ遺伝子は、増殖的な感染における転写される、最初のウイルス遺伝子である。そしてその転写産物は、いかなる他のウイルス遺伝子産物の作用にも依存しない。しかし、残っているウイルスの初期遺伝子の転写産物は、Ｅ１ａ遺伝子発現を必要とする。Ｅ１ａプロモーターもまた、Ｅ１ａ遺伝子の発現を制御することに加え、ウイルスＤＮＡの複製開始に必要な部位のみならず、ウイルスゲノムのパッケージングのためのシグナルを組み込む。Ｓｃｈｍｉｄ，Ｓ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｐ．ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９９：ｐａｇｅｓ６７−８０（１９９５）を参照。
【００７６】
Ｅ１ａアデノウイルスベクターに適用される本発明は、ＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、転写開始部位を含む、基本的なアデノウイルスＥ１ａプロモーターを、腫瘍特異性を示し、好ましくはＥ２Ｆ応答性で、より好ましくはヒトのＥ２Ｆ−１プロモーターである基本的なプロモーターと置換することを含む。したがって、このウイルスは、分子を欠失している（すなわち、このような分子が非機能性である）Ｅ２Ｆ応答性プロモーターからの転写物を活性化する細胞では抑制される。正常な分裂しない細胞、または静止期の細胞は、転写因子Ｅ２ＦがｐＲｂ（すなわち網膜芽細胞腫タンパク質）と結合して、Ｅ２ＦをＥ２Ｆ応答性プロモーターの結合に利用できなくして、このプロモーターを活性化できなくなると、このクラスに入る。それとは対照的に、遊離のＥ２Ｆを含む細胞は、Ｅ２Ｆを基本とする転写を支持する。そのような細胞の例は、ｐＲｂの機能がなく、増殖性のウイルスの感染を可能にする新生物細胞である。
【００７７】
Ｅ１ａプロモーターに位置するエンハンサー配列、パッケージングシグナル、ＤＮＡ複製開始部位を保持することは、ｐＲｂ機能がない新生物細胞内でのアデノウイルス感染が野生型のレベルまで進行することを確証するものである。本質的に、改変されたＥ１ａプロモーターは、実質的な腫瘍特異的死滅を生じる腫瘍特異的転写活性化を与え、正常細胞ではより一層の安全性をさらに与える。
【００７８】
内在性Ｅ１ａプロモーターをＥ２Ｆ応答プロモーターと置換することによって、Ｅ１ａアデノウイルスベクターを作製することにおいて、アデノウイルス５型のゲノムにおけるヌクレオチド３７５の上流にある要素は、そのままに保たれる。ヌクレオチドの番号付けは、Ｓｃｈｍｉｄ，Ｓ．Ｉ．，ａｎｄ  Ｈｅａｒｉｎｇ，Ｐ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１９９：ｐａｇｅｓ  ６７−８０（１９９５）に記載されているとおりである。これは、ウイルスゲノムのパッケージングのために同定された７つ全てのＡの繰り返しモチーフを含む（上記、ＳｃｈｍｉｄとＨｅａｒｉｎｇの図２を参照）。ヌクレオチド３７５〜ヌクレオチド５３６の配列は、ＢｓａＡＩ〜ＢｓｒＢＩ制限酵素開始部位によって欠失されるが、Ｅ１Ａタンパク質の転写開始コドンの２３塩基対上流はまだ保持している。Ｅ２Ｆ応答性プロモーター（好ましくはヒトＥ２Ｆ−１）は、既知の材料と方法を使用して、欠失した内在性のＥ１ａプロモーター配列の代わりに置換されている。Ｅ２Ｆ−１プロモーターは、実施例１に述べられているとおりに単離され得る。
【００７９】
Ｅ４領域は、アデノウイルス感染の後期に起こる事象の多くに関係しており、効率的なウイルスＤＮＡ複製、後期ｍＲＮＡの蓄積とタンパク質合成、スプライシング、および宿主細胞のタンパク質合成の遮断に必要である。Ｅ４転写ユニットの大部分が欠損したアデノウイルスは、複製が大幅に不完全で、総じて、高い力価に達するには、Ｅ４を相補している細胞株で増殖させなければならない。Ｅ４プロモーターは、ウイルスゲノムの右末端の近くに位置し、複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を支配する。多くの調節要素が、最大限の転写活性を仲介するために重要であるこのプロモーターにおいて特徴づけられた。これらの配列に加え、Ｅ４プロモーター領域は、ウイルスＤＮＡ複製に必要な調節配列を含む。Ｅ４プロモーターの描写とこれらの調節配列の位置は、図２と図３でみることができる。
【００８０】
本発明のもう１つの実施形態は、Ｅ４の基本的なプロモーターが腫瘍特異性を示すことが実証されたもの（好ましくは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター、さらに好ましくはヒトＥ２Ｆ−１プロモーター）と置換されたアデノウイルスベクターの作製である。Ｅ４発現を駆動するＥ２Ｆ応答性プロモーターが好ましい理由は、Ｅ１ａプロモーターがＥ２Ｆ応答性プロモーターと置換されたＥ１ａアデノウイルスベクターについて上記に考察したものと同じである。ｐＲｂの腫瘍抑制機能は、Ｅ２Ｆ−１プロモーターなどのようなＥ２Ｆ応答性プロモーターを抑制するその能力と相関する（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．６：９９−１０８；Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ．１９９６．公表された正誤表は、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９６  Ｄｅｃ  ９；１２８８（３）：Ｅ−１，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１２８８：Ｍ１−５．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｗ．Ｒ．，Ｊ．Ｗ．Ｒｏｄｇｅｒｓ，ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９２：１１５４４−８で見られる）。ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターは、徹底的に特徴付けられ、ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ−１／―２／―３、Ｇ１サイクリン／ｃｄｋ複合体、およびＥ１Ａを含むｐＲｂシグナル伝達経路に応答することが示された（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｋ．Ｏｈｔａｎｉ，ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｎｅｖｉｎｓ．１９９４，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１５１４−２５；Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，Ｅ．Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４６６０；Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，Ｊ．Ａ．ＭｃＮｅｉｌ，Ｊ．Ｂ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９６，Ｇｅｎｅ．１７３：１６３−９）。全てでなくても、この制御のほとんどがＥ２Ｆ−１プロモーター内に存在する複数のＥ２Ｆ部位の存在に起因していた。それゆえ、この（これらの）改変を有するウイルスは、完全な（野生型の）ｐＲｂ経路を含む正常な細胞の中で弱毒化されることが予測されるが、ｐＲｂの抑制機能が欠損している細胞の中で正常な感染／複製プロフフィールを示す。この変異ウイルスの正常な感染／複製プロフィールを維持するために、本発明者らは、Ｅ４プロモーターの遠位の末端に逆末端反復配列（ＩＴＲ）を保持した。なぜなら、これはウイルスＤＮＡ複製に必要な制御配列の全てを含むからである（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｌ．ａｎｄ  Ｐ．Ｈｅａｒｉｎｇ．１９９３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６７：３９３１−９；Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ，Ｊｒ．１９８４，Ｃｅｌｌ．３７：３０９−１９；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｅ．Ａ．Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８７５−８６；Ｗｉｄｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８６４−７４）。これにより、このウイルスに感染したｐＲｂ経路欠損腫瘍細胞中で、ウイルスが野生型のレベルに達成しやすくなる。
【００８１】
本発明において、Ｅ４領域を含む本発明のアデノウイルス構築物において、Ｅ４プロモーターは、好ましくはウイルスゲノムの右末端の近くに位置し、そしてそれは複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の転写を支配する：
【００８２】
【表１】
2007522797.tif 000003
多くの調節要素が、転写活性を媒介するこのプローブにおいて特徴づけられた：
【００８３】
【表２】
2007522797.tif 000004
これらの配列に加え、Ｅ４プロモーター領域は、ウイルスのＤＮＡ複製に必要とされる要素を含む（Ｈａｔｆｉｅｌｄ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｅａｒｉｎｇ．１９９３，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６７：３９３１−９；Ｒａｗｌｉｎｓ，Ｄ．Ｒ．，Ｐ．Ｊ．Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ，Ｊｒ．１９８４，Ｃｅｌｌ．３７：３０９−１９；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｐ．Ｊ．，Ｅ．Ａ．Ｏ‘Ｎｅｉｌｌ，Ｒ．Ｊ．Ｗｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８７５−８６；Ｗｉｄｅｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍ．Ｄ．Ｃｈａｌｌｂｅｒｇ，Ｄ．Ｒ．Ｒａｗｌｉｎｓ，ａｎｄ  Ｔ．Ｊ．Ｋｅｌｌｙ．１９８７，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８６４−７４）。Ｅ４プロモーターの描写とこれらの調節配列の位置は、図１と図２で見ることができる。Ｊｏｎｅｓ，Ｃ．，ａｎｄ  Ｋ．Ａ．Ｌｅｅ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：４２９７−３０５（１９９１）も参照。これらの考察を考慮して、Ｅ４プロモーターシャトルを、２つの新規な制限エンドヌクレアーゼ部位：ヌクレオチド３５，５７６にあるＸｈｏＩ部位とヌクレオチド３５，８１５にあるＳｐｅＩ部位を創出することによって設計した（図３参照）。ＸｈｏＩとＳｐｅＩで消化し、ヌクレオチド３５，５８１〜ヌクレオチド３５，８１７を取り除く。これによって、Ｅ４の転写に最大限影響を与えることが示された配列の全てを含む、Ｅ４転写開始部位に対して塩基−２０８〜塩基＋２９を効率的に除去する。とりわけ、これは、プロモーターの活性化に最も重要な効果をもつことが実証されたＥ４Ｆ結合部位の２つの逆反復配列を含む。しかし、ウイルスのＤＮＡ複製にとって重要な３つ全てのＳｐ１結合部位、５つのＡＴＦ結合部位のうちの２つ、ＮＦ１とＮＦＩＩＩ／Ｏｃｔ−１の両方の結合部位は保持されている。除去されたＥ４プロモーター要素の多くは、同様な機能を保持する部位（例えば、転写開始部位とＴＡＴＡボックス）で置換され得るが、Ｅ２Ｆ応答性プロモーター部位をとおして腫瘍細胞特異性を与えられる。
【００８４】
好ましいＥ２Ｆ応答性プロモーターは、ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターである。ｐＲｂ経路に対する応答を媒介するＥ２Ｆ−１プロモーターにおいて重要な調節要素は、インビトロとインビボの両方で位置づけてられている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｋ．Ｏｈｔａｎｉ，ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｎｅｖｉｎｓ．１９９４，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．８：１５１４−２５；Ｎｅｕｍａｎ，Ｅ．，Ｅ．Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｗ．Ｒ．Ｓｅｌｌｅｒｓ，ａｎｄ  Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５：４６６０；Ｐａｒｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｙ．Ｍａｎｏｍｅ，Ｔ．Ｔａｎａｋａ，Ｐ．Ｗｅｎ，Ｄ．Ｗ．Ｋｕｆｅ，Ｗ．Ｇ．Ｋａｅｌｉｎ，Ｊｒ．，ａｎｄ  Ｈ．Ａ．Ｆｉｎｅ．１９９７，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．３：１１４５−９）。したがって、ＳｐｅＩ部位とＸｈｏＩ部位をその中に組み込んだプライマーを用いてＰＣＲを行い、転写開始部位に対して―２１８〜＋５１の塩基対にあるヒトＥ２Ｆ−１プロモーター断片を、本研究者らは単離した。これによって、Ｅ４プロモーターシャトル内に存在する同じ部位を作製し、Ｅ４プロモーターをＥ２Ｆ−１プロモーターに直接的に置換することが可能となる。このベクターの構造の詳細は、実施例に記述した。
【００８５】
本発明の１つの実施形態は、ｐＲｂシグナル伝達経路における要素（すなわち、分子）に対して応答するヌクレオチド転写制御配列で、内在性のヌクレオチド転写制御配列を、高速かつ容易に置換することを可能にする、アデノウイルスＥ１ａおよび／またはＥ４シャトルベクターを記載するものである。ここで、そのような内在性のヌクレオチド転写制御配列は、好ましくは、Ｅ１ａおよび／またはＥ４プロモーター配列であり、上述のｐＲｂシグナル伝達経路における要素としては、ｐＲｂ／ｐ１０７、Ｅ２Ｆ転写因子（例えば、Ｅ２Ｆ−１／Ｅ２Ｆ−２／Ｅ２Ｆ−３）およびＧ１サイクリン／ｃｄｋ複合体が挙げられる。上記のＥ１ａアデノウイルスベクターまたはＥ４アデノウイルスベクターは、インタクトな（つまり、野生型である）ｐＲｂ経路を含む正常な細胞においては弱毒されているが、Ｒｂ経路の機能が欠失している細胞（ここで、この機能としては、ｐＲｂの抑制機能が挙げられる）では、通常の感染プロファイルが提示されるものと予測される。内在性のＥ１ａおよび／またはＥ４の配列が置換された、ｐＲｂシグナル伝達経路における要素に応答性であるヌクレオチド転写制御配列を有するＥ１ＡアデノウイルスベクターまたはＥ４アデノウイルスベクターのいずれもが、Ｅ２Ｆ−１プロモーターにおいて自己調節するＥ２Ｆ部位の存在のために、Ｅ１Ａ−ＣＲ２（保存領域２）ドメインにおける第２の変異を有することが好ましい。これは、Ｅ２Ｆ要素のｐＲｂ媒介性抑制を破壊するＥ１Ａの能力を最小化するのに、望ましい。
【００８６】
上記で言及したように、アデノウイルスの腫瘍性タンパク質（ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅ１ａは、ｐＲＢ／Ｅ２Ｆ複合体を破壊し、その結果、Ｅ２Ｆを放出することで、Ｅ２Ｆを活性化させる。好ましいＥ１ａおよび／またはＥ４アデノウイルスシャトルベクター構築物は、ｐＲｂに結合しかつＥ２Ｆを排除するＥ１ａの領域での変異体である構築物である。したがって、本発明のＥ１ａシャトルベクターおよび／またはＥ４シャトルベクターを作製するために、本発明の方法および組成物を使用するための、適切なＥ１ａ−ＲＢの複製欠損アデノウイルス構築物としては、以下の例が挙げられる、それらに限定されない：（１）効率的なＲＢの結合に必要であるＣＲ１とＣＲ２ドメインを欠失しているが（アミノ酸２〜１５０；ヌクレオチド５６０〜１００９の欠失）、そのＣＲ３ドメインを実質的に保持している、アデノウイルス血清５型ＮＴ  ｄｌ１０１０（Ｗｈｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ５６：６７）、および（２）野生型アデノウイルス中のＥ１ａ領域の全てがコードされているヌクレオチド４４８〜１３４９に及ぶ領域を欠失した欠損型ウイルスゲノムを含む、アデノウイルス血清５型ｄｌ３１２（Ｊｏｎｅｓ  Ｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ  Ｔ（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）７６：３６６５）。Ａｄ５  ＮＴ  ｄｌ１０１０が、好ましいＥ１ａ−ＲＢの複製欠損アデノウイルスであり、Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ博士（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手可能である。
【００８７】
ＲＢ（Ｅ１ａ（−））と結合する能力を欠失している、さらなるＥ１ａ変異体は、Ｅ１ａ遺伝子領域（代表的には、ＣＲ１ドメインおよび／またはＣＲ２ドメイン）に変異を生成し、その変異体Ｅ１ａポリペプチドをｐ１０５またはＲＢの結合フラグメントと水性結合条件で接触させ、そして、ＲＢに特異的に結合しない変異体Ｅ１ａポリペプチドを本発明の用途の適切なＥ１ａ（−）変異体であると同定することによって、当業者により作製され得る。代替的なアッセイは、３００ｋＤａタンパク質および／またはｐ１０７タンパク質あるいはそれらの結合フラグメントと、Ｅ１ａポリペプチドの変異体とを水性結合条件下で接触する工程、ならびに、３００ｋＤａタンパク質および／またはｐ１０７タンパク質に特異的に結合しない変異体Ｅ１ａポリペプチドを、Ｅ１ａおよび／またはＥ４シャトルベクターを作製する本発明の用途にとって適切な候補Ｅ１ａ（−）変異体であると同定する工程を包含する。代替的な結合アッセイは、Ｅｌａ（−）変異体タンパク質が転写因子Ｅ２Ｆとの複合体を形成する能力がないこと（またはＥ１ａタンパク質が存在しないこと）あるいは／または生理条件下で、ＲＢ：Ｅ２Ｆ複合体からＲＢタンパク質を解離させる能力を欠失することを決定する工程を包含する。（Ｃｈｅｌｌａｐｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｃｅｌｌ，Ｊｕｎ１４；６５（６）：１０５３−６１）。
【００８８】
あるいは、Ｅ１ａ依存的転写調節配列などに連結した様々なレポーターポリペプチドのＥ１ａの転写によるトランス活性化の欠失などのような、Ｅ１ａ機能を欠失している変異体を決定するための機能性アッセイが使用される。このような不活性する変異は、代表的に、Ｅ１ａ  ＣＲ１ドメイン（Ａｄ５中のアミノ酸３０〜８５：ヌクレオチド６９７〜７９０位）および／またはＣＲ２ドメイン（Ａｄ５中のアミノ酸１２０〜１３９；ヌクレオチド９２０〜９６７位）で生じ、これらのＣＲ１ドメインおよびＣＲ２ドメインは、ｐ１０５ＲＢタンパク質とｐ１０７タンパク質との結合に関連する。好ましくは、ＣＲ３ドメイン（アミノ酸１５０〜１８６の範囲にある）が残っており、短縮型ｐ２８９Ｒポリペプチドとして発現し、アデノウイルス初期遺伝子のトランス活性化において機能的である。
【００８９】
Ｅ２Ｆ応答性プロモーターであるヒトＥ２Ｆ−１は、Ｅ１ａ内在性プロモーターおよび／またはＥ４内在性プロモーターと置き換わる、好ましいプロモーターであるが、ｐＲｂ経路の要素によって直接的または間接的に活性化される任意のＥ２Ｆ応答性ヌクレオチド配列が、内在性プロモーターを置換するのに十分であることに留意することが重要である。
【００９０】
Ｅ１ａアデノウイルスベクターおよび／またはＥ４アデノウイルスベクターの構築は、特定の転写ヌクレオチド開始部位を除去することを包含するが、除去または保持されるそのような部位の正確な数は、本発明を制限するように解釈されないことに留意することが重要である。本発明を記載する上で意図されることは、内在性のプロモーターの位置において、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターが、腫瘍細胞を死滅させるＥ１ａ遺伝子および／またはＥ４遺伝子を駆動するように機能することである。このプロセスは、Ｅ２Ｆ応答性プロモーターに存在する転写開始部位の数またはタイプに従い依存して変化する。
【００９１】
上記で言及したように、本発明の別の局面は、異種遺伝子を本発明のアデノウイルスベクターに組み込むことである。そのアデノウイルス複製サイクルには、２つの段階があるつまり、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、およびＥ４の４つの転写ユニットが発現される期間である初期、ならびにウイルスのＤＮＡ合成の開始の後におこる後期であって、このとき、後期転写産物が主要後期プロモーター（ＭＬＰ）から主に発現される（Ｈａｌｂｅｒｔ，Ｄ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．５６：２５０−７を参照）。異種遺伝子の発現の好ましい特徴は、その発現がアデノウイルス複製サイクルの後期に起こることである。本発明のアデノウイルスベクターは、ＲＢ機能が実質的に欠如している新生物細胞で複製するので、そのような異種遺伝子は、このような新生物細胞では発現するが、正常細胞では発現しない。したがって、異種遺伝子を伴うこのようなアデノベクターは、抗腫瘍活性を増大させる。この抗腫瘍活性の増大は、部分的には、新生物細胞で複製されるアデノウイルスベクターのためであり、部分的には、アデノウイルス複製の後期の機能としてその異種遺伝子が発現するためである。その結果として、異種遺伝子の後期の発現は、アデノウイルスの感染の新生物細胞特異性に直接的に関連する。
【００９２】
本発明のアデノウイルスベクターの驚くべき局面は、ウイルスのＥ３領域、好ましくはＥ３Ｂ領域に挿入されている異種遺伝子が、感染の後期に発現した遺伝子と同様な発現パターンを示すことであり、すなわち、発現が、ウイルスＤＮＡ複製に依存するか、またはウイルスのＤＮＡ複製の間に起こるということである。したがって、Ｅ３Ｂ領域に挿入されている異種遺伝子を有するそのようなウイルスは、異種遺伝子の発現にとって好ましい実施形態であるが、この後期の発現はまた、主要後期プロモーターなどのような、後期遺伝子発現を調節する内在性アデノウイルス遺伝子発現機構の制御下に、異種遺伝子を置くことによって実現され得る。
【００９３】
本明細書に記載される発明は、アデノウイルスおよびＥ２Ｆ応答性プロモーターの面から記されるが、本発明は、アデノウイルスに限定されてないことに留意することが重要である。実際、このようなウイルスによる選択的な腫瘍細胞の死滅を与える特定の遺伝子の発現を制御するためにＥ２Ｆ応答性プロモーターが組み入れられ得るように、アデノウイルスと類似のライフサイクルを提示するウイルスの事実上全てに対して応用できることを当業者は認識する。
【００９４】
（発明の使用）
上記のように、本発明のアデノウイルスは、ｐＲｂ経路の機能を改変してしまった疾患を処置するために使用され得る。さらに、本発明のアデノウイルス療法は、従来の化学療法のような抗新生物プロトコール、または他のウイルスと併用され得る。米国特許第５，６７７，１７８号を参照のこと。化学療法は、当業者によって周知の方法によって施され、それらの周知の方法としては、全身的に、癌に対して直接注入すること、または適切な徐放性物質を用いるかまたは腫瘍内動脈に灌流させることで癌部位に対して局所化されることによって、施されることが挙げられる。好ましい化学療法薬剤は、シスプラチンであり、好ましい投与量は、処置される癌の特性および慣用的として考慮される他の要因に基づき、当業者によって選択され得る。好ましくは、シスプラチンは、５０〜１２０ｍｇ／ｍ２の投与量で３〜６時間かけて静脈投与される。さらに、８０ｍｇ／ｍ２の投与量で４時間かけて静脈注射することが望ましい。シスプラチンと併用され投与されることが好ましい第二の化学療法薬剤は、５−フルオロウラシルである。好ましい５−フルオロウラシルの投与量は、５日間に亘って連続して１日当たり８００〜１２００ｍｇ／ｍ２である。
【００９５】
本発明のアデノウイルスを使用するアデノウイルス治療は、遺伝子治療などのような、他の抗新生物プロトコールと組み合わせられ得る。米国特許第５，６４８，４７８号を参照。上記のように、本発明における使用のためのアデノウイルス構築物は、特異的な癌細胞死滅を示す。そのような構築物はまた、チミジンリン酸化酵素、シトシン脱アミノ酵素などを含む、プロドラッグ活性化因子遺伝子を有し、それは、適切なプロドラッグの存在下、本発明のＥ１ａアデノウイルスベクターおよび／またはＥ４アデノウイルスベクターの抗新生物効果を促進する。米国特許第５，６３１，２３６号を参照。
【００９６】
本発明のアデノウイルス変異体が、宿主動物でのウイルスの効果を弱める免疫反応を誘発する事象において、アデノウイルス変異体は、ウイルスの効果を最大限にするために、適切な免疫抑制薬剤とともに投与され得る。あるいは、アデノウイルスの外側のコートタンパク質を改変して、免疫原性の低いウイルスを産生することによる種々の方法が存在する。ＰＣＴ／ＵＳ９８／０５０３（アデノウイルスの外側のコートであるヘキソンタンパク質の主要な免疫原性成分が、免疫原性を下げるために遺伝子操作され得ることが示される）を参照のこと。ヘキソンタンパク質には通常見られないアミノ酸の配列を、正常なウイルスのヘキソンタンパク質のエピトープの代わりに使用することによって、キメラヘキソンタンパク質を作製することにより、これを行う。そのようなアデノウイルスの構築物は、野生型のウイルスに比べ、免疫原性が低い。
【００９７】
本発明のもう１つの局面は、抗新生物活性を有する異種遺伝子を、Ｅ１ａシャトルベクターおよび／Ｅ４シャトルベクター、好ましくはそのウイルスのＥ１Ｂ領域およびＥ３領域、さらに好ましくはＥ３Ｂ領域、または異種遺伝子が後期発現パターンを示すウイルスの他の領域に組み込むことである。生物学的に活性なペプチドをコードする、そのような異種遺伝子、またはその断片の例としては、免疫調節性タンパク質、および上記のプロドラッグアクチベーター（つまり、シトシン脱アミノ酵素、チミジンリン酸化酵素、米国特許第５，３５８，８６６号または同第５，６７７，１７８号）をコードするものが挙げられる。前者の例は、インターロイキン２（米国特許第４，７３８，９２７号または同第５，６４１，６６５号）；インターロイキン７（米国特許第４，９６５，１９５号または同第５，３２８，９８８号）；インターロイキン１２（米国特許第５，４５７，０３８号）；腫瘍壊死因子α（米国特許第４，６７７，０６３号または同第５，７７３，５８２号）；インターフェロンガンマ（米国特許第４，７２７，１３８号または同第４，７６２，７９１号）；またはＧＭ−ＣＳＦ（米国特許第５，３９３，８７０号または同第５，３９１，４８５号）が挙げられる。さらなる免疫調節性のタンパク質は、マクロファージ炎症性タンパク質をさらに含み、ＭＩＰ−３（Ｗｅｌｌ，Ｔ．Ｎ．ａｎｄ  Ｐｅｉｔｓｃｈ，ＭＣ．Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ  ｖｏｌ  ６１（５）：ｐａｇｅｓ  ５４５−５０，１９９７）、細胞自殺誘導タンパク質またはアポトーシス誘導タンパク質、ＢＡＤとＢＡＸが挙げられる。Ｙａｎｇ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ８０，ｐａｇｅｓ  ２８５−２９１（１９９５）；およびＳａｎｄｅｅｐ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．９１，ｐａｇｅｓ２３１−２４１（１９９７）を参照。単球走化タンパク質（ＭＣＰ−３アルファ）も使われ得る。異種遺伝子の好ましい実施形態は、正常細胞には毒性がなく、癌に対して毒性があることが好ましいタンパク質をコードする遺伝子に融合されている、細胞膜を横切るタンパク質をコードする遺伝子（ＶＰ２２またはＴＡＴ）からなるキメラ遺伝子である。本発明のアデノウイルスＥ１Ａ変異体構築物の効率を上げるために、それらは、特定の腫瘍細胞の型への促進された向性を示すために改変され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９８／０４９６４に示すように、アデノウイルスの外側のコートにあるタンパク質は、正常細胞に比べ腫瘍細胞でより多く存在する受容体と結合する化学薬剤（好ましくは、ポリペプチド）を提示するために、改変され得る。米国特許第５，７７０，４４２号および米国特許第５，７１２，１３６号も参照。そのポリペプチドは、抗体であり得、好ましくは単鎖抗体である。
【００９８】
（アデノウイルス変異体の精製）
アデノウイルスを、超遠心を使用する塩化セシウムによるバンド形成を含む多くの技術によって、慣用的に精製される。しかし、アデノウイルスを大きなスケールで生成するには、塩化セシウム超遠心により容易に得られるものよりさらに多くの収量を得られる方法が望ましく、その方法は１回以上のクロマトグラフの工程を含む。イオン交換クロマトグラフィーを利用する方法が望ましい。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／２１５０４；およびＨｕｙｇｈｅら  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．６：１４０３−１４１６（１９９６）を参照。
【００９９】
（処方）
アデノウイルス（アデノウイルス変異体を含む）は、患者に対する治療的投与および診断的投与のために処方され得る。治療または予防に使うために、薬理学的に有効な用量のアデノウイルスを含む滅菌組成物を、例えば、新生物状態の処置のために、ヒト患者または獣医学的な非ヒト患者に投与する。一般的に、その組成物は、水性懸濁液中で、約１０１３〜１０１５以上のアデノウイルス粒子を含む。薬剤的に受容可能なキャリアまたは賦形剤が、しばしばそのような滅菌組成物において使われる。様々な水溶液が使用され得る。例えば、水、緩衝化した水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどである。これらの溶液は無菌であり、一般的に所望されるアデノウイルスベクター以外の特定の物質はない。その組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨを調整し緩衝する薬剤、毒性を調整する薬剤など（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど））を含む。アデノウイルスによる細胞への感染を促進する賦形剤が含まれ得る。
【０１００】
本発明のアデノウイルス、またはこのウイルスに含まれるＤＮＡもまた、リポソームまたは免疫リポソームによる送達によって新生物細胞へ送達され得る；そのような送達は、新生物細胞の集団に存在する細胞表面特性（例えば、免疫リポソームのイムノグロブリンに結合する細胞表面タンパク質）に基づき新生物細胞を選択的に標的にする。代表的に、ビリオンを含む水性懸濁液は、リポソームまたは免疫リポソームに包まれる。例えば、アデノウイルスビリオンの懸濁液は、従来の方法により、ミセルの中に包まれて、免疫リポソームが形成され得る（米国特許第５，０４３，１６４号、米国特許第４，９５７，７３５号、米国特許第４，９２５，６６１号；Ｃｏｎｎｏｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ（１９８５）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：５８２；Ｌａｓｉｃ  ＤＤ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５５：２７９；Ｎｏｖｅｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ｅｄ．Ｐｒｅｓｃｏｔｔ  ＬＦ  ａｎｄ  Ｎｉｍｍｏ  ＷＳ：Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：ｐａｇｅ１５８５）。固体の癌細胞に存在する癌細胞抗原（例えば、ＣＡＬＬＡ、ＣＥＡ）に特異的に結合する抗体を含む免疫リポソームは、細胞を標的にビリオンまたはビリオンＤＮＡを向けるために使われ得る。
【０１０１】
本発明のアデノウイルスまたはそのカクテルを含む組成物は、新生物の疾患に対する予防的処置および／または治療的処置のために投与されうる。治療の応用において、組成物は、特定の新生物の疾患が既に発症している患者に対して、治癒するために充分な量またはこの状態とその合併症を少なくても部分的に停止させるのに充分な量で投与される。これを遂行するために充分な量とは、「治療上有効な量」または「有効用量」と定義される。この使用に際し、有効な量は、この状態の重篤度、患者の総合的な状況、および投与経路に依存する。
【０１０２】
予防への応用において、本発明のアデノウイルスまたはそのカクテルを含む組成物は、新生物の疾患の状態に現在置かれていない患者に対して、癌の再発に対する患者の耐性を高め、緩解の時間を長くするために投与される。そのような量は、「予防上有効な量」と定義される。このとき、繰り返すと、正確な量は、患者の健康状態と免疫の総合的なレベルに依存使用する。
【０１０３】
以下に続く実施例は、本発明の具体的な実施形態およびその種々の用途を示す。それらは、例示の目的で示されているに過ぎず、そして本発明を限定するとは解釈されない。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１）
（Ｅ２Ｆ−１Ｅ４アデノウイルスのベクターの構築）
組換えプラスミドｐＡｄ７５−１００は、Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｈｅａｒｉｎｇから入手した。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２においてウイルスゲノムの右末端の方へ７５．９マップユニット（ｍ．ｕ．）にあるＥｃｏＲＩ部位から、１００ｍ．ｕ．（ＢａｍＨＩリンカーは、１００ｍ．ｕ．に位置する）にあるＥｃｏＲＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間に、Ａｄ５ｄｌ３０９断片を含む。このＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩ断片をＬｉｔｍｕｓ２８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に直接サブクローニングし、Ｌ２８：ｐ７５−１００．ｄｌ３０９を生成した。ｄｌ３０９（Ａｄ５のヌクレオチド３０，００５からヌクレオチド３０，７５０)において失われている野生型Ａｄ５Ｅ３の配列は、Ｌ２８：ｐ７５−１００．ｄｌ３０９のＮｏｔＩ〜ＮｄｅＩ断片を、ｐＡＤ５−ＳＮ（米国特許出願第０９／３４７，６０４号（未公開）に記載されている企業内でもっているベクター）に由来する野生型ＮｏｔＩ〜ＮｄｅＩ断片（Ａｄ５ヌクレオチド２９，５１０−ヌクレオチド３１，０８９）と置き換えることにより再構築した。このプラスミドをＬ２８：ｐ７５−１００．ｗｔとした。プロモーターの往復的利用（ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｓｈｕｔｔｌｅ）を発生させるために、わずかに小さいベクターを作製して、変異誘発の鋳型にした。ｐＡＤ７５−１００に由来するＥｃｏＲＶ〜ＢａｍＨＩ断片（Ａｄ５のヌクレオチド３３，７５８からヌクレオチド３３，９３９）をｐＫＳＩＩ＋に直接サブクローニングすることによって、ｐＫＳＩＩ＋：ｐ９４−１００を構築した。ヌクレオチド３５，５７７のＸｈｏＩ部位とヌクレオチド３５，８１６のＳｐｅＩ部位とを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位指向性変異誘発法を用いて作製した。これらの部位を作製するために使用したオリゴヌクレオチドは以下であった：ＸｈｏＩ
【０１０５】
【化１】
2007522797.tif 000005
とその相補鎖、
【０１０６】
【化２】
2007522797.tif 000006
およびＳｐｅＩ
【０１０７】
【化３】
2007522797.tif 000007
とその相補鎖
【０１０８】
【化４】
2007522797.tif 000008
。このベクターはＳｐｅＩ制限酵素部位、ＸｈｏＩ制限酵素部位の両方を持ち、ｐＫＳＩＩ＋：Ｅ４ＰＳＶとした。ｐＫＳＩＩ＋骨格にはＳｐｅＩとＸｈｏＩの両部位が存在するので、ｐＫＳＩＩ＋：Ｅ４ＰＳＶのＥｃｏＲＶ〜ＢａｍＨＩ断片を、ＰｖｕＩＩ部位およびＢａｍＨＩ部位を介してｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ｐＲＳＥＴ：Ｅ４ＰＳＶとした。全てのベクターと点変異は、ＡＢＩ自動シークエンサーの二本鎖配列解析により確認した。
【０１０９】
ヒトＥ２Ｆ−１プロモーターを、ｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１（−２４２）とｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１ΔＥ２Ｆ（−２４２）から、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離した。ｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１（−２４２）は、転写開始部位に対して−２４２位までヒト野生型Ｅ２Ｆ−１プロモーターを含む。ｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１ΔＥ２Ｆ（−２４２）は、Ｅ２Ｆ結合部位のパリンドロームが、両方とも不活性化点変異を含むこと以外は、全て同じ配列を含む。ＰＣＲで使用したプライマーの配列は、以下のとおりであった：ＳｐｅＩ−Ｅ２Ｆ１Ｐ
【０１１０】
【化５】
2007522797.tif 000009
とＸｈｏＩ−Ｅ２Ｆ１Ｐ
【０１１１】
【化６】
2007522797.tif 000010
。鋳型ＤＮＡ１００ｎｇを、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った：最初の変性が９８℃で５分、以下変性が９８℃で１分、アニーリング／プライマー伸長が６８℃で１分を３０サイクル、最後に伸長反応を６８℃で５分。そのＰＣＲ産物をＱｉａｇｅｎのキットで精製し（Ｑｉａｇｅｎ  ｐｕｒｉｆｙ）、ＳｐｅＩとＸｈｏＩで消化し、ゲルで精製し、ＳｐｅＩとＸｈｏＩで消化したｐＲＳＥＴ：Ｅ４ＰＳＶにライゲーションした。これらのプロモーターシャトルベクターをＥ２Ｆ１−Ｅ４ＰＳＶおよびＥ２Ｆ１Δ−Ｅ４ＰＳＶとし、ヒトＥ２Ｆ１プロモーターの転写開始部位に対して−２１８から＋５１までの配列を有する。機能的なウイルスを生成するために使用した最終的なベクターを、Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ＰＳＶとＥ２Ｆ１Δ―Ｅ４ＰＳＶの両ベクターからのＢｓｔＥＩＩ〜ＢａｍＨＩ断片を、上記と同じ制限酵素で消化したＬ２８：ｐ７５−１００．ｄｌ３０９とＬ２８：ｐ７５−１００．ｗｔの両方にサブクローニングすることによって作製した。これらのベクターを、Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ＰＳＶ．３０９、Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ＰＳＶ．ｗｔ、Ｅ２Ｆ１Δ−Ｅ４ＰＳＶ．３０９、Ｅ２Ｆ１Δ−Ｅ４ＰＳＶ．ｗｔとした。全てのベクターを、上で述べたように二本鎖配列解析により確認した。
【０１１２】
（実施例２）
（Ｅ２Ｆ１−Ｅ４アデノウイルスの構築）
１０μｇのＥ２Ｆ１−Ｅ４ＰＳＶ．３０９をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、子牛腸由来リン酸化酵素で処理し、ゲルで精製した。ＥｃｏＲＩで消化した１μｇのｄｌ９２２／４７ＴＰ−ＤＮＡを、Ｅ４領域を駆動する野生型Ｅ２Ｆ−１プロモーターを含む精製した断片約５μｇに、１６℃で一晩ライゲーションした。ライゲーションしたものを標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて２９３細胞にトランスフェクションした。要約すると、ライゲーションしたＤＮＡを、２４μｇの鮭精子由来ＤＮＡと５０μｌの２．５Ｍ塩化カルシウムと混合し、最終体積が５００μｌになるように水で調整した。この溶液を、５００μｌのＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０５）に滴下しながら加えた。２５分間静置後、２枚の６０ｍｍディッシュ上、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）で補充したＤＭＥＭの中で６０〜８０％のコンフルエンシーまで培養した２９３細胞に、生成した沈殿物を滴下しながら加えた。１６時間後、一層の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムとマグネシウムは入ってない）で１回洗浄し、その後、２％ＦＢＳで補充したＤＭＥＭ中の１％のシープラークアガロースからなる５ｍｌの寒天を重層した。プラークを単離するまで３〜４日毎に、３〜４ｍｌの上記寒天をディッシュに重層した。
【０１１３】
（実施例３）
（Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ウイルス増殖とその確認）
初代プラークをパスツールピペットで単離し、細胞変性効果が完結するまで、６ウェルディッシュに２％ＦＢＳで補充した２ｍｌのＤＭＥＭの中で培養した２９３細胞中で増殖させた。ウイルスを含む上清の１０分の１（２００μｌ）をＤＮＡ解析のために取っておき、残りを凍結バイアルに入れ−８０℃で保存した。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎが推奨するとおりＱｉａｇｅｎのＢｌｏｏｄ  Ｋｉｔを用いて分離した。この試料の１０分の１を用いて、望んでいる変異の存在を確かめるためにＰＣＲによりスクリーニングした。その際、以下のプライマーを使用した：ｄｌ９２２／４７に対して
【０１１４】
【化７】
2007522797.tif 000011
および
【０１１５】
【化８】
2007522797.tif 000012
、
Ｅ４領域のＥ２Ｆ−１プロモーターに対しては
【０１１６】
【化９】
2007522797.tif 000013
および
【０１１７】
【化１０】
2007522797.tif 000014
。ＰＣＲを、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲキットを用い、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ９６００機器で遂行した。その際、以下の条件を使用した：最初の変性が９８℃で５分、以下変性が９８℃で１分、アニーリング／プライマー伸長が６８℃で３分を３０サイクル、最後のプライマー伸長を６８℃で５分。陽性のプラーク（ＰＣＲで判定した）を、続いて配列解析により確認した。上記ＰＣＲ産物をゲルで精製し、その同じプライマーで配列解析した。陽性プラークを、プラーク精製の第二ラウンドに供し、上記のように確認した。ウイルスを２９３細胞の中で増殖させ、二度の塩化セシウム勾配超遠心により精製した。
【０１１８】
（実施例４）
（Ｅ２Ｆ１−Ｅ１ａおよびＥ２Ｆ１−Ｅ１ａ／Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ベクターの構築）
ｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１（−２４２）およびｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１ΔＥ２Ｆ（−２４２）を鋳型として用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりヒトＥ２Ｆ−１プロモーターを単離した。ｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１（−２４２）は、転写開始部位に対して−２４２位までヒト野生型Ｅ２Ｆ１プロモーターを含む。ｐＧＬ３：Ｅ２Ｆ−１ΔＥ２Ｆ（−２４２）は、Ｅ２Ｆ結合部位のパリンドロームが両方とも不活性化点変異を含むこと以外は、全て同じ配列を含む。ＰＣＲで使用したプライマーの配列は以下のとおりであった：ＢａｍＨＩ−Ｅ２Ｆ１Ｐ
【０１１９】
【化１１】
2007522797.tif 000015
およびＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ２Ｆ１Ｐ
【０１２０】
【化１２】
2007522797.tif 000016
。鋳型ＤＮＡ１００ｎｇを、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、以下の条件でＰＣＲ増幅を行った：最初の変性が９８℃で５分、以下変性を９８℃で１分、アニーリング／プライマー伸長が６８℃で１分を３０サイクル、最後のプライマー伸長が６８℃で５分。そのＰＣＲ産物は、Ｑｉａｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製し、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ゲルで精製した後、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで部分的に（ｐａｒｔｉａｌｌｙ）消化したｐ９９２／４７―ＳＶにライゲーションした（以下参照）。これらのプロモーターシャトルベクターをＥ２Ｆ１ｗｔ−９２２／４７．ＰＳＶとＥ２Ｆ１Δ−９２２／４７．ＰＳＶとした。これらのプロモーターシャトルベクターは、ヒトＥ２Ｆ１プロモーターの転写開始に対して−２１８から＋５１までの配列を有する。全てのベクターをＡＢＩ自動シークエンサーの二本鎖配列解析により確認した。
【０１２１】
Ｐ９２２／４７−ＳＶは、ヌクレオチド９２２からヌクレオチド９４７まで欠失しているＥ１Ａ−ＣＲ２をも含むＥ１Ａプロモーターシャトルベクターである。プラスミドＰ９２２／４７−ＳＶは下記の手順で構築した。まず最初にｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後、再びライゲーションし、ｐＳＰ６４ＤｅｌｔａＨ３を作製した。ｐＸＣ１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）に由来する１，７３７ｂｐのＥｃｏＲＩ〜ＸｂａＩ断片（Ａｄ５とｐＢＲ３２２  ＤＮＡの両方を含む）を、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したｐＳＰ６４ＤｅｌｔａＨ３にライゲーションし、ｐＳＰ６４−ＲＩ／Ｘｂａを作製した。ｐＳＰ６４−ＲＩ／ＸｂａをＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ  ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した後、再びライゲーションしてＰＤｅｌｔａＥ１Ｄｅｌｔａ＋を作製した。この分子間欠失により、ｐＸＣ１プラスミドの９５２９から９８７５までの配列が取り除かれ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＢａｍＨＩ部位とＣｌａＩ部位も同時に取り除くことができた。ＰＤｅｌｔａＥ１ＤｅｌｔａをＢｓＡａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩリンカー（ＮＥＢ）とライゲーションすることによって、Ａｄ５のヌクレオチド３７６に新しくＨｉｎｄＩＩＩ部位を創出して、これをＰＤｅｌｔａＥ１Ｄｅｌｔａ＋Ｈを作製した。そのプラスミドのＡｄ５のヌクレオチド５３９に、ＰＣＲ変異誘発により新しくＢａｍＨＩ部位を創出した。最初に２回のＰＣＲ反応を行った。ＰＤｅｌｔａＥ１Ｄｅｌｔａ＋Ｈを鋳型として用い、プライマー：ｐＢＲ３２２に由来する５’ＥｃｏＸＣ１部位と３’Ｂａｍ
【０１２２】
【化１３】
2007522797.tif 000017
と３’Ｂａｍ
【０１２３】
【化１４】
2007522797.tif 000018
と共に用い、一方、プラスミドｐＸＣ１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）を鋳型として、プライマー：Ｂｓｒ−Ｂａｍ
【０１２４】
【化１５】
2007522797.tif 000019
と３’Ｅ１Ａ．Ｘｂａ
【０１２５】
【化１６】
2007522797.tif 000020
と共にＰＣＲ反応に用いた。そのＰＣＲ産物をアガロースゲルで分離し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットで精製した。次に、２種類のＰＣＲ産物を混合し、最も外側のプライマー対である５’ＥｃｏＸＣ１と３’Ｅ１Ａ．Ｘｂａを使い、再びＰＣＲを行った。その結果生じた約１，４００ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したＰＤｅｌｔａＥ１Ｄｅｌｔａ＋Ｈにライゲーションし、ＰＤｅｌｔａＥ１Ｄｅｌｔａ＋Ｈ＋Ｂを作製した。ＰＤｅｌｔａＥ１Ｄｅｌｔａ＋Ｈ＋ＢをＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、その１，３９３ｂｐ断片を、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化したｐＸＣ１（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）へライゲーションすることによってｐＸＣ１−ＳＶを構築した。最後に、ｐＣＩＡ−９２２／４７（Ｐｅｔｅｒ  Ｗｈｉｔｅから贈与）をＰＣＲのための鋳型として、以下のプライマーと共に使用することによってｐ９２２／４７−ＳＶを作製した：Ｂｓｒ−Ｂａｍ
【０１２６】
【化１７】
2007522797.tif 000021
と３’Ｅ１Ａ．Ｘｂａ
【０１２７】
【化１８】
2007522797.tif 000022
。生じたＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋカラムにより精製し、ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化し、続いてＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化したｐＸＣ１−ＳＶへライゲーションした。
【０１２８】
（実施例５）
（Ｅ２Ｆ１−Ｅ１ａおよびＥ２Ｆ１−Ｅ１ａ／Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ウイルスの構築）
ＯＮＹＸ−１５０（Ｅ２Ｆ１ｗｔ−９２２／４７）とＯＮＹＸ−１５１（Ｅ２Ｆ１Ｄｅｌｔａ−９２２／４７）は、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法により１０μｇのＥ２Ｆ１ｗｔ−９２２／４７．ＰＳＶまたは１０μｇのＥ２Ｆ１Ｄｅｌｔａ−９２２／４７．ＰＳＶをそれぞれ１０μｇのｐＪＭ１７（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ）とともに２９３細胞にコトランスフェクションすることによって作製した。ＯＮＹＸ−４１１（Ｅ２Ｆ１ｗｔ−９２２／４７＋Ｅ２Ｆ１ｗｔ−Ｅ４）は以下の手順で作製した。まず１０μｇのプラスミドＥ２Ｆ１−Ｅ４ＰＳＶ．３０９（ＩＤ−０８６）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化した。次に、消化したＤＮＡを子牛腸由来脱リン酸化酵素で処理し、ゲルで精製した。次に、Ｅ４領域を駆動する野生型Ｅ２Ｆ−１プロモーターを含む精製した断片５μｇにＥｃｏＲＩで消化した１μｇのＯＮＹＸ−１５０（Ｅ２Ｆ１ｗｔ−９２２／４７）ＴＰ−ＤＮＡを１６℃で一晩ライゲーションした。リン酸カルシウムによるトランスフェクションは下記の方法で行った。まず、ＤＮＡと５０μｌの２．５Ｍ塩化カルシウムと混合し、最終体積が５００μｌになるように調整した。ＯＮＹＸ−４１１の場合には、トランスフェクションミックスは、２４μｇの鮭精子由来ＤＮＡ、さらにライゲーションしたＤＮＡを含んだ。この溶液を、５００μｌのＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０５）に滴下しながら加えた。２５分間静置後、２枚の６０ｍｍディッシュ上、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭの中で６０〜８０％のコンフルエンシーまで培養した２９３細胞に、生成した沈殿物を滴下しながら加えた。１６時間後、一層の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（カルシウムとマグネシウムは入ってない）で１回洗浄し、その後、２％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭの中の１％のシープラークアガロースからなる５ｍｌの寒天を重層した。プラークを単離するまで、３〜４日毎に３〜４ｍｌの上記寒天をディッシュに重層した。
【０１２９】
（実施例６）
（Ｅ２Ｆ１−Ｅ１ａおよびＥ２Ｆ１−Ｅ１ａ／Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ウイルスの増殖と確認）
初代プラークをパスツールピペットで単離し、細胞変性効果が完結するまで、６ウェルディッシュの中で２％ＦＢＳを補充した２ｍｌのＤＭＥＭの中で培養した２９３細胞またはＡ５４９細胞のどちらかの中で増殖させた。ウイルスを含む上清の１０分の１（２００μｌ）をＤＮＡ解析のために取っておき、残りを凍結バイアルに入れ−８０℃で保存した。ＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎが推奨するとおりＱｉａｇｅｎのＢｌｏｏｄ  Ｋｉｔを用いて分離した。この試料の１０分の１を用いて、望んでいる変異の存在を確かめるために、以下のセットのプライマー対を使用してＰＣＲによりスクリーニングした。Ｅ１Ａを駆動するヒトＥ２Ｆ１プロモーターの存在を、プライマーＡｄ５−ｌｅｆｔ
【０１３０】
【化１９】
2007522797.tif 000023
とＥ１Ａｓｔａｒｔ．ＮＣ
【０１３１】
【化２０】
2007522797.tif 000024
を用い確認した。Ｅ１Ａ内のヌクレオチド９２２からヌクレオチド９４７までの欠失の存在を、プライマーＡｆ−７
【０１３２】
【化２１】
2007522797.tif 000025
とＡｆ−５
【０１３３】
【化２２】
2007522797.tif 000026
を用い確認した。Ｅ４領域全体を駆動するヒトＥ２Ｆ１プロモーターの存在を、プライマーＥ４．３ＮＣｂ
【０１３４】
【化２３】
2007522797.tif 000027
とＡｄ５−３’ｅｎｄ
【０１３５】
【化２４】
2007522797.tif 000028
を用い確認した。Ｅ３領域の欠失（ｄｌ３０９）の存在を、プライマーＥ３．Ｃ８
【０１３６】
【化２５】
2007522797.tif 000029
と３’−Ｅ３Ｉ
【０１３７】
【化２６】
2007522797.tif 000030
を用い確認した。ＰＣＲを、ＣｌｏｎｔｅｃｈのＡｄｖａｎｔａｇｅ  ｃＤＮＡ  ＰＣＲキットを用い、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ９６００機器で遂行した。その際、以下の条件を使用した：最初の変性が９８℃で５分、以下変性が９８℃で１分、アニーリング／プライマー伸長が６８℃で３分を３０サイクル、最後のプライマー伸長を６８℃で５分。陽性のプラーク（ＰＣＲで判定した）を、続いて配列解析により確認した。上記ＰＣＲ産物をゲルで精製し、その同じプライマーで配列解析した。陽性プラークを、２９３細胞またはＡ５４９細胞のどちらかを用いてプラーク精製の第二ラウンドに供し、上記のように厳密に確認した。ウイルスを２９３細胞の中で増殖させ、２度の塩化セシウム勾配超遠心により精製した。全ての大量調製したウイルスを、上記と同様のＰＣＲと配列解析により確認した。さらに、全ての大量調製したウイルスをＨｉｎｄＩＩＩまたはＸｈｏＩのどちらかで消化し、その断片を０．９％アガロースゲルで分離することによって解析し確認した。
【０１３８】
（実施例７）
（Ｏｎｙｘ−４４３の構築）
図４（Ａ）にＯＮＹＸ−４４３のゲノム構造を示す。それを以下のように構築した。プラスミドｐＥ３ＳＶ＋Ｖ＋Ｂ（米国特許出願第０９／３４７，６０４号に記載され、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）への寄託物（ＡＴＣＣ第        ）上にある）を、ＯＮＹＸ−４４３を構築するために使用した。このプラスミドはアデノウイルスのＥ３領域を含む。まず、ｐＥ３ＳＶ＋Ｖ＋ＢをＮｈｅＩエンドヌクレアーゼで消化し（２８５３２）、そして天然のＭｕｎＩエンドヌクレアーゼで消化（２９３５５）することによってＥ３領域から６．７Ｋとｇｐ１９Ｋ遺伝子を欠失させ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで埋め、再びライゲーションすることによって、ｐＥ３ＳＶ＋Ｖ＋ＢΔｇｐ１９Ｋプラスミドを創出した。ＮｈｅＩ部位とＭｕｎＩ部位は、予めｐＥ３ＳＶ＋Ｖ＋Ｂの中に設計しておいた。
【０１３９】
次に、Ｅ．ｃｏｌｉのシトシン脱アミノ酵素遺伝子（ＣＤ）（ｐＣＤ２、ＡＴＣＣ第４０９９９  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）を、プライマーＣＤ−Ｃｌａ
【０１４０】
【化２７】
2007522797.tif 000031
とＣＤ−Ｓｗａ
【０１４１】
【化２８】
2007522797.tif 000032
を用いてＰＣＲ増幅した。そのＰＣＲ産物を精製し、ＣｌａＩエンドヌクレアーゼとＳｗａＩエンドヌクレアーゼで消化し、同じくＣｌａＩとＳｗａＩで消化したｐＥ３ＳＶ＋Ｖ＋ＢΔｇｐ１９Ｋにライゲーションし、ｐＥ３ＳＶ＋Ｖ＋ＢΔｇｐ１９Ｋ＋ＣＤ（Ｃ／Ｓ）を創出した。ＣＤについての細菌の開始コドンであるＧＴＧは、真核生物の開始コドンであるＡＴＧと置き換わっていたので、プライマー設計の際に留意すべきである。
【０１４２】
ウイルスＤＮＡでの相同的組換えを容易にするため、アデノウイルスのさらなる配列をｐＥ３ＳＶ＋Ｖ＋ＢΔｇｐ１９Ｋ＋ＣＤ（Ｃ／Ｓ）の５’領域に付加した。そのプラスミドをＳｐｅＩで消化し、ＮｈｅＩエンドヌクレアーゼで（１９５４９）、およびＳｐｅＩエンドヌクレアーゼで消化した（２７０８２）ｐＮＢから分離した７５３３ｂｐ断片にライゲーションし、ｐＮＢΔｇｐ１９Ｋ−ＣＤ（Ｃ／Ｓ）を作製した。ｐＮＢは米国特許出願第０９／３４７，６０４号に記載されている。ＮｈｅＩとＳｐｅＩは互換性のある粘着末端なので、挿入したＤＮＡの方向を制限酵素で消化することにより確認した。
【０１４３】
最後に、ＥｃｏＲＩで消化したＯＮＹＸ−４１１由来のウイルス性ＴＰ−ＤＮＡを利用した相同的組換えによりＯｎｙｘ−４４３を産出した（Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ  ＴＷ，  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ：Ｗｏｌｄ  ＷＳＭ（ｅｄ．）Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９９，ｐｐ１１−２４）。次に、ｐＮＢΔｇｐ１９Ｋ−ＣＤ（Ｃ／Ｓ）をＢａｍＨＩで消化し、その消化したプラスミドとＴＰ−ＤＮＡを、製造会社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって記載されているとおりにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してＡ５４９細胞にコトランスフェクションした。組換えウイルスＯＮＹＸ−４４３は３回プラーク精製し、以前に記載された方法（Ｈａｗｋｉｎｓ  ＬＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２００１；８：１１２３−１１３１）を使用してＰＣＲ−配列決定により確認した。塩化セシウムで精製したＯＮＹＸ−４４３ウイルス由来のウイルスＤＮＡに、ＯＮＹＸ−４４３のＥ１領域とＥ３領域全体、さらにＥ４領域のＰＣＲ解析とＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４４】
（実施例８）
（Ｏｎｙｘ−４４３中のシトシン脱アミノ酵素の発現）
インビトロとインビボの両方において、Ｏｎｙｘ−４４３中のＣＤの発現が存在することを示した。
【０１４５】
インビトロにおけるＣＤの発現。
【０１４６】
本発明者らはまず、培養腫瘍細胞（Ｃ３３Ａ、Ｈ１２９９、ＤＵ１４５およびＬＮＣａｐ）とヒトの正常な初代細胞（ヒトの肝細胞と静止期にある細い気道の上皮細胞および乳腺の上皮細胞）にＯＮＹＸ−４４３を感染させ、ＣＤの発現を比較した｛（図４（Ｂ））｝。ＭＯＩが１のとき、ＯＮＹＸ−４４３に感染した癌細胞は、感染２４時間後すぐに検出可能なレベルのＣＤを発現した。ＣＤタンパク質の量は時間と共に増加し、感染７２時間後には最大レベルに達した。
【０１４７】
癌細胞と比較して、ＯＮＹＸ−４４３に感染した正常な細胞は、感染７２時間後までに検出可能なレベルのＣＤを発現せず、またその発現レベルは、癌細胞の発現レベルより有意に低かった。ヒトの正常な細い気道の上皮細胞と乳腺の上皮細胞の静止期と分裂期で、同様の結果が得られた。ＯＮＹＸ−４４３を感染させた後のＣＤの発現パターンは、癌細胞と正常な細胞の中で親ウイルスであるＯＮＹＸ−４１１が差動的に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）複製することと矛盾しなかった。これらの実験で発現したＣＤは機能的で、インビトロで５−ＦＣを５−ＦＵに変換することができた。
【０１４８】
免疫ブロット法を、以下に簡単に記したように行った。ＭＯＩを１にして培養細胞に感染させた。示された感染して記載した時間の後に、その細胞を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ[ｐＨ６．８]、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＳＤＳ、５％  β―メルカプトエタノール中で溶解した。動物実験用に、癌の試料を瞬間凍結し、液体窒素中で粉末化し、続いて上記の溶解緩衝液に溶解させた。細胞の残骸は遠心して除き、溶解性のタンパク質は、１２％の成形済みタンパク質用ゲル（ＢｉｏＷｈｉｔａｋｅｒ）で電気泳動し、分画した。電気泳動後、そのタンパク質を電気泳動的にＰＶＤＦ膜に転写した。その後、ブロットを、１％  粉乳と０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで希釈した抗体とインキュベートし、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で可視化した。抗ＣＤ抗体は１：５０，０００希釈した[Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｌ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，８：１１２３−１１３１，２００１]。ウサギ抗線維抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ）は１：１０００に希釈した。
【０１４９】
インビボにおける、ウイルスの静脈投与後のＣＤの発現
次に本発明者らは、ヒトの腫瘍を異種移植したヌードマウスに尾静脈を介してＯＮＹＸ−４４３を静脈注射し、異種移植した腫瘍におけるＣＤの活性と、肝臓、肺、膵臓などの正常な組織におけるＣＤの活性を調べた。簡単に記すと、２×１０６の腫瘍細胞をヌードマウスに皮下注射することで、腫瘍を定着させた。腫瘍の大きさが平均１００ｍｍ３に達したときに、ウイルスを尾静脈注射によって静脈投与した。それぞれの動物に一日当たり２×１０８ｐｆｕのウイルスを５日間連続注射した。例外として、ＤＵ１４５の場合は一日当たり５×１０８ｐｆｕのＯＮＹＸ−４４３を５日連続で投与した。ウイルス投与の最初の日を、１日目と定義した。動物は示されている時点で屠殺し、それらの腫瘍と正常組織試料を、シトシンからウラシルに変換するアッセイを使ってＣＤ活性を解析した。
【０１５０】
ＣＤアッセイは、以下に簡単に記すように行った。腫瘍サンプルと肝臓サンプルを瞬間凍結し、液体窒素中で粉末化した。２０〜４０ｍｇの組織粉末を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の中に溶解させ、続いて凍結と融解を３回おこなった。シトシンと５−ＦＣ変換アッセイのために、２００μｇのタンパク質抽出物を[２−１４Ｃ]シトシンまたは[２−１４Ｃ]５−フルオロシトシン（１μＣｉ／ｍｍｏｌ；Ｍｏｒａｖｅｋ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂｒｅａ、ＣＡ））と共にインキュベートした。反応は代表的には、３７℃で２時間行った。反応産物は薄層クロマトグラフィープレート（ＶＷＲ）で分離し、オートラジオグラフィーで可視化した。
【０１５１】
ＬＮＣａｐの異種移植片モデルのデータを図５Ａに示す。この研究から２つの知見が得られた。１つ目、腫瘍内にあるＣＤの活性は、ＯＮＹＸ−４４３を注射した動物では高く、また長時間持続する。実際、ＯＮＹＸ−４４３を注射した動物の腫瘍中のＣＤの活性が、研究期間中ずっと絶えず増加した。この結果は、５−ＦＣを基質として用いてかつ直線的に比例する値域内でアッセイが行われた図５Ｂに明確に示されている。２つ目、ＯＮＹＸ−４４３を注射した動物の肝臓内におけるＣＤの活性は低い（図５Ａ）。ＯＮＹＸ−４４３を接種した動物の大多数において、肝臓内のＣＤの活性は検出できなかった。
【０１５２】
静脈へのウイルスの接種に続くＣＤの発現を、Ｈｅｐ３Ｂ、ＤＵ１４５、Ｃ３３Ａを含む異種移植した他のマウスモデルにおいて評価した。Ｈｅｐ３Ｂ腫瘍では、ＯＮＹＸ−４４３によるＣＤの発現もまた高かった（図６Ａ）。Ｃ３３Ａ腫瘍内の発現パターンは、Ｈｅｐ３Ｂモデルのときと同様であった。ＤＵ１４５腫瘍においては、ＯＮＹＸ−４４３は、少なくとも２４日間、持続して高いレベルのＣＤ活性を示した(図６Ｂ)。対照的に、ＯＮＹＸ−４４３を注射した動物の肝臓ではＣＤ活性が検出されなかった。肺組織と膵臓組織においても、静脈注射に続くＣＤ活性は検出されなかった。
【０１５３】
まとめると、ＯＮＹＸ−４４３は、インビボにおいて好ましい異種の発現プロフィールを有し、様々な腫瘍において優れたＣＤ活性レベル、および肝臓と比較してより良好な腫瘍特異性を示している。
【０１５４】
（ＣＤの活性、ＣＤタンパク質レベルとウイルスの後期遺伝子発現との相関）
本発明者らが検出したＣＤ活性が、ＣＤタンパク質の発現レベルに反映しているか否かを判定するために、ＣＤ活性とＣＤタンパク質レベルの両方を調べられるある代表的な実験により動物の腫瘍試料を解析した。データは、ＣＤ酵素活性（シトシンからウラシルへ変換）とＣＤタンパク質との相関を示す。このことは、そのＣＤ活性アッセイは、ＣＤ遺伝子発現レベルを反映することを示している。
【０１５５】
本発明者らはまた、ＣＤ遺伝子の発現がＯＮＹＸ−４４３の複製に相関しているか、もしそうなら、発現したＣＤが後期タンパク質なのか判定することができる。２つの実験により、これがその場合であることを確認できた。１つ目、線維は、その発現がウイルスのＤＮＡ複製に厳密に依存している後期ウイルスタンパク質であり、アデノウイルスの複製のマーカーとしてよく使われる。したがって、Ｃ３３Ａ腫瘍を有し、図５Ａに書かれているようにＯＮＹＸ−４４３を静脈から注射したマウスから採取した腫瘍の試料中のアデノウイルス線維の発現を調べる。示されている時点で、腫瘍の試料を取り出し、シトシンからウラシルに変換するアッセイによりＣＤ活性と、免疫ブロット法によりアデノウイルスの線維タンパク質レベルとを解析する。その結果から、ＣＤ活性と線維発現とに良い相関があることがわかり、ＣＤ発現はウイルスのベクターの複製と直接関連していることがわかる。
【０１５６】
２つ目に、ＣＤがアデノウイルスの後期タンパク質として発現することを示すために実験を行うことができる。これは、ＣＤの発現に対するａｒａＣ（１−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン）の効果を判定することにより行われる。アデノウイルスの後期タンパク質の発現の重要な特徴は、その発現がウイルスのＤＮＡ合成に依存していることである。したがって、本物の後期タンパク質の発現を示す実験は、ＤＮＡ複製のインヒビターであるａｒａＣ存在下、発現が起こるのかどうか決めることである。
【０１５７】
そこで、Ａ５４９細胞を含む培地に２０μｇ／ｍｌの濃度になるようにａｒａＣを加え得る。Ａ５４９細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能であり、ｍ．ｏ．ｉを１０にしてＯＮＹＸ−４４３を感染させ、細胞の溶解産物をウェスタンブロットにより解析する。その結果、Ｅ３Ｂ中のＣＤは、その発現はＤＮＡの複製に依存しているので、本物の後期タンパク質であることを示す。
【０１５８】
（実施例９）
（Ｅ２Ｆ１−Ｅ１ａ／Ｅ２Ｆ１−Ｅ４ウイルスの組換え体）
Ｏｎｙｘ−４１１（Ｅ２Ｆ１ｗｔ−９２２／４７＋Ｅ２Ｆ１ｗｔ−Ｅ４）は、実施例４と実施例５に記載されているとおりに構築した。ＯＮＹＸ−４１１のゲノムは、Ｅ２Ｆ１プロモーターのコピーを２つ含み、それはウイルスのＥ１Ａ遺伝子とＥ４遺伝子それぞれの発現を制御する。したがって、これら２つの部位にこのプロモーターを挿入することにより、ＯＮＹＸ−４１１の相同的組換え体が誘発されると推測される。本発明者らは、２つの生存可能なウイルスがＯＮＹＸ−４１１の相同的組換えに起因することを観察した。本発明者らは、これら分子内組換え産物をＲ１、分子間組換え産物をＲ２と名づけた。そのウイルスのＲ３体も存在し、詳細は以下で考察する。
【０１５９】
以下に記載の実験において、ＯＮＹＸ−４１１骨格に基づいて作製した、ある特定のウイルス構築物を使用した。それらは以下のとおりである：Ｅ３領域の中にＣ．ｋｅｆｙｒ酵母のシトシン脱アミノ酵素（ＣＤ）遺伝子（米国特許仮出願Ｓ／Ｎ：６０／４３６，７０７）を含むＯＮＹＸ−４５１、Ｅ３Ｂ領域の中にヒトＧＭ−ＣＳＦ（米国特許第５，３９３，８７０号または同第５，３９１，４８５号）を含むＯＮＹＸ−４５２、ヒトＴＮＦアルファ遺伝子（米国特許第４，６７７，０６３号または同第５，７７３，５８２号）を含むＯＮＹＸ−４５５。これらのウイルスは、以下のようにｐＥ２Ｆ−ＧＢＶを用いて作製した。まず、ｐＬ２８．ＷＴ．Ｅ２Ｆ１Ｐ．Ｅ４．３０９（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．１：３２５−３７．２００１に記載）をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで完全に消化した。９ｋｂのウイルス配列を精製し、ｐＧＥＭ−７ｚｆ（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＥｃｏＲＩ〜ＢａｍＨＩの隙間にサブクローニングし、ｐＧＥＭ．ｄｌ３０９．（７５−１００）．ＷＴ．Ｅ２Ｆ１Ｐを作製した。次に、ｐＥ３ＳＶ＋Ｂ＋Ｖ（Ｈａｗｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１１４２−１１４８．２００１）をＥｃｏＲＩとＮｄｅＩで完全に消化し、３．８ｋｂのウイルス配列を精製し、このウイルス配列をｐＧＥＭ．ｄｌ３０９．（７５−１００）．ＷＴ．Ｅ２Ｆ１Ｐのその対応する断片と置き換えることにより、ｐＥ２Ｆ−ＧＢＶを作製した。この２番目のクローニングの工程で、特有な制限酵素部位を数多く導入し、引き続く外来の導入遺伝子の挿入を容易にした。Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシン脱アミノ酵素、ヒトＧＭ−ＣＳＦおよびヒトＴＮＦ−αのｃＤＮＡを、ＣｌａＩとＳｗａＩで消化したｐＥ２Ｆ−ＧＢＶにクローニングし、それぞれｐＥ２Ｆ−ｙＣＤ、ｐＥ２Ｆ−ＧＭおよびｐＥ２Ｆ−ＴＮＦを作製した。ｐＥ２Ｆ−ｙＣＤは野生型ｇｐ１９Ｋを含む。ｐＥ２Ｆ−ＧＭは、ＮｈｅＩとＭｕｍＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗで埋めて、再びライゲーションし、ｇｐ１９Ｋを完全に欠失した。ｍｐＥ２Ｆ−ＴＮＦは、ＮｈｅＩ〜ＭｕｍＩの隙間に挿入することで、ｇｐ１９Ｋの代わりに、ＨＳＶチミジンリン酸化酵素ｃＤＮＡを含む。ｐＥ２Ｆ−ｙＣＤ、ｐＥ２Ｆ−ＧＭ、ｐＥ２Ｆ−ＴＮＦを、それぞれＯＮＹＸ−４５１、ＯＮＹＸ−４５２、ＯＮＹＸ−４５５を作製するために使用した。要約すると、これらのプラスミドをＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、ウイルス配列を含むその９ｋｂ断片を精製し、ＥｃｏＲＩで消化したＯＮＹＸ−４１１  ＴＰ−ＤＮＡをＡ５４９細胞にコトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞を、標準的な栄養素を含むソフトアガーを重層して増殖させた。プラークは、代表的には、感染後６〜１０日で現れた。個々のプラークを、正確な組換えウイルスについてスクリーニングした。組換えウイルスを、Ｅ１とＥ３領域全てにおいてＰＣＲ解析とＤＮＡ配列決定をすることにより確認した。
【０１６０】
ＯＮＹＸ−４１１は、逆末端反復配列−パッケージング信号−Ｅ２Ｆ１プロモーター（ＩＴＲ−Ψ―Ｐ）をその左末端に、逆末端反復配列−Ｅ２Ｆ１プロモーター（ＩＴＲ−Ｐ）をその右末端に有する。Ｒ１では、この配置が逆転している。つまり、ＩＴＲ−Ｐがウイルスゲノムの左末端に、ＩＴＲ−Ψ−Ｐが右末端に存在する。Ｒ２では、ゲノムの両末端にＩＴＲ−Ψ−Ｐを有する。これらの構造を図７に示す。この図の中で、ＯＮＹＸ−４１１はＲ０とする。
【０１６１】
ＰＣＲとサザンブロット解析に基づき、Ｒ１とＲ２はともに、ＯＮＹＸ−４１１（Ｒ０）の調製物中にそれぞれ存在することが示された。Ｒ１は微量に存在し、ＰＣＲでのみ検出可能で、Ｒ２は全ウイルス集団の２０％まで存在する。
【０１６２】
ＯＮＹＸ−４１１、Ｒ１およびＲ２の安定性を判定するために実験を行った。Ｒ２はＯｎｙｘ−４１１と同一なので、Ｒ２はＲ１より安定であると推測した。
【０１６３】
ＯＮＹＸ−４１１のＥ３Ｂ領域の中に挿入された異なる導入遺伝子を含むＲ２ウイルスのいくつかをプラーク精製することによって、このことを証明した。同じウイルスのプラークをいくつか単離した。ＯＮＹＸ−４５１のＲ２体は、Ｅ３Ｂ領域の中に酵母Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシン脱アミノ酵素遺伝子（米国特許仮出願Ｓ／Ｎ：６０／４３６，７０７）を含み、一方、ＯＮＹＸ−４５２のＲ２体は、Ｅ３Ｂ領域の中にヒトＧＭ−ＣＳＦ（米国特許第５，３９３，８７０号または同第５，３９１，４８５号）を含み、そしてＯＮＹＸ−４５５のＲ２体は、Ｅ３Ｂ領域の中にヒトＴＮＦアルファ遺伝子（米国特許第４，６７７，０６３号または同第５，７７３，５８２号）を含む。これらＲ２体の同定は、直接的ＤＮＡ配列決定により確認した（図８）。混合物の中から純粋なＲ２体を区別するために、本発明者らは最初の混合物（Ｒ０、Ｒ１およびＲ２を含む）を「Ａ」体、精製したＲ２を「Ｂ」体と名づけた。Ｂ体は、子孫の増殖、細胞毒性、遺伝子発現パターン、腫瘍細胞対正常細胞の選択性などの点においＡ体と生物学的に区別不能であることを、本発明者らは示した。これらのデータから、Ｂ体は、Ａ体と同じ生物学的活性と腫瘍崩壊性効力を保持することが示唆される。
【０１６４】
最後に、上記に加え、パッケージング配列の重複、または「Ａ」の反復配列（Ｓｃｈｍｉｄ  ａｎｄ  Ｈｅａｒｉｎｇ：Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐ．３３７５−３３８４，ｖｏｌ．７１，Ｎｏ．５  １９９７）が、ウイルスゲノムの左末端に起こった。そのパッケージング配列はＡＩ〜ＡＶＩＩの７つあると考えられる。ＯＮＹＸ−４１１とその誘導体（図９の中に、ＯＮＹＸ−４ＸＸとしてまとめて表示した）をインビトロでＡ５４９細胞の中で繰り返し継代（８回継代）したときに、それらの配列の重複をサザンブロット解析により示した。その解析は、ＯＮＹＸ−４１１、ＯＮＹＸ−４５１、ＯＮＹＸ−４５２、ＯＮＹＸ−４５５のそれぞれから２度プラーク精製したウイルスに対して解析を行った。サザンブロット解析を、標準的技術を用いて行った。要約すると、全ＤＮＡを細胞の培養上清から抽出し、ＢａｍＨＩまたはＸｈｏＩのどちらかで消化し、２％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に転写した。放射性物質で標識したＥ２Ｆ１プロモーター配列をプローブとして、ハイブリダイゼーションを行った。この結果を図９に示す。
【０１６５】
ＸｈｏＩで消化したブロットは、Ａ体については、４１１の単離体（Ａ−１とＡ−２）、４５１の単離体（Ａ−１とＡ−２）において、両方とも３本のバンドが見られることが示される。一番上のバンドは、ウイルスゲノムの左末端にあるＥ２Ｆ１プロモーター配列を表す。下の２本のバンドは、それぞれ右末端にあるＲ０とＲ１＋Ｒ２を表す。４５１、４５２、４５５のＢ体の２つの単離体であるＢ−１とＢ−２については、目で確認できるのは２本のバンドだけである；上のバンドは、ウイルスゲノムの左末端にあるＥ２Ｆ１プロモーター配列を表し、一方、下のバンドは、右末端にあるＲ２を表す。
【０１６６】
それに比べ、ＢａｍＨＩのブロット（図９）には、２本のバンドが見られた；上のバンドは、ゲノムの右末端にあるＥ２Ｆ１プロモーターを表し、５００ｂｐ断片は、ゲノムの左末端にあるＥ２Ｆ１プロモーター配列を表す。さらに、約１００〜２００ｂｐにある断片が、５００ｂｐにある断片より大きいということが重要である。この断片は、継代の後期にしか現れず、５回継代したときに初めて見ることができる。このことは、ＯＮＹＸ−４１１Ａ−２、４５１Ｂ−１、４５５Ｂ−１および４５５Ｂ−２でもっとも明らかであるが、８回継代したクローンにおいても検出できる。
【０１６７】
この現象を理解するために、本発明者らは、選択したクローンに対してＰＣＲを実行した。その際、使用したプライマーＰ３とＰ５は以下のとおりであった：
Ｐ３：
【０１６８】
【化２９】
2007522797.tif 000033
Ｐ５：
【０１６９】
【化３０】
2007522797.tif 000034
使用したそのＤＮＡの鋳型は、８回継代したウイルスから精製した。ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲルで分離し、エチジウムブロマイド染色により可視化した（図１０）。そのＰＣＲ産物は、予測外の様々な大きさの断片を多く含んだ。最も多量の断片を単離し（図１０の中に矢印で示してある）、配列決定を行った。
【０１７０】
ＤＮＡ配列決定により、ウイルスの配列の縦列反復が明らかとなった（図１１）。本発明者らが解析した３つのクローンのうち、１つは１０７ｂｐの挿入（４５１Ｂ−１）、もう１つは２０２ｂｐの挿入（４５５Ｂ−１）、残りの１つは、１１５ｂｐの挿入（４５５Ｂ−２）を有した。周到な検査により、３つの重複した配列全てにアデノウイルス５型のパッケージング配列の一部または全部を含まれることが示される。これら重複した配列は、間に隙間がない本来のパッケージング配列に隣接していた。
【０１７１】
パッケージング配列の重複は、おそらく相同性組換えの結果ではない。なぜなら複数のバンドがＰＣＲによって検出されたからである（図１０）。これは、ＤＮＡ配列決定の結果（図１１）により確認した異なる切断点を用いたことを示している。重複したパッケージング配列を有する全てのウイルスは、まとめて本明細書中でＲ３体といわれる（図１）。
【０１７２】
上記の結果は以下を支持する：１）Ｒ３は、Ａ体およびＢ体にも由来し得る。Ａ体はＲ０体を優勢に含み、Ａ体の中のＲ２体の比率が継代を重ねても変化しないので、Ｒ３体はＲ０体に由来し得る。Ｒ３体はまたＲ２体にも由来し得る。２）もし同じ条件の下、他のアデノウイルス（例えば、野生型アデノウイルスのＯＮＹＸ−０１５（米国特許第５，６７７，１７８号）または、実施例５に記載のＯＮＹＸ−１５０のような単一のＥ２Ｆ１プロモーターを有するウイルス）を培養したら、パッケージング配列の重複はこれらウイルスにも起こる。３）Ｒ３の増殖は、Ｒ０体と、Ｒ１体またはＲ２体を超える利点を有する。それは、パッケージングの効率の向上を可能にするさらなるパッケージング配列の結果であり、このことにより、より大きなウイルスゲノムが完全なウイルス粒子に会合することが可能になる。これは、本発明者らが観察したこと、すなわち連続する継代の実験（図９）においてＲ３体がウイルス集団を素早く支配したことと一致しており、このことはＲ３が他の種より早く増殖したことを示唆する。したがって、さらにパッケージング配列を付加することによって、ＯＮＹＸの選択的に複製するアデノウイルスの全体的な腫瘍崩壊活性を改善し、よってこのウイルスがより効率的に複製し伝播することを可能にするのみならず、任意のアデノウイルス産物（複製能のあるアデノウイルス、または複製能のないアデノウイルス、および弱い（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスを含む）の作製も改良する。
【０１７３】
今や本発明は十分に記載されており、多くの変更および改変が添付した特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明に対して行われ得ることが当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】図１は、Ｅ１ａ−２８９Ｒポリペプチドのドメイン構造を模式的に示す。
【図２】図２は、アデノウイルスＥ４プロモーターを示す。
【図３】図３は、本発明のＥ４シャトルベクターとＳｐｅＩとＸｈｏＩの制限酵素部位の位置（Ｅ４プロモーターを、選択したあるプロモーターで置換することを容易にする）を図式的に示す。
【図４】図４（Ａ）は、ＯＮＹＸ−４４３のゲノム構造を示す。ＯＮＹＸ−４４３は、ＯＮＹＸ−４１１のＥ３Ｂ領域に挿入されているＣＤ遺伝子を有する。ＯＮＹＸ−４４３はまた、ｇｐ１９Ｋの完全な欠失を含む。図４（Ｂ）は、ＯＮＹＸ−４４３に感染した細胞の中のインビトロでのＣＤの発現を示す。ヒト癌細胞株と培養した正常なヒト肝細胞に、ＭＯＩを１ｐｆｕ／細胞で感染させた。示されている時点に、細胞抽出液を調製し、ＣＤタンパク質発現レベルを免疫ブロット法により解析した。
【図５】図５は、ＯＮＹＸ−４４３を静脈注射した後の、ＬＮＣａＰ異種移植腫瘍と肝臓におけるＣＤ発現を示す。図５（Ａ）。ＬＮＣａＰ異種移植腫瘍を有するヌードマウスに尾静脈注射を介してウイルスを静脈に投与した。それぞれの動物に、１日当たり２×１０８ｐｆｕの投与量を５日間連続注射した。示されている時点で（〜日目、〜ｄ）、動物を屠殺し、腫瘍と肝臓を取り出し、１４Ｃ−シトシンからウラシルへ変換するアッセイを用いてＣＤの酵素活性を解析した。ウイルスを投与した最初の日を１日目（Ｄａｙ１）と定義した。Ｃ：１４Ｃ−シトシン、Ｕ：１４Ｃ−ウラシル。それぞれのレーンは、個々の動物を表す。上のパネル：ＬＮＣａＰ異種移植腫瘍のＣＤ活性。下のパネル：それに対応するマウス肝臓のＣＤ活性。それぞれの反応において、全部で５０μｇのタンパク質を使用した。図５（Ｂ）。１４Ｃ−５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）から５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）へ変換するアッセイを用いて、ＣＤ活性を定量した。５−ＦＣと５−ＦＵの量は、フォスフォイメージャーにより決定し、５−ＦＵへ変換された投入量の５−ＦＣの百分率をプロットした。
【図６】図６に、ＯＮＹＸ−４４３を静脈注射した後のＨｅｐ３Ｂ異種移植腫瘍とＤＵ１４５異種移植腫瘍とそれに対応する肝臓におけるＣＤの発現を示す。ウイルスの注射と動物試料の解析を、図５（Ａ）に記載したとおりに行った。Ｈｅｐ３Ｂの研究において、ＯＮＹＸ−４４３を、５日間連続、１日当たり２×１０８ｐｆｕの量で注射した（図６（Ａ））。ＤＵ１４５の研究においては、ＯＮＹＸ−４４３を、５日間連続、１日当たり５×１０８ｐｆｕの量で注射した（図６（Ｂ））。示されている時点に（〜日目、〜ｄ）、動物を屠殺し、腫瘍と肝臓を取り出し、ＣＤの酵素活性を解析した。それぞれのレーンは、個々の動物を表す。
【図７】図７は、ＯＮＹＸ−４ＸＸのゲノムの変化を示す。ＯＮＹＸ−４ＸＸは、ＯＮＹＸ−４１１、ＯＮＹＸ−４５１、ＯＮＹＸ−４５２、ＯＮＹＸ−４５５にまとめて言及する。
【図８】図８は、ＯＮＹＸ−４ＸＸ  Ｒ２末端の配列を確認したことを示す。
【図９】図９に連続継代後の、あるＯＮＹＸ−４ＸＸウイルスのサザンブロット解析を示す。
【図１０】図１０は、ＯＮＹＸ−４ＸＸの新しい種（具体的にはＲ３）のＰＣＲ解析を示す。
【図１１】図１１に、野生型アデノウイルスとＯＮＹＸ−４ＸＸウイルス、具体的には、ＯＮＹＸ−４５１（ＹＣＤ）−１、ＯＮＹＸ−４５５（ＴＮＦ）−１、およびＯＮＹＸ−４５５（ＴＮＦ）−２におけるＡＩからＡＶＩＩのアデノウイルスパッケージング要素の重複を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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