(57)【要約】  本発明は、高親和性および特異性で、Ｇタンパク質共役型受容体が仲介するシグナル伝達を遮断するかまたは増進し、そして／またはＧタンパク質共役型受容体の特定の配座異性体を安定化する、ペプチドおよび他の化合物を同定する方法に関する。これらの方法と組み合わせて発展したアッセイ、治療法、および他の方法もまた、開示する。
2007525170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチドを同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する、前記ペプチドライブラリーのメンバーを選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項１０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片がＧαサブユニットである、請求項４の方法。
【請求項１１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項４の方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項４の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項２２】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｂ）高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドを提供し；
（ｃ）前記高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｄ）工程（ｂ）のペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｂ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３１】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項２５の方法。
【請求項３２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項２５の方法。
【請求項３３】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項２５の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求２２の方法。
【請求項３５】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項２２の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｂ）のペプチドの構造に基づく、候補化合物の集中的（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーがコンビナトリアル・ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３８】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが薬剤様分子を含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが集中的小分子ライブラリーである、請求項３７の方法。
【請求項４０】
前記集中的小分子ライブラリーのメンバーが、工程（ｂ）のペプチドの化学的構造に基づく、請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項１の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチド。
【請求項４２】
請求項２２の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物。
【請求項４３】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項２２の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を阻害する方法であって、前記Ｇタンパク質共役型受容体が同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｇタンパク質に結合するのに干渉する化合物と、前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）請求項１の方法にしたがって同定されたペプチドを提供し、ここで前記ペプチドは検出可能なペプチドシグナルを提供するように標識されている；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）前記ペプチドと前記Ｇタンパク質共役型受容体を、前記ペプチドが前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する条件下で接触させ；
（ｄ）未結合ペプチドを前記Ｇタンパク質共役型受容体から取り除き；
（ｅ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｆ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物の前記ライブラリーのメンバーと、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させ；
（ｇ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｈ）前記Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達活性が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているか、そしてＧタンパク質共役型受容体ペプチド結合が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているかを決定し；そして
（ｉ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合増加、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達増加の両方を生じる化合物を同定し、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合減少、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達減少の両方を生じる化合物を同定し、そしてペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、工程（ａ）のペプチドの結合親和性増加を生じる化合物を同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項４７】
ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体の前記シグナル伝達活性を測定する方法が：
（ａ）イノシトールリン酸集積測定；
（ｂ）細胞内Ｃａ２＋レベル測定；
（ｃ）アデニルシクラーゼ活性測定；
（ｄ）経内皮電気抵抗測定；
（ｅ）ストレスファイバー形成測定；
（ｆ）リガンド結合測定；
（ｇ）受容体発現測定；
（ｈ）受容体脱感作測定；
（ｉ）キナーゼ活性測定；
（ｊ）ホスファターゼ活性測定；
（ｋ）核転写因子測定；
（ｌ）遊走（走化性）すべての測定；
（ｍ）スーパーオキシド形成測定；
（ｎ）一酸化窒素形成測定；
（ｏ）細胞脱顆粒測定；
（ｐ）ＧＩＲＫ活性測定；
（ｑ）アクチン重合測定；
（ｒ）血管狭窄測定；
（ｓ）細胞浸透性測定；
（ｔ）アポトーシス測定；
（ｕ）細胞分化測定；
（ｖ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の膜会合の測定；
（ｗ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の細胞質ゾル集積の測定；および
（ｘ）Ｒａｎなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の核会合の測定
からなる群より選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４からなる群より選択される化合物。
【請求項４９】
療法Ｇタンパク質共役型シグナル伝達修飾ペプチドを哺乳動物に提供する方法であって、前記哺乳動物に、請求項４８の化合物を発現する発現構築物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５０】
過剰なＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項４８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達増進剤を同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する前記ペプチドライブラリーメンバーを選択し；
（ｄ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｅ）工程（ｃ）で選択した前記ペプチドライブラリーのメンバーと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｆ）工程（ｃ）で選択したペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｃ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項５２】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５３】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項５１の方法。
【請求項５５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項６０】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項５４の方法。
【請求項６１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項５４の方法。
【請求項６２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項５４の方法。
【請求項６３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項５１の方法。
【請求項６４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項５１の方法。
【請求項６６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項５１の方法。
【請求項６７】
請求項６６の方法であって、前記酵素連結免疫吸着アッセイが：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定し；
（ｂ）タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供し；
（ｃ）前記Ｇタンパク質共役型受容体に対して、少なくとも前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合する条件下で、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体を、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの存在下でインキュベーションし；
（ｄ）前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを取り除き；
（ｅ）前記の結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体を、前記抗体が前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合する条件下で、インキュベーションし；
（ｆ）未結合抗体を取り除き；そして
（ｇ）前記の結合した抗体を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項６８】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーであり、そして前記抗体が抗マルトース結合タンパク質抗体である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と前記シグナル伝達増進剤の相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項５１の方法。
【請求項７０】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７１】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７１の方法。
【請求項７３】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７４】
工程（ｄ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｃ）で選択された化合物の構造に基づく、候補化合物の集中的ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７５】
候補化合物の前記ライブラリーがペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７６】
候補化合物の前記ライブラリーが小分子ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７７】
請求項５１記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７８】
請求項６７記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７９】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項４８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項８０】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、請求項７８記載の化合物を投与することを含む、前記方法。
【請求項８１】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）Ｇタンパク質共役型受容体−化合物結合対を共結晶させ；
（ｃ）前記共結晶結合対をＸ線結晶学に供し；そして
（ｄ）前記共結晶結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８２】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）前記結合対を核磁気共鳴研究に供し；そして
（ｃ）前記結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８３】
Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナーを単離する方法であって：
（ａ）請求項７８の結合化合物を含む固体支持体を提供し；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナー化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）候補化合物の前記ライブラリーと、前記固体支持体を、前記化合物への前記候補化合物の結合が生じる条件下で接触させ；
（ｄ）未結合候補化合物および非特異的に結合した候補化合物を前記固体支持体から溶出し；そして
（ｅ）前記固体支持体から、結合した候補化合物を回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項８４】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８１の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８５】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８２の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８６】
請求項７７のペプチドをコードするＤＮＡを含む核酸であって、前記ＤＮＡが異種転写制御配列に機能可能であるように連結されている、前記核酸。
【請求項８７】
請求項８６の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８８】
請求項８７の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項８９】
請求項４８のペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項９０】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項８９の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［０００１］本出願は、先の同時係属仮出願第６０／２７５，４７２号、２００１年３月１４日出願に優先権を請求する、先の同時係属出願第０９／８５２，９１０号、２００１年５月１１日出願の一部係属出願である。
【０００２】
発明の背景
１．技術分野
［０００２］本発明は、一般的に、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の活性を調節する分野、並びに直接アゴニスト、間接的アゴニスト、完全アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアロステリック・アゴニストを含む、Ｇタンパク質共役型受容体アンタゴニストおよびアゴニスト化合物を同定し、そして調製する分野に関する。本発明はまた、ＧＰＣＲに結合して、ＧＰＣＲの特定のコンホメーションを安定化する化合物も含む。これらの化合物は、薬剤を発見する目的でリード化合物として、あるいはＸ線結晶学またはＮＭＲなどの方法によって、特定のコンホメーションのＧＰＣＲ三次元構造を研究するために、役立つことも可能である。本発明はまた、ＧＰＣＲに結合し、そしてＧＰＣＲが同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｇタンパク質（単数または複数）に接触する方式に影響を及ぼすことによって、ＧＰＣＲの機能を調節することも可能な小分子を、ハイスループット・スクリーニングを用いて同定するアプローチにも関する。ＧＰＣＲ調節剤を同定する第一の工程として、Ｇタンパク質を模倣するかまたはＧタンパク質に拮抗し、そして研究中の特定の受容体に高親和性で結合する、ペプチド類似体（ａｎａｌｏｇ）を同定する。次いで、これらのペプチドを特異性に関して試験する。最も特異的なペプチドを競合アッセイで用いて、例えば、（１）高親和性ペプチドの結合を増加させる（「スーパー・アゴニスト」）ことが可能であるか、または（２）おそらくＧＰＣＲでの結合に関して競合することによって、高親和性ペプチドの結合を減少させる（「アンタゴニスト」）ことが可能である、小分子または他のペプチドに関してスクリーニングする。
【背景技術】
【０００３】
２．背景技術の説明
［０００３］多数の化学的メッセンジャーが、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）に結合することによって、細胞に対して効果を発揮する。ＧＰＣＲには、広い範囲の生物学的活性受容体、例えばホルモン受容体、ウイルス受容体、増殖因子受容体、ケモカイン受容体、センサー受容体および神経受容体が含まれる。これらの受容体は、ＧＰＣＲ上の細胞外結合部位にリガンドが結合することによって活性化され、そして多様なＧタンパク質を通じて作用を仲介する。受容体およびＧタンパク質間に生じる分子相互作用は、特定の細胞性反応への環境シグナルの伝達の基礎である。
【０００４】
［０００４］Ｇタンパク質共役型受容体は、膜の細胞内側に、Ｇタンパク質結合ドメインを形成する、７つの膜貫通らせんを有する。リガンド結合によって受容体が活性化され、これによって受容体のコンホメーションが変化して、受容体の細胞内側のＧタンパク質結合部位が暴露されることが、実験によって示唆されている。細胞外環境から細胞内環境へのシグナルの伝達には、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の作用が必要である。受容体およびＧタンパク質間に生じる分子相互作用は、環境シグナルを特定の細胞性反応へと伝達する基礎である。ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、多部位様式でＧＰＣＲと相互作用し、接触の主要部位はＧαサブユニットのカルボキシル末端であると考えられている。Ｈａｍｍら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：８３２−８３５，１９９８；ＯｓａｗａおよびＷｅｉｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３１０５２−３１０５８，１９９５；Ｇａｒｃｉａら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：４４６０−４４６９，１９９５；Ｓｕｌｌｉｖａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１５１９−２１５２５，１９９４；Ｗｅｓｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：１４４２８−１４４３０，１９８５。
【０００５】
［０００５］不活性状態では、Ｇタンパク質は、１つのαサブユニット、１つのβサブユニットおよび１つのγサブユニット、並びに結合したデオキシグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）からなるヘテロ三量体である。リガンドが結合すると、ＧＰＣＲは活性化される。活性化された受容体のコンホメーションが変化することで、Ｇタンパク質の活性化が導かれ、続いてＧＤＰに対するＧαの親和性が減少し、ＧＤＰが解離して、そしてＧＴＰに置換される。ＧＴＰが結合すると、Ｇαは活性コンホメーションを採り、受容体から解離し、そして下流エフェクターを活性化する。Ｇタンパク質自体に触媒されてＧＴＰがＧＤＰに加水分解されると、Ｇタンパク質は基底不活性型に戻る。したがって、Ｇタンパク質は、受容体からエフェクターにシグナルを中継する中間体として、そしてまたシグナルの期間を調節する時計として、両方の二重の役割を果たす。多様な研究によって、受容体−Ｇタンパク質相互作用および選択性を仲介する際に、Ｇタンパク質αサブユニットのカルボキシル末端が関連すると見なされてきている。
【０００６】
［０００６］カルボキシル末端の１１アミノ酸が、受容体相互作用に、そしてこの相互作用の特異性に、最も重要である。Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３６１−３６６，１９９６；Ｋｏｓｔｅｎｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１４８７−１４９５，１９９７。しかし、Ｇα上の他の領域もまた受容体接触に関与する。Ｇβγ二量体の部分もまた、ＧＰＣＲ結合に関連すると見なされてきている。Ｏｎｒｕｓｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：３８１−３８４，１９９７；Ｌｉｃｈｔａｒｇｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：７５０７−７６１１、１９９６；ＭａｚｚｏｎｉおよびＨａｍｍ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３００３４−３００４０，１９９６；Ｂａｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２０７１−３２０７７，１９９７を参照されたい。Ｇαタンパク質のカルボキシル末端アミノ酸領域（およびヘテロ三量体Ｇタンパク質の他のＧＰＣＲ結合領域）は、受容体が仲介するＧタンパク質活性化の分子的基礎を提供するだけでなく、受容体活性化の忠実度を決定する際にも重要な役割を果たす。Ｃｏｎｋｌｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７４−２７６，１９９３；Ｃｏｎｋｌｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：８８５−８９０，１９９６。
【０００７】
［０００７］活性化ＧＰＣＲ（Ｒ＊）との相互作用において、Ｇｔのカルボキシル末端１１アミノ酸（アミノ酸３４０〜３５０）が関与していることが多くの研究から示唆されており、これには、（ａ）百日咳毒素がＣｙｓ０３４７のＡＤＰ−リボシル化を触媒し、これがＲ＊からＧｔを脱共役するという発見；（ｂ）Ｇｔのアミノ酸３４０〜３５０に対応するペプチドが、ＧｔからＲ＊を脱共役することも可能であり、そしてそれ自体、Ｒ＊に結合し、そしてＧｔの効果を模倣することも可能であるという発見；（ｃ）部位特異的突然変異誘発；および（ｄ）Ｒ＊との相互作用の際、特定の受容体への共役の特異性が、そのカルボキシル末端にあることの、関連Ｇタンパク質における立証が含まれる。
【０００８】
［０００８］Ｇタンパク質は、リガンド結合シグナルに対する細胞性反応の特異性および時間的特性を決定する際に、重要で、そして複雑な役割を果たす。ＨａｍｍおよびＧｉｌｃｈｒｉｓｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：１８９−１９６，１９９６。多数の受容体が、単一のＧタンパク質サブタイプを活性化させることも可能であり、そしていくつかの場合、単一の受容体が１より多いＧタンパク質を活性化させ、それによって多数の細胞内シグナルを仲介することも可能である。しかし、他の場合では、Ｇタンパク質と受容体の相互作用は、非常に選択的な方式で制御され、特定のヘテロ三量体のみが結合する。
【０００９】
［０００９］認識部位は、活性化分子が結合する、受容体上の正確な分子領域である。アゴニストは、受容体と相互作用し、そして生理学的反応を開始することも可能な内因性物質または薬剤である。薬剤は、内因性アゴニスト（すなわちホルモンまたは神経伝達物質）と同じ部位で、また異なる部位で相互作用することも可能である。隣接部位または異なる部位に結合するアゴニストは、アロステリック・アゴニストと称される。アロステリック結合部位に結合した結果、正常リガンドとの相互作用は、増進するかまたは減少することも可能である。アロステリック調節剤が受容体に誘導するコンホメーション変化は、古典的リガンドの結合ドメインだけでなく、受容体およびＧタンパク質間の相互作用に関与するドメインにも影響する。
【００１０】
［０００１０］視覚的系は、Ｇタンパク質シグナルが重要である系の一例である。網膜の桿体細胞は、光受容体の９５％を占め、そして光に非常に感受性である。桿体は、夜間または非常に薄暗い照明下での視覚を可能にする。桿体の視覚タンパク質ロドプシンは、桿体外節（ＲＯＳ）の円盤膜に存在する。ロドプシンは原型的なＧＰＣＲである。ＨｅｌｍｒｅｉｃｈおよびＨｏｆｍａｎｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２８６：２８５−３２２，１９９６；Ｍｅｎｏｎら，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：１６５９，２００１；Ｔｅｌｌｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：７７６１，２００１。ロドプシンは、リガンドに活性化されないため、ＧＰＣＲの中ではユニークである。
【００１１】
［０００１１］夜間の視覚は、生物が、薄暗い光の強度のわずかな相違を区別し、そして暗順応した際は、光のわずかな変化を検出する能力に関連する。ある人々は、目が完全に暗順応した際でも、夜間に見ることが、一貫して困難であると訴えている。こうした人々は、他の人々には容易に見える物体を検出できず、そして比較的明るい光源に短時間曝露されると、混乱し、そしてまた回復の遅れも示す。薄暗い照明空間での操縦および夜間の運転または飛行は、これらの個体に深刻な問題を提示する。さらに、ある個体は、夜盲症または真の夜盲を有し、これは、網膜感度測定に基づいて診断される。
【００１２】
［０００１２］全人口中の夜盲症発生率に関する明確なデータは入手可能でなく、これは、全人口の代表的サンプルに対して、測定が行われたことがないためである。選択群（例えば学童、軍人）の研究によって、正常集団には、ある割合で、視覚感度が低く、疾患または変性過程に関連する夜盲症を患う多くの個体と同程度に能力が劣るか、またはそうした個体より劣る個体が含まれることが示されている。例えば海軍軍人の約２パーセントは、これに基づく「夜盲」として、夜の職務に不適格とされていた。これはまた、加齢の疾患でもある。一般集団が高齢化するにつれ、夜盲の発生率が増加する。夜盲はまた：
（１）網膜色素変性症（疾患の初期段階では、暗順応が起こるものの、その速度が遅延する。疾患が進行するにつれて、桿体機能が次第に失われ、そして絶対刺激頂（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）が上昇する。１００，０００を超えるアメリカ人が網膜色素変性症を有し、そして網膜色素変性症の人々は大部分、４０歳までに盲目になる。Ｆａｒｒａｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１（５）：８５７−８６４，２００２）； 
（２）緑内障（緑内障では、初期には桿体感度が低下し、そして該感度が進行性に損なわれることが観察される。Ｃｕｒｓｉｅｆｅｎら，Ｄｏｃ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０３（１）：１−１２，２００１。緑内障は、米国における盲目の主要原因の１つであり、そして米国において最も迅速に増加しつつある群の１つである６０歳を超える個体においては、盲目の最も一般的な原因の１つである）；
（３）ＬＡＳＩＫ（最近の研究によって、ＬＡＳＩＫ手術を受けた患者のかなりの数（３０〜６０％）が、夜間視覚試験に落第することが示されている。Ｍｉｌｌｅｒら，ＣＬＡＯ  Ｊ．２７：８４−８８，２００１；Ｂｒｕｎｅｔｔｅら，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １０７：１７９０−１７９６，２０００）；
（４）薬剤の副作用（メチルテストステロン、キニジネシス、パラメタジオンおよびトリメタジオン（抗痙攣剤）、クエストラン（コレステロール低下剤）、アキュタン（抗にきび剤）、ヒドロキシクロロキン（抗マラリア剤）、ビデックス（ＨＩＶ）、およびネファゾドン（抗うつ剤）を含む、いくつかの薬物が夜盲を引き起こしうる）
を含むいくつかの疾患でも観察されている。したがって、夜盲に対する薬剤アプローチの有用性は明らかである。集団が高齢化するにつれて、影響を受ける個体の数は増加するであろう。
【００１３】
［０００１３］ヒト食餌ビタミンＡ欠損は、夜盲を引き起こす可能性もあり、そしてこれをビタミンＡ補充によって逆転させることも可能である。しかし、網膜色素変性症（ＲＰ）、白内障、糖尿病網膜症、および緑内障などの視覚疾患に関連する夜盲は、ビタミンＡ補充によって幾分押さえられる程度であり、こうした補充は疾患の経過を変化させない。網膜変性および視覚損失を引き起こす突然変異の多くは、光受容体カスケードタンパク質をコードする遺伝子中にあり；他の突然変異は、光受容体構造タンパク質をコードする遺伝子中にある。ＰａｎｇおよびＬａｍ，Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．１９：１８９，２００２。ロドプシン、ＰＤＥβ、またはＧαｔ中の突然変異が、異なる型の先天性定常夜盲で同定されてきている。Ｐｅｐｅ，Ｐｒｏｇ．Ｒｅｔｉｎ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２０：７３３−７５９，２００１。定常夜盲は、網膜変性には関連せず、そして暗所中で見る能力がないことに明示され；日中の視覚は、ほとんど影響を受けない。先天性定常夜盲（ＣＳＮＢ）は、桿体系の異常な機能に主に特徴付けられる、非進行性網膜障害の群を指す。同一突然変異を持つファミリーメンバー間であっても、臨床的不均一性があることから、遺伝的または環境的いずれかの修飾因子が、疾患の重症度に影響を及ぼす可能性が提起される。Ｇｏｔｔｌｏｂ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１２：３７８−３８３，２００１。
【００１４】
［０００１４］ロドプシン、Ｇαｔ、またはＰＤＥβの欠損から生じる夜盲において、桿体光受容体は、正常よりはるかに明るい光強度にのみ反応し、そして光に対する桿体の感度は、暗順応していない正常個体のものと同様である。白色点状眼底および小口病では、桿体光受容体は、薄暗い光に対して正常感度を達成することが可能であるが、正常個体において、ほぼ０．５時間で達成されるのに比較して、２時間以上の暗順応を必要とする。Ｄｒｙｊａ，Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１３０：５４７，２０００。これらの定常夜盲の型各々で、劣った桿体感度および暗順応の時間経過は、同定される遺伝子欠損に引き起こされることが知られるか、または引き起こされると仮定される生理学的異常と相関する。ロドプシンが光伝達カスケードを活性化する効力を増加させることは、夜盲に対する新規の薬理学的アプローチになりうる。活性化されたロドプシンは、桿体視覚Ｇタンパク質、Ｇｔを活性化し、Ｇｔは視覚伝達カスケードを活性化する。ロドプシンの有効なシグナル伝達を薬理学的に増加させると、人々が微光中で見て、そして機能する能力に有意に影響を与えうる。したがって、Ｇタンパク質共役型受容体がシグナル伝達する能力を増進させる小分子化合物を同定することが可能であれば、大きな利益になりうる。
【００１５】
［０００１５］Ｇタンパク質およびその受容体は、多数の異なる化学的リガンドに仲介される多数の細胞内シグナルに影響を及ぼすため、疾患病理を調節するかなりの潜在能力が存在する。多くの医学的に重要な生物学的プロセスは、Ｇタンパク質シグナル伝達経路およびその下流エフェクター分子に影響を受ける。Ｈｏｌｌｅｒら，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３４０：１０１２−１０２０，１９９９を参照されたい。Ｇタンパク質共役型受容体およびそのリガンドは、多くの薬剤製品のターゲットであり、そして熱心な薬剤発見努力の的である。過去１５年間に渡って、ＧＰＣＲをターゲットとするほぼ３５０の療法剤が市場に成功裡に導入されてきている。Ｇタンパク質が仲介するシグナル伝達系は偏在性の性質があり、そして非常に多数の病的状態に影響を及ぼすため、アゴニストおよびアンタゴニスト効果両方を含む、これらの系を調節する新規方法を見出すことが非常に望ましい。異なる効果を持つ、異なる個々のリガンドに反応した、ＧＰＣＲの三次元コンホメーションの研究は、ＧＰＣＲに対する特定の調節効果を与える特定の構造を持つ薬剤の検索および開発を補助するため、こうした研究を行う能力があることもまた、非常に望ましい。
【００１６】
［０００１６］薬剤受容体理論は、質量作用の法則に基づき、そして親和性（既定のいずれかの時点で、薬剤が受容体を占有する見込み）、薬剤またはリガンド濃度が関与する複合体会合を表す、固有効力（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ）（固有活性）、および受容体の活性化状態を含む。アゴニストとして分類される薬剤は、受容体と相互作用して、活性化された受容体の比率を改変し、こうして細胞活性を修飾する。慣用的なアゴニストは、活性化された受容体の比率を増加させ；逆アゴニストは比率を減少させる。直接アゴニストは受容体に作用し、一方、間接的アゴニストは、内因性アゴニスト（神経伝達物質自体）の作用を促進する。受容体活性化のアロステリック調節は、耐性の発展を回避する、新規アプローチである。
【００１７】
［０００１７］ＧＰＣＲに影響を及ぼす、現在利用可能な薬剤の大部分は、Ｇタンパク質共役型受容体およびその細胞外リガンド（単数または複数）間の結合に拮抗することによって作用する。一方、受容体サブタイプ選択的薬剤は、得ることが困難であった。リガンド結合に干渉する薬剤を設計する、古典的アプローチへのさらなる障害は、プロテイナーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ）などのいくつかのＧＰＣＲに特有の、受容体を酵素的に切断し、そして束縛されたリガンドを生成する機構のため、こうしたＧＰＣＲには、慣用的なアンタゴニストが無効であることであった。他の場合では、受容体の固有活性または恒常的活性が、直接、病理を導き、したがって、リガンド結合の拮抗が非現実的である。これらの理由から、ＧＰＣＲ活性化およびシグナル伝達の結果を遮断する、別のターゲットが非常に望ましい。異なるアゴニスト、アンタゴニストまたは他のリガンドの影響下でのＧＰＣＲの構造的コンホメーションの理解が進むこともまた、ＧＰＣＲに非常に特異的な効果を持つ化合物の設計を可能にする。
【００１８】
［０００１８］新規薬剤による阻害の別の潜在的なターゲットの１つは、形質膜内部の受容体−Ｇタンパク質界面であった。Ｋｏｎｉｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６８７８−６８８２，１９８９；Ａｃｈａｒｙａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６５１９−６５２４，１９９７；Ｖｅｒｒａｌｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：６８９８−６９０２，１９９７。Ｇαのカルボキシル末端およびＧタンパク質ヘテロ三量体の他の領域は、受容体の細胞質表面の結合部位とぴったり合わさる。Ｓｏｎｄｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３１１−３１９，１９９６；Ｓｏｎｄｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３６９−３７４，１９９６；Ｗａｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４０５−１４１２，１９９６；Ｍｉｘｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：９５４−９６０，１９９５；Ｌａｍｂｒｉｇｈｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６２１−６２８，１９９４；Ｌａｍｂｒｉｇｈｔら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３１１−３１９，１９９６；Ｓｏｎｄｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３６９−３７４，１９９６；Ｗａｌｌら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１４０５−１４１２，１９９６；Ｍｉｘｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：９５４−９６０，１９９５。これらの結合領域に対応するか、またはこれらの領域を模倣するペプチドは、受容体シグナル伝達を遮断するか、または受容体の活性アゴニスト結合コンホメーションを安定化させることも可能である。Ｈａｍｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：８３２−８３５，１９８８；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４９１２−１４９１９，１９９８。
【００１９】
［０００１９］例えば、桿体光受容体であるロドプシンの場合、ＧαＣ末端ペプチド、Ｇα３４０〜３５０は、受容体を活性メタロドプシンＩＩコンホメーションに安定化させる。Ｈａｍｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：８３２−８３５，１９８８；ＯｓａｗａおよびＷｅｉｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３１０５２−３１０５８，１９９５。ＧαＳ由来の２つのカルボキシル末端ペプチド（３５４〜３７２および３８４〜３９４）は、β２−アドレナリン作用性受容体への高親和性アゴニスト結合を誘発し、そしてこれらがＧαｓおよびアデニリルシクラーゼを活性化させる能力を阻害するが、Ｇαｉ２由来の対応するペプチドにはこうした作用はない。Ｒａｓｅｎｉｃｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２１５１９−２１５２５，１９９４。したがって、Ｇαのカルボキシル末端は、Ｇタンパク質反応の特異性を仲介するのに重要である。しかし、この現象をうまく利用する薬剤発見アプローチは、利用可能でない。Ｊｏｎｅｓら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ  ９（１２）：１６４１，１９９９。
【００２０】
［０００２０］一般的に、ＧＰＣＲは、活性化のため、アゴニスト結合を必要とする。しかし、いくつかの受容体では、アゴニストの非存在下であっても、基本的なシグナル伝達活性が生じうる（恒常的活性）。さらに、受容体アミノ酸配列を修飾すると、リガンドを必要とせずに、活性状態コンホメーションを安定化することも可能である。恒常的（アゴニスト独立）シグナル伝達活性が、突然変異体型および野生型（または天然）受容体両方に関して立証されてきている（Ｔｉｂｅｒｉおよび  Ｃａｒｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２７９２５−２７９３１，１９９４；Ｈａｓｅｇａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７１：１８５７−１８６０，１９９６）。ヒトにおいて疾患を引き起こす、いくつかのＧＰＣＲ、例えば甲状腺刺激ホルモン受容体（Ｖａｓｓａｒｔら，Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６６：２３−３０，１９９５）は、アゴニスト独立活性を示すことが見出されてきている。逆アゴニストは、受容体に結合し、そしてこの活性を抑制する剤である。
【００２１】
［０００２１］実験的に、いくつかの単一アミノ酸突然変異がアゴニスト独立活性を生じてきている。例えば、第三細胞質ループ中の単一の部位で突然変異された、β２およびα２アドレナリン作用性受容体は、恒常的活性を示す。Ｒｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１６４８３−１６４８７，１９９３；Ｓａｍａｍａら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：３９０−３９４，１９９４。いくつかの場合、ＧＰＣＲのカルボキシル・テールまたは細胞内ループが大きく欠失した突然変異が生じると、恒常的活性が導かれている。例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン受容体におけるカルボキシル末端の一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）欠失、またはトロンビン受容体の第二細胞外ロープにおける、より小さい欠失は、受容体を恒常的に活性にする。Ｎｕｓｓｅｎｚｖｅｉｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３８９−２３９２，１９９３；Ｍａｔｕｓ−Ｌｅｉｂｏｖｉｔｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１０４１−１０４７，１９９５；Ｎａｎｅｖｉｃｚら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１６１９−２１６２５，１９９５。
【００２２】
［０００２２］これらの発見は、伝統的な受容体理論の修飾を導いた。Ｓａｍａｍａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：４６２５−４６３６，１９９３。現在、受容体は少なくとも２つのコンホメーション、不活性コンホメーション（Ｒ）および活性化されたコンホメーション（Ｒ＊）で存在することが可能であり、そしてこれらの２つの状態間で平衡が存在し、大部分の受容体ではＲ＊よりＲが顕著に好まれると考えられている。いくつかの受容体（天然および突然変異体）では、アゴニストの非存在下で、シグナル伝達を開始するのに十分な数の受容体が活性Ｒ＊状態にあることを可能にする、平衡シフトが存在することが提唱されてきている。したがって、化学的または物理的外部刺激に反応して、ＧＰＣＲはコンホメーション変化を経て、ヘテロ三量体Ｇタンパク質の活性化を導き、該Ｇタンパク質が細胞内シグナル伝達事象を開始する。
【００２３】
［０００２３］いくつかの研究によって、多くのＧＰＣＲが、多数のコンホメーション状態で存在することと一致する特性を示すことが示唆されている。ロドプシンでは、多数の配座異性体が存在することが、吸光度変化から明らかである。Ｓａｋｍａｒ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１−３４，１９９８。中間体コンホメーションを通じた遷移によって、活性化が生じ、これらの型の間の平衡によって、特徴的なｐＨ感受性が示される。ＡｒｍｉｓおよびＨｏｆｆｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７８４９−７８５３，１９９３；ＶｏｇｅｌおよびＳｉｅｂｅｒｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：３５２９−３５３５，２００２を参照されたい。薬理学的研究によって、別個の受容体配座異性体が存在することが、機能的重要性を有しうることが示唆されている。ベータ・アドレナリン作用性受容体およびＧタンパク質の融合タンパク質の研究によって、部分アゴニストは、完全アゴニストによって安定化されるものとは別個のコンホメーション状態を安定化することが示唆されている。Ｓｅｉｆｅｒｔら，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７：１２１８−１２２６，２００１。
【００２４】
［０００２４］いくつかの受容体において、同一受容体に作用する異なるアゴニストが、「シグナル輸送」と呼ばれる現象である、下流経路の相対的活性化を導きうるという観察によってもまた、多数の活性受容体配座異性体集団が存在することが示唆される。Ｋｅｎａｋｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１６：２３２−２３８，１９９５；Ｂｅｒｇら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５４：９４−１０４，１９９８；Ｃｏｒｄｅａｕｘら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２８６６７−２８６７５，２００１；Ｍａｒｉｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４１１００−４１１１１，２００１。蛍光研究によってもまた、機能的に別個のアゴニストと複合体形成した際、異なる受容体コンホメーション集団が存在することが示唆されている。Ｇｈａｎｏｕｎｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４４３３−２４４３６，２００１。いくつかのＧＰＣＲにおいて、別個で、機能的に関連する配座異性体が存在することに関して、この裏づけが増えてきていることから、これらの受容体では、分子活性化機構が多数のコンホメーション間のスイッチングの手段を提供しているに違いないことが示唆される。結晶法およびＮＭＲなどの方法によって、これらの配座異性体を研究する方法は、特定の配座異性体を調節するかまたは安定化させることも可能な化合物を発見するプロセスにおいて、非常に有用であろう。
【００２５】
［０００２５］制御現象に関与するタンパク質−タンパク質相互作用は、可逆性であり、そしてタンパク質表面のわずかな部分のみが関与する傾向にある。一般的に、目的のタンパク質−タンパク質相互作用を遮断するペプチドを同定するため、天然相互作用タンパク質の１つのセクションを模倣することを試みて、特定のペプチドを合成するか、またはスクリーニング後にランダムペプチドライブラリーから活性配列を選択する。ペプチドは、アミノ酸配列で構成されるが、配列中に直鎖でコードされるＤＮＡの認識とは異なり、ペプチド結合は三次元構造に依存する。
【００２６】
［０００２６］視覚色素、ロドプシンは、Ｇタンパク質受容体ファミリーの最も広範に研究されているメンバーである。最近、結晶ウシ・ロドプシンのＸ線構造が解像度２．８Åで決定された。これによって、原型的なＧＰＣＲの構造−機能関係を分子レベルで理解する新たな道が開けた。ロドプシンは、円盤膜タンパク質の９０％以上を構成するため、円盤膜タンパク質に行う測定は、大部分は、天然環境下のロドプシンの特性を反映する。ロドプシンは、アポタンパク質オプシンおよび発色団１１−シス・レチナールからなる。オプシンは３４８アミノ酸からなり、約４０ｋＤａの分子量を有し、そして多様な長さの７つの膜貫通らせんおよび１つの短い細胞質らせんに折りたたまれる。レチニリデン発色団（ビタミンＡ１のアルデヒド）は、プロトン化シッフ塩基を介してらせん７のＬｙｓ−２９６に共有結合され、そして受容体を不活性コンホメーションに維持する。
【００２７】
［０００２７］光を吸収すると、発色団が迅速に１１−シスから全トランスに異性化し、これがオプシン部分の一連のコンホメーション変化を誘導する。この反応は、高い効率（量子収率０．６７）で起こり、そして主な光産物、フォトロドプシンが非常に短時間で（２００ｆｓ）形成される。続いて、フォトロドプシンは、数ピコ秒以内に熱的に弛緩して、歪んだ全トランス立体配置、バソロドプシンになる。ナノ秒の時間スケールで、バソロドプシンは青色シフト中間体と平衡を確立し、その後、混合物は崩壊してルミロドピシンを形成する。次いで、ルミロドプシンはメタロドプシンＩに変換され、そして続いて、Ｇタンパク質共役のための活性コンホメーションであるメタロドプシンＩＩに変換される。したがって、ロドプシンには、タンパク質の特定のアミノ酸のプロトン化によって調節される、２つのコンホメーション・スイッチがある：不活性メタＩ状態から活性メタＩＩ状態への遷移、および結合したレチナールの非存在下での、オプシンの不活性状態から活性状態への遷移である。現在のモデルによれば、受容体は、タンパク質の荷電基間の静電相互作用によって不活性コンホメーションに維持され、これは活性状態コンホメーションへの遷移に伴うプロトン取り込みによって無効にされる。
【００２８】
［０００２８］活性受容体種メタＩＩは、シッフ塩基の加水分解および受容体の解離によって、数分以内にアポタンパク質オプシンおよびレチナールへとゆっくりと崩壊する。研究者らは、オプシンが活性状態および不活性状態のｐＨ依存性コンホメーション平衡にあることを示した。中性ｐＨでのメタＩＩの崩壊中、メタＩＩ形成の構造変化の大部分は逆転し、そして崩壊産物オプシンは、最終的に、メタＩＩのものと類似の活性コンホメーションを採る。
【００２９】
［０００２９］ＧＰＣＲ活性化プロセスでは４つの別個の工程が観察可能である：（１）光子またはリガンド結合によるシグナルの生成；（２）膜を通じたシグナル伝達；（３）Ｇタンパク質との相互作用；および（４）二次メッセンジャーの活性化。各期で起こるプロセスの種類は明らかに異なるが、これらは別個で、そして独立しているというわけではない。例えば、リガンド結合およびＧタンパク質結合間のアロステリック効果が、いくつかのＧＰＣＲに関して観察されるとともに、アゴニストおよびアンタゴニスト結合の陽イオン依存性アロステリック制御が観察されている。Ｗｅｓｓｌｉｎｇ−ＲｅｓｎｉｃｋおよびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２４４４−１２４４７，１９８７；ＨｅｐｌｅｒおよびＧｉｌｍａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．１７：３８３−３８７，１９９２；Ｎｕｎｎａｒｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１２３８７−１２３９２，１９８７；Ｎｅｖｅ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３９：５７０−５７８，１９９１；Ｎｅｖｅら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３９：７３３−７３９，１９９１。
【００３０】
［０００３０］いくつかの細胞質タンパク質は、もっぱら光活性化型ロドプシン（Ｒ＊）と相互作用する。結晶構造によって、不活性型のロドプシンは細胞質タンパク質とは有意に相互作用しないことが示されているため、この構造は、Ｒ＊状態に関する間接的な情報のみを提供することが可能である。さらに、不活性ロドプシン構造の細胞質表面ドメインの２つの領域（アミノ酸残基２３６〜２３９および３２８〜３３３）は、結晶構造解析によって、完全には解明されていない。したがって、特定の配座異性体を安定化させうるツールは、ロドプシンなどのＧＰＣＲの構造を研究するのに有用であろう。
【００３１】
［０００３１］薬剤が、恒常的活性を示す受容体に結合し、そしてその活性を減少させると、負の拮抗作用が立証される。負のアンタゴニストは、受容体を不活性状態に束縛することによって作用するようである。Ｓａｍａｍａら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：３９０−３９４，１９９４。他の受容体系で最初に記載されたが、負の拮抗作用は、オピオイド、β２−アドレナリン作用性、セロトニン２Ｃ型、ブラジキニン、およびＤ１Ｂドーパミン受容体などのＧＰＣＲでも起こることが示されている。ＳｃｈｕｔｚおよびＦｒｅｉｓｓｍｕｔｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８２００−８２０６，１９９２；ＣｏｓｔａおよびＨｅｒｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７３２１−７３２５，１９８９；Ｃｏｓｔａら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：５４９−５６０，１９９２；Ｓａｍａｍａら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：３９０−３９４，１９９４；Ｐｅｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２６９９−２７０２，１９９４；Ｃｈｉｄｉａｃら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４５：４９０−４９９，１９９４；Ｂａｒｋｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１１６８７−１１６９０，１９９４；Ｌｅｅｂ−Ｌｕｎｄｂｅｒｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５９７０−２５９７３，１９９４；ＴｉｂｅｒｉおよびＣａｒｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２７９２５−２７９３１，１９９４。
【００３２】
［０００３２］言及されているように、恒常的活性型受容体の概念は、病理生理学的状態を説明する洞察を提供する。例えば、高血圧などの疾患プロセスにおいて、恒常的活性型受容体は、交感神経系の影響下にはもはやない可能性もある。高血圧では、恒常的活性型ＧＰＣＲが、脳、腎臓または末梢血管を含む、多数の領域で発現されている可能性もある。新規に認識された種類の薬剤（負のアンタゴニストまたは逆アンタゴニスト）は、望ましくない恒常的活性を減少させ、重要な新規療法剤として作用することも可能である。したがって、天然および突然変異ＧＰＣＲ両方の負のアンタゴニストを同定する（または負のアンタゴニスト化合物の結合が引き起こす、ＧＰＣＲにおけるコンホメーション変化を理解し、そして安定化させる）技術は、重要で、予測可能であるとともに、いまだに実現されていない薬剤適用を有する。さらに、少なくともいくつかの恒常的に活性であるＧＰＣＲは腫瘍原性であるため、これらのＧＰＣＲの負のアンタゴニストを同定すると、抗腫瘍薬剤および／または抗細胞増殖薬剤の開発につながりうる。
【００３３】
［０００３３］Ｇαｔのカルボキシル末端領域の突然変異誘発研究によって、この結合領域において、ロドプシンによるＧαｔ活性化に必須の、いくつかの特定のアミノ酸残基が同定されてきている。Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３６１−６，１９９６。Ｇαｑ由来の３〜５のカルボキシル末端アミノ酸を、Ｇαｉ由来の対応する残基で置換すると、もっぱらＧαｉサブユニットを通じてシグナルを伝達して、キメラαサブユニットを活性化し、そしてＧαｑエフェクターであるホスホリパーゼＣβを刺激する受容体となった。Ｃｏｎｋｌｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７４−２７６，１９９３；Ｃｏｎｋｌｉｎら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５０：８８５−８９０，１９９６。これらの研究はすべて、Ｇαカルボキシルペプチド配列が、個々のＧタンパク質のシグナル伝達反応の特異性に関与することを示唆する。１６のユニークなＧαサブユニット（Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、ＧαＯ１、ＧαＯ２、ＧαＺ、Ｇαｔ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４、Ｇαｓ、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１５／１６、ＧαＯＬＦおよびＧαｇｕｓｔ）が存在し、これらサブユニットが、数百がクローニングされている、異なるＧＰＣＲとの特異的相互作用を仲介すると考えられている。したがって、ＧＰＣＲに結合するＧタンパク質領域に対応するペプチドを、受容体−Ｇタンパク質相互作用の競合阻害剤として使用することも可能である。Ｈａｍｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１−８３２−８３５，１９８８；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４９１２−１４９１９，１９９８。しかし、この機会を利用する薬剤発見アプローチは、利用可能ではない。Ｊｏｎｅｓら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ  ９（１２）：１６４１−１６５４，１９９９。
【００３４】
［０００３４］例えば、最新のハイスループット・スクリーニングアッセイで使用するための潜在的なリード化合物の同定、および受容体分子の望ましい三次元コンホメーションに関する情報を用いた新規化合物のコンピュータによる設計は、最新の薬剤発見プロセスの重要な側面である。この種の方法を用いた際に直面される主な困難の１つは、潜在的な候補分子の非常に巨大なコンビナトリアル・ライブラリーから、有用な結合化合物を同定するのが困難であることである。文字通り、数十万の化合物をスクリーニングする際、結合、調節活性またはコンホメーション安定化に関して陽性である（偽陽性を含む）化合物を性質決定するのは、高価であり、そして時間がかかるプロセスである。したがって、ハイスループット・スクリーニングのための強力でそして有用なリード化合物、および三次元コンホメーション研究に有用な結合パートナーを同定することが可能であり、そしてスクリーニングプロセスにおける偽陽性の数を減少させる方法が、非常に望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３５】
発明の概要
［０００３５］したがって、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチドを同定する方法であって、天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、該ペプチドライブラリーをスクリーニングし；そして天然ペプチドより高い親和性で該Ｇタンパク質共役型受容体に結合する、該ペプチドライブラリーのメンバーを選択することを含む、前記方法を提供する。スクリーニングは、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関して、またはＧタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われることも可能である。
【００３６】
［０００３６］Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドは、Ｇタンパク質サブユニット、あるいは、例えば長さ約７〜約７０アミノ酸、または長さ約７〜約５５アミノ酸、または長さ約８〜約５０アミノ酸、または長さ約９〜約２３アミノ酸、そして最も好ましくは長さ約１１アミノ酸である、その断片であることも可能である。Ｇタンパク質サブユニット断片は、好ましくはＧαサブユニットまたはＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドであるが、別にＧβγ二量体であることも可能である。
【００３７】
［０００３７］スクリーニングは競合結合アッセイを含むことも可能であり、これは好ましくは、Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられ、例えばペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能であり、そして／またはＧタンパク質共役型受容体への結合が、Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、酵素連結免疫吸着アッセイにおけるものがある。
【００３８】
［０００３８］ペプチドライブラリーは、好ましくはコンビナトリアル・ペプチドライブラリーまたはタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーであり、例えばペプチドディスプレイライブラリーまたはマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである。
【００３９】
［０００３９］別の態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって、該Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドを提供し；該高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと競合する、該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の該ライブラリーをスクリーニングし；そして該高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で該Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の該ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が該高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の該ライブラリーのメンバーを同定することを含む、前記方法もまた、提供する。スクリーニングは、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して、またはＧタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われることも可能である。
【００４０】
［０００４０］Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドは、Ｇタンパク質サブユニット、あるいは、例えば長さ約７〜約７０アミノ酸、または長さ約７〜約５５アミノ酸、または長さ約８〜約５０アミノ酸、または長さ約９〜約２３アミノ酸、そして最も好ましくは長さ約１１アミノ酸である、その断片であることも可能である。Ｇタンパク質サブユニット断片は、好ましくはＧαサブユニットまたはＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドであるが、別にＧβγ二量体であることも可能である。
【００４１】
［０００４１］スクリーニングは競合結合アッセイを含むことも可能であり、これは好ましくは、Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられ、例えばペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能であり、そして／またはＧタンパク質共役型受容体への結合が、Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、酵素連結免疫吸着アッセイにおけるものがある。
【００４２】
［０００４２］候補化合物のライブラリーは、好ましくは、高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの構造に基づく、候補化合物の集中的（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーである。候補化合物のライブラリーは、コンビナトリアル・ライブラリー、例えば薬剤様分子のコンビナトリアル・ライブラリー、またはそのメンバーが、例えば高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの化学的構造に基づくことも可能な、集中的小分子ライブラリーであることも可能である。
【００４３】
［０００４３］本発明は、上述の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチドおよび化合物とともに、Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、こうした化合物を該細胞に投与することを含む、前記方法もまた提供する。やはり提供するのは、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を阻害する方法であって、該Ｇタンパク質共役型受容体が同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｇタンパク質に結合するのに干渉する化合物と、該Ｇタンパク質共役型受容体を接触させることを含む、前記方法である。
【００４４】
［０００４４］さらなる態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって、上述の方法の少なくとも１つにしたがって同定されたペプチドを提供し、ここで該ペプチドは検出可能なペプチドシグナルを提供するように標識されている；候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物のライブラリーを提供し；該ペプチドと該Ｇタンパク質共役型受容体を、該ペプチドが該Ｇタンパク質共役型受容体に結合する条件下で接触させ；未結合ペプチドを該Ｇタンパク質共役型受容体から取り除き；ペプチドが結合した該Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして該検出可能ペプチドシグナルを測定し；候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物の該ライブラリーのメンバーと、ペプチドが結合した該Ｇタンパク質共役型受容体を接触させ；ペプチドが結合した該Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして該検出可能ペプチドシグナルを測定し；該Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達活性が、該候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているか、そしてＧタンパク質共役型受容体ペプチド結合が、該候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているかを決定し；そしてペプチドが結合した該Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、該Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合増加、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達増加の両方を生じる化合物を同定し、ペプチドが結合した該Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、該Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合減少、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達減少の両方を生じる化合物を同定し、そしてペプチドが結合した該Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、上述の方法にしたがって同定されたペプチドの結合親和性増加を生じる化合物を同定することを含む、前記方法を提供する。ペプチドが結合した該Ｇタンパク質共役型受容体の該シグナル伝達活性を測定する方法は、イノシトールリン酸集積測定；細胞内Ｃａ２＋レベル測定；アデニルシクラーゼ活性測定；経内皮電気抵抗測定；ストレスファイバー形成測定；リガンド結合測定；受容体発現測定；受容体脱感作測定；キナーゼ活性測定；ホスファターゼ活性測定；核転写因子測定；遊走（走化性）すべての測定；スーパーオキシド形成測定；一酸化窒素形成測定；細胞脱顆粒測定；ＧＩＲＫ活性測定；アクチン重合測定；血管狭窄測定；細胞浸透性測定；アポトーシス測定；細胞分化測定；プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の膜会合の測定；プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の細胞質ゾル集積の測定；およびＲａｎなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の核会合の測定からなる群より選択されることも可能である。
【００４５】
［０００４５］さらなる態様において、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４からなる群より選択される化合物を提供する。
【００４６】
［０００４６］さらなる態様において、本発明は、療法Ｇタンパク質共役型シグナル伝達修飾ペプチドを哺乳動物に提供する方法であって、該哺乳動物に、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４からなる群より選択される化合物を発現する発現構築物を投与することを含む、前記方法を提供する。さらに、本発明は、過剰なＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４からなる群より選択される化合物を投与することを含む、前記方法を提供する。
【００４７】
［０００４７］さらなる態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達増進剤を同定する方法であって、天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、該ペプチドライブラリーをスクリーニングし；天然ペプチドより高い親和性で該Ｇタンパク質共役型受容体に結合する該ペプチドライブラリーメンバーを選択し；該Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；上で選択された該ペプチドライブラリーのメンバーと競合する、該Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の該ライブラリーをスクリーニングし；そして上で選択されたペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で該Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の該ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が、上で選択されたペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の該ライブラリーのメンバーを同定することを含む、前記方法を提供する。この態様で使用するスクリーニング法は、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して、またはＧタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することを含むことも可能である。Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドは、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片であることも可能であり、例えば長さ約７〜約７０アミノ酸、長さ約７〜約５５アミノ酸、長さ約８〜約５０アミノ酸、長さ約９〜約２３アミノ酸、または最も好ましくは長さ約１１アミノ酸のＧタンパク質サブユニット断片である。Ｇタンパク質サブユニット断片は、好ましくはＧαサブユニットまたはＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドであるが、別にＧβγ二量体であることも可能である。
【００４８】
［０００４８］スクリーニングは競合結合アッセイを含むことも可能であり、これは好ましくは、Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられ、例えばペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能であり、そして／またはＧタンパク質共役型受容体への結合が、Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、酵素連結免疫吸着アッセイにおけるものがある。
【００４９】
［０００４９］候補化合物のライブラリーは、好ましくは、高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの構造に基づく、候補化合物の集中的ライブラリーである。候補化合物のライブラリーは、コンビナトリアル・ライブラリー、例えば薬剤様分子のコンビナトリアル・ライブラリー、またはそのメンバーが、例えば高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの化学的構造に基づくことも可能な、集中的小分子ライブラリーであることも可能である。
【００５０】
［０００５０］本発明の方法で使用する酵素連結免疫吸着アッセイは、該Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定し；タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供し；該Ｇタンパク質共役型受容体に対して、少なくとも該Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合する条件下で、該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、固定されたＧタンパク質共役型受容体を、該Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの存在下でインキュベーションし；該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを取り除き；結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体を、該抗体が該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合する条件下で、インキュベーションし；未結合抗体を取り除き；そして結合した抗体を検出する工程を含むことも可能である。該タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーは、好ましくはマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーであり、そして該抗体は、好ましくは抗マルトース結合タンパク質抗体である。該Ｇタンパク質共役型受容体への結合は、好ましくは、該Ｇタンパク質共役型受容体とシグナル伝達増進剤の相互作用から生じるシグナルを測定することによって、決定される。
【００５１】
［０００５１］該ペプチドライブラリーは、好ましくはコンビナトリアル・ペプチドライブラリー、例えばタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリー、例えばマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーまたは適切なペプチドディスプレイライブラリーいずれかである。候補化合物のライブラリーは、好ましくは、天然ペプチドより高い親和性でＧタンパク質共役型受容体に結合するとして上で選択された化合物の構造に基づく、候補化合物の集中的ライブラリーである。ライブラリーは、ペプチドライブラリーまたは小分子ライブラリーであることも可能である。
【００５２】
［０００５２］さらなる態様において、本発明は、上述の方法によって同定される化合物を提供する。さらなる態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療する方法であって、どちらもこれらの化合物を投与することを含む、前記方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって、該Ｇタンパク質共役型受容体と、上述の方法の少なくとも１つによって同定された化合物を、結合が生じ、そして該Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；Ｇタンパク質共役型受容体−化合物結合対を共結晶させ；該共結晶結合対をＸ線結晶学に供し；そして該共結晶結合対の三次元構造を決定する、ここで該Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られることを含む、前記方法を提供する。さらなる態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって、該Ｇタンパク質共役型受容体と、上述の方法の少なくとも１つによって同定された化合物を、結合が生じ、そして該Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；該結合対を核磁気共鳴研究に供し；そして該結合対の三次元構造を決定する、ここで該Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られることを含む、前記方法を提供する。
【００５３】
［０００５３］さらなる態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナーを単離する方法であって、上述の方法の少なくとも１つによって同定された結合化合物を含む固体支持体を提供し；候補Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナー化合物のライブラリーを提供し；該候補化合物のライブラリーと、該固体支持体を、該化合物への該候補化合物の結合が生じる条件下で接触させ；未結合候補化合物および非特異的に結合した候補化合物を該固体支持体から溶出し；そして該固体支持体から、結合した候補化合物を回収することを含む、前記方法を提供する。
【００５４】
［０００５４］さらなる態様において、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって、上述の方法の少なくとも１つによって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして該原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで該候補構造は、該Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測されることを含む、前記方法を提供する。
【００５５】
［０００５５］さらなる態様において、本発明は、上述の方法の少なくとも１つによって同定されたペプチドをコードするＤＮＡを含む核酸であって、該ＤＮＡが異種転写制御配列に機能可能であるように連結されている、前記核酸、この核酸を含む発現ベクター、および該発現ベクターでトランスフェクションされた細胞を提供する。本発明はまた、上述の方法いずれかによって同定されたペプチドを特異的に認識する抗体、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００５６】
好ましい態様の詳細な説明
［０００８８］本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）およびその同族Ｇタンパク質（単数または複数）間の結合に干渉するか、またはその結合を増加させることが可能な化合物、並びにコンホメーション研究のため、ＧＰＣＲの特定のコンホメーションを安定化させる化合物を同定する方法を含む。これらの化合物は、Ｇタンパク質が仲介するシグナル伝達を調節し、そしてしたがって、薬剤として、潜在的に有用な薬剤を同定するリード化合物として、薬剤候補を同定するアッセイの構成要素として、あるいは例えばＸ線結晶学または核磁気共鳴などの既知の方法によるコンホメーション研究における結合パートナーとして、使用することも可能である。
【００５７】
［０００８９］スクリーニングおよび薬剤同定のための方法は、Ｇタンパク質のＧＰＣＲ結合領域の構造を模倣し、そしてしたがって、受容体−Ｇタンパク質相互作用を特異的に調節することが可能であるか、または高親和性で既定の受容体に特異的に結合するペプチドを用いる。これらの高親和性ペプチドは、発現構築物の背景で、細胞内に搬送されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで受容体が仲介する特定の細胞性反応のブロッカーまたはアゴニストとして作用することも可能であるし、あるいは患者に直接投与されることも可能である。該ペプチドはまた、伝統的な薬剤化合物を提供するか、または結合における構造−機能関係を研究するための、スクリーニング、同定および選択プロセスの基礎を形成する。特に、本発明は、特定のＧタンパク質の受容体−Ｇタンパク質界面で、化合物を遮断するかまたは模倣する高親和性類似体ペプチドを同定し、そしてこれらの高親和性類似体をハイスループット・スクリーニングで用いて、あるＧタンパク質またはＧタンパク質種のＧＰＣＲシグナル伝達と、同様に特異的に拮抗するか、またはこうしたシグナル伝達を特異的にアゴナイズする他のペプチドまたは小分子を同定することを可能にする。
【００５８】
［０００９０］小分子を類似のハイスループット・スクリーニングプロセスで使用して、さらなる化合物を同定することも可能である。「小分子」は、ＧＰＣＲの界面領域に結合するか、またはこうした結合に干渉するか、あるいはこうした作用の候補である、非ペプチド有機化合物いずれかを示す。ＧＰＣＲの特定の配座異性体に結合し、そして該異性体を安定化する、こうした分子もまた、本明細書において、「小分子」の定義に含まれる。本発明の方法を用いて、ＧＰＣＲを通じたシグナル伝達を使用して、生物学的プロセスを阻害するかまたは増進し、あるいは特定のＧＰＣＲ配座異性体に結合し、そして該異性体を安定化させる、受容体−Ｇタンパク質界面に向けられるペプチドまたは小分子を設計することも可能である。ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質界面の配座異性体に結合するか、その結合に干渉するか、または該異性体を安定化させる、こうした化合物（限定されるわけではないが、アゴニスト、逆アゴニスト、アロステリック・アゴニスト、ブロッカー、アンタゴニスト、阻害剤、負のアンタゴニスト、部分アゴニスト、および増進剤とともに、特定の配座異性体に結合しそして該異性体を安定化させる化合物を含む）は、「修飾剤」または「修飾」化合物と称され、そしてペプチドおよび小分子両方を含むことも可能である。薬剤設計に向けたこのアプローチは、入手可能なリガンドがないＧタンパク質−ＧＰＣＲ相互作用、リガンドが知られていないオーファン受容体、突然変異体恒常的活性化型受容体、グレーブス病におけるＴＳＨ受容体のように、抗体に架橋された不可逆的活性化型受容体、およびプロテイナーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ）をターゲティングするのに有用である。しかし、このアプローチは、いかなるＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用にも、そしてより広く、受容体−タンパク質相互作用一般で、同等によく働く。
【００５９】
［０００９１］該方法は、実質的にいかなるＧＰＣＲに結合し、そして増進するかまたは阻害することが可能な高親和性化合物を同定するのにも有用であるため、このアプローチは、特定の種のＧタンパク質が関連する機能障害または疾患を防止し、改善し、または修正することも可能な化合物を同定するのに有用である。ＧＰＣＲ増進剤および阻害剤が有用である状態および疾患状態には、限定されるわけではないが：脳卒中；心筋梗塞；再狭窄；アテローム性動脈硬化症；低血圧；高血圧；狭心症；急性心不全；心筋アポトーシス；癌；細菌、真菌、原生動物およびウイルス感染などの感染、並びに特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２に引き起こされる感染；敗血症ショック；疼痛；慢性アレルギー性障害；喘息；炎症性腸疾患；骨粗鬆症；関節リウマチ；グレーブス病；術後腸閉塞；尿閉；精巣中毒症；潰瘍；肥満；良性前立腺肥大；並びに不安症、癲癇、統合失調症、躁うつ病、パーキンソン病、アルツハイマー病、せん妄、痴呆症、薬物嗜癖、食欲不振、過食、気分障害および睡眠障害を含む、精神病および神経学的障害；禁煙、並びにＧタンパク質共役型受容体阻害によって治療可能な他の疾患または状態いずれか、並びにＧタンパク質共役型受容体活性化によって治療可能な他の疾患または状態いずれかが含まれる。多様なＧタンパク質が結合する受容体は、非常に異なっているため、異なるＧＰＣＲ、あるいは異なるＧＰＣＲ種またはＧＰＣＲ群に特異的に干渉することが可能な類似体ペプチド集団を生成することが可能になることから、この広範囲な組の障害の治療が可能である。上に列挙したような、多様な疾患および状態に対する、Ｇタンパク質およびＧタンパク質シグナル伝達の関係が、当該技術分野に知られる。
【００６０】
［０００９２］本発明のスクリーニング法を用いて、特定のスクリーニングで同定される配列は、すべての受容体に結合するのではなく、目的の特定の受容体にのみ結合する。Ｇタンパク質およびＧＰＣＲの間の相互作用は、非常に特異的である。例えば、Ｇαｉ１／２ペプチドがＡ１アデノシンＧタンパク質共役型受容体−Ｇタンパク質界面に結合する能力を、１つのアミノ酸を相違させて、実質的に減少させるか、または除去することも可能である。Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１４９１２−１４９１９，１９９８。Ｇタンパク質上のＧＴＰ／ＧＤＰ交換の上流制御、およびＧタンパク質が仲介するエフェクター活性化はどちらも、界面結合化合物で阻害可能である。したがって、１つのＧＰＣＲの特定の作用に特異的に干渉するか、またはこうした作用を安定化させるように、高親和性類似体ペプチドを設計することも可能である。同様に、アゴナイズペプチドまたは増進ペプチドもまた、１つのＧＰＣＲに特異的に影響を及ぼすことも可能である。これらの特異的に作用するペプチド類似体は、薬剤化合物自体としても、そしてまた同じ特異的ＧＰＣＲ相互作用を有する他のペプチドおよび小分子結合剤に関する最新のハイスループット・スクリーニングにおける強力なリード化合物としても、有用である。
【００６１】
［０００９３］本発明は、１つの態様において、第一の工程として、受容体がヘテロ三量体Ｇタンパク質と相互作用する能力を増進するかまたは阻害する小分子に関するスクリーニングに頼る。ロドプシンおよびトランスデューシンを用いたスクリーニングによって、ロドプシンが、ロドプシンの活性化型であるＭＩＩを形成する能力を、有意に増進させる小分子が発見されてきた。こうした小分子は、夜盲に有効な、潜在的な療法剤へと向けられる、薬剤発見努力において、リード化合物として働くことも可能である。スクリーニングを用いて小分子を同定し、そして次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ解析を用いて同定される化合物を試験すると、強力な高親和性化合物が発見されるであろう。
【００６２】
［０００９４］したがって、本発明を用いて、ロドプシンがシグナル伝達する能力を増進する小分子を同定することも可能である。本発明の方法は、１つの態様において、化合物ライブラリーをスクリーニングして、活性化されたロドプシンへのＧタンパク質ペプチドの結合を増加させる、より多くの分子を発見することを含む。該方法はまた、いくつかのアッセイにおいて、これらの分子を試験して、ＭＩＩ安定化、グアノシン５’−Ｏ−（３−［３５Ｓ］チオ）三リン酸（ＧＴＰγＳ）結合、および３’，５’環状ＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）活性化を含む、ロドプシン・シグナル伝達に対する影響を決定することも含む。
【００６３】
［０００９５］さらに、該方法は、やはりＧｔに共役することが示されている、別のＧＰＣＲ、例えばヒト・トロンビン受容体（ＰＡＲ１）を用いて、小分子の影響を測定することによって、特異性に関して小分子を試験することを含む。Ｓｅｉｂｅｒｔら，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．４２：５１７，１９９９。野生型マウスおよび突然変異体マウスの網膜電図写真（ＥＲＧ）を用い、本発明の方法にしたがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの視覚の感受性の増進を試験することも可能である。Ｃｈａｎｇら，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．４２：５１７−５２５，２００２。本発明の方法はまた、場合によって、増進剤またはアンタゴニストの化学構造を最適化し、発見した化学実体の薬物動態学的研究、毒性学的研究および代謝研究、並びに広い動物有効性研究、および夜盲の薬理学的治療に関する臨床試験を行うことも含む。したがって、本発明の方法を用いて、例えば、光活性化型ロドプシンに対する高親和性Ｇｔペプチドの結合を増進する小分子を同定し、該小分子がｉｎ  ｖｉｔｒｏでロドプシン・シグナル伝達を増進するかどうかを決定し、該小分子がロドプシンに特異的であるかどうか、または該小分子が他のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質シグナル伝達事象を増進可能であるかどうかを決定し、そして該小分子を、定常夜盲のマウスモデルにおいて、ＥＲＧで測定した際の、視覚の感度増進に関して試験することも可能である。
【００６４】
［０００９６］第一の工程は、光活性化または暗順応ロドプシンいずれかに高親和性で結合するＧｔのＣ末端に基づく配列を持つペプチドを同定することであった。次いで、これらのペプチド類似体を、他のＧＰＣＲに対比して、ロドプシンに結合する特異性に関して、それとともに該受容体のＭＩＩコンホメーションを安定化する能力に関して試験した。本発明の方法はまた、光活性化型ロドプシンに結合し、そしてそうすることによって、高親和性ペプチド類似体の結合を増進する小分子も同定する。化合物の結合親和性（ＥＣ５０）は、成功する薬剤候補の最初の判断基準である。同定された小分子を、ＭＩＩ安定化およびＭＩＩ崩壊、ＧＴＰγＳ結合、およびＰＤＥ活性化などのアッセイを用いて、ロドプシン・シグナル伝達を増進する能力に関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験する。
【００６５】
［０００９７］活性化に際して、ロドプシンはコンホメーション変化を経て、これによって、Ｇｔとの相互作用およびＧｔの活性化が可能になり、最終的にＰＤＥの刺激につながる。光活性化型ロドプシンへのＧｔの結合は、高親和性受容体状態を誘導し、これは、受容体の活性シグナル伝達メタロドプシンＩＩ状態の安定化によって、分光光度的に測定可能である。スプリット・ビームＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  ＤＷ２０００分光光度計を用いて、例えば、受容体が、光活性化後に、適切なコンホメーション変化を経るかどうかを決定することも可能である。このアッセイは、受容体のコンホメーションに作用する小分子を示す。ロドプシンの活性中間体、メタロドプシンＩＩ（ＭＩＩ）が、小分子の存在によって安定化される場合、受容体の活性化エネルギーが低下する。本発明のアッセイ系を用いて、通常は必要とされるヘテロ三量体Ｇタンパク質なしに、受容体が活性ＭＩＩコンホメーションを採ることを可能にする化合物が同定された。「増進剤」は、受容体の活性（シグナル伝達）コンホメーションを安定化させる。「阻害剤」は、トランスデューシンのロドプシンへの結合を遮断し、そしてこうして、アゴニスト（光）およびＧタンパク質の存在下であっても、受容体が適切なコンホメーションを採るのを阻害する。
【００６６】
［０００９８］メタロドプシンＩＩ崩壊を用いて、ＭＩＩ崩壊の変化によって、化合物有効性の相違を調べることも可能である。相違は、化合物がＭＩＩのレチナール・シッフ塩基連結に非特異的に付着する影響による可能性があると仮定することも可能である。したがって、個々の化合物の存在下で、時間に依存するＭＩＩ崩壊を比較することも可能である。受容体活性化の過程で、ＧαｔサブユニットはＧＴＰ分子に結合する。ＧＴＰγＳ結合アッセイは、受容体がシグナル伝達する能力を決定することも可能であり、ＧＴＰγＳ結合の増加は、受容体が仲介する、αサブユニットからのＧＤＰの遊離およびそれに続くＧＴＰの結合の指標となる。不活性トランスデューシン（Ｇｔ・ＧＤＰ）から活性状態（Ｇｔ・ＧＤＰ）への変換には、ＧβγからのＧαの解離が付随する。次いで、遊離Ｇαｔ・ＧＴＰがｃＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）に結合し、そして２つの阻害性γサブユニットを解離させることによって、該酵素を活性化する。その結果、活性化されたＰＤＥ（ＰＤＥ＊）の遊離した触媒性αサブユニットおよびβサブユニットがｃＧＭＰをＧＭＰに変換することが可能である。したがって、ロドプシン・シグナル伝達に影響を及ぼす化合物を、ＰＤＥアッセイに対する影響に関して試験することも可能である。
【００６７】
［０００９９］一般的に、高親和性ペプチド融合タンパク質を競合して解離させるのに用いた際に、適切な用量曲線を示して、ロドプシンに対する結合に関してＥＣ５０＜１００μＭを生じる小分子は、続く研究に適しており、そしてＭＩＩを安定化する能力に関して、こうした小分子を試験する。好ましくは、ＭＩＩ安定化に関して、ＥＣ５０＜１０μＭのものをさらに解析する。さらなる解析には、小分子の存在下でのロドプシンの熱安定性（ＭＩＩ崩壊）、およびＧＴＰγＳ結合（機能に対する小分子の影響に関するアッセイ）が含まれることも可能である。ＧＴＰγＳ結合速度は、Ｇαサブユニットの律速ＧＤＰ遊離によって調節される。天然Ｇαｔは、Ｇβγｔの存在下または非存在下で、非常にゆっくりした固有のＧＤＰ遊離速度を示す。したがって、グアノシン５’−Ｏ−（３−［３５Ｓ］チオ）三リン酸（ＧＴＰγＳ）結合の増加は、受容体が仲介する、αサブユニットからのＧＤＰの遊離およびそれに続くＧＴＰの結合を示す。
【００６８】
［０００１００］ＧＴＰγＳ結合アッセイを以下のように、または当該技術分野に知られる方法いずれかを用いて行うことも可能である。単独のＧαサブユニット（１ｍＭ）、またはアッセイしようとする小分子の存在下のＧαサブユニットを、２ｍＭ  Ｇβγｔまたは２ｍＭ  Ｇβγｔおよび尿素洗浄ＲＯＳ膜（５００ｎＭロドプシン）と混合し、そして２５℃で３分間インキュベーションする。５ｍＭ  ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．１ｍＣｉ）の添加によって、結合反応を開始することも可能である。５０μｌのアリコットをいくつかの時点で抜き取り、１３０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する１ｍｌの氷冷２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・２ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液と混合し、そしてＷｈａｔｍａｎＴＭ硝酸セルロースフィルター（０．４５ｍｍ）を通過させる。同じ緩衝液（３ｍｌ、氷冷）でフィルターを３回洗浄し、そして３ａ７０Ｂ混合物中に溶解した後、液体シンチレーションカウンター中でカウントする。本発明とともに使用可能な典型的な方法に関しては、Ｓｋｉｂａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４１３−４２４，１９９６を参照されたい。当業者は、アッセイに行うことも可能な変動および調整を認識するであろうし、そしてこうした変動は、本発明の範囲内であると見なされる。結合反応に関するｋａｐｐ値は、等式、ＧＴＰγＳ結合（結合％）＝１００％（１−ｅ−ｋｔ）にデータを当てはめることによって計算可能である。小分子（単数または複数）を、ＰＤＥ活性化に影響を及ぼす能力に関して試験することもまた可能である。ＰＤＥγへのＧｔα結合は、ＰＤＥの触媒性αサブユニットおよびβサブユニットに対するガンマ・サブユニットの阻害効果を取り除き、そしてこれらのサブユニットの加水分解活性がほぼ３００倍増加することを可能にする。
【００６９】
［０００１０１］Ｃｅｒｉｏｎｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２３７：４０９−４２３，１９９４によって記載されるように、２０℃での蛍光分光を用いて、ロドプシンによるＧｔαの活性化を、小分子の存在下または非存在下で監視することも可能である。このアッセイは、照明に際して野生型ロドプシンに触媒される、Ｇα：ＧＴＰγＳ（トランスデューシンのサブユニットおよびＧＴＰγＳ間の複合体）形成速度を測定する。励起波長は２９５ｎｍ（２ｎｍバンド幅）であり、そして蛍光発光を３４０ｎｍ（１２ｎｍバンド幅）で監視する。簡潔には、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．２）、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、および０．０１％  ｎ−ドデシルβ−マルトシドを含有する反応混合物中、ロドプシン（４０ｎＭ）をＧｔ（２５０ｎＭ）の溶液に添加する。溶液を３００秒間攪拌して平衡にする。ＧＴＰγＳ（５μＭ）を最終濃度５μＭになるよう反応混合物に添加して、そして蛍光の増加をさらに２０００秒間追跡する。活性化速度を計算するため、最初の６０秒間を含むデータポイントを通じて、ＧＴＰγＳ添加後の最初の蛍光増加の傾斜を決定した。化合物なしを１．００として、野生型ロドプシンに関して得た値に対して、小分子の存在下での値を規準化することも可能である。これらのアッセイにおいて、ロドプシンに直接作用するようである分子、または当業者に容易に明らかとなるこれらのアッセイ上の変動を、次のレベルの試験に採用する。他のＧＰＣＲに仲介されるプロセスに影響を及ぼすことなく、ロドプシン−トランスデューシン・シグナル伝達を特異的に調節する能力に関してもまた、小分子をアッセイする。
【００７０】
［０００１０２］好ましい小分子「増進剤」および「阻害剤」は、受容体に関してだけでなく、受容体−Ｇタンパク質相互作用に関しても、ユニークに特異的である。１０００を超えるＧＰＣＲが存在し、そしてありとあらゆるＧＰＣＲに対する化合物の影響を個々に決定する単純な方法はないため、いくつかの選択されたそして代表的なＧＰＣＲシグナル伝達系を試験することも可能である。Ｇｔとヒト・トロンビン受容体（ＰＡＲ１）の機能する共役が立証されてきている。Ｓｅｉｂｅｒｔ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６６（３）：９１１−９１６，１９９９。ＰＡＲ１に対する影響に関する試験には、小分子（単数または複数）が、アデニリルシクラーゼ活性、カルシウム流入、およびイノシトールリン酸集積などの、トロンビンが仲介するシグナル伝達事象に対する影響を有するかどうかを決定することが含まれることも可能である。ＰＡＲ１または他のＧＰＣＲへの機能的共役に関する他の試験が当該技術分野に知られ、そしてやはり使用可能である。
【００７１】
［０００１０３］基質として［α−３２Ｐ］ＡＴＰ（１ｍＭ；１２０〜４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、そして［２，８−３Ｈ］ｃＡＭＰ（２ｍＭ；２００，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を用いて、最終体積５０μｌ中でアデニリルシクラーゼ活性を測定し、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５中の５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１００μＭパパベリン、１μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、並びに２０ｍＭクレアチンリン酸および１２０単位クレアチンホスホキナーゼ／ｍｌからなるＡＴＰ再生系を含有するアッセイ混合物において、回収を監視することも可能である。ＡＴＰおよびｃＡＭＰの濃度を、それぞれ１５．４および１４．６ｍＭ１ｃｍ−１のε値を用いて、２５９ｎｍで、分光光度法で測定することも可能である。タンパク質の添加によってアッセイを開始することも可能であり、そして３７℃で１０分間インキュベーションした後、２体積の停止溶液（２％  ＳＤＳ／４５ｍＭ  ＡＴＰ／１３ｍＭ  ｃＡＭＰ）で反応を停止する。次いで、試料を加熱し（例えば１００℃に３分間）、そして形成された環状［α−３２Ｐ］ＡＭＰを回収することも可能である。その開示が本明細書に援用される、Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２５６７２−２５６７９，２００１を参照されたい。最後に、その開示が本明細書に援用される、Ｃｈａｎｇら，Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ．４２：５１７−５２５，２００２に記載されるように、夜盲の動物モデルにおいて、先の工程を通過した化合物を試験することも可能である。
【００７２】
［０００１０４］ｉｎ  ｖｉｖｏ系において、光反応に対する小分子の影響を評価するため、小分子（単数または複数）に曝露されたマウスの網膜電図写真を用いて、ａ波およびｂ波両方の振幅を測定することも可能である。相対光強度の対数に対して振幅をプロットすると、化合物が桿体シグナル伝達にのみ影響を及ぼしているかどうかが示される。正常範囲内で閾値ｂ波を誘発するための感度もまた測定可能である。突然変異体動物もまた、試験して、野生型ロドプシン・シグナル伝達に対する増進剤の影響だけでなく、夜盲の動物に対する影響も観察することも可能である。
【００７３】
［０００１０５］試験しようとする小分子を無菌ＰＢＳに溶解し、そして点眼剤として投与することも可能である。最初の結果が陰性であった場合、ＩＶまたはＩＭ注射を用いて、実験を反復することも可能である。最も見込みのある候補は、同定された化合物からリード化合物に進めるのに必要な工程を経る。このアプローチは、夜盲に対する薬理学的治療であって、遺伝子治療、レーザー切除および網膜交換などのより侵襲性の処置に対する必要性を回避する、前記治療を同定する。
【００７４】
［０００１０６］タンパク質間の相互作用部位をマッピングすることは、界面領域に相当する合成ペプチドを用いて、２つのタンパク質間の界面の一部を同定することを伴う。ペプチドは、相互作用の競合阻害剤として作用することから同定される。ｔｒＮＯＥＳＹを用いた、結合コンホメーションにあるペプチド構造のＮＭＲ研究を、相互作用のため最低限必要な構造を定義する、置換ペプチド類似体活性の解析と組み合わせて、ロドプシン−トランスデューシン相互作用とともに、Ｇタンパク質−エフェクター相互作用の構造的基礎を理解するために用いた。ＧｔのＣ末端に相当するペプチドを用いて、ロドプシンを活性コンホメーション（ＭＩＩ）または不活性コンホメーションに安定化することも可能である。ヘテロ三量体Ｇタンパク質の三次元構造によって、Ｇタンパク質αサブユニットの最後の７アミノ酸は構造化されていないことが明らかになり、これは、αサブユニットのこの領域が、適合が誘導された活性化受容体の細胞質表面への結合に必須であることを示している。単一アミノ酸の相違が、親和性に１０００倍の影響を及ぼすことも可能であるため、この相互作用は非常に特異的である。
【００７５】
［０００１０７］ハイスループット・スクリーニングは、薬剤業界内で最初に開発されてきた、最近の技術である。この技術は、新規生物学的ターゲットが多量に生じ、そして変化を伴う商業環境において、薬剤業界が新規薬剤を迅速に生成する必要があることに応じて、出現してきた。この開発は、新規機器の発明によって、新規アッセイ法によって、そして莫大な数のデータポイントを効率的に取り扱うことを可能にするデータベースが利用可能になったことによって、補助されてきた。ハイスループット・スクリーニングを、コンビナトリアル・ケミストリー、合理的設計、および実験法の自動化と組み合わせることによって、一度に１つの化合物を扱う伝統的なアプローチに比較して、有意に加速された薬剤発見プロセスが導かれてきた。スクリーニングは、手動で行われることも可能であるが、時間および労働を節約する手段として、化合物ライブラリーをロボット・スクリーニングすることが好ましい。
【００７６】
［０００１０８］薬剤発見プロセスの１つの重要な側面は、強力なリード化合物の同定である。試験のため、化合物を純粋にランダムに選択しても、既定の受容体に対して多くの活性化合物が得られる可能性は低い。典型的には、製薬会社は、スクリーニングあたり、１００，０００以上の化合物をスクリーニングして、およそ１００の潜在的なリード化合物を同定する。平均して、これらの化合物の１つまたは２つのみが、実際にリード化合物シリーズを生じる。したがって、企業は、有用な化合物の検索において、ますます多数のデータセットをアッセイしてきている。次いで、化合物のアクセス可能性が課題となる：歴史的な化合物コレクションは、サイズおよび入手可能性が限定されている。対照的に、要求に応じて、巨大なコンビナトリアル・ケミストリー・ライブラリーを合成することも可能であるが、かなりの技術的困難があり、そして費用がかかる。ライブラリーサイズが拡大するにつれて、これらの非常に巨大なコンビナトリアル・ライブラリーから望ましい化合物を選択するのが困難になる。文字通り、数十万の化合物をスクリーニングする際、特に多くの「ヒット」が偽陽性であることが判明する場合には、候補リード化合物を性質決定するのは、高価であり、そして時間がかかるプロセスとなる。
【００７７】
［０００１０９］本明細書に記載する薬剤発見プロセスに対する多工程アプローチは、これらの問題の多くに解決策を提供する。本発明の１つの態様は、Ｇタンパク質αサブユニット・カルボキシル末端の特性を利用して、Ｇタンパク質／ＧＰＣＲ相互作用の高親和性の競合阻害剤またはアゴニストとして作用するペプチドを同定することである。しかし、該方法は、いかなる特異的タンパク質−タンパク質、タンパク質−小分子、タンパク質−核酸相互作用などでも使用可能である。さらに、ＧＰＣＲ結合に関与するＧαサブユニットの領域いずれか、またはＧβγ二量体の領域いずれかに基づくペプチドも、同様に使用可能である。多くのこうしたＧＰＣＲ結合領域が当該技術分野に知られる。高親和性競合剤の同定は、潜在的に有用な薬剤を試験する、特異的高親和性リード化合物を提供することによって、ハイスループット・スクリーニングの不都合な点の多くを克服するスクリーニング法および選択法の第一の工程を形作る。この方法で選択されたペプチドは、結合パートナーに対して天然タンパク質より１，０００倍以上高い親和性を有するため、この工程は、有用な薬剤化合物をスクリーニングし、そして同定するのに成功する、１つの鍵である。
【００７８】
［０００１１０］好ましいプロセスの次の工程は、第一の工程で同定された高親和性リードペプチドに対する、候補ペプチドまたは小分子薬剤化合物のハイスループット・スクリーニングを含む。リードペプチド化合物は、望ましい受容体に対する強力でそして特異的な結合剤であるため、スクリーニングアッセイは、該ペプチドの結合を減少させうる化合物（「ブロッカー」）または該ペプチドの結合を増加させる化合物（「アゴニスト」）に関して試験する。ペプチドが特異的受容体−Ｇタンパク質結合に必要な工程すべてを模倣するよう働くため、該アッセイ系によって、結合および機能の両方を同時に測定することが可能になる。この部位を用いることによって、この系は、有用な親和性（ｎＭからμＭ範囲）で結合する候補化合物の同定だけでなく、その選択法の長所によって、Ｇタンパク質結合を増加させるかまたは減少させることによって機能に影響を及ぼす候補化合物の同定も容易にする。偽陽性化合物の数、および結合剤と同定されるが低親和性でしか結合しない化合物の数が減少するか、または実質的になくなるため、薬剤発見プロセスのハイスループット・スクリーニング工程は、非常に単純化される。成功の可能性が高い化合物のみがスクリーニングによって同定されるため、有用な化合物を直接同定可能であり、そして特異的で強力な薬剤化合物であることを確認するために性質決定しそしてさらに研究する必要がある化合物ははるかにより少なくなる。さらに、該方法は、目的の正確な部位に直接結合することを通じて化合物を同定するため、新たに同定された薬剤化合物の結合機構および作用機構を発見し、そして別のプロセスによって後で確認する必要がない。
【００７９】
［０００１１１］本発明にしたがって、同定された高親和性ペプチドを用いて、ＧＰＣＲ逆アゴニストを同定することもまた可能である。本発明の方法の第一の工程で同定される高親和性ペプチドは、受容体に結合し、そして受容体を活性コンホメーションまたはＲ＊コンホメーションに安定化させる。強力なアゴニストを同定するために使用するスクリーニングは、この結合と競合し、そしてまた、ＧＰＣＲをＲ＊状態に安定化することが可能な化合物を探し出す。一方、逆アゴニストは、ＧＰＣＲを不活性状態またはＲ状態に安定化させる。したがって、高親和性ペプチドの解離またはＧＰＣＲに対する親和性の減少を検出するよう設計されたスクリーニングを用いて、逆アゴニストを同定する。
【００８０】
［０００１１２］本説明は、Ｇタンパク質共役型受容体およびその同族Ｇαタンパク質間の相互作用に関連する例を提供するが、この方法論を用いて、特にＧＰＣＲおよびＧαまたはＧβγ  Ｇタンパク質サブユニットの領域いずれかの間の相互作用いずれかを含む、大部分のタンパク質−タンパク質相互作用のペプチド阻害剤を同定することも可能である。この方法によって選択される高親和性ペプチドをハイスループット・スクリーニングで用いて、多様な特異的生物学的プロセスの調節剤として使用可能な小分子を同定することも可能である。
【００８１】
［０００１１３］非常に高親和性のペプチドＧＰＣＲブロッカーを産生するため、例えばｔｒＮＯＥＳＹ（ＮＭＲ）を用いて、受容体に結合したコンホメーションの野生型Ｇαカルボキシル末端ペプチドまたは他のＧＰＣＲ結合ペプチドいずれかの三次構造を研究することも可能である。Ｄｒａｔｚら，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：２７６−２８０，  １９９３。これらの種の研究から得られるＧタンパク質領域の構造データを、置換ペプチド類似体の活性解析と組み合わせて、ペプチドまたはリガンドいずれかとＧＰＣＲの相互作用の最低限の構造上の必要条件を定義する。以下の実験系は、受容体−Ｇタンパク質相互作用を定義するのに使用可能な系の例である：（ｉ）網膜桿体細胞におけるロドプシン−トランスデューシン（Ｇαｔ）、（ｉｉ）Ｃ６神経膠腫細胞におけるβ−アドレナリン作用性受容体−Ｇαｓ、（ｉｉｉ）チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるアデノシンＡ１受容体−Ｇα１、（ｉｖ）ラット海馬ＣＡ１錐体ニューロンにおけるＧＡＢＡＢ受容体−Ｇα１、（ｖ）ヒト胚性腎臓細胞におけるムスカリン性Ｍ２受容体−Ｇα１など。好適であるかまたは望ましいＧＰＣＲまたはＧＰＣＲ群いずれを用いて、相互作用必要条件を定義することも可能であり、そして当業者は、この種の受容体結合における構造−活性関係を理解する多くの方法を知っている。これらの方法はいずれも、これらの方法での使用が意図され、そして例示する態様の特定の方法の代わりに用いることも可能である。
【００８２】
［０００１１４］プラスミドディスプレイ法は、タンパク質−タンパク質相互作用の競合阻害剤として働きうる、特異的でそして強力なペプチドを同定する効率的な手段を提供する。構造−活性研究から収集した情報を用いて、ＧＰＣＲ結合領域、例えばＧαサブユニット・カルボキシル末端に関連する配列をコードする変異体ペプチドライブラリーを、各Ｇαサブタイプ種またはＧβγ種に関して調製することも可能である。ライブラリーの元となることも可能な典型的な天然配列には、以下の表ＩＩＩに列挙するものが含まれる。ライブラリーは、配列内に、コンピュータが生成したランダム置換を持つペプチドを好適に含有し、そして一度に多数のペプチド配列を試験することが可能である。好ましくは、およそ５０％のアミノ酸残基が天然ＧＰＣＲ結合領域と同一であり、そして残りのアミノ酸残基がアミノ酸いずれかからランダムに選択されるように、各ライブラリー中のペプチド配列を構築する。ペプチドは、約７〜約５５アミノ酸残基、または長さ約８〜約５０アミノ酸残基、または約７〜約７０アミノ酸残基以上、好ましくは約９〜約２３アミノ酸残基、または約９〜約１５アミノ酸残基のサイズ範囲であることも可能である。１１量体ペプチドが最も好ましい。約１０％〜約９０％のアミノ酸残基が天然配列から変化していないライブラリーを構築することも可能であるが；約３０％〜約７０％が変化していないことが好ましく、そして約５０％が最も好ましい。
【００８３】
［０００１１５］あるいは、合成ペプチドライブラリーは、タンパク質のランダムに生成される重複領域を用いて、ＧＰＣＲと相互作用することが知られるタンパク質いずれに基づくことも可能である。ペプチドは、長さ約７〜７０アミノ酸、または長さ約８〜５０アミノ酸または好ましくは長さ約９〜約２３アミノ酸、または長さ約９〜約１５アミノ酸、そして最も好ましくは長さ約１１アミノ酸であることも可能である。好適にペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを、ペプチドのＮ末端にリンカー配列をつけて、ＬａｃＩ遺伝子の３’端にクローニングすることも可能である。リンカー配列は、スクリーニング成功に必須ではないが、一般的に好ましい。クローニング目的のため、ペプチドコード配列のどちらかの末端に、制限酵素部位を配置することも可能である。ペプチドライブラリーの配置図および１つのペプチドの例に関して、以下の表Ｉを参照されたい。やはり使用可能なさらなるペプチドを以下の表ＩＩおよび表ＩＩＩに示す。実際のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドを、正しい塩基が７０％、そして残りの塩基が各々１０％であるように合成して、ペプチド配列に沿ったいかなる特定の位でも、正しいアミノ酸を有する可能性がおよそ５０％であるバイアスペプチドライブラリーを生じる。塩基を異なる比で用いて、配列中のいかなる特定の位でも、望ましい突然変異誘発率を達成することも可能である。
【００８４】
表Ｉ．  合成ペプチドライブラリーの構築例
【００８５】
【表１】
2007525170.tif 000003
【００８６】
ｎ＝ヌクレオチド塩基いずれか；ｋ＝グアニジンまたはチミジン；Ａ＝制限酵素部位；Ｂ＝リンカー配列；Ｃ＝ペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド；Ｄ＝停止コドン；Ｅ＝制限酵素部位。
【００８７】
表ＩＩ．  Ｇαサブユニットペプチドおよび対応するＤＮＡ構築物
【００８８】
【表２】
2007525170.tif 000004
【００８９】
表ＩＩＩ．  ライブラリー／ミニ遺伝子構築＊のための典型的な天然Ｇタンパク質配列
【００９０】
【表３】
2007525170.tif 000005
【００９１】
＊ミニ遺伝子構築物を産生するため、各ヌクレオチド配列は、５’−ｇａｔｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇａ−（配列番号４３）および−ｔｇａａ−３’（配列番号４４）を用いることによって、ペプチドのＮ末端にアミノ酸ＭＧをコードするように構築されなければならない。
【００９２】
［０００１１６］結合反応を行うのに好都合であり、そして効率がよいように、ディスプレイ系において、ペプチドを好適に合成する。例えば、当該技術分野に知られるようなプラスミドまたはファージディスプレイ系を使用することも可能である。ペプチドディスプレイ系が好ましいが、ＧＰＣＲとペプチドの効率的な接触および結合測定を可能にする、いかなる方法を用いることも可能である。
【００９３】
［０００１１７］ペプチドディスプレイ（「プラスミド上のペプチド」）ライブラリーは、本発明で使用するのに好適な系であり、ＬａｃＩおよびｌａｃＯ間の高親和性結合を利用する。「プラスミド上のペプチド」ディスプレイは、２つの主な理由から、本発明での使用に好ましい。該技術は、実験室で容易にセットアップされる。さらに、提示するタンパク質のカルボキシル末端でペプチドを融合させると、スクリーニング中、カルボキシル末端ペプチドの正常な提示が模倣される。アミノ末端または内部ペプチドを試験する場合、天然提示を模倣するため、ペプチドを適切な位にクローニングすることも可能である。
【００９４】
［０００１１８］カルボキシル末端ペプチドを試験するための「プラスミド上のペプチド」法は、一般的に以下のように働く。当業者は、この一般的な説明および以下の実施例を指針として用い、異なる条件に適合するのに必要とされるように、これらの方法を修飾することも可能であろう。目的の天然ＧＰＣＲ結合ペプチドに基づく縮重ＰＣＲによって、ペプチドライブラリーを生成し、そしてＬａｃＩのカルボキシル末端に融合させる。融合遺伝子を所持するプラスミドベクターを介して、ペプチドライブラリーを発現させる。プラスミドはまた、Ｌａｃオペロン（ＬａｃＯ）も含有し、そして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）がＬａｃ１融合タンパク質を転写し、そして翻訳すると、該融合タンパク質は、コードプラスミドに四量体として戻って、ｌａｃＯ  ＤＮＡ結合配列を通じて結合し、プラスミド上で目的の挿入配列をディスプレイする。したがって、転写および翻訳後、天然ペプチド配列に関連する異なる配列をコードする変異体ペプチドが、ｌａｃ１遺伝子のカルボキシル末端伸展として、ディスプレイされる。したがって、受容体への結合に関してスクリーニング可能な、安定なＬａｃＩ−ペプチド−プラスミド複合体が形成される。その開示が本明細書に援用される、Ｇａｔｅｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５：３７３−３８６，  １９９６に記載される方法が、適切である。典型的な方法に関しては、実施例７および実施例９を参照されたい。
【００９５】
［０００１１９］ペプチドをディスプレイするのに用いた大腸菌株は、ＡＲＩ８１４であったが、これは以下の遺伝子型を有する：Δ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）  ｅｎｄＡ１  ｎｕｐＧ  １ｏｎ−１１  ｓｕｌＡ１  ｈｓｄＲ１７  Δ（ｏｍｐＴ−ｆｅｐＣ）  ２６６  ΔｃｌｐＡ３１９：：ｋａｎ  ΔｌａｃＩ  ｌａｃＺＵ１１８。この株は、形質転換または形質導入によって導入された非修飾ＤＮＡの制限を防止する、ｈｓｄＲ１７アレルを含有する。ｏｍｐＴ−ｆｅｐＣ欠失は、対形成塩基性残基間でペプチドを消化する、ＯｍｐＴプロテアーゼをコードする遺伝子を取り除く。ｌｏｎ−１１およびｃｌｐＡ突然変異もまた、ＡＴＰ依存性細胞質プロテアーゼによるタンパク質分解を制限する。ｌａｃＩ遺伝子の欠失は、プラスミドのｌａｃＯ部位への結合に関して、融合構築物と競合する、野生型ｌａｃリプレッサーの発現を防止する。ｌａｃＺ突然変異は、リプレッサーの非存在下でβ−ガラクトシダーゼを作成する、細胞の代謝供給源の浪費を防止する。ｅｎｄＡ１突然変異は、アフィニティー精製に対して有害な影響を有するヌクレアーゼを除去し、そしてｒｅｃＡ欠失は、ＲｅｃＡが触媒する相同組換えを通じたプラスミドの多量体化を防止する。この株は、頑強な増殖特性を有し、そして免疫担当細胞が高収率であることからも選択された。典型的には、ｍｇ  ＤＮＡあたり２ｘ１０１０コロニーの形質転換効率が達成された。大腸菌のこの株が好ましいが、当業者は、記載する方法で使用するのが好適である、多くの代替法を知っている。したがって、当該技術分野に知られる適切でそして好適な細菌株はいずれも、本発明での使用に意図される。
【００９６】
［０００１２０］リゾチームを用いた細胞壁の穏やかな酵素消化によって、ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質ライブラリーを細菌から遊離させることも可能である。細胞破片をペレットにした後、アフィニティー精製のため、固定された受容体に溶解物を直接添加することも可能であるし、また溶解物を精製なしに用いることも可能である。これらのペプチドのディスプレイライブラリーをスクリーニングして、特定のＧＰＣＲに高親和性で結合するペプチドを同定する。この方式で、ＧＰＣＲに結合し、そしてあらかじめ選択した、特定のＧタンパク質の活性化に干渉するか、またはこうした活性化を増進することも可能な、高親和性ペプチドに関してスクリーニングし、そして該ペプチドを同定することが可能である。ライブラリーを、いかなる望ましいＧＰＣＲに対してスクリーニングすることも可能である。コンビナトリアル・ライブラリーは、特定のＧαサブユニットまたはＧβγサブユニットに基づくペプチドを含有するため、このサブユニットまたはサブユニット種に結合するか、またはこれらを通じてシグナル伝達を仲介する、いかなるＧＰＣＲを用いることも可能である。異なるＧタンパク質のカルボキシル末端配列または他の領域に基づく、多数のライブラリーを、同一ＧＰＣＲまたは異なるＧＰＣＲをスクリーニングするために構築することも可能である。
【００９７】
［０００１２１］プラスミドディスプレイライブラリーをスクリーニングするため、ＥＬＩＳＡによるスクリーニング用に、マイクロタイタープレート上に、目的のＧタンパク質共役型受容体を好適に固定することも可能である。次いでプラスミド調製物（細菌溶解物）をウェルに添加することも可能である。このスクリーニング法は、ライブラリープラスミド上にディスプレイされたペプチドが受容体に結合するのを可能にすることを含み、ときに「パニング」と呼ばれる。受容体に結合する配列はウェルに固着するため、非結合配列を洗浄工程によって除去することも可能である。次いで、付着したプラスミドを増殖させ、そして大腸菌を形質転換するのに用いることも可能である。「パニング」プロセスは一般的に、２〜８回反復される。しかし、一般的に、３〜４回の連続スクリーニングが十分であり、そして好ましい。後の周期のパニングでは、好ましくは、親ペプチド（野生型配列）が、受容体に結合するプラスミドと同時インキュベーションされて、そして競合阻害剤として働く。この方式で、ディスプレイライブラリー上の高親和性配列のみが固定受容体に捕捉される。天然ペプチドよりむしろ、既に同定されている高親和性ペプチドまたは小分子を用いて、同じ競合阻害を好適に行うことも可能である。「パニング」法を一般的に記載する模式図に関しては図１を、そして特定の態様に関しては実施例７を参照されたい。この態様の選択プロセスは、好ましくは、低塩緩衝液中で行われ、これは塩濃度が高いと、Ｌａｃ１−ｌａｃＯ複合体が不安定化され、そしてペプチドが誤ったプラスミドと会合するようになりうるためである。同じ理由から、パニング緩衝液は、好ましくは、Ｌａｃ１をｌａｃＯにより緊密に結合させる、ラクトースを含有する。
【００９８】
［０００１２２］本発明の選択プロセスは、各周期のパニングとともに、ますます高い親和性結合のペプチド配列同定を可能にする。例えば、パニングされないライブラリーの多様性は、以下の表ＩＶに示す配列に似て、すなわち非常にランダム化されている可能性がある。連続周期の選択後、選択された付着ペプチドは、以下の表Ｖに示すものにより似ているであろう。
【００９９】
表ＩＶ．  パニングされていないＧｑライブラリーにおける多様性
【０１００】
【表４】
2007525170.tif 000006
【０１０１】
表Ｖ．パニングされたＧα１１ライブラリーにおける選択
【０１０２】
【表５】
2007525170.tif 000007
【０１０３】
［０００１２３］ＬａｃＩは、通常、四量体であり、そして最小機能ＤＮＡ結合種は二量体である。したがって、融合タンパク質上、ペプチドが多価でディスプレイされ、協同する方式で、固定された受容体への結合が導かれる。この協同結合によって、固有の親和性が非常に低い結合事象の検出が可能になる。アッセイが高感度であることは、低親和性のヒットが最初に同定可能である点で好適であるが、ＥＬＩＳＡにおけるシグナルが、結合したペプチドの固有の親和性にかならずしも相関しない点が不都合である。
【０１０４】
［０００１２４］シグナル強度が親和性とよりよく相関する１つの好ましいＥＬＩＳＡは、クローン集団由来の目的の配列を、タンパク質、例えば大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードする遺伝子と、インフレームで融合させることを伴う。配列が単量体融合タンパク質に移されたら、これを大腸菌で過剰発現し、そして受容体に結合したタンパク質を検出するＥＬＩＳＡによるアッセイのため、または好適なアッセイいずれかのため、未精製溶解物として、または精製融合タンパク質としていずれかで用いることも可能である。望ましい場合、ＭＢＰに融合したＴＧＧＧリンカーのみを発現するベクターを単独で有するか、あるいはＭＢＰに融合したＧｔ：３４０−３５０Ｋ３４１Ｒペプチドを有する対照を用いることも可能である。凍結細胞ストックは、好ましくは、２５％グリセロール中、−８０℃で維持される。好ましくは、生じるシグナルが、光活性化型ロドプシンに対するペプチドの親和性と相関するＥＬＩＳＡによって、ＭＢＰに融合した高親和性Ｇαペプチドを解析する。ＭＢＰ−ペプチド融合体を発現し、そしてアミロース・アフィニティーカラム上で精製し、そして目的のペプチドの相対的親和性を測定するのに用いる。バックグラウンドより少なくとも２標準偏差高い吸光度の試料は、高親和性結合ペプチドを含有すると見なされることも可能である。しかし、アッセイパラメーターおよび操作者の必要性に応じて、望ましい切捨て点いずれを用いることも可能である。
【０１０５】
［００１２５］以下のように、適切なＥＬＩＳＡを行うことも可能であるが、当業者はアッセイ中の条件に関して、技術を修飾することが可能であろう。一連の希釈のＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質を、あらかじめ０．１％  ＢＳＡでブロッキングした、固定された光活性化型ロドプシンを含む９６ウェルプレートに添加する。３７℃で１時間インキュベーションした後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０でウェルを洗浄し、そして抗ＭＰＢ抗体、その後、西洋ワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼにコンジュゲート化したヤギ抗ウサギ抗体で探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。アッセイの発色を２０分間進行させ、その後、マイクロタイタープレート読取装置上で、Ａ４５０を測定する。その開示が本明細書に援用される、Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１５：３８８−４０４，２０００を参照されたい。
【０１０６】
［０００１２６］天然ペプチド、ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質、またはヘテロ三量体Ｇタンパク質を用いて、受容体上の結合部位に競合する能力を測定することによって、精製した融合タンパク質をさらに試験することも可能である。競合ＥＬＩＳＡの使用によって、固定された受容体への個々の融合タンパク質の結合に関して、ＩＣ５０値を計算することが可能になる。
【０１０７】
［０００１２７］融合タンパク質同時インキュベーションを用いて、より低い親和性のペプチド融合タンパク質がＧＰＣＲに結合するのを防止する、競合ＥＬＩＳＡ形式でペプチド融合タンパク質を解析することも可能である。ペプチド結合に干渉しない、好適なタンパク質いずれかが使用可能であり、これらには、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質またはユビキチンが含まれるが、ＭＢ−Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒなどのマルトース結合タンパク質融合タンパク質が好ましい。競合ＥＬＩＳＡは、どのペプチド配列が、光活性化型ロドプシンに最高の親和性を有するかを示す。いくつかの異なるアッセイ形式が適切である。例えば、合成Ｇｔ：３４０−３５０Ｋ３４１Ｒペプチドを用いて、結合に関して、Ｇα高親和性ペプチドを含有するＭＢＰ融合タンパク質と競合させることも可能である。さらに、Ｇα高親和性ペプチドを含有するＭＢＰ融合タンパク質を用いて、光活性化型ロドプシンへの結合に関して、ＬａｃＩ−Ｇｔ：３４０−３５０Ｋ３４１Ｒペプチド融合タンパク質と競合させることも可能である。組換えへテロ三量体Ｇｔもまた、高親和性ペプチドに対して試験することも可能である。一定濃度のＭＢＰ−Ｇαペプチド融合タンパク質を、天然ペプチド、ＬａｃＩ−Ｇαｔペプチド融合タンパク質または組換えへテロ三量体Ｇｔの連続希釈によって競合するＥＬＩＳＡ形式を用いて、変異体ペプチドの相対的親和性を評価することも可能である。ウェルを好適に抗ＭＢＰ抗体で探査して、結合したままであるＭＢＰ−Ｇαペプチド融合タンパク質の量を測定することも可能である。非線形回帰によって用量−反応曲線を解析して、ＥＣ５０を計算することも可能である。
【０１０８】
［０００１２８］ライブラリーをｐＪＳ１４２にクローニングして、ライブラリーのランダムコード領域の始まりの近傍にＢｓｐＥＩ制限部位を生成する。好適に、ＢｓｐＥＩおよびＳｃａＩで消化すると、９００塩基対のＤＮＡ断片の精製が可能になり、この断片をｐＥＬＭ３にサブクローニングすることも可能であり、このベクターは、ＭＢＰ融合タンパク質を、還元環境である細胞質に導く。あるいは、ｐＥＬＭ１５に、この断片をクローニングすることも可能であり、このベクターは、ＭＢＰ融合タンパク質を、酸化環境である周辺質に導く。ｐＥＬＭ３およびｐＥＬＭ１５は、それぞれ、ｐＭＡＬｃ２ベクターおよびｐＭＡＬｐ２ベクターの単純な修飾物であり、商業的に入手可能である（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）。ｐＥＬＭ３をＡｇｅＩおよびＳｃａＩで消化すると、ｐＪＳ１４２ライブラリーからＢｓｐＥＩ−ＳｃａＩ断片を効率的にクローニングすることが可能になる。望ましい結果を達成するのに好適な、適切な方法いずれを用いることも可能である。これらの方法の修飾は、分子生物学の当業者に周知であり、そして本明細書での使用に意図される。
【０１０９】
［０００１２９］ヘテロ三量体Ｇタンパク質の存在下、競合結合アッセイを用いて、高親和性ペプチドが、ＧＰＣＲに競合的に結合し、そしてＧタンパク質の認識に干渉するか、または該認識を増進するという証明を得ることも可能である。例えば、スクリーニングに用いるＧＰＣＲがロドプシンである場合、ヘテロ三量体Ｇタンパク質、トランスデューシン（Ｇｔ）が使用可能である。Ｇｔは、多数のエピトープでロドプシンに結合し、そしてαサブユニットのミリストイル化およびγサブユニット・カルボキシル末端のファルネシル化を介して膜に結合する。カルボキシル末端天然ペプチドＬａｃＩ構築物および／またはへテロ三量体Ｇｔによる結合が劣っていれば、ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質が高親和性で結合することが示される。Ｇαサブユニットいずれか、例えばＧαｉ、ＧαｓおよびＧαｑに対するカルボキシル末端ペプチドライブラリーを用いて、ＧＰＣＲいずれか、例えばトロンビン受容体（ＰＡＲ１、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４）、ドーパミン受容体（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５）、バソプレッシン受容体（Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２）およびヒスタミン受容体（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に結合する高親和性ペプチドを決定するために、パニング、ペプチド合成および結合研究の類似の戦略を使用することも可能である。より高い結合親和性のペプチド類似体が解明されたら、これらを利用して、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用を阻害することも可能である。
【０１１０】
［０００１３０］この方法によって選択される、高親和性で、望ましいＧＰＣＲ仲介シグナル伝達事象の特異的遮断または増進に特徴付けられるペプチドを、ＧＰＣＲ活性を修飾することによって利益を得る障害を治療する、伝統的な薬剤または遺伝子治療などの療法剤として用いるか、あるいは高親和性ペプチド類似体と競合するか、または高親和性ペプチド類似体もしくは高親和性ペプチド類似体−融合タンパク質の結合親和性を調節する（すなわち増加させるかまたは減少させる）ことが可能な化合物のさらなるライブラリーをスクリーニングするのに用いることも可能である。
【０１１１】
［０００１３１］スクリーニング用の小分子ライブラリーを選択し、そして合成するための、当該技術分野に知られる方法はいずれも、本発明での使用に意図される。スクリーニングしようとする小分子を、コンビナトリアル・ライブラリーの形で、好適に収集する。例えば、薬剤様小分子ライブラリー、例えばβ−ターン模倣ライブラリー等を、例えばＣｈｅｍＤｉｖ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍｄｉｖ．ｃｏｍ）、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｃｏｐ．ｃｏｍ）またはＣｏｍｂｉｃｈｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｏｍｂｉｃｈｅｍｌａｂ．ｃｏｍ）から購入することも、あるいは合成することも可能であるし、そしてこうしたライブラリーは、その開示が本明細書に援用される、ＴｉｅｔｚｅおよびＬｉｅｂ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：３６３−３７１，１９９８；Ｃａｒｒｅｌｌら，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２：１７１−１８３，１９９５；米国特許第５，８８０，９７２号、米国特許第６，０８７，１８６号および米国特許第６，１８４，２２３号に記載される。
【０１１２】
［０００１３２］当該技術分野に知られるこれらのライブラリーはいずれも、スクリーニングに適しており、ランダムライブラリーまたは個々の化合物も同様である。一般的に、親水性化合物は、より容易に溶解し、より容易に合成され、そしてより容易に化合するため、こうした化合物が好ましい。約５００の平均分子量を有する化合物が、しばしば、最も有用であるが、この範囲外の化合物、またはこの範囲から遠く外れた化合物であってもまた、使用可能である。一般的に、約５．０のｃ  ｌｏｇＰスコアを有する化合物が好ましいが、該方法は、すべての種類の化合物で有用である。Ｌｉｐｉｎｓｋｉの「５のルール」のような単純なフィルターは、予測値を有し、そしてこうしたフィルターを用い、生物学的に利用可能な小分子のみを用いることによって、本発明のこの戦略によって発見されるリード化合物の品質を改善することも可能である。Ｌｉｐｉｎｓｋｉら，Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．２３：３−２５，１９９７を参照されたい。
【０１１３】
［０００１３３］薬剤標的に対して、コンビナトリアル・ケミストリー小分子「ライブラリー」をスクリーニングすることも可能である。この考え方は、化学構造が多様であれば、１０２００のありうる小有機分子の干草の山から、１本の針を見つける見込みが増加するというものである。これらのコレクションは、新規の容易に入手可能なリード化合物の優れた供給源を提供する。例えば、ＣｈｅｍＤｉｖは、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ（小分子ライブラリー）を設計する際に、８００より多い個々の化学コア、ユニークな構築ブロックライブラリー、および自社（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）化学反応を用いて、１年に８０，０００〜１００，０００の化合物を組み立てる。２００〜４００の化合物のセットであるＣｏｍｂｉＬａｂリード化合物ライブラリーもまた、フォローアップとして産生することも可能である。さらに、ＣｈｅｍＤｉｖの化合物は、「薬剤類似性定義」（群類似性および進歩した神経ネットアプローチ）の自社アルゴリズム、並びに分配係数、溶解度、解離係数、および急性毒性などのＡＤＭＥ＆Ｔ（吸収、分布、代謝、排出および毒性）特性予測のための多様な知的な装置にしたがって調整され、薬剤に対する類似性を確実にするよう設計される。
【０１１４】
［０００１３４］したがって、新規小分子ライブラリーの集中的合成は、最初のリード化合物に構造的に関連する多様な化合物を提供することも可能であり、こうした化合物をスクリーニングして、最適な構造を選択することも可能である。好ましくは、ｐＫａ、ｌｏｇＰ、大きさ、水素結合および極性などの特性に基づいて、「薬剤様」であると予測される化合物ライブラリーを選択する。第一の工程で高親和性ペプチドを生じ、そして続く工程で小分子を生じる本発明の多工程アプローチは、通常のハイスループット・スクリーニング法では選択され、そしてアッセイされなければならない、より低い親和性の小分子を除去することによって、人為的ヒットの数を減少させる。さらに、該アプローチは、受容体上のあらゆる部位への結合に関するスクリーニングよりむしろ、Ｇタンパク質を模倣するペプチドの結合を調節することが可能な分子に関する検索に重点を置く。この技術の他の利点は、実行するのが簡単であり、多くの異なる種類の受容体に受け入れられ、そして非常に大きい化合物ライブラリーを迅速にスクリーニング可能であることである。
【０１１５】
［０００１３５］いかなる供給源由来の受容体を用いても、ペプチドまたは小分子のスクリーニングを好適に行うことが可能である。一般的に、細胞から受容体を精製し、そして液体小胞中で受容体を再構成するか、あるいは受容体を発現するかまたは過剰発現する昆虫細胞または哺乳動物細胞から単離した膜を使用することが好適である。ＰＡＲ１およびロドプシンが好適な受容体であるが、本発明で使用するのに適したいかなる受容体も意図される。スクリーニングに用いる受容体を天然供給源から精製するか、または受容体を過剰発現する細胞から精製し、そして液体小胞中で再構成することも可能である。受容体を天然に発現する細胞、例えば、ＰＡＲ１を発現するＳｆ９細胞から、あるいは受容体を発現するよう遺伝子操作されている細胞、例えばＰＡＲ１を過剰発現する哺乳動物細胞または昆虫細胞から、受容体を含有する膜を精製することも可能である。３つの異なる方法によって発現された受容体（ＰＡＲ１）をスクリーニングすることから同定されたペプチドを、表ＸＩ、ＸＩＩ、およびＸＩＩＩに示す。結果によって、こうした方法が、高い度合いの保存を示す、類似の結果を生じることが示され、（Ｎ３４８；Ｌ３４９）が、受容体発現の３つの方法すべてで同定されている。最初に、ペプチドまたは小分子をスクリーニングしようとする、ペプチド融合タンパク質または高親和性ペプチドの結合親和性を決定することが好適である。これによって、アッセイ中の受容体およびペプチドＭＢＰペプチド融合タンパク質または小分子の量を最適化することが可能になる。
【０１１６】
［０００１３６］一般的に、１ウェル−１化合物アプローチを用いて、ライブラリーを試験して、ペプチド融合タンパク質または高親和性ペプチドと、受容体への結合に関して競合する化合物を同定することが好適である。ウェルあたり単一の化合物を、各約１μＭで、または試験しようとする化合物およびペプチドに対する受容体の親和性に応じた好適な濃度いずれかで用いることも可能である。化合物を試験のためプールすることも可能であるが、このアプローチはデコンボルーション（ｄｅｃｏｎｖａｌｕｔｉｏｎ）を必要とする。ウェルあたり約２〜約１００以上の化合物の群で、またはウェルあたり約１０〜約５０化合物の群で、各約１０ｎＭで、または試験しようとする化合物に対する受容体の親和性に応じた、好適な濃度いずれかで、化合物をプールすることも可能である。望ましい場合、いくつかの異なる濃度を用いることも可能である。最初の例では、スクリーニングされるペプチドのメンバーは層状である（ｌａｙｅｒ）ため、望ましくは、プールするアプローチを用いて、ペプチドをスクリーニングする。ペプチドを個々にスクリーニングすることも可能であるが、好ましくは、ウェルあたり約１０４〜１０１２ペプチド、またはウェルあたり約１０８〜１０１０ペプチド、または最も好ましくはウェルあたり約１０９ペプチドのプールでスクリーニングする。
【０１１７】
［０００１３７］ＥＬＩＳＡ、あるいは蛍光アッセイまたはラジオイムノアッセイなどの他の好適なアッセイいずれかを用いて、（１）各ウェル中、１以上のペプチドが、高親和性ペプチド融合タンパク質または高親和性ペプチドによる結合の量を減少させるかどうか、あるいは（２）各ウェル中、１以上のペプチドが受容体に結合するかどうかを決定することも可能である。化合物を一連の濃度で試験することもまた可能であるし、そしてこれは、ペプチドまたはペプチド融合タンパク質の親和性が知られていない場合、一般的に好ましい。ＥＬＩＳＡにおいて、ＯＤ４５０が対照ウェル（試験化合物なし）の半分以下であるウェルは、一般的に「陽性」と見なされ、そしてこれをさらに研究することも可能である。しかし、アッセイ構成要素およびアッセイの目的に応じて、適切な切捨て点いずれを用いることも可能である。
【０１１８】
［０００１３８］マイクロタイターウェル、バイオチップ、または好適なアッセイ表面いずれか上に固定した望ましいＧＰＣＲを用いて、高親和性ペプチド類似体に対するスクリーニングを行うことも可能である。溶液中で行う結合アッセイもまた、適切である。１つ、いくつか、または数千の候補小分子薬剤化合物を、高親和性ペプチド類似体の存在下または非存在下で、受容体への結合に関してスクリーニングすることも可能である。好ましくは、高親和性結合ペプチドの存在下でアッセイを行い、結合に関して、高親和性結合ペプチドに競合するのに成功しうる候補化合物のみが、受容体に捕捉されることを確実にする。あるいは、高親和性ペプチド類似体の存在下でのスクリーニングによって、競合的に結合することが同定された有機化合物または小分子を、さらにより高い親和性を持つさらなる小分子候補化合物に関するスクリーニングにおいて、リード化合物として用いることもまた可能である。どちらのスクリーニングプロセスにおいても、好適な方法いずれかによって、例えばＥＬＩＳＡ、蛍光アッセイまたはラジオイムノアッセイによって、結合を検出することも可能である。
【０１１９】
［０００１３９］２工程プロトコルを用いて、Ｇタンパク質シグナル伝達を遮断する化合物を同定することによって、強力で、そして強く結合する化合物のみが選択されるため、化合物のハイスループット・スクリーニングおよび選択された化合物の性質決定は、時間および費用両面で有意に負担が軽減される。Ｇタンパク質共役型受容体上の結合部位に関して、Ｇタンパク質と強く競合する高親和性ペプチドを同定する、第一の工程がこのことを確実にするが、これは高親和性ペプチドが、特定の望ましい結合特異性、細胞系内で機能を修飾する能力、およびｉｎ  ｖｉｖｏで機能を修飾する能力を持つように設計され、そしてこうしたことに関して試験されるためである。
【０１２０】
［０００１４０］好ましくは、最も強い結合および有効なペプチド類似体または小分子のみが第二のまたは続くスクリーニング工程で用いられる。慣用的なハイスループット・スクリーニング法を用いた場合には、検出され、そして次いでさらに研究されていたであろう、より低い親和性の小分子を排除することによって、この２工程または多工程プロトコルは、偽陽性の数、および弱くしか結合しない化合物の同定を減少させる。この方法は、したがって、実行するのに単純で、安価であり、２、３の構成要素のみからなり、多くの異なる種類の受容体に受け入れられ、そして大きな化合物ライブラリーを迅速にスクリーニングすることが可能である。この方法は、受容体作用の阻害剤または増進剤、例えばトロンビン受容体修飾剤、ドーパミン受容体修飾剤、ヒスタミン受容体修飾剤、またはバソプレッシン受容体修飾剤として機能する、新規種類の小有機ペプチド擬似体分子を効率的に同定することを可能にする。これらの同定された化合物は、単一のＧＰＣＲ、ＧＰＣＲ種をターゲットとするか、あるいはＧＰＣＲに活性化される単一のＧタンパク質経路を遮断するかまたは増進することも可能である。
【０１２１】
［０００１４１］既知の方法いずれかにしたがって、療法剤として使用するため選択された化合物（ペプチドまたは小分子いずれか）の徹底的な評価を進めることも可能である。ｐＫａ、ｌｏｇＰ、サイズ、水素結合および極性などの、化合物の特性は、有用な情報である。本発明の方法による同定前に、すでに有用な化合物であることが知られていないならば、これらを容易に測定するか、または例えば２Ｄ関連表（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ  ｔａｂｌｅ）から計算することも可能である。適切な結合実験によって、会合／解離速度定数を決定することも可能である。吸収および毒性などのパラメータもまた、測定することも可能であり、それとともに、生物学的活性のｉｎ  ｖｉｖｏ確認を行うことも可能である。当該技術分野に知られる方法にしたがって、小分子用に、スクリーニングを最適化することも可能である。さらに、陽性を迅速に解析することを可能にするデータ提示のソフトウェア系を用いることが好ましい。実施例３６および図２を参照されたい。
【０１２２】
［０００１４２］当該技術分野に周知の方法にしたがって、本発明のスクリーニングによって同定されたペプチドまたは小分子を、適切な薬剤賦形剤または薬剤賦形剤の組み合わせいずれかとともに、配合することによって、薬剤調製物を調製する。静脈内、筋内、皮下、経口、直腸、膣、経皮、経粘膜、舌下等の経路いずれかによる投与のため、調製物を作成することも可能であるが、一般的に、ペプチド調製物には、非経口経路が好ましい。いかなる適切なビヒクルを用いることも可能であり、静脈内投与には、例えば生理食塩水または乳酸加リンゲル液を用いることも可能である。
【０１２３】
［０００１４３］ＧＰＣＲ関連疾患または状態の治療のための投薬量は、障害の性質、関与するＧＰＣＲ、投与経路、患者の全身肉体状態および健康状態に関する要因、並びに治療する医師の判断に応じるであろう。当業者は、これらの要因をよく知っており、そして最適な結果を得る投薬量の操作は日常的と見なされる。一般的に、静脈内投与のための投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇの間で多様であることが可能であるが、この範囲は、患者の必要性に応じて拡大可能である。こうした拡大された範囲は、本発明の範囲内と見なされる。
【０１２４】
［０００１４４］あるいは、本発明記載のペプチドを、発現構築物の搬送によって、細胞に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、提供することも可能である。遺伝物質を直接導入して、遺伝子治療をｉｎ  ｖｉｖｏで行うことも可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子移入は、体内で該ペプチドが見られる部位の細胞、例えば腕の皮膚細胞に、または遺伝子移入ベクターの吸入後、肺上皮細胞に、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを導入するであろう。あるいは、患者から一時的に取り除かれた生存細胞に遺伝子を移入し、そして次いで、治療後に戻す、ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子移入（例えば骨髄細胞）もまた使用可能である。
【０１２５】
［０００１４５］特定の組織または細胞に進入するように、遺伝子移入ベクターを操作することも可能である。形質導入ターゲティングは、遺伝子移入ベクターが、特定の細胞表面受容体と相互作用することを可能にする。形質導入ターゲティングはまた、腫瘍細胞などの迅速に分裂する細胞をターゲットとする遺伝子移入ベクターを用いることによって、細胞分裂速度を利用することも可能である。転写ターゲティングは、別個の細胞プロモーターおよびエンハンサー要素を補充して、療法遺伝子の転写に影響を及ぼす。遺伝子を特定の細胞に搬送するのを補助する、モノクローナル抗体、炭水化物リガンド、およびタンパク質リガンドで、ベクターを操作することによって、トランスフェクション効率もまた、増進される。
【０１２６】
［００１４６］細胞内で高親和性ペプチドを産生するのに用いる遺伝子移入ベクターは、ウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純疱疹ウイルス、またはワクシニアウイルス）であることも可能である。代替法として、非ウイルスベクターを用いることもまた可能であり、これらには、裸のＤＮＡの注入、あるいは陽性荷電脂質、または陽イオン性リポソームへの付着によるＤＮＡまたはペプチドの導入、エレクトロポレーションあるいは弾道（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）ＤＮＡ注入（ｅｘ  ｖｉｖｏ適用に限定される）とともに、分枝ペプチドの導入などの方法が含まれる。
【０１２７】
［０００１４７］脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）に駆動されるＧＦＰを同時発現する天然Ｃ末端配列のＴｅｔ誘導性レトロウイルスベクター（ｐ−Ｔｅｔ−Ｔｉ−ＧＦＰ）を用いることも可能である。これらのベクターが高親和性ペプチド配列をコードするように、修飾することも可能である。さらに、空間的発現または時間的発現を可能にする配列によって、高親和性ペプチドを駆動することも可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のため、血清不含培地中のＧＰ−２９３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）など、汎親和性生産株からウイルス上清を収集することも可能である。４℃、２２，０００ｒｐｍで２時間、超遠心することによって、ウイルス上清を濃縮し、そして少なくとも１０８ＩＵ（感染単位）／ｍｌの力価で、血清不含培地中、元来の体積の１／１００に、ペレットを再懸濁し、そして−８０℃で保存することも可能である。
【０１２８】
［０００１４８］ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来レトロウイルスベクターは、内皮細胞に療法遺伝子を安定して搬送するために一般的に用いられるビヒクルである。ｉｎ  ｖｉｖｏのレトロウイルス研究のため、Ｔｅｔ誘導性であり、そして脳心筋炎ウイルス由来の内部リボソーム進入部位に駆動されるＧＦＰを同時発現する、複製不全ネズミモロニーレトロウイルスベクター（ｐＴｅｔ−ＧＦＰ）に、高親和性ペプチドを好適にサブクローニングする。次いで、これらの構築物を、産生株に一過性にトランスフェクションして、１０６〜１０１０ＩＵ／ｍｌの細胞不含力価を生じることも可能である。必要な場合、水疱性口内炎ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質である、ＶＳＶ−Ｇを利用する、汎親和性レトロウイルス発現系（ＧＰ−２９３；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を利用して、低トランスフェクション効率を克服することも可能である。細胞に基づくこの革新的遺伝子移入法を用いることによって、安定した、長期の、そして局所化された、高親和性Ｃ末端ペプチドの遺伝子発現を得ることも可能である。
【０１２９】
［０００１４９］この方法によって同定された化合物が、ｉｎ  ｖｉｖｏで、疾患症候群に関与するＧタンパク質シグナル伝達事象を調節可能であることを、最終的に立証するため、選択的Ｇタンパク質シグナル伝達事象との拮抗または該事象の増進を確認することも可能である。化合物が天然Ｇタンパク質結合と競合する能力を試験する１つの方法は、受容体を所持する細胞において、受容体−Ｇタンパク質界面を遮断するペプチドを発現することを伴う。多様なＧαサブユニット由来のカルボキシル末端ペプチド配列（表ＶＩを参照されたい）などのＧＰＣＲ結合領域ペプチドをコードするプラスミド構築物を用いて、選択的ＧＰＣＲ遮断の代謝上の効果を定性的および定量的に研究可能であるように、こうした構築物をｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、細胞において発現させることも可能である。こうした研究は、化合物が所持する結合が、ｉｎ  ｖｉｖｏで選択的Ｇタンパク質シグナルを調節するのに有用であることの立証を提供する。
【０１３０】
［０００１５０］実施例２３および実施例２４に記載するものなどの方法により、ミニ遺伝子アプローチを用いて、ペプチドの発現が好適に達成されるが、いかなる適切な方法を用いることもまた可能である。ミニ遺伝子ベクターは、ハイスループット・スクリーニング前に、細胞系において、高親和性ペプチドを評価することを可能にする。これらの方法を用いて、いかなる望ましいペプチド配列を発現することも可能である。当業者は、高親和性ペプチド類似体を含むタンパク質およびペプチド構築物の構築、トランスフェクションおよび発現の代替法をよく知っており、そしてこうした方法は、本発明の方法とともに使用することが意図される。
【０１３１】
［０００１５１］ヒト胚性腎細胞を、好適に、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、およびＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（５０００Ｕ／ｍｌ；５０００μｇ／ｍｌ／Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中、９５％空気／５％  ＣＯ２の大気中で、３７℃で培養する。トランスフェクション前日に細胞を６０〜７０％の密度で蒔き、そしてＱｉａｇｅｎのＥｆｆｅｃｔｅｎｅキットを用いて、挿入物を含むｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１−高親和性ペプチド）またはベクター単独のＤＮＡ（３μｇ）で１．５時間、一過性トランスフェクションすることも可能である。トランスフェクション後、細胞を１回洗浄した後、完全ＨＭＥＣ培地を添加する。必要な場合、トランスフェクション４８時間後に、培地にネオマイシンを添加することによって、ミニ遺伝子を所持する細胞の選択を行うことも可能である。トランスフェクションの効率を監視するため、細胞をＧＦＰプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）でトランスフェクションする。必要な場合、３００μｇ／ｍｌジェネテシン（Ｇ４１８）を用いて、トランスフェクタントを選択することも可能である。ｍＲＮＡ発現に関して、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲおよびノーザンブロット解析を用いて、ＨＥＫトランスフェクタント中のベクターの発現を確認することも可能であり、そして先に記載されるようなＨＰＬＣによって、ペプチド発現を性質決定することも可能である。その開示が本明細書に援用される、Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３４４：５８−６９，２００２を参照されたい。
【０１３２】
表ＶＩ．  Ｃ末端ミニ遺伝子ペプチドの典型的な配列
【０１３３】
【表６】
2007525170.tif 000008
【０１３４】
［０００１５２］上に論じるように、多くの受容体が多数のＧタンパク質と相互作用し、そしてこれを活性化する。高親和性結合カルボキシル末端ペプチドを細胞に導入する、ミニ遺伝子戦略を用いて、個々のＧタンパク質との特異的Ｇタンパク質共役型受容体の相互作用を阻害し、こうして本発明の方法によって同定された化合物を用いた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの特異的Ｇタンパク質遮断の実現可能性を立証することが可能である。多数のＧタンパク質を活性化する受容体は、各々特定の反応セットを仲介するシグナル伝達経路の別個のセットを活性化するため（例えばトロンビン受容体）、実質的に他の経路に影響を及ぼさずに、１つの経路を阻害することも可能である。
【０１３５】
［０００１５３］受容体−Ｇタンパク質界面を遮断するペプチドを発現することによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＧタンパク質シグナル伝達事象と選択的に拮抗するため、哺乳動物細胞へのトランスフェクション後、多様なＧαサブユニットのＣ末端ペプチド配列を発現するように、ミニ遺伝子プラスミドベクターを設計した。ランダムな順序でＧαｉ１／２のカルボキシル末端をコードする、対照ミニ遺伝子ベクターもまた生成した（ＧαｉＲ、表ＶＩを参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内シグナル伝達経路を効果的に遮断するため、ミニ遺伝子アプローチに必要な１つの重要な要素は、望ましいペプチドが適切な量で発現されることである。したがって、ｍＲＮＡ、タンパク質または両方を検出する好適な方法によって、ミニ遺伝子発現を確認しなければならない。当該技術分野に知られるいかなる好適な方法を用いることも可能である。
【０１３６】
［０００１５４］ＧＰＣＲ結合ペプチドを発現するミニ遺伝子アプローチが細胞に及ぼす効力を決定するため、そして他の経路が影響を受けずに、既定の受容体が活性化するシグナルに反応する、１つのＧタンパク質経路が、特異的に阻害されることを示すため、測定可能な細胞性シグナル伝達終点を示すように設計した系において、化合物を好適にアッセイすることも可能である。こうした系の１つの例は、内皮細胞における、トロンビン受容体、ＰＡＲ１である。この受容体は、多数のＧタンパク質を活性化する。誘導されるＰＡＲ１遺伝子発現の転写解析；［Ｃａ２＋］、ＭＡＰキナーゼ（「ＭＡＰＫ」）活性、アデニリルシクラーゼ活性、およびイノシトールリン酸集積を含む、エフェクター分子の生化学的解析；それとともに細胞増殖および内皮浸透性などの機能アッセイを含む、いくつかのシグナル伝達終点が、この受容体でのリガンド結合による、異なるＧタンパク質の特異的活性化または活性化の調節を測定するのに利用可能である。いかなる好適な方法によって、シグナル伝達活性を測定することも可能であり、これらの方法には：イノシトールリン酸集積測定；細胞内カルシウム濃度レベル測定；経内皮電気抵抗測定；ストレスファイバー形成測定；リガンド結合（アゴニスト、アンタゴニスト、逆アゴニスト等）測定；受容体発現測定；受容体脱感作測定；キナーゼ活性測定；ホスファターゼ活性測定；核転写因子測定；細胞遊走（走化性）測定；スーパーオキシド形成測定；一酸化窒素形成測定；細胞脱顆粒測定；ＧＩＲＫ活性測定；アクチン重合測定；血管狭窄測定；細胞浸透性測定；アポトーシス測定；細胞分化測定；プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の膜会合の測定；プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の細胞質ゾル集積の測定；ｓｒｃなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の細胞質ゾル集積の測定；およびＲａｎなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の核会合の測定が含まれる。経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の変化によって測定されるような、トロンビンが誘導する細胞退縮の機構におけるＧα  Ｃ末端ミニ遺伝子の機能的影響もまた、Ｇタンパク質阻害測定に使用可能である。
【０１３７】
［０００１５５］例えば、Ｇαｉミニ遺伝子構築物を発現するヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）において、トロンビンが仲介するＰＡＲ１遺伝子誘導が阻害された。しかし、Ｇαｑミニ遺伝子構築物の発現は、トロンビンが仲介するイノシトールリン酸集積に影響を及ぼした。Ｇαｑの発現はまた、トロンビンが誘導する細胞内［Ｃａ＋＋］ｉ上昇およびトロンビンが誘導するＭＡＰＫ活性をともに特異的に減少させた。
【０１３８】
［０００１５６］ＨＭＥＣにおけるＧαｉ機構のトロンビン活性化は、イソプロテレノール（Ｇαｓを通じて作用する）に反応して増加するｃＡＭＰレベルを減少させる。ＧＰＣＲ結合ペプチド発現が、Ｇαｉシグナル伝達を遮断することを示すため、イソプロテレノール単独に反応するｃＡＭＰレベル増加に関するアッセイを、Ｇαｉを発現する細胞におけるトロンビン・プレインキュベーション後の増加に比較することも可能である。
【０１３９】
［０００１５７］Ｇｏｈｌａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７９０１−１７９０７，１９９９による最近の研究は、トロンビン受容体が、ＥＧＦ受容体から独立した方式で、Ｇα１２を介してストレスファイバー集積を誘導することを手際よく立証した。ストレスファイバー形成は、Ｒｈｏ依存性であるようである。Ｇ１２およびＧ１３はどちらも、Ｒｈｏシグナル伝達経路に関連付けられてきている。したがって、ＨＭＥＣにおけるＧα１２およびＧα１３  ＧＰＣＲ結合ペプチドの発現を用いて、これらのペプチドが、トロンビンに反応したストレスファイバーの出現を遮断可能であるかどうか決定した。
【０１４０】
［０００１５８］分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）の細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）サブファミリーは、増殖および分化に関与する多くの細胞シグナル伝達事象を制御する。これは、ＧＰＣＲ結合ペプチドが、特定のＧタンパク質仲介経路に影響を及ぼしうるかどうかを決定しうる、別のアッセイの基礎を形成する。ＨＡ−ＭＡＰＫとともにＧＰＣＲ結合ペプチドをコードするミニ遺伝子でＨＭＥＣ細胞をトランスフェクションした後、ＨＡ−ＭＡＰＫを免疫沈降すると、ＧＰＣＲ結合ペプチドを発現する細胞に対する影響のみを測定することが可能になる。
【０１４１】
［０００１５９］多くの研究によって、Ｍ２ムスカリン性受容体（ｍＡＣｈＲ）がＧｉ／ＧＯファミリーにのみ共役することが示されている。Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：５６７６−５６８５，１９９３；Ｌａｉら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５８：９３８−９４４，１９９１；Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．４５：８９０−８９８，１９９４；Ｔｈｏｍａｓら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７１：１０４２−１０５０，１９９４を参照されたい。最後の５アミノ酸が、ＧαｉまたはＧαＯ由来の対応する残基で置換されている、突然変異体Ｇαｑ＊＊にＭ２  ｍＡＣｈＲが効率的に共役可能であり、このことは、この受容体が、Ｇαｉ／Ｏサブユニットのカルボキシル末端に特異的に認識されるドメインを含有することを示唆する。Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１１６４２−１１６４６，１９９５を参照されたい。
【０１４２】
［０００１６０］ミニ遺伝子構築物を用いて発現されたカルボキシル末端Ｇαペプチドによる、Ｇタンパク質共役型受容体仲介細胞性反応の阻害を試験するため、百日咳毒素感受性Ｍ２  ｍＡＣｈＲに制御される、Ｇβγに直接活性化される原型チャネル（ＧＩＲＫチャネル）がモデルとして選択された。このモデルでは、Ｇαカルボキシル末端および下流エフェクター系の重要性がよく確立されている。Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９０５９−２９０６２，１９９５；Ｋｒａｐｉｖｉｎｓｋｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１６９４６−１６９５２，１９９８；Ｓｏｗｅｌｌら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：７９２１−７９２６，１９９７を参照されたい。カリウム流を内向きに整流するＭ２  ｍＡＣｈＲ活性化の阻害を試験して、Ｇαカルボキシル末端ペプチド・ミニ遺伝子で一過性にトランスフェクションした細胞、または高親和性Ｇαペプチドに対してスクリーニングすることによって同定された薬剤化合物で処理した細胞上のＧＰＣＲのアゴニスト刺激後の下流機能性反応の阻害を立証することも可能である。
【０１４３】
［０００１６１］ＧＩＲＫチャネルは、多くの興奮性細胞における電気活性を調節する。Ｂｒｅｉｔｗｉｅｓｅら，Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１５２：１−１１，１９９６；Ｊａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９：１５５−１６０，１９９７；Ｗｉｃｋｍａｎら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．５：２７８−２８５，１９９５を参照されたい。チャネルは、Ｇβγの直接相互作用の結果開放されるため、ＩＫＡＣｈの全細胞パッチクランプ記録を用いて、Ｇαカルボキシル末端ペプチド・ミニ遺伝子で一過性にトランスフェクションした細胞、または高親和性Ｇαペプチドに対してスクリーニングすることによって同定された薬剤化合物で処理した細胞上のＧＰＣＲのアゴニスト刺激後の下流機能性反応の阻害を立証することも可能である。ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４を発現する細胞をそのリガンドであるアセチルコリン（ＡＣｈ）で灌流すると、カリウム流の内向き整流が活性化される。
【０１４４】
［０００１６２］ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞性結果の指標となることが認められた、よく確立された受容体モデルを用いて、この種のデータは、既定のＧＰＣＲを介して活性化される個々のＧタンパク質が、細胞事象を仲介する際に特定の役割を有し、そして個々のＧαサブユニットのＧＰＣＲ結合領域を模倣するリガンドによって、特異的方式で調節されうることを示すことも可能である。特に、多数のＧタンパク質を活性化し、こうしたＧタンパク質の各々が特定の反応セットを仲介するシグナル伝達経路の別個のセットを活性化する、トロンビン受容体などの受容体では、本発明の方法を用いて、１つの経路を遮断する一方、すべての他の経路を機能するままにしておくことが可能である。連続アフィニティー精製および競合結合によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで同定された高親和性ペプチド類似体は、Ｇタンパク質シグナル伝達の下流の結果を特異的に阻害することが可能である。
【０１４５】
［０００１６３］上に記載するアッセイは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ競合結合研究によって同定された化合物が、ＧＰＣＲが細胞内で多数のＧタンパク質を制御する場合であっても、特定のＧＰＣＲ−Ｇタンパク質相互作用を選択的に調節する能力を、明らかに立証する。さらに、該ペプチドは、非常に有効に天然配列と競合する。さらに、上に記載し、そして以下の実施例に例示する、ミニ遺伝子アプローチは、内皮浸透性の増加の機構に関与することも可能なＧα１２およびＧα１３などの他のＧタンパク質の役割を体系的に試験することを可能にし、そしてこのアプローチが、Ｇαサブユニット調節化合物を選択し、そして同定しうることを明らかに立証する。したがって、該ペプチドは、Ｇタンパク質シグナル伝達が過剰であることに特徴付けられる障害または症候群いずれの治療で使用するのにも適している。
【０１４６】
［０００１６４］別の側面において、本発明は、本発明が提供する物質を用いて、特定のオーファン受容体が共役するＧタンパク質を同定する方法に関する。例えば、記載する方法を用いて、ＧＰＣＲいずれかを、一連のＧαサブユニットペプチドと試験して、どの種のＧタンパク質（単数または複数）が、受容体の効果を仲介するかを決定することも可能である。実施例１２〜１４に記載する方法が適切である。当業者は、これらのアッセイを指針として用いて、他のアッセイ、または変動および修飾を設計することが可能である。
【０１４７】
［０００１６５］多くのコンホメーション状態で、ロドプシンを分光光度的に測定することも可能である。高親和性で生物学的に活性であるロドプシン状態は、「エキストラ」ＭＩＩアッセイによって、前駆体ＭＩから容易に区別可能である。実施例３５を参照されたい。このアッセイは、ＭＩＩが、高ｐＨおよび低温の条件下、Ｇｔの存在下で安定化され、そして分光光度的に測定可能であるという観察に基づく。Ｃ末端ペプチドがヘテロ三量体Ｇｔと同じ方式で、メタＩＩを安定化する能力があることから、活性化された受容体のアゴニスト結合部位とＧタンパク質の相互作用の構造的基礎を調べるツールが提供される。
【０１４８】
［０００１６６］本発明の１つの態様にしたがった、スクリーニングの基本骨格は、Ｇタンパク質を模倣するか、またはＧＰＣＲの活性コンホメーションを安定化させる、高親和性ペプチドの結合を増加させる小分子を同定することも可能である。これらの小分子は、適切な用量曲線を有し、そして低μＭ範囲のＥＣ５０を有する。尿素洗浄桿体外節の試料は、Ｇタンパク質が添加されなければ、典型的には、ほとんどまたはまったく（＜５％）安定化されないが、スクリーニングの一例において、本発明によって同定された小分子は、ロドプシンの活性（シグナル伝達）コンホメーション（ＭＩＩ）を安定化させる。小分子のみを添加すると、７０％の安定化が生じる。ＭＩＩの安定化のＥＣ５０もまた、低μＭ範囲にあるようである。さらに、これらの同じ小分子をヒト胚性腎（ＨＥＫ）細胞に添加して、第二のＧＰＣＲに対するカルシウム反応を測定すると、関連しないＧＰＣＲのシグナル伝達は増進されず、そして急性毒性反応は生じないようである。
【０１４９】
［０００１６７］薬剤発見は、製品の本質的にランダムなスクリーニングから、潜在的な生物活性剤、例えばアゴニスト、アンタゴニストおよび逆アゴニストとして、多数の合成分子を合理的に、そしてコンビナトリアルに設計するとともに、ポリペプチド、タンパク質、または核酸であることも可能な、生物学的ターゲットを構造的に性質決定することを含むプロセスへと発展してきた。療法ターゲットの構造を理解するのを容易にするいくつかのアプローチが発展してきている。これらには、タンパク質および核酸の配列決定（Ｆｉｎｄｌａｙら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード，１９８９；Ａｄａｍｓら，Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ中，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，１９９４）、ＮＭＲを介した、二次構造および三次構造の解明（Ｊｅｆｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：２７５，１９９８；ＥｒｉｋｓｏｎおよびＦｅｓｉｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：２７１−２８９，１９９２）、Ｘ線結晶学（ＥｒｉｋｓｏｎおよびＦｅｓｉｋ，Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：２７１−２８９，１９９２）、並びにタンパク質フォールディングを予測するためのコンピュータアルゴリズム（Ｃｏｐｅｌａｎｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，ニューヨーク，１９９４；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９９２）が含まれる。ＥＬＩＳＡ（ＫｅｍｅｎｙおよびＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅ，ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ；Ｗｉｌｅｙ，ニューヨーク，１９８８）および放射性リガンド結合アッセイ（ＢｅｒｓｏｎおよびＹａｌｏｗ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，２２：５１−６０，１９６８；Ｃｈａｒｄ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｅｉｅｒ  ｐｒｅｓｓ，アムステルダム／ニューヨーク，１９８２）、表面プラズモン共鳴（Ｋａｒｌｓｓｏｎら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３００：１３２−１３８，２００２）、およびシンチレーション近接アッセイ（Ｋａｒｉｖら，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．４：２７−３２，１９９９）もまた、受容体−Ｇタンパク質相互作用の性質を理解するのに使用可能である。
【０１５０】
［０００１６８］目的のタンパク質−タンパク質相互作用を遮断するペプチドは、相互作用しているタンパク質の１つの表面に結合し、そして受容体と完全タンパク質の相互作用を模倣することによって、相互作用を遮断する。活性受容体結合ペプチドのコンホメーションが結合型と入れ替わる場合には、ペプチドがより緊密に結合しているならば転移ＮＯＥＳＹ  ＮＭＲ法またはＸ線回折を用いて、これらのコンホメーションを研究することも可能である。結合したペプチドのコンホメーションは、目的のタンパク質−タンパク質相互作用を遮断する非ペプチド小分子薬剤リード化合物を設計するのに有用なテンプレートを提供することも可能である。光活性化可能なアミノ酸類似体でペプチド残基を置換し、ペプチドを受容体結合部位に架橋し、受容体をペプチド断片に切断し、そして結合部位の位置を質量分析で解析することによって、光化学架橋を用いて、受容体上のペプチドの結合部位を調べることもまた可能である。多様な実験からの構造データを組み合わせることによって、コンピュータグラフィックスを用いて相互作用タンパク質表面のモデルを発展させることが可能になり、そしてこれは、相互作用を調節する新規非ペプチド分子の設計の指針となる。
【０１５１】
［０００１６９］Ｘ線回折結晶学では、研究中の分子の結晶型をＸ線ビームに曝露して、そして入射の角度から多様な角度で回折放射線の強度を測定する。Ｘ線ビームは、多数の回折「反射」に回折し、各反射は、逆格子ベクトルに相当する。反射の回折強度から、「構造因子」として知られる、一連の数字の大きさを決定する。構造因子は、一般的に、複素数であり、複素平面内に大きさおよび位相を有し、そして結晶の単位格子内の電子分布によって定義される。
【０１５２】
［０００１７０］目的の特定のコンホメーションを安定化させるペプチドに結合した、受容体または受容体部分から、結晶を形成することも可能である。ありうるアミノ酸配列の完全なセットをスキャンして、高親和性で特定の受容体に特異的に結合するものを見出すコンビナトリアル技術を用いて、ペプチドを同定する、本発明の方法は、ＧＰＣＲの特定のコンホメーションに結合するペプチドを同定することも可能である。ＮＭＲまたは結晶学による構造決定研究のため、これらのペプチドを受容体に結合させる（そして共結晶化する）ことも可能である。当該技術分野に知られる方法いずれか、例えば、その開示が本明細書に援用される、Ｋｉｍｐｌｅら，Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：８７８−８８１，２００２の方法にしたがって、この方式の共結晶化を行うことも可能である。
【０１５３】
［０００１７１］したがって、別の態様において、活性化されたロドプシンに結合する高親和性ペプチド類似体の選択に関して上述した方法にしたがって、ＧＰＣＲの特定の配座異性体に結合するペプチドを同定するアッセイを行う。高親和性ペプチドが同定されたら、ペプチド擬似体研究にこれらを用いることも可能である。特定のペプチド、例えばオリゴペプチドのコンホメーションおよび望ましい特徴を模倣するが、望ましくない特徴、例えば柔軟性（コンホメーションの喪失）および代謝性分解を回避する化合物は、「ペプチド擬似体」として知られる。高親和性ペプチド類似体の三次元構造を模倣するか、受容体への結合を可能にする表面活性基を有するか、または高親和性ペプチド類似体の三次元構造を模倣する物理的コンホメーションを有する、ペプチド擬似体を用いて、薬剤組成物を作成することも可能である。本発明記載の合理的薬剤設計を用いて、指定された受容体に結合する高親和性ペプチド類似体の機能を模倣する能力を持つ薬剤を同定することも可能である。化合物は、同一のまたは類似の生物学的活性を所持するように、好ましくは、高親和性ペプチド類似体の表面活性官能基、または実質的に類似の基を、同一のまたは実質的に類似の配向で含む。高親和性ペプチド類似体中の表面活性官能基は、受容体が存在する場合、部分的に二次構造または三次構造のため、特定の配向を所持する。合理的薬剤設計は、親分子の機能を模倣する、適切な化合物の同定および化学的修飾両方を含む。
【０１５４】
［０００１７２］一次構造、二次構造および三次構造によって、部分的に、ペプチド擬似体の物理的コンホメーションを決定する。ペプチドの一次構造は、高親和性ペプチド類似体のアミノ酸の数および正確な配列によって定義される。二次構造は、ポリペプチド鎖がらせん構造または他の安定な構造いずれかを所持する度合いによって定義される。三次構造は、ポリペプチドが、大規模なコイル形成またはフォールディングを経て、複雑で、幾分強固な三次元構造を生じる傾向によって定義される。
【０１５５】
［０００１７３］コンピュータモデリング技術によって、科学者が、選択された分子の三次元原子構造を視覚化することが可能になり、そして分子を模倣するか、または分子と相互作用する新規化合物を合理的に設計することが可能になる情報が得られる。選択された分子のＸ線結晶解析および／またはＮＭＲ画像化由来のデータに基づいて、あるいは例えば米国特許第５，６１２，８９５号に記載されるように、もっぱらまたは部分的に一次構造に基づく非経験的な技術から、三次元構造を決定することも可能である。コンピュータグラフィックス系によって、新規化合物がどのようにターゲット分子と連結するかを予測することが可能になり、そして完全な結合特異性を持つように、化合物およびターゲット分子の構造の実験操作を行うことが可能になる。
【０１５６】
［０００１７４］薬剤設計に用いるため、多くのデータベースおよびコンピュータソフトウェアプログラムが利用可能である。例えば、Ｇｈｏｓｈａｌら，Ｐｏｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８（４）：３５９−３７７，１９９６；Ｗｅｎｄｏｌｏｓｋｉら，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６０（２）：１６９−１８３，１９９３；およびＨｕａｎｇら，  Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．１１：２１−７８，１９９７を参照されたい。制約された、代謝的に安定な非ペプチド部分を含むデータベースを用いて、スクリーニングで同定された高親和性ペプチドの適切な類似体に関して検索し、そしてこうした類似体を示唆することも可能である。これらの分子の活性領域の既知の構造に対して三次元類似性を有する非ペプチド（有機）構造（例えば非ペプチド類似体、および／または二ペプチド類似体）の三次元データベースを用いて、検索を行うことも可能である。例えば、Ａｌｌｅｎ，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｂ．５８：３８０−３８８，２００２を参照されたい。
【０１５７】
［０００１７５］あるいは、分子力学などの他の手段によって生成された三次元構造を考慮に入れることも可能である。さらに、三次元データベース比較の検索アルゴリズムが文献において入手可能である。Ｒｕｆｉｎｏら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．８：５−２７，１９９４。こうした検索のための商業的ソフトウェアもまた、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．（９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  ９２１２１−３７５２）などの業者から入手可能である。すべての残基レベルで、置換部分を有する類似体をシミュレーションするかまたは合成することによって、体系的な方式で検索を行う。好ましくは、主鎖の一部の置換が三次構造を妨害せず、そして側鎖置換が高親和性ペプチド／受容体相互作用を保持するのに適合するように注意を払う。
【０１５８】
［０００１７６］重要なアミノ酸の結合角および空間的幾何学に関する情報を用い、本明細書に記載するようなコンピュータプログラムを用いて、ペプチド擬似体を発展させることも可能である。既定のリガンドがターゲット受容体タンパク質に結合するかどうか決定するには、熱タンパク質アンフォールディング、または熱「シフト」アッセイが用いられてきた。物理的熱シフトアッセイにおいて、温度増加の関数として、タンパク質の生物物理パラメータにおける変化を監視する。例えば、熱量測定研究において、測定される物理的パラメータは、タンパク質が温度に誘導されるアンフォールディング遷移を経る際の、熱容量における変化である。示差走査熱量測定を用いて、Ｇタンパク質共役型受容体のリガンドの親和性を測定することも可能である。Ｇｒａｕｓｃｈｏｐｆら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：８８７８：８７，２０００；Ｂｒａｎｄｔｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：６９２７−４０，１９９０。したがって、当業者に一般的な方法を用いて、受容体の熱シフトを調節する能力に関して、高親和性ペプチドをアッセイすることも可能である。
【０１５９】
［０００１７７］ＧＰＣＲから高解像度の結晶構造を得ることが困難であるため、Ｇタンパク質、受容体およびリガンド間の相互作用を性質決定するために、多様な生物物理学的方法が適用されてきた。これらには、蛍光標識ペプチド類似体を用いて行う蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）実験（Ｂｅｔｔｉｏら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６０：４２０−３７，２００１）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）実験（Ａｙｏｕｂら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２１５２２−８，２００２）、光親和性標識（Ｔｕｒｅｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７７：１６７９１−１６７９７，２００２）、蛍光分光（ＧｈａｎｏｕｎｉらＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４４３３−２４４３６，２００１）、部位特異的スピン標識（Ｈｕｂｂｅｌｌら，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：７３５−７３９，２０００）、フーリエ変換赤外示差分光（Ｖｏｇｅｌら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１１１４９−１１１５９，１９９６）、および内因性トリプトファン蛍光分光（Ｆａｒｒｅｎｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：５０７３−５０７６，１９９５）が含まれる。
【０１６０】
［０００１７８］以下の限定されない実施例を提供して、本発明の特定の側面を例示する。
【実施例】
【０１６１】
（実施例１）
ペプチドライブラリーの構築
［０００１７９］バイアスペプチドライブラリーの構築が先に記載されてきている。Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３６１−３６６，１９９６；Ｓｃｈａｔｚら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：１７１−１９１，１９９６。ライブラリー構築に用いたベクターは、ｐＪＳ１４２であった（図３を参照されたい）。このベクターは、ＬａｃＩおよびバイアス１１量体ペプチドコード配列の間のリンカー配列とともに、ライブラリーオリゴヌクレオチドをクローニングするための制限部位を有した。突然変異誘発ライブラリーをコードするよう合成したオリゴヌクレオチドを、各位に関して、７０％の正しい塩基および１０％の他の塩基各々で合成した。この突然変異誘発率は、１１のコドンがいずれも適切な（天然）アミノ酸である可能性がおよそ５０％、そして別のアミノ酸である可能性がおよそ５０％であるような、バイアスライブラリーを生じる。さらに、４つのランダムＮＮＫ（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴを示し、そしてＫはＧまたはＴを示す）コドンのリンカーを配列の５’端で合成して、全部で１５のランダムコドンを作成する。この方法を用いて、Ｇαｔのカルボキシル末端配列（ＩＫＥＮＬＫＤＣＧＬＦ；配列番号１５）に基づいて、連結に用いるベクター、マイクログラムあたり、１０９より多い独立クローンを含むライブラリーを構築した。このライブラリーを生成するのに用いた核酸は：
【０１６２】
【化１】
2007525170.tif 000009
【０１６３】
であった。
（実施例２）
Ｇαサブユニットペプチドライブラリーを生成するための配列
［０００１８０］実施例１の方法および以下の表ＶＩＩに列挙する配列を用いて、ライブラリーを生成した。
【０１６４】
表ＶＩＩ．  Ｃ末端Ｇαサブユニットペプチドライブラリー構築物
【０１６５】
【表７】
2007525170.tif 000010
【０１６６】
（実施例３）
トロンビン受容体を発現する昆虫細胞からの膜単離
［０００１８１］０．１％プルロニックＦ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）、１０％ウシ胎児血清、および２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有する２００ｍｌのＧｒａｃｅの昆虫細胞培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて、１リットルのスピナ・フラスコ中、２７℃で２５時間、Ｓｆ９細胞（２ｘ１０８細胞）を培養した。感染効率３〜５のＴｈＲ／ｐＢｌｕｅｂａｃ組換えウイルスで、Ｓｆ９細胞を感染させ、そして２７℃で４日間培養した。細胞を採取し、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、そして次いで１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に再懸濁した。次いで、低速に設定した手持ちホモジナイザーで２０秒間、細胞をホモジナイズした。次いで、壊れた細胞を１７，０００ｘｇで１５分間沈降した。上清を廃棄し、そして５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４および１０％グリセロールからなる緩衝液にペレットを再懸濁した。膜調製物中の受容体濃度は、１〜１０，０００ｐｍｏｌ／ｍｇの範囲であった。スクリーニングのため、２００μｇ／ｍｌの最終濃度を用いた。ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質を用いて、天然Ｇｑ−Ｃ末端ペプチドに結合する能力に関して、トロンビン受容体を試験した。
【０１６７】
（実施例４）
トロンビン受容体を過剰発現する哺乳動物細胞からの膜の単離
［０００１８２］ポリメラーゼ連鎖反応によってＰＡＲ１受容体ｃＤＮＡ（２．１ｋｂ挿入物）を得て、そして哺乳動物発現ベクターｐＢＪ５にクローニングした。リン酸カルシウム共沈殿法によって、チャイニーズハムスター卵巣細胞に、生じたプラスミドをトランスフェクションした。１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコの修飾イーグル培地を用いて、ＰＡＲ１トランスフェクション細胞を増殖させた。５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを用いて、細胞を脱離させ、そしてＰＢＳ中で２回洗浄した。ペレットを膜調製に直ちに用いるか、または−２０℃で凍結保存した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（１０ストローク）を用いて、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．５ｍＭ  ＰＭＳＦを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中にペレットをホモジナイズし、そして１０秒間超音波処理した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、核破片および損なわれていない細胞を除去した。上清を１２，０００ｘｇで３０分間沈降し、そして生じたペレットを、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．５、２５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％スクロース、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ、５０μｇ／ｍｌアンチパイン、１μｇ／ｍｌアプロチニン、４０μｇ／ｍｌベスタチン、１００μｇ／ｍｌキモスタチン、０．５μｇ／ｍｌロイペプチン、および０．７μｇ／ｍｌペプスタチンに再懸濁した。膜をアリコットし、そして−８０℃で凍結した。
【０１６８】
（実施例５）
桿体外節の調製
［０００１８３］Ａｒｓｈａｒｋｙら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９８８２−１９８８７，１９９４に記載されるように、薄暗い赤色光下で、新鮮な網膜から、ウシ桿体外節（ロドプシン含有膜）を調製した。切開のため、氷上の単離緩衝液（９０ｍＭ  ＫＣｌ、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、５０μＭフェニルメチルスルホニルフロリド、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５）中の３０％（ｗ／ｖ）スクロース、２００ｍｌを満たしたビーカーに網膜を入れ、切開中、中程度に一定に溶液を攪拌した。切開後、網膜溶液を、氷上で１時間、暗所に放置した。網膜−スクロース溶液を８本の５０ｍｌ試験管に分配し、そして４℃、３０００ｘｇで４分間沈降した。上清を新たな８本の遠心管にデカントし、そして氷上に置いた。試験管上端から１．５ｃｍ下まで単離緩衝液を満たし、次いで１７，０００ｘｇで２０分間沈降した（「スピン１」）。
【０１６９】
［０００１８４］ペレットを少量の３０％スクロースに再懸濁し、そして８本の試験管から４本の試験管にまとめた。試験管上端から１．５ｃｍ下まで３０％スクロースを満たし、４℃、５０００ｘｇで４分間沈降し、そして上清を４本の清浄試験管にデカントした。これらの試験管上端から１．５ｃｍ下まで単離緩衝液を満たし、そして４℃、１７，０００ｘｇで２０分間沈降した（「スピン２」）。
【０１７０】
［０００１８５］６本の勾配試験管中に、以下の表ＶＩＩＩの溶液、＃２、＃３、＃４を上から下の順序で用いて、段階的スクロース勾配を調製した。
表ＶＩＩＩ．  スクロース勾配溶液
【０１７１】
【表８】
2007525170.tif 000011
【０１７２】
［０００１８６］「スピン１」および「スピン２」由来のペレットを、試験管あたり１ｍｌの２６％スクロース緩衝液を用いて、単離緩衝液中に再懸濁した。スラリーを作成した後、各試験管を１ｍｌピペットでホモジナイズし、そして試験管をまとめた。ペレット溶液を注意深くスクロース勾配上に上層し、そして勾配層に進入しないようにした。スイングバケットローター中、勾配試験管を４℃で、２４，０００ｘｇに３０分間供し、その後、膜を含有するオレンジの層を注意深く収集して、ペレットまたはペレット近くの黒ずんだ溶液を乱さないようにした。膜を６本の５０ｍｌ試験管に分配し、そして氷上に置いた。次いで、試験管上端から１．５ｃｍ下まで単離緩衝液を満たし、そして４℃、１７，０００ｘｇで２０分間沈降した。上清を廃棄し、そして５μｇ／ｍｌペプスタチンおよび１０μｇ／ｍｌ  Ｅ−６４を含有する１ｍｌの単離緩衝液に、ペレットを再懸濁した。この懸濁物を、アルミホイルを巻いた１５ｍｌコニカル試験管中で、必要になるまで−８０℃で保存し、次いで融解し、ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）中でホモジナイズし、そして３０，０００ｘｇで３０分間沈降した。上述のように、上清を廃棄し、そしてペレットを再懸濁し、そして再び沈降した。次いで、ペレットを尿素緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、７Ｍ尿素）に再懸濁し、ホモジナイズし、そして４５，０００ｋｇで４０分間沈降した。これらのペレットを再懸濁し、そして緩衝液Ａ（２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１００μＭ  ＰＭＳＦ）中でホモジナイズし、次いで３０，０００ｘｇで３０分間沈降した。各ペレットを再懸濁し、そして１ｍｌ緩衝液Ａ中でピペッティングすることによってホモジナイズし、そしてアッセイで使用するため、アルミホイルで覆った試験管中、１００μｌのアリコットにして、−８０℃で保存した。スクリーニングのため、１０μｇ／ｍｌで受容体をウェルに添加した。実施例１８におけるように、結合アッセイを行った。
【０１７３】
（実施例６）
昆虫細胞からのＰＡＲ１トロンビン受容体の精製および受容体の脂質小胞への再構成
［０００１８７］０．１％プルロニックＦ−６８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、１０％ウシ胎児血清、および２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＧｒａｃｅの昆虫細胞培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州グランドアイランド）中、１リットルのスピナ・フラスコ中、２７℃で２５時間、Ｓｆ９細胞（２ｘ１０８細胞）を培養した。感染効率３〜５のＴｈＲ／ｐＢｌｕｅｂａｃ（組換えウイルス）で、該細胞を感染させ、そして２７℃で４日間培養した。細胞を採取し、２．７ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、そして使用するまで−７０℃で保存した。細胞を溶解緩衝液（２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２、７．５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド、１０ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン、５０ｍＭ  ＮａＦ）に再懸濁し、そして洗浄した。続く工程はすべて、４℃以下で、冷たい緩衝液および遠心分離ローターを用いて、氷上で行った。細胞を最大速で１分間ホモジナイズし、そして３０，０００ｘｇで４５分間沈降した。ペレットを溶解緩衝液に再懸濁し、そしてホモジナイズ／洗浄工程を３回反復した。生じたペレットを、３０ｍｌの可溶化緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、１５ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロリド、１０ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１０ｍｇ／ｍｌアプロチニン、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．１％（ｗ／ｖ）ジギトニン、０．１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸（ｄｅｏｘｙｃｈｏａｔｅ）Ｎａ）に再懸濁し、そして次いで１分間ホモジナイズした。懸濁物を４℃で９０分間攪拌し、そして次いで３０，０００ｘｇで６０分間沈降した。０．２％ジギトニンを含有する可溶化緩衝液で平衡化した、抗ＰＡＲ１モノクローナル抗体カラム上に上清を装填した。上清を適用した後、０．２％（ｗ／ｖ）ドデシルマルトシドＮａを含有する１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、１０カラム体積でカラムを洗浄した。１０ｍＭトリエチルアミン、ｐＨ１１．８を用いて、受容体を溶出した。１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．４を用いて、溶出分画を直ちに中和した。５０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．２％（ｗ／ｖ）ドデシルマルトシドＮａを含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４に対して、プールした分画を透析した。アリコットを−８０℃で保存した。
【０１７４】
［０００１８８］脂質小胞を調製するため、２００μｌのホスファチジルセリン（ＣＨＣｌ３中、５０ｍｇ／ｍｌ；Ｍａｔｒｅｙａ）を回転蒸発装置中で３０分間、または乾燥Ｎ２流を用いて、乾燥させた。２００μｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２％（ｗ／ｖ）ドデシルマルトシドＮａ）を添加した後、Ｎ２大気下で試験管を密封し、そして水槽超音波装置中で３０分間超音波処理した。実施例５におけるように調製した精製受容体を用いて、同じ日に、脂質小胞中に受容体を再構成した。精製受容体ストック（２００μｇ／ｍｌ）を氷上で融解し、そして適切なアゴニストペプチド（最終濃度１００ｎＭ）とともに、５０μｌを４℃で２０分間インキュベーションした。トロンビン受容体の場合、アゴニストは、トロンビン受容体アゴニスト・ペプチド（ＣａｌｂｉｏＣｈｅｍ）である。８０μｌの超音波処理脂質および５０μｌの緩衝液Ａを添加した後、ボルテックス装置を用いて試料を混合し、そして氷上に１０分間置いた。次いで、０．２％  ＢＳＡで洗浄し、そしてドデシルマルトシドＮａを含まない５ｍｌ緩衝液Ａであらかじめ平衡化しておいた、１ｍｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉ−ｇｅｌＴＭカラム上に、試料を装填した。２．５ｍｌのＨＥＫ緩衝液を用いて、カラムから再構成小胞を溶出した。
【０１７５】
［０００１８９］ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度解析のため、試料（１００〜２００μｌ）を収集した。各バッチの濃度は、一般的に、約１０〜１０００μｇ／ｍｌであった。使用のため、約１〜１００μｇ／ｍｌで、マイクロタイタープレートに受容体を入れた。ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質を用いて、天然Ｇｐ−Ｃ末端ペプチドに結合する能力に関して、精製、再構成したトロンビン受容体を試験した。対照として、ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質を用いて、天然Ｇｐ−Ｃ末端ペプチドに結合する能力に関して、空の小胞もまた試験した。
【０１７６】
（実施例７）
ＧＰＣＲ結合高親和性ペプチド類似体の同定（パニング）
［０００１９０］以下のように電気的にコンピテントな（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞を産生した。単一コロニーのＡＲＩ８１４細菌を、５ｍｌ無菌ＳＯＰ（２０ｇ／ｌバクトトリプトン；１０ｇ／ｌバクト酵母エキス；５ｇ／ｌ  ＮａＣｌ；２．５ｇ／ｌ無水Ｋ２ＨＰＯ４；１ｇ／ｌ  Ｍｇ２ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）中、３７℃で一晩増殖させた。この一晩増殖物の１ｍｌを、５００ｍｌのＳＯＰに添加し、そしてＯＤ６００読取値が０．６〜０．８になるまで細菌を増殖させた。すべてのさらなる洗浄工程を冷温中で行った。細胞を少なくとも１５分間氷冷水槽に入れ、次いで、４℃、４０００ｘｇで１５分間、遠心分離に供して、その後、５００ｍｌの１０％グリセロールに再懸濁した。氷上に３０分間静置した後、上述のように、沈降とともに、細胞を５００ｍｌおよび２０ｍｌの１０％グリセロール中でさらに２回洗浄し、そして最後に４℃、５０００ｘｇで１０分間沈降し、そして１ｍｌの１０％グリセロールに再懸濁した。後で使用するため、ドライアイスおよびイソプロパノールを用いて、細胞を１００μｌのアリコットで迅速凍結した。
【０１７７】
［０００１９１］トランスフェクションするため、融解したＡＲＩ８１４細胞のアリコット（４０μｌ）を、３本の冷却した微量遠心管各々に入れた。実施例１にしたがって、Ｇαｔの１１量体カルボキシル末端ペプチド（配列番号１５）に基づくペプチドディスプレイライブラリーを調製した。２μｌのライブラリープラスミドを試験管に添加し、そして混合した。第一周期の「パニング」のため、２００μｌのプラスミドライブラリーを添加した。続く周期のため、３セットのトランスフェクションを行った（受容体を含有するウェル由来の付着プラスミド（＋）；受容体を含有しないウェル由来の付着プラスミド（−）；およびインキュベーションしていないＰＲＥ試料）。以下を参照されたい。
【０１７８】
［０００１９２］各周期のパニングには、前より少ないライブラリーを用いた（第２周期：１００μｌ；第３周期：５０μｌ；第４周期：１０μｌ）。パニングが完了した後、ＬａｃＩ融合タンパク質のＤＮＡを溶出した。このＤＮＡ（５０μｌ）を用いて、冷却無菌０．１ｃｍ電極ギャップキュベットを用いたエレクトロポレーションによって、大腸菌細胞をトランスフェクションした。２００ｍΩのＰｕｌｓｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒ装置とともに、１．８ｋＶ、２５μＦ容量、時間定数４〜５ｍ秒に設定したＢｉｏＲａｄ大腸菌Ｐｕｌｓａｒセットを用いて、キュベットを１回パルス処理した。直ちに１ｍｌのＳＯＣを添加し、そしてラベルを貼った１７ｘ１００ｍｍポリスチレン試験管に、混合物を移した。試験管を３７℃で１時間振盪した。各セットからアリコットを採取し、ＬＢ−Ａｍｐプレート上に１００μｌ、未希釈試料から１０−６希釈試料までを蒔いた。ＰＲＥプレートのカウントはライブラリーの多様性を示し、一方、（＋）プレートおよび（−）プレートの比較は、特定のクローンがパニング法によって濃縮されているかどうかを示した。
【０１７９】
［０００１９３］あらかじめ３７℃に温めた２００ｍｌ  ＬＢ−ＡＭＰ培地を含有する１ｌフラスコに、＋受容体試験管中に残った〜９００μｌを添加し、そしてＯＤ６００＝０．５になるまで、振盪しながら３７℃で増殖させた。次いで、細胞の試験管を、氷冷水槽に少なくとも１０分間入れ、そして続く洗浄工程中、４℃以下への冷却を維持した。細胞を５０００ｘｇで６分間沈降し、１００ｍｌ  ＷＴＥＫ緩衝液中に再懸濁し、５０００ｘｇで６分間沈降し、５０ｍｌ  ＴＥＫ緩衝液に再懸濁し、５０００ｘｇで６分間再沈降し、そして４ｍｌ  ＨＥＫ緩衝液に再懸濁した。細胞を凍結バイアルに分け、そして−７０℃で保存した。１つの試験管を次の周期のパニングに用い、そしてその他はバックアップ用に保存した。
【０１８０】
［０００１９４］パニング法を図１に例示する。ライブラリーを「パニング」によってスクリーニングするため、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび１ｍＭジチオスレイトール（ＨＥＫ／ＤＴＴ）を含有する冷３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５中、実施例５にしたがって調製したロドプシン受容体を、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ４（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）マイクロタイターウェルに直接固定した（０．１〜１μｇタンパク質／ウェル）。４℃で１時間振盪した後、未結合膜断片をＨＥＫ／ＤＴＴで洗い流した。ＨＥＫＬ（３５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；５０ｍＭ  ＫＣｌ；０．２Ｍ  α−ラクトース；ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＤＴＴを含む）中の２％  ＢＳＡ  １００μｌで、ウェルをブロッキングした。第１周期および第２周期に関してはＢＳＡをブロッキングに用い；後の周期に関しては、１％脱脂粉乳を用いた。第１周期のパニングのため、９６ウェルプレートの約２４ウェルを用いた。続く周期では、受容体を含む８ウェルおよび受容体を含まない８ウェルを調製した。
【０１８１】
［０００１９５］Ｇｔライブラリーを融解し（２ｍｌアリコット）、そして氷上で６ｍｌの溶解緩衝液と混合した。溶解緩衝液は、４．２５ｍｌのＨＥ（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ：０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）；１ｍｌの５０％グリセロール；７５０μｌのＨＥ中の１０ｍｇ／ｍｌプロテアーゼ不含ＢＳＡ；１０μｌの０．５Ｍ  ＤＴＴ；および６．２５μｌの０．２Ｍ  ＰＭＳＦを含有する。新たに調製したリゾチーム溶液（１５０μｌの冷ＨＥ中の１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム）を添加し、そして試験管を穏やかに数回反転させ、そして氷上で、２分間以下でインキュベーションした。混合後に、試験管の上端へと泡がゆっくり移動するのに注目することによって、粘性の増加が観察可能であることから、溶解の度合いが示される。２ｍｌの２０％ラクトースおよび２５０μｌの２Ｍ  ＫＣｌ中で混合することによって、溶解を終結させた。直ちに、４℃、１３，０００ｘｇで１５分間、試験管を遠心分離し、そして上清を新規試験管に移した。０．１％の少量のアリコット（ＰＲＥ試料）を、ラベルを貼った別個の試験管に保存した。ブロッキングしたロドプシン受容体コーティングプレートをＨＥＫＬ／１％  ＢＳＡで４回リンスし、そして光活性化型ロドプシンの場合は、氷上で５分間以下、室内光に曝露して、ロドプシンを活性化し（表ＩＸ）、また暗順応（不活性）ロドプシンの場合は、暗所に放置した（表Ｘ）。その直後、ペプチドライブラリー由来の未精製細菌溶解物（２００μｌ）を各ウェルに添加し、そして４℃で１時間、穏やかに振盪させた。第２周期では、この同じ方法にしたがった。第３周期では、用いる溶解物の量を１００μｌに減少させた。続く周期では、溶解物を、ＨＥＫＬ／ＢＳＡ中で１：１０に希釈した。すべての周期で、２００μＭ天然ペプチド５〜１０μｌをウェルに添加して、より低い親和性で結合するペプチドを追い払った。
【０１８２】
［０００１９６］細菌溶解物とインキュベーションした後、冷ＨＥＫＬ／１％  ＢＳＡで４回、ウェルを洗浄した。超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（２００μｌのＨＥＫＬ／１％  ＢＳＡ中、０．１ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加し、そして４℃で３０分間穏やかに振盪した。冷ＨＥＫＬでプレートを４回洗浄し、そして冷ＨＥＫで２回洗浄し、次いで、室温で３０分間、勢いよく振盪しながら、ＨＥ中の１ｍＭ  ＩＰＴＧ／０．２Ｍ  ＫＣｌを５０μｌ／ウェル、添加することによって、溶出した。ウェルの各群由来の溶出物（＋受容体または−受容体）を、必要に応じて、１以上の微量遠心管中で合わせた。先に保存しておいたＰＲＥ試料の体積を、溶出試料の体積と一致するようにして、そしてこれらと平行して沈殿させた。沈殿させるため、１／１０体積の５Ｍ  ＮａＣｌを各試料と混合し、次いで１μｌの２０ｍｇ／ｍｌグリコーゲンを試料と混合した。次いで、等体積のＲＴイソプロパノールを添加し、そして完全に混合した。試料を１３，０００ｘｇ、１５分間の遠心分離に供し、そして上清を吸引した。ペレットを５００μｌの冷８０％エタノールで洗浄し、そして再び１３，０００ｘｇ、１０分間の遠心分離に供した。プラスミドＤＮＡのペレットを、無菌再蒸留水中で再懸濁し、ＰＲＥ試料２００μｌ、および＋受容体試料または−受容体試料４μｌを−２０℃で保存した。
【０１８３】
［０００１９７］光活性化型ロドプシンおよび暗順応ロドプシン両方を用いて、この方式でライブラリーをスクリーニングした。以下の表ＩＸおよびＸを参照されたい。光活性化型ロドプシンを用いて得た配列のうち６つは、ロドプシン結合に際して、天然配列より１００〜１０００倍強力であり、そしてこれらを表ＩＸに列挙する。Ｇαｔライブラリーを用いて、光活性化型ロドプシンをパニングすると、残基Ｌ３４４、Ｃ３４７およびＧ３４８が不変であった。また、最高の親和性の配列各々において、３４１位の塩基性残基（Ｒ３４１）は中性残基に変化していた。Ｇαｔライブラリーを用いて、暗順応ロドプシンをパニングすると、Ｌ３４４、Ｃ３４７、およびＧ３４８残基はもはや不変ではなく（Ｌ３４４は配列の６２．５％に存在し、Ｃ３４７は配列の２５％に存在し、Ｇ３４８は配列の７５％に存在する）、そして３４１位の残基は、通常、変化しなかった。したがって、不活性暗順応状態にある受容体のコンホメーションは、光活性化受容体とは異なるセットのペプチド類似体に結合することを可能にする。さらに、光活性化受容体では、最も重要なのはペプチドの最後の７アミノ酸（３４４〜３５０）であるが、暗順応ロドプシン結合には、最初の６アミノ酸（３４０〜３４５）が最も重要であるようである。
【０１８４】
表ＩＸ．  光活性化型ロドプシン高親和性配列
【０１８５】
【表９】
2007525170.tif 000012
【０１８６】
表Ｘ．  暗順応ロドプシン高親和性配列
【０１８７】
【表１０】
2007525170.tif 000013
【０１８８】
（実施例８）
Ｇｑペプチドライブラリーを用いたＰＡＲ１のスクリーニング
［０００１９８］実施例７の方法を用い、Ｇｑライブラリーを用いて、ＰＡＲ１受容体の異なる供給源をスクリーニングした。脂質小胞中で再構成した精製ＰＡＲ１（実施例６）、ＰＡＲ１を発現するＳｆ９昆虫細胞から調製した膜（実施例３）、およびＰＡＲ１を過剰発現している哺乳動物細胞から調製した膜を用いた。スクリーニングの結果を、それぞれ、表ＸＩ、ＸＩＩおよびＸＩＩＩに示す。３つのスクリーニングすべての競合剤として用いたペプチドは、ＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（配列番号２）であった。４残基リンカー配列はランダムであり、そして場合によって、結合ペプチドのアミノ末端に存在する。これらの結果は、同定された高親和性ペプチドが、スクリーニングされるＰＡＲ１の３つの供給源すべてで類似であることを示す。Ｇｑバイアスライブラリーを用いてＰＡＲ１をパニングした場合、受容体認識に重要であるようであり、そしてしたがって不変である位は、Ｎ３４８、Ｌ３４９およびＶ３５０である。
【０１８９】
表ＸＩ．  再構成精製組換えＰＡＲ１受容体；スクリーニング結果。
【０１９０】
【表１１】
2007525170.tif 000014
【０１９１】
表ＸＩＩ．  ＰＡＲ１受容体Ｓｆ９昆虫細胞膜；スクリーニング結果。
【０１９２】
【表１２】
2007525170.tif 000015
【０１９３】
表ＸＩＩＩ．  ＰＡＲ１を過剰発現する哺乳動物（ＣＨＯ）細胞；スクリーニング結果。
【０１９４】
【表１３】
2007525170.tif 000016
【０１９５】
（実施例９）
ＧＰＣＲ結合高親和性ペプチド類似体の同定（パニング）
［０００１９９］Ｇｓライブラリーでパニングした組換え再構成β２アドレナリン作用性受容体を用いて、実施例７の方法を反復した。パニングスクリーニングおよび選択したペプチドのＥＬＩＳＡ結合親和性の結果を、以下の表ＸＩＶに示す。
【０１９６】
表ＸＩＶ．  Ｇｓライブラリーでスクリーニングした、β２−アドレナリン作用性受容体
【０１９７】
【表１４】
2007525170.tif 000017
【０１９８】
（実施例１０）
ＧＰＣＲ結合高親和性ペプチド類似体の同定（パニング）
［０００２００］Ｇｔライブラリーでのロドプシンスクリーニングを用いて、実施例７の方法を反復した。パニングスクリーニングおよび選択したペプチドのＥＬＩＳＡ結合親和性の結果を、以下の表ＸＶに示す。結合の順位を同定するため、二次抗体をＨＲＰにコンジュゲート化したＥＬＩＳＡ法を用いて、溶解物を解析した。基質添加後、分光計を用いてマイクロプレートを読み取った。結合は、受容体を含むウェルのＯＤ４５０−受容体を含まないウェル（空の脂質小胞を含む対照ウェル）のＯＤ４５０である。
【０１９９】
表ＸＶ．  Ｇｔライブラリーを用いたロドプシンスクリーニング
【０２００】
【表１５】
2007525170.tif 000018
【０２０１】
（実施例１１）
さらなるペプチド類似体
［０００２０１］以下の表ＸＶＩに示す競合ペプチドを用いて、チャイニーズハムスター卵巣で発現されたＰＡＲ１を、Ｇｔ、Ｇ１２およびＧ１３ライブラリーに対してスクリーニングした。実施例１記載のチャイニーズハムスター卵巣細胞から得た、ＰＡＲ１受容体に対する高親和性結合に関するスクリーニングで、示すようなＧｔ、Ｇ１２またはＧ１３ライブラリー、および競合剤として、それぞれ、ＩＲＥＮＬＫＤＣＧＬＦ（配列番号１２４）、ＬＱＥＮＬＫＤＩＭＬＱ（配列番号３８）またはＬＱＤＮＬＫＱＬＭＬＱ（配列番号２３３）を用いて、以下の表ＸＶＩＩに示す、さらなるペプチド類似体を同定した。
【０２０２】
表ＸＶＩ．  ＣＨＯ発現ＰＡＲ１を用いて同定されたペプチド
【０２０３】
【表１６】
2007525170.tif 000019
【０２０４】
表ＸＶＩＩ．  Ｇ１１ライブラリーを用いてスクリーニングしたＰＡＲ１結合ペプチド（ＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ；配列番号２）
【０２０５】
【表１７】
2007525170.tif 000020
【０２０６】
（実施例１２）
ＬａｃＩ溶解物の調製
［０００２０２］パニングの最後の周期で、（＋）受容体プレートからいくつかのクローンを選択し、そしてＬＢ−Ａｍｐ培地中で一晩増殖させた。「ＥＬＩＳＡ溶解物培養」のため、一晩培養物３００μｌを３ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培地で希釈した。別の３０μｌを等体積の５０％グリセロールに添加し、ラベルを貼った微量遠心管中、−７０℃で保存した。残った４．５ｍｌを、標準的ミニプレップ・プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ  ＳｐｉｎｐｒｅｐＴＭキット）を用いたＤＮＡ作成に用い、そしてライブラリーのランダム領域を終結させるＴＡＡ停止コドンから５６塩基対下流の部位のベクターに相同である、１９塩基対の逆プライマー（ＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＡＴＣＣＧ；配列番号２６５）を用いて、配列決定した。ＤＮＡを−２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡ溶解物培養を３７℃で１時間振盪させた。３３μｌの２０％アラビノース（０．２％最終濃度）を添加し、３７℃で２〜３時間振盪して、発現を誘導した。次いで、培養物を、４０００ｘｇ、５分間の沈降に供し、ペレットを３ｍｌの冷ＷＴＥＫ緩衝液に再懸濁し、４０００ｘｇで５分間再沈降し、そしてペレットを１ｍｌの冷ＴＥＫ緩衝液に再懸濁した。１．５ｍｌの微量遠心管に移した後、ペレットを１３，０００ｘｇで２分間沈降し、そして上清を吸引した。細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（４２ｍｌ  ＨＥ、５ｍｌの５０％グリセロール、３ｍｌのＨＥ中の１０ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、７５０μｌのＨＥ中の１０ｍｇ／ｍｌリゾチームおよび６２．５μｌの０．２Ｍ  ＰＭＳＦ）に再懸濁し、そして氷上で１時間インキュベーションした。１１０μｌの２Ｍ  ＫＣｌを溶解混合物に添加し、そして反転して混合し、次いで、４℃、１３，０００ｘｇで１５分間沈降した。透明な未精製溶解物（約０．９ｍｌの上清）を新規試験管に移し、そして−７０℃で保存した。
【０２０７】
（実施例１３）
ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質のＰＡＲ１受容体特異的結合
［０００２０３］個々のクローンにコードされるペプチドの結合特性を以下のようにアッセイした。Ｓｆ９昆虫細胞から調製した精製ＰＡＲ１受容体（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０％グリセロール中、１〜１０，０００ｐｇ／ｍｌ）を、実施例６にしたがって、脂質小胞中に再構成した。０．２〜２０，０００μｇ／ｍｌの範囲の受容体を含有する膜（＋／−受容体）の連続希釈を、マイクロタイタープレート上のウェルに添加し、そして４℃で１時間、穏やかに振盪した。洗浄後、実施例１２記載の方法にしたがって、ＬａｃＩ−Ｇｑクローンから調製したＬａｃＩ−Ｇｑ溶解物の１：１〜１：１０，０００連続希釈をウェルに添加し、プレートを４℃で１時間、穏やかに振盪して、そして洗浄した。抗ＬａｃＩ抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し（１：１０００）、そしてプレートを４℃で１時間、穏やかに振盪した。洗浄後、ＨＲＰ−コンジュゲート化ヤギ抗ウサギ抗体（Ｋｉｅｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し（１：２５００）、そしてプレートを４℃で１時間、穏やかに振盪した。プレートを洗浄し、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼを用いて発色させ、そして次いで、ＥＬＩＳＡ読取装置中、ＯＤ４５０で読み取った。ＥＬＩＳＡの一般的方法論を図４に例示する。図５に示す結果は、ＬａｃＩ−Ｇｑ融合タンパク質が、濃度依存方式でトロンビン受容体に結合することを示す。ＬａｃＩ−Ｇｑ融合タンパク質が空の小胞に結合する能力は、トロンビン受容体で再構成した小胞よりも有意に低かった。
【０２０８】
（実施例１４）
高親和性ペプチドの存在下でのスクリーニング
［０００２０４］光活性化型ロドプシンに対して、実施例７に記載するパニング法によって同定されたものより、さらに高い親和性を有するペプチドを同定するため、第３周期および第４周期のライブラリー・インキュベーションに、高親和性ペプチドを含んだ。天然配列より１０００倍高く、光活性化型ロドプシンへの結合を示すペプチドとして、第一のスクリーニングでペプチド８（ＬＬＥＮＬＲＤＣＧＭＦ；配列番号１２５）が同定された。第３周期および第４周期において、ウェルに１０μｌの１００μＭ（最終濃度１００ｎＭ）のペプチド８を含んだことを除いて、実施例７に記載するとおりに、Ｇαｔライブラリーのスクリーニングを行った。このスクリーニングによって、ロドプシンに非常に高い親和性で結合し、そしてなおかつその活性型、メタロドプシンＩＩにロドプシンを安定化する、いくつかのクローンが明らかになった。以下の表ＸＶＩＩＩを参照されたい。表ＩＸおよび表ＸＶＩＩＩを比較すると、スクリーニングにペプチド８を用いた結果、３４１位が中性残基に変化することが明らかである。残基Ｌ３４４、Ｃ３４７およびＧ３４８は、ペプチド８がスクリーニングに含まれていてもいなくても、安定なままであった。ペプチド８を用いた結果、３４０位のイソロイシンの発生率はより高く（天然ペプチドでは１７％であるのに対して、ペプチド８では７１％）、そして３４２位のグルタミンの発生率はより低かった（天然ペプチドでは６７％であるのに対して、ペプチド８では２９％）。この種の情報は、薬剤または薬剤スクリーニング化合物として使用するための非常に強力な類似体ペプチドの発見に寄与するだけでなく、Ｇαおよび受容体間の接触部位の根底にある、構造フレームワークの理解も進める。
【０２０９】
［０００２０５］この方式で同定されたクローンのいくつかに対して行った結合アッセイを図６に示す。スクリーニングプロセスでペプチド８を用いて同定されたペプチドはすべて、ペプチド８と等しいかまたはそれより高い親和性で、光活性化型ロドプシンに結合した。最初のバー（ＨＡＰ＝ペプチド８）を残りのバーと比較されたい。
【０２１０】
表ＸＶＩＩＩ．  ペプチド８を添加したスクリーニングで同定された、典型的な光活性化型ロドプシン高親和性配列
【０２１１】
【表１８】
2007525170.tif 000021
【０２１２】
（実施例１５）
ＭＢＰベクターへのサブクローニングおよびＭＢＰ未精製溶解物の調製
［０００２０６］ｐＥＬＭ３をＡｇｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて室温で消化して、そして０．７％アガロースゲル上で、切断されたベクターを切断されなかったベクターから分離した。ＤＮＡを精製し（Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ−ａ−ｇｅｌキット）、そしてＳｃａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。１％アガロースゲル上で、５．６ｋｂ  ＭＢＰベクター断片を分離し、そして上述のように精製した。ペプチドライブラリーの最後のアフィニティー精製周期中、細胞を採取する前に、２００ｍｌの増幅培養物の２０ｍｌ部分を取り置いた。この２０ｍｌ部分を、飽和するまで、通常は一晩、増殖させ、そして該細胞からＤＮＡを調製した（Ｑｉａｇｅｎミディプレップ・キット）。ｐＪＳ１４２プラスミドＤＮＡをＢｓｐＥＩおよびＳｃａＩで消化した。１％アガロースゲル上で、３．１ｋｂおよび１．７ｋｂベクター断片から、０．９ｋｂペプチドコード断片を分離し、そして精製した。
【０２１３】
［０００２０７］異なる比の５．６ｋｂ  ＭＢＰベクター断片およびペプチドコード０．９ｋｂ断片（１：２、１：１、２．５：１、５：１、１０：１）を、０．４ｍＭ  ＡＴＰを含有するリガーゼ緩衝液中、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて、１４℃で一晩、連結した。温度を１０分間、６５℃に上昇させることによって、連結を終結させた。バックグラウンドを低下させるため、連結混合物をＸｂａＩで消化した後、１μｌグリコーゲンをキャリアーとして用いて、イソプロパノール沈殿した。８０％エタノールで１回洗浄した後、ペレットを２０μｌの再蒸留水に再懸濁した。ＸｂａＩで消化した連結混合物の沈殿物１μｌを用いて、実施例７に記載するように、ＡＲＩ８１４細胞を形質転換した。細胞を１ｍｌ  ＳＯＣ中、３７℃で１時間振盪させた後、１００μｌの懸濁物をＬＢ−Ａｍｐプレート上に蒔いた。実施例１２のＬａｃＩ溶解物に関して記載するように、未精製溶解物を調製した。
【０２１４】
（実施例１６）
ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質精製
［０００２０８］単一ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質クローンの一晩培養物（１ｍｌ）を２００ｍｌのＬＢ−ＡＭＰ培地に接種した。ＯＤ６００＝０．５になるまで、培養物を３７℃で振盪した。３７℃で２時間、連続して振盪しながら、１５０μｌの１Ｍ  ＩＰＴＧ（最終濃度０．３ｍＭ）を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。次いで、培養物を５０００ｘｇで２０分間沈降し、そして５ｍＭカラム緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；１ｍＭ  ＤＴＴ）中に再懸濁し、そして１６．２５μｌの０．２Ｍ  ＰＭＳＦを添加した。次いで、再懸濁した細胞ペレットを−７０℃で保存した。保存したペレットを冷水中で融解し、そして氷温水槽に入れた。Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ５５  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒを用いて、１５秒間未満、短いパルスでペレットを超音波処理した（４０％一定時間、アウトプット５、全部で１分間の期間で、５回反復）。超音波ペレットを９０００ｘｇで３０分間の遠心分離に供し、その後、上清を取り置き、そしてカラム緩衝液を用いて１００ｍｌに希釈した。通常、タンパク質濃度は、およそ２．５ｍｇ／ｍｌであった。７．５ｍｌアミロース樹脂をＢｉｏＲａｄ使い捨てカラムに注ぎ、そして８体積のカラム緩衝液で洗浄することによって、カラムを調製した。希釈した未精製抽出物を約１ｍｌ／分の重力流によって装填し、そして８体積のカラム緩衝液でカラムを再び洗浄した。１０ｍｌのカラム緩衝液中の１０ｍＭマルトースで融合タンパク質を溶出し、そしてＡｍｉｃｏｎ  ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  ３０ＴＭカラムを用いて濃縮し、次いでアリコットし、そして−７０℃で保存した。
【０２１５】
（実施例１７）
ＥＬＩＳＡによってライブラリー未精製溶解物をスクリーニングする方法
［０００２０９］マイクロタイターウェルを、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する最終体積１００μｌのＨＥＫ中、０．１〜１．０μｇ／ウェルのロドプシン受容体で、振盪しながら４℃で１時間コーティングした。次いで、１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００μｌのＨＥＫ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をウェルに添加し、そして４℃で少なくとも３０分間、振盪を続け、次いで１ｍＭ  ＤＴＴを含有するＨＥＫで４回洗浄することによって、ウェルをＢＳＡでブロッキングした。１ｍＭ  ＤＴＴを含有するＨＥＫ中、未精製溶解物を１：５０に希釈し、そしてコーティングしたウェルに添加した（１００μｌ／ウェル）。プレートを４℃で１時間振盪し、ＰＢＳ／０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ２０  １ｍＭマルトースで４回洗浄し、そして次いで、０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ２０および１ｍＭマルトースを含有するＰＢＳ中、１００μｌの１：１０００ウサギ抗ＭＢＰ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で、振盪しながら、４℃で３０分間、探査した。もう１度洗浄した後、１％  ＢＳＡおよび１ｍＭマルトースを含有するＰＢＳ中、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化した、１００μｌの１：７５００のヤギ抗ウサギ二次抗体を用いて、振盪しながら、４℃で３０分間、探査した。０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ２０および１ｍＭマルトースを含有するＰＢＳで、プレートを４回洗浄した。西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質（Ｂｉｏ−Ｆｘ；１００μｌ）を添加し、そして２０〜３０分間発色させた。１００μｌの２Ｎ硫酸を添加することによって反応を停止し、そしてプレートをＯＤ４５０で読み取った。発色があまり迅速に（１０分未満）起こるか、または陰性対照ウェルのバックグラウンドが高すぎる（０．２より高い）場合、未精製溶解物の１：１００または１：２００希釈を用いて、アッセイを反復した。
【０２１６】
（実施例１８）
高親和性ロドプシン結合ペプチド融合タンパク質の結合アッセイ
［０００２１０］パニングの第４周期で同定されたペプチドコード配列の全集団（実施例７を参照されたい）を、ｐＪＳ１４２からｐＥＬＭ３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に移した。このプラスミドは、修飾ポリリンカーを含むｐＭａｌ−ｃ２誘導体であり、イソプロピルβ−チオガラクト−ピラノシドによって誘導可能であり、そしてリーダー配列が欠失された大腸菌ｍａｌＥ遺伝子を含有し、そしてＭＢＰ融合タンパク質の細胞質発現を導く。ＭＢＰ−カルボキシル末端ペプチド類似体融合タンパク質を大腸菌で発現させた。
【０２１７】
［０００２１１］アッセイのため、暗所で、実施例５に記載するようなＲＯＳ膜（ロドプシン）１μｇ／ウェルを、冷ＨＥＫ／ＤＴＴ中、マイクロタイターウェル上に、４℃で１時間、直接固定した。ウェルをリンスし、ＨＥＫ／ＤＴＴ中、１％  ＢＳＡで、４℃で１時間ブロッキングし、そして再びリンスした。氷上で５分間、光に曝露することによって、結合したロドプシンを活性化した後、ＭＢＰ融合タンパク質を添加した（未精製細菌溶解物を、１μＭジチオステイトールを含むＨＥＫ中で１：５０に希釈し；精製タンパク質を０．２〜１２０ｎＭで用いた）。ＭＢＰ−Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒ（ｐＥＬＭ１７）融合タンパク質およびリンカー配列のみを含むＭＢＰ（ｐＥＬＭ６）は、最終濃度５０ｎＭで対照ウェルに存在した。３０分後、ウェルを洗浄し、そしてウサギ抗ＭＢＰ抗体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加した。未精製溶解物では、１：１０００希釈で、そして精製タンパク質では１：３０００希釈で、抗ＭＢＰ抗体を用いた。３０分後、ウェルを再洗浄し、そして西洋ワサビ・ペルオキシダーゼにコンジュゲート化したヤギ抗ウサギ抗体（未精製溶解物では１：７５００希釈；精製タンパク質では１：１０，０００希釈；Ｋｉｅｒｋａｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加した。３０分後、０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ２０を含有するＰＢＳでプレートを４回洗浄した。西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ基質（１００μｌ）を添加し、そして約２０分間発色させた。１００μｌの２Ｎ硫酸を添加することによって、反応を停止した。結果を図７に示す。値はＯＤ４５０の吸光度を示す。アッセイの陽性対照は、ＭＢＰ融合タンパク質Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒをコードする、ｐＥＬＭ１７であった。リンカー配列のみに融合してＭＢＰタンパク質を発現するｐＥＬＭ６は、陰性対照として働いた。アッセイ内のいかなる固有の非特異的結合も反映する、「溶解物なし」の対照ウェルを含んだ。図７を参照されたい。
【０２１８】
［０００２１２］高親和性ＭＢＰ融合タンパク質のＩＣ５０値は、３．８〜４２ｎＭの範囲であり、ＩＣ５０が６μＭであるＭＢＰ−Ｇαｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｒよりも、最大３桁、より強力である。最高親和性配列のすべてで、天然配列では陽性荷電残基である３４１位は、中性残基に変化していた。Ｌｅｕ３４４、Ｃｙｓ３４７、およびＧｌｙ３４８が不変であることが見出され、そして３４０位、３４９位、および３５０位には常に疎水性残基が位置し、これらの残基が非常に重要な性質を持つことが示された。
【０２１９】
（実施例１９）
ロドプシンへの高親和性ペプチド融合タンパク質の結合は、ヘテロ三量体Ｇｔによって競合的に阻害可能である
［０００２１３］光活性化型ロドプシンを、ＧｔのＣ末端に基づくペプチドに関してスクリーニングして、多数の高親和性配列を得た。ライブラリー由来の高親和性ペプチドを含有するＭＢＰ融合タンパク質（クローン８、９、１０、１８、２３、２４由来の配列とともに、野生型ペプチド配列をコードするｐＥＬＭ１７、およびペプチドを含有しないｐＥＬＭ６；ＭＢＰ−８、ＭＢＰ−９、ＭＢＰ−１０、ＭＢＰ−１８、ＭＢＰ−２３、ＭＢＰ−２４、ＭＢＰ−ｐＥＬＭ１７）の結合を、これらが、ヘテロ三量体Ｇｔの存在下または非存在下で、ロドプシン（０．５μｇロドプシン／ウェル）に結合する能力に関して評価した。
【０２２０】
［０００２１４］各クローン由来の溶解物（５０μｌ）を添加し、そして光の元でインキュベーションした。４５分後、１μＭのヘテロ三量体Ｇｔを添加し、そして溶液を３０分間インキュベーションした。抗ＭＢＰ抗体を添加し、次いでヤギ抗ウサギ・アルカリホスファターゼ・コンジュゲート化抗体および基質を添加した。発色させた。吸光度データを図８に提示する。
【０２２１】
［０００２１５］得られた大部分のペプチド配列は、天然Ｇαｔ  Ｃ末端配列に非常に相同であった。これらの配列のうちいくつかは、非常に高親和性（親ペプチドより＞１０００倍高い）であり、そして受容体仲介Ｇタンパク質活性化の強力でそして特異的なアンタゴニストである。光活性化型ロドプシンへの結合に関して、そしてこれらがＭＩＩコンホメーションを安定化させる能力に関して、高親和性ペプチド融合タンパク質を試験した（表ＸＸＩ）。
【０２２２】
［０００２１６］ＭＢＰ−８は、高親和性でロドプシンに結合し、そしてＭＩＩを安定化させるため、スクリーニングにはこのペプチドを用いた。ＭＢＰ−１８およびＭＢＰ−２４は、どちらも、ロドプシンに対して、ＭＢＰ−８より高い結合親和性を示したが、親和性が非常に高いため、小分子がこれらの結合を競合的に阻害することが不可能である可能性もあることから、これらのペプチドは用いなかった。もちろん、好適であるように、別のペプチド、例えばさらに強力な小分子を見出すためのより高い親和性のペプチドを用いて、スクリーニングを反復することも可能である。
【０２２３】
表ＸＩＸ．  選択したＭＢＰ−高親和性ペプチド融合タンパク質に関する、パニングＥＬＩＳＡのＯＤ４５０の吸光度、並びにＭＩＩ結合およびＭＩＩ安定化のＥＣ５０値
【０２２４】
【表１９】
2007525170.tif 000022
【０２２５】
［０００２１７］ヘテロ三量体Ｇｔは、光活性化型ロドプシンに対する高親和性ペプチド融合タンパク質を競合的に阻害した。図８を参照されたい。ヘテロ三量体Ｇｔは、ロドプシン結合の多数の決定因子を含有し、そしてαサブユニットのミリストイル化およびγサブユニット・カルボキシル末端のファルネシル化を介して、膜結合する。したがって、コンビナトリアル・ライブラリーから選択されたペプチド配列は、非常に高い親和性で受容体に結合する。
【０２２６】
（実施例２０）
ＰＡＲ１へのＭＢＰクローンの結合
［０００２１８］ＰＡＲ１に結合する高親和性ペプチドを同定するため、ＰＡＲ１を過剰発現している哺乳動物細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）から調製した膜を、Ｇ１１ペプチドライブラリーでパニングした。選択したクローンのＥＬＩＳＡ結合親和性の結果を、ＰＡＲ１またはＧｑ共役型ムスカリン性Ｍ１受容体いずれかを発現しているＳＦ９細胞から調製した膜への結合に関して、図９に示す。結合を定量化するため、二次抗体がＨＲＰにコンジュゲート化されているＥＬＩＳＡ法を用いて、精製ＭＢＰクローンを解析した。対照ＭＢＰ−Ｇｑ融合タンパク質に関する結合を示す。図９を参照されたい。データは、二つ組で行った２回の別個の実験の平均である。ＭＢＰクローン、ＰＡＲ−１３およびＰＡＲ−３４は、どちらも、ＰＡＲ１に対して高い結合親和性とともに特異性を示す。ＭＢＰクローン、ＰＡＲ−２３およびＰＡＲ−３３は、どちらも、低親和性および低特異性であるようである。配列に関しては、表ＸＩＩＩを参照されたい。
【０２２７】
（実施例２１）
ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質の結合特異性
［０００２１９］Ｇ１１ライブラリーから選択された、ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質のＰＡＲ１結合クローンを、ＨＥＫ／ＤＴＴ中で１：１００に希釈し、そして実施例３にしたがって調製した、受容体を発現しないか、Ｍ１受容体（Ｇｉに共役する）またはＰＡＲ１受容体を発現する細胞由来のＳｆ９昆虫細胞膜への用量−反応結合に関して試験した。図１０に示すように、増加する量の膜を、マイクロタイターウェルにコーティングし、インキュベーションし、そしてリンスした。ＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質溶解物を添加し、インキュベーションし、そしてリンスし、そしてＬａｃＩ抗体を用いて、上述のように受容体と結合したＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質を測定した。単一の代表的なクローンを図１０に示し、そしてこれによって、ＰＡＲ１に対する選択されたペプチドの特異性が立証される。
【０２２８】
（実施例２２）
ＰＡＲ１への天然Ｇαｑ−マルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質の結合
［０００２２０］実施例６に上述するように、１００ｎｍｏｌのトロンビン受容体活性化ペプチドの存在下で、精製した再構成ＰＡＲ１でマイクロタイターウェルをコーティングした。精製マルトース結合タンパク質−Ｇαｑ（ＭＢＰ−Ｇαｑ）を図１１に示す濃度で添加し、そして４℃で１時間、振盪装置上でインキュベーションした。ウェルをリンスし、そして次いで、上述のように、ウサギ抗マルトース結合タンパク質抗体で探査し、次いでアルカリホスファターゼ・コンジュゲート化二次抗体で探査した。基質を添加し、そして約２０分間発色させた。４０５ｎｍで吸光度を測定し、そしてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン２．０）を用いて、用量−反応曲線を計算した。図１１の結果を参照されたい。活性化ＰＡＲ１へのＧαｑ結合の計算ＩＣ５０は、２１４ｎＭであった。
【０２２９】
（実施例２３）
Ｇαペプチド・ミニ遺伝子構築物用のオリゴヌクレオチドの設計
［０００２２１］新規に操作された５’端および３’端とともに、Ｇαサブユニットの最後の１１アミノ酸をコードするｃＤＮＡを合成した（Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）。５’端はＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有し、その後、ヒト・リボソーム結合コンセンサス配列（５’−ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ−３’；配列番号２６９）、翻訳開始のためのメチオニン・コドン（ＡＴＧ）、並びに翻訳中のリボソーム結合部位および新生ペプチドをタンパク質分解から保護するためのグリシン・コドン（ＧＧＡ）を含有した。翻訳停止コドン（ＴＧＡ）の直後の３’端にＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を合成した。したがって、Ｇｉα１／２カルボキシル末端配列の全長５６ｂｐオリゴヌクレオチドは
５’−ｇａｔｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｇｇａａｔｃａａｇａａｃａａｃｃｔｇａａｇｇａｃｔｇｃｇｇｃｃｔｃｔｔｃｔｇａａ−３’（配列番号２７０）であり、そして相補鎖は、
５’−ａｇｃｔｔｔｃａｇａａｇａｇｇｃｃｇｃａｇｔｃｃｔｔｃａｇｇｔｔｇｔｔｃｔｔｇａｔｔｃｃｃａｔｇｇｔｇｇｃｇｇｃｇ−３’（配列番号：２７１）であった。図１２を参照されたい。対照として、新規に操作された５’端および３’端とともに、ランダムな順序でＧαｉ１／２カルボキシル末端をコードするオリゴヌクレオチド（ＧαｉＲ）もまた、合成した。
【０２３０】
［０００２２２］ＤＮＡを無菌ｄｄＨ２Ｏ中に希釈して、１００μＭのストック濃度を形成した。１ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ３（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中で、相補的ＤＮＡを８５℃で１０分間アニーリングし、次いで、ゆっくりと室温に冷却した。次いで、ＤＮＡを４％アガロースゲル電気泳動に供し、そしてアニーリングしたバンドを切除した。製造者のプロトコルにしたがって、キットを用い（ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキット、Ｂｉｏ１０１）、バンドからＤＮＡを精製した。各制限酵素で消化した後、ｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミドベクターを０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、適切なバンドを切り出し、そして上述のようにＤＮＡを精製した（ＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩキット、Ｂｉｏ１０１）。あらかじめＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した、切断／清浄化ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、アニーリング／清浄化ｃＤＮＡを、室温で１時間連結した。
【０２３１】
［０００２２３］連結反応のため、ベクターｃＤＮＡに対して、いくつかの異なる比の挿入物（２５μＭ：２５ｐＭ〜２５０ｐＭ：２５ｐＭのアニーリングｃＤＮＡの範囲）をプレーティングした。連結反応後、試料を６５℃に５分間加熱して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを非活性化した。実施例７に記載するように、連結混合物（１μｌ）を５０μｌのコンピテント細胞にエレクトロポレーションし、そして直ちに細胞を１ｍｌのＳＯＣ（Ｇｉｂｃｏ）に蒔いた。３７℃で１時間振盪した後、ミニ遺伝子プラスミドＤＮＡを含有する１００μｌのエレクトロポレーション細胞を、ＬＢ／Ａｍｐプレート上に蒔き、そして３７℃で１２〜１６時間インキュベーションした。挿入物が存在することを確認するため、ＬＢ／Ａｍｐ中でコロニーを一晩増殖させ、そしてそのプラスミドＤＮＡを精製した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｓｐｉｎキット）。プラスミドＤＮＡを、Ｎｃｏ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）で、３７℃で１時間消化し、そして１．５％（３：１）アガロースゲル電気泳動に供した。ベクターのみの場合、３本のバンドが生じた。５６ｂｐのアニーリングしたオリゴヌクレオチド挿入物が存在する場合、消化パターンが３本のバンド（３３４５ｂｐ、１３５２ｂｐ、７３５ｂｐ）から４本のバンド（３３４５ｂｐ、１０１１ｂｐ、７３５ｂｐ、３８０ｂｐ）になるように、バンドパターンにシフトを生じる、新規ＮｃｏＩ部位が存在する。図１３を参照されたい。正しい電気泳動パターンを持つＤＮＡを配列決定して、適切な配列であることを確認した。この方法を用いて、高親和性ペプチドいずれかを挿入し、ミニ遺伝子を一定して生成することも可能である。
【０２３２】
（実施例２４）
ミニ遺伝子構築物からのペプチドの発現
［０００２２４］多様なＧタンパク質αサブユニット（Ｇαｉ、Ｇαｏ、Ｇαｓ、Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１２、Ｇα１３、Ｇα１４）のカルボキシル末端配列に対応するミニ遺伝子挿入物とともに、ランダムな順序のＧαｉ配列を含有する対照ミニ遺伝子（ＧαｉＲ）を含む構築物を用いて、ＧＰＣＲ結合ペプチドの発現を達成した。５’端および３’端に、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む、各Ｇαのカルボキシル末端由来のペプチド配列に対応する短い相補的オリゴヌクレオチドを合成することによって、ミニ遺伝子挿入物ＤＮＡを作成した。相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングし、そしてその開示が本明細書に援用される、Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：６６１０−６６１６，  １９９９の方法にしたがって、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＢＡ３．１に連結した。
【０２３３】
［０００２２５］その開示が本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  ｖｏｌ．  １−３（１９８９）の方法にしたがって、標準的リン酸カルシウム法を用いて、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション細胞におけるミニ遺伝子構築物の転写を確認するため、当該技術分野に知られる方法を用いて、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションした４８時間後、細胞から総ＲＮＡを単離した。逆転写酵素ＰＣＲを用いてｃＤＮＡを作成し、そして適切なＧαカルボキシル末端ペプチド挿入物に特異的なプライマー（順方向：５’−ＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡ（配列番号２７２）；逆方向：５’−ＧＣＧＡＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＧＣＴＡ（配列番号２７３））とともに、テンプレートとして該ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲ解析を行った。Ｇαミニ遺伝子のこれらのプライマーは、挿入されたペプチド・コード・オリゴヌクレオチドが存在する場合のみ、４３４ｂｐ断片を増幅する；空のｐｃＤＮＡ３．１ベクターでトランスフェクションされた細胞には、バンドは観察されない。ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル上で分離した。単一の４３４ｂｐのバンドが存在していれば、Ｇαカルボキシル末端ペプチド・ミニ遺伝子ＲＮＡが転写されていたことが示された。図１４を参照されたい。ベクター逆方向プライマーとともにＴ７順方向プライマーを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターの存在を確認し、そしてＧ３ＤＰＨプライマー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて総ＲＮＡの量を近似する、対照実験を行った。
【０２３４】
［０００２２６］ペプチドがトランスフェクション細胞で産生されていることを確認するため、既知の方法にしたがって、トランスフェクション４８時間後、細胞を溶解し、そしてホモジナイズした。以下のように、勾配逆相ＨＰＬＣによって、細胞質抽出物を解析した：ｄｄＨ２Ｏ中の０．１％  ＴＦＡで平衡化したＣ４カラム（Ｖｙｄａｃ）上に、１００μｌの細胞質分画抽出物を装填した。４５分間に渡って０〜６０％に増加するアセトニトリル勾配中の０．１％  ＴＦＡを用いて、ペプチドを溶出した。ピークを収集し、凍結乾燥し、そしてイオンスプレー質量分析（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ−Ｕｒｂａｎａ  Ｃｈａｍｐａｇｎｅ）を用いて分析した。Ｇαｉ１／２ペプチドベクター（ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ）でトランスフェクションした細胞由来のピーク１、およびｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションした細胞由来のピーク１の質量分析によって、各細胞質抽出物には、１４５０ダルトンのペプチド（どちらの１３アミノ酸のペプチド配列に対しても、期待される分子量）が存在することが示された。ミニ遺伝子がコードするペプチドが、細胞質で見られる主要なタンパク質であり、ベクターが適切なペプチド配列を多量に産生したことが強く示唆された。
【０２３５】
（実施例２５）
トロンビンが仲介するイノシトールリン酸集積の、界面Ｇタンパク質ペプチドによる阻害
［０００２２７］トランスフェクションの２４時間前に、ＨＭＥＣを６ウェルプレートに１ｘ１０５ウェルで植えた。実施例２４に記載するように、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲ、またはｐｃＤＮＡ−Ｇｑで細胞を一過性にトランスフェクションした。２４時間後、４μＣｉ／ｍｌ  ［３Ｈ］−ミオイノシトールを含有する２ｍｌ培地中で細胞をインキュベーションして、細胞イノシトール脂質の定常状態の標識を得た。トランスフェクション４８時間後、イノシトールリン酸（ＩＰ）集積に関して、一過性にトランスフェクションした細胞をアッセイした。α−トロンビンでの刺激の２時間前に、細胞を洗浄し、そして５ｍＭ  ＬｉＣｌを含有する培地で、培地交換した。細胞を１０ｎＭ  α−トロンビンで１０分間刺激した。培地を吸引し、そして氷冷メタノール（最終濃度５％）を添加することによって、イノシトールリン酸（ＩＰ）形成を停止した。
【０２３６】
［０００２２８］過塩素酸で溶解した細胞を、４℃、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。１．６ｍｌ陰イオン交換樹脂（ＤＯＷＥＸ  ＡＧ１−Ｘ８、ギ酸型、２００〜４００メッシュ）を含有するＰｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を通じて、ＩＰを含有する上清を溶出した。過塩素酸沈殿したペレット（ホスファチジルイノシトールおよび脂質を含有する）を１ｍｌのクロロホルム−メタノール−１０Ｍ  ＨＣｌ（２００：１００：１、ｖ／ｖ／ｖ）に再懸濁した。これらの懸濁物を３５０μｌのＨＣｌおよび３５０μｌのクロロホルムと混合し、そして２５００ｒｐｍで５分間沈降して、相を分離した。より下の疎水相を回収し、そして総ホスファチジルイノシトール中の放射能の量を測定するため、計測バイアル中で乾燥させた。生じた［３Ｈ］−ＩＰの相対量を以下のように計算した：（［３Ｈ］−ＩＰ（ｃｐｍ）／［３Ｈ］−ＩＰ（ｃｐｍ）＋［３Ｈ］−イノシトール（ｃｐｍ））。ｐｃＤＮＡトランスフェクション細胞で得た基底値（トロンビン刺激なし）を用いて、各値を規準化した。図１５を参照されたい。示す結果は、三つ組で行った少なくとも３回の独立した実験の規準化した平均±ＳＥＭである。＊＊記号はｐ＜０．００５を示す。結果によって、トロンビンの添加が、対照細胞（ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ）におけるＩＰ産生を増加させることが示される。ｐｃＤＮＡ−Ｇｑでトランスフェクションした細胞では、トロンビンが仲介するＩＰ産生の増加が見られず、一方、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉでトランスフェクションした細胞では、通常の反応が見られた。これによって、Ｇｑ  Ｃ末端ミニ遺伝子ベクターをＨＭＥＣにトランスフェクションして、続いて、Ｇｑ  Ｃ末端ペプチドが発現されると、トロンビンが仲介するＩＰ増加が阻害されうることが示される。
【０２３７】
（実施例２６）
トロンビンが誘導するＰ１加水分解および細胞内Ｃａ＋＋増加の、界面Ｇタンパク質ペプチドによる阻害
［０００２２９］Ｇαｑ  Ｃ末端ミニ遺伝子ベクターの発現が、細胞内［Ｃａ＋＋］ｉレベルに影響を及ぼしうるかどうかを決定するため、空のベクター（ｐｃＤＮＡ）、あるいは受容体に結合する能力に関して同定された、高親和性ペプチドをコードする、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑ、またはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲミニ遺伝子ＤＮＡ（１μｇ）でＨＭＥＣをトランスフェクションした。トランスフェクション細胞を、トランスフェクション４８時間後、２４ウェルプレートのカバーガラス上に、低集密度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）で蒔いた。細胞を２時間接着させた。培地を吸引し、そして各カバーガラスを１０μＭオレゴングリーン４８８  ＢＡＰＴＡ−１アセトキシメチルエステル（カルシウム感受性色素）および０．１％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ−１２７とインキュベーションし、そして３７℃で２０〜３０分間インキュベーションし、次いで洗浄緩衝液で２回リンスした。Ｃａ＋＋緩衝液中でトロンビン（〜７０ｎＭ）を添加する前に、基底状態を確立した。１０秒ごとに記録を行い、そしてトロンビンでの刺激後は、１７０秒間続けて記録した。ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅを用いて画像を定量化した。少なくとも７０の細胞からの個々に記録したデータを用いて、蛍光変化（ｙ軸）を計算した。トロンビン添加３０秒後に、蛍光（［Ｃａ＋＋］ｉレベル）が増加することを示す、図１６Ａを参照されたい。図１６Ａの各バーは、７０を超える個々の記録した細胞の平均（（ＦＳ−ＦＢ／ＦＢ−１）±ＳＥＭに相当する。＊＊記号はｐ＜０．００５を示す。図１６Ｂは、［Ｃａ＋＋］ｉの動力学；トロンビンで細胞を刺激した後の蛍光変化を示す。示すデータは、空のベクター（ｐｃＤＮＡ）またはＧｑ  Ｃ末端ミニ遺伝子ベクター（ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑ）のｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞の各記録時点での平均（（ＦＳ−ＦＢ／ＦＢ−１）±ＳＥＭを示す。矢印は、トロンビンを添加した時間を示す。各時点は、１００を超える個々の記録した細胞に相当する。
【０２３８】
［０００２３０］図１６に示すように、トロンビン添加によって細胞を活性化した後、細胞内［Ｃａ＋＋］ｉレベルが一過性に増加した。トロンビン添加の３０秒後、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑでトランスフェクションした細胞は、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞に比較して、４４％減少した、カルシウム反応を有した（図１６Ａ）。トロンビン刺激後に測定したすべての時点を平均すると、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑトランスフェクション細胞は、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞に比較して、４５％の減少を有した（図１６Ｂ）。ｐｃＤＮＡ−ＧαｉまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションした細胞は、トロンビン刺激された［Ｃａ＋＋］ｉレベルにはいかなる影響も持たなかったため、この減少は特異的であるようであった。したがって、Ｇαｑ  Ｃ末端ペプチドを発現する細胞は、トロンビンでの活性化後に［Ｃａ＋＋］ｉレベルを刺激する能力が阻害されているようであり、これは、Ｇαｑの発現によって、この下流仲介因子が特異的に遮断されたことを示す。
【０２３９】
［０００２３１］ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉ、ｐｃＤＮＡ−Ｇｑ、またはｐｃＤＮＡ−Ｇｓミニ遺伝子構築物を、ＨＭＥＣにトランスフェクションし、そしてイノシトールリン酸（ＩＰ）集積をアッセイするのに用いた。２４時間後、細胞を２４ウェルプレートに再度植え付け、そして［３Ｈ］−ミオイノシトール（２μＣｉ／ｍｌ）で標識した。４８時間後、細胞をリンスし、そしてトロンビン（１０ｎＭ）を含みまたは含まずに１０分間インキュベーションした。［３Ｈ］ＩＰを分離するため、ＤｏｗｅｘＴＭカラムを用いて、上述のように、総ＩＰ集積をアッセイした。生じた［３Ｈ］ＩＰの相対量を以下のように計算した：（［３Ｈ］ＩＰ（ｃｐｍ）／［３Ｈ］ＩＰ（ｃｐｍ）＋［３Ｈ］イノシトール（ｃｐｍ））。ｐｃＤＮＡトランスフェクション細胞で得られる基底値（トロンビン刺激なし）によって、各値を規準化した。図１７を参照されたい。示す結果は、三つ組で行った少なくとも３回の独立した実験の規準化した平均±ＳＥＭである。＊＊記号はｐ＜０．００５を示す。
【０２４０】
（実施例２７）
トロンビンが誘導するＭＡＰＫ活性のＧＰＣＲ結合Ｃ末端ペプチドによる防止
［０００２３２］実施例２４記載の方法を用いて、赤血球凝集素（ＨＡ）−ＭＡＰＫ（１ｘ１０５／ｍｌ）を、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｑまたはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲミニ遺伝子構築物とともに、ＨＭＥＣに同時トランスフェクションした。３０時間後、細胞を１８時間、血清枯渇させ、そして次いで、１０ｎＭトロンビンで２０分間処理した。次いで、細胞をＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％デオキシコール酸、０．１％  ＳＤＳ、１０％グリセロール、１０μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１０μｇ／ｍｌロイペプチン）で溶解し、そして１２ＣＡ５抗体（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）（１時間、４℃）およびプロテインＡセファロースビーズ（３時間、４℃）を用いて、ＨＡ−ＭＡＰＫタンパク質を免疫沈降した。ＲＩＰＡ緩衝液中、免疫複合体を３回洗浄した。マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）基質およびキナーゼアッセイキット（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州レークプラシッド）を用いて、免疫沈降物のキナーゼ活性を測定した。各々に関してＭＡＰＫ活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）を得て、そしてＭＡＰＫ活性の相対的増加（トロンビンが仲介する倍増加）を以下のように計算した：（刺激された活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）−基底活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ））／基底活性（ｎｍｏｌ／分／ｍｇ）。結果を図１８に、少なくとも３回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして示す。＊記号はｐ＜０．０５を示す。
【０２４１】
［０００２３３］１０ｎｍｏｌのトロンビンを添加すると、ｐｃＤＮＡ対照ベクターでトランスフェクションした細胞では、ＨＡ−ＭＡＰＫ活性に３．６６倍の増加が生じた。同様に、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲでトランスフェクションした細胞は、トロンビン仲介ＭＡＰＫ活性の本質的に均等な増加（４．４６倍の増加）を有した。しかし、Ｇαｉ、Ｇαｑ、Ｇα１２またはＧα１３  ＧＰＣＲ結合ペプチドをコードするミニ遺伝子構築物でトランスフェクションした内皮細胞は、ｐｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞に比較して、トロンビンが仲介するＨＡ−ＭＡＰＫ活性の有意な減少を示した（それぞれ、５９％、５７％、５０％および７７％）。
【０２４２】
（実施例２８）
トロンビン誘導性の経内皮電気抵抗の減少
［０００２３４］Ｇαｑ、Ｇαｉ、ＧαｉＲミニ遺伝子構築物を発現するか、またはミニ遺伝子構築物を発現しないＨＭＥＣ単層に、交流（５０μＡ；毎分２パルス）を流すことによって、経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定した。基底ＴＥＥＲは、ミニ遺伝子トランスフェクションによって、有意に変化しなかった。しかし、１０ｎＭのトロンビンを添加すると、１０ｎＭトロンビンの存在下の非トランスフェクション細胞に比較して、Ｇαｑミニ遺伝子を発現している細胞のＴＥＥＲに減少が見られた。図１９を参照されたい（多数の実験の代表）。トロンビンに反応した経内皮電気抵抗の減少は、Ｇαｑのカルボキシル末端のミニ遺伝子でトランスフェクションした内皮細胞で有意に減少したが、Ｇαｉ、ＧαｉＲ、または空のベクターでトランスフェクションした細胞では、まったく影響はなかった。これらの結果によって、Ｇαｑが、内皮細胞形状変化に対するトロンビンの効果に部分的に関与することが示唆された。
【０２４３】
（実施例２９）
トロンビン仲介性ストレスファイバー形成の阻害
［０００２３５］ＨＭＥＣ細胞を、ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２またはｐｃＤＮＡ−Ｇα１３ミニ遺伝子構築物各１μｇ／１００ｍｍプレートでトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞のマーカーとして、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の遺伝子を含有するｐＧｒｅｅｎＬａｎｔｅｒｎ−１プラスミドを、ミニ遺伝子構築物とともに、同時トランスフェクションした。４８時間後、細胞を１８時間血清枯渇させ、そして１０ｎＭトロンビンで２０分間処理した。トロンビンに曝露した後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理し、そして１ｍＭローダミン−ファロイジンでＦ−アクチンに関して３０分間染色した。細胞を徹底的に洗浄し、ＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄＴＭアンチフェード・マウント培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）を用いてマウントした。６０ｘ油浸対物レンズを用いる、微分干渉顕微鏡および落射蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）観察両方を備えた倒立顕微鏡（Ｄｉａｐｈｏｔ  ２００、Ｎｉｋｏｎ，  Ｉｎｃ．）で細胞を観察した。蛍光画像およびＤＩＣ画像を、顕微鏡に接続された冷却積算ＣＣＤアレイカメラ（Ｉｍａｇｅｐｏｉｎｔ、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ，  Ｌｔｄ．）を用いて、各細胞フィールドに関して記録した。Ｇα１２ペプチドおよびＧα１３ペプチドによる、トロンビン仲介性ストレスファイバーの阻害を示す蛍光画像に関しては、図２０を参照されたい。
【０２４４】
［０００２３６］ｐｃＤＮＡでトランスフェクションした血清枯渇細胞は、辺縁に、薄い表層（ｃｏｒｔｉｃａｌ）Ｆ−アクチンの縁を示し、そしてストレスファイバーをほとんど含有しなかった（図２０、パネルＡ）。存在するものは、目立たず、そしてランダムな方向を向いているようであった。ｐｃＤＮＡでトランスフェクションしたＨＭＥＣでは、トロンビンへの曝露の２０分後、アクチンが顕著なストレスファイバーに再編成され、典型的には細胞の長軸に沿った平行のパターンに配置された（図２０、パネルＢ）。ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２（図２０、パネルＣ）またはｐｃＤＮＡ−Ｇα１３（図２０、パネルＤ）ミニ遺伝子でトランスフェクションした細胞では、トロンビンへの曝露後、非常に異なるパターンが観察された。ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２およびｐｃＤＮＡ−Ｇα１３トランスフェクション細胞のどちらでも、トロンビン刺激はストレスファイバーの出現を生じなかった。ｐｃＤＮＡ−Ｇα１３でトランスフェクションした細胞では、周辺のアクチンの縁が、より厚く、そしてより直線性であるようであり、細胞−細胞接合部の明らかな輪郭を提供した。したがって、先の報告と一致して、トロンビンは、内皮細胞において、迅速なストレスファイバー形成を誘導した。ｐｃＤＮＡ−Ｇα１２またはｐｃＤＮＡ−Ｇα１３ミニ遺伝子いずれかのトランスフェクションは、トロンビンに誘導されるストレスファイバー形成をもはや示さない細胞を生じた。ストレスファイバー形成が、小さいＧＴＰアーゼＲｈｏに依存することを考慮すると、これらの結果は、Ｇα１２およびＧα１３が、Ｒｈｏシグナル伝達に緊密に関連するという他の知見と一致し、そしてＧＰＣＲ結合ペプチドが、細胞内で発現された際に、このＧタンパク質経路を特異的に遮断する能力を有することを立証する。
【０２４５】
（実施例３０）
ＧＰＣＲ結合ペプチドによる、単一の損なわれていない細胞におけるＧタンパク質活性の阻害
［０００２３７］Ｍ２  ｍＡＣＲを安定して発現する（〜４００ｆｍｏｌ受容体／ｍｇタンパク質）、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ストレプトマイシン／ペニシリン（各１００Ｕ；Ｇｉｂｃｏ）およびＧ４１８（５００ｍｇ／ｌ；Ｇｉｂｃｏ）を補ったＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。１０％  ＣＯ２中、３７℃で細胞を増殖させた。電気生理学的研究のため、すべてのトランスフェクションにおいて、ＣＤ８レポーター遺伝子系を用い、抗ＣＤ８−抗体でコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ（Ｄｙｎａｌ）を用いて、トランスフェクション細胞を視覚化した。以下の量のｃＤＮＡを用いて、細胞をトランスフェクションした：ｐＣ１−ＧＩＲＫ１（ラット）−１μｇ；ΠＨ３−ＣＤ＊（ヒト）−１μｇ；ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｑ、またはｐｃＤＮＡ−Ｇαｓ−４μｇ。したがって、典型的には、１つの１０ｃｍディスクをトランスフェクションするのに用いるｃＤＮＡの総量は７μｇであった。ＧＩＲＫ１およびＧＩＲＫ４のｃＤＮＡは、Ｆ．  ＬｅｓａｇｅおよびＭ．  Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ（フランス・ニース）から寄贈された。Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎら，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １３０：１３５−１４５，  ２０００の方法にしたがって、ＨＥＫ細胞の一過性トランスフェクションには、標準的リン酸カルシウム法を用いた。すべてのアッセイを、トランスフェクション４８〜７２時間後に行った。
【０２４６】
［０００２３８］Ｍ２  ｍＡＣｈＲを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を、ＧＩＲＫ１、ＧＩＲＫ４およびｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｓ、またはｐｃＤＮＡ−Ｇαｑいずれかで一過性にトランスフェクションして、全細胞電流を記録した。内向きに整流されたＫ＋流の測定には、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ；２０ｍＭ  ＫＣｌ；２ｍＭ  ＣａＣｌ２；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．４を含有する細胞外溶液を用いて、全細胞電流を記録した。パッチピペットを満たす溶液は、１００ｍＭグルタミン酸カリウム；４０ｍＭ  ＫＣｌ；５ｍＭ  ＭｇＡＴＰ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４；５ｍＭ  ＮａＣｌ；２ｍＭ  ＥＧＴＡ；１ｍＭ  ＭｇＣｌ２；および０．０１ｍＭ  ＧＴＰで構成された。慣用的な全細胞パッチ技術を用いて、電圧固定下で、膜電流を記録した。その開示が本明細書に援用される、Ｂｕｎｅｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４８９：７０１−７７７，  １９９５およびＢｕｎｅｍａｎｎら，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４８２：８１−８９，  １９９５を参照されたい。異なるトランスフェクション条件または培養条件による変動を最小限にするため、対照実験（ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでのトランスフェクション）を平行して行った。水平プラー（Ｐ−９５  Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＆  Ｐｏｕｌｓｅｎ）を用いて、ホウケイ酸ガラスキャピラリー（ＧＦ−１５０−１０、Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐ．）でパッチピペットを製作した。満たしたピペットのＤＣ抵抗は、３〜６ＭΩの範囲であった。
【０２４７】
［０００２３９］パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００、Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて膜電流を記録した。ローパス・ベッセルフィルター（１〜３ｋＨｚコーナー周波数）を用いて、シグナルをアナログ・フィルター処理（ａｎａｌｏｇ−ｆｉｌｔｅｒｅｄ）した。電圧調節、データ獲得およびデータ評価用のハードウェア／ソフトウェアパッケージ（ＭＦＫ、ドイツ・フランクフルト／マインによるＩＳＯ２）を備えたＩＢＭ適合ＰＣを用いて、データをデジタル保存した。内向き方向のＫ＋流を測定するため、カリウム平衡電位を約−５０ｍＶに設定し、そして保持電位は−９０ｍＶであった。３００ｍ秒以内の溶液交換を可能にする、ソレノイド作動性灌流装置を用いて、アセチルコリン（ＡＣｈ；１μＭ）の適用によって、アゴニスト誘導性電流を誘発した。１０秒ごとに直線電圧傾斜（５００ｍ秒以内に−１２０ｍＶ〜＋６０ｍＶ）を適用した。アゴニスト非依存性電流を減じることによって、アゴニストが誘導する電流の電流電圧特性を決定することが可能であった。機能するチャネルを発現していない可能性がある細胞由来の電流が記録された実験を排除するため、基底のアゴニスト非依存性Ｂａ＋＋（２００μＭ）感受性内向き整流電流を示す細胞のみを解析に用いた。データ解析のため、ＡＣｈが誘導する内向き整流Ｋ＋流の最大電流密度（ピーク振幅）を−８０ｍＶで測定し、そして比較した。
【０２４８】
［０００２４０］ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４およびｐｃＤＮＡ−ＧｉまたはｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ  ＤＮＡで一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、１μＭのＡＣｈで灌流すると、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ  ＤＮＡでトランスフェクションした細胞が、Ｍ２  ｍＡＣｈＲアゴニストに対して、劇的に損なわれた反応を有することが明らかになった。異なるトランスフェクション条件（ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４およびｐｃＤＮＡ−Ｇｉでトランスフェクションした細胞、またはＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４およびｐｃＤＮＡ−ＧｉＲでトランスフェクションした細胞）に関する、ＡＣｈが誘発する電流の最大振幅を示すデータを要約した、図２１を参照されたい。ｐｃＤＮＡ−Ｇｉミニ遺伝子ベクターは、Ｇαｉペプチドの細胞内高発現を生じ、受容体がヘテロ三量体Ｇαｉをシグナル伝達する能力の減少を導く。
【０２４９】
［０００２４１］ＡＣｈによって誘発された最大電流は、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲでトランスフェクションした細胞における２４．１＋／−８．８ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１１）に比較して、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉでトランスフェクションした細胞において、３．７＋／−１．５ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝１４）であった。これは、Ｇαｉミニ遺伝子構築物が、アゴニストが仲介するＭ２  ｍＡＣｈＲ  ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４反応を完全に遮断する一方、対照ミニ遺伝子構築物（ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲ）がまったく影響を持たないことを示す。図２１Ａを２１Ｂおよび２１Ｃに比較されたい。ＧαｑまたはＧαｓのＧαカルボキシル末端をコードするミニ遺伝子構築物、ｐｃＤＮＡ−ＧαｑまたはｐｃＤＮＡ−Ｇαｓでトランスフェクションした細胞は、対照ベクターでトランスフェクションした細胞のものと有意に異ならなかった。これらの知見によって、Ｍ２  ｍＡＣｈＲが活性化するＧタンパク質共役型内向き整流Ｋ＋流反応の、Ｇαｉミニ遺伝子の発現による阻害が特異的であることが確認される。
【０２５０】
（実施例３１）
ヒト微小血管内皮細胞における選択的Ｇタンパク質シグナル伝達阻害
［０００２４２］トロンビン受容体ＰＡＲ１を天然に発現するヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）において、Ｇタンパク質シグナル伝達最終作用の異なる測定値をアッセイした。１ｘ１０５細胞／ウェルで、６ウェルプレート上に細胞を植え付け、そして２４時間後、製造者のプロトコルにしたがって、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、Ｇαカルボキシル末端ペプチドを含有するミニ遺伝子構築物（ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、またはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲ；ウェルあたり１μｇ）で一過性にトランスフェクションした。２４時間後、３μＣｉ／ｍｌ  ［３Ｈ］−アデニンで細胞を３７℃で３０分間標識した。さらに２４時間後、１ｍＭイソブチル−メチルキサンチンを含有する血清不含培地で、細胞を洗浄した。ｃＡＭＰ集積を刺激するため、１μＭイソプロテレノールで、３７℃で３０分間、細胞を処理した。ｃＡＭＰ集積に対するトロンビンの阻害効果を見るため、イソプロテレノールを添加する１５分前に、細胞をトロンビン（５０ｎＭ）であらかじめ処理した。培地を吸引した後、氷冷５％トリクロロ酢酸を添加することによって、反応を終結させた。
【０２５１】
［０００２４３］（ｃＡＭＰ／ｃＡＭＰ＋ＡＴＰ）ｘ１０００として、図２２に結果を提供する。二つ組で３回の別個の実験を行った。＊＊記号はｐ＜０．００５を示す。基底ｃＡＭＰレベルは、試験した条件すべてで、本質的に均等であった。イソプロテレノールで内皮細胞を刺激すると、β−アドレナリン作用性受容体が活性化され、Ｇｓ経路を通じて、該細胞のｃＡＭＰレベルが増加する。ｐｃＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉ、またはｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションした細胞は、ほとんど相違を示さず、イソプロテレノールが仲介するｃＡＭＰ集積の増加は、それぞれ、８２倍、６４倍、および７７倍であった。イソプロテレノールを添加する前に、内皮細胞をあらかじめトロンビンとインキュベーションすると、Ｇｉ経路のトロンビン活性化のため、ｃＡＭＰレベルの減少が観察された。ｐｃＤＮＡでトランスフェクションし、そしてトロンビンとあらかじめインキュベーションした内皮細胞は、イソプロテレノールのみで刺激した細胞よりも、ｃＡＭＰレベルの３９％の減少を示した。同様に、ｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲでトランスフェクションし、そしてトロンビンとあらかじめインキュベーションした細胞は、イソプロテレノールのみで刺激した細胞よりも、４３％の減少を示した。しかし、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉでトランスフェクションし、そしてトロンビンとあらかじめインキュベーションした細胞は、イソプロテレノールのみで刺激した細胞と比較して、ｃＡＭＰレベルの０．１％の減少しか示さなかった。したがって、Ｇαｉ  Ｃ末端ペプチドを発現している細胞は、トロンビンでの活性化後、アデニルシクラーゼを阻害不能であるようであり、トロンビンが仲介するＧｉシグナル伝達が、ｐｃＤＮＡ−Ｇαｉミニ遺伝子の発現によって、特異的に阻害されることが示された。
【０２５２】
（実施例３２）
逆アゴニストを同定するスクリーニング法
［０００２４４］実施例７に記載するように、ロドプシン受容体を含有する尿素洗浄桿体外節膜断片をマイクロタイターウェル上に固定し、そしてブロッキングする。受容体を光活性化する。標識した天然Ｇαｔカルボキシル末端ペプチドを、各ウェルに添加し、そして４℃で１時間、穏やかに振盪する。ウェルを洗浄して未結合ペプチドを取り除く。実施例７記載の方法にしたがって調製したＧαｔカルボキシル末端ペプチド由来の未精製細菌溶解物（標識）（２００μｌ）を各ウェルに添加し、そして振盪しながら４℃で１時間インキュベーションする。
【０２５３】
［０００２４５］次いで、ウェルを洗浄して未結合標識を取り除く。ＥＬＩＳＡによって上清またはウェル結合標識を定量化して、ライブラリーペプチドの非存在下でインキュベーションした対照ウェルに比較して、ライブラリーペプチドとインキュベーションした後の受容体からの標識天然ペプチドの解離を検出する。
【０２５４】
（実施例３３）
小分子ライブラリースクリーニング法
［０００２４６］以下のように、ＧＰＣＲ仲介Ｇタンパク質シグナル伝達の阻害に関して、小分子ライブラリーをスクリーニングする。実施例３にしたがって昆虫細胞から調製した、ＰＡＲ１トロンビン受容体を、マイクロタイターウェル上に固定し、ブロッキングし、そして洗浄する。ＣｈｅｍＤｉｖ（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した小分子ライブラリーを、９６ウェルまたは３８４ウェルプレート中、ＭＢＰ−ペプチド融合タンパク質（０．１〜１０００ｎＭ）と同時に添加し、そして４℃で１時間振盪する。小分子を約５〜５０００ｎＭで用いて、最初のスクリーニングを行う。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭおよび１ｍＭマルトースを含有する冷ＰＢＳ中、ウェルを４回洗浄する。ライブラリー化合物を含まずにインキュベーションした対照ウェルに対して、実施例１７に記載するように、抗ＭＢＰ抗体を用いて、ウェルに付着するマルトース結合タンパク質の量を定量化する。
【０２５５】
（実施例３４）
非常に高い親和性で活性化ロドプシンに結合する、Ｇｔに基づくペプチドの同定
［０００２４７］各位ですべてのありうる突然変異を導入するが、Ｋ３４１Ｒ変化を含むＧαｔ配列に向かう全体のバイアスを伴って、ＧｔのＣ末端配列に基づくコンビナトリアル・ペプチドライブラリーを構築し、そして高親和性結合に関してパニングした。その開示が本明細書に援用される、Ｍａｒｔｉｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１：３６１−３６６，  １９９６；Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ３１５：３８８−４０４，  ２０００、並びに用いる方法に関しては、実施例７および１２を参照されたい。Ｃ末端配列内の特定の残基は、非常に保存されていた。おそらく、より興味深いのは、既定の位で天然アミノ酸を選択しない（Ｒ３４１、以下に示すペプチド中の第二の残基）だけでなく、その位で特定のアミノ酸（ロイシン）を選択するようであることである。表ＸＸを参照されたい。表ＸＸＩは、ＧｔのＣ末端配列に基づく同じコンビナトリアル・ペプチドライブラリーを用いた、暗順応ウシ・ロドプシンのスクリーニングから得られるアミノ酸配列を示す。Ｇｔで観察されるように、カルボキシル末端配列内の特定の残基は保存され、そして特定の残基は選択されない。特に、同一の位で（すなわちＣ３４７位）、光活性化型ロドプシンおよび暗順応ロドプシンの選択の間には、極端な相違があり、このことは、活性化に際して、受容体がコンホメーション変化を経て、Ｇタンパク質が相互作用することも可能な新規部位が暴露されることを示す。
【０２５６】
表ＸＸ．  光活性化型ロドプシンを用い、ＧｔのＣ末端配列に基づいてスクリーニングされた、最高親和性アミノ酸配列の並列
【０２５７】
【表２０】
2007525170.tif 000023
【０２５８】
表ＸＸＩ．  暗順応ロドプシンを用い、ＧｔのＣ末端配列に基づいてスクリーニングされた、アミノ酸配列の並列
【０２５９】
【表２１】
2007525170.tif 000024
【０２６０】
［０００２４８］光順応ロドプシンに対する結合に関して選択されたすべての高親和性配列において、通常、陽性に荷電した残基である３４１位が中性残基に変化した。ＲからＬへの特定のアミノ酸変化が選択されるようである。この単一の変化を含んで合成したペプチドを、高親和性結合に関してアッセイし、そして結果を表ＸＸに示す。暗順応ロドプシンに対する結合に関して選択したペプチドでは、３４１位の中性アミノ酸を支持する選択はなかった。表ＸＸＩを参照されたい。Ａｒｇが７５％に見られる。光活性化型ロドプシンに関して選択されたペプチドでは、Ｌｅｕ３４４、Ｃｙｓ３４７、およびＧｌｙ３４８が不変であることが見出され、そして３４０位、３４９位および３５０位には、疎水性残基が常に位置し、これらの残基が重要な性質を持つことが示された。これは、暗順応ロドプシンへの結合に関して選択されるペプチドとはかなり異なっており、暗順応ロドプシンには、不変な位はまったくなかった。最も特筆すべきなのは、Ｃｙｓ３４７位を選択しないようであることである。Ｃｙｓ３４７およびＧｌｙ３４８はどちらもＩＩ’型  βターンの一部であり、これはＭＩＩ安定化に必要である。これによって、ＧｔのＣｙｓ３４７に結合するのに必要なロドプシン上の部位が、受容体が光子を受け取り、そしてＭＩＩを形成した後に初めて暴露されることが示唆される。Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５：３８８，  ２０００を参照されたい。他の研究によって、光活性化型ロドプシンに結合するＣｙｓ３４７の重大な性質は、その疎水性のためであることが示されている。Ａｒｉｓら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：２３３３，  ２００１。Ｃｙｓ３４７を、疎水性アミノ酸で置換すると（Ｃｙｓ３４７Ｍｅｔ、Ｃｙｓ３４７ＶａｌおよびＣｙｓ３４７Ａｂｕ）（Ａｂｕ＝２−アミノ酪酸）、親ペプチドと同じ度合いに、そして類似の強度で、ＭＩＩが安定化される。暗順応ロドプシンペプチドにおいて、３４７でＬｙｓが選択されるようであることから、暗順応ロドプシンへのＧαｔペプチドの結合が、光活性化型ロドプシンとは非常に異なることが明らかに示される。これらの結果によって、ＧｔのＣ末端テールに認識されるロドプシン上の部位は、受容体が暗順応しているかまたは光活性化されているかに応じて異なることが示される。これは、光活性化型ロドプシンへの結合に関して選択された高親和性ペプチドが、活性化状態の受容体のみに結合し、そして暗順応受容体には結合しないことを暗示する。
【０２６１】
（実施例３５）
メタロドプシンＩＩに対する、ペプチド、ペプチド−融合タンパク質または小分子の親和性を決定するアッセイ
［０００２４９］「エキストラＭＩＩ」アッセイでは、ＥＤＴＡで洗浄したロドプシン（実施例５；５μＭ）を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．２中、Ｇｔ３４０−３５０類似体またはＧｔの非存在下または多様な濃度での存在下で、５．３℃でインキュベーションする。３９０ｎｍおよび４４０ｎｍのＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  ＤＷ２０００分光光度計中、水ジャケット型および温度調節型循環装置キュベットホルダーを用いて、試料を５．４℃に維持する。ロドプシンの１０％をブリーチする閃光を提示し、そして１分間インキュベーションした後、第二のスペクトルを測定し、そしてスペクトルの相違を計算する。３９０ｎｍおよび４４０ｎｍの吸光度間の相違として、「エキストラ」ＭＩＩを計算する。プログラムＧｒａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭを用いた非線形回帰によって、αｔ３４０３５０（λ）、突然変異体α３４０−３５０Ｋ３４１Ｌ（ν）、およびヘテロ三量体Ｇｔ（ｖ）によるＭＩＩ安定化の用量反応曲線を解析し、そして図２３に示す。
【０２６２】
［０００２５０］ＭＩＩ崩壊アッセイでは、ペプチド、高親和性ペプチドを発現する融合タンパク質または小分子の存在下、０．１Ｍ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴを含有する１０ｍＭ  Ｋ２ＰＯ４、ｐＨ６．５中、ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  ＤＷ２０００分光光度計中で、ＥＤＴＡで洗浄したＲＯＳ（１０μＭ）の吸光度スペクトルを測定する。スペクトルを暗所で測定し、次いで、室内光で完全にブリーチする。ブリーチした試料のスペクトルを、６時間の期間に渡って、３０分間隔で測定する。
【０２６３】
（実施例３６）
小分子ライブラリースクリーニングのデータ解析
［０００２５１］競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、活性化ロドプシンに結合し、そしてＭＢＰ−８高親和性ペプチド融合タンパク質の結合を増加させる／減少させる化合物に関して、小分子ライブラリー（ＣｈｅｍＤｉｖの薬剤様分子の多様なコレクションを代表する１０，０００化合物ライブラリー）をスクリーニングした。中程度の親和性に基づいて、ＭＢＰ８を選択した。より高い親和性およびＭＩＩを安定化する能力を示すＭＢＰ（すなわちＭＢＰ１８；表ＸＩＸ）を用いて、スクリーニングを反復することも可能である。いかなる大きさのライブラリーで、これらの種類のスクリーニングを用いることも可能であり、したがって、化合物ライブラリーのサイズを１０倍以上増加させ、そして類似の方式で、小分子ヒットに関するスクリーニングを続けることも可能である。
【０２６４】
［０００２５２］結合した光活性化型ロドプシン結合ペプチド融合タンパク質の阻害または刺激の量に相当するユニークな色コードを持つ比色読取値として、スクリーニング結果を示す、ソフトウェアプログラムが好適であり、そして好ましい。光活性化型ロドプシン結合ＭＢＰ−８高親和性ペプチド融合タンパク質を、８０の異なる化合物による競合結合に関してアッセイする、２つの代表的な９６ウェルプレートを用いた。実験を二つ組で行い、そして２つの別個のプレートの結果を平均した。
【０２６５】
［０００２５３］ＭＩＩの用量反応曲線（図２４）は、ＰＬ＿０３０２  Ｒ３．Ｃ４（σ）およびヘテロ三量体Ｇｔ（ν）両方が、ロドプシンの活性化型を安定化することを示す。ＥＤＴＡで洗浄したロドプシン（５μＭ）を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ８．２中、５．３℃でインキュベーションし、そして「エキストラ」ＭＩＩを測定した。色コード読取を用いて、ＭＢＰ−８結合を２５％より増進させた化合物に関して、用量研究を行って、ＥＣ５０曲線を生成した。以下の表ＸＸＩＩは、各化合物のメタロドプシンＩＩ安定化に関する計算ＥＣ５０値を提供する。
【０２６６】
表ＸＸＩＩ．  ＭＩＩへのＭＢＰ−８結合に対する、選択した小分子のＥＣ５０値
【０２６７】
【表２２】
2007525170.tif 000025
【０２６８】
（実施例３７）
ロドプシンに非常に高親和性であるアゴニストは、ＰＡＲ−１刺激されたＣａ＋＋過渡応答に対してまったく影響を持たない
［０００２５４］非関連受容体（ＰＡＲ１）がＣａ＋＋シグナル伝達を活性化する能力に対する影響に関して、小分子ＰＬ＿０５６８  Ｒ１．Ｃ５、ＰＬ＿０５５１  Ｒ８．Ｃ１、ＰＬ＿０８９４  Ｒ３．Ｃ７、ＰＬ＿０３０２  Ｒ３．Ｃ４、およびＰＬ＿１０１２  Ｒ２．Ｃ１を試験した。９６ウェル形式で、ヒト胚性腎細胞を培養し、そして２時間接着させた。培地を吸引し、そして０．１％（ｖ／ｖ）プルロニックＦ１２７および１０μＭオレゴングリーンＢａｐｔａ−１アセトキシメチルエステルを含有する、０．５ｍｌの装填緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．８３ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２５ｍＭマンノース）中で、プレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。３０分後に小分子を適切なウェルに添加し、そして３７℃でさらに３０分間、細胞をインキュベーションした。ＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎＴＭ系を用いて、カルシウム濃度に関して、９６ウェルプレートを試験した。トロンビン添加（±７０ｎＭ）前に、基底状態を確立した。５秒ごとに記録を行い、そしてトロンビンでの刺激後、＞１００秒続けた。図２５を参照されたい。
【０２６９】
（実施例３８）
小分子による、ロドプシンへのＭＢＰ−８結合の調節
［０００２５５］細胞における小分子の影響を試験するため、サンショウウオ（ｓａｌａｍａｎｄｅｒ）の暗順応網膜から単離した桿体に対して、光反応実験を行った。網膜の小片を細かく刻むことによって、単一の桿体を単離した。光受容体を暗順応網膜から機械的に単離し、そして倒立顕微鏡のステージ上の重力送り灌流チャンバーに入れた。ＲｉｅｋｅおよびＢａｙｌｏｒ，  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｊ．  ７１：２５５３−２５７２，  １９９６に記載されるように、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０ｍＭグルコースおよび３ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６を含有するリンゲル溶液中で、Ｂａｙｌｏｒら（Ｂａｙｌｏｒら，  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （Ｌｏｎｄ．）．  ２８８：５８９−６１１，  １９７９；Ｂａｙｌｏｒら  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  （Ｌｏｎｄ．）．  ２８８：５８９−６１１，  １９７９）に記載される吸引電極を用いて、膜電流を記録した。吸引電極によって収集された膜電流を増幅し、２０Ｈｚでローパス・フィルター処理し（３ｄＢポイント；８極ベッセル・ローパス）、１００Ｈｚでデジタル化し、そして続く解析のため、コンピュータに保存した。５０〜５００ｎｍ光の１０ｍ秒閃光によって、光反応を誘発した。較正した減光フィルターを用いて、閃光強度を調節した。できるだけ多くの暗電流を収集するように、細胞を吸引電極中に配置した。一連の電気的に調節されたピンチバルブ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｖａｌｖｅｓ、ニュージャージー州ブーントン）であって、その出口が、直径約１００μｍの共通の灌流パイプに連結された、前記ピンチバルブを用いて、溶液変化（これによって小分子の添加を達成した）を達成した。この系を用いると、溶液変化は、２００〜３００ｍ秒で完了した。直径約５０μｍの開口部のガラスパイプ対を通じて、陽圧によって溶液を駆動した。パイプを圧電トランスレーション・ステージ（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ニューヨーク州フィッシャー）に載せた。この系を用いると、外節の切断端での溶液変化は、１０ｍ秒未満で完了した。
【０２７０】
［０００２５６］デュアルビーム・オプティカルベンチから、光刺激を搬送した。タングステン−ハロゲン電球からの光を１０ｎｍの公称帯域幅の干渉フィルターに通過させることによって、単色光を得た。刺激光の波長（桿体には５２０ｎｍ、そして錐体には４４０ｎｍまたは６２０ｎｍ）および強度をそれぞれ、較正した狭帯域干渉フィルターおよび減光フィルターを用いて設定した。サンショウウオＬ感受性、Ｓ感受性、および紫外線感受性錐体は、６００ｎｍ、４３０ｎｍ、および３６０ｎｍのピーク感受性を有し（ＭａｋｉｎｏおよびＤｏｄｄ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  １０８：２７−３４，  １９９６）、そして６２０ｎｍ、４４０ｎｍ、および３８０ｎｍの光に対する反応の相対的振幅によって、容易に同定される。同定後、Ｓ錐体を４４０ｎｍ光で刺激し、そしてＬ錐体を６２０ｎｍで刺激した。紫外光感受性錐体は研究しなかった。較正した一組の減光フィルターを用いて、光強度を調節し、そして光通路中の電気的に調節されるシャッターによって、閃光を生じた。
【０２７１】
［０００２５７］それぞれ５μＭ化合物ＰＬ＿０３０２Ｒ３Ｃ４の存在下または非存在下の、サンショウウオの暗順応網膜から単離した桿体の光反応を示す結果を図２６および図２７に示す。各図のパネルＡは、閃光が増加した結果の光反応の時間に対してプロットした膜電流（反応）を示す。パネルＢでは、最高閃光の電流が１．０であるように、ピーク反応を規準化した。円は、各閃光のピーク反応に対応する。図２７のパネルＢでは、二分する（ｂｉｓｓｅｃｔｉｎｇ）線によって、ＰＬ＿０３０２Ｒ３Ｃ４の存在下では、電流の同じ変化を得るのに、より低い強度しか必要でないことが示される。結果によって、化合物ＰＬ＿０３０２Ｒ３Ｃ４が、閃光の強度に応じて、ピーク反応（電流変化によって測定されるようなもの）を２０％〜５０％増加させ、そしてしたがって、活性化されるロドプシン受容体の量を増加させることが示される。この結果は、これらの別個の実験の代表である。結果によって、化合物ＰＬ＿３０２Ｒ３Ｃ４が、アロステリック・アゴニストとして作用可能であり、そして細胞において、受容体のシグナル伝達活性を増加させることが示唆される。
【０２７２】
［０００２５８］ＭＰＢ−８の結合を増進する能力に関してもまた、小分子を試験した。ＥＤＴＡで洗浄したロドプシンを含有する９６ウェルプレートに、ＰＥＬＭ６（ＭＢＰ対照）およびＭＢＰ−８をプレーティングした。小分子化合物ライブラリーを添加し、そして結合したままのｐＥＬＭ６またはＭＢＰ−８の量を測定した。標準法を用いた。
【０２７３】
［０００２５９］図２８〜３２は、高親和性ペプチド融合タンパク質、ＭＢＰ−８が、ＥＤＴＡ洗浄したロドプシンに結合するのを増進する小分子の能力を示す、ＭＢＰ−８結合曲線を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】［０００５６］図１は、基本的な２工程基本骨格を示す模式図である。
【図２】［０００５７］図２は、ＧＰＣＲ結合ペプチドを分離し、そして同定するのに用いる親和性スクリーニング法の基礎を示す模式図である。
【図３】［０００５８］図３は、ベクターｐＪＳ１４２の模式図である。
【図４】［０００５９］図４は、ＥＬＩＳＡ法を示す模式図である。
【図５】［０００６０］図５は、濃度依存方式で、ＬａｃＩ−Ｇｑ融合タンパク質がトロンビン受容体に結合することを示す結果を提供する。
【図６】［０００６１］図６は、スクリーニングプロセスにおいて、ペプチド８を用いて同定された、いくつかのクローンに対して行った、結合アッセイのデータを示す。
【図７】［０００６２］図７は、ＰＡＲ１受容体へのＬａｃＩペプチド融合タンパク質の結合データを提供する。ｐＥＬＭ６は、ＭＢＰベクターのみであり；ｐＥＬＭ１７は、ＭＢＰ−天然Ｇｔ３４０−３５０ペプチド融合タンパク質である。
【図８】［０００６３］図８は、高親和性ペプチド８融合タンパク質（ＭＢＰ８）に対して、高親和性融合タンパク質の結合を比較する棒グラフである。
【図９】［０００６４］図９は、精製ＭＢＰ−Ｃ末端融合タンパク質を用いた、ヒト・トロンビン受容体（ＰＡＲ１）を過剰発現するＣＨＯ細胞のパニングのＥＬＩＳＡ結果を示す。ＭＢＰ−Ｇ１１＝ｘｘｘｘ（配列番号１）ＬＱＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（配列番号２）；ＰＡＲ−１３＝ＶＲＰＳ（配列番号３）ＬＱＬＮＲＮＥＹＹＬＶ（配列番号４）；ＰＡＲ−２３＝ＬＳＲＳ（配列番号５）ＬＱＱＫＬＫＥＹＳＬＶ（配列番号６）；ＰＡＲ−３３＝ＬＳＴＮ（配列番号７）ＬＨＬＮＬＫＥＹＮＬＶ（配列番号８）；ＰＡＲ−３４＝ＬＰＱＭ（配列番号９）ＱＲＬＮＶＧＥＹＮＬＶ（配列番号１０）；ＰＡＲ−４５＝ＳＲＨＴ（配列番号１１）ＬＲＬＮＧＫＥＬＮＬＶ（配列番号１２）。
【図１０】［０００６５］図１０は、ｌａｃＩ−Ｇｑ溶解物でアッセイした、ＳＦ９膜（ＰＡＲ１受容体）の用量−反応曲線を示す。
【図１１】［０００６６］図１１は、脂質小胞中で再構成したＰＡＲ１への天然Ｇｑペプチド−マルトース結合タンパク質の結合を示す濃度反応曲線である。
【図１２】［０００６７］図１２は、典型的なｃＤＮＡミニ遺伝子構築物を示す模式図である。配列番号２７０および２７１を示す。
【図１３】［０００６８］図１３は、ミニ遺伝子ベクターのＮｃｏＩ消化物のアガロースゲルである。レーン１は１ｋｂ  ＤＮＡラダーであり；レーン２はｐｃＤＮＡ３．１であり；レーン３はｐｃＤＮＡ−Ｇαｉであり；レーン４はｐｃＤＮＡ−ＧαｉＲであり；そしてレーン５はｐｃＤＮＡ−Ｇαｑである。
【図１４】［０００６９］図１４は、トランスフェクション細胞におけるペプチド・ミニ遺伝子ＲＮＡの転写を示す、ＰＣＲ産物のアガロースゲルである。レーン１はサイズマーカーを含有し、レーン２は、ｐｃＤＮＡ−ＧｉＲでトランスフェクションした細胞からのＰＣＲ産物を含有し、レーン３は、ｐｃＤＮＡ−Ｇｉでトランスフェクションした細胞からのＰＣＲ産物を含有し、そしてレーン４は、空ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクションした細胞からのＰＣＲ産物を含有する。
【図１５】［０００７０］図１５は、基底値に対して規準化した、トロンビン刺激後の相対的［３Ｈ］イノシトールリン酸産生を示す棒グラフである。
【図１６】［０００７１］図１６は、同定された高親和性ペプチドをコードするミニ遺伝子ベクターの存在下または非存在下での、ＧＰＣＲが仲介する細胞内カルシウム濃度増加の阻害を示すデータを提示する。図１６Ａは、トロンビン添加の３０秒後の蛍光（［Ｃａ＋＋］ｉレベル）増加を示す。図１６Ｂは、トロンビンでの細胞刺激後の［Ｃａ＋＋］蛍光変化の動力学を示す。
【図１７】［０００７２］図１７は、同定された高親和性ペプチドをコードするミニ遺伝子ベクターの存在下または非存在下での、ＧＰＣＲが仲介するホスホイノシトール（ＰＩ）加水分解の阻害を示すデータを提示する。
【図１８】［０００７３］図１８は、ＧＰＣＲ結合ペプチドを発現する細胞における、同定された高親和性ペプチドをコードするミニ遺伝子ベクターの存在下または非存在下での、ＧＰＣＲが仲介するＭＡＰＫ活性の相対的増加を示す棒グラフである。
【図１９】［０００７４］図１９は、Ｇαｑ、Ｇαｉ、ＧαｉＲまたは空ベクターを発現する細胞における、トロンビンが誘導する経内皮電気抵抗の減少を示す。
【図２０】［０００７５］図２０は、Ｆ−アクチンに関して染色した細胞の一連の写真であり、ｐｃＤＮＡ−Ｇ１２またはｐｃＤＮＡ−Ｇ１３ミニ遺伝子構築物を発現する細胞における、トロンビン曝露後のストレスファイバー形成の阻害を示す。
【図２１】［０００７６］図２１は、ＧＩＲＫ１／ＧＩＲＫ４および示すミニ遺伝子構築物で一過性にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞に関するアセチルコリン（Ａｃｈ）反応（ｐＡ／ｐＦ）を示す棒グラフである。
【図２２】［０００７７］図２２は、Ｇαカルボキシル末端ペプチド挿入物を含有するミニ遺伝子構築物を発現する細胞における、選択的Ｇタンパク質仲介アデニリルシクラーゼの阻害を示す。
【図２３】［０００７８］図２３は、αｔ３４０３５０、突然変異体αｔ３４０−３５０Ｋ３４１Ｌおよびヘテロ三量体ＧｔによるＭＩＩ安定化の用量−反応曲線を示す。
【図２４】［０００７９］図２４は、小分子ＰＬ＿０３０２Ｒ３Ｃ４によるＭＩＩ安定化を示す。
【図２５】［０００８０］図２５は、ロドプシンのスーパー・アゴニストが、ＰＡＲ１が刺激するＣａ２＋過渡応答に影響を及ぼさないことを示す蛍光データを提示する。
【図２６】［０００８１］図２６は、小分子ＰＬ＿０３０２Ｒ３Ｃ４の存在下で、暗順応したサンショウウオ網膜の単離桿体の光反応（電流変化によって測定されるもの）を示すグラフである。
【図２７】［０００８２］図２７は、小分子の非存在下で、暗順応したサンショウウオ網膜の単離桿体の光反応（電流変化によって測定されるもの）を示すグラフである。
【図２８】［０００８３］図２８は、化合物ＰＬ＿１０１２Ｒ２Ｃ１を添加したＭＢＰ−８結合曲線であり、該化合物の構造を示し、該化合物が、ＥＤＴＡで洗浄したロドプシンへのＭＢＰ−８結合を増進させる能力を示す。
【図２９】［０００８４］図２９は、化合物ＰＬ＿０８９４Ｒ３Ｃ７を添加したＭＢＰ−８結合曲線であり、該化合物の構造を示し、該化合物が、ＥＤＴＡで洗浄したロドプシンへのＭＢＰ−８結合を増進させる能力を示す。
【図３０】［０００８５］図３０は、化合物ＰＬ＿０５６８Ｒ１Ｃ５を添加したＭＢＰ−８結合曲線であり、該化合物の構造を示し、該化合物が、ＥＤＴＡで洗浄したロドプシンへのＭＢＰ−８結合を増進させる能力を示す。
【図３１】［０００８６］図３１は、化合物ＰＬ＿０５５１Ｒ８Ｃ１を添加したＭＢＰ−８結合曲線であり、該化合物の構造を示し、該化合物が、ＥＤＴＡで洗浄したロドプシンへのＭＢＰ−８結合を増進させる能力を示す。
【図３２】［０００８７］図３２は、化合物ＰＬ＿０３０２Ｒ３Ｃ４を添加したＭＢＰ−８結合曲線であり、該化合物の構造を示し、該化合物が、ＥＤＴＡで洗浄したロドプシンへのＭＢＰ−８結合を増進させる能力を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月11日(2007.4.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチドを同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する、前記ペプチドライブラリーのメンバーを選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項１の方法。
【請求項４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項１の方法。
【請求項５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項４の方法。
【請求項１０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片がＧαサブユニットである、請求項４の方法。
【請求項１１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項４の方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項４の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項１の方法。
【請求項１６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項１の方法。
【請求項１７】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項１の方法。
【請求項１８】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項１９】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項１の方法。
【請求項２２】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｂ）高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドを提供し；
（ｃ）前記高親和性Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｄ）工程（ｂ）のペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｂ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項２２の方法。
【請求項２５】
工程（ｂ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項２２の方法。
【請求項２６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項２９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３０】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項２５の方法。
【請求項３１】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項２５の方法。
【請求項３２】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項２５の方法。
【請求項３３】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項２５の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）の前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求２２の方法。
【請求項３５】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と活性化リガンドの相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項２２の方法。
【請求項３６】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｂ）のペプチドの構造に基づく、候補化合物の集中的（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）の候補化合物の前記ライブラリーがコンビナトリアル・ライブラリーである、請求項２２の方法。
【請求項３８】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが薬剤様分子を含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記コンビナトリアル・ライブラリーが集中的小分子ライブラリーである、請求項３７の方法。
【請求項４０】
前記集中的小分子ライブラリーのメンバーが、工程（ｂ）のペプチドの化学的構造に基づく、請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項１の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾ペプチド。
【請求項４２】
請求項２２の方法にしたがって同定される、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物。
【請求項４３】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項１の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４４】
Ｇタンパク質共役型受容体を有する細胞において、Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を修飾する方法であって、請求項２２の方法にしたがって同定された化合物を前記細胞に投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達を阻害する方法であって、前記Ｇタンパク質共役型受容体が同族（ｃｏｇｎａｔｅ）Ｇタンパク質に結合するのに干渉する化合物と、前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物を同定する方法であって：
（ａ）請求項１の方法にしたがって同定されたペプチドを提供し、ここで前記ペプチドは検出可能なペプチドシグナルを提供するように標識されている；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）前記ペプチドと前記Ｇタンパク質共役型受容体を、前記ペプチドが前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する条件下で接触させ；
（ｄ）未結合ペプチドを前記Ｇタンパク質共役型受容体から取り除き；
（ｅ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｆ）候補Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達修飾化合物の前記ライブラリーのメンバーと、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体を接触させ；
（ｇ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体のシグナル伝達活性を測定し、そして前記検出可能ペプチドシグナルを測定し；
（ｈ）前記Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達活性が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているか、そしてＧタンパク質共役型受容体ペプチド結合が、前記候補化合物との接触後に増加しているかまたは減少しているかを決定し；そして
（ｉ）ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合増加、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達増加の両方を生じる化合物を同定し、ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、前記Ｇタンパク質共役型受容体へのペプチド結合減少、およびＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達減少の両方を生じる化合物を同定し、そしてペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体との接触が、工程（ａ）のペプチドの結合親和性増加を生じる化合物を同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項４７】
ペプチドが結合した前記Ｇタンパク質共役型受容体の前記シグナル伝達活性を測定する方法が：
（ａ）イノシトールリン酸集積測定；
（ｂ）細胞内Ｃａ２＋レベル測定；
（ｃ）アデニルシクラーゼ活性測定；
（ｄ）経内皮電気抵抗測定；
（ｅ）ストレスファイバー形成測定；
（ｆ）リガンド結合測定；
（ｇ）受容体発現測定；
（ｈ）受容体脱感作測定；
（ｉ）キナーゼ活性測定；
（ｊ）ホスファターゼ活性測定；
（ｋ）核転写因子測定；
（ｌ）遊走（走化性）すべての測定；
（ｍ）スーパーオキシド形成測定；
（ｎ）一酸化窒素形成測定；
（ｏ）細胞脱顆粒測定；
（ｐ）ＧＩＲＫ活性測定；
（ｑ）アクチン重合測定；
（ｒ）血管狭窄測定；
（ｓ）細胞浸透性測定；
（ｔ）アポトーシス測定；
（ｕ）細胞分化測定；
（ｖ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の膜会合の測定；
（ｗ）プロテインキナーゼＣなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の細胞質ゾル集積の測定；および
（ｘ）Ｒａｎなどの、ＧＰＣＲ活性化に際して転位置するタンパク質の核会合の測定
からなる群より選択される、請求項４６の方法。
【請求項４８】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１３、１５、１７、２１、２３、２５〜２７、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４５〜８５、９４〜１１１、１２５〜１５０、１６０〜１６４、１７５〜１７８および１８３〜２６４からなる群より選択される化合物。
【請求項４９】
療法Ｇタンパク質共役型シグナル伝達修飾ペプチドを哺乳動物に提供するための医薬組成物であって、請求項４８の化合物を発現する発現構築物を含む、前記医薬組成物。
【請求項５０】
過剰なＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達が原因因子である疾患状態を治療するための医薬組成物であって、請求項４８記載の化合物を含む、前記医薬組成物。
【請求項５１】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達増進剤を同定する方法であって：
（ａ）天然Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドに基づくペプチドライブラリーを提供し；
（ｂ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、前記ペプチドライブラリーをスクリーニングし；
（ｃ）天然ペプチドより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する前記ペプチドライブラリーメンバーを選択し；
（ｄ）前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合に関してスクリーニングする候補化合物のライブラリーを提供し；
（ｅ）工程（ｃ）で選択した前記ペプチドライブラリーのメンバーと競合する、前記Ｇタンパク質共役型受容体への高親和性結合に関して、候補化合物の前記ライブラリーをスクリーニングし；そして
（ｆ）工程（ｃ）で選択したペプチドと等しいかまたはそれより高い親和性で前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合する候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定するか、あるいはその結合が工程（ｃ）のペプチドの結合親和性増加を生じる、候補化合物の前記ライブラリーのメンバーを同定する
ことを含む、前記方法。
【請求項５２】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、損なわれていないＧタンパク質共役型受容体への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５３】
工程（ｂ）または工程（ｅ）の前記スクリーニングが、Ｇタンパク質共役型受容体の少なくとも細胞内断片への結合に関して試験することによって行われる、請求項５１の方法。
【請求項５４】
工程（ａ）の前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドが、Ｇタンパク質サブユニットまたはその断片である、請求項５１の方法。
【請求項５５】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約７０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５６】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約７〜約５５アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５７】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約８〜約５０アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５８】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約９〜約２３アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項５９】
前記Ｇタンパク質サブユニット断片が長さ約１１アミノ酸である、請求項５４の方法。
【請求項６０】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧαサブユニットである、請求項５４の方法。
【請求項６１】
前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドがＧαサブユニット・カルボキシル末端ペプチドである、請求項５４の方法。
【請求項６２】
前記Ｇタンパク質サブユニットがＧβγ二量体である、請求項５４の方法。
【請求項６３】
工程（ｂ）の前記スクリーニングが競合結合アッセイを含む、請求項５１の方法。
【請求項６４】
前記競合結合アッセイが、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと、前記ペプチドライブラリーのメンバーの同時インキュベーションに特徴付けられる、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記ペプチドライブラリーメンバーが、検出可能シグナルを提供可能である、請求項５１の方法。
【請求項６６】
前記スクリーニングが酵素連結免疫吸着アッセイである、請求項５１の方法。
【請求項６７】
請求項６６の方法であって、前記酵素連結免疫吸着アッセイが：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体を固体支持体上に固定し；
（ｂ）タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーを提供し；
（ｃ）前記Ｇタンパク質共役型受容体に対して、少なくとも前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドと同程度に高い結合親和性を有するタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーが、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体に結合する条件下で、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーのメンバーと、前記の固定されたＧタンパク質共役型受容体を、前記Ｇタンパク質共役型受容体結合ペプチドの存在下でインキュベーションし；
（ｄ）前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーの未結合メンバーを取り除き；
（ｅ）前記の結合したタンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーと、前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーのタンパク質部分を特異的に認識する抗体を、前記抗体が前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーメンバーに特異的に結合する条件下で、インキュベーションし；
（ｆ）未結合抗体を取り除き；そして
（ｇ）前記の結合した抗体を検出する
工程を含む、前記方法。
【請求項６８】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ディスプレイライブラリーであり、そして前記抗体が抗マルトース結合タンパク質抗体である、請求項６７の方法。
【請求項６９】
前記Ｇタンパク質共役型受容体への結合が、前記Ｇタンパク質共役型受容体と前記シグナル伝達増進剤の相互作用から生じるシグナルを測定することによって決定される、請求項５１の方法。
【請求項７０】
前記ペプチドライブラリーがコンビナトリアル・ペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７１】
前記コンビナトリアル・ペプチドライブラリーがタンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーがマルトース結合タンパク質−ペプチド融合タンパク質ライブラリーである、請求項７１の方法。
【請求項７３】
前記ペプチドライブラリーがペプチドディスプレイライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７４】
工程（ｄ）の候補化合物の前記ライブラリーが、工程（ｃ）で選択された化合物の構造に基づく、候補化合物の集中的ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７５】
候補化合物の前記ライブラリーがペプチドライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７６】
候補化合物の前記ライブラリーが小分子ライブラリーである、請求項５１の方法。
【請求項７７】
請求項５１記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７８】
請求項６７記載の方法によって同定される化合物。
【請求項７９】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療するためのものである医薬組成物であって、請求項４８記載の化合物を含む、前記医薬組成物。
【請求項８０】
Ｇタンパク質共役型受容体シグナル伝達の改変が原因因子である疾患状態を治療するための医薬組成物であって、請求項７８記載の化合物を含む、前記医薬組成物。
【請求項８１】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）Ｇタンパク質共役型受容体−化合物結合対を共結晶させ；
（ｃ）前記共結晶結合対をＸ線結晶学に供し；そして
（ｄ）前記共結晶結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８２】
Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定する方法であって：
（ａ）前記Ｇタンパク質共役型受容体と、請求項７８の化合物を、結合が生じ、そして前記Ｇタンパク質共役型受容体のコンホメーションが安定化される条件下で接触させ；
（ｂ）前記結合対を核磁気共鳴研究に供し；そして
（ｃ）前記結合対の三次元構造を決定する、ここで前記Ｇタンパク質共役型受容体の原子座標が得られる
ことを含む、前記方法。
【請求項８３】
Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナーを単離する方法であって：
（ａ）請求項７８の結合化合物を含む固体支持体を提供し；
（ｂ）候補Ｇタンパク質共役型受容体結合パートナー化合物のライブラリーを提供し；
（ｃ）候補化合物の前記ライブラリーと、前記固体支持体を、前記化合物への前記候補化合物の結合が生じる条件下で接触させ；
（ｄ）未結合候補化合物および非特異的に結合した候補化合物を前記固体支持体から溶出し；そして
（ｅ）前記固体支持体から、結合した候補化合物を回収する
ことを含む、前記方法。
【請求項８４】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８１の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８５】
Ｇタンパク質共役型受容体の活性化を修飾する小分子を設計する方法であって：
（ａ）請求項８２の方法にしたがって、Ｇタンパク質共役型受容体の三次元構造を決定し；そして
（ｂ）前記原子座標に基づくコンピュータモデリングによって候補構造を設計する、ここで前記候補構造は、前記Ｇタンパク質共役型受容体に結合すると予測される
ことを含む、前記方法。
【請求項８６】
請求項７７のペプチドをコードするＤＮＡを含む核酸であって、前記ＤＮＡが異種転写制御配列に機能可能であるように連結されている、前記核酸。
【請求項８７】
請求項８６の核酸を含む発現ベクター。
【請求項８８】
請求項８７の発現ベクターでトランスフェクションされた細胞。
【請求項８９】
請求項４８のペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項９０】
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体からなる群より選択される、請求項８９の抗体。