(57)【要約】  ｈｓｉＲＮＡ混合物を調製し、遺伝子発現をイン・ビボで沈黙化する組成物および方法が提供される。組成物は屁にＲＮＡ分解酵素ＩＩＩに関する。方法はｄｓＲＮＡの調製物を有効量の変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと反応させてｈｓｉＲＮＡ混合物を製造することを対象とする。【選択図】        図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｈｓｉＲＮＡ混合物を調製する方法であって、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の調製物を有効量の変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと反応させて前記ｈｓｉＲＮＡ混合物を生成することを含む方法。
【請求項２】
前記変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩはマグネシウムバッファまたはマンガンバッファに含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩは大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ３８に対応する位置に変異を有することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記変異は大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ３８Ａ、Ｅ３８Ｔ、Ｅ３８ＷまたはＥ６５Ａであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｈｓｉＲＮＡ混合物の形成方法であって、
大きいｄｓＲＮＡを変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと有効時間の間結合させて前記大きいｄｓＲＮＡを切断して前記ｈｓｉＲＮＡ混合物を形成し、
（ｉ）ゲル電気泳動により決定されるように前記大きいｄｓＲＮＡの少なくとも９０％が切断され、かつ
（ｉｉ）前記ｈｓｉＲＮＡ調製品を構成する前記切断されたｄｓＲＮＡの少なくとも３０％が１８〜３０ｎｔのフラグメントサイズを有する方法。
【請求項６】
前記有効時間は約１分間〜２０時間であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程（ｉ）および（ｉｉ）は２０分後に達成されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記工程（ｉ）および（ｉｉ）は５時間後に達成されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記工程（ｉ）および（ｉｉ）は１０時間後に達成されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩはＥ３８ＡまたはＥ６５Ａであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記大きいｄｓＲＮＡは少なくとも５０ｎｔの長さを有することを特徴とする、請求項１および５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
対象遺伝子の遺伝子発現の下方制御方法であって、
（ａ）大きいｄｓＲＮＡの調製品から変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを用いてｄｓＲＮＡフラグメントを含有する非均質ｓｉＲＮＡ混合物を調製すること、
（ｂ）前記ｓｉＲＮＡ混合物から選択されたｄｓＲＮＡに対象遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分解させること、および
（ｃ）前記対象遺伝子の遺伝子発現を下方制御することを含む方法。
【請求項１３】
前記変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩはＥ３８ＡまたはＥ６５Ａであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方はイン・ビトロで起きることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ａ）および（ｂ）の少なくとも一方はイン・ビボで起きることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記前記イン・ビボ工程は真核細胞内で起きることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記真核細胞は哺乳類に１つ以上の対象遺伝子の発現を低減すると表現型変化を引き起こすように存在することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記表現型変化は哺乳類における病気の診断を提供することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記表現型変化は前記哺乳類における所望の特徴の向上であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記表現型は選択された表現型に対して診断的であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子発現の下方発現は遺伝子生産物が機能する生化学的経路を分析するツールであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記生化学的経路はさらに診断試薬と組み合わせてさらに分析することができることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記診断試薬は１種以上の抗体であることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記真核細胞は非ヒト動物中に存在するものであることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記真核細胞は前記ＤＮＡ配列を含有する受精卵細胞から創出される遺伝子同入導入動物の成分であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記工程（ａ）はさらに第１のｈｓｉＲＮＡ遺伝子表現を下方制御するために第１のｈｓｉＲＮＡ混合物を１つ以上の追加のｈｓｉＲＮＡ混合物と結合することを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
個々のｓｉＲＮＡフラグメントをｈｓｉＲＮＡ混合物から選択し、前記個々のｓｉＲＮＡフラグメントを遺伝子表現下方制御のために真核細胞内に導入することをさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
前記調製品の少なくとも３０％が１８〜３０ｎｔのサイズのフラグメントを用いてなり、前記調製品は１０を越える異なるシーケンスのフラグメントを含み、前記調製品は細胞における対象遺伝子表現を下方制御することが可能であり、前記対象遺伝子はＡｋｔ１，２，３、Ｅｒｋ１，２、Ｍｓｋ１、ｐ３８、ＩＲＳ１、ＰＫＲ、ｐＴＥＮ、ＣＲＥＢ、ＥＲａ、Ｅｒｂ、ＤＡＸ、ｐ５３、ＤＮＭＴ１、ＤｎＭＴ３Ｂ、ＤｎＭＴ３Ａ、ＴＲＩＰ、Ｒｂ、ＭｅＣｐ２、カスパーゼ（Ｃａｓｐａｓｅ）３、Ｌａ、Ｆｕｒｉｎ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｆｆｌｕｃおよびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）からなる群から選ばれる、ｈｓｉＲＮＡ混合物。
【請求項２９】
１つ以上の変異を含む変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを含む組成物であって、１つの変異が大腸菌のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ３８に相当する位置に配置され、グルタミン酸（Ｅ）がアラニン（Ａ）に変異したものである組成物。
【請求項３０】
さらに大きいｄｓＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、突然変異ＲＮＡ分解酵素を用いた短い二重鎖ＲＮＡの組成物および製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
短い二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は遺伝子発現を沈黙化（ｓｉｌｅｎｃｅ）する強力なツールである（特許文献１、特許文献２、特許文献３）。二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の大きいフラグメントは哺乳類においてインターフェロン（ＩＦＮ）応答経路の活性化による非特異的応答を導き、翻訳を抑制し、細胞の死をもたらす（非特許文献１および非特許文献２）。ｓｉＲＮＡの標準的な生成方法は所定の短いシーケンスの化学的合成に基づいている。この方法のコストが高いことに加えて、ＲＮＡｉ実験に有効な短いシーケンスを予測するのに一般にコンピュータモデルが必要である。
【０００３】
マグネシウムイオンバッファの存在下で大きいｄｓＲＮＡの部分的消化により得られた短い長さのｄｓＲＮＡの混合物は培養哺乳類細胞系統における同起源（ｃｏｇｎａｔｅ）遺伝子の発現をＲＮＡｉを介してノックダウンすることが示されている（非特許文献３）。しかしながら、適切なサイズ範囲の生産物を生じる部分消化を達成することはしばしば困難でありかつ時間のかかるプロセスであり、所望のサイズのフラグメントを得るのにゲル分離を必要とする。さらに、出発物質に含まれている全ての可能なシーケンスを含むことが保証されない。特許文献４は、引用により本明細書において参照されるが、遷移金属イオンの存在下でＲＮ分解酵素ＩＩＩが遺伝子沈黙化（silencing）に適したサイズのフラグメントの非均質な混合物をどのようにして生成することが可能であるかについては記載していない。これはｓｉＲＮＡフラグメントを作製する既存の方法に対する顕著な改善である。
【０００４】
【特許文献１】国際出願公開第０１／２９０５８号パンフレット
【特許文献２】国際出願公開第０１／６８８３６号パンフレット
【特許文献３】国際出願公開第０１／７５１６４号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００４−００３８２７８号明細書
【非特許文献１】Ｙａｎｇ等著「モレキュラー・セル・バイオロジー」第２１巻第７８０７−７８１６頁（２００１年）［Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２１：７８０７−７８１６（２００１）］
【非特許文献２】ウィアンニ等著「ナチュラル・セル・バイオロジー」第２巻第７０−２５、２５−３３頁（２０００年）［Ｗｉａｎｎｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：７０−２５，２５−３３（２０００）］
【非特許文献１】Ｙａｎｇ等著「プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス」米国第９９巻第９９４２−９９４７頁（２００２年）［Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：９９４２−９９４７］
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、方法論の自由度を向上させて、例えば実験者の都合により決定される広い範囲内で変化し得る非臨界的培養時間を可能にし、および／または非均質ｓｉＲＮＡ混合物を創出するのに用いられるバッファの範囲を広げることを許容するようにすることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、本発明は、非均質ｓｉＲＮＡ（ｈｓｉＲＮＡ）混合物を調製する方法であって、ｄｓＲＮＡを有効量の変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと反応させてｈｓｉＲＮＡ混合物を生成する工程を含む方法を提供する。
【０００７】
本明細書において記載したいかなる実施形態においても、変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩは、例えば大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ３８に対応する位置、例えばＥ３８Ａ、Ｅ３８Ｔ、Ｅ３８Ｗにおける変異、または大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ６５に対応する位置、例えばＥ６５Ａにおける変異を特徴としている。
【０００８】
本発明の一実施形態では、ｈｓｉＲＮＡの調製品形成方法であって、大きいｄｓＲＮＡを変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと有効時間結合させて前記大きいｄｓＲＮＡを切断してｈｓｉＲＮＡ調整品を形成することを含み、（ｉ）ゲル電気泳動により決定されるように前記大きいｄｓＲＮＡの少なくとも９０％が切断され、かつ（ｉｉ）前記ｈｓｉＲＮＡ調製品を構成する前記切断されたｄｓＲＮＡの少なくとも３０％が１８〜３０ｎｔ(ヌクレオチド）のフラグメントサイズを有する方法が提供される。有効時間は約１分〜２０時間、例えば１０分以上、５時間以上または１０時間であってもよい。
【０００９】
本明細書に記載のいずれの実施形態においても、前記大きいｄｓＲＮＡは少なくとも約５０ｎｔの長さを有する。
【００１０】
本発明の一実施形態では、対象遺伝子の遺伝子発現の下方制御方法であって、（ａ）大きいｄｓＲＮＡの調製品から変異ＲＮＡ分解酵素を用いてｄｓＲＮＡフラグメントを含有する非均質ｓｉＲＮＡ混合物を調製すること、（ｂ）前記ｓｉＲＮＡ混合物から選択されたｄｓＲＮＡに対象遺伝子から転写されたｍＲＮＡを分解させること、および（ｃ）前記対象遺伝子の遺伝子発現を下方制御することを含む方法が提供される。工程（ａ）および（ｂ）の少なくとも１つはイン・ビボで起きるようにすることができる。それらの場合、前記イン・ビボ工程は真核細胞内行われ、前記真核細胞は哺乳類、または、より一般的には人以外の動物内に、１つ以上の対象遺伝子の発現を低減すると表現型変化を引き起こすように存在することが可能である。表現型変化は哺乳類における病気の診断を提供することが可能であり、または選択された表現型に対して診断的であることが可能である。遺伝子発現の下方制御は遺伝子生産物が機能する生化学的経路を分析するツールとして使用することができる。この生化学的経路はさらに診断試薬、例えば１つ以上の抗体である診断試薬と組み合わせてさらに分析することが可能である。
【００１１】
本発明の一実施形態では。上述の方法の工程（ａ）は、さらに、遺伝子表現を下方制御するために第１のｈｓｉＲＮＡ混合物を１つ以上の追加のｈｓｉＲＮＡ混合物と組み合わせることを含んでいてもよい。
【００１２】
本発明の一実施形態では、個々のｓｉＲＮＡフラグメントをｈｓｉＲＮＡ混合物から選択し、前記個々のｓｉＲＮＡフラグメントを遺伝子表現下方制御のために真核細胞内に導入する方法が提供される。
【００１３】
本発明の一実施形態では、ｈｓｉＲＮＡ調製品が提供され、この調製品では前記調製品の少なくとも３０％が１８〜３０ｎｔのサイズのフラグメントを用いてなり、前記調製品は１０を越える異なるシーケンスのフラグメントを含み、前記調製品は細胞における対象遺伝子表現を下方制御することが可能であり、前記対象遺伝子はＡｋｔ１，２，３、Ｅｒｋ１，２、Ｍｓｋ１、ｐ３８、ＩＲＳ１、ＰＫＲ、ｐＴＥＮ、ＣＲＥＢ、ＥＲａ、Ｅｒｂ、ＤＡＸ、ｐ５３、ＤＮＭＴ１、ＤｎＭＴ３Ｂ、ＤｎＭＴ３Ａ、ＴＲＩＰ、Ｒｂ、ＭｅＣｐ２、カスパーズ（Ｃａｓｐａｓｅ）３、Ｌａ、Ｆｕｒｉｎ、ＥＧＦＰ、ＲＦＰ、Ｆｆｌｕｃおよびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）からなる群から選ばれる方法が提供される。
【００１４】
本発明の一実施形態では、１つ以上の変異を含む変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを含む組成物であって、１つの変異が大腸菌のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ３８に相当する位置に配置され、グルタミン酸（Ｅ）がアラニン（Ａ）に変異したものである組成物が提供される。この組成物はさらに大きいｄｓＲＮＡを含んでいてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明者はマグネシウムイオン（図３〜１１）またはマンガンイオンを含む標準バッファの存在下でＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ変異体を用いた消化により遺伝子発現を有効に沈黙化するのに適したｄｓＲＮＡフラグメントの選択的生成を報告する。異なるタイプの変異体は、ＲＮＡ結合または切断残基を変える単一点変異と、二点変異体を含むものとして記載されている。マンガン含有バッファ（米国特許出願公開第２００４−００３８２７８号明細書）中の野生型ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩに対して記載された活性に匹敵または改善された活性を有する変異体の例は図面（図１２）および実施例（例えば実施例１参照）に提供される。
【００１６】
変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩは組換により高収率で製造することができる。これらの酵素は使用するのが便利であるが、その理由としては：基質と一緒に酵素をインキュベートする時間は臨界的に重要ではないこと、および酵素はそれぞれの使用のための特定の濃度を決定するために滴定する必要がないことが挙げられる。これらの特徴により変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩは高処理量反応に特に有効である。変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ消化後に得られるｄｓＲＮＡ生産物はここに遺伝子沈黙化に有効であることが示された。
【００１７】
ここに、野生型または活性変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを不活性変異体（Ｅ１１７Ｄ）と混合すると図１３〜図１６に示されるように拡散サイズラダーを形成することができる。図１３において、Ｅ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩおよびＥ１１７ＤをテンプレートＤＮＡと反応させて種々のサイズの生産物を生成する。これはＥ１１７Ｄがテンプレートに結合するが基質を切断してＥ３８Ａ用の潜在的な切断サイトをブロックすることはないからである。この効果は図１４に示される。同様に、野生型ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩおよびＥ１１７Ｄを一緒に混合すると、異なるサイズのフラグメントのラダーが観察される（図１６）。
【００１８】
明細書および任意の請求項において使用されている下記の用語は以下に定義される。これらの定義はこれらの用語が用いられている文脈が別様であることを必要としない限り適用されるべきである。
【００１９】
「ｈｓｉＲＮＡ混合物」は、遺伝子発現を沈黙化するのに適した少なくとも１つのフラグメント（ｓｉＲＮＡ）を含む短い二本鎖ＲＮＡフラグメントの非均質（ｈ）混合物をいう。ｈｓｉＲＮＡ混合物のＲＮＡフラグメントは一貫して、エチジウム染色生（ｎａｔｉｖｅ）ポリアクリルアミドゲル分析により決定した１８〜２５塩基対の長さを有するかなりの部分（フラグメントの総数の約１５％より大きい）を含む。２５ヌクレオチドより大きいかまたは１８ヌクレオチドより小さいフラグメントの存在は除外されない。ｈｓｉＲＮＡ混合物は「大きい」ｄｓＲＮＡを変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩで消化することにより得るのが好ましい。
【００２０】
「沈黙化（Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）」は細胞内の遺伝子発現を標的阻害することにより部分的または完全に機能喪失させることをいい、「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）」ともいわれる。場合によって、および対応すべき生物学的課題に応じて、遺伝子発現を部分的に低減するのが好ましいことがある。あるいはまた、遺伝子発現をできるだけ低減するのが望ましいことがある。沈黙化の程度は当技術において既知の任意の方法により決定することが可能であり、それらの方法のあるものは引用により本明細書において参照される国際出願公開第９９／３２６１９号パンフレット中にまとめられている。検定に応じて、遺伝子発現の定量により種々の量、例えば１０％、３３％、５０％、９０％、９５％または９９％よりも大きい量の阻害の検出が可能になる。
【００２１】
「大きい二本鎖ＲＮＡ（ｌａｒｇｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ）」は約４０塩基対（ｂｐ）よりも大きい、例えば１００ｂｐ以上、特に３００ｂｐよりも大きい二本領域を有する任意のｄｓＲＮＡまたはヘアピンをいう。大きいｄｓＲＮＡの配列は１つ以上のｍＲＮＡまたは全ＲＮＡの１つ以上のセグメントを表すものであってもよい。大きいｄｓＲＮＡの最大サイズはここでは限定されない。ｄｓＲＮＡは修飾された塩基を含んでいてもよく、この修飾はリン酸糖骨格にまたはヌクレオチドになされていてもよい。そのような修飾としては窒素またはイオウヘテロ元素または当技術において既知の任意の修飾を挙げることができる。ｄｓＲＮＡは酵素的に、組換技術により、および／または化学合成により、あるいは市販のキット例えばメガスクリプト（ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（アンビオン社、テキサス州オースチン市）および当技術において既知の方法を用いて作製することができる。本発明の一実施形態では、大きいｄｓＲＮＡを作製するのにハイスクライブ（ＨｉＳｃｒｉｂｅTM）（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）が使用される。大きいｄｓＲＮＡを作製し保存する他の方法が国際出願公開第９９／３２６１９号パンフレットに記載されている。
【００２２】
二本鎖構造はヘアピンやマイクロＲＮＡに生じるような自己相補的ＲＮＡ鎖により、または２つの異なる自己相補型ＲＮＡ鎖により形成することができる。
【００２３】
ｈｓｉＲＮＡ混合物の文脈における「非均質」は、ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩまたはその変異体で切断した後の単一の大きいｄｓＲＮＡまたは大きいｄｓＲＮＡの混合物から生成された同一でない配列を有するｄｓＲＮＡフラグメントをいう。これらのフラグメントは集合的に大きいＲＮＡの全長からの配列を含み、それ故非均質な混合物を形成する。
【００２４】
「ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ」は天然の酵素またはその組換体をいう。ｄｓＲＮＡ特異的エンドヌクレアーゼのＲＮＡ分解酵素ＩＩＩファミリーは高度に保存された９アミノ酸ストレッチがＲＮＡ分解酵素ＩＩＩシグナチュア・モチーフ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｍｏｔｉｆ）として知られる触媒センターに存在することを特徴としている（下記参照）。変異体も誘導体もこの定義に含まれる。ここに記載されているバクテリアＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの哺乳類細胞において沈黙化を達成する用途を持つことにより、共通の特徴的コンセンサス配列の存在に基づいて、本実施形態において真核生物、原核生物、ウイルスまたは始原細菌（ａｒｃｈｅａ）由来のＲＮＡ分解酵素を使用することの根拠を与えている。本発明の実施形態は１つより多いＲＮＡ分解酵素を使用してＲＮＡフラグメント混合物を調製することを除外していない。ここでは、ＲＮＡ分解酵素がアミノ酸コンセンサス配列［ＤＥＱ］［ｋＲＱＴ］［ＬＭ］Ｅ［ＦＹＷ］［ＬＶ］ＧＤ［ＳＡＲＨ］（ＰＲＯＳＩＴＥ：ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ用のＰＤＯＣ００４４８資料）を含む任意のＲＮＡ分解酵素を使用することができる。理論に拘束されるつもりはないが、ここで示唆されることは、このタイプのＲＮＡ分解酵素ＩＩＩには基質ＲＮＡに特異的に接触する領域があるということである。この領域は４つの特異的アミノ酸を含み、ここでは、この領域の少なくとも１つの特定のアミノ酸が変異するとｄｓＲＮＡフラグメントを生成するためのＲＮＡ分解ＩＩＩの活性が増加することが示されている。図１はＲＮＡ分解酵素の特徴的機能を示し、図２は異なる出所のＲＮＡ分解酵素に保存された配列を示し、図１２は本出願人により試験されたＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの異なる領域における種々の変異を示す。
【００２５】
変異体に対する名称指定は特定のＲＮＡ分解酵素単離物におけるアミノ酸位置により割り当てられる。これらのアミノ酸位置は出所の異なるＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ同士の間で変えることができる。例えば大腸菌におけるＥ３８は超好熱細菌（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）におけるＥ３７に対応する。大腸菌における位置Ｅ３８と超好熱細菌における位置Ｅ３７は上記のコンセンサス配列の第１のアミノ酸位置に対応し、公開データベースからのＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのアミノ酸配列をそれらのコンセンサス配列により整列することにより決定される。本発明の実施形態は実際の数の指定に限定されるものではない。好ましい実施形態はＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのコンセンサス配列におけるアミノ酸の相対的位置に言及している。
【００２６】
ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩにおける変異は点変異、追加、欠失（切断ドメインではないことが好ましい）、再配置（ドメイン結合領域内であることが好ましい）のいずれにも言及している。変異はＲＮＡ分解酵素ＩＩＩタンパク質の単一のサイトまたは複数のサイトのいずれにおいてでもよい。変異はランダム突然変異生成および標的遺伝学を含む標準的技法により生成することができる。実施例１は変異体の作製に対する一つのアプローチを与えるが、このアプローチは限定的であることを意図したものではない。
【００２７】
変異体の例としては、２３ｂｐ生産物を生成したＥ３８Ａ、Ｅ３８Ｔ、Ｅ３８ＷおよびＥ６５Ａが挙げられる。ゲル電気泳動により決定されたＥ６５Ａ、Ｅ３８Ｔ、Ｅ３８Ｗは１６時間インキュベーションにおける安定性（図１１参照）に関してＥ３８Ａとは異なるが、ｄｓＲＮＡフラグメントの生成においては野生型ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと少なくとも同程度に有効であった。Ｅ３８Ａ、Ｅ３８Ｔ、Ｅ３８ＷおよびＥ６５Ａ変異体はＭｇ2+バッファにおいて野生型ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと比べて２３ｂｐ生産物の収率が増加した。理論に拘束されるつもりはないが、ここでは、Ｅ３８ＡがｄｓＲＮＡテンプレートを結合および切断しそのためｄｓＲＮＡ生産物から容易に分離されないことが想定される。この複合体は比較的安定であり、ｄｓＲＮＡ生産物はＲＮＡ文化酵素ＩＩＩ、野生型（ｗｔ）または変異体、によるさらなる切断に利用できない。このことが変異体ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの消化が、全サンプルが１１ｎｔフラグメントのような小さなフラグメントに切断されることなく、一夜行うことが可能であることの説明になるであろう。
【００２８】
「完全消化」は、約３０塩基対よりも大きなサイズのｄｓＲＮＡのフラグメント（装荷ウェル内に保持されたまたは酵素に結合された消化された材料を除く）がエチジウムブロマイド染色２０％ポリアクリルアミドゲル上で容易に検出されないような低濃度であるＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ反応をいう。
【００２９】
「宿主細胞」は培養真核細胞またはヒトを含む哺乳類のような脊椎動物および昆虫のような無脊椎動物を含む動物の細胞をいう。宿主細胞はまた植物および微生物由来の細胞もいう。
【００３０】
「重複（Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」は、２つのＲＮＡフラグメントが１本鎖上の複数のヌクレオチドで重複する配列を有する場合、例えば、複数のヌクレオチド（ｎｔ）数が２〜５ヌクレオチドと少数または５〜１０ヌクレオチド以上の場合をいう。
【００３１】
「相補的配列」は当該配列がハイブリッド形成する配列と１００％同等である必要はないが、特定の核酸にストリンジェントな条件でハイブリッド形成することが可能である配列をいい、この場合、ストリンジェントな条件としては、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃、１２〜１６時間反応させた後水洗することを含む。配列変動は、遺伝子突然変異、株多型性、進化的分岐（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）または化学的修飾により起きるもののように、許容し得る。
【００３２】
メッセンジャーＲＮＡの「部分または全部」はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の大きいｄｓＲＮＡに相補的である部分をいう。
【００３３】
「実質的部分」は、ｈｓｉＲＮＡ混合物中に含まれる配列に表される大きいｄｓＲＮＡの配列の量をいう。一実施形態では、代表的配列は２０％より大きい。他の実施形態では、代表的配列は３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％よりも大きくてもよい。
【００３４】
「１つ以上のｄｓＲＮＡ」は配列が相互に異なるｄｓＲＮＡをいう。
【００３５】
「対象遺伝子またはｍＲＮＡ」は関心のある任意の遺伝子またはｍＲＮＡをいう。実際、遺伝学または配列決定により先に同定されている遺伝子のいずれかを対象として表すことができる。対象遺伝子またはｍＲＮＡとしては発生遺伝子および制御遺伝子並びに代謝または構造遺伝子、あるいは酵素をコードする遺伝子を挙げることができる。対象遺伝子は表現型を調査している細胞または生体において表現型特徴に直接または間接的に影響を与えるように発現させることが可能である。対象遺伝子は内生的、または外生的のいずれであってもよい。そのような細胞としては成体または配偶子を含む胚性動物または植物の任意の細胞、あるいは例えば不死の細胞系統や一次細胞培養に生じるような任意の単離細胞が挙げられる。
【００３６】
「安定な調製品」という用語は本明細書および特許請求の範囲において変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの存在下で切断されるテンプレートｄｓＲＮＡの調製品であって出発物質の少なくとも３０％が約１８〜３０ｎｔ、特に約２１〜２３ｎｔのサイズを有するフラグメントに切断され、切断生産物が２時間より長く、特に５時間、さらに１６時間安定であるものを記載するのに用いられている。安定性はサイズプロフィルおよび特定の時間におけるゲル上のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ反応生成物の量に検知し得る変化が存在しないことに関する。安定性は変異体ＲＮＡ分解酵素生成物を野生型ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ反応生成物と比較することにより観察される相対的尺度であってもよい。
【００３７】
ｈｓｉＲＮＡ混合物を脊椎動物、無脊椎動物、植物またはプロトプラスト細胞、あるいは微生物に導入することは直接細胞内にまたは細胞外から空腔または間質腔内に、生体の循環系内に、経口的に、入浴により、経皮的に、経粘膜ルートにより、局所的にまたはウイルスベクターを使用して宿主にＤＮＡをトランスフェクトすることにより行うことができる。
【００３８】
トランスフェクションまたは形質転換の標準的プロトコルを用いてｄｓＲＮＡを培養細胞内に導入することができ、例えばＮＥＢカタログ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）のトランスフェクション試薬またはリポフェクタミン２０００、オリゴフェクタミン（インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバード市）、トランスイット  ＴＫＯ（ＴＲＡＮＳ−ＩＴ  ＴＫＯ（登録商標））（マイラス（Ｍｉｒｕｓ）社、ウィスコンシン州マジソン市）、ターゲフェクト（ターゲティング・システムズ社、カリフォルニア州サンティー市）、リン酸カルシウムまたはエレクトロポレーション（電気穿孔法）を用いるプロトコルである。ｈｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ由来のフラグメントを含有する改変されたベクターとしては全生体をトランスフェクションまたは形質転換するためのバクテリアベクター、プラスミドまたはウイルスベクター改変されたベクターを挙げることができる。遺伝子銃を植物に対して用いてｄｓＲＮＡを例えば葉緑体内に指向させることも可能である。外来の拡散を生体および細胞内に導入するための方法論は当技術において周知である。ｄｓＲＮＡ混合物を、特定のｄｓＲＮＡ混合物由来の個々のフラグメントを発現するＤＮＡクローンを介して全体動物に導入することは拡散を導入するための標準的技法を用いて達成することが可能である。
【００３９】
本明細書および特許請求の範囲において、単数形で表現されていても、文脈が明かに別様に規定していない限り、単数形に限定されるものではない。
【００４０】
本発明の方法の利点としては下記の点が挙げられる。
（ａ）さらなるサイズ分離工程に依存しない急速かつ経済的な方法による遺伝子発現の沈黙化に適したサイズの、高濃度のｄｓＲＮＡフラグメントを急速に（数分内に）得ること。この方法は複数の重複するｄｓＲＮＡフラグメントで約２０％未満が未切断の大きいｄｓＲＮＡであり、約３０％超が１８〜３０塩基対、特に２１〜２３ｂｐのフラグメントサイズを有するものからｄｓＲＮＡフラグメント調製品を提供する。本方法の好適な実施形態では、大きいｄｓＲＮＡの６０％もが２１〜２３ｎｔのフラグメントに切断される。簡単であるために、このアプローチは自動化および高スループット化しやすい。
（ｂ）遺伝子沈黙化効果を生じる特定のフラグメントを同定する必要がなく遺伝子沈黙化活性を有するｄｓＲＮＡフラグメントの調製品を形成すること。ここに、前記調製品はさらに精製することなく長期間既存の酵素的アプローチに関して実質的に安定である。
（ｃ）前記方法の生産物を個々のフラグメントをクローニングし、またはクローンのライブラリもしくはアレイを形成することにより、これらのフラグメントをそれらが由来するＲＮＡに関してマッピングすることを可能にし、並びに個々のフラグメントを遺伝子沈黙化活性について試験してこれらのフラグメントをそれらが由来したＲＮＡに関してマッピングすることを可能にする手段を提供し、ここで、前記ライブラリは必要であればゲノム全体に及ぶものであってもよく、かつ、イン・ビボの用途に対しては、ｓｉＲＮＡの連続的供給を提供すること。例えば、ｓｉＲＮＡはプラスミドまたはウイルスベクターに導入することが可能である。ＲＮＡウイルス、例えばレンチウイルスは細胞を感染させる手段並びにクローニングベヒクルを提供する。
（ｄ）種々の用途用のｄｓＲＮＡ試薬を提供すること。それら用途としては、真核細胞または生物の単一の遺伝子または遺伝子のファミリーを沈黙化して核酸に対する標準的なトランスフェクション又は形質転換技法を用いて機能を研究することが挙げられる。
（ｅ）例えば、対象遺伝子を一意的に表し、ゲノムの他の領域への相同性をできるだけ小さくするように設計された大きいｄｓＲＮＡ構築物を選択することにより、的外れの効果を合成ｄｓＲＮＡ調製物と比べて減らすこと。
（ｆ）これらのｄｓＲＮＡフラグメントを治療剤または治療剤のスクリーニングあるいは対象妥当性確認試験に用いること。
（ｇ）ｄｓＲＮＡフラグメントをコードするＤＮＡをクローニングして、各実験についてデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成の必要がなく、遺伝子沈黙化ｄｓＲＮＡの連続的またはイン・ビボの調整された供給を提供すること。
【００４１】
ここに記載されたＥ３８ＡのようなＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの他の利点としては、さらに、（ｉ）対象ｍＲＮＡの大部分または全配列に対応するより大きいｄｓＲＮＡ分子の実質的に完全な消化により生成されるｄｓＲＮＡ生産物の所望のサイズ範囲を得て、有効な対象短配列を選択する必要をなくすようにする能力、（ｉｉ）標準バッファ中でインキュベーションしてｄｓＲＮＡを作製し、それを単一の反応容器内で所望のサイズに切断するのを容易にすること、（ｉｉｉ）所望のサイズ範囲のフラグメントの野生型ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩに関して収率が向上していること、（ｉｖ）変異酵素を用いて得られたフラグメントの安定性が標準マグネシウムバッファにおいて野生型ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩと比較して向上していること、（ｖ）完全な反応が１０分という短い時間で達成でき、少なくとも１６時間までのより長いインキュベーション時間は所望の反応生産物を得るのに有害ではないというインキュベーション時間に柔軟性があること、（ｖｉ）合成生産物に対して遺伝子沈黙化試薬のコストが低いこと、（ｖｉｉ）反応を多重化する機会およびフラグメントのライブラリを生成する機会があること、（ｖｉｉ）約５０ｂｐもの小さいサイズを持つフラグメントから約２３ｂｐのｄｓＲＮＡの多数のランダムに切断されたフラグメントを形成する能力、および（ｖｉｉｉ）イン・ビボ（細胞培養または全体生物）の大きいｄｓＲＮＡから、標準的プロトコルを用いてトランスフェクション、感染または注入により変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを導入することにより、約２３ｂｐのフラグメントを生成する能力が挙げられる。
【００４２】
直線状ｄｓＲＮＡまたはヘアピンを含む大きいｄｓＲＮＡ分子（約４０ｂｐより大きく、少なくとも１０ｋｂまで）をフラグメント化すると、沈黙化するｍＲＮＡに対応する多数の有効な短い配列（１８〜３０ｂｐ）を含む一群の短いＲＮＡが提供される。
【００４３】
加えて、ここに記載された方法の利点により、閾値を越える消化時間または酵素使用量を較正する必要がなくなる（図２、３、４および６）。ここで、時間の閾値は数分であり、濃度の閾値は酵素：基質の１：１（ｗ／ｗ）の範囲を含むことができる。ゲル電気泳動または他の面倒な分離方法により不所望の消化生産物を除去する任意的な追加工程を省略して本方法を自動化し易くし、かつ高スループット様式に適したものにすることができる。ＲＮＡ出発材料はイン・ビトロの酵素転写（ＮＥＢカタログ、ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）により、または化学合成により容易に得ることができ、二本鎖分子または二本鎖ヘアピンを形成する一本鎖ＲＮＡであることができる。
【００４４】
出発材料（大きいｄｓＲＮＡ）のの一部分、例えば少なくとも３０％、さらに詳しくは４０％または５０％より大きい部分は変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩで消化した後のサイズが培養した哺乳類および昆虫細胞における遺伝子沈黙化に適した１８〜３０ｂｐ、特に２１〜２３ｂｐの範囲内である。これらのフラグメントも植物、微生物およびヒトを含む動物のような全体生物並びにこれらに由来する培養細胞において遺伝子沈黙化に活性であることが期待される。ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）とは異なり、２１〜２３ｎｔの範囲外のサイズを有するフラグメントは遺伝子沈黙化に干渉しない。
【００４５】
好適な一実施形態では、ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ３８Ａ変異体は標準バッファ（ＮＥＢバッファ２、ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）中３７℃で１０分以内に基質の６０％も前記好ましいサイズ範囲に変換することが可能である。大きいｄｓＲＮＡのＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ  Ｅ３８Ａ変異体で消化することによるＲＮＡフラグメントの収率は、例えば、マンガンイオンの存在下ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（ｗｔ）を用いて得られる収率の２倍にもなり、マグネシウムイオンの存在下ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（ｗｔ）を用いて得られる収率の約１０倍にもなることがある（例えば、図７参照）。
【００４６】
遺伝子沈黙化の分野における問題の一つは、特定のメッセンジャーＲＮＡ、他のＲＮＡまたは遺伝子を有効に標的とする所望の目標を達成することができる短いｄｓＲＮＡ（１５〜３０ｂｐ）を同定する問題である。本発明の実施形態では、この問題は対象のすべてまたは一部に同等である配列を有する大きいｄｓＲＮＡを用い、この大きいＲＮＡを遺伝子の沈黙化に適したサイズの多数の重複するフラグメントに切断することにより解決される。ｄｓＲＮＡの適した配列を切断前に選択することは、例えば、実施例ＶＩのアルゴリズムにより決定することができる。ここで断言されるのは、切断生産物は大きいｄｓＲＮＡの全長の代表であることであり、そしてｄｓＲＮＡフラグメント調製物は昆虫細胞および哺乳類細胞を含む広範囲の細胞における遺伝子沈黙化を可能にすることである。重要なことは、的外れ効果がｈｓｉＲＮＡ混合物の使用により最小限になることである。
【００４７】
いったんｄｓＲＮＡフラグメント混合物が得られると、混合物中の個々のｄｓＲＮＡフラグメントに対応するＤＮＡ配列を含むクローンのライブラリを作製することが可能である。適切なプロモーターが提供されると、ここのクローンまたはそれらの混合物を用いて細胞をトランスフェクションして長期遺伝子沈黙化に使用するための短いｄｓＲＮＡの連続的供給が提供されるようにすることが可能である。個々のクローンまたはクローンの選択された混合物を対象細胞または生物にトランスフェクション下結果としての遺伝子発現の沈黙化は、例えば治療用途において、細胞をｄｓＲＮＡ自体でトランスフェクションすることにより達成される遺伝子沈黙化効果よりも特段の利点を有することがある。これにより特定の遺伝子の遺伝子発現を特異的に調節する作用物の無制限の供給を提供する治療用途用の新しい試薬が提供される。
【００４８】
遺伝子沈黙化の特異性
特定の対象ｍＲＮＡ用の遺伝子沈黙化の特異性を、対象ｍＲＮＡにおける配列のＢＬＡＳＴ分析を用いて確認して、ＲＮＡの延長領域（１１塩基を越える長さ）は他の遺伝子の転写物と同等ではないことが見いだされ、非特異的遺伝子沈黙化を避けることが可能である。
【００４９】
ここに記載された方法を用いて、遺伝子ファミリーの一成員のみに特異的でありその遺伝子ファミリーの他の成員に由来するｍＲＮを沈黙化しないＡＲＮＡ調製物を対象ｍＲＮＡのセグメントに相補的な配列を持つ長いｄｓＲＮＡ（長いｄｓＲＮＡセグメントともいわれる）から調製することができる。あるいはまた、遺伝子ファミリーの任意の遺伝子に特異性を有するがこの遺伝子ファミリー外の他の遺伝子に対する特異性を持たないＲＮＡ調製物を調製することができる。
【００５０】
特異であるか、またはｍＲＮＡのファミリーのコンセンサス領域の一部分もしくは全部を形成するｍＲＮＡ配列を対象とすることにより適切な遺伝子沈黙化効果を達成することが可能である。
【００５１】
変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩが他の酵素調製物と比べて改善された切断活性を有するかを決定するのに容易に使用することができる検定法は下記のイン・ビボおよびイン・ビトロ試験を含む。
（１）イン・ビボ検定：マーカータンパク質の転写物に相補的配列を有するｄｓＲＮＡをＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ消化して非均質ｄｓＲＮＡフラグメント調製物を生成する。正常に前記マーカータンパク質を発現する宿主細胞をＲＮＡフラグメント調製物を用いてトランスフェクションし、マーカー表現型の発現の変化を測定してＲＮＡフラグメント混合物を用いたトランスフェクションの結果、発現におけるノックダウン効果が生じたかを確かめる。イン・ビボ検定は、引用により本明細書において参照される米国特許出願公開第２００４−００３８２７８号明細書にさらに詳細に記載されている。
（２）イン・ビトロ検定：ｄｓＲＮＡをＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ消化し、消化物をアクリルアミドゲルにかけて、選定されたバッファ中で種々のインキュベーション時間において生成されるフラグメントのサイズを決定する。
【００５２】
ここに記載された方法は複数ｄｓＲＮＡフラグメント混合物を生成することに適用することも可能であり、次いで、これら混合物は複数の遺伝子を同時に沈黙化するのに使用することができる。追加の用途としては、上流または下流制御領域をｄｓＲＮＡを用いて標的として発現を調節することが挙げられる。したがって、単一のＤＮＡテンプレートまたは複数の異なるＤＮＡテンプレートから得られる大きいｄｓＲＮＡの非均質な集団をマグネシウムイオンの存在下に変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩにより消化することができる。
【００５３】
選定されたｓｉＲＮＡフラグメントを作製するための上述のｄｓＲＮＡフラグメント混合物またはそれらのクローンの生成は実施例Ｖに記載されたタイプのキットを用いることにより部分的にまたは全体的に達成することができる。所望の大きいｄｓＲＮＡを作製、ｄｓＲＮＡ混合物を生成、およびそのような混合物で細胞をトランスフェクションする方法のいずれかまたは全部の記載を含む指示書を提供することができる。
【００５４】
例示的用途
ｈｓｉＲＮＡフラグメントが利用できるようになったので所望のノックダウン効果を全体生物において遺伝子治療の欠点なしに達成することができる試薬または治療剤および新規な治療アプローチの供給が提供される。しかしながら、ｓｉＲＮＡフラグメントまたはｄｓＲＮＡ混合物を発現するクローンを、対象遺伝子の完全な、調節されたまたは一時的なイン・ビボ沈黙化に用いることが可能である。
【００５５】
病原体に由来する遺伝子を阻害の対象にすることができる。例えばこの遺伝子は宿主の免疫抑制を直接引き起こすことができるか、または病原体の複製、病原体の感染または感染の維持に重要であり得る。阻害的ＲＮＡを細胞内にイン・ビボまたはエクス・ビボで導入し、次いで生物体内に置いて治療することができ、あるいは生物体を直接イン・ビボ投与により処置することが可能である。遺伝子治療方法を想定することができる。例えば、病原体による感染の危険のある細胞または既に感染した細胞、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症を本発明のＲＮＡ導入による処置の対象とすることが可能である。対象遺伝子は病原体または宿主内に病原体が侵入する原因となる宿主遺伝子、病原体または宿主による薬剤代謝、病原体のゲノムの複製または一体化、宿主における感染の確立または拡大、または病原体の次世代の組立であり得る。予防法（すなわち、感染の阻止または危険の低減）並びに感染に関連する症状の頻度および重篤度の低減を想定することができる。
【００５６】
本発明の実施形態は固形腫瘍および白血病を含む任意のタイプの癌の治療または治療の開発に適用することができる。
【００５７】
本発明の実施形態は以下のように例示される。これらの実施例は本発明の理解のために提供され、本発明を限定するものではない。
【００５８】
本明細書に記載されている引用例は、米国仮特許出願第６０／５３８，８０５号、第６０／５７２，２４０号および６０／５４３，８８０号明細書を含め、すべて引用により本明細書の一部を構成するものとする。
【実施例１】
【００５９】
大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ変異体の調製
大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ変異体はすべて（ＰＣＲを用いた突然変異誘発により生成されたＥ１１７Ｄを除く）標準２工程ＰＣＲ縫製技法［「メソッズ  オブ  エンザイモロジー」第１８５巻第６０〜８９頁（１９９０年）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９（１９９０）］により構築した。ここで用いた他のクローニング技法は当技術において標準的なものであり、サムブルック、ジェイ．、フリッチュ、イー．エフ．、マニアティス、ティー．著、「分子クローニング：実験室のマニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー出版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー市１，９８９年（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９）に見出すことができる。出発プラスミドとして用いたのは、ｐＥＴ１６Ｂにクローニングした大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（ＥＭＤバイオサイエンス社、カリフォルニア州サンジエゴ市であり、Ｈｉｓ−タグ付きＲＮＡ分解酵素ＩＩＩタンパク質をＴ７プロモーターの制御下に生成した。
【００６０】
ＷＴ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ
大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩをｐＭａｌＥ／ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩクローンから下記のプライマーを用いて増幅した：
ACAGGATCCCATGAACCCCATCGTAATTAAT (配列番号１)
ACAGGATCCTCTAGAGTCATTCCAGCTCCAGTTTTT (配列番号２)
【００６１】
このＰＣＲ生産物をＢａｍＨＩで切断しｐＥＴ１６ｂのＢａｍＨＩサイトにクローニングし、Ｈｉｓ−タグ付きＷＴ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを合成するプラスミドを得た。このＨｉｓ−タグ付きＷＴ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのｐＥＴ１６ｂにおけるクローンをＰＣＲ反応において基質として用いてすべてのアミノ酸置換変異体（Ｅ１１７Ｄを除く）を下記のように形成した。
【００６２】
Ｅ３８Ａ変異体の形成
Ｅ３８Ａ変異を有する大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（寄託番号Ｘ−０２９４６）のカルボキシ末端半分を構築するのに用いたプライマーは下記である：
CAGTAAACATAACGCGCGTTTAGAAT (配列番号３)
ACAGGATCCTCTAGAGTCATTCCAGCTCCAGTTTTT (配列番号２)
【００６３】
Ｅ３８Ａ変異を有する大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのアミノ末端半分を構築するのに用いたプライマーは下記である：
AATTCTAAACGCGCGTTATGTTTACT (配列番号４)
TAATACGACTCACTATAGGG (配列番号７)
（ＮＥＢプライマーカタログ＃１２４８（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）。
【００６４】
これら２つのＰＣＲ生産物を、次に両者を反応のための基質とプライマーとして用いて一緒に１つのＰＣＲ反応で「縫製し」た。得られた生成物をＸｂａＩで切断し、修飾されたｐＥＴ１６ｂに戻してＸｂａＩサイトにおいてクローニングしてＥ３８Ａ変異を有するＨｉｓ−タグ付きＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを得た。
【００６５】
Ｅ６５Ａ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの形成
Ｅ６５Ａ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを同様の２工程方法で構築した。第１の工程で、Ｈｉｓ−タグ付きＲＮＡ分解酵素ＩＩＩプラスミドを２つのＰＣＲで下記のプライマーのセットを用いて増幅した：
CTCGTGTGGATGCAGGCGATATGAGCCGGAT (配列番号 5)
ACAGGATCCTCTAGAGTCATTCCAGCTCCAGTfT (配列番号 2)
遺伝子の３’−端を増幅。
TCCGGCTCATATCGCCTGCATCCACACGAGGGA (配列番号6)
TAATACGACTCACTATAGGG (配列番号 7)
遺伝子の５’−端を増幅。
【００６６】
２つのＰＣＲ生産物を次いで次オンＰＣＲ反応の基質として用い、Ｉ．Ｂ．に記載された修飾されたｐＥＴ１６ｂベクターのＸｂａＩサイトにクローニングした。
【００６７】
追加のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの形成
任意の特異点変異を、クローニングした野生型（ｗｔ）ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ遺伝子からＥ３８ＡおよびＥ６５Ａ変異体を作製するのに説明されたものと同様の方法により構築することが可能である。第１の工程で、１つはコーディング鎖用、他方は非コーディング鎖用の２つのプライマーをそれらが所望の変異を選択されたアミノ酸に導入するように設計する。これらのプライマーは十分な長さとスパンを持ち変異を導入するのに必要な不一致が与えられても依然として基質にアニールするようにしている。コーディング鎖用のプライマーはＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ遺伝子のこの領域を増幅する、ＰＣＲにおける対向鎖上の適切な下流プライマーと合致される。非コーディングプライマーと対向鎖上の上流の適切なプライマーとを用いて同様のｐＣＲを行いＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ遺伝子の重複する上流フラグメントを得る。これら２つのフラグメントを基質と外部プライマーとして用いてこれら２つのフラグメントを「縫い合わせる」。得られたＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ遺伝子は所望の点変異を含み、適切なベクターに戻してクローニングすることができる。Ｅ１１７Ｄを除くすべての変異はこのようにして構築した。
【００６８】
大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ遺伝子のＥ３８残基は超好熱細菌（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ遺伝子のＥ３７残基に対応する。同様に、Ｄ４５はＤ４５に、Ｅ６５はＥ６４に、Ｅ１１７はＥ１１０に対応する。これはいくつかの標準多重配列一致ソフトウェアパッケージにより決定された。対応するアミノ酸残基は任意のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ遺伝子について同様の方法により決定することができる。
【実施例２】
【００６９】
ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ変異体の生成と精製
発現と精製
各変異体の培養物３０ｍｌとＷＴクローンを大腸菌ＥＲ２５６６（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）において対数期中程まで成長させ、次いでＩＰＴＧを終濃度１００ｍＭまで添加することにより誘導し、１５℃で一夜震盪した。誘導された培養物を超音波処理により溶解した。
【００７０】
ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ変異体を明澄にした溶解物からキアジェン・ニッケル（Ｑｉａｇｅｎ  Ｎｉｃｋｅｌ）樹脂アフィニティー精製（製造元の指示に従う）により精製し、標準的方法により検定した。酵素反応をＮＥＢバッファ２（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）中で３７℃１時間０．５μｇの９００ｂｐ  ｄｓＲＮＡを基質として用いて行った。この反応の生成物を非変成ポリアクリルアミド電気泳動により分析した。
【００７１】
０．５μｇのＭａｌＥ  ｄｓＲＮＡ（ハイスクライブ  キット（Ｈｉｓｃｒｉｂｅ  ｋｉｔ）−ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）をＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（野生型（ｗｔ）および変異体）で２０μｌの反応混合物における最適条件と矛盾しない範囲で、ＮＥＢバッファ２（０．０５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１ｍＭジチオスレイトール）（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）中で３７℃、１時間消化した。
【００７２】
図３Ａから分かるように、ｄｓＲＮＡをＥ３８Ａで消化した最終生産物は主に約２３ｂｐ長のｄｓＲＮＡフラグメントである（レーン７、８および９）。この生産物は１分という短い時間で出現し、反応は１０分で「完了した」（図６）。加えて、この２３ｂｐ生産物は少なくとも１６時間安定であり（図３Ｂ、レーン７〜９）、数日間かけて徐々に消失した（図５）。
【００７３】
Ｅ６５Ａ（図１０）の活性はブラスチュク、ジェイ．他著、「ストラクチャー」第９巻第１２２５〜１２３６頁（２００１年）（Ｂｌａｓｚｃｚｙｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：１２２５−１２３７（２００１））に報告されているものとは正反対である。この報文では、著者はＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ６５Ａ変異をＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの機能を無効化するものと記載している。本発明者の検定によると、Ｅ６５ＡはＥ３８Ａと同様の生産物を精製した（図１０、レーン６〜８）。しかしながら、この生産物は安定性が低いと考えられ、１６時間までに消失した（図１０Ｂ、レーン４および６）。
【実施例３】
【００７４】
培養細胞におけるｄｓＲＮＡ切断と遺伝子沈黙化活性
ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ変異体消化のｄｓＲＮＡ生産物のＲＮＡ干渉を誘導する能力を試験するために、米国特許出願公開第２００４−００３８２７８号明細書に従うイン・ビボ検定を以下のように行った：ホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡ配列から作製されたｄｓＲＮＡを野生型（ｗｔ）ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（ショートカット（Ｓｈｏｒｔｃｕｔ）またはＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを切断した（図９）。ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現するリポータープラスミド、トランスフェクションコントロールとして作用する他のリポーターおよびｄｓＲＮＡでトランスフェクションした。リポーターでトランスフェクションしたがｄｓＲＮＡではトランスフェクションしなかった細胞、または関係のない消化ｄｓＲＮＡでトランスフェクションした細胞は顕著なルシフェラーゼ活性を示した。
【００７５】
野生型または変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ由来のｈｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞はルシフェラーゼ活性がノックダウンされていた。得られた結果を図９に示す。
【実施例４】
【００７６】
Ｅ３８Ａ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩでｄｓＲＮＡを切断した切断生産物は一組の重複する非均質フラグメントである。
変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの短いｄｓＲＮＡ切断生産物は親配列全体を表す配列を含む。これはｄｓＲＮＡ切断生産物をクローニングしｄｓＲＮＡ切断生産物を配列決定することにより、またはテンプレートＤＮＡ配列フラグメントにハイブリッド形成することにより決定される。クローニングしたＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ生産物のライブラリの生成は容易に達成される。ここで重複するフラグメントが存在することを示すのに用いられる技法は、引用により本明細書の一部を構成する米国特許出願公開第２００４−００３８２７８号明細書に記載されたものと同じである。
【実施例５】
【００７７】
ｈｓｉＲＮＡを生成するキットおよび哺乳類細胞において遺伝子を沈黙化するためのキット
ｄｓＲＮＡ混合物をイン・ビボで生成し、任意にＲＮＡフラグメントを哺乳類細胞にトランスフェクションするキットが提供される。
【００７８】
本発明の一実施形態では、各キットは複数の大きいｄｓＲＮＡを細胞のトランスフェクションのために処理する試薬を含むとともに、使用法の指示を含む。
【００７９】
キットの成分
キットは酵素と任意にベクター、プライマーおよび／またはバッファを含むことができる。キットは以下に示す試薬（それぞれニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド（マサチューセッツ州ビバリー市）から得ることができる）の１つ以上を含むことができる。
【００８０】
【表１】
2007520221.tif 000003
【００８１】
さらに、キットはトランスフェクション試薬、ＲＮＡサイズマーカーおよびストレプトアビジン−被覆ビーズを含んでいてもよい。
【００８２】
【表２】
2007520221.tif 000004
【００８３】
キットは変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを最適化されたバッファ中で用いて長いｄｓＲＮＡから約１８〜３０ｎｔ（特に２１〜２３ｎｔ）の範囲のフラグメントを生成する。ｄｓＲＮＡ生産物を変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩで切断して遺伝子発現沈黙化に適したｄｓＲＮＡ混合物を再現可能に生成する。混合物中の異なるｓｉＲＮＡの配列を全対象遺伝子の配列にマッピングする。ｄｓＲＮＡ混合物はエタノール沈殿により生成することができ、トランスフェクションに使用することができる。
【００８４】
キットに添付された指示の例としては下記が挙げられる：
（１）イン・ビトロ転写に先立ってＤＮＡテンプレートをクローニングしてｄｓＲＮＡを生成
転写用ＤＮＡテンプレートを作製する一つのアプローチは関心のあるＤＮＡをリトマス（Ｌｉｔｍｕｓ）２８ｉ／３８ｉ双方向転写ベクター（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）にクローニングすることである。次いで、関心のあるＤＮＡを、単一のＴ７プロモーター特異プライマー、例えばＢＴ７ミニマル・プライマー（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ）を用いるＰＣＲにより増幅することができ、このプライマーは対象配列の側面に終端をなすＴ７プロモーターが配列した線状生産物を生成する。
【００８５】
あるいはまた、Ｔ７プロモーターを付加した対象遺伝子特異プライマーを用いて任意の特異的ｃＤＮＡ配列を増幅することができる。例えば、増幅プライマー：
【表３】
2007520221.tif 000005
ここでＴ７プロモーター（下線）は５’端にあり、対象特異配列（太字）に先行している、を任意のｃＤＮＡテンプレートを増幅するために使用することができる。
【００８６】
ビオチン化ＢＴ７プライマーを用いてＴ７プロモーターを側面に配置した任意の配列を増幅することができる。任意に、この増幅されたビオチン化ＤＮＡテンプレートをストレプトアビジン磁性ビーズ（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）に結合することにより単離することができ、転写のテンプレートとして直接使用することができる。固定化ＤＮＡテンプレートを形成するために、２５〜５０μｌのストレプトアビジン磁性ビーズ懸濁物を等量の１Ｍ  ＮａＣｌとともに増幅（ＰＣＲ）反応混合物に添加し、室温で１０〜１５分間インキュベートする。上清を磁力の存在下に除去し、ビーヅを０．５ｍｌのＴＥ、０．５Ｍ  ＮａＣｌで洗浄する。再懸濁したビーズは転写反応に直接用いることができる。不動化ＤＮＡテンプレートのイン・ビトロ転写によりＤＮＡ−を含まないｄｓＲＮＡが生成される。
【００８７】
増幅は任意のポリメラーゼ依存方法、例えばＰＣＲにより達成することができる。増幅生産物をエタノール沈殿またはクロマトグラフィー法［例えばキアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ（登録商標））カラム（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）社、カリフォルニア州スチューディオ・シティ市）によりに精製し、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ミリ−Ｑ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）水または同等のものを用いて調製）に再懸濁して終濃度〜５００μｇ／ｍｌにする。
【００８８】
ＧＬ３ルシフェラーゼからなるコントロールを、ＧＬ３ルシフェラーゼ遺伝子の１．０−ｋｂｐフラグメントをリトマス（Ｌｉｔｍｕｓ）３８ｉのＳｐｈＩおよびＮｇｏＭＩＶサイトにクローニングしたリトマス（Ｌｉｔｍｕｓ）３８ｉＬｕｃプラスミドを用いて調製することができる。ＭｆｅＩおよびＳｔｕＩで（別個の反応で）線状化し、次いで結合した線状化されたテンプレートをイン・ビトロ転写して１．０ｋｂｐ長のｄｓＲＮＡが生成される。
【００８９】
パイロット研究を行って、１００〜６００ｂｐ長のｄｓＲＮＡを切断することにより得られた、リトマス（Ｌｉｔｍｕｓ）２８ｉ／３８ｉベクター（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）にサブクロニングしたｃＤＮＡの制限フラグメントに由来するＲＮＡを含む１つ以上のフラグメントを用いて、ｈｓｉＲＮＡ混合物を特定の遺伝子沈黙化のために提供するようにすることができる。
【００９０】
イン・ビトロ転写
上述のようにして調製したＤＮＡテンプレートを用いてイン・ビトロ転写を行う。転写反応に用いられるテンプレートの体積は精製方法によって決まる。未精製ＰＣＲ産物用には、５μｌ以下が３０μｌ反応毎に用いられる。添加されるテンプレートＤＮＡの量は３０μｌ毎に１μｇを越えるべきではない。
【００９１】
【表４】
2007520221.tif 000006
【００９２】
４２℃でインキュベーションを行うと大量の二次構造を含むＲＮＡ転写物の収率を改善することができる。二次構造の含量を特定の転写物において計量することは困難であるため、本発明者は可能であればすべての転写を４２℃で行うことを推奨する。転写収率は最初の９０分間は（ほぼ）直線状に増加し、２〜３時間後に最大になる。要すれば、反応を一夜行うことができるが、収率はそれ以上高くならない。二本鎖ＲＮＡは３７℃で長期間インキュベーションを行っても安定である。
【００９３】
転写反応は、ＲＮＡ分解酵素のコンタミネーションがないように注意しながら、１％アガロースゲル上で分析することができる。二本鎖ＲＮＡは反応において使用したＤＮＡテンプレートとほぼ同様に移動する。リトマス（Ｌｉｔｍｕｓ）３８ｉｌｕｃコントロールテンプレートからの転写物の予想される長さは１０００ｂｐである。
【００９４】
ｄｓＲＮＡ転写生産物をエタノール沈殿により精製する。１０分の１の体積の３Ｍ  ＮａＯＡｃをｐＨ５．５で２体積の冷９５％エタノールと一緒に添加する。氷上で１５分間インキュベーションするか、または−２０℃で一夜貯蔵する。微小遠心機（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用い１５分間１４，０００ｒｐｍで高速回転し、２体積の８０％エタノールを添加し、室温で１０分間インキュベーションし、５分間延伸し、遠心管を傾斜して排液する。ペレットを風乾する。乾燥したＲＮＡを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡまたは水に溶解する。
【００９５】
ｄｓＲＮＡ混合物の形成
１Ｘ（１０倍希釈）（０．１４μｇ／μｌ）の濃度のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩおよび０．０７μｇ／μｌのｄｓＲＮＡを以下の実施例のように消化反応において使用する。
【００９６】
【表５】
2007520221.tif 000007
【００９７】
消化生産物を監視するためには、１０〜２０％生ポリアクリルアミドゲルが適している。消化生産物は、長いｄｓＲＮＡが切断されて、出発材料の長いｄｓＲＮＡの長さとは関係なく、１８〜２５ヌクレオチドの範囲のサイズを有するフラグメントのｄｓＲＮＡ混合物を生じる。この混合物はトランスフェクションに使用する前にエタノール沈殿の単一工程により精製することができる。
【００９８】
ｈｓｉＲＮＡフラグメントのエタノール沈殿
１０分の１の体積の３Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２μｌグリセロール溶液および３体積の冷９５％エタノールを添加する。−７０℃に３０分間、または−２０℃に２時間〜一夜置く。微小遠心機（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）を用い１５分間１４，０００ｒｐｍで高速回転する。慎重に小さなペレットを避けながら上清を除去し、２体積の８０％エタノールを添加し、室温で１０分間インキュベーションし、５分間遠心し、遠心管を傾斜して排液する。ペレットを風乾する。乾燥したＲＮＡを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡまたはｄＨ2Ｏに溶解する。
【００９９】
ｄｓＲＮＡ濃度の決定
ｄｓＲＮＡ濃度はＵＶ分光光度計（２６０ｎｍにおけるＯＤの１は４０μｇ／ｍｌ  ｄｓＲＮＡに相当する）または蛍光光度計［リボグリーン（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（登録商標））、モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）社、オレゴン州ユジーン市］を用いて、または当技術において用いられるｓｉＲＮＡ標準との比較により測定することができる。
【０１００】
トランスフェクションのガイドライン
エタノール沈殿後、オリゴヌクレオチドのトランスフェクションに適した試薬およびプロトコル、例えばリポフェクチン（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）２０００、オリゴフェクタミン（ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、トランスイット（ＴＲＡＭＳ−ＩＴ（登録商標））（マイラス（Ｍｉｒｕｓ）社、ウィスコンシン州マジソン市）、およびターゲフェクト（Ｔａｒｇｅｆｅｃｔ）（ターゲティング・システムズ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）社、カリフォルニア州サンティー市）またはニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド（マサチューセッツ州ビバリー市）により提供されるトランスフェクション試薬を用いて、ｄｓＲＮＡ混合物を直接哺乳類の細胞にトランスフェクションすることができる。さらに、リン酸カルシウムと電気穿孔法が短いＲＮＡをトランスフェクションするのに有効であると報告されている。
【０１０１】
トランスフェクション・ウェル（２４−ウェル方式）当り２５〜１００ｎｇの量のｄｓＲＮＡを最初の量として用い、実験的発見にしたがって調整することができる。
【０１０２】
大きいｄｓＲＮＡを上述のようなイン・ビトロトランスフェクションにより合成することができるが、これは改変されたリボヌクレオチド、例えば２−フルオロ−リボ−ＣＴＰ、２−Ｏ−メチル−リボ−ＵＴＰ、２−Ｏ−メチル−リボ−ＡＴＰ、２−Ｏ−メチル−リボ−ＧＴＰまたはｄｓＲＮＡをより安定にもしくは分解に抵抗性にする、他の２’改変体をＮＴＰＳの代わりに上述の１０Ｘバッファ中に含む改変された転写バッファを用いて行うことができる。これらの目的のためにデュラスクライブ（ＤＵＲＡＳＣＲＩＢＥ（登録商標））キット（エピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、ウィスコンシン州マジソン市）を使用することができる。
【実施例６】
【０１０３】
特異的ｓｉＲＮＡ混合物
同定された対象用のｍＲＮＡ配列のセグメントを、各対象配列を用いて行った遺伝子データベースとの配列の比較に引き続いて選択することができる。
【０１０４】
アルゴリズムを使用して配列を例えば１６〜２１ｂｐの窓を用いて走査する。次いで、ＢＬＳＴスコアが各セグメントについて完全なデータベース（例えば、ユニジーン（ＵＮＩＧＥＮＥ））と位置合わせさせた後に得られる。設定された限界よりも高いＢＬＡＳＴスコアから計算した事項は報告から削除した。他の対象に対するヒットのないことを示す対象配列を選択するのが好ましい。
【０１０５】
セグメントサイズは特に限定されないが、セグメントは約１５０〜１０００ｂｐの範囲内、例えば２００〜４００ｂｐの範囲の長さのものを選択することができる。
【０１０６】
対象ｄｓＲＮＡに対応する選択されたＤＮＡセグメントを効率的に増幅するＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲプライマー設計用の標準的プロトコルを使用して増幅することができる。例えば、プライマーはＴ７プロモーター配列を５’端に含んでいてもよい。他の配列をＴ７プロモーターの代わりに用いて二重Ｔ７プロモーターベクター（リトマス（Ｌｉｔｍｕｓ）２８ｉ、リトマス３８ｉ、リトマス−Ｕ、ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）の一方に対するクローニングを容易にすることが可能である。
【０１０７】
リトマスＵについて、以下のプライマー配列を使用することができる：ｇｇｇｑａａａｇｕおよびｇｇａｇａｃａｕ、ここにｕはウラシルを表す。ＰＣＲ反応後、増幅されたＤＮＡ生産物を、ＵＳＥＲプロトコル（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）を用いて直接リトマスＵ内でクローニングすることができる。次いで、クローニングされたフラグメントをｄｓＲＮＡの製造に使用することができる（例えば、米国特許出願公開第２００４−００３８２７８号明細書参照）。
【０１０８】
ｈｓｉＲＮＡの調製に使用するのに適していると決定された各配列について表１に寄託番号および配列を記載した。
【０１０９】
ｈｓｉＲＮＡ混合物の調製を実施例２に記載した。
【０１１０】
ｈｓｉＲＮＡ混合物の機能を実施例３に記載したとおおりに細胞をトランスフェクションすることにより決定することができる。さらに、ウエスタンブロット法またはタンパク質活性検定法をトランスフェクション後の種々の時点で実施して遺伝子発現が下方制御されたかを決定することができる。
【０１１１】
【表６】
2007520221.tif 000008
【０１１２】
表１はここに記載した変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを用いて調製することができ、培養されまたはイン・ビボで生じる細胞における遺伝子沈黙化のために使用することができる対象遺伝子の例を挙げている。遺伝子（ｃＤＮＡ）配列のための座標は上記のＧｅｎＢａｎｋの寄託番号中に含まれている。
【０１１３】
ｈｓｉＲＮＡ混合物を形成するための適切なＲＮＡ配列を選択のためのアルゴリズム
１．長さＮの対象配列ＳＯをユーザーから入力する。
２．ユーザーにより特定された長さＬのすべての可能なオリゴヌクレオチド部分配列（Ｓ1、Ｓ2、Ｓ3．．．Ｓ(n-L+1)）をＳＯから抽出する。
３．各オリゴヌクレオチド部分配列のヌクレオチド組成を計算する。
４．へリックス形成の自由エネルギーの熱安定性を各オリゴヌクレオチド部分配列に沿って計算する。この計算のために、この配列は２塩基の３’オーバーハングを持つ二本鎖ＲＮＡデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ）であるとして取り扱う。
５．（任意）二本鎖ＲＮＡデュプレックスオの２つの端部の安定性の差を計算する。差について、５’センス鎖末端の安定性が有利であると採点する。対向末端の差を不利であると採点する。
６．ユーザーにより選択された対象生物のトランスクリプトームを表す配列のデータベースを配列ＳＯで検索してユーザーにより特定されたレベルのＳＯに対する類似性を持つ配列を突き止める。これらの類似配列を対象配列の均等物としてマークし、それらのアイデンティティーを記録する。
７．ユーザーにより選択された対象生物の同じトランスクリプトーム・データベースを検索してそのトランスクリプトーム内の各オリゴヌクレオチド部分配列の出現頻度を決定する。オリゴヌクレオチド部分配列がユーザーに特定されたレベルの類似度をこのトランスクリプトーム・データベースからの部分配列に対して持つ場合、このオリゴヌクレオチド部分配列の存在を記録する。各存在について、トランスクリプトーム内の一致セグメントも同様に記録する。一致セグメントは「クロスターゲット（ｃｒｏｓｓ  ｔａｒｇｅｔ）」または「オフターゲット（ｏｆｆ  ｔａｒｇｅｔ）」一致と呼ばれる。先行するステップの対象ＳＯに均等であると同定された配列を抜き出し、クロスターゲット一致としては算入しない。
８．各オリゴヌクレオチド部分配列について、トランスクリプトームにおけるクロスターゲット一致の頻度を表すデータ、ヌクレオチド組成およびその末端の熱安定性の差が提示される。
９．一般に低クロスターゲット頻度の領域、注程度の％ＧＣ組成および高密度の好適熱安定性差が以後のプライマー選択用の望ましい領域であると考えられる。
【０１１４】
このアルゴリズムの本実施形態において、ＢＬＡＳＴアルゴリズムの変形例を使用するＮＣＢＩからのメガブラスト・プログラムを用いてトランスクリプトーム・データベースを検索する。クロスターゲットを同定するのに用いられる類似度の基準は、対象オリゴヌクレオチド部分配列とトランスクリプトーム・データベース中の主題（ｓｕｂｊｅｃｔ）配列との間のユーザーにより特定された最小数の連続ヌクレオチドの一致があることである。表示されたヌクレオチド組成の指標は％ＧＣである。オリゴヌクレオチド部分配列の量末端における熱安定性は４末端塩基対ヌクレオチドを用いて計算し、不対合オーバーハング配列は除外する。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１はＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの３つのクラス−ヒトダイサー（ＨｓＤｉｃｅｒ）；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ドロシャ（Ｄｒｏｓｈａ）、（Ｄｍ  Ｄｒｏｓｈａ）；サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（ＳｃＲＮＴ１）；大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（Ｅｃ  ＲＮＡｓｅＩＩＩ）の例の一致を示す概略図である。一番上の線はアミノ酸残基の数を示す。クラス記号はＩ、ＩＩおよびＩＩＩで示し、相当するｄｓＲＮＡ生産物のサイズを塩基対数で示した。タンパク質のドメインは以下のように示した。ヘリカーゼ、点描；ＰＡＺ、ブロック；ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、格子縞；ＲＮＡ切断ドメイン（ＲＣＤ）、黒塗り；相同残基に１つ以上の置換があるＲＮＡ切断ドメイン、灰色。「生産物（ｐｒｏｄｕｃｔ）」はマグネシウムイオンを含有するバッファ中で規定される非修飾酵素により生成されたｄｓＲＮＡフラグメントのサイズをいう。
【図２】図２は種々のバクテリアや酵母のＲＮＡ分解酵素のアミノ酸の一致（配列番号：９−２５）を示す図である。強調されている残基：  黒色−図示の全ての例の間で１００％保存；  灰色−図示の例の大多数の間で保存；  星印−ｄｓＲＮＡとの接触を提案されている残基［ストラクチャー第９巻第１２２５頁２００１年（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：１２２５（２００１））］。
【図３】図３はＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ（Ｅ３８Ａ）の活性を示す図である。  Ｈｉｓ−タグ付きＥ３８Ａ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ融合体を標準ニッケル樹脂アフィニティーにより精製し、タンパク質濃度を標準的方法により決定した。基質ＭａｌＥ  ｄｓＲＮＡ（９００ｂｐ）０．５ｍｇをＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ  ｐＨ７．９（ＮＥＢ  バッファ２）（ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイテッド、マサチューセッツ州ビバリー市）に連続希釈したものを用い３７℃で１時間行った消化を示す。次いで、反応混合物を２０％ポリアクリルアミド・ゲルを通して電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。    図３Ａ：０．５μｇ  ｄｓＲＮＡ基質を以下の量：０．０３、０．０６、０．１２５、０．２５、０．５、１、２および４μｇ（レーン２〜９）のＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素を用い、２０μｌの体積でそのうち１０μｌを各ウェルに装荷し３７℃で１時間切断した結果を示す図である。  レーン１−酵素なし。  レーン１０−道生ｄｓＲＮＡ２２量体（サイズマーカー）  レーン７−０．５μｇのｄｓＲＮＡを１μｇの酵素とインキュベートしたところ完全に消化された。（ここで、完全消化はゲル電気泳動で２２ｂｐバンドより実質的に大きいｄｓＲＮＡが存在しないことであると定義される。）  レーン９は２２ｂｐ生産物の量がｄｓＲＮＡ基質の〜６０％であることを示す。ｄｓＲＮＡは既知量の合成ｄｓＲＮＡ２２量体を用いたデンシトメトリーにより低了した。    図３Ｂ：消化を図３Ａの場合と同様に設定したが、一夜インキュベートしたところ、約２２ｂｐの生産物が完全なＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを含有する混合物の存在下で長期間にわたって安定性が向上することが示された。  レーン番号は図３Ａの酵素条件に対応する。
【図４】図４は図３に示す条件下でＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを用いた消化の結果を示す図である。  図４Ａ：０．５μｇのｄｓＲＮＡを、１０ｍＭの亜鉛、ニッケル、マンガン、コバルトまたはマグネシウム塩を含有するバッファの体積２０μｌ中の４μｇの変異ＲＮＡ分解酵素で消化。  図４Ｂ：０．５μｇのｄｓＲＮＡを、１０ｍＭ  Ｍｎ塩を含有するバッファの体積２０μｌ中の４μｇの変異ＲＮＡ分解酵素の２倍希釈シリーズを用いて消化：  レーン１−酵素なし。  レーン１０−合成ｄｓＲＮＡ２２量体。
【図５】図５は９００ｂｐＭａｌＥ  ｄｓＲＮＡおよび３２μｇのＥ３８  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを全量１６０ｍｌのＮＥＢバッファ２に溶解したものを３７℃で用いた経時反応を示す図である。１０ｍｌのサンプルを指定された時間−１時間、１日、２日、３日、４日および５日において取り出し、終濃度２５ｍＭのＥＤＴＡを添加することにより反応を停止した。  ゲルの左端の第１のレーンは合成２２ｂｐ  ｄｓＲＮＡサイズ標準を含む；  ゲルの右端の最終レーンは５日模擬消化ｄｓＲＮＡの生産物を含む。
【図６】図６は分で示された時間の間、図５に記載されたように酵素反応を行った結果を示す図である。  左から右に：合成２２量体ｄｓＲＮＡサイズマーカー；１、５、１０、２０、３０、４０および５０分消化および未消化ｄｓＲＮＡ。
【図７】図７は図３に記載されたように酵素反応を行った結果を示す図である。  レーン１、合成ｄｓＲＮＡの５０量体の模擬消化；  レーン２、合成ｄｓＲＮＡの５０量体のＥ３８Ａ消化；  レーン３、合成ｄｓＲＮＡ２２量体。
【図８】図８はｄｓＲＮＡ切断用の種々の市販酵素キットとＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩとの比較を示す図である。それぞれの基質は０．５μｇの９００ｂｐ  ＭａｌＥ  ｄｓＲＮＡであった。市販キット用の条件は製造元の指示に従う。Ｅ３８Ａ用の反応条件は図３に記載されている通りである。「−」模擬反応；「２３」−合成ｄｓＲＮＡの２３量体。百分率は示されたレーンにおけるそれらの反応条件に対する生産物収率である。ｄｓＲＮＡフラグメントの生産物収率は図３に記載されている通りに定量した。  図８Ａ：サイレンサー（ＳｉｌｅｎｃｅｒTM）ｓｉＲＮＡカクテルキット（ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ）（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社、テキサス州）。  図８Ｂ：ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）−組換ダイサー（ヒト）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社、カリフォルニア州ラ・ホラ市）。  図８Ｃ：ショートカット（ＳｈｏｒｔＣｕｔ）（ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ）−ショートカットＲＮＡｉキット（ＳｈｏｒｔＣｕｔ  ＲＮＡｉ  Ｋｉｔ）（ニュー・イングランド・バイオラブ社、マサチューセッツ州ビバリー市）。  図８Ｄ：Ｅ３８Ａ−左側パネルは４μｇ（右）から出発し０．５μｇ（左）で終わる連続希釈力価を示す。示されたレーン（ボックス）に示される反応条件を用い、分で表す以下の時間−１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０にわたってより短い消化を行った。  上記比較により、ダイサーおよびＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの消化産物は大きいｄｓＲＮＡのかなりの部分がダイサー消化において切断されなかったのに対して、Ｅ３８Ａについては、大きいｄｓＲＮＡは観られなかった。この差は、ダイサー切断産物とは異なり、Ｅ３８Ａ変異切断産物には細胞にトランスフェクションする前に大きいｄｓＲＮＡを除去するさらなる分離工程が必要ではないことを意味する。
【図９】図９はショートカットＲＮＡ分解酵素ＩＩＩか、またはＥ３８Ａのいずれかで切断したホタルルシフェラーゼｄｓＲＮＡのＲＮＡ干渉活性を示す図である。ホタルルシフェラーゼｄｓＲＮＡを調製し製造元の指示に従ってショートカットＲＮＡ分解酵素ＩＩＩで消化するか、または図３に記載された条件に従ってＥ３８Ａで消化した。  ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を１日目に２４ウェルプレートに５０％の密度で播き、一夜培養した。細胞は２日目に、ホタルルシフェラーゼ遺伝子をリポーターとして含むｐＧＬ３ベクターと、加えてウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼをコントロールとして含むもの０．３ｍｇ／ウェルで、製造元の指示に従いトランスフェクション試薬としてＦｕｇｅｎｅを用いてトランスフェクションした。３日目に、ショートカットＲＮＡｉキット（黒棒）またはＥ３８Ａ（灰色棒）により調製されたルシフェラーゼｄｓＲＮＡまたはバッファ（白棒）を細胞にトランスフェクションした。４日目に細胞を収穫し、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社のデュアル・ルシフェラーゼ・アッセイ・キット（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）を用い、製造元（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社、ウィスコンシン州、マジソン市）の指示に従いルシフェラーゼ活性を測定した。
【図１０】図１０はＥ６５Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩにより切断されたｄｓＲＮＡを示す図である。ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＨｉｓ−タグ付きＥ６５Ａ変異体を図３に記載されている通りに精製し、定量した。  図１０Ａ：図３に記載された条件に従って０．５ｍｇのＭａｌＥ  ｄｓＲＮＡを、レーン８の４ｍｇから出発してレーン１の３２ｎｇまでのＥ６５Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＮＥＢバッファ２中の連続希釈溶液で消化（ニュー・イングランド・バイオラブ社、マサチューセッツ州ビバリー市）。  レーン９−合成ｄｓＲＮＡ２２量体。  図１０Ｂ：図１０Ａのレーン４および８の反応条件を繰り返し、消化を１６時間行った。
【図１１】図１１はＥ３８ＴおよびＥ３８Ｗ変異体の活性を示す図である。ＲＮＡ分解酵素のＨｉｓ−タグ付きＥ３８ＴおよびＥ３８Ｗ変異体を精製し、図３に記載された通りに定量した。  ０．５μｇのＭａｌＥ  ｄｓＲＮＡ（９００ｂｐ）をＲＮＡ分解酵素を、レーン１０（図１１Ａ）およびレーン９（図１１Ｂ）に出発する４μｇの変異酵素の２倍希釈におけるＲＮＡ分解酵素ＩＩＩのＥ３８Ｔ（図１１Ａ）およびＥ３８Ｗ（図１１Ｂ）変異体のＮＥＢバッファ２中の連続希釈溶液で消化（ニュー・イングランド・バイオラブ社、マサチューセッツ州ビバリー市）。消化は３７℃で３０分間行った。模擬消化をレーン２（図１１Ａおよび図１１Ｂ）に示し、レーン１（図１１Ａおよび図１１Ｂ）に示される各変異体４μｇを用い一夜消化した。ｄｓＲＮＡサイズ標準はレーン１１（図１１Ａ）およびレーン１０（図１１Ｂ）である。
【図１２】図１２は超好熱細菌［アクイフェックス・エオリクス（Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ）］と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの一致を示す図であり、ハイライトした領域とタンパク質の特定アミノ酸がｄｓＲＮＡと相互作用してｄｓＲＮＡの切断に関与するものと考えられる（Ｂｌａｓｚｃｚｙｋ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９：１２２５（２００１））。数字は右側のアミノ酸の残基の数を示す。一番上の行は超好熱細菌由来のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの配列を示し、第２行目は大腸菌由来のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩの配列を示す。以下の行はすべて活性を測定した大腸菌のＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ変異体の配列を示す。変異体の名称は第１欄にリストされている。第２欄にリスとされている各変異体の活性−ｗｔ−野生型活性、２３−活性により約２３ｎｔのｄｓＲＮＡフラグメントが生成される。ｉ−不活性変異残基はボックスで囲みハイライトした；灰色、不活性；黒色、２３量体ｄｓＲＮＡを生成；ハイライトなし、野生型。大腸菌残基：３８、４５、６５、１１７は超好熱細菌の残基３７、４４、６４、１１０にそれぞれ対応する。
【図１３】図１３はＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ  Ｅ３８ＡおよびＥ１１７Ｄの活性の漫画描写を示す図である。上のパネル−（灰色６角形）はｄｓＲＮＡを結合子、それを切断してｄｓＲＮＡ２３量体を生じる。中央のパネル−Ｅ１１７Ｄ（黒色６角形）はｄｓＲＮＡを結合するが、切断はしない。下のパネル−Ｅ３８ＡおよびＥ１１７Ｄを一つの反応において混合することからの提案された結果。ｄｓＲＮＡは切断され、Ｅ３８Ａ単独の２３量体の多量体からなるｄｓＲＮＡラダーを生じる。このサイズラダーは２つの変異体の比率を変えることにより上下にシフトすることが可能である。
【図１４】図１４はＥ３８Ａ／Ｅ１１７Ｄ混合実験を示す図である。Ｅ３８ＡとＥ１１７Ｄを種々の比率で混合し、氷の上に置き、次いで、図３に記載された条件下でｄｓＲＮＡ消化に用いる。４ｍｇの全酵素を０．５μｇのｄｓＲＮＡと混合した。  レーン１，２−ｄｓＲＮＡサイズ標準、サイズを示す。  レーン３〜１３、ゲルの頂部に示した比率を用い、消化。  レーン１４−模擬消化。
【図１５】図１５はＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ  ＷＴおよびＥ１１７Ｄの活性を描く漫画を示す図である。上のパネル−ＷＴ（白色６角形）がｄｓＲＮＡを結合し（平行線）、それを切断してｄｓＲＮＡ  １１量体またはそれより小さいものを生じる。中央のパネル−Ｅ１１７Ｄ（黒色６角形）がｄｓＲＮＡを結合するが、切断はしない。下のパネル−ＷＴおよびＥ１１７Ｄを一つの反応において混合することからの提案された結果。ｄｓＲＮＡは切断されて２組の生産物：ゲル上に観られなかった１１量体またはそれより小さい生産物、およびＥ３８Ａ変異ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ消化のみに由来する２３量体生産物の多量体からなるｄｓＲＮＡラダーを生じる。このサイズラダーは２つの変異体の比率を変えることにより上下にシフトすることが可能である。
【図１６】図１６は混合実験において変異Ｅ１１７Ｄと混合したＷＴ  ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを示す図である。ＷＴおよびＥ１１７Ｄを種々の比率で混合し、氷の上に置き、次いで図３に記載されている条件下でｄｓＲＮＡ消化に使用した。４ｍｇの全酵素を０．５ｍｇのｄｓＲＮＡと混合した。レーン１，２−ｄｓＲＮＡサイズ標準、サイズを示す；レーン３〜１３、ゲルの上に示す比率を用いて消化；レーン１４−模擬消化。
【図１７】図１７は実施例ＶＩのアルゴリズムに従って分析されたヒトＰ５３配列用の出力を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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