(57)【要約】  T細胞刺激量のワクチンを患者に投与することを含む、慢性B型肝炎の治療方法が開示される。前記ワクチンは、カルボキシ末端が短縮されたキメラ肝炎Bウイルスヌクレオキャプシド（コア）タンパク質（HBc）の免疫原性効果量を含む。前記キメラHBcは、自己会合粒子の安定性の強化及びこれら粒子による核酸結合の実質的欠如を目的として操作されている。前記キメラタンパク質分子は、HBcのN-末端、免疫原性ループ内又はC-末端の1つ若しくは2つ以上でペプチド結合した1つ若しくは2つ以上の免疫原性エピトープを含むことができる。自己会合粒子の安定性の強化は、前記キメラ分子のアミノ末端及びカルボキシ末端の一方又は両方近くに少なくとも1つの異種システイン残基が存在することによって達成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）B型肝炎ウイルスに慢性感染した患者に医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子を含むワクチンのT細胞刺激量を投与すること、および、
（b）前記患者をHBcに対し活性化されたT細胞を誘導するために十分な時間維持することを含む慢性肝炎を治療する方法であって、
前記免疫原性粒子が組換え肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質分子を含み、
前記キメラタンパク質分子は長さが約550までのアミノ酸残基であって、
（i）HBc配列の残基4位から約75位まで及び約85位から約140位までを含み、場合によって、
（a'）キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、及びC-末端の1つ又は2つ以上でペプチド結合した免疫原性エピトープ、又は
（b'）長さが約1から40のアミノ酸残基であって共役ハプテンのための化学的に反応性を有するリンカー残基を構成するHBc免疫優勢ループ内の挿入、
を含む、HBc分子のN-末端165アミノ酸残基の少なくとも約125残基のHBc配列、
（ii）（a'）HBcプレコア配列の配列以外の配列中の配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に存在する1つから3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、および、
（b'）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端方向に、キメラ分子のC-末端から約30残基内にある1つから約3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、
の一方又は両方を含み、
前記キメラ分子が、
（a'）HBc配列内に20％を超える保存的に置換されたアミノ酸残基を含まず、
（b'）宿主細胞内で発現すると自己会合して実質的に核酸と結合しない粒子を形成し、
前記粒子は、上記C-末端システイン残基、又はN-末端システイン残基のいずれも含まないか又は目的のキメラ分子に存在するC-末端若しくはN-末端システイン残基が別の残基に置換されているがその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である、
前記慢性肝炎の治療方法。
【請求項２】
ペプチド結合した免疫原性エピトープ又は共役エピトープのための異種リンカー残基が免疫原性エピトープである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
免疫原性エピトープがB細胞エピトープである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
組換えHBcキメラタンパク質分子が、第一と命名する免疫原性エピトープが結合した場所とは異なる場所で、前記キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、又はC-末端にペプチド結合した第二の免疫原性エピトープを含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
B細胞エピトープがHBc配列中のアミノ酸残基76位から85位の間の位置でペプチド結合し、さらに前記HBc配列の76位から8位までの少なくとも5残基が存在する、請求項3に記載の方法。
【請求項６】
アミノ酸残基76位から85位の間のHBc配列が存在するがB細胞エピトープによって中断される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
組換えHBcキメラタンパク質分子がさらに、第一と命名する免疫原性エピトープが結合した場所とは異なる場所で、前記キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、又はC-末端でペプチド結合した免疫原性T細胞エピトープを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
T細胞免疫原性エピトープがC-末端のHBcアミノ酸残基とペプチド結合している、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
C-末端システイン残基の少なくとも1つが存在する請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
キメラが、HBcキメラタンパク質分子のN-末端のシステイン残基とともに、中断されていない4位から少なくとも140位までのHBcアミノ酸残基配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
キメラが、中断されていない4位から149位までのHBcアミノ酸残基配列を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
キメラが、HBc免疫優勢ループ内に存在する共役エピトープのための異種リンカー残基を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
共役エピトープのための異種リンカー残基が、HBc配列中のアミノ酸残基76と85の間の場所でペプチド結合し、さらに前記HBc配列の76位から85位までの少なくとも4残基が存在する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
アミノ酸残基76と85位の間のHBc配列が存在するが、共役エピトープのための異種リンカー残基によって中断される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
組換えHBcキメラタンパク質分子が、4位から少なくとも140位までのHBcアミノ酸残基配列を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
キメラが4位から149位までのHBcアミノ酸残基配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
共役エピトープのための異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン及びチロシン残基からなる群から選択される、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
B型肝炎ウイルスに慢性感染した患者に、医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性効果量の免疫原性粒子を含むワクチンのT細胞刺激量を投与すること、を含む慢性肝炎を治療する方法であって、
前記免疫原性粒子は、約135から約525アミノ酸残基の長さを有し、さらにN-末端からドメインI、II、III及びIVと称される4つのペプチド結合したアミノ酸残基配列ドメインを含む組換え肝炎Bウイルスコア（HBc）タンパク質キメラ分子を含み、
（i）ドメインIは約71から約110アミノ酸残基を含み、前記残基の配列は、
（a'）少なくともHBcの5位から75位までの残基の配列、
（b'）HBcプレコア配列の配列以外の配列中の配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位に存在する0から3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、及び
（c'）場合により、HBc残基番号2‐4の1つにペプチド結合した、約30までのアミノ酸残基を含む免疫原性エピトープ、
を含み；
（ii）ドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約5から約250のアミノ酸残基を含み、
（a'）HBcの76位から85位の配列中の0から全ての残基が存在し、前記残基は（ｂ'）場合により存在する免疫原性エピトープ又は共役エピトープのためのリンカー残基を構成する1つから約245アミノ酸残基の配列にペプチド結合しており；
（iii）ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列であり；
（iv）ドメインIVは、
（a'）ドメインIIIの135位の残基にペプチド結合した、136位から約149位までのHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、
（b'）キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、及び
（c'）165位からC-末端までのHBcにとって異種の免疫原性配列内の0から約100アミノ酸残基、
を含み、
前記キメラ分子は、
（i）キメラのHBc配列中で約10％を超えないアミノ酸残基が置換されたアミノ酸残基配列を有し、
（ii）宿主細胞内で発現すると自己会合して粒子を形成し、さらに
（iii）少なくとも1つのN-末端システイン残基又はC-末端システイン残基を含み、
前記粒子は実質的に核酸と結合せず、さらに、（ａ）上記のC-末端システイン残基若しくはN-末端システイン残基のいずれも含まないか又は（ｂ）目的とするキメラ分子に存在する（iii）のシステイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である、
前記慢性肝炎の治療方法。
【請求項１９】
組換えHBcキメラタンパク質分子が2つの免疫原性エピトープを含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
組換えHBcキメラタンパク質分子が、ドメインI及びII、II及びIV又はI及びIVに存在する2つの免疫原性エピトープを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
2つの免疫原性エピトープの1つがB細胞エピトープである、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
2つの免疫原性エピトープの1つがT細胞エピトープである、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
2つの免疫原性エピトープの1つが同じ又は別のT細胞エピトープである、請求項19に記載の方法。
【請求項２４】
ドメインIがHBc残基番号2−4の1つとペプチド結合した免疫原性エピトープを含み、さらに前記エピトープがT細胞エピトープである請求項18に記載の方法。
【請求項２５】
ドメインIIが免疫原性エピトープを含み、さらに前記エピトープがB細胞エピトープである請求項18に記載の方法。
【請求項２６】
165位からC-末端のHBcにとって異種である配列が、HBc残基番号140−149の1つとペプチド結合した免疫原性T細胞エピトープである請求項18に記載の方法。
【請求項２７】
ドメインIIが共役エピトープのための異種リンカー残基を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２８】
組換えHBcキメラタンパク質分子が、前記キメラ分子のC-末端の約30残基内に1つから3つのC-末端システイン残基を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項２９】
組換えHBcキメラタンパク質分子が、B細胞エピトープである、ドメインIIに存在する免疫原性エピトープを含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
B細胞エピトープが6から約50アミノ酸残基を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
B細胞エピトープが20から約30アミノ酸残基を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３２】
組換えHBcキメラタンパク質分子が、前記キメラ分子のC-末端から約30残基内に1つシステイン残基を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３３】
アミノ酸残基番号76から85の間のHBc配列は存在するが、前記免疫原性エピトープによって中断される、請求項28に記載の方法。
【請求項３４】
システイン残基がキメラタンパク質のC-末端の約5アミノ酸残基内に位置する、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
165位からC-末端のHBcにとって異種である配列が、HBc残基番号140−149の1つとペプチド結合した免疫原性T細胞エピトープである、請求項18に記載の方法。
【請求項３６】
免疫原性エピトープ又は共役エピトープのための異種リンカー残基が共役エピトープのための異種リンカー残基である、請求項18に記載の方法。
【請求項３７】
共役エピトープのための異種リンカー残基が、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン及びチロシン残基からなる群から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
組換えHBcキメラタンパク質分子が、前記HBcキメラタンパク質分子のC-末端にただ1つのシステイン残基を含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
B型肝炎ウイルスに慢性感染した患者に医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子の免疫原性効果量を含むワクチンのT細胞刺激量を投与することを含む慢性肝炎を治療する方法であって、
前記免疫原性粒子が、約170から約250アミノ酸残基の長さを有し、N-末端からドメインI、II、III及びIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む組換え肝炎Bウイルスコア（HBc）タンパク質キメラ分子を含み、
（a）ドメインIは、HBcの約4位から約75位までの残基の配列とともに前記配列のアミノ末端HBc残基とペプチド結合した約25残基までの第一の配列を含み、前記約25までの残基配列は、配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-14位から約+１に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に0又は1つのシステイン残基［N-末端システイン残基］を含み；
（b）ドメインIIは、ドメインIのHBc残基番号75とペプチド結合した約5から約55アミノ酸残基を含み、場合によって存在するHBcの76位から85位に対して異種である約50アミノ酸残基までの第２の配列にペプチド結合した、HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基が存在し、；
（c）ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列であり；さらに
（d）ドメインIVは、
（i）ドメインIIIの135位の残基にペプチド結合した、136位から約149位までのHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、
（ii）キメラ分子のC-末端の約30残基内の0又は1つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、及び、
（iii）165位からC-末端までのHBcにとって異種である第三の配列中の0から約50アミノ酸残基を含み；
前記キメラ分子は、
（i）宿主細胞内で発現すると自己会合して粒子を形成し、
（ii）前記N-末端システイン残基又はC-末端システイン残基の少なくとも一方又は他方を含み、および、
（iii）配列番号:1のHBc配列に示された配列と比較して、約5％を超えないアミノ酸残基がキメラのHBc配列中で置換されているアミノ酸残基配列を有し、
前記粒子が約1.2から約1.7の280nm対260nm吸収比を示し、さらに、キメラ分子に存在する前記N-末端システイン残基若しくはC-末端システイン残基を欠くか、又はキメラ分子に存在する前記N-末端システイン残基若しくはC-末端システイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である、
前記慢性肝炎の治療方法。
【請求項４０】
ドメインIIの前記第二の配列がB細胞エピトープを特徴付ける、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
第二の配列が15から約50アミノ酸残基を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
第二の配列が20から約30アミノ酸残基を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４３】
アミノ酸残基番号76から85の間のHBc配列は存在するが第二の配列によって中断される、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
B細胞エピトープが、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）、クリプトスポリジウム・パルブム（Cryptosporidium parvum）、HIV、口蹄疫ウイルス、インフルエンザウイルス、イェルシニア・ペスチス（Yersinia pestis）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、モラキセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、トリパノソーマ・クルジ（Trypanosoma cruzi）、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）、プラスモジウム・ビバクス（Plasmodium vivax）、プラスモジウム・ベルジー（Plasmodium berghi）、プラスモジウム・ヨエリー（Plasmodium yoelli）、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）、フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）、RSV、プラスモジウム・エントアメーバ・ヒストリチカ（Plasmodium Entamoeba histolytica）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、マンソン住血吸虫（Scistosoma mansoni）、HBV及びエボラウイルスからなる群から選択される病原体に存在するアミノ酸配列である、請求項40に記載の方法。
【請求項４５】
165位からC-末端のHBcにとって異種の配列が、HBc残基番号140−149の1つにペプチド結合した免疫原性T細胞エピトープである、請求項40に記載の組換えHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４６】
T細胞エピトープがHBVに由来する、請求項45に記載の組換えHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４７】
N-末端システイン残基が前記キメラタンパク質分子のN-末端の約5アミノ酸残基内に位置する、請求項40に記載の組換えHBcキメラタンパク質分子。
【請求項４８】
B型肝炎ウイルスに慢性感染した患者に医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子を含むワクチンのT細胞刺激量を投与し、HBcに対して活性化されたT細胞の誘導に十分な時間前記患者を維持することを含む、肝炎Bウイルスに対抗するガンマ-産生CD8+、CD4+ T細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球の1つ又は2つ以上の産生を強化する方法であって、
前記希釈剤が（a）トール様レセプター4（TLR-4）に対するアゴニスト及び（b）トール様レセプター9（TLR-9）に対するアゴニストの一方又は両方を含み、
前記免疫原性粒子が組換え肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質分子を含み、
前記キメラタンパク質分子は、長さが約550までのアミノ酸残基であって、
（i）HBc配列の残基4位から約75位及び約85位から約140位までを含み、
さらに場合によって
（a'）キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、及びC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した免疫原性エピトープ、又は
（b'）長さが約1から40アミノ酸残基であって共役ハプテンのための化学的に反応性を有するリンカー残基を構成するHBc免疫優勢ループ内の挿入を含む、HBc分子のN-末端165アミノ酸残基の少なくとも約125のHBc配列、
を含み、さらに、
（ii）（a'）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に存在する1つから3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、及び
（b'）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端方向にあって、キメラ分子のC-末端から約30残基内にある1つから約3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］の一方又は両方を含み、
前記キメラ分子は、
（a'）HBc配列内に20％を超える保存的置換アミノ酸残基を含まず、
（b'）宿主細胞内で発現すると自己会合して実質的に核酸と結合しない粒子を形成し、
前記粒子は、上記に記載したC-末端システイン残基、又はN-末端システイン残基のいずれも含まないか又は目的のキメラ分子に存在するC-末端若しくはN-末端システイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である、
前記細胞及びリンパ球の産生強化の方法。
【請求項４９】
TLR-4のアゴニストが構造的にモノホスホリル脂質Aと関係を有する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
構造的にモノホスホリル脂質Aと関係を有するアゴニストがアミノアルキルグルコサミドホスフェートである、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
TLR-4アゴニスト及び前記TLR-9アゴニストの一方又は両方が医薬的に許容できる希釈剤及び前記免疫原性粒子と混合される、請求項48に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用：本出願は、2003年2月21日出願の出願番号10/372,076号の部分継続出願であり、前記出願はそれ自体2002年2月21日出願の出願番号10/080,299号及び2002年2月22日出願の出願番号10/082,014号の部分継続出願である（前記出願は引用により本明細書に含まれる）。
本発明は、免疫学およびタンパク質工学の学際的分野に関し、特に、肝炎Bウイルスに対する免疫反応を強化することによって慢性肝炎患者を治療するワクチンの免疫原として有用であり、C-末端およびN-末端のシステイン残基の一方又は両方を介して自己会合する粒子の安定性強化のための操作が施されたキメラ肝炎Bウイルス（HBV）ヌクレオキャプシドタンパク質（HBc）に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で3億五千万人を超えるB型肝炎（HBV）の慢性感染キャリアがいる。HBVは肝臓に感染するウイルスで、慢性肝炎、肝硬変及び肝細胞癌（肝臓の癌）の発症率を増加させる。B型肝炎は肝細胞癌の80％を超える原因であり、毎年世界中で1−2百万人の命を奪い、重大な保健衛生の脅威であり新規治療薬の成長市場となっている。
B型肝炎感染の重篤度は感染者の感染時の免疫系の状態に左右される。B型肝炎は出産時の母子感染に際してもっとも患者を衰弱させる。なぜならば幼児の免疫系は、典型的には前記ウイルスに対し効果的な反応を惹起することができないからである。結果として、慢性感染は90％の幼児に発生し、肝細胞癌発症率ははるかに高い（20から30％）。感染が1−5歳に発生する場合、慢性感染発症率は25−50％に低下する。感染が小児期の後期又は成人期に発生する場合、慢性感染の機会はわずか2−6％である。成人で慢性感染した者では肝細胞癌はほとんど発生しない。
慢性キャリアは高い感染性を示し、2つの一般的カテゴリーに分類される：（1）無症状慢性持続性B型肝炎（この場合大半の慢性キャリアは彼らの症状に対して治療を求めない）及び慢性活性化B型肝炎（慢性持続性肝炎ほど一般的ではないがより重篤である）。無症状慢性持続性HBVの患者で症状が存在する場合、それらの症状は比較的軽いもので、例えば疲労感、腹部痛、虚弱、発熱並びに脂肪及びアルコールに対する不寛容である。前記疾患は通常は重篤な肝臓病に進行しないが、いくらかの患者は慢性活性化B型肝炎を発症するであろう。慢性活性化B型肝炎の帰結には肝硬変及び原発性肝細胞癌（PHC）が含まれる。肝硬変の場合、繊維性組織が形成され、損傷した肝細胞と置き換わる。続いて肝臓は硬くなり、肥大し変形し、最終的には機能を果たさなくなる。B型肝炎発生率の低い地域では比較的稀であるが、前記発生率の高い地域では非常に一般的であり死因としての頻度は高い。
【０００３】
慢性B型肝炎の現行の治療は、インターフェロンアルファ-2の4ヶ月間の注射を必要とする。米国で承認されたインターフェロンアルファ-2には4種の製品がある。シェーリングプラウ（Schering Plough）のイントロン（Intron(登録商標)）A、アムゲン（Amgen）のインフェルゲン（Infergen）、ホフマンラロシュ（Hoffmann-La Roche）のロフェロン（Roferon）、及びグラクソスミスクライン（GlaxoSmithKline）のウェルフェロン（Wellferon）である。イントロン(登録商標)Aは、B型肝炎のために承認されたアルファインターフェロンの唯一の形態であり、他のものはC型肝炎についてのみ承認されている。
インターフェロンアルファはMHCクラスI分子の数を増加させ、それによって免疫細胞が感染細胞を認識しこれを破壊する能力を高めると考えられている。インターフェロンアルファはまた、肝細胞のHBV-RNAを切断するリボヌクレアーゼ酵素の量を増加させ、HBVの増殖を妨げる。
インターフェロンアルファはいくらかの人々では慢性B型肝炎感染を完全に排除することができるが、全患者の半分以上が治療に反応しないので前記の使用は限定される。慢性B型肝炎の患者で、インターフェロンアルファは、前記患者の体内のウイルス量を減少させ、患者の肝臓の損傷を遅らせることによって前記疾患の進行を遅らせることができる。
インターフェロンアルファ-2治療の副作用は、治療開始時に1週間又は2週間仕事から離れるように推奨されるほどの消耗を伴うことがある。もっとも一般的な副作用は、インフルエンザ様倦怠（flu-fatigue）、発熱、筋肉痛、全身の痛み、悪寒、吐き気である。軽度の脱毛並びに肌の乾燥及び掻痒もまた発生するであろう。
【０００４】
インターフェロンアルファ治療が効果的でないこと及び前記の副作用のために、抗ウイルス剤及び治療用ワクチンが可能な治療選択肢として研究されている。有望な結果が第二世代ヌクレオシド類似体（例えばラミブジン及びファムシクロビル）で認められている。ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤であるゼフィックス（Zeffix(登録商標)）（ラミブジン）は、慢性B型肝炎治療として有望なただ1つの薬剤候補物質であり、FDAの市販承認を受け、1999年に米国で販売されている。評価中の他の抗ウイルス剤には、BMS200、475、ガンシクロビル及びアデフォビルジピボキシルが含まれる。上記候補物質とインターフェロンアルファとの併用療法もまた研究されている。
ホフマンラロシュ及びシェーリングプラウ社は、ペガシス（PEGASYS(登録商標)）（Hoffman La Roche）及びPEG-INTRON（登録商標）（Schering Plough Corp.）と称される、いわゆる彼らのPEG化（pegylated）インターフェロンバージョンの市販承認を最近米国食品医薬局（FDA）に申請した。PEG化インターフェロンは、それらを1週間に1度投与し、持続的レベルのインターフェロンを患者の体内で提供できるようにポリエチレングリコール（PEG）によって修飾したアルファインターフェロンである。前記PEG化製剤はインターフェロンレベルの山と谷を回避し、さらにインターフェロンを週に3回投与したときに生じるインターフェロンの副作用を排除することができる。PEG化インターフェロンは、単一療法又は併用療法の後で再発した患者で特に有益であろう。
【０００５】
ワクチンアプローチは慢性肝炎の治療で試みられた。Couillinと共同研究者らは、肝炎B表面抗原（HBsAg）によるワクチン接種が慢性肝炎患者のHBsAg耐性を克服することができるか否かを調べた（Couillin et al. (1999)  J. Infect. Dis., 180:15-26）。彼らは、HBsAgは前記集団の一部分で有効であるとした。
研究はまた動物モデルでも実施され、免疫反応を前記疾患の動物モデルで誘導できるか否かが調べられた。したがって、Bocherと共同研究者らは、ヒト化（トリメラ）マウスモデルでのワクチン接種に対する免疫反応を調べた（Bocher et al. (2001) E. J. Immun., 31:2071-2079）。前記疾患のモデルとして、前記著者らは、B型肝炎に慢性的に感染している患者のPBMCを前記マウスに移し、続いて肝炎Bコアタンパク質（HBc）又は肝炎Bコアタンパク質をコードするDNAで前記マウスにワクチン接種した。前記著者らは、マウスをHBc又はHBcコードDNAで免疫した場合にHBc特異的Tヘルパー細胞及びB細胞反応を報告した。前記著者らは、HBcタンパク質又はHBcコードDNAのいずれも、慢性B型肝炎感染に対する治療的ワクチン接種のための候補ワクチンとなることができることを報告した。これらの実験では非常に大量のHBc投与が免疫反応の誘導に必要であったことに留意すべきである。感染個体のPBMCを移植されたマウスの免疫反応は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ISN）の添加によってさらに強化することができる。
【０００６】
能動的ワクチン接種を考慮するほかに、受動免疫移入が試みられた。Lauと共同研究者らは、HBV免疫個体から慢性感染個体への骨髄移入は感染の消散をもたらすことを示した（Lau et al. (2002) Gastroenterology， 122：614-624）。前記消散はHBc反応性T細胞の移入に付随し、そのために前記著者らはHBcタンパク質又は[HBcコード]DNAによる治療的免疫はB型肝炎慢性感染患者で調査する価値があると述べるに至った。
肝炎Bコアタンパク質（HBc）はしたがって、慢性B型肝炎に対する治療ワクチンのための潜在的に有用な抗原として認識された。しかしながら、前記潜在能力を実行に移すためにはいくつかの問題を克服しなければならない（HBcの組換え体の生成は困難である）。以下で考察するように、生成収量は、おそらくHBcタンパク質の固有の核酸結合特性のために非常に低く、さらに生成されたウイルス様粒子（VLP）を管理当局が認容するレベルまで精製することはさらに困難である。
HBc製造に付随する困難の結果として、HBVに慢性感染した個体でHBcに対する免疫反応を誘導するためにまた別のアプローチが追及された。したがって、例えば、WO01/16163（Hultgren and Sallberg）では、HBc配列の1位から183位に至るいくつかのアミノ酸残基を含む多重オーバーラップ合成ペプチドの使用が提唱されている。前記の発明者らは、完全なタンパク質を含むペプチド混合物による免疫は、慢性感染個体でウイルスのクリアランスを促進する免疫反応を誘導することができると提唱し、HBcタンパク質をコードするDNAを用いてHBVに慢性感染したチンパンジーを免疫した（Sallberg et al. (1998) Human Gene Therapy 10:1719-1729）。タンパク質をコードするDNAの使用によって、タンパク質の精製の要求は克服されるが、DNAワクチン接種はヒトでは顕著な成功率を伴わなかった。
米国特許6,020,167号（Thoma）は、慢性HBV感染の治療に有用であると称されるワクチンを開示している。このワクチンは、ポリペプチドを提示することができる担体に結合させた1つ又は2つ以上のHBV PreS1又はHBVコアT細胞活性化エピトープを有するポリペプチドを含む。粒子形成担体は好ましいと主張され、HBVコアの完全又は実質的部分及び表面タンパク質（それぞれHBc及びHBsAg）が請求の範囲として提示された担体であった。以下で考察されるように、完全なコアタンパク質は核酸と結合する傾向が有り、このことはワクチン製造には問題であろう。さらにまた、核酸結合を軽減させるためにカルボキシ末端が短縮されたコア分子は不安定な可能性があり、ワクチンとして不均一な混合物を提供するであろう。
【０００７】
ヘパドナウイルス科は、ヒトにB型肝炎を引き起こすエンベロープDNA含有動物ウイルス（HBV）である。ヘパドナウイルス科には、他の哺乳類（例えばウッドチャック（WHV）、地上性リス（GSHV））のB型肝炎ウイルス、並びにアヒル（DHV）およびサギ（HeHV）で見出される鳥類のウイルスが含まれる。本明細書で用いられる肝炎Bウイルス（HBV）は、考察が非哺乳類ウイルスの特別な例に言及しないかぎり、鳥類宿主に感染するウイルスと対比される哺乳類に感染するヘパドナウイルス科のメンバーを指す。
哺乳類の肝炎Bウイルス（HBV又はヘパドナウイルス）のヌクレオキャプシド又はコアは、ウイルスのサブタイプにより183又は185のアミノ酸残基配列を含むが、一方、アヒルのウイルスキャプシドは262のアミノ酸残基を含む。いくつかのヘパドナウイルス科の肝炎Bコアタンパク質モノマーは、感染細胞内で自己会合して、肝炎Bコアタンパク質粒子（HBc粒子）として知られる安定な凝集物を形成する。HBc粒子について2つの三次元構造が報告されている。小集団を構成する第一のものは、ダイマーとして90コピーのHBcサブユニットタンパク質、又は180の個々のモノマータンパク質を含み、第二の、主要な集団は、ダイマーとして120コピーのHBcサブユニットタンパク質、又は240の個々のモノマータンパク質を含む。これらの粒子はそれぞれT=4又はT=3粒子と称され、この場合 “T”は三角分割数である。ヒトに感染するウイルス（ヒトウイルス)のこれらHBc粒子は、直径がそれぞれ約30又は34nmである（Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74；Metzger et al. (1998) J. Gen. Virol. 79:587-590）。
【０００８】
Conwayら（Nature 386:91-94 (1997)）は、凍結電子顕微鏡写真から決定した、9Åの解像度でヒトHBc粒子の構造を記載している。Bottcherら（Nature 386:88-91 (1997)）はヒトHBcモノマーのポリペプチド折り畳みを記載し、アルファヘリックス領域およびそれらの連結ループ領域が形成するアミノ酸残基の凡その番号を付与したスキームを提供した。Zhengら（J. Biol. Chem. (1992) 267(13):9422-9429）は、1つ又は2つ以上のシステインを欠く変異タンパク質に関する彼らの研究、および他の研究者のC-末端短縮タンパク質に関する研究（Birnbaum et al, (1990) J. Virol. 64:3319-3330）から、コア粒子形成は、アルギニン富裕C-末端ドメイン、核酸の結合、又はジスルフィド結合形成には左右されないことを報告している。
肝炎Bヌクレオキャプシド又はウイルスコアタンパク質（HBc）は、免疫された宿主動物のT細胞応答を刺激する免疫原性担体部分として記載された。例えば米国特許4,818,527号、同4,882,145号および同5,143,726号を参照されたい。この担体の特に有用な応用は、免疫優勢ループ部位に外来又は異種B細胞エピトープを提示する能力である。前記ループは残基位置約70‐90に存在し、より一般的には前記タンパク質のアミノ末端（N-末端）から約75から85位であると記載されている（Clarke et al. （1991）F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 313-318）。
【０００９】
ウイルスの複製中に、HBVのヌクレオキャプシドは、前記ウイルスのRNAプレゲノム、ウイルス逆転写酵素（Pol）および末端タンパク質（Polに由来する）と会合して複製能力を有するコアを形成する。ヌクレオキャプシドとウイルスRNAプレゲノム間の会合は、カルボキシル-末端（C-末端）に存在するアルギニン富裕ドメインによって仲介される。ウイルスRNAプレゲノムが存在しない異種発現系（例えば大腸菌）で発現される場合、プロタミン様C-末端（すなわち150位から183位の残基）が大腸菌RNAと結合することができる（Zheng et al. (1992) JBC 267(13):9422-9429）。
ワクチン部分として応用する場合、HBVヌクレオキャプシドは宿主由来の核酸と結合しないことが好ましい。Birnbaumら（J. Virol. 64:3319-3330 (1990)）は、HBVヌクレオキャプシドのプロタミン様C-末端ドメインは、会合してウイルス様粒子を形成するタンパク質の能力を損なうことなく欠失させることができることを示した。したがって、約144位まで末端短縮されたタンパク質（すなわち1位から約144位のHBc配列を含む）は自己会合することができるが、残基139を超える欠失はキャプシドの会合を停止させる（Birnbaum et al. (1990) J. Virol. 64:3319-3330；Seifer et al. (1995) Intervirology 38:47-62）。
【００１０】
Zlotnickら（Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:9556-9561 (1997)）は、完全長および末端短縮HBcタンパク質の粒子への会合を調べた。完全長分子の考察の他に、前記著者らは1位から149位のHBc配列を含む末端短縮タンパク質の調製を報告した（前記末端短縮形では、48、61および107位のシステインが各々アラニンで置き換えられ、さらに１つのシステイン残基がC-末端（150位）に付加されていた）。前記のC-末端のメルカプタンは電子顕微鏡検査での標識のための金原子クラスターとの結合に用いられた。
さらに最近、Metzgerら（J. Gen. Virol. 79:587-590 (1998)）は、ヒトのウイルス配列の138位のプロリン（Pro-138又はP138）が粒子形成に必要であることを報告した。前記の著者らはまた、カルボキシ末端において142残基および140残基の長さに末端短縮した粒子の会合能力は影響を受け、139および137残基の長さを生じる末端短縮では会合能力が完全に失われることを報告した。
末端短縮粒子は標準的なB型肝炎コア粒子と比べて安定性の低下を示すことをいくつかのグループが示した（Galena et al. (1998) J. Virol. 63:4645-4652；Inada et al. (1989) Virus Res. 14:27-48）。このことは、粒子サイズの変動性、および精製調製物中に粒子フラグメントが存在することによって証明された（Massen et al. (1994) Arch. Virol. 135:131-142）。このように、上記のMetzgerらの報告に先立って、Pumpensら（Intervirology 38:63-74 (1995)）は、自己会合に必要なHBc配列のためのカルボキシ末端の境界はアミノ酸残基130および144の間に位置し、最初の2つ又は3つのアミノ末端残基を他の配列に置き換えることができるが4つ又は11のアミノ末端残基の欠如は、形質転換した大腸菌細胞でのキメラタンパク質の完全な消失をもたらすことを記載して文献の報告を要約した。
【００１１】
種々の挿入ポリペプチド配列を含む、内部挿入を保持する、組換えによって作製されたハイブリッドHBc粒子（当業界ではHBcキメラ粒子又はHBcキメラ体と称される）は、多様な生物（大腸菌、枯草菌（B. subtilis）、ワクシニア、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、ビール酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）を含む）で異種発現によって調製されてきた。例えば以下を参照されたい：Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74；およびいくつかの研究者グループの研究が記されている前記文献中の引用文献。
そのようなHBcキメラ体は、電子顕微鏡で分析したとき、異種エピトープを欠く粒子と比較してしばしば秩序の低い構造を有するようである（Schodel et al. (1994) J. Exp. Med. 180:1037-1046）。いくつかの事例では、異種エピトープのC-末端短縮HBc粒子への挿入は、異種発現後にハイブリッド粒子を回収できないほど劇的な安定化喪失の影響を示す（Schodel et al. (1994) Infect. Immunol. 62:1669-1676）。したがって、多くのキメラHBc粒子は不安定で精製中に破壊され、その程度は、前記粒子が回収不能であるか又は極めて低い安定性を示すほどであり、そのことがワクチン開発を困難にしている。
上記の文献（Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74）は、挿入されたポリペプチド配列がN-末端、C-末端および末端間に存在する粒子形成キメラを列挙している。前記文献に報告されている挿入配列の長さはN-末端で24から50残基、内部で7から43残基、C-末端で11から741残基である。
【００１２】
最近、Kratzら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:1915-1920）は、238残基の緑色蛍光タンパク質（GFP）を内部融合させた末端短縮HBc配列で構成されたキメラHBc粒子の大腸菌発現について記載した。前記キメラは、HBcのアミノ酸残基79および80と置き換えられた一対のグリシン富裕可撓性リンカーアームによってフランキングされる挿入GFP配列を含んでいた。前記粒子は、ウサギを宿主動物として天然のGFPに対して効果的に抗体を誘導すると記載された。
米国特許5,990,085号は、（i）カルボキシ末端短縮HBcの免疫原性ループの残基78と79の間で、および（ii）カルボキシ末端短縮HBcの残基144の後に融合した抗原性ウシインヒビンペプチドから形成された2つの融合タンパク質について記載している。発現された融合タンパク質は、宿主動物に投与されたとき抗インヒビン抗体の産生を誘導すると記載された。前記特許で報告された免疫後30日の力価は比較的低く、ループ挿入を含む融合タンパク質については1:3000から15000で、残基144の後に挿入されたものについては1:100から125である。
米国特許6,231,864号は、ハプテンと結合させた、戦略的に改変したB型肝炎コアタンパク質の製造および使用を教示する。前記改変コアタンパク質は、ハプテンが懸垂結合されている化学的に反応性を有するアミノ酸残基を含む長さが1から約40残基の挿入を含む。
【００１３】
WO01/27281は、HBcに対する免疫応答は、天然の分子のC-末端システイン含有配列の存在又は欠如によってそれぞれTh1応答からTh2応答に変化させることができることを開示している。前記開示はまた、C-末端システインによるジスルフィド形成は粒子の安定化に役立つと述べている。C-末端システインの直ぐ上流の天然のHBc配列のいくつかの残基の存在は好ましいが、要件とはならないと記載された。短縮C-末端HBc配列の置換に用いることが可能なそのような選択肢には、C-末端システインおよびHBc以外のタンパク質からエピトープを区別する随意の配列が含まれると記載された。
公開されたPCT出願WO01/98333は、C-末端のシステイン残基を維持しながら、天然のHBcのC-末端に存在する4つのアルギニンリピートの1つ又は2つ以上を欠失させることができることを教示している。前記出願はまた、前記欠失領域をHBc以外のタンパク質のエピトープによって置き換え、前記のようにして形成された分子のHBc部分が添加されたエピトープのための担体として機能できるようにすることを開示している。
PCT/US01/25625（WO02/13765A2、2002年2月21日公開）及びPCT/US01/41759（WO02/14478A2、2002年2月21日公開）に対応する公開されたPCT出願は、C-末端短縮HBc粒子の安定化は、前記粒子が組み立てられるキメラタンパク質で1つ又は2つ以上の添加システイン残基の使用により達成できることを開示している。前記添加されたシステイン残基は、キメラタンパク質のC-末端に存在するか、又はC-末端近くに存在することが開示されている。
【００１４】
完全長のHBc粒子の安定性を維持しながら、完全長HBc粒子の核酸結合能力を失わせることができる構造的特徴は、ヘパドナウイルスヌクレオキャプシドデリバリー系を用いたワクチン開発で極めて有益であろう。実際、Ulrichらは、外来エピトープのための担体としてHBcキメラを使用することに関する彼らの最近の総説で、人間のワクチンで前記キメラを使用するために解決すべき潜在的な3つの問題を記載している（Ulrich et al. Adv. Virus Res., 50:141-182 (1998)）。第一の潜在的な問題は、キメラワクチン内の核酸の免疫される宿主への偶然による移入である。第二の潜在的な問題は以前から存在するHBcに対する免疫による干渉である。第三の可能な問題は、長期保存にも耐えることができる完全なキメラ粒子の増殖可能な調製物の要求に関する。
上記の4つのPCT出願公開は、Ulrichらによって開示された潜在的な問題の克服に用いることができる教示を含んでいるように思われる。以下で開示されるように、本発明は、予期に反して高力価の抗体を提供し、さらにある特徴ではまたHBcキメラの安定性に関する問題を解決するとともに核酸結合能力のない構築物を提供するまた別のHBcキメラを提供する。さらにまた、意図される組換えキメラは、既に存在する抗HBc抗体に対し（もし存在するとしても）最小限の抗原性を示す。
N-末端短縮形のHBcキメラ分子に関する上記の粒子の不安定性に関する発見にもかかわらず、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163, 1999（October））は、完全長のHBcの残基5に融合されたインフルエンザM2タンパク質のN-末端24残基部分を含むHBcキメラの粒子形成が大腸菌発現で生じたことを報告した。
【００１５】
ワクチンへの応用のためにC-末端が切り縮められたハイブリッドHBcの以前に検討された使用によって、それらの完全長の対応物を陵駕する、発現レベルの強化および大腸菌RNA結合の欠如を含むいくつかの利点が提供される。しかしながら、異種エピトープをディスプレイするように創出されたC-末端短縮粒子はしばしば不安定で、発現後に結合して安定な粒子構造を形成できないか、又は精製時および／又は精製後に容易に非粒子構造に分解する粒子を生じる。そのような安定性の欠如は、HBc149位までC-末端が短縮された、さらにまたインフルエンザA M2タンパク質の上記残基1−24、を含むキメラHBc分子を含む粒子によって示される。
他の研究者らは、野生型ヘパドナウイルスコア抗原では、HBcAg開始コドンの上流のシステイン残基は粒子形成の防止に直接関与することを報告した（Schodel et al. (Jan. 15, 1993), J. Biol. Chem. 268(2):1332-1337；Wasenauer et al. (Mar. 1993), J. Virol. 67(3):1315-1322；Nassal et al. (Jul. 1993), J. Virol. 67(7):4307-4315）。前記3グループはいずれも、野生型HBeAgでは、プレコア配列の-7位のシステイン残基（コア遺伝子が-30位に存在する上流の開始メチオニンから翻訳されるときに存在する）が粒子形成の防止に必要で、したがって粒子状HBcAgから分泌非粒子状HBeAgへの変化に必要であることを報告した。
【発明の開示】
【００１６】
以下で考察される本発明の1つの特徴は、上述の製造及び夾雑に関する問題を克服した、肝炎Bウイルスに慢性感染している個体への投与を目的とするタンパク質免疫原を提供することである。さらにまた、本タンパク質は物理的安定性を維持し、さらに既に存在している肝炎Bウイルス感染を身体から除去するために特に有用な免疫反応を誘導するために高度な操作が施されている。
以下で詳細に記載される本発明は、これまでにワクチンで観察された問題のいくつかを克服する慢性肝炎のためのワクチン治療を提供する。したがて、本発明のワクチンは、既に存在しているB型肝炎ウイルス感染を身体から除去するために特に有用な免疫反応を誘導するためにT細胞活性化を提供することによって強化された免疫応答を誘導し、さらに実質的に核酸結合を示さないが、安定で均一な担体分子を利用する。
【００１７】
発明の簡単な概要
本発明の目的はB型肝炎ウイルスに慢性感染した個体を治療する方法である。本方法は、B型肝炎ウイルスに慢性感染した患者に前記ウイルスに対する免疫反応を強化するために十分な量で、医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた、末端短縮及び安定化させた組換えヘパドナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質粒子を含むワクチンを投与することによる。前記ウイルスに対するそのような免疫応答の強化は、単独で又は他の療法と併用して、前記個体が身体から前記ウイルスを除去し、もはや感染状態でないようにすることを可能にする。前記末端短縮及び安定化された組換えヘパドナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質は宿主の核酸を実質的に含まないことが好ましい。
本方法は、宿主細胞で発現されると自己会合して粒子を形成する、医薬的に許容される希釈剤に溶解又は分散された組換えヘパドナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質、すなわち肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質（本明細書ではキメラ肝炎Bコアタンパク質分子、HBcキメラ分子、又は単にキメラとも称される）を含むワクチンを利用する。目的のキメラ分子は、天然のコア分子（そのC-末端は通常は残基約183位に存在する）と比較して少なくともC-末端で末端短縮されている。目的のキメラ分子を含む粒子は好ましくは、N-末端及びC-末端の一方若しくは両方のシステイン残基、又はN-末端及びC-末端近くのシステイン残基によって安定化される。目的のキメラ分子は、HBcのN-末端の165アミノ酸残基の約125又は全部を含み、さらに1つ又は2つ以上の他のアミノ酸残基又は残基配列を含むことができ、前記他の残基又は残基配列は典型的にはHBVのB若しくはT細胞エピトープ、別の病原体、又は別のタンパク質（例えばウシインヒビン）である。
【００１８】
本発明のある特徴では、慢性肝炎を治療する本発明の方法は、B型肝炎ウイルスに慢性感染した患者に医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子を含むワクチンの抗HBc T細胞刺激量を投与する工程を含む。前記免疫原性粒子は好ましくは免疫刺激性アジュバントと一緒に投与される。好ましい免疫刺激性アジュバントには、脂質A類似体（例えばモノホスホリル脂質A）又は合成アミノアルキルグルコサミドホスフェートが含まれる。免疫刺激性分子は、好ましくはミクロ粒子状担体（例えば水中油乳濁液）又はミクロ粒子状鉱物塩（例えば水酸化アルミニウムゲル）と結合している。前記免疫原性粒子はそれ自体組換え肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質分子で構成され、前記キメラタンパク質分子は長さが約550までのアミノ酸残基である。前記キメラタンパク質分子は、（a）HBc分子のN-末端165アミノ酸残基の約125から全部のHBc配列を含み、さらに残基4位から約75位まで及び約85位から約140位までのHBc配列を含む。HBcキメラ分子配列は場合によって、（a'） キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内（すなわち残基約76位から約85位の間）、及びC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した免疫原性エピトープを含むアミノ酸配列、又は（b'）長さが約1から40アミノ酸残基であり共役ハプテンのための化学的に反応性を有するリンカー残基を構成するHBc免疫優勢ループ内の挿入、又は（c'）76位から85位の配列の0から全部を含む。
前記キメラタンパク質分子はまた、（a'）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に存在する1つから3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、及び（b'）HBc配列のC-末端残基から前記キメラ分子のC-末端方向でキメラ分子のC-末端から約30残基内にある1つから約3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］の一方又は両方を含む。
【００１９】
キメラタンパク質分子はHBc配列内に20％を超える保存的置換アミノ酸残基を含まず、自己会合して粒子を形成する。これらの粒子は、宿主細胞で発現（その後の採集及び精製）したときに、好ましくは実質的に核酸結合を示さない（以下で考察されるように280nmと260nmの吸収比は約1.7を示す）が、280nmと260nmの吸収比が約0.9から約1.15であるような最小量の結合核酸もまた含有することができる。したがって、280nmと260nmの吸収比が約0.9から約1.7を示す粒子も本発明で用いることができる。前記粒子は、（i）上記に記載したC-末端システイン残基、又はN-末端システイン残基のいずれも含まない、又は（ii）本発明のキメラ分子に存在するC-末端又はN-末端システイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子粒子、よりも安定である。
患者は、HBcに対して活性化されたT細胞を誘導させるために十分な時間維持される。本発明の他の特徴では、患者は抗ウイルス薬（例えばラミブジン）で処置され、ウイルス負荷が軽減される。抗ウイルス薬による処置はワクチン接種と同時でも、ワクチン接種に先行してもよい。本発明のまた別の特徴には、患者への投与を意図した抗ウイルス薬及びHBcキメラの両方を含むキットが含まれる。
本発明の別の特徴では、患者はHbsAgを含む血清を有し、前記治療は患者血清中の前記抗原量の低下をもたらす。本発明のさらに別の特徴では、前記患者の血清はHBeAgを含み、前記治療は患者血清中のHBeAg抗原量の低下をもたらす。
【００２０】
好ましい組換え肝炎Bウイルスコア（HBc）タンパク質キメラ分子は長さが約135から約525アミノ酸残基で、N-末端から、ドメインI、II、III及びIVと称される4つのペプチド結合したアミノ酸残基配列ドメインを含む。
前記キメラ分子のドメインIは約71から約110アミノ酸残基を含み、その配列は（i）少なくともHBcの5位から75位までの残基の配列、（ii）HBcプレコア配列の配列以外の配列中に、配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に存在する0から3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、（iii）場合により、HBc残基2位‐4位の1つにペプチド結合した、約30までのアミノ酸残基を含む免疫原性エピトープを含む。
前記キメラ分子のドメインIIは、ドメインIのHBc残基75にペプチド結合した約255までのアミノ酸残基を含み、（i）HBc76位から85位の配列中の0から全部の残基が存在し、前記残基は（ii）場合によって存在する、免疫原性エピトープ又は共役エピトープのためのリンカー残基を構成する1つから約245アミノ酸残基の配列にペプチド結合している。
キメラのドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から約135位のまでのHBc配列である。
キメラ分子のドメインIVは以下を含む：（i）ドメインIIIの135位の残基にペプチド結合した、約136位から約163位までのHBcアミノ酸残基配列の5から30残基、（ii）キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、及び（iii）165位からC-末端までのHBcに存在する配列以外の免疫原性配列中の0から約100アミノ酸残基。
好ましいキメラ分子は、（i）キメラのHBc配列で約10％を超えないアミノ酸残基が置換されたアミノ酸残基配列を有し、（ii）宿主細胞で発現された場合に自己会合して粒子を形成する。前記粒子は核酸との結合を実質的に含まず、さらにまた、前記粒子は、上記に記載したC-末端システイン残基のいずれも含まず、その上（i）N-末端システイン残基を欠くか、又は（ii）目的のキメラ分子内に存在するN-末端システイン残基が別の残基に置換されているがその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である。
【００２１】
いくつかの実施態様では、ドメインIのHBc配列は、5位から75位の残基に加えて少なくとも１つのN-末端システイン残基を含むのが好ましい。他の実施態様では、目的のキメラ分子は、N-末端システイン残基だけではなく、上記に記載したように、ドメインIV内に、単独又はアミノ酸残基配列内に存在する１つのシステイン残基を含むことが好ましい。さらにまた別の実施態様では、好ましいキメラ分子は、ただ1つの又は2つ以上のC-末端システイン残基を含み、ドメインIは非HBc性システイン残基を含まない。あるシステイン残基は、図1のHBc配列の各々の約61位に存在する。
考慮されている方法は、医薬的に許容できる希釈組成物（典型的にはまた水を含む）に溶解又は分散された前述の自己会合キメラ分子粒子を含むワクチンを利用する。目的のキメラ分子のドメインI、II及びIIIの1つ又は2つ以上に存在する特に好ましい非HBcエピトープは、肝炎B表面タンパク質（HBs）のPreS1又はPreS2領域由来の免疫原性配列である。
本発明はいくつかの利点及び長所を有する。
本発明の具体的な利点は、治療用ワクチンとしてのその使用によって極めて強いT細胞活性化が提供されることである。
本発明の別の利点は、組換え免疫原は、容易にさらに周知の細胞培養技術を用いて製造されることである。
本発明の長所は、免疫原は周知の組換え技術を用いて容易に製造されることである。
本発明のまた別の長所は、好ましい免疫原は、C-末端又はN-末端システイン残基の一方又は両方を欠く他のHBc キメラよりも製造に際してはるかに安定性を示し、その一方で実質的に核酸を含まない。
更に別の利点及び長所は、当業者には以下の記載から明白であろう。
【００２２】
定義
HBcキメラとの関係で使用される数字は、配列番号:1のHBc aywのアミノ酸残基配列内の位置を（前記について付加又は欠失が存在するか否かにかかわらず）示している（HBcキメラでは1つ又は2つ以上の残基が前記配列に付加され又は前記配列から欠失している）。したがって、HBc149はキメラが残基149で終了することを表示し、一方、HBc149＋C150は、当該キメラが、配列番号:1の配列内番号に対応してHBc150位にシステイン残基を含むことを示す。
“抗体”という用語は、免疫グロブリンと称されるグリコシル化タンパク質ファミリーのメンバーである分子（特異的に抗原と結合することができる）を指す。
“抗原”という語は、歴史的に抗体または受容体と結合する存在物を指すために、および、抗体の産生を誘導する存在物を意味するためにも用いられてきた。より最近の使用は、抗原の意味を抗体又は受容体と結合する存在物に限定し、一方、“免疫原”という語は抗体産生を誘導する存在物、又は、受容体と結合する存在物に用いられる。本明細書で考察される実体が免疫原性であり、かつ抗原性を有する 場合は、免疫原または抗原のいずれとして言及するかは、その意図される使用にしたがって行われる。
“抗原決定基”は、抗体結合部位又はT細胞受容体が免疫学的に結合する抗原の実際の構造部分を指す。前記用語はまた“エピトープ”と互換的に用いられる。したがって、抗原決定基は、抗体産生又はT細胞活性化を刺激する構造であり、そのような構造の存在は、どの構造に抗体が結合するか、又はT細胞活性化を誘導するかを決定することによって確認することができる。
【００２３】
本明細書で用いられる“共役物”という用語は、アミノ酸残基側鎖を介して担体タンパク質に機能的に連結されたハプテンを指す。
本明細書で用いられる“保存的置換”という用語は、あるアミノ酸残基が別の生物学的に類似の残基によって置き換えられたことを意味する。保存的置換の例には、１つの疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン）によるもう１つの疎水性残基の置換、または1つの極性残基によるもう１つの極性残基の置換（例えばアルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミンとアスパラギンなど）が含まれる。
ペプチド配列に関して用いられる“対応する（一致する）”という用語は、記載のペプチド配列に約3つまでのアミン酸残基がアミノ末端又はカルボキシ末端の一方又は両方に付加され又は前記から削除されたもので、さらに前記ポリペプチド配列の個々のアミノ酸残基に保存的置換のみを含む前記ペプチド配列を意味する。
本明細書では“ドメイン”という用語は、Galibertら（Nature 281:646-650 (1979)）が報告したHBcAg サブタイプayw（配列番号:1）の位置番号に対応する残基位置番号付与によって特定される、組換えHBcキメラ分子の部分を指すために用いられる。少なくともキメラのドメインI、IIおよびIIIのポリペプチド部分は、天然に存在するHBcAgの対応する配列と類似の三次構造で存在すると考えられる。
【００２４】
本明細書で用いられる“融合タンパク質”という用語は、ペプチド結合によってそれらの対応するカルボキシ末端およびアミノ末端のアミノ酸残基間で機能的に末端対末端（頭部対尾部）結合された、自然界では通常は一緒に結合した状態で見出されない少なくとも2つのアミノ酸残基配列を含むポリペプチドを指す。本発明の融合ペプチドは、アミノ酸残基配列中の融合タンパク質のポリペプチドと一致するポリペプチドと免疫反応する抗体の産生を誘導するHBcキメラ分子である。
本明細書で用いられる“Ｂ型肝炎”という語句は、上記で考察されたようにそのもっとも広い意味で哺乳類のヘパドナウイルス科の任意のメンバーを指す。
“ポリペプチド”および“ペプチド”という語は本明細書では互換的に用いられ、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボキシ基との間でペプチド結合によって一方が他方に連結された一連の直鎖状アミノ酸残基を指す。ポリペプチドは種々の長さを有することができ、それらの中性の形態（荷電をもたない）でも、塩の形態でもよい。アミノ酸残基配列は酸性基および塩基性基を含むこと、及び、ペプチドが示す個々のイオン化状態は、前記ペプチドが溶液の場合は周囲の媒体のpH値に、または前記ペプチドが固体の場合は前記ペプチドが得られた媒体のpH値に左右されることは当業者にはよく理解されていよう。したがって、“ポリペプチド”またはそれに匹敵する用語には、関連する適切なアミノ酸残基配列が含まれる。ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書では常に左から右に、アミノ末端（N-末端）からカルボキシ末端（C-末端）の方向で示される。
【００２５】
“残基”という用語は、アミノ酸残基という語句と互換的に用いられる。本明細書で特定される全てのアミノ酸残基は天然型またはL型立体配置である。標準的なポリペプチドの命名法にしたがって（J. Biol. Chem. 243:3557-59 (1969)）、アミノ酸残基の略語は以下の対応表に示されているとおりである。
2007525421.tif 000002
【００２６】
HBcキメラとの関係で使用される数字は、配列番号:1のHBc aywのアミノ酸残基配列内の位置を（前記について付加又は欠失が存在するか否かにかかわらず）示している（HBcキメラでは1つ又は2つ以上の残基が前記配列に付加され又は前記配列から欠失している）。したがって、HBc149はキメラが残基149で終了することを表示し、一方、HBc149＋C150は、当該キメラが、配列番号:1の配列内番号に対応してHBc150位にシステイン残基を含むことを示す。
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、慢性B型肝炎感染を治療する方法を意図している。本発明の方法は、宿主細胞内で発現後自己会合して粒子を形成する組換えヘパドナウイルスヌクレオキャプシドタンパク質（すなわち肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質分子）を利用する。意図されているキメラ分子は、天然のコア分子に対して少なくともC-末端で末端短縮されている（天然のコア分子のC-末端は図1のawyサブタイプについては通常は残基183位である）。意図されているキメラ分子を含む粒子は、以下で考察するように、C-末端及びN-末端の一方または両方に、又は前記末端の近くに位置するシステイン残基によって安定化され、さらに好ましくは実質的に核酸と結合しない。
本発明のキメラ分子は、HBcのN-末端の165アミノ酸残基の少なくとも約125、より好ましくは少なくとも約135から全部を含み、さらに1つ又は2つ以上の他のアミノ酸残基配列を含むことができる。前記他のアミノ酸残基配列は典型的には、HBV、別の病原体、又は別のタンパク質（例えばウシインヒビン）のB若しくはT細胞エピトープである。本発明のキメラ分子に取り込ませることができる非HBVタンパク質由来のB細胞又はT細胞エピトープの例は、以下の表A及びBに例示されている。キメラ分子に取り込むことができるB型肝炎ウイルスに由来する好ましいT細胞エピトープの例は、表面抗原Pre-S2配列144−160である。キメラ分子に取り込むことができる肝炎Bウイルスに由来する好ましいB細胞エピトープの例は、表面抗原Pre-S2配列130−144である。
慢性肝炎を治療する本発明の方法は、肝炎Bウイルスに慢性感染した患者に、医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子を含むワクチンの抗HBc T細胞刺激量を投与する工程を含む。前記免疫原性粒子は、好ましくはアジュバントと一緒に投与される。
本明細書で用いられる好ましいアジュバントは、トール様レセプターと相互作用する分子である。もっとも好ましいアジュバントは脂質A類似体、例えばモノホスホリル脂質A及びアミノアルキルグルコサミドホスフェートである。他の好ましいアジュバントにはサポニン及び化学的に改変されたアルキル化サポニンが含まれる。アジュバントはさらにミクロ粒子状担体、例えば水中油乳濁液又は鉱物塩を含むことができる。
【００２８】
本免疫原性粒子は組換え肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質分子を含み、前記キメラタンパク質分子は長さが約550までのアミノ酸残基である。このようなキメラタンパク質分子は、（a）HBc分子のN-末端165アミノ酸残基の約125から全部のHBc配列を含み、残基4位から約75位及び約85位から約140位のHBc配列を含む。
HBcキメラ分子の配列は、場合によって（a'）前記キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内（すなわち残基76位と85位の間）及びC-末端の1つ又は2つ以上でペプチド結合した、免疫原性エピトープを含むアミノ酸配列、又は（b'）長さが1から約40アミノ酸残基で化学的に非反応性の残基又は共役ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する、HBc免疫優勢ループ内の挿入、又は（c'）76位から85位の配列の0から全ての残基を含む。
本キメラタンパク質分子はまた、
（a'） HBcプレコア配列の配列以外の配列中の配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位置の0から3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、及び、
（b'） HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端方向にあって、キメラ分子のC-末端から約30残基内にある1つから約3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、の一方又は両方を含む。
キメラタンパク質分子は、HBc配列中に約20％を超えない保存的置換されたアミノ酸残基を含み、宿主細胞内での発現に際して自己会合して粒子を形成する。本発明のある特徴では、前記粒子は実質的に核酸と結合せず、約1.2から約1.7の280nm対260nmでの吸収比を示し、一方他の特徴では、最小限を超える核酸結合が存在し、粒子は約0.9から約1.15の280nm対260nmでの吸収比を示す。したがって、大雑把には、本発明の粒子の280nm対260nmの吸収比は約0.9から約1.7であろう。核酸結合は下記で考察される。本粒子は、上記のC-末端システイン残基若しくはN-末端システイン残基のいずれも含まないか、又は目的のキメラ分子に存在するC-末端若しくはN-末端システイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である
【００２９】
ワクチンが投与される患者は、HBcに対して活性化されたT細胞を誘導させるために十分な時間維持される。他の実施態様では、本方法はHBsAgが患者の血流を循環している患者で実施され、前記患者は循環HBsAgの量を低下させるために十分な時間維持される。本発明のさらに別の特徴では、患者の血清はHBeAgを含み、本治療は患者の血清中のHBeAg抗原の量の低下をもたらす。当業者は、HBc/HBeAg及びHBsAgに対するそれぞれのT細胞活性化についてアッセイする既知の方法を熟知していよう。
本キメラタンパク質は、N-末端、HBc免疫原性（イムノドミナント）ループ内、又はC-末端に1つ又は2つ以上の免疫原性エピトープを提示することができ、又は非反応性（異種残基）又は免疫原性ループ内にB細胞若しくはT細胞エピトープのためのリンカー残基を提示することができ、又は76位から85位の残基の0から全部を有し得る。ある特徴では、前記キメラタンパク質は、自己会合粒子への形成に際して安定性の強化を付与する1つ又は2つ以上のN-末端システイン残基を含む。
別の実施態様では、本キメラタンパク質は、自己会合粒子への形成に際して安定性の強化を付与する1つ又は2つ以上のC-末端システイン残基を含む。本発明のキメラタンパク質分子はまた、N-末端及びC-末端の両方に、又はN-末端及びC-末端の両方の近くにシステイン残基を含むことができる。すなわち、キメラタンパク質分子はN-末端システイン残基及びC-末端システイン残基を上記で定義したように含むことができる。
【００３０】
いくつかの好ましい実施態様では、目的のキメラタンパク質は、自己会合粒子が実質的に核酸と結合しないようにHBc残基149位の（カルボキシ末端に向かって）下流にアルギニン及び／又はリジンが十分に排除されている。他の実施態様では、アルギニン富裕リピート配列の2つを含む149位から約163位のHBc配列が存在する（図1参照）。他の実施態様では、1つのアルギニン富裕配列を含む約156位までのHBc配列が存在する。さらに他の実施態様では、C-末端HBc配列はHBc140位と149位の間で終わり、キメラ分子は、図1の天然のHBc配列に存在する150位からC-末端までのアルギニンリピート、又はアルギニンの1つ又は2つ以上の代わりにリジン残基を含む同様な配列を含まない。核酸結合の実質的な欠如は下記で考察され、容易に決定される。
考察を容易にするために、本明細書で引用される本発明のキメラ配列及び配列の位置番号は、配列番号:1に示されているサブタイプaywのヒト肝炎Bコアタンパク質の配列及び位置番号付与を基準にしている（Gailbert et al., （1979） Nature， 281：646-650）。しかしながら、哺乳類のヘパドナウイルスキャプシドタンパク質配列の高い類似性及び前記タンパク質によって示される同様な粒子形成（当業者には周知である）を考えれば、ヒトHBcサブタイプaywに関する考察はまたサブタイプadwとともにウッドチャック及び地上性リスのタンパク質にも応用可能である。このような高い類似性の結果として、これらのHBc配列は本明細書では特段の記載がなければ“HBc”配列として一般的に記載される。
【００３１】
ある実施態様では、目的のHBcキメラは長さが約550残基までであり、さらに、
（a）残基5位から約75位まで及び約85位から約140位までのHBc配列を含む、HBc分子のN-末端165アミノ酸残基の約125から全部の配列、及び、
（a'）キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、又はC-末端の1つ又は2つ以上でペプチド結合した免疫原性エピトープ、又は、
（b'）長さが約1から40のアミノ酸残基であって、化学的に非反応性の残基若しくは共役ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成するHBc免疫優勢ループ内の挿入、又は、
（c'）76位から85位までの配列の0から全部の残基、
を含む。
本キメラタンパク質分子はまた、
（a'）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に存在する1つから3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、及び、
（b'）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端方向にあって、キメラ分子のC-末端から約30残基内にある1つから約3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、
の一方又は両方を含む。
前記キメラ分子は、HBc配列内に20％を超える保存的置換アミノ酸残基を含まず、宿主細胞内での発現に際して自己会合して粒子を形成する。前記粒子は、（i）上記に記載したN-末端システイン残基、又はC-末端システイン残基のいずれも含まないか、又は（ii）目的のキメラ分子に存在するN-末端又はC-末端システイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも生成に際して安定である。既に記載したように、前記粒子はいくつかの実施態様では実質的に核酸との結合を含まず、他の実施態様では非最少量の核酸と結合する。
【００３２】
患者はHBcに対して活性化されたT細胞を誘導させるために十分な時間維持される。他の実施態様では、患者は先ず初めにウイルス負荷を減少させるために十分な時間抗ウイルス薬（例えばラムブジン）で処置され、続いて患者は、場合によってアジュバントを含む医薬的に許容できる賦形剤中の1つ又は2つ以上の目的のキメラ分子を投与される。さらに別の実施態様では、本発明の方法は、その血流中をHBsAgが循環している患者で実施され、前記患者は循環HBsAg の量を減少させるために十分な時間維持される。本発明の更に別の特徴では、患者の血清はHBeAgを含み、この処置は患者血清中のHBeAg抗原量の減少をもたらす。
目的のキメラ分子は、（i）図１及び配列番号:1に示したようにHBcのN-末端に対して約-20位から約+１位の位置、又は（ii）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端方向にあって、キメラ分子のC-末端から約30残基内の位置の一方又は両方に存在する少なくとも1つのシステイン残基を含む。負のアミノ酸位置の考え方はリーダー配列（例えばHBcのプレコア配列）と通常密接に関係する。与えられたキメラ分子配列を配列番号:1の配列と単純にアラインメントを実施して、HBcの+1位の開始メチオニン残基の位置に対応するキメラの位置を決定することができるという点で、本明細書ではこの考え方が同様に用いられている。
アミノ酸残基配列が通常左から右へ、さらにN-末端からC-末端の方向で示されるかぎり、HBcの開始メチオニンが占める位置の左に存在する、アラインメントを実施された全てのキメラ分子残基は、負の位置を有する。目的のシステイン残基は、キメラの開始メチオニンに対応する位置に対してアラインメントされたHBcの開始メチオニンの左へ約20残基の位置に存在する。
【００３３】
ある特徴では、好ましいHBcキメラは約135から約525のL-α-アミノ酸残基配列を有し、さらに連続的にペプチド結合した4つのドメイン、すなわちドメインI、II、III及びIVを含む。これら4つのドメインは天然のタンパク質の場合と同じ態様で一緒に結合されている。すなわち、α-アミノ酸以外の残基を含む、したがってペプチド結合を形成できないポリペプチド、D-アミノ酸残基を含むポリペプチド、又は2つ又は3つ以上のポリペプチドがアミノ酸残基の側鎖を解して機能的に結合しているオリゴペプチド共役物と比べれば、それらは互いにペプチド結合している。目的のキメラHBcタンパク質はしたがって通常の組換え技術の方法を用いた発現によって製造することができる。
前記キメラ分子のドメインIは約71から約110アミノ酸残基を含み、その配列は、（i）少なくともHBcの5位から約75位までの残基の配列、（ii）HBcプレコア配列の配列以外の配列において配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から約+1位、好ましくはアミノ酸-14位から約+1位に対応するキメラ分子のアミノ酸位置の0から3つのシステイン残基（N-末端システイン残基）、及び（iii）場合により、HBc残基2‐4の1つにペプチド結合した、免疫原性エピトープ（免疫原）を含む約30アミノ酸残基までを含む配列、を含む。前記免疫原性エピトープは、それが存在する場合は、典型的には抗肝炎B免疫反応を誘導するために用いられるエピトープである。
【００３４】
前記キメラ分子のドメインIIは、ドメインIのHBc残基75とペプチド結合した約255までのアミノ酸残基を含み、ドメインIIでは、（i）HBcの76位から85位の配列中の0から全部の残基が存在し、それらの残基は、（ii）場合によって存在する、免疫原性エピトープを含む1つから約245のアミノ酸残基、又は（iii）化学的に非反応性の残基若しくは共役ハプテンのための化学的に反応性のリンカー残基を構成する、1から約40アミノ酸残基の長さを有するHBc免疫優勢ループ内の挿入にペプチド結合している。76位から85位の10残基の配列（76−85位配列）が存在し、かつ、エピトープ含有又はリンカー含有配列の1つから約245残基によって中断されていることが特に好ましい。
ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列である。
キメラ分子のドメインIVは以下を含む：（i）ドメインIIIの135位の残基とペプチド結合した、136位から約149位のHBcアミノ酸残基配列の5から約14残基、（ii）キメラ分子のC-末端から約30残基内の0から3つのシステイン残基（C-末端システイン残基）、及び（iii）約150位からC-末端までのHBcには存在しない免疫原性配列中の0から約100アミノ酸残基。好ましくは、ドメインIVは、HBcの前記位置には存在しない配列中に0から約50アミノ酸残基の配列を含み、より好ましくは、前記配列は0から約25残基である。ドメインIVはまた、好ましくは1つのC-末端システイン残基を含む。
【００３５】
キメラ分子は、（i）キメラのHBc配列において約10％を超えないアミノ酸残基が置換されたアミノ酸残基配列を有し、さらに（ii）宿主細胞で発現すると自己会合して粒子を形成する。前記粒子は実質的に核酸と結合せず、上記のC-末端システイン残基のいずれも含まず、さらに（i）N-末端システイン残基を欠くか、又は（ii）目的のキメラ分子に存在するN-末端システイン残基が別の残基で置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である
ある特徴では、目的のキメラ分子は、HBc残基番号2‐5の1つとペプチド結合したN-末端にエピトープを含む配列を含んでいる。別の特徴では、目的のキメラ分子は、免疫優勢ループ内のHBc残基番号76と85の間に位置する、分子の中央近くでペプチド結合した、エピトープ含有又はリンカー残基含有配列を含む。さらに別の特徴では、エピトープ含有配列は、HBc残基番号136‐149の1つとペプチド結合したキメラ分子のC-末端部分に位置する。さらに別の特徴では、2つ又は3つのエピトープ含有配列が上記の場所に存在するか、又は1つ又は2つのエピトープ含有配列が、エピトープのためのリンカー残基と一緒に存在する。前記のキメラ分子の各々はまた、上記で考察したようにN-末端又はC-末端システイン残基の一方又は両方を含んでいる。これらのキメラ分子及びそれらの自己会合粒子のいくつかの例は以下で考察される。
【００３６】
既に記載したように、前記の特徴をもつ目的のHBcキメラ分子は約135から約525アミノ酸残基を含む。いくつかの好ましい実施態様では、HBc残基4番が存在し、一方残基2‐5番が他の好ましい実施態様で存在し、したがってドメインIはHBc残基4または2番で開始し、残基番号75（すなわちHBc75位のHBc残基）まで続くことができる。残基番号1はメチオニン（DNA開始コドンのアミノ酸）である。ただ1つの開始シグナルがコードDNA又はRNAに存在することができるように、通常はHBcの1位に存在する天然のメチオニンは存在しないであろう。
ドメインI又はドメインIIの免疫優勢ループに存在することができる異種免疫原性エピトープは、好ましくは約15から約50残基を含む。ただし約6アミノ酸残基の短い挿入が抗体を誘導することができ、さらに抗体及びT細胞レセプターによって認識され、したがって有用である。
本発明の別の実施態様では、1つ又は2つ以上の化学的に非反応性の（異種の）アミノ酸残基が、B-エピトープとして機能しないが、肝炎Bウイルス感染患者の血流を循環している抗体によるキメラ粒子の認識を低下させるようにドメインIIに挿入される。本発明の好ましい特徴では、キメラ分子は、残基75、76、77、78、79、80、81又は82位に、もっとも好ましくは残基77位にただ1つのアミノ酸挿入を含む。前記化学的に非反応性の挿入残基はアラニン、ロイシン又はイソロイシンであり、もっとも好ましくはアラニン残基である。粒子の抗原性を天然のHBc粒子よりも低下させること（すなわちHBV感染によって生じる抗HBc抗体に認識されにくくする）が好ましい。当業者は、ドメインIIに挿入される任意の数のアミノ酸残基及び配列を用いて抗原性を減少させることができる。
76位から85位までのドメインIIの残基の全てが存在するのが好ましい（1つ又は2つ以上の他の残基によって中断されていたとしても）。ドメインIIは好ましくは少なくとも4つの残基を含む（これは発現又は使用に干渉しない任意の配列であろう）が、これら残基は、好ましくは75位と85位の残基の間の配列の一部分である。
【００３７】
ドメインIIIは残基85にペプチド結合したHBc残基86から135を含む。
ドメインIVは少なくとも5残基の配列を含み、前記配列は、（i）残基135にペプチド結合した、HBc136位から140位、好ましくは149位までの残基の配列；（ii）0から3つのシステイン残基を含み；さらに（iii）場合によって、特にHBc配列が残基140で終わるとき、約100残基までの免疫原性エピトープの配列を含むことができるが、ただし約25残基までの短い配列がより好ましい。前記ドメインIVの免疫原性配列は好ましくはHBc配列にとって異種であり、約165位からHBcC-末端のHBcの配列以外の配列である。前記免疫原性配列は、ドメインIVに存在するときは好ましくはT細胞エピトープであるが、ドメインIおよびIIの一方または他方に通常存在するB細胞エピトープでもよい。HBc配列由来の、及び肝炎B表面タンパク質（HBs又はHBsAg）のpreS1およびpreS2由来のT細胞エピトープ例は、以下の表AおよびBで提供される。
ドメインIVはまた0から3つのシステイン残基を含むことができ、これらのシステイン残基はキメラ分子のカルボキシ末端（C-末端）の約30残基内に存在する。好ましくは1つのシステイン（Cys）残基が存在し、好ましくは前記Cysは、T細胞エピトープがドメインIVの部分として存在しない場合はカルボキシ末端（C-末端）残基として存在する。そのようなT細胞エピトープが存在するときは、好ましいCysはHBcキメラのC-末端の最後の5残基内に好ましくは存在する。
【００３８】
ある実施態様では、特に好ましいキメラは2つの免疫原性エピトープ配列を含む。これら2つの免疫原性エピトープ配列は、ドメインIおよびII、又はIIおよびIV、またはIおよびIVに存在する。前記2つの免疫原性エピトープ配列の1つはいくつかの実施態様では好ましくはB細胞エピトープである。他の実施態様では、前記2つの免疫原性エピトープ配列の1つはT細胞エピトープである。より好ましくは、前記2つの免疫原性エピトープの両方が同じ又は異なるT細胞エピトープである。さらにまた、T細胞エピトープの配置場所に複数のT細胞エピトープが存在することができるように、複数のB細胞エピトープがB細胞エピトープの配置場所に存在することができる。
キメラ分子が免疫原性エピトープ配列をドメインIIに含む実施態様では、前記配列は1つ又は2つ以上のB細胞エピトープを含むことが好ましく、アミノ酸残基76と85の間のHBc配列が存在するが、前記免疫原性エピトープによって中断されていることが好ましく、キメラはさらにHBc残基140‐156の1つとペプチド結合した1つ又は2つ以上のT細胞エピトープをドメインIV内に含むのが好ましい。
この同じ好ましい形態は、共役エピトープのための異種リンカー残基がドメインIIに存在するキメラ分子についても同様で、それによってドメインIIで1つ又は2つ以上の免疫原性エピトープが提供され、残基76と85は存在するが異種リンカー残基によって中断され、T細胞エピトープはHBc残基140‐156の１つとペプチド結合して存在する。そのようなキメラ分子から形成される粒子は、典型的には約1:4から1:1の共役エピトープ対C-末端ペプチド結合T細胞エピトープの比を含み、約1:2の比が一般的である。
【００３９】
上記のキメラ分子の例示構造では、共役エピトープのための異種リンカー残基はドメインIIに存在し、T細胞エピトープはドメインIVに存在し、追加B細胞エピトープはドメインIIには存在しない。下記で考察するように抗ループモノクローナル抗体の結合によりELISAアッセイで測定したとき、そのようなキメラはT細胞エピトープの免疫原性を示すが、HBc抗原性は最低限示されるだけである。
目的の好ましいHBcキメラ分子は、約135から約525残基の配列を含む。各々が約15から約50残基の好ましい長さを有する1つ又は2つの免疫原性エピトープ及び約140から約165残基の好ましいHBc部分の長さを含む好ましいHBcキメラ分子は、約170から約250アミノ酸残基の配列の長を有する。1つ又は2つの免疫原性エピトープを含む特に好ましいキメラ分子は、約190から約210残基の長さを有する。追加の免疫原性エピトープを含まない特に好ましいキメラ分子は、約140から約165残基の長さを有し得る。N-末端およびC-末端HBc部分の長さの多様性並びに免疫原性ループに挿入できるいくつかの意図されるエピトープの種々の長さを考慮して、広範囲のキメラ分子の長さが意図されることは理解されよう。
【００４０】
宿主細胞中で発現すると、目的の組換えタンパク質は自己会合して、実質的に核酸との結合を含まない粒子を形成する。目的のHBcキメラ粒子は一般的に球状の形態であって、目的の調製物について通常サイズが均質である。したがって、これらのキメラ粒子は、類似の形状およびサイズを有する天然のHBc粒子に類似し、感染者から回収することができる。
目的のキメラ粒子は上記で考察したキメラ分子を含む。より一般的に言えば、そのようなキメラ粒子は、C-末端短縮HBcキメラタンパク質を含み、前記キメラタンパク質は、N-末端165残基の少なくとも約125の配列を有し、さらに（i）N-末端、C-末端又は免疫優勢ループの1つ若しくは2つ以上とペプチド結合した免疫原性エピトープ、又は免疫優勢ループ内に異種の非反応性残基もしくはエピトープのための異種リンカー残基、及び（ii）上記で述べたようにN-末端の1つから3つのシステイン残基及びC-末端の１つから3つのシステイン残基の一方又は両方、並びに135位から少なくとも1つの5 HBc残基配列を含む。
目的の粒子では、ドメインIVのアルギニン及び／又はリジン残基は十分に排除されてあり、したがって自己会合粒子は実質的に核酸結合を含まず、以下で考察するように約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す。したがって、目的のキメラタンパク質は155位から183位の間でHBc配列を含まず、より好ましくは155位から183位の間でHBc配列を含まない。
上記のN-末端システイン残基の存在によって、安定な免疫原性粒子を形成するキメラ分子の能力の予期せぬ強化が提供される。したがって、目的のHBcキメラ粒子免疫原は、サイズ排除分析クロマトグラフィーによって測定されるように、採集及び初回精製に際して結合を維持する粒子を形成する傾向がある。
【００４１】
目的の粒子は、（i）キメラ分子がN-末端システイン残基を欠くか、又は（ii）目的のキメラ分子に存在するN-末端システイン残基が別の残基に置換され、さらに上記に記載したC-末端システイン残基のいずれも含まないが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である。いくつかの事例では、N-末端システイン残基が存在しないかぎり粒子は形成されない。両タイプの配列についての安定性強化の例は下記の実施例で例示される。
N-末端システイン残基を含む本発明の粒子はまた、N-末端システイン残基を欠くキメラ分子から生成された粒子よりも、典型的にははるかに高い収量で調製される。前記収量の増加は、採集された粒子集団でも、又は以下で考察するようにスーパーロース（Superose(登録商標)）を用いた分析用ゲルろ過でも観察することができる。
目的の粒子によって示される核酸結合の実質的欠如は、水溶液中での粒子の280および260nmの両方で測定される吸収を比較することによって（すなわち280/260吸収比）容易に決定できる。目的の粒子は、タンパク質の発現に用いられた生物細胞に本来存在するオリゴマー及び／又はポリマーDNA並びにRNA種である核酸と実質的に結合しない。そのような核酸は260nmで吸収を、さらに280nmで比較的低い吸収を示し、一方、タンパク質（例えば意図されるキメラ）は260nmで比較的低い吸収を示し、280nmでより強い吸収を示す。
したがって、残基150‐183（または150‐185）位（当業者には時にプロタミン領域と称される）にアルギニン富裕およびリジン富裕配列を含む、組換えにより発現させたHBc粒子又はキメラHBc粒子は、約0.8の280nm吸収対260nm吸収比（280:260吸収比）を示す。他方、ドメインIVにアルギニンおよびリジンをほとんど含まず、その結果自己会合した粒子が核酸結合を実質的に含まない粒子、例えば天然に存在するHBcのアルギニン富裕核酸結合領域を含まない粒子（約10未満、好ましくは約6未満、より好ましくは3つ未満のアルギニン若しくはリジン残基又はそれらの混合物を互いに隣接して含む粒子）は、約1.2から約1.7の280/260吸収比を示す。例示タンパク質は、HBc残基約165位、好ましくは約155位、より好ましくは約140位から149位で終わる天然の配列又はキメラ配列を有し、約0.9から約1.7の280/260吸収比を示す。より例示的な280/260吸収比は、約165位で終わる配列については約0.9から約1.0であり、約155位で終わる配列については約1.1から約1.2であり、約140位から約149位で終わる配列については約1.4から約1.7である。前記の範囲は、大半が、与えられたキメラHBc粒子のドメインIIおよびIVに存在する芳香族アミノ酸残基の数に依るものである。
【００４２】
目的のキメラHBcタンパク質のドメインIは、少なくともアミノ酸残基5位で始まり75位までのHBcのアミノ酸残基配列を構成し、ドメインIIIは86位から137位のHBc配列を構成する。哺乳類のヘパドナウイルスのいずれの配列もドメインIおよびIIIのどちらかのために用いることができ、2つ又は3つ以上のウイルスに由来する配列を1つのキメラで用いることができる。好ましくは、さらに構築の容易さのために、ヒトのayw配列がキメラの全体を通して用いられる。
最初の3つのアミノ末端（N-末端）残基の欠失よりも多くの欠失を含むドメインIを有するHBcキメラは、大腸菌細胞でのHBcキメラタンパク質の完全な消失をもたらすことが報告された（Pumpens et al. (1995) Intervirology 38:63-74）。他方、インフルエンザM2タンパク質由来の免疫原性23残基ポリペプチドをHBcのN-末端配列に融合させた最近の研究で、天然のHBc配列の残基1‐4を置換したとき生成された融合タンパク質は粒子を形成することが報告された（Neirynck et al. (October, 1999) Nature Med. 5（10）:1157-1163）。したがって、従来技術は、HBcの残基2‐4の1つに付加アミノ酸配列がペプチド結合して存在するときは粒子を形成することができるが、追加される配列が存在せず、さらに残基1‐3より多い残基がHBcのN-末端から欠失する場合、粒子は形成されないことを教示している。
HBcの最初の5つのN-末端残基の1つとペプチド結合したN-末端エピトープ配列は、ただ1つのシステイン残基、又は免疫原性配列を含む約30残基までの配列を含むことができる。1つから3つのシステイン残基は前記配列内の都合のよい位置に存在することができるが、典型的には、付加されるN-末端のシステイン残基は、配列番号:1に示されるHBcのN-末端に対して約-20から約+1位に存在するように、より好ましくは約-14から約+1位に存在するように、付加される配列のC-末端近くに存在する。例示的な配列は、B細胞又はT細胞エピトープ、例えば以下で考察および例示されるようなもの（それぞれ表Aおよび表B）、2つのシステイン残基を含む上記のNeirynckらのインフルエンザM2タンパク質由来の23残基ポリペプチド、及び少なくとも約6残基を含む前記配列の変種、使用発現系の結果として融合タンパク質として生じるまた別の（異種）タンパク質の配列（例えばβ-ガラクトシダーゼ）、又は別の肝炎B関連配列、例えばPreS1若しくはPreS2領域に由来するもの又は主要HBsAg免疫原性配列である。
【００４３】
ドメインIIは5から約250アミノ酸残基の配列である。これらの残基のうちで、0（存在しない）、及び好ましくは少なくとも4残基、より好ましくは少なくとも8残基が約76位から約85位のHBc配列の部分を構成し、さらに1つから約245残基、好ましくは1つから約50残基がHBcにとって異種（外来）であるか、又は免疫原性HBc配列（例えばBまたはT細胞エピトープ）に対応する。
したがって、少なくともHBc残基75及び85はそれぞれドメインI及びIIに存在する。これらの残基は、（i）エピトープ、例えばB細胞又はT細胞エピトープのための異種リンカー残基、又は（ii）好ましくは6から50、より好ましくは約15から約50、もっとも好ましくは約20から約30アミノ酸残基を含む免疫原性B又はT細胞エピトープを構成し、さらに、それらが、HBc配列の76位から85位の残基の0残基、又は好ましくは少なくとも4、より好ましくは少なくとも8残基、又は全ての残基との間でペプチド結合できるように配置される。免疫原性B細胞エピトープ配列は、好ましくはリンカー残基によってこの位置に結合されるか、又はHBc配列にペプチド結合される。B細胞エピトープの使用は以下で例証しながら考察する。
【００４４】
前記好ましい少なくとも4つのHBc残基は、１つの配列内に全部があってもよく、例えば残基82‐85であってもよく、又は、残基76‐77と84‐85が存在する場合若しくは残基76と83‐85が存在する場合のように異種リンカー残基のいずれかの側に分割されてあっても（フランキングしていても）よい。より好ましくは、ドメインIIは、残基76から85までのHBc配列の少なくとも8残基を含む。もっとも好ましくは、76位から85位までの10残基の全ての配列がキメラに存在する。
HBcループ配列に付加される1つから約245残基はHBc配列にとって異種であっても、又はHBc配列の1つ又は2つ以上の免疫原性部分に一致していてもよい。付加される単一の異種残基は、上記で考察したように、B細胞エピトープのための異種リンカー残基である。より長い配列、上記で述べたように、典型的には少なくとも6残基の長さから50アミノ酸残基の長さまで、より好ましくは約15から約50残基の長さの配列が（ただし制限部位によってコードされる異種残基を除く）、免疫原（例えばB細胞又はT細胞エピトープ）を含む１つの配列内に存在する。
目的のキメラの発現後のリンカー残基への結合のため、およびキメラのN-末端、免疫原性ループ内またはC-末端の1つ若しくは2つ以上でのHBcキメラ内での発現のために有用な例示的ペプチドB細胞エピトープは下記の表Aに、前記配列が得られた遺伝子に与えられた一般名称、発表されたエピトープの引用文献若しくは特許、および配列番号とともに例示される。
【００４５】
表A：B細胞エピトープ
生物 遺伝子 配列  参考文献*  配列番号
肺炎連鎖球菌
（Streptococcus
pneumoniae)
PspA1       KLEELSDKIDELDAE      1                       9
PsP2        QKKYDEDQKKTEE-
KAALEKAASEEM-
DKAVAAVQQA           1                       10
クリプトスポリジウム・パルブム
（Cryptosporidium parvum）
P23        QDKPADAPAAEAPA-
AEPAAQQDKPADA         2                       11
HIV             GP120       RKRIHIGPGR-  
AFYITKN               3                       12
口蹄疫ウイルス  VP1         YNGECRYNRNA-
VPNLRGDLQVL-
AQKVARTLP             4                       13
インフルエンザウイルス
A8/PR8            HA        YRNLLWLTEK            8                       14
A型               M2
(A8/PR8/34)                 SLLTEVETPIR- 
NEWGCRCNGSSD        29                      15
SLLTEVETPIR- 
NEWGCRCNDSSD        29                      16
SLLTEVETPIR-
NEWGARANDSSD                                17
EQQSAVDADDS-
HFVSIELE            35                      18
SLLTEVETPIR-
NEWGSRSNDSSD                                19
SLLTEVETPIR-
NEWGSRCNDSSD                                20
SLLTEVETPIR-
NEWGCRSNDSSD                                21
SLLTEVETPIR-
NEWGCRANDSSD                                22
SLLTEVETPIR-
NEWGARCNDSSD                                23
MSLLTEVETPIR-
NEWGCRCNDSSD                                24
MSLLTEVETPIR-
NEWGSRSNDSSD                                25
MGISLLTEVETPIR-
NEWGCRCNDSSD-
ELLGWLWGI                                   26
MSLLTEVETPIR-
NEWGARANDSSD                                27
MSLLTEVETPIR-
NEWGCRANDSSD                                28
MSLLTEVETPIR-
NEWGARCNDSSD                                29
MSLLTEVETPIR-
NEWGCRSNDSSD                                30
MSLLTEVETPIR-
NEWGSRCNDSSD                                31
X1X2X3X4X5X6X7X8T-
X10X11X13X14X15X16 X17X18-
X19X20X21X22X23X24                          32
B型        NB               NNATFNYTNVNPISHIR                             33
ペスト菌（Yersinia pestis）
V Ag
DILKVIVDSMNHH-
GDARSKLREELAE-
LTAELKIYSVIQA-
EINKHLSSSGTIN-
IHDKSINLMDKNL-
YGYTDEEIFKASA-
EYKILEKMPQTTI-
QVDGSEKKIVSIK-
DFLGSENKRTGAL-
GNLKNSYSYNKDN-
NELSHFATTCSD                  9               34
インフルエンザ菌（Haemophilus infuenza）
pBOMP
CSSSNNDAA-
GNGAAQFGGY                    10              35
NKLGTVSYGEE                                   36
NDEAAYSKN-
RRAVLAY                                       37
モラキセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis） 
copB
LDIEKDKKK-
RTDEQLQAE-
LDDKYAGKGY                    11              38
LDIEKNKKK-
RTEAELQAE-
LDDKYAGKGY                                    39
IDIEKKGKI-
RTEAELLAE-
LNKDYPGQGY                                    40
ポルフィロモナス・ギンギバリス（Porphyromonas gingivalis）  
HA
GVSPKVCKDVTV-
EGSNEFAPVQNLT                12               41
RIQSTWRQKTV-
DLPAGTKYV                                     42
トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）
KAAIAPAKAAA-
APAKAATAPA                    14              43
プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）
CS
(NANP)4                       24              44
NANPNVDP-
(NANP)3NVDP                                   45
NANPNVDP-  
(NANP)3                                       46
(NANP)3 NVDPNANP                              47
NANPNVDP-
(NANP)3NVDPNANP                               48
NPNVDP(NANP)3NV                               49
NPNVDP-
(NANP)3NVDP                                   50
NPNVDP(NANP)3-
NVDPNA                                        51
NVDP(NANP)3NV                                 52
NVDP(NANP)3NVDP                               53
NVDP(NANP)3-  
NVDPNA                                        54
DP(NANP)3NV                                   55
DP(NANP)3NVDP                                 56
DP(NANP)3-
NVDPNA                                        57
ビバックス（vivax）  CS 
GDRADGQPAG-
DRADGQPAG                     20              58
RADDRAAGQP-
AGDGQPAG                                      59
ANGAGNQPG-
ANGAGDQPG                                     60
ANGADNQPG-
ANGADDQPG                     27              61
ANGAGNQPG-
ANGADNQPG                                     62
ANGAGNQPG-
ANGADDQPG                                     63
APGANQEGGAA-
APGANQEGGAA                   28              64
ANGAGNQPGAN-
GAGDQPGANGA-
DNQPGANGADD-
QPG                                           65
ベルギー（berghi）  CS
DPPPPNPN-
DPPPPNPN                      2               66
イエーリー（yoelli）ＣＳ
(QGPGAP)4                                     67
ストレプトコッカス・ソブリヌス（Streptococcus sobrinus）
AgI/II
KPRPIYEA-
KLAQNQK                       16              68
AKADYEAK-
LAQYEKDL                                      69
シゲラ・フレキシネリ（Shigella flexneri）
Invasin
KDRTLIEQK                     18              70
呼吸器系多核体形成ウイルス（RSV）
G 
CSICSNNPT-
CWAICK                        19              71
エントアメーバ・ヒストリチカ（Entamoeba histolytica）
lectin 
VECASTVCQNDN-
SCPIIADVEKCNQ                 21              72
シストソーマ・ジャポニクム（Schistosoma japonicum）
para 
DLQSEISLSLE-
NGELIRRAKSA-
ESLASELQRRVD                  22              73
シストソーマ・マンソニ（Schistosoma mansoni）
para 
DLQSEISLSLE-
NSELIRRAKAA-
ESLASDLQRRVD                  22              74
ウシインヒビン
αC サブユニット
STPPLPWPW-
SPAALRLLQ-
RPPEEPAA                      30              75
エボラウイルス    
膜固着糖タンパク質
ATQVEQHHRR-
TDNDSTA                       31              76
HNTPVYKLD-
ISEATQVE                      31              77
GKLGLITNTI-
AGVAVLI                       31              78
大腸菌
ST
CCELCCYPACAGCN                33              79
NTFYCCELCC-
YPACAGCN                      33              80
SSNYCCELCC-  
YPACAGCN                      33              81
アルツハイマー病
β-アミロイド
DAEFRHDSGYE-                  34              82
VHHQKLVFFAE-
DVGSNKGAIIG-
LMVGGVVIA
DAEFRHDSGYE-                                  83
VHHQKL
EDVGSNKGAII                                   84
DAEFRHDSGYE-                                  85
VHHQKLVFFAE-
DVGSNKGAIIG
髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）
PorA 
YVAVENGVAKKVA                                 86
HFVQQTPKSQPTLVP                               87
HVVVNNKVATHVP                                 88
PLQNIQPQVTKR                                  89
AQAANGGAASGQVKVTKVTKA                         90
YVDEQSKYHA                                    91
HFVQNKQNQPPTLVP                               92
KPSSTNAKTGNKVEVTKA                            93
YWTTVNTGSATTTTFVP                             94
YVDEKKKMVHA                                   95
HYTRQNNADVFVP                                 96
YYTKDTNNNLTLVP                                97
PPQKNQSQPVVTKA                                98
PPSKGQTGNKVTKG                                99
PPSKSQPQVKVTKA                                100
QPQTANTQQGGKVKVTKA                            101
QPQVTNGVQGNQVKVTKA                            102
QPSKAQGQTNNQVKVTKA                            103
PPSSNQGKNQAQTGNTVTKA                          104
PPSKSQGKTGNQVKVTKA                            105
PPSKSQGTNNNQVKVTKA                            106
PPSKSQPGQVKVTKVTKA                            107
QLQLTEQPSSTNGQTGNQVKVTKA                      108
QLQLTEAPSKSQGAASNQVKVTKA                      109
SAYTPAHVYVDNKVAKHVA                           110
SAYTPAHFVQNKQNNNPTLVP                         111
VEGRNYQLQLTE                                  112
PAQNSKSAYTPA                                  113
QLQLTEPPSKNQAQTQNKVTKA                        114
GRDAFELFLLGSGSDE                              115
RHANVGRDAFELFLLGSGSDEA-
KGTDPLKNH                                     116
GRDAFNLFLLGRIGDDDE                            117
GRNAFELFLIGSATSDQ                             118
QVKVTKAKSRIRTKI                               119
TLVPAVVGKPGSD                                 120
NspA
HAKASSSLGSAKGFSPR                             121
TRYKNYKAPSTDFKL                               122
SLNRASVDLGGSDSFSQT                            123
GKVNTVKNVRSGELSAGVRVK                         124
GKVNTVKNVRSGELSVGVRVK                         125
免疫グロブリンＥ
APEWPGSRDKRTL                                 126
EDGQVMDVD                                     127
STTQEGEL                                      128
GHTFEDSTKK                                    129
GGGHFPPT                                      130
PGTINI                                        131
FTPPT                                         132
INHRGYWV                                      133
GEFCINHRGYWVCGDPA                             134
MAPEWPGSRDKRTL                                135
MEDGQVMDVD                                    136
MSTTQEGEL                                     137
MGHTFEDSTKK                                   138
MGGGHFPPT                                     139
MPGTINI                                       140
MFTPPT                                        141
MINHRGYWV                                     142
MGEFCINHRGYWVCGDPA                            143
Ｂ型肝炎 
表面
PreS1
MGTNLSVPN-
PLGFFPDHQLDP                    36            144
PLGFFPDH                                      145
PLGFFPDHQL                                    146
PreS2
MQWNSTAFHQ-                     36            147
TLQDPRVRG-
LYLPAGG
MQWSTAFHQ-                                    148
TLQDP
MQWNSTALHQ-                                   149
ALQDP
QDPRVR                          37            150
QDGRVR                          37            151
DPRVRG-                         38            152
LYLPAGG
DPRVRG-                         39            153
LYFPAGG
*公開されたエピトープの引用は以下の表Bで提供される。
【００４６】
配列番号:32の上記インフルエンザA M2配列において残基X1からX8は存在又は存在せず、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基で、それぞれメチオニン、セリン、ロイシン、ロイシン、スレオニン、グルタミン酸、バリンおよびグルタミン酸であるが、ただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より大きな8までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とし、
残基X15およびX16は存在又は存在せず、存在する場合はそれぞれトリプトファン及びグリシンであり、
残基X17およびX19は存在又は存在せず、存在する場合はそれぞれ別個にシステイン、セリン、又はアラニンであり、
残基X18は存在又は存在せず、存在する場合はアルギニンであり、さらに
残基X20からX24までは存在又は存在せず、存在する場合は、M2タンパク質配列に天然に存在する残基であって、それぞれアスパラギン、アスパラギン酸、セリン、セリン及びアスパラギン酸であり、ただし下付文字を有する1つのX残基が存在するときは、より小さな15までの下付数字をもつ残余の下付文字の有るXもまた存在することを条件とする。
【００４７】
異種残基または配列のどちらかの側に存在するドメインIIの残りの残基はHBc76位から85位の残基である。したがって、残基78から82が置換されている例示的な例では、ドメインIIのキメラ配列は76から77、続いて制限部位コード残基、免疫原性（エピトープ）配列、更に別の制限部位コード残基、及びHBc配列84から85が続く。残基78と79の間への挿入によって調製されるキメラの例示的な配列は、2位から78位、その後に制限部位コード残基、免疫原性配列、更に別の制限部位コード残基及びHBc配列79から85が続く。本発明の他のキメラのドメインIからIIの配列は、前記の説明および以下の例示から明らかで、列挙の必要はないであろう。
複数のグリシン残基を含み、さらに上記記載の髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）B細胞エピトープ配列のC-末端でペプチド結合した約5から約9残基の長さを有する短い親水性ペプチドは、前記配列を含むキメラ粒子の発現で役立つことが判明した。有用な短いペプチドの１つは、文献（Karpenko et al. (2000) Amino Acids 18:329-337）に開示されもので、配列番号:144のGSGDGEGGの配列を有する。
既に述べたように、化学的に非反応性の異種残基又は共役エピトープのためのリンカーは、HBc配列のアミノ酸76位と85位との間の位置でペプチド結合することができる。免疫原性エピトープでの事例のように、残基76から85のHBc配列は好ましくは存在するが、付加残基によって中断される。このキメラは、好ましくは、キメラタンパク質のN-末端又はC-末端近くのシステイン残基とともに4位から少なくとも140位のHBc配列を含む。より好ましくは、1位から149位のHBc配列は存在するが、残基76と85の間で共役エピトープのための異種リンカーによって中断され、さらにキメラ分子はC-末端システインを含む。
【００４８】
化学的に非反応性の残基は上記で考察した。共役エピトープのための異種リンカーはもっとも好ましくはリジン（K）残基である。グルタミン酸又はアスパラギン酸、チロシン及びシステイン残基もまた、チロシン及びシステイン残基を用いることができるように、リンカー残基として用いることができる。例えば3つのリジンの配列のように2つ以上のリンカーが存在してもよいと記載されているが、不均質な共役（共役ハプテンが第一のキメラのあるリンカーに結合し、第二のキメラでは別のリンカーに結合する）がそのような使用で形成されるので前記のような使用は好ましくない。米国特許6,231,864B1は、1つ又は2つ以上の連結残基を含むがN-末端安定化システイン残基を欠くHBcキメラ分子を開示している。
さらにまた、考慮しているHBcキメラに存在する、挿入される化学的に非反応性の残基、又はリンカー残基、又は免疫原性エピトープ含有配列はまた、免疫原性（エピトープ）配列の一方又は両側にある（フランキングしている）“可撓性リンカーアーム”によってHBc配列残基から分離され得ることもまた特記される。これは、特に前記免疫原性配列が約30アミノ酸残基を超える長さである場合の事例である。例示的な可撓性リンカーアーム配列は、典型的には約4から約10のグリシン残基を含み、これらは、そうでなければ彎曲しているループ配列から前記配列を外側に突き出させると考えられており、更なる安定性を前記構築物に付加することを可能にする。これらの可撓性リンカーアームは、髄膜炎菌B細胞エピトープ配列（例えば配列番号:125のペプチド）に関して以前に考察したものと類似する。他の可撓性リンカーアーム配列の例は文献（Kratz et al. (March 1999) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 96:1915-1920）に開示され、以下のアミノ酸残基配列によって表される：
GGGGSGGGGT    配列番号:155
GGGGSGGGG     配列番号:156
直ぐ下の配列は、挿入されたエピトープ含有配列のC-末端で利用され、一方、その後の配列は、挿入された免疫原性配列のN-末端およびC-末端の各々で用いられる：
GSGDEGG        配列番号:154
GGGGSGGG       配列番号:157
【００４９】
上記に記載したように、ドメインIIIは86位から135位のHBc配列を構成する。結果として、ドメインIおよびIIについて上記で考察した例示キメラの配列は、第一に考察したキメラが84位から140位までのHBcの配列を有し、第二に考察したキメラが79位から140位までのHBcの配列を有するように伸長することができる。
ドメインIVは、（i）約136位から約140位までのHBc配列、場合によって149位までのHBc配列を含み、（ii）0から約3つまでのシステイン（Cys）残基を含み、さらに（iii）165位からC-末端の好ましくはHBcにとって異種である免疫原性配列内に約100までのアミノ酸残基を含む配列であり、ただし、ドメインIVはHBc配列の136位から140位までの少なくとも5つのアミノ酸残基を含むことを条件とする。ドメインIVの免疫原性配列はより好ましくは約50までのアミノ酸残基を含み、もっとも好ましくは約25までのアミノ酸残基を含む。したがって、ドメインIVの配列は、165位からC-末端までのC-末端HBc配列を除く実質的に任意の配列であろう。
【００５０】
ドメインIVの配列の長さは、5残基（すなわち136位から140位の残基）から、約125までのアミノ酸残基（免疫原性配列の約100免疫原性残基とともに約HBc165位までの残基）であて、ドメインIVは合計3つまでのシステイン残基を含み、目的のキメラタンパク質が全長約135から約525残基を有することができるように十分な長さを有する。ドメインI又はIIの一方又は両方とペプチド結合したエピトープは、これらのエピトープのために好ましいようにそれぞれ約30まで又は約50までの残基を含む場合、ドメインIVエピトープを含むキメラ分子のより好ましい長さは約170から約250残基である。2つの免疫原性エピトープを含む特に好ましいキメラ分子は長さが約190から約210残基を有する。生じた粒子が核酸結合を含まないことは、上記で考察したように280/260吸収比を測定することによって決定される。
ドメインIV配列は0から3つまでのCys残基を含むことができる。Cysが存在する場合は、1つ又は2つ以上のCys残基は、キメラ分子のC-末端から約30残基内に、好ましくはキメラタンパク質分子のC-末端に又は約5アミノ酸残基内に存在することが好ましい。さらにまた、2つ以上のCys残基がドメインIV配列内に存在する場合は、前記Cys残基は互いに隣接するのが好ましい。
ドメインIV配列は、目的のキメラを免疫原として用いようとしている生物についての1つのT細胞エピトープ、複数のT細胞エピトープ（同じか又は異なっている）、又はさらに追加のB細胞エピトープを含むのが好ましい。例示的なドメインIVのT細胞エピトープ配列は表Aのように下記の表Bに、下線を付した例示の付加C-末端システイン残基（C）とともに提供されている。
【００５１】
表B：T細胞エピトープ
生物 遺伝子  配列＊ 引用文献 配列番号
HIV            P24          GPKEPFRDY-
VDRFYKC                  3                15
ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）  
毒素                        FQVVHNSYN-
RPAYSPGC                 5                159
ボレリア・バルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi）
ospA         VEIKEGTVTLKRE
IDKNGKVTVSLC             6                160
TLSKNISKSG-
EVSVELNDC                7                161
インフルエンザウイルス
A8/PR8         HA           SSVSSFERFEC              8                162
LIDALLGDPC              32                163
TLIDALLGC               32                164
トリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）
SHNFTLVASVII-
EEAPSGNTC               13                165
プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）
MSP1
SVQIPKVPYPNGIVYC        15                166
DFNHYYTLKTGLEADC                          167
PSDKHIEQYKKI-           23
KNSISC                                    168
EYLNKIQNSLST-           26
EWSPCSVT                                  169
P. ビバックス（P. Vivax）
YLDKVRATVGTE-  
WTPCSVT                                   170
P.イエリー（P. yoelii）
EFVKQISSQLTE-
EWSQCSVT                                  171
ストレプトコッカス・ソブリヌス（S. sobrinus）
AgI/II
KPRPIYEAKL-
AQNQKC                          16        172
AKADYEAKLA-
QYEKDLC                                   173
LCMV (リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス)
NP    
RPQASGVYM-
GNLTAQC                         17        174
破傷風菌（Clostridium tetani）
tox
QYIKANSKFIG-
ITELC                           20        175
髄膜炎菌（Neisseria meningitis）
PorB            AIWQVEQKASIAGTDSGWC                       176
NYKNGGFFVQYGGAYKRHC                       177
HNSQTEVAATLAYRFGNVC                       178
PorB            TPRVSYAHGFKGLVDDADC                       179
RFGNAVPRISYAHGFDFIC                       180
AFKYARHANVGRNAFELFC                       181
SGAWLKRNTGIGNYTQINAC                      182
AGEFGTLRAGRVANQC                          183
IGNYTQINAASVGLRC                          184
GRNYQLQLTEQPSRTC                          185
SGSVQFVPAQNSKSAC                          186
HANVGRDAFNLFLLGC                          187
LGRIGDDDEAKGTDPC                          188
SVQFVPAQNSKSAYKC                          189
NYAFKYAKHANVGRDC                          190
AHGFDFIERGKKGENC                          191
GVDYDFSKRTSAIVSC                          192
HDDMPVSVRYDSPDFC                          193
RFGNAVPRISYAHGFDFIERGKKGENC               194
NYAFKYAKHANVGRDAFNLFLLGC                  195
SGAWLKRNTGIGNYTQINAASVGLRC                196
SGSVQFVPAQNSKSAYTPAC                      197
OpaB            TGANNTSTVSDYFRNRITC                       198
IYDFKLNDKFDKFKPYIGC                       199
Opa-5d          LSAIYDFKLNDKFKPYIGC                       200
Opac            NGWYINPWSEVKFDLNSRC                       201
Ｂ型肝炎
表面
PreS1         MGTNLSVPN-   
PLGFFPDHQLDP              36, 40        144
PLGFFPDH                                 145
PLGFFPDHQL                               146
PreS2         MQWNSTAFHQ-                36            147
TLQDPRVRG-
LYLPAGG
MQWSTAFHQ-                               148
TLQDP
MQWNSTALHQ-                              149
ALQDP              
QDPRVR                     37            150
QDGRVR                     37            151
*下線を付したC（C）は天然配列に由来するものではない。
【００５２】
引用文献：
1.  EPO 786 521A.
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【００５３】
好ましくは、残基4位から少なくとも140位までのHBcのアミノ酸配列が目的のキメラ分子及び粒子に存在する。より好ましくは2位から149位及び約163位までの配列が存在する。B細胞エピトープは、（存在する場合は）好ましくは残基76と85の間に存在する。既に記載したように、少なくとも1つのシステイン残基がドメインIのN-末端に若しくはその近くに存在し、又は以前に考察したようにC-末端若しくはその近くに存在する。1つ又は2つ以上のT細胞エピトープもまた、HBc配列へのN-末端付加またはC-末端付加として存在できる。目的の組換えHBcキメラは実質的に結合核酸を含まない。N-末端又はC-末端に付加されたCys残基を含む目的のキメラ粒子は、前記付加Cysを含まない類似の粒子よりも安定である。
目的の組換えHBcキメラ分子は、典型的には自己会合粒子として存在し、使用される。これらの粒子は180から240個のキメラ分子（90又は120個のダイマー対）、通常は240個のキメラ分子を含み、これらはジスルフィド還元剤（例えば2-メルカプトエタノール）の存在下でタンパク質分子に分離し、個々の分子はしたがって主としてジスルフィド結合によって一緒に結合して粒子を形成すると考えられる。
【００５４】
理論に拘束されないが、前記の観察された安定性の強化及びいくつかの事例では目的のHBc キメラの発現の強化は、粒子のキメラタンパク質分子間のN-末端システインによるジスルフィド結合の形成によると考えられる。システインとして存在するか、シスチンとして存在するかにかかわらず、N-末端システイン残基は、前記タンパク質及び会合粒子が発現される核酸に存在するコドンによって前記残基がコードされるかぎりシステインとして言及される。
これらの粒子は、HBV感染患者で観察される粒子と類似するが、前記粒子は非感染性である。種々の原核および真核宿主で発現されると、個々の組換えHBcキメラ分子は宿主内で会合して粒子を形成し、前記粒子は宿主細胞から容易に採集でき、所望の場合には精製することができる。
上記に記載したように、HBc免疫優勢ループは、通常は無傷のタンパク質のアミノ末端（N-末端）から約75位から約85位に位置すると記載されている。ドメインIIの免疫原性エピトープ含有配列は前記免疫優勢ループ配列中に配置される。前記配置は実質的にHBcループ配列のHBc免疫原性を排除するが、一方、会合キメラ粒子においては前記免疫原性配列又はリンカー残基を極めて免疫原性の高い位置に提示する。
上記で考察したＮ−及びC-末端短縮、種々のエピトープ及びスペーサーの挿入の他に、目的のキメラ分子はまた、HBcドメインI、II、IIIおよびIVを構成するアミノ酸残基に保存的置換を含むことができる。保存的置換は以前に定義したとおりである。保存的置換の例示は、2位および3位の残基（アスパラギン酸およびイソロイシン；DI）のグルタミン酸およびロイシン（EL）残基による置換で観察される（前記EL残基は、所望のN-末端エピトープ（N-末端システイン残基を含む）をコードする核酸を付加するために用いられるEcoRI制限部位によってコードされる）。
より稀には、“非保存的”変更、例えばグリシンのトリプトファンによる置換が意図される。類似の軽微な変更にはまたアミノ酸の欠失、挿入または前記の両方が含まれよう。生物学的活性または粒子形成を停止させることなく、どのアミノ酸残基を置換、挿入又は欠失させることができるかという決定は、当分野で周知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENEソフト（DNASTAR Inc., Madison, WI）を用いて見出すことができる。
【００５５】
本発明のキメラ分子のHBc部分（すなわちHBc配列を有する部分で、付加されたエピトープの配列もしくは残基、リンカー、可撓性リンカーアーム又は制限酵素の人工的産物である異種残基以外の配列を有する）は、もっとも好ましくは図1に示すサブタイプayw（配列番号:1）のアミノ酸残基配列であって、一端又は両端での短縮のために欠如しているサブタイプaywの任意の部分を差し引いた配列を有する。典型的には、前記配列はHBc2位から149位の配列である。いくぶん好ましさの劣るものは、サブタイプadw、adw2およびadywのアミノ酸残基配列に一致するもので、前記もまた図1（配列番号:2、3および4）に示されている。さらに好ましさの劣るものは、ウッドチャックおよび地上性リスのアラインメントされた2位から149位の配列であり、これらは図1の最後の2つの配列（配列番号:5および6）である。いずれかに記載したように、異なる哺乳類のHBcタンパク質に由来する異なる配列の部分を単一のキメラに一緒に用いてもよい。
上記に記載した本発明のキメラ分子のHBc部分が2位から約165位に対応する哺乳類のHBc分子の配列以外の配列を有する場合、2位から165位までの配列番号:１と比較したときに前記アミノ酸残基の約20％を超えない残基が置換されてある。配列番号:1の2位から165位と比較したとき、約10％を超えないアミノ酸残基が置換されていることが好ましく、より好ましくは約5％を超えない、もっとも好ましくは約3％を超えないアミノ酸残基が置換される。
【００５６】
したがって、164のHBc残基を有する目的のキメラは、配列番号:1の1位から165位の残基とは異なる約32までの残基、好ましくは約16までの残基を含むことができる。より好ましくは、約8残基がayw配列（配列番号:1）と残基2‐165位で異なり、もっとも好ましくは約5残基が異なる。ドメインIIの免疫優勢ループ又は末端以外の置換は好ましくはキメラ分子の非ヘリックス部分に存在し、典型的には残基2から約15及び残基24から約50の間に存在し、粒子形成の担保に役立つ。例えば以下を参照されたい：Koschel et al. (1999) J. Virol. 73(3):2153-2160。
HBc配列が165位を超えてC-末端で又はN-末端で短縮されている場合、又は免疫原性ループ内に1つ又は2つ以上の欠失を含む場合、配列の全長が164残基未満であるために置換される残基数は比例して減少する。分子のどこか別の場所での欠失は、計算のために保存的置換と考えられる。
本発明のまた別の特徴では、上記で考察したHBcキメラ分子のいずれかで、HBc48位及び107位の一方又は好ましくは両方のシステイン残基が別の残基（例えば好ましくはセリン残基）で置換される。これらの自己会合粒子は、48位及び107位の両方でシステイン残基を含むがその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも、37℃で20mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で14日間保存した場合に、より安定である。したがって、48位及び107位の1つ又はより好ましくは両方のシステインの欠如は、N-末端又はC-末端システイン又はその両方の存在によって安定化されている粒子の保存安定性を強化する。
したがって通常存在する48位及び107位のHBcシステイン残基は、本発明の全てのキメラ分子において他の残基（例えばセリン、スレオニン、ロイシン、イソロイシン、アスパラギン又はグルタミン）で置換され、さらに本発明のキメラ分子は少なくとも1つのN-末端又はC-末端システイン残基（HBc配列にとって天然の残基ではない）を含んでいる。したがって、いくつかの実施態様では、ドメインIのHBc配列は少なくとも1つのN-末端システイン残基とともに5位から75位の残基を含むのが好ましい。他の実施態様では、目的のキメラ分子は、N-末端システイン残基だけではなく、上記で述べたように単独で存在するか又はアミノ酸残基配列内に存在するドメインIV内に1つのシステイン残基を含むのが好ましい。更に別の態様では、好ましいキメラ分子はただ1つ又は2つ以上のシステイン残基を含み、さらにドメインIは非HBcシステイン残基を含まない。HBcシステイン残基は、図1のHBc配列の各々で約61位に存在する。
【００５７】
キメラの調製
目的のキメラHBc免疫原は、典型的には周知の組換えDNA技術を用いて調製される。したがって、特定のポリペプチド配列をコードする核酸配列がHBcをコードする前駆体配列に付加され又は前記前駆体配列から欠失されて、目的のキメラをコードする核酸が形成される。
目的のキメラ免疫原の例では、典型的にはN-末端システインとしてインフルエンザA M2配列に存在するシステインが利用される。HBc分子をコードするポリヌクレオチドのin vitro変異導入によるそのようなキメラ分子の調整のためのプライマーは以下で考察される。システイン含有M2ポリペプチドエピトープがN-末端に存在しない場合は、N-末端システインは、単にM2ポリペプチドのシステイン含有部分をコードするプライマー又は単純なN-末端開始配列（例えばMet-Cys-又はMet-Gly-Cys-）を用いin vitro変異導入によって提供することができる。
本発明のさらに別の特徴では、組換えによって作製される免疫原性キメラ粒子は、HBV感染患者に組換え肝炎B表面抗原（HBsAg）と同時に投与される。前記組換え肝炎B表面抗原は場合によってPreS1又はPreS2領域の一方又は両方を含むことができる。
肝炎B表面抗原の製造方法は当業界で周知である。酵母での肝炎B表面抗原の製造例は米国特許4,977,092号に記載されている。HBcキメラ粒子及びHBsAgは同じ容器にあってもよいが、又、HBcキメラ粒子が1つの容器に存在し、HBsAgは第二の容器に存在し、前記2つが注射前に混合されるキットとして提供されてもよい。HBsAgの好ましい投与量は約10から約100μg、もっとも好ましくは約20から約50μgである。HBsAgは場合によって水酸化アルミニウムゲルを基剤にして製剤化される。好ましい使用方法では、一緒にしたHBc粒子及びHBsAgがアジュバント（例えばMPL又はRC-529）と一緒に投与される。
【００５８】
免疫したら、患者は、HBcキメラ粒子に対して免疫反応の誘導のために十分な時間維持される。維持時間は典型的には約3から約12週続き、ブースター（ワクチンの第二の免疫投与）を含むことができる。その後のブースター投与もまた意図される。
抗HBsAg又は他の抗体の生成は、血漿又は血清サンプルを前記免疫患者から採取し、以下に記載するように、その中に存在する抗体を適切な抗原（例えば合成HBsAgポリペプチド抗原）と結合するそれらの能力についてELISAアッセイで分析することによって、又は当業界で周知のウェスタンブロットのようなまた別のイムノアッセイによって容易に確認される。
免疫原性エピトープ配列、化学的に反応性のリンカー残基配列、又は化学的に非反応性の配列をループ配列に配置するための以下の2つの手法のいずれも好ましい。第一の手法は置き換えと称され、免疫優勢ループの部分をコードするDNAが切り出され、免疫原性エピトープ（例えばB細胞エピトープ）をコードするDNAで置き換えられる。第二の手法は挿入と称され、免疫原性エピトープがループ内の隣接する残基の間に挿入される。
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いる位置特異的変異導入を一つの例示的な置き換えアプローチで用いて、一対の異なる制限部位（例えばEcoRIとSacI）（免疫優勢ループをコードするDNAの各末端に近い制限部位）をコードするキメラHBcDNA配列を提供する。置換される例示的な残基は76から81である。ループコード部分を切り出し、免疫原性B細胞エピトープをコードする所望の配列を制限部位に連結し、得られたDNAを用いてHBcキメラを発現させる。前記技術の例示的な使用のために、例えばPumpensら（Intervirology 38:63-74 (1995)）の報告の表2を参照されたい。
【００５９】
あるいは、単一又は2つの制限部位を位置特異的変異導入によって前記領域にコード化し、DNAを制限酵素で切断し、“接着”末端を生じさせる。前記接着末端を連結に用いるか、又はエンドヌクレアーゼで平滑末端を作製し、平滑末端を有する異種DNAセグメントを前記切断領域に連結することができる。HBcへの配列置換のこのタイプの例は、以下の文献に報告された研究で見出すことができる：Schodel et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.319-325；Schodel et al. Behring Inst. Mitt. 1997(98): p.114-119；Schodel et al. J. Exp. Med. (1994) 180(3):1037-4。後者の2つの文献は、それぞれP.イエーリー（yoelii）およびP.ベルゲイ（berghei）に対するワクチンの製造を論じている。
HBc免疫原性ループ内の挿入位置及びループ残基の存在は、免疫原の活性にとって重要であり得る。したがって、前述の公開されたPCT出願、PCT/US01/25625およびPCT/US01/41759に説明されているとおり、HBc残基78と79との間におけるマラリアのB細胞エピトープの配置は、残基76と81の間の領域を切り出して置き換えた同じ免疫原を配置したものより10倍から1000倍強い免疫原性を有する粒子状免疫原を提供する。さらにまた、残基78と79の間に同じマラリア免疫原を配置したものは、残基77と78の間に配置したものと比較して、予期に反する約15倍の免疫原性の強化を生じさせた。
【００６０】
したがって、一般的には挿入が好ましい。挿入手法の例示的な例では、位置特異的変異導入を用いて互いに隣接する2つの制限部位が、隣接アミノ酸をコードするコドン（例えば残基78および79のアミノ酸残基）の間に作製される。この技術では、もとは隣接していたHBcループ内の残基の間に4つのアミノ酸残基（各制限部位に対して2つ）をコードする12の塩基対が付加される。
制限酵素による切断、免疫原性B細胞エピトープ配列をコードするDNAの連結、及び前記DNAを発現してHBcキメラを形成させると、HBcループアミノ酸配列は、そのN-末端側で5'制限部位によりコードされる2つの残基によって、続いてC-末端に向かって免疫原性B細胞エピトープによって、続いて3'制限部位によりコードされるさらに2つの免疫原性非ループ残基、続いてループ配列の残余によって中断されるのが認められる。この同じ手法を用いて、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163 (1999)）が報告したように、ドメインIにN-末端システインまたはN-末端免疫原性配列を挿入し、又はドメインIVにT細胞エピトープ又は1つ若しくは2つ以上のシステイン残基を挿入することができる。残基82と83の間の挿入を用いる類似の手法が報告された（Schodel et al. (1990) F. Brown et al. eds., Vaccines 90, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.193-198）。
【００６１】
より具体的には、C‐末端短縮HBc配列（例えばHBc149）をコードするDMA配列は、残基78と79の間に隣接するEcoRIおよびSacI部位を含むように操作される。前記DNAを両酵素で切断すると、EcoRIの接着3'末端を有するHBc1‐78をコードする1つのフラグメントが提供され、一方、他方のフラグメントは5'末端SacI接着末端を有し、79‐149位の残基をコードしている。5'-AATTオーバーハングを有し、その後に所望のB細胞エピトープをコードする配列およびAGCT3'オーバーハングが続く合成核酸の連結によって、残基78と79の間の各々の側に2つの異種残基［それぞれGlyIle（GI）およびGluLeu（EL）］がフランキングしたB細胞エピトープをコードするHBcキメラ配列が提供される。これにより、通常EcoRI部位は破壊され、SacI部位は温存される。
類似の手法が、システイン含有配列、例えば326位から345位のP.ファルシパルム（falciparum）CSタンパク質配列（本明細書ではPF/CS326-345（Pf-UTC）と称する）を含むマラリアT細胞エピトープのドメインIVへの挿入に用いられる。ここでは、EcoRIおよびHindIII制限部位を149位のアミノ酸残基の後に作製する。EcoRIおよびHindIIIによる消化の後、T細胞エピトープコード配列、1つ又は2つ以上の終止コドンおよび3'AGCTオーバーハングがその後に続く上記のAATT5'オーバーハングを有する合成DNAを前記消化した配列に連結し、HBc1‐149残基とそれに続く2つの異種残基（GI）、終止コドンおよびHindIII部位をコードする配列を形成する。
【００６２】
残基79位で開始するHBcをコードする配列が続くSacI制限部位を有するフォワードプライマーを用いたPCR増幅、それに続くSacIおよびHindIIIによる消化によって、2つの付加された残基およびC-末端のT細胞エピトープとともにＨＢc79‐149をコードする配列が提供される。前記構築物のSacIによる消化及び連結によって、HBcのN-末端から1‐78位、2つの付加残基、マラリアB細胞エピトープ、2つの付加残基、HBc79‐149、2つの付加残基及びT細胞エピトープを有する、図2Cに示された所望の組換えHBcキメラ免疫原をコードする完全な遺伝子が提供される。
類似の技術を用いて、B細胞エピトープの共役のための異種リンカー残基をループ領域配列内に配置することができる。目的のリンカー残基には、リジン（Lys）（特に好ましい）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、システイン（Cys）およびチロシン（Tyr）が含まれる。
配列番号:1で示されるアミノ酸残基はGluおよびAsp残基を77位および78位に含むことを特に記載しておく。それにもかかわらず、さらに追加される異種カルボキシル含有残基の導入が意図される。存在するグルタミン酸及びアスパラギン酸の化学反応性は他の要因によって低下するであろう。例えば、近傍のプロリン（例えば79位に見出されるようなもの）は、近接するカルボキシル基の化学反応性を中和しこれを低下させることができることは当業界では公知である。
ここでは、第一に記載した挿入手法を用い、5つの異種残基がループ配列内に配置される。すなわち、１つはB細胞エピトープを共役させるための異種リンカー残基であり、2つの残基は、前記1つの残基のいずれかの側で隣接する2つの残基であってそれら自身もまたループ配列残基に隣接し、さらに挿入された制限部位の発現生成物（制限酵素の人工産物）である。B細胞エピトープのための異種リンカー残基をコードする単一のコドンをHBcループ配列に付加するために位置特異的変異導入もまた用いることができることを記載しておく。
【００６３】
好ましくは、B細胞またはT細胞エピトープのいずれかの側の（フランキングする）2つの異種残基を使用するのは便利さのためであることを記載しておく。結果として、HBc配列の部分ではない0から3つまたは4つ以上の付加残基を挿入される配列の一方の側又は両側で用いることができる。挿入物およびHBc核酸の一方の端又は両端を適切なヌクレアーゼ（例えばS1ヌクレアーゼ）で“咀嚼し”一緒に連結することができる平滑末端を提供する。挿入されるB細胞またはT細胞エピトープの部分でもなく、HBc配列の一部分でもない付加異種残基は、以下で考察される構築物のいくつかにおいてはGluLeuがAspIleを代替する場合のように、前記残基がすでに存在する残基の保存的置換でない限り表示のドメインに存在する残基数には数えられない。
タバコ（Nicotiana tabacum）の59残基のリブロースビス-ホスフェートカルボキシラーゼ-オキシゲナーゼシグナルペプチドをコードする177塩基対のDNAの合成について米国特許5,656,472で考察され説明されているように、所望の組換えHBcキメラ核酸の全部又は一部を周知の合成方法を用いて合成できることもまた特に記載しておく。例えば、ドメインIIIおよびIVに連結することができる平滑末端または“接着末端”を有するドメインIおよびIIを合成し、目的のHBcキメラ（B細胞エピトープのN-末端側に0から3つの付加残基およびC-末端側にまたはドメインII/III結合部に又は他のいくつかの所望位置に0から3つの付加残基を含む）を発現する構築物を提供することができる。
また別の挿入技術は文献に報告された：Clarke et al. (1991) F. Brown et al. eds., Vaccines 91, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp.3131-318）。ここでは遺伝暗号の縮退を利用し、前記研究者らは、残基80および81位に本来存在する残基をコードする残基80および81に一致する単一の制限部位を作出した。したがって彼らが発現させたHBcキメラは制限部位コード残基を含まず、挿入のすぐ隣のHBcループ残基を含んでいた。
上記に記載したHBcキメラ分子又は前記コード配列の相補物もまた本発明に包含される。いくつかの好ましい実施態様では、そのような核酸セグメントは単離され精製された形態で存在する。
【００６４】
生きている生物では、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基は、前記タンパク質をコードする遺伝子のデオキシリボ核酸（DNA）と遺伝暗号を介して直接的関係を有する。したがって、遺伝暗号の周知の縮退により、同じキメラアミノ酸残基をコードするが、先に考察した遺伝子配列とは十分に異なる（2つの配列は高ストリンジェンシーではハイブリダイズしないが中等度のストリンジェンシーでハイブリダイズする）付加DNAおよび対応するRNA配列（核酸）を所望のように調製することができる。
高ストリンジェンシー条件は、約50℃−55℃の温度で6ＸのSSC中でのハイブリダイゼーション、および68℃の温度で1−3ＸのSSC中での最終的洗浄を含むと定義できる。中等度のストリンジェンシー条件は、約50℃から約65℃の温度で0.2から0.3MのNaCl中でのハイブリダイゼーション、続いて約50℃から約55℃で0.2ＸのSSC、0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）中での洗浄を含む。
（1）それ自体又はその相補鎖が、その残基4位から136位のHBc部分（それが存在する場合）が配列番号:1、2、3、4、5又は6の配列であるキメラ分子をコードし、さらに（2）少なくとも中等度のストリンジェンシー（上記で考察）でハイブリダイズし；さらに（3）そのHBc配列が、配列番号:202、203、204、205、206又は207のDNA配列と少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも95％、もっとも好ましくは100％の同一性を共有する核酸配列はDNA変種配列と定義される。周知のように、核酸配列（例えば本発明の核酸配列）は、本明細書のいずれかの場所で考察されるように適切なプロモーターと機能的に連結されたとき適切な発現系で発現される。
【００６５】
目的のキメラ分子をコードする類似体または類似核酸（DNAまたはRNA）配列もまた本発明の部分として包含される。キメラ類似体核酸配列またはその相補性核酸配列は、配列番号:1、2、3、4、5または6に示される残基4位から残基136位のHBc配列部分と少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％、もっとも好ましくは少なくとも95％同一であるHBcアミノ酸残基配列をコードする。前記DNAまたはRNAは本明細書では、配列番号: 202、203、204、205、206及び207の核酸の配列の“類似体”または前記と“類似である”と称され、本明細書で配列番号:202、203、204、205、206及び207の核酸配列又はそれらの相補鎖と中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。類似配列をコードする核酸はまた、適切なトランスフェクションおよび発現に際して目的のキメラを生成する。
種々の宿主がしばしば個々のアミノ酸残基をコードするために用いられる個々のコドンに対して優先性を有する。そのようなコドンの優先性は周知であり、所望のキメラ配列をコードするDNA配列は例えばin vitro変異導入を用いて変更し、それによって前記酵素が発現される宿主に優先的なコドンを個々の宿主のために利用することができる。さらにまた、遺伝暗号の縮退を用いて、配列番号:1、2、3、4、5若しくは6のDNA又はそれらの相補鎖との実質的な同一性を回避した配列番号: 202、203、204、205、206又は207の配列のHBc部分をコードすることができる。したがって、有用な類似DNA配列は、配列番号: 202、203、204、205、206又は207のヌクレオチド配列又は相補鎖と中等度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするとは限らないが、なお目的のキメラ分子を提供することができる。
【００６６】
上記に述べた目的のキメラをコードする遺伝子を特定する外因性核酸セグメント（例えばDNAセグメント又は配列）、及び適合宿主生物で前記遺伝子の発現を駆動するために適したプロモーターに機能的に連結されたベクターを含む、組換え核酸分子（例えばDNA分子）もまた本発明の目的である。より具体的には、キメラ又はDNA変種（配列番号: 202、203、204、205、206又は207のキメラ遺伝子と少なくとも90％同一性を有し、さらに前記遺伝子と中等度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする）のHBc部分のための遺伝子を表すDNAセグメントに機能的に連結された、宿主細胞でのキメラの発現を駆動させるためのプロモーターを含むベクターを含む組換えDNA分子もまた考慮される。
さらに、配列番号:1、2、3、4、5又は6の配列のHBc部分と少なくとも80％同一、より好ましくは90％同一、もっとも好ましくは95％同一性を有するHBcキメラ部分のアミノ酸残基をコードする類似体核酸配列であるDNAセグメントに機能的に連結された、宿主細胞においてキメラの発現を駆動させるためのプロモーターを含むベクターを含む組換えDNA分子も考慮される。前記組換えDNA分子は、適切なトランスフェクション及び宿主細胞で発現されると目的のキメラ分子を提供する。
地上性リスのHBcの30アミノ酸残基のN-末端配列は他のいずれのHBc配列ともアラインメントすることができないので、前記の配列及びそのコード核酸配列並びにそれらの相補鎖は上記の同一性のパーセンテージに含まれず、ハイブリダイゼーションの測定で用いられる前記30残基配列又はその相補鎖をコードする核酸の部分でもないことを特に記載しておく。同様に、HBcのN-末端およびC-末端のどちらか又は両端で短縮された配列は同一性の計算に含まれず、免疫優勢ループの残基が異種エピトープの挿入のために除去される配列でもない。したがって、キメラ分子に存在する前記HBc-コード塩基又はHBc配列残基のみが同一性百分率の計算に含まれ、アラインメントされる核酸又はアミノ酸残基配列と比較される。
【００６７】
本明細書に開示した遺伝子のコード配列が配列番号:172、173、174、175、176及び177に示されているので、その単離核酸セグメント（好ましくはDNA配列）、変種及び類似体（遺伝子の最初のコドンATGで始まり、各遺伝子の終止コドンの直ぐ下流で終わる）は、当分野でよく知られた、文献（Current Protpcols In Molecular Biology, Ausabel et al. eds., John Wiley & Sons (New York: 1987), p. 8.1.1-8.1.6）でも考察されているin vitro変異導入によって調製することができる。したがって、所望の制限部位は、開始コドンで又は開始コドンの上流、および終止コドンでまたは終止コドンの下流に作製することができ、それによって前記のまた別の遺伝子を調製し切り出し単離することができる。
当分野でよく知られたように、要求される核酸（例示すればDNA配列）（開始および終止シグナルを含む）が存在するかぎり、追加される塩基対は通常は前記セグメントのどちらかの末端に存在することができ、前記セグメントはなおタンパク質発現に利用することができる。前記の場合、もちろんのこと、発現を抑制したり、発現されるべき所望の酵素を消費する更なる生成物を発現させたり、当該所望の酵素によって精製される所望される反応生成物を消費する生成物を発現したり、又は別の態様で前記DNAセグメントの遺伝子の発現に干渉したりする機能的に連結されたDNA配列が前記セグメント中に存在しないと仮定される。
したがって、前記DNAセグメントがそのような干渉DNAセグメントを含まないかぎり、本発明のDNAセグメントは長さが約500から約15000塩基対であろう。組換えDNA分子、特に発現ベクターの最大サイズは、複製および発現（所望される場合）に必要な最小限のDNA配列の全てが存在するならば、主に便利さおよび宿主細胞に収容できるベクターサイズによって決定される。最小限のベクターサイズはよく知られている。そのような長いDNAセグメントは好ましくはないが用いることはできる。
【００６８】
上記で述べたキメラをコードするDNAセグメントを化学的な技術、例えばMatteucciら（J. Am. Chem. Soc.. 103:3185 (1981)）のホスホトリエステル法によって合成することができる。もちろん、コード配列を化学的に合成することによって、本来のアミノ酸残基配列をコードする塩基を適切な塩基で置換することにより、簡単に所望の改変のいずれも実施することができる。しかしながら、上記で考察した配列を含むDNAセグメントが好ましい。
目的のHBcキメラは多くの形質転換宿主系、典型的には宿主細胞で製造する（発現させる）ことができるが、ただし無細胞（in vitro）系での発現もまた意図される。前記の宿主細胞系には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：組換えファージ、プラスミド、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された微生物、例えば細菌；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス；タバコモザイクウイルス）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は適切に形質転換させた動物細胞系、例えばCHO、VERO又はCOS細胞。本発明はまた用いられる宿主細胞系によって制限されない。
HBcキメラをコードする遺伝子を含むDNAセグメントは、好ましくは前記遺伝子を含む組換えDNA分子（プラスミドベクター）から得られる。キメラ遺伝子のHBcキメラタンパク質への発現を指令することができるベクターは、本明細書では“発現ベクター”と称される。
発現ベクターはプロモーターを含む発現制御エレメントを含む。キメラコード遺伝子は発現ベクターに機能的に連結され、前記プロモーター配列がRNAポリメラーゼの結合およびキメラコード遺伝子の発現を指令することを可能にする。誘導性プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、文献に記載された（Poszkowski et al. (1989) EMBO J. 3:2719;およびOdell et al. (1985) Nature 313:810）構成的プロモーターの他に時間的制御プロモーター、空間的制御プロモーター、時間的空間的制御プロモーター（Chua et al. (1989) Science 244:174-181）がポリペプチドコード遺伝子の発現に有用である。
原核細胞（例えば大腸菌）での使用に好ましいプロモーターはRec7プロモーターであり、これは外因的に供給されるナリジクス酸によって誘導することができる。より好ましいプロモーターはプラスミドベクターJHEX25（Promega Corp.から入手できる）に存在し、これは、外因的に供給されるイソプロピル-β-D-チオガラクト-ピラノシド（IPTG）によって誘導することができる。さらに好ましいプロモーター、tacプロモーターはプラスミドベクターpＫＫ223-3に存在し、外因的に供給されるIPTGによってまた誘導することができる。PKK233-3プラスミドは、多数の大腸菌株、例えばXL-1、TB1、BL21およびBLRで、約25から約100μMのIPTGを誘導に用いて良好に発現させることができる。驚くべきことには、約25から約50μMのIPTG濃度が2Lのシェーカーフラスコおよび発酵装置で最適結果を提供することが判明した。
【００６９】
他の微生物、例えばサルモネラ（例えば腸チフス菌（S. typhi）、ネズミチフス菌（S. typhimurium）及びネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッド）、酵母（例えばビール酵母菌（S. cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris））、哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞）、一般的には単子葉及び双子葉の両植物細胞（具体的には経口ワクチン又は接種物を所望する場合のように双子葉植物の貯蔵器官（例えば根、種子又は果実））、並びに昆虫細胞（例えば、オートグラファ・カリフォルニア核多角体ウイルス（AcNPV）又はバキュロウイルスを使用するS. Frugiperda細胞又はTorichoplusia）での本発明のキメラ分子の発現は、公開された前述の出願WO02/14478A2で考察されている。これらの発現方法はしたがって本明細書ではこれ以上は考察されないが、本発明に包含される。
相補的な接着末端または平滑末端を介してDNAをベクターに機能的に連結するために多様な方法が開発された。例えば、ベクターDNAに挿入されるべきDNAセグメントに相補的なホモポリマー列を付加することができる。続いて前記相補的ホモポリマーテール間の水素結合によって前記ベクターおよびDNAセグメントを結合させ、組換えDNA分子を形成する。
あるいは、1つ又は2つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーを用いて、上記で述べたようにDNAセグメントを発現ベクターに結合させることができる。前記合成リンカーは、平滑末端DNA分子の連結を触媒することができる酵素（例えばバクテリオファージT4DNAリガーゼ）の存在下で、大過剰の合成リンカー分子とともに平滑末端をもつDNAセグメントをインキュベートすることによって平滑末端DNAセグメントに結合させる。
したがって、反応生成物は、それらの末端に合成リンカー配列を有するDNAセグメントである。続いてこれらのDNAセグメントを適切な制限エンドヌクレアーゼで切断し、さらに、合成リンカーの末端と適合する末端を生じる酵素で切断しておいた発現ベクターと連結する。多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、多くの供給元（New England Biolabs（Beverly, MA）を含む）から市場で入手できる。所望のDNAセグメントはまたPCR技術を用いて入手することができる。前記技術では、遺伝子をベクターに挿入できるように、フォワードおよびリバースプライマーは増幅後に切断することができる所望の制限部位を含む。また別には、当分野で周知のように、PCR生成物は、T-オーバーハングを含むベクター（Promega Corp., A3600, Madison, WI）に直接クローニングすることもできる。
発現されたキメラタンパク質は、単細胞内であれ多細胞宿主の細胞内であれ自己会合して粒子を形成する。粒子を含む細胞は標準的な方法を用いて採集され、フレンチプレスセル、リゾチーム、ソニケーター、ビーズビーター又はミクロ液化装置（Microfluidics International Corp., Newton MA）を用いて溶解される。溶解物を清澄にした後、粒子を45％硫酸アンモニウムで沈殿させ、20mMのリン酸ナトリウム（pH6.8）に再懸濁し、同じ緩衝液に対して透析する。前記透析物質を簡単な遠心で清澄にし、上清をセファロース（Sepharose（登録商標））CL-4Bを用いてゲルろ過クロマトグラフィーに付す。粒子含有分画を特定し、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付し、硫酸アンモニウムで再度沈殿させ、その後で再懸濁、透析、滅菌ろ過し、-70℃で保存する。
【００７０】
HBcキメラ共役物
物質が化学的に（共有結合によって）付加されているキメラHBc粒子もまた本発明の部分を構成する。特に、HBV表面抗原に対応するペプチド配列をキメラ粒子に共有結合させることができる。非HBV配列もまたHBcキメラに有利に共役させることができる。あるいは、非ペプチド化合物を有利にHBcキメラ粒子に結合させることができる。そのような非ペプチド化合物にはオリゴヌクレオチド、糖類、免疫刺激性アルキル化糖類が含まれる。
任意の化学的に反応性の部分（ハプテン）を、目的のHBcキメラ又はキメラ粒子（例えばリジン、グルタミン酸若しくはアスパラギン酸、システイン又はチロシンのような異種リンカー残基をドメインIIのループ領域に含むキメラ粒子）に結合させることができる。問題の分子は典型的にはB細胞免疫原であるが、免疫系の特定のレセプター又は細胞にキメラを誘導することを目的とする免疫刺激性分子でよい。共有結合させるハプテンはポリペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、炭水化物（糖類、すなわちオリゴ糖又は多糖類）、又は非ポリペプチド、非炭水化物性化学物質（例えば2,4-ジニトロベンゼン）、又は医薬（例えばコカイン又はニコチン）でよい。
そのようにして形成させたHBcキメラ粒子共役物は、以下で考察されるように接種物又はワクチンとして有用である。キメラタンパク質は発現に際して自己会合し、更に共役物は発現後に形成されるので、共役物の生成は遊離タンパク分子に対して会合粒子を用いて実施される。
タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸残基側鎖を介して個々のハプテン分子を前記タンパク質又はポリペプチドと機能的に結合させ、ペンダント結合した免疫原性共役物（例えば分枝鎖ポリペプチドポリマー）を生成する方法は当業界では周知であり、PCT WO02/14478A2（2002年2月21日公開）に詳細に記載されている。
【００７１】
接種物及びワクチン
上記に記載した好ましくは粒状形の組換えHBcキメラ免疫原は、免疫原性効果量で、好ましくは水性である医薬的に許容できる担体組成物に溶解又は分散されて接種物又はワクチンが生成される。抗体の誘導が所望される宿主動物、又はB型肝炎ウイルスが慢性感染し、したがって免疫を必要としている宿主動物、例えば哺乳類（例えばマウス、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、サル、類人猿、又はヒト）又は鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、又はカモ）に投与したとき、接種物は添加された免疫原中に存在するB細胞エピトープ（例えばPre-S2 B細胞エピトープ）と免疫反応する抗体を誘導する。ワクチンでは、前記誘導された抗体はまた、in vivoでウイルス又はウイルス感染細胞と免疫反応（結合）し、インフルエンザ感染から宿主を防御すると考えられている。接種物は、免疫された宿主動物で活性化されたT細胞の産生を誘導することができるが、しかし前記活性T細胞は防御能を持たず、一方、ワクチンによって誘導された活性化T細胞は宿主を防御する。
したがって、インフルエンザに感染しない第二の宿主で抗体が誘導される場合のように、ある動物ではワクチンである接種物は別の宿主に対して接種物となることができる。本発明の事例では、HBVの慢性キャリアである患者は主として活性化T細胞により防御されると考えられている。
各免疫で用いられる組換えHBcキメラ免疫原の量は、免疫原性効果量と称され、下記で考察するように、とりわけ組換えHBcキメラ免疫原、免疫される動物宿主及びワクチン中のアジュバントの有無に応じて広範囲に変動することができる。ワクチンおよび接種物に対する免疫原性効果量によって、下記で考察される防御又は抗体活性がそれぞれ提供される。
【００７２】
ワクチン又は接種物は典型的には、1回の接種当り（ユニットドース）約１マイクログラムから約１ミリグラム、好ましくは約10マイクログラムから約50マイクログラム/ユニットドースの組換えHBcキメラ免疫原濃度を含む。マウスの免疫は典型的には10又は20μgのキメラ粒子を含む。
本発明の好ましい実施態様では、キメラHBc粒子又はペンダント結合ハプテンを有するキメラ粒子は、B型肝炎ウイルスに慢性感染した患者にT細胞活性化を誘導する態様で投与される。そのような処置は注射による反復投与を含む。もっとも好ましい投与方法には筋肉内又は皮下注射が含まれるが、また別の好ましい方法には皮内投与が含まれる。皮内投与は、例えばパウダージェクト・ファーマシューティカル（Powderject Pharmaceuticals, Plc, Oxford, England）が開発したような装置を用いて粒状物爆撃によって達成するか、又はパッチを用いて実施できる。
免疫原性粒子の投与に好ましいパッチは、長さが約50から約1000マイクロメートルの多数の小さな隆起部を有する。前記隆起部は表皮に浸透し、免疫原性粒子をパッチから皮膚へ伝達させるために役立つ。ランゲルハンス細胞のアクチベーターが好ましくは皮内投与と同時に投与される。アクチベーターには樟脳、ジメチルスルホキシド及びジフェニルフタレートが含まれる。投与が筋肉内又は皮下注射で実施される場合、キメラHBc分子粒子は好ましくはTh-1促進アジュバントの存在下で投与される。
患者はキメラ粒子を1回又は2回以上投与される。粒子の投与量はB型肝炎ウイルスに対するT細胞反応の強化が誘導されるように、好ましくは約10μgから約500μg、もっとも好ましくは約20μgから約100μgである。前記ウイルスに対する免疫反応の強化は、T細胞反応及び／又はB細胞反応によって測定できる。本発明の方法の成果は、HBVに対するこれら反応の一方又は両方が、患者の最初の治療前の反応と比較して強化されるということである。
【００７３】
本発明のいくつかの特徴では、免疫療法はHBsAg分子（Pre-S1及びPre-S2領域を含む）の全部又は部分を含む。これらの免疫は一緒に実施してもよいし、同日若しくはは別の日に別々に投与してもよいし、又は1つの免疫原で数回連続して免疫しその後で他の免疫原で数回免疫してもよい。
T細胞活性化は種々の技術によって測定することができる。通常の実施では、宿主動物は目的のHBcキメラ粒子ワクチン又は接種物を接種され、抹消単核血球（PMBC）がその後で採集される。続いて、前記PMBCをin vitroでT細胞免疫原の存在下で約3から5日間培養する。HBVに対するT細胞反応の場合は、T細胞免疫原はHBsAg、HBc又はそのフラグメントである。続いて、前記培養PMBCを増殖又はサイトカイン（例えばIL-2、GM-CSF又はIFN-γ）分泌についてアッセイする。T細胞活性化についてのアッセイは当分野では周知である。例えば米国特許5,478,726号および前記で引用された文献を参照されたい。
B細胞反応は抗体として測定される。HBVの場合には、抗表面抗原抗体（Pre-S1及びPre-S2領域を含む）の出現は免疫反応の強化を示す。
ワクチンは典型的には、1回の接種当り（ユニットドース）約１マイクログラムから約１ミリグラム、好ましくは約10マイクログラムから約50マイクログラム/ユニットドースの組換えHBcキメラ免疫原濃度を含む。“ユニットドース”という用語は、本発明のワクチン又は接種物に関する場合、動物に対する分割できない投与量として適切な物理的に分離されたユニットを指し、各ユニットは、必要な希釈剤（すなわち担体又はビヒクル）と一緒に所望の免疫誘導効果を個々に又は総合的に生じるように計算した予め定めた量の活性物質を含む。
【００７４】
ワクチンは、典型的には回収された組換えHBcキメラ免疫原から、前記免疫原、好ましくは粒状形の前記免疫原を、生理学的に寛容な（許容される）希釈ビヒクル（例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水（PBS）、酢酸緩衝食塩水（ABS）、5％マンニトール溶液、リンゲル液など）中で懸濁して水性組成物を形成することによって調製される。前記希釈ビヒクルはまた、以下で考察されるように油性物質、例えばピーナツ油、スクアラン又はスクアレンを含むことができる。ビヒクルはさらに以下で考察されるように免疫刺激分子を含むことができる。
活性成分としてタンパク質性物質を含むワクチンの調製もまた当分野ではよく理解されている。典型的にはそのようなワクチンは非経口薬として、溶液又は懸濁液のどちらかとして調製される。注射前の液体として溶液又は懸濁液に適した固形物もまた調製できる。前記調製物はまた乳濁させることもできる。
免疫原として活性な成分は、医薬的に許容できさらに前記活性成分と適合する賦形剤としばしば混合される。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど及び前記の組合せである。さらにまた、所望される場合は、接種物又はワクチンは、組成物の免疫原としての有効性を強化する微量の補助物質、例えば湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤を含むことができる。
有利には目的のワクチンはまたアジュバントを含む。本発明のワクチンおよび接種物のために適切なアジュバントは、キメラのB細胞エピトープに対する抗体反応を強化することができるアジュバントとともに、キメラに含まれるT細胞エピトープに対して細胞仲介応答を強化することができるアジュバントを含む。アジュバントは当分野で周知である（例えば以下を参照されたい：Vaccine Design-The Subunit and Adjubant Approach, 1995 Pharmaceutical Biotechnology, Vol.6, M.F. Powell and M.J. Newman, Plenum Press, New York and London, ISBN 0-306-44867-X）。
例示的なアジュバントには、完全フロイントアジュバント（CFA）（人間には使用されない）、不完全フロイントアジュバント（IFA）、スクアレン、スクアランおよびミョウバン(alum)（例えばアルヒドロゲル（Alhydrogel（登録商標））（Superfos, Denmark））が含まれる。これらは当分野ではよく知られた物質であり、いくつかの供給元から市販されている。
【００７５】
本発明の免疫原とともに使用するために好ましいアジュバントには、アルミニウム又はカルシウム塩（例えば水酸化物又はリン酸塩）が含まれる。本発明での使用に特に好ましいアジュバントは水酸化アルミニウムゲル、例えばアルヒドロゲル（登録商標）である。水酸化アルミニウムゲルの場合、キメラタンパク質は、単位投与量当たり約50から約800マイクログラム、好ましくは約400から約600マイクログラムのアルミニウムが存在するようにアジュバントと混合される。リン酸カルシウムナノ粒子（CAP）はバイオサンテ社（Biosante Inc., Lincolnshire, IL）によって開発されたアジュバントである。対象の免疫原は粒子の外側を被覆するか、又は内部の内側を被包化することができる（He et al. (Nov. 2000) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7(6):899-903）。
本発明の免疫原で使用されるまた別の特に好ましいアジュバントはエマルジョンである。本発明のエマルジョンは水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョンである。免疫原性キメラタンパク質粒子の他に、そのようなエマルジョンは、周知のようにスクアレン、スクアラン、ピーナツ油などの油相および分散剤を含む。非イオン性分散剤が好ましく、そのような物質には、ソルビタン並びにマンニドのモノ-およびジ-C12-C24-脂肪酸エステル、例えばソルビタンモノ-ステアレート、ソルビタンモノ-オレエートおよびマンニドモノ-オレエートが含まれる。免疫原含有エマルジョンは乳濁物として投与される。
【００７６】
好ましくは、そのようなエマルジョンは油中水エマルジョンであり、スクアレン、グリセロール及び界面活性剤、例えばマンニドモノ-オレエート（Arlacel（登録商標）A）を（場合によってスクアランとともに）含み、水相中でキメラタンパク質とともに乳化される。油相は好ましくは約0.1から約10％の、より好ましくは約0.2から約1％のワクチンを含む。油相のまた別の成分にはα-トコフェロール、混合鎖ジ-及びトリ-グリセリド並びにソルビタンエステルが含まれる。そのようなエマルジョンのよく知られた例には、モンタニド（Montanide（登録商標））ISA-720およびモンタニド（登録商標）ISA703（Seppic, Castres, France）が含まれる。これらは各々、スクアレンおよびスクアランの両方を含むと考えられ、いずれもスクアレンが優勢であるが、モンタニド（登録商標）ISA703では優勢の程度は低い。もっとも好ましくは、モンタニド（登録商標）ISA-720が用いられ、油対水の比は7：3（w/w）が用いられる。他の好ましい水中油エマルジョンアジュバントには、WO95/17210およびEP0399843に開示されたものが含まれる。
本明細書では小分子アジュバントの使用も包含される。本発明で有用な小分子アジュバントのあるタイプは、米国特許4,539,205号、同4,643,992号、同5,011,828号および同5,093,318号に記載された7-置換-8-オキソ-又は8-スルホ-グアノシン誘導体である（前記文献は参照により本明細書に含まれる）。これらの物質のうちで、7-アリル-8-オキソグアノシン（ロキソリビン）が特に好ましい。前記分子は抗原（免疫原）特異的応答の誘導に特に有効であることが示された。
【００７７】
好ましい有用なアジュバントには、モノホスホリル脂質A（MPL）、3-デアシルモノホスホリル脂質A（3D-MPL）が含まれ、これらは、コリキサ社（Corixa Corp., Seattle, WA）によって製造されている周知のアジュバントである（以前はリビイムノケム社（Ribi Immunochem, Hamilton, Montana）が製造していた）。前記アジュバントは、細菌から抽出された3つの成分［MPL（モノホスホリル脂質）＋TDM（トレハロースジミコレート）＋CWS（細胞壁骨格）］を2％スクアレン/トウィーン（Tween（登録商標））80エマルジョン中に含んでいる。このアジュバントはGB2122204Bに教示された方法によって調製することができる。3-デ-O-アシル化モノホスホリル脂質Aの好ましい形態は、直径が0.2μm未満の小粒子サイズを有するエマルジョンである（EP0689454B1）。
もっとも好ましいものは、アミノアルキルグルコサミド-ホスフェート（AGP）と称されるMPLと構造的に関連する化合物で、例えばコリキサ社からRC-529｛2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル-アミノ]-エチル-2-デオキシ-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-2-[(R)-3-テトラ-デカノイルオキシテトラ-デカノイル-アミノ]-p-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩｝の名称で入手できる。RC-529は、RC-529SEとしてスクアレンエマルジョンとして、さらにRC-529AFとして水性製剤でコリキサ社から入手できる（米国特許6,355,257号及び6,303,347号；米国特許6,113,918号；及びU.S. Publication No. 03-0092643を参照されたい）。
【００７８】
もっとも好ましいさらに別のアジュバントには、CpG（又はODN；フランキング配列とともに、CpGヌクレオチドモチーフを1回又は2回以上含むオリゴヌクレオチド）アジュバント（Coley Phamaceutical Groupから入手できる）；QS21と称されるアジュバント（Aquila Biopharmaceuticals, Inc.から入手できる）；SBAS2（今はASO2）（SKB（今はグラクソ-スミスクライン）から入手できる）（QS21及びMPLイオンを水中油エマルジョン中に含む）；米国特許4,767,842号に記載されたいわゆるムラミルジペプチド類似体；及びMF59（Chiron Corp.から入手できる）（米国特許5,709,879号および6,086,901号を参照されたい）が含まれる。
より具体的には、南アメリカの樹木、キラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）の樹皮に由来するアジュバント活性を有する免疫学的に活性なサポニン分画（例えばQuil（登録商標）A）もまた有用である。クィル（Quil(登録商標)）Aの誘導体、例えばQS21（Quil(登録商標)Aの誘導体のHPLC精製分画）及びその製造方法は米国特許5,057,540号に開示されている。QS21（QA21としてもまた知られている）の他に、他の分画（例えばQA17）もまた記載されている。
ムラミルジペプチドアジュバントには、N-アセチル-ムラミル-L-スレオニル-D-イソグルタミン（thur-MDP）、N-アセチル-nor-ムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン（CGP11637、nor-MDPと称される）、及びN-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトリル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)エチルアミン（（CGP）1983A、MTP-PEと称される）が含まれる。
好ましいアジュバント混合物にはさらに、3D-MPLとQS21との組合せ（EP0671948B1）、3D-MPLとQS21とを含む水中油エマルジョン（WO95/17210、PCT/EP98/05714）、他の担体との3D-MPL製剤（EP0689454B1）、コレステロール含有リポソーム中で製剤化されたQS21（WO96/33739）又は免疫刺激性オリゴヌクレオチド（WO96/01555）が含まれる。また別のアジュバントには、WO99/52549に記載されたもの及びポリオキシエチレンエーテルの非粒子状懸濁物（UK特許出願9807805.8）が含まれる。
【００７９】
（a）トール様レセプター4（TLR-4）に対するアゴニスト（例えばMPL(登録商標)）又は構造的に関連する化合物（例えばRC-529）又は脂質A模倣体、及び（b）トール様レセプター9（TLR-9）に対するアゴニスト、例えば非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド含有CpGモチーフの一方又は両方を含むアジュバントの使用が特に好ましい。上述の免疫原性HBc含有粒子又はそのような免疫原性HBcと化学的に結合させた粒子と医薬的に許容できる希釈剤中で混合し、及び適切な宿主動物（例えばB型肝炎ウイルスに慢性感染したヒト）を免疫すると、前記のようなアジュバントはγ-産生CD8+、CD4+ T細胞及び細胞毒性Tリンパ球の産生を前記免疫宿主において強化する。アラム（ミョウバン）もまた前記アジュバント混合物に存在することができる。最初の結果は、アラムはIgG1型の抗体産生を促すTh2免疫反応を強化する傾向にあり、一方、RC-529型のアジュバントはIgG2a及びIgG2b抗体の産生を促すTh1免疫反応並びにT細胞免疫原が存在するとき（HBc粒子が免疫原を含む場合のように）T細胞反応を促すことを示した。
もっとも好ましいアジュバント混合物は安定な油中水エマルジョンを含み、さらにアミノアルキルグルコサミンホスフェート（例えば米国特許6,113,918号に記載されたもの）を含む。アミノアルキルグルコサミンホスフェートのうち、RC-529｛2-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-エチル-2-デオキシ-4-O-ホスホノ-3-O-[(R)-3-テトラデカノイルオキシテトラデカノイル]-2-[(R)-3-テトラ-デカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-p-D-グルコピラノシドトリエチルアンモニウム塩｝として知られる分子がもっとも好ましい。好ましい油中水エマルジョンはWO9956776に記載されている。
【００８０】
好ましい使用方法では、アジュバント及び免疫原はキットの形で提供される。キットは、組換えによって作製された免疫原性キメラ粒子の容器、及びアジュバントの容器を含む。前記2つの容器の内容物は使用前に一緒に混合され、好ましくは患者への投与直前に混合される。もっとも好ましい使用方法では、組換えによって製造されたキメラ粒子は凍結乾燥ケーキとして提供される。前記凍結乾燥ケーキはアジュバントの水性製剤で再構成される。
アジュバントはアジュバント量で用いられ、前記の量は、前記アジュバント、動物および組換えHBcキメラ免疫原に応じて変動することができる。典型的な量は各免疫当たり約1μgから1mgで変動することができる。適切な濃度又は量は容易に決定できることは当業者には理解されよう。
ワクチンは、典型的には非経口投与のために製剤化される。例示的な免疫は皮下（SC）、筋肉内（IM）、静脈内（IV）、腹腔内（IP）又は皮内（ID）に実施される。他の投与方法に適したさらに別の製剤には座薬及び(いくつかの事例では)経口製剤も含まれる。接種のために鼻腔スプレーの使用もまた、文献（Neirynck et al. (Oct. 1999) Nature Med., 5(10):1157-1163）で考察されたとおり本発明に包含される。座薬のためには、伝統的な結合剤及び担体、例えばポリペプチドアルカレングリコール又はトリグリセルドを含むことができる。そのような座薬は、活性成分を0.5％から10％、好ましくは1−2％の範囲で含む混合物から生成することができる。経口製剤は通常用いられるような賦形剤、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。
ワクチン組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は散剤の形態を有し、活性成分として免疫原性効果量のHBcキメラ又はHBcキメラ共役物を、好ましくは粒子として含む。典型的な組成物では、好ましいHBcキメラ又はHBcキメラ共役物粒子の免疫原性効果量は、上記に記載したように、単位用量当たり活性成分が約1μgから約1mg、より好ましくは約5μgから約50μである。
【００８１】
HBcキメラ粒子およびHBcキメラ粒子共役物は中性又は塩の形でワクチンに製剤化することができる。医薬的に許容できる塩には酸付加塩が含まれ（タンパク質又はハプテンの遊離アミノ基により形成される）、無機酸（例えば塩酸、リン酸）又は有機酸（例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、リンゴ酸など）で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム若しくは鉄水酸化物）および有機塩基（例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導することができる。
さらに別の実施態様では、目的のHBcキメラをコードする遺伝子が適切に弱毒化された腸内細菌（例えば腸チフス菌、ネズミチフス菌、ネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッド又は大腸菌）にトランスフェクトされているワクチン又は接種物が包含される。例示的な弱毒化又は無毒化腸チフス菌およびネズミチフス菌およびネズミチフス菌-大腸菌ハイブリッドが上記で提供した引用文献で考察されている。これらのワクチンおよび接種物は特に、鼻粘膜、腸粘膜および生殖管を介して感染又は伝達される疾患（例えばインフルエンザ、酵母（例えばアスペルギルスおよびカンジダ）、ウイルス（例えばポリオ、口蹄疫、A型肝炎）および細菌（例えばコレラ、サルモネラおよび大腸菌）に対して使用するために、さらに粘膜IgA応答がIgG全身応答に加えて又は前記に代わって所望される場合に意図される。
腸内細菌は凍結乾燥し、医薬的に許容できる乾燥希釈剤と混合し、摂取のために錠剤又はカプセルにし、通常の固形医薬のように宿主動物に投与又は摂取させることができる。さらにまた、これら細菌ワクチンの水性調製物は、経口、鼻腔、直腸又は膣投与のように粘膜免疫で使用するために利用される。
【００８２】
目的のキメラ分子粒子を含む植物材料を用いる経口免疫は、トランスジェニック植物組織（例えば根（ニンジンのように）又は種子（例えば米またはコーン））の単純な摂取によって達成できる。この事例では、口又は腸管の水分は免疫に通常用いられる水性媒体を提供し、さらに周囲の植物組織は医薬的に許容できる希釈剤を提供する。
ワクチンは、投薬製剤に適合した態様および治療的に有効で免疫原量で投与される。投与されるべき量は、治療される対象者、対象者の免疫系の抗体合成能力、および所望される防御の程度に左右される。投与に要求される活性成分の正確な量は、医師の判定に依存し、各人に固有である。しかしながら、適切な投薬範囲は個体当たり数十マイクログラムの規模である。初回投与およびブースター注射のための適切な治療計画もまた変動可能であるが、典型的には初回投与に間隔をあけて（数週又は数ヶ月）その後の注射または別の投与が続く。
HBV感染個体で治療免疫反応を誘導するまた別の方法は、免疫原性キメラ粒子を患者の樹状突起細胞にex vivoで投与し、続いて前記樹状突起細胞を患者に戻すものであることを特に記載しておく。身体から樹状突起細胞を単離し、前記を抗原の存在下で培養する方法は当業界ではよく知られている（Nestle et al. (2001) Nature Medicine 7:761-765、及び前記文献中の引用文献）。
本発明のまた別の特徴は、したがってHBVに慢性感染した患者でHBcに対するT細胞反応を誘導する方法である。前記方法は、患者の身体から樹状突起細胞を単離し、前記樹状突起細胞を免疫原性キメラ粒子と接触させ、前記接触を維持して活性化樹状突起細胞を形成させ、場合によって樹状突起細胞をサイトカイン（例えばGMCSF）で刺激し、続いて前記活性化樹状突起細胞を患者に投与する工程を含む。
本発明は以下の非限定的実施例によって説明する。
【００８３】
実施例１
B細胞エピトープ含有キメラ調製物
Ａ．プラスミドベクターpKK223-3N、pKK223-3の改変型の調製
プラスミドベクターpKK223-3（Pharmacia）を唯一のNcoI制限部位を樹立することによって改変し、NcoI-HindIII制限フラグメントとしてHBc遺伝子の挿入及びその後の大腸菌宿主での発現を可能にした。pKK223-3プラスミドベクターを改変するために、新たにSphI-HindIIIフラグメントをPCRプライマーpKK223-3/433-452-F及びｐKK223-NcoI-mod-R、並びに鋳型としてpKK223-3を用いて作製した。このPCRフラグメントを制限酵素SphI及びHindIIIで切断して467bpのフラグメントを作製し、続いてこれをpKK223-3ベクターの4106bpフラグメントと連結して本来の480bpのSphI-HindIIIフラグメントと効率的に置換した。生成されたプラスミド（pKK223-3N）はしたがって親プラスミドよりも13bp短く、さらに導入されたNcoI部位（図1を参照されたい、図では点線が不在の塩基を示している）の上流に改変されたヌクレオチド配列を含んでいる。最終的なプラスミド、pKK223-3Nは4573bpのサイズを有する。プラスミドpKK223-3Nの制限部位は図1に示され、プラスミドpKK223-3Nを形成するためにpKK223-3に実施したヌクレオチドの変更は、下記に示すように下線で表示されている。
pKK223-3/433-452-F  
GGTGCATGCAAGGAGATG                                  配列番号:208
pKK223-NcoI-mod-R
GCGAAGCTTCGGATCccatggTTTTTTCCTCCTTATGTGAAATTGTTATCCGCTC
配列番号:209
【００８４】
Ｂ．V1及びV2クローニングベクターの調製
改変HBc遺伝子（合成dsDNAフラグメントの免疫優勢ループ領域への定方向性挿入を許容できる）はPCRを用いて構築した。［アミノ酸E77とD78との間に挿入を許容するプラスミドはV1と称され、一方アミノ酸D78とP7９との間に挿入を許容するプラスミドはV2と称される。］HBc149遺伝子は、2つのPCRプライマー（そのうちの１つはアミノ末端を増幅し、他方はカルボキシ末端を増幅する）を用いて2つの半分部分として増幅した。V1については、PCR反応の生成物（N-末端及びC-末端）は両者とも246bpフラグメントであり、V2については、生成物は249bp（N-末端）及び243bpフラグメント（C-末端）である。
調製したN-末端フラグメントをNcoI及びEcoRIで消化し、C-末端フラグメントをEcoRI及びHindIIIで消化した。V1及びV2フラグメント対を続いて共通のEcoRIオーバーハングで一緒に連結させた。続いて生成されたNcoI-HindIIIフラグメントをpKK223-3N（NcoI及びHindIIIによる消化によって準備してあった）に連結した。
B細胞エピトープをV1及びV2プラスミドに挿入するために、プラスミドをEcoRI及びSacI制限酵素で消化した。続いて、5'EcoRI及び3'SacIオーバーハングを含む合成dsDNAフラグメントを挿入した。V1及びV2の両事例において、グリシン-イソロイシン（EcoRI）及びグルタミン酸-ロイシン（SacI）アミノ酸対（前記制限部位によってコードされる）は挿入B細胞エピトープにフランキングしている。前記挿入された制限部位は下記のプライマーで下線を付されている。
【００８５】
V1
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                          配列番号:210
HBc-E77/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCTTCCAAATTAACACCCACC                     配列番号:211
HBc-D78/EcoRI-SacI-F
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCGATCCAGCGTCTAGAGAC            配列番号:212
HBc149/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                   配列番号:213
【００８６】
V2
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                          配列番号:210
HBc-D78/EcoRI-R
5'-GCGGAATTCCATCTTCCAAATTAACACCCAC                   配列番号:214
HBc-P79/EcoRI-SacI-F
5'-CGCGAATTCAAAAAGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG           配列番号:215
HBc149/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                   配列番号:213
【００８７】
N-末端システインおよび免疫優勢ループにP. ファルシパルム由来のCS-リピートエピトープを含むキメラ粒子を発現させるベクター
2つの発現ベクター［V2.Pf1(N-MGCELDP)およびV2.Pf1(N-MGCDIDP)］を調製して、N-末端システイン残基のキメラ粒子安定化能力を決定した。ベクターV2.Pf1(N-MGCELDP)を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBc(MGCELDP)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いてベクターV2.pf1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoIおよびHindIIIで切断し、pKK-223-3N（既に同じ2つの酵素で切断されている）に挿入する。
ベクターV2.Pf1(N-MGCDIDP)を作製するために、オリゴヌクレオチド、HBc(MGCDIDP)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いてベクターV2.pf1からハイブリッドHBc遺伝子を増幅させる。得られた528bpフラグメントをNcoI及びHindIIIで切断し、pKK-223-3N（既に同じ2つの酵素で切断されている）に挿入する。
HBc(MGCELDP)-NcoI-F
M  G  C  E  L  D  P  Y  K  E  F  G                  配列番号:216
5'-GCGCCATGGGGTGTGAGCTCGACCCTTATAAAGAATTTGG                 配列番号:217
HBc(MGCDIDP)-NcoI-F
M  G  C  D  I  D  P  Y  K  E  F  G                  配列番号:218
5'-GCGCCATGGGGTGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG                 配列番号:219
【００８８】
C．V7クローニングベクターの調製
T細胞エピトープをHBcキメラC-末端に融合させるために、新規なベクター、V7を構築した。固有のEcoRIおよびSacI制限部位をバリン149とHindIII部位との間に挿入し、合成dsDNAのEcoRI-HindIII（又はEcoRI-SacI）制限部位への定方向性挿入を容易にした。下記のPCRプライマー対を用いて、アミノ末端にNcoI制限部位並びにカルボキシル末端にEcoRI、SacIおよびHindIII部位を有するHBc149遺伝子を増幅させた。前記PCR反応生成物（479bp）をNcoI/HindIIIで消化し、pKK223-3NでクローニングしV7を作製した。
T細胞エピトープを挿入するために、プラスミド（V7）をEcoRI/HindIII（又はEcoRI-SacI）で消化し、EcoRI/HindIII（又はEcoRI/SacI）オーバーハングを有する合成dsDNAフラグメントをV7に連結した。全てのV7構築物について、天然のHBcの最後のアミノ酸（バリン149）及び挿入されるT細胞エピトープの最初のアミノ酸は、EcoRI制限部位を形成するヌクレオチドによってコードされるグリシン-イソロイシンの二ペプチド配列によって分離されている。EcoRI/SacIに挿入されるエピトープの場合、T細胞エピトープの後ろ、終止コドンの前にSacI部位によって提供される付加グルタミン酸-ロイシン残基が存在する。以下のプライマーでも制限部位に下線が付されている。
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                            配列番号:210
HBc149/SacI-EcoRI-H3-R
5'-CGCAAGCTTAGAGCTCTTGAATTCCAACAACAGTAGTCTCCG          配列番号:220
【００８９】
D．V12発現構築物の調製
V12ベクターをV2及びV7ベクターから構築する。V12ベクターは、アミノ酸78と79の間にB細胞エピトープを含むとともに、バリン149の下流にT細胞エピトープを含む。EcoRI/HindIIIに挿入されたT細胞エピトープを含むV7ベクターのカルボキシル末端を2つのPCRプライマー（HBc-P79/SacI-FおよびpKK223-3/4515-32R）を用いて増幅し、SacI及びHindIII制限部位によってフランキングされたアミノ酸79−149及びT細胞エピトープに対応するdsDNAフラグメントを提供する。
前記PCR生成物をSacIおよびHindIIIで切断し、続いて、同じ2つの酵素で切断して用意した所望のV2ベクターにクローニングする。前記PCRプライマーは、HBc遺伝子のアミノ酸149の後ろに存在するT細胞エピトープに関係なく、全てのV7遺伝子のカルボキシル末端の増幅に使うことができる。
このアプローチの普遍性の1つの例外は、Pf-CS（C17A）変異を含むV12構築物の調製の場合である（この構築物は既存のV12構築物から作製した）。この事例では、V12構築物はHBc149/NcoI-F（配列番号:180）及びミスマッチリバースPCRプライマー（配列番号:292）を用いて増幅した（これによりC17A変異が促進される）。得られたPCR生成物をNcoI及びHindIIIで消化し、pKK223-3N（先に同じ酵素で切断）で戻しクローニングした。制限部位には下線が付されている。
HBc-P79/SacI-F
5'-CGCGAGCTCCCAGCGTCTAGAGACCTAG                            配列番号:221
pKK223-2/4515-32R
5'-GTATCAGGCTGAAAATC                                       配列番号:222
【００９０】
Ｅ．V2に挿入されるP.ファルシパルムCS-リピートB細胞エピトープ
V2およびV7構築物のために、対象のB細胞（V2）又はT細胞（V7）エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントをEcoRI/SacI制限部位に挿入する。対象のB細胞及びT細胞エピトープをコードする合成dsDNAフラグメントは、相補性一本鎖DNAオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、95℃で5分加熱し、続いて-1℃/分の速度で室温に冷却することによって調製する。このアニーリング反応はTE緩衝液中で実施される。二本鎖DNAは、上部に示したコードされるエピトープ配列とともに下記に示されている。記号、＃、は、以下のアミノ酸配列のいくつかで終止コドンの存在を示すために用いられる。
Pf1
I  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGAACGCTA
TTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCTTGCGAT
N  P  E  L                         配列番号:223
ATCCGGAGCT                         配列番号:224
TAGGCC                             配列番号:225
Pf3
I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGAACGCTAATCCGA
TTGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCTTGCGATTAGGCT
N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  E  L      配列番号:226
ACGCTAATCCGAACGTTGACCCGAACGCTAATCCGGAGCT      配列番号:227
TGCGATTAGGCTTGCAACTGGGCTTGCGATTAGGCCTCGAGG    配列番号:228
Pf3.1
I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCC
TTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGG
N  A  N  P  E  L      配列番号:229
AAATGCGAACCCAGAGCT      配列番号:230
TTTACGCTTGGGTC          配列番号:231
Pf3.2
I  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V  D  P
AATTAACGCGAATCCGAATGCCAACCCTAACGCCAACCCAAACGTGGATCCGA
TTGCGCTTAGGCTTACGGTTGGGATTGCGGTTGGGTTTGCACCTAGGCT
N  A  N  P  E  L              配列番号:232
ATGCGAACCCAGAGCT              配列番号:233
TACGCTTGGGTC                  配列番号:234
Pf3.3
I  N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGCGAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAA
TTGCGCTTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTT
N  A  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  E  L      配列番号:235
ACGCCAACCCGAATGTTGACCCCAATGCCAATCCGGAGCT      配列番号:236
TGCGGTTGGGCTTACAACTGGGGTTACGGTTAGGCC          配列番号:237
Pf3.4
I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
N  P  N  V  E  L              配列番号:238
ACCCGAATGTTGAGCT              配列番号:239
TGGGCTTACAAC                  配列番号:240
Pf3.5
I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
N  P  N  V  D  P  E  L               配列番号:241
ACCCGAATGTTGACCCTGAGCT               配列番号:242
TGGGCTTACAACTGGGAC                   配列番号:243
Pf3.6
I  N  P  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A
AATTAATCCGAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCA
TTAGGCTTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGT
N  P  N  V  D  P  N  A  E  L              配列番号:244
ACCCGAATGTTGACCCTAATGCTGAGCT              配列番号:245
TGGGCTTACAACTGGGATTACGAC                  配列番号:246
Pf3.7
I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
N  V  E  L                      配列番号:247
ATGTTGAGCT                      配列番号:248
TACAAC                          配列番号:249
Pf3.8
I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
N  V  D  P  E  L               配列番号:250
ATGTTGACCCTGAGCT               配列番号:251
TACAACTGGGAC                   配列番号:252
Pf3.9
I  N  V  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTAACGTGGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGA
TTGCACCTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCT
N  V  D  P  N  A  E  L              配列番号:253
ATGTTGACCCTAATGCTGAGCT              配列番号:254
TACAACTGGGATTACGAC                  配列番号:255
Pf3.10
I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACC
CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGG
N  V  E  L                      配列番号:256
CGAATGTTGAGCT                      配列番号:257
GCTTACAAC                          配列番号:258
Pf3.11
I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTG
CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAAC
D  P  E  L                    配列番号:259
ACCCTGAGCT                    配列番号:260
TGGGAC                        配列番号:261
Pf3.12
I  D  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  A  N  P  N  V
AATTGATCCAAATGCCAACCCTAACGCTAATCCAAACGCCAACCCGAATGTTG
CTAGGTTTACGGTTGGGATTGCGATTAGGTTTGCGGTTGGGCTTACAAC
D  P  N  A  E  L              配列番号:262
ACCCTAATGCCGAGCT              配列番号:263
TGGGATTACGGC                  配列番号:264
【００９１】
Ｆ．P.ファルシパルム普遍的T細胞エピトープ
Pf-UTC（PF/CS326-345）
I  E  Y  L  N  K  I  Q  N  S  L  S  T  E  W  S  P
AATTGAATATCTGAACAAAATCCAGAACTCTCTGTCCACCGAATGGTCTCCGT
CTTATAGACTTGTTTTAGGTCTTGAGAGACAGGTGGCTTACCAGAGGCA
C  S  V  T  #  #            配列番号:265
GCTCCGTTACCTAGTA            配列番号:266
CGAGGCAATGGATCATTCGA        配列番号:267
【００９２】
P.ビバックスCS-リピートB細胞エピトープ
Pv-T1A
I  P  A  G  D  R  A  D  G  Q  P  A  G  D  R  A  A
AATTCCGGCTGGTGACCGTGCAGATGGCCAGCCAGCGGGTGACCGCGCTGCAG
GGCCGACCACTGGCACGTCTACCGGTCGGTCGCCCACTGGCGCGACGTC
G  Q  P  A  G  E  L              配列番号:268
GCCAGCCGGCTGGCGAGCT              配列番号:269
CGGTCGGCCGACCGC                  配列番号:270
Pv-T1B
I  D  R  A  A  G  Q  P  A  G  D  R  A  D  G  Q  P
AATTGACAGAGCAGCCGGACAACCAGCAGGCGATCGAGCAGACGGACAGCCCG
CTGTCTCGTCGGCCTGTTGGTCGTCCGCTAGCTCGTCTGCCTGTCGGGC
A  G  E  L               配列番号:271
CAGGGGAGCT               配列番号:272
GTCCCC                   配列番号:273
Pv-T2A
I  A  N  G  A  G  N  Q  P  G  A  N  G  A  G  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGGGCAAACGGCGCGGGTGATCAAC
CGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCCCGTTTGCCGCGCCCACTAGTTG
P  G  E  L                          配列番号:274
CAGGGGAGCT                          配列番号:275
GTCCCC                              配列番号:276
Pv-T2B
I  A  N  G  A  D  N  Q  P  G  A  N  G  A  D  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGATAATCAGCCGGGTGCAAACGGGGCGGATGACCAAC
CGCTTGCCGCGGCTATTAGTCGGCCCACGTTTGCCCCGCCTACTGGTTG
P  G  E  L                          配列番号:277
CAGGCGAGCT                          配列番号:278
GTCCGC                              配列番号:279
Pv-T2C
I  A  N  G  A  G  N  Q  P  G  A  N  G  A  G  D  Q
AATTGCGAACGGCGCCGGTAATCAGCCGGGAGCAAACGGCGCGGGGGATCAAC
CGCTTGCCGCGGCCATTAGTCGGCCCTCGTTTGCCGCGCCCCCTAGTTG
P  G  A  N  G  A  D  N  Q  P  G  A  N  G  A  D  D
CAGGCGCCAATGGTGCAGACAACCAGCCTGGGGCGAATGGAGCCGATGACC
GTCCGCGGTTACCACGTCTGTTGGTCGGACCCCGCTTACCTCGGCTACTGG
Q  P  G  E  L                          配列番号:280
AACCCGGCGAGCT                          配列番号:281
TTGGGCCGC                              配列番号:282
PV-T3
I  A  P  G  A  N  Q  E  G  G  A  A  A  P  G  A  N
AATTGCGCCGGGCGCCAACCAGGAAGGTGGGGCTGCAGCGCCAGGAGCCAATC
CGCGGCCCGCGGTTGGTCCTTCCACCCCGACGTCGCGGTCCTCGGTTAG
Q  E  G  G  A  A  E  L                  配列番号:283
AAGAAGGCGGTGCAGCGGAGCT                  配列番号:284
TTCTTCCGCCACGTCGCC                      配列番号:285
【００９３】
実施例２
アッセイ手順
Ａ．抗原性
１．粒子ELISA
精製粒子を被覆緩衝液（50mM重炭酸ソーダ、pH9.6）中で10μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した（50μL/ウェル）。前記ELISAストリップを室温で一晩インキュベートした（約18時間）。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水（PBS）、pH7.4、0.05％トゥイーン(Tween(登録商標))-20）で洗浄し、さらにPBS中の3％BSAで1時間ブロックした（75μL/ウェル）。ELISAストリップを乾燥状態で-20℃で必要になるまで保存した。
粒子の抗原性を決定するために、抗血清をPBS中の１％BSAを用いて希釈し、50μL/ウェルを抗原被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス(IgG)-HRP（The Binding Site, San Diego, CA; HRP=セイヨウワサビペルオキシダーゼ）共役物（50μL/ウェル）又は他の適切な抗体を30分用いて探索した。ELISA洗浄緩衝液で洗浄した後、前記反応物をTMブルー基質の添加によって（50μL/ウェル）可視化した。10分後に1NのH2SO4（100μL/ウェル）を添加して反応を停止させ、450nmに設定したELISAプレート読取装置で読み取った。
【００９４】
２．合成ペプチドELISA
20アミノ酸残基の合成ペプチド［(NANP)5］を被覆緩衝液（50mM重炭酸ソーダ、pH9.6）中で2μg/mLの濃度に希釈し、ELISAストリップのウェルを被覆した（50μL/ウェル）。一晩（約18時間）フード中で排気をオンにしてインキュベートすることによってウェル上でペプチドを乾燥させる。次の朝、前記ウェルをELISA洗浄緩衝液（リン酸緩衝食塩水（PBS）、pH7.4、0.05％トゥイーン(Tween(登録商標))-20）で洗浄し、さらにPBS中の3％BSAで1時間ブロックした（75μL/ウェル）。ELISAストリップを乾燥状態で-20℃で必要になるまで保存した。
粒子の抗原性を決定するために、抗血清（モノクローナル又はポリクローナル）をPBS中の１％BSAを用いて希釈し、50μL/ウェルを抗原被覆ELISAウェルに添加した。血清を1時間インキュベートし、ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、抗マウス(IgG)-HRP共役物（上記のように50μL/ウェルで）又は他の適切な抗体を30分用いて探索し、再度ELISA洗浄緩衝液で洗浄し、続いてTMブルー基質の添加（100μL/ウェル）によって可視化した。10分後に1NのH2SO4（100μL/ウェル）を添加して反応を停止させ、450nm に設定したELISAプレート読取装置で読み取った。
Ｂ．粒子の免疫原性
粒子の免疫原性をアッセイするために、フロイントの完全アジュバント中の粒子20μgでマウスをIPで免疫し、4週間してフロイントの不完全アジュバント中の10μgの粒子でブースター免疫した。マウスを2、4、6および8週で採血した。
【００９５】
Ｃ．熱安定性プロトコル
50mMのNaPO4（pH6.8）を用いて精製粒子を1mg／mLの濃度に希釈し、アジ化ナトリウムを最終濃度0.02％で添加して細菌の増殖を防ぐ。粒子を37℃でインキュベートし、所望の時点でアリコットを採取する。サンプルをSDS-PAGEサンプル緩衝液（還元性）と混合し、15％SDS-PAGEゲルで泳動する。クマシーブルーでゲルを染色してから分析する。
Ｄ．ハイブリッド粒子の分析用ゲルろ過による分析
分析用ゲルろ過による精製ハイブリッドHBc粒子の分析は25mLのスーパーロース（Superose(登録商標)）6HR 10/30クロマトグラフィーカラム（Amersham Pharmacia #17-0537-01）及びバイオカッド（BioCAD(登録商標)）スプリントパーフュージョンクロマトグラフィーシステム（SPRINT Perfusion Chromatography System）を用いて実施する。UV検出装置は260nm及び280nmの両方の波長をモニターできるように設定する。カラムを3カラム容積（CV；約75mL）の緩衝液（50mMのNaPO4（pH6.8））で流速0.75mＬ/分で平衡化させる。
50mMのNaPO4（pH6.8）を用いて分析しようとする粒子を1mg/mLの濃度に希釈する。続いて200マイクロリットル（μL）のサンプルを200μLのループにロードし、カラムに注入する。前記サンプルを50mMのNaPO4（pH6.8）で、流速0.75mL/分でカラムから溶出させる。280nmトレースの積分はバイオカッド（BioCAD(登録商標)）ソフトウェア（PerSeptive(登録商標)）を用いて実施し、結果が提供される。
【００９６】
実施例３
280：260吸収比の決定
リン酸緩衝食塩水（PBS）（pH7.4）を用いてタンパク質サンプルを0.1から0.3mg/mLの濃度に希釈する。PBSを用いて分光光度計のブランクを決定し、タンパク質サンプルの吸収を260nm及び280nmの波長で測定する。続いて、280nmで測定されたサンプルの吸収値を同じサンプルの260nmで測定された吸収値で割って、与えられたサンプルの280：260吸収比を決定する。前記吸収比をいくつかのサンプル（天然粒子（HBc183）、残基149位の後ろで末端短縮されたHBc粒子（HBc149）、及び本明細書のいずれかの場所で特定したいくつかのHBcキメラを含む）について得た。結果は下記の表8に示されている。完全長粒子ICC-1559は、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163）が最初に報告した粒子調製物であり、一方、完全長粒子ICC-1607は同様な粒子であるが、ポリペプチドの17位及び19位のM2ポリペプチドシステイン（配列番号:9のX17およびX19）がセリン残基に変異している。
表8
2007525421.tif 000003
【００９７】
実施例４
末端短縮HBc粒子のC-末端のシステイン
Ａ．ハイブリッドHBc粒子のC-末端へのシステイン残基の付加
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いてハイブリッドHBc粒子を発現する遺伝子を簡単に変異させ、N-末端に付加システインを含むHBcキメラのC-末端にシステイン又はシステイン含有ペプチドを導入することができる。例えば、配列番号:287をコードするPCRオリゴヌクレオチドプライマーを第二の適切なプライマーと協調的に用いて、ハイブリッドHBc遺伝子を増幅し、さらにコドンV149と終止コドンの間にシステインコドンを取り込ませることができる。例示的な構築物は以下で考察されるICC-1492と称されるものである。さらにまた、以下で考察されるV2.Pf1［N-M2(17-24/C19S)］の製造も参照されたい。
肝炎Bコア粒子は183（又は185、ウイルスのサブタイプによる）から140まで末端短縮することができ、会合して球状ウイルス様粒子を形成する能力を維持することができる。アミノ酸150はアルギニン富裕C-末端ドメインの最初のアルギニン残基を表しているので、多くのグループがアミノ酸149まで末端短縮された粒子を用いた。
【００９８】
実施例５
インフルエンザM2構築物
最近、Neirynckら（Nature Med. 5(10):1157-1163 (1999)およびWO99/07839）は、M2の24アミノ酸残基の細胞外ドメインの完全長HBc粒子（HBc183）（アミノ酸残基1−4を欠く）のN-末端への融合を報告した。本明細書でIM2HBcと称する前記構築物の模式図は下記に示されている。前記模式図では前記24merはHBcのN-末端と連結されている。
IM2HBc
MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-HBc(5-183)        配列番号:286
ある例示調製物では、M2エピトープは肝炎Bコアの免疫優勢ループに挿入され、ICC-1475と称される粒子が良好に発現され、さらに前記のような挿入および精製について上記で考察した技術を用いて精製された。M2エピトープの変異型（M2の天然の17位および19位の2つのシステイン残基がアラニン残基によって置換されている）もまた免疫優勢ループ中で発現され（ICC-1473粒子）、生じた粒子が精製された。これら2つの粒子を下記に模式的に示す。
ICC-1475
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-EL-HBc(79-149)    配列番号:287
ICC-1473
HBc(1-78)-GI-SLLTEVETPIRNEWGARANDSSD-EL-HBc(79-149)-C  配列番号:288
【００９９】
ICC-1473粒子構築物は、天然の配列（ICC-1475）と比較したとき約7倍多い精製粒子を生じさせた。システイン残基の変異が粒子の潜在保護能力を変化させたのか否かは決定されていない。しかしながら、HBcの免疫優勢ループに送達されたエピトープは、それらが他の領域（N-末端を含む）に融合された場合と比較して通常は顕著に免疫原性を示し、生じる粒子は抗HBc免疫原性の低下を示す。
M2のN-末端24merエピトープがC-末端短縮肝炎Bコア粒子のN-末端と融合された粒子も調製されている。前記構築物（ICC-1438）はまたN-末端プレコア配列（配列番号:289）を含んでいた。ハイブリッドタンパク質（ICC-1492）の末端（この事例ではHBc遺伝子のVal-149の直後）にただ1つのシステイン残基を含む同様な構築物を調製した。これらの構築物を下記に模式的に示す。
ICC-1438
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)     配列番号:289
ICC-1492
MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGI-HBc(2-149)-C   配列番号:290
本来の開始メチオニンからの翻訳開始を防止するために、前記残基のコドンはイソロイシンのコドンに変異させられていることを述べておく。EcoRI（GI）およびSacI（EL）制限部位によって付与された残基には下線が付されている。プレコア配列は下線を付されたEL残基と“-HBc(2-149)”の間に列挙されている。
本明細書の別の箇所で述べたSDS-PAGEによる分析では、ICC-1438モノマー構築物（レーン2）はICC-1492（レーン3）と比較して調製時に不安定であることが示され、図10のSDS-PAGEゲルでHBc149（レーン1）、ICC-1475（レーン4）及びICC-1473（レーン5）が更なる分子量コントロールとして機能している。ICC-1438モノマーの不安定性は粒子の解析的ゲルろ過を用いた場合明瞭ではなかった。
ICC-1475（図10、レーン4）及びICC-1473（図10、レーン5）は、いずれもICC-1438及びICC-1492よりもわずかに小さな分子量を有すると期待された。なぜならば、前者の2つは免疫優勢ループに直接挿入されたM2エピトープを含み、したがってICC-1438及びICC-1498に存在するプレコア配列（配列番号:259）を欠くからである。期待通り、ICC-1492はICC-1475及びICC-1473よりも大きかったが、ICC-1438（ICC-1492と同一であるが、C-末端のシステイン残基を確保している）は、明白な切断のためにICC-1475及びICC-1473より明瞭には大きくはない。
HBcのN-末端（ドメインI）又はループ（ドメインII）に連結された、以前に考察したM2のN-末端細胞外配列を含み、さらにまた、HBcのC-末端（ドメインIV）にシステイン残基を含む構築物もまた意図される。
【０１００】
免疫優勢ループ融合を含むハイブリッドHBc粒子のアミノ末端を改変してシステイン残基、および最小M2-由来配列を取り込むために、一連の合成オリゴヌクレオチドを合成する。V2.Pf1(N-M2(17-24/C17S))を作製するために、オリゴヌクレオチドM2(17-24/C17S)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いて、ベクターV2.Pf1のハイブリッドHBc遺伝子を増幅する。得られた546bpフラグメントをNcoIおよびHindIIIで切断し、pKK223-3N（同じ2つの酵素によってその前に切断されている）に挿入する。
V2.Pf1(N-M2(17-24/C19S))を作製するために、オリゴヌクレオチドM2(17-24/C19S)-NcoI-F及びHBc149/HindIII-Rを用いて、ベクターV2.Pf1のハイブリッドHBc遺伝子を増幅する。得られた540bpフラグメントをNcoIおよびHindIIIで切断し、pKK223-3N（同じ2つの酵素によってその前に切断されている）に挿入する。
M2(17-24/C17S)-NcoI-F
M  G  S  R  C  N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E
GGCGCCATGGGGTCTAGATGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGA 
F  G                                  配列番号:291
ATTTCG                                配列番号:292
M2(17-24/C19S)-NcoI-F
M  G  C  N  D  S  S  D  I  D  P  Y  K  E  F  G
GCGCCATGGGGTGTAACGATTCAAGTGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGG 
配列番号:293
配列番号:294
【０１０１】
実施例６
N-およびC-末端の両システイン残基を含む又は含まないHBcキメラ分子
C-末端が残基149で末端短縮されたHBcのN-末端で、又はN-末端近くでペプチド結合したインフルエンザAの残基1−24 、M2タンパク質を含む一連のHBcキメラ分子含有粒子を調製した。前記成分のキメラタンパク質分子は、M2配列又は変種を含む種々のN-末端配列を含み、さらにいくつかはC-末端システイン残基を含んでいた。
以下の表9に挙げた全ての精製粒子を解析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、精製後の粒子状構造の維持を評価した。ICC-1603と称される粒子（N-末端システイン残基を含まない）は、亜粒子状構造への解離を示す証拠を提示した（図３）。その理由は、タンパク質が1500秒という数地域で溶出したからである（粒子はほぼ1000秒で溶出する）。
粒子ICC-1590（N-末端M2配列の2つのセリン残基がシステイン残基に変異していることを除いてICC-1603粒子と同様である）の同様な分析で、前記構築物は精製後に粒状構造を維持することが示され、溶出は約1000秒で生じ、これはハイブリッド粒子にとって典型的である（図4）。ICC-1590粒子については解離の証拠は存在しなかった。
ICC-1560粒子（そのキメラタンパク質もまた2つのN-末端システイン残基を有する）の解析により、ICC-1560粒子もまた精製後に粒子状化することを示したが、ある程度の解離も示し（図5）、安定性はICC-1590粒子ほどは強固でないことを示唆した。ICC-1590とICC-1560粒子のN-末端配置の比較（以下の表11）によって、ICC-1560粒子の2つのシステイン残基の相対的な位置は、3つのアミノ酸残基（DEL）の欠失のためにICC-1590粒子と比較して3アミノ酸残基だけシフトしていることが示された。このことは、システイン残基は、最適な架橋を可能にするためにコア遺伝子の開始部から最小限の距離に存在することが必要であろうということを示している。
【０１０２】
実施例７
M2またはM2変種配列およびC-末端システイン残基を含む粒子
ICC-1603粒子は図3に示されているように精製後迅速に解離した。ICC-1605粒子を構成するHBcキメラ分子は、ICC-1605の成分キメラ分子がただ1つのC-末端安定化システインを有することを除いてICC-1603粒子の分子と類似する。C-末端システイン残基のICC-1603への付加がより高い安定性をタンパク質に付与することができるか否かを決定するために、ICC-1605粒子の発現を誘導するプラスミドを作製した。精製の後で、解析的サイズ排除クロマトグラフィーを用いてICC-1605粒子を分析した（図６）。
この実験の結果によって、粒子の安定化はICC-1603粒子の場合よりも完全であるが、ICC-1590粒子よりも不完全であることが示された（ICC-1590粒子は2つのアミノ末端システイン残基を含みC-末端安定化システインを含まない）。顕著な量のICC-1605は粒子構造のままであったが、広い範囲にわたって溶出する亜粒子構造をもつ不均質な混合物の存在を示す証拠があった。これらの観察は、このハイブリッド粒子（ICC-1603）の場合、ICC-1605で見出されるようなC-末端安定化は、ICC-1590粒子で見出されるN-末端安定化よりも不完全であることが考えられる。
ハイブリッド粒子のアミノ末端およびカルボキシ末端システインの安定化の合体の両立性を調べるために、ICC-1604粒子の発現を指令する発現プラスミドを構築した。ICC-1604粒子の成分キメラ分子は、（ICC-1590のように）天然のM2ポリペプチド配列に存在する2つのアミノ末端安定化システイン残基、および、（ICC-1605のように）C-末端安定化システインを含む。ICC-1604粒子の分析によって、前記粒子は精製後均質な粒子状態を維持することが示され（図７）、このことは前記2つの安定化の方法は補完的であり、互いに協調的に用いられることを示している。
HBcのN-末端とN-末端システイン残基との間のまた別のリンカー配列をICC-1438粒子及びICC-1492粒子を用いて調べた。これら粒子は両方とも、アミノ酸配列ELLGWLWGIDI（配列番号:265）をM2融合部とHBcのアミノ酸D4との間に含んでいる。前記配列のC-末端側の9つのアミノ酸残基はHBcのプレコア配列のアミノ酸-6からHBcのアミノ酸I3に由来し、この位置から翻訳が開始するのを防ぐためにHBcの開始コドンはイソロイシンに変異させてある（これは本実験との妥協案である）。HBプレコア配列は-7位にシステインを含んでいる。
これらの粒子は、ICC-1438成分キメラ分子はHBcの149位で終了するが、ICC-1492の成分キメラ分子はHBcの149位で終了し、配列番号:1のHBcに対応する150位に末端システインを含むという点でのみ相違していた。また別の方法であるが上記で考察したものと類似の方法（それによれば粒子は約10分で溶出する）を用いて解析的ゲルろ過によって分析したとき、両構築物は精製後に粒子状態であることが示された（ICC-1438は図8に、ICC-1492は図10に示されている）。この実験により、末端短縮粒子のアミノ末端およびカルボキシル末端システインによる安定化の両立性、並びにアミノ酸配列における実質的変動およびN-末端システイン残基とHBc遺伝子の開始部との間の距離に対する寛容性が示された。
【０１０３】
表9
2007525421.tif 000004
【０１０４】
下記の表10は、HBeAg並びにICC-1590、ICC-1560、ICC-1603、ICC-1604及びICC-1605と称される粒子のN-末端の配置を明らかにするアラインメントを示している。配列は、全ての構築物が共有する配列番号:1のHBcのN-末端のアミノ酸残基4位からアラインメントされている。N-末端のシステイン残基には（存在する場合）下線が付されている。
表10
構築物の名称 配列 配列番号
HBeAg                       SKLCLGWLWGMDID                          295
ICC-1590/ICC-1604           MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELD             296
ICC-1560                    MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD                 24
ICC-1603/ICC-1605           MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSDELD             297
ICC-1438/ICC-1492           MGISLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDELLGWLWGIDID  298
【０１０５】
下記の表11は、N-末端インフルエンザA M2配列または考慮された変種を含む粒子の安定性を評価した結果の一覧を提供する。表に示されているように、安定な粒子は、N-末端システイン残基を、配列番号:1のHBc配列のN-末端に対してマイナス14（-14）位から自身のN-末端付近の位置に含むHBcキメラ分子から生成されている。
表11
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【０１０６】
実施例８
部分的に末端短縮されたHBc粒子：部分的末端短縮粒子を発現させる発現ベクターの合成
部分的に末端短縮されたHBcを発現させる発現プラスミドの調製のために、単一のアミノ末端オリゴヌクレオチドPCRプライマー（HBc149/Nco-I-F）を固有のC-末端プライマーと一緒に用いた。例えば、HBc156（E.Cr；ICC-1600粒子）発現プラスミドを調製するために、プライマーHBc149/NcoI-F及びHBc156(E.cR)-H3-Rを用いてHBc156(E.cR)+C（ICC-1601粒子）発現プラスミドを調製した。使用した全てのプライマーの配列は下記に示されている。
粒子の末端短縮（及びいくつかの事例ではC-末端システイン残基の取り込み）の他に、大腸菌での発現に最適なコドンも使用した。いくつかのアルギニンコドン（特にAGA及びAGG）は大腸菌では稀にしか利用されず、翻訳時にポリペプチド合成を失速させて未成熟な終了をもたらすので、大腸菌での効率的なタンパク質の発現にとって問題であると考えられている。HBcの150から183の間の16のアルギニンのうち、7つは稀なAGAコドンによってコードされ、2つは極めて稀なAGGコドンによってコードされている。したがって、本実験では、全てのAGA及びAGGコドンを大腸菌によってより頻繁に用いられるコドンで置換した。前記稀なアルギニンコドンの連続置換を可能にするために、HBc156遺伝子を先ず初めに合成し（ICC-1600及びHBc156+C ICC-1601粒子）、続いてHBc163構築物のための鋳型として用い（ICC-1634及びHBc163+C ICC-1632粒子）、HBc163構築物をその後でHBc171構築物のための鋳型として用い（ICC−1642及びHBc171+C ICC-1643粒子）、最後にHBc171構築物をアルギニンコドン最適化HBc182及びHBc183構築物のための鋳型として用いる。非最適化HBc182構築物（ICC-1575）もまた対照の目的で製造した。全てのPCR生成物を制限酵素NcoI及びHindIII制限酵素で切断し、発現ベクターpKK223-3N（上記に記載したように同じ酵素切断されている）でクローニングする。
アミノ末端プライマー配列（NcoI制限部位には下線が引かれている）：
HBc149/NcoI-F
5'-TTGGGCCATGGACATCGACCCTTA                            配列番号:210
カルボキシ末端プライマー配列（HindIII制限部位には下線が引かれている）：
HBc156(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCTCCGG
配列番号:299
HBc156C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACAAGGGGAGCGGCCTCGTCGACGAACAACAGTAGTCT-
CCGG                                               配列番号:300
HBc163C(E.cR)-H3-R  5'-GCGAAGCTTACTAACAAGGCGAGGGAGTGCGCCGACGAGGGGAGCGGCCTCG 
配列番号:301
HBc171(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
配列番号:303
HBc171C(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACACGGCGATTGAGAGCGTCGACGGCGAGGCGAGGGAGT
配列番号:304
HBc183(E.cR)-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCGAGATTGAGATCGCCGGCGACGCGG-
CGATTGAGAGCGTC            配列番号:305
HBc182-H3-R
5'-GCGAAGCTTACTATTGAGATTCCCGAGATTGA                             配列番号:306
HBc183-H3-R
5'-GGAAAGCTTACTAACATTGAGATTCCCG                                 配列番号:307
HBc149/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                              配列番号:213
HBc149+C/HindIII-R
5'-CGCAAGCTTACTAGCAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG                        配列番号:308
【０１０７】
実施例９
粒子製剤
コリキサ（Corixa）529-SEによる製剤化
組換え肝炎Bコア粒子溶液は精製後ろ過滅菌する。所望の用量の免疫原性粒子（典型的には0.02から0.2mg）を含む特定量の溶液をバイアルに加える。コリキサ529-SE（コリキサ社（Corixa Corp., WA）から入手できる）を所望の濃度（典型的には0.01から0.2mg）で添加し、さらに食塩水を添加して体積を1mlにする。得られた混合物を撹拌して実質的に均一にする。
アルヒドロゲル及びコリキサRC-529との製剤化
コリキサRC-529（典型的には0.02から0.2mg；コリキサ社（Corixa Corp., WA）から入手できる）を水酸化アルミニウムゲル（1mg）に添加する。続いて精製した組換え免疫原性キメラ粒子を添加し（典型的には0.02から2mgの用量で）、食塩水を加えて体積を1mLとする。得られた混合物を攪拌して実質的に均質にする。
【０１０８】
本明細書に引用した特許及び文献はそれぞれ参照により本明細書に含まれる。英文中で冠詞“a”又は“an”の使用は1つ又は2つ以上を意味する。
先行の記述及び実施例は例示を目的とし、限定と解されるべきではない。本発明の範囲内でなお他の変型が可能であり、当業者にはそれらの変型は明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図1A及び図1Bとして２つのパネルで示された、6種のウイルスに由来する哺乳類HBcタンパク質の6種の公表された配列のアラインメントを示す。第一の（配列番号:1）ヒトウイルスの配列はaywサブタイプであり、Galibertら（Nature 281:646-650（1983））に公表されている。第二のヒトウイルスの配列（配列番号:2）adwサブタイプはOnoら（Nucleic Acids Res. 11(6):1747-1757 (1983)）に公表されている。第三のヒトウイルスの配列（配列番号:3）はadw2サブタイプであり、Valenzuelaら（Animal Virus Genetics, Field et al. eds., Academic Press, New York (1980) pages 57-70）に公表されている。第四のヒトウイルスの配列はadywサブタイプであり、Pasekら（Nature 282:575-579 (1979)）に公表されている。第五の配列（配列番号:5）はウッドチャックのウイルスの配列で、Galibertら（J. Virol. 41:51-65 (1982)）に公表されている。第六の哺乳類の配列（配列番号:6）は地上リスの配列で、Seegerら（J. Virol. 51:367-375）に公表されている。
【図２】本明細書で組換えHBcキメラの作製のために用いたプラスミドベクターpKK223-3Nの調製に際して市販のプラスミドベクターpKK223-3に施した改変を示す。改変された配列（配列番号:7）は市販されているベクター（配列番号:8）の配列の下に示されている。付加されたNcoI部位の塩基は小文字で示され、さらに付加された塩基は二重下線で示されている。一方、欠失塩基は点線で示されている。本配列のこのセグメントに存在する2つの制限部位（NcoI及びHindIII）が表示されている。
【図３】ICC-1603粒子の解析用サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルである。このプロフィルでは、280nmの吸収は縦座標に、時間（秒）は横座標に示されている。
【図４】図3で述べたように、ICC-1590粒子の解析用サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルである。
【図５】図3で述べたように、ICC-1560粒子の解析用サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルである。
【図６】図3で述べたように、ICC-1605粒子の解析用サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルである。
【図７】図3で述べたように、ICC-1604粒子の解析用サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルである。
【図８】図3で述べたように、ICC-1438粒子の解析用サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルである。
【図９】図3で述べたように、ICC-1492粒子の解析用サイズ排除クロマトグラフィーの溶出プロフィルである。
【図１０】粒子調製後の還元条件下におけるSDS-PAGE分析の写真である。図は、ICC-1438モノマー構築物（レーン2）は、ICC-1492構築物（レーン3）と比較してエージング後に不安定であることを示している。HBc-149（レーン1）、ICC-1475（レーン4）及びICC-1473（レーン5）はさらに別の分子量対照として用いられている。
【図１１】PCT/US01/25625（ICC-102.2）から引用した（I）及び（II）の2つの連続反応を示す反応工程図である。（I）スルホ-スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン1-カルボキシレート（スルホ-SMCC）を用いてキメラ肝炎Bコアタンパク質（sm-HBc）粒子にハプテンをペンダント結合させるための活性化担体を形成し、続いて（II）スルフヒドリル末端を有する（システイン末端を有する）ハプテンを前記活性化担体と結合させて共役粒子を形成する。（図を簡明にするために）sm-HBc粒子はただ1つのペンダントアミノ基を有する枠として示され、一方、スルフヒドリル末端を有するハプテンはSH基で終わる線として示されている。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年1月18日(2007.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子を含むワクチンであって、
前記免疫原性粒子が組換え肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質分子を含み、
前記キメラタンパク質分子は長さが550までのアミノ酸残基であって、
（i）HBc配列の残基4位から75位まで及び85位から140位までを含むHBc分子のN-末端165アミノ酸残基の少なくとも125残基のHBc配列を含み、
（ａ’）キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、及びC-末端の1つ又は2つ以上でペプチド結合した免疫原性エピトープ、又は
（ｂ’）長さが1から40のアミノ酸残基であって化学的に非反応性の異種アミノ酸残基を含むHBc免疫優勢ループ内の挿入、を含み、
（ii）以下の（ａ’）および（ｂ’）の一方または両方を含み：
（ａ’）HBcプレコア配列の配列以外の配列中の配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から+１に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に存在する1つから3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、および、
（ｂ’）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端方向に、キメラ分子のC-末端から30残基内にある1つから3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、
前記キメラ分子が、
（ａ’）HBc配列内に20％を超える保存的に置換されたアミノ酸残基を含まず、
（ｂ’）宿主細胞内で発現すると自己会合して実質的に核酸と結合しない粒子を形成し、
前記粒子は、上記C-末端システイン残基、又はN-末端システイン残基のいずれも含まないか又は目的のキメラ分子に存在するC-末端若しくはN-末端システイン残基が別の残基に置換されているがその他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である、
前記ワクチン。
【請求項２】
組換えHBcキメラタンパク質分子がさらに、免疫原性エピトープ又は1以上の化学的に非反応性の異種アミノ酸残基を含む１〜40アミノ酸残基を有する挿入が結合した場所とは異なる場所で、前記キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、又はC-末端でペプチド結合した免疫原性T細胞エピトープを含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
C-末端システイン残基の少なくとも1つが存在する請求項２記載のワクチン。
【請求項４】
アミノ酸残基76と85位の間のHBc配列が存在するが、1以上の化学的に非反応性の異種アミノ酸残基を含む１〜40アミノ酸残基を有する挿入によって中断される、請求項１記載のワクチン。
【請求項５】
医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子の免疫原性効果量を含むワクチンであって、
前記免疫原性粒子が、170から250アミノ酸残基の長さを有し、N-末端からドメインI、II、III及びIVと称される4つのペプチド結合アミノ酸残基配列ドメインを含む組換え肝炎Bウイルスコア（HBc）タンパク質キメラ分子を含み、
（a）ドメインIは、HBcの4位から75位までの残基の配列とともに前記配列のアミノ末端HBc残基とペプチド結合した25残基までの第一の配列を含み、前記25までの残基配列は、配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-14位から+１に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に0又は1つのシステイン残基［N-末端システイン残基］を含み；
（b）ドメインIIは、ドメインIのHBc残基番号75とペプチド結合した5から55アミノ酸残基を含み、1以上の化学的に非反応性の異種アミノ酸残基を含む、HBcの76位から85位に対して異種である40アミノ酸残基までの第２の配列にペプチド結合した、HBcの76位から85位の配列中の少なくとも4つの残基が存在し、；
（c）ドメインIIIは、ドメインIIの残基85にペプチド結合した86位から135位までのHBc配列であり；さらに
（d）ドメインIVは、
（i）ドメインIIIの135位の残基にペプチド結合した、136位から149位までのHBcアミノ酸残基配列の5から14残基、
（ii）キメラ分子のC-末端の30残基内の0又は1つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、及び、
（iii）165位からC-末端までのHBcにとって異種である第三の配列中の0から50アミノ酸残基を含み、
前記キメラ分子は、
（i）宿主細胞内で発現すると自己会合して粒子を形成し、
（ii）前記N-末端システイン残基又はC-末端システイン残基の少なくとも一方又は他方を含み、および、
（iii）配列番号:1のHBc配列に示された配列と比較して、5％を超えないアミノ酸残基がキメラのHBc配列中で置換されているアミノ酸残基配列を有し、
前記粒子が1.2から1.7の280nm対260nm吸収比を示し、さらに、キメラ分子に存在する前記N-末端システイン残基若しくはC-末端システイン残基を欠くか、又はキメラ分子に存在する前記N-末端システイン残基若しくはC-末端システイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である、
前記ワクチン。
【請求項６】
肝炎Bウイルスに対抗するガンマ-産生CD8+、CD4+ T細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球の1つ又は2つ以上の産生を強化するための組成物であって、
医薬的に許容できる希釈剤に溶解又は分散させた免疫原性粒子を含むワクチンを含み、
前記希釈剤が（a）トール様レセプター4（TLR-4）に対するアゴニスト及び（b）トール様レセプター9（TLR-9）に対するアゴニストの一方又は両方を含み、
前記免疫原性粒子が組換え肝炎Bコア（HBc）キメラタンパク質分子を含み、
前記キメラタンパク質分子は、長さが550までのアミノ酸残基であって、
（i）HBc配列の残基4位から75位及び85位から140位までを含む、HBc分子のN-末端165アミノ酸残基の少なくとも125残基のHBc配列を含み、
さらに、
（ａ’）キメラのN-末端、HBc免疫優勢ループ内、及びC-末端の1つ又は2つ以上にペプチド結合した免疫原性エピトープ、又は
（ｂ’）長さが1から40アミノ酸残基であって1以上の非反応性異種アミノ酸残基を含む挿入、
をHBc免疫優勢ループ内に含み、
（ii）以下の（ａ’）および（ｂ’）の一方または両方を含み：
（ａ’）HBcプレコア配列の配列以外の配列で配列番号:1のHBc配列のN-末端からアミノ酸-20位から+１位に対応するキメラ分子のアミノ酸位置に存在する1つから3つのシステイン残基［N-末端システイン残基］、及び
（ｂ’）HBc配列のC-末端残基からキメラ分子のC-末端方向にあって、キメラ分子のC-末端から30残基内にある1つから3つのシステイン残基［C-末端システイン残基］、
前記キメラ分子は、
（ａ’）HBc配列内に20％を超える保存的置換アミノ酸残基を含まず、
（ｂ’）宿主細胞内で発現すると自己会合して実質的に核酸と結合しない粒子を形成し、
前記粒子は、上記に記載したC-末端システイン残基、又はN-末端システイン残基のいずれも含まないか又は目的のキメラ分子に存在するC-末端若しくはN-末端システイン残基が別の残基に置換されているが、その他の点では同一であるHBcキメラ分子から形成された粒子よりも安定である、
前記組成物。
【請求項７】
TLR-4のアゴニストが構造的にモノホスホリル脂質Aと関連する、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
構造的にモノホスホリル脂質Aと関係を有するアゴニストがアミノアルキルグルコサミドホスフェートである、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
TLR-4アゴニスト及びTLR-9アゴニストの一方又は両方が医薬的に許容できる希釈剤及び免疫原性粒子と混合される、請求項６記載の組成物。