(57)【要約】  オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたコード化金属ナノ粒子およびそれらの使用方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド（発蛍光団を含むもの）を含むコード化された金属ナノ粒子。
【請求項２】
金、銀、および白金からなる群より選択される少なくとも1つの金属を含む、請求項1のコード化された金属ナノ粒子。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドが、チオール結合を介して、コード化された金属ナノ粒子と結合している、請求項1のコード化された金属ナノ粒子。
【請求項４】
コード化された金属ナノ粒子の表面からオリゴヌクレオチドを引き離すスペーサー基をさらに含む、請求項1のコード化された金属ナノ粒子。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドがヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項1のコード化された金属ナノ粒子。
【請求項６】
複数タイプの粒子を含むコード化された金属粒子の集成体であって、各粒子は10nm〜50μmの長さであり、かつ複数のセグメントから構成され、前記タイプの少なくとも1つは、前記セグメントの配列に基づいて、前記タイプの他の1つと弁別可能であり、各粒子がオリゴヌクレオチド（発蛍光団を含むもの）を含む、コード化された金属粒子の集成体。
【請求項７】
前記タイプの少なくとも1つが、光学的手段、電気的手段、物理的手段、化学的手段または磁気的手段によって、前記タイプの他の1つと弁別可能である、請求項6のコード化された金属粒子の集成体。
【請求項８】
前記タイプの少なくとも1つが、光学的手段によって、前記タイプの他の1つと弁別可能である、請求項7のコード化された金属粒子の集成体。
【請求項９】
前記タイプの少なくとも1つが、反射率差によって、前記タイプの他の1つと弁別可能である、請求項8のコード化された金属粒子の集成体。
【請求項１０】
前記粒子のそれぞれが2〜50個のセグメントを含み、各粒子の長さが1〜15μmであり、各粒子の幅が30nm〜2μmであり、セグメントの長さが50nm〜10μmである、請求項6のコード化された金属粒子の集成体。
【請求項１１】
他の1タイプとは異なるオリゴヌクレオチドを含むタイプを少なくとも1つは含む、請求項6のコード化された金属粒子の集成体。
【請求項１２】
ナノ粒子を製造する方法であって、
a）コード化された金属ナノ粒子を用意すること、
b）コード化された金属ナノ粒子にオリゴヌクレオチドをコンジュゲートすること
を含む方法。
【請求項１３】
前記オリゴヌクレオチドが遊離チオール基を含み、前記コンジュゲーションが金属-硫黄結合の形成を含む、請求項12の方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが発蛍光団を含む、請求項12の方法。
【請求項１５】
コンジュゲーションを評価することをさらに含む、請求項12の方法であって、前記評価が
a）コード化された金属ナノ粒子にコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチドを用意すること、
b）発蛍光団からの蛍光を刺激することができる光を、コード化された金属ナノ粒子に照射すること、
c）コード化された金属ナノ粒子から伝えられる蛍光を検出すること、
を含み、蛍光の増加によってコンジュゲーションが示される方法。
【請求項１６】
オリゴヌクレオチドが配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドである、請求項12の方法。
【請求項１７】
標的核酸を検出する方法であって、
a）オリゴヌクレオチド（発蛍光団を含むもの）を含むコード化された金属ナノ粒子を用意すること、
b）標的核酸を、オリゴヌクレオチドを含むコード化された金属ナノ粒子と、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させること、および
c）ハイブリダイゼーションを検出すること
を含む方法。
【請求項１８】
前記ハイブリダイゼーションが蛍光の増加によって検出される、請求項17の方法。
【請求項１９】
前記ハイブリダイゼーションの検出がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行なわれる、請求項17の方法。
【請求項２０】
標的核酸を基準核酸と比較する方法であって、
a）標的核酸および基準核酸を、オリゴヌクレオチド（発蛍光団を含むもの）を含むコード化された金属ナノ粒子と、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で接触させること、
b）標的核酸とのハイブリダイゼーションレベルおよび基準核酸との第2ハイブリダイゼーションレベルを決定すること、ならびに
c）第1ハイブリダイゼーションレベルと第2ハイブリダイゼーションレベルとを比較して、標的核酸と基準核酸の間の類似点または相違点を決定すること
を含む方法。
【請求項２１】
前記ハイブリダイゼーションが蛍光の増加によって検出される、請求項20の方法。
【請求項２２】
前記ハイブリダイゼーションの検出がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行なわれる、請求項20の方法。
【請求項２３】
ポリヌクレオチドを検出する方法であって、
a）試料ポリヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド（発蛍光団を含むもの）を含むコード化された金属ナノ粒子と接触させること、
b）発蛍光団からの蛍光を刺激することができる光を、コード化された金属ナノ粒子に照射すること、
c）コード化された金属ナノ粒子から伝えられる蛍光を検出すること、
d）試料ポリヌクレオチドとコード化された金属ナノ粒子の間のハイブリダイゼーションの程度に関する情報を、そのハイブリッドから放射される蛍光の量に基づいて取得すること
を含む方法。
【請求項２４】
前記ハイブリダイゼーションが蛍光の増加によって検出される、請求項23の方法。
【請求項２５】
前記ハイブリダイゼーションの検出がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で行なわれる、請求項23の方法。
【請求項２６】
複数の標的核酸を検出する方法であって、
a）複数タイプの粒子を含むコード化された金属粒子の集成体（各粒子は10nm〜50μmの長さであり、かつ複数のセグメントから構成され、前記タイプの少なくとも1つは、前記セグメントの配列に基づいて、前記タイプの他の1つと弁別可能であり、各粒子がオリゴヌクレオチド（発蛍光団を含むもの）を含む集成体）を用意すること、
b）複数の標的核酸を、ハイブリダイゼーションが可能な条件下で、コード化された金属粒子の集成体と接触させること、
c）ハイブリダイゼーションを検出すること、および
d）ハイブリダイゼーションを示すコード化された金属粒子のタイプを同定すること
を含む方法。
【請求項２７】
複数のポリヌクレオチドを検出する方法であって、
a）試料ポリヌクレオチドを、複数タイプの粒子を含むコード化された金属粒子の集成体（各粒子は10nm〜50μmの長さであり、かつ複数のセグメントから構成され、前記タイプの少なくとも1つは、前記セグメントの配列に基づいて、前記タイプの他の1つと弁別可能であり、各粒子がオリゴヌクレオチド（発蛍光団を含むもの）を含む集成体）と接触させること、
b）発蛍光団からの蛍光を刺激することができる光を、コード化された金属粒子の集成体に照射すること、
c）コード化された金属ナノ粒子から伝えられる蛍光を検出すること、
d）試料ポリヌクレオチドとコード化された金属ナノ粒子の間のハイブリダイゼーションの程度に関する情報を、そのハイブリッドから放射される蛍光の量に基づいて取得すること、
e）ハイブリダイゼーションを示すコード化された金属粒子のタイプを同定すること
を含む方法。
【請求項２８】
試料中の目的核酸配列の存在を検出するためのキットであって、オリゴヌクレオチド（（発蛍光団を含むもの）を含むコード化された金属ナノ粒子、適切な包装手段、および当該キットの1以上の構成要素を保持するための1以上の容器を含むキット。
【請求項２９】
請求項23の方法を行なうための説明書をさらに含む、請求項28のキット。
【請求項３０】
以下の1以上をさらに含む、請求項28のキット：
DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、リボヌクレオチド三リン酸またはデオキシリボヌクレオチド三リン酸（標識物または非標識物）、標識試薬、検出試薬、緩衝剤。
【請求項３１】
請求項6の集成体と、以下の1以上とを含むキット：
包装手段、集成体を使用するための説明書、集成体の1以上の構成要素を保持するための1以上の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は分子生物学、特に核酸ハイブリダイゼーション、および標的核酸を同定するためのプロトコールである。
【背景技術】
【０００２】
生物学的アッセイにおける検出法としての蛍光消光の使用は普及しており、これには1996年に初めて記述された技術である分子ビーコンの使用が含まれる。Tyagi,S.およびKramer,F.R.「Molecular Beacons: probes that fluoresce upon hybridization（分子ビーコン：ハイブリダイゼーション時に蛍光を発するプローブ）」Nature Biotechnol. 1996,14，303-308。通例、分子ビーコンには、発蛍光団レポーター色素および非蛍光性消光剤発色団が用いられる。近接している場合、発蛍光団は非蛍光性発色団へのエネルギー移動によって消光される。しかし発蛍光団と消光剤とを引き離すと、蛍光シグナルが生じる。分子ビーコンは、例えば核活動の監視、病原体の検出およびSNP検出などといった様々なアッセイフォーマットで使用されている。
【０００３】
分子ビーコンなどの蛍光エネルギー移動系を使ったアッセイでは、標的核酸を標識する必要がなく、標的核酸を当該アッセイの他の構成要素から分離する必要もない。例えば、RT-PCRにおける標的配列の増幅をサイクルごとに監視するために、蛍光消光が使用されている。
【０００４】
分子ビーコンの消光は、一般に、非蛍光性発色団4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（DABCYL）を使って達成される。有機発蛍光団が金属表面に極めて近接した時に消光が起こる場合もある。Lakowicz,J.R.「Radiative Decay Engineering: Biophysical and Biomedical Applications（放射崩壊工学：生物物理学および生物医学への応用）」Anal. Biochem. 2001，298，1-24。金属の存在は、発蛍光団の蛍光量子収率を変化させることができる代替的無放射エネルギー減衰経路になる。蛍光は、近距離（＜50オングストローム）では消光されるが、中距離（75〜100オングスローム）では増強される。この現象はローダミン色素の蛍光を消光するAg薄膜およびAu薄膜に関して数多く記録されている。
【０００５】
Au表面に連結すると、発蛍光団は適切に機能し、消光するだろう。Du,H.，Disney,M.，Miller,B.およびKrauss,T.「Hybridization-Based Unquenching of DNA Hairpins on Au Surfaces: Prototypical ”Molecular Beacon” Biosensors（Au表面でのDNAヘアピンのハイブリダイゼーションに基づく脱消光：プロトタイプ”分子ビーコン”バイオセンサー）」J. Am. Chem. Soc. 2003，125，4012-4013を参照されたい。Auコロイド上での消光型発蛍光団アッセイは、一塩基ミスマッチを持つオリゴヌクレオチドを区別することができる。Maxwell,D.J.，Taylor,J.R.およびNie,S.「Self-assembled nanoparticle probes for recognition and detection of biomolecules（生体分子を認識および検出するための自己集合性ナノ粒子プローブ）」J. Am. Chem. Soc. 2002，124，9606-9612、Dubretret,B.，Calame,M.およびLibchaber,A.J.「Single-mismatch detection using gold-quenched fluorescent oligonucleotides（金消光型蛍光オリゴヌクレオチドを使った単一ミスマッチ検出）」Nature Biotechnol. 2001，19，365-370を参照されたい。この作用が可能であるのは、蛍光色素がコロイドAg上およびコロイドAu上に可逆的に吸着するからである。Nie,S.およびEmory,S.R.「Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface-Enhanced Raman Scattering（表面増強ラマン散乱による単一分子および単一ナノ粒子のプロービング）」Science 1997，275，1102-1106、Krug,J.T.,II，Wang,G.D.，Emory,S.R.およびNie,S.「Efficient Raman Enhancement and Intermittent Light Emission Observed in Single Gold Nanocrystals（単一金ナノ結晶で観察される効率のよいラマン増強およ間欠発光）」J. Am. Chem. Soc. 1999，121，9208-9214。オリゴヌクレオチドが一本鎖である場合、それらは柔軟性を持ち、Au表面に引きつけられることで、環状構造を形成することができる。しかしハイブリダイズした場合、二本鎖になったオリゴヌクレオチドは、蛍光色素が表面と相互作用できないほどに堅い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
DNAを調査し、塩基の配列を決定するために利用できるアッセイは、数多く存在する。これらのアッセイは、一度に何百もの塩基のデノボDNA配列決定から、SNP検出の場合のように一塩基の調査まで、さまざまである。これらのアッセイの大部分では、調査対象の細胞または生物学的抽出物中に同様に存在する何千もの分子および事象の中から、特定の生成物または事象を同定するために、ラベルが必要である。質量分析法や核磁気共鳴分光法など、天然分子を直接検出することができる解析技術も少しは存在するが、これらは多くの場合、非常に特殊な試料調製、著しく精巧で高価な装置を必要とし、複雑な生化学的バックグラウンドの下では役に立たない場合も多い。したがって複雑な生物学的系では、通例、目的の分子をアッセイするべく、それを「可視」化するための何らかの方法で、目的の分子が標識される。生物学で用いられる一般的なラベルには、放射能、有機発蛍光団および量子ドットなどがある。しかし、調査対象分子を標識することで、追加ステップが必要になるので、アッセイにはある程度の複雑さが加わり、その結果として、アッセイを適正かつ一貫して行なうことが困難になり、「キット」化または製品化が困難になり、そしてアッセイを屋外携帯可能にし、頑強にすることが困難になる。したがって、標識ステップを必要としないアッセイがあれば、望ましいだろう。
【０００７】
多重化により、2以上の測定を同時に行なうことが可能になる。これには数多くの利点がある。測定値を集めるための時間と費用を削減することができる。多くの場合、測定値を獲得するのに必要な試料の量も減らすことができる。さらに重要なことに、複数の実験にわたってデータを確実に比較することができるようになる。そのうえ多重化は、複数の内部対照を組み込むことにより、測定結果に信頼性を加えることができる。したがって、マルチプレックス解析に使用することができるアッセイがあれば、望ましいだろう。
【０００８】
現在使用されている多くのアッセイは、DNA配列決定に用いられる超並列キャピラリー電気泳動装置やRT-PCR用の専門リーダーなどといった専門装置を必要とする。しかし多くの場合、単一の実験に向けられた専用の装置は、費用、人員および/またはスペース上の理由から実行可能でないだろう。例えば第一対応者部隊（First Responder Unit）の移動分析検査室（Mobile Analytical Laboratories：MAL）はバイオテロの可能性がある現場に召集される。MALは、GC-MS、びらん性因子を検出するための浸漬試験試薬類、放射能を検出するための線量計、空気捕集器、PCRサーモサイクラーおよび炭疽菌やペストなどの病原体をリアルタイムRT-PCRによって検出するための試薬類、ならびにCDCなどの機関に画像を電子メールするために無線接続されたカメラに連結された蛍光顕微鏡を装備しうる。もし追加の専門機器が必要になるのであれば、そのような部隊で追加のアッセイを行なうことはできない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、金属表面による蛍光消光を使ってDNAを検出するための、粒子に基づく多重化可能な診断アッセイを提供する。本発明は、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド（例えばDNA、RNA）を検出するためのマルチプレックス診断アッセイも提供する。
【発明の効果】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、非専門装置で行なうことができる簡単なアッセイを提供する。本アッセイはマルチプレックスフォーマットで実行しうる。本アッセイは、例えば病原体監視、環境監視、健康管理診断など、数多くの分野に有用であり、食品媒介病原体検出の分野（field food-borne pathogen detection）にも有用である。本発明は「ラベルフリー」の多重化可能なDNA解析アッセイを可能にするものであり、専用および専門の解析用装置を必要としない。本発明は、検査室に基づかない環境で、技師ではない操作者によって、より多数の解析をより迅速に行なうことを可能にする。さらに、本アッセイは高い特異性および感度を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
「ある（aまたはan）」実体という用語は、1以上の当該実体を指すことに留意すべきである。例えば、あるタンパク質とは、1以上のタンパク質または少なくとも1つのタンパク質を指す。したがって「ある（aまたはan）」「1以上の（one or more）」および「少なくとも1つの（at least one）」という用語は、本明細書では、互換的に使用することができる。また、「含む（comprising）」「包含する（including）」および「持つ（having）」という用語も互換的に使用できることに留意すべきである。本明細書で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはそれらの任意の組合せで構成される短いポリマーを指す。これらのオリゴヌクレオチドは少なくとも5ヌクレオチド長であるが、約20〜約100ヌクレオチド長であってもよい。一定の実施形態では、オリゴヌクレオチドが、発蛍光団を包む検出可能なラベルと接合される。
【００１２】
本発明のアッセイの典型的なマルチプレックス実施形態では、各ナノバーコード（Nanobarcodes）粒子「フレーバー（flavor）」（すなわち特定のコード化がなされた各粒子）が、異なるオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされ、そのオリゴヌクレオチドは蛍光色素で標識される。どのオリゴヌクレオチドプローブが、一意的にコード化されたどの粒子に取り付けられているかという記録を、保存しておく。DNA（または他の標的ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド）をアッセイに添加すると、1以上のナノバーコードフレーバーにコンジュゲートされた相補配列とのハイブリダイゼーションが起こる。その結果生じるハイブリッドは比較的堅く、発蛍光団を表面から離れさせるので、発蛍光団はもはや消光されなくなる。蛍光顕微鏡を使って解析すると、消光されていない発蛍光団を持つナノバーコード粒子は明るく見え、他のナノバーコード粒子は暗く見えるだろう。明るいナノバーコード粒子のフレーバーのデコーディングにより、どのDNA配列が存在したかが示される。
【００１３】
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、少なくとも、所望の標的ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（これらの一方または両方を本明細書では「標的核酸」と呼ぶものとする）に相補的な一本鎖核酸配列と、シグナルを生成するための検出可能なラベルとを含む。一部のオリゴヌクレオチドは、標的相補配列が標的に結合していない時に検出条件下で互いにハイブリダイズすることによって可逆的に相互作用する相補的核酸配列または「アーム（arm）」を含む。これらのオリゴヌクレオチドを「ヘアピン」オリゴヌクレオチドという場合もある。ヘアピンオリゴヌクレオチドについては本明細書の他の項で説明する。検出可能なラベルが発蛍光団である場合、オリゴヌクレオチドは分子ビーコンである（または分子ビーコンと同様に機能する）ことができる。分子ビーコンは、ステム-ループ（ヘアピン）構造を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブである。分子ビーコンでは、通例、発蛍光団レポーター色素および非蛍光性消光剤発色団が使用される。近接している場合、発蛍光団は非蛍光性発色団へのエネルギー移動によって消光される。しかし発蛍光団と消光剤とを引き離すと、蛍光シグナルが生じる。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドでは、コード化された金属ナノ粒子を、非蛍光性消光剤として利用する。
【００１４】
使用するオリゴヌクレオチドがヘアピンオリゴヌクレオチドである必要はない。一本鎖DNAは柔軟な主鎖を持つので、DNAはコンフォメーション的に柔軟である。過去の研究により、多くの蛍光色素は、金表面および銀表面に自発的に吸着することが示されている。したがってその場合、オリゴヌクレオチドは、その一端を、コード化された金属粒子にコンジュゲートすると共に、他端にはそのコード化された金属粒子の表面に近接する発蛍光団を持たせることができ、この場合、DNAは金属粒子の表面と接触するのではなく、アーチ様の構造を形成する。ヘアピン（「ステム-ループ」）構成および非ヘアピン（「アーチ形」）構成はどちらも本発明の範囲に包含される。本明細書ではナノバーコード粒子に関して好ましい実施形態を説明するが、本発明はそのように限定されるわけではない。本発明の範囲は、例えば金属製のナノバーコード粒子、または1以上の金属セグメントを持つナノバーコード粒子など、任意のコード化された金属粒子、またはコード化可能な金属粒子に及ぶ。
【００１５】
本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートコード化金属粒子には多くの用途がある。それらは、例えばリアルタイムPCR検出、一塩基突然変異スクリーニング、対立遺伝子識別、すなわちホモ接合体とヘテロ接合体との弁別、例えば組織または血液試料中の一定のウィルスまたは細菌の存在および存在量を検出するためにオリゴヌクレオチドコンジュゲートコード化金属粒子をPCRと共に使用することができるような臨床診断アッセイなど、通常の分子ビーコンが使用されてきた状況で使用することができる。これらの方法は当業者には周知である。
【００１６】
2つの異なる病原体を弁別するには簡単なマルチプレックスアッセイ（2プレックス）を使用しうる。図1を参照して述べると、縞模様パターンが異なる2つのナノバーコード粒子を使用する。第1粒子10は、病原体A由来のDNAに相補的な第1プローブオリゴヌクレオチド30にコンジュゲートする。第2粒子11は、病原体B由来のDNAに相補的な第2プローブオリゴヌクレオチド31にコンジュゲートする。プローブオリゴヌクレオチドは、粒子への取付けヶ所から離れた部分で蛍光色素で標識する。第1プローブオリゴヌクレオチドは第1蛍光色素40で標識し、第2プローブオリゴヌクレオチドは第2蛍光色素41で標識される。通例、第1蛍光色素および第2蛍光色素は同じであり、検出ステップは単一の波長で行なわれる。しかし、別の実施形態では、第1蛍光色素および第2蛍光色素が異なる。
【００１７】
病原体A由来のDNA 50を添加すると、病原体DNAと相補配列30の間でハイブリダイゼーションが起こる。その結果生じるDNA構造60は堅く、それゆえに、発蛍光団40を第1粒子10の消光表面20から引き離すことになる。蛍光に基づく顕微鏡で解析すると、一方の粒子は消光されていない蛍光のために明るく見え、他方の粒子はその蛍光が消光されるので暗く見えるだろう。反射率モードを使うことで、明るい粒子の縞模様パターンを見分けることができる。このようにして、明るい粒子は第1粒子10と同定され、それに応じて、病原体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは第1オリゴヌクレオチド20と同定されるだろう。ナノバーコードパターンは非常に数多く存在しうるので、標的核酸を標識しなくても、単一の蛍光色素だけを使って、非常に高い多重化が可能になる。
【００１８】
図4に記載の代替実施形態。上述のように、ナノバーコード粒子10は、発蛍光団40で標識されるプローブオリゴヌクレチド30にコンジュゲートされる。しかしこの場合は、消光剤分子70がオリゴヌクレオチド30に導入されていて、ナノバーコード粒子10の金属表面はもはや消光剤としては必要でなく、コード化された固体支持体として使用されるに過ぎないようになっている。病原体A由来のDNA 50を添加すると、病原体DNAと相補配列30の間でハイブリダイゼーションが起こる。その結果生じるDNA構造60は堅く、それゆえに、発蛍光団40を粒子10の消光分子70から引き離すことになる。蛍光に基づく顕微鏡で解析すると、粒子は消光されていない蛍光のために明るく見える。反射率モードを使うことで、明るい粒子の縞模様パターンを見分けることができる。このようにして、明るい粒子は、第1粒子10と同定され、それに応じて、病原体にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは第1オリゴヌクレオチド20と同定される。
【００１９】
ナノバーコード［Nanobarcodes（登録商標）］粒子は、電気化学産業から取り入れた電気メッキ法を使って製作される、コード化可能で、機械可読で、耐久性を持つ、サブミクロンサイズの縞状金属ロッドである。この技術の威力は、隣り合った金属ストライプの反射率の相違によって粒子が本質的にコード化されることである。図1を参照されたい。本発明の実施形態では、金属表面を標識するために、適切なコード化金属粒子をどれでも使用することができる。ある実施形態では、粒子が、セグメント化されたマイクロスケールまたはナノスケールの粒子、例えば米国特許出願第09/677,198号「Assemblies Of Differentiable segmented Particles（弁別可能なセグメント化された粒子の集成体）」および米国特許出願第09/677,203号「Methods of Manufacturing Colloidal Rod Particles as Nanobar Codes（ナノバーコードとしてのコロイド状ロッド粒子の製造方法）」（どちらも2000年10月2日に出願されたものであり、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているものなどである。これらの粒子をナノバーコード［Nanobarcodes（登録商標）］粒子と呼ぶ。
【００２０】
ナノバーコード粒子は、一つには、そのサイズによって、そして少なくとも2つのセグメントの存在によって、規定される。粒子の長さは10nm〜50μmであることができる。一部の実施形態では、粒子の長さが500nm〜30μmである。別の実施形態では、本発明の粒子の長さが1〜15μmである。本発明の粒子の幅または直径は5nm〜50μmの範囲内にある。一部の実施形態では幅が10nm〜1μmであり、別の実施形態では幅または横断面寸法が30〜500nmである。
【００２１】
ナノバーコード粒子はしばしば「ロッド」状であるといわれる。しかし、長軸に沿って見た粒子の横断面形状は任意の形状を持つことができる。ナノバーコード粒子は少なくとも2つのセグメントを備え、多ければ50個ものセグメントを備える。一部の実施形態では、粒子は2〜30個のセグメントを持ち、最も好ましくは3〜20個のセグメントを持つ。粒子は異なる2〜10タイプのセグメント、好ましくは異なる2〜5タイプのセグメントを持ちうる。粒子のセグメントは、それをその粒子の隣接セグメントと区別できるということによって規定される。
【００２２】
上述のように、ナノバーコード粒子は少なくとも2つのセグメントが存在することを特徴とする。セグメントとは、何らかの手段によって、その粒子の隣接領域と識別可能である粒子の一領域を示す。好ましい実施形態では、セグメントが異なる材料で構成され、セグメントは粒子の長さに沿った組成の変化によって区別できる。特に好ましい実施形態では、セグメントが異なる金属で構成される。粒子のセグメントは、粒子の長さを二分して、粒子全体と（概ね）同じ横断面および幅を持つと共に、粒子全体の長さの一部に相当する領域を形成する。一部の実施形態では、あるセグメントはその隣接セグメントとは異なる材料で構成される。しかし、全てのセグメントが、その粒子の他の全てのセグメントと区別できる必要があるわけではない。例えば、ある粒子は2タイプのセグメント（例えば金と白金）で構成されるが、単に金と白金のセグメントを交互に並べるだけで、10個、さらには20個の異なるセグメントを備えることができるだろう。本発明の粒子は少なくとも2つのセグメントを含有し、多ければ50個ものセグメントを含有する。粒子は2〜30個のセグメントを持つことができ、別の実施形態では、3〜20個のセグメントを持ちうる。粒子は異なる2〜10タイプのセグメント、好ましくは異なる2〜5タイプのセグメントを持ちうる。コード化された基材としてナノバーコード粒子を用いる利点は、高度に多重化される可能性（例えば3つの金属の9ストライプ＝約10,000通りの組合せ）である。撮像された粒子のアイデンティティ（同定）を極めて高レベルの正確さで迅速にデコード（解読）するソフトウェア（NBSeeＴＭソフトウェア）が開発されている。一部の実施形態では、本明細書に提案するアッセイを解析するために、NBSeeソフトウェアを使用する。
【００２３】
粒子のセグメントは、それをその粒子の隣接セグメントと区別できるということによって規定される。セグメント同士を区別する能力には、任意の物理的または化学的調査手段、例えば電磁気的、磁気的、光学的、分光測定的、分光学的および機械的手段などによる区別が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一定の実施形態では、セグメント間を調査する方法は光学的方法（反射率）である。
【００２４】
隣接セグメントは、それらが何らかの手段で区別可能である限り、同じ材料でできていてもよい。例えば、同じ元素材料の異なる相、または有機ポリマー材料のエナンチオマーは、隣り合ったセグメントを構成することができる。さらに、単一の材料から構成されるロッドも、例えば表面の機能化によって、または様々な直径を持たせることによって、セグメントを他のセグメントと区別できるのであれば、ナノバーコード粒子とみなすことができるだろう。また、有機ポリマー材料を含む粒子も、セグメントの相対的光学特性を変化させるであろう色素の包含によって規定されるセグメントを持つことができるだろう。本発明の一定の実施形態では、粒子が「機能化」される（例えばIgG抗体またはオリゴヌクレオチドで覆われた表面を持つ）。そのような機能化は、選択したセグメントもしくは全てのセグメント、粒子の本体または粒子の一端もしくは両端に施すことができる。機能化は実際にセグメントを覆うか、粒子全体を覆うことができる。そのような機能化には、例えば抗体、抗体断片、またはオリゴヌクレオチドなどの有機化合物、無機化合物、およびそれらの組合せが含まれうる。そのような機能化は、検出可能なタグであるか、検出可能なタグに結合するであろう化学種を含んでもよい。機能化の例は本明細書に記載する。一部の実施形態では、粒子の機能単位または機能化は検出可能なタグを含む。検出可能なタグは、検出、同定、計数、追跡、位置特定、位置三角測量および/または定量に使用することができる任意の化学種であることができる。そのような測定は、1個以上の光子の吸収、放出、生成および/または散乱、1個以上の粒子の吸収、放出、生成および/または散乱、質量、電荷、ファラデーまたは非ファラデー電気化学特性、電子親和力、プロトン親和力、中性子親和力、または他の任意の物理的もしくは化学的特性、例えば溶解度、分極率、融点、沸点、三重点、双極子モーメント、磁気モーメント、サイズ、形状、酸性度、塩基性度、等電点、拡散係数、または沈降係数など（ただしこれらに限定されるわけではない）に基づいて達成することができる。そのような分子タグはそのような性質の1つまたは任意の組合せによって検出または同定することができるだろう。
【００２５】
粒子の組成は、その粒子を構成するセグメントの組成を記述することによって、最も適切に規定される。粒子は極めて異なる組成を持つセグメントを含有しうる。例えば単一の粒子は、金属である1セグメントと、有機ポリマー材料であるセグメントとから構成されうる。
【００２６】
本発明のセグメントは任意の材料から構成されうる。好ましい実施形態では、セグメントが、金属（例えば銀、金、銅、ニッケル、パラジウム、白金、コバルト、ロジウム、イリジウム）、任意の金属カルコゲニド、金属酸化物（例えば酸化第二銅、二酸化チタン）、金属硫化物、金属セレン化物、金属テルル化物、合金、金属窒化物、金属リン化物、金属アンチモン化物、半導体、半金属を含む。セグメントは、分子膜などの有機単分子層または二分子層から構成されてもよい。例えば、有機分子の単分子層、または制御された自己集合分子層を、様々な金属表面と結合させることができる。
【００２７】
セグメントは、任意の有機化合物もしくは有機材料、または無機化合物もしくは無機材料、あるいは有機ポリマー材料、例えば当業者に公知の多数のモノポリマーおよびコポリマーから構成されうる。ペプチド、オリゴヌクレオチドおよび多糖などの生物学的ポリマーも、セグメントの主要成分であることができる。セグメントは、粒状の材料、例えば金属、金属酸化物もしく有機粒状材料、または複合材料、例えばポリアクリルアミド中の金属、ポリマー材料中の色素、多孔性金属などから構成されてもよい。本発明の粒子のセグメントは、ポリマー材料、結晶性もしくは非結晶性材料、アモルファス材料またはガラスから構成されてもよい。
【００２８】
セグメントは、粒子表面上の切欠きによって規定されるか、粒子の表面と接触しても接触しなくてもよいくぼみ、ディビット（divit）、孔、小胞、泡、小孔またはトンネルの存在によって規定されうる。セグメントは、そのような物理的属性の角度、形状、もしくは密度、または表面の輪郭の、見分けうる変化によっても規定されうる。粒子が例えばポリマーまたはガラスで被覆される本発明の実施形態では、セグメントが他の材料間の空隙からなってもよい。
【００２９】
各セグメントの長さは10nm〜50μmでありうる。一部の実施形態では、各セグメントの長さが50nm〜20μmである。通例、長さは、セグメント移行部を規定する線に対して概して垂直に走る軸と定義され、一方、幅は、セグメント移行部を規定する線に対して平行に走る粒子の寸法である。セグメント同士の境界面は、一定の実施形態では、粒子の長さに対して垂直である必要はなく、滑らかな移行部の線である必要もない。さらに、一定の実施形態では、あるセグメントの組成を、隣接セグメントの組成に混ぜ合わせてもよい。例えば、金のセグメントと白金のセグメントの間には、金と白金の両方から構成される5nm〜5μmの領域が存在してもよい。このタイプの移行部は、セグメントが区別可能である限り、許容できる。どの粒子についても、セグメントは、粒子の残部のセグメントの長さに対して任意の長さを持ちうる。
【００３０】
上述のように、粒子は任意の横断面形状を持つことができる。好ましい実施形態では、粒子は縦方向軸に沿って概ね直線的である。しかし一定の実施形態では、粒子は曲線状またはらせん状であってもよい。粒子の末端は平坦でも、凸状でも、凹状でもよい。さらに末端は、釘状または鉛筆の先端状であってもよい。鋭い先端を持つ本発明の実施形態は粒子をラマン分光法的用途またはエネルギー場効果が重要である他の用途に使用する場合に好ましい。どの粒子でも末端は同じであるか異なることができる。同様に、粒子の輪郭は、アッセイの感度または特異性に寄与するように、有利に選択することができる（例えば波状の輪郭は溝内に位置する発蛍光団の「消光」を増強すると予想されるだろう）。
【００３１】
本発明において、これらの粒子の一部の実施形態は、与えられた波長で異なる光反射率を持つ異なる金属（例えば金および銀）のセグメントから形成されるセグメント化された円柱形またはロッド形粒子である。その結果、粒子の反射率イメージは縞状に見え、粒子は縞模様パターンでコード化されるとみなされる。材料の数、ストライプ、およびストライプの厚さを変えることにより、数多くの縞模様パターンを形成させることができる。粒子を組み合わせて異なるコードを持つ粒子の群にすることにより、コードの数は劇的に増加する。粒子は、例えばテンプレート中に異なる金属のセグメントを逐次電気メッキし、その結果生成した粒子をテンプレートから外すことなどによって、製造することができる。
【００３２】
粒子を電気化学堆積法によって製造する場合、セグメントの長さ（ならびにそれらの密度および多孔度）は、各電気メッキステップで流す電流量を制御することによって調節することができる。その結果、ロッドは、各セグメントの長さ（およびアイデンティティ）を前もってプログラムすることが可能なナノメートル規模の「バーコード」のようになる。他の形態の電気化学堆積法でも同じ結果を得ることができる。例えば、電極の面積、不均一系速度定数、メッキ材料の濃度、および電位を制御することにより、無電解法で堆積を達成することができる。同じ結果を、セグメントの長さまたは他の属性を制御することができる別の製造法を使って得ることもできるだろう。ロッドの直径およびセグメントの長さは、通例、ナノメートル規模であるが、全長は、好ましい実施形態では、金属成分の反射率差を利用して光学顕微鏡で直接可視化することができるような長さである。多セグメント化された粒子の合成および特徴づけは、Martinら，Adv. Materials 11:1021-25（1999）に記載されている。この論文は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【００３３】
粒子の適用と読出しは手作業で（金属成分を含む粒子成分の反射率差を利用して、光学顕微鏡によって）行なうことができる。あるいは適用と読出しの両方を自動的に行なうこともできる。特に、自動画像処理法を使って、各粒子のコードを決定し、標識された物体のアイデンティティを確認することができる。上述のセグメント化された粒子の場合、例えば吸光度、蛍光、ラマン、超ラマン、レイリー散乱、超レイリー散乱、CARS、和周波発生、縮退四光波混合、前方光散乱、後方散乱、または角度光散乱）、走査プローブ技術（近接場走査型光学顕微鏡、AFM、STM、化学力または水平力顕微鏡、および他の変法）、電子ビーム技術（TEM、SEM、FE-SEM）、電子的、機械的、および磁気的検出機構（SQUIDを含む）などの適切な方法（ただしこれらに限定されるわけではない）が、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第09/676,890号「Methods of Imaging Colloidal Rod Particles as Nanobar Codes（ナノバーコードとしてのコロイド状ロッド粒子の画像法法）」（2000年10月2日出願）に記載されている。粒子が取付けられる特定金属表面を撮像するためにソフトウェアパラメーターを適合させる必要があるかもしれない。
【００３４】
マイクロスケールまたはナノスケールの粒子は、例えばインクおよびワニスなどの様々なラベル専用ホスト媒質に配合したり、物品に添付するなど、数多くのブランドセキュリティ方法に役立つ。コード化されたナノバーコード粒子は、例えば、通し番号付き追跡用タグに使用することができる。ナノバーコード粒子のユニークな特徴（例えば縞模様パターン、長さ、直径）により、各群がある粒子「タイプ」または粒子「フレーバー」を構成する弁別可能な粒子群を作り出すことが可能になる。次に、特定フレーバーの粒子を、単独で、または他の1以上のフレーバーの粒子と組み合わせて使用することにより、物品に一意的なタグを付けることができる。そのような方法は、特定のタグを特定の物品に一致させることに依拠している。典型的な応用例では、ナノバーコード粒子を合成し、タイプまたはフレーバーに従って予め群に分類してから、それらを物品に添付する。後日、物品を光学的に検査して、添付されている粒子のフレーバーを決定することができる。多くの場合、これで十分である。しかし場合によっては、コードの複雑さおよび要求される異なるタグの数に応じて、本方法は、かなり精巧な粒子取扱技術を必要としうる。多くの場合、インクおよびワニス印刷には、微量選別および微量取扱に対応するために必要な装置がない。
【００３５】
ある実施形態では、ナノバーコード粒子が、アルミナまたはポリカーボネートテンプレートにおける電気化学的堆積と、それに続くテンプレート溶解によって製造される。通例、それらは金属イオンの電気化学的還元を交互に行なうことによって製造されるが、テンプレート材料を使って、またはテンプレート材料を使わずに、他の手段によって容易に製造することもできる。上述のセグメント化された粒子の場合、好適な方法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第09/677,203号「Method of Manufacture of Colloidal Rod Particles as Nanobar Codes（ナノバーコードとしてのコロイド状ロッド粒子の製造方法）」（2000年10月2日出願）に記載されている。ナノバーコード粒子は、粒径を規定するテンプレート中に金（Au）、ニッケル、白金（Pt）、または銀（Ag）などの不活性金属を電気メッキした後、その結果生じた縞状ナノロッドをテンプレートから外すことにより、半自動化された拡張性の高い方法で製造される。通常のバーコードが光学スキャナを使って隣り合った黒線と白線の間のコントラストを測定することによって読み取られるのと同様に、個々のナノバーコード粒子も、通常の光学顕微鏡を使って単一粒子内の隣り合った金属ストライプ間の反射率差を測定することによって読み取られる。
【００３６】
ナノバーコード粒子を使ってゲノムアッセイが行なわれている。このアッセイでは、粒子がコード化された基材として役立つ。Penn,S.G.，Hel,L.およびNatan,M.J.「Nanoparticles for bioanalysis（バイオアナリシス用ナノ粒子）」Curr Opin Chem Biol 2003，7，609-615を参照されたい。このアプローチでは、極めて高レベルの多重化が達成されるが、通例、問題の生体分子を標識するか、追加のラベルを系に加える必要がある。本発明では金属ナノバーコード粒子が蛍光放射を消光するだろうという事実を利用する。プローブオリゴヌクレオチドをナノバーコード粒子に取付けることにより、蛍光消光を検出手段として使用することができ、分析物の標識を行なわずに高感度蛍光検出の利点が得られる。ナノバーコード粒子はコード化されているので、アッセイは単一の発蛍光団を使用した場合でも多重化されうる。これらの実施形態では、分子ビーコン対を、その対の蛍光色素メンバーが励起される波長の電磁放射線の量子によって励起させることができるが、金属ナノバーコード粒子の非存在下で予想されうる蛍光色素からの蛍光は、少なくともその一部が消光される。蛍光色素と金属ナノバーコード粒子とが近接している場合は、金属ナノバーコード粒子による消光が、蛍光シグナルの検出を妨げる。しかし、蛍光色素とナノバーコード粒子とが分離されると、蛍光シグナルが検出可能になる。
【００３７】
好ましくは、オリゴヌクレオチドで誘導体化された粒子を製造するために用いられる方法は、十分に制御される。ビオチン誘導体化オリゴヌクレオチドおよびアミン誘導体化オリゴヌクレオチドをナノバーコード粒子に（カルボジイミド結合化学を使って）取付けるためのプロトコールはどちらも既に開発され、特徴づけられている。しかし、本明細書に記載する蛍光オリゴヌクレオチドに対する金属粒子の消光効果は、これらの連結化学のどちらでも観察されていない。これはおそらく、これらの大きな部分が、ナノバーコード粒子の表面を効果的にブロックするからだろう。
【００３８】
蛍光オリゴヌクレオチドを粒子に結合させようと試みる場合、おそらく多くの異なる構成が生じるだろう。図3Aは、プローブオリゴヌクレオチドがチオール結合を介して粒子表面にうまく結合した望ましい配向を示している。発蛍光団は粒子表面に近接しており、消光される。図3Bは、不成功に終わったオリゴヌクレオチドの取付けを示しており、この場合、発蛍光団は粒子表面に吸着されている。オリゴヌクレオチドは粒子表面にチオール結合を介して結合していない。しかし発蛍光団は粒子表面に近接しているので、この配向も発蛍光団の消光をもたらすだろう。図3Cでは、プローブオリゴヌクレオチドが粒子表面にチオール結合を介してうまく結合しているが、発蛍光団は粒子表面に近接していない。これは、例えば色素の静電反発力、またはオリゴヌクレオチドが互いに接近してパッキングされすぎたことによる立体障害など、多数の理由で起こるかもしれない。表面と色素の間の相互作用は不十分であり、蛍光色素は消光されないだろう。
【００３９】
図3Cに示す構成は、粒子表面に対して発蛍光団がとりうる位置を制約するであろう内部「ヘアピン」配列（分子ビーコン）を使用することによって、ほとんど排除することができる。「ヘアピン」とは、一本のDNA鎖またはRNA鎖の近隣相補配列間での塩基対形成によってポリ核酸が形成する構造である。「ヘアピンループ」とは、一本鎖DNAまたは一本鎖RNAが折りたたまれ、3'セグメントに属するヌクレオチドと5'セグメントに属するヌクレオチドとが塩基対を形成して、その結果生じる構造がその名が示すとおりに見えるようになっている領域である。ヘアピン構造を図3Dに示す。
【００４０】
図3Aに示す成功した構成を図3Bに示す不成功に終わった構成または結合の失敗と区別することは、品質管理にとって難題である。これら3つのシナリオはいずれも、蛍光に基づく顕微鏡法による調査では、「暗部」に見えるだろう。しかし、この課題に対処するために、多数のアプローチを用いることができる。
【００４１】
文献には、蛍光色素と金属表面との併用に関する開示が豊富にある。本発明の教示内容を使って、本発明で使用するために有機蛍光色素を選択し最適化することは、当業者の技術で可能である。
【００４２】
ナノバーコード粒子のサイズ（通例、数ミクロン×数百ナノメートル）ゆえに、それらはAuコロイドよりもAu薄膜に近い挙動をする。
【００４３】
ナノバーコード粒子は、いくつもの異なる金属で構成させることができる。異なる金属（例えばAu表面対Ag表面対Pt表面）の非放射性蛍光消光には相違が存在しうる。発蛍光団が金属と直接接触している場合、ほとんどの金属が可視蛍光を消光することは、理論的に示唆される。AuとAgは異なる表面プラズモン帯域を持つので、どの発蛍光団についても消光の度合いが異なり、ストライプパターンが見えるだろう。本発明の教示内容および公表された文献に基づいてそのような系を最適化する方法は、当業者には理解されるだろう。例えばローダミン蛍光はAuおよびAgによって消光される。
【００４４】
蛍光消光は、経時的な発蛍光団挙動の直接監視によって定量することができる。発蛍光団の蛍光寿命は、それが消光される場合は、変化することが知られている。したがって、結合時に発蛍光団が起こす変化を理解するために、与えられた系の蛍光寿命データを考慮することができる。粒子間の寿命変化の分布を理解するために、高分解能蛍光寿命イメージを取得することができる。Au、AgおよびPtによる金属消光に対してどれが最も高い感受性を持つかを理解するために、一覧に記載される発蛍光団の寿命イメージを取得することができる。
【００４５】
また、金属表面からの発蛍光団の距離を変化させることによって、最適な消光を決定することもできる。この距離は、例えばビオチン-BSAとアビジンとが交互に重なった層を使うことなどによって制御することができる。あるいは、様々な長さの色素標識アルカンチオールを使って、この距離を制御することもできる。そのような色素標識アルカンチオールは合成するか、供給業者から購入することができる。
【００４６】
上に概説した最適化戦略によって得られる測定値から、本発明のアッセイの理論的検出限界を決定することができる。ナノバーコード粒子を粒子として使用する場合、粒子の反射率を測定する波長（400nm）から離れた蛍光放射極大を持つ色素を使用することができる。反射率を測定する波長の近くに蛍光放射極大を持つ色素は、蛍光を定量するソフトウェアの正確さに影響を及ぼしうる。蛍光が反射率を測定する波長（400nm）に近い場合は、蛍光の縞模様パターン（蛍光チャンネルへの反射率シグナルの「リークスルー」）が定量を妨害する場合もありうる。
【００４７】
DNA分子上のリン酸基間の反発力ゆえに、DNA分子は、おそらく単なる吸着では、自己集合性単分子層を形成しないだろう。Huang,E.，Satjapipat,M.，Han,S.およびZhou,F.「Surface Structure and Coverage of an Oligonucleotide Probe Tethered onto a Gold Substrate and Its Hybridization Efficiency for a Polynucleotide Target（金基材上に繋留されたオリゴヌクレオチドプローブの表面構造および表面被覆率ならびにポリヌクレオチド標的に対するそのハイブリダイゼーション効率）」Langmuir 2001，17，1215-1224を参照されたい。吸着密度はオリゴヌクレオチド長および吸収手法の関数であると報告されている。金属表面にチオールオリゴヌクレオチドを取付ける方法については豊富な文献がある。Au薄膜がチオール化DNAおよびメルカプトプロパノールの混合物中に浸漬された。DNAは表面に吸収された後、メルカプトへキサノールでブロックされた。
【００４８】
オリゴヌクレオチドは溶液中のAuナノ粒子に24時間にわたって吸収させた後、リン酸緩衝液および塩化ナトリウムで、さらに40時間にわたって滴定することができる。
【００４９】
個別に表面被覆率および組成を最適化するために、カップリングプロトコールの多数の態様を調節することができる。例えば、オリゴヌクレオチドの長さを変化させることができ、吸着時間および吸着温度を変化させることができ、粒子とプローブオリゴヌクレオチドの間に「スペーサー」基を使用することができる（例えばアルカンチオールまたはポリヌクレオチド）。粒子上のプローブオリゴヌクレオチドのパッキング密度は、その後の消光能力およびハイブリダイゼーション効率に、著しい影響を持つだろう。パッキングが密すぎると、プローブオリゴヌクレオチドは、それらが消光されなくなるような形で（例えば、それらがヘアピンを形成することができないか、発蛍光団が金属表面に容易に接近できなくなるような形で）、立体的に制約されるだろう。さらに、そのような密なパッキングは、標的オリゴヌクレオチドと立体的に制約されたプローブオリゴヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションを妨害し、その結果として、ハイブリダイゼーション効率を低下させうる。ハイブリダイゼーション効率を最大化することは重要である。なぜなら、それにより、アッセイのダイナミックレンジおよび検出限界が最大化されるだろうからである。したがって、密なパッキングは避けるべきである。
【００５０】
粒子へのオリゴのカップリングの進行を監視するには、多数の方法を用いることができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、メルカプトエタノールまたは他のチオール含有分子を使って交換反応により、粒子の表面から脱離させることができる。チオール誘導体化オリゴヌクレオチドをAuコロイドおよびAu薄膜から脱離させるための詳細なプロトコールは、当業者であれば入手することができる。これらの方法は、一連のメルカプトエタノール濃度について時間経過および温度経過評価を行なって反応の終点を決定することにより、ナノバーコード粒子に関して最適化することができる。
【００５１】
表面へのオリゴヌクレオチドの取付けの成功を確認するためのもう一つのアプローチでは、「プレハイブリダイズさせた」オリゴヌクレオチド、すなわち粒子表面に取付ける前に既に相補的配列にハイブリダイズさせてあるプローブオリゴヌクレオチドを使用する。二本鎖オリゴヌクレオチドの方が堅いので、うまく取付けられたコンフォメーションでは、発蛍光団は粒子表面と相互作用せず、それゆえに消光されないだろう。したがって、表面への連結の成功は、蛍光をもたらすだろう。図5Aを参照されたい。しかし、カップリングに失敗した場合は、消光が起こるだろう。図5Bを参照されたい。
【００５２】
表面へのオリゴヌクレオチドの取付けの成功を確認するためのもう一つの代替的アプローチは、（a）非標識チオール結合プローブオリゴヌクレオチドを粒子の表面にカップリングし、次に（b）そのプローブオリゴヌクレオチドを蛍光標識された相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることである。カップリングの成功後にハイブリダイゼーションが成功すると、蛍光が生じるだろう。図5C参照。しかしカップリングの失敗後にハイブリダイゼーションを行なうと、蛍光の消光が起こるだろう。図5D参照。
【００５３】
重要なことに、上述の方法はいずれも、図3Cに図示したように表面と相互作用していない正しく配向した発蛍光団からの結果を決定することができない。したがって、一部の実施形態では、ヘアピンループを利用する。なぜなら、それにより、偽陽性が生じうる一つの様式（可能性の低い様式ではあるが）が排除されるからである。したがって、この問題を最小限に抑えるために、一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、それらがヘアピンループを持つように構築する。ヘアピンループは発蛍光団と粒子表面との相互作用を強制する。
【００５４】
上述のように、本発明は、ハイブリダイゼーションが起こると蛍光強度が増加し、陰性対照実験では蛍光強度が不変のままであるようなアッセイを提供する。個々のアッセイのパラメータは、緩衝液条件、ハイブリダイゼーション時間、ハイブリダイゼーション温度、オリゴヌクレオチド配列要件、チオール-Au結合安定性、ならびにストリンジェンシー洗浄の回数および特徴を調節することによって、最適化することができる。本明細書にいうストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、核酸分子（オリゴヌクレオチドを含む）を使って類似する核酸配列を持つ分子が同定される際の標準的ハイブリダイゼーション条件を指す。そのような標準的条件は、例えば、Sambrookら「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Labs Press（1989）などに開示されている。Sambrookらの刊行物は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、通例、ハイブリダイゼーション反応にプローブとして用いられる核酸分子と少なくとも約70％の核酸配列同一性を持つ核酸分子の単離を可能にする。ヌクレオチドミスマッチが30％以下とするようなハイブリダイゼーションを達成するために適切なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を計算するための式は、例えばMeinkoth,J.ら，Anal. Biochem. 138:267-284（1984）などに開示されており、上記Meinkoth,J.らの文献は参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件が、探索に用いられる核酸分子と少なくとも約80％の核酸配列同一性を持つ核酸分子のハイブリダイゼーションを可能にする。別の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件が、探索に用いられる核酸分子と少なくとも約90％の核酸配列同一性を持つ核酸分子の単離を可能にする。別の実施形態では、ハイブリダイゼーション条件が、探索に用いられる核酸分子と少なくとも約95％の核酸配列同一性を持つ核酸分子の単離を可能にする。
【００５５】
当業者は、ナノ粒子-生体分子相互作用および表面-生体分子相互作用の挙動に関する多くの基礎研究からも情報を得るだろう。例えば、スペース長、濃度、相補鎖長およびオリゴヌクレオチド長の影響を特徴づけるために、12nm Auナノ粒子に取付けられたDNAのハイブリダイゼーション効率の体系的研究が行なわれている。また、Auナノ粒子（サイズが13nmから50nmにわたるもの）の存在下で起こるDNAハイブリダイゼーションの挙動に関する非常に綿密なモデルであって、観察される鋭いハイブリダイゼーション転移温度（これはタグを持たないDNA二重鎖で観察されるものより鋭い）を説明するモデルも得られている。
【００５６】
ハイブリダイゼーションの成功を確認するには、多数の方法を使用することができる。例えば、図6に示すように、標識標的核酸を使ってハイブリダイゼーションを行なうことができる。粒子結合型プローブオリゴヌクレオチドを標識標的核酸と接触させると、標識ヌクレオチドがプローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションとストリンジェンシー洗浄に続いて、反応液中のナノバーコード粒子の蛍光シグナルを決定する。温度を上昇させ、塩濃度を低下させることにより、二本鎖オリゴヌクレオチドを「融解」させて、標識標的核酸を遊離させることができる。反応液を遠心分離し、溶出液の蛍光を定量することにより、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの量を決定することができる。その後、表面に結合しているオリゴヌクレオチドをアルカンチオールで脱離させ、溶出液を集め、蛍光を測定することができる。この方法により、表面被覆率とハイブリダイゼーション効率の両方を同じ粒子から決定することが可能になるだろう。
【００５７】
Au-チオール結合は高塩濃度条件下（0.5M NaCl）で安定である。さらに、Au-チオール、Ag-チオールおよびPt-チオール結合が安定な生物学的に意味のある条件は、温度を約25℃から約70℃まで変化させた場合の効果、塩濃度を約0Mから約1Mまで変化させた場合の効果、および約0％〜約10％のSDS界面活性剤および約0％〜約50％のホルムアミドを含めた場合の効果を決定することによって、さらに特徴づけることができる。実施例 を参照されたい。
【００５８】
表面で行なわれる多くのハイブリダイゼーションアッセイでは、ハイブリダイゼーションが立体障害を受けずに起こりうるように、調査対象配列を表面から引き離すために、「スペーサー」が必要である。この効果は、マイクロアレイなどの平坦な表面ならびにコロイドAuで報告されている。重要なことに、本発明は、Auコロイドよりもかなり大きく、それゆえに平坦な表面に、より近い働きをする粒子を含む。スペーサー基は、核酸スペーサーである場合には、核酸配列上で約0塩基から約20塩基まで変化させることができ、炭化水素スペーサーを使用する場合は、同じ長さのスペーサーであることができる。スペーサーが望まれる場合は、C6(CH2)xを使用することができる。スペーサー（スペーサーが存在する場合）およびオリゴヌクレオチドプローブの長さは、発蛍光団が消光に必要な距離以内に近づくことを許すのに十分であることが重要である。それより長いスペーサー（スペーサーが存在する場合）およびオリゴヌクレオチドプローブも、本発明の範囲に包含される。ただしオリゴヌクレオチドプローブが長くなるほど、それを合成するための費用は高くなり、また、そのプローブが自己相補的な配列および/または標的核酸と競合する配列を含有する可能性は高くなる。
【００５９】
本発明はヘアピン構成も非ヘアピン構成も包含する。ヘアピン配列の使用は、もちろん、ヘアピンを形成するために内部相補配列を必要とするので、プローブオリゴヌクレオチドの全体的配列に対していくらかの制約を加える。Dubertretら，2001参照。非ヘアピン構成が消光をもたらすのは、オリゴヌクレオチドが柔軟であり、かつ負に荷電した発蛍光団が正に荷電した金属表面に近接して存在する傾向を示すからである。Mawellら，2002参照。
【００６０】
プローブオリゴヌクレオチドの配列の長さは、許容できる頑強さおよび再現性を可能にする任意の長さであることができる。ハイブリダイゼーション効率の決定にも、表面被覆率に対する長さの効果の決定にも、上述したような方法を使用することができる。しかし、特に、配列は約8〜約100塩基長であることができる。アッセイ条件を最適化すれば、あるPCR産物の希釈系列をアッセイする複数の実験を行なって、Zeiss顕微鏡システムでの単一成分ッセイの線形性、ダイナミックレンジおよび感度を調べることができる。
【実施例】
【００６１】
本発明を例証するために以下の実験を行なった。
【００６２】
実施例１
チオールオリゴとコンジュゲートさせたナノバーコード粒子の製造
前もって製造されたナノバーコード粒子を、QC後に1×109NBC/mlの濃度で、二重脱イオンH2O中に保存する。NBC 100μLを10mMリン酸緩衝食塩水pH7.4（PBS）（Sigmaカタログ番号P-3813）で2回洗浄し、PBS 100μLで再懸濁する。5μMプローブチオ標識DNAオリゴ（二重脱イオンH2O中）500μLを加え、室温で一晩保存することにより、プローブをNBC上に自己集合させる。0.3M NaCl/10mM PBS 600μLを加え、室温で2時間保存する。0.3M NaCl/10mM PBSで洗浄する。NBCを再懸濁するためにPBS 100μLを加え、4℃で保存する。これはそのままハイブリダイゼーションに使用することができる。
【００６３】
実施例２
ハイブリダイゼーションおよび結果の読取り
ハイブリダイゼーション緩衝液（HS114、Molecular Research Center, Inc.）90μl、10μM標的オリゴ10μL、NBC-プローブ3μLを混合する。42℃で1時間振とうする。1×SSCで1回、0.1×SSCで1回洗浄する。5mM PBS 30μLを加え、顕微鏡で撮像する。
【００６４】
実施例３
非ヘアピンループ
カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）で標識した32マーオリゴヌクレオチド（M1）をナノバーコード粒子（NBC）にコンジュゲートした。得られたコンジュゲート粒子（NBC-M1）を相補配列（M1C）、非相補配列（M2C）および水対照と共にインキュベートした。相補配列（M1C）とのハイブリダイゼーション時に、TAMRAラベルからの蛍光シグナルは200MFIを越えたのに対して、水および非相補対照では50MFI未満だった。図4A。TAMRAで標識された異なるオリゴヌクレオチド（M2）をNBCにコンジュゲートする同様の実験を行なった。得られたコンジュゲート粒子（NBC-M2）を相補配列（M2C）、非相補配列（M1C）および水対照と共にインキュベートした。相補配列とのハイブリダイゼーション時に、TAMRAラベルからの蛍光シグナルは200MFIを越えたのに対して、水および非相補対照では50MFI未満だった。図4B。これらの結果は、コンジュゲートオリゴヌクレオチドがその相補配列にハイブリダイズしない限り、蛍光消光が起こっていることを示す。
【００６５】
実施例４
マルチプレックスアッセイ
ナノバーコード粒子をTAMRA標識HIVプローブオリゴヌクレオチドまたはTAMRA標識HCVオリゴヌクレオチドとコンジュゲートした。図7に示すように、TAMRA標識HCVオリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートしたナノバーコード粒子は、相補的HCV標的オリゴヌクレオチドと接触させた場合に、（非相補的）HIV標的オリゴヌクレオチドまたは水と比較して、はるかに強い蛍光を示すことがわかった。図7（パネルB）。同様に、TAMRA標識HIVオリゴヌクレオチドプローブにコンジュゲートしたナノバーコード粒子は、相補的HIV標的オリゴヌクレオチドと接触させた場合に、（非相補的）HBCオリゴヌクレオチドまたは水と比較して、強い蛍光を示すことがわかった。図7（パネルA）。
【００６６】
もう一つの解析では、以下のように、異なるタイプのコード化粒子にプローブ配列を連結した。コード（00001）を持つナノバーコード粒子にHIVプローブ配列（HIV mb2）をコンジュゲートした。コード（00010）を持つナノバーコード粒子にHCVプローブ配列（HCV mb2）をコンジュゲートした。コード（01100）を持つナノバーコード粒子にHBVプローブ配列（HBV mb2）をコンジュゲートした。
【００６７】
次に、コンジュゲートナノバーコード粒子を表1に示す標的配列（すなわちHIV mb1c、HCV mb1c、HBV mb1c）にばく露した。図8に示すように、いずれの場合も最大蛍光は、問題の標的オリゴヌクレオチドに相補的なTAMRA標識オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしたナノバーコード粒子で観察された。
【００６８】
【表１】
2007531496.tif 000002
【００６９】
オリゴヌクレオチドはBiosource International（カリフォルニア州カマリロ）から入手した。配列はPerrin A.ら，Analytical Biochemistry，2003，322，148-155から選択した。上記HIV配列はgag糖タンパク質遺伝子をコードし、上記HBV配列はポリメラーゼをコードする。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】病原体ポリヌクレオチドを検出するための、本発明のマルチプレックスアッセイ実施形態の概略図である。
【図２】カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）標識オリゴヌクレオチドにコンジュゲートした様々なナノバーコード［Nanobarcodes（登録商標）］粒子の中央蛍光強度をプロットした棒グラフである。図3Aでは、粒子をTAMRA標識32マーオリゴヌクレオチド（M1）にコンジュゲートし、そのコンジュゲート粒子について、相補的M1C（灰色の棒）、非相補的M2C（黒色の棒）および水（白色の棒）の存在下での蛍光を示す。図3Bでは、粒子を異なるTAMRA標識オリゴヌクレオチド（M2）とコンジュゲートし、そのコンジュゲート粒子について、非相補的M1C（灰色の棒）、相補的M2C（黒色の棒）および水（白色の棒）の存在下での蛍光を示す。
【図３】ナノバーコード粒子上のチオール-DNA-発蛍光団化学種のとりうる配向を表す略図である。
【図４】2つの異なる発蛍光団を含む代替的アッセイ設計を表す略図である。
【図５】標的核酸（発蛍光団標識物および非標識物）にハイブリダイズしたナノバーコード粒子コンジュゲートチオール-DNA化学種（発蛍光団標識物および非標識物）のとりうる配向を表す略図である。
【図６】ナノバーコード粒子にコンジュゲートされたチオール-DNA-発蛍光団化学種への発蛍光団標識標的核酸の結合を表す略図である。
【図７】TAMRA標識HIVプローブオリゴヌクレオチドまたはTAMRA標識HCVオリゴヌクレオチドにコンジュゲートした様々なナノバーコード［Nanobarcodes（登録商標）］粒子の中央蛍光強度をプロットした棒グラフである。
【図８】HIVプローブ配列（HIV mb2）、HCVプローブ配列（HCV mb2）またはHBVプローブ配列（HBV mb2）にコンジュゲートした様々なナノバーコード［Nanobarcodes（登録商標）］粒子の中央蛍光強度をプロットした棒グラフである。
【図１】
2007531496.tif 000003
【図２】
2007531496.tif 000004
【図３】
2007531496.tif 000005
【図４】
2007531496.tif 000006
【図５】
2007531496.tif 000007
【図６】
2007531496.tif 000008
【図７】
2007531496.tif 000009
【図８】
2007531496.tif 000010
【配列表】
2007531496000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年3月3日(2006.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007531496000001.app
【国際調査報告】
2007531496.tif 000013