(57)【要約】  構造（Ｉ）で表される化合物、並びにこのような化合物を製造する方法を開示する。ここで、上記方法は、ジアシルジケトピペラジンを第１のアルデヒドと反応させて、中間体化合物を生じさせること、上記中間体化合物を第２のアルデヒドと反応させて、上記一般構造を有する化合物種を生じさせることとを含み、上記第１のアルデヒド及び上記第２のアルデヒドは、オキサゾールカルボキサルデヒド、イミダゾールカルボキサルデヒド、ベンズアルデヒド、イミダゾールカルボキサルデヒド誘導体、及びベンズアルデヒド誘導体から成る群から選択され、それにより上記化合物（式中、Ｒ1、Ｒ1’、Ｒ1”、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5及びＲ6、Ｘ1及びＸ2、Ｙ、Ｚ、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、添付の説明と一致した様式で定義され得る）を製造する。血管増殖を治療するための組成物及び方法もまた開示される。
2007520565.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）の構造を有し、血管虚脱を誘導する化合物：
【化１】
2007520565.tif 000098
式中、
Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ、Ｒ1’及びＲ1”は、互いに共有結合されるか、又は互いに共有結合されず、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル基及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子から成る群から選択され、それぞれ非置換であるか、又は上述に定義するようなＲ5基で置換され、
Ｙは、窒素原子、Ｒ5で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎは、０、１又は２の整数であり、
ｎ個のそれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであり得る）。
【請求項２】
前記第１のアルデヒドは、イミダゾールカルボキサルデヒドである、請求項１に記載の
化合物。
【請求項３】
前記第２のアルデヒドは、ベンズアルデヒドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ、水素原子である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ1及びＸ2はそれぞれ、酸素原子である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ4は、飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
前記飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキルは、第三ブチル基である、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ1は、置換フェニルを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
前記置換フェニル基は、メトキシベンゼンである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記第１のアルデヒドは、ベンズアルデヒドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
前記第２のアルデヒドは、イミダゾールカルボキサルデヒドである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
ｎは、０又は１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ｎは、１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
ｎは、１であり、Ｚ、Ｚ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4はそれぞれ、炭素原子である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
血管増殖を低減させるのに有効な量、又は血管密度を低減させるのに有効な量で、請求項１に記載の化合物を動物へ投与することを含む、動物における状態を治療する方法。
【請求項１６】
前記状態は、免疫及び非免疫炎症、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、動脈硬化斑における毛細血管増殖、並びに骨粗しょう症から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記状態は腫瘍性状態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍性状態は癌である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記状態は癌ではない、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記状態は網膜症である、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記網膜症は糖尿病性網膜症である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記網膜症は加齢性黄斑変性である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記動物はヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物はＫＰＵ−０２である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記状態は、過剰血管新生に関連する状態である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
動物における血管虚脱を誘導する方法であって、治療上有効な量の式（Ｉ）を有する化合物で前記動物を治療することを含み、前記治療上有効な量の前記化合物は、前記血管系においてチューブリン脱重合を引き起こし、前記化合物は、下記構造を有する方法：
【化２】
2007520565.tif 000099
式中、
Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ、Ｒ1’及びＲ1”は、互いに共有結合されるか、又は互いに共有結合されず、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル基及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子から成る群から選択され、それぞれ非置換であるか、又は上述に定義するようなＲ5で置換され、
Ｙは、窒素原子、Ｒ5で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎは、０、１又は２の整数であり、
ｎ個のぞれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個
に、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであり得る。
【請求項２７】
前記動物はヒトである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヒトは、腫瘍、糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性から成る群から選択される疾患を有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患は癌ではない、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物はＫＰＵ−０２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
血管増殖を治療又は予防するための薬学的組成物であって、薬学的に有効な量の請求項１に記載の化合物を、該化合物にとって薬学的に許容可能な担体と一緒に含む薬学的組成物。
【請求項３２】
前記血管増殖は、癌、加齢性黄斑変性及び糖尿病性網膜症から成る群から選択される疾患の症状である、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
非腫瘍組織血管系よりも腫瘍血管系を優先的に標的とする方法であって、
式（Ｉ）の構造を有する化合物を動物へ投与することを含む方法：
式中、
Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ、Ｒ1’及びＲ1”は、互いに共有結合されるか、又は互いに共有結合されず、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル基及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子から成る群から選択され、それぞれ非置換であるか、又は上述に定義するようなＲ5で置換され、
Ｙは、窒素原子、Ｒ5で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎは、０、１又は２の整数であり、
ｎ個のそれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであり得る。
【請求項３４】
前記非腫瘍組織は、皮膚、筋肉、脳、腎臓、心臓、脾臓及び腸から成る群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記腫瘍血管系は、非腫瘍組織血管系よりも、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び９０％優先的に標的とされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記動物はヒトである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
非腫瘍組織血管系よりも腫瘍血管系を優先的に標的とする作用物質を動物へ投与することを含む、非腫瘍組織血管系よりも腫瘍血管系を優先的に標的とする方法。
【請求項３８】
増大された血管系に関連するか、又は血管系に依存する状態の治療のための薬剤の調製における式（Ｉ）の構造を有する化合物の使用：
式中、
Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ、Ｒ1’及びＲ1”は、互いに共有結合されるか、又は互いに共有結合されず、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、
置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子及び硫黄原子から成る群から選択され、それぞれ、非置換であるか、又は上述に定義するようなＲ5で置換され、
Ｙは、窒素原子、Ｒ5で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎは、０、１又は２の整数であり、
ｎ個のそれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ独立して、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであり得る。
【請求項３９】
前記状態は癌である、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記状態は癌ではない、請求項３８に記載の使用。
【請求項４１】
前記状態は、免疫及び非免疫炎症、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、動脈硬化斑における毛細血管増殖、並びに骨粗しょう症から成る群から選択される、請求項３８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の背景］
［発明の分野］
本発明は、化学及び医学の分野における化合物及び合成的製造方法に関する。より具体的には、本発明は、癌の治療及び真菌感染の治療において有用な化合物及び化合物を製造する方法に関する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、２００３年８月１日に出願された米国特許出願第１０／６３２，５３１号の一部継続であり、２００４年２月４日に出願された米国仮出願第６０／５４２，０７３号及び２００４年１１月１日に出願された米国仮出願第６０／６２４，２６２号に対する優先権を主張し、それらはすべて、デヒドロフェニラヒスチン及びそれらの類似体、並びにデヒドロフェニラヒスチン及びそれらの類似体の合成という表題であり、それらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
［関連技術の簡単な説明］
単一の普遍的細胞メカニズムが真核生物の細胞周期プロセスの調節を制御すると考えられている。例えば、ハートウェル，Ｌ．Ｈ．他（Hartwell, L.H. et al.），サイエンス（Science）(１９８９)，２４６:６２９−３４を参照されたい。細胞周期の制御メカニズムで異常が生じると、癌又は免疫障害が起こり得ることも知られている。したがって、同様に既知であるように、抗腫瘍剤及び免疫抑制剤は、細胞周期を調節する物質の中の１つであり得る。したがって、真核生物の細胞周期抑制剤を製造する新規方法が、抗腫瘍化合物及び免疫増強化合物として必要とされ、またこれは、化学療法剤、抗腫瘍剤としてヒトの癌治療において有用であるべきである。例えば、ロバージ，Ｍ．他（Roberge, M. et al.），Cancer Res.(１９９４)，５４，６１１５−２１を参照されたい。
【０００４】
真菌類、特に病原性の真菌類及びその関連感染は、より一層の臨床的課題を示す。現存する抗真菌剤に関して、有効性及び毒性、並びに現在入手可能であるか、又は開発中の薬物に耐性の病原性の真菌の株の開発及び／又は発見には限界がある。例えば、ヒトに対して病原性である真菌類としては、特に、Ｃ．アルビカンス(C. albicans)、Ｃ．トロピカリス(C. tropicalis)、Ｃ．ケフィア(C. kefyr)、Ｃ．クルセイ(C. krusei)及びＣ．ガルブラタ(C. galbrata)を含むカンジダ(Candida)属種、Ａ．フミガーツス(A. fumigatus)及びＡ．フラブス(A. Flavus)を含むアスペルギルス(Aspergillus)属種、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)を含むブラストミセス(Blastomyces)属種、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、バシジオボラス・ラナルム(Basidiobolus ranarum)、コニディオボルス(Conidiobolus)属種、ヒストプラズマ・カプスラタム(Histoplasma capsulatum)、Ｒ．オリザエ(R. oryzae)及びＲ．ミクロスポルス(R. microsporus)を含むリゾプス(Rhizopus)属種、クスダマカビ(Cunninghamella)属種、リゾムコール(Rhizomucor)属種、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、シュードアレシェリア・ボイジイ(Pseudallescheria boydii)、リノスポリジウム・シーベリ(Rhinosporidium seeberi)、及びスポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix schenckii)が挙げられる(クォン−チュン，Ｋ．Ｊ．及びベネット，Ｊ．Ｅ．（Kwon-Chung, K.J. & Bennett, J.E.），１９９２，医真菌学（Medical Mycology），Lea and Febiger，マルバーン，ペンシルバニア(Ma
lvern, PA)）。
【０００５】
近年、トリプロスタチンＡ及びＢ（これらは、プロリン及びイソプレニル化トリプトファン残基からなるジケトピペラジンである）、並びに５つの他の構造的に関連したジケトピペラジンが、Ｍ期にて細胞周期の進行を阻害し（キュイ，Ｃ．他（Cui, C. et al.），１９９６，J Antibiotics，４９:５２７−３３、キュイ，Ｃ．他（Cui, C. et al.），１９９６，J Antibiotics，４９:５３４−４０を参照）、これらの化合物はまた、微小管構築にも影響を及ぼす（ウスイ，Ｔ．他（Usui, T. et al.），１９９８，Biochem J，３３３:５４３−４８、コンドン，Ｍ．（Kondon, M. et al.），１９９８，J Antibiotics，５１:８０１−０４を参照）ことが報告されている。さらにチューブリン（これは、２つの５０ｋＤａのサブユニット（α−及びβ−チューブリン）から構成される高分子であり、微小管の主要構成成分である）のコルヒチン結合部位（ＣＬＣ部位）に結合することにより、有糸分裂を阻害し、したがって真核生物の細胞周期を阻害する、天然化合物及び合成化合物が報告されている。例えば、イワサキ，Ｓ．（Iwasaki, S.），１９９３，Med Res Rev，１３:１８３−１９８、ハメル，Ｅ．（Hamel, E.），１９９６，Med Res Rev，１６:２０７−３１、ヴァイゼンベルグ，Ｒ．Ｃ．他（Weisenberg, R.C. et al.），１９６９，Biochemistry，７:４４６６−７９を参照されたい。微小管は、軸索輸送、細胞運動性及び細胞形態の決定等の、幾つかの必須の細胞機能に関与すると考えられている。したがって、微小管機能の阻害剤は、広範囲の生物活性を有し得るものであり、医療目的及び農薬目的に適用可能である。また、ＣＬＣ、ステガナシン（クプチャン，Ｓ．Ｍ．他（Kupchan, S.M. et al.），１９７３，J Am Chem Soc，９５:１３３５−３６を参照）、ポドフィロトキシン（サケット，Ｄ．Ｌ．（Sackett, D.L.），１９９３，Pharmacol Ther，５９:１６３−２２８を参照）、及びコンブレタスタチン（ペティット，Ｇ．Ｒ．他（Pettit, G.R. et al.），１９９５，J Med Chem，３８：１６６−６７）等のコルヒチン（ＣＬＣ）部位リガンドは、真核生物の細胞周期阻害剤として有用であることを証明でき、したがって化学療法剤として有用であり得る可能性がある。
【０００６】
ジケトピペラジン型代謝産物は、マイコトキシン（ホラーク，Ｒ．Ｍ．他（Horak R.M.
et al.），１９８１，JCS Chem Comm，１２６５−６７、アリ，Ｍ．他（Ali M. et al.），１８９８，Toxicology Letters，４８:２３５−４１を参照）として、又は二次代謝産物（スメズガード，Ｊ．他（Smedsgaard J et al.），１９９６，J Microbiol Meth，２５:５−１７を参照）として様々な真菌類から単離されたが、ジケトピペラジン型代謝産物又はそれらの誘導体の特定の構造、及び特に、それらのｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性についてはほとんど知られていない。これらの化合物は、マイコトキシンとして単離されているだけでなく、ジケトピペラジン型代謝産物の１つのタイプであるフェニラヒスチンの化学合成が、J. Org. Chem.，(２０００)６５、８４０２頁においてハヤシ他（Hayashi et al.）により記載されている。当該技術分野では、このようなジケトピペラジン型代謝産物誘導体の１つであるデヒドロフェニラヒスチンは、その親フェニラヒスチンの酵素作用による脱水素化により製造されている。癌の発生の増大に伴い、動物細胞特異的増殖阻害活性（animal cell-specific proliferation-inhibiting activity)並びに高い抗腫瘍活性及び選択性を有する実質的に精製されたジケトピペラジン型代謝産物誘導体種を化学的に製造することが特に必要とされている。したがって、実質的に精製され、且つ構造的及び生物学的に特徴付けられたジケトピペラジン型代謝産物誘導体を合成的に製造する効率的な方法が特に必要とされている。
【０００７】
同様に、ＰＣＴ公報ＷＯ／０１５３２９０号（２００１年７月２６日）は、フェニラヒスチン又は特定のフェニラヒスチン類似体を、ストレプトミセス・アルブルス(Streptomyces albulus)から得られる脱水素酵素に曝すことにより、デヒドロフェニラヒスチンを製造する非合成的方法について記載している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
［発明の概要］
下記式（Ｉ）の構造を有する化合物種に関して、化合物及び化合物の合成的製造方法が開示される。
【０００９】
【化１】
2007520565.tif 000003
【００１０】
開示される化合物は、式（Ｉ）
（式中、Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル基及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子から成る群から選択され、それぞれ非置換であるか、又は上述に定義するようなＲ5基で置換され、
Ｙは、窒素原子、上述のＲ5基で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎは、０、１又は２の整数であり、
ｎ個のそれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであり得るが、
但し、特定の化合物で、Ｒ1、Ｒ1’、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5がそれぞれ水素原子である場合、Ｘ1及びＸ2はそれぞれ酸素原子であり、且つＲ6は３，３−ジメチルブチル−１−エン又は水素原子のいずれかであることは当てはまらない）
の構造を有する。
【００１１】
本方法は、
ジアシルジケトピペラジンを第１のアルデヒドと反応させて、中間体化合物を生じさせる工程と、
上記中間体化合物を第２のアルデヒドと反応させて、上記の一般構造を有する上記の化合物種を生じさせる工程と
を含み、
上記第１のアルデヒド及び上記第２のアルデヒドは、オキサゾールカルボキサルデヒド、イミダゾールカルボキサルデヒド、ベンズアルデヒド、イミダゾールカルボキサルデヒド誘導体、及びベンズアルデヒド誘導体から成る群から選択され、それにより化合物を製造する。
【００１２】
開示される化合物は、式（Ｉ）の構造を有し、式中、
Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル基及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子から成る群から選択され、それぞれ非置換であるか、又は上述に定義するようなＲ5基で置換され、
Ｙは、窒素原子、上述のＲ5基で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄
原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎは、０、１又は２の整数であり、
ｎ個のそれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであり得る。
【００１３】
本発明の化合物及び方法の好ましい実施の形態では、イミダゾールカルボキサルデヒドは、５−（１，１−ジメチル−２−エチル）イミダゾール−４−カルボキサルデヒドであり、ベンズアルデヒドは、単一のメトキシ基を含む。本明細書中に記載する化合物のさらなる好ましい実施の形態は、ｔ−ブチル基、ジメトキシ基、クロロ基及びメチルチオフェン基を有する化合物、及びこのような化合物を製造する方法、並びに表２、表３及び表４に記載する化合物、及びこのような化合物を製造する方法を包含する。
【００１４】
同様に、腫瘍性組織を治療するか、又は癌若しくは病原性の真菌による感染を予防するための方法及び物質を開示する。これらの方法及び物質は、哺乳類の被験体、より具体的にはヒトの治療に特によく適しており、被験体にデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を投与することを包含する。本方法は、被験体に、抗腫瘍又は抗真菌の有効量のデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を投与することを含む。
【００１５】
さらなる実施の形態は、動物における状態を治療する方法に関し、当該方法は、血管増殖を低減させるのに有効な量で、又は血管密度を低減させるのに有効な量で、本明細書中に記載するような化合物を動物へ投与することを包含し得る。例示的な状態としては、腫瘍（例えば、癌）並びに血管新生に関連するか、又は血管新生に依存する他の状態（例えば、免疫及び非免疫炎症、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、動脈硬化斑における毛細血管増殖、骨粗しょう症等を包含する）が挙げられる。幾つかの実施の形態では、疾患は癌ではない。
【００１６】
他の実施の形態は、動物における血管虚脱を誘導する方法に関する。この方法は、例えば、治療上有効な量の本明細書中に記載するような式（Ｉ）を有する化合物で上記動物を治療することを包含し得る。上記治療上有効な量の上記化合物は、血管系においてチューブリン脱重合を引き起こし得る。
【００１７】
好ましくは、上記動物はヒトである。好ましくは、疾患は、腫瘍、糖尿病性網膜症、加齢性黄斑変性等であり得る。幾つかの態様では、疾患は癌ではないか、又は癌は、上記方法及び使用から特異的に排除され得る。好ましくは、上記化合物は、ＫＰＵ−０２である。
【００１８】
さらなる実施の形態は、血管増殖を治療又は予防するための薬学的組成物であって、薬学的に有効な量の本明細書中に開示する化合物を、この化合物にとって薬学的に許容可能な担体と一緒に含む薬学的組成物に関する。血管増殖は、疾患、例えば癌、加齢性黄斑変性及び糖尿病性網膜症の症状にもなり得る。
【００１９】
幾つかの実施の形態は、非腫瘍組織血管系よりも腫瘍血管系を優先的に標的とする方法に関する。この方法は、本明細書中に記載するような式（Ｉ）の構造を有する化合物を、動物、好ましくはヒトへ投与する工程を包み得る。上記非腫瘍組織は、例えば、皮膚、筋肉、脳、腎臓、心臓、脾臓、腸等であり得る。上記腫瘍血管系は、非腫瘍組織血管系よりも、例えば約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％及び９０％優先的に標的とされ得る。
【００２０】
他の実施の形態は、非腫瘍組織血管系よりも腫瘍血管系を優先的に標的とする方法に関し、この方法は、非腫瘍組織血管系よりも腫瘍血管系を優先的に標的とする作用物質を動物へ投与することを包み得る。
【００２１】
さらなる実施の形態は、増大された血管系に関連するか、又は血管系に依存する状態の治療のための薬剤の調製における式（Ｉ）の構造を有する化合物の使用に関する。幾つかの態様では、上記状態は癌であることもあるが、一方で、特定のタイプの癌又はすべての癌が特異的に排除されることもある。上記状況は、過剰血管新生に関連するか、血管系に関連するか、又は血管系に依存する任意の他の状態であり得る。例としては、免疫及び非免疫炎症、関節リウマチ、慢性関節リウマチ、乾癬、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、動脈硬化斑における毛細血管増殖、骨粗しょう症等が挙げられる。
【００２２】
添付の図面は、本明細書中に援用され、且つその一部を形成し、本発明の特定の好ましい実施の形態を単に説明しているに過ぎない。残り（以降）の本明細書と合わせて、添付の図面は、当業者に、本発明の特定の化合物を製造する好ましい様式を説明するのに役立つよう意図される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本明細書中で引用される米国特許を含む、本明細書中で引用される参照文献はそれぞれ、法に則って差し支えない最大限度にまで、参照によりその全体が本明細書中に完全に援用されるとみなされる。「デヒドロフェニラヒスチン及びそれらの類似体、並びにデヒドロフェニラヒスチン及びそれらの類似体の合成」という表題の、共に２００３年８月１日に出願された米国特許出願第１０／６３２，５３１号及びPCT出願のPCTUS０３／２４２３２は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【００２４】
本開示は、デヒドロフェニラヒスチン及びデヒドロフェニラヒスチン類似体を含む新規化合物を含む化合物の合成的製造方法を提供し、また比較的高収率で、薬学的に許容可能な細胞周期阻害剤、抗腫瘍剤及び抗真菌剤を製造する方法を提供し、ここで上記化合物及び／又はそれらの誘導体は、これらの細胞周期阻害剤、抗腫瘍剤及び抗真菌剤中の有効成分の中の１つである。他の目的として、現在利用可能な非合成方法により得ることができない新規化合物を提供することを含む。同様に、腫瘍成長の阻害に有効な量の新規抗腫瘍化合物種の成員を投与する工程を含む、癌、特にヒトの癌を治療する方法を提供することが目的である。本発明はまた、被験体における病原性の真菌を予防又は治療する方法を提供し、この方法は、被験体に、抗真菌に有効な量の新規抗真菌化合物種の成員を投与すること、例えば、対象となる抗真菌効果を提供する量及び様式で、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を投与することを含む。本明細書中に開示する化合物並びにこのような化合物を製造する方法及び使用する方法の好ましい実施形態では、必ずしも本発明の実施形態のすべてではないが、これらの目的は達成されている。
【００２５】
本明細書中には、化合物、及び化合物種を製造する方法が開示され、この化合物は、下記式（Ｉ）：
【００２６】
【化２】
2007520565.tif 000004
【００２７】
（式中、
Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ、Ｒ1’及びＲ1”は、互いに共有結合されるか、又は互いに共有結合されず、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル基及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子から成る群から選択され、それぞれ非置換であるか、又は上述に定義するようなＲ5基で置換され、
Ｙは、窒素原子、上記のＲ5基で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎは、０、１又は２の整数であり、
ｎ個のそれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであってよい）で表わされる。
【００２８】
本方法は、
ジアシルジケトピペラジンを第１のアルデヒドと反応させて、中間体化合物を生じさせる工程と、
上記中間体化合物を第２のアルデヒドと反応させて、上記一般構造を有する上記化合物種を生じさせる工程とにより、式（Ｉ）の化合物を生じさせる方法を含み、
上記第１のアルデヒド及び上記第２のアルデヒドは、オキサゾールカルボキサルデヒド、イミダゾールカルボキサルデヒド、ベンズアルデヒド、イミダゾールカルボキサルデヒド誘導体、及びベンズアルデヒド誘導体から成る群から選択され、それにより式（Ｉ）
（式中、
Ｒ1、Ｒ4及びＲ6は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ1’及びＲ1”は、独立して、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル、ヒドロキシ、カルボキシ、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ7、シアノ、アルキルチオ、ポリハロゲン化アルキルを含むハロゲン化アルキル、ハロゲン化カルボニル及びカルボニル−ＣＣＯ−Ｒ7（ここで、Ｒ7は、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ24アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ24アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、アジド、置換ニトロ、フェニル、及び置換フェニル基から選択される）から成る群から選択され、
Ｒ2、Ｒ3及びＲ5は、それぞれ別個に、水素原子、ハロゲン原子、並びに飽和Ｃ1〜Ｃ12アルキル、不飽和Ｃ1〜Ｃ12アルケニル、アシル、シクロアルキル、アルコキシ、シクロアルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アミノ、置換アミノ、ニトロ、及び置換ニトロ基、スルホニル基及び置換スルホニル基から成る群から選択され、
Ｘ1及びＸ2は、別個に、酸素原子、窒素原子、及び硫黄原子から成る群から選択され、
Ｙは、窒素原子、上述のＲ5基で置換された窒素原子、酸素原子、硫黄原子、酸化硫黄原子、メチレン基及び置換メチレン基から成る群から選択され、
ｎ個のそれぞれのＺ（０でない場合）、並びにＺ1、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、炭素原子、硫黄原子、窒素原子又は酸素原子から選択され、
破線の結合は、単結合又は二重結合のいずれかであり得る）を有する化合物を形成する。
【００２９】
また、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の化合物の薬学的に許容可能な塩及びプロドラッグエステルが提供され、本明細書中に開示する方法によりこのような化合物を合成する方法が提供される。
【００３０】
「プロドラッグエステル」という用語は、特に本明細書中に開示する方法により合成される式（Ｉ）の化合物のプロドラッグエステルを指す場合、例えば血中での又は組織の内部での加水分解により、ｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に転換されて本発明の化合物を生じる、化
合物の化学的誘導体を指す。「プロドラッグエステル」という用語は、生理学的条件下で加水分解される幾つかのエステル形成基のいずれかを付加することにより形成される、本明細書中に開示する化合物の誘導体を指す。プロドラッグエステル基の例としては、ピボイルオキシメチル、アセトキシメチル、フタリジル、インダニル及びメトキシメチル、並びに（５−Ｒ−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基を含む当該技術分野で既知の他の基が挙げられる。プロドラッグエステル基の他の例は、例えば、Ｔ．ヒグチ及びＶ．ステラ（T. Higuchi and V. Stella），「新規輸送システムとしてのプロドラッグ（Pro-drugs as Novel Delivery Systems）」, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series， American Chemical Society）(１９７５)、及び「薬物設計におけるバイオリバーシブルな担体：理論と応用（Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application）」，Ｅ．Ｂ．ローチェ（E. B. Roche）編，Pergamon Press:ニューヨーク（New York），１４−２１(１９８７)（カルボキシル基を含有する化合物のためのプロドラッグとして有用なエステルの例を提供する）に見出され得る。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「プロドラッグエステル」という用語はまた、例えば血中での加水分解により、ｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に転換されて本発明の化合物を生じる、化合物の化学誘導体を指す。「プロドラッグエステル」という用語は、生理学的条件下で加水分解される幾つかのエステル形成基のいずれかを付加することにより形成される、本明細書中に開示する化合物の誘導体を指す。プロドラッグエステル基の例としては、ピボイルオキシメチル、アセトキシメチル、フタリジル、インダニル及びメトキシメチル、並びに（５−Ｒ−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル基を含む当該技術分野で既知の他の基が挙げられる。プロドラッグエステル基の他の例は、例えば、Ｔ．ヒグチ及びＶ．ステラ（T. Higuchi and V. Stella）,「新規な輸送システムとしてのプロドラッグ（Pro-drugs as Novel Delivery Systems）」, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series， American Chemical Society，(１９７５)、及び「薬物設計におけるバイオリバーシブルな担体：理論と応用（Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application）」，Ｅ．Ｂ．ローチェ（E. B. Roche）編，Pergamon Press:ニューヨーク（New York），１４−２１(１９８７)（カルボキシル基を含有する化合物のためのプロドラッグとして有用なエステルの例を提供する）に見出され得る。
【００３２】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、特に本明細書中に開示する方法により合成される式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩を指す場合、化合物の任意の薬学的に許容可能な塩を指し、好ましくは、化合物の酸付加塩を指す。薬学的に許容可能な塩の好ましい例は、アルカリ金属塩（ナトリウム又はカリウム）、アルカリ土類金属塩（カルシウム又はマグネシウム）、又はアンモニア若しくは薬学的に許容可能な有機アミン、例えば、Ｃ1〜Ｃ7アルキルアミン、シクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン又はトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンにより誘導されるアンモニウム塩である。塩基性アミンである、上記方法により合成される化合物に関して、薬学的に許容可能な塩の好ましい例は、薬学的に許容可能な無機酸又は有機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、硫酸、リン酸、又は脂肪族若しくは芳香族のカルボン酸若しくはスルホン酸、例えば酢酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸又はナフタレンスルホン酸の酸付加塩である。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容可能な塩」という用語はまた、化合物の任意の薬学的に許容可能な塩を指し、好ましくは、化合物の酸付加塩を指す。薬学的に許容可能な塩の好ましい例は、アルカリ金属塩（ナトリウム又はカリウム）、アルカリ土類金属塩（カルシウム又はマグネシウム）、又はアンモニア若しくは薬学的に許容可能な有機アミン、例えば、Ｃ1〜Ｃ7アルキルアミン、シクロヘキシルアミン、トリエタノールアミン、エチレンジアミン又はトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタンにより誘導されるアンモニウム塩である。塩基性アミンである化合物に関して、薬学的に許容可能な塩の好
ましい例は、薬学的に許容可能な無機酸又は有機酸、例えば、ハロゲン化水素酸、硫酸、リン酸、又は脂肪族若しくは芳香族のカルボン酸若しくはスルホン酸、例えば酢酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸又はナフタレンスルホン酸の酸付加塩である。
【００３４】
本明細書中に開示される好ましい薬学的組成物は、本明細書中に開示する方法により合成される式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩及びプロドラッグエステルを含む。したがって、薬学的処方物の製造が、薬学的な賦形剤及び塩の形態の活性成分を緊密に混合することを含む場合、非塩基性の薬学的賦形剤、すなわち酸性の賦形剤又は中性の賦形剤のいずれかを使用することが好ましい。
【００３５】
本明細書中に開示する化合物の方法の好ましい実施形態では、比較的強固な平面状の擬似三環構造が形成され得る。このような比較的強固な平面状の擬似三環構造を安定化するために、Ｒ3は、好ましくは水素であるように選択されてもよい。
【００３６】
本明細書中に記載する化合物及び方法の他の好ましい実施形態では、ｎは、０又は１であり、より好ましくは１であり、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4は、それぞれ別個に、酸素原子、窒素原子及び炭素原子から選択され、より好ましくは、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4の少なくとも１つは炭素原子であり、Ｚ2、Ｚ3及びＺ4の少なくとも２つが炭素原子であることが最も好ましい。Ｚは同時に全て炭素原子であってもよい。
【００３７】
本明細書中に開示する方法及び組成物のさらなる他の好ましい実施形態は、以下の式（Ｉａ）及び式（Ｉｂ）：
【００３８】
【化３】
2007520565.tif 000005
【００３９】
（式中、可変の基は、本明細書中に定義する通りである）の構造を有する化合物を包含する。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「ハロゲン原子」という用語は、元素周期表の第７列の放射性安定原子のいずれか１つ、すなわち、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味し、フッ
素及び塩素が好ましい。
【００４１】
本明細書中で使用する場合、「アルキル」という用語は、任意の非分岐状又は分岐状の置換又は非置換の飽和炭化水素を意味し、Ｃ1〜Ｃ6の非分岐の飽和非置換炭化水素が好ましく、メチル、エチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルが最も好ましい。置換飽和炭化水素の中では、Ｃ1〜Ｃ6モノ及びジ及び過ハロゲン置換飽和炭化水素及びアミノ置換炭化水素が好ましく、ペルフルオロメチル、ペルクロロメチル、ペルフルオロ−ｔｅｒｔ−ブチル、及びペルクロロ−ｔｅｒｔ−ブチルが最も好ましい。「置換（された）」という用語は、関連技術の現行の多数の特許に見られるように、その通常の意味を有する。例えば、米国特許第６，５８３，１４３号、同第６，５０９，３３１号、同第６，５０６，７８７号、同第６，５００，８２５号、同第５，９２２，６８３号、同第５，８８６，２１０号、同第５，８７４，４４３号、及び同第６，３５０，７５９号を参照されたい。具体的に、「置換（された）」という用語の定義は、米国特許第６，５８３，１４３号で提供されるものと同程度の幅があり、この特許は、「置換（された）」という用語を、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、複素環及び複素環アルキル等の任意の基として定義しており、ここで、少なくとも１つの水素原子が置換基で置き換えられる。「置換（された）」という用語はまた、米国特許第６，５０９，３３１号に提供される定義と同程度の幅があり、この特許は、「置換アルキル」という用語を、この用語が、アルコキシ、置換アルコキシ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノアシル、アミノアシルオキシ、オキシアシルアミノ、シアノ、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、カルボキシルアルキル、ケト、チオケト、チオール、チオアルコキシ、置換チオアルコキシ、アリール、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、複素環、ヘテロシクロオキシ、ヒドロキシアミノ、アルコキシアミノ、ニトロ、−ＳＯ−アルキル、−ＳＯ−置換アルキル、−ＳＯ−アリール、−ＳＯ−ヘテロアリール、−ＳＯ2−アルキル、−ＳＯ2−置換アルキル、−ＳＯ2−アリール、及び−ＳＯ2−ヘテロアリールから成る群から選択される、１〜５個の置換基、好ましくは１〜３個の置換基を有する、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有するアルキル基を指すように定義している。上述の他の特許もまた、当業者に十分理解される「置換（された）」という用語に関する標準的な定義を提供している。「シクロアルキル」という用語は、環を構成する好ましくは５〜１２個の原子を有する、任意の非芳香族炭化水素環を指す。「アシル」という用語は、オキソ酸に由来するアルキル基又はアリール基を指し、アセチル基が好ましい。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「アルケニル」という用語は、任意の非分岐状又は分岐状の置換又は非置換の、多不飽和炭化水素を含む不飽和炭化水素を意味し、Ｃ1〜Ｃ6の非分岐状の単一不飽和及び二不飽和の非置換炭化水素が好ましく、単一不飽和のジハロゲン置換炭化水素が最も好ましい。構造（Ｉ）の化合物のＲ1及びＲ4の位置では、ｚ−イソプレニル部分が特に好ましい。「シクロアルケニル」という用語は、環を構成する好ましくは５〜１２個の原子を有する、任意の非芳香族炭化水素環を指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「アリール」、「置換アリール」、「ヘテロアリール」及び「置換ヘテロアリール」という用語は、環を構成する好ましくは５個、６個又は７個の原子、最も好ましくは６個の原子を有する、芳香族炭化水素環を指す。「ヘテロアリール」及び「置換ヘテロアリール」は、少なくとも１つのヘテロ原子、例えば酸素、硫黄又は窒素原子が、少なくとも１つの炭素原子と一緒に環中に存在する芳香族炭化水素環を指す。
【００４４】
「アルコキシ」という用語は、任意の非分岐状又は分岐状の置換又は非置換の飽和又は不飽和エーテルを指し、Ｃ1〜Ｃ6の非分岐状の飽和非置換エーテルが好ましく、メトキシが好ましく、またジメチル、ジエチル、メチル−イソブチル及びメチル−ｔｅｒｔ−ブチ
ルエーテルも好ましい。「シクロアルコキシ」という用語は、環を構成する好ましくは５〜１２個の原子を有する任意の非芳香族炭化水素環を指す。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、「精製された」、「実質的に精製された」及び「単離された」という用語は、化合物がその自然状態で通常付随する他の異なる化合物を含まない化合物を指し、したがって本発明の化合物は、所定の試料の少なくとも０．５重量％、１重量％、５重量％、１０重量％又は２０重量％、最も好ましくは少なくとも５０重量％又は７５重量％の質量を含む。
【００４６】
式（Ｉ）の化合物は、当該技術分野で既知であり、且つ入手可能な試薬から化学的に合成又は製造され得る。例えば、ジアシルジケトピペラジン（ジアセチルジケトピペラジン）の修飾は、例えばロウリン他（Loughlin et al.），２０００，Bioorg Med Chem Lett，１０:９１により、又はブロッキニ他（Brocchini et al.）によりＷＯ９５／２１８３２に記載されている。ジアシルジケトピペラジン（ジアセチルジケトピペラジン）は、例えば、酢酸ナトリウム及び無水酢酸ナトリウムによる、安価な２，５−ピペラジンジオン（ＴＣＩカタログ番号Ｇ０１００、２５ｇ）のジアセチル化により製造され得る。活性化されたケトピペラジンのジアセチル構造は、Ｂｏｃ（ｔ−ブトキシカルボニル）、Ｚ（ベンゾイルオキシカルボニル）等のカルバメートを含むように、他のアシル基で置き換えることができる。
【００４７】
イミダゾールカルボキサルデヒドは、以下に示すように、例えば、ハヤシ他（Hayashi et al.），２０００，J Organic Chem，６５:８４０２に開示する手順に従って製造され得る。
【００４８】
【化４】
2007520565.tif 000006
【００４９】
本明細書中に開示する合成方法は、好ましくは、ＤＭＦ中で且つ脱酸素雰囲気下で、塩基として炭酸セシウムの存在下で実施されてよい。不活性な雰囲気は、例えば、ワタナベ他（Watanabe et al.），第１８回複素環化学国際会議，横浜，日本（２００１年７月３０日）（18th International Congress of Heterocyclic Chemistry in Yokohama, Japan
(30 July 2001)），要旨集，２２５頁により報告されたように、炭酸セシウムによる処理中に起こり得るジケトピペラジン環の活性型α−炭素原子の考えられる酸化（以下を参照）を防ぐ。
【００５０】
【化５】
2007520565.tif 000007
【００５１】
合成方法の他の実施形態は、式（Ｉ）により表される化合物の合成において使用されるか、又は関与する化合物の修飾を包含する。このような誘導体は、フェニル環への修飾、他の芳香族環系の導入、芳香族環の位置（position）、イミダゾール環系への変更及び／又はイミダゾール環の５位へのさらなる修飾を含んでもよい。このような修飾の例は、例えば実施例４に記述される。このような修飾の結果は、フェニル環の窒素含有量の増加及び／又は化合物の溶解性を増加し得る化合物を含む。他の修飾は、既知のチューブリン阻害剤の誘導体を取り入れてもよく、それによりチューブリン阻害剤の活性を模倣する。他の修飾は、本明細書中に開示する方法で使用するイミダゾールカルボキサルデヒドの製造に関与するβ−ケトエステルの合成を単純化し得る。
【００５２】
薬学的組成物
本発明は、保管及びその後の投与用に調製される薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物の中の、本明細書中に開示する方法により任意に且つ好ましくは製造される、本明細書中に開示される化合物を包含し、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤の中に薬学的に有効な量の上記に開示する生成物を有する。治療用途のための許容可能な担体又は希釈剤は、薬学の技術分野で既知であり、例えば、「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」, Mack Publishing Co. (Ａ．Ｒ．ゲナーロ（A.R. Gennaro）編.１９８５)に記載されている。防腐剤、安定剤、色素、さらには香味剤を薬学的組成物に供給してもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、アスコルビン酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として添加してもよい。さらに、酸化防止剤及び懸濁化剤を使用してもよい。
【００５３】
デヒドロフェニラヒスチン又はデヒドロフェニラヒスチン類似体の組成物は、経口投与用の錠剤、カプセル又はエリキシル剤、直腸投与用の坐剤、注射可能な投与のための滅菌溶液又は懸濁液、経皮投与用のパッチ、及び皮下沈積物等として処方及び使用されてもよい。注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液として、注射若しくは注入の前に液体中の溶液若しくは懸濁液として適切な固体形態として、又はエマルジョンとして、従来の形態で調製することができる。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システイン及びヒト血清アルブミン等である。さらに、所望される場合には、注射可能な薬学的組成物は、少量の無毒性の補助物質、例えば湿潤剤及びｐＨ緩衝剤等を含有してもよい。所望される場合には、吸収を増強する調製物（例えば、リポソーム）を利用してもよい。
【００５４】
非経口投与用の薬学的処方物としては、水溶性の形態の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性化合物の懸濁液が、適切な油性注射懸濁液として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又は媒質としては、ゴマ油のような脂肪油、又はダイズ油、グレープフルーツ油若しくはアーモンド油のような他の有機油、又はオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、又はリポソームが挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストランのような、懸濁液の粘度を増大させる物質を含有してもよい。任意に、懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の製造を可能にするために、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を増大させる作用
物質を含有してもよい。
【００５５】
経口用途用の薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と組み合わせること、得られた混合物を任意に粉砕すること、及び所望される場合には、錠剤又はドラジェコアを得るために適切な助剤を添加した後に顆粒の混合物を加工処理することにより得てもよい。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールを含む糖等の充填剤、例えばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）のようなセルロース調製物である。所望される場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、又はアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム等のその塩のような崩壊剤を添加してもよい。ドラジェコアには、適切なコーティングが施される。この目的で、濃縮糖溶液を使用してもよく、それは任意に、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してもよい。活性化合物の用量の識別のために、又は活性化合物の用量の種々の組合せを特徴付けるために、染料又は顔料を錠剤又はドラジェコーティングに添加してもよい。この目的で、濃縮糖溶液を使用してもよく、それは任意に、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物を含有してもよい。活性化合物の用量の識別のために、又は活性化合物の用量の種々の組合せを特徴付けるために、染料又は顔料を錠剤又はドラジェコーティングに添加してもよい。このような処方物は、当該技術分野で既知の方法を用いて製造することができる（例えば、米国特許第５，７３３，８８８号（注射可能な組成物）、同第５，７２６，１８１号（難水溶性化合物）、同第５，７０７，６４１号（治療上活性なタンパク質又はペプチド）、同第５，６６７，８０９号（親油性作用物質）、同第５，５７６，０１２号（可溶化高分子作用物質）、同第５，７０７，６１５号（抗ウイルス処方物）、同第５，６８３，６７６号（粒子状薬剤）、同第５，６５４，２８６号（局所用処方物）、同第５，６８８，５２９号（経口懸濁液）、同第５，４４５，８２９号（徐放性処方物）、同第５，６５３，９８７号（液体処方物）、同第５，６４１，５１５号（制御放出性処方物(controlled release formulations)）及び同第５，６０１，８４５号（球状処方物）を参照）。
【００５６】
さらに、眼内、鼻内及び耳介内の送達を含む用途のための薬学技術分野で既知の様々な薬学的組成物を本明細書中に開示する。薬学的処方物としては、点眼薬のような水溶性形態での、又はゲランガム(シェッデン他（Shedden et al.），2001, Clin Ther，23（3）： 440-50)若しくはヒドロゲル(メイヤー他（Mayer et al.）, 1996, Ophthalmologica 210: 101-3)中の、活性化合物の水性眼用溶液、眼用軟膏、眼用懸濁液（例えば、微粒子、液体担体媒質中に懸濁される薬物含有高分子小粒子(ジョシ，Ａ．（Joshi, A.）, 1994 J
Ocul Pharmacol 10: 29-45)、脂質溶解性処方物(アルム他（Alm et al.）, 1989 Prog Clin Biol Res 312: 447-58)、及びミクロスフェア(モルデンティ（Mordenti）, 1999 Toxicol Sci 52: 101-6)）、及び眼挿入物が挙げられる。このような適切な薬学的処方物は、ほとんどの場合、及び好ましくは、安定性及び快適さのために滅菌され、等張性であり、且つ緩衝化されるように処方される。薬学的組成物はまた、正常な繊毛作用の維持を確実にするために、多くの場合、多くの点で鼻分泌を刺激するように製造されるドロップ及びスプレーを包含してもよい。「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」(Mack Publishing, 第１８版)に開示されるように、また当業者に既知であるように、適切な処方物は、ほとんどの場合、及び好ましくは、等張性であり、ｐＨ５．５〜６．５を維持するようにわずかに緩衝化され、またほとんどの場合、及び好ましくは、抗菌防腐剤及び適切な薬物安定剤を含む。耳介内送達用の薬学的処方物としては、耳の中での局所塗布のための懸濁液及び軟膏が挙げられる。このような耳用処方物のための通常の溶
媒としては、グリセリン及び水が挙げられる。
【００５７】
細胞周期阻害剤、腫瘍成長阻害又は真菌成長阻害化合物として使用する場合、式（Ｉ）の化合物は、経口又は非経口経路のいずれかにより投与することができる。経口投与する場合、式（Ｉ）の化合物は、カプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップ又はその他の形態で投与することができる。非経口投与する場合、式（Ｉ）の化合物は、水性懸濁液、油性調製物等として、又は点滴、坐剤、軟膏剤、軟膏等として、注射又は注入により投与する場合は、例えば、皮下的に、腹腔内、静脈内、筋内に投与することができる。同様に、式（Ｉ）の化合物は、化合物を腫瘍と最適に接触させ、それにより腫瘍の成長を阻害するために、当業者が適切であると考える場合には、局所的、直腸的、又は膣的に投与してもよい。腫瘍の部位での局所投与はまた、制御放出性処方物、デポ処方物及び注入ポンプ送達と同様に、腫瘍の切除前又は切除後のいずれかで意図される。
【００５８】
投与方法
本発明はまた、開示する化学化合物及び開示する薬学的組成物を製造する方法及び投与する方法を包含する。このような開示する方法は、特に、（ａ）カプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップ、又はその他の形態での投与を含む経口経路による投与、（ｂ）水性懸濁液、油性調製物等として、又は点滴、坐剤、軟膏剤、軟膏等としての投与、注射又は注入により、皮下的に、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮内投与を含む、非経口経路による投与、（ｃ）局所投与、（ｄ）直腸投与、又は（ｅ）化合物を生存組織と最適に接触させるために、当業者が適切であると考える場合には、膣投与、及び（ｆ）制御放出性処方物、デポ処方物及び注入ポンプ送達による投与が挙げられる。このような投与様式のさらなる例として、及び投与様式のさらなる開示として、眼内、鼻内及び耳介内経路による投与の様式を含む、開示する化学化合物及び薬学的組成物の様々な投与方法を本明細書中に開示する。
【００５９】
用量として必要とされるデヒドロフェニラヒスチン又はデヒドロフェニラヒスチン類似体の組成物の薬学的に有効な量は、投与経路、治療されるヒトを含む動物のタイプ、及び対象とする特定の動物の身体特性に応じる。用量は、所望の効果を達成するように合わせて調製できるが、体重、食事、同時投薬等の因子、及び医療技術分野の当業者が認識するであろう他の因子に依存する。
【００６０】
上記方法を実施する際、生成物又は組成物は、単独で、若しくは互いに組み合わせて、又は他の治療剤又は診断用薬と組み合わせて使用することができる。例えば、本明細書中に開示するように、本明細書中に開示する化合物は、他の活性物、具体的には、他の化学療法剤、例えば生物製剤及び特定の化学療法剤であるＣＰＴ−１１、タキソテン（ドカタキセル）及びパクリタキセルと併用する場合、癌の治療に有効である。本明細書中に開示する化合物はまた、Ｅｒｂｕｉｔｕｘ(イムクローン／ブリストルマイヤーズ（Imclone/bristol-Myers）)及びＩｒｅｓｓａ(アストラゼネカ（AstraZeneca）)のような抗血管剤、抗血管新生剤、他のＶＥＧＦ阻害剤及び生物製剤、より具体的には、少なくとも１つの抗ＶＥＧＦ抗体、特にＤＣ１０１を含むＶＥＧＦ受容体に対するモノクローナル抗体、マウスＶＥＦＧ受容体２（ｆｌｋ−１）を阻害するラットモノクローナル抗体を含む他の活性物と併用する場合、癌の治療に有効である。このような組合せは、通常哺乳類において、好ましくはヒトにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用され得る。このような組合せをｉｎ  ｖｉｖｏで使用する際、本発明で開示する化合物は、単独で用いて、又は他の化学療法剤若しくは他の生物製剤生成物と併用されて、各種の投与形態を使用して、非経口的、静脈内、注入又は注射により、皮下的に、筋内に、結腸に、直腸に、膣に、鼻に、又は腹腔内への投与を含む各種の方法で哺乳類に投与されてよい。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化学活性の試験にも適用してもよい。
【００６１】
当業者に容易に明らかであるように、投与されるべき有用なｉｎ  ｖｉｖｏでの投与量、及び特定の投与の様式は、年齢、体重及び治療される哺乳類の種、使用する特定の化合物、並びにこれらの化合物が使用される特定用途に依存して様々である。有効投与量レベル、すなわち所望の結果を達成するのに必要な投与量レベルの決定は、日常的な薬理学的方法を使用して技術分野の当業者により成すことができる。通常、生成物のヒトへの臨床適用は、より低い投与量レベルから始め、所望の効果が達成されるまで投与量レベルを増加させる。或いは、許容可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を使用して、確立された薬理学的方法を用いる本発明の方法により確認される組成物の有用な用量及び投与経路を確立することができる。
【００６２】
ヒトでない動物の研究では、潜在的な生成物の適用は、より高い投与量レベルで始め、所望の効果がもはや達成されないか、又は不都合な副作用が消滅するまで、投与量を減少させる。投与量は、所望の影響及び治療の徴候に応じて、広範囲に及ぶことがある。通常、投与量は、約１０マイクログラム／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは約１００マイクログラム／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）であり得る。或いは、投与量は、当業者に理解されるように、患者の表面積に基づいて算出してもよい。投与は、３日おきに、１日おきに、毎日、１日２度、又は１日３度を基準にする経口投与であってよい。
【００６３】
正確な処方、投与経路及び投与量は、患者の状態を考慮して、個々の医師により選択され得る。例えば、フィングル他（Fingl et al.），「治療の薬理学的基礎（The Pharmacological Basis of Therapeutics）」，１９７５を参照されたい。主治医は、毒性又は臓器機能障害に応じて投与を終結、中断又は調節する方法及び時期を理解するであろうことに留意すべきである。逆に、主治医はまた、臨床反応が適正でない場合（毒性を除く）に、より高レベルに治療を調節することも理解するであろう。目的の障害の管理における投与用量の規模は、治療されるべき症状の重篤性及び投与経路により様々である。症状の重篤性は、例えば、部分的に、標準的な予後評価方法により評価され得る。さらに、用量、及びおそらく用量頻度もまた、個々の患者の年齢、体重及び反応に従って様々である。上記事項と同程度のプログラムを、獣医学で使用してもよい。
【００６４】
治療されるべき特定の症状に応じて、このような作用物質は、処方され、全身的に又は局所的に投与され得る。処方及び投与に関する各種技法は、「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」，第１８版，Mack Publishing Co.，イーストン（Easton），ペンシルベニア(１９９０)に見受けられ得る。適切な投与経路としては、経口、直腸、経皮、膣、経粘膜又は腸投与、筋内、皮下、脊髄内注射、並びに髄腔内、直接脳室内へ、静脈内、注入による、腹腔内、鼻内又は眼内注射を含む非経口送達が挙げられ得る。
【００６５】
注射又は注入に関して、作用物質は、水溶液中、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液又は生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝液中に処方してもよい。このような経粘膜投与用に、浸透されるバリアに対して適切な浸透剤が処方物中で使用される。このような浸透剤は、一般に当該技術分野で既知である。全身投与に適した投与量中への、本発明の実施のために本明細書中に開示する化合物を処方するための薬学的に許容可能な担体の使用は、本発明の範囲内である。担体の適正な選択及び適切な製造の実施によって、本明細書中に開示する組成物、特に溶液として処方される組成物は、例えば静脈内注射又は注入により、非経口的に投与されてよい。本発明の化合物は、経口投与に適した投与量中へ、当該技術分野で既知の薬学的に許容可能な担体を用いて容易に処方することができる。このような担体により、治療されるべき患者の経口摂取用に、化合物を錠剤、丸剤、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤等に処方することが可能となる。
【００６６】
細胞内投与されるように意図される作用物質は、当業者に既知の技法を用いて投与され
てもよい。例えば、このような作用物質は、リポソームに封入された後、上述のように投与されてもよい。リポソーム形成の時点で水溶液中に存在する分子はすべて、水性内部に取り込まれる。リポソームの内容物はともに、外部の微視的環境から保護され、且つ、リポソームが細胞膜と融合するため、細胞質へ効率的に送達される。さらに、リポソームの疎水性に起因して、有機低分子を細胞内に直接投与してもよい。
【００６７】
有効量の決定は、特に本明細書中に提供する詳細な開示を鑑みて、十分に当業者の能力内にある。有効成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の加工処理を容易とする賦形剤及び助剤を含む、適切な薬学的に許容可能な担体を含有してもよい。経口投与用に処方される調製物は、錠剤、ドラジェ、カプセル又は溶液の形態であってよい。薬学的組成物は、例えば、従来の混合、溶解、粒状化、ドラジェ作製、浮揚化、乳化、封入化、取り込み、又は凍結乾燥プロセスにより、それ自体既知の様式で製造されてもよい。
【００６８】
本明細書中に開示する化合物は、既知の方法を用いて、有効性及び毒性に関して評価することができる。例えば、ある特定の化学部分を共有する特定の化合物、又は化合物のサブセットの毒性学は、哺乳類の細胞系、好ましくはヒト細胞系のような細胞系に対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで毒性を決定することにより確立され得る。このような研究の結果は、多くの場合、哺乳類、より具体的にはヒトのような動物における毒性の予想に役立つ。或いは、マウス、ラット、ウサギ、又はサルのような動物モデルにおける特定の化合物の毒性は、既知の方法を用いて決定され得る。特定の化合物の有効性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法、動物モデル、又はヒト臨床試験のような幾つかの当該技術分野で理解される方法を用いて確立されてよい。当該技術分野で理解されるｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルは、癌、心血管疾患及び様々な真菌感染を含む、本明細書中に開示する化合物により軽減される症状を含むほぼすべての種類の症状に関して存在する。同様に、許容可能な動物モデルを使用して、このような症状を治療するための化学物質の有効性を確立してもよい。有効性を決定するためにモデルを選択する場合、当業者は、適切なモデル、用量、及び投与経路、並びに投与計画を選択するように現在の技術水準により誘導され得る。当然のことながら、ヒトの臨床試験もまた、ヒトにおける化合物の有効性を決定するのに使用することができる。
【００６９】
抗癌剤、又は腫瘍成長阻害化合物として使用する場合、本明細書中に開示する化合物は、経口経路又は非経口経路のいずれかにより投与され得る。経口投与する場合、本明細書中に開示する化合物は、カプセル、錠剤、顆粒、スプレー、シロップ又はその他の形態で投与することができる。非経口投与する場合、本明細書中に開示する化合物は、水性懸濁液、油性調製物等として、又は点滴、坐剤、軟膏剤、軟膏等として投与することができ、注射又は注入により投与する場合、皮下的に、腹腔内、静脈内、筋内、皮内等に投与することができる。同様に、本明細書中に開示する化合物は、化合物を腫瘍と最適に接触させ、それにより腫瘍の成長を阻害するために、当業者が適切であると考える場合には、局所的、直腸、又は膣に投与してもよい。腫瘍の部位又は他の疾患状態での局所投与はまた、腫瘍切除前若しくは後のいずれかで、又は疾患状態の当該技術分野で理解される治療の一部として意図される。制御放出性処方物、デポ処方物及び注入ポンプ送達も同様に意図される。
【００７０】
抗癌剤又は抗腫瘍剤として使用する場合、約０．０００７ｍｇ／日〜約７，０００ｍｇ／日の有効成分、より好ましくは約０．０７ｍｇ／日〜約７０ｍｇ／日の有効成分の量で、好ましくは１日当たり１回、又はあまり好ましくはないが、１日当たり２回〜約１０回で、ヒト患者に経口又は非経口投与してもよい。代替的且つまた好ましくは、化合物は、例えば静脈内点滴により連続的に規定量で好ましく投与してもよい。したがって、７０キログラムの体重の患者に関して、有効な抗腫瘍成分の好ましい日用量は、約０．０００７ｍｇ／ｋｇ／日〜約３５ｍｇ／ｋｇ／日（１．０ｍｇ／ｋｇ／日及び０．５ｍｇ／ｋｇ／
日を含む）、より好ましくは０．００７ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ／日（０．０３５ｍｇ／ｋｇ／日を含む）であろう。それにもかかわらず、当業者に理解されるように、ある特定の状況では、特に進行した腫瘍又は致死的な腫瘍を効果的且つ積極的に治療するために、上述の好ましい投与量範囲を超える、又は場合によってははるかに超える量で抗腫瘍化合物を投与する必要がある場合もある。
【００７１】
抗真菌剤として使用する場合、特定の真菌病原体の治療又は予防に有効なデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体の好ましい量は、真菌の特徴及び感染の程度に幾分応じ、標準的な臨床技法により決定することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを任意に使用して、最適な投与量範囲を同定する手助けとしてもよい。有効な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析、又は好ましくは動物モデルから得られる用量反応曲線から外挿してもよい。正確な投与量レベルは、主治医又は他の医療提供者により決定されるべきであり、投与経路、並びに個体の年齢、体重、性別及び全身の健康状態、感染の性質、重篤性及び臨床病期、併用治療の使用（又は不使用）を含む既知の因子に応じる。
【００７２】
デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体の有効な用量は、通常、１日当たり約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ（哺乳類体重）の範囲であり、単回用量又は複数回用量で投与される。概して、化合物は、患者１人当たり約１〜約２，０００ｍｇの日用量範囲で、このような治療を必要とする患者に投与してもよい。
【００７３】
腫瘍成長阻害化合物として本明細書中に開示する化合物を含む投薬を処方するために、既知の界面活性剤、賦形剤、滑化剤、懸濁剤、並びに薬学的に許容可能な膜形成物質及びコーティング助剤等を使用してもよい。好ましくは、アルコール、エステル、硫酸化した脂肪族アルコール等を界面活性剤として使用してもよく、スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸塩、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース等を賦形剤として使用してもよく、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等を滑化剤として使用してもよく、ヤシ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、ダイズを懸濁剤又は潤滑剤として使用してもよく、セルロース若しくは糖のような炭水化物の誘導体としての酢酸フタル酸セルロース、又はポリビニルの誘導体としての酢酸メチル−メタクリル酸共重合体を懸濁剤として使用してもよく、フタル酸エステルのような可塑剤等を懸濁剤として使用してもよい。上述の好ましい成分のほかに、特に化合物が経口投与される場合に、甘味剤、芳香剤、着色剤、防腐剤等を化合物の投与処方物に添加してもよい。
【００７４】
薬学的組成物における本明細書中に開示する組成物はまた、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。このような組成物は、保管用及びその後の投与用に調製されてもよい。治療用途のための許容可能な担体又は希釈剤は、薬学技術分野で既知であり、例えば、「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」，Mack Publishing Co.(Ａ．Ｒ．ゲナーロ編（A.R. Gennaro）.１９８５)に記載されている。例えば、このような組成物は、経口投与用の錠剤、カプセル又は溶液、直腸又は膣投与用の坐剤、注射投与用の滅菌溶液又は懸濁液として処方及び使用してもよい。注射剤は、液体溶液又は懸濁液、注射若しくは注入の前に液体中の溶液又は懸濁液に適切な固体の形態として、又はエマルジョン等の従来の形態で調製することができる。適切な賦形剤としては、生理食塩水、デキストロース、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、塩酸システイン等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、所望される場合、注射可能な薬学的組成物は、少量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤、ｐＨ緩衝剤等を含有してもよい。所望される場合、吸収増強調製物（例えば、リポソーム）を利用してもよい。
【００７５】
用量として必要とされる組成物の薬学的に有効な量は、投与経路、治療される動物のタイプ、及び対象とする特定の動物の身体特性に応じる。用量は、所望の効果を達成するように合わせることができるが、体重、食事、併用投薬、及び医療技術分野の当業者が認識する他の因子等の因子に応じる。
【００７６】
上述のような生成物又は組成物は、単独で、又は互いに組み合わせて、又は他の治療剤又は診断用薬と組み合わせて使用することができる。具体的には、本明細書中に開示する化合物生成物は、癌の治療のために、単独で、又は他の化学療法剤又は生物製剤（抗体を含む）と組み合わせて、又は、真菌感染の治療のために、他の抗感染物質と組み合わせて使用してもよい。これらの生成物又は組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで利用され得る。有用な投与量及び最も有用な投与様式は、年齢、体重及び治療される動物、使用する特定の化合物、及びこれらの組成物（複数可）を使用する特定の用途に応じて様々に変化する。特定の疾病のための管理又は治療における用量の規模は、治療されるべき症状の重篤性及び投与経路により様々であり、疾患状態及びそれらの重篤性に応じて、組成物は処方され、全身的に又は局部的に投与され得る。処方及び投与に関する各種技法は、「レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」，第１８版，Mack Publishing Co.，イーストン（Easton），ペンシルベニア（PA）(１９９０)に見受けられる。
【００７７】
細胞周期阻害剤、腫瘍成長阻害剤、又は抗真菌化合物として、好ましくは本明細書中に開示する方法により合成的に製造される式（Ｉ）の化合物を処方するために、既知の界面活性剤、賦形剤、滑化剤、懸濁剤、並びに薬学的に許容可能な膜形成物質及びコーティング助剤等を使用してもよい。好ましくは、アルコール、エステル、硫酸化された脂肪族アルコール等を界面活性剤として使用してもよく、スクロース、グルコース、ラクトース、デンプン、結晶セルロース、マンニトール、軽質無水ケイ酸塩、アルミン酸マグネシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルシウムカルボキシメチルセルロース等を賦形剤として使用してもよく、ステアリン酸マグネシウム、タルク、硬化油等を滑化剤として使用してもよく、ヤシ油、オリーブ油、ゴマ油、落花生油、ダイズ等を懸濁剤又は潤滑剤として使用してもよく、セルロース若しくは糖のような炭水化物の誘導体としての酢酸フタル酸セルロース、又はポリビニルの誘導体としての酢酸メチル−メタクリル酸共重合体を懸濁剤として使用してもよく、フタル酸エステルのような可塑剤等を懸濁剤として使用してもよい。上述の好ましい成分に加えて、特に化合物が経口投与される場合に、甘味剤、芳香剤、着色剤、防腐剤等を、上記方法により製造される化合物の投与処方物に添加してもよい。
【００７８】
上記方法により製造され得る細胞周期阻害剤、抗腫瘍剤及び抗真菌剤は、約０．００１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日の活性成分、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日の活性成分の量で、好ましくは周期的に３日おきに１回、１日おきに１回、１日当たり１回、１日当たり２回、又はあまり好ましくはないが、１日当たり２回〜約１０回で、ヒト患者に経口又は非経口投与してもよい。代替的に且つ又は好ましくは、上記方法により製造される化合物は、例えば静脈内点滴により連続的に規定量で好ましく投与され得る。したがって、７０キログラムの体重の患者に関して、活性な抗腫瘍成分の好ましい日用量は、約０．０７ｍｇ／日〜約７００グラム／日、より好ましくは７ｍｇ／日〜約７グラム／日である。それにもかかわらず、当業者に理解されるように、ある特定の状況では、特に進行した腫瘍又は致死的な腫瘍を効果的且つ積極的に治療するために、上述の好ましい投与量範囲を超える、又は場合によってははるかに超える量で、上記方法により製造される抗腫瘍化合物を投与する必要がある場合もある。
【００７９】
生化学試験試薬として上記方法により製造される細胞周期阻害剤を使用する場合、本発
明の方法により製造される化合物は、有機溶媒又は含水有機溶媒中に溶解し、且つ様々な培養細胞系のいずれかに直接適用される場合、細胞周期の進行を阻害する。使用可能な有機溶媒としては、例えば、メタノール、メチルスルホキシド等が挙げられる。処方物は、例えば、粉末、顆粒若しくは他の固体阻害剤、又は有機溶媒若しくは含水有機溶媒を用いて調製される液体阻害剤であり得る。細胞周期阻害剤として使用するための本発明の方法により製造される化合物の好ましい濃度は、概して約１〜約１００μｇ／ｍｌの範囲であるが、最も適切な使用量は、当業者に理解されるように、培養細胞系のタイプ及び使用の目的に応じて様々に変化する。同様に、ある特定の用途では、上述の範囲外の量を使用することが、当業者にとって必要であるか、又は好ましい場合がある。
【００８０】
薬学的展望から、ある特定の実施形態は、被験体における真菌感染及び／又は病原性の真菌を予防又は治療する方法を提供し、上記被験体に、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を含む組成物を投与すること、例えば、目的とする抗真菌効果を提供する量及び様式で、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を投与することを含む。
【００８１】
他の実施形態は、上述の又は以下に参照する真菌のような病原性の真菌による感染患者の治療又は予防を包含する。
【００８２】
別の実施形態は、１つ以上の他の抗真菌剤、特にデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体以外の作用物質（例えば、アンホテリシンＢ又はその類似体若しくは誘導体（１４（ｓ）−ヒドロキシアンホテリシンＢメチルエステル、１−アミノ−４−メチルピペラジンとのアンホテリシンＢのヒドラジド、及び他の誘導体を含む）を含む）、又は他のポリエンマクロライド系抗生物質（例えば、ナイスタチン、カンジシジン、ピマリシン及びナタマイシン、フルシトシン、グリセオフルビン、エキノカンジン又はオーレオバシジン（天然に存在する類似体及び半合成類似体を含む）、ジヒドロベンゾ［ａ］ナフタセンキノン、ヌクレオシドペプチド抗真菌物質（ポリオキシン及びニッコーマイシンを含む）、ナフチフィン及び他のスクワレンエポキシダーゼ阻害剤のようなアリルアミン、並びに例えばクロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、テルコナゾール、イトラコナゾール又はフルコナゾール等のようなアゾール、イミダゾール及びトリアゾールに耐性である病原性の真菌による感染患者の治療又は予防に関する。従来のさらなる抗真菌剤及び開発中の新規作用物質に関しては、例えば、ターナー及びロドリゲス（Turner and Rodriguez），１９９６，Current Pharmaceutical Design，２:２０９−２２４を参照されたい。別の実施形態は、患者が１つ以上の他の抗真菌剤にアレルギー性であるか、又はそうでなければ不耐性である、若しくは無反応である場合に、又は他の抗真菌剤の使用が他の場合では禁忌を示す人において、病原性の真菌による感染患者の治療又は予防を包含する。これらの他の抗真菌剤としては、特に、上記に開示する抗真菌剤及び本明細書中の他の箇所に開示する抗真菌剤が挙げられる。
【００８３】
上述の治療又は予防方法において、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体は、有効な抗真菌量で被験体に投与される。
【００８４】
他の実施形態は、例えば、上述の作用物質又は作用物質のタイプのいずれかを含む、１つ以上の他の抗真菌剤の投与と併用して（例えば、好ましくは脂質又はリポソーム処方物中のアンホテリシンＢ、フルコナゾールのようなアゾール又はトリアゾール、例えばオーレオバシジン、ジヒドロベンゾ［ａ］ナフタセンキノン、若しくはエキノカルジンによる治療と組み合わせて）、並びに異なるデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を用いて、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体の投与による病原性の真菌による感染患者の治療又は予防に関する。
【００８５】
デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体は、他の抗真菌剤が投与される前に、後に、
又は同時に投与してもよい。ある特定の実施形態では、併用療法により、単独で使用される場合に使用する量に対して、抗真菌剤の一方又は両方を減少させた量で使用することが可能となる。
【００８６】
さらに他の実施形態は、病原性の真菌による感染の治療又は予防のための、被験体へのデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体の投与に関し、ここで上記被験体は、例えば、遺伝病、糖尿病のような疾患、又はＨＩＶ若しくは他の感染、癌若しくは他の疾患のための化学療法又は放射線治療、又は組織若しくは臓器移植又は自己免疫障害の治療に関連して薬剤により又は他のものにより誘導される免疫抑制の結果として、免疫抑制されるか、又は免疫無防備状態である。患者が、例えば組織又は臓器移植に関連して、免疫抑制剤により治療中であるか、又は治療されるであろう場合、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体は、免疫抑制剤（複数可）とともに同時投与しても良く、病原性の真菌感染を治療又は予防し得る。
【００８７】
本発明の別の態様は、１つ以上の抗ＨＩＶ治療薬（例えば、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、又は抗ウイルス剤を含む）の投与と一緒に、抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体の投与による、ＨＩＶに感染しているか、又は感染していることが疑われる患者における病原性の真菌による感染の治療又は予防である。デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体は、抗ＨＩＶ剤（複数可）の投与前に、後に、又は同時に投与してもよい。
【００８８】
本発明の別の態様は、好ましくは細菌感染を治療又は予防するための有効量及びレジメンでの、１つ以上の他の抗生物質化合物、特に１つ以上の抗菌剤の投与と一緒に、抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体の投与による、病原性の真菌による感染患者の治療又は予防である。同様に、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体は、他の作用物質（複数可）の投与前に、後に、又は同時に投与してもよい。
【００８９】
開示する方法により治療又は予防され得る病原性の真菌感染としては、特に、アスペルギルス症（侵入性肺アスペルギルス症を含む）、ブラストミセス症（顕著な又は急速進行性の感染及び中枢神経系におけるブラストミセス症を含む）、カンジダ症（例えば腎臓結石、尿路閉塞、腎移植又は抑制の乏しい真性糖尿病の患者における尿路の逆行性カンジダ症を含む）、コクシジオイデス症（他の化学療法に十分に応答しない慢性疾患を含む）、クリプトコックス症、ヒストプラスマ症、ムコール菌症（例えば、頭蓋顔面ムコール菌症及びムコール肺炎を含む）、パラコクシジオイデス症及びスポロトリクム症が挙げられる。抗真菌量の１つ以上のデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を含む組成物の投与は、真菌が１つ以上の他の抗真菌療法に耐性であるか、又は１つ以上の他の抗真菌療法が、例えば上述のように禁忌を示す、哺乳類被験体における病原性の真菌感染を治療又は予防するのに特に有用であり得ることに留意すべきである。
【００９０】
開示する方法を実施する際に使用するための、少なくとも１つの抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を含有する抗真菌薬学的組成物もまた提供される。これらの薬学的組成物は、特にそれらの抗真菌的な使用に関する、特に、指示書及び情報を含む適切な添付文書と一緒に包装してもよい。第２の抗真菌剤と一緒に１つ以上のデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を含有する薬学的組成物もまた提供される。
【００９１】
真菌感染を治療する方法
本明細書中に開示するある特定の実施形態は、例えば、アスペルギルス症（侵入性肺アスペルギルス症を含む）、ブラストミセス症（顕著な又は急速進行性の感染及び中枢神経系におけるブラストミセス症を含む）、カンジダ症（例えば腎臓結石、尿路閉塞、腎移植又は抑制の乏しい真性糖尿病の患者における尿路の逆行性カンジダ症を含む）、コクシジ
オイデス症（他の化学療法に十分に応答しない慢性疾患を含む）、クリプトコックス症、ヒストプラスマ症、ムコール菌症（例えば、頭蓋顔面ムコール菌症及びムコール肺炎を含む）、パラコクシジオイデス症及びスポロトリクム症を含む病原性の真菌感染を治療又は予防する方法に関する。上記方法は、真菌感染を治療又は予防するように、上述のような少なくとも１つの抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体をヒト被験体に投与することを包含してもよい。ある特定の実施形態では、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体は、アンホテリシンＢ、又は上述したようなイミダゾール若しくはチアゾール作用物質のような１つ以上の非デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体抗真菌剤の投与と併用して投与してもよい。
【００９２】
病原性の真菌感染は、例えば生物の中でも特に、カンジダ属(Candida)、白癬菌属(Trichophyton)、小胞子菌属(Microsporum)又は表皮菌属(Epidermophyton)の種により引き起こされる局所性であることもあり、又は例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)により引き起こされる粘膜性である場合もある（例えば、鵞口瘡及び膣カンジダ症）。感染は、例えばカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、クリピトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus fumigatus)、コクシジオイデス属(Coccidioides)、パラコクシジオイデス属 (Paracoccidioides)、ヒストプラスマ属(Histoplasma)又はブラストミセス属(Blastomyces)種により引き起こされる全身性である場合もある。感染はまた、真菌性菌腫、クロモブラストミコーシス、クリプトコックス髄膜炎又はフィコミコーシスを包含し得る。
【００９３】
さらなる実施形態は、カンジダ属種（Ｃ．アルビカンス(C. albicans)、Ｃ．トロピカリス(C. tropicalis)、Ｃ．ケフィア(C. kefyr)、Ｃ．クルセイ(C. krusei)及びＣ．ガルブラタ(C. galbrata)を含む）、アスペルギルス(Aspergillus)属種（Ａ．フミガーツス(A. fumigatus)及びＡ．フラブス(A. Flavus)を含む）、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ブラストミセス(Blastomyces)属種（ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)を含む）、ニューモシスティス・カリニ(Pneumocystis carinii)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、バシジオボラス・ラナルム(Basidiobolus ranarum)、コニディオボルス(Conidiobolus)属種、ヒストプラズマ・カプスラタム(Histoplasma capsulatum)、リゾプス(Rhizopus)属種（Ｒ．オリザエ(R. oryzae)及びＲ．ミクロスポルス(R. microsporus)を含む）、クスダマカビ(Cunninghamella)属種、リゾムコール(Rhizomucor)属種、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)、シュードアレシェリア・ボイジイ(Pseudallescheria boydii)、リノスポリジウム・シーベリ(Rhinosporidium seeberi)、及びスポロトリックス・シェンキイ(Sporothrix schenckii)から成る群から選択される病原性の真菌感染を治療又は予防する方法に関する。同様に、上記方法は、不都合な免疫抑制効果を誘導することなく、真菌感染が治療又は予防されるように、非免疫抑制性抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を、それを必要とする患者に投与することを包含してもよい。
【００９４】
さらなる実施形態は、本明細書中の他の箇所で言及する１つ以上の抗真菌剤（例えば、アンホテリシンＢ、フルシトシン、イミダゾール及びトリアゾールのうちの１つ（例えば、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、及び他の上述の例を含む）を含む）に耐性である病原性の真菌感染を含む、他の抗真菌療法に耐性である病原性の真菌感染を治療又は予防する方法に関する。上記方法は、被験体における別の抗真菌療法に耐性である真菌感染が治療又は予防されるような量及び投薬計画で、患者に１つ以上の抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を投与することを包含してもよい。
【００９５】
さらなる実施形態は、別の抗真菌療法にアレルギー性であるか、不耐性であるか、若しくは応答性でない患者において、又は本明細書中の他の箇所で言及する１つ以上の他の抗
真菌剤（例えば、アンホテリシンＢ、フルシトシン、イミダゾール及びトリアゾールのうちの１つ（例えば、フルコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール、及び他の上述の例を含む）を含む）を含む他の抗真菌剤の使用が他の場合では禁忌を示す人において、病原性の真菌感染を治療又は予防する方法に関する。上記方法は、真菌感染が治療又は予防されるような量で、このような患者に１つ以上の抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を投与することを包含してもよい。
【００９６】
包装されたデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体
ある特定の実施形態は、包装されたデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体、好ましくは包装された非免疫抑制性の抗真菌デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体に関し、この用語は、ヒト被験体内で不都合な免疫抑制効果を引き起こすことなく、抗真菌剤としてのデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体（複数可）を投与するための指示書とともに包装された、上述のような少なくとも１つのデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体を包含するものと意図される。幾つかの実施形態では、非免疫抑制性の抗真菌デヒドフェニラヒスチン又はその類似体は、上述の好ましい化合物のサブセットの１つの成員である。デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体は、単に指示書と一緒に包装され得るか、又は別のデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体、ラパマイシン又は別の成分若しくは添加剤、例えば上記薬学的組成物の成分の１つ以上とともに包装され得る。パッケージは、上記薬学的組成物の成分の１つ以上を充填した１つ以上の容器を含有し得る。任意に、薬学的又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制する行政機関により定められた形態の注意書きをこのような容器（複数可）に添付することができ、この注意書きは、ヒト投与に関する製造、使用又は販売の機関による承認を示す。
【００９７】
以下の非限定的な実施例は、ある特定の好ましい実施形態を用いて、好ましい方法を記載すると意味する。使用する特定の方法の詳細における変動及び得られる正確な化学的組成物における変動は、明らかに当業者に理解されよう。
（実施例）
【実施例１】
【００９８】
Ａ．デヒドロフェニラヒスチンの合成
図１に示すように、以下の基本的な反応スキームに従って、デヒドロフェニラヒスチンを縮合により合成した。
【００９９】
【化６】
2007520565.tif 000008
【０１００】
Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−２，５−ピペラジンジオン
無水酢酸（Ａｃ2Ｏ）１００ｍＬ中の完全な２，５−ピペラジンジオン１［２，５−ピペラジンジオン(アルドリッチ（Aldrich）Ｇ６４０−６)、２５．０ｇ、０．２１８ｍｏｌ］２５．０ｇを、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（１７．９６ｇ、０．２１８ｍｏｌ）と混合した。Ａｒ雰囲気下で二重コイル状の凝縮器を用いて、混合物を１１０℃で８時間加熱した。蒸発によりＡｃ2Ｏを除去した後、残渣をＡｃＯＥｔ中に溶解して、１０％ク
エン酸、１０％ＮａＨＣＯ3及び飽和ＮａＣｌ（それぞれ３回）で洗浄して、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥し、真空中で濃縮した。エーテルを用いて残渣を粉砕して、固体を形成させた。この固体を、エーテル−ヘキサンを用いてＥｔＯＡｃから再結晶させて、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−２，５−ピペラジンジオン１、２６．４ｇ（６１％）を得た。
【０１０１】
１−アセチル−３−｛（Ｚ）−１−［５−（１，１−ジメチル−２−プロペニル）−１Ｈ−４−イミダゾリル］メチリデン｝]−２，５−ピペラジンジオン２
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の５−（１，１−ジメチル−２−プロペニル）イミダゾール−４−カルボキサルデヒド（１００ｍｇ、０．６０９ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物１（２４１ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（１９８ｍｇ、０．６０９ｍｍｏｌ）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。得られた混合物を室温で５時間攪拌した。溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ及び１０％Ｎａ2ＣＯ3の混合物中に溶解し、有機相を１０％Ｎａ2ＣＯ3でもう１回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥して、真空中で濃縮した。溶離液としてＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（１００：０〜５０：１）を用いてシリカ上でのカラムクロマトグラフィーにより、残存油状物質を精製して、淡黄色固体２、６０ｍｇ（３３％）を得た。
【０１０２】
デヒドロフェニラヒスチン
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）中の２（３０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンズアルデヒド（５１μＬ、０．４９６ｍｍｏｌ、５当量）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（５３ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。得られた混合物を８０℃で２．５時間加熱した。（温度は徐々に増加させなくてはならない。迅速な加熱は、ベンジリデン部分でのＥ異性体の産生を増加させる。）溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解し、水で２回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥して、真空中で濃縮した。ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（１０：１）を用いたＴＬＣ上で、３６５ｎｍのＵＶで鮮黄緑色の発光を伴うスポットを観察することができる。この粗生成物の純度は、ＨＰＬＣ分析から７５％以上であった。得られた残渣を９０％ＭｅＯＨ水中に溶解して、逆相ＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ、ＯＤＳ−ＡＭ、２０×２５０ｍｍ）にかけて、水中の７０％ＭｅＯＨから７４％ＭｅＯＨへの直線勾配を用いて、流速１２ｍＬ／分で１６分かけて溶出させ、所望の画分を収集し、蒸発により濃縮して、黄色のデヒドロフェニラヒスチン１９．７ｍｇ（６０％）を得た。合成粗デヒドロフェニラヒスチンのＨＰＬＣプロファイルを図２に表す。
【０１０３】
図４に示すように、デヒドロフェニラヒスチンの精製では、主要ピークは、デヒドロフェニラヒスチンの所望のＺ型化合物であった。Ｅ異性体の形成は、微量構成成分として観察され（約１０％）、これは、Ｚ異性体よりも極性の高いピークとして溶出した。他の微量ピークとして、デヒドロフェニラヒスチンのジメチルアリル部分が還元された還元型のＺ及びＥ化合物も観察された。これらの還元化合物の形成は、還元不純物を伴うアルデヒド２に起因し、これは、ＤＩＢＡＬ−Ｈによる還元中に産生し、その後のプロセスで分離されなかった。
【０１０４】
これらの微量化合物は、分取用のＨＰＬＣによる精製により除去することができ、純度９５％以上で、収率６０％でベンジリデン部分にてＺ立体配置を有するデヒドロフェニラヒスチンを得ることがきる（２工程で収率２０％）。ジケトピペラジン環のイミダゾール側鎖でＥ立体配置を有する化合物は、このＨＰＬＣチャートでは観察されず、図１中の化合物１〜３からの第１の反応はＺ選択的であることを示唆する。
【０１０５】
Ｂ．化学特性
上記デヒドロフェニラヒスチン化合物は、淡黄色固体である。その構造は、標準的なＮＭＲ分析により確認される。
【実施例２】
【０１０６】
ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン誘導体の合成及び物理特性
デヒドロフェニラヒスチンの構造誘導体を、以下の反応スキームに従って合成して、ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンを生成した。経路Ａによる合成（図１を参照）は、ある特定の点で、実施例１において合成されるデヒドロフェニラヒスチンの合成に類似する。
【０１０７】
【化７】
2007520565.tif 000009
【０１０８】
経路Ａ
Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−２，５−ピペラジンジオン１は、実施例１と同様に調製した。
【０１０９】
１）１−アセチル−３−｛（Ｚ）−１−［５−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−４−イミダゾリル］メチリデン｝]−２，５−ピペラジンジオン（１６）
【０１１０】
【化８】
2007520565.tif 000010
【０１１１】
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の５−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾール−４−カルボキサルデヒド１５（３．０２ｇ、１９．８ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物１（５．８９ｇ、２９．７２ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（９．７ｇ、２９．７２ｍｍｏｌ）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。得られた混合物を室温で５時間攪拌した。溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ及び１０％Ｎａ2ＣＯ3の混合物中に溶解し、有機相を１０
％Ｎａ2ＣＯ3でもう１回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥して、真空中で濃縮した。溶離液としてＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（１００：０〜５０：１）を用いてシリカ上でのカラムクロマトグラフィーにより、残存油状物質を精製して、淡黄色固体１６、１．９０ｇ（３３％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ１２．１４（ｄ，ｂｒ−ｓ，１Ｈ）、９．２２（ｂｒ−ｓ，１Ｈ）、７．５７（ｓ，１Ｈ）、７．１８（ｓ，１Ｈ）、４．４７（ｓ，２Ｈ）、２．６５（ｓ，３Ｈ）、１．４７（ｓ，９Ｈ）。
【０１１２】
２）ｔ−Ｂｕ−デヒドロフェニラヒスチン
【０１１３】
【化９】
2007520565.tif 000011
【０１１４】
ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の１−アセチル−３−｛（Ｚ）−１−［５−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−４−イミダゾリル］メチリデン｝]−２，５−ピペラジンジオン（１６）（１１ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンズアルデヒド（１９μＬ、０．１９ｍｍｏｌ、５当量）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（４３ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ、３．５当量）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。得られた混合物を８０℃で２．５時間加熱した。溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解し、水で２回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥して、真空中で濃縮した。得られた残渣を９０％ＭｅＯＨ水中に溶解して、逆相ＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ、ＯＤＳ−ＡＭ、２０×２５０ｍｍ）にかけて、水中の７０％ＭｅＯＨから７４％ＭｅＯＨへの直線勾配を用いて、流速１２ｍＬ／分で１６分かけて溶出させ、所望の画分を収集し、蒸発により濃縮して、黄色のｔｅｒｔ−ブチル−デヒドロフェニラヒスチン６．４ｍｇ（５０％）を得た。1Ｈ  ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１２．３４（ｂｒ−ｓ，１Ｈ）、９．１８（ｂｒ−ｓ，１Ｈ）、８．０９（ｓ，１Ｈ）、７．５９（ｓ，１Ｈ）、７．３１〜７．４９（ｍ，５Ｈ）、７．０１（ｓ，２Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）。
【０１１５】
ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンを製造するためのデヒドロフェニラヒスチン反応は、実施例１と同一である。
【０１１６】
回収したｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンの総収率は１６．５％であった。
【０１１７】
経路Ｂ
Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−２，５−ピペラジンジオン１は、実施例１と同様に調製した。
【０１１８】
１）１−アセチル−３−［（Ｚ）−ベンジリデン１］−２，５−ピペラジンジオン（１７）
【０１１９】
【化１０】
2007520565.tif 000012
【０１２０】
ＤＭＦ（５ｍＬ）中のベンズアルデヒド４（０．５４ｇ、５．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物１（２．０ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（１．６５ｇ、５．０５ｍｍｏｌ）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。得られた混合物を室温で３．５時間攪拌した。溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ及び１０％Ｎａ2ＣＯ3の混合物中に溶解し、有機相を１０％Ｎａ2ＣＯ3でもう１回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥して、真空中で濃縮した。残存固体を、ＭｅＯＨ−エーテルから再結晶させて、１７の灰色がかった白色固体を得た：収量１．９５ｇ（７９％）。
【０１２１】
２）ｔ−Ｂｕ−デヒドロフェニラヒスチン
【０１２２】
【化１１】
2007520565.tif 000013
【０１２３】
ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の１−アセチル−３−［（Ｚ）−ベンジリデン１］−２，５−ピペラジンジオン（１７）（４８ｍｇ、０．１９７ｍｍｏｌ）の溶液に、５−ｔｅｒｔ−ブチルイミダゾール−４−カルボキサルデヒド１５（３０ｍｇ、０．１９７ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（９６ｍｇ、０．２９６ｍｍｏｌ）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。得られた混合物を８０℃で１４時間加熱した。溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解し、水で２回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥して、真空中で濃縮した。得られた残渣を９０％ＭｅＯＨ水中に溶解して、逆相ＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ、ＯＤＳ−ＡＭ、２０×２５０ｍｍ）にかけて、水中の７０％ＭｅＯＨから７４％ＭｅＯＨへの直線勾配を用いて、流速１２ｍＬ／分で１６分かけて溶出させ、所望の画分を収集し、蒸発により濃縮して、黄色のｔｅｒｔ−ブチル−デヒドロフェニラヒスチン０．８ｍｇ（１．２％）を得た。
【０１２４】
回収したｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンの総収率は０．９％であった。
【０１２５】
経路Ａ及び経路Ｂからの合成粗ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンのＨＰＬＣプロファイルを図４に示す。
【０１２６】
２つの他のｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン誘導体を経路Ａの方法に従って合成した。さらなるｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン誘導体の合成では、ベンズアルデヒド化合物４に対する修飾を行った。
【０１２７】
図４は、実施例１の合成デヒドロフェニラヒスチン（図２）と上述に例示した経路Ａにより製造されるｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン化合物のＨＰＬＣプロファイル（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＭ（２０×２５０ｍｍ）、勾配：メタノール−水系で２０分間、続いて１００％メタノール系で１０分で６５％から７５％、流速：１２ｍＬ／分、Ｏ．Ｄ．２３０ｎｍ）の類似性を示す。
【０１２８】
アルデヒドの導入順序は、収率に関係があり、したがって、合成の局面である。デヒドロフェニラヒスチンの類似体を、対照又はモデルとして合成し、ここでは、イミダゾール環の５位で、ジメチルアリル基を、類似の立体障害を有するｔｅｒｔ−ブチル基に変更させた。
【０１２９】
「経路Ａ」を用いたこの「ｔｅｒｔ−ブチル（ｔＢｕ）−デヒドロフェニラヒスチン」の合成は、上述に示す通りであった。特に、アルデヒドの導入順序は、正確にデヒドロフェニラヒスチン合成に追随し、ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン１６．５％の総収率を示した。この収率は、デヒドロフェニラヒスチンの収率（２０％）に類似していた。アルデヒドの導入順序が、デヒドロフェニラヒスチン合成に関して「経路Ａ」と逆の順序である「経路Ｂ」を使用すると、第１のベンズアルデヒド４の導入では、収率７６％の中間体化合物１７が得られたものの、総収率０．９％という、ほんの微量の所望のｔＢｕ−デヒドロＰＬＨしか得られなかった。この結果は、イミダゾール環における隣接する５位上に四級炭素を有する置換基を有する非常に嵩高いイミダゾール−４−カルボキサルデヒド１５を、中間体化合物１７に導入することは困難であり得ることを示し、アルデヒドの導入に関する順序が、本明細書中に開示する合成を用いて、高収率のデヒドロフェニラヒスチン又はデヒドロフェニラヒスチンの類似体を得るためには重要な局面であることを示唆した。
【０１３０】
図４に示すように、最終粗生成物のＨＰＬＣ分析から、経路Ａの粗試料中では、非常に高含有量のｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン及び少量の副生成物の形成が観察された（左）。しかしながら、経路Ｂを用いて得られた試料では、比較的より少量の所望のｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン及び幾つか他の副生成物が観察された（右）。
【実施例３】
【０１３１】
デヒドロフェニラヒスチン及び類似体の代替的でより大量のスケールでの合成
３−Ｚ−ベンジリデン−６−［５”−（１，１−ジメチルアリル）−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン［デヒドロフェニラヒスチン］（１）の合成
【０１３２】
【化１２】
2007520565.tif 000014
【０１３３】
試薬：ａ）ＬＤＡ、ＣＨ3ＣＨＯ、ｂ）Ｔｏｓ−Ｃｌ、ピリジン、ｃ）ＤＢＵ、ｄ）ＮａＯＨ、ｅ）Ｃ2Ｃｌ2Ｏ2、ｆ）ＫＯＯＣＣＨ2ＣＯＯＥｔ、ＢｕＬｉ、ｇ）ＳＯ2Ｃｌ2、ｈ）Ｈ2ＮＣＨＯ、Ｈ2Ｏ、ｉ）ＬｉＡｌＨ4、ｊ）ＭｎＯ2、ｋ）１，４−ジアセチル−ピペラジン−２，５−ジオン、Ｃｓ2ＣＯ3、ｌ）ベンズアルデヒド、Ｃｓ2ＣＯ3
【０１３４】
３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル−酪酸メチルエステル
【０１３５】
【化１３】
2007520565.tif 000015
【０１３６】
ヘプタン／ＴＨＦ／エチルベンゼン中のＬＤＡ（２Ｍ、１９６ｍｌ、０．３９ｍｏｌ）の溶液を、アルゴン下で−６０℃にて、ＴＨＦ（２７０ｍＬ）中のイソ酪酸メチル（４５ｍｌ、０．３９ｍｏｌ）の溶液に添加して、得られた混合物を３０分間攪拌した。−６０℃に予冷したＴＨＦ（４５ｍｌ）中のアセトアルデヒド（２７ｍｌ、０．４８ｍｏｌ）の溶液を徐々に添加して、得られた溶液をさらに３０分間攪拌した。飽和塩化アンモニウム（５０ｍｌ）を添加して、溶液を室温に加温した。反応混合物を酢酸エチルで抽出して、抽出物をＨＣｌ（２Ｍ）、炭酸水素ナトリウム、続いて食塩水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥し、濾過した後、蒸発させて、透明な油状物質（５２．６ｇ）を得た。７６〜８２℃／３０ｍｍＨｇでの蒸留により、純粋な３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル酪酸メチルエステル（４２．３ｇ、７４％）が得られた。(バーク他（Burk et al.）, J. Am. Chem. Soc., 117: 4423-4424(1995)）。
【０１３７】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．１５（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，３Ｈ）；１．１７（ｓ，６Ｈ）；２．６６（ｄ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＯＨ）；３．７１（ｓ，３Ｈ，−ＯＭｅ）；３．８７（ほぼクインテット（quintet），Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３）。
【０１３８】
２，２−ジメチル−３−（トルエン−４−スルホニルオキシ）−酪酸メチルエステル
【０１３９】
【化１４】
2007520565.tif 000016
【０１４０】
ピリジン（１００ｍｌ）中の３−ヒドロキシ−２，２−ジメチル酪酸メチルエステル（５２．０ｇ、０．３６ｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に、塩化ｐ−トルエンスルホニル（６９．０ｇ、０．３６ｍｏｌ）を徐々に添加した。混合物を室温に加温して、６０時間攪拌した。反応物を再び氷中で冷却して、ＨＣｌ（２Ｍ）を添加することにより酸性化した。得られた溶液を酢酸エチルで抽出して、抽出物をＨＣｌ、続いて食塩水で洗浄して、乾燥し、蒸発させて、油状物質を得て、これは、静置すると白色沈殿物を形成した。この混合物を最小限度量の酢酸エチル中に溶解し、続いて軽油を添加して、白色沈殿物を得て、これを収集して、さらなる量の軽油で洗浄した。濾液をある程度蒸発させて、結晶の第２の産生物を収集し、第１の産生物に加えて、２，２−ジメチル−３−（トルエン−４−スルホニルオキシ）−酪酸メチルエステル（８１．２ｇ、７６％）を得た。
【０１４１】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＮＭｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．１２（ｓ，３Ｈ）；１．１３（ｓ，３Ｈ）；１．２４（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，３Ｈ）；２．４５（ｓ，３Ｈ，−ＰｈＭｅ）；３．５８（ｓ，３Ｈ、−ＯＭｅ）；４．９４（カルテット（quartet），Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３）、７．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．７８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１４２】
最終濾液の蒸発により、さらなる粗２，２−ジメチル−３−（トルエン−４−スルホニルオキシ）−酪酸メチルエステル（１９．０ｇ、１８％）が得られた。
【０１４３】
２，２−ジメチル−ブタ（but)−３−エン酸メチルエステル
【０１４４】
【化１５】
2007520565.tif 000017
【０１４５】
ＤＢＵ（１５ｍｌ）中の２，２−ジメチル−３−（トルエン−４−スルホニルオキシ）−酪酸メチルエステル（１８．０６ｇ、０．０６ｍｏｌ）の溶液を１４０〜１６０℃で３．５時間加熱した。混合物を室温に冷却した後、エーテルで希釈した。混合物をＨＣｌ（１Ｍ）、炭酸水素ナトリウム、続いて食塩水で洗浄した。エーテル層を乾燥し、ある程度蒸発させて、２，２−ジメチル−ブタ−３−エン酸メチルエステルの濃縮溶液（１０ｇ）を得た。(サヴとカトツェネレンボーゲン（Savu and Katzenellenbogen）, J. Org. Chem, 46: 239-250 (1981))。生成物の揮発性（ｂｐ  １０２℃）により、さらなる蒸発は回避した。(ツアコナス他（Tsaconas et al.）, Aust. J. Chem., 53: 435-437 (2000))。
【０１４６】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＮＭｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３１（ｓ，６Ｈ）；３．６８（ｓ，３Ｈ）；５．０６（ｄ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．１１（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．０３（ｄｄ，Ｊ＝１７．１，１０．７Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）。
【０１４７】
２，２−ジメチル−ブタ−３−エン酸
【０１４８】
【化１６】
2007520565.tif 000018
【０１４９】
上述の２，２−ジメチル−ブタ−３−エン酸メチルエステルのエーテル溶液（１０ｇ）をエタノール（２５ｍｌ）で希釈して、水酸化ナトリウム（４Ｍ、２２ｍｌ）を添加して、混合物を一晩攪拌した。溶液をある程度蒸発させて、エタノールを除去し、得られた混合物をＨＣｌ（１Ｍ、１００ｍｌ）に添加した。生成物を酢酸エチルで抽出して、抽出物を乾燥し、蒸発させて、２，２−ジメチル−ブタ−３−エン酸（６．０１ｇ、８８％、２工程）を得た。(ハヤシ他（Hayashi et al.）, J. Org. Chem., 65: 8402-8405 (2000))。
【０１５０】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３３（ｓ，６Ｈ）；５．１１（ｄ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．１５（ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．０５（ｄｄ，Ｊ＝１７．２，１０．８Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）。
【０１５１】
マロン酸水素モノエチル(ウィーレンガ及びスクルニク（Wierenga and Skulnick），「
マロン酸モノエチルからの脂肪族及び芳香族β−ケトエステル：２−ブチリル酢酸エチル("Aliphatic and Aromatic β-keto Esters from Monoethyl Malonate: Ethyl 2-Butyrylacetate")」，有機合成（Organic Syntheses），Collective Volume，７，２１３)。
【０１５２】
【化１７】
2007520565.tif 000019
【０１５３】
マロン酸カリウムエチル（２５．０ｇ、０．１５ｍｏｌ）を水（１５．６ｍｌ）中に懸濁させて、氷浴中で冷却した。濃ＨＣｌ（１２．５ｍｌ）を３０分かけて滴下した後、混合物をさらに１０分間攪拌した。沈殿物を濾過した後、エーテルで２度洗浄した。濾液を分離して、水相をエーテルで抽出した。合わせたエーテル溶液を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、蒸発させて、マロン酸水素モノエチル（１９．２ｇ、９９％）を油状物質として得て、これを使用前に一晩真空下で（又は５０℃／１ｍｍで１時間）乾燥した。
【０１５４】
４，４−ジメチル−３−オキソ−ヘキサ(hex)−５−エン酸エチルエステル
【０１５５】
【化１８】
2007520565.tif 000020
【０１５６】
塩化オキサリル（３．８３ｍｌ、４３．９ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（２５ｍｌ）中の２，２−ジメチル−ブタ−３−エン酸（５．０ｇ、４３．９ｍｍｏｌ）及びＤＭＦ（１滴）の冷却（０℃）溶液に滴下した。混合物を０℃で１時間、続いて室温で１６時間攪拌した。分別蒸留（１２１℃／７６０ｍｍＨｇ）により、塩化２，２−ジメチル−ブタ−３−エノイル（４．１ｇ、７１％）が得られた。
【０１５７】
マロン酸水素モノエチル（７．２ｇ、０．０５ｍｏｌ）及びビピリジル（数ミリグラム）をＴＨＦ（９０ｍｌ）中に溶解し、系に窒素を流し込んだ。溶液を−７０℃に冷却した後、ＢｕＬｉ（ヘキサン中２．５Ｍ、３７ｍｌ、０．０９ｍｏｌ）を添加した。わずか約１０ｍｌのＢｕＬｉを添加した後、溶液はピンク色になり、磁気攪拌を可能にするのにさらなるＴＨＦ（１５ｍｌ）を必要とした。冷却浴を取り外して、残りのＢｕＬｉを添加して、温度を−１０℃に到達させ、この時点で、溶液は無色となった。混合物を再び−６０℃に冷却して、ＴＨＦ（１２ｍｌ）中の塩化２，２−ジメチル−ブタ−３−エノイル（４．１ｇ、０．０３ｍｏｌ）の溶液を滴下した。添加が完了した後、混合物を０℃に加温して、３時間攪拌し、続いてそれをエーテル／１Ｍ  ＨＣｌの１：１の混合物（２６０ｍｌ）に０℃で添加し、さらに１．５時間攪拌した。有機層を取り出し、ＨＣｌ（１Ｍ）、炭酸水素ナトリウム溶液、食塩水で洗浄した後、乾燥し、蒸発させて、４，４−ジメチル−３−オキソ−ヘキサ−５−エン酸エチルエステル（５．６ｇ、９８％）を得た。(ハヤシ他（Hayashi et al.）, J. Org. Chem., 65: 8402-8405 (2000))。クーゲルロールオーブンを用いた蒸留（１６０℃／１ｍｍＨｇ）により、純粋な物質が得られた。
【０１５８】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．２６（ｓ，６Ｈ）；１．２７（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ，−ＣＨ2ＣＨ3）；３．５１（ｓ，２Ｈ）；４．１８（ｑ，Ｊ＝６．
９Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ2ＣＨ3）；５．２０（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．２１（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．８９（ｄｄ，Ｊ＝１７．７，９．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）。
【０１５９】
２−クロロ−４，４−ジメチル−３−オキソ−ヘキサ−５−エン酸エチルエステル
【０１６０】
【化１９】
2007520565.tif 000021
【０１６１】
塩化スルフリル（０．８４ｍｌ、１０．４ｍｍｏｌ）を、クロロホルム（７ｍｌ）中の４，４−ジメチル−３−オキソ−ヘキサ−５−エン酸エチルエステル（１．８３ｇ、９．９３ｍｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に添加した。得られた混合物を室温に加温して、３０分間攪拌し、その後、それを還流下で２時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物をクロロホルムで希釈して、続いて炭酸水素ナトリウム、水、続いて食塩水で洗浄した。有機相を乾燥し、蒸発させて、２−クロロ−４，４−ジメチル−３−オキソ−ヘキサ−５−エン酸エチルエステル（２．０１ｇ、９３％）を褐色油状物質として得た。(ハヤシ他（Hayashi et al.）, J. Org. Chem., 65: 8402-8405 (2000))。
【０１６２】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．２８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ，−ＣＨ2ＣＨ3）；１．３３（ｓ，３Ｈ）；１．３４（ｓ，３Ｈ）；４．２４（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ2ＣＨ3）；５．１９（ｓ，１Ｈ）；５．２８（ｄ，Ｊ＝１６．９Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．２９（ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．９６（ｄｄ，Ｊ＝１６．９，１０．９Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）。
【０１６３】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝８．４５（２１９．３［Ｍ（Ｃｌ37）＋Ｈ］+）分。
【０１６４】
この物質は、さらに精製せずに反応させた。
【０１６５】
５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルエステル
【０１６６】
【化２０】
2007520565.tif 000022
【０１６７】
ホルムアミド（３６．８ｍｌ）中の２−クロロ−４，４−ジメチル−３−オキソ−ヘキサ−５−エン酸エチルエステル（１９．４ｇ、０．０９ｍｏｌ）及び水（１．９４ｍｌ、０．１１ｍｏｌ）の懸濁液を少しの間振とうした後、１５×１８ｍｌのバイアルに分配した。バイアルを密封して、１５０℃で５時間加熱した。室温に冷却した後、バイアルの内容物を合わせて、クロロホルムで排気的に抽出した。抽出物を乾燥し、蒸発させて、濃縮ホルムアミド溶液（１４．７ｇ）を得た。これを、クロロホルム中の１％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ3Ｎを詰め込まれたシリカカラム（直径７ｃｍ、高さ１１ｃｍ）に添加した。この混合液２Ｌ、続いてクロロホルム中の２％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ3Ｎ  ２Ｌによるカラムの溶出により、初期の画分中に、５−（１，１−ジメチル−アリル）−オキサゾール−４−カ
ルボン酸エチルエステルであると思われる化合物（１．２３ｇ、７％）が得られた。
【０１６８】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝８．６８（５０．４％）分。
【０１６９】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．４０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ，−ＣＨ2ＣＨ3）；１．５４（ｓ，６Ｈ）；４．３８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ2ＣＨ3）；５．０３（ｄ，Ｊ＝１７．４Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．０２（ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．２６（ｄｄ，Ｊ＝１７．４，１０．４Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；７．８３（ｓ，１Ｈ）。
【０１７０】
ＬＣＭＳ  ｔR＝８．００（２１０．１［Ｍ＋Ｈ］+、３６１．１［２Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０１７１】
所望の５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルエステルは、より後方の分画から回収された（３．１３ｇ、１７％）。(ハヤシ他（Hayashi et al.）, J. Org. Chem., 65: 8402-8405 (2000))。
【０１７２】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝５．５２（９６．０％）分。
【０１７３】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）；１．５７（ｓ，６Ｈ）；４．３５（ｑ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）；５．０４−５．１４（ｍ，２Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．２８（ｄｄ，Ｊ＝１８．０，１０．４Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；７．５２（ｓ，１Ｈ）。
【０１７４】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝５．３０（２０９．１［Ｍ＋Ｈ］+、４１７．２［２Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０１７５】
さらなる５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルエステルもカラムから回収され（３．５９ｇ、１９％）、それはより純度が低いが、さらなる反応には依然として十分であった。
【０１７６】
クロロホルム中の５％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ3Ｎによるカラムのさらなる溶出により類似の反応（より小スケール）から単離された別の副生成物は、５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸であると思われる化合物であった（０．
２７ｇ、９％）。
【０１７７】
ＨＰＬＣ（２４５ｎｍ）ｔR＝５．１４（６８．９％）分。
【０１７８】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１．４５（ｓ，６Ｈ）；４．９７（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．０１（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．２８（ｄｄ，Ｊ＝１７．７，１０．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；７．６８（ｓ，１Ｈ）。
【０１７９】
ＬＣＭＳ  ｔR＝４．７２（１８１．０［Ｍ＋Ｈ］+、３６１．１［２Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０１８０】
［５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル(yl)］−メタノール
【０１８１】
【化２１】
2007520565.tif 000023
【０１８２】
ＴＨＦ（６０ｍｌ）中の５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルエステル（３．１３ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（４０ｍｌ）中の水素化リチウムアルミニウムの懸濁液（９５％懸濁液、１．００ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）に滴下して、混合物を室温で４時間攪拌した。ガスの発生が終わるまで、水を添加し、混合物を１０分間攪拌した後、焼結漏斗に通して濾過した。沈殿物をＴＨＦで、続いてメタノールで洗浄し、濾液及び洗浄液を合わせて、蒸発させた後、凍結乾燥させて、［５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−メタノール（２．５６ｇ、１０２％）を得た。残留水は、さらなる反応の前に、クロロホルムで共沸させることにより除去した。(ハヤシ他（Hayashi et al.）, J. Org. Chem., 65: 8402-8405 (2000)参照)。
【０１８３】
ＨＰＬＣ（２４０ｎｍ）ｔR＝３．９４（５６．８％）分。
【０１８４】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１．４３（ｓ，６Ｈ）；４．５７（ｓ，２Ｈ）；５．０１（ｄ，Ｊ＝１０．５Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．０３（ｄ，Ｊ＝１７．７Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．１０（ｄｄ，Ｊ＝１７．７，１０．５Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；７．４６（ｓ，１Ｈ）。
【０１８５】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝３．７７（１６７．３［Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０１８６】
５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド
【０１８７】
【化２２】
2007520565.tif 000024
【０１８８】
二酸化マンガン（２０ｇ、０．２３ｍｏｌ）を、アセトン（３００ｍｌ）中の［５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−イル］−メタノール（２．５６ｇ、０．０２ｍｏｌ）の溶液に添加して、得られた混合物を室温で５時間攪拌した。混合物を濾紙に通して濾過して、残渣をアセトンで洗浄した。濾液及び洗浄液を合わせて、蒸発させて、５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド（１．８２ｇ、５１％）を得た。(ハヤシ他（Hayashi et al.）, J. Org. Chem., 65: 8402-8405 (2000))。
【０１８９】
ＨＰＬＣ（２４０ｎｍ）ｔR＝４．０８（９１．５％）分。
【０１９０】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．５６（ｓ，６Ｈ）；５．１６（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．１９（ｄ，Ｊ＝１７．３Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ2）；６．２２（ｄｄ，Ｊ＝１７．３，１０．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）、７．７５（ｓ，１Ｈ）、１０．０２（ｓ，１Ｈ，ＨＣＯ）。
【０１９１】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝３．７５（１６５．２［Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０１９２】
１−アセチル−３−［５’−（１，１−ジメチル−アリル）−１Ｈ−イミダゾール−４’−Ｚ−イルメチレン(ylmethylene)］−ピペラジン−２，５−ジオン
【０１９３】
【化２３】
2007520565.tif 000025
【０１９４】
ＤＭＦ（３５ｍｌ）中の５−（１，１−ジメチル−アリル）−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド（１．７８ｇ、０．０１ｍｏｌ）の溶液に、１，４−ジアセチル−ピペラジン−２，５−ジオン（８．５９ｇ、０．０４ｍｏｌ）を添加して、混合物を排気させた後、アルゴンを流し込んだ。排気−流し込みのプロセスをさらに２回繰り返した後、炭酸セシウム（３．５３ｇ、０．０１ｍｏｌ）を添加した。排気−流し込みのプロセスをさらに３回繰り返した後、得られた混合物を４５℃で５時間加熱した。少量となるまで、反応混合物をある程度蒸発させて（高真空下で加熱）、得られた溶液を氷水（５０ｍｌ）に滴下した。黄色の沈殿物を収集し、水で洗浄した後、凍結乾燥させて、１−アセチル−３−［５’−（１，１−ジメチル−アリル）−１Ｈ−イミダゾール−４’−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン（１．１８ｇ、３６％）を得た。(ハヤシ（Hayashi）,私信（personal communication）(２００１))。
【０１９５】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝６．０１（７２．６％）分。
【０１９６】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．５３（ｓ，６Ｈ）；２．６４（ｓ，３Ｈ）；４．４７（ｓ，２Ｈ）；５．１９（ｄ，Ｊ＝１７．３Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．２３（ｄ，Ｊ＝１０．７Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．０６（ｄｄ，Ｊ＝１７．３，１０．７Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；７．１６（ｓ，１Ｈ）、７．５９（ｓ，１Ｈ）、９．４７（ｂｓ，１Ｈ）；１２．１１（ｂｓ，１Ｈ）［１，４−ジアセチル−ピペラジン−２，５−ジオン混入汚染物δ２．５９（ｓ，６Ｈ）；４．６０（ｓ，４Ｈ）が約２％観察された。］
【０１９７】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝６．６５（３０３．３［Ｍ＋Ｈ］+、６０５．５［２Ｍ＋Ｈ］+）分。（異なる系を使用することに注意）。
【０１９８】
３−Ｚ−ベンジリデン−６−［５”−（１，１−ジメチルアリル）−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン
【０１９９】
【化２４】
2007520565.tif 000026
【０２００】
ＤＭＦ（７０ｍｌ）中の１−アセチル−３−［５’−（１，１−ジメチル−アリル）−１Ｈ−イミダゾール−４’−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン（２．９１ｇ、９．６２ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンズアルデヒド（４．８９ｍｌ、４８．１ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を排気させて、アルゴンを流し込んだ。排気−流し込みのプロセスをさらに２回繰り返した後、炭酸セシウム（４．７０ｇ、１４．４ｍｏｌ）を添加した。排気−流し込みのプロセスをさらに３回繰り返した後、得られた混合物を以下に示すような温度勾配下で加熱した。
【０２０１】
総時間５時間後に、反応物を室温に冷却して、混合物を氷冷水（５００ｍｌ）に添加した。沈殿物を収集し、水（３００ｍｌ）で洗浄した後、凍結乾燥させて、黄色の固体（２．８０ｇ）を得た。この物質をクロロホルム（２５０ｍｌ）中に溶解して、濾紙に通して濾過して、共沸させて、残存水を蒸発させた。残留黄色沈殿物（２．７０ｇ、ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝７．２６（９３．６％）分）をクロロホルム（２０ｍｌ）中にある程度溶解させて、懸濁液を５分間超音波処理した後、固体を収集して、風乾させて、３−Ｚ−ベンジリデン−６−［５”−（１，１−ジメチルアリル）−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン（１．８２ｇ、５４％）を得た。(ハヤシ（Hayashi）,私信(２００１))。ｍ．ｐ．２３９〜２４０℃（ｄｅｃ．）。
【０２０２】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝６．８０（１．９２）分、７．３３（９５．０１％）。
【０２０３】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．５３（ｓ，６Ｈ）；５．１８（ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；５．２１（ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．０６（ｄｄ，Ｊ＝１７．６，１１．０Ｈｚ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ2）；６．９９（ｓ，１Ｈ，−Ｃ−Ｃ＝ＣＨ）；７．００（ｓ，１Ｈ，−Ｃ−Ｃ＝ＣＨ）；７．３０−７．５０（ｍ，５×ＡｒＨ）；７．６０（ｓ，Ｈ２”）；８．０７（ｂｓ，ＮＨ）；９．３１（ｂｓ，ＮＨ）；１２．３０（ｂｓ，ＮＨ）。
【０２０４】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝６．２２（３４９．３［Ｍ＋Ｈ］+、Ｅ異性体）、６．７３（３４９．５［Ｍ＋Ｈ］+、６９７．４［２Ｍ＋Ｈ］+、Ｚ異性体）分。
【０２０５】
ＥＳＭＳ  ｍ／ｚ  ３４９．５［Ｍ＋Ｈ］+、３９０．３［Ｍ＋ＣＨ4ＣＮ］+。
【０２０６】
クロロホルム溶液の蒸発により、さらなる３−Ｚ−ベンジリデン−６−［５”−（１，１−ジメチルアリル）−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン（０．７６ｇ、２９％）が得られた。
【０２０７】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝７．２９（８４．５％）分。
【０２０８】
３−Ｅ−ベンジリデン−６−［５”−（１，１−ジメチルアリル）−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン
【０２０９】
【化２５】
2007520565.tif 000027
【０２１０】
上述のように合成される物質の粗試料の分取用ＨＰＬＣによる精製により、幾何異性体
３−Ｅ−ベンジリデン−６−［５”−（１，１−ジメチルアリル）−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン（１．７ｍｇ）が得られた。
【０２１１】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝６．７５（８７．７９）分。
【０２１２】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．５２（ｓ，６Ｈ）；５．１９（ｄ，Ｊ＝２０．８Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ2）；５．２２（ｄ，Ｊ＝１４．０Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ2）；６．０５（ｄｄ，Ｊ＝１８．０，１０．４Ｈｚ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ2）；６．３３（ｓ，１Ｈ，Ｃ−Ｃ＝ＣＨ）；６．９０−７．６５（ｍ，７Ｈ）。
【０２１３】
ＥＳＭＳ  ｍ／ｚ  ３４９．５［Ｍ＋Ｈ］+、３９０．４［Ｍ＋ＣＨ4ＣＮ］+。
【０２１４】
３−Ｚ−ベンジリデン−６−（５”−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン）−ピペラジン−２，５−ジオン（２）の合成
【０２１５】
【化２６】
2007520565.tif 000028
【０２１６】
試薬：ｇ）ＳＯ2Ｃｌ2、ｈ）Ｈ2ＮＣＨＯ、Ｈ2Ｏ、ｉ）ＬｉＡｌＨ4、ｊ）ＭｎＯ2、ｋ）１，４−ジアセチル−ピペラジン−２，５−ジオン、Ｃｓ2ＣＯ3、ｌ）ベンズアルデヒド、Ｃｓ2ＣＯ3
【０２１７】
２−クロロ−４，４−ジメチル−３−オキソ−ペンタン酸エチルエステル
【０２１８】
【化２７】
2007520565.tif 000029
【０２１９】
塩化スルフリル（１４．０ｍｌ、０．１７ｍｏｌ）を、クロロホルム（１００ｍｌ）中
のピバロイル酢酸エチル（２７．１７ｇ、０．１６ｍｏｌ）の冷却（０℃）溶液に添加した。得られた混合物を室温に加温して、３０分間攪拌し、その後、それを還流下で２．５時間加熱した。室温に冷却した後、反応混合物をクロロホルムで希釈して、続いて炭酸水素ナトリウム、水、続いて食塩水で洗浄した。
【０２２０】
有機相を乾燥し、蒸発させて、２−クロロ−４，４−ジメチル−３−オキソ−ペンタン酸エチルエステル（３３．１ｇ、１０２％）を透明な油状物質として得た。(デュラント他（Durant et al.），「アミノアルキルイミダゾール類及びそれらの製造プロセス」("Aminoalkylimidazoles and Process for their Production"）、特許番号ＧＢ１３４１３７５号（英国、１９７３年）)。
【０２２１】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝８．８０（９２．９％）分。
【０２２２】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．２７（ｓ，９Ｈ）；１．２９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；４．２７（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）；５．２２（ｓ，１Ｈ）。
【０２２３】
13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１３．８、２６．３、４５．１、５４．５、６２．９、１６５．１、２０３．６。
【０２２４】
５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルエステル
【０２２５】
【化２８】
2007520565.tif 000030
【０２２６】
ホルムアミド（４７．５ｍｌ）及び水（２．５ｍｌ）中の２−クロロ−４，４−ジメチル−３−オキソ−ペンタン酸エチルエステル（２５．０ｇ、０．１２ｍｏｌ）の溶液を振とうした後、１５×８ｍｌのバイアルに分配した。バイアルすべてを密封して、続いて１５０℃で３．５時間加熱した。バイアルを室温に冷却した後、水（２０ｍｌ）を添加して、混合物をクロロホルムで排気的に抽出した。クロロホルムを除去して、濃縮ホルムアミド溶液（２２．２ｇ）を得て、これを、クロロホルム中の１％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ3Ｎを詰め込まれたフラッシュシリカカラム（直径６ｃｍ、高さ１２ｃｍ）に添加した。この混合物２．５Ｌ、続いてクロロホルム中の２％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ3Ｎ  １Ｌによるカラムの溶出により、初期の画分中に、５−ｔｅｒｔ−ブチル−オキサゾール−４−カルボン酸エチルエステルであると思われる生成物（６．３ｇ、２６％）が得られた。
【０２２７】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝８．７７分。
【０２２８】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．４１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）；１．４３（ｓ，９Ｈ）；４．４０（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）；７．８１（ｓ，１Ｈ）。
【０２２９】
13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１４．１、２８．８、３２．５、６１．３、１３６．９、１４９．９、１５６．４、１５８．３。
【０２３０】
ＥＳＭＳ  ｍ／ｚ  １９８．３［Ｍ＋Ｈ］+、２３９．３［Ｍ＋ＣＨ4ＣＮ］+。
【０２３１】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝７．９７（１９８．１［Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０２３２】
５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸エチルエステルは、より後方の画分から回収された（６．２０ｇ、２６％）。(デュラント他（Durant et al.），「アミノアルキルイミダゾール類及びそれらの製造プロセス」("Aminoalkylimidazoles and Process for their Production"）、特許番号ＧＢ１３４１３７５号（英国、１９７３年）)。
【０２３３】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝５．４１（９３．７％）分。
【０２３４】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３８（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，３Ｈ）；１．４７（ｓ，９Ｈ）；４．３６（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）；７．５４（ｓ，１Ｈ）。
【０２３５】
13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１３．７、２８．８、３２．０、５９．８、１２４．２、１３３．３、１４９．２、１６２．６。
【０２３６】
ＥＳＭＳ  ｍ／ｚ  １９７．３［Ｍ＋Ｈ］+、２３８．３［Ｍ＋ＣＨ4ＣＮ］+。
【０２３７】
５％ＭｅＯＨ／１％Ｅｔ3Ｎ  １Ｌによるカラムのさらなる溶出により、５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボン酸であると思われる化合物が得られた（０．５０ｇ、２％）。
【０２３８】
ＨＰＬＣ（２４５ｎｍ）ｔR＝４．６８（８３．１％）分。
【０２３９】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ）；７．６９（ｓ，１Ｈ）。
【０２４０】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．３７（ｓ，９Ｈ）；７．７４（ｓ，１Ｈ）。
【０２４１】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＳＯ）δ１．２８（ｓ，９Ｈ）；７．６８（ｓ，１Ｈ）。
【０２４２】
ＥＳＭＳ  ｍ／ｚ  １６９．２［Ｍ＋Ｈ］+、２１０．４［Ｍ＋ＣＨ4ＣＮ］+。
【０２４３】
（５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−メタノール
【０２４４】
【化２９】
2007520565.tif 000031
【０２４５】
ＴＨＦ（６０ｍｌ）中の５−ｔｅｒｔ−ブチル−３−イミダゾール−４−カルボン酸エチルエステル（３．３０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＨＦ（４０ｍｌ）中の水素化リチウムアルミニウムの懸濁液（９５％懸濁液、０．８９ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）に滴下して、混合物を室温で３時間攪拌した。ガスの発生が終わるまで、水を添加し、混合物
を１０分間攪拌した後、焼結漏斗に通して濾過した。沈殿物をＴＨＦで、続いてメタノールで洗浄し、濾液及び洗浄液を合わせて、蒸発させた。残渣を一晩凍結乾燥させて、（５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−メタノール（２．７１ｇ、１０５％）を白色固体として得た。(デュラント他（Durant et al.）,「アミノアルキルイミダゾール類及びそれらの製造プロセス」("Aminoalkylimidazoles and Process for their
Production"），特許番号ＧＢ１３４１３７５号（英国、１９７３年）)。
【０２４６】
ＨＰＬＣ（２４０ｎｍ）ｔR＝３．７０（６７．４％）分。
【０２４７】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ１．３６（ｓ，９Ｈ）；４．６２（ｓ，２Ｈ）；７．４３（ｓ，１Ｈ）。
【０２４８】
13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ3ＯＤ）δ３１．１、３３．０、５７．９、１３１．４、１３３．９、１４０．８。
【０２４９】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝３．４１（１５５．２［Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０２５０】
この物質は、さらに精製せずに使用した。
【０２５１】
５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド
【０２５２】
【化３０】
2007520565.tif 000032
【０２５３】
二酸化マンガン（３０ｇ、０．３５ｍｏｌ）を、アセトン（７００ｍｌ）中の（５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−メタノール（４．９７ｇ、０．０３ｍｏｌ）の不均一溶液に添加して、得られた混合物を室温で４時間攪拌した。混合物をセライトパッドに通して濾過して、パッドをアセトンで洗浄した。濾液及び洗浄液を合わせて、蒸発させた。残渣をエーテルで粉砕して、５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド（２．５０ｇ、５１％）を無色固体として得た。(ハヤシ（Hayashi）,私信(２０００))。
【０２５４】
ＨＰＬＣ（２４０ｎｍ）ｔR＝３．７１（８９．３％）分。
【０２５５】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．４８（ｓ，９Ｈ）；７．６７（ｓ，１Ｈ）；１０．０６（ｓ，１Ｈ）。
【０２５６】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝３．３８（１５３．２［Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０２５７】
粉砕由来の濾液の蒸発により、さらなる５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド（１．８８ｇ、３８％）が得られた。
【０２５８】
１−アセチル−３−（５’−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４’−Ｚ−イルメチレン）−ピペラジン−２，５−ジオン
【０２５９】
【化３１】
2007520565.tif 000033
【０２６０】
ＤＭＦ（５０ｍｌ）中の５−ｔｅｒｔ−ブチル−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド（２．５０ｇ、１６４．４ｍｍｏｌ）の溶液に、１，４−ジアセチル−ピペラジン−２，５−ジオン（６．５０ｇ、３２．８ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を排気させた後、アルゴンを流し込んだ。排気−流し込みのプロセスをさらに２回繰り返した後、炭酸セシウム（５．３５ｇ、１６．４ｍｍｏｌ）を添加した。排気−流し込みのプロセスをさらに３回繰り返した後、得られた混合物を室温で５時間攪拌した。少量となるまで、反応混合物をある程度まで蒸発させて（高真空下で加熱）、得られた溶液を水（１００ｍｌ）に滴下した。黄色い沈殿物を収集した後、凍結乾燥させて、１−アセチル−３−（５’−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４’−Ｚ−イルメチレン）−ピペラジン−２，５−ジオン（２．２４ｇ、４７％）を得た。(ハヤシ（Hayashi）,私信(２０００))。
【０２６１】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝５．５４（９４．４％）分。
【０２６２】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．４７（ｓ，９Ｈ）；２．６５（ｓ，３Ｈ）、４．４７（ｓ，２Ｈ）；７．１９（ｓ，１Ｈ）；７．５７（ｓ，１Ｈ）、９．２６（ｓ，１Ｈ）、１２．１４（ｓ，１Ｈ）。
【０２６３】
13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3＋ＣＤ3ＯＤ）δ２７．３、３０．８、３２．１、４６．５、１１０．０、１２３．２、１３１．４、１３３．２、１４１．７、１６０．７、１６２．８、１７３．０
【０２６４】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝５．１６（２９１．２［Ｍ＋Ｈ］+、５８１．６［２Ｍ＋Ｈ］+）分。
【０２６５】
３−Ｚ−ベンジリデン−６−［５”−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオン
【０２６６】
【化３２】
2007520565.tif 000034
【０２６７】
ＤＭＦ（５５ｍｌ）中の１−アセチル−３−（５’−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４’−Ｚ−イルメチレン）−ピペラジン−２，５−ジオン（２．４３ｇ、８．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンズアルデヒド（４．２６ｍｌ、４１．９ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を排気させて、窒素を流し込んだ。排気−流し込みのプロセスをさらに２回繰り返した後、炭酸セシウム（４．０９ｇ、１２．６ｍｏｌ）を添加した。排気−流し込みのプロセスをさらに３回繰り返した後、得られた混合物を以下に示すような温度勾配下で加
熱した。総時間５時間後に、反応物を室温に冷却して、混合物を氷冷水（４００ｍｌ）に添加した。沈殿物を収集し、水で洗浄した後、凍結乾燥させて、黄色の固体（２．５７ｇ、ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝６．８３（８３．１％）分）を得た。この物質をクロロホルム（１００ｍｌ）中に溶解して、残存水を共沸により蒸発させて、褐色油状物質が生じた。これをクロロホルム（２０ｍｌ）中に溶解して、氷中で冷却した。９０分後に、黄色い沈殿物を収集して、風乾させて、３−Ｚ−ベンジリデン−６−（５”−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン）−ピペラジン−２，５−ジオン（１．５９ｇ、５６％）を得た。(ハヤシ（Hayashi）,私信(２０００))。
【０２６８】
ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝６．３８（２．１％）、６．８０（９５．２）分。
【０２６９】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ１．４６（ｓ，９Ｈ）；７．０１（ｓ，１Ｈ，−Ｃ−Ｃ＝ＣＨ）；７．０３（ｓ，１Ｈ，−Ｃ−Ｃ＝ＣＨ）；７．３０−７．５０（ｍ，５Ｈ，Ａｒ）；７．６０（ｓ，１Ｈ）；８．０９（ｂｓ，ＮＨ）；９．５１（ｂｓ，ＮＨ）；１２．４０（ｂｓ，ＮＨ）。
【０２７０】
ＬＣ／ＭＳ  ｔR＝５．８４（３３７．４［Ｍ＋Ｈ］+、Ｅ異性体）、６．２５（３３７．４［Ｍ＋Ｈ］+、６７３．４［２Ｍ＋Ｈ］+、Ｚ異性体）分。
【０２７１】
ＥＳＭＳ  ｍ／ｚ  ３３７．３［Ｍ＋Ｈ］+、３７８．１［Ｍ＋ＣＨ4ＣＮ］+。
【０２７２】
クロロホルム溶液の蒸発により、さらなる３−Ｚ−ベンジリデン−６−（５”−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン）−ピペラジン−２，５−ジオン（０．８２ｇ、２９％）が得られた。ＨＰＬＣ（２１４ｎｍ）ｔR＝６．８２（７０．６％）分。
【０２７３】
一般的な実験
炭酸水素ナトリウムは、５％溶液を指す。
【０２７４】
有機溶媒は、別記しない限り、硫酸ナトリウムにより乾燥した。
【０２７５】
分析条件
ＮＭＲ条件
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）分析は、ヴァリアン・イノヴァ・ユニティ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  Ｕｎｉｔｙ）４００ＭＨｚ  ＮＭＲマシーンで実施した。試料は、０．１％ＴＭＳを含有する重水素化クロロホルム中で測定した（別記しない限り）。ケミカルシフト（ｐｐｍ）は、ＴＭＳ（０．００ｐｐｍ）、又はＣＤ3ＯＤ中で測定する試料に関してはＣＨ3ＯＨの３．３０ｐｐｍを参照した。カップリング定数は、ヘルツ（Ｈｚ）で表される。
【０２７６】
分析用ＨＰＬＣ条件
システム６条件：
ＲＰ−ＨＰＬＣは、Ｒａｉｎｉｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ−ＭＶ  Ｃ１８（５μｍ、１００Å）  ５０×４．６ｍｍカラムで実施した。
緩衝液Ａ：０．１％水性ＴＦＡ
緩衝液Ｂ：９０％ＭｅＣＮ水中の０．１％ＴＦＡ
勾配：１１分かけて０％〜１００％の緩衝液Ｂ
流速：１．５ｍＬ／分
【０２７７】
ＬＣＭＳ条件
ＬＣＭＳは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−１００機器で実施した。ＬＣ条件：
逆相ＨＰＬＣ分析
カラム：Ｍｏｎｉｔｏｒ  ５μｍ  Ｃ１８  ５０×４．６ｍｍ
溶媒Ａ：水中０．１％ＴＦＡ
溶媒Ｂ：９０％ＭｅＣＮ水中０．０８５％ＴＦＡ
勾配：１１．０分かけて０％〜１００％のＢ
流速：１．５ｍＬ／分
波長：２１４ｎｍ
ＭＳ条件：
イオン源：イオンスプレー
検出：イオン計数
質量分析計に対する流速：カラムから分割した後、３００μＬ／分（１．５ｍＬ／分）。
【０２７８】
ＥＳＭＳ条件
ＥＳＭＳは、エレクトロスプレーインレットを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ｓｃｉｅｘ−ＡＰＩ  ＩＩＩ  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳで実施した。
溶媒：６０％ＭｅＣＮ水中０．１％ＡｃＯＨ
流速：２５μＬ／分
イオンスプレー：５，０００Ｖ
オリフィスプレート：５５Ｖ
収集時間：２．３０分
スキャン範囲：１００〜１，０００ａｍｕ／ｚ
スキャンステップサイズ：０．２ａｍｕ／ｚ
【０２７９】
分取用ＲＰ−ＨＰＬＣ精製条件
逆相ＨＰＬＣ精製は、以下の条件を用いて、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＸｔｅｒｒａＭＳカラム（１９×５０ｍｍ、５μｍ、Ｃ１８）によりＮｅｂｕｌａを用いて実施した：溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ水
溶媒Ｂ：９０％ＭｅＣＮ水中０．１％ＴＦＡ
勾配：４分かけて５％〜９５％のＢ
流速：２０ｍＬ／分
波長：２１４ｎｍ
【０２８０】
略記は以下の通りである：ｂｒｓ：ブロードシングレット、ＢｕＬｉ：ｎ−ブチルリチウム、ｄ：ダブレット、ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、ＥＳＭＳ：エレクトロスプレー質量分析、ＨＣｌ：塩酸、ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー、ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析、ＬＤ：リチウムジイソプロピルアミド、Ｍ+：分子イオン、ｍ：マルチプレット、ＭｅＣＮ：アセトニトリル、Ｍ：質量分析、ＭＷ：分子量、ＮＭＲ：核磁気共鳴、ｑ：カルテット、ｓ：シングレット、ｔ：トリプレット、ｔR：保持時間、ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸、ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
【０２８１】
デヒドロフェニラヒスチンの合成に関する詳細な手順
【０２８２】
【化３３】
2007520565.tif 000035
【０２８３】
１−アセチル−３−｛（Ｚ）−１−［５−（１，１−ジメチル−２−プロペニル）−１Ｈ−４−イミダゾリル］メチリデン｝]−２，５−ピペラジンジオン（２）
【０２８４】
【化３４】
2007520565.tif 000036
【０２８５】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の５−（１，１−ジメチル−２−プロペニル）イミダゾール−４−カルボキサルデヒド（１００ｍｇ、０．６０９ｍｍｏｌ）の溶液に、化合物１（２４１ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（１９８ｍｇ、０．６０９ｍｍｏｌ）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。酸素の除去は、このような除去がジケトピペラジン環の６位にあるα炭素の酸化を減少させると考えられることから好ましい。得られた混合物を室温で５時間攪拌した。溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ及び１０％Ｎａ2ＣＯ3の混合物中に溶解し、有機相を１０％Ｎａ2ＣＯ3でもう１回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＣＯ3により乾燥して、真空中で濃縮した。溶離液としてＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（１００：０から５０：１へ）を用いてカラムクロマトグラフィーによりシリカ上で、残存油状物質を精製して、淡黄色固体２、６０ｍｇ（３３％）を得た。
【０２８６】
デヒドロフェニラヒスチン
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）中の２（３０ｍｇ、０．０９９ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンズアルデヒド（５１μＬ、０．４９６ｍｍｏｌ、５当量）を添加して、溶液を短期間で繰り返し排気させて、酸素を除去し、Ａｒを流し込み、続いてＣｓ2ＣＯ3（５３ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加して、排気−流し込みのプロセスを再び繰り返した。得られた混合物を８０℃で２．５時間加熱した。（温度は徐々に増加させなくてはならない。迅速な加熱は、ベンジリデン部分でのＥ異性体の産生を増加させる。）溶媒を蒸発により除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解し、水で２回及び飽和ＮａＣｌで３回洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4により乾燥して、真空中で濃縮した。ＣＨＣｌ3−ＭｅＯＨ（１０：１）を用いたＴＬＣ上で、３６５ｎｍのＵＶで鮮黄緑色の発光を伴うスポットを観察することができる。この粗生成物の純度は、ＨＰＬＣ分析から７５％以上であった。得られた残渣を９０％ＭｅＯＨ水中に溶解して、逆相ＨＰＬＣカラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ、ＯＤＳ−ＡＭ、２０×２５０ｍｍ）にかけて、水中の７０％ＭｅＯＨから７４％ＭｅＯＨへの直線勾配を用いて、流速１２ｍＬ／分で１６分かけて溶出して、所望の画分を収集し、蒸発により濃縮
して、黄色のデヒドロフェニラヒスチン１９．７ｍｇ（６０％）を得たが、収率は各工程に関して最適化されていない。
【実施例４】
【０２８７】
デヒドロフェニラヒスチン及びデヒドロフェニラヒスチン類似体の生物学的特性
Ａ．生物学的評価
合成したｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン及びデヒドロフェニラヒスチンの生物学的特性を、ＨＴ２９ヒト結腸細胞及びＰＣ−３前立腺腺癌細胞の両方で評価した。
【０２８８】
ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）、すなわちヒト結腸直腸腺癌を、ＭｃＣｏｙの完全培地（１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン並びに１００ＩＵ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐをそれぞれ補充した、Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを有するＭｃＣｏｙの５Ａ培地）中に維持した。ＰＣ−３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４３５）、すなわちヒト前立腺腺癌を、Ｆ１２Ｋ完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、並びに１００ＩＵ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐをそれぞれ補充したＦ１２Ｋ培地）中に維持した。細胞系は、９５％加湿インキュベータ中で３７℃、５％ＣＯ2で培養した。
【０２８９】
腫瘍細胞毒性アッセイに関して、ＨＴ−２９又はＰＣ−３細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ３９０４黒壁付き透明底組織培養プレート(clear-bottom culture plate)に、完全培地９０μｌ中、５，０００個の細胞／ウェルで播種し、プレートを一晩インキュベートして、細胞を樹立させて、対数増殖期に入らせた。デヒドロフェニラヒスチン及びｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンの２０ｍＭストック溶液を１００％ＤＭＳＯ中に調製して、−２０℃で保管した。２つの化合物の１０倍濃縮連続希釈液を、２．０×１０ー5Ｍ〜２．０×１０-10Ｍの範囲の最終濃度となるように、適切な培養培地中で調製した。１０×連続希釈液の１０μｌ容量を、三重反復で試験ウェルに添加して、プレートを４８時間インキュベータに戻した。ＤＭＳＯの最終濃度は、試料すべてにおいて０．２５％であった。
【０２９０】
薬物暴露の４８時間後に、Ｍｇ2+、Ｃａ2+を含まないＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍｌレサズリン（シグマ−アルドリッチ化学株式会社（Sigma-Aldrich Chemical Co.）から入手)１０μｌを各ウェルに添加して、プレートを３〜４時間、インキュベータに戻した。プレートを取り出して、Ｆｕｓｉｏｎ蛍光分析計(パッカード機器（Packard Instruments）)において５３０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光フィルタを用いて、レサズリン蛍光を測定した。細胞なしのレサズリン色素を用いて、バックグラウンドを決定し、これを実験ウェルすべてに関するデータから差し引いた。データは、Ｐｒｉｓｍソフトウェア(グラフパッドソフトウェア（GraphPad Software）)を用いて解析した。データは、培地のみで処理した細胞（１００％細胞成長）の平均に対して正規化し、標準的なＳ字状用量反応曲線フィッティングアルゴリズムを用いて、ＥＣ50値を決定した。
【０２９１】
以下の表１に示すように、ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンは、デヒドロフェニラヒスチンと比較して、約４倍大きい細胞毒性活性を示す。
【０２９２】
【表１】
2007520565.tif 000037
【０２９３】
また、ＨＴ−２９、ＰＣ−３及びＰ−３８８細胞のさらなるデータについて図４１を参照。
【０２９４】
Ｂ．デヒドロフェニラヒスチン誘導体の構造及び活性研究
フェニラヒスチン、デヒドロフェニラヒスチン及びデヒドロフェニラヒスチンの各種誘導体の細胞毒性効果を、Ｐ３８８マウス白血病細胞、ＨＴ−２９ヒト結腸細胞、及びＰＣ−３前立腺腺癌細胞で検査した。
【０２９５】
上記で説明したように、ＨＴ−２９、すなわちヒト結腸直腸腺癌を、ＭｃＣｏｙの完全培地（１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、１×ＮＥＡＡ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン並びに１００ＩＵ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐをそれぞれ補充した、Ｌ−グルタミン及び２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを有するＭｃＣｏｙの５Ａ培地）中に維持した。ＰＣ−３、すなわちヒト前立腺腺癌を、Ｆ１２Ｋ完全培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％ＨＥＰＥＳ、並びにそれぞれ１００ＩＵ／ｍｌ及び１００μｇ／ｍｌのＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＦ１２Ｋ培地）中に維持した。細胞系は、９５％加湿インキュベータ中で３７℃、５％ＣＯ2で培養した。
【０２９６】
腫瘍細胞毒性アッセイに関して、ＨＴ−２９又はＰＣ−３細胞を、Ｃｏｒｎｉｎｇ３９０４黒壁付き透明底組織培養プレートに、完全培地９０μｌ中、５，０００個の細胞／ウェルで播種し、プレートを一晩インキュベートして、細胞を樹立させて、対数増殖期に入らせた。デヒドロフェニラヒスチン及びｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンの２０ｍＭストック溶液を１００％ＤＭＳＯ中に調製して、−２０℃で保管した。２つの化合物の１０倍濃縮連続希釈液を、２．０×１０-5Ｍ〜２．０×１０-10Ｍの範囲の最終濃度となるように、適切な培養培地中で調製した。１０×連続希釈液の１０μｌ容量を、三重反復で試験ウェルに添加して、プレートを４８時間インキュベータに戻した。ＤＭＳＯの最終濃度は、試料すべてにおいて０．２５％であった。
【０２９７】
薬物暴露の４８時間後に、Ｍｇ2+、Ｃａ2+を含まないＰＢＳ中の０．２ｍｇ／ｍｌレサズリン（シグマ−アルドリッチ化学株式会社（Sigma-Aldrich Chemical Co.）から入手)
１０μｌを各ウェルに添加して、プレートを３〜４時間、インキュベータに戻した。プレートを取り出して、Ｆｕｓｉｏｎ蛍光分析計(パッカード機器（Packard Instruments）)において５３０ｎｍ励起及び５９０ｎｍ発光フィルタを用いて、レサズリン蛍光を測定した。細胞なしのレサズリン色素を用いて、バックグラウンドを決定し、これを実験ウェルすべてに関するデータから差し引いた。データは、Ｐｒｉｓｍソフトウェア(グラフパッドソフトウェア（GraphPad Software）)を用いて解析した。データは、培地のみで処理した細胞（１００％細胞成長）の平均に対して正規化し、標準的なＳ字状用量反応曲線フィッティングアルゴリズムを用いて、ＥＣ50値を決定した。
【０２９８】
フェニラヒスチン、デヒドロフェニラヒスチン及びデヒドロフェニラヒスチン誘導体のＥＣ50及びＩＣ50値を、以下の表２にまとめる。
【０２９９】
【表２】
2007520565.tif 000038
【０３００】
フェニル環に対する修飾は、細胞毒性活性の有意な効果を有する。ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン（♯６）の活性と比較すると、メタ位にあるメトキシ基（ＫＰＵ−９）の活性は、Ｐ３８８細胞において、ＩＣ50  ２０．８±３．３ｎＭで、他の誘導体と比較し
て最も高い活性を示した。ＫＰＵ−９誘導体はまた、ＨＴ−２９細胞においても細胞毒性を示した（ＥＣ50  ３１ｎＭ）。デヒドロフェニラヒスチン、ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチン（ＫＰＵ−２）及びＫＰＵ−９誘導体はすべて、Ｐ３８８細胞において細胞毒性を示した。
【０３０１】
Ｃ．さらなるデヒドロフェニラヒスチン誘導体の構造及び活性研究
フェニラヒスチン、デヒドロフェニラヒスチン及びデヒドロフェニラヒスチンの各種誘導体の細胞毒性効果を、上述の方法論を用いて、ＨＴ−２９ヒト結腸細胞及びＰＣ−３前立腺腺癌細胞で検査した。
【０３０２】
【表３】
2007520565.tif 000039
【表３−１】
2007520565.tif 000040
【表３−２】
2007520565.tif 000041
【表３−３】
2007520565.tif 000042
【表３−４】
2007520565.tif 000043
【０３０３】
さらなる細胞毒性アッセイは、細胞生存度の指標としてレザズリン蛍光を使用して、この実施例下で上述のように実施された。結果を以下で表３．１に示す。
【０３０４】
【表３．１】
2007520565.tif 000044
【表３．１−１】
2007520565.tif 000045
【表３．１−２】
2007520565.tif 000046
【表３．１−３】
2007520565.tif 000047
【表３．１−４】
2007520565.tif 000048
【表３．１−５】
2007520565.tif 000049
【表３．１−６】
2007520565.tif 000050
【表３．１−７】
2007520565.tif 000051
【表３．１−８】
2007520565.tif 000052
【実施例５】
【０３０５】
他のデヒドロフェニラヒスチン類似体
Ａ．デヒドロフェニラヒスチン誘導体の合成に関する修飾
デヒドロフェニラヒスチンの他の誘導体は、上述の技法を単独で使用して、又は他の既知の有機合成技法と併用して合成される。
【０３０６】
合成方法に関与するジアシルジケトピペラジン並びに第１のアルデヒド及び第２のアルデヒドに対する修飾は、産生する所望の誘導体に従って様々である。以下を施された誘導体が合成される：
Ａ）フェニル環を修飾し、且つ／又は他の芳香族環系を導入すること、
Ｂ）芳香族環の位置を変更すること、
Ｃ）イミダゾール芳香族環系を変更すること、及び／又は
Ｄ）イミダゾール環上の５位を修飾すること。
【０３０７】
下記の図は、デヒドロフェニラヒスチンの誘導体を産生するように修飾されるデヒドロフェニラヒスチン化合物の領域を表す。修飾の非限定的な例を開示しており、この開示に基づいて、当業者には理解されよう。
【０３０８】
【化３５】
2007520565.tif 000053
【０３０９】
デヒドロフェニラヒスチン化合物への上記修飾を発展させて、化合物の誘導体は、フェニル環での以下の置換基（Ａ）：−ＣＦ3、−ＳＯ2ＮＨ2（−ＳＯ2ＮＲ1Ｒ2）、−ＳＯ3Ｈ、−ＣＯＮＨ2（−ＣＯＮＲ1Ｒ2）、−ＣＯＯＨ等を含んでもよい。他の環構造（Ｃ）はまた、下記を含んでもよい：
【０３１０】
【化３６】
2007520565.tif 000054
【０３１１】
Ｂ．合成したデヒドロフェニラヒスチン誘導体の例
合成したデヒドロフェニラヒスチン誘導体のさらなる例を表４に開示する。
【０３１２】
【表４】
2007520565.tif 000055
【表４−１】
2007520565.tif 000056
【表４−２】
2007520565.tif 000057
【表４−３】
2007520565.tif 000058
【表４−４】
2007520565.tif 000059
【表４−５】
2007520565.tif 000060
【表４−６】
2007520565.tif 000061
【表４−７】
2007520565.tif 000062
【表４−８】
2007520565.tif 000063
【０３１３】
Ｃ．デヒドロフェニラヒスチン誘導体の評価
上述の誘導体の評価は、実施例３に記載した方法に従って評価される。誘導体のさらなる評価は、細胞増殖に対する阻害効果、特定の細胞メカニズム（すなわち、微小管機能）に対する効果、細胞周期の進行に対する効果の決定、癌細胞系に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍活性の評価等の特定の活性にまで拡大される。幾つかの評価方法プロトコルを以下に示す。
【０３１４】
１）デヒドロフェニラヒスチン及びその類似体の細胞増殖阻害効果
９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに、ヒト肺癌に由来するＡ−５４９細胞に対して抗腫瘍効果を有するＥＭＥＭ培養培地(ニッセイセイヤク株式会社（Nissui Seiyaku Co., Ltd.）)に１０％ウシ胎児血清を添加することにより得られる培養培地中に、１０5個の細胞／ｍｌになるように調製したヒト肺癌に由来するＡ−５４９細胞を１００μｌ入れる。上述の例により得られる誘導体のメタノール溶液を、最上列のウェルに添加して、検体を片対数希釈方法により希釈して、添加し、プレートを、二酸化炭素ガスインキュベータ中で、３７℃で４８時間インキュベートする。得られたものを、ＭＴＴ試薬（３−（４，５−ジメチル−２−チアゾール）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラブロミド（１ｍｇ／ｍｌ・ＰＢＳ）を有する１０μｌのロットに添加した後、二酸化炭素ガスイ
ンキュベータ中で、３７℃で６時間インキュベートする。培養培地を廃棄して、細胞中で産生される結晶をジメチルスルホキシド１００μｌ／ウェル中に溶解する。続いて、５９５ｎｍの光の吸収をマイクロプレートリーダで測定する。未処理の細胞の光吸収を、既知の濃度の検体で処理した細胞の光吸収と比較することにより、細胞増殖５０％を阻害した検体濃度（ＩＣ50）を算出する。
【０３１５】
２）デヒドロフェニラヒスチン及びその類似体の細胞周期阻害活性
細胞株Ａ４３１は、ヒト肺癌に由来する。１０％ウシ胎児血清及び１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液(シグマ（SIGMA）Ｍ２０２５)を含有するＥＭＥＭ培養培地を用いて、Ａ４３１細胞を、５％二酸化炭素ガス及び水蒸気で飽和させたインキュベータ中で３７℃でインキュベートする。上記方法により得られるデヒドロフェニラヒスチンの精製検体を、対数増殖期の細胞に添加し、細胞周期の進行を、フローサイトメトリー及び顕微鏡観察により分析する。
【０３１６】
ＨｅＬａ細胞の細胞周期進行に対する効果を図４２に示す。
【実施例６】
【０３１７】
合成したデヒドロフェニラヒスチン（デヒドロＰＬＨ）誘導体の構造活性相関
１）誘導体合成の大要
本明細書中に開示するデヒドロＰＬＨの誘導体の多く（しかし、すべてではない）は、フェニル環に１つ、２つ又は３つの修飾を含む（以下の表５）。誘導体は、上述の方法により合成した。表５に示すように、ある特定の化合物は、デヒドロＰＬＨ及びｔＢｕ−デヒドロＰＬＨよりも強力な細胞毒性活性を示した。３ｎＭのＥＣ50値を示す最も強力な化合物は、ＫＰＵ−９０であった。この値は、それぞれ、デヒドロＰＬＨ及びｔＢｕ−デヒドロＰＬＨの値よりも１６倍及び４倍高かった。これらの誘導体は、フェニル環のｏ又はｍ位で、フッ素及び塩素原子のようなハロゲン原子又はメチル、ビニル若しくはメトキシ基による一置換を有する。ナフタレン、チオフェン及びフラン環のようなヘテロアリール構造に対する置換を伴う誘導体もまた強力な活性を誘発した。ＫＰＵ−３５、４２、６９、８０及び８１もまた、ｔＢｕ−デヒドロＰＬＨよりも高い活性を示した。
【０３１８】
【表５】
2007520565.tif 000064
【表５−１】
2007520565.tif 000065
【表５−２】
2007520565.tif 000066
【０３１９】
２）フェニル環に対するメトキシ基の導入
コルヒチンは、ＰＬＨと同じβ−チューブリン上の結合部位を認識する。コルヒチンは、そのＡ環及びＢ環上に４つの特徴的なメトキシ基を有する。単一又は複数のメトキシ基による一連の置換を実施した。細胞毒性活性の結果を表６に示す。
【０３２０】
【表６】
2007520565.tif 000067
【表６−１】
2007520565.tif 000068
【０３２１】
結果は、ｍ又はｏ位での置換が、ＨＴ−２９細胞に対する細胞毒性活性を増大させることを示した。ＫＰＵ−９及び１６は、高い活性を示した。三重置換を伴うメトキシ誘導体（ＫＰＵ−１１、１７及び４５）もまた活性を示した。ＫＰＵ−２４の構造は、質量分析により確認した。
【０３２２】
３）電子求引基による修飾
フェニル環上のより拡張された構造活性相関を研究するために、電子求引基及び電子供与基の両方を含む一連の種々の官能基を導入した。ＨＴ−２９細胞に対する細胞毒性の結果を、それぞれ表７及び表８に示す。
【０３２３】
ｏ又はｍ位での置換は、効果的に活性を増大させた。これらの結果は、メトキシ基の場合とよく一致した。
【０３２４】
【表７】
2007520565.tif 000069
【表７−１】
2007520565.tif 000070
【表７−２】
2007520565.tif 000071
【０３２５】
【表８】
2007520565.tif 000072
【表８−１】
2007520565.tif 000073
【表８−２】
2007520565.tif 000074
【０３２６】
本開示は、任意の特定の科学的理論に拘束又は限定されない。それにもかかわらず、当業者は、本明細書中に提示する結果を、立体障害にあまり影響を及ぼさない比較的小さな官能基がより強力な活性を誘発するのに好ましい場合があるということ、またエトキシ基（メトキシ基と比較した場合）又はＢｒ原子（Ｃｌ原子と比較した場合）のようなわずかに大きな基は、例えばチューブリン結合部位との相互作用に好ましくない立体障害に影響を及ぼし得ることを示唆するものと解釈してもよいことが理解されよう。さらに、これらの置換基の電気特性は活性に影響を及ぼさなかったことから、これらの比較的小さな置換基は、β−チューブリンの結合部位と直接相互作用はしないが、結合に適切なデヒドロＰＬＨのコンホメーションを制限することが示唆される。或いは、別の考え得る仮説としては、水素供与体として水素結合を形成することができる親水性水酸基の導入は、活性を劇的に減少させるため、疎水性の特性は、β−チューブリン上のｏ又はｍ位の結合部位でより重要な要素であり得る。
【０３２７】
表９に示すように、ｏ位での細胞毒性活性における置換基の効果を、表１０に示すようなｍ位の場合と同様に順序付けてもよい。ｔＢｕ−デヒドロＰＬＨよりも高い活性を示した有効な官能基を有する化合物はまた、さらに修飾されてもよい。また、可視光照射下でＺからＥへの立体化学の移行が観察されたため、共役二重結合における電子密度を減少させる置換基は、光によるＺからＥへの移行の減少に寄与する場合があり、物理化学的により安定な構造を生じる。温度もまた、この移行をもたらし得る。
【０３２８】
環の２つの部位での修飾は、強力であるが、同時に生物学的に安定な化合物の開発に所望されることがある。フェニラヒスチンのフェニル環は、チトクロームＰ−４５０により酸化される。したがって、フェニル環の電子密度を減少させる二重の修飾は、Ｐ−４５０酸化を回避するのに有効であり得る。したがって、−ＯＭｅ、−Ｍｅ、−Ｃｌ、−Ｆ及び
Ｂｒのような活性を増大させることができる要素に対するフッ素原子のような小さな電子求引基の組合せは、より強力且つ生物学的に安定な薬物化合物を産生し得る。
【０３２９】
【表９】
2007520565.tif 000075
【表９−１】
2007520565.tif 000076
【０３３０】
【表１０】
2007520565.tif 000077
【表１０−１】
2007520565.tif 000078
【０３３１】
４）アリール複素環へのフェニル環の置換
フェニル環はまた、ヘテロアリール基で置き換えてもよい。細胞毒性活性に関するこのような置き換えの結果を表１１に示す。アリール窒素原子は、ジケトピペラジン環のＮＨ基と水素結合を形成し、ピリジンとジケトピペラジン環との間での分子のコンホメーションを一平面状に制限し得るため、デヒドロＰＬＨの活性コンホメーションは、ジケトピペラジン環のアミド水素原子とフェニル環のｏ−水素原子との間での立体反発により形成されるある特定レベルの二面角を要する（図６）。
【０３３２】
【表１１】
2007520565.tif 000079
【表１１−１】
2007520565.tif 000080
【０３３３】
より小さなフラン又はチオフェン環によるフェニル環の置き換え（例えばＫＰＵ−２９又はＫＰＵ−４２）は、活性を示した。フェニル環は、強力な活性を維持しつつ、他の芳香族構造に変更させることできる。
【０３３４】
５）フェニラヒスチンの代謝
最近の彼の研究では、（±）−フェニラヒスチンを、ラット肝ミクロソーム又はヒト肝Ｐ４５０で処理した。ヒトの場合では、少なくとも７つの代謝産物が検出され、それらのうちの２つ、すなわちＰ１及びＰ３が、主要な代謝産物であり、回収された代謝産物の６０％以上に相当した。
【０３３５】
ｔＢｕ−デヒドロＰＬＨではエキソオレフィン構造が存在しないため、本発明の合成した誘導体は、Ｐ１及びＰ４のような酸化をもたない。しかしながら、Ｐ３及びＰ５のような酸化は、肝代謝中に形成される。このような代謝を防止する様々な誘導体は、フェニル
環でのＰ４５０酸化を回避するのに有効である。イミダゾール環もまた、好ましくない酸化を回避するように修飾することができる。
【０３３６】
６）デヒドロＰＬＨの物理化学的安定性
物理化学的安定性は、デヒドロＰＬＨの好ましくない問題の１つである。フェニラヒスチンでは、ベンジル部分に付加的なオレフィン構造が存在しないため、このような問題は存在しない。しかしながら、デヒドロＰＬＨでは、ベンジリデン部分は、おそらく可視光で容易に活性化することができ、二重結合のより長い共役の存在に起因して、ＺからＥへの移行が頻繁に起きる。この移行は、標準的な室内照明下でさえも起きた。細胞毒性アッセイでは、幾つかの化合物が、インキュベーション中に、Ｅ体へと移行するが、この移行は、デヒドロＰＬＨの場合では、おそらく１：１の比で平衡となる。この移行は制御することができる。このＺ体からＥ体への移行はまた、チューブリン阻害剤と同じタイプであるコンブレタスタチンＡでも既知であり、この問題を改善するための研究が幾つか報告された。
【０３３７】
７）プロドラッグ合成
Ｅ体はまた、デヒドロＰＬＨ、或いは１つ以上のその類似体（本明細書中に記載する類似体を含む）のプロドラッグとして使用されてもよい。抗チューブリン薬剤の望ましくない特性の１つは、腫瘍と無傷組織との間での低い選択性を含むが、これらの薬剤は、分子標的療法の１つに属する。これは、望ましくない副作用を引き起こす。しかしながら、化合物が、腫瘍組織のみで選択的に機能する場合、抗微小管薬剤のマイナスの副作用を低減させることができる。デヒドロＰＬＨ（Ｚ体）は、可視光照射によりそのＥ異性体から産生することができるため、Ｅ体を投与して、腫瘍部位のみで光照射を実施すると、腫瘍のみが、光により産生するＺ体により損傷を受け、無傷組織に対する不利な影響は低減する。
【０３３８】
Ｅ体は、嵩高いが、生分解性のアシル基の付加により化学的に保護することができ、このアシル基は、プロドラッグとしてジケトピペラジン環に導入される。このアシル基は、体内でプロテアーゼにより切断することができる。したがって、アシル化したＥ化合物を投与前に維持し、続いて投与後に、それを真のＥ体に変更させて、局所的な光照射により生理活性なＺ体へ移行させることができる。
【０３３９】
ｔＢｕ−デヒドロＰＬＨのこのアシルＥ体の合成スキームを図９に概要する。
【実施例７】
【０３４０】
合成したデヒドロフェニラヒスチンの薬学的処方物
１）点滴、注射、注入等により静脈内に投与される処方物
粉末グルコース５ｇを含有するバイアルそれぞれに、上記方法により合成される化合物１０ｍｇを無菌的に添加し、密封する。窒素、ヘリウム又は他の不活性ガスを満たした後、バイアルを冷暗所に保管する。使用前に、内容物をエタノール中に溶解して、０．８５％生理食塩水溶液１００ｍｌに添加する。得られた溶液を、癌性腫瘍の成長を阻害する方法として、このような腫瘍を有すると診断されたヒトにおいて、約１０ｍｌ／日〜およそ１，０００ｍｌ／日で、当業者により適切と思われる通りに、点滴により静脈内に、或いは皮下又は腹腔内注射により投与する。
【０３４１】
２）経口投与等されるべき処方物
上記方法により合成される化合物１ｇ、ラクトース９８ｇ及びヒドロキシプロピルセルロース１ｇを完全に混合することにより得られる混合物を、任意の従来の方法により顆粒として成形する。顆粒を完全に乾燥させて、ふるいにかけて、ビンの中の或いはヒートシーリングによるパッケージングに適した顆粒調製物を得る。得られた顆粒調製物を、ヒト
における癌性腫瘍を治療する技術分野の当業者により適切であると思われる通りに、症状に応じて、約１００ｍｌ／日〜約１，０００ｍｌ／日で経口投与される。
【０３４２】
３）局所的に投与されるべき処方物
有効量の化合物の個体への投与はまた、個体の皮膚の患部に直接、化合物（複数可）を投与することにより局所的に達成することができる。この目的では、投与されるか、又は塗布される化合物は、ジェル、軟膏、ローション又はクリームのような薬理学的に許容可能な局所担体（これは、水、グリセロール、アルコール、プロピレングリコール、脂肪アルコール、トリグリセリド、脂肪酸エステル、又は鉱物油のような担体を含むが、これらに限定されない）を含む組成物の形態である。他の局所担体としては、液体石油、パルミチン酸イソプロピル、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中のモノラウリン酸ポリオキシエチレン（５％）、又は水中のラウリル硫酸ナトリウム（５％）が挙げられる。酸化防止剤、湿潤剤、粘性安定剤、及び類似の作用物質のような他の物質を、必要に応じて添加してもよい。アゾン（Ａｚｏｎｅ）のような経皮浸透増強剤もまた包含してもよい。さらに、ある特定の状況では、化合物は、皮膚上、皮膚中又は皮膚下に置かれるデバイス内に配置させてもよいことが予測される。このようなデバイスとしては、パッチ、インプラント、及び受動又は能動放出メカニズムのいずれかによる化合物を皮膚へ放出する注射が挙げられる。
【実施例８】
【０３４３】
ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチルフェニラヒスチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬理学
ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチルフェニラヒスチンを用いて実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性の研究としては、Ａ）６つの腫瘍細胞系のパネル、Ｂ）多剤耐性腫瘍細胞における研究、及びＣ）作用メカニズムを決定するための研究が挙げられた。
【０３４４】
Ａ）６つの腫瘍細胞系のパネルにおけるＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチルフェニラヒスチンの研究
以下の細胞系（括弧中は供給源）を使用した：ＨＴ２９（ヒト結腸腫瘍、ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−３８）、ＰＣ３（ヒト前立腺腫瘍、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４３５）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト胸部腫瘍、ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−２６）、ＮＣＩ−Ｈ２９２（ヒト非小細胞肺腫瘍、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１８４８）、ＯＶＣＡＲ−３（ヒト卵巣腫瘍、ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１６１）、Ｂ１６−Ｆ１０（マウス黒色腫、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６４７５）及びＣＣＤ−２７ｓｋ（正常なヒト線維芽細胞、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１４７５）。細胞を、それらの各々の培養培地中にコンフルエント以下の密度で維持した。
【０３４５】
細胞毒性アッセイは、細胞生存度の指標としてレサズリン蛍光を用いて、実施例４において上述したように実施した。
【０３４６】
開示する化合物は、様々な各種及び別個の腫瘍細胞系に対して有効な作用物質である。具体的には、例えば、ＫＰＵ−２及びＫＰＵ−３５は有効性（低ナノモル範囲で活性を示す）及び効力（最大細胞毒性効果に関して最も応答性を示す）の両方に関して、ＨＴ−２９腫瘍細胞系に対して最も有効的であった。ｔ−ブチル−フェニラヒスチンは、ＰＣ−３腫瘍細胞系に対してその最大の有効性を示したが、最大の効力は、ＨＴ−２９細胞系に対して示された。ＫＰＵ−２及びＫＰＵ−３５は、ｔ−ブチル−フェニラヒスチンよりも概して１０〜４０倍強力であったのに対して、効力は、種々の腫瘍細胞系において３つの化合物すべてに関して同様であった。ＨＴ−２９、ＰＣ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞系はすべて、ＮＰＩ化合物に対して同様に反応したのに対して、Ｂ１６−Ｆ１０は、いくらか感受性が弱いようであった。ｔ−ブチル−フェニラヒスチンは、ＯＶＣＡＲ−３細胞系を除いて、＞２０〜＞１００の割合で、正常な線維芽細胞と腫
瘍細胞系との間で顕著な差を示した。
【０３４７】
【表１２】
2007520565.tif 000081
【０３４８】
Ｂ）薬物耐性細胞系における研究
臨床腫瘍学における化学療法剤の使用における主な挑戦の１つは、腫瘍細胞による薬剤効果に対する耐性の発生である。耐性の発生に関しては幾つかのメカニズムが存在し、そのそれぞれが、化学療法薬物に対して異なる効果を有する。これらのメカニズムとしては、ＭＤＲ１によりコードされるＰ−糖タンパク質又はＭＲＰ１によりコードされる多剤耐性関連タンパク質１のようなＡＴＰ依存性流出ポンプの発現の増大を含む。薬剤摂取の減少、薬剤の標的の変更、薬物誘導性ＤＮＡ損傷の修復の増大、アポトーシス経路の変更、及びチトクロームＰ４５０酵素の活性化は、癌細胞が抗癌薬物に対して耐性となるメカニズムの他の例である。選択した化合物を、異なる２つの耐性メカニズム：Ｐ−糖タンパク質の過剰発現及びトポイソメラーゼＩＩ活性の変更を示す異なる３つの細胞系で研究した。
【０３４９】
１）ヒト子宮肉腫腫瘍細胞系ペア：ＭＥＳ−ＳＡ（タキソール感受性）及びＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５（タキソール耐性）
この細胞系は、上昇したｍｄｒ−１  ｍＲＮＡ及びＰ−糖タンパク質（排出ポンプメカニズム）を発現する。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）による前処理は、Ｐ−糖タンパク質を阻害し、耐性が上昇したＰ−糖タンパク質に起因する化合物に関して耐性細胞系において活性を回復させる。
【０３５０】
表１３からわかるように、ＫＰＵ−２及びＫＰＵ−３５は、耐性細胞系において感受性の系と同様の有効性を有し、ｔ−ブチル−フェニラヒスチンの有効性は、ほんのわずかに減少した。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）前処理は、選択した化合物の有効性を変えなかった。対比して、タキソールは、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５耐性細胞系において事実上不活性であったのに対して、この化合物は、感受性細胞系では非常に強力であった。ＣｓＡ処理は
、ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５細胞系のタキソールに対する感受性を回復させた。ＭＥＳ−ＳＡ／ＤＸ５細胞系はまた、エトポシド（６０倍）、ドキソルビシン（３４倍）及びミトザントロン（２０倍）に対して減少した感受性を示した。
【０３５１】
これらのデータは、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果は、この細胞系ではタキソール関連の耐性メカニズム（ｐ−糖タンパク質）に影響を受けず、またタキソール由来の交差耐性は、このモデルではこれらの選択した化合物には起こらないことを示す。
【０３５２】
【表１３】
2007520565.tif 000082
【０３５３】
図４３に示すさらなるデータも参照。
【０３５４】
２）ヒト急性前骨髄球性白血病細胞系ペア：ＨＬ−６０（ミトキサントロン感受性）及びＨＬ−６０／ＭＸ−２（ミトキサントロン耐性）
この細胞系は、Ｐ−糖タンパク質の過剰発現なしで変更されたトポイソメラーゼＩＩ触媒活性を有する非定型的な薬物耐性特性を有するとみなされる。
【０３５５】
表１４でわかるように、これらの結果は、選択した新規化合物の有効性が、感受性及び耐性ＨＬ−６０細胞系で非常に類似することを示す。対比して、ミトキサントロンは、耐性ＨＬ−６０／ＭＸ−２細胞系においてある因子によって２４倍効力を失う。
【０３５６】
したがって、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンは、この細胞系では、ミトキサントロンと同じ耐性メカニズムに影響を受けず、このモデルではこれらの選択した新規化合物に対するミトキサントロン由来の交差耐性は存在しない。
【０３５７】
【表１４】
2007520565.tif 000083
【０３５８】
３）ヒト胸部癌腫細胞系ペア：ＭＣＦ−７（タキソール感受性）及びＭＣＦ−７／ＡＤＲ（タキソール耐性）
この研究は、タキソールと比較してＫＰＵ−２を含む。ＫＰＵ−２は、この細胞系ペアの感受性成員及び耐性成員の両方で、類似の有効性を示した。対比して、タキソールは、耐性細胞系では事実上不活性であったのに対して、感受性細胞系では低ナノモルの有効性が存在した（表１５）。
【０３５９】
これらの研究により、種々のヒト腫瘍細胞系において、タキソール耐性はＫＰＵ−２に移行しないことが確認される。
【０３６０】
【表１５】
2007520565.tif 000084
【０３６１】
Ｃ）作用メカニズムの研究
１）微小管機能に対する作用
α−チューブリンの染色により、チューブリンに対する、コルヒチン及びタキソールと比較した場合のＫＰＵ−２及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を評価するために、ヒト臍帯静脈内皮細胞（CambrexからのＨｕＶＥＣ）をこの研究において使用した。
【０３６２】
ＫＰＵ−２、ｔ−ブチル−フェニラヒスチン又はコルヒチンへの３０分の暴露（すべて２μＭで）は、ＨｕＶＥＣ細胞において、ＤＭＳＯ対照で観察されるものと対比して、無傷の微小管構造の欠如、及び細胞膜小疱形成（アポトーシスの明らかな指標）により示される微小管脱重合を誘導したのに対して、タキソールは、これらの条件下では、微小管脱重合を誘導しなかった。コルヒチンは、既知の微小管脱重合剤であるのに対して、タキソールは、チューブリン安定剤である。ＣＣＤ−２７ｓｋ細胞をＫＰＵ−２又はコルヒチンに暴露させた場合に、同様の結果が得られた。
【０３６３】
２）アポトーシスの誘導
アポトーシス及びその調節障害は、腫瘍学において重要な役割を果たす。腫瘍細胞におけるプログラム細胞死周期の選択的な誘導は、多くの化学療法薬発見プログラムの目標である。このアポトーシスの誘導は、特徴的な細胞膜小疱形成、ＤＮＡ断片化、抗アポトーシス因子Ｂｃｌ−２の過剰リン酸化、カスパーゼカスケード(caspase cascade)の活性化
及びポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を含む種々の方法により証明することができる。
【０３６４】
アポトーシス細胞死の特徴的な徴候としては、細胞膜小疱形成、核の崩壊、細胞収縮及び凝縮、並びに最終的にはネクローシス細胞死と非常に異なる細胞死が挙げられる。ＫＰＵ−２は、ヒト前立腺腫瘍細胞において、アポトーシスの初期段階と関連した典型的な形態学的変化を誘導した。同様の見解がまた、ＫＰＵ−２によるＨｕＶＥＣ細胞の処理で明らかであった。
【０３６５】
３）ＤＮＡ断片化
アポトーシスの最終段階の特徴は、ゲル電気泳動により可視化することができる特有のラダーパターンを生じるヌクレオソーム間のＤＮＡ切断である。このアプローチを用いて、ハリミド(halimide)及びデヒドロフェニラヒスチン（ＫＰＵ−１）と比較して、ジャーカット(Jurkat)細胞（ヒトＴ細胞白血病系）におけるＤＮＡラダーリングに対するＫＰＵ−２の効果を研究した。ＫＰＵ−２は、１ｎＭ濃度でＤＮＡラダーリングを誘導したのに対して、ハリミド及びＫＰＵ−１は、相当低い有効性であった。
【０３６６】
４）カスパーゼカスケードの活性化
カスパーゼ−３、カスパーゼ−８及びカスパーゼ−９を含むカスパーゼカスケードにおける幾つかの酵素は、アポトーシス中に活性化される。カスパーゼ−３の活性を、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンによる処理後に、ジャーカット細胞でモニタリングした。
【０３６７】
カスパーゼ−３は、ハリミドと同様の様式で、３つの化合物すべてによる処理により、用量依存的な様式で活性化されたことが、結果により示される。カスパーゼ−３の活性化は、ジャーカット細胞系における細胞毒性のＩＣ50に関して、同様の濃度範囲にわたって起こった（表１６）。
【０３６８】
【表１６】
2007520565.tif 000085
【０３６９】
５）ジャーカット細胞におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断
ジャーカット細胞において、これらの化合物がアポトーシスを誘導する能力を評価するために、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断をモニタリングした。ＰＡＲＰは、カスパーゼ−３の主要な細胞内標的の１つである１１６ｋＤａの核タンパク質である。ＰＡＲＰの切断は、８９ｋＤａの安定な生成物を生成し、このプロセスは、ウェスタンブロット法により容易にモニタリングすることができる。カスパーゼによるＰＡＲＰの切断は、アポトーシスの特質の１つであり、したがって、このプロセスにとって優れたマーカーとして役立つ。１００ｎＭでのＫＰＵ−２は、化合物への細胞の暴露の１０時間後に、ジャーカット細胞におけるＰＡＲＰの切断を誘導した。ＫＰＵ−２は、ハリミド又はＫＰＵ−１のいずれよりも活性であるようであった。
【０３７０】
６）ＨｕＶＥＣ細胞における血管透過性の増強
微小管を脱重合する化合物（例えば、コンブレタスタチンＡ−４−リン酸塩、ＺＤ６１２６）は、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍において、血管虚脱を誘導することが示されている。この血管虚脱は、最初に電解質への、次いで直後の巨大分子への血管細胞透過性の迅速な誘導の後に起こる。蛍光標識したデキストランに対するＨｕＶＥＣ細胞の透過性の増強を、血管虚脱に関する代用アッセイとして使用する。
【０３７１】
ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンはすべて迅速に（１時間以内）、コルヒチンと同様の程度に、有意なＨｕＶＥＣ単層透過性を誘導した。微小管安定剤であるタキソールは、このアッセイでは不活性であった（図１２）。
【０３７２】
７）広範囲のキナーゼスクリーンにおけるプロファイル
ＫＰＵ−２を、６０個の異なるキナーゼのパネル中で、１０μＭの濃度で初めにスクリーニングした。ＡＴＰ濃度は、１０μＭであった。４つのキナーゼは、一次スクリーニングでは５０％以上が阻害され、二次スクリーニングで決定したＩＣ50を表１７に提示する。ＩＣ50値はすべて、低マイクロモル範囲内であり、それは、これらのキナーゼの阻害が腫瘍細胞の細胞毒性に関して観察される低ナノモル活性に関連しないことを示す。
【０３７３】
【表１７】
2007520565.tif 000086
【実施例９】
【０３７４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬理学
ＫＰＵ−２による予備研究を、マウスにおいてＭＸ−１（胸部）及びＨＴ−２９（結腸）異種移植片モデル並びにＰ−３８８マウス白血病腫瘍モデルを用いて実施した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍パネルにおいて活性に基づき選択される他の腫瘍モデルは、ＤＵ−１４５（前立腺）、ＭＣＦ−７（胸部）、及びＡ５４９（肺）細胞系であった。ヒト膵臓腫瘍（ＭｉａＰａＣａ−２）もまた含まれた。新規化合物を、単一療法として、及び臨床的に使用する化学療法剤と併用して研究した。選択した新規化合物の用量は、急性忍容性試験により決定し（最大許容用量、ＭＴＤ）、各研究中に必要であれば調節した。臨床的に使用する化学療法剤の用量は、過去の(historical)研究に基づいて選択した。
【０３７５】
ＫＰＵ−２は、これらの５つの腫瘍モデルにおいて研究されるべき第１の化合物であった。この研究の初期の結果に従って、３つの化合物すべてを、ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍、ＤＵ−１４５ヒト前立腺及びＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍異種移植片モデルにおいて比較した。
【０３７６】
上述のモデルはすべて、皮下異種移植片移植技法(subcutaneous xenograft implantation technique)を使用し、拡大された（又は明らかな）抗腫瘍活性をもたらす皮下の血管系に対する化合物の選択的効果を潜在的に受けやすい。この可能性を防ぐために、他の２つの腫瘍モデルを研究に取り入れてきた。これらのうちの一方は、Ｂ１６−Ｆ１０マウス黒色腫腫瘍細胞の静脈内注射後の、肺転移の観察である。もう一方のモデルは、マウス乳房脂肪体におけるＭＤＡ−２３１ヒト胸部腫瘍細胞の移植である。この後者のモデルは異
種移植片モデルであるものの、皮下の血管系は役割を果たしていない。
【０３７７】
方法
１）異種移植片モデル
使用した動物は（例外は、個々の研究に対して示してある）、５〜６週齢の雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）（〜２０ｇ、ハーラン（Harlan））であった。群の大きさは、別記しない限り、１群当たり９〜１０匹のマウスであった。
【０３７８】
腫瘍移植に使用した細胞系は、ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍、ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍、Ａ５４９ヒト非小細胞肺腫瘍、ＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓腫瘍、ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍であった。
【０３７９】
選択した新規化合物は、個々の研究に対して示した用量で、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路により単一療法として投与された。併用研究では、選択した参照化学療法剤(reference chemotherapy agents)は、化合物の１５〜３０分前に注射した。
【０３８０】
これらの研究で使用した担体は、選択した新規化合物に関しては、ＤＭＳＯ１２．５％、クレマフォー（Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ）５％及びピーナッツ油８２．５％であり、タキソテールに関しては、（１：３）ポリソルベート８０：１３％エタノールであり、パクリタキセルに関しては、（１：１）クレマフォー：エタノールであり、ＣＰＴ−１１に関しては、溶液１ｍＬ当たり、塩酸イリノテカン２０ｍｇ、ソルビトールＮＦ粉末４５ｍｇ、及び乳酸０．９ｍｇを含んでいた。ｐＨは、ＮａＯＨ又はＨＣｌで７．４に調節された。生理食塩水希釈物を用いて、参照化合物に使用する注射濃度を達成する。
【０３８１】
ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍モデル
ヌードマウス宿主において皮下で（ｓ．ｃ．）成長中の腫瘍から収集されるＨＴ−２９腫瘍の断片を、トロカールにより皮下へ動物に移植した。腫瘍サイズが５ｍｍ×５ｍｍに到達した際（約１０〜１７日）、動物を処理群と対照群とに適合させた。１日目から始めて、１週間に２度マウスを秤量し、１週間に２度カリパスを用いて、腫瘍測定結果を得た。腫瘍測定結果は、式（Ｗ2×Ｌ）／２を用いて、推定腫瘍重量（ｍｇ）に変換した。対照群の推定腫瘍重量が平均１，０００ｍｇに達した際に、マウスを秤量して、屠殺して、腫瘍を取り出した。腫瘍を秤量して、１群当たりの平均腫瘍重量を算出して、腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）を各群に対して決定した（１００％−平均処理腫瘍重量の変化／平均対照腫瘍重量の変化×１００）。
【０３８２】
このモデルでは、個々の研究に対して別記しない限り、選択した新規化合物を、３日毎に１５日間［１、４、８、１１及び１５（ｑ３ｄ×５）］、腹腔内注射した。ＣＰＴ−１１は、１日目、８日目及び１５日目に（ｑｗ×３）腹腔内投与した。
【０３８３】
ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍モデル
雌ヌードマウス（約２０ｇ）に、２１日放出性の(21-day release)エストロゲン（０．２５ｍｇ）ペレットを皮下移植した２４時間後に、ＭＣＦ−７腫瘍断片（ヌードマウス宿主において皮下腫瘍から収集される）を皮下に移植した。続いて、標準的な化学療法剤としてタキソテールを使用して、ＨＴ−２９モデルに関して記載されているように、研究を進めた。
【０３８４】
このモデルでは、個々の研究に対して別記しない限り、新規化合物は、１日目〜５日目まで毎日（１日目及び５日目を含む（ｑｄ×５））、腹腔内経路により注射した。タキソテールは、１日目、３日目及び５日目に（ｑｏｄ×３）、静脈内投与した。
【０３８５】
Ａ５４９ヒト肺腫瘍モデル
ヌードマウス宿主において皮下で成長中の腫瘍から収集されるＡ５４９腫瘍の断片を、トロカールにより皮下へ動物に移植した。腫瘍サイズが５ｍｍ×５ｍｍに到達した際（約１０〜１７日）、動物を処理群と対照群とに適合させた。残りの研究は、標準的な化学療法剤としてタキソテール及びＣＰＴ−１１を使用して、ＨＴ−２９モデルに関して記載されているように進めた。
【０３８６】
このモデルでは、個々の研究に対して別記しない限り、試験化合物は、ＣＰＴ−１１併用に関しては、ｑ３ｄ×５の用量スケジュールで、或いはタキソテールとの併用に関しては、ｑｄ×５の用量レジメンで、腹腔内経路により投与した。ＣＰＴ−１１は、ｑｗ×３のスケジュールで、腹腔内経路により投与した。タキソテールは、ｑｏｄ×３の用量レジメンで、静脈内投与した。
【０３８７】
ＭｉａＰａＣａ−２ヒト膵臓腫瘍モデル
ヌードマウス宿主において皮下で成長中の腫瘍から収集されるＭｉａＰａＣａ−２腫瘍の断片を、トロカールにより皮下へ動物に移植した。腫瘍サイズが５ｍｍ×５ｍｍに到達した際（約１０〜１７日）、動物を処理群と対照群とに適合させた。残りの研究は、標準的な化学療法剤としてゲムシタビンを使用して、ＨＴ−２９モデルに関して記載されているように進めた。
【０３８８】
このモデルでは、個々の研究に対して別記しない限り、試験化合物は、３日毎に１日目、４日目、７日目、１０日目及び１５日目に（ｑ３ｄ×５）、腹腔内経路により投与した。ゲムシタビンは、１日目、４日目、７日目及び１０日目に（ｑ３ｄ×４）、腹腔内経路により投与した。
【０３８９】
ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍モデル
雄のヌードマウス宿主において皮下で成長中の腫瘍から収集されるＤＵ−１４５腫瘍の断片を、トロカールにより皮下へ雄マウスに移植した。腫瘍がおよそ５ｍｍ×５ｍｍに到達した際（約１３〜１７日）、動物を処理群と対照群とに適合させた。残りの研究は、標準的な化学療法剤としてタキソテールを使用して、ＨＴ−２９モデルに関して記載したように進めた。
【０３９０】
このモデルでは、個々の研究に対して別記しない限り、試験化合物は、１日目、３日目、５日目、８日目及び１１日目に（ｑ３ｄ×５）、腹腔内経路により投与した。タキソテールは、１日目、３日目及び５日目に（ｑ２ｄ×３）、静脈内投与した。
【０３９１】
２）非皮下移植腫瘍モデル
使用した動物は、５〜６週齢の雌ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）（ＭＤＡ−２３１研究）又はＢ６Ｄ２Ｆ１マウス（Ｂ１６−Ｆ１０研究）（約２０ｇ、ハーラン）であった。群の大きさは、別記しない限り、１群当たり１０匹のマウスであった。
【０３９２】
使用した細胞系は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト胸部腫瘍細胞及びＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫細胞であった。
【０３９３】
ＮＰＩ化合物は、個々の研究に対して示した用量で、腹腔内経路により単一療法として投与された。併用研究に関して、選択した参照化学療法剤は、ＮＰＩ化合物の１５〜３０分前に注射した。
【０３９４】
ＭＤＡ−２３１ヒト胸部腫瘍
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物から収集した２×１０6個のＭＤＡ−２３１細胞を、雌ヌ
ードマウスの乳房脂肪体中に注射した。腫瘍サイズが５ｍｍ×５ｍｍに到達した際（約１４〜２８日）、動物を処理群と対照群とに適合させた。続いて、研究は、標準的な化学療法剤としてパクリタキセルを使用して、ＨＴ−２９モデルに関して記載したように進めた。
【０３９５】
このモデルでは、個々の研究に対して別記しない限り、試験化合物は、１日目、４日目、８日目、１１日目及び１５日目に（ｑ３ｄ×５）、腹腔内経路により投与した。パクリタキセルは、１日目〜５日目に（ｑｄ×５）、腹腔内経路により投与した。
【０３９６】
Ｂ１６−Ｆ１０転移性マウス黒色腫モデル
０日目に、ｉｖ経路により、マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０細胞（Ｂ１６−Ｆ１０細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物から調製される）を施した。１日目に、マウスを処理群及び対照群に無作為に抽出して、処理を開始した。１日目から始めて、１週間に２度マウスを秤量した。マウスすべてを１６日目に屠殺して、肺を取り出し、秤量し、表面コロニーを計数した。結果は、処理マウスの平均コロニー／対照マウスの平均コロニー（Ｔ／Ｃ）×１００％として表す。転移成長阻害（ＭＧＩ）は、この数字を１００％から差し引いたものである。パクリタキセルは、この研究で使用される標準的な化学療法剤であった。
【０３９７】
このモデルでは、個々の研究に対して別記しない限り、試験化合物は、１日目〜５日目に（ｑｄ×５）、腹腔内経路により投与した。パクリタキセルは、１日目〜５日目に（ｑｄ×５）、静脈内投与した。
【０３９８】
適切である場合（ｎ≧３）、結果を平均±ＳＥＭとして表記する。別記しない限り、幾つかの群における研究の統計学的解析を、ＡＮＯＶＡを用いてニューマン・クールス(Neuman-Keuls)事後試験により実施した。片側ｔ検定もまた、化合物若しくは薬剤、又はその組合せが腫瘍成長を低減させるという仮定に基づいて使用された。
【０３９９】
結果
ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルの研究
１．ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおけるＫＰＵ−２＋／−ＣＰＴ−１１のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
この研究は、ＨＴ−２９モデルにおいて、ＫＰＵ−２単独に関して、及び関連化学療法薬ＣＰＴ−１１との併用に関して、投与量強度（dosage strength）及び投薬レジメンにおける変化を評価した。
【０４００】
ＫＰＵ−２は、７．５ｍｇ／ｋｇの用量で５日間毎日（ｑｄ×５）ｉｐにより、３．７５ｍｇ／ｋｇの用量で５日間１日２度ｉｐにより、７．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日おきに１０日間（ｑｏｄ×５）ｉｐにより、及び７．５ｍｇ／ｋｇの用量で２日おきに１５日間（ｑ３ｄ×５）ｉｐにより投与した。７．５ｍｇ／ｋｇの用量でｑ３ｄ×５でｉｐによるＮＰＩ−２３５８とＣＴＰ−１１との併用は、いずれかの化合物単独よりも相当大きな効果をもたらし、それは研究の継続期間中持続した（図１３）。研究の生存中の部分中でのこれらの観察は、解剖時の群平均最終腫瘍重量により確認され、それに関して、併用群のみが、対照よりも統計学的に有意に低い腫瘍重量を示した。さらに、併用療法群の平均腫瘍重量とＣＰＴ−１１単一療法群の平均腫瘍重量との間の差は、統計学的に有意であった（図１４）。解剖時の個々の最終腫瘍重量を検査すると、同時療法におけるより大きな効果が明らかである（図１４）。同時療法のＴＧＩは７８％であり、これと比較して、ＣＰＴ−１１単独では３８．９％であった。併用療法群に関するＴＧＩは、正の結果に関する５８％のＮＣＩ基準を上回る。
【０４０１】
２．５つのヒト腫瘍異種移植片モデルに対するＫＰＵ−２＋／−の標準的な化学療法の研
究
この研究は、５つの異なる部門から構成され、各々それ自身のプロトコル、タイミング、投薬レジメン及び参照化合物を有する。各部門は、特定の腫瘍モデルの提示内で考慮される。
【０４０２】
ＨＴ−２９部門の研究の目的は、上述の研究で使用されるものと比較した場合に、ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおけるＫＰＵ−２のわずかに高い用量（１０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑ３ｄ×５）を研究することであり、そこでは、ＫＰＵ−２（７．５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑ３ｄ×５）とＣＰＴ−１１（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑｗ×３）との間で顕著な相乗効果が観察された。
【０４０３】
図１５で観察され得るように、このモデルにおけるＫＰＵ−２とＣＰＴ−１１との併用は、腫瘍成長の阻害において、顕著な相乗効果をもたらし、腫瘍成長は、併用療法群において、処理２９日目までほぼ完全に阻害された。併用療法は、効力を維持し、この群に関する推定腫瘍成長は、いずれかの単一療法群よりも有意に低かった。したがって、ＫＰＵ−２及びＣＰＴ−１１の投与は、腫瘍成長を阻害し、有効な抗腫瘍処理である。
【０４０４】
研究の生存中の部分の観察（推定腫瘍成長、図１５）は、解剖時に切除された腫瘍の重量の測定により支持される（図１６）。併用群における腫瘍重量は、ＣＰＴ−１１単独に関する腫瘍重量と同様に（ｐ＜０．０５）、対照よりも有意に低かった（ｐ＜０．０１）。
【０４０５】
個々の最終腫瘍重量が考慮される場合（図１６）、併用群に関する腫瘍サイズは通常、他の処理群又は対照群よりも小さかった。併用群のＴＧＩは６５．８％であり、ＮＣＩ基準により正の効果を示したのに対して、単一療法は、ＮＣＩ基準であるＴＧＩ＞５８％に達しなかった。
【０４０６】
３．ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片研究におけるＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの活性の研究
この研究の結果を、図１７及び表１８に表わす。併用療法群はすべて、新規化合物とＣＰＴ−１１との間に顕著な相乗効果を示した。個々の腫瘍重量は、同時療法処理の有効性を実証する（図１８）。各場合において、併用群のＴＧＩは、正の効果のＮＣＩ基準を上回るのに対して、ＣＰＴ−１１単一療法のＴＧＩは、このレベルに達しなかった。
【０４０７】
【表１８】
2007520565.tif 000087
【０４０８】
４．ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおけるＣＰＴ−１１と併用したＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果の概要
ＣＰＴ−１１と併用した場合、ＫＰＵ−２は、標準的な化学療法剤であるＣＰＴ−１１の効果を、正の効果に関するＴＧＩ≧５８％のＮＣＩ基準を十分に超過したレベルにまで高めた。３つの研究により得られた結果は、生存中の観察（図１９）及び解剖時に切除した腫瘍の重量（図２０）の両方に非常に類似している。
【０４０９】
ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおける研究
このモデルを用いて、２つの研究を完了させた。第１の研究は、ＫＰＵ−２単独及びタキソテールとの併用を含み、第２の研究は、単独で用いた及びタキソテールと併用した、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンを比較した。
【０４１０】
１．ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおけるタキソテールと併用したＫＰＵ−２の効果
この研究の生存中の部分中で得られるデータからわかるように（図２１）、ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍の最も有効な処理は、ＫＰＵ−２＋タキソテールの併用療法であった。処理効果は、研究の初期に最も顕著であり、研究が進行するにつれ減少するようであった。２０日目〜２７日目の処理日から、併用療法は、ＮＣＩ基準（ＴＧＩ≧５８％）を上回る明白なＴＧＩを供し、併用療法の推定腫瘍重量は、いずれかの単一療法よりも有意に低かった。
【０４１１】
２．ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおける、単独での又はタキソテールとの併用による、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの活性
上述の研究におけるタキソテールと併用したＫＰＵ−２で得られたデータに基づいて、単独で用いた及びタキソテールと併用した、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンを比較する第２の研究を開始した。
【０４１２】
この研究の生存中の部分中で行われる観察により、ＫＰＵ−２又はＫＰＵ−３５のいずれかとタキソテールとの併用は、タキソテール単独よりも腫瘍成長を大きく減少させることが示される（図２２）。腫瘍成長は、タキソテールと併用したＫＰＵ−３５によりほぼ完全に阻止された。
【０４１３】
解剖時に切除された腫瘍重量により、研究の生存中の区分で行われた観察を確認した。ＫＰＵ−２（図２３）又はＫＰＵ−３５（図２４）のいずれかとタキソテールとの併用は、腫瘍成長を阻止する際に、タキソテール単独よりも有意に効果的であった。ＫＰＵ−３５の場合では、１０匹のうち３匹のマウスが、腫瘍の収縮に関する徴候を示した。腫瘍成長阻害指数は、ＫＰＵ−２において腫瘍成長の顕著な阻害（群平均＝７４．１％）、またＫＰＵ−３５においてほぼ全体の阻止（群平均＝９２．５％）を示した。タキソテール単独では、正の効果に関するＮＣＩで確立された基準（ＴＧＩ≧５８％）に達しなかった。
【０４１４】
５．ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍異種移植片モデルにおける研究
この研究は、ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍異種移植片モデルにおけるＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を比較した。化合物の用量は、１日目、２日目、３日目、４日目及び７日目に投与した。タキソテールは、１日目、３日目及び７日目に投与した。
【０４１５】
選択した新規化合物は、このモデルにおいてタキソテールと併用して使用する場合、初期段階で統計学的に有意な効果が見られ、推定腫瘍成長を明らかにほぼ完全に阻止する（図２５）。３つの化合物のうち、ＫＰＵ−２が最も効果的であるようであり、ｔ−ブチル−フェニラヒスチンにおいてもまた、タキソテールの有意な増強作用を示した。
【０４１６】
６．Ａ５４９ヒト非小細胞肺腫瘍異種移植片モデルにおける研究
この研究における生存中の観察（図２６）により、ＫＰＵ−２（７．５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑｄ×５）とタキソテールとの併用は、対照群又はいずれかの単一療法群と比較した場合に、腫瘍成長の顕著な阻害をもたらすことが示された。これは、解剖時の腫瘍重量により確認され、同時療法群の平均が、タキソテール単独又は対照群の平均よりも有意に低かった（図２７）。同時療法群の腫瘍重量は、低腫瘍重量のクラスターを形成し、効果の一貫性を示す。
【０４１７】
腫瘍成長指数を算出すると、同時療法群は、対照群と比較した場合に、正の効果に関するＮＣＩ基準（ＴＧＩ≧５８％）を十分に超過して、７４．４％のＴＧＩを示した。タキソテール単独は２６．１％のＴＧＩを示した。
【０４１８】
７．ＭＤＡ−２３１ヒト胸部腫瘍同所異種移植片モデルにおける研究
このモデルは、自然環境の代用であるマウス乳房脂肪体へのヒト腫瘍組織の配置を包含する。この様式では、皮下血管床における特定の作用に起因する正の効果の可能性が回避される。この研究は、単独で用いた及びパクリタキセル（１６ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑｄ×５）と併用した、ＫＰＵ−２（７．５ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ、ｑ３ｄ×５）の効果を比較した。
【０４１９】
研究の３週目に入って、併用療法群で、非常に有意な効果である腫瘍成長の有意な阻害が見られた。この効果は、タキソテール単独よりも顕著であるようであった（図２８）。
【０４２０】
８．マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０転移性腫瘍モデルにおける研究
この研究では、マウスへのＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の静脈内注射の１６日後に、肺の表面上に出現してくる転移の数に対する、単独で用いた及びパクリタキセルと併用した、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を試験した。このモデルは、異種移植片モデルではないが、腫瘍塊への高度な血管化は含まない。
【０４２１】
このモデルでは、最も有効な治療は、パクリタキセルにおける平均転移計数よりも約１０％低い平均転移計数を示すＫＰＵ−２単独であった（それぞれ、４１．６％及び３５．０％のＭＧＩ）（図２９）。この研究はそれ自体、併用療法が単一療法より有効であることを立証はしないものの、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンが、高度に血管化された腫瘍において最も有効であることを示す。
【実施例１０】
【０４２２】
病原性の真菌類に対する活性に関するアッセイ
デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体のＡＦ／ＩＳ値を決定する際に使用するための、上述の既知の抗真菌化合物に関する、病原性の真菌に対するデヒドロフェニラヒスチン又はその類似体の比較活性は、例えばDiagn Micro and Infect Diseases， 21: 129-133, (1995)に記載されているＮＣＣＬＳブロスマクロ希釈法のマイクロタイタープレートの適応により、真菌生物に対して直接測定される。抗真菌活性はまた、真菌感染の全動物モデルにおいて決定され得る。例えば、ムコール肺炎のステロイド処理されたマウスモデルを使用してもよい(ゴルダイル，Ｌ．Ｚ．とシュガー，Ａ．Ｍ．（Goldaill, L.Z. & Sugar, A.M.） 1994 J Antimicrob Chemother 33: 369-372)。実例として、このような研究では、多数の動物に、真菌の感染の前に、感染時に、又は感染後に始まって、それぞれ、デヒドロフェニラヒスチン若しくはその類似体が投与されないか、様々な用量のデヒドロフェニラヒスチン若しくはその類似体（及び／又は１つ以上の他の真菌剤との組合せ）が投与されるか、又は陽性対照（例えば、アンホテリシンＢ）が投与される。動物は、２４時間に１度、選択用量のデヒドロフェニラヒスチン若しくはその類似体、陽性対照、又は担体のみで処理してもよい。処理は、例えば最大１０日までの既定日数の間続けられる。動物は、処理期間後のある期間（例えば、合計３週間）観察され、死亡率を毎日評価する
。モデルは、感染しやすいヒト被験体を模倣するように設計された、他の処理（例えば、ステロイドによる処理）有り又は無しの、全身性、肺、膣及び他の感染モデルを包含し得る。
【０４２３】
さらに説明するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効力（例えば、デヒドロフェニラヒスチン又はその類似体（ｍｇ）／被験体（ｋｇ）で表されるＥＤ50）を決定する一方法は、げっ歯類モデル系である。例えば、マウスを、病原体の５０％致死用量のおよそ１０倍で、静脈内感染等により、真菌病原体に感染させる（例えば、１０6個のＣ．アルビカンス(C. Albicans)細胞／マウス）。真菌感染直後に、デヒドロフェニラヒスチン化合物を、既定投薬容量でマウスに投与する。ＥＤ50は、感染後２０日目に記録される生存率から、ファンデルウェーデン（Van der Waerden）の方法(Arch Exp Pathol Pharmakol 195: 389-412, 1940)により算出される。一般的に、未処理の対照動物は感染後７日〜１３日目に死亡する。
【０４２４】
別の例示的実施形態では、サブローデキストロース寒天（ＳＤＡ）斜面培地で２８℃で４８時間成長させたＣ．アルビカンス・ウィスコンシン(C. Albicans Wisconsin)（Ｃ４３）及びＣ．トロピカリス(C. tropicalis)（Ｃ１１２）を生理食塩水中に懸濁させて、分光光度計にて５５０ｎｍで透過率４６％に調節する。接種材料は、血球計によりさらに調節され、プレート計数により、およそ１又は５×１０7ＣＦＵ／ｍｌであることが確認される。ＣＦ−１マウスを、尾静脈への１又は５×１０6ＣＦＵの注射により感染させる。感染の４時間後に、及びその後３又は４日以上にわたって１日１回、エタノール：水（１０：９０）中の抗真菌剤を、静脈内又は皮下投与する。毎日、生存をモニタリングする。ＥＤ50は、マウスの５０％生存を可能にする用量と定義することができる。
【実施例１１】
【０４２５】
抗糸状菌（antimicotic）活性の評価
ベンズイミダゾール及びグリセオフルビンは、真菌微小管に結合することが可能な抗チューブリン剤である。いったん結合すると、これらの化合物は、感受性生物において細胞分裂及び細胞内輸送を妨害し、細胞死をもたらす。商業的に、ベンズイミダゾールは、獣医学用医薬及び植物疾病制御において殺菌剤として使用される。ボトリチス・シネレア(Botrytis cinerea)、ベアウベリア・バッシアナ(Beauveria bassiana)、ヘルミントスポリウム・ソラニ(Helminthosporium solani)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びアスペルギルス属(Aspergillus)を含む多種多様の真菌種は、これらの分子の影響をうけやすい。しかしながら、毒性の問題及び高まっていく薬物耐性は、それらの使用にマイナスの影響を与えている。グリセオフルビンは、白癬菌(Trichophyton)属種、小胞子菌(Microsporum)属種及びエピデルモフィトン・フルコッサム(Epidermophyton floccosum)により引き起こされる皮膚、毛髪及び爪の白癬感染を治療するために臨床的に使用される。しかしながら、その抗真菌範囲は、この種の真菌生物に制限される。遺伝毒性もまた大きな副作用である。テルビナフィンは、代替的な第一選択治療であるが、より費用がかかる。さらに、臨床耐性が、紅色白癬菌(Trichophyton rubrum)（すべての皮膚糸状菌感染における主な病原因子）で近年観察されている。
【０４２６】
カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)では、細胞が微小管阻害剤であるノコダゾール及びクロロプロファムに暴露される場合に、微小管／微小繊維形成が影響を受ける。これらの結果はさらに、有効な抗糸状菌剤として細胞骨格阻害剤の探索を確証する。したがって、本明細書中に開示する幾つかの化合物の抗糸状菌活性を評価した。
【０４２７】
具体的には、開示する化合物を、市販の微小管阻害剤並びに公認の抗真菌剤と一緒に評価した。この研究で使用する試験化合物及び対照として、（−）−フェニラヒスチン、ＫＰＵ−１、ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−１１及びＫＰＵ−１７、ＫＰＵ−３５、ｔ−ブチルフェ
ニラヒスチン、コルヒチン（３つのカンジダ属(Candida)単離菌に対して試験した市販の微小管阻害剤）、ベノミル（３つのカンジダ属(Candida)単離菌に対して試験した市販の微小管阻害剤）、グリセオフルビン（６つの皮膚糸状菌の単離菌に対する試験における市販の微小管阻害及び抗生物質対照(antibiotic control)）、アンホテリシンＢ（３つのカンジダ属(Candida)単離菌に対して試験するための抗生物質対照）、イトラコナゾール（２つのアスペルギルス属(Aspergillus)単離菌に対して試験するための抗生物質対照）が挙げられる。
【０４２８】
これらの化合物を試験した微生物には、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アスペルギルス・フミガーツス(Aspergillus
fumigatus)、紅色白癬菌(Trichophyton rubrum)、毛瘡白癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、エピデルモフィトン・フルコッサム(Epidermophyton floccosum)が含まれた。カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（１つの単離菌）を除いて、各種の２つの単離菌を試験した。
【０４２９】
抗真菌感受性試験は、臨床研究所規格委員会（National Committee for Clinical Laboratory Standards），Ｍ３８−Ａ「分生胞子形成糸状真菌のブロス希釈抗真菌感受性試験に関する参照方法：認証基準(Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidium-Forming Filamentous Fungi; Approved Standards)」に概要される方法に従って行った。これは、グルタミンを有し、且つ炭酸水素塩を有さないＲＰＭＩ−１６４０中での試験、接種材料サイズ０．４〜５×１０4及び３０又は３５℃で４８時間のインキュベーションを含む。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、薬物を含まない対照試験管と比較した場合に、混濁度の８０％の減少をもたらした最低濃度として定義した。薬物濃度は、研究化合物において０．０３〜１６μｇ／ｍｌ、イトラコナゾール及びグリセオフルビンにおいて０．０１５〜８μｇ／ｍｌであった。
【０４３０】
化合物が標的微生物の成長を阻害した際の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、ＮＣＣＬＳプロトコルの修正バージョンに従って評価した。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、最初の２４時間間隔で決定し、ここで薬物を含まない対照試験管において成長を測定することができる。定義したＭＩＣは、成長対照(growth control)と比較した場合に、混濁度の８０％の減少を示す最低濃度であった。最小致死濃度（ＭＬＣ）は、ＭＩＣ濃度及びＭＩＣを超える各濃度から０．１μｌを平板培養することにより決定した。ＭＬＣは、９９．９５％の死滅を示す真菌成長の５個以下のコロニーを示す最初の濃度で得られた。ＭＩＣが得られた場合、最小殺菌濃度（ＭＦＣ）を決定して、化合物の静真菌性／殺菌性を評価した。この手順は、薬物処理細胞試料（ＭＩＣ濃度で、及びＭＩＣを超えた濃度で化合物を含有する試験ウェルから取り出した）を、阻害濃度より有意に低い化合物濃度に希釈すること、及びそれら試料を寒天プレートに沈着させることとを伴う。化合物は、細胞が成長を再開させることが可能である場合に静真菌性としてスコア付けされ、また化合物が生物を死滅させてしまったために再成長が不可能である場合に殺真菌性としてスコア付けされた。
【０４３１】
本明細書中に開示する化合物は、２つの白癬菌(Trichophyton)属種に対して有効であることがわかった。紅色白癬菌(T. rubrum)は、ヒト皮膚糸状菌感染に関する根本的な病原因子であり、臨床剤の開発における注目すべき重要な生物であり得る。
【０４３２】
化合物ＫＰＵ−２、ＫＰＵ−１１及びＫＰＵ−１７、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチルフェニラヒスチンは、皮膚糸状菌感染を治療するのに使用される現在の標準的な薬剤であるグリセオフルビンと有効性において同等であったか、又は場合によってはそれよりも強力であった。
【０４３３】
化合物（−）−フェニラヒスチン及びＫＰＵ−１は、紅色白癬菌(T. rubrum)に対して
試験した場合、他の化合物よりも有意に強力ではなく、感受性毛瘡白癬菌(T. mentagrophytes)単離菌に対して試験した場合は、弱いが他のものと同程度であった。
【０４３４】
ＭＦＣを決定することができるこれらの場合では、結果は、これらの化合物が事実上静真菌性であることを示す（表１９及び表２０を参照）。
【０４３５】
【表１９】
2007520565.tif 000088
【０４３６】
【表２０】
2007520565.tif 000089
【実施例１２】
【０４３７】
［血管ターゲッティング活性の評価］
腫瘍及び腫瘍状態は、本明細書中に開示する化合物を使用して治療することができる。血管ターゲッティング剤（ＶＴＡ）による腫瘍における血液供給の閉塞は、腫瘍の退縮を誘導する。例えばＮＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５を含む本明細書中に開示する化合物はＶＴＡであり得る。多くのＶＴＡは、微小管上のコルヒチン結合部位で相互作用することにより、それらの血管効果を示す。この相互作用は、腫瘍における樹立血管系の特徴的な迅速な虚脱及び閉塞を誘導し、従って既存の血管の完全性をそこない、壊死を招く。
【０４３８】
血管虚脱は、例えばＶＴＡへの暴露の３０〜６０分内に起こり得て、腫瘍の中央部分における未熟且つ増殖中の内皮細胞の形状を変化させるが、静止状態で且つ成熟した内皮細胞の形状を変化させないことを包含する。血管細胞に対するこの差動効果は、正常な血管に対して腫瘍血管における増殖中の未熟内皮細胞のより高い割合に起因して、腫瘍に対する選択的効果に関する論理的根拠を提供する。ＶＴＡは、活性の３つの重複範囲に分類することができる：（１）強力な血管効果及び細胞毒性効果、（２）弱い細胞毒性効果を伴う強力な血管効果及び（３）弱い血管効果を伴う強力な細胞毒性効果。
【０４３９】
ＫＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５のｉｎ  ｖｉｖｏ血管ターゲッティング活性
動物モデルは、腫瘍誘導性血管新生を阻害し、樹立腫瘍血管系を標的とし、且つ腫瘍成長を阻害する新たな療法を研究するのに必須である。
【０４４０】
マウス同系「偽同所性」乳癌モデルを使用して、これらの問題に取り組んだ。トーレス・フィルホ他（Torres Filho et al.），Microvascular Research (1995) 49, 212-226（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。「偽同所性環境」を創出するために、背面皮下（skinflap：皮膚弁）房のカバーガラスを取りはずして、ドナーマウス由来の乳房脂肪体の小片を房へ移植した。脂肪体移植片の上に、ヒストン（Ｈ２Ｂ）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で形質導入したＮ２０２乳腺腫瘍細胞を含有する腫瘍スフェロイドを塗布した。Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ形質導入細胞の使用により、腫瘍成長を可視化し、且つ有糸分裂及びアポトーシスをモニタリングすることが可能となる。
【０４４１】
蛍光ビデオ顕微鏡により、意識のあるマウスにおける腫瘍微小循環の比較的非侵襲性の研究が可能となる。このモデルは、腫瘍血管系、腫瘍成長、有糸分裂及びアポトーシスに対する化合物の影響に関するデータを提供し、単独で用いて、又は他の治療薬と併用して、化合物の活性を検査するのに有用である。このモデルを利用すると、ＫＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５は、単回静脈内投与後に、中心壊死を導く迅速な血管虚脱及び樹立腫瘍の退縮を誘導することが示された。
【０４４２】
腫瘍成長の１２日目に、マウスを５ｍｇ／ｋｇ  ＫＰＵ−３５の２分注入、１０ｍｇ／ｋｇ  ＫＰＵ−０２の５分静脈内注入、又は賦形剤（水中の１０％ソルトール（ｗ／ｗ）＋２％ＤＭＳＯ）の急速な注入により静脈内処理した。１３日目に、１０ｍｇ／ｋｇ  ＫＰＵ−０２、ＫＰＵ−３５又は賦形剤の５分注入を施した。ＫＰＵ−０２又はＫＵＰ−３５による処理は、良好な耐容性を示した。マウスはさらに２日間観察した。腫瘍内及び腫瘍周囲の腫瘍面積、血流速度並びに血管密度を可視化した。実時間観察を、スチール写真及びビデオ顕微鏡を使用して様々な時点で記録した。
【０４４３】
この研究により、ＫＰＵ−０２又はＫＰＵ−３５のいずれかによる単回静脈内処理後に、中央血管系の迅速な虚脱が実証される。血管機能の変化は、脂肪体又は皮膚周囲における血管系に対して観察される影響を伴わずに、有意な中心腫瘍壊死をもたらした（図３０）。これらの観察は、ＫＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５の選択性及び特異性を支持し、これらはともに、個々に樹立腫瘍血管系を崩壊し得る。
【０４４４】
ヒト腫瘍異種移植片におけるＫＰＵ−０２のｉｎ  ｖｉｖｏ活性
ＫＰＵ−０２をＣＰＴ−１１（イリノテカン）、タキソテール又はパクリタキセルとともに投与する場合、ヒト結腸（ＨＴ−２９）、胸部（ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ２３１）及び肺（Ａ５４９）腫瘍異種移植片モデルにおいて、顕著な抗腫瘍活性が見られた（表２１）。ＨＴ−２９におけるＫＰＵ−０２の影響は強く、これらの研究で再現可能であり、用量依存性効果を示し、すなわち７．５ｍｇ／ｋｇが、２．５ｍｇ／ｋｇよりも統計上高かった（図３２、図３３）。
【０４４５】
ＨｕＶＥＣ細胞におけるＫＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
腫瘍血管系に対するＫＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５の上述のｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、ＨｕＶＥＣ細胞における同じ化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果により支持された。ヒト臍静脈内皮細胞は、「未熟体」とみなされる腫瘍内皮の良好なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルとみなされる。腫瘍内皮は、支持性血管壁細胞を欠如し、腫瘍血管系の完全性に関して微小管ネットワークにますます依存する。したがって、微小管ネットワークの崩壊は、血管虚脱を引き起こす。
【０４４６】
ＫＰＵ−０２は、ＨｕＶＥＣ細胞において迅速なチューブリン脱重合を誘導する。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＣＣ２５１９Ａ）を、ＥＧＭ−２(Cambrex)培地において集密以下（subconfluent）の密度で維持した。細胞をインキュベータ中で５％ＣＯ2及び９５％加湿空気中で３７℃にて培養した。チューブリン染色アッセイ用に、ＨｕＶＥＣ細胞を組織培養適合性カバーガラス(Fisher)上にＥＧＭ−２中３×１０4個の細胞／ｍｌの密度で播種した。プレートを２日間インキュベータへ戻した。
【０４４７】
試験化合物のストック（２０ｍＭ）溶液を１００％ＤＭＳＯ中で調製した。化合物の４００倍希釈物を１００％ＤＭＳＯ中で調製した。希釈物の５μｌ容量を個々のウェルへ添加して、２００ｎＭの最終濃度をもたらした。ＤＭＳＯの最終濃度は、サンプルすべてにおいて０．２５％であった。プレートを３０分間インキュベータに戻した。ＨｕＶＥＣ細胞を２００ｎＭ  ＫＰＵ−０２又はＫＰＵ−３５で３０分間処理した。
【０４４８】
細胞をｄＰＢＳ中ですすいだ後、１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン中で室温にて１０分間固定した。固定後、α−チューブリンを間接的な免疫蛍光により可視化した。具体的に、細胞を０．２％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００／ｄＰＢＳ中で１０分間透過処理した。細胞を洗浄した後、カバーガラスを加湿チャンバへ移して、カバーガラスを抗体緩衝液（２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０／ｄＰＢＳ）中で２時間ブロックした。カバーガラスを、抗体緩衝液中の０．１μｇ／ｍｌ  マウスα−チューブリン(Molecular Probes)５０μｌで１時間インキュベートした後、洗浄して、１μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＦＩＴＣ(Jackson ImmunoResearch Laboratories)５０μｌとともに暗所で１時間インキュベートした。最終的に、細胞を洗浄して、２μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ(Molecular Probes)で１０分間処理した後、Ｈ2Ｏですすいで、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ(Vector
Labs)封入培地を用いて鏡検用に封入した(mount)。正立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１）上の６０倍油浸漬対物レンズを使用して、細胞を画像化した。ＣＣＤカメラ及びＭａｇｎａｆｉｒｅ２．０ソフトウェア(Olympus)を使用して、画像をデジタル処理で捕獲した。後の画像処理は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ２．０(Adobe)及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｐｏｗｅｒｐｏｉｎｔで実施された。
【０４４９】
図３３は、ＫＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５が、ＨｕＶＥＣ細胞においてチューブリン脱重合を迅速に誘導することを示す。
【０４５０】
ＫＰＵ−０２は、ＨｕＶＥＣ細胞において容量依存性単層透過性を誘導する。
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨｕＶＥＣ、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＣＣ２５１９Ａ）を、ＥＧＭ−２(Cambrex)培地において集密以下の密度で維持した。細胞をインキュベータ中で５％ＣＯ2
及び９５％加湿空気中で３７℃にて培養した。単層透過性アッセイ用に、ＨｕＶＥＣ細胞を、２４ウェルプレートにおいてフィブロネクチンコーティングされた３．０μｍ  Ｆｌｕｏｒｏｂｌｏｋ挿入片(Becton Dickinson)上でＥＧＭ−２培地中１×１０5個の細胞／ｍｌで播種した。プレートを４日間インキュベータへ戻して、細胞を集密に到達させた。
【０４５１】
試験化合物のストック溶液（２０ｍＭ）を１００％ＤＭＳＯ中で調製した。化合物の１０倍濃縮された段階希釈物をＥＧＭ−２中で調製した。段階希釈物の１０μｌ容量を二連で試験挿入片へ添加して、２μＭ〜２ｎＭの範囲の最終濃度をもたらした。ＤＭＳＯの最終濃度は、サンプルすべてにおいて０．２５％であった。細胞を２ｎＭ〜２μＭ  ＫＰＵ−０２で１５分間処理した。
【０４５２】
ｄＰＢＳ中のＦＩＴＣ−デキストラン（５０ｍｇ／ｍｌ）（３８．２ｋＤａ、Sigma）をＥＧＭ−２中で２．５倍希釈して、ＦＩＴＣ−デキストラン１０μｌを各挿入片へ添加した。ＦＩＴＣ−デキストランの最終濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。プレートをインキュベータへ戻して、３０分後に、２４ウェルプレートの下方チャンバの蛍光を、Ｆｕｓｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ(Packard Bioscience)を使用して、λｅｘ＝４８５ｎｍ及びλｅｍ＝５３０ｎｍフィルタを用いて読取った。
【０４５３】
図３４は、ＫＰＵ−０２が、用量依存性様式で単層透過性を誘導することが可能であることを示す。図３４に示す結果は、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを表す。
【０４５４】
125Ｉ−ＩＡＰによるＰ２２ラット肉腫モデルにおける血流
腫瘍血流は、Ｐ２２ラット肉腫を保有するラットにおいて、定量的125Ｉ−ヨードアンチピリン（ＩＡＰ）技法を使用してモデル中で評価した。ＫＰＵ−０２（１５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）は、投与の１時間後に賦形剤の２３％まで、顕著に且つ選択的に腫瘍血流を低減させ、血流は、２４時間後に顕著に低減されたままであった（賦形剤の５９％）。対比して、非腫瘍組織における血流は、１時間ではかなり少ない程度で影響を受けた（図３５を参照）。
【０４５５】
投与後の２４時間での血流の低減は、図３６に示すように、賦形剤と比較してＫＰＵ−０２に関して、組織間でより変化しやすかった。腫瘍への血流は、最も影響を受けた。他の組織は、血流においてわずかな低減を示した。骨格筋血流は、投与後の２４時間で増大されるようであった。
【０４５６】
１時間で観察されるＫＰＵ−０２の影響は、同じ技法を使用してＣＡ４Ｐに関して過去に報告された影響よりも、より長期に続くようであり、且つ腫瘍血流に関してより選択的であるようだった。
【０４５７】
Ｐ２２ラット肉腫モデルを用いた実験では、ＫＰＵ−０２  ７．５及び１５ｍｇ／ｋｇ
ＩＰ（１用量当たりｎ＝２）は、投与後２４時間までに用量依存性腫瘍壊死をもたらし、最高用量は、図３７で示されるように腫瘍のほぼ完全な壊死をもたらすことが実証された。ＫＰＵ−０２処理ラットにおける腫瘍はすべて、壊死の徴候を示したのに対して、賦形剤処理したラットにおける腫瘍は示さなかった。診療所で扱われているＶＴＡ（例えば、ＣＡ４Ｐ、ＺＤ６１２６、ＡＶＥ８０６２）は、ＩＡＰ方法論（又は類似の技術）を使用して、腫瘍血液に対して類似の質的効果を示し、ｄｃｅ−ＭＲＩ技法を使用してＰ２２ラット肉腫腫瘍及びヒトにおいて血流の低減を実証した。スティーブンソンＪＰ（Stevenson JP），ローゼンＭ（Rosen M），サンＷ（Sun W），ガラファーＭ（Gallagher M），ハラーＤＧ（Haller DG），ヴァウンＤ（Vaughn D）他，「癌を有する患者への５日のスケジュールでの抗血管剤コンブレスタチンＡ４リン酸塩の第Ｉ相治験：変更された腫瘍血流に関する磁気共鳴画像証明(Phase I trial of the antivascular agent combretastati
n A4 phosphate on a 5-day schedule to patients with cancer: magnetic resonance imaging evidence for altered tumor blood flow」, J Clin Oncol 2003; 21(23):4428-38、エベルホックＪＬ（Evelhoch JL），ロルッソＰＭ（LoRusso PM），ヒーＺ（He Z），デルプロポストＺ（DelProposto Z），ポリンＬ（Polin L），コルベットＴＨ（Corbett TH）他，「血管ターゲッティング剤ＺＤ６１２６に対するマウス及びヒト腫瘍の応答の磁気共鳴画像測定(Magnetic resonance imaging measurements of the response of murine
and human tumors to the vascular-targeting agent ZD6126)」, Clin Cancer Res 2004; 10(11):3650-7、及びガドゲールＳＭ（Gadgeel SM），ロルッソＰＭ（LoRusso PM），オズニアクＡＪ（Wozniak AJ），ホィーラーＣ（Wheeler C.），「固形腫瘍を有する患者にける新規血管ターゲッティング剤であるＺＤ６１２６の用量段階的増大研究(A dose-escalation study of the novel vascular-targeting agent, ZD6126, in patients with solid tumors)」, Proc Am Soc Clin Oncol 2002; 21: アブストラクト438（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【０４５８】
微小管ターゲッティング剤との併用療法
ＶＴＡは、周辺に対して腫瘍の中央部分における血管系に選択的に損傷を与え、これが機能性を回復させるという見解は、ＶＥＧＦ及びＥＧＦに対する化学療法薬（タキソール、ビンブラスチン及びシスプラチン）、放射線療法並びに血管新生阻害剤と併用してこれらの作用物質を使用することを支持する。新たなＶＴＡは、これらの療法に取って代わるのではなく、これらの療法を補足し、より高い抗腫瘍活性を提供するはずである。
【０４５９】
他の状態（condition：症状）の治療
癌のほかに、他の疾患が、本明細書中に開示するＶＴＡを使用して治療され得る。状態としては、他の腫瘍、網膜症、及び血液供給、好ましくは生存可能な状態のままであり、且つ／又は増殖するための新たな血管系からの血液供給に依存する任意の他の状態又は疾患が挙げられる。
【０４６０】
多くの状態は、過剰又は不適切な血管系に関連する。過剰な血管系に関連する状態の例としては、免疫及び非免疫炎症、関節炎リウマチ、慢性関節炎リウマチ並びに乾癬のような炎症性障害；糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児の網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス、動脈硬化斑における毛細血管増殖、及び骨粗しょう症のような血管の不適切又は不適当な侵襲に関する障害；並びに例えば固形腫瘍、腫瘍転移、血行性腫瘍（例えば、白血病）、血管線維腫、カポージ肉腫、良性腫瘍（例えば、血管腫（hemangiomas）、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫）、並びに腫瘍成長を支持するのに血管形成を要する他の癌を含む癌関連障害が挙げられる。血管系依存性疾患のさらなる例としては、例えば、オースラー・ウェーバー症候群、心筋血管新生、斑新生血管形成、毛細血管拡張症、血友病性関節及び創傷肉芽形成が挙げられる。さらに、過剰な血管系はまた、生物学的及び機械的移植片（組織／臓器移植片、ステント等）の一部として臨床的な問題に関連する。本発明の化合物及び組成物は、血管系を標的とするのに、好ましくは非疾患組織血管系よりも優先的に疾患血管系を標的とするのに使用することができ、したがって、当該化合物及び組成物は、かかる状態の治療において使用することができる。血管形成が役割を果たし、且つ本発明の化合物及び組成物を使用することができる他の疾患は、当該技術分野で既知である。
【０４６１】
網膜症の例としては、加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）、糖尿病性網膜症等が挙げられる。病理学的血管新生は、先進国世界において集約して失明の主要原因である多数の網膜症に対する主要な寄与因子である。カーン（Kahn）及びヒーラー（Hiller），Am J Ophthalmol (1974) 78, 58-67（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。例えば、網膜及び円板新生血管形成は、２０年以上にわたって糖尿病性網膜症を有する患者の３０〜５０％に見られる。ヤンコ他（Yanko et al），Retina (2003) 23, 518-522（これは、
その全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、網膜下新生血管形成は、黄斑変性を有する患者のおよそ１０％における重症な合併症である。フェリス他（Ferris et al），Arch Ophthalmol (1984), 102, 1640-1642（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。
【０４６２】
血管ターゲッティング剤（例えば、コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ−４））は、非腫瘍性組織において新血管の崩壊を引き起こすことが示されている。グリックス他（Griggs
et al），Br J Cancer (2001) 84, 832-835（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。さらに、ＣＡ−４Ｐは、増殖性網膜症中に見られる網膜新生血管形成を阻害することが示された。グリックス他（Griggs et al），Am J Path (2002) 160, 1097-1103（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。最後に、ＣＡ−４Ｐリン酸塩は、ＶＥＧＦ誘導性網膜新生血管形成の発達を抑制し、脈絡膜新生血管形成の発達を阻害し、且つ／又はその部分的退縮を引き起こすことが実証された。ナンブ他（Nambu et
al），Invest Ophthalmology & Visual Sci (2003) 44, 3650-3655（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。本明細書に開示する化合物は、網膜症を治療するのに使用することができる。例えば、グリックス（２００１年及び２００２年）及びナンブの方法論は、網膜症を治療するのに使用される。さらに、本明細書中に開示する化合物及び組成物は、血管密度及び／又は血管増殖を低減するのに有効な量で、標的領域に化合物及び／又は組成物を塗布することによりかかる網膜症を治療するのに使用することができる。
【０４６３】
【表２１】
2007520565.tif 000090
【実施例１３】
【０４６４】
［構造活性相関］
ｔＢｕ−デヒドロＰＬＨのフェニル環に対する様々な修飾由来の活性の影響は、図３８におけるデータにより示される。ｍ又はｏ位での比較的疎水性の基及びより小さな官能基による置換は、ＨＴ−２９細胞で細胞毒性活性を増大又は維持したのに対して、ｐ位での
置換は活性を減少させたことが明らかである。任意の特定の理論に拘束されないが、このデータは、チューブリンによるフェニル環の厳密な認識を示唆する。
【０４６５】
３Ｄ−ＱＳＡＲ（ＣｏＭＦＡ）分析（図３９を参照）もまた、ｍ及びｏ位での立体的に好ましい領域の存在及びｐ位での立体的に好ましくない領域の存在を支持する。Ｘ線結晶解析（図４０を参照）は、強力な誘導体のコンホメーションは、フェニル環と、ＤＫＰ及びイミダゾール環により形成される擬似三環式コア（cor）鋳型との間にある一定量の二面角を要することを示唆する。したがって、フェニル環の適切なコンホメーション的制限による修飾は、強力な活性を誘発し得る。任意の特定の理論に拘束されないが、チューブリンのコルヒチン結合部位でのＰＬＨ誘導体の結合様式は、コルヒチン及びその既知の相同体の結合様式とは異なる可能性がある。
【実施例１４】
【０４６６】
［微小管に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用］
微小管タンパク質及びチューブリンの精製
微小管タンパク質（ＭＴＰ）は、これまでに記載されるように調製した（ファーレルＫＷ（Farrell KW）及びウィルソンＬ（Wilson L.）(1987)。チューブリン−コルヒチン複合体は、反対側の微小管末端を差示的にだめにする(Tubulin-colchicine complexes differentially poison opposite microtubule ends) Biochemistry 23(16):3741-8（これは、その全体が参照により本明細書に援用される））。７０％チューブリン及び３０％微小管関連タンパク質（ＭＴＰ）から構成されるＭＴＰ調製物は、ＰＥＭ１００（１００ｍＭ  １−４ピペラジンジエタンスルホン酸（Ｐｉｐｅｓ）、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ｐＨ６．８）及び１ｍＭ  ＧＴＰ中での温重合及び冷脱重合の３サイクルによりウシの脳から単離した。ＭＴＰは、液体窒素中に滴下凍結させて、使用するまで−７０℃で保管した。チューブリンは、ホスホセルロースクロマトグラフィにより微小管タンパク質から精製されて（ＰＣ−チューブリン）、ＰＥＭ（５０ｍＭ  Ｐｉｐｅｓ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、ｐＨ６．８）中で保管した。タンパク質濃度は、標準物質としてウシ血清アルブミンを使用して(Bradford, 1976)、ブラッドフォードアッセイ(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)により決定した。
【０４６７】
試験作用物質
ＫＰＵ−０２のストック溶液は、ＤＭＳＯ中で２０ｍＭの濃度で調製した。コンブレスタチンＡ４(National Cancer Institute, Bethesda, MD)（ＣＡ４）のストック溶液は、ＤＭＳＯ中で５ｍＭの濃度で調製した。コルヒチン(Sigma Chemicals, St. Loius, MO)（ＣＬＣ）は、水中で３ｍＭの濃度で調製した。作用物質はすべて、琥珀色のエッペンドルフチューブを用いて、周辺光から遮蔽した。段階希釈物は、ＤＭＳＯ及び／又はＰＥＭ５０中で所望の濃度になるまで作製された。
【０４６８】
定常状態微小管ポリマー質量の決定
ＭＴＰ（２ｍｇ／ｍｌ）は、１ｍＭ  ＧＴＰを含有するＰＥＭ１００中の一連の薬物濃度及び最終ＤＭＳＯ濃度０．５％の存在下で微小管へ重合させた。サンプルは、３７℃で７５分間、３５０ｎｍでの光散乱によりモニタリングした。
【０４６９】
重合反応物を遠心分離して、定常状態での可溶性チューブリンの尺度である上清中の微小管タンパク質の濃度、及び微小管ポリマーの尺度であるペレットを重合の阻害を算出するのに使用した。インキュベーション後、重合された微小管を遠心分離（１５０，０００×ｇ、４５分、３７℃）により、重合されていないＭＴＰから分離、沈降させた。上清を除去して、微小管ペレットを脱イオンＨ2Ｏ中で（２４時間、０℃）脱重合させた後、タンパク質をブラッドフォードアッセイにより決定した。
【０４７０】
阻害パーセントは、２つの方法で算出され、２つの方法から得られた値を比較した。１つの方法では、ペレット中の微小管タンパク質の比（非薬物に対する薬物）を算出した。上清に対するペレット中の微小管タンパク質の別の比（非薬物に対する薬物）もまた算出した。その数は、密接に一致して、前者の値がより小さな分散及び実験的摂動を受けるため、それらを使用した。
【０４７１】
微小管平均長分布
透過型電子顕微鏡法を使用して、試験作用物質の非存在下又は存在下での微小管の平均長分布を決定した。７５分で、且つ沈降に先立って、ポリマー質量実験からの１０μｌ分取量を、ＰＥＭ１００緩衝化０．２％グルタルデヒド２９０μｌへの希釈により固定した。固定されたサンプル３０μｌを、ｆｏｒｍｖａｒコーティングした１５０ＩＣＧメッシュ電子顕微鏡グリッド上へ９０秒間定着させた。過剰なサンプルは、Ｗｈａｔｍａｎフィルタ紙で拭い取った。シトクロムＣ３０μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）を３０秒間塗布して、プロトフィラメント解像度を増強させて、ネガティブ染色を促進した。酢酸ウラニル（１．５％）を２０秒間塗布して、過剰分を拭い取った。グリッドをＪｅｏｌ電子顕微鏡１２００
ＥＸ１１において２０００倍及び３０，０００倍の倍率で観察した。Ｚｅｉｓｓ  ＭＯＰＩＩＩを使用して、サンプル１つ当たり少なくとも１００個の微小管に関して微小管長分布及び平均長を決定した。
【０４７２】
ＣＬＣ競合アッセイ
ＰＣ−チューブリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、ＰＥＭ５０中で１ｍＭ  ＧＴＰ、１％ＤＭＳＯ、試験作用物質１０μＭ及び７〜２５μＭ［3Ｈ］ＣＬＣとともに３７℃で１２０分間インキュベートした。［3Ｈ］ＣＬＣ結合の測定に続いて、これまでに記載されるように(ウィルソン（Wilson），1970)、ＤＥＡＥ−セルロースフィルタ結合アッセイを行った。この方法は、ＤＥＡＥ−セルロースを含浸させたフィルタ紙へのチューブリンの吸着に依存する。Ｗｈａｔｍａｎ  ＤＥ８１フィルタ紙は、サンプル塗布に先立ってＰＥＭ５０で予め湿潤させた。総１００μｌ反応容量を、氷上のパラフィルム上で２．５ｃｍ円板のフィルタ紙へ適用した。紙円板は、ＰＥＭ５０  ５０ｍｌを５回連続して交換して、５分／洗浄、４℃で浸漬により洗浄して、未結合のコルヒチンすべてを除去した。続いて、チューブリン結合コルヒチンが付着している紙円板を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ
Ｒｅａｄｙタンパク質溶液(Fullerton, CA)２ｍｌを含有するシンチレーションバイアル中で直接計数した。円板すべてを一緒に洗浄した。紙円板への未結合のＣＬＣの無視し得る結合は、チューブリンの存在又は非存在下のいずれかで、対照中で見られた。
【０４７３】
Ｋi値は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおける実験データの二重逆数プロットの直線回帰により算出した。実験条件下でのＣＬＣに関するチューブリンのＫm値がまず決定され、ｘは、−１／Ｋmに等しい切片である。薬物の存在下でのＫm app、Ｋmは、実験的に決定した。Ｋiは、Ｋm app＝α  Ｋmという関係を使用して、競合阻害α＝Ｋm（１＋［Ｉ］／Ｋi）に関して決定した。
【０４７４】
蛍光分光法
蛍光測定は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＬＳ５０Ｂ蛍光分光光度計を使用して実施した。ＰＣ−チューブリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＥＭ５０、２ｍＭ  ＧＴＰ、３％ＤＭＳＯ中で、０〜３０μＭ  ＫＰＵ−０２とともにインキュベートした。ＫＰＵ−０２とチューブリンとの相互作用は、４，４’−ジアニリノ−１，１’−ビナフチル−５，５’−ジスルホン酸、二カリウム塩（ビスＡＮＳ、Molecular Probes, Eugene, OR)蛍光により、３９５ｎｍの励起波長及び４８７ｎｍの発光波長最大値が報告された。励起帯域及び発光帯域は１０ｎｍであった。この実験は２度実施した。
【０４７５】
ビス−ＡＮＳフルオロフォアは、タンパク質の疎水性表面を探索して、ビス−ＡＮＳ蛍
光シグナルの強度の変化は、タンパク質の溶媒接近可能な表面積の変化の結果である。リガンド結合時にチューブリン−ビス−ＡＮＳ相互作用を変化させるいくらかのコンホメーション変化が存在する場合、ビス−ＡＮＳは、結合を報告するのに使用することができる。
【０４７６】
ＰＣ−チューブリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）は、０〜３０μＭ  ＫＰＵ−０２とともに、２５℃で２０分間インキュベートした。続いて、ビス−ＡＮＳ（２５μＭ）を添加して、サンプルの相対蛍光強度を２５℃で１５分以内に測定した。緩衝液ブランクスペクトルを収集して、ＫＰＵ−０２＋ビス−ＡＮＳが、実験波長範囲において無視し得る蛍光を生じることが示された。
【０４７７】
Ｋdは、方程式Ｆ＝（（−Ｆmax×Ｌ）／（Ｋd＋Ｌ））＋Ｆ0（式中、Ｆは、総リガンド濃度Ｌの存在下でのビス−ＡＮＳ−チューブリンの蛍光強度であり、Ｆmaxは、完全にリガンドされたチューブリンのビス−ＡＮＳ蛍光強度であり、Ｆ0は、薬物の非存在下でのビス−ＡＮＳ蛍光である）を使用して、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌにおいて実験データを適合させることにより決定した。Ｆmaxは、１／Ｌに対して１／（Ｆ0−Ｆ）をプロットすること、及び１／Ｌ＝０へ外挿することにより決定した。ＫＰＵ−０２により占有される結合部位Ｂの割合は、以下の関係：Ｂ＝（Ｆ0−Ｆ）／（Ｆ0−Ｆmax）を使用して決定した。遊離リガンドの濃度は、チューブリン二量体１つにつき単一の結合部位と仮定すると、Ｌｆｒｅｅ＝Ｌ−Ｂ［Ｃ］（式中、［Ｃ］は、リガンド結合部位のモル濃度である）を用いて決定した。
【０４７８】
ＫＰＵ−０２による微小管重合の阻害
ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで無細胞系においてＭＡＰリッチなチューブリン（ＭＴＰ）（２ｍｇ／ｍｌ）の重合を変更させるその能力に関してアッセイした。最初に、重合の阻害を、ホスホセルロース精製した微小管関連タンパク質を含まないチューブリンを使用してアッセイした（データは示さず）。ＫＰＵ−０２は、チューブリンとともに同時精製するＭＡＰの存在下で構築されるＭＴと比較した場合、グリセロール及びＤＭＳＯシードとともに構築されるＭＴに対してより強力な阻害剤であった。安定化ＭＡＰの非存在下での微小管ポリマーは、２時間にわたって定常状態に到達しなかったが、これらのアッセイにより、ＫＰＵ−０２は、精製チューブリンと直接相互作用すること、及びＫＰＵ−０２は、ＭＡＰを通じてその主な効果を発揮しないことが実証された。
【０４７９】
ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、光散乱（図４４）及び沈降分析（図４５）により測定される場合、ＣＬＣよりも強力にＭＴ重合を阻害した。ＭＴＰ（２ｍｇ／ｍｌ）は、一連の薬物濃度の存在下で微小管へ重合されて、３５０ｎｍでの光散乱によりモニタリングされる場合に定常状態に到達することが可能であった。図４１は、ＤＭＳＯ薬物賦形剤（白菱形）、１．２５μＭ（白四角）、２．５μＭ（−）及び５μＭ（白丸）のＮＰＩ−２３５８（ａ）、ＣＡ４（ｂ）並びにＣＬＣ（ｃ）の存在下での微小管タンパク質重合の濁度スペクトルを表す。ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、同等の有効性でＭＴ重合を阻害した。図４５は、一連のＫＰＵ−０２（白丸）、ＣＡ４（白四角）及びコルヒチン（白菱形）濃度の非存在又は存在下での微小管重合の阻害を表す。７５分の構築後の総ポリマー質量は、沈降により決定した。エラーバーは、３回の実験からの標準偏差値である。重合が５０％阻害された濃度（ＩＣ50）は、ＫＰＵ−０２に関して２．４±０．４μＭ、ＣＡ４に関して２．２±０．３μＭ、及びＣＬＣに関して７．６±２．４μＭである（表２２）。（統計学的解析により得られる分散は、別記しない限り、標準偏差値として報告される）。ＭＡＰリッチなチューブリンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの重合に関してＩＣ50を上回る濃度で、ＭＴＰは凝集動態を示し、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４が、タンパク質を隔離して、微小管構築を防止することを示唆する。
【０４８０】
【表２２】
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【０４８１】
図４４に示されるように、試験した作用物質の３つすべてが、１．２５〜５μＭで、微小管重合の程度の濃度依存性阻害をもたらした。スペクトル間で留意すべき２つの重要な差が存在する。第１に、経時的な吸光度の増大の初速度は、薬物濃度を増大させるとともに減少する（図４４Ａ及び図４４Ｂ）。スペクトルは、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４の存在下でのＭＴ形成に関する遅延期間が存在することを示す。チューブリンの可溶性構築適格性プールを著しく且つ迅速に低減させる薬物は、重合の初速度を減少させる。対比して、重合の初速度は、ＣＬＣのすべての濃度で不変である（図４４Ｃ）。第２に、ＫＰＵ−０２又はＣＡ４の存在下でのＭＴＰは、時間とともに直線的に増大する吸光度値により示されるように、高濃度（５μＭ以上）で定常状態に到達しない（図４４Ａ及び図４４Ｂ）。対比して、ＣＬＣの存在下でのＭＴＰは、高薬物濃度で定常状態に到達する（図４４Ｃ）。
【０４８２】
重合を５０％分阻害するのに要される薬物の量（ＩＣ50）は、遠心分離により沈降される微小管ポリマーの減少と、薬物濃度の増加との間の直線関係の分析から決定した（図４５）。図４５におけるエラーバーは、少なくとも３回の独立した実験からの標準偏差値を表す。
【０４８３】
透過型電子顕微鏡法により測定される平均微小管長の減少
透過型電子顕微鏡法は、定常状態で形成されるポリマーについて記載するために、及び光散乱スペクトルから導かれる結論を評価するために、作用物質−微小管重合反応で実施した。ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣはすべて、定常状態で形成される微小管の長さを減少させた。ＭＴは、薬物濃度を増大させるとともに次第に短くなった（図４６、図４７及び図４８）。図４６は、（Ａ）ＫＰＵ−０２、（Ｂ）ＣＡ４及び（Ｃ）ＣＬＣの存在下での定常状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの平均微小管長の度数ヒストグラムを表す。Ｚｅｉｓｓ  ＭＯＰＩＩＩを使用して、微小管長分布及び平均長を決定した。１つの薬物濃度当たり少なくとも１００個の微小管を計数した。図４７は、試験化合物の非存在又は存在下で微小管を記録するのに使用される電子顕微鏡法を表す。７５分で、ポリマー質量実験からのサンプルを固定及び染色して、Ｊｅｏｌ電子顕微鏡−１２００  ＥＸ１１において２
０００倍の倍率で観察した。（Ａ）ＫＰＵ−２、（ｂ）ＣＡ４及び（Ｃ）ＣＬＣの存在下で定常状態でｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるＭＡＰリッチな微小管の代表的な電子顕微鏡写真。スケールバーは１０μＭ。図４８は、ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びコルヒチンの存在下での定常状態でのＭＴ長減少のグラフ的概要を表す。黒い棒は１．２５μＭ、斜線を施した棒は２．５μＭ。ＫＰＵ−０２及びＣＡ４の存在下では、ＭＴは、ＭＴＰが濁度により検出されるような凝集動態を示し、且つＭＴが観察されなくなる薬物濃度まで、薬物濃度を増大させるとともに次第に短くなる。エラーバーは、少なくとも１００個の微小管の測定からの標準偏差値である。
【０４８４】
ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣは、ＭＴ核形成に影響を及ぼさなかった。重合反応で形成される無数の短い微小管は、ＫＰＵ−０２、ＣＡ４又はＣＬＣの存在が核形成に影響を及ぼさないことを明示している。核形成が影響を受けた場合は、無数のより短い微小管とは対照的に、数少ないより長い微小管が、対照サンプルに対して薬物処理サンプルで観察されている。
【０４８５】
ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、平均ＭＴ長を減少させることにおいて同等に強力であった。電子顕微鏡法により分析される最低薬物濃度である１．２５μＭでは、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、平均ＭＴ長をおよそ７０％分減少させ、ＣＬＣは、４０％分減少させた（図４８）。
【０４８６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの微小管重合に関してＩＣ50を超える薬物濃度では、微小管は、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４に関して電子顕微鏡法により観察されない。対比して、微小管は、アッセイしたＣＬＣ濃度すべてに関して電子顕微鏡法により観察された。ＩＣ50を超える薬物濃度では、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４の存在下での微小管タンパク質は、経時的な光吸光度の線形増大を特徴とする凝集動態を示す（図４４Ａ及び図４４Ｂ）のに対して、ＣＬＣの存在下では、光散乱ポリマーは、定常状態に到達する（図４４Ｃ）。ＫＰＵ−０２又はＣＡ４を用いたＭＴＰが経時的に３５０ｎｍで吸光度を増大するという観察にもかかわらず、薬物特異的タンパク質凝集体は観察されなかった。
【０４８７】
蛍光分光法
チューブリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）は、ＰＥＭ５０、２ｍＭ  ＧＴＰ中で、２５℃、２０分間、一連の濃度のＫＰＵ−０２とともにインキュベートした。ＫＰＵ−０２は、濃度依存性様式でビスＡＮＳ蛍光を消光した（図４９Ａ）。最大発光でのビス−ＡＮＳ蛍光強度の非直線回帰分析により測定される場合、ＫＰＵ−０２及びチューブリンに関して、Ｋd＝１０±１．６μＭ（標準誤差）である（図４９Ｂ）。結合データの二重逆数プロットは、チューブリン二量体１つにつきＫＰＵ−０２の単一の結合部位と仮定すると、６．４μＭの解離定数をもたらした（図４９Ｃ）。非直線及び直線回帰分析方法により得られる２つの異なるＫd値は、十分密接であり、値はほぼ等価であるとみなした。図４９Ａは、増大するＫＰＵ−０２の存在下でのチューブリンの蛍光発光スペクトルを表す。薬物結合は、ビス−ＡＮＳ蛍光の消光をもたらす。図４９Ｂは、ＫＰＵ−０２  １０μＭに関するチューブリンのＫdを獲得するのに適した４８７ｎｍでの蛍光発光最大値を表す（標準偏差１．６μＭ）。挿入図は未処理である。図４９Ｃは、薬物１モル／チューブリン二量体（モル）と仮定して、結合データの二重逆数変換を表す。
【０４８８】
ＣＬＣ結合の競合阻害
ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、チューブリンに対するＣＬＣ結合を競合的に阻害した（図５０）。図５０は、阻害アッセイの結果を表し、ここではホスホセルロース精製したチューブリン（０．２ｍｇ／ｍｌ）を、ＫＰＵ−０２又はＣＡ４の非存在下（白菱形）、或いは１０μＭ  ＫＰＵ−０２（白丸）又は１０μＭ  ＣＡ４（白四角）存在下での様々な濃度の［3Ｈ］ＣＬＣとともにインキュベートした。チューブリン−ＣＬＣのＫmは、１１±
４．４μＭであり、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４に関する阻害定数は、それぞれ３．２±１．７μＭ及び２．４±０．３μＭであった。定数は、３回の独立した実験から算出した。コルヒチン−チューブリン結合反応は、時間及び温度依存性であり、結合解離定数は、アッセイの条件に依存して、Ｋd＝０．１〜１μＭである(ウィルソンＬ及びメザＩ（Meza I.）(1973)，コルヒチンの作用メカニズム。キタムラサキウニ精子尾部外側二重チューブリンのコルヒチン結合特性(The mechanism of action of colchicine. Colchicine binding
properties of sea urchin sperm tail outer doublet tubulin) Journal of Cell Biology 58(3):709-19（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）。試験条件下で、ＣＬＣに関するチューブリンのＫmは、１１±４．４μＭである。Ｋmは、ＣＬＣに関するチューブリンの全Ｋdとみなされ得るが、ＣＬＣ結合の時間依存性に起因して、Ｋmは、Ｋdに関して報告される値よりも大きい。ＫＰＵ−０２及びＣＡ４に関するＫiは、それぞれ３．２±１．７μＭ及び２．４±０．３μＭであった。Ｋiは、ＣＬＣ結合を５０％分阻害するのに要される薬物の量として定義され、Ｋiは、チューブリンに結合される放射性ＣＬＣの量に基づく。Ｋiは、ＣＬＣと競合する薬物の能力の尺度であり、Ｋiは、結合親和性が報告される方法のため、薬物−チューブリン結合解離の直接的な尺度ではない。
【０４８９】
結果
アッセイしたＣＬＣのすべての濃度で、ＭＡＰリッチなチューブリンは、定常状態に到達した。対比して、より高いＫＰＵ−０２又はＣＡ４薬物濃度では、ＭＡＰリッチなチューブリンは、定常状態へと重合せず、微小管は、電子顕微鏡法により観察されなかった。ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、利用可能なチューブリンの濃度を有効に減少させた。可溶性チューブリンのプールのこの減少は、ＭＴ臨界濃度を増大させて、重合を防止した。ｉｎ
ｖｉｔｒｏポリマー質量を減少させるのに要されるＫＰＵ−０２及びＣＡ４の化学量論量は、微小管タンパク質が、その濃度以上では定常状態に到達しないというデータと結び付き、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、可溶性チューブリンが結合され、且つ重合を防止される隔離メカニズムにより作用することを示唆した。
【０４９０】
定常状態での電子顕微鏡法による観察、すなわち試験作用物質の存在下で形成されるＭＡＰリッチな微小管は、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４がチューブリンを隔離するという提唱メカニズムと一致した。ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣの存在下で、平均微小管長の濃度依存的減少が見られた。ＫＰＵ−０２及びＣＡ４の存在下では、重合の初速度の薬物濃度依存的減少が見られ、これらの薬物は、伸長に利用可能なチューブリンを低減させることを示した。初期重合速度のこの減少は、ＣＬＣを用いた場合では、チューブリンとのそのゆっくりとした会合に起因して見られなかった。さらに、微小管は、重合に関してＣＬＣのＩＣ50を超えるＣＬＣ濃度で形成されたが、微小管は、重合に関してＫＰＵ−０２又はＣＡ４のＩＣ50を超えるＫＰＵ−０２又はＣＡ４濃度では形成されなかった。任意の特定の理論に拘束されないが、ＫＰＵ−０２又はＣＡ４により結合される可溶性チューブリンの濃度は、チューブリン重合が進行するのに要される臨界濃度以下でなくてはならない。
【０４９１】
結合研究により、チューブリンが、ＣＬＣよりもＫＰＵ−０２に対してより低い親和性を有することが示された。ＫＰＵ−０２及びＣＡ４によるチューブリンへのＣＬＣ結合の阻害は、２０分のインキュベーション期間内に起こり、チューブリンとのＫＰＵ−０２及びＣＡ４の会合が、ＣＬＣよりも比較的速く平衡へ近づくことを示した（データは示さず）。ＫＰＵ−０２は、フェニラヒスチン（ハリミド）を特徴付ける研究（カノウＫ（Kanoh K），コウノＳ（Kohno S），カタカＪ（Kataka J），タカハシＪ（Takahashi J）及びウノＩ（Uno I.），(1999)，（−）−フェニラヒスチンは、チューブリン重合を阻害することにより、有糸分裂時の細胞を停止させる((-)-Phenylahistin arrests cells in mitosis by inhibiting tubulin polymerization). The Journal of Antibiotics 52(2): 134-141（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）と一致して、ＣＬＣ結合部
位と重複する部位で、チューブリンへのＣＬＣ結合を競合的に阻害した。ＣＬＣの構造類似体であるＣＡ４もまた、ＣＬＣ結合を競合的に阻害した。任意の特定の理論に拘束されないが、チューブリン結合領域をＣＬＣと共有するにもかかわらず、ＫＰＵ−０２及びＣＡ４は、ＣＬＣとは異なったメカニズムにより、チューブリンと相互作用し、微小管を阻害するようである。
【実施例１５】
【０４９２】
［微小管に対するｉｎ  ｖｉｖｏ作用］
細胞培養研究
ＧＦＰ−α−チューブリン(Clontech, Palo Alto, CA)で安定にトランスフェクトしたＭＣＦ７ヒト乳癌細胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)を、２５０ｍｌ組織培養フラスコ又は３５ｍｍ  ６ウェルプレートにおいて、５％ウシ胎児血清、０．１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び非必須アミノ酸を補充したダルベッコ改変イーグル培地(Sigma)中で（倍加時間、２９時間）、３７℃で５％ＣＯ2にて培養した。元の培地を、所要濃度の試験作用物質又はＤＭＳＯ賦形剤を含有する等量の培地と取り替えることにより、実施例１４で記載されるように調製されるＫＰＵ−０２、ＣＡ４又はＣＬＣとともに細胞をインキュベートして、インキュベーションを３７℃で２０時間続けた。
【０４９３】
有糸分裂の進行
所定の薬物濃度での有糸分裂時の細胞の割合（分裂指数）は、乳癌細胞系ＭＣＦ７において決定した。細胞を６ウェルプレート中で３×１０4個の細胞／ｍｌの密度で平板培養した。２４時間後、細胞を、薬物の非存在又は非存在下で、一連の濃度範囲にわたって（１ｎＭ〜１μＭ）２０時間インキュベートした。培地を収集して、細胞をヴェルセン（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＫＨ2ＰＯ4、８．１ｍＭ  Ｎａ2ＰＯ4及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）ですすいで、トリプシンで剥離させて、培地を添加し戻して、浮遊中且つ結合されにくい分裂細胞が確実に分析に含まれるようにした。細胞をＰＢＳ中の１０％ホルマリンで、３７℃で一晩固定し、メタノール中で１０分間透過処理して、４，６−ジアミジノ−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色して、核を可視化させた。染色した細胞をＶｅｃｔａｓｈｉｌｅｄ封入培地(Burlingame, CA)中でカバーガラス上へ展着させて、ネイルエナメルでスライド上に密封した。蛍光顕微鏡法を使用して、分裂指数を決定した。結果は、４〜７回の実験の平均値及び標準偏差であり、実験では、各濃度に関して３００個の細胞を計数した。ＩＣ50は、２０時間で最大分裂蓄積の５０％を実験的に誘導する薬物濃度であった。
【０４９４】
免疫蛍光顕微鏡法
細胞は有糸分裂進行に関する場合と同様に調製したが、但し、細胞は、ポリ−Ｌ−リシン（５０μｇ／ｍｌ、Sigma)処理したカバーガラス上へ播種した。染色の当日、細胞をＰＢＳ中ですすいで、１０％ホルマリンで３７℃で一晩固定した。細胞をＰＢＳ中ですすいで、−２０℃にてメタノール中で透過処理して、ＰＢＳで水和させた。カバーガラスを、ＰＢＳ／ＢＳＡ（１％）中の２０％正常ヤギ血清で、室温で１時間処理した。細胞を、ＰＢＳ／ＢＳＡ中で希釈した抗α−及びβ−チューブリンのマウスモノクローナルカクテルであるＤＭ１Ａ／ＤＭ１Ｂ中で、室温で１時間インキュベートした後、ＦＩＴＣ結合二次抗体及びＤＡＰＩで染色した。カバーガラスを、Ｐｒｏｌｏｎｇ  ａｎｔｉｆａｄｅ培地(Molecular Probes, Eugene OR)を使用して取り付けた。
【０４９５】
微小管動態の分析用の細胞の調製
細胞は有糸分裂進行に関する場合と同様に調製したが、但し、細胞展着を促進するために、細胞は、ポリ−Ｌ−リシン（５０μｇ／ｍｌ、Sigma)で２時間、続いてラミニン及びフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ、Sigma)で３７℃で１時間前処理したカバーガラス上へ播種した。細胞は、薬物又はＤＭＳＯとともに２０時間インキュベートして、血清飢餓
にした。分析前に、カバーガラスを記録培地（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳで緩衝され、且つ３．５ｇ／Ｌショ糖を補充した、フェノールレッド及び炭酸水素ナトリウムを欠如する培養培地）へ移した。光退色を防止するために、Ｏｘｙｒａｓｅ（３０μｌ／ｍｌ、Oxyrase Inc, Mansfield, OH）を記録培地へ添加した直後に、二重カバーガラス密閉チャンバに細胞を密封した。
【０４９６】
経時的顕微鏡法及び画像獲得
微小管は、Ｐｌａｎ  ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  １．４Ｎ．Ａ．×１００対物レンズを用いて、Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００蛍光顕微鏡を使用して観察した。ステージは、Ｐｙｒｅｘボックス中に密閉して、強制空気加熱系により３６±１℃で維持した。各細胞の３０枚の画像を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア(Universal Imaging, Media, PA)により駆動されるＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＨＱデジタルカメラ(Tucson, AZ)を使用して、１０ＭＨｚで、３００ｍｓ露光時間、増幅率２及び輝度を増強するために２×２ビニングを用いて、４秒間隔で獲得した。
【０４９７】
微小管動態の分析
経時的な微小管のプラス末端の位置は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌにエクスポートされたＭｅｔａｍｏｒｐｈ  Ｔｒａｃｋ  Ｐｏｉｎｔｓアプリケーションを使用して追跡されて、Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  Ｍｅｓｕｒｅｍｅｎｔソフトウェアを使用して解析された。個々の微小管の長さは、時間の関数としてグラフ化された。個々の成長及び短縮速度は、直線回帰により決定した。２つのポイント間での０．５μｍ以上の変化は、成長又は短縮事象とみなされ、２つのポイント間での０．５μｍ未満の変化は、減衰された動態又は中断の期間であるとみなされた。各条件に関して、少なくとも２５個の微小管を分析した。結果は、少なくとも３回の独立した実験の平均値及び標準偏差である。
【０４９８】
各微小管に関する時間ベースのカタストロフィ度数は、微小管１つ当たりのカタストロフィ数を、成長又は減衰中に費やされる時間で除算することにより算出された。微小管１つ当たりの時間ベースのレスキュー度数は、微小管１つ当たりのレスキューの総数を、短縮に費やされる時間で除算することにより算出された。距離ベースのカタストロフィ及びレスキュー度数は、それぞれ、移行(transition)数を、成長又は短縮された長さで除算することにより同様に算出された。２分以下の間、目に見えた微小管は、度数分析に含まれた。微小管１つ当たりの動態は、微小管の総寿命で除算された、成長及び短縮された長さとして算出された。０．３分間以上目に見えた微小管は、動態分析に含まれた。
【０４９９】
前中期で阻止された細胞周期進行
細胞が有糸分裂時に蓄積するＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣに関する濃度範囲を決定した。２０時間後、細胞の６０〜７０％は、ビンカアルカロイド及び２−メトキシエストラジオールのようなＭＴ脱重合剤、並びにタキソール、エポチロンＢ及びディスコデルモライドのようなＭＴ安定剤に関する研究(ジョルダンＭＡ（Jordan MA）(2002)，微小管及びチューブリンと相互作用する抗腫瘍薬物の作用のメカニズム(Mechanism of action of antitumor drugs that interact with microtubules and tubulin). Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents 2: 1-17（これは、その全体が参照により本明細書に援用される）におけるに中期での細胞の３０〜４０％と比較して、前中期で阻害された。５０％最大分裂阻止に必要な薬物濃度（ＩＣ50）は、１ｎＭ〜１μＭの薬物で評価した（図５１）。図５１は、ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣによる有糸分裂進行阻害に関するｌｏｇ［薬物］応答曲線を表す。ＭＣＦ７細胞を、ＮＰＩ−２３５８（白丸）、ＣＡ４（白四角）及びコルヒチン（白菱形）の存在下で培養した。分裂指数を評価するために、ＭＣＦ７細胞を６ウェルプレート中で３×１０4個の細胞／ｍｌの密度で平板培養した。２４時間後、細胞を、薬物の非存在又は非存在下で、一連の濃度範囲にわたって（１ｎＭ〜１μＭ）２０時間インキュベートした。細胞を固定して、ＤＡＰＩで染色して、核を可視化さ
せた。蛍光顕微鏡法を使用して、分裂指数を決定した。結果は、３又は４回の実験の平均値及び標準偏差であり、実験では、各薬物濃度に関して３００個の細胞を計数した。ＫＰＵ−０２に関する分裂阻止ＩＣ50は、１７．４±１．２ｎＭであり、ＣＡ４に関する分裂阻止ＩＣ50は、５．４±０．７ｎＭであり、ＣＬＣに関する分裂阻止ＩＣ50は、２３．８±３．１ｎＭであった（表２３）。
【０５００】
【表２３】
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【０５０１】
ほとんどのＭＴターゲティング作用物質は、中期から後期への移行で有糸分裂を阻止する。中期から後期への移行での分裂阻止は、ＭＴ動態の抑制と関連する。任意の特定の理論に拘束されないが、より早期の前中期阻止は、ＭＴポリマーの枯渇とともに、低濃度でＭＴ動態を安定化する他の脱重合薬物（例えば、ビンブラスチン）と比較した場合、ＫＰＵ−０２に関して作用の異なったメカニズムを示唆する。
【０５０２】
紡錘体及び間期アレイＭＴの脱重合
ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣは、ＭＣＦ７細胞において強力な微小管脱重合剤であることが観察された。紡錘体微小管は、間期アレイ微小管よりも脱重合及び／又は重合の阻害の影響を受けやすいが、両方の微小管集団が影響を受けた（図５２）。図５２は、ＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡法画像を表す。間期アレイは、紡錘体よりもＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣによる脱重合に対して比較的安定である。細胞は、分裂進行に関する場合と同様に調製及び播種して、各薬物に関して分裂阻止ＩＣ50で２０時間処理した。細胞を、抗α−及びβ−チューブリンのマウスモノクローナルカクテルであるＤＭ１Ａ／ＤＭ１Ｂ中でインキュベートした後、ＦＩＴＣ結合二次抗体及びＤＡＰＩで染色した。ａ〜ｄ，対照（ａ）、ＫＰＵ−０２（ｂ）、ＣＡ４（ｃ）及びＣＬＣ（ｄ）処理した細胞におけるチューブリン、及びｅ〜ｈ，対照（ａ）、ＫＰＵ−０２（ｆ）、ＣＡ４（ｇ）及びＣＬＣ（ｈ）処理した細胞におけるＤＮＡ。細矢印は、紡錘体ポリマー及び有糸分裂期染色体を示し、太矢印は、間期アレイ及び核を示す。
【０５０３】
分裂阻止に関するＩＣ25で、ＫＰＵ−０２は、紡錘体形態を劇的に変更させた。図５３Ａ〜図５３Ｃは、ＫＰＵ−０２（Ａ）、ＣＡ４（Ｂ）及びＣＬＣ（Ｃ）で２０時間処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡法画像を表す。薬物濃度の増大に伴う紡錘体破壊。１〜４，対照（１）、分裂阻止に関するＩＣ25の濃度（２）、分裂阻止に関するＩＣ50（３）
及び分裂阻止に関するＩＣ50の２倍（４）におけるα−並びにβ−チューブリン；５〜８，隣接しているパネルに関するＤＮＡの相当する画像。ＫＰＵ−０２又はＣＡ４に関してＩＣ25では正常な二極性紡錘体は存在しなかった（図５３Ａ及び図５３Ｂ）。化合物処理した細胞は、会合しない染色体を伴う単極性又は二極性紡錘体を有した。対比して、ＣＬＣに関しては、正常な二極性紡錘体が、ＩＣ25で存続した（図５３Ｃ）。ＫＰＵ−０２に関するＩＣ50では、有糸分裂細胞の７５％が、チューブリンの星状体又は焦点を含有しており、残存細胞は、検出可能な有糸分裂ポリマーを有さなかった。ＣＬＣの存在下では、細胞の半数が、会合しない染色体を伴って二極性であり、残りの半数は、単極性であった。分裂阻止に関して２倍のＩＣ50の濃度では、ＫＰＵ−０２、ＣＡ４又はＣＬＣで処理した有糸分裂細胞において、検出可能なＭＴポリマーはほとんど存在しなかった。
【０５０４】
微小管間期アレイは、検査した化合物のすべてに関して、紡錘体よりも脱重合に対してより抵抗性であった（図５２）。しかしながら、ポリマーの質的減少が、３つすべての化合物に関して、用量依存的様式で観察された（図５４Ａ〜図５４Ｃ）。図５４Ａ〜図５４Ｃは、ＫＰＵ−０２（ａ）、ＣＡ４（ｂ）及びＣＬＣ（ｃ）で２０時間処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡法画像を表す。薬物濃度の増大に伴う間期ＭＴ脱重合。１〜４，対照（１）、分裂阻止に関するＩＣ25の濃度（２）、分裂阻止に関するＩＣ50（３）及び分裂阻止に関する２×ＩＣ50（４）におけるα−並びにβ−チューブリン；５〜８，隣接しているパネルに関するＤＮＡの相当する画像。推定上、ＭＡＰリッチなチューブリンがｉｎ  ｖｉｔｒｏポリマー質量アッセイで隔離されると同時に、チューブリンは、細胞内安定化ＭＡＰの存在にも関わらず、これらの間期細胞で隔離される。
【０５０５】
生きているＭＣＦ７細胞におけるＭＴ動的不安定性の抑制又は調節の欠如
ＫＰＵ−０２並びにＣＡ４は、ＭＣＦ７細胞における最大分裂阻止の２５％（表２４）又は５０％（表２５）を与える濃度で、ＭＴ動的不安定性に対して測定可能な効果を有さなかった。任意の特定の理論に拘束されないが、これらのデータは、ＫＰＵ−０２（及びＣＡ４）の作用の抗増殖性メカニズムが、微小管動態の抑制ではなく、ＭＴ重合の阻害に主として起因することを示唆する。
【０５０６】
【表２４】
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【０５０７】
【表２５】
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【０５０８】
上述の例は、単に本発明の理解を助長するために記載する。したがって、開示する方法及び化合物は、デヒドロフェニラヒスチンのさらなる誘導体を包含し、また別の場合ではそれらを提供することが当業者には理解されるであろう。
【０５０９】
本発明は、例えば、言及した目的及び利点、並びに他の固有の事項を得るために十分に適応していることが当業者には容易に理解されよう。本明細書中に記載する方法及び手順は、現在の好ましい実施形態の代表であり、例示であり、本発明の特許請求の範囲に対する限定として意図されない。本明細書中の変更及び他の使用は、当業者に想到され、それは本発明の精神に包含される。
【０５１０】
本発明の特許請求の範囲及び精神から逸脱せずに、本明細書で開示した本発明に対し様々な代替及び修正を行うことができることは、当業者には容易に理解されるであろう。
【０５１１】
上述のように、明細書中で言及する特許及び刊行物はすべて、本発明が関係する技術分野における当業者の水準を示す。特許及び刊行物はすべて、法で許される程度に、参照により本明細書に援用され、したがって個々の特許及び刊行物はそれぞれ、参照により援用されるように具体的且つ独立して示されるものとして扱われ得る。
【０５１２】
本明細書中に例示的に適切に記載される本発明は、本明細書中に具体的に開示されない任意の要素（複数可）、限定（複数可）の非存在下で実施されてもよい。使用してきた用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定の用語としては使用されず、このような用語及び表現の使用において、示され、且つ記載される特徴の等価物又はその一部を排除する意図はない。様々な修正が本発明の特許請求の範囲内で可能であることが理解される。したがって、本発明を、好ましい実施形態及び任意の特徴により具体的に開示してきたが、本明細書中に開示する概念の修正及び変更は当業者によりなされてもよく、このような修正及び変更は、本発明の特許請求の範囲の範疇であるとみなされることが理解されるべきである。
【０５１３】
ある特定の図中では、化合物は、代替的な記号表示を用いて識別される。これらの代替的な記号表示を変換するための完全なチャートは以下の通りである：
【０５１４】
【表２６】
2007520565.tif 000095
【表２６−１】
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【表２６−２】
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【図面の簡単な説明】
【０５１５】
【図１】ジアシルジケトピペラジン１を、イミダゾールカルボキサルデヒド２と反応させて、中間体化合物３を得て、それをベンズアルデヒド４と反応させて、デヒドロフェニラヒスチンを生成させることにより、デヒドロフェニラヒスチンを生成させる反応スキームを示す図である。
【図２】合成粗デヒドロフェニラヒスチンのＨＰＬＣプロファイルを表す図である。
【図３】ジアシルジケトピペラジン１を、ベンズアルデヒド４と反応させて、中間体化合物１７を得て、それをイミダゾールカルボキサルデヒド１５と反応させて、デヒドロフェニラヒスチンを生成させることにより、デヒドロフェニラヒスチンを生じさせる反応スキームを示す図である。
【図４】経路Ａ及び経路Ｂから生成された粗合成ｔＢｕ−デヒドロフェニラヒスチンのＨＰＬＣプロファイルを表す図である。
【図５】強力な細胞障害活性についてのデヒドロＰＬＨに関する２つの修飾方法を示す図である。
【図６】フェニル部分でのデヒドロＰＬＨの推定の活性コンホメーションを表す図である。
【図７】フェニラヒスチンのチトクロームＰ４５０代謝を表す図である。
【図８】ｔＢｕ−デヒドロＰＬＨのＺ−Ｅ転位を示す図である。
【図９】アシル−Ｅ−ｔＢｕ−デヒドロＰＬＨの合成イメージ及びプロドラッグイメージを表す図である。
【図１０】３−Ｚ−ベンジリデン−６−［５”−（１，１−ジメチルアリル）−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン］−ピペラジン−２，５−ジオンの温度勾配を表す図である。
【図１１】３−Ｚ−ベンジリデン−６−（５”−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４”−Ｚ−イルメチレン）−ピペラジン−２，５−ジオンの温度勾配を表す図である。
【図１２】ＦＩＴＣ−デキストランへのＨｕＶＥＣ単層透過性に対する、コルヒチン及びタキソールと比較したＫＰＵ−２、ＫＰＵ−３５及びｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を表す図である。
【図１３】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける推定腫瘍成長に対する単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図１４】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、個々のマウスにおいて解剖時に切除した腫瘍の重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図１５】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける推定腫瘍成長に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図１６】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、個々のマウスにおいて解剖時に切除した腫瘍の重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図１７Ａ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける推定腫瘍成長に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図１７Ｂ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける推定腫瘍成長に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−３５の効果を表す図である。
【図１７Ｃ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける推定腫瘍成長に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を表す図である。
【図１８Ａ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、個々のマウスにおいて解剖時に切除した腫瘍の重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図１８Ｂ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、個々のマウスにおいて解剖時に切除した腫瘍の重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−３５の効果を表す図である。
【図１８Ｃ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、個々のマウスにおいて解剖時に切除した腫瘍の重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を表す図である。
【図１９Ａ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける腫瘍成長に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である（３つの研究の比較）。
【図１９Ｂ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける腫瘍成長に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である（３つの研究の比較）。
【図１９Ｃ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける腫瘍成長に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である（３つの研究の比較）。
【図２０Ａ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける最終腫瘍重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である（３つの研究の比較）。
【図２０Ｂ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける最終腫瘍重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である（３つの研究の比較）。
【図２０Ｃ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける最終腫瘍重量に対する、単独の及びＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である（３つの研究の比較）。
【図２１】ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおける推定腫瘍成長に対する、単独の又はタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２２Ａ】ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルの生存中の部分中で行った観察に基づいた推定腫瘍成長に対する、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２２Ｂ】ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルの生存中の部分中で行った観察に基づいた推定腫瘍成長に対する、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−３５の効果を表す図である。
【図２２Ｃ】ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルの生存中の部分中で行った観察に基づいた推定腫瘍成長に対する、単独の及びタキソテールと組み合わせたｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を表す図である。
【図２３】ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおける、解剖時に切除した個々の腫瘍重量に対する、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２４】ＤＵ−１４５ヒト前立腺腫瘍異種移植片モデルにおける、解剖時に切除した個々の腫瘍重量に対する、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−３５の効果を表す図である。
【図２５Ａ】ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍異種移植片モデルにおける、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２５Ｂ】ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍異種移植片モデルにおける、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−３５の効果を表す図である。
【図２５Ｃ】ＭＣＦ−７ヒト胸部腫瘍異種移植片モデルにおける、単独の及びタキソテールと組み合わせたｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を表す図である。
【図２６】Ａ５４９ヒト肺腫瘍異種移植片モデルにおける、推定腫瘍成長に対する、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２７】Ａ５４９ヒト肺腫瘍異種移植片モデルにおける、解剖時に切除した腫瘍重量に対する、単独の及びタキソテールと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２８】マウス乳房脂肪体に移植したＭＤＡ−２３１ヒト胸部腫瘍モデルにおける、推定腫瘍重量に対する、単独の及びパクリタキセルと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２９Ａ】マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０転移性腫瘍モデルにおける、単独の及びパクリタキセルと組み合わせたＫＰＵ−２の効果を表す図である。
【図２９Ｂ】マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０転移性腫瘍モデルにおける、単独の及びパクリタキセルと組み合わせたＫＰＵ−３５の効果を表す図である。
【図２９Ｃ】マウス黒色腫Ｂ１６Ｆ１０転移性腫瘍モデルにおける、単独の及びパクリタキセルと組み合わせたｔ−ブチル−フェニラヒスチンの効果を表す図である。
【図３０】図３０の背面皮下房(dorsal skinfold chamber)における腫瘍血管系に対する、ＫＰＵ−３５及びＫＰＵ−０２の効果を表す図である。
【図３１】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、推定腫瘍重量に対するＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−０２の効果を表す図である。
【図３２Ａ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、切除した腫瘍重量に対するＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−０２の効果を表す図である。
【図３２Ｂ】ＨＴ−２９ヒト結腸腫瘍異種移植片モデルにおける、切除した腫瘍重量に対するＣＰＴ−１１と組み合わせたＫＰＵ−０２の効果を表す図である。
【図３３】ＫＰＵ−０２及びＫＰＵ−３５により誘導されるＨｕＶＥＣ細胞における、迅速なチューブリン脱重合を表す図である。
【図３４】ＨｕＶＥＣ細胞における単層透過性に対する、ＫＰＵ−０２の効果を表す図である。
【図３５Ａ】１２５Ｉ−ＩＡＰ技法を使用したｐ２２ラット肉腫モデルにおける腫瘍血流に対する、ＫＰＵ−０２の効果を表す図である。
【図３５Ｂ】１２５Ｉ−ＩＡＰ技法を使用したｐ２２ラット肉腫モデルにおける腫瘍血流に対する、ＫＰＵ−０２の効果を表す図である。
【図３６】投薬の１時間及び２４時間後の種々の組織における血流に対するＫＰＵ−０２  １５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰの効果（賦形剤対照％として表される）を表す図である。
【図３７】Ｐ２２ラット肉腫モデルにおけるＫＰＵ−０２  ７．５ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ及び１５．０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰにより誘導される、腫瘍壊死の効果を表す図である。
【図３８】ＨＴ−２９細胞での様々なｔＢｕ−デヒドロ−ＰＬＨ誘導体の活性を列挙する図である。
【図３８−１】図３８の続き。
【図３８−２】図３８の続き。
【図３８−３】図３８の続き。
【図３８−４】図３８の続き。
【図３９】ｔＢｕ−デヒドロ−ＰＬＨ誘導体の３Ｄ  ＱＳＡＲ（ＣｏＭＦＡ）分析を表す図である。
【図４０】ｔＢｕ−デヒドロ−ＰＬＨ誘導体のＸ線結晶分析を表す図である。
【図４１】コルヒチンと比較した様々なフェニラヒスチン誘導体の生物学的活性を表す図である。
【図４２】ｔＢｕ−デヒドロ−ＰＬＨ（ＫＰＵ−２）及びＫＰＵ−３５によるＨｅＬａ細胞の細胞周期進行に対する効果を表す図である。
【図４３】パクリタキセルと比較した場合の薬物感受性及び薬物耐性腫瘍細胞系に対する、デヒドロ−ＰＬＨ並びにｔＢｕ−デヒドロ−ＰＬＨ（ＫＰＵ−２）の効果を表す図である。
【図４４Ａ】ＤＭＳＯ薬物賦形剤（白菱形）、１．２５μＭ（白四角）、２．５μＭ（−）及び５μＭ（白丸）ＫＰＵ−０２の存在下での微小管タンパク質重合の濁度スペクトルを表す図である。
【図４４Ｂ】ＤＭＳＯ薬物賦形剤（白菱形）、１．２５μＭ（白四角）、２．５μＭ（−）及び５μＭ（白丸）ＣＡ４の存在下での微小管タンパク質重合の濁度スペクトルを表す図である。
【図４４Ｃ】ＤＭＳＯ薬物賦形剤（白菱形）、１．２５μＭ（白四角）、２．５μＭ（−）及び５μＭ（白丸）ＣＬＣの存在下での微小管タンパク質重合の濁度スペクトルを表す図である。
【図４５】一連のＫＰＵ−０２（白丸）、ＣＡ４（白四角）及びコルヒチン（白菱形）濃度の非存在又は存在下でのＭＴの阻害を表す図である。
【図４６Ａ】ＫＰＵ−０２の存在下での定常状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの平均微小管長の度数ヒストグラムを表す図である。
【図４６Ｂ】ＣＡ４の存在下での定常状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの平均微小管長の度数ヒストグラムを表す図である。
【図４６Ｃ】ＣＬＣの存在下での定常状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの平均微小管長の度数ヒストグラムを表す図である。
【図４７Ａ】ＫＰＵ−０２の存在下での定常状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるＭＡＰリッチな微小管の電子顕微鏡写真を表す図である。
【図４７Ｂ】ＣＡ４の存在下での定常状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるＭＡＰリッチな微小管の電子顕微鏡写真を表す図である。
【図４７Ｃ】ＣＬＣの存在下での定常状態でのｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されるＭＡＰリッチな微小管の電子顕微鏡写真を表す図である。
【図４８】ＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びコルヒチンの存在下での定常状態でのＭＴ長減少のグラフ概要を表す図である。
【図４９Ａ】増大するＫＰＵ−０２の存在下でのチューブリンの蛍光発光スペクトルを表す図である。
【図４９Ｂ】ＫＰＵ−０２に関するチューブリンのＫdを獲得するための４８７ｎｍでの蛍光発光最大値への適合を表す図である。挿入図は、未処理を表す図である。
【図４９Ｃ】結合データの二重逆数変換を表す図である。
【図５０】ＫＰＵ−０２若しくはＣＡ４の非存在下（白菱形）又は１０μＭ  ＫＰＵ−０２（白丸）若しくは１０μＭ  ＣＡ４（白四角）の存在下での様々な濃度の［3Ｈ］ＣＬＣを用いたチューブリンへのコルヒチン結合の競合阻害アッセイのグラフ式の結果を表す図である。
【図５１】ＫＰＵ−０２（白丸）、ＣＡ４（白四角）及びコルヒチン（白菱形）の存在下で培養したＭＣＦ７細胞におけるＫＰＵ−０２、ＣＡ４及びＣＬＣによる有糸分裂進行阻害のｌｏｇ［化合物］応答曲線を表す図である。
【図５２】ＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を表す図である。ａ〜ｄ：対照におけるチューブリン（ａ）対照におけるチューブリン、（ｂ）ＫＰＵ−０２、（ｃ）ＣＡ４及び（ｄ）ＣＬＣ処理細胞；ｅ〜ｈ：対照におけるＤＮＡ（ｅ）対照におけるＤＮＡ、（ｆ）ＫＰＵ−０２、（ｇ）ＣＡ４及び（ｈ）ＣＬＣ処理細胞。
【図５３Ａ】ＫＰＵ−０２で処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を表す図である。
【図５３Ｂ】ＣＡ４で処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を表す図である。
【図５３Ｃ】ＣＬＣで処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を表す図である。
【図５４Ａ】ＫＰＵ−０２で処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を表す図である。
【図５４Ｂ】ＣＡ４で処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を表す図である。
【図５４Ｃ】ＣＬＣで処理したＭＣＦ７細胞の免疫蛍光顕微鏡画像を表す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３８−４】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４７Ｃ】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５４Ｃ】
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【国際調査報告】
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