(57)【要約】  アッセイ試料を収容可能な容器、インキュベータ、試料分離システム、画像収集システムおよびピペッタを含む免疫学的または免疫血液学的アッセイシステムを開示する。本免疫学的アッセイシステムは、洗浄器も含み得る。フィルターを含み得る容器に免疫学的アッセイ試料を入れる工程；該容器に検査用試薬を添加する工程；該容器内の試料と試薬との混合物をインキュベートする工程；該容器内の試料と試薬との混合物を、反応した成分と反応していない成分に分ける工程；および該容器を分析して、該試料と試薬との間の相互作用の存在を判定する工程を含む、免疫学的アッセイ方法も開示する。好ましくは、該容器の底は、相互作用をより容易に分析可能とするように、試料の反応済成分をその容器の底一面に均等に広げることを助長する材料のものである。
2007524831.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アッセイ試料および試薬を収容可能な容器を含むこと、ここで該容器が凹凸のある表面を有する底を含むことを特徴とする、免疫学的アッセイシステム。
【請求項２】
前記容器を設置可能なインキュベータをさらに含むこと、ここで該インキュベータが、前記アッセイ試料と前記試薬が反応している間、前記容器を収容することを特徴とする、請求項１に記載の免疫学的アッセイシステム。
【請求項３】
前記インキュベータの極めて近くに試料分離システムをさらに含むこと、ここで該試料分離システムが、前記アッセイ試料および前記試薬を様々な成分に分離するように設計されていることを特徴とする、請求項１に記載の免疫学的アッセイシステム。
【請求項４】
前記試料分離システムの極めて近くに画像収集システムをさらに含むこと、ここで該画像収集システムが、前記アッセイ試料および前記試薬中の成分間の相互作用の存在を検出するように設計されていることを特徴とする、請求項１に記載の免疫学的アッセイシステム。
【請求項５】
前記容器と、前記インキュベータと、前記試料分離システムと前記画像収集システムとの到達距離内にロボットアームを含むロボット式ピペッタをさらに含むこと、ここで該ロボット式ピペッタが、前記容器と、前記インキュベータと、前記試料分離システムと前記画像収集システムとの間で前記アッセイ試料または前記試薬を移送するように設計されていることを特徴とする、請求項１に記載の免疫学的アッセイシステム。
【請求項６】
前記容器の底が、ポリプロピレン、ナイロン、硝酸セルロースおよびポリフッ化ビニリデンから選択されるフィルター材料を含むことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記容器の底が、０．４５ミクロン（μｍ）サイズの細孔を有するポリプロピレン；０．４５μｍサイズの細孔を有する硝酸セルロース；０．４５μｍサイズの細孔を有するナイロン６，６；１．２μｍサイズの細孔を有するナイロン６，６；０．２μｍサイズの細孔を有するＨＰＶＭ膜；１．０μｍサイズの細孔を有するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）；１．２μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ；０．２μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ；および０．２５μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦから選択されるフィルター材料を含むことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記試料分離システムが、遠心分離機であることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記画像収集システムが、フローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータであることを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記アッセイ試料が、赤血球および抗体を含むことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
反応済試料および試薬成分を前記容器の底面上に均等に広げるための手段を含むことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記反応済試料および試薬成分を容器の底面に均等に広げるための手段が、遠心分離機であるとを特徴とする、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記容器の底面上の反応済成分を分析するための手段をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
前記反応済成分を分析するための手段が、フローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータであることを特徴とする、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
反応容器；
希釈された濃度の免疫血液学的試料；
希釈された濃度の試薬；および
フローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータ
を含むことを特徴とする、免疫学的アッセイシステム。
【請求項１６】
真空濾過システムをさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
遠心分離システムをさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記免疫血液学的試料が、赤血球、抗原および同種異系抗体のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
前記試薬が、抗体および患者の血漿のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
Ａ−抗原、Ｂ−抗原、Ｒｈ（Ｄ）−抗原、ケル抗原、ダッフィ抗原、抗体および同種異系抗体のうちの少なくとも１つを検出することを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２１】
Ａ−抗原、Ｂ−抗原、Ｒｈ（Ｄ）−抗原、ケル抗原、ダッフィ抗原、抗体および同種異系抗体のうちの少なくとも２つを検出することを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２２】
Ａ−抗原、Ｂ−抗原、Ｒｈ（Ｄ）−抗原、ケル抗原、ダッフィ抗原、抗体および同種異系抗体のうちの少なくとも３つを検出することを特徴とする、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２３】
凹凸のある表面を有する底を有する容器を用意する工程；
免疫学的試料と試薬の混合物を該容器内で反応させる工程；
該試料と試薬との混合物を遠心分離する工程；ならびに
該容器内の成分を分析して、該試料成分と試薬成分の間の相互作用の存在を判定する工程
を含むことを特徴とする、免疫学的アッセイ方法。
【請求項２４】
前記遠心分離が、低速での遠心分離であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記低速での遠心分離が、約１，０００ｇの最高速度での遠心分離を含むことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記低速での遠心分離が、約２５０ｇから約４００ｇの速度での遠心分離を含むことを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料と試薬との混合物の未反応部分の全てを容器から分離する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料と試薬との混合物をインキュベートする工程をさらに含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料と試薬との混合物が、赤血球および抗体を含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記凹凸のある表面が、遠心分離中、試料中の相互作用した成分を、前記容器内の一箇所だけに移動させることなく、前記容器の底面上に均等に広がらせることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
前記容器が、
不活性材料、および
多数の細孔
を含むフィルターを備えていることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記フィルターが、ポリプロピレン、ナイロン、硝酸セルロースおよびポリフッ化ビニリデンから選択される材料を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
フィルターが、０．４５ミクロン（μｍ）サイズの細孔を有するポリプロピレン；０．４５μｍサイズの細孔を有する硝酸セルロース；０．４５μｍサイズの細孔を有するナイロン６，６；１．２μｍサイズの細孔を有するナイロン６，６；０．２μｍサイズの細孔を有するＨＰＶＭ膜；１．０μｍサイズの細孔を有するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）；１．２μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ；０．２μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ；および０．２５μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦから成る群より選択される材料を含むことを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記成分が、フローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータにより分析される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３５】
前記遠心分離が、短期間の遠心分離であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記遠心分離が、最大時間約１分の遠心分離であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料と試薬との混合物を反応させる工程が、その試料と試薬との混合物のインキュベーションを含むことを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記遠心分離が、低速かつ短期間の遠心分離であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
希釈された免疫血液学的試料と希釈された試薬を混合して試料混合物を作る工程；
該試料混合物をフローサイトメトリーにより分析する工程；および
所定の成分が該免疫血液学的試料中に存在するか否かを判定する工程
を含むことを特徴とする、免疫学的アッセイ方法。
【請求項４０】
前記免疫血液学的試料が、赤血球、抗原および同種異系抗体のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記試薬が、抗体および患者の血漿のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記所定の成分が、Ａ−抗原、Ｂ−抗原、Ｒｈ（Ｄ）−抗原、ケル抗原、デュフィ抗原、抗体および同種異系抗体のうちの少なくとも１つであることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記所定の成分が、Ａ−抗原、Ｂ−抗原、Ｒｈ（Ｄ）−抗原、ケル抗原、デュフィ抗原、抗体および同種異系抗体のうちの少なくとも２つであることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記所定の成分が、Ａ−抗原、Ｂ−抗原、Ｒｈ（Ｄ）−抗原、ケル抗原、デュフィ抗原、抗体および同種異系抗体のうちの少なくとも３つであることを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
真空濾過により反応容器の底面上に前記試料混合物を広げる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
低速遠心分離により反応容器の底面上に前記試料混合物を広げる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には免疫学的アッセイシステムに関し、より詳細には免疫学的試料及び免疫血液学的試料の成分を分離および分析するためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的アッセイは、抗体と抗原との反応を検出するように設計される。これらのアッセイは、一般に、赤血球（ＲＢＣ）などの細胞またはビーズを「抗原担体」として利用する。適切なアッセイ構成においては、抗体は抗原担体を架橋させることができ、それによって最初は個々の抗原担体と抗体であったものから大きな三次元抗原−抗体凝集体が生じる。他の構成においては、抗体は抗原担体を架橋させることなく結合する。
【０００３】
血液バンク設定における免疫血液学的検査は、輸血前に輸血の供血者と受血者の間の適合性を判定するために、ＲＢＣおよび抗体を使用する。例えば、受血者からの抗体が供血者からのＲＢＣを架橋（凝集）させ、結果として大きなＲＢＣ凝集体が形成する場合、その供血者と受血者は、不適合である。現行の市販検査用試薬は、これらの凝集体と個々の凝集していないＲＢＣを区別するように設計されている。例えば、標準的な「試験管検査」では、ＲＢＣを抗体と混合し、約１０００×重力加速度（ｇ）で、短期間、およそ３０秒、遠心分離して、抗原−抗体複合物の形成を促進し、その後、凝集したＲＢＣと凝集していないＲＢＣを区別することができるように手で穏やかに再懸濁させる。試験管検査は、大きな労力を要し、自動化に適さず、結果は、個々のオペレータの技能に依存するので検査室間での標準化が難しい。
【０００４】
凝集したＲＢＣを同定するために使用される別の手法として、標準的なクロマトグラフ原理に基づくスピンカラム法がある。この方法論においては、均質なマトリックス材料、例えばビーズ、ゲルまたはポリアクリルアミドなどを満たした試験管を使用して、凝集したＲＢＣを単独のＲＢＣから分離する。このマトリックス材料は、注意深く制御された遠心力のもとで大きな（「４＋」）凝集体がかろうじてそのマトリックスに入るような特定のサイズの穴または細孔を有するように設計される。しかし、それに続く小ささの凝集体（「３＋」から「＋１」まで）は、漸進的な度合いでそのマトリックスに入らず、凝集していないＲＢＣは、そのマトリックスに入らないばかりでなく、試験管の底に完全に沈降する。単一の均質クロマトグラフマトリックスにおいて、様々なサイズのＲＢＣ凝集体から単独のＲＢＣを有効に分離するには、比較的長く、約１０分の、遠心分離の実施を、８０ｘｇの注意深く制御された低速遠心分離条件下で行わなければならない。最適な遠心分離条件からの逸脱、例えば、アッセイの実施を短くするために遠心分離速度をより高速にすることは、ＲＢＣの不良分離を導き、その結果、供血者と受血者の間の適合性を判定するアッセイ能力を損なうことになる。この方法論は、ある程度は自動化に適しており、オペレータの技能にさほど依存しない。
【０００５】
スピンカラム法は、カラムの製造コストのため、試験管検査より有意に費用が嵩む。このマトリックス材料は、溶液状態であり、一般に、包装、輸送および保管条件を注意深く制御することを必要とする。加えて、試験管検査での約３０秒に対して遠心分離工程が長時間、約１０分であるため、検査が、試験管検査での検査より遅い。アッセイ結果の解釈は、読み取りが「アナログ」尺度に基づくため、すなわち、一般にはマトリックスによるＲＢＣ移行距離を判断しなければならないため、オペレータの訓練も必要である。
【０００６】
免疫血液学的検査のためのこの技法の方法には、主としておもて検査法（forward-blood typing）、うら検査法（reverse-blood typing）、および抗体スクリーニングの３つがある。これらの各々を別々に論じる。
【０００７】
ＡＯＢ／Ｄおもて検査法
おもて検査法は、ＲＢＣ表面の特異的で臨床的に重要な抗原の存在を判定するために使用される。Ａ−抗原、Ｂ−抗原、Ｒｈ（Ｄ）−抗原、ならびにケル（Ｋｅｌｌ）およびデュフィ（Ｄｕｆｆｙ）などを含む他のＲＢＣ抗原が挙げられるがこれらに限定されない。通常、これらの抗原の各々は、個別の検査／反応で検査される。そのため、これら３つのＲＢＣ抗原を同定するために３つの別個の反応が必要とされる。このプロトコルは、ＲＢＣ上のＡ、ＢおよびＲｈ（Ｄ）抗原の存在を検出するために３つの別の試験管／反応を設定することを従来必要としている。
【０００８】
Ａ抗原およびＢ抗原の型判定には、ヒト抗血清を使用することもできるが、我々は現在、適切な抗原に対する一次マウス抗体を使用している。理論上、これらの抗体は、フルオレセインなどの蛍光染料または多数の他の市販染料のうちのいずれかで直接標識することができるが、分析装置、すなわち、フローサイトメータまたは他の適切な計器が、それらを検出できることを条件とする。しかしながら、Ａ抗原およびＢ抗原は、一部が糖残基から成るため、これらの抗原に対して作成された殆どの抗体は、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）類の抗体であり、直接標識することが難しい。
【０００９】
ＩｇＭ抗Ａ抗体およびＩｇＭ抗Ｂ抗体は、ＲＢＣを凝集させる傾向があり、これが、血液型判定を行うための大部分の市販技術の根本原理である。しかし、ＲＢＣの凝集は、フローサイトメトリーによる細胞の分析の妨げとなる。大きな凝集物がそのフローセルを通過することができずにむしろフローセルを詰まらせ、その結果、その後の装置の整備が必要となるからである。それ故、従来、ＲＢＣ凝集とフローサイトメトリーとは相容れないものであった。実際、この分野の先行出版物は、抗体によるＲＢＣの凝集により、フローサイトメトリーの免疫血液学への応用が現実には制限されることを示唆している。さらに、通常、フローサイトメトリーの従事者は、フローサイトメトリーの前に試料から凝集体／凝集物を除去して、装置を詰まらせないように努める（例えば、Ｂｅｒｎｅｍａｎ，Ｚ．Ｎ．，Ｄ．Ｒ．ｖａｎ  Ｂｏｃｋｓｔａｅｌｅ，Ｗ．Ｍ．Ｕｙｔｔｅｎｂｒｏｅｃｋ，Ｃ．Ｖａｎ  Ｚａｅｌｅｎ，Ｊ．Ｃｏｌｅ−Ｄｅｒｇｅｎｔ，Ｌ．Ｍｕｙｌｌｅ，およびＭ．Ｅ．Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓ，「赤血球血液型Ａ抗原密度プロフィールのフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ−Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｒｏｆｉｌｅ）」，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ６１：２６５（１９９１）；  Ｇａｒｒａｔｔｙ，Ｇ．，およびＰ．Ａ．Ａｒｎｄｔ，「フローサイトフルオロメトリーの赤血球免疫学への応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３８：２５９（１９９９）；  Ｓｈａｒｏｎ，Ｒ．，およびＥ．Ｆｉｂａｃｈ，「ＡＢＯ赤血球抗原の定量的フローサイトメトリー分析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＢＯ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ）」，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １２：５４５（１９９１））。
【００１０】
うら検査法
うら検査法は、血漿および血清中の天然抗Ａ抗体および天然抗Ｂ抗体の存在を判定するために使用される。この検査が、上で説明したおもて検査法の確認としての役割を果たして、正しい血液型が個人に割り当てられることを確実にする。通常、これら２つの抗体の各々を、個別の検査／反応で試験する。典型的には、Ａ、ＢまたはＯ型試薬細胞を収容している３本の別の試験管を使用する。各試験管について、一個人の血漿を添加し、インキュベートして、洗浄し、その後、ヒトＩｇＭに対する市販蛍光標識二次抗体を添加する。
【００１１】
おもて検査法と同様に、ＩｇＭ抗Ａ抗体およびＩｇＭ抗Ｂ抗体（この場合はヒト由来のもの）の存在は、ＲＢＣを凝集させる傾向があり、これが、血液型判定を行う大部分の市販技術の根本原理である。さらに、上述のとおり、大きな凝集物が、そのフローセルを通過することができずにむしろフローセルを詰まらせ、その結果、その後の装置の整備が必要となるため、ＲＢＣの凝集は、フローサイトメトリーによる細胞の分析の妨げとなる。
【００１２】
予想外のＲＢＣ同種異系抗体のスクリーニング
以前に輸血を受けたことがある患者または供血者か、妊娠している個人においては、異種ＲＢＣに対する抗体（ＲＢＣ同種異系抗体）が生じていることがある。強い同種異系抗体が存在する場合、ＲＢＣ凝集を含むおもて検査法およびうら検査法についての問題と同じ問題が、あてはまる。
【００１３】
以上のように、上述の欠点および不備に対処する、これまでに対処されていない要求が、当業界には存在する。
【非特許文献１】Ｂｅｒｎｅｍａｎ，Ｚ．Ｎ．，Ｄ．Ｒ．ｖａｎ  Ｂｏｃｋｓｔａｅｌｅ，Ｗ．Ｍ．Ｕｙｔｔｅｎｂｒｏｅｃｋ，Ｃ．Ｖａｎ  Ｚａｅｌｅｎ，Ｊ．Ｃｏｌｅ−Ｄｅｒｇｅｎｔ，Ｌ．Ｍｕｙｌｌｅ，およびＭ．Ｅ．Ｐｅｅｔｅｒｍａｎｓ，「赤血球血液型Ａ抗原密度プロフィールのフローサイトメトリー分析（Ｆｌｏｗ−Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｒｏｕｐ  Ａ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｐｒｏｆｉｌｅ）」，Ｖｏｘ  Ｓａｎｇ  ６１：２６５（１９９１）
【非特許文献２】Ｇａｒｒａｔｔｙ，Ｇ．，およびＰ．Ａ．Ａｒｎｄｔ，「フローサイトフルオロメトリーの赤血球免疫学への応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ３８：２５９（１９９９）
【非特許文献３】Ｓｈａｒｏｎ，Ｒ．，およびＥ．Ｆｉｂａｃｈ，「ＡＢＯ赤血球抗原の定量的フローサイトメトリー分析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＢＯ  Ｒｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ）」，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  １２：５４５（１９９１））
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
解決しようとする課題は、現行の試験管検査およびスピンカラム法の欠点であり、また免疫学的アッセイの技法をより自動化に適するようにすることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
免疫学的および免疫血液学的アッセイのためのシステムおよび方法をここに開示する。簡単に説明すると、代表的なアッセイシステムは、アッセイ試料および試薬を収容可能な容器、ここで該容器が凹凸のある表面を有する底を含む；インキュベータの極めて近くに設けられる試料分離システム；前記試料分離システムの極めて近くに設けられる画像収集システム；及び、前記フィルター容器、前記インキュベータ、前記試料分離システムおよび前記画像収集システムの到達距離内に設けられる、ロボットアームを含むロボット式ピペッタを含む。不規則な又は凹凸のある表面を有する前記容器は、ポリプロピレン、ナイロン、硝酸セルロース、およびポリフッ化ビニリデンのうちの少なくとも１つから選択されるフィルター材料を有するフィルター容器であり得る。さらに、前記フィルター容器は、多数の細孔も含むものであり得る。
【００１６】
さらに、免疫学的および免疫血液学的アッセイのための方法を開示する。本免疫学的方法は、試料と検査用試薬（このうち一方は抗原担体（ＲＢＣまたはビーズ）を含有し、他方は抗体を含有する）の間の相互作用を特定するものである。これに関して、代表的方法を、容器を用意する工程；免疫学的試料と試薬との混合物とを該容器内で反応させる工程；該試料と試薬との混合物とを低速で、または短期間、遠心分離する工程；場合により、該ＲＢＣまたは他の抗原担体を洗浄する工程；及び、該容器内の成分を分析して、該試料成分と試薬成分の間の相互作用の存在を判定する工程、に、おおまかに要約することができる。
【００１７】
希釈された免疫血液学的試料と希釈された試薬を混合して試料混合物を作成する工程；該試料混合物をフローサイトメトリーにより分析する工程；および、所定の成分が該免疫血液学的試料中に存在するか否かを判定する工程を含むことを特徴とする、免疫学的アッセイ方法も開示される。反応容器、希釈された濃度の免疫血液学的試料、希釈された濃度の試薬、およびフローまたはキャピラリーサイトメータを含む免疫学的アッセイシステムも開示する。また、反応容器、希釈された濃度の免疫血液学的試料、希釈された濃度の試薬、およびフローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータを含むことを特徴とする、免疫学的アッセイシステムも開示する。
【００１８】
開示するアッセイシステムおよび方法の他の方法、特徴および利点は、以下の図面および詳細な説明を検討することにより、当業者には明らかであるか、または明らかとなるであろう。すべてのそうした追加的方法、特徴および利点は、本開示の範囲内に包含され、添付の特許請求の範囲によって保護される。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の免疫学的アッセイシステムにより、現行の試験管検査およびスピンカラム法の欠点を克服し得ると同時に、免疫学的アッセイの技法をより自動化に適合させ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（詳細な説明）
免疫学的および免疫血液学的試料の成分を分離および分析するためのシステムおよび方法を一般的に開示する。これに関して、本免疫学的アッセイシステムの実施形態は、現行の試験管検査およびスピンカラム法の欠点を克服すると同時に、免疫学的アッセイの技法をより自動化に適合させる。
【００２１】
ある実施形態において、本免疫学的アッセイシステムは、容器システムを含む手段であり、ここで該フィルターは、特定のサイズの多数の穴または細孔の存在により個別の分画分子量およびサイズのカットオフを示す１つまたは複数のフィルターを備えたフィルターであることを特徴とする。免疫学的試料を試薬と混合し、前記フィルター上に置く。真空、遠心分離、または前記試料をフィルターに通す何らかの別の方法を適用すると、前記試料の成分は、様々なフィルターによりそれらのサイズに従って互いから分別される。
【００２２】
別の実施形態において、本免疫学的アッセイシステムは、反応容器、希釈された濃度の免疫血液学的試料、希釈された濃度の試薬、およびフローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータを含む。ここで開示される代替システムは、任意の真空濾過システムおよび／または任意の遠心分離システムを含んでもよい。
【００２３】
さらに別の実施形態において、本免疫学的アッセイシステムは、１つまたはそれ以上の容器を含み、それらの各々が、凹凸のある地形の底面を有する容器システムを含む計器である。本件明細書において「地形（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）」は、その容器の底面が起伏の特徴を有すること、または表面が、底面の複数の部分が他の部分より高いか、突出部を含むような輪郭となっていることを意味する。「凹凸のある（ｕｎｅｖｅｎ）」は、その底面が、完全に平滑ではないことを意味するが、その容器の底の隆起した起伏が、規則正しい構造（例えば均等間隔の突出部の列）であってはならないという意味ではない。多数の製造業者から市販されている安価な例は、底がフィルター材料で覆われている９６ウエルプレートである。通常、こうしたフィルタープレートを使用して、フィルターの細孔径より大きな材料とその細孔径より小さな材料を、例えば小さいほうの材料をフィルターに通させるように真空または遠心分離を適用することにより、分離する。しかし、ある実施形態では、材料をフィルターに通して移動させる必要がない。この実施形態では、免疫学的試料を試薬と混合し、容器の中に入れて反応させる。このフィルターは、不規則な表面を提供し、それが、遠心分離の影響下で抗原担体（例えばビーズまたは赤血球（ＲＢＣ））が容器の端に移動するのを遅らせ、それにより遠心終了時には底のフィルター材料一面に抗原担体が本質的に均等に分散された結果を生ずる。これらのフィルタープレートの使用は、均等に分散された抗原担体薄膜が、凝集性抗体の存在下で大きな凝集物または凝集体を形成せず、それにより後続の試薬相互作用の分析を向上させる利点を有する。
【００２４】
本明細書における抗原担体は、例えば、合成ビーズまたは試薬細胞（例えばＲＢＣ、ＷＢＣもしくは血小板）でありうる。本件明細書においては例として、該抗原担体を通常、ＲＢＣと呼ぶであろうが、当業者には、本アッセイシステムおよび方法において使用することができる他の抗原担体を想像することができる。
【００２５】
上述のように、底にフィルター材料を備えた９６ウエルアッセイプレートを容器として使用することができ、その多数の例が市販されている。抗体とＲＢＣをこのウエル内で反応させ、その後、遠心分離すると、そのウエルの底の不規則な地形がＲＢＣの転動および移動を妨げるので、ＲＢＣが底一面に均等に広がる。対照的に、底にフィルター材料を備えていない標準的な９６ウエルプラスチックアッセイプレートのように、その容器が平滑な底を有する場合、遠心力により、ＲＢＣのすべてがその平滑な底に沿って転動し、前記容器の隅に局在することになりうる。ＲＢＣに結合する抗体の存在下では、平坦な底のプレート内で緊密に密集したＲＢＣは、大きな凝集物または凝集体を形成しうるが、不規則な底の地形を有するプレート内では、分散したＲＢＣは、個別の細胞として残存するか、非常に小さな凝集物を形成するのみである。画像収集システムとしてフローサイトメータを使用して試料を分析する場合、個々の細胞および不規則な底の地形を有するプレート内で形成される小さな凝集物は、容易かつ正確に分析することができる。対照的に、平滑な底のプレートからの大きな凝集体は、該サイトメータを詰まらせ、損傷させることがあり、これは、試料の分析を防止または妨害する。
【００２６】
本開示免疫学的システムを使用して、抗体と細胞の間、または場合によっては、抗体と（抗原担体として作用するように改良および／または形成することができる）合成ビーズの間の相互作用を測定することができる。本免疫学的システムは、少なくとも２つの異なる方法で使用することができる。１つの方法では、患者試料の「細胞成分」、例えばＲＢＣ、白血球（ＷＢＣ）または血小板を、「試薬抗体」と混合する。その混合物の成分を分離するかｉｎ  ｓｉｔｕで放置し、その後、分析して、細胞成分と試薬抗体の間の相互作用の存在を判定することができる。
【００２７】
もう１つの方法では、本免疫学的システムは、患者の抗体を含有する試料、例えば血漿または血清試料と、合成ビーズまたは試薬細胞（例えばＲＢＣ、ＷＢＣもしくは血小板）でありうる抗原担体とを混合する。その混合物は、分離してもよいし、その場に放置してもよく、その後、その成分を分析して、抗体試料と試薬細胞または合成ビーズの間の相互作用の存在を判定する。
【００２８】
本開示図面を参照すると、本開示アッセイシステムおよび方法をより良く理解することができる。図面中の構成要素は、必ずしも縮尺で製図したものではなく、本明細書において開示する原理を明確に図示する上での代替物として提示するものであることを強調しておく。また、図面中、同じ参照番号は、幾つかの図を通して一致する部分を示す。
【００２９】
図１は、免疫学的システム１００の実施形態を描写している。図１に示す免疫学的システム１００は、アッセイ試料を収容可能な容器１０５；該容器を設置可能な任意のインキュベータ１１０；該インキュベータ１１０の極めて近く、またはその中に配置された試料分離システム１１５；該試料分離システム１１５の極めて近くに、任意で設けられる画像収集システム１３０；ならびに該フィルター容器１０５、インキュベータ１１０、試料分離システム１１５および／または画像収集システム１３０への到達距離内に、任意で設けられる、ロボットアームを含む任意のロボット式ピペッタ１３５を含む計器である。この免疫学的システム１００は、その中に配置された任意の洗浄器１４０、およびアッセイ試料を保持するための試料ホルダー１４６が中に配置されている任意のターンテーブルシステム１４５を含んでもよい。さらに、場合によってはこの免疫学的システム１００に、アッセイ試料１４７を収容した試験管および／または試薬１４８を収容した試験管を含んでもよい。
【００３０】
ある実施形態においては、容器１０５はフィルター容器である。「フィルター容器」１０５は、アッセイ試料を収容可能であり、中に配置される１つまたはそれ以上のフィルター１５０を含むことができる容器を意味する。好ましくは、該フィルター容器１０５は、不活性材料および多数の細孔を含むフィルター１５０を含む。好ましい実施形態では、多数のフィルター容器１０５が、単一ユニット、例えばプレート１０６に配列される。ここでは、以後、容器１０５をフィルター容器１０５と呼ぶことがあるが、他の実施形態では、容器１０５が別のタイプの容器（例えば上述のような凹凸のある地形を有する底面の容器）であってもよい。
【００３１】
免疫学的システム１００内に任意で配置され得るインキュベータ１１０は、その中にフィルター容器１０５を配置可能な形状およびサイズのものである。多くのサイズおよび形状のインキュベータを使用することができるが、好ましい実施形態では、インキュベータ１１０は、その中に多数のフィルター容器１０５またはフィルター容器のプレート１０６を配置可能な形状およびサイズのものである。インキュベータ１１０は、フィルター容器１０５が該インキュベータ１１０内に配置されているときにそれらを加熱することができる、任意で配置され得る加熱要素をさらに含んでもよい。
【００３２】
試料分離システム１１５も、その中にフィルター容器１０５を配置することが可能な形状およびサイズのものである。多数のサイズおよび形の試料分離システムを使用することができるが、好ましい実施形態では、多数のフィルター容器１０５および／またはフィルター容器のプレート１０６をその中に配置することができる。試料分離システム１１５は、例えば、遠心分離機１２５、濾過システム、および／または印加電場でありうるが、これに限定されない。試料分離システム１１５は、フィルター容器１０５がその試料分離システム１１５内に設置されているとき、該フィルター容器１０５内に配置されたアッセイ試料１４７をフィルター１５０に通し、それによって該アッセイ試料を、サイズを基に様々な成分に分離するタイプのものである。試料分離システム１１５が遠心１２５分離機でありうる別の実施形態では、遠心分離のプロセスが、アッセイ試料１４７中の一切の反応済成分（例えばＲＢＣ）を任意の洗浄器１４０で洗浄し、ＲＢＣの凝集を生じずに画像収集システム１３０で分析することができるように、容器の底面上に均等に広がらせるであろう。
【００３３】
任意で用い得る画像収集システム１３０は、例えば、限定ではないが、カメラ、フローサイトメータ、キャピラリーサイトメータ、顕微鏡などの特別なレンズ、または人間の目でさえありうる。通常、アッセイ試料は、試料分離システム１１５から取り出した後、画像収集システム１３０によって分析される。画像収集システム１３０は、フィルター容器１０５を分析して、前記容器内に配置されたフィルター１５０の上の材料の有無を判定することもできる。
【００３４】
画像収集システム１３０は、特に、それがフローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータの形態をとる場合、フィルター１５０上の材料のサイズおよび反応した状態を判定するために使用することもできる。例えば、画像収集システム１３０は、その材料が、個々の抗原担体の形態のものなのか、抗原担体の凝集体の形態のものなのかを判定することが可能であり、また蛍光標識抗体が、フィルター１５０上に、またはフィルター１５０が存在しない場合には容器内に、存在する抗原担体に結合しているのか否かを判定することができる。
【００３５】
本システム内で任意で使用されるロボット式ピペッタ１３５は、一般に知られており、当業者に使用されているタイプのものである。ある実施形態によると、例えば、限定ではないが、Ｔｏｍｔｅｃ，Ｉｎｃ．（米国、コネチカット州のハムデン）またはＣＲＳ  Ｒｏｂｏｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カナダ、オンタリオ州のバーリントン）が製造および市販しているロボット式ピペッタシステムを使用することができる。
【００３６】
洗浄器１４０は、画像収集システム１３０からロボット式ピペッタ１３５のロボットアームの到達距離範囲内に任意で配置される。洗浄器１４０は、その中にフィルター容器１０５、多数のフィルター容器１０５、および／またはフィルター容器のプレート１０６を配置することが可能なサイズおよび形状のものである。洗浄器１４０は、アッセイ混合物中に存在する抗原担体からすべての試薬を洗い落として、フィルター容器１０５のフィルター１５０に通すように設計される。あるいは、ＲＢＣなどの抗原担体が、遠心分離後、フィルター容器１０５の底一面に均等に分散されている場合、洗浄器１４０を使用して、ＲＢＣ層の上にある液体を吸引するか、ピペットで取り除き、その後、ＲＢＣの上により多くの液体をピペットまたは別途方法で分配してもよい。洗浄を含むこれらの工程を、複数の回数、反復してもよい。洗浄器１４０の構造は多数あるだろうが、洗浄器１４０は、真空吸引またはピペッティングシステムでありうる。
【００３７】
図２は、図１の免疫学的システム１００のフィルター容器１０５構成要素の一例を描写している。図２は、試料分離のために遠心分離機１２５内に配置する前の、分析される試料１４７を収容しているプレート構造１０６内の多数のフィルター容器１０５（ａ）、および遠心分離機１２５から取り出した後の該容器（ｂ）を表している。図２でわかるように、フィルター１５０は、フィルター容器１０５内に配置されている。遠心分離後、抗原担体１５５が、フィルター容器１０５内のフィルター１５０の底一面に均等に分散されていることに注目されたい。
【００３８】
多様な実施形態に従って、フィルター１５０の細孔径を変化させることができる。例えば、フィルター１５０の細孔は、約０．０１ミクロン（μｍ）から約５０μｍの範囲のサイズのものである。フィルター１５０の細孔のサイズは、フィルター容器１０５の用途に依存する。この用途のある実施形態において、フィルター１５０を使用して、例えばＲＢＣ凝集体を保持し、一方個々の赤血球はフィルター１５０の細孔を通過させることが望まれる場合、細孔径の範囲は、約３μｍから約４０μｍの間である。しかし、抗原担体を保持するが、抗体を含有する液体は通過させるためにフィルター容器１５０が使用される、抗原担体（例えば、ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板または合成ビーズ）から液体のみを濾過して除去するためにフィルター容器１０５を使用する場合、好ましい実施形態における細孔径の範囲は、約０．１μｍから約３μｍである。さらに好ましくは、この細孔径は、約０．２μｍから約１．２μｍの範囲である。この方法論に最適な細孔径は、０．４５μｍである。
【００３９】
フィルター１５０が、非常に小さな（例えば約０．２から約１．２μｍの）細孔径を含むとき、該フィルターは、抗原担体から液体をさほど有効に濾過させて除去することができないこともある。この場合、フィルター１５０は、不規則な地形の凹凸のある表面として機能し得、これが、フィルター容器１０５が試料分離システム１１５（例えば遠心分離機１２５）の中に置かれているときに、アッセイ試料中の反応済成分をフィルター容器の底面上に均等に広がらせる。遠心分離後にフィルター容器の底一面にＲＢＣまたは他の抗原担体が均等に広がっていることにより、抗原担体の集合または凝集が低減され、ならびに特にその画像収集システム１３０がフローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータである場合、画像収集システム１３０によるアッセイ試料における相互作用の存在の分析がより容易かつ正確になる。
【００４０】
別の実施形態では、フィルター容器１０５の厚さは、フィルター１５０の用途に依存して変化しうる。例えば、フィルター１５０の厚さは、約３μｍから約５ｍｍの範囲でありうる。好ましい実施形態において、フィルター１５０の厚さは、約３μｍから約１００μｍの間である。場合により、フィルター１５０の厚さは、約１０μｍから約７５μｍの間である。
【００４１】
上述のように、フィルター容器１０５の様々な実施形態において、フィルター１５０は、多くの異なるタイプの材料から製造することができる。好ましい実施形態において、フィルター１５０は、不活性材料および多数の細孔を含む。フィルター１５０の不活性材料は、フィルター１５０の用途に依存して変更しうる。
【００４２】
例えば、フィルター１５０の機能が、遠心分離後、フィルター１５０の表面上に反応済成分を均一に広がらせる機能である場合、フィルター１５０の不活性材料は、例えば、ポリプロピレン、ナイロン、硝酸セルロースおよびポリフッ化ビニリデン材料でありうるが、これらに限定されない。好ましくは、フィルター１５０は、下記のうちの１つから製造される：０．４５ミクロン（μｍ）サイズの細孔を有するポリプロピレン（英国、ケント州のＷｈａｔｍａｎ  ｐｌｃによって製造され、同社からＵｎｉＦｉｌｔｅｒ（登録商標）として市販されているもの）；０．４５μｍサイズの細孔を有する硝酸セルロース（Ｗｈａｔｍａｎ  ｐｌｃによって製造され、同社からＵｎｉＦｉｌｔｅｒ（登録商標）として市販されているもの）、０．４５μｍサイズの細孔を有するナイロン６，６（米国、ニューヨーク州、ロチェスターのＮａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって製造され、同社からＳｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（商標）として市販されているもの）；１．２μｍサイズの細孔を有するナイロン６，６（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによって製造され、同社からＳｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（商標）として市販されているもの）；０．２μｍサイズの細孔を有するＨＰＶＭ膜（米国、ニューヨーク州、ロチェスターのＮａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｎａｔｉｏｎａｌによって製造され、同社から市販されているもの）；１．０μｍサイズの細孔を有するポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）（米国、マサチューセッツ州、ベッドフォードのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．により製造され、同社からＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（登録商標）として市販されているもの）；１．２μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ；０．２μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｉｎｃ．により製造され、同社から市販されているもの）；０．２μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ（米国、マサチューセッツ州、アクロンのＣｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造され、同社から市販されているもの）；および０．２５μｍサイズの細孔を有するＰＶＤＦ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって製造され、同社から市販されているもの）。ある実施形態においては、０．４５μｍサイズの細孔を有するポリプロピレンが、最適なフィルター材料１５０として機能することが判明した。
【００４３】
図３は、図２で描写した容器１０５に対し別の実施形態である容器１０６を図示するも。この容器１０６は、免疫学的システム１００において容器１０５の代わりに使用することができる。容器１０６は、上述の凹凸のある地形を有する底、または上述のフィルター材料のいずれかを含み得る。この凹凸のある地形またはフィルター材料は、下で論じるような遠心分離後、抗体担体１５５を容器１０６の底面上に均等に広げることを助長する。
【００４４】
図４は、免疫学的システム１００の一構成要素である遠心分離機１２５の１つのタイプである試料分離システム１１５を描写している。当業者に公知であり、使用されているあらゆるタイプの遠心分離システムを、遠心分離機１２５として使用することができることは、理解されよう。フィルター容器１０５および／またはフィルタープレート１０６を保持するように改良されているのであれば、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ（米国、カルフォルニア州、フラートン）によって製造され、同社から市販されている典型的な遠心分離機を、ある実施形態に応じて使用することができる。図４に示した遠心分離機１２５は、好ましい実施形態において使用される遠心分離の角度を示している。多様な角度を用いうるが、好ましい実施形態において、フィルター容器１０５は、遠心分離機が静止しているとき回転軸１７５に対して０℃の角度で始まり、遠心分離中に９０℃の角度に移動し、遠心分離終了時に０℃の角度に戻る「スイングバケットローター」の中に置かれる。
【００４５】
免疫学的システム１００のある実施形態において、フィルター容器１０５、試料およびフィルター１５０の向きは、試料分離システム１１５が、試料をフィルター１５０と接触させ、フィルター１５０の呼び細孔径より小さい試料の成分を、フィルター１５０を通過させてフィルター１５０の下の収集リザーバーに行かせて、大きすぎてフィルター細孔を通ることに適さずにフィルター１５０の上のフィルター容器１０５に残る試料の成分と分離することができるような向きである。
【００４６】
免疫学的システム１００のある実施形態において、容器１０５は、上述の凹凸のある地形を有する底、または上述のフィルター材料のうちのいずれかを含み得る。該凹凸のある地形またはフィルター材料は、容器１０５の底面上へ抗原担体１５５が均等に広がることを助長する。凹凸のある地形またはフィルター材料は、遠心分離中に抗原担体１５５が容器１０５の一部または片側のみに移動するのを防止する。抗原担体１５５が、遠心分離中に容器１０５の一部に移動すると、抗原担体１５５は凝集して大きな凝集塊になり、分散させることおよび画像収集システム１３０により正確に読み取ることが難しくなりうる。従って、この容器１０５は、特に画像収集システム１３０がフローサイトメータまたはキャピラリーサイトメータであるとき、画像収集システム１３０から得ることができる結果を向上させる。
【００４７】
本発明の他の実施形態には、免疫学的アッセイ方法が含まれる。この方法は一般的に、希釈された免疫血液学的試料と希釈された試薬を混合して試料混合物を作成する工程、該試料混合物をフローサイトメトリーにより分析する工程、および、所定の成分が該免疫血液学的試料中に存在するか否かを判定する工程を含む。この方法は、例えば次のタイプのアッセイに応用することができる。
【００４８】
ＡＢＯ／Ｄおもて検査法
本開示方法のある実施形態においては、標識されていない一次マウス抗体を使用し、市販の抗マウス免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）蛍光標識二次抗体を使用して、その存在を検出する。
【００４９】
フローサイトメトリーを使用する血液型判定にこの技法を応用可能とするために、次の方法を利用しうる。ＲＢＣと抗体を混合し、その後、ＲＢＣを洗浄した後にＲＢＣの凝集が発生しないまたは最小限にしか発生しないところまで、一次ＩｇＭ抗体を希釈する。可能性のある多数の希釈度を用いることができるが、約１：５００から１：１０００の希釈度が、最適な結果を呈す。この方法は、おもて検査法に付随する試薬コストを低減させる。ここで本方法が開示されるまでは、一般に、本発明分野では、高感度の血液型判定には高い抗体力価が必要であると考えられていた。しかし、本方法では、フローサイトメトリーにより高感度検出が利用可能であるため、上記抗体希釈物を使用して血液型判定を行い得ることが、実際の実験データにより示されている。例えば、異なる希釈度の抗Ａ抗体（１：５０から１：１０００）を使用して、Ｏ型ＲＢＣ（Ａ抗原を有さない）またはＡ型ＲＢＣ（Ａ抗原を有する）のいずれかを着色した代表データを表１に示す。ＲＢＣの蛍光シグナルをフローサイトメトリーによって収集し、平均蛍光を計算した。Ｏ型ＲＢＣは、Ａ抗原を有さないので、極めて低い蛍光を有することに注目されたい。抗Ａ抗体が１：１０００に希釈されているときでさえ、Ａ型ＲＢＣの平均蛍光（１９．５）が、Ｏ型ＲＢＣのもの（４．１１）より未だ有意に高いことは、注目に値する。従って、免疫血液学的検査に一般に使用される抗体は、抗体−ＲＢＣ相互作用がフローサイトメトリーによって検出されるときには、この分野で可能であると一般に考えられているものより、ずっと低い濃度まで希釈され得る。
【００５０】
【表１】
2007524831.tif 000003
【００５１】
二次抗体も、適切な希釈度で使用されることが望ましい。高すぎる力価を有する抗体を使用すると、通常、凝集が生成するものと考えられる。可能性のある多くの希釈度を用いることができるが、約１：１００の希釈度が、最適な結果を呈す。この方法もまた、おもて検査法に付随する試薬コストを低減させる。ＩｇＭ分子は、蛍光タグと直接結合させることが通常難しいが、標識ＩｇＭ抗体の作成により、二次抗体使用の必要が無くなり、故に、凝集を低減させることとなろう。さらに、細胞に対する抗原を検出するためのフローサイトメトリーの標準的な使用では、殆どの抗体を４℃で細胞とともにインキュベートしなければならない。例えば、該二次抗体のインキュベーションが、約１：１００希釈では、意外にも室温で有効に行うことができる。
【００５２】
最後に、上記のように適切な抗体希釈物を使用していても、典型的な試験管の中で細胞を遠心分離によって洗浄すると、すべての細胞が集まって緊密な１個のペレットになり、それを抗体が架橋させることがあるため、やはり、多少の凝集が生じることがある。このレベルの凝集は、フローサイトメトリー分析には大きすぎることがある。そのため、上述のような一次および二次抗体の適切な希釈物の使用に加えて、ＲＢＣを強固に凝集させない洗浄手順を利用してもよい。２つのそうした手順が知られている：（１）真空濾過を利用し、有効に架橋するほど互いに近接しないように細胞をフィルター上に広げる、迅速自動フローサイトメトリー検査（Ｒａｐｉｄ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｔｅｓｔｉｎｇ（ＲＡＦＴ））法。この技法は、米国特許仮出願第６０／１７９，２４８号、米国特許出願第０９／７７３，８２６号、および特許協力条約特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０３２０６号（これらはすべて、本明細書に参考として組み込まれている）に記載されている；（２）真空濾過を使用するのではなく、下で説明するようにマイクロタイタフィルタープレートを低速で遠心分離する工程。
【００５３】
上述のように、伝統的に、従来のアッセイ法では、ＲＢＣ上のＡ、ＢおよびＲｈ（Ｄ）抗体の存在を検出するために３本の別の試験管／反応を設定する必要があった。しかし、本開示方法および装置においてフローサイトメトリーを使用することにより、３つすべての抗原を１本の試験管で同時に検出することができる。このタイプのマルチプレクシング（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）は、多数の方法で行うことができる。
【００５４】
ある実施形態において、抗Ａ、抗Ｂおよび抗Ｒｈ（Ｄ）抗体は各々、別々に、異なる蛍光レポーター分子で標識することができる。例えば、ヒトＩｇＧ抗Ｒｈ（Ｄ）抗体は、市販のキットを使用してイソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で直接標識することにより、この用途に使用することができる。別の実施形態において、ＩｇＭ抗体が異なる種（例えばヒトＩｇＭ抗ＡおよびマウスＩｇＭ抗Ｂ）由来のものである場合には、それらを識別する異なる二次抗体（異なる蛍光タグを含有するもの）を使用することができる（例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＭおよびヤギ抗マウスＩｇＭ）。
【００５５】
ＡＢＯうら検査法
おもて検査法とは対照的に、一次抗体の強度は、患者ごとに異なるので、制御することができない。この理由で、洗浄において適切な方法を使用することにより、ＲＢＣの凝集が防止される。上と同様、この方法は、米国特許出願第０９／７７３，８２６号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０３２０６号に記載の技法、または本明細書において下記にて説明する技法のいずれかを使用する。おもて検査法と同様、二次抗体の力価は、凝集を制限するために適切に決定する。うらＡＢＯ血液型検査における方法の一例の詳細を下の表２に示す
【００５６】
【表２】
2007524831.tif 000004
【００５７】
予想外なＲＢＣ同種異系抗体のスクリーニング
ここで開示される予想外ＲＢＣ同種異系抗体をスクリーニングするためのアッセイ方法は、うら検査法について上で説明した方法と同様である。例えば、ここで開示されるアッセイは、上の表２にある例に従って行うことができる。
【００５８】
さらに別の実施形態として、図５のフローチャートに描いたような免疫学的アッセイ方法１８０が挙げられる。この免疫学的アッセイ方法１８０は、ブロック１８５に見られるような、免疫血液学的試料をフィルター容器１０５または容器１０６に入れる任意の工程を含む。ブロック１９０に示したように、次の工程は、フィルター容器１０５または１０６へのアッセイ試薬の添加を含む。ブロック１９５に示した次の任意の工程は、前記試料と試薬を混合して、試料混合物２００を作る工程である。ブロック２０５に示したように、この方法は、その試料混合物２００をインキュベートする工程を任意で含む。
【００５９】
ブロック２０５に示したインキュベーション工程において、試料混合物２００を約４℃から約３７℃の範囲の温度でインキュベートし得る。好ましい実施形態において、試料混合物２００は、ほぼ室温（２０〜２５℃）と約３７℃の間の温度範囲でインキュベートされる。試料混合物２００のインキュベーション時間は、インキュベーション無しから約３０分のインキュベーション時間の範囲でありうる。好ましい実施形態において、インキュベーション時間は、約２から約５分の範囲である。
【００６０】
この任意のインキュベーション後の、ブロック２１０に描写したような次の任意の工程は、試料混合物２００を様々な成分に分離する工程である。この工程は、試料混合物２００を収容しているフィルター容器１０５および／またはプレート１０６を試料分離システム１１５の中に置くことによって、通常、達成される。ブロック２１０の分離工程において使用する試料分離システム１１５が、遠心分離機１２５である場合、その遠心分離速度は、好ましくは約１００から約１，０００  ×  重量加速度（ｇ）の速度であるが、他の速度を使用してもよい。好ましい実施形態において、この遠心分離の最高速度は、約２５０ｇから４００ｇの範囲である。遠心分離時間は、約５秒から約５分の範囲でありうる。好ましい実施形態では、最高遠心分離時間が約１分であるが、他の時間を用いてもよい。
【００６１】
試料を遠心分離すると、ＲＢＣまたは他の抗原担体は、容器の底に均等に分散され、その上にある液体は、残留抗体、または抗原担体と反応していない他の試薬を含有し得る。ブロック２１２に示したように、その上清液を容器１０５／１０６から除去してもよい。除去は、例えば、ロボットピペッティングなどのピペッティング、または未反応成分の単なる注ぎ出しによって達成することができるが、これに限定されない。
【００６２】
上清液を除去する場合、フィルター容器の底に残っている抗原担体を任意で洗浄してもよい。この洗浄工程は、ブロック２１３に示したように、該抗原担体への緩衝溶液の添加によって達成することができる。この緩衝溶液は、例えば、食塩水、例えば０．９％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液；リン酸緩衝食塩水；またはこのアッセイ方法中に細胞成分の生存を保つあらゆる生理食塩液でありうるが、これに限定されない。好ましい実施形態では、ｐＨ７．４の０．９％（重量／容量）ＮａＣｌの溶液を使用する。この緩衝液は、ピペッタまたは他の手段により添加することができる。
【００６３】
緩衝溶液を添加した後、前記緩衝液を、ブロック２０５に示したように抗原担体とともに任意でインキュベートしてもよく、その後、場合によっては、ブロック２１０にあるようにその上清液から抗原担体を除去してもよく、また、ブロック２１２にあるようにその上清を除去してもよい。試料混合物２００がその用途に適するように充分に洗浄されるまで、１回から約１０回、このプロセスを繰り返し得る。
【００６４】
前記洗浄工程は、生理食塩液を用意する工程、および約１０マイクロリットルから約５ミリリットルの生理食塩液を試料混合物２００に添加する工程を含み得る。ブロック２０５、２１０、２１２および２１３に含まれている任意の洗浄工程の後、ブロック１９０に示した工程に進めることにより、試料を他の抗体などのさらなる試薬と反応させてもよい。これらの工程は、矢印により図示した順序で、選択されたあらゆる回数、繰り返すことができるが、好ましくは１回と５回の間である。
【００６５】
ブロック２１５に示したように、任意の分離工程２１０、任意の液体除去工程２１２および任意の洗浄工程２１３の後、フィルター容器１０５および／またはプレート１０６を分析して、試料２００中の相互作用の有無を判定してもよい。試料２００は、画像収集システム１３０内にフィルター容器１０５および／またはプレオート１０６を置くことによって分析する。アッセイ試料と試薬の間の相互作用が、ブロック２１５に示したような分析工程における画像収集システム１３０によりフィルター１５０上の材料において検出されれば、免疫血液学的アッセイ方法１８０は完了する。アッセイ結果は、例えばアッセイ試料中の細胞成分と抗体試薬の間に相互作用かあるかどうかに基づいて判定することとなる。
【００６６】
該相互作用は、それ自体、抗体による細胞成分の凝集が形成されていることまたは共に集塊をなしていることの証拠となる。該凝集は、画像収集システム１３０によって検出することができる。同様に、該アッセイ方法は、画像収集システム１３０により抗体成分による細胞試薬の凝集の存在または不在を検出することによって、アッセイ試料中の抗体成分と細胞性試薬との間の相互作用を検出するために使用することができる。あるいは、これらのアッセイで使用される抗体を、蛍光染料に結合させるか、または別途手法で標識してもよい。この場合、標識抗体と抗原担体の間の相互作用は、フローサイトメトリーまたはキャピラリーサイトメトリーを用いて該抗原担体の蛍光標識として検出することができる。この実施形態では、ＲＢＣまたは他の抗原担体の一切の凝集を最少にすることが望ましい。
【００６７】
本開示アッセイシステムおよび方法の上記実施形態は、実施の単なる可能な例であり、本明細書において開示する原理の明確な理解のためだけに提示されていることを強調しておく。本発明の精神および原理から実質的に逸脱することなく、上記実施形態（複数を含む）に多くの変形および修正を施すことができる。そうした修正および変形は、本明細書における本開示の範囲内に包含され、特許請求の範囲により保護されるものと考える。
【００６８】
優先権主張
本出願は、２００３年６月２４日に出願され、米国実用特許出願番号１０／６０２，９８１を与えられた、「免疫学的アッセイのシステムおよび方法」と題する同時係属米国出願への優先権を主張するものである。前記出願は、参考として本明細書に全面的に組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明で開示される免疫学的システムの代表例を説明する図である。
【図２】図１の免疫学的システムのフィルター容器内での試料と試薬の混合物の間の相互作用を図示する。
【図３】相互作用した試料と試薬を描く、図１の免疫学的システムのフィルター容器の代表例を図示する。
【図４】運転中の遠心分離機の具体例として、図１の免疫学的システムの分離システム要素の代表例を図示する。
【図５】図１の免疫学的システムを使用する、本発明で開示される免疫学的アッセイ方法の代表例のフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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