(57)【要約】  本発明は、組織または血液試料から患者における卵巣癌の存在を検出するためのゲノム解析の使用およびこの測定を実施するためのキットに関するものである。さらに本発明は、卵巣癌患者の処置方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者が卵巣癌に罹患しているか否かの測定方法であって、
ａ）患者から試料を得、
ｂ）患者からの試料において表９に列挙した遺伝子の２個またはそれ以上の遺伝子発現レベルを測定し、
ｃ）（ｂ）で測定した２個またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルを表１に列挙した同遺伝子のレベルと比較し、
ｄ）（ｃ）で測定した２個またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現レベル間における類似度（ＤＯＳ）を測定し、そして
ｅ）２個またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現レベル間におけるＤＯＳから、試料が患者における卵巣癌の存在の証拠を示す確率を測定する
段階を含む方法。
【請求項２】
遺伝子発現レベルを、表９における遺伝子番号１〜２８を含む表に列挙した遺伝子のサブセットについて測定する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
試料が患者から得た細胞を含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
試料が、患者における固体腫瘍から取出した細胞を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
試料が、患者から抜取った血液細胞および血清を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
試料が、患者から抜取った体液を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
遺伝子発現レベルの測定方法が、患者からの試料におけるタンパク質発現産物レベルの測定を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
タンパク質発現産物の存在およびレベルが、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いて検出される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
試薬が、抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントから成る群から選択される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
表９における２個またはそれ以上の遺伝子の転写ポリヌクレオチドの試料におけるレベルを測定することにより、試料における発現レベルを評価する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
転写されたポリヌクレオチドがｍＲＮＡである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
転写されたポリヌクレオチドがｃＤＮＡである、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
検出段階がさらに転写ポリヌクレオチドの増幅を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
方法をエクスビボで実施する、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
卵巣癌に罹患した対象の処置方法であって、対象の細胞に、表６に示されている発現が卵巣癌でアップレギュレーションされる遺伝子の１個またはそれ以上と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを供給することを含む方法。
【請求項１６】
卵巣癌発症の危険性がある対象における卵巣癌の阻止方法であって、卵巣癌でアップレギュレーションされる表６に示した遺伝子の１個またはそれ以上の発現を阻止することを含む方法。
【請求項１７】
卵巣癌の疑いがある患者についての処置戦略の決定に使用されるキットであって、
ａ）表９における遺伝子の２個またはそれ以上のポリペプチド発現産物を認識し、それに結合し得る２個またはそれ以上の抗体、
ｂ）抗体および個体からの体液試料を含むのに適したもので、表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子が存在する場合、抗体をそれらにより発現されたポリペプチドと接触させ得る容器、
ｃ）表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子により発現されたポリペプチドと抗体の組合わせを検出する手段、および
ｄ）使用およびキットの結果の解釈についての説明書
を含むキット。
【請求項１８】
患者における卵巣癌の存在または非存在の決定に使用されるキットであって、
ａ）表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現産物を認識し、それに結合し得る２個またはそれ以上のポリペプチド、
ｂ）ポリヌクレオチドおよび個体からの体液試料を含むのに適したもので、ｍＲＮＡが存在する場合、ポリヌクレオチドをそれと接触させ得る容器、
ｃ）表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子からのｍＲＮＡとポリヌクレオチドの組合わせのレベルを検出する手段、および
ｄ）使用およびキットの結果の解釈についての説明書
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野に属し、ゲノム解析の使用による卵巣癌の評価および処置に関するものである。特に、本発明は、遺伝子発現パターンの測定による患者組織における卵巣癌の存在の決定に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
卵巣癌は、合衆国における女性が罹患する癌の最も多いタイプの一つであり、生涯発癌リスクは１／７０である。Whittemore、Gynecol.Oncol.、第５５巻、３号、２部、Ｓ１５−Ｓ１９頁（１９９４）参照。卵巣癌は通常発見が遅れがちな、急速に死に至る病気であり、依然として良い予防方法は無い。卵巣癌にとっての最大の危険因子は、病気の家族歴であることから、遺伝的性質の影響が強いと思われる。Schildkrautおよび Thompson、Am.J.Epidemiol.、１２８巻、３号、４５６−４６６頁（１９８８）参照。他の因子、例えば人口統計学、生活様式および生殖因子もまた、卵巣癌のリスクの一因であることが示されている。
【０００３】
卵巣生検およびセルラインの幾つかのマイクロアレイ発現解析を実施することにより、卵巣癌において特異的に過剰発現される遺伝子が同定された。Schummer et al.、Gene、２３８巻、２号、３７５−３８５頁（１９９９）参照。他の試験も試みることにより、遺伝子発現レベルと特異的腫瘍型との相関関係が明らかにされた。Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９８巻、３号、１１７６−１１８１頁（２００１）、および Ono et al.、Cancer Res.、６０巻、１８号、５００７−５０１１頁（２０００）参照。
【０００４】
これらの種類の試験は、腫瘍発生の分子機構に関する我々の理解を深め、場合によっては腫瘍の分類を改善することを目的としたもので、解析間でのオーバーラップがほとんど無い遺伝子のリストを提供している。技術的な差異の中には、試料の品質、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の増幅および異なるマイクロアレイプラットホームといった試験間における一貫性の見かけ上の欠如または低い再現性を部分的に説明し得るものもある。しかしながら、腫瘍の異質性は、試験間、特に少しの腫瘍しか分析されていない試験間で観察される差異の一因となる重要因子であると思われる。さらに、マイクロアレイ実験における遺伝子発現レベルの比較は、歴史的にはシグナル強度の比率（比率変化）を用いて行なわれてきたが、統計学的方法の使用は限られ、追加試料による確認は欠如している。
【０００５】
しかしながら、見かけ上高レベルで発現されるか、または発現の変化が最大である遺伝子が、必ずしも最も関連性があるとは限らないものであり得る。発現レベルが低いときでも、遺伝子の非常に堅固な調節の小さな崩壊が劇的な結果をもたらし得ることも考えられる。
【０００６】
すなわち、発現速度が卵巣癌において一貫性および信頼性のある形で改変されている遺伝子の同定が要望されている。かかるリストであれば、卵巣腫瘍発生および進行についての新たな考察を提供し、可能性のある新規薬剤標的、および病気の診断、モニターおよび処置を目的とするバイオマーカーを示唆できるはずである。
【発明の開示】
【０００７】
本発明においては、統計学的試験および最近報告された１点除外（leave-one-out）法［van't Veer et al.、Nature、４１５巻、６８７１号、５３０−５３６頁（２００２）参照］の組合わせを適用することにより、腫瘍および正常卵巣組織の発現プロファイルが分析され、これらのパターンについても、限定するわけではないが、血液および血清を含む様々な体液における遺伝子発現産物で測定され得る。van't Veer et al.、前出参照。
【０００８】
２つの独立した試料セット、すなわち試験セットおよび確認セットの試験により、卵巣腫瘍発生に伴う幾つかの既知遺伝子の関与が確認されるだけでなく、新規遺伝子が同定される。これらの発見は、卵巣腫瘍発生および進行についての新たな考察をもたらすもので、可能性のある新たな薬剤標的、および病気の診断および監視を目的とするバイオマーカーが示唆される。
【０００９】
一実施態様において、本発明は、患者が卵巣癌に罹患しているか否かの測定方法であって、
ａ）患者から試料を得、
ｂ）患者からの試料において表９に列挙した遺伝子の２個またはそれ以上の遺伝子発現レベルを測定し、
ｃ）（ｂ）で測定した２個またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現レベルを表１に列挙した同遺伝子のレベルと比較し、
ｄ）（ｃ）で測定した２個またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現レベル間における類似度（ＤＯＳ）を測定し、そして
ｅ）２個またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現レベル間におけるＤＯＳから、試料が患者における卵巣癌の存在の証拠を示す確率を測定する
ことを含む方法を提供する。
【００１０】
好ましい実施態様において、本発明は、表９における遺伝子番号１〜２８を含む表９に列挙した遺伝子のサブセットについて遺伝子発現レベルを測定する方法を提供する。
【００１１】
別の実施態様では、本発明は、患者から得た細胞を含む試料を用いる。これらは、患者における固体腫瘍から取出した細胞であり得るか、または好ましい実施態様では、試料は患者から抜取った血液細胞および血清を含む。最も好ましい実施態様において、試料は患者から抜取った体液を含む。
【００１２】
好ましい実施態様において、本発明は、患者からの試料におけるタンパク質発現産物のレベルの測定を含む遺伝子発現レベルの測定方法を用いる。これは、限定するわけではないが、タンパク質と特異的に結合する試薬を用いたタンパク質発現産物の存在およびレベルの検出を含む様々な方法で行われ得、この場合、試薬は、抗体、抗体誘導体および抗体フラグメントから成る群から選択され得る。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、表９における２個またはそれ以上の遺伝子の転写ポリヌクレオチドの試料中におけるレベルを測定することにより、試料における発現レベルを評価する方法を提供する。これらの転写ポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であり得る。
【００１４】
好ましい実施態様において、この方法は、さらに転写されたポリヌクレオチドの増幅段階を含む。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、卵巣癌に罹患した対象の処置方法であって、表８に示した発現が卵巣癌でアップレギュレーションされる遺伝子の１個またはそれ以上と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを対象の細胞に供給することを含む方法を含む。
【００１６】
さらに、本発明は、卵巣癌発症の危険性がある対象における卵巣癌の阻止方法であって、卵巣癌でアップレギュレーションされる表８に示した遺伝子の１個またはそれ以上の発現を阻害することを含む方法を提供する。
【００１７】
本発明はまた、卵巣癌の疑いがある患者についての治療戦略の決定に使用されるキットであって、
ａ）表９における遺伝子の２個またはそれ以上のポリペプチド発現産物を認識し、それに結合し得る多数（例えば、２個またはそれ以上）の抗体、
ｂ）抗体および個体からの体液試料を含むのに適したもので、表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子が存在する場合、抗体をそれらにより発現されたポリペプチドと接触させ得る容器、
ｃ）表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子により発現されたポリペプチドと抗体の組合わせを検出する手段、および
ｄ）使用およびキットの結果の解釈についての説明書
を含むキットを提供する。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、患者における卵巣癌の存在または非存在の決定に使用されるキットであって、
ａ）表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子のｍＲＮＡ発現産物を認識し、それに結合し得る多数（２個またはそれ以上）のポリヌクレオチド、
ｂ）ポリヌクレオチドおよび個体からの体液試料を含むのに適したもので、ｍＲＮＡが存在する場合、ポリヌクレオチドをそれと接触させ得る容器、
ｃ）表９に示した２個またはそれ以上の遺伝子からのｍＲＮＡとポリヌクレオチドの組合わせのレベルを検出する手段、および
ｄ）使用およびキットの結果の解釈についての説明書
を含むキットを提供する。
【００１９】
図面の簡単な説明
図１（Ａ）。プローブセットの増加数を用いた試料の再分類。
【００２０】
図１（Ｂ）。分類遺伝子の最適数決定に関するプローブセットの数の関数としての誤差のプロット。上限６から上限５５（Ａ）または全９００（Ｂ）までの個々のプローブセットの増加数による計算値。矢印は、誤分類を最小限にするプローブセットの最小数（Ｎ＝２８）を示す。
【００２１】
図２。卵巣状態の分類についての閾値ＣＣ値の測定。
【００２２】
図３。異なるサイズのプローブセットに関する試験および確認生検プロファイルと平均正常プロファイルの相関関係。ＮまたはＴは、それぞれ正常または腫瘍状態を表す。「ｒ」は、平均正常プロファイルをもつ対応する生検試料（１群）のプローブセットプロファイルのＰＣＣ値である。試料を最高ＣＣから最低まで順序づけている。
【００２３】
図４。異なるサイズのプローブセットについての全正常プロファイルの平均と生検プロファイルの相関関係。ＮまたはＴは、それぞれ正常または腫瘍状態を表す。「ｒ」は、全正常試料の平均プロファイルをもつ対応する生検試料のプローブセットプロファイルのＰＣＣ値である。試料を最高ＣＣから最低まで順序づけている。
【００２４】
発明の実施方法
本発明は、限定するわけではないが、患者からの生検組織または血液、血清または他の体液を含む患者からの試料が、患者における卵巣癌の存在の証拠を含むか否かを測定する方法を提供する。
【００２５】
本発明は、一部には、正常組織との比較による、卵巣癌からの組織で特異発現される約９００遺伝子の発見に基いている。この本発明方法は、正常組織との比較による、卵巣癌で特異発現されることが示されている約９００またはそれより少ない遺伝子の活性の測定を含む。
【００２６】
好ましい実施態様においては、９００遺伝子のうちの小さなフラクションのみを測定する。様々な実施態様で、これらの測定は、生検などからの組織自体におけるものであり得、または好ましい実施態様においては、限定するわけではないが、血液または他の体液を含む様々な組織におけるｃＲＮＡまたはポリペプチド発現産物を含む遺伝子発現のさらに間接的な測定として実施され得る。
【００２７】
次いで、組織状態が未知である個体から得たこれら９００遺伝子の２個またはそれ以上の発現割合の直接的または間接的測定結果は、卵巣癌組織または正常組織で測定された同じ２個またはそれ以上の遺伝子についての発現値と比較され得る。
【００２８】
次いで、癌組織対正常組織に対して未知の２個またはそれ以上の遺伝子発現値の「類似度」（ＤＯＳ）を測定する。
【００２９】
このＤＯＳは、得られる値が、２群の数、すなわち卵巣癌状態が未知であり、測定されるべき個体からの組織における２個またはそれ以上の遺伝子について測定した遺伝子発現値および組織が卵巣癌を含むことが判明している個体および組織が卵巣癌を含まないことが判明している個体からの同じ２個またはそれ以上の遺伝子について測定した遺伝子発現値の間におけるＤＯＳの既知関数であるという結果をもたらす手順により測定され得る。
【００３０】
本明細書で使用されている「ＤＯＳ」の語は、直接的または間接的方法により決定された遺伝子発現値の比較により測定される、遺伝子発現値のパターンが同様であるかまたは数値的に類似している程度をいう。
【００３１】
好ましい実施態様では、ＤＯＳは、相関係数（ＣＣ）をもたらす数学的計算により決定される。特に好ましい実施態様では、ピアソン相関係数（ＰＣＣ）を決定するが、得られる値が２群の数の間におけるＤＯＳの既知関数であるという結果を生じるものであれば他の数学的手順でも使用され得る。
【００３２】
次いで、かくして算出されたＤＯＳ（ＰＣＣ）の値は、組織試料が、卵巣癌に罹患している場合または罹患していない場合の患者からのものである確率と直接関連付けられ得る。すなわち、患者のＤＯＳ（ＣＣまたはＰＣＣ）が、卵巣癌に罹患していない患者からの遺伝子発現値と比べて高いとき、またはＤＯＳ（ＣＣまたはＰＣＣ）が、卵巣癌ではない患者からの遺伝子発現値と比べて高いとき、患者が卵巣癌に罹患していない場合または罹患している場合の確率はそれぞれ大きくなる。
【００３３】
すなわち、所定の症例において、ＤＯＳの値を用いることにより、卵巣癌の存在確率が決定され得る。当業者であれば、各患者についての臨床環境によりカットオフとして使用されるかまたは特異的患者に関して臨床的決定を下す助けとなるＤＯＳ（ＰＣＣ）の値が決定されることは理解できるはずである。例えば、一実施態様では、最適な精度で卵巣癌患者の一群の数を測定することが望ましい。これは、偽陽性（卵巣癌有りとして誤分類された卵巣癌無し）を最小限にすると同時に偽陰性（卵巣癌無しとして誤分類された卵巣癌有り）を最小限にすることを意味する。
【００３４】
本発明の好ましい一実施態様では、これは、２８予測プローブセット（下記）を用いて、図３に示されている通りの結果を生じ、遺伝子発現プロファイルがＣＣ≦０.９２０で平均正常（卵巣癌無し）プロファイルと相関関係を示す場合、組織試料は、ＣＣ＞０.９２０の場合より６３倍高い確率［オッズ比（ＯＲ）＝６３、９５％信頼区間（ＣＩ）：３.３−１１９４.７］で卵巣癌を含むと思われる。
【００３５】
本発明の一実施態様でこの閾値を使用するため、遺伝子発現プロファイルが、平均非卵巣癌発現プロファイルとの比較時に＞０.９２０のＰＣＣに達する患者は、非卵巣癌群に分類され、卵巣癌に罹患していないと推測され、発現プロファイルが≦０.９２０のＰＣＣであった患者は、卵巣癌群に分類され、高い確率で卵巣癌に罹患していると推測される。
【００３６】
さらなる好ましい実施態様において、ＰＣＣは最適感度を生じるように設定され得る。すなわち、偽陰性（卵巣癌無しと誤分類された卵巣癌有り）となり得る数を最小限に抑える。かかる最適感度設定は、卵巣癌発現の可能性を達成可能な最大の確実性でもって排除しなければならない状況で指示される。この実施態様において、閾値は、ＰＣＣを＞０.９５５に設定することにより決定される。この場合、与えられた例において、表９に示した２８予測プローブ（表９に示したプローブセット１〜２８）を用いると、非卵巣癌群と比べてＣＣが＞０.９５５である患者の１００％は卵巣癌に罹患しておらず、非卵巣癌群と比べてＣＣが＜０.８７０である患者の１００％は卵巣癌に罹患していた。
【００３７】
実施例で示したところによると、当業者であれば、感度を最大にするかまたは特異性を最大にするかまたは偽陽性または偽陰性の率を望ましいものにするＰＣＣを選択できるはずである。当業者であれば、容易に臨床的状況に合わせてＰＣＣの選択を調節することにより、最大の恩恵および安全性を患者に提供できるはずである。
【００３８】
本発明の別の側面は、卵巣癌の処置方法である。これらの方法は、卵巣癌でアップレギュレーションされることが見出された遺伝子の過剰な遺伝子発現を抑制する様々な努力により構成される。これらの遺伝子は表８に示されている。これらの遺伝子の過剰な発現を減少させる方法には、限定するわけではないが、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡの使用およびこれらの過剰発現遺伝子のタンパク質発現産物を複合させ不活化する方法がある。
【００３９】
測定方法
本発明の実施態様の中には、９００遺伝子の選択された群の遺伝子発現を、下記の通り組織試料からのｍＲＮＡレベルを測定することにより決定する場合もある。
【００４０】
実施態様の中には、限定するわけではないが、腫瘍および血液組織を含む組織においてポリペプチド遺伝子発現産物を測定することにより、遺伝子発現をより間接的に測定し得るものもある。
【００４１】
実施態様の中には、表９に列挙した遺伝子の一つによりコード化される１種またはそれ以上のタンパク質の存在または量を同定することにより、遺伝子発現を測定する場合もある。
【００４２】
本発明はまた、興味の対象である２種またはそれ以上のマーカー、例えば表２からの２種またはそれ以上のマーカーを検出するシステムを提供する。例えば、特定マーカーの限られたセットが関連性のある情報を提供すると決定されている場合、限られたセットのマーカーを検出する検出システムが提供される。例えば、一般的なマイクロアレイにより組織で発現される全遺伝子を検出するのとは反対に、特定されたマイクロアレイまたは他の検出技術を用いることにより、生物学的状態、例えば卵巣癌の存在または非存在などを特定する複数、例えば２８、４２などのマーカーを検出する。
【００４３】
本発明が、遺伝子発現バイオマーカーが検出または測定される方法により制限されることは無い。実施態様によっては、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質を、組織試料、例えば生検試料で検出する場合もある。他の実施態様では、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはタンパク質を、体液、例えば血清、血漿、尿または唾液で検出する。本発明の好ましい実施態様によると、本発明方法はエクスビボで実施される。さらに本発明は、これら関連性のある遺伝子発現バイオマーカーを検出するためのキットを提供する。
【００４４】
好ましい実施態様の中には、タンパク質またはポリペプチド発現産物を検出するものもある。タンパク質発現は、適切な方法により検出され得る。実施態様によっては、タンパク質に特異的な抗体の結合によりタンパク質を検出する場合もある。例えば、実施態様によっては、限定するわけではないが、ラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」免疫検定法、免疫放射線検定法、ゲル拡散沈澱反応、免疫拡散検定法、例えばコロイド状金、酵素または放射性同位元素標識を用いる、in situ免疫検定法、例えばウエスタンブロット、沈澱反応、凝集検定法、例えばゲル凝集検定法、血球凝集反応検定法など、補体固定検定法、免疫蛍光検定法、プロテインＡ検定法、免疫電気泳動検定法およびプロテオーム検定法、例えばゲル電気泳動結合質量分析法の使用による試料中の多タンパク質の同定を含む適切な技術を用いて抗体結合を検出する場合もある。
【００４５】
一実施態様において、一次抗体における標識を検出することにより、抗体結合を検出する。別の実施態様では、一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより、一次抗体を検出する。さらなる実施態様では、二次抗体を標識する。免疫検定法において結合を検出するための多くの方法が当業界では知られており、本発明の範囲内に包含される。
【００４６】
実施態様の中には、自動式検出検定法を使用する場合もある。免疫検定法の自動式方法には、限定されるわけではないが、米国特許第５８８５５３０号、同第４９８１７８５号、同第６１５９７５０号および同第５３５８６９１号に記載されたものがあり、これらの各々については、出典明示により援用する。実施態様の中には、結果の分析および提示についても自動化されている場合がある。例えば、実施態様によっては、マーカーに対応する一連のタンパク質の存在または非存在に基いて診断および／または予後を下すソフトウェアを使用する場合もある。
【００４７】
他の実施態様では、米国特許第５５９９６７７号および同第５６７２４８０号（各々、出典明示により援用する）に記載された免疫検定法を使用する。他の実施態様では、タンパク質を免疫組織化学により検出する。さらに他の実施態様では、ｃＤＮＡまたはＲＮＡレベルでマーカーを検出する。
【００４８】
本明細書で使用されている「遺伝子発現バイオマーカー」の語は、特異的遺伝子の遺伝子発現の割合または程度を示し得る生物学的マーカー、例えば限定されるわけではないが、特異的遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはポリペプチド発現産物を全て包含するものとする。
【００４９】
本発明の実施態様の中には、ＰＣＲに基く検定法を用いて遺伝子発現バイオマーカーを検出するものもある。さらに他の実施態様では、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてＲＮＡの発現を検出する。ＲＴ−ＰＣＲでは、逆転写酵素を用いてＲＮＡを酵素的にｃＤＮＡに変換する。次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲ反応についての鋳型として使用する。ＰＣＲ産物は、限定されるわけではないが、ゲル電気泳動およびＤＮＡ特異的染料による染色または標識プローブへのハイブリダイゼーションを含む適切な方法により検出され得る。
【００５０】
実施態様の中には、米国特許第５６３９６０６号、同第５６４３７６５号および同第５８７６９７８号（各々、出典明示により援用する）に記載された競合的鋳型方法の標準化混合法による定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用する場合もある。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーション検定法を用いて遺伝子発現バイオマーカーを検出する。ハイブリダイゼーション検定法では、試料からの核酸が相補的核酸分子、例えばオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーションする能力に基いて、マーカーの存在または非存在を測定する。様々なハイブリダイゼーション検定法が利用可能である。
【００５２】
実施態様によっては、興味の対象である配列へのプローブのハイブリダイゼーションを、結合プローブの視覚化、例えばノーザンまたはサザーン検定法により直接検出する場合もある。例えば、Ausabel et al.編、Current Protocols in Molecular Biology、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（１９９１）参照。これらの検定法では、ＤＮＡ（サザーン）またはＲＮＡ（ノーザン）を単離する。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡを、ゲノムで開裂することが稀であり、検定されているマーカーのいずれにも近くない一連の制限酵素により開裂する。次いで、ＤＮＡまたはＲＮＡを例えばアガロースゲルにおいて分離し、膜に移す。例えば放射性標識ヌクレオチドの組込みによる一標識プローブまたは複数標識プローブを、低度、中度または高度ストリンジェンシー条件下で膜と接触させる。未結合プローブを除去し、標識プローブの視覚化により結合の存在を検出する。
【００５３】
実施態様によっては、ＤＮＡチップ検定法はジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ、アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア）である。例えば、米国特許第６０４５９９６号、同第５９２５５２５号および同第５８５８６５９号（各々、出典明示により援用する）参照。ジーンチップ技術は、「チップ」に固定したオリゴヌクレオチドプローブの縮小型高密度アレイを使用する。プローブアレイは、固相化学合成法を半導体業界で使用されるフォトリソグラフィー製作技術と組合わせた、アフィメトリックスの光指向型化学合成方法により製造される。一連のフォトリソグラフィーマスクを用いてチップ暴露部位を特定した後、特異的化学合成工程を実施することによる製法で、アレイにおける予め特定された位置に各プローブを配置した、オリゴヌクレオチドの高密度アレイを構築する。多プローブアレイを大きなガラスウエハーにおいて同時に合成する。次いで、ウエハーを方形に切り、個々のプローブアレイを、環境からそれらを保護し、ハイブリダイゼーション用のチャンバーとしての役割を果たす射出成形したプラスチックカートリッジにパッケージする。
【００５４】
分析すべき核酸を単離し、ＰＣＲにより増幅し、蛍光リポーター基で標識する。次いで、フルーイディックスステーションを用いて、標識ＤＮＡをアレイとインキュベーションする。次いで、アレイをスキャナーに挿入すると、ハイブリダイゼーションのパターンが検出される。プローブアレイに結合している、既に標的に組込まれていた蛍光リポーター基から放出された光として、ハイブリダイゼーションデータを集める。標的と完全にマッチするプローブは、一般的に誤対合を有するものより強いシグナルを発する。アレイにおける各プローブの配列および位置は既知であるため、相補性により、プローブアレイに適用された標的核酸の同一性が測定され得る。
【００５５】
他の実施態様では、電子捕捉プローブを含むＤＮＡマイクロチップ（ナノジェン、サンディエゴ、カリフォルニア）を使用する。例えば、米国特許第６０１７６９６号、同第６０６８８１８号、および同第６０５１３８０号（各々、出典明示により援用する）参照。超小型電子技術の使用を通じて、ナノジェンの技術は、その半導体マイクロチップ上の指定された試験部位へ行き交う荷電分子の活発な運動および集中を可能にする。所定の遺伝子発現バイオマーカーに特有なＤＮＡ捕捉プローブを、マイクロチップ上の特定部位に電子的に配置または「指向」させる。核酸分子は強い負電荷を有するため、それらを正電荷領域へ電子的に移動させ得る。
【００５６】
さらなる実施態様では、表面張力の差異による平らな表面（チップ）上での流体の分離に基いたアレイ技術（プロトジーン、パロアルト、カリフォルニア）を使用する。例えば、米国特許第６００１３１１号、同第５９８５５５１号、および同第５４７４７９６号（各々、出典明示により援用する）参照。プロトジーンの技術は、流体が、化学的コーティングにより付与された表面張力の差異により平らな表面上で分離され得るという事実に基づいている。一旦分離させると、オリゴヌクレオチドプローブを、試薬のインクジェット式印刷によりチップ上で直接合成する。
【００５７】
さらに別の実施態様では、「ビーズアレイ」を遺伝子発現バイオマーカーの検出に使用する（イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア）。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／６７６４１号および同ＷＯ００／３９５８７号（各々、出典明示により援用する）参照。イルミナは、光ファイバー束およびアレイへ自己集合するビーズを組合わせたビーズアレイ技術を使用する。各光ファイバー束は、束の直径によって何千から何百万の個々のファイバーを含む。ビーズを、所定のマーカーの検出に特異的なオリゴヌクレオチドでコーティングする。ビーズのバッチを合わせて、アレイに特異的なプールを形成させる。検定を実施するため、ビーズアレイを調製した試料と接触させる。ハイブリダイゼーションは、適切な方法を用いて検出される。
【００５８】
本発明の好ましい実施態様の中には、特異的構造の酵素開裂によりハイブリダイゼーションを検出する場合もある、例えばインベーダー（INVADER、登録商標）検定法、サード・ウェーブ・テクノロジーズ。例えば、米国特許第５８４６７１７号、同第６０９０５４３号、同第６００１５６７号、同第５９８５５５７号、および同第５９９４０６９号（各々、出典明示により援用する）参照。実施態様の中には、結合プローブのハイブリダイゼーションを、ＴａｑＭａｎ検定法（ＰＥバイオシステムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）を用いて検出する場合もある。例えば、米国特許第５９６２２３３号および同第５５３８８４８号（各々、出典明示により援用する）参照。ＰＣＲ反応中に検定を実施する。ＴａｑＭａｎ検定法は、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＡＭＰＬＩＴＡＱ ＤＮＡポリメラーゼの５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を活用する。所定のマーカーに特異的なプローブをＰＣＲ反応に含ませる。プローブは、５'−リポーター染料、例えば蛍光染料および３'−クエンチャー染料を伴うオリゴヌクレオチドにより構成される。ＰＣＲ中に、プローブがその標的に結合した場合、ＡＭＰＬＩＴＡＱポリメラーゼの５'−３'核酸分解（nucleolytic）活性により、リポーターおよびクエンチャー染料間でプローブが開裂される。クエンチャー染料からのリポーター染料の分離により、蛍光が増加する。シグナルは、各サイクルのＰＣＲにより蓄積し、蛍光計でモニターされ得る。
【００５９】
本発明のシステムおよび方法を用いて製造および使用される追加の検出検定法には、限定するわけではないが、酵素誤対合開裂方法、例えばバリアジェニクス（米国特許第６１１０６８４号、同第５９５８６９２号および同第５８５１７７０号参照、これらについては出典明示により援用する）、分岐ハイブリダイゼーション方法、例えばケイローン（米国特許第５８４９４８１号、同第５７１０２６４号、同第５１２４２４６号、および同第５６２４８０２号参照、これらについては出典明示により援用する）、ローリングサークル複製（例えば、米国特許第６２１０８８４号および同第６１８３９６０号参照、これらについては出典明示により援用する）、ＮＡＳＢＡ（例えば、米国特許第５４０９８１８号参照、これについては出典明示により援用する）、分子ビーコン技術（例えば、米国特許第６１５００９７号参照、これについては出典明示により援用する）、Ｅ−センサー技術（Motorola、米国特許第６２４８２２９号、同第６２２１５８３号、同第６０１３１７０号、および同第６０６３５７３号参照、これらについては出典明示により援用する）、サイクリングプローブ技術（例えば、米国特許第５４０３７１１号、同第５０１１７６９号、および同第５６６０９８８号参照、これらについては出典明示により援用する）、リガーゼ連鎖反応［Barnay、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、第８８巻、１８９−９３頁（１９９１）参照］、およびサンドイッチハイブリダイゼーション方法（例えば、米国特許第５２８８６０９号参照、これについては出典明示により援用する）がある。
【００６０】
実施態様によっては、質量分析法を用いて、遺伝子発現バイオマーカーを検出する場合もある。例えば、実施態様の中には、ＭＡＳＳＡＲＲＡＹ（登録商標）システム（シーケノム、サンディエゴ、カリフォルニア）を用いて、遺伝子発現バイオマーカーを検出するものもある。例えば、米国特許第６０４３０３１号、同第５７７７３２４号および同第５６０５７９８号参照、これらについては各々出典明示により援用する。
【００６１】
幾つかの実施態様において、本発明は、遺伝子発現バイオマーカーの同定、特性確認および定量用のキットを提供する。実施態様の中には、キットが、検出試薬および緩衝液に加えて、遺伝子発現バイオマーカーに特異的な抗体を含む場合もある。他の実施態様では、キットは、核酸の検出に特異的な試薬、例えばオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。好ましい実施態様において、キットは、制御装置、検定法実施についての説明書および結果の分析および提示に必要なソフトウェアを全て含め、検出検定法の遂行に必要な成分を全部含む。実施態様によっては、キットが、インビトロ診断検定法および／または医薬品または食品の標識についての環境保護局または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）による要請に応じた目的用途の陳述書を含む説明書を含む場合もある。
【００６２】
表９に表された結果と、生物体の遺伝子発現パターンを比較することにより、生物体が卵巣癌を含むか含まないかを示し得る遺伝子発現プロファイルを生物体が有するか否かが示される。
【００６３】
別の実施態様では、本発明は、卵巣癌特有の遺伝子発現の変化を阻害、遅延、打消しまたは模倣する能力について試験化合物をスクリーニングする方法である。この実施態様の典型例では、まず卵巣癌に罹患していることが判明している試験哺乳類を試験化合物で処置し、次いで卵巣癌に応答して発現が変化している遺伝子または配列の発現レベルについて哺乳類の代表的組織を分析する。好ましくは、組織は腫瘍からの生検材料であるか、または好ましい実施態様では、容易に得られる組織、例えば血液または血清である。
【００６４】
次いで、卵巣癌を有することが判明しているが試験化合物を投与されていない対照哺乳類と組織の分析結果を比較することにより、卵巣癌無しのパターンに向かって発現を改変させるように哺乳類試料において遺伝子発現バイオマーカー配列の発現を修飾し得る試験化合物を同定する。
【００６５】
本発明の別の実施態様では、卵巣癌無しの状態を模倣するための治療について表２に開示した遺伝子の配列を使用する。一般に、卵巣癌では発現低下するものとして本発明で同定された遺伝子については遺伝子発現の増幅を、および卵巣癌で過剰発現されるものとして本発明で同定された遺伝子についてはその発現の低減化を試みる。例えば、卵巣癌で増加するものとして表２に示された遺伝子または配列についてはその発現の減少を、または卵巣癌で低減化されることが見出された遺伝子の発現についてはその増加を試み得る。
【００６６】
発現を増加および減少させる方法は当業者には公知である。発現を補充する例としては、生物体への遺伝子の追加コピーの供給がある。発現を減少させる好ましい例には、ＲＮＡアンチセンス技術または医薬介入がある。表２に開示された遺伝子は、適切な薬剤開発標的となる。表２に列挙した遺伝子またはこれらの遺伝子によりコード化されるタンパク質の活性を模倣または阻害する現存の医薬化合物を使用するかまたは新たに開発することによる薬剤開発を目的として本願で提示された情報が使用される。従って、本発明で開示されている遺伝子発現バイオマーカーまたは遺伝子は、分子レベルでの卵巣癌に特有な変化の抑制を目標とした医薬開発および遺伝子治療またはＲＮＡアンチセンス療法についての標的を代表するものである。これらの遺伝子発現改変はまた、卵巣癌の根底にある様々な機構を理解する上である一定の役割を演じ得る。さらに、これらの遺伝子は、診断目的に使用され得る卵巣癌のバイオマーカーを代表するものである。
【００６７】
本発明が発現プロファイルの形態により限定されることはない。実施態様によっては、発現プロファイルをコンピューターソフトウェアで維持することもある。実施態様によっては、発現プロファイルが書面にしたデータである場合もある。本発明が、発現プロファイルで提供または表示されたマーカーの数により限定されることはない。例えば、発現プロファイルは、試料の生物学的状態を示す、表２に示した２個またはそれ以上のマーカーを含み得る。
【００６８】
さらに本発明は、発現情報、例えば１個またはそれ以上の試料から得た表２からの１個またはそれ以上のマーカーを含む発現プロファイルを含むデータベースを提供する。実施態様によっては、限定されるわけではないが、一つまたはそれ以上の公的または私的情報データベース、例えばＯＭＩＭ、ＧｅｎＢａｎｋ、ＢＬＡＳＴ、モレキュラー・モデリング・データベース、Ｍｅｄｌｉｎｅ、ゲノムデータベースなどとのマーカーの比較を含むデータ分析にデータベースを使用する場合もある。上記実施態様の中には、自動化方法を実施することにより、本発明方法を用いて得られたデータから得られた情報を一つまたはそれ以上の公的または私的データベースにおける情報へ自動的に関連付ける場合もある。関連付けは、例えば表現型、例えば病気の状態との相関関係を表すのに使用される。
【００６９】
我々はまた、本発明が表９に列挙したマウス遺伝子の哺乳類相同体を包含するものと解釈している。当業者であれば、表９に列挙した遺伝子と充分に高い相同性をもつ特定遺伝子を同定することにより、他の哺乳類種における相同体を容易に調べることができるはずである。「高い相同性」とは、相同性がヌクレオチドまたはアミノ酸レベルで少なくとも全部で５０％（遺伝子またはタンパク質内で）であることを意味する。
略語のリスト
Ａ              非存在の
ＡｖｇＤｉｆｆ  平均差異（アフィメトリックスアレイにおけるプローブセットの全体的                強度）
ＣＨＴＮ        協同ヒト組織ネットワーク
ＣＩ            信頼区間
ＦＩＧＯ        産婦人科学会
ＧＡＰＤＨ      グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧＮＦ          ゲノミクス・インスティテュート・オブ・ザ・ノヴァリティス・リサー                チ・ファンデーション
ｍｇ            ミリグラム
ＮＣＢＩ        全米バイオテクノロジー情報センター
Ｎｅｇ          陰性
ｎＭ            ナノメートル
ＯＭＩＭ        オンライン・メンデリアン・インヘリタンス・イン・マン
ＯＲ            オッズ比
ＯＲＦ          読み枠
Ｐ              存在（する）
ＰＧ            薬理遺伝学
Ｐｏｓ          陽性
ＱＣ            品質管理
ＲＮＡ          リボ核酸
【実施例１】
【００７０】
好ましい方法
【００７１】
卵巣腫瘍の発生および進行に関与する遺伝子を同定するため、我々は、一連の正常および腫瘍卵巣生検の遺伝子発現プロファイルを比較した。１２０００を越える遺伝子についての遺伝子発現データを各試料から作成した。正常および癌卵巣生検間で最も特異的に発現されていることを我々が観察した９００プローブセットのうち、９８％は腫瘍生検でダウンレギュレーションされていた。８正常および１０腫瘍試料を用いて、我々は、「正常」および「腫瘍」として生検を分類するのに使用され得る最少数のプローブセット（２８）を同定した。この発見は、別の実験室で以前にプロファイリングされていた生検の第二セット（４「正常」および１４「腫瘍」）で確認された。他の卵巣生検と比較するための対照標準として使用され得る平均正常卵巣プロファイルが確立された。「正常」および「腫瘍」卵巣生検間における最も特異発現された遺伝子の同定により、卵巣腫瘍の発生および進行の分子機構に対する新たな洞察がもたらされ得る。この試験で同定された遺伝子の中には卵巣癌に関与することが知られているものもあるが、大部分は、病気および処置の診断または監視を目的とする薬剤標的および分子バイオマーカーについての新規候補を示す。
【００７２】
（材料及び方法）
（試料）
急速冷凍卵巣生検は、アステランド（デトロイト、ミシガン）から入手されたもので、１０「腫瘍」試料および１０近接「正常」組織により構成されていた。また、４つの追加試料について全ＲＮＡをアンビオン（オースティン、テキサス）およびストラタジーン（ラジョラ、カリフォルニア）から購入した。確認段階で使用される試料からの遺伝子発現プロファイルを予めＧＮＦで作成し、記録しておいた。Welsh et al.（２００１）前出、参照。
【００７３】
分析した腫瘍のほとんどは、悪性表面上皮漿液性腫瘍、例えば乳頭嚢胞癌、乳頭嚢胞腺癌または乳頭嚢胞癌であった。他には粘液性嚢胞癌、類内膜腺癌および成熟奇形腫があった。
【００７４】
試料情報の要約を下記表１に示す。
【表１】
2007526749.tif 000002
【表２】
2007526749.tif 000003
注：同一患者から得た一対の試料（正常および腫瘍近接組織）を一緒に囲んでいる。ＦＩＧＯ段階システムを用いて卵巣癌の段階を示している。
【００７５】
（ＲＮＡ発現プロファイリング）
全ＲＮＡを各生検から抽出し、前記要領で処理した。ＲＮＡ抽出技術については、当業者には充分に知られている。プロファイリングした試料を全て、アフィメトリックスにより推奨された要領（GeneChip Expression Analysis Technical Manual、改訂版１、２００１年７月）でアフィメトリックスのジーンチップ（登録商標）システムを用いて処理した。試料を１：５０に希釈した後、ベックマン‐コールターＤＵ６５０分光光度計を用いて、２６０ｎＭおよび２８０ｎＭ波長で試料を測定することにより、濃縮および総量のＲＮＡおよびｃＲＮＡを評価した（表２参照）。この試験に使用したアレイのタイプは、ヒトゲノムＵ９５Ａｖ２であった（http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/hgu95.affx）。
【００７６】
（分析戦略）
下記の幾つかの段階で、発現プロファイルの分析を実施した。
【００７７】
（最高品質のマイクロアレイデータの選択）
我々は、スケーリング係数が６より低く、３０％を越える割合のプローブセットがアフィメトリックスＭＡＳ４.０アルゴリズムによりいわゆる「存在する」であるマイクロアレイのみ我々の分析用に使用した。
【００７８】
（プローブセットのサブセットの選択）
発現データを、データベースからジーン・スプリング（登録商標）プログラム（シリコン・ジェネティクス、レッドウッドシティー、カリフォルニア）へ直接インポートした。少数の試料でしか発現されない遺伝子については除外した。マイクロアレイにおける１２６２７のプローブセットのうち、試料の１０％またはそれ以上においてＡｖｇＤｉｆｆが少なくとも１００であるもののみをさらなる分析に使用した。クラスタリング実験を実施することにより、正常および腫瘍生検の種々の遺伝子発現プロファイルを視覚化した。
【００７９】
両群の試料（群１：正常生検、群２：腫瘍生検）において低品質またはシグナル強度が非常に低いプローブセットを排除することにより、さらなるフィルタリングを達成した。２群のうちの一方における試料の少なくとも７５％においていわゆる「存在する」（Ｐ）ではないプローブセットについては、それ以上分析には使用しなかった。さらに、２０より低いＡｖｇＤｉｆｆ値を全て２０の値に変換した。
【００８０】
（最も特異的に発現された遺伝子への集中）
２群の試料間で特異発現された遺伝子の選択を２段階で実施した：
１．各プローブセットのＡｖｇＤｉｆｆを、ＳＡＳ８.２を用いたノンパラメトリック一方向ＡＮＯＶＡ検定により２群の試料間で比較した。
２．次いで、ｐ＜０.０５である各プローブセットのＡｖｇＤｉｆｆと、試料の群（正常または腫瘍）との相関関係を明らかにした。最高絶対ＰＣＣから最低までプローブセットをランク付けした（マイクロソフト・エクセルで算出）。
【００８１】
（試料の再分類）
我々は、前述の「１点除外法」分析戦略を用いることにより、正常卵巣組織と卵巣腫瘍を区別するプローブセットの最適数を決定した。van't Veer et al.（２００２）、前出参照。
【００８２】
除外されたどの試料についても、我々は、各群（群１および２）の試料における各プローブセットの平均ＡｖｇＤｉｆｆを測定した。除外された試料の発現プロファイルおよび各群の平均プロファイル間のＰＣＣを各プローブセットについて計算した。正常卵巣組織からの腫瘍の区別における各プローブセットの有効性を、２つのＣＣの高いほうに基いて「正常」または「腫瘍」として各試料を再分類することにより評価した。
【００８３】
我々は、遺伝子のセット（５から出発）を増加させて用いたときに誤分類された試料の数を測定した。本明細書で使用されている「偽Ｎｅｇ」は、正常卵巣組織として不正確に分類された腫瘍として定義され、逆に「偽Ｐｏｓ」は、腫瘍として不正確に分類された正常組織として定義される。
【００８４】
次いで、正常卵巣組織と腫瘍を最も有効に識別したプローブセットを、ＧＮＦで作製された卵巣組織（「正常」および「腫瘍」）の異なるセットの遺伝子発現プロファイルを分類する能力について試験した（表１参照）。
【００８５】
（ＯＲの統計的測定）
所望の閾値相関値を用いて、「正常」または「腫瘍」として正確および不正確に識別された生検の数を示す、２×２表を構築した。ＯＲを９５％ＣＩと一緒に、ＳＡＳバージョン８.２を用いて計算した。０.０５のｐ値カットオフによるフィッシャーの正確確率検定を用いて、統計的有意性を測定した。
（遺伝子）
【００８６】
プローブセット名およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号間のリンクは、アフィメトリックスにより短い遺伝子記載と一緒に提供されている。我々は、ＮＣＢＩデータベース、主としてＬｏｃｕｓＬｉｎｋ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/index.html）、ＯＭＩＭ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.html）およびＰｕｂＭｅｄ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi）の検索によりこの記載を補完および更新した。
【００８７】
（結果）
（ＲＮＡ発現プロファイリング）
２０の生検のうち１８から、試料をさらに処理するのに必要な５ｍｇを越える精製全ＲＮＡが得られた（表２参照）。得られた精製全ＲＮＡが１ｍｇに満たない試料ｐ６１７５は、最小の試料であった（３８ｍｇ）。１％アガロースゲルでの電気泳動により、ＲＮＡの品質を評価した。２８Ｓおよび１８ＳリボソームＲＮＡの両バンドの欠如が、試料ｐ６１６９およびｐ６１８０について観察され、ある程度のＲＮＡの分解を示していた。マクロアレイハイブリダイゼーションについては、最大１５ｍｇのｃＲＮＡを利用可能なときに使用したが、１２ｍｇ未満ということは無かった。充分なｃＲＮＡが２１試料について利用可能であった（表２参照）。
【００８８】
（品質評価）
ＰＧ（この試験）でハイブリダイゼーションした２１アレイおよびＧＮＦで以前にハイブリダイゼーションした１８アレイからのデータを、品質についてチェックした（表３参照）。Welsh et al.（２００１）、前出参照。３つ（ｐ６１６９、ｐ６１８０およびｐ６１８５）を除く全てのものは、６より低いスケーリング係数の我々の基準に合格しており、３０％を越えるプローブセットは「Ｐ」とみなされた（表３参照）。３６の残りの発現プロファイルを２セット：８正常および１０腫瘍生検からのデータから成るＰＧで作成された１８プロファイルの試験セット、および４正常および１４腫瘍生検からＧＮＦで以前に作成された１８プロファイルの確認セットに分けた。Welsh et al.（２００１）、前出参照。
【００８９】
（分析）
（クラスタリング分析）
試験セットの１８試料の発現データを、ＧＥＮＥＳＰＲＩＮＧ（登録商標）ソフトウェアへインポートした。アフィメトリックスＵ９５Ａマイクロアレイにおける１２６２７プローブセットのうち、２１７４は、これら１８試料の２つまたはそれ以上において少なくとも１００のＡｖｇＤｉｆｆを有しており、クラスタリング分析に使用された。得られた試料およびプローブセットのクラスタリングツリーを図１に示す。興味深いことに、実験の系統樹は、２群の試料、すなわち正常（上方）および腫瘍（下方）生検に対応する２本の主たる分枝を含む。調べられた遺伝子の大多数（＞９０％）は、正常卵巣組織において全般的な高い発現性を有する。プローブセットの系統樹は、腫瘍組織で高い発現性をもつ遺伝子については小さなクラスターのみを示す（左部分）。
【００９０】
（最も特異発現した遺伝子の選択）
２１７４プローブセットのうち、多数の「Ａ」または「わずかな」コールを与えることから（両群で＞７５％）２１７がさらなる分析から排除された。
【００９１】
残り１９５７プローブセットについてのデータを、正常群および腫瘍群間におけるノンパラメトリック一方向ＡＮＯＶＡ検定についてのＳＡＳバージョン８.２へエクスポートした。合計９００のプローブセットは、２群間において顕著に異なるＡｖｇＤｉｆｆ値を有していた（ｐ＜０.０５）。これらの遺伝子を表９に列挙する。
【００９２】
次いで、これら９００プローブセットのＡｖｇＤｉｆｆと２群の試料（群１：正常、群２：腫瘍）との相関関係を明らかにした。絶対ＰＣＣ（Ｒ）−値は、０.０４２〜０.８７７の範囲で変動し、６９４のプローブセット（７７％）のＲ値が０.５より高かった。最高の絶対ＰＣＣから最低までの範囲で変動する９００プローブセットのＡｖｇＤｉｆｆデータは、付表１において入手可能である。
【００９３】
（１点除外法および試料の再分類）
前述の「１点除外」分析戦略を、９００選択プローブセットの発現について１８卵巣試料に適用した。van't Veer et al.（２００２）、前出参照。
【００９４】
最初の５プローブセットを使用した時に誤分類された試料の数は６であった（２つの偽Ｐｏｓおよび４つの偽Ｎｅｓ）。増大する遺伝子のセットを使用した。誤分類の数は２と７の間で変動しており、最初の２８プローブセットを用いたとき最小に達した（図１）。これらの最初の２８プローブセットは、１つの偽Ｐｏｓおよび１つの偽Ｎｅｇを表示しただけであった。興味深いことに、正常生検の完全な分類（偽Ｐｏｓが０）は、最初の３２プローブセットにより達成され（２つの偽Ｎｅｇも検出した）、腫瘍生検の完全な分類（偽Ｎｅｇが０）は全く見られなかった。
【００９５】
（最適な分類セットおよび相関関係の閾値）
我々は、未知または疑わしい状態の生検の分析を目的とする対照標準として使用される、分類プローブセットについて平均正常（腫瘍無し）生検プロファイルを決定した。我々は、腫瘍の不均質性故に、対照標準「腫瘍」プロファイルが決定され得ないと予測した。我々は、最初の２８プローブセットの分類値を、８つの正常生検プロファイル全てを用いて計算された平均正常プロファイルと１８試料の各々に関するそれらの発現を比較することにより調べた。次いで、試料を最高から最低までの相関値によりランク付けをし、誤差割合を閾値相関関係が引き出される関数として測定した。結果は図２に表示されている。不正確に割当てられた試料の最少数は２であった［１つの偽Ｐｏｓ（ｐ６１７７）および１つの偽Ｎｅｇ（ｐ６１６８）］。対応するＣＣ値は０.９２０と０.９２１の間であった。正常または腫瘍であると正確および不正確に予測された試料の数に基いて、ＯＲおよびフィッシャーの正確検定を実施した。観察された生検状態および予測生検状態間の差異は有意であった：ＯＲ＝６３；９５％ＣＩ：３.３〜１１９４.７、ｐ＝０.００２９。２８予測プローブセットの発現プロファイルが、ＣＣ≦０.９２０で平均正常プロファイルと相関関係を示す場合、ＯＲは、試験セットの卵巣生検が、卵巣腫瘍からのものである可能性がほぼ６３倍であることを示している（表４参照）。我々の試験セットにおいて、ＣＣ＞０.９５５であるプロファイルの１００％は、正常生検に対応し、ＣＣ＜０.８７０であるプロファイルの１００％は腫瘍生検に対応する（図３参照）。
【００９６】
（平均正常プロファイルの確認）
我々は、１点除外法により選択された２８プローブセットにより、一連の１８卵巣試料において腫瘍卵巣生検と正常なものとを区別することができた。次いで、我々は、独立した卵巣生検が、それらの発現プロファイルを２８分類プローブセットの同平均正常プロファイルと比較することにより正確に分類され得るか否かを試験した。
【００９７】
図３は、２８プローブセットの相関関係に基いた全卵巣生検の分類を要約している。注目すべきことに、確認セットの正常および腫瘍試料のプロファイルは、互いに明白に区別された（図３参照）。この試験セットでは、ＣＣ＜０.８７０であるプロファイルの１００％は腫瘍生検に対応する。興味深いことに、正常プロファイルは試験セットの場合よりも低いＣＣを有しており、確認セットにおいて正常および腫瘍生検を明白に区別する閾値相関値は、０.７６２と０.８７６の間である。
【００９８】
我々は、試験セットの平均正常プロファイルおよび確認セットの平均正常プロファイル間においてノンパラメトリックｔ−試験を実施した。同様に、我々は、両セットの平均腫瘍プロファイルを比較した。統計的差異は全く観察されなかったため（それぞれ、ｐ＝０.３７３およびｐ＝０.１１０）、我々は、両セットを合わせることにより、２８プローブセットの分類値を増加させた。我々は、１２の全正常生検プロファイル（試験セットから８および確認試験から４）を用いて計算された平均正常プロファイルと全試料についての発現を比較した。結果は、相関値により正常生検と腫瘍生検プロファイルが非常に顕著に区別されることを確認している（図４および表５参照）。以前に判明したところによると、腫瘍試料（ｐ６１６８）のプロファイルは平均正常プロファイルと高い相関関係を有していた。
【００９９】
（個々の遺伝子発現および生検状態間の相関関係）
卵巣生検分類についてのプローブセットの選択は、当初は１８試験試料のプロファイルに基いて為された。同一プローブセットで３６の正常および腫瘍試料が全て明白に区別されたことから（図４参照）、我々の方法により選択された遺伝子は多くの他の卵巣腫瘍において特異発現されることが示唆された。しかしながら、腫瘍の不均質性故に、個々の遺伝子発現における差異は、分析された試料により変動すると思われる。我々は、１８試験試料において特異発現された９００プローブセットが、３６の全生検を分析したときにも特異発現される程度を評価した。
【０１００】
まず試験セットからの１８試料を、次いで試験セットおよび確認セットの両方からの全３６試料を用いることにより、プローブセットを最高絶対ＰＣＣから最低までランク付けした。選択された９００プローブセットから、６９４および４７３は、それぞれ１８および３６試料により０.５よりも高い絶対ＣＣを有していた。４１２プローブセットは、両場合とも０.５よりも高い係数を有していた。興味深いことに、生検分類のために当初選択された２８プローブセットから、１９が上位１００にランクされ、他の９プローブセットは、０.３５９〜０.７０３の範囲にわたる相関値を有していた。
【０１０１】
（正常および腫瘍卵巣生検間で特異発現された遺伝子）
（卵巣腫瘍でアップレギュレーションされる遺伝子）
正常および腫瘍卵巣生検間で特異発現された遺伝子の中で、我々は、卵巣腫瘍でアップレギュレーションされることが既に知られている数個の遺伝子、例えばクローディン４、トポイソメラーゼIIアルファ、カリクレイン８、オステオポンチンをコーディングする遺伝子、および卵巣癌の潜在的新規マーカーを検出した（表６参照）。
【０１０２】
接着結合の一成分であるクローディン４は、膜貫通型受容体のこのファミリーの別の構成員、クローディン３と一緒に卵巣腫瘍でアップレギュレーションされることが示されている。Hough et al.、Cancer Res.、第６０巻、２２号、６２８１−６２８７頁（２０００）参照。Costaおよび同僚らは、トポイソメラーゼIIアルファのレベルが、卵巣表面上皮新生物の予後の悪さと相関関係を示すことを報告している。カリクレイン８は、正常卵巣組織ではなく癌での免疫組織化学により検出されたことから、卵巣癌の予後マーカーであると示唆された。Underwood et al.、Cancer Res.、第５９巻、１７号、４４３５−４４３９頁（１９９９）、および Magklara et al.、Clin.Cancer Res.、第７巻、４号、８０６−８１１頁（２００１）参照。オステオポンチンもまた、卵巣癌についての診断マーカーとして以前に提案されている。Kim et al.、JAMA、２８７巻、１３号、１６７１−１６７９頁（２００２）参照。別の遺伝子、Ｃ２０ＯＲＦ１は、正常肺組織では発現されないが、肺癌セルラインで発現されることが示された。Manda et al.、Genomics、６１巻、１号、５−１４頁（１９９９）参照。腫瘍のタイプ、病気の段階または他の腫瘍特異性故に生検の一部でしか過剰発現されなかった可能性のある他の遺伝子は、我々の分析法では検出されなかった。
【０１０３】
（卵巣腫瘍でダウンレギュレーションされる遺伝子）
さらに我々は、プロファイリングされた卵巣腫瘍生検においてダウンレギュレーションされる多数の遺伝子を調べた。分析目的のため、我々は、２８プローブセットおよび上位１００のダウンレギュレーション遺伝子をそれらの産物の既知または推測される機能に基いた８カテゴリーにおいて分類した（表７および８参照）。興味深いことに、これら１００遺伝子のほぼ３０％の機能は依然として未知である。他の遺伝子のほとんどは、ある一定の役割を演じているか、または転写調節（１６遺伝子）、細胞周期調節、増殖分化、細胞死または腫瘍抑制（１２遺伝子）およびシグナル伝達（６遺伝子）に関与しているのではないかと既に推測されている。このリストは、可能性のある幾つかの腫瘍サプレッサー：トランスフォーミング成長因子ベータ受容体III（ＴＧＦβＲ３）をコーディングする遺伝子、血小板由来増殖因子受容体様遺伝子（ＰＤＧＦＲＬ）、腫瘍形成抑制（ＳＴ１３）遺伝子、カザールモチーフをもつ復帰突然変異誘導性高システインタンパク質をコーディングする遺伝子（ＲＥＣＫ）および父系発現３（ＰＥＧ３）遺伝子を含む。
【０１０４】
この観察結果は、まだ識別されていない機能をもつ遺伝子が、細胞周期調節、増殖分化、シグナル伝達または転写調節に関与すると思われることを示している。それらの中には腫瘍サプレッサーとして作用し得るものもある。卵巣腫瘍またはセルラインにおけるダウンレギュレーションは、これらの遺伝子の一つだけ、すなわち我々の試験で２つの別々のプローブセットにより検出されたＩＧＦＢＰ５について報告されている（表８参照）。Welsh et al.（２００１）、前出参照。
【０１０５】
細胞外マトリックスのタンパク質をコーディングする６遺伝子のみがラミニンアルファ２（ＬＡＭα２）を含めて認められた。Yangおよび同僚らは、前悪性腫瘍上皮の基底膜におけるＬＡＭα２の一時的喪失およびそれに続くＤａｂ２の不活化は、卵巣表面上皮の腫瘍形成に伴う一般的な初期事象であると報告している。Yang et al.、Cancer、９４巻、９号、２３８０−２３９２頁（２００２）参照。興味深いことに、Ｄａｂ２のダウンレギュレーション（プローブセット４７９）もまた、０.４９のＣＣ値で我々の試験において観察された。
【０１０６】
これらの結果を考え合わせると、卵巣生検において発現性が統計的に有意に減少した遺伝子のほとんどは、事実、細胞集団または組織構成における変化、例えば結合組織および脂肪細胞の喪失故に検出されたのではなく、腫瘍の発生または進行に関与していることが判明した。
【０１０７】
（検討）
我々が本発明で使用しているフィルタリングおよび分析方法により、正常および腫瘍卵巣試料間で特異的に発現される遺伝子のリストが提供された。我々は、卵巣生検をそれらの発現プロファイルに基いて「正常」または「腫瘍」として正確に分類するのに小さなサブセット（２８〜４２プローブセット）で充分であることを示した。この発現サインの確認は、独立した研究室でプロファイリングされた異なる生検において為されたもので、正常または腫瘍試料間で観察された発現の差異が、研究室または分析誤差ではなく生物学的過程を反映していることを確認している。
【０１０８】
本発明では調べていない特異発現遺伝子の検出に影響し得る幾つかの因子には、試験セットにおける試料の数、および試験試料の不均質性がある。事実、生検および特に腫瘍生検は、かなりのレベルの不均質性：腫瘍細胞の腫瘍型、等級、パーセンテージ、結合および脂肪組織の存在などを有することが予測される。我々は、様々な等級の異なるタイプの卵巣腫瘍を試験することにより（表１参照）、以前に報告されたある種の腫瘍タイプにより特異的に関与する遺伝子ではなく、腫瘍発生および進行の一般的経路に関与する遺伝子について検索した。Ono et al.（２０００）、前出、および Welsh et al.（２００１）前出参照。
【０１０９】
我々の生検発現プロファイルのクラスタリング分析は、正常および腫瘍試料を区別する圧倒的多数の遺伝子が腫瘍においてダウンレギュレーションされることを明らかにした。事実、最も特異発現された９００プローブを、３６の全生検におけるそれらの発現および正常および腫瘍状態間におけるＣＣに基いてランク付けしたとき、上位２２０プローブ（０.８６５−０.６４４のＲ）は腫瘍でダウンレギュレーションされていた。我々は、上位１００遺伝子（０.８６５〜０.７２のＲ）、および腫瘍で過剰発現された上位１０遺伝子（０.６４３〜０.４４３のＲ）の機能をより密接に調べた。最も特異発現された遺伝子の中で、我々は、卵巣腫瘍においてアップレギュレーションされることが既に知られている幾つかの遺伝子、並びに卵巣癌の潜在的新規マーカーを検出した。しかしながら、我々は、由来が異なり、等級が異なり、そして腫瘍細胞含有率が異なる様々なタイプの後期段階腫瘍を試験したため、遺伝子のほとんどはダウンレギュレーションされていた。転写調節、細胞周期調節、増殖分化、シグナル伝達、細胞死または腫瘍抑制にこれらの遺伝子の多くが関与していることから、卵巣癌におけるそれらの役割をさらに評価する必要性が強調される。機能が依然として未知である他の遺伝子のリストは、腫瘍発生および進行において新規のある一定の役割を演じる可能性のあるものを示すことになる。
【０１１０】
（ＲＮＡ存在量または活性の修飾方法）
ＲＮＡ存在量および活性の修飾方法は、現行では３種：リボザイム、アンチセンス種およびＲＮＡアプタマーに分類される。Good et al.、Gene Ther.、４巻、１号、４５−５４頁（１９９７）参照。これらの物質に細胞を制御可能な形で適用または曝露することにより、ＲＮＡ存在量の制御可能な摂動が誘発される。
【０１１１】
（リボザイム）
リボザイムは、ＲＮＡ開裂反応を触媒し得るＲＮＡである。Cech、Science、２３６巻、１５３２−１５３９頁（１９８７）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／１１３６４号（１９９０）；Sarver et al.、Science、２４７巻、１２２２−１２２５頁（１９９０）参照。「ヘアピン」および「ハンマーヘッド」ＲＮＡリボザイムは、特定標的ｍＲＮＡを特異的に開裂するよう設計され得る。高度に配列特異的な方法で他のＲＮＡ分子を開裂させ得、事実上全種のＲＮＡにターゲッティングされ得る、リボザイム活性をもつ短いＲＮＡ分子の設計については規則が確立されている。Haseloff et al.、Nature、３３４巻、５８５−５９１頁（１９８８）；Koizumi et al.、FEBS Lett.、２２８巻、２２８−２３０頁（１９８８）；および Koizumi et al.、FEBS Lett.、２３９巻、２８５−２８８頁（１９８８）参照。リボザイム方法は、上記の小ＲＮＡリボザイム分子に細胞を曝露し、細胞においてその発現を誘導することなどを含む。Grassiおよび Marini、Annals of Med.、２８巻、６号、４９９−５１０頁（１９９６）、および Gibson、Cancer Meta.Rev.、１５巻、２８７−２９９頁（１９９６）参照。
【０１１２】
リボザイムは、ｍＲＮＡの開裂、およびそれによる細胞におけるｍＲＮＡ存在量の修飾に触媒的に有効とするのに充分な数で常用手順によりインビボで発現され得る。Cotton et al.、EMBO J.、第８巻、３８６１−３８６６頁（１９８９）参照。特に、リボザイムコーディングＤＮＡ配列は、前記規則に従って設計され、例えば標準的ホスホルアミダイト化学により合成されるものであり、ｔＲＮＡをコード化する遺伝子のアンチコドンステムおよびループにおける制限酵素部位へライゲーションされ得、次いで当業界における常用方法により興味の対象である細胞へ形質転換され、そこで発現され得る。好ましくは、誘導性プロモーター、例えばグルココルチコイドまたはテトラサイクリン応答（esponse）エレメントもまた、リボザイム発現が選択的に制御され得るようにこの構築物へ導入される。使用に際し充分満足できる形にするため、高度および構成的活性プロモーターが使用され得る。ｔＤＮＡ遺伝子、すなわちｔＲＮＡをコード化する遺伝子は、小さなサイズ、高速転写および異なる種類の組織における偏在的発現性故に、この適用においては有用である。従って、リボザイムは、事実上いかなるｍＲＮＡ配列であっても開裂するように常用手順で設計され得、細胞は、上記リボザイム配列をコーディングするＤＮＡにより常用手順で形質転換されることにより、制御可能で触媒的に有効な量のリボザイムを発現させ得る。従って、事実上細胞におけるいかなるＲＮＡ種であっても、その存在量は修飾または摂動され得る。
【０１１３】
（アンチセンス分子）
別の実施態様において、標的ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）種の活性、具体的にはその翻訳速度は、アンチセンス核酸の制御可能な適用により制御可能な形で阻害され得る。高レベルでの適用により、充分な阻害が達成され得る。本明細書で使用されている「アンチセンス」核酸は、コーディングおよび／または非コーディング領域と相補的な配列により、標的ＲＮＡの配列特異的、例えば非ポリＡ部分、例えばその翻訳開始領域とハイブリダイゼーションし得る核酸をいう。本発明のアンチセンス核酸は、２本鎖または１本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡまたはその修飾または誘導体であるオリゴヌクレオチドであり得、細胞へ制御可能な方法で直接投与され得るかまたは標的ＲＮＡの翻訳を摂動するのに充分な制御可能量での外因性導入配列の転写により細胞内で製造され得る。
【０１１４】
好ましくは、アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドを有し、好ましくは６オリゴヌクレオチドから約２００オリゴヌクレオチドの範囲に及ぶオリゴヌクレオチドである。具体的な面では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１５ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドまたは少なくとも２００ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドは、１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡまたはそれらのキメラ混合物または誘導体または修飾体であり得る。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸バックボーンが修飾され得る。オリゴヌクレオチドは、他の追加基、例えばペプチド、または細胞膜を通る輸送の促進剤［例、Letsinger et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８６巻、６５５３−６５５６頁（１９８９）；Lemaitre et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８４巻、６４８−６５２頁（１９８７）；およびＰＣＴ公開ＷＯ８８／０９８１０号（１９８８）参照］、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤［例、Krol et al.、Bio Techniques、６巻、９５８−９７６頁（１９８８）参照］またはインターカレーション剤［例、Zon,Pharm.Res.、５巻、９号、５３９−５４９頁（１９８８）参照］を含み得る。
【０１１５】
本発明の好ましい側面において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは１本鎖ＤＮＡとして提供される。オリゴヌクレオチドは、その構造におけるいかなる位置でも当業界で公知の構成成分により修飾され得る。
【０１１６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、限定するわけではないが、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２,２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２,６−ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも１個の修飾塩基部分を含み得る。
【０１１７】
別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、限定するわけではないが、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソースを含む群から選択される少なくとも１個の修飾糖部分を含む。
【０１１８】
さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよびホルムアセタールまたはそれらの類似体から成る群から選択される少なくとも１個の修飾リン酸バックボーンを含む。
【０１１９】
さらに別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、２−ａ−アノマーオリゴヌクレオチドである。ａ−アノマーオリゴヌクレオチドは、通常のＢユニットとは対照的に、鎖が互いに平行である相補的ＲＮＡとの特異的な２本鎖ハイブリッドを形成する。Gautier et al.、Nucl.Acids Res.、１５巻、６６２５−６６４１頁（１９８７）参照。
【０１２０】
オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤などにコンジュゲートされ得る。
【０１２１】
本発明のアンチセンス核酸は、標的ＲＮＡ種の少なくとも一部分に相補的な配列を含む。しかしながら、絶対的相補性は、好ましいが、要求されるわけではない。本明細書でいう「ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイゼーションし得るだけの充分な相補性を有することにより安定したデュプレックスを形成する配列を意味する。２本鎖アンチセンス核酸の場合、デュプレックスＤＮＡの１本鎖がかくして試験され得るかまたはトリプレックス形成が検定され得る。ハイブリダイゼーション能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方により異なる。一般的に、ハイブリダイゼーションする核酸が長いとき、それが含み、依然として安定したデュプレックス（場合によってはトリプレックス）を形成し得る標的ＲＮＡとの塩基誤対合は多くなる。当業者であれば、ハイブリダイゼーションした複合体の融解点を測定する標準手順の使用により誤対合の許容できる程度を確認できるはずである。標的ＲＮＡの翻訳の阻害に有効となるアンチセンス核酸の量は、標準的検定技術により決定され得る。
【０１２２】
本発明オリゴヌクレオチドは、当業界で公知の標準的方法により、例えば自動式ＤＮＡ合成装置、例えばバイオサーチ、アプライド・バイオシステムズなどから市販されているものの使用により合成され得る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Stein et al.、Nucl.Acid Res.、１６巻、３２０９頁（１９８８）の方法により合成され得、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御型多孔質ガラスポリマー支持体などの使用により製造され得る。Sarin et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８５巻、７４４８−７４５１頁（１９８８）参照。別の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、２'−O-メチルリボヌクレオチド［Inoue et al.、Nucl.Acid Res.、１５巻、６１３１−６１４８頁（１９８７）参照］またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体［Inoue et al.、FEBS Lett.、２１５巻、３２７−３３０頁（１９８７）参照］である。
【０１２３】
次いで、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、制御されているかまたは充分に満足すべき方法で細胞に投与され得る。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらが細胞により取込まれ得る制御レベルでの細胞の成長環境に置かれ得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドの取込は、当業界でよく知られた方法の使用により促され得る。
【０１２４】
（細胞内発現されたアンチセンス分子）
別の実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、外性配列からの転写により制御可能な形で細胞内発現される。発現が高レベルであるように制御されている場合、充分に満足できる摂動または修飾が誘発される。例えば、ベクターは、それが細胞により取込まれるようにインビボで導入され得、その細胞内で、ベクターまたはその一部分が転写されて、本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を製造する。かかるベクターは、アンチセンス核酸をコード化する配列を含む。かかるベクターは、それが転写されて所望のアンチセンスＲＮＡを製造し得る限り、エピソームのままであるかまたは染色体に組込まれ得る。上記ベクターは、当業界において標準的な組換えＤＮＡ技法により構築され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルスまたはその他当業界で公知のものであり得、哺乳類細胞での複製および発現に使用され得る。アンチセンスＲＮＡをコード化する配列の発現は、興味の対象である細胞で作用することが当業界で知られているプロモーターによるものであり得る。上記プロモーターは、誘導性または構成的であり得る。最も好ましくは、プロモーターは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの発現制御を達成するように外来部分の投与により制御可能または誘導可能なものである。上記の制御可能プロモーターにはＴｅｔプロモーターがある。哺乳類細胞についての他の使用可能なプロモーターには、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域［Bernoist および Chambon、Nature、２９０巻、３０４−３１０頁（１９８１）参照］、ラウス肉腫ウイルスの３'長末端反復に含まれるプロモーター［Yamamoto et al.、Cell、２２巻、７８７−７９７頁（１９８０）参照］、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター［Wagner et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７８巻、１４４１−１４４５頁（１９８１）参照］、メタロチオネイン遺伝子の調節配列など［Brinster et al.、Nature、２９６巻、３９−４２頁（１９８２）参照］がある。
【０１２５】
従って、アンチセンス核酸は、事実上いかなるｍＲＮＡ配列でもターゲッティングできるように常用手順で設計され得、細胞は、有効で制御可能または充分に満足できる量のアンチセンス核酸が発現されるように上記アンチセンス配列についてコードする核酸により常用手順で形質転換されるかまたはそれらに曝露され得る。従って、細胞における事実上いかなるＲＮＡ種であってもその翻訳は修飾または摂動され得る。
【０１２６】
（ＲＮＡアプタマー）
最後に、さらなる実施態様において、ＲＮＡアプタマーは、細胞へ導入されるかまたはそこで発現され得る。ＲＮＡアプタマーは、タンパク質、例えばＴａｔおよびＲｅｖ ＲＮＡ［Good et al.（１９９７）、前出参照］に特異的であり、それらの翻訳を特異的に阻害し得るＲＮＡリガンドである。
【０１２７】
（タンパク質存在量の修飾方法）
タンパク質存在量の修飾方法には、特に、タンパク質分解速度を改変する方法および天然標的タンパク質種の活性の存在量に影響を及ぼすタンパク質に結合する抗体を使用する方法がある。タンパク質種の分解速度を増加（または減少）させると、その種の存在量は減少（または増加）する。高温および／または特定薬剤への曝露に応答して標的タンパク質の分解速度を増加させる方法は、当業界では公知であり、本発明でも使用され得る。例えば、上記一方法では熱誘導性または薬物誘導性Ｎ−末端デグロンを使用するが、これは高温、例えば３７℃では分解シグナルを露出して急速なタンパク質分解を促し、低温、例えば２３℃では隠された状態であるため急速な分解を阻止するＮ−末端タンパク質フラグメントである。Dohmen et al.、Science、２６３巻、１２７３−１２７６頁（１９９４）参照。かかるデグロンの一例は、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓ、すなわちＮ−末端ＶａｌがＡｒｇにより置換され、６６位のＰｒｏがＬｅｕにより置換されているマウスジヒドロ葉酸レダクターゼの変異型ある。この方法によると、例えば標的タンパク質Ｐについての遺伝子は、当業界で公知の標準遺伝子ターゲッティング方法により［Lodish et al.、Molecular Biology of the Cell、W.H.Freemenアンド・カンパニー、ニューヨーク、特に８章（１９９５）参照］融合タンパク質Ｕｂ−Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓ−Ｐ（「Ｕｂ」はユビキチンを表す）をコードする遺伝子と置換される。Ｎ−末端ユビキチンは、翻訳後急速に開裂されてＮ−末端デグロンを露出する。低温では、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓに対し内側のリシンは露出されず、融合タンパク質のユビキチン化は起こらず、分解は緩慢であり、活性標的タンパク質レベルは高い。高温（メトトレキセートの非存在下）では、Ａｒｇ−ＤＨＦＲｔｓに対して内側のリシンが露出され、融合タンパク質のユビキチン化が起こり、分解は急速であり、活性標的タンパク質レベルは低い。分解の加熱活性化はメトトレキセート暴露により制御可能な形で遮断されるため、この技術はまた分解速度の制御可能な修飾を可能にする。この方法は、他の誘導因子、例えば薬剤および温度変化に応答性を示す他のＮ−末端デグロンに適用可能である。
【０１２８】
（抗体でタンパク質活性を修飾）
標的タンパク質活性はまた、（中和性）抗体により低減化され得る。上記抗体への暴露を制御されているかまたは充分満足できる状態にすることにより、タンパク質存在量／活性は、制御されているかまたは充分に満足できる形で修飾または摂動され得る。例えば、タンパク質表面における適切なエピトープに対する抗体は、野生型非凝集野生型形態の場合と比べて活性が劣るかまたは極小である複合体へ活性形態を凝集させることにより標的タンパク質の野生型活性形態の存在量を減少させ、それによって間接的にその活性を減少させ得る。別法として、抗体は、例えば活性部位と直接相互作用するかまたは活性部位への基質の接近を遮断することにより、直接的にタンパク質活性を減少させ得る。逆に、ある種の場合、（活性化）抗体はまた、タンパク質およびそれらの活性部位と相互作用することにより生じる活性を増加させ得る。いずれの場合にしても、（記載されている様々なタイプの）抗体は、（記載されている方法により）特異的タンパク質種に対して産生され、それらの効果はスクリーニングされ得る。抗体の効果が検定され、標的タンパク質種濃度および／または活性を上昇または低下させる適切な抗体が選択され得る。上記検定法では、抗体を細胞へ導入し（下記参照）、当業界で公知の標準的手段、例えば免疫検定法により、標的タンパク質の野生型量または活性の濃度を検定する。野生型形態の正味の活性は、標的タンパク質の既知活性に適切な検定手段により検定され得る。
【０１２９】
抗体は、例えば細胞への抗体の顕微注入［Morgan et al.、Immunol.Today、９巻、８４−８６頁（１９８８）参照］または細胞への所望の抗体をコード化するハイブリドーマｍＲＮＡの形質転換［Burke et al.、Cell、３６巻、８４７−８５８頁（１９８４）参照］を含む、多数の方法で細胞へ導入され得る。さらなる技術では、組換え抗体は改変され、広く多様な非リンパ系細胞型で異所発現させることにより、標的タンパク質と結合させ、そして標的タンパク質活性を遮断させ得る。Biocca et al.、Trends Cell Biol.、５巻、２４８−２５２頁（１９９５）参照。抗体の発現は、好ましくは制御可能なプロモーター、例えばＴｅｔプロモーター、または構成的活性プロモーターの制御下で行なわれる（充分に満足できる摂動を生じさせるため）。第一段階は、標的タンパク質に対して適切な特異性をもつ特定モノクローナル抗体の選択である（下記参照）。次いで、選択された抗体の可変域をコード化する配列は、例えば全抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、１本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメント（ペプチドリンカーにより結合されたＶＨおよびＶＬ領域）、二重特異性抗体（特異性が異なる２つのＳｃＦｖフラグメントが会合したもの）などを含む、様々な改変抗体形態へクローン化され得る。Hayden et al.、Curr.Opin.Immunol.、９巻、２１０−２１２頁（１９９７）参照。様々な形態の細胞内発現抗体は、様々な既知細胞内先導配列との融合体としてそれらを発現させることにより、細胞区画、例えば細胞質、核、ミトコンドリアなどへターゲッティングされ得る。Bradbury et al.、Antibody Engineering、Borrebaeck、編集者、２巻、２９５−３６１頁、ＩＲＬプレス（１９９５）参照。特に、ＳｖＦｖ形態は、細胞質ターゲッティングに特に適切であると思われる。
【０１３０】
抗体型には、限定されるわけではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーがある。当業界で知られている様々な手順が、標的タンパク質に対するポリクローナル抗体の生産に使用され得る。抗体の生産については、様々な宿主動物が標的タンパク質での注射により免疫化され得、それらの宿主動物には、限定されるわけではないが、ウサギ、マウス、ラットなどがある。宿主の種によって、免疫学的応答を高めるのに様々なアジュバントが使用され得、例えば、限定されるわけではないが、フロイントアジュバント（完全および不完全）、鉱質ゲル、例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えばリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント、例えばバシラス・カルメッテ‐グエリン（ＢＣＧ）およびコリネバクテリウム・パルブム（corynebacterium parbum）が挙げられる。
【０１３１】
標的タンパク質に指向されたモノクローナル抗体の製造については、培養中の連続セルラインにより抗体分子を生産させるものであれば、いかなる技術でも使用され得る。上記技術には、限定されるわけではないが、KohlerおよびMilstein、Nature、２５６巻、４９５−４９７頁（１９７５）により最初に開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Kozbor et al.、Immunol.Today、４巻、７２頁（１９８３）参照］およびＥＢＶハイブリドーマ技術によるヒトモノクローナル抗体の製造［Cole et al.、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Lissインコーポレイテッド、７７−９６頁（１９８５）参照］がある。本発明の追加的実施態様において、モノクローナル抗体は、最新の技術を用いて無菌動物において製造され得る。ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５参照。本発明によると、ヒト抗体が使用され得、ヒトハイブリドーマを用いるか［Cote et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８０巻、２０２６−２０３０頁（１９８３）参照］またはインビトロでＥＢＶウイルスによりヒトＢ細胞を形質転換する［Cole et al.（１９８５）前出参照］ことにより得られる。事実、本発明によると、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と一緒に標的タンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」製造のために開発された技術［Morrison et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、８１巻、６８５１−６８５５頁（１９８４）；Neuberger et al.、Nature、３１２巻、６０４−６０８頁（１９８４）；Takeda et al.、Nature、３１４巻、４５２−４５４頁（１９８５）参照］が使用され得る。上記抗体も本発明の範囲内に含まれる。
【０１３２】
さらに、モノクローナル抗体が有利な場合、それらは、別法としてファージディスプレー技術を用いて大きな抗体ライブラリーから選択され得る。Marks et al.、J.Biol.Chem.、２６７巻、１６００７−１６０１０頁（１９９２）参照。この技術を用いることにより、１０１２以下の異なる抗体のライブラリーがｆｄ繊維状ファージの表面で発現され、モノクローナル抗体の選択に利用可能な抗体の「シングル・ポット」インビトロ免疫系が作製された。Griffiths et al.、EMBO J.、１３巻、３２４５−３２６０頁（１９９４）参照。上記ライブラリーからの抗体の選択は、固定化標的タンパク質にファージを接触させ、標的に結合したファージを選択およびクローニングし、抗体可変域をコード化する配列を、所望の抗体形態を発現する適切なベクターへサブクローニングすることを含む、当業界で公知の技術により実施され得る。
【０１３３】
本発明によると、１本鎖抗体製造について報告された技術（米国特許第４９４６７７８号参照）は、標的タンパク質に特異的な１本鎖抗体の製造に適合化され得る。本発明の追加的実施態様では、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築について報告された技術［Huse et al.、Science、２４６巻、１２７５−１２８１頁（１９８９）参照］を使用することにより、標的タンパク質について所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定が可能となる。
【０１３４】
標的タンパク質のイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当業界で公知の技術により生成され得る。例えば、上記フラグメントには、限定されるわけではないが、抗体分子のペプシン消化により製造され得るＦ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成され得るＦａｂ'フラグメント、パパインおよび還元剤で抗体分子を処理することにより生成され得るＦａｂフラグメントおよびＦｖフラグメントがある。
【０１３５】
抗体の製造において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当業界で公知の技術、例えばＥＬＩＳＡにより実施され得る。標的タンパク質に特異的な抗体を選択するため、標的タンパク質に結合する抗体について生成されたハイブリドーマまたはファージディスプレー抗体ライブラリーが検定され得る。
【０１３６】
（タンパク質活性の修飾方法）
タンパク質活性を直接修飾する方法には、上記で検討されている通り、特に、優性抑制型突然変異、特異的薬剤または化学部分および抗体の使用がある。
【０１３７】
優性抑制型突然変異は、細胞での発現時にターゲッティングされたタンパク質種の活性を破壊する内在性遺伝子または突然変異体内在性遺伝子への突然変異である。ターゲッティングされたタンパク質の構造および活性により、その標的の活性を破壊する優性抑制型突然変異の構築に適切な戦略の選択を導く一般的規則が存在する。Hershkowith、Nature、３２９巻、２１９−２２２頁（１９８７）参照。活性モノマー形態の場合、不活性形態の過剰発現により、標的タンパク質の正味の活性を著しく縮小するのに充分な天然基質またはリガンドについての競合が誘発され得る。上記の過剰発現は、例えば突然変異体遺伝子と活性が増強されたプロモーター、好ましくは制御可能または誘導可能なプロモーター、または構成的に発現されるプロモーターを会合させることにより達成され得る。別法として、標的リガンドと事実上不可逆的な会合が行われるように活性部位残基へ変化がなされ得る。上記変化は、ある種のチロシンキナーゼでの活性部位セリン残基の注意深い置換により達成され得る。Perlmutter et al.、Curr.Opin.Immunol.、８巻、２８５−２９０頁（１９９６）参照。
【０１３８】
活性マルチマー形態の場合、幾つかの戦略により、優性抑制型突然変異体の選択が誘導され得る。マルチマー活性は、マルチマー会合ドメインに結合し、マルチマー形成を阻止する外性タンパク質フラグメントをコードする遺伝子の発現により制御されているかまたは充分に満足できる形で低減化され得る。別法として、特定タイプの不活性タンパク質ユニットの制御可能であるかまたは充分満足できる形の過剰発現により、不活性マルチマーにおける野生型活性ユニットが拘束され、それによってマルチマー活性が低減化され得る。Nocka et al.、EMBO J.、９巻、１８０５−１８１３頁（１９９０）参照。例えば、二量体ＤＮＡ結合性タンパク質の場合、ＤＮＡ結合ドメインがＤＮＡ結合ユニットから欠失されるか、または活性化ドメインが活性化ユニットから欠失され得る。また、この場合、ＤＮＡ結合ドメインユニットは、活性化ユニットとの会合を誘発するドメインを伴わずに発現され得る。それによって、発現活性化の可能性は全く存在しない状態でＤＮＡ結合部位は拘束される。通常、特定タイプのユニットが活性中における立体配座変化を被る場合、堅固なユニットの発現により生成された複合体は不活化され得る。さらなる例について、細胞機構、例えば細胞運動、有糸分裂過程、細胞構造などに関与するタンパク質は、典型的には少数タイプの多くのサブユニットの会合により構成される。これらの構造は、構造上の欠陥を伴う少数のモノマーユニットを含ませることによる崩壊に高い感受性を示す場合が多い。上記突然変異体モノマーは、関連性のあるタンパク質活性を破壊するもので、制御されているかまたは充分に満足できる形で細胞において発現され得る。
【０１３９】
優性抑制型突然変異に加えて、温度（または他の外因性因子）に感受性を示す突然変異体標的タンパク質は、当業界でよく知られている突然変異誘発およびスクリーニング手順により見出され得る。
【０１４０】
また、当業者であれば、標的タンパク質に結合し、阻害する抗体の発現は、別の優性抑制型戦略として使用され得ることは容易に理解できるはずである。
【０１４１】
（小分子薬剤によるタンパク質の修飾）
最後に、ある種の標的タンパク質の活性は、外因性薬剤またはリガンドへの曝露により制御されているかまたは充分に満足できる形で修飾または摂動され得る。本発明方法は癌治療における様々な薬剤の有用性の試験または確認に適用されることが多いため、薬剤曝露は、ｍＲＮＡおよび発現されたタンパク質の両方である、細胞成分の重要な修飾／摂動方法である。好ましい実施態様において、投入された細胞成分は、薬剤曝露または遺伝子操作、例えば遺伝子欠失またはノックアウトにより摂動され、系の応答は遺伝子発現技術、例えば遺伝子転写物アレイとのハイブリダイゼーションにより測定される（以下に記載）。
【０１４２】
好ましい場合では、細胞における唯一の標的タンパク質と相互作用し、その一標的タンパク質のみの活性を改変する、すなわち活性を増強または減少させる薬剤が知られている。変動量の上記薬剤に対し徐々に変化をつけて細胞を曝露することにより、インプットとしてその標的タンパク質を有するネットワークモデルの徐々に変化する摂動が誘発される。充分に満足できる程度の曝露により、充分に満足できる修飾／摂動が誘発される。例えば、シクロスポリンＡは、シクロフィリンとの複合体を介して作用する、カルシニューリンタンパク質の非常に特異的な調節物質である。従って、シクロスポリンＡの一連の滴定を用いることにより、カルシニューリンタンパク質の所望の阻害量が生成され得る。別法として、シクロスポリンＡへ充分満足できる程度曝露することによりカルシニューリンタンパク質は最大限に阻害される。
【０１４３】
（測定方法）
本発明の実験方法は、細胞成分の測定に依存するものである。測定された細胞成分は、細胞の生物学的状態のいずれかの側面に由来するものであり得る。それらは、ＲＮＡ存在量が測定される転写状態、タンパク質存在量が測定される翻訳状態、タンパク質活性が測定される活性状態からのものであり得る。細胞特性はまた、例えば１種またはそれ以上のタンパク質の活性が、他の細胞成分のＲＮＡ存在量（遺伝子発現）と一緒に測定される場合といった混合側面に由来するものであり得る。この項は、薬剤または経路応答における細胞成分の典型的な測定方法について記載している。本発明は、上記測定の他の方法にも適合化され得る。
【０１４４】
好ましくは、本発明では他の細胞成分の転写状態を測定する。転写状態は、次の小項に記載されている、核酸または核酸模擬プローブのアレイとのハイブリダイゼーション技術により、または後続の小項に記載されている、他の遺伝子発現技術により測定され得る。しかしながら、測定された結果は、ｍＲＮＡ存在量および／または割合を表す値を含むデータであり、それらは通常（ＲＮＡ分解速度の差異が存在しない場合における）ＤＮＡ発現割合を反映している。
【０１４５】
本発明の様々な別の実施態様においては、転写状態以外の生物学的状態、例えば翻訳状態、活性状態の側面または混合側面が測定され得る。
【０１４６】
全実施態様において、細胞成分の測定は、いつ測定が行われるかとは比較的無関係な方法で実施されるべきである。
【０１４７】
（転写状態測定）
好ましくは、転写状態の測定は、この小項で記載されている、転写物アレイとのハイブリダイゼーションにより行われる。ある種の他の転写状態測定方法については、この小項で後述されている。
【０１４８】
（転写物アレイ概説）
好ましい実施態様において、本発明は、本明細書において「マイクロアレイ」とも称する「転写物アレイ」を使用する。転写物アレイは、細胞における転写状態の分析、および特に癌細胞の転写状態の測定に使用され得る。
【０１４９】
一実施態様において、転写物アレイは、細胞に存在するｍＲＮＡ転写物を表す検出可能標識ポリヌクレオチド、例えば全細胞ｍＲＮＡから合成された蛍光標識ｃＤＮＡをマイクロアレイとハイブリダイゼーションさせることにより製造される。マイクロアレイは、細胞または生物体のゲノムにおける遺伝子の多く、好ましくは遺伝子の大部分またはほぼ全部の産物についての結合、例えばハイブリダイゼーション部位のアレイが配列された表面である。マイクロアレイは、多くの方法で製造され得、その幾つかについては後述する。しかしながら、製造されたマイクロアレイはある種の特徴を共有している。アレイは再現性があるため、所定のアレイの多数のコピーが製造され、互いに容易に比較され得る。好ましくは、マイクロアレイは小さく、通常５ｃｍ２より小さいものであり、それらは結合、例えば核酸ハイブリダイゼーション条件下で安定している材料から製造される。マイクロアレイにおける所定の結合部位または結合部位の特有なセットは、細胞における単一遺伝子の産物と特異的に結合する。一特異的ｍＲＮＡにつき複数の物理的結合部位（以後「部位」）が存在し得るが、明快にするため、以下の考察では単一部位が存在するものと仮定する。一実施態様では、各位置に既知配列の固定された核酸を含む位置的にアドレス可能なアレイが使用される。
【０１５０】
細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが製造され、適切なハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイとハイブリダイゼーションしたとき、特定遺伝子に対応するアレイにおける部位へのハイブリダイゼーションレベルは、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの細胞における優勢さを反映することは容易に理解できるはずである。例を挙げると、例えば発蛍光団により検出可能に標識された、全細胞ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが、マイクロアレイとハイブリダイゼーションしたとき、細胞では転写されない遺伝子に対応する、すなわち遺伝子産物と特異的に結合し得るアレイ上の部位はほとんどまたは全くシグナル、例えば蛍光シグナルを生じず、コード化されたｍＲＮＡが優勢である遺伝子は比較的強いシグナルを発する。
【０１５１】
（マイクロアレイの製造）
マイクロアレイは、当業界では公知であり、遺伝子産物、例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ポリペプチドおよびそれらのフラグメントに配列が対応するプローブが既知の位置で特異的にハイブリダイゼーションまたは結合され得る表面により構成される。一実施態様において、マイクロアレイは、各位置が遺伝子によりコード化された産物、例えばタンパク質またはＲＮＡについての別々の結合部位を表し、結合部位が生物体のゲノムにおける遺伝子の大部分またはほぼ全部の産物について存在するアレイ、すなわちマトリックスである。好ましい実施態様において、以後「部位」と称す「結合部位」は、特定の同族体ｃＤＮＡが特異的にハイブリダイゼーションし得る核酸または核酸類似体である。結合部位の核酸または類似体は、例えば合成オリゴマー、完全長ｃＤＮＡ、完全長より短いｃＤＮＡまたは遺伝子フラグメントであり得る。
【０１５２】
好ましい実施態様において、マイクロアレイは、標的生物体ゲノムにおける全部またはほぼ全部の遺伝子の産物についての結合部位を含むが、全部またはほぼ全部を包括することが、必ずしも要求されるわけではない。通常、マイクロアレイは、ゲノムにおける遺伝子の少なくとも約５０％、多くの場合少なくとも約７５％、さらに多くは少なくとも約８５％、さらに多くは少なくとも約９０％より大、そして最も多くは少なくとも約９９％に対応する結合部位を有する。好ましくは、マイクロアレイは、興味の対象である生物学的ネットワークモデルを試験および確認するのに直接関連した遺伝子についての結合部位を有する。「遺伝子」は、ｍＲＮＡが、生物体、例えば単細胞または多細胞生物体における細胞で転写される好ましくは少なくとも５０、７５または９９のアミノ酸の読み枠（ＯＲＦ）として同定される。ゲノムにおける遺伝子の数は、生物体により発現されたｍＲＮＡの数から、またはゲノムの充分に特性確認された部分からの外挿により推定され得る。興味の対象である生物体のゲノムを配列決定したとき、ＯＲＦの数が測定され、ｍＲＮＡコーディング領域がＤＮＡ配列解析により同定される。例えば、サッカロマイシス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）ゲノムは、完全に配列決定されており、９９アミノ酸より長いＯＲＦを約６２７５有すると報告されている。これらのＯＲＦの解析は、タンパク質産物を特定すると思われる５８８５のＯＲＦが存在することを示している。Goffeau et al.、Science、２７４巻、５４６−５６７頁（１９９６）参照（出典明示により援用する）。対照的に、ヒトゲノムは、約１０５の遺伝子を含むと推定される。
【０１５３】
（マイクロアレイ用の核酸の製造）
上記で示した通り、特定同族体ｃＤＮＡが特異的にハイブリダイゼーションする「結合部位」は、その結合部位で結合された通常核酸または核酸類似体である。一実施態様において、マイクロアレイの結合部位は、生物体ゲノムにおける各遺伝子の少なくとも一部分に対応するＤＮＡポリヌクレオチドである。これらのＤＮＡは、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡからの遺伝子セグメントのＰＣＲ増幅、例えばＲＴ−ＰＣＲ、またはクローン化配列により得られる。ＰＣＲプライマーは、遺伝子またはｃＤＮＡの既知配列に基いて選択され、特有のフラグメント、すなわちマイクロアレイ上の他のフラグメントと共有する連続的同一配列が１０塩基を越えないフラグメントの増幅をもたらす。コンピュータープログラムは、要求される特異性および最適な増幅特性を有するプライマーの設計に有用である。例えば、Oligo  ｐｌバージョン５.０、ナショナル・バイオサイエンシーズ、参照。非常に長い遺伝子に対応する結合部位の場合、オリゴ−ｄＴプライマーｃＤＮＡプローブがマイクロアレイとハイブリダイゼーションしたときに完全長に満たないプローブでも有効に結合するように遺伝子の３'末端付近のセグメントを増幅することが望ましい場合もある。典型的には、マイクロアレイ上の各遺伝子フラグメントは、約５０ｂｐと約２０００ｂｐの間、さらに典型的には約１００ｂｐと約１０００ｂｐの間、そして通常は約３００ｂｐと約８００ｂｐの間の長さである。ＰＣＲ方法は公知であり、例えばInnis et al.編、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、アカデミック・プレス・インコーポレイテッド、サンディエゴ、カリフォルニア（１９９０）（出典明示により援用する）に記載されている。コンピューター制御式ロボットシステムが核酸の分離および増幅に有用であることは容易に理解できるはずである。
【０１５４】
マイクロアレイ用核酸の別の生成手段は、例えばＮ−ホスホネートまたはホスホルアミダイト化学を用いることによる、合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの合成によるものである。Froehler et al.、Nucleic Acid Res.、１４巻、５３９９−５４０７頁（１９８６）；および McBride et al.、Tetrahedron Lett.、２４巻、２４５−２４８頁（１９８３）参照。合成配列は、長さが約１５塩基と約５００塩基の間、典型的には約２０塩基と約５０塩基の間の長さである。実施態様によっては、合成核酸が非天然塩基、例えばイノシンを含む場合もある。上記で示した通り、核酸類似体は、ハイブリダイゼーションの結合部位として使用され得る。適切な核酸類似体の一例は、ペプチド核酸である。例えば、Egholm et al.、Nature、３６５巻、５６６−５６８頁（１９８３）；および米国特許第５５３９０８３号も参照。
【０１５５】
別の実施態様において、結合（ハイブリダイゼーション）部位は、遺伝子、ｃＤＮＡ、例えば発現された配列標識、またはそれからの挿入体のプラスミドまたはファージクローンから製造される。Nguyen et al.、Genomics、２９巻、２０７−２０９頁（１９９５）参照。さらに別の実施態様において、結合部位のポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【０１５６】
（固体表面への核酸の結合）
核酸または類似体は、ガラス、プラスチック、例えばポリプロピレンおよびナイロン、ポリアクリルアミド、ニトロセルロースまたは他の材料で製造され得る固体支持体に結合される。表面への核酸の好ましい結合方法は、Schena et al.、Science、２７０巻、４６７−４７０頁（１９９５）により概括的に報告されている通り、ガラスプレートでの印刷によるものである。この方法は、ｃＤＮＡのマイクロアレイの製造に特に有用である。また、DeRisi etal.、Nat.Genet.、１４巻、４５７−４６０頁（１９９６）；Shalon et al.、Genome Res.、６巻、６３９−６４５頁（１９９６）；および Schena et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９３巻、１０５３９−１１２８６頁（１９９５）も参照。上述の文献については、各々出典明示により援用する。
【０１５７】
マイクロアレイの第２の好ましい製造方法は、高密度オリゴヌクレオチドアレイの製造によるものである。ｉn ｓitu 合成についてのフォトリソグラフィー技術［Fodor et al.、Science、２５１巻、７６７−７７３頁（１９９１）；Pease et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９１巻、１１号、５０２２−５０２６頁（１９９４）；Lockhart et al.、Nat.Biotechnol.、１４巻、１６７５頁（１９９６）；および米国特許第５５７８８３２号、同第５５５６７５２号および同第５５１０２７０号参照、各々出典明示により援用する］または特定されたオリゴヌクレオチドの他の迅速な合成および沈積方法［Blanchard et al.、Biosens.Bioelectron.、１１巻、６８７−６９０頁（１９９６）参照］を用いることによる表面上の特定位置に、特定された配列と相補的な数千のオリゴヌクレオチドを含むアレイの製造技術については公知である。これらの方法を使用するとき、既知配列のオリゴヌクレオチド、例えば２０量体は、表面、例えば誘導体化ガラススライド上で直接合成される。通常、製造されたアレイは重複しており、一つのＲＮＡにつき幾つかのオリゴヌクレオチド分子を伴う。オリゴヌクレオチドプローブは、オルターナティブスプライシングされたｍＲＮＡを検出するために選択され得る。
【０１５８】
例えばマスキングによる、マイクロアレイの他の製造方法も使用され得る。MaskosおよびSouthern、Nucleic Acids Res.、２０巻、１６７９−１６８４頁（１９９２）参照。原則として、例えばナイロンハイブリダイゼーション膜上のドットブロットといった、いかなるタイプのアレイでも［Sambrook et al.、Molecular Cloning-- A Laboratory Manual、第２版、１〜３巻、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８９）参照、これについては出典明示により援用する］使用され得るが、当業者であれば、ハイブリダイゼーション体積が小さくなるため、非常に小さいアレイが好ましいことは容易に理解できるはずである。
【０１５９】
（標識プローブの生成）
全体およびポリ（Ａ）＋ＲＮＡの製造方法は、よく知られており、Sambrook et al.、前出（１９８９）に概括的に記載されている。一実施態様において、ＲＮＡは、グアニジニウムチオシアネート溶解、次いでＣｓＣｌ遠心分離を用いることにより、本発明において興味の対象である様々なタイプの細胞から抽出される。Chirgwin et al.、Biochemistry、１８巻、５２４９−５２９９頁（１９７９）参照。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロースでの選択により選別される。Sambrook et al.、前出（１９８９）参照。興味の対象である細胞には、野生型細胞、薬剤曝露野生型細胞、修飾／摂動細胞成分（複数も可）をもつ細胞、および修飾／摂動細胞成分（複数も可）をもつ薬剤曝露細胞がある。
【０１６０】
標識ｃＤＮＡは、オリゴｄＴ−プライマーまたはランダムプライマー逆転写によりｍＲＮＡから製造され、両方法とも当業界ではよく知られている。例えば、Klug およびBerger、Methods Enzymol.、１５２巻、３１６−３２５頁（１９８７）参照。逆転写は、検出可能な標識にコンジュゲートされたｄＮＴＰ、最も好ましくは蛍光標識ｄＮＴＰの存在下で実施され得る。別法として、分離されたｍＲＮＡは、標識ｄＮＴＰの存在下における２本鎖ｃＤＮＡのインビトロ転写により合成された標識アンチセンスＲＮＡに変換され得る。Lockhart et al.、前出（１９９６）参照（これについては出典明示により援用する）。別の実施態様において、ｃＤＮＡまたはＲＮＡプローブは、検出可能標識の非存在下で合成され得、それに続いて例えばビオチニル化ｄＮＴＰまたはｒＮＴＰを組込むか、または類似手段、例えばビオチンのプソラレン誘導体をＲＮＡに光架橋させ、次いで標識ストレプトアビジン、例えばフィコエリスリンコンジュゲートストレプトアビジンまたは均等内容物を付加することにより標識され得る。
【０１６１】
蛍光標識プローブを使用する場合には、フルオレセイン、リッサミン、フィコエリスリン、ローダミン（パーキン・エルマー・シータス）、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３.５、Ｃｙ５、Ｃｙ５.５、Ｃｙ７、蛍光体Ｘ（アマシャム）などを含む、多くの適切な発蛍光団が知られている。例えば、Kricka、Nonisotopic DNA Probe Techniques、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア（１９９２）参照。発蛍光団の対は、それらが容易に区別され得るように互いに異なる放射スペクトルを有するものが選択されるものとする。
【０１６２】
別の実施態様では、蛍光標識以外の標識が使用される。例えば、放射性標識、または一対の異なる放射スペクトルを有する放射性標識が使用され得る。Zhao et al.、Gene、１５６巻、２０７頁（１９９５）；および Pietu et al.、Genome Res.、６巻、４９２頁（１９９６）参照。しかしながら、放射性粒子が散乱することから、広く間隔をあけた結合部位が必要とされるため、放射性同位元素の使用はそれほど好ましくはない実施態様である。
【０１６３】
一実施態様において、０.５ｍＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰおよびｄＣＴＰ＋０.１ｍＭのｄＴＴＰ＋蛍光デオキシリボヌクレオチド、例えば０.１ｍＭのローダミン１１０ＵＴＰ（パーキン・エルマー・シータス）または０.１ｍＭのＣｙ３ ｄＵＴＰ（アマシャム）を含む混合物を、逆転写酵素、例えばＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ.ＴＭ.II（ＬＴＩインコーポレイテッド）と４２℃で６０分間インキュベーションすることにより、標識ｃＤＮＡを合成する。
【０１６４】
（マイクロアレイへのハイブリダイゼーション）
核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、プローブが特異的アレイ部位と「特異的に結合」または「特異的にハイブリダイゼーション」するように、すなわちプローブが、相補的核酸配列をもつ配列アレイ部位とはハイブリダイゼーション、デュプレックス形成または結合するが、非相補的核酸配列をもつ部位とはハイブリダイゼーションしないように選択される。本明細書で使用されているところによると、ポリヌクレオチドの短い方が２５塩基以下である場合、標準的塩基対合規則の使用による誤対合は全く存在せず、またはポリヌクレオチドの短い方が２５塩基より長い場合に誤対合が多くても５％に過ぎないとき、一ポリヌクレオチド配列は、もう一方と相補的であると考えられる。好ましくは、ポリヌクレオチドは完全に相補的（誤対合無し）である。特異的ハイブリダイゼーション条件下で、陰性対照を含むハイブリダイゼーション検定法を実施することにより、特異的ハイブリダイゼーションが行なわれることは容易に立証され得る。例、Shalon et al.（１９９６）前出；および Chee et al.前出参照。
【０１６５】
最適なハイブリダイゼーション条件は、標識プローブおよび固定化ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの長さ、例えばオリゴマー対ポリヌクレオチド＞２００塩基、およびタイプ、例えばＲＮＡ、ＤＮＡおよびＰＮＡにより異なる。核酸について特異的、すなわちストリンジェントなハイブリダイゼーション条件についての一般的パラメーターは、Sambrook et al.（１９９６）前出、および Ausubel et al.、Current Protocols in Molecular Biology、グリーン・パブリッシングおよびワイリー‐インターサイエンス、ニューヨーク（１９８７）に記載されている（出典明示により援用する）。Schena et al.のｃＤＮＡマイクロアレイを使用するとき、典型的ハイブリダイゼーション条件は、６５℃で４時間５×ＳＳＣ＋０.２％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、次いで低ストリンジェンシー洗浄緩衝液（１×ＳＳＣ＋０.２％ＳＤＳ）中２５℃、次いで高ストリンジェンシー洗浄緩衝液（０.１×ＳＳＣ＋０.２％ＳＤＳ）中２５℃で１０分間の洗浄である。Shena et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９３巻、１０６１４頁（１９９６）参照。有用なハイブリダイゼーション条件もまた提供されている。例えば、Tijessen、Hybridization With Nucleic Acid Probes、エルスヴィア・サイエンス・パブリッシャーズＢ.Ｖ.（１９９３）；および Kricka（１９９２）前出参照。
【０１６６】
（シグナル検出およびデータ分析）
蛍光標識プローブを使用するとき、転写物アレイの各部位における蛍光放射は、好ましくは走査型共焦レーザー顕微鏡により検出され得る。一実施態様では、適切な励起線を用いる別々の走査を、使用されている２種の発蛍光団の各々について実施する。別法として、２種の発蛍光団に特異的な波長での同時試料照明を可能にするレーザーが使用され得、２種の発蛍光団からの放射線が同時に分析され得る。Shalon et al.（１９９６）前出参照、出典明示により援用する。好ましい実施態様において、コンピューター制御型Ｘ−Ｙステージおよび顕微鏡対物レンズを備えたレーザー蛍光スキャナーでアレイを走査する。２種の発蛍光団の連続励起は、マルチライン混合ガスレーザーにより達成され、放射された光線は波長により分離され、２本の光電子増倍管で検出される。蛍光レーザー走査装置は、Schena et al.（１９９６）前出、および本明細書で引用されている他の参考文献に記載されている。別法として、Ferguson et al.、Nat.Biotechnol.、１４巻、１６８１−１６８４頁（１９９６）により報告された光ファイバー束を用いることにより、多数の部位におけるｍＲＮＡ存在量レベルが同時にモニターされ得る。
【０１６７】
シグナルを記録し、そして好ましい実施態様では、例えば１２ビットアナログ‐ディジタルボードを用いるコンピューターにより分析する。一実施態様では、グラフィックスプログラム、例えばＨｉｊａａｋグラフィックス・スイートを用いて、走査画像からスペックルを除去し、次いで各部位における各波長での平均ハイブリダイゼーションのスプレッドシートを作製する画像グリッドプログラムを用いて分析する。必要ならば、２種の発蛍光団についてチャンネル間における「クロストーク」（またはオーバーラップ）に関する実験的に決定された補正が行われ得る。転写物アレイにおける特定ハイブリダイゼーション部位について、好ましくは２種の発蛍光団の放射割合を計算する。この割合は、同族体遺伝子の絶対発現レベルとは無関係であるが、発現が薬剤投与、遺伝子欠失または他の試験事象により顕著にモジュレーションされる遺伝子については有用である。
【０１６８】
好ましくは、陽性または陰性として摂動を識別するのに加えて、摂動の大きさを測定することが有利である。これは、当業者には容易に理解できる方法により実施され得る。
【０１６９】
（他の転写状態測定方法）
細胞の転写状態は、当業界で公知の他の遺伝子発現技術により測定され得る。幾つかの上記技術は、電気泳動分析に関するコンプレキシティーが制限された制限フラグメントのプールを製造するもので、例えばフェージングプライマーと二重制限酵素消化を組合わせる方法［例えば、欧州特許第０５３４８５８Ａ１号（１９９２）、Zabeau et al.参照］または特定されたｍＲＮＡ末端に最も近い部位をもつ制限フラグメントを選択する方法［例えば、Prashar et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９３巻、６５９−６６３頁（１９９６）参照］がある。他の方法は、例えば多数のｃＤＮＡの各々における充分な長さの塩基、例えば２０〜５０塩基を配列決定することにより各ｃＤＮＡを同定するか、または特定されたｍＲＮＡ末端経路パターンに対して既知の位置で生成されている、短い標識、例えば９〜１０塩基を配列決定することによりｃＤＮＡプールを統計的にサンプリングする。例えば、Velculescu、Science、２７０巻、４８４−４８７頁（１９９５）参照。
【０１７０】
（他側面の測定）
本発明の様々な実施態様において、転写状態以外の生物学的状態、例えば翻訳状態、活性状態の側面または混合側面を測定することにより、薬剤および経路応答が得られる。これらの実施態様の詳細はこの項で記載されている。
【０１７１】
（翻訳状態測定）
翻訳状態の測定は、幾つかの方法に従って実施され得る。例えば、タンパク質の全ゲノムモニタリング、すなわち「プロテオーム」［Goffeau et al.（１９９６）、前出参照］は、結合部位が、細胞ゲノムによりコード化された複数のタンパク質種に特異的である、固定化された好ましくはモノクローナルの抗体を含むマイクロアレイを構築することにより実施され得る。好ましくは、抗体は、コード化されたタンパク質の実質的フラクション、または少なくとも興味の対象である生物学的ネットワークモデルを試験または確認するのに直接関連したタンパク質について存在する。モノクローナル抗体の作製方法はよく知られている。例えば、Harlowおよび Lane、Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク（１９８８）参照、これについては出典明示により援用する。好ましい実施態様では、細胞のゲノム配列に基いて設計された合成ペプチドフラグメントに対してモノクローナル抗体を産生させる。上記抗体アレイにより、細胞からのタンパク質をアレイと接触させ、それらの結合を当業界で公知の検定法により検定する。
【０１７２】
別法として、タンパク質は、二次元ゲル電気泳動システムにより分離され得る。二次元ゲル電気泳動は、当業界ではよく知られており、典型的には一次元目に等電点電気泳動、次いで二次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行う。例えば、Hames et al.、Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach、ＩＲＬプレス、ニューヨーク（１９９０）；Shevchenko et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９３巻、１４４０−１４４５頁（１９９６）；Sagliocco et al.、Yeast、１２巻、１５１９−１５３３頁（１９９６）；Lander、Science、２７４巻、５３６−５３９頁（１９９６）参照。得られた電気泳動図は、質量分析技術、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を用いるウエスタン・ブロッティングおよび免疫ブロット分析、および内部およびＮ−末端マイクロシーケンシングを含む、多様な技術により分析され得る。これらの技術を用いることにより、薬剤に曝露された細胞、例えば酵母または例えば特異的遺伝子の欠失または過剰発現により修飾された細胞における場合を含む、所定の生理学的条件下で製造された全タンパク質の実質的フラクションを同定することが可能である。
【０１７３】
（生物学的状態の他の側面に基いた実施態様）
ｍＲＮＡ存在量以外の細胞成分をモニタリングすると、ｍＲＮＡのモニタリングでは遭遇しなかったある種の技術的困難が現時点では露呈されるが、本発明方法の使用により細胞機能の特性確認に関連したタンパク質の活性が測定され得、本発明の実施態様が上記測定結果に基づき得ることは当業者には容易に理解できるはずである。活性の測定は、特性確認されている特定の活性に適切な機能的、生化学的または物理的手段により実施され得る。活性が化学的形質転換を伴う場合、細胞性タンパク質を天然基質と接触させることにより、形質転換割合が測定され得る。活性が多量体単位での会合、例えばＤＮＡとの活性化ＤＮＡ結合複合体の会合を伴う場合、会合したタンパク質の量または会合の二次的結果、例えば転写されたｍＲＮＡの量が測定され得る。また、例えば細胞周期制御における場合のように、一機能的活性のみが判明している場合、機能の目的達成能が観察され得る。既知であり、また測定されてはいるが、タンパク質活性の変化は、前述の本発明方法により分析される応答データを形成している。
【０１７４】
別の非限定的実施態様において、応答データは、細胞の生物学的状態の混合側面により形成され得る。応答データは、例えばある種のｍＲＮＡ存在量における変化、ある種のタンパク質存在量の変化、およびある種のタンパク質活性の変化から構築され得る。
【０１７５】
（コンピューター・インプリメンテーション）
好ましい実施態様において、以前の方法のコンピューター操作段階は、生物学系のモデルを形成および試験するのに強力で好都合な設備を提供できるように一コンピューターシステムまたは一つまたはそれ以上のネットワーク化コンピューターシステムでインプリメンテーション（実装）されている。コンピューターシステムは、内蔵コンポーネントを含み、外付けコンポーネントに連結されている単一ハードウェアプラットホームであり得る。このコンピューターシステムの内蔵コンポーネントは、メイン・メモリと相互連結したプロセッサエレメントを含む。例えば、コンピューターシステムは、２００Ｍｈｚまたはそれより大きいクロック速度および３２ＭＢまたはそれより大きいメイン・メモリのインテル・ペンティアムベースのプロセッサーであり得る。
【０１７６】
外付けコンポーネントは、大容量データ記憶システムを含む。この大容量記憶システムは、一つまたはそれ以上のハードディスクであり得、それらは典型的にはプロセッサおよびメモリと一緒にパッケージされている。典型的には、上記ハードディスクは、少なくとも１ＧＢのストレージを提供する。他の外付けコンポーネントは、「マウス」または他のグラフィックインプット装置であり得るポインティングデバイスと一緒に、モニターおよびキーボードであり得るユーザーインターフェースデバイスを含む。典型的には、コンピューターシステムはまた、他のローカルコンピューターシステム、リモートコンピューターシステム、または広域通信ネットワーク、例えばインターネットとリンクされている。このネットワークリンクにより、コンピューターシステムは、他のコンピューターシステムとデータおよびプロセッシングタスクを共有できる。
【０１７７】
このシステムのオペレーション中にメモリへローディングされるのは、幾つかのソフトウェアコンポーネントであり、それらは当業界では標準的であると同時に本発明にとって特殊なものである。これらのソフトウェアコンポーネントは、本発明方法に従ってコンピューターシステムを集合的に機能させる。これらのソフトウェアコンポーネントは、典型的には大容量記憶システムで記憶される。別法として、ソフトウェアコンポーネントは、リムーバブル媒体、例えばフロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ（説明せず）で記憶され得る。ソフトウェアコンポーネントは、コンピューターシステムおよびそのネットワーク相互連結の管理を担うオペレーティングシステムを代表する。このオペレーティングシステムは、例えばマイクロソフトのＷｉｎｄｏｗｓファミリーのもの、例えばＷｉｎｄｏｗｓ ９５、Ｗｉｎｄｏｗｓ ９８またはＷｉｎｄｏｗｓ ＮＴまたはＵｎｉｘオペレーティングシステム、例えばＳｕｎ Ｓｏｌａｒｉｓであり得る。ソフトウェアは、このシステムに好都合に存在する共通言語および機能を含むもので、本発明に特異的な方法をインプリメンテーションするプログラムを支援する。本発明の分析方法をプログラムするのに使用され得る言語には、Ｃ、Ｃ＋＋または、それほど好ましくはないがＪＡＶＡがある。最も好ましくは、本発明方法は、等式の記号エントリーおよび高レベル仕様の処理、例えば使用すべきアルゴリズムを可能にする数学的ソフトウェアパッケージでプログラムされ、それによってユーザーは、個々の等式またはアルゴリズムを手順からプログラムする必要性から解放される。上記パッケージには、例えばマスワークス（ナティック、マサチューセッツ）によるＭａｔｌａｂ、ウォルフラム・リサーチ（シャンペイン、イリノイ）によるＭａｔｈｅｍａｔｉｃａおよびマスソフト（ケンブリッジ、マサチューセッツ）によるＭａｔｈＣＡＤがある。
【０１７８】
好ましい実施態様において、解析ソフトェアコンポーネントは、実際に互いに相互作用する独立したソフトウェアコンポーネントを含む。解析ソフトェアは、システムのオペレーションに必要な全データを含むデータベースを表す。上記データは、必ずしも限定されるわけではないが、先行実験の結果、ゲノムデータ、実験手順および費用および当業者にとっては明白である他の情報を一般的に含む。解析ソフトェアは、本発明の分析方法を実行する一つまたはそれ以上のプログラムを含むデータリダクションおよびコンピューター操作コンポーネントを含む。
【０１７９】
解析ソフトェアはまた、コンピューターシステムのユーザーが試験ネットワークモデルおよび所望により実験データをコントロールおよびインプットするためのユーザーインターフェースを含む。ユーザーインターフェースは、システムに対し条件を指定するためのドラッグ‐アンド‐ドロップインターフェースを含み得る。ユーザーインターフェースはまた、大容量記憶システムコンポーネント、例えばハードドライブから、リムーバブル媒体、例えばフロッピーディスクまたはＣＤ−ＲＯＭから、またはネットワーク、例えばローカルエリアネットワーク、または広域通信ネットワーク、例えばインターネットを通して現システムと通信する異なるコンピューターシステムからの実験データをローディングする手段を含み得る。
【０１８０】
本発明の解析方法をインプリメンテーションするための代替的システムおよび方法は、当業者にとっては明白なものであり、それらも本発明の請求の範囲内に包含されるものとする。特に、本発明の請求の範囲は、当業者であれば容易に理解できる本発明方法をインプリメンテーションするための代替的プログラム構造を包含するものとする。
表２．精製全ＲＮＡおよびｃＲＮＡの定量化
【表３】
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【０１８１】
表３．実験ＱＣの要約
【表４】
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【０１８２】
表４．２８プローブセット発現プロファイルによる１８卵巣試験試料の予測対観察状態の比較
【表５】
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注：観察数は各試料群について示されており、ランダム関連付け下で予測される値を括弧内に示す。
「ｒ」＝平均正常プロファイルをもつ生検試料の２８プローブセットプロファイルのＰＣＣ値
ＯＲ＝６３（９５％ＣＩ：３.３−１１９４.７）、ｐ＝０.００２９
【０１８３】
表５．２８、３２または４２プローブセット発現プロファイルによる３６卵巣試料の予測対観察状態の比較
【表６】
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【０１８４】
表６．卵巣腫瘍でアップレギュレーションされる遺伝子のリスト
１８試験試料のみ（Ｒ１）または全３６試料（Ｒ２）で分析された発現レベルについての絶対ＣＣ値を示す。
【表７】
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【０１８５】
表７．卵巣癌において最も特異的に発現される遺伝子の機能的カテゴリー
【表８】
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＊５遺伝子（ＧＰＲＫ５、ＩＧＦＢＰ５、ＩＲＳ１、ＩＴＰＲ１およびＲＢＰＭＳ）については、２種の異なるプローブセットにより類似した結果が得られた。
【０１８６】
表８．卵巣腫瘍機能的カテゴリーにおいてダウンレギュレーションされる遺伝子のリスト
【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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注：肉太の遺伝子記号は、２つの独立したプローブセットにより検出される遺伝子を示した。絶対ＣＣ値は、全３６試料（Ｒ１）および１８試験試料のみ（Ｒ２）で分析された発現レベルについて示されている。各機能性カテゴリーでは、Ｒ１値を下げることによりプローブセットを列挙している。
＊は、１００最高Ｒ１値内にはランク付けされていない２８分類セットからの遺伝子を示す。
【０１８７】
表９．卵巣癌で特異的な影響を受ける９００遺伝子の完全セット
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【０１８８】
表１０．ＰＣＣ値に基いた上位１００プローブセットのランク付け
【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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注：絶対ＣＣ値は、全３６試料（Ｒ１）および１８試験試料のみ（Ｒ２）で分析された発現レベルについて示されている。
ＣＣ≧０.５は、イタリック体で下線が施されている。
【０１８９】
（引用されている参考文献）
本明細書で引用されている参考文献については全て、個々の各出版物または特許または特許出願が具体的で個々に全目的に適う完全な形で引用されて説明の一部となっているのと全く同程度に全目的にかなう完全なものとして出典明示により援用されているものとする。本明細書の参考文献の検討内容は、著者らによる主張を要約しているに過ぎないものとし、参考文献の内容が先行技術を構成するということを認証しているものではない。出願者は、引用されている参考文献の正確さおよび適切さに異議を申し立てる権利を留保している。
【０１９０】
さらに、本明細書で引用されている全てのＧｅｎＢａｎｋ受入番号、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ番号およびタンパク質受入番号は、それらの各番号が具体的で個々に全目的に適う完全な形で引用されて説明の一部となっているのと全く同程度に全目的に適う完全なものとして出典明示により援用されているものとする。
【０１９１】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施態様に関して限定されているわけではなく、それらは本発明の個々の側面の単なる説明に過ぎないものとする。当業者であれば容易に理解できるように、本発明の多くの修飾および変形がその精神および範囲から逸脱することなく加えられ得る。本明細書で列挙されているものに加えて、本発明の範囲内における機能的に均等内容の方法および装置は、上記の記載および添付の図面から当業者であれば容易に想到できるものである。上記修飾および変形も、本発明の請求の範囲内に含まれるものとする。本発明は、本明細書に添付された請求の範囲により認められる完全な均等内容範囲と一緒に、かかる請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１Ａ】図１（Ａ）。プローブセットの増加数を用いた試料の再分類。
【０１９３】
【図１Ｂ】図１（Ｂ）。分類遺伝子の最適数決定に関するプローブセットの数の関数としての誤差のプロット。上限６から上限５５（Ａ）または全９００（Ｂ）までの個々のプローブセットの増加数による計算値。矢印は、誤分類を最小限にするプローブセットの最小数（Ｎ＝２８）を示す。
【０１９４】
【図２】図２。卵巣状態の分類についての閾値ＣＣ値の測定。
【０１９５】
【図３】図３。異なるサイズのプローブセットに関する試験および確認生検プロファイルと平均正常プロファイルの相関関係。ＮまたはＴは、それぞれ正常または腫瘍状態を表す。「ｒ」は、平均正常プロファイルをもつ対応する生検試料（１群）のプローブセットプロファイルのＰＣＣ値である。試料を最高ＣＣから最低まで順序づけている。
【０１９６】
【図４】図４。異なるサイズのプローブセットについての全正常プロファイルの平均と生検プロファイルの相関関係。ＮまたはＴは、それぞれ正常または腫瘍状態を表す。「ｒ」は、全正常試料の平均プロファイルをもつ対応する生検試料のプローブセットプロファイルのＰＣＣ値である。試料を最高ＣＣから最低まで順序づけている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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