(57)【要約】  反応性カルボニル種と反応するその能力が認知されているカルボニル捕捉剤は、正常細胞に対する類似作用無しに、異常細胞の死を加速又は誘発することが可能な作用物質としての関係が指摘されている。従って、それらは、正常なアポトーシス系路が分断された細胞や、過増殖性細胞成長が発生する場合等、細胞死の加速又は誘発が望ましいケースにおける有用な治療作用物質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異常細胞において細胞死を誘発又は加速させる方法であって、前記異常細胞に対して、Ｄ−ペニシラミンメチルエステル、アミノグアニジン、及び３−メルカプトイソロイシンから成るグループから選択されるカルボニル捕捉剤を前記異常細胞の死を誘発又は加速させるのに十分な量の投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記異常細胞が、皮膚細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異常細胞が、癌細胞又は前癌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記癌細胞が、扁平上皮癌細胞、上皮癌細胞、メラノーマ細胞又は腺癌細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記カルボニル捕捉剤を局所的に投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記前癌細胞が、ケラチン生成細胞である請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記カルボニル捕捉剤をヒトに投与する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記カルボニル捕捉剤が、Ｄ−ペニシラミンメチルエステルである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記カルボニル捕捉剤が、アミノグアニジンである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記カルボニル捕捉剤が、３−メルカプトイソロイシンである請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年３月２日に出願され、ここにその全体を参考文献として合体させる出願番号６０／５４９，８０５の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ジカルボニル捕捉剤などのカルボニル捕捉剤を使用して、細胞死を誘発する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景と従来技術
非メラノーマ疾患や、メラノーマ皮膚がん等を含む皮膚疾患の増加については十分に記録されており、前悪性又は悪性段階の皮膚がんのための有効な治療法が依然として欠如していることも同様に十分に記録されている。
【０００４】
ディグペン（Diegpen）他, Br. J. Dermatology146: 1-6 (2002)は、コーカソイド人種に影響を与える最も一般的な癌として、非メラノーマ皮膚がん、“ＮＭＳＣ”、について記載している。ＮＭＳＣの約８０％は基底細胞癌腫であり、２０％は扁平細胞癌である。光線性角化症として知られている状態は、前癌状態であり、これが扁平細胞癌に発展する可能性がある。浸潤性扁平細胞癌へと進行する比率は、毎年２０％に上るものと推定されている。May, J., Am. Acad. Dermatol. 42: 8-10 (2000)を参照。
【０００５】
メラノーマは、米国における全皮膚がんの約５％に過ぎないが、それは皮膚がんによる死亡の８０％近くを占める。初期診断によって、外科切除による治癒率は高くなるが、悪性メラノーマは、浸潤性になり転移する傾向が非常に高い。メラノーマ細胞は、化学療法、アポトーシスの全ての形態の治療的誘発、すべての形態の治療法に対して高い抵抗性を有する。
【０００６】
最近、内因性の反応性カルボニル種、別名「ＲＣＳ」、特に、解糖と脂質の過酸化中に形成される、グリオキサル、メチルグリオキサル及びマロンジアルデヒドを含むジカルボニル化合物、によって媒介される細胞カルボニルストレス(stress)が、増殖シグナリングとヒトの腫瘍細胞の転移との両方に関連するものとして指摘されている。例えば、タグチ（Taguchi）他, Nature 405 (6784): 354-60 (2000)を参照。
【０００７】
ＲＣＳと組織タンパク質との間の反応を介して形成される、「最終糖化反応物」、又は「ＡＧＥ」と呼ばれている、ＲＣＳ由来タンパク質エピトープ、はメラノーマに多く見られ、ＡＧＥは、メラノーマ増殖と転移に関係する膜受容体であるＲＡＧＥの潜在的リガンドである。アベ（Abe）他, J. Invest. Dermatol. 122 (2), 461-467 (2004)を参照。
【０００８】
本質的に、腫瘍細胞解糖作用の増加及びミトコンドリア脂質過酸化作用から由来するＲＣＳは、共有結合修飾を介してミトコンドリア膜透過性遷移孔開口を抑制する小分子抗アポトーシス性のモジュレータであるとする見解を支持する証拠が増大しつつある。スピア（Speer）他, J. Biol. Chem. 278 (37), 34757-63を参照。
【０００９】
ワンドラック（Wondrak）他, Biochem. Pharmacol.7105: 1-13 (2002)によって、細胞カルボニルストレスの治療的介入に有用であるとして、一連の非常に効果的な非毒性カルボニル捕捉剤が同定されている。この文献を、４／６／２００４発行の米国特許第６，７１６，６３５号、７／９／２００２発行の米国特許第６，４１７，２３５号と共に、ここに参考文献として合体させる。特に、前記’６３５特許は、ＲＣＳ及びＲＡＧＥ化合物、作用機序、いかにそれらが形成されるか、等に関して詳細な説明を提供している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
非メラノーマ疾患や、メラノーマ皮膚がん等を含む皮膚疾患の増加については十分に記録されており、前悪性又は悪性段階の皮膚がんのための有効な治療法が依然として欠如している。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
今般、これらのカルボニル捕捉剤が、メラノーマおよびその他の癌細胞に対して顕著なアポトーシス誘発作用を及ぼし、正常細胞に対してはそのような作用を及ぼさないものであることが発見された。以下の例に記載されるように、これが本発明の特徴である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
ここでの開示は、対象体に対して、カルボニル捕捉剤を、この捕捉剤が投与される細胞の死を誘発するのに十分な量と態様で投与することによって細胞死を誘発する方法である本発明の特徴を記載するものである。
【００１３】
実際には、前記カルボニル捕捉剤は、その細胞死の増強が望まれる対象体に対して投与される。本発明は、非ガン性、前癌性、及びガン性過増殖性細胞疾患を含むものであり、更に、細胞における不適切および／又は異常な増加が見られる状態、具体例としては、炎症性過増殖状態、良性前立腺肥大、バレット食道、ウィルス誘発性足底及び生殖器疣膂、光線性角化症、非メラノーマ及びメラノーマ皮膚がん、等の状態も含む。上述した証拠は、前記捕捉剤は、異常細胞中における細胞死誘発物質としてのみ作用するものであることを示している。従って、正常な細胞の早期又は不適切な死の誘発に関する問題は無い。
【００１４】
使用される前記カルボニル捕捉剤は、上述し、上に例示したいずれのものであってもよい。その他のカルボニル捕捉剤も同定し使用することが可能である。上述し、ここに参考文献として合体させた米国特許第６，７１６，６３５号は、そのような化合物をいかにして同定するかを教示している。
【００１５】
投与態様は様々なものとすることができる。例えば、ローション、クリーム、洗液（wash）、ロールオン（roll-on）、ソープ、等の局所投与が投与の１つの好ましい態様であるが、皮内、真皮下、筋肉内、静脈内、経口、舌下、等も可能である。供与形態は、治療される状態に応じて様々なものとなるであろう。
【実施例】
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、ネズミ（Ｂ１６）及びヒト（Ｇ−３６１，Ａ−３７５，ＬＯＸ）細胞ラインの悪性メラノーマ細胞ラインに対するＤ−ペニシラミンを使用したアポトーシス誘発の比較を示している。この図において、“Ｃ”は、対照を示し、 “Ｐ”はＤ−ペニシラミンでの治療を示す。
【００１７】
図２は、Ｄ−ペニシラミンに対する曝露後における、前悪性不死化ヒトケラチン生成細胞に対する実験の結果を要約している。
【００１８】
図３は、Ｄ−ペニシラミンと、Ｄ−ペニシラミンメチルエステルとに対する曝露後における、悪性ヒト扁平上皮細胞癌ラインＡ４３１におけるアポトーシスの誘発を示している。
【００１９】
図４は、上皮癌細胞ラインに対するＤ−ペニシラミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミンとアミノグアニジンを使用した結果の要約を提供している。
【００２０】
図５は、ヒトメラノーマラインＡ３７５と正常線維芽細胞ラインＣＦ３とにおける誘発されたアポトーシスを比較している。使用した化合物は、Ｄ−ペニシラミンの親油性誘導体、３−メルカプトロイシンであった。
【００２１】
図６は、カルボニル捕捉剤活性のために構造的要求が存在することを示し、ここでは、Ｄ−ペニシラミン、アミノグアニジン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミン、及びペニシラミンジスルフィドがテストされた。
【００２２】
図７は、正常細胞と悪性細胞との混合物から悪性メラノーマ細胞を選択的に除去することにおける本発明による化合物の有効性を示している。
【００２３】
図８は、アポトーシス機序がミトコンドリア膜電位差の脱分極に関連していることを示している。
【００２４】
好適実施例の詳細な説明
例１
この例は、３−メルカプト−Ｄ−バリン（“Ｄ−ペニシラミン”）が悪性細胞ラインのアポトーシスを誘発したことを示す実験を示すものである。
【００２５】
マウスメラノーマ細胞ラインＢ１６と、更に、三つのヒトメラノーマライン、即ち、Ｇ−３６１，Ａ−３７５及びＬＯＸ、とを使用した。これらの細胞のサンプルを、２４時間に渡って、１０ｍＭのＤ−ペニシラミンに連続的に晒した。アポトーシスを、標準アッセイ、即ち、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ヨウ化プロピジウムを使用したフローサイトメトリー染色、を使用して測定した。対照として、正常なヒト皮膚線維芽細胞、即ち“ＣＦ３”細胞を使用した。
【００２６】
図１に示すその結果は、対照ラン（化合物無し）、とテストラン（化合物有り）とをそれぞれ上下に示している。これらの図面から、悪性細胞においてはアポトーシスが誘発されたのに対して、正常なＣＦ３細胞では変化が無かったことが明らかである。
【００２７】
図面に図示されていない実験において、３−メルカプトイソロイシンでも類似の結果が得られた。
【００２８】
例２
これらの実験では、前悪性不死化ヒトケラチン生成細胞又は”“ＨａＣａＴ”細胞に対して、Ｄ−ペニシラミンを、１２．５ｍＭの濃度で添加し、曝露を２４時間連続させた。
【００２９】
図２において、対照（化合物無し）は、左側に、そしてテスト化合物Ｄ−ペニシラミンの作用は、右側に図示されている。ここでも、アポトーシスが誘発された。
【００３０】
例３
このセットの実験は、Ｄ−ペニシラミンと、それのより親油性の強い誘導体である、Ｄ−ペニシラミンメチルエステルの両方を利用した。
【００３１】
前記誘導体を作るために、−１０℃で保存しておいた７５ｍｌのＭｅＯＨ中で１８ｍｌのＳＯＣｌ２を攪拌し、種々の量のＤ−ペニシラミン（１５ｇ，１００．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物が室温に達する間攪拌を続けた。混合物を、６０時間還流し、その後、溶媒が蒸発し、粗生成物が残り（１５．２ｇ，９３．３ｍｍｏｌ）、これをメタノール中に溶解させ、その後、エーテルを添加して結晶化させた。結晶化生成物を、収集し、これを、真空乾燥させたところ、７．６ｇの純粋生成物が残された。その構造を、’Ｈ−ＮＭＲと質量分析法によって確認した。Ｃ６Ｈ１４Ｏ２ＮＳの算出ｍ／ｚは、１６４．１での観察で、１６４．１［Ｍ＋Ｈ］＋であった。
【００３２】
各ケースにおいて、１０ｍＭの前記テスト化合物を、２４時間に渡って、ヒトＡ４３１細胞に対して使用し、アポトーシスを上述したようにして測定した。
【００３３】
図３において、“Ｄ−Ｐ”は、Ｄ−ペニシラミンを示し、“Ｄ−Ｐ−ＯＣＨ３”は、前記メチルエステルを示す。前記エステルの場合に、より強力なアポトーシス作用が見られた。
【００３４】
例４
その他のガン、特に、上皮ガンに対する前記化合物の効能を測定した。ヒトＨｅＬａ頚部腺癌細胞を使用し、１０ｍＭのＤ−ペニシラミンと、２５ｍＭのアミノグアニジンでテストした。これらを、カルボニル捕捉剤として作用しない、Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミンでテストした。
【００３５】
図４に、前記対照（“Ｃ”）、Ｄ−ペニシラミン（“Ｄ−Ｐ”）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミン（“ＮＡＰ”）そしてアミノグアニジン（“ＡＧ”）でのこれらの実験の結果を示す。カルボニル捕捉剤として知られているＤ−ペニシラミンとアミノグアニジンとの両方がアポトーシス誘発物質であったのに対して、ＮＡＰはそうではなかった。
【００３６】
例５
３−メチル−３−エチル−Ｌ−システイン（メルカプトイソロイシン、又は“ＭＥＣ”）は、前にテストしたよりも親油性の高いカルボニル捕捉剤である。局所投与システムでは、高い親油性が望ましいので、この化合物をテストすることが興味深かった。
【００３７】
ＭＥＣを、Clarke, H.T. ed., The Chemistry of Penicillin (Princeton University Press, 1949), pg. 466のリーチ，ビー・イー（Leach, B.E.）他「Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンからのＤ．Ｌ−ペニシラミンの合成」に従って９５％の純度に合成し、その構造を’Ｈ−ＮＭＲで確認した。
【００３８】
悪性ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５と正常な線維芽細胞（ＣＦ３）とを、１０ｍＭのＭＥＣを使用して２４時間の曝露でテストした。
【００３９】
図５に示されているように、悪性細胞においては顕著なアポトーシスの誘発が見られたのに対して、正常細胞ではなんら誘発は観察されなかった。
【００４０】
例６
これらの実験は、構造／作用関連性が存在するか否かを調べるために構成された。換言すると、抗酸化物質としてではなく、カルボニル捕捉剤としての活性が抗がん活性のための重要であるか否かを調べることに注目した。
【００４１】
前記化合物Ｄ−ペニシラミン（Ｄ−Ｐ）、アミノグアニジン（ＡＧ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミン（ＮＡＰ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）及びペニシラミンジスルフィド（ＰＳＳ）がテストされた。Ｄ−Ｐ，ＮＡＣおよびＮＡＰは抗酸化物質として知られている。Ｄ−Ｐとアミノグアニジンとはカルボニル捕捉剤として知られている。
【００４２】
ヒトメラノーマ細胞ラインＧ−３６１に対するテストにおいて、Ｄ−ＰとＡＧのみがアポトーシスを誘発した。これらの結果は、一級アミノ及びチオール置換の構造的要求が存在すること、そして、抗酸化活性は、アポトーシス発生性（apoptogenicity）と関連性が無いということ、を示している。図６にこれらの結果を要約する。
【００４３】
例７
ガンの治療におけるカルボニル捕捉剤の治療的潜在性をこれらの実験で証明した。
【００４４】
ＣＦ３線維芽細胞とＡ３７５メラノーマ細胞との両方をコラーゲンマトリックス内に埋め込んだ皮膚メラノーマ再構築物（reconstruct）を作成した。前記マトリクスへの「播種（seeding）」の７２時間後、前記対照が図７中において示しているように、前記メラノーマ細胞は大きく増殖した。しかし、１２．５ｍＭのＤ−Ｐでの処理によって、メラノーマ細胞は除去され、前記線維芽細胞コラーゲンネットワークの構造的完全性は維持された。
【００４５】
例８
これらの実験は、前記カルボニル捕捉剤処理が誘発した優先性アポトーシスがミトコンドリア膜電位差“ΔΨｍ”の脱分極によって起こることを証明するものである。リアーズ（Reers）他, Biochemistry 30 (18): 4480-6 (1991)に従って、電位差測定色素（potentiometric）ＪＣ−１を使用した。１０ｍＭのＤ−ペニシラミンを培地に添加した２４時間後に前記色素を加えた。ＲＣＳ前処理として、５ｍＭのフェニルグリオキサルを１５分間使用し、その後、PBSで洗浄し、新しい培地を添加した。
【００４６】
図８は、細胞がカルボニル捕捉剤で処理された時には、ミトコンドリア膜電位差が失われたこと、そして、細胞がフェニルグリオキサルで前処理されてからカルボニル捕捉剤で処理された時には、ミトコンドリア膜電位差が保存されたことを極めて明瞭に示している。
【００４７】
上記開示は、対象体に対して、カルボニル捕捉剤を、この捕捉剤が投与される細胞の死を誘発するのに十分な量と態様で投与することによって細胞死を誘発する方法である本発明の特徴を記載するものである。
【００４８】
実際には、前記カルボニル捕捉剤は、その細胞死の増強が望まれる対象体に対して投与される。本発明は、非ガン性、前癌性、及びガン性過増殖性細胞疾患を含むものであり、更に、細胞における不適切および／又は異常な増加が見られる状態、具体例としては、炎症性過増殖状態、良性前立腺肥大、バレット食道、ウィルス誘発性足底及び生殖器疣膂、光線性角化症、非メラノーマ及びメラノーマ皮膚がん、等の状態も含む。上述した証拠は、前記捕捉剤は、異常細胞中における細胞死誘発物質としてのみ作用するものであることを示している。従って、正常な細胞の早期又は不適切な死の誘発に関する問題は無い。
【００４９】
使用される前記カルボニル捕捉剤は、上述し、上に例示したいずれのものであってもよい。その他のカルボニル捕捉剤も同定し使用することが可能である。上述し、ここに参考文献として合体させた米国特許第６，７１６，６３５号は、そのような化合物をいかにして同定するかを教示している。
【００５０】
投与態様は様々なものとすることができる。例えば、ローション、クリーム、洗液（wash）、ロールオン（roll-on）、ソープ、等の局所投与が投与の１つの好ましい態様であるが、皮内、真皮下、筋肉内、静脈内、経口、舌下、等も可能である。供与形態は、治療される状態に応じて様々なものとなるであろう。
【００５１】
本発明のその他の態様は当業者にとって明らかであろうから、ここで繰り返す必要はない。
【００５２】
ここで使用した用語と表現は、記載の用語であって、限定の用語ではなく、これらの用語及び表現を使用するに当たって、図示、記載された特徴構成又はそれらの一部のいかなる均等物も除外する意図はなく、本発明の範囲で種々の改変が可能であると理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】マウス（Ｂ１６）及びヒト（Ｇ−３６１，Ａ−３７５，ＬＯＸ）細胞ラインの悪性メラノーマ細胞ラインに対するＤ−ペニシラミンを使用したアポトーシス誘発の比較を示す図であり、“Ｃ”は、対照を示し、 “Ｐ”はＤ−ペニシラミンでの治療を示す。
【図２】Ｄ−ペニシラミンに対する曝露後における、前悪性不死化ヒトケラチン生成細胞に対する実験の結果を要約する図。
【図３】Ｄ−ペニシラミンと、Ｄ−ペニシラミンメチルエステルとに対する曝露後における、悪性ヒト扁平上皮細胞癌ラインＡ４３１におけるアポトーシスの誘発を示す図。
【図４】上皮癌細胞ラインに対するＤ−ペニシラミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミンとアミノグアニジンを使用した結果の要約を提供する図。
【図５】ヒトメラノーマラインＡ３７５と正常線維芽細胞ラインＣＦ３とにおける誘発されたアポトーシスを比較する図であり、使用した化合物は、Ｄ−ペニシラミンの親油性誘導体、３−メルカプトロイシンであった。
【図６】カルボニル捕捉剤活性のために構造的要求が存在することを示す図であり、ここでは、Ｄ−ペニシラミン、アミノグアニジン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ペニシラミン、及びペニシラミンジスルフィドがテストされた。
【図７】正常細胞と悪性細胞との混合物から悪性メラノーマ細胞を選択的に除去することにおける本発明による化合物の有効性を示す図。
【図８】アポトーシス機序がミトコンドリア膜電位差の脱分極に関連していることを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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2007526313.tif 000011
2007526313.tif 000012