(57)【要約】本発明は、血管新生を調節するための方法および組成物を提供する。2007520564.tif 000051
2007520564.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
CCX-CKR2活性を調節する物質を被験者に投与する段階を含む、被験者における血管新生を調節する方法。
【請求項２】
物質がCCX-CKR2に対するリガンドの結合を調節する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
リガンドがSDF-1およびI-TACからなる群より選択される、請求項2記載の方法。
【請求項４】
CCX-CKR2活性を促進して、それによって血管新生を促進する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
物質が、血管新生を促進する第二の物質と併用して投与される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
物質がCCX-CKR2アゴニストである、請求項1記載の方法。
【請求項７】
アゴニストが、ポリペプチド、抗体、および質量1,500ダルトン未満の物質から選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
CCX-CKR2活性が、被験者の細胞において組換え型CCX-CK2を発現することによって促進される、請求項4記載の方法。
【請求項９】
細胞が内皮細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
CCX-CKR2活性がI-TACを被験者に投与することによって促進される、請求項4記載の方法。
【請求項１１】
I-TACが被験者に局所投与される、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
被験者が脈管化の増加を必要とする、請求項4記載の方法。
【請求項１３】
被験者が創傷、骨折、火傷、炎症疾患、心疾患、レスチノシス（restinosis）、虚血心、末梢血管疾患、心筋梗塞、卒中、不妊、乾癬、または強皮症を有する、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
被験者が創傷を有し、物質が創傷に適用されて、それによって創傷治癒を増強する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
物質がCCX-CKR2活性を阻害する、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
物質が、CCX-CKR2の発現を阻害するポリヌクレオチドである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
物質が、ポリペプチド、抗体、および質量1,500ダルトン未満の物質からなる群より選択されるアンタゴニストである、請求黄15記載の方法。
【請求項１８】
物質がCCX-CKR2活性を増強する、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
CCX-CKR2活性を減少させて、それによって血管新生を減少させる、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
物質が、CCX-CKR2の発現を阻害するポリヌクレオチドである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
物質が第二の抗血管新生物質と併用して投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
物質がCCX-CKR2アンタゴニストである、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
アンタゴニストが、ポリペプチド、抗体、および質量1,500ダルトン未満の物質から選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
被験者が癌を有する、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
被験者が固形腫瘍を有し、物質が腫瘍にターゲティングされる、または送達される、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
化学療法剤または放射線の量が物質と併用して被験者に投与される、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
量が、化学療法剤または放射線を単独で投与すれば治療下となる量である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
被験者が癌を有しない、請求項19記載の方法。
【請求項２９】
血管新生が眼、皮膚、関節、卵巣組織、または子宮内膜組織から選択される組織において減少する、請求項19記載の方法。
【請求項３０】
物質が避妊物質として用いられる、請求項19記載の方法。
【請求項３１】
被験者が関節炎を有し、物質が被験者における関節炎の症状を減少させるために有効な量で投与される、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
CCX-CKR2活性を減少させる物質と併用した化学療法剤の量を含む、薬学的組成物。
【請求項３３】
量が、化学療法剤が単独で投与されれば治療下となる量である、請求項32記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
CCX-CKR2活性を増加する物質と、血管新生を促進する第二の物質とを含む薬学的組成物。
【請求項３５】
CCX-CKR2活性を減少させる物質と、血管新生を減少させる第二の物質とを含む、薬学的組成物。
【請求項３６】
CCX-CKR2活性を減少させる物質と、第二の抗関節炎剤とを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、そのそれぞれが全ての目的に関して参照により本明細書に組み入れられる、2004年2月3日に提出された米国特許仮出願第60/541,849号；2004年8月4日に提出された米国特許仮出願第60/598,958号；および2004年11月8日に提出された米国特許仮出願第60/626,195号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
発明の背景
血管新生は、それによって新しい血管が形成され、正常な多様な身体活動（生殖、発達、および創傷修復のような）にとって必須である基本的なプロセスである。プロセスは完全には理解されていないが、毛細血管の主な細胞である内皮細胞の増殖を刺激および阻害する分子の複雑な相互作用を伴うと考えられている。通常の条件で、これらの分子は、微小血管を長期間、休止状態（すなわち、毛細管の増殖を認めない状態）に維持するように思われ、この期間は数週間持続する、または場合によっては10年間持続することもある。しかし、創傷治癒の際のような必要な場合には、これらの同じ細胞が急速に増殖して、5日間もの短い期間で代謝回転しうる。
【０００３】
血管新生は、正常な状態で高度に調節されたプロセスであるが、多くの疾患（「血管新生疾患」という特徴を有する）は、持続的な調節されない血管新生によって促進される。言い換えれば、調節されない血管新生は、特定の疾患を直接引き起こす可能性がある、または既存の病態を悪化させる可能性がある。固形腫瘍の増殖および転移はいずれも血管新生依存的である（Folkman, 1986, J. Cancer Res. 46:467〜473（非特許文献１）；Folkman, J. Nat. Cancer Inst, 82:4〜6(1989)（非特許文献２）；Folkman et al., 「Tumor Angiogenesis」, Chapter 10, pp.206〜32, in THE MOLECULAR BASIS OF CANCER, Mendelsohn et al, eds. (1995)（非特許文献３））。
【０００４】
腫瘍を有する動物において薬剤として用いる場合、天然の血管新生阻害剤は、小さい腫瘍の増殖を防止することができる（O'Reilly et al., Cell 79:315〜328(1994)（非特許文献４））。実際に、いくつかのプロトコールにおいて、そのような阻害剤を適用すると、治療の中止後であっても腫瘍の退縮および休眠を引き起こす（O'Reilly et al., Cell 88:277〜285(1997)（非特許文献５））。その上、特定の腫瘍に血管新生阻害剤を提供すると、他の治療療法（例えば、化学療法）に対するその反応を増強することができる（例えば、Teischer, et al, Int. J. Cancer 57:920〜925(1994)（非特許文献６）を参照されたい）。
【０００５】
血管新生はまた、Folkman et al., Science 235:442〜447(1987)（非特許文献７）に記述されるように、創傷治癒、胚の発達、月経周期、および炎症のような様々な生物学的プロセス、ならびに癌、糖尿病性網膜症、およびリウマチ性関節炎のような様々な疾患の発病において重要な役割を果たす。眼の血管新生は、失明の最も一般的な原因として関係しており、約20の眼科疾患の病態の基礎となっている。関節炎のような特定の既に存在する病態では、新たに形成された毛細血管が関節に浸潤して、軟骨を破壊する。糖尿病では、網膜において形成された新たな毛細血管が硝子体液に浸潤して、出血および失明を引き起こす。
【０００６】
一方、状況によっては血管新生の促進は有益となりうる。例えば、血管新生の促進は、様々な生理的プロセスを加速するために、ならびに創傷、骨折、および火傷の治癒、炎症疾患、虚血性心疾患、末梢血管疾患、および心筋梗塞のような脈管新生の増加を必要とする疾患の治療に役立ちうる。血管新生の阻害は、血管新生の増加がそのような疾患の進行に貢献する、癌、糖尿病性網膜症、およびリウマチ性関節炎の様な疾患の治療において役立ちうる。
【０００７】
したがって、血管新生の操作は、それによって血管新生を含む様々な病態または疾患を治療または予防する治療アプローチを表す。
【０００８】
【非特許文献１】Folkman, 1986, J. Cancer Res. 46:467〜473
【非特許文献２】Folkman, J. Nat. Cancer Inst, 82:4〜6(1989)
【非特許文献３】Folkman et al., 「Tumor Angiogenesis」, Chapter 10, pp.206〜32, in THE MOLECULAR BASIS OF CANCER, Mendelsohn et al, eds. (1995)
【非特許文献４】O'Reilly et al., Cell 79:315〜328(1994)
【非特許文献５】O'Reilly et al., Cell 88:277〜285(1997)
【非特許文献６】Teischer, et al, Int. J. Cancer 57:920〜925(1994)
【非特許文献７】Folkman et al., Science 235:442〜447(1987)
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な概要
本発明は、被験者における血管新生を調節する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、CCX-CKR2活性を調節する物質を被験者に投与する段階を含む。いくつかの態様において、物質はCCX-CKR2に対するリガンドの結合を調節する。いくつかの態様において、リガンドは、SDF-1およびI-TACからなる群より選択される。いくつかの態様において、被験者は血管新生の増加または減少を必要とする。
【００１０】
いくつかの態様において、方法は、CCX-CKR2活性を促進して、それによって血管新生を促進する。いくつかの態様において、物質は、血管新生を促進する第二の物質と併用して投与される。
【００１１】
いくつかの態様において、物質は、CCX-CKR2アゴニストである。いくつかの態様において、アゴニストは、ポリペプチド、抗体、および質量1,500ダルトン未満の物質から選択される。いくつかの態様において、CCX-CKR2活性は、被験者の細胞において組換え型CCX-CK2を発現することによって促進される。いくつかの態様において、細胞は内皮細胞である。
【００１２】
いくつかの態様において、CCX-CKR2活性はI-TACを被験者に投与することによって促進される。
【００１３】
いくつかの態様において、I-TACは被験者に局所投与される。
【００１４】
いくつかの態様において、被験者は脈管化の増加を必要とする。いくつかの態様において、被験者は創傷、骨折、火傷、炎症疾患、心疾患、再狭窄、虚血性心疾患、末梢血管疾患、心筋梗塞、卒中、不妊、乾癬、または強皮症を有する。
【００１５】
いくつかの態様において、被験者は創傷を有し、物質は創傷に適用され、それによって創傷治癒が増強される。いくつかの態様において、物質はCCX-CKR2活性を阻害する。いくつかの態様において、物質はCCX-CKR2活性を増強する。
【００１６】
いくつかの態様において、方法はCCX-CKR2活性を減少させて、それによって血管新生を減少させる。いくつかの態様において、物質はCCX-CKR2の発現を阻害するポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、物質は、ポリペプチド、抗体、および質量1,500ダルトン未満の物質からなる群より選択されるアンタゴニストである。いくつかの態様において、物質は、CCX-CKR2の発現を阻害するポリヌクレオチドである。いくつかの態様において、物質は第二の抗血管新生物質と併用して投与される。
【００１７】
いくつかの態様において、物質はCCX-CKR2アンタゴニストである。いくつかの態様において、アンタゴニストは、ポリペプチド、抗体、および質量1,500ダルトン未満の物質から選択される。
【００１８】
いくつかの態様において、被験者は癌を有する。いくつかの態様において、被験者は固形腫瘍を有し、物質は腫瘍にターゲティングまたは送達される。
【００１９】
いくつかの態様において、化学療法剤または放射線照射量は、物質と併用して被験者に投与される。いくつかの態様において、量は、化学療法剤または放射線が単独で投与されれば治療下となる量である。
【００２０】
いくつかの態様において、被験者は癌を有しない。
【００２１】
いくつかの態様において、血管新生は、眼、関節、卵巣組織、または子宮内膜組織から選択される組織において減少する。いくつかの態様において、物質は避妊薬として用いられる。
【００２２】
いくつかの態様において、被験者は関節炎を有し、物質は被験者における関節炎の症状を減少させるために有効な量で投与される。
【００２３】
本発明はまた、CCX-CKR2活性を減少させる物質と併用した化学療法剤の量を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、量は、化学療法剤が単独で投与されれば治療下となる量である。
【００２４】
本発明はまた、CCX-CKR2活性を増加させる物質と、血管新生を促進する第二の物質とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２５】
本発明はまた、CCX-CKR2活性を減少させる物質と、血管新生を減少させる第二の物質とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２６】
本発明はまた、CCX-CKR2活性を減少させる物質と、第二の抗関節炎剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２７】
定義
本明細書において「CCX-CKR2」と呼ばれる「RDC1」は、7回膜貫通ドメイン推定Gタンパク質共役受容体（GPCR）を指す。CCX-CKR2のイヌのオルトログが1991年に初めて同定された。Libert et al., Science 244:569〜572(1989)を参照されたい。イヌの配列はLibert et al., Nuc. Acids Res. 18(7):1917(1990)に記述されている。マウス配列は、例えばHeesen et al., Immunogenetics 47:364〜370(1998)に記述されている。ヒト配列は例えば、Sreedharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :4986〜4990(1991)に記述されるが、彼らはこのタンパク質を血管活性腸管ペプチドの受容体であると誤って記述した。「CCX-CKR2」には、配列番号：1、配列番号：2、配列番号：3、配列番号：4、配列番号：5、配列番号：6、配列番号：7、配列番号：8、配列番号：9、または配列番号：10と実質的に類似である、またはこれらの保存的改変変種である配列が含まれる。
【００２８】
「被験者」は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、または他の哺乳類を含む動物を指す。
【００２９】
「化学療法剤」は、個体に投与した場合に、癌様細胞の増殖の阻害、遅延、もしくは停止を引き起こすために十分である、または癌様細胞において細胞障害作用を発揮するために十分である物質を指す。したがって、「化学療法剤の有効量」という句は、癌様細胞の増殖の阻害、遅延、もしくは停止を引き起こすために十分である、または癌様細胞において細胞障害作用を発揮するために十分である、個体に投与される化学療法剤の量を指す。「治療下量」は、癌様細胞の増殖の阻害、遅延、もしくは停止を引き起こすために十分である量より少ない、または癌様細胞において細胞障害作用を発揮するために十分である量より少ない量を指す。
【００３０】
「抗体」は、分析物（抗原）に特異的に結合してこれを認識する、免疫グロブリン遺伝子もしくは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチド、またはその断片を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子と共に、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κまたはλのいずれかとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、次にこれは免疫グロブリンクラス、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEをそれぞれ定義する。
【００３１】
例としての免疫グロブリン（抗体）構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の二つの同一の対からなり、各対は、一つの「軽鎖」（約25 kD）および一つの「重鎖」（約50〜70 kD）を有する。各鎖のN-末端は、抗原認識に主に関与するアミノ酸約100〜110個またはそれ以上の可変領域を定義する。可変軽鎖（VL）および可変重鎖（VH）という用語はそれぞれ、それらの軽鎖および重鎖を指す。
【００３２】
抗体は、例えば無傷の免疫グロブリンとして、または様々なペプチダーゼによる消化によって生じた十分に特徴付けのなされた多数の断片として存在する。このように、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下で抗体を消化して、F(ab)'2を生じ、これはそれ自身ジスルフィド結合によってVH-CH1に結合された軽鎖であるFabの二量体である。F(ab)'2は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合を切断するために軽度の条件で還元され、それによってF(ab)'2二量体はFab'単量体に変換される。Fab'単量体は本質的に、ヒンジ領域の一部を有するFabである。（Paul(Ed.)「Fundamental Immunology」, Third Edition, Raven Press, NY(1993)を参照されたい）。様々な抗体断片が無傷の抗体の消化に関して定義されているが、当業者は、そのような断片をデノボで化学合成してもよく、または組換えDNA方法論を利用して合成してもよいことを認識するであろう。このように、本明細書において用いられるように「抗体」という用語には、抗体全体の改変によって産生された抗体断片、または組換えDNA方法論を用いてデノボで合成された抗体断片（例えば、一本鎖Fv）が含まれる。
【００３３】
「ヒト化」抗体は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子の残りの免疫グロブリン構造とを有する分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合させた完全な可変ドメイン、または可変ドメインにおける適当なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（CDRs）のみのいずれかを含んでもよい。抗原結合部位は、野生型であってもよく、または一つもしくはそれ以上のアミノ酸置換によって改変、例えばヒト免疫グロブリンにより厳密に類似するように改変されてもよい。いくつかの型のヒト化抗体は全てのCDR配列を保存する（例えば、マウス抗体のCDRs 6個全てを含むヒト化マウス抗体）。ヒト化抗体の他の型は、当初の抗体に関して変化している一つまたはそれ以上のCDRs（1個、2個、3個、4個、5個、6個）を有する。
【００３４】
タンパク質またはペプチドを指す場合、「抗体に特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的（または選択的に）免疫反応する」という句は、タンパク質および他の生体物質の不均一な集団の存在下におけるタンパク質の存在に関して決定的である結合反応を指す。このように、指定されたイムノアッセイ条件では、明記された抗体は、特定のタンパク質に結合して、試料中に存在する他のタンパク質に対して有意な量で結合しない。そのような条件での抗体に対する特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性のために選択される抗体を必要とする可能性がある。例えば、本発明の任意のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して作製された抗体は、そのタンパク質と特異的に免疫反応するが、多形変種、例えば配列番号：2と少なくとも80％、85％、90％、95％、または99％同一であるタンパク質を除く他のタンパク質とはとは反応しない抗体を得るために選択することができる。多様なイムノアッセイフォーマットを用いて、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択してもよい。例えば、固相ELISAイムノアッセイ、ウェスタンブロット、または免疫組織化学は、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に用いられている。特異的免疫反応性を決定するために用いることができるイムノアッセイフォーマットおよび条件に関する記述に関しては、Harlow and Lane,「Antibodies : A Laboratory Manual」, Cold Spring Harbor Publications, NY(1988)を参照されたい。典型的に、特異的または選択的反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも2倍であり、より典型的にバックグラウンドの10〜100倍であろう。
【００３５】
「リガンド」は、受容体に結合することができる物質、例えばポリペプチドまたは他の分子を指す。
【００３６】
本明細書において用いられるように、「ケモカイン受容体に結合する物質」は、高い親和性でケモカイン受容体に結合する物質を指す。「高親和性」は、薬理学的に関連する反応を誘導するために十分な親和性、例えば薬学的に関連する濃度（例えば、約10-5 Mより低い濃度で）でケモカイン受容体に対する天然のケモカインリガンドの結合に関する有意な競合能を指す。高親和性を有するいくつかの例としての物質は、10-6 Mより高い親和性で、時に10-7 M、10-8 M、または10-9 Mより高い親和性でケモカイン受容体に結合するであろう。物質の濃度が10-4 Mより低い場合に天然の受容体リガンドとの結合に関して競合することができない物質は、本発明の目的に関して「結合しない」と見なされるであろう。
【００３７】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形でデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを指す。特に限定していなければ、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似のように代謝される天然のヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を含む。特に明記していなければ、特定の核酸配列はまた、その保存的改変変種（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列と共に明確に示された配列を暗に含む。特に、縮重コドン置換は、一つまたはそれ以上の選択された（または全ての）コドンの第三の部分が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基に置換されている配列を作製することによって得てもよい（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081(1991)；Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605〜2608(1985)；およびCassol et al., (1992)；Rossolini et al., Mol. Cell Probes 8:91〜98(1994)）。
【００３８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において互換的に用いられる。この用語は、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーと共に、天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに当てはまる。本明細書において用いられるように、この用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって結合している完全長のタンパク質（すなわち抗原）を含む任意の長さのアミノ酸の鎖を含む。
【００３９】
「アミノ酸」という用語は、天然および合成アミノ酸と共に、天然に存在するアミノ酸と類似のように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸と共に、後に改変されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γカルボキシグルタメート、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、改変R基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。「アミノ酸模倣体」は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが天然に存在するアミノ酸と類似のように機能する化学化合物を指す。
【００４０】
アミノ酸は、本明細書においてその一般的に公知の三文字記号によって、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される一文字記号のいずれかによって言及される可能性がある。同様に、ヌクレオチドは、その一般的に許容される一文字コードによって言及される可能性がある。
【００４１】
「配列同一性の百分率」は、比較ウィンドウにおいて二つの最適に整列させた配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。百分率は、マッチした位置の数を生じるように、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が双方の配列において起こる位置の数を決定すること、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数によって除する段階、および結果に100を乗じて配列同一性の百分率を生じる段階によって計算される。
【００４２】
二つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況において「同一」または「同一性(％)」という用語は、比較ウィンドウに対して最大の対応が得られるように比較および整列させた場合に、例えば全CCX-CKR2ポリペプチドの明記された領域に対して、または以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いてもしくは手動での整列および肉眼的検分によって測定した場合に指定された領域に対して、同じである二つまたはそれ以上の配列または小配列を指す。任意で、同一性は、長さがヌクレオチドもしくはアミノ酸少なくとも約50個の領域に対して存在する、またはより好ましくは長さがヌクレオチドもしくはアミノ酸100〜500個、もしくは1000個もしくはそれ以上の領域に対して存在する。
【００４３】
二つまたはそれ以上のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の状況において、「類似性」または「類似性(％)」という用語は、比較ウィンドウに対して最大の対応が得られるように比較および整列させた場合にCCX-CKR2ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの明記された領域もしくは全配列に対して、または以下の配列比較アルゴリズムの一つを用いてもしくは手動での整列および肉眼的検分によって測定した場合に指定された領域に対して、同じである（すなわち、60％、任意で65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％）、アミノ酸残基またはヌクレオチドの明記された百分率それぞれを有するアミノ酸残基の明記された百分率を有する二つまたはそれ以上の配列または小配列を指す。任意で、同一性は、長さがアミノ酸もしくはヌクレオチド少なくとも約50個の領域に対して存在する、またはより好ましくは長さがアミノ酸もしくはヌクレオチド100〜500個、もしくは1000個もしくはそれ以上の領域に対して存在する。
【００４４】
配列比較のために、典型的に一つの配列が、それに対して試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力して、必要であれば小配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを用いることができ、または代わりのパラメータを指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較して試験配列に関する％配列同一性を計算する。
【００４５】
本明細書において用いられるように「比較ウィンドウ」には、２つの配列が最適に整列された後に配列が同数の連続する位置の参照配列と比較される、例えば完全長の配列、アミノ酸もしくはヌクレオチド20〜600個、約50〜約200個、または約100〜約150個からなる群より選択される連続する位置の数の任意の一つのセグメントに対する参照が含まれる。比較のために配列を整列させる方法は当技術分野において周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばSmith and Waterman(1970)Adv. Appl. Math. 2:482cのローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch(1970)J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson and Lipman(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピューターによる実行によって、または手動でのアラインメントおよび肉眼での検分によって（例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology（1995 supplement）を参照されたい）実行することができる。
【００４６】
％配列同一性および配列類似性を決定するために適しているアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これは、Altschul et al.(1977)Nuc. Acids. Res. 25:3389〜3402およびAltschul et al.(1990)J. Mol. Biol. 215:403〜410においてそれぞれ記述されている。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジーセンター（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通して公共に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合にいくつかの陽性値閾値スコアTとマッチするまたは満足する、問い合わせ配列における長さWの短いワードを同定することによって、高いスコアの配列対（HSPs）を最初に同定することを含む。Tは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.、上記）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いHSPsを発見するための検索を開始するためのシードとして作用する。ワードヒットは累積的なアラインメントスコアが増加しうる限り、各配列に沿って双方の方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関してパラメータM（マッチする残基の対に関する報酬スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基に関するペナルティスコア；常に＜0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコア行列を用いて累積スコアを計算する。各方向におけるワードヒットの伸長は以下の場合に停止する：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量X低下する場合；一つまたはそれ以上の負のスコア残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれ未満となる場合；またはいずれかの配列の末端に達する場合。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXはアラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M＝5、N＝4および双方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムはデフォルトとしてワード長3および期待値（E）10、およびBLOSUM 62スコア行列（Henikoff and Henikoff(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照されたい）アルゴリズム（B）50、期待値（E）10、M＝5、N＝4および双方の鎖の比較を用いる。
【００４７】
BLASTアルゴリズムはまた、二つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Karlin and Altschul(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5787）。BLASTアルゴリズムによって提供された類似性の一つの測定手段は、最小和確率（P(N)）であり、これは、それによって二つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列のあいだのマッチが偶然に起こるであろう確率の指標を提供する。例えば、核酸は、参照核酸に対して試験核酸を比較した場合の最小和確率が0.2未満である場合、より好ましくは約0.01未満である場合、および最も好ましくは約0.001未満である場合に、参照配列と類似であると見なされる。
【００４８】
二つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの指標は、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが、下記のように第二の核酸によってコードされるポリペプチドに対して作製された抗体と免疫学的に交叉反応することである。このように、ポリペプチドは典型的に、例えば二つのペプチドが保存的置換のみによって異なる場合、第二のポリペプチドと実質的に同一である。二つの核酸配列が実質的に同一であることのもう一つの指標は、二つの分子またはその相補体が下記のようにストリンジェントな条件で互いにハイブリダイズすることである。二つの核酸配列が実質的に同一であることのさらにもう一つの指標は、同じプライマーを用いて配列を増幅できることである。
【００４９】
CCX-CKR2活性の「調節物質」は、CCX-CKR2活性を直接または間接的に増加または減少する分子を指し、これにはCCX-CKR2結合またはシグナル伝達に関するインビトロおよびインビボアッセイを用いて同定されたそれらの分子が含まれる。CCX-CKR2活性は、例えば、CCX-CKR2ポリペプチドをアゴニストに接触させることによって、および／または場合によっては細胞においてCCX-CKR2を発現させることによって増加させることができる。アゴニストは、CCX-CKR2の活性を増加させる分子を指す。アゴニストは、例えばCCX-CKR2に結合してその活性を刺激、増加、開く、活性化する、促進する、活性化を増強する、感作する、またはアップレギュレートする物質である。調節物質は、CCX-CKR2との結合に関して、SDF-1およびI-TACのような公知のCCX-CKR2リガンドならびに本明細書に記述の低分子と競合する可能性がある。
【００５０】
アンタゴニストは、例えばI-TACまたはSDF-1のようなアゴニストの結合を遮断することによってCCX-CKR2活性を阻害する分子を指す。アンタゴニストは、CCX-CKR2に結合して、刺激を部分的または完全に遮断する、その活性を減少させる、防止する、活性化を遅延する、不活化する、脱感作する、またはダウンレギュレートする物質である。アンタゴニストには、例えば抗体および有機低分子が含まれる。
【００５１】
調節物質には、例えば、CCX-CKR2と他のシグナル伝達タンパク質との相互作用を変化させる物質が含まれる。調節物質には、天然に存在するケモカイン受容体リガンドの、例えば活性が変化した遺伝子改変版と共に、天然に存在するおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、化学低分子、siRNAs等が含まれる。阻害剤および活性化剤に関するアッセイには、例えばCCX-CKR2を発現する細胞に推定の調節化合物を適用する段階、および次に、CCX-CKR2シグナル伝達に及ぼす機能的影響を決定する段階、またはCCX-CKR2に対するリガンド（例えば、SDF-1またはI-TAC）結合に及ぼす結果を決定する段階が含まれる。可能性がある活性化剤、阻害剤、または調節物質によって処置したCCX-CKR2を含む試料またはアッセイを、阻害の程度を調べるために、阻害剤、活性化剤、または調節物質を含まない対照試料と比較する。対照試料（阻害剤によって処置していない）に100％の相対的ケモカイン受容体活性を割付する。対照と比較してCCX-CKR2活性または発現値が約95％未満、任意で約90％、任意で約80％、任意で約50％、または約25〜0％であれば、CCX-CKR2の阻害が得られる。CCX-CKR2の活性化は、対照と比較してCCX-CKR2活性または発現値が少なくとも約105％、約110％、任意で少なくとも約105％、約150％、任意で少なくとも約105％、約200〜500％、または少なくとも約105％、約1000〜3000％またはそれ以上である場合、CCX-CKR2の活性化が得られる。
【００５２】
「siRNA」は、遺伝子発現による干渉を引き起こすことができ、細胞、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および体内、例えば哺乳類の体内（ヒトを含む）において特定の遺伝子の転写後沈黙化を引き起こしうる低分子干渉RNAsを指す。RNA干渉の現象は、Bass, Nature 411:428〜29(2001)；Elbahir et al., Nature 411:494〜98(2001)；およびFire et al., Nature 391:806〜11(1998)；および干渉RNAを作製する方法も同様に考察されている国際公開公報第01/75164号において記述および考察されている。siRNAは一般的に二本鎖RNA配列を形成し、これは相同的な転写物の分解を誘発する。siRNAの二本鎖部分は、例えば異なる二つの相補的RNA配列から、ヘアピン構造を形成する一つのRNA配列として形成されてもよい。配列に基づくsiRNAおよび本明細書において開示される遺伝子産物をコードする核酸は、典型的に100塩基対より少なく、例えば約30 bpsまたはそれより短くなりえて、相補的DNA鎖または合成アプローチを用いることを含む当技術分野で公知のアプローチによって作製することができる。siRNAは、干渉を引き起こすことができ、細胞、例えば哺乳類細胞（ヒト細胞を含む）および体内、例えば哺乳類の体内（ヒトを含む）において特定の遺伝子の転写後沈黙化を引き起こすことができる。本発明に従う例としてのsiRNAは、29 bps、25 bps、22 bps、21 bps、20 bps、15 bps、10 bps、5 bpsまでまたはその付近もしくはそのあいだの任意の整数を有しうる。最適な阻害siRNAを設計するためのツールには、DNAengine Inc（Seattle, WA）およびAmbion Inc.（Austin, TX）から入手可能なツールが含まれる。
【００５３】
一つのRNAi技術は、センスおよびアンチセンス配列がドナーおよびアクセプタースプライシング部位の適切なスプライシング方向でイントロン配列に隣接する領域に存在する遺伝子構築物を用いる。または、様々な長さのスペーサー配列を用いて構築物における配列の自己相補的領域を分離してもよい。遺伝子構築物転写物のプロセシングのあいだ、イントロン配列をスプライシングして除去し、センスおよびアンチセンス配列と共にスプライス接合配列を結合させて、二本鎖RNAを形成させる。二本鎖RNAに結合してこれを切断するリボヌクレアーゼを選択して、それによって特異的mRNA遺伝子配列の分解に至る事象のカスケードを開始させ、特異的遺伝子を沈黙化させる。
【００５４】
「化合物」という用語は、特異的分子を指し、これにはそのエナンチオマー、ジアステレオマー、多形およびその塩が含まれる。
【００５５】
本明細書において用いられるように、「ヘテロ原子」という用語は、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）およびケイ素（Si）が含まれると意味される。
【００５６】
「置換された」という用語は、親分子または基に結合した基を指す。このように、メチル置換基を有するベンゼン環は、メチル置換ベンゼンである。同様に、水素置換基5個を有するベンゼンは、親分子に結合した場合に非置換フェニル基となるであろう。
【００５７】
「置換ヘテロ原子」という用語は、ヘテロ原子が置換されている基を指す。ヘテロ原子は、水素、ハロゲン、アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アリール、アリーレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヘテロシクリル、カルボサイクル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、およびスルホニルが含まれるがそれらに限定されるわけではない基または原子によって置換されてもよい。代表的な置換ヘテロ原子には、例として、シクロプロピルアミニル、イソプロピルアミニル、ベンジルアミニル、およびフェノキシが含まれる。
【００５８】
「アルキル」という用語はそれ自身、またはもう一つの置換基の一部として、特に明記していなければ、指定された炭素原子数（すなわち、C1-8は炭素原子1〜8個を意味する）を有する直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを意味する。アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、t-ブチル、イソブチル、sec-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、n-オクチル等が含まれる。「アルケニル」という用語は、一つまたはそれ以上の二重結合を有する不飽和アルキル基を指す。同様に、「アルキニル」という用語は、一つまたはそれ以上の三重結合を有する不飽和アルキル基を指す。そのような不飽和アルキル基の例には、ビニル、2-プロペニル、クロチル、2-イソペンテニル、2-(ブタジエニル)、2,4-ペンタジエニル、3-(1,4-ペンタジエニル)、エチニル、1-および3-プロピニル、3-ブチニル、ならびに高次相同体および異性体が含まれる。「シクロアルキル」という用語には、表示された数の環原子（例えば、C3-6シクロアルキル）を有し、環の頂点のあいだが完全に飽和されているまたは頂点のあいだに一つのみの二重結合を有するを有する炭化水素環を指す。「シクロアルキル」はまた、例えばビシクロ[2,2,1]ヘプタン、ビシクロ[2,2,2]オクタン等のような二環および多環式炭化水素環を指すと意味される。
【００５９】
「アルキレン」という用語はそれ自身、またはもう一つの置換基の一部として、-CH2CH2CH2CH2-によって例示されるアルカンに由来する二価のラジカルを意味する。典型的に、アルキル（またはアルキレン）基は、炭素原子1〜24個を有し、炭素原子10個またはそれ未満を有する基が本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般的に炭素原子4個またはそれ未満を有するより短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。
【００６０】
「アルケニル」という用語は、直鎖または分枝鎖であってもよく、少なくとも一つ、典型的に1、2、または3個の炭素-炭素二重結合を有する一価の不飽和炭化水素基を指す。特に明記していなければ、そのようなアルケニル基は典型的に、炭素原子2〜10個を含む。代表的なアルケニル基には、例として、エテニル、n-プロペニル、イソプロペニル、n-ブト-2-エニル、n-へクス-3-エニル等が含まれる。
【００６１】
「アルキニル」という用語は、直鎖または分枝鎖であってもよく、少なくとも一つ、典型的に1、2、または3個の炭素-炭素三重結合を有する一価の不飽和炭化水素基を指す。特に明記していなければ、そのようなアルキニル基は典型的に、炭素原子2〜10個を含む。代表的なアルキニル基には、例として、エチニル、n-プロピニル、n-ブト-2-イニル、n-へクス-3-イニル等が含まれる。
【００６２】
「アリール」という用語は、特に明記していなければ、単環または互いに縮合もしくは共有結合してもよい多環（環3個まで）となりうる多価不飽和の、典型的に芳香族の炭化水素基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、N、O、およびSから選択されるヘテロ原子1個〜5個を含むアリール基（または環）であって、窒素および硫黄原子が任意で酸化されており、窒素原子（複数）が任意で四級化されているアリール基を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子または炭素原子を通して分子の残りの部分に結合することができる。アリール基の非制限的な例には、フェニル、ナフチル、およびビフェニルが含まれ、ヘテロアリール基の非制限的な例には、1-ピロリル、2-ピロリル、3-ピロリル、1-ピラゾリル、3-ピラゾリル、2-イミダゾリル、4-イミダゾリル、ピラジニル、2-オキサゾリル、4-オキサゾリル、5-オキサゾリル、3-イソキサゾリル、4-イソキサゾリル、5-イソキサゾリル、2-チアゾリル、4-チアゾリル、5-チアゾリル、2-フリル、3-フリル、2-チエニル、3-チエニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、2-ピリミジル、4-ピリミジル、5-ベンゾチアゾリル、プリニル、2-ベンゾイミダゾリル、ベンゾピラゾリル、5-インドリル、1-イソキノリル、5-イソキノリル、2-キノキサリニル、5-キノキサリニル、3-キノリル、および6-キノリルが含まれる。上記のアリールおよびヘテロアリール環系のそれぞれの置換基は、下記の許容される置換基の群から選択される。
【００６３】
簡潔のために、他の用語（例えば、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル）と組み合わせて用いる場合の「アリール」という用語には、先に定義したアリールおよびヘテロアリール環が含まれる。このように、「アリールアルキル」という用語には、アリールまたはヘテロアリール基がアルキル基に結合しているラジカルが含まれると意味される（例えば、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチル等）。
【００６４】
「アリーレン」という用語は、単環（すなわちフェニレン）または縮合環（すなわちナフタレンジイル）を有する二価の芳香族炭化水素を指す。特に定義されなければ、そのようなアリーレン基は典型的に、環の炭素原子6〜10個を含む。代表的なアリーレン基には、例として1,2-フェニレン、1,3-フェニレン、1,4-フェニレン、ナフタレン-1,5-ジイル、ナフタレン2,7-ジイル等が含まれる。
【００６５】
「アラルキル」という用語は、アリール置換アルキル基を指す。代表的なアラルキル基にはベンジルが含まれる。
【００６６】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ」（またはチオアルコキシ）という用語は、その通常の意味において用いられ、それぞれ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子を通して分子の残りに結合したアルキル基を指す。さらに、ジアルキルアミノ基に関して、アルキル部分は同じまたは異なりえて、同様に結合して、それぞれが結合される窒素原子と共に3〜7員環を形成することができる。したがって、-NRaRbとして表される基は、ピペリジニル、ピロリジニル、モルホリニル、アゼチジニル等が含まれると意味される。
【００６７】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語はそれら自身、またはもう一つの置換基の一部として、特に明記していなければ、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。さらに、「ハロアルキル」のような用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルが含まれると意味される。例えば、「C1-4ハロアルキル」という用語には、トリフルオロメチル、2,2,2-トリフルオロエチル、4-クロロブチル、3-ブロモプロピル等が含まれると意味される。
【００６８】
「シクロアルキル」という用語は、単環または縮合環を有する一価の飽和炭素環炭化水素基を指す。特に明記していなければ、そのようなシクロアルキル基は典型的に炭素原子3〜10個を含む。代表的なシクロアルキル基には、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれる。
【００６９】
「シクロアルキレン」という用語は、単環または縮合環を有する二価の飽和炭素環炭化水素基を指す。特に明記していなければ、そのようなシクロアルキレン基は典型的に炭素原子3〜10個を含む。代表的なシクロアルキレン基には、例としてシクロプロパン-1,2-ジイル、シクロブチル-1,2-ジイル、シクロブチル-1,3-ジイル、シクロペンチル-1,2-ジイル、シクロペンチル-1,3-ジイル、シクロヘキシル-1,2-ジイル、シクロヘキシル-1,3-ジイル、シクロヘキシル-1,4-ジイル等が含まれる。
【００７０】
「ヘテロアリール」という用語は、単環または縮合環を有し、環において窒素、酸素、または硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子（典型的にヘテロ原子1〜3個）を含む置換または非置換一価芳香族基を指す。特に明記していなければ、そのようなヘテロアリール基は、典型的に総環原子5〜10個を含む。代表的なヘテロアリール基には、例として、一価の種のピロール、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、フラン、チオフェン、トリアゾール、ピラゾール、イソキサゾール、イソチアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、トリアジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンズイミダゾール、ベンズチアゾール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン等が含まれ、結合点は利用できる任意の炭素または窒素環原子である。
【００７１】
「ヘテロアリーレン」という用語は、単環または縮合環を有し、環において窒素、酸素、または硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子（典型的にヘテロ原子1〜3個）を含む二価の芳香族基を指す。特に明記していなければ、そのようなヘテロアリーレン基は典型的に総環原子5〜10個を含む。代表的なヘテロアリーレン基には、例として、二価の種のピロール、イミダゾール、チアゾール、オキサゾール、フランチオフェン、トリアゾール、ピラゾール、イソキサゾール、イソチアゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン、ピリミジン、トリアジン、インドール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンズイミダゾール、ベンズチアゾール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン等が含まれ、結合点は利用できる任意の炭素または窒素環原子である。
【００７２】
「ヘテロシクリル」または「複素環基」という用語は、単環または縮合環を有し、環において窒素、酸素、または硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子（典型的にヘテロ原子1〜3個）を含む置換または非置換の一価の飽和または不飽和（非芳香族）基を指す。特に明記していなければ、そのような複素環基は典型的に総環原子2〜9個を含む。代表的な複素環基には、例として、一価の種のピロリジン、モルホリン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ピペリジン、1,4-ジオキサン、チオモルホリン、ピペラジン、3-ピロリン等が含まれ、結合点は利用できる任意の炭素または窒素環原子である。
【００７３】
「カルボサイクル」という用語は、環におけるそれぞれの原子が炭素である芳香族または非芳香族環を指す。代表的なカルボサイクルには、シクロヘキサン、シクロヘキセン、およびベンゼンが含まれる。
【００７４】
「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、フルオロ（-F）、クロロ（-Cl）、ブロモ（-Br）、およびヨード（-I）を指す。
【００７５】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」という用語は、-OH基を指す。
【００７６】
「アルコキシ」という用語は、Rが置換または非置換アルキル、アルキレン、シクロアルキル、またはシクロアルキレンとなりうる-OR基を指す。適した置換基には、ハロ、シアノ、アルキル、アミノ、ヒドロキシ、アルコキシ、およびアミドが含まれる。代表的なアルコキシ基には、例としてメトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシ、およびトリフルオロメトキシが含まれる。
【００７７】
「アリールオキシ」という用語には、Rが置換または非置換アリールまたはヘテロアリール基となりうる-OR基を指す。代表的なアリールオキシ基にはフェノキシが含まれる。
【００７８】
「スルホニル」という用語は、Rがアルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルキレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、複素環、またはハロゲンとなりうる-S(O)2-または-S(O)2R-基を指す。代表的なスルホニル基には、例としてスルホネート、スルホンアミド、スルホニルハライド、およびジピロピルアミドスルホネートが含まれる。
【００７９】
「縮合」という用語は、二つまたはそれ以上の分子が共有結合する反応を指す。同様に縮合産物は、縮合反応によって形成された産物である。
【００８０】
「複素環」という用語は、少なくとも一つの硫黄、窒素、または酸素ヘテロ原子を含む飽和または不飽和非芳香族環基を指す。それぞれの複素環は、任意の利用可能な環の炭素またはヘテロ原子で結合することができる。それぞれの複素環は一つまたはそれ以上の環を有してもよい。多数の環が存在する場合、それらは互いに縮合または共有結合することができる。それぞれの複素環は、窒素、酸素、または硫黄から選択される少なくとも一つのヘテロ原子（典型的にヘテロ原子1〜5個）を有しなければならない。好ましくはこれらの基は、窒素原子0〜5個、硫黄原子0〜2個、および酸素原子0〜2個を含む。より好ましくは、これらの基は、窒素原子0〜3個、硫黄原子0〜1個、および酸素原子0〜1個を含む。複素環基の非制限的な例には、ピロリジン、ピペリジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、ブチロラクタム、バレロラクタム、イミダゾリジノン、ヒダントイン、ジオキソラン、フタルイミド、1,4-ジオキサン、モルホリン、チオモルホリン、チオモルホリン-S,S-ジオキシド、ピペラジン、ピラン、ピリドン、3-ピロリン、チオピラン、ピロン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン等が含まれる。
【００８１】
上記の用語（例えば、「アルキル」、「アリール」、および「ヘテロアリール」）には、いくつかの態様において、表記のラジカルの置換および非置換型の双方が含まれるであろう。ラジカルの各タイプの好ましい置換基を以下に示す。簡潔のために、アリールおよびヘテロアリールという用語は、以下に提供されるように置換または非置換型を指し、「アルキル」という用語および関連する脂肪族ラジカルは、置換されていることが示されている場合を除き、非置換型を指すと意味される。
【００８２】
アルキルラジカル（しばしばアルキレン、アルケニル、アルキニル、およびシクロアルキルと呼ばれる基を含む）の置換基は、ゼロから（2m'+1）までの範囲の数の-ハロゲン、-OR'、NR'R"、-SR'、-SiR'R"R'''、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R'''、-NR"C(O)2R'、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NR'S(O)2R"、-CNおよび-NO2から選択され、m'はそのようなラジカルにおける炭素原子の総数である多様な基となりうる。R'、R"、およびR'''はそれぞれ独立して、水素、非置換C1-8アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換アリール、ハロゲン1〜3個によって置換されたアリール、非置換C1-8アルキル、C1-8アルコキシもしくはC1-8チオアルコキシ基、または非置換アリールC1-4アルキル基を指す。R'およびR"が同じ窒素原子に結合している場合、それらは窒素原子と結合して3-、4-、5-、6-、または7-員環を形成することができる。例えば、-NR'R"には、1-ピロリジニルおよび4-モルホリニルが含まれると意味される。
【００８３】
同様に、アリールおよびヘテロアリール基の置換基は多様であり、一般的に、芳香族環系における0から空いている原子価の総数までの数の、-ハロゲン、-OR'、-OC(O)R'、-NR'R"、-SR'、-R'、-CN、-NO2、-CO2R'、-CONR'R"、-C(O)R'、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR"C(O)2R'、-NR'、-C(O)NR"R'''、-NH-C(NH2)=NH、-NR'C(NH2)=NH、-NH-C(NH2)=NR'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NR'S(O)2R"、-N3、ペルフルオロ(C1-C4)アルコキシおよびペルフルオロ(C1-C4)アルキルから選択され、R'、R"、およびR'''は独立して、水素、C1-8アルキル、C3-6シクロアルキル、C2-8アルケニル、C2-8アルキニル、非置換アリールおよびヘテロアリール、（非置換アリール）-C1-4アルキルおよび非置換アリールオキシ-C1-4アルキルから選択される。他の適した置換基には、炭素原子1〜4個のアルキレン結合によって環原子に結合した上記のアリール置換基のそれぞれが含まれる。
【００８４】
アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2個を、任意で、式-T-C(O)-(CH2)q-U-の置換基によって置換してもよく、式中、TおよびUは独立して、-NH、-O-、-CH2、または単結合であり、qは0〜2の整数である。または、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2個は任意で、式-A-(CH2)r-B-の置換基によって置換してもよく、式中AおよびBは独立して、-CH2-、-O-、-NH-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'、または単結合であり、rは1〜3までの整数である。または、アリールまたはヘテロアリール環の隣接する原子上の置換基の2個を、任意で式-(CH2)s-X-(CH2)t-の置換基によって置換してもよく、式中sおよびtは独立して0〜3の整数であり、Xは-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、または-S(O)2NR'-である。-NR'-および-S(O)2NR'-における置換基R'は、水素または非置換C1-6アルキルから選択される。
【００８５】
本明細書において用いられるように、「ヘテロ原子」という用語には、酸素（O）、窒素（N）、硫黄（S）およびケイ素（Si）が含まれると意味される。
【００８６】
「薬学的に許容される塩」という用語には、本明細書に記述の化合物において認められる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸または塩基によって調製した活性化合物の塩が含まれると意味される。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含む場合、未希釈または適した不活性溶媒において、そのような化合物の中性型を十分量の所望の塩基と接触させることによって塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される無機塩に由来する塩の例には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等が含まれる。薬学的に許容される有機塩基に由来する塩には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等のような、置換アミン、環状アミン、天然に存在するアミン等を含む一級、二級、および三級アミンの塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含む場合、未希釈または適した不活性溶媒において、そのような化合物の中性型を十分量の望ましい酸に接触させることによって、酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、炭酸一水素酸、燐酸、燐酸一水素酸、燐酸二水素酸、硫酸、硫酸一水素、ヨウ化水素酸、または燐酸等のような無機酸に由来する塩と共に、酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的非毒性の有機酸に由来する塩が含まれる。同様に、アルギネート等のようなアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸等のような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge, S.M., et al., 「Pharmaceutical Salts.」, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66:1〜19を参照されたい）。本発明の特定の特異的化合物は、化合物を塩基または酸付加塩のいずれかに変換することができる塩基性および酸性官能基の双方を含む。
【００８７】
化合物の中性型は、塩を塩基または酸に接触させて、通常のように親化合物を単離することによって、再生してもよい。化合物の親型は、極性溶媒における溶解度のような特定の物理的特性において様々な塩の形とは異なるが、それ以外では、塩は本発明の目的に関して化合物の親型と同等である。
【００８８】
塩型の他に、本発明は、プロドラッグの形である化合物を提供する。本明細書に記述の化合物のプロドラッグは、本発明の化合物を提供するために生理的条件で化学変化を容易に受ける化合物である。さらに、プロドラッグは、エクスビボの環境で化学または生化学法によって本発明の化合物に変換することができる。例えば、プロドラッグは、適した酵素または化学試薬と共に経皮パッチリザーバーに入れると本発明の化合物に徐々に変換されうる。
【００８９】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和型のみならず水和型を含む溶媒型で存在しうる。一般的に溶媒和型は、非溶媒和型と同等であり、本発明の範囲に含まれると意図される。本発明の特定の化合物は、多数の結晶または非晶系型で存在してもよい。一般的に、物理的な型は全て、本発明によって企図される用途に関して同等であり、本発明の範囲に含まれると意図される。
【００９０】
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）または二重結合を有する；ラセミ化合物、ジアステレオマー、幾何学的異性体、位置異性体、および個々の異性体（例えば、異なるエナンチオマー）は全て本発明の範囲に含まれると意図される。本発明の化合物はまた、そのような化合物を構成する原子の一つまたはそれ以上で原子同位体の非天然特性を含んでもよい。例えば、化合物は、トリチウム（3H）、ヨウ素-125（125I）、または炭素-14（14C）のような放射活性同位元素によって放射標識してもよい。本発明の化合物の同位元素変種は全て、放射活性であるか否かによらず、本発明の範囲に含まれると意図される。
【００９１】
発明の詳細な説明
I．緒言
本発明は、CCX-CKR2の調節が血管新生、創傷治癒、および関節炎を調節するという予想外の発見に基づいている。本発見に基づいて、本発明は、CCX-CKR2を調節することによって被験者における血管新生および／または創傷治癒、および／または関節炎を調節する方法を提供する。本明細書においてより詳細に記述されるように、CCX-CKR2活性を調節する多様な異なる方法が存在する。
【００９２】
CCX-CKR2活性は、例えば受容体の活性を刺激するアゴニストにCCX-CKR2を接触させることによってアップレギュレートすることができる。他の態様において、CCX-CKR2は、被験者の細胞において発現され、任意でCCX-CKR2アゴニストに接触される。CCX-CKR2アゴニストの例には、例えばSDF-1およびI-TACのような天然に存在するアゴニストと共に、抗体に基づくおよびCCX-CKR2を活性化する低分子が含まれる。
【００９３】
CCX-CKR2活性は、例えばCCX-CKR2の発現を減少させることによって、またはCCX-CKR2をアンタゴニストに接触させることによって減少させることができる。アンタゴニストは、例えば天然に存在するアゴニスト（例えば、SDF-1またはI-TAC）と競合しうる、またはそれらがCCX-CKR2に結合することを防止することができる。アンタゴニストには、CCX-CKR2に結合する抗体（例えば、CCX-CKR2に対する結合に関してSDF-1またはI-TACと競合する抗体）と共に有機低分子（例えば、本明細書に記述の分子）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００９４】
当業者は、CCX-CKR2活性を減少させる物質を、薬学的組成物において他の抗血管新生物質および／または化学療法剤または放射線および／または他の抗関節炎剤と併用することができることを理解するであろう。いくつかの場合において、化学療法剤または放射線の量は、抗血管新生物質と併用せずに提供されれば治療下となるであろう量である。当業者は、「併用」が治療における併用を含みうることを認識するであろう（すなわち、二つもしくはそれ以上の薬物を混合物として投与することができる、または被験者に少なくとも同時または少なくとも異なる時期に導入することができるが、いずれも同時に被験者の血流に入るように投与することができる）。
【００９５】
II．CCX-CKR2ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
本発明の多数の態様において、対象CCX-CKR2ポリペプチドをコードする核酸は、組換え法を用いて単離およびクローニングされるであろう。そのような態様は、例えばタンパク質発現のために、または変種、誘導体、発現カセット、もしくはCCX-CKR2ポリペプチド（例えば、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、および配列番号：10）に由来する他の配列の生成の際に、CCX-CKR2ポリヌクレオチド（例えば、配列番号：1、配列番号：3、配列番号：5、配列番号：7および配列番号：9）を単離するために、CCX-CKR2遺伝子発現をモニターするために、異なる種におけるCCX-CKR2配列を単離もしくは検出するために、患者における診断目的のために、例えばCCX-CKR2における変異を検出するため、またはCCX-CKR2核酸もしくはCCX-CKR2ポリペプチドの発現を検出するために用いられる。いくつかの態様において、CCX-CKR2をコードする配列は異種プロモーターに対して機能的に結合する。いくつかの態様において、本発明の核酸は特に例えばヒト、マウス、ラット、イヌ等を含む任意の哺乳類に由来する。
【００９６】
いくつかの場合において、本発明のCCX-CKR2は、ヒトCCX-CKR2配列（例えば、配列番号：2、配列番号：4、配列番号：6、配列番号：8、および配列番号：10）の細胞外アミノ酸を含むが、他の残基は変化しているか存在しない。他の態様において、CCX-CKR2ポリペプチドは、CCX-CKR2のリガンド結合断片を含む。例えば、いくつかの場合において、断片はI-TACおよび／またはSDF1に結合する。7回膜貫通型受容体（CCX-CKR2はそのうちの一つである）の構造は当業者に周知であり、したがって、膜貫通ドメインを容易に決定することができる。例えば、容易に入手可能な疎水性アルゴリズムは、インターネット上でGタンパク質共役受容体データベース（GPCRDB）において例えば、http://www.gpcr.org/7tm/seq/DR/RDC1_HUMAN.TABDR.htmlまたはhttp://www.gpcr.org/7tm/seq/vis/swac/P25106.htmlにおいて認められうる。
【００９７】
本発明は、組換え遺伝子学の分野において日常的な技術に依存する。本発明において用いられる一般的な方法を開示する基本的なテキストには、Sambrook et al., 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」(3rd ed. 2001)；Kriegler, 「Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual」(1990)；および「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel et al., eds, 1994)が含まれる。
【００９８】
哺乳類組織からCCX-CKR2をコードする遺伝子を同定するための適当なプライマーおよびプローブは、本明細書に提供された配列（例えば、配列番号：1）に由来しうる。PCRの全般的な概要に関しては、Innis et al, 「PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications」, Academic Press, San Diego(1990)を参照されたい。
【００９９】
III．CCX-CKR2の調節
A．ケモカイン受容体の調節物質を同定する方法
多くの異なるスクリーニングプロトコールを利用して、細胞、特に哺乳類細胞、および特にヒト細胞においてCCX-CKR2の活性または機能のレベルを調節する物質を同定することができる。一般的な意味において、スクリーニング法は、例えばCCX-CKR2に結合することによって、リガンド（例えば、I-TACおよび／またはSDF1）のCCX-CKR2に対する結合を防止することによって、またはCCX-CKR2を活性化することによって、CCX-CKR2（またはその細胞外ドメイン）と相互作用する物質を同定するために複数の物質をスクリーニングすることを含む。いくつかの態様において、物質はもう一つのタンパク質に対する物質の親和性の少なくとも1.5、2、3、4、5、10、20、50、100、300、500、または1000倍でCCX-CKR2に結合する。
【０１００】
1．ケモカイン受容体結合アッセイ
いくつかの態様において、CCX-CKR2調節物質は、SDF-1またはI-TACのようなCCX-CKR2のリガンドと競合する分子のスクリーニングによって同定される。当業者は、競合分析を行うために多くの方法が存在することを認識するであろう。いくつかの態様において、CCX-CKR2を有する試料を標識CCX-CKR2リガンドと共にプレインキュベートした後、可能性がある競合分子に接触させる。CCX-CKR2に結合したリガンドの量が変化（例えば、減少）すれば、分子が、可能性があるCCX-CKR2調節物質であることが示される。
【０１０１】
CCX-CKR2に結合することができる物質に関するスクリーニングによって、予備スクリーニングを行うことができ、そのように同定された物質の少なくともいくつかはケモカイン受容体調節物質である可能性がある。結合アッセイは通常、CCX-CKR2を一つまたはそれ以上の試験物質に接触させる段階、およびタンパク質と試験物質とを十分に反応させて結合複合体を形成させる段階を含む。形成された如何なる結合複合体も、多数の確立された任意の分析技術を用いて検出することができる。タンパク質結合アッセイには、免疫組織化学結合アッセイ、フローサイトメトリー、放射リガンド結合、ユーロピウム標識リガンド結合、ビオチン標識リガンド結合、またはCCX-CKR2のコンフォメーションを維持する他のアッセイが含まれるがそれらに限定されるわけではない。そのようなアッセイにおいて用いられるケモカイン受容体は、天然に発現されうる、クローニング、または合成されうる。結合アッセイを用いてアゴニストまたはアンタゴニストを同定してもよい。例えば、CCX-CKR2を可能性があるアゴニストに接触させて、CCX-CKR2活性を測定することによって、CCX-CKR2活性を刺激する分子を同定することが可能である。
【０１０２】
2．細胞および試薬
本発明のスクリーニング法は、インビトロまたは細胞に基づくアッセイにおいて行うことができる。インビトロアッセイは、例えばCCX-CKR2を含む膜分画または細胞全体を用いて行われる。細胞に基づくアッセイは、CCX-CKR2が発現される任意の細胞において行うことができる。
【０１０３】
細胞に基づくアッセイは、物質の結合、または物質によるCCX-CKR2の活性の調節に関してスクリーニングするために、CCX-CKR2を含む全細胞または細胞分画を含む。本発明の方法に従って用いることができる例としての細胞タイプには、例えば好中球、単球、マクロファージ、好酸球、抗塩基球、肥満細胞、T細胞およびB細胞のようなリンパ球、白血病、バーキットリンパ腫、腫瘍細胞、内皮細胞、周細胞、線維芽細胞、心細胞、筋細胞、乳腺腫瘍細胞、卵巣癌、子宮頚癌、神経膠芽腫、肝細胞、腎細胞、およびニューロン細胞と共に、酵母を含む真菌細胞を含む任意の哺乳類細胞が含まれる。細胞は、初代培養細胞もしくは腫瘍細胞、または他のタイプの不死化細胞株となりうる。当然のこととして、CCX-CKR2は、内因性型のCCX-CKR2を発現しない細胞において発現させることができる。
【０１０４】
いくつかの場合において、CCX-CKR2の断片と共にタンパク質融合体をスクリーニングのために用いることができる。CCX-CKR2リガンドに対する結合に関して競合する分子が望ましい場合、用いるCCX-CKR2断片は、リガンド（例えば、I-TACまたはSDF1に結合することができる）に結合することができる断片である。または、CCX-CKR2の如何なる断片も、CCX-CKR2に結合する分子を同定するための標的として用いることができる。CCX-CKR2断片には、例えばCCX-CKR2のアミノ酸1個を除く全てを含むタンパク質までの、アミノ酸少なくとも20、30、40、50個の任意の断片が含まれうる。典型的に、リガンド結合断片は、CCX-CKR2の膜貫通領域および／または細胞外ドメインのほとんどまたは全てを含むであろう。
【０１０５】
3．シグナル伝達または接着活性
いくつかの態様において、CCX-CKR2活性化によって誘発されたシグナル伝達を用いてCCX-CKR2調節物質を同定する。ケモカイン受容体のシグナル伝達活性は、多くの方法で決定することができる。例えば、シグナル伝達活性は、ケモカイン受容体媒介細胞接着を検出することによって決定することができる。ケモカインとケモカイン受容体との相互作用によって、インテグリンの親和性および結合力の改変を通して急激な接着が起こりうる。例えば、Laudanna, Immunological Reviews 186:37〜46(2002)を参照されたい。
【０１０６】
シグナル伝達はまた、環状AMPまたはイノシトールホスフェートのような二次伝達物質を定性的および定量的に決定することによって測定することができると共に、燐酸化または脱燐酸化事象も同様にモニターすることができる。例えば、Premack et al, Nature Medicine 2:1174〜1178(1996)およびBokoch, Blood 86:1649〜1660(1995)を参照されたい。
【０１０７】
さらに、CCX-CKR2活性化の下流の他の事象も同様にモニターしてシグナル伝達活性を決定することができる。下流の事象には、ケモカイン受容体の刺激の結果として起こる活性または発現が含まれる。例としての下流の事象には、例えば細胞の状態の変化（例えば、正常細胞から癌細胞へ、または癌細胞から非癌様細胞へ）が含まれる。細胞反応には、細胞（例えば、内皮細胞）の接着が含まれる。血管新生に関与する確立されたシグナル伝達カスケード（例えば、VEGF媒介シグナル伝達）も同様に、CCX-CKR2調節物質によって引き起こされた効果に関してモニターすることができる。物質が血管新生を促進する能力は、例えばLeung et al.(1989)Science 246:1306〜1309によって考察されているように、ニワトリの尿漿膜において評価することができる。もう一つの選択肢は、Rastinejad et al.(1989)Cell 56:345〜355によって考察されているように、ラット角膜によるアッセイを行うことである。他のアッセイは、米国特許第5,840,693号に開示されている。卵巣の血管新生モデルも同様に用いることができる（例えば、Zimmerman, R.C., et al., (2003)J. Clin. Invest. 112:659〜669；Zimmerman, R.C., et al., (2001)Microvasc. Res. 62:15〜25；およびHixenbaugh, E.A. et al.(1993)Anat. Rec. 235:487〜500を参照されたい）。
【０１０８】
実施例においてより詳細に記述されているように、CCX-CKR2の発現によって、同じ条件で増殖させたCCX-CKR2を発現しない細胞と比較して、低血清条件で増殖させたCCX-CKR2発現細胞の生存期間の延長が起こる。このように、CCX-CKR2のアンタゴニズムは、細胞の生存を減少させると予想されるが、活性化（例えば、アゴニストによって）は、細胞の生存を増加させると予想される。その結果、細胞の生存およびアポトーシスは、CCX-CKR2活性に関する読出しとして役立ちうる。
【０１０９】
広範囲の細胞死およびアポトーシスアッセイを、CCX-CKR2の調節物質を同定するためのスクリーニング法に組み入れることができる。一般的に、このタイプのアッセイは典型的に、通常、細胞死またはアポトーシスの可能性がある調節物質である試験化合物の存在下および非存在下の双方で、細胞死またはアポトーシスを誘導する条件に細胞集団を供することを含む。次に、試験物質の存在下および非存在下における細胞死またはアポトーシスの程度を比較することによって、試験物質が細胞死またはアポトーシスに対してどのような作用を有するかを評価するために、アッセイを細胞、その抽出物について行う。細胞死またはアポトーシスに関してアッセイする代わりに、反対のタイプのアッセイ、すなわち細胞の生存と共に、細胞増殖および細胞増殖のような関連活性のアッセイを行うことができる。特定のタイプのアッセイによらず、いくつかのアッセイは、I-TACまたはSDF-1のようなCCX-CKR2を活性化するリガンドの存在下で行われる。
【０１１０】
細胞死およびアポトーシスの特徴である異なる多様なパラメータを、本発明のスクリーニング法に関してアッセイすることができる。そのようなパラメータの例には、遺伝子またはタンパク質発現分析、DNA断片化、細胞膜組成の変化、膜透過性、デス受容体または下流のシグナル伝達経路の成分（例えば、カスパーゼ）の活性化、一般的ストレス反応、NF-κB活性化およびマイトゲンに対する反応による毒性反応の細胞系路の活性化のモニタリングが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１１１】
アポトーシスの減少においてCCX-CKR2が果たす役割を考慮して、もう一つのアプローチは、アポトーシスおよび細胞死の反対をアッセイすること、すなわち細胞生存または細胞増殖を検出するスクリーニングを行うことである。細胞の生存は、例えば、細胞が生存したままである期間、当初の細胞の特定の割合がなおも生存している期間、または細胞数の増加をモニターすることによって、検出することができる。これらのパラメータは、確立された技術を用いて肉眼的にモニターすることができる。
【０１１２】
アポトーシスを評価するもう一つのアッセイは、アネキシンV（Alexa Fluor(r)488色素に結合）およびヨウ化プロピジウム（PI）（Molecular Probes, Eugene Oregon）によって細胞を標識することを含む。PIは、赤色の蛍光核酸結合色素であり、生存およびアポトーシス細胞の双方に対して非浸透性である。PIは、細胞における核酸に堅固に結合することによって壊死細胞のみを標識する。アネキシンVは、アポトーシス細胞がホスファチジルセリン（PS）を細胞の外表面に移動させるという事実を利用する。アネキシンVは（PS）に対して高親和性を有するヒト抗凝固剤である。生存細胞ではないアポトーシス細胞は、その外表面にPSを発現する。アネキシンV（Alexa Fluor(r)488色素によって標識）は、これらの細胞を緑色の蛍光で標識する。次に、細胞を蛍光活性化セルソーター（FACS）上で分析して、赤色および緑色のチャンネルで蛍光を評価することができる：アポトーシス細胞（アネキシン陽性、PI陰性）は緑色のチャンネルに限って蛍光を発する；生存細胞（アネキシン陰性、PI陰性）は赤色および緑色のチャンネルの双方において低い蛍光を示す；ならびに壊死または死細胞（アネキシン陽性、PI陽性）は、赤色および緑色のチャンネルの双方において強く陽性である。
【０１１３】
その他のスクリーニング法は、特定の調節タンパク質の発現がCCX-CKR2の存在または活性化によって誘導されるという観察に基づいている。そのようなタンパク質の検出はこのように、CCX-CKR2の活性を間接的に決定するために用いることができる。下記の実施例においてより詳細に記述するように、一連のELISA試験を行って、CCX-CKR2をトランスフェクトした細胞および非トランスフェクト細胞に関して、細胞培養培地における様々な分泌タンパク質の相対的濃度を比較した。これらの試験を通して、CCX-CKR2が増殖因子、ケモカイン、メタロプロテナーゼおよびメタロプロテナーゼの阻害剤を含む多様な多くの調節タンパク質の産生を誘導することが決定された。このように、提供されるスクリーニング法のいくつかは、試験物質が、CCX-CKR2による特定の増殖因子、ケモカイン、メタロプロテナーゼおよびメタロプロテナーゼの阻害剤の産生を調節するか否かを決定することを含む。いくつかの場合において、アッセイは、限定された血清条件で増殖した細胞（またはその抽出物）がCCX-CKR2誘導タンパク質の産生を増加させることが認められたことから、これらの細胞について行う（実施例を参照されたい）。
【０１１４】
以下のタンパク質は、検出された様々なクラスのタンパク質と共に各クラスにおける特定のタンパク質の例である：（1）増殖因子（例えば、GM-CSF）；（2）ケモカイン（例えば、RANTES、MCP-1）；（3）メタロプロテナーゼ（例えば、MMP3）；および（4）メタロプロテナーゼの阻害剤（例えば、TIMP-1）。これらの様々なクラスにおける他のタンパク質も同様に検出されうると予想される。
【０１１５】
これらの特定のタンパク質は、当技術分野で公知の標準的な免疫学的検出法を用いて検出することができる。ハイスループットフォーマットにおいて用いるために適している一つのアプローチは、例えば、マルチウェルプレートにおいて行われるELISAである。TIMP-1を検出するためのELISAキットは、Dako Cytomation（プロダクトコード番号EL513）から入手可能である。上記のタンパク質に特異的に結合する抗体の供給元のさらなる例は、下記の実施例において提供される。酵素であるメタロプロテナーゼのようなタンパク質も同様に、公知の酵素アッセイによって検出することができる。
【０１１６】
他の態様において、CCX-CKR2の可能性がある調節物質をその細胞接着調節能に関して試験する。内皮細胞単層に対する腫瘍細胞の接着は、転移浸潤モデルとして研究されている（例えば、Blood and Zetter, Biovhem, Biophys. Acta, 1032, 89〜119(1990)を参照されたい）。これらの内皮細胞単層は、リンパ管を模倣して、様々なサイトカインおよび増殖因子（例えば、TNFαおよびIL-1β）によって刺激されうる。CCX-CKR2を発現する細胞は、静的な接着アッセイと共に、インビボでの血管力を模倣するような流動条件下に細胞が存在するアッセイの双方において、この単層に対する接着能に関して評価することができる。さらに、接着を評価するアッセイはまた、インビボで行うことができる（例えば、von Andrian, U.H. Microcirculation 3(3):287〜300(1996)を参照されたい）。
【０１１７】
4．バリデーション
前述の任意のスクリーニング法を用いて最初に同定された物質をさらに、明白な活性を確認するために試験することができる。好ましくは、そのような試験は、適した動物モデルによって行われる。そのような方法の基本的なフォーマットは、ヒトの疾患モデルとして役立つ動物に対して最初にスクリーニングする際に同定されたリード化合物を投与すること、および次に疾患（例えば、癌、心筋梗塞、創傷治癒、または血管新生に関連した他の疾患）が実際に調節されたか否かおよび／または疾患または病態が改善されたか否かを決定することを含む。バリデーション試験において利用される動物モデルは、一般的に任意の種の哺乳類である。適した動物の特定の例には、霊長類、マウス、ラット、およびゼブラフィッシュが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１１８】
いくつかの態様において、関節炎動物モデルを用いてCCX-CKR2を調節する物質に関してスクリーニング、および／またはその治療的用途を確認する。例としての関節炎動物モデルには、例えば、コラーゲン誘発関節炎（CIA）動物モデルが含まれる。
【０１１９】
B．CCX-CKR2と相互作用する物質
CCX-CKR2の調節物質（例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト）には、例えば抗体（モノクローナル抗体、ヒト化、または当技術分野で公知の他のタイプの結合タンパク質）、有機低分子、siRNA、CCX-CKR2ポリペプチドまたはその変種、ケモカイン（SDF-1および／またはI-TACが含まれるがそれらに限定されるわけではない）、ケモカイン模倣体、ケモカインポリペプチド等が含まれうる。
【０１２０】
CCX-CKR2の調節物質として試験される物質は、ポリペプチド、糖、核酸、または脂質のような任意の低分子化学化合物または生物学的物質となりうる。または調節物質は、ケモカインまたは他のリガンドの遺伝子改変型、ペプチド模倣体となりうる。典型的に、試験化合物は、低分子化学分子およびペプチドとなるであろう。本質的に如何なる化学化合物も、本発明のアッセイにおいて可能性がある調節物質またはリガンドとして用いることができるが、水溶液または有機（特にDMSO-基剤）溶液に溶解することができる化合物が最もしばしば用いられる。アッセイは、アッセイの段階を自動化する段階、および任意の簡便な起源からの化合物を、典型的に平行して行われる（例えば、マイクロタイターフォーマットまたはロボットアッセイにおけるマイクロタイタープレートにおいて）アッセイに提供する段階によって、大きい化学ライブラリをスクリーニングするように設計される。Sigma（St. Louis, MO）、Aldrich（St. Louis, MO）、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）、Fluka Chemika-Biochemica Analytika（Buchs, Switzerland）等を含む多くの化学化合物の供給元が存在すると認識されるであろう。
【０１２１】
いくつかの態様において、物質は分子量が1500ダルトン未満であり、いくつかの場合において1,000、800、600、500、または400ダルトン未満である。より小さい分子は、経口吸収を含む、良好な薬物動態特徴と適合する物理化学特徴を有する可能性が、より高分子量の物質より高いことから、大きさの比較的小さい物質が望ましい。例えば、透過性および溶解度に基づいて薬物として成功する可能性がより低い物質は、Lipinski et al.によって以下のように記述された：5個より多いH-結合ドナーを有する（OHsおよびNHsの合計として表記される）；500より大きい分子量を有する；5より大きいLogPを有する（または4.15より大きいMLogP）；および／または10個より多いH-結合アクセプターを有する（NsおよびOsの合計として表記）。例えば、Lipinski et al. Adv. Drug Delivery Res 23:3〜25(1997)を参照されたい。生物学的輸送体の基質である化合物のクラスは典型的に規則の例外である。
【０１２２】
一つの態様において、ハイスループットスクリーニング法は、可能性がある多数の治療化合物（可能性がある調節物質またはリガンド化合物）を含む、組み合わせ化学またはペプチドライブラリを提供することを含む。そのような「組み合わせ化学ライブラリ」または「リガンドライブラリ」を、本明細書において記述される一つまたはそれ以上のアッセイにおいてスクリーニングして、望ましい特徴的な活性を示すそれらのライブラリメンバー（特に化学種またはサブクラス）を同定する。このように同定された化合物は、通常の「リード化合物」として役立ちうる、またはそれらを、可能性があるもしくは実際の治療物質として用いることができる。
【０１２３】
組み合わせ化学ライブラリは、多数の化学「構築ブロック」を組み合わせることによって、化学合成または生物合成のいずれかによって産生された多様な化学化合物のコレクションである。例えば、ポリペプチドライブラリのような直鎖状の組み合わせ化学ライブラリは、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸の数）に関してあらゆる可能性がある方法で化学構築ブロック（アミノ酸）の組を組み合わせることによって形成される。何百万もの化学化合物を、化学構築ブロックのそのような組み合わせ混合によって合成することができる。
【０１２４】
組み合わせ化学ライブラリの調製およびスクリーニングは、当技術分野で周知である。そのような組み合わせ化学ライブラリには、ペプチドライブラリ（例えば、米国特許第5,010,175号、Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487〜493(1991)およびHoughton et al., Nature 354:84〜88(1991)を参照されたい）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。化学多様性ライブラリを作製するための他の化学も同様に用いることができる。そのような化学には、ペプトイド（例えば、PCT公開国際公開公報第91/19735号）、コードされるペプチド（例えば、PCT公開国際公開公報第93/20242号）、ランダムバイオオリゴマー（例えば、PCT公開国際公開公報第92/00091号）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドのようなディバーソマー（diversomers）（Hobbs et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909〜6913(1993)）、ビニル様ポリペプチド（Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568(1992)）、グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣体（Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:9217〜9218(1992)）、低分子化合物ライブラリの類似の有機合成（Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661(1994)）、オリゴカーバメート（Cho et al., Science 261:1303(1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（Campbell et al., J. Org. Chem. 59:658(1994)）、核酸ライブラリ（Ausubel, Berger, and Sambrookを参照されたい、全て上記）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第5,539,083号を参照されたい）、抗体ライブラリ（例えば、Vaughn et al., Nature Biotechnology 14(3):309〜314(1996)およびPCT/US96/10287を参照されたい）、炭化水素ライブラリ（例えば、Liang et al., Science 274:1520〜1522(1996)および米国特許第5,593,853号を参照されたい）、有機低分子ライブラリ（例えば、ベンゾジアゼピン、Baum C & EN, Jan 18, page 33(1993)；イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；ジアゾリジノンおよびメタチアザノン、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、第5,288,514号等を参照されたい）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１２５】
組み合わせライブラリの調製のための装置は、市販されている（例えば、357 MPS、390 MPS、Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照されたい）。さらに、多数の組み合わせライブラリが市販されている（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Loius, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD等を参照されたい）。
【０１２６】
C．血管新生の阻害剤
CCX-CKR2の阻害剤には、例えば抗体アンタゴニスト、ペプチドアンタゴニスト、siRNA分子または低分子アンタゴニストが含まれうる。
【０１２７】
抗体の作製は当技術分野で周知である。いくつかの態様において、CCX-CKR2に対して特異的な抗体を、I-TACまたはSDF-1のようなCCX-CKR2アゴニストとの競合能に関してスクリーニングする。抗体には、抗体変種または断片、一本鎖抗体、ヒト化またはヒト抗体等を含む任意のタイプの免疫学的親和性物質が含まれる。
【０１２８】
他の態様において、ペプチドアンタゴニストが提供される。ペプチドアンタゴニストは、CCX-CKR2と相互作用するペプチドを同定するために、任意の数の周知のディスプレイ技術を用いて容易に選択することができる。
【０１２９】
他の態様において、siRNA分子はCCX-CKR2の発現を阻害するために用いられる。例えばsiRNA分子の様々な組成物に関する記述と共にsiRNA配列の同定法に関する記述に関して、米国特許公開第2004/0019001号を参照されたい。例えば、標的配列を特定の長さの全ての断片または小配列、例えば標的配列内に含まれる23ヌクレオチドの断片の一覧にin silicoで分析する。望ましい特徴に関してその構造を分析した後、siRNA分子をインビトロ細胞培養または動物モデル系においてスクリーニングして、最も活性なsiRNA分子または標的RNA配列内での最も好ましい標的部位を同定する。
【０１３０】
いくつかの態様において、CCX-CKR2の調節物質は有機低分子である。一つの態様において、本発明の活性化合物（すなわち、CCX-CKR2調節物質）は、以下の構造（I）を有する：
2007520564.tif 000003
式中、
mは、1〜5までの整数であり、ベンジル環を置換するそれぞれのYは、独立して、水素、アルキル、ハロ置換アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、ハロゲン、複素環、アリール、アリーレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヒドロキシ、アルコキシ、およびアリールオキシからなる群より独立して選択される；
nは、0、1、2、または3である；
Zは、-CH-、または-N-である；
R1およびR2はそれぞれ独立して、アルキルもしくは水素である、またはZはR1およびR2と共に、少なくとも一つの窒素を含み、任意で一つもしくはそれ以上のさらなるヘテロ原子を含む5-または6-員環を形成し、該5-6-員環は任意でおよび独立して、アルキル、アルケニル、フェニル、ベンジル、スルホニル、および置換ヘテロ原子からなる群より選択される一つもしくはそれ以上の部分によって置換される；
R3、R4、およびR5はそれぞれ独立して、水素、アルキル、ハロ置換アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、複素環、アリール、アリーレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヒドロキシ、アルコキシ、およびアリールオキシからなる群より選択される；ならびに
R6はアルキルまたは水素である；
但し、Zが窒素であって、R1およびR2はZと共にモルホリニル基を形成する場合、nは3であって、R3、R4およびR5の少なくとも一つがヒドロキシ、アルコキシ、もしくはアリールオキシである；または
nが1である場合、Zは炭素であり、R1およびR2は-CH2CH2NCH2CH2-ではない組み合わせである；または
R1がR2と共に-CH(CH3)(CH2)4-である場合、Zは-CH-である；または
R5がt-ブチルである場合、R3は水素である；または
R4およびR5が共に5-員環を形成する場合、フェニル環に結合した原子の少なくとも一つは炭素である。2002年12月20日に提出された米国特許仮出願第60/434,912号および2003年12月20日に提出された米国特許仮出願第60/516,151号を参照されたい。
【０１３１】
置換フェニル環にオレフィンを結合させる波状の結合は、その環がR6に対してシスまたはトランスのいずれかである可能性があることを意味している。好ましい態様において、nは、1、2、または3である。もう一つの好ましい態様において、nは2または3である。さらに好ましい態様において、nは3である。
【０１３２】
もう一つの態様において、好ましい化合物はR6が水素である一般構造（I）を有する。さらなる態様において、好ましい化合物はR6がメチルである一般構造（I）を有する。
【０１３３】
もう一つの態様において、好ましい化合物は一般構造（I）を有し、式中、R3、R4、およびR5は独立して、水素、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、およびハロ置換アルキルである。より好ましくはR3、R4、およびR5は独立してアルコキシまたは水素である。もう一つの態様において、好ましい化合物は、R4が水素であって、R3およびR5がトリフルオロメトキシおよび(-OCH2CF3)トリフルオロアルコキシ基を含むアルコキシ（-OR）である一般構造（I）を有する。さらなる態様において、R3は水素であって、R4およびR5はアルコキシである。これらの態様のいずれにおいてもアルコキシ基はメトキシ（-OCH3）またはエトキシ（-OCH2CH3）であってもよい。
【０１３４】
もう一つの態様において、好ましい化合物はR4およびR5が共に複素環、アリール、またはヘテロアリール環を形成する一般構造（I）を有する。もう一つの好ましい態様において、R3は水素であって、R4およびR5は共に-O(CH2)3O-、-(CH)4-、または-N(CH)2N-である。
【０１３５】
もう一つの態様において、好ましい化合物は一般構造（I）を有し、Zは窒素であり、ZはR1およびR2と共にヘテロアリールまたは複素環基を形成する。好ましい態様において、化合物は一般構造（I）を有し、ZはCHであって、ZはR1およびR2と共にヘテロアリールまたは複素環基を形成する。より好ましい化合物は、ZがCHであって、ZがR1およびR2と共に窒素を含む複素環基を形成する一般構造（I）を有する。さらなる態様において、ZはR1およびR2と共に、置換または非置換モルホリニル、ピロリジニル、ピペリジニル、またはピペラジニル基を形成する。
【０１３６】
ヘテロアリールまたは複素環基の好ましい置換基には、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、アルコキシ、ヒドロキシ、ヘテロ原子およびハロゲン化物が含まれる。特に好ましい態様において、ヘテロアリールまたは複素環基は、ベンジル、フェニル、メチル、エチル、シクロヘキシル、メトキシ-メチル（-CH2OCH3）、またはシクロヘキシル-メチル（-CH2(C6H11)）基によって置換される。
【０１３７】
一つの態様において、好ましい化合物は、一般構造（I）を有し、ZはR1およびR2と共にアルキル、またはメトキシ-メチル-置換ピロリジニル基、ベンジル-、フェニル-、メチル-、エチル-、もしくは置換ヘテロ原子置換ピペリジニル基；またはベンジル-、フェニル-、もしくはスルホニル置換ピペラジニル基である。特に好ましい置換ヘテロ原子基には、アルコキシ、アミニル、シクロアルキルアミニル、アルキルアミニル、シクロプロピルアミニル、イソプロピルアミニル、ベンジルアミニルおよびフェノキシが含まれる。好ましくは、置換ヘテロ原子は、ピペリジニル環の3位に存在する。
【０１３８】
もう一つの局面において、好ましい化合物は一般構造（I）を有し、ZはR1およびR2と共に
2007520564.tif 000004
である。
【０１３９】
一般構造（I）を有する好ましい化合物はまた、窒素原子としてZを有し、R1およびR2をそれぞれアルキルまたはメチル基として有し、または共に-C(C(O)N(CH3)2)(CH2)3-を形成するR1およびR2を有する。
【０１４０】
もう一つの態様において、ZはR1およびR2と共に、窒素を含み、任意で一つまたはそれ以上のさらなるヘテロ原子を含む5-員環を形成する。この態様において、nは好ましくは1であり、Zは好ましくは-CH-である。このタイプの特に好ましい態様において、ZはR1およびR2と共に、
2007520564.tif 000005
であり、
式中、
R7は好ましくは水素、アルキル、アリール、またはアラルキルである。
【０１４１】
もう一つの好ましい態様において、R7はハロゲン化ベンジルまたはフェニル基となりうる。さらなる態様において、R7は好ましくは水素、メチル、エチル、ベンジル、またはパラ-フルオロ-フェニルである。
【０１４２】
もう一つの態様において、本発明の活性化合物は一般構造（II）を有する：
2007520564.tif 000006
式中、
mは1〜5の整数である；
ベンジル環を置換するそれぞれのYは、水素、アルキル、ハロ置換アルキル、アルキレン、アルケニル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、ハロゲン、複素環、アリール、アリーレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヒドロキシ、およびアルコキシからなる群より独立して選択される；
nは1、2、または3である；ならびに
R3、R4、およびR5は、それぞれ独立して、水素、アルキル、ハロ置換アルキル、アルキレン、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、複素環、アリール、アリーレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、ヒドロキシ、アルコキシ、およびアリールオキシからなる群より独立して選択される。
【０１４３】
上記の構造（I）におけるように、置換されたフェニル環にオレフィンを結合させる波状の結合は、環がシスまたはトランスのいずれかであってもよいことを示している。
【０１４４】
もう一つの態様において、好ましい化合物はnが3である一般構造（II）を有してもよい。もう一つの態様において、好ましい化合物は一般構造（II）を有してもよく、式中R3、R4、およびR5は先の構造（I）に関して記述されるように置換される。現在、特に好ましい化合物は、R3、R4、およびR5がアルコキシまたはメトキシである一般構造（II）を有する。
【０１４５】
当業者に公知の多くの合成経路を用いて、本発明の活性化合物を合成してもよいが、一般的な合成法を下記のスキームIに示す。
2007520564.tif 000007
スキームI
【０１４６】
スキームIにおいて、アルデヒド（2）は還元的アミノ化によって一級アミン（3）との縮合反応を受ける。適した一級アミンは、例えばAldrich, Milwaukee, WIから市販されている、または当業者に公知の化学経路によって合成してもよい。
【０１４７】
アミノ化反応は、テトラヒドロフラン（THF）、ジクロロメタン、またはメタノールが含まれるがそれらに限定されるわけではない任意の適した溶媒において還元剤によって行って、中間体（4）を形成してもよい。縮合反応のための適した還元剤には、シアン化水素化ホウ素ナトリウム（Mattson et al., J. Org. Chem. 1990, 55, 2552およびBarney et al., Tetrahedron Lett. 1990, 31, 5547）；トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（Abdel-Magid et al., Tetrahedron Lett. 31:5595(1990)において記述）；水素化ホウ素ナトリウム（Gribble, Mutaitis Synthesis 709(1987)において記述）；おペンタカルボニル鉄およびアルコールKOH（Watanabe et al., Tetrahedron Lett 1879(1974)）；およびBH3-ピリジン（Pelter et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans 1:717(1984)）が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【０１４８】
中間体（4）の化合物（5）への変換は、塩基の存在下で適切に置換された塩化アシルと共に、テトラヒドロフランまたはジクロロメタンのような任意の適した溶媒において行ってもよい。三級アミン塩基が好ましい。特に好ましい塩基にはトリエチルアミンおよびHunnings塩基が含まれる。
【０１４９】
または、中間体（4）の化合物（5）への変換は、4-N,N-ジメチルアミノ-ピリジンのような触媒の存在下で、またはヒドロキシベンゾトリアゾール（K. Horiki, Synth. Commun. 7:251において記述されるように）の存在下で、1-エチル-3-(3-ジメチルブチルプロピル)カルボジイミドまたはジシクロヘキシル-カルボジイミド（B. Neises and W. Steglich, Angrew. Chem. Int. Ed. Engl.17:522(1978)）のような適したカップリング試薬によって得ることができる。
【０１５０】
一つの局面において、CCX-CKR2の調節物質は以下の式を有する化合物：
2007520564.tif 000008
およびその全ての薬学的に許容される塩であり、式中下付文字は1〜3の整数である；記号R1は水素、ハロゲン、C1-8アルコキシ、C1-8アルキル、C1-8ハロアルキル、C3-6シクロアルキル、C3-6シクロアルコキシ、C3-6シクロアルキルC1-4アルキル、またはC3-6シクロアルキルC1-4アルコキシを表し、記号R2およびR3は、それぞれ、C1-8アルキルおよびC1-8ハロアルキルから独立して選択されるメンバーであり、または任意でそれぞれが5員環から10員環に結合する酸素原子に結合する；文字Xは結合またはCH2を表す；記号Arは結合または縮合二環芳香族環系を表す；および文字ZはC1-8アルキル、C1-8ハロアルキル、C3-6シクロアルキル、C2-8アルケニル、C2-8アルキニル、-CORa、-CO2Ra、-CONRaRb、-NRaCORb、-SO2Ra、-X1CORa、-X1CO2Ra、-X1CONRaRb、-X1NRaCORb、-X1SO2Ra、-X1SO2NRaRb、-X1NRaRb、-X1ORa、および-X1Raから独立して選択される1〜4個のR4置換基によって任意で置換される5、6、または7員環の飽和窒素複素環を表し、式中X1は、C1-4アルキレンおよびC2-4アルキレンから選択され、それぞれのRaおよびRbは、水素、C1-8アルキル、C1-8ハロアルキル、C3-6シクロアルキル、およびアリールC1-4アルキルから独立して選択され、R4置換基のそれぞれの脂肪族部分は任意で、-OH、ORm、-OC(O)NHRm、-OC(O)N(Rm)2、-SH、-SRm、-S(O)Rm、-S(O)2Rm、-SO2NH2、-S(O)2NHRm、-S(O)2N(Rm)2、-NHS(O)2Rm、-NRmS(O)2Rm、-C(O)NH2、-C(O)NHRm、-C(O)N(Rm)2、-C(O)Rm、-NHC(O)Rm、-NRmC(O)Rm、-NHC(O)NH2、-NRmC(O)NH2、-NRmC(O)NHRm、-NHC(O)NHRm、-NRmC(O)N(Rm)2、-NHC(O)N(Rm)2、-CO2H、-CO2Rm、-NHCO2Rm、-NRmCO2Rm、-CN、-NO2、-NH2、-NHRm、-N(Rm)2、-NRmS(O)2NH2、および-NRmS(O)2NHRmから選択される1〜3個のメンバーによって置換され、各Rmは、独立して非置換C1-6アルキルである。
【０１５１】
いくつかの態様において、Zは以下から選択され、
2007520564.tif 000009
式中、波状の線は分子の残りの結合点を示す。
【０１５２】
一つのグループの態様において、Arは、ナフタレン、キノリン、ベンゾチオフェン、イソキノリン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチアゾール、ベンズイミダゾール、1,4-ベンゾジオキサン、キノキサリンおよびナフチリジンから選択される縮合二環芳香環系である。
【０１５３】
もう一つのグループの態様において、Arは、ビフェニル（フェニル環が、化合物の残りの結合に対してオルト、メタ、またはパラ方向で結合している）、5-フェニルチアゾリル、および5-または6-員環ヘテロアリール部分（例えば、チアゾリル、チエニル、イミダゾリル、ピラゾリル、フリル、オキサゾリル、ピリジル、ピリミジニル、ピラジニル等）によって置換されたフェニルから選択される結合二環芳香環系であり、上記のそれぞれは任意でアリール基に関して一般的に提供される置換基から選択される1〜6個の置換基によって任意で置換される（上記を参照されたい）。
【０１５４】
いくつかの態様において、下付文字nは1または2である。他の態様において、記号R1は水素またはC1-8アルコキシを表す。なお他の態様において、記号R2およびR3は、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、または他のC1-4ハロアルキル対部分（例えば、トリフルオロメチル、2,2,2-トリクロロエチル、3-ブロモプロピル等）を表す。
【０１５５】
いくつかの態様において、nは1または2である；R1は水素およびC1-8アルコキシからなる群より選択される；R2およびR3はそれぞれ独立してメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、およびC1-4ハロアルキルからなる群より選択される；XはCH2；Arは、ナフタレン、キノリン、ベンゾチオフェン、イソキノリン、ベンゾフラン、インドール、ベンゾチアゾール、ベンズイミダゾール、1,4-ベンゾジオキサン、キノキサリンおよびナフチリジンからなる群より選択される縮合二環芳香環系である；Zは以下からなる群より選択されるメンバーである：
2007520564.tif 000010
式中、波状の線は化合物の残りに対する結合点を示す；ならびにR4はC1-8アルキル、C3-6シクロアルキル、-X1ORaおよび-X1Raからなる群より選択されるメンバーであり、X1はC1-4アルキレンおよびC2-4アルケニレンからなる群より選択されるメンバーであり、Raは、C1-8アルキル、およびC3-6シクロアルキルからなる群より選択される。
【０１５６】
いくつかの態様において、nは1または2である；R1は水素およびC1-8アルコキシからなる群より選択される；R2およびR3はそれぞれ独立してメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、およびC1-4ハロアルキルからなる群より選択される；Xは結合である；Arは、ビフェニル、5-フェニルチアゾリルおよび5または6員環ヘテロアリール部分によって置換されたフェニルからなる群より選択される置換または非置換結合二環芳香環系である；Zは以下からなる群より選択されるメンバーである：
2007520564.tif 000011
式中、波状の線は化合物の残りに対する結合点を示す；ならびにR4はC1-8アルキル、C3-6シクロアルキル、-X1ORaおよび-X1Raからなる群より選択されるメンバーであり、X1はC1-4アルキレンおよびC2-4アルケニレンからなる群より選択されるメンバーであり、Raは、C1-8アルキル、およびC3-6シクロアルキルからなる群より選択される。
【０１５７】
上記の化合物がSDF-1およびI-TACケモカインに対する有用なアンタゴニストであることを証明するために、化合物をインビトロでスクリーニングして、それらの多数の濃度におけるCCX-CKR2受容体からのSDF-1およびI-TACの置換能を決定した。化合物を、125I-標識SDF-1および／または125I-標識I-TACケモカインの存在下でCCX-CKR2受容体部位を発現する乳腺細胞と混合した。化合物が多数の濃度でCCX-CKR2受容体部位から標識SDF-1またはI-TACを置換することができるか否かを、スクリーニングプロセスによって決定した。
【０１５８】
有効なSDF-1およびI-TACアンタゴニストであると思われる化合物は、1.1マイクロモル濃度（μM）またはそれ未満の濃度で、およびより好ましくは300 ナノモル濃度（nM）またはそれ未満の濃度で、CCX-CKR2受容体からSDF-1および／またはI-TACケモカインの少なくとも50％を置換することができた。いくつかの場合において、化合物は、200 nMまたはそれ未満の濃度でCCX-CKR2受容体からSDF-1および／またはI-TACの少なくとも50％を置換することができる。これらの基準を満たす例としての化合物を、下記の表IおよびIIに再現する。同様に、米国特許公開第2004/0171655号および2004年9月29日に提出された米国特許仮出願第60/614,563号を参照されたい。
（表１）
2007520564.tif 000012
2007520564.tif 000013
2007520564.tif 000014
2007520564.tif 000015
2007520564.tif 000016
2007520564.tif 000017
（表２）
2007520564.tif 000018
2007520564.tif 000019
2007520564.tif 000020
【０１５９】
分子CCX7923（PCT/US02/38555を参照されたい）は、市販されており、当技術分野で公知の方法によって、N-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-N,N-ジメチル-1,3-プロパンジアミンと、ブロモメチル-ビシクロ(2,2,1)ヘプト-2-エンとの縮合によって作製することができる。CCX0803（PCT/US02/38555を参照されたい）は、市販されており、当技術分野で周知の方法によって、3-(2-ブロモエチル)-5-フェニルメトキシ-インドールと、2,4,6-トリフェニルピリジンとの縮合によって作製することができる。例えば「Organic Function Group Preparations」、第2版1巻（S.R. Sandler & W. Karo 1983）；「Handbook of Heterocyclic Chemistry」（A.R. Katrizky, 1985）；「Encyclopedia of Chemical Technology」、第4版（J. I. Kroschwitz, 1996）を参照されたい。本発明のいくつかの態様において、CCX7923はCCX-CKR2の調節物質として含まれない。
【０１６０】
IV．アゴニスト
CCX-CKR2のアゴニストには、SDF-1およびI-TACのような天然に存在するアゴニストと共に、抗体、ケモカイン断片、ペプチド模倣体、および有機低分子アゴニストが含まれる。アゴニストは、本明細書に記述するように、CCX-CKR2活性を増加させる分子を同定するために、標準的なライブラリスクリーニングを用いて選択することができる。
【０１６１】
V．被験者においてCCX-CKR2を発現させる
いくつかの態様において、CCX-CKR2は、被験者において発現され、それによって血管新生を促進する。いくつかの場合において、CCX-CKR2をコードするポリヌクレオチドは、インビトロで細胞に導入されて、その後細胞が被験者に導入される。これらの場合のいくつかにおいて、細胞をまず被験者から単離して、ポリヌクレオチドを導入した後、被験者に再導入する。他の態様において、CCX-CKR2をコードするポリヌクレオチドは、インビボで被験者の細胞に直接導入される。
【０１６２】
いくつかの場合において、CCX-CKR2をコードするポリペプチドは、（i）対象組織、（ii）組織に導入された外因性の細胞、または（iii）組織内に存在しない隣接細胞から細胞に導入される。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドは、内皮細胞に導入される、内皮細胞が会合する組織は、内皮の遊走または増殖を増強することが望ましい任意の組織である。
【０１６３】
同様に、ポリヌクレオチドは、CCX-CKR2の発現を阻害するために細胞に導入することができる。典型的に、これらのポリヌクレオチドには、CCX-CKR2転写またはRNA安定性を阻害するように設計されたアンチセンスまたはsiRNA構築物が含まれるであろう。そのようなポリヌクレオチドは、CCX-CKR2ポリヌクレオチドの送達と類似の手段によって送達することができる。
【０１６４】
通常のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入法を用いて、哺乳類細胞または標的組織に、本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸を導入することができる。そのような方法を用いて、本発明のポリペプチド（例えば、CCX-CKR2）をコードする核酸をインビボで細胞に投与することができる。いくつかの態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療用途のために投与される。非ウイルス送達系には、DNAプラスミド、裸の核酸、およびリポソームのような送達媒体と複合体にした核酸が含まれる。ウイルスベクター送達系には、DNAおよびRNAウイルスが含まれ、それは細胞に送達後エピソームとなる、またはゲノムに組み入れられる。遺伝子治療技法の論評に関しては、Anderson, Science 256:808〜813(1992)；Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211〜217(1993)；Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162〜166(1993)；Dillon, TIBTECH 11:167〜175(1993)；Miller, Nature 357:455〜460(1992)；Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149〜1154(1988)；Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35〜36(1995)；Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31〜44(1995)；Haddada et al.,in「Current Topics in Microbiology and Immunology」Doerfler and Bohm(eds)(1995)；およびYu et al., Gene Therapy 1:13〜26(1994)を参照されたい。
【０１６５】
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、多価陽イオンまたは脂質：核酸結合物、裸のDNA、人工ビリオン、およびDNAの物質による取り込みが含まれる。リポフェクションは、例えば米国特許第5,049,386号、第4,946,787号、および第4,897,355号において記述されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Transfectam（商標）およびLipofectin（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体-認識リポフェクションにとって適した陽イオンおよび中性脂質には、Felgner、国際公開公報第91/17424号、国際公開公報第91/16024号の脂質が含まれる。送達は、細胞（エクスビボ投与）または標的組織（インビボ投与）となりうる。
【０１６６】
免疫脂質複合体のような標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal, Science 270:404〜410(1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291〜297(1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382〜389(1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647〜654(1994)；Gao et al., Gene Therapy 2:710〜722(1995)；Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817〜4820(1992)；米国特許第4,186,183号、第4,217,344号、第4,235,871号、第4,261,975号、第4,485,054号、第4,501,728号、第4,774,085号、第4,837,028号、および第4,946,787号を参照されたい）。
【０１６７】
本発明の操作されたポリペプチドをコードする核酸を送達するためにRNAまたはDNAウイルスに基づく系を用いることは、体内の特定の細胞へのウイルスのターゲティングおよび核へのウイルス荷重の移動のための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与することができ（インビボ）、またはそれらはインビトロで細胞を処置するために用いることができ、改変された細胞を患者に投与する（エクスビボ）。本発明のポリペプチドを送達するための通常のウイルスに基づく系には、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれうるであろう。ウイルスベクターは、標的細胞および組織における遺伝子移入に関する現在最も効率的で使い道の多い方法である。宿主ゲノムに組み入れられることはレトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法に関して可能であり、それによって挿入されたトランスジーンがしばしば長期的に発現される。さらに、異なる多くの細胞タイプおよび標的組織において高い導入効率が認められている。
【０１６８】
レトロウイルスの親和性は、外来のエンベロープタンパク質を組み入れること、標的細胞の可能性がある標的集団を拡大させることによって改変することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染して、典型的に高いウイルス力価を生じることができるレトロウイルスベクターである。したがって、レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存するであろう。レトロウイルスベクターは、外来配列の6〜10 kbまでのパッケージング能を有するシス作用型の長末端反復を含む。ベクターの複製およびパッケージングにとって、最小のシス作用型LTRsで十分であり、これを用いて標的細胞に治療遺伝子を組み入れて、永続的なトランスジーン発現を提供する。広く用いられるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）およびその組み合わせに基づくベクターが含まれる（例えば、Buchscher et al., J.Virol. 66:2731〜2739(1992)；Johann et al., J. Virol. 66:1635〜1640(1992)；Sommerfelt et al. Virol. 176:58〜59(1990)；Wilson et al., J. Virol. 63:2374〜2378(1989)；Miller et al., J. Virol. 65:2220〜2224(1991)；PCT/US94/05700を参照されたい）。
【０１６９】
本発明のポリペプチドの一過性の発現が好ましい態様において、アデノウイルスに基づく系が典型的に用いられる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞タイプにおいて非常に高い形質導入効率を有することができ、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターによって、高い力価および発現レベルが得られる。このベクターは、比較的単純な系において大量に産生されうる。アデノ随伴ウイルス（「AAV」）ベクターはまた、細胞に標的核酸を形質導入するために用いられ、例えば核酸およびペプチドのインビトロ産生のために、ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子治療技法のために（例えば、West et al., Virology 160:38〜47(1987)；米国特許第4,797,368号；国際公開公報第93/24641号；Kotin, Human Gene Therapy 5:793〜801(1994)；Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351(1994)を参照されたい）。組換え型AAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号；Tratschin et al., Mol. Cell Biol. 5:3251〜3260(1985)；Tratschin et al., Mol. Cell Biol. 4:2072〜2081(1984)；Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466〜6470(1984)；およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822〜3828(1989)を含む多くの出版物において記述されている。
【０１７０】
pLASNおよびMFG-Sは、臨床試験において用いられているレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., Blood 85:3048〜305(1995)；Kohn et al., Nat. Med. 1:1017〜102(1995)；Malech et al., PNAS 94:22 12133〜12138(1997)）。PA317/pLASNは、遺伝子治療の臨床試験において用いられた第一の治療ベクターであった（Blaese et al., Science 270:475〜480(1995)）。MFG-Sパッケージングベクターに関して50％またはそれより高い形質導入効率が認められている（Ellem et al., Immunol. Immunother. 44(1):10〜20(1997)；Dranoff et al., Hum Gene Ther. 1:111〜2(1997)）。
【０１７１】
組換え型アデノ随伴ウイルスベクター（rAAV）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ随伴2型ウイルスに基づく有望な代用遺伝子送達系である。ベクターは全て、トランスジーン発現カセットに隣接するAAV 145 bp逆方向末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込による効率的な遺伝子移入および安定なトランスジーン送達は、このベクター系にとって重要な特徴である（Wagner et al., Lancet 351:9117 1702〜3(1998)；Kearns et al., Gene Ther. 9:748〜55(1996)）。
【０１７２】
複製欠損組換え型アデノウイルス（Ad）を、トランスジーンがAd E1a、E1b、およびE3遺伝子を置換するように操作することができる；その後複製欠損ベクターをトランスで欠損遺伝子機能を供給するヒト293細胞において増殖させる。Adベクターは、インビボで、肝臓、腎臓、および筋系の組織において認められる細胞のような、非分裂分化細胞を含む多数の組織に形質導入することができる。通常のAdベクターは、大きい運搬能を有する。臨床試験においてAdベクターを用いる例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫のためのポリヌクレオチド治療を伴った（Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083〜9(1998)）。臨床試験における遺伝子移入のためにアデノウイルスベクターを用いるさらなる例には、Rosenecker et al., Infection 24:1 5〜10(1996)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083〜1089(1998)；Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205〜18(1995)；Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597〜613(1997)；Topf et al., Gene Ther. 5:507〜513(1998)；Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083〜1089(1998)が含まれる。
【０１７３】
パッケージング細胞を用いて、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子を形成する。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングする293細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ2細胞またはPA317細胞が含まれる。遺伝子治療において用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生細胞株によって産生される。ベクターは典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込にとって必要な最小のウイルス配列を含み、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質に関する発現カセットによって置換される。欠失ウイルス機能はパッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において用いられるAAVベクターは、典型的に、宿主ゲノムへのパッケージングおよび組込にとって必要なAAVゲノムからのITR配列のみを有する。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、すなわちrepおよびcapをコードするがITR配列を欠損するヘルパープラスミドを含む細胞株にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてアデノウイルスに感染させる。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列を欠損するために有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えばアデノウイルスがAAVより感受性が高い熱処理によって減少させることができる。
【０１７４】
多くの遺伝子治療応用において、特定の組織タイプに対して高い程度の特異性を有する遺伝子治療ベクターを送達することが望ましい。ウイルスベクターは、典型的に、ウイルス外表面上でのウイルス外皮タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所定の細胞タイプに対する特異性を有するように改変される。リガンドは、対象細胞タイプ上に存在することが公知である受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., PNAS 92:9747〜9751(1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスがgp70と融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変されうること、および組換え型ウイルスがヒト上皮細胞増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳癌細胞に感染することを報告した。この原理を、リガンド融合タンパク質を発現する他の対のウイルスおよび受容体を発現する標的細胞に拡大することができる。例えば、糸状ファージを操作して、選択された実質的に如何なる細胞受容体に対しても特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、FABまたはFv）を表示させることができる。先の説明はウイルスベクターに主に当てはまるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取り込みに都合がよいと考えられる特異的取り込み配列を含むように操作することができる。
【０１７５】
遺伝子治療ベクターは、典型的に下記のように、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または頭蓋内注入）または局所適用によって個々の患者に投与することによってインビボで送達されうる。または、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）または万能ドナー造血幹細胞のような、細胞にエクスビボで送達して、その後通常、ベクターを組み入れた細胞に関して選択後、患者に細胞を再移植することができる。
【０１７６】
診断、研究、または遺伝子治療（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入）のためのエクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい態様において、細胞を被験生物から単離して、本発明のポリペプチドをコードする核酸（遺伝子またはcDNA）をトランスフェクトして、被験生物（例えば、患者）に再度注入する。エクスビボトランスフェクションにとって適した様々な細胞タイプが当業者に周知である（例えば、Freshney et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique(3 rd ed. 1994)、および患者からの細胞を単離および培養する方法に関する考察に関してそこに引用されている参考文献を参照されたい）。
【０１７７】
一つの態様において、幹細胞を細胞トランスフェクションおよび遺伝子治療のためにエクスビボ技法において用いる。幹細胞を用いる長所は、それらがインビトロで他の細胞タイプに分化することができること、または哺乳類（細胞のドナーのような）に導入することができ、それらが骨髄に定着することである。CD34+細胞をインビトロで、GM-CSF、IFN-γ、およびTNF-αのようなサイトカインを用いて、臨床的に重要な免疫細胞タイプに分化させる方法は、公知である（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693〜1702(1992)を参照されたい）。
【０１７８】
幹細胞は、公知の方法を用いて形質導入および分化のために単離される。例えば、幹細胞は、CD4+およびCD8+（T細胞）、CD45+（汎B細胞）、GR-1（顆粒球）およびIad（分化した抗原提示細胞）のような、望ましくない細胞に結合する抗体によって骨髄細胞を選別することによって、骨髄細胞から単離される（Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693〜1702(1992)を参照されたい）。
【０１７９】
治療核酸を含むベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）はまた、インビボで細胞の形質導入のために生物に直接投与することができる。または、裸のDNAを投与することができる。投与は、分子を導入して血液または組織細胞に最終的に接触させるために通常用いられる任意の経路によって行う。そのような核酸を投与する適した方法が利用可能であって当業者に周知であり、一つより多い経路を用いて特定の組成物を投与することができるが、特定の経路はしばしば、他の経路より即時的でより有効な反応を提供することができる。
【０１８０】
薬学的に許容される担体は部分的に、投与される特定の組成物と共に、組成物を投与するために用いられる特定の方法によって決定される。したがって、下記のように、本発明の薬学的組成物には広範な適した製剤が存在する（例えば、「Remington's Pharmaceutical Science」, 17th ed, 1989を参照されたい）。
【０１８１】
VII．疾患および障害の治療
A．血管新生の増加
本発明は、本明細書に記述するように、それを必要とする任意の患者において血管新生を増加させることを企図する。血管新生の増加は、例えば、創傷、骨折、および火傷の治癒と共に、炎症疾患、心疾患、例えば再狭窄、虚血心、心筋梗塞および末梢血管疾患（例えば、糖尿病における）にとって有用となりうる。血管新生の増強はまた、例えば卒中、不妊、強皮症を治療するためと共に、顕微鏡手術後ならびに脚、指および臓器の再結合後に有用となりうる。
【０１８２】
B．血管新生の減少
本発明は、本明細書に記述するように、それを必要とする任意の被験者において血管新生を減少させることを企図する。例えば、CCX-CKR2活性を減少させて、それによって血管新生を減少させることは、腫瘍、特に固形腫瘍の形成、増殖および／または転移を阻害するために有用である。腫瘍の例には、米国特許第5,945,403号において記述されるように、癌腫、腺癌、リンパ腫、肉腫、および他の固形腫瘍；白血病のような血液媒介腫瘍；腫瘍の転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫が含まれる。いくつかの場合、血管新生は、例えば癌腫、神経膠腫、中皮腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、腺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、神経膠芽腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、およびバーキットリンパ腫、頭頚部癌、結腸癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝胆道癌、胆嚢癌、小腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、陰茎癌、尿道癌、精巣癌、子宮頚癌、膣癌、子宮癌卵巣癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、膵内分泌癌、カルチノイド癌、骨癌、皮膚癌、網膜芽腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を有する被験者において、本発明の方法に従って減少する（さらなる癌に関しては「CANCER: PRINCIPLES AND PRACTICE」De Vita V.T. et al., eds 1997を参照されたい）。
【０１８３】
望ましくないまたは問題がある血管新生を伴う他の障害には、リウマチ性関節炎；乾癬；眼の血管新生疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後線維増殖症、ルベオーシス；オスラー-ウェーバー症候群；心筋血管新生；プラーク脈管新生；毛細血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；腸の癒着を含む内皮細胞の過剰または異常刺激疾患、クローン病、乾癬のような皮膚疾患、エクセマ（excema）、および強皮症、糖尿病、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、加齢関連黄斑変性、アテローム性動脈硬化症、強皮症、創傷肉芽腫および過増殖性瘢痕、すなわちケロイドが含まれ、ならびにネコひっかき病および潰瘍（Helicobacter pylori）のような病的結果として血管新生を有する疾患も同様に治療することができる。血管新生阻害剤は、開腹または腹腔鏡手術の後に起こる接着、特に腹腔または骨盤の癒着、および火傷の収縮を防止または阻害するために用いることができる。血管新生阻害剤を用いて有効に治療すべきである他の疾患には、移植後の瘢痕形成の防止、肝硬変、急性呼吸窮迫症候群後の肺線維症、または新生児の他の肺線維症、一時的な人工器官の埋め込み、および脳硬膜間の術後の癒着が含まれる。子宮内膜症、ポリープ症、心肥大と共に肥満も同様に、血管新生阻害剤によって治療される可能性がある。これらの障害は、子宮類線維腫、前立腺肥大、およびアミロイドーシスのように、他のタイプの正常組織の大きさまたは増殖の増加を含む可能性がある。CCX-CKR2の調節物質は、本明細書に記述の任意の障害または疾患に対して予防的または治療的に用いてもよい。
【０１８４】
CCX-CKR2活性の減少も同様に、障害の宿主を有効に治療するために新生血管形成の予防において用いることができる。このように、例えば、血管新生の減少は、血管の障害（例えば、血管腫およびアテローム斑内の毛細管増殖）、筋疾患（例えば、心筋の血管新生、心筋梗塞、または平滑筋内の血管新生）、関節（例えば、関節炎、血友病関節等）、および血管新生に関連する他の障害の治療の一部として用いることができる。血管新生の促進はまた、様々な生理的プロセスを加速するために、ならびに創傷、骨折および火傷の治癒、炎症疾患、虚血心、および末梢血管疾患のような脈管化の増加を必要とする疾患の治療のために役立ちうる。
【０１８５】
下記の実施例に記述されるように、CCX-CKR2のアンタゴニストはまた、創傷治癒を増強するために用いてもよい。本発明を特定の作用機序に限定する意図はないが、CCX-CKR2のアンタゴニズムによって内因性のリガンドが代わりにより低い親和性の受容体に結合して、それによって創傷治癒の増強を誘発する可能性がある。例えば、SDF-1はCCX-CKR2とCXCR4の双方に結合するが、CXCR4にはより低い親和性で結合する。同様に、I-TACは、I-TACがCCX-CKR2に結合する場合より低い親和性でCXCR3に結合する。これらのリガンドがCCX-CKR2に結合することを防止することによって、CCX-CKR2アンタゴニストはリガンドを他の受容体に結合させて、それによって創傷治癒を増強する。このように、創傷治癒を増強するためのCCX-CKR2のアンタゴニズムは、アゴニストによるCCX-CKR2の刺激によって創傷治癒を増強する場合とは異なるメカニズムによって媒介される可能性がある。
【０１８６】
新生血管形成に関連した障害および症状を治療する他に、血管新生の阻害を用いて、新生血管形成に関連した正常な生理的状態の発生を調節または防止することができる。このように、例えば、本発明の方法は避妊として用いることができる。本発明に従って、卵巣または子宮内膜におけるCCX-CKR2活性の減少は、排卵、胚の着床、胎盤形成等に関連した新生血管形成を減弱させることができる。
【０１８７】
血管新生の調節物質はなお他の治療的用途を有する。したがって、本発明のCCX-CKR2調節物質は、以下のために用いてもよい：
（a）脂肪組織剥離および肥満の治療。例えば、Kolonin et al., Nature Medicine 10(6):625〜632(2004)を参照されたい。
（b）子癇前症の治療。例えばLevine et al., N. Engl. J. Med. 350(7)672〜683(2004)；Maynard et al., J. Clin. Invest., 111(5):649〜658(2003)を参照されたい；および
（c）心血管疾患の治療。例えば、March et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287:H458〜H463(2004)；Rehman et al., Circulation 109:1292〜1298(2004)を参照されたい。
【０１８８】
VIII．投与および薬学的組成物
本発明の薬学的組成物は薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物と共に組成物を投与するために用いられる特定の方法によって部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成物には適した広範な製剤が存在する（例えば、「Remington's Pharmaceutical Science」, 17 th ed. 1985を参照されたい）。
【０１８９】
投与のために適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を等張にする溶質を含みうる水性および非水性溶液、等張滅菌溶液、ならびに懸濁剤、溶解剤、濃化剤、安定化剤、および保存剤を含みうる水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。本発明の実践において、組成物は例えば、経口、鼻腔内、局所、静脈内、腹腔内、皮下、または髄腔内投与することができる。化合物の製剤は、アンプルおよびバイアルのような単位用量または多用量密封容器の形となりうる。溶液および懸濁液は、既に記述された種類の滅菌粉末、顆粒剤および錠剤から調製することができる。調節物質は、調製された食品または薬剤の一部として投与することができる。
【０１９０】
組成物は、例えば、インスリンまたは化学療法を特異的臓器または腫瘍に送達するために用いられるタイプの注入ポンプによって投与することができる。本発明の組成物は、シリンジまたはカテーテルを用いて、腫瘍に、または切除前後の原発腫瘍の部位に直接注射することができる；または原発腫瘍の切除後に全身投与することができる。本発明の組成物は、必要に応じて局所塗布または局所投与してもよい。持続的な局所投与の場合、腫瘍部位に注射される徐放性インプラントにおいて酵素を投与してもよい。皮膚疾患の局所治療の場合、酵素製剤を軟膏またはゲルとして皮膚に投与してもよい。
【０１９１】
CCX-CKR2の発現または活性の調節物質（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）は、単独または他の適した成分と共に、吸入によって投与されるエアロゾル製剤（すなわち、それらが「ネブライズ」されうる）において調製されうる。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等のような加圧式の許容される噴射剤に入れることができる。
【０１９２】
いくつかの態様において、本発明のCCX-CKR2調節物質は、例えば、化学療法剤、放射線等を含む他の適当な治療物質と併用して投与することができる。併用治療において用いるための適当な物質の選択は、通常の薬学的原理に従って当業者が行ってもよい。治療物質の併用は、例えば、癌、創傷、腎機能障害、脳機能障害または神経機能障害のような様々な障害の治療または予防を行うために相乗作用する可能性がある。このアプローチを用いれば、各物質のより低い用量によって治療的有効性が得られ、それによって有害な副作用の可能性を減少させることが可能である。
【０１９３】
本発明の状況において、患者に投与される用量は、経時的に被験者において有用な反応を得るために十分でなければならない（例えば、腫瘍の大きさまたは腫瘍の負荷を減少させるために）。任意の患者の最適な用量レベルは、用いられる特定の調節物質の有効性、患者の年齢、体重、身体活動度および食事を含む多様な要因、他の薬剤との可能性がある併用、ならびに特定の疾患の重症度に依存するであろう。用量の大きさはまた、特定の被験者における特定の化合物またはベクターの投与を伴う任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定されるであろう。
【０１９４】
投与される調節物質の有効量を決定するために、医師は、調節物質の循環中の血漿レベル、調節物質の毒性、および抗調節物質抗体の産生を評価してもよい。一般的に、調節物質の用量等量は、典型的な被験者に関して約1 ng/kg〜10 mg/kgであろう。
【０１９５】
投与に関して、本発明のケモカイン受容体調節物質は、被験者の体格および全体的な健康に適用した場合の、調節物質のLD-50、様々な濃度での調節物質の副作用によって決定される割合で投与することができる。投与は、1回または分割用量で行うことができる。
【０１９６】
IX．併用治療
CCX-CKR2の阻害剤は、単独、または一つまたはそれ以上の他の薬剤と併用して供給することができる。可能性がある併用パートナーには、例えばさらなる抗血管新生因子および／または化学療法剤（例えば細胞障害薬）、または放射線療法、癌ワクチン、免疫調節物質、抗血管物質、シグナル伝達阻害剤、抗増殖物質、またはアポトーシス阻害剤が含まれうる。
【０１９７】
CCX-CKR2の阻害剤は、インテグリンの関与を遮断する抗体およびペプチド、メタロプロテナーゼを阻害するタンパク質および低分子（例えば、マリマスタット）、内皮細胞における燐酸化カスケードを遮断する物質（例えば、ハーバマイシン）、血管新生の公知の誘導物質のドミナントネガティブ受容体、血管新生の誘導物質に対する抗体もしくはその活性を遮断する他の化合物（例えば、スマリン）、または他の手段によって作用する他の化合物（例えば、レチノイド、IL-4、インターフェロン等）と併用して用いることができる。実際に、そのような因子は異なるメカニズムによって血管新生を調節する可能性があることから、他の血管新生物質と併用してCCX-CKR2の阻害剤を用いることは、所望の組織における血管新生のより強力な（およびおそらく相乗的な）阻害を増強しうる。
【０１９８】
MMP-2（マトリクス-メタロプロテナーゼ2）阻害剤、MMP-9（マトリクス-メタロプロテナーゼ9）阻害剤、およびCOX-II（シクロオキシゲナーゼII）阻害剤のような抗血管新生物質を、CCX-CKR2の阻害剤および本明細書に記述の薬学的組成物と併用して用いることができる。CCX-CKR2の阻害剤はまた、EGFR抗体、EGF抗体、およびEGFR阻害剤である分子のような、EGFR（上皮細胞増殖因子受容体）反応を阻害することができる物質、VEGF受容体およびVEGFを阻害することができる分子のようなVEGF（血管内皮増殖因子）阻害剤、ならびにerbB受容体に結合する有機分子または抗体のようなerbB受容体阻害剤、例えばHERCEPTIN（商標）（Genentech, Inc.of South San Francisco, Calif. USA）のようなシグナル伝達阻害剤と共に用いることができる。
【０１９９】
CCX-CKR2活性を増加または減少させる分子はまた、血管新生および／または創傷治癒を促進する薬物を含む他の薬物と併用することができる。当業者は、一つまたはそれ以上の内科外科的に有用な物質または治療物質、例えば血管新生を必要とする望ましい部位に組成物を適用した場合に、血管新生反応をさらに強化することができる、および／または治癒プロセスを加速および／または有用に改変することができる物質を組み入れることができることを認識するであろう。例えば、血管新生、修復および／または組織増殖をさらに促進するために、いくつかのホルモン、増殖因子、またはマイトゲンタンパク質、例えば線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、マクロファージ由来増殖因子等の少なくとも一つを組成物に含めることができる。さらに抗菌剤、例えば硫酸ゲンタマイシンまたはエリスロマイシンのような抗生物質を組成物に含めることができる。他の内科外科的に有用な物質には、抗炎症薬、鎮痛剤、麻酔剤、ルビファシエント（rubifacient）、酵素、抗ヒスタミン剤および色素が含まれうる。
【０２００】
CCX-CKR2活性を減少させる物質はまた、関節炎を治療するための薬剤を含む他の薬剤と併用することができる。そのような物質の例には、抗炎症治療薬が含まれる。例えば、プレドニゾロンおよびメチルプレドニゾロンのようなグルココルチコステロイドはしばしば用いられる抗炎症薬である。非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）も同様に炎症を抑制するために用いられる。NSAIDsは、炎症部位で過剰に産生されるプロスタグランジンの産生にとって中心となるシクロオキシゲナーゼ（COX）酵素COX-1およびCOX-2を阻害する。さらに、炎症促進サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNFα）は、関節炎を含む多数の炎症事象に関連しており、抗TNFα治療は現在臨床で用いられている。
【０２０１】
実施例
以下の実施例は、本発明を説明するために提供されるのであって、制限するためではない。
【０２０２】
実施例1
SDF-1/CXCR4ケモカイン-受容体対は、SDF-1がもう一つの受容体を通して機能しないと報告されていること、およびCXCR4のさらなるリガンドが同定されていないという点において、限定的な相互作用を共有すると長い間考えられてきた（Zlotnik, A. and Yoshie, O., Immunibty 12:121〜127(2000)）。この考え方は、双方の遺伝子の遺伝的ノックアウトによって胚の死が起こるという事実によって支持される（Nagasawa, T. et al., Nature 382, 635〜638(1996)；Yong-Rui Zou et al., Nature 393:595〜599(1998)）。
【０２０３】
SDF-1およびCXCR4の生物学を評価する努力において、本発明者らは、いくつかの異なる細胞タイプにおけるこの受容体リガンド対を評価することに着手した。当初、本発明者らは、FACS分析によって決定したいくつかの腫瘍細胞タイプにおける受容体発現を評価し始めた。市販の四つの抗体、クローン12G5、171、172、および173を、多数の細胞株において試験した。興味深いことに、調べた乳腺腫瘍細胞株は、CXCR4を発現してCXCR4メッセージを発現すると報告されたが、本発明者らの実験では、抗体は異なる細胞タイプにおいて異なるように反応した。調べたT細胞株、CEM-NKrおよびJurkatは、正常なヒトIL-2培養リンパ球（PBMC）と共に四つ(for)全てのクローンと反応した。しかし、二つの乳腺腫瘍腫瘍株MCF-7およびMDA MB-231は、広く用いられている抗CXCR4クローン12G5と反応せず、他の抗体とごく弱く（T細胞と比較して）反応するに過ぎなかった。もう一つの乳腺腫瘍株MDA MB 435sを含めた。この株は、CXCR4 mRNAを発現せず、期待されるようにいずれの抗体も表面上のCXCR4を認識しない。このように、MCF-7およびMDA MB231細胞におけるCXCR4メッセージの検出能にもかかわらず、抗-CXCR4抗体は、T細胞と比較してこれらの細胞において変化した反応性を示した。
【０２０４】
本発明者らはさらに、DisplaceMax（商標）技術（Dairaighi DJ, et al., J. Biol. Chem. 274(31)：21569〜21574(1999)）を用いてリガンド結合プロフィールを調べることによって、これらの細胞上でのSDF-1受容体発現を調べた。125I-SDF-1αをサインリガンド結合として用いるて、90を超えるケモカイン要素について試験した。予想されるように、SDF-1（マウスおよびヒト、ヒト型はSDF-1αおよびSDF-1βと呼ばれるタンパク質の二つの選択的スプライシング型を有する）およびHHV8コードケモカインvMIP-IIのみが、CEM-NKr上で標識SDF-1との結合に関して競合した。意外にも、MCF-7上の結合プロフィールは、有意に変化した。SDF-1およびvMIP-IIがSDF-1トレーサーを置換するのみならず、これらの細胞では、I-TAC（マウスおよびヒト）がSDF-1との結合に関する競合能を示した。次に、本発明者らは、これらの乳腺腫瘍細胞におけるトレーサーとしてI-TACを標識して、同じリガンドサインを産生した。唯一の報告されたI-TAC受容体は、CXCR3である（Cole KE et al., J. Exp. Med. 187(12):2009〜21(1998)）。興味深いことに、報告された他の二つのCXCR3リガンドであるMIGおよびIP-10は、ここで標識SDF-1を置換しない。このように、MCF-7細胞において発現されたSDF-1のその受容体に対する結合は、リガンド特異性に関してCEM-NKrにおいて発現されたものとは異なる。
【０２０５】
CEM-NKrおよびMCF-7において発現されたSDF-1受容体に対するリガンド結合プロフィールの変化を考慮して、本発明者らは、二つの細胞タイプに対するリガンドの親和性を調べた。CEM-NKrにおいて、125I-SDF-1αとコールドのSDF-1αまたはSDF-1βとの相同的競合によって、低いnM範囲のIC50値が得られた（それぞれ、1 nMおよび1.5 nM）。しかし、CEM-NKrとは対照的に、MCF-7細胞はnM下のSDF-1受容体親和性を示した。さらに、I-TACは、低いnM親和性で同様にMCF-7上で放射標識SDF-1α結合に関して競合することができる。さらに、本発明者らは、SDF-1およびI-TACのMCF-7細胞において発現された受容体に対する特異的結合能を阻害するが、CEM-NKrでは阻害しない低分子を開発した。CCX700と呼ばれ、表IおよびIIに例示されるこの一連の分子は、低いnM親和性でMCF-7細胞に対する放射標識SDF-1およびI-TACの結合を特異的に阻害する。しかし、CEM-NKrでは、同じ化合物がこれらの細胞に対するSDF-1結合に影響を及ぼさない。さらに、文献において、特徴的なSDF-1受容体であるCXCR4に結合すると記述される化合物（AMD3100）は、CEM-NKrに対するSDF-1結合を阻害するが、MCF-7細胞に対するSDF-1結合に対して影響を有しない。このように、MCF-7細胞において発現されたSDF-1受容体は、リガンド結合特異性および親和性の変化を示し、この受容体は、CEM-NKrにおいて発現されたSDF-1受容体とは薬理学的に異なる。
【０２０６】
MCF-7と比較してCEM-NKrにおいて発現されたSDF-1受容体の異なる特性を考慮して、本発明者らは、この受容体がCXCR4とは異なる遺伝子である可能性を調べ始めた。文献検索およびいくつかの孤児GPCRを評価した後、本発明者らは最終的に新規SDF-1結合特徴に関与する遺伝子を同定した。CCX-CKR2と呼ばれるこの遺伝子は、CXCR4またはCCX-CKR2を内因性に発現しない細胞株（MDA MB 435）において発現された場合、本発明者らが既に検出した特徴的な結合プロフィールを再現する。CCX-CKR2 MDA MB 435細胞において、125I-SDF-1はnM下で結合して、SDF-1およびI-TACは低いnM親和性で競合する。さらに、本発明者らのCCX-CKR2アンタゴニストシリーズCCX700（表１および２において例示される）は、これらの細胞において結合に関して競合することができるが、AnorMedからの広く用いられているCXCR4アンタゴニストは、これらの細胞における125I SDF-1結合に影響を及ぼさない。このように、本発明者らがCEM-NKrと比較してMCF-7細胞において検出した結合異常は、CCX-CKR2と呼ばれる別個の遺伝子として本明細書において同定されたさらなるSDF-1受容体によって説明される。
【０２０７】
診断薬として放射リガンド結合アッセイを用いて、本発明者らは、CCX-CKR2を発現する多数の腫瘍タイプを同定した。これらの細胞タイプを表3に記載する。興味深いことに、この受容体は、いくつかの例外を除いて正常細胞に対して腫瘍細胞上で選択的に発現されるように思われる。正常細胞起源としてマウス臓器を用いて、本発明者らは、正常な成体腎、正常な成体脳、および胎児肝の特定の段階を除いて、調べた全ての臓器ホモジネートにおいてCCX-CKR2発現を検出することができなかった。成体腎および脳における発現レベルは、放射リガンド結合シグナルによって決定するには低い。対照的に、この受容体は、胚の発達の11〜13日まで胎児肝において高度に発現される。しかし、E15までにこれは消失し、E17では検出できない。このように、CCX-CKR2は、発達の際の胎児肝において選択的に発現され、その後腫瘍細胞において再度発現される。
（表３)  CCX-CKR2は腫瘍細胞において広く発現されるが正常細胞では発現されない
2007520564.tif 000021
* これらの臓器における発現は、放射リガンド結合シグナルによって決定した場合、弱い。
【０２０８】
本発明者らはまた、CCX-CKR2がゼブラフィッシュのモルフォリノモデルにおいて血管新生に関与することを決定した（Nasevicius, A., and Ekker S.C., Nature Genetics 26:216〜220(2000)；Ekker S. and Larson J.D. Genesis 30:89〜93(2001)）。ゼブラフィッシュは初期発達に関与する遺伝子の機能を評価するために用いられている。ヒトにおける遺伝子の90％より多くがゼブラフィッシュにおいて同じ機能を有する。ゼブラフィッシュは、ヒトCCX-CKR2タンパク質配列と59％相同であるCCX-CKR2のオルトログを有する。モルフォリノ技術を用いて、ゼブラフィッシュ相同体を発達中の胚において「ノックダウン」した。CCX-CKR2遺伝子のモルフォリノによる阻害は、初期発達を阻害してほとんどの胚は死亡する。しかし、阻害剤の用量を滴定することによって、CCX-CKR2の遮断効果が出現し始める。興味深いことに、CCX-CKR2が阻害された胚において、モルファント（morphant）は伸長を示し、初期段階（受精後9時間）で細胞は背側および腹側領域への分配ができないことを示唆している。さらに発達に伴って（受精後28時間）魚は背側化表現型を有し、血管の欠損を有する。受精後56時間までにモルファントは心外膜浮腫を示す。結論すると、初期ゼブラフィッシュの発達においてCCX-CKR2を阻害すると、軽度の背側化表現型および劇的な血管欠損が起こる。発達の際にCCX-CKR2を有しないゼブラフィッシュは血管系を発達させることができず、それらは血液を有するものの、この血液は循環することができない。
【０２０９】
CCX-CKR2はまた、ヒトB細胞リンパ腫の異種移植片モデルにおいて評価されている。このモデルにおいて、免疫欠損マウスにヒトB細胞リンパ腫NAMALWAを接種した。マウスにCCX700シリーズの化合物または溶媒対照のいずれかを毎日投与した。興味深いことに、溶媒を与えたマウスは、大きく被膜を有する血管に富む腫瘍を選択的に発症したが、CCX700を与えたマウスは腫瘍を有したがその腫瘍は血管形成が著しく減少して被膜を有しなかった。この知見は、CCX-CKR2の阻害剤が腫瘍の血管床発達能を阻害したという点において、ゼブラフィッシュの試験からの結果と一致する。
【０２１０】
CCX-CKR2の阻害剤はまた、同系肺癌マウスモデルにおいて腫瘍容積を減少させるために有効であった。
【０２１１】
実施例2
CCX-CKR2を発現する細胞が内皮細胞単層に接着できることは、インビトロ静的接着アッセイにおいて評価されている。HUVEC細胞（Clontech, CA）を、細胞密度100,000個/ウェルで24ウェルプラスチック組織プレートに一晩接着させた。細胞を10 ng/ml TNFα＋10 ng/ml IL-1βを含む培地、または培地単独において37℃で5時間処置した。MDA MB 435（ATCC, VA）野生型細胞またはCCX-CKR2を安定にトランスフェクトした細胞に3 ng/mlカルセインAM（Neuroprobes, OR）のPBS溶液を室温で30分間負荷した。インキュベーション後、細胞をPBSにおいて洗浄して、HBSS（Hank's緩衝生理食塩液溶液）において細胞密度200,000個/ウェルで浮遊させた。MDA MB 435野生型またはCCX-CKR2発現細胞を、HUVECを含む組織培養プレートに1試料あたり2ウェルずつ加えた。プレートを37℃で15分間インキュベートして、HBSSによって2回洗浄した。
【０２１２】
接着細胞を顕微鏡およびTECANマルチウェルプレートリーダー上での蛍光強度によって定量した。非刺激HUVECを含むウェルでは、非常に少数のMDA MB 435細胞（野生型またはCCX-CKR2）が内皮細胞層に結合した。しかし、HUVEC単層をTNFαおよびIL-1βによって刺激したウェルでは、野生型の非CCX-CKR2発現細胞と比較して有意により多くのCCX-CKR2発現細胞が単層に接着した。蛍光強度によって定量すると、活性化HUVEC単層と共にCCX-CKR2発現MDA MB 435細胞を含むウェルは、野生型細胞と活性化HUVEC単層とを含むウェルの4倍のシグナルを生じた。これらのデータは、CCX-CKR2が活性化内皮単層に対する接着に関与していることを証明する。
【０２１３】
実施例3
本実施例は、マウス創傷治癒モデルにおけるCCX-CKR2リガンド競合物質の有効性を証明する。
【０２１４】
創傷治癒は、典型的に三つの相に分けられる。炎症相として知られる第一の相は、止血および炎症を含む。増殖相と呼ばれる次の相は、上皮形成、血管新生、および肉芽組織形成を特徴とする。最後に、成熟相において、創傷は収縮してコラーゲンが沈着する。一般的に、血管新生に影響を及ぼす物質がこのプロセスにおいて影響を及ぼすのは、創傷血管新生における増殖相において起こる。
【０２１５】
本発明者らは、上記のゼブラフィッシュ試験を通して血管新生の調節にCCX-CKR2を関連させた。これらの結果を考慮して、本発明者らは、創傷治癒のモデルにおいてCCX-CKR2に対して特異的な化合物を試験した。
【０２１６】
創傷治癒試験において、ICR由来雄性マウス（24±2 g）を用いた。試験期間において、動物を個別ケージに個々に収容した。ヘキソバルビタール（90 mg/kg, IP）麻酔下で、各動物の肩および背部領域の毛を刈った。鋭い穿孔器（ID 12 mm）を適用して皮筋層および癒着組織を含む皮膚を除去した。CCX-CKR2との結合に関して既にSDF-aおよびI-TACと競合することが示されている試験化合物（700シリーズの化合物、100μg/マウス）および溶媒（0.5％CMC（カルボキシメチルセルロース）/PBS pH 7.4、20 μl/マウス）をそれぞれ、皮膚損傷の直後から1日1回10日間局所投与した。陽性対照であるA2アデノシン受容体アゴニスト（CGS-21680；10 μg/マウス）も同様に、実験期間中毎日局所投与した。透明なプラスチックシート上に軌跡を得た創傷領域を、画像分析装置（Life Science Resources Vista, Version 3.0）を用いることによって、1、3、5、7、9および11日目に測定した。創傷の％閉鎖（％）を計算して創傷の半閉鎖時間（CT50）を決定して、グラフパッドプリズム（Graph Pad Software, USA）を用いて直線回帰によって決定および分析した。各測定時点で治療群と溶媒群との比較に、対応のないStudent's t検定を適用した。差は、P＜0.05レベルで統計学的有意であると見なされた。
【０２１７】
このモデルにおける700シリーズの化合物による治療は創傷の閉鎖を促進した。700シリーズの化合物は100μg/マウスの10日間投与により、3、5、7、9、および11日目で創傷の閉鎖を有意に増加させ（P＜0.05）、対応する溶媒対照値と比較してCT50は減少した。本発明者らはまた、他の公知のSDF-1/CXCL12受容体による創傷治癒に対する何らかの関与を調べるために、公知のCXCR4アンタゴニストであるAMD3100を含めた。比較すると、CXCR4アンタゴニスト（100μg/マウス）は、溶媒対照群と比較して創傷の閉鎖（％）またはCT50において有意な増加を引き起こさなかった。このように、700シリーズの化合物は、マウス皮膚創傷アッセイにおいて有意な創傷治癒活性を示したが、AMD 3100は示さなかった。
【０２１８】
本発明者らは次に、700シリーズ化合物の用量範囲の効果を調べた。本発明者らは再度、700シリーズの化合物が創傷閉鎖を有意に（溶媒対照と比較して）増強すること、およびこの作用が調べた全ての用量に存在することを発見した。興味深いことに、創傷閉鎖の増強は、調べた中間用量（100μgおよび25μg）において最も強く、最高（250μg）および最低（5μg）用量では弱い。このように、700シリーズの化合物は、他の報告された血管新生治療物質と一貫して、「U字」型の用量反応を有するように思われる。
【０２１９】
例を挙げると血小板好中球、白血球、マクロファージ、線維芽細胞およびケラチノサイトのような、多くの細胞タイプが創傷治癒に関与しているが、本発明者らは、特にこれらの細胞タイプの全てに対するCCX-CKR2発現を調べなかった。確かに上皮は創傷治癒においても同様に役割を有する。本発明者らは、炎症性サイトカインTNFαおよびIL-1βが、多数のタイプの初代培養内皮細胞においてCCX-CKR2を実際にアップレギュレートすることを証明した。したがって、本発明の範囲を制限する意図はないが、CCX-CKR2特異的化合物の効果が、活性化内皮またはまだ決定されていない細胞集団に作用しうる可能性がある。
【０２２０】
実施例4
本実施例は、CCX-CKR2がアポトーシスを減少させることによって細胞生存を促進することを証明する。
【０２２１】
ケモカインとケモカイン受容体との相互作用は典型的に、細胞内カルシウム動員および走化性を測定することによって評価される。しかし、CCX-CKR2は一過性のカルシウム動員を引き起こさず、または細胞をそのリガンドであるCXCL12もしくはCXCL11に反応して遊走させない。しかし、CCX-CKR2を発現する細胞は、活性化内皮細胞単層に対する接着の増加を示す。さらに、培養培地に低血清を供給した条件では（すなわち、通常の10％の代わりに1％）、3日後の生存接着細胞の回収量は、CCX-CKR2-MDA MB 435トランスフェクタント（CCX-CKR2 435sと命名）では非トランスフェクトWT細胞（WT 435s）よりかなり多かった。この知見と一致して、これらの培養物から回収した上清において回収された死細胞の発生率は、CCX-CKR2トランスフェクタントと比較してWTではより高かった。この作用は、DNAインターカレート色素7AAD（7アミノアクチノマイシンD）を用いて蛍光によって可視化されうる。CCX-CKR2-435トランスフェクタントまたは野生型435細胞を異なる血清濃度で増殖させて、それらを回収して7AAD（DMSOにおいて1μg/ml）と共に室温で15〜30分間インキュベートした。FACS分析により、野生型435細胞ではCCX-CKR2-435トランスフェクタントより多くの死／アポトーシス細胞（すなわち、7AAD陽性）が明らかとなった。
【０２２２】
本発明者らは、培養CCX-CKR2トランスフェクタントまたは非トランスフェクトWT細胞が、アポトーシス細胞のみを検出するアネキシンと、死細胞を検出するがアポトーシス細胞を検出しないヨウ化プロピジウム（PI）とによって同時染色させる一連の実験においてこれらの知見を拡大した。このアプローチは、細胞のアポトーシスを誘導することがわかっている物質、例えばカンプトテシン（CMP）またはTNFα＋シクロヘキシミド（CHX）を用いて証明されるように、細胞集団におけるアポトーシス細胞の比率を容易に同定し、これはこれらのアッセイにおいて優れた対照を提供する。
【０２２３】
このアッセイを用いて、本発明者らは、最適（10％）または限定的（1％）血清のいずれかにおいて増殖させたCCX-CKR2-435トランスフェクタントまたは野生型435細胞の経時的なアポトーシス細胞の発生を測定した。10％血清において増殖させた細胞タイプはいずれも、4日間の培養期間において優れた生存率を示した。対照的に1％血清において増殖させたWT細胞は、3および4日間の培養後生存細胞の劇的な減少を示した。アネキシンおよびPIの同時染色によって、アポトーシスおよび死細胞の双方の発生がこのように反映されたことが明らかとなった。興味深いことに、1％血清において増殖させたCCX-CKR2-435細胞は、4日間の培養器間において優れた生存率を示し、CCX-CKR2の435への導入が、最適下血清補給条件で起こる迅速な細胞アポトーシスの発生からこれらの細胞を保護することを示唆した。
【０２２４】
同じCCX-CKR2-435トランスフェクタント、およびさらに、CCX-CKR2をトランスフェクトした435細胞の異なる非クローン集団を用いた第二の実験において同一の結果が得られた。後者の結果は、初回クローントランスフェクタントのアポトーシス減少特性が、一つのトランスフェクタントクローンの特定の異常よりむしろCCX-CKR2発現に起因することを示した。
【０２２５】
補足的なデータは、CCX-CKR2のアンタゴニストを用いて得られている。これらの実験において、CCX-CKR2アンタゴニストを正常細胞に加えても、作用を示さなかったが、CCX-CKR2を発現する細胞にアンタゴニストを加えると、用量依存的に細胞死を誘導した。
【０２２６】
実施例5
本実施例は、CCX-CKR2の細胞発現が多数の調節タンパク質の誘導を引き起こすことを証明する。
【０２２７】
CCX-CKR2媒介シグナル伝達事象を調べるための代わりのアプローチとして、CCX-CKR2をトランスフェクトしたMDA MB 435細胞から回収した上清を、野生型MDA MB 435s（435s）細胞から回収した上清と比較して、大きい分泌タンパク質ファミリーの有無に関して特異的ELISAアッセイによって評価した。CCX-CKR2を発現する435s細胞は、特に限定的な血清条件で増殖させた場合に、野生型435s細胞と比較して実質的に大量のGM-CSF、RANTES、MCP-1、TIMP-1、およびMMP3を産生した。興味深いことに、これらの因子は全て、腫瘍形成に関連した増殖、血管のリモデリング、および走化性に関与することが報告されている。それらはまた、上記のCCX-CKR2のアポトーシス回避表現型に関与する可能性がある。
【０２２８】
実施例6
本実施例は、CCX-CKR2のsiRNAに基づく阻害を証明する。
【０２２９】
本発明者らは、CXCR4またはCCX-CKR2のいずれかに対して特異的なSMARTpool（商標）siRNA（Dharmacon）を得た。SMARTpool（商標）siRNAは、それぞれが明記されたmRNAの異なる領域を標的とする、異なる四つのsiRNA配列のプールである。これらのsiRNAプールをHeLa細胞において試験した。CXCR4発現を12G5または173 Mab染色およびFACSによって評価したが、CCX-CKR2発現は125I-SDF1を用いて結合アッセイにおいて測定した。CXCR4は、検出可能な125I-SDF1結合を示さないコンフォメーションでHeLa細胞において発現され、このように、CCX-CKR2発現の検出を可能にする。CCX-CKR2 SMARTpool（商標）siRNA（25〜100 nM）は、125I-SDF1結合の有意な阻害（≧50％）を示したが、CXCR4 SMARTpool（商標）siRNAは阻害を示さなかった。類似の結果が293-CCX-CKR2トランスフェクタントについて得られた。
【０２３０】
さらに、以下の三つのsiRNA配列はそれぞれ、4 nMもの低い濃度で細胞に導入した場合にSDF-1結合を減少させることが判明した：
2007520564.tif 000022
マウスCCX-CKR2転写物に基づく以下のヘアピンsiRNAは、マウスCCX-CKR2発現の阻害によってSDF-1結合を減少させる：
2007520564.tif 000023
【０２３１】
実施例7
本実施例は、CCX-CKR2の阻害が関節炎の有効な治療であることを証明する。
【０２３２】
CCX-CKR2活性を阻害する化合物の有効性を、Enbrel（登録商標）と比較してラット関節炎モデルにおいて決定した。ラットに700シリーズのCCX-CKR2結合分子を皮下投与した。発症したII型コラーゲン関節炎ラットを、炎症（関節の腫脹）、軟骨破壊、および骨吸収の阻害に関してモニターした。
【０２３３】
体重125〜150 gの雌性Lewisラットを用いた。物質を溶媒、すなわちII型コラーゲンおよびフロイントの不完全アジュバントにおいて送達した。動物（関節炎に関して1群10匹、正常対照に関して1群4匹）を1ケージあたり4〜5匹ずつ収容して動物施設に到着後4〜8日間馴化させた。
【０２３４】
投与を0日目に開始して16日目まで継続した。馴化させた動物をイソフルランによって麻酔してコラーゲン注射を行った（D0）。6日目に、動物を2回目のコラーゲン注射のために再度麻酔した。コラーゲンは、0.01 N酢酸において4 mg/ml溶液を調製することによって調製した。コラーゲンおよびフロイントの不完全アジュバントの等量を、水中に入れた場合にこの材料のビーズがその形をとどめているようになるまで、手で混合することによって乳化させた。各動物に混合物300μlを毎回背部の3カ所に塗布した。
【０２３５】
正常（疾患前）な左右足首関節の測定を9日目に行った。10〜14日目に、関節炎の発症を認めた。
【０２３６】
ラットの体重を、試験0、3、6、9、10、11、12、13、14、15、16、および17日目に測定して、キャリパーによる足首の測定を9日目から毎日行った。最終的な体重を17日に測定した。最終の体重測定後、動物を最終血清採取のために投与後約24時間（17日）で麻酔した後安楽死させて組織を採取した。膝も同様に顕微鏡のためにホルマリンに採取した。
【０２３７】
固定液において1〜2日後、および脱石灰において4〜5日後、足首の関節を縦方向に半分に切断して、膝を前部平面において半分に切断して処理し、抱埋して切片を作製し、トルイジンブルーによって染色した。コラーゲン関節炎の足首および膝を、以下の基準に従って炎症、パンヌス形成、および骨吸収に関して0〜5の採点を行った。
膝および足首の炎症
0＝正常
1＝関節周囲組織における炎症細胞の最小の浸潤
2＝軽度の浸潤
3＝中等度の浮腫を伴う中等度の浸潤
4＝顕著な浮腫を伴う顕著な浸潤
5＝重度の浮腫を伴う重度の浸潤
足首パンヌス（脛足根骨関節について強調）
0＝正常
1＝軟骨および軟骨下骨におけるパンヌスの軽度の浸潤
2＝軽度の浸潤（端部での脛骨の＜1/4）
3＝中等度の浸潤（脛骨1/4〜1/3に罹患、小足根骨の罹患）
4＝顕著な浸潤（脛骨1/2〜3/4に罹患、小足根骨の破壊）
5＝重度の浸潤（脛骨＞3/4に罹患、全体的な構築の重度の変形）
膝パンヌス
0＝正常
1＝軟骨および軟骨下骨におけるパンヌスの軽度の浸潤
2＝軽度の浸潤（脛骨もしくは大腿骨の表面または軟骨下領域の1/4までに及ぶ）
3＝中等度の浸潤（脛骨もしくは大腿骨の表面または軟骨下領域の＞1/4であるが＜1/2）
4＝顕著な浸潤（脛骨または大腿表面の1/2〜3/4に及ぶ）
5＝重度の浸潤（表面の＞3/4に及ぶ）
軟骨の障害（足首）
0＝正常
1＝最小＝明白な軟骨細胞の喪失またはコラーゲン破壊を認めない、トルイジンブルー染色の最小から軽度の消失
2＝軽度＝巣状の軽度（表層的）軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊、および表面の＜1/4の脛骨の完全な破壊、小足根骨の軽度の変化を伴う、トルイジンブルー染色の軽度の喪失
3＝中等度＝多数の巣状の中等度（中間域までの深さ）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲン破壊、脛骨1/4〜1/3の厚み全体の破壊、小足根骨の深さ1/2〜3/4までの罹患を伴う、トルイジンブルー染色の中等度の喪失。
4＝顕著＝多数の巣状の顕著な（深部域までの深さ）軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲン破壊、脛骨1/2〜3/4の厚み全体の破壊、小足根骨の破壊を伴う、トルイジンブルー染色の顕著な喪失。
5＝重度＝多数の巣状の重度（最高到達点までの深さ）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊。
軟骨の損傷（膝、大腿骨顆に強調）
0＝正常
1＝軽度＝明白な軟骨細胞の喪失またはコラーゲン破壊を認めないトルイジンブルー染色の最小から軽度の喪失
2＝軽度＝巣状の軽度の（表層的）軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲン破壊を伴うトルイジンブルー染色の軽度の喪失
3＝中等度＝多数の巣状からびまん性の中等度の（中間域までの深さ）軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲンの破壊を伴うトルイジンブルー染色の中等度の喪失
4＝顕著＝多数の巣状からびまん性の顕著な（深部域までの深さ）軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲン破壊を伴うトルイジンブルー染色の顕著な喪失
5＝重度＝大腿骨および脛骨上の多数の巣状の重度（最高到達点までの深さ）の軟骨細胞の喪失および／またはコラーゲン破壊を伴うトルイジンブルー染色の重度のびまん性の喪失。
骨吸収（足首）
0＝正常
1＝最小＝低倍率では容易に認められない小さい領域の吸収、まれな破骨細胞
2＝軽度＝低倍率では容易に認められないより多数の領域の吸収、より多数の破骨細胞、脛骨端＜1/4が吸収される
3＝中等度＝皮質の厚み全体の欠損を伴わない髄質骨梁骨および皮質骨の明白な吸収、一部の髄質骨梁骨の喪失、低倍率で明白な病変、より多数の破骨細胞、脛骨の1/4〜1/3が罹患、小足根骨の罹患
4＝顕著＝皮質骨の厚み全体の欠損、しばしば残りの皮質表面のプロフィールの歪み、髄質骨の顕著な喪失、多数の破骨細胞、脛骨の1/2〜3/4の罹患、小足根骨の破壊を伴う
5＝重度＝皮質骨の厚み全体の欠損、しばしば残りの皮質表面のプロフィールの歪み、髄質骨の顕著な喪失、多数の破骨細胞、脛骨の＞3/4の罹患、全体的な構築の重度の破壊を伴う。
骨吸収（膝）
0＝正常
1＝最小＝低倍率では容易に認められない小さい領域の吸収、まれな破骨細胞
2＝軽度＝より多数の吸収領域、脛骨または大腿骨表面（内側または外側）の1/4が罹患する軟骨下骨の明確な喪失
3＝中等度＝脛骨または大腿骨表面（内側または外側）の＞1/4であるが＜1/2に罹患する軟骨下骨の明白な吸収
4＝顕著＝脛骨または大腿骨表面（内側または外側）の＞1/2であるが＜3/4に罹患する軟骨下骨の明白な吸収
5＝重度＝脛骨または大腿骨表面（内側または外側）の＞3/4に罹患する破壊による全関節の歪み
【０２３８】
足首関節直径の臨床データは、投与曲線下面積（AUC）を決定することによって分析した。AUCの計算に関して、各ラットの足首関節（キャリパーを用いて）の毎日の測定を、マイクロソフトエクセルに入力して、疾患発症後から最終日までの治療期間の面積を計算した。各群の平均値を決定して、処置および正常動物の値を比較することによって、関節炎対照からの％阻害を計算した。データはStudent's t-検定によって分析した。各群の足首重量および組織学的パラメータ（平均値±SE）も同様に、Student's t-検定を用いて差に関して分析した。足首の重量およびAUCの％阻害を、以下の式を用いて計算した：
％阻害＝A−B/A×100
A＝疾患対照の平均値−正常の平均値
B＝処置の平均値−正常の平均値
ラットを以下のように処置した：
群N    処置、1日2回または4回の皮下投与を0〜16日
1      正常対照、溶媒の皮下投与（2 ml/kg）を1日4回
2      関節炎＋溶媒の1日4回皮下投与（2 ml/kg）
3      関節炎＋CCX754 100 mg/kgの1日4回皮下投与
【０２３９】
700シリーズの化合物を投与した群の動物は、溶媒処置群と比較して有意に減少した関節の炎症を示した（P＜0.0001）。図1を参照されたい。関節炎を発症した群（溶媒群）のラットは、試験期間において体重の減少を示したが、関節炎を示さないラット（正常対照）または最小の炎症を有するラット（700シリーズ処置）はそれぞれ、体重の増加または安定化を示した。
【０２４０】
実施例8
本実施例は、N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミドの調製について説明する。
方法1
2007520564.tif 000024
【０２４１】
段階1：(S)-2-{[ナフタレン-2-イルメチル]-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
窒素下で、2-(S)-アミノメチル-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル（スキーム1に従って調製）2 g（10 mmol）を無水ジクロロメタン50 mlに溶解した。この溶液にナフタレン-2-カルバルデヒド2 g（13 mmol）および分子ふるいを加えた。混合物を一晩攪拌した。分子ふるいを濾過して、有機部分を濃縮した。得られた混合物を0℃に冷却したメタノール100 mlに溶解して、水素化ホウ素ナトリウム0.75 g（20 mmol）を加えた。1時間後、薄層クロマトグラフィーは反応の終了を示した。この混合物に水10 mlを非常に徐々に加えて、ジクロロメタンによって3回抽出し、合わせた有機相を塩水によって洗浄して硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して濃縮すると、オレンジ色の油2.76 g（精製なし）が得られた。LC-MSD、m/z：C21H28N2O2[M+H]：341.1。HPLC、C18カラム勾配20〜95％アセトニトリル-0.1％TFAで7分でのLC保持時間：3.2分。
【０２４２】
段階2：2-(S)-{[(3,4-ジメトキシ-ベンゾイル)-ナフタレン-2-イルメチル]-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
3,4-ジメトキシ安息香酸1.04 g（5.72 mmol）をテトラヒドロフラン30 mlに溶解して、この混合物に1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩1.4 g（6.6 mmol）、トリエチルアミン0.66 g（5.72 mmol）を加えて、30分後に1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.77 g（5.72 mmol）を加えた。混合物を1時間攪拌した。この混合物に2-{[ナフタレン-2-イルメチル]-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル1.5 g（4.4 mmol）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。飽和重炭酸ナトリウム50 mlを加えて、酢酸エチル100 mlによって3回抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて濾過して、真空下で濃縮した。シリカゲルヘキサン：1-ジクロロメタン：1上で精製すると、白色粉末1.1 gを生じた。LC-MSD、m/z：C30H36N2O5[M+H]：505.2。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：5.0分。
【０２４３】
段階3：(S)-3,4-ジメトキシ-N-ナフタレン-2-イルメチル-N-ピロリジン-2-イルメチル-ベンズアミド
ジクロロメタンおよび30％トルフルオロ酢酸の20 ml混合物において、2-{[(3,4-ジメトキシ-ベンゾイル)-ナフタレン-2-イルメチル-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル1.1 g（2.18 mmol）を溶解した。室温で1時間後、重炭酸ナトリウムの飽和溶液を塩基性pHとなるまで加えて、混合物をジクロロメタンによって抽出して硫酸マグネシウム上で乾燥させて、濾過して真空下で濃縮すると0.88 gが得られた。LC-MSD、m/z：C25H28N2O3[M+H]：404.2。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：1.37分。
【０２４４】
段階4：N-(S)-(1-シクロへキス-3-エニルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミド
3,4-ジメトキシ-N-ナフタレン-2-イルメチル-N-(S)-ピロリジン-2-イルメチル-ベンズアミド0.88 g（2.17 mmol）を無水ジクロロメタン20 mlに溶解して、この混合物に1,2,3,6-テトラヒドロベンズアルデヒド0.26 g（2.39 mmol）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.68 g（3.25 mmol）および分子ふるいを加えた。反応混合物を窒素下で室温で一晩攪拌した。分子ふるいを濾過して、この混合物に飽和重炭酸ナトリウムを加えて、ジクロロメタンによって3回抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて濾過し、真空下で濃縮した。油0.8 gが得られ、これを勾配20〜90％アセトニトリル-0.1％TFAの逆相HPLC C18カラムを用いて精製すると、白色粉末0.6 gが得られた。LC-MSD、m/z：C32H38N2O3[M+H]：499.4。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.87分。
【０２４５】
段階5：N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミド
N-(S)-(1-シクロヘキス-3-エニルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミドをメタノール5 mlに溶解して、この溶液に2 mgパラジウム5％炭素を加えた。混合物を大気圧の水素下で室温で攪拌した。2時間後、反応は終了する。触媒を濾過してメタノールを真空下で濃縮すると、白色粉末10 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C32H40N2O3[M+H]：501.4。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：4.52分。
2007520564.tif 000025
スキーム1：2-(S)-アミノメチル-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルの調製
方法2：
2007520564.tif 000026
【０２４６】
段階1：(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-ナフタレン-2-イルメチル-アミン(S)-C-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イル)-メチルアミン（スキーム2に従って調製）0.24 g（1 mmol）およびナフタレン-2-カルバルデヒド0.19 g（1.2 mmol）を、ジクロロメタン10 mlに溶解した。この混合物にトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.51 g（2 mmol）および分子ふるいを加えた。反応物を窒素下で一晩混合した。分子ふるいを濾過して、HCl 3 mlによって洗浄して、粉末重炭酸ナトリウムによって酸性層を塩基性pHに変換して、酢酸エチルによって抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過して濃縮すると黄色の油100 mgが得られた。
【０２４７】
段階2：N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミド
方法1の段階2に従って、3,4-ジメトキシ安息香酸40 mg（0.22 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩40 mg（0.22 mol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール20 mg（0.18 mmol）、トリエチルアミン0.03 ml（0.22 mmol）、および(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-ナフタレン-2-イルメチル-アミン50 mg（0.15 mmol）からテトラヒドロフラン1 mlにおいて調製すると、白色粉末72 mgを生じた。LC-MSD、m/z：C32H40N2O3[M+H]：501.4。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：4.2分。
2007520564.tif 000027
a：ベンジルクロロホルメート、炭酸ナトリウム、THF、3時間、室温
b：6 N HCl、ジオキサン、14時間、室温
c：シクロヘキサンカルボキサルデヒド、メタノール、酢酸、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、0℃〜室温
d：10％Pd/チャコール、メタノール、H2 2.5 Kg、5時間
スキーム2：C-(1-(S)-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-メチルアミンの調製
【０２４８】
実施例9
本実施例は、N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-N-キノリン-3-イルメチル-ベンズアミドの調製を示す。
2007520564.tif 000028
【０２４９】
段階1：(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-キノリン-3-イルメチル-アミン
実施例8と類似の実験条件で、(S)-C-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イル)-メチルアミン0.25 g（1.3 mmol）、キノリン-3-カルバルデヒド0.2 g（1.3 mmol）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.53 g（2.6 mmol）、および分子ふるいからジクロロメタン8 mlにおいて調製した。化合物40 mgが得られた。
【０２５０】
段階2：N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-N-キノリン-3-イルメチル-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、3,4-ジメトキシ安息香酸32 mg（0.17 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩34 mg（0.17 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール19 mg（0.14 mmol）、トリエチルアミン0.24 mlおよび(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-キノリン-3-イルメチル-アミン40 mg（0.11 mmol）をテトラヒドロフラン1 mlにおいて反応させ、C18カラム、20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAの勾配による逆相HPLC精製によって白色固体11 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C31H39N2O3[M+H]：502.2。HPLC上、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.2分。
【０２５１】
実施例10
本実施例は、N-ベンゾフラン-2-イルメチル-N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-ベンズアミドの調製を示す。
2007520564.tif 000029
【０２５２】
段階1：2-(S)-{[(ベンゾフラン-2-イルメチル)-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
実施例8と類似の実験条件で、ベンゾフラン-2-カルバルデヒド0.15 g（1 mmol）、2-アミノメチル-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル0.26 g（1.2 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.43 g（2 mmol）をジクロロメタン10 mlにおいて反応させると、88％純粋な油0.2 gが得られた。
【０２５３】
段階2：2-(S)-{[ベンゾフラン-2-イルメチル-(3,4-ジメトキシ-ベンゾイル)-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-トリメトキシ安息香酸72 mg（0.39 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩75 mg（0.39 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール45 mg（0.33 mmol）、トリエチルアミン0.05 ml（0.39 mmol）、および2-(S)-{[(ベンゾフラン-2-イルメチル)-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル100 mg（0.3 mmol）をテトラヒドロフラン3 mlにおいて反応させた。化合物を酢酸エチル：メタノール9：1のシリカゲルクロマトグラフィー溶出によって精製すると、白色の油状化合物93 mgが得られた。
【０２５４】
段階3：N-ベンゾフラン-2-イルメチル-N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4-ジメトキシ-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、2-(S)-{[ベンゾフラン-2-イルメチル-(3,4-ジメトキシ-ベンゾイル)-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル110 mg（0.22 mmol）およびトリフルオロ酢酸と17％ジクロロメタンの混合物1 ml、脱保護後のN-ベンゾフラン-2-イルメチル-3,4-ジメトキシ-N-(S)-ピロリジン-2-イルメチル-ベンズアミド64 mg（0.16 mmol）、シクロヘキサンカルバルデヒド19 mg（0.17 mmol）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム68 mg（0.32 mmol）および分子ふるいからジクロロメタン1 mlにおいて調製した。白色粉末50 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C30H38N2O4[M+H]：491.2。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.91分。
【０２５５】
実施例11
本実施例は、N-ベンゾフラン-2-イルメチル-N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4,5-トリメトキシ-ベンズアミドの調製について記述する。
2007520564.tif 000030
【０２５６】
段階1：2-(S)-{[ベンゾフラン-2-イルメチル-(3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル)-アミノ]-メチル}-ピロロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル
2-(S)-{[ベンゾフラン-2-イルメチル]-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル0.33 g（0.28 mmol）、3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル塩酸塩65 mg（0.28 mmol）およびトリエチルアミン0.04 ml（0.28 mmol）。1時間後、飽和重炭酸ナトリウムを加えて、混合物をジクロロメタンによって抽出して有機相を合わせて、硫酸マグネシウム上で乾燥させて濾過して、真空下で濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー、酢酸エチル-ヘキサン5.5〜4.5による溶出によって精製すると、淡黄色の油100 mgが得られた。
【０２５７】
段階2：N-ベンゾフラン-2-イルメチル-N-(S)-(1-シクロヘキシルメチル-ピロリジン-2-イルメチル)-3,4,5-トリメトキシ-ベンズアミド
実施例10と類似の実験条件で、(S)-{[ベンゾフラン-2-イルメチル-(3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイル)-アミノ]-メチル}-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル0.1 g（0.19 mmol）、トリフルオロ酢酸0.15 ml（1.9 mmol）から1 mlジクロロメタンにおいて調製した。脱保護したアミン0.06 g（0.188 mmol）を、シクロヘキサンカルバルデヒド0.023 g（0.19 mmol）およびアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.06 g（0.38 mmol）にジクロロメタン1 mlにおいて加えると白色粉末70 mgを得た。LC-MSD、m/z：C31H40N2O5[M+H]：521.2。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.88分。
【０２５８】
実施例12
本実施例は、3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000031
【０２５９】
段階1：[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ナフタレン-2-イルメチル-アミン
実施例8と類似の実験条件で、2-ナフタレンカルボキサルデヒド0.15 g（1 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.14 g（1.1 mmol）、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。粗材料は淡黄色の油110 mgである。
【０２６０】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミド
実施例11と類似の実験条件で、[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ナフタレン-2-イルメチル-アミン0.11 g（0.42 mmol）、3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイルクロリド0.11 g（0.51 mmol）、およびトリエチルアミン0.06 g（0.72 mmol）から無水ジクロロメタン10 mlにおいて調製した。化合物を、C18カラムの勾配20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAによって逆相HPLCを用いて精製すると、精製材料180 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C28H34N2O4[M+H]：463.5。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.01分。
【０２６１】
実施例13
本実施例は、3,4,5-トリメトキシ-N[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミドの調製を説明する。
2007520564.tif 000032
【０２６２】
段階1：[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ナフタレン-1-イルメチル-アミン
実施例12と類似の実験条件で、1-ナフタレンカルボキサルデヒド0.15 g（1 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.14 g（1.1 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。粗材料は透明な油210 mgである。
【０２６３】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-N-ナフタレン-1-イルメチル-ベンズアミド
実施例12と類似の実験条件で、[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ナフタレン-1-イルメチル-アミン0.21 g（0.79 mmol）、3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイルクロリド0.021 g（0.95 mmol）、およびトリエチルアミン0.11 g（1.18 mmol）から、無水ジクロロメタン15 mlにおいて調製した。化合物をC18カラムの勾配20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAによる逆相HPLCを用いて精製し、精製材料280 mgを生じた。LC-MSD、m/z：C28H34N2O4[M+H]：463.5。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.13分。
【０２６４】
実施例14
本実施例は、N-ベンゾフラン-2-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000033
【０２６５】
段階1：ベンゾフラン-2-イルメチル-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例12と類似の実験条件で、2-ベンゾフランカルボキサルデヒド0.14 g（1.1 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.14 g（1 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。シリカクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.25による溶出によって精製すると、化合物83 mgが得られた。
【０２６６】
段階2：N-ベンゾフラン-2-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-トリメトキシ安息香酸0.08 g（0.32 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.060 g（0.38 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.05 g（0.38 mmol）、トリエチルアミン0.05 ml（0.38 mmol）、およびベンゾフラン-2-イルメチル-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン0.08 g（0.3 mmol）からテトラヒドロフラン3 mlにおいて調製した。逆相HPLCを用いて、20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAの勾配のC18カラムによって精製すると、白色粉末100 mgがTFA塩として得られた。LC-MSD、m/z：C26H32N2O5[M+H]：453.5。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：2.73分。
【０２６７】
実施例15
本実施例は、N-ベンゾ[b]チオフェン-2-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000034
【０２６８】
段階1：ベンゾ[b]チオフェン-2-イルメチル-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例12と類似の実験条件で、ベンゾ[b]チオフェン-2-カルバルデヒド0.18 g（1.1 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.14 g（1 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.25によって溶出すると、化合物73 mgが得られた。
【０２６９】
段階2：N-ベンゾ[b]チオフェン-2-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-トリメトキシ安息香酸0.07 g（0.26 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.05 g（0.31 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.04 g（0.3 mmol）、トリエチルアミン0.03 ml（0.31 mmol）、およびベンゾ[b]チオフェン-2-イルメチル-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン0.07 g（0.26 mmol）からテトラヒドロフラン3 mlにおいて調製した。逆相HPLCを用いて20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAの勾配のC18カラムによって精製すると、ハイドロスコーピック（hydroscopic）粉末50 mgがTFA塩として得られた。LC-MSD、m/z：C26H32N2O4S[M+H]：469.5。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：2.858分。
【０２７０】
実施例16
本実施例は、N-(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-イルメチル)-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000035
【０２７１】
段階1：(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]ジオキシン-6-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例12と類似の実験条件で、ベンゾ[b]チオフェン-2-カルバルデヒド0.18 g（1.1 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.14 g（1 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.25によって溶出すると、化合物0.21 gが得られた。
【０２７２】
段階2：(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]-ジオキシン-6-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-ジメトキシ安息香酸0.19g（0.91 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.14 g（0.91 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.12 g（0.91 mmol）、トリエチルアミン0.12 ml（0.91 mmol）、および(2,3-ジヒドロ-ベンゾ[1,4]-ジオキシン-6-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン0.21 g（0.76 mmol）からテトラヒドロフラン5 mlにおいて調製した。逆相HPLCを用いて20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAの勾配のC18カラムによって精製すると、化合物150 mgがTFA塩として得られた。LC-MSD、m/z：C26H34N2O6[M+H]：471.5。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：1.805分。
【０２７３】
実施例17
本実施例は、3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-N-キノリン-3-イルメチル-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000036
【０２７４】
段階1：[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル-キノリン-3-イルメチル-アミン
実施例12と類似の実験条件で、キノリン-3-カルバルデヒド0.25 g（1.5 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.22 g（1.8 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.25によって溶出すると、淡黄色の油状化合物160 mgが得られた。
【０２７５】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-N-キノリン-3-イルメチル-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-ジメトキシ安息香酸0.11g（0.55 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.10 g（0.55 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.05 g（0.40 mmol）、トリエチルアミン0.08 ml（0.55 mmol）、および[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-キノリン-3-イルメチル-アミン0.1 g（0.37 mmol）からテトラヒドロフラン5 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いてジクロロメタン-メタノール9：1を用いて溶出すると、淡黄色の油80 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C27H33N3O4[M+H]：464.5。HPLC、C18カラムの勾配、0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：1.93分。
【０２７６】
実施例18
本実施例は、3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-N-キノリン-2-イルメチル-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000037
【０２７７】
段階1：[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル-キノリン-2-イルメチル-アミン
実施例12と類似の実験条件で、キノリン-2-カルバルデヒド0.25 g（1.5 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.22 g（1.8 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.25によって溶出すると、暗いオレンジ色の油状化合物0.24 gが得られた。
【０２７８】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-N-キノリン-2-イルメチル-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-ジメトキシ安息香酸0.11g（0.55 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.10 g（0.55 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.05 g（0.40 mmol）、トリエチルアミン0.08 ml（0.55 mmol）、および[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-キノリン-2-イル-アミン0.1 g（0.37 mmol）からテトラヒドロフラン5 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いてジクロロメタン-メタノール9：1を用いて溶出させると、淡黄色の油50 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C27H33N3O4[M+H]：464.5。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：0.81分。
【０２７９】
実施例19
本実施例は、N-ベンゾ[b]チオフェン-3-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000038
【０２８０】
段階1：ベンゾ[b]チオフェン-3-イルメチル-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例12と類似の実験条件で、ベンゾ[b]チオフェン-3-カルバルデヒド0.16 g（1 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.14 g（1.1 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.25によって溶出すると、化合物140 mgが得られた。
【０２８１】
段階2：N-ベンゾ[b]チオフェン-3-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-ジメトキシ安息香酸0.13g（0.62 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.09 g（0.62 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.08 g（0.62 mmol）、トリエチルアミン0.08 ml（0.62 mmol）、およびベンゾ[b]チオフェン-2-イルメチル-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン0.14 g（0.51 mmol）をテトラヒドロフラン3 mlにおいて反応させた。逆相HPLCを用いて勾配20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAのC18カラムによって精製すると、ハイドロスコーピック粉末120 mgがTFA塩として得られた。LC-MSD、m/z：C26H32N2O4S[M+H]：469.5。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.07分。
【０２８２】
実施例20
本実施例は、N-ベンゾチアゾル-2-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000039
段階1：ベンゾ[チアゾル-2-イルメチル[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例12と類似の実験条件で、ベンゾチアゾル-2-カルバルデヒド0.16 g（1 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.14 g（1.1 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.31 g（1.5 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.25によって溶出すると、化合物0.15 mgが得られた。
【０２８３】
段階2：N-ベンゾチアゾル-2-イルメチル-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミド
実施例8と類似の実験条件で、3,4,5-ジメトキシ安息香酸0.14 g（0.65 mmol）、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩0.1 g（0.65 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール0.08 g（0.65 mmol）、トリエチルアミン0.09 ml（0.65 mmol）、およびベンゾトリアゾル-2-イルメチル-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン0.15 g（0.54 mmol）からテトラヒドロフラン3 mlにおいて調製した。逆相HPLCを用いて勾配20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAのC18カラムによって精製すると、ハイドロスコーピック粉末120 mgがTFA塩として得られた。LC-MSD、m/z：C25H31N3O4S[M+H]：470.5。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：2.50分。
【０２８４】
実施例21
本実施例は、3,4,5-トリメトキシ-N-(1-メチル-1H-ベンゾイミダゾル-2-イルメチル)-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000040
【０２８５】
段階1：(1-メチル-1H-ベンゾイミダゾル-2-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例12と類似の実験条件を用いて、1-メチル-1H-ベンゾイミダゾル-2-カルバルデヒド0.2 g（1.25 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.18 g（1.38 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.39 g（1.87 mmol）からジクロロメタン10 mlにおいて調製した。反応後材料を粗材料として用いた。
【０２８６】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N-(1-メチル-1H-インドル-2-イルメチル)-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミド
実施例12と類似の実験条件で、(1-メチル-1H-ベンゾイミダゾル-2-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン、粗材料3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイルクロリド0.37 g（1.62 mmol）、およびトリエチルアミン0.26 ml（1.87 mmol）から無水ジクロロメタン5 mlにおいて調製した。化合物を逆相HPLCを用いて、勾配20〜80％アセトニトリル-0.1％TFAのC18カラムによって精製すると、純粋な材料110 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C26H34N4O4[M+H]：467.2。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：0.43分。
【０２８７】
実施例22
本実施例は、N-(1H-インドル-2-イルメチル)-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000041
【０２８８】
段階1：(1H-インドル-2-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン
実施例12と類似の実験条件で、1H-インドール-2-カルバルデヒド0.14 g（2 mmol）、2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチルアミン0.3 g（2.4 mmol）、およびトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム0.87 g（1.87 mmol）からジクロロメタン20 mlにおいて調製した。シリカゲルクロマトグラフィーを用いて、酢酸エチル-メタノール-水酸化アンモニウム9-1-0.1〜8-2-0.2によって溶出すると、明るい茶色の油0.3 gが得られた。
【０２８９】
段階2：N-(1H-インドル-2-イルメチル)-3,4,5-トリメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミド
実施例12と類似の実験条件で、(1H-インドル-2-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン0.8 g（0.31 mmol）、3,4,5-トリメトキシ-ベンゾイルクロリド0.08 g（0.34 mmol）、およびトリエチルアミン0.06 ml（0.46 mmol）から無水ジクロロメタン5 mlにおいて調製した。化合物を逆相HPLCを用いて、勾配20〜70％アセトニトリル-0.1％TFAのC18カラムによって精製して、純粋な材料50 mgを得た。LC-MSD、m/z：C26H33N3O4[M+H]：452.2。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：1.99分。
【０２９０】
実施例23
本実施例は、N-(1H-インドル-2-イルメチル)-3,5-ジメトキシ-N-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000042
【０２９１】
実施例12と類似の実験条件で、(1H-インドル-2-イルメチル)-[2-(1-メチル-ピロリジン-2-イル)-エチル]-アミン0.1 g（0.38 mmol）、3,5-ジメトキシ-ベンゾイルクロリド0.08 g（0.42 mmol）、およびトリエチルアミン0.08 ml（0.57 mmol）から無水ジクロロメタン1.5 mlにおいて調製した。化合物を逆相HPLCを用いて、勾配20〜70％アセトニトリル-0.1％TFAのC18カラムによって精製して、純粋な材料50 mgを得た。LC-MSD、m/z：C25H31N3O3[M+H]：422.2。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：2.7分。
【０２９２】
実施例24
本実施例は、N-ビフェニル-3-イル-3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000043
【０２９３】
段階1：3-(ビフェニル-3-イルアミノ)-プロピオン酸メチルエステル
丸底フラスコに3-アミノビフェニル2.6 g（15.3 mmol）、アクリル酸メチル1.5 g（16.9 mmol）、および酢酸第二銅0.1 gを加えて、反応混合物を90℃で5時間攪拌して、さらに5倍量のアクリル酸メチル7 g（75 mmol）、および酢酸第二銅0.25 gを加えて、反応混合物をさらに5時間加熱した。粗材料を、15％酢酸エチルおよび石油エーテルを用いるシリカゲルクロマトグラフィーを用いて精製した。油1.6 gを得た。
【０２９４】
段階2：3-(ビフェニル-3-イルアミノ)-プロピオン酸
3-(ビフェニル-3-イルアミノ)-プロピオン酸メチルエステル1.6 g（6.3 mmol）を水8 mlおよびテトラヒドロフラン8 mlに溶解して、この溶液に水酸化リチウム0.4 g（9.5 mmol）を加えて、反応物を室温で5時間攪拌した。溶媒を混合物から完全に除去して、水10 mlを加えて、酢酸エチルによって洗浄した。水溶液を1 M HClによって酸性にして、酢酸エチルによって3回抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄して、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、真空下で濃縮すると、次の段階の粗材料として用いられる酸1.6 gを得た。
【０２９５】
段階3：3-(ビフェニル-3-イルアミノ)-1-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロパン-1-オン
3-(ビフェニル-3-イルアミノ)-プロピオン酸1.6 g（6.6 mmol）、2-メチルピペリジン0.78 g（7.9 mmol）の混合物に固体O-(ベンゾトリアゾル-1-イル)-N,N,N',N',-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート4.7 g（1.3 mmol）およびトリエチルアミン3.86 ml（27 mmol）をジクロロメタン25 mlにおいて加えて、室温で一晩放置した。反応混合物を水で洗浄して、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて濾過し、真空下で濃縮した。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、酢酸エチルによって溶出させると材料2 gが得られた。
【０２９６】
段階4：ビフェニル-3-イル-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-アミン
3-(ビフェニル-3-イルアミノ)-1-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロパン-1-オン1 g（3.1 mmol）のテトラヒドロフラン溶液10 mlを、水素化アルミニウムリチウム0.1 g（3.1 mmol）の無水テトラヒドロフラン冷溶液10 mlに滴下して加えた。混合物を5時間攪拌した後、飽和硫酸ナトリウム溶液によって反応を停止させた。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによってクロロホルム-メタノール9：1を用いて精製すると、化合物0.2 gが得られた。
【０２９７】
段階5：N-ビフェニル-3-イル-3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-ベンズアミド
3,4,5-トリメトキシ安息香酸0.19 g（0.89 mmol）を塩化チオニル0.26 ml（3.5 mmol）に溶解して、保護管に入れて3時間還流した。過剰量の塩化チオニルを真空下で除去した。ビフェニル-3-イル[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-アミン0.23 g（0.746 mmol）をジクロロメタン5 mlに溶解して、トリエチルアミン4.1 ml（3 mmol）を加えて、混合物を冷却して、塩化酸のジクロロメタン溶液5 mlを滴下して加えて、一晩攪拌した。溶媒を真空下で除去して、クロロホルム-メタノール9-1を用いてシリカゲルクロマトグラフィーによって精製すると、化合物40 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C31H38N2O4[M+H]：503.6。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.96分。
【０２９８】
実施例24
本実施例は3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000044
【０２９９】
段階1：[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-ナフタレン-2-イルメチル-アミン
2-ナフタルデヒド1 g（6.4 mmol）、3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピルアミン0.99 g（6.4 mmol）を無水ジクロロメタン25 mlにおいて分子ふるい5 gに加えた。反応物を室温で一晩攪拌した。分子ふるいを濾過して、ジクロロメタンを真空下で濃縮した。混合物に無水メタノール15 mlを加えて、水素化ホウ素ナトリウム0.3 g（8 mmol）を加えて、その後30分反応を進行させ、メタノールを真空下で濃縮して、クロロホルムによって希釈して、有機相を水20 mlによって2回洗浄した後、塩水によって洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、真空下で濃縮した。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーにおいて3.5％メタノールのクロロホルム溶液による溶出を用いて精製し、油0.6 gを得た。
【０３００】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-N-ナフタレン-2-イルメチル-ベンズアミド
[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-ナフタレン-2-イルメチル-アミン0.55 g（1.8 mmol）、3,4,5-トリメトキシ安息香酸0.04 g（2.2 mmol）、トリエチルアミン0.02 mlおよびO-(ベンゾトリアゾル-1-イル)-N,N,N',N',-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート0.18 g（3.6 mmol）、無水ジクロロメタン5 ml。化合物を2％メタノールのクロロホルム溶液を用いて精製した。LC-MSD、m/z：C30H38N2O4[M+H]：491.6。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.86分。
【０３０１】
実施例25
本実施例は、3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-N-(5-フェニル-チアゾル-2-イルメチル)-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000045
【０３０２】
段階1：[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-(5-フェニル-チアゾル-2イルメチル)-アミン
実施例24と類似の実験条件で、5-フェニル-チアゾル-2-カルバルデヒド0.16 g（1.05 mmol）、3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピルアミン0.2 g（1.05 mmol）を無水ジクロロメタン5 mlにおいて分子ふるい2 gに加えた。反応物を室温で一晩攪拌した。分子ふるいを濾過して、ジクロロメタンを真空下で濃縮した。混合物に、0℃で無水メタノール15 mlを加えて、水素化ホウ素ナトリウム0.04 g（1.155 mmol）を加えて、その後30分反応を進行させる。反応をアセトン2 mlによって終了させ、メタノールを真空下で濃縮して、クロロホルムによって希釈して、有機相を水20 mlによって2回洗浄した後、塩水によって洗浄した。有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥させて、真空下で濃縮した。化合物0.3 gを得た。
【０３０３】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-N-(5-フェニル-チアゾル-2-イルメチル)-ベンズアミド
実施例24と類似の実験条件で、[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-(5-フェニル-チアゾル-2-イルメチル)-アミン0.15 g（0.45 mmol）、3,4,5-トリメトキシ-安息香酸0.10 g（0.499 mmol）、トリエチルアミン0.15 mlおよび1-プロパンホスホン酸環状無水物（50％酢酸エチル溶液）0.34 g（0.54 mmol）、酢酸エチル20 mlから調製した。化合物を、中性アルミナゲルクロマトグラフィーを用いてクロロホルムによる溶出によって精製して、材料120 mgを得た。LC-MSD、m/z：C29H37N3O4S[M+H]：524.6。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.54分。
【０３０４】
実施例26
本実施例は、3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-N-ナフタレン-2-イル-ベンズアミドの調製を記述する。
2007520564.tif 000046
【０３０５】
段階1：[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-ナフタレン-2-イルアミン
丸底フラスコにおいて窒素下で酢酸パラジウム（II）0.09 g（0.4 mmol）、rac-2,2'-ビス(ジフェニルホスフィノ)-1,1'-ビナフチル0.53 g（0.8 mmol）、燐酸三カリウム一塩基酸0.06 g（29 mmol）をDME 25 mlにおいて加えて、この混合物に2-ブロモナフタレン1.7 g（8.2 mmol）および2-メチル-ピペリジン-N-プロピルアミン4 g（25.6 mmol）を加えた。混合物を17時間還流した。反応混合物をセライトに濾過して、濃縮した。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーを用いて、5％メタノールのクロロホルム溶液によって溶出した。化合物0.47 gを得た。
【０３０６】
段階2：3,4,5-トリメトキシ-N-[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-N-ナフタレン-2-イル-ベンズアミド
実施例24と類似の実験条件で、3,4,5-トリメトキシ安息香酸0.53 g（2.5 mmol）、塩化チオニル0.24 ml（3.34 mmol）、トリエチルアミン0.7 ml（5 mmol）および[3-(2-メチル-ピペリジン-1-イル)-プロピル]-ナフタレン-2-イルアミン0.47 g（1.67 mmol）からクロロホルム15 mlにおいて調製した。化合物をシリカゲルクロマトグラフィーによって精製すると、材料150 mgが得られた。LC-MSD、m/z：C29H36N2O4[M+H]：477.5。HPLC、C18カラムの勾配0.1％TFAを含む20〜95％アセトニトリルで7分でのLC保持時間：3.49分。
【０３０７】
本明細書において引用した全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の出版物または特許出願が特におよび個々に参照として本明細書に組み入れられることが示されるように、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３０８】
前述の本発明は、理解を明快にする目的で説明および例によっていくぶん詳細に記述してきたが、特定の変更および改変をそれらに行ってもよく、それらも添付の請求の範囲の趣旨または範囲に含まれることは、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかとなるであろう。
【０３０９】
2007520564.tif 000047
2007520564.tif 000048
2007520564.tif 000049
2007520564.tif 000050
【図面の簡単な説明】
【０３１０】
【図１】時間の関数としてのマウスの関節の直径を示す。マウスをCCX-CKR2阻害剤または溶媒のみによって処置した。*は、P＝0.043（溶媒対CCX-CKR2阻害剤）を示す。**はP＝0.0002（溶媒対CCX-CKR2阻害剤）を示す。***はP＜0.0001（溶媒対CCX-CKR2阻害剤）を示す。
【図１】
2007520564.tif 000052
【配列表】
2007520564000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年10月4日(2006.10.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007520564000001.app
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３０】
さらに、以下の三つのsiRNA配列（配列番号:11〜13)はそれぞれ、4 nMもの低い濃度で細胞に導入した場合にSDF-1結合を減少させることが判明した：
2007520564.tif 000057
マウスCCX-CKR2転写物に基づく以下のヘアピンsiRNA（配列番号:14〜18)は、マウスCCX-CKR2発現の阻害によってSDF-1結合を減少させる：
2007520564.tif 000058
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【国際調査報告】
2007520564.tif 000059
2007520564.tif 000060