(57)【要約】本発明は、候補化合物がＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）のモジュレーターであるか否かを同定する方法に関する。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、哺乳動物ＧＰＣＲ、好ましくはヒトＧＰＣＲである。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、内因的に心筋細胞により発現される。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは、Ｇｑとカップリングされる。本発明は、さらに、ＧＰＣＲのモジュレーターを用いる方法に関する。好ましいモジュレーターは、逆アゴニストおよびアンタゴニストである。本発明における逆アゴニストおよびアンタゴニストは、肥大性心筋障害および鬱血性心不全、特に、心筋梗塞後の再形成、心臓弁疾患、維持された心臓後負荷、および家族性肥大性心筋障害に由来する肥大性心筋障害を含む、心臓病の予防または治療のための治療剤として有用である。
2007524382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、ここで、該レセプターは、Ｇタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該候補化合物を該レセプターと接触させる工程；および
（ｉｉ）該レセプター機能性が調節されるか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、レセプター機能の変化は、該候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのモジュレーターであることを示す、方法。
【請求項２】
候補化合物が心血管障害のモジュレーターであるか否かを同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該候補化合物をＲＵＰ４０  ＧＰＣＲと接触させる工程であって、ここで、該レセプターは、Ｇタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られる、アミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉｘ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｘ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、工程；
（ｂ）該レセプターの機能が調節されるか否かを決定する工程；
を包含し、
ここで、レセプター機能の変化は、該候補化合物が心血管障害のモジュレーターであることを示す、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法に従って同定されたモジュレーター。
【請求項４】
アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項３に記載のモジュレーター。
【請求項５】
逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項３に記載のモジュレーター。
【請求項６】
ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの活性を調節する方法であって、ここで、該レセプターは、Ｇタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを用いてヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み；
該方法は、該レセプターを請求項３に記載のモジュレーターと接触させる工程を含む、方法。
【請求項７】
前記接触させる工程が、前記モジュレーターを、前記レセプターを含む個体に投与する工程を包含し、ここで、該個体は、心臓病の予防または治療を必要としている、請求項６の記載の方法。
【請求項８】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
心臓病の予防または治療を必要とする個体において該心臓病を予防するか、または治療する方法であって、該方法は、治療上有効量の請求項３に記載のモジュレーターをＲＵＰ４０  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得られる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、方法。
【請求項１３】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記肥大型心筋症が：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
組成物を調製する方法であって、該方法は、モジュレーターを同定する工程、次いで、キャリアおよびモジュレーターを混合する工程を包含し、ここで、モジュレーターは、請求項１または２に記載の方法によって同定可能である、方法。
【請求項１８】
前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項３に記載のモジュレーターを含むか、請求項３に記載のモジュレーターで実質的に構成されるか、または請求項３に記載のモジュレーターで構成される薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
【請求項２０】
前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項１９に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
【請求項２１】
請求項１９に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を心臓病の予防または治療を必要とする個体に提供する工程、または投与する工程を包含する、該心臓病を予防するか、または治療する方法。
【請求項２２】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
心臓病の予防または治療のための医薬の調製のための請求項３に記載のモジュレーターの使用方法。
【請求項２７】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドであるか否かを同定する方法であって、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１、３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得られる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該候補化合物の存在下または不存在下で、該レセプターを該ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドと接触させる工程；および
（ｉｉ）該標識された既知のリガンドの該レセプターへの結合が、該候補化合物の存在下で阻害されるか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、該阻害は、候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドであることを示す、方法。
【請求項３２】
ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；および
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得られる、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸、または配列番号２のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３３】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、およびブタからなる群より選択される、請求項３２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３４】
前記発現が、心筋細胞選択的である、請求項３２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３５】
前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、野生型コントロール哺乳動物に対して、鬱血性心不全または肥大型心筋症に対する素因を呈するか、または鬱血性心不全または肥大型心筋症を現す、請求項３２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３６】
請求項３に記載のモジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療に効果を有するか否かを同定するために請求項３５記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該モジュレーターをトランスジェニック非ヒト哺乳動物するか、または投与しない工程；
（ｂ）該モジュラーターの投与が、以下；
（ｉ）湿潤または乾燥心臓重量の低下；
（ｉｉ）湿潤または乾燥心臓重量／体重の比率の低下；
（ｉｉｉ）心筋細胞の断面積の低下；および
（ｉｖ）ＡＮＦ遺伝子の誘導のレベルの低下；
からなる群より選択される効果を有するか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、該決定は、該モジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療についての効果を有することを示す、方法。
【請求項３７】
該モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
ＲＵＰ４０遺伝子に破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３９】
前記破壊が、心筋細胞選択的である、請求項３８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４０】
前記哺乳動物が、マウス、ラットおよびブタからなる群より選択される、請求項３８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４１】
前記哺乳動物が、マウスであり、かつ前記ＲＵＰ４０遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４２】
前記哺乳動物が、ラットであり、かつ前記ＲＵＰ４０遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３８に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４３】
前記哺乳動物が、野生型コントロール哺乳動物に対して、横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）につき低下した肥大型心筋症を発現する請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４４】
心臓病のための薬学的薬剤としての候補化合物をスクリーニングするためのＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの使用であって、ここで、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド度配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得られる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含むレセプターである、使用。
【請求項４５】
前記心血管障害が、心臓病である、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求候４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記薬学的薬剤が、前記レセプターのリガンドである、請求項４４に記載の使用。
【請求項５１】
前記薬学的薬剤が、前記レセプターのモジュレーターである、請求項４４に記載の使用。
【請求項５２】
アゴニスト、部分アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項５１に記載のモジュレーター。
【請求項５３】
逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される請求項５１に記載のモジュレーター。
【請求項５４】
ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの活性を調節する方法であって、ここで、該レセプターは、Ｇタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１、３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は、配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得られる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み、該方法は、該レセプターを、請求項５１に記載のモジュレーターと接触させる工程を包含する、方法。
【請求項５５】
前記接触させる工程が、前記モジュレーターを、前記レセプターを含む個体に投与する工程を包含し、ここで、該個体は、心臓病の予防または治療を必要とする、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
心臓病の予防または治療を必要とする個体において該心臓病を予防するか、または治療する方法であって、該方法は、治療上有効量の請求項５１に記載のモジュレーターをＲＵＰ４０  ＧＰＣＲと接触させる工程を包含し、該レセプターは、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１、３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸は、配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得られる、アミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む、方法。
【請求項６１】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
組成物を調製する方法であって、該方法は、モジュレーターを得る工程、次いで、キャリア、および該モジュレーターを混合する工程を包含し、ここで、該モジュレーターは、請求項５１に記載の使用に従う、方法。
【請求項６６】
前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項５１に記載のモジュレーターを含むか、請求項５１に記載のモジュレーターで実質的に構成されるか、または請求項５１に記載のモジュレーターで構成される薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
【請求項６８】
前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項６７に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物。
【請求項６９】
心臓病について予防するか、または治療する方法であって、該方法は、該予防または治療を必要とする個体に請求項６７に記載の薬学的または生理学的に受容可能な組成物を提供する工程または投与する工程を包含する、方法。
【請求項７０】
前記心臓病が、先天性心不全である、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
心臓病についての予防または治療のための医薬を調製するための請求項５１に記載のモジュレーターを使用する方法。
【請求項７５】
前記心臓病が、鬱血性心不全である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記心臓病が、肥大型心筋症である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記心臓病が、先天性心臓欠陥である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
請求項５１に記載の前記モジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療に対して効果を有するか否かを同定するために、請求項３２に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該モジュレーターを請求項３２記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与するか、または投与しない工程；
（ｂ）該モジュレーターの投与が、以下：
（ｉ）湿潤または乾燥心臓重量の低下；
（ｉｉ）湿潤または乾燥心臓重量／体重の比率の低下；
（ｉｉｉ）心筋細胞の断面積の低下；および
（ｉｖ）ＡＮＦ遺伝子の誘導のレベルの低下；
からなる群より選択される効果を有するか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、該決定は、該モジュレーターが鬱血性心不全または肥大型心筋症の予防または治療に効果を有することを示す、方法。
【請求項８０】
前記モジュレーターが、逆アゴニストまたはアンタゴニストである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記個体が、哺乳動物である、請求項７〜１６、２１〜２５、５５〜６４、および６９〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記哺乳動物が、非ヒト哺乳動物である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、示された日付でＵ．Ｓ．速達便で介して米国特許商標局に出願された以下の仮出願からの優先権の利益を主張する：２００３年６月２０日に出願された米国仮出願第６０／４８０，０４６号。前記出願の開示をここで引用してその全体を援用する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、候補化合物がＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）のモジュレーターであるか否かを同定する方法に関する。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは哺乳動物、好ましくはヒトである。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲは心筋細胞によって内因的に発現される。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲはＧｑにカップリングする。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲはイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）の細胞内レベルを増加させる。いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲのモジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。本発明は、さらに、ＧＰＣＲのモジュレーターを使用する方法に関する。好ましいモジュレーターは逆アゴニストおよびアンタゴニストである。本発明の逆アゴニストおよびアンタゴニストは肥大性心筋障害および鬱血性心不全、特に、心筋梗塞後再形成、心臓弁疾患、維持された心臓後負荷、心筋炎および家族性肥大性心筋障害に由来する肥大性心筋障害を含めた心臓病の予防または治療用の治療剤として有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（Ａ．鬱血性心不全）
鬱血性心不全（ＣＨＦ）は毎年５００，０００を超える新しい症例が診断されるほぼ５００万人のアメリカ人に罹る。定義によると、ＣＨＦは、心臓病が拍出を低下させ、静脈圧を増加させ、不全となる心臓の進行性劣化を引き起こす分子異常を伴う臨床的症候群である（心臓病：Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、およびＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ、  Ｋａｔｚ、ＡＭ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｌｓ、２０００から）。数十年の研究にもかかわらず、ＣＨＦの原因の詳細な理解は依然として不明瞭である。しかしながら、科学的および臨床的知見は、該病気のプロセスの初期相が「心臓肥大」（また、「肥大性心筋障害」）として知られたストレスに対する心筋の適合不良応答よりなることを明瞭に示している。軽減されない高血圧の状況における心臓への慢性的過剰負荷、弁疾患、または組織損傷（心筋梗塞）は肥大性増殖応答をもたらし、これは、心臓拍出が一時的に回復する限りは最初は適合するが、減時に徐々に適合不良となり、その結果、収縮機能が減少し、心臓が拡張され、不全となる。５年の生存率は、一旦心不全が兆候的になれば、５０％未満であるので、心筋肥大を加速させる分子的プロセスをコードしない心不全のいずれの定義も、この症候群の主な臨床的特徴を見逃している。
【０００４】
細胞培養および小動物実験は、心筋細胞上のＧタンパク質共役型レセプターが心臓収縮機能のコードに重要なレギュレーターであり、また、心筋細胞肥大の調節にも関与していることを明瞭に示した（レビューについては；Ａｄａｍｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ、  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０、１６２６−１６３４、２００１参照）。事実、ヒトにおけるＣＨＦの治療のためのＡＣＥ阻害剤の正の効果は、心筋におけるアンジオテンシンＩＩレセプター活性化の間接的阻害を介して適合不良肥大の低下に少なくとも部分的に関与すると考えられる。
【０００５】
しかしながら、過去１０年間にわたるＣＨＦ用の薬理学的療法における改善にもかかわらず（ＡＣＥ阻害剤、データ−遮断剤）、死亡率の２０〜３０％低下が現在の最適療法で示されているにすぎない。将来、良好な薬物の開発および新しい治療剤の同定は、ＣＨＦに罹った患者の臨床的結果を改善するようである。
【０００６】
（Ｂ．Ｇタンパク質共役型レセプター）
多数のレセプタークラスがヒトに存在するが、現在までに、最も豊富であって治療的に関連するのはＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）クラスによって示される。ヒトゲノム内に３０，０００〜４０，０００程の遺伝子があると見積もられ、これらのうち、ほぼ２％がＧＰＣＲをコードすると見積もられる。
【０００７】
ＧＰＣＲは医薬製品の開発のための重要な領域を表し；１００の公知のＧＰＣＲのほぼ２０から、全ての処方医薬のほぼ６０％が開発されてきた。例えば、１９９９年においては、トップの１００ブランド名処方医薬のうち、以下の薬物がＧＰＣＲと相互作用する（薬物に関連して治療される原発性病気および／または障害を括弧に入れて示す）：
【０００８】
【化１】
2007524382.tif 000003
。
【０００９】
ＧＰＣＲは、その各々は膜にわたる７つのアルファラセンを形成する２２〜２４の間の疎水性アミノ酸の７つの配列を有する共通の構造的モチーフを有する［各スパンは数字によって確認される、すなわち、膜貫通−１（ＴＭ−１）膜貫通１（ＴＭ−２）等］。膜貫通ラセンは細胞膜の外部または「細胞外」側の膜貫通２および膜貫通−３、膜貫通４および膜貫通５、および膜貫通６および膜貫通７の間のアミノ酸のストランドによって接合される［これらは、各々、「細胞外」領域１、２および３（ＥＣ−１，ＥＣ−２およびＥＣ−３）といわれる］。また、膜貫通ラセンは細胞膜の内側または「細胞内」側で膜貫通−１および膜貫通２、膜貫通３および膜貫通４、および膜貫通５および膜貫通６の間でアミノ酸のストランドによって接合される［これらは、各々、「細胞内」領域１、２および３（ＩＣ−１，ＩＣ−２およびＩＣ−３）といわれる］。レセプターの「カルボキシン」（「Ｃ」）末端は細胞内の細胞内空間に存在し、レセプターの「アミノ」（「Ｎ」）末端は細胞の外側の細胞外空間に存在する。
【００１０】
一般に、リガンドがレセプターに結合すると（しばしば、レセプターの「活性化」といわれる）、レセプターの立体配座が変化し、これは、細胞内領域および細胞内「Ｇタンパク質」の間のカップリングを促進する。ＧＰＣＲはＧタンパク質に対して「乱交雑」であり、すなわち、ＧＰＣＲは１を超えるＧタンパク質と相互作用できることが報告されている。Ｋｅｎａｋｉｎ、Ｔ．、４３  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０９５（１９８８）参照。他のＧタンパク質は存在するが、現在、Ｇｑ，Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｚおよびＧｏは同定されているＧタンパク質である。Ｇタンパク質とのリガンド−活性化ＧＰＣＲカップリングは（「シグナル変換」といわれる）シグナリングカスケードプロセスを開始させる。正常な条件下では、シグナル変換は、結局は、細胞の活性化または細胞の阻害をもたらす。理論に拘束されるつもりはないが、ＩＣ−３ループならびにレセプターのカルボキシ末端がＧタンパク質と相互作用されると考えられる。
【００１１】
Ｇｓ−共役型ＧＰＣＲは細胞内ｃＡＭＰレベルを上昇させる。Ｇｉ−、Ｇｏ−，またはＧｚ−共役型ＧＰＣＲは細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させる。Ｇｑ−共役型ＧＰＣＲは細胞内ＩＰ３およびＣａ２＋レベルを上昇させる。
【００１２】
また、Ｇ１５またはＧ１６のような、ＧＰＣＲのいくつかのクラスをホスホリパーゼＣ経路にカップリングさせるように見える乱交雑Ｇタンパク質［Ｏｆｆｅｒｍａｎｎｓ  ＆  Ｓｉｍｏｎ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９５）２７０：１５１７５−８０］、または多数の異なるＧＰＣＲを同一経路、例えば、ホスホリパーゼＣにカップリングさせるように設計されたキメラＧタンパク質［Ｍｉｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｒｅｅｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９９）２０：１１８−２４］もある。
【００１３】
メラノフォア技術（後記参照）はＧＰＣＲのＧタンパク質カップリングを質問するのに、また、ある化合物がＧＰＣＲのモジュレーターであるか否かを同定するのに有用である。
【００１４】
生理学的条件下では、ＧＰＣＲは２つの異なる立体配座：「不活性」状態および「活性」状態の間で平衡して細胞膜に存在する。不活性状態のレセプターは、細胞内シグナリング変換経路にリンクして、生物学的応答に導くシグナル変換を開示させることができない。レセプターの立体配座を活性状態に変化させると、（Ｇタンパク質を介して）変換経路への連鎖を可能とし、生物学的応答を生じさせる。
【００１５】
レセプターはリガンドまたは薬物のような化合物によって活性状態に安定化させることができる。専らそれに限定されるものではないが、レセプターのアミノ酸配列に対する修飾を含めた最近の発見は、活性状態立体配座にあるレセプターを促進し、安定化させるリガンドまたは薬物以外の手段を提供する。これらの手段は、レセプターへのリガンド結合の効果を刺激することによって、レセプターを活性状態に効果的に安定化させる。そのようなリガンド−非依存性手段による安定化は「構成的レセプター活性化」といわれる（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
（発明の要旨）
ＲＵＰ４０は、セクレチンファミリーのそれと同様なヘプタラセンドメインを含むクラスＩＩのＧＰＣＲである。ヒトＲＵＰ４０ポリペプチドを高度するヌクレオチド配列は配列番号１に与えられる。該コードされたヒトＲＵＰ４０ポリペプチドのアミノ酸配列はアミノ酸配列番号２に与えられる。ラットＲＵＰ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号３に与えられる。該コードされたラットＲＵＰ４０ポリペプチドのアミノ酸配列番号４に与えられる。部分的マウスＲＵＰ４０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号５に与えられる。該コードされた部分マウスＲＵＰ４０ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号６に与えられる。
【００１７】
ＲＵＰ４０はシグナルペプチド、ＳＥＡモジュール、およびＧＰＣＲタンパク質分解部位（ＧＰＳ）ドメインを有すると予測される。シグナルペプチドのタンパク質分解切断は、ヒトＲＵＰ４０では配列番号２のほぼアミノ酸２１および２２の間で、およびラットＲＵＰ４０では配列番号４のほぼアミノ酸２４および２５の間で起こると予測される（ＳｉｇｎａｌＰ；ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ−２．０／）。ＳＥＡモジュール内のタンパク質分解切断が、ヒトＲＵＰ４０では配列番号２のほぼアミノ酸２２６および２２７の間で、およびラットＲＵＰ４０では配列番号４のほぼアミノ酸２２３および２２４の間で起こると予測される［Ａｂｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２３３９１−８；その開示をここで引用してその全体を援用する］。ＧＰＳドメインは、ヒトＲＵＰ４０では配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７に近似的に、およびラットＲＵＰ４０では配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００にほぼ対応する［Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖ，  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：４６５１８−２６；その開示をここで引用してその全体を援用する］。ＧＰＳドメイン内でのタンパク質切断はヒトＲＵＰ４０につき配列番号２のアミノ酸９９０および９９１のほぼ間、およびラットＲＵＰ４０につき配列番号４のアミノ酸９９３および９９４のほぼ間で起こると予想される［Ｋｒａｓｎｏｐｅｒｏｖ，  Ｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（２００２）２７７：４６５１８−２６］。
【００１８】
ＲＵＰ４０は哺乳動物の心臓、肺、大動脈および脂肪で高度に発現される。心臓においては、ＲＵＰは左心室によって高度に発現される。心室内では、ＲＵＰ４０は心筋細胞によって発現される。出願人らは、心筋細胞におけるＲＵＰ４０の過剰発現の結果、増大したＩＰ３蓄積、および心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）発現および肥大の引き続いての増加が起こると判断した。心臓肥大をもたらす横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）に付されたマウスにおける過剰負荷された圧力の条件下で、ＲＵＰ４０  ｍＲＮＡのレベルは維持されるか、またはわずかに増大する。高レベルの心筋発現、および肥大シグナリングを生じる能力の組合せは、ＲＵＰ４０を、血液動力学または遺伝的障害からの肥大心筋障害の治療用の魅力的な治療標的とする。本発明の逆アゴニストおよびアンタゴニストは、肥大心筋障害および鬱血性心不全、特に、心筋梗塞後再形成に由来する肥大心筋障害、心臓弁疾患、維持された心臓後負荷、心筋炎、および家族性肥大心筋障害を含めた心臓病の予防または治療用の治療剤として有用である。
【００１９】
第１の局面では、本発明は、候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの調節因子であるか否かを同定する方法を特徴とする。ここで上記レセプターは、Ｇタンパク質に結合し、上記レセプターは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸配列にコードされたアミノ酸配列であって、その核酸配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトｃＤＮＡサンプルについて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得られる、アミノ酸配列。
【００２０】
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１，０００
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列の生物学的活性フラグメント；または配列番号２もしくは配列番号４の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的活性フラグメント。
上記の方法は、以下の工程：
（ｉ）上記候補化合物を上記レセプターに接触させる工程；
（ｉｉ）上記レセプター機能が、調節されているか否かを決定する工程；
を包含し、ここでレセプター機能の変化は、上記候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの調節因子であることを示す。
【００２１】
いくつかの実施形態では、配列番号２または配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの上記生物学的活性フラグメントは、式「ｎ１〜ｎ２」〜「ｃ」により提供される群から選択され、それらの式は、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの「ｎ１〜ｎ２」の間のアミノ酸から選択されるＮ末端アミノ酸と、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」で固定されたＣ末端アミノ酸とを有する、一組のフラグメントを表す。いくつかの実施形態では、「ｎ１」は、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」は、ＧＰＳドメイン内のほぼ推定タンパク質分解切断部位に対してＣ末端側のアミノ酸であり、そして「ｃ」は、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態では、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２、ｎ２＝９９４およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態では、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの上記生物学的活性フラグメントは、配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６および９９１〜１，３４６から選択され、ここでアミノ酸２２は、ほぼ推定シグナルペプチドタンパク質分解切断部位であることが分かっており、アミノ酸２２７は、ＳＥＡモジュール内のほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっており、そしてアミノ酸９９１は、ＧＰＳドメイン内のほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっている。いくつかの実施形態では、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの上記生物学的活性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９および９９４〜１，３４９から選択され、ここでアミノ酸２５は、ほぼ推定シグナルペプチドのタンパク質分解切断部位であることが分かっており、アミノ酸２２４は、ＳＥＡモジュール内でのほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっており、そしてアミノ酸９９４は、ＧＰＳドメイン内でのほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっている。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２２、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態では、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２５、ｎ２＝９９４およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態では、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４およびｃ＝１，３４９である。
【００２２】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された改変体を作製する方法は、当業者の範囲内である（例えば、ＷＯ９８／４６９９５として１９９８年１０月２２日に公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９号を参照のこと；それらの開示は、全体として本明細書に参考として援用されている）。
【００２３】
配列番号２、配列番号４または配列番号６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内であると考えられている。制限のためではなく、説明の目的であるが、配列番号２のアミノ酸６０４位にあるメチオニンのスレオニンによる置換を含むか、配列番号２のアミノ酸８０１位にあるバリンのイソロイシンによる置換を含むか、または配列番号２のアミノ酸８５６位にあるスレオニンのメチオニンによる置換を含む、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によりコードされるアミノ酸配列であり、その核酸配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトｃＤＮＡサンプルについて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得られる。
【００２４】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物のオルトログは、本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態では、上記哺乳動物のオルトログは、マウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【００２５】
（ａ）から（ｊ）のいずれかと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％。少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％，少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む、上記ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。同一性％は、公知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に決定され得る。そのようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＩＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ［ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４〜８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３〜１０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３〜８０；Ｈｉｇｇｉｎｓら、（１９９６）Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：３８３〜４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９〜３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６〜２７２；上記開示は、全体として本明細書に参考として援用されている］が、挙げられるが、決してこれらに限定されない。
【００２６】
いくつかの実施形態では、タンパク質配列の相同性は、上記分野では、周知［例えば、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：２２６４〜８；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，１９９３，１９９７（すべて上述と同じ）を参照のこと］のＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を使用して評価される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、２つのアミノ酸配列の間の同一性％を決定する方法は、問合せ配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）と取り出された配列との間の全体として最良な一致を決定する方法であって、Ｂｒｕｔｌａｇら［Ｃｏｍｐ  Ａｐｐ  Ｂｉｏｓｃｉ（１９９０）６：２３７〜２４５；この開示は、全体として本明細書に参考として援用されている］のアルゴリズムに基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いたグローバル配列アラインメントともいう。配列アラインメントにおいて、問合せ配列と取り出された配列は、両方ともアミノ酸配列である。そのグローバル配列アラインメントの結果が、同一性％である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメータは：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＰＡＭ  ０、ｋ−タプル（ｋ−ｔｕｐｌｅ）＝２、ミスマッチペナルティ（Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、ジョイニングペナルティ（Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ランダマイゼーショングループ（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ）＝２５、長さ（Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ）＝１、ウィンドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ）＝配列長、ギャップペナルティ（Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ギャップサイズペナルティ（Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５、ウィンドウサイズ＝２４７または取り出されたアミノ酸配列の長さのいずれか短い方。
【００２８】
内部欠失ではなくＮ末端またはＣ末端の欠失に起因して、上記取り出された配列が、問合せ配列より短い場合は、同一性％における結果は、手作業で補正されなければならない。なぜなら、上記ＦＡＳＴＤＢプログラムは、グローバル同一性％を計算する場合、上記取り出された配列のＮ末端およびＣ末端の切断を計数しないからである。上記問合せ配列に対してＮ末端およびＣ末端で切断されている上記取り出された配列について、同一性％は、取り出された配列のＮ末端およびＣ末端と同じである上記問合せ配列の残基数（それは対応する取り出された配列の残基と一致／整列したものではない）を上記問合せ配列の全塩基の％として計算することによって補正される。残基が一致／整列しているか否かについては、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果により決定される。その後、この％が同一性％から引かれ、上記特定のパラメータを使用した上記ＦＡＳＴＤＢプログラムにより計算され、最終的な同一性％スコアに到達する。この最終同一性％スコアは、本発明の目的のために使用されるものである。上記取り出された配列のＮ末端側およびＣ末端側の残基のみが、それらは上記問合せ配列と一致／整列していないが、上記同一性％スコアを手作業で調整する目的のために考慮される。即ち、問合せアミノ酸残基のみが、上記取り出された配列の最もＮ末端側の残基および最もＣ末端側の残基の外側にある。
【００２９】
例えば、９０アミノ酸残基の取り出された配列は、同一性％を決定するために１００残基の問合せ配列と整列される。上記取り出された配列のＮ末端において、欠失が起こり、従って、上記ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、Ｎ末端における第１の残基と一致／整列しない。１０個の不対残基は、上記配列の１０％（（一致しないＮ末端およびＣ末端の残基数）／（問合せ配列の全残基数））を示し、従って、ＦＡＳＴＣＢプログラムで計算された同一性％スコアから１０％を差引く。残りの９０残基が完全一致すると、最終同一性％は、９０％である。
【００３０】
別の例では、９０残基の取り出された配列が、１００残基の問合せ配列と比較される。今回は、上記欠失が内部であり、従って、上記問合せ配列と一致／整列しない、取り出された配列のＮ末端またはＣ末端の残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢにより計算された同一性％は、手作業補正されない。前と同じように、対象配列のＮ末端およびＣ末端の外側の残基位置のみが、ＦＡＳＴＤＢアラインメントにおいて示されたように、問合せ配列と一致／整列されず、それらが手作業で補正される。他の補正は、本発明の目的のためにはなされない。
【００３１】
いくつかの実施形態では、上記ＲＵＰ４０は、組換え体である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、上記ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは、異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記異種アミノ酸配列は、エピトープタグである。いくつかの実施形態では、上記エピトープタグは、赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態では、上記エピトープタグは、ｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態では、上記エピトープタグは、Ｖ５エピトープタグである。上記ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグまたはＶ５タグを提供する手順は、当業者には周知である（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を、さらに包含する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、ＳＥＡモジュール内のタンパク分解切断を、さらに包含する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、ＧＰＳドメイン内のタンパク質分解切断を、さらに包含する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、上記接触させる工程が、ＧＰＣＲの既知のリガンドの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、上記既知のリガンドは、ＧＰＣＲのアゴニストである。
【００３６】
本発明はまた、候補化合物が心血管障害の調節因子であるか否かを同定する方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）候補化合物とＲＵＰ４０  ＧＰＣＲとを接触させる工程（上記レセプターがＧタンパク質に結合し、上記レセプターは、以下の群：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸にコードされたアミノ酸配列であって、その核酸配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトｃＤＮＡサンプルについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得られる、アミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉｘ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１，０００；
（ｘ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列の生物学的活性フラグメント；または配列番号２もしくは配列番号４の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的活性フラグメント；
から選択されるアミノ酸配列を含む）。
【００３７】
（ｂ）上記レセプター機能が調節されているか否かについて決定する工程；
を包含し、ここでレセプター機能の変化は、上記候補化合物が、心血管障害の調節因子であることを示す。
【００３８】
いくつかの実施形態では、配列番号２または配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの上記生物学的活性フラグメントは、式「ｎ１〜ｎ２」〜「ｃ」により提供される群から選択され、それらの式は、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの「ｎ１〜ｎ２」の間のアミノ酸から選択されるＮ末端アミノ酸と、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」で固定されたＣ末端アミノ酸とを有する、一組のフラグメントを表す。いくつかの実施形態では、「ｎ１」は、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」は、ＧＰＳドメイン内のほぼ推定タンパク質分解切断部位に対してＣ末端側のアミノ酸であり、そして「ｃ」は、完全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態では、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２、ｎ２＝９９４およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態では、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの上記生物学的活性フラグメントは、配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６および９９１〜１，３４６から選択され、ここでアミノ酸２２は、ほぼ推定シグナルペプチドのタンパク質分解切断部位であることが分かっており、アミノ酸２２７は、ＳＥＡモジュール内でのほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっており、そしてアミノ酸９９１は、ＧＰＳドメイン内のほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっている。いくつかの実施形態では、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの上記生物学的活性フラグメントは、配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９および９９４〜１，３４９から選択され、ここでアミノ酸２５は、ほぼ推定シグナルペプチドタンパク質分解切断部位であることが分かっており、アミノ酸２２４は、ＳＥＡモジュール内のほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっており、そしてアミノ酸９９４は、ＧＰＳドメイン内のほぼ推定タンパク質分解切断部位であることが分かっている。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２２、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態では、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２５、ｎ２＝９９４およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態では、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲに関しては、ｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４およびｃ＝１，３４９である。
【００３９】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体を作製する方法は、当業者の範囲内である（例えば、ＷＯ９８／４６９９５として１９９８年１０月２２日に公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９号を参照のこと；それらの開示は、全体として本明細書に参考として援用されている）。
【００４０】
配列番号２、配列番号４または配列番号６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内にあると考えられている。制限のためではなく、説明の目的であるが、配列番号２のアミノ酸６０４位にあるメチオニンのスレオニンによる置換を含むか、配列番号２のアミノ酸８０１位にあるバリンのイソロイシンによる置換を含むか、または配列番号２のアミノ酸８５６位にあるスレオニンのメチオニンによる置換を含む、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態では、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によりコードされるアミノ酸配列であり、その核酸配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと、配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトｃＤＮＡサンプルについて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得られる。
【００４１】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物のオルトログは、本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態では、上記哺乳動物のオルトログは、マウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【００４２】
（ｉ）から（ｘ）のいずれかと、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％。少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％，少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む、上記ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、上記ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは、組換え体である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、上記ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは、異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、上記異種アミノ酸配列は、エピトープタグである。いくつかの実施形態では、上記エピトープタグは、赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態では、上記エピトープタグは、ｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態では、上記エピトープタグは、Ｖ５エピトープタグである。上記ＨＡタグ、ｃ−ｍｙｃタグまたはＶ５タグを提供する手順は、当業者には周知である（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を、さらに包含する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、ＳＥＡモジュール内のタンパク分解切断を、さらに包含する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、上記レセプターは、ＧＰＳドメイン内のタンパク質分解切断を、さらに包含する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、上記接触させる工程が、ＧＰＣＲの既知のリガンドの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、上記既知のリガンドは、ＧＰＣＲのアゴニストである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、上記心血管障害が、心疾患である。心疾患としては、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂（ｐｏｓｔ−ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｈｅａｒｔ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、心室中隔破裂（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｅｐｔａｌ  ｒｕｐｔｕｒｅ）、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤（ｈｅａｒｔ  ａｎｅｕｒｙｓｍ）、右心疾患（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ）、リウマチ性心疾患、心室機能不全が挙げられるが、決してこれらに限定されない。心疾患としてはまた、決してこれらに限定されないが、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、大動脈弁逸脱症（ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｐｒｏｌａｐｓｅ）、僧帽弁逸脱症、三尖弁逸脱症（ｔｒｉｃｕｓｐｉｄ  ｖａｌｖｅ  ｐｒｏｌａｐｓｅ）、僧帽弁機能不全、僧帽弁狭窄、三尖弁狭窄を含む弁疾患を包含する。心疾患は、決してこれらに限定されないが、肥大型心筋症、うっ血性心筋症、弁下部性大動脈狭搾症、弁下部性肺動脈狭窄（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｂｖａｌｖｕｌａｒ  ｓｔｅｎｏｓｉｓ）、拘束型心筋症、シャガス心筋症を含む心筋疾患を、さらに包含する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、上記心血管障害は、肥大性心筋症である。いくつかの実施形態では、上記肥大性心筋症は、血流力学的障害から発症する。いくつかの実施形態では、上記肥大性心筋症は、遺伝的障害から発症する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、上記肥大性心筋症は、以下：
（ａ）心筋梗塞後のリモデリング；
（ｂ）弁疾患；
（ｃ）持続性心後負荷（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｆｔｅｒｌｏａｄ）
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大性心筋症
からなる群より選択される障害から発症する、肥大性心筋症である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、上記心血管障害は、先天性心欠損症（ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｈｅａｒｔ  ｄｅｆｅｃｔ）である。先天性心欠損症としては、大動脈縮窄症、大動脈肺動脈中隔欠損症、ファロー三徴症、心室性心臓中隔欠損症（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｈｅａｒｔ  ｓｅｐｔａｌ  ｄｅｆｅｃｔ）および家族性肥大心筋症が挙げられるが、決して限定されるものではない。
【００５２】
特定の実施形態では、レセプター機能の減少は、候補化合物が心筋細胞肥大をブロックするかまたは減少させる化合物であることを示している。
【００５３】
特定の実施形態では、レセプター機能の減少は、候補化合物が哺乳動物の肥大性心筋症をブロックするかまたは減少させる化合物であることを示している。
【００５４】
特定に実施形態では、レセプター機能の減少は、候補化合物が哺乳動物の肥大性心筋症の予防または処置のために有用であることを示している。
【００５５】
本発明はまた、候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの調節因子であるか否かを同定する方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現が可能な条件下で、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ発現宿主細胞を培養する工程（上記宿主細胞は、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸にコードされたアミノ酸配列であって、その核酸配列は、配列番号７に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーと配列番号８に示されるヌクレオチド配列を含む特異的プライマーとを使用して、ヒトｃＤＮＡサンプルについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことにより得られる、アミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉｘ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１，０００；
（ｘ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
または配列番号２もしくは配列番号４のアミノ酸配列の生物学的活性フラグメント；または配列番号２もしくは配列番号４の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的活性フラグメント；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、上記組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされる）；
（ｂ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ発現宿主細胞と候補化合物とを接触させる工程；
（ｃ）コントロール宿主細胞と工程（ｂ）の候補化合物とを接触させる工程であって、上記コントロール宿主細胞は、組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲタンパク質を発現しない、工程；
（ｄ）工程（ａ）の宿主細胞および工程（ｃ）のコントロール宿主細胞からの上記組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲと相互作用する上記候補化合物の調節作用を測定する工程；ならびに
（ｅ）上記宿主細胞に対する候補化合物の調節効果をコントロール宿主細胞に対する候補化合物の調節効果と比較する工程
を包含する、方法。
【００５６】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されたＮ末端アミノ酸および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９４であって、ｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号２の２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解の近似的部位であると予測される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡドメイン内の予測されたタンパク質切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【００５７】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体を作製する方法は当業者の範囲内のものである（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９号参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【００５８】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの変異体改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定されるものではないが例示として、配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンの代わりにスレオニンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりにイソロイシンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりにメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの変異体改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であり、該核酸配列は、配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【００５９】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【００６０】
（ｉ）〜（ｘ）のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチミン（ＨＡエピトープタグ）である。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。
【００６２】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＳＥＡモジュール内のタンパク質分解切断を含む。  
【００６４】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＧＰＳドメイン内のタンパク質分解切断を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、該トランスフェクションは一過性である。他のいくつかの実施形態において、該トランスフェクションは安定である。
【００６６】
いくつかの実施形態において、該発現ベクターはｐＣＭＶである。いくつかの他の実施形態において、該発現ベクターはアデノウイルスである。例示的アデノウイルスベクターはＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＡｄＥａｓｙＴＭとして購入することができる。［Ｈｅ，  ＴＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：２５０９−１４；および米国特許第５，９２２，５７６号；その開示をここで引用してその全体を援用する］。他の適当なベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【００６７】
いくつかの実施形態において、該宿主細胞は哺乳動物であって、２９３、２９３Ｔ、ＣＨＯおよびＣＯＳ−７からなる群より選択される。他のいくつかの実施形態において、該宿主細胞はメラノフォアである。他のいくつかの実施形態において、該宿主細胞は心筋細胞である。他の適当な宿主細胞は当業者に容易に明らかであろう。
【００６８】
また、本発明は：
（ａ）組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を可能とするであろう条件下でＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉｘ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｘ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードするヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており；
（ｂ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞の第一の集団を該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの公知のリガンドと接触させ；
（ｃ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞の第二の集団を候補化合物と、およびヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲリガンドと接触させ；
（ｄ）工程（ｃ）の候補化合物とコントロール宿主細胞を接触させ、ここで、該コントロール宿主細胞は組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲタンパク質を発現せず；
（ｅ）工程（ｂ）、工程（ｃ）および工程（ｄ）の細胞からの、既知のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲリガンドの存在下または不存在下で、組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲと相互作用する候補化合物の調節効果を測定し；次いで
（ｆ）工程（ｂ）、工程（ｃ）および工程（ｄ）から決定された候補化合物の調節効果を比較する；
工程を含む、候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのモジュレーターであるか否かを決定する方法に関する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【００７０】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体を作製する方法は当業者の範囲内にある（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９号参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【００７１】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定するものではなく例示として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりにスレオニンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１のバリンの代わりにイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりにメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内であると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードするアミノ酸によってコードされたアミノ酸配列であり、該核酸配列は、配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【００７２】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内と考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【００７３】
（ｉ）〜（ｘ）のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミン酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【００７４】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチミン（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。
【００７５】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＳＥＡモジュール内のタンパク質分解切断を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＧＰＳドメイン内のタンパク質分解切断を含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、該リガンドは該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアゴニストである。
【００７９】
いくつかの実施形態において、該トランスフェクションは一過性である。他のいくつかの実施形態において、該トランスフェクションは安定である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、該発現ベクターはｐＣＭＶである。いくつかの他の実施形態において、該発現ベクターはアデノウイルスである。他の適当なベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【００８１】
いくつかの実施形態において、該宿主細胞は哺乳動物であって、２９３、２９３Ｔ、ＣＨＯおよびＣＯＳ−７からなる群より選択される。他のいくつかの実施形態において、該宿主細胞はメラノフォアである。他のいくつかの実施形態において、該宿主細胞は心筋細胞である。他の適当な宿主細胞は当業者に容易に明らかであろう。
【００８２】
また、本発明は：
（ａ）組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を可能とするであろう条件下でＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉｘ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｘ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており；
（ｂ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現宿主細胞の第一の集団を候補化合物と接触させ；
（ｃ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞の第二の集団を工程（ｂ）の候補化合物と接触させず；
（ｄ）工程（ｂ）の候補化合物にコントロール宿主細胞を接触させ、ここで、該コントロール宿主細胞は組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲタンパク質を発現せず；
（ｅ）工程（ｂ）および工程（ｃ）の細胞からの、および工程（ｄ）の細胞からの、組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲタンパク質と相互作用する、候補化合物の調節効果を測定し；次いで、
（ｆ）工程（ｂ）および工程（ｃ）から、および工程（ｄ）から決定された候補化合物の調節効果を比較する；
工程を含む、候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのモジュレーターであるかないかを決定する方法に関する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＣドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【００８４】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体を作製する方法は当業者の範囲内である（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【００８５】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの変異体改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定されるものではなく、例示として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりのスレオニンの置換、配列番号２のアミノ酸位置８０１のバリンの代わりのイソロイシンの置換、または配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりのメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの変異体改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であり、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを用い、ヒトｃＤＮＡサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【００８６】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【００８７】
（ｉ）〜（ｘ）のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内であると考えられる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチミン（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＳＥＡモジュール内のタンパク質分解切断を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＧＰＳドメイン内にタンパク質分解切断を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、該トランスフェクションは一過性である。他のいくつかの実施形態において、該トランスフェクションは安定である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、該発現ベクターはｐＣＭＶである。いくつかの他の実施形態において、該発現ベクターはアデノウイルスである。他の適当なベクターは当業者に容易に明らかであろう。
【００９４】
いくつかの実施形態において、該宿主細胞は２９３、２９３Ｔ、ＣＨＯおよびＣＯＳ−７からなる群より選択される。他のいくつかの実施形態において、該宿主細胞はメラノフォアである。他のいくつかの実施形態において、該宿主細胞は心筋細胞である。他の適当な宿主細胞は当業者に容易に明らかであろう。
【００９５】
いくつかの実施形態において、該Ｇタンパク質はＧｑである。
【００９６】
いくつかの実施形態において、該Ｇタンパク質は細胞内ＩＰ３のレベルを上昇させる。
【００９７】
いくつかの実施形態において、該Ｇタンパク質は細胞内Ｃａ２＋のレベルを上昇させる。
【００９８】
他のいくつかの実施形態において、該決定はメラノフォアアッセイの使用を介する。
【００９９】
他のいくつかの実施形態において、該決定は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ２＋からなる群より選択される二次メッセンジャーのレベルの測定を介するものである。いくつかの好ましい実施形態において、該二次メッセンジャーはＩＰ３である。いくつかの好ましい実施形態において、ＩＰ３のレベルは低下する。いくつかの好ましい実施形態において、心筋細胞ＩＰ３のレベルは低下する。いくつかの実施形態において、該二次メッセンジャーはＭＥＫＫ１活性である。いくつかの実施形態において、ＭＥＫＫ１活性のレベルは低下する。いくつかの実施形態において、心筋細胞ＭＥＫＫ１活性のレベルは低下する。いくつかの好ましい実施形態において、該二次メッセンジャーはＣａ２＋である。いくつかの好ましい実施形態において、細胞内Ｃａ２＋のレベルは低下する。いくつかの好ましい実施形態において、心筋細胞Ｃａ２＋のレベルは低下する。いくつかの実施形態において、該Ｃａ２＋測定はＦＬＩＰＲによって行われる。
【０１００】
いくつかの実施形態において、該決定は該ＧＰＣＲを含む膜で行われる。いくつかの実施形態において、該膜はＢｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭでの細胞のホモゲナイゼーションによって作製される。いくつかの実施形態において、該膜調製は該ポリトロンの各々の１０〜２０秒持続の３バーストでのホモゲナイゼーションによってなされる。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、該決定は細胞内ＩＰ３レベルの低下によって媒介される活性の測定を介する。いくつかの実施形態において、該活性は心筋細胞肥大の阻害である。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、該決定はＡＰ１−レポーターアッセイを介する。他のいくつかの実施形態において、該決定はＳＲＦレポーターアッセイを介する。いくつかの実施形態において、該レポーターはルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、該レポーターはβ−ガラクトシダーゼである。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、該組換え宿主細胞は、さらに、乱交雑Ｇ１５またはＧ１６アルファサブユニットを含み、該決定は細胞内Ｃａ２＋の測定を介する。いくつかの実施形態において、該Ｃａ２＋測定はＦＬＩＰＲによって行われる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、該組換え宿主細胞は、さらに、乱交雑Ｇ１５またはＧ１６サブユニットを含み、該決定は細胞内ＩＰ３の測定を介する。
【０１０５】
いくつかの好ましい実施形態において、該測定は、該ＧＰＣＲを含む膜へのＧＴＰγＳ結合の測定を介する。いくつかの好ましい実施形態において、該ＧＴＰγＳは［３５Ｓ］で標識される。いくつかの好ましい実施形態において、該ＧＰＣＲを含む膜への該ＧＴＰγＳの結合は低下する。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、候補化合物によって引き起こされたレセプターの調節を、レセプターの既知のモジュレーターとレセプターとを接触させることによって引き起こされたレセプターの第二の調節を比較する工程を含む。いくつかの実施形態において、該公知のモジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、候補化合物はポリペプチドではない。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、候補化合物は抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、候補化合物は低分子である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、候補化合物は低分子であり、但し、低分子はポリペプチドではない。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、候補化合物は低分子であり、但し、該低分子は抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、候補化合物はポリペプチドであり、但し、ポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、候補化合物は脂質である。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、候補化合物は抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、該方法は、さらに、該同定されたモジュレーターの合成を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、該方法はさらに：所望により、化合物の構造を決定し；次いで、化合物またはモジュレーター、あるいは化合物の名称または構造を供することを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、該方法はさらに：所望により、化合物の構造を決定し；所望により、化合物の名称または構造を供し；次いで、化合物を生産しまたは合成することを含む。
【０１１８】
第二の局面において、本発明は第一の局面の方法に従って同定された、または２３番目の局面に従ってスクリーニングされたＧＰＣＲのモジュレーターをその要旨とする。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは配列番号２のアミノ酸配列を有するＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの逆アゴニストまたはアンタゴニストであり、ＩＣ５０は１００μＭ未満、１０μＭ未満、または１μＭ未満である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、一過的にまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜で行われたＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、一過的にトランスフェクトされたメラノフォアで行われた色素分散アッセイにおいて、または配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲポリペプチドを発現するアデノウイルス感染心筋細胞におけるＩＰ３アッセイによって、１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１００μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにお��て６μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストはアンタゴニストである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはＧＰＣＲに対して選択的である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心臓病のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該心臓病は鬱血性心不全である。いくつかの実施形態において、該心臓病は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的に利用可能である。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはポリペプチドではない。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは低分子である。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは低分子であり、但し、該低分子はポリペプチドではない。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは低分子であり、但し、該低分子は抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはポリペプチドであり、但し、該ポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは脂質である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０１３２】
第三の局面において、本発明はＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの活性を調節する方法をその要旨とし、ここで、該レセプターはＧタンパク質にカップリングし、該レセプターは：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み；該方法はレセプターを第二の局面のモジュレーターと接触させる工程を含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【０１３４】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体を作製する方法は当業者の範囲内である（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【０１３５】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定されるものではなくその例として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりのスレオニンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１のバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりのメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であり、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【０１３６】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【０１３７】
（ａ）〜（ｊ）のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該異種アミノ酸はエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチミン（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＳＥＡモジュール内のタンパク質分解切断を含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＧＰＳドメイン内のタンパク質分解切断を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、該Ｇタンパク質はＧｑである。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、該Ｇタンパク質は細胞内ＩＰ３レベルを上昇させる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアンタゴニストである。  
【０１４５】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心臓病のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該心臓病は鬱血性心不全である。いくつかの実施形態において、該心臓病は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはＧＰＣＲにつき選択的である。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ配列番号２のアミノ酸配列を有する逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、一過的にまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜で行ったＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、一過的にトランスフェクトされたメラノフォアで行った色素分散アッセイにおいて、または配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲポリペプチドを発現するアデノウイルス感染心筋細胞におけるＩＰ３アッセイによって、１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１００μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて９０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて８０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて７０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて６０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて５０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて４０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて２０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて９μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて８μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて７μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて６μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて５μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて４μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて３μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーター��該アッセイにおいて２μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該モジュレーターは該アッセイにおいて１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭナイシ１００μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストはアンタゴニストである。
【０１４８】
他のいくつかの実施形態において、該接触は該モジュレーターのレセプターを含む膜への投与を含む。
【０１４９】
他のいくつかの実施形態において、該接触は該モジュレーターのレセプターを含む細胞への投与を含む。
【０１５０】
他のいくつかの実施形態において、該接触は該モジュレーターのレセプターを含む組織への投与を含む。
【０１５１】
他のいくつかの実施形態において、該接触はモジュレーターのレセプターを含む個体への投与を含む。なおいくつかの実施形態において、該個体は哺乳動物である。他のなおいくつかの実施形態において、該哺乳動物はウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである。なおより好ましいのはマウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである。最も好ましいのはヒトである。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的に利用可能である。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、は少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であることを示すことができる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、該投与は経口である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、該個体は心血管障害に対する予防または治療を必要とするものである。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋傷害、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺心臓病、リウマチ性心臓病、および心室性機能不全を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、大動脈弁脱出症、僧帽弁脱出症、三尖弁脱出症、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大性心筋障害、鬱血性心筋障害、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、制限性心筋障害、シャガス心筋障害を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は血流力学障害に由来する。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は遺伝的障害に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、該個体は：  
（ａ）心梗塞後再形成；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）維持された心臓後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する肥大性心筋障害に対する予防または治療を必要とするものである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は先天性心臓機能障害である。先天性心臓機能障害は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺中隔機能障害、ファロー３徴症、心室性心臓中隔機能障害、および家族性肥大性心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、該個体は拡大された心臓を呈する障害に対する予防または治療が必要なものである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１６０】
第４の局面において、本発明は治療上有効量の第２の局面のモジュレーターをＲＵＰ４０  ＧＰＣＲと接触させることを含む、心血管障害の予防または治療が必要な個体において該予防または治療の方法をその要旨とし、該レセプターは：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化されて変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および全長ＲＵ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、「ｎ１」は全長ＲＵ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＳドメイン内の予測されるタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であり、「ｃ」は全長ＲＵ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９であるいくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【０１６２】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体を作製する方法は当業者の範囲内のものである（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９号参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【０１６３】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定されるものではなく例として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりのスレオニンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８０１のバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりのメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であり、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【０１６４】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【０１６５】
（ａ）〜（ｊ）のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはＧＰＣＲに対して選択的である。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的に利用可能である。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心臓病のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該心臓病は鬱血性心不全である。いくつかの実施形態において、該心臓病は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ配列番号２のアミノ酸配列を有するＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、該モジュレーターは一過的にまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜で行ったＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、一過的にトランスフェクトされたメラノフォアでおこなった色素分散アッセイにおいて、または配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲポリペプチドを発現するアデノウイルス感染心筋細胞におけるＩＰ３アッセイによって、１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１００μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アンタゴニストである。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、該接触は該モジュレーターの該個体への経口投与を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、該個体は心血管障害に対する予防または治療の必要があるものである。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋傷害、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺心臓病、リウマチ性心臓病、および心室性機能不全を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、大動脈弁脱出症、僧帽弁脱出症、三尖弁脱出症、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大性心筋障害、鬱血性心筋障害、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、制限性心筋障害、シャガス心筋障害を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は血流力学障害に由来する。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は遺伝的疾患に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆
いくつかの実施形態において、該個体は：
（ａ）心筋梗塞後再形成；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）維持された心臓後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する肥大性心筋障害に対する予防または治療を必要とするものである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は先天性心臓機能障害である。先天性心臓機能障害は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺中隔機能障害、ファロー３徴症、心室性心臓中隔機能障害、および家族性肥大性心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、該個体は拡大された心臓を呈する障害に対する予防または治療が必要なものである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、該個体は哺乳動物である。なおいくつかの実施形態において、該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである。なおより好ましいのは、マウス、ラット、非ヒト霊長類またはヒトである。最も好ましいのはヒトである。
【０１７８】
第５の局面において、本発明はＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのモジュレーターを同定し、次いで、キャリアおよび該モジュレーターを混合することを含む組成物の調製方法をその要旨とし、ここで、該モジュレーターは第１の局面の方法によって同定可能である。
【０１７９】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ配列番号２のアミノ酸配列を有するＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、該モジュレーターは一過的にまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜で行ったＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、一過的にトランスフェクトされたメラノフォアでおこなった色素分散アッセイにおいて、または配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲポリペプチドを発現するアデノウイルス感染心筋細胞におけるＩＰ３アッセイによって、１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１００μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アンタゴニストである。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはＧＰＣＲに対して選択的である。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心臓病のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該心臓病は鬱血性心不全である。いくつかの実施形態において、該心臓病は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的に利用可能である。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、は少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であることを示すことができる。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、第１の局面の方法によって同定可能な該モジュレーターは第１の局面の方法によって同定される。
【０１８５】
第６の局面において、本発明は、第２の局面のモジュレーターを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる医薬または生理学的に受容可能な組成物をその要旨とする。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、医薬または生理学的に受容可能な組成物は薬学的組成物である。いくつかの実施形態において、医薬または生理学的に受容可能な組成物は生理学的に受容可能な組成物である。いくつかの実施形態において、医薬または生理学的に受容可能な組成物は第２の局面によるモジュレーターを含む。いくつかの実施形態において、該医薬または生理学的に受容可能な組成物は第２の局面によるモジュレーターより実質的になる。いくつかの実施形態において、医薬または生理学的に受容可能な組成物は第２の局面によるモジュレーターよりなる。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアンタゴニストである。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはＧＰＣＲに対して選択的である。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、は少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であることを示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であることを示すことができる。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心臓病のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該心臓病は鬱血性心不全である。いくつかの実施形態において、該心臓病は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ配列番号２のアミノ酸配列を有するＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。ある実施形態において、該モジュレーターは一過的にまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜で行ったＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、一過的にトランスフェクトされたメラノフォアでおこなった色素分散アッセイにおいて、または配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲポリペプチドを発現するアデノウイルス感染心筋細胞におけるＩＰ３アッセイによって、１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１００μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アンタゴニストである。
【０１９１】
第７の局面において、本発明は、第６の局面の該医薬または生理学的に受容可能な組成物を心血管障害の予防または治療を必要とする個体に供するまたは投与することを含む該防または治療の方法をその要旨とする。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋傷害、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺心臓病、リウマチ性心臓病、および心室性機能不全を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、大動脈弁脱出症、僧帽弁脱出症、三尖弁脱出症、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大性心筋障害、鬱血性心筋障害、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、制限性心筋障害、シャガス心筋障害を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は血流力学障害に由来する。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は遺伝的障害に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１９４】
また、本発明は、第６の局面の該医薬または生理学的に受容可能な組成物を肥大性心筋障害の予防または治療を必要とする個体に供するまたは投与することを含む該予防または治療の方法に関し、該肥大性心筋障害は：
（ａ）心筋梗塞後再形成；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）維持された心臓後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は先天性心臓機能障害であり、第６の局面の該医薬または生理学的に受容可能な組成物を該予防または治療を必要とする個体に供するまたは投与することを含む。先天性心臓機能障害は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺中隔機能障害、ファロー３徴症、心室性心臓中隔機能障害、および家族性肥大性心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０１９６】
また、本発明は、第６の局面の該医薬または生理学的に受容可能な組成物を障害の予防または治療を必要とする個体に供するまたは投与することを含む該予防または治療の方法に関し、ここで、該障害は拡大された心臓と共に呈される。いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアゴニストまたは逆アゴニストである。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、治療上有効量の該医薬または生理学的に受容可能な組成物が該個体に供され、または投与される。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、該医薬または生理学的に受容可能な組成物の該供与または投与は経口である。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、該個体は哺乳動物である。なお、いくつかの実施形態において、該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。なおより好ましいのはマウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。より好ましいのはヒトである。
【０２００】
第８の局面において、本発明は、心血管障害の予防または治療用の医薬の調製のための第２の局面のモジュレーターを使用する方法をその要旨とする。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはＧＰＣＲに対して選択的である。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的に利用可能である。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心臓病のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該心臓病は鬱血性心疾患である。いくつかの実施形態において、該心臓病は肥大性心筋障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは配列番号２のアミノ酸配列を有するＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの逆アゴニストまたはアンタゴニストであり、ＩＣ５０は１００μＭ未満、１０μＭ未満、または１μＭ未満である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、一価的にまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜で行われたＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、一価的にトランスフェクトされたメラノフォアで行われたブタ分散アッセイにおいて、または配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲポリペプチドを発現するアデノウイルス感染心筋細胞におけるＩＰ３アッセイによって、１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１００μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにお��て６μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストはアンタゴニストである。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、該治療は該医薬の該個体への経口投与を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋傷害、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺心臓病、リウマチ性心臓病、および心室性機能不全を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、大動脈弁脱出症、僧帽弁脱出症、三尖弁脱出症、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大性心筋障害、鬱血性心筋障害、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、制限性心筋障害、シャガス心筋障害を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは、逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は肥大性心筋障害であり、第６の局面の該医薬または生理学的に受容可能な組成物を該予防または治療を必要とする個体に供するまたは投与することを含む。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は血流力学障害に由来する。いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は遺伝的障害に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２０８】
いくつかの実施形態において、該肥大性心筋障害は：
（ａ）心筋梗塞後再形成；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）維持された心臓後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大性心筋障害
からなる群より選択される障害に由来する。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は先天性心臓機能障害である。先天性心臓機能障害は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺中隔機能障害、ファロー３徴症、心室性心臓中隔機能障害、および家族性肥大性心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、該個体は拡大された心臓と共に呈される障害の予防または治療を必要とするものである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアゴニストである。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、該個体は哺乳動物である。なおいくつかの実施形態において、該哺乳動物は、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、ウサギ、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。なおより好ましいのは、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはヒトである。最も好ましいのは、ヒトである。
【０２１２】
第９の局面において、本発明は、候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドであるか否かを同定する方法をその要旨とし、該レセプターは：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体；またはその該生物学的に活性なフラグメントを含み；該方法は
（ａ）候補化合物の存在下、または不存在下でレセプターをＧＰＣＲの標識された既知のリガンドと接触させ；次いで、
（ｂ）該標識された既知のリガンドの結合が候補化合物の存在下で阻害されるか否かを決定する；
工程を含み、ここで、該阻害はＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドである候補化合物を示す。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは組換えのものである。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは１以上のエピトープタグを含む。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。
【０２１５】
また、本発明は；
（ａ）組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を可能とするであろう条件下でＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉｘ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｘ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており；
（ｂ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞の第１の集団を該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドに暴露し；
（ｃ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞の第２の集団を該化合物および工程（ｂ）の該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドに暴露し；
（ｄ）工程（ｂ）および工程（ｃ）の該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞の標識された既知のリガンドの結合を測定し；次いで、
（ｅ）該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲへの標識された既知のリガンドの結合を、工程（ｂ）および工程（ｃ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞と比較する；
工程を含み、ここで、該化合物の存在下における該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドの結合の阻害はＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドである該化合物を示すことを特徴とする候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドであるか否かを決定する方法に関する。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。
【０２１７】
また、本発明は：
（ａ）組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を可能とするであろう条件下でＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現宿主細胞を培養し、該宿主細胞は；
（ｉ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｉｖ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｖｉ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｖｉｉ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｖｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉｘ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｘ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号２または４のアミノ酸配列のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む該組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトされており；
（ｂ）工程（ａ）のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ−発現細胞からの膜を調製し；
（ｃ）工程（ｂ）の膜調製物の第１の集団を工程（ｂ）の該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドに暴露し；
（ｄ）工程（ｂ）の膜調製物の第２の集団を候補化合物および該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドに暴露し；
（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）の膜調製物への該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドの結合を測定し；次いで、
（ｆ）該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドの、工程（ｃ）および工程（ｄ）の膜調製物への結合を比較する；工程を含み、ここで、該化合物の存在下における該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの標識された既知のリガンドの結合の阻害はＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドである該化合物を示すことを特徴とする、候補化合物がＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのリガンドであるか否かを決定する方法に関する。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、該膜調製物はＢｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭでの細胞のホモゲナイゼーションによって作製される。いくつかの実施形態において、該膜調製物はポリトロンの各々の１０〜２０秒持続の３バーストでのホモゲナイゼーションによって作製される。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、該「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ−アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６，２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつき、ｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつき、ｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつき、ｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【０２２０】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体の作製方法は当業者の範囲内にある（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【０２２１】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定されるものではなく、例として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりのスレオニンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１のバニンの代わりのイソロイシンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりのメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であり、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【０２２２】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【０２２３】
（ｉ）〜（ｘ）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２２４】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチミン（ＨＡエピトープタグ）である。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。
【０２２５】
いくつかの実施形態において、該既知のリガンドは第２の局面のモジュレーターである。
【０２２６】
他の実施形態において、該既知のリガンドはＧＰＣＲに対して特異的な抗体、または該抗体の誘導体である。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、該標識は：
（ａ）放射性同位体；  
（ｂ）酵素；および
（ｃ）フルオロフォア
からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、該標識は放射性同位体である。なおいくつかの実施形態において、該標識は３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、および１２５Ｉからなる群より選択される。
【０２２８】
他の実施形態において、該方法は、さらに、候補化合物による標識された第１の既知のリガンドの結合の阻害のレベルを、ＧＰＣＲに結合することが知られている第２のリガンドによる該標識された第１の既知のリガンドの結合の阻害の第２のレベルと比較する工程を含む。
【０２２９】
第１０の局面において、本発明は、ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその要旨とし、該レセプターは：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；および
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；または配列番号２のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、該「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ−アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６，２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＦＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつき、ｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつき、ｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。
【０２３１】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体の作製方法は当業者の範囲内にある（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【０２３２】
配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定されるものではなく、例として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりのスレオニンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１のバニンの代わりのイソロイシンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりのメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は、内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であり、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【０２３３】
（ａ）〜（ｄ）に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２３４】
いくつかの実施形態において、該非ヒト哺乳動物は、マウス、ラットまたはブタである。
【０２３５】
いくつかの実施形態において、ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該発現は心筋細胞−選択的である。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、該ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該心筋細胞−選択的発現はアルファミオシン重鎖プロモーターによって付与される［Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９１）  ２６６：２４６１３−２０；その開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は野生型コントロール哺乳動物に対して鬱血性心不全または肥大性心筋障害に対する素因を呈するか、または鬱血性心不全または肥大性心筋障害を発現する。
【０２３８】
第１１の局面において、本発明は、：
（ａ）第２の局面のモジュレーターをトランスジェニック非ヒト哺乳動物に投与し、または投与せず；
（ｂ）該モジュレーターの投与が；
（ｉ）湿潤または乾燥心臓重量の低下；
（ｉｉ）湿潤または乾燥心臓重量／体重の比率の低下；
（ｉｉｉ）心筋細胞の断面積の低下；および
（ｉｖ）ＡＮＦ遺伝子の誘導のレベルの低下；
からなる群より選択される効果を有するか否かを決定する；
工程を含む、ここで、該決定は、鬱血性心不全または肥大性心筋障害に対する予防または治療で効果を有するモジュレーターを示すことを特徴とする、第２の局面のモジュレーターが鬱血性心不全または肥大性心筋障害に対する予防または治療で効果を有するか否かを同定するための、鬱血性心不全または肥大性心筋障害に対する該素因を呈し、または鬱血性心不全または肥大性心筋障害を発現する第１０の局面のトランスジェニック非ヒト哺乳動物の使用方法をその要旨とする。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、該哺乳動物はマウスである。いくつかの実施形態において、該該哺乳動物はラットである。いくつかの実施形態において、該該哺乳動物はブタである。
【０２４１】
第１２の局面において、本発明は、ＲＵＰ４０遺伝子中に破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその要旨とする。いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＵＰ４０遺伝子中に破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその要旨とし、ここで、内因性ＲＵＰ４０遺伝子の天然の発現はない。いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＵＰ４０遺伝子の心筋細胞−選択的破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその要旨とする。いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＵＰ４０遺伝子の心筋細胞−選択的破壊を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物をその要旨とし、ここで、内因性ＲＵＰ４０遺伝子の天然の心筋細胞の発現はない。内因性ＲＵＰ遺伝子の天然発現を評価する方法は当業者の範囲内にあり、限定されるものではないが、ＲＰ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、および免疫細胞化学を含む。  
【０２４２】
いくつかの実施形態において、該非ヒト哺乳動物はマウス、ラットまたはブタである。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、該心筋細胞−選択的破壊はミオシン軽鎖２（ｍｌｃ−２ｖ）の心室特異的イソ形態についてのプロモーターによって付与される［Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９９）  ２７４：１００６６−７０；その開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、該哺乳動物はマウスであって、該ＲＵＰ４０遺伝子は配列番号６のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の対立遺伝子改変体を含むポリペプチドをコードする。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、該哺乳動物はラットであって、該ＲＵＰ４０遺伝子は配列番号４のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の対立遺伝子改変体を含むポリペプチドをコードする。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０遺伝子中に破壊を含む該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、野生型コントロール哺乳動物に対して横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）につき低下した肥大性心筋障害を発現する。
【０２４７】
第１３の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または該アミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドをその要旨とし、ここで、該生物学的に活性なフラグメントまたは構成的に活性な変異体は配列番号２の位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含み、または配列番号２の位置６０４にメチオニン、および位置８５６にスレオニンを含む。いくつかの実施形態において、該単離されたポリヌクレオチドは配列番号１のポリヌクレオチドを含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。また、本発明は、該単離されたポリヌクレオチドの相補体に関する。いくつかの実施形態において、該単離されたポリヌクレオチドまたはその相補体は精製されたものである。
【０２４８】
上記対立遺伝子改変体が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む配列番号２アミノ酸配列の対立遺伝子改変体をコードするヌクレオチド配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドは本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２４９】
上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であり、かつ上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含み、または配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニン、およびアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列の改変体をコードするヌクレオチド配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドは本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝８５６およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６，２２〜１，３４６、および２２７〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。
【０２５１】
本発明はまた、配列番号１の少なくとも１８ヌクレオチドの連続スパンを含む単離されたポリペプチドに関し、ここで、この連続スパンは、配列番号１のヌクレオチド１，８１０〜１，８１２を含むか、配列番号１のヌクレオチド２，５６６〜２，５６８を含むか、または配列番号１のヌクレオチド１，８１０〜１，８１２およびヌクレオチド２，５６６〜２，５６８を含む。いくつかの実施形態において、この単離されたポリヌクレオチドは、精製されている。
【０２５２】
第１４の局面において、本発明は、第１３の局面の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターをその要旨とする。
【０２５３】
いくつかの好ましい実施形態において、このベクターは、発現ベクターである。いくつかの好ましい実施形態において、この発現ベクターは、真核生物発現ベクターである。いくつかの好ましい実施形態において、この発現ベクターは、ｐＣＭＶである。いくつかの好ましい実施形態において、この発現ベクターは、アデノウイルス発現ベクターである。他の適切な発現ベクターは、当業者に容易に認識される。
【０２５４】
第１５の局面において、本発明は、第１４の局面の発現ベクターで形質転換されたか、トランスフェクトされたか、または感染された宿主細胞をその要旨とする。
【０２５５】
いくつかの実施形態において、この宿主細胞は、真核生物である。いくつかの実施形態において、この真核生物宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。いくつかの好ましい実施形態において、この宿主細胞は、真核生物であり、より好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは２９３、２９３Ｔ、ＣＨＯ、およびＣＯＳ−７細胞からなる群より選択される。他の好ましい実施形態において、この宿主細胞は、真核生物であり、より好ましくはメラノフォアである。他の適切な宿主細胞は、当業者に容易に認識される。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、本発明は、形質転換されたか、このトランスフェクトされたか、または感染された宿主細胞の精製された集団に関する。
【０２５７】
第１６の局面において、本発明は、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号２のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む組換えポリペプチドを発現する組換え宿主細胞をその要旨とする。
【０２５８】
上記対立遺伝子改変体が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む配列番号２アミノ酸配列の対立遺伝子改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２５９】
上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であり、かつ上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含み、または配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニン、およびアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む、配列番号２のアミノ酸配列の改変体は、本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２６０】
いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝８５６およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６，２２〜１，３４６、および２２７〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、本発明は、該組換えポリペプチドを発現する該組換え宿主細胞の精製された集団に関する。
【０２６２】
第１７の局面において、本発明は、第１６の局面の組換え宿主細胞の膜をその要旨とする。
【０２６３】
第１８の局面において、本発明は、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号２のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的に活性なフラグメントを含む単離されたポリペプチドをその要旨とする。いくつかの実施形態において、該単離されたポリペプチドは精製されている。
【０２６４】
上記対立遺伝子改変体が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２６５】
上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であって、上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列の改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２６６】
いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝８５６およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６，２２〜１，３４６、および２２７〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。
【０２６７】
また、本発明は、配列番号２の少なくとも６つのアミノ酸の連続スパンを含む単離されたポリペプチドに関し、ここで、該連続スパンは配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含み、または配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニン、およびアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む。
【０２６８】
第１９の局面において、本発明は、適当な条件下で、宿主細胞が配列番号２のアミノ酸配列、または該アミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または該アミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその生物学的に活性なフラグメントを含むポリペプチドを生産するように、第１４の局面の発現ベクターで細胞を形質転換し、トランスフェクトし、または感染させることを含む組換え宿主細胞の生産方法をその要旨とし、ここで、該生物学的に活性なフラグメントまたは構成的に活性な変異体は配列番号２の位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含み、または配列番号２の位置６０４にメチオニン、位置８５６にスレオニンを含む。
【０２６９】
上記対立遺伝子改変体が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２７０】
上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であって、上記改変体アミノ酸配列が配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニンを含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニンを含む配列番号２のアミノ酸配列の改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２７１】
いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および配列番号２の全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝８５６およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６，２２〜１，３４６、および２２７〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝８５６、およびｃ＝１，３４６である。
【０２７２】
第２０の局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるポリペプチドに対して特異的に結合するが、配列番号２のアミノ酸位置６０４にメチオニン以外のアミノ酸置換よりなり、配列番号２のアミノ酸位置８５６にスレオニン以外のアミノ酸置換よりなり、または配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニン以外のアミノ酸置換、およびアミノ酸位置８５６のスレオニン以外のアミノ酸置換よりなる該ポリペプチドの改変体に対しては特異的に結合しない抗体、または該抗体の抗原結合フラグメントをその要旨とする。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態において、該モノクローナル抗体は精製されている。抗体を作製する方法は当業者の範囲内のものである（例えば、２００２年８月２９日にＷＯ  ０２／０６６５０５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【０２７３】
第２１の局面において、本発明は、上記抗体が上記ポリペプチドに特異的に結合することができる条件下で、該抗体を該ポリペプチドと接触させることを含む、第２０の局面の抗体に、配列番号２のアミノ酸配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるポリペプチドを結合させる方法をその要旨とする。
【０２７４】
第２２の局面において、本発明は、；
（ａ）請求項１の方法による上記モジュレーターを同定し；次いで、
（ｂ）（ａ）で同定されたモジュレーターを合成する；
工程を含む、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのモジュレーターの製法をその要旨とする。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニストおよびアンタゴニストからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０２７６】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ配列番号２のアミノ酸配列を有するＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択される値未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは一過的にまたは安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの膜で行ったＧＴＰγＳ結合アッセイにおいて、一過的にトランスフェクトされたメラノフォアで行った色素分散アッセイにおいて、または配列番号２のアミノ酸配列を有する組換えＲＵＰ４０  ＧＰＣＲポリペプチドを発現するアデノウイルス感染心筋細胞におけるＩＰ３アッセイによって、１００μＭ未満の、１０μＭ未満の、または１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１００μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１０μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて９μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて８μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて７μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて６μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて５μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて４μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて３μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて２μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは該アッセイにおいて１μＭ未満のＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１００μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは１μＭ〜１０μＭの間隔から選択された値未満の該アッセイにおけるＩＣ５０を持つ逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストは逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、該逆アゴニストまたはアンタゴニストはアンタゴニストである。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターはＧＰＣＲに対して選択的である。
【０２７８】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心臓病のモジュレーターである。いくつかの実施形態において、該心臓病は鬱血性心不全である。いくつかの実施形態において、該心臓病は肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは心筋細胞肥大のモジュレーターである。
【０２７９】
いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的に利用可能である。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は腹腔内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、または少なくとも４５％であると示すことができる。いくつかの実施形態において、該経口生物学的利用性は静脈内投与に対して少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、または少なくとも１５％であると示すことができる。
【０２８０】
第２３の局面において、本発明は、心血管障害用の薬学的薬剤としての候補化合物をスクリーニングするためのＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの使用をその要旨とし、ここで該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは；
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント、または配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含むレセプターである。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつき、ｎ１＝２、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６，２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物的学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９，２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されるシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡモジュール内の予測されるタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、およびアミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されるタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【０２８２】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体の作製方法は当業者の範囲内にある（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ  ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６，５５５，３３９参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【０２８３】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。限定されるものではなく、例として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりにスレオニンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１のバリンの代わりのイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりのメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲ対立遺伝子改変体は内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であり、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。
【０２８４】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【０２８５】
（ａ）〜（ｊ）のいずれかに対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。パーセント同一性は公知のコンピュータプログラムを用いて慣用的に決定することができる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムは、断じて限定されるものではないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷを含む［Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２２：４６７３−８０；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ２６６：３８３−４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５：３３８９−３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：２６６−２７２；その開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０２８６】
いくつかの実施形態において、タンパク質配列の相同性は上記分野でよく知られた基本的局所整列サーチツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価される。［例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （１９９０）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，１９９３，１９９７，全て前掲］。
【０２８７】
いくつかの実施形態において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を決定するための方法は、問い合わせ配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）およびＢｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｃｏｍｐ  Ａｐｐ  Ｂｉｏｓｃｉ  （１９９０）  ６：２３７−２４５；その開示をここで引用してその全体を援用する］のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用い、全体的配列整列ともいう質問するべき配列の間の最良の総じてのマッチを決定する方法である。配列整列において、問い合わせ配列および質問配列はともにアミノ酸配列である。該全体的配列整列の結果はパーセント同一性で表す。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列で用いられる好ましいパラメータは；マトリックス＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、接合ペナルティ＝２０、ランダム化群＝２５、長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列の長さ、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝２４７、または質問アミノ酸配列の長さいずれか短いほうである。
【０２８８】
もし質問配列が内部欠失のためではなくＮ−またはＣ末端欠失のため問い合わせ配列よりも短ければ、パーセント同一性における結果は手動で修正しなければならない。なぜならば、全体的パーセント同一性を計算する場合には、ＦＡＳＴＤＢプログラムは質問配列のＮ−およびＣ末端切形を考慮しないためである。問い合わせ配列に対するＮ−およびＣ末端で切形された質問配列では、対応する質問配列残基とマッチ／整列しない、質問配列のＮ−およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を、問い合わせ配列の合計塩基の数として計算することによって、パーセント同一性は修正される。残基がマッチ／整列したか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、特定のパラメータを用いて前記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性からこのパーセンテージを差し引いて最終のパーセント同一性スコアに到達する。この最終のパーセント同一性スコアは、本発明の目的で用いられるものである。問い合わせ配列とマッチ／整列しない質問配列のＮ−およびＣ末端に対する残基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的で考慮される。すなわち、質問配列の最も遠いＮ−およびＣ末端残基の外側にある問い合わせアミノ酸残基のみ。
【０２８９】
例えば、９０アミノ酸残基の質問配列は１００−残基の問い合わせ配列と整列させて、パーセント同一性を決定する。欠失は質問配列のＮ末端で起こり、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列はＮ末端の最初の残基とはマッチ／整列しない。１０の不対残基は配列の１０％を表し（マッチしなかったＮ−およびＣ末端における残基の数／問い合わせ配列における残基の合計数）、従って、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから１０％を差し引く。もし残存する９０残基が完全にマッチすれば、最終パーセント同一性は９０％であろう。
【０２９０】
もう一つの例において、９０−残基の質問配列を１００−残基の問い合わせ配列と比較する。このとき欠失は内部にあり、従って、問い合わせとマッチ／整列しない配列は、質問配列のＮ−またはＣ末端には残基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセント同一性は手動で修正されない。再度、問い合わせ配列とマッチ／整列しないＦＡＳＴＤＢ整列で提示される、対象の配列のＮ−およびＣ末端の外側にある残基位置のみが手動で修正される。他の修正は本発明の目的ではなされない。
【０２９１】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは組換えのものである。
【０２９２】
いくつかの実施形態において、該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは異種アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、該異種アミノ酸配列はエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはｃ−ｍｙｃエピトープタグである。いくつかの実施形態において、該エピトープタグはＶ５エピトープタグである。該ＨＡ、ｃ−ｍｙｃまたはＶ５タグを供するための手法は、当業者によく知られている（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ  およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。
【０２９３】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、シグナルペプチドのタンパク質分解切断を含む。
【０２９４】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＳＥＡモジュール内にタンパク質分解切断を含む。
【０２９５】
いくつかの実施形態において、該レセプターは、さらに、ＧＰＳドメイン内にタンパク質分解切断を含む。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋症、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺性心、リウマチ性心疾患、および心室機能障害を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全症、大動脈弁狭窄、大動脈弁逸脱、僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大型心筋症、鬱血性心筋症、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、拘束型心筋症、シャガス心筋症を含む心筋症を含む。
【０２９７】
いくつかの実施形態において、心血管障害は肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、該肥大型心筋症は血行動態障害に由来する。いくつかの実施形態において、該肥大型心筋症は遺伝性疾患に由来する。いくつかの実施形態において、肥大型心筋症は心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎、または家族性肥大型心筋症に由来する。
【０２９８】
いくつかの実施形態において、該心血管障害は先天性心臓欠陥である。先天性心臓欠陥は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺動脈中隔欠損、ファロー三徴症、心室中隔欠損症、および家族性肥大型心筋症を含む。
【０２９９】
いくつかの実施形態において、心血管障害は肥大した心臓と共に呈される心血管障害である。
【０３００】
いくつかの実施形態において、心血管障害は心臓病である。いくつかの実施形態において、心臓病は肥大型心筋症または鬱血性心不全である。いくつかの実施形態において、肥大型心筋症は心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎、または家族性肥大型心筋症に由来する。
【０３０１】
いくつかの実施形態において、薬学的薬剤は抗体またはその抗原結合部位ではない。
【０３０２】
いくつかの実施形態において、薬学的薬剤は低分子であり、但し、低分子は抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０３０３】
いくつかの実施形態において、薬学的薬剤はポリペプチドであり、但し、ポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントではない。
【０３０４】
いくつかの実施形態において、薬学的薬剤は脂質である。
【０３０５】
いくつかの実施形態において、薬学的薬剤は抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０３０６】
いくつかの実施形態において、薬学的薬剤はレセプターのリガンドである。
【０３０７】
いくつかの実施形態において、薬学的薬剤はレセプターのモジュレーターである。いくつかの実施形態において、薬学的薬剤はレセプターのアゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、またはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、薬学的薬剤はレセプターの逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、薬学的薬剤はレセプターの逆アゴニストである。いくつかの実施形態において、薬学的薬剤はレセプターのアンタゴニストである。
【０３０８】
いくつかの実施形態において、該使用は、さらに、該スクリーニングされた薬学的薬剤の合成を含む。
【０３０９】
いくつかの実施形態において、該使用はさらに：
（ａ）所望により、化合物の構造を決定し、次いで、
（ｂ）化合物または薬学的薬剤、または化合物の名称または構造を供する；
ことを含む。
【０３１０】
いくつかの実施形態において、該使用はさらに；
（ａ）所望により、化合物の構造を決定し；
（ｂ）所望により、化合物の名称または構造を供し；次いで、
（ｃ）化合物を供し、または合成する；
ことを含む。
【０３１１】
出願人は、本発明の実施形態のいずれかからのいずれかの１以上の候補化合物を排除する権利を留保する。また、出願人は、本発明の実施形態のいずれかからのいずれかの１以上のモジュレーターを排除する権利を留保する。出願人は、さらに、本発明の実施形態のいずれかから、いずれかの１以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、または該ポリヌクレオチドまたは該ポリペプチドのいずれかの１以上のフラグメントを排除する権利を留保する。出願人は、加えて、本発明の実施形態のいずれかからいずれかの１以上の心血管障害を排除する権利を留保する。
【０３１２】
本出願を通じて、種々の刊行物、特許および公表された特許出願が引用される。本出願中で言及されたこれらの刊行物、特許および公表された特許出願の開示は、ここで引用してその全体を本開示に一体化させる。公開、特許、または公開された特許出願の出願人によるここでの引用は、先行技術としての該刊行物、特許または公開された特許出願の出願人による自認ではない。
【０３１３】
当業者の範囲内にある開示された発明の修飾および延長は、前記開示および後の請求の範囲に含まれる。
【０３１４】
（詳細な説明）
（定義）
レセプターに関連する科学文献は、レセプターに対して種々の効果を有するリガンドに言及するのに多数の用語を採用している。明瞭性および整合性のため、以下の定義を本特許書類を通じて用いる。これらの定義がこれらの用語についての他の定義とコンフリクトする程度に、以下の定義が支配する。
【０３１５】
アゴニストは、それがレセプターに結合した場合に細胞内応答を活性化する物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。いくつかの実施形態において、アゴニストは、それがレセプターに結合して（例えば、膜へのＧＴＰγＳ結合を増強させ、または細胞内ＩＰ３レベルを増強させる）場合に細胞内応答を活性化することが従前には知られていなかった物質である。
【０３１６】
本明細書中で用いるアミノ酸省略を表に記載する：
【０３１７】
【表１】
2007524382.tif 000004
。
【０３１８】
アンタゴニストは、アゴニストと同一の部位においてレセプターに競合的に結合するが、細胞内応答を活性化せず、従って、アゴニストによって誘導された細胞内応答を阻害することができる物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。アンタゴニストは、アゴニストの不存在下においてベースライン細胞内応答を減少させない。いくつかの実施形態において、アンタゴニストは、アゴニストと競合して、それらがレセプターに結合する場合、細胞応答を阻害することが従前には知られていなかった物質であり、例えば、ここで、該細胞応答は膜へのＧＴＰγＳ結合、または細胞内ＩＰ３レベルの上昇である。
【０３１９】
抗体とは、本明細書中においては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含むことを意図する。抗体は、さらに、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭを含むことを意図する。抗体は、一本鎖の全抗体を含めた全抗体、およびＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２を含めたその抗原結合フラグメントを含む。抗体はいずれの動物起源のものであってもよい。好ましくは、抗体はヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスター、ラクダ、ラバ、ヒツジ、ウマまたはニワトリである。好ましくは、抗体は、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、および１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫｄ値を持つ結合親和性を有する。本発明の抗体は上記分野で知られたいずれかの適当な方法によって調製することができる。
【０３２０】
生物学的に活性なフラグメントは、全長ポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能の一部または全てを保持する全長ポリペプチドまたはアミノ酸配列のフラグメントを意味する。特別な実施形態において、全長ＧＰＣＲポリペプチドまたはアミノ酸配列の活性なフラグメントは、全長ＧＰＣＲポリペプチドまたはアミノ酸配列の機能の一部または全てを保持する。該ＧＰＣＲ機能は、限定されるものではないが、リガンド結合、Ｇタンパク質カップリング、およびＧタンパク質へのリガンド−促進カップリングを含むと理解される。いくつかの実施形態において、該ＧＰＣＲ機能はＧタンパク質カップリングである。いくつかの実施形態において、該ＧＰＣＲ機能はＧタンパク質へのリガンド−促進カップリングである。限定されるものではなく、例として、生物学的に活性なフラグメントは、本明細書中において、Ｎ末端メチオニンが存在しない全長ＧＰＣＲポリペプチドを含むことを意図する。
【０３２１】
候補化合物は、スクリーニング技術に適応できる分子（限定されるものではないが、例えば、化学化合物）を意味する。候補化合物は、例えば、ポリペプチド、脂質、低分子、抗体、ポリヌクレオチドであり得る。
【０３２２】
心駆出分画率は、単一収縮で左心室から拍出される血液の分率をいうために採用する。例えば、もし１００ｍＬの血液が左心室にあって、収縮に際して９０ｍＬが拍出されるならば、心駆出分画率は９０％である。
【０３２３】
心臓肥大は、心臓の筋肉（心筋）の肥大をいうために採用する。心臓肥大は、通常、必ずしも常ではないが、心筋に課された増大した血行動態的負荷に対する適合応答である。
【０３２４】
心臓弁疾患は、病原性心臓血行動態をもたらす心臓中の弁の１以上の異常な構造または機能をいうために採用する。
【０３２５】
コドンは、リン酸基に結合されたヌクレオシド［アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）およびチミジン（Ｔ）］を一般に含み、翻訳された場合に、アミノ酸をコードする３つのヌクレオチド（またはヌクレオチドに対する同等体）のグループを意味する。
【０３２６】
組成物は少なくとも１つの成分を含む物質を意味する。「薬学的組成物」は組成物の例である。  
【０３２７】
化合物の効率は、レセプターの機能を阻害し、または刺激する化合物の能力；すなわち、レセプター結合親和性とはコントロール的にシグナル変換経路を活性化し／阻害する能力の尺度を意味する。化合物効率を検出する例示的手段は、本特許書類の実施例のセクションに開示される。
【０３２８】
を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、実質的になる（ｃｏｎｓｉｎｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）、およびなる（ｃｏｎｓｉｎｓｔｉｎｇ  ｏｆ）とは、本明細書中においては、その標準的意味に従って定義される。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．に記載された定義された意味は上記分野における定義された意味を支配し、連邦巡回裁判所判例に記載された定義された意味はＭ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．に記載された意味を支配する。
【０３２９】
先天性心臓欠陥とは、例えそれがかなり遅く発見されたとしても、誕生時に存在する心臓循環の構造または機能における異常をいう。
【０３３０】
鬱血性心不全とは、血液を効果的に送液するその能力を心臓が失う障害をいう。鬱血性心不全は年齢をとると共により頻繁となる。虚血性心疾患は、鬱血性心不全の最も普通の原因であり、全ての場合の６０〜７０％を占める。１２ｍｍＨｇより大きな増大した静脈圧力は、２５秒よりも長い循環時間と同等な心拍出量の低下のように、鬱血性心不全についての主なＦｒａｍｉｎｇｈａｍ基準の１つである。
【０３３１】
構成的に活性なレセプターは、そのリガンドまたはその化学的同等体へのレセプターへの結合を介する以外の手段によって活性な状態に安定化されたレセプターを意味する。構成的に活性なレセプターは内因性または非内因性であってよい。
【０３３２】
構成的に活性化されたレセプターは、構成的に活性なように修飾されている内因性レセプターを意味する。
【０３３３】
構成的レセプター活性化は、そのリガンドまたはその化学的同等体への結合の不存在下におけるレセプターの活性化を意味する。
【０３３４】
接触、または接触するとはインビトロ系であるかまたはインビトロ系であるかを問わず、少なくとも二つの存在を一緒にすることを意味する。
【０３３５】
減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）は、測定可能な量の低下をいうのに用いられ、用語「低下（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減少（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「降下（ｌｏｗｅｒ）」、および「少量化（ｌｅｓｓｅｎ）」と同義に用いられる。
【０３３６】
超音波心臓検査とは、超音波を用いて、生きた動物において心臓の構造および機能を測定する方法をいうのに採用される。限定するものではなく例として、超音波心臓検査は肥大した心臓の測定で用いることができる。
【０３３７】
内因性とは、哺乳動物が天然で生産する物質を意味する。限定されるものではなく例えば、用語「レセプター」に関する内因性は、哺乳動物（限定されるものではないが例えばヒト）によって天然で生産されることを意味する。内因性は、遺伝子の対立遺伝子改変体ならびにそのようにコードされた対立遺伝子ポリペプチド改変体を含むと理解される。コントロール的に、この意味において用語非−内因性とは、哺乳動物（限定されるものではないが例えば、ヒト）によって天然で生産されないことを意味する。例えば、限定されるものではないが、構成的に活性となるように操作される場合を除き、その内因性形態では構成的に活性ではないレセプターは、もっとも好ましく、本明細書中においては「非−内因性の構成的に活性化されたレセプター」をいう。
【０３３８】
肥大した心臓は、心室壁の厚みの増大（身体サイズに基づく正常な範囲を超える）をいうのに採用される。
【０３３９】
発現ベクターは、本明細書中においては、上記発現ベクター用の適当な宿主細胞組換体においてクローン化されたＤＮＡの転写および転写されたｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。適当に構築された発現ベクターは、宿主細胞中での自律複製のための複製起点、選択マーカー、限定された数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、および活性なプロモーターを含有すべきである。転写すべき該クローン化されたＤＮＡは、上記発現ベクター内の構成的にまたは条件付きで活性なプロモーターに操作可能に連結される。限定されるのではなくその例として、ｐＣＭＶは発現ベクターである。
【０３４０】
本明細書中で開示する発明の関係では、Ｇタンパク質共役型レセプター融合タンパク質およびＧＰＣＲ融合タンパク質は、各々、少なくとも一つのＧタンパク質、もっとも好ましくはそのようなＧタンパク質のアルファ（α）サブユニット（これは、ＧＴＰに結合するサブユニットである）に融合した内因性の構成的に活性なＧＰＣＲ、または非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲを含む非内因性タンパク質を意味し、Ｇタンパク質は好ましくは内因性ＧＰＣＲに天然でカップリングするＧタンパク質と同一のタイプである。例えば、限定されるものではないが、内因性状態においては、もしＧタンパク質「Ｇｓα」がＧＰＣＲとカップリングする支配的Ｇタンパク質であれば、特異的ＧＰＣＲに基づきＧＰＣＲ融合タンパク質は、Ｇｓαに融合したＧＰＣＲを含む非内因性タンパク質であろう；いくつかの状況においては、以下に記載するように、非支配的Ｇタンパク質はＧＰＣＲに融合させることができる。Ｇタンパク質には構成的に活性なＧＰＣＲのＣ末端に直接的に融合することができるか、あるいは二つの間にスペーサーがあり得る。
【０３４１】
血行動態は、循環系を通じての血液の運動、およびそれに関連する力に関するように採用される。限定されるものではなくその例として、心筋に課される上昇した要求をもたらす保持された血行動態摂動は、心臓肥大の結果となる。あるいは、心筋の細胞内の遺伝的異常は、血行動態とは独立した心臓肥大をもたらし得る。限定されるものではなくその例として、筋節タンパク質における突然変異のような遺伝性疾患は家族性肥大型心筋症をもたらす［例えば、Ｂａｓｈｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ（２００３）４８：５５−６４参照］。
【０３４２】
宿主細胞は、その中に取り込まれた発現ベクターを有することができる細胞を意味する。該取り込みは、限定されるものではなくその例として、形質転換、トランスフェクションまたは感染を通じて起こり得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は真核生物、より好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、２９３．２９３Ｔ．ＣＨＯおよびＣＯＳ−７細胞からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は心筋細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は真核生物、より好ましくはメラノフォアである。
【０３４３】
肥大型心筋症は、心筋を形成する細胞のサイズの増加による心臓の肥大をいうために採用される。
【０３４４】
本明細書中で用いられる予防または治療が必要とは、本明細書中においては、個体または動物が処置を必要とする、または処置が有益である世話人（例えば、ヒトにおける医師、看護士、看護従事者等；非ヒト哺乳動物を含めた動物の場合には獣医）によってなされる判断をいう。この判断は、世話人の技量の範囲にあるが、個体または動物が病気である、または病気になりうるという知識を含む種々の因子に基づき、本発明の化合物によって治療できる疾患の結果としてなされる。
【０３４５】
増加した静脈圧は、循環系の弱化によって引き起こされたそこでの血液のプーリングによる静脈系（静脈）で発生する上昇した血圧をいうように採用される。
【０３４６】
本明細書中で用いる個体は、哺乳動物を含めたいずれの動物も、好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、もっとも好ましくはヒトをいう。
【０３４７】
用語「応答」との関係で、阻害する、または阻害しているとは、化合物の不存在下におけるのとは反対に、化合物の存在下で応答が減少し、または妨げられることを意味する。
【０３４８】
逆アゴニストは、内因性形態、またはレセプターの構成的に活性化された形態いずれかに結合して、アゴニストの不存在下で観察されたレセプターのベースライン細胞内応答を低下させる物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
【０３４９】
虚血性心疾患とは、心臓の組織への酸素の欠如によって引き起こされる障害をいい、ここで、心筋は影響され、心臓は適切には拍出できない。虚血性心疾患は、合衆国における最も一般的な心筋症である。
【０３５０】
単離されたとは、その元来の環境（例えば、もしそれが天然で生じるならば天然環境）から物質が取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然系において共存する物質のいくらかまたは全てから分離された同一のポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部でありおよび／またはそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であり、ベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではない点で依然として単離されている。
【０３５１】
リガンドはＧＰＣＲに特異的に結合する分子を意味する。リガンドは、例えば、ポリペプチド、脂質、低分子および抗体であり得る。内因性リガンドは天然ＧＰＣＲについての内因性天然リガンドである。リガンドはＧＰＣＲの「アンタゴニスト」、「アゴニスト」、「部分的アゴニスト」または「逆アゴニスト」などであり得る。
【０３５２】
本明細書中で用いるように、用語調節または修飾とは、特定の活性の量、質、または効果、機能または分子の増加または減少をいう。
【０３５３】
心筋梗塞とは、その領域への酸素の不適切な供給による心筋の領域の損傷または死滅をいう。心筋梗塞は、しばしば、冠動脈（血液および酸素を心筋に運ぶ血管）の一つをブロックする血餅によって引き起こされる。血餅が、血液および酸素が心臓のその領域に到達するのを妨げ、その領域における心臓細胞の死滅に至る。
【０３５４】
心筋炎は、細菌、ウィルスまたは未知の病原体の心筋の炎症をいうために採用される。
【０３５５】
オーファンレセプターは、そのレセプターに特異的な内因性リガンドが同定されていない、または知られていない内因性レセプターを意味する。
【０３５６】
部分的アゴニストは、それが十分なアゴニストが行う程度よりも低くレセプターに結合する場合に細胞内応答を活性化させる物質（例えば、リガンド、候補化合物）を意味する。
【０３５７】
薬学的薬剤は、薬学的組成物中の有効成分として用いることができる化合物を意味する。
【０３５８】
薬学的組成物は、少なくとも一つの有効成分を含み、それにより、上記組成物は哺乳動物（例えば、限定されるものではないがヒト）において特定の効果的な結果のための調査に使用できる組成物を意味する。当業者であれば、有効成分が当業者の要求に基づく所望の効果的な結果を有するか否かを判断するのに適当な技術を理解し、認識するであろう。
【０３５９】
ポリヌクレオチドは、一本鎖またはデュプレクス形態のいずれかである１を超えるヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を意味する。本発明のポリヌクレオチドは、合成、組換え、エクス・ビボ生成、その組み合わせを含めたいずれかの公知の方法によって、ならびに上記分野で知られたいずれかの精製方法を利用して調製することができる。
【０３６０】
ポリペプチドは、ポリマーの長さには関係せずアミノ酸のポリマーをいう。かくして、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれる。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾を特定せず、または排除しない。例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドは用語ポリペプチドに明示的に含まれる。
【０３６１】
（心筋梗塞後リモデリング）
心筋梗塞による心筋組織の喪失は、心室に課される維持された過剰の血行動態負荷をもたらす。心室肥大は、心臓が増大した負荷を補償する主なメカニズムの一つを構成する。しかしながら、血行動態過剰負荷に直面して心臓性能を維持するためのこの適合の能力は有限であり、慢性的に維持される場合、適合不良となる。徐々に、適合した肥大表現型は、肥大した心室が暫時膨張し、収縮機能が弱まるにつれ、明白な心不全に転じる。心臓における心筋梗塞に対する適合したおよび適合不良の応答の自然歴を「リモデリング」という。
【０３６２】
プライマーは、本明細書中においては、標的ヌクレオチド配列に相補的であって、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするのに用いられる特異的オリゴヌクレオチド配列を示すように用いられる。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合のための開始点として働く。
【０３６３】
精製されたとは、本明細書中においては、限定されるのではないが、他の核酸、炭水化物、脂質および（ポリヌクレオチドの合成で用いられる酵素のような）タンパク質を含めた他の化合物から分離されている本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドベクターを記載するのに用いられる。少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、または少なくとも約９０％のサンプルが単一のポリヌクレオチド配列を含む場合に、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、典型的には、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％重量／核酸サンプルの重量を含む。ポリヌクレオチドの純度または均質性は、例えばサンプルのアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動のような上記分野でよく知られた多数の手段により、続いて、ゲルを染色するに際して単一のポリヌクレオチドバンドを可視化することによって示すことができる。
【０３６４】
同様に、用語精製されたとは、本明細書中においては、限定されているものではないが、核酸、脂質、炭水化物および他のタンパク質を含めた他の化合物から分離されている本発明のポリペプチドを記載するために本発明で用いられる。いくつかの好ましい実施形態において、ポリペプチドは、サンプルのポリペプチド分子の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％または少なくとも約９９．５％が単一アミノ酸配列を有する場合に実質的に純粋である。いくつかの好ましい実施形態において、実質的に純粋なポリペプチドは、典型的には、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または約９９．５％重量／タンパク質サンプルの重量を含む。ポリペプチドの純度または均質性はサンプルのアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動のような上記分野でよく知られた多数の方法、続いて、ゲルを染色する際に単一ポリペプチドバンドを可視化することによって示される。
【０３６５】
同様に、用語精製されたとは、本明細書中においては、発現ベクターで形質転換された、トランスフェクトされた、または感染された宿主細胞の集団を記載するのに用いられる。いくつかの好ましい実施形態においては、該集団は、該形質転換され、トランスフェクトされ、または感染された宿主細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。
【０３６６】
同様に、用語精製されたとは、本明細書中においては、組換えポリペプチドを発現する宿主細胞の集団を記載するのに用いられる。いくつかの好ましい実施形態においては、該集団は、該組換えポリペプチドを発現する該宿主細胞の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。
【０３６７】
さらに、本明細書中で用いるように、用語精製されたとは、絶対的な純度を求めるのではなく；むしろ、相対的な定義を意図している。
【０３６８】
レセプター機能とは、限定されるものではないが、遺伝子転写の調節、イオンの流入または流出の調節、触媒反応の実行、および／またはＧタンパク質を介する活性の調節を含めた、細胞において刺激を受け取り、効果を適度にするレセプターの正常な操作をいう。
【０３６９】
低下した心拍出量は、心臓の心室の各収縮に伴い、より少量の血液が循環系（動脈）に拍出されるように、心不全により減少した拍出能力をいうために採用される。
【０３７０】
二次メッセンジャーは、レセプター活性化の結果として生じた細胞内応答を意味する。二次メッセンジャーは、例えば、イノシトール三リン酸（ＩＰ３）、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）、ＭＡＰキナーゼ活性、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）活性、およびＣａ２＋を含むことができる。二次メッセンジャー応答はレセプター活性化の決定のために測定することができる。加えて、二次メッセンジャー応答は、例えば、逆アゴニスト、部分的アゴニスト、アゴニストおよびアンタゴニストを含めた候補化合物の同定のために測定することができる。
【０３７１】
シグナル／ノイズ比率とは、活性化、増幅または刺激に応答して生じたシグナルを意味し、ここで、シグナルはバックグラウンドノイズ、または非−活性化、非−増幅、または非刺激に応答しての基礎レベルを超える。
【０３７２】
低分子は、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、有機化合物または無機化合物（すなわち、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物を含む）、およびその塩、エステルおよび他の薬学的に受容可能な形態を含めた、１モル当たり約１０、０００グラム未満の分子を有する化合物を意味するように採用される。ある好ましい実施形態においては、低分子は、１モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物である。ある好ましい実施形態においては、低分子は１モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物である。ある好ましい実施形態において、低分子は、１モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機または無機化合物である。
【０３７３】
スペーサーは、注目するＧタンパク質の開始コドンまたは開始領域の前を除いた、遺伝子、例えば注目するＧＰＣＲの最後のコドンまたは最後のアミノ酸後に位置するアミノ酸の翻訳された数を意味し、ここで、アミノ酸の翻訳された数は注目するＧタンパク質の開始領域とイン−フレームにて置かれる。翻訳されたアミノ酸の数は１、２、３、４、など、１２までであり得る。
【０３７４】
用語「応答」との関係で、刺激する、または刺激しつつあるとは、化合物の不存在下におけるのとは反対に、化合物の存在下で応答が増加することを意味する。
【０３７５】
被験体は、限定されるものではないが、ヒトおよびヒヒを含めた霊長類、ならびにイヌおよびネコのようなペット動物、ラットおよびマウスのような実験的動物、およびウマ、ヒツジおよびウシのような農場動物を意味する。
【０３７６】
（持続した心後負荷）
後負荷は、心臓から循環系への血液の流れに対する抵抗性の尺度である。高い全身血圧または大動脈の異常な狭化（縮窄）は心臓に課される後負荷を増加させる。
【０３７７】
本明細書中で用いる治療上有効量とは、研究者、獣医、医療医師または他の臨床家によって求められている、組織、系、動物、個体またはヒトにおいて生物学的または医学的応答を誘導する活性化合物または薬学的薬剤の量をいい、これは、以下のうちの一以上を含む；
（１）病気の予防；例えば、病気、疾患または障害に対して素因があり得るが、病気の病理学または徴候学を未だ経験または表示しない個体において病気、疾患または障害を予防すること、
（２）病気の阻害；例えば、病気、疾患または障害の病理学または徴候学を経験している、または表示している個体において病気、疾患、または障害を阻害すること（すなわち、病理学および／または徴候学のさらなる発展の組織）、および
（３）病気の軽減；例えば、病気、疾患または障害の病理学または徴候学を経験または表示している個体において病気、疾患または障害を軽減すること（すなわち、病理学および／または徴候学の逆行）。
【０３７８】
本明細書中で用いる用語としての改変体は、各々、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドとは異なるが、本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な改変体は、もう一つの参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。改変体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもさせなくてもよい。ポリペプチドの典型的な改変体は、もう一つの参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。改変体および参照ポリペプチドは、いずれかの組合せにて一以上の置換、付加、欠失によってアミノ酸配列が異なり得る。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの改変体は対立遺伝子改変体のような天然で起こるものであってよいか、またはそれは天然で生じることが知られていない改変体であり得る。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然改変体は、突然変異誘発技術によって、または直接的合成によってなすことができる。
【０３７９】
心室容量は、心臓の左および右心室の内部寸法の尺度をいうために採用される。心不全においては、心室の肥大である。
【０３８０】
（Ａ．導入）
以下のセクションの順序は表象的な効率のために記載され、開示または後の請求の範囲を制限することを意図せず、またはそのように解釈されるべきではない。
【０３８１】
（Ｂ．レセプター発現）
（１．注目するＧＰＣＲポリペプチド）
本発明のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることでき；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことができる。
【０３８２】
本発明のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは配列番号２または４のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメントを含むことができる。本発明のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは配列番号２または４のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、または配列番号２または４のアミノ酸配列の該生物学的に活性なフラグメントを含むことができる。
【０３８３】
いくつかの実施形態において、配列番号２または４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは、全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸間隔「ｎ１〜ｎ２」から選択されるＮ末端アミノ酸、および全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸「ｃ」に固定されたＣ末端アミノ酸を持つフラグメントの組を表す、式「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」によって供される群から選択される。いくつかの実施形態において、「ｎ１」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのアミノ酸２であり、「ｎ２」は、ＧＰＳドメイン内の予測されるタンパク質分解切断の近似的部位に対してＣ末端側のアミノ酸であって、「ｃ」は全長ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲのＣ末端アミノ酸である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６、２２〜１，３４６、２２７〜１，３４６、および９９１〜１，３４６から選択され、ここで、アミノ酸２２は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２７はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９１はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該生物学的に活性なフラグメントは配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９、２５〜１，３４９、２２４〜１，３４９、および９９４〜１，３４９から選択され、ここで、アミノ酸２５は予測されたシグナルペプチド切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸２２４はＳＥＡモジュール内の予測されたタンパク質分解切断の近似的部位であると理解され、アミノ酸９９４はＧＰＳドメイン内の予測されたタンパク質分解の近似的部位であると理解される。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２７、ｎ２＝９９１、およびｃ＝１，３４６である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２５、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１３４，９である。いくつかの実施形態において、配列番号４のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲにつきｎ１＝２２４、ｎ２＝９９４、およびｃ＝１，３４９である。
【０３８４】
ＧＰＣＲの構成的に活性化された変異体の作製方法は当業者の範囲内にある（例えば、１９９８年１０月２２日にＷＯ９８／４６９９５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４９６；および米国特許第６、５５５、３３９号参照；その開示をここで引用してその全体を援用する）。
【０３８５】
配列番号２、４または６のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内に考えられる。限定されるものではなく例として、配列番号２のアミノ酸位置６０４のメチオニンの代わりにスレオニンの置換を含み、配列番号２のアミノ酸位置８０１にバリンの代わりにイソロイシンの置換を含み、または配列番号２のアミノ酸位置８５６のスレオニンの代わりにメチオニンの置換を含む配列番号２のＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの対立遺伝子改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。ある実施形態においては、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体を含むことができる。ある実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体は、特異的プライマー配列番号７および配列番号８を用いてヒトＤＮＡサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる内因性ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、配列番号２のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体は、配列番号７を含む特異的プライマーおよび配列番号８を含む特異的プライマーを用いてヒトＤＮＡサンプルに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる内因性ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲヌクレオチド配列によってコードされる。
【０３８６】
配列番号２のヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの哺乳動物オルソログは本発明の範囲内にあると考えられる。いくつかの実施形態において、該哺乳動物オルソログはマウスＲＵＰ４０、ラットＲＵＰ４０、ブタＲＵＰ４０、および非ヒト霊長類ＲＵＰ４０を含む。
【０３８７】
以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
（ｅ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができ；
（ｆ）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｇ）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｈ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
（ｉ）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；および
（ｊ）配列番号６のアミノ酸１〜１４１；
からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む該ＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの改変体は本発明の範囲内にあると考えられる。パーセント同一性は公知コンピュータプログラムを用いて慣用的に決定することができる。
【０３８８】
ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーおよび配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９５％同率のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９６％同一であるアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９７％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９８％同一性アミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによ���て得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．１％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．２％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．３％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．４％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．５％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列���号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．６％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．７％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．８％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、または内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも約９９．９％同一性のアミノ酸配列を含み、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して少なくとも、例えば、９５％「同一性」を有するアミノ酸配列とは、それが、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６のうちの各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸変化を含んでよい以外は配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して、あるいは内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列に対して同一であることを意味し、該核酸配列は配列番号７に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマー、および配列番号８に記載されたヌクレオチド配列を含む特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプ���に対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって得ることができる。かくして、例えば、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を得るためには、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６と比較して、該配列中のアミノ酸残基の５％（１００のうち５）までを挿入し、欠失し、またはもう１つのアミノ酸で置換することができる。これらの変化は、アミノまたはカルボキシ末端で、あるいはそれらの末端位置の間で起こることができ、該配列中の残基の間で個々に、または該配列内の１以上の連続基において散在させ得る。
【０３８９】
ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．１％、少なくとも約９９．２％、少なくとも約９９．３％、少なくとも約９９．４％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９６％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９７％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．１％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．２％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．３％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．４％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．６％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．７％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．８％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。ある���施形態において、対象の方法で用いることができるＧＰＣＲは、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも約９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも、例えば、９５％「同一性」を有するアミノ酸配列とは、アミノ酸配列が、それが、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６の各１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸変化を含むことができる以外は、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して同一であることを意味する。かくして、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を得るためには、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６と比較して、該配列中のアミノ酸残基の５％（１００のうちの５）までを挿入し、欠失し、またはもう１つのアミノ酸で置換することもできる。これらの変化はアミノまたはカルボキシ末端において、あるいはそれらの末端位置の間のどこかで起こることができ、該配列中の残基の間で個々に、あるいは該配列内の１以上の連続基において散在させることができる。
【０３９０】
いくつかの実施形態において、対象の方法で用いることができるＲＵＰ４０  ＧＰＣＲは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に記載された配列を有するフィルター−結合ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列によってコードされたＧタンパク質共役型レセプターのアミノ酸配列を含む。ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られている。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルトの溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍＬの変性され、剪断された鮭精子ＤＮＡを含む溶液中での４２℃における一晩のインキュベーション；引き続いての、約６５℃における０．１〜０．２×ＳＳＣにおける上記フィルターの洗浄を含む。
【０３９１】
（ａ．配列同一性）
いくつかの実施形態において、２つのアミノ酸配列の間のパーセント同一性を決定するための方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．［Ｃｏｍｐ  Ａｐｐ  Ｂｉｏｓｃｉ（１９９０）６：２３７−２４５；その開示をここで引用してその全体を援用する］のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて、全体的配列整列ともいう、問い合わせ配列（例えば、配列番号２のアミノ酸配列）および質問すべき配列の間の最良の総じてのマッチを決定する方法である。配列整列においては、問い合わせおよび質問配列は共にアミノ酸配列である。該全体的配列整列の結果は、パーセント同一性で表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列で用いられる好ましいパラメータは：マトリックス＝ＰＡＭ  ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、接合ペナルティ＝２０、ランダム化グループ２５、長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列の長さ、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝２４７または質問されたアミノ酸配列の長さのいずれか短い方である。
【０３９２】
内部欠失のためではなく、Ｎ−またはＣ末端欠失のために問い合わせ配列よりも質問配列が短いならば、パーセント同一性で表した結果は手動で修正しなければならない。なぜならば、ＦＡＳＴＤＢプログラムは、全体的パーセント同一性を計算する場合に、質問配列のＮ−およびＣ末端切形を考慮しないためである。Ｎ−およびＣ末端で切形された質問配列については、問い合わせ配列に対して、問い合わせ配列の合計ｂｓｅｓのパーセントとして、対応する質問配列の残基とマッチ／整列しない、質問配列のＮ−およびＣ末端である問い合わせ配列の残基の数を計算することによってパーセント同一性は修正される。残基がマッチ／整列したか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセンテージを、特定のパラメータを用いて前記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性から差し引いて、最終のパーセント同一性スコアに到達する。この最終パーセント同一性スコアは、本発明の目的のために用いられるものである。問い合わせ配列とマッチ／整列しない、質問配列のＮ−およびＣ末端に対する残基のみが、パーセント同一性スコアを手動で調整する目的と考えられる。すなわち、質問配列の最も遠いＮ−およびＣ末端残基の外側の問い合わせアミノ酸残基のみである。
【０３９３】
例えば、９０アミノ酸残基の質問配列を１００−残基の問い合わせ配列と整列させて、パーセント同一性配列を決定する。欠失は質問配列のＮ末端で起こり、従って、ＦＡＳＴＤＢ整列はＮ末端の最初の残基とはマッチ／整列しない。１０の不対残基は配列の１０％を表し（マッチしないＮ−およびＣ末端における残基の数／問い合わせ配列中の残基の合計数）、従って、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算されたパーセント同一性スコアから１０％を差し引く。もし残りの９０残基が完全にマッチすれば、最終のパーセント同一性は９０％となろう。
【０３９４】
もう１つの例において、９０−残基の質問配列の１００−残基の問い合わせ配列と比較する。この時、欠失は内部にあり、従って、問い合わせとマッチ／整列しない残基は質問配列のＮ−またはＣ末端にはない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって計算されたパーセント同一性は手動で修正されない。もう一度、手動で問い合わせ配列とマッチ／整列しない、ＦＡＳＴＤＢ整列で表示されるように、対象の配列のＮ−およびＣ末端の外側である残基位置のみが手動で修正される。他の修正は本発明目的ではなされない。
【０３９５】
（ｂ．融合タンパク質）
ある実施形態において、注目するポリペプチドは融合タンパク質であって、例えば、アフィニティータグドメインまたはレポータードメインを含むことができる。適当なアフィニティータグは、もう１つの部位、通常はもう１つのポリペプチド、最も通常には抗体に対して特異的に結合することができるいずれかのアミノ酸配列を含む。適当なアフィニティータグは、上記分野で知られているように、エピトープタグ、例えば、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、（ヘマグルチミンインフルエンザウィルスからの）ＨＡタグ、ｍｙｃタグ等を含む。適当なアフィニティータグは、上記分野で知られているように、結合基質が知られているドメイン、例えば、ＨＩＳ、ＧＳＴおよびＭＢＰタグ、および特異的結合パートナー、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体が入手できる他のタンパク質からのドメインも含む。適当なアフィニティータグは、特異的に結合することができ、適当な結合パートナー、例えば、ＩｇＧ  Ｆｃレセプターを用いて検出することができる、ＩｇＧ  Ｆｃ領域のようないずれかのタンパク質−タンパク質相互作用ドメインも含む。そのような融合タンパク質が、欠失された、または別のアミノ酸で置換されたいずれかのそのＮ末端メチオニン残基を有するＧＰＣＲとイン−フレーム融合した異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含むことができると明示的に考えられる。
【０３９６】
適当なレポータードメインは、ポリペプチドの存在を報告することができるいずれのドメインも含む。アフィニティータグを用いて、例えば、タグに特異的に結合する標識された抗体を用いてポリペプチドの存在を報告することができると認識されるが、発光レポータードメインがより通常には用いられる。適当な発光レポータードメインは（例えば、蛍、Ｖａｒｇｕｌａ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉからの）ルシフェラーゼ、またはその発光改変体を含む。他の適当なレポータードメインは（例えば、クラゲ、サンゴ、およびＡｅｑｕｏｒｉａ、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ、Ｓｔｙｌａｔｕｌａ種からのもののような他の腔腸動物からの）蛍光タンパク質、またはその発光改変体を含む。これらのレポータータンパク質の発光改変体は上記分野で非常によく知られており、天然レポータータンパク質と比較して、より明るく、より暗くすることができ、あるいは異なる励起および／または発光スペクトルを有することができる。例えば、上記分野で知られているように、いくつかの改変体は、それらがもはや緑色には見えず、青色、シアン色、黄色、増強された黄色赤（各々、ＢＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ  ｅＹＦＰおよびＲＦＰという）に見えることができ、または他の発光スペクトルを有するように変化される。他の適当なレポータードメインは、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、および分泌された胚性アルカリ性ホスファターゼのような、生化学または色変化を通じてポリペプチドの存在を報告することができるドメインを含む。
【０３９７】
また上記分野で知られているように、アフィニティータグまたはレポータードメインは注目するポリペプチド中のいずれの位置に存在させることもできる。しかしながら、ほとんどの実施形態において、それは注目するポリペプチドのＣ−またはＮ末端に存在させる。
【０３９８】
（２．注目するＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸）
核酸を操作するための遺伝子暗号および組換え技術、および前記したように注目するＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列は公知であるため、注目するＧＰＣＲポリペプチドをコードする核酸の組換えおよび生産は当業者の十分に技量内のものである。ある実施形態においては、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９９５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第二版，（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）方法が用いられる。例えば、ＧＰＣＲコーディング配列は、本明細書中に記載する必要がない種々の組換え方法のいずれか１つ、またはその組合せを用いてＧＰＣＲコーディング配列のライブラリーから単離することができる。また、タンパク質をコードする核酸配列におけるヌクレオチドの引き続いての置換、欠失および／または付加を標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行うこともできる。
【０３９９】
例えば、部位特異的突然変異誘発およびサブクローニングを用いて、注目するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに核酸残基を導入し／欠失し／置換することができる。他の実施形態においては、ＰＣＲを用いることができる。また、全くオリゴヌクレオチドからの化学適合性によって、注目するポリペプチドをコードする核酸を作製することもできる（例えば、Ｃｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）  ２９７：１０１６−８）。
【０４００】
いくつかの実施形態において、注目するポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種、特に哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長類、またはヒト種の細胞における発現のために最適化させる。いくつかの実施形態においては、注目するポリペプチドをコードする核酸のコドンは、特定の種、特に両生類種の細胞における発現のために最適化される。
【０４０１】
（ａ．ベクター）
本発明は、さらに、対象の核酸を含む（「構築体」ともいう）ベクターを提供する。本発明の多くの実施形態において、対象の核酸配列は、該配列が、例えば、プロモーターを含めた発現制御配列に連結された後、宿主において発現される。また、対象の核酸は、典型的には、エピソームとして、または宿主の染色体ＤＮＡの一体的部分として宿主細胞中で複製することができる発現ベクターに入れられる。通常、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能とするために選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを含む（例えば、ここで引用して援用する米国特許第４，７０４，３６２号参照）。単一およびデュアル発現カセットベクターを含めたベクターは上記分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９９５）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第二版，（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）。適当なベクターはウィルスベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（ヒト人工染色体、細菌人工染色体、酵母人工染色体等）、ミニ−染色体等を含む。レトロウィルス、アデノウイルスおよびアデノ−関連ウィルスベクターを用いることができる。
【０４０２】
細胞中で注目するポリペプチドを生産する目的で、種々の発現ベクターが当業者に入手できる。ある実施形態で用いられる１つの適当なベクターはｐＣＭＶである。このベクターは、特許手続を目的とする微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の規定の下で、１９９８年１０月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託された（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）。該ＤＮＡはＡＴＣＣによってテストされ、生きていると判断された。ＡＴＣＣは以下の受託番号をｐＣＭＶに割り当てた：ＡＴＣＣ＃２０３３５１。
【０４０３】
対象の核酸は、通常、注目する対象のポリペプチドをコードする単一のオープンリーディングフレームを含むが、ある実施形態においては、注目するポリペプチドの発現用の宿主細胞は真核生物細胞、例えば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞であり得るため、オープンリーディングフレームはイントロンによって中断され得る。適当な核酸は、典型的には、対象の核酸に加えて、ＲＮＡの安定性、翻訳効率などを指令することができる３’および５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる転写ユニットの一部である。また、対象の核酸は、注目するポリペプチドの転写および発現を指令するプロモーター、および転写ターミネーターを、対象の核酸に加えて含む発現カセットの一部であってもよい。
【０４０４】
真核生物プロモーターは、ウィルスプロモーター、および真核生物遺伝子に由来するプロモーターを含めた真核生物宿主細胞において機能的であるいずれのプロモーターでもあり得る。例示的真核生物プロモーターは、限定されるものではないが、以下の：マウスメタロチオネインＩ遺伝子配列のプロモーター（Ｈａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８，１９８２）；ヘルペスウィルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５，１９８２）；ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４−３１０，１９８１）；酵母ｇａｌｌ遺伝子配列プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）  ７９：６９７１−６９７５，１９８２；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１：５９５１−５９ＳＳ，１９８４）、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ−１プロモーター、エクジソン−応答性プロモーター、テトラサイクリン−応答性プロモーター等を含む。ウィルスプロモーターは一般には特に強力なプロモーターであるので特に興味深いであろう。ある実施形態においては、標的病原体のプロモーターであるプロモーターが用いられる。本発明で用いるプロモーターは、それが導入される細胞型（および／または動物）で機能的であるように選択される。ある実施形態においては、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。
【０４０５】
ある実施形態においては、対象のベクターは選択マーカーの発現も提供することができる。適当なベクターおよび選択マーカーは上記分野でよく知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第３版，  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９９５））およびＳａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版，（２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．）で議論されている。種々の異なる遺伝子が選択マーカーとして使用されており、選択マーカーとして対象のベクターで使用される特別な遺伝子は便宜のために主として選択される。公知の選択マーカー遺伝子は：チミジンキナーゼ遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、アスパラギンシンターゼ遺伝子、抗生物質抵抗性遺伝子、例えば、ｔｅｔｒ、ａｍｐｒ、Ｃｍｒまたはｃａｔ、ｋａｎｒまたはｎｅｏｒ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子）、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
【０４０６】
前記したように、注目するポリペプチドは、アフィニティードメインおよび／またはレポータードメインを含む融合タンパク質であり得る。例えば、ＧＰＣＲのＣ−またはＮ末端においてレポーターまたはタグおよびＧＰＣＲの間に融合を作製する方法は十分に当業者の技量内のものであり（例えば、ＭｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９  ５６：１１８２−９１；Ｒａｍｓａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００１，３１５−３２３）、さらに記載しない。そのような融合タンパク質は、欠失されたまたは別のアミノ酸で置換されたそのＮ末端メチオニン残基を有するＧＰＣＲとイン−フレーム融合した異種Ｎ末端ドメイン（例えば、エピトープタグ）を含むことができるのは明示的に考えられる。注目するポリペプチドは、まず、天然ポリペプチドから作製することができ、次いで、前記した適当なレポーター／タグに操作可能に連結させることができる。
【０４０７】
対象の核酸は、通常、注目するポリペプチドをコードする核酸の構築を容易とするために制限部位、多数クローニング部位、プライマー結合部位、連結可能末端、組換え部位等を含むこともできる。
【０４０８】
（ｂ．宿主細胞）
本発明は、さらに、対象の核酸を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。適当な宿主細胞は原核生物、例えば、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、ならびに真核生物細胞、例えば、動物細胞（例えば、昆虫、哺乳動物、魚類、両生類、鳥類または爬虫類細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシまたはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ細胞）、真菌細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞）を含む。ある実施形態においては、注目するポリペプチドをコードする核酸を発現するのに適したいずれの細胞も宿主細胞として用いることができる。通常、動物宿主細胞系が用いられ、その例は以下の通りである：サル腎臓細胞（ＣＯＳ細胞）、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶＩ細胞（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５  １）；ヒト胚腎臓細胞（ＨＥＫ−２９３［「２９３」］、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ＨＥＫ−２９３Ｔ［「２９３Ｔ」］細胞；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｐ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７７：４２１６，（１９８０）；シリアンゴールデンハムスター細胞ＭＣＢ３９０１（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９５９５）；マウスｓｅｒｔｏｌｉ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸部癌腫細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）；およびマウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１）。ある実施形態においては、メラノフォアを用いる。メラノフォアは下等脊椎動物で見出される皮膚細胞である。関連する材料および方法は米国特許第５，４６２，８５６号および米国特許第６，０５１，３８６号の開示に従うであろう。これらの特許の開示をここで引用してその全体を援用する。さらなる細胞系は当業者に明らかであり、広く種々の細胞系がＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９から入手できる。
【０４０９】
（Ｂ．候補化合物のスクリーニング）
（１．遺伝的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
Ｇタンパク質レセプターが活性となると、それはＧタンパク質（例えば、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｚ）に結合し、ＧＴＰのＧタンパク質への結合を刺激する。次いで、Ｇタンパク質はＧＴＰａｓｅとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰにゆっくりと加水分解し、それにより、正常な条件下では、レセプターは脱活性化されるようになる。しかしながら、活性化されたレセプターはＧＤＰをＧＴＰに変化させ続ける。ＧＴＰの非−加水分解性アナログ（３５Ｓ）ＧＴＰγＳを用いて、活性化されたレセプターを発現する膜への増強された結合をモニターすることができる。（３５Ｓ）ＧＴＰγＳを用いて、リガンドの不存在下および存在下において膜へのＧタンパク質カップリングをモニターすることができる、と報告されている。とりわけ、当業者によく知られかつ入手可能なこのモニタリングの例は、１９９５年にＴｒａｙｎｏｒおよびＮａｈｏｒｓｋｉによって報告された。このアッセイシステムの好ましい使用は候補化合物の最初のスクリーニングである。なぜならば、該システムは、レセプターの細胞内ドメインと相互作用する特定のＧタンパク質にかかわらず、全てのＧタンパク質共役型レセプターに一般に適用できるためである。
【０４１０】
（２．特異的ＧＰＣＲスクリーニングアッセイ技術）
「ジェネリック」Ｇタンパク質共役型レセプターアッセイ（すなわち、アゴニスト、逆アゴニストまたはアンタゴニストである化合物を選択するためのアッセイ）を用いて一旦候補化合物が同定されれば、いくつかの実施形態においては、レセプター部位に該化合物が相互作用したことを確認するためのさらなるスクリーニングが好ましい。例えば、「ジェネリック」アッセイによって同定された化合物はレセプターに結合しないであろうが、その代わり、細胞内ドメインからのＧタンパク質を単に「カップリング解除」させることができる。
【０４１１】
別の実施形態において、限定されるものではなくその例として、前記で提供される「特異的」Ｇタンパク質共役型レセプターアッセイを用いて候補化合物を、初期スクリーニングを介して同定することができる。
【０４１２】
（ａ．Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｏおよびＧｚ）
Ｇｓは酵素アデニリルシクラーゼを刺激する。他方、Ｇｉ（およびＧｚおよびＧｏ）はアデニリルシクラーゼを阻害する。アデニリルシクラーゼはＡＴＰのｃＡＭＰへの変換を触媒し；かくして、Ｇｓタンパク質にカップリングする活性化されたＧＰＣＲはｃＡＭＰの増大した細胞レベルと関連する。他方、Ｇｉ（またはＧｚ、Ｇｏ）タンパク質にカップリングする活性化されたＧＰＣＲはｃＡＭＰの減少した細胞レベルに関連する。一般に、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）参照。かくして、ｃＡＭＰを検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、レセプターに対して逆アゴニストであるかを決定することができる（すなわち、そのような化合物はｃＡＭＰのレベルを減少させるであろう）。ｃＡＭＰを測定するための上記分野で知られた種々のアプローチを利用することができ；いくつかの実施形態においては、好ましいアプローチはＥＬＩＳＡベースのフォーマットでの抗ｃＡＭＰ抗体の使用に頼る。利用できるもう１つのタイプのアッセイは全細胞二次メッセンジャーレポーターシステムアッセイである。遺伝子に対するプロモーターは特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。環状ＡＭＰは、次いで、ｃＡＭＰ応答エレメントと呼ばれる特異的部位におけるプロモーターに結合し、遺伝子の発現を駆動するｃＡＭＰ−応答性ＤＮＡ結合タンパク質または転写因子（ＣＲＥＢ）の結合を促進することによって遺伝子発現を駆動する。レポーター遺伝子、例えば、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ前に多数のｃＡＭＰ応答エレメントを含有するプロモーターを有するレポーターシステムを構築することができる。かくして、活性化されたＧｓ−連結レセプターは、次いで、遺伝子を活性化するｃＡＭＰの蓄積、およびレポータータンパク質の発現を引き起こす。次いで、標準的な生化学アッセイ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５）を用いて、β−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質を検出することができる。
【０４１３】
（ｂ．Ｇｑ）
Ｇｑは酵素ホスホリパーゼＣの活性化に関連し、これは、今度は、リン脂質ＰＩＰ２を加水分解し、２つの細胞内メッセンジャー：ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）を放出する。ＩＰ３の増加した蓄積はＧｑ−およびＧｏ−関連レセプターの活性化に関連する。一般に、「Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ」，第８章，Ｆｒｏｍ  Ｎｅｕｒｏｎ  Ｔｏ  Ｂｒａｉｎ（第３版）  Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ編，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）参照。ＩＰ３蓄積を検出するアッセイを利用して、候補化合物が、例えば、Ｇｑ関連レセプターに対する逆アゴニストであるかを決定することができる（すなわち、そのような化合物はＩＰ３のレベルを低下させるであろう）。また、Ｇｑ−関連レセプターを、Ｇｑ−依存性ホスホリパーゼＣがＡＰ１エレメントを含有する遺伝子の活性化を引き起こす点で、ＡＰ１レポーターアッセイを用いて調査することができ；かくして、活性化されたＧｑ−関連レセプターはそのような遺伝子の発現の増加の証拠となり、それにより、それに対する逆アゴニストはそのような発現の減少の証拠となり、およびアゴニストはそのような発現の増加の証拠となる。そのような検出のための商業的に入手可能なアッセイが利用できる。
【０４１４】
（３．ＧＰＣＲ融合タンパク質）
逆アゴニストまたはアゴニストの直接的同定用の候補化合物のスクリーニングで用いられる内因性の構成的に活性なＧＰＣＲまたは非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲの使用は、定義により、レセプターはそれに結合した内因性リガンドの不存在下においてでさえ活性化である点で、興味深いスクリーニング挑戦を提供する。かくして、そのような化合物が逆アゴニストまたはアゴニストであり得るか、あるいはそのようなレセプターに対して効果を有しないか否かに関する理解を可能とするためのそのような差別化を目的として、候補化合物の存在下における非−内因性レセプターおよびその化合物の不存在下における非−内因性レセプターの間を区別するために、いくつかの実施形態においては、そのような区別を増強することができるアプローチを利用するのが好ましい。いくつかの実施形態において、好ましいアプローチはＧＰＣＲ融合タンパク質の使用である。
【０４１５】
一般に、一旦、前記したアッセイ技術（ならびに当業者に知られた技術）を用いて非−内因性ＧＰＣＲが構成的に活性化されると判断されれば、内因性ＧＰＣＲにカップリングする圧倒的なＧタンパク質を決定することが可能である。Ｇタンパク質のＧＰＣＲへのカップリングは、評価することができるシグナリング経路を提供する。いくつかの実施形態においては、哺乳動物発現系を用いてスクリーニングを行うのが好ましい。というのは、そのようなシステムは内因性Ｇタンパク質をその中に有すると期待されるためである。かくして、定義によると、そのようなシステムにおいては、非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲは連続的にシグナルを発するであろう。いくつかの実施形態においては、このシグナルは、例えば、レセプターに対する逆アゴニストの存在下で、特に、それが逆アゴニストと接触した場合にレセプターとの間で、スクリーニングの関係で、より容易に区別できるようであるようにこのシグナルが増強されるのが好ましい。
【０４１６】
ＧＰＣＲ融合タンパク質は、非−内因性ＧＰＣＲとのＧタンパク質カップリングの効率を高めることを意図する。ＧＰＣＲ融合タンパク質は、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲ、または非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲいずれかでのスクリーニングで好ましい。なぜならば、そのようなアプローチはそのようなスクリーニング技術で生じるシグナルを増加させるためである。これは有意な「ノイズに対するシグナル」比率を促進するのに重要であり；そのような有意な比率は、本明細書中に開示された候補化合物のスクリーニングで好ましい。
【０４１７】
ＧＰＣＲ融合タンパク質の発現にいうような構築体の構築は、当業者の技量内のものである。商業的に入手可能な発現ベクターおよびシステムは、調査者の特定の要求にフィットできる種々のアプローチを提供する。そのようなＧＰＣＲ融合タンパク質構築体の構築における重要な基準は、限定されるものではないが、ＧＰＣＲ配列およびＧタンパク質配列が共にイン−フレームであること（好ましくは、内因性ＧＰＣＲについての配列はＧタンパク質配列の上流にある）、およびＧＰＣＲの「停止」コドンが、ＧＰＣＲの発現に際して、Ｇタンパク質も発現できるように欠失されるか、または置き換えられていることも含む。ＧＰＣＲはＧタンパク質に直接連結させることができるか、あるいは２つ（好ましくは、この数は当業者によって容易に確認できるが約１２以下）の間にスペーサー残基があり得る。便宜に基づき、スペーサーを用いるのが好ましい。いくつかの実施形態において、非−内因性ＧＰＣＲにカップリングするＧタンパク質はＧＰＣＲ融合タンパク質構築体の創製に先立って同定されているのが好ましい。同定されているＧタンパク質は数個に過ぎない故に、Ｇタンパク質の配列を含む構築体（すなわち、ユニバーサルＧタンパク質構築体、後記実施例４（ａ）参照）は内因性ＧＰＣＲ配列のその中への挿入のために利用できるのが好ましい；これは、異なる配列を有する種々の異なる内因性ＧＰＣＲの大規模なスクリーニングの関係でさらなる効率を提供する。
【０４１８】
前記したように、Ｇｉ、ＧｏおよびＧｚにカップリングする活性化されたＧＰＣＲは、これらのタイプのＧＰＣＲ挑戦に基づいてｃＡＭＰ作製アッセイの形成を阻害すると予測される［すなわち、ｃＡＭＰシグナルは活性化に際して減少し、かくして、例えば、（さらにこのシグナルを減少させるであろう）アゴニストの挑戦の直接的同定を行う］。本明細書中で開示するように、これらのタイプのレセプターについて、精力的なシクラーゼ−ベースのアッセイを確立する努力において、ＧＰＣＲの内因性Ｇタンパク質に基づかないＧＰＣＲ融合タンパク質を創製するのが可能である。かくして、例えば、内因性Ｇｉ共役型レセプターをＧｓタンパク質に融合させることができ−そのような融合構築体は、発現に際して、内因性ＧＰＣＲが、シクラーゼ−ベースのアッセイを確立することができるように、「天然」Ｇｉタンパク質よりはむしろ例えば、Ｇｓとカップリングするように「駆動する」または「強いる」。かくして、Ｇｉ、ＧｏおよびＧｚ共役型レセプターについては、いくつかの実施形態において、ＧＰＣＲ融合タンパク質を用い、アッセイがアデニリルシクラーゼ活性の検出に基づく場合には、融合構築体がＧｓ（酵素アデニリルシクラーゼの形成を刺激する同等のＧタンパク質）で確立されるのが好ましい。
【０４１９】
【表２】
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同等に効果的なのは、Ｇｓ、Ｇｉ、ＧｏまたはＧｚタンパク質と融合したＧｑタンパク質を利用するＧタンパク質融合構築体である。いくつかの実施形態において、好ましい融合構築体はＧｑタンパク質で達成することができ、ここで、Ｇタンパク質α−サブユニット（「Ｇαｑ」）の最初の６つのアミノ酸は欠失されており、ＧαｑのＣ末端における最後の５つのアミノ酸は注目するＧタンパク質のＧαの対応するアミノ酸で置き換えられている。例えば、融合構築体は、Ｇｉタンパク質と融合したＧｑ（６アミノ酸欠失）を有することができ、これは、「Ｇｑ／Ｇｉ融合構築体」がもたらされる。この融合構築体は、内因性Ｇｉ共役型レセプターが、二次メッセンジャー、例えば、イノシトール三リン酸またはジアシルグリセロールがｃＡＭＰ生産の代わりに測定できるようにその非−内因性Ｇタンパク質のＧｑにカップリングさせるであろう。
【０４２０】
（４．シグナル−エンハンサーＧｓ共役型ＧＰＣＲでの標的Ｇｉ共役型ＧＰＣＲの共トランスフェクション（ｃＡＭＰベースのアッセイ））
Ｇｉ共役型レセプターはアデニリルシクラーゼを阻害し、従って、ｃＡＭＰ生産のレベルを減少させ、これはｃＡＭＰレベルの挑戦の評価をなすことができることが知られている。いくつかの実施形態においては、活性化に際して圧倒的にＧｉにカップリングするレセプターの活性化の指標としてｃＡＭＰの生産の減少を測定する効果的な技術は、シグナルエンハンサー、例えば、活性化に際してＧｓと圧倒的にカップリングする非−内因性の構成的に活性化されたレセプター（例えば、ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ；前記参照）を、Ｇｉ連結ＧＰＣＲで共トランスフェクトすることによって達成することができる。明らかなように、Ｇｓ共役型レセプターの活性化は、ｃＡＭＰの生産の増加に基づいて決定することができる。Ｇｉ共役型レセプターの活性化は、ｃＡＭＰ生産の減少に導く。かくして、共トランスフェクションアプローチはこれらの「反対」効果を有利に開発することを意図する。例えば、発現ベクター単独での、非−内因性の構成的に活性化されたＧｓ共役型レセプター（「シグナルエンハンサー」）の共トランスフェクションはベースラインｃＡＭＰシグナルを生じる（すなわち、Ｇｉ共役型レセプターはｃＡＭＰレベルを減少させるが、これは、構成的に活性化されたＧｓ共役型シグナルエンハンサーによって確立されたｃＡＭＰレベルの実質的増加に対するものである）。次いで、シグナルエンハンサーを「標的レポーター」で共トランスフェクトすることによって、Ｇｉ共役型標的レセプターの逆アゴニストは測定されたｃＡＭＰシグナルを増加させ、他方、Ｇｉ共役型標的レセプターのアゴニストはこのシグナルを減少する。
【０４２１】
このアプローチを用いて直接的に同定された候補化合物を独立して評価して、これらがシグナル増強レセプターを標的化しないことを確認すべきである（これは、共トランスフェクトされたレセプターに対するスクリーニングに先立って、またはその後に行うことができる）。
【０４２２】
（Ｃ．医療化学）
（候補化合物）
上記分野で知られたいずれの分子も、本発明のＧＰＣＲの活性を調節する（増加させる、または減少させる）その能力につきテストすることができる。活性を調節する化合物を同定するためには、候補化合物を、レセプターを発現する細胞に直接的に供することができる。
【０４２３】
本発明のこの実施形態は、レセプターの量または活性を調節する、例えば、阻害する、拮抗するまたは作動する分子についての化学的ライブラリーをスクリーニングするのによく適合する。化学的ライブラリーはペプチドライブラリー、ペプチドミメティックライブラリー、化学的に合成されたライブラリー、組換えの、例えば、ファージ提示ライブラリー、およびインビトロ翻訳−ベースのライブラリー、他の非ペプチド合成有機ライブラリー等であり得る。本発明のこの実施形態は、限定されるものではないが、血漿および組織抽出物を含めた生物学的物質を含む内因性候補化合物をスクリーニングし、生物学的活性を有することが知られた内因性化合物のライブラリーをスクリーニングするのにもよく適合する。
【０４２４】
いくつかの実施形態において、候補化合物の直接的同定は、コンビナトーリアル化学技術を介して精製させた化合物と組み合わせて行われ、それにより、何千もの化合物がそのような分析のためにランダムに調製される。候補化合物は化学ライブラリーのメンバーであり得る。これはいずれかの便宜な数の個々のメンバー、例えば、数十〜数百〜数千〜数百万の適当な化合物、例えば、ペプチド、ペプトイドおよび他のオリゴマー化合物（環状または線状）、および鋳型−ベースのより小さな分子、例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ビアリール、炭素環および多環化合物（例えば、ナフタレン、フェノチアジン、アクリジン、ステロイド等）、炭水化物およびアミノ酸誘導体、ジヒトドピリジン、ベンズヒドリルおよび複素環（例えば、トリジン、インドール、チアゾリジン等）を含むことができる。引用した数およびリストした化合物のタイプは例示的であって、限定するものではない。好ましい化学ライブラリーは低分子量の化学化合物および潜在的治療剤を含む。
【０４２５】
例示的化学ライブラリーはいくつかの源（ＡｒＱｕｌｅ、Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ、ＣｈｅｍＤｅｓｉｇｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）から商業的に入手可能である。いくつかの場合において、これらの化学ライブラリーは、それに対してメンバー化合物が結合し、かくして、効果的なモジュレーターである分子の直接的かつ即座の同定を可能とする基材上の各メンバーのライブラリーの同一性をコードするコンビナトーリアル戦略を作り出される。かくして多くのコンビナトーリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上の位置はその化合物の組成を特定する。また、１つの例においては、単一のプレート位置は、注目する相互作用を含むウェルへの投与によってスクリーニングすることができる１〜２０の化学物質を有することができる。かくして、もし調節が検出されれば、相互作用対のより徐々により小さくするプールを調節活性につきアッセイすることができる。そのような方法によって、多くの候補分子をスクリーニングすることができる。
【０４２６】
用いるのに適した多くの多様なライブラリーは上記分野で知られており、それを用いて、本発明にしたがってテストすべき化合物を提供することができる。別法として、ライブラリーは標準的な方法を用いて構築することができる。さらに、より一般的で構造的に拘束された有機性の多様な（例えば、非ペプチド）ライブラリーを用いることもできる。その例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２）を用いることができる。
【０４２７】
本発明のもう１つの実施形態において、コンビナトーリアル化学を用いて、本発明のＧＰＣＲのモジュレーターを同定することができる。コンビナトーリアル化学は、その多くが構造的に同様であり得る数十万の化合物を含有するライブラリーを作り出すことができる。高スループットスクリーニングプログラムは既知の標的に対する親和性につきこれらの膨大なライブラリーをスクリーニングすることができるが、より小さなジメンションのライブラリーを達成するが、最大の化学的多様性を提供する新しいアプローチが開発されている（例えば、Ｍａｔｔｅｒ，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０  １２１９−１２２９参照）。
【０４２８】
コンビナトーリアル化学、アフィニティーフィンガープリンティングの１つの方法は、タンパク質の規定されたパネルに対する結合親和性につき低分子の区別されるライブラリーをテストするのに従前用いられてきた。スクリーニングによって得られたフィンガープリントを用いて、注目する他のタンパク質またはレセプター（本発明においては、本発明のレセプター）に対する個々のライブラリーメンバーの親和性を予測する。フィンガープリントを、注目するタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られたフィンガープリントと比較して、ライブラリー化合物が同様に反応するか否かを予測する。例えば、複合体またはタンパク質成分との相互作用についての大きなライブラリー中の各リガンドをテストするよりはむしろ、その活性を有することが知られている他の化合物と同様なフィンガープリントを有するリガンドのみをテストすることができよう（例えば、Ｋａｕｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ，１９９５，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．  ８：２５−２８；およびＫａｕｖａｒ，Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．Ｌ．Ｓｔａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｓｋｅｒｒｉｔｔ．Ｅｄｉｔｏｒｓ，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５−３１２参照。）。
【０４２９】
（モジュレーターとして同定された候補化合物）
一般に、そのようなスクリーニングの結果はユニークなコア構造を有する化合物であろう；然る後、これらの化合物を好ましいコア構造（類）の周りの追加の化学的修飾に付して、その医学的特性をさらに増強することができる。そのような技術は当業者に知られており、本特許処理においては詳細には取り扱わない。
【０４３０】
いくつかの実施形態において、該同定されたモジュレーターは生物学的に入手可能である。当業者に利用可能な多数の計算アプローチが、薬物の経口生物学的利用性の予測のために開発されている［Ｏｏｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２００２）１５８７：１１８−２５；Ｃｌａｒｋ  ＆  Ｇｒｏｏｔｅｎｈｕｉｓ，Ｃｕｒｒ  ＯｐｉｎＤｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖｅｌ（２００２）５：３８２−９０；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｃｈｅｍ  （２００２）２３：１７２−８３；Ｎｏｒｉｎｄｅｒ  ＆  Ｈａｅｂｅｒｌｅｉｎ，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ（２００２）５４：２９１−３１３；Ｍａｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ（２００１）］  ４：４５３−７５；Ｐｏｄｌｏｇａｒ  ＆  Ｍｕｅｇｇｅ，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ（２００１）  １：２５７−７５；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］。さらに、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）が、非ヒト霊長類およびヒト身体を含めた薬物の経口投与後に、哺乳動物身体中での経口生物学的利用性の評価を含めた薬物分布の直接的測定を得るのに多数のグループによって成功して用いられてきた［Ｎｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ（２００３）４４：１０５−８；Ｇｕｌｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  （２００２）２９：１０３１−８；Ｋａｎｅｒｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  （１９９９）  １４５：７６−８１；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］。また、実施例１８を含め、後記参照。
【０４３１】
（Ｄ．薬学的組成物）
本発明は、治療上有効量の本発明のモジュレーターを治療（または予防）を必要とする個体に投与することによる治療（および予防）の方法を提供する［また、例えば、２００２年８月２９日にＷＯ  ０２／０６６５０５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１参照；その開示をここで引用してその全体を援用する］。好ましい局面において、モジュレーターは精製されている。該個体は、好ましくは、限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウスなどを含めた動物であり、好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０４３２】
本発明のモジュレーターは、単独で、あるいは当業者によく知られた技術を用いて適当なキャリアまたは賦形剤と混合される場合には薬学的または生理学的に受容可能な組成物にて非ヒト動物（後記実施例参照）および／またはヒトに投与することができる。適当な薬学的に受容可能なキャリアは当業者に入手可能である；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，１９８０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，（Ｏｓｌｏ  ｅｔ  ａｌ．編）参照。
【０４３３】
次いで、薬学的または生理学的に受容可能な組成物を治療上効果的な用量で供する。治療上効果的な用量とは、心臓病の兆候または生理学的状態の予防または軽減をもたらすのに十分なモジュレーターの量をいう。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋症、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺性心、リウマチ性心疾患、および心室機能障害を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全症、大動脈弁狭窄、大動脈弁逸脱、僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大型心筋症、鬱血性心筋症、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、拘束型心筋症、シャガス心筋症を含む心筋障害を含む。他の実施形態において、治療上有効な用量とは、心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎、および家族性肥大型心筋症からなる群より選択される障害に由来する肥大型心筋症の兆候または生理学的状態の予防または軽減をもたらすのに十分なモジュレーターの量をいう。いくつかの実施形態において、治療上有効な用量とは、鬱血性心臓機能障害の兆候または生理学的状態の予防または軽減をもたらすのに十分なモジュレーターの量をいう。先天性心臓欠陥は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺動脈中隔欠損、ファロー三徴症、心室中隔欠損症、および家族性肥大型心筋症を含む。いくつかの実施形態において、治療上有効な用量は、肥大した心臓と共に提示される障害の兆候または生理学的状態の予防または軽減をもたらすのに十分なモジュレーターの量をいう。
【０４３４】
本発明のモジュレーターは、単独で、または他の薬学的または生理学的に受容可能な化合物と組み合わせて供することができると明示的に考えられる。本発明の障害の治療用の他の化合物は現在上記分野でよく知られている。本発明の１つの局面は、さらに、カプトプリル、エナラプリルマレイン酸塩、リニノプリル、ラミプリル、ペリンドプリル、フロセミド、トラセミド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、アミロライド塩酸塩、スピロノラクトン、アテノロール、ビソプロロール、カルベジロール、メトプロロール酒石酸塩、およびジロキシンからなる群より選択される１以上の剤を含む本明細書中に開示された実施形態に従う使用を含む。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋症、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺性心、リウマチ性心疾患、および心室機能障害を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全症、大動脈弁狭窄、大動脈弁逸脱、僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大型心筋症、鬱血性心筋症、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、拘束型心筋症、シャガス心筋症を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は血行動態または遺伝性疾患に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は、心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎および家族性肥大型心筋症からなる群より選択される障害に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は先天性心臓欠陥である。先天性心臓欠陥は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺動脈中隔欠損、ファロー三徴症、心室中隔欠損症、および家族性肥大型心筋症を含む。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は肥大した心臓と共に提示される障害である。
【０４３５】
（投与の経路）
適当な投与の経路は、上記分野で知られた方法を用いる、経口、鼻腔内、直腸、経粘膜、または腸投与、筋肉内、皮下、髄質内注射を含めた非経口送達、ならびにクモ膜下腔、直接的心室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、肺内（吸入）または眼内注射を含む。他の特に好ましい投与経路はエアロゾルおよびデポ処方である。本発明の医薬の徐放性処方、特にデポ剤は明示的に考えられる。いくつかの実施形態において、投与の経路は経口である。
【０４３６】
（組成物／処方）
本発明に従って用いられる薬学的または生理学的に受容可能な組成物および医薬は、賦形剤および補助剤を含む１以上の生理学的に受容可能なキャリアを用いて便宜な方法で処方することができる。適切な処方は選択された投与の経路に依存する。
【０４３７】
本明細書中に記載されたある種の医薬は薬学的または生理学的に受容可能なキャリアおよび少なくとも１つの本発明のモジュレーターを含むであろう。注射のためには、本発明の剤は水性溶液、好ましくは、ハンクスの溶液、リンゲル液のような生理学的適合する緩衝液、またはリン酸または炭酸水素塩緩衝液のような生理食塩水中に処方することができる。経粘膜投与のためには、浸透させるべきバリアに対して適切な浸透剤を処方で用いる。そのような浸透剤は一般に上記分野で知られている。
【０４３８】
経口により摂取することができる薬学的または生理学的に受容可能な製剤はゼラチンで作製されたプッシュ−フィットカプセル、ならびにゼラチン、およびグリセロールまたはソルビトールのような可塑剤で作製されたソフトなシールされたカプセルを含む。該プッシュ−フィットカプセルはラクトースのような充填剤、澱粉のようなバインダーおよび／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤および、所望により、安定化剤と混合した有効成分を含むことができる。ソフトカプセルにおいては、活性な化合物を脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールのような適当な液体に溶解または懸濁させることができる。また、安定剤も添加できる。経口投与のための全ての処方はそのような投与に適当な用量であるべきである。
【０４３９】
バッカル投与では、組成物は慣用的に処方された錠剤またはロゼンジの形態を取ることができる。
【０４４０】
吸入による投与では、本発明に従って用いられる化合物は、便宜には、適当な気体状プロペラント、例えば、二酸化炭素を用い、ネビュライザー用の圧縮パックからエアロゾルスプレーの形態で送達される。圧縮エアロゾルの場合には、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを供することによって決定することができる。吸入器または散布器で用いられる、例えば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、化合物およびラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基剤の粉末ミックスを含有するように処方することができる。
【０４４１】
化合物は注射によって、例えば、ボーラス注射または連続的注入による非経口投与用に処方することができる。注射のための処方は、例えば、保存剤を加えたアンプルまたは多用量容器中で単位投与量にて供すことができる。組成物は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態を取ることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。
【０４４２】
非経口投与のための薬学的または生理学的に受容可能な処方は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。水性懸濁液はナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を増加させる物質を含有することができる。所望により、懸濁液は、適当な安定化剤、あるいは高度に濃縮された溶液の調製を可能とするための化合物の溶解度を増加させる剤を含有することもできる。
【０４４３】
別法として、有効成分は、滅菌されたパイロジェン−フリー水のような適当なビヒクルでの使用前の復元のために粉末または凍結乾燥形態とすることができる。
【０４４４】
前記した処方に加えて、化合物はデポ製剤として処方することもできる。そのような長期作用処方は移植によって（例えば、皮下または筋肉内）、あるいは筋肉内注射によって投与することができる。かくして、例えば、化合物は（例えば、に受容可能な油中のエマルジョンとして）適当なポリマーまたは疎水性物質、またはイオン交換樹脂とで、あるいは貧溶解性誘導体、例えば、貧溶解性塩として処方することができる。
【０４４５】
特別な実施形態において、化合物は制御放出系を介して送達することができる。１つの実施形態において、ポンプを用いることができる（Ｌａｎｇｅｒ，前掲；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９）。もう１つの実施形態において、ポリマー物質を用いることができる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ編，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，  Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ編，  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：８５８−８６３）。他の制御放出系はＬａｎｇｅｒによってレビューで考察されている（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）。
【０４４６】
加えて、化合物は、治療剤を含有する固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスのような徐放系を用いて送達することができる。種々の徐放物質が確立されており、当業者によく知られている。徐放カプセルは、その化学的性質に応じて、数週間から１００日以上まで化合物を放出することができる。
【０４４７】
治療剤の化学的性質、および生物学的安定性に応じて、モジュレーター安定化のためのさらなる戦略を使用することができる。
【０４４８】
また、薬学的または生理学的に受容可能な組成物は適当な固体またはゲル相キャリアまたは賦形剤を含むこともできる。そのようなキャリアまたは賦形剤の例は、限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールのようなポリマーを含む。
【０４４９】
（効果的な投与量）
本発明で用いるのに適した薬学的または生理学的に受容可能な組成物は、有効成分がその意図した目的を達成するのに十分な量で含有された組成物を含む。より具体的には、治療上有効量は、治療すべき対象の現存する兆候の進展を予防し、またはそれを軽減するのに十分な量を意味する。効果的な量の決定は、特に、本明細書中に提供された詳細な開示に徴して当業者の能力の範囲内のものであろう。
【０４５０】
本発明の方法で用いるいずれの化合物についても、治療上有効な用量は細胞培養アッセイからまず見積もることができる。例えば、用量は、インビトロ系で細胞死滅−保護的であることが示された濃度点または範囲を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルで処方することができる（例えば、インビトロアッセイおよびインビボ動物モデルについては後記参照）。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量を用いてより正確に決定することができる。
【０４５１】
治療上有効な用量とは、患者において兆候の軽減をもたらす化合物の量をいう。そのような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（テスト集団の５０％にとって致死的な用量）およびＥＤ５０（テスト集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的な医薬手法によって決定することができる。毒性効果および治療効果の間の用量比率は治療指標であり、それは、ＬＤ５０およびＥＤ５０の間の比率として表すことができる。高い治療指数を示した化合物が好ましい。
【０４５２】
これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトで用いる投与量の範囲を処方するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんど無いまたは全く無い、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。該投与量は、使用する投与形態および利用する投与の経路に応じてこの範囲内で変化させることができる。正確な処方、投与の経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の意志によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，  Ｃｈ．１参照）。  
【０４５３】
投与の量および間隔は、特定の状況に応じて、本発明の障害を予防または治療するのに十分な活性化合物の血漿中レベルを供するように個々に調整することができる。これらの効果を達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与の経路に依存するであろう。
【０４５４】
また、投与の間隔は、最小有効濃度についての値を用いて決定することもできる。化合物は、血漿中レベルを上記時間の１０〜９０％の間、好ましくは３０〜９９％の間、最も好ましくは５０〜９０％の間、最小有効濃度上のレベルに維持する方法を用いて投与すべきである。局所投与または選択的摂取の場合には、薬物の有効な局所濃度は血漿中濃度には無関係であろう。
【０４５５】
投与される組成物の量は、勿論、治療すべき対象、対象の重量、疾患の重傷度、投与の方法、および主治医の判断に依存するであろう。
【０４５６】
所望の効果、本発明の障害の予防または治療を達成するために日または正規のベースに基づいて投与することができる本発明のモジュレーターの量についての好ましい投与量範囲は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投与量範囲は０．１〜３０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投与量範囲は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の好ましい投与量範囲は０．１〜３．０ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、これらの日投与量は、１日の間に周期的に少量ずつ送達または投与することができる。これらの投与量範囲は好ましい範囲に過ぎず、本発明で限定するつもりではないことに注意されたし。いくつかの実施形態において、本発明の該疾患は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋症、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺性心、リウマチ性心疾患、および心室機能障害を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全症、大動脈弁狭窄、大動脈弁逸脱、僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大型心筋症、鬱血性心筋症、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、拘束型心筋症、シャガス心筋症を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は血行動態または遺伝性疾患に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎、および家族性肥大型心筋症からなる群より選択される障害に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は、先天性心臓欠陥である。先天性機能障害は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺動脈中隔欠損、ファロー三徴症、心室中隔欠損症、および家族性肥大型心筋症を含む。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は、肥大した心臓と共に提示される障害である。
【０４５７】
（Ｅ．治療の方法）
本発明は、本発明のモジュレーターでの上記治療を必要とする個体に供することを含む、本発明の障害を予防または治療する方法にとりわけ向けられる。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は心臓病である。心臓病は、限定されるものではないが、鬱血性心不全、鬱血性心筋症、心肥大、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔破裂、（細菌を含めた）心内膜炎、心臓動脈瘤、肺性心、リウマチ性心疾患、および心室機能障害を含む。また、心臓病は限定されるものではないが、大動脈弁不全症、大動脈弁狭窄、大動脈弁逸脱、僧帽弁逸脱、三尖弁逸脱、僧帽弁閉鎖不全、僧帽弁狭窄、および三尖弁狭窄を含む心臓弁疾患を含む。心臓病は、さらに、限定されるものではないが、肥大型心筋症、鬱血性心筋症、大動脈弁下狭窄、肺弁下狭窄、拘束型心筋症、シャガス心筋症を含む心筋障害を含む。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は血行動態または遺伝性疾患に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎、および家族性肥大型心筋症からなる群より選択される障害に由来する肥大型心筋症である。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は、先天性心臓欠陥である。先天性機能障害は、限定されるものではないが、大動脈縮窄、大動脈肺動脈中隔欠損、ファロー三徴症、心室中隔欠損症、および家族性肥大型心筋症を含む。いくつかの実施形態において、本発明の該障害は、肥大した心臓と共に提示される障害である。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該モジュレーターは経口的に生物学的利用可能である。いくつかの実施形態において、モジュレーターは経口的に摂取される薬学的組成物にて個体に供される。好ましくは、個体は哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０４５８】
（Ｆ．他の用途）
ＲＵＰ４０レセプターの機能を調節する（すなわち、増加させる、減少させる、またはブロックする）剤は、候補化合物をＲＵＰ４０レセプターと接触させ、ＲＵＰ４０レセプターの機能に対する候補化合物の効果を測定することによって同定することができる。ＲＵＰ４０レセプターの機能を調節する化合物の選択性は、ＲＵＰ４０レセプターに対する効果を、ＲＵＰ４０以外の複数のＧタンパク質共役型レセプターに対するその効果と比較することによって見積もることができる。いくつかの実施形態において、内因性ヒトＲＵＰ４０レセプターの機能を調節する化合物の選択性は、内因性ヒトＲＵＰ４０レセプターに対する効果を、ＲＵＰ４０以外の複数の内因性ヒトＧタンパク質共役型レセプターに対するその効果と比較することによって見積もることができる。ＲＵＰ４０レセプターの機能を調節する化合物の同定に続き、そのような候補化合物は、さらに、限定されるものではないが、インビボモデルを含めた他のアッセイでテストして、それらの活性を確認または定量することができる。ＲＵＰ４０レセプターの機能のモジュレーターは、正常または異常ＲＵＰ４０レセプター機能が関連する病気および生理学的状態の予防または治療で治療上有用である。
【０４５９】
心血管障害のモジュレーターである（すなわち、それを増加させ、減少させ、またはブロックする）剤は、候補化合物をＲＵＰ４０レセプターと接触させ、ＲＵＰ４０レセプターの機能に対する候補化合物の効果を測定することによって同定することができる。ＲＵＰ４０レセプターの機能を調節する化合物の選択性は、ＲＵＰ４０レセプターに対するその効果を、ＲＵＰ４０以外の複数のＧタンパク質共役型レセプターに対するその効果を比較することによって見積もることができる。いくつかの実施形態において、内因性ヒトＲＵＰ４０レセプターの機能を調節する化合物の選択性は、内因性ヒトＲＵＰ４０レセプターに対するその効果を、ＲＵＰ４０以外の複数の内因性ヒトＧタンパク質共役型レセプターに対するその効果を比較することによって見積もることができる。ＲＵＰ４０レセプターの機能を調節する化合物の同定に続き、そのような候補化合物は、さらに、限定されるものではないがインビボモデルを含めた他のアッセイでテストして、それらの活性を確認または定量することができる。ＲＵＰ４０レセプターの機能のモジュレーターは、肥大型心筋症および鬱血性心不全、特に、心筋梗塞後リモデリング、心臓弁疾患、持続した心後負荷、心筋炎、および家族性肥大型心筋症に由来する肥大型心筋症を含めた心臓病の予防または治療で治療的に有用である。
【０４６０】
他の実施形態においては、心臓病のモジュレーターである（すなわち、それを増加させ、減少させ、またはブロックする）剤は、候補化合物をＲＵＰ４０レセプターと接触させ、次いで、ＲＵＰ４０レセプター発現に対する候補化合物の効果を測定することによって同定することができる。いくつかの実施形態において、該剤は細胞においてＲＵＰ４０レセプターの発現を低下させる。いくつかの実施形態において、該剤は心筋細胞においてＲＵＰ４０レセプターの発現を低下させる。いくつかの実施形態において、該剤はヒト心筋細胞においてＲＵＰ４０レセプターの発現を低下させる。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０レセプターは細胞または心筋細胞によって内因的に発現される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０レセプター発現のレベルは抗−ＲＵＰ４０レセプター抗体を用いて測定される。限定されるものではなく例として、抗−ＲＵＰ４０レセプター抗体は実施例１２に記載されたものであり得る。当業者であれば、細胞におけるＲＵＰ４０発現のレベルを測定するのに用いることができるヒト、ラットまたはマウスＲＵＰ４０レセプターに対する抗体を生産する能力が保証される。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０レセプター発現のレベルは、ＲＵＰ４０レセプターに特異的な放射性標識リガンドを用いて測定される（後記参照）。いくつかの実施形態において、ＲＵＰ４０レセプター発現のレベルはノーザンブロットまたはＲＴ−ＰＣＲによって測定される。
【０４６１】
また、本発明は、候補化合物が細胞においてＲＵＰ４０レセプターの発現を低下させる剤であるか否かを同定する方法に関し、該方法は：
（ａ）ＲＵＰ４０レセプターを含む複数の細胞を候補化合物と接触させ、または接触させず；
（ｂ）候補化合物と接触させた細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベル、および候補化合物と接触させなかった細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルを測定し；次いで、
（ｃ）候補化合物と接触させた細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルを、候補化合物と接触させなかった細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルを比較する工程を含み；ここで、候補化合物と接触させなかった細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルと比較した候補化合物と接触させた細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルの低下は、候補化合物が細胞においてＲＵＰ４０レセプターの発現を低下させる剤であることを示す。
【０４６２】
また、本発明は、候補化合物が心臓病を減少させ、またはブロックする剤であるか否かを同定する方法に関し、該方法は：
（ａ）ＲＵＰ４０レセプターを含む複数の細胞を候補化合物と接触させ、または接触させず；
（ｂ）候補化合物と接触させた細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルおよび候補化合物と接触させなかった細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルを測定し；次いで、
（ｃ）候補化合物と接触させた細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルを、候補化合物と接触させなかった細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルと比較する工程を含み、ここで、候補化合物と接触させなかった細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルと比較した、候補化合物と接触させた細胞におけるＲＵＰ４０レセプター発現のレベルの低下は、候補化合物が心臓病を減少させる、またはブロックさせる剤であることを示す。
【０４６３】
本発明は、細胞（例えば、心筋細胞）においてＲＵＰ４０発現を低下させる該剤、該剤を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、および（例えば、肥大性心筋細胞障害または鬱血性心不全のような心臓病を予防または治療するための）該組成物を使用する方法に関し、ここで、該化合物はアンチセンス核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ）である。本発明は、細胞（例えば、心筋細胞）においてＲＵＰ４０発現を低下させる該剤、該剤を含む組成物（例えば、薬学的組成物）、および（例えば、肥大型心筋症または鬱血性心不全のような心臓病の予防または治療のための）該組成物を用いる方法に関し、ここで、該化合物は標準的な手法に従ってＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードする遺伝子のヌクレオチド配列に由来するヌクレオチド配列を含む小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子である。当業者に知られているように、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡは、一般に、標的遺伝子の発現を調節することができる［例えば、Ｈｏｌｍｌｕｎｄ  ＪＴ，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（２００３）１００２：２４４−２５１；およびＤｅｖｒｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００４）４：３１９−３２７参照；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０４６４】
また、本発明は、ヒトを含めた、組織サンプル中のＲＵＰ４０をつきとめ、それを定量するための、および放射性同位体−標識化合物の結合を阻害することによってＲＵＰ４０リガンドを同定するために、インビトロおよびインビボ双方において、放射性イメージングのみならず、アッセイにおいても有用であろうＲＵＰ４０のモジュレーターまたはリガンドとして同定される本発明の化合物の放射性同位体−標識バージョンに関する。そのような放射性同位体−標識化合物を含む新規なＲＵＰ４０アッセイを開発するのが本発明のさらなる目的である。限定されるものではなく、例として、放射性イメージングを介して可視化された正常な範囲を超える上昇した心室ＲＵＰ４０は、本発明の心血管障害、例えば、肥大型心筋症または鬱血性心不全の危険性がある、またはそれに向けて進行する個体を同定することができると考えられる。
【０４６５】
本発明は、ＲＵＰ４０のモジュレーターまたはリガンドとして同定された本発明の化合物の放射性同位体−標識バージョンを含む。
【０４６６】
いくつかの実施形態において、化合物の放射性同位体−標識バージョンは、１以上の原子が、典型的には天然で見出される（すなわち、天然で生じる）原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられ、または置換されるという事実を除いて該化合物と同一である。本発明の化合物に取り込むことができる適当な放射性核種は、限定されるものではないが、２Ｈ（ジューテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉを含む。本発明の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核種は、その放射性標識化合物の具体的適用に依存するであろう。例えば、インビトロＲＵＰ４０標識および競合アッセイでは、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓを取り込む化合物は一般には最も有用であろう。放射性イメージング適用では、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒまたは７７Ｂｒは、一般には、最も有用である。いくつかの実施形態においては、放射性核種は３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび８２Ｂｒからなる群より選択される。
【０４６７】
有機化合物に放射性同位体を取り込むための合成方法を本発明の化合物に適用することができ、それは上記分野においてよく知られている。例えば、活性レベルのトリチウムを標的分子に取り込むこれらの合成方法は、以下の通りである：
Ａ．トリチウムガスでの接触還元−この手法は、通常、高い特異的活性の産物を生じ、ハロゲン化または不飽和前駆体を必要とする
Ｂ．ホウ水素化ナトリウム［３Ｈ］での還元−この手法はむしろ高価であって、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含む前駆体を必要とする
Ｃ．水素化アルミニウムリチウム［３Ｈ］での還元−この手法は、ほとんど理論的な特異的活性にて産物を供する。また、それは、アルデヒド、ケトン、ラクトン、エステルなどのような還元可能な官能基を含有する前駆体を必要とする
Ｄ．トリチウムガス暴露標識−この手法は、適当な触媒の存在下で、交換可能なプロトンを含む前駆体をトリチウムガスに暴露することを含む
Ｅ．ヨウ化メチル［３Ｈ］を用いるＮ−メチル化−この手法は、通常、適当な前駆体を高い特異的活性のヨウ化メチル［３Ｈ］で処理することによってＯ−メチルまたはＮ−メチル（３Ｈ）産物を調製するのに使用される。この方法は、一般に、例えば、約７０〜９０Ｃｉ／ミリモルのようなより高い特異的活性を可能とする。
【０４６８】
活性レベルの１２５Ｉを標的分子に取り込むための合成方法は以下のものを含む：
Ａ．サンドマイヤー（Ｓａｎｄｍｅｙｅｒ）および類似の反応−この手法は、アリールまたはヘテロアリールアミンを、テトラフルオロホウ酸塩のようなジアゾニウム塩に、引き続いて、Ｎａ１２５Ｉを用いて１２５Ｉ標識化合物に変換する。示された手法はＪ．  Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７，９４３−９４８においてＺｈｕ，Ｄ．−Ｇ．および共同研究者によって報告された
Ｂ．フェノールのオルト１２５ヨウ素化−この手法は、Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．１９９９，４２，Ｓ２６４−Ｓ２６６においてＣｏｌｌｉｅｒ，Ｔ．Ｌ．および共同研究者によって報告されているようにフェノールのオルト位置における１２５Ｉの取り込みを可能とする
Ｃ．１２５Ｉでの臭化アリールおよびヘテロアリール交換−この方法は、一般に、２工程プロセスである。最初の工程は、トリ−アルキルスズハライドまたはヘキサアルキルニスズ［例えば、（ＣＨ３）３ＳｎＳｎ（ＣＨ３）３］の存在下で、例えば、Ｐｄ触媒反応を用いる［すなわち、Ｐｄ（Ｐｈ３Ｐ）４］、またはアリールまたはヘテロアリールリチウムを介する、臭化アリールまたはヘテロアリールの対応するトリ−アルキルスズ中間体への変換である。示された手法は、Ｊ．Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｏｍｐｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２００１，４４，Ｓ２８０−Ｓ２８２においてＢａｓ，Ｍ．−Ｄ．および共同研究者によって報告された。
【０４６９】
いくつかの実施形態において、化合物の放射性同位体−標識バージョンは、放射性核種を含む１以上の置換基の付加を除いて、該化合物と同一である。いくつかのさらなる実施形態において、該化合物はポリペプチドである。いくつかのさらなる実施形態において、該化合物は抗体またはその抗原結合フラグメントである。いくつかのさらなる実施形態において、該抗体はモノクローナルである。適当な該放射性核種は、限定されるものではないが、２Ｈ（ジューテリウム）、３Ｈ（トリチウム）、１１Ｃ、１３Ｃ、１４Ｃ、１３Ｎ、１５Ｎ、１５Ｏ、１７Ｏ、１８Ｏ、１８Ｆ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、８２Ｂｒ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉおよび１３１Ｉを含む。本発明の放射性標識化合物に取り込まれる放射性核種は、その放射性標識化合物の具体的適用に依存するであろう。例えば、インビトロＲＵＰ４０標識および競合アッセイでは、３Ｈ、１４Ｃ、８２Ｂｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓを取り込む化合物は一般には最も有用であろう。放射性イメージング適用では、１１Ｃ、１８Ｆ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒまたは７７Ｂｒは、一般には、最も有用である。いくつかの実施形態においては、放射性核種は３Ｈ、１１Ｃ、１８Ｆ、１４Ｃ、１２５Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび８２Ｂｒからなる群より選択される。
【０４７０】
放射性核種を含む１以上の置換基を付加する方法は当業者の技量内のものであり、限定されるものではないが、酵素的方法による［Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｃ  ＪＪ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６９）  １１３：２９９−３０５；Ｔｈｏｒｅｌｌ  ＪＩ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  ＢＧ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （１９６９）２５１：３６３−９；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］および／またはクロラミン−Ｔ／ヨードゲン／ヨードビーズ方法によって［Ｈｕｎｔｅｒ  ＷＭ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣ，  Ｎａｔｕｒｅ（１９６２）  １９４：４９５−６；Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ  ＦＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ（１９６３）８９：１１４−２３；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］放射性同位体ヨウ素の付加を含む。
【０４７１】
開示されたレセプターおよび方法の他の使用は、とりわけ、本特許書類をレビューすることに基づき当業者に明らかとなるであろう。
【実施例】
【０４７２】
以下の実施例は、本発明の明瞭化を目的とするものに掲げ、本発明を限定するものではない。具体的な核酸およびアミノ酸配列を本明細書中で開示するが、当業者であれば、同一または実質的に同様な以下に報告する結果を達成しつつ、これらの配列に対して重要でない修飾をなす能力が備わっている。
【０４７３】
以下の実施例は、説明目的で掲げ、限定するものではない。当業者であれば、本明細書中の開示に基づいて同等なアッセイおよび方法を設計することができ、その全ては本発明の一部を形成する。
【０４７４】
種々の発現ベクターは、細胞において注目するポリペプチドを生産する目的で当業者に入手可能である。１つの適当なベクターはｐＣＭＶであり、これはある実施形態で用いられる。このベクターは、特許手続の目的での微生物の寄託の国際的承認に関するブタベスト条約の規定に従い、１９９８年１０月１３日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡ）に寄託された。該ＤＮＡはＡＴＣＣによってテストされ、生きていると判断された。ＡＴＣＣは以下の受託番号をｐＣＭＶに割り当てた：ＡＴＣＣ  ＃２０３３５１。ある実施形態においては、利用するベクターはアデノウイルス発現ベクターであるのが好ましい。例示的アデノウイルス発現ベクターはＱＢｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から商業的に入手可能であり、または米国特許第５，９２２，５７６号に記載されたものを含む。
【０４７５】
本発明の対象の事項に関連し、当業者によく知られた組換えＤＮＡ技術は、例えば、その各々の開示をここで引用してその全体を一体化させる、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；米国特許第６，３９９，３７３号；および２００２年８月２９日にＷＯ  ０２／０６６５０５として公開されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０２／０１４６１に見出すことができる。
【０４７６】
（実施例１）
（内因性ヒトＲＵＰ４０の全長クローニング）
内因性ヒトＲＵＰ４０をコードするポリヌクレオチドはＣｌｏｎｔｅｃｈ多重組織ｃＤＮＡパネル、カタログ番号Ｋ１４２５−１、具体的には、ヒト胎児脾臓第一鎖ｃＤＮＡ成分からクローン化した。
【０４７７】
該クローンは、以下の遺伝子−特異的プライマー：
５’−ＡＴＡＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＣＴＴＴＧＴＧＣＣ−３’（配列番号７；アンチセンス）
５’−ＡＴＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＧＴＴＧＡＧＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号８センス）
を用い、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ−２ポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈカタログ番号Ｋ１９１４−ｙ）を用いるポリメラーゼ連鎖反応によって生じさせた。アンチセンスプライマーは下線を施したＫｐｎ１制限部位、および太文字／イタリック体開始コドンを含む。センスプライマーは下線を施したＮｏｔ１制限部位、および太文字／イタリック体の停止コドンを含む。
【０４７８】
Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ−２ポリメラーゼは、工程２〜３を３５回反復し、以下のサイクルによって５０μＬ反応中での増幅のために用いた：工程１：１５秒間の９４．０Ｃ；工程２：１５秒間の９４．０Ｃ；工程３：６．０分間の６８．０Ｃ；工程４：３．０分間の６８．０Ｃ。ほぼ４．１ｋｂのＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲルから単離し、ｐｃｒ４−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて完全に配列決定した。核酸配列については配列番号１、および推定されるアミノ酸配列については配列番号２参照。
【０４７９】
例えば、ラット心臓、肺または脂肪組織から生じたｃＤＮＡを鋳型として用い、内因性ラットＲＵＰ４０をコードするポリヌクレオチドを同様にクローン化するのは当業者の技量内のものである。
【０４８０】
（実施例２）
（レセプターの発現）
種々の細胞がタンパク質の発現のための技術で入手可能であるが、哺乳動物細胞またはメラノフォアを利用するのが最も好ましい。この一番の理由は現実性、すなわち、ＧＰＣＲの発現のための例えば酵母細胞の利用に基づいて予測され、可能であれば、哺乳動物系で進化したレセプター−カップリング、遺伝的メカニズムおよび分泌経路を含まない（事実、酵母の場合には含まない）非−哺乳動物細胞をプロトコルに導入し；かくして、潜在的使用として、非−哺乳動物細胞で得られた結果は哺乳動物細胞またはメラノフォアから得られたのと同程度には好ましくない。哺乳動物細胞のうち、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７、２９３および２９３Ｔ細胞は特に好ましいが、利用される特異的哺乳動物細胞は当業者の特別な用語に基づいて予測できる。いくつかの実施形態において、心筋細胞が好ましい。実施例８を含めたメラノフォアに関連し、後記参照。
【０４８１】
（ａ．一過的トランスフェクション）
１日において、６×１０６／１０ｃｍ皿の２９３細胞ウェルを平板培養する。２日に、２つの反応試験管を調製する（各試験管に従う割合はプレート当たりである）：試験管Ａは４μｇＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；レセプターｃＤＮＡを持つｐＣＭＶベクター）を０．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で混合することによって調製した；試験管Ｂは、０．５ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中で２４μＬのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することによって調製した。試験管ＡおよびＢを逆さにすることによって（数回）混合し、続いて、室温で３０〜４５分間インキュベートした。混合物を「トランスフェクション混合物」という。平板培養した２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて、５ｍＬの無血清ＤＭＥＭを添加する。１ｍＬのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて、３７℃／５％ＣＯ２にて４時間インキュベートする。トランスフェクション混合物を吸引によって除去し、続いて、１０ｍＬのＤＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清を加えた。細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。４８時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、分析のために利用する。
【０４８２】
（ｂ．安定な細胞株）
ほぼ１２×１０６の２９３細胞を１５ｃｍの組織培養プレート上で平板培養する。１０パーセントの胎児ウシ血清および１パーセントのピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、および抗生物質を含有するＤＭＥ高グルコース培地中で増殖させる。２９３細胞の２４時間の平板培養に続き（または〜８０％密集まで）、１２μｇのＤＮＡ（例えば、レセプターｃＤＮＡを含むｐＣＭＶベクター）を用いて細胞をトランスフェクトする。１２μｇのＤＮＡを６０μＬのリポフェクタミンおよび２ｍＬのＤＭＥ高グルコース培地（血清無し）と組合わせる。培地を平板から吸引し、細胞を血清を含まない培地で１回洗浄する。ＤＮＡ、リポフェクタミンおよび培地混合物を１０ｍＬの血清を含まない培地と共にプレートに添加する。３７℃における４〜５時間のインキュベーションに続き、培地を吸引し、血清を含有する２５ｍＬの培地を加える。トランスフェクションから２４時間後に、培地を再度吸引し、血清を含む新鮮な培地を加える。トランスフェクションから４８時間後、培地を吸引し、最終濃度５００μｇ／ｍＬのゲネチシン（Ｇ４１８薬物）を含有する血清を含む培地を加える。トランスフェクトされた細胞は、今や、Ｇ４１８抵抗性遺伝子を含有する積極的にトランスフェクトした細胞についての選択を受ける。培地は選択が起こるので４〜５日ごとに取り替える。選択の間、細胞を増殖させて安定なプールが得られ、安定なクローン選択のために分ける。
【０４８３】
（実施例３）
（ＧＰＣＲ活性化の評価のためのアッセイ）
種々のアプローチが、哺乳動物ＧＰＣＲの活性化の評価で利用できる。以下に例示する；当業者であれば、当業者の用語に優先的に有益である技術を決定する能力が備わる。
【０４８４】
（１．膜結合アッセイ：［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
Ｇタンパク質共役型レセプターが、リガンド結合または構成的活性化の結果のいずれかとして、その活性状態にある場合、レセプターはＧタンパク質にカップリングし、ＧＤＰの放出、および引き続いてのＧＴＰのＧタンパク質への結合を刺激する。Ｇタンパク質−レセプター複合体のアルファサブユニットはＧＴＰａｓｅとして作用し、ＧＴＰをＧＤＰへとゆっくりと加水分解し、その時点で、レセプターは正常には脱活性化される。活性化されたレセプターはＧＴＰの代わりにＧＤＰで交換を続ける。非−加水分解性ＧＴＰアナログ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを利用して、活性化されたレセプターを発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳの増強された結合を示すことができる。活性化を測定するために［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を用いる利点は（ａ）それが全てのＧタンパク質共役型レセプターに一般的に適用でき；（ｂ）それは膜表面において基部側にあり、細胞内カスケードに影響する分子をあまり拾わないようにすることである。
【０４８５】
該アッセイは、関連レセプターを発現する膜への［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合を刺激するＧタンパク質共役型レセプターの能力を利用する。該アッセイは、従って、直接的同定方法で用いて、内因性ＧＰＣＲおよび非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲに対する候補化合物をスクリーニングすることができる。該アッセイは一般的であって、全てのＧタンパク質共役型レセプターにおける薬物発見に適用できる。
【０４８６】
該［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１および約２０ｍＭの間のＭｇＣｌ２（２０ｍＭが好ましいが、この量は結果の最適化のために調整することができる）ｐＨ７．４、約０．３および約１．２ｎＭの間の［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（１．２が好ましいが、この量は結果の最適化のための調整することができる）を含む結合緩衝液、および１２．５〜７５μｇの膜タンパク質（例えば、Ｇｓ融合タンパク質を発現する２９３細胞；この量は最適化のために調整することができる）および１０μＭ  ＧＤＰ（この量は最適化のために変化させることができる）中で１時間インキュベートする。次いで、小麦胚芽アグルチミンビーズ（２５μＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）を加え、混合物を室温にてさらに３０分間インキュベートする。次いで、試験管を室温にて１５００×ｇにおいて５分間遠心し、次いで、シンチレーションカウンターで計数する。
【０４８７】
（２．アデニリルシクラーゼ）
細胞ベースのアッセイのために設計されたＦｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は、粗製原形質膜で用いるのに修飾することができる。該Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体も含むシンチラントコーティングを含むことができる。ウェルで生じたｃＡＭＰは、放射性ｃＡＭＰトレーサーのｃＡＭＰ抗体への結合につき直接的競合によって定量することができる。以下のものは、レセプターを発現する全細胞におけるｃＡＭＰレベルの変化の測定のための簡単なプロトコルとして働く。
【０４８８】
トランスフェクトされた細胞を一過的トランスフェクションからほぼ２４時間後に収穫する。培地を注意深く吸引により除き、捨てる。１０ｍＬのＰＢＳを細胞の各皿に温和に加え、続いて、注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍＬのＰＢＳを各プレートに加える。細胞をピペットによりプレートから取り出し、細胞懸濁液を５０ｍＬの円錐遠心チューブに集める。次いで、細胞を室温にて１，１００ｒｐｍにて５分間遠心する。細胞ペレットを適当な容量のＰＢＳに注意深く再度懸濁させる（約３ｍＬ／プレート）。次いで、ヘモサイトメーターを用いて細胞をカウントし、さらなるＰＢＳを加えて、適当な数の細胞を得る（最終容量は約５０μＬ／ウェルである）。
【０４８９】
ｃＡＭＰ標準および｛１１ｍＬの検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μＬ）を含む｝検出緩衝液を調製し、製造業者の指示に従って維持する。スクリーニングのためにアッセイ緩衝液を新しく調製し、それは、５０μＬの刺激緩衝液、３μＬのテスト化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μＬの細胞を含むものであった。アッセイ緩衝液を使用するまで氷上で保存する。アッセイは、５０μＬのｃＡＭＰ標準を適当なウェルに添加し、５０μＬのＰＢＳＡをウェルＨ１１およびＨ１２に添加することによって開始する。５０μＬの刺激緩衝液を全てのウェルに加える。ＤＭＳＯ（または選択された候補化合物）を、３μＬの化合物溶液を分注することができ、ピンツールを用いて適当なウェルに加え、最終アッセイ濃度は１２μＭのテスト化合物および１００μＬの合計アッセイ容量である。次いで、細胞をウェルに加え、室温にて６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μＬの検出ミックスをウェルに加える。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、続いて、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターでカウントする。次いで、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線からｃＡＭＰ／ウェルの値を外挿する。
【０４９０】
（３．Ｇｉ共役型標的ＧＰＣＲのための細胞−ベースのｃＡＭＰ）
ＴＳＨＲは、活性化に際してｃＡＭＰの蓄積を引き起こすＧｓ共役型ＧＰＣＲである。ＴＳＨＲは、アミノ酸残基６２３を突然変異することによって（すなわち、アラニン残基をイソロイシン残基に変化させることによって）構成的に活性化される。Ｇｉ共役型レセプターはアデニリルシクラーゼを阻害すると予測され、従って、ｃＡＭＰ生産のレベルを減少させ、これは、ｃＡＭＰレベル挑戦の評価をなすことができる。Ｇｉ共役型レセプターの構成的活性化の指標としてのｃＡＭＰの生産の減少を測定するための効果的な技術は、最も好ましくは、Ｇｉ連結標的ＧＰＣＲで、「シグナルエンハンサー」としての非−内因性の構成的に活性化されたＴＳＨＲ（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）（または内因性の構成的に活性なＧｓ共役型レセプター）を共トランスフェクトして、ｃＡＭＰのベースラインレベルを確立することによって達成することができる。Ｇｉ共役型レセプターの非−内因性バージョンを創製するに際して、次いで、標的ＧＰＣＲのこの非−内因性バージョンをシグナルエンハンサーで共トランスフェクトし、スクリーニングで用いることができるのはこの物質である。我々は、そのようなアプローチを利用して、ｃＡＭＰアッセイを用いる場合にシグナルを効果的に発生させ；このアプローチは、好ましくは、Ｇｉ共役型レセプターに対する候補化合物の直接的同定で用いられる。Ｇｉ共役型ＧＰＣＲについては、シグナルエンハンサーのこのアプローチを内因性または構成的に活性化されたＧｉ共役型ＧＰＣＲいずれかと組み合わせて用いる場合に、標的ＧＰＣＲの逆アゴニストはｃＡＭＰシグナルを増加させ、アゴニストはｃＡＭＰシグナルを減少させることに注意されたし。
【０４９１】
１日に、２×１０４の２９３細胞／ウェルが平板培養される。２日に、２つの反応試験管を調製する（各試験管についての割合はプレート当たりである）：試験管Ａは、１．２ｍＬの無血清ＤＭＥＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中の合計４μｇのＤＮＡ（例えば、ｐＣＭＶベクター；突然変異したＴＨＳＲを含むｐＣＭＶベクター（ＴＳＨＲ−Ａ６２３Ｉ）；ＴＳＨＲ−Ａ６２３ＩおよびＧＰＣＲなど）につき、トランスフェクトされた各レセプターの２μｇＤＮＡを哺乳動物細胞に混合することによって調製され；試験管Ｂは、１．２ｍＬの無血清ＤＭＥＭ中に１２０μＬのリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を混合することによって調製される。次いで、試験管ＡおよびＢを逆さにすることによって（数回）混合し、続いて、室温にて３０〜４５分間インキュベートする。該混合物は「トランスフェクション混合物」という。平板培養した２９３細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、続いて、１０ｍＬの無血清ＤＭＥＭを加える。次いで、２．４ｍＬのトランスフェクション混合物を細胞に加え、続いて、３７℃／５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。次いで、吸引によってトランスフェクション混合物を取り出し、続いて、２５ｍＬのＤＭＥＭ／１０％胎児ウシ血清を加える。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートする。インキュベーションの２４時間後、次いで、細胞を収穫し、分析で利用する。
【０４９２】
Ｆｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）は細胞−ベースのアッセイのために設計されたが、当業者の要望に応じて、粗製原形質膜で用いるのに修飾することができる。該Ｆｌａｓｈ  Ｐｌａｔｅウェルは、ｃＡＭＰを認識する特異的抗体をやはり含むシンチラントコーティングを含む。ウェル中で生じたｃＡＭＰは、放射性ｃＡＭＰトレーサーのｃＡＭＰ抗体への結合につき直接的競合によって定量することができる。以下のものは、レセプターを発現する全細胞中のｃＡＭＰレベルの変化の測定のための簡単なプロトコルとして働く。
【０４９３】
一過性トランスフェクションからほぼ２４時間後に、トランスフェクトされた細胞を収穫する。培地を注意深く吸引して取り出し、捨てる。１０ｍＬのＰＢＳを温和に細胞の各皿に加え、続いて、注意深く吸引する。１ｍＬのＳｉｇｍａ細胞解離緩衝液および３ｍＬのＰＢＳを各プレートに加える。細胞をピペットによりプレートから取り出し、細胞懸濁液を５０ｍＬの円錐遠心チューブに集める。次いで、細胞を１，１００ｒｐｍにて室温で５分間遠心する。細胞ペレットを注意深く適当な容量のＰＢＳに再懸濁させる（約３ｍＬ／プレート）。次いで、ヘモサイトメーターを用いて細胞をカウントし、さらなるＰＢＳを加えて、適当な数の細胞を得る（最終容量は約５０μＬ／ウェルである）。
【０４９４】
ｃＡＭＰ標準および｛１１ｍＬの検出緩衝液に対して１μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ（５０μＬ）を含む｝検出緩衝液を調製し、製造業者の指示に従って維持する。アッセイ緩衝液はスクリーニングのために新たに調製すべきであり、それは５０μＬの刺激緩衝液、３μＬのテスト化合物（１２μＭの最終アッセイ濃度）および５０μＬの細胞を含む。アッセイ緩衝液は用いるまで氷上で貯蔵することができる。該アッセイは、５０μＬのｃＡＭＰ標準を適当なウェルに加え、５０μＬのＰＢＳＡをウェルＨ−１１およびＨ１２に加えることによって開始させることができる。５０μＬの刺激緩衝液を全てのウェルに加える。３μＬの化合物溶液を分注することができるピンツールを用いて、選択された化合物（例えば、ＴＳＨ）を適当なウェルに加え、最終アッセイ濃度は１２μＭのテスト化合物および１００μＬの合計アッセイ容量である。次いで、細胞をウェルに加え、室温にて６０分間インキュベートする。次いで、トレーサーｃＡＭＰを含有する１００μＬの検出ミックスをウェルに加える。次いで、プレートをさらに２時間インキュベートし、続いて、Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンターでカウントする。次いで、各アッセイプレート内に含まれる標準ｃＡＭＰ曲線からｃＡＭＰ／ウェルの値を外挿する。
【０４９５】
（４．レポーター−ベースのアッセイ）
（ａ．ＣＲＥ−ＬＵＣレポーターアッセイ（Ｇｓ−関連レセプター））
２９３および２９３Ｔ細胞をウェル当たり２×１０４細胞の密度にて９０ウェルプレート上で平板培養し、製造業者の指示に従って翌日にリポフェクタミン試薬（ＢＲＬ）を用いてトランスフェクトする。ＤＮＡ／脂質混合物を以下のようにして各６−ウェルトランスフェクションのために調製し：１００μＬのＤＭＥＭ中の２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬのＤＭＥＭ中の２μＬの脂質と温和に混合する｛２６０ｎｇのプラスミドＤＮＡは２００ｎｇの８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミド、内因性レセプターまたは非−内因性レセプターを含む５０ｎｇのｐＣＭＶ、またはｐＣＭＶ単独、および１０ｎｇのＧＰＲＳ発現プラスミド［ｐｃＤＮＡ３中のＧＰＲＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］よりなる｝。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは以下のようにして調製した：ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中のＢｇｌＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位においてラットソマトスタチンプロモーター（−７１／＋５１）をクローン化することによって、ベクターＳＲＩＦ−β−ｇａｌを得た。８コピーのｃＡＭＰ応答エレメントは、アデノウイルス鋳型ＡｄｐＣＦ１２６ＣＣＲＥ８［Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  （１９９６）７：１８８３−１８９３参照；その開示をここで引用してその全体を援用する］からＰＣＲによって得、Ｋｐｎ−ＢｇｌＶ部位にてＳＲＩＦ−β−ｇａｌベクターにクローン化し、その結果、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクターが得られた。８×ＣＲＥ−Ｌｕｃレポータープラスミドは、８×ＣＲＥ−β−ｇａｌレポーターベクター中のベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子をＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ部位にて、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得られたルシフェラーゼ遺伝子で置き換えることによって生じた。室温での３０分間のインキュベーションに続き、ＤＮＡ／脂質混合物を４００μＬのＤＭＥＭで希釈し、１００μＬの希釈された混合物を各ウェルに加える。１０％ＦＣＳを含む１００μＬのＤＭＥＭを細胞培養インキュベーター中での４時間のインキュベーションの後に各ウェルに加える。翌日、トランスフェクトされた細胞を２００μＬ／ウェルの１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで変化させる。８時間後、ウェルは、ＰＢＳでの１回の洗浄の後に、フェノールレッド無くして１００μＬ／ウェルのＤＭＥＭに変化させた。製造業者の指示に従って、ＬｕｃＬｉｔｅＴＭレポーター遺伝子アッセイキット（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いてルシフェラーゼ活性を翌日に測定し、１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭシンチレーションおよびルミネッセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）で読む。
【０４９６】
（ｂ．ＡＰ１レポーターアッセイ（Ｇｑ−関連レセプター））
Ｇｑ刺激を検出するための方法は、そのプロモーターにＡＰ１エレメントを含有する遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ−依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＡＰ−１シス−レポーティングシステム（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，カタログ番号２１９０７３）を、リン酸カルシウム沈殿の成分が４１０ｎｇのｐＡＰ１−ｌＵＣ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミド、および２０ｎｇ  ＣＭＶ−ＳＥＡＰである以外は、ＣＲＥＤレポーターアッセイに関して前記したプロトコルに従って利用することができる。
【０４９７】
（ｃ．ＳＲＦ−Ｌｕｃレポーターアッセイ（Ｇｑ−関連レセプター））
Ｇｑ刺激を検出するための１つの方法は、そのプロモーター中に血清応答因子を含有する遺伝子の活性化を引き起こすＧｑ−依存性ホスホリパーゼＣの既知の特性に依存する。ＰａｔｈｄｅｔｅｃｔＴＭ  ＳＲＦ−Ｌｕｃ−レポーティングシステム（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を利用して、例えば、ＣＯＳ７細胞におけるＧｑ共役型活性につきアッセイすることができる。細胞は、製造業者の指示に従い、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎＴＭキット（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，カタログ番号２００２８５）を用い、該システムのプラスミド成分、および内因性または非−内因性ＧＰＣＲをコードする示された発現プラスミドでトランスフェクトする。簡単に述べれば、４１０ｎｇのＳＲＦ−Ｌｕｃ、８０ｎｇのｐＣＭＶ−レセプター発現プラスミドおよび２０ｎｇのＣＭＶ−ＳＥＡＰ（分泌されたアルカリ性ホスファターゼ発現プラスミド；アルカリ性ホスファターゼ活性はサンプル間のトランスフェクション効率の変動につき制御するためにトランスフェクトされた細胞の培地中で測定する）を、製造業者の指令に従って、リン酸カルシウム沈殿中で合わせる。沈殿の半分を９６−ウェルプレート中の３ウェルに等しく分配し、無血清培地中で細胞を２４時間保持する。示されれば、最後の５時間、細胞をテスト化合物または適当なコントロールと共にインキュベートする。次いで、細胞を溶解させ、製造業者の指示に従い、ＬｕｃｌｉｔｅＴＭキット（Ｐａｃｋａｒｄ，カタログ番号６０１６９１１）および「Ｔｒｉｌｕｘ  １４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ」液体シンチレーションおよびルミネッセンスカウンター（Ｗａｌｌａｃ）を用いてルシフェラーゼ活性につきアッセイする。データはＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍＴＭ  ２．０ａ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を用いて分析することができる。
【０４９８】
（５．細胞内ＩＰ３蓄積アッセイ（Ｇｑ−関連レセプター））
１日に、レポーター（内因性および／または非−内因性）を含む細胞を通常１×１０５細胞／ウェルにて（この数は最適化することができる）２４ウェルプレート上で平板培養することができる。２日に、まず５０μＬの無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の０．２５μｇＤＮＡおよび５０μＬの無血清ＤＭＥＭ／ウェル中の２μＬのリポフェクタミンを混合することによって細胞をトランスフェクトすることができる。溶液を温和に混合し、室温にて１５〜３０分間インキュベートする。細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、４００μＬの無血清培地をトランスフェクション培地と混合し、細胞に加える。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて３〜４時間インキュベートし、次いで、トランスフェクション培地を除去し、１ｍＬ／ウェルの正規の増殖培地で置き換える。３日に、細胞を３Ｈ−ｍｙｏ−イノシトールで標識する。簡単に述べれば、培地を除去し、細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄する。次いで、０．５ｍＬの無イノシトール／無血清培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加え／０．２５μＣｉの３Ｈ−ｍｙｏ−イノシトール／ウェルを含むウェルおよび細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて１６〜１８時間インキュベートする。４日に、細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、無イノシトール／無血清培地、１０μＭパルギリン、１０ｍＭ塩化リチウム、または０．４ｍＬのアッセイ培地および５０μＬの１０×ケタンセリン（ｋｅｔ）を最終濃度１０μＭまで含有する０．４５ｍＬのアッセイ培地を加える。次いで、細胞を３７℃にて３０分間インキュベートする。次いで、細胞を０．５ｍＬのＰＢＳで洗浄し、２００μＬの新鮮な／氷冷停止溶液（１Ｍ  ＫＯＨ；１８ｍＭホウ酸ナトリウム；３．８ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加える／ウェル。溶液を５〜１０分間、または細胞が溶解するまで氷上に維持し、次いで、２００μＬの新鮮な／氷冷中和溶液（７．５％ＨＣＬ）によって中和する。次いで、溶解物を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、１ｍＬのクロロホルム／メタノール（１：２）を加える／チューブ。溶液を１５秒間渦巻かせ、上相をＢｉｏｒａｄ  ＡＧ１−Ｘ８ＴＭアニオン交換樹脂（１００〜２００メッシュ）に適用する。まず、樹脂を１：１．２５Ｗ／Ｖにて水で洗浄し、０．９ｍＬの上相をカラムに負荷する。カラムを１０ｍＬの５ｍＭ  ｍｙｏ−イノシトールおよび１０ｍＬの５ｍＭホウ酸ナトリウム／６０ｍＭギ酸ナトリウムで洗浄する。イノシトール三リン酸を、２ｍＬの０．１Ｍギ酸／１Ｍギ酸アンモニウムを含む１０ｍＬのシンチレーションカクテルを含有するシンチレーションバイアルに溶出させる。１０ｍＬの０．１Ｍギ酸／３Ｍギ酸アンモニウムで洗浄することによってカラムを再生させ、ｄｄ  Ｈ２Ｏで２回濯ぎ、４℃にて水中に保存する。
【０４９９】
（実施例４）
（融合タンパク質の調製）
（ａ．ＧＰＣＲ：Ｇｓ融合構築体）
構成的に活性化されたＧＰＣＲ−Ｇタンパク質融合構築体の設計は以下のように達成された：ラットＧタンパク質Ｇｓα（長形態；Ｉｔｏｈ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，８３  ＰＮＡＳ  ３７７６（１９８６））の５’および３’両末端は、その上にＨｉｎｄＩＩＩ（５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’）を含むように作製した。（フランキングＨｉｎｄＩＩＩ配列を含めた）正しい配列の確認に続き、そのベクターのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を用いるサブクローニングによって、全配列をｐｃＤＮＡ３．１（−）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ番号Ｖ７９５−２０）にシャトルした。Ｇｓα配列についての正しい向きはｐｃＤＮＡ３．１（−）へのサブクローニングの後に決定した。次いで、ＨｉｎｄＩＩＩ配列にラットＧｓα遺伝子を含む修飾されたｐｃＤＮＡ３．１（−）を確認した；このベクターは、今や、「ユニバーサル」Ｇｓαタンパク質ベクターとして入手できた。ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流に種々のよく知られた制限部位を含み、かくして、Ｇｓタンパク質の上流に、内因性の構成的に活性なＧＰＣＲのコーディング配列を挿入する能力を便宜には供する。この同一アプローチを利用して、他の「ユニバーサル」Ｇタンパク質ベクターを作り出すことができ、勿論、当業者に知られた他の商業的に入手可能なまたは適当なベクターを利用することができ−重要な基準は、ＧＰＣＲについての配列がＧタンパク質のそれより上流であって、それとイン−フレームであることである。
【０５００】
（ｂ．Ｇｑ（６アミノ酸欠失）／Ｇｉ（融合構築体））
Ｇｑ（ＤＥＬ）／Ｇｉ融合構築体の設計は以下のようにして達成できる：Ｎ末端の６つのアミノ酸（ＴＬＥＳＩＭ  Ｃｑγ−サブユニットの配列を有するアミノ酸２〜７）を欠失し、配列ＥＹＮＬ部位を有するＣ末端の５つのアミノ酸を、配列ＤＣＧＬＦを有するＧｉαタンパク質の対応するアミノ酸と置き換える。この融合構築体は以下のプライマー：
【０５０１】
【化２】
2007524382.tif 000006
および鋳型として、ヘマグルチミンタグを持つマウスＧｑα−野生型バージョンを含むプラスミド６３３１３を用いるＰＣＲによって得られる。下方キャップ中のヌクレオチドはスペーサーとして含まれる。
【０５０２】
ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）は以下のサイクルによって、工程２〜４を３５回反復する。増幅で利用される：２分間の９５℃；２０秒間の９５℃；２０秒間の５６℃；２分間の７２℃；および７分間の７２℃。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、ＡＢＩ  Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒキット（Ｐ．Ｅ．Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定した。融合構築体の配列を含むＴＯＰＯクローンからのインサートを、２工程クローニングプロセスによって、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にて発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にシャトルする。また、その開示をここで引用してその全体を援用する、２００２年９月６日にＷＯ  ０２０６８６００として公表されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／０５６２５参照。
【０５０３】
（実施例５）
（［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアッセイ）
（膜調製）
いくつかの実施形態において、注目する標的ＧＰＣＲを含み、例えば、逆アゴニスト、アゴニスト、またはアンタゴニストとして候補化合物の直接的同定で用いるための膜は、好ましくは、以下のように調製される：
（ａ．材料）
「膜掻取緩衝液」は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡ。ｐＨ７．４を含み；「膜洗浄緩衝液」は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐｈ７．４を含み；「結合緩衝液」は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ２および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４を含む。
【０５０４】
（ｂ．手法）
全ての材料は該手法を通じて氷上に維持する。まず、培地を細胞の密集単層から吸引し、続いて、１０ｍＬの冷ＰＢＳ濯ぎ、続いて、吸引する。しかる後、５ｍＬの膜膜掻取緩衝液を加えて、細胞を掻取り；氷に続けて、細胞抽出物を５０ｍＬの遠心チューブに移す（２０、０００ｒｐｍにおいて４℃にて１７分間遠心）。しかる後、上澄みを吸引し、ペレットを３０ｍＬの膜洗浄緩衝液に再懸濁させ、続いて、２０、０００ｒｐｍにおいて４℃にて１７分間遠心する。次いで、上澄みを吸引し、ペレットを結合緩衝液に再懸濁させる。次いで、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭホモゲナイザーを用いてホモゲナイズする（全ての材料が懸濁液となるまで１５〜２０秒間バースト）。これを、本明細書中においては、「膜タンパク質」という。
【０５０５】
（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ）
ホモゲナイゼーションに続き、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用い、膜のタンパク質濃度を測定する。（本明細書中タンパク質は約１．５ｍｇ／Ｌまで希釈し、アリコットし、後に用のために凍結することができる（−８０℃）；凍結する場合、用いるプロトコルは以下の通りである：アッセイの日、凍結された膜タンパク質を室温で解凍し、続いて、攪拌し、次いで、約１２×１，０００ｒｐｍにおいて約５〜１０秒間、Ｐｏｌｙｔｒｏｎでホモゲナイズする；多数の調製では、異なる調製のホモゲナイゼーションの間にホモゲナイザーは徹底的に洗浄すべきである）。
【０５０６】
（ａ．材料）
結合緩衝液（前記）；Ｂｒａｄｆｏｒｄ色素試薬；Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質標準を製造業者の指令に従って利用する（Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号００〜０００６）。
【０５０７】
（ｂ．手法）
二連チューブを調製し、一つは膜を含み、一つはコントロール「ブランク」としてのものである。各々は８００μＬの結合緩衝液を含有した。しかる後、１０μＬのＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質標準（１ｍｇ／Ｌ）を各チューブに加え、次いで、１０μＬの膜タンパク質を丁度一つのチューブ（ブランクではない）に加える。しかる後、２００μＬのＢｒａｄｆｏｒｄ色素試薬を各チューブに加え、続いて、各々を攪拌する。５分後、チューブを再度渦巻かせ、その中の材料をキュベットに移す。次いで、波長５９５において、ＣＥＣＩＬ３０４１分光光度計を用いてキュベットを読む。
【０５０８】
（直接的同定アッセイ）
（ａ．材料）
ＧＤＰ緩衝液は３７．５ｍＬの結合緩衝液および２ｍｇのＧＤＰ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｇ−７１２７）よりなるものであって、続いて、結合緩衝液に系列希釈し、０．２μＭのＧＤＰを得た（各ウェル中のＧＤＰの最終濃度は０．１μＭ  ＧＤＰであった）；候補化合物を含む各ウェルは、１００μＬのＧＤＰ緩衝液（最終濃度、０．１μＭ  ＧＤＰ）、結合緩衝液中の５０μＭの膜タンパク質、および結合緩衝液中の５０μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎｍ）（１０ｍＬの結合緩衝液当たり２．５μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）よりなる２００μＬの最終容量を有する。
【０５０９】
（ｂ．手法）
候補化合物は、好ましくは、９６−ウェルプレートフォーマットを用いてスクリーニングする（これらは−８０℃凍結することができる）。膜タンパク質（またはコントロールとしての、標的ＧＰＣＲを排除する発現ベクターを含む膜）を懸濁するまで軽くホモゲナイズする。次いで、前記したＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。次いで、膜タンパク質（およびコントロール）を結合緩衝液中で０．２５ｍｇ／Ｌまで希釈する（最終アッセイ濃度、１２．５μｇウェル）。しかる後、１００μＬのＧＤＰ緩衝液をＷａｌｌａｃ  ＳｃｉｎｔｉｔｒｉｐＴＭ（Ｗａｌｌａｃ）の各ウェルに加える。次いで、５μＬのピン−ツールを用いて、５μＬの候補化合物をかかるウェルに移動する（すなわち、２００μＬの合計アッセイ容量中５μＬは、候補化合物の最終スクリーニング濃度が１０μＭとなるように１：４０の比率である）。再度、汚染を回避するために、各移動工程ののち、ピンツールは水（１×）、エタノール（１×）および水（２×）を含む三つの貯蔵器中で濯ぐべきであり−各濯ぎの後に過剰の液体はツールから振盪し、紙およびキムワイプ（ｋｉｍｗｉｐｅ）で乾燥すべきである。しかる後、５０μＬの膜タンパク質を各ウェルに加え（標的ＧＰＣＲ無しの膜を含むコントロールウェルを利用した）、室温にて５〜１０分間プレインキュベートした。しかる後、結合緩衝液中の５０μＬの［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ（０．６ｎＭ）を各ウェルに加え、続いて、室温にて６０分間シェーカーでインキュベートする（再度、この例においては、プレートをホイルで被覆した）。次いで、４０００ＲＰＭにおいて２２℃にて１５分間プレートを回転させることによって、アッセイを停止させた。次いで、プレートを８チャンネルのマニフォールドで吸引し、プレートカバーでシールする。次いで、（製造業者の指令に従い）設定「Ｐｒｏｔ．＃３７」を用いてプレートをＷａｌｌａｃ１４５０で読む。
【０５１０】
（実施例６）
（環状ＡＭＰアッセイ）
例えば、逆アゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストとしての候補化合物を直接的に同定するためのもう一つのアッセイアプローチは、シコラーゼーベースのアッセイを利用することによって達成される。直接的同定に加えて、このアッセイアプローチは独立したアプローチとして利用して、前記実施例に記載された［３５Ｓ］ＧＴＰγＳアプローチからの結果の確認を供することができる。
【０５１１】
以下のプロトコルに従い、内因性または非−内因性の構成的に活性化されたＧＰＣＲに対する逆アゴニストおよびアゴニストとしての候補化合物の直接的同定のために、修飾されたＦｌａｓｈ  ＰｌａｔｅＴＭアデニリルシクラーゼキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；カタログ番号ＳＭＰ００４Ａ）を好ましくは利用する。
【０５１２】
トランスフェクトされた細胞をトランスフェクションからほぼ三日後に収穫する。膜は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液中での懸濁された細胞のホモゲナイゼーションによって調製された。ホモゲナイゼーションは、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ＰｏｌｙｔｒｏｎＴＭを用いて氷上でほぼ１０秒間行う。得られたホモゲネートを４９、０００×ｇにおいて４℃にて１５分間遠心する。次いで、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する緩衝液に得られたペレットを再懸濁させ、１０秒間ホモゲナイズし、続いて、４９、０００×ｇにおいて４℃にて１５分間遠心する。次いで、用いるまで、得られたペレットを−８０℃で貯蔵する。直接的同定スクリーニングの日に、膜ペレットを室温にてゆっくりと解凍し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４および１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有する緩衝液に再懸濁させ、０．６０ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得る（再懸濁させた膜は使用するまで氷の上に置く）。
【０５１３】
ｃＡＭＰ標準および（１１ｍＬの検出緩衝液に対して２μＣｉのトレーサー［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ１００μＬ）を含む）検出緩衝液を調製し、製造業者の指示に従って維持する。アッセイ緩衝液をスクリーニングのために新たに調製し、それは２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭホスホクレアチン（Ｓｉｇｍａ）、０．１ユニット／ｍＬのクレアチンホスホキナーゼ（Ｓｉｇｍａ）５０μＭ  ＧＴＰ（Ｓｉｇｍａ）、および０．２ｍＭ  ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ）を含有した；次いで、アッセイ緩衝液を用いるまで氷上で貯蔵した。
【０５１４】
候補化合物は、好ましくは、４０μＬの膜タンパク質（３０μｇ／ウェル）および５０μＬのアッセイ緩衝液と共に９６−ウェルプレートのウェルに加える（３μＬ／ウェル；１２μＭ最終アッセイ濃度）。次いで、この混合物を温和に振盪しつつ室温にて３０分間インキュベートした。
【０５１５】
インキュベーションに続き、１００μＬの検出緩衝液を各ウェルに加え、続いて、２〜２４時間インキュベートする。次いで、（製造業者の指示に従い）「Ｐｒｏｔ．＃３１」を用い、プレートをＷａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴＭプレートリーダーでカウントする。
【０５１６】
限定されるものではなく例として、得られた代表的なスクリーミングアッセイプレート（９６ウェルフォーマット）の結果を図１に示す。各棒線は各ウェルで異なる化合物の結果を表し、「標的ＧＰＣＲ」は内因性の構成的に活性なＧｓ−共役型ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質である。また、図１で示される代表的な結果は、各プレート（「ｍ」）の平均結果に基づく標準偏差を提供し、一次スクリーニングからの「リード」としての逆アゴニストの選択についての平均＋二つの任意の優先性は、少なくとも平均プレート応答から２標準偏差を差し引いたものだけ、パーセント応答を低下させる候補化合物の選択を含む。逆に、一次スクリーニングからの「リード」としてのアゴニストの選択についての任意の優先性は、少なくとも平均プレート応答から２標準偏差を差し引いたものだけ、パーセント応答を増加させる候補化合物の選択を含む。これらの選択プロセスに基づき、以下のウェル中の候補化合物を、各々、ウェルＡ２およびＧ９において該内因性ＧＰＳＣに対する推定逆アゴニスト（化合物Ａ）およびアゴニスト（化合物Ｂ）として直接的に同定された。図１参照。明瞭性のためには：これらの化合物は、このＧＰＣＲに対する内因性リガンドのいずれの知識もなくして直接的に同定されたことに注意された。レセプター機能に基づくアッセイ技術に焦点を当てることによって、我々は、このレセプター（化合物Ａ）の機能的活性を低下させ、ならびにレセプター（化合物Ｂ）機能的活性を増加させることができる化合物を確認することができる。
【０５１７】
（実施例７）
（細胞内カルシウム濃度の測定のための蛍光測定イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）アッセイ（Ｇｑ関連レセプター））
各クローン系からの標的ＧＰＣＲ（実験）およびｐＣＭＶ（陰性コントロール）により安定にトランスフェクトされた細胞を、翌日のアッセイのために、完全培養基（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含むＤＭＥＭ）を含むウェル当たり５．５×１０４細胞にてポリ−Ｄ−リシンでプレ処理した９６−ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、＃３５６６４０）に蒔く。Ｆｌｕｏ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、＃Ｆ１４２０２）インキュベーション緩衝液ストックを調製するために、２ｍｇのＦｌｕｏ４−ＡＭＯ４６７μＬのＤＭＳＯおよび４６７μＬのプルオロン酸（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、＃Ｐ３０００）に溶解させて、１ｍＭストック溶液が得られ、これは−２０℃にて一ヶ月間貯蔵することができる。Ｆｌｕｏ４−ＡＭは蛍光カルシウムインジケータ色素である。
【０５１８】
候補化合物は洗浄緩衝液（ｐＨ７．４の１×  ＨＢＳＳ／２．５ｍＭプロベニシド／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）中で調製する。
【０５１９】
アッセイの時点において、培養基をウェルから取り出し、細胞に、ｐＨ７．４の１００μＬの４μＭ  Ｆｌｕｏ４−ＡＭ／２．５ｍＭプロベニシド（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ８７６１）／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／完全培地を負荷する。３７℃／５％ＣＯ２におけるインキュベーションを６０分間進行させる。
【０５２０】
１時間のインキュベーションの後、Ｆｌｕｏ４−ＡＭインキュベーション緩衝液を取り出し、細胞を１００μＬの洗浄緩衝液で二回洗浄する。各ウェルには１００μＬの洗浄緩衝液を残す。プレートを３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーターに６０分間戻す。
【０５２１】
ＦＬＩＰＲ（蛍光測定イメージングプレートリーダー；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を、３０秒目に５０μＬの候補化合物を加え、さらに１５０秒間で候補化合物によって惹起された細胞内カルシウム濃度（［Ｃａ２＋］）の一過性変化を読むようにプログラムする。合計蛍光変化カウントを用いて、ＦＬＩＰＲソフトウェアを用いて、アゴニストの活性を決定する。機器ソフトウェアは蛍光の読みを正規化して、ゼロにおける同等な初期の読みを得る。
【０５２２】
いくつかの実施形態において、標的ＧＰＣＲを含む細胞は、さらに、乱交雑Ｇアルファ１５／１６またはキメラＧｑ／Ｇｉアルファユニットを含む。
【０５２３】
前記したものは、安定にトランスフェクトされた細胞を用いるアゴニスト活性についてのＦＬＩＰＲアッセイを提供するが、当業者であれば、該アッセイを容易に修飾して、アンタゴニスト活性を特徴付けることができよう。また、該当業者は、別法として、一過的にトランスフェクトされた細胞を用いることができるのも容易に認識するであろう。
【０５２４】
（実施例８）
（メラノフォア技術）
メラノフォアは下等脊椎動物で見出される皮膚細胞である。それは色素を含むメラノソームと呼ばれるオルガネラを含む。メラノフォアは、Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）活性化に際して、微小管ネットワークに沿ってこれらのメラノソームを再分布させることができる。この色素移動の結果は、細胞の明らかな明化または逆明化である。メラノフォアにおいて、Ｇｉ−共役型レセプターの活性化に由来する細胞内ｃＡＭＰの減少したレベルはメラノソームを細胞の中心に移動させ、その結果、色が劇的に明るくなる。もしｃＡＭＰレベルが次いで上昇すれば、Ｇｓ−共役型レセプターの活性化に続き、メラノソームは再度分配され、細胞は再度暗く見える。また、Ｇｑ−共役型レセプターの活性化に由来するジアシルグリセロールの増大したレベルは、この再分布を誘導することができる。加えて、該技術は、ある種のレセプターチロシンキナーゼの研究にも適合する。メラノフォアの応答はレセプター活性から数分以内に送り、その結果、単純で頑強な色の変化が起こる。該応答は、慣用的な吸光度マイクロプレートリーダーまたは適当なビデオイメージングシステムを用いて容易に検出することができる。他の皮膚細胞とは異なり、メラノフォアは神経堤に由来し、シグナリングタンパク質の十分な補充を発現するようである。特に、該細胞は極端に広い範囲のＧタンパク質を発現し、従って、機能的にほとんど全てのＧＰＣＲを発現することができる。
【０５２５】
メラノフォアを用いて、ＧＰＣＲに対する天然リガンドを含めた化合物を同定することができる。この方法は、特定の刺激体に応答してそれらの色素を分散または凝集させることができる色素細胞系のテスト細胞を導入し、ＧＰＣＲにつきコードする内因性クローンを発現させることによって行うことができる。刺激体、例えば、メラトニンは色素沈着の初期状態を設定し、ここで、もしＧＰＣＲの活性化が色素分散を誘導するならば、色素がテスト細胞内で凝集する。しかしながら、細胞を刺激体で刺激すると色素配置の初期状態を設定し、ここで、もしＧＰＣＲが色素凝集を誘導するならば、色素は分散される。次いで、テスト細胞を化学化合物と接触させ、細胞中の色素配置が色素配置の初期状態から変化したか否かを判断する。限定されるものではないが、ＧＰＣＲにカップリングしたリガンドを含めた候補化合物による色素細胞の分散がペトリ皿上で暗く見え、他方、色素細胞の凝集は明るく見える。
【０５２６】
材料および候補は米国特許第５、４６２，８５６号および米国特許第６、０５１、３８６号の開示に従う。これらの特許の開示はここで引用してその全体を援用する。
【０５２７】
細胞を９６−ウェルプレート中で平板培養する（プレート当たり一つのレセプター）。トランスフェクションから４８時間後、各プレート上の細胞の半分を１０ｎＭメラトニンで処理する。メラトニンはメラノフォア中の内因性Ｇｉ−共役型レセプターを活性化し、それらがその色素を凝集させるようにする。細胞の残りの半分を無血清培地０．７×  Ｌ−１５（Ｇｉｂｃｏ）に移す。一時間のち、無血清培地中の細胞は色素が分散した状態のままであり、他方、メラトニン−処理細胞は色素が凝集した状態にある。この時点で、細胞をテスト化合物の用量応答で処理する。もし平板培養したＧＰＣＲがテスト化合物に結合すれば、メラノフォアは該化合物に応答して色変化を受けると予測される。もしレセプターがＧｓまたはＧｑ共役型レセプターいずれかであれば、メラトニン−凝集メラノフォアは色素分散を受けるであろう。コントロール的に、もしレセプターがＧｉ−共役型レセプターであれば、色素が分散した細胞は用量−依存性色素凝集を受けると予測される。
【０５２８】
（実施例９）
（ＭＡＰキナーゼアッセイ）
ＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化キナーゼ）をモニターして、レセプターの活性化を見積もることができる。ＭＡＰキナーゼはいくつかのアプローチによって検出することができる。一つのアプローチは、未リン酸化（不活性）またはリン酸化（活性）いずれかにて、リン酸化の見積もりに基づく。リン酸化されたタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ中でより遅い移動度を有し、従って、ウェスタンブロッティングを用いて未刺激タンパク質と比較することができる。別法として、リン酸化されたタンパク質に対して特異的な抗体が入手可能であり（Ｎｅｗ  ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、これを用いて、リン酸化されたキナーゼの増加を検出することができる。いずれの方法においても、細胞をテスト化合物で刺激し、次いで、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で抽出する。可溶性画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用し、タンパク質を電気泳動によりニトロセルロースまたはＩｍｍｏｂｉｌｉｎに移動させる。免疫反応性バンドは標準的なウェスタンブロッティング技術によって測定される。目で見える、またはケミルミネセントシグナルをフィルム上に記録し、これは、デンシトメトリーによって定量することができる。
【０５２９】
もう一つのアプローチは、リン酸化アッセイを介するＭＡＰキナーゼ活性の見積もりに基づく。細胞をテスト化合物で刺激し、可溶性抽出物を調製する。調製物を、ガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、およびインスリンまたはＰＨＡＳ−Ｉによって調節されたリン酸化加熱および酸安定タンパク質のようなＭＡＰキナーゼに対する特異的基質と共に３０℃にて１０分間インキュベートする。反応は、Ｈ３ＰＯ４の添加によって停止させ、サンプルを氷にうつす。アリコットをＷｈａｔｍａｎ  Ｐ８１クロマトグラフィーペーパー上にスポットし、これは、リン酸化されたタンパク質を保持する。該クロマトグラフィーペーパーを洗浄し、液体シンチュレーションカウンターで３２Ｐをカウントする。別法として、細胞抽出物をガンマ−３２Ｐ−ＡＴＰ、ＡＴＰ再生系、およびフィルター支持体に対するストレプトアビジンが結合したビオチニル化ミエリン塩基性タンパク質と共にインキュベートする。ミエリン塩基性タンパク質が活性化されたＭＡＰキナーゼに対する基質である。リン酸化反応は３０℃にて１０分間行う。次いで、抽出物をフィルターを通して吸引し、これは、リン酸化されたミエリン塩基性タンパク質を保持する。フィルターを洗浄し、液体シンチュレーションカウンティングによって３２Ｐにつきカウントする。
【０５３０】
（実施例１０）
（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ−１（ＭＥＫＫ１）アッセイ）
ＭＥＫＫ１のインビトロキナーゼ活性はＭｉｎａｍｉｎｏ  ｅｔ  ａｌによって記載されているように測定する。［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ｅｔ  ａｌ．、  ｓｉ  ＵＳＡ（２００２）  ９９：３８６６−３８７１；その開示をここで引用してその全体を援用する］。簡単に述べれば、細胞溶解物（４００μｇ）をＭＥＫＫ１（２μｇ）（カタログ番号ｓｃ−２５２、Ｓａｎｔｓ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔｓ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）に対する一次抗体で４時間免疫沈澱させ、続いて、タンパク質Ｇ−セファロース（５０％ｗｔ／ｖｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に４℃に２時間インキュベートする。ＧＳＴ−ＳＥＫ１（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、  Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）を基質として用いる。サンプルをＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分解し、ＰｈｏｓｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いることによって、リン酸化された基質を検出し、定量する。
【０５３１】
（実施例１１）
（ヒトＲＵＰ４０の組織分布）
（Ａ．Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術）
オリゴヌクレオチドを含有するマイクロアレイの設計および製造のためのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘにヌクレオチド配列を提出して、それらのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）技術を用いてＧタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）の発現レベルをモニターした。また、マイクロアレイには、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｎｅ  Ｂａｎｋからの、または商業的に入手可能な源から得られた特徴付けしたヒトの脳組織用のプローブが存在した。ＲＮＡサンプルを増幅し、標識し、マイクロアレイにハイブリダイズさせ、製造業者の指示に従ってデータを解析した。
【０５３２】
ＧｅｎｅＣｈｉｐを用い、ヒトＲＵＰ４０の発現プロフィールを質問した。図２参照。図２は、種々の組織におけるヒトＲＵＰ４０の発現レベルを表すプロットである。ヒトＲＵＰ４０が心臓、肺、大動脈および脂肪でコードに発現されることは明らかである。ヒトＲＵＰ４０は脾臓においてはより低いレベルで発現される。心臓内では、ＲＵＰ４０は左心室によってコードに発現される。また、ＲＵＰ４０の選択的発現がマウスにおいて心臓、肺および脂肪で見られる。（データは示さず）。
【０５３３】
（実施例１２）
（ラット心臓におけるＲＵＰ４０の免疫染色）
配列番号４のアミノ酸９６４〜９８５に対応するペプチドＮＴＧＧＷＤＳＳＧＣＴＶＥＤＤＧＲＤＮＲＤＲを用い、ラットＲＵＰ４０に対して向けられたアフィニティ−精製ポリクローナルウサギ抗体を調製した。（ＳｙｎＰｅｐ、Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）。麻酔した成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットからの単離された心臓組織をセクショニングのためにパラフィンに埋めた。左心室を通る系列的６ミクロンの横方向セクションを調製し、標準的な技術を用いて、ペルオキシダーゼ−ベースの免疫組織化学を行った。非−免疫化ウサギ（カタログ番号＃Ｎ１６９９、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）からの免疫グロブリンを陰性コントロールとして用いた。心筋細胞は、サイトゾル全体に渡って散漫な染色を示し、原型質膜において染色はより強かった（図３）。
【０５３４】
（実施例１３）
（新生ラット心室心筋細胞（ＮＲＶＭ）によるＲＵＰ４０の発現）
（一次細胞培養）
新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を従前に記載されているように単離し、培養した［Ａｄａｍｓ、ＪＶ  ｅｔ  ａｌ．、ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ  （１９９６）  ２７１：１１７９−１１８６］。簡単に述べれば、１〜２日齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット子供から心臓を得、コラゲナーゼで消化し、Ｐｅｒｃｏｌｌグラジエントを通過させることによって筋細胞を精製した。細胞を、１％ゼラチンで予めコートした組織培養皿上で平板培養し、１０％ウマ血清、５％胎児ウシ血清、および抗生物質（１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を補足した４：１  ＤＭＥＭ／培地−１９９中で一晩維持した。平板培養培地中での１８時間後に、筋細胞を維持培地（ＤＭＥＭ／培地１９９＋抗生物質）で洗浄して、死滅した細胞およびデブリスを除去し、実験の持続の間が維持培地を交換した。
【０５３５】
（ＲＴ−ＰＣＲ）
前記したようにＮＲＶＭおよび線維芽細胞から単離した全ＲＮＡを、製造業者の指示に従って、ＰＣＲキット（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＮＪ）用のＲＴを用い、逆転写されたＤＮＡ（ＲＴ−ＤＮＡ）の生成のための鋳型として用いた。ＲＵＰ４０発現はＰＣＲによってＲＴ−ＤＮＡサンプルで検出した。ＰＣＲ条件が：２分間の９６℃；３０秒間の９６℃、３０秒間の５５℃、２分間の７２℃の３０サイクル；１０分間の７２℃であった。
【０５３６】
用いたラットＲＵＰ４０順方向プライマーは配列番号
【０５３７】
【化３】
2007524382.tif 000007
を有する。用いたラットＲＵＰ４０逆方向プライマーは配列番号
【０５３８】
【化４】
2007524382.tif 000008
を有する。増幅されたラットＲＵＰ４０  ＤＮＡ産物はサイズ４０３塩基対のものである。Ｇ３ＰＤＨアンプリファイアー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、ＮＪ）を内部コントロールとして各ＰＣＲ反応に加えた。
【０５３９】
（結果）
ＲＵＰ４０は心筋細胞で発現することが判明した。結果は図４に示す。ＲＴ−ＰＣＲは、無血清（ＳＦＭ）条件下に２４時間維持した新生心室筋細胞（ＮＲＶＭ）におけるＲＵＰ４０転写体の発現を示す。筋細胞におけるＲＵＰ４０転写体レベルはフォルボール１２−ミニステート１３−アセテート（ＰＭＡ）の添加から２４時間後に劇的に降下したが、フェニレフリン（ＰＥ）またはプロスタグランジンＦ２アルファ（ＰＧ）の培地への添加の後には上昇したままであった。一次心室線線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ）におけるＲＵＰ４０発現のほとんど検出不可能なレベルに注意した。Ｇ３ＰＤＨ  ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ反応で用いた鋳型の等しいレベル、およびゲル負荷の合致性を示す。増幅は、鋳型の不存在下における増幅に対応するゲルの「−」レーンによって示されるように、鋳型−依存性であった。ラット心室筋細胞によるＲＵＰ４０の発現は、実施例１１で決定され、図２に示されたヒトおよびマウス（図示せず）ＲＵＰ４０の発現プロフィールに合致する。
【０５４０】
（実施例１４）
（増大したＩＰ３蓄積における心筋細胞結果でのＲＵＰ４０の過剰発現）
（一次細胞培養）
新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を従前に記載されているように単離し、培養した［Ａｄａｍｓ、ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｎ  Ｃｈｅｍ（１９９６）２７１９：８６；その開示をここで引用してその全体を援用する］。簡単に述べれば、心臓を１〜２日齢Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット子供から得、コラゲナーゼで消化し、筋細胞をＰｅｒｃｏｌｌグラジエントを通すことによって生成した。細胞を０．２×１０６細胞／ウェルにて２４ウェルゼラチンコートプレート上で平板培養し、１０％ウマ血清、５％胎児ウシ血清、および抗生物質（１００ユニット／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）を補足した４：１  ＤＭＥＭ／培地−１９９中で一晩維持した。平板培養培地中での１８時間の後、筋細胞を維持培地（ＤＭＥＭ／培地１９９＋抗生物質）で洗浄して、死滅した細胞およびデブリスを除去し、実験の継続中には維持培地を交換した。
【０５４１】
（ＲＵＰ４０アデノウイルスベクターの構築）
アデノウイルスの実験では、配列番号２のヒトＲＵＰ４０ポリペプチドをコードする配列番号１のポリヌクレオチドを、ＨＥＫ２９３細胞における相同組換えによる組換え体ＲＵＰ４０（ＡｄＲＵＰ４０）の生成に先立ち、ｐＳｈｕｔｔｌｅＣＭＶ（Ｑｐｉｏｇｅｎｅ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローンした。
【０５４２】
（アデノウイルス感染）
平板培養の期間の後、筋細胞を前記した維持細胞にスイッチし、組換えアデノウイルスで直ちに感染させるか、または偽感染させた。アデノウイルスベクターでのＮＲＶＭの感染が従前に記載されているように行った［Ａｄａｍｓ、ＪＷ  ＥＴ  ａｌ．、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ（２０００）８７：１１８０−７］。感染の最適多重度（ＭＯＩ）は、０．１〜５００ＰＦＵ／細胞の用量範囲にわたって細胞当たり２０〜５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）であると測定された。２０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩの結果、ＧＰＦをコードするコントロールアデノウィルス（Ａｄａｇｆａでの感染のち最初の４８時間の間にいずれの細胞傷害性なくして、［このコントロールウィルスに感染したＮＲＶＭにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現によって測定して］９５％を超える感染効率がもたらされた。
【０５４３】
（ＩＰ３アッセイ）
アデノウイルス感染筋細胞を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−緩衝化培地中に１０ｍＭ  ＬｉＣｌを含有するアッセイ培地の添加に先立ち、２μＣｉ／ｍＬの［３Ｈ］ミオイノシトールを含有する維持倍地中で１８〜２４時間インキュベートした。アッセイ緩衝液中の３０分の後、細胞を冷酸固定し、（０．１Ｍギ酸）、溶解物を、Ｄｏｗｅｘ  １００〜２００メッシュ（ホルメート形態）樹脂ビーズを含有するカラムに移した。イノシトールリン酸を１Ｍギ酸アンモニウムおよび０．１Ｍギ酸で溶出させ、液体シンチレーションカウンティングによって定量した。
【０５４４】
（結果）
Ａｎｏｖａ／Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ａｄｈｏｃ統計解析によって判断して、心筋細胞におけるＲＵＰ４０の過剰発現は増大したＩＰ３蓄積を刺激した。従って、過剰発現されたＲＵＰ４０は、アッセイの条件下で構成的Ｇｑカップリング活性のレベルを発現した。結果を図５に示す。
【０５４５】
（実施例１５）
（ＲＵＰ４０の過剰発現は心筋細胞において肥大および心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）発現を刺激する）
（一次細胞培養）
新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を従前に記載されているように［Ａｄａｍｓ、ＪＷ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ（１９９６）２７１：１１７９−８６］、実施例１４に記載されているように調製した。
【０５４６】
（ＲＵＰ４０アデノウイルスベクターの構築）
（アデノウイルス感染）
ＲＵＰ４０アデノウイルスベクター構築およびアデノウイルス感染は実施例１１に記載されているように行った。
【０５４７】
（結果：肥大）
ＲＵＰ４０の過剰発現は心筋細胞における肥大を刺激した。結果を図６Ａに示した。細胞当たり２０プラーク形成単位（ＰＦＵ）にてＡｄｒｕｐ４０で４８時間感染させたＮＲＭＶは、ＡｄＧＦＰコントロールウィルスで感染させたコントロール細胞と比較して増大した細胞サイズを示した。
【０５４８】
（結果：心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の発現）
ＲＵＰ４０の過剰発現は、心筋細胞における心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の発現を刺激した。結果を図６Ｂに示し、これは、内因性ＡＮＦ転写体の発現のレベルおよび、組換えヒトＲＵＰ４０転写体の発現のレベルを示す。ＮＲＶＭを、２０ＰＦＵ／細胞の感染多重度にて、ヒトＲＵＰ４０をコードする組換体アデノウイルスまたはコントロールアデノウィルス（Ａｄｇｆｐ）で処理した。アデノウイルス感染の２４時間の後に、全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析を行って、ウィルスにより発現されたＲＵＰ４０のレベルを測定した。ヌクレオチド２，８５８〜３、６０６よりなるラットＲＵＰ４０のｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた。同一膜を、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の発現、心筋細胞肥大の遺伝子マーカーにつきプローブした［Ｒｏｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：８２７７−８１］。プローブはランダムプライミングによって［３２Ｐ］で標識した。加えて、膜をメチレンブルーで染色して、ＲＮＡの同等負荷および導入を確認した。
【０５４９】
（実施例１６）
（横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）に由来する圧力過剰負荷の条件下でのＲＵＰ４０の心筋発現）
（横方向大動脈収縮（ＴＡＣ））
マウスにおける横方向大動脈の外科的収縮は従前に記載されているように行った［Ｒｏｃｋｍａｎ、ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｔＳｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：８２７７−８１］。簡単に述べれば、８週齢マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）をケタミンおよびキシラジンの混合物で麻酔した。解剖顕微鏡下で、中線頸部切開を行って、ミクロ外科技術によって気管および頚動脈を露出させた。成功した気管内挿管の後、０．２ｍＬの時機容量での補足酸素および一分当たり１１０の呼吸速度にて、カニーレを容量サイクルドげっ歯類ベンティレータ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に連結させた。胸腔を小さな切開を通じて左上方胸骨縁の第二の肋間空間に入れ、２７−ゲージの針に対する７−０ナイロン縫合結紮を結ぶことによって大動脈収縮を行って、針を抜いたときの直径の０．４ｍｍ狭化および６０〜７０％の再現性のある横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）が得られた。大動脈バンディングに続き、気胸を排気し、動物から抜管し、回復させる。コントロール偽−手術マウスは外科的処置を受けたが、横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）には付さない。外科的処置から７日後に、生存する動物を安楽死させ、逆方向灌流によって心臓をホルマリンで固定した。
【０５５０】
固定された心臓組織をＯＣＴ：Ａｑｕａ  Ｍｏｕｎｔの５０：５０混合物（ＶＷＲ、＃４１７９９−００８、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）に埋め込み、ドライアイス／エタノール中で凍結した。ブロックを低温セクショニングを行うまで−８０℃に維持した。低温セクショニングの後、組織セクションをシールされたスライドボックス中で−２０℃にて貯蔵した。
【０５５１】
（インサイチュハイブリダイゼーション）
配列番号５のマウスＲＵＰ４０ポリヌクレオチドを、ＳＰ６およびＴ７プロモーターに近接挟まれた部位にてＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）にサブクローンした。時節的には製造業者の指令に従い、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲｉｂｏＰｒｏｂｅ転写キット（＃Ｐ１４６０；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用い、配列番号５のポリヌクレオチドに相補的な［３５Ｓ］−放射性標識アンチセンスマウスＲＵＰ４０  ｍＲＮＡプローブを調製した。コントロール放射性標識センスプローブはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて同様にして調製した。
【０５５２】
固定した組織セクションを解凍し、直ちに、室温における一連の固定後インキュベーションに付した：３分間でＰＢＳ；１０分間で１０％ホルマリン；１０分間でＰＢＳ；および１０分間でＰＢＳ。
【０５５３】
次いで、組織セクションを浸透化およびアセチル化に付した。この目的で、組織セクションをプロテイナーゼＫ（０．５Ｍトリス、０．２５Ｍ  ＥＴＴＡ、ｐＨ８．０中０．００１％プロテイナーゼＫ）と共に３７℃にて１０分間インキュベートし、続いて、室温にて５分間洗浄した。次いで、組織セクションをトリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ  ＴＦＡ、ｐＨ８．０）と共に室温にて５分間インキュベートし、続いて、０．１Ｍ  ＴＥＡ  ｐＨ８．０中の２．５％無水酢酸と共に室温にて５分間インキュベートした。次いで、組織セクションを、各々、２×  ＳＳＣ；５０％エタノール；９５％エタノール；および１００％エタノールと共に室温にて２分間インキュベートした。次いで、組織セクションを乾燥し、翌日のハイブリダイゼーションまで乾燥下に維持した。
【０５５４】
組織セクションのハイブリダイゼーションを、セクション当たり８０〜１００μＬの容量にて、０．４７ｍＭＡＣｌ、５４％ホルムアミド中で６０℃にて２０時間行った。放射性標識プローブを１×１０７ｃｐｍ／ｍＬで用いた。次いで、組織セクションを室温にて４×  ＳＳＣで毎回１０分間、４回洗浄した。ハイブリダイズしなかったプローブを、３７℃における３０分間のＲＮａｓｅＡ（０．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０中２０μｇ／ｍＬ）でのインキュベーションで消化した。次いで、組織セクションを室温にて２×  ｓｓｃで毎回５分間２回洗浄し、続いて、１×  ＳＳＣで室温にて１０分間洗浄し、続いて、０．５×  ＳＳＣで室温にて１０分間洗浄した。続いて、組織セクションを０．１×  ＳＳＣで６５℃にて３０分間洗浄し、続いて、０．１×  ＳＳＣで室温にて５分間洗浄し、続いて、アルコール中で脱水した。
【０５５５】
次いで、ハイブリダイゼーションを受けた組織セクションをＸ−線フィルムに暴露し、オートラジオグラフィーによってＲＵＰ４０ハイブリダイゼーションシグナルを可視化した。この目的で、組織セクションをＢｉｏｍａｘ  ＭＲフィルムに一日間、４日間、次いで、暴露した。オートラジオグラフィーの後、ＭＴＢ−２液体エマルジョン（ＶＷＲ、＃ＩＢ１６５４４３３、Ｗｅｓｔ、Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）を用いて組織セクションをエマルジョン浸漬した。エマルジョン浸漬した組織セクションを一週間エマルジョンに暴露し、ついで、現像した。現像の後、組織セクションをビスベンズイミド（ＰＢＳ中０．００１％）で逆染色し、カバーグラスに乗せた。暗視野コンデンサー（銀粒は白色に見える）およびＤＡＰＩフィルターキューブを用いて組織セクションを写真に撮って、（蛍光ビスベンズイミド逆染色を観察した）。
【０５５６】
（結果）
横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）に由来する圧力過剰負荷の条件下で、ＲＵＰ４０の肥大レベルは維持される、またはわずかに増大した。結果を図７に示す。インサイチュハイブリダイゼーションは、成体マウス心臓における広い心筋発現を示した。アンチセンスＲＵＰ４０放射性標識リボプローブは、心臓の全てのチャンバーにおけるＲＵＰ４０発現を検出した。陰性コントロールとしての対象偽−操作マウスからのさらなるセクションについてセンスコントロールリボプローブを用いて、心臓セクションのプローブ標識のノイズ比率を示した。
【０５５７】
（実施例１７）
（肥大心筋障害のインビボ動物モデル）
本発明の化合物は、限定されるものではなく例示する意図の、Ｒｏｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．のインビボ動物モデル［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：８２７７−８１；その開示をここで引用してその全体を援用する］を用いる肥大心筋障害についての予防または治療の効果を有することが示すことができ、ここで、マウスは横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）に由来する圧力過剰負荷の条件に付される。いくつかの実施形態において、該化合物は逆アゴニストまたはアンタゴニストである。該化合物は腹腔内注射によって投与される。好ましい用量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ；１．０ｍｇ／ｋｇ；３．０ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ；３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。プラセボ群にはビヒクルを単独で投与する。
【０５５８】
マウスにおける横方向大動脈の外科的収縮は従前に記載されているように行う。［Ｒｏｃｋｍａｎ、ＨＡ  ｅｔ  ａｌ，．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：８２７７−８１］。簡単に述べれば、８週齢マウス（Ｃ５７／ＢＬ６）をケタミンおよびヒシラジンの混合物で麻酔する。解剖顕微鏡下で、中線頸部切開を行って、ミクロ外科技術によって気管および頚動脈を露出させる。成功した気管内挿管の後、０．２ｍＬの時機容量での補足酸素および一分当たり１１０の呼吸速度にて、カニューレを容量サイクルドげっ歯類ベンティレータ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に連結させた。胸腔を小さな切開を通じて左上方胸骨縁の第二の肋間空間に入れ、２７−ゲージの針に対する７−０ナイロン縫合結紮を結ぶことによって大動脈収縮を行って、針を抜いたときの直径の０．４ｍｍ狭化および６０〜７０％の再現性のある横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）が得られた。大動脈バンディングに続き、気胸を排気し、動物から抜管し、回復させる。コントロール偽−手術マウスは外科的処置を受けたが、横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）には付さない。テスト化合物およびビヒクル単独の用量を腹腔内注射によって毎日投与する。外科的処置から７日後、生存する動物を安楽死させ、肥大心筋障害のいくつかのパラメータを評価した［Ｒｏｃｋｍａｎ、ＨＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９１）８８：８２７７−８１］。
【０５５９】
湿潤および乾燥心臓重量を評価する。湿潤および乾燥心臓重量／体重比率を評価する。筋細胞の断面積（核における平均細胞面積）を評価する。ｍＲＮＡの該レベルにおける心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）遺伝子の誘導を評価する。湿潤または乾燥心臓重量の低下、湿潤または乾燥心臓重量／体重比率の低下、筋細胞の断面積の低下、化合物の投与でのＡＮＦ遺伝子の誘導のレベルの低下は、肥大型心筋症の予防または治療についての用途を有する化合物を示す。
【０５６０】
（実施例１８）
（経口生物学的利用性）
経口生物学的利用性を直接的に評価するための物理化学的分析アプローチは当業者によく知られており、それを用いることができる［例えば、限定するものではないが：Ｗｏｎｇ  ＰＣ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣａｒｄｉｏｖａｓＣＤｒｕｇ  Ｒｅｖ（２００）２０：１３７−５２：およびＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅａｄａｃｈｅ（２００２）Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ５４−６２；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］。限定されるものではなくさらに説明するために、該代替分析アプローチは液体クロマトグラフィー−タンデム質量測定を含むことができる［Ｃｈａｖｅｚ−Ｅｍｇ  ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＢ  Ａｎａｌｙｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ（２００２）７６７：１１７−２９；Ｊｅｔｔｒ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００２）７１：２１−９；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｆ（１９９９）３９：１１５５−６１；およびＢａｒｒｉｓｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（１９９６）１０：１０３３−７；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０５６１】
陽電子射出断層測定法（ＰＥＴ）は、薬物の経口投与の後に哺乳動物身体において、経口生物学的利用性を含めた薬物分布の直接的測定を得るのに成功して用いられてきた［Ｇｕｌｙａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ（２００２）２９：１０３１−８；その開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０５６２】
別法として、本発明のモジュレーターの経口生物学的利用性は、限定するものではなく例えば説明として、実施例１７のマウスモデルを介して発展させたインビボデータに基づいて決定することができる。モジュレーターは、０．１ｍｇ  ｋｇ−１〜１００ｍｇ  ｋｇ−１の範囲の用量にて経口胃管栄養によって投与される。モジュレーターの経口投与は、肥大型心筋症の予防または治療の用途を有することが示される。モジュレーターの効果は、用量−依存性であって、腹腔内投与の後の効果に匹敵することが示される。経口投与を介する、湿潤または乾燥心臓重量、湿潤または乾燥心臓重量／体重比率心筋細胞の断面積、またはＡＮＦ遺伝子の誘導のレベルの半最大低下を達成するのに必要なモジュレーターの用量は、腹腔内投与を介する、湿潤または乾燥心臓重量、湿潤または乾燥心臓重量／体重比率心筋細胞の断面積、またはＡＮＦ遺伝子の誘導のレベルの半最大低下を達成するのに必要なモジュレーターの用量に匹敵する。その例として、もし該経口用量が該腹腔内用量の２倍であれば、モジュレーターの経口生物学的利用性は５０％をとる。より一般的には、もし該用量がθｍｇ  ｋｇ−１であって該腹腔内用量がρｍｇ  ｋｇ−１であれば、パーセンテージとしてのモジュレーターの経口生物学的利用性は［（ρ／θ）×１００］をとる。いくつかの実施形態において、モジュレーターは逆アゴニストまたはアンタゴニストである。
【０５６３】
本発明のモジュレーターの経口生物学的利用性の測定は、限定するものではなく例示する目的で本明細書中に示したもの以外のインビボ動物モデルを用いて行うことができるのは当業者に明らかであろう。参照投与経路は腹腔内以外とすることができるのは容易に考えられる。いくつかの実施形態において、該参照投与経路は静脈内とすることができる。
【０５６４】
（実施例１９）
（ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を含むトランスジェニックマウス／ラット／ブタ）
また、本発明は、ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの発現を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物に関する方法および組成物を提供し、該レセプターは：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；および
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
からなる群より選択されるアミノ酸配列、または配列番号２のアミノ酸配列の生物学的に活性なフラグメント；配列番号２のアミノ酸配列の構成的に活性化された変異体、またはその該生物学的に活性なフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、該非ヒト哺乳動物はマウス、ラットまたはブタである。
【０５６５】
マウス、ラットおよびブタのようなトランスジェニック動物を作製する方法は当業者によく知られており、いずれのそのような方法も本発明で用いることができる。簡単に述べれば、トランスジェニック哺乳動物は、例えば、ＥＳ細胞のような多能性幹細胞を、ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードするポリニクレオチド（「導入遺伝子」）でトランフェクトすることによって生産することができる。次いで、首尾よく形質転換されたＥＳ細胞を初期の段階の胚に導入することができ、次いで、これを同一種の哺乳動物の子宮に移植する。ある場合には、形質転換された（「トランスジェニック」）細胞は得られた動物の胚系の一部を含み、次いで、該胚系中のトランスジェニック細胞を含む成体動物を他の動物と接合させることができ、それにより、結局は、それらの細胞の各々中の導入遺伝子を有し、かつそれらの子孫の各々に導入遺伝子を安定に伝達することができるトランスジェニック動物の集団を生産することができる。ポリヌクレオチドを導入する他の方法を用いることができ、例えば、マイクロインジェクションを介して、ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲをコードするポリヌクレオチドを受精卵または初期段階の胚に導入する。別法として、導入遺伝子は、導入遺伝子を含有するレトロウィルスで接合体を感染させることによって動物に導入することができる［Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９７６）  ７３：１２６０−４］。トランスジェニック哺乳動物を作製する方法は、例えば、その各々の開示をここで引用してその全体を援用する、Ｗａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９２）  ４９：１１３−２０；Ｈｏｇｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ．，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（１９８６）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ，  Ｎ．Ｙ．；  ｉｎ  Ｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ（１９９９）  １３：１７６２−７３；ＷＯ  ９１／０８２１６；米国特許第４，７３６，８６６号；および米国特許第６，５０４，０８０号に記載されている。
【０５６６】
いくつかの実施形態において、ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該発現は心筋細胞−選択的である。いくつかの実施形態において、該ヒトＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの該心筋細胞−選択的発現はアルファミオシン重鎖プロモーターによって付与される［Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９１）  ２６６：２４６１３−２０；その開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０５６７】
（実施例２０）
（肥大型心筋症のトランスジェニックインビボ動物モデル）
本発明の化合物は、実施例１９に記載されたトランスジェニックインビボ動物モデルを用い、心血管障害の予防または治療の効果を有することが示すことができ、ここで、該トランスジェニック動物は野生型コントロール動物に対して肥大型心筋症に対する素因を呈し、または肥大型心筋症を発現する。該心血管障害は心臓病、さらに詳しくは肥大型心筋症および鬱血性心不全を含む。もしいずれかの年齢において、上記動物が年齢にマッチした野生型コントロール動物に対して、増大した湿潤または乾燥心臓重量、増大した湿潤または乾燥心臓重量／体重の比率、心筋細胞の増大した断面積、ＡＮＦ遺伝子の誘導の増大したレベルを呈するならば、該トランスジェニック動物は肥大型心筋症に対する該素因を呈し、または肥大型心筋症を発現する。いくつかの実施形態において、該動物はマウスである。
【０５６８】
該化合物は、該化合物を肥大型心筋症表現型の開始に先立って該トランスジェニック動物に投与し、ビヒクル単独が投与された該トランスジェニック動物によって呈された該肥大型心筋症表現型を妨げるかを判断することによって該心血管障害の予防の効果につき評価することができる。該化合物は、もしビヒクル単独を投与された該トランスジェニック動物によって呈された増大した湿潤または乾燥心臓重量、増大した湿潤または乾燥心臓重量／体重の比率、心筋細胞の増大した断面積、またはＡＮＦ遺伝子の誘導の増大したレベルを該化合物の投与が妨げれば、該心血管障害の予防につき効果を有すると示すことができる。
【０５６９】
該化合物は、肥大型心筋症表現型の開始後に該化合物を該トランスジェニック動物に投与し、該投与が肥大型心筋症を阻害し、または軽減するかを決定することによって、外心血管障害の治療につき効果を評価することができる。該化合物は、もし該化合物の投与が、ビヒクル単独を投与された該トランスジェニック動物によって呈された増大した湿潤または乾燥心臓重量、増大した湿潤または乾燥心臓重量／体重の比率、心筋細胞の増大した断面積、またはＡＮＦ遺伝子の誘導の増大したレベルを阻害するか軽減するならば、該心血管障害の阻害または軽減の効果を有すると示すことができる。
【０５７０】
いくつかの実施形態において、該化合物は逆アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態において、該化合物は腹腔内注射によって投与される。好ましい用量は０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。他の好ましい用量は０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ；１．０ｍｇ／ｋｇ；３．０ｍｇ／ｋｇ；１０ｍｇ／ｋｇ；３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇからなる群より選択される。プラセボ群にはビヒクル単独を投与する。いくつかの実施形態において、該用量は毎日投与される。いくつかの実施形態において、該用量は１週間、２週間、３週間、および４週間の群から選択される期間の間投与される。この投与の経路、これらの投与量範囲、用量投与のこの頻度、および用量投与のこの持続は例示的なものであって、本発明を限定する意図のものではないことに注意されたし。
【０５７１】
（実施例２１）
（ＲＵＰ４０遺伝子中の破壊を含むトランスジェニックマウス／ラット／ブタ）
（マウス）
好ましいＤＮＡ構築体は、５’−末端から３’−末端へと：（ａ）マウスＲＵＰ４０ゲノム配列に含まれる最初のヌクレオチド配列；（ｂ）ネオマイシン抵抗性についてのマーカー（ｎｅｏ）のような陽性選択マーカーを含むヌクレオチド配列；および（ｃ）マウスＲＵＰ４０ゲノム配列に含まれ、最初のマウスＲＵＰ４０ヌクレオチド配列（ａ）の下流のゲノムに位置する第２のヌクレオチド配列を含む。マウスＲＵＰ４０ゲノム配列は、当業者によく知られた方法を用いて単離される（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；その開示をここで引用してその全体を援用する）。マウスＲＵＰ４０ゲノム配列の該単離用のプローブは、マウスＲＵＰ４０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡに由来し、ここで、該ｃＤＮＡはマウス心臓、肺または脂肪組織からのｍＲＮＡを鋳型として用いて得ることができる。
【０５７２】
好ましい実施形態において、このＤＮＡ構築体はヌクレオチド配列（ａ）の上流、またはヌクレオチド配列（ｃ）の下流に位置する陰性選択マーカーも含む。好ましくは、陰性選択マーカーはチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子［Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−２８］、ヒグロマイシンベータ遺伝子［Ｔｅ  Ｒｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：４２９９−４３０３］またはジフテリアトキシンＡフラグメント（Ｄｔ−Ａ）遺伝子［Ｎａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１２５−３５；Ｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９０）８７：９９１８−９９２２］を含み、それらの開示をここで引用してその全体を援用する。好ましくは、陽性選択マーカーは、マウスＲＵＰ４０ポリペプチドをコードする配列を中断するように、マウスＲＵＰ４０エクソン配列内に位置する。これらの置き換えベクターは、例えば、その開示をここで引用してその全体を援用する、Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８６）４４：４１９−２８；Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８７）５１：５０３−１２；Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３６：３４８−５２；Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１０：７０５−３０；および米国特許第５，６３１，１５３号によって記載されている。
【０５７３】
第１および第２のヌクレオチド配列（ａ）および（ｃ）はマウスＲＵＰ４０調節配列、イントロン配列、エクソン配列または調節および／またはイントロンおよび／またはエクソン配列双方を含む配列内に異ならなく位置することができる。ヌクレオチド配列（ａ）および（ｃ）のサイズは１〜５０ｋｂ、好ましくは１〜１０ｋｂ、より好ましくは２〜６ｋｂ、最も好ましくは２〜４ｋｂの範囲である。
【０５７４】
選択された遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法は当業者によく知られており、首尾よく広い範囲の遺伝子を不活化するのに用いられてきた。
【０５７５】
（ラット）
類似の、または別の［例えば、Ｚａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３）２１：６４５−５１；その開示をここで引用してその全体を援用する］方法を用いて、ＲＵＰ４０遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックラットを作製することができる。
【０５７６】
（ブタ）
類似の、または別の方法を用いて、ＲＵＰ４０遺伝子中に破壊を含むトランスジェニックブタを作製することができる。［例えば、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５：１０８９−１０９２参照；その開示をここで引用してその全体を援用する］。
【０５７７】
（Ｃｒｅ  ｌｏｘＰ系：）
（ＲＵＰ４０遺伝子中に心筋細胞−選択的破壊を含むトランスジェニックマウス／ラット／ブタ）
（マウス）
これらの新しいＤＮＡ構築体は、Ｐ１ファージの部位特異的組換え系を用いる。該Ｐ１ファージは３４塩基対ｌｏｘＰ部位と相互作用するＣｒｅと呼ばれるレコンビナーゼを保有する。該ｌｏｘＰ部位は８ｂｐの保存された配列によって分離された１３ｂｐの２つの回文配列を含む［Ｈｏｅｓｓ  ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９８６）１４；２２８７−３００；その開示をここで引用してその全体を援用する］。同一の向きを有する２つのｌｏｘＰ部位の間のＣｒｅ酵素による組換えは、ＤＮＡフラグメントの欠失に導く。
【０５７８】
相同組換え技術と組み合わせて用いるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系はＧｕ  ｅｔ  ａｌ．によって最初に記載された［Ｇｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１５５−６４；Ｇｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）  ２６５：１０３−６；その開示をここで引用してその全体を援用する］。簡単に述べれば、ゲノムの標的とする位置に挿入すべき注目するヌクレオチド配列は、同一の向きに、かつ組換え体ゲノムから切り出すべきヌクレオチド配列の各末端に位置する少なくとも２つのｌｏｘＰ部位を保有する。切り出し事象は、組換え細胞宿主の核内にレコンビナーゼ（Ｃｒｅ）酵素の存在を必要とする。レコンビナーゼ酵素は（ａ）Ｂａｕｂｏｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されているような［Ｂａｕｂｏｎｉｓ  Ｗ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  Ｂ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９９３）２１：２０２５−９；その開示をここで引用してその全体を援用する］、酵素の細胞へのリポフェクションによるように、Ｃｒｅ酵素を所望の細胞に直接的に注射することによって、この酵素を含有する培養基中で組換え細胞宿主をインキュベートし；（ｂ）Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．［Ｇｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９３）７３：１１５５−６４；その開示をここで引用してその全体を援用する］およびＳａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｓａｕｅｒ  Ｂ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｎ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８８）８５：５１６６−７０；その開示をここで引用してその全体を援用する］によって記載されているように、組換え宿主細胞において機能的なプロモーターに操作可能に連結したＣｒｅコーディング配列を含むベクターで宿主細胞をトランスフェクトし、そのプロモーターは所望により誘導性であり、該ベクターは組換え細胞宿主に導入され；（ｃ）Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．［Ｇｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６５：１０３−６；その開示をここで引用してその全体を援用する］によって記載されているように、組換え細胞宿主において機能的なプロモーターに操作可能に連結したＣｒｅコーディング配列を含むポリヌクレオチドを宿主細胞のゲノムに導入することによって（そのプロモーターは所望により誘導性であり、該ポリヌクレオチドはランダム挿入事象または相同組換え事象いずれかによって宿主細胞のゲノムに挿入される）所望の時点に運ぶことができる。
【０５７９】
Ｃｒ−ｌｏｘＰ系を用いるベクターおよび方法は、例えば、その各々の開示をここで引用してその全体を援用するＺｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）；Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９９）２７４：１００６６−７０；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７３：１２５２−６；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）１２５：１９４３−９によって記載されている。
【０５８０】
本発明の好ましい実施形態において、Ｃｒｅは前記戦略（ｃ）によって宿主細胞のゲノムに導入され、ここで、該プロモーターは心筋細胞選択的であり、（ｌｏｘＰ−近接；「フロックスド（ｆｌｏｘｅｄ）」）マウスＲＵＰ４０ゲノム配列の心筋細胞選択的破壊に導く。いくつかの実施形態において、該心筋細胞選択的プロモーターはミオシン軽鎖２（ｍＬｃ−２ｖ）の心室特異的イソ形態のためのそれである［Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  （１９９９）２７４：１００６６−７０；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ（１９９８）２７４：１２５２−６；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する］。Ｃｒｅレコンビナーゼをコードする配列の内因性ｍｌｃ−２ｖ遺伝子座への挿入を含むトランスジェニックマウス（「ｍｌｃ−２ｖ  ｃｒｅノック−インマウス」）は記載されている［Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）１２５：１９４３−９；その開示をここで引用してその全体を援用する］。選択された遺伝子をフロックスする方法は当業者の技量内のものである［例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９８）１２５：１９４３−９参照］。
【０５８１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ｍｌｃ−２ｃｒｅ対立遺伝子（前掲）をフロックスドＲＵＰ４０遺伝子と交雑することを含む、ＲＵＰ４０遺伝子の心筋細胞選択的破壊を含むトランスジェニックマウスの作製方法をその要旨とする。
【０５８２】
ＲＵＰ４０遺伝子に心筋細胞選択的破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する他の方法は当業者によく知られている；例えば、Ｋｕｈｎ  Ｒ  ａｎｄ  Ｔｏｒｒｅｓ  ＲＭ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（２００２）１８０：１７５−２０４；Ｓａｕｅｒ  Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）１４：３８１−９２；Ｇｕｔｓｔｅｉｎ  ＤＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）８８：３３３；Ｍｉｎａｍｉｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００１）８８：５８７；およびＢｅｘ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ（２００２）１６８：２６４１−２６４４参照；その各々の開示をここで引用してその全体を援用する。
【０５８３】
（ラット）
類似の、または別の［例えば、Ｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００３）２１：６４５−５１参照；その開示をここで引用してその全体を援用する］方法を用いて、ＲＵＰ４０遺伝子に心筋細胞破壊を含むトランスジェニックラットを作製することができる。
【０５８４】
（ブタ）
類似の、または別の方法を用いて、ＲＵＰ４０遺伝子に心筋細胞−選択的破壊を含むトランスジェニックブタを作製することができる。［例えば、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９５：１０８９−１０９２参照；その開示をここで引用してその全体を援用する］。
【図面の簡単な説明】
【０５８５】
【図１】限定されるものではなく例として、図１は、内因性の構成的に活性なＧｓ−共役型ＧＰＣＲのＧｓα融合タンパク質構築体である。「標的レセプター」に対する候補化合物の一次スクリーニングからの結果を示す。「化合物Ａ」についての結果はウェルＡ２に供される。「化合物Ｂ」についての結果はウェルＧ９に供される。
【図２】ＲＵＰ４０の発現をモニターするプローブを含有する慣用的高密度オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用い、マイクロアレイ分析をヒト組織サンプルで行った。ヒストグラムプロットは、プロファイリングした組織の各々についての、ＲＵＰ４０の２連測定の相対的発現レベル（平均差）および標準誤差を供する。相対的発現レベルは垂直軸に示す。組織密度は水平軸に示し、（左側から右側）に以下の通りである：坐骨神経；後根神経節；脳梁；神経前駆細胞；淡蒼球；帯状回；前方視床下部；下垂体、女性；活性化された星状細胞；下垂体、男性；尾状核被殻；腹側被蓋領域（ＶＴＡ）；胎児脳；小脳；嗅球；扁桃；休止期星状細胞；海馬；全脳；延髄；前方海馬；黒質；前頭皮質、前方ＢＭ９；脊髄；視床；下方橋；上方橋；ＨＬ−６０＋ＤＭＳＯ；活性化されたＴＨＰ−１；ＨＬ６０；ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）；Ｕ８７；ＭＣＦ７；ＳＨＳＨ５Ｙ；接着性単球；ＴＨＰ−１；ＳＨＳＨ５Ｙ＋ＢＤＮＦ；脾臓；ナチュラルキラー細胞；骨髄性前駆細胞、骨髄；リンパ節；好中球；胸腺；ＣＤ３４＋前駆細；Ｔ−細胞、ＣＤ８＋休止；Ｔ−細胞、ＣＤ４＋休止；Ｔ−細胞、ＣＤ８＋活性化；ＡＣ１３３＋；Ｂ−細胞、ＣＤ１９＋；骨髄；骨髄性前駆細胞、動員された末梢血液；Ｔ−細胞、ＣＤ４＋活性化；赤血球前駆細胞；単球、ＣＤ１４＋；ＣＤ３４＋、動員された末梢血液；ＣＤ３４＋、臍帯血；好酸球；樹状前駆細胞；左心室；軟骨；培養された前脂肪細胞；培養された脂肪細胞；初代脂肪細胞；脂肪；内臓脂肪；ＨＵＶＥＣ；大動脈平滑筋細胞、増殖型；心膜；大動脈平滑筋細胞、収縮型；大動脈内皮細胞；心臓；大動脈；胃；直腸；結腸；小腸；肝臓；胎児肝臓；食道；骨格筋；皮膚；膵臓；腎臓；膀胱；副腎；唾液腺；膀胱胆汁；平滑筋；気管；骨；膵島；間葉幹細胞；肺；メラノフォア；十二指腸；胎盤；卵巣；精巣；乳房；前立腺上皮；頸部；子宮；前立腺。プロットを精査すると、ヒトＲＵＰ４０の発現は心臓、肺、大動脈および脂肪で高度に発現されることが示される。ヒトＲＵＰ４０は脾臓にて低レベルで発現される。心臓内ではＲＵＰ４０は左心室によって高度に発現される。マウスでは、ＲＵＰ４０は心臓、肺および脂肪で選択的に発現される（図示せず）。
【図３】心臓におけるＲＵＰ４０発現は免疫組織化学的に測定した。成体ラット心臓セクションをウサギ抗−ＲＵＰ４０抗体で、または非−免疫化ウサギからの免疫グロブリン（陰性コントロール）で染色した。心筋細胞は、形質細胞膜におけるより強い染色を伴うサイトゾル全体にわたって散漫な染色を示した。
【図４】ＲＵＰ４０は心筋細胞で発現される（ＲＴ−ＰＣＲ分析）。ＲＴ−ＰＣＲは、無血清（ＳＦＭ）条件下で２４時間維持した新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）におけるＲＵＰ４０転写体の発現を示す。筋細胞におけるＲＵＰ４０転写体レベルは、フォルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）の添加から２４時間後に劇的に降下したが、フェニレフリン（ＰＥ）またはプロスタグランジンＦ２α（ＰＧ）の培地への添加の後に上昇したままであった。一次心臓線維芽細胞（Ｆｉｂｒｏ）におけるほとんど検出できないレベルのＲＵＰ４０発現に注意されたし。Ｇ３ＰＤＨ  ＰＣＲ産物はＰＣＲ反応で用いる鋳型の等しいレベル、およびゲル負荷の合致を示した。鋳型の不存在下における増幅に対応するゲルの「−」レーンによって示されるように、増幅は鋳型−依存性であった。
【図５】心筋細胞におけるＲＵＰ４０の過剰発現は増大したＩＰ３蓄積を刺激する。新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を、配列番号２のヒトＲＵＰ４０ポリペプチドをコードする組換えアデノウィルス（ＡｄＲＵＰ４０）で感染させ、緑色蛍光タンパク質（ＡｄＧＦＰ）をコードする組換えアデノウイルスで感染させ、または偽感染させた（コントロール）。
【図６Ａ】ＲＵＰ４０の過剰発現は心筋細胞の肥大を刺激する。新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を配列番号２のヒトＲＵＰ４０ポリペプチドをコードする組換えアデノウィルス（ＡｄＲＵＰ４０）で感染させ、または緑色蛍光タンパク質をコードする組換えアデノウィルス（ＡｄＧＦＰ）で感染させた。４８時間でＡｄＲＵＰ４０で感染させたＮＲＶＭは、ＡｄＧＦＰコントロールウィルスで感染させたコントロール細胞、または偽−感染コントロール細胞（コントロール）と比較して上昇した細胞レベルを示す。
【図６Ｂ】ＲＵＰ４０の過剰発現は、心筋細胞において心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）の発現を増加させた。新生ラット心室筋細胞（ＮＲＶＭ）を、配列番号２のヒトＲＵＰ４０ポリペプチドをコードする組換えアデノウイルス（ＡｄＲＵＰ４０）、または緑色蛍光タンパク質をコードする組換えアデノウィルス（ＡｄＧＦＰ）で感染させた。アデノウイルス感染から２４時間後に全ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析を行って、ウィルスにより発現されたＲＵＰ４０のレベルを測定した。同一の膜を心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）発現のためにプローブした。
【図７】横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）からの圧力過剰負荷誘導心臓肥大の条件下で、ＲＵＰ４０  ｍＲＮＡのレベルは維持されるか、あるいはわずかに増加した。外科的処置を受けたマウスを、横方向大動脈収縮に付す（ＴＡＣ）か、または付さなかった（ＳＨＡＭ）。ＴＡＣおよびＳＨＡＭマウスにおけるＲＵＰ４０  ｍＲＮＡの心筋発現を、アンチセンスリボプローブを用い、インサイチュハイブリダイゼーションによって外科処置から７日後に測定した。センスリボプローブを陰性コントロールとして用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
2007524382000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月15日(2007.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物が心筋細胞肥大のモジュレーターであるか否かを同定する方法、または心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大、および肥大型心筋症より選択される障害を予防または処置するための薬学的薬剤として候補化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該候補化合物をＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役型レセプター（ＧＰＣＲ）と接触させる工程であって、ここで、該レセプターは、Ｇタンパク質にカップリングし、該レセプターは、以下：
（ｉ）アミノ酸配列であって、以下：
（ａ’）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ’）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ’）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ’）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２の生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列；またはその構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２の構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｉｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号７および配列番号８の特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することによって得られ得る、アミノ酸配列；
（ｖ）アミノ酸配列であって、以下：
（ａ’）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｂ’）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｃ’）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；および
（ｄ’）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；
からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４の生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列；またはその構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号４の構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸１−１４１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｉｘ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列によってコードされたＧタンパク質共役型レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み；そして
（ｂ）レセプターの機能が調節されるか否かを決定する工程であって、ここで、レセプター機能の変化は、該候補化合物が心筋細胞肥大のモジュレーターであることを示す工程を包含する、
方法。
【請求項２】
前記レセプターが配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レセプターが配列番号２のアミノ酸配列を含む方法であって、ここで、配列番号２の該アミノ酸配列が、以下：
ａ）配列番号２のアミノ酸６０４位にあるメチオニンのスレオニンによる置換；
ｂ）配列番号２のアミノ酸８０１位にあるバリンのイソロイシンによる置換；および
ｃ）配列番号２のアミノ酸８５６位にあるスレオニンのメチオニンによる置換
からなる群より選択される、１つ以上の置換を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２２〜１，３４６；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２２７〜１，３４６；および
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
からなる群より選択される、アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記レセプターが、配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記レセプターが、以下：
ａ）配列番号４のアミノ酸２〜１，３４９；
ｂ）配列番号４のアミノ酸２５〜１，３４９；
ｃ）配列番号４のアミノ酸２２４〜１，３４９；および
ｄ）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記レセプターが、配列番号６のアミノ酸１〜１４１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＵＲ４０  Ｇタンパク質共役型レセプターが、宿主細胞またはその膜中にある、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、酵母宿主細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記宿主細胞が、心筋宿主細胞またはメラニン宿主細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補化合物が、鬱血性心不全または鬱血性心筋症における心筋細胞肥大の調節のための薬学的薬剤としてスクリーニングされる、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記候補化合物が、心筋梗塞後リモデリングにおける心筋細胞肥大の調節のための薬学的薬剤としてスクリーニングされる、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役型レセプターの逆アゴニストを同定する工程を包含する、請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役型レセプターのアンタゴニストを同定する工程を包含する、請求項１〜１４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役型レセプターのアゴニストを同定する工程を包含する、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役型レセプターの部分アゴニストを同定する工程を包含する、請求項１〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、前記アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストを医薬として処方する工程をさらに包含する、請求項１５〜１８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役型レセプターが、構成的活性を有する、請求項１〜１９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役型レセプターが、組換体である、請求項１〜２０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大、肥大型心筋症、鬱血性心筋症または鬱血性心不全の危険性を有するか、またはこれらを発現している個体の同定において、放射性イメージング剤としての使用のための候補化合物をスクリーニングするためのＲＵＰ４０  ＧＰＣＲの使用であって、該レセプターが、以下：
（ｉ）アミノ酸配列であって、以下：
（ａ’）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ’）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ’）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ’）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２の生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列；またはその構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２の構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｉｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号７および配列番号８の特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することによって得られ得る、アミノ酸配列；
（ｖ）アミノ酸配列であって、以下：
（ａ’）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｂ’）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｃ’）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；および
（ｄ’）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；
からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号４の生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列；またはその構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｖｉｉ）配列番号４の構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸１−１４１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｉｘ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列によってコードされたＧタンパク質共役型レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、
ここで、該レセプターのリガンドとしての化合物の同定が、化合物の放射性同位体標識バージョンが、心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大、肥大型心筋症、鬱血性心筋症または鬱血性心不全の危険性があるか、またはこれらを発現している個体を同定するのに適した放射性イメージング剤であることを示している、
使用。
【請求項２３】
野生型コントロール哺乳動物に対して、肥大型心筋症もしくは鬱血性心不全に対する疾病素質を呈するか、またはこれらを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、該非ヒト該哺乳動物においてＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役レセプターを発現する工程を包含し、該レセプターが、以下：
（ｉ）アミノ酸配列であって、以下：
（ａ’）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ’）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ’）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ’）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号２の生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列；またはその構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号２の構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｉｖ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号７および配列番号８の特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することによって得られ得る、アミノ酸配列；および
（ｖ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列によってコードされたＧタンパク質共役型レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２４】
前記レセプターが、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６を含む、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記レセプターが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、ここで、該配列番号２のアミノ酸配列が、以下：
ａ）配列番号２のアミノ酸６０４位にあるメチオニンのスレオニンによる置換；
ｂ）配列番号２のアミノ酸８０１位にあるバリンのイソロイシンによる置換；および
ｃ）配列番号２のアミノ酸８５６位にあるスレオニンのメチオニンによる置換
からなる群より選択される１つ以上の置換を有する、方法。
【請求項２６】
前記レセプターが、以下：
（ａ）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ）配列番号２のアミノ酸２〜１，３４６；
（ｃ）配列番号２のアミノ酸２２７〜１，３４６；および
（ｄ）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、およびブタからなる群より選択される、請求項２３〜２６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記発現が、心筋細胞選択的である、請求項２３〜２７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
肥大型心筋症または鬱血性心不全を予防または処置について効果を有する化合物を同定する方法であって、請求項２３〜２８のうちのいずれか１項に記載の方法によって生成されるトランスジェニック非ヒト哺乳動物に、該化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
前記方法が、前記化合物の投与が、以下：
（ｉ）湿潤または乾燥心臓重量の低下；
（ｉｉ）湿潤または乾燥心臓重量／体重の比率の低下；
（ｉｉｉ）心筋細胞の断面積の低下；および
（ｉｖ）心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）遺伝子の誘導のレベルの低下；
からなる群より選択される効果を有するか否かを決定する工程；
を包含し、ここで、該決定は、該モジュレーターが肥大型心筋症または鬱血性心不全の予防または治療についての効果を有することを示す、方法。
【請求項３１】
野生型コントロール哺乳動物に対して、横方向大動脈収縮（ＴＡＣ）につき低下した肥大型心筋症を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を作製する方法であって、非ヒト哺乳動物のＲＵＰ４０遺伝子に破壊する工程を包含し、該ＲＵＰ４０遺伝子が、配列番号２を有するヒトＲＵＰ４０の該哺乳動物中のオルソログである、方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物が、マウス、ラット、およびブタからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記哺乳動物がマウスであり、前記ＲＵＰ４０遺伝子が、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物がラットであり、前記ＲＵＰ４０遺伝子が、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記破壊が、心筋細胞選択的である、請求項３１〜３４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
心筋細胞肥大を調節するための薬剤、または、心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大および肥大型心筋症より選択される障害を予防または処置するための薬剤を同定するための方法であって、該方法は：
（ａ）候補化合物を、該ＲＵＰ４０レセプターを含む複数の心筋細胞と接触させる工程であって、該ＲＵＰ４０レセプターが、配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６、または配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９と、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む工程；
（ｂ）候補化合物と接触される細胞中のＲＵＰ４０レセプターの発現レベル、および候補化合物と接触されない細胞中のＲＵＰ４０発現レベルを測定する工程；ならびに
（ｃ）候補化合物と接触される細胞中のＲＵＰ４０レセプターの発現レベルと、候補化合物と接触されない細胞中のＲＵＰ４０の発現レベルとを比較する工程であって、ここで、該候補化合物と接触されない細胞中のＲＵＰ４０レセプターの発現レベルと比較した候補化合物と接触される細胞中のＲＵＰ４０レセプターの発現レベルの減少が、心筋細胞肥大を調節するのに、または該障害を予防もしくは処置するのに適している化合物であることを示している工程を包含する、
方法。
【請求項３７】
前記薬剤が、鬱血性心不全または鬱血性心筋症を処置または予防するために心筋細胞肥大を調節する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬剤が、心筋梗塞後リモデリングにおいて心筋細胞肥大を調節する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記方法が、医薬として前記薬剤を処方する工程をさらに包含する、請求項３６〜３９のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＲＵＰレセプターが内因的に発現される、請求項３６〜４０のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記心筋細胞が、ヒト心筋細胞である、請求項３６〜４１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大、および肥大型心筋症より選択される障害を予防または処置するために使用するための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの逆アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項４４】
鬱血性心不全または鬱血性心筋症における心筋細胞肥大を調節するための使用のための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの逆アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項４５】
心筋梗塞後リモデリングにおける心筋細胞肥大を調節するための使用するための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの逆アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項４６】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項４３に記載の逆アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項４７】
前記哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターが、ヒトＲＵＰレセプターである、請求項４３〜４６のうちのいずれか１項に記載の、逆アゴニストまたはアンタゴニスト。
【請求項４８】
心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大、および肥大型心筋症より選択される障害を予防または処置するための使用のための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの阻害。
【請求項４９】
鬱血性心不全または鬱血性心筋症における心筋細胞肥大を調節するために使用するための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの阻害。
【請求項５０】
心筋梗塞後リモデリングにおける心筋細胞肥大を調節するための使用のための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの阻害。
【請求項５１】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項４８に記載の阻害。
【請求項５２】
前記哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターが、ヒトＲＵＰレセプターである、請求項４８〜５１のうちのいずれか１項に記載の、阻害。
【請求項５３】
心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大、および肥大型心筋症より選択される障害を予防または処置するための使用のための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの逆アゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項５４】
鬱血性心不全または鬱血性心筋症における心筋細胞肥大を調節するための使用のための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの逆アゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項５５】
心筋梗塞後リモデリングにおける心筋細胞肥大を調節するための使用のための、哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターの逆アゴニストまたはアンタゴニスト、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項５６】
前記肥大型心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項５３に記載の、薬学的組成物。
【請求項５７】
前記哺乳動物ＲＵＰ４０レセプターが、ヒトＲＵＰレセプターである、請求項５３〜５６のうちのいずれか１項に記載の、薬学的組成物。
【請求項５８】
心筋細胞肥大のモジュレーターのための候補化合物、または心臓肥大、左心室肥大、右心室肥大、および肥大型心筋症より選択される障害を予防または処置するための薬学的薬剤のための候補化合物をスクリーニングする方法であって、該方法は、Ｇタンパク質共役レセプターを使用することにより特徴付けられ、該レセプターは、以下：
（ａ）アミノ酸配列であって、以下：
（ａ’）配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６；
（ｂ’）配列番号２のアミノ酸１〜９９０；
（ｃ’）配列番号２のアミノ酸９９１〜１，３４６；
（ｄ’）配列番号２のアミノ酸９５４〜９９７；
からなる群より選択されるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列；またはその構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｄ）内因性ＲＵＰ４０レセプターをコードする核酸によってコードされるアミノ酸配列であって、該核酸配列は、配列番号７および配列番号８の特異的プライマーを使用してヒトｃＤＮＡサンプルに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することによって得られ得る、アミノ酸配列；
（ｅ）アミノ酸配列であって、以下：
（ａ’）配列番号４のアミノ酸１〜１，３４９；
（ｂ’）配列番号４のアミノ酸１〜９９３；
（ｃ’）配列番号４のアミノ酸９９４〜１，３４９；および
（ｄ’）配列番号４のアミノ酸９５４〜１０００；
からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；
（ｆ）配列番号４の生物学的に活性なフラグメントのアミノ酸配列；またはその構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｇ）配列番号４の構成的に活性化された変異体のアミノ酸配列；
（ｈ）配列番号６のアミノ酸１−１４１と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列；および
（ｉ）ストリンジェントな条件下で、配列番号１にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列に対して相補的な配列によってコードされたＧタンパク質共役型レセプターのアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
方法。
【請求項５９】
前記レセプターが、配列番号２のアミノ酸１〜１，３４６を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記候補化合物が、鬱血性心不全または鬱血性心筋症における心筋細胞肥大の調節ための薬学的薬剤としてスクリーンされる、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記候補化合物が、心筋梗塞後リモデリングにおける心筋細胞肥大の調節のための薬学的薬剤としてスクリーニングされる、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記肥大性心筋症が、以下：
（ａ）心筋梗塞後リモデリング；
（ｂ）心臓弁疾患；
（ｃ）持続した心後負荷；
（ｄ）心筋炎；および
（ｅ）家族性肥大型心筋症；
からなる群より選択される障害に由来する、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役レセプターの逆アゴニストを同定する工程を包含する、請求項５８〜６２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役レセプターのアンタゴニストを同定する工程を包含する、請求項５８〜６２のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役レセプターのアゴニストを同定する工程を包含する、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記方法が、ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役レセプターの部分アゴニストを同定する工程を包含する、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
前記方法が、前記アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニストまたは逆アゴニストを、医薬として処方する工程をさらに包含する、請求項６３〜６６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役レセプターが、構成的活性を有する、請求項５８〜６７のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＲＵＰ４０  Ｇタンパク質共役レセプターが、組換体である、請求項５８〜６８のうちのいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2007524382.tif 000036
2007524382.tif 000037
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