(57)【要約】本発明は、感染した宿主生物中に存在する肝炎ウイルスの負荷を変えるための方法に関する。この方法は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｋ（ｈｎＲＮＰ  Ｋ）と肝炎ウイルスの制御領域であるエンハンサーＩＩ領域との複合体形成を調節することを含む。さらに、複合体形成を調節する化合物を同定する方法、および肝炎感染の診断における当該化合物の使用がある。本発明は、ｈｎＲＮＰ  ＫのエンハンサーＩＩ領域への結合親和性を低下させる、ウイルス配列のエンハンサーＩＩ領域の１７５２位における突然変異にも関する。
2007520461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ｋまたはその機能断片と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との複合体形成の調節からなる、肝炎ウイルスに感染した宿主生物中の肝炎ウイルスの負荷を変化させるための方法。
【請求項２】
前記ウイルスが、マウス肝炎ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス、ジリス肝炎ウイルス、北極ジリスＢ型肝炎ウイルス、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アヒルＢ型肝炎ウイルス、サギＢ型肝炎ウイルス、ツクシガモＢ型肝炎ウイルス、ハクガンＢ型肝炎ウイルス、ヒメハクガンＢ型肝炎ウイルス、コウノトリＢ型肝炎ウイルス、ウーリー・モンキーＢ型肝炎ウイルス、オランウータン・ヘパドナウイルス、ＧＢウイルスＢ、およびヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
宿主生物が微生物または哺乳動物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物がラット、マウス、リス、ハムスター、ウッドチャック、オランウータン、ウーリー・モンキー、チンパンジー、タマリン（ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）、マーモセットおよびヒトからなる群から選択される、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記複合体形成の調節を細胞内のヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ｋまたはその機能断片のバリアントの総量を変えることによって行う、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との複合体形成を調節する化合物を投与することからなる、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
制御領域がヘパドナウイルスのエンハンサーＩＩである、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
エンハンサーＩＩ領域がＢ型肝炎ウイルスゲノムの１５５４〜１６４５位を含んでなる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルスがヒトＢ型肝炎ウイルスである、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体形成を調節する適切な化合物を同定するためのｉｎ  ｖｉｖｏの方法である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との複合体形成を調節する適切な化合物を投与することからなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
宿主生物中の肝炎ウイルス粒子の数を経時的に測定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
得られた結果と対照の測定結果とを比較することをさらに含む、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対照の測定が、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と肝炎ウイルスゲノム上
の制御領域との複合体形成を調節しない化合物の使用からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
肝炎ウイルスがヒトＢ型肝炎ウイルスであり、制御領域がエンハンサーＩＩであり、対照の測定がウイルス配列の１７５２位にアデニンを含まないＨＢＶバリアントを使用することからなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
宿主生物がｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片を発現する組換え微生物である、請求項１乃至３および５乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
微生物が肝臓組織由来の細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が肝細胞株または肝芽腫細胞株であるか、あるいは肝細胞株または肝芽腫細胞株に由来する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞株がＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＣＣＭ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｓｋ−Ｈｅｐ−１、Ｓｎｕ１８２、ＨｕＨ−６またはＨｕＨ−７からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｈｎ  ＲＮＰＫタンパク質またはその機能断片と肝炎ウイルスの前記制御領域との複合体形成を核酸分子によって低下させる、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
核酸分子がアプタマー、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子または小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
核酸分子が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８または配列番号１０の配列からなるｓｉＲＮＡ分子である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と肝炎ウイルスの制御領域との相互作用を、細胞成分のリン酸化状態を調節する化合物によって調節する、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
化合物がｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片のリン酸化レベルを変化させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
化合物がｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片の細胞内の量を変化させる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
化合物が細胞表面の分子のアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項２４乃至２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
細胞表面の分子が受容体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
受容体が受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ活性を有する膜受容体、またはＧタンパク質共役受容体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
受容体が血小板由来増殖因子の受容体、エリスロポイエチンの受容体、腫瘍壊死因子の受容体、白血病抑制因子の受容体、インターフェロンの受容体、インスリンの受容体、イ
ンスリン様増殖因子の受容体、インターロイキンの受容体、繊維芽細胞増殖因子の受容体、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の受容体、形質転換増殖因子の受容体、または表皮増殖因子の受容体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
アゴニストまたはアンタゴニストがタンパク質である、請求項２７乃至３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
タンパク質がリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、免疫グロブリン、または受容体チロシンキナーゼに対して結合性のアンキリン骨格またはクリスタリン骨格に基づくタンパク質である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と、エンハンサーＩＩ領域を含む肝炎ウイルスまたはその機能断片との間の複合体の形成を変化させることが可能な化合物を同定するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、前記複合体を形成する構成成分を互いに接触させることからなる方法。
【請求項３４】
（ａ）前記ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と肝炎ウイルスゲノム上のエンハンサーＩＩ制御領域との複合体形成を調節する化合物を試験管に加えること、および
（ｂ）前記複合体形成を検出すること
からなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
検出が適切な分光法、光化学法、光度測定法、蛍光測定法、放射線法、酵素法または熱力学法によって行われるか、あるいは細胞の作用に基づく、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
光化学法が架橋反応からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
分光法が蛍光相関分光法の使用からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
光度測定検出法が、光学的に検出可能な標識の使用からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
放射線検出法が放射活性標識の使用からなる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
電気泳動移動度シフトアッセイの使用からなる、請求項３８または３９に記載の使用。
【請求項４１】
Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ配列のエンハンサーＩＩ領域からなる少なくとも２つの核酸分子であって、その１つが前記配列の１７５２位にアデニンを含まない核酸分子を使用することからなる、請求項３３乃至４０のいずれかに記載の使用。
【請求項４２】
１７５２位にアデニンを含まない核酸分子を対照の測定用に使用する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と肝炎ウイルスとの複合体形成を阻害することから肝炎感染の治療に有用な可能性のある化合物をｉｎ  ｖｉｔｒｏでスクリーニングするための請求項３３乃至４２のいずれか１項に記載の方法であって、自動ワークステーションを使用するマルチウェル・マイクロプレート上での化合物ライブラリーの同時スクリーニングからなる方法。
【請求項４４】
肝炎感染がＨＢＶによって引き起こされる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
肝炎感染を治療するための医薬品を製造するための化合物の使用であって、化合物が、アプタマー、マイクロＲＮＡ分子、小さな干渉ＲＮＡ分子、細胞中のｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の絶対量を調節する化合物、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化レベルを調節する化合物、および細胞のキナーゼまたはホスファターゼの制御を誘導することが可能な細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニストからなる群から選択され、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との複合体形成の調節によってウイルスの負荷が変化することを特徴とする使用。
【請求項４６】
細胞のキナーゼまたはホスファターゼの制御を誘導することが可能な細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニストが、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、免疫グロブリン、または受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ活性を有する膜受容体、もしくはＧタンパク質共役受容体に対して結合性のアンキリン骨格もしくはクリスタリン骨格に基づくタンパク質である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
肝炎感染を治療するための医薬品を製造するための、請求項８乃至４４のいずれか１項に記載の方法によって同定される化合物の使用であって、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との複合体形成の調節によってウイルスの負荷が変化することを特徴とする使用。
【請求項４８】
肝炎感染がＨＢＶによって引き起こされる、請求項４５乃至４７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４９】
アプタマー、マイクロＲＮＡ分子、小さな干渉ＲＮＡ分子、細胞中のｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の絶対量を調節する化合物、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化レベルを調節する化合物、および細胞のキナーゼまたはホスファターゼの制御を誘導することが可能な細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニストからなる群から選択される化合物の、肝炎感染を診断するための組成物を製造するための使用。
【請求項５０】
細胞のキナーゼまたはホスファターゼの制御を誘導することが可能な細胞表面受容体のアゴニストまたはアンタゴニストが、リポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテイン、グルボディ、免疫グロブリン、または受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ活性を有する膜受容体、もしくはＧタンパク質共役受容体に対して結合性のアンキリン骨格もしくはクリスタリン骨格に基づくタンパク質である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
肝炎感染を診断するための組成物を製造するための、請求項８乃至４４のいずれか１項に記載の方法によって同定される化合物の使用。
【請求項５２】
肝炎感染を評価する際に使用するためのキットまたは組成物を製造するための核酸分子の使用であって、核酸分子が、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ配列のエンハンサーＩＩ領域からなる少なくとも２つの核酸分子であって、その１つが前記配列の１７５２位にアデニンを含まないことを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝炎ウイルスに感染した宿主生物中に存在する肝炎ウイルスの負荷を変えるための方法に関する。この方法は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ｋまたはその機能断片と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との複合体形成の調節からなる。さらに本発明は、前記複合体形成を調節することが可能である化合物を同定するための方法に関する。本発明は、このような調節を行うことが可能である化合物、例えば核酸分子、免疫グロブリン、細胞表面受容体のアンタゴニストおよびアゴニスト、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化レベルを調節する化合物、およびｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の細胞内の量を調節する化合物などにも関する。最後に本発明は、肝炎感染を診断するためのこのような化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスは、共にウイルス性肝炎の原因の大部分を占める、７つの既知ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＴＴ型肝炎ウイルス）の中の２つである。Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスによる感染によって引き起こされる肝炎は、主たる世界的な健康問題であり、今日世界中で最も一般的な感染の１つである。世界中で４億人を超える人々がＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に慢性的に感染しており、１億７千万人を超える人々がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染している（それぞれの総説に関しては、非特許文献１および２を参照のこと）。比較として、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している人々の数は、６千万人であると推測されている。慢性肝炎は、肝不全；肝硬変に進行する慢性肝炎；静脈瘤出血、腹水、および肝細胞癌の危険がある活動性肝炎を伴う肝硬変；肝炎ウイルス伝播の危険がある高ウイルス血症を伴う慢性肝炎、肝臓外の合併症を伴う慢性肝炎など重大な合併症と関係がある。Ｃ型肝炎は欧州および米国における肝臓移植の主な原因である。Ａ型肝炎は慢性疾患を引き起こすことはないが、慢性肝臓疾患を併発した急性Ａ型肝炎は、より重度の疾患および高い死亡率をもたらす可能性があることを示唆する証拠がある（非特許文献３）。Ｄ型肝炎ウイルスは、ＨＢＶ感染を前提条件とする不完全ウイルスである。Ｄ型肝炎ウイルスによる重複感染は、急性肝炎から肝硬変への進行を引き起こすことが多い（非特許文献４）。Ｅ型肝炎ウイルスは急性肝炎、自己限定性肝炎、黄疸性肝炎を引き起こす可能性があり（非特許文献５）、Ｇ型肝炎ウイルス感染はいかなる既知の疾患状態との関係も見出されていないが（非特許文献６）、該ウイルス感染はヒトにおいて一般的であり持続することが多い。肝臓疾患に対するＴＴウイルスの影響は、現時点では明らかでない（非特許文献７）。
【０００３】
ＨＢＶまたはＨＣＶに関する治療が利用可能であるが、これまで慢性感染した患者においてウイルスの完全な根絶をもたらしたものは無い。したがって、今日のＨＢＶまたはＨＣＶの治療の共通の望ましい目標は、免疫グロブリンすなわち抗体、または小分子の開発と、肝臓内壊死および炎症の消失ならびに線維症進行の低下を伴うレベルまでウイルス複製を安定に抑制することとに限られる。
【０００４】
ＨＢＶおよびＨＣＶの治療用に現在利用可能な薬剤の中では、インターフェロンαがいずれのウイルスの治療にも適していることが知られている。インターフェロンαは、免疫系の細胞によって生成される分子であり、ウイルスおよび他の侵入物質に応答して分泌される。インターフェロンαは、血中レベルの大幅な変動をもたらす次善の薬物動態を有しているので（非特許文献８および９）、大型、分岐状、４０ｋＤのポリマーなどのポリエチレングリコール分子を結合させることによって作製される「ＰＥＧ化インターフェロン」の施用につながっている。
【０００５】
２つの他の薬剤、ラミブジンおよびアデフォビルがＨＢＶの治療に現在利用可能であり、その両方がヌクレオシド類似体である。このように、これらの薬剤は、ウイルスの酵素であるヌクレオシド逆転写酵素を阻害することによってウイルス増幅を遮断する。副作用としてこれらの薬剤は、肝臓に対する重大な障害および乳酸アシドーシスを引き起こす可能性があり（一般的概要に関しては、非特許文献１０を参照のこと）、腎毒性の副作用も報告されている。重大な欠点は、ヌクレオシド逆転写酵素の突然変異を含むＨＢＶの耐性バリアントが出現することである。いずれの薬剤も、一般にインターフェロンと組み合わせて使用される（非特許文献１１）。類似の作用機構に基づく他の化合物が第２相試験を経ている。
【０００６】
ＨＣＶの治療用には、インターフェロンα以外に、これもヌクレオシド類似体である、リバビリンと呼ばれる１種の薬剤が唯一現在利用可能である。リバビリンも一般にインターフェロンと組み合わせて使用される。その治療作用の正確な機構は、依然として完全には理解されていない。リバビリンは一般に、ある種の酵素を阻害することにより細胞内のグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）のレベルを低下させて、間接的にウイルスのＲＮＡ合成を阻害すると考えられている。しかしながら、ＨＣＶの複製に対するその効果は小さい（非特許文献１２）。さらに、貧血、好中球減少、および血小板減少などの血液の異常が一般的な副作用である（非特許文献１３）。
【０００７】
既存の薬剤の組合せを使用する療法は、ＨＣＶ感染の治療においてより有効であるようだが（非特許文献２および１２）、ＨＢＶ感染に関しては、このような付加的な利点は、これまで確認すらされていない（非特許文献１）。さらに、前述の療法のいずれにおいても、大部分の患者は長期の応答を得ていない（非特許文献１１および１４）。１例として、幾つかの試験から、インターフェロン治療に対する持続的応答が、わずか１０〜２０％のＨＣＶ感染患者にしか見られなかったことが示されている（非特許文献１２）。したがって、肝炎感染を治療する代替標的および代替方法を検索する必要性が存在する。
【０００８】
このような検索は、対応するウイルスの蓄積および機能についての詳細な理解に基づくことが好ましい。ＨＢＶに関しては、その複製の制御の根底にある要素に関するある程度の詳細な情報が入手可能であるが、例えばＨＣＶに関してはこれまでほとんど知られていない。ＨＢＶは、ＲＮＡ中間体を介して複製するヘパドナウイルス・ファミリーのＤＮＡウイルスである。Ｂ型肝炎ウイルスのゲノムは、４つの重なりあう遺伝子と、３つのプロモーターと、２つのエンハンサー領域とを含む、３．２キロベースの環状で部分的に二本鎖のＤＮＡである。２つの別個に制御されるエンハンサーのいずれも、３つ全てのプロモーターの活性を増大させることが可能である（非特許文献１５）。
【０００９】
ＨＣＶは、フラビウイルス・ファミリーのＲＮＡウイルスである。その一本鎖の１０キロベースのゲノムは、１つの遺伝子を含んでいる。１つの単離体由来のＨＣＶは、１つの配列によってではなく、互いに密接に関係がある一群の変異配列によって定義可能であるという事実によって、このゲノムのさらなる調査が妨げられてきた。この多様性は、遺伝的に異なるグループまたは遺伝子型に対応する（非特許文献１６）。３’非翻訳領域が、複製および制御領域に必要不可欠な２つのシグナルを含むということが示唆されている（非特許文献１７）。
【００１０】
Ｄ型肝炎ウイルスは不完全ウイルスであり（非特許文献４）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）は、７．２キロベースのゲノムを有する、未分類の、小さな、一本鎖のエンベロープを持たないＲＮＡウイルスである（非特許文献５）。Ｇ型肝炎ウイルスは、フラビウイルス科に属しエンベロープを有するＲＮＡウイルスである（非特許文献１８）。ＴＴウイルスは、ヘテロ性のようであり、一本鎖の環状ＤＮＡゲノムから構成されているが、充分には特徴解析されていない（非特許文献７）。
【００１１】
Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡのエンハンサーＩに結合する核酸分子を使用して、Ｂ型肝炎ウイルスの複製を調節する試みがなされている（例えば特許文献１を参照）。しかしながら、宿主のどの細胞タンパク質が肝炎ウイルスのＲＮＡ合成を制御することが可能であるかは、これまでほとんど不明である。モルヒネはＣ型肝炎ウイルスの複製に影響を与えうることが示唆されているが（非特許文献１９）、その正確な作用機構は知られていない。幾つかの転写因子、ＬＲＨ−１／ｈＢ１Ｆ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３ｂ、ＨＮＦ４およびＣ／ＥＢＰは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＢＶのエンハンサーＩＩ領域の活性を増大させることが可能であることが認められてきているが、しかしながら、それらの正確な役割は、たとえ認められているとしても、依然確認を必要とする状態である（非特許文献２０）。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１４８９８５Ａ１号明細書
【非特許文献１】チング  エルエルら（Ｃｈｉｎｇ  ＬＬ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｌａｎｃｅｔ  ３６２（９４０１）、２００３、ｐ．２０８９〜２０９４
【非特許文献２】ポイナルド、ティーら（Ｐｏｙｎａｒｄ、Ｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｌａｎｃｅｔ  ３６２（９４０１）、２００３、ｐ．２０９５〜２１００
【非特許文献３】クックスレイ  ジー（Ｃｏｏｋｓｌｅｙ  Ｇ）、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．  １９（Ｓｕｐｐｌ１）、２００４、Ｓ１７〜２０
【非特許文献４】ビーン  ピー（Ｂｅａｎ  Ｐ）、Ａｍ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ．２１（５）、２００２、２５〜２７
【非特許文献５】ワン  エル、ツワン  エイチ（Ｗａｎｇ  Ｌ、Ｚｈｕａｎｇ  Ｈ）、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  １０（１５）、２００４、２１５７〜２１６２
【非特許文献６】スタプレトン  ジェーティー（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ  ＪＴ）、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．  ２３（２）、２００３、１３７〜１４８
【非特許文献７】ヒノ  エス（Ｈｉｎｏ  Ｓ）、Ｒｅｖ  Ｍｅｄ  Ｖｉｒｏｌ．  １２（３）、２００２、１５１〜１５８
【非特許文献８】レディ  ケーアールら（Ｒｅｄｄｙ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４（４）、２００２、５７１〜５８６
【非特許文献９】フェレンチ  ピー（Ｆｅｒｅｎｃｉ  Ｐ）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ．  ５７（７）、２００３、６１０〜６１５
【非特許文献１０】ロシュ  ビー、サムエル  ディー（Ｒｏｃｈｅ  Ｂ、Ｓａｍｕｅｌ  Ｄ）、Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．  １０Ｓｕｐｐｌ、２００４、Ｓ７４
【非特許文献１１】マルセリン  ピーら（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５１（１２）、２００４、１２０６〜１２１７
【非特許文献１２】レイチャード  オーら（Ｒｅｉｃｈａｒｄ  Ｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｌａｎｃｅｔ  ３５１（９０９６）、１９９８、８３〜８７
【非特許文献１３】オング  ジェーピー、ヨウノシ  ゼットエム（Ｏｎｇ  ＪＰ、Ｙｏｕｎｏｓｓｉ  ＺＭ）、Ｃｌｅｖｅ  Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ７１、Ｓｕｐｐｌ３、２００４、Ｓ１７〜２１
【非特許文献１４】パパテオドリディス  ジーブイ（Ｐａｐａｔｈｅｏｄｏｒｉｄｉｓ  ＧＶ）、ハッジヤンニス  エスジェイ（Ｈａｄｚｉｙａｎｎｉｓ  ＳＪ）、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．  １９（１）、２００４、２５〜３７
【非特許文献１５】スー  エイチ、イー  ジェーケー（Ｓｕ  Ｈ、Ｙｅｅ  ＪＫ）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（７）、１９９２、２７０８〜２７１２
【非特許文献１６】マーテルら（Ｍａｒｔｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２（１１）、２００４、−９０
【非特許文献１７】イー  エム、レモン  エスエム（Ｙｉ  Ｍ、Ｌｅｍｏｎ  ＳＭ）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（６）、２００３、３５５７〜３５６８
【非特許文献１８】ハラツ  アールら（Ｈａｌａｓｚ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  ３３（８）、２００１、５７２〜５８０
【非特許文献１９】リー  ワイら（Ｌｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６３（３）、２００３、１１６７〜７５
【非特許文献２０】カイ  ワイエヌら（Ｃａｉ  ＹＮ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １３（６）、２００３、４５１〜８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって本発明の目的は、ヌクレオシド類似体またはインターフェロンの使用とは異なる作用に基づいて、宿主生物中の肝炎ウイルスの負荷を変化させる代替法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
この目的は、そのような複合体の形成を調節することによって、特に独立請求項に記載した方法によって解決される。
したがって本発明は、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ｋまたはその機能断片が、ウイルスゲノム上の制御領域と複合体を形成することが可能であるという発見に基づく。
【００１４】
この発見は特に驚くべきものである、何故ならｈｎＲＮＰ  Ｋは、多くの他の細胞成分と同様にＣ型肝炎ウイルスのヌクレオキャプシドの成分と結合することが、これまでに発見されているからである（ヒジー  ティーワイら（Ｈｓｉｅｈ  ＴＹ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７３（２８）、１９９８、１７６５１〜１７６５９；ライ
エムエム、ウエア  シーエフ（Ｌａｉ  ＭＭ、Ｗａｒｅ  ＣＦ）、Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４２、２０００、１１７〜１３４）。この結合の結果は、人体の細胞中のｈｎＲＮＰ  Ｋの既知の細胞機能に影響を与え、したがって肝炎感染によって引き起こされる幾つかの状態の原因であると推測されている（ライ  エムエム、ウエア  シーエフら（Ｌａｉ  ＭＭ、Ｗａｒｅ  ＣＦ  ｅｔ  ａｌ．）、上記）。
【００１５】
ｈｎＲＮＰ  Ｋは、可変スプライシングによって生じる種々のバリアント（変異体）の形で存在することが知られており（デジガルド  ケーら（Ｄｅｊｇａａｒｄ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２３６（１）、１９９４、３３〜４８）、多様な機能群を有する。ｈｎＲＮＰ  Ｋはシャトルタンパク質として働き、さまざまな細胞因子と結合し、転写因子として働く（ボムスツティック  ケー、デニセンコ  オー、オストロビスキー  ジェー（Ｂｏｍｓｚｔｙｋ  Ｋ、Ｄｅｎｉｓｅｎｋｏ  Ｏ、Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ
Ｊ）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ２６（６）、２００４、６２９〜６３８；シャウン  エーら（Ｓｈａｗｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、１３（６）、２００３、４５１〜４５８）。ｈｎＲＮＰ  Ｋは、同タンパク質をＤＮＡおよびＲＮＡのいずれとも相互作用可能とするＫホモロジー（ＫＨ）ドメインおよびＲＧＧボックスなどの、多数の調節ドメインを有する。一本鎖ＤＮＡとの結合を特に担う領域は、ＫＨドメイン３を含むものとして同定されている（ブラッドドック  ディーティーら（Ｂｒａｄｄｏｃｋ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２１（１３）、２００２、３４７６〜３４８５；バッケ  ピーエイチら（Ｂａｃｋｅ  ＰＨ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ
Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０（Ｐｔ４）、２００４、７８４〜７８７）。
【００１６】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片とウイルスゲノム上の制御領域との複合体の形成を調節する方法は、任意の肝炎ウイルスによって引き起こされる感染について使用することが可能である。このようなウイルスの例は、マウス肝炎ウイルス、ウッドチャ
ック肝炎ウイルス、ジリス肝炎ウイルス、北極ジリスＢ型肝炎ウイルス、ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、アヒルＢ型肝炎ウイルス、サギＢ型肝炎ウイルス、ツクシガモＢ型肝炎ウイルス、ハクガンＢ型肝炎ウイルス、ヒメハクガンＢ型肝炎ウイルス、コウノトリＢ型肝炎ウイルス、ウーリー・モンキーＢ型肝炎ウイルス、オランウータン・ヘパドナウイルス、ＧＢウイルスＢ、またはヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）である。本発明の好ましい実施形態は、ヘパドナウイルス、特にヒトＢ型肝炎ウイルスの使用からなる。
【００１７】
該当する肝炎ウイルスは、野生型または既知の肝炎ウイルスのバリアントであってもよい。この点において用語「バリアント」は、対応する既知の配列と比較するとそのヌクレオチド配列が異なっている任意の形の核酸を指す。その違いは例えば、天然配列に導入された多型、１ヌクレオチドの突然変異、置換、（一続きの長さの）欠失または挿入、Ｎ末端および／またはＣ末端への付加によるものでありうる。
【００１８】
同様にｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質は、野生型または既知のｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のバリアントであってよい。この点において用語「バリアント」は、対応する既知の配列と比較するとそのアミノ酸配列が異なっている任意の形のタンパク質を指す。その違いは例えば、対応するコード核酸配列の天然配列に導入された多型、１ヌクレオチドの変化または修飾、置換、（一続きの長さの）欠失または挿入、Ｎ末端および／またはＣ末端への付加、対応するペプチドの可変スプライシング、翻訳後修飾、および有機分子との結合によるものでありうる。
【００１９】
この点において、当然ながら用語「肝炎ウイルス」または「ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質」は、このようなバリアントを含むことを意味する。
用語「制御領域」は、肝炎ウイルスの発現または増幅を刺激するかあるいは低下させることが可能である、肝炎ゲノムの任意の部分を指す。このような領域の例は、サイレンサー、エンハンサーまたはプロモーターである。本発明の現在好ましい一実施形態では、制御領域はヘパドナウイルス、特にヒトＢ型肝炎ウイルスのエンハンサーＩＩ領域である。
【００２０】
前述のように本発明の方法は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の機能断片の使用も含み得る。このような断片は、３つの基準によって定義され得るポリペプチドである。第１に、該断片は、肝炎ウイルスの制御領域と結合して該肝炎ウイルスの複製に影響を与えるほど充分に安定した複合体を形成することが可能である。機能断片はＫホモロジードメイン、特にＫＨドメイン３を含むことが好ましい。第２に、このような機能断片は、肝炎ウイルスのバリアントとの複合体形成が影響を受けるような方法で化合物によって調節され得る。第３に、このような断片は、天然に存在するｈｎＲＮＰ  Ｋバリアントの対応するアミノ酸配列と、少なくとも６０％の配列同一性を有しているとよい。好ましい実施形態では、それぞれの断片は、既知のｈｎＲＮＰ  Ｋバリアントの対応するアミノ酸配列と、少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。用語「配列同一性」は、既知のｈｎＲＮＰ  Ｋバリアントのアミノ酸配列と問題のアミノ酸配列との相同性の整合（アラインメント）後に得られる、対様式の同一な残基の割合（％）を指し、その割合の数字は、２つの配列のうち長いほうの配列中の残基数に対するものである。
【００２１】
本発明の方法をｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法として使用する場合、該方法は肝炎ウイルスの機能断片の使用も含むことが可能である。この用語は、それぞれの肝炎ウイルスの一部分を形成する核酸分子を指すものとする。ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の機能断片に関するのと同様の３つの基準で、このような核酸分子断片を定義するものとする。第１に、該断片は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と結合し、少なくとも１つの適切な方法によって検出可能であるほど充分に安定した複合体を形成することが可能である。ヘパドナウイルスの場合、機能断片はエンハンサーＩＩ領域を含むことが好ましい。第２に、このような機能断片は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質バリアントとの複合体形成が影響を受けるような方法で化
合物によって調節され得る。第３に、このような断片は、天然に存在するそれぞれの肝炎ウイルスバリアントの対応するアミノ酸配列と、少なくとも６０％の配列同一性を有しているとよい。好ましい実施形態では、このような断片は、既知のそれぞれの肝炎ウイルスバリアントの対応する核酸配列と、少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を有する。用語「配列同一性」は、既知のそれぞれの肝炎ウイルスバリアントの核酸配列と問題の核酸配列との相同性の整合後に得られる、対様式の同一な残基の割合（％）を指し、その割合の数字は、２つの配列のうち長いほうの配列中の残基数に対するものである。
【００２２】
対応する宿主生物は、肝炎ウイルスが感染する可能性のある任意の生物種であってよい。本発明の方法を、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と肝炎ウイルスとの間の複合体形成を調節することが可能である化合物の同定または選択の目的でスクリーニング法として使用する場合、宿主生物が感染する可能性を、免疫抑制物質またはトランスジェニック技法などの追加の手段の助けによって引き出してもよい。宿主生物は、例えば哺乳動物または無脊椎動物の種由来であってよい。感染する可能性がある哺乳動物の例は、ラット、マウス、リス、ハムスター、ウッドチャック、オランウータン、ウーリー・モンキー、チンパンジー、タマリン（ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）、マーモセットまたはヒトである。
【００２３】
前述の複合体の形成を調節することによって、感染した宿主生物中の肝炎ウイルスの負荷を変化させる方法は、さまざまな方法で行うことが可能である。一般にこの調節は、それぞれのｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の活性化状態を変えることによって、転写のレベルまたは機能レベルで行うことが可能である。転写のレベルでの調節は、宿主生物の細胞中に存在していて肝炎ウイルスとの複合体形成に利用可能なｈｎＲＮＰ  Ｋの量を変えることである。この場合留意すべきことは、一般にそれぞれのｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質は、肝炎ウイルスのそれぞれの負荷量に応じて、肝炎ウイルスの複製を最大に刺激する最適レベルで存在することである。この最適レベルより高量および少量のいずれに外れても、通常はウイルス複製の促進が低下することになる。この傾向の１例は、図１２中に見ることが可能である。これらの観察結果は、発現および機能レベルでの両方の調節を組み合わせると特に関連性がありうる。機能レベルでの前記複合体形成の調節は、複合体の構成成分の改変、または複合体形成への直接的干渉を含み得る。前記複合体形成に対して結果的に影響をもたらすこのような調節および他の調節を行うための好ましい実施形態は、化合物を投与することからなる。
【００２４】
前記複合体形成を調節するために使用される化合物は、任意の性質のものであってよい。化合物は、例えば生物供給源または非生物供給源から単離されてもよいし、あるいは化学的または生物工学的に生成されてもよい。このような化合物の例は、限定するものではないが、小さな有機分子または生物活性ポリマー、例えばポリペプチド、例えば免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様機能を有する結合タンパク質、あるいはオリゴヌクレオチドである。このような化合物の１実施形態は核酸分子、特にＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子、特にアプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（登録商標）（国際公開広報第０１／９２６５５号パンフレット中に記載）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子または小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子である。
【００２５】
小さな干渉ＲＮＡの使用は、特定の遺伝子を「ノックダウン」するためのツールとなってきている。該ツールは、翻訳後レベルで行われてｍＲＮＡ分解を伴うＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による、遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制を利用する。ＲＮＡ干渉は、ゲノムを保護する細胞機構に相当する。ｓｉＲＮＡ分子は、該ｓｉＲＮＡと多酵素複合体とが結合していわゆるＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することによって、ｓｉＲＮＡに相補的なＲＮＡの分解を仲介する。ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣの一部分となり、相補的ＲＮＡ分子を標的としてこれを切断する。このことにより、それぞれの遺伝子
の発現の消失がもたらされる（概要に関しては、シオウド  エム（Ｓｉｏｕｄ  Ｍ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２５２、２００４、１〜８を参照のこと）。本発明において好適なこのようなｓｉＲＮＡの実施形態は、１０〜３５ヌクレオチド、より好ましくは１５〜２５ヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成された分子を含む。このようなｓｉＲＮＡ分子は、遺伝子の抑制を引き起こすには充分な長さであるが、配列非特異的なインターフェロン応答を引き起してｍＲＮＡ翻訳の全体的な阻害をもたらすと思われるほど長くはない。この技術は、ＨＩＶ−１  ＤＮＡの発現の阻害など、ウイルスに関する治療用途に施用されてきている（リー  エヌエスら（Ｌｅｅ  ＮＳ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０（５）２００２、５００〜５０５）。本発明の１実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子を使用してｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子の分解を誘導する。ｓｉＲＮＡの使用は、ｈｎＲＮＰ  Ｋの発現を調節するための現時点で好ましい実施形態でもある。
【００２６】
前記複合体形成を調節するために使用する化合物の他の例は、細胞成分、特にタンパク質のリン酸化状態を変えることができる分子である。タンパク質のリン酸化状態に影響を与えることが知られている化合物の例は、広範囲のキナーゼ阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、チロシンリン酸化刺激物質またはチロシンホスファターゼ阻害剤である。
【００２７】
細胞成分のリン酸化状態を変えることが可能な化合物の１つの好ましい選択は、細胞タンパク質のチロシンリン酸化レベルを調節する調節物質である。この選択は、細胞内のチロシン残基のリン酸化状態の変化が、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と肝炎ウイルスの制御領域との複合体形成の効率に対して影響を与えるという本発明の発見に基づく。この影響はｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のチロシン残基のリン酸化状態の変化、およびｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の細胞内の量の変化のいずれをも原因としうる。したがって、細胞内のチロシン残基のリン酸化状態を変える化合物の使用も、細胞内のｈｎＲＮＰ  Ｋバリアントの合計量を調節することによってｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との間の複合体形成を変化させる方法の１実施形態である。
【００２８】
前述の化合物群の中で、本発明において同定かつ使用されうる適切な化合物は、その大多数が市販されているチロシンキナーゼ阻害剤、例えばチロホスチン、キナゾリン、キノキサリン、キノリン、２−フェニルアミノピリミジン、フラボノイド、ベンゾキノイド、アミノサリチル酸またはスチルベンなどから選択することが可能である（これらは例えば国際公開第９６１８７３８号パンフレット、国際公開第０３０３５６２１号パンフレットおよびその中に引用されている参照文献中に記載されており、例えば、実験による同定の例は米国特許第６，７４０，６６５号明細書を参照されたい）。チロホスチンの例は、ＡＧ２１３、ＡＧ４９０、ＡＧ８７９、ＡＧ１２９５、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５１７、ＡＧＬ２０４３、チロホスチン４６およびメチル２，５−ジヒドロキシ桂皮酸である。キナゾリンは例えばＰＤ１５３０３５、ＰＤ１５６２７３、ゲフィチニブまたはラパチニブであり；キノキサリンは例えばＰＤ１５３０３５またはＺＤ１８３９である。キノリンの１例は５−メチル−５Ｈ−インドロ［２，３−β］キノリンであり、２−フェニルアミノピリミジンの１例はイマチニブであり、フラボノイドの例はゲニスタインまたはケルセチンであり、ベンゾキノイドの１例はヘルビマイシンＡであり、アミノサリチル酸の１例はラベンダスチンＡであり、スチルベンの１例はピセアタノール（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ）である。他の適切な化合物は、チロホスチン  エルブスタチンなどの受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＷＨＩ−Ｐ９７またはチロホスチンＡＧ５９２などのＥＧＦＲ特異的受容体チロシンキナーゼ阻害剤、アウリントリカルボン酸などのチロシンリン酸化刺激物質、または過バナジン酸ナトリウムまたはイソキサゾールカルボン酸などのチロシンホスファターゼ阻害剤を含むことが可能である。
【００２９】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のチロシンリン酸化を調節する、このような化合物の他の例は、チロシンキナーゼまたはチロシンホスファターゼの制御を誘導することが可能な細胞表面分子のアゴニストまたはアンタゴニストである。このような細胞表面分子の例は、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ活性を有する膜受容体、ならびにチロシンキナーゼおよびチロシンホスファターゼを制御する経路と連動するシグナル伝達を担うＧタンパク質共役受容体である（例えば、パイン  エヌジェーら（Ｐｙｎｅ  ＮＪ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ３１（６）、２００３、１２２０〜１２２５を参照）。特に受容体チロシンキナーゼに関しては、ｈｎＲＮＰ  Ｋと核酸分子との結合およびｈｎＲＮＰ  Ｋの発現のいずれにも影響を与える可能性があることが示唆されている（オストロビスキー  ジェーら（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（１６）、２００１、９０４４〜９０４９；マンダル  エムら（Ｍａｎｄａｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６（１３）、２００１、９６９９〜９７０４）。ｈｎＲＮＰ  Ｋはさらに、ｉｎ
ｖｉｖｏでリン酸化されることが知られている（デジガルド  ケーら（Ｄｅｊｇａａｒｄ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２３６（１）、１９９４、３３〜４８）。受容体チロシンキナーゼの例は、血小板由来増殖因子の受容体、エリスロポイエチンの受容体、腫瘍壊死因子の受容体、白血病抑制因子の受容体、インターフェロンの受容体、インスリンの受容体、インスリン様増殖因子の受容体、インターロイキンの受容体、繊維芽細胞増殖因子の受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子の受容体、形質転換増殖因子の受容体、または表皮増殖因子（ＥＧＦ）の受容体である。このような受容体は、さまざまなタンパク質のチロシン残基をリン酸化する能力を有し、かつ受容体自体が同様の効果を有する細胞内の他の因子を制御しうることが知られている（例えば、パジン
エムジェー、ウイリアムス  エルティー（Ｐａｚｉｎ  ＭＪ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＬＴ）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １７（１０）、１９９２、３７４〜３７８を参照、ＥＧＦ受容体に関しては、例えばジャンマット  エムエル、ジアコーン  ジー（Ｊａｎｍａａｔ  ＭＬ、Ｇｉａｃｃｏｎｅ  Ｇ）、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  ８（６）、２００３、５７６〜５８６を参照）。したがって本文脈中の用語「アゴニスト」および「アンタゴニスト」は、このような効果を生み出す細胞表面分子の能力および該能力の調節を指す。
【００３０】
このようなアゴニストまたはアンタゴニストの好ましい実施形態は、チロシンキナーゼまたはチロシンホスファターゼの制御を誘導することが可能な細胞表面上の分子と結合するタンパク質分子である。このようなタンパク質性結合分子の例は、免疫グロブリンまたはその断片、あるいはリポカリンファミリーのポリペプチドに基づくムテインである（国際公開第０３０２９４６２号パンフレット、ベステら（Ｂｅｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６、１９９９、１８９８〜１９０３）。ビリン結合タンパク質、ヒト好中球ゼラチナーゼ結合リポカリン、ヒトアポリポタンパク質Ｄまたはグリコデリン（ｇｌｙｃｏｄｅｌｉｎ）などのリポカリンは、ハプテンとして知られる選択された小さなタンパク質領域と結合するように修飾されうる天然のリガンド結合部位を有する。他のタンパク質性結合分子の例は、いわゆるグルボディ（ｇｌｕｂｏｄｙ）（国際公開第９６／２３８７９号パンフレットを参照のこと）、アンキリン骨格に基づくタンパク質（ヒリニービッチ−ヤコブスカ  エーら（Ｈｒｙｎｉｅｗｉｃｚ−Ｊａｎｋｏｗｓｋａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｏｌｉａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｂｉｏｌ．  ４０、２００２、２３９〜２４９）、またはクリスタリン骨格に基づくタンパク質（国際公開第０１／０４１４４号パンフレット、独国特許出願公開第１９９３２６８８号明細書）、およびスケッラ（Ｓｋｅｒｒａ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．  １３、２０００、１６７〜１８７に記載されたタンパク質である。
【００３１】
免疫グロブリンまたはその断片は例えば、潜在的に有効な受容体アンタゴニストまたはアゴニストであることが知られており（２つの例に関しては、ゴエツル  イージェーら（
Ｇｏｅｔｚｌ  ＥＪ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ９３（１）、２００４、６３〜６９、およびデベッツ  アールら（Ｄｅｂｅｔｓ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５（９）、２０００、４９５０〜４９５６を参照のこと）、治療においてもアンタゴニストまたはアゴニストとして使用されてきている（例えば、コーエン  エスエーら（Ｃｏｈｅｎ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐａｔｈｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ．  ６（３）、２０００、１６３〜１７４を参照のこと）。これはＥＧＦ受容体を対象とする免疫グロブリンにも当てはまる（ゴエツル  イージェーら（Ｇｏｅｔｚｌ  ＥＪ
ｅｔ  ａｌ．）、上記）。（組換え）免疫グロブリン断片の例はＦａｂ断片、ＦＶ断片、単鎖ＦＶ断片（ｓｃＦＶ）、二重特異性抗体またはドメイン抗体であり（ホルト  エルジェーら（Ｈｏｌｔ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２１（１１）、２００３、４８４〜４９０）、これらは全て当業者にはよく知られている。この点において留意すべきことは、アンタゴニストまたはアゴニストとして働く免疫グロブリンを得ることは、充分に当業者の能力の範囲内にあることである。この目的のために、ケラーおよびミルシュタイン（Ｋｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、１９７５、４９５〜４９７）に従った古典的な免疫処置プロトコル、および免疫グロブリン断片を用いるファージ・ディスプレーなどの進化的方法（ブレッケ
オーエイチ、ロゼット  ジーエー（Ｂｒｅｋｋｅ  ＯＨ、Ｌｏｓｅｔ  ＧＡ）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ３（５）、２００３、５４４〜５５０）を使用することが可能である。
【００３２】
本発明の幾つかの実施形態については、化合物をライブラリーの形で使用することが可能である。このようなライブラリーの例は、モデル化合物として化学合成されたさまざまな有機小分子、または多数の配列バリアントを含む核酸分子の集合体である。
【００３３】
前記複合体形成を調節する化合物は、任意の適切な手段によって投与することが可能である。宿主生物が哺乳動物である場合、化合物は非経口的あるいは経口的に（経腸）投与することが可能である。哺乳動物への投与に関する好ましい実施形態では、施用、例えば化合物の調製物の経口投与、静脈内投与、あるいは吸入によって、血液および肝臓への送達を確実にする。経口施用するための調製物の例は、錠剤、ピルまたは飲用溶液であり、静脈内投与するための調製物の例は注射用溶液または輸液であり、吸入により投与するための調製物の例はエアロゾル混合物またはスプレーである。宿主生物が組換え微生物である場合、投与の例は微生物環境への化合物の注入または添加である。微生物が単細胞である場合、後者の投与形態を、微生物を改変する技法と組み合わせて行うことがおそらく可能である。このような技法は、細胞膜のエレクトロポレーションまたは浸透処理を含み得る。
【００３４】
宿主生物中に存在する肝炎ウイルスの負荷を変えるための本発明の方法は、さまざまな目的に使用することが可能である。このような目的の例は、治療、診断または試験目的である。試験目的の場合、幾つかの方法は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質とＨＢＶゲノム上のエンハンサーＩＩ制御領域との複合体形成を調節することが可能であることが既に同定されている化合物の施用を含み得るが、一方他の方法は、このような化合物の同定を対象とすることもできる。本発明の後者の実施形態では、該方法が、一定期間中の宿主生物中の肝炎ウイルス粒子の数を測定する工程を含むことが好ましい。
【００３５】
一定期間中の宿主生物中の肝炎ウイルス粒子の数の測定は、幾つかの手段によって行うことが可能である。このような測定は、肝炎ウイルスに感染した後に１回行ってもよいし、幾つかの時点において行ってもよい。検出法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または例えば免疫グロブリンと結合した形態のビオチン−ストレプトアビジン系の使用などの、肝炎ウイルスに起因するシグナルの増幅を含むことが可能である。測定は直接的検出を利用してもよいし、間接的な検出を利用してもよい。間接的な検出の１例は、細胞生存率
または細胞複製の測定などの細胞の作用の測定である。直接的な検出の１例は免疫グロブリンの使用であり、免疫グロブリンは標識と結合していてもよい。宿主生物が微生物である場合、細胞内免疫グロブリンを使用することが可能である（ビジンチン  エムら（Ｖｉｓｉｎｔｉｎ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９０（１〜２）、２００４、１３５〜１５３）。しかしながら、留意すべきことは、微生物中で形成されるウイルス粒子の量の測定は、当該微生物の周辺環境へと放出されたウイルスの量を測定することにより実施可能であるということである。
【００３６】
市販のキットを用いることもできる直接的な検出方法は、ヌクレオタンパク質複合体を完全に解離させる工程と、続く核酸抽出およびＰＣＲ、またはこの技法の変形（ネスティドＰＣＲ、もしくは核酸がＲＮＡである場合はＲＴ−ＰＣＲなど）の工程とを含むことが可能である。その後の工程は電気泳動、ＨＰＬＣ、フローサイトメトリー（ムルロニー  ピーエム、ミカラック  ティーアイ（Ｍｕｌｒｏｏｎｅｙ  ＰＭ、Ｍｉｃｈａｌａｋ  ＴＩ）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７（２）、２００３、９７０〜９７９）、蛍光相関分光法（バイナー  オーエイチら（Ｗｅｉｎｅｒ  ＯＨ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ６１（２）、２０００、８４〜８９）、またはこれらの技法の変形を含むことが可能である。例えば標識した内部プローブとのハイブリダイゼーションおよびフィルムへの曝露、あるいは染色および既知濃度の標準サンプルとの比較による視覚化および定量化、あるいは圧電型核酸バイオセンサーの使用（ツォー  エックスら（Ｚｈｏｕ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２７（１）、２００２、３４１〜３４５）などの、最終工程が必要とされるかもしれない。これらの工程の幾つかあるいは全ては、自動分離／検出システムの一部であってもよい。このような工程の例は、自動リアル−タイムＰＣＲプラットホーム、自動ウイルス核酸単離プラットホーム（例えばキアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社のＢｉｏＲｏｂｏｔ（登録商標））、ＰＣＲ産物分析装置（例えばロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社のＣＯＢＡＳ（登録商標）ＴａｑＭａｎ（登録商標））およびリアルタイム検出システム（例えばＡＢＩ社のＰｒｉｓｍ（登録商標）７７００またはＲｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ（商標）配列検出装置、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社のＡｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）モニター）である。現在市販されているシグナルの増幅および検出アッセイには、ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）ＨＢＶモニター試験またはＣＯＢＡＳ（登録商標）ＡＭＰＬＩＣＯＲ（登録商標）ＨＣＶモニター試験（いずれもロシュ・モレキュラー・ダイアグノスティック社（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ＶＥＲＳＡＮＴ（登録商標）ＨＢＶ３．０アッセイ（ベイヤー・ヘルスケア・ダイアグノスティック社（Ｂａｙｅｒ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）またはダイジーン（Ｄｉｇｅｎｅ）Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ（登録商標）ＩＩ  ＨＢＶ  ＤＮＡ試験（ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ））がある。
【００３７】
宿主生物中に存在する肝炎ウイルスの負荷を変えるための本発明の方法を、ｈｎＲＮＰ
ＫとＨＢＶとの間の複合体形成を調節することが可能な化合物を同定する目的でｉｎ  ｖｉｖｏにおいて使用する場合、この方法の有利な実施形態は、得られた結果と１つまたは複数の対照測定の結果とを比較することをさらに含む。
【００３８】
このような対照測定は、主要な測定本体と異なる任意の条件を含み得る。このような対照測定は、測定方法について、例えばウイルスの増幅が起こらない条件、あるいは任意または特定のｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と任意または特定の肝炎ウイルスとの間の複合体形成が起こる可能性がないか調節され得ない条件を含むことが好ましい。特に、このような対照測定は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片とＢ型肝炎ウイルスゲノム上のエンハンサーＩＩ制御領域との複合体形成を調節しない化合物の使用を含み得る。
【００３９】
特に好ましい実施形態において、対照測定は、ウイルス配列の１７５２位にアデニン（
Ａ）を含まないＨＢＶバリアントの使用を含むであろう。この実施形態は、感染した宿主における高レベルの血清中ＨＢＶ  ＤＮＡと、ウイルス配列１７５２位のＡヌクレオチドの存在との間に、相関関係が存在するという驚くべき発見に基づく。血清中ＨＢＶ  ＤＮＡが低レベルであるキャリアは、この位置には主にグアニン（Ｇ）ヌクレオチドを有する。同様に、１７５２位にアデニンを含むＨＢＶ断片は、グアニンを有する断片よりｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質に関して有意に高い結合親和性を示し、一方でチミンまたはシトシンを含むこのような断片に関しては、複合体形成を検出することはできなかった。これらの発見を示す例は、図５および図１８中に見ることが可能である。
【００４０】
本発明の他の実施形態では、宿主生物は微生物である。このような微生物は、単細胞からなることが好ましい。適切な微生物の１例は、組換え肝炎ウイルスおよび組換えｈｎＲＮＰ  Ｋ、またはそれらの機能断片を発現する。このような微生物の好ましい実施形態は、確立された標準的方法を使用して、ＨＢＶおよびｈｎＲＮＰ  Ｋバリアントをコードする核酸分子を含むクローニングベクターを用いて形質転換された、宿主細胞である。このような形質転換法は、１つまたは複数の細胞改変技法、例えばＤＮＡ注入、エレクトロポレーションまたはマグネトフェクション（プランク  シーら（Ｐｌａｎｋ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ３８４（５）、２００３、７３７〜７４７）などを含むことが可能である。
【００４１】
このような微生物の好ましい実施形態は、肝臓組織、例えば限定するものではないが肝細胞株または肝芽腫細胞株に由来する細胞である。このような細胞の例は、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨＣＣＭ、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｓｋ−Ｈｅｐ−１、Ｓｎｕｌ８２、ＨｕＨ−６またはＨｕＨ−７であるが、これらだけには限られない。適切な細胞株に関して、留意すべきことは、肝炎ウイルス、および特にヒトＣ型肝炎ウイルスの核酸分子は、当業者が通常予想するよりも少ない細胞株にしか見出されず種選択的であることである（ツー  キューら（Ｚｈｕ  Ｑ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（１７）、２００３、９２０４〜９２１０；バーテンシュラガー  アール（Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ  Ｒ）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３９（３）、２００４、８３５〜８３８で認められ確認された）。これらのウイルスは、特定の宿主細胞環境、すなわちウイルス・レプリカーゼの高い誤差率による多数の配列変異の存在によって助長されたと予想される影響に対して適応し得ることが観察されている（ツー、ら（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．）、上記）。
【００４２】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と肝炎ウイルスゲノム上の制御領域との間の複合体形成を変化させることが可能な化合物を同定するための方法の他の実施形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでこの複合体の構成成分を互いに曝露することからなる。構成成分、すなわちｈｎＲＮＰ
Ｋタンパク質またはその機能断片、および例えばヘパドナウイルスの核酸成分またはその機能断片は、任意の適切な形で使用することが可能である。その例は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片、および／またはＨＢＶまたはその機能断片を含む、１つまたは複数の細胞溶解物または抽出物の使用である。他の例は、適切な水溶液中の、濃縮、精製または単離されたｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片と、濃縮、精製または単離されたＨＢＶ、その機能断片、あるいはそれらに由来する核酸分子とを使用することである。用語「濃縮された」は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質またはその機能断片が、その細胞中または溶液中に存在する全タンパク質に占める割合について、該タンパク質または断片を採取した細胞または溶液中におけるよりも有意に高いことを意味する。濃縮は例えば、細胞抽出物からの核分画の単離を含んでもよい。これは遠心分離などの標準的技法によって行うことが可能である。濃縮の他の手段の例は濾過または透析であり、これらは例えば一定分子量未満の分子の除去、有機溶媒または硫酸アンモニウムを使用する沈殿を対象とし得る。精製は例えばクロマトグラフィー技法、例えばゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティ精製、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは疎水性電荷誘導クロマトグラフィーを含むことが可能である。精製に関する他の例は、分取用キ
ャピラリー電気泳動などの電気泳動技法である。単離は同様の方法の組合せを含むことが可能である。
【００４３】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と肝炎ウイルスまたはその機能断片とを曝露することからなる、本発明のこの実施形態は、生成する肝炎ウイルスの量を利用することもあるが、必ずというわけではない。好ましい実施形態では、方法は、生体分子の結合自体を測定することからなる。このような測定は例えば、分光法、光化学法、光度測定法、蛍光測定法、放射線法、酵素法または熱力学法による手段、あるいは細胞の作用を利用することが可能である。分光検出法に関する１例は蛍光相関分光法である（トンプソン  エヌエルら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＮＬ  ｅｔ  ａｌ）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．  １２（５）、２００２、６３４〜６４１）。光化学法は例えば光化学架橋反応である（スティーン  エイチ、ジェンセン  オーエヌ（Ｓｔｅｅｎ  Ｈ、Ｊｅｎｓｅｎ  ＯＮ）、Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  Ｒｅｖ．  ２１（３）、２００２、１６３〜１８２）。光活性標識、蛍光標識、放射活性標識または酵素標識の使用（概要に関しては、リッペ  アールエー、ら（Ｒｉｐｐｅ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．
１６０、２００１、４５９〜４７９を参照のこと）はそれぞれ、光度測定法、蛍光測定法、放射線法および酵素法による検出に関する例である。熱力学法による検出に関する１例は、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ、概要に関しては、ベラツクエツ−カンポイ  エーら（Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ−Ｃａｍｐｏｙ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ２６１、２００４、３５〜５４を参照のこと）である。細胞への影響を使用する方法の１例は、細胞の酵素検出または細胞複製などを含めた細胞生存率の測定である。これらの方法の幾つかは、さらに電気泳動またはＨＰＬＣなどの分離技法を含んでもよい。詳細には、標識の使用に関する例には、プローブとしての化合物や、触媒される反応が検出可能なシグナルをもたらす酵素の結合した免疫グロブリンが含まれる。放射活性標識および電気泳動による分離を使用する方法の１例は、電気泳動移動度シフトアッセイである。
【００４４】
ＨＢＶ配列の１７５２位におけるアデニン成分の存在が高レベルの血清中ＨＢＶ  ＤＮＡと相関関係を有するという発見に基づき、本発明は、肝炎感染の診断または評価を目的とする、前記複合体の形成を調節するための方法にも言及する。
【００４５】
本発明を、以下の図面および非制限的実施例によってさらに例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（実施例）
【実施例１】
【００４７】
ヘテロ核リボヌクレオタンパク質（ｈｎＲＮＰ）Ｋバリアントの発現多様性
別途記載のない限り、確立された細胞培養法および遺伝学的組換え法を使用した。
ＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変イーグル完全培地（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に１０％ウシ胎児血清（サイトシステムズ（Ｃｙｔｏｓｙｓｔｅｍｓ））を補った中で、加湿５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。
【００４８】
全てのＰＣＲ産物は、Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲシステム（商標）（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を使用して作製した。ＰＣＲ産物は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ精製キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して精製した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用してライゲーションを行った。製造者の教示書に従いプロトコルを実施した。
【００４９】
全ＲＮＡは、製造者の教示書に従いＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン社（Ｑ
ｉａｇｅｎ））を用いてＨｅｐＧ２から単離した。ｈｎＲＮＰ  Ｋの「バリアント２」および「バリアント３」クローンは、得られたそれぞれのｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質をコードする１．４ｋｂのＲＴ−ＰＣＲ断片をクローニングすることによって構築した。得られたクローンの配列は、バリアント２および３についてそれぞれＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３１２６２およびＮＭ＿０３１２６３に対応した。ただしクローニングした配列は、ヌクレオチド５０１位にシトシンの代わりにチミンを含んでいた。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１にそれぞれクローニングした。「バリアント２」のクローニングプライマーは、５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１６）および５’−ＣＴＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号１７）であり、「バリアント３」のクローニングプライマーは、５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１８）および５’−ＣＴＴＧＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣ−３’（配列番号１９）であった。
【００５０】
ＨＢＶ１７５２Ａの完全長複製型クローンは、鋳型としてＨＢＶゲノムを含むｐＢＲ３２５プラスミド（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）を使用して構築した。プライマーを設計して、２つの断片：１〜１９００および１６００〜３２１５を増幅させた。領域１６００〜１９００は、コアプロモーターおよび重なり合う転写停止領域を含んでいた（バイス  エルら（Ｗｅｉｓｓ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１６、１９９６、２１４〜２１８）。内部のＥｃｏＲＩ部位（１／３２１５）を使用する２つの断片のイン−フレームライゲーションによって、連続したウイルスのオープン・リーディング・フレームをｐｃＤＮＡ３．１中のＮｒｕＩ部位に確実にクローニングし、複製型の構築物を得た。ウイルスの転写は、ＮｒｕＩ部位がＣＭＶ  ＩＥプロモーター（チェン  ダブリューエヌら（Ｃｈｅｎ  ＷＮ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  ９５、２０００、１０９８）の外側にあるので、ウイルス自体のプロモーターの下で行われた。１７５２ΔＧ、１７５２ΔＴおよび１７５２ΔＣの完全長複製型クローンは、１７５２Ａに関して記載したようにして構築した。第１の断片、１６００〜３２１５をＨＢＶ−ｐＢＲ３２５プラスミドから最初に増幅させ、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。１７５２Ｇ、１７５２Ｔおよび１７５２Ｃ突然変異体は、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって第１の断片においてそれぞれ別々に作製した。構築物を確認するために塩基配列決定を行った。次いで第２の断片３２１５（１位でもある）〜１９００をＨＢＶ−ｐＢＲ３２５から得て、ｐｃＤＮＡ３．１中の第１の断片の下流にクローニングした。
【００５１】
ＨｅｐＧ２細胞は、３５ｍｍの組織培養皿中にウェル当たり１×１０６個の平均細胞密度で平板培養し、製造者の教示書に従いＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてトランスフェクションした。簡潔に述べると、２ｍｇのプラスミドＤＮＡをそれぞれのトランスフェクション混合物に使用し、細胞に一滴ずつ加えた。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、続いて細胞をハーベストし、次にＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。対照実験用に、空の発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションした。実験は２連で行った。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、細胞をハーベストし、次にＤＮｅａｓｙキット（登録商標）（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＢＶウイルス力価の負荷は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）装置（ロシュ・ダイアグノスティック社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ））で製造者の教示書に従いＲｅａｌＡｒｔ（商標）ＨＢＶ  ＬＣ  ＰＣＲキット（アトラス社（Ａｒｔｕｓ  ＧｍｂＨ））を使用してリアルタイムＰＣＲによって測定した。
【００５２】
図４中に示すように、空の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１は、ＨＢＶと同時感染させてもＨＢＶウイルス力価に対していかなる影響もなく、ｈｎＲＮＰ  Ｋと同時感染させた場合にもＨＢＶの検出はもたらさなかった。ＨＢＶのＤＮＡウイルス負荷は、３μｇのプラスミドでトランスフェクトした細胞（＋）よりも、６μｇのプラスミドでトランスフェクトした細胞（＋＋）において有意に高かった。
【実施例２】
【００５３】
ヌクレオチド１７５２位にアデニンと異なる塩基を含むＨＢＶバリアントの発現レベルの定量
肝芽腫細胞株ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＫＨｅｐ１およびＨＣＣＭの細胞を、ダルベッコ改変イーグル完全培地（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に１０％ウシ胎児血清（サイトシステムズ社（Ｃｙｔｏｓｙｓｔｅｍｓ））を添加した中で、加湿５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。
【００５４】
サルウイルス４０のエンハンサーおよびプロモーターを備えたルシフェラーゼ・ プラ
スミドであるｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌプラスミド、およびルシフェラーゼ遺伝子から上流のサルウイルス４０プロモーターを備えたエンハンサーを含まないルシフェラーゼ・ 
プラスミドであるｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒプラスミドを、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手した。ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏ／Ａプラスミドは、プライマーＬｕｃＦ（配列番号２０、５’−ＧＣＡＣＧＣＧＴＣＡＡＣＧＡＣＣＧＡＣＣＴＴＧＡＧＧ−３’）、およびＬｕｃＲ（配列番号２１、５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣ−３’）を使用するＰＣＲによって、ＨＢＶヌクレオチド１６８６位〜１８０１位（図６参照）を含むエンハンサーＩＩの基本機能単位を増幅させることにより構築した。この１３１ｂｐのＰＣＲ断片をＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩで消化したｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒと連結させた。他の突然変異構築物は、Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒ（商標）部位特異的ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発システム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して構築し、（図７中に示したように）ヌクレオチド１７５２位にＨＢＶエンハンサーＩＩ突然変異を導入した。第１の突然変異はヌクレオチドをＡからＧに変異させ（ｐＧＬ３Ｐｒｏｍｏ／Ｇ）、第２の突然変異はヌクレオチドをＡからＴに変異させ（ｐＧＬ３Ｐｒｏｍｏ／Ｔ）、最後にヌクレオチドをＡからＣに突然変異させた（ｐＧＬ３Ｐｒｏｍｏ／Ｃ）。この３つの突然変異オリゴヌクレオチドの配列は、それぞれ５’−ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡＧＧＴＴＡＡＡ−３’（配列番号２２）、５’−ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＡＧＧＴＴＡＡＡ−３’（配列番号２３）、および５’−ＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＣＴＴＡＧＧＴＴＡＡＡ−３’（配列番号２４）であった。構築物を確認のために塩基配列決定した。ｈｎＲＮＰ  Ｋクローンは、ＨｅｐＧ２細胞から抽出した全ＲＮＡ由来のｈｎＲＮＰ  Ｋをコードする１．４ｋｂのＲＴ−ＰＣＲ断片をクローニングすることによって構築した。ＥｃｏＲＩ−およびＸｈｏＩで消化したＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ−およびＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。クローニングプライマーは、５’−ＴＡＡＡＡＧＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＧＣＡＡＡＣＴＧＡＡＣＡＧ−３’（配列番号２５）、および５’−ＣＴＡＧＴＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＡＧＡ−３’（配列番号２６）であった。１７５２Ｇ、１７５２Ｔおよび１７５２Ｃの完全長複製型クローンは、１７５２Ａに関して記載したようにして構築した。第１の断片、１６００〜３２１５をＨＢＶ−ｐＢＲ３２５プラスミドから最初に得て、ｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。１７５２Ｇ、１７５２Ｔおよび１７５２Ｃ突然変異体は、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって第１の断片において別々にそれぞれ作製した。構築物を確認するために塩基配列決定を行った。次いで第２の断片３２１５（１位でもある）〜１９００をＨＢＶ−ｐＢＲ３２５から増幅させて、ｐｃＤＮＡ３．１中の第１の断片の下流にクローニングした。
【００５５】
トランスフェクション用に、２４ウェルプレート中にウェル当たり５×１０４個の平均細胞密度で細胞を平板培養し、製造者の教示書に従いＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ（商標）（ジーンセラピー社（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ））を用いてトランスフェクションした。簡潔に述べると、３μｇのプラスミドＤＮＡを無血清培地で１：１に希釈し、やはり無血清培地で１：１に希釈しておいたＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ試薬と混合した。室温で４５分のインキュベーションの後、このトランスフェクション混合物を、６０〜９０％コンフルエントの細胞に一適ずつ加えた。トランスフェクション後３時間で、新たな増殖培地を加えた。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、細胞をハーベストし、リン酸緩衝生理食塩水（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、４．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、および１．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）ですすいだ。ＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲノムＤＮＡを抽出した後、ＨＢＶウイルス力価の負荷を、製造者の教示書に従いＨｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）ＩＩ  ＨＢＶ  ＤＮＡアッセイ（ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ））を使用して測定した。
【００５６】
ルシフェラーゼ・アッセイ用に、３μｇのプラスミドＤＮＡおよび１μｇのｃｏｎｔｒｏｌ／ｐｒｏｍｏｔｅｒルシフェラーゼ・プラスミドＤＮＡをそれぞれのトランスフェクション混合物に使用し、３７℃で４８時間のインキュベーションの後、細胞を細胞培養物溶解試薬（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２５ｍＭのトリスリン酸ｐＨ７．８、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭの１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸、１０％のグリセロール、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とともにハーベストした。２０μｌの細胞溶解物を発光測定装置用チューブに分注し、次いで該チューブをＴｕｒｎｅｒ２０／２０型発光測定装置（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））内に配置する。１００μｌのルシフェラーゼ・アッセイ試薬（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））をチューブに注入することによって、読み取りを開始した。ルシフェラーゼ活性は、相対光量値（ＲＬＵ）として測定した。相対的ルシフェラーゼ活性を、エンハンサー要素を含まないベクターに対する倍数として表した。トランスフェクション効率の変動を調節するために、実験は３連で行い、少なくとも３回繰り返した。比較のため、図８の結果を、ヌクレオチド１７５２位にアデニンを有するＨＢＶバリアントを発現するＨｅｐＧ２細胞のレベルに標準化した（左上の第３列「Ａ」を１００％に設定）。１７５２位に他のヌクレオチドを有するＨＢＶバリアント（図８の「Ｇ」、「Ｔ」、および「Ｃ」）は、低レベルのルシフェラーゼ活性に反映されるように、ＳＶ４０プロモーターの増大ははるかに低かった。これらのデータは、本発明者によりエンハンサーＩＩ領域中に発見された点突然変異（図５）が、エンハンサーＩＩの転写効率に対して重大な影響を有することも示している。
【実施例３】
【００５７】
ヌクレオチド１７５２位にアデニンと異なる塩基を含むＨＢＶバリアントの対照測定のための使用
ＨｅｐＧ２細胞を、ダルベッコ改変イーグル完全培地（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に１０％ウシ胎児血清（Ｃｙｔｏｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した中で、加湿５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。ＨｅｐＧ２細胞は、３５ｍｍの組織培養皿中にウェル当たり１×１０６個の平均細胞密度で平板培養した。完全長の１７５２Ａ複製型ＨＢＶクローン（実施例１参照）、各１７５２Ｇクローン、各１７５２Ｔクローン、または各１７５２Ｃクローン（実施例２参照）と、「バリアント２」または「バリアント３」用の２つのｈｎＲＮＰ  Ｋ発現構築物のうちいずれか（実施例１参照）とを用いたコトランスフェクションは、実施例１に記載したものと同様に行った。対照実験用に、空の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１をｈｎＲＮＰ  Ｋ発現構築物の代わりに使用した。３７℃で４８時間のインキュベーションの後、細胞をハーベストし、次にＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＢＶウイルス力価の負荷は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）装置（ロシュ・ダイアグノスティック社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ））で、製造者の教示書に従いＲ
ｅａｌＡｒｔ（商標）ＨＢＶ  ＬＣ  ＰＣＲキット（Ａｒｔｕｓ  ＧｍｂＨ）を使用してリアルタイムＰＣＲによって測定した。予想通りＨＢＶウイルス力価はｈｎＲＮＰ  Ｋ濃度と共に用量依存的に増大し、バリアント２と３の間に有意な機能上の違いはなかった（図１２）。対照として使用した空の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１は、ＨＢＶウイルス力価に対していかなる影響も有していなかった。ヌクレオチド１７５２位にアデニンと異なる塩基を含むＨＢＶバリアントは、１７５２Ａ構築物と比較すると６８〜８０％減少したＨＢＶ  ＤＮＡを有しており、ＨＢＶ複製のレベルがより低いことが示されたが（図１２）、高用量のｈｎＲＮＰ  Ｋは、３つの構築物の複製効率を増大させることができた。図１２においてさらに見ることが可能であるように、ｈｎＲＮＰＫおよびＨＢＶの複合体形成に対するｈｎＲＮＰＫおよびＨＢＶの用量依存性は上限を有するようであり、それを超えると複製効率のさらなる増大を得ることはできない。これらのデータは、本発明者が、ＨＢＶ複製を誘導するのに必要とされるウイルスの構成成分ならびにそのパートナーである宿主の構成成分を正確にマッピングした明確な証拠も与えている。
【実施例４】
【００５８】
ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化レベルの調節
部位特異的突然変異誘発によって作製した、Ｙ７２、Ｙ４４９およびＹ４５８において異なるｈｎＲＮＰ  Ｋバリアント２および３の５つの突然変異体。それぞれのチロシン残基はフェニルアラニンと交換して、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化を阻害する化合物の効果を模倣した。チロシンの代わりにフェニルアラニンを含む突然変異体は、鋳型として野生型のｈｎＲＮＰ  Ｋ「バリアント２」クローンおよび「バリアント３」クローンを使用し、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して作製した。構築物を確認するために塩基配列決定を行った。使用した突然変異プライマーは、以下すなわち、１．ＹＭｕｔＦ１（配列番号２７）：Ｙ７２Ｆ用の正方向プライマー、５’−ＣＴＣＣＧＴＡＣＡＧＡＣＴＴＴＡＡＴＧＣＣＡＧＴＧＴＴ−３’；２．ＹＭｕｔＦ２（配列番号２８）：Ｙ７２Ｆ用の逆方向プライマー、５’−ＧＡＣＴＧＡＡＡＣＡＣＴＧＧＣＡＴＴＡＡＡＧＴＣＴＧＴ−３’；３．ＹＭｕｔＦ３（配列番号２９）：Ｙ４４９Ｆ用の正方向プライマー、５’−ＣＡＧＡＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣ−３’；４．ＹＭｕｔＦ４（配列番号３０）：Ｙ４４９Ｆ用の逆方向プライマー、５’−ＣＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＡＡＡＡＣＴＧＴＧＣ−３’；５．ＹＭｕｔＦ５（配列番号３１）：Ｙ４５８Ｆ用（バリアント２（ｖ２）用）の正方向プライマー、５’−ＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴ−３；６．ＹＭｕｔＦ６（配列番号３２）：Ｙ４５８Ｆ用（ｖ２用）の逆方向プライマー、５’−ＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＣＴＴ−３’；７．ＹＭｕｔＦ７（配列番号３３）：Ｙ４５８Ｆ用（バリアント３（ｖ３）用）の正方向プライマー、５’−ＡＧＴＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＡ−３’；８．ＹＭｕｔＦ８（配列番号３４）：Ｙ４５８Ｆ用（ｖ３用）の逆方向プライマー、５’−ＧＡＡＴＣＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＴＧＣＴＴ−３’であった。
【００５９】
ＨｅｐＧ２細胞を、ＨＢＶ複製型クローン１７５２Ａおよびそれぞれの突然変異体と共にコトランスフェクションした。対照は、ＨＢＶ複製型クローン１７５２Ａを空の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１とともにコトランスフェクションした。
【００６０】
ＨＢＶウイルス力価の負荷は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（ロシュ・ダイアグノスティック社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ））で、製造者の教示書に従いＲｅａｌＡｒｔ  ＨＢＶ  ＬＣ  ＰＣＲキット（Ａｒｔｕｓ  ＧｍｂＨ）を使用してリアルタイムＰＣＲによって測定した。キットは、ＨＢＶゲノムの１２０ｂｐ領域の増幅用、および特異的な増幅産物の並行検出用の試薬および酵素を含み、さらにキットは、ＰＣＲ阻害の可能性について確認するための異なる内部対照を含んでいる。ＨＢＶウイルス負荷は、ｈｎＲＮＰ  Ｋの野生型バリアント２または３と共にコトランスフェクトすると、
それぞれ約２．５倍および２倍増大した（図１４参照）。しかしながら、幾つかのｈｎＲＮＰ  Ｋバリアント２の突然変異体に関しては、ＨＢＶ負荷の増大は低かった。これらのデータは、ｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成が、ｈｎＲＮＰ  Ｋのリン酸化によって、特に残基Ｙ４４９およびＹ４５８が位置するＫＨ３ドメイン中のリン酸化によって影響を受けることを示している（図１４参照）。したがってこれらの結果は、ＫＨ３ドメイン中の残基Ｙ４４９およびＹ４５８が、ｈｎＲＮＰ  Ｋの制御において重要であり、ひいてはｈｎＲＮＰ  ＫがＨＢＶウイルス負荷の上方制御を変化させる可能性があることも示唆している。
【実施例５】
【００６１】
抗ＥＧＦＲ免疫グロブリンによるｈｎＲＮＰ  Ｋの調節
ヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７の細胞を、ダルベッコ改変イーグル完全培地（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に１０％ウシ胎児血清（Ｃｙｔｏｓｙｓｔｅｍｓ）を添加した中で、加湿５％ＣＯ２中で３７℃において培養した。
【００６２】
実施例１に記載したのと同様にＨＢＶ  １７５２Ａ複製型構築物を用いて、細胞をトランスフェクションした。４μｇのプラスミドＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用してトランスフェクションした。３７℃で６時間のインキュベーションの後、一群の異なる抗ＥＧＦＲ免疫グロブリン（図１５参照）を加えた。Ａｂ１（アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ）、米国カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）所在、カタログ番号２９６１５）は、ヒトＥＧＦＲの１０１６位のチロシンリン酸化部位（この配列はマウスおよびラット起源のものでは同一である）に対応する合成ペプチドに対して産生された、ウサギ抗ＥＧＦＲ（リン酸特異的）ポリクローナル免疫グロブリンである。この免疫グロブリンは、０．０２％のＰｒｏｃｌｉｎ（登録商標）３００を含む２００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中に１００μｇの、エピトープ親和性を用いて精製済みのウサギＩｇＧとして供給される。０．２２μｇ／μｌを、図１５中に示すようにそれぞれの細胞アッセイ用に使用した。Ａｂ２（リサーチ・ダイアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、米国ニュージャージー州フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ）所在、カタログ番号ＲＤＩ−ＥＧＦＲａｂＳ）は、組換えヒトＥＧＦＲ（エクソン１５〜１８に該当する領域を含むＥＧＦＲの細胞質ドメインの一部分）に対して産生された、ヒツジ抗ＥＧＦＲ免疫グロブリンである。この免疫グロブリンは、０．０５％のアジ化ナトリウムを含む２００μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中に２００μｇのＩｇＧとして供給される。０．４３μｇ／μｌをそれぞれの細胞アッセイ用に使用した。Ａｂ３（リサーチ・ダイアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、カタログ番号ＲＤＩ−ＥＧＦＲＣａｂｒＸ）は、ヒト、マウスおよびラットＥＧＦＲにおいて同一であるカルボキシ末端近くの領域にマッピングされるアミノ酸１１６８〜１１８１位由来の合成ペプチド（ＮＨ２−Ｃ−Ｓ−Ｌ−Ｄ−Ｎ−Ｐ−Ｄ−Ｙ−Ｑ−Ｑ−Ｄ−Ｆ−Ｆ−Ｐ−Ｋ−Ｅ−ＣＯＯＨ）に対して産生された、ウサギ免疫グロブリンである。アミノ末端のシステインを合成して、担体との結合を容易にした。ＥＧＦＲの認識は、チロシン１１７３のリン酸化状態とは無関係である。ｅｒｂＢ−２、ｅｒｂＢ−３またはｅｒｂＢ−４に対しては反応が観察されなかった。この免疫グロブリンは、タンパク質濃度約８５ｍｇ／ｍｌの２５０μｌの滅菌濾過済み非希釈血清として供給される。４６μｇ／μｌをそれぞれの細胞アッセイ用に使用した。Ａｂ４（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、米国ミズーリー州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）所在、カタログ番号Ａ２０４）は、免疫原としてヒトＥＧＦＲの２０アミノ酸の融合タンパク質に対して産生されたヒツジ免疫グロブリンである。この配列は、リン酸化領域に隣接している（Ｎ末端配列近辺）。この免疫グロブリンは受容体分子の内側ドメインを認識し、リン酸化を阻害するが、ＥＧＦの結合は阻害しないと思われる。この免疫グロブリンは、０．１５Ｍのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．５）中の１．３ｍｇ／ｍｌの滅菌濾過済み溶液として供給される。０．１μｇ／μｌをそれぞれの細胞アッセイ用に使用した。免疫グロブリンの未使用の等分試料を
トランスフェクション後２４時間で加えて、阻害効果を増大させた。細胞をさらにインキュベートし、トランスフェクション後４８時間で細胞をハーベストし、次にＤＮｅａｓｙキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＢＶウイルス力価の負荷は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（ロシュ・ダイアグノスティック社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ））で、製造者の教示書に従いＲｅａｌＡｒｔ  ＨＢＶ  ＬＣ  ＰＣＲキット（Ａｒｔｕｓ  ＧｍｂＨ）を使用してリアルタイムＰＣＲによって測定した。
【００６３】
ｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成を阻害することが可能な抗ＥＧＦＲ免疫グロブリンを１つ同定した（図１５参照、２つの細胞株の第３番目の棒グラフ）。Ａｂ２（リサーチ・ダイアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、カタログ番号ＲＤＩ−ＥＧＦＲａｂＳ）は、２つの細胞株いずれにおいても３倍を超えてＨＢＶウイルス力価を低下させた。これらのデータは、この免疫グロブリンがｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化をもたらすＥＧＦ受容体のシグナル伝達を阻害することが可能であることを示している。
【実施例６】
【００６４】
ｓｉＲＮＡによるｈｎＲＮＰ  Ｋの調節
ｈｎＲＮＰ  Ｋに対するｓｉＲＮＡ二重鎖は、ダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（ＳｍａｒｔＰｏｏｌ（登録商標））、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）およびプロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ）から購入した。選択した標的部位を図１６中に示すが、該標的部位は配列ＡＡＧＣＡＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴ（配列番号３、ヌクレオチド１３６６〜１３８６位、図１６の「標的２」）および供給元Ｂ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））についてはＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＡＴＴＡＴ（配列番号５、ヌクレオチド６８８〜７０８位、図１６の「標的１」）に対応する。それぞれのｓｉＲＮＡ配列は、ＧＣＡＧＵＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＧＵＵＵ（配列番号２）およびＣＧＡＵＧＡＡＡＣＣＵＡＵＧＡＵＵＡＵ（配列番号４）であった。供給元Ｃ（プロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ））について使用した第１の標的配列は、ＡＡＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＡＧＡ（配列番号７）であり、それぞれのｓｉＲＮＡ配列は、ＣＵＵＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＡＡＵＡＧＡＴＴ（配列番号６）であった。この標的配列は、ヌクレオチド１０２９〜１０４９位に対応する（図１６の「標的３」）。供給元Ｃについて使用した第２の標的配列は、ヌクレオチド１８７位におけるＡＡＧＡＡＴＡＴＴＡＡＧＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＴ（配列番号９）であった（図１６の「標的１」）。それぞれのｓｉＲＮＡ配列は、ＧＡＡＵＡＵＵＡＡＧＧＣＵＣＵＣＣＧＵＴＴ（配列番号８）であった。第３の供給元Ｃの配列ＡＧＧＡＣＧＵＧＣＡＣＡＧＣＣＵＵＡＵＴＴ（配列番号１０）は、ヌクレオチド６５５〜６７５位の標的配列ＡＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＡＴ（図１６の「標的２」、配列番号１１）から作製した。ＨｅｐＧ２細胞を、２４ウェル組織培養プレート中で、１ｍｇのプラスミドＤＮＡ（１７５２Ａ完全長複製型クローン、実施例１参照）およびそれぞれのｓｉＲＮＡ二重鎖（２ｍｇ）を用いて、６ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用してコトランスフェクションした。４８時間後、細胞を回収し、ＲＮＡおよびＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットおよびＤＮｅａｓｙ（登録商標）キット）。対照として、蛍光標識した非標的ｓｉＲＮＡでも細胞をトランスフェクションして、トランスフェクション効率を調べた。トランスフェクションは２連で行った。ｈｎＲＮＰ  ＫのｍＲＮＡレベルは、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定した。反応は、プライマー５’−ＡＧＡＣＣＧＴＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号３５）および５’−ＧＡＴＣＧＡＡＧＣＴＣＣＣＧＡＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号３６）を用いて、ＲＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｓｙｂｒ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））を使用し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））で２ｍｌのＲＮＡを使用して行った。ラミンＡ／Ｃ検出用に、リアルタイム逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ
）反応を、同じキットを使用して、レリオットら（Ｌｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、２００２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、８７、７２８〜７３４）に記載の改良型プライマー（５’−ＣＣＣＴＴＧＣＴＧＡＣＴＴＡＣＣＧＧＴＴＣ−３’（配列番号３７）および５’−ＴＧＣＣＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＴＣＧＧＴ−３’（配列番号３８））を用いて行った。Ｔ７  ＲｉｂｏＭａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写システム（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させたＲＮＡを用いて作製した標準曲線を使用することによって、ＲＮＡの絶対量の定量を実施した。精製した転写ＲＮＡの濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ＲＮＡ定量試薬（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））によって測定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させたＲＮＡの段階希釈物を２連で調製した。得られたデータは図１７に示す。ｈｎＲＮＰ  ＫのｍＲＮＡレベルは、トランスフェクトションしていない細胞対照、非標的ｓｉＲＮＡ対照およびラミンＡ／ＣのｓｉＲＮＡ対照に対して３０％低下した。キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）およびプロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ）のｓｉＲＮＡ（図１７のＢ、Ｃ）はＨＢＶウイルス負荷を５０％低下させ、ダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のｓｉＲＮＡ（Ａ）はＨＢＶレベルを１５％低下させた。
【００６５】
この３つの供給元の間のｓｉＲＮＡのＨＢＶ複製に対する有効性の違いは、おそらく選択した標的領域の違いによるものである（図１６参照）。しかしながら、３種類のｓｉＲＮＡはいずれもｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成、したがってＨＢＶ複製に影響を与えるようである。ラミンｓｉＲＮＡでトランスフェクションしたＨｅｐＧ２細胞において、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定されたラミンＡ／ＣのｍＲＮＡレベルは、トランスフェクトションしていない細胞に対して４５％の低下を示し、一方で非標的ｓｉＲＮＡおよびｈｎＲＮＰ  ＫのｓｉＲＮＡは、ラミンＡ／ＣのｍＲＮＡレベルに対して影響がなかった。したがってラミンの発現は、ｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成の調節用に選択したｓｉＲＮＡによって影響されないようである。これらのデータによって、ｈｎＲＮＰ  ＫがＨＢＶ複製の過程で重要な役割を果たすことも再度確認される。
【実施例７】
【００６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶの相互作用の検出
この実施例では、以下のように核タンパク質抽出物を調製することによって、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の濃縮を行った。
【００６７】
ＨｅｐＧ２細胞（実施例１参照）をトリプシン処理し、氷冷１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回すすぎ、５×元の充填細胞体積（ＰＣＶ）の緩衝液Ａ［１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．９）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫＣｌおよび１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）］と共に１０分間氷上でインキュベートした。４℃における３分間の１，０００ｒｐｍでの遠心分離後、細胞を２×元のＰＣＶの緩衝液Ａ中に再懸濁させ、加圧型（Ｄｏｕｎｃｅ型）ホモジナイザーでＳペッスルを用いて１０ストロークでホモジナイズした。核分画を２，５００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって沈殿させ、１．５×緩衝液Ｂ［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、４２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、２５％のグリセロール］中に再懸濁させ、Ｄｏｕｎｃｅ型ホモジナイザーでさらに１０ストローク処理した。次いで細胞懸濁物を微量遠心分離用チューブに移し、軽く攪拌しながら４℃で３０分間インキュベートした。核の残骸は、４℃における４０分間の１３，０００ｒｐｍでの遠心分離によって除去した。上清を、２００ｍｌの緩衝液Ｃ［２０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｍＭのＫＣｌ、４２０ｍＭのＮａＣｌ、２５％のグリセロール、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）］（緩衝液は２回交換した）に対して４℃で４時間透析した。透析後、核抽出物を２０分間の１３，０００ｒｐｍでの遠心分離によって浄化した。次いで核抽出物
を等分試料に分け、−７０℃で保存した。タンパク質濃度は、標準としてアセチル化ウシ血清アルブミンを使用して、タンパク質アッセイキット（バイオ−ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を用いて定量した。
【００６８】
ＨＢＶとｈｎＲＮＰ  Ｋの相互作用は、「電気泳動移動度シフトアッセイ」または「ＥＭＳＡ」として当業者に周知の方法によって分析した。結合反応手順は、１０μｇのＨｅｐＧ２核抽出物、０．１〜０．２μｇの非特異的競合ＤＮＡポリ（ｄＩ−ｄＣ）（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）および３２Ｐ−ｄＡＴＰ末端標識プローブ（１×１０４〜１×１０５ｃｐｍ）を含む、２０μｌの反応混合物（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴ）中において、２０分間３７℃において行った。遊離ＤＮＡとＤＮＡ−タンパク質複合体とを、６％の非変性ポリアクリルアミドゲルで展開した。ゲルを１時間８０℃において真空下で乾燥させてから、Ｘ線フィルム（Ｂｉｏｍａｘ（登録商標）、コダック社（Ｋｏｄａｋ）に−８０℃で曝露した。オリゴヌクレオチド・プローブの配列（ヌクレオチド変化を示す）は以下のもの、すなわちプローブ１：ＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＡＴＧＡＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧ（配列番号１２）；プローブ２：ＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＡＴＴＡＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴ（配列番号１３）；プローブ３：ＡＧＡＣＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＡＴＧＣＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧ（配列番号１４）；プローブ４：ＡＧＴＴＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＡＧＧＴＴＡＡＡＧＧＴ（配列番号１５）とした。得られた画像は図１８に示す。１７５２Ａプローブ（プローブ２、レーン５〜８）によって、バンドの形でｈｎＲＮＰ  Ｋが検出された。対応するｈｎＲＮＰのより弱いバンドは、１７５２Ｇプローブ（プローブ４、図１８のレーン１３〜１６）によって検出された。その後のバンドの濃度分析から、１７５２Ａプローブはプローブ４より約３００％強いシグナルを検出したことが示された。これは、この２つのプローブがｈｎＲＮＰ  Ｋに関して対して異なる結合親和性を有することを示している。
【実施例８】
【００６９】
ＨＢＶと複合体を形成するものとしてのｈｎＲＮＰ  Ｋの同定
ヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２から、細胞をハーベストし氷冷緩衝液Ａ（０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で細胞を２回すすぐことによって核タンパク質抽出物を得て、５×元の充填細胞体積の緩衝液Ｂ（０．３３Ｍのスクロース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４）と共に１５分間氷上でインキュベートした。４℃における５分間の３，０００ｒｐｍでの遠心分離後、ペレットを緩衝液Ｂで１回洗浄し、２００ｍｌの緩衝液Ｃ［０．４５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＳｉｇｍａＰ８３４０）］を用いて氷上で軽く再懸濁させた。細胞混合物を軽く攪拌しながら１５分間インキュベートし、次に５分間１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をＤＮＡ結合タンパク質アッセイ用に保存した。二本鎖オリゴヌクレオチド・プローブのアニーリングは、それぞれ３’端および５’端をビオチンで標識した各１ｎｍｏｌｅのアンチセンス・プローブおよびセンス・プローブを含む、１００ｍｌのＭｉｌｌｉ  Ｑ脱イオン水を使用して行った。オリゴヌクレオチド混合物の溶液を、５分間で９５℃に加熱して、ゆっくりと室温に冷却した。ＤＮＡと相互作用するタンパク質を、（ガダレタ  ディーら（Ｇａｄａｌｅｔａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７１、１９９６、ｐ．１３５３７）に以前に記載されたようにして捕捉した。簡潔に述べると、配列番号１４および配列番号１５（図１９に示す）を有するオリゴヌクレオチド混合物を、５ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン（ダイナル・バイオテク社（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に、結合および洗浄用緩衝液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中において１５分間室温でインキュベートした。次いで磁気ビーズを結合および洗浄用緩衝液で洗浄し、ＴＧＥＤ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％のグリセロール、１ｍＭの
ＤＴＴ、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて平衡化した。抽出した核タンパク質４０μｇを、非特異的競合ＤＮＡポリ（ｄＩ−ｄＣ）（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と２：１（ｗ／ｗ）で混合し、ＴＧＥＤ緩衝液を用いて５００μｌに調整した。核タンパク質−ポリ（ｄＩ−ｄＣ）溶液を、３０分間室温で平衡化した磁気ビーズ−オリゴヌクレオチド・プローブに加えた。非結合タンパク質は、ＴＧＥＤ緩衝液を用いて洗浄除去した。結合したタンパク質は、１ＭのＮａＣｌを含んだＴＧＥＤ緩衝液を用いて溶出させた。同じ捕捉および溶出手順を、核タンパク質−ポリ（ｄＩ−ｄＣ）混合物の新しい等分試料を用いてさらに４回繰り返した。溶出画分を集め、アセトン沈殿を施した。２−Ｄゲル電気泳動を、若干改変を加えてアマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプロトコルに従って行った。簡潔に述べると、アセトン沈殿タンパク質を含むそれぞれのサンプルを、再水和用緩衝液（７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、４％のＣＨＡＰＳ、０．５％のＩＰＧ緩衝液ｐＨ３〜１０、１．０ｍｇのＤＴＴ）を用いて３５０μｌの体積にした。短時間渦流混合することによって混合物を混合し、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を１８ｃｍ、ｐＨ３〜１０（非線形）Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（商標）ＤｒｙＳｔｒｉｐ（商標）に載せ、一定電圧（５０Ｖ）で一晩積極的に再水和を行った。等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、ＩＰＧｐｈｏｒ（商標）（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して２０℃において段階式に行った。簡潔に述べると、ストリップに５００Ｖで１時間、２０００Ｖで１時間、５０００Ｖで１時間、および８０００Ｖで１２時間、合計９０ＫＶｈを累積させて泳動した。ＩＥＦの後、ＩＰＧストリップを１５ｍｌのＳＤＳ平衡緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、６Ｍの尿素、３０％のグリセロール、２％のＳＤＳ、６６ｍＭのＤＴＴ、微量のブロモフェノールブルー、ｐＨ８．８）中で３０分間インキュベートし、次いでＤＴＴの代わりにヨードアセトアミド（３７５ｍｇ／１５ｍｌ）を含んだ同じ緩衝液を用いて３０分間、第２回目のインキュベーションを行った。二次元目の垂直ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩ  ＸＬ、バイオ−ラッド・ラボラトリーズ社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を、１０％ゲルを使用して１５０Ｖの一定電圧で１５℃にて６〜８時間行った。ゲルの銀染色（ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ（商標）銀染色キット、インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））により、非特異的結合の対照オリゴヌクレオチド・プローブと比較して、特異的なＤＮＡ結合タンパク質の明確な濃縮が実証された（図１９参照）。また、特異的なタンパク質スポットが分子量約５６ｋＤａとして現れることも明らかとなった。
【００７０】
特異的タンパク質スポットを切り出して製造者の教示書に従って脱染色した後、このゲルプラグを乾燥させ、重炭酸アンモニウム溶液中に浸し、ＤＴＴを用いて還元した。アルキル化はヨードアセトアミドを使用して行った。サンプルをＰｒｏＧｅｓｔ（商標）ワークステーションで一晩３７℃においてトリプシン消化した。ギ酸を加えて反応を停止させた。ペプチドをＣ１８  Ｚｉｐ−Ｔｉｐ（商標）で精製し、６０％アセトニトリル、０．２％ＴＦＡ中に調製したα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸のマトリクスを用いて溶出させた。１５マイクロリットルの溶出物を、流速２０ｎｌ／分で７５ｍｍのＣ１８カラムで処理した。トリプシン消化物の質量マップは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ（登録商標）Ｑ−ＴＯＦ２型質量分析計を使用して、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ．）によって得た。ペプチド断片の配列クエリは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を使用することによりプロテオミック・リサーチ・サービス社（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｉｎｃ）において行った（http://www.proteomicresearchservices.com/ ）。得られたデータは、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジン（www.matrixscience.com ）を使用して検索した。２１個の入手し塩基配列決定したペプチドの結果を、図２０に示す。５６ｋＤａタンパク質の配列アラインメントから、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質に対する相同性のスコアが高いことが明らかとなった。さらに、分析したタンパク質の分子質量は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の分子質量と一致した。
【実施例９】
【００７１】
ｈｎＲＮＰ  Ｋと肝炎ウイルスの制御領域との間の複合体形成のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分析および定量
ｈｎＲＮＰ  Ｋと肝炎ウイルスの制御領域、例えばＨＢＶのエンハンサーＩＩとの間の相互作用を分析する方法は、「ＧＳＴプルダウンアッセイ」として当業者に知られている。
【００７２】
この方法は以下の工程を含む。すなわち、３５Ｓ標識したエンハンサーＩＩを、製造者の教示書に従いｉｎ  ｖｉｔｒｏで翻訳し（ＴｎＴ（登録商標）ウサギ網状赤血球溶解物システム、プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、過剰のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）または融合タンパク質ＧＳＴ−ｈｎＲＮＰ  Ｋと共に０．２ＭのＮａＣｌ中でインキュベートする。ＧＳＴ−ｈｎＲＮＰ  Ｋは、標準的技法を使用して、完全長１．４ｋｂのｈｎＲＮＰ  ＫをＧＳＴベクターにクローニングすることによって構築することが可能である。第１の工程では、ＧＳＴおよびＧＳＴ−ｈｎＲＮＰ  ＫベクターでＤＨ５αを形質転換し、５９５ｎｍにおいて０．５の光学密度まで増殖させ、０．２ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを用いて２時間誘導した。次いで組換えタンパク質を、製造者の教示書に従い、予めＧＳＴｒａｐ（商標）ＨＰカラム中に充填されたＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（商品名）（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、注文番号１７−５２８１−０１）を使用する、確立したクロマトグラフィー技法を使用して精製する。溶出物を、１０ｍＭのリン酸（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ、および２０％グリセロールを含む水性緩衝液に対して一晩透析する。１０μｌのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳混合物を、１．８×１０−１０ｍｏｌの組換え融合タンパク質と共に１１０μｌの最終体積でインキュベートする。氷上で３時間の後、結合した複合体を、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）ビーズ（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、注文番号１７−５２７９−０１）の５０％（容積比）のスラリー２５μｌをインキュベーション緩衝液中に加えることによって精製し、４℃で１５分間混合する。１ｍｌのインキュベーション緩衝液で徹底的に洗浄した後、ビーズを電気泳動分析用にＬａｅｍｍｌｉ法のゲルに載せる。陽性の結果は、３５Ｓ−エンハンサーＩＩのＧＳＴ−ｈｎＲＮＰ  Ｋとの結合がＧＳＴ単独との結合より少なくとも５倍を超える結果を示すと思われる。この相互作用のさらなる確認は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳されたｈｎＲＮＰ  ＫをＧＳＴ−エンハンサーＩＩと結合させる相互交換実験によって繰り返すことも可能である。
【実施例１０】
【００７３】
ｈｎＲＮＰ  Ｋと肝炎ウイルスの制御領域との間の複合体形成のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分析および定量
ｈｎＲＮＰ  Ｋと肝炎ウイルスの制御領域、例えばＨＢＶのエンハンサーＩＩとの間の相互作用を分析する他の方法は、「クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイ」または「ＣｈＩＰアッセイ」として当業者に知られている。
【００７４】
実施例１に記載したのと同様に、１７５２Ａ完全長複製型クローンを用いてＨｅｐＧ２細胞をトランスフェクションし、トランスフェクション後４８時間で細胞をハーベストする。次いで細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％のＳＤＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＰＭＳＦ）中に溶解し、２０％Ｄｕｔｙで３０秒間の超音波処理を５〜８回実施する。遠心分離を最大速度で１０分間行って、細胞の残骸を除去する。５０μｌの超音波処理サンプルを使用し、５０μｌの１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８を加える。次いでプロナーゼ（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ）、２０ｍｇ／ｍｌ）をサンプルに加えて、最終濃度１．５μｇ／μｌとする。４２℃で２時間、次いで６５℃で一晩のインキュベーションの後、Ｌ
ｉＣｌを０．８Ｍの最終濃度まで加える。免疫沈降用希釈緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤）を加えて、抽出物を希釈する。１ｍｌの抽出物を４０μｌのプロテインＡセファロース・ビーズ（プロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂ、アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））と混合し、１５分間インキュベートする。次いでビーズを卓上遠心分離機での遠心分離などの標準技法によって沈殿させ、その後上清を新しいチューブに移す。抗ｈｎＲＮＰ  Ｋ免疫グロブリンを加え、その後溶液を軽く攪拌しながら一晩４℃でインキュベートする。予め平衡状態にしたプロテインＡビーズを加え、次いで３時間インキュベートする。ビーズを洗浄し、結合した免疫グロブリン複合体は溶出用緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ）を用いて溶出させる。実施例１に記載したのと同様にＤＮｅａｓｙキット（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、ＤＮＡを抽出する。実施例１および４に記載したようにリアルタイムＰＣＲを使用して、エンハンサーＩＩ領域に対して設計したプライマーを使用することによりＤＮＡ量を定量化する。この技法は、実施例１および４に示されている。陽性のバンドを、標準的技法を使用してアガロースゲル中に検出する。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】コアプロモーターのすぐ上流にある、Ｂ型肝炎ウイルスのエンハンサーＩＩ（Ｅｎｈ  ＩＩ）領域の位置を概略的に示す図。この領域（図６も参照）はウイルスの複製に関与することが示されている。
【図２】完全長複製型ＨＢＶ構築物のクローニングを示す図。ｐＢＲ３２５に含まれた市販のＡＴＣＣクローン（上側）は、両端にＥｃｏＲＩ部位を含む。プライマーを設計して、２つの断片：１〜１９００および１６００〜３２１５を増幅させた。続いて内部のＥｃｏＲＩ部位（１／３２１５）を使用したライゲーションによって、連続的なウイルスのオープン・リーディング・フレームを確保した。したがって複製型クローンは、その５’端にプロモーター（１６００〜１９００）を、およびその３’端に終結領域（１６００〜１９００）を含むものであった。この構築物をｐｃＤＮＡ３．１のＮｒｕＩ部位にクローニングした。ＮｒｕＩはｐＣＭＶプロモーターの外側にあるので、ウイルスの転写はウイルス自身のプロモーターの下で行われる。
【図３】微生物中でのｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶの同時発現を概略的に示す図。バリアント２またはバリアント３の完全長ｈｎＲＮＰ  Ｋ遺伝子をコードする１．４ｋｂのＲＴ−ＰＣＲ断片を、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。ｈｎＲＮＰ  Ｋバリアント２および３のクローンは、ＨｅｐＧ２細胞から抽出した全ＲＮＡから得たものである。クローニングした配列は、ヌクレオチド５０１位にシトシンの代わりにチミンを含むこと以外は、バリアント２および３についてそれぞれＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０３１２６２、およびＮＭ＿０３１２６３に対応した。ｈｎＲＮＰ  Ｋ発現構築物を、ＨＢＶの完全長複製型クローンと共にＨｅｐＧ２細胞にコトランスフェクションして、ＨＢＶ構築物の複製効率に対するｈｎＲＮＰ  Ｋの影響を決定した。
【図４】組換え微生物（図３）におけるＨＢＶの増幅に対するｈｎＲＮＰ  Ｋの促進効果を示す図。ＨｅｐＧ２細胞を、感染性の完全長複製型ＨＢＶ、ｈｎＲＮＰ  ＫおよびｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクションした。細胞を４８時点でハーベストした後にゲノムＤＮＡを抽出して、ＨＢＶ  ＤＮＡウイルス負荷を測定した。「＋」および「＋＋」は、それぞれ３μｇおよび６μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションに用いたことを示す。
【図５Ａ】高ウイルス性（Ｈｉ）のＨＢＶと低ウイルス性（Ｌｏ）のＨＢＶとの間の明確な分離は、ヌクレオチド１７５２位における変化と相関関係があることを示す図。患者のＨＢＶ  ＤＮＡ力価レベルに対応する、ヌクレオチド１７２０〜１７６９のＤＮＡ配列のデータを示す。合計６０の患者について照合し、ＤＮＡを血清から単離し、２回のＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ産物を精製し直接塩基配列決定して、産物の同一性を確認した。配列の結果をアラインメントして比較した。
【図５Ｂ】高ウイルス性（Ｈｉ）のＨＢＶと低ウイルス性（Ｌｏ）のＨＢＶとの間の明確な分離は、ヌクレオチド１７５２位における変化と相関関係があることを示す図。患者のＨＢＶ  ＤＮＡ力価レベルに対応する、ヌクレオチド１７２０〜１７６９のＤＮＡ配列のデータを示す。合計６０の患者について照合し、ＤＮＡを血清から単離し、２回のＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲ産物を精製し直接塩基配列決定して、産物の同一性を確認した。配列の結果をアラインメントして比較した。
【図６】ＨＢＶのエンハンサーＩＩ領域の配列を示す図。感染したドナーにおける血清中ＨＢＶ  ＤＮＡのレベルの変化と関係があるとして同定された点突然変異の位置に印をつけてある。エンハンサー活性に関する最小配列はすでに、ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００３９７７で公開されたように、ＨＢＶゲノムのヌクレオチド１６８７〜１８０５位に定義されている（イー  ジェーケー（Ｙｅｅ  ＪＫ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６、１９８９、６５８〜６６１；ワン  ワイら（Ｗａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６４（８）、１９９０、３９７７〜３９８１；ユー  シーエイチ、ティング  エルピー（Ｙｕｈ  ＣＨ、Ｔｉｎｇ  ＬＰ）、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６４（９）、１９９０、４２８１〜４２８７）。このエンハンサーのバリアントは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＢＶの低複製率と以前から関係づけられている（ウチダ  ティーら（Ｕｃｈｉｄａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８、１９９４、２８１〜２８５）。初期の刊行物の幾つかは、前記ＮＣＢＩ受託番号の配列を参照していないので、ヌクレオチドの計数え方が幾分ずれている。
【図７】１７５２位にアデニンの代わりにグアノシン、チミジンおよびシチジンを有する３つのＨＢＶ構築物の作製について概略的に示す図。部位特異的突然変異誘発をエンハンサーＩＩ領域のヌクレオチド１７５２について行い（１７５２Ａ、１７５２Ｇ、１７５２Ｔおよび１７５２Ｃ）、増幅させた断片を、エンハンサーを含まないルシフェラーゼ・ レポーター・ ベクター中のＳＶ４０プロモーターの上流に挿入した。
【図８】対照測定に使用した、ヌクレオチド１７５２位にアデニンと異なる塩基を含むＨＢＶバリアントまたはその断片を発現する細胞中の発現活性のレベルを示す図。発現レベルは、エンハンサーＩＩ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＣ＿００３９７７のヌクレオチド１６８６〜１８０１位）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、およびルシフェラーゼ遺伝子を含むベクターを発現する細胞のルシフェラーゼ活性によって表される（実施例２参照）。対応する値を第３列に示し（「Ａ」）、１７５２位にグアニン、チミンまたはシトシン（「Ｇ」、「Ｔ」および「Ｃ」）を有するエンハンサーＩＩを含むベクターを発現する細胞の値と比較している。１７５２位にアデニンを含まない構築物は、ＳＶ４０プロモーターにｃｉｓ結合させると該プロモーターを最小限〜弱く促進し、その結果１７５２Ａを含むエンハンサーと比較して低いレベルのルシフェラーゼ発現をもたらす。第１列は、ＳＶ４０プロモーター配列およびエンハンサー配列を含むベクターを使用し、最適なルシフェラーゼ発現がもたらされた内標準陽性対照のルシフェラーゼ活性を表す（第１列、「＋」）。第２列（「−」）は内標準陰性対照のルシフェラーゼ活性を示し、該対照は、ＳＶ４０プロモーター−ルシフェラーゼ遺伝子のみを含むがエンハンサー要素は含まないベクター自体のクローニングを行ったものである。いずれもヒト肝細胞癌に由来する４つの異なる細胞株、ＨｅｐＧ２、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（この図では「ＰＰ５」と略記）、ＳＫＨｅｐ１およびＨＣＣＭを使用した。ＨＣＣＭおよびＰＬＣ／ＰＲＦ／５にはＨＢＶゲノムのコピーが組込まれており、ＨｅｐＧ２およびＳＫ−Ｈｅｐ１−は、ＨＢＶ感染の病歴およびＨＢＶゲノムの組込みのない患者から得た。それぞれのエンハンサーＩＩクローン（１７５２Ａ、１７５２Ｇ、１７５２Ｔおよび１７５２Ｃ）を用いて細胞を一過的にトランスフェクションした。それぞれのトランスフェクションでは、３μｇのＤＮＡを１μｇの対照／プロモーター−ルシフェラーゼＤＮＡと共にトランスフェクションし、４８時間の時点で採取し、次にルシフェラーゼ活性の分析値を、発光測定装置を用いて決定した相対光量値（ＲＬＵ）として測定した。ルシフェラーゼ・アッセイの結果は、内標準陽性対照のレベル（適宜１００％に設定）に対して標準化した。
【図９Ａ】ｈｎＲＮＰ  Ｋの既知のバリアントのアミノ酸配列および対応するコードｃＤＮＡ配列を示す図（バリアント１、２および３のＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号は、それぞれＮＭ＿００２１４０、ＮＭ＿０３１２６２、およびＮＭ＿０３１２６３である）。バリアント３とバリアント１は、コード領域ではなく５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が異なっているので、一方のみを示す。バリアント２は、他の２つの既知バリアントと比較してコード領域の端部に６０塩基の欠失を有し、その結果フレーム・シフトがもたらされている。したがって、そのＣ末端は他の２つのバリアントとは異なっている。この２つのバリアントの間の機能的差異に関する比較検討はこれまで報告されていない。
【図９Ｂ】ｈｎＲＮＰ  Ｋの既知のバリアントのアミノ酸配列および対応するコードｃＤＮＡ配列を示す図（バリアント１、２および３のＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号は、それぞれＮＭ＿００２１４０、ＮＭ＿０３１２６２、およびＮＭ＿０３１２６３である）。バリアント３とバリアント１は、コード領域ではなく５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が異なっているので、一方のみを示す。バリアント２は、他の２つの既知バリアントと比較してコード領域の端部に６０塩基の欠失を有し、その結果フレーム・シフトがもたらされている。したがって、そのＣ末端は他の２つのバリアントとは異なっている。この２つのバリアントの間の機能的差異に関する比較検討はこれまで報告されていない。
【図９Ｃ】ｈｎＲＮＰ  Ｋの既知のバリアントのアミノ酸配列および対応するコードｃＤＮＡ配列を示す図（バリアント１、２および３のＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号は、それぞれＮＭ＿００２１４０、ＮＭ＿０３１２６２、およびＮＭ＿０３１２６３である）。バリアント３とバリアント１は、コード領域ではなく５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が異なっているので、一方のみを示す。バリアント２は、他の２つの既知バリアントと比較してコード領域の端部に６０塩基の欠失を有し、その結果フレーム・シフトがもたらされている。したがって、そのＣ末端は他の２つのバリアントとは異なっている。この２つのバリアントの間の機能的差異に関する比較検討はこれまで報告されていない。
【図９Ｄ】ｈｎＲＮＰ  Ｋの既知のバリアントのアミノ酸配列および対応するコードｃＤＮＡ配列を示す図（バリアント１、２および３のＧｅｎｅｂａｎｋ受託番号は、それぞれＮＭ＿００２１４０、ＮＭ＿０３１２６２、およびＮＭ＿０３１２６３である）。バリアント３とバリアント１は、コード領域ではなく５’非翻訳領域（ＵＴＲ）が異なっているので、一方のみを示す。バリアント２は、他の２つの既知バリアントと比較してコード領域の端部に６０塩基の欠失を有し、その結果フレーム・シフトがもたらされている。したがって、そのＣ末端は他の２つのバリアントとは異なっている。この２つのバリアントの間の機能的差異に関する比較検討はこれまで報告されていない。
【図１０】ｈｎＲＮＰ  Ｋ遺伝子の１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の形で天然に存在するバリアントを示す図。１８人の正常なボランティアから、ｈｎＲＮＰ  Ｋ完全長ｃＤＮＡをクローニングおよび塩基配列決定した。表に全ての確認された変化が列挙されている。被験体５，６，７および１４〜１８由来のＤＮＡサンプルは、公開されているｈｎＲＮＰ  Ｋの配列（いずれもバリアント３、図９と比較されたい）と比べていかなる変化も含んでおらず、したがって表中には挙がっていない。ｎｔ２５２において、Ｃ→Ｔの変化を含む新規のＳＮＰ（被験体９および１０）が同定されたが、同義コドンではない。２つの異なるサンプル（被験体１１および１２）において欠失が観察され、ＫＨ３ドメインのすぐ上流に１５塩基の欠失が見られた（ｎｔ１１０８〜ｎｔ１１２２、ｎｔ：ＡＴＧＡＴＴＡＴＴＣＣＴＡＴＧ、配列番号１）。
【図１１】これまでに同定されたｈｎＲＮＰ  Ｋ遺伝子の１ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を要約する図。図１０に示す得られた結果以外に、ｈｎＲＮＰ  Ｋ遺伝子のＳＮＰを、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベース（www.ensembl.org ）およびＣｅｌｅｒａデータベースから抽出した。ｄｂＳＮＰからはわずか２つのＳＮＰしか報告されておらず、該ＳＮＰはいずれも確認されていない。さらに、非翻訳領域（ＵＴＲ）およびイントロン領域における幾つかのＳＮＰが、公開データベース中に報告されているが、いずれも確認されていない（結果は示さない）。
【図１２】ｈｎＲＮＰ  ＫおよびＨＢＶのバリアント間の複合体形成に関する、２つの構成成分の用量依存性の例を示す図。トランスフェクションに一定量のＨＢＶ  ＤＮＡを使用した場合、ＨＢＶウイルス力価は、ｈｎＲＮＰ  Ｋ濃度と共に一定地点まで用量依存的に増大し、バリアント２と３の間に有意な機能上の違いはない。対照として、空の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１は、ＨＢＶウイルス力価に対していかなる影響も有していない。ヌクレオチド１７５２位にアデニンとは異なる塩基を含むＨＢＶバリアントは、１７５２Ａバリアント（左側）と比較するとＨＢＶ  ＤＮＡが６８〜８０％減少しており、ＨＢＶ複製レベルの低下が示されている。それにもかかわらず、ｈｎＲＮＰ  Ｋの用量を増大させると、他の３つのバリアントの複製効率を増大させることが可能である。ＨｅｐＧ２細胞を、図に示すように、完全長複製型ＨＢＶクローンである１７５２Ａ、１７５２ΔＧ、１７５２ΔＴおよび１７５２ΔＣと、用量を増大させた（５０、２５０および１２５０ｎｇ／ｍｌ）ｈｎＲＮＰ  Ｋバリアント２（ｖ２）またはバリアント３（ｖ３）とでコトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で細胞をハーベストした後、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＢＶ  ＤＮＡウイルス負荷をリアルタイムＰＣＲによって測定した。トランスフェクションは２連で行い、標準偏差を示す。
【図１３】（Ａ）ｈｎＲＮＰ  Ｋ中の全１７個のチロシン（Ｙ）残基を示す図。ｈｎＲＮＰ  Ｋはｉｎ  ｖｉｖｏでリン酸化されている（デジガルド  ケーら（Ｄｅｊｇａａｒｄ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２３６（１）、１９９４、３３〜４８）。ｈｎＲＮＰ  Ｋと幾つかのＲＮＡ分子およびＤＮＡ分子との結合は、チロシン残基のリン酸化によって刺激され得る（オストロビスキー  ジェーら（Ｏｓｔｒｏｗｓｋｉ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９８（１６）、２００１、９０４４〜９０４９）。３個のチロシン残基（印の付いているＹ７２、Ｙ４４９およびＹ４５８）は、Ｋホモロジー（ＫＨ）ドメイン内に位置するので、特にＨＢＶとの複合体形成と関係がある可能性が高い。これらの領域は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質と核酸との相互作用に関与しているとして確認されている。  （Ｂ）チロシン残基の部位特異的突然変異誘発（Ｙ→Ｆ）を示す図。ＫＨ１ドメインおよびＫＨ３ドメイン中のチロシン残基が、リン酸化できないフェニルアラニン（Ｆ）に置換されている。矢印は該当するアミノ酸の位置を示し、これらのアミノ酸はそれぞれの突然変異体Ｍ１〜Ｍ４において（ＹからＦに）交換されている。
【図１４】ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化レベルを変化させる化合物によって達成可能な調節効果を示す図。化合物によってリン酸化レベルを変える代わりに、チロシン残基をフェニルアラニンに突然変異させることによって特定のチロシン残基のリン酸化を抑制した（図１３Ｂ参照）。このことは、該当部位、すなわちＫＨドメインＫＨ１およびＫＨ３の残基Ｙ７２、Ｙ４４９およびＹ４５８におけるリン酸化を選択的に阻害する化合物を使用することに相当すると考えられる。ＨｅｐＧ２細胞を、ＨＢＶ複製型クローン１７５２Ａおよびそれぞれの突然変異体と共にコトランスフェクションした。「−」は、ＨＢＶ複製型クローン１７５２Ａと、対照の役割を果たす空の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１とのコトランスフェクションを示す。ＨＢＶウイルス力価は、ｈｎＲＮＰ  Ｋのバリアント２と共にコトランスフェクションすると約２．５倍増大し、バリアント３と共にコトランスフェクションすると約２倍増大する。ある特定の部位のチロシンの代わりにフェニルアラニンを含む（図１７ＡおよびＢ参照）幾つかのｈｎＲＮＰ  Ｋバリアント２突然変異体は、ＨＢＶウイルス力価の低下を示した。これらのデータは、ＫＨ３ドメイン中の残基Ｙ４４９およびＹ４５８が、ｈｎＲＮＰ  Ｋすなわち一本鎖ＤＮＡとの結合を担うとして以前に同定された領域（ブラッドック  ディーティーら（Ｂｒａｄｄｏｃｋ  ＤＴ  ｅｔ  ａｌ．）、ＥＭＢＯ  Ｊ  ２１（１３）、２００２、３４７６〜３４８５；バッケ  ピーエイチら（Ｂａｃｋｅ  ＰＨ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ６０（Ｐｔ４）、２００４、７８４〜７８７）の制御において、重要である可能性があることを示している。したがって、これらの突然変異体によるＨＢＶウイルス負荷の調節は、ｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成がｈｎＲＮＰ  Ｋのリン酸化により影響を受けることを示している。これらのデータは、ｈｎＲＮＰ  Ｋのバリアント２および３とＨＢＶとの間の複合体形成における幾つかの違いも反映している可能性がある。
【図１５】ｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成を調節する抗ＥＧＦＲ免疫グロブリンの同定に関する１例を示す図。一群の異なる抗ＥＧＦＲ免疫グロブリン（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ）、リサーチ・ダイアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を並べて、ＨＢＶ１７５２Ａ複製型構築物を用いてトランスフェクションした２つの異なる肝細胞株、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７に関して試験した（図２参照）。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、４μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション６時間後に、抗ＥＧＦＲ免疫グロブリン群を、製造者の推奨に従い以下の濃度で、すなわちＡｂ１（アナスペック社（ＡｎａＳｐｅｃ）、カタログ番号２９６１５）を１１μｇ、Ａｂ２（リサーチ・ダイアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、カタログ番号ＲＤＩ−ＥＧＦＲａｂＳ）を２１．５μｇ、Ａｂ３（リサーチ・ダイアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、カタログ番号ＲＤＩ−ＥＧＦＲＣａｂｒＸ）を２．３ｍｇ、およびＡｂ４（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ａ２０４）を５μｇ加えた。免疫グロブリンの新たな等分試料をトランスフェクション２４時間後に加え、阻害効果を増大させた。トランスフェクション４８時間後に細胞をハーベストし、ゲノムＤＮＡを抽出し、ＨＢＶウイルス負荷を測定した。免疫グロブリンの１つ（Ａｂ２）は、いずれの細胞株においても３倍を超えてＨＢＶウイルス力価を低下させることができた。このことは、この免疫グロブリンが、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質のリン酸化をもたらすＥＧＦ受容体のシグナル伝達を阻害することが可能であることを示している。
【図１６】図１７に示すｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成の調節のための、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の選択を示す図。ｈｎＲＮＰ  Ｋに対するｓｉＲＮＡ二重鎖は、３つの異なる製造業者、ダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）（ＳｍａｒｔＰｏｏｌ（登録商標）、「供給元Ａ」）、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）（「供給元Ｂ」）およびプロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ）（「供給元Ｃ」）から購入した。供給元Ｂ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））のｓｉＲＮＡ分子の第１の配列は、ＧＣＡＧＵＡＵＵＣＵＧＧＡＡＡＧＵＵＵ（配列番号２）であった。この配列は、ヌクレオチド１３６６〜１３８６位（図１６では「標的２」で表す）における標的配列ＡＡＧＣＡＧＴＡＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴ（配列番号３）から作製した。供給元Ｂの第２の配列は、ヌクレオチド６８８〜７０８位（図１６では「標的１」で表す）における標的配列ＴＡＣＧＡＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＡＴＴＡＴ（配列番号５）から作製した、ＣＧＡＵＧＡＡＡＣＣＵＡＵＧＡＵＵＡＵ（配列番号４）であった。供給元Ｃ（プロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ））のｓｉＲＮＡ分子の第１の配列は、標的配列ＡＡＣＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＡＴＡＧＡ（配列番号７）から作製した、ＣＵＵＧＧＧＡＣＵＣＵＧＣＡＡＵＡＧＡＴＴ（配列番号６）であった。この標的配列は、ヌクレオチド１０２９〜１０４９位（図１６中では「標的３」）に対応する。供給元Ｃの第２の配列、ＧＡＡＵＡＵＵＡＡＧＧＣＵＣＵＣＣＧＵＴＴ（配列番号８）は、ヌクレオチド１８７位（図２０では「標的１」）の標的配列ＡＡＧＡＡＴＡＴＴＡＡＧＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＴ（配列番号９）から作製した。最後に、供給元Ｃの配列ＡＧＧＡＣＧＵＧＣＡＣＡＧＣＣＵＵＡＵＴＴ（配列番号１０）は、ヌクレオチド６５５〜６７５位（図１６では「標的２」）における標的配列ＡＡＡＧＧＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＡＴ（配列番号１１）から作製した。
【図１７】小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）による、ｈｎＲＮＰ  ＫとＨＢＶとの間の複合体形成の調節の１例を示す図。  （Ｉ、上段）ＨｅｐＧ２細胞を、ｈｎＲＮＰ  ＫのｓｉＲＮＡ（２μｇ、図１６参照）とともに、またはｓｉＲＮＡを含めずに１７５２Ａ完全長複製型ＨＢＶクローンでコトランスフェクションした。標的化していない（「非標的」）およびラミンＡ／Ｃ（「ラミン」）のｓｉＲＮＡを、対照として使用した。ｈｎＲＮＰ  Ｋの発現を、ｓｉＲＮＡトランスフェクション後４８時間で測定した。最初の２列は、トランスフェクションしていない細胞および非標的ｓｉＲＮＡでトランスフェクションした細胞を表す。白色の列は、ＨＢＶおよびラミンＡ／ＣのｓｉＲＮＡでコトランスフェクションした細胞を表す。右側の列は、ＨＢＶおよびｈｎＲＮＰ  ＫのｓｉＲＮＡ（Ａ：ダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、Ｂ：キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）、Ｃ：プロリゴ社（Ｐｒｏｌｉｇｏ））でコトランスフェクションした細胞を表す。  （ＩＩ、中段）ＨＢＶウイルス負荷を、上記（Ｉ）と同様にトランスフェクションした細胞においてリアルタイムＰＣＲで定量化した。  （ＩＩＩ、下段）ラミンＡ／Ｃの発現を、リアルタイムＰＴ−ＰＣＲで測定した。トランスフェクションしていない細胞を１００％として比率を標準化した。結果は２つの独立のサンプルを表すものであり；平均値の標準誤差を示してある。定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって測定したｈｎＲＮＰ  ＫのｍＲＮＡレベルは、トランスフェクションしていない細胞、非標的ｓｉＲＮＡおよびラミンＡ／Ｃ  ｓｉＲＮＡの対照に対して、３０％の低下を示している。これに対してＨＢＶウイルス負荷は、製造業者ＢおよびＣからのｓｉＲＮＡを使用すると５０％低下したが、製造業者ＡからのｓｉＲＮＡでは１５％低下した。
【図１８】電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）における、ＨＢＶのＤＮＡ断片とｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質との間の複合体形成のｉｎ  ｖｉｔｒｏ測定を示す図。２８量体オリゴヌクレオチド・プローブを１７５２Ａまたは１７５２Ｇヌクレオチドを含むように設計し、対照プローブは隣接する上流配列から選択した。４つのそれぞれのプローブを用いて、ＨｅｐＧ２核抽出物を使用してＥＭＳＡを行った。プローブ１（配列番号１２）：レーン１〜４；プローブ２（配列番号１３、Ａ１７５２）：レーン５〜８；プローブ３（配列番号１４）：レーン９〜１２；プローブ４（配列番号１５、Ｇ１７５２）：レーン１３〜１６。それぞれの組のプローブは、漸増濃度（０．０μｇ、０．０５μｇ、０．１０μｇおよび０．１５μｇ）の、非特異的な競合ＤＮＡ［ポリ−（ｄＩ）−ポリ−（ｄＣ）］をそれぞれ含む。この競合ＤＮＡは、非特異的タンパク質の標識プローブへの結合を最小限にするために含める。ＤＮＡ−タンパク質複合体は、遊離ＤＮＡ分子とは異なる速度で移動する。したがってｈｎＲＮＰ  Ｋの結合は、ＨＢＶ  ＤＮＡプローブとは異なる移動度のシグナルによって示される。その後、複合体中の第２の構成成分としてのｈｎＲＮＰ  Ｋの存在を、図１９中に示すのと同様の分析によって確認することが可能である。ｈｎＲＮＰ  Ｋを１７５２Ａプローブを使用して検出し（プローブ２、レーン５〜８）、これより弱い同様のサイズのバンドを１７５２Ｇプローブを使用して検出した（プローブ４、レーン１３〜１６）。バンドの濃度分析から、プローブ２によって検出されたタンパク質が、プローブ４によって検出されたタンパク質より約３００％高い濃度であることが示され、１７５２ＡプローブはｈｎＲＮＰ  Ｋに関してより高い結合親和性を有することが示唆された。
【図１９】ＨＢＶと細胞タンパク質との間の複合体形成の確認を示す図。ＨｅｐＧ２細胞から得た４０μｇの核タンパク質抽出物を、２：１（ｗ／ｗ）の割合の非特異的な競合ＤＮＡであるポリ（ｄＩ−ｄＣ）の存在下で、５ｍｇのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２８０ストレプトアビジン−ビオチン−オリゴヌクレオチドに結合させた。非結合タンパク質を洗浄除去し、結合タンパク質は溶出させて１８ｃｍでｐＨ３〜１０の非線形のＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ（商標）Ｄｒｙｓｔｒｉｐ（商標）に載せた。再水和を一定電圧（５０Ｖ）で一晩行った。１次元目の等電点電気泳動の後、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）における垂直方向の分離を実施した。銀染色によって検出された特異的タンパク質スポットの推定分子量を示す（矢印）。銀染色は、約５６ｋＤａの分子量で特異的タンパク質スポットが現れたことも明らかにした。
【図２０】細胞タンパク質の同定を示す図。特異的タンパク質スポットを切り出し、製造者の教示書に従って脱染色した後、ゲルプラグをヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで消化した。トリプシン分解質量マップを、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）によって得た。ペプチド断片の配列クエリを、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を使用することによりプロテオミック・リサーチ・サービス社（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｉｎｃ）において行った（http://www.proteomicresearchservices.com/ ）。得られた２１個の塩基配列決定したペプチドの結果を示す。５６ｋＤａタンパク質の配列アラインメントから、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質に対する相同性スコアが高いことが明らかとなった。さらに、分析したタンパク質の分子質量は、ｈｎＲＮＰ  Ｋタンパク質の分子質量と一致した。
【図２１】既知のｈｎＲＮＰ  Ｋバリアントのアミノ酸配列（図９も参照されたい）およびＭＡＬＤＩペプチド質量マッピングによって割り当てられたトリプシン分解ペプチドによって調査した各領域（囲み部分）を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図２０】
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【図２１】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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