(57)【要約】  活性化単核食細胞により生産されたエンセファロトキシンは、アルツハイマー病（ＡＤ）、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷、または神経−ＡＩＤＳのような神経変性疾患および神経炎症疾患を含む神経学的疾患を有する個体に存在する。本発明の方法によるエンセファロトキシンの生化学的検出は、初期の前徴段階で神経学的疾患の診断を可能とし、これにより疾患の進行に早期に介入し、ならびに神経変性疾患を発症する危険性がある個体または群の同定を可能とする。また本発明の方法は、神経疾患の進行および処置を監視するメカニズムも提供する。
2007524353.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンを検出することを含んでなる、個体の神経疾患または認知喪失の危険性を診断する方法であって、該検出が該個体の生物学的サンプルをニューロンに、エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下および不存在下の両方で接触させ、そして該エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのニューロンの生存に関して該エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下でのニューロンの生存を比較し、該エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのニューロンの生存の減少は、該神経疾患の指標となり、エンセファロトキシンはＮ−硫酸化およびＯ６−硫酸化を有する少なくとも１つのグルコサミンを含んでなるオリゴ糖であり；該エンセファロトキシンはペプチド結合を欠き；そして該エンセファロトキシンは約２０００ダルトン未満の分子量を有し；エンセファロトキシン  インアクチベーターはヘパリンリアーゼＩ、Ｎ−スルファミニダーゼ、グルコサミン−６−スルファターゼまたは亜硝酸溶液である、上記方法。
【請求項２】
上記神経疾患が、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷またはアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記生物学的サンプルが、脳脊髄液、脊髄組織または脳組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記エンセファロトキシンが約７００〜約１９００ダルトンの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記個体がヒト、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタまたは齧歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記個体がヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記亜硝酸溶液が約１．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ニューロンの生存を比較する上記工程が、上記エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのエンセファロトキシンのＥＤ５０に対して、上記エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下での上記エンセファロトキシンのＥＤ５０を比較することを含んでなり、ここで該エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下でのエンセファロトキシンのＥＤ５０に比べて該エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのエンセファロトキシンの低いＥＤ５０は、該神経疾患の指標となる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
個体の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンを検出することを含んでなる、個体の神経疾患または認知喪失の危険性を診断する方法であって、該検出工程が該エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下での該生物学的サンプル中の光吸収に対して、該エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下での該生物学的サンプル中の光吸収を比較することを含んでなり、該エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下での吸収の上昇は該神経疾患の指標となり、エンセファロトキシンはＮ−硫酸化およびＯ６−硫酸化を有する少なくとも１つのグルコサミンを含んでなるオリゴ糖であり、ペプチド結合を欠き、そして約２０００ダルトン未満の分子量を有する上記方法。
【請求項１０】
上記光の吸収が２３２ナノメートルの波長で測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
エンセファロトキシン  インアクチベーターが、ヘパリンリアーゼＩ、Ｎ−スルファミニダーゼ、グルコサミン−６−スルファターゼまたは亜硝酸溶液である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
上記亜硝酸溶液が約１．５のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記エンセファロトキシンが４〜８個のサッカリド単位を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記エンセファロトキシンが約７００〜約１９００ダルトンの分子量を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
上記エンセファロトキシンが４〜８個のサッカリド単位を含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
上記神経疾患が、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷またはアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
個体の第１および第２の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンレベルを比較することを含んでなる、個体の神経疾患の処置を監視する方法であって、該第１の生物学的サンプルは第２の生物学的サンプルよりも早い時点で該個体から採取され、該第２の生物学的サンプルは該神経障害の処置後に該個体から採取され、そして該エンセファロトキシンレベルは該生物学的サンプルの光吸収により測定され、該第２の生物学的サンプルの上昇した吸収は、該神経疾患の進行の指標となり、エンセファロトキシンはＮ−硫酸化およびＯ６−硫酸化を有する少なくとも１つのグルコサミンを含んでなるオリゴ糖であり；該エンセファロトキシンはペプチド結合を欠き；そして該エンセファロトキシンは約２０００ダルトン未満の分子量を有する上記方法。
【請求項１８】
上記エンセファロトキシンが約７００〜約１９００ダルトンの分子量を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記エンセファロトキシンが４〜８個のサッカリド単位を含んでなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
上記の光吸収が２３２ナノメートルの波長で測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
上記第１の生物学的サンプルが、上記神経疾患の処置後に上記個体から採取される請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
上記神経疾患が、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷またはアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
上記個体がヒト、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタまたは齧歯類である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
上記個体がヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
個体のエンセファロトキシンレベルの上昇を経時的に検出することを含んでなる、個体の神経疾患の進行を監視する方法であって、該検出工程が該個体の第２の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンの光吸収に対して、該個体の第１の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンの上昇した光吸収を測定することを含んでなり、該第２の生物学的サンプルは該第１の生物学的サンプル前に該患者から採取され、そしてエンセファロトキシンはＮ−硫酸化およびＯ６−硫酸化を有する少なくとも１つのグルコサミンを含んでなるオリゴ糖を含んでなり、ペプチド結合を欠き、そして約２０００ダルトン未満の分子量を有し、該上昇した光吸収は該神経疾患の進行の指標となる上記方法。
【請求項２６】
上記神経疾患が、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷またはアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記の光吸収が２３２ナノメートルの波長で測定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
上記エンセファロトキシンが約７００〜約１９００ダルトンの分子量を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
上記エンセファロトキシンが４〜８個のサッカリド単位を含んでなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
個体のエンセファロトキシンレベルの上昇を経時的に検出することを含んでなる、個体の神経疾患の進行を監視する方法であって、該検出工程が該個体の第１の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、該個体の第２の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、そして該第２の生物学的サンプルの存在下で減少したニューロンの生存を検出することを含んでなり、該第２の生物学的サンプルは該第１の生物学的サンプルよりも後の時点に採取され；該エンセファロトキシンはＮ−硫酸化およびＯ６−硫酸化を有する少なくとも１つのグルコサミンを含んでなるオリゴ糖を含んでなり、ペプチド結合を欠き；そして約２０００ダルトン未満の分子量を有し、そして該減少したニューロンの生存は該神経疾患の進行の指標となる上記方法。
【請求項３１】
上記神経疾患が、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷またはアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
上記エンセファロトキシンが約７００〜約１９００ダルトンの分子量を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
上記エンセファロトキシンが４〜８個のサッカリド単位を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
上記生物学的サンプルが、脳脊髄液、脊髄組織または脳組織である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
上記個体がヒト、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタまたは齧歯類である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
上記個体がヒトである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
上記生物学的サンプルの１つが上記神経疾患の前徴症状期に採取される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
上記の減少したニューロンの生存が、上記の第１の生物学的サンプルのＥＤ５０を第２の生物学的サンプルのＥＤ５０と比較することにより検出され、第１の生物学的サンプルのＥＤ５０に比べて第２の生物学的サンプルの低いＥＤ５０は、上記神経疾患の進行の指標となる請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
個体の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンレベルの上昇を経時的に検出することを含んでなる、個体の神経疾患の処置を監視する方法であって、該検出工程が該個体の第１の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、該個体の第２の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、そして第２の該生物学的サンプルの存在下で減少したニューロンの生存を検出することを含んでなり、該第２の生物学的サンプルは該第１の生物学的サンプルよりも後の時点でかつ該神経疾患の処置後に採取され；該エンセファロトキシンはＮ−硫酸化およびＯ６−硫酸化を有する少なくとも１つのグルコサミンを含んでなるオリゴ糖を含んでなり、ペプチド結合を欠き、そして約２０００ダルトン未満の分子量を有し；そして該減少したニューロンの生存は該神経疾患の進行の指標となる上記方法。
【請求項４０】
上記神経疾患が、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷またはアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
上記エンセファロトキシンが約７００〜約１９００ダルトンの分子量を有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
上記エンセファロトキシンが４〜８個のサッカリド単位を含んでなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
上記生物学的サンプルが、脳脊髄液、脊髄組織または脳組織である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
上記個体がヒト、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタまたは齧歯類である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
上記個体がヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
上記のニューロンの生存の減少が、上記第１の生物学的サンプルのＥＤ５０を第２の生物学的サンプルのＥＤ５０と比較することにより検出され、第１の生物学的サンプル中のＥＤ５０に比べて第２の生物学的サンプルの低いＥＤ５０は、該神経疾患の進行の指標となる請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
上記生物学的サンプルが、脳脊髄液、脳組織または脊髄組織を含んでなる、請求項９、１７または２５に記載の方法。
【請求項４８】
上記個体がヒト、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタまたは齧歯類である、請求項９または２５に記載の方法。
【請求項４９】
上記個体がヒトである、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、２００３年１月２７日に出願された特許文献１の利益を主張する。その出願内容は全部、引用により本明細書に編入する。
政府の認可との関係
本明細書の開示の一部は、国立衛生研究所、認可番号ＡＧ１２５４８の認可により支援されてきた。米国政府は、本出願に特定の権利を有することができる。
発明の分野
本発明は、神経疾患の臨床的発現と影響を受けた脳の単核食細胞により生産される神経毒との相関に関する。また本発明は、個体の生物学的サンプル中の神経毒を検出することにより、神経疾患または認知喪失の危険性を診断するための方法に関する。神経毒であるエンセファロトキシン（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｔｏｘｉｎ）は、神経疾患、例えばＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷およびアルツハイマー病（ＡＤ）において、ニューロンを慢性的に傷害する炎症カスケードにより放出されることが分かった。この炎症カスケードには単核食細胞の活性化およびシナプス結合およびニューロンの損失が関与し、これは情報処理、注意、学習および情報の回復（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）に低下を生じ、知的機能の全体的喪失をもたらす。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
神経疾患に関連する認知喪失および痴呆は、記憶、学習および情報処理のための解剖学的物質（ａｎａｔｏｍｉｃａｌ  ｓｕｂｓｔｒａｔａ）として働くニューロンおよびシナプスに対する傷害から生じる。多くの関心にもかかわらず、これらの障害における進行性のニュローンの損失の原因となる生化学経路は解明されていない。
【０００３】
アルツハイマー病（ＡＤ）は世界中で１５００万以上の症例があり、そして年配者における最も頻度の高い痴呆の症例である（非特許文献１）。ＡＤにはニュローンとシナプスとの連結を破壊するメカニズムが関与すると考えられている。この疾患の神経病理学には、Ａβ１−４２の凝集物を含む老人性斑の形成を含む（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。ＡＤ患者の灰白質に見い出される老人性斑は、反応性の小膠細胞と接しており、そしてニュローンの損傷と関連している（非特許文献６；非特許文献１；非特許文献７）。インビトロで試験したＡβ斑と相互作用する小膠細胞に由来する斑の成分は、小膠細胞が有力な神経毒を放出することを刺激することが分かり、すなわち反応性の小膠細胞症とＡＤの神経病理学とを関連づける（非特許文献８）。
【０００４】
現在、幾つかの証拠の裏づけが、小膠細胞が誘導する神経毒がＡＤの病理に寄与するという概念を支えている。第１に、小膠細胞が誘導する毒素は斑を負うＡＤ脳の領域から抽出することができるが、年齢が合った対照またはＡＬＳ脳組織の同一の脳の領域からは抽出できない（非特許文献８；非特許文献９）。第２に、毒性活性の局所的分布はＡＤの新皮質組織および海馬（ｖｓ．対照またはＡＬＳ）、多数の反応性小膠細胞を含有する領域に小膠細胞が誘導するニューロン毒（ｎｅｕｒｏｎ  ｐｏｉｓｏｎ）の最大濃度を示す。対照的に、正常またはＡＬＳ患者に由来する大脳、白質および新皮質組織は（もしあるとしてもわずかに反応性の小膠細胞クラスターを有するだけである）、神経毒活性をほとんど示さない。さらに各脳領域中の反応性小膠細胞クラスターの相対数は、その領域から抽出された神経毒活性のレベルと有意に相関する（ｐ＜０．００５）。第３に、単離した斑断片または合成のヒトＡβ１−４０またはＡβ１−４２ペプチドは、ヒトの小膠細胞が神経毒をカルチャーに放出することを活性化することが分かっている（非特許文献８；非特許文献９）。しかし神経毒の効果は、斑またはペプチドがニューロンの頂点に直接配置された時、または小膠細胞がＡＤ、ＡＬＳまたは正常、加齢対照の脳から単離された、斑を含まない画分に暴露された時、検出されない（非特許文献８；非特許文献９）。このように単離された斑のニューロンに対する毒性効果は間接的であり、そして斑が刺激する小膠細胞から放出される神経毒活性により媒介される。第４に、ＡＤ患者に由来するＣＳＦに見い出されるが、疾患対照に由来するサンプル中に検出されない神経毒活性がある（Ｇｉｕｌｉａｎへの特許文献２；非特許文献１０）。第５に、Ａβ−結合微小球の海馬への浸出は、ラットにおいて浸入部位に炎症応答を生じる（Ｇｉｕｌｉａｎへの特許文献２）。まとめると、これらのデータは、Ａβペプチドとの接触を介する小膠細胞の斑−活性化が、ＡＤ脳の個別の領域で殺ニューロン（ｎｅｕｒｏｎ−ｋｉｌｌｉｎｇ）因子を生産することを示す（非特許文献８）。
【０００５】
ＡＤを発症しているほとんどの患者は、軽度の認知傷害（ＭＣＩ）の移行期間を通して進行するが、それらはたいてい疾患の初期の間に医師に示されないだろう。研究グループの間では、ＭＣＩの患者にはＡＤへ進行する危険性が増加するという共通認識がある（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。記憶障害はＭＣＩに共通する最も顕著な特性であるが、主に言語または空間視覚に関する機能おける欠如を含む他のパターンも含む可能性がある（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。記憶障害は通常、ＭＣＩの最も顕著な特徴であるが、主に言語または視覚運動能に欠陥を含む他のパターンを含むかもしれない（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。軽度認知障害を特徴づける試みは、痴呆の重篤度を無し、軽度、中程度、または重度と評価する痴呆評価尺度（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ：ＣＤＲ）スケールを使用して行われてきた。非特許文献１８は、０．５のＣＤＲの患者はほとんどの場合で「大変軽度」のＡＤであるらしいと結論した［ＣＤＲ０．５の分類は、一貫した軽い物忘れを特徴とし、これは軽度であり、見当識、社会適応、家庭および趣味、判断力、および介護状況のような他の機能障害があるとしてもわずかである。］また他の測定も、ＭＣＩ個体を同定するために使用されてきた。例えば良くない遅延した想起は進行の最もよい予測、痴呆ではない年配の個体の後の痴呆の予測、および正常な老化と軽度ＡＤとの間の最高の識別となることが示された（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。ＭＣＩの個体がＡＤの臨床診断を発症するのに要する時間は、アルツハイマー病共同研究（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｓｔｕｄｙ：ＡＤＣＳ）により約３０％が２年、そして約４５％が３年であると予想された。
【０００６】
ＨＩＶ−１感染および神経−ＡＩＤＳは、脳および脊髄に荒廃させる効果を生じる。ＨＩＶ−感染中の認知障害の元にある解剖学的基礎は不明であるが、痴呆が進行した疾患では新皮質全体に分散した大きなニューロンの４０％まで減少がある（非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。
【０００７】
ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）は、認知機能不全、運動機能の低下、および行動変化を特徴とする。これは主に、ＣＤ４細胞カウントが比較的低い時、ＨＩＶ感染のさらに進行した段階で起こる。機能不全の進行は可変性であるが、致命的な結果を伴う深刻な合併症とみなされる。ＨＩＶによる認知喪失の診断は排除プロセスによる−−ＨＩＶに特異的なＣＮＳに対する損傷を監視するために認可されたマーカーは無い。そのようなマーカー無しでは、重大な機能喪失が現れるまで患者を評価するための臨床的指標が無く、そしてＨＩＶの脳傷害を保護するための新規処置法を開発する好機もほとんど無い。したがって初期の前兆段階の患者を同定することが大変望まれている。
【０００８】
ＨＡＡＲＴ（本明細書では３以上の抗レトロウイルス剤を使用した併用療法と定める）の前に、ＡＩＤＳの患者の６０％が痴呆を発症した。この発病率は約１０〜１５％に低下したようだが、認知機能不全はＨＩＶ／ＡＩＤＳ群の半分以上に問題を残す（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。
【０００９】
ＨＩＶ−１の脳の病状には、新皮質で拡散したスナプスの損傷、皮質ニューロンの損失、および侵襲する血液単球、小膠細胞および多核巨細胞を含む感染した反応性の単核食細胞群が関与する。これらの巨細胞は、ｇｐ１２０、レトウルイルスエンベロープタンパク質で覆われたＨＩＶに感染した単核食細胞の融合；ＨＩＶ−１感染中に認知障害と相関した巨細胞の存在を表す。現在、この分野のほとんどの研究グループは、感染した単核食細胞により放出される毒素が、ＨＩＶ−１（＋）群の認知喪失の主原因であることに同意している（非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献１９；非特許文献２９；非特許文献２０；非特許文献２１）。
【００１０】
今では幾つかの証拠の裏付けが、単核食細胞が誘導する神経毒がＨＩＶ−１感染中に脳内のニューロン損傷に寄与するという概念を支えている。第１に、ＨＩＶ−１はニューロンに感染せず、しかもニューロンに対する直接的毒性効果も示さなかった（非特許文献３０；非特許文献２２；非特許文献３１）。第２に、ＨＩＶ−１単核食細胞（ＴＨＰ−１、Ｕ９３７、ヒト血液単球、およびヒト脳の小膠細胞）は、インビトロでＨＩＶ−１に感染した時に神経毒を放出した；対照的にリンパ球（Ｈ９、ヒト血液リンパ球）は放出しなかった（非特許文献３０；非特許文献２２）。第３に、感染したドナーから単離したヒト単核食細胞（血液単球および小膠細胞）は、インビトロ実験から回収されたものと同じ神経毒を放出した；ここでも単離された感染リンパ球は放出しなかった（非特許文献３０）。第４に、神経毒活性は感染した個体の脳組織から回収することができる（非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。第５に、ウイルスエンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０は、ヒト血液の単球および小膠細胞から神経毒の放出を刺激することができる；ｔａｔを含有する他のウイルスタンパク質はしなかった（非特許文献３１）。第６に、高濃度の神経毒がＨＩＶ−１（＋）個体の脳脊髄液に見い出された。そして第７に、神経毒であるヘパランオリゴ糖のファミリーは、ＨＩＶ−１感染細胞から、そしてＨＩＶ  ＣＳＦから単離することができる。
【００１１】
反応性の単核食細胞は多数の生物活性物質を放出するが、これら化合物の幾つかは実際に神経変性疾患で存在することが見いだされた濃度で有害なニューロンとなり得る（非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４；非特許文献２２）。さらにそのような候補ニューロン毒素の少数が、ＡＤおよびＨＡＤの両方に存在する。例えば、Ａβ１−４２の「毒性」形態の組織濃度の上昇は、ＡＤの特徴であるが（非特許文献３１）、ＨＡＤでは生じない。同様に上昇したキノリン酸レベルがＨＡＤ個体の脳脊髄液（ＣＳＦ）中に生じるが（非特許文献３３）、ＡＤ患者のそれには生じない（非特許文献３４）。対照的にＡＤおよびＨＡＤ脳組織の両方が、潜在的な神経毒作用を持つ異質な低分子量の安定な分子群を含む（非特許文献２２；非特許文献８；非特許文献９）。アミロイド斑、合成β−アミロイドペプチド、ＨＩＶ−１またはｇｐ１２０に暴露されることにより活性化された培養した単核食細胞は、これらの同じ神経毒を生産する（非特許文献２３；非特許文献３５）。そのような考察は、共通するが同定されていない経路が、免疫により駆動される（ｉｍｍｕｎｅ−ｄｒｉｖｅｎ）神経病状をＡＤおよびＨＡＤの両方で媒介することを示唆している。
【００１２】
神経疾患の臨床的発現は、有意な程度のニューロンの損失およびシナプスの傷害が、十分に適応できる機能に必要な臨界値を越えた後にのみ起こるので、疾患の病状の初期の前兆を検出することは、疾患の進行を遅らせるための好機を与える。本発明は、例えばアルツハイマー病、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、神経−ＡＩＤＳ、クロイツフェルト−ヤコブ病、軽度認知障害（ＭＣＩ）、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中または急性外傷を含む神経疾患および認知喪失の危険性を診断する方法を提供する。本発明の方法は、神経疾患および認知喪失の危険性の早期検出を可能とし、これにより疾患の進行に、より早く介入できるようにする。また個体のエンセファロトキシンレベルを監視することにより、神経疾患の進行および処置を監視する方法も提供する。
【００１３】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／４４３，２１９号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０４３，２８３号明細書
【非特許文献１】Ｔｅｒｒｙ，Ｒ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（編集）、アルツハイマー病（ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ）、ラベン出版（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９４
【非特許文献２】Ｓｅｌｋｏｅ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９１，６：４８７−４９８
【非特許文献３】Ｙａｎｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，１９９１，３２５：１８４９−１８５７
【非特許文献４】Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．  Ａｇｉｎｇ，１９９２，１３，６２３−６２５
【非特許文献５】Ｙｏｕｎｋｉｎ，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１９９５，３７：２８７−２８８
【非特許文献６】Ｔｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，「アルツハイマー病の認知変化の構造的基礎（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」で、アルツハイマー病（ＡＬＺＨＥＩＭＥＲ’Ｓ  ＤＩＳＥＡＳＥ）、ＮＹ、ラベン出版（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９４、第１１章、１７９−１９６
【非特許文献７】Ｐｅｒｌｍｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，１９９２，３３：５４９−５５８
【非特許文献８】Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．，  １９９５，  ２７：１１９−１３７
【非特許文献９】Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：６０２１−６０３７
【非特許文献１０】Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６５：１３−１８
【非特許文献１１】Ｇｒｕｎｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ４６：４０３
【非特許文献１２】Ｆｌｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４１：１００６−１００９
【非特許文献１３】Ｍａｓｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４４：１４２７−１４３２
【非特許文献１４】Ｔｉｅｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４６：１４９−１５４
【非特許文献１５】Ｈｕｇｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｂｒ．Ｊ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，１４０：５６６−５７２
【非特許文献１６】Ｂｅｒｇ（１９９８）Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｕｌｌ．，２４：６３７−６３９
【非特許文献１７】Ｍｏｒｒｉｓ（１９９３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４３：２４１２−２４１４
【非特許文献１８】Ｒｕｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．，４６：３７９−３８２
【非特許文献１９】Ｍａｓｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．，５１：５８５−５９３
【非特許文献２０】Ａｓａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈ  １４８：３１−３８
【非特許文献２１】Ｅｖｅｒａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５２：５６１−５６６
【非特許文献２２】Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０；１５９３−１５９６
【非特許文献２３】Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：２７６９−２７７３
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【非特許文献２６】Ｖｉｔｏｋｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３２１：１０１５−１０２１
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【非特許文献２９】Ｍａｓｌｌｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５４：３５０−３５７
【非特許文献３０】Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：３１３９−３１５３
【非特許文献３１】Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４５２：４５８−４６７
【非特許文献３２】Ｈａｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７：３５３
【非特許文献３３】Ｍｏｕｒｄｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，１０５：２３３
【非特許文献３４】Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６３，１１７８
【非特許文献３５】Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２９７１９
【発明の開示】
【００１４】
発明の要約
本発明は、個体の神経疾患または認知喪失の危険性を診断する方法の様々な態様を提供する。これは個体の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンを検出することにより行われる。本発明の幾つかの態様では、エンセファロトキシンの検出には、個体の生物学的サンプルをニューロンに、エンセファロトキシンのインアクチベーターの存在下および不存在下の両方で接触させ、そしてエンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのニューロンの生存に関して、エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下でのニューロンの生存を比較することを含む。エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのニューロンの生存の減少は、神経疾患または認知喪失の危険性の指標となる。幾つかの態様では、エンセファロトキシンはエンセファロトキシン  インアクチベーターの存在および不存在下の両方で生物学的サンプル中の光吸収を測定することにより検出され、エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下での吸収の上昇が、該神経疾患または認知喪失の危険性の指標となる。好ましくは光吸収は２３２ナノメーター（ｎｍ）の波長で測定される。
【００１５】
本発明の幾つかの態様では、エンセファロトキシンはＮ−硫酸化およびＯ６−硫酸化を有する少なくとも１つのグルコサミンを有するオリゴ糖であり；ペプチド結合を欠き；そして約２０００ダルトン未満の分子量を有する。好ましくはエンセファロトキシンは４〜８個のサッカリド単位を有する。好ましくはエンセファロトキシンの分子量は、約７００から約１９００ダルトンの間である。
【００１６】
幾つかの態様では、エンセファロトキシン  インアクチベーターはヘパリンリアーゼＩ、亜硝酸、グルコサミン−６−スルファターゼまたはＮ−スルファミニダーゼである。好ましくは亜硝酸溶液は約１．５のｐＨを有する。
【００１７】
本発明の幾つかの態様では、生物学的サンプルは脳脊髄液、脊髄組織または脳組織である。
【００１８】
本発明の方法により診断または監視できる神経疾患には、限定するわけではないがアルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）関連痴呆（ＨＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷および神経−ＡＩＤＳのような神経変性および神経炎症疾患および障害を含む。種々の態様において、本発明の方法はヒト、霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタまたは齧歯類個体の診断または監視に使用することができる。
【００１９】
本発明の幾つかの態様では、ニューロンの生存の比較は、エンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのエンセファロトキシンのＥＤ５０に対して、エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下でのエンセファロトキシンのＥＤ５０を比較することを含んでなり、ここでエンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下でのエンセファロトキシンのＥＤ５０に比べてエンセファロトキシン  インアクチベーターの不存在下でのエンセファロトキシンの低いＥＤ５０は、該神経疾患または認知喪失の危険性の指標となる。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、個体の神経疾患の処置を監視する方法が提供される。幾つかの態様では、監視法には個体の第１および第２の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンのレベルを比較することを含み、第１の生物学的サンプルは第２の生物学的サンプルよりも早い時点で個体から採取され、第２の生物学的サンプルは神経障害の処置後に個体から採取され、そしてエンセファロトキシンレベルは該生物学的サンプルの光吸収により測定され、第２の生物学的サンプルの上昇した吸収は、神経疾患の進行の指標となる。幾つかの態様では、第１の生物学的サンプルが神経疾患の処置（例えば薬剤の投与）後に個体から採取され、取り出され、または抽出される。
【００２１】
本発明のさらなる態様では、個体のエンセファロトキシンレベルの上昇を経時的に検出することを含んでなる、個体の神経疾患の進行を監視する方法が提供され、エンセファロトキシンレベルの上昇の検出は、個体の第２の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンの光吸収に対して、個体の第１の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンの上昇した光吸収を測定することを含んでなり、第２の生物学的サンプルは第１の生物学的サンプル前に患者から採取され、上昇した光吸収は神経疾患の進行の指標となる。
【００２２】
また本発明の態様により提供されるのは、個体のエンセファロトキシンレベルの上昇を経時的に検出することを含んでなる、個体の神経疾患の進行を監視する方法であり、上昇の検出は、個体の第１の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、個体の第２の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、そして第２の生物学的サンプルの存在下で減少したニューロンの生存を検出することを含んでなり、第２の生物学的サンプルは第１の生物学的サンプルよりも後の時点に採取され；そして第２の生物学的サンプルの存在下で減少したニューロンの生存は神経疾患の進行の指標となる。
【００２３】
本発明の幾つかの態様では、生物学的サンプルの１つが該神経疾患の前駆症状期に採取される。
【００２４】
本発明の別の態様では、個体のエンセファロトキシンレベルの上昇を経時的に検出することにより個体の神経疾患の処置を監視する方法、エンセファロトキシンレベルの上昇の検出は、個体の第１の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、個体の第２の生物学的サンプルをニューロンと接触させ、そして第２の生物学的サンプルの存在下で減少したニューロンの生存を検出することを含み、第２の生物学的サンプルは第１の生物学的サンプルよりも後の時点、かつ神経疾患の処置後に採取され；そして減少したニューロンの生存は神経疾患の進行の指標となる。
【００２５】
本明細書に引用する参照の特許、特許出願および科学文献は、参考文献により全部、本明細書に編入する。本明細書で引用した任意の参考文献と本明細書中の具体的教示との間に矛盾がある場合は、後者を選ぶことにより解決されるだろう。同様に、技術的に理解されている用語または句の定義と、本明細書で具体的に教示する用語または句の定義との間に矛盾がある場合も、後者を選ぶことにより解決されるだろう。
【００２６】
本明細書で使用するように、用語「約」は許容範囲内で述べた値の近似を指す。好ましくは範囲は述べた値の＋／−１０％である。
【００２７】
確定的な（ｄｅｆｉｎｉｔｅ）ＡＤは、一致した神経病理学的基準（ＮＩＡ−レーガンワーキンググループ。アルツハイマー病の死後診断に関する一致した推奨（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｓｔｍｏｒｔｅｍ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）。（１９９７）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ，１８：Ｓ１）を使用して剖検で（ａｕｔｏｐｓｙ）診断した。確実な（ｐｒｏｂａｂｌｅ）ＡＤに関する臨床的定義は、一致した推奨（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ）（ＭｃＫｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ３４：９３９）に従い、学習／記憶における平均標準平均値より少なくとも２標準偏差（ＳＤ）落ちる精神測定の能力として定める動作と障害を有し［ウェクスラー記憶検査−ＩＩＩ論理的記録下位検査（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｃａｌｅ−ＩＩＩ  Ｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｕｂｔｅｓｔ）、ホプキンス言語学習検査（Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｖｅｒｂａｌ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｔｅｓｔ）−改定、または簡易な視覚記憶検査（Ｂｒｉｅｆ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔｅｓｔ）−改定］、そして以下の認識領域内の少なくとも１つの検査について、標準平均よりも２ＳＤ下である：注意／情報処理（Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ／Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）［言語維持注意力検査（Ｖｅｒｂａｌ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  Ａｔｔｅｎｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）、記号数字モダリティー検査（Ｓｙｍｂｏｌ  Ｄｉｇｉｔ  Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ  Ｔｅｓｔ）、ウェクスラー成人知能検査−ＩＩＩ数唱範囲（Ｄｉｇｉｔ  Ｓｐａｎ）、トレイルＡ検査（Ｔｒａｉｌｓ  Ａ  Ｔｅｓｔ）およびゆっくりとした聴覚連続足し算（Ｐａｃｅｄ  Ａｕｄｉｔｏｒｙ  Ｓｅｒｉａｌ−Ａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ：ＰＡＳＡＴ）］、見当識（方向質問）、言語［記名および分類の流暢さ（Ｎａｍｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｔｅｇｏｒｙ  Ｆｌｕｅｎｃｙ）、ＦＡＳ検査］、実行機能（Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）［ウィスコンシン  カード分類検査（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃａｒｄ  Ｓｏｒｔ  Ｔｅｓｔ）およびトライアルＢ検査（Ｔｒｉａｌｓ  Ｂ  Ｔｅｓｔ）］。ＭＣＩの個体は、痴呆が無いが、ＡＤに関するものと同じ検査バッテリーを使用して、標準平均値よりも少なくとも１．５ＳＤ低く測定される情報および記憶障害により確認される記憶の病訴を含む健忘の特徴を示す個体である。
【００２８】
ＨＩＶ−１関連認知障害に関する臨床的定義は、他の病因については証拠を示さない個体を使用して、一致した推奨に従った（アメリカ神経学会のワーキンググループであるＡＩＤＳタスクフォース（Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ＡＩＤＳ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ（１９９２）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４１：７７８）。ＨＩＶ−関連痴呆（ＨＡＤ）に関して測定される障害は、１つの領域で標準平均から２．５ＳＤ落ちたか、または任意の以下の検査において少なくとも２つの領域で２ＳＤ落ちた：学習／記憶、言語、注意／情報処理、抽象／問題解決および運動能力［溝のあるペグボート（Ｇｒｏｏｖｅｄ  Ｐｅｇｂｏａｒｄ）］。軽度認知−運動機能不全（ＭＣＭＤ）の個体は、少なくとも２つの認知領域における任意の検査で平均標準値から下に１．５ＳＤ落ちるか、または１つの領域において平均値よりも２．０ＳＤ下であると定める。
【００２９】
本明細書で使用する「認知喪失」またはその変形は、情報処理、注意、学習、情報想起の少なくとも１つの低下、および知的機能の全体的喪失を指す。認知喪失は、例えば注意／情報処理［言語維持注意力検査、記号数字モダリティー検査、ウエクスラー成人知能検査−ＩＩＩ数唱範囲、トレイルＡ試験およびゆっくりとした聴覚連続足し算（ＰＡＳＡＴ）］、見当識（方向質問）、言語［記名および分類の流暢さ、ＦＡＳ試験］、実行機能［ウィスコンシン  カード分類検査およびトライアルＢ検査］、学習／記憶、抽象／問題解決、運動能力［溝のあるペグボード］、およびホプキンス言語検査を含む当該技術分野で知られている任意の方法により測定することができる。認知喪失の危険がある個体は認知の測定可能な喪失はないが、平均群よりも大きな認知喪失の機会を有する。例えばアルツハイマー病の患者の第１親等の親類は、認知喪失の危険性がある。
【００３０】
本明細書で使用する用語「接触」または「接触する」は、化合物を目的分子の物理的近位に直接的または間接的に一緒にすることを意味する。接触することは、例えば任意の数のバッファー、塩、溶液中、または細胞もしくは細胞抽出物中で起こることができる。
【００３１】
用語「ペプチド結合」は、１つのアミノ酸のカルボキシル基と第２のアミノ酸のアミノ基との間の水分子の損失により形成される共有アミド結合を意味する。
【００３２】
用語「サッカリド」または「サッカリド単位」には、酸化され、還元され、または置換されたサッカリドを含む。本発明のサッカリドには限定するわけではないが、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、フルクトース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、リブロース、ソルボース、タガトース、グルコン酸、グルクロン酸、グルカル酸イズロン酸  ラムノース、フコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、シアル酸、Ｎ−硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ）、２−硫酸化イズロン酸（ＩｄｏＡ２Ｓ）、アセタール、アミンおよびリン酸化糖、オリゴサッカリドのようなサッカリドの誘導体、ならびに種々の糖の開放鎖形等を含む。「オリゴ糖」は、２以上のサッカリド単位を有する分子を指す。
【００３３】
本発明の神経毒の状態を説明するために使用する時、用語「精製した」は、他の細胞物質を実質的に含まない神経毒を指す。「実質的に含まない」とは、少なくとも約６０％または約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％または約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％、約９８％または約１００％、他の細胞物質を含まないことを指す。
【００３４】
神経変性または神経炎症疾患の病状の前徴症状期は、本明細書では認知、行動または社会的障害の臨床的発現が、ＭＣＩ（記憶試験を用いた健忘的特徴が、標準平均よりも１．５ＳＤ低い）またはＡＤ（記憶および認知領域の少なくとももう１つで標準平均よりも２ＳＤ低い）に関して、診断閾値には未だ達していない間の疾患の段階と定める。この定義により、前徴症状期は例えば、臨床的に定めた認知障害、非痴呆（ＣＩＮＤ）群を包含する（Ｔｏｕｋｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ．Ｐｓｙｃｈｏｇｅｒｉａｔｒ．，Ｓｕｐｐ．１：１８３−２０２）、Ｈｏｍにより説明される危険な無症候群（（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１６：５６８−５７６）、年齢に関連する記憶障害（ＡＡＭＩ、Ｇｏｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｌｚ．Ｄｉｓ．Ａｓｓｏｃ．Ｄｉｓ．，１５：７２−７９）、Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ実験の無症状コホート（Ｅｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５７：８０８−８１３）または剖検で同定された確定無症状ＡＤ群（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．５８：１３９５−１４０２）を包含する。一般に、これらすべての群は年齢、教育および民族について調整された標準平均スコアよりも約１ＳＤ低い記憶検査値（言葉、エピソード記憶）を示す。全体として、ＡＤの危険にある群は、標準化された記憶検査評価試験から毎年約０．３〜０．６ＳＤの速度で長期的な低下を示した。
【００３５】
本発明により取り組んだ神経変性疾患に関与するシグナルカスケードは、（１）単核食細胞の活性化；（２）エンセファロトキシンの単核食細胞放出；および（３）エンセファロトキシンがニューロンに及ぼす毒性効果を含む出来事を含んでなる。単核食細胞のアクチベーターにより誘導される単核食細胞の神経毒性は、神経毒インヒビターまたはインアクチベーターと本明細書で呼ぶ作用物質により阻害または不活性化され得る。
【００３６】
単核食細胞は、１つの核、および食作用としても知られている粒子を飲み込む能力を有する免疫細胞である。単核食細胞は血液および中枢神経系および脳を含む体組織に見い出され、そして例えば小膠細胞、単球、マクロファージ、組織球、樹状細胞、小膠細胞の前駆体、単核細胞の前駆体、マクロファージの前駆体、小膠細胞様細胞系、マクロファージ様細胞系、または単核食細胞の上記定義に従い活性である小膠細胞様の表面分子を発現するように改変された細胞系を含む。本発明に従い定義されるニューロンには、ニューロンおよびニューロン様細胞を含み、これはニューロンが典型的な通常の、非疾患状態の条件下で神経活性を表すＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体を発現するように改変された細胞である。
【００３７】
単核食細胞の活性化は、神経毒の放出を引き起こすプロセスを開始する。また単核食細胞の活性化は、本明細書では免疫活性化も指し、そのマーカーは単核食細胞をさらに活動的とする任意のプロセスであり、そして限定するわけではないが増加する運動、食作用、形態学における改変、および例えば補体、スカベンジャー、Ａβを含む膜に付随するタンパク質および血液細胞抗原、組織適合性抗原のような分子の生合成、発現、生産または分泌のような活性を特徴とする。分子の生産には、一酸化窒素シンテターゼ、スーパーオキシド  ジスムターゼのような生物活性剤の生合性に関与する酵素、エイコサノイド、サイトカイン、フリーラジカルおよび一酸化窒素のような低分子を含む。因子の放出にはプロテアーゼ、アポリポタンパク質Ｅのようなアポリポタンパク質およびインターロイキン−１のようなサイトカイン、腫瘍壊死因子ならびにエンセファロトキシンおよび過酸化水素のような他の分子を含む。
【００３８】
単核食細胞の神経毒性またはニューロン毒性とは、ニューロンの損傷、破壊または死を導くプロセスを指し、これは生化学的または組織学的方法により測定される代謝機能の損失、細胞内物質の放出、不浸透性色素の浸透（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｅｒｍｅａｎｔ  ｄｙｅｓ）、細胞数の減少により測定される。例えばニューロフィラメントまたはシナプトフィシンの損失のような生化学的マーカーの変化、あるいは乳酸デヒドロゲナーゼの放出、あるいは蛍光核色素およびトリパンブルーを含む不浸透性色素の浸透のような細胞損傷の他の証拠。細胞の損傷、破壊または死のこれらのおよび他の同定法、またはニューロン機能の測定法は、当業者には知られており、そして本発明で意図するものである。
【００３９】
本明細書では神経毒は、ニューロンを損傷し、破壊し、または殺すが、例えば膠のような中枢神経系細胞には寛容である物質と定める。神経毒は、ニューロン機能および生存を破壊するような様式でニューロンと相互作用する。またニューロンに及ぼす神経毒の可能な作用を本明細書では神経傷害とも呼ぶが、これにはグルコース代謝、ＡＴＰの生産およびＮａ＋、Ｃａ２＋およびＫ＋イオンチャンネルを含む細胞膜をわたるイオン勾配の維持、タンパク質および核酸の合成、およびミトコンドリア呼吸および細胞死を含め、正常な細胞代謝の阻害または破壊を含む。
【００４０】
本明細書で使用するエンセファロトキシンは、低分子量（＜２０００ダルトン）、熱安定性、プロテアーゼに対する耐性を有する神経毒の１種を指し、そして亜硝酸、Ｎ−スルファミダーゼ、グルコサミン−６−スルファターゼおよびヘパリンリアーゼＩに対する暴露で活性を失う。エンセファロトキシンは少なくとも１つのＧｌｃＮＳ残基を含んでなる。エンセファロトキシンは好ましくは約７００から１，９００ダルトンの間の分子量を有する。エンセファロトキシンは好ましくは４〜８個のサッカリド残基を有する。
【００４１】
エンセファロトキシン  インアクチベーターまたはインヒビターは、活性化単核食細胞から放出される神経毒を不活性化するか、または神経毒の効果を阻害する作用物質である。本発明の目的に関して、阻害する、阻害、不活性化する、不活性化およびそれらの変形は、減少する、抑制する、遅らせる、ゆっくりさせる、および中止すると類似語的に使用する。また不活性化また阻害は、カスケードが静止し、停止し、または遮断されるような神経毒カスケードの完全な阻害を指す。エンセファロトキシンの不活性化には、約１０％、２０％、５０％、より好ましくは約８０％、９０％または９５％、そして最も好ましくは約９８％、９９％または１００％まで神経毒性活性の減少を含む。例としてエンセファロトキシンに対する暴露で傷害の危険性にあるニューロンが、エンセファロトキシンおよび化合物の存在下で傷害を受けないような、エンセファロトキシンの神経毒活性を減少するか、またはニューロンの生存を上昇させるならば、化合物はエンセファロトキシンインアクチベーターである。好ましくは危険にあるニューロンの約１０％、２０％または５０％より多くが、エンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下でエンセファロトキシンにより傷害されない。さらに好ましくは危険にあるニューロンの約８０％、９０％または９５％、そして最も好ましくは約９８％、９９％または１００％がエンセファロトキシン  インアクチベーターの存在下でエンセファロトキシンにより傷害されない。好ましくは本発明のエンセファロトキシン  インアクチベーターには、ヘパリン  リアーゼＩ、Ｎ−スルファミニダーゼ、グルコサミン−６−スルファターゼおよび亜硝酸を含む。亜硝酸は好ましくは約１．５のｐＨを有する。より好ましくは亜硝酸に対する暴露は室温で起こる。
【００４２】
単核食細胞およびアクチベーターの有効な量は、それぞれがカスケードで反応（ｅｖｅｖｔ）を正常に生じる量であるが、エンセファロトキシン  インアクチベーターの添加についてはそうではない。有効な量は本開示の観点から当業者には知られ、そして単核食細胞、ニューロン、アクチベーターまたは成分の使用、および細胞の哺乳動物起源に依存して変動するだろう。
【００４３】
本発明のインビトロ神経毒性アッセイは、エンセファロトキシンの存在およびその不活性化を検出し、そしてＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体を発現するように変更されたニューロンまたはニューロン様細胞系のカルチャーを使用する。神経毒活性の存在、またはニューロン機能の尺度もしくはニューロンの生存の測定は、細胞数の減少、細胞の代謝機能のような生化学マーカーの変化、細胞内物質の放出、限定するわけではないが蛍光核色素およびトリパンブルーのような不浸透性色素の浸透、ニューロフィラメントもしくはシナプトフィシンの損失、乳酸デヒドロゲナーゼの放出、または細胞損傷の他の証拠により測定される。ニューロン機能を測定する他の方法には、グルコース代謝、ＡＴＰ生産、膜をわたるイオン勾配の維持、およびタンパク質合成、核酸合成、およびミトコンドリア呼吸の破壊を含む正常な細胞の代謝の阻害を検出することを含む。試験生化学的サンプルによるニューロンに対する炎症マーカーまたは損傷の減少を、対照と比較することができる。細胞の損傷として示すことができる、細胞の神経毒性を同定し、またはニューロン機能を測定するための、これらのおよび他の方法は、当業者に知られており、そして本発明で意図するものである。
【００４４】
本発明のアッセイシステムを使用して、神経疾患の初期、例えば前徴または前駆症状の段階と個体を診断することが可能である。さらに本発明の方法を使用して、個体の生物学的サンプル中のエンセファロトキシンを検出することにより、認知喪失の危険性がある個体もしくは集団を同定することが可能である。また本発明の方法は、個体のエンセファロトキシンレベルの上昇を経時的に検出することにより、神経疾患の進行を監視することも可能とする。本発明の方法に従い診断される患者または個体には、限定するわけではないがヒトのような哺乳動物、限定するわけではないがサル、チンパンジーおよび類人猿のような霊長類、限定するわけではないがラットおよびマウス、モルモットのような齧歯類、イヌ、ネコ、ウサギおよびブタを含む。本発明の方法に従う生物学的サンプルには、脳または脊髄組織のような中枢神経系組織、または脳脊髄液（ＣＳＦ）を含む。本発明に従い同定または監視される神経疾患には、限定するわけではないがアルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ＨＩＶ−１関連痴呆（ＨＡＤ）、軽度認知障害、プリオン疾患、軽度認知／運動機能不全、急性脳卒中、急性外傷、神経−ＡＩＤＳおよび免疫が媒介する脳の炎症のような神経変性性および神経炎症性疾患を含む。
【００４５】
本発明の方法は、患者の生物学的サンプルの神経毒アッセイを含み、これは個体の神経疾患もしくは傷害または認知喪失の危険性を診断するために使用することができる。また本発明の方法は、個体の年齢、家族歴、初期症状または他の危険因子の観点から、神経疾患または障害を発症する危険がある個体を同定するための初期検出法として使用することができる。例えば血液、脊髄組織、脳脊髄液または脳組織のような生化学的サンプルを患者から採取し、そして本明細書に記載するように本発明のエンセファロトキシンインアクチベーターを用いて評価して、患者のエンセファロトキシンの存在を同定するか、または神経疾患に罹患する可能性がある患者を同定することができる。患者のサンプルを対照と比較し、神経毒の上昇したレベルが存在するかどうかを決定することができる。
【００４６】
同様に本発明の方法は、本発明の神経毒インアクチベーターを使用して処置の前、および処置を通して患者の全身に存在する神経毒の量を測定することにより、患者の処置または疾患の進行の速度を監視する。またこの方法は、神経毒レベルを監視して薬剤用量の調整を可能とするためにも使用することができる。
【００４７】
例えば本発明は、患者の生物学的サンプルをヘパリンリアーゼＩ、Ｎ−スルファミニダーゼ、グルコサミン−６−スルファターゼまたは亜硝酸のようなエンセファロトキシン  インアクチベーターと接触させることにより、患者のエンセファロトキシンの存在およびレベルをアッセイする方法を提供する。その後、インアクチベーターの存在下での阻害の量を測定した対照と比較する。対照と比べてエンセファロトキシンレベルが上昇した時、個体中にエンセファロトキシンの上昇が存在する。
【００４８】
本発明は神経変性疾患または認知喪失の危険性を早期検出するための方法を提供し、これにより疾患の進行に早い介入を可能とする。以下の実施例は具体的説明のみであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４９】
エンセファロトキシンの精製
エンセファロトキシンは、ＨＰＬＣシービング（ｓｉｅｖｉｎｇ）クロマトグラフィー（ペンシルバニア州、モンゴメリーヴィレのトーソーバイオサイエンス（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）からのＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ２５００ＰＷＸＬカラム；７．８×３００ｍｍ）により２Ｍ  ＮａＣｌで溶出して；アニオン交換ＨＰＬＣ（カリフォルニア州、サニーヴァレのディオネックス社（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐ）からの直列ＰｒｏＰａｃＰＡ１カラム４×２５０ｍｍ）により２Ｍ  ＮａＣｌの直線勾配を１８０分間にわたり用いて；あるいは製造元のプロトコールを使用して吸着クロマトグラフィー（Ｏａｓｉｓ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ））により脳脊髄液から単離した。
エンセファロトキシンの構造的特徴決定および不活性化
エンセファロトキシン（Ａβ刺激化小膠細胞系ＢＶ２から有機抽出、ゲル濾過および順次のＣ１８ＨＰＬＣにより単離）の構造的特徴決定および不活性化は、種々の亜硝酸分解プロトコールにより行った。神経毒活性は、ｐＨ１．５の亜硝酸処理により排除したが、ｐＨ４．０での他の酸処理またはヒドラジン分解では排除されなかった（図１）。この結果は、エンセファロトキシンの内部構造が少なくとも１つのＧｌｃＮＳ残基を含むことを示した。エンセファロトキシンの化学構造は、ヘパリンまたは硫酸ヘパラン（ＨＳ）ポリマーを攻撃する高度に選択的な酵素を用いた処理によりさらに調査した。従来よりヘパリンリアーゼＩは主にヘパリン含有ＧｌｃＮＳ（１→４）ＩｄｏＡ２Ｓ配列に作用し、そしてＨＳ上のヘパリンリアーゼＩＩＩは主にＧｌｃＮＡ（１→４）ＩｄｏＡまたはＧｌｃＮＡｃ（１→４）ＧｌｃＡ配列に作用する。（一般に、これらの酵素は少なくとも４個の残基のオリゴマーを必要とする。）最後に、エンセファロトキシンは、２、３または６位のＯ−硫酸化部位（ＨＳおよびヘパリンで見いだされる）に高度に選択的なスルファターゼ、ならびにＮ−硫酸化部位を分解するＮ−スルファミニダーゼで処理した（図１）。ヘパリンリアーゼＩＩＩではなくヘパリンリアーゼＩ［ＧｌｃＮＳ（１→４）ＩｄｏＡ２Ｓ］は、Ｏ−６ＳおよびＧｌｃＮＳから基を除去するスルファターゼのようにエンセファロトキシンを不活性化した。さらに末端アミンを修飾するための化学的方法（アセチル化、ＰＦＰＡ修飾等）は、非置換ＧｌｃＮ残基のような末端アミンの存在を示唆する。したがってエンセファロトキシンは、ＧｌｃＮＳ、ＩｄｏＡ２Ｓ、ＧｌｃＮ残基にＯ−結合硫酸化を６位に含む少なくとも４残基のヘパリン様オリゴ糖を含む。
【００５０】
神経毒の分子量は、３００から３０００ダルトンの直線ふるい範囲（ｌｉｎｅａｒ  ｓｉｅｖｉｎｇ  ｒａｎｇｅ）を有するＴＳＫ−ＧＷ２５００ＰＸＬを使用して見積もった。市販されているヘパランオリゴマーを標準として使用した。確実なＡＤに由来するＣＳＦサンプル（１００ｕｌ）は、約７００から１９００ダルトンのサイズの低い分子量範囲を有する神経毒活性の弱いピークおよび主要ピークを示した。これらの予想される分子量は、約４〜８残基長のオリゴ糖を示唆した（図２）。
神経毒バイオアッセイ
ラットの海馬から調製した培養したニューロンを、毒性試験に使用した。これらのカルチャーは小膠細胞（５〜１０％）が混ざった大膠細胞（＞７０％）床の上にプロセスが生成した（ｐｒｏｃｅｓｓ−ｂｅａｒｉｎｇ）ニューロン（全細胞群の１０〜２０％）から成る。小膠細胞を排除するために、カルチャーは１０μｇ／ｍｌのアセチル化ＬＤＬに１８時間結合したサポリンに暴露した。７２時間の終わりに、カルチャーを３％パラホルムアルデヒドで室温にて１２時間固定し、そして抗−ニューロフィラメント抗体（ＳＭＩ−３１１、１：１５０；ＲＴ−９７、１：１５０；スターンバーガーモノクローナル社（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ，Ｉｎｃ．；）に抗−ＭＡＰ−２（１：２００；ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１８４９５９；）を加えた混合物と、４℃で２％のウマ血清および０．３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下で一晩インキュベーションすることにより免疫染色して、ニューロン細胞体と神経突起とを線引きした。場あたりの免疫標識した細胞は蛍光顕微鏡を２００Ｘの倍率で使用して数えた。殺ニューロンは、それぞれ３枚カバースリップに関して、少なくとも８つの無作為に選択した場を数えた後、平行の未処理対照カルチャーで発現した％平均生存として表した。
【００５１】
１ｍｌのＣＳＦは吸着クロマトグラフィーにより分画し、真空下で乾燥させ、そしてＮａＣｌのような電解質およびグルコースを含んでなる人工ＣＳＦに再構成した。分画した毒素の量を増して（元のサンプル容量の０．１〜５００ｕｌの等量範囲）、３連のカルチャーに加えた。結果は容量対％殺ニューロンとしてプロットした（殺しは、未処理対照カルチャーに対して、免疫染色された海馬ニューロンの損失％として算出した）。例えばヘパリンリアーゼＩ、Ｎ−スルファミニダーゼ、グルコサミン−６−スルファターゼまたは亜硝酸処理による不活性化は、試験した各ＣＳＦサンプルに関するエンセファロトキシンの存在を確認するために使用した。図３に示すように、ＡＤに関する高レベルの毒素（左にシフトした曲線）、ＭＣＩに関する中間レべル（右にシフトした曲線）、および毒素無し（平らな線）のプロファイルを、疾患対照から採取したサンプルについて特記した。異なる群を比較するために、ＣＳＦ神経毒性指数を開発して、神経毒のレベルを反映するスコアを割り当てた。この指数はＥＤ５０として算出した（殺ニューロンの最大レベルの５０％を生じる同等のＣＳＦ容量）。この測定を使用して、高い神経毒レベルは低い指数スコアを有し；例えば高いトキシン濃度は約１の低い指数スコア、約５〜１００で中間レベル、そして正常な年配の人は１０００の値を示す。
エンセファロトキシンの化学アッセイ
エンセファロトキシンを検出するためのアニオン−交換ＨＰＬＣ条件を確立した（０．０−０．７ｍ  ＮａＣｌ勾配；ＰｒｏＰＡＫ  ＰＡ−１カラム；２３２ｎｍ  ＵＶモニタリング）。小膠細胞系ＢＶ２はヒトＡβ１−４２に４８時間暴露し、そしてコンディショニングした培地を吸着クロマトグラフィーにより分画した。２３２ｎｍで検出した３つのピークに対応する３つの生物学的に活性なピーク（ピーク３８、４８および５３）を回収した（図４Ａ）。３つすべてのピークが亜硝酸ｐＨ１．５およびヘパリンリアーゼＩに感受性であった（データは示さず）。重要なことは、これらいずれのピークも非刺激ＢＶ２細胞の対照カルチャーからは回収されなかった（図４Ｂ）。
神経変性疾患のＣＳＦバイオマーカーとしてのエンセファロトキシン
急な剖検例に由来する脳室ＣＳＦを使用して、エンセファロトキシンはＡＤ症例（病理学的に確認）に由来するすべてのＣＳＦに高濃度で存在するが、年齢が合った正常またはＡＬＳの例には存在しないことが測定された（図５）。重要なことは、確実なＡＤと臨床診断された個体から採取した腰椎のＣＳＦも、０．１から５μｌの間のＥＤ５０として測定された大変高いエンセファロトキシン濃度を有する顕著なパターンを示したことであった。
【００５２】
調査プロトコールを確立して、認知障害がある年配の個体からだけでなく、我々の病院の神経学者により見られる他の群に由来するサンプルも評価した。後者の群は種々の診断カテゴリーからなり、最大の群は頭痛の異型（ｈｅａｄａｃｈｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ）、多発性硬化症または非ＡＤ痴呆（血管型、外傷型）に罹患していた。［これら後者の群に関する神経毒アッセイは、別の臨床的徴候について得たＣＳＦの残りのアリコートについて、個体の同意を得て行った。］このような離れた個体から得たデータは、確実なＡＤであるすべての患者が、等量ＣＳＦ容量について０．５から１５μｌの範囲のＥＤ５０を有する高レベルの神経毒を有することを示す（より低いＥＤ５０容量は、より高い毒素濃度を示すことに注意されたい）；ＭＣＩの年配の個体は５０から２００μｌの間のＥＤ５０を有した。等級に関するノンパラメトリックのクラスカル−ウォリスの１元ＡＮＯＶＡは、神経毒レベルが試験した疾患群で有意に異なる（ＥＤ５０により測定した時）ことを示した（確実なＡＤ、ＭＣＩ、非ＡＤ痴呆、頭痛およびＭＳ；Ｐ＝０．０００００１） 。クラスカル−ウォリスの多重比較試験は、ＡＤおよびＭＣＩの両方の神経毒レベルがＭＳ、頭痛または非ＡＤ痴呆で見いだされるレベルよりも有意に大きいことを示した（すべての比較についてｐ＜０．０２）。
【００５３】
全体としてこれらの考察は、幾つかの重要な傾向を明らかにした。第１に、確実なＡＤの患者は最高の毒素濃度を有し、ＡＤ解剖例に由来する脳室ＣＳＦに類似する狭い範囲内に落ちた。第２に、非炎症性メカニズムに続く重篤な認知障害または痴呆は（血管型、外傷型）、ＣＳＦ中に検出可能な量のエンセファロトキシンを示さなかった。［神経毒は脳卒中または外傷後に急に傷害を受けた組織に見いだすことができるが、これらの神経毒レベルは急性の炎症応答が消えれば消える（約３〜７日の損傷後；Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２７：３３−４２；Ｇｉｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｓｔｒｏｋｅ，２４：８４−９３；Ｇｉｕｌｉａｎ，（１９９３）Ｇｌｉａ，７：１０２−１１０）］。そして第３に、ＭＣＩ個体は有意な量のエンセファロトキシンを示す傾向があるようだが、それはＡＤ  ＣＳＦに見られる全毒性活性のわずか１／１０〜１／１００ほどであった（図５）。
【００５４】
エンセファロトキシンに関係するオリゴ糖がヒトＣＳＦにも見いだされるのかどうかを決定するために、エンセファロトキシンを吸着クロマトグラフィーによりＣＳＦから単離し、そして小膠細胞培養基に使用したものと同じヘパリンリアーゼ、亜硝酸処理、そしてスルファターゼで処理した。ＡＤ例に由来する脳室ＣＳＦおよび確実なＡＤ個体に由来する腰椎ＣＳＦは、同じ不活性化プロファイルを示し（図１）、ヒト疾患中のエンセファロトキシンがヘパリン様オリゴマーを含むことを示した。そのような神経毒性オリゴ糖の存在の確認は、アニオン交換ＨＰＬＣから生じ、小膠細胞エンセファロトキシン画分から回収された神経毒性ピーク３８の存在を示した。アニオン交換プロファイルによる、ＡＤおよびＭＣＩに由来するＣＳＦサンプル間に類似性があり（ピーク３８および４８）、小膠細胞カルチャーで記録されるように（図４）、さらにＭＣＩ群にはピーク５３があった（図６）。
【００５５】
確定的なＡＤ例の脳室の脳脊髄液に関するＨＰＬＣプロファイルは、確定的なＡＤの有志（図７Ｂ）、およびＨＡＤの有志（図７Ｃ）に由来する腰椎液サンプルとほぼ同一であった。ヘパリンリアーゼＩおよびＮ−スルファミニダーゼによる酵素的処理は、これらすべての神経毒性ピークを排除した。アニオン交換ＨＰＬＣにより回収された殺ニューロン活性は、、ヘパリンリアーゼＩＩ（図７Ｂ）、プロテアーゼまたはヘパリンリアーゼＩＩＩ処置（データは示さず）に対して感受性が無かった。
【００５６】
神経学的障害における神経毒生産の広がりを調査するために、種々の疾患群に由来する個体の脳精髄液を調査した。ＣＳＦ神経毒性指数スコアとして表される神経毒濃度［標準化されたラットの海馬カルチャーアッセイにおいて、総ニューロン殺効果の５０％を達成するＣＳＦの等容量として表す］は、確定的なＡＤの患者のみ（死後の診断；ｎ＝７）またはＨＩＶ−１感染（ｎ＝５２）が、ＣＳＦ神経毒の検出可能なレベルを有したことを示す（図８Ａ）。多発性硬化症（ＭＳ；ｎ＝２０）、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ｎ＝８）またはニューロパシー（ｎ＝１４）のような慢性の反応性免疫応答を誘導することができる神経障害は、ＣＳＦ神経毒が無かった。同様に精神的な病気（ｎ＝５）、頭痛（ｎ＝６）または種々の他の神経疾患（ｎ＝２１；真菌の髄膜炎および神経梅毒を含む）を有する個体には、検出できる神経毒が無い。最後に日常的に脊髄撮影を行っている有志（ｎ＝２０）に由来するＣＳＦサンプルは、神経毒活性を含まなかった。
【００５７】
確定的ＡＤの症例におけるＣＳＦに関する神経毒指数値は１から１０の範囲であったが、ＨＩＶ（＋）群に関してはさらに広い分布が見られた（０．１〜１０００）。ＨＩＶ−１（＋）コホートに関して神経毒の広い分布を調査するために、徹底的な医学的、神経学的および神経精神学的評価を受けたＨＩＶ−１（＋）有志に由来する７つの暗号化された（ｃｏｄｅｄ）腰椎ＣＳＦサンプルを、国立神経−ＡＩＤＳ組織協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏ−ＡＩＤＳ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）のテキサス支部を通して得た（Ｍｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，２７：３２６−３３５）。神経毒は認知機能不全（ｎ＝４）の個体で検出されるが、正常な認知を有する患者には検出されない（ｎ＝３；フィッシャーの精密試験（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  Ｅｘａｃｔ  Ｔｅｓｔ）、ｐ＝０．０２８）。低いＣＳＦ神経毒指数スコアは、ＨＡＤのＨＩＶ（＋）個体で検出された（０．１〜４．０の範囲）；高い指数スコアは、認知障害がほとんど無いか、または無いＨＩＶ（＋）個体で検出された（すべて＞２００）；そして中程度の指数スコアは、軽度の認知−運動障害と同定されたＨＩＶ（＋）個体に関連した（１．０〜２１．０）（ＭＣＭＤ：アメリカ神経生物学学会のワーキンググループ、ＡＩＤＳタスクフォース（１９９２）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４１：７７８；図８Ｂ）。指数値に関するＭＣＭＤ（中央値７．３；平均＋／−ＳＥ、９．０＋／−２．７；ｎ＝８）とＨＡＤ（０．１中央値；０．８＋／−０．３；ｎ＝１４）との間の有意差は、高い信頼レベルを示す（ｐ＝０．０００１；クラスカル  ウォリス）。ＭＣＭＤ群を含むＨＩＶ−１（＋）個体と、認知障害が無い個体（中央値１０００．０；平均９００＋／−９９．７μｌ；ｎ＝８）との間の分離も有意である（ｐ＝０．００１）。ＣＮＳに対するＨＩＶ損傷の程度はＣＳＦ神経毒のレベルを反映し、認知障害、脳の病理段階およびニューロン毒素の生産との間の原因となる関連を意味している。
【００５８】
神経毒レベルが加齢群における認知低下も反映するのかどうかを決定するために、ＣＳＦを健忘型の軽度認知障害がある年配の有志から得た（ＭＣＩ；客観的な記憶欠失、しかし痴呆ではない：Ｂｉｓｃｈｋｏｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｃｔａ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．Ｓｃａｎｄ，１０６：４０３−４１４；ｎ＝６）、障害のある記憶の状態はＡＤの初期段階を反映すると考えられた（Ｄｅｋｏｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０２：８３０）。対照として役立つ年配の有志（＞７０歳であり、記憶病訴が無い；ｎ＝８）に対するＭＣＩ患者の比較は、群間に顕著な差異を示した（図８Ｃ）。ＭＣＩに関する神経毒指数スコアは約７〜２０の範囲であり（中央値１０．０；平均１１．５＋／−１．６；ｎ＝６）、そして年配の対照について測定された値はより意に低い（すべて＞１０００；ｎ＝８；クラスカル  ウォリス：ｐ＝０．０００５）。確実な定ＡＤ（臨床基準により定められた）の有志に関する指数スコアは、０．１〜１０（中央値１．７、平均３．０＋／−０．８；ｎ＝２１）の値の範囲を示す。確実なＡＤおよびＭＣＩ値も有意に異なり（ｐ＝０．０１１１；クラスカル  ウォリス）、ＣＳＦエンセファロトキシンのレベルと、認知機能不全の元にある脳の病理段階との間の関連性をさらに証明する。重要であるのは、外傷、アルコール依存症または血管損傷から派生するような、慢性の脳の炎症が無い他の痴呆形態は、検出可能なＣＳＦ神経毒がほとんど無いか、または無い（中央値１０００；平均９３３：０＋／−６６．６；ｎ＝１２）。これらの考察は、確定的ＡＤ（図８Ａ）および血管型痴呆（図８Ａ）の剖検で確認された症例で見い出されるＣＳＦエンセファロトキシン値と一致する。
【００５９】
ＣＳＦ神経毒濃度に従い群を分類するために、判別式分析をＨＩＶ（＋）個体に関する３つの診断カテゴリーおよび年配者に関する３つの診断カテゴリーに適用した。表１から分かるように、ＣＳＦ神経毒指数は、ＭＣＭＤ（１−１００）またはＨＡＤ（＜１）の群の中からどのＨＩＶ（＋）有志が認知における障害がほとんど無いか、または無いかを正確に予測する（カット−オフ＞１００）。同様に指数はＭＣＩまたはＡＤの年配者から非アルツハイマーの痴呆（カット−オフ＞１００）の個体を正しく分離する。また１００より大きいカット−オフ値は、記憶の病訴が無い年配者を１００％の精度で予測する。
【００６０】
【表１】
2007524353.tif 000003
【００６１】
疾患病状の進行に関するバイオマーカーとしてのＣＳＦエンセファロトキシン
１６４名の個体に由来するデータは、ＡＤ患者のすべてがＣＳＦ中に高レベルの神経毒を有し、等量のＣＳＦ容量について０．５〜１５μｌの範囲のＥＤ５０であることを示した。軽度の認知障害の年配の個体は、５０から２００μｌの間のレベルを有した。神経変性疾患を含む種々の他の神経障害がある個体には、検出可能な毒性がなく（ＥＤ５０＞１０００μｌ）；血管および外傷後の非ＡＤ型痴呆にも毒性活性が無かった。ＨＩＶ−１（＋）個体は、広範囲の毒素濃度を示した（０．６μｌから１０００μｌより高い範囲のＥＤ５０）。
【００６２】
４０名のＨＩＶ−１（＋）個体に由来するＣＳＦを調査した。毒性のレベルは認知障害の程度と関連した。例えば正常な認知のＨＩＶ−１（＋）個体はＥＤ５０＞１０００μｌを示したが、中程度から重度の認知欠失の個体は、確定した痴呆のＡＤ個体に見いだされる範囲に類似する０．６〜５μｌの神経毒レベルを生産した。軽度から中程度の認知障害のＨＩＶ−１（＋）個体は、１０〜３００μｌの範囲のＥＤ５０を有するＣＳＦ神経毒のレベルを中間に有した。
【００６３】
種々の診断群における神経毒指数を測定し、そして確定的ＡＤ（ｎ＝７；死後に得た脳室ＣＳＦを使用した神経病理学的診断により定めた）と比較した。図８Ａに示すように、ＡＤと測定可能な毒素を欠く他の診断カテゴリーとの間に顕著な差異があり（１０００の指数スコア）、これは広い群にわたる神経毒性指数の値を証明する。さらに図９に示すように、ＣＳＦのエンセファロトキシンレベルは、ＭＣＩ（解剖的特徴）または確実なＡＤ群（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ診断基準を使用して）と比べた時、記憶の病訴が無い年配、または非ＡＤ型痴呆（血管型、外傷後型、神経梅毒型）の間で明らかに異なる。判別式分析（表１Ｂ）は、ＡＤについて４未満、そしてＭＣＩについて４〜１００のカット−オフ神経毒性指数値を確立し、他の群に対するＭＣＩまたは確実なＡＤに関する毒の等級に基づき、診断を正しく振り分ける能力を提供する。元の病理学的プロセスは、個体が前兆段階から軽度障害へ移行すると進行し（ＭＣＩでは、標準化記憶試験の標準より下に１．５ＳＤ落ちる）、次いで痴呆がより進んだ段階へ移行する（ＡＤでは、記憶および少なくとも１つの他の領域で、標準より下に２ＳＤ落ちる）。有意な記憶喪失前の疾患の初期段階（ＭＣＩの診断前の段階）には、ＣＳＦエンセファロトキシンの存在により検出可能なニューロン傷害免疫カスケードが関与する。この無症状の段階は、ＡＤ病理の前駆症状期である。
【００６４】
トキシンレベルと疾患の進行の臨床的発現との間の相関が解明された。ＣＳＦのエンセファロトキシンを有するＭＣＩおよび軽度ＡＤ個体（ＭＭＳＥ＞２０；ＣＤＲ＜１）は、詳細な神経−認知バッテリーにかけられた。単純な線形回帰分析を行って、主要な認知領域を表す標準化された試験組からＴスコアを用いて神経毒性指数の値を比較した。（ＴスコアはＳＤとして１０を用いて５０に標準化された；生のスコアは年齢、性別、民族および教育レベルについて調整する）。表２に示すように、より高い有意な相関が指数スコアと異常な記憶との間に存在し；すなわち、より高濃度の毒素が、より大きな記憶欠損の個体に見いだされるが、他の認知領域（抽象、言語、処理スピード）には見いだされない。
【００６５】
【表２】
2007524353.tif 000004
【００６６】
表３は、ＨＩＶ−１（＋）有志（ｎ＝３３）での特異的認知検査に関するＣＳＦ神経毒指数値およびＴスコアを比較する。信頼レベルは直線回帰分析に基づき、そして注意／情報処理および学習／記憶の領域での認知欠損は、ＣＳＦのエンセファロトキシン量に緊密に相関するが、言語および運動機能には相関しないことを示す。分析に先立ち、神経毒性指数はデータがおよその正規分布になるように対数変換された。
【００６７】
【表３】
2007524353.tif 000005
【００６８】
【表４】
2007524353.tif 000006
【００６９】
小膠細胞の抑制剤がＣＳＦのエンセファロトキシンレベルに及ぼす効果の調査
薬剤処置および疾患の進行を監視するためのバイオマーカーとしてのエンセファロトキシンの使用は、６週間の二重盲検無作為化試験で調査し、ＣＳＦ中のエンセファロトキシンレベルの変化として１次終点を用いてプラセボに対する幾つかの薬剤を比較した。群の割り当てを隠したにもかかわらず、図１０の代表的データにより示されるような顕著なパターンが同定された。暗号化された薬剤を受けた幾人かの個体が、約１０倍まで毒性レベルの減少を示したが、そのような減少は個体を正常な年配者で見られる指数スコアの範囲にシフトさせなかった（すなわち、指数スコアは１００のＭＣＩカット−オフ値未満に留まった）。これらのデータは、この試験に使用した活性薬剤のいずれも完全な神経保護を提供するために十分に投与されなかったことを示唆した。有意に異常なエンセファロトキシン濃度の持続は、単一の薬剤試験ではＡＤの臨床経過を改変させないようである。
【００７０】
２次的な終点を使用して、培養した血液の単核細胞にＡβが誘導する毒性を薬剤処置が減少させる能力を評価した。動物実験では、血液の単核食細胞がＡβに対する脳の小膠細胞の応答を反映することが分かった。したがって薬剤処置前に、登録した個体でベースラインの毒性基準を有する血液の単核細胞のカルチャーにおける薬剤応答を、実体を隠した単一薬剤試験に登録した後に調査した。Ａβが誘導する毒性の基準を有する７６の単核細胞サンプルの実験は、以下を示した：
１）場合により単一薬剤（実体を隠した）は、血液単核細胞のＡβ活性化を完全に抑制する；
２）血液の単核細胞を抑制する単一薬剤は、ＣＳＦのエンセファロトキシンレベルの部分的阻害のみを示す；
３）薬剤抑制の証拠が無い個体に由来する血液単核細胞を使用したｅｘ  ｖｉｖｏ実験は、１／１０用量でＤＡＰ／ＨＣＱの組み合わせに対してすばらしい感受性を示した。
【００７１】
本明細書に引用または記載した各特許、特許出願および刊行物は、参考文献により全部、本明細書に編入する。
【００７２】
本明細書に示し、そして記載するものに加えて、本発明の種々の修飾は、前述の説明から当業者に明白であろう。そのような修飾も特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】硫酸ヘパリンおよびヘパリンに特異的な種々の方法によるエンセファロトキシンの不活性化を具体的に説明する。図１Ａに示すように、ＢＶ２小膠細胞により放出されるエンセファロトキシンは、亜硝酸ｐＨ１．５により、ヘパリンリアーゼＩ（Ｅ．Ｃ．４．２．２．７）により、Ｏ−６で分解するスルファターゼおよびＮ−硫酸化グルコサミン（ＧｌｃＮＳ）（グルコサミン−６−スルファターゼ（Ｅ．Ｃ．３．１．６．１４）およびＮ−スルファミニダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１０．１１））から不活性化された。図１Ｂに示すように、ＡＤ脳の脳室のＣＳＦ中に見いだされるエンセファロトキシンは、亜硝酸ｐＨ１．５により、ヘパリンリアーゼＩにより、およびＯ−６で分解するスルファターゼにより、およびＧｌｃＮＳから不活性化された。図１Ｃに示すように、ＡＤ患者の腰椎ＣＳＦから回収されたエンセファロトキシンは、亜硝酸ｐＨ１．５により、ヘパリンリアーゼＩにより、およびＯ−６で分解するスルファターゼにより、およびＧｌｃＮＳから不活性化された。
【図２】３００〜３０００ダルトンの直線ふるい範囲を持つＴＳＫ−ＧＷ２５００ＰＸＬを使用して、エンセファロトキシンの分子量測定を具体的に説明する。市販されているヘパランオリゴマーを標準として使用した。確実なＡＤに由来するＣＳＦサンプル（１００μｌ）は、約７００〜１，９００ダルトンのサイズの範囲である神経毒性の小さいピークおよび主要ピークを示した。これらの推定上の分子量は、エンセファロトキシンの少なくとも幾つかの形態が約４〜８個のサッカリド残基を含んでなることを示唆している。
【図３】確実なＡＤ、ＭＣＩおよび正常な年配者から単離したエンセファロトキシンに関する用量応答曲線を示す。より大きな認知障害の個体に、上昇した量の毒素が見い出される。
【図４】図４Ａは、Ａβ１−４２で刺激した小膠細胞ＢＶ２細胞に由来するエンセファロトキシンのアニオン交換ＨＰＬＣ（ＰｒｏＰＡＫ  ＰＡ１、０．０〜０．７Ｍ  ＮａＣｌ、ＵＶ＠２３２ｎｍ）分離の結果を示す。エンセファロトキシンに対応する３つのピーク（ピーク３８、４８および５３）が検出された。ピーク３８、４８および５３のエンセファロトキシンは、１）ヘパリンリアーゼＩに感受性、２）亜硝酸ｐＨ１．５に感受性、そして３）海馬ニューロンに毒性であった（データは示さず）。図４Ｂに示すように、これらの幾つかのピークは、Ａβ１−４２に暴露されなかった対照ＢＶ２細胞から回収したコンディション培地では不存在であった。
【図５】図５Ａは、剖検例から回収した脳室および腰椎ＣＳＦ中のエンセファロトキシンの存在を具体的に説明する。図５Ｂは、生きている個体の剖検例から回収した脳室および腰椎ＣＳＦ中のエンセファロトキシンの存在を具体的に説明する。データは、培養した海馬ニューロンの死を誘導するために必要なＣＳＦ容量で表す。用量応答曲線で示すように（図５Ａ）、確定的ＡＤ（剖検により確認された診断）の個体に見られるように、小容量の高トキシン濃度は曲線を左にシフトする。これらのデータはＥＤ５０としても表すことができる（５０％の最大の殺しを与えるために必要なＣＳＦ容量）。図５Ｂに示すように、類似のパターンは小さいＥＤ５０（０．１〜１０μｌ）を有する確実なＡＤ（臨床診断）の患者、続いて中程度の値（１０〜２００μｌ）を持つＭＣＩ群の患者で見い出された。重要なのは、種々の他の診断群が、検出可能なエンセファロトキシンを示さなかったことであった（ＥＤ５０＞１０００μｌ）。
【図６】アニオン交換ＨＰＬＣにおいて、ＡＤ（パネルＡ、Ｂ）およびＭＣＩ（Ｃ）はＣＳＦ中にピーク３８、４８および５３を示すが、正常な年配者の対照（Ｄ）では示さない。これらのピークはヘパリンリアーゼＩに感受性であった（データは示さず）。図６Ｅに示すように、これらＨＰＬＣ画分のバイオアッセイで、同じピークが神経毒性であることを確認する。
【図７】アニオン交換ＨＰＬＣ（９０分間にわたり０〜２．０ＭのＮａＣｌの直線勾配）で、神経毒活性の３つの別れたピークが、確定的ＡＤ（図７Ａ）、確実なＡＤ（図７Ｂ）およびＨＡＤ（図７Ｃ）からのＣＳＦの１００μｌに見いだされることを示す。毒性活性は血管型痴呆から回収されない（図７Ａ）。ヘパリンリアーゼＩＩではなく、ヘパリンリアーゼＩおよびＮ−スルファミニダーゼがすべての毒性ピークを排除する。
【図８】種々の神経障害に由来する脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルから、ＣＳＦ神経毒性指数［標準化ラット海馬ニューロンカルチャーアッセイに及ぼす総殺効果の５０％を達成するための等量ＣＳＦ容量の値として算出］を具体的に説明する。図８Ａに示すように、確定的なアルツハイマー病（ＡＤ）およびＨＩＶ−感染からのサンプルはエンセファロトキシンを含む。日常的な腰椎ミエログラム（ミエログラム）中に得られた脳脊髄液は、記憶病訴がない個体に由来した。ニューロパシーは頭または末梢神経障害の患者を指し、一方、精神医学的診断の患者に神経疾患の証拠は無かった。他の神経学的疾患には、真菌髄膜炎、神経梅毒、多発性硬化症（ＭＳ）、および筋委縮側軸硬化症（ＡＬＳ）を含む。図８ＢはＣＳＦ指数スコアを、認知喪失が無いＨＩＶ−１（＋）の有志、軽度の認知運動機能不全（ＭＣＭＤ）またはＨＡＤと比較する。有意な差異はＭＣＭＤとＨＡＤ間に存在し、ここでもより多の毒素が認知障害のより大きな程度に関連するパターンを支持している。図８Ｃは認知喪失がない年配の有志に関するＣＳＦ指数スコアを、ＭＣＩ、確実なＡＤまたは非ＡＤ痴呆（外傷、血管またはエタノール損傷により生じた）と比較する。ＭＣＩは他の形態の痴呆より高いエンセファロトキシンの一貫した、しかも有意に上昇したレベルを示す。棒は中央値を示す。図８Ｄは、ゆっくりした聴覚による連続足し算検査（ＰＡＳＡＴ、情報処理の感度のある測定）について、神経毒性指数値対Ｔスコアを比較する。示すように、有意な直線関係がＣＳＦ神経毒性指数とこの認知測定との間に存在する（ｎ＝２６；ｐ＜０．０００１；相関係数＝０．７４）。
【図９】年配の個体からのＣＳＦのＣＳＦ神経毒性指数スコアの比較を示す。確実なＡＤおよびＭＣＩは、分布値が重複する有意な毒性レベルを示す。ＣＳＦ神経毒レベルは、年齢が共通する他のカテゴリーからＡＤ病状を明らかに分離する。
【図１０】ＣＳＦエンセファロトキシンレベルに及ぼす薬剤効果の２例を示す。単一薬剤処置（薬剤の実態は暗号化されたままである）は、６週間の試験後に毒素の完全な抑制を提供できなかった（すなわち、表１に特記されるように、１００より大きな正常範囲に指数スコアをシフトした）。対照的に、６週間のＤＡＰ／ＨＣＱは今日まで試験したすべての個体において毒素生産の完全な阻害を提供した（５の５）。
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【図２】
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【図３】
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【図９】
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【図１０】
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