(57)【要約】本発明は、アドヘジンであるＭＩＣ１とＭＩＣ３が不活性化された、アピコンプレックスの住肉胞子虫科の弱毒突然変異株、およびそれらのワクチンへの使用に関するものである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アドヘジンＭＩＣ１を不活性化する突然変異とアドヘジンＭＩＣ３を不活性化する突然変異を含むことを特徴とする、アピコンプレックスの住肉胞子虫科の突然変異株。
【請求項２】
トキソプラズマの株に関するものであることを特徴とする、請求項１に記載の突然変異株。
【請求項３】
トキソプラズマ・ゴンディ株に関するものであることを特徴とする、請求項２に記載の突然変異株。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一つに記載の突然変異株を使用することを特徴とする、ワクチンを得るための使用方法。
【請求項５】
前記ワクチンが抗トキソプラズマ症ワクチンであることを特徴とする、請求項４に記載の使用方法。
【請求項６】
請求項１から３のいずれか一つに記載の突然変異株を含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トキソプラズマ、ネオスポラなどのような、アピコンプレックスの住肉胞子虫科（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｄａｅ）の弱毒突然変異株、およびそれらのワクチンへの使用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アピコンプレックス門（アピコンプレクサ門）は、大半が細胞内に存在する、多数の寄生生物から構成される。これらの寄生生物はトキソプラズマ症、マラリア、ネオスポラ症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症などの病気の原因となるものである。それらは共通して、数段階で宿主細胞内に侵入する固有の過程を持っており、その結果、その中で寄生生物が成長する寄生胞（ｐａｒａｓｉｔｏｐｈｏｒｏｕｓ  ｖａｃｕｏｌｅ）が形成される（ＭＥＮＡＲＤ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３：６３−７３，  ２００１；  ＳＯＬＤＡＴＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ３１：  １２９３−１３０２，  ２００１）。
【０００３】
トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）は必ず細胞内に寄生する原生動物であり、ヒトや動物のトキソプラズマ症の原因となる。それは、ネオスポラあるいは住肉胞子虫などのヒトや動物の他の主要な病原体も含む住肉胞子虫科に属する（ＬＥＶＩＮＥ、  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｏｚｏａｎ  Ｐｈｙｌｕｍ  Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ．  Ｖｏｌ．１，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬ，  ｐ．２０３，  １９８８；  ＴＥＮＴＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ３２  （５）：  ５９５−６１６，  ２００２）。その生活環には二つの別個の側面がある。タキゾイトを産生し、ついでブラディゾイトを含むシストを生成する、ヒト、マウス、ヒツジ、ブタなどの中間宿主における「無性」サイクルと、（スポロゾイトを含む）オーシストを生成し、それが糞便内に排出される、ネコにおける「有性」サイクルである。
【０００４】
動物のトキソプラズマ症は畜産の分野で大きな経済的問題になっている。収入のための全ての動物が病気に冒される。動物への伝染は、病原性トキソプラズマに感染したネコによって環境内に排出される耐性型のオーシストを摂取することによって起きる。妊娠中に感染したヒツジ、ヤギおよびブタにおいては流産を引き起こす。ヒツジの総数が１億頭と推定される欧州連合においては、トキソプラズマによる流産のために毎年１００万頭の子ヒツジが失われている。
【０００５】
他方で、ブラディゾイトの存在によって感染した食肉（とりわけ羊肉と豚肉）の消費がヒトの主たる感染源になっている。妊娠中に感染すると、トキソプラズマ症は先天奇形の第二の原因になる。加えて、最近２０年の間に、この寄生生物は日和見病原体として出現し、エイズ患者における脳炎の原因となっている。
【０００６】
アピコンプレクサによる寄生虫症に対する防御を提供するワクチンの開発は、多数の研究の対象となっている。主に二つの戦略がとられている。１）防御免疫反応を誘発することができる寄生虫抗原の同定、およびワクチン組成へのこれらの抗原の導入と、２）寄生生物の弱毒株の選定である。例えば、トキソプラズマ症の場合、哺乳類にトキソプラズマに対する免疫を付与するために、トキソプラズマ・ゴンディのさまざまな弱毒株の使用が提案された（米国特許第５０４５３１３号明細書、米国特許第４４７３５４９号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１６４７５４号明細書、英国特許第２２０４３２３号明細書）。
【０００７】
現在、弱毒株に基づく抗トキソプラズマ症ワクチンが一つだけ市販されている。それは、トキソプラズマ・ゴンディＳ４８株の生きたタキゾイトに基づくワクチンＴＯＸＯＶＡＸ（登録商標）である。この株の弱毒化の原因となる突然変異の性質は明らかになっていない。
【０００８】
アピコンプレックス、そしてとくにトキソプラズマ・ゴンディによる感染の鍵となる過程は、寄生生物の宿主細胞への付着と、それに次ぐ、寄生生物の細胞内への侵入である。アピコンプレックスが侵入するための仕組みは、二つのタイプの分泌性の細胞小器官、つまりはミクロネームとロプトリーの、連続した開口放出に関与する。
【０００９】
最近の研究で、宿主細胞の認識とこれに対する接着におけるミクロネームの中心的役割が明らかにされた。一般名で「ＭＩＣ」と命名されたミクロネームのタンパク質は、高等真核生物のタンパク質の接着ドメインに相同なモジュールを含んでいる（ＴＯＭＬＥＹ  ｅｔ  ＳＯＬＤＡＴＩ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  １７：  ８１−８８，  ２００１）。
【００１０】
現在、トキソプラズマ・ゴンディにおいて１０数個のＭＩＣタンパク質が知られている（ＳＯＬＤＡＴＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ３１：１２９３−１３０２，  ２００１）。それらの一部は、マラリア原虫においてはＴＲＡＰと命名されているトキソプラズマ・ゴンディのＭＩＣ２のように、膜貫通タンパク質である（ＭＡＴＵＳＣＨＥＷＳＫＩ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：１５９７−１６０６、２００２）。他のものは可溶性のタンパク質であり、それらはミクロネームとなるものであり、膜貫通タンパク質と協働して、侵入の際に寄生生物の表面に再分布するものである。
【００１１】
最近、宿主細胞の表面に結合することのできる二つの可溶性タンパク質ＭＩＣ１とＭＩＣ３の特性がトキソプラズマ・ゴンディにおいて明らかにされた（ＡＣＨＢＡＲＯＵ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，  ４７，  ２２３−２３３，１９９１；  ＦＯＵＲＭＡＵＸ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ８３：  ２０１−２１０，  １９９６；  ＧＡＲＣＩＡ−ＲＥＧＵＥＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２：  ３５３−３６４，  ２００２）。
【００１２】
ＭＩＣ１タンパク質は、ＴＲＡＰのＴＳＰ−１タイプのドメインと遠い相同性を有する縦列反復ドメインを含み、ラクトースへの結合特異性を示す（ＬＯＵＲＥＮＣＯ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．  １１：  ５４１−５４７，  ２００１）。
【００１３】
ＭＩＣ３タンパク質は、ジスルフィド架橋で結合した３８ｋＤａの二つのサブユニットで形成された、見かけの分子量が９０ｋＤａの二量体である。ＭＩＣ３は、そのうち二つがオーバーラップする五つのＥＧＦタイプのドメインと、ジスルフィド架橋に富んだ、宿主細胞表面への結合に不可欠であると考えられる「キチン結合ドメイン」タイプの一つのドメインとを含んでいる（ＧＡＲＣＩＡ−ＲＥＧＵＥＴ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  上述；  ＣＥＲＥＤＥ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２１：２５２６−２５３６，  ２００２）。
【００１４】
ＭＩＣ１とＭＩＣ３は、他のＭＩＣタンパク質と協働して、独立した二つの複合体ＭＩＣ１／４／６とＭＩＣ３／８を形成する。膜貫通タンパク質ＭＩＣ６とＭＩＣ８は、ＭＩＣ１／４タンパク質とＭＩＣ３タンパク質をそれぞれミクロネームとするための輸送役を果たす。ＭＩＣ１タンパク質は、複合体ＭＩＣ１／４／６が分泌経路の所期段階の区域を離れるのに必要不可欠なものである（ＲＥＩＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５２：  ５６３−５７８，  ２００１）。
【００１５】
近年、トキソプラズマ・ゴンディのＭＩＣ３タンパク質が、主要なワクチン抗原を構成し、速やかな、そしてきわめて強い体液性免疫反応を引き起こすことが明らかになった（国際公開第０１／６４２４３号パンフレット）。
【特許文献１】国際公開第０１／６４２４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
トキソプラズマ・ゴンディの侵入能力と病原性におけるＭＩＣ１とＭＩＣ３の役割を研究することを目的として、本発明者らは、アドヘジンであるＭＩＣ１とＭＩＣ３の一方および／または他方を不活性化した、トキソプラズマ・ゴンディの突然変異株を構築した。
【００１７】
本発明者らが確認したところでは、ＭＩＣ１を不活性化すると、インビトロで線維芽細胞の侵入能力が約５０％減じるが、ＭＩＣ３を不活性化すると、この侵入能力は変化しない。二つのタンパク質を同時に不活性化すると、ＭＩＣ１だけを不活性化したときと比較して侵入能力がほとんど変わらない。インビボでの病原性は、ＭＩＣ１とＭＩＣ３を別個に不活性化した影響をほとんど受けない。逆に、二つのタンパク質を同時に不活性化することによって病原性は大幅に減じた。
【００１８】
本発明者らがさらに確認したところでは、ＭＩＣ１とＭＩＣ３が構成する主要抗原がないにも関わらず、これらの二つのタンパク質を不活性化したトキソプラズマ・ゴンディの二重突然変異株は、トキソプラズマ症に対して効果のあるワクチン防御を得ることを可能にする。
【００１９】
つぎに本発明者らは、動物、とくにマウスと雌ヒツジに対する前記株の感染および防御の特性の研究に着手した。
【００２０】
本発明者らが明らかにしたところでは、この株のワクチン接種は、トキソプラズマ・ゴンディの病原性野生株に再感染した際の脳内シスト形成から動物を防御する。これにより、この病原性野生株による感染の範囲、妊娠している雌の場合の胎盤通過のおそれ、ワクチン接種した動物の肉の消費による伝染の可能性が大幅に減じ、いずれ、感染の全体的な有病率を低下させることを可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、本発明はアドヘジンＭＩＣ１を不活性化する突然変異とアドヘジンＭＩＣ３を不活性化する突然変異を含む、アピコンプレックスの住肉胞子虫科の突然変異株を対象とするものである。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様によれば、前記住肉胞子虫科の生物はトキソプラズマとネオスポラから選択される。
【００２３】
前記突然変異株のこの実現方法の好ましい構成によれば、前記突然変異株はトキソプラズマ、とくにトキソプラズマ・ゴンディの株である。
【００２４】
これにおいて：
・「アドヘジンＭＩＣ１を不活性化する突然変異」は、ＭＩＣ１の発現がなくなる、または、非機能的な、すなわちＭＩＣ４タンパク質やＭＩＣ６タンパク質と複合体を形成することができない、もしくはラクトースを結合することができないＭＩＣ１タンパク質が発現する、あらゆる突然変異を意味する。
・「アドヘジンＭＩＣ３を不活性化する突然変異」は、ＭＩＣ３の発現がなくなる、または、非機能的な、すなわち宿主細胞の表面への結合機能を喪失したＭＩＣ３タンパク質が発現する、あらゆる突然変異を意味する。
【００２５】
ＭＩＣ１またはＭＩＣ３の発現をなくす突然変異の例は、とりわけ、対応する遺伝子全体、またはそのコード領域、またはプロモーター領域の欠失である。非機能的なＭＩＣ３タンパク質を発現させる突然変異の例は、とくに「ＭＩＣ３タンパク質のキチンへの結合ドメイン」タイプのドメイン、すなわち前記タンパク質のアミノ酸８４−１４４をコードするｍｉｃ３遺伝子の領域に影響する突然変異である。とりわけ、少なくともＭＩＣ３タンパク質の１２６位のトリプトファンまたは１２８位のフェニルアラニンに影響する突然変異が関係することもある。
【００２６】
これらの突然変異は、対象とする配列の部位における一つまたは複数の塩基の挿入、欠失、または置換によって、従来の仕方で生じさせることができる。
【００２７】
トキソプラズマにおいて使用可能な突然変異誘発および形質転換の技術の非制限的例として、とくに下記の刊行物に記載のものが挙げられる。ＫＩＭ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：  ９１１−９１４，  １９９３）、  ＤＯＮＡＬＤ  ｅｔ  ＲＯＯＳ，  （Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ６３：  ２４３−２５３，  １９９４）、  ＳＯＬＤＡＴＩ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ７４：  ８７−９７，  １９９５）、  ＤＯＮＡＬＤ  ｅｔ  ＲＯＯＳ，  （Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ９１：  ２９５−３０５，  １９９８）。
【００２８】
本発明は、アピコンプレクサによる寄生虫症に対する、とくにトキソプラズマ症に対する防御免疫を付与するためのワクチンを得るための、本発明に従ったアピコンプレクサ、そしてとりわけトキソプラズマの突然変異株の利用をも対象とするものである。
【００２９】
本発明は、先に定義したような、本発明に従ったアピコンプレクサの、またとりわけトキソプラズマの突然変異株を作用成分として含むことを特徴とするワクチンも対象とするものである。
【００３０】
本発明は、ＭＩＣ１および／またはＭＩＣ３を不活性化したトキソプラズマ・ゴンディの突然変異株の構築と、ＭＩＣ１とＭＩＣ３を不活性化した二重突然変異体のワクチンとしての使用の例を参照する、以下の説明を読むことによって明らかになるであろう。
【００３１】
しかしながら、これらの例は本発明の対象を説明するためだけに与えられたものであり、それを制限するものではない。
【実施例１】
【００３２】
トキソプラズマ・ゴンディにおけるＭＩＣ１および／またはＭＩＣ３の不活性化
【００３３】
使用したプラスミド
【００３４】
プラスミドｐｍｉｃ３ＫＯ−１とｐｍｉｃ３ＫＯ−２をそれぞれ、ＲＨｈｘｇｐｒｔ―株からｍｉｃ３ＫＯ単一突然変異体を構築するためと、ｍｉｃ１ＫＯ株からｍｉｃ１−３ＫＯ二重突然変異体を構築するために使用した。プラスミドｐＭ３ＭＩＣ３ｔｙとｐＭ２ＭＩＣ１ｍｙｃ＋ｐＭ３ＭＩＣ３をそれぞれ、ｍｉｃ３ＫＯ突然変異体においてＭＩＣ３の発現を回復させる（ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３株）ためと、ｍｉｃ１−３ＫＯ二重突然変異体においてＭＩＣ１とＭＩＣ３の発現を回復させる（ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３株）ために使用した。
【００３５】
プラスミドｐｍｉｃ３ＫＯ−１
【００３６】
Ｍｉｃ３遺伝子（２１３６ｂｐ）の３’ＵＴＲ領域を、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ（登録商標）ＳＫ（−）のＮｏｔＩ部位へトキソプラズマ・ゴンディの２２４７ｂｐのゲノムＤＮＡ断片（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＪ１３２５３０）を挿入した結果得られたプラスミドｐＢｌｕｅＭＩＣ３（ＣＥＲＥＤＥら、２００２、前掲）から、ＰＣＲによって増幅した。
【００３７】
増幅のために、プライマーＭＬ９：５’−ＧＴＧＴＡＡＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）とＭＬ１０：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を使用した。増幅領域は、プラスミドｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴ（ＤＯＮＡＬＤおよびＲＯＯＳ、１９９８、前掲）の制限部位ＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩの間でクローニングした。Ｍｉｃ３の５’ＵＴＲ領域の１９７７ｂｐのＤＮＡ断片を、Ｍｉｃ３の５’ゲノム配列の３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をＸｂａＩ／ＮｈｅＩで消化することで得、そしてｐｍｉｎｉＨＸＧＰＲＴのＸｂａＩ部位においてクローニングした。
【００３８】
得られたプラスミドは、ｍｉｃ３のＯＲＦの３’および５’フランキング領域に囲まれた選択マーカーＨＸＧＰＲＴ（ヒポキサンチン−キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）を含むものであり、ｐｍｉｃ３ＫＯ−１と命名した。
【００３９】
プラスミドｐｍｉｃ３ＫＯ−２
【００４０】
上述のようにして得られたｍｉｃ３の３’ＵＴＲ領域および５’ＵＴＲ領域を、プラスミドｐＴＵＢ／ＣＡＴ（ＫＩＭら、１９９３、前掲）内のプラスミドｐｉｍｎｉＨＸＧＰＲＴについて記載されたものと同一の制限部位である、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）選択マーカーをコードする配列の両側に挿入する。
【００４１】
それによって生じるプラスミドは、ｍｉｃ３のＯＲＦの３’および５’フランキング領域によって囲まれたＣＡＴ選択マーカーを含むものであり、ｐｍｉｃ３ＫＯ−２と命名した。
【００４２】
プラスミドｐＭ３ＭＩＣ３ｔｙ
【００４３】
このプラスミドは、ＮｓｉＩ部位とＰａｃＩ部位の間にエピトープＴＹ（ＢＡＳＴＩＮ  ｅｔ．，  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ７７（２）：２３５−２３９，１９９６）を付加した、プラスミドｐＴ８ＧＦＰＰｆｍｙｏＡｔａｉｌ（ＨＥＴＭＡＮＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １１：  １３８５−１４００，  ２０００）から構築した。このプラスミドは、ＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間にチューブリンのプロモーターを有し、部位ＥｃｏＲＩとＮｓｉＩを両側に有するＧＦＰをコードする遺伝子を含んでいる。
【００４４】
Ｍｉｃ３のプロモーター領域（５６２ｂｐ）は、プライマーＭＬ２３：５’−ＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＣＡＡＧＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）とＭＬ２４：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＣＴＴＧＣＴＡＧＧＴＡＡＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を用いることによってプラスミドｐＢｌｕｅＭＩＣ３からＰＣＲによって増幅し、チューブリンのプロモーターの代わりにＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位に挿入した。
【００４５】
プライマーＭＬ２４により、ＥｃｏＲＩ部位の上流にＢｇ１ＩＩ制限部位を導入し、次いでＢｇ１ＩＩ部位とＮｓｉＩ部位においてＧＦＰをコードする遺伝子の代わりにＭｉｃ３遺伝子をクローニングする。
【００４６】
ＭＩＣ３をコードする配列は、制限部位Ｂｇ１ＩＩとＮｓｉＩをそれぞれ導入するプライマーＭＬ１１：５’−ＧＣＡＣＡＡＴＴＧＡＧＡＴＣＴＡＡＡＡＴＧＣＧＡＧＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）とＭＬ１５：５’−ＴＧＣＴＡＴＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＣＴＧＣＴＴＡＡＴＴＴＴＣＴＣＡＣＡＣＧＴＣＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いることによって、プラスミドｐＢｌｕｅＭＩＣ３からＰＣＲによって増幅した。
【００４７】
プラスミドｐＭ２ＭＩＣ１ｍｙｃおよびｐＭ３ＭＩＣ３
【００４８】
プラスミドｐＭ２ＭＩＣ１ｍｙｃ（ＲＥＩＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５２：  ５６３−５７８，  ２００１）は、Ｍｉｃ２遺伝子の５’および３’フランキング配列の制御の下で、そのＣ末端をエピトープｍｙｃによって標識したタンパク質ＭＩＣ１を発現する。
【００４９】
プラスミドｐＭ３ＭＩＣ３は、フレオマイシンの選択マーカーを発現させる発現カセットを含むベクターｐＴ／２３０−ＴＵＢ５／ＢＬＥのＳａｃＩ部位とＰａｃＩ部位の間で、Ｍｉｃ３遺伝子とその５’および３’フランキング領域を含むベクターｐＢｌｕｅＭＩＣ３（ＳＯＬＤＡＴＩ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．  ７４：８７−９７，  １９９５）の２０７２ｂｐのＰｖｕＩ／ＳａｃＩ断片をクローニングすることによって構築する。
【００５０】
ｍｉｃ３ＫＯ突然変異株およびｍｉｃ１−３ＫＯ、ならびにｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３およびｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３補完突然変異株の構築
【００５１】
増殖期のアピコンプレックスゲノムのハプロイドは、一回の相同組換えで、Ｍｉｃ３遺伝子の不活性化を可能にする。
【００５２】
使用した全てのトキソプラズマ・ゴンディは、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたダルベッコの最少培地（ＤＭＥＭ）で培養したヒトの線維芽細胞（ＨＦＦ）で生成したものである。それらは、宿主細胞の溶解の際に採取した。
【００５３】
ｍｉｃ３ＫＯ株
【００５４】
突然変異誘発に用いたトキソプラズマ・ゴンディの株は、ヒポキサンチン−キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＸＧＰＲＴ）の遺伝子が欠失し、そしてこのためにミコフェノール酸に感受性のある、ＲＨｈｘｇｐｒｔ-株である（ＤＯＮＡＬＤおよびＲＯＯＳ、１９９８、前掲）。
【００５５】
精製し、次いでＫｐｎＩで線状化した８０〜１００μｇのプラスミドｐｍｉｃ３ＫＯ−１を、ＣＹＴＯＭＩＸエレクトロポレーション溶剤において懸濁した１０7のＲＨｈｘｇｐｒｔ-タキゾイトに添加し（ＶＡＮ  ＤＥＮ  ＨＯＦＦ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：  ２９０２，  １９９２）、エレクトロポレーションを、装置ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（パラメーター：２ｋＶ、Ｒ＝４８オーム）上の、４ｍｍギャップを備えた、８００μｌの容積を有するキュベット内で行った。
【００５６】
エレクトロポレーションの後、タキゾイトを培養中のＨＦＦ細胞の単層上に置いた。突然変異体の選択のために、エレクトロポレーションの翌日に培地に選択剤（２５μｇ／ｍｌのミコフェノール酸と５０μｇ／ｍｌのキサンチン）を加え、この培地で３回継代培養した。
【００５７】
最後の継代から五日後に、寄生生物を、選択剤の存在下で９６ウェルプレートのウェルにおけるＨＦＦ細胞の限界希釈によってクローニングし、そして維持されたクローンを増幅する。
【００５８】
ｍｉｃ１−３ＫＯ株
【００５９】
突然変異誘発に用いたトキソプラズマ・ゴンディの株は、Ｍｉｃ１遺伝子を欠失させ、ｍｉｃ１ＫＯ株のＨＸＧＰＲＴをコードする遺伝子によって置換することにより上記のＲＨｈｘｇｐｒｔ―株から派生した、ｍｉｃ１ＫＯ株である（ＲＥＩＳＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １５２：  ５６３−５７８，  ２００１）．
【００６０】
精製し、次いでＫｐｎＩで線状化した８０〜１００μｇのプラスミドｐｍｉｃ３ＫＯ−２を、上記の条件でエレクトロポレーションするために、１０7のｍｉｃ１ＫＯタキゾイトに添加した。
【００６１】
突然変異体を、選択剤である２０μＭのクロラムフェニコールの存在下で、上記のように選択し、クローニングした。
【００６２】
ＭＩＣ３を不活性化した突然変異体はｍｉｃ３ＫＯと命名し、ＭＩＣ１とＭＩＣ３を不活性化した突然変異体はｍｉｃ１−３ＫＯと命名した。
【００６３】
ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３株
【００６４】
ＭＩＣ３の発現は、１００μｇのベクターｐＭ３ＭＩＣ３ｔｙと１０μｇのプラスミドｐＴＵＢ／ＣＡＴによる、ｍｉｃ３ＫＯの寄生生物のコトランスフェクションによって回復した。
【００６５】
選択は、上記のように２０μＭのクロラムフェニコールの存在下で実施した。
【００６６】
ＭＩＣ３を補完したｍｉｃ３ＫＯ株は、ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３と命名した。
【００６７】
ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３株
【００６８】
ＭＩＣ１とＭＩＣ３の発現は、１００μｇのベクターｐＭ２ＭＩＣ１ｍｙｃと１０μｇのプラスミドｐＭ３ＭＩＣ３を用いた、ｍｉｃ１−３ＫＯの寄生生物のコトランスフェクションによって回復した。
【００６９】
突然変異体を上記のように、選択剤である１０μｇ／ｍｌフレオマイシンの存在下で選択し、そしてクローニングした。
【００７０】
ＭＩＣ１とＭＩＣ３を補完したｍｉｃ１−３ＫＯ株を、ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３と命名した。
【００７１】
突然変異体ｍｉｃ３ＫＯ、ｍｉｃ１−３ＫＯ、ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３およびｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３の全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とウェスタンブロットによって分析した。（０．１ＭのＤＴＴの存在下または非存在下で）ＳＤＳ緩衝液中で沸騰させることによって細胞の全タンパク質を抽出し、１０％ポリアクリルアミドゲル上で分離した後に、タンパク質をニトロセルロース膜上に移した。ウェスタンブロットを、抗ＭＩＣ３（１：４００のＴ４２Ｆ３）および抗ＭＩＣ１（Ｔ１０１Ｆ７）モノクローナル抗体を用いてＧＡＲＣＩＡ−ＲＥＧＵＥＴら（１９９８、前掲）に記載されているように標識し、アルカリフォスファターゼに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０００）によって検出した。
結果を図１に示した。
【００７２】
図１の凡例：
１＝トキソプラズマ・ゴンディＲＨの野生株
２＝ｍｉｃ３ＫＯ突然変異体
３＝ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３突然変異体
４＝ｍｉｃ１ＫＯ突然変異体（ＲＥＩＳＳら、２００１）
５＝ｍｉｃ１ＫＯ＋ＭＩＣ１突然変異体（ＲＥＩＳＳら、２００１）
６＝ｍｉｃ１−３ＫＯ突然変異体
７＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３突然変異体
【００７３】
結果が示しているように、ＭＩＣ３の発現は、ｍｉｃ３ＫＯ（２）とｍｉｃ１−３ＫＯ（６）では検出することができないが、ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３（３）とｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３（７）では回復している。ＭＩＣ１の発現は、ｍｉｃ１ＫＯ（４）とｍｉｃ１−３ＫＯ（６）では検出することができないが、ｍｉｃ１ＫＯ＋ＭＩＣ１（５）とｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３（７）では回復している。
【００７４】
これらの結果を免疫蛍光で確認した。ＨＦＦ細胞単層上で一晩培養したタキゾイトをＰＢＳで洗浄し、２０分間４％ホルムアルデヒドで固定した。３回洗浄した後、感染したＨＦＦ細胞を、１０分間ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理し、３０分間１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で反応を停止させ、ついで細胞を２％ＦＢＳで希釈した一次抗体（抗ＭＩＣ１  Ｔ１０１Ｆ７  ｍＡｂ、抗ＭＩＣ３  Ｔ４２Ｆ３  ｍＡｂ）と４０分間インキュベートし、洗浄し、ついで二次抗体（ＦＩＴＣと結合したヤギ抗マウス抗体、およびテキサスレッド標識ヤギ抗ウサギ抗体）とインキュベートした。観察は、落射蛍光の能力を備えたＬｅｉｃａ  ＤＭＲＡ２顕微鏡で行い、映像をＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  ｃｏｏｌＳＮＡＰ  ＣＣＤカメラで記録した。
【００７５】
結果は、野生型のＭＩＣ３の発現が補完株（ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３、ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３）のミクロネームにおいて観察されたのに対し、ｍｉｃ３ＫＯのタキゾイトにおいては一切のＭＩＣ３タンパク質が検出されなかったことを示した。ｍｉｃ１ＫＯ＋ＭＩＣ１とｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３におけるＭＩＣ１の補完は、寄生胞と核周囲腔とにおいてＭＩＣ１の一定の蓄積をもたらす。
【実施例２】
【００７６】
トキソプラズマ・ゴンディの感染特性に対するＭＩＣ１および／またはＭＩＣ３不活性化の効果
【００７７】
上述の実施例１に記載したトキソプラズマ・ゴンディの突然変異体を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのグルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＤＭＥＭ培地で培養したＨＦＦ細胞上で通常の継代をして維持した。
【００７８】
侵入能力
【００７９】
精製したｍｉｃ１ＫＯ、ｍｉｃ１ＫＯ＋ＭＩＣ１、ｍｉｃ３ＫＯおよびｍｉｃ１−３ＫＯの２×１０5のタキゾイトを、ガラスカバースリップ上で培養したＨＦＦ細胞に添加した。細胞を１２時間固定し、ついでメチレンブルー−エオシン混合物（キットＲＡＬ５５５）を用いて染色し、長持ちするようにスリップの下に置いた（ＰＥＲＴＥＸ、Ｍｉｃｒｏｍ、フランス）。寄生生物の侵入能力を表す寄生胞の数を、スリップごとに無作為に選択した１０つのフィールド内で数え、データを、５回の独立した反復に基づいた、４つのスリップに由来するフィールドあたりの寄生胞の平均として表した。
【００８０】
対照は、侵入能力がトキソプラズマ・ゴンディＲＨの野生株のそれにほぼ等しいＲＨｈｘｇｐｒｔ-株で同じ条件で行った。
【００８１】
結果を、図２に示した（***＝有意に低い侵入、ｐ＜０．０００１）。
【００８２】
結果は、ｍｉｃ１ＫＯの寄生生物の侵入能力がＲＨｈｘｇｐｒｔ-対照株に対して約５０％低下したことを示している。
【００８３】
反対に、ｍｉｃ３ＫＯの寄生生物の侵入能力および対照株のそれは同等のものである（図２Ａ）。ｍｉｃ１−３ＫＯの寄生生物の侵入能力は、ｍｉｃ１ＫＯ突然変異体のそれと有意差がなく（図２Ａ）、ＭＩＣ１とＭＩＣ３は、トキソプラズマ・ゴンディによる線維芽細胞の侵入における追加的機能はないことが分かる。
【００８４】
ＭＩＣ１によってｍｉｃ１ＫＯを補完することで、侵入能力は対照株のそれに近いレベルまで回復する（図２Ｂ）。
【００８５】
病原性
【００８６】
マウスは、トキソプラズマ・ゴンディＲＨの野生株の２０のタキゾイトによって腹腔内経路で感染した後、一般的に９日で死亡する。
【００８７】
突然変異体ｍｉｃ１ＫＯ、ｍｉｃ３ＫＯ、ｍｉｃ１−３ＫＯ、ｍｉｃ１ＫＯ＋ＭＩＣ１、ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３およびｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３の病原性研究は、１０頭の雄ＯＦ１マウス群で、マウスあたり２０のｍｉｃ１−３ＫＯ株タキゾイトを腹腔内に注射し、そして感染したマウスの進行を追跡することによって行った。
【００８８】
対照は、病原性がトキソプラズマ・ゴンディＲＨの野生株のそれに等しいＲＨｈｘｇｐｒｔ-株を用いて、９頭の雄ＯＦ１マウス群で同一条件で行った。
【００８９】
結果を図３に示した。
図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃの凡例：
◆＝ｍｉｃ１ＫＯ株（Ａ）、ｍｉｃ３ＫＯ株（Ｂ）、ｍｉｃ１−３ＫＯ株（Ｃ）
■＝ｍｉｃ１ＫＯ＋ＭＩＣ１株（Ａ）、ｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３株、ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３（Ｃ）
△＝ＲＨｈｘｇｐｒｔ-株（Ａ、ＢおよびＣ）
【００９０】
ＲＨｈｘｇｐｒｔ-株に感染させたマウスは、感染から９日後に全て死亡した。ｍｉｃ１ＫＯまたはｍｉｃ３ＫＯで感染させたマウスは死亡がわずかに遅れた（感染から９日と２２日の間でマウスが死亡）が、これは補完したｍｉｃ１ＫＯ＋ＭＩＣ１およびｍｉｃ３ＫＯ＋ＭＩＣ３突然変異体に感染したマウスの場合には認められなかった。ｍｉｃ３ＫＯに感染させたマウスの中で１頭だけが感染の後４４日間生存し、このマウスはトキソプラズマ・ゴンディの特異的抗体反応を示した（結果は示していない）。これらの結果が示すところでは、Ｍｉｃ１またはＭｉｃ３遺伝子を別個に不活性化しても、マウスにおける病原性のわずかな低下にしか至らない。
【００９１】
反対に、ｍｉｃ１−３ＫＯ株に感染したマウスの場合、ほとんど全てが生存していた（感染の後４０日で９０％が生存）。ＭＩＣ１およびＭＩＣ３によるｍｉｃ１−３ＫＯの補完（ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ１−３株）は、寄生生物の病原性を回復させる。
【００９２】
マウスは、さまざまな量のｍｉｃ１−３ＫＯ二重突然変異体でも感染させ、ｍｉｃ１−３ＫＯの致死量（ＬＤ１００）をＲＨｈｘｇｐｒｔ-対照株のそれと比較した。対照株の９日目のＬＤ１００が２０未満のタキゾイトであるのに対し、ｍｉｃ１−３ＫＯ株のそれは、２×１０3程度のタキゾイトである。
【実施例３】
【００９３】
トキソプラズマ・ゴンディの病原性へのＭＩＣ３の付着機能の関与
【００９４】
ＭＩＣ３の付着機能に関わる残基の決定
【００９５】
ＭＩＣ３の「キチン結合ドメイン」タイプのドメインが、宿主細胞の表面への結合に必要不可欠であることが示されている（ＣＥＲＥＤＥら、２００２、前掲）。
【００９６】
ＭＩＣ３の機能性に不可欠な残基を決定するために、さまざまな突然変異をこのドメインに導入した。
【００９７】
実施した突然変異は下記の通りである。
・１０２位（Ｃ１０２Ｇ突然変異体）、１０７位（Ｃ１０７Ｇ突然変異体）、１０８位（Ｃ１０８Ｇ突然変異体）におけるシステイン残基をグリシン残基に置換する。
・１０３位において、プロリン残基をアラニン残基に置換する（Ｐ１０３Ａ突然変異体）。
・１０９位（Ｓ１０９Ａ突然変異体）および１３０位（Ｓ１３０Ａ突然変異体）において、セリン残基をアラニン残基に置換する。
・９６位（Ｙ９６Ａ突然変異体）、１３５位（Ｙ１３５Ａ突然変異体）、および１４１位（Ｙ１４１Ａ突然変異体）において、チロシン残基をアラニン残基に置換する。
・９７位（Ｆ９７Ａ突然変異体）、１２１位（Ｆ１２１Ａ突然変異体）、および１２８位（Ｆ１２８Ａ突然変異体）において、フェニルアラニン残基をアラニン残基に置換する。
・１２６位において、トリプトファン残基をアラニン残基（Ｗ１２６Ａ突然変異体）に置換する。
【００９８】
突然変異の位置は、ＭＩＣ３前駆体のポリペプチド配列を参照することによって示される（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＢ５６６４４）。
【００９９】
突然変異は、ｐＯＣ２プラスミド（ＣＥＲＥＤＥら、２００２、前掲）に含まれる、成熟型ＭＩＣ３をコードする配列の、ＰＣＲ（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって導かれた突然変異誘発によって生じさせた。
【０１００】
得られたプラスミドは、それぞれｐＣ１０２（Ｃ１０２Ｇ突然変異体）、ｐＣ１０７（Ｃ１０７Ｇ突然変異体）、ｐＣ１０８（Ｃ１０８Ｇ突然変異体）、ｐＰ１０３（Ｐ１０３Ａ突然変異体）、ｐＳ１０９（Ｓ１０９Ａ突然変異体）、ｐＳ１３０（Ｓ１３０Ａ突然変異体）、ｐＹ９６（Ｙ９６Ａ突然変異体）、ｐＦ９７（Ｆ９７Ａ突然変異体）、ｐＦ１２１（Ｆ１２１Ａ突然変異体）、ｐＷ１２６（Ｗ１２６Ａ突然変異体）、ｐＦ１２８（Ｆ１２８Ａ突然変異体）、ｐＹ１３５（Ｙ１３５Ａ突然変異体）、およびｐＹ１４１（Ｙ１４１Ａ突然変異体）と命名した。
【０１０１】
プラスミドは、キットＱｉａｇｅｎ  ｋｉｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、所期の突然変異の存在をシーケンシングによって確認した。
【０１０２】
ＭＩＣ３突然変異タンパク質を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのトリプトース、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＢＨＫ−２１培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で培養したＢＨＫ−２１細胞（Ｂａｂｙ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｋｉｄｎｅｙ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）のトランスフェクションによって発現させた。
【０１０３】
それぞれのプラスミドについて、２４ウェルプレートにおいて２４時間カバースリップ上で予め培養した３×１０5のＢＨＫ−２１細胞を、製造者（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）が推奨する条件に従い、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）を用いて、精製したプラスミドでトランスフェクトした。細胞を２４時間培養してからさらに分析した。
【０１０４】
ＭＩＣ３突然変異タンパク質の結合特性を、トランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞におけるそれらの位置を特定する分析をすることによって検討した。トランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞を、１５分間ＰＢＳ中の３％パラホルムアルデヒドで固定し、ついで洗浄し、１０分間ＰＢＳ中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で透過処理した。細胞を担持するスリップを次に０．５％ＳＡＢを含有するＰＢＳで洗浄し、抗ＭＩＣ３抗体（Ｔ８２Ｃ１０、１：２００）または抗Ｖ５抗体（１：５００）を含む同じ緩衝液において１時間インキュベートし、ついでＴＲＩＴＣに結合したヤギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、１：４００）と１時間インキュベートし、各インキュベーションの間にＰＢＳで何回も洗浄した。ついでスリップを洗浄し、顕微鏡用スライドに取り付けた。落射蛍光顕微鏡によって視覚化した。
【０１０５】
それらの位置を特定することによって、突然変異体の四つのカテゴリを定義した。
【０１０６】
第一のカテゴリ（突然変異体Ｃ１０２Ｇ，Ｃ１０７Ｇ、Ｃ１０８Ｇ、Ｙ１４１Ａ、Ｆ１２１Ａ）において、タンパク質は分泌系で保持される。第二のカテゴリ（Ｙ１３５Ａ、Ｙ９６Ａ、Ｆ９７Ａ、Ｓ１０９Ａ、Ｐ１０３Ａ）において、タンパク質は正常に分泌され、野生型の成熟型ＭＩＣ３タンパク質がそうするように、トランスフェクトした細胞の表面に結合する。第三のカテゴリ（Ｗ１２６Ａ、Ｙ１２８Ａ）において、タンパク質は正常に分泌されるが、トランスフェクトした細胞の表面には結合しない。第四のカテゴリ（Ｓ１３０Ａ）において、タンパク質は正常に分泌され、ガラスプレートの表面に細胞から付着した細胞性物質の網に結合する。
【０１０７】
これらの結果は、システイン残基に影響する全ての突然変異が大きな分泌欠陥に至ることを示している。対応するＭＩＣ３突然変異タンパク質は大きな核周囲小胞の形で堆積し、それらのタンパク質がうまく折り畳まなかった、あるいは不完全な形で集合したことを示す。この結果はドメインの折り畳みにおけるシステインの役割と合致している。
【０１０８】
他の置換に関して言えば、Ｆ１２１ＡとＹ１４１Ａの二つの突然変異はともにタンパク質の放出に影響する。その他の突然変異（Ｙ１３５Ａ、Ｙ９６Ａ、Ｆ９７Ａ、Ｓ１０９Ａ、Ｐ１０３Ａ、Ｗ１２６Ａ、Ｆ１２８Ａ、Ｓ１３０Ａ）はすべて二量体の形で発現し、分泌される。そのうち二つ（Ｗ１２６Ａ、Ｙ１２８Ａ）は、トランスフェクトしたＢＨＫ―２１細胞に結合しない。これらの結合特性が喪失しているため、これら二つの突然変異体は上清の中に豊富に分泌される。Ｓ１３０Ａ突然変異体の場合、抗ＭＩＣ３抗体による標識は、野生型のＭＩＣ３タンパク質の場合のように、トランスフェクトした細胞の細胞膜とは結合せず、あたかもＲ−ＭＩＣ３  Ｓ１３０Ａタンパク質がプレートに付着した細胞性物質に結合したかのように、細胞間隙に結合する。
【０１０９】
これらの結果は、二つの芳香族残基Ｗ１２６とＹ１２８が宿主細胞表面のレセプターとの相互作用に関与し、Ｓ１３０残基もまた、相互作用の特異性に関与することによってＭＩＣ３の結合特性に寄与することを示している。
【０１１０】
トキソプラズマ・ゴンディの病原性へのＷ１２６残基およびＹ１２８残基の関与
【０１１１】
トキソプラズマ・ゴンディの病原性におけるＭＩＣ３の付着機能の役割を研究するために、Ｗ１２６ＡおよびＦ１２８Ａ突然変異体によるｍｉｃ１−３ＫＯ二重突然変異株の補完性の実験を実施した。
【０１１２】
プラスミドｐＭ３ＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ、ｐＭ３ＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ、およびｐＭ３ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａを、プラスミドｐＭ３ＭＩＣ３から構築した。これらのプラスミドはフレオマイシン選択遺伝子を有し、それぞれ突然変異体Ｗ１２６Ａ、Ｆ１２８ＡおよびＹ１３５Ａを発現する。所期の突然変異の存在を、シーケンシングによって確認した。
【０１１３】
ｍｉｃ１−３ＫＯ株を、プラスミドｐＭ３ＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ（ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ株）またはｐＭ３ＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ（ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ株）によってトランスフェクトした。結合のポジティブコントロールとして、ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３株と、プラスミドｐＭ３ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａによってトランスフェクトしたｍｉｃ１−３ＫＯ株（ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａ）を使用した。
【０１１４】
様々な株のＭＩＣ３タンパク質の発現をウェスタンブロットによって分析し、それらの結合特性を細胞ブロットによって分析した。細胞ブロットは、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ培地（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で培養したＭｏｄｅ−Ｋ細胞懸濁液（ＶＩＤＡＬ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １６６：  ６３−７３，  １９９３）でインキュベートした、ウェスタンブロットに用いたニトロセルロース膜の写しで行った。
【０１１５】
結果を、図４Ａ（ウェスタンブロット）と４Ｂ（細胞ブロット）に示した。
【０１１６】
図４Ａと４Ｂの凡例。
１＝トキソプラズマ・ゴンディＲＨの野生株
２＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３株
３＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ株
４＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ株
５＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａ株
【０１１７】
ウェスタンブロットの結果は、全ての株におけるＭＩＣ３タンパク質の発現を示している。これら全てのタンパク質は還元条件において、二量体についての所期のサイズまで泳動する。しかしながら、Ｗ１２６ＡおよびＹ１３５Ａタンパク質は他のものより早く泳動し、これは構造の変化を示唆している。
【０１１８】
細胞ブロットの結果は、所期の通り、細胞が未処理のＭＩＣ３（１）、ＭＩＣ３ｍｙｃ（２）、およびＭＩＣ３Ｙ１３５Ａ（５）に強く結合することを示している。逆に、細胞はＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ（３）およびＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ（４）に結合することはできない。他方で、ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａの構造の変化はその結合特性に影響しない。
【０１１９】
ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ株、ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ株、および対照としてｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａ株を、マウスにおける病原性に対するＭＩＣ３の付着機能の関与の分析に使用した。
【０１２０】
株の病原性の分析
病原性の試験を実施例２に記載のように行った。それぞれの寄生生物の２０のタキゾイトを雄のＯＦ１マウス（１１から２０頭からなる群）に腹腔内注射し、その生存を４０日間追跡した。その結果を図５に示した。
【０１２１】
図５の凡例。
◆＝ｍｉｃ１−３ＫＯ株
■＝ｍｉｃ１ＫＯ株
△＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３株
○＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａ株
＋＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ株
ｘ＝ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ株
【０１２２】
所期の通り、ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３株に感染させたマウスは、ｍｉｃ１ＫＯに感染させたマウスと同じように振る舞い、同じような経過で９から２６日で死亡した。ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａ株に感染させたマウスの生存は長い（これは寄生胞における、ＭＩＣ３Ｙ１３５Ａタンパク質の一部不完全なアドレッシングによる可能性がある）。
【０１２３】
反対に、感染から４０日後、ｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｗ１２６Ａ株およびｍｉｃ１−３ＫＯ＋ＭＩＣ３Ｆ１２８Ａ株に感染させたマウスのそれぞれ８３．３％および９５％の生存が認められた。
【０１２４】
これらの結果は、宿主細胞に対するＭＩＣ３の結合機能が寄生生物の病原性には必要不可欠であることを示している。
【実施例４】
【０１２５】
ＭＩＣ１−３ＫＯ突然変異株によるマウスのワクチン接種
【０１２６】
実験手順
【０１２７】
９．５週齢の雄のＯＦ１マウス群を次のように処理した。
・２１頭（群１）にｍｉｃ１−３ＫＯ突然変異株を接種した。
・２１頭（群２）にｍｉｃ１−３ＫＯ突然変異株を接種し、ついで約１ヶ月後に、シスト原であるトキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株で再感染させた。
・１０頭（群３）を、群２の再感染の際に、シスト原であるトキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株で感染させた。
【０１２８】
０日目、群１および２のマウスに、腹腔経由でｍｉｃ１−３ＫＯ突然変異株の２０のタキゾイトを接種した。
【０１２９】
１４日目、マウスの感染を、トキソプラズマ（ＲＨ株）の全抽出物を用いて抗トキソプラズマ・ゴンディＩｇＧの存在を調査することによって検査した。
【０１３０】
３７日目、実質的に免役付与した（抗トキソプラズマＩｇＧが存在する）群２のマウス（８頭）と群３のマウス（８頭）に、トキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株の７０のシストを強制摂取させた。
【０１３１】
６１日目、三つの群のマウスを屠殺した。トキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋの感染による抗ＭＩＣ３ＩｇＧの存在を調査し（ｍｉｃ１−３ＫＯワクチン株はこのタンパク質を発現しないため）、そして、これらのマウスの脳のホモジェネート内の脳内シストの計数を行った（Ｍａｌａｓｓｅｚ血球計算器での計数、検出限度は脳あたり３０シスト）。
【０１３２】
１５週齢の未処理の８頭の雄ＯＦ１マウスに、群２の８頭のマウス（脳内寄生のない対照）のそれぞれの脳の１／３を強制摂取させた。１頭の対照マウスに、群３のマウス（ポジティブコントロール）に由来するトキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株の６０のシストを接種した。
【０１３３】
８２日目、６１日目に強制摂取させたマウスにおける抗ＭＩＣ３ＩｇＧの存在を調査した。
【０１３４】
１０３日目、マウスを屠殺し、脳内シストの計数を行った。
【０１３５】
結果
【０１３６】
１４日目
【０１３７】
群１と２の４２頭のマウスのうち、８頭は１０日目頃、感染の急性期で死亡した（これはＭＩＣ１−３ＫＯ突然変異体の残った病原性に対するマウスの高い感受性を反映している）。寄生虫抗原に対するＩｇＧの検出による感染の検査は、１６頭が陰性、つまり感染していないことを示した。したがって、群１および２はそれぞれ１０頭と８頭に減った。
【０１３８】
６１日目
【０１３９】
抗ＭＩＣ３ＩｇＧの調査
【０１４０】
群１（ネガティブコントロール）のマウスの血清内に抗ＭＩＣ３ＩｇＧは一切検出されなかったが、群３（ポジティブコントロール）のマウスの血清内には抗ＭＩＣ３ＩｇＧの存在が検出された。反応がきわめて弱い１頭を除き、群２のマウスの血清内には抗ＭＩＣ３ＩｇＧの存在が検出された。
【０１４１】
脳内シストの計数
【０１４２】
顕微鏡検査では、群１のマウスの脳は脳内シストを含んでいない（ネガティブコントロール）が、群３のマウスの脳は、２２５０から７２５０シスト／脳、すなわち平均４０３７シスト／脳を含んでいる（ポジティブコントロール）。群２のマウスでは、７頭のマウスは脳内シストを含んでおらず、１頭は３０の脳内シストを含んでいる（すなわちＭａｌａｓｓｅｚ血球計算器での１０μｌの１６回の計数で観察された唯一のシスト）。
【０１４３】
８２日目
【０１４４】
群２のマウスの脳を強制摂取させた未処理マウスは、抗ＭＩＣ３ＩｇＧを有する。群３のマウスに由来するトキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株の６０のシストを接種した対照マウスも同様に抗ＭＩＣ３ＩｇＧを有する。
【０１４５】
１０３日目
【０１４６】
群２のマウスの脳を強制摂取させた未処理マウスは、それぞれ５００、３７５、１０００、２５０、１６５、１２５、３１０および３７５の脳内シストを示す。比較として、トキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株の６０のシストを接種した対照マウスは、２２５０の脳内シストを有する。
【０１４７】
結論
【０１４８】
ｍｉｃ１−３ＫＯ突然変異体によって免役付与したマウスは、トキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株に再感染した際に脳内シストをほとんど形成しない（９９．９％の防御）。
【０１４９】
反対に、再感染させたマウスの多くの脳は経口感染するものであり、したがって、ｍｉｃ１−３ＫＯのワクチン株による免疫付与は、再感染の際に寄生生物を完全になくすものではない。
【実施例５】
【０１５０】
ＭＩＣ１−３ＫＯ突然変異体による雌ヒツジのワクチン接種
【０１５１】
動物
【０１５２】
「南プレアルプス（ｐｒｅ−ａｌｐｅｓ  ｄｕ  ｓｕｄ）」種の７０頭を超える雌ヒツジで、トキソプラズマ症に対する免疫状態を決定した。それらのトキソプラズマ症に対する血清反応陰性のため、３６頭だけを実験のために確保した。
【０１５３】
自然汚染をできる限り抑えるために、雌ヒツジを実験の間、ヌジリ（アンドル＝エ＝ロワール県）のＩＮＲＡの用地の密閉した羊舎で維持した。環境汚染防止のため、羊舎用の内衣を着用した飼育係と実験者だけが建物に入ることができ、またシャワーを浴びた後にしか密閉区域を出ることができない。使用した用具と生物材料は消毒浴を通した後にしか外に出さず、また糞尿は焼却する。
【０１５４】
ワクチンの接種後、ホルモンを含浸させたスポンジを雌ヒツジの膣内に挿入することによる発情同期化の後の自然交配によって、雌ヒツジを繁殖させた。
【０１５５】
トキソプラズマ・ゴンディ株
【０１５６】
ＲＨ株
【０１５７】
全寄生生物抽出物（ＥＴ）の生産を、病原性ＲＨ株（タイプＩ）から行う。これを、１０6のタキゾイトを腹腔内注射することで雌のＯＦ１マウスで連続継代して維持する。三日後、マウスを屠殺し、５ｍＬのＲＰＭＩ培地で腹腔を洗浄してタキゾイトを回収した。タキゾイトの計数はＭａｌａｓｓｅｚ血球計算器で行い、株を維持するために１０6のタキゾイトを健康なマウスに腹腔内に再注射した。
【０１５８】
全寄生生物抽出物の調製のために、ＲＨ株のタキゾイトを洗浄し、１０分間６０ワット／秒で三回超音波処理し、４℃で３０分間２０００ｇで遠心分離した。上澄みを濃縮し、分割した。濃度は、基準としてＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ（ウシ血清アルブミン））を用いる定量キット（Ｍｉｃｒｏ  ＢＧＡ）によって決定した。アリコートは−２０℃で保存する。
【０１５９】
Ｍｉｃ１−３ＫＯワクチン株
【０１６０】
Ｍｉｃ１−３ＫＯ株を上記の実施例１に記載したようにして得た。株を、１０％ウシ胎児血清、５０ｍＭのグルタミン酸塩、５０ｍＭのペニシリンおよび５０ｍＭのストレプトマイシンを加えたＩＭＤＭ培地で培養した、ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）系における連続継代によって維持する。
【０１６１】
ＰＲＵ試験株
【０１６２】
妊娠中期の雌ヒツジの感染を、感染したネコの精製した糞便から生成したＰＲＵタイプＩＩ株（Ｐｒｕｇｎｉａｕｄ株）の４００のオーシストで実施した。
【０１６３】
試験手順
【０１６４】
ワクチン接種
【０１６５】
血清反応陰性の３６頭の雌ヒツジを、１２頭の三つの群に分割した。
・対照群。
・「低用量の群」（ＫＯ  ＦＡ）と称す、Ｍｉｃ１−３ＫＯの１０5のタキゾイトを接種する群。
・「高用量の群」（ＫＯ  ＦＯ）と称す、Ｍｉｃ１−３ＫＯの２×１０6のタキゾイトを接種する群。
【０１６６】
これらの雌ヒツジのワクチン接種は、皮下注射で行った。
【０１６７】
体温の測定
【０１６８】
免疫付与の後、ヒツジの直腸体温が生理的レベルで安定するまで毎朝測定した。雌ヒツジの生理的体温は３８．５℃である。ヒツジの活動と、作業によって発生したストレスを考慮すると、温度４０．０℃からが高体温であると考えられる。
【０１６９】
体液性免疫反応研究
【０１７０】
体液性免疫反応を、血清中の特異的抗トキソプラズマ・ゴンディＩｇＧの出現の反応速度をＥＬＩＳＡによって評価することによって研究した。
【０１７１】
血清の獲得
血清は、免疫付与の前に（Ｄ０）、ついでワクチン接種後２４日（Ｄ２４）、３９日（Ｄ３９）、９８日（Ｄ９８）および１３４日（Ｄ１３４）に採取した。
【０１７２】
血液は頸静脈の部位で採取し、凝血塊の形成を可能にするために、（抗凝固剤なしの）採取物を＋４℃で一晩置いた。血清を、採取物を１５００ｒｐｍ、５分間、＋２０℃で遠心分離することによって回収した。上澄みを回収し、３ｍＬのサンプルに分割し、−２０℃で保存した。
【０１７３】
ＥＬＩＳＡ試験
上述のようにして得られたトキソプラズマ・ゴンディＲＨ株の全抽出物を、マイクロタイタープレートの平底ウェル（Ｎｕｎｃ）の感作に使用する。１００μＬの抽出物（５０ｍＭ、ｐＨ＝９．６の炭酸塩緩衝液内で１０μｇ／ｍＬの濃度）をそれぞれのウェルに載せる。＋４℃で一晩置いた後、自動洗浄機（ＭｕｌｔｉＷａｓｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ）を用いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）で三回洗浄した。
【０１７４】
非特異部位を、ＢＳＡが４％のＰＢＳで、３７℃で１時間３０分（湿潤雰囲気）、プレートをインキュベートすることによって飽和する。
【０１７５】
ＰＢＳ−Ｔで希釈した（１／５０および１／１００希釈）血清の各サンプル１００μＬを載せ、３７℃で１時間インキュベートする。
【０１７６】
三回の洗浄を二回繰り返した後に、アルカリフォスファターゼ（ＰＡＬ、Ｓｉｇｍａ）に結合したヒツジ抗ＩｇＧを１００μＬ載せ、ＰＢＳ−Ｔで１／５０００に希釈し、３７℃で１時間３０分インキュベートする。新たに三回の洗浄を二回繰り返した後に、ＤＥＡ−ＨＣｌ中に１ｍｇ／ｍＬのパラニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）１００μＬを用いて暴露する。
【０１７７】
読取は、１０から２０分のインキュベートの後に、波長λ＝４０５ｎｍにしたプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）で行う。
【０１７８】
測定可能な上限値は、対照群の雌ヒツジの吸光値（ＯＤ）に応じて決定した。１／１００希釈の血清では０．３５ＯＤに決定した。
【０１７９】
感染
【０１８０】
繁殖をワクチン接種の二ヶ月後に実施した。妊娠中期では、妊娠している雌の感染は、ＰＲＵ株の４００のオーシストの強制摂取によって行った。感染後数日間、直腸体温を、それが生理的値に戻るまで毎朝測定し、体液性および細胞性免疫反応を上述したように評価した。
【０１８１】
最後に、雌ヒツジを出産するときに、熱性の流産および感染性流産を検査した。
【０１８２】
結果
【０１８３】
免疫付与後の体温の測定
【０１８４】
様々な群の雌ヒツジの免疫付与後の平均体温を図６に示した。
【０１８５】
対照群の体温は生理的なままであった。反対に、ワクチン接種した二つの群において、３日目に体温のピーク（４０．５℃）が観察された。ＦＯ群の高体温（２日目に４０．１℃）は、ＦＡ群（２日目に３９．５℃）のものよりも早く生じた。免疫付与後４日で生理的値への体温の回復が観察される。
【０１８６】
免疫付与後の体液性免疫反応の研究
【０１８７】
１／１００希釈した雌ヒツジの様々な群の血清で０日（Ｄ０）、２４日（Ｄ２４）、３９日（Ｄ３９）、９８日（Ｄ９８）、および１３４日（Ｄ１３４）にＥＬＩＳＡ試験を実施した結果の平均を図７に示した。
【０１８８】
対照の雌ヒツジは、体液性免疫反応を示さなかった。
【０１８９】
ＦＯ群およびＦＡ群の雌ヒツジは、２４日目から抗トキソプラズマＩｇＧ反応を示した。実験終了（１３４日目）までこの反応が維持されていることが観察される。
【０１９０】
妊娠効率
【０１９１】
雄との交配後、開始時の３６頭の雌ヒツジに対し、３０頭だけが妊娠した。それぞれの群で２頭の雌ヒツジが妊娠していないことが観察された。
【０１９２】
感染後の体温測定の研究
【０１９３】
様々な群の雌ヒツジの感染後の平均体温を図８に示した。
【０１９４】
感染後、雌ヒツジ全体に高体温が観察された。
【０１９５】
対照群において、熱のピークは５日目から９日まで五日間持続し、最高は６日目の４１．５℃であった。ワクチン接種した二つの群について、熱のピークは４日目から６日目まで三日間持続し、最高は５日目の４１．２℃であった。
【０１９６】
対照群において熱のピークが観察されたとき（６日目）、ＫＯ  ＦＡ群およびＫＯ  ＦＯ群の雌ヒツジの体温はすでに低下しており（４０．０と４０．５℃の間）、他方で対照群の雌ヒツジで観察されたピークは７日目まで維持され、ついで９日目まで徐々に低下し、このとき、観察された平均体温は４０．５℃であった（７日目から９日目までのＫＯ  ＦＡおよびＫＯ  ＦＯでは３９．０℃）。
【０１９７】
ワクチン接種した雌ヒツジの熱のピークは、対照群に比べ、早く生じ、持続せず、最高体温は低かった。
【０１９８】
流産と出産の追跡
【０１９９】
死亡したまたは生育力のある子ヒツジを、出産時に識別し、秤量する。
【０２００】
流産には二つのタイプがある。
・オーシストによる感染に従った体温上昇による熱性の流産、
・胎児内で寄生生物が生育したことによる、感染性トキソプラズマによる流産。
【０２０１】
熱性の流産
【０２０２】
これらの流産は、感染後の熱のピークの結果生じた。
【０２０３】
結果を下記の表１にまとめた。
【０２０４】
【表１】
2007524409.tif 000002
【０２０５】
対照群の６頭の雌ヒツジは感染の後１５日で流産した。逆に、ワクチン接種した雌ヒツジでは熱性の流産は一切観察されなかった。
【０２０６】
トキソプラズマ感染による流産
【０２０７】
これらの流産は妊娠中に起こり、寄生生物の胎盤の通過と、胎児の中での生育による。それらは、一般的に妊娠末期に観察される。
【０２０８】
結果を下記の表２にまとめた。
【０２０９】
【表２】
2007524409.tif 000003
【０２１０】
これらの結果を解釈するために、ＫＯ  ＦＯ群の１頭の雌ヒツジを除外した。なぜならこの雌ヒツジの場合、産み育てることが困難であったからである。２頭の子ヒツジのうちの１頭に生育力があった。しかし母ヒツジに育児放棄され、生存できなかった。したがって、それは結果に含めていない。
【０２１１】
対照群において、熱性の流産がなかった４頭の雌ヒツジのどれも妊娠期間をまっとうできず、生育力のある子ヒツジを出産しなかった。
【０２１２】
低容量群（ＫＯ  ＦＡ）では１０頭の雌ヒツジのうち１頭だけが流産した。
【０２１３】
高用量群（ＫＯ  ＦＯ）では、９頭の雌ヒツジのうち三つの流産が確認された。
【０２１４】
総合的なワクチンの防御率を、流産の総数（熱性＋感染性）に応じて評価した。雌ヒツジが２頭の子ヒツジを出産し、そのうちの１頭が生存していたときは、流産は結果に数えなかった。なぜならこの流産には、妊娠中の場所の不足、誕生直後の子ヒツジに対する関心または世話の欠如など、感染以外の仮説がいくつも立てられるためである。したがって、これらの雌ヒツジはワクチン接種によって防御されたものに数える。
【０２１５】
結果は下記の表３にまとめた。
【０２１６】
【表３】
2007524409.tif 000004
【０２１７】
ＫＯ  ＦＡ群の防御率は、ＫＯ  ＦＯ群が６７％であるのに対し、９０％である。対照群については、防御はゼロである。
【０２１８】
生育力のある子ヒツジ
【０２１９】
高用量群の妊娠した９頭の雌ヒツジのうち７頭の子ヒツジに生育力があり、低容量群の１０頭の妊娠した雌ヒツジのうち９頭の子ヒツジに生育力がある。これらの子ヒツジは健康で、奇形はない。体重は２２００から５２００ｇの間であり、出産予定日に生まれた子ヒツジ（妊娠期間五ヶ月）の正常な体重に対応する。
【実施例６】
【０２２０】
ＭＩＣ１−３ＫＯ株とＳ４８株（ＴＯＸＯＶＡＸ（登録商標））の比較
【０２２１】
ｍｉｃ１−３ＫＯのタキゾイトとＳ４８のタキゾイトの免疫電気泳動の特徴の比較
【０２２２】
ｍｉｃ１−３ＫＯ株とＳ４８株のタキゾイトの全タンパク質を、先に実施例１について述べたような、非還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動とウェスタンブロットによって分析した。ウェスタンブロットは、抗ＭＩＣ３モノクローナル抗体（Ｔ８２Ｃ１０）または抗ＭＩＣ１モノクローナル抗体（Ｔ１０１Ｆ７）、トキソプラズマ・ゴンディ７６Ｋ株に経口感染させたマウスの血清、あるいは未処理マウスの血清を用いて検出した。結果を図９に示した。
【０２２３】
図９の凡例。（Ａ）Ｓ４８のタキゾイトの溶解物、（Ｂ）ｍｉｃ１−３ＫＯのタキゾイトの溶解物。レーン１：抗７６Ｋ血清、レーン２：未処理マウスの血清、レーン３：抗ＭＩＣ１血清、レーン４：抗ＭＩＣ３血清。
【０２２４】
これらの結果は、ｍｉｃ１−３ＫＯ株とＳ４８株が非常に異なる電気泳動の特性を有することを示すものであり、とくに、ｍｉｃ１−３ＫＯ株とは反対に、Ｓ４８株が二つのタンパク質ＭＩＣ１とＭＩＣ３を発現することを示している。
【０２２５】
ｍｉｃ１−３ＫＯ株とＳ４８株によって付与したワクチン防御の比較
【０２２６】
これらの株の一方または他方によって付与されたワクチン防御を、上述の実施例５の手順を用いて評価した。
【０２２７】
このために、血清反応陰性の雌ヒツジの群れを三つの群に分けた。
・１２頭の対照群。
・ｍｉｃ１−３ＫＯ株の１０5のタキゾイトで免疫付与した１３頭の群（Ｔｏｘｏ  ＫＯ  １−３）。
・Ｓ４８株の１０5のタキゾイトで免疫付与した１２頭の群（Ｔｏｘｏ  Ｓ４８）。
【０２２８】
ワクチン接種の後、それぞれの群について下記の測定を実施した。
・免疫付与後の体温の測定
・ＥＬＩＳＡ法による体液性免疫反応の追跡
・ＰＲＵ株の４００のオーシストによる妊娠した雌の感染
・感染後の体温の測定
・流産と出産の追跡
【０２２９】
免疫付与後の体温
【０２３０】
様々な群の雌ヒツジの免疫付与後の平均体温を図１０に示した。
【０２３１】
免疫付与後の体液性免疫反応
【０２３２】
１／１００に希釈した雌ヒツジの様々な群の血清の、０日（Ｄ０）、２４日（Ｄ２４）、３９日（Ｄ３９）のＥＬＩＳＡ試験の結果の平均を図１１に示した。
【０２３３】
妊娠効率
【０２３４】
雄との交配後、（開始の１２頭のうち）１１頭の対照雌ヒツジ、（開始の１３頭のうち）１２頭のＴｏｘｏＫＯ雌ヒツジ、および（開始の１２頭のうち）１２頭のＴｏｘｏＳ４８雌ヒツジが妊娠した。
【０２３５】
感染後の体温
【０２３６】
様々な群の雌ヒツジの、感染後の平均体温を図１２に示した。
【０２３７】
流産と出産の追跡
【０２３８】
熱性の流産（試験的感染による熱ピーク後１週間）
【０２３９】
結果を下記の表４にまとめた。
【０２４０】
【表４】
2007524409.tif 000005
【０２４１】
感染性の流産（妊娠の最後の２週間）
【０２４２】
結果を下記の表５にまとめた。
【０２４３】
【表５】
2007524409.tif 000006
【０２４４】
総合的な防御
【０２４５】
結果を下記の表６にまとめた。
【０２４６】
【表６】
2007524409.tif 000007
【０２４７】
ＴｏｘｏＫＯ群およびＴｏｘｏＳ４８群のそれぞれについての防御率は６６．６％である。対照群については、防御はゼロである。
【０２４８】
ＭＩＣ１−３ＫＯおよびＳ４８の２つの株はしたがって、同等の防御レベルを付与する。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】各株のＭＩＣ３およびＭＩＣ１を示す電気泳動の結果を示した図。
【図２】各株の侵入能力を示したグラフ。
【図３】各株に感染したマウスの進行を示したグラフ。
【図４】各株のＭＩＣタンパク質の発現とその結合特性を示した図。
【図５】各株の病原性を示したグラフ。
【図６】各群の免疫付与後の体温を示したグラフ。
【図７】各群の免疫付与後のＥＬＩＳＡの結果を示したグラフ。
【図８】各群の感染後の体温を示したグラフ。
【図９】各溶解物および血清の電気泳動の結果を示した図。
【図１０】各群の免疫付与後の体温を示したグラフ。
【図１１】各群の免疫付与後の血清のＥＬＩＳＡの結果を示したグラフ。
【図１２】各群の感染後の体温を示したグラフ。
【図１】
2007524409.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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