(57)【要約】  本発明は、ウマ２型インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ１）遺伝子を発現するＤＮＡワクチンに関する。ＨＡ１内に停止コドンを操作して作成することによって、ＨＡ１の発現を確実にする。リポソーム内にＤＮＡワクチンを被包し、そして鼻腔内接種すると、全長ＨＡ遺伝子を発現するＤＮＡワクチンに比較して、有意により低い投薬量で、防御免疫を誘発するのに十分である。投薬量がより低ければ、抗ＤＮＡ抗体の誘導のリスクが減少する。呼吸器上皮細胞に直接、鼻腔内接種することによって、ＤＮＡ組込みのリスクが減少する。ワクチンを更新するのに、コード配列を新規ウイルスで置換しさえすればよいため、本発明のワクチンは、現在の不活性化ワクチンまたは生弱毒化ワクチンより好適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウマ・インフルエンザウイルスのワクチンであって、ウマ２型インフルエンザウイルスの株のＨＡ１コード配列を含む単離ＤＮＡの有効免疫量、および薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤を含む、前記ワクチン。
【請求項２】
ＨＡ１コード配列が、株Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８、Ａ／Ｅｑ／マイアミ／６３、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／８１、Ａ／Ｅｑ／フォンテンブロー／７９、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９４、Ａ／Ｅｑ／ニューマーケット／２／９３、Ａ／Ｅｑ／ニューヨーク／９９、およびＡ／Ｅｑ／オクラホマ／２０００からなる群より選択される、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
ＨＡ１コード配列が株Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８のものである、請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
ＨＡ１コード配列が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項５】
さらなる抗原性構成要素、さらなる抗原性構成要素のコード配列、および他のワクチンからなる群の１以上をさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
ＨＡ１コード配列を含有するベクターをさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項７】
ベクターが真核発現ベクターである、請求項６記載のワクチン。
【請求項８】
ベクターが、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯおよびｐＶＡＸ１からなる群より選択される、請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項１０】
アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、ミネラルゲル、表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョンまたは炭化水素エマルジョン、キーホール・リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン、およびジニトロフェノールからなる群より選択される、請求項９記載のワクチン。
【請求項１１】
アジュバントがＭＥＴＡＳＴＩＭ（登録商標）である、請求項９記載のワクチン。
【請求項１２】
ＨＡ１コード配列が被包されているリポソームをさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項１３】
ウマ・インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、ウマに、請求項１のワクチンの有効免疫量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１４】
ＨＡ１コード配列をベクターに挿入し、そしてワクチンを気道に鼻腔内搬送する工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ベクターが真核生物ベクターである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ベクターが、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯおよびｐＶＡＸ１からなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ベクターがリポソームである、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
体重１グラムあたり少なくとも０．０１μｇのＤＮＡの投薬量でワクチンを投与する、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
体重１キログラムあたり０．００１μｇのＤＮＡ〜体重１グラムあたり０．０１μｇのＤＮＡの範囲内の投薬量でワクチンを投与する、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野：
本発明は、ウマ・インフルエンザウイルスのワクチン、そしてより詳細には、優れた粘膜免疫を誘発する、典型的な投薬量より低い投薬量の鼻腔内投与可能なウマ２型インフルエンザウイルスのＨＡ１コード配列を含むＤＮＡワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景：
ウマ・インフルエンザウイルス（ＥＩＶ）は、ウマにおいて、上気道感染の主要病原体である。該ウイルスは、何世紀にも渡るウマの呼吸器疾患の集団発生の原因に関係するとされてきている。該ウイルスの蔓延は迅速であり、そして罹患率は非常に高い。感染したウマは、典型的な「流感」症状：呼吸器の苦痛、咳、発熱、および粘液分泌の迅速な開始を発展させる。稀な症例では、二次的な細菌性気管支肺炎から死に至る。死亡率は低いが、ウマ・インフルエンザウイルス感染の影響は重大である。１９９２年の香港の大発生では、競馬が中止された結果、収益が１億２千ＵＳドル減少したと概算される。他のウマ競技における経済的重要性はこれより低い可能性があるが、ウマ・インフルエンザの大発生のため、何度か、国際的なウマのイベントが中断されたことがある。臨床的な徴候を示さないが、激しいトレーニングを経た感染馬は、肺機能の減少などの長期の結果に苦しむ可能性もある。臨床的に不健康なウマは、トレーニングの時間を失うという、明白な不都合を被る。
【０００３】
ウマ・インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルスであり、オルソミクソウイルス科のメンバーである。ウイルス・ゲノムは、マイナス鎖ＲＮＡの８つのセグメントからなる。ウイルス・キャプシドは、２つの表面ウイルス糖タンパク質：赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）を係留する脂質エンベロープに封入されている。ＨＡは、ＥＩＶの最も抗原性の高いウイルス・タンパク質と考えられている。ＨＡは、およそ７７ｋＤの分子量を有する。このウイルス・タンパク質は、ＨＡ０として合成され、そしてプロテアーゼ作用によって切断され、そして続いて単一のジスルフィド結合が還元されて、アミノ末端ＨＡ１部分（５０ｋＤ）およびカルボキシ末端ＨＡ２部分（２７ｋＤ）になる。ＨＡ２部分は、膜の脂質二重層上に係留され、そしてＨＡ１部分は、非共有連結によってＨＡ２に結合している。この赤血球凝集素は、ウイルスが、宿主細胞膜の受容体に結合し、続いて侵入につながり、そしてウイルスが脱殻し、したがってウイルス複製を開始するのに関与する。ワクチン接種の主な目的は、ウイルスがコードするこの分子に向かう免疫を誘導することである。
【０００４】
ウマ・インフルエンザウイルスには２つのサブタイプがある。１型、またはウマ１型インフルエンザウイルス（Ｈ７Ｎ７）は、この１５年間、先進国で単離されていない。しかし、ウマ２型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ８）は、大規模なワクチン接種プログラムにもかかわらず、世界中に出回り続けている。Ｈ３Ｎ８ウイルスが成功しているのは、おそらく、アミノ酸置換によってＨＡの抗原性が連続的に変化する、抗原性ドリフトのためである［１］。ウマ２型インフルエンザウイルスの最近の単離体は、「アメリカ」系統または「ユーラシア」系統いずれかに分類可能である。さらに、より最近のウマ２型インフルエンザウイルスは、多数の系統に分かれてきており［２］、そして少なくとも北米では、２つの進化系統が、隔年で出回る［３］。
【０００５】
現在のＥＩＶワクチンは、典型的には、ホルマリンまたはβ−プロピオラクトンで不活性化された全ウイルスからなる。抗原性構成要素は、ウマ・インフルエンザウイルス１型および２型で構成されている。Ａ／Ｅｑ／プラハ／５６は、１型の唯一のワクチン株であり、一方、２型の構成要素は、原型のＡ／Ｅｑ／マイアミ／６３、およびＡ／Ｅｑ／ケンタッキー／８１またはＡ／Ｅｑ／フォンテンブロー／７９などのより最近の株である。ウマ・インフルエンザの抑制に関するＷＨＯ／ＯＩＥ協議の最近の会議では、ワクチンは、「アメリカ」ウイルス（Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９４）および「ユーラシア」ウイルス（Ａ／Ｅｑ／ニューマーケット／２／９３）両方を含むべきであり、そして原型Ａ／Ｅｑ／マイアミ／６３は使用中止すべきであるという以前の提案が確認された［４］。
【０００６】
最近の前向き研究において、Ｍｏｒｌｅｙら［５］は、現在の商業的ワクチンがウイルス感染に対して防御せず、そして臨床的症状の抑制に最低限の効果を有するのみであることを示している。現在の商業的ワクチンが提供する防御に不足があるのは、以下の要因：
・免疫原性が欠如している；
・ワクチン株の選択肢が乏しい；および／または
・不適切な免疫を誘発する
の１つ、またはそれより多くの組み合わせによる。
【０００７】
ウマ２型インフルエンザウイルス（Ｈ３Ｎ８）は、進化し続けており、防御免疫を誘発するには、ワクチン株を定期的に更新することが必要である。しかし、異なるワクチン製造者の間で、多種多様なワクチン株が選択されている。
【０００８】
以前のＥＩＶによって生成される免疫は、アミノ酸置換の結果、ＨＡの抗原性が変化する（抗原性ドリフト）ため、より最近の単離体に対しては、防御しないであろう。該ウイルスのこの特性は、「失敗がない（ｆａｉｌ−ｐｒｏｏｆ）」有効なワクチンを作成するには大きな障害である。より最近のウイルス株で、そしてより頻繁な間隔で置換することによって、ワクチンを更新することが推奨されてきた［６］。製品中に旧型の（ｏｕｔｄａｔｅｄ）ウイルス株をなお使用し続けている製造者もある。ウマ・インフルエンザウイルスに特異的な抗体は誘発されるが、これらのワクチンには問題が多い。第一に、血清抗体レベルは、防御の指標として劣っている。第二に、出回っているウイルス株がワクチン株とは十分に異なるため、最低限の交差反応性しかない。こうした旧型のワクチンに誘発される「部分的」免疫は、感染宿主を無症候性キャリアーにし、すなわち、この宿主は感染するが、部分的免疫のため、臨床症状が抑制される。これらの感染宿主は認識されず、これによってウイルスの蔓延が促進される。
【０００９】
インフルエンザウイルスは、上気道の繊毛上皮細胞に付着することによって感染を開始する。したがって、粘膜抗体は、ウイルスに対する有効な防御を提供する。実際、ウマ・インフルエンザウイルスに対する防御における鼻抗体の重要性が長年認識されてきている。マウスモデルにおいて、ＩｇＡの移入によって、インフルエンザウイルス感染に対する防御が与えられることが示されている［７］。
【００１０】
現在のワクチンは血清抗体を誘発するが、粘膜免疫をターゲットとするものはない。抗原および抗体両方の測定値が標準化されていないため、血清抗体レベルおよびワクチン有効性の間の相関は不明である［８］。
【００１１】
ウマ・インフルエンザウイルスの現在のワクチンに対する粘膜免疫応答を後押しするため、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）の使用［９］、および粘膜領域への直接接種［１０］を含む、いくつかの戦略が用いられてきている。しかし、これらの戦略を用いた結果、わずかな改善しか示されなかった。
【００１２】
最近認可された、低温に適応し（温度感受性突然変異体）そして弱毒化された組換えウマ・インフルエンザウイルスに基づく、Ｈｅｓｋａ  Ｃｏｒｐ．（コロラド州フォートコリンズ）のワクチンは、粘膜免疫を誘発する試みである。該ワクチンは、粘膜免疫を誘発するため、鼻腔内接種によって投与される。低温適応弱毒化ウイルスを、粘膜部位に直接、鼻腔内接種すると、粘膜に会合するリンパ系組織（ＭＡＬＴ）の強い刺激が提供される。したがって、このワクチンは、非常に免疫原性であり、そして粘膜免疫を誘発する。しかし、該ワクチンは、再集合（ｒｅ−ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）を通じた組換えウイルスに基づくため、ワクチンを更新するには、低温適応弱毒化ウイルスの再操作が必要である。更新されたワクチンが認可可能となる前に、必要な安全性試験および有効性試験をすべて行わなくてはならない。
【００１３】
ＤＮＡワクチン、または遺伝子免疫の分野は、迅速に浮上しつつある技術である。タンパク質のコード配列を含有するＤＮＡプラスミドをマウスに筋内注射すると、抗原が発現されるだけでなく、該抗原に対する免疫応答もまた誘発されるという発見は、予期せぬものであった［１１、１２］。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡトランスフェクションと類似の方式で、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮＡプラスミドを取り込むと考えられている。ＤＮＡプラスミドは宿主細胞内で複製はしないが、コードされる抗原は、宿主細胞によって転写され、そして翻訳される。抗原は細胞表面上で発現されるかまたは分泌されるかいずれかであり、そして免疫応答が誘発される［１３］。この新たな免疫方法論は、多くの研究者によって、そしてインフルエンザウイルス一般［１４］を含む広い範囲の感染性病原体に対して、そしてウマ・インフルエンザウイルスに特異的に［１５］、有効であることが示されている。Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／８１のＨＡ遺伝子を発現するＤＮＡワクチンを、皮膚および粘膜を介して投与した後、相同ウイルス曝露に対して、ウマが防御されることが示された［１５］。
【００１４】
特許の当該技術分野において、ＥＩＶに対するワクチンおよび方法論が、米国特許第６，４８２，４１４号；第６，４３６，４０８号；第６，３９８，７７４号；第６，１７７，０８２号；第６，０４５，７９０号；第４，９２０，２１３号；第４，６９３，８９３号；第４，６８９，２２４号；第４，６８３，１３７号；第４，６３１，１９１号；および第４，６１９，８２７号に記載されており、これらの特許はすべて、本明細書に援用される。米国特許第４，９２０，２１３号および第４，６３１，１９１号は、ウマ・インフルエンザウイルスに対してウマを免疫する組換えウイルスに関する。２つの株由来のＨＡ糖タンパク質およびＮＡ糖タンパク質をコードするＤＮＡ配列を用いて、ワクシニア所持ワクチンを構築し、初回抗原刺激投与および追加免疫投与のための合成ペプチドを設計し、そしてＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質に基づくワクチンの組換え合成を可能にした。
【００１５】
ウマ・インフルエンザウイルスの理想的なワクチンは、現在のワクチンの上記欠陥に対処して、非常に免疫原性であり、粘膜免疫を誘発し、そして容易な「更新」を行いやすいものでなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
発明の概要
本発明は、ウマ２型インフルエンザウイルス由来のＨＡ糖タンパク質のＨＡ１セグメントをコードする配列を含有するＤＮＡワクチンを鼻腔内投与した際に、防御免疫が与えられるという発見に基づく。ＨＡ１を発現しているＤＮＡワクチンをリポソームベクターに被包し、そしてＢａｌｂ／ｃマウスの鼻腔に接種した。２回の追加免疫ワクチン接種後、致死未満用量の感染性相同ウイルスにマウスを曝露した。非免疫対照群では、７．９％の最大体重損失が観察された。ＤＮＡワクチン免疫群および陽性対照群（不活性化相同ウイルスで免疫）では、観察される体重損失は、それぞれ１．８％および１．６％であった。さらに、ウイルス特異的ＩｇＧ抗体およびＩｇＡ抗体が誘発された。ＨＡの前駆体は、ＨＡ１およびＨＡ２に切断される。抗原性部位は、ウイルス・タンパク質のＨＡ１部分に位置するため、ＨＡ１は免疫原性ウイルス糖タンパク質である。上述のこれらの結果によって、防御免疫を誘発するには、ＨＡ１のみの発現で十分であることが示された。さらに、全長ＨＡ遺伝子を発現するＤＮＡワクチンに比較した際、ＨＡ１  ＤＮＡワクチンが防御を与えるのに必要な投薬量は、はるかにより少ないことが発見された。
【００１７】
ワクチンを更新する際に、新規ウイルス由来のＨＡ１コード配列を挿入することによって、抗原を置換することだけが必要である限り、本発明のＤＮＡワクチンは、現在の不活性化ワクチンまたは生弱毒化ワクチンに勝る、他の利点を所持する。さらに、ワクチンを鼻腔内接種して、粘膜免疫をターゲットとすることも可能である。ワクチンを操作して、発現される抗原の免疫原性を最適化することもまた、可能である。
【００１８】
先行技術に勝る、本発明の発見の別の大きな利点は、遺伝子銃、筋内注射または皮内注射によってＤＮＡワクチンを搬送する場合、導入されたＤＮＡが宿主細胞の染色体に組み込まれるリスクがあることである。不都合な結果または癌の発展を伴う突然変異が、潜在的に起こるリスクがある。リポソーム被包後に鼻腔内接種すると、ＤＮＡワクチンは、気道の上皮細胞に直接搬送される。上皮細胞は高速で入れ替わるため、染色体組込みのリスクは、有意に減少する。さらに、以下に記載するように、ＨＡ１のみを使用する（操作された停止コドンを用いる）と、必要な投薬量が減少し、組込みのリスクがさらに減少するとともに、抗ＤＮＡ抗体が誘発されるリスクも減少する。
【００１９】
したがって、本発明の１つの態様において、ウマ２型インフルエンザウイルスのＨＡ１またはそのエピトープのＤＮＡコード配列を含むＤＮＡワクチン組成物であって、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む、前記ＤＮＡワクチン組成物を提供する。ＨＡ１コード配列は、ウマ２型インフルエンザウイルスの既知の株から選択可能であり、そして１つの態様において、好ましくは、株Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８由来である。特定の例において、ＨＡ１コード配列は配列番号１のヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
本発明の別の態様において、免疫応答を増進するため、そして／または接種後の適切な吸収率を促進するため、ＤＮＡワクチンをアジュバントと合わせる。
本発明のさらなる態様において、ウマ・インフルエンザウイルス感染を防御するかまたはその重症度を減少させるため、ウマにおいて免疫応答を誘導する方法であって、潜在的に危険な状態にある動物に、有効免疫量の本発明のワクチンを、単独で、あるいはアジュバントまたはさらなる抗原性構成要素もしくはコード配列と組み合わせて投与して、ウマ・インフルエンザウイルス感染を抑制する手段を提供することを含み、該ワクチンが、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む、前記方法を提供する。
【００２１】
好ましくは、ＤＮＡワクチンはベクターを含み、そして最も好ましくは、ＤＮＡはリポソームに被包され、そして優れた粘膜免疫を誘発するため、被験者の気道に鼻腔内搬送される。
【００２２】
本発明のより優れた理解、並びに本発明の目的および利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかであり、この説明は、本発明を実行するために意図される、最適の様式を単に例示する目的で、本発明の好ましい態様のみを記載する。理解されるであろうように、本発明は、すべて本発明の範囲および精神から逸脱することなく、多様な明白な観点で修飾が可能である。したがって、本説明は、例示の性質のものと見なすべきであり、そして制限と見なしてはならない。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、本明細書に例示する構築物の詳細および記載する工程への適用に限定されないことを理解することが重要である。本発明は、他の態様および多様な方式で実施するかまたは実行することが可能である。本明細書に使用する言葉遣いおよび専門用語は、説明の目的のためであり、そして限定するものではないことを理解しなければならない。
【００２４】
本発明は、ＥＩＶに対して防御するように設計された、新規ＤＮＡワクチンおよび方法を提供する。本発明は、ＤＮＡ仲介ワクチン接種に関し、そして好ましくは、最新の株いずれかから選択されるＨＡ１またはそのエピトープをコードする単離ＤＮＡのベクターを介して直接導入し、該ＤＮＡが次いで、接種されたウマの細胞内で発現されることを含む。本発明のワクチンを、単独で、あるいは当業者に知られる、さらなる抗原性構成要素もしくはコード配列と組み合わせて、または他のワクチンと組み合わせて、投与することも可能である。
【００２５】
好ましくは、単離ＨＡ１コード配列は、株Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８、Ａ／Ｅｑ／マイアミ／６３、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／８１、Ａ／Ｅｑ／フォンテンブロー／７９、Ａ／Ｅｑ／サスカトゥーン／９０、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９２、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９４およびＡ／Ｅｑ／ニューマーケット／２／９３、Ａ／Ｅｑ／ニューヨーク／９９、Ａ／Ｅｑ／オクラホマ／００からなる群より選択され、そしてより好ましくは株Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８由来である。最も好ましくは、ＨＡ１コード配列は、ケンタッキー／９８由来の配列番号１のヌクレオチド配列を含む。しかし、本明細書に意図するように、本発明は、他の株のＨＡ１コード配列、並びにＨＡ１、そのエピトープ、および／または模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を有効にコードする、その類似体、断片、突然変異体、置換体、合成物、または変異体を含む（ＨＡ１遺伝子のヌクレオチド配列を得ることも可能な、多様なウイルス株と、対応するＧｅｎＢａｎｋ寄託番号のリストに関しては、例えば、本明細書に援用される、以下の参考文献［２］の表１および３を参照されたい）。その結果、本発明は、全長抗原、抗原断片、抗原誘導体、あるいはこうした抗原、抗原断片または抗原誘導体と別のタンパク質との融合産物であることも可能なタンパク質をコードし、そして／または適切な形質転換細胞で発現する、ＤＮＡ配列を含む。本発明はまた、本明細書に記載する株を含む、最新の株の免疫原特性を持つ、単離組換え株を有するＤＮＡワクチンも意図する。
【００２６】
本明細書において定義するような、「単離」ＤＮＡは、天然配列に天然に付随する他の細胞構成要素から実質的に分離されているものである。該用語は、天然存在環境から取り出されている核酸配列を含み、そして組換えＤＮＡ単離体またはクローニングされたＤＮＡ単離体、および化学的に合成された類似体または生物学的に合成された類似体を含む。
【００２７】
用語「ベクター」は、一般的に、多くのものが当該技術分野に知られ、それ自体では「不活性」である（それ自体に対する免疫を誘発しない）、ＤＮＡワクチンベクターいずれかを指し、レシピエントに容易に導入可能であり（挿入物に対する免疫を誘発する）、そして宿主染色体に組み込まれない。本明細書に援用され、そして当該技術分野に知られる多様なベクターおよび搬送系を概説する、米国特許第６，４６８，９８４号および第６，３３９，０６８号を参照されたい。好ましいベクターは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッドから商業的に入手可能なｐＶＡＸ１およびｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ真核生物発現ベクターである。
【００２８】
本発明のワクチンは、機能可能であるように連結されたＨＡ１コード配列の発現を制御する核酸配列を含むことも可能である。発現調節配列は、該発現調節配列が、核酸配列の転写、および必要に応じて翻訳を調節し、そして制御する場合、該核酸配列に機能可能であるように連結されている。したがって、発現調節配列は、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質コード遺伝子直前の開始コドン（すなわちＡＴＧ）、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にする遺伝子の正しい読み枠を維持するイントロンのスプライシングシグナル、および停止コドンを含むことも可能である。
【００２９】
本発明のワクチンは、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤をさらに含む。ワクチンに適したキャリアーは当業者に周知であり、そして限定されるわけではないが、タンパク質、糖などが含まれる。こうしたキャリアーは、水性または非水性溶液、懸濁物、およびエマルジョンであることも可能である。非水性キャリアーの例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能有機エステルである。水性キャリアーには、水、アルコール性／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁物が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース溶液、デキストロースおよび塩化ナトリウム溶液、乳酸加リンゲル溶液または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体補充剤および栄養補充剤、リンゲルのデキストロース溶液に基づくものなどの電解質補充剤等が含まれる。保存剤および他の添加剤もまた存在可能であり、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガス等がある。好ましい保存剤には、ホルマリン、チメロサール、ネオマイシン、ポリミキシンＢおよびアンホテリシンＢが含まれる。
【００３０】
用語「アジュバント」は、接種後、免疫応答を増進し、そして／または適切な吸収率を促進する、化合物または混合物を指し、そして本明細書において、いかなる取り込み促進剤も含む。許容しうるアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオールなどの界面活性物質、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョンまたは炭化水素エマルジョン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールなどが含まれる。好ましいアジュバントは、Ｆｏｒｔ  Ｄｏｄｇｅ  Ａｎｉｍａｌ  ＨｅａｌｔｈのＭＥＴＡＳＴＩＭ（登録商標）アジュバントである。
【００３１】
該方法は、本発明のワクチンの有効免疫用量を動物に投与することを含む。本発明の目的のため、本発明のワクチンの「有効免疫量」は、体重１キログラムあたり少なくとも０．００１μｇのＤＮＡであり、そして好ましくは、体重１キログラムあたり０．００１μｇのＤＮＡ〜体重１グラムあたり０．０１μｇのＤＮＡの範囲内である。望ましい粘膜免疫を誘発するため、ワクチンは、上述のようなリポソーム／アジュバント中に被包された後、好ましくは、鼻腔内投与されるが、望ましいならば、当業者に周知の方法いずれかによって、例えば筋内、皮下、腹腔内、静脈内、経口、皮内、または眼球によって、別の方式で、投与されることも可能である。
【００３２】
本発明を以下の実施例によってさらに例示し、この実施例は、本発明の理解を補助することを意図するが、請求項に示すような本発明を、いかなる点でも制限することを意図せず、そしてそのように見なしてはならない。
【実施例】
【００３３】
（実施例）
材料および方法
ウイルスおよびウイルス増幅：
ウマ２型インフルエンザウイルス、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ博士、ケンタッキー大学から寛大に寄贈された。先に記載されるように［２］、ウイルス増幅および性質決定を行った。簡潔には、９〜１１日齢の孵化鶏卵中、ウイルスを３７℃で７２時間培養した。Ｍａｈｒら［１６］に記載されるように、尿膜液を採取した。１０００ｇで１５分間遠心分離することによって清澄にした後、ニワトリ赤血球を用いた赤血球凝集アッセイによって、ウイルス力価を決定した。
【００３４】
ＤＮＡワクチンの構築：
クローニング用のＤＮＡテンプレートを合成するため、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ＨＡ１オープンリーディングフレームを調製した。ウイルスＲＮＡを抽出し、そして単一１２プライマー（５’ＡＧＣＡＡＡＡＧＣＡＧＧ３’）（配列番号２）およびＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いてｃＤＮＡを合成した。プライマーＥＨ３−２９＋（５’ＣＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＴＴ３’）（配列番号３）およびＥＨ３−１０６１−（５’ＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＡ３’）（配列番号４）またはＥＨ３−２９＋およびＥＨ３−１０６１ＳＴＯＰ（５’ＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＧＴＡ３’）（配列番号５）を用いたＰＣＲによって、テンプレートを合成した。９５℃１分間、４５℃２分間、および７２℃３分間を２５周期で、そしてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて、ＰＣＲを行った。製造者の指示にしたがって、ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ真核生物ベクターに連結した。２つのクローンを同定し、そして続く実験に用いた：ｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−６およびｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−１１（逆方向プライマー中に構築された停止コドンを含む）。感染したウマ由来の回復期血清を用い、ＰＣＲによって、そしてウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって、ＨＡ１の発現を確認した。ｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−１１をＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで制限エンドヌクレアーゼ消化して、ＨＡ１挿入物を切り出し、その後、ｐＶＡＸ１のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入物を連結することによってさらなるクローンを構築し、その結果、ｐＶＡＸ／ＫＹ８９−１１を生成した。
【００３５】
ＤＮＡ免疫およびウイルス曝露：
大腸菌中でプラスミドＤＮＡを増幅し、ＭａｘｉＰｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、該ＤＮＡを抽出し、そして精製した。分光解析によって、そして制限エンドヌクレアーゼ消化後のアガロースゲル電気泳動によって、ＤＮＡ調製物の濃度および純度を決定した。ＤＮＡワクチン接種のため、ＤＮＡ調製物を、ダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナ州インディアナポリス）中で、２０μｇ／ｍｌに希釈した。接種前に、等体積のリポフェクタミン（Ｒｏｃｈｅ）溶液（ＤＭＥＭ中２０μｇ／ｍｌ）と懸濁物を、室温で２０分間混合した。
【００３６】
４〜８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、メイン州バーハーバー）を４匹の群に分けた。鼻腔内接種のため、各マウスをイソフルラン（フォーレン、１−クロロ−２，２，２−トリフルオロエチルジフルオロメチルエーテル）で麻酔した。マイクロピペットを用いて、２５．０μｌのＤＮＡ懸濁物（０．０１μｇ／ｇ体重の投薬量）を鼻腔にしみこませた。２群のマウスには、ＤＮＡワクチンを投与し、一方にはｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−６を、そして第二の群にはｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−１１を投与した。２つの陰性対照群も含んだ。１群にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を接種し、そして第二の群には、緑色蛍光タンパク質を発現する非関連プラスミドＤＮＡベクター（ｐＧＦＰ／グリーンランタン、Ｇｉｂｃｏ，  ＢＲＬ）を接種した。さらなる群には、陽性対照群として、マウスあたり、８．０ＨＡ単位（１．６ｘ１０７の５０％鶏卵感染用量［ＥＩＤ５０］、または１ｘ１０６疫病（ｐｌａｇｕｅ）形成単位［ｐｆｕ］と同等）のＵＶ不活性化Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８を接種した。第２１日および第３５日に、同じ投薬量で、２回の追加免疫ワクチン接種を投与した。第５０日にウイルス曝露を行った（第二の追加免疫の１５日後）。各マウスに、１６ＨＡ単位（３．２ｘ１０７  ＥＩＤ５０、または２ｘ１０６ｐｆｕと同等）の相同ウイルス（Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８）を鼻腔内接種し、そして続く１０日間、各マウスの体重を測定した。
【００３７】
さらに、ＤＮＡワクチン接種が特異的抗体を誘発するかどうか調べるため、第０日、第２１日、第３５日、第５０日および第６５日に、後眼窩出血（麻酔後）によって、血清を収集した。これらの時点は、それぞれ、「プレ出血」、第一の追加免疫ワクチン接種および第二の追加免疫ワクチン接種、ウイルス曝露、および曝露１５日後に相当する。
【００３８】
ウイルス特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）：
スクロース勾配で精製した相同ウマ・インフルエンザウイルス、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８の懸濁物を用いて、ＥＬＩＳＡプレートを調製した。５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３緩衝液中で、０．６ＨＡ単位／ｍｌにウイルスを希釈し、そしてこのウイルス懸濁物１００μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加した。抗原がプレート上に「コーティング」されるように、プレートを室温で２４時間放置した。ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッキング緩衝液［２．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１．０％スキムミルクを含有するＰＢＳ］を添加し、そして室温でさらに１時間インキュベーションした。ＰＢＳで再び洗浄した後、１００μｌの希釈マウス血清（２．０％  ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１０）を添加し、そして上述のようにインキュベーションした。室温で１時間インキュベーションし、そしてＰＢＳで洗浄した後、１００μｌの希釈（２％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：２０００）アルカリホスファターゼ・コンジュゲート化ウサギ抗ネズミＩｇＧまたはＩｇＡ抗血清（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を添加した。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを再びＰＢＳで洗浄し、そして１００μｌの「基質」を添加した［１．０ｍｇ／ｍｌの４−ニトロフェニルリン酸溶液（ｐＮＰＰ）、Ｓｉｇｍａ］。室温で２．５時間インキュベーションした後、マイクロプレート読取装置（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、バーモント州ウィヌースキ）を用いて、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。すべての血清試料を３つ組でアッセイした。「プレ出血」血清の平均吸光度を、免疫血清の吸着値から減じ、そして結果を４０５ｎｍでの光学密度の増加（ΔＯ．Ｄ．４０５）として表した。
【００３９】
結果
ＤＮＡワクチンの検証：
３つのＤＮＡワクチンベクターを構築し、そして同定した。これらを、ＰＣＲによって、そして制限消化によって、両方で性質決定した。ＰＣＲおよび制限解析によって、挿入物が正しいサイズ（およそ１．０ｋｂ）であり、そして図１に示すようなｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯおよびｐＶＡＸ１ベクター中のＣＭＶプロモーターに関して正しい方向であることが示された。ＥＨ３−１０６１ＳＴＯＰプライマーに含有される停止コドンは、ＨＡ１遺伝子挿入物の翻訳が、ベクターｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−１１のＶ５エピトープおよびＨｉｓ６タグをコードする配列の前で終結するようにする。ｐＶＡＸ／ＫＹ９８−１１は、ＨＡ１内の「内蔵」停止コドンを利用する。一方、ベクターｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−６では、挿入物の終結は、ベクター中の停止コドンに依存し、したがって産物は、カルボキシ末端で、Ｖ５およびＨｉｓ６「タグ」に連結される。回復期ウマ血清を用いたウェスタンブロット・ハイブリダイゼーションによって、どちらのベクターも、ＭＤＢＫ細胞にトランスフェクションした後、ＨＡ１抗原の正しい発現と一致する、およそ５０ｋＤのタンパク質を産生することが立証された（データ未提示）。
【００４０】
ＤＮＡ免疫およびウイルス曝露：
マウスは、インフルエンザウイルス感染に特徴的な明白な呼吸器症状を発展させないため、体重損失モデルを使用して、ＤＮＡワクチンの有効性を評価した。ウイルス曝露およびそれに続く回復後の体重損失を、症状の重症度、そしてしたがって、ＤＮＡワクチンによって与えられる防御レベルを比較する基準とした。ウイルス曝露後、各マウスの体重を毎日測定し、そして結果を、ウイルス曝露前の体重に対する体重変化パーセントとして表した。各群に関して、平均体重損失に加えて平均の標準誤差（ＳＥＭ）を、感染後の日数に対してプロットし、これを図２に示す。
【００４１】
ワクチン接種したマウス（両方のＤＮＡワクチンベクターまたはＵＶ不活性化ウイルスを用いる）は、ウイルス曝露後、無食欲、「ふわふわした外皮（ｆｌｕｆｆｙ  ｃｏａｔ）」の外観（発熱の指標）、および無活動などの臨床的症状をほとんどまたはまったく発展させないことは、注目に値した。ＰＢＳで免疫した陰性対照群は、重症感染の徴候を示し、そして第１日に体重を失い始め、ウイルス曝露後、第８日に、最大７．９％の体重を失った。体重損失は、１０日より長く持続した。第二の陰性対照群（ｐＧＦＰ）もまた、最初の３日間、有意な体重損失（４．６％体重）を示し、次いで、回復し始めた。対照的に、免疫群はいずれも、いかなる有意な体重損失も示さなかった。
【００４２】
体重の変化に対して、ペアード・スチューデントｔ検定を行って、統計的有意性があるかどうかを決定した。ＰＢＳ対照群にｐＴＯＰＯＫＹ９８−６およびｐＴＯＰＯＫＹ９８−１１を比較したＰ値は、それぞれ、０．００１および０．００６であった。これは、陽性対照群（ＵＶ不活性化ウイルスで免疫）およびＰＢＳ群間のＰ値が０．０００１であるのに匹敵する。したがって、どちらのＤＮＡワクチンベクターに関しても、これらは、不活性化ウイルスに誘発されるものと類似の防御免疫を誘発した。
【００４３】
ウイルス特異的ＩｇＧおよびＩｇＡの力価測定：
ＥＬＩＳＡの結果を図３Ａおよび図３Ｂに示す。上述のように、対照血清のＯ．Ｄ．４０５ｎｍを推定し、そして結果を、３つ組ウェルの増加したＯ．Ｄ．４０５ｎｍの平均として標準誤差を加えて表す。第２１日および第３５日に、追加免疫ワクチン接種を投与し、そして第５０日に、マウスを生ウイルスに曝露した。ウイルス曝露１５日後にもまた、血清を試験した。
【００４４】
ＵＶ不活性化ウイルスで免疫したマウス（陽性対照群）では、ウイルス特異的ＩｇＧは、早くも第２１日に検出され、増加したＯ．Ｄ．は０．４９であった（図３Ａ）。しかし、ＩｇＡは、わずかにしか検出されず、増加したＯ．Ｄ．は０．０９であった（図３Ｂ）。第３５日、第一の追加免疫の２週間後、ＩｇＧレベルは、３倍より多く増加した。興味深いことに、第二の追加免疫ワクチン接種によって、ＩｇＧレベルがさらに増加するのでなく、第５０日のＩｇＧレベルは、第３５日のものより、実際に低かった。しかし、生ウイルス曝露後、期待通りに、ＩｇＧレベルの増加があり、Ｏ．Ｄ．は１．２から約１．７になった。ＩｇＡでも同様のパターンが観察された。しかし、そのレベルは有意に低かった。
【００４５】
ＤＮＡワクチン免疫群に関しては、どちらも検出可能なウイルス特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ応答を有し、そしてそのパターンは、ＵＶ不活性化ウイルスに誘発されるものと類似である。第一の追加免疫ワクチン接種後、ＩｇＧおよびＩｇＡの１．５〜２倍の増加があった（ｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−６ワクチン接種群では、増加はそれぞれ、０．３１から０．５５、そして０．１７から０．３６）。同様に、第二の追加免疫ワクチン接種は、ＩｇＧまたはＩｇＡのレベルをさらには上昇させなかった。しかし、ＩｇＧは、ウイルス曝露後、３倍より多く増加した。ＩｇＡもまた上昇したが、２倍未満であった。
【００４６】
興味深いことに、非特異的ベクター、ｐＧＦＰをワクチン接種した陰性対照群では、ウイルス曝露前に、ウイルス特異的ＩｇＧまたはＩｇＡが「検出」された。しかし、０．２  Ｏ．Ｄ．未満の増加は、非特異的結果である可能性もある。ウイルス曝露後、初感染で期待されるように、ＩｇＧおよびＩｇＡ両方が検出された（図３Ａおよび図３Ｂ）。同様に、ＰＢＳ免疫群に関しては、ウイルス曝露１５日後のＩｇＧおよびＩｇＡのＯ．Ｄ．は、それぞれ、１．６８±０．１２および０．３５±０．０３であった（データ未提示）。
【００４７】
考察
防御のためのより少ないＤＮＡ
インフルエンザウイルスは、ＤＮＡワクチン研究において、モデル生物として用いられてきている。早くも１９９３年には、ＨＡ発現プラスミドがインフルエンザに対する防御を与えることが示されていた［１７］［１８］［１９］［１３］。しかし、これらの研究は、全長ＨＡ遺伝子からなるＤＮＡ構築物を用いて行われた。ＨＡは、受容体結合および膜融合のためのウイルス糖タンパク質であり、そしてＨＡ２分子の大半は、膜内在性タンパク質である。赤血球凝集素は、ＨＡ０前駆体として合成され、次いでタンパク質分解的にＨＡ１およびＨＡ２に切断される。ＨＡ１は主な防御抗原性部位を含有し、そしてウイルス・エンベロープに係留されているＨＡ２に、非共有的に連結される［２０］。本明細書において、ＨＡ１単独の発現が、防御免疫を誘発するのに十分であることを報告する。前駆体ＨＡ０をＨＡ１およびＨＡ２に切断するには、組織特異的プロテアーゼが必要であるため、ＨＡ２を除くと、酵素プロセシングの必要性が回避可能である。さらに、ＨＡ２の非存在下では、合成されるＨＡ１は膜結合性でなく、そしてしたがってより多くのＨＡ１分子が遊離し、そして抗原提示細胞に取り込まれて、より強い免疫応答を誘発することが可能になる。したがって、このＤＮＡワクチンの免疫原性は、有意に増進する。さらに、このＤＮＡワクチンは、免疫のため、より少ない量しか必要でない。体重１グラムあたりわずか０．０１μｇ  ＤＮＡによって防御免疫が誘発され、これはＷｏｎｇら［２１］に報告されるより１０倍低く、そして遺伝子銃接種で用いられるより２倍低い［１７］。Ｆｙｎａｎらに報告されるのと同じ投薬量を、平均４００ｋｇのウマに適用する場合、必要なＤＮＡ量は、接種あたり４．０ｍｇであろうことに注目すべきである。
【００４８】
さらに、ＤＮＡワクチンを被包し、より少ないＤＮＡで免疫し、そして粘膜部位に接種することによって、体細胞または生殖系列細胞にＤＮＡが組み込まれる潜在的可能性のリスクが、有意に減少する。
【００４９】
ＩｇＡの役割
インフルエンザウイルスは、気道で感染を開始する。多くの先の研究が示すように、インフルエンザウイルスまたは他の呼吸器感染に対する防御では、粘膜免疫が重要である［２２、２３］。分泌性ＩｇＡは、粘膜免疫に重要な役割を果たす。ＩｇＡは、インフルエンザウイルス感染に対する防御に関与することが示されている［２４］。さらに、インフルエンザ特異的ＩｇＡの受動移入によって、インフルエンザウイルス感染からレシピエントマウスが防御される［７］。Ｌｕｎｎらは、ポニーにおいて、ウマ・インフルエンザウイルスに対するＤＮＡワクチンを調べた［１５］。遺伝子銃を用いて、舌、結膜、および瞬膜を含む、いくつかの粘膜部位にＤＮＡワクチンを搬送した。各場合で、強いＩｇＧ応答が刺激された。しかし、誘発されたＩｇＡ応答は劣っていた。
【００５０】
結果によって、ＤＮＡワクチンをリポソームに被包し、そしてＤＮＡワクチンを気道に搬送すると、よりよい粘膜免疫が誘発されることが示される。血清ウイルス特異的ＩｇＡに対応する増加があったため、防御はおそらく、気道（粘膜部位）のＩｇＡによって仲介されるのであろう。
【００５１】
追加免疫および非特異的免疫
結果によって、第二の追加免疫はウイルス特異的ＩｇＧまたはＩｇＡの力価の増加を生じないため、不要である可能性もあることが示唆される。おそらく、第一の追加免疫ワクチン接種後の力価は、数週間残ることも可能であり、第二の追加免疫を不要にするのであろう。あるいは、ウイルス特異的抗体の存在が、第二の追加免疫ワクチン接種によって導入されるさらなる抗原を中和した可能性もある。
【００５２】
興味深いことに、どちらのＤＮＡワクチン接種群でも、ウイルス曝露後、ＩｇＧレベルは３倍より多く増加した（図３Ａ、ｐＴＯＰＯＫＹ９８−６およびｐＴＯＰＯＫＹ９８−１１両方）。対照的に、ＵＶ不活性化ウイルスでは、増加は１倍未満であった。この観察は、ＤＮＡワクチンが優れた初回抗原刺激応答を誘発するという、他の研究者による先の報告に匹敵する。ＤＮＡワクチンによるこの「非アムネスティー（ａｎａｍｎｅｓｔｙ）」応答は、おそらく、不活性化抗原に誘発される応答とは、動力学および抗原提示経路が異なることによるのであろう。さらに、ＤＮＡワクチンによる免疫応答の誘導に利用可能な抗原の真の量を決定するのは困難であり、ＤＮＡワクチンによるこの「初回抗原刺激効果」増進の機構は解明されていないままである。
【００５３】
ｐＧＦＰで免疫したマウス（陰性対照として用いる）の体重損失が第３日にピークとなり、そして他の陰性対照群（ＰＢＳ）より有意に早い、第４日には回復し始めたことに注目することもまた、興味深い。ＰＢＳ群に対するペアード・スチューデントｔ検定は、０．０３３のＰ値を生じた。しかし、これらのマウスは、ＰＢＳ対照群と類似の臨床的特徴を有した。さらに、体重損失は、ウイルス曝露後の最初の３日間はＰＢＳ群に匹敵した。真の防御の基準が、臨床的症状がまったくないことであるならば、Ｐ値が有意であったとしても、これらのマウスは「防御」されていない。ウイルス曝露前に、ウイルス特異的抗体はまったく検出されなかった（吸光度値がバックグラウンドレベルの境界であった）ため、「より早期の回復」は、特異的免疫のためではない。ＤＮＡワクチンベクターの特定のモチーフが、非特異的免疫を誘発することが周知である。粘膜部位でリポソームを導入することもまた、非特異的免疫を誘導しうる。
【００５４】
さらなるデータ
ウマにおける粘膜免疫のプロトコルを確立するため、数頭のウマに、本発明のＤＮＡワクチンを鼻腔内接種し、そして数週間後に鼻洗浄液を収集すると、ウイルス特異的抗体に対する陽性シグナルが明らかになった。
【００５５】
参考文献
以下の刊行物を本明細書に援用する：
【００５６】
【化１】
2007525456.tif 000002
【００５７】
【化２】
2007525456.tif 000003
【００５８】
【化３】
2007525456.tif 000004
【００５９】
【化４】
2007525456.tif 000005
【００６０】
上記を考慮すると、本発明のいくつかの目的が達成され、そして他の好適な結果が得られたことがわかるであろう。本発明の範囲から逸脱することなく、多様な変化を作成可能であるため、上記説明に含有されるか、または付随する図に示されるすべての事柄は、例示として解釈すべきであり、そして限定した意味で解釈してはならないことが意図される。本発明は、特定の度合いの具体性を持って記載されているが、本発明は、例示の目的で本明細書に示した態様（単数または複数）には限定されず、請求項の各要素が権利を与えられるのと同等の完全な範囲を含めて、付随する単数または複数の請求項の範囲によってのみ限定されることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１は、本発明のＤＮＡワクチンの実施例態様の模式的マップである。Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８のＨＡ１遺伝子を、真核生物発現ベクター：どちらもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から入手可能なｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯまたはｐＶＡＸ１いずれかに挿入する。ウマ２型インフルエンザウイルス（例えばＡ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８）のＨＡ１を発現する構築ベクターのうち、ｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−６はベクターが提供する停止コドンを利用し、一方、ｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−１１およびｐＶＡＸ／ＫＹ９８−１１の場合は、ＰＣＲ中、逆方向プライマーによって停止コドンが提供される。挿入物：Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８のＨＡ１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１９７２４１）。シグナルペプチドを最初の列に示す。囲んだ配列：抗原性部位Ａ（１３２〜１４６）；部位Ｂ（１８７〜１９９）；部位Ｃ（５１〜５５、２７３〜２７８）；および部位Ｄ（１７１〜１７４、２０９〜２１７、２４１〜２４６）。Ｖ５：Ｖ５エピトープ；Ｈｉｓ６：６ヒスチジンタグ；ＢＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモン・ポリアデニル酸シグナル。
【図２】図２は、記載する体重損失研究の実験結果を反映するグラフである。感染マウスの体重損失パーセントを、ウイルス曝露後の日数に対してプロットする。不活性化ＫＹ９８：陽性対照群；ＰＢＳおよびｐＧＦＰ：陰性対照群。ｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−６およびｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−１１：ＤＮＡワクチン免疫群。ＰＢＳ対照群、並びにｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−６およびｐＴＯＰＯ／ＫＹ９８−１１間のスチューデントｔ検定のＰ値は、それぞれ、０．００１および０．００６である。
【図３Ａ】図３Ａは、血清ウイルス特異的ＩｇＧに関する、記載するＥＬＩＳＡの実験結果を反映するグラフである。第２１日および第３５日に、追加免疫を投与した。＊で示すような、第二の追加免疫の１５日後の第５０日、および感染１５日後にウイルスに曝露した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、血清ウイルス特異的ＩｇＡに関する、記載するＥＬＩＳＡの実験結果を反映する別のグラフである。第２１日および第３５日に、追加免疫を投与した。＊で示すような、第二の追加免疫の１５日後の第５０日、および感染１５日後にウイルスに曝露した。
【図１】
2007525456.tif 000006
【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月13日(2007.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウマ・インフルエンザウイルスのワクチンであって、ＨＡ２をコードするＤＮＡを欠き、少なくともＨＡ１タンパク質の断片をコードする配列を含む単離ＤＮＡの有効免疫量、ここで該配列はウマ２型インフルエンザウイルスの株に由来する；および、薬理学的に許容しうるキャリアーまたは希釈剤を含む、前記ワクチン。
【請求項２】
ウマ２型インフルエンザウイルスの株が、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８、Ａ／Ｅｑ／マイアミ／６３、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／８１、Ａ／Ｅｑ／フォンテンブロー／７９、Ａ／Ｅｑ／ケンタッキー／９４、Ａ／Ｅｑ／ニューマーケット／２／９３、Ａ／Ｅｑ／ニューヨーク／９９、およびＡ／Ｅｑ／オクラホマ／２０００からなる群より選択される、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
株がＡ／Ｅｑ／ケンタッキー／９８である、請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
ＨＡ２をコードするＤＮＡを欠き、少なくともＨＡ１タンパク質の断片をコードする配列が配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項５】
さらなる抗原性構成要素、さらなる抗原性構成要素のコード配列、および他のワクチンからなる群の１以上をさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項６】
ＨＡ２をコードするＤＮＡを欠き、少なくともＨＡ１タンパク質の断片をコードする配列を含有するベクターをさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項７】
ベクターが真核発現ベクターである、請求項６記載のワクチン。
【請求項８】
ベクターが、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯおよびｐＶＡＸ１からなる群より選択される、請求項７記載のワクチン。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項１０】
アジュバントが、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、ミネラルゲル、表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョンまたは炭化水素エマルジョン、キーホール・リンペット（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）・ヘモシアニン、およびジニトロフェノールからなる群より選択される、請求項９記載のワクチン。
【請求項１１】
ＨＡ２をコードするＤＮＡを欠き、少なくともＨＡ１タンパク質の断片をコードする配列が被包されているリポソームをさらに含む、請求項１記載のワクチン。
【請求項１２】
ウマ・インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、ウマに、請求項１のワクチンの有効免疫量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１３】
ＨＡ２をコードするＤＮＡを欠き、少なくともＨＡ１タンパク質の断片をコードする配列をベクターに挿入し、そしてワクチンを気道に鼻腔内搬送する工程をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ベクターが真核生物ベクターである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ベクターが、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯおよびｐＶＡＸ１からなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ベクターがリポソームである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
体重１グラムあたり少なくとも０．０１μｇのＤＮＡの投薬量でワクチンを投与する、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
体重１キログラムあたり０．００１μｇのＤＮＡ〜体重１グラムあたり０．０１μｇのＤＮＡの範囲内の投薬量でワクチンを投与する、請求項１２記載の方法。