(57)【要約】  本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び予防するための栄養及び医薬組成物、並びに製品のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を増大させるための方法に関する。それに加えて本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）の活性を阻害するため、特にシクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び予防するための医薬品又は機能食品を調製するための、１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び／又は予防するための栄養及び／又は医薬組成物であって、治療上有効量の１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品を含み、前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品がシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える、栄養及び／又は医薬組成物。
【請求項２】
１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品が、ホエー分画、スキムミルク分画、ラクトシル化ホエータンパク質調製品、ヒト乳、ウシ乳、水牛乳の未処理ホエータンパク質の単離調製品、ウシ乳の酸性カゼイン分画及び／又は甘味カゼイン分画、及び／又はこれらの組合せ、或いは表７の亜分画１及び８〜１７からなる群から選択される、請求項１に記載の栄養及び／又は医薬組成物。
【請求項３】
ホエー分画が酸性ホエー、甘味ホエー及び可溶性ホエーからなる群から選択される、請求項２に記載の栄養及び／又は医薬組成物。
【請求項４】
前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の生物学的利用能及び／又は生物分解安定性が、その中に含まれる１つ又は複数の成分の１つ又は複数の官能基を保護することによって増大される、前記請求項のいずれかに記載の栄養及び／又は医薬組成物。
【請求項５】
乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳系発酵製品、アイスクリーム、シリアル系製品、乳系粉末、乳児用調製粉乳又はペットフードから選択される食材を含む、前記請求項のいずれかに記載の栄養組成物。
【請求項６】
経口、局所、非経口、又は直腸投与形態である、前記請求項のいずれかに記載の栄養及び／又は医薬組成物。
【請求項７】
シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び／又は予防するための栄養及び／又は医薬組成物を調製するための、シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を示す１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の使用。
【請求項８】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を示す乳タンパク質分画及び／又は乳タンパク質調製品が、ホエー分画、スキムミルク分画、ラクトシル化ホエータンパク質調製品、ヒト乳、ウシ乳、水牛乳の未処理ホエータンパク質の単離調製品、ウシ乳の酸性カゼイン分画及び／又は甘味カゼイン分画、及び／又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
栄養及び／又は医薬組成物が経口、局所、非経口、又は直腸投与形態で与えられる、請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患が、癌及び／又は前癌性状態、特に結腸、胃、食道、肝臓、胆管、膵臓、頭部及び首部、肺、乳、膀胱、女性生殖器及び皮膚の癌及び／又は前癌性状態、並びに／或いは炎症性疾患、特に関節炎、リウマチ熱、インフルエンザ又は他のウイルス感染に伴う症状、月経困難症、頭痛、歯痛、変形性関節疾患、並びに／或いはアルツハイマー病からなる群から選択される、請求項７から９までに記載の使用。
【請求項１１】
医薬及び／又は栄養組成物が、癌治療及び／又は前癌性状態の治療中、特に化学療法、放射線療法、生物療法中、及び／又は疼痛の治療中、並びに／或いは炎症性疾患の治療中並びに／或いはアルツハイマー病の治療中に同時治療をもたらす、請求項７から９までのいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
栄養組成物が乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳系発酵製品、アイスクリーム、シリアル系製品、乳系粉末、乳児用調製粉乳から選択される食材を含む、請求項７から１０までのいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
製品のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を増大させるための方法であって、前記製品においてシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の量を増大させることを含む方法。
【請求項１４】
１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品が、ホエー分画、スキムミルク分画、ラクトシル化ホエータンパク質調製品、ヒト乳、ウシ乳、水牛乳の未処理ホエータンパク質の単離調製品、ウシ乳の酸性カゼイン分画及び／又は甘味カゼイン分画、及び／又はこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記製品が栄養及び／又は医薬及び／又は機能食品組成物である、請求項１３又は１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える乳タンパク質分画を単離するための方法であって、
クリーム層及びスキムミルクの層を得るために乳を１３．６００ｇで３０分間遠心分離にかけるステップと、
前記クリーム層を分離し、前記スキムミルクを単離するステップと、
２ｍｍｏｌ／ｌＣａ２＋の最終濃度が得られるような量のＣａＣｌ２の水溶液をスキムミルクに加えるステップと、
前記混合物を３５℃まで加熱し、１リットル当たり５０ｍｇの活性キモシンの活性を有するレンネットを前記混合物に加えるステップと、
３０分間１３．６００ｇで混合物を遠心分離にかけて相分離を得るステップと、
甘味ホエータンパク質相を単離するステップ、
又は
前記混合物を２５℃まで加熱し、前記混合物をＨＣｌ（３２％）の水溶液を用いて４．６のｐＨまで酸性化して酸性ホエータンパク質相を得るステップと
を含む方法。
【請求項１７】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える乳タンパク質分画を単離するための方法であって、
クリーム層及びスキムミルクの層を得るために乳を１３．６００ｇで３０分間遠心分離にかけるステップと、
前記クリーム層を分離するステップと、
前記スキムミルクを単離するステップと、
２ｍｍｏｌ／ｌＣａ２＋の濃度を有する混合物が得られるような量のＣａＣｌ２の水溶液をスキムミルクに加えるステップと、
非可溶性ミセルカゼイン相から可溶性酸性ホエータンパク質相を分離するために１０００００ｇで１時間遠心分離にかけるステップと、
可溶性酸性ホエータンパク質相を単離するステップとを含む方法。
【請求項１８】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える乳分画であって、請求項１６又は１７に記載の方法に従って入手可能である乳分画。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び／又は予防するための栄養及び医薬組成物、及び製品のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を増大させるための方法に関する。詳細には本発明は、シクロオキシゲナーゼ−２の活性を阻害するため、特にシクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び／又は予防するための食品又は医薬品を調製するための、１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素は、アラキドン酸をプロスタグラジン（ＰＧ）に転換するのに必要とされる重要な酵素である。ＣＯＸの２つのイソ型、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２がこれまで同定されており、これらは多くの点で異なっている。ＣＯＸ−１は大部分の組織で構成的に発現され、胃粘膜の維持及び腎血流の調節などの正常な生理機能を制御するプロスタグラジンの生成を担うと推定される。第２のイソ型ＣＯＸ−２は、大部分の正常組織において構成的に発現されないようであるが、非常に誘導性であり、特定の位置のみで、例えば炎症の部位及び癌細胞において発見することができる。
【０００３】
ＣＯＸ酵素は膜と結合することが見出されており、それらは従来の膜貫通領域を有していない。その代りにＣＯＸ酵素は、疎水性領域を形成するための並列する４個の両親媒性ヘリックスを含む。この疎水性領域は、膜中の酵素の「下側」部分を固定する。シクロオキシゲナーゼの活性部位は、両親媒性ヘリックス近くの疎水性領域中に位置する。酵素の基質及び阻害剤は、脂質二重層中に含まれるチャンネルを介して活性部位に達すると考えられる（Ｗ．Ｋｒａｕｓｅ、Ｒ．Ｎ．Ｄｕｂｏｉｓ、「プロスタグラジン及び他の脂質メディエーター（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）」６１（２０００）、１４５〜１６１）。
【０００４】
ＣＯＸ阻害剤、特にＣＯＸ−２阻害剤は、炎症疾患などのさまざまな異なる疾患を治療するために使用されており、鎮痛剤としても使用されている。さらに、ＣＯＸ−２は前悪性及び悪性組織中で一般に過剰発現されることが見出されてきており、ＣＯＸ−２阻害剤を用いた治療は、動物の腸、食道、舌、乳、皮膚、肺及び膀胱の腫瘍の形成を減らすことが示されている（Ｋ．Ｓｕｂｂａｒａｍａｉａｈ、Ａ．Ｊ．Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇ、「薬理科学の傾向（ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」２４（２００３）、９６〜１０２）。
【０００５】
例えばアスピリン及びイブプロフェンなどの、さまざまなよく知られている非ステロイド抗炎症薬（いわゆるＮＳＡＩＤ）は、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２を阻害する。近年、ＣＯＸ−２酵素のみを特異的に阻害する、新たなクラスの阻害剤（ＣＯＸＩＢ）が記載されている（Ｍ．Ｅ．Ｔｕｒｉｎｉ、Ｒ．Ｎ．Ｄｕｂｏｉｓ、「生理学及び疾患（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．）」Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５３（２００２）、３５〜５７）。しかしながらＮＳＡＩＤは、重大な副作用、例えば腎臓の問題並びに十二指腸及び胃潰瘍を引き起こすことが知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって本発明の課題は、シクロオキシゲナーゼ、特にＣＯＸ−２を阻害するための他の手段を提供することであり、それらの手段は有害な副作用の危険性が低いことと結び付かなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この課題は、ＣＯＸ−２によって介在される疾患を治療及び／又は予防するための、ＣＯＸ−２阻害活性を示す特異的な乳の分画及び／又は調製品を提供することによって解決された。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
一態様によれば、本発明はシクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び／又は予防するための栄養及び／又は医薬組成物を提供し、前記組成物は治療上有効量の１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品を含み、シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える。
【０００９】
本出願中で使用する用語「シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療及び／又は予防する」は、発現、特にシクロオキシゲナーゼ−２の増大した発現と関係がある疾患を治療すること、及び個体の身体の特定部位におけるシクロオキシゲナーゼ−２のレベルを低下させることによって、或いは個体の身体中の特定部位におけるシクロオキシゲナーゼ−２のレベルの上昇を防ぐことによって影響を受ける可能性がある疾患を予防することを含む。シクロオキシゲナーゼ−２の増大したレベルは、健康な個体中の特定部位に平均して統計的に存在するシクロオキシゲナーゼ−２のレベルを上回る量を示す。
【００１０】
本発明に従い予防及び治療することができる、シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患及び／又はその発症の第一群は、その前癌性状態のいずれかを含めた癌である。手元の科学データに従い、前悪性及び悪性組織中でＣＯＸ−２が過剰発現され、このようなＣＯＸ−２の増大した発現は腫瘍形成の誘導の際に少なくとも部分的に関係があると現在仮定されている。実際、ＣＯＸ−２のこのような過剰発現は、例えば結腸、胃、食道、肝臓、胆管（ｂｉｌｉａｒｙ  ｓｔｅｍ）、膵臓、頭部及び首部、肺、乳、膀胱、女性生殖器及び皮膚などの器官中の幾つかの前悪性及び悪性状態において観察されてきている。さらに、従来技術のＣＯＸ−２阻害剤に基づく腫瘍の首尾よい治療は既に達成されている。したがって、本発明の組成物の投与は、癌及び／又は前癌性状態を治療及び／又は予防する際に役立つであろう。
【００１１】
さらにＣＯＸ−２阻害剤は、その存在が疼、熱及び炎症の発症及び進行と関係があるプロスタグラジンの形成を阻害することが示されてきている。本発明に従い治療及び／又は予防を目的とする、シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患の他の標的群は、関節炎、リウマチ熱、インフルエンザ又は他のウイルス感染に伴う症状、月経困難症、頭痛、歯痛、変形性関節疾患などである。さらにアルツハイマー病は、本発明の標的疾患であるとみなされる。何故ならＣＯＸ−２阻害剤は、この疾患の発症に対して予防効果があることが示されてきているからである。
【００１２】
本発明の栄養及び／又は医薬組成物は、必要性のある任意の個体、好ましくは哺乳動物、特にヒト及び動物、例えばペットに投与するように設計する。
【００１３】
本明細書で言及する「シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性」は、以下で実施例中に示すＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞に基づいて、且つ当分野で知られている他のアッセイにも基づいてＣＯＸ−２スクリーニング法に従い測定することができる。
【００１４】
所与の個体に具体的に必要とされる、１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の治療上有効量は、例えば体重、年齢、一般的な健康状態、性別、食事、投与の時間、投与の経路、排出率、薬剤の組合せなどのさまざまな要因を考慮して当業者の当分野の一般知識に従って、当業者により容易に決定することができる。基本的に、特定の個体に関する特別な投薬方式は、疾患の一般的予防又は急性治療が目的とされるかどうかという事実に依存するであろう。例えば、前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の１日量は、７０ｋｇの人間の場合７ｍｇと７０ｇの間から選択することができる、すなわち１日量が体重１キロ当たり約０．１ｍｇ〜約１ｇに相当する量から選択してよく、約０．５ｍｇ〜約１００ｍｇに相当する量から選択することが好ましく、約５ｍｇ〜約７０ｍｇに相当する量から選択することがさらに好ましく、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇに相当する量から選択することが一層さらに好ましい。
【００１５】
本発明の栄養組成物は、水、タンパク質及び／又はペプチド、炭水化物、脂肪からなる群から選択される少なくとも１つの物質を含むヒト又は動物が消費するのに適した任意の組成物である。
【００１６】
本発明の医薬組成物は、本明細書で詳細に述べる少なくとも１つの治療上活性がある化合物を含む任意の組成物である。
【００１７】
さらに本発明は、栄養及び／又は医薬組成物を提供し、この組成物はシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える多量の前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品を含み、前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の量が増大していない栄養及び／又は医薬組成物のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性より高い、シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える。
【００１８】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える、このような多量の前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品は、さらなる量の前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品を加えることによって、且つ／或いは乳分画と生物学的活性がある化合物が濃縮された乳分画を置換することによって得ることができる。濃縮は当分野でよく知られている物理、化学及び生物技法に従い得ることができ、例えば実施例中に記載するアッセイに基づいて行うことができる。
【００１９】
前に概略した濃縮又は添加から生じる生成物のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性は、関連栄養／医薬組成物、即ち添加及び／又は濃縮された１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の一部を有する栄養／医薬組成物、増大したシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を有する栄養／医薬組成物と同じ組成物のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性より、例えば少なくとも１％、さらに好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも１０％高く、詳細には２５％高くなければならない。
【００２０】
広範囲にわたる研究中に本発明者は、特定の乳タンパク質分画は、このような乳において本来見ることができずこのような乳の活性を超える、シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与えることを実証した。何らかの理論に縛られることは望まずに、ヒト乳中で観察される低い最初の活性は、血清タンパク質と関係があるようであると仮定することができる。カゼイン自体が阻害効果を有する可能性があり、酸性化又はレンネット処理によって活性化される（したがってホエー分画中で見られる）「潜在的な生物活性」を含む可能性がある。
【００２１】
増大したＣＯＸ−２阻害活性を示すことが分かった前記乳分画として、ヒト乳、ウシ乳、水牛乳、又は他の哺乳動物乳のホエー分画、ヒト乳、ウシ乳、水牛乳、ウシ乳、又は他の哺乳動物乳のスキムミルク分画、ウシ乳の酸性カゼイン分画、ウシ乳の甘味カゼイン分画など、或いはこれらの組合せを言及することができる。ホエー分画として、例えば酸性ホエー分画、甘味ホエー分画、可溶性ホエー分画及びこれらの組合せを使用することができる。
【００２２】
可溶性ホエータンパク質のさらなる亜分画化及びスクリーニングによって、ウシ乳由来の可溶性ホエータンパク質の幾つかの亜分画が好ましいことが明らかになっている。
【００２３】
原則として、可溶性ホエータンパク質の亜分画の分離及び単離は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、或いは疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩ−ＨＰＬＣ）、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）などによって行うことができ、例えばこれらは全て同じ分離原則に基づくものである。ＨＩＣの原則は当業者に知られている。一般には、そのサンプルを有する疎水性物質を含む平衡化カラム（固定相）上にサンプルを載せる。疎水性物質は、例えばＲｏｈｍａｎｄＨａｓｓからＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  Ｘａｄ１６  ＸＡＤ１６として商品化されているマクロ多孔質架橋ポリスチレンであってよい。またＡｍｅｒｓｈａｍからの１５ＲＰＣＴＮ１７−０７２７−０２（ポリスチレン−ジビニルベンゼン）、或いは相当物も使用することができる。
【００２４】
タンパク質をカラムに載せる前に、カラムはバッファーを用いて平衡状態にすることができる。分画を載せた後、バッファー又はバッファーの混合物（移動相）はカラム中を移動させることができ、それによってバッファーの混合物は変化し、したがってカラムからのそれらの疎水性に従い溶出タンパク質亜分画はさまざまな性質を有する可能性がある。この方法に従うホエータンパク質の分離は、「ポリスチレン−ジビニルベンゼンの逆相高速液体クロマトグラフィーによる、プロテオースペプトン及びカゼイノマクロペプチドを含む主要なウシホエータンパク質の同時分離及び定量化（Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｂｏｖｉｎｅ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｏｓｅ  ｐｅｐｔｏｎｅ  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｄ−ｐｈａｓｅ  ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｎ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ−ｄｉｖｉｎｙｌｂｅｎｚｅｎｅ）」、Ｄ．Ｆ．Ｅｌｇａｒら、「クロマトグラフィージャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」Ａ８７８（２０００）１８３〜１９６中に記載されている。
【００２５】
カラムから溶出したタンパク質の亜分画は、固定相からの亜分画の溶出に影響を与えた、バッファーの混合物の組成又はアセトニトリル含量によって正確に記載することができる。例えば可溶性ホエータンパク質は、ポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍからの１５ＲＰＣ  ＴＮ  １７−０７２７−０２）を充填したカラムに載せることができ、バッファーＡは０．１ｖｏｌ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水中として定義することができ、バッファーＢは８０ｖｏｌ％アセトニトリル及び０．８５ｖｏｌ％ＴＦＡ（ｖｏｌ％）として定義することができる。次いで、バッファーＡとＢの混合及び移動は、特定の系、例えばＦＰＬＣ（迅速なタンパク質液体クロマトグラフィー）ＵＮＩＣＯＲＮステーション（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって調節することができ、カラムを介して流すことができる。
【００２６】
溶出したタンパク質の亜分画は、前述のバッファーＡとＢの混合比の溶出範囲によって定義することができる。特定のバッファー組成を使用して（溶出順はｐＨ依存性なので）、タンパク質亜分画の溶出時間又は間隔は、本発明のタンパク質分画の溶出時に存在するアセトニトリルの相対量によって簡単に記載することができる。
【００２７】
望むならば、このようにして得た亜分画は蒸発、限外濾過などの当分野でよく知られている技法によって濃縮することができ、或いは例えば真空、凍結、スプレー、流動床、オーブン、又は任意の他の適切な乾燥法による乾燥前に透析して有機溶媒を除去することができる。
【００２８】
実施例中及び表７中に列挙する亜分画は、ＣＯＸＩＩ阻害を促進する際に非常に有効であることが示されてきている。一層さらに好ましい実施形態によれば、本発明は、非常に有効である表５中に示す亜分画１、９、１０、及び１４に関する。
【００２９】
一般に、任意の哺乳動物起源（ヒト、ウシ、水牛、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウマなど）の乳は、本発明の乳タンパク質分画又はタンパク質調製品を調製するために使用することができる。
【００３０】
スキムミルク、酸性ホエー及び甘味ホエーは、実施例中に記載する方法に従い調製することができる。本発明の文脈で使用する用語「可溶性ホエータンパク質」又は「可溶性タンパク質」は、超遠心分離（例えば１時間、１００．０００ｇ）後、或いは当業者に知られている他の方法に従い、水溶液中で回収したタンパク質を意味する。用語「非可溶性タンパク質」又は「ミセルカゼイン」は、（例えば実施例１に示すステップに従う、或いは当業者に知られている他の方法に従う）このような超遠心分離の後に沈殿から回収した洗浄済み物質を示す。
【００３１】
特に、高いシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性は、ヒト乳由来の甘味ホエーによって、及びウシ乳由来の幾つかの分画、即ち天然の、スキムミルク、甘味ホエー、可溶性ホエー、甘味カゼインによって与えられる。実施例中で調べた全３種の乳種（ヒト、ウシ、水牛）に関しては、甘味ホエーを用いて最高のＣＯＸ−２阻害率を得て、これはしたがって本発明の好ましい実施形態を表す。
【００３２】
ホエータンパク質調製品は良い結果をもたらしたが、しかしながら幾つかの乳タンパク質分画ほど有効ではなかった。したがって、本発明の乳タンパク質分画において、ＣＯＸ−２阻害活性を増大させるプラスの相乗効果が与えられると仮定することができる。望むならば、乳タンパク質分画とホエータンパク質調製品を組み合わせることもできる。
【００３３】
本発明の乳タンパク質分画中に存在する、シクロオキシゲナーゼ−２阻害化合物の同定を対象とする研究は、これらの化合物はタンパク質状でなければならないことを示した。知られている化合物であるラクトフェリンは、いかなるシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性も有していないことが示されている。
【００３４】
前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の、生物分解に関する生物学的利用能及び安定性は、前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品中に存在する化合物の、例えば−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＣＯＯＨなどの１つ又は複数の官能基を保護することによってさらに増大させることができる。例えば１つ又は複数の糖又は炭水化物、例えばラクトースなどとの反応によって、このような保護を行うことができる。例えば、ラクトースの存在下で乳タンパク質を加熱することによって、ラクトシル化タンパク質が生成する。保護後、化合物は分解、特に身体中のタンパク質分解に対する高い耐性をもたらし、したがって高い生物学的利用能を一般にもたらす。誘導体化を使用して望ましい溶解度、したがって望ましい調節された生物学的利用能を得ることもできる。
【００３５】
他の態様によれば、本発明はシクロオキシゲナーゼ−２の活性を阻害することによって、ＣＯＸ−２介在疾患を治療するための栄養又は医薬組成物を調製するための、１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の使用に関する。
【００３６】
ＣＯＸ−２阻害活性を与える、１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品は、例えば従来の非毒性の薬剤として許容可能な担体、賦形剤、アジュバント及び賦形薬を含む経口、局所、非経口、又は直腸投与形態で投与することができる。本明細書で使用する用語、非経口は、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射又は注入技法を含む。
【００３７】
本発明の栄養又は医薬組成物は、シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患、例えば癌又は前癌性状態、特に結腸、胃、食道、肝臓、胆管、膵臓、頭部及び首部、肺、乳、膀胱、女性生殖器及び皮膚の癌又は前癌性状態、並びに／或いは炎症性疾患、関節炎、リウマチ熱など、インフルエンザ又は他のウイルス感染に伴う症状、月経困難症、頭痛、歯痛、変形性関節疾患など、並びに／或いはアルツハイマー病を治療又は予防するために使用することができる。
【００３８】
さらに、本発明の栄養又は医薬組成物は、従来の癌治療及び／又は前癌性状態の治療、化学療法、放射線療法、生物療法中、並びに／或いは炎症性疾患の治療中並びに／或いはアルツハイマー病の治療中に、同時治療剤として施すことができる。
【００３９】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える、１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品は、例えばＮＳＡＩＤなどの従来の医薬品の部分的又は完全な代用としても有用である可能性がある。したがって本発明は、治療上有効量の前記１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品、並びに１つ又は複数の治療上有効な成分、例えば疼痛寛解物質、増強剤、Ｈ２−アンタゴニスト、充血緩和剤、鎮咳薬、利尿薬、鎮痛性又は非鎮痛性抗ヒスタミン、癌及び／又は前癌状態を治療又は予防するための物質などを含む、前に定義したシクロオキシゲナーゼ−２介在疾患を治療するための医薬組成物を含む。
【００４０】
活性成分を含む医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、薬用ドロップ、水性又は油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳濁液、硬質又は軟質カプセル、或いはシロップ又はエリキシル剤などの、経口使用に適した任意の形であってよい。
【００４１】
経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物を製造するための当分野で知られている任意の方法に従って調製することができ、このような組成物は、薬剤として上質で口に合う調製品を与えるために、甘味剤、着香剤、着色剤及び防腐剤からなる群から選択される１つ又は複数の物質を含むことができる。
【００４２】
錠剤を製造するのに適した、不活性希釈剤、顆粒剤、崩壊剤、及び潤滑剤などの非毒性の薬剤として許容可能な賦形剤と混合された活性成分を、錠剤は含む。錠剤は非コーティング状態であってよく、或いは知られている技法によって錠剤をコーティングして、胃腸管内での分解及び吸収を遅らせ、それによって長期間持続的作用をもたらすことができる。
【００４３】
経口使用するための配合物は、活性成分が不活性な固体希釈剤と混合された硬質ゼラチンカプセルとして、或いは活性成分が水又は油状媒体と混合された軟質ゼラチンカプセルとして存在することもできる。
【００４４】
水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適した賦形剤、例えば懸濁剤、分散剤又は湿潤剤、防腐剤、着色剤、着香剤、及び甘味剤などと混合された活性物質を含む。
【００４５】
水を加えることによって水性懸濁液を調製するのに適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤、及び１つ又は複数の防腐剤と混合された活性成分を与える。他の賦形剤、例えば甘味剤、着香剤、及び着色剤が存在してもよい。
【００４６】
前に示した乳タンパク質分画及び／又は乳タンパク質調製品は、任意の栄養、医薬又は機能食品組成物において使用することができ、これらの組成物は例えば水、タンパク質及び／又はペプチド、脂肪及び炭水化物からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含むことができる。前記組成物はミネラル及びビタミンを、例えばＵ．Ｓ．ＲＤＡに従い１日の用量の３０％〜１５０％の量でさらに含むことができる。これに加えて、このような組成物は、繊維状物質、着香剤、乳化剤、ラジカルスカベンジャー、防腐剤、酸、脂質、フルーツ及びフルーツジュース、茶などを含むことができる。
【００４７】
特に、本発明の組成物は、例えば乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳系発酵製品、アイスクリーム、シリアル系製品、乳系粉末、乳児用調製粉乳又はペットフードから選択される食品組成物を含むことができる。
【００４８】
例えば、消費者によって非常に容認されると予想することができる配合物は、例えば乳製品を主成分とする飲料、本発明の乳タンパク質分画及び／又は調製品を含む水、フルーツジュース又は茶などの従来の飲料である。
【００４９】
有利な配合物の他の例は、例えばデザート調製品、ゲル又は泡状物質（例えば「ムース」（「泡状物質」）、ブラマンジェ、ゼリー、フラン、ヨーグルトを主成分とする調製品など）の形、或いは本発明の乳タンパク質分画及び／又は調製品を含む充填物又は芯を有するベーカリー食品を含むスナックの形の組成物である。本発明の乳タンパク質分画及び／又は調製品は、例えば任意の従来の食品上に上層又はコーティングの形で施してもよく、任意の従来の食品中に充填物質として含まれてよい。
【００５０】
他の態様によれば、本発明は、製品のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を増大させるための方法を提供し、前記方法は、前記製品においてシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える１つ又は複数の乳タンパク質分画及び／又は１つ又は複数の乳タンパク質調製品の量を増大させるステップを含む。
【００５１】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性が増大している製品は、例えば栄養及び／又は医薬及び／又は機能食品組成物、特に乳製品であってよい。
【００５２】
本発明者は、良い収率を与え前記乳タンパク質分画中の活性成分のシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を本質的に保つ、乳タンパク質分画を単離するための方法も見出した。
【００５３】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える、甘味ホエータンパク質又は酸性ホエータンパク質を単離するための方法は、クリーム層及びスキムミルクの層を得るために乳を１３．６００ｇで３０分間遠心分離にかけるステップと前記クリーム層を分離させるステップと、前記スキムミルクを単離するステップと、２ｍｍｏｌ／ｌＣａ２＋の濃度を有する混合物が得られるような量のＣａＣｌ２の水溶液をスキムミルクに加えるステップと、前記混合物を３５℃まで加熱し、１リットル当たり５０ｍｇの活性キモシンの活性を有するレンネットを前記混合物に加えるステップ（例えばスキムミルク１リットル当たり０．４〜０．６、好ましくは０．５μｌのレンネットの量）、又は前記混合物を２５℃まで加熱し、前記混合物をＨＣｌ（３２％）の水溶液を用いてｐＨ４．６まで酸性化するステップと、３０分間１３６００ｇで混合物を遠心分離にかけて相分離を得るステップと、甘味ホエータンパク質又は酸性ホエータンパク質をそれぞれ単離するステップとを含む。
【００５４】
シクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える可溶性ホエータンパク質を単離するための方法は、クリーム層及びスキムミルクの層を得るために乳を１３．６００ｇで３０分間遠心分離にかけるステップと、前記クリーム層を分離させるステップと、前記スキムミルクを単離するステップと、２ｍｍｏｌ／ｌＣａ２＋の濃度を有する混合物が得られるような量のＣａＣｌ２の水溶液をスキムミルクに加えるステップと、非可溶性ミセルカゼイン相から可溶性ホエータンパク質相を分離するために１００．０００ｇで１時間遠心分離にかけるステップと、可溶性ホエータンパク質相を単離するステップとを含む。
【００５５】
さらに他の態様によれば、本発明はシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性を与える乳分画に関するものであり、前記乳分画は前に概略した方法の１つに従って入手可能である。
【００５６】
そのシクロオキシゲナーゼ−２阻害活性のため、本発明の乳タンパク質分画は、特にＮＳＡＩＤが禁忌であるような場合、例えば潰瘍、凝固障害、腎臓疾患などに罹患している個体の場合、従来のＮＳＡＩＤの代替品となるであろう。さらに、このような製品には本質的に有害な副作用がなく、したがってさらに長期間消費される可能性があると予想することができる。このことは、シクロオキシゲナーゼ−２介在疾患の予防が望まれるとき、例えばその遺伝的素因のため或いはよく知られている危険因子への露出のために（例えば典型的な「西洋食」、高脂肪及び低繊維などの危険性の高い栄養食品、化学物質への露出など）、癌を発症する高い危険性を有すると推測される人間の場合、特に関心が高いであろう。
【００５７】
乳製品は人類によって長年消費されてきているので、本発明の機能食品又は医薬品は、消費者によって非常に容認されるであろうと予想することができる。
【００５８】
以下の実施例は、言及する特定の実施形態に本発明を制限することなく本発明を例示する。
【実施例】
【００５９】
全ての溶媒は分析又はＨＰＬＣ等級であり、Ｍｅｒｃｋ（Ｄｉｅｔｉｋｏｎ、スイス）から購入した。水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水精製システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｖｏｌｋｅｔｓｗｉｌ、スイス）を使用して室内で精製したか、或いはＨＰＬＣ等級であった（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）。ＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、ＨＣｌ（３２％）、水酸化ナトリウム、ペルヒドロール３０％Ｈ２Ｏ２ｐ．Ａ．は、全てＭｅｒｃｋからのものであった。
【００６０】
レンネット（「圧縮成分（ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｓｉｍｐｌｅ）」）はＴＥＸＥＬ（３８４７０  Ｖｉｎａｙ、フランス）によって生成し、１リットル当たり５０ｍｇの活性キモシンの活性で、Ｒｈｏｎｅ  Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｈｒｅｒ（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｑｕｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ、７７０００  Ｍｅｌｕｎ、フランス；バッチ番号１０１０８９００７）から得た。
【００６１】
（実施例１）
乳サンプル調製
他に明確に示さない限り、Ｃ．Ａｌａｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｄｕ  Ｌａｉｔ、Ｐｒｉｎｃｉｐｅ  ｄｅｓ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｌａｉｔｉｅｒｅｓ．ＳＥＰＡＩＣ、パリ、第４版、１９８４、ｐ．２９〜３５及び１５９〜１７８中に記載されたのと同様の、乳分画を調製するための標準的なステップを行った。
【００６２】
示した研究室規模の分画化ステップは、従来の産業用の乳の方法から開始して開発した。驚くことに、選択性及び分離効率は、以下に示した方法のステップを行うことによって、特に大きな加速度での遠心分離及び具体的に適合させた洗浄ステップを行うことによって有意に増大させることができた。
【００６３】
１．１  ウシ乳
ウシ乳は地方の市場（「Ｔｏｎｉ  ｌａｉｔ」、スイス）から得た。
【００６４】
第一のステップでは、固定アングルローターＳｏｒｖａｌ  ＧＳ３（９０００ｒｐｍ、３０分間）を使用して、１３６００ｇまでの加速度を有する遠心分離によって全乳からクリームを抽出した。２．２００ｍｌの全乳から開始して、上層において９０ｇのクリームを回収した。上層の分離後、２０９０ｍｌのスキムミルクを得た。
【００６５】
カゼインからの甘味ホエーの分離は、カゼイン凝固を誘導するスキムミルクの酵素処理によって行う。５２０μｌの２００ｍＭ（２００ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液を５２０ｍｌのスキムミルクに加えて、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａ２＋の最終濃度を有する混合物に到達させた。このスキムミルク混合物を３５℃に加熱し、次いで２５０μｌのレンネットを適度な磁気攪拌の下ですぐに加えた。１分後、水浴中において３５℃で５０ｍｉｎ（分間）混合物をインキュベートし、遠心分離用のボトルに注ぎ、その後１３．６００ｇで３０分間遠心分離にかけて（固定アングルローターＳｏｒｖａｌ  ＧＳ３；９０００ｒｐｍ、３０分間）、非可溶性レンネットカゼインから甘味ホエーを分離した。
【００６６】
４７６ｍｌの上清（即ち「甘味ホエー」）は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（甘味ホエー）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【００６７】
レンネットカゼイン（４５ｇ）を２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液２８６ｍｌ中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％のＮａＣｌを補い、次いで遠心分離にかけ、上清（２４６ｍｌ）を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（レンネットカゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【００６８】
３１ｇの回収した洗浄済みレンネットカゼインを、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に、２５０ｍｌの体積が得られるように０．９重量％のＮａＣｌを補った。次いで混合物を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（レンネットカゼイン）凍結させた。
【００６９】
カゼインからの酸性ホエーの分離は、カゼイン凝固を誘導するスキムミルクの化学的酸性化によって行う。５２０μｌの２００ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液を５２０ｍｌのスキムミルクに加えて、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａ２＋の最終濃度を有する混合物に到達させた。この混合物は、適度な磁気攪拌の下でｐＨ６．６〜ｐＨ４．６のＨＣｌ（３２％）の水溶液を加えることによって、２５℃において酸性化させた。１分間の攪拌の後、混合物を２５℃で６０分間インキュベートし、遠心分離用のボトルに注ぎ、その後１３６００ｇで３０分間遠心分離にかけて（固定アングルローターＳｏｒｖａｌ  ＧＳ３；９０００ｒｐｍ、３０分間）、非可溶性酸性カゼインから酸性ホエーを分離した。
【００７０】
５０３ｍｌの上清（即ち酸性ホエー）は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（酸性ホエー）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【００７１】
酸性カゼイン（４１ｇ）を、ｐＨ４．６を有する２０ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）の酢酸ナトリウムの水溶液２３３ｍｌ中に分散させた。このようにして得た混合物を遠心分離にかけ、上清（２５０ｍｌ）を分離し、その後容器中に等分試料に分け、これらは標識し（酸性カゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【００７２】
２８．６ｇの回収した洗浄済み酸性カゼインを水中に分散させた。この混合物のｐＨは、ＮａＣｌを加えることによって４．６７〜６．６に調整した。その後、体積を２５０ｍｌに調整し、このようにして得た混合物は容器中に等分試料に分け、これらは標識し（酸性カゼイン）凍結させた。
【００７３】
可溶性（ホエー）タンパク質と洗浄済み非可溶性タンパク質（ミセルカゼイン）を分離するために、以下のステップを行った：
【００７４】
２５０μｌの２００ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液を２５０ｍｌのスキムミルクに加えて、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａ２＋の最終濃度を有する混合物を得た。この乳を超遠心分離にかけて（固定アングルローター４５ＴＩ中、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−６０Ｍ超遠心分離機中においてチューブの中央部の１０００００ｇに対応する３２０００ｒｐｍの速度で、４２．１ｇのスキムミルクを含む６本のチューブを１時間遠心分離にかけた）、非可溶性ミセルカゼインから可溶性ホエータンパク質を分離した。
【００７５】
２２８ｍｌの上清（即ち可溶性ホエータンパク質）は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（可溶性ホエータンパク質）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【００７６】
ミセルカゼイン（２４ｇ）を、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液２２０ｍｌ中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％のＮａＣｌを補った。混合物は超遠心分離にかけた（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−６０Ｍ超遠心分離機中において１時間、チューブの中央部の１００．０００ｇに対応する３２．０００ｒｐｍの速度で）。上清（２２９ｍｌ）を分離し、次いで容器中に等分試料に分け、これらは標識し（ミセルカゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【００７７】
２２ｇの回収した洗浄済みミセルカゼインを、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に、２５０ｍｌの最終体積が得られるように０．９重量％のＮａＣｌを補った。この混合物を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（ミセルカゼイン）凍結させた。
【００７８】
１．２  ヒト母乳
ヒト母乳は、母乳サンプルを提供することに賛成した健康な母親から、赤ん坊の栄養供給を危険にさらさなかった量（１０〜６０ｍｌ）得た。サンプルは乳のポンプ圧搾によって、或いは時折手作業による圧搾によって産後７０日までに得て、回収後２時間以内に処理した。他に明確に示さなかったときは、全ての手順のステップは、前の１．１に記載したのと同様に行った。
【００７９】
２００ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）ＣａＣｌ２の水溶液７．２ｍｌを７１５ｍｌの全乳に加えて、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）Ｃａ２＋の最終濃度の混合物を得た。（前の１．１に記載したのと同様の）クリームを分離するための遠心分離後、２６．６ｇのクリームを上層として回収し、７１３ｇのスキムミルクを分離した。
【００８０】
分離甘味ホエー／カゼインは、カゼイン凝固を誘導するスキムミルクの酵素処理によって得る。スキムミルク（２００ｇ）を３５℃で加熱し、次いで１００μｌのレンネットを適度な磁気攪拌の下ですぐに加えた。１分後、水浴中において３５℃で５０分間混合物をインキュベートし、遠心分離用のボトルに注ぎ、その後１３．６００ｇで３０分間遠心分離にかけて（１．１に記載したのと同様に）、非可溶性レンネットカゼインから甘味ホエーを分離した。
【００８１】
１９９ｍｌの上清（即ち「甘味ホエー」）は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（甘味ホエー）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【００８２】
レンネットカゼイン（２ｇ）を２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液９８ｍｌ中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％のＮａＣｌを補った。生成した混合物を遠心分離にかけ、上清（９９ｍｌ）を分離し、次いで容器中に等分試料に分け、これらは標識し（レンネットカゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【００８３】
１．１５ｇの回収した洗浄済みレンネットカゼインを、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％体積のＮａＣｌを補って、１００ｍｌの体積を得た。生成した混合物は次いで容器中に等分試料に分け、これらは標識し（レンネットカゼイン）凍結させた。
【００８４】
カゼインからの酸性ホエーの分離は、カゼイン凝固を誘導するスキムミルクの化学的酸性化によって行う。２００ｍｌのスキムミルクを、適度な磁気攪拌の下でｐＨ６．６〜ｐＨ４．６のＨＣｌ（３２％）の水溶液を加えることによって、２５℃において酸性化させた。１分間の攪拌の後、混合物を２５℃で６０分間インキュベートし、遠心分離用のボトルに注ぎ、その後１３６００ｇで３０分間遠心分離にかけて（実施例１．１に記載したのと同様に）、非可溶性酸性カゼインから酸性ホエーを分離した。
【００８５】
１９５ｍｌの上清（即ち酸性ホエー）は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（酸性ホエー）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【００８６】
酸性カゼイン（４．９ｇ）を、ｐＨ４．６を有する２０ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）の酢酸ナトリウムの水溶液９５ｍｌ中に分散させ、混合物を遠心分離にかけた。上清（９６ｍｌ）を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（酸性カゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【００８７】
２．９ｇの回収した洗浄済み酸性カゼインを９５ｍｌの水中に分散させた。この混合物のｐＨは、ＮａＯＨを加えることによって６．２に調整した。その後、体積を１００ｍｌに調整した。混合物は次いで容器中に等分試料に分け、これらは標識し（酸性カゼイン）凍結させた。
【００８８】
可溶性（ホエー）タンパク質と洗浄済み非可溶性タンパク質（ミセルカゼイン）を分離するために、以下のステップを行った：
【００８９】
スキムミルクは、１．１に記載したのと同様に超遠心分離にかけた。
【００９０】
１９８ｍｌの上清は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（可溶性ホエータンパク質）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【００９１】
ミセルカゼイン（０．５ｇ）を、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液３２ｍｌ中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％のＮａＣｌを補い超遠心分離にかけた（実施例１．１に記載したのと同様に）。このようにして得た上清（３２．８ｍｌ）を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（ミセルカゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【００９２】
０．４ｇの回収した洗浄済みミセルカゼインを、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％のＮａＣｌを補って、３３ｍｌの体積を得た。生成した混合物は容器中に等分試料に分け、これらは標識し（ミセルカゼイン）凍結させた。
【００９３】
１．３  水牛乳
純粋で新鮮な水牛乳をパキスタンのラホール地方で入手し、近隣の研究室に供給冷蔵し、そこでそれを凍結乾燥させた。凍結温度は約−２０℃〜約−２５℃、乾燥温度は４０℃であった。真空圧は２トール未満に保ち、最終的な圧力は０．２トールであった。乾燥粉末はアルミニウムコーティングしたプラスチックバッグ中に密封し、出荷して次いで室温で保存した。他に明確に示さなかったときは、全ての手順のステップは実施例１．１に記載したのと同様に行った。
【００９４】
７０ｇの粉末を４６８ｍｌのＨ２Ｏ中に溶かし、２００ｍＭ（２００ｍｍｏｌ／ｌ）ＣａＣｌ２の水溶液５．４ｍｌを加えることによって、凍結乾燥させた水牛乳を１３％の全固形物（ＴＳ）で還元した。Ｃａ２＋２ｍＭの最終濃度を有する還元水牛乳５４３ｍｌを得た。実施例１．１に概略したのと同様のクリームを分離するための遠心分離後、４６ｇのクリームを上層として回収し、４８５ｍｌのスキムミルクを分離した。
【００９５】
カゼインからの甘味ホエーの分離は、カゼイン凝固を誘導するスキムミルクの酵素処理によって行った。１４５ｍｌのスキムミルクを３５℃で加熱し、次いで７３μｌのレンネットを適度な磁気攪拌の下ですぐに加えた。１分後、水浴中において３５℃で５０分間混合物をインキュベートし、遠心分離用のボトルに注ぎ、その後１３６００ｇで３０分間遠心分離にかけて（実施例１．１に記載したのと同様に）、非可溶性レンネットカゼインから甘味ホエーを分離した。
【００９６】
１３０ｍｌの上清（即ち「甘味ホエー」）は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（甘味ホエー）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【００９７】
レンネットカゼイン（１４ｇ）を２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液１４０ｍｌ中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％のＮａＣｌを補い、遠心分離にかけた（実施例１．１に概略したのと同様に）。このようにして得た上清（１３０ｍｌ）を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（レンネットカゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【００９８】
１３ｇの回収した洗浄済みレンネットカゼインを、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％体積のＮａＣｌを補って、１４５ｍｌの体積を得た。生成した混合物は次いで容器中に等分試料に分け、これらは標識し（レンネットカゼイン）凍結させた。
【００９９】
分離酸性ホエー／カゼインは、カゼイン凝固を誘導するスキムミルクの化学的酸性化によって行う。１４５ｍｌのスキムミルクを、適度な磁気攪拌の下でｐＨ６．７４〜ｐＨ４．６のＨＣｌ（３２％）の水溶液０．６ｍｌを加えることによって、２５℃において酸性化させた。１分間の攪拌の後、混合物を２５℃で６０分間インキュベートし、遠心分離用のボトルに注ぎ、その後１３６００ｇで３０分間遠心分離にかけて（実施例１．１に記載したのと同様に）、非可溶性酸性カゼインから酸性ホエーを分離した。
【０１００】
１２９ｍｌの上清は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（酸性ホエー）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【０１０１】
酸性カゼイン（１３ｇ）を、ｐＨ４．６を有する２０ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）の酢酸ナトリウムの水溶液１３０ｍｌ中に分散させ、混合物は遠心分離にかけた（実施例１．１参照）。上清（１２９ｍｌ）を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（酸性カゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【０１０２】
１２ｇの回収した洗浄済み酸性カゼインを水中に分散させ、ＮａＯＨを加えることによってｐＨを６．７に調整した。その後、体積を１４５ｍｌに調整した。混合物は次いで容器中に等分試料に分け、これらは標識し（酸性カゼイン）凍結させた。
【０１０３】
可溶性タンパク質と洗浄済み非可溶性タンパク質（ミセルカゼイン）を分離するために、以下のステップを行った：
【０１０４】
１４５ｍｌの水牛のスキムミルクを超遠心分離にかけて（実施例１．１に記載したのと同様に）、非可溶性ミセルカゼインからホエーを分離した。１３２ｍｌの上清は、１０×１．３ｍｌの等分試料（エッペンドルフ）及び４０ｍｌのプラスチックチューブに分画化し、これらは標識し（可溶性ホエータンパク質）、液体窒素中に浸すことによって凍結させ、プラスチックバッグ中に−２０℃で保存した。
【０１０５】
ゼラチン状ミゼルカゼイン（１１．４ｇ）を２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液１３３ｍｌ中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％のＮａＣｌを補った。この混合物を超遠心分離にかけた（前の１．１参照）。このようにして得た上清（１２５ｍｌ）を容器中に等分試料に分け、これらは標識し（ミセルカゼイン洗浄物）、液体窒素中に凍結させた。
【０１０６】
１１ｇの回収した洗浄済みミセルカゼインを、２ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＣａＣｌ２の水溶液中に分散させ、前記ＣａＣｌ２溶液に０．９重量％体積のＮａＣｌを補って、１４５ｍｌの体積を得た。生成した混合物は次いで容器中に等分試料に分け、これらは標識し（ミセルカゼイン）凍結させた。
【０１０７】
（実施例２）
ウシ乳由来の可溶性ホエータンパク質の亜分画化
実施例１に記載したのと同様に得た１５ｍｌの可溶性ホエータンパク質を、３７℃の水浴中において２０分間で解凍し、攪拌によって混合し、５４１５エッペンドルフ遠心分離機中で１３．０００ｒｐｍにおいて１分間遠心分離にかけた。０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルター（３０６／ＧＳＷＰＯ４７００．ＧＳ）上での濾過の後、１０ｍｌのこの調製物は、１００ｍｌのＳｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣＴＮ１７−０７２７−０２（ポリスチレン−ジビニルベンゼン）を充填し、ＵＮＩＣＯＲＮステーション（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって調節されるＥＰＬＣシステムと結合させたＨＲ１６×５０カラム中に注入した。
【０１０８】
クロマトグラフィー条件は以下の通りであった：
Ａバッファー：ＴＦＡ０．１％水中（０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅシステム上で濾過した２０００ｍｌのｍｉｌｉＱ水、及び２ｍｌのＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ９１６９９、１００ｍｌ）；
Ｂバッファー：アセトニトリル８０％、ＴＦＡ０．８５％（０．４５μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅシステム上で濾過した４００ｍｌのｍｉｌｉＱ水、及び１．６００ｍｌのアセトニトリル、超音波浴中で１５分間脱気し、最終的に１．７ｍｌのＴＦＡを補った）。
【０１０９】
カラムは２０％のＢバッファーを用いて平衡状態にした。次いで、１カラム体積（ＣＶ）のサンプルを注入した後、Ｂバッファーを７５％１５ＣＶ及び１００％２．５ｃＶで増大させた。最終的に、勾配は２０％Ｂバッファー０．４ＣＶまで低下させた。流速は３ｍｌ／分に固定した。
【０１１０】
９６個の１８ｍｌ分画をプラスチックチューブ中に回収した。分画は−２０℃で保存した。ＨＩＣ−ＨＰＬＣ分析後、９６の回収したチューブは、ＨＰＬＣ概略の類似性によって１４の分画に集め、後のスクリーニングのための凍結乾燥前に蒸発によって濃縮させた。
【０１１１】
表１は、亜分画が溶出している、バッファーＢの体積パーセンテージ範囲又はアセトニトリル範囲による１４のホエータンパク質亜分画を示す。
【表１】
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【０１１２】
（実施例３）
ＣＯＸ−２スクリーニング
２．１  材料及び方法
ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞（正常なヒトへその緒の静脈に由来する永久内皮細胞系；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１３７０；Ｍ．Ｍｉｒａｌｐｅｉｘ、Ｍ．Ｃａｍａｃｈｏら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２１（１９９７）、１７１〜１８０）を、９６ウエルプレート（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＣＳ）上に接種し、１００ｎＭ（ｎｍｏｌ／ｌ）ホルボール１２−ミリスチン酸エステル１３−酢酸塩で６時間３７℃において処理して、ＣＯＸ−２イソ酵素を誘導した。５０μＭ（μｍｏｌ／ｌ）アラキドン酸を次いで加え、試験化合物又は混合物の存在下で３７℃において３０分間、細胞をインキュベートした。プロスタグラジンＥ２の生成はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定し、液体シンチレーションカクテル（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用しシンチレーションカウンター（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて放射能を測定した。
【０１１３】
得られた結果は対照値の割合として、及び試験化合物の存在下で得られた対照値の阻害率として表す。対照値は、試験化合物の不在下における３７℃で６時間のホルボールミリスチン酸エステル酢酸塩（ＰＭＡ）を用いた刺激後の（腫瘍壊死因子α型：ＴＮＦαを用いて行うこともできる）、ＨＵＶ−ＥＣ−Ｃ細胞のＣＯＸ−２活性に対応する。
【０１１４】
対照値（ＩＣ５０）の最大の半分の阻害を引き起こした濃度及びヒル係数（ｎＨ）を、それらの阻害曲線の非線形回帰分析によって、参照化合物（シクロヘキシイミド）に関して測定した。これらのパラメータは、ヒルの式の曲線との適合によって得た。参照化合物に関して得たＩＣ５０値は、得られた過去の平均値±０．５ｌｏｇ単位の許容制限値内であった。
【０１１５】
全てのＣＯＸ−２スクリーニング実験は一度行った。以下では、１０％未満の阻害値は考慮せず、「０」として示している。
【０１１６】
２．２  ヒト乳分画のＣＯＸ−２スクリーニング
ヒトスキムミルクは、有意なＣＯＸ−２阻害を示す（２５％；表２）。酸性化又はレンネットによってカゼインを除去すると（それぞれ酸性ホエー及び甘味ホエーが生じる）、５１％及び５８％のＣＯＸ−２阻害の値を得た。したがって、カゼインを除去することによって、ＣＯＸ−２阻害が大幅に改善される。さらに、カゼイン単独（酸性、甘味、ミセル）では、ＣＯＸ−２に対するいかなる阻害効果も示さない。
【０１１７】
ヒト乳由来の可溶性ホエーは、出発産物（即ちヒトスキムミルク）と全く同様に働いた。
【表２】
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【０１１８】
２．３  水牛乳のＣＯＸ−２スクリーニング
水牛のスキムミルクは、並の阻害効果を示す（３６％；表３）。ヒト乳とは対照的に、カゼインの酸性除去は、おそらく酸性化後の酸誘導型の活性の消失のために、その活性の３分の２の消失をもたらす（１２％に低下）。ｐＨを一定に保つ場合（即ちレンネット処理及び超遠心分離の場合）、活性は両方の場合４４％に増大する。
【０１１９】
ヒト乳と同様に、ミセル水牛乳カゼインはいかなる活性も示さなかった。酸性カゼイン及び甘味カゼインは、それらの溶解性の欠如のために試験しなかった。
【表３】
2007505078.tif 000004
【０１２０】
２．４  ウシ乳のＣＯＸ−２スクリーニング
ウシの生乳及びウシのスキムミルクの高い活性（５２〜５３％；表４）は、クリームの除去はＣＯＸ−２阻害に対していかなる影響もないことを示す。活性は可溶性ホエー中では一定の状態であり（５３％）、酸性ホエー中ではわずかに低下し（４５％）、甘味ホエー中では増大する（６８％）。何らかの理論に縛られることは望まずに、酸性ホエー中の活性の低下は、水牛乳の場合と同様に酸の影響と関係がある可能性があり、一方レンネット処理による活性の増大は、カゼインの不安定化が幾らかの「潜在的な」生物活性を誘導するという理論によって説明することができると思われ、同様にこれは１００％を超える収率をもたらす「分画化の失敗」中に時々記載される。
【表４】
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【０１２１】
２．５  ホエータンパク質調製品のＣＯＸ−２スクリーニング
２つの市販のホエータンパク質調製品も、ＣＯＸ−２スクリーニングに施した：
多量のラクトシルβ−ラクトグロブリン形を含むＬａｃｐｒｏｄａｎ８０（ＭＤ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、Ｖｉｂｙ、デンマーク）；
ラクトシルβ−ラクトグロブリンを実質的に欠いているＷＰＩ９５、未処理ホエータンパク質の単離品（質量分析法によって確認）。ＷＰＩはＤａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．Ｉｎｃ．６２０  Ｎｏｒｔｈ  Ｍａｉｎ、Ｌｅ  Ｓｕｅｕｒ、ＭＮ５６０５８  米国から入手可能である；ＢＩＰＲＯ  ｂａｔｃｈ  ＪＥ２５１−０−４２０。
【表５】
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【０１２２】
表４から明らかにすることができるように、さらにこれらの化合物は、それぞれ２３％及び３３％の相当なＣＯＸ−２阻害活性を示す。これとは対照的に、トリプシンによるタンパク質分解は、ホエータンパク質のＣＯＸ−２阻害活性を害する。さらに、天然の「抗酸化剤アミノ酸」システインは、ＣＯＸ−２阻害に対していかなる影響も有していない。
【０１２３】
２．５  酸化したウシの乳のＣＯＸ−２スクリーニング
新鮮なウシの乳のサンプル（５０ｍｌ）にペルヒドロール（３０％Ｈ２Ｏ２）を補って、生成した混合物中に０．１ｍＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ（ｍｍｏｌ／ｌ）のＨ２Ｏ２の最終濃度を得た。全てのサンプルは３０℃で４時間インキュベートした。
【表６】
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【０１２４】
未処理のウシの乳、及び０．１ｍＭのＨ２Ｏ２で処理した乳は、ＣＯＸ−２阻害に対して同程度の「並の」影響を示す（４１％）。１ｍＭのＨ２Ｏ２では、阻害はわずかに低下し（３５％まで）、さらに１０ｍＭまで増大させることによってＣＯＸ−２阻害は２７％まで低下し、１００ｍＭのＨ２Ｏ２では−これはしかしながら生理的条件とはほど遠いが−それを超える阻害活性は全く観察されない。
【０１２５】
これらの結果は、ウシの乳中の活性、即ちＣＯＸ−２阻害成分は０．１〜１０ｍＭのレベルでＨ２Ｏ２に耐性があることを示す。阻害効果の低下はタンパク質酸化の増大に対応し、このことはＣＯＸ−２阻害活性はタンパク質に基づいており、タンパク質の元の状態と強く関係していることを示す。
【０１２６】
２．６  可溶性ホエータンパク質の亜分画のＣＯＸ−２スクリーニング
可溶性ホエータンパク質の亜分画によるＣＯＸ−２阻害の結果を表７に示す。正の値は、対照と比較して良い性能を示す。
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】実施例１．１．に概略するウシ乳分画の調製を示す図である。
【図２】実施例１．２．に概略するヒト乳分画の調製を示す図である。
【図３】実施例１．３．に概略する水牛乳分画の調製を示す図である。及び
【図４】ヒト乳（ＨＭ）、ウシの乳（ＣＭ）及び水牛乳（ＢＭ）由来のさまざまな乳タンパク質分画及び乳タンパク質調製品の、ＣＯＸ−２阻害活性の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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