(57)【要約】  本発明は、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を調節する組成物及び方法を対象にする。本発明は、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量が実質的に変化せずにｃ−Ｒｅｌの細胞内局在性が変化することをアッセイして判定されるｃ−Ｒｅｌ活性のモジュレーターのスクリーニングも対象にする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中でｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更する分子を識別する方法であって、
（ａ）前記細胞を１つ以上の候補分子に接触させることと、
（ｂ）前記細胞中でｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を含み、
ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を前記１つ以上の候補分子に接触されない細胞中の前記量に対して実質的に変更せずに、核に局在したｃ−Ｒｅｌの量が増加又は減少することは、前記候補分子がｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更することを示す方法。
【請求項２】
細胞中でｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更する分子を識別する方法であって、
（ａ）前記細胞中で１つ以上の候補分子を組み換え発現することと、
（ｂ）前記細胞中でｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を含み、
ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を前記１つ以上の候補分子が発現されない細胞中の前記量に対して実質的に変更せずに、核に局在したｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、前記候補分子がｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更することを示す方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）は、前記細胞を、ｃ−Ｒｅｌの抗体又はこの抗体の結合領域、及び前記抗体の蛍光標識化された結合パートナーに、免疫特異的結合に導く条件で接触させることを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）は、前記細胞を、ｃ−Ｒｅｌの蛍光標識化された抗体又はこの抗体の結合領域に、免疫特異的結合に導く条件で接触させることを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）は、前記細胞から単離された核タンパク質を、質量分析法によって配列決定することを含む請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、培養細胞である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
細胞中でｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更する分子を識別する方法であって、
（ａ）１つ以上の候補分子を前記細胞に微量注入することと、
（ｂ）前記細胞中でｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を含み、
ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を前記１つ以上の候補分子が微量注入されない細胞中の前記量に対して実質的に変更せずに、核に局在したｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、前記候補分子がｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更することを示す方法。
【請求項８】
ｃ−Ｒｅｌ活性を直接又は間接的に調節する分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ｃ−Ｒｅｌを発現する細胞を、１つ以上の候補分子に接触させることと、
（ｂ）ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を前記候補分子に接触されない細胞中の前記レベルに対して実質的に変更せずに、前記細胞中で核に局在したｃ−Ｒｅｌのレベルを検出することと、を含み、
前記候補分子の存在下で核に局在したｃ−Ｒｅｌのレベルが高い又は低いことは、前記分子がｃ−Ｒｅｌの活性を調節することを示す方法。
【請求項９】
ｃ−Ｒｅｌ活性を直接又は間接的に調節する分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ｃ−Ｒｅｌを発現する細胞中で、１つ以上の候補分子を組み換え発現することと、
（ｂ）ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を前記候補分子が発現されない細胞中の前記レベルに対して実質的に変更せずに、前記細胞中で核に局在したｃ−Ｒｅｌのレベルを検出することと、を含み、
前記候補分子の存在下で核に局在したｃ−Ｒｅｌのレベルが高い又は低いことは、前記分子がｃ−Ｒｅｌの活性を調節することを示す方法。
【請求項１０】
前記候補分子は、核へのｃ−Ｒｅｌ局在の量を減少させ、それによりｃ−Ｒｅｌ活性の候補阻害剤となる請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記候補分子は、核へのｃ−Ｒｅｌ局在の量を増加させ、それによりｃ−Ｒｅｌ活性の候補アゴニストとなる請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１２】
前記候補分子は、固定ランダムペプチドライブラリに由来する請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１３】
前記核へのｃ−Ｒｅｌ局在は、前記細胞を、ｃ−Ｒｅｌに結合する分子、及びｃ−Ｒｅｌ以外の核特異的タンパク質に結合する分子に、結合に導く条件で接触させることと、それが起こる、同じ細胞内部位への分子のいかなる結合も検出することを含む方法によって検出される請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）は、ｃ−Ｒｅｌの蛍光標識化された抗体又はこの抗体の結合領域と、細胞を、免疫特異的結合に導く条件で接触させることを含む請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１５】
核へのｃ−Ｒｅｌの移動を阻害するが、ＮＦκＢの発現及び／又はＩκＢの量を実質的に変更しない化合物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の化合物、及び、薬理学的に許容できるキャリア又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１７】
成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進物質を更に含む請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＴＮＦアンタゴニストを更に含む請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＩＬ−１２産生に関連する疾患又は障害を治療又は回復する方法であって、請求項１７に記載の組成物を、前記疾患又は障害を治療又は回復するのに十分な量で、必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２０】
成長ホルモン、成長ホルモン分泌促進物質、ＴＮＦアンタゴニスト、抗炎症剤、及び／又は免疫調節剤を同時投与することを更に含む請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
必要であると識別された患者において、ＩＬ−１２産生に関連する疾患又は障害を治療又は回復する方法であって、請求項１７に記載の組成物を、前記疾患又は障害を治療又は回復するのに十分な量で、必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項２２】
必要であると識別された患者に投与するために標識化された請求項１５に記載の化合物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体が、ここに参考として組み込まれる、それぞれ２００３年１１月１０日及び２００３年１１月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／５１９０４８号及び第６０／５１９０４０号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を調節する組成物及び方法を対象にする。本発明は、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量が実質的に変更せずに、ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在が変化することをアッセイすることによって判定されるｃ−Ｒｅｌ活性の調節物質のスクリーニングも対象にする。
【背景技術】
【０００３】
自己免疫疾患及び炎症性障害の発達におけるサイトカインの役割は、周知である。インターロイキン１２（ＩＬ−１２）のようなサイトカインは、炎症性刺激への急性位相応答を媒介し、マクロファージ及び他の細胞の殺菌性機能を強化し、且つ特異なリンパ球応答を促進する。ＩＬ−１２は、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫神経疾患、ギラン−バレ症候群、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫血小板減少、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、乾癬、疱疹性皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、クローン病、潰瘍性大腸炎、間質性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症、心筋炎、甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎、１型又は免疫媒介真性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺病、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、副腎の自己免疫疾患；リウマチ関節炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、及び移植片対宿主病を含むがそれらに限定されない多重Ｔｈ１優性自己免疫疾患において、役割を果たす。
【０００４】
インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）は、２つの独立して調節されるサブユニットｐ３５及びｐ４０からなり、ジスルフィド結合されたヘテロ二量体サイトカイン（ｐ７０）である。ＩＬ−１２は、細菌、細菌生成物、例えばリポ多糖（ＬＰＳ）及び細胞内寄生生物の刺激で、食細胞及び抗体提示細胞、特にマクロファージ及び樹状細胞によって産生される。ＩＬ−１２の十分に立証された生物学的機能は、Ｔ及びＮＫ細胞からのインターフェロン−γ発現の誘導、及びＴｈ１Ｔリンパ球型への分化である。その発現が、ＩＬ−１２によって誘導されるＩＦＮ−γは、単球及びマクロファージからのＩＬ−１２産生の強くかつ選択的なエンハンサーである。効果は、ＬＰＳ又は黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ  Ｉ（ＳＡＣ）による刺激の前の少なくとも８時間のＩＦＮ−γによる広範囲な治療後に明白であり、特にＩＦＮ−γの進行中の産生がある慢性疾患において、ＩＬ−１２産生がＩＦＮ−γによって増加することを示唆している。ＩＬ−１２産生を引き起こす感染性又は炎症性刺激の後、強力なフィードバックループが、ＩＬ−１２誘導ＩＦＮ−γに、ＩＬ−１２産生を更に増加させることを促進し、結果として生じる炎症誘導性サイトカインの過剰産生につながることが推定される。サイトカインＩＬ−２３は、ＩＬ−１２のｐ１９サブユニット及び同じｐ４０サブユニットからなるヘテロ二量体である。
【０００５】
ＬＰＳは、マクロファージ中で、ｐ５０／ｃ−Ｒｅｌ及びｐ５０／ｐ６５のヘテロ二量体が細胞質から核まで移動するのを刺激する。これらヘテロ二量体の両方とも、ｐ４０のプロモーター中で、ＮＦκＢ部位と結合する。しかしながら、ｃ−Ｒｅｌのみが、インビトロ及びインビボで多数の炎症誘導性刺激に応答しｐ４０産生に至らせるＴｏｌｌ様レセプター−４（ＴＬＲ４）を介したＬＰＳ誘導シグナル伝達に、重要であることが示された。
【０００６】
本出願のセクション２又は他のいずれかのセクションの引用又は識別は、かかる参照が、本発明の先行技術として利用できるという自白として解釈されるべきでない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、候補分子に接触されない、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような陰性対照に接触される細胞に関して、ＮＦκＢの発現及び／又はＩκＢの量のいかなる変更も検出することなく（例えば、ＮＦｋＢ及び又はＩｋＢの発現レベルを変更する物質を評価するが、検出せずに）、１つ以上の候補分子に接触される細胞（例えば免疫細胞）の核に局在したｃ−Ｒｅｌ分子レベルの変更を検出することによって、ｃ−Ｒｅｌ依存性転写を選択的に変更する分子を識別する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子と、細胞（例えばナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、又は単球細胞のような免疫細胞）を接触させることと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、ｃ−Ｒｅｌ依存性転写を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子と接触しない、又はＰＢＳのような陰性対照と接触する細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性転写を変更することを示す方法を提供する。この実施態様によれば、ＩＦＮ−γ及び／又はリポ多糖（ＬＰＳ）によって同時に刺激されながら、細胞が候補分子と接触することがある。好ましくは、この実施態様によれば、細胞は、ＩＦＮ−γ及び／又はリポ多糖（ＬＰＳ）の刺激に続き候補分子と接触する。特定の実施態様において、候補分子と接触した細胞は、マクロファージ、単球、又は樹状細胞である。
【０００９】
もう１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子を組換え発現する細胞（例えばナチュラルキラー細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、又は単球細胞のような免疫細胞）を接触させることと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、ｃ−Ｒｅｌ依存性転写を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子を発現しない細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性転写を変更することを示す方法を提供する。この実施態様によれば、細胞は、候補分子の発現誘導の前、同時、又は後に、ＩＦＮ−γ及び／又はリポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激され得る。特定の実施態様において、候補分子を発現する細胞は、マクロファージ、単球、又は樹状細胞である。
【００１０】
当該技術分野において公知のいかなる方法も、細胞の核に局在したｃ−Ｒｅｌレベルを測定するために使用できる。例えば細胞中のｃ−Ｒｅｌの局在は、免疫特異性結合につながる条件で、細胞を、ｃ−Ｒｅｌに対する抗体又は前記抗体の結合領域、及び前記抗体の蛍光標識結合パートナーと接触させることによって検出できる。あるいは、細胞中のｃ−Ｒｅｌの局在は、免疫特異性結合につながる条件で、細胞を、ｃ−Ｒｅｌに対する蛍光標識抗体又は前記抗体の結合領域と接触させることによって検出できる。細胞中のｃ−Ｒｅｌの局在は、細胞から単離された核タンパク質を質量分析によって配列決定することによっても検出できる。更に、細胞中のｃ−Ｒｅｌの局在は、ｃ−Ｒｅｌ依存性転写の量を測定すること、例えばｐ４０転写、全細胞ｐ４０タンパク質レベル、又は全核ｐ４０タンパク質レベルを測定することによって検出できる。
【００１１】
当該技術分野において公知のいかなる方法も、ＮＦκＢの発現レベルを測定するために使用でき、免疫特異性結合によるＮＦκＢファミリーメンバーｐ５０、ｐ６５及びｃ−Ｒｅｌのタンパク質レベルを測定すること、又はｍＲＮＡをコード化するレベルを測定することを含むが、それらに限定されない。特定の実施態様において、ＮＦκＢの発現は、例えば全細胞タンパク質抽出物を使用するウェスタンブロットにおいて測定されるような、ＮＦκＢファミリーメンバーＰ５０、ｐ６５及びｃ−Ｒｅｌの発現を指す。当該技術分野において公知のいかなる方法も、ＩκＢの量を測定するために使用でき、例えば全細胞又は細胞質タンパク質抽出物を使用するウェスタンブロットにおいて測定されるように、細胞中のコード化ｍＲＮＡ又はＩκＢタンパク質の総量を測定すること、又は例えば未処理細胞中のレベルと比較して、処理細胞中のＩκＢタンパク質レベルを測定することにより、ＩκＢの分解レベルを測定することを含むが、それらに限定されない。
【００１２】
ＮＦκＢ及び／又はＩκＢ（ＩκＢα及びＩκＢβを含む）の発現及び／又は量において、ここで使用されるような用語「実質的に変更する」は、１０％を超え、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、又は９５％を超えるＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量の変化を意味する。
【００１３】
発現がｃ−Ｒｅｌ転写に依存するいかなるタンパク質も、ｃ−Ｒｅｌ依存性転写の変更の結果として変更できる。かかるタンパク質の例には、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＩＦＮ−γ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ−１、Ｊａｇｇｅｄ−１、ＩＲＦ−４、及びｃ−ｍｙｃが含まれる。従って、１つ以上のかかるタンパク質の発現は、本発明の方法に従ってｃ−Ｒｅｌ依存性転写を選択的に変更すると識別される分子によって変更できる。好ましい実施態様において、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−２３の発現レベルは、本発明の方法に従ってｃ−Ｒｅｌ依存性転写を選択的に変更すると識別される分子によって変更される。
【００１４】
本発明は、候補分子と接触しない、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）のような陰性対照と接触する細胞に関して、ＮＦκＢの発現及び／又はＩκＢの量のいかなる変更も検出することなく（例えば、ＮＦｋＢ及び又はＩｋＢの発現レベルを変更する物質を評価するが、検出せずに）、１つ以上の候補分子と接触する細胞（例えば免疫細胞）の核に局在したｃ−Ｒｅｌ分子のレベル変更を検出することによって、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更する分子を識別する方法を提供する。産生タンパク質のｃ−Ｒｅｌに依存するサイトカインの例には、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、及びＩＦＮ−γが含まれるが、それらに限定されない。従って、１つ以上のかかるサイトカインの発現は、本発明の方法に従ってｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子によって変更できる。好ましい実施態様において、ＩＬ−１２及び／又はＩＬ−２３の発現レベルは、本発明の方法に従ってｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子によって変更される。
【００１５】
１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子と、細胞（好ましくは、ＩＦＮ−γ及び／又はＬＰＳ刺激の後又は同時に）を接触させることと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子と接触しない、又はＰＢＳのような陰性対照と接触する細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を変更することを示す方法を提供する。この実施態様によれば、候補分子と接触する細胞は、好ましくは、マクロファージ、単球、又は樹状細胞である。
【００１６】
もう１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子を細胞中で組換えにより発現することと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子を発現しない細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を変更することを示す方法を提供する。この実施態様によれば、細胞は、候補分子の発現誘導の前、同時、又は後に、ＩＦＮ−γ及び／又はリポ多糖（ＬＰＳ）によって刺激され得る。特定の実施態様において、候補分子を発現する細胞は、マクロファージ、単球、又は樹状細胞である。
【００１７】
もう１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子を、細胞に微量注入することと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、（ＩＦＮ−γ及び／又はＬＰＳ刺激の後又は同時に）細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子によって微量注入されない、又は陰性対照よって微量注入される細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を変更することを示す方法を提供する。この実施態様によれば、候補分子と接触する細胞は、好ましくは、マクロファージ、単球、又は樹状細胞である。
【００１８】
１つの実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、１つ以上の次のタンパク質：ＰＵ−１、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、ＳＴＡＴ１、ＥＲＫ、ＰＫＡ、ＩκＢ及びｐ３８キナーゼの発現レベル及び／又は活性を変更しない。もう１つの実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、核内のＩＣＳＢＰのレベルを減少させる。特定の実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも１５％、少なくとも１８％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、又は少なくとも４５％だけ細胞の核内のインターフェロンコンセンサス配列結合タンパク質（ＩＣＳＢＰ）のレベルを減少させる。
【００１９】
もう１つの実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、核内のｐ５０のレベルを減少させる。もう１つの実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、核内のｐ６５のレベルを増加する。特定の実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、少なくとも３５％、好ましくは少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、又は少なくとも８５％だけ核内のｐ６５のレベルを増加する。もう１つの実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、細胞中のｐ３５転写を減少させる。更にもう１つの実施態様において、本発明の方法に従って細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性転写及び／又はｃ−Ｒｅｌサイトカイン産生を選択的に変更すると識別される分子は、次の効果：核内のＩＣＳＢＰレベルの減少、核内のｐ５０のレベルの減少、核内のｐ６５のレベルの増加、及びｐ３５転写の減少の２つ以上をもたらす。
【００２０】
本発明は、次のステップ：（ａ）ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる１つ以上の薬剤を標識化することと、（ｂ）１つ以上の標識化薬剤と薬物標的との間に複合体が形成される条件で、１つ以上の標識化薬剤に細胞を接触させることと、（ｃ）複合体を単離することと、（ｄ）複合体から薬物標的を識別することと、を記載した順序で含み、細胞中でｃ−Ｒｅｌ依存性転写の選択的阻害を媒介する薬物標的を識別する方法も提供する。もう１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌの量を減少させる１つ以上の薬剤を標識化することと、（ｂ）１つ以上の標識化薬剤と薬物標的の間に複合体が形成される条件で、１つ以上の標識化薬剤に細胞を接触させることと、（ｃ）複合体を単離することと、（ｄ）複合体から薬物標的を識別することと、を記載した順序で含み、細胞中でｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に阻害する薬物標的を識別する方法を提供する。識別された薬物標的は、その場合サイトカイン発現レベル、特にｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインレベルを変更する化合物を識別するために使用できる。
【００２１】
本発明は、ｃ−Ｒｅｌ細胞内局在を変更するが、ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を変更しない分子と細胞を接触させることによってｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更することと、発現又は活性が、分子と接触しないか又はＰＢＳのような陰性対照と接触する細胞と比較して、分子と接触する細胞中で変更される分子を識別することと、を含み、発現又は活性が、ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在の変更、すなわち核内のｃ−Ｒｅｌの増加又は減少のために変更される分子を識別する方法も対象にする。
【００２２】
本発明の１つの実施態様において、ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在、特にｃ−Ｒｅｌの核の減少を変更するがＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更しない分子にｃ−Ｒｅｌを発現する細胞を接触させることを含み、ｃ−Ｒｅｌの活性を調節する方法が提供される。この実施態様の側面において、細胞中のｃ−Ｒｅｌタンパク質の全体的レベルは、変わらない。他の側面において、細胞中のｃ−Ｒｅｌタンパク質の全体的レベルは、変更される。本発明のもう１つの実施態様において、ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更するが、ＮＦκＢ発現のレベル又はＩκＢの量を実質的に変更しない分子にｃ−Ｒｅｌを発現する細胞を接触させることを含み、細胞中のＮＦκＢ発現のレベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなく細胞中でｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を調節する方法が提供される。上記実施態様の側面において、上記の１つ以上のスクリーニングアッセイによって識別される。特定の実施態様において、１つ以上の候補分子に細胞を接触させることと、細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を含むスクリーニング法によって、分子は識別され、これにより、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量をそのように接触しない又はＰＢＳのような陰性対照と接触する細胞中の前記量に対して実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌの量の減少を引き起こすこれらの分子が識別される。
【００２３】
特定の実施態様において、本発明は、核内でｃ−Ｒｅｌの量を減少させるが、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更しない分子、例えば上記のスクリーニングアッセイで識別された分子と細胞を接触させることを含み、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、細胞中でｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を阻害する方法を提供する。実施態様の１つの側面において、方法は、核内でｃ−Ｒｅｌの量を減少させるが、例えば細胞抽出物中のｐ５０、ｐ６５及びｃ−Ｒｅｌの量によって測定されるような細胞中のＮＦκＢ発現のレベルを実質的に変更しない分子、例えば上記のスクリーニングアッセイで識別された分子に細胞を接触させることを含む。もう１つの側面において、方法は、核内でｃ−Ｒｅｌの量を減少させるが、例えば細胞中のＩκＢの量によって測定されるような細胞中のＩκＢの量を実質的に変更しない分子に細胞を接触させることを含む。
【００２４】
本発明は、被検者に由来する試料中の核へのｃ−Ｒｅｌ局在のレベルを測定することにより、被検者において正常なＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を有するがｃ−Ｒｅｌ細胞内局在が異常であることで特徴付けられる疾患又は障害の存在又は疾患又は障害を発達させる素因を診断又はスクリーニングする方法を提供し、この方法において、疾患若しくは障害、又は疾患若しくは障害を発達させる素因を有さない類似試料中の局在レベルに対するｃ−Ｒｅｌの核局在レベルの減少又は増加は、疾患若しくは障害、又は疾患若しくは障害を発達させる素因の存在を示す。
【００２５】
本発明は、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインを発現する細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させるために有効であるが細胞中のＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更しない量で、分子を被検者に投与することを含み、必要とする被検者においてｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生に関連する疾患又は障害を治療する方法も提供する。かかる分子の非限定的な例には、ここに記載されるアッセイを利用して識別されたものが含まれる。好ましくは、被検者はヒトである。この実施態様の１つの側面において、疾患又は障害は、ＩＬ−１２産生に関連する疾患である。もう１つの実施態様において、疾患又は障害は、自己免疫疾患である。
【００２６】
本発明は、第１サイトカイン産生を阻害する第１薬剤を、第２サイトカイン産生を阻害する第２薬剤と共に、第１及び／又は第２サイトカインを発現する細胞中でＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、患者に投与することを含み、前記第２サイトカインはｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインであり、必要とする被検者において第１薬剤の活性を強化する方法も提供する。この実施態様の１つの側面において、第１及び第２サイトカインは、同一又は異なる。好ましくは、被検者はヒトである。幾つかの側面において、第１薬剤は、ｃ−Ｒｅｌ活性又は細胞内局在を変更しない自己免疫／炎症性疾患の治療用である。
【００２７】
本発明は、薬剤と細胞を接触させることと、細胞中のいかなる表現型効果も観察することと、を含み、細胞中でＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる薬剤の、生物学的効果を評価する方法も提供する。もう１つの実施態様において、本発明は、薬剤を被検者に投与することと、被検者におけるいかなる表現型効果も観察することと、を含み、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる薬剤の、被検者における生物学的効果を評価する方法を対象とする。被検者は、哺乳動物、例えばマウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヒト等である。
【００２８】
本発明は、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる分子を含む組成物を提供する。本発明は、かかる組成物を必要とする被検者に投与することを含み、例えば自己免疫障害のような異常ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生に関連する疾患又は障害を治療又は予防する方法を更に提供する。幾つかの実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６３８４０３２号；２００２年５月７日に出願された米国特許出願第０９／５９４３６２号；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／００６６２４号（公開第２００２００８２２５９号）；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／０００７４２号（公開第２００３０１３９４０３号）；２００２年７月１０日に出願された米国特許出願第１０／１９２３４７号（公開第２００３０１１４４４６号）；２００２年１１月２６日に出願された米国特許出願第１０／３０５０３９号；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号；国際公開第ＷＯ０３／０４５１６号；２００３年１０月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５４６号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７９１号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８７号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８８号；発明の名称「Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５０；発明の名称「Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５２；発明の名称「Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５３に記載されたような化合物を有さない。
【００２９】
幾つかの実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６３８４０３２号；２００２年５月７日に出願された米国特許出願第０９／５９４３６２号；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／００６６２４号（公開第２００２００８２２５９号）；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／０００７４２号（公開第２００３０１３９４０３号）；２００２年７月１０日に出願された米国特許出願第１０／１９２３４７号（公開第２００３０１１４４４６号）；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号；国際公開第ＷＯ０３／０４５１６号に記載されたような化合物を有さない。
【００３０】
幾つかの実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６６８０３１５号；米国特許第６６９３０９７号；米国特許第６６６０７３３号；米国特許出願第１０／６５５６７２号；米国特許出願第１０／６５６６７１号；２００３年９月５日に出願された米国特許出願第１０／６５６３６０号；２００３年１０月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５４６号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７９１号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８７号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８８号；発明の名称「Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５０；発明の名称「Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５２；発明の名称「Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５３に記載されたような化合物を有さない。
【００３１】
幾つかの実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６６８０３１５号；米国特許第６３８４０３２号；２００３年９月５日に出願された米国特許出願第１０／６５６３６０号；２００２年５月７日に出願された米国特許出願第０９／５９４３６２号；米国特許出願第１０／６５５６７２号；米国特許出願第１０／６５６６７１号；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／００６６２４号（公開第２００２００８２２５９号）；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／０００７４２号（公開第２００３０１３９４０３号）；２００２年７月１０日に出願された米国特許出願第１０／１９２３４７号（公開第２００３０１１４４４６号）；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号；国際公開第ＷＯ０３／０４５１６号；２００３年１０月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５４６号に記載されたような化合物を有さない。
【００３２】
幾つかの実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７９１号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８７号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８８号；発明の名称「Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５０；発明の名称「Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５２；発明の名称「Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５３に記載されたような化合物を有さない。
【００３３】
他の実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６３８４０３２号；２００２年５月７日に出願された米国特許出願第０９／５９４３６２号；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／００６６２４号（公開第２００２００８２２５９号）；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／０００７４２号（公開第２００３０１３９４０３号）；２００２年７月１０日に出願された米国特許出願第１０／１９２３４７号（公開第２００３０１１４４４６号）；２００２年１１月２６日に出願された米国特許出願第１０／３０５０３９号；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号；国際公開第ＷＯ０３／０４５１６号；２００３年１０月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５４６号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７９１号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８７号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８８号；発明の名称「Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５０；発明の名称「Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５２；発明の名称「Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５３に記載されたような構造を有する。１つの側面において、分子は、ここに開示されたスクリーニング法のいずれによっても識別される。もう１つの側面において、分子は、当該技術分野で公知の技術によって精製される。
【００３４】
他の実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６３８４０３２号；２００２年５月７日に出願された米国特許出願第０９／５９４３６２号；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／００６６２４号（公開第２００２００８２２５９号）；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／０００７４２号（公開第２００３０１３９４０３号）；２００２年７月１０日に出願された米国特許出願第１０／１９２３４７号（公開第２００３０１１４４４６号）；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号；国際公開第ＷＯ０３／０４５１６号に記載されたような構造を有する。１つの側面において、分子は、ここに開示されたスクリーニング法のいずれによっても識別される。もう１つの側面において、分子は、当該技術分野で公知の技術によって精製される。
【００３５】
他の実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６６８０３１５号；米国特許第６６９３０９７号；米国特許第６６６０７３３号；米国特許出願第１０／６５５６７２号；米国特許出願第１０／６５６６７１号；２００３年９月５日に出願された米国特許出願第１０／６５６３６０号；２００３年１０月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５４６号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７９１号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８７号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８８号；発明の名称「Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５０；発明の名称「Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５２；発明の名称「Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５３に記載されたような構造を有する。１つの側面において、分子は、ここに開示されたスクリーニング法のいずれによっても識別される。もう１つの側面において、分子は、当該技術分野で公知の技術によって精製される。
【００３６】
他の実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６６８０３１５号；米国特許第６３８４０３２号；２００３年９月５日に出願された米国特許出願第１０／６５６３６０号；２００２年５月７日に出願された米国特許出願第０９／５９４３６２号；米国特許出願第１０／６５５６７２号；米国特許出願第１０／６５６６７１号；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／００６６２４号（公開第２００２００８２２５９号）；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／０００７４２号（公開第２００３０１３９４０３号）；２００２年７月１０日に出願された米国特許出願第１０／１９２３４７号（公開第２００３０１１４４４６号）；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号；国際公開第ＷＯ０３／０４５１６号；２００３年１０月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５４６号に記載されたような構造を有する。１つの側面において、分子は、ここに開示されたスクリーニング法のいずれによっても識別される。もう１つの側面において、分子は、当該技術分野で公知の技術によって精製される。
【００３７】
他の実施態様において、分子は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７９１号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８７号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８８号；発明の名称「Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５０；発明の名称「Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５２；発明の名称「Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５３に記載されたような構造を有する。１つの側面において、分子は、ここに開示されたスクリーニング法のいずれによっても識別される。もう１つの側面において、分子は、当該技術分野で公知の技術によって精製される。
【００３８】
他の実施態様
他の実施態様において、本発明は、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく、且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる分子を細胞に接触させることを含み、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、細胞中のｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を阻害する方法を対象とする。特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインは、ＩＬ−１２である。この実施態様の幾つかの側面において、ＩＬ−１２転写が阻害され、又は核内のｐ６５の量が増加し、又は核へのｃ−Ｒｅｌの移動が阻害され、又はｃ−Ｒｅｌ発現が実質的に変更されない。他の側面において、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３  ｐ４０発現が阻害され、又はＩＬ−１２／２３サブユニットｐ４０プロモーターのＮＦκＢ要素が阻害され、又はＩＬ−１２／ＩＬ−２３サブユニットｐ４０プロモーターのＥｔｓ−２要素の活性化が阻害される。更に他の側面において、ＩＬ−１２サブユニットｐ３５発現が阻害され、且つ／又はＩＬ−１２サブユニットｐ３５プロモーターのＮＦκＢ要素が阻害される。更に他の側面において、核内のＩＣＳＢＰの量が同様に減少し、又はＩＣＳＢＰ発現が阻害される。幾つかの側面において、細胞は、マクロファージ、単球細胞、又は樹状細胞からなる群から選択される。
【００３９】
更にもう１つの特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインは、ＩＬ−２３である。この実施態様の幾つかの側面において、核内のｐ６５の量が増加し、又は核へのｃ−Ｒｅｌの移動が阻害され、又はｃ−Ｒｅｌ発現が実質的に変更されない。更に他の側面において、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３サブユニットｐ４０発現が阻害され、又はＩＬ−１２／２３サブユニットｐ４０プロモーターのＮＦκＢ要素が阻害され、又はＩＬ−１２／２３サブユニットｐ４０プロモーターのＥｔｓ−２要素の活性化が阻害され、又は核内のＩＣＳＢＰの量が同様に減少する。更に他の側面において、ＩＣＳＢＰ発現が阻害される。幾つかの側面において、細胞は、マクロファージ、単球細胞、又は樹状細胞からなる群から選択される。
【００４０】
他の実施態様において、本発明は、テスト薬剤と細胞を接触させることと；細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を測定することと；ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる薬剤を選択することと、を含み、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に阻害する薬剤（あるいは、候補分子又は化合物と呼ばれる）を識別する方法を対象とする。この実施態様の幾つかの側面において、核内のｃ−Ｒｅｌ量は、ルシフェラーゼアッセイを使用するステップによって測定される。ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインは、ＩＬ−１２又はＩＬ−２３であってよい。
【００４１】
更にもう１つの実施態様において、本発明は、標的発見方法を提供する。１つの側面において、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に阻害する薬剤を識別する方法が、提供され、その方法は、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる薬剤を標識化することと；標識化薬剤及び薬物標的の間で複合体を形成する条件で標識化薬剤と細胞を接触させることと；複合体を単離することと；複合体から薬物標的を識別することと、を含む。この実施態様において、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインは、ＩＬ−１２又はＩＬ−２３である。
【００４２】
本発明は、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、サイトカインを産生する細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる有効量の薬剤を患者に投与することを含み、必要とする患者においてｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生に関連した障害を治療する方法も対象とする。１つの側面において、障害は、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫神経疾患、ギラン−バレ症候群、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫血小板減少、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、乾癬、疱疹性皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、クローン病、潰瘍性大腸炎、間質性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症、心筋炎、甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎、１型又は免疫媒介真性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺病、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、副腎の自己免疫疾患；リウマチ関節炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、及び移植片対宿主病からなる群から選択される自己免疫疾患である。
【００４３】
もう１つの実施態様において、本発明は、必要であると識別された被検者においてｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生に関連した障害を治療する方法も対象とする。被検者は、保健専門家によってそれが必要であると識別されるか、又は自己診断してもよい。方法は、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、サイトカインを産生する細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる有効量の薬剤を患者に投与することを含む。１つの側面において、障害は、多発性硬化症、重症筋無力症、自己免疫神経疾患、ギラン−バレ症候群、自己免疫ブドウ膜炎、自己免疫溶血性貧血、悪性貧血、自己免疫血小板減少、側頭動脈炎、抗リン脂質症候群、血管炎、ヴェゲナー肉芽腫症、ベーチェット病、乾癬、疱疹性皮膚炎、尋常性天疱瘡、白斑、クローン病、潰瘍性大腸炎、間質性肺線維症、骨髄線維症、肝線維症、心筋炎、甲状腺炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫肝炎、１型又は免疫媒介真性糖尿病、グレーブス病、橋本甲状腺病、自己免疫卵巣炎及び睾丸炎、副腎の自己免疫疾患；リウマチ関節炎、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、脊椎関節症、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、及び移植片対宿主病からなる群から選択される自己免疫疾患である。
【００４４】
もう１つの実施態様において、本発明によるスクリーニング法によって識別される化合物は、使用説明書に従って標識化される。説明書は、それが必要であると識別された被検者に投与するための指示、投与量、剤形、及び使用期間を含んでもよい。被検者は、ヒト、霊長類、イヌ、ウマ、ブタ、ウシ又はネコのような哺乳動物であってもよい。
【００４５】
更にもう１つの実施態様において、本発明は、必要とする患者において、第１サイトカイン産生を阻害する第１薬剤の活性を強化する方法を対象とし、この方法は、第１薬剤を、第２サイトカイン産生を阻害する第２薬剤と共に、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく、且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、患者に投与することを含み、第２サイトカイン産生がｃ−Ｒｅｌ依存性である。幾つかの側面において、第１サイトカイン及び第２サイトカインは同一であるか、又は第１サイトカイン及び第２サイトカインは異なる。他の側面において、第２サイトカインは、ＩＬ−１２又はＩＬ−２３である。
【００４６】
更にもう１つの実施態様において、本発明は、薬剤と細胞を接触させることと、細胞中のいかなる表現型効果も観察することと、を含む、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる薬剤の、生物学的効果を評価する方法を対象とする。更にもう１つの実施態様において、本発明は、薬剤と細胞を接触させることと、被検者におけるいかなる表現型効果も観察することと、を含み、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる薬剤の被検者における生物学的効果を評価する方法を対象とする
【００４７】
更にもう１つの実施態様において、本発明は、ＮＦκＢ転写因子発現のレベルを実質的に変更することなく且つＩκＢ分解のレベルを実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる化合物を、その化合物が米国特許第６３８４０３２号；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号に記載された構造を有さないという条件で、対象とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
本発明は、ｃ−Ｒｅｌの活性、特に核内に存在するｃ−Ｒｅｌのレベルが、ＮＦκＢの発現又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、増加又は減少できるという発明者の発見に部分的に基づく。
【００４９】
本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子に細胞を接触させることと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、ｃ−Ｒｅｌ依存性転写を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子と接触しない細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性転写を変更することを示す方法を対象とする。もう１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子と細胞を接触させることと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、細胞中でｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子と接触しない細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を変更することを示す方法を対象とする。もう１つの実施態様において、本発明は、次のステップ：（ａ）１つ以上の候補分子を細胞中で組換えにより発現することと、（ｂ）細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を記載した順序で含み、細胞中でｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を選択的に変更する分子を識別する方法であって、１つ以上の候補分子と接触しない細胞中の量に対してＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少することは、候補分子がｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生を変更することを示す方法を対象とする。特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインは、ＩＬ−１２又はＩＬ−２３である。
【００５０】
本発明は、第１サイトカイン産生を阻害する第１薬剤を、第２サイトカイン産生を阻害する第２薬剤と共に、第１及び／又は第２サイトカインを発現する細胞中でＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、患者に投与することを含み、前記第２サイトカインはｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカインであり、必要とする被検者における第１薬剤の活性を強化する方法も対象とする。この実施態様の側面において、第１及び第２サイトカインは同一又は異なる。好ましくは、被検者はヒトである。
【００５１】
Ｃ−ＲＥＬ／ＫＢの細胞内局在の検出
ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在、すなわち核又は細胞質への局在を検出する当該技術分野で公知のいかなる方法も、本発明において使用できる。例示的であり且つ限定的としてではなく、１つのかかる検出方法は、ｃ−Ｒｅｌに特異な抗体と細胞を接触させ、且つ次に抗体が核に局在するか否かを検出することである。ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を検出する特定の方法は、標識化した、例えば蛍光色素で標識化した抗ｃ−Ｒｅｌ抗体、及び標識化した、例えば抗ｃ−Ｒｅｌ抗体と異なる蛍光色素で標識化した抗ＤＮＡ抗体を、全細胞に接触させ、且つ次に例えばレーザー操作顕微鏡検査によって、細胞中で共局在した両方の標識を有する細胞を検出することである。
【００５２】
従って、本発明により包含される検出方法には、ｃ−Ｒｅｌ分子のインサイチュ検出用の免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡検査が含まれる。インサイチュ検出は、ｃ−Ｒｅｌに結合する標識化分子にｃ−Ｒｅｌ分子を内在的又は組換えで発現する細胞を接触させること、及び、発生し且つ核に局在したあらゆる結合を検出することによって達成できる。あるいは、未標識化分子は、分子の標識化結合パートナーと組み合わせて使用できる。かかるアッセイを使用すると、ｃ−Ｒｅｌ分子の存在だけでなく、細胞内分布、すなわち核内の分布も判定することが可能である。あるいは、ｃ−Ｒｅｌは、フラグタグのような検出可能な部分によって発現できる。その場合、タグに特異的な抗体は、組換えｃ−Ｒｅｌ分子の検出を可能にする。
【００５３】
ｃ−Ｒｅｌのイムノアッセイには、通常、ｃ−Ｒｅｌに特異的な検出可能な標識化分子、例えばｃ−Ｒｅｌの抗体の存在下で、インビボ又はインビトロ培養で細胞のような試料をインキュベートすること、及び当該技術分野において公知の多数の技術のいずれかによって結合分子を検出することが含まれる。
【００５４】
特定の実施態様において、生物学的試料、例えば新規に得られた細胞は、細胞を固定化することが可能なニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、又は他の固体担体のような固相担体又はキャリアと接触させ、且つそれらに固定化できる。担体は、次に適切な緩衝液によって洗浄でき、その次に検出可能な標識化分子による処理が続く。固相担体は、次に緩衝液によって２度目に洗浄でき、非結合分子を除去する。固体担体上の結合標識の量は、次に従来の手段によって検出できる。
【００５５】
ｃ−Ｒｅｌ分子への所与の抗体の結合活性は、周知の方法により判定できる。当業者は、定常の実験法を用いることにより、各判定のための操作上の、且つ最適なアッセイ条件を判定することができるであろう。
【００５６】
ｃ−Ｒｅｌの抗体が検出可能に標識化される方法の１つは、それを、酵素及び酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に連結させることによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，”Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”，１９７８，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ２：１−７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）；Ｖｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０；Ｂｕｔｌｅｒ，１９８１，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），１９８０，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，；Ｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），１９８１，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ  Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ））。ｃ−Ｒｅｌ分子に結合された抗体に結合される酵素は、例えば分光光度、蛍光定量又は視覚的手段によって検出できる化学部分を産生するように適切な基質、好ましくは色素発生基質と反応する。
【００５７】
蛍光若しくは化学発光若しくは生物発光化合物、又は放射性部分又は当該技術分野において公知の他の標識によって抗体を標識化することも可能である。
【００５８】
ｃ−Ｒｅｌ核局在を検出及び／又は測定するもう１つの方法は、当該技術分野において公知のいずれかの方法によって核タンパク質を単離し、且つ核タンパク質のプール中のタンパク質を識別するために、ｃ−Ｒｅｌが核タンパク質のプール中に存在するか否かを好ましくは質量分析によって検出することである。核タンパク質の単離は、当該技術分野において公知のいずれかの方法によって達成できる。核タンパク質の単離後、ｃ−Ｒｅｌの検出が、例えば抗ｃ−Ｒｅｌ抗体によってｃ−Ｒｅｌを免疫沈降させること、又はイムノアフィニティーカラム上又はプレート上若しくはウェル中に固定化された抗ｃ−Ｒｅｌ抗体に結合すること、又はウェスタンブロット法によってタンパク質を視覚化することによって達成できる。本発明のもう１つの実施態様において、核へのｃ−Ｒｅｌ局在は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に核タンパク質を単離及び分離すること、ゲルから分離されたタンパク質を溶出すること、及びアミノ酸配列を判定するために溶出されたタンパク質に質量分析を受けさせることによって検出及び／又は測定できる。かかる質量分析は、例えばＮｅｕｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０：４６−５０；Ｎｅｕｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：３８５−３９０；及びＷｉｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：４６６−４６９に記載されたような、当該技術分野において公知のいずれかの適切な質量分析法によって実行できる。非限定例として、溶出したペプチドは、Ｗｉｌｍ  ａｎｄ  Ｍａｎｎ，１９９６，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６８：１−８に記載されたように、５％メタノール／５％ギ酸溶液中で溶解され、且つ毛管カラムを使用して脱塩される。次に、ペプチドは、ナノエレクトロスプレーイオン源の噴霧針に直接、５０％メタノール／５％ギ酸溶液（０．５−２μｌ）中で１つのステップで希釈される。ペプチドの質量スペクトルが得られる。ペプチドは、次に第１四極子中で順々に選択される。質量分析計の第１部分は、一度に１つのｍ／ｚ値のペプチドイオン種の伝達を可能にするマスフィルターとして使用される。次に、各ペプチドは、衝突細胞中のアルゴンによる衝突誘導解離によって個別に断片化される。結果として生じたペプチド断片イオンは、第３四極子中で分離され、且つ検出される。トリプシンペプチドに関して、このことは、通常、カルボキシ末端を含むペプチド断片の「入れ子集合」をもたらす。２つの隣接する断片間の質量差は、対応するアミノ酸残基の質量に対応するので、そのカルボキシからアミノ末端への部分配列が、判定できる。
【００５９】
ｃ−Ｒｅｌの局在が検出及び／又は測定される細胞は、インビトロ（例えば細胞培養中に単離された）又はインビボであってもよい。ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在が検出される細胞は、いかなる細胞、例えば内在的に又は組換えで発現するもの、又はその断片若しくは相同体であってもよい。細胞は、脊椎動物、昆虫（例えばショウジョウバエ）、線虫、哺乳動物、ウシ、マウス、ラット、トリ、魚、霊長類、ヒト等であってもよい。発現されるｃ−Ｒｅｌは、脊椎動物、昆虫、線虫、哺乳動物、ウシ、マウス、ラット、トリ、魚、霊長類、ヒト等であってもよい。細胞は、一次組織、細胞系統、又はｃ−Ｒｅｌ導入遺伝子を含み且つ発現する動物の細胞であってもよい。例えば、形質転換動物は、ショウジョウバエ（例えばキイロショウジョウバエ）又は線虫であってもよい。好ましい実施態様において、導入遺伝子は、ヒトｃ−Ｒｅｌをコード化する。形質転換動物は、当該技術分野において周知の標準的な方法によって作ることができる。
【００６０】
本発明の特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌに対して作られ、結合ドメインを含む抗体及び断片は、上記方法の特定の実施態様においてｃ−Ｒｅｌを検出するために使用される。従って、ｃ−Ｒｅｌタンパク質、断片、又はその類似体若しくは誘導体、特にヒトｃ−Ｒｅｌタンパク質又はその断片は、抗ｃ−Ｒｅｌタンパク質抗体を生成する免疫原として使用できる。かかる抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片であるか、Ｆａｂ発現ライブラリ由来であってもよい。かかる抗体の産生方法は、当該技術分野において周知であり、その幾つかは以下に記載する。
【００６１】
ｃ−Ｒｅｌに特異的な抗体は、当該技術分野において周知の方法、本発明のｃ−Ｒｅｌタンパク質の局在及び／又は数量化に関する、例えば適切な生理的試料におけるこれらタンパク質の撮像やレベル測定のための上記検討した方法、診断方法等で使用できる。これは、ｃ−Ｒｅｌタンパク質の誘導体、相同体又は類似体にも当てはまる。
【００６２】
ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量は、ＮＦκＢファミリーメンバー及びそのいずれかのサブユニット、例えばｐ５０、ｐ６５又はｃ−Ｒｅｌ、又はＩκＢに特異的な抗体の使用を含む、当該技術分野において公知のいずれかの方法を使用しても判定できる。例えば、ＩκＢに特異な抗体を使用して、ＩκＢの量を、例えば以下の実施例で教示される例証的な方法によって判定できる。ＮＦκＢの発現レベルは、ｐ５０、ｐ６５又はｃ−Ｒｅｌの量を測定することによって判定できる。
【００６３】
ｃ−Ｒｅｌが核内に位置するか否かについての他の検出方法は、転写活性に関してｃ−Ｒｅｌに依存するタンパク質又はそのコード化ｍＲＮＡ分子の存在、及び発現の増加（核内のｃ−Ｒｅｌ増加）又は減少（核内のｃ−Ｒｅｌ減少）があるか否かを測定することを含んでよい。
【００６４】
抗体産生
当該技術分野において公知の種々の手順は、ｃ−Ｒｅｌ、ＮＦκＢファミリーメンバー若しくはそのいずれかのサブユニット、又はＩκＢ、又はタンパク質の断片、誘導体、相同体若しくは類似体の抗体の産生に使用できる。本発明の抗体には、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えにより産生された抗体、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、多特異的抗体（二重特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（二重特異的ｓｃＦｖｓを含む）、単鎖抗体Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び上記いずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、それらに限定されない。特に、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原（例えば抗体の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ））に免疫特異的に結合する抗原結合部位を有する分子が含まれる。
【００６５】
抗体の産生に関して、種々の宿主動物は、例えば未変性ｃ−Ｒｅｌタンパク質又は合成型、又は前述のものの誘導体による注射によって免疫化できる。かかる宿主動物には、ウサギ、マウス、ラット等が含まれるが、それらに限定されない。種々のアジュバントが、宿主種に応じて免疫応答を増加させるために使用でき、且つフロイント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのような無機ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロン酸ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、ジニトロフェノール、及びカルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）及びコリネバクテリウムパルブムのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含んでよいが、それらに限定されない。以下の事項は、ｃ−Ｒｅｌに特に言及するが、ここに記載された方法のいずれも、ｃ−Ｒｅｌ、ＮＦκＢファミリーメンバー若しくはそのいずれかのサブユニット、又はＩκＢに同様に適用される。
【００６６】
ｃ−Ｒｅｌ、又はその誘導体、相同体若しくは類似体に対して作られるモノクローナル抗体の調製に関して、培養中の連続継代細胞系統による抗体分子の産生を提供するいかなる技術も使用できる。かかる技術には、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）によって当初開発されたハイブリドーマ技術、トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：２６−３２）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）が含まれるが、それらに限定されない。本発明の追加の実施態様において、モノクローナル抗体は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５号に記載された最近の技術を利用して、無菌動物から産生できる。
【００６７】
本発明によれば、ヒト抗体は使用でき、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）又はインビトロでＥＢＶウイルスによってヒトＢ細胞を形質転換することによって（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）得られる。実際、本発明によれば、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、ｃ−Ｒｅｌに特異的なマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）が使用でき。即ち、かかる抗体は、本発明の範囲内である。
【００６８】
本発明によれば、単鎖抗体の産生に関して記載された技術（米国特許第４９４６７７８号）は、ｃ−Ｒｅｌ特異的抗体を産生できるように適応させてよい。本発明の追加の実施態様は、ｃ−Ｒｅｌタンパク質、その誘導体又は類似体に所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速且つ容易な識別を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリ構築に関して記載された技術を利用する（Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１）。非ヒト抗体は、公知の方法（例えば、米国特許第５２２５５３９号）によって「ヒト化」できる。
【００６９】
ｃ−Ｒｅｌのイディオタイプを含む抗体断片は、当該技術分野において公知の技術によって生成できる。例えば、かかる断片には、抗体分子のペプシン消化によって産生できるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させることにより生成できるＦａｂ’断片；パパイン及び還元剤によって抗体分子を処理することにより生成できるＦａｂ’断片；及びＦｖ断片が含まれるが、それらに限定されない。合成抗体、例えば化学合成によって産生された抗体は、本発明において有用である。
【００７０】
抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは、当該技術分野において公知の技術、例えばＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）によって達成できる。ｃ−Ｒｅｌ、又はその誘導体、相同体若しくは類似体の特定のドメインに特異的な抗体を選択するために、かかるドメインを含むｃ−Ｒｅｌタンパク質、又はその誘導体、相同体若しくは類似体の断片に結合する産生物の生成したハイブリドーマをアッセイできる。
【００７１】
組換え発現
本発明のスクリーニング方法で使用するｃ−Ｒｅｌ、及びその誘導体又は断片又は相同体の組換え産生方法は、当業者にとって周知である。ｃ−Ｒｅｌ、その誘導体、断片、及び相同体をコード化する核酸は、当該技術分野において公知である。例証的なヒトｃ−Ｒｅｌ分子をコード化するヌクレオチド配列は、公知であり、図１に提供される（配列番号１）。ｃ−Ｒｅｌをコード化する核酸は、当該技術分野において公知のいかなる方法によっても、例えば各配列の３’及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用するＰＣＲ増幅によって、且つ／又は各ヌクレオチド配列に特異的なオリゴヌクレオチドを使用するｃＤＮＡ又はゲノムライブラリからのクローニングによって得ることができる。
【００７２】
相同体（例えばヒト以外の種のｃ−Ｒｅｌをコード化する核酸）又は他の関連配列（例えばパラログ）は、核酸ハイブリダイゼーション及びクローニングの分野において周知の方法を使用して、プローブとして特定のヒト配列の全部又は一部による、低度、中度又は高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションによって得ることができる。
【００７３】
図１に示され（配列番号２）、コード化されたｃ−Ｒｅｌタンパク質は、タンパク質精製及び組換えタンパク質発現の分野において周知の方法によって得ることができる。１つ以上のタンパク質の組換え発現に関して、タンパク質をコード化するヌクレオチド配列の全部又は一部を含む核酸は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されるタンパク質コード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに導入できる。必要な転写及び翻訳シグナルは、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子及び／又はその隣接領域の未変性プロモーターによっても供給できる。
【００７４】
種々の宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現するために利用できる。これらには、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス等）に感染した哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母含有酵母ベクターのような、微生物；又はバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡによって形質転換された細菌が含まれるが、それらに限定されない。ベクターの発現要素は、その強度及び特異性の点で異なる。利用される宿主−ベクターに応じて、多数の適切な転写及び翻訳要素のいずれかが使用できる。
【００７５】
好ましい実施態様において、ヒトｃ−Ｒｅｌは、ヒトｃ−Ｒｅｌコード配列を発現させることによって得られる。更にもう１つの実施態様において、ｃ−Ｒｅｌの誘導体、断片又は相同体は、組換えにより発現される。１つの実施態様において、ｃ−Ｒｅｌタンパク質は、ｃ−Ｒｅｌ配列と異なるアミノ酸配列が、ｃ−Ｒｅｌ配列にペプチド結合を介して結合される、キメラ又は融合タンパク質として発現される。異なるアミノ酸配列は、発現されたキメラ又は融合タンパク質の検出又は単離のための、フラッグタグのようなタグであってもよい。
【００７６】
当該技術分野において利用できるいかなる方法も、適切な転写／翻訳制御シグナル及びタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築するために、ベクターへのＤＮＡ断片の挿入のために使用できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ及び合成技術及びインビボ組換え技術（遺伝子組換え）が含まれてよい。ｃ−Ｒｅｌ、又はその誘導体、断片若しくは相同体をコード化する核酸配列の発現は、遺伝子又はその断片が、組換えＤＮＡ分子によって形質転換された宿主中で発現されるように、第２核酸配列によって調節できる。例えばタンパク質の発現は、当該技術分野において公知のいかなるプロモーター／エンハンサーによっても制御できる。特定の実施態様において、プロモーターは、ｃ−Ｒｅｌの遺伝子にネイティブではない。もう１つの特定の実施態様において、プロモーターは、免疫細胞、例えば末梢血単核細胞、樹状細胞、又は単球細胞、又は脾細胞において活性である。使用できるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７３２７−３７３１）又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７９−９４）；ノパリン合成酵素プロモーターを含む植物発現ベクター（Ｈｅｒｒａｒ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３）又はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１）、及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼ（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０）；Ｇａｌ４プロモーターのような、酵母及び他の菌類からのプロモーター要素（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５１：  ４５８−４７６）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（Ｓｃｈｉｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：２３７−２５７）、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター（Ｓｔｒｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９：６５１−６７４−２５７；Ｇｕａｒｅｎｔｅ  １９８７，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：４２５−４５２）、アルカリホスファターゼプロモーター（Ｓｔｒｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２９：６５１−６７４−２５７；Ｇｕａｒｅｎｔｅ  １９８７，Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１：４２５−４５２）、及び組織特異性を示し、且つ形質転換動物に利用された次の動物転写制御領域：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ  １９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞で活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ球において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ球及びマスト細胞で活性であるマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝臓で活性であるアルブミン制御領域（Ｐｉｎｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓で活性であるアルファ−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  １９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）、肝臓で活性であるアルファ−１抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄性細胞で活性であるベータグロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）、脳の乏突起膠細胞で活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）、骨格筋で活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ  １９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、視床下部の性腺刺激細胞で活性である性腺刺激抄出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  １９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）が含まれるが、それらに限定されない。
【００７７】
特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌ、又はその断片、誘導体若しくは相同体をコード化する核酸配列に作動可能に結合されたプロモーターと、１つ以上の複製起点と、任意で１つ以上の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが使用される。
【００７８】
もう１つの特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌのコード配列、又はその一部を含む発現ベクターは、３つのｐＧＥＸベクター（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ発現ベクター；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ７：３１−４０）の各々のＥｃｏＲＩ制限部位に遺伝子配列をサブクローニングすることによって作られる。このことは、正しいリーディングフレーム中の合成物の発現を可能にする。
【００７９】
重要な配列を含む発現ベクターは、３つの一般的なアプローチ：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在又は不存在、及び（ｃ）挿入配列の発現、によって識別できる。第１のアプローチにおいて、ｃ−Ｒｅｌ配列は、挿入配列に相同及び相補的な配列を含むプローブへの核酸ハイブリダイゼーションによって検出できる。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクター中への対象配列の挿入によって引き起こされるある種の「マーカー」機能（例えば抗体物質耐性、バキュロウイルス中の閉塞体（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）形成等）の存在又は不存在に基づいて識別及び選択できる。例えば、ｃ−Ｒｅｌ遺伝子又はその一部が、ベクターのマーカー遺伝子配列中に挿入されると、ｃ−Ｒｅｌ断片を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能（例えばベータ−ガラクトシダーゼ活性の損失）の不存在によって識別される。第３のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、組換えベクターによって発現されるｃ−Ｒｅｌをアッセイすることによって識別できる。
【００８０】
一旦、組換えｃ−Ｒｅｌ分子が識別され単離されると、それらを増殖するために、当該技術分野において公知の幾つかの方法が使用できる。適切な宿主系及び成長条件を使用して、組換え発現ベクターは多量に増殖及び増幅できる。上記のように、使用できる発現ベクター又は誘導体には、ワクシニアウイルス又はアデノウイルスのようなヒト又は動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス、酵母ベクター；ラムダファージのようなバクテリオファージベクター；プラスミド及びコスミドベクターが含まれるが、それらに限定されない。
【００８１】
その上、所望の特定の方法で挿入配列の発現を調節し又は発現タンパク質を修飾又は処理する宿主細胞株が選択できる。幾つかのプロモーターからの発現は、幾つかの誘導物質の存在下で高めることができるため、遺伝子操作したｃ−Ｒｅｌの発現を制御できる。更に、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後処理及び修飾のための固有且つ特異的メカニズム（例えばグリコシル化、リン酸化等）を有する。適切な細胞系又は宿主系は、異種タンパク質の所望の修飾及び処理が確実に達成されるように選択できる。例えば、細菌系の発現は、非グリコシル化コアタンパク質を合成するために使用でき、他方で哺乳動物細胞中の発現は、非相同タンパク質の「未変性」グリコシル化を確実にする。更に、異なるベクター／宿主発現系は、異なる程度で処理反応を行い得る。
【００８２】
他の特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌタンパク質又はその断片、相同体若しくは誘導体は、異なるタンパク質の非相同タンパク質配列にペプチド結合を介して接合したタンパク質、断片、相同体又は誘導体を含む融合又はキメラタンパク質合成物として発現できる。かかるキメラ合成物は、当該技術分野において公知の方法によって、適切なコードフレーム中で所望のアミノ酸を互いにコード化する適切な核酸配列をライゲーションすること、及び当該技術分野において公知の方法によって適切な宿主中でキメラ合成物を発現することによって作ることができる。
【００８３】
モジュレーターを識別するスクリーニング方法
本発明の１つの実施態様において、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量、及びそれ故におそらく、ｃ−Ｒｅｌタンパク質が遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサー中のＮＦκＢ結合部位で配列特異的ＤＮＡ結合複合体を形成することで転写開始複合体を作り出す役割を果たす遺伝子の転写を活性化する活性、を実質的に変更することなく、候補分子の（質的及び／又は量的に）ｃ−Ｒｅｌ細胞内局在を変更する能力を検出することによって、ｃ−Ｒｅｌ活性のモジュレーター、例えば阻害剤、アンタゴニスト又はアゴニストを識別する方法が提供される。かかる遺伝子の例証的な例は、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン、例えばサブユニットｐ４０及びｐ３５の各々がそのプロモーター中にＮＦκＢ部位を含むものであるＩＬ−１２及びＩＬ−２３である。本発明の実施態様の１つの側面において、ｃ−Ｒｅｌ活性のモジュレーターを識別する方法は、細胞に候補モジュレーター分子を提供することと、ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなく核と同時精製又は共局在するｃ−Ｒｅｌ量を検出又は測定することと、を含み、核に同時精製又は共局在するｃ−Ｒｅｌの量又は存在の、候補分子に接触しない細胞と比較した差は、候補分子がｃ−Ｒｅｌ活性を調節することを示す。本発明のスクリーニング方法に有用な代表的な細胞及び細胞系には、候補分子と接触する前に、好ましくはＩＦＮ−γ及び／又はＬＰＳによって刺激されるマクロファージ、樹状細胞、単球細胞、末梢血単核細胞が含まれるが、それらに限定されない。
【００８４】
本発明の特定の側面は、核へのｃ−Ｒｅｌ局在を阻害又は促進する分子を識別することに関連する。もう１つの特定の側面において、細胞中に発現されたｃ−Ｒｅｌの転写レベル又は翻訳レベルでの全体量に影響を及ぼすことなく、核へのｃ−Ｒｅｌ局在を阻害又は促進する分子を識別することに関連する。好ましい側面において、例えばｃ−Ｒｅｌの核への移動を阻害すること又は核内のｃ−Ｒｅｌ分解率を増加させることによって、核内でｃ−Ｒｅｌ量を減少させる分子が、識別される。他の側面において、核内のｃ−Ｒｅｌ量又は核へのｃ−Ｒｅｌ移動は阻害されるが、ＮＦκＢファミリーメンバーｐ６５は核内で増加する。更にもう１つの側面において、核へのｃ−Ｒｅｌ移動は阻害され、ＩＣＳＢＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルに影響を及ぼして又は及ぼさずにＩＣＳＢＰ量も減少する。更にもう１つの側面において、核へのｃ−Ｒｅｌ移動は減少し、ｐ４０のプロモーター中のＥｔｓ−２結合ドメインは、核内のｃ−Ｒｅｌ量が減少しない細胞と比較して、転写を活性化する能力をもはや有さない。
【００８５】
上記事項を実行するために使用できる方法は、当該技術分野において公知であり、且つ／又は上記セクション５．１に開示された方法である。本発明のこの実施態様の方法において使用される細胞は、ｃ−Ｒｅｌ又はその断片、誘導体若しくは類似体を内在的に又は組換えによって発現する。ｃ−Ｒｅｌの組換え発現は、セクション５．１．１に記載されたように、又は当該技術分野において周知の手順を使用して、発現ベクターに核酸をコード化するｃ−Ｒｅｌを導入すること、及びその後にｃ−Ｒｅｌを発現する細胞にベクターを導入すること、又は発現用細胞に核酸をコード化するｃ−Ｒｅｌを単に導入することによって実行される。特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌは、タグがｃ−Ｒｅｌ活性又は細胞内局在に影響がない場合には、検出を容易にするため、タグによって発現される。多数の種からｃ−Ｒｅｌをコード化する核酸は、クローニングされて配列決定され、その発現は、当該技術分野において周知である。ヒトｃ−Ｒｅｌヌクレオチド及びアミノ酸配列の例証的な例を図１に示す（配列番号１及び２）。発現は、発現ベクターによってもよく、染色体内であってもよい。特定の実施態様において、ヒト樹状細胞系統、又はヒト単球細胞系統ＴＨＰ−１のような標準ヒト細胞系統、又はヒト末梢血単核細胞は、スクリーニングアッセイにおいて用いられる。特定の側面において、免疫細胞が用いられるとき、免疫細胞は、１つ以上の候補分子と接触する前、同時又は後に、リポ多糖（ＬＰＳ）又はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）のような免疫活性化化合物に接触される。
【００８６】
ベクターへのｃ−Ｒｅｌコード化ＤＮＡ結合複合体の挿入のための、当業者に公知のいかなる方法も、上記セクション５．１に記載された方法を含み、ｃ−Ｒｅｌを発現する発現ベクターを構築するために使用できる。その上、所望の特定の方法で、ｃ−Ｒｅｌの発現を調節する又は遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株が選択できる。幾つかのプロモーターからの発現は、幾つかの誘導物質の存在下で高められるため、ｃ−Ｒｅｌタンパク質の発現を制御できる。更に、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後処理及び修飾のための固有且つ特異的メカニズム（例えばグリコシル化、開裂）を有する。適切な細胞系又は宿主系は、発現されるｃ−Ｒｅｌタンパク質の所望の修飾及び処理を確実にするように選択できる。例証的な細胞系統は、以下の実施例の部に記載されるものである。
【００８７】
本発明のもう１つの実施態様において、ｃ−Ｒｅｌ活性の選択的阻害を媒介する薬物標的を識別する方法が提供される。１つのかかる例証的方法は、次のステップ：（ａ）ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなく細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる１つ以上の薬剤を標識化することと、（ｂ）１つ以上の標識化薬剤と薬物標的との間に複合体が形成される条件で、１つ以上の標識化薬剤に細胞を接触させることと、（ｃ）複合体を単離することと、（ｄ）複合体から薬物標的を識別することと、を記載した順序で含む。
【００８８】
候補分子
当該技術分野において公知のいかなる分子も、ｃ−Ｒｅｌ（又はその量）の細胞内局在の変化によって検出されるような、ｃ−Ｒｅｌ活性を調節する（増加又は減少させる）能力に関してテストできる。例として、局在の変化は、候補分子への曝露の前又は後に、核ともに精製する又は核に局在するｃ−Ｒｅｌ量の変化を検出することによって検出できる。ｃ−Ｒｅｌ活性を調節する分子を識別するために、候補分子は、ｃ−Ｒｅｌを発現する細胞に直接提供でき、又は、候補タンパク質の場合には、核酸がｃ−Ｒｅｌ発現細胞中で候補タンパク質を合成するために組換え発現される条件でそのコード化核酸を提供することによって提供できる。
【００８９】
核へのｃ−Ｒｅｌの移動を阻害するが、ＮＦκＢの発現及び／又はＩκＢの量を実質的に変更しない好ましい化合物には、次の化合物が含まれる。
化合物１：Ｎ−（１Ｈ−インドール−３−イルメチレン）−Ｎ’−［４−モルホリン−４−イル−６−（２−ピリジン−２−イル−エトキシ）−［１，３，５］トリアジン−２−イル］−ヒドラジン；
化合物２：Ｎ−（３−メチル−ベンジリデン）−Ｎ’−［６−モルホリン−４−イル−２−（２−ピリジン−２−イル−エトキシ）−ピリミジン−４−イル］−ヒドラジン；
化合物３：Ｎ−（１Ｈ−インドール−３−イルメチレン）−Ｎ’−［４−モルホリン−４−イル−６−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ピリジン−２−イル］−ヒドラジン；
化合物４：Ｎ−［３，５−ジフルオロ−２−モルホリン−４−イル−６−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ピリジン−４−イル］−Ｎ’−（３−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジン；
化合物５：Ｎ−（３−メチル−ベンジリデン）−Ｎ’−［４−モルホリン−４−イル−６−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ピリジン−２−イル］−ヒドラジン；
化合物６：Ｎ−メチル−Ｎ’−（３−メチル−ベンジリデン）−Ｎ−［４−モルホリン−４−イル−６−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ピリジン−２−イル］−ヒドラジン；
化合物７：４−メチル−２−｛［４−モルホリン−４−イル−６−（２−モルホリン−４−イル−エトキシ）−ピリジン−２−イル］−ヒドラゾノノメチル｝−フェニルアミン；
化合物８：Ｎ−（６，７−ジメトキシ−２−モルホリン−４−イル−キノリン−４−イル）−Ｎ’−（３−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジン；
化合物９：Ｎ−７−クロロ−２−モルホリン−４−イル−キナゾリン−４−イル）−Ｎ’−（３−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジン；
化合物１０：Ｎ−［７−メトキシ−２−モルホリン−４−イル−６−（２−フェノキシ−エトキシ）−キナゾリン−４−イル］−Ｎ’−（３−メチル−ベンジリデン）−ヒドラジン；
化合物１１：Ｎ−［６−モルホリン−４−イル−２−（２−ピリジン−２−イル−エトキシ）−ピリミジン−４−イルメチレン］−Ｎ’−ｍ−トリル−ヒドラジン；
化合物１２：Ｎ−（３−クロロ−フェニル）−Ｎ’−［６−モルホリン−４−イル−２−（２−ピリジン−２−イル−エトキシ）−ピリミジン−４−イルメチレン］−ヒドラジン；
化合物１３：Ｎ−（３−メトキシ−フェニル）−Ｎ’−［６−モルホリン−４−イル−２−（２−ピリジン−２−イル−エトキシ）−ピリミジン−４−イルメチレン］−ヒドラジン；及び
化合物１４：Ｎ−（２，５−ジメチル−フェニル）−Ｎ’−［６−モルホリン−４−イル−２−（２−ピリジン−２−イル−エトキシ）−ピリミジン−４−イルメチレン］−ヒドラジン
【００９０】
本発明のこの実施態様は、化学ライブラリから、核とともに精製する又は核に局在するｃ−Ｒｅｌ量を変更することによって、ｃ−Ｒｅｌ活性を調節、例えば阻害、拮抗又は作用（ａｇｏｎｉｚｅ）する分子をスクリーニングすることに適している。化学ライブラリは、ペプチドライブラリ、ペプチド模倣薬ライブラリ、化学合成されたライブラリ、組換え、例えばファージ提示ライブラリ、及びインビトロ翻訳ベースライブラリ、他の非ペプチド合成有機ライブラリ等であってもよい。
【００９１】
本発明の方法を使用してスクリーニングされるライブラリは、種々のタイプの化合物を含むことができる。本発明の方法によってスクリーニングできるライブラリの例には、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー（ｒａｎｄｏｍ  ｂｉｏｏｌｉｇｏｍｅｒｓ）；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒｓ）；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性（ｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ）ペプチド模倣薬；オリゴカルバミン酸塩；ホスホン酸ペプチジル；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；炭水化物ライブラリ；小分子ライブラリ（好ましくは、小有機分子ライブラリ）が含まれるが、それらに限定されない。幾つかの実施態様において、スクリーニングされるライブラリ中の化合物は、核酸又はペプチド分子である。非限定的な例において、ペプチド分子は、ファージ提示ライブラリ中に存在できる。他の実施態様において、化合物のタイプには、非天然発生アミノ酸、例えばＤ−アミノ酸、γ−アミノリン酸及びγ−アミノリン酸のような、アミノ酸のリン系類似体、又は非ペプチド結合を有するアミノ酸、ホスホロチオエート及びＰＮＡのような核酸類似体、ホルモン、抗原、合成又は天然発生薬物、アヘン剤、ドーパミン、セロトニン、カテコールアミン、トロンビン、アセチルコリン、プロスタグランジン、有機分子、フェロモン、アデノシン、ショ糖、ブドウ糖、ラクトース及びガラクトースからなるペプチドを含むペプチド類似体が含まれるが、それらに限定されない。ポリペプチド又はタンパク質のライブラリも、本発明のアッセイにおいて使用できる。
【００９２】
好ましい実施態様において、組合せライブラリには、ベンゾジアゼピン、イソプレノイド、チアゾリジノン、メタチアザノン、ピロリジン、モルホリノ合成物及びベンゾジアゼピンが含まれるが、それらに限定されない小有機分子ライブラリである。もう１つの実施態様において、コンビナトリアルライブラリには、ペプトイド；ランダムバイオオリゴマー；ベンゾジアゼピン；ヒダントイン、ベンゾジアゼピン及びジペプチドのようなダイバーソマー；ビニル性ポリペプチド；非ペプチド性ペプチド模倣薬；オリゴカルバミン酸塩；ホスホン酸ペプチジル；ペプチド核酸ライブラリ；抗体ライブラリ；又は炭水化物ライブラリが含まれる。コンビナトリアルライブラリは、市場で入手可能である（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ；ＣｈｅｍＳｔａｒ，Ｌｔｄ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ；３Ｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ；Ｍａｒｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ；等参照）。
【００９３】
好ましい実施態様において、ライブラリは、ライブラリの化合物が細胞取り込みにより受け入れられるように予め選択される。例えば、化合物は、化合物が細胞に入り込む可能性を高める、寸法、親油性、親水性、及び水素結合等の特定パラメータに基づいて選択される。もう１つの実施態様において、化合物は、三次元又は四次元コンピュータ計算プログラムによって分析される。
【００９４】
本発明の方法により使用するコンビナトリアル化合物ライブラリは、合成できる。薬理学的、生物学的、又は他の活性に関してスクリーニングできる小有機化合物の大きなコレクション又はライブラリの作成に向けられた合成方法には、大きな重要性がある。広大なコンビナトリアルライブラリを作り出すために適用される合成方法は、溶液中、又は固相中すなわち固体担体上で行われる。固相合成によれば、過剰な試薬を容易に添加して各反応ステップ後に洗い流すことができるので、多段階反応を実行すること及び反応を高収率で完了することが容易となる。固相組合せ合成は、同様に単離、精製及びスクリーニングを改良する傾向を有する。しかしながら、より伝統的な溶液相化学は、固相化学よりもより多種多様な有機反応を支持する。
【００９５】
本発明のコンビナトリアル化合物ライブラリは、ここに全体を参考として組み込む、Ｋｉｌｃｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６１９０６１９号に記載された装置を使用して合成できる。米国特許第６１９０６１９号は、複数の離散化合物の平行合成、又は化合物のコンビナトリアルライブラリのための複数の反応容器を保持することが可能な合成装置を開示する。
【００９６】
１つの実施態様において、コンビナトリアル化合物ライブラリは、溶液中で合成できる。ここに全体を参考として組み込む、Ｂｏｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第６１９４６１２号に記載された方法は、コンビナトリアルライブラリの溶液相合成の鋳型として有用な化合物を特徴とする。鋳型は、反応産物が、液−液又は固−液抽出を使用して、未反応反応物から容易に精製できるように設計されている。鋳型を使用してコンビナトリアル合成によって合成された化合物は、好ましくは小有機分子である。ライブラリ中の幾つかの化合物は、非ペプチド又はペプチドの効果を模倣する。コンビナトリアル化合物ライブラリの固相合成とは対照的に、液相合成は、多段階固相合成の個別のステップを観察する特定の手順の使用を必要としない（Ｅｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：２６５２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：２６５０；Ｆｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：７９５５；Ｌｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４９：７５８８；Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：８９４；Ｙｏｕｎｇｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔ．８：７７；Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＡＭ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：５４１９；Ｂｒｕｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：３９９；及びＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：４３１）。
【００９７】
本発明の方法に有用なコンビナトリアル化合物ライブラリは、固体担体上で合成できる。１つの実施態様において、スプリット合成方法、合成中に固体担体を分離及び混合するプロトコルは、固体担体上で化合物のライブラリを合成するために使用される（例えば、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：４１−４４８；Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６、及びそこに引用された参考文献を参照）。最終ライブラリ中の各固体担体は、その表面に付着した実質的に１タイプの化合物を有する。固体担体上にコンビナトリアルライブラリを合成する他の方法は、１つの産物が各担体に付着するものであり、当業者には知られている（例えばＮｅｆｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９７：４４９−４７２を参照）。
【００９８】
ここで使用されるように、用語「固体担体」は、特定のタイプの固体担体に限定されない。むしろ多数の担体が、利用可能であり、且つ当業者には知られている。固体担体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビード、木綿、プラスチックビード、ポリスチレンビード、アルミナゲル及び多糖が含まれる。適切な固体担体は、所望の最終用途及び種々の合成手順の適合性に基づいて選択できる。例えば、ペプチド合成に関して、固体担体は、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ｐＭＢＨＡ）樹脂のような樹脂（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）、クロロメチルポリスチレン、ヒドロキシメチルポリスチレン及びアミノメチルポリスチレンを含むポリスチレン（例えばＢａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ等から得られるＰＡＭ−ｒｅｓｉｎ）、ポリ（ジメチルアクリルアミド）移植スチレンコジビニルベンゼン（例えば、Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ，Ｃａｎａｄａから得られるＰＯＬＹＨＩＰＥ樹脂）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得られる）、ポリエチレングリコールによって移植されたポリスチレン樹脂（ＴＥＮＴＡＧＥＬ又はＡＲＧＯＧＥＬ，Ｂａｙｅｒ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得られる）、又はセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）であってもよい。
【００９９】
本発明の幾つかの実施態様において、化合物は、リンカーを介して固体担体に付着できる。リンカーは、一体である（ｉｎｔｅｇｒａｌ）又は固体担体の一部であってもよく、固体担体上に合成される又は合成後に固体担体に付着される非一体であってもよい。リンカーは、固体担体に化合物付着点を提供するだけでなく、リンカーの性質に応じて、様々な条件で様々な分子群が固体担体から開裂されることを可能にすることにも有用である。例えば、リンカーは、とりわけ、求電子開裂、求核開裂、光開裂（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）、酵素開裂、金属による開裂、還元条件での開裂又は酸化条件での開裂ができる。好ましい実施態様において、化合物は、化合物のハイスループットスクリーニングの前に固体担体から開裂される。
【０１００】
本発明の幾つかの実施態様において、化合物は、小分子である。
【０１０１】
代表的なライブラリは、幾つかの供給源から市場で入手可能である（ＡｒＱｕｌｅ，Ｔｒｉｐｏｓ／ＰａｎＬａｂｓ，Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）。場合によっては、これらの化学ライブラリは、メンバー化合物が付着される基質上でライブラリの各メンバーの識別性をコード化し、これにより有効なモジュレーター分子の直接且つ即時の識別を可能にするコンビナトリアル戦略を使用して生成される。従って、多くのコンビナトリアルアプローチにおいて、化合物のプレート上の位置は化合物の組成を特定する。同様に、１つの実施例において、単一のプレート位置は、対象の相互作用を含むウェルへの投与によってスクリーニングできる１−２０の化学物質を有することができる。従って、調節が検出された場合、相互作用対のますます小さいプールを調節活性に関してアッセイできる。かかる方法によって、多くの候補分子をスクリーニングできる。
【０１０２】
使用に適した多くの多様性ライブラリは、当該技術分野において公知であり、本発明によりテストする化合物を提供するために使用できる。あるいは、ライブラリは、標準的方法を使用して構築できる。化学（合成）ライブラリ、組換え発現ライブラリ、又はポリソームベースライブラリは、使用できるライブラリの代表的タイプである。
【０１０３】
ライブラリは、固定若しくは半硬質（ある程度の構造適合性を有する）、又は、線形若しくは非固定であってもよい。ライブラリは、ｃＤＮＡ又はゲノム発現ライブラリ、ランダムペプチド発現ライブラリ、又は化学合成ランダムペプチドライブラリ、又は非ペプチドライブラリである。発現ライブラリはアッセイが行われる細胞中に導入され、ライブラリの核酸がそのコード化されたタンパク質を合成するために発現される。
【０１０４】
１つの実施態様において、本発明において使用できるペプチドライブラリは、インビトロで化学合成されるライブラリであってよい。かかるライブラリの例は、各ペプチドの第１及び第２残基が個別に且つ具体的に定義された遊離ヘキサペプチドの混合物を記載したＨｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６；固コレクションの各ビードがその上にアミノ酸残基の単一ランダム配列を固定化したペプチドライブラリを作製した「１つのビード、１つのペプチド」アプローチを記載しているＬａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；スプリット合成及びＴ−バッグ（Ｔ−ｂａｇ）合成方法を記載しているＭｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；及びＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）：１２３３−１２５１に示される。単に他の例として、コンビナトリアルライブラリが、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：  １０９２２−１０９２６；Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；又はＳａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２の方法に従って、使用するために調製できる。国際公開第ＷＯ９３／２０２４２号及びＢｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｒｎｅｒ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３は、各化学ポリマーライブラリメンバーにオリゴヌクレオチド識別子を含む「コード化コンビナトリアル化学ライブラリ」を記載している。
【０１０５】
好ましい実施態様において、スクリーニングされたライブラリは、（例えばジスルフィド結合を有することに基づき）ランダムペプチドが固定されるランダムペプチドファージ提示ライブラリである生物学的発現ライブラリである。
【０１０６】
更に、より一般的な構造的に固定された有機多様性（例えば非ペプチド）ライブラリも使用できる。例として、ベンゾジアゼピンライブラリ（例えばＢｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２）が、使用できる。
【０１０７】
使用できる立体配座的に固定されたライブラリには、酸化環境において、システインを形成するためにジスルフィド結合により架橋する不変システイン残基、修飾ペプチド（例えばフッ素、金属、同位体標識を組み込む、リン酸化される等）、１つ以上の非天然発生アミノ酸を含むペプチド、非ペプチド構造、及び有意なγ−カルボキシグルタミン酸画分を含むペプチドを含むものが含まれるが、それらに限定されない。
【０１０８】
非ペプチド、例えばペプチド誘導体（例えば、１つ以上の非天然発生アミノ酸を含むもの）のライブラリも使用できる。これらの１つの例は、ペプチドライブラリである（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１）。ペプトイドは、アルファ炭素に付着せず、バックボーンアミノ窒素に付着する天然発生側鎖を有する、非天然アミノ酸のポリマーである。ペプトイドは、ヒト消化酵素によって容易に分解しないので、好適に、薬物の使用により容易に適合可能である。化学変化したコンビナトリアルライブラリを生成するために、ペプチド中のアミド基が予めメチル化され、使用できるライブラリのもう１つの例は、Ｏｓｔｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，により１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２）に記載されている。
【０１０９】
本発明によってスクリーニングできるペプチドライブラリのメンバーは、２０の天然発生アミノ酸を含むことに限られない。特に、化学合成されたライブラリとポリソームベースライブラリは、（ライブラリ作製において使用されるアミノ酸の前駆体プール中でそれらを含有することにより）２０の天然発生アミノ酸に加えて、アミノ酸の使用を可能にする。特定の実施態様において、ライブラリメンバーには、１つ以上の非天然又は非古典的アミノ酸又は環状ペプチドが含まれる。非古典的アミノ酸には、共通アミノ酸、αアミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸のＤ−異性体；γ−Ａｂｕ、６−アミノヘキサン酸；Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸；３−アミノプロピオン酸;オルニチン；ノルロイシン；ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキサアラニン、β−アラニン、デザイナーアミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、フルオロアミノ酸及び一般的にアミノ酸類似体が含まれるが、それらに限定されない。更に、アミノ酸はＤ（右旋性）又はＬ（左旋性）であってもよい。
【０１１０】
特定の実施態様において、ｃ−Ｒｅｌの断片及び／又は類似体、特にペプチド模倣薬は、ｃ−Ｒｅｌ核局在又は輸送の競合的又は非競合的阻害剤としての活性に関してスクリーニングされる。
【０１１１】
本発明のもう１つの実施態様において、ｃ−Ｒｅｌ核局在又は輸送のモジュレーターを識別するために、コンビナトリアル化学が使用できる。コンビナトリアル化学は、多くが構造的に類似していてもよい数十万の化合物を含むライブラリを作り出せる。ハイスループットスクリーニングプログラムは、公知の標的の親和力に関してこれらの広大なライブラリをスクリーニングすることが可能であるが、より小さな寸法であり最大の化学多様性を提供するライブラリを実現する新しいアプローチが開発された（例えば、Ｍａｔｔｅｒ，１９９７，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１２１９−１２２９を参照）。
【０１１２】
コンビナトリアル化学の１つの方法、アフィニティーフィンガープリント法は、タンパク質の定義パネルの結合親和力に関して、小分子の離散ライブラリをテストするために、以前使用された。スクリーニングによって得られたフィンガープリントは、重要な他のタンパク質又はレセプター（本発明においてｃ−Ｒｅｌ）の個別のライブラリメンバーの親和力を予測するために使用される。フィンガープリントは、ライブラリ化合物が同じように反応するか否かを予測するために、対象のタンパク質と反応することが知られている他の化合物から得られたフィンガープリントと比較される。例えば、ｃ−Ｒｅｌとの相互作用に関して大きなライブラリ中の全てのリガンドをテストするよりも、その活性を有することが知られている他の化合物に類似したフィンガープリントを有するリガンドをテストできる（例えば、Ｋａｕｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：１０７−１１８；Ｋａｕｖａｒ，１９９５，Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．８：２５−２８；及びＫａｕｖａｒ，Ｔｏｘｉｃ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｄ．Ｋｕｒｔｚ．Ｌ．Ｓｔａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈ．Ｅｄｉｔｏｒｓ，１９９５，ＡＯＡＣ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，３０５−３１２参照）。
【０１１３】
Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５（Ｋａｙ）は、いかなる先行する従来のライブラリのそれよりも長い、完全にランダムな配列のペプチドをコード化するペプチドライブラリを構築する方法を開示している。Ｋａｙに開示されたライブラリは、長さが約２０アミノ酸を超える完全合成ランダムペプチドをコード化する。かかるライブラリは、好適に、ｃ−Ｒｅｌモジュレーターを識別するためにスクリーニングできる。（１９９６年３月１２日の米国特許第５４９８５３８号；及び１９９４年８月１８日の国際公開第ＷＯ９４／１８３１８号も参照）。
【０１１４】
他のライブラリには、抗体ライブラリ及び細胞中で発現される細胞内発現抗体のライブラリが含まれてよい。
【０１１５】
各化合物がアドレス又は識別子を有する化合物のアレイ又はマイクロアレイをライブラリが含むならば、化合物は、例えば、個別のテストアッセイに適用された当初の化合物リストと陽性試料とを相互参照することによって解析できる。
【０１１６】
ライブラリがペプチド又は核酸ライブラリであるならば、化合物の配列は、ペプチド又は核酸の直接配列決定によって判定できる。かかる方法は、当業者に周知である。
【０１１７】
種々のタイプのペプチドライブラリの包括的な検討は、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２５１に認められる。
【０１１８】
スクリーニングアッセイで識別される化合物
本発明は、上記スクリーニングアッセイによって識別される化合物及びこれらのアッセイの使用によってかかる薬剤を製造する工程を更に対象とする。化合物には、核酸、アンチセンス核酸、リボザイム、三重らせん体、抗体、及びポリペプチド分子、小無機又は有機分子が含まれるが、それらに限定されない。従って、１つの実施態様において、本発明は、前記スクリーニングアッセイのいずれかのステップを含む方法によって得られる化合物を含む。例えば、化合物は、１つ以上の候補分子と細胞を接触させることと；細胞中のｃ−Ｒｅｌ分子の局在を検出することと、を含む方法によって得られ、１つ以上の候補分子に接触しない細胞中の量に対して、ＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく核内のｃ−Ｒｅｌ量が増加又は減少する。
【０１１９】
一旦テスト化合物が本発明のスクリーニング方法により適切な活性を有すると識別されると、テスト化合物は、例えば動物におけるｃ−Ｒｅｌ活性又は細胞内局在のモジュレーターの活性を確認するため、又は潜在的副作用に関して、動物モデル中で更なるテストを受けることができる。テスト化合物は、その所望の活性を確認するために、細胞ベース又は動物アッセイの両方で、ｃ−Ｒｅｌ活性又は細胞内局在を調節する公知の化合物に対してもテストできる。識別された化合物は、かかる化合物の投与に関連し得る毒性又は副作用を判定するためにもテストできる。あるいは、ここに記載されたように識別された化合物は、かかる化合物の作用機序を判定するために動物モデル中で使用できる。
【０１２０】
細胞中でＮＦκＢの発現レベル及び／又はＩκＢの量を実質的に変更することなく、細胞の核内のｃ−Ｒｅｌ量を減少させる薬剤の生物学的効果を評価するかかる代表的な評価方法は、薬剤と細胞を接触させることと、細胞中のあらゆる表現型効果を観察することと、を含む。もう１つの例証的な方法は、テスト被検者／動物に薬剤を投与することと、テスト被検者／動物におけるあらゆる表現型効果を観察することと、を含む。
【０１２１】
本発明は、ここに記載されたかかる化合物の処理方法の上記スクリーニングアッセイによって識別される化合物の使用にも関係する。従って、ここに記載されたような、診断、予後又は治療に使用するための薬物又は医薬組成物の設計、製剤、合成、製造及び／又は製造にかかる化合物を使用することは、本発明の範囲内である。例えば、１つの実施態様において、本発明は、上記スクリーニングアッセイの１つによって得ることが可能な化合物の構造及び／又は特性を参照することによって、薬物又は医薬組成物を合成又は製造する方法を含む。例えば、薬物又は医薬組成物は、上記に記載したスクリーニング方法によって得られる化合物の構造及び／又は特性に基づき合成できる。
【０１２２】
更に、識別された化合物は、治療又は予防方法における使用のための製剤化前に、化合物をより安定にする、すなわち被検者における半減期を増加させる、又は化合物を被検者の組織に更に容易に吸収されるようにするために、当該技術分野において公知の方法を使用して修飾できる。かかる修飾には、ＰＥＧ付加（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、多量体化が含まれるが、それらに限定されない。かかる修飾は、化合物を投与により適するようにするために、薬化学者によって行われる。更に、識別される化合物は、血液脳関門を通過できるように修飾されてよい。
【０１２３】
所望の生物活性を示す化合物は、有用な薬理学的活性を有する同属種又は類似体の発達又は設計のためにリード化合物として使用できる。例えば、一旦リード化合物が識別されると、より有効であり得る化合物の変異体を設計するために分子モデリング技術が使用できる。分子モデリング系の例は、ＣＨＡＲＭ及びＱＵＡＮＴＡプログラムである（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。ＣＨＡＲＭは、エネルギー最小化及び分子動力学機能を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、構築、図形モデリング及び分子構造の分析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子相互の行動の対話型構築、修飾、視覚化及び分析を可能にする。有用な薬理学的活性を有する同属種又は類似体の発達又は設計のためのリード化合物として使用できる代表的化合物は、各々、全体がここに参照として組み込まれる、米国特許第６３８４０３２号；２００２年５月７日に出願された米国特許出願第０９／５９４３６２号；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／００６６２４号（公開第２００２００８２２５９号）；２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第１０／０００７４２号（公開第２００３０１３９４０３号）；２００２年７月１０日に出願された米国特許出願第１０／１９２３４７号（公開第２００３０１１４４４６号）；２００２年１１月２６日に出願された米国特許出願第１０／３０５０３９号；国際公開第ＷＯ００／７８７５７号；国際公開第ＷＯ０３／０４５１６号；２００３年１０月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ０３／３２５４６号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７９１号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８７号；２００３年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／５１８７８８号；発明の名称「Ｆｕｓｅｄ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５０；発明の名称「Ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ  Ｈｙｄｒａｚｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５２；発明の名称「Ｐｙｒｉｄｉｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」、Ｍｉｔｓｕｎｏｒｉ  Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、２００４年１１月１０日に出願された国際特許出願代理人事件整理番号（５０５８６）６１２５３に記載されている。
【０１２４】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７：１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，１９９８，Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７；ＭｃＫｉｎａｌｙ  ＆  Ｒｏｓｓｍａｎｎ，１９８９，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．２９：１１１−１２２；Ｐｅｒｒｙ  ＆  Ｄａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；Ｌｅｗｉｓ  ＆  Ｄｅａｎ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６：１２５−１４０及び１４１−１６２；Ａｓｋｅｗ  ｅｔ  １９８９，  Ｊ．  ＡＭ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．１１１：１０８２−１０９０のような多数の論文は、特定のタンパク質と相互作用をする薬物のコンピュータモデリングを検討している。化学物質をスクリーニング及び図形的に描く他のコンピュータープログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ），Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ），及びＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｏｎｔａｒｉｏ）のような会社から入手可能である。これらは、特定のタンパク質に特異的な薬物への応用のために主に設計されたが、いずれかの識別された領域に特異的な薬物の設計に適応させることができる。あるいは、スクリーニングにおいて確認される僅かな生物性を有する又は生物活性を有さないリード化合物も、生物活性を有する化合物の類似体及び同属種を設計するために使用できる。
【０１２５】
医薬組成物及び治療／予防投与
本発明は、本発明の治療物（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）、すなわち本発明のスクリーニング方法によって識別される化合物を、被検者に有効量投与することによる治療（及び予防）方法を提供する。好ましい側面において、治療物は実質的に精製されている。被検者は、好ましくはウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であり、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。特定の実施態様において、非ヒト哺乳動物は被検者である。
【０１２６】
特定の実施態様において、本発明は、ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量が実質的に変更せずｃ−Ｒｅｌの細胞内局在が異常であることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなくｃ−Ｒｅｌの核局在を減少させる分子を含む組成物及び薬理学的に許容できるキャリアを、かかる疾患又は障害を有する被検者に投与することを含む方法を提供する。もう１つの特定の実施態様において、本発明は、ＩＬ−１２産生関連疾患又は障害を治療する方法であって、ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなくｃ−Ｒｅｌの核局在を減少させる分子を含む組成物及び薬理学的に許容できるキャリアを、かかる疾患又は障害を有する被検者に投与することを含む方法を提供する。もう１つの特定の実施態様において、本発明は、ｃ−Ｒｅｌ依存性サイトカイン産生に関連する疾患又は障害を治療する方法であって、ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなくｃ−Ｒｅｌの核局在を減少させる分子を含む組成物及び薬理学的に許容できるキャリアを、かかる疾患又は障害を有する被検者に投与することを含む方法を提供する。更にもう１つの特定の実施態様において、本発明は、自己免疫疾患又は障害を治療する方法であって、ＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなくｃ−Ｒｅｌの核局在を減少させる分子を含む組成物及び薬理学的に許容できるキャリアを、かかる疾患又は障害を有する被検者に投与することを含む方法を提供する。前述の方法においてＮＦκＢの発現レベル又はＩκＢの量を実質的に変更することなくｃ−Ｒｅｌの核局在を減少させる分子は、ここのスクリーニング方法によって識別されるもの（例えば詳細な説明において記載されたもの）であってもよい。
【０１２７】
ここに記載された化合物及び組成物は、いかなるＩＬ−１２産生関連障害、例えば炎症性障害、免疫疾患、神経系障害及び骨量減少疾患を治療及び予防するために有用である。治療及び予防方法も提供される。
【０１２８】
用語「炎症性障害」は、ＩＬ−１２産生によって引き起こされ、悪化され又は媒介される、いかなる炎症性疾患、障害又は状態も含む。かかる炎症性障害には、喘息、成人呼吸促迫症候群、全身性紅斑性狼瘡、炎症性腸疾患（クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む）、多発性硬化症、インスリン依存性真性糖尿病、自己免疫関節炎（リウマチ関節炎、若年性リウマチ関節炎、乾癬性関節炎を含む）、炎症性肺症候群、尋常性天疱瘡、突発性血小板減少性紫斑点病、自己免疫髄膜炎、重症筋無力症、自己免疫甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群（シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含む）、円形脱毛症、節足動物刺傷反応に起因するアレルギー応答、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、（スティーヴェンズ−ジョンソン症候群のような）薬疹、らい病反転反応、らい性結節性紅斑、自己免疫ブドウ膜炎、アレルギー性脊髄炎、無形成貧血、赤芽球ろう、突発性血小板減少、多発性軟骨炎、ヴェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、グレーブス眼症、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、及び間質性肺線維症が含まれるが、それらに限定されない。
【０１２９】
「炎症性障害」は、急性炎症性障害を明白に含む。急性炎症性障害には、移植片対宿主病、移植拒絶、敗血症性ショック、内毒血症、ライム関節炎、感染性髄膜炎（例えば、ウイルス、細菌、ライム病関連）、喘息の急性発症及び自己免疫疾患の急性発症が含まれる。
【０１３０】
「炎症性障害」は、慢性炎症性障害を明白に含む。慢性炎症性障害の非限定的な例には、喘息、風疹関節炎、及び全身性紅斑性狼瘡、乾癬、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、多発性硬化症及びリウマチ関節炎のような慢性自己免疫疾患が含まれる。
【０１３１】
用語「免疫疾患」は、ＩＬ−１２産生によって引き起こされ、悪化され又は媒介されるいかなる免疫疾患、障害又は状態も含む。かかる免疫疾患には、リウマチ関節炎、若年性リウマチ関節炎、全身性発症若年性リウマチ関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、胃潰瘍、血清陰性関節炎、骨関節炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、全身性紅斑性狼瘡、抗リン脂質症候群、虹彩毛様体炎／ブドウ膜炎／視神経炎、特発性肺線維症、全身性血管炎／ヴェゲナー肉芽腫症、サルコイドーシス、睾丸炎／精管切除反転法、アレルギー／アトピー性疾患、喘息、アレルギー鼻炎、湿疹、アレルギー接触性皮膚炎、アレルギー結膜炎、過敏性肺臓炎、移植体、臓器移植拒絶、移植片対宿主病、全身炎症反応症候群、敗血症候群、グラム陽性敗血症、グラム陰性敗血症、培養陰性敗血症、真菌性敗血症、好中球減少性発熱、尿路性敗血症、髄膜炎菌血症、外傷／出血、熱傷、電離放射線の曝露、急性膵炎、成人呼吸促迫症候群、リウマチ関節炎、アルコール誘導肝炎、慢性炎症性病変、サルコイドーシス、クローン病変、鎌状赤血球貧血、糖尿病、ネフローゼ、アトピー性疾患、過敏性反応、アレルギー性鼻炎、枯草熱、通年性鼻炎、結膜炎、子宮内膜症、喘息、じんま疹、全身アナフィラキシー、皮膚炎、悪性貧血、溶血性疾患、血小板減少、いずれかの臓器又は組織の移植片拒絶、腎臓移植拒絶、心臓移植拒絶、肝臓移植拒絶、膵臓移植拒絶、肺移植拒絶、骨髄移植（ＢＭＴ）拒絶、皮膚同種移植片拒絶、軟骨移植拒絶、骨移植片拒絶、小腸移植拒絶、胎児胸腺インプラント拒絶、上皮小体移植拒絶、いずれかの臓器又は組織の異種移植片拒絶、同種移植片拒絶、抗レセプター過敏症反応、グレーブス病、レイノー病、Ｂ型インスリン抵抗性糖尿病、喘息、重症筋無力症、抗体媒介性細胞障害反応、ＩＩＩ型過敏性反応、全身性紅斑性狼瘡、ＰＯＥＭＳ症候群（多発性神経症、巨臓器症、内分泌疾患、単一クローン性高ガンマグロブリン血症、及び皮膚変化症候群）、多発性神経症、巨臓器症、内分泌疾患、単一クローン性高ガンマグロブリン血症、皮膚変化症候群、抗リン脂質症候群、天疱瘡、強皮症、混合結合組織病、特発性アディソン病、真性糖尿病、慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、白斑、血管炎、心筋梗塞後心臓切開症候群、ＩＶ型過敏症、接触皮膚炎、過敏症肺臓炎、同種移植片拒絶、細胞内生物に起因する肉芽腫、薬剤感受性、代謝性／特発性、ウィルソン病、ヘマクロマトーシス、α−１−抗トリプシン欠乏、糖尿病網膜症、橋本甲状腺病、骨粗鬆症、視床下部−下垂体−副腎軸評価、原発性胆汁性肝硬変、甲状腺炎、脳脊髄炎、悪液質、嚢性線維症、新生児慢性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、家族性食血細胞リンパ組織球増多症、皮膚病変、乾癬、脱毛、ネフローゼ症候群、腎炎、糸球体腎炎、急性腎不全、血液透析、尿毒、毒性、子癇前症、ｏｋｔ３療法、抗ｃｄ３療法、サイトカイン療法、化学療法、放射線療法（例えば、無力症、貧血、悪液質等が含まれるが、それらに限定されない）、慢性サリチル酸中毒等が含まれるが、限定されない。例えば、各々、全体が参考として組み込まれる、ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、１２ｔｈ−１７ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ���Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．（１９７２、１９７７、１９８２、１９８７、１９９２、１９９９）、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．（１９９８、２０００）を参照されたい。
【０１３２】
用語「神経系障害」は、ＩＬ−１２産生によって引き起こされ、悪化され又は媒介されるいかなる神経系疾患、障害又は状態も含む。かかる神経系障害には、神経変性疾患、多発性硬化症、片頭痛、エイズ痴呆複合症候群、多発性硬化症及び急性横断脊髄炎のような脱髄疾患；皮質脊髄系の傷害のような錐体外路及び小脳障害；基底核の障害及び小脳障害；ハンチントン舞踏病及び老年舞踏病のような運動過剰性運動障害；ＣＮＳドーパミンレセプターを遮断する薬剤によって誘導されるような、薬剤誘導運動障害；パーキンソン病のような運動低下運動障害；進行性核上性麻痺；小脳の構造的病変；脊髄小脳変性、例えば脊髄性運動失調、フリードライヒ運動失調、小脳皮質変性、多系統変性（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ及びＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）；全身障害（レフスム病、無βリポタンパク質血症、運動失調、末梢血管拡張、及びミトコンドリア多臓器障害）；脱髄性コア障害、例えば多発性硬化症、急性横断脊髄炎；及び運動単位の障害、例えば運動因性筋萎縮（前角細胞変性、例えば筋萎縮性側索硬化症、小児性棘筋萎縮及び若年棘筋萎縮）；アルツハイマー病；中年におけるダウン症候群；広汎性レーヴィー体疾患；レーヴィー体型の老人性痴呆；ヴェルニッケ−コルサコフ症候群；慢性アルコール中毒；クロイツフェルト−ヤコブ病；亜急性硬化性全脳炎、ハレルフォルデン−スパッツ病（Ｈａｌｌｅｒｒｏｒｄｅｎ−Ｓｐａｔｚ  ｄｉｓｅａｓｅ）；及びボクサー痴呆等が含まれるが、これらに限定されない。かかる方法は、かかる調節、治療又は療法を必要とする細胞、組織、臓器、動物又は患者に、少なくとも１種のＴＮＦ抗体又は特定部分又は変異体を含む有効量の組成物又は医薬化合物を投与することを任意に含むことができる。例えばｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ、１６、Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．（１９９２）を参照されたい。
【０１３３】
用語「骨量減少疾患」は、ＩＬ−１２産生によって引き起こされ、悪化され又は媒介されるいかなる骨量減少疾患、障害又は状態、例えば歯周病、非悪性骨障害（例えば、骨粗鬆症、骨のパジェット病、骨形成不全、線維性異形成症、及び原発性上皮小体亢進）、エストロゲン欠乏、炎症性骨量減少、骨悪性疾患、関節炎、大理石骨病、及びある種の癌関連障害（例えば、悪性高カルシウム血症（ＨＣＭ）、多発性骨髄腫の骨溶解性骨病変及び乳癌の骨溶解性骨転移、及び他の転移癌）も含む。
【０１３４】
これらの定義が重複する場合、疾患、状態又は障害は、ＩＬ−１２産生関連障害の上記一覧に記載された分類のいずれかの構成要素であると考えてよい。特定のＩＬ−１２産生関連疾患には、リウマチ関節炎、敗血症、クローン病、多発性硬化症、乾癬、又はインスリン依存性真性糖尿病が含まれる。
【０１３５】
治療物が上記のアッセイによって識別される調節化合物を含むときに用いることができる製剤及び投与方法；追加の適切な製剤及び投与経路は、ここで以下に記載されたものから選択できる。その上、本発明の治療物は、同様に本発明の疾患又は障害を治療するためのいずれかの公知の薬物と併せて投与できる。
【０１３６】
種々の送達システムが、公知で、本発明の治療物を投与するために使用でき、例えばリポソーム、微粒子及びマイクロカプセル中のカプセル化、治療物を発現できる細胞の使用、レセプター媒介エンドサイトーシスの使用（例えばＷｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）；レトロウイルス又は他のベクターの一部としての治療核酸の構築等である。導入方法には、皮内、筋肉内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が含まれるが、それらに限定されない。化合物は、いかなる従来の経路、例えば注入、大量瞬時投与、上皮又は粘膜皮膚内層を通した吸収（例えば、経口、直腸、腸粘膜等）によっても投与でき、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与できる。投与は、全身又は局所であってもよい。更に、脳室内及び髄腔内注射を含むいずれかの適切な経路によって、中枢神経系に本発明の医薬組成物を導入することが望ましくなり得る。脳室内注射は、例えば、オマヤレザバーのようなレザバーに付着した脳室内カテーテルによって、容易に行うことができる。肺投与も、例えば吸入器又はネブライザーの使用、及びエアロゾル化剤による製剤によって行うことができる。
【０１３７】
好ましい実施態様において、治療物は、経口投与用に製剤される。これらの剤形には、当該技術分野において周知の持続放出製剤が含まれ、錠剤（コーティングされた、又はされていない）、カプレット、硬質ゼラチンカプセル、軟質ゼラチンカプセル、トローチ、糖剤、分散、懸濁液、溶液等が含まれる。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，１９８５，Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．，Ｌｅａ  ａｎｄ  Ｆｅｂｉｇｅｒ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９９５，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照されたい。投与が容易であるために、錠剤及びカプセルが好ましく、最も好適な経口剤単位形となり、その場合、固体医薬賦形剤が用いられる。必要に応じて、錠剤及びカプレット又はカプセルは、標準的な水性又は非水性技術によってコーティングできる。
【０１３８】
特定の実施態様において、本発明の医薬組成物を、治療の必要がある領域に局所的に投与することが望ましくなり得る。このことは、例えば、非限定で、手術中の局所注入、例えば手術後の創傷包帯と併せた、局所適用、注射、カテーテル、座薬、又はインプラントによって行うことができ、かかるインプラントは、唾液腺膜（ｓｉａｌａｓｔｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）のような膜、又は繊維を含む多孔質、無孔質、又はゼラチン状材料を含む。１つの実施態様において、投与は、悪性腫瘍又は新生物形成若しくは新生物形成前組織の部位（又は以前の部位）での直接注射によってもよい。
【０１３９】
もう１つの実施態様において、治療物は、小胞、特にリポソーム中で送達できる（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｉｎ：Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ，ｅｄｓ．，Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７；一般的に同書参照）。
【０１４０】
更にもう１つの実施態様において、治療物は、放出制御システムを介して送達できる。１つの実施態様において、ポンプが使用できる（Ｌａｎｇｅｒ，上掲；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−２４０；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７−５１６；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−５７９）。もう１つの実施態様において、ポリマー材料が、使用できる（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−１９２；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−３５６；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：８５８−８６３）。更にもう１つの実施態様において、放出制御システムは、治療標的、すなわち脳の近傍に置くことができ、これにより全身容量の一部分のみが必要となる（例えばＧｏｏｄｓｏｎ，１９８４，Ｉｎ：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，上掲，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８）。他の放出制御システムは、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３）による検討において論じられている。
【０１４１】
本発明は、医薬組成物も提供する。かかる組成物は、治療上有効量の治療物、及び薬理学的に許容できるキャリアを含む。特定の実施態様において、用語「薬理学的に許容できる」は、動物、且つ特にはヒトへの用途で、連邦又は州政府の監督庁によって承認され、又は米国薬局方若しくは他の一般的に認められた薬局方に記載されていることを意味する。用語「キャリア」は、治療物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを指す。かかる医薬キャリアは、石油、動物、植物又は合成由来の水及び油のような滅菌液であってよく、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等が含まれるが、それらに限定されない。医薬組成物が経口投与される時、水は好ましいキャリアであり得る。医薬組成物が静脈内に投与される時、食塩水及び水性デキストロースは好ましいキャリアである。食塩液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、注射可能な溶液のための液体キャリアとして、好ましく用いられる。適当な医薬賦形剤には、デンプン、ブドウ糖、乳糖、蔗糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。所望の場合、組成物は、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤も含んでよい。これらの組成物は、溶液、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、持続放出製剤等の形状をとってよい。組成物は、トリグリセリドのような従来の結合剤及びキャリアによって、座薬として製剤できる。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準的なキャリアを含むことができる。適切な医薬キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。かかる組成物は、患者に適切な投与のための形状を提供するように、適切な量のキャリアと共に、好ましくは精製された形状で治療上有効量の治療物を含む。製剤は、投与方法に適しているべきである。
【０１４２】
好ましい実施態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適した医薬組成物として、通常の手順により製剤される。通常、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張緩衝剤中の溶液である。必要な場合、組成物は、注射部位での疼痛を緩和するために、可溶化剤及びリドカインのような局所麻酔薬を含むことができる。一般的に、成分は、別個に、又は単位剤形中で一緒に混合されて、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又はサシェット（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような気密密封された容器中の乾式凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、提供される。組成物が注入によって投与される場合、滅菌の医薬品グレードの水又は食塩水を含む注入ビンで投薬できる。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合されるように、注射用の滅菌水又は食塩水のアンプルを提供してよい。
【０１４３】
本発明の治療物は、中性又は塩形状で製剤できる。薬理学的に許容できる塩には、遊離カルボキシル基、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から誘導されるものによって形成される塩、遊離アミン基、例えばイソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等によって誘導されるもの及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムと水酸化第二鉄等によって誘導されるものによって形成される塩が含まれる。
【０１４４】
好ましい医薬組成物及び剤形は、本発明の治療物又はその薬理学的に許容できるプロドラッグ、塩、溶媒和化合物、又はクラスレートを、任意で、１つ以上の追加の活性薬物と組み合わせて含む。
【０１４５】
特定の障害又は状態の治療に有効な本発明の治療物の量は、障害又は状態の性質、及び標準的臨床技術によって決定できる。その上、最適な用量範囲を識別に役立つように、インビトロアッセイを任意に用いることができる。製剤で用いる正確な用量は、投与経路及び疾患又は障害の重症度によっても決まり、医師の判断及び各患者の状況により決定せねばならない。しかしながら、静脈内投与の適切な投与量範囲は、一般的に体重１キログラム当たり約１−５０ミリグラムの活性化合物である。鼻腔内投与の適切な投与量範囲は、一般的に体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇから体重１ｋｇ当たり約５０ｍｇである。有効用量は、インビトロ又は動物モデルテストシステムから導かれた用量応答曲線から推定できる。
【０１４６】
座薬は、一般的に、０．５から１０重量％の範囲の活性成分を含む。経口製剤は、好ましくは１０％から９５％の活性成分を含む。
【０１４７】
小分子の代表的用量は、被検者又は試料の重量１キログラム当たりミリグラム又はマイクログラムの量の小分子を含む（例えば、１キログラム当たり約１マイクログラムから１キログラム当たり約５００ミリグラム、１キログラム当たり約１００マイクログラムから１キログラム当たり約５ミリグラム、又は１キログラム当たり約１マイクログラムから１キログラム当たり約５０マイクログラム）。
【０１４８】
本発明が包含する抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及び融合タンパク質に関して、患者に投与される投与量は、通常、患者の体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇから１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与される投与量は、患者の体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜２ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜１ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．７５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．２５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．１５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．１０ｍｇ、０．００１ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．０１ｍｇ〜０．２５ｍｇ、又は０．０１ｍｇ〜０．１０ｍｇである。一般的に、ヒト抗体は、異種ポリペプチドへの免疫応答のために、他種由来の抗体よりも人体中で長い半減期を有する。従って、ヒト抗体の低い投与量及び頻度の低い投与がしばしば可能である。更に、本発明の抗体又はその断片の投与量及び投与頻度は、例えば脂質化のような修飾により、抗体の取り込み及び組織浸透を強化することで、減少できる。
【０１４９】
更に、幾つかの実施態様において、ＩＬ−１２産生は、ＩＬ−６又はＩＦＮ−γ産生を阻害するために必要な濃度よりも、低い薬物濃度で阻害できるので、適切な投与量には、ＩＬ−１２を選択的に阻害するが他のサイトカインを阻害しないものが含まれる。
【０１５０】
本発明の治療物は、米国特許第３８４５７７０；３９１６８９９；３５３６８０９；３５９８１２３；及び４００８７１９、５６７４５３３、５０５９５９５、５５９１７６７、５１２０５４８、５０７３５４３、５６３９４７６、５３５４５５６及び５７３３５６６号に記載されたような、当業者に周知な放出制御手段又は送達装置によっても投与できる。これらの放出制御組成物は、種々の比率で所望の放出プロフィールを提供するために、そこに使用される１つ以上の活性成分、例えばヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透系、多層コーティング、微小粒子、リポソーム、小球体等、又はその組み合わせの減速又は制御された放出を提供するために使用できる。当業者に公知の適切な放出制御製剤は、本発明の医薬組成物による使用のために容易に選択できる。
【０１５１】
全ての放出制御医薬品は、薬剤療法を、制御されない医薬品によって実現されるものよりも改良するという共通の目標を有する。理想的には、医療において最適に設計された放出制御調剤は、最小限の時間で状態を治療又は制御するために使用される最小限の薬物物質により特徴づけられる。放出制御製剤の利点には、薬物の長時間の活性、投与頻度減少及び／又は患者のコンプライアンス増加が含まれる。
【０１５２】
大部分の放出制御製剤は、所望の治療効果を迅速に発揮する治療物量を最初に放出し、適切なレベルの治療効果を徐々に長時間にわたって維持するために、継続的に治療物の他の量を放出するように設計されている。体内で、この一定のレベルの治療物を維持するために、治療物は、代謝され、体から排出された治療物の量と同様の速度で組成物から放出されねばならない。治療物の放出制御は、種々の誘導物質、例えば、ｐＨ、温度、酵素、水又は他の生理学的条件若しくは化合物によって刺激され得る。本発明との関連でのかかる放出制御成分には、活性成分の放出制御を容易にする、ポリマー、ポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、リポソーム、小球体等、又はその組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【０１５３】
本発明は、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分で満たされた１つ以上の容器を備える医薬パック又はキットも提供する。任意に、医薬品又は生物学製品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であって、ヒト投与のための製造、使用又は販売の機関による承認を反映する通知を、かかる容器に記載してもよい。
【０１５４】
ＩＬ−１２産生に関連する疾患若しくは障害、又は異常ｃ−Ｒｅｌ細胞内局在、又は自己免疫疾患若しくは障害を、必要とされる患者において治療又は予防する方法は、本発明の化合物を投与される患者に、有効量の１つ以上の他の治療剤を投与することを更に含んでよい。かかる治療剤には、ＩＬ−１２産生又は異常ｃ−Ｒｅｌ細胞内局在に関連する障害又はその症候を予防又は治療するために従来使用されるような他の治療剤が含まれてよい。他の治療剤は、ステロイド又は非ステロイド性抗炎症剤であってもよい。有用な非ステロイド性抗炎症剤には、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナック、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、フルブフェン、ケトプロフェン、インドプロフェン、ピロプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラモプロフェン、ムロプロフェン、トリオキサプロフェン、スプロフェン、アミノプロフェン、チアプロフェニン酸、フルプロフェン、ブクロクス酸、インドメタシン、スリンダック、トルメチン、ゾメピラック、チオピナック、ジドメタシン、アセメタシン、フェンチアザック、クリダナック、オキシピナック（ｏｘｐｉｎａｃ）、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、ニフルミン酸、トルフェナム酸、ジフルリサル（ｄｉｆｌｕｒｉｓａｌ）、フルフェニサル、ピロキシカム、スドキシカム、イソキシカム；アスピリン、サリチル酸ナトリウム、三サリチル酸コリンマグネシウム、サルサレート、ジフルニサル、サリチルサリチル酸（ｓａｌｉｃｙｌｓａｌｉｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）、スルファサラジン及びオルサラジンを含むサリチル酸誘導体；アセトアミノフェン及びフェナセチンを含むパラアミノフェノール誘導体；インドメタシン、スリンダック、及びエトドラックを含むインドール及びインデン酢酸；トルメチン、ジクロフェナック、及びケトロラックを含むヘテロアリール酢酸；メフェナム酸、及びメクロフェナム酸を含むアントラニル酸（フェナメート）；オキシカム（ピロキシカム、テノキシカム）、及びピラゾリジンジオン（フェニルブタゾン、オキシフェンタルタゾン（ｏｘｙｐｈｅｎｔｈａｒｔａｚｏｎｅ））を含むエノール酸；及びナブメトンを含むアルカノン、並びにその薬理学的に許容できる塩及びその混合物が含まれるが、それらに限定されない。ＮＳＡＩＤのより詳細な記載に関しては、全体が、参考として組み込まれる、Ｐａｕｌ  Ａ．Ｉｎｓｅｌ、Ａｎａｌｇｅｓｉｃ−Ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ  Ｅｍｐｌｏｙｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｏｕｔ，ｉｎ  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ６１７−５７（Ｐｅｒｒｙ  Ｂ．Ｍｏｌｉｎｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｗ．Ｒｕｄｄｏｎ  ｅｄｓ．，９ｔｈ  ｅｄ  １９９６）及びＧｌｅｎ  Ｒ．Ｈａｎｓｏｎ，  Ａｎａｌｇｅｓｉｃ，Ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｖｏｌ  ���Ｉ  １１９６−１２２１（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）を参照されたい。
【０１５５】
予防及び治療剤の他の例には、免疫調節剤、抗炎症剤（例えば、副腎コルチコイド、コルチコイドステロイド（例えば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾン）グルココルチコイド、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤（例えばアスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナック、ＣＯＸ−２阻害剤）、及びロイコトリエンアンタゴニスト（例えばモンテルカスト、メチルキサンチン、ザフィルルカスト、及びジレウトン）、ベータ−２−アゴニスト（例えばアルブテロール、ビテロール、フェノテロール、イソエタリン（ｉｓｏｅｔｈａｒｉｅ）、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリンホルモテロール、サルメテロール及びサルブタモールテルブタリン）、抗コリン作動薬（例えば臭化イプラトロピウム、及び臭化オキシトロピウム）、スルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン剤、抗マラリア性薬品（例えばダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、エリトロマイシン（ｅｒｙｔｈｏｍｙｃｉｎ）、ペニシリン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））が含まれるが、それらに限定されない。
【０１５６】
併用治療法において、本発明の化合物及び他の薬剤はいずれも、従来の方法によって哺乳動物（例えばヒト、男性又は女性）に投与される。薬剤は、単一の剤形又は別個の剤形で投与できる。他の治療剤の有効量は、当業者に周知である。しかしながら、他の治療剤の最適な有効量の範囲を決定することは、当業者が設計する範囲内にある。他の治療剤が、動物に投与される本発明の１つの実施態様において、本発明の化合物の有効量は、他の治療剤が投与されない場合のその有効量未満である。もう１つの実施態様において、従来の薬剤の有効量は、本発明の化合物が投与されない場合のその有効量未満である。このようにして、いずれかの薬剤の高い用量に関連する望ましくない副作用を最小限に抑制できる他の可能な利点（投薬計画改善及び／又は薬剤コスト減少を含む）は、当業者には明瞭であろう。
【０１５７】
種々の実施態様において、治療（例えば予防又は治療剤）は、５分未満離して、３０分未満離して、１時間離して、約１時間離して、約１時間から約２時間離して、約２時間から約３時間離して、約３時間から約４時間離して、約４時間から約５時間離して、約５時間から約６時間離して、約６時間から約７時間離して、約７時間から約８時間離して、約８時間から約９時間離して、約９時間から約１０時間離して、約１０時間から約１１時間離して、約１１時間から約１２時間離して、約１２時間から約１８時間離して、約１８時間から約２４時間離して、約２４時間から約３６時間離して、約３６時間から約４８時間離して、約４８時間から約５２時間離して、約５２時間から約６０時間離して、約６０時間から約７２時間離して、約７２時間から約８４時間離して、約８４時間から約９６時間離して、又は約９６時間から約１２０時間離して投与される。好ましい実施態様において、２つ以上の治療が、同じ患者の診察中に投与される。
【０１５８】
幾つかの実施態様において、本発明の１つ以上の化合物及び１つ以上の他の治療（例えば予防又は治療剤）は、循環的に投与される。循環治療は、一時期の第１治療（例えば第１予防又は治療剤）の投与、それに続く一時期の第２治療（例えば第２予防又は治療剤）の投与、任意で、それに続く一時期の第３治療（例えば予防又は治療剤）の投与等と、且つ治療の１つへの耐性の発達を抑制し、治療の１つの副作用を回避又は低減し、且つ／又は治療の効果を改良するために、この逐次投与すなわちサイクルを反復することを伴う。
【０１５９】
幾つかの実施態様において、本発明の同じ化合物の投与は反復でき、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月又は少なくとも６ヶ月を隔てることができる。他の実施態様において、本発明の化合物以外の同じ治療（例えば予防又は治療剤）の投与は、反復でき、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２ヶ月、７５日、３ヶ月又は少なくとも６ヶ月、隔てることができる。
【０１６０】
当業者に周知のいかなる免疫調節剤は、本発明の方法及び組成物の同時投与において使用できる。免疫調節剤は、被検者における免疫応答の１つ以上又は全ての側面に影響を及ぼすことができる。免疫応答の側面には、炎症性応答、補体カスケード、白血球及びリンパ球分化、増殖及び／又はエフェクター機能、単球及び／又は好塩基球数、及び免疫系の細胞間の細胞伝達が含まれるが、それらに限定されない。本発明の幾つかの実施態様において、免疫調節剤は、免疫応答の１つの側面を調節する。他の実施態様において、免疫調節剤は免疫応答の１つ以上の側面を調節する。本発明の好ましい実施態様において、被検者への免疫調節剤の投与は、被検者の免疫応答能力の１つ以上の側面を阻害又は減少させる。本発明の特定の実施態様において、免疫調節剤は被検者において免疫応答を阻害又は抑制する。本発明によれば、免疫調節剤はｃ−Ｒｅｌに免疫特異的に結合する抗体ではない。幾つかの実施態様において、免疫調節剤は抗炎症剤ではない。幾つかの実施態様において、免疫調節剤は抗血管形成剤ではない。他の実施態様において、免疫調節剤はインテグリンアンタゴニストではない。他の実施態様において、免疫調節剤は、ＴＮＦ−αアンタゴニストではない。幾つかの実施態様において、免疫調節剤は、化学療法剤である。幾つかの実施態様において、免疫調節剤は化学療法剤ではない。
【０１６１】
免疫調節剤の例には、サイトカイン、ペプチド模倣薬、及び抗体（例えばヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Ｆｖｓ、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ）２断片、又はエピトープ結合断片）、核酸分子（例えばアンチセンス核酸分子及び三重らせん体）、小分子、有機化合物、及び無機化合物のようなタンパク質性製剤を含むが、それらに限定されない。特に免疫調節剤には、メトトレキセート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン、イムラン、シクロスポリンＡ、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（例えばＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、マロノニトリロアミンド（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｏａｍｉｎｄｅｓ）（例えばレフルナミド（ｌｅｆｌｕｎａｍｉｄｅ））、Ｔ細胞レセプターモジュレーター、サイトカインレセプターモジュレーター及びモジュレータマスト細胞モジュレーターが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６２】
Ｔ細胞レセプターモジュレーターの例には、抗Ｔ細胞レセプター抗体（例えば、抗−ＣＤ４抗体（例えばｃＭ−Ｔ４１２（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）、ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１（登録商標）（ＩＤＥＣ及びＳＫＢ）、ｍＡＢ  ４１６２Ｗ９４、Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ及びＯＫＴｃｄｒ４ａ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ））、抗−ＣＤ３抗体（例えばＮｕｖｉｏｎ  （Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）、ＯＫＴ３（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ）、又はＲｉｔｕｘａｎ（ＩＤＥＣ））、抗−ＣＤ５抗体（例えば抗−ＣＤ５リシン結合免疫複合体）、抗−ＣＤ７抗体（例えばＣＨＨ−３８０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、抗−ＣＤ８抗体、抗−ＣＤ４０リガンドモノクローナル抗体（例えばＩＤＥＣ−１３１（ＩＤＥＣ））、抗−ＣＤ５２抗体（例えばＣＡＭＰＡＴＨ  １Ｈ（Ｉｌｅｘ））、抗−ＣＤ２抗体（例えばＭＥＤＩ−５０７  Ｉｎｃ．（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、国際公開第ＷＯ０２／０９８３７０及びＷＯ０２／０６９９０４号）、抗−ＣＤ１１ａ抗体（例えばＸａｎｅｌｉｍ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、及び抗Ｂ７抗体（例えばＩＤＥＣ−１１４）（ＩＤＥＣ）））、ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン、及びＬＦＡ−３ＴＩＰ（Ｂｉｏｇｅｎ、国際公開第ＷＯ９３／０８６５６号及び米国特許第６１６２４３２号）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６３】
サイトカインレセプターモジュレーターの例には、可溶性サイトカインレセプター（例えばＴＮＦ−αレセプター又はその断片の細胞外ドメイン、ＩＬ−１βレセプター又はその断片の細胞外ドメイン、及びＩＬ−６レセプター又はその断片の細胞外ドメイン）、サイトカイン又はその断片（例えばインターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、及びＧＭ−ＣＳＦ）、抗サイトカインレセプター抗体（例えば抗ＩＦＮレセプター抗体、抗ＩＬ−２レセプター抗体（例えばＺａｎａｐａｘ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ））、抗ＩＬ−３レセプター抗体、抗ＩＬ−４レセプター抗体、抗ＩＬ−６レセプター抗体、抗ＩＬ−１０レセプター抗体、抗ＩＬ−１２レセプター抗体、抗ＩＬ−１３レセプター抗体、抗ＩＬ−１５レセプター抗体、及び抗ＩＬ−２３レセプター抗体）、抗サイトカイン抗体が含まれるが、それらに限定されない。
【０１６４】
特定の実施態様において、サイトカインレセプターモジュレーターは、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、又はその断片である。もう１つの実施態様において、サイトカインレセプターモジュレーターは、ＴＮＦ−αレセプター又はその断片の細胞外ドメインである。幾つかの実施態様において、サイトカインレセプターモジュレーターは、ＴＮＦ−αアンタゴニストではない。
【０１６５】
１つの実施態様において、サイトカインレセプターモジュレーターは、マスト細胞モジュレーターである。代替的な実施態様において、サイトカインレセプターモジュレーターは、マスト細胞モジュレーターではない。マスト細胞モジュレーターの例には、幹細胞因子（ｃ−キットレセプターリガンド）抑制剤（例えばｍＡｂ  ７Ｈ６、ｍＡｂ  ８Ｈ７ａ、ｐＡｂ  １３３７、ＦＫ５０６、ＣｓＡ、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｔｈａｓｏｎｅ）、及びフルコンシノニド（ｆｌｕｃｏｎｃｉｎｏｎｉｄｅ）、ｃ−キットレセプター抑制剤（例えばＳＴＩ  ５７１（以前、ＣＧＰ  ５７１４８Ｂとして知られていた））、マスト細胞プロテアーゼ阻害剤（例えばＧＷ−４５、ＧＷ−５８、ワートマニン、ＬＹ  ２９４００２、カルフォスチンＣ、サイトカラシンＤ、ゲニステイン、ＫＴ５９２６、スタウロスポリン及びラクトフェリン）、リラキシン（”ＲＬＸ”）、ＩｇＥアンタゴニスト（例えば抗体ｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５オマリズマブ、ＨＭＫ−１２及び６ＨＤ５及びｍＡＢ  Ｈｕ−９０１）、ＩＬ−３アンタゴニスト、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１０アンタゴニスト及びＴＧＦ−ベータが含まれるが、それらに限定されない。
【０１６６】
免疫調節剤は、中和抗体の形成を阻害するために、Ｔヘルパーサブセット（ＴＨ１又はＴＨ２）とＢ細胞との間の相互作用を妨げるように選択されてよい。ＴＨ（Ｔヘルパー）細胞によるＢ細胞の活性化に必要な相互作用を妨げ又は遮断することで中和抗体の産生を遮断する抗体は、本発明の方法における免疫調節剤として有用である。例えば、Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化は、Ｂ細胞上のＣＤ４０抗原へのＴヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドの結合、及びＢ細胞上のＢ７抗原へのＴ細胞上のＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ４リガンドの結合のような、幾つかの相互作用が起こることを必要とする（Ｄｕｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１５（９）：４０６−４１０（１９９４））。
【０１６７】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）−ＣＤ４０の相互作用は、Ｔヘルパー細胞活性化及び機能の両方での広い活性、並びにシグナル伝達経路に重複性がないため、免疫応答を遮断するために望ましい点である。従って、本発明の特定の実施態様において、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０との相互作用は、本発明の１つ以上の化合物及び免疫調節剤の投与時に一過的に遮断される。このことは、ＴＨ細胞上でＣＤ４０リガンドを遮断し且つＢ細胞上のＣＤ４０抗原によるＴヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドの正常な結合を妨げる薬剤によって処理することで達成できる。ＣＤ４０リガンドの抗体（抗ＣＤ４０Ｌ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏから入手可能；例えば、１９９３年８月１８日に公開された欧州特許出願公開第５５５８８０号参照）又は可溶性ＣＤ４０分子は、本発明の方法により選択でき、免疫調節剤として使用できる。
【０１６８】
免疫調節剤は、ＴＨ１細胞及び細胞毒性Ｔリンパ球（“ＣＴＬ”）の間の相互作用を阻害して、ＣＴＬ媒介死滅の発生を減少させるために選択できる。免疫調節剤は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、分化、活性及び／又は機能を変更（例えば阻害又は抑制）するために選択できる。例えば、Ｔ細胞に特異的な抗体は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、分化、活性及び／又は機能を枯渇させ又は変更するために、免疫調節剤として使用できる。
【０１６９】
本発明の１つの実施態様において、Ｔ細胞、好ましくは記憶Ｔ細胞を減少又は枯渇させる免疫調節剤は、本発明の方法によって、ＩＬ−９ポリペプチドの異常発現及び／又は活性に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、ｃ−Ｒｅｌの異常な細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、又は感染（好ましくは呼吸器感染）の危険にある又は罹患した被検者に投与される。例えば、米国特許第４６５８０１９号を参照されたい。本発明のもう１つの実施態様において、ＣＤ８＋Ｔ細胞を不活性化する免疫調節剤は、本発明の方法によって、ｃ−Ｒｅｌの異常細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、ｃ−Ｒｅｌの異常細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、又は感染（好ましくは呼吸器感染）の危険にある又は罹患した被検者に投与される。特定の実施態様において、抗ＣＤ８抗体は、ＣＤ８＋細胞を減少又は枯渇させるために使用される。
【０１７０】
もう１つの実施態様において、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のＴＨ０、ＴＨ１及び／又はＴＨ２サブセットの１つ以上の生物活性（例えば分化、増殖及び／又はエフェクター機能）を減少させ又は阻害する免疫調節剤は、本発明の方法によって、ｃ−Ｒｅｌの異常な発現細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、ｃ−Ｒｅｌの異常な細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、又は感染（好ましくは呼吸器感染）の危険にある又は罹患した被検者に投与される。かかる免疫調節剤の１つの例は、ＩＬ−４である。ＩＬ−４は、ＴＨ１細胞機能を犠牲にして、ＴＨ２細胞の抗原特異的活性を強化する（例えばＹｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ，１９８６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８３：５８９４−５８９８；及び米国特許第５０１７６９１号参照）。Ｔヘルパー細胞（特にＴＨ１及び／又はＴＨ２細胞）の生物活性（例えば分化、増殖及び／又はエフェクター機能）に影響を及ぼす免疫調節剤の他の例には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、及びインターフェロン（ＩＦＮ）−γが含まれるが、それらに限定されない。
【０１７１】
もう１つの実施態様において、本発明の方法によって、ｃ−Ｒｅｌの異常な細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、又は感染（好ましくは呼吸器感染）の危険があり又は罹患した被検者に投与される免疫調節剤は、抗原提示を妨げるサイトカインである。特定の実施態様において、本発明の方法に使用される免疫調節剤は、ＩＬ−１０である。ＩＬ−１０も細菌除去を伴うマクロファージ作用を減少させ又は阻害する。
【０１７２】
免疫調節剤は、マスト細胞の活性化、脱顆粒、増殖、及び／又は浸潤の減少又は阻害のために選択できる。幾つかの実施態様において、免疫調節剤には、マスト細胞と、幹細胞因子（ｃ−キットリガンド）、ＩｇＥ、ＩＬ−４、環境刺激物及び病原菌等のマスト細胞活性化剤と、の間の相互作用を妨げる。特定の実施態様において、免疫調節剤は、花粉、チリダニ、タバコの煙及び／又はペットの鱗屑等の環境刺激物へのマスト細胞の応答を減少させ又は阻害する。もう１つの特定の実施態様において、免疫調節剤は、ウイルス、細菌及び菌類のような病原菌へのマスト細胞の応答を減少させ又は阻害する。マスト細胞の活性化、脱顆粒、増殖、及び／又は浸潤の減少又は阻害をするマスト細胞モジュレーターの例には、幹細胞因子（ｃ−キットレセプターリガンド）抑制剤（例えばｍＡｂ  ７Ｈ６、ｍＡｂ  ８Ｈ７ａ、及びｐＡｂ  １３３７（Ｍｅｎｄｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２９３  （３）：８４２−８４９参照）、ＦＫ５０６、及びＣｓＡ（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  ２９１（５）：２７５−２８３）、デキサメタゾン、及びフルコンシノニド（Ｆｉｎｏｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９７  ９９（７）：１７２１−１７２８参照））、ｃ−キットレセプター抑制剤（例えばＳＴＩ  ５７１（以前、ＣＧＰ  ５７１４８Ｂとして知られていた（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００  Ｂｌｏｏｄ  ９６（３）：９２５−９３２参照））、マスト細胞プロテアーゼ阻害剤（例えばＧＷ−４５、ＧＷ−５８（Ｔｅｍｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９  （５）：２６６２−２６６９参照）、ワートマニン、ＬＹ  ２９４００２、カルフォスチンＣ、及びサイトカラシンＤ（Ｖｏｓｓｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １９９７：９０９−９２２参照）、ゲニステイン、ＫＴ５９２６、及びスタウロスポリン（Ｎａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２０８（２）：５７６−５８１参照）、ラクトフェリン（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６５（６）：１００７−１０１５参照））、リラキシン（”ＲＬＸ”）（Ｂａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｃｏｌ  ２（８）：１１９５−１２９４参照）、）、ＩｇＥアンタゴニスト（例えば抗体ｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５オマリズマブ（Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  １１１（２）：２７８−２８４；Ｃｏｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  １１１（１）：８７−９０；Ｂｕｓｓｅ  ａｎｄ  Ｎｅａｖｉｌｌｅ，２００１  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  １（１）：１０５−１０８；及びＴａｎｇ  ａｎｄ  Ｐｏｗｅｌｌ，２００１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｅｄｉａｔｒ  １６０（１２）：６９６−７０４参照）、ＨＭＫ−１２及び６ＨＤ５（Ｍｉｙａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２２０２  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏ  １２８（１）：２４−３２参照）、及びｍＡＢ  Ｈｕ−９０１（ｖａｎ  Ｎｅｅｒｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１  Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏ  １２４（１−３）：４００参照）、ＩＬ−３アンタゴニスト、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１０アンタゴニスト及びＴＧＦ−ベータ（Ｍｅｔｃａｌｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ４（４  Ｐｔ  ２）：２２７−２３０参照）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１７３】
好ましい実施態様において、免疫調節剤として利用されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチド（抗体を含む）は、これらのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドへの免疫応答の可能性を減少させるように、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの受容体として同種から誘導される。もう１つの好ましい実施態様において、被検者がヒトであるとき、免疫調節剤として利用されるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、ヒト又はヒト化される。
【０１７４】
本発明の１つの実施態様によれば、１つ以上の免疫調節剤は、ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更し且つＮＦκＢの発現及び／又はＩκＢの量を実質的に変更しない本発明の化合物の前、後又は同時に、ｃ−Ｒｅｌの異常な細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、又は感染（好ましくは呼吸器感染）の危険がある又は罹患した被検者に投与される。好ましくは、１つ以上の免疫調節剤は、ｃ−Ｒｅｌの細胞内局在を変更し且つＮＦκＢの発現及び／又はＩκＢの量を実質的に変更しない本発明の化合物と組み合わせて、当業者が必要であると考える免疫応答の１つ以上の局面を減少させ又は阻害するために、ｃ−Ｒｅｌの異常細胞内局在に関連し又はそれを特徴とする疾患又は障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、又は感染（好ましくは呼吸器感染）の危険がある又は罹患した被検者に投与される。当業者に周知のいかなる技術も、特定の被検者における免疫応答の１つ以上の局面を測定し、これにより被検者に免疫調節剤をいつ投与することが必要であるかを判定するために使用できる。好ましい実施態様において、約５００細胞／ｍｍ３、好ましくは６００細胞／ｍｍ３、６５０細胞／ｍｍ３、７００細胞／ｍｍ３、７５０細胞／ｍｍ３、８００細胞／ｍｍ３、９００細胞／ｍｍ３、１０００細胞／ｍｍ３、１１００細胞／ｍｍ３、又は１２００細胞／ｍｍ３の平均絶対リンパ球数が、被検者において維持される。もう１つの好ましい実施態様において、被検者の絶対リンパ球数が、５００細胞／ｍｍ３以下、５５０細胞／ｍｍ３以下、６００細胞／ｍｍ３以下、６５０細胞／ｍｍ３以下、７００細胞／ｍｍ３以下、７５０細胞／ｍｍ３以下、又は８００細胞／ｍｍ３以下ならば、被検者は本発明の化合物を投与されない。
【０１７５】
好ましい実施態様において、１つ以上の免疫調節剤は、免疫応答の１つ以上の局面を一過的に減少させ又は阻害するように、本発明の化合物と組み合わせて投与される。免疫系の１つ以上の局面のかかる一過的な阻害又は減少は、数時間、数日、数週間、又は数ヶ月持続し得る。好ましくは、免疫応答の１つ以上の局面における一過的な阻害又は減少は、数時間（例えば２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２４時間、３６時間、又は４８時間）、数日（例えば３日、４日、５日、６日、７日、又は１４日）、又は数週間（例えば３週間、４週間、５週間、又は６週間）持続する。
【０１７６】
当業者に周知な、炎症性障害の治療において有用な薬剤を含むあらゆる抗炎症剤は、本発明の組成物及び方法において使用できる。抗炎症剤の非限定的な例には、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド性抗炎症剤、抗コリン作動薬（例えば臭化アトロピン、硝酸メチルアトロピン、臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（商標）））、ベータ２−アゴニスト（例えばアルブテロール（ＶＥＮＴＯＬＩＮ（商標）及びＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標））、ビトルテロール（ＴＯＲＮＡＬＡＴＥＴＭ（商標））、レバルブテロール（ＸＯＰＯＮＥＸＴＭ）（商標））、メタプロテレノール（ＡＬＵＰＥＮＴ（商標））、ピルブテロール（ＭＡＸＡＩＲ（商標））、テルブタリン（ＢＲＥＴＨＡＩＲＥ（商標）及びＢＲＥＴＨＩＮＥ（商標））、アルブテロール（ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標）、ＲＥＰＥＴＡＢＳ（商標）、及びＶＯＬＭＡＸ（商標））、ホルモテロール（ＦＯＲＡＤＩＬ  ＡＥＲＯＬＩＺＥＲ（商標））、及びサルメテロール（ＳＥＲＥＶＥＮＴ（商標）及びＳＥＲＥＶＥＮＴ  ＤＩＳＫＵＳ（商標））及びメチルキサンチン（例えばテオフィリン（ＵＮＩＰＨＹＬ（商標）、ＴＨＥＯ−ＤＵＲ（商標）、ＳＬＯ−ＢＩＤ（商標）、及びＴＥＨＯ−４２（商標）））を含む。ＮＳＡＩＤの例には、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、ジクロフェナック（ＶＯＬＴＡＲＥＮ（商標））、エトドラック（ＬＯＤＩＮＥ（商標））、フェノプロフェン（ＮＡＦＬＯＮ（商標））、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮ（商標））、ケトララック（ｋｅｔｏｒａｌａｃ）（ＴＯＲＡＤＯＬ（商標））、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯ（商標））、ナブメントン（ｎａｂｕｍｅｎｔｏｎ）（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））、スリンダック（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標））、トルメチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標））、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（商標））、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標））、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮ（商標））、及びナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））が含まれるが、それらに限定されない。かかるＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１及び／又はＣＯＸ２）を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症剤の例には、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標））、コルチコイドステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン（ＭＥＤＲＯＬ（商標））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＰＲＥＤＮＩＳＯＮＥ（商標）及びＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））、プレドニゾロン（ＰＲＥＬＯＮＥ（商標）及びＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（商標））、トリアムシノロン、アザルフィジン、及びエイコサノイドの抑制剤（例えばプロスタグランジン、トロンボキサン、及びロイコトリエン）が含まれるが、それらに限定されない。抗炎症性治療及びその投与量、投与経路、及び推奨される使用法は、当該技術分野において公知であり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｄｅｓｋ  Ｆｅｒｅｎｃｅ（５７ｔｈ  ｅｄ．２００３）等の文献に記載されている。
【０１７７】
関節炎、炎症媒介骨量減少、及び炎症成分を有する他の障害に関して、本発明の化合物及び組成物の併用療法で使用する好ましい従来の治療薬には、ナプロキセンナトリウム（Ａｎａｐｒｏｘ（登録商標）及びＡｎａｐｒｏｘ（登録商標）ＤＳ、Ｒｏｃｈｅ）、フルルビプロフェン（Ａｎｓａｉｄ（登録商標）；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ジクロフェナックナトリウム＋ミソプロスチル（ｍｉｓｏｐｒｏｓｔｉｌ）（Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ（登録商標）、Ｓｅａｒｌｅ）、バルデコキシブ（Ｂｅｘｔｒａ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ジクロフェナックカリウム（Ｃａｔａｆｌａｍ（登録商標）及びＶｏｌｔａｒｅｎ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、セレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、スリンダック（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、サルサレート（Ｄｉｓａｌｃｉｄ（登録商標）、３Ｍ）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）、ナプロキセンナトリウム（ＥＣ  Ｎａｐｒｏｓｙｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ）、インドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ（登録商標）及びＩｎｄｏｃｉｎ  ＳＲ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）、エトドラック（Ｌｏｄｉｎｅ（登録商標）及びＬｏｄｉｎｅ  ＸＬ（登録商標）Ｗｙｅｔｈ）、メロキシカム（Ｍｏｂｉｃ（登録商標）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ（登録商標）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｅｌａｎ（登録商標）、Ｅｌａｎ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ（登録商標）及びＯｒｕｖａｉｌ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ（登録商標）、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、トルメチンナトリウム（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ（登録商標）、ＭｃＮｅｉｌ）、三サリチル酸コリンマグネシウム（Ｔｒｉｌｉｓａｔｅ（登録商標）、Ｐｕｒｄｕｅ  Ｆｒｅｄｒｉｃｋ）、及びロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）が含まれる（但し限定されない）。
【０１７８】
標的障害の中に疼痛がある全ての場合において、他の治療剤は鎮痛剤であってよい。有用な鎮痛剤には、フェナセチン、ブタセチン、アセトアミノフェン、ネフォパム、アセトアミドキノン、及びその混合物が含まれるが、それらに限定されない。
【０１７９】
骨粗鬆症、パジェット病及び骨老化に関連した他の障害に対して使用するために、本発明の化合物及び組成物と組み合わせて使用できる好ましい従来の薬剤には、二ホスホン酸塩、（例えばエチドロネート（Ｄｉｄｒｏｎｅｌ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ）、パミドロネート（Ａｒｅｄｉａ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びアレンドロネート（Ｆｏｓａｍａｘ（登録商標）Ｍｅｒｃｋ））、チルドロネート（Ｓｋｅｌｉｄ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ，Ｉｎｃ）、リセドロネート（Ａｃｔｏｎｅｌ（登録商標）、Ｐｒｏｃｔｅｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ／Ａｖｅｎｔｉｓ）、カルシトニン（Ｍｉａｃａｌｃｉｎ（登録商標））、エストロゲン（Ｃｌｉｍａｒａ（登録商標）、Ｅｓｔｒａｃｅ（登録商標）、Ｅｓｔｒａｄｅｒｍ（登録商標）、Ｅｓｔｒａｔａｂ（登録商標）、Ｏｇｅｎ（登録商標）、Ｏｒｔｈｏ−Ｅｓｔ（登録商標）、Ｖｉｖｅｌｌｅ（登録商標）、Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）他）、エストロゲン及びプロゲスチン（Ａｃｔｉｖｅｌｌａ（商標）、ＦｅｍＨｒｔ（登録商標）、Ｐｒｅｍｐｈａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｅｍｐｒｏ（登録商標）他）、上皮小体ホルモン及びその部分、例えば、テリパラチド（Ｆｏｒｔｅｏ（登録商標）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．）、選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭｓ）（例えばラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ（登録商標））及び現在研究中の治療（例えば他の上皮小体ホルモン、フッ化ナトリウム、ビタミンＤ代謝物、及び他の二ホスホン酸塩及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター）が含まれる（但し限定されない）。
【０１８０】
あらゆる上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）は、本発明の化合物と組み合わせて使用できる。用語、上皮小体ホルモンは、骨形成を刺激し且つ骨量を増加できる上皮小体ホルモン、その断片又は代謝物、及びその構造類似体を指す。上皮小体ホルモン関連ペプチド、並びに上皮小体関連ペプチドの活性断片及び類似体も含まれる（国際公開第ＷＯ９４／０１４６０号参照）。かかる骨同化機能活性は、標準アッセイ分野の当業者によって容易に判定される。種々のこれらの化合物は、以下に記載され参照される。しかしながら、他の上皮小体ホルモンも当業者に公知であろう。典型的な上皮小体ホルモンは、次の参考文献に開示されている。「Ｈｕｍａｎ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｒｔｅｂｒａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ」、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．、３、（Ｓｕｐｐ  １）：１９９−２０３。「ＰＴＨ  １−３４  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ａｄｄｅｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ」Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ  Ｉｎｔ．１：１６２−１７０
【０１８１】
あらゆる成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進物質は、本発明の化合物と組み合わせて使用できる。用語、成長ホルモン分泌促進物質は、成長ホルモンの放出を刺激し且つ成長ホルモンの作用（例えば、骨形成を増加させ、骨量増加をもたらす）を模倣する化合物を指す。かかる作用は、当業者に周知である標準アッセイの分野における当業者に容易に判定される。種々のこれらの化合物が、以下の国際公開に開示されている：ＷＯ９５／１４６６６；ＷＯ９５／１３０６９；ＷＯ９４／１９３６７；ＷＯ９４／１３６９６；及びＷＯ９５／３４３１１。しかしながら、他の成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進物質も当業者に公知であろう。特に、好ましい成長ホルモン分泌促進物質は、Ｎ−［１（Ｒ）−［１，２−ジヒドロ−１−メタンスルホニルスピロ［３Ｈ−インドール−３，４’−ピペリジン］−１’−イル）カルボニル］−２−（フェニルメトキシ）エチル］−２−アミノ−２−メチルプロパンアミド：ＭＫ−６６７である。他の好ましい成長ホルモン分泌促進物質には、２−アミノ−Ｎ−（２−（３ａ−（Ｒ）−ベンジル−２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（Ｒ）−ベンジルオキシメチル−２−オキソ−エチル）−イソブチルアミド、又はそのＬ−酒石酸塩；２−アミノ−Ｎ−（１−（Ｒ）−ベンジルオキシメチル−２−（３ａ−（Ｒ）−（４−フルオロ−ベンジル）２−メチル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−２−オキソ−エチル）−イソブチルアミド；２−アミノ−Ｎ−（２−（３ａ−（Ｒ）−ベンジル−３−オキソ−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ−［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−１−（Ｒ）ベンジルオキシメチル−２−オキソ−エチル）−イソブチルアミド；及び２−アミノ−Ｎ−（１−（２，４−ジフルオロ−ベンジルオキシメチル）−２−オキソ−２−（３−オキソ−３ａ−ピリジン−２−イルメチル−２−（２，２，２−トリフルオロ−エチル）−２，３，３ａ，４，６，７−ヘキサヒドロ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−５−イル）−エチル）−２−メチル−プロピオンアミドが含まれる。
【０１８２】
本発明のあらゆる方法は、本発明の少なくとも１種の化合物を含む有効量の組成物又は医薬組成物を、かかる調節、治療又は療法を必要とする細胞、組織、臓器、動物又は患者に投与することを含んでよい。かかる方法は、Ｌ−１２産生に関連する障害を治療するための同時投与又は併用療法であって、投与が、ＴＮＦアンタゴニスト（例えば、ＴＮＦ抗体又は断片、溶解性ＴＮＦレセプター又は断片、その融合タンパク質、又は小分子ＴＮＦアンタゴニストであるが、限定されない）抗リウマチ薬（例えば、メトトレキセート、オーラノフィン、アウロチオグルコース、アザチオプリン、エタネルセプト、チオリンゴ酸金ナトリウム、硫酸ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、スルファサルジン（ｓｕｌｆａｓａｌｚｉｎｅ））、筋弛緩剤、麻薬、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静剤、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌剤（例えば、アミノグリコシド、抗真菌薬、駆虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロライド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、他の抗菌剤）、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、糖尿病関連薬剤、無機、栄養、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、下痢止め薬、鎮咳薬、制吐剤、抗潰瘍剤、緩下剤、抗凝固剤、エリトロポイエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｉｅｉｔｉｎ）（例えば、エポエチンアルファ）、フィルグラスチム（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ）、サルグラモスチム（ＧＭ−ＣＳＦ、リューカイン）、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制薬（例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ）、成長ホルモン、ホルモン置換剤、エストロゲンレセプターモジュレーター、散瞳薬、毛様体筋麻痺薬、アルキル化剤、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品、抗うつ薬、抗躁薬、抗精神病薬、抗不安剤、催眠薬、交感神経興奮剤、覚醒剤、ドネペジル、タクリン、喘息薬剤、ベータアゴニスト、吸入ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリン又は類似体、ドルナーゼアルファ（パルモザイム）、サイトカイン又はサイトカインアゴニストから選択される少なくとも１種の活性薬剤を、本発明の化合物の前、同時、及び／又は後に投与することを更に含む方法を、任意で更に含んでよい。適切な投与量は、当該技術分野において周知である。例えば、各々、全体が本明細書中に参考として組み込まれる、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．（２０００）；ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００、Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ、Ｃａｌｉｆ．（２０００）を参照されたい。
【０１８３】
本発明の組成物、併用療法、同時投与、装置、及び／又は方法に適したＴＮＦアンタゴニストには、抗ＴＮＦ抗体（例えば、レミケード（インフリキシマブ）又はヒュミラ（アダリムマブ））、例えば、又はその抗原結合断片、及びＴＮＦに特異的に結合するレセプター分子（例えばエンブレル（エタネルセプト））；ＴＮＦ合成、ＴＮＦ放出、又は標的細胞へのその作用を予防及び／又は阻害する化合物、例えばサリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼ阻害剤（例えばペントキシフィリン及びロリプラム）、Ａ２ｂアデノシンレセプターアゴニスト及びＡ２ｂアデノシンレセプターエンハンサー；ＴＮＦレセプターシグナル伝達を予防及び／又は阻害する化合物、例えば有糸分裂活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ阻害剤；膜ＴＮＦ開裂を遮断及び／又は阻害する化合物、例えばメタロプロテイナーゼ阻害剤；ＴＮＦ活性を遮断及び／又は阻害する化合物、例えばアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えばカプトプリル）；及びＴＮＦ産生及び／又は合成を遮断及び／又は阻害する化合物、例えばＭＡＰキナーゼ阻害剤が含まれるが、それらに限定されない。
【０１８４】
明瞭にするために、「腫瘍壊死因子抗体」、「ＴＮＦ抗体」、「ＴＮＦ抗体」、又は断片等は、インビトロ、インサイチュ、及び／又は好ましくはインビボで、ＴＮＦ活性を減少、遮断、阻害、抑止、又は干渉する。例えば、本発明の適切なＴＮＦヒト抗体は、ＴＮＦａに結合でき且つ抗ＴＮＦ抗体、その抗原結合断片、ＴＮＦａに特異的に結合する特定の突然変異体又はドメインを含む。適切なＴＮＦ抗体又は断片は、ＴＮＦ  ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質合成、ＴＮＦ放出、ＴＮＦレセプター信号伝達、膜ＴＮＦ開裂、ＴＮＦ活性、ＴＮＦ産生及び／又は合成を減少、遮断、抑止、干渉、予防、又は阻害することもできる。
【０１８５】
前述及び他の有用な併用療法は、当業者が理解及び認識するであろう。かかる併用療法の潜在的な利点には、有害な副作用を最小限に抑えるために個別の活性成分の各々を少量で使用できること、有効性の相乗的な改善、投与又は使用の容易さの改善、及び／又は化合物調製又は製剤の全体的費用の減少が含まれる。本発明の化合物の生物活性は、多数の細胞に基づくアッセイによって評価できる。かかるアッセイの１つは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はヒト単球細胞系統（ＴＨＰ−１）からの細胞を使用して行うことができる。細胞は、テスト化合物の存在下でヒトインターフェロン−γ（ＩＮＦＮγ）とリポ多糖との組み合わせ、又はＩＦＮγと黄色ブドウ球菌Ｃｏｗａｎ  Ｉとの組み合わせによって刺激される。ＩＬ−１２産生の阻害レベルは、抗ヒトＩＬ−１２抗体によるサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを使用し、ｐ７０の量を判定することによって測定できる。次に、テスト化合物のＩＣ５０が判定される。具体的には、ＰＢＭＣ又はＴＨＰ−１細胞は、テスト化合物によってインキュベートされる。細胞生存度は、ＭＴＳ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム］（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の生物還元（ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を使用して評価された。
【０１８６】
他の治療剤には、骨抗吸収剤、例えばプロゲスチン、ポリホスホン酸塩、二ホスホン酸塩、エストロゲンアゴニスト／アンタゴニスト、（Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）のような）エストロゲン、エストロゲン／プロゲスチンの組み合わせ、及び（エストロン、エストリオール、又は１７α，１７β−エチニルエストラジオールのような）エストロゲン誘導体が含まれてよい。典型的なプロゲスチンは、商業的供給源から入手可能であり、アルゲストンアセトフェニド、アルトレノジスト、酢酸アマジノン、酢酸アナゲストン、酢酸クロルマジノン、シンゲストール（ｃｉｎｇｅｓｔｏｌ）、酢酸クロゲストン、酢酸クロメゲストン、酢酸デルマジノン、デソゲストレル、ジメチステロン、ジドロゲステロン、エチネロン、二酢酸ジチノジオール（ｄｔｈｙｎｏｄｉｏｌ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ）、エトノゲストレル、酢酸フルロゲストン、ゲスタクロン、ゲストデン、カプロン酸ゲストノロン、ゲストリノン、ハロプロゲステロン、ヒドロキシプロゲステロン、カプロン酸塩、レボノルゲストレル、リネストレノール、メドロゲストン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メレンゲストロール、二酢酸メチノジオール、ノルエチンドロン、酢酸ノルエチンドロン、ノルエチノドレル、ノルゲスチメート、ノルゲストメット、ノルゲストレル、オキソゲストンフェンプロピオネート、プロゲステロン、酢酸キンゲスタノール、キンゲストロン、及びチゲストール（ｔｉｇｅｓｔｏｌ）が含まれる。好ましいプロゲスチンは、メドロキシプロゲステロン、ノルエチンドロン、及びノルエチノドレルである。
【０１８７】
典型的な骨吸収阻害ポリホスホン酸塩には、米国特許第３６８３０８０号に開示された型のポリホスホン酸塩が含まれる。好ましいポリホスホン酸塩は、ジェミナルジポリホスホン酸塩（二ホスホン酸塩とも呼ばれる）である。チルドロン酸二ナトリウムは、特に好ましいポリホスホン酸塩である。イバンドロン酸は、特に好ましいポリホスホン酸塩である。アレンドロン酸塩は、特に好ましいポリホスホン酸塩である。ゾレドロン酸は、特に好ましいポリホスホン酸塩である。他の好ましいポリホスホン酸塩には、６−アミノ−１−ヒドロキシ−ヘキシリデン−二ホスホン酸及び１−ヒドロキシ−３（メチルペンチルアミノ）−プロピリデン−二ホスホン酸が含まれる。ポリホスホン酸塩は、酸、又は溶解性アルカリ金属塩若しくはアルカリ土類金属塩の形状で投与できる。ポリホスホン酸塩の加水分解性エステルも、同様に含まれる。具体的な例には、エタン−１−ヒドロキシ１，１−ジホスホン酸、メタンジホスホン酸、ペンタン−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、メタンジクロロジホスホン酸、メタンヒドロキシジホスホン酸、エタン−１−アミノ−１，１−ジホスホン酸、エタン−２−アミノ−１，１−ジホスホン酸、プロパン−３−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、プロパン−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、プロパン−３，３−ジメチル−３−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、フェニルアミノメタンジホスホン酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメタンジホスホン酸、Ｎ（２−ヒドロキシエチル）アミノメタンジホスホン酸、ブタン−４−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、ペンタン−５−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸、ヘキサン−６−アミノ−１−ヒドロキシ−１，１−ジホスホン酸及びその薬理学的に許容できるエステル及び塩が含まれる。
【０１８８】
特に、本発明の化合物は、哺乳動物のエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストと組み合わせられる。いかなるエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストも、この目的で使用できる。用語、エストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、エストロゲンレセプターと結合し、骨代謝回転を阻害し、且つ／又は骨量減少を阻害する化合物を指す。特に、エストロゲンアゴニストは、本明細書中で、哺乳動物組織中のエストロゲンレセプター部位に結合可能であり、且つ１つ以上の組織中でエストロゲンの作用を模倣可能な化合物と定義される。エストロゲンアンタゴニストは、本明細書中で、哺乳動物組織中のエストロゲンレセプター部位に結合可能であり、且つ１つ以上の組織中でエストロゲンの作用を遮断可能な化合物と定義される。かかる活性は、エストロゲンレセプター結合アッセイ、標準骨組織形態測定及び密度測定方法、及びＥ．Ｆ  Ｅｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１−７４（１９９４）；Ｓ．Ｊ．Ｇｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．３１（１）：５０−６２  （１９９６）；Ｗａｈｎｅｒ  Ｈ．Ｗ．ａｎｄ  Ｆｏｇｅｌｍａｎ  Ｉ．、Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．、Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．、Ｌｏｎｄｏｎ、ｐｐ．１−２９６（１９９４））を含む標準アッセイ分野の当業者に容易に判定される。種々のこれらの化合物を、下記に記載及び参照する。
【０１８９】
好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第５０４７４３１号に開示されたドロロキシフェン：（フェノール，３−（１−（４−（２−（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）−２−フェニル−１−ブテニル）−，（Ｅ）−）及び関連する化合物である。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３８：３９１１−１１（１９９７）に開示された３−（４−１，２−ジフェニル−ブト−１−エニル）−フェニル−アクリル酸である。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第４５３６５１６号に開示されたタモキシフェン：（エタンアミン，２−（−４−（１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル，（Ｚ）−２−，２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボキシレート（１：１））及び関連する化合物である。もう１つの関連する化合物は、米国特許第４６２３６６０号に開示された４−ヒドロキシタモキシフェンである。
【０１９０】
好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第４４１８０６８号に開示されたラロキシフェン：（メタノン，（６−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）ベンゾ［ｂ］チエン−３−イル）（４−（２−（１−ピペリジニル）エトキシ）フェニル）塩酸塩）である。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第４９９６２２５号に開示されたトレミフェン：（エタンアミン，２−（４−（４−クロロ−１，２−ジフェニル−１−ブテニル）フェノキシ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル，（Ｚ）−，２−ヒドロキシ−１，２，３−プロパントリカルボキシレート（１：１）である。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第３８２２２８７号に開示されたセントクロマン（ｃｅｎｔｃｈｒｏｍａｎ）：１−（２−（（４−（−メトキシ−２，２，ジメチル−３−フェニル−クロマン−４−イル）−フェノキシ）−エチル）−ピロリドンである。レボルメロキシフェンも好ましい。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第４８３９１５５号に開示されたイドキシフェン：（Ｅ）−１−（２−（４−（１−（４−ヨード−フェニル）−２−フェニル−ブト−１−エニル）−フェノキシ）−エチル）−ピロリドンである。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第５４８８０５８号に開示された２−（４−メトキシ−フェニル）−３−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）フェノキシ）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−６−オールである。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第５４８４７９５号に開示された６−（４−ヒドロキシ−フェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−ベンジル）−ナフタレン−２−オールである。もう１つの好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．に譲渡された国際公開第ＷＯ９５／１０５１３号に、その製法と共に開示された（４−（２−（２−アザ−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−イル）−エトキシ）−フェニル）−（６−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−フェニル）−ベンゾ［ｂ］チオフェン−３−イル）−メタノンである。他の好ましいエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストには、米国特許第５５５２４１２号に記載された化合物が含まれる。その中に記載された特に好ましい化合物には：シス−６−（４−フルオロ−フェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；（−）−シス−６−フェニル−５−（４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；シス−６−フェニル−５−（４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール；シス−１−（６’−ピロリジノエトキシ−３’−ピリジル）−２−フェニル−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン；１−（４’−ピロリジノエトキシフェニル）−２−（４”フルオロフェニル）−６−ヒドロキシ−１，２，３，���−テトラヒドロイソキノリン；シス−６−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル−５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−オール，及び１−（４’−ピロリジノールエトキシフェニル）−２−フェニル−６−ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリンが含まれる。他のエストロゲンアゴニスト／アンタゴニストは、米国特許第４１３３８１４号に記載されている。米国特許第４１３３８１４号は、２−フェニル−３−アロイル−ベンゾチオフェン及び２−フェニル−３−アロイルベンゾチオフェン−１−オキシドを開示する。
【０１９１】
当業者は、骨量増加剤とも呼ばれる他の骨同化剤が、本発明の化合物と併用できることを認めるであろう。骨量増加剤は、Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、「Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｒａｃｔｕｒｅ  Ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｏｓｔｍｅｎｏｐａｕｓａｌ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ（１９９４）．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ＷＨＯ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ  ８４３」に詳述された、骨折閾値を超えるレベルまで骨量を増加させる化合物である。あらゆるプロスタグランジン又はプロスタグランジンアゴニスト／アンタゴニストは、本発明の化合物と組み合わせて使用できる。当業者は、ＩＧＦ−１、フッ化ナトリウム、上皮小体ホルモン（ＰＴＨ）、上皮小体ホルモンの活性断片、成長ホルモン又は成長ホルモン分泌促進物質も使用できることを認めるであろう。以下の段落で、本発明の化合物と組み合わせて投与できる典型的な化合物を極めて詳細に記載する。
【０１９２】
プロスタグランジン：用語、プロスタグランジンは、骨粗鬆症及び過剰破骨細胞骨吸収に関連する他の障害の治療に有用な、天然プロスタグランジンＰＧＤ１、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＥ１、及びＰＧＦ２の類似体である化合物を指す。これらの化合物は、プロスタグランジンレセプターに結合する。かかる結合は、標準アッセイの分野の当業者によって容易に判定される（例えば、Ｓ．Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＰ２  Ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７（１）：２６３−２７０（１９９３））。
【０１９３】
プロスタグランジンは、塩基性化合物プロスタイン酸に関係する脂環式化合物である。塩基性プロスタグランジンの炭素原子は、カルボン酸炭素原子からシクロペンチル環を通って隣接側鎖の末端炭素原子へ順次番号が付けられる。通常、隣接側鎖はトランス配向にある。シクロペンチル部分のＣ−９でのオキソ基の存在は、Ｅクラス内のプロスタグランジンを示し、他方でＰＧＥ２は、Ｃ１３−Ｃ１４にトランス不飽和二重結合を、Ｃ５−Ｃ６位にシス二重結合を含む。
【０１９４】
種々のプロスタグランジンが、以下に記載され参照される。しかしながら、他のプロスタグランジンも当業者に公知であろう。典型的なプロスタグランジンは、米国特許第４１７１３３１及び３９２７１９７号に開示されている。Ｎｏｒｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  ｉｎ  Ｂｏｎｅ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ，  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ  ４１：１３９−１５０（１９９０）は、骨同化プロスタグランジンの概説である。いかなるプロスタグランジンアゴニスト／アンタゴニストも、本発明の化合物と組み合わせて使用できる。用語プロスタグランジンアゴニスト／アンタゴニストは、プロスタグランジンレセプターに結合し（例えば、Ｓ．Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＰ２  Ｓｕｂｔｙｐｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９７（１）：２６３−２７０（１９９３））、且つインビボでプロスタグランジンの作用を模倣する（例えば、骨形成を刺激し、且つ骨量を増加する）化合物を指す。かかる作用は、標準アッセイの分野の当業者によって容易に判定される。Ｅｒｉｋｓｅｎ  Ｅ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｏｎｅ  Ｈｉｓｔｏｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｙ、  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４、ｐｐ．１−７４；Ｓ．Ｊ．Ｇｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｄｕａｌ−Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  Ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ、Ｉｎｖ．Ｒａｄｉｏｌ．３１（１）：  ５０−６２（１９９６）；Ｈ．Ｗ．Ｗａｈｎｅｒ  ａｎｄ  Ｉ．Ｆｏｇｅｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ：Ｄｕａｌ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−Ｒａｙ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、  Ｍａｒｔｉｎ  Ｄｕｎｉｔｚ  Ｌｔｄ．Ｌｏｎｄｏｎ、ｐｐ．１−２９６（１９９４）。多数のこれらの化合物が、以下に記載され参照される。しかしながら、他のプロスタグランジンアゴニスト／アンタゴニストも当業者に公知であろう。典型的なプロスタグランジンアゴニスト／アンタゴニストは、以下に開示されている。米国特許第３９３２３８９号は、骨形成活性に有用な２−デスカルボキシ（ｄｅｓｃａｒｂｏｘｙ）−２−（テトラゾール−５−イル）−１１−デソキシ−１５−置換−オメガ−ペンタノルプロスタグランジンを開示する。米国特許第４０１８８９２号は、骨形成活性に有用な１６−アリール−１３，１４−ジヒドロ−ＰＧＥ２ｐ−ビフェニルエステルを開示する。米国特許第４２１９４８３号は、骨形成活性に有用な２，３，６−置換−４−ピロンを開示する。米国特許第４１３２８４７号は、骨形成活性に有用な２，３，６−置換−４−ピロンを開示する。米国特許第４０００３０９号は、骨形成活性に有用な１６−アリール−１３，１４−ジヒドロ−ＰＧＥ２ｐ−ビフェニルエステルを開示する。米国特許第３９８２０１６号は、骨形成活性に有用な１６−アリール−１���，１４−ジヒドロ−ＰＧＥ２ｐ−ビフェニルエステルを開示する。米国特許第４６２１１００号は、骨形成活性に有用な置換シクロペンタンを開示する。米国特許第５２１６１８３号は、骨形成活性に有用なシクロペンタノンを開示する。
【０１９５】
フッ化ナトリウムは、本発明の化合物と組み合わせて使用できる。用語フッ化ナトリウムは、あらゆる形状のフッ化ナトリウムを指す（例えば、緩速放出フッ化ナトリウム、持続放出フッ化ナトリウム）。徐放フッ化ナトリウムは、米国特許第４９０４４７８号に開示されている。フッ化ナトリウムの活性は、生物学的プロトコルの分野の当業者によって容易に判定される。
【０１９６】
骨形成タンパク質は、本発明の化合物と組み合わせて使用できる（例えば、Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ１，Ｂｏｎｅ  １９（６）：５８１−５８８（１９９６）参照）。
【０１９７】
動物モデル
自己免疫障害用の動物モデルは、本発明の治療物又は医薬組成物を評価するために使用できる。１型糖尿病、甲状腺自己免疫病、全身性紅斑性狼瘡、及び糸状体腎炎のような自己免疫障害の動物モデルが開発された（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，２９：２３５−２４６；Ｋｒｏｇｈ  ｅｔ  １９９９，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８１：５１１−５１５；Ｆｏｓｔｅｒ，１９９９，Ｓｅｍｉｎ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１９：１２−２４）。
【０１９８】
次の一連の実施例は、例証として、本発明の範囲の限定ではなく示される。
【実施例】
【０１９９】
Ｉ．ＩＬ−１２ｐ４０のレベル測定
ＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０のｍＲＮＡレベルを検査するために、ノーザンブロット分析を行った。ヒトＰＢＭＣ及びヒト単球細胞系統ＴＨＰ−１細胞を、化合物１の存在下及び不存在下でＩＦＮ−γ／ＳＡＣによって刺激した。ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して遠心分離によって単離し、５×１０５細胞／ウェルの９６−ウェルプレート内で、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加え、ＲＰＭＩ媒質中で調製した。次に、細胞をＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）によって、次に０．０１％ＳＡＣ又は１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳによって、異なる濃度の化合物２又は他の化合物の存在下で、準備刺激した。テスト化合物をＤＭＳＯ中で調製し、最終ＤＭＳＯ濃度を、無化合物対照を含む全ての培養において０．２５％に調節した。無細胞上清を、サイトカイン測定のために１８時間後取り出した。ＴＨＰ−１細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ＦＣＳ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を加えたＲＰＭＩ  １６４０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で培養した。全ＲＮＡを単離し、ＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０  ｃＤＮＡプローブを使用して、ノーザンブロット分析を行った。１μＭ化合物１の存在下又は不存在下で、ＩＦＮ−γによって準備刺激し、次にＳＡＣの刺激を続けたｈＰＢＭＣ及びＴＨＰ−１細胞の培養中のｍＲＮＡ蓄積の動態を最初に検査した。
【０２００】
ｈＰＢＭＣ中でのＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０の両方のｍＲＮＡは、ＳＡＣの添加後４時間までに検出でき、６時間でピークに達した。ｐ３５ｍＲＮＡの発現は、全てのサンプリング時間で、化合物１によって完全に阻害された一方で、ｐ４０サブユニットに関するｍＲＮＡの発現は、著しく減少したが不完全であった。ＩＦＮ−γ／ＳＡＣにより刺激されたＴＨＰ−１細胞中で、ＩＬ−１２ｐ３５ｍＲＮＡは、無化合物対照で僅かに視認され、１μＭ化合物１の存在下では検出不可能であった。対照的に、ＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡは、ＳＡＣの添加後４時間までに容易に検出でき、６時間でピークに達した。この場合も、化合物１は、ｐ４０メッセージの発現を著しく減少させたが、不完全であった。
【０２０１】
ＩＦＮ−γ／ＳＡＣ刺激されたｈＰＢＭＣ中のＩＬ−１２ｍＲＮＡ発現に対する化合物１の阻害効果の用量応答研究を行った。ＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０の両方のｍＲＮＡレベルがＳＡＣの添加後６時間で最大だったので、この時点を用量応答分析について選択した。ＩＦＮ−γ／ＳＡＣによるＩＬ−１２ｐ３５ｍＲＮＡ蓄積の誘導は、１ｎＭ未満のＩＣ５０で、３ｎＭ化合物１によって完全に逆転した。対照的に、ＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡ蓄積は、１ｎＭ化合物１によって僅かに阻害され、１０ｎＭで最大であったが、依然として不完全な阻害であった。このようなｐ３５に対するｐ４０の明らかに弱い阻害は、ｐ３５プロモーターの阻害がより効果的であることに起因し、又は、単純に、ｐ４０がｐ３５に対して非常に多く産生され、その阻害がより高濃度の薬物を必要とすることの帰結であるかもしれない。
【０２０２】
従って、化合物１は、ｐ３５及びｐ４０の両方のｍＲＮＡレベルの減少を引き起こした。その後の核ランオン実験により、この効果が転写開始レベルにあることが示された。
【０２０３】
ＩＩ．ＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０プロモーター活性に対する化合物２の効果
ノーザンブロットの結果、ｐ３５及びｐ４０プロモーター活性の研究に着手した。ｐ３５及びｐ４０プロモーターがルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を指示するＤＮＡコンストラクトを、マウスマクロファージ細胞系統ＲＡＷ２６４．７に一時的にトランスフェクトした。ＲＡＷ２６４．７細胞系統を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手し、１０％ＦＣＳ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を加えたＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で培養した。
【０２０４】
刺激に応答してｐ３５及びｐ４０の両方のプロモーターにドライブされるルシフェラーゼ合成を、化合物１及び化合物２の存在下及び不存在下で判定した。ヒトＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０プロモーター／ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを構築するために、ヒトＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０遺伝子の幾つかの配列モチーフを含むｐ３５（−１．５ｋｂから＋３ｂｐ）及びｐ４０（−１．３ｋｂから＋５６ｂｐ）プロモーター断片を生成した。断片は、次のようなプライマー：ＩＬ−１２ｐ３５  １．５ｋｂ−Ｆ：５’−ＧＣＡＧＣＡＴＴＡＧＡＡＧＧＧＧＣＣＴＴＡＧＡＧＡ−３’（配列番号３）、及びＩＬ−１２ｐ３５  １．５ｋｂ−Ｒ：５’−ＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＧＴＣＣＣＧＡＧＧＣＧＣＧ−３’（配列番号４）；ＩＬ−１２ｐ４０  −１．３ｋｂ−Ｆ：５’−ＡＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＡＧＴＴＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号５）、及びＩＬ−１２ｐ４０  １．３ｋｂ−Ｒ：５’−ＴＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧ−３’（配列番号６）を使用して、ヒトＰＢＭＣから得られたゲノムＤＮＡから、ＰＣＲで生成した。ｐ４０プロモーターレポーターコンストラクト中の欠失は、次のようなプライマー：ＩＬ−１２ｐ４０  −２５０ｂｐから＋５６  ｂｐ（ｐ４０／−２５０ｂｐ）Ｆ：５’−ＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号７）及びＩＬ−１２ｐ４０  −２５０ｂｐから＋５６ｂｐ（ｐ４０／−２５０ｂｐ）Ｒ：５’−ＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧ−３’（配列番号８）；ＩＬ−１２ｐ４０  −１５０ｂｐから＋５６ｂｐ（ｐ４０／−１５０ｂｐ）Ｆ：５’−ＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣ−３’（配列番号９）及びＩＬ−１２ｐ４０  −１５０ｂｐから＋５６ｂｐ（ｐ４０／−１５０ｂｐ）Ｒ：５’−ＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧ−３’（配列番号１０）によって、ＰＣＲで生成した。結果として生じたＰＣＲ産物を、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でルシフェラーゼ遺伝子の上流にライゲーションした。全てのコンストラクトを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２０５】
ＲＡＷ２６７．４細胞に一過的トランスフェクトをし、次に、この細胞を、更に１６時間、異なる濃度での化合物１、化合物２、又は陰性対照（構造的に関連した不活性化合物）の存在下又は不存在下で、マウス組換えＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１０時間、その後ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）又はＳＡＣ（０．０２５％）で刺激した。トランスフェクションは、記載された手順により、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して行った。トランスフェクトＤＮＡの総量は、挿入のない各対照プラスミドを添加することで、一定とした。
【０２０６】
細胞に、トランスフェクション効率を観察するためのβ−ガラクトシダーゼ発現を構成的に活性なＣＭＶプロモーターが指揮するベクターｐＣＭＶ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を共トランスフェクトした。ルシフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ活性を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  β−ｇａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により調製した細胞抽出物中で判定した。次に、ルシフェラーゼ活性を、β−ガラクトシダーゼ値を使用して規格化した。ルシフェラーゼ活性は、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳ又はＩＦＮ−γ／ＳＡＣによる刺激後における、ＲＡＷ２６４．７細胞中のＩＬ−１２ｐ４０及びｐ３５プロモーターコンストラクトの場合に、強く誘導された。このｐ４０及びｐ３５プロモータードライブのルシフェラーゼ発現は、化合物１及び化合物２の存在下で抑制されたが、不活性な陰性対照化合物の存在下では抑制されなかった。結果を図２Ａ〜２Ｂに示す。この結果は、化合物２がＩＬ−１２転写を阻害するメカニズムを裏付けている。ＩＦＮ−γ／ＬＰＳによって刺激されたｐ３５プロモータードライブのルシフェラーゼ発現は、化合物１よりも化合物２によって更に効果的に阻害された一方で、陰性対照化合物はプロモーター活性を全く抑制しなかった。ＴＨＰ−細胞中のＩＬ−１２産生に対する化合物１、化合物２、及び陰性対照化合物のＩＣ５０は、それぞれ４０ｎＭ、１０ｎＭ、及び１０００ｎＭ超であった。これらの結果は、ＥＬＩＳＡによって評価されたＩＬ−１２タンパク質合成に対する阻害活性と一致し、ｐ３５プロモーター活性の阻害がＩＬ−１２に対する阻害活性を反映したものであることを表している。ＥＬＩＳＡは、次の方法によって行った。ヒトＩＬ−１２ｐ７０（ヘテロ二量体）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）のＥＬＩ−ＰＡＩＲキットを製造業者の指示に基づいて使用し、アッセイした。ヒトＩＬ−１２ｐ４０は、Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）のＥＬＩＳＡキットを製造業者の指示に基づいて使用して、アッセイした。
【０２０７】
ＩＬ−１２ｐ３５及びｐ４０ｍＲＮＡレベルを検査するノーザンブロット解析を、作用のメカニズムを解明するために行った。化合物１は、ｐ３５及びｐ４０ｍＲＮＡレベルの減少を引き起こした。核ランオン実験により、この効果が転写開始レベルにあることが示された。ｐ３５及びｐ４０プロモーターがルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を指揮するＤＮＡ発現プラスミドが細胞にトランスフェクトされると、化合物１及び化合物２によってルシフェラーゼの発現を阻害できることが示された。これらの結果により、化合物２がｐ３５及びｐ４０遺伝子のＩＬ−１２転写を阻害するメカニズムが確認される。
【０２０８】
次に、この効果に関与するＩＬ−１２転写プロモーター要素の分析を始めた。ｐ４０プロモーターを使用して欠失分析を行った。ｐ４０プロモーターにおいて転写要素がより良く定義されていることから、ｐ３５プロモーターではなくｐ４０プロモーターを選択した。ｐ４０遺伝子の転写活性化に関与するＩＬ−１２阻害剤応答配列を特定するために、３つの異なるプロモーターを構築し、ＲＡＷ２６４．７細胞中に一過的トランスフェクトした。図３Ａ−３Ｂに示されるように、ＡＰ１要素領域を通してＮＦ−κＢからなるプロモーターは減少したプロモーター活性化を示す一方、ｐ４０プロモーターの５’隣接領域を含み且つ大きな近位欠失を有するプロモーターは、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳによる刺激に応答して、著しく減少したプロモーター活性を示した。ＰＵ−１、ＮＦ−κＢ及びＡＰ１要素と共にＥｔｓ−２要素を備えるプロモーターのみがＩＦＮ−γ／ＬＰＳ刺激に応答して高いルシフェラーゼ活性を示し、Ｅｔｓ−２要素がＩＬ−１２ｐ４０プロモーター活性の調節に関与することが示唆された。このＩＬ−１２プロモータードライブのルシフェラーゼ活性は、化合物１の存在下で著しく抑制された。これらの結果は、プロモーター活性の抑制において応答する要素が、ＩＬ−１２ｐ４０プロモーターのＴＡＴＡボックスから−２５０ｂｐの領域に位置することを示唆している。
【０２０９】
個別のｐ４０プロモーター転写要素の役割をより詳細に評価するために、これらの多数の要素中に突然変異を生成した。この作業の目標は、化合物２による阻害を受けて、ｐ４０プロモーター活性を減少させるが除去はしない突然変異の効果を評価することである。Ｅｔｓ−２要素中の全ての突然変異はレポーター遺伝子発現の誘導を完全に除去し、これにより、この要素の重要性が強調された。ＮＦκＢ要素に部位特異的突然変異生成を行った結果、ｐ４０プロモーターのＩＦＮ−γ／ＬＰＳによる誘導が減少したが明らかに測定可能となった。部位特異的突然変異生成は、製造業者の指示に従って、Ｇｅｎｅ  Ｔａｉｌｏｒ  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって行った。ＩＬ−１２突然変異体配列は、次の通りである：ＩＬ−１２ｐ４０−Ｅｔｓ２  ｍｕｔ−Ｆ：５’−ＴＡＴＴＣＣＣＣＡＣＣＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＴＴＡＧＴＴＣＡＴＴ−３’（配列番号１１）及びＩＬ−１２ｐ４０−Ｅｔｓ２  ｍｕｔ−Ｒ：５’−ＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡ−３’（配列番号１２）；ＩＬ−１２Ｐ４０−ａｐ−１  ｍｕｔ−Ｆ：５’−ＴＴＧＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＡＧＴＴＴＡ−３’（配列番号１３）及びＩＬ−１２ｐ４０−ＡＰ−１  ｍｕｔ−Ｒ：５’−ＴＧＴＴＧＣＡＡＣＡＴＴＧＡＡＡＡＣＡＡＣＴＣＴＣＡＡＡＡＣ−３’（配列番号１４）；ＩＬ−１２ｐ４０−ＮＦｋＢ  ｍｕｔ−Ｆ：５’−ＣＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＣＡＧＡＡＧＧＴＴＴＴ−３’（配列番号１５）及びＩＬ−１２ｐ４０−ＮＦｋＢ  ｍｕｔ−Ｒ：５’−ＡＧＡＡＧＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧ−３’（配列番号１６）；ＩＬ−１２ｐ４０−ＰＵ−１  ｍｕｔ−Ｆ：５’−ＡＣＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＴ−３’（配列番号１７）及びＩＬ−１２ｐ４０−ＰＵ−１  ｍｕｔ−Ｒ：５’−ＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧＴＧＴＧＴＡＴＣＡ−３’（配列番号１８）。
【０２１０】
興味深いことに、化合物２による発現の抑制はこの突然変異体コンストラクト中で減少したことから、ＮＦκＢの役割が示唆された。転写因子ＮＦκＢがＩＬ−１２ｐ４０遺伝子発現の調節に関与することが示されたので、ＳＴＡ−１８５６が、ｐ４０プロモーター上の同属部位へのＮＦκＢの結合を変更するか否かを検査した。ＳＡＣにより又はよらずに処理し、１μＭ化合物１又は１０ｍＭ  ＡＳＡの存在下又は不存在下でインキュベートし、ＩＦＮ−γ準備刺激したＴＨＰ−１細胞から、核抽出物を調製した。まず、ＴＨＰ−１細胞を、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１％ノニデットｐ４０（ＮＰ−４０）、及び０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む２０容量の緩衝液Ａ中に懸濁させ、次に、５分間、４℃、１００００ｒｐｍで均質化及び遠心分離することによって、核抽出物の単離を行った。続いて、核ペレットを、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び１ｍｌ当たり１０μｇロイペプチン、２０μｇペプスタチン及び１０μｇアンチパインを含む緩衝液Ｃ中で懸濁し、４℃で３０分間インキュベートし、２０分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液Ｄに対して透析した。
【０２１１】
この工程から得られた抽出物を、突然変異されたＮＦκＢ結合部位又はＩＬ−１２ｐ４０の転写開始部位から−１２０〜−１０２領域に対応するＮＦκＢ標的配列を含むオリゴヌクレオチドを使用するゲルシフトアッセイにおいて、使用した。ｐ４０プロモーターからの同属配列を含むプローブへのＮＦκＢの結合は、ＩＦＮ−γ／ＳＡＣ刺激ＴＨＰ−１細胞において強く誘導された。この相互作用は、過剰な非標識化プローブに競合するが、２つの塩基対が置換される突然変異がされたオリゴヌクレオチドには競合しないので、特異的である。化合物１は、ＮＦκＢ結合に対していかなる影響も示さなかった。対照的に、ＡＳＡは、１μＭ化合物１及び１０ｍＭ  ＡＳＡに誘発されるＩＬ−１２ｐ７０タンパク質合成の阻害率がそれぞれ９７％及び４５％だったという事実にも拘わらず、結合を著しく減少させた。ＩκＢに対する化合物２の効果がなくなることと組み合わせると、これらの結果は、ＩＬ−１２産生に対する化合物１／化合物２の強い阻害活性がＮＦκＢ結合活性合計の総計的減少に起因しないことを示唆する。ＮＦκＢを強力に遮断する化合物が化合物１／化合物２よりも遙かに幅広いサイトカイン阻害プロフィールを有することから、このことは予期されるものであった。
【０２１２】
ＮＦ−κＢ結合における化合物２の作用を理解するために、ＥＬＩＳＡに基づく転写因子−ＤＮＡ結合活性アッセイシステムを使用して、ＮＦ−κＢファミリーメンバーであるｐ５０、ｃ−Ｒｅｌ及びｐ６５を調査した。ＤＮＡ転写因子結合活性アッセイは、製造業者の指示に従って、ＥＺ−ｄｅｔｅｃｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  ｋｉｔ−ｐ５０又はｐ６５（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）及びＢＤ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ＴｒａｎｓＦａｃｔｏｒ  Ｋｉｔｓ−ＮＦｋＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して行った。
【０２１３】
ｐ５０、ｃ−Ｒｅｌ及びｐ６５の結合活性は、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳ刺激後３時間で、ＴＨＰ−１細胞の核抽出物中において著しく増加した。化合物２（５００ｎＭ）の存在下、３時間でｃ−Ｒｅｌの結合活性は著しく減少し、ｐ５０は僅かに減少した。ｐ６５の場合、結合活性の増加は、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳ刺激に応答して、化合物２の存在下で観察された。このことは、ｐ５０及びｃ−Ｒｅｌが減少したことにより結合競合がなくなった結果である。
【０２１４】
ＩＩＩ．ＮＦ−κＢタンパク質移動：
ＤＮＡ−タンパク質相互作用研究により、ＩＬ−１２中で機能活性ヘテロ二量体を形成するｃ−Ｒｅｌ及びｐ５０の結合活性が減少し、ｐ６５の結合活性が化合物２処理に応答して増加することが示された。この変化を理解するために、ウェスタンブロット分析を使用してＮＦ−κＢタンパク質の細胞内局在を調査した。核内のｃ−Ｒｅｌ及びｐ５０タンパク質の量が減少したことが認められ、ｐ６５の量が、未処理細胞と比較して、化合物２（５００ｎＭ）で３時間処理された細胞において、著しく増加したことが認められた。この結果は、ＤＮＡ−タンパク質相互作用研究と一致し、ｐ５０／ｃ−Ｒｅｌ活性の低下及びｐ６５結合活性の増加が、核内のＮＦ−ｋＢタンパク質の不均衡を誘発してｐ５０／ｃ−Ｒｅｌの結合活性に影響を及ぼすことができることを示唆するものである。
【０２１５】
ＩＶ．ｃ−Ｒｅｌ及びＩＣＳＢＰに対する化合物２の効果（核内での両方のレベルを測定する）
分析した転写因子のうち２つの因子ＩＣＳＢＰ及びｃ−Ｒｅｌが、化合物１／化合物２処理により影響を受けたようである。ＩＣＳＢＰは、Ｅｔｓ−２部位に間接的に結合する。ＩＬ−１２の第１のＴＦκＢトランス活性化因子は、ｃ−Ｒｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体である。他の二量体（ｐ６５／ｐ５０及びｐ５０／ｐ５０）は、活性に欠ける又は阻害機能を有する。従って、ｃ−Ｒｅｌは、ＮＦκＢを介した活性化及びＩＣＳＢＰとの相互作用の双方の結果としてのＩＬ−１２転写において、役割を果たす。ウェスタンブロット分析及びＤＮＡ結合研究はいずれも、化合物２処理に続く核ｃ−Ｒｅｌレベルの減少を示した。図４に示されるように、ＴＨＰ１核ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０及びｐ６５タンパク質のウェスタンブロットアッセイは、次の方法で行った；１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、純粋なニトロセルロース膜（ＢｉｏＲｅｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移行した。膜を、ＴＢＳＴ緩衝液中の５％ミルクでブロッキングし、次に、１：５００希釈した抗ｃ−Ｒｅｌ、抗ｐ６５、抗ｐ５０、抗ＩＣＳＢＰ又は抗ＰＵ−１抗体により、室温で１時間又は４℃で一晩、インキュベートした（全ての抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した）。膜を洗浄し、１：２０００希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ抱合抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）によって、室温で１時間インキュベートした。
【０２１６】
ＩＦＮ−γプラスＬＰＳ及びＩＦＮ−γプラスＳＡＣ処理の両方とも、核ｃ−Ｒｅｌ、ｐ６５及びｐ５０の量を強力に増加させた。化合物２処理はｃ−Ｒｅｌのレベルを著しく減少させ、処理後の核ｃ−Ｒｅｌレベルは非刺激レベル以下であった。対照的に、核ｐ６５タンパク質は、化合物２処理後に増加した。ｐ５０レベルは、化合物２処理後に僅かに減少したが、非刺激レベルより高いままであった。従って、化合物２処理により、第１のＩＬ−１２活性化ＮＦκＢ二量体である核ｃ−Ｒｅｌ／ｐ５０の量の減少が誘発されることが示された。
【０２１７】
ＩＬ−１２プロモーター−ルシフェラーゼレポートシステムによる共トランスフェクションを使用して、化合物２によって発現が減少するＩＣＳＢＰを過剰発現した。ＩＣＳＢＰの過剰発現コンストラクトは、次のようなプライマー：ＩＣＳＢＰ−ｅｘｐ−Ｆ：５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＴＧＴＧＴＧＡＣＣＧＧＡＡＴＧＧ−３’（配列番号１９）及びＩＣＳＢＰ−ｅｘｐ−Ｒ：５’−ＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＴＧＣＡＧＧＡＣＧＣＡＧＡＣ−３’（配列番号２０）を使用して、ヒトＰＢＭＣのｃＤＮＡからＰＣＲで生成し、結果として生じたＰＣＲ産物をｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にライゲーションした。ＩＣＳＢＰ過剰発現は、ｐ４０の発現レベルを増加し、化合物２による阻害を減少させた。
【０２１８】
Ｖ．ＩκＢに対する化合物２の影響
ＩκＢ分解は、ＮＦκＢ依存性遺伝子のシグナル伝達経路におけるステップの１つである。ウェスタンブロット及びＦＡＣＳ分析を使用して、ＩκＢα及びＩκＢβの誘導性分解における化合物２の活性をＴＨＰ−１細胞において調査した。ＴＨＰ−１及びＲＡＷ２６４．７細胞の細胞質中のＩκＢα及びＩκＢβの量は、ＩＦＮ−γ／ＬＰＳ又はＩＦＮ−γ／ＳＡＣによる誘導に応答して３０分で著しく減少した。しかしながら、化合物２（５００ｎＭ）により及びそれによらずに、３０分及び２時間処理した試料間に、有意な差は観察されなかった。同様の結果が、化合物２が刺激の３０分前に添加された化合物２前処理試料から観察された。これらの結果により、転写因子として作用できる核に遊離ＮＦκＢが移動することを可能にする、ＩκＢα及びＩκＢβの分解を化合物２が誘導しないことが示された。
【０２１９】
ＶＩ．核内のＥｔｓ２のレベル測定
転写因子ＩＣＳＢＰは、ＰＵ−１への結合を通じて、間接的にＥｔｓ−２要素に結合する。各抽出物をＥｔｓ−２ＤＮＡ要素ビーズに結合させ、このビーズを遊離タンパク質から結合物を分離するために単離し、ＩＣＳＢＰ又はＰＵ−１の抗体を用いたウェスタンブロットでタンパク質を分析した。Ｅｔｓ−２ＤＮＡのビーズへの抱合は、次の方法によって行った。Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，ｖｏｌ  １６５  ｐａｇｅｓ  ２７１−２７９に詳述されたように、ビオチン化プライマーを使用したＰＣＲで、１．３ｋｂ野生型ヒトＩＬ−２１ｐ４０レポーターから、ＩＬ−１２ｐ４０  Ｅｔｓ−２部位（−２９２から−１９６）を包含するビオチン化ＤＮＡ断片を合成した。ＰＣＲ産物を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）によって精製した。２μｇのビオチン化ＤＮＡを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液中の１００μｌのストレプタビジン結合磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｍ２８０，Ｄｙｎａｌ，Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）に抱合させた。２μｇのＤＮＡに抱合された１０μｇのビーズは、ＴＧＥＤＮ緩衝液（１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％グリセロール）によって平衡化し、２時間４℃で５００μｇのＴＨＰ−１細胞核抽出物及び２０μｇニシン精子ＤＮＡ（ＧｉｂＣｏ）によってインキュベートした。ビーズをＴＧＥＤＮ緩衝液中で洗浄し、結合物質を０．５％ＳＤＳ及び１Ｍ  ＮａＣｌを加えた２０μｌのＴＧＥＤＮ緩衝液中に溶出させた。溶出物質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分離し、抗ＩＣＳＢＰ又は抗ＰＵ−１抗体を使用した免疫ブロット分析で検出した。
【０２２０】
ウェスタンブロット分析により、化合物１で処理されたＴＨＰ−１細胞の核抽出物中のＩＣＳＢＰ量が著しく減少することが示された（図５参照）。対照的に、ＰＵ−１のレベルは、化合物処理によって影響を受けなかった（図６参照）。
【０２２１】
ＩＣＳＢＰ及びｃ−Ｒｅｌのいずれもが化合物２処理された細胞の核内で減少したという検出事項は、特に重要である。これら２つの転写因子は相互に作用するので、両方の因子のレベル減少は、深刻な効果を有することが予期される。化合物２は、トランス活性化に関するＩＣＳＢＰ−ｃ−Ｒｅｌ相互作用に依存する遺伝子の発現を選択的に阻害する。
【０２２２】
ｃ−Ｒｅｌは、単球及びマクロファージ中のｐ３５及びｐ４０の両方、並びに樹状細胞（ＤＣ）中でのｐ３５の発現に関与するが、樹状細胞中のｐ４０発現はｃ−Ｒｅｌ依存性である（Ｇｒｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００１；１９４：１０２１−１０３１）。化合物２がｃ−Ｒｅｌを介して作用するならば、この薬物は、ＰＢＭＣによるｐ４０及びｐ７０の両方の産生を阻害するはずであるが、ＤＣ中のｐ４０を阻害しないはずである。このことは、次の方法で単球誘導樹状細胞を生成することによってテストされた。ヒトＰＢＭＣを無血清ＤＭＥＭ中に１×１０７細胞／ｍｌで懸濁し、５％ＣＯ２のもと、３７℃で２時間インキュベートした。次に、非接着細胞を、ＰＢＳによる洗浄によって除去した。接着細胞を、ｒｈＩＬ−４（１００Ｕ／ｍｌ）及びｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、６−７日間培養した。半分量の新規な培地及び全量の新規なサイトカインを、１日おきに添加した。次に、細胞を、異なる濃度の化合物２又は他の化合物の存在下で、ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）及びそれに続く０．０１％ＳＡＣ又は１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳによって準備刺激した。テスト化合物を、ＤＭＳＯ中で調製し、最終ＤＭＳＯ濃度を、無化合物対照を含む全ての培養において０．２５％に調節した。サイトカイン測定のために、無細胞上清を１８時間後に採取した。
【０２２３】
化合物２は実際にヒトＤＣ中のｐ７０を阻害したが、ｐ４０産生は阻害しなかった（１０μＭ以下の化合物２では、阻害がなかった）。同様に、トキソプラズマ抗原（ＳＴＡｇ）刺激に続くＩＬ−１２ｐ４０産生の誘導は、ｃ−Ｒｅｌ依存性であることが示された。従って、化合物２がｃ−Ｒｅｌを介して作用するのであれば、ＳＴＡｇ刺激に続くＩＬ−１２ｐ４の強力な阻害が観察されるべきではない。予備的な結果は、化合物２のＩＣ５０媒介ｐ４０阻害が、ＩＦＮ−γ／ＳＡＣ刺激に対しＳＴＡｇによって約１０００倍高く、他方でデキサメタソンのＩＣ５０は、ＳＡＣ及びＳＴＡｇ刺激の両方の場合で同じであった。これら２つの結果から、化合物２によるＩＬ−１２産生の阻害がｃ−Ｒｅｌ経路を介することが更に確認された。
【０２２４】
ＶＩＩ．化合物２処理細胞中のＮＦ−κＢメンバーの核移動の動態
化合物２は、ｃ−Ｒｅｌ及びｐ５０の核移動を妨害する。化合物２によって処理されたＬＰＳ刺激細胞中でのＮＦ−κＢファミリーメンバーの核移動の動態を検査した。ＴＨＰ１細胞を、１００ｎＭ化合物２の存在下又は不存在下、ＬＰＳで刺激し、処理後５分、１５分、３０分、１時間、３時間及び６時間に回収した核（ｎ．ｐ．）抽出物を免疫ブロットすることによって、ＮＦ−κＢ  ｃ−Ｒｅｌファミリーメンバーの分布を判定した。ＬＰＳ刺激に応答して、ｐ５０は早くも刺激５分後に核へ移動し、時間が経過するにつれ蓄積した（図７免疫ブロット及び図８デンシトメトリー）。ＬＰＳ刺激細胞の化合物２による処理は、刺激後５分から１時間で、ｐ５０の核流入の動態に対する影響を有さず、３時間で核タンパク質レベルの小さい減少を示した。ｐ６５核移動を検査する実験を、図９（免疫ブロット）及び図１０（デンシトメトリー）に示す。ＬＰＳ刺激細胞において、ｐ６５は早くも刺激後５分で核へ移動し、刺激後１５−３０分で最大レベルに蓄積された。ＬＰＳ刺激細胞の化合物２による処理は、ｐ６５の核流入の動態に対する影響を有しない。後の時間（６時間）での核ｐ６５のレベルは、化合物２処理細胞において、未処理細胞に対してわずかに増加した。
【０２２５】
理論に拘束されることは望まないが、化合物２は、ＬＰＳ刺激に応答してｐ５０及びｐ６５核移動の動態に影響を及ぼすことはない。後の時間で、化合物２は、ｐ５０の核移動を低下させ（３時間の時点）、ｐ６５の核移動を強化し（６時間の時点）、ＮＦ−κＢファミリーに対する選択的効果を示している。
【０２２６】
ＶＩＩＩ．ｐ５２及びＲｅｌ−Ｂの核移動に対する化合物２の効果
Ｒｅｌ  Ｂ及びｐ５２は、優先的に互いに複合体を形成するＲｅｌファミリーの２つのメンバーである。ｐ５０及びｐ６５と同様に、ｐ５２は実質的に全ての細胞型で検出された一方、ｃ−Ｒｅｌ及びＲｅｌ  Ｂはリンパ組織でのみ検出された。ｐ５２及びＲｅｌ−Ｂ核移動に対する化合物２の影響を判定するために、１００ｎＭの化合物２の存在下又は不存在下でＩＦＮｇ＋ＬＰＳによってＴＨＰ１細胞を刺激し、処理６時間後に核を免疫ブロットすることでｐ５２及びＲｅｌ−Ｂの分布を判定した。図１１に示されるように、核Ｒｅｌ−Ｂは化合物２の存在下で僅かに増加した。ｐ５２において、著しい差は認められなかった。この結果により、化合物２がｃ−Ｒｅｌ及びｐ５０の核移動を特異的に阻害するが、他のＮＦ−ｋＢ及びＲｅｌ−Ｂ核移動は阻害しないことが示唆される。
【０２２７】
細胞系及び培養条件：
ＴＨＰ−１細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ＴＨＰ−１細胞を、１０％ＦＣＳ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を加えたＲＰＭＩ  １６４０（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で培養した。細胞を、ＩＦＮｇ（１００Ｕ／ｍｌ）、続いて１μｇ／ｍｌ  ＬＰＳによって、異なる濃度の化合物２の存在下、準備刺激した。化合物２をＤＭＳＯ中で調製し、無化合物対照を含む全ての培養において、最終ＤＭＳＯ濃度を０．２５％に調節した。サイトカイン測定のために、無細胞上清を１８時間後に採取した。
【０２２８】
核抽出物の単離：
ＴＨＰ−１細胞を、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）、０．１％ノニデットｐ４０（ＮＰ−４０）、及び０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含む２０容量の緩衝液Ａ中に懸濁させ、５分間、４℃、１００００ｒｐｍで均質化及び遠心分離した。次に、核ペレットを、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ９ｐＨ７．９）、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１ｍｌ当たり１０μｇロイペプチン、２０μｇペプスタチン、及び１０μｇアンチパインを含む緩衝液Ｃ中で懸濁し、４℃で３０分間インキュベートし、２０分間１４０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、２０％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１ｍＭ  ＤＴＴを含む緩衝液Ｄに対して透析した。
【０２２９】
ウェスタンブロット：
１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、純粋なニトロセルロース膜（ＢｉｏＲｅｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に移行した。膜を、ＴＢＳＴ緩衝液中の５％ミルクでブロッキングし、１：５００希釈した抗ｃ−Ｒｅｌ、抗ｐ６５、抗ｐ５０、抗ＩＣＳＢＰ又は抗ＰＵ−１抗体によって、室温で１時間又は４℃で一晩、インキュベートした（全ての抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入した）。膜を洗浄し、１：２０００希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ抱合抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）によって、室温で１時間インキュベートした。
【０２３０】
化合物３−１４は、実施例ＩからＶＩＩＩに記載された手順で、化合物１及び２と同様な活性を有することが予期される。
【０２３１】
当業者に明らかなように、本発明の多くの修正及び応用例はその精神及び範囲から逸脱することなくなされる。ここに記載された特定の実施態様は例としてのみ与えられ、本発明は、請求項の文言及びかかる請求項が権利を与えられる均等物の範囲全体によってのみ限定されるべきである。かかる修正は、請求項の範囲内に含まれることが意図される。
【０２３２】
ここで引用された全ての参考文献、特許及び非特許は、全体が参考として、各個別の公開又は特許又は特許出願は、あらゆる目的において、全体が参照として、特異的且つ個別に組み込まれることが示されるように、同じ範囲のあらゆる目的のためにここに組み込まれる。
【０２３３】
ここに開示された全ての特徴、特定の実施態様及び特定の置換基は、いかなる組み合わせで組み合わされてもよい。明細書で開示された各特徴、実施態様又は置換基は、同じ、同等、又は類似した目的に役立つ代替的特徴、実施態様又は置換基によって置換されてよい。化合物の場合、特定の値は、安定した構造をもたらすあらゆる組み合わせで組み合わされてよい。更に、１つのタイプの化学構造中の置換基の特定の値は（好ましい、又は好ましくないものであろうと）、同じ又は異なるタイプの化学構造において、他の置換基の値（好ましい、又は好ましくないものであろうと）と組み合わされてよい。従って、別段の明確な記載がない限り、開示された各特徴、実施態様又は置換基は、包括的な一連の同等又は類似した特徴、実施態様又は置換基の例にすぎない。
【図面の簡単な説明】
【０２３４】
【図１ａ】ヒトｃ−Ｒｅｌのヌクレオチド及びアミノ酸配列を列挙する（配列番号１）。
【図１ｂ】ヒトｃ−Ｒｅｌのヌクレオチド及びアミノ酸配列を列挙する（配列番号２）。
【図２Ａ】ＩＦＮ−γ及びＩＦＮ−γ／ＬＰＳ誘導ｐ４０を示すグラフである。
【図２Ｂ】テスト分子のｐ３５発現阻害能を示すグラフである。
【図３Ａ】使用される様々なテストプロモーターの略図である。
【図３Ｂ】種々のテストプロモーターのＩＦＮ−γ／ＬＰＳ刺激への応答能を示すグラフである。
【図４】ＮＦκＢファミリーメンバーｃ−Ｒｅｌ、ｐ６５又はｐ５０の存在に対する刺激を受けた及び刺激を受けない細胞における、ＴＨＰ−１核抽出物のウェスタンブロット分析である；α−チューブリンは、内部対照である。
【図５】刺激を受けた及び刺激を受けない細胞における、抗ＩＣＳＢＰ抗体を用いたＴＨＰ−１核抽出物のウェスタンブロット分析である。
【図６】刺激を受けた及び刺激を受けない細胞における、抗ＰＵ−１抗体を用いたＴＨＰ−１核抽出物のウェスタンブロット分析である。
【図７】テスト分子がＮＦ−ｋＢ  ｐ５０核移動に与える効果を示す免疫ブロットである。
【図８】テスト分子がｐ５０核移動に与える効果を示すデンシトメトリーの結果を表すグラフである。
【図９】テスト分子がＮＦ−ｋＢ  ｐ６５核移動に与える効果を示す免疫ブロットである。
【図１０】テスト分子がｐ６５核移動に与える効果を示すデンシトメトリーの結果を表すグラフである。
【図１１】テスト分子がｃ  ｒｅｌを含むＮＦ−ｋＢメンバーの核移動に与える効果を示す免疫ブロットを表す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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