(57)【要約】【課題】同定されたイオンチャネルの数を増やし、その複雑さを更に理解することによって、イオンチャネル機能を変更する治療における今後の取り組みに寄与すること。【解決手段】特定の配列を有する新規α１Ｄカルシウムチャネルサブユニットポリペプチド、核酸、並びに、ポリペプチド及び核酸のフラグメント、及び、この使用方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの単離されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
ＫＩＶＡ配列は、細胞外ドメイン内にある請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドは、ヒト型である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列を含まない請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの単離されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、配列番号６に少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、前記ポリペプチドは、次の特徴：
（ａ）配列番号６のアミノ酸１２９１−１３０５の欠失、
（ｂ）配列番号２の挿入、又は、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸１８０４−１８１２の欠失、の１つ以上を含むポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは配列番号２の挿入を含み、この挿入は細胞外ドメイン内にある請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記挿入は、反復ドメインの第３及び第４膜貫通セグメントの間にある請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記挿入は、第４反復ドメインの第３及び第４膜貫通セグメントの間にある請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記挿入は、配列番号６のアミノ酸１２９０の後にある請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記挿入は、配列番号６のアミノ酸１２９０にある請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドは、前記特徴（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のいずれか２つを有する請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは、前記特徴（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の３つ全てを有する請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号４の少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含む単離されたポリペプチドであって、
前記ポリペプチドは、アミノ酸１２８１−１２８４の少なくとも１つ、並びに／又は、アミノ酸１７９２及び１７９３を含むポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２ではない、細胞外ドメインの一部分は、他のカルシウムチャネルα１サブユニットからの細胞外ドメインによって置換される請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれかに記載のポリペプチドをコードするＬ−型カルシウムα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの単離された核酸分子。
【請求項１８】
前記核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
核酸分子は、配列番号３のヌクレオチド配列からなる請求項１８に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記核酸は、配列番号３の核酸配列の対立遺伝子である請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項１７に記載のＬ−型カルシウムα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子のフラグメントであって、
前記フラグメントは、配列番号２をコードするフラグメント。
【請求項２２】
プロモータに操作可能に連結された請求項１７に記載のＬ−型カルシウムα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項２３】
請求項１７に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載のＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドに優先的に結合する薬剤。
【請求項２５】
請求項５に記載のＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドに選択的に結合し、且つ、配列番号５の配列を含むＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニットポリペプチドには結合しない薬剤。
【請求項２６】
前記薬剤は、小分子、核酸、又は、タンパク質である請求項２４に記載の薬剤。
【請求項２７】
前記薬剤は、Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドのカルシウムチャネル活性を調節（例えば、阻害又は増強）する請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２８】
前記薬剤は、抗体又はその抗原結合フラグメントである請求項２６に記載の薬剤。
【請求項２９】
前記抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である請求項２８に記載の薬剤。
【請求項３０】
請求項２７に記載の薬剤及び薬理学的に許容し得る担体を含む医薬組成物。
【請求項３１】
細胞内でＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド活性を調節する方法であって、
α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを含むＬ−型カルシウムチャネルを調製すること、
前記チャネルを、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドの活性を調節するために有効な量のＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットモジュレータに接触させること、を含み、
前記α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを、請求項１から１６のいずれかに記載のα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドとする方法。
方法。
【請求項３２】
前記モジュレータは、小分子、核酸、又は、タンパク質である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドの活性を調節する薬剤を同定する方法であって、
α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを含む第１カルシウムチャネルを調製すること、
前記チャネルを試験化合物に接触させること、及び、
カルシウムチャネルの活性を評価すること、を含み、
前記α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを、請求項１から１６のいずれかに記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドとし、
基準値に対する活性の変化を、前記化合物がチャネルを調節する薬剤であることを示すものとする方法。
【請求項３４】
前記試験化合物は、小分子、ペプチド、又は、核酸である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記カルシウムチャネルは、生体試料内に含まれる請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料は、細胞膜を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料は、細胞を含む請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞は、真核細胞である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞は、アフリカツメガエルの卵母細胞である請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞は、哺乳動物細胞である請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記活性は、カルシウム濃度の調節を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記評価は、カルシウムフラックスを検出することを含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記接触は、試験化合物がない場合に、第１の量のカルシウムフラックスを引き起こす条件で行われる請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記評価は、カルシウムフラックスアッセイを使用することを含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記アッセイは、パッチクランプ電気生理を使用する請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記アッセイは、二電極電位クランプ電気生理を使用する請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記アッセイは、蛍光アッセイである請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
請求項３３に記載の方法であって、
請求項１から１６に記載のα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド以外のα１Ｄサブユニットポリペプチドを含む第２カルシウムチャネルを調製するステップ、
前記第２チャネルを前記試験化合物に接触させるステップ、
前記第２カルシウムチャネルの活性を評価するステップ、を更に含む方法。
【請求項４９】
前記試験化合物の存在下での前記第１カルシウムチャネルの活性を、前記試験化合物の存在下での前記第２カルシウムチャネルの活性と比較することを更に含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
複数のカルシウムチャネルを調製する請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
前記α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項５２】
Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドアイソフォームに選択的に結合する薬剤を同定する方法であって、
請求項１から１６のいずれかに記載の第１α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドアイソフォームを調製すること、
前記第１ポリペプチドを試験化合物に接触させること、
前記試験化合物の前記第１ポリペプチドへの結合を検定すること、
第２α１Ｄサブユニットポリペプチドを調製すること、
前記第２ポリペプチドを前記試験化合物に接触させること、
前記試験化合物の前記第２ポリペプチドへの結合を検定すること、を含み、
前記α１Ｄサブユニットポリペプチドを、請求項１から１６に記載のα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド以外とし、
前記第１ポリペプチドに結合し且つ前記第２ポリペプチドに実質的に結合しない化合物を、この化合物がＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドアイソフォームに選択的に結合する薬剤であることを示すものとする方法。
【請求項５３】
カルシウム電流に関する障害の治療に有用な薬剤を同定する方法であって、
請求項１から１６のいずれかに記載のα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを含むカルシウムチャネルを調製すること、
前記チャネルを試験化合物に接触させること、及び、
前記チャネルの活性を評価すること、を含み、
基準値に関する活性の変化を、前記試験化合物がカルシウム電流に関する障害に有用な薬剤であることを示すものとする方法。
【請求項５４】
前記障害は、心臓病である請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記化合物を（例えば動物モデルを使用して）インビボで投与することを更に含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
インビボで使用する化合物を修飾することを更に含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
カルシウムチャネル電流に関する障害を有する被験者を治療する方法であって、
治療を必要とする被験者に、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを含むカルシウムチャネルに選択的な薬理学的薬剤を投与することを含む方法。
【請求項５８】
前記障害は、心臓病である請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
全ての細胞は、必須生理機能を行うために細胞膜を横切る無機イオンの調節された運動に依存する。電気的興奮性、シナプス可塑性、及びシグナル伝達は、イオン濃度の変化が決定的役割を果たすプロセスの例である。一般に、これらの変化を可能にするイオンチャネルは、各々が２つ以上の膜貫通ドメインを含む１つ又は複数のサブユニットからなるタンパク質性細孔である。大部分のイオンチャネルは、寸法及び電荷の物理的優先度により、特定のイオン、主にＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、又はＣｌ−に選択性を有する。イオンは、能動輸送よりむしろ電気化学力によって膜を横断し、これにより、単一のチャネルは毎秒数百万のイオンを通過させることができる。チャネルの開口、つまり「ゲーティーング」は、チャネルのサブクラスに依存し、電位の変化又はリガンド結合によって厳重に制御される。イオンチャネルは、非常に多くの生理的プロセスに関与するため、魅力的な治療標的である。しかし、特定の組織型における特定のチャネルに特異性を有する薬剤の生成は、依然として大きな課題のままである。
【０００２】
電位開口型イオンチャネルは、膜電位の変化に応答して開口する。例えば、ニューロンのような興奮性細胞の脱分極は、Ｎａ＋イオンの一過性流入をもたらし、これにより、神経活動電位が伝搬される。このＮａ＋濃度の変化は、電位開口型Ｋ＋チャネルによって探知され、この電位開口型Ｋ＋チャネルは、続いてＫ＋イオンを流出させる。Ｋ＋イオンの流出は、膜を再分極させる。他の細胞型は、活動電位の生成を、電位開口型Ｃａ２＋チャネルに依存する。電位開口型イオンチャネルは、分泌、恒常及び分裂促進プロセスの調節のような、非興奮性細胞内の重要な機能も実行する。リガンド開口型イオンチャネルは、神経伝達物質（例えば、グルタミン酸、セロトニン、アセチルコリン）のような細胞外刺激、又は細胞内刺激（例えば、ｃＡＭＰ、Ｃａ２＋、リン酸化）によって、開口できる。
【０００３】
カルシウムチャネルには、電位開口型クラス及び非電位開口型クラスが含まれる。電位開口型カルシウムチャネルは、更に、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｐ、Ｑサブタイプに分割できる。他のサブタイプは陽電位で活性化する一方、Ｔ型チャネルは、陰電位で一時的に活性化する。電位開口型Ｃａ２＋チャネルのα１サブユニットは、電位開口型ナトリウムチャネルのαサブユニットに類似し、各々が６つの膜貫通ドメインを含む４つの反復領域を含む。Ｐ／Ｑ型αサブユニットは、脳、運動ニューロン及び腎臓において発現し、伝達物質の放出のために重要である。Ｎ−型α１サブユニットは、中枢及び末梢神経系において発現し、伝達物質の放出のために重要である。Ｌ−型α１サブユニットは、心臓、肺、平滑筋、線維芽細胞、脳、膵臓及び神経内分泌系において発現し、筋興奮と収縮との連関を媒介する。Ｒ−型サブユニットは、脳及び筋肉において発現し、伝達物質の放出のために重要である。Ｔ−型サブユニットは、脳、心及び平滑筋において発現する。その他のα１サブユニットは、網膜及び骨格筋において発現する。アルファ−１サブユニットは、例えばＣａ２＋流入の動態、Ｃａ２＋電流振幅又は電位依存性を変更することによってチャネルの機能を調節する、補助サブユニットに結合する。
【０００４】
非電位開口型Ｃａ２＋チャネルには、リガンド開口型チャネルが含まれる。これらのチャネルは、筋肉及び他の組織において発現するＣａ２＋ＡＴＰａｓｅである。Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅの突然変異は、ブローディ（Ｂｒｏｄｙ）筋疾患（ＡＴＰ２Ａ１）、ダリエル−ホワイト病及び毛包性角化症（ＡＴＰ２Ａ２）、聴覚障害及び前庭均衡失調（ＡＴＰ２Ｂ２）の原因となる。非電位開口型Ｃａ２＋チャネルのもう１つの重要なクラスは、細胞内クラスであり、この細胞内クラスには、リアノジン受容体、イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）受容体、ニコトゥイーン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）受容体、及びスフィンゴ脂質受容体（ＥＤＧ１）が含まれる。一般に、細胞内Ｃａ２＋チャネルは、ホモ四量体複合体を形成する。これら複合体は、細胞内Ｃａ２＋レベルの上昇、リアノジン、カフェイン、ＩＰ３、ＮＡＡＤＰ、及びスフィンゴシン−１−リン酸のような第２メッセンジャーによって刺激される。これらのチャネルを介した細胞内Ｃａ２＋の放出は、シグナル伝達事象の増幅をもたらす。
【０００５】
イオンチャネル機能の遺伝的又は薬理的摂動は、劇的な臨床結果をもたらし得る。遺伝性ＱＴ延長症候群、てんかん、膵嚢胞性線維症、及び偶発性運動失調は、イオンチャネルサブユニットの突然変異に起因する遺伝性疾患のうちの数例である。ある薬剤によって引き起こされる不整脈及び発作のような毒性副作用は、イオンチャネル機能の妨害によるものである（非特許文献１及び２参照）。薬剤は、イオンチャネル活性の治療的調節に有用であり、高血圧、狭心症、心筋虚血、喘息、膀胱過敏性、脱毛症、疼痛、心不全、月経困難、ＩＩ型糖尿病、不整脈、移植片拒絶、発作、痙攣、てんかん、脳卒中、胃自発運動過剰症、精神病、癌、筋ジストロフィー、及び睡眠発作を含む多くの病理的状態の治療に使用できる（非特許文献３及び４参照）。同定されたイオンチャネルの数を増やし、その複雑さを更に理解することは、イオンチャネル機能を変更する治療における今後の取り組みに寄与するであろう。
【非特許文献１】Ｓｉｒｏｉｓ  ａｎｄ  Ａｔｃｈｉｓｏｎ，Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１７（１）：６３−８４、１９９６
【非特許文献２】Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：６８１−６８５，１９９６
【非特許文献３】Ｃｏｇｈｌａｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４：１６２７−１６５３，２００１
【非特許文献４】Ａｃｋｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｃｌａｐｈａｍ，Ｄ．Ｅ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：１５７５−１５８６，１９９７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本明細書において、新規α１Ｄカルシウムチャネルサブユニットポリペプチド、核酸、並びに、ポリペプチド及び核酸のフラグメントが提供される。同様に、新規サブユニットポリペプチド、核酸、及びこれらのフラグメント、を使用する方法が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一側面において、本発明は、単離Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドであって、このポリペプチドがアミノ酸配列ＫＩＶＡ（配列番号２）を含むことを特徴とする。ＫＩＶＡ配列は、カルシウムチャネルの細胞外ドメイン内にあってもよい。α１Ｄポリペプチドは、ヒト型であってもよい。１つの実施態様において、ポリペプチドは、次のアミノ酸配列：ＴＲＹＹＥＴＹＩＲ（配列番号１０）を含まない。
【０００８】
１つの実施態様において、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
１つの実施態様において、ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列からなる。
【００１０】
もう１つの側面において、本発明は、ポリペプチドが、配列番号６に少なくとも８５％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９９％）の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、ポリペプチドが、次の特徴：
（ａ）配列番号６のアミノ酸１２９１−１３０５の欠失、
（ｂ）配列番号２の挿入、又は、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸１８０４−１８１２の欠失、の１つ以上を含む、単離Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドであることを特徴とする。
【００１１】
１つの実施態様において、ポリペプチドは配列番号２の挿入を含み、この挿入は細胞外ドメイン内にある。この挿入は、カルシウムチャネルサブユニットの反復ドメインの第３及び第４膜貫通セグメントの間にあってもよい。例えば、挿入は、第４反復ドメインの第３及び第４膜貫通セグメントの間にあってもよい。１つの実施態様において、挿入は、配列番号６のアミノ酸１２９０の後に起きる。例えば、挿入は、配列番号６のアミノ酸１２９０にある。
【００１２】
１つの実施態様において、ポリペプチドは、特徴（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のいずれか２つを有する。
【００１３】
１つの実施態様において、ポリペプチドは、特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の３つ全てを有する。
【００１４】
もう１つの側面において、本発明は、配列番号４の少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含む単離ポリペプチドであることを特徴とする。ポリペプチドは、アミノ酸１２８１−１２８４の少なくとも１つ、並びに／又は、アミノ酸１７９２及び１７９３を含み得る。１つの実施態様において、細胞外ドメインの一部分は、置換される部分が、ＫＩＶＡ（配列番号２）配列を含まない、他のカルシウムチャネルα１サブユニット（例えば、他のカルシウムチャネルα１Ｄサブユニット、又はカルシウムチャネルα１Ｓサブユニット、α１Ｃサブユニット若しくはα１Ｆサブユニット）からの細胞外ドメインによって置換される。
【００１５】
様々な実施態様において、本明細書に記載されるカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドは、（例えば蛍光標識、放射活性標識、又は他の検出可能な化合物、又は毒素によって）ラベルされる。
【００１６】
更にもう１つの側面において、本発明は、単離Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子であることを特徴とする。１つの実施態様において、核酸は、ポリペプチドが、アミノ酸配列ＫＩＶＡ（配列番号２）を含む単離Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドをコードする。１つの実施態様において、ＫＩＶＡ配列は、カルシウムチャネルの細胞外ドメイン内にある。
【００１７】
１つの実施態様において、核酸は、ヒトα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドをコードする。１つの実施態様において、核酸は、次のアミノ酸配列：ＴＲＹＹＥＴＹＩＲ（配列番号１０）を含まないポリペプチドをコードする。
【００１８】
１つの実施態様において、核酸は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。
【００１９】
１つの実施態様において、核酸は、配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。
【００２０】
１つの実施態様において、核酸は、ポリペプチドが、配列番号６に少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつポリペプチドが、次の特徴：
（ａ）配列番号６のアミノ酸１２９１−１３０５の欠失、
（ｂ）配列番号２の挿入、又は、
（ｃ）配列番号６のアミノ酸１８０４−１８１２の欠失、の１つ以上を含む、単離Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドをコードする。
【００２１】
１つの実施態様において、核酸は、配列番号２のアミノ酸の挿入をコードし、この挿入は、細胞外ドメイン内にある。この挿入は、カルシウムチャネルサブユニットの反復ドメインの第３及び第４膜貫通セグメントの間にあってもよい。例えば、挿入は、第４反復ドメインの第３及び第４膜貫通セグメントの間にあってもよい。１つの実施態様において、挿入は、配列番号６のアミノ酸１２９０の後に起きる。例えば、挿入は、配列番号６のアミノ酸１２９０にある。
【００２２】
１つの実施態様において、核酸は、特徴（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のいずれか２つを有するポリペプチドをコードする。
【００２３】
１つの実施態様において、核酸は、特徴（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の３つ全てを有するポリペプチドをコードする。
【００２４】
１つの実施態様において、核酸は、配列番号４の少なくとも１０個の隣接アミノ酸を含む単離ポリペプチドをコードする。ポリペプチドは、アミノ酸１２８１−１２８４の少なくとも１つ、並びに／又は、アミノ酸１７９２及び１７９３を含み得る。１つの実施態様において、細胞外ドメインの一部分が他のカルシウムチャネルα１サブユニットからの細胞外ドメインによって置換され、置換される部分はＫＩＶＡ（配列番号２）配列を含まない。
【００２５】
１つの実施態様において、核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
【００２６】
１つの実施態様において、核酸分子は、配列番号３のヌクレオチド配列からなる。
【００２７】
１つの実施態様において、核酸は、配列番号３の核酸配列の対立遺伝子である。
【００２８】
１つの実施態様において、核酸は、Ｌ−型カルシウムα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子のフラグメントであり、このフラグメントは、配列番号２をコードする。
【００２９】
もう１つの側面において、本発明は、プロモーターに操作可能に連結されたＬ−型カルシウムα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子を含む発現ベクターであることを特徴とする。
【００３０】
更にもう１つの側面において、本発明は、Ｌ−型カルシウムα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子を含む宿主細胞であることを特徴とする。
【００３１】
１つの側面において、Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド、例えば本明細書において記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドに優先的に結合する薬剤であることを特徴とする。
【００３２】
１つの実施態様において、薬剤は、Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドに選択的に結合し、かつ、配列番号５の配列を含むＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニットポリペプチドには結合しない。
【００３３】
薬剤は、小分子、核酸、又はタンパク質であってもよい。薬剤は、Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドのカルシウムチャネル活性を調節（例えば抑制又は増強）できる。薬剤は、抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、又は、モノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体のＦａｂフラグメントであってもよい。
【００３４】
本発明は、Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドに優先的に結合する薬剤及び薬理学的に許容し得る担体を含む医薬組成物であることを特徴とする。
【００３５】
カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド又は核酸の存在を、インビトロ（例えば組織のような生体試料）又はインビボ（例えば被験者におけるインビボイメージング）で検出する方法も、本明細書において提供される。この方法は、（ａ）試料を、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド又は核酸に結合する薬剤に接触させること、及び、（ｂ）（例えば本明細書において記載される結合アッセイを使用して）薬剤及び試料の間での複合体形成を検出すること、を含む。この方法は、基準試料（例えば、対照試料）を薬剤に接触させること、及び、基準試料と比較して、薬剤及び試料の間の複合体形成の程度を決定すること、を含んでもよい。
【００３６】
本明細書に記載したカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸及び／又はポリペプチドを使用したスクリーニングアッセイ用キット、及び、例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドをインビトロで発現し、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドのモジュレータを同定するためのカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸の使用といった、使用の説明も、提供される。キットは、例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを検出、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドの活性を観察するための、標識又は追加薬剤といった追加試薬を少なくとも１つ更に含み得る。
【００３７】
１つの側面において、本発明は、カルシウムチャネルを作成する方法であることを特徴とする。この方法は、例えばＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドをコードする核酸を調製することを含み得る。方法は、カルシウムチャネルα２／δサブユニット及び／又はカルシウムチャネルβサブユニットをコードする１つ以上の核酸を調製することを更に含み得る。方法は、核酸を発現するステップを更に含み得る。
【００３８】
１つの側面において、本発明は、細胞内でＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド活性を調節する方法であることを特徴とする。例えば、この方法は、
α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを含むＬ−型カルシウムチャネルを調製すること、
このチャネルを、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドの活性を調節するために有効な量のＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットモジュレータに接触させること、を含み、
前記α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを、請求項１から１６のいずれかに記載のα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドとする。
【００３９】
モジュレータは、小分子、核酸、又はタンパク質であってもよい。
【００４０】
もう１つの側面において、本発明は、細胞内でＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドの活性を調節する薬剤を同定する方法であることを特徴とする。例えば、この方法は、
α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド、例えば本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを含む第１カルシウムチャネルを提供すること、
このチャネルを試験化合物に接触させること、及び、
カルシウムチャネルの活性を評価すること、を含み、
基準値に対する活性の変化を、化合物がチャネルを調節する薬剤であることを示すものとする。
【００４１】
試験化合物は、小分子、ペプチド、又は核酸であってもよい。
【００４２】
カルシウムチャネルは、生体試料内に含まれ得る。試料は、細胞膜を含み得る。１つの実施態様において、試料は、細胞を含む。細胞は、真核細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｏｏｃｙｔｅ）又は哺乳動物細胞であってもよい。
【００４３】
方法において評価される活性は、カルシウム濃度の調節を含み得る。評価は、カルシウムフラックスを検出することを含み得る。
【００４４】
α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを含むカルシウムチャネルの接触は、試験化合物がない場合に第１の量のカルシウムフラックスが引き起こされる条件下で、行う。
【００４５】
１つの実施態様において、評価は、カルシウムフラックスアッセイを使用することを含み得る。
【００４６】
１つの実施態様において、アッセイは、パッチクランプ電気生理を使用する。
【００４７】
１つの実施態様において、アッセイは、二電極電位クランプ電気生理を使用する。
【００４８】
１つの実施態様において、アッセイは、蛍光アッセイである。
【００４９】
Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドの活性を調節する薬剤を同定する方法は、
例えば本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド以外のα１Ｄサブユニットポリペプチドを含む第２カルシウムチャネルを調製するステップ、
前記第２チャネルを前記試験化合物に接触させるステップ、
前記第２カルシウムチャネルの活性を評価するステップ、を更に含み得る。
【００５０】
この方法は、試験化合物の存在下での第１カルシウムチャネルの活性を、試験化合物の存在下での第２カルシウムチャネルの活性と比較することを更に含み得る。
【００５１】
任意で、方法は、レコードを調製すること又は方法の結果のデータセットを生成すること、例えば印刷を調製すること又はコンピュータ読み取り可能なデータセットを生成すること、を更に含み得る。
【００５２】
方法の幾つかの実施態様において、複数のカルシウムチャネルを調製する。
【００５３】
方法の幾つかの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。
【００５４】
もう１つの側面において、本発明は、Ｌ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドに選択的に結合する薬剤を同定する方法であることを特徴とする。例えば、この方法は、
第１α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド、例えば本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを調製すること、
第１ポリペプチドを試験化合物に接触させること、
試験化合物の第１ポリペプチドへの結合を検定すること、
第２α１Ｄサブユニットポリペプチドを調製すること、
第２ポリペプチドを前記試験化合物に接触させること、
試験化合物の第２ポリペプチドへの結合を検定すること、を含み、
第１ポリペプチドに結合し且つ前記第２ポリペプチドに実質的に結合しない化合物を、この化合物がＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドアイソフォームに選択的に結合する薬剤であることを示すものとする。
【００５５】
もう１つの側面において、本発明は、カルシウム電流に関する障害の治療に有用な薬剤を同定する方法であることを特徴とする。例えば、この方法は、
α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド、例えば本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドを含むカルシウムチャネルを調製すること、
前記チャネルを試験化合物に接触させること、及び、
前記チャネルの活性を評価すること、を含み、
基準値に関する活性の変化を、前記試験化合物がカルシウム電流に関する障害に有用な薬剤であることを示すものとする。
【００５６】
障害は、心臓病、又は内分泌障害、又はニューロン障害であり得る。
【００５７】
方法は、化合物を（例えば動物モデルを使用して）インビボで投与することを更に含み得る。
【００５８】
方法は、インビボで使用する化合物を修飾することを更に含み得る。
【００５９】
もう１つの側面において、本発明は、カルシウムチャネル電流に関する障害を有する被験者を治療する方法であることを特徴とする。例えば、この方法は、
治療を必要とする被験者に、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを含むカルシウムチャネルに選択的な薬理学的薬剤を投与することを含む。
【００６０】
１つの実施態様において、障害は、心臓病である。
【００６１】
被験者を治療する方法は、このような治療を必要とする被験者を識別するステップを更に含み得る。このような治療を必要とする被験者を識別することは、被験者又は医療従事者の判断であってよく、主観的（例えば見解）又は客観的（例えば試験又は診断方法によって測定可能）であってよい。
【００６２】
本発明の１つ以上の実施態様の詳細を、表及び以下の記載に示す。本発明の他の特徴、目的及び利点は、以下の記載及び請求項より明らかになるであろう。
（配列の簡単な説明）
【００６３】
次の配列は、表１に提供される。
【００６４】
配列番号１は、ヒトＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット「ＫＩＶＡ」部位のヌクレオチド配列である。
【００６５】
配列番号２は、ヒトＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット「ＫＩＶＡ」部位のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号３は、ヒトＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットｃＤＮＡのヌクレオチド配列である。
【００６７】
配列番号４は、ヒトＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号５は、ヒトＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニットのコード領域のヌクレオチド配列である（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｍ７６５５８）。
【００６９】
配列番号６は、ヒトＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニットポリペプチドのアミノ酸配列である（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｑ０１６６８）。
【００７０】
配列番号７は、配列番号３によってコードされる新規アイソフォームの「ＫＩＶＡ」部位をコードするヌクレオチド配列によって置換された配列番号５（配列番号５の塩基対３８７１−３９１５）のヌクレオチド配列である。
【００７１】
配列番号８は、配列番号４の新規アイソフォーム内の「ＫＩＶＡ」挿入によって置換された配列番号６（配列番号６のアミノ酸１２９１−１３０５）のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号９は、配列番号３のヌクレオチド配列がない配列番号５（配列番号５の塩基対５４０９−５４３５）のヌクレオチド配列である。
【００７３】
配列番号１０は、配列番号４のヌクレオチド配列がない配列番号６（配列番号６のアミノ酸１８０４−１８１２）のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
本発明は、ひとつにはＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニットの新規アイソフォームをコードするｃＤＮＡの同定に基づく。新規ｃＤＮＡは、ヒト心房組織から単離された。ｃＤＮＡのコード配列は、配列番号３に示される。新規アイソフォームの予測されるアミノ酸配列は、配列番号４に示される。関連するヒトＬ−型カルシウムチャネルα１Ｄサブユニットヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）に受入番号Ｍ７６５５８で寄託された（配列番号５）。新規アイソフォームは、幾つかの点でＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおける関連配列と異なる。第１に、新規アイソフォームのヌクレオチド配列は、Ｍ７６５５８の塩基対４３８１−４４２５の欠失を含む（これは、Ｍ７６５５８における配列のコード領域である、配列番号５の塩基対３８７１−３９１５の欠失に等しい）。第２に、新規アイソフォームは、配列番号１に示す新規ヌクレオチド配列による塩基対４３８１−４４２５の置換を含む。これらの変化は、次の相違点と共に、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｑ０１６６８のα１Ｄサブユニットポリペプチドに関連するポリペプチド配列をもたらす。第１に、新規アイソフォームは、９個のアミノ酸（残基１２９１−１３０５）の欠失を含む。第２に、ヌクレオチド４３８１−４４２５での塩基対の置換は、配列ＫＩＶＡ（配列番号２）との１５個のアミノ酸の置換をもたらす。ヌクレオチド４３８１−４４２５の置換部位は、遺伝子の第４反復領域の第３及び第４膜貫通セグメント（Ｓ３及びＳ４）の接合部にある（以下のα１サブユニットドメイン構造の考察参照）。興味深いことに、この接合部は、ラットから単離された心房α１Ｄアイソフォーム内の挿入部位である（Ｔａｋｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２９：３０３５−３０４２、１９９７）。同様に、新規ヒト心房α１Ｄアイソフォームは、複数の独立した機会に単離されてきた。これらの結果は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット及び他のα１Ｄポリペプチドの変異部位が保存されていることを示唆する。
【００７５】
本明細書で使用されるように、用語「カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット」又は「α１Ｄ＋ＫＩＶＡ」は、以上に記載した新規アイソフォームの１つ以上の特徴を有するカルシウムチャネルα１Ｄサブユニット核酸又はポリペプチドを示す。カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドに関して、これらの特徴は、（ｉ）「ＫＩＶＡ」アミノ酸配列の挿入、（ｉｉ）ヒトカルシウムチャネルα１Ｄサブユニットのアミノ酸残基１２９１−１３０５、又は関連するカルシウムチャネルサブユニットにおける対応する領域又は配列での約１５個のアミノ酸の欠失、（ｉｉｉ）ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｑ０１６６８（同じく配列番号６）における配列の残基１８０３−１８１１、又は関連するカルシウムチャネルサブユニットにおける対応する領域又は配列でのヒトカルシウムチャネルα１Ｄサブユニットの約９個のアミノ酸の欠失を含む。欠失は、（ｉｉに関して）配列番号８及び（ｉｉｉに関して）配列番号１０に相同なアミノ酸配列の欠失を含む。α１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸に関して、これらの特徴は、（ｉｖ）「ＫＩＶＡ」配列をコードする１２個のヌクレオチドの挿入、（ｖ）ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｍ７６５５８のヒトカルシウムチャネルα１Ｄサブユニットの残基４３８１−４４２５（若しくは配列番号５の残基３８７１−３９１５）、又は関連する対応領域又は配列（例えば非ヒトカルシウムチャネルα１Ｄサブユニット）に、対応する約４５の塩基対の欠失、及び（ｖｉ）ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｍ７６５５８のヒトカルシウムチャネルα１Ｄサブユニットの残基５４１９−５９４５（若しくは配列番号５の残基５４０９−５４３５）、又は関連する対応領域（例えば非ヒトカルシウムチャネルα１Ｄサブユニット）に、対応する約２７の塩基対の欠失を含む。核酸の欠失は、（ｉｖに関して）配列番号１、（ｖに関して）配列番号７、及び（ｖｉに関して）配列番号９の配列に相同なヌクレオチド配列の欠失を含む。
【００７６】
Ｌ−型電位開口型カルシウムチャネル
電位開口型カルシウムチャネルは、約１３０−２００キロダルトン（ｋＤ）の大きいα１サブユニット、小さいδサブユニットに共有結合するα２サブユニット、及び約６０ｋＤ以下のβサブユニットを有する、多サブユニット膜貫通タンパク質である。これらのチャネルは、細胞内へのカルシウムイオン流入を媒介する。α１サブユニットは、チャネルの電位感受性、孔形成部分を形成し、他のサブユニットは、α１サブユニットの活性を調節する。本明細書に記載されるカルシウムチャネルを含む電位開口型イオンチャネルは、膜分極の変化に対応して、静止状態（分極、閉鎖チャネル、活性化可能）、開口状態（脱分極、開口チャネル、活性化）、及び閉鎖状態（脱分極、閉鎖チャネル、不活性化）のサイクルを経る。イオン伝導α１サブユニットの荷電領域は、膜分極の変化を感知する。βサブユニットは、カルシウムチャネルのα１サブユニットの電流、電位依存性、活性化及び不活性化を調節する。
【００７７】
Ｌ−型カルシウムチャネルは、α１Ｓ、α１Ｃ、α１Ｄ、又はα１Ｆサブユニットを含む高電位活性化カルシウムチャネルであり、それぞれＣａＶ１．１、ＣａＶ１．２、ＣａＶ１．３、及びＣａＶ１．４とも称される。Ｌ−型カルシウムチャネルは、一般にジヒドロピリジンによって拮抗される。Ｌ−型チャネルは、骨格筋、心筋、内分泌細胞、ニューロン、及び網膜を含む多くの組織において発現し、興奮−収縮連関、カルシウム恒常性、遺伝子調節、ホルモン分泌、及び緊張性神経伝達物質放出を含む種々の生物学的作用を媒介する（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：５２１−５５、２０００）。
【００７８】
カルシウムチャネルのα１サブユニットは、４つの反復ドメイン（Ｉ−ＩＶ）を含む。これらの反復ドメインの各々は、６つの膜貫通セグメント（Ｓ１−Ｓ６）を含む（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６：５２１−５５、２０００）。
【００７９】
本明細書で使用されるように、「カルシウムチャネル」は、心臓細胞等の筋細胞のような細胞内でシグナルを受け取ること、伝導すること、及び伝達することに関与するタンパク質を指す。カルシウムチャネルは、一般に、多くの細胞型、例えばニューロン、筋肉及び内分泌細胞において発現する。
【００８０】
本明細書で使用されるように、「カルシウムチャネル媒介活性」は、カルシウムチャネル、例えば脳細胞又は筋細胞内のカルシウムチャネル、に関連する活性、機能又は応答を示す。カルシウムチャネル媒介活性は、例えば神経系、筋組織、心臓組織、その他の細胞及び組織内で、シグナルを受け取ること、伝導すること、及び伝達することに関連する活性である。カルシウムチャネル媒介活性には、例えば細胞内へのカルシウム流入、興奮−収縮連関、ホルモン分泌調節、及び細胞からの神経伝達物質放出の調節が含まれる。同様に、本明細書で同義的に使用されるように、「カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット活性」、「カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの生物活性」又は「カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの機能活性」は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質、ポリペプチド又は核酸分子の、活性、機能又は応答を指す。
【００８１】
本発明の単離タンパク質、例えば本明細書に記載されたカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質は、配列番号４のアミノ酸に充分に相同なアミノ酸配列を有するか、配列番号３に充分に相同なヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書で使用されるように、用語「充分に相同」とは、第１アミノ酸又はヌクレオチド配列が、充分な又は最小数の、第２アミノ酸又はヌクレオチド配列と同一又は等価のアミノ酸残基（例えば、類似側鎖を有するアミノ酸残基）又はヌクレオチドを含み、これにより、第１及び第２アミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメイン若しくはモチーフ、又は共通の機能活性を共有することを指す。
【００８２】
従って、本発明の他の実施態様は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット活性を有する、単離カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質及びポリペプチドであることを特徴とする。好ましいタンパク質は、好ましくは細胞外ドメイン内でＫＩＶＡ配列（配列番号２）を有し且つＴＲＹＹＥＴＹＩＲ配列（配列番号１０）を欠くカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質である。その他の好ましいタンパク質は、配列番号４の配列を有するタンパク質である。
【００８３】
長さが約６４２６個のヌクレオチドである（配列番号３の）新規ヒトカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットコード配列は、約２００ｋＤの分子量を有し、長さが約２１４１個のアミノ酸残基であるタンパク質をコードする。この新規アイソフォームをコードする遺伝子は、心房において発現する。
【００８４】
本発明の種々の側面が、以下において更に詳細に記載される。
【００８５】
単離核酸分子
本発明の一側面は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチド又はその生物活性を有する部分をコードする単離核酸分子、並びに、本明細書に記載された新規カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの関連アイソフォームをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に充分な核酸フラグメント、及びカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子の増幅又は突然変異用のＰＣＲプライマーとして使用するためのフラグメントに関する。本明細書で使用されるように、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、並びにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログを含むことが意図される。核酸分子は、一本鎖又は二重鎖であってもよいが、好ましくは二重鎖ＤＮＡである。
【００８６】
「単離」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から単離されたものである。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が由来する生体のゲノムＤＮＡにおいて自然に核酸に隣接する配列（すなわち、核酸の５’又は３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施態様において、単離カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて自然に核酸分子に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含んでもよい。更に、ｃＤＮＡ分子のような「単離」核酸分子は、組換え技術によって生成されたとき、他の細胞物質又は培地を実質的に含まなくてよく、又は、化学合成されたとき、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まなくてよい。
【００８７】
本発明の核酸分子、例えば配列番号１、配列番号３のヌクレオチド配列又はその一部を有する核酸分子は、標準分子生物学技術及び本明細書において提供される配列情報を使用して、単離され得る。ハイブリダイゼーションプローブとして配列番号１又は配列番号３の核酸配列の全部又は一部を使用すると、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸分子は、標準ハイブリダイゼーション及びクローニング技術（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照）を使用して単離され得る。
【００８８】
更に、配列番号３の全部又は一部を包含する核酸分子は、配列番号１又は配列番号３の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって単離され得る。
【００８９】
本発明の核酸は、標準ＰＣＲ増幅技術に従って、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡを使用し、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することで、増幅され得る。このように増幅された核酸は、適切なベクターにクローニングでき、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けられる。更に、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準合成技術によって、例えば自動ＤＮＡシンセサイザーを使用して調製できる。
【００９０】
もう１つの実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号１、配列番号３に示すヌクレオチド配列の相補体又はこれらヌクレオチド配列の一部である、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸分子を含む。配列番号１又は配列番号３に示すヌクレオチド配列に相補的である核酸分子は、配列番号１又は配列番号３に示すヌクレオチド配列にハイブリダイズできるように、配列番号１又は配列番号３に示すヌクレオチド配列に充分に相補的である。
【００９１】
更にもう１つの好ましい実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号３に示すヌクレオチド配列の全長、又はこのヌクレオチド配列の一部に少なくとも約７５％、８５％、９５％又はそれ以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００９２】
更に、本発明の核酸分子は、配列番号３の核酸配列の一部のみ、例えばプローブ又はプライマーとして使用され得るフラグメント、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質の生物活性部分をコードするフラグメントを含んでよい。ヒトα１Ｄ＋ＫＩＶＡｃＤＮＡのクローニングから決定されるヌクレオチド配列によって、関連するアイソフォーム及び他種由来の相同体の同定及び／又はクローニングに使用するために設計される、プローブ及びプライマーを生成できる。プローブ／プライマーは、一般に、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３のセンス配列、配列番号１、配列番号３のアンチセンス配列、又は、配列番号１、配列番号３の自然発生する対立遺伝子変異体又は突然変異体の、少なくとも約１２又は１５、好ましくは約２０又は２５、より好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５又は７５個の連続ヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を一般に含む。
【００９３】
α１Ｄ＋ＫＩＶＡヌクレオチド配列に基づくプローブは、関連するアイソフォームをコードする転写物を検出するために使用できる。プローブは、そこに取り付けられた標識基を更に含んでよい。標識基は、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、酵素又は酵素補因子であってよい。このようなプローブは、例えば、被験者の細胞試料においてα１Ｄ＋ＫＩＶＡをコードする核酸のレベルを測定することによって、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質を発現又は誤発現する細胞又は組織を同定する診断試験キットの一部として使用できる。核酸のレベルの測定としては、例えば、α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡレベルを検出すること、又は、ゲノムα１Ｄサブユニット遺伝子が、α１Ｄ＋ＫＩＶＡアイソフォームの発現に影響を及ぼす領域内に突然変異又は欠失を有するか否かを決定することが挙げられる。
【００９４】
「α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の生物活性部分」をコードする核酸フラグメントは、配列番号３のヌクレオチド配列の一部を単離すること、（例えばインビトロ組換え発現によって）α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のコード部分を発現すること、及び、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のコード部分の活性を評価すること、によって調製できる。ここで、配列番号３のヌクレオチド配列の一部は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ生物活性（α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の生物活性は、本明細書に記載される）を有するポリペプチドをコードする部分である。
【００９５】
本発明は、遺伝子コードの縮重のために配列番号３に示すヌクレオチド配列と異なり、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされるものと同じα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードする核酸分子を、更に包含する。もう１つの実施態様において、本発明の単離核酸分子は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００９６】
配列番号１、及び配列番号３に示したα１Ｄ＋ＫＩＶＡヌクレオチド配列に加えて、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のアミノ酸配列の変化を導くＤＮＡ配列多型が、個体群（例えばヒト個体群）内に存在し得ることは、当業者によって認識されるであろう。α１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子内のこのような遺伝子多型は、対立遺伝子自然変異のために、個体群内の個体間に存在し得る。本明細書で使用されるように、用語「遺伝子」及び「組換え遺伝子」は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質、好ましくは哺乳動物α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。このような対立遺伝子自然変異は、一般に、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子のヌクレオチド配列内に１−５％の差異をもたらし得る。対立遺伝子自然変異の結果であり、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の機能活性を変えないα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子内の任意の及びこれら全てのヌクレオチド変異、並びに結果として生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあることが意図される。
【００９７】
更に、他のα１Ｄ＋ＫＩＶＡカルシウムチャネルファミリーのメンバーをコードし、配列番号１及び配列番号３のα１Ｄ＋ＫＩＶＡ配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。例えば、他のα１Ｄ＋ＫＩＶＡｃＤＮＡは、ヒトα１Ｄ＋ＫＩＶＡのヌクレオチド配列に基づいて同定できる。更に、様々な種のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードし、配列番号１及び配列番号３のα１Ｄ＋ＫＩＶＡ配列と異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。例えばマウスα１Ｄ＋ＫＩＶＡｃＤＮＡは、ヒトα１Ｄ＋ＫＩＶＡのヌクレオチド配列に基づいて同定できる。
【００９８】
本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡｃＤＮＡの対立遺伝子自然変異体及び相同体に対応する核酸分子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で開示されるｃＤＮＡ又はその一部を、標準ハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとして使用することで、本明細書で開示されるα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸への相同性に基づいて単離できる。
【００９９】
従って、もう１つの実施態様において、本発明の単離核酸分子は、長さが少なくとも１５、２０、２５、３０個又はそれ以上のヌクレオチドであり、配列番号３のヌクレオチド配列を含む核酸分子にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。好ましくは、分子は、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。他の実施態様において、核酸は、長さが少なくとも３０、３００、５００、７００、８５０、９５０、又は２０００個のヌクレオチドである。本明細書で使用されるように、用語「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」は、互いに少なくとも６０％、８５％、又は９５％の相同性を有するヌクレオチド配列が一般に互いにハイブリダイズされたままであるようなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件を示すことが意図される。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６，１９９１に見出すことができる。適度なハイブリダイゼーション条件は、３０℃で２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションし、次に５０℃で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄すること、に均等な条件と定義される。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイゼーションし、次に６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で洗浄すること、に均等な条件と定義される。
【０１００】
適度な条件又は高度にストリンジェントな条件下で配列番号３の配列にハイブリダイズする本発明の単離核酸分子は、自然発生する核酸分子に対応できる。本明細書で使用されるように、「自然発生」する核酸分子は、自然に発生する（例えば天然タンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を指す。
【０１０１】
個体群中に存在し得るα１Ｄ＋ＫＩＶＡ配列の自然発生した対立遺伝子変異体に加え、当業者は、配列番号１又は配列番号３のヌクレオチド配列を変異することによって、変化を導入でき、これによって、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の機能能力を変えることなく、コードされるα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のアミノ酸配列を変化できることを更に認識するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換を導くヌクレオチド置換は、配列番号１又は配列番号３の配列内でなされ得る。「必須」アミノ酸残基が生物活性に必要とされる一方、「非必須」アミノ酸残基は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡの野生型配列（例えば配列番号４の配列）から生物活性を変えることなく変更できる残基である。例えば、本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の間で保存されているアミノ酸残基は、特に変化を受けにくいことが予測される。更に、本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質と他のα１Ｄカルシウムチャネルサブユニットとの間で保存されている追加アミノ酸残基は、変化を受けやすいことが予測されない。
【０１０２】
従って、本発明のもう１つの側面は、活性に必須でないアミノ酸残基の変化を含むα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードする核酸分子に関する。このようなα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、依然として、生物活性を保持する配列番号４とアミノ酸配列において異なる。生物活性は、本明細書で記載されるアッセイ、例えばカルシウムチャネル活性アッセイ、例えばＣａ２＋流入アッセイによって測定できる。１つの実施態様において、単離核酸分子は、配列番号４に少なくとも約６５％、７５％、８５％、９５％又はそれ以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０３】
配列番号４のタンパク質に相同であるα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードする単離核酸分子は、コードされるタンパク質に１つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失が導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加又は欠失を配列番号３のヌクレオチド配列に導入することによって、生成できる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような標準技術によって、配列番号３に導入できる。保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行うことができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義される。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。従って、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質内の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基によって置換される。配列番号３の突然変異誘発に続いて、コードされるタンパク質を組み換えて発現でき、タンパク質の活性を測定できる。
【０１０４】
突然変異α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、（１）非α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質分子、例えばカルシウムチャネルβ、γ、又はα２／βサブユニット、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣと相互作用する能力、（２）α１Ｄ＋ＫＩＶＡ依存性シグナル変換経路を活性化する能力、（３）神経伝達物質の放出を調節する能力、（４）膜興奮性を調節する能力、（５）興奮−収縮連関を調節する能力、に関して検定できる。
【０１０５】
上述したα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードする核酸分子に加えて、本発明のもう１つの側面は、この核酸分子にアンチセンスである単離核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸には、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的、例えば二重鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、又はＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は、全α１Ｄ＋ＫＩＶＡコード鎖、又はその一部のみに相補的であってよい。１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」にアンチセンスである。用語「コード領域」は、アミノ酸残基に翻訳されるコドン（例えば配列番号３に対応するヒトカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットのコード領域）を含むヌクレオチド配列領域を指す。もう１つの実施態様において、アンチセンス核酸分子は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」にアンチセンスである。用語「非コード領域」は、アミノ酸に翻訳されないコード領域に隣接する５’及び３’配列を示す（すなわち、５’及び３’非翻訳領域とも称される）。
【０１０６】
本明細書で開示されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡをコードするコード鎖配列（例えば配列番号１、及び配列番号３）を与えられれば、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソンクリック塩基対合則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡの全コード領域に相補的であってよいが、より好ましくはα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡのコード領域又は非コード領域の一部にのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り囲む領域に相補的であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＫＩＶＡ配列をコードする領域に相補的、例えば配列番号１に相補的であってよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば長さが約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個のヌクレオチドであってよい。本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において公知である手順を用いて、化学合成及び酵素連結反応を使用して構成できる。アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、例えば、自然発生ヌクレオチド、又は分子の生物的安定度を増加、若しくはアンチセンス及びセンス核酸の間に形成された二重鎖の物理的安定度を増加させるように設計され、様々に修飾されたヌクレオチドを使用して化学的に合成できる。例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドが使用できる。アンチセンス核酸を生成するために使用できる修飾ヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサントゥイーン、キサントゥイーン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、１，５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルキュエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。代替的に、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされた発現ベクターを使用して、生物学的に生成できる（すなわち、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、以下で更に記載される目的の標的核酸にアンチセンス方向であるＲＮＡである）。
【０１０７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、一般に、被験者に投与されるか、インサイチュ生成され、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズ又は結合し、これにより、例えば転写及び／又は翻訳を抑制することによってタンパク質の発現を抑制する。ハイブリダイゼーションは、安定した二重鎖を形成するための従来のヌクレオチド相補性によったものでよく、例えばＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合に、二重らせんの主溝内の特異な相互作用を介してもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位での直接注入が含まれる。代替的に、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするために修飾された後、全身投与され得る。例えば全身投与に関して、アンチセンス分子は、例えばアンチセンス核酸分子を細胞表面受容体又は抗原に結合された抗体又はペプチドに連結することによって、選択された細胞表面に発現した受容体又は抗原に特異的に結合するように修飾してよい。アンチセンス核酸分子は、同様に、本明細書に記載されたベクターを使用して細胞に送出できる。アンチセンス核酸分子は、アンチセンス分子の充分な細胞内濃度を実現するために、強いｐｏｌ  ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの制御下に置かれるベクターコンストラクトが、好ましい。
【０１０８】
更にもう１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、通常のβユニットに反して、鎖が互いに平行に延びる相補的ＲＮＡと特異二重鎖ハイブリッドを形成する（Ｇａｕｌｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１、１９８７）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０、１９８７）を含んでもよい。
【０１０９】
更にもう１つの実施態様において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。リボザイムは、相補領域を有する、ｍＲＮＡのような一本鎖核酸を開裂できるリボヌクレアーゼ活性を備える触媒ＲＮＡ分子である。従って、リボザイム（例えば（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５８５−５９１、１９８８に記載される）ハンマーヘッド型リボザイム）は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ転写物を触媒的に開裂し、これによりα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡの翻訳を抑制するために使用できる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡコード核酸の特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示されるα１Ｄ＋ＫＩＶＡｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち配列番号１、又は配列番号３）に基づいて設計できる。例えば、テトラヒメナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡをコードするｍＲＮＡにおいて開裂されるヌクレオチド配列に活性部位のヌクレオチド配列が相補的となるように、構築される（例えば、Ｃｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４９８７０７１号明細書、及びＣｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５１１６７４２号明細書参照）。代替的に、α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡは、ＲＮＡ分子プールから特異リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために使用できる（例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８、１９９３参照）。
【０１１０】
本発明のもう１つの実施態様において、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の発現を抑制するために使用できる。種々の抑制ＲＮＡｉ分子が同定でき、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの発現を抑制する抑制ＲＮＡｉ分子は、本明細書で記載される治療方法において投与される医薬組成物として配合できる。
【０１１１】
ＲＮＡｉは、特定のｍＲＮＡが宿主細胞中で分解されるメカニズムを示すために使用される用語である。ｍＲＮＡを抑制するために、サイレンシングする遺伝子（例えば、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドをコードする遺伝子）の一部に対応する二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞内に導入される。ｄｓＲＮＡは、短鎖干渉性ＲＮＡ（つまり、ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる２１−２５個のヌクレオチド長の二重鎖にダイジェストされ、この二重鎖は、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（つまり、ＲＩＳＣ）として知られているものを形成するために、ヌクレアーゼ複合体に結合する。ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ鎖の１つと内在性ｍＲＮＡとの間での塩基対合相互作用によって、相同転写物を標的とする。ＲＩＳＣは、次に、ｓｉＲＮＡの３’末端から約１２個のヌクレオチドのｍＲＮＡを開裂する（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１５：４８５−４９０，２００１、及び、Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎ．２：１１０−１１９，２００１参照）。ＲＮＡｉは、ヒト胚腎臓及びＨｅＬａ細胞を含むヒト細胞で成功した（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４−４９８，２００１参照）。ジーンサイレンシングは、ＲＮＡヘアピンの内在的発現を強制することによって（Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１４４３−１４４８，２００２参照）、又は、（Ｃａｐｌｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：４９−５１，２００２において検討された）小型（２１−２３ｎｔ）ｄｓＲＮＡのトランスフェクションによって、哺乳動物細胞内で誘発できる。
【０１１２】
ＲＮＡｉ技術は、標準分子生物学的手法を利用する。（本明細書では、例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットポリペプチドをコードする配列に対応するであろう）ｄｓＲＮＡは、標準方法によって生成できる（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによってα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット配列に対応する鋳型ＤＮＡの両鎖を同時に転写することによる。ＲＮＡも、化学合成又は組換え生産できる）。ｄｓＲＮＡを生成するキットは、（例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ．Ｉｎｃ．から）市販されている。ＲＮＡｉを媒介するために使用されるＲＮＡは、ホスホロチオエートヌクレオチドのような合成又は修飾されたヌクレオチドを含んでよい。ｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡを作るように設計されたプラスミドによって細胞をトランスフェクトする方法も、当該技術分野において慣例となっている手法である。
【０１１３】
ＲＮＡｉにより観察されるものと類似する遺伝子サイレンシング効果は、ｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドコンストラクトによってトランスフェクトされた哺乳動物細胞において報告された（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２８１：６３９−６４４，２００１）。従って、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット配列を含むｍＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッド、並びに、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット配列を含む二重鎖（例えば２１−２３ｂｐモノマーを含む二重鎖）は、本発明の範囲内である。ハイブリッド及び二重鎖は、本明細書に記載されるアッセイに従って活性を検査でき（すなわち、これらは検査薬として役立ち得る）、抑制活性を示すハイブリッド及び二重鎖は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット活性に関連した疾患又は状態、例えば心臓病を有する又は発症し得る被験者を治療するために使用できる。
【０１１４】
本発明のｄｓＲＮＡ分子（α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット遺伝子の部分に対応する二重鎖ＲＮＡ分子）は、多くの点で異なってよい。例えば、これらは、３’ヒドロキシル基を含んでもよく、上記のように２１、２２又は２３個の連続するヌクレオチド鎖を含んでもよい。更に、これらは、平滑末端を有してもよく、３’末端、５’末端、又は両末端に突出末端を含んでもよい。例えば、ＲＮＡ分子の少なくとも１つの鎖は、長さが約１から約６個のヌクレオチド（（ピリミジン又はプリンヌクレオチドのいずれか）例えば１−５、１−３、２−４又は３−５ヌクレオチド長）の３’突出を有してよい。両鎖が突出を含む場合、突出の長さは、同一でも、各鎖に関して異なっていてもよい。ＲＮＡ二重鎖の安定度を更に向上するために、３’突出は（例えばアデノシン又はグアノシンヌクレオチドのようなプリンヌクレオチドを含むことによって、又は、修飾されたアナログでピリミジンヌクレオチドを置換（例えば、２’−デオキシチミジンによるウリジン２ヌクレオチド３’突出の置換は、許容され、ＲＮＡｉの効率に影響を及ぼさない）することによって）、分解に対して安定化してよい。二重鎖又はハイブリッドのインヒビターを作り出す、又は単にアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの役割を果たす、一本鎖α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットＲＮＡ分子も本発明の範囲内である。目的とするＲＮＡｉを媒介する標的遺伝子、例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット遺伝子への充分な相同性を有するならば、任意のｄｓＲＮＡが本発明の方法において使用できる。２１−２３個のヌクレオチドを有する二重鎖が上述されているが、本発明はそのようには限定されず、使用できるｄｓＲＮＡの長さに上限はない（例えばｄｓＲＮＡは、遺伝子約２１塩基対から遺伝子全長又はそれ以上（例えば５０−１００、１００−２５０、２５０−５００、５００−１０００、又は１０００を超える塩基対）に及んでよい）。
【０１１５】
これらの核酸は、ヒトに投与されるとき、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットｍＲＮＡレベルを減少でき、これによりα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの発現を抑制する。細胞又は生体は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットｍＲＮＡが分解される条件で維持され、これにより細胞又は生体内でＲＮＡｉが媒介される。代替的に、細胞は、個体から得られ、エキソビボで処理され、個体に再導入できる。
【０１１６】
更にもう１つの実施態様において、本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸分子は、塩基部分、糖部分、リン酸バックボーンが修飾されることにより、例えば分子の安定度、ハイブリダイゼーション、又は溶解度を改善できる。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸バックボーンは、ペプチド核酸を生成するように修飾できる（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３，１９９６参照）。本明細書で使用されるように、用語「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」は、ＤＮＡミミック等の核酸ミミックを指し、ＤＮＡミミックにおいては、デオキシリボースリン酸バックボーンが、偽性ペプチドバックボーンによって置換され、４個の天然核酸塩基のみが保持されている。ＰＮＡの中性バックボーンによれば、低いイオン強度の条件下での、ＤＮＡ及びＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを行うことができることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．前掲、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５，１９９６に記載されたような標準固相ペプチド合成手順を使用して実行できる。
【０１１７】
α１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸分子のＰＮＡは、治療及び診断用途で使用できる。例えば、ＰＮＡは、例えば転写停止又は翻訳停止の誘導又は複製の抑制による、遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス又は抗原薬剤として使用できる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸分子のＰＮＡは、他の酵素と組み合わせて使用されるときは「人工制限酵素」（例えばＳ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．，前掲））として、又は、ＤＮＡ配列決定若しくはハイブリダイゼーションのプローブ又はプライマー（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．ｅｔ  ａｌ．前掲、Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、前掲）として、遺伝子内で一塩基対突然変異分析（例えばＰＮＡ特異的ＰＣＲクランプ）にも使用できる。
【０１１８】
もう１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡのＰＮＡは、ＰＮＡに親油基又は他のヘルパー基を取り付けること、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成すること、又はリポソームの使用若しくは当該技術分野において公知な他の薬物送達技術、によって（例えばその安定度又は細胞摂取量を向上するために）修飾できる。
【０１１９】
他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、（例えば宿主細胞レセプターをインビボで標的とするために）ペプチドのような他の付加された基、又は細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．８６：６５５３−６５５６，１９８９、Ｌｅｍａｉｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２，１９８７、  国際公開第ＷＯ８８／０９８１０号パンフレット参照）若しくは血液脳関門（例えば国際公開第ＷＯ８９／１０１３４号パンフレット参照）を横断する輸送を容易にする薬剤、を含んでよい。更に、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発開裂剤（例えばＫｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６，１９８８参照）又は挿入剤（例えばＺｏｎ  Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９，１９８８参照）によって、修飾できる。このために、オリゴヌクレオチドは、他の分子（例えばペプチド、ハイブリダイゼーション誘発架橋剤、輸送剤、又はハイブリダイゼーション誘発開裂剤）に結合させてよい。
【０１２０】
単離α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質及び抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体
本発明の１つの側面は、単離カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質、及びその生物活性部分、並びに抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体を産生する免疫原としての使用に適したポリペプチドフラグメントに関する。１つの実施態様において、標準タンパク質精製技術を使用する適切な精製系によって、未変性α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質が細胞又は組織源から単離できる。もう１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生成される。組換え発現の代わりに、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質又はポリペプチドは、標準ペプチド合成技術を使用して化学合成できる。
【０１２１】
「単離」又は「精製」タンパク質又はその生物活性部分は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質が由来する細胞若しくは組織源からの細胞物質その他の混入タンパク質を実質的に含まず、あるいは、化学合成される場合には、化学前駆体その他の化学物質を実質的に含まない。術語「細胞物質を実質的に含まない」には、タンパク質が単離又は組換えにより生成された細胞の細胞成分から分離された、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質製剤が含まれる。１つの実施態様において、術語「細胞物質を実質的に含まない」には、（乾燥重量で）約３０％未満の非α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質（本明細書では「混入タンパク質」とも呼ばれる）、より好ましくは約２０％、１０％、又は５％未満の非α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質を有するα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質製剤が含まれる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質又はその生物活性タンパク質は、組換えにより生成される場合、実質的に培地を含まないこと、つまり、培地がタンパク質製剤の約２０％、１０％、又は５％未満であることが好ましい。
【０１２２】
術語「化学前駆体又はその他の化学物質を実質的に含まない」には、タンパク質が、タンパク質合成に関与する化学前駆体その他の化学物質から分離された、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質製剤が含まれる。１つの実施態様において、述語「化学前駆体又はその他の化学物質を実質的に含まない」には、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、又は５％未満の化学前駆体又は非α１Ｄ＋ＫＩＶＡ化学物質を有するα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質製剤が含まれる。
【０１２３】
本明細書で使用されるように、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の「生物活性部分」は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ分子及び非α１Ｄ＋ＫＩＶＡ分子の間の相互作用に関与する、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質フラグメントを含む。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の生物活性部分には、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のアミノ酸配列、例えば配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列に充分に相同である又はそれから派生したアミノ酸配列を含むペプチドが含まれ、これらのペプチドは完全長のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の活性を少なくとも１つ示す。一般に、生物活性部分は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメイン又はモチーフ、例えばβ、γ又はα２／δカルシウムチャネルサブユニットを含む。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の生物活性部分は、カルシウムチャネル媒介活性を調節する標的として使用できる。
【０１２４】
１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の生物活性部分は、少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の生物活性部分は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット活性を媒介し、例えばＫＩＶＡ配列を有すること、及び／又は配列番号８及び／又は配列番号１０のアミノ酸配列を有しないことといった、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質の１つ以上の特徴を含む。タンパク質の他の領域が欠失された生物活性部分は、組換え技術によって調製でき、未変性α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の１つ以上の機能活性について評価できる。
【０１２５】
１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、配列番号２又は配列番号４に示すアミノ酸配列を有する又は配列番号２又は配列番号４に実質的に相同であり、配列番号４のタンパク質の機能活性を保持するが、後述するように、対立遺伝子自然変異又は突然変異誘発のためにアミノ酸配列が異なっている。
【０１２６】
従って、もう１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、配列番号２又は配列番号４に少なくとも約５０％、７５％、８５％、９５％、９９％又はそれ以上相同であるアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【０１２７】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の相同性を決定するために、最適に比較できるように配列をアラインメントする（例えば、第２アミノ又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第１アミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入してよく、非相同配列は、比較のために無視してよい）。比較のためにアラインメントされた参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも５０％であってよく、７０％、８０％、又は９０％であってさえよい。続いて、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。分子は、第１配列のある位置が第２配列の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められている場合、その位置において相同である（すなわち、本明細書で使用されるように、アミノ酸又は核酸「相同性」は、アミノ酸又は核酸「同一性」に等しい）。２つの配列間の相同性は、これらの配列によって共有される同一位置数の関数である（つまり、相同％＝同一位置数／位置総数×１００）。
【０１２８】
配列比較及び二配列間の相同性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。配列比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３のように修正された、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８，１９９０のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、点数＝１００、語長＝１２で実行することにより、本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、点数＝５０、語長＝３で実行することにより、本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップを有するアラインメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２，１９９７に記載されたようにして、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを使用できる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用できる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを参照されたい。配列比較に使用される数学的アルゴリズムのもう１つの非限定例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭＩ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティー、及び４のギャップペナルティーが使用できる。
【０１２９】
本発明は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡキメラたんぱく質又は融合タンパク質も提供する。本明細書で使用されるように、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」には、非α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドに操作自在に連結されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドが含まれる。「α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチド」は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。「非α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチド」は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質に実質的に相同でないタンパク質、又は本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の１つ以上の特徴を含まないタンパク質、に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質に実質的に相同でないタンパク質は、例えば、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質と異なり、同じ又は異なる生体から派生するタンパク質である。本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の１つ以上の特徴を含まないタンパク質は、ＫＩＶＡ配列を有し且つ配列番号８及び／又は配列番号１０の配列を有しないようなものである。α１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質内で、α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の全部又は一部に対応できる。好ましい実施例において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の少なくとも１つの生物活性部分を含む。もう１つの好ましい実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の少なくとも２つの生物活性部分を含む。融合タンパク質内で、用語「操作自在に連結された」は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチド及び非α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドが、互いにインフレームで融合されていることを指すことが意図される。非α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドのＮ末端又はＣ末端に融合できる。
【０１３０】
例えば、１つの実施態様において、融合タンパク質は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合された、ＧＳＴ−α１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質である。このような融合タンパク質は、組換えα１Ｄ＋ＫＩＶＡの精製を容易化できる。
【０１３１】
もう１つの実施態様において、融合タンパク質は、Ｎ末端に異種シグナル配列を含むα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質である。ある種の宿主細胞（例えば哺乳動物宿主細胞）において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡの発現は、異種シグナル配列の使用を介して増加できる。
【０１３２】
本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質は、医薬組成物に組み込み、被験者にインビボで投与できる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ基質の生物学的利用能に影響を及ぼすために使用できる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質の使用は、カルシウムチャネル活性に関連する障害、例えば動脈硬化、虚血再灌流障害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再構築、心室再構築、急速心室ペーシング、冠状動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、血管性心臓病、心房細動、ＱＴ延長症候群、鬱血性心不全、洞結節機能不全、アンギナ、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、又は不整脈のような心臓血管障害の処置に、治療上有用であり得る。
【０１３３】
更に、本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡ融合タンパク質は、被験者の体内で抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体を生成するため、α１Ｄ＋ＫＩＶＡリガンドを精製するため、及びスクリーニングアッセイにおいてα１Ｄ＋ＫＩＶＡ基質とのα１Ｄ＋ＫＩＶＡの相互作用を抑制する分子を同定するため、に免疫原として使用できる。
【０１３４】
本発明のα１Ｄ＋ＫＩＶＡキメラたんぱく質又は融合タンパク質は、標準組換えＤＮＡ技術により生成できる。例えば、様々なポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、例えば、ライゲーション用の平滑末端又は食い違い末端の末端を用い、適切な末端を提供するための制限酵素ダイジェストをし、付着末端を適切に埋め、望ましくない結合を避けるためにアルカリホスファターゼ処理をし、酵素的ライゲーションをするといった従来技術により、インフレームで一緒にライゲートされる。融合遺伝子は、自動ＤＮＡシンセサイザーを含む従来技術により合成できる。代替的に、２つの連続する遺伝子フラグメント間に、アニールし、再増幅することでキメラ遺伝子配列を生成する相補的突出を発生させるアンカープライマーを使用して、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を実行できる（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２参照）。更に、融合部分をすでにコードする多くの発現ベクターが、市販されている（例えばＧＳＴポリペプチド）。α１Ｄ＋ＫＩＶＡをコードする核酸は、融合部分がα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質にインフレームで連結されるように、このような発現ベクターにクローニングされる。
【０１３５】
本発明は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡアゴニスト（ミミック）、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡアンタゴニストとして機能するα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の変異体にも関する。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の変異体は、突然変異誘発、例えば離散点突然変異又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質切断により、生成できる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のアゴニストは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の自然発生形式の、実質的に同じ生物活性又はサブセットを保持できる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のアンタゴニストは、例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質のカルシウムチャネル媒介活性を競合的に調節することによって、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の自然発生形式の１つ以上の活性を抑制できる。従って、機能が制限された変異体による治療によって、特異な生物的効果が誘発され得る。１つの実施態様において、タンパク質の自然発生形式の生物活性のサブセットを有する変異体による被験者の治療は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の自然発生形式による治療に比べて、被験者における副作用が少ない。
【０１３６】
１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡアゴニスト（ミミック）又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡアンタゴニストとして機能するα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の変異体は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の突然変異体、例えば切断突然変異体、のコンビナトリアルライブラリを、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質アゴニスト又はアンタゴニスト活性でスクリーニングすることによって、同定できる。１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ変異体の斑入り（ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、斑入り遺伝子ライブラリによってコードされる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡ変異体の斑入りライブラリは、例えば、個別のポリペプチドとして、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡ配列のセットを中に含む（例えばファージディスプレイ用の）より大きい融合タンパク質のセットとして、潜在的α１Ｄ＋ＫＩＶＡ配列の縮重セットが発現されるよう、合成オリゴヌクレオチド混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲートすることにより、生成できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的α１Ｄ＋ＫＩＶＡ変異体のライブラリを生成するために使用できる方法は、種々ある。縮重遺伝子配列の化学合成は自動ＤＮＡシンセサイザー内で実行でき、合成遺伝子は適切な発現ベクターにライゲートできる。遺伝子の縮重セットを使用することにより、１種の混合物中で、潜在的α１Ｄ＋ＫＩＶＡ配列の所望のセットをコードする全配列を調整できる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該技術分野において公知である（例えばＮａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３，１９８３、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３，１９８４、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６，１９８４、Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７，１９８３参照）。
【０１３７】
更に、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質コード配列のフラグメントのライブラリは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の変異体をスクリーニングし、次いで選択するための、α１Ｄ＋ＫＩＶＡフラグメントの斑入り個体群を生成するために使用できる。
【０１３８】
本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、結合した又は結合しない結合剤の検出を容易にするために、検出可能物質を直接又は間接的にラベルできる。適切な検出可能物質には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、及び放射性材料が含まれる。
【０１３９】
単離α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質、又はその部分若しくはフラグメントは、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体調製の標準技術を用いて、α１Ｄ＋ＫＩＶＡに結合する抗体を生成するための免疫原として、使用できる。完全長のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質が免疫原として使用でき、代替的に、本発明は免疫原として使用するためのα１Ｄ＋ＫＩＶＡの抗原ペプチドフラグメントを提供する。α１Ｄ＋ＫＩＶＡの抗原ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列、又は配列番号４に示すアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を、特に、配列番号６のアミノ酸配列とは異なるα１Ｄ＋ＫＩＶＡ領域において含み、ペプチドに対して産生された抗体がα１Ｄ＋ＫＩＶＡとの特異的免疫複合体を形成するよう、α１Ｄ＋ＫＩＶＡのエピトープを包含する。好ましくは、抗原ペプチドは、少なくとも１０、１５、２０又は３０個のアミノ酸残基を含む。
【０１４０】
一般にα１Ｄ＋ＫＩＶＡ免疫原は、適切な被験者（例えばウサギ、ヤギ、マウス又はその他の哺乳動物）を免疫原で免疫することによって抗体を調製するために使用される。適切な免疫原製剤には、例えば組換えによって発現したα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質又は化学合成されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドが含まれる。製剤は、フロイント完全アジュバント又は不完全アジュバントのようなアジュバント、又は類似の免疫刺激剤を更に含んでよい。免疫原α１Ｄ＋ＫＩＶＡ製剤によって適切な被験者を免疫すると、ポリクローナル抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体応答が誘発される。
【０１４１】
従って、本発明のもう１つの側面は、抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体に関する。本明細書で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、すなわちα１Ｄ＋ＫＩＶＡのような、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を指す。免疫グロブリン分子の免疫活性部分の例には、抗体をペプシン等の酵素によって処理することによって生成できる、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２フラグメントが含まれる。本発明は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡに結合するポリクローナル及びモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡの特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位を一種のみ含む抗体分子の個体群を指す。従って、モノクローナル組成物は、一般に、それが免疫反応する特定のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質に単結合親和力を示す。
【０１４２】
抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡポリクローナル抗体は、上記のように、適切な被験者をα１Ｄ＋ＫＩＶＡ免疫原で免疫することにより調製できる。免疫された被験者における抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体力価は、固定化α１Ｄ＋ＫＩＶＡを使用した酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のような標準技術によって、長期に亘って監視できる。所望の場合、α１Ｄ＋ＫＩＶＡに対する抗体分子は、哺乳動物から（例えば血液から）単離でき、更に、ＩｇＧ画分を得るためにタンパク質Ａクロマトグラフィーのような公知技術によって精製できる。抗体産生細胞は、免疫後の適当な時、例えば抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体力価が最高である時に、被験者から得られ、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５４９７によって当初記載されたハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６，１９８１、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３，１９８０、Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１，１９７６、及びＹｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５，１９８２も参照）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２，１９８３）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５）又はトリオーマ技術といった、標準技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用できる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを生成する方法は、周知である（一般にＲ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）、Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ  Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２，１９８１、Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６，１９７７参照）。簡潔に言えば、不死細胞系（一般に骨髄腫）は、上記のようなα１Ｄ＋ＫＩＶＡ免疫原により免疫された哺乳動物からのリンパ球（一般に脾細胞）に融合され、得られるハイブリドーマ細胞の培養上清は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定するためにスクリーニングされる。
【０１４３】
リンパ球及び不死化細胞系の融合に使用される多くの周知手順の任意のものは、抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡモノクローナル抗体を生成する目的に応用できる（例えばＧ．Ｇａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２，１９７７、Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．，前掲、Ｌｅｍｅｒ，Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，前掲、Ｋｅｎｎｅｔｈ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，前掲参照）。更に、当業者であれば、同様に有用な多くの変形例があることを認識するであろう。
【０１４４】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の代わりに、モノクローナル抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡとの組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングし、これによってα１Ｄ＋ＫＩＶＡに結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することにより、同定でき単離できる。ファージディスプレイライブラリを生成及びスクリーニングするキットは、市販されている（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１）。更に、抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングにおける使用に特に利用できる方法及び試薬の例は、例えばＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第５２２３４０９号明細書、Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ９２／１８６１９号パンフレット、及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４，１９９０において見出すことができる。
【０１４５】
更に、標準組換えＤＮＡ技術を使用して製造できるヒト部分及び非ヒト部分の両方を含む、キメラ抗体及びヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体及びヒト化モノクローナル抗体は、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号明細書、Ａｋｉｒａ，ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１８４１８７号明細書、Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．，欧州特許出願第１７１４９６号明細書、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１７３４９４号明細書、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．国際公開第ＷＯ８６／０１５３３号パンフレット、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４８１６５６７号明細書、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．欧州特許出願第１２５０２３号明細書、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３，１９８８、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３，１９８７、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６，１９８７、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８，１９８７、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５，１９８７、Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９，１９８５、ａｎｄ  Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９，１９８８）、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７，１９８５、Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４，１９８６、Ｗｉｎｔｅｒ米国特許第５２２５５３９号明細書、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５，１９８６、Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４，１９８８、及びＢｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０，１９８８に記載された方法を使用する、当該技術分野で公知な組換えＤＮＡ技術によって生成できる。
【０１４６】
抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体（例えばモノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準技術によって、α１Ｄ＋ＫＩＶＡを単離するために使用できる。抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体は、細胞からの天然α１Ｄ＋ＫＩＶＡ、及び宿主細胞内で発現する組換えα１Ｄ＋ＫＩＶＡの精製を容易化できる。更に、抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質発現量及び発現パターンを評価するために、（例えば細胞可溶化物又は細胞上清中で）α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質を検出するために使用できる。抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体は、例えば所与の治療措置の有効性を決定するために、臨床試験手順の一部として組織内のタンパク質レベルを監視するために診断上使用できる。検出は、検出可能な物質に抗体を結合（つまり、物理的に連結）することによって、容易化できる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生体発光材料、及び放射性材料が含まれる。適切な酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオトゥイーン、及びアビジン／ビオトゥイーンが含まれ、適切な蛍光材料の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンが含まれ、発光材料の例には、ルミノールが含まれ、生体発光材料の例には、ルシフェラーゼ、フリフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な放射性材料の例には、１２５Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが含まれる。
【０１４７】
組換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明のもう１つの側面は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質（又はその一部）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターに関する。本明細書で使用されるように、用語「ベクター」は、それが連結された他の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドとは追加ＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二重鎖ＤＮＡループを指す。もう１つのタイプのベクターはウイルスベクターであって、追加ＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートできるものである。ある種のベクター（例えば、細菌複製開始点を有する細菌ベクター、及びエピソーム哺乳動物ベクター）は、それらが導入される宿主細胞内において自律複製できる。その他のタイプのベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み入れられ、これにより宿主ゲノムと一緒に複製される。更に、ある種のベクターは、それらが操作自在に連結された遺伝子の発現を指示できる。このようなベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形状である。プラスミドは、ベクターの最も一般的に使用される形状なので、本明細書で、「プラスミド」及び「ベクター」は、同義的に使用され得る。しかしながら、本発明は、同様の機能に貢献する、ウイルスベクターのような（例えば複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）、他形状の発現ベクターも含むことが意図される。
【０１４８】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞内で核酸の発現に適した形状の本発明の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞に基いて選択される１つ以上の制御配列を含み、この制御配列が発現される核酸配列に操作自在に連結されていることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「操作自在に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、インビトロ転写／翻訳系において、又はベクターが宿主細胞内に導入されたときは宿主細胞において）ヌクレオチド配列が発現されるように、調節配列に連結されていることを意味することが意図される。用語「調節配列」には、プロモーター、エンハンサーその他の発現制御要素（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれることが意図される。このような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に記載されている。調節配列には、ヌクレオチド配列の構成的発現を多くのタイプの宿主細胞内で指示するもの、ヌクレオチド配列の発現をある種の宿主細胞においてのみ指示するもの（例えば組織特異的調節配列）、が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル等のような要因次第であることが、当業者によって認識されるであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入でき、これによって、本明細書で記載されるような核酸によってコードされるタンパク質又はペプチド（融合タンパク質又融合はペプチドを含む）、例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質、突然変異形状のα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質、融合タンパク質、を生成できる。
【０１４９】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞内でのα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の発現のために設計できる。例えば、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、大腸菌、（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）昆虫細胞、酵母細胞、両生動物細胞、又は哺乳動物細胞といった細菌細胞内で発現できる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において更に検討されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えばＴ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで、転写及び翻訳できる。
【０１５０】
原核生物でのタンパク質発現は、ほとんどの場合、融合又は非融合タンパク質の発現を指示する構成的プロモーター又は誘導性プロモーターを含むベクターを用いて、大腸菌内で行われる。
【０１５１】
精製された融合タンパク質は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性アッセイ（例えば以下で詳細に記載する直接アッセイ又は競合的アッセイ）において、又は例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡに特異的な抗体を生成するために、使用できる。
【０１５２】
もう１つの実施態様において、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）内の発現のベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４），ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３，１９８２），ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３，１９８７），ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が含まれる。
【０１５３】
あるいは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞内で発現できる。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）内でのタンパク質発現のために利用できるバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５，１９８３）及びｐＶＬ系列（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｖｉｒｏｌ．１７０：３１−３９，１９８９）が含まれる。
【０１５４】
更にもう１つの実施態様において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞内で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０，１９８７）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５，１９８７）が含まれる。哺乳動物細胞内で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節要素によってしばしば提供される。例えば、一般に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞及び真核細胞の双方に適切な他の発現系に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の１６及び１７章を参照されたい。
【０１５５】
もう１つの実施態様において、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞タイプ内において、優先的に核酸発現を指示できる（例えば、組織特異的調節要素が、核酸を発現するために使用される）。組織特異的調節要素は、当該技術分野において公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的、Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７，１９８７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ  Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５，１９８８）、特にＴ細胞レセプターのプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３，１９８９）及び免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０，１９８３、Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８，１９８３）、ニューロン特異的プロモーター（例えばニューロフィラメントプロモーター、Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７，１９８９）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６，１９８５）、及び乳腺特異的プロモーター（例えば乳清プロモーター、米国特許第４８７３３１６号明細書及び欧州特許出願公開第２６４１６６号明細書）、が含まれる。発生的に調節されるプロモーター、例えばマウスホメオボックスプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９，１９９０）及びα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６，１９８９）も、包含される。
【０１５６】
本発明は、発現ベクターにアンチセンス方向でクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を含む、組換え発現ベクターを更に提供する。すなわち、このＤＮＡ分子は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡにアンチセンスであるＲＮＡ分子が（ＤＮＡ分子転写によって）発現されるように、調節配列に操作自在に連結される。アンチセンス方向でクローニングされた核酸に操作自在に連結され、アンチセンスＲＮＡ分子の連続発現を種々の細胞タイプにおいて指示する調節配列が選択できる。例えば、アンチセンスＲＮＡの構成的、組織特異的又は細胞タイプ特異的な発現を指示するウイルスプロモーター及び／又はエンハンサー、又は調節配列が、選択できる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高性能調節領域の制御下で生成される組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒ウイルスの形状であり、これらの活性はベクターが導入される細胞タイプによって決定できる。アンチセンス遺伝子を使用した遺伝子発現調節の論考に関しては、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照されたい。
【０１５７】
本発明のもう１つの側面は、核酸、例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又は本発明の組換え発現ベクターが導入された、宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書で同義的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代又は潜在的後代をも指すことが理解される。突然変異又は環境の影響により、ある種の変更が後続世代で発生し得るので、このような後代は、実際には、親細胞と同一でない場合もあるが、それでも本明細書で使用される用語の範囲に含まれる。
【０１５８】
宿主細胞は、いかなる原核細胞又は真核細胞であってもよい。例えば、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、大腸菌、昆虫細胞、酵母細胞、アフリカツメガエル卵母細胞等のアフリカツメガエル細胞、又は（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞のような）哺乳動物細胞といった細菌細胞内で発現できる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１５９】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換技術又はトランスフェクション技術を通して、原核細胞又は真核細胞内に導入できる。本明細書で使用されるように、「形質転換」及び「トランスフェクション」は、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、又は電気穿孔法を含む、外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞に導入する種々の技術的に認識された技術を指すことが意図される。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトする適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、その他の実験マニュアルにおいて見出される。核酸は、微量注入によっても導入できる。
【０１６０】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクター及びトランスフェクション技術に応じて、細胞の小フラクションしか外来ＤＮＡをそのゲノム内に組み込まない場合があることが知られている。これらの組み込み体を同定し選択するため、一般的に、選択可能マーカー（例えば抗生物質耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子と共に宿主細胞に導入される。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートのような薬剤への耐性を付与ものが含まれる。選択可能マーカーをコードする核酸は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードするベクターと同じベクターで宿主細胞内に導入してもよく、別個のベクター上で導入してもよい。導入された核酸が安定してトランスフェクトされた細胞は、薬剤選抜によって特定できる（例えば、選択可能マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は残存するが、他の細胞は死亡する）。
【０１６１】
培養されている原核宿主細胞又は真核宿主細胞といった、本発明の宿主細胞は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質を生成する（つまり、発現させる）ために使用できる。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を使用したα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の生成方法を更に提供する。
【０１６２】
本発明の核酸分子は、ベクター内に挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用できる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５３２８４７０号明細書参照）、又は定位的注射（例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７，１９９４参照）によって、被験者に送達される。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は、許容できる希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含んでもよく、遺伝子送達媒体が埋め込まれた叙放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、レトロウイルス等の組換え細胞から、完全な遺伝子送達ベクターが無傷で生成できる場合には、医薬製剤は遺伝子送達系を作る１個以上の細胞を含んでよい。
【０１６３】
本発明の使用及び方法
本明細書に記載された核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、及び抗体は、次の方法：ａ）スクリーニングアッセイ、ｂ）予測薬剤（例えば診断アッセイ、予後診断アッセイ、臨床試験監視、薬理遺伝学）、及びｃ）処置方法（例えば、治療及び予防）、の１つ以上において使用できる。
【０１６４】
本発明の単離核酸分子は、以下で更に記載するように、例えば、（例えば遺伝子治療の応用における、宿主細胞内の組換え発現ベクターを通して）α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質を発現させるため、（例えば生体試料中の）α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質をコードする遺伝子内の遺伝的変化を検出するため、及び、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性を調節するため、に使用できる。α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ基質の不充分又は過剰な生成、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡインヒビターの生成、を特徴とする障害を治療するために使用できる。更に、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、自然発生α１Ｄ＋ＫＩＶＡ基質をスクリーニングするため、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性を調節する薬剤又は化合物をスクリーニングするために使用できる。また、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の不充分若しくは過剰な生成、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡ野生型タンパク質と比較して減少した活性又は異常な活性を有するα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質形状の生成を特徴とする障害、例えば動脈硬化、虚血再灌流障害、再狭窄、動脈炎症、血管壁再構築、心室再構築、急速心室ペーシング、冠状動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、血管性心臓病、心房細動、ＱＴ延長症候群、鬱血性心不全、洞結節機能不全、アンギナ、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣、又は不整脈といった心臓血管障害を治療するために使用できる。更に、本発明の抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質を検出及び単離し、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性を調節するために使用できる。
【０１６５】
スクリーニングアッセイ
本発明は、モジュレーター、すなわち本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを含むカルシウムチャネルに結合する、候補化合物又は試験化合物又は薬剤（例えばタンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、ペプトイド、小分子その他の薬剤）を特定する方法を提供する。このように特定された化合物は、例えば治療手順において、これらのカルシウムチャネルの活性を調節するために使用できる。
【０１６６】
１つの実施態様において、本発明は、本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット又はサブユニットの生物活性部分を含むカルシウムチャネルの基質である、試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。もう１つの実施態様において、本発明は、これらのカルシウムチャネルに結合する又はその活性を調節する、候補又は試験化合物をスクリーニングするアッセイを提供する。
【０１６７】
イオンチャネル調節化合物は、（例えば細胞及び非細胞ベースの）インビトロ、及びインビボの方法のいずれでも、同定できる。１つの実施態様において、カルシウムチャネル活性を測定するために、Ｃａ２＋流入アッセイが使用される。Ｃａ２＋濃度の変化を測定するアッセイは、当該技術分野において公知である。例えば、試験系には、検出可能なＣａ２＋感受性薬剤を装填してもよい。試験化合物を用いた次の処置において、Ｃａ２＋感受性薬剤が検出されることは、Ｃａ２＋濃度の変化を示唆する。１つの実施態様において、アッセイには、試験系（例えば細胞又は封入膜製剤）に電位を加えることによる刺激に続くカルシウムを検出することが含まれる。
【０１６８】
イオンチャネル活性を測定するアッセイは、フラックスアッセイ、パッチクランプ電気生理、及び二電極電位クランプ電気生理を含む（例えばＬｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  １８：１５３−１６６，１９９７参照）。パッチクランプ生理は、次のように実行される。簡潔に言えば、小型電極を含むピペットチップが、ピペット及び膜の間に密封を生み出すように、細胞膜に押圧される。電極は、ピペットチップの縁部によって画定される膜を通って流れるイオンを捕捉する。細胞内又は膜パッチ内又は細胞全体にわたる電流を測定するために、種々の形状が使用できる。
【０１６９】
二電極電位クランプ（ＴＥＶＣ）生理は、次のように実行される。簡潔に言えば、２つの鋭敏な微小電極が細胞膜を介して押圧される。一方の電極は膜電位を監視し、他方の電極は膜電位を所望のレベルに保持するために電流を注入する。パッチクランプ及びＴＥＶＣ技術のいずれによっても、イオンチャネル電流の速度及び強度の両方に関する情報が提供される。
【０１７０】
１つの実施態様において、カルシウムチャネルは、アフリカツメガエル卵母細胞系を使用して検定される。カルシウムチャネルの一過性発現の詳細な記述、及びアフリカツメガエル卵母細胞からの記録に関しては、例えばＸｕ  ａｎｄ  Ｌｉｐｓｃｏｍｂｅ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１（１６）：５９４４−５９５１，２００１、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）を参照されたい。もう１つの実施態様において、アッセイは、例えばヒト又はマウス細胞を使用する、哺乳動物細胞ベースのアッセイである。
【０１７１】
化合物
本発明の試験化合物は、生物ライブラリ、ペプトイドライブラリ（ペプチドの機能性を有し、酵素分解に耐性であり且つ生物活性を保持する新規な非ペプチドバックボーンを備える分子ライブラリ；例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８−８５，１９９４参照）、空間的にアドレス可能平行固相又は溶液相のライブラリ、逆重畳を必要とする合成ライブラリ方法、「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ−ｂｅａｄ  ｏｎｅ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」ライブラリ方法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリ方法、を含む当該技術分野において公知なコンビナトリアルライブラリ方法における多数のアプローチを、単独で又は任意のものを使用して得ることができる。生物ライブラリ及びペプトイドライブラリのアプローチは、ペプチドライブラリに限られ、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小分子ライブラリに応用できる（Ｌａｍ，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５，１９９７）。
【０１７２】
分子ライブラリの合成方法の例は、当該技術において、例えばＤｅＷｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９，１９９３、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２，１９９４、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８，１９９４、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３，  １９９３、Ｃａｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９，１９９４、Ｃａｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１，１９９４、及びＧａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３，１９９４において見出すことができる。
【０１７３】
化合物のライブラリは、溶液内（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１，１９９２）、又はビーズ（Ｌａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６，１９９３）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５２２３４０９号明細書）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ，米国特許第５２２３４０９号明細書）、プラスミド（Ｃｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９，１９９２）、又はファージ（Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０，１９９０、Ｄｅｖｌｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６，１９９０、Ｃｗｉｒｌａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２，１９９０、Ｆｅｌｉｃｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０，１９９１、Ｌａｄｎｅｒ前掲）上に、存在してよい。
【０１７４】
試験化合物として使用される化合物（すなわち、潜在的インヒビター、アンタゴニスト、アゴニスト）は、商業的供給源から入手でき、又は、容易に入手可能な出発物質から、当該技術分野の当業者に公知の標準合成技術及び方法論を使用して合成できる。本明細書に記載された方法によって同定される化合物の合成に有用な、合成化学変換及び保護基の方法論（保護及び保護解除）は、当該技術分野において公知であり、例えばＲ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）、Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）、及びＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、及びその後版に記載されたものが含まれる。
【０１７５】
１つの側面において、化合物は有機小分子、つまり、１０００ａｍｕ未満、あるいは３５０〜７５０ａｍｕの分子量を有する化合物である。他の側面において、化合物は、（ｉ）非ペプチド性のもの、（ｉｉ）更なる置換基を有してもよい、１個以上５個以下のヘテロシクリル基又はヘテロアリール環基を有するもの、（ｉｉｉ）それぞれの薬理学的に許容できる塩の状態のもの、又は（ｉｖ）ペプチド性のもの、である。
【０１７６】
用語「ヘテロシクリル」は、単環式ならば１−３個のヘテロ原子、二環式ならば１−６個のヘテロ原子、又は三環式ならば１−９個のヘテロ原子を有する、非芳香族３−８員単環式、８−１２員二環式、又は１１−１４員三環式環構造を指す。へテロ原子は、Ｏ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば、単環式、二環式、又は三環式の各々であれば、炭素原子、及びＮ、Ｏ、Ｓの１−３、１−６、１−９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２又は３個の原子は、置換基によって置換されてもよい。
【０１７７】
用語「ヘテロアリール」は、単環式ならば１−３個のヘテロ原子、二環式ならば１−６個のヘテロ原子、又は三環式ならば１−９個のヘテロ原子を有する、芳香族５−８員単環式、８−１２員二環式、又は１１−１４員三環式環構造を指す。へテロ原子は、Ｏ、Ｎ、又はＳから選択され（例えば、単環式、二環式、又は三環式の各々であれば、炭素原子、及びＮ、Ｏ、Ｓの１−３、１−６、１−９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２、３又は４個の原子は、置換基によって置換されてもよい。
【０１７８】
用語「置換基」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル又はヘテロアリール基上で、その基の任意の原子で「置換された」基を指す。適切な置換基には、特に限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ、アミノ、ＳＯ３Ｈ、ペルフルオロアルキル、ペルフルオロアルコキシ、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、カルボキシル、オキソ、チオキソ、イミノ（アルキル、アリール、アラルキル）、Ｓ（Ｏ）ｎアルキル（式中ｎは０−２である）、Ｓ（Ｏ）ｎアリール（式中ｎは０−２である）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロアリール（式中ｎは０−２である）、Ｓ（Ｏ）ｎヘテロシクリル（式中ｎは０−２である）、アミン（モノ−、ジ−、アルキル、シクロアルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル及びその組み合わせ）、エステル（アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル）、アミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル及びその組み合わせ）、スルホンアミド（モノ−、ジ−、アルキル、アラルキル、ヘテロアラルキル及びその組み合わせ）、非置換アリール、非置換ヘテロアリール、非置換ヘテロシクリル、及び非置換シクロアルキル、が含まれる。１つの側面において、基上の置換基は、独立して、上述した置換基の任意の一種又はサブセットである。
【０１７９】
本発明で想定される化合物の置換基及び変化の組み合わせは、安定した化合物の形成をもたらすものに限られる。本明細書で使用される用語「安定した」は、製造を可能にするのに充分な安定性を有し、且つ、本明細書に詳述する目的（例えば、輸送、貯蔵、検定、被験者への治療的投与）に有用となるのに充分な期間、化合物の完全性を維持する化合物を指す。
【０１８０】
本明細書での化合物の薬理学的に許容し得る塩には、薬理学的に許容し得る無機及び有機の酸及び塩基に由来するものが含まれる。適切な酸性塩には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ジグルコン酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘミスルフェート（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタノエート、ヘキサノエート、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコトゥイーン酸塩、硝酸塩、パーモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクトゥイーン酸塩、過硫酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカノエートが含まれる。
【０１８１】
本明細書に記載された化合物は、１つ以上の不斉中心を含み、これにより、ラセミ化合物及びラセミ混合物、単一エナンチオマー、単一ジアステレオマー、及びジアステレオマー混合物として発生し得る。このような化合物の全異性体形状は、本発明に明確に含まれる。本明細書に記載された化合物は、複数の互変異性形状で代表することもでき、その全てが本明細書に含まれる。化合物は、シス−若しくはトランス−又はＥ−若しくはＺ二重結合異性体形状でも発生し得る。このような化合物の全異性体形状は、本発明に明確に含まれる。
【０１８２】
結合アッセイ
α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを含むカルシウムチャネルへの試験化合物の結合能も、評価できる。カルシウムチャネル結合は、チャネル調節活性に必須ではないが、カルシウムチャネルに結合する化合物は、チャネルの活性調節に有用であり得る。このことは、例えば、基質等の化合物に放射性同位体又は酵素ラベルを結合させ、ラベルされた基質等の化合物を複合体内で検出することによって、カルシウムチャネルへの基質の結合を決定することで、達成できる。あるいは、本明細書に記載されるα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを含むカルシウムチャネルは、試験化合物の複合体調節能を監視するために、放射性同位体又は酵素標識と結合してよい。例えば、化合物は、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈによって直接的又は間接的にラベルしてよく、放射性同位体は、放射線放出の直接計数又はシンチレーション計数によって検出できる。あるいは、化合物は、例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼによって酵素的にラベルしてよく、酵素ラベルは適切な基質の生成物への転換を測定することによって検出できる。
【０１８３】
α１Ｄサブユニットを含む又はいかなる反応体のラベルもない、カルシウムチャネルとの試験化合物の相互作用能は評価できる。例えば、マイクロフィジオメーターは、化合物と、この化合物又はカルシウムチャネルの標識がないカルシウムチャネルとの相互作用を検出するために、使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２，１９９２）。本明細書で使用されるように、「マイクロフィジオメーター」（例えばサイトセンサー）は、光学アドレス可能電位計測機（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞が環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、化合物とカルシウムチャネルとの間の相互作用の指標として使用できる。
【０１８４】
さらにもう１つの実施態様において、本明細書に記載されたカルシウムチャネル又はその生物活性部分を試験化合物に接触し、チャネル又はその生物活性部分への試験化合物の結合能を評価する、無細胞アッセイが提供される。好ましくは、無細胞アッセイは、膜を含む。無細胞アッセイは、標的遺伝子タンパク質及び試験化合物の反応混合物をこれら二成分が相互作用し結合するのに充分な条件及び時間で調製すること、これによって、除去及び／又は検出できる複合体を形成すること、を含む。
【０１８５】
二分子間の相互作用は、例えば蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ）を使用しても検出できる（例えばＬａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５６３１１６９号明細書、Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４８６８１０３号明細書参照）。第１の「ドナー」分子への蛍光体ラベルは、その放出蛍光エネルギーが第２の「アクセプター」分子への蛍光標識によって吸収され、次に第２のアクセプター分子は吸収したエネルギーにより蛍光を発することができるように選択される。あるいは、「ドナー」タンパク質分子は、トリプトファン残基の自然蛍光エネルギーを単に使用してもよい。「アクセプター」分子標識が「ドナー」の分子標識と区別できるように、異なる光波長を放出する標識が選択される。標識間のエネルギー転移効率は分子間の距離に関係するので、分子間の空間関係を評価してもよい。アッセイ中の「アクセプター」分子標識の蛍光放出は、分子間に結合が発生する状況で、最大となるべきである。ＦＥＴ結合現象は、当該技術分野において周知の標準蛍光分析検出手段を介して（例えば蛍光計を使用して）、好都合に測定できる。
【０１８６】
もう１つの実施態様において、本明細書に記載されたカルシウムチャネルへの試験化合物の結合能を測定することは、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）を使用して達成できる（例えばＳｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５，１９９１、及びＳｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５，１９９５参照）。「表面プラズモン共鳴」又は「ＢＩＡ」は、いずれの反応体をラベルすることもなく、生物特異的相互作用をリアルタイムで検出する（例えばビアコア）。（結合現象を示唆する）結合表面での質量変化は、表面近くでの光の屈折率の変化（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）をもたらし、生体分子間のリアルタイム反応を示すものとして使用できる検出可能なシグナルをもたらす。
【０１８７】
１つの実施態様において、カルシウムチャネル又は試験化合物を含む試料は、固相に固定される。固相に固定されたチャネル／試験化合物複合体は、反応終了時に検出できる。
【０１８８】
一方又は両方のタンパク質の非複合体形から複合体形を単離するのを容易化するため、並びにアッセイの自動化に適応するために、カルシウムチャネル、抗カルシウムチャネル抗体又はその標的分子を固定化することが好ましい場合がある。カルシウムチャネルへの試験化合物の結合、又は候補化合物の存在及び不存在下におけるカルシウムチャネルの標的分子との相互作用は、反応物を収容するのに適した任意の容器内で、行うことができる。このような容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管、及び微小遠心分離管が含まれる。１つの実施態様において、一方又は両方のタンパク質が結合されることを可能にするドメインを、マトリックスに加える融合タンパク質が提供される。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット融合タンパク質、又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質は、グルタチオンセファローズビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレートに吸着でき、これらは次に、試験化合物、又は試験化合物及びＧＳＴ標識サブユニットを有するカルシウムチャネルを含む試料と組み合わされ、混合物は、複合体形成に繋がる条件（例えば、塩及びｐＨの生理的条件）でインキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズ又はマイクロタイタープレートウェルは、あらゆる非結合成分を除去するために洗浄され、マトリックスがビーズに固定化され、複合体が例えば上記のように直接的又は間接的に測定される。
【０１８９】
カルシウムチャネルサブユニットの複合体をマトリックスに固定化する他の技術には、ビオトゥイーン及びストレプタビジンの接合を使用することが含まれる。例えばビオトゥイーン化α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質は、当該技術分野における公知技術（例えばビオトゥイーン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用してビオトゥイーンＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製でき、ストレプトアビジンで被覆した９６ウェルプレートのウェルに固定化できる（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）。
【０１９０】
アッセイを行うために、非固定化成分は、固定成分を含む被覆表面に添加される。反応が完結した後、未反応成分は、形成された複合体が固体表面上に固定化されたままであるような条件で、（例えば洗浄によって）除去される。固体表面上に固定された複合体の検出は、多数の方法で達成できる。事前に非固定化された成分が予めラベルされている場合、表面に固定化された標識が検出されることは、複合体が形成されていることを示す。事前に非固定化された成分が予めラベルされていない場合、表面に固定された標識を検出するために、間接標識が使用できる。例えば、固定化された成分に特異的な、標識された抗体を使用する（抗体は、順次、例えばラベルされた抗Ｉｇ抗体によって、直接的にラベル、又は間接的にラベルしてよい）。
【０１９１】
１つの実施態様において、このアッセイは、カルシウムチャネル上のエピトープと反応し且つチャネルの標的分子への結合を妨げない抗体を使用して実行される。このような抗体はプレートのウェルに誘導体化され、非結合の標的又はカルシウムチャネルは、抗体接合によってウェル内に捕捉できる。このような複合体を検出する方法には、上述したＧＳＴ固定化複合体に関するものに加え、カルシウムチャネルの成分と反応する抗体を使用した複合体の免疫検出、並びにチャネルに関連した酵素活性の検出による酵素結合アッセイ、が含まれる。
【０１９２】
あるいは、無細胞アッセイは、液相で行ってもよい。このようなアッセイにおいて、反応生成物は、分画遠心分離（例えばＲｉｖａｓ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ａ．Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １８：２８４−７，１９９３参照）、クロマトグラフィー（ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動及び免疫沈降（例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）を含む（但しそれに限定されない）多数の標準技術の任意のものによって、未反応成分から単離される。このような樹脂及びクロマトグラフ技術は、当業者に公知である（例えばＨｅｅｇａａｒｄ，Ｎ．Ｈ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １１：１４１−８，１９９８、Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｗｅｅｄ，Ｓ．Ａ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．６９９：４９９−５２５，１９９７参照）。更に、蛍光エネルギー転移も、本明細書に記載されるように、溶液から複合体を更に精製することなく結合を検出するために、好都合に使用できる。好ましくは、無細胞アッセイは、例えば膜成分又は合成膜成分を含むことによって、カルシウムチャネル複合体の構造を保存する。
【０１９３】
好ましい実施態様において、アッセイは、カルシウムチャネル又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの生物活性部分を含むチャネルを、アッセイ混合物を形成するためにチャネルに結合する公知の化合物に接触させること、アッセイ混合物を試験化合物に接触させること、及び、試験化合物のカルシウムチャネルとの相互作用能を測定することを含み、試験化合物のカルシウムチャネルとの相互作用能を測定することは、試験化合物が、公知の化合物と比較して、カルシウムチャネルに優先的に結合する能力、又は、チャネル活性を調節する能力を測定することを含む。
【０１９４】
本明細書に記載されたカルシウムチャネルは、タンパク質等の１つ以上の細胞性又は細胞外の巨大分子と、インビボで相互作用できる。この論考のために、このような細胞及び細胞外巨大分子は、本明細書で「結合パートナー」と称される。このような相互作用を混乱させる化合物は、標的遺伝子生成物の活性を調節する際に、有用となる場合がある。このような化合物には、抗体、ペプチド、小分子といった分子が含まれるが、これらには限定されない。代替的実施態様において、本発明は、試験化合物が、カルシウムチャネルの下流エフェクター、例えばカルシウム感受性タンパク質、の活性調節を介してカルシウムチャネルの活性を調節する能力を測定する方法を提供する。前述したように、例えば、適切な標的へのカルシウム感受性分子（例えばカルシニューリンのようなカルシウム活性化ホスファターゼ、又はカルシウム活性化転写因子）の活性（例えばカルシニューリンの基質の脱リン酸化、又はカルシウム活性化転写因子によるＤＮＡ結合及び転写活性化）を測定してもよいし、カルシウム感受性分子の適切な標的への結合を測定してもよい。
【０１９５】
カルシウムチャネル及び細胞外結合パートナーの間の相互作用を妨げる化合物を同定するために、標的遺伝子生成物及び結合パートナーを含む反応混合物は、これら二生成物が複合体を形成するのに充分な条件及び時間のもとで、調製される。抑制薬剤を試験するために、反応混合物は、試験化合物の存在及び不存在下で用意される。試験化合物は、当初反応混合物に含まれていてもよく、カルシウムチャネル及びその細胞性若しくは細胞外の結合パートナーの添加後に添加してもよい。対照反応混合物は、試験化合物なしで、又はプラセボと共に、インキュベートされる。カルシウムチャネル及び細胞性又は細胞外の結合パートナー間のあらゆる複合体の形成は、次に検出される。対照反応において複合体が形成され、試験化合物を含む反応混合物では形成されないことは、その化合物が、標的遺伝子生成物及び相互作用的結合パートナーの相互作用を妨げていることを示唆する。更に、試験化合物及び正常な標的遺伝子生成物を含む反応混合物における複合体の形成は、１つ以上の突然変異サブユニットを含むカルシウムチャネル及び試験化合物を含む反応混合物における複合体形成とも比較できる。この比較は、突然変異体の相互作用を乱し且つ正常な標的遺伝子生成物を乱さない化合物の同定が望まれる場合に、重要であり得る。
【０１９６】
これらのアッセイは、異種又は同種の型式で実行できる。異種アッセイは、カルシウムチャネル又は結合パートナーを固相に固定すること、及び反応終了時に固相上に固定された複合体を検出することを含む。同種アッセイでは、反応全体が液相中で行われる。いずれのアプローチにおいても、反応物の添加順は、試験される化合物に関する異なる情報を得るために、変更してよい。標的遺伝子生成物及び結合パートナー間の相互作用を例えば競合的に妨害する試験化合物は、試験物質の存在下で反応を行うことによって、同定できる。あるいは、予備形成された複合体を破壊する化合物、例えば、より高い結合定数を有し例えば複合体から成分の１つを移動させる化合物は、複合体が形成された後、反応混合物に試験化合物を添加することによって、検査できる。種々の型式を以下に簡単に記載する。
【０１９７】
異種アッセイ系において、標的遺伝子生成物又は相互作用的細胞性若しくは細胞外の結合パートナーは、固体表面（例えばマイクロタイタープレート）に固定され、他方で非固定種は、直接的又は間接的にラベルされる。固定種は、非共有結合又は共有結合によって、固定化できる。あるいは、固定された種に特異的な固定化抗体が、種を固体表面に固定するために使用できる。
【０１９８】
アッセイを行うために、固定化種のパートナーは、試験化合物を有する又は有さない被覆表面に暴露される。反応が完結した後、未反応成分は（例えば洗浄によって）除去され、形成されたあらゆる複合体は、固体表面上に固定化されたままである。非固定化種が予めラベルされている場合、表面に固定化された標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。非固定化種が予めラベルされていない場合、例えば当初の非固定化種に特異的なラベル抗体を使用して（抗体は、順次、例えばラベルされた抗Ｉｇ抗体によって直接的にラベルされてもよく、間接的にラベルされてもよい）、表面に固定された複合体を検出するために、間接標識が使用できる。反応化合物の添加順に応じて、複合体形成を妨げる、又は予備形成された複合体を破壊する試験化合物が、検出できる。
【０１９９】
あるいは、反応は、試験化合物の存在又は不存在下、液相中で行われ、反応生成物が未反応化合物から単離され、例えば結合化合物の１つに特異的な固定化抗体を用いて溶液中に形成された任意の複合体を固定し、他のパートナーに特異的なラベル抗体を使用して固定複合体を検出することにより、複合体が検出できる。再び、液相への反応物の添加順に応じて、複合体形成を妨げる、又は予備形成された複合体を破壊する試験化合物が、同定できる。
【０２００】
本発明の代替的実施態様において、同種アッセイが使用できる。例えば、カルシウムチャネルサブユニット又はその結合パートナーはラベルされるが、標識によって生成されたシグナルは複合体形成によって消されるので、標的遺伝子生成物及び相互作用的細胞性又は細胞外の結合パートナー生成物の予備形成複合体が、調製される（例えば、このアプローチを免疫アッセイに使用する米国特許第４１０９４９６号明細書参照）。予備形成された複合体からの一種と競合し、移動させる試験物質を添加すると、バックグラウンド上のシグナルが生成される。このようにして、標的遺伝子生成物−結合パートナー相互作用を乱す試験物質は同定できる。
【０２０１】
更にもう１つの側面において、カルシウムチャネルタンパク質と結合又は相互作用し（「カルシウムチャネル−結合タンパク質」又は「カルシウムチャネル−ｂｐ」）、カルシウムチャネル活性に関与する、他のタンパク質を同定するために、カルシウムチャネルタンパク質又はそのフラグメントが、ツーハイブリッドアッセイ又はスリーハイブリッドアッセイでの「ベイトタンパク質」として使用できる（例えば米国特許第５２８３３１７号明細書、Ｚｅｒｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ７２：２２３−２３２，１９９３、Ｍａｄｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４，１９９３、Ｂａｒｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４，１９９３、Ｉｗａｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６，１９９３、及びＢｒｅｎｔ国際公開第ＷＯ９４／１０３００号パンフレット参照）。このようなカルシウムチャネル−ｂｐは、例えば、カルシウム媒介シグナル経路の下流要素としてのカルシウムチャネル又はカルシウム感受性標的によるシグナルのアクチベーター又はインヒビターである。
【０２０２】
ツーハイブリッドシステムは、単離可能なＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインからなる、大部分の転写因子が備える調節性に基づく。簡潔に言えば、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡコンストラクトを使用する。一方のコンストラクトでは、（例えばサブユニットの細胞外ドメインの可溶性部分に対応する）カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質又はそのフラグメントをコードする遺伝子が、公知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子に融合される。他方のコンストラクトでは、未同定タンパク質（「プレイ」又は「試料」）をコードするＤＮＡ配列ライブラリーからのＤＮＡ配列が、公知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合される（あるいは、カルシウムチャネルサブユニットは、活性化ドメインに融合されてもよい。）。「ベイト」及び「プレイ」タンパク質が、インビボで相互作用でき、カルシウムチャネルサブユニット依存性複合体を形成すると、転写因子のＤＮＡ結合ドメイン及び活性化ドメインが非常に近接する。この近接によって、転写因子に応答して転写調節部位に操作自在に連結されたレポーター遺伝子（例えばｌａｃＺ）の転写が行われる。レポーター遺伝子の発現を検出でき且つ機能転写因子を含む細胞コロニーは、単離され、カルシウムチャネルサブユニットと相互作用するタンパク質をコードするクローン化遺伝子を得るために、使用できる。
【０２０３】
もう１つの実施態様において、カルシウムチャネルサブユニット発現のモジュレータが同定される。例えば、細胞又は無細胞混合物を候補化合物に接触させ、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を、候補化合物の不存在下でのα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルに比較して、評価する。α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が、候補化合物の不存在下よりも存在下において大きい場合、この候補化合物はα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はタンパク質発現の刺激物質として同定される。あるいは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が、候補化合物の不存在下よりも存在下において小さい場合（統計的には著しく少ない）、この候補化合物はα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はタンパク質発現のインヒビターとして同定される。α１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルは、本明細書に記載されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はタンパク質を検出する方法によって、測定できる。
【０２０４】
もう１つの側面において、本発明は、本明細書に記載された２つ以上のアッセイの組み合わせに関する。例えば、調節剤は、細胞ベース又は無細胞アッセイを使用して、同定でき、薬剤のカルシウムチャネル活性調節能は、インビボ、例えば疼痛障害、又は脈拍若しくは外傷性脳損傷に関連する障害の動物モデルのような動物において、確認できる。
【０２０５】
本発明は、更に、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤に関する。従って、本明細書に記載されるような同定された薬剤（例えば、カルシウムチャネル調節剤、本明細書に記載された１つ以上のカルシウムチャネルサブユニットに対応するアンチセンス核酸分子、カルシウムチャネル特異的抗体、又はカルシウムチャネル−結合パートナー）を適切な動物モデルで更に使用して、このような薬剤による治療効率、毒性、副作用、又は作用機序を決定することは、本発明の範囲内である。更に、上記のスクリーニングアッセイによって同定される新規薬剤は、本明細書に記載されたような治療に使用できる。
【０２０６】
本発明の診断アッセイ及び予後診断アッセイは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの発現レベルを評価し、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ分子のヌクレオチド又はアミノ酸配列中の変異及び突然変異を同定する方法を含む。
【０２０７】
発現の監視及びプロファイリング
カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質又は核酸の、生体試料内での存在、レベル、又は不存在は、被験者から生体試料を得ること、及び、この生体試料を、タンパク質又は核酸の存在が生体試料中で検出されるよう、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質又はカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質をコードする核酸（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出可能な化合物又は薬剤に接触させることによって、評価できる。用語「生体試料」には、被験者から単離された組織、細胞及び生体液、並びに被験者中に存在する組織、細胞及び液体、が含まれる。好ましい生体試料は、心臓組織である。カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子の発現レベルは、多数の方法で測定できる。このような方法には、特に限定されないが、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子によってコードされたｍＲＮＡを測定すること、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子によってコードされたタンパク質の量を測定すること、又はカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットによってコードされたタンパク質の活性を測定すること、が含まれる。
【０２０８】
カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子に対応するｍＲＮＡの細胞内レベルは、インサイチュ及びインビトロ型式のいずれでも、測定できる。
【０２０９】
単離ｍＲＮＡは、特に限定されないが、サザン分析又はノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析、及びプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用できる。ｍＲＮＡレベル検出のためのある好ましい診断法は、検出すべき遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と単離ｍＲＮＡとを接触させることを含む。核酸プローブは、例えば本明細書に記載された核酸のような完全長のカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット核酸、又はその一部、例えば長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０又は５００個のヌクレオチドであり且つカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡにストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズするのに充分なオリゴヌクレオチド、であってよい。プローブは、アレイ、例えば下記のアレイのアドレスに配置できる。診断アッセイで使用するその他の適切なプローブは、本明細書に記載される。
【０２１０】
１つの形式において、ｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）は、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上に運び、このｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースのような膜に転移させることによって、表面上に固定化され、プローブに接触させられる。代替的型式において、プローブは、例えば下記に記載する二次元遺伝子シップアレイにおいて、表面上に固定化され、このｍＲＮＡ（又はｃＤＮＡ）はプローブと接触させられる。当業者であれば、公知のｍＲＮＡ検出方法を、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子によってコードされたｍＲＮＡのレベルを検出する用途のために、適合させることができる。
【０２１１】
カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの１つによってコードされる試料中のｍＲＮＡレベルは、核酸増幅、例えばｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ（１９８７）米国特許第４６８３２０２号明細書）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８９−１９３，１９９１）、自立的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８，１９９０）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７，１９８９）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７，１９８８）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５８５４０３３号明細書）又は他のいずれかの核酸増幅法を用い、続いて、当該技術分野における公知技術を使用して増幅分子を検出することで、評価できる。本明細書で使用されるように、増幅プライマーは、遺伝子の５’又は３’領域（それぞれプラス及びマイナス鎖、又はその逆）にアニールでき且つ中間に短い領域を含む核酸分子対であると定義される。一般的に増幅プライマーは、長さが約１０から３０個のヌクレオチドであり、かつ長さが約５０から２００個のヌクレオチドの領域に隣接する。適切な条件下で適切な試薬を用いることにより、このようなプライマーは、このプライマーに隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０２１２】
インサイチュ方法では、細胞又は組織試料は、調製／処理し、支持体、一般にスライドガラスの上に固定化し、続いて、分析すべきカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子をコードするｍＲＮＡにハイブリダイズできるプローブに接触させればよい。
【０２１３】
もう１つの実施態様において、本明細書の方法は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出可能な化合物又は薬剤と、対照試料とを更に接触させること、及び、この対照試料内でのカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在を、試験試料内でのカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在と比較すること、を含む。更にもう１つの実施態様において、米国特許第５６９５９３７号明細書に記載されたような遺伝子発現の連続分析が、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ転写レベルを検出するために、使用される。
【０２１４】
カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子によってコードされるタンパク質のレベルを測定するために、種々の方法が使用できる。一般的に、これらの方法は、試料を、タンパク質に選択的に結合する抗体等の薬剤に接触させることで、この試料内でのタンパク質レベルを評価することを含む。好ましい実施態様において、抗体は、検出可能な標識を担持する。抗体は、ポリクローナルであっても、更に好ましくはモノクローナルであってもよい。無傷な抗体又はそのフラグメント（例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２）は使用できる。プローブ又は抗体に対する用語「ラベルした」は、検出可能な物質をプローブ又は抗体に結合すること（すなわち、物理的に連結すること）によるプローブ又は抗体の直接的ラベル、並びに、検出可能な物質との反応性によるプローブ又は抗体の間接的ラベル、を包含することが意図される。検出可能な物質の例は、本明細書に提供される。
【０２１５】
検出法は、生体試料中のカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質を、インビトロ及びインビボで検出するために使用できる。タンパク質検出用のインビトロ技術には、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）及びウェスタンブロット分析が含まれる。タンパク質検出用のインビボ技術には、被験者に標識付けされた抗カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット抗体を導入することが含まれる。例えば、抗体は、標準撮像技術によって被験者における存在及び位置が検出可能な放射性マーカーによって、ラベルできる。もう１つの実施態様において、試料は、ラベル、例えばビオトゥイーン化され、次に、抗体、例えば（後述するように）抗体アレイに位置決めされた抗カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット抗体に接触させられる。この試料は、例えば蛍光標識に結合されたアビジンによって検出できる。
【０２１６】
もう１つの実施態様において、この方法は、対照試料を、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質を検出可能な化合物又は薬剤に接触させること、及び、対照試料中のタンパク質の存在を試験試料中のタンパク質の存在と比較すること、を更に含む。
【０２１７】
本発明は、生体試料中でカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質の存在を検出するキットも含む。例えば、このキットは、生体試料中でカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質又はｍＲＮＡを検出可能な化合物又は薬剤を含んでよい。化合物又は薬剤は、適切な容器内に包装してよい。キットは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質又は核酸を検出するキットを使用するための説明書を更に含んでもよい。
【０２１８】
抗体に基づくキットに関して、キットは、（１）本発明のマーカーに対応するポリペプチドに結合する（例えば固体担体に取り付けられた）第１抗体、及び任意で、（２）ポリペプチド又は第１抗体に結合し且つ検出可能な薬剤に接合される第２の異なる抗体、を含んでよい。
【０２１９】
オリゴヌクレオチドベースのキットに関して、このキットは、（１）オリゴヌクレオチド、例えば本発明のマーカーに対応するポリペプチドをコードする核酸配列にハイブリダイズする、検出可能にラベルされたオリゴヌクレオチド、又は（２）本発明のマーカーに対応する核酸分子を増幅するために有用なプライマー対、を含んでよい。キットは、緩衝剤、防腐剤、又はタンパク質安定化剤も含んでよい。キットは、検出可能な薬剤を検出するために必要な成分（例えば酵素又は基質）も含んでよい。キットは、検定され含有される試験試料と比較できる、対照試料又は一連の対照試料を含んでもよい。キットの各成分は、個別の容器内に封入してよく、全ての種々の容器は、キットを使用して行われたアッセイの結果を解釈するための説明書と共に、単一の包装内にあってよい。
【０２２０】
本明細書に記載される診断法は、カルシウムチャネル発現又は活性に関連する疾患又は障害を有する又は発症する危険のある、被験者を特定できる。本明細書で使用されるように、用語「望ましくない」は、心不整脈又は心室細動のような生体反応に関与する望ましくない現象を含む。
【０２２１】
１つの実施態様において、カルシウムチャネル発現又は活性に関連する疾患又は障害が同定される。試験試料を被験者から入手し、１つ以上のカルシウムチャネルタンパク質又は核酸（例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を評価するところ、カルシウムチャネルタンパク質又は核酸のレベル、例えば存在又は不存在は、カルシウムチャネル発現又は活性に関連する疾患又は障害を有する又は発症する危険のある、被験者の診断に役立つ。本明細書で使用されているように、「試験試料」は、目的の被験者から得られた、生体液（例えば血清）、細胞試料、又は心臓組織等の組織、を含む生体試料を指す。
【０２２２】
本明細書に記載された予後診断アッセイは、カルシウムチャネル発現又は活性に関連する疾患又は障害を治療するための薬剤（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子又はその他の薬剤候補）を被験者に投与できるか否かを判定するために、使用できる。例えば、このような方法は、被験者が、疼痛障害又は脈拍又は外傷性脳損傷の薬剤で効果的に治療できるか否かを判定するために、使用できる。
【０２２３】
もう１つの側面において、本発明は、デジタルコード化された複数のデータ記録を有するコンピュータ媒体であることを特徴とする。各データ記録には、試料中のカルシウムチャネルの発現又は活性レベルを示す値、及び試料の記述子が含まれる。試料の記述子は、試料の識別子、試料を処理する化合物、試料が由来する被験者（例えば患者）、診断又は治療（例えば好ましい治療）であってよい。好ましい実施態様において、データ記録には、カルシウムチャネル以外の遺伝子（例えば、カルシウムチャネルの活性に関する障害に関連する他の遺伝子、又はアレイ上の他の遺伝子）の発現レベルを示す値が、更に含まれる。データ記録は、表、例えば、関係データベースのようなデータベースの一部である表、として構築できる（例えばＯｒａｃｌｅ又はＳｙｂａｓｅデータベース環境のＳＱＬデータベース）。
【０２２４】
試料を評価する方法も、同様に扱われる。方法は、例えば被験者から試料を用意すること、及び試料の遺伝子発現プロファイルを測定することを含み、このプロファイルは、カルシウムチャネル発現又は活性のレベルを示す値を含む。この方法は、値又はプロファイル（すなわち複数の値）を、基準値又は基準プロファイルと比較することを更に含んでよい。試料の遺伝子発現プロファイルは、（例えば試料から核酸を用意し、核酸をアレイに接触させること、又は試料中のカルシウムチャネルの活性を検定することによって）本明細書に記載された方法のいかなるものによっても、得ることができる。方法は、被験者の心臓病を診断するために使用でき、Ｌ−型カルシウムチャネル発現の変化は、被験者が心臓病を有する又は有する傾向があるという指標である。方法は、被験者の心臓、神経内分泌、又はニューロン（例えば脳又は末梢神経）障害の治療を監視するために使用できる。例えば、遺伝子発現プロファイルは、治療を受けている被験者からの試料に関して測定できる。プロファイルは、基準プロファイル、又は治療前に若しくは障害開始前に被験者から得られたプロファイルと比較できる（例えばＧｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８６：５３１，１９９９参照）。
【０２２５】
更にもう１つの側面において、本発明は試験化合物を評価する方法であることを特徴とする（上記の「スクリーニングアッセイ」も参照）。この方法は、細胞及び試験化合物を用意すること、試験化合物を細胞に接触させること、接触された細胞に関して対象の発現プロファイルを得ること、及び、対象の発現プロファイルを１つ以上の基準プロファイルと比較すること、を含む。プロファイルは、カルシウムチャネル活性又は発現のレベルを示す値を含む。好ましい実施態様において、対象の活性又は発現プロファイルは、標的プロファイル、例えば正常細胞又は細胞の所望の条件のプロファイルと比較される。対象の発現プロファイルが非接触細胞から得られた発現プロファイルよりも標的プロファイルに類似するならば、その試験化合物は、好ましいものと評価される。
【０２２６】
もう１つの側面において、本発明は、被験者を評価する方法であることを特徴とする。この方法は、：ａ）被験者、例えば被験者の試料を取得する介護者等の介護者から、試料を得ること、ｂ）試料用に対象の発現プロファイルを測定することを含む。任意に、方法は、ｃ）対象の発現プロファイルを１つ以上の基準発現プロファイルと比較するステップ、及びｄ）対象の基準プロファイルに最も類似する基準プロファイルを選択するステップ、のいずれか又は両方を更に含んでよい。対象の発現プロファイル及び基準プロファイルは、カルシウムチャネル活性又は発現レベルを示す値を含む。２つの基準プロファイルを比較するために、種々の定常統計的測定が使用できる。１つの可能な計量は、２つのプロファイル間の差である距離ベクトルの長さである。対象及び基準プロファイルの各々が多次元ベクトルとして示され、各次元はプロファイルの値である。
【０２２７】
方法は、結果を介護者に伝達することを更に含んでよい。この結果は、対象の発現プロファイル、対象の発現プロファイルと他のプロファイルとの比較の結果、最も類似する基準プロファイル、又は前述のいずれかの記述子であってよい。結果は、コンピュータネットワークを通じて伝達できる。例えば、結果は、コンピュータ送信、例えば搬送波に埋め込まれたコンピュータデータ信号形状であってよい。
【０２２８】
以下のステップを実行するための実行可能なコードを有するコンピュータ媒体も、特徴である。対象の発現プロファイル（例えば本明細書に記載された任意の対象の発現プロファイル）を受け、基準発現プロファイルのデータベースにアクセスし、ｉ）対象の発現プロファイルに最も類似する整合基準プロファイルを選択する、又はｉｉ）対象の発現プロファイルの少なくとも１つの基準プロファイルへの類似性に関して少なくとも１つの比較点数を決定する。対象の発現プロファイル及び基準発現プロファイルの各々は、カルシウムチャネル活性又は発現レベルを示す値を含む。
【０２２９】
アレイ及びその使用
もう１つの側面において、本発明は、複数のアドレスを有する基質を含むアレイであることを特徴とする。複数の中の少なくとも１つのアドレスは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットに対応する分子、例えばカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸又はポリペプチド、に特異的に結合する捕捉プローブを含む。アレイは、少なくとも１０、１００、１０００又は１００００若しくはそれ以上、又はこれらの間の範囲のアドレス／ｃｍ２の密度を有してよい。基質は、スライドガラス、ウェーハ（例えばシリカ又はプラスチック）、質量分析プレートのような二次元基質、又はゲルパッドのような三次元基質であってよい。複数のアドレスに加え、アドレスはアレイ上に配置できる。
【０２３０】
好ましい実施態様において、複数の中の少なくとも１つのアドレスは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸、例えばセンス又はアンチセンス鎖、に特異的にハイブリダイズする核酸捕捉プローブを含む。複数のアドレスのアドレスサブセットは、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットをコードするカルシウムチャネル遺伝子の核酸捕捉プローブであってよい。サブセットの各アドレスは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸の異なる領域にハイブリダイズする捕捉プローブを含んでよい。アレイは、ハイブリダイゼーションにより遺伝子の配列決定をするために使用できる（例えば米国特許第５６９５９４０号明細書参照）。
【０２３１】
アレイは、種々の方法、例えばフォトリソグラフィー法（例えば米国特許第５１４３８５４、５５１０２７０及び５５２７６８１号明細書参照）、機械的方法（例えば米国特許第５３８４２６１号明細書に記載されたような定方向フロー法）、（米国特許第５２８８５１４号明細書に記載されたような）ピンベースの方法、及びビーズベースの技術（例えば国際出願第ＰＣＴ  ＵＳ／９３／０４１４５号明細書に記載されたような）によって、生成できる。
【０２３２】
もう１つの実施態様において、複数の中の少なくとも１つのアドレスは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチド又はそのフラグメントに特異的に結合するポリペプチド捕捉プローブを含む。ポリペプチドは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドの自然発生相互作用パートナーであってよい。好ましくは、ポリペプチドは、例えばモノクローナル抗体又は単鎖抗体といった、本明細書に記載された抗体である（「抗カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体」参照）。
【０２３３】
もう１つの側面において、本発明は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの発現を分析する方法であることを特徴とする。この方法は、上記のアレイを用意すること、アレイを試料に接触させること、及び、アレイへのカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ分子（例えば核酸又はポリペプチド）の結合を検出すること、を含む。任意に、方法は、試料からの核酸を、アレイとの接触前又は接触中に増幅することを更に含む。
【０２３４】
もう１つの実施態様において、アレイは、アレイ中の遺伝子の組織特異性を解明するため、組織中で遺伝子発現、特にカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットの発現を検定するために使用できる。種々の充分数の試料を分析するならば、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットと同時に調節される他の遺伝子を同定するために、クラスター化（例えば階層的クラスター化、ｋ−平均クラスター化、ベイズのクラスター化）が使用できる。例えば、アレイは、複数遺伝子の発現の定量化のために使用できる。このように、組織特異性のみならず、組織内の一連の遺伝子の発現レベルも解明される。定量的データは、その組織発現自体及びその組織内の発現レベルに基づいて、遺伝子をグループ化（例えばクラスター）するために使用できる。
【０２３５】
例えば、遺伝子発現のアレイ分析は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット発現による細胞−細胞相互作用の効果を評価するために使用できる。第１組織を摂動させ、第１組織と相互作用する第２組織からの核酸を分析できる。このような状況において、ある細胞タイプが生物的刺激に応答して他の細胞タイプに与える効果は、例えば遺伝子発現レベルで細胞−細胞相互作用の効果を監視するために、決定される。
【０２３６】
もう１つの実施態様において、細胞は、治療薬に接触させられる。細胞の発現プロファイルはアレイを使用して測定され、発現プロファイルは、治療薬に接触しなかった同様の細胞のプロファイルと比較される。例えば、アッセイは、治療薬の望ましくない効果の分子機序を決定及び分析するために使用できる。治療薬がある細胞タイプを治療するために治療上投与されているが、他の細胞タイプに対しては望ましくない効果を有するならば、本発明は、望ましくない効果の分子機序を決定するアッセイを提供し、これにより、反作用する薬剤を同時投与するか、さもなければ望ましくない効果を処置する機会を提供する。同様に、単一の細胞タイプ内でさえ、望ましくない生物学的効果は分子レベルで決定できる。従って、薬剤が標的遺伝子以外の発現に与える効果は、解明して中和できる。
【０２３７】
もう１つの実施態様において、アレイは、アレイ中の１以上の遺伝子の発現を経時的に監視するために、使用できる。例えば、様々な時点から得られた試料は、アレイによって検査できる。このような分析によって、カルシウムチャネル活性に関連する疾患又は障害の発達を特定及び／又は特徴付けできる。同様に、この方法によれば、カルシウムチャネル活性に関連する疾患又は障害の治療及び／又は進行が評価できる。
【０２３８】
アレイは、正常細胞及び異常細胞における、１つ以上の遺伝子のディファレンシャル発現パターンを解明するために有用である。これにより、診断又は治療的介入の分子標的として役立ち得る一連の遺伝子（例えば、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットコードする遺伝子が含まれる）が提供される。
【０２３９】
もう１つの側面において、本発明は、複数のアドレスを有するアレイであることを特徴とする。複数の各アドレスは、単一のペプチドを含む。複数の中の少なくとも１つのアドレスは、その上に、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチド又はそのフラグメントを配置する。ポリペプチドアレイを製造する方法は、当該技術分野において、例えばＤｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：９８９−９９４，２０００、Ｌｕｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１，１９９９、Ｇｅ，Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：ｅ３，Ｉ−ＶＩＩ，２０００、ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓ．Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３，２０００、及び国際公開第ＷＯ９９／５１７７３号パンフレットに記載されている。好ましい実施態様において、複数の各アドレスは、その上に、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチド又はそのフラグメントに、少なくとも６０％−９９％同一であるポリペプチドを配置している。例えば（例えば対立遺伝子変異体、部位特異的突然変異体、ランダム突然変異体、又はコンビナトリアル突然変異体によってコードされる）カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドの複数の変異体が、複数の個別アドレスに配置できる。
【０２４０】
ポリペプチドアレイは、カルシウムチャネル結合化合物（例えばカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡポリペプチドに特異性を有する被験者の試料からの抗体）、又はカルシウムチャネル−結合タンパク質若しくはリガンドの存在を検出するために、使用できる。
【０２４１】
もう１つの側面において、本発明は複数のプローブを分析する方法であることを特徴とする。この方法は、例えば遺伝子発現を分析するために有用である。
方法は、各アドレスが、独特の捕捉プローブを有する複数の他の各アドレスから、互いに位置的に区別できる、複数のアドレスを有する二次元アレイを用意することを含み、ここで、捕捉プローブは、例えば、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを含むカルシウムチャネルを発現する細胞又は被験者、又は、例えばカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸又はタンパク質と細胞との接触、又は細胞又は被験者へのカルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸又はタンパク質の投与によって、カルシウムチャネル媒介応答が発現した細胞又は被験者、に由来するものであり、
各アドレスが、複数の他の各アドレスから互いに位置的に区別でき、独特の捕捉プローブを有する、複数のアドレスを有する二次元アレイを用意することを含み、ここで、捕捉プローブは、例えば、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを発現しない（又は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニット陽性の複数の捕捉プローブの場合ほど高度には発現しない）細胞又は被験者、又は、カルシウムチャネル媒介応答が発現しなかった（又は第１の試料よりも狭い範囲で発現した）細胞又は被験者、に由来するものであり、
アレイを（好ましくは、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸、ポリペプチド又は抗体以外である）１つ以上の照会プローブに接触させること、及び、これにより複数の捕捉プローブを評価することを含む。例えば核酸の場合には、結合、及び複数のアドレスでの捕捉プローブとのハイブリダイゼーションは、例えば核酸、ポリペプチド又は抗体に取り付けられた標識のシグナル生成によって検出される。
【０２４２】
もう１つの側面において、本発明は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを分析する方法、例えば構造、機能、又は他の核酸若しくはアミノ酸配列への関連性を分析する方法であることを特徴とする。この方法は、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸又はアミノ酸配列を用意すること、この配列を、例えば核酸又はタンパク質配列データベースといった配列集合からの一配列、好ましくは複数の配列と比較して、カルシウムチャネルα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットを分析すること、を含む。
【０２４３】
検出アッセイ
本明細書で同定されるｃＤＮＡ配列の一部又はフラグメント（及び対応する完全な遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として、多数の方法によって使用できる。
【０２４４】
例えば、ポリヌクレオチド試薬は、診断アッセイ、予後診断アッセイに使用でき、臨床試験の監視は予後診断（予測）目的で使用され、これにより予防的に個体を治療する。従って、本発明の１つの側面は、個体が疾患又は障害に苦しんでいるか、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ発現又は活性に関連した異常又は望まない障害を発症する恐れがあるか否かを決定するために、生体試料（例えば、血液、血清、細胞、組織）の状況で、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質及び／又は核酸の発現並びにα１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性を測定するための診断アッセイに関する。本発明は、個体がα１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質、核酸の発現、又は活性に関連した障害を発症する危険があるか否かを決定するための予後診断（予測）アッセイも提供する。例えば、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットをコードする遺伝子の突然変異は、生体試料において検定され、予後診断又は予測目的で使用できる。
【０２４５】
本発明のもう１つの側面は、薬剤（例えば薬剤、化合物）がインビボでα１Ｄ＋ＫＩＶＡ発現又は活性に与える影響の監視に関する。
【０２４６】
薬剤（例えば薬剤）がα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質の発現又は活性（例えば膜興奮性の調節）に与える影響を監視することは、基礎的な薬剤スクリーニングだけでなく、臨床試験にも応用できる。例えば、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイによってα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子発現、タンパク質レベルを増加する又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性を上方制御すると決定された薬剤の有効性は、減少又は増加したα１Ｄ＋ＫＩＶＡ遺伝子発現、タンパク質レベル、又は下方制御されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡを示す被験者の臨床実験において監視できる。例えば、カルシウムチャネルに関連する障害に関与するその他の遺伝子は、特定の細胞の表現型マーカーとして使用できる。
【０２４７】
治療法
本発明のもう１つの側面は、治療目的でα１Ｄ＋ＫＩＶＡ発現又は活性を調節する方法に関する。従って、模範的な実施例では、本発明の調節法は、細胞を、α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質、又はこの細胞に関連するα１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質の活性の１つ以上を調節する薬剤に、接触させることを含む。α１Ｄ＋ＫＩＶＡサブユニットタンパク質活性を調節する薬剤は、核酸又はタンパク質、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質の自然発生標的分子（例えばα１Ｄ＋ＫＩＶＡ基質）、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体、α１Ｄ＋ＫＩＶＡアゴニスト又はアンタゴニスト、α１Ｄ＋ＫＩＶＡアゴニスト又はアンタゴニストのペプチドミメティック、その他の小分子、といった本明細書に記載された薬剤であってよい。１つの実施態様において、薬剤は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性の１つ以上を刺激する。このような刺激薬剤の例には、活性α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質、及び細胞に導入されたα１Ｄ＋ＫＩＶＡをコードする核酸分子が含まれる。もう１つの実施態様において、薬剤は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性の１つ以上を抑制する。このような抑制薬剤の例には、アンチセンスα１Ｄ＋ＫＩＶＡ核酸分子、抗α１Ｄ＋ＫＩＶＡ抗体、及びα１Ｄ＋ＫＩＶＡインヒビターが含まれる。これらの調節法は、（例えば細胞を薬剤とともに培養することによって）インビトロで、あるいは（例えば薬剤を被験者に投与することによって）インビボで、行うことができる。このように、本発明は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質又は核酸分子の異常又は望ましくない発現若しくは活性を特徴とする、疾患又は障害に苦しむ個体を治療する方法を提供する。１つの実施態様において、方法は、薬剤（例えば、本明細書で記載されるスクリーニングアッセイによって同定される薬剤）、又はα１Ｄ＋ＫＩＶＡ発現又は活性を調節する（例えば、上方制御又は下方制御する）薬剤を組み合わせて、投与することを含む。もう１つの実施態様において、方法は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡタンパク質又は核酸分子を、減少した又は異常なα１Ｄ＋ＫＩＶＡ発現又は活性を補償するための治療として、投与することを含む。
【０２４８】
α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性の刺激は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡが異常に下方調節される状況、及び／又は、α１Ｄ＋ＫＩＶＡ活性が増加すると有益な効果をもたらすであろう状況、において望ましい。活性の拮抗も同じく望ましくなり得る。例えば、モジュレータは、心調律の調節に望ましい場合がある。
【０２４９】
医薬組成物
本明細書で使用されるように、本発明の組成物、例えば本明細書に記載された方法により同定されたカルシウムチャネルモジュレータは、薬理学的に許容し得る誘導体又はプロドラッグを含むものと定義される。「薬理学的に許容し得る誘導体又はプロドラッグ」は、本発明の化合物の任意の薬理学的に許容し得る塩、エステル、エステル塩、本発明の化合物を（直接的又は間接的に）受容体への投与後に提供できる、本発明の化合物のその他の誘導体を意味する。特に好ましい誘導体及びプロドラッグは、このような化合物が哺乳動物に投与されたときに（例えば、経口投与された化合物を血液中に吸収されるのを更に容易にすることによって）本発明の化合物の生物学的利用能を増加させるもの、又は親種比べて生物学的区画（例えば脳、又はリンパ系）への親化合物の送達を増強するものである。好ましいプロドラッグには、水溶解度又は腸膜を介した能動輸送を増強する基が、本明細書に記載された式の構造に付加された誘導体が含まれる。
【０２５０】
本発明の化合物は、選択的生物特性を増強するために適切な機能性を付加することによって、修飾してよい。このような修飾は、当該技術分野では公知であり、所与の生物学的区画（例えば脳、又はリンパ系、中央神経系）への生物的浸透を増加させ、経口利用性を向上させ、注射による投与を可能にし、代謝を変更し、排泄速度を変更するために溶解度を増加させるものが含まれる。
【０２５１】
本発明の化合物の薬理学的に許容し得る塩は、薬理学的に許容し得る無機及び有機の酸及び塩基に由来したものが含まれる。適切な酸性塩の例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩（ｃａｍｐｈｏｒａｔｅ）、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシルスルフェート、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタノエート、グリコール酸塩、ヘミスルフェート（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタノエート、ヘキサノエート、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコトゥイーン酸塩、硝酸塩、パーモエート（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクトゥイーン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカノエートが含まれる。シュウ酸等の他の酸は、それ自体は薬理学的に許容されないが、本発明の化合物及びその薬理学的に許容し得る酸添加塩を得る際に、中間体として有用な塩の調製に使用できる。適切な塩基から誘導される塩には、アルカリ金属（例えばナトリウム）、アルカリ土類金属（例えばマグネシウム）、アンモニウム及びＮ−（アルキル）４＋塩が含まれる。本発明は、本明細書に開示された化合物の任意の塩基性窒素含有基の四級化も予見する。水溶性若しくは油溶性又は分散性の生成物は、このような四級化によって得られる。本明細書の任意の式の化合物の塩形状は、カルボキシ基（例えばＬ−アルギニン、Ｌ−リシン、Ｌ−ヒスチジン塩）のアミノ酸塩であってよい。
【０２５２】
本明細書に記載された式の化合物は、例えば静脈内、動脈内、真皮下、腹腔内、筋肉内、又は皮下に注射することによって、又は経口、口腔内、経鼻、経粘膜、局所で、点眼薬で、又は吸入によって、体重１キロ当たり約０．５〜約１００ｍｇの服用量、あるいは４〜１２０時間毎に一服当たり１ｍｇ〜１０００ｍｇの服用で、又は特定の薬剤の要件に従って、投与できる。本明細書の方法では、所望の又は一定の効果を達成するために、有効量の化合物又は化合物組成物の投与が考慮される。一般に、本発明の医薬組成物は、１日当たり約１から約６回、又は連続輸液として投与される。このような投与は、慢性又は急性治療としても使用できる。１回の投与形状を生成するために担体材料に混合される活性成分量は、治療される宿主及び特定の投与方式に応じて、変化する。典型的な製剤は、約５％から約９５％（ｗ／ｗ）の活性化合物を含む。あるいは、このような製剤は、約２０％から約８０％の活性化合物を含む。
【０２５３】
以上に列挙した用量よりも低い又は高い用量が、必要とされる場合がある。いかなる特定患者に対する特殊な服用量及び治療計画は、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、排泄速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度及び経過、状態又は症状、患者の疾患、状態又は症状の性質、及び治療を行う医師の判断を含む、種々の要因に依存する。
【０２５４】
必要であれば、患者の状態の改善後、本発明の化合物、組成物、又は組み合わせの維持量を投与してもよい。その後、症状が所望のレベルまで緩和された場合、投与の量若しくは頻度、又は両方は、症状に応じて、改善された状態が維持されるレベルまで減少してよい。しかしながら、患者が、疾患の症状の再発後、長期にわたり断続的な治療を必要とする場合もある。
【０２５５】
本明細書で説明した組成物は、本明細書で説明した式の化合物、並びに追加の治療薬があればこの追加の治療薬を、イオンチャネル媒介障害又はその症状を含む疾患又は疾患の症状を調節できる有効な量、含有する。
【０２５６】
用語「薬理学的に許容し得る担体又はアジュバント」は、本発明の化合物と共に患者に投与できる担体又はアジュバントであって、治療量の化合物を送達するのに充分な用量で投与されたときに、その薬理活性を破壊せず、非毒性である担体又はアジュバントを指す。
【０２５７】
本発明の医薬組成物に使用できる薬理学的に許容し得る担体、アジュバント及び媒体には、特に限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシトゥイーン、コハク酸ｄ−α−トコフェロールポリエチレングリコール１０００、トゥイーンその他の類似したポリマー送達マトリックスのような医薬投与形状で使用される界面活性剤等の自己乳化性薬物送達システム（ＳＥＤＤＳ）、ヒト血清アルブミン等の血清タンパク質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水等の緩衝物質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ボリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛油等の塩又は電解質が含まれる。α−、β−、及びγ−シクロデキストリンといったシクロデキストリン、又は、２−及び３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリンといった化学的に修飾された誘導体、その他の可溶化誘導体も、本明細書に記載された式の化合物の送達を強化するために好適に使用できる。
【０２５８】
本発明の医薬組成物は、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、直腸、経鼻、口腔内、経膣又は移植されたリザーバを経由して、好ましくは経口投与又は注射投与によって、投与できる。本発明の医薬組成物は、従来の非毒性で薬理学的に許容し得る担体、アジュバント又は媒体、の任意のものを含んでもよい。薬理学的に許容し得る酸、塩基又は緩衝液によって、製剤のｐＨを調整して、配合された化合物又はその送達形状の安定性を強化してよい場合もある。本明細書で使用されるような非経口という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液包内、胸骨内、クモ膜下、病巣内及び頭蓋内への、注射又は輸液技術を含む。
【０２５９】
医薬組成物は、滅菌注射用製剤、例えば、滅菌注射可能な水性又は油性の懸濁液のような形状であってもよい。この懸濁液は、当該技術分野において公知の技術に従って、適切な分散剤又は湿潤剤（例えばトゥイーン８０）、及び懸濁剤を使用して、処方できる。滅菌注射可能な製剤は、滅菌注射可能な、溶液、又は、例えば１、３−ブタンジオール溶液のような非経口で無毒性の許容し得る希釈液又は溶剤中の懸濁液であってもよい。使用可能な許容し得る媒体及び溶剤には、マンニトール、水、リンガー液、及び生理食塩液がある。更に、滅菌不揮発性油は、溶剤又は懸濁媒として、従来使用されている。このために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含むあらゆる無刺激不揮発性油が使用できる。オレイン酸等の脂肪酸及びそのグリセリド誘導体は、オリーブ油又はヒマシ油が、特にそのポリオキシエチル化の形で薬理学的に許容し得る天然油であるので、注射液の調製に有用である。これらの油剤又は懸濁液は、長鎖アルコール希釈液及び分散剤、又はカルボキシメチルセルロース、又はエマルジョン又は懸濁液のような薬理学的に許容し得る投与形状の処方に通常使用される類似する分散剤、を含んでもよい。トゥイーン又はスパン（Ｓｐａｎ）及び／又は他の類似する乳化剤のようなその他の通常使用される界面活性剤、又は薬理学的に許容し得る固体、液体その他の投与形状の製造に通常使用される生物活性エンハンサーも、処方のために使用できる。
【０２６０】
本発明の医薬組成物は、特に限定されないが、カプセル、錠剤、エマルジョン及び水性懸濁液、分散剤及び溶液を含む、経口的に許容し得るあらゆる投与形状で、経口投与できる。経口用の錠剤の場合、通常使用される担体は、ラクトース及びコーンスターチを含む。ステアリン酸マグネシウムのような平滑剤も、一般に添加される。カプセル形状での経口投与に関して、有用な希釈液は、ラクトース及び乾燥コーンスターチを含む。水性懸濁液及び／又はエマルジョンが経口で使用される場合、活性成分は、油相で懸濁又は溶解し、乳化剤及び／又は懸濁剤と混合してよい。所望ならば、ある種の甘味料及び／又は香味料及び／又は着色剤が添加されてもよい。
【０２６１】
本発明の医薬組成物は、直腸投与用の坐薬の形状で投与してもよい。これらの組成物は、本発明の化合物を、室温では固体であり且つ直腸温度では液体であって、直腸内で融解して活性成分を放出する適切な非刺激性賦形剤とともに、混合することによって調製できる。このような材料には、カカオ脂、蜜蝋、及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０２６２】
本発明の医薬組成物の局所投与は、所望される治療が、局部適用によって容易に到達できる領域又は器官に関連する場合に有用である。皮膚に局所適用するためには、医薬組成物は、担体中に懸濁又は溶解された活性成分を含む適切な軟膏で処方するべきである。本発明の化合物の局所投与用担体には、特に限定されないが、鉱油、流動石油、白色石油、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化蝋、及び水が含まれる。あるいは、医薬組成物は、適切な乳化剤により担体中に懸濁又は溶解された活性化合物を含む適切なローション及びクリームで処方してもよい。適切な担体には、特に限定されないが、鉱油、ソルビタンモノステアリン酸、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が含まれる。本発明の医薬組成物は、肛門坐薬製剤又は適切な浣腸製剤によって、下部腸管に局所適用してもよい。局所経皮パッチも本発明に含まれる。
【０２６３】
本発明の医薬組成物は、鼻エアロゾール又は吸入によって投与してよい。このような組成物は、医薬製剤の技術分野で周知の技術によって調製され、ベンジルアルコールその他の適切な防腐剤、生物学的利用能を強化する吸収促進剤、フルオロカーボン及び／又は当該技術分野で公知であるその他の可溶剤又は分散剤を用いて、塩類溶液として調製してもよい。
【０２６４】
本明細書の式の化合物、及び追加の薬剤（例えば治療薬）を有する組成物は、移植可能な装置を使用して投与できる。移植可能な装置及び関連する技術は、当該技術分野において公知であり、本明細書で説明した化合物又は組成物の連続送達又は徐放送達が望まれる場合に、送達システムとして有用である。更に、移植可能装置送達システムは、化合物又は組成物の送達の特定点（例えば局在化部位、器官）を標的にするために有用である（Ｎｅｇｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（６）：５６３（２００１）参照）。交互送達法を含む徐放技術も、本発明において使用できる。例えば、ポリマー技術に基づく徐放処方、持続放出技術及びカプセル化技術（例えば、ポリマー、リポソーム）も、本明細書で説明された化合物及び組成物を送達するために使用できる。
【０２６５】
本明細書の活性化学療法混合物を送達するためのパッチも、本発明の範疇である。パッチは、材料層（例えばポリマー、布、ガーゼ、包帯）、及び本明細書の製剤の化合物を含む。材料層の一方の側面は、この材料層に接着された保護層を含んでよく、これにより、化合物又は組成物の通過に耐えることができる。パッチは、パッチを被験者の定位置に保持するための接着剤を更に含んでよい。接着剤は、被験者の皮膚に接触されると、一時的に皮膚に接着する組成物であり、天然又は合成由来のものが含まれる。それは防水性であってもよい。長時間に亘って被験者の皮膚とパッチとの接触状態を保つために、接着剤がパッチ上に配置されてもよい。接着剤は、偶然接触しやすい位置に装置を保持するが、積極的行為（例えば引き裂き、剥がしその他の意図的な除去）を受けると、装置又は接着剤自体に負荷された外力に屈して、接着的接触を中断するように、粘着又は接着力を有するように作製できる。接着剤は、感圧性であってもよく、つまり、これにより、接着剤又は装置に圧力を加える（例えば押圧、摩擦）と、接着剤（及び皮膚に接着される装置）の皮膚に対する位置決めができる。
【０２６６】
本発明の組成物が、本明細書に記載された製剤の化合物及び１つ以上の追加の治療薬剤又は予防的薬剤の混合物を含む場合、化合物及び追加の薬剤は、いずれも、単独投与計画で通常投与される服用量の約１〜１００％、より好ましくは約５〜９５％の服用量レベルで存在すべきである。追加の薬剤は、本発明の化合物とは別に、複数投与計画の一部として、別個に投与してもよい。あるいは、これらの薬剤は、単独投与形式の一部で、単一組成物中で本発明の化合物と共に混合してもよい。
【０２６７】
以上に記載された化合物及び方法は、カルシウムチャネル機能の治療的調節に使用できる。
【０２６８】
【表１】
2007525968.tif 000002
【０２６９】
本明細書で言及された全ての参考文献は、印刷、電子、コンピュータ読み取り可能記憶媒体、特に限定されないが、アブストラクト、論文、機関紙、出版物、テキスト、専門書、インターネットウェブサイト、データベース、ソフトウェアパッケージ、特許及び特許公開を含むその他の形状のいずれであっても、その全体が参考として明確に組み込まれる。本発明の多数の実施態様は記載されている。しかしながら、種々の修正が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、行われてよいことが理解されるであろう。従って、その他の実施態様は、請求項の範囲内にある。