(57)【要約】  一般外科、形成外科、及び神経外科での埋込型材料として用いる熱変性微生物由来セルロース材料について記載する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療又は外科用途の埋込型材料又は局所材料を作製する方法であって：
ａ）微生物由来セルロースを提供するステップと；
ｂ）前記セルロースを非発熱性にするために、前記微生物由来セルロースを処理するステップと；
ｃ）前記微生物由来セルロースを0℃未満の温度にさらし、次に前記微生物セルロースを、０℃を超える温度にさらすことにより、前記微生物由来セルロースを部分脱水するステップと；
ｄ）次に除去された液体を廃棄するステップと；
を含む方法。
【請求項２】
微生物由来セルロースが細菌のAcetobacter xylinumにより作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記微生物由来セルロースを処理するステップが、化学洗浄を用いることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
化学洗浄が水酸化ナトリウムを用いる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
水酸化ナトリウム濃度が約0.1M〜約4Mである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
温度が約1時間〜約60日間、0℃又はそれ以下であり続ける、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
次の温度が約1時間〜約60日間、０℃より高くあり続ける、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
どちらの温度も約1〜約21日間、不変である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ａ）埋込型材料として用いるために、請求項１に記載の方法で作製された微生物由来セルロースと；
ｂ）前記微生物由来セルロースを含有する防湿包装と；
を含むキット。
【請求項１０】
前記微生物由来セルロースがガンマ照射により滅菌される、請求項１に記載の埋込型材料。
【請求項１１】
組織増強の方法であって：
ａ）請求項１に記載の方法により作製された微生物由来セルロースを含む埋込型材料を提供するステップと；
ｂ）前記材料をその必要がある対象に移植するステップと；
を含む方法。
【請求項１２】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する組織代用品を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する埋込型充填剤を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する埋込型外科用メッシュを構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する組織修復剤を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）パッド内に残存する液体を有機溶媒と交換するステップと；
ｂ）有機溶媒を超臨界流体と交換するステップと；
ｃ）超臨界流体をガスとして除去するステップと；
を含む、微生物由来セルロースをさらに乾燥型に処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
有機溶媒がメタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、及びその混合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
交換を約10分〜約60日間の期間行う、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記期間が約30分〜約7日間である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
超臨界流体が二酸化炭素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
圧力が約1000psi〜約4000psiである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記圧力が約1500psi〜約2500psiである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
所望の圧力時間が約30分〜約7日間である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
当該時間長約1時間〜約6時間である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）埋込型材料として用いるために、請求項１６に記載の方法で作製された微生物由来セルロースと；
ｂ）前記微生物由来セルロースを含有する防湿包装と；
を含むキット。
【請求項２６】
請求項１６に記載の方法で作製された微生物由来セルロースを含み、前記微生物由来セルロースが非発熱性である、生体内埋込型材料。
【請求項２７】
前記微生物由来セルロースがガンマ照射又はエチレンオキシドにより滅菌される、請求項１６に記載の生体内埋込型材料。
【請求項２８】
組織増強の方法であって：
ａ）請求項１６に記載の方法により作製された微生物由来セルロースを含む埋込型材料を提供するステップと；
ｂ）前記材料をその必要がある対象に移植するステップと；
を含む方法。
【請求項２９】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する組織代用品を構成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する埋込型充填剤を構成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する埋込型外科用メッシュを構成する、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
材料が一般外科、形成外科、又は神経外科に適する組織修復剤を構成する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が参照により本明細書に組み入れられている、2003年8月22日に提出された米国仮出願番号60/497,064の利益を請求する。
【０００２】
本発明は、多糖類材料、より詳細には、医療及び外科用途に適する移植特性を有する微生物由来セルロースに関する。本発明は、組織修復材料、ヒト組織代用品、ならびに形成・再建外科及び神経外科のインプラントとしての微生物由来セルロースの使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
医療分野における合成材料の埋込型装具としての広範囲における使用は、十分実証されてきた。これらの埋込型合成材料は一般に、2つの主要群、すなわち一時的／生体吸収性と長期インプラント／非生体吸収性に分けられる。生体吸収性合成材料の例は、外科用縫合糸として長期間用いられているポリ1-乳酸（PLLA）及びポリ1-グリコール酸（PLGA）を含む高分子を含む。米国特許第6,031,148号に記載されたように、当該材料から目的とする用途に応じて、フィルム、メッシュ、さらに複雑な三次元構造が作製されてきた。
【０００４】
長期埋込型及び非生体吸収性材料の例は、血管グラフト（米国特許第5,718,973号）、組織修復シート及びパッチ（米国特許第5,433,996号）を含む広範囲の医療用埋込型物品で用いられてきたポリ（テトラフルオロエチレン）PTFEである。高分子ハイドロゲルも、外科用インプラントに利用され（米国特許第4,836,884号）；軟組織及び血管代用品としての用途が見出されている。
【０００５】
当該材料には各々、適切なインプラント材料になるにあたり、ある物理的特徴がある。当該特性は、特定の用途に特に重要でありうる良好な生体適合性、強度、化学薬品安定性などを含む。例えばRTFEには、管状グラフトの製造に重要である、強度及び相互接続微小繊維構造がある。含水率が高いため生体組織と表面類似性がある合成ハイドロゲルは、炎症が周囲組織に対して最小限であり、プロテーゼ装具として理想的である。しかしながら、当該合成材料は、物理的及び生化学的特性の範囲が限定されることも含め、制限及び欠点もある。それゆえ特定の外科用途にさらに適した代替材料を開発する必要がある。
【０００６】
ビスコース又は再生セルロースの埋込型物品としての使用は公知である。複数の研究者が、セルロース及びその誘導体の組織生体適合性の研究（Miyamoto, T. et al., Tissue Biocompatibility of Cellulose and its derivatives. J. Biomed. Mat. Res., V.23, 125-133（1989））、並びに当該材料のある特定の用途の調査がなされた。酸化型再生セルロースは、止血剤及び接着バリアとして長年用いられており（Dimitrijevich, S. D., et al. In vivo Degradation of Oxidized regenerated Cellulose. Carbohydrate Research, V.198, 331-341（1990）, Dimitrijevich, S.D., et al. Biodegradation of Oxidized regenerated Cellulose Carbohydrate Research, V.195, 247-256（1990））、非酸化再生セルロースよりも極めて高速で分解することが公知である。Martsonらにより研究されたセルローススポンジは皮下移植されると、骨との生体適合性及び結合組織形成を示した（Martson, M., et al., Is cellulose sponge degradable or stable as an implantation material? An in vivo subcutaneous study in rat. Biomaterials, V.20, 1989-1995（1999）, Martson, M., et al., Connective Tissue formation in Subcutaneous Cellulose sponge implants in rats. Eur. Surg. Res., V.30, 419-425（1998）, Martson, M., et al., Biocompatibility of Cellulose Sponge with Bone. Eur. Surg. Res., V.30 , 426-432（1998））。著者らは、セルロース材料が存続可能な長期安定性インプラントでありうると概説している。セルロースの他の形態及び誘導体も調査されている（Pajulo, O. et al. Viscose cellulose Sponge as an Implantable matrix:Changes in the structure increase production of granulation tissue. J. Biomed. Mat. Res., V.32, 439-446（1996）。
【０００７】
しかしながら従来技術では、ある単細胞生物が生成する独自形態のセルロースの使用可能性は挙げていない。この点、ある微生物が生成する微生物セルロースは、100年以上公知で研究されてきた。微生物由来セルロースは、ハイドロゲルと類似して含水率が高く、PTFEのような著しい強度を含め、植物セルロースにはない明確な特徴がある。微生物セルロースは、各種の形状又は寸法に合成でき、形状保持力が優れている。当該特性はほとんど、独自の薄層微小繊維三次元構造に帰する。不織態様に配置された微小繊維は、綿繊維のような植物セルロースよりも約200倍細く、単位体積当たりの表面積は非常に大きい。
【０００８】
多数の新規な特性があっても、微生物セルロースは十分に利用されておらず、それゆえ用途の提案は限定されてきた。例えば医療分野における微生物由来セルロースの使用は、液体装填パッド（米国特許第4,788,146号）、創傷被覆材（米国特許第5,846,213号）、及び他の局所用途（米国特許第4,912,049号）に限定されている。Melloら（Mello, L.R., et al., Duraplasty with Biosynthetic Cellulose: An Experimental Study. Journal of Neurosurgery, V.86, 143-150（1997））は、（米国特許第4,912,049号）に記載のものに類似の、実験的動物試験での硬膜形成材料としての生合成セルロースの使用を開示した。彼らは、乾燥型微生物由来セルロースが硬膜代用品に適する結果を示した。しかしながら、Melloらの開示した材料は、発熱物質除去ステップがなく、材料は、当初は局所用途のために開発された米国特許第4,912,049号（BIOFILL（商標）創傷被覆材）で記載のように、伸張されている間に完全に乾燥される。これに対して、本発明は非発熱性埋込型材料を提供し、外科用メッシュを部分脱水するために熱的脱水方法を用いる。これは、従来から開示されたセルロース性材料では利用できない本発明に優れた適合性及び吸収特性を与える。
【０００９】
本発明の別の態様によれば、微生物セルロースを乾燥する方法が各種記載された。Blaneyらは米国特許第5,580,348号及び第5,772,646号で、平均孔径が約0.1〜約10ミクロンの微生物多糖類を含む吸収性材料について記載する。吸収性材料は、微生物多糖類が生成される場合の水性培地を大部分除去するため、微生物多糖類の超臨界二酸化炭素乾燥を含む工程で作製される。
【００１０】
Blaneyらの生成物及び工程は、本発明者らが見出した本生成物及び工程とは異なる。本発明者らは、微生物由来セルロースを液体の温度誘発除去を用いて部分脱水することにより、乾燥せずに移植できる、又は乾燥埋込型材料を実現するために超臨界二酸化炭素などの溶媒を用いうる、埋込型微生物セルロースの作製方法を確定した。どちらの材料にも所望の生成物に応じて、乾燥型又は湿潤型のどちらかで滅菌を行う。本生成物が非発熱性（非エンドトキシン性）、引張強度及び縫合保持力が高まり、ガンマ照射による滅菌、及び生体適合性の結果、生体内移植しうる点でも、Blaneyらの生成物は本生成物とは異なる。
【００１１】
第6,599,518号のSolvent Dehydrated Microbially-Derived Cellulose for Implantationにおける材料は、本発明記載の材料と同様の生成物である。当該発明は、メタノール、アセトン、又は他の有機溶媒を用いる、含水率が15％未満までの溶媒脱水について記載する。本発明は、脱水後にパッド中にさらにかなりの液体が残っており、溶媒脱水材料で必要な、適合性を改善するための再水和が必要ない点で、当該材料とは異なる。その乾燥型超臨界CO2での本発明も、さらに吸収性が高いため、溶媒脱水とは異なる。
【００１２】
溶媒脱水では埋込型材料が十分に乾燥するため、本発明以前には微生物由来セルロースを含み、許容される部分脱水埋込型材料はなかった。従って、広範囲の医療及び外科用途に用いられうる、微生物由来セルロースを含む部分脱水埋込型材料が要望されている。各種の用途のために微生物由来セルロースを移植する方法も特に望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、生体内移植しうる材料である微生物由来埋込型セルロースと、その作製方法を提供することである。材料は組織代用品、バルク化剤、及び外科用メッシュとして用いうる。本発明の他の目的は、微生物由来埋込型セルロースを提供することであり、該材料には引張強度、伸長、及び縫合性等の所望の機械特性があり生体内移植が可能である。本発明のさらに他の目的は、非発熱性及び生体適合性であり、滅菌可能な微生物由来セルロースを提供することである。本発明のさらに他の目的は、適合性があり、液体吸収性微生物由来セルロースを提供することである。これら及び他の目的は、以下に記載する教示の点から、当業者に直に明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の材料は、熱変性微生物由来セルロース、特に、栄養培地中で増殖し、制御条件下で培養したAcetobacter xylinumの培養物から作製されたセルロースの埋込型を含む。セルロースフィルム又は薄膜は、制御条件下での培養を含む、A.xylinum増殖を介して作製される。薄膜は、発熱物質及び生存微生物を破壊するために水酸化ナトリウムで化学的に処理した後、濾過水ですすぐ。各薄膜を圧縮後、材料を密封容器に入れて、温度を０℃未満に低下させる。ある期間後、温度を０℃より高くし、放出される過剰な水分を除去する。次に好ましい実施形態を、切断、包装及びガンマ滅菌する。別の実施形態は、乾燥型生成物を得るために、水をメタノールに交換し、メタノールを超臨界二酸化炭素に交換し、最後にCO2を除去してさらに処理する。次にこの生成物を切断、包装、及びガンマ又はエチレンオキシド滅菌する。
【００１５】
本発明の１の態様では、微生物由来セルロースから水和及び乾燥熱変性セルロースの両方を作製する方法を提供する。本方法は、セルロース生成微生物を栄養培地、制御条件下で増殖させるステップと、微生物由来セルロースを水酸化ナトリウムで化学処理し、次の処理前に、材料から発熱物質を除去し、生存生物を破壊するするステップと、を含む。
【００１６】
本発明の別の態様では、セルロースを最初に密封容器におき、温度を０℃未満に低下して脱水する（水を除去する）。ある時間後、温度を０℃より高くし、放出する過剰水分を除去する。
【００１７】
本発明の他の実施形態では、本材料の乾燥を超臨界二酸化炭素法を用いて処理できる。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態では、熱変性微生物由来セルロースは、形成外科、一般外科、及び神経外科の埋込型医用材料として用いられる。熱変性微生物由来セルロースは、外科的要件を満たす所望の寸法及び形状に切断でき、適合性のため接着しなくても様々な表面に合せて成形できるので、各種の外科処置に有用である。
【００１９】
本発明のさらなる態様は、場合により第２の耐水性パウチ内に入れ、乾燥している場合にはガンマ滅菌又はエチレンオキシド滅菌した、微生物由来セルロース及び密封耐水性パウチを含む包装を含むキットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
別途規定しない限り、「a」又は「an」は、「1つ又はそれ以上」を意味する。本発明の熱変性微生物由来セルロースの作製において、セルロースは細菌、好ましくは細菌Acetobacter xylinum（野生種）により合成され、接種フラスコから回収し、所望量の微生物由来セルロースを得るため、最適培地による次のフラスコ及びタンクでの線形培養のために、継続接種及び培養を介して増殖した。培地は、例えばスクロース、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、クエン酸、酢酸、及び微量元素等の栄養素よりなり、その結果増殖培地のpHは酸性となる。滅菌培地にA.xylinumの増殖培養物から接種し、生物反応器トレーに適切な量を充填して、セルロースの水に対する最終比が約1:20〜約1:100となった。生物反応器トレーを密閉して、30℃±2℃の制御環境において、微生物由来セルロースの薄膜成長が完了するまで培養する。薄膜を生物反応器トレーから除去して、化学的に処理して細菌副生成物及び残留培地を除去する。約0.1M〜4Mの好ましい濃度の腐食性溶液、好ましくは水酸化ナトリウムを用いて、生存する生物及び細菌から生成した発熱物質（エンドトキシン）を薄膜から除去する。次に処理した薄膜を濾過水ですすいで、微生物汚染（生物負荷）を抑える。
【００２１】
次に薄膜を所望の厚さまで圧縮する。セルロースの強度、完全性、及び機能に影響を及ぼす所望の密度を得るために、元の充填体積及び圧縮ステップは本発明の一部をなす。本発明の他の処理は、セルロースを密封容器に配置し、温度を０℃未満に下げることにより継続する。ある時間後、セルロースを部分脱水するために、温度を０℃より高くし、放出する過剰な水分を除去する。１つの理論に縛られることなく、０℃未満において、水の結晶が形成され、セルロースメッシュの表面にもたらされると考えられる。０℃より高い温度では、除去された液体は外科用メッシュを再水和することができず、それにより各外科処置での埋込型医療装具として用いる場合、引張強度、伸長（伸び）、適合性、及び縫合保持力が向上した生成物が生じる。所望の脱水レベルに応じて、フィルムは１回又はそれ以上の温度変化サイクルを受ける。過剰な液体は、注入、拭取り、又は真空吸引より除去される。部分脱水試料のセルロース含有率及び吸収能力について試験する。
【００２２】
部分脱水試料は、さらに試料中の液体（水）をメタノールと交換して処理される。次にメタノール浸漬試料を超臨界流体抽出器に入れ、超臨界状態でメタノールを二酸化炭素と交換する。交換が行われて温度が上昇すると、CO2が除去され、試料は乾燥セルロースパッドとなる。
【００２３】
制御環境下で、湿潤又は乾燥フィルムは、当業者が理解する各種の形状及び寸法に切断できる。各ユニットを耐水性単一又は二層パウチシステムに包装して、35kGyもの高い線量レベルのガンマ照射へ暴露することにより滅菌できるが、好ましくは用いられる線量はより低い。ガンマ線量は、ISO 11137 Sterilization of Health Care Products-Requirements for validation and routine control-Radiation Sterilizationに記載されているように、非滅菌材料の生物負荷レベルにより決定される。
【００２４】
耐水性包装は、耐水性内部及び外部山形剥離性パウチを含む。材料は、例えばガンマ照射の滅菌に適するシリカ被膜ポリエステルで封着したポリエステル/LDPE/銀膜混合物でもよい。
【００２５】
本発明の微生物由来セルロースは、一般外科、形成外科、及び神経外科用途の微生物由来セルロース材料の移植に関する組織増強又は修復に使用できる。外科用途の例は、一般軟組織増強、骨盤底再建、膀胱頚部吊上げ、ヘルニア修復、鼠径ヘルニアパッチ、及び硬膜形成術を含むが、これに限定されるわけではない。
【００２６】
本発明のセルロース材料の他の用途は、適所への縫合能に関する。縫合保持力は、埋込型医療品が手術、治療、及び作用中に位置を固定及び維持するのに重要である。外科医は、埋込型材料が針挿入中に断裂せずに縫合できるだけでなく、インプラントの縫合端から引き離れずに縫合を維持できることに依存するに違いない。
【００２７】
外科処置で用いられる本発明の微生物由来セルロースの性能は、材料が、安全かつ所期の目的に効果的であり、生体適合性が十分である必要がある。
【００２８】
一般、形成、及び神経外科用の埋込型医療器具の作製には、本発明は発熱物質除去及び滅菌工程に耐える性能が必要である。生物医学高分子は、金属、セラミックス、及び合成繊維等の他の材料よりも熱及び化学薬品安定性が低いことが多く；従って、それらは従来の方法を用いて滅菌することがより困難である。埋込型医療器具として用いられるいずれの材料でも、治療方法を妨げ、レシピエントに有害なエンドトキシン（非発熱性）、微生物、及び他の考えられる汚染物質を含まないことが必要である。
【００２９】
本発明は、細菌又は発熱物質に暴露された材料の交差汚染のため存在しうるエンドトキシンを破壊することが知られる加熱腐食性溶液を用いて発熱物質を除去する。次に、材料を、生物負荷レベル（非滅菌材料に通常存在する微生物量）に基づく所定の滅菌保証レベルで微生物汚染を破壊するのに十分な線量でガンマ照射する。試料は約35kGyの線量でガンマ照射した。材料は、強アルカリ水酸化ナトリウム溶液により高温で発熱物質除去でき、機械特性に著しい影響を及ぼさずにガンマ滅菌に耐えうることが結論付けられる。また乾燥型は、ガンマ照射又はエチレンオキシド滅菌のどちらも受けうる。
【００３０】
インプラントを目的とする医療器具は、目的とする使用に適合するために、米国食品医薬品局（FDA）規定又は国際標準化機構（ISO）規則のどちらかに合致する各種の基準を満たす必要がある。埋込装具がヒト組織に安全／生体適合性であることを証明するために、細胞毒性試験が関連すると見なされる。本発明では、国際標準化機構10993:Biological Evaluation of Medical Devices, Part 5:Tests for Cytotoxicity:in vitro Methods Guidelinesに基づく試験管内生体適合性試験を、細胞毒性に関する潜在性を判定するために実施した。
【００３１】
微生物由来セルロースの機械特性は、引張強度、伸長％、及び縫合保持力に関係する。材料は、多方向性並びに線形高分子の特性があると見なされるのに対し、高分子鎖は延伸方向に並ぶ；従って、切断方向については注意が払われなかった。
【００３２】
本発明を例示するために、以下の実施例を与える。しかしながら本発明はこれらの実施例に記載の特定条件又は詳細事項に限定されないことを理解すべきである。明細書を通じて、全ての参考文献は、参照により本特許出願に具体的に組み入れられる。
【実施例１】
【００３３】
（埋込型微生物由来セルロースの製造）
本実施例は、生物負荷（微生物汚染）を最小限にするために制御環境内でA.xylinumにより生成される標準熱変性微生物由来セルロースフィルムの作製に関する。培養容器から滅菌培地にA.xylinumを接種し、生物反応器トレーに約110gの量を充填して、薄膜の最適増殖が見られるまで培養した。薄膜をトレーから出し、次に約1時間加熱した腐食性溶液をタンクで化学処理（発熱物質除去）した。次に薄膜を濾過水で連続的にすすいだ。フィルムを空気圧縮機で圧縮して、所望の重量及びセルロース含有率の薄膜を得た。
【００３４】
次に、圧縮フィルムを密封容器に入れて温度を下げ、2〜10日の様々な期間0℃未満に保った。その後フィルムを周囲温度にして、過剰な水を廃棄した。このバッチの平均セルロース含有率は、6.47%であった。本実施例で記載したように処理した次のバッチでセルロース含有率を試験した。セルロース含有率は5.2%〜18.4%の範囲であり、全体の平均は12.7%であった。各試料ユニットをパウチに入れて密封し、各機械試験に用いた。図1は、溶媒脱水微生物セルロースとの比較を示す。
【実施例２】
【００３５】
（様々な厚さの熱変性微生物由来フィルムの製造）
A.xylinumから生成された様々な厚さの熱変性微生物由来セルロースフィルムを、一般に、実施例１の手順に従って作製した。
【００３６】
培養容器から滅菌培地にA.xylinumを接種し、生物反応器トレーに各量を充填し、薄膜の最適増殖が見られるまで培養した。薄膜をトレーから出し、次に約１時間加熱した水酸化ナトリウム（初期充填重量に応じて）をタンクで化学処理（発熱物質除去）した。次に薄膜に濾過水で連続的にすすいだ。フィルムを空気圧縮機で圧縮し、所望の重量及びセルロース含有率の薄膜を得た。
【００３７】
次に、圧縮フィルムを密封容器に入れて、温度を下げて２〜１０日の各期間０℃未満に保った。その後フィルムを周囲温度にして過剰な水を廃棄した。
【００３８】
圧縮フィルムの一部を、超臨界CO2を用いて以下のようにさらに処理した。材料を100%メタノールに2〜7日間入れて、毎日新鮮メタノールに交換した。次に材料をポリプロピレンメッシュで包み、超臨界流体交換システムに入れた。約2000psiのCO2圧で約３時間交換した。試料を乾燥型で取り出した。乾燥材料の試験は全て、最小限の水和後に実施した。
【実施例３】
【００３９】
熱変性微生物由来セルロースフィルムの機械特性
Ａ．微生物由来セルロースの機械特性試験
埋込型医用材料に利用しうる引張強度、伸長、及び縫合保持力（引き出し）を判定するために、熱変性微生物由来セルロースの機械試験を行った。本発明の試料を外科用ハサミ及び鋳型を用いて試験用に1cm x 4cm細片又は1cm x 8cm細片に切断した。例えばフィルム端に平行な区域では各細片を切断せず、各フィルム内の区域全体を示すためにフィルム内の各方向の細片を切断した。厚さは、電子カリパスを用いてミリメートル単位で±0.03mmまで精密に測定した。
【００４０】
熱変性微生物由来セルロースの機械特性は、引張機（United Calibration Corporation) Model SSTM-2kNを用いて、荷重対クロスヘッド距離移動配置を用いて決定した。500ポンド荷重セルを校正した。各試験の開始前に試験片のゲージ長を記録した。ゲージ長は、各グリップ間の試験片の長さである（各40mm細片では25mm、縫合糸が付着した各細片では60mmと測定した）。上部グリップはざらつきがあり、下部グリップと一列になるように取付けた。下部グリップはざらつきがあり、各引張サイクル中の移動を避けるために装置基部に固定した。空気グリップを用いて、各グリップのクランプ内に試料を締めた。試料が真っ直ぐで、荷重をゼロにするために、試験前に各試料を提示した。1Nの予備荷重を5mm/分の速度で印加し、試験は300mm/分に設定したクロスヘッド速度で実施した。
【００４１】
各試料をそのまま試験した。引張強度及び伸長試験では、1cm x 4cmの各試料を、長い寸法が力の印加方向と平行になるように、試験機の上部クランプの中心に配置した。上部グリップを締め、試料下部を下部クランプに配置して締めた。縫合保持力では、細片を半分に折り、縫合糸を試験試料の折り曲げた「二重厚」端部に端部から2〜4mmに挿入して、1cm x 8cmの各試料を作製した（図４）。Ethicon 2-0 Prolene縫合糸を先細SH針により用いた。上部グリップを締め、表面に沿って保持圧を均一に分散させた。縫合糸を力の印加方向に平行に下部グリップのクランプ間に注意深く挿入して締めた。基準に従ったが、試料がクランプを滑落する場合、又はクランプ端部、若しくはクランプ内で破損した場合、又は試料が破損して縫合糸が試料から裂けない場合は、その結果は棄却し、材料が利用できる間は試験を反復した。
【００４２】
試料は、試料が破損するまで又は縫合糸材料が試料から裂けるまで、300mm/分の一定速度で試験を行った。最終引張強度（破損応力）及び伸長率（最大歪）を、引張機ソフトウェアで生成した応力−歪曲線から計算した。
【００４３】
Ｂ．引張強度及び伸長％試験の結果
熱変性微生物セルロース試料の平均引張強度及び伸長％を図２及び３に示す。
【００４４】
表１は、ピーク荷重の平均を示す（ニュートン）。伸長％は、各応力−歪曲線から最大歪対応力として計算した。すべての結果は有効であった。
【表１】
2007518457.tif 000003
【００４５】
引張強度の範囲は10.4〜53.4ニュートンであり、生体材料を試験するときの一貫した結果を測定するための50%棄却基準に収まった。伸長％の範囲は9.3%〜40.0%であった。この値は、埋込型材料を一般及び形成外科治手術中の軟組織修復を支持又は維持するために用いる場合の最適な伸び度を示す。熱変性微生物由来セルロースは、溶媒脱水微生物由来セルロースと比較すると、歪破断が高く、弾性率が低い。
【００４６】
Ｃ．縫合保持試験の結果
市販の埋込型製品を縫合するための説明書は通常、製品端部から2〜4mm以上を手術部位の軟組織に縫合することを要する；従って、試料は全て縫合糸を下端から2〜4mmに挿入して試験した（図４）。基本性能を測定するために他の材料及び市販製品と比較する場合、縫合糸引出しデータを調査しなければならない。
【００４７】
TMMC折曲げ材料のピーク荷重（ニュートン）の平均結果は7.47N+/-1.18であった。TMMC非折曲げ材料のピーク荷重（ニュートン）の平均結果は1.66N±0.64であった。図５。すべての結果は有効であった。
【実施例４】
【００４８】
熱変性微生物由来セルロースと溶媒脱水微生物由来セルロースの機械特性の比較
各種微生物由来セルロース材料の一般機械強度解析を、各程度の引張強度、伸長％、及び縫合保持力を実証するために実施した。表２ならびに図２、３及び５は、熱変性微生物由来セルロース（TMMC）の、溶媒脱水微生物セルロース（SDMC）に対する、そして空気乾燥伸長微生物由来セルロースBIOFILL（商標）（BioFill Productos Biotechnologicos, Curritiba, Parana, Brazil.）に対する比較を示す。BIOFILL（商標）を1 x 4cm細片に切断して、実施例３のように試験をした。BIOFILL（商標）はA.xylinumから合成され、フィルム処理されて伸長の間に空気乾燥される。
【００４９】
表２は、熱変性微生物セルロース、溶媒脱水微生物セルロース、及びBIOFILL（商標）セルロースの引張強度、伸長％、及び縫合糸引き出しについての平均試験データの結果を示す。TMMCは、SDMCと比較して引張強度(N)(-59%)が低く、湿潤微生物セルロースと比較して引張強度は同等で、空気乾燥BIOFILL（商標）と比較して引張強度(+165%)が優れていた。引張強度は、外科的取扱、挿入、治療工程、及びインプラント機能の間重要である。
【００５０】
熱変性微生物セルロースは、SDMCと比較して伸長％が同等であった。これは、インプラント適用が硬膜形成術などの場合、熱変性微生物セルロースの「伸び」及び適合性が限定された、所望の特徴を有することを示す。
【表２】
2007518457.tif 000004
【００５１】
図２に示すように、TMMCの引張強度は低いが、SDMCの伸長％と同等である。
【００５２】
さらに図３及び５に示すように、TMMCは空気乾燥セルロース（BIOFILL（商標））よりも優れている。
【００５３】
空気乾燥セルロース（BIOFILL（商標））は伸長性が最小限であり、機械試験中は取扱が極めて困難であった。再水和後、空気乾燥セルロース（BIOFILL（商標））は透明になり、グリップクランプへ挿入中、巻上げ及びしわのために取扱が困難となり、周囲作業条件中、即時乾燥により引出し工程前に複数のピースが破損した。
【００５４】
縫合糸引出しに関して、図５は、縫合保持力の結果を示す。BIOFILL（商標）材料が縫合できないため、空気乾燥セルロース（BIOFILL（商標））が存在しないことに注目することが重要である。TMMC及びSDMCは同様に、試験工程中、縫合を保持できた。
【００５５】
本発明のセルロース材料並びに溶媒脱水セルロース及び空気乾燥セルロース（BIOFILL（商標））は、Acetobacter xylinumに由来した。結果は、異なる工程から生成された材料間の機械特性が明らかに相違することを示す。機械特性の相違は、本発明の微生物由来セルロースの作製工程に起因すると考えられる。セルロースフィルムの熱変性は、生じたフィルム特性、特に適合性を制御でき、それゆえ本発明が、特に硬膜用途において先行する移植材料よりも優れた結果である埋込型材料として実施可能であることが予想される。
【実施例５】
【００５６】
膨潤比較
あるインプラント材料（すなわち硬膜代用品）の所望の特徴は、最大に達し、その形状を維持する周囲流体の吸収により多少の厚さの増加が可能になることである。等張性塩水に浸漬した場合の時間経過による各材料の厚さの変化を示すために、試験を実施した。
【００５７】
熱変性微生物セルロース及び溶媒脱水微生物セルロースの試料を、カリパスを用いて誤差0.03mmで、初期厚を測定した。次に材料を塩水に浸漬して、28日までの各時間測定した。図６のグラフは、材料の厚さが最初に増加し、次に安定したことを示している。TMMCの増加は、おおよそ0.25mmだったが、SDMCの増加はわずかに0.16mmだった。
【００５８】
いくらかの流体を吸収することから、TMMCは、過度に厚くならずに過剰の流体を吸収する可能性が示された。
【実施例６】
【００５９】
生体適合性試験
埋込型材料は生体適合性でなければならない。これを証明する試験は、国際標準化機構（ISO）10993文書に従う。用途に応じて、特定の試験が必要である。微生物セルロースは表３の試験を用いて検討した。
【表３】
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【００６０】
本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の方法及び組成に各種の改良及び変形を行いうることは、当業者に明らかであろう。それゆえ、本発明は、本発明の改良及び変形が添付の請求項及びその同等物の範囲内に含まれるという条件で対象にすることが意図される。本明細書で引用されたすべての特許、刊行物、及び参考文献は、参照により個々に組み入れられるのと同程度に、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】溶媒脱水微生物セルロース（SDMC）と比較した熱変性微生物由来セルロース（TMMC）のセルロース含有率の相違を示す。
【図２】再水和された溶媒脱水微生物セルロース（SDMC）と比較した熱変性微生物由来セルロース（TMMC）の機械強度（力(N)）及び伸長（％）を示す。
【図３】伸張された空気乾燥セルロース（BIOFILL（商標））と比較した熱変性微生物由来セルロースの機械強度（力(N)）及び伸長(%)を示す。
【図４】各種材料の縫合試験構成の概略図である。
【図５】溶媒脱水（SDMC）及び空気乾燥セルロース（BIOFILL（商標））と比較した熱変性微生物由来セルロースの縫合保持力を示す（Biofillは縫合強度なし、F=0）。
【図６】塩水への各時間浸漬後の、溶媒脱水微生物セルロース（SDMC）と比較した熱変性微生物由来セルロース（TMMC）の厚さの増加を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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