(57)【要約】本発明は、医療デバイスの細胞結合特性を定量するための方法を提供する。この方法を実施する際、少なくとも１つの型の結合因子を有する医療デバイスが、その医療デバイスにおけるその結合因子について親和性を有するリガンドを発現する細胞とともにインキュベートされる。上記医療デバイスに結合する細胞は、少なくとも１つのマーカーで標識される。このマーカーが、検出され、そして上記医療デバイスに結合している細胞の量が、決定される。あるいは、上記少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を発現する少なくとも１つの型のリガンドを有する標識された細胞が、提供され得、この細胞は、上記医療デバイスとともにインキュベートされる。上記結合因子に対する親和性を有する細胞株上での上記リガンドの相対的発現もまた、決定される。
2007538233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療デバイスの細胞結合特性を定量するための方法であって、該方法は、
ａ）少なくとも１つの型の結合因子を有する医療デバイスを提供する工程；
ｂ）該医療デバイスを、該少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を発現する少なくとも１つの型のリガンドを有する細胞とともに、インキュベートする工程；
ｃ）該医療デバイスに結合する細胞を標識する工程；
ｄ）該医療デバイスに結合している細胞を検出する工程；および
ｅ）該医療デバイスに結合している細胞の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を有する細胞における、前記少なくとも１つの型のリガンドの相対的発現を決定する工程；
をさらに包含する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、該方法は、ハイスループットスクリーニングを組み込んでいる、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ｄ）は、マルチウェルハイスループットマイクロプレートリーダーを使用して行われる、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記マルチウェルプレートが、白色の不透明９６ウェルプレートである、方法。
【請求項６】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ｃ）において、標識する工程は、少なくとも１つの蛍光マーカーを使用することによって行われる、方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、前記少なくとも１つの蛍光マーカーは、核酸色素である、方法。
【請求項８】
請求項６に記載の方法であって、前記少なくとも１つの蛍光マーカーのスペクトル特徴は、前記アッセイにおいて使用される物質の自己蛍光スペクトル範囲から十分に分離される、方法。
【請求項９】
請求項７に記載の方法であって、前記核酸色素は、ＤＡＰＩである、方法。
【請求項１０】
請求項７に記載の方法であって、前記核酸色素は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２である、方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ｄ）において、前記検出は、前記医療デバイスに結合している細胞の少なくとも１つの蛍光マーカーの検出である、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記蛍光マーカーの蛍光は、該蛍光マーカーの励起波長に対応する励起波長および該蛍光マーカーの発光波長に対応する発光波長にて測定される、方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ｃ）におけるインキュベーションは、マルチウェルプレートにおいて行われる、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記マルチウェルプレートは、２４ウェルプレートである、方法。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の方法であって、既知細胞数の複数点コントロール標準曲線と比較すること、該標準曲線に対して非線形回帰分析を適用すること、その後、該曲線の方程式を使用して未知の値を補間することによって、測定した蛍光を細胞数と相関付けることによって、請求項１の工程（ｅ）を行う工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ａ）の後に、スペクトル走査試験が、前記アッセイにおいて使用される物質の自己蛍光範囲を同定するために実施される、方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ｂ）の後に、前記細胞が固定溶液で固定される、方法。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の方法であって、工程（ｂ）の後に、前記細胞が空気乾燥される、方法。
【請求項１９】
請求項１または２に記載の方法であって、前記医療デバイスは、ステントである、方法。
【請求項２０】
請求項１または２に記載の方法であって、前記医療デバイスは、足場である、方法。
【請求項２１】
請求項１または２に記載の方法であって、前記医療デバイスは、合成移植物である、方法。
【請求項２２】
請求項１または２に記載の方法であって、前記医療デバイスは、移植物である、方法。
【請求項２３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子は、リガンドである、方法。
【請求項２４】
請求項１または２に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子は、抗体である、方法。
【請求項２５】
請求項１または２に記載の方法であって、前記細胞株は、ヒト細胞株である、方法。
【請求項２６】
請求項１または２に記載の方法であって、前記細胞株は、動物細胞株である、方法。
【請求項２７】
請求項２に記載の方法であって、前記リガンドを標識することによって請求項２を行うことを包含し、該標識することは、
ａ）蛍光標識された前記少なくとも１つの結合因子を提供する工程；
ｂ）該少なくとも１つの結合因子についてのリガンドを発現する既知数の細胞を提供する工程；
ｃ）該既知数の細胞の少なくとも１つの細胞リガンドを、該少なくとも１つの蛍光標識された結合因子で標識する工程；
ｄ）ハイスループット蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、該細胞リガンドに結合している該少なくとも１つの蛍光標識された結合因子を検出および定量する工程；
ｅ）試験中のバッチの細胞における該少なくとも１つの細胞リガンドの相対的発現を、以前のバッチの同じ既知数の細胞の蛍光強度との蛍光強度の比較によって、決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子は、リガンドである、方法。
【請求項２９】
請求項２７に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子は、抗体である、方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子の蛍光標識は、フィコエリトリンである、方法。
【請求項３１】
請求項２に記載の方法であって、二重標識することによって請求項２を行うことを包含し、該二重標識することは、
ａ）蛍光標識された前記少なくとも１つの結合因子を提供する工程；
ｂ）該少なくとも１つの結合因子についてのリガンドを発現する既知数の細胞を提供する工程；
ｃ）該既知数の細胞の少なくとも１つの細胞リガンドを、該少なくとも１つの蛍光標識された結合因子で標識する工程；
ｄ）該既知数の細胞を、少なくとも１つの蛍光核マーカーで標識する工程；
ｅ）ハイスループット蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、該少なくとも１つの蛍光核マーカーを検出および定量する工程；
ｆ）ハイスループット蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、該細胞リガンドに結合している該少なくとも１つの蛍光標識された結合因子を検出および定量する工程；
ｇ）試験中のバッチの細胞における該少なくとも１つの細胞リガンドの相対的発現を、以前のバッチの同じ既知数の細胞の蛍光強度との蛍光強度の比較によって、決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子の蛍光標識のスペクトル特徴は、前記少なくとも１つの蛍光核マーカーのスペクトル特徴から十分に分離される、方法。
【請求項３３】
請求項３１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子は、リガンドである、方法。
【請求項３４】
請求項３１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子は、抗体である、方法。
【請求項３５】
請求項３１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの結合因子の蛍光標識は、フィコエリトリンである、方法。
【請求項３６】
請求項３１に記載の方法であって、前記少なくとも１つの蛍光核マーカーは、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２である、方法。
【請求項３７】
医療デバイスの細胞結合特性を定量するためのキットであって、該キットは、
結合因子；該結合因子について親和性を発現する細胞株；蛍光マーカー；抗体を含む結合因子；リガンドを含む結合因子；ヒト細胞株を含む細胞株；動物細胞株を含む細胞株；核酸色素；ブロッキング溶液、インキュベーション緩衝液、および洗浄緩衝液；固定溶液；細胞培地および細胞上清；指示書；ならびにこれらの組み合わせ；
のうちの少なくとも１つを備える、キット。
【請求項３８】
請求項１〜３６のうちのいずれか１項に記載の方法であって、前記細胞は、細胞株に由来する、方法。
【請求項３９】
請求項１または２のうちのいずれかに記載の方法であって、前記医療デバイス上の複数の点で該医療デバイスに結合している細胞の数を決定することによって、工程（ｅ）を行う工程；を包含する、方法。
【請求項４０】
医療デバイスの細胞結合特性を定量するための方法であって、該方法は、
ａ）少なくとも１つの型の結合因子を有する医療デバイスを提供する工程；
ｂ）該少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を発現する少なくとも１つの型のリガンドを有する標識された細胞を提供する工程；
ｃ）該標識された細胞とともに該医療デバイスをインキュベートする工程；
ｄ）該医療デバイスに結合している細胞を検出する工程；および
ｅ）該医療デバイスに結合している細胞の量を決定する工程；
を包含する、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、
前記少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を有する細胞における前記少なくとも１つの型のリガンドの相対的発現を決定する工程；
をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、医療デバイスにおける結合因子に関する。より具体的には、本発明は、医療デバイスの操作された表面の細胞結合特性を、上記医療デバイスに結合している細胞の量を検出することによって測定することに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
医療デバイスは、損傷した脈管、損傷した組織、損傷した器官、および他の構造を修復または置換して、患者の長期の結果を有意に改善するために、一般的に使用される。例えば、冠状動脈疾患（主要な死亡原因である進行性疾患）を有する患者のうちの約３分の１は、介入医療デバイス（例えば、ステント）で処置される（非特許文献１）。図１におおいて示されるようなステントは、硬化またはアテローム性動脈硬化症によって引き起こされる遮断された血管を開くのを助けるために使用される、小さい金属製の網目状のチューブである。
【０００３】
アテローム性動脈硬化症は、沈着物（例えば、コレステロールおよび脂肪物質）の蓄積が動脈の内層に蓄積する場合に生じる。この蓄積物（プラークとしても公知である）は、硬化して動脈を狭窄し、その結果、その動脈を通る血流が有意に減少される。血餅が形成し得る。血流が心臓に対して遮断される場合は、その血餅は、心臓発作を引き起こし得、一方、脳に到る流れを防止する血餅は、脳卒中を引き起こし得る。
【０００４】
バイパス手術に対する代替法が、血流を改善させるためにしばしば使用される。遮断された動脈は、経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）またはバルーン血管形成術として公知である手順を用いて開放され得る。脈管形成手順において、先端部に膨張可能な小さいバルーンを備えるカテーテルが、挿入され、そして閉塞部位へと誘導される。このバルーンが、拡張され、プラーク蓄積物を動脈壁へと押しやることによって、動脈を開放する。動脈内層に対する損傷がバルーン血管形成術から生じる場合には、一連の複雑な炎症事象および組織リモデリングが、生じ得る。これは、血栓症に至り得、しばしば、動脈の再狭小化または再狭窄をもたらす。
【０００５】
ステントは、急性再狭窄および亜急性再狭窄の発祥を低減するために、遮断された動脈中に挿入され得る。その後、このステントは、展開され、そして脈管が開放した状態を維持するために足場のように作用する。このステントは、血管形成術の代わりまたは血管形成術と一緒のいずれかで使用され得る。バルーン血管形成術（再狭窄の確率は４０％である）と比較した場合、ステントは、再狭窄の確率を２５％まで低減する（非特許文献２）。ステントはまた、脳に血液を供給する頚部の遮断された頚動脈を開放することによって、脳卒中を防止するために使用され得る。またはステントは、他の遮断された通路（例えば、食道、尿管、および胆管）を開放した状態で維持するために使用され得る。
【０００６】
再狭窄はまた、移植される医療デバイスを用いる場合に生じ得るので、その医療デバイスは、治療剤でコーティングされ得て、通路の再閉鎖を防止するのを補助し、そして凝固することなくそのデバイスの上を血液が流れるのを可能にする。これらの因子は、血栓症および／もしくは再狭窄をもたらす炎症応答を防止するのを補助する化学物質（例えば、ヘパリンまたはホスホリルコリン）であり得るか、あるいはこれらの因子は、細胞増殖を防止することによって再狭窄を阻害する細胞傷害性因子（例えば、コラーゲン）であり得るか、あるいはこれらの因子は、ステント挿入によって引き起こされる損傷部位に特定の細胞を動員して新たな組織（例えば、内皮細胞）がその医療デバイスを覆うのを促進する結合因子（例えば、抗体または抗原）であり得る。
【０００７】
特許文献１（本明細書において参考として援用される）は、内皮層がバルーン血管形成術によって損傷している動脈を、再内皮化するための技術を考察する。多重特異的抗体が、好ましくは血管形成術の前に、患者の血流中に導入される。その多重特異的抗体は、内皮前駆細胞上の表面マーカーに対する第一の抗原結合部位に結合し、かつまた、内皮下エピトープに対する第二の抗原結合部位にも結合する。一旦この血管形成術が実際されて内皮下層の標的エピトープが露出されると、その内皮前駆細胞にすでに結合している多重特異的抗体もまた、その内皮下層に結合する。その後、その細胞は増殖し、そしてその細胞は、露出している内皮下層を覆う。
【０００８】
治療剤による医療デバイスのコーティングは、当業者にとって周知である。特許文献２（本明細書において参考として援用される）において、タキソールの再狭窄阻害コーティングおよびヘパリンの血餅防止コーティングが、ステントに適用される。移植可能なデバイスをコーティングするための方法は、特許文献３、特許文献４、および特許文献５（これらは、本明細書において参考として援用される）に記載される。特許文献６（これは、本明細書において参考として援用される）において、医療デバイスが、循環する前駆細胞上の表面リガンドと反応する抗体でコーティングされて、医療デバイス上での前駆内皮細胞の付着とその後の増殖とを促進する。特許文献７（これは、本明細書において参考として援用される）は、再狭窄およびアテローム性動脈硬化症を防止および／もしくは処置するための治療剤としての、ニトロソ化タキサンまたはニトロシル化タキサンの使用を考察する。特許文献１（これは、本明細書において参考として援用される）において、医療デバイスは、多重特異的抗体の抗原結合部位が対する化合物でコーティングされ得、一方、その多重特異的抗体の別の抗原結合部位は、内皮前駆細胞の表面マーカーに対する。好ましくは、その多重特異的抗体は、血管形成術およびそのデバイスの移植の前に、血流中に導入される。最近の進歩は、上記の参考文献において記載されるように、病理部位への細胞の付着および／または病理部位に対する細胞の標的化に治療効果が依存するデバイスに対して、なされている。病理部位に対する前駆細胞または幹細胞の標的化は、科学界において非常に興味深い。なぜなら、これらの細胞は、劣化した損傷または持続している損傷を有する組織を再生し得るからである。細胞を病理部位へと標的化する医療デバイスは、ステントには限定されない。移植物は、損傷組織を修復するための細胞の結合を促進するために使用され得る。例えば、異直物は、損傷骨格組織の組織操作された再生において使用されている。その移植物は、内皮修復細胞のための結合部位を提供する（非特許文献３）。神経成長因子を放出する移植物は、変性脳細胞を標的とすることが示されており、このことは、アルツハイマー病の処置のためにかなりの関心を生じた（非特許文献４）。移植可能なコラーゲン（移植可能な医療デバイスとして使用される）は、皮膚創傷の治癒を増加させることが示されている（非特許文献５）。そのようなデバイスの治療効果は、臨床試験前には不確かであるので、そのようなデバイスがどのようによく細胞接着を促進するかを、開発中の臨床前段階において測定する必要がますます増えている。生存し亜棒および生理的に適切な条件を使用して、上記デバイスを機能的に試験することは、インビボでの有効性を予測し得、そしてそのデバイスがどのようにさらに開発および最適化され得るかに関して有用なフィードバックを提供し得る。そのような試験は、そのようなデバイスの設計において技術的進歩を促進し得、さらに改善された患者の結果をもたらす。さらに、そのような方法は、ヒトに移植するためのそのようなデバイスの使用の前に、製造の品質管理を確実にするために必要である。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００４／００２９２６８号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２３１，６００号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００３／０１５７２４１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，６４１，６１１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，５９６，１９５号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００２／００４９４９５号明細書
【特許文献７】米国特許第６，６５６，９６６号明細書
【非特許文献１】Ｍｉｃｈａｅｌｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２；１０６：１８７
【非特許文献２】Ｄａｎｇａｓら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２；１０５：２５８６
【非特許文献３】Ｃａｐｌａｎ，Ｎａｖａｒｔｉｓ  Ｆｏｕｎｄ  Ｓｙｍｐ．２００３；２４９：１７−２５
【非特許文献４】Ｍａｈｏｎｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９；９６：４５３６〜４５３９
【非特許文献５】Ｂｏｙｃｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９３；３７（９）：１８９０〜１８９５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
従って、本発明は、医療デバイスに対する細胞の結合を定量するための方法を提供する。この方法は、
ａ）少なくとも１つの型の結合因子を有する医療デバイスを提供する工程；
ｂ）上記医療デバイスを、上記少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を発現する少なくとも１つの型のリガンドを有する細胞とともに、インキュベートする工程；
ｃ）上記医療デバイスに結合する細胞を標識する工程；
ｄ）上記医療デバイスに結合している細胞を検出する工程；および
ｅ）上記医療デバイスに結合している細胞の量を決定する工程；
を包含する。
【００１０】
品質管理手順として望ましい場合、本発明は、上記少なくとも１つの結合因子に対する親和性を有する細胞株における上記少なくとも１つのリガンドの相対的発現を決定するための方法を、さらに提供する。
【００１１】
本発明はまた、医療デバイスの細胞結合特性を定量するための方法を提供する。この方法は、
ａ）少なくとも１つの型の結合因子を有する医療デバイスを提供する工程；
ｂ）上記少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を発現する少なくとも１つの型のリガンドを有する標識された細胞を提供する工程；
ｃ）上記標識された細胞とともに上記医療デバイスをインキュベートする工程；
ｄ）上記医療デバイスに結合している細胞を検出する工程；および
ｅ）上記医療デバイスに結合している細胞の量を決定する工程；
を包含する。
【００１２】
上記方法は、上記医療デバイスとしてステントを使用する工程を包含し得る。上記ステントは、抗体でコーティングされる。上記ステントは、上記抗体に対して特異的なリガンドを構成的に発現するヒト細胞株とともにインキュベートされる。上記細胞が上記ステントに結合している場合、蛍光核酸マーカーが、上記細胞を標識するために使用される。上記デバイスに結合している細胞の数は、既知数の蛍光標識された細胞の標準曲線を使用して、補間によって算出される。
【００１３】
従って、医療デバイスの細胞結合特性を定量するためのキットが、提供される。このキットは、
結合因子；上記結合因子について親和性を発現する細胞株；蛍光マーカー；抗体を含む結合因子；リガンドを含む結合因子；ヒト細胞株を含む細胞株；動物細胞株を含む細胞株；核酸色素；ブロッキング溶液、インキュベーション緩衝液、および洗浄緩衝液；固定溶液；細胞培地および細胞上清；指示書；ならびにこれらの組み合わせ；
のうちの少なくとも１つを備える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
以下の説明は、例示に過ぎないものであり、限定するものではない。本発明の他の実施形態は、この説明を考慮すれば当業者にとって明らかである。
【００１５】
本発明は、医療デバイスに対する細胞の結合を定量するための方法を記載する。特に、本発明は、マルチウェルプレートにおいて、結合因子を有する医療デバイスを、上記医療デバイス上の上記結合因子に対する親和性を有する１つの細胞型とともにインキュベートすることに関する。上記医療デバイスに結合している細胞が、マーカーで標識される。上記マーカーは、ハイスループット蛍光マイクロプレートリーダーを用いて検出され、上記医療デバイスに結合している細胞が、定量される。
【００１６】
本発明は、損傷した組織、損傷した器官、および他の構造を修復または置換するために使用される種々の医療デバイスに適用され得る。医療デバイスとしては、体組織および体液と接触するデバイス（例えば、移植可能なデバイス）が挙げられ得るが、これらに限定はされない。特に対象とされる医療デバイスとしては、ステント、脈管移植物、合成移植物、またはプロテーゼが挙げられる。ステントの型としては、ワイヤステント、管状ステント、網目状ステント、または中実ステントが挙げられ得る。図１は、代表的なステントを示す。用語「医療デバイス」とはまた、本明細書中で使用される場合、体組織および体液と接触しないかもしれない医学において使用されるデバイス（例えば、医学研究において使用される、足場およびデバイス）も包含する。上記医療デバイス上に適用される物質としては、１つ以上の結合因子が挙げられ得る。結合因子とは、好ましくは対象生物学的実体上にある別の物質と、化学的または静電的に結合する任意の物質を指す。使用され得る結合因子には、抗体、抗原、または上記の組み合わせがある。好ましい実施形態において、上記医療デバイスは、特定の内皮細胞の細胞表面上にある標的抗原に対する親和性を発現する少なくとも１つの結合因子（好ましくは抗体）を有する、心血管ステントである。上記ステントは、代表的には、上記細胞とのインキュベーションの前にブロッキング溶液とともにインキュベートされる。上記ブロッキング工程は、抗体−抗原相互作用以外の機構による細胞の結合（すなわち、非特異的結合）を防止する。その後、上記ステントは、対象抗原を発現する細胞とともにインキュベートされる。
【００１７】
本明細書に記載される好ましい実施形態において、これらのインキュベーション条件は、以下の条件について最適化されている：デバイスのプレブロッキング；インキュベーション容器のサイズ；インキュベーション溶液としての緩衝液または培地；種々の振盪プロトコル（平行振盪  対  回転振盪  対  横転振盪；毎分回転数（ｒ．ｐ．ｍ．）など）；種々のインキュベーション温度；種々のインキュベーション時間；細胞の量／濃度など。この特定の場合において選択される条件としては、３％  ＢＳＡを用いる１５分間の非特異的結合部位のブロッキング；リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）および１％  ＢＳＡを希釈剤として使用する、回転振盪しながらの３７℃にて１時間の２４ウェルプレート中でのインキュベーション；およびそのインキュベーションの間の４００μｌ体積当たり５００，０００個の細胞が挙げられるが、これらの条件は、本方法とともに試験が進行するにつれてさらに最適化され得、実際に、上記方法が使用され得る各々の新規細胞の型、リガンドの型、結合因子の型、およびデバイスの型について改めて最適化される必要があることが、認識される。そのような最適化は、上記デバイスに対する細胞結合に対して大きな影響力を有する可能性がある。
【００１８】
一旦、上記細胞が上記医療デバイスに結合されると、未結合細胞は、生理的緩衝液（すなわち、ＰＢＳ）中に上記デバイスを浸漬することによって簡単に洗い流され、結合している細胞は、当業者にとって周知であるように、固定溶液または空気乾燥によって上記デバイスに固定され得、そしてマーカー（好ましくは蛍光ＤＮＡ結合マーカー）で標識され得る。使用される固定溶液に依存して、上記固定溶液を除去するためのプロセス（すなわち、空気乾燥、リンスなど）（これは、当業者にとって周知である）は、変化し得る。上記ＤＮＡ結合マーカーは、上記細胞を、上記細胞の核中にあるＤＮＡに結合する蛍光色素で染色する。好ましい実施形態において、ステントに対する固定および／またはステントの空気乾燥が、検出前の工程の間に細胞損失を回避するために必要であり得るが、種々のデバイス、結合因子、または細胞型を使用するアッセイのさらなる実施形態においては、この工程は不必要であることが示され得る。あるいは、上記少なくとも１つの型の結合因子に対する親和性を発現する少なくとも１つの型のリガンドを発現する標識された細胞が、提供され得、これは、上記医療デバイスとともにインキュベートされる。
【００１９】
多くの種々のＤＮＡ色素が、市販されている。適切な色素が、上記アッセイにおいて使用される特定の細胞型の色素取込み特徴に適合するように選択されなければならず、その特定のアッセイの仕様に従う動的線形定量のための適切なシグナル強度を提供しなければならず、その特定のアッセイの他の成分と関連する非特異的スペクトルノイズとの重複を回避しなければならない。この実施形態において、ＤＡＰＩ色素およびＨｏｅｃｈｓｔ色素の両方が、首尾よく使用されているが、他の核酸色素もまた、使用され得る。核酸色素は、侵入するために上記細胞の透過化処理を必要とし得る。その場合、上記細胞は、当業者にとって公知である透過化処理プロトコルに従って、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−ＢＳＡ溶液を用いて透過化処理される。核酸色素以外の細胞色素もまた、当業者にとって公知であるように使用され得る。上記アッセイの蛍光は、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて、ハイスループット形式で測定される。この実施形態において、９６ウェルプレートが使用されるが、異なるサイズのプレートが、上記医療デバイスのサイズおよび上記マイクロプレートリーダーの能力に従って、使用され得る。上記マイクロプレートリーダーは、適切な波長設定およびカットオフフィルターを用いて、蛍光標識された核酸の発光を励起させて検出するように設定される。デバイスを伴わない既知数の蛍光標識された細胞の標準物もまた、上記プレートに添加され、その結果、細胞数と蛍光単位との間の関係が、決定される。上記医療デバイスに結合している細胞の量は、その標準曲線に対する非線形回帰フィットによって算出され得る。図２は、代表的な標準曲線を示す。蛍光単位が、Ｙ軸上にあり、細胞数が、Ｘ軸上にある。図３は、マイクロプレートアッセイ（本発明の実施形態に従う）における特異性および用量応答の関連性が、細胞結合の顕微的証拠によって十分に確認されていることを示す；すなわち、何の細胞にも結合しないステント（Ａ、下図）は、アッセイにおいて何のシグナルも示さず（Ａ、上図）、少数の細胞（Ｂ）、中程度の数の細胞（Ｃ）、または多数の細胞（Ｄ）に結合するステント（下図）は、マイクロプレートアッセイにおいて、対応して増加した蛍光シグナルを生じる（上図）。蛍光写真を示すこの図の下図において、暗い部分は、細胞が存在しないことを示し、一方、白点は、結合している細胞の蛍光核を示すことに、留意されたい。細胞は、細胞培養条件に起因する結合因子に対して特異的なリガンドのその細胞での発現に関して変化し得るので、その細胞リガンドの発現の品質管理は、そのアッセイにおいて使用される細胞のバッチにおいて実施され得る。これは、医療デバイスに結合している細胞の数のアッセイ間格差は、そのデバイスに関連し、細胞表面発現の変動性には関連しないことを、確認する。本実施形態において、蛍光標識された結合因子（上記医療デバイス上にある同じ因子）が、上記アッセイにおいて使用される同じバッチの既知数の細胞の標準曲線で、上記デバイスを用いずにインキュベートされる。その蛍光は、マイクロプレートリーダーを用いて測定され、その標準曲線の非線形回帰フィットの式は、細胞数と蛍光単位との間の関係を示す。その後、種々のアッセイにおいて使用される所定ロットの蛍光結合因子について、アッセイ間での上記曲線の数学的属性の比較は、そのアッセイにおいて使用される細胞のバッチの間での除期結合因子に関する細胞リガンド発現の差異を示唆する。細胞リガンド発現は、そのＤＮＡが染色されていない細胞において確認され得るが、本方法のこの実施形態において、細胞リガンド発現のこの品質管理チェックは、１つの標準曲線についての２つのスペクトル的に分離した発光体（ｆｌｕｏｒ）（一方は、ＤＮＡ結合因子、もう一方は、細胞表面抗原結合因子に付着している）を使用する二重染色プロトコルの実施を介して、デバイスによって結合された細胞数を定量するために使用される細胞の同じ標準曲線において確認される。本出願人は、フィコエリトリンで標識した抗体（ＰＥ−抗体）を、医療デバイスに細胞を結合させるために使用されるリガンドの膜発現マーカーとして使用し、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を、その細胞のＤＮＡを標識するために使用する、そのような二重染色方法を開発した。この方法は、非特異的細胞膜抗原をＰＢＳ（ウシ胎仔血清）−ＢＳＡ溶液によりブロックすること、ＰＥ−抗体とのインキュベーション、ＰＢＳによる細胞の洗浄、Ｈｏｅｃｈｓｔとのインキュベーション、さらなる洗浄、細胞の計数、および９６ウェルプレートの複製ウェル中への既知数の播種を包含し、その結果、約８点の標準曲線が、作成される。その後、上記のように、２つの別個の励起／発光波長設定（第一の設定は、核マーカーの検出のための設定であり、第二の設定は、表面抗原マーカーの検出のための設定である）にて、シグナルがプレートから読取られる。その２つの読出しに対して非特異的回帰式を適用すると、２つの標準曲線が提供される。１つは、デバイスに結合している細胞の数を算出するためのものであり、第二の曲線は、その潜在的方向シフトまたはパラメーター（例えば、最大値もしくは５０％値）の変化が、リガンドの発現についての細胞バッチの品質管理として役立つものである。細胞リガンド発現が、そのＤＮＡが染色されていない細胞において確認される場合には、より限定的な品質管理サンプル（例えば、少数のサンプル、中程度の数のサンプル、および／または多数のサンプル）の組が、分析され得る。このようにして、サンプルのスループット能力は、品質管理分析ではなくサンプルのウェル利用性を最大にすることによって維持される。
【００２０】
デバイスに対する非特異的細胞結合についてチェックする上記アッセイにおいて使用され得るコントロールとしては、細胞株を、結合因子を保有しないデバイスとともにインキュベートすることが挙げられ得る。あるいは、コントロールとしては、結合因子を、その結合因子に対する親和性を発現しない別の細胞型の存在下で有するデバイスが挙げられ得る。
【００２１】
開発されたアッセイは、そのアッセイが、１）以前の顕微的方法が可能にするよりもかなりハイスループットの様式で、細胞と医療デバイスとの間の結合相互作用を直接測定し、２）以下の段落において記載されるような、先行技術のアッセイを超えるいくつかの自明ではない改善点を組み込んでおり、そして３）実際の医療デバイスを使用し、そのデバイス物質の代理片を使用するのではない（すなわち、従って、そのデバイスの構造に関連する生物学的に関連する問題が、この方法に組み込まれる）という点で、発明である。本方法の終点の尺度として使用される、蛍光プレートの読取りは、確かに、広範に使用される確立された技術であるが、本方法は、その医療デバイス自体が直接測定される点で、蛍光読取りのための標準的プレートアッセイに対して新規であり、溶液中に存在するバイオマーカーを測定する標準的蛍光プレートアッセイとは対照的である。
【００２２】
さらに、上記デバイスの外形およびステンレス鋼の遮光特性は、サンプルマトリックスを出入りする種々の光波長の通過がシグナルに寄与する測定デバイス（すなわち、蛍光マイクロプレートリーダー）と組合わされると、そのアッセイの多数の最適化を必要とする技術的難問を提供した。この難問は、従来の蛍光プレートアッセイの一部ではない。
【００２３】
プレートアッセイは、一般的には、溶液またはプレート物質自体のバックグラウンド蛍光（時には、自己蛍光と呼ばれる）について、他のすべての値からブランクを差し引くことによって制御する。このアッセイにおいて、バックグラウンドプレート蛍光は、誤差を生じることなく各ウェルから差し引かれ得ない。上記デバイスは、コーティングされたステンレス鋼製のらせん状網目の管様構造からなり得るので、この医療デバイスは、プレート表面への光透過またはプレート表面からの光透過に、ウェル間で制御不能かつ不均一な様式で干渉する。広範に変動する範囲の偽陰性シグナルは、プレート由来の蛍光が差し引かれる場合に生じ得る。
【００２４】
本出願人は、自明ではない最適化に関するこの問題を、まず、アッセイにおいて使用される物質（プレート、溶液、細胞、および医療デバイスが挙げられるが、これらに限定はされない）の自己蛍光範囲を同定するためのスペクトル走査試験を実施することによって、克服する。その後、それらのアッセイ物質の自己蛍光スペクトルを回避するスペクトル特徴を有するＤＮＡマーカーが、選択される。励起波長および発光波長ならびにカットオフフィルターが、細胞検出用の波長範囲が空のウェルの自己蛍光とも溶液を充填されたウェルの自己蛍光とも重ならないように、設定される。従って、認知可能なバックグラウンド（ブランク）蛍光は、図３ａ上図において示されるように、このアッセイにおいて検出されない。
【００２５】
プレートアッセイは、通常は、アッセイウェル中に存在する溶液全体にわたって分散している蛍光を測定し、その発光検出器は、各ウェルの中心にある１点を読取る。その原理は、蛍光がある点と別の点とで同じである均一溶液に依存している。これは、蛍光が、デバイスに対する細胞結合の点においてのみ生じ、かつそのデバイスがそのウェルの分散した領域を占めるに過ぎない、医療デバイスの測定のためには当てはまらない。
【００２６】
この難問に創意工夫して取り組むために、蛍光シグナルは、１点ではなくウェル全体（９点（９６ウェルプレートの各ウェル全体にわたって均等に間隔を空けている。これは、本出願人の機器を用いて可能な最大の点数である）から走査される。また、白色プレート（これは、シグナルの反射を増強する）が、そのバックグラウンドが低いので通常は蛍光のために好ましい黒色プレートよりも、使用される。
【００２７】
本方法は、ほんの少しの割合しか抗原陽性細胞を含まない新たに単離された単核細胞の混合集団よりも、対象抗原を構成的に発現するヒト細胞株を使用する。本発明のこの実施形態において記載されるように、このアッセイにおいて１つの細胞型を使用することによって、本出願人は、種々の型の細胞の間を免疫細胞化学的に識別することに基づいた先行技術の蛍光検出アッセイと比較して、創意工夫して蛍光染色を単純にする。本方法において、蛍光は、すべての細胞の標識として役立つ。従って、起こり得る識別能力誤差は、要因ではない。
【００２８】
新鮮な血球を使用する先行技術のアッセイと比較して、細胞株を使用する利点としては、血液ドナー被験体を募集する必要も、各実験のためにヒト血球の長期にわたる可変的な調製を行うこともないこと；ならびに単に個体（すなわち、ドナー）間での変動性に起因する高い実験間での変動性を回避することが、挙げられる。さらに、細胞株は、培養において容易に維持可能であり、無限に増殖され得る。このことは、再現可能な試験物質の一定供給源を提供する。最後に、細胞株の使用は、多数の抗原陽性細胞が上記デバイスに結合するために利用可能であることを確保し（蛍光マイクロプレートリーダーの測定範囲内に出力シグナルが存在することを可能にする）、従って、このハイスループット検出方法（数百個ものサンプルが、数分間で読取られ得、かつ正確に定量され得る）の使用を可能にする。
【００２９】
定量能力における有意な改良が、標準曲線の組み込みによって、本方法にもたらされる。以前のアッセイにおける結果は、同じ個体から単離された同じバッチの血球を使用して、同じ実験において分析された他のサンプルと比較して表わされた場合にのみ、意味があるに過ぎなかった。本方法を使用すると、デバイスに結合している全細胞数が、各実験についての非線形回帰によって算出され得る。別々のバッチの細胞を使用して別々の操作者によって別々の日に実施された別々の実験が、互いに対して直接比較され得る。
【００３０】
開示される本発明の実施形態は、現在好ましいと考えられているが、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更および改変がなされ得る。本開示は、例示的であり網羅的ではないことが意図される。本開示は、当業者に対して多くの変化形および選択肢を示唆する。これらの選択肢および変化形は、添付された特許請求の範囲の範囲内に包含されることが、意図される。当業者は、記載される特定の実施形態に対する他の等価物（本実施形態に添付された特許請求の範囲によって包含されることがこれもまた意図される）を認識し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本発明は、添付の図面と組み合わせて上記説明を参照することによってよく理解される。
【図１】図１は、先行技術の代表的ステントの写真である。
【図２】図２は、細胞数に対する蛍光の代表的標準曲線を示すグラフである。
【図３】図３の上図は、本発明の一実施形態に従って、上記アッセイの蛍光強度によって測定した場合の、種々の結合能力のステントに結合している細胞の数の例証である。図の下図は、図３の上図に示されるステントの写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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