(57)【要約】本発明は、ホルミルペプチドレセプタ（ＦＲＰ）レセプタファミリーおよびホルミルペプチドレセプタ様１（ＦＰＲＬ１）の１以上のアゴニストの、ヒトの感染に対して抵抗性のバイオマーカーとしての使用に関する。前記バイオマーカーは、診断、予防および治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルミルペプチドレセプタ（ＦＲＰ）レセプタファミリーおよびホルミルペプチドレセプタ様１（ＦＲＰ１）の１以上のアゴニストの、ヒトのＨＩＶ感染に対して抵抗性のバイオマーカーとしての使用。
【請求項２】
前記アゴニストは、可溶性ＳＡＡ、ＷＫＹＭＷＶｍペプチド、細菌走化性ペプチドｆＭＬＦおよび約８．６ｋＤａのそのフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＩＬ−２２、Ｊａｃｋ／ＳＴＡＴ経路、ＳＯＣＳ３、ベータ・デフェンシン（２および３）および急性期アポリポタンパク質血清アミロイドＡｃまたはＡ−ＳＡＡまたはそのフラグメント、ＩＬ−８サイトカインおよびその等価物を含む少なくとも１種の先天性免疫応答タンパク質を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
バイオマーカーは、ＩＬ−２２および／またはＳＯＣＳ１および／またはＳＴＡＴ３および／またはＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって血漿中に確認される約８．６ｋＤａの可溶性タンパク質および／またはＩＬ−８およびその等価物を含む群から選択される、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
バイオマーマーは、リン酸化されたＳＴＡＴおよび／またはＳＯＣＳタンパク質である、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
ケモカインのバイオマーカーは、ＧＲＯ−α、ＭＩＰ−３β、ＳＤＦ１−β、およびガンマ・ケモカイン・リンフォタクチンおよびその等価物を含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項７】
診断ツールとしての請求項１〜６のいずれか１つに記載のバイオマーカーの使用。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１つに記載されたタンパク質の少なくとも１種の有効量を含む、ウイルスまたはレトロウイルス感染、特にはＨＩＶ感染を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項９】
ＩＬ−２２、Ｊａｃｋ／ＳＴＡＴ経路、ＳＯＣＳ３、ベータ・デフェンシンおよび急性期アポリポタンパク質血清アミロイドＡ−ＳＡＡまたはそのフラグメント、ＩＬ−８サイトカインおよびその等価物を含む群から選択される１以上のタンパク質の有効量を、薬学的に不活性な賦形剤と組み合わせて含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
経口、筋肉内、静脈内または粘膜ルートによる投与用の、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
経口用に、医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、滴剤、パッチまたはスプレーの形態で提示される、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
注射による投与用に、医薬組成物は、滅菌または滅菌可能な溶液または懸濁液または乳液から製造される静脈内、皮下または筋肉内ルートによる注射用溶液の形態下にあり、粘膜適用のためにゲルの形態下にある、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ウイルス感染に対する先天性の宿主の抵抗性を良好にする方法であって、
請求項１〜７のいずれか１つにおいてバイオマーカーとして定義されたタンパク質の少なくとも１種、ＩＬ−２２を、先天性の免疫応答を助ける開始サイトカインとして用いる工程を包含する、方法。
【請求項１４】
感染に対する先天性の免疫応答を助ける開始サイトカインとしてＩＬ−２２が用いられる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトの感染に対して抵抗性のバイオマーカーおよびその生物学的適用、詳細には、診断、予防および治療における適用に関する。
【０００２】
本発明は、一般的には病原体に起因する感染、特にはウイルスおよびレトロウイルスに起因する感染、より特定的にはＨＩＶ感染に対して抵抗性のバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００３】
いくつかのウイルス性疾患、特に、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引き起こされる後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）が２０世紀の終わりに現れた。その発見以来２０年以上を経ても、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の流行病は、全世界において、依然として、健康上、社会上および経済上の理由のために主要な負担になっている。２００２年中、約３１０万の死が記録される一方で、約５００万の新たな感染ケースが記録された。世界中で４千万を超える人が感染し、このウイルスの広がりを防止するため、並びに、現在の治療法を改善するための薬剤を見出すことが緊急に必要である。今日まで、宿主の遺伝子レパートリ、先天性および後天性の免疫応答、ウイルスの突然変異または弱毒化の全てが、より高いまたはより低い感染に対する個々の感受性を説明するために求められた。ヒト免疫不全ウイルスのターゲット細胞への取り込みのメカニズムを理解する際に多くの進歩がなされた。ウイルスのコレセプターの識別およびそのレセプタに結合させられるウイルスのエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）の構造等のランドマークとなる発見は、いかにＥｎＶがウイルスおよび細胞膜の融合を媒介するかの重要な見識を図１に記載されるように提供した。
【０００４】
反復してＨＩＶ露出に遭っているにも拘わらず感染から多少は「免れる」人もいること、並びに、ＨＩＶに感染した人の中に疾患の進行が極めて遅い人もいることは、天然のＨＩＶ抵抗の基礎をなすメカニズムを解明するための有益な手掛かりを提示する。著しいことに、両方のこのような集団、いわゆる露出血清反応陰性（Exposed Seronegative：ＥＳＮ）、露出非感染（Exposed Uninfected：ＥＵ）および緩慢進行（Slow Progressors：ＳＰ）、長期進行（Long Term Progressors：ＬＴＰ）の各個人は、共通の免疫応答、例えば、共通のターゲットに対抗する生じさせられた中和性抗体の発生を有しており、これは、ウイルスの取り込みおよび／または広がりにおいて防御的な役割を果たし得る。
【０００５】
１９８９年に、Ｒａｎｋｉによる論文に、奇妙な現象が記載された：ＨＩＶ特異的Ｔ細胞のＨＩＶ、未変性ｇｐ（グリコプロテイン）１２０および組み換えエンベロープおよびコアタンパク質に対する応答が、既知のＨＩＶ陽性の男性の抗体陰性および抗原陰性の性パートナーにおいて検出され得たというものである（１，非特許文献１）。２つの他の報告は、当該初期の観測結果を確認し、その著者は、セロコンバージョンおよび感染をもたらさないＨＩＶへの露出がヘルパーＴリンパ球の排他的初回刺激と関連する可能性を提起した（２，３，非特許文献２〜３）。親からＨＩＶに露出されたヘルスケアワーカー、およびＨＩＶ感染した母親の健康な新生児を含む、ＨＩＶ感染のリスクが高い異なる個人の集団において行われた分析が示したことは、抗体ではなくＨＩＶ特異的ヘルパーＴ細胞が全ての対象に存在したことである（４，非特許文献４）。これらの観測結果は、ＨＩＶ特異的ヘルパーＴ細胞の排他的初回刺激に至るウイルス露出が実際のＨＩＶ感染に対する防御に関連し得るという仮説につながった。この仮説は、ナイロビの３の商業的性従業者（Pumwanniの集団）によって大幅に強化され（５，非特許文献５）、自ら売春婦をし始めた大部分の女性が１年以内にＨＩＶ感染したが、感染に対して明らかに抵抗性である者が少数ながら比較的多数にのぼった（試験された個人の約１５％であると後に推定された）ことによって明らかに証明された。２）Sarah Rowland-Jonesは、ＨＩＶ感染した母親の健康な新生児の中にＨＩＶ特異的ＣＴＬが存在することを示した（６，非特許文献６）。これらの新生児中のＨＩＶ特異的ＩＦＮα分泌ＣＤ８  Ｔリンパ球の検出は、セロコンバージョンに関連しないＨＩＶ露出が実際の不発感染と関連することおよび生きている複製しているウイルスが実際に特異的な免疫の刺激の原因となっていることを認識する転換点であった。事実、実際のウイルス感染によってのみ、ＨＬＡクラスＩ分子に関連するウイルス抗原の提示およびＣＤ８媒介免疫応答の惹起をもたらす。（はるか後に、この設定での細胞媒介型免疫の防御的役割は、所定期間にわたり商業的性労働を中断したケニヤ人のＨＩＶ抵抗性の性労働者において生ずる遅発性のセロコンバージョンが、低減した抗原露出に起因するＨＩＶ特異的ＣＤ８＋応答の低減に関係するという観測結果によってさらに補強された）（７，非特許文献７）。３）感染に至らない用量のＳＩＶにサル（macaque）がインビボで露出され、このサルにおいて、ＳＩＶ特異的ヘルパーＴ細胞が検出された実験により、同一ウイルスの感染用量による次の挑戦に対する防御が証明された（８，非特許文献８）（これらの結果は、他の探索研究者によって明確に確認されたわけではない）。
【０００６】
ＨＩＶ感染に対する防御の免疫相関物の調査分野が生じた。続いて、極めて重要な報告が示したことは、ＨＩＶに露出されたが感染しなかった人では、１）ＣＣＲ５レセプタにおける０．３２の欠損によって表される特定の遺伝子的な背景（９，非特許文献９）が存在し得ること（１０−１２，非特許文献１０〜１２）；２）細胞抗ウイルス因子（ＣＡＦ）を含む可溶性の因子の産生（１３、１４，非特許文献１３−１４）、ベータ・ケモカインおよびアルファ・デフェンシン（１５，非特許文献１５）が増加すること（１６−１８，非特許文献１６〜１８）、３）分泌性ＨＩＶ特異的ＩｇＡおよびヘルパーＴおよびＣＴＬが子宮頚膣流体物および射精物において検出され得ること（１９−２２，非特許文献１９−２２）、４）ＮＫ細胞の活性が特に強力であること（２３，非特許文献２３）である。このため、血清反応陰性の人におけるＨＩＶ特異的ヘルパーＴ細胞の検出の最初の記載から１５年後に、ＨＩＶ感染に対する可能な抵抗性は、おそらく良好な遺伝子的かつ天然の免疫設定の範囲内で、全身の粘膜細胞媒介免疫および粘膜に閉じ込められたＩｇＡの惹起と相関していると要約され得る。
【０００７】
【表１】
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【０００８】
【非特許文献１】ランキ・エイ（Ranki, A）、マッチネン・エス（Mattinen, S）、ヤーコーン・アール（Yarchoan, R）、ブローダー・エス（Broder, S）、ゲラエブ・ジェイ（Ghrayeb, J.）、ラーデビルタ・ジェイ（Lahdevirta, J）、クローン・ケイ（Krohn,K）著，「T-cell response towards HIV in infected individuals with and without zidovudine therapy, and in HIV-exposed sexual partners」，Aids，１９８９年，第３巻，ｐ．６３−６９
【非特許文献２】クレリシ・エム（Clerici, M）、ベルゾフスキー・ジェイ・エイ（Berzofsky, J.A）、シェアラー・ジー・エム（Shearer, G.M）、タケット・シー・オー（Tacket, C.O）著，「Exposure to human immunodeficiency virus (HIV) type I indicated by HIV-specific T helper cell responses before detection of infection by polymerase chain reaction and serum antibodies [corrected]」，１９９１年，J Infect Dis，第１６４巻，ｐ．１７８−１８２
【非特許文献３】クレリシ・エム（Clerici, M）、ジオルジ・ジェイ・ブイ（Giorgi, J.V.）、チョウ・シー・シー（Chou, C.C）、ゲードマン・ブイ・ケイ（Gudeman, V.K）、ザック・ジェイ・エイ（Zack, J.A）、グプタ・ピー（Gupta, P）、ホ・エイチ・エヌ（Ho, H.N）、ニシャニアン・ピー・ジー（Nishanian, P.G）、ベロゾフスキー・ジェイ・エイ（Berzofsky, J.A）、シェアラー・ジー・エム（Shearer, G.M），「Cell-mediated immune response to human immunodeficiency virus (HIV) type 1 in seronegative homosexual men with recent sexual exposure to HIV-1」，１９９２年，J Infect Dis，第１６５巻，ｐ．１０１２−１０１９
【非特許文献４】クレリシ・エム（Clerici, M）、レビン・ジェイ・エム（Levin, J.M）、ケセル・エイチ・エイ（Kessler, H.A）、ベロゾフスキー・ジェイ・エイ（Berzofsky, J.A）、ランデイ・エイ・エル（Landay, A.L）、シェアラー・ジー・エム（Shearer, G.M），「HIV-specific T-helper activity in seronegative health care workers exposed to contaminated blood」，１９９４年，Jama，第２７１巻，ｐ．４２−４６
【非特許文献５】ホウク・ケイ・アール（Fowke, K.R）、ナゲルケルケ・エヌ・ジェイ（Nagelkerke, N.J.）、キマニ・ジェイ（Kimani, J.）、シモネセン・ジェイ・エヌ（Simonsen, J.N.）、アンザラ・エイ・オー（Anzala, A.O）、ブワヨ・ジェイ・ジェイ（Bwayo, J.J.）、マクドナルド・ケイ・エス（MacDonald, K.S）、ヌグギ・イー・エヌ（Ngugi, E.N.）、プラマー・エフ・エイ（Plummer, F.A.）著，「Resistance to HIV-1 infection among persistently seronegative prostitutes in Nairobi, Kenya」，１９９６年，Lancet，第３４８巻，ｐ．１３４７−１３５１
【非特許文献６】ローランド−ジョーンズ・エス（Rowland-Jones, S）、サットン・ジェイ（Sutton, J.）、アリヨシ・ケイ（Ariyoshi, K）、ドン・ティー（Dong, T.）、ゴッチ・エフ（Gotch, F.）、マクアダム・エス（McAdam, S.）、ウィトビー・ディー（Whitby, D.）、サバリー・エス（Sabally, S.）、ギルモア・エイ（Gallimore, A.）、コラー・ティー（Corrah, T）著，「HIV-specific cytotoxic Tcells in HIV-exposed but uninfected Gambian women」，１９９５年，Nat Med，第１巻，ｐ．５９−６４
【非特許文献７】カウル・アール（Kaul, R）、ローランド−ジョーンズ・エス・エル（Rowland-Jones, S.L.）、キマニ・ジェイ（Kimani, J）、ドン・ティー（Dong, T.）、ヤン・エイチ・ビー（Yang, H.B.）、キアマ・ピー（Kiama, P.）、ロストロン・ティー（Rostron,  T.）,ニジャビ・イー（Njagi, E）、ブワヨ・ジェイ・ジェイ（Bwayo, J.J）、マクドナルド・ケイ・エス（MacDonald, K.S.）、 マクマイケル・エイ・ジェイ（McMichael, A.J）、プラマー・エフ・エイ（Plummer, F.A.）著，「Late seroconversion in HIV-resistant Nairobi prostitutes despite pre-existing HIVspecific CD8+ responses.」２００１年，J Clin Invest，第１０７巻，ｐ．３４１−３４９
【非特許文献８】クレリシ・エム（Clerici, M）、クラーク・イー・エイ（Clark, E.A）、ポラシノ・ピー（Polacino, P）、アクセベルグ・アイ（Axberg, I）、クラー・エル（Kuller, L）、カセイ・エヌ・アイ（Casey, N.I.）、モルトン・ダブリュー・アール（Morton, W.R）、シエラ・ジー・エム（Shearer, G.M.）、ベンベニステ・アール・イー（Benveniste, R.E），「T-cell proliferation to subinfectious SIV correlates with lack of infection after challenge of macaques」，１９９４年，Aids，第８巻，ｐ．１３９１−１３９５
【非特許文献９】サムソン・エム（Samson, M.）、リベルト・エフ（Libert, F.）、ドランツ・ビー・ジェイ（Doranz, B.J.）、ルッカー・ジェイ（Rucker, J.）、リエスナルド・シー（Liesnard, C.）、ファーバー・シー・エム（Farber, C.M.）、サラゴスチ・エス（Saragosti,S.）、ラポウメローリ・シー（Lapoumeroulie, C.）、コグノクス・ジェイ（Cognaux, J.）、フォレセイル・シー（Forceille, C.）、ムイルデルマンス・ジー（Muyldermans, G）、ベルホステッド・シー（Verhofstede, C.）、バートンボーイ・ジー（Burtonboy, G.）、ゲオルゲス・エム（Georges, M.）、イマイ・ティー（Imai, T）、ラナ・エス（Rana, S）、イ・ワイ（Yi, Y.）、シムス・アール・ジェイ（Smyth, R.J.）、コールマン・アール・ジー（Collman, R.G.）、ドンズ・アール・ダブリュー（Doms, R.W.）、バサート・ジー（Vassart, G.）、パーメンティア・エム（Parmentier, M.）著，「Resistance to HIV-1 infection in caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene.」，１９９６年，Nature，第３８２巻，ｐ．７２２−７２５
【非特許文献１０】コストリキス・エル・ジー（Kostrikis, L.G.）、ハン・ワイ（Huang, Y.）、モーレ・ジェイ・ピー（Moore, J.P）、ウォーレンスキー・エス・エム（Wolinsky, S.M.）、チャン・エル（Zhang, L.）、グオ・ワイ（Guo, Y.）、ドイツ・エル（Deutsch,L.）、フェア・ジェイ（Phair, J.）、ノイマン・エイ・ユー（Neumann, A.U）、ホ・ディー・ディー（Ho, D.D.）著，「A chemokine receptor CCR2 allele delays HIV-1 disease progression and is associated with a CCR5 promoter mutation.」，１９９８年，Nat Med，第４巻，ｐ．３５０−３５３
【非特許文献１１】パクストン・エイチ（Paxton, H.）、ピンス・エム（Pins, M.）、デントン・ジー（Denton, G.）、マクゴングル・エイ・ディー（McGonigle, A.D.）、メイスナー・ピー・エス（Meisner, P.S.）、ハイル・ジェイ・ピー（Phair, J.P.）著，「Comparison of CD4 cell count by a simple enzyme-linked immunosorbent assay using the TRAx CD4 test kit and by flow cytometry and hematology.」，１９９５年，Clin Diagn Lab Immunol，第１１巻，ｐ．１０４−１１４
【非特許文献１２】キレント・シー（Quillent, C.）、オバーリン・イー（Oberlin, E.）、ブラウン・ジェイ（Braun, J.）、ロウセット・ディー（Rousset, D.）、ゴンザレス−カナリ・ジー（Gonzalez-Canali, G.）、メタイス・ピー（Metais, P.）、モンタグニア・エル（Montagnier, L.）、ビアリチア・ジェイ・エル（Virelizier, J.L.）、アレンザナ−セイスデドス・エフ（Arenzana-Seisdedos, F.）、ベレッタ・エイ（Beretta, A.）著，「HIV-1-resistance phenotype conferred by combination of two separate inherited mutations of CCR5 gene.」，１９９８年，Lancet，第３５１巻，ｐ．１４−１８
【非特許文献１３】ヒュシェ・エフ・ダブリュー（Hsueh, F.W.）、ウォーカー・シー・エム（Walker, C.M.）、ブラックボーン・ディー・ジェイ（Blackbourn, D.J.）、レビー・ジェイ・エイ（Levy, J.A.）著，「Suppression of HIV replication by CD8+ cell clones derived from HIV-infected and uninfected individuals」，１９９６年，Cell Immunol，第１５９巻，ｐ．２７１−２７９
【非特許文献１４】マクケビック・シー・イー（Mackewicz, C.E.）、ブラックボーン・ディー・ジェイ（Blackbourn, D.J.）、レビー・ジェイ・エイ（Levy, J.A.）著，「CD8+ T cells suppress human immunodeficiency virus replication by inhibiting viral transcription.」，１９９５年，Proc Natl Acad Sci U S A，第９２巻，ｐ．２３０８−２３１２
【非特許文献１５】トラバットニ・ディー（Trabattoni, D.）、カプト・エス・エル（Caputo, S.L.）、マフェイス・ジー（Maffeis, G.）、ビッチ・エフ（Vichi, F.）、ビアシン・エム（Biasin, M.）、ピエロッティ・ピー（Pierotti, P.）、ファサーノ・エフ（Fasano, F.）、サレセッラ・エム（Saresella, M）、フランキーニ・エム（Franchini, M.）、フェランテ・ピー（Ferrante, P.）、マゾッタ・エフ（Mazzotta, F.）、クレリチ・エム（Clerici, M.）著，「Human alpha Defensin in HIV-Exposed But Uninfected Individuals.」，２００４年，J Acquir Immune Defic Syndr，第３５巻，ｐ．４５５−４６３
【非特許文献１６】ストランフォード・エス・エイ（Stranford, S.A.）、スカーニック・ジェイ（Skurnick, J.）、ロウリア・ディー（Louria, D.）、オスモンド・ディー（Osmond, D.）、チャン・エス・ワイ（Chang, S.Y.）、スニスキー・ジェイ（Sninsky, J.）、フェラーリ・ジー（Ferrari, G.）、ワインホウルド・ケイ（Weinhold, K.）、リンドクイスト・シー（Lindquist, C.）、レビー・ジェイ・エイ（Levy, J.A.）著，「Lack of infection in HIVexposed individuals is associated with a strong CD8(+) cell noncytotoxic anti-HIV response.」，１９９９年，Proc Natl Acad Sci U S A，第９６巻，ｐ．１０３０−１０３５
【非特許文献１７】レビー・ジェイ・エイ（Levy, J.A.）、マクケビック・シー・イー（Mackewicz, C.E.）、バーカー・イー（Barker, E.）著，「Controlling HIV pathogenesis: the role of the noncytotoxic anti-HIV response of CD8+ T cells.」，１９９６年，Immunol Today，第１７巻，ｐ．２１７−２２４
【非特許文献１８】フルチ・エル（Furci, L.）、スカラッチ・ジー（Scarlatti, G.）、ブラステロ・エス（Burastero, S.）、タンブッシ・ジー（Tambussi, G.）、コログネシ・シー（Colognesi, C.）、キレント・シー（Quillent, C.）、ロンギ・アール（Longhi, R.）、ロベッロ・ピー（Loverro, P.）、ボゴノボ・ビー（Borgonovo, B.）、ガッフィ・ディー（Gaffi, D.）、カロウ・イー（Carrow, E.）、マルナチ・エム（Malnati, M.）、ルッソ・ピー（Lusso, P.）、シカルディ・エイ・ジー（Siccardi, A.G.）、ラザリン・エイ（Lazzarin, A.）、ベレッタ・エイ（Beretta, A.）著，「Antigen-driven C-C chemokinemediated HIV-1 suppression by CD4(+) T cells from exposed uninfected individuals expressing the wild-type CCR-5 allele.」，１９９７年，J Exp Med，第１８６巻，ｐ．４５５−４６０
【非特許文献１９】リゼング・キュー（Lizeng, Q.）、ニルソン・シー（Nilsson, C.）、ソウリアル・エス（Sourial, S.）、アンダーソン・エス（Andersson, S.）、ラーセン・オー（Larsen, O.）、アーバイ・ピー（Aaby, P.）、エーンルント・エム（Ehnlund, M.）、ブジョリンク・イー（Bjorling, E.）著，「Potent neutralizing serum immunoglobulin A (IgA) in human immunodeficiency virus type 2-exposed IgG-seronegative individuals.」，２００４年，J Virol，第７８巻，ｐ．７０１６−７０２２
【非特許文献２０】マゾーリ・エス（Mazzoli, S.）、トラバットーニ・ディー（Trabattoni, D.）、ロカプート・エス（Lo Caputo, S.）、ピコーニ・エス（Piconi, S.）、ブレ・シー（Ble, C.）、メアッシ・エフ（Meacci, F.）、ルザンテ・エス（Ruzzante,S.）、サルビ・エイ（Salvi, A.）センピシ・エフ（Semplici, F.）、ロンギ・アール（Longhi, R.）、フシ・エム・エル（Fusi, M.L.）、トファニ・エヌ（Tofani, N.）、ビアシン・エム（Biasin, M.）、ビア・エム・エル（Villa, M.L.）マゾッタ・エフ（Mazzotta, F.）、クレリシ・エム（Clerici, M.）著，「HIV-specific mucosal and cellular immunity in HIVseronegative partners of HIV-seropositive individuals.」，１９９７年，Nat Med，第３巻，ｐ．１２５０−１２５７
【非特許文献２１】ベイラー・シー（Beyrer, C.）、アーテンスタイン・エイ・ダブリュー（Artenstein, A.W.）、ルグパオ・エス（Rugpao, S.）、ステフェンズ・エイチ（Stephens, H.）、バンコット・ティー・シー（VanCott, T.C.）、ロブ・エム・エル（Robb, M.L.）、リンコウ・エム（Rinkaew, M.）、ビルクス・ディー・エル（Birx, D.L.）、カームブーンラング・シー（Khamboonruang, C.）、ジマー・ピー・エイ（Zimmerman, P.A.）、ネルソン・ケイ・イー（Nelson, K.E.）、ナトプラタン・シー（Natpratan, C.）著，「Epidemiologic and biologic characterization of a cohort of human immunodeficiency virus type 1 highly exposed, persistently seronegative female sex workers in northern Thailand. Chiang Mai HEPS Working Group.」，１９９９年，J Infect Dis，第１７９巻，ｐ．５９−６７
【非特許文献２２】ベルク・エル（Belec, L.）、ガイス・ピー・ディー（Ghys, P.D.）、ホキニ・エイチ（Hocini, H.）、ヌケヌガソング・ジェイ・エヌ（Nkengasong, J.N.）、トランコート−ディアロウ・ジェイ（Tranchot-Diallo, J.）、ディアロウ・エム・オー（Diallo, M.O.）、エッチグネ−トラオレ・ブイ（Ettiegne-Traore, V.）、マウリス・シー（Maurice, C.）、ベッカート・ピー（Becquart, P.）、マッタ・エム（Matta, M.）、シ−モハムト・エイ（Si-Mohamed, A.）、チョモント・エヌ（Chomont,N.）、コウリバリ・アイ・エム（Coulibaly, I.M.）、ウィクトー・エス・ゼット（Wiktor, S.Z）、カザッチキネ・エム・ディー（Kazatchkine, M.D.），「Cervicovaginal secretory antibodies to human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) that block viral transcytosis through tight epithelial barriers in highly exposed HIV-1-seronegativ African women.」，２００１年，J Infect Dis，第１８４巻，ｐ．１４１２−１４２２
【非特許文献２３】スコット−アルガラ・ディー（Scott-Algara）、トルオング・エル・エックス（Truong, L.X.）、ベルスミッセ・ピー（Versmisse, P.）、デデビット・エイ（David, A.）、ルオング・ティー・ティー（Luong, T.T.）、ヌグイエン・エヌ・ブイ（Nguyen, N.V.）、セオドロウ・アイ（Theodorou, I.）、バレ−シノウッシ・エフ（Barre-Sinoussi）、パンシノ・ジー（Pancino, G.）著，「Cutting edge: increased NK cell activity in HIV-1-exposed but uninfected Vietnamese intravascular drug users.」，２００３年，J Immunol，第１７１巻，ｐ．５６６３−５６６７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＨＩＶ感染に対する天然の抵抗性のメカニズムの理解は、抗ウイルスの新規な戦略の識別、特には、革新的な診断法、治療法およびワクチン設計の開発の意味合いを持つかもしれない。
【００１０】
本発明者らは、ＨＩＶに露出されたが未感染の人（ＥＵ）、ＨＩＶに露出されかつ感染した人（ＨＩＶ＋）および健康なドナー（ＨＣ）からのタンパク質のプロファイル（プロテオーム）およびゲノム発現（トランスクリプトーム）に関する研究を比較し、ＨＩＶ感染に対する抵抗メカニズムを説明し得るＥＵからのバイオマーカーを識別した。
【００１１】
本発明者らは、ウイルス抵抗性に関係するタンパク質の誘導の原因となるらしいキーとなるサイトカインを識別した。
【００１２】
本発明者らはまた、別のサイトカインが研究された集団の中で多形性を示し、ＥＵの中で特定のパターンを示すことを見出した。次いで、他の等価物も、ＦＲＲまたはＦＰＲＬ１レセプタについてのそれらの作用によってＨＩＶ抵抗性プロセスおよび続くＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４  ＨＩＶコレセプタの多形性に関与するようである。次いで、これらのサイトカインの組み合わせは、ウイルス感染の遮断に間接的に関与する要素であると考えられた。個々におよび組み合わせて、それらはまた、ＨＩＶ抵抗メカニズムに関与するようである。
【００１３】
そこで、本発明の目的は、このようなサイトカインおよびその誘導されたカスケードのタンパク質を含む、ＨＩＶ感染に対して抵抗性のバイオマーカーを提供することにある。
【００１４】
別の目的によると、本発明は、前記サイトカインおよびそれらが誘導したカスケードのタンパク質の個々にまたは組み合わせての使用を含む、診断、予防および治療に有用な新しいツールを提供することを意図する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明は、ホルミルペプチドレセプタ（Formyl peptide receptor：ＦＰＲ）のレセプタファミリーおよびホルミルペプチドレセプタ様１（Formyl peptide receptors-like 1：ＦＲＰＬ１）の１以上のアゴニストの、ヒトのＨＩＶ感染に対して抵抗性のバイオマーカーとしての使用に関する。より詳細には、前記アゴニストは、可溶性のＳＡＡ、ＷＫＹＭＷＶｍペプチド、細菌走化性ペプチドｆＭＬＦおよび約８．６ｋＤａのそのフラグメントを含む群から選択される。
【００１６】
本発明は、より具体的には、ＩＬ−２２、Ｊａｃｋ／ＳＴＡＴ経路、ＳＯＣＳ３、ベータデフェンシン（２および３）および急性期アポリポタンパク質血清アミロイドＡｃまたはＡ−ＳＡＡまたはそのフラグメント、ＩＬ−８サイトカインおよびその等価体を含む少なくとも１種の先天性免疫応答タンパク質の、ＶＩＨ感染に対して抵抗性のバイオマーカーとしての使用に関する。
【００１７】
有利には、バイオマーカーは、ＩＬ−２２および／またはＳＯＣＳ１および／またはＳＴＡＴ３および／または血漿においてＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって識別される約８．６ｋＤａの可溶性タンパク質および／またはＩＬ−８およびその等価体を含む群から選択される。
【００１８】
本発明はまた、リン酸化されたＳＴＡＴおよび／またはＳＯＣＳタンパク質の使用に関する。
【００１９】
あるいはおよび／または加えて、本発明は、ＧＲＯ−α、ＭＩＰ−３β、ＳＤＦ１−βおよびガンマケモカイン・リンフォタクチン（lymphotactin）およびその等価体を含む群から選択されるケモカインの、バイオマーカーとしての使用に関する。
【００２０】
前記タンパク質は、ＨＩＶ感染に対して抵抗性のバイオマーカーとしてのそれらの性質の観点から生物学的な適用において非常に有用である。特に、それらは、診断、治療および予防において非常に興味深い。
【００２１】
このように、本発明は、前記タンパク質を使用することを含む診断ツールとしてのそれらの使用にも関する。
【００２２】
本発明はまた、病原体に起因するあらゆる感染、特にウイルスまたはレトロウイルス感染、特定的にはＨＩＶ感染を予防または治療するための医薬組成物に関する。
【００２３】
このような組成物は、バイオマーカーとして定義された上記タンパク質の少なくとも１種の有効量を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。
【００２４】
好ましい医薬組成物は、ＩＬ−２２、Ｊａｃｋ／ＳＴＡＴ経路、ＳＯＣＳ３、ベータ・デフェンシン（２および３）および急性期アポリポタンパク質血清アミロイドＡｃまたはＡ−ＳＡＡまたはそのフラグメント、ＩＬ−８サイトカインおよびその等価体を含むカスケードの１以上のタンパク質の有効量を、薬学的に不活性な賦形剤と組み合わせて含む。
【００２５】
本発明の医薬組成物は、有利には、経口、筋肉内、静脈内または粘膜ルートによる投与用に調製される。
【００２６】
経口投与用に、それらは、錠剤、丸剤、カプセル剤、滴剤、パッチまたはスプレーの形態で提示される。
【００２７】
注射による投与用には、医薬組成物は、静脈内、皮下または筋肉内ルートによる注射溶液の形態下で、滅菌または滅菌可能な溶液または懸濁液または乳液から製造される。
【００２８】
粘膜ルートによる投与用に、医薬組成物は、ゲルの形態下である。
【００２９】
投与用量は、患者の状態に応じて当業者によって容易に調整されるだろう。
【００３０】
さらに別の態様によると、本発明は、ウイルス感染に対する先天性の宿主抵抗性を良好にする方法であって、バイオマーカーとして上記に定義された少なくとも１種のタンパク質、特に、ＩＬ−２２を、感染に対する先天性の免疫応答を助ける開始サイトカインとして用いる工程を包含する、方法に関する。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の実施例において、図１〜１０を参照しながら与えられることになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
（材料および方法）
（露出されたが未感染（ＥＵ）である人の採用）
ＨＩＶに露出されたが未感染である人が研究に登録された。各場合において、ＥＳＮは、ＨＩＶ感染患者の性パートナーであった：各カップルにおいて、コンドームなしの性交の長期にわたる履歴が報告された（他の既知の危険因子はない）。ＥＵの試験対象患者基準は、少なくとも４年間にわたり保護なしで性交したことが複数回あって、研究期間の前の４月以内にリスクのある挿入をしたことが少なくとも４回ある履歴であった。ＥＵは、培養およびＲＮＡウイルス負荷法により繰り返してＨＩＶ血清反応陰性であった。ＨＩＶ感染した人および健康なコントロールも研究に登録された。ＨＩＶ患者およびＨＣは、ＥＵと年齢および性の点で適合した。全てのＥＵ、ＨＩＶ＋およびＨＣの人は、フランスにあるSanta Maria Annunziatta病院の感染病部門によって少なくとも４年（研究期間に先行して）にわたり長期追跡された。これにより、我々は、該当する期間中に性的に伝染させられた病気または任意の他の病状が報告されたＥＳＮおよびＨＣを研究から除外することができた。ＥＵは、ＣＣＲ５−Δ３２アレルの存在を基礎として特徴付けられた；１人に異型接合の欠失が検出された。全てのＥＵ、ＨＩＶ患者および低リスクの未感染の人は、末梢血単核細胞を寄付することに同意した。
【００３３】
（細胞）
頻繁に無防御の性交をしたまたはシリンジ交換により侵襲的な薬物注射をしたＥＵおよびＨＩＶ＋である不調和のカップルからのＴ細胞についてプロテオミクスおよびトランスクリプトーム比較研究が行われた。ＨＣからのＴ細胞は、これらの分析のコントロールであった。３の集団；ＨＣ、ＥＵおよびＨＩＶ＋から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が収集され、フィコール−ハイパックにより分離され、短期（６日）に培養され（Yssel, H. and Spits, H, in Current Protocols in Immunology, Chapter 7.19）、次いで、Ｔリンパ球（ＣＤ４＋およびＳＤ８＋）が、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化され、１０％のＦＣＳが補給されたＲＰＭＩ中で培養された。簡単には、ＣＤ３−ＴＣＲ複合体を活性化するために、１０μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３、ＳＰＶ−Ｔ３ｂモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いて、４時間にわたり３７℃で２４ウェルのプレートをコーティングした。続いて、１％のＡＢ＋ヒト血清および１μｇ／ｍＬの抗ＣＤ２８  Ｌ２９３  ＭＡｂを含有する培地（Yssel’s medium, Irvine scientific, Santa Ana, CA）の存在下にこれらのコーティングされたウェル中に１０６の細胞が沈着させられた。３種のＴ細胞活性化時間が、それぞれ、２、６および１８時間になされた。Ｔ細胞の遺伝子発現の研究のために、活性化された細胞が１集団当たり５人からプールされた（それぞれ、等価数の細胞および全ＲＮＡを有する、表２）。この研究は、Serial Analysis Gene Expression (SAGE, Velculescu 1995, [24]).を用いて行われた。続いて、ＳＡＧＥの結果を個々に確認するためのさらなる使用のために、プールの各個人の全ＲＮＡのセットが凍結された。これらの細胞のセットはまた、パワー・ウェスタン（Power and Western）ブロット分析を行うために用いられた（下記参照）。３集団からの人（ｎ＝２５、表２）の血漿中に存在する可溶性のタンパク質がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ Ciphergen（登録商標）アプローチによって分析された。
【００３４】
樹状細胞は、健康なドナーからの単核細胞から誘導された。簡単には、高度に精製された単核細胞を得るために、バフィーコートが処理され、この単核細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４および１５０ｎｇのＧＭ−ＣＳＦ（Becton and Dickinson）の存在下に１０％のＦＣＳが補給されたＤＭＥＭ培養液中で７日間にわたり、適切なＭＡｂ（抗ＤＣサイン（sign）、抗ＣＤ１ａ、抗ＣＤ８３および抗ＣＤ８６  ＭＡｂｓ）を用いて良好に特徴付けられるようになり、また、ホルミルペプチドレセプタ−様１（Formyl peptide receptor-like 1：ＦＲＰＬ１）（ホルミルペプチドレセプタ（ＦＰＲ）ファミリーに属するレセプタ）の未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の存在を示すまで培養された。細胞は、５％ＣＯ２の湿った雰囲気中に３７℃で維持された。
【００３５】
（抗体および試薬）
組み換えヒトＩＬ−２２、抗−ＣＣＲ５ポリクローナルＡｂ、抗ヒトＩＬ−２２ポリクローナルがR&D Systems（オックスフォード大学，英国）から購入され、血清アミロイドＡ（Ａ−ＳＡＡ）およびＩＬ−８タンパク質がPeprotech（Rocky Hill，NJ）から購入され、ＭＩＰ−１βが、Francoise Baleux（パスツール研究所、パリ、フランス）から得られ、抗ＩＬ−８  ＭＡｂがBenderから購入され、抗ＣＸＣＲ４、抗ＳＡＡ１および２  ＭＡｂ（Ｂｉｏｓｏｒｃｅ）、抗ＳＡＡ  ＭＡｂ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、抗−アクティブＳＴＡＴ−１ポリクローナル  Ａｂ、抗−ＳＴＡＴ１  ＭＡｂ、抗−アクティブＳＴＡＴ−３ポリクローナル  Ａｂ、抗−ＳＴＡＴ−３  ｐＡｂ、抗−アクティブ  Ｓ
ＴＡＴ−５  ポリクローナル  Ａｂ、抗−ＳＴＡＴ−５  ＭＡｂは、Becton and Dickinson（Palo Alto，CA）から購入された。抗−ＳＯＣＳ  ３  ポリクローナル  Ａｂ（Santa Cruz研究所、Santa Cruz、CA）。
【００３６】
（プロテイン−チップ  ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦアプローチによる血漿分析）
分析前に、血漿サンプルは、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離され、沈殿は廃棄され、上清は、最適化された結合バッファー（binding buffer（ＢＢ）：ＮａＣｌ  ０．２５０Ｍ、Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ｐＨ７．５）に希釈された（１：１０）。希釈された血漿サンプルは、１時間中に、予め飽和された強アニオン交換（ＳＡＸ２）プロテイン−チップ（登録商標）上に、５分の２のＢＢ浴によって塗布された。未結合のタンパク質は、洗浄バッファ（ＷＢ：ＮａＣｌ  １Ｍ，Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ｐＨ７．５）による５分の３回の洗浄および５μＬの純粋な２回の蒸留水による最後の洗浄を用いて洗い流された。チップに捕捉されたタンパク質は、続いて、室温（ＲＴ）で空気乾燥させられた後、レーザエネルギーを吸収するために、マトリクス（９９．９％アセトニトリルおよび０．１％トリフルオロ酢酸中のＳＰＡ（3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnapynic acid）によりそれらを被覆した。マトリクスが調合されたサンプルは室温で乾燥させられた。その後、これらのサンプルは、捕捉したタンパク質を脱着させるために、１００００〜４００００ショット（不定単位）で変化するレーザ強度で平均で１００実時間（real time）のレーザ発射を受け、タンパク質スペクトル（プロテオグラム）を生じさせた。イオン化されかつ脱着されたタンパク質が検出され、プロテオグラム像上に示されたそれらの分子質量は、Protein-Chip Biology System IIソフトウェア（PBS II；Ciphergen）およびCiphergen PeaksソフトウェアによるＴＯＦ分析を用いて決定された。チップ表面によって捕捉された各タンパク質の質量対電荷比（ｍ／ｚ）は、外部較正標準：ヒト・アンギオテンシンＩ（１．２９６５キロダルトン，ｋＤａ）、ヒトＡＣＴＨ（２．９３３５ｋＤａ）、ヒト・α−エンドルフィン（３．４６５０ｋＤａ）、ウシ・インシュリン（５．７３３６ｋＤａ）およびウシ・ユビキチン（８．５６４８ｋＤａ）によって決定された。
【００３７】
（〜８．６ｋＤａのタンパク質のＥＵ血漿からの欠失）
１ｍＬのＰＢＳにより３回洗浄された２５マイクロリットルの磁気ビーズ（Dynal）が、Clinisciencesからの抗−Ａ−ＳＡＡ（ＳＡＡ−１  ＆  ＳＡＡ−２）ＭＡｂ  ２５μｇに加えられ、１００μｇ／ｍＬの濃度とされ、回転（orbital）振とうして１８時間にわたり４℃でインキュベートされた。抗−Ａ−ＳＡＡ  ＭＡｂをコーティングしたビーズは、続いて、１ｍＬのＰＢＳにより３回洗浄された。次いで、５００マイクロリットルのＥＵ血漿が加えられ、３７℃で３時間振とうしながらインキュベートされた。次いで、この血漿の上清は、特定のCiphergen Chipを用いて再分析された。抗−Ａ−ＳＡＡ  １＆２  ＭＡｂと共に予めインキュベートされたかまたはされなかった５マイクロリットルのＥＵが適用され、先に示されたようにＳＥＬＤＩ−Ｔｏｆ（Ciphergen（登録商標））によって分析された。
【００３８】
（組換えＡ−ＳＡＡタンパク質によるＨＩＶ−１感染の阻害）
ＨＩＶ−１感染の前に、１時間にわたり、所定の濃度で、ＥＰＲＬ１のアゴニストである急性期のヒトアポリポタンパク質血清アミロイドＡ（Peprotec（登録商標）からのＳＳＡ）と共にｉＤＣ細胞がインキュベートされた。続いて、細胞は、０．１のＭＯＩで２時間にわたりＨＩＶ−１  ＡＤＡまたはＨＸＢ２に感染させられた。細胞は、広範囲にわたって洗浄され、完全培地においてインキュベートされた。ＨＩＶ−１  ｐ２４レベルは、感染から４日後に酵素結合免疫吸着検定法（Beckman-Coulter，フランス）によって測定された。
【００３９】
（ＳＡＧＥ分析）
ＳＡＧＥは、原則的に、ＵＲＬ：WWW.sagenet.orgにおいて入手できるVelculescuのプロトコール（７）の詳説に概説されるように、Powell（９）およびKenzelmann（９）の改変により行われた。
【００４０】
（パワーブロット分析）
タンパク質の免疫ブロット分析は、（www.translab.com/shtml）に記載されるように行われた。簡潔には、３集団からのＣＤ３／ＣＤ２８刺激されたＴ細胞が、溶解バッファ（Ｔｒｉｓ  １０ｍＭ  ｐＨ７．４  オルトバナジン酸ナトリウム  １ｍＭ，ＳＤＳ  １％）によって溶解させられ、超音波処理がなされ、遠心分離によって浄化された。１ゲル中で広いサイズ範囲のタンパク質を検出するために、タンパク質は５〜１５％勾配のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに移された。４００マイクログラムのタンパク質が、ゲルの全体幅にわたって長型ウェルに装填された。これは、標準２５ウェルのゲル上のレーン毎に電気泳動にかけられる約１５μｇのタンパク質になる。続いて、ゲルは、終夜、Immobilon（登録商標）−Ｐ膜（Millipore，Bedford，ＭＡ）に転写された。転写後、膜は、１時間にわたり５％のミルクにより閉塞された。続いて、膜は、膜全体を４５のチャネルに分けるウェスタンブロッッティング・マニホルドに挿入された。各チャネルにおいて、種々の複合抗体反応混液が加えられ、１時間にわたりハイブリダイズすることができるようにされた。染色の後、膜は洗浄され、３０分にわたり、二次的なヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase：ＨＲＰ）とハイブリダイズさせられた。全ての抗体は、マウスのモノクローナルである。膜は洗浄され、SuperSignal West Pico（Pierce，Santa Clara，ＣＡ）により展開された。
【００４１】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
逆転写によって、活性化されたＴ細胞から単離された全ＲＮＡがｃＤＮＡに変換された。４２℃で５０分にわたる各全ＲＮＡサンプルの逆転写のために、次の試薬が用いられた：１μｇの全ＲＮＡおよび２００単位のSuperscript II逆転写酵素（ＲＴ，Gibco-BRL）；供給されたような（as aupplied）ＲＴバッファ；１００ｍｍｏｌ／Ｌのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、４０単位のRnasin（Promega，Madison，ＷＩ，米国）；１．２５ｍｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ；および５００ｎｇのオリゴｄＴｓ。ＰＣＲは、次のように行われた；２μＬのｃＤＮＡ；１．２５ｍｍｏｌ／Ｌの各ｄＮＴＰ，２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Promega）；２．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ２，２．５μＬの１０Ｘバッファおよび２０ｐｍｏｌの各プライマー対；２５μＬの全容積中。以下の特定のプライマーが用いられた：ＩＬ−２２：配列番号１のセンス5’-TGACAAGTCCAACTTCCAGCAG-3’、配列番号２のアンチセンス5’-TCTGGATATGCAGGTCATCACC-3’；ＩＬ−８：配列番号３のセンス5’-AACTTCTCCACAACCCTCTG-3’、配列番号４のアンチセンス5’-TTGGCAGCCTTCCTGATT-3’；ＧＡＰＤＨ：配列番号５のセンス5’- CCA-CCC-ATG-GCA-AAT-TCC-ATGGCA-3および配列番号６のアンチセンス5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’。事前のインキュベーション（９４℃、５分）の後、各ＰＣＲサンプルは、変性（９４℃、１分）、プライマーのアニーリング（５６℃、１分）および最終的な伸長（７２℃、１０分）を伴うプライマーの伸長（７２℃、１０分）の２９サイクルの増幅養生を経た。
【００４２】
（ウェスタンブロット分析）
各集団（ＨＣ、ＥＵおよびＨＩＶ＋）からの１００万のＣＤ３／ＣＤ２８活性化Ｔ細胞（上記に示されたような）が、１％  ＮＰ４０バッファに溶解させられた。各群について、還元条件下に等量のタンパク質が電気泳動にかけられ、電気泳動によりニトロセルロール膜に転写された。膜は、５％のＢＳＡおよび０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳ（５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ  ＨＣｌ，ｐＨ７．５）中で３０分にわたりインキュベートされ、次いで、一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートされた。タンパク質は、ＥＣＬシステム（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，ＮＪ）を用いて視覚化された。ブロットは、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＴＢＳで洗浄され、ＨＲＰ接合ヤギ抗ウサギまたは抗マウス二次抗体（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，ＮＪ）と共にインキュベートされた。別の抗体による再ブロットのために、フィルタは、以前に記載されたように取り除かれた（１０）。
【００４３】
（ＨＩＶ−１  コレセプターのリン酸化評価）
未成熟樹状細胞がＭＩＰ−１αまたは急性期Ａ−ＳＡＡ（Peprotec（登録商標））により、（図７において）示されたような濃度で、示された期間にわたって３７℃で刺激された。次いで、細胞は、２０分後に、氷を用いて周期的に混合しながら、ホスファターゼインヒビター（１ｍＭのフェニルスルホニル・フルオリド、５μｇ／ｍＬのアプロチニン、５μｇ／ｍＬのロイペプチン、１ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＧＴＡ）を含有する溶解バッファ（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１５％のグリセロール、５ｍＭのＥＤＴＡ）に溶解させられた。細胞溶解液は、３０μＬの洗浄されたタンパク質Ａ  セファロースビーズ（１５μＬの充填状ビーズ）により４℃で１時間にわたり事前清浄化され、１μｇのポリクローナル抗ホスホセリン抗体（ＢＤ）が２００μｇの細胞溶解液に加えられた。反応混合物は、４℃で終夜インキュベートされた。免疫複合体は、５０μＬの洗浄されたタンパク質Ａ  セファロースビーズ（２５μＬの充填状ビーズ）を加えることにより捕捉された。反応混合物は、さらに２時間にわたり４℃でインキュベートされた。ビーズは、スパンダウンされ（１４０００ｒｐｍで１０秒）、上清が排出され、氷冷の１ＸＩＰバッファにより３回洗浄され、その後、３０μＬの２Ｘ  レムリサンプル・バッファ中に再懸濁させられ、免疫複合体を取り除くために５分にわたり煮沸された。１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  precast gel（Invitrogen）上の電気泳動の後、タンパク質は、ニトロセルロース膜に転写された。ＣＣＲ５は、ポリクローナル抗ＣＣＲ５（R & D Systems）およびＥＣＬシステム（Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，ＮＪ）を用いて視覚化された。
【００４４】
（ヒト・ケモカイン、Searchlight（登録商標）アレイ）
ケモカインSearchlight（登録商標）アレイ（Pierce Endogen，Perbio,ホ゛ストン）の製造業者の指示に従って、８のケモカインの血漿含有量について、各研究対象の集団からの４つの異なる血漿が分析された。
【００４５】
（結果）
性的または全身性のルートを介してヒト免疫不全タイプ１ウイルス（ＨＩＶ−１）に繰り返し露出されているにも拘わらず、特定の人は、未感染のままである。ＨＩＶ−１感染に対する抵抗性の基礎をなしている分子レベルでのメカニズムを調査するために、本発明者らは、ＨＩＶ−１に露出されたが未感染の人（ＥＵ）、彼らのＨＩＶ−１感染した性的パートナーおよび健康なコントロールの集団からのＣＤ３／ＣＤ２８活性化末梢血Ｔ細胞（細胞シグナリングおよび遺伝子発現を高めるため）および血漿（それらの可溶性のタンパク質を研究するため）についての比較研究を行った（表２）。
【００４６】
【表２】
2007516701.tif 000003
【００４７】
相補的なゲノム、プロテオミックなおよび細胞のシグナリング分析は、Serial Analysis Gene Expression（ＳＡＧＥ）、Surface-Enhanced Laser Desorption lonisation and Time Of Fly Mass Spectrophotometry（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ，Ciphergen（登録商標）およびPower blotting（登録商標）をそれぞれ用いて行われた（材料および方法の項を参照）。天然の抗ウイルスメカニズムに関してLong term non progressors(LTNP)およびＥＵの人の遺伝子および生理学の理解は、ＨＩＶ感染に対する治療の基礎を提供し得る。そこで、本発明者らは、ＥＵの人において頻繁にＨＩＶの露出を受けた人に感染がないことに基づいて、生理病理学的メカニズムを研究した。
【００４８】
ＳＡＧＥ法によるトランスクリプトーム分析の遺伝子タグの多数（ＨＣ：２１１９３タグ、ＥＵ：２２６９７タグ、およびＨＩＶ＋：１７２８５タグ）から得られた最初の結果が示したことは、ＥＵでは、Ｔｈ１  ＩＬ−２２およびＳＯＣＳ１を過剰に発現することが見出され、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂは、ＨＩＶ＋では、類似のレベルを示したＥＵおよびＨＣ集団に比較して過小に発現することであり（表３）、これらの過程の結果は、「推測的な（priori）」考えを全く有することなく得られたものである。
【００４９】
【表３】
2007516701.tif 000004
【００５０】
３集団からのプールされたＴ細胞からのタンパク質のパワーブロット分析を並行して用いる際、急性期応答因子ＳＴＡＴ３が検出された。１集団当たり２５人からの血漿分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦアプローチを利用）は、分子量約８．６ｋＤａの可溶性タンパク質の発現の増加を示した（図２）。
【００５１】
ＩＬ−２２が、Ｊａｃｋ／ＳＴＡＴ経路、ＳＯＣＳ  ３、ベータ・デフェンシンおよび急性期アポリポタンパク質血清アミロイドＡ（Ａ−ＳＡＡ）：ＳＡＡ−１およびＳＡＡ−２を含む先天性の免疫応答（２５）のカスケード（図３）を開始することを考慮に入れると、これらのデータは、それらの意義を確認および拡張するための種々の方法を用いてさらに展開される（材料および方法の項を参照）。肝臓および他の組織において、血管上皮として合成されると、ＡＳＡＡは、血漿中でＨＤＬ（２６）およびＨＤＬ不含有と関連して見出される。Ａ−ＳＡＡプロモーターは、ＬＰＳによって誘導され得る炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ１α、ＴＮＦα、ＩＦＮαおよびＩＬ６に対して高い応答性である。さらに最近、Ｔｈ１  ＩＬ−２２サイトカインがＡ−ＳＡＡ発現に関与し得ることが示された。これらの観察が示唆したことは、Ａ−ＳＡＡは、局所部位における免疫の先天性の防御分子としての役割を果たし得るということである（２７）。Ａ−ＳＡＡの形質導入後開裂（post transductional cleavage）は、約８．５ｋＤａの分子量のＣ末端（term）フラグメントを生じさせる（２８、２９）。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ分析から得られた約８．６ｋＤａのタンパク質を識別するために、血漿ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦプロファイリング前の特異的な抗Ａ−ＳＡＡ  ＭＡｂが図４に示すように用いられ、約８．６ｋＤａに対応する像がこの抗Ａ−ＳＡＡ  ＭＡｂを用いて激減させられていた。興味深いことに、Ａ−ＳＡＡがＩＬ−８サイトカインを誘導することができることも知られており（３０）、そこで、このサイトカインがＥＵカスケードを特徴付けていることを確認するために、各集団の５人からＩＬ−８特異的ＲＴ−ＰＣＲが行われた。図５は、ＰＣＲが２つの他の群（ＨＩＶ＋およびＨＣ）と比較してＥＵにおいてＩＬ−８の特異的な多形性を証明していことを明らかに示している。特異的なＩＬ−２２  ＲＴ−ＰＣＲも、プールを形成した各人において行われ（図６）、我々は、ＥＵのみがこの重要なＴｈ１サイトカインを有意に過剰発現したことを観察することができた。
【００５２】
他の制御および検証がなされ、ウェスタンブロット分析が、プールされたサンプルからのタンパク質についてなされた。ＥＵ群においてＳＴＡＴ１およびＳＴＡＴ３がリン酸化された（図７Ａおよび７Ｂ）のに対して、ＨＩＶ＋においてＳＴＡＴ５がダウンレギュレートされたが、ＨＣおよびＥＵ群の両方において同等以上の高さの活性化レベルであったことも観察された（図７Ｃ）。ＳＯＣＳ３タンパク質の発現（図７Ｄ）、ＳＴＡＴ３応答性遺伝子は、ＥＵにおいてアップレギュレートされた。さらに、これらのＥＵの人は、アルファ・デフェンシンを過剰発現することを示した（１５）。さらに、ＩＬ−８がＦＰＲレセプタファミリーを通じてＨＩＶコレセプターを脱感作することができること（３１、３２）およびＳＴＡＴ１が細胞の抗ウイルス因子（ＣＡＦ）媒介型のＨＩＶ−１長期繰り返し（ＬＴＲ）活性化およびＨＩＶ複製の阻害に必要であることが示された（３３）。
【００５３】
ＦＰＲおよびＦＰＲＬ１のアゴニスト、可溶性のＡ−ＳＡＡ、ＷＫＹＭＷＶｍペプチド、細菌走化性ペプチドｆＭＬＦ、および可能性なその約８．６ｋＤａのフラグメントは、Ａ−ＳＡＡを用いた特異的ウェスタンブロット法での我々の実験に示されるようにリン酸化（図８）およびＦＰＲ活性化によるＨＩＶ−１コレセプターＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の両方のダウン修飾（３４−３７）を誘導する。それで、報告されるように（３１、３７、３８）、Ａ−ＳＡＡタンパク質がＨＩＶ−１感染を阻害したことが示された（図９）。Peprotec（登録商標）から購入された、これらのアッセイに用いられたＡ−ＳＡＡは、約８．６ｋＤａのフラグメントを示す（図１０）。
【００５４】
これらの結果により、ＥＵを特徴付ける先天性のＨＩＶ感染に対する宿主の抵抗性を良好にする事象のカスケードを識別することが可能となった。ＩＬ−２２は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴを介して、ベータ・デフェンシン、Ａ−ＳＡＡを誘導することができ、当該Ａ−ＳＡＡは、その発現のＩＬ８分泌を誘導する（３０）ので、これらの結果は、このカスケードを明らかに示した。さらに、ＩＬ−８（３１）およびα−デフェンシン（３９）は、ＨＩＶ−１感染を減少させることを示した。我々の結果は、ＩＬ−２２が先天性の免疫応答を助け、ＨＩＶ感染に対する抵抗メカニズムを提供する開始サイトカインであることを示す（図２）。
【００５５】
他の探索的アプローチは、Ｓｅｒｃｈｌｉｇｈｔ（Ｐｅｒｂｉｏ（登録商標））ヒト・ケモカインアレイ（表４）を用いることによって、集団（ＥＵ、ＨＣ、ＨＩＶ＋）当たり４人からの血漿中のいくつかのケモカインをチェックすることであった（表４）。
【００５６】
【表４Ａ】
2007516701.tif 000005
【００５７】
ＧＲＯ−α、ＭＩＰ−３β、ＳＤＦ１−βおよびガンマ・ケモカイン・リンフォタクチンが、ＨＩＶ＋と比較していくつかのＥＵおよび時にはＨＣにおいてより大きく過剰発現されることが見出された。ＨＩＶ感染でのこれらのケモカインの役割が明瞭に解明されたわけではないが、リンフォタクチンは、抗ＨＩＶ活性を示す（１）。しかしながら、我々の研究対象集団のＥＵにおいて、我々が、ＥＵに特異的なＩＬ−８の多形性を見出したことを考慮に入れて、いくつかのＥＵの抗ウイルス作用を（個々にまたは組み合わせて）持ち得るこれらのケモカインの特異的な多形性の存在を考慮することが可能である。
【００５８】
加えて、ＳＡＧＥ分析は、興味深いことに、ＨＩＶ＋ではＧｒａｎｚｙｍｅ  Ｂがダウンレギュレートされるが、ＥＵおよびＨＣの人では維持されることを示す。これは、ＨＩＶ−ＨＡＡＲＴ治療された人においてつくられたｇｒａｎｚｙｍｅの損失の観察を確認する（２、３）。本発明者らはまた、ＳＡＧＥ分析において、ＨＣおよびＨＩＶ＋よりもＥＵでのＩＦＮ−ガンマのより高い産生を観察した。これらのサイトカインは、典型的には、抗ウイルス性であり、これは、他者によってなされたＥＵについてのいくつかの研究において見出された。
【００５９】
【表４Ｂ】
2007516701.tif 000006
【００６０】
事象のカスケードが先天性の免疫の複数かつ主要な要素を誘導することが見出されたことを考慮すると、本発明の範囲は、ＨＩＶ以外の他のウイルスおよびレトロウイルスにも及ぶ。
【００６１】
ＥＵがより大量のリン酸化されたＳＴＡＴ１を示すことおよび重要なことに、この要素が、ＣＤ８  Ｔ細胞によって分泌される「細胞の抗ウイルス因子」（ＣＡＦ）の活性に必須であることも考慮されるだろう。ＥＵおよびＨＣと比較してＨＩＶ＋がＧｒａｎｚｙｍｅｓ  Ｂを遊離するらしいことも示された。Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂは、感染した細胞を殺すために、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＮＫによって産生される。ＣＡＦ  Ｇｒａｎｚｙｍｅｓ  ＢのＳＴＡＴ−１依存性の産生は、ＨＩＶ感染に拘わらずＡＩＤＳの伸展に抵抗する人での抗ＨＩＶ活性において主要な役割を果たす。ＳＡＧＥ分析において、ＨＣおよびＨＩＶ＋よりもＥＵにおいてＩＦＮ−ガンマのより高い産生も観察された。これらのサイトカインは、典型的には、抗ウイルス性である。これらのカスケード要素は、ウイルス感染に対する抵抗性の要素としてだけでなく、誘導された疾患に対する抵抗性の要素としても含まれるべきである。
【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】細胞のレセプタに対するウイルスのエンベロープ付着の種々の工程。
【図２】種々の集団からの人からのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦタンパク質プロファイル。
【図３】カスケード感染ＥＵのＨＩＶ−１感染についての阻害効果。
【図４】抗Ａ−ＳＡＡ  Ｍａｂを用いる約８．６ｋＤａのタンパク質の欠失。
【図５】比較としての、種々の集団からの人からのＩＬ−８  ＲＴ−ＰＣＲ。
【図６】比較としての、種々の集団からの人からのＩＬ−２２  ＲＴ−ＰＣＲ。
【図７】種々の集団からの人からのＳＡＧＥ分析のウエスタン確認。
【図８】急性期ＳＡＡタンパク質をＦＰＲレセプタに結合させることによるＶＩＨ−１  ＣＣＲ５  コレセプタリン酸化の誘導。
【図９】未発達樹状細胞のＨＩＶ−１  Ｒ５感染性。
【図１０】約８．６ｋＤａフラグメントを示すＳＡＡ調製のＳＥＬＤＩ−ＴＯＦプロファイル
【図１】
2007516701.tif 000007
【図２】
2007516701.tif 000008
【図３】
2007516701.tif 000009
【図４】
2007516701.tif 000010
【図５】
2007516701.tif 000011
【図６】
2007516701.tif 000012
【図７】
2007516701.tif 000013
【図８】
2007516701.tif 000014
【図９】
2007516701.tif 000015
【図１０】
2007516701.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月11日(2006.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現またはサイトカインのレベルとして測定される場合のウイルス感染に対する抵抗性のバイオマーカーとしてのＩＬ−２２の使用。
【請求項２】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって血漿中に確認される約８．６ｋＤａの可溶性タンパク質と組み合わせてＩＬ−２２が用いられる、請求項１による使用。
【請求項３】
ウイルス感染がＨＩＶ感染である、請求項１または２による使用。
【請求項４】
ウイルス感染に対する先天性の宿主の抵抗性を良好にする方法であって、ＩＬ−２２が、感染に対する先天性の免疫応答を助ける開始サイトカインとして、ウイルス感染に対する先天性の免疫応答の引き金を引く際の予防剤として用いられる、方法。
【請求項５】
ウイルス感染に対する先天性の宿主の抵抗性を良好にする方法であって、ＩＬ−２２が、感染に対する先天性の免疫応答を助ける開始サイトカインとして、ウイルス感染に対する先天性の免疫応答の引き金を引く際の治療剤として用いられる、方法。
【請求項６】
ＩＬ−２２がＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって血漿中に確認される約８．６ｋＤａの可溶性タンパク質と組み合わせて用いられる、請求項４または５の方法。
【請求項７】
ウイルス感染がＨＩＶ感染である、請求項３〜５のいずれか１つによる方法。
【請求項８】
ウイルス感染に対する予防または治療用の組成物におけるアジュバント（adjuvant）および先天性システムの誘導物質としてのＩＬ−２２の使用。
【請求項９】
ウイルス感染がＨＩＶ感染である、請求項８による使用。
【請求項１０】
ＩＬ−２２の有効量をサイトカインまたはエンコードするＤＮＡの形態で、薬学的に不活性な賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物。
【請求項１１】
経口または粘膜ルートまたは注射による投与用の、請求項１０の医薬組成物。 
【請求項１２】
経口投与用に、医薬組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、滴剤、パッチまたはスプレーの形態で提示される、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１３】
注射による投与用に、医薬組成物は、滅菌または滅菌可能な溶液または懸濁液または乳液から製造される静脈内、皮下または筋肉内ルートによる注射用溶液の形態下にある、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１４】
粘膜投与用に、医薬組成物はゲルの形態下にある、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１５】
ウイルスまたはレトロウイルス感染、特にＨＩＶ感染を予防または治療するための、請求項１０〜１４のいずれか１つによる医薬組成物。
【請求項１６】
調査診断産物中へのＩＬ−２２の使用を含む多因子先天性免疫評価法。
【請求項１７】
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって血漿中に確認される約８．６ｋＤａの可溶性タンパク質の使用をさらに含む、請求項１６の方法。
【国際調査報告】
2007516701.tif 000017
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2007516701.tif 000019
2007516701.tif 000020