(57)【要約】  本発明は、アポトーシス誘発、抗アレルギーおよび抗炎症作用を有する沙棘種子抽出物を開示する。当該抽出物は以下の方法により得られる：沙棘の種子に対しエタノールによる抽出を２回繰り返し行い、これらの抽出液を合わせ、減圧濃縮して褐色粉末状の抽出物を得る；前記粉末状抽出物を水に溶解し、エチルエーテル、酢酸エチルおよびブタノールを抽出溶媒として、順次それぞれ３回抽出を行う；エチルエーテル画分を濃縮し、褐色のオイルを得る；前記褐色のオイルをシリカゲルカラムに付し、酢酸エチルで溶出し、溶出画分を回収して当該抽出物を得る。当該抽出物は、好酸球に対しアポトーシスを誘発する活性を有する。当該抽出物は、ＭＢＰキナーゼを活性化することができる。当該抽出物は、過剰な好酸球に起因して生じる各種疾患に対して好酸球のアポトーシスを誘発する作用を発揮する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
沙棘種子抽出物であって、
沙棘の種子に対しエタノールによる抽出を２回繰り返し行い、該抽出液を合わせ、減圧濃縮して褐色粉末状の抽出物を得るステップと、
前記粉末状抽出物を水に溶解し、エチルエーテル、酢酸エチルおよびブタノールを抽出溶媒として、順次それぞれ３回抽出を行うステップと、
エチルエーテル画分を濃縮し、褐色のオイルを得るステップと、
前記褐色のオイルをシリカゲルカラムに付し、酢酸エチルで溶出し、溶出画分を回収するステップと
を含む方法により得られることを特徴とする沙棘種子抽出物。
【請求項２】
前記エタノールの濃度が８０％であることを特徴とする請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
前記エタノール浸漬時間が１２時間であることを特徴とする請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
前記酢酸エチルの溶出濃度が１５％であることを特徴とする請求項１に記載の抽出物。
【請求項５】
アポトーシスを誘発する活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抽出物。
【請求項６】
好酸球のアポトーシスを誘発する活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抽出物。
【請求項７】
ＭＢＰキナーゼを活性化できることを特徴とする請求項２に記載の抽出物。
【請求項８】
過剰な好酸球に起因して生じる各種疾患に対して好酸球のアポトーシス誘発作用を発揮することを特徴とする請求項３に記載の抽出物。
【請求項９】
アレルギー性鼻炎に対して好酸球のアポトーシス誘発作用を発揮することを特徴とする請求項３に記載の抽出物。
【請求項１０】
アトピー性気管支喘息に対して好酸球のアポトーシス誘発作用を発揮することを特徴とする請求項３に記載の抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アポトーシス誘発、抗アレルギーおよび抗炎症の作用を有する沙棘種子抽出物に関わる。
【背景技術】
【０００２】
沙棘（サージ）（Ｈｉｐｐｏｐｈａｅ  ｒｈａｍｎｏｉｄｅｓ  Ｌ．）（和名：スナヂグミ）は、古くから中国で利用されているグミ科の薬用植物で、チベットおよびヨーロッパの温帯乾燥地域に自生する。沙棘は自然界における長い進化の過程で、抵抗力を有する数々のビタミンと生物活性とを含む天然物質を形成してきており、このため沙棘の種子からは高い生理活性をもつ様々な物質を抽出することができ、血中脂質の調節、冠状動脈疾患や狭心症など心臓・脳血管の疾患の予防と治療、抗放射線、抗炎症・傷跡再生促進などに効果がある。わが国のチベットの代表的な医薬書である『四部医典』には、沙棘により作られた煎じ薬、散剤、丸薬、膏薬、「酥」（小麦粉を入れて練り乾燥した薬）、灰薬、酒薬など７種類の調合薬および８４種類の沙棘の調剤方法が収録記載されている。１９４１〜１９４２年に旧ソ連で沙棘の成分としてビタミンＣおよびカロチンが初めて分析されたが、１９８０年代半ばには、沙棘に含有される１００種余りもの生物活性物質が相次いで発見されている。１９７７年に沙棘は医薬品として『中華人民共和国薬典』に収録され、当該『薬典』には「沙棘は、果実の表面はオレンジ色を呈し、種子は長めの卵形で、褐色で光沢があり、種子の核は乳白色で、油を含み、香りは軽微で、酸味と渋みがあり、鎮咳去痰、消化促進、血行促進・うっ血除去の効能を有する」と記されている。アポトーシス誘発、抗アレルギーおよび抗炎症の作用を有する沙棘種子抽出物は、これまで発見されていなかった。
【０００３】
炎症性の呼吸器疾患は、リンパ球および好酸球に起因する炎症反応が繰り返し起きることによる慢性病であると考えられており、炎症発生時のリンパ球および顆粒球細胞の増殖調節のメカニズムを明らかにすることが、これらの疾患を知る上で極めて重要である。例えば、アトピー性気管支喘息は、好酸球、肥満細胞などの浸潤を主とするアレルギー性の慢性気道炎症である。発症時には、気道局所の好酸球数が増加し、好酸球の生存が延長されているので、もし好酸球をアポトーシスに導けば、気道局所の消炎に確かな効果を得ることができ、気道局所の好酸球の働きを抑制することは気道炎症の鎮静につながる。
【０００４】
ヒト好酸球（ＥＯＳ）の増加は、慢性気管支喘息の特徴である。好酸球増加症は、寄生虫感染特有の特徴でもあるが、ＥＯＳは蠕形動物に対する免疫作用をもつ細胞である。最近の研究で、好酸球増加症の発症機序がいくつか報告されている。その１つは、インターロイキン（ＩＬ）−３、ＩＬ−５のようなアレルゲン特異性ヘルパー（ＣＤ４＋）Ｔリンパ球Ｔｈ２亜型の細胞活性化因子および顆粒球−マクロファージのコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。ＩＬ−５は好酸球増加症と関わりがあり、これらはいずれもＥＯＳの増殖と活性化に対し特異的な働きをする。２つ目は、ＥＯＳにおけるα４β１インテグリン、活性化抗原（ＶＬＡ）−４の発現であるが、これはＶＬＡ−４および血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１の血管壁への付着を意味し、これらはいずれも選択的な好酸球増加症につながる。３つ目として、走化因子８ｋＤ  ｃ−ｃの産生がＥＯＳの動員および脱顆粒において重要な役割を果たしているということ。４つ目には、ＬＴおよびＰＡＦなど数種の伝達物質の抑制剤が好酸球増加症に効果があるが、これはいくつかの伝達物質が好酸球増加症の形成に関わっていることを示している。
【０００５】
気道のアレルギー性疾患をその発症の各段階で干渉または遮断する薬品は、いずれも抗アレルギー薬ということができ、このような薬品が喘息の予防と治療において最も主要な薬品となっている。よく使用される薬品には次のものがある。（１）クロモグリク酸ナトリウム：肥満細胞が炎症性伝達物質を放出するのを抑制し、好酸球、好中球および肺胞マクロファージ細胞の活性化を抑制し、気道アレルギーに対する抗炎症効果を有する。（２）ケトチフェン、（３）抗ヒスタミン剤：肥満細胞、好酸球、好塩基球および肺胞マクロファージなどの炎症細胞による伝達物質の放出を抑制するが、この種の薬品でよく使用されるものとしては、ベンジルスルフェート、テルフェナジン、セチリジン、アステミゾール（ヒスマナール）などがある。
【０００６】
これまでに数多くの喘息治療薬が報告されてはいるが、現在のところ、その大多数が化学的手段により合成された化合物であるため、その性質上、継続的に使用すれば不可避的に下記のような様々な副作用が生じる。例えば、抗アレルギー剤は眠気を生じさせ、患者の精神、生活、仕事に支障を来たす。ホルモン系の薬品では高血圧、糖尿病、肥満症などの疾患が発生または進行し、さらにその負のフィードバックとしての抑制作用により、神経−内分泌−免疫機能に乱れが生じ、長期間使用する間に分泌腺が徐々に萎縮し、さらには機能を喪失することさえあり、ひいては体の生理機能がいっそう大きく損なわれる。また痙攣や咳を鎮める薬の使用は、交感神経を興奮させるため、心臓機能を低下させ、突然死を引き起こすことさえある、などである。
【０００７】
またアレルギー性鼻炎では、主にアレルギー患者が吸い込んだアレルゲン（ダニ、真菌、花粉など）が、すでに肥満細胞、好酸球、血小板などの細胞上に結合している特異的ＩｇＥと結合し、これらの細胞から炎症伝達物質を放出させ、このため鼻の粘膜に炎症が生じる。炎症のプロセスには、炎症細胞および好酸球、好中球などの細胞の浸潤、ヒスタミン、ＬＴおよびＰＧなどの一次および二次炎症伝達物質の放出、ならびに好酸球の活性化による即時相および遅発相反応が含まれる。現在よく使用されている医薬品も多くの副作用をもつ。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、化学薬剤の生じるような副作用の心配が全くない、植物である沙棘の種子から抽出されたアポトーシス誘発、抗アレルギーおよび抗炎症の作用を有する物質を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の技術的方案は、沙棘の種子の有機溶剤抽出物を活性物質として、以下のステップを含む方法により得られるものである：
沙棘の種子に対しエタノールによる抽出を２回繰り返し行い、これらの抽出液を合わせ、減圧濃縮して褐色粉末状の抽出物を得るステップ；
前記粉末状抽出物を水に溶解し、エチルエーテル、酢酸エチル、ブタノールを抽出溶媒として、順次それぞれ３回抽出を行うステップ；
エチルエーテル画分を濃縮し、褐色のオイルを得るステップ；
前記褐色のオイルをシリカゲルカラムに付し、酢酸エチルで溶出し、溶出画分を回収するステップ。
【００１０】
前記エタノールの濃度は好ましくは８０％とする。
前記エタノール浸漬時間は好ましくは１２時間とする。
前記酢酸エチルの溶出濃度は好ましくは１５％とする。
【００１１】
前記抽出物は、アポトーシスを誘発する活性を有する。
前記抽出物は、好酸球のアポトーシスを誘発する活性を有する。
前記抽出物は、ＭＢＰキナーゼを活性化することができる。
前記抽出物は、過剰な好酸球に起因して生じる様々な疾患に対し、好酸球のアポトーシスを誘発する作用を発揮する。
前記抽出物は、アレルギー性鼻炎に対し、好酸球のアポトーシスを誘発する作用を発揮する。
前記抽出物は、アトピー性気管支喘息に対し、好酸球のアポトーシスを誘発する作用を発揮する。
【００１２】
本発明は従来技術と比べ、下記の利点をもつ：
沙棘種子の抽出物は、好酸球減少作用などの面において優れた効果を示し、過剰な好酸球に起因して生じる様々な疾患に対する効果的な予防と治療に使用できる。すなわち、アレルギー性鼻炎あるいはアトピー性気管支喘息の予防と治療において有効に作用する。アポトーシス誘発剤、抗アレルギー剤、抗炎症薬および健康補助食品として使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
実施例１  沙棘種子抽出物の調製
沙棘の種子６．７ｋｇに篩による夾雑物除去などの前処理を行った後、８０％エタノール［エタノール：水＝８：２（体積比、以下同じ）］５５Ｌにて１２時間浸漬抽出する。次いで再度８０％エタノール５５Ｌにより抽出を行い、これらの抽出液を合一し、減圧濃縮および真空乾燥を行い、褐色粉末状の抽出物１３８４．９ｇを得た。
【００１４】
前記粉末状抽出物６７４．２ｇを水２Ｌに溶解し、エチルエーテル２Ｌ、酢酸エチル２Ｌ、ブタノール２Ｌを抽出剤として、順次それぞれ３回抽出を行った。次いでエチルエーテル画分を濃縮し、褐色のオイル４３６．５ｇを得た。前記各画分の中から、エチルエーテル画分の濃縮抽出物を７．４２ｇ採取し、シリカゲルカラム（ワコーシリカゲルＣ−３００  和光純薬社製、５．５×１５ｃｍ）に付し、（１）ヘキサン１Ｌ、（２）５％酢酸エチル２．５Ｌ、（３）１０％酢酸エチル２Ｌ、（４）１５％酢酸エチル２Ｌ、（５）２０％酢酸エチル３．５Ｌ、（６）３０％酢酸エチル３Ｌを順次用いて溶出し、次いで（７）１００％酢酸エチル２．５Ｌで溶出した。（１）の画分（収量４５．４ｍｇ）、（２）の画分（収量２．９５０３ｇ）、（３）の画分（収量１．０６１ｇ）、（４）の画分（収量７５２．６ｍｇ）、（５）の画分（収量５２１．３ｍｇ）、（６）の画分（収量２８４．４ｍｇ）および（７）の画分（収量１０４．７ｍｇ）を得た。
【００１５】
実施例２  好酸球性細胞のアポトーシス誘発試験およびＭＢＰキナーゼ活性試験
好酸球性細胞のアポトーシス誘発試験
試験はＶｅｒｍｅｓらの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１８４，Ｐ．３９−５９，１９９５年）に準拠して行った。好酸球性細胞ＨＬ−６０細胞を、細胞濃度が１−３×１０6細胞／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させる。この細胞浮遊液５００μｌに、濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように被検物質（前記実施例１で最終的に回収された画分の１つ）または培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で６時間または２４時間培養する。遠心洗浄した後、アネキシンＶ緩衝液を加え、次いでアネキシンＶ−ＦＩＴＣを５μｌ添加する。フローサイトメトリーにより、アネキシンＶ陽性の細胞をアポトーシス誘発細胞として、全細胞数に対する百分率で評価した。
【００１６】
ＭＢＰキナーゼ活性試験
試験はＤｅ  Ｓｏｕｚａらの方法（Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ.９９，Ｐ．３４３２−３４３８，２００２年）に準拠して行った。好酸球性細胞ＨＬ−６０細胞を、細胞濃度が１−３×１０6細胞／ｍｌになるようにＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊させる。この細胞浮遊液５００μｌに、濃度が１００μｇ／ｍｌとなるように被検物質または培地を添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件下で６時間または２４時間培養する。遠心洗浄した後、可溶化緩衝液を添加して細胞を溶解し、ＭＢＰ５ｍｇ／ｍｌを含有するゲルを用いて電気泳動する。ゲルに対し変性剤除去、リフォールディング処理をした後、32Ｐ−ＡＴＰで標識し、リン酸化反応を３時間実施する。ゲルを乾燥した後、イメージアナライザーを用いて放射活性を解析する。３６ｋＤａにバンドが出現した場合、ＭＢＰキナーゼ活性化は陽性（＋）とした。
【００１７】
沙棘種子の抽出物は、ＨＬ−６０細胞において濃度依存的なアポトーシス誘発を観察した。また、ゲル内ＭＢＰキナーゼ分析（Ｉｎ−ｇｅｌ  ＭＢＰ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）においては、沙棘種子抽出物は３６ｋＤａのＭＢＰキナーゼを活性化した。以上の結果は、沙棘種子抽出物は好酸球に対しアポトーシスを誘発し、このアポトーシスは３６ｋＤａのＭＢＰキナーゼと関わりのあることを示している。以上より、沙棘種子抽出物は好酸球性の炎症に対する抗炎症薬に使用可能な成分を含有していると推断する。
【００１８】
得られた結果を表１に示す。
抽出物４は強いアポトーシス誘発活性を有し、これはＭＢＰキナーゼの活性化を伴っていることを確認した。
【００１９】
【表１】
2007526260.tif 000002
【国際調査報告】
2007526260.tif 000003
2007526260.tif 000004
2007526260.tif 000005
2007526260.tif 000006