(57)【要約】本発明の一つの局面では、高密度アレイが、転写産物またはゲノム構造を検出し、そして特性決定するためにタンデムで５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）または５’ＲＡＧＥ(ゲノムＤＮＡの迅速増幅）および３’ＲＡＧＥと共に使用される。１つの実施形態において、核酸配列を分析する方法であって、以下の工程：テンプレートとして核酸を使用してＲＡＣＥ反応を実施する工程；およびマイクロアレイを使用して、該ＲＡＣＥ反応を分析する工程を包含する核酸配列を分析する方法が提供される。
2007524400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸配列を分析する方法であって、以下の工程：
テンプレートとして核酸を使用してＲＡＣＥ反応を実施する工程；および
マイクロアレイを使用して、該ＲＡＣＥ反応を分析する工程
を包含する核酸配列を分析する方法。
【請求項２】
前記核酸配列がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＡＣＥが３’ＲＡＣＥである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記マイクロアレイが高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイがタイリングアレイである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイが、３５塩基未満のインターバルでＲＮＡのテンプレートとして機能を果たすゲノム配列を整列配置する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記インターバルが２５塩基未満である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記インターバルが５塩基未満である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＡＣＥが５’ＲＡＣＥである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記マイクロアレイが、高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイがタイリングアレイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイが、３５塩基未満のインターバルでＲＮＡのテンプレートとして機能を果たすゲノム配列を整列配置する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記インターバルが２５塩基未満である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記インターバルが５塩基未満である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ゲノムＤＮＡを分析する方法であって、以下の工程：
ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＲＡＧＥ反応を実施する工程：および
マイクロアレイを使用して、該ＲＡＧＥ反応を分析する工程
を包含するゲノムＤＮＡを分析する方法。
【請求項１６】
前記マイクロアレイが高密度オリゴヌクレオチドプローブアレイである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記オリゴヌクレオチドプローブアレイがリシークエンシングアレイである、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法１１９条ｅ項により、２００３年７月２日に出願した米国仮出願番号  ６０／４８４，８４９に基づき優先権を主張する。上記’８４９出願は、本明細書に参考として援用されている。本出願はまた、２００３年１２月１９日に出願した米国出願番号  １０／７４１，１９３の継続出願であり、優先権を主張する。そしてこれもまた、本明細書に参考として援用されている。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所、米国国立癌研究所により与えられた契約番号Ｎ０１−ＣＯ−１２４００に基づいた政府の支援でなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
(発明の背景）
本出願は、生物学的分析、マイクロアレイ技術およびバイオインフォマティクスに関連する。
【０００４】
完全長ｃＤＮＡを得ることについて、ｃＤＮＡクローニングまたは５’ＲＡＣＥ方法論および３’ＲＡＣＥ方法論の注意深い技術的アプローチの使用が、以前は必要であった。ｃＤＮＡ努力の産物およびＲＡＣＥ努力の産物は、特異的な分子種であることが、最適には要求されていた（即ち、ゲル上で単一バンドまたはライブラリーの中での主要なクローン）。従って、完全長転写産物の特性決定をするさらなる方法は、当該分野において大きな需要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の一つの局面では、高密度アレイは、転写産物またはゲノム構造を検出し、そして特性決定するために、タンデムで５’および３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）またはＲＡＧＥ（ゲノムＤＮＡの迅速増幅）と共に使用される。上記ＲＡＣＥは、３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥのいずれかであり得る。ＲＡＣＥまたはＲＡＧＥの産物を、オリゴヌクレオチドプローブ、好ましくは、高密度オリゴヌクレオチドプローブを形成する基板に固定して分析し得る。上記アレイは、ゲノムタイリングアレイ（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｉｌｉｎｇ  ａｒｒａｙ）、リシークエンシングアレイおよび他の適切なアレイであり得る。
【０００６】
本発明の方法の例示的な適用としては、１）転写産物の５’末端および３’末端の遺伝子座の同定（５’末端および３’末端のいずれかの検出および特性決定）；２）完全長ｃＤＮＡの構造の決定；３）関連する転写産物の別のスプライスアイソフォームの検出および特性決定；４）転写産物の鎖または起源の決定；５）ハイスループット様式で遺伝子の発見および遺伝子の特性決定を可能にする複数（＞２）のＲＡＣＥ反応を共有（ｐｏｏｌｉｎｇ）する能力；６）ＲＡＣＥ反応の産物をＰＣＲ増幅することにより、低いコピー数の転写産物を使用して、上記５つの仕事を実行する能力；７）相互に大きく離れているところから発する転写に由来する転写産物（エクソン）の関連を検出する能力；ならびに８）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用するＲＡＣＥ様反応による特異的な欠失、転座および再配列の同定（拡張）が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、多くの好ましい実施の形態を有し、そして当業者に公知の詳細に関する多くの特許、特許出願および他の参考文献に依存する。従って、特許、特許出願または他の参考文献を引用する場合、または以下に繰り返す場合、全ての目的のために、および列挙される命題のために、全体が参考として援用される。
【０００８】
（Ｉ．一般）
本出願で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他を指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、用語「薬剤（ａｎ  ａｇｅｎｔ）」は、それらの混合物を含む、複数の薬剤を含む。
【０００９】
個体は、ヒトに限定されず、哺乳動物、植物、細菌またはそれらのうちの任意のものからの細胞も含む、他の生物体であり得るが、これらに限定されない。
【００１０】
本開示のいたるところで、本発明の種々の局面が、一連の構成で提示され得る。一連の構成の記載は、単に便宜的および簡潔性のためであって、本発明の範囲に関する柔軟性のない限定と解釈されるべきではない。従って、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲およびその範囲内の個別の数値を、詳細に開示するものと考えられるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、詳細には、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などのような部分範囲、ならびに例えば、１、２、３、４、５および６の範囲内の個別の数字もまた、詳細に開示すると考えられるべきである。これはその範囲の広さにかかわらず適用される。
【００１１】
本発明の実施は、他で示されない限り、当該分野の技術範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術および説明を使用し得る。そのような従来技術としては、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、連結反応および標識を使用したハイブリダイゼーションの検出が挙げられる。適切な技術の詳細な説明は、本明細書における以下の実施例を参考にされ得る。しかしながら、当然、他の等価な従来操作もまた、使用され得る。そのような従来技術および記載は、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ），Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，および  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）、Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｇａｉｔ、「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」１９８４、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹおよびＢｅｒｇら、（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹのような標準的実験取扱説明書において見出され、全ての目的のために、その全体が、参考として本明細書に援用される。
【００１２】
本発明は、いくつかの好ましい実施形態でのアレイを含む、固体の基板を、使用し得る。ポリマー（タンパク質を含む）アレイ合成に適切な方法および技術は、米国特許出願番号０９／５３６，８４１、ＷＯ  ００／５８５１６、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，２４２，９７４号、同第５，２５２，７４３号、同第５，３２４，６３３号、同第５，３８４，２６１号、同第５，４０５，７８３号、同第５，４２４，１８６号、同第５，４５１，６８３号、同第５，４８２，８６７号、同第５，４９１，０７４号、同第５，５２７，６８１号、同第５，５５０，２１５号、同第５，５７１，６３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，５９３，８３９号、同第５，５９９，６９５号、同第５，６２４，７１１号、同第５，６３１，７３４号、同第５，７９５，７１６号、同第５，８３１，０７０号、同第５，８３７，８３２号、同第５，８５６，１０１号、同第５，８５８，６５９号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９６８，７４０号、同第５，９７４，１６４号、同第５，９８１，１８５号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１９３号、同第６，０９０，５５５号、および同第６，１３６，２６９号、同第６，２６９，８４６号、および同第６，４２８，７５２号ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９９／００７３０（国際公開番号ＷＯ  ９９／３６７６０）およびＰＣＴ／ＵＳ０１／０４２８５に記載されており、その全体が、本明細書に参考として全ての目的のために援用されている。
【００１３】
特定の実施形態における合成技術を記載している特許としては、米国特許第５，４１２，０８７号、同第６，１４７，２０５号、同第６，２６２，２１６号、同第６，３１０，１８９号、同第５，８８９，１６５号および同第５，９５９，０９８号が挙げられる。核酸アレイは、上記の特許の多くに記載されているが、同じ技術がポリペプチドアレイに適用される。
【００１４】
本発明における有用な核酸アレイとしては、商品名ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）で、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から市販されている核酸アレイを含む。本発明はまた、固体の基質に連結されたポリマーの多くの使用を、企図している。これらの使用としては、遺伝子発現モニタリング、プロフィール化、ライブラリースクリーニング、遺伝子型決定および診断が挙げられる。遺伝子発現モニタリング、およびプロフィール化方法は、米国特許第５，８００，９９２号、同第６，０１３，４４９号、同第６，０２０，１３５号、同第６，０３３，８６０号、同第６，０４０，１３８号、同第６，１７７，２４８号および同第６，３０９，８２２号に示され得る。従って、遺伝子型分類およびそれらの用途は、米国特許出願番号６０／３１９，２５３、同１０／０１３，５９８および米国特許第５，８５６，０９２号、同第６，３００，０６３号、同第５，８５８，６５９号、同第６，２８４，４６０号、同第６，３６１，９４７号、同第６，３６８，７９９号および同第６，３３３，１７９号に示される。他の用途は、米国特許第５，８７１，９２８号、同第５，９０２，７２３号、同第６，０４５，９９６号、同第５，５４１，０６１号および同第６，１９７，５０６号に具体化される。
【００１５】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるサンプルの調製方法を企図する。遺伝子型決定する前か、または同時に、その遺伝子サンプルは、種々の機構（そのいくつかは、ＰＣＲを使用し得る）により増幅され得る。例えば、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９，４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  １，１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；および米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号およ同第５，３３３，６７５号を参照のこと（その各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）。そのサンプルは、アレイ上で増幅され得る。例えば、米国特許第６，３００，０７０号および米国特許出願番号０９／５１３，３００を参照のこと（これらは、本明細書中で参考として援用される）。
【００１６】
他の適切な増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９），Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７（１９８８）およびＢａｒｒｉｎｇｅｒら，Ｇｅｎｅ  ８９：１１７（１９９０））、転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３（１９８９）およびＷＯ８８／１０３１５）、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，１８７４（１９９０）およびＷＯ  ９０／０６９９５）、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅（米国特許第６，４１０，２７６号）、コンセンサス配列プライマーポリメラーゼ連鎖反応（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰ−ＰＣＲ）（米国特許第４，４３７，９７５号）、任意プライマーポリメラーゼ連鎖反応（ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＡＰ−ＰＣＲ）（米国特許第５，４１３，９０９号、同第５，８６１，２４５号）、および核酸ベースの配列増幅（ＮＡＢＳＡ）（米国特許第５，４０９，８１８号、同第５，５５４，５１７号、および６，０６３，６０３号を参照のこと、その各々は、本明細書中で参考として援用される）が挙げられる。使用され得る他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、５，４９４，８１０号、同第４，９８８，６１７号、およびＵＳＳＮ  ０９／８５４，３１７に記載されている（その各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【００１７】
サンプル調製のさらなる方法および核サンプルの複雑性を減少するための技術は、Ｄｏｎｇら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １１，１４１８（２００１），米国特許第６，３６１，９４７号、同第６，３９１，５９２号ならびに米国特許出願番号０９／９１６，１３５、０９／９２０，４９１、０９／９１０，２９２および１０／０１３，５９８に記載される。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイを構築するための方法は、当該分野で良好に開発されている。ハイブリダイゼーションアッセイ手順およびハイブリダイゼーションアッセイ条件は、その適用に依存して変化し、以下に参照される方法を包含する公知の一般的な結合方法に従って選択される：Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８９）；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第１５２巻，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９８７）；ＹｏｕｎｇおよびＤａｖｉｓｍ，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ，８０：１１９４（１９８３）。繰り返しかつ制御されたハイブリダイゼーション反応を実施するための方法および装置は、米国特許同第５，８７１，９２８号、同第５，８７４，２１９号、同第６，０４５，９９６号および同第６，３８６，７４９号、同第６，３９１，６２３号に記載されている（その各々は、本明細書中で参考として援用される）。
【００１８】
本発明はまた、特定の好ましい実施形態におけるリガンド間のハイブリダイーゼションシグナルの検出を企図する。米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５７８，８３２号；同第５，６３１，７３４号；同第５，８３４，７５８号；同第５，９３６，３２４号；同第５，９８１，９５６号；同第６，０２５，６０１号；同第６，１４１，０９６号；同第６，１８５，０３０号；同第６，２０１，６３９号；同第６，２１８，８０３号；および同第６，２２５，６２５号、米国特許出願番号６０／３６４，７３１、およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ  ９９／４７９６４として公開）を参照のこと（その各々はまた、全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）。
【００１９】
シグナルの検出および強度データを加工するための方法および装置は、例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、同第５，５４７，８３９号、同第５，５７８，８３２号、同第５，６３１，７３４号、同第５，８００，９９２号、同第５，８３４，７５８号；同第５，８５６，０９２号、同第５，９０２，７２３号、同第５，９３６，３２４号、同第５，９８１，９５６号、同第６，０２５，６０１号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１４１，０９６号、同第６，１８５，０３０号、同第６，２０１，６３９号；６，２１８，８０３号および同第６，２２５，６２５号、米国特許出願番号６０／３６４，７３１、ならびにＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０６０９７（ＷＯ  ９９／４７９６４として公開）（その各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）に開示される。
【００２０】
本発明の実施はまた、従来の生物学的方法、ソフトウェアおよびシステムを使用し得る。本発明のコンピュータソフトウェア産物は、代表的には、本発明の方法の論理工程を実施するためのコンピュータ実行可能手順を有する読み込み可能媒体を備える。適切なコンピュータ読み込み可能媒体としては、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ／ＤＶＤ／ＤＶＤ−ＲＯＭ、ハードディスクドライブ、フラッシュメモリ、ＲＯＭ／ＲＡＭ、磁気テープなどが挙げられる。上記コンピュータ実行可能手順は、適切なコンピュータ言語または複数の言語の組み合せで書き込まれ得る。基本的なコンピュータの生物学的方法は、例えば、ＳｅｔｕｂａｌおよびＭｅｉｄａｎｉｓら，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（ＰＷＳ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，１９９７）；Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓｅａｒｌｅｓ，Ｋａｓｉｆ（編），Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９９８）；ＲａｓｈｉｄｉおよびＢｕｅｈｌｅｒ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｂａｓｉｃｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，２０００）ならびにＯｕｅｌｅｔｔｅおよびＢｚｅｖａｎｉｓ  Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，第２版，２００１）に記載される。
【００２１】
本発明はまた、種々の目的（例えば、プローブの設計、データの管理、分析、および装置の操作）のために種々のコンピュータプログラム産物およびコンピュータプログラムソフトウェアを利用し得る。米国特許第５，５９３，８３９号、同第５，７９５，７１６号、同第５，７３３，７２９号、同第５，９７４，１６４号、同第６，０６６，４５４号、同第６，０９０，５５５号、同第６，１８５，５６１号、同第６，１８８，７８３号、同第６，２２３，１２７号、同第６，２２９，９１１号、同第６，３０８，１７０号を参照のこと。
【００２２】
さらに、本発明は、米国特許出願番号１０／０６３，５５９、６０／３４９，５４６、６０／３７６，００３、６０／３９４，５７４、６０／４０３，３８１に示されるようなネットワーク（例えばインターネット）を介して遺伝子の情報を提供するための方法を含む好ましい実施形態を有し得る。
【００２３】
（ＩＩ．用語）
以下の用語は、本明細書中で使用されるとおり以下の一般的な意味を有することが意図される。
【００２４】
本発明による核酸は、ピリミジン塩基およびプリン塩基、好ましくはそれぞれシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、およびアデニン（Ａ）、およびグアニン（Ｇ）の任意のポリマーまたはオリゴマーを含み得る。Ａｌｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＯＦ  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，７９３−８００（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂ．１９８２）を参照のこと。実際には、本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはペプチド核酸成分、およびその任意の化学改変体（例えば、これらの塩基のメチル化形態、ヒドロキシメチル化形態、またはグリコシル化形態など）を企図する。そのポリマーまたはオリゴマーは、組成物中で異種性であっても相同性であってもよく、そして天然に生じる供給源より単離され得るか、または人工的にもしくは合成的に作製され得る。さらに、その核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でも、またはそれらの混合物であってもよく、そして１本鎖の形態または２本鎖の形態（相同性２本鎖、異種性２本鎖およびハイブリッド形態を含む）において恒久的にまたは一時的に存在し得る。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも８ヌクレオチド長、そしてより好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長の範囲の核酸、またはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする化合物である。本発明のポリヌクレオチド配列としては、天然の供給源より単離され得るデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）の配列、組換え作製された配列、または人工的に合成された配列およびそれらの疑似体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドのさらなる例は、構成塩基が、ホスホジエステル結合よりもむしろペプチド結合により結合されるペプチド核酸（ＰＮＡ）である（Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７−１５００（１９９１），Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７１−７５（１９９９）に記載される）。本発明はまた、特定のｔＲＮＡ分子において認識され３重らせんにおいて存在すると仮定されている非従来型の塩基対（例えば、フーグスティーン型塩基対）が存在する状態を包含する。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド］は、本出願において、交換可能に使用される。
【００２６】
「アレイ」は、合成的か、または生合成的かのどちらで調製されてもよい、意図的に作製された分子の集合である。アレイの分子は、互いに同じでも異なっていてもよい。そのアレイは、種々の形式（例えば、可溶性分子のライブラリ；樹脂ビーズ、シリカ片、または他の固体支持体に連結された化合物のライブラリ）を想定し得る。
【００２７】
核酸ライブラリまたは核酸アレイは、種々の異なる形態（例えば、可溶性分子のライブラリ；樹脂ビーズ、シリカ片、または他の固体支持体に連結された化合物のライブラリ）で合成的か、または生合成的かのどちらで調製されてもよい、意図的に作製された核酸の集合である。さらに、用語「アレイ」は、本質的に任意の長さ（例えば、１〜約１０００ヌクレオチド長のモノマー）の核酸を基板上にスポッティングすることにより調製され得る核酸のライブラリを含むはずである。用語「核酸」は、本明細書中で使用される場合、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のいずれか）のポリマー形態をいい、そのヌクレオチドは、プリン塩基およびピリミジン塩基、あるいは天然のヌクレオチド塩基、化学的にかまたは生化学的に改変されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む。上記ポリヌクレオチドの骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）は、代表的にはＲＮＡまたはＤＮＡにおいて見出されるように糖またはリン酸基、あるいは改変されるかまたは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。ポリヌクレオチドは、改変されたヌクレオチド（例えば、メチル化されたヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ）を含み得る。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により割り込まれ得る。従って、用語ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシド、およびデオキシヌクレオチドは、一般に、本明細書中に記載されるようなアナログを含み得る。これらのアナログは、核酸配列またはヌクレオチド配列に組み込まれる場合、溶液中で天然に生じる核酸配列とのハイブリダイゼーションを可能にする、天然に生じるヌクレオシドまたはヌクレオチドと共通していくつかの構造的特徴を有するアナログ分子である。代表的には、これらのアナログは、塩基部分、リボース部分またはホスホジエステル部分を置換および／または改変することにより、天然に生じるヌクレオシドおよびヌクレオチドから得られる。その変化は、ハイブリッド形成を安定化するかまたは不安定化するように設計され得るか、あるいは相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションの特性を所望されるとおりに亢進するように設計され得る。
【００２８】
「固体支持体」、「支持体」および「基板」は、交換可能に使用され、そして、材料または剛体表面もしくは半剛体表面（ｓｅｍｉ−ｒｉｇｉｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）を有する材料群、または表面をいう。多くの実施形態において、固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平面であるが、いくつかの実施形態において、異なる化合物のために、例えば、ウェル、上げられた領域（ｒａｉｓｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）、ピン（ｐｉｎ）、エッチング溝（ｅｔｃｈｅｄ  ｔｒｅｎｃｈ）などを有する合成領域を物理的に分離することが所望され得る。他の実施形態に従って、その固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、微粒子または他の幾何学的構成の形態であり得る。
【００２９】
（コンビナトリアル合成ストラテジー）
コンビナトリアル合成ストラテジーは、反応物マトリクス（ｒｅａｃｔａｎｔ  ｍａｔｒｉｘ）およびスイッチマトリクス（ｓｗｉｔｃｈ  ｍａｔｒｉｘ）により表される試薬の連続的な添加により多様なポリマー配列の平行合成について順序良くはけられたストラテジーであり、その生成物は、生成物マトリクス（ｐｒｏｄｕｃｔ  ｍａｔｒｉｘ）である。反応物マトリクスは、添加されるべき構築ブロックのｍ行のマトリクスのｌ列である。スイッチマトリクスは、行において配列されたｌとｍとの間の二進数で好ましくは順序付けられた二進数の全てまたは一部である。「バイナリストラテジー（ｂｉｎａｒｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）」は、少なくとも２つの連続した工程により、基板上の目的の領域の一部（しばしば領域の半分）を照明するストラテジーである。バイナリ合成ストラテジーにおいて、反応物の整列されたセットから形成され得る全ての可能な化合物が、形成される。最も好ましい実施形態において、バイナリ合成とは、前述の添加工程を考慮する合成ストラテジーをいう。例えば、遮蔽ストラテジー（ｍａｓｋｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）のスイッチマトリクスが、以前に照明した領域を半分にし、以前に発光した領域の約半分を発光し、残りの半分を保護するストラテジー（一方ではまた、以前に保護した領域の約半分を保護し、以前に保護した領域の約半分を発光するストラテジー）。バイナリ領域は、非バイナリ領域に散在し、基板の一部のみがバイナリスキーム（ｂｉｎａｒｙ  ｓｃｈｅｍｅ）に供され得ることが認識されている。コンビナトリアル「被覆ストラテジー」は、光または他の空間的に選択的な脱保護剤または活性化剤を使用して、他の材料（例えば、アミノ酸）の添加のために材料から保護基を取り除く合成である。
【００３０】
モノマー：とは、同時に結合され、オリゴマーまたはポリマーを形成し得る分子のセットの任意のメンバーをいう。本発明において有用なモノマーのセットとしては、例えば、（ポリ）ペプチド合成のセット、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または合成アミノ酸のセットが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中に用いられる場合、「モノマー」とは、オリゴマーの合成のための基準セット（ｂａｓｉｓ  ｓｅｔ）の任意のメンバーをいう。例えば、Ｌ−アミノ酸のダイマーは、ポリペプチドの合成のための４００「モノマー」の基準セットを形成する。モノマーの種々の基準セットは、ポリマーの合成の連続的な工程において使用され得る。用語「モノマー」は、種々の化学的サブユニットと結合され、いずれかのサブユニット単独よりも大きな化合物を形成する化学的サブユニットをもいう。
【００３１】
バイオポリマーまたは生物学的ポリマー：は、生物学的部分または化学的部分の反復単位を意味することが意図される。代表的なバイオポリマーとしては、核酸、オリゴヌクレオチド、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、ホルモン、オリゴサッカライド、脂質、糖タンパク質、リポポリサッカライド、リン脂質、これらの合成アナログ（逆向きの、ヌクレオチド、ペプチド核酸、Ｍｅｔａ−ＤＮＡ、および上記の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。「バイオポリマー合成」は、バイオポリマー（有機物および無機物の両方）の合成的生産を包含する。
【００３２】
バイオポリマーに関連しているのは、バイオポリマーの単一の単位またはバイオポリマーの一部（ｐａｒｔ）ではない単一の単位を意味することが意図される「バイオモノマー」である。従って、例えば、ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドバイオポリマーの中のバイオモノマーであり、そしてアミノ酸は、タンパク質またはペプチドバイオポリマーの中のバイオモノマーであり；例えば、アビジン、ビオチン、抗体、抗体フラグメントなどもまた、バイオモノマーである。開始バイオモノマー：または「開始剤バイオモノマー」は、反応性の求核試薬を介して、共有結合的にこのポリマーの表面に結合された第一のバイオモノマー、または、このポリマーに結合されたリンカーもしくはスペーサーアームに結合された第一のバイオモノマーを示すことが意図され、ここで、このリンカーまたはスペーサーアームは、反応性求核試薬を介してこのポリマーに結合される。
【００３３】
相補的または実質的に相補的：とは、ヌクレオチド間あるいは核酸間（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の二本鎖間、またはオリゴヌクレオチドプライマーと配列決定もしくは増幅されるべき一本鎖核酸のプライマー結合部位との間）のハイブリダイゼーションまたは塩基対合（ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）をいう。相補的ヌクレオチドは、一般的に、ＡとＴ（もしくはＡとＵ）、またはＣとＧである。一方の鎖のヌクレオチドが、最適には適切なヌクレオチドのインサートもしくは欠失とアライメントされて比較され、もう一方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、一般的には少なくとも約９０％〜９５％、そしてより好ましくは約９８％〜１００％の核酸と対になる場合、２個の一本鎖ＲＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子は、実質的に相補的であると言われる。あるいは、ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖が、選択的ハイブリダイゼーションの条件下でその相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相補性が存在する。代表的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも１４個〜２５個のヌクレオチドの長さ（ｓｔｒｅｔｃｈ）について、少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性がある場合、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照のこと。これは、本明細書中に参考として援用される。
【００３４】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、２本の一本鎖のポリヌクレオチドが非共有結合的に結合して、安定な二重鎖のポリヌクレオチドを形成するプロセスをいう。用語「ハイブリダイゼーション」とは、三重鎖のハイブリダイゼーションをもいう。（普通に）生じた二重鎖のポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」である。安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドの集団の比率は、本明細書中で、「ハイブリダイゼーションの度合い」と呼ばれる。
【００３５】
ハイブリダイゼーションの条件としては、代表的には、約１Ｍ未満の塩濃度、より一般的には、約５００ｍＭ未満の塩濃度および約２００ｍＭ未満の塩濃度が挙げられる。ハイブリダイゼーションの温度は、５℃と同じくらい低温でもよいが、代表的には、２２℃よりも高く、より代表的には、約３０℃よりも高く、好ましくは、約３７℃を超えた温度であり得る。ハイブリダイゼーションは、一般的には、ストリンジェントな条件（すなわち、プローブがその標的配列にハイブリダイズする条件）で実行される。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして種々の環境において異なる。より長いフラグメントは、特異的ハイブリダイゼーションのために、より高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。他の因子（相補鎖の塩基の組成および相補鎖長、有機溶媒の存在および塩基のミスマッチの程度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得るので、パラメーターの組み合わせが、任意の絶対的な基準一つのみよりも重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特定の配列の熱的融点（ｔｈｅｒｍａｌ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ｐｏｉｎｔ）よりも、約５℃低くなるように選択される。このＴｍは、（規定されたイオン強度、ｐＨおよび核酸組成の下で）上記標的配列に相補的なプローブの５０％が平衡してハイブリダイズする温度である。
【００３６】
代表的には、ストリンジェントな条件としては、ｐＨ７．０〜ｐＨ８．３、少なくとも２５℃の温度における少なくとも０．０１Ｍからせいぜい１ＭのＮａ（または他の塩）のイオン濃度が挙げられる。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａホスフェート、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、および２５℃〜３０℃の温度の条件が、対立遺伝子特異的プローブのハイブリダイゼーションに適切である。ストリンジェントな条件については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈｅ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびＡｎｄｅｒｓｏｎ「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」初版、ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９９）を参照のこと。これらは、上記の目的のために、その全体が本明細書中により、参考として援用される。
【００３７】
ハイブリダイゼーションのプローブは、核酸の相補鎖に塩基特異的な様式で結合し得る核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）である。このようなプローブとしては、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１４９７〜１５００（１９９１）、Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０：７１〜７５（１９９９）に記載されるようなペプチド核酸および他の核酸アナログおよび核酸擬似物が挙げられる。１９９６年４月３日に出願された米国特許第６，１５６，５０１号を参照のこと。
【００３８】
特異的にハイブリダイズすることとは、その配列が、（例えば、全細胞の）複合体混合物のＤＮＡもしくはＲＮＡの形態で存在する場合、特定のヌクレオチド配列もしくはストリンジェントな条件下の配列に、実質的にまたはこれらの配列にのみ、分子を結合させること、分子を二重鎖形成させること、または分子をハイブリダイズさせることをいう。
【００３９】
プローブ：プローブは、特定の標的により認識され得る分子である。いくつかの実施形態において、プローブは、表面に固定化され得る。本発明により調査され得るプローブの例としては、細胞膜レセプターに対する、アゴニストおよびアンタゴニスト、毒素（ｔｏｘｉｎ）および毒物（ｖｅｎｏｍ）、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピオイドペプチド、ステロイドなど）、ホルモンレセプター、ペプチド、酵素、酵素基質、補助因子、薬物、レクチン、糖類、オリゴヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライド、タンパク質、モノクローナル抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
標的：所定のプローブに対して親和性を有する分子。標的は、天然に存在する分子であっても、人工の分子であってもよい。また、これらは、不変の状態で、または他の種を有する凝集物として使用され得る。標的は、結合メンバーに、共有結合的にかまたは非共有結合的に、直接的にかまたは特定の結合物質を介してのいずれかで、結合され得る。本発明により使用され得る標的の例としては、特定の抗原決定基（例えば、ウイルス上の抗原決定基、細胞上の抗原決定基もしくは他の物質上の抗原決定基）に対して反応性の、抗体、細胞膜レセプター、モノクローナル抗体および抗血清、薬物、オリゴヌクレオチド、核酸、ペプチド、補助因子、レクチン、糖類、ポリサッカライド、細胞、細胞膜ならびにオルガネラが挙げられるが、これらに限定されない。標的は、時として、当該分野で抗プローブと呼ばれる。用語標的が、本明細書中で用いられる場合、意味に違いは、全く意図されない。「プローブ標的対」は、２個の巨大分子が、分子認識を介して結合し、複合体を形成する際に形成される。
【００４１】
有効量とは、所望の結果を誘導するのに十分な量をいう。
【００４２】
ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ転写物：本明細書中で用いられる場合、遺伝子またはｍＲＮＡ転写物に由来する、プレｍＲＮＡ転写物、転写物プロセシング中間体、翻訳の準備の整った成熟ｍＲＮＡ、および遺伝子の転写物（すなわち、ｍＲＮＡ転写物由来の核酸）が挙げられるが、これらに限定されない。転写物のプロセシングとしては、スプライシング、編集および崩壊が挙げられ得る。本明細書中に用いられる場合、ｍＲＮＡ転写物由来の核酸とは、その核酸の合成について、このｍＲＮＡ転写物またはその部分配列が最終的にテンプレートとして役立つ核酸をいう。従って、ｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、そのｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、上記ｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどは、すべて上記ｍＲＮＡ転写物に由来し、このような由来産物（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ）の検出は、サンプル中の元の転写物の存在および／または存在量を表示する。従って、サンプル由来のｍＲＮＡとしては、上記遺伝子のｍＲＮＡ転写物、このｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡ、このｃＤＮＡから転写されたｃＲＮＡ、この遺伝子から増幅されたＤＮＡ、増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどである。
【００４３】
フラグメント、セグメント、またはＤＮＡセグメントとは、より大きなＤＮＡポリヌクレオチドまたはＤＮＡの一部（ｐｏｒｔｉｏｎ）をいう。例えば、ポリヌクレオチドは、粉砕されても、複数のセグメントへと断片化されてもよい。核酸を断片化する種々の方法は、当該分野において周知である。これらの方法は、例えば、性質が、化学的または物理的であり得る。化学的断片化としては、ＤＮａｓｅを用いた部分的崩壊；酸を用いた部分的脱プリン化（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）、制限酵素の使用；イントロンコード化エンドヌクレアーゼ；核酸セグメントの特異的ハイブリダイゼーションに依存して切断剤をこの核酸分子の特異的な位置に局在させる、ＤＮＡベースの切断方法（例えば、三重鎖形成法およびハイブリッド形成法）；または、公知の位置もしくは未知の位置にてＤＮＡを切断する他の酵素もしくは化合物である。物理的な断片化の方法は、ＤＮＡを高い剪断速度に供することを伴い得る。高い剪断速度は、例えば、ピットまたはスパイクを有する、チャンバもしくはチャネルにＤＮＡを通すことにより、または、このＤＮＡサンプルを制限されたサイズの流路（例えば、ミクロンもしくはサブミクロンの大きさの断面の寸法を有するアパーチャ）に押し込むことにより、生み出され得る。他の物理的方法としては、音波破砕および噴霧化が挙げられる。物理的断片化法および化学的断片化法の組み合わせ（例えば、熱およびイオンの媒介する加水分解による断片化）が同様に使用され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら）を参照のこと。これは、全ての目的のために、本明細書中に参考として援用される。これらの方法は、核酸を選択されたサイズの範囲のフラグメントに消化するために最適化され得る。有用なサイズの範囲は、１００、２００、４００、７００または１０００〜５００、８００、１５００、２０００、４０００または１０，０００塩基対であり得る。しかし、より大きなサイズの範囲（例えば、４０００、１０，０００または２０，０００〜１０，０００、２０，０００または５００，０００塩基対）もまた、有用であり得る。
【００４４】
遺伝子多型とは、集団中の遺伝的に決定された代替の配列または対立遺伝子の二つ以上の出現例をいう。遺伝子多型のマーカーおよび部位は、分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）が生じる座である。好ましいマーカーは、少なくとも２個の対立遺伝子を有し、各々は、１％を超える頻度で出現し、そしてより好ましくは、選択された集団の１０％または２０％を超える頻度で出現する。遺伝子多型は、一以上の塩基の変更、インサート、繰り返し、もしくは欠失を含み得る。遺伝子多型の座は、一の塩基対と同じくらい小さい。遺伝子多型のマーカーとしては、制限フラグメント長遺伝子多型、タンデムリピート数の変化（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ）（ＶＮＴＲ）、超可変性領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単一配列リピート、および挿入エレメント（例えば、Ａｌｕ）が挙げられる。最初に同定された対立遺伝子形態は、参照形態（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｆｏｒｍ）として任意に表され、そして他の対立遺伝子形態は、代替の対立遺伝子または改変体対立遺伝子として表される。選択された集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子形態は、時として、野生型形態と呼ばれる。二倍体の生物は、対立遺伝子に対してホモ接合であっても、ヘテロ接合であってもよい。二倍体の遺伝子多型は、２個の形態を有する。３倍体（ｔｒｉａｌｌｅｌｉｃ）の遺伝子多型は、３個の形態を有する。単一のヌクレオチド遺伝子多型（ＳＮＰ）は、遺伝子多型に含まれ得る。
【００４５】
一塩基多型（ＳＮＰ）は、ヒト集団において、２つの代替的塩基がかなりの頻度（＞１％）で存在する位置であり、最も一般的な型のヒトの遺伝的変異である。この部位は、通常、高度に保存された対立遺伝子配列（例えば、集団の１／１００もしくは１／１０００未満のメンバーにおいて変異している配列）の前および後にある。一塩基多型は、通常、多型部位における、１ヌクレオチドの別のヌクレオチドとの置換に起因して生じる。トランジションは、１つのプリンの別のプリンによる置き換え、または１つのピリミジンの別のピリミジンによる置き換えである。トランスバーションは、１つのプリンのピリミジンによる置き換え、またはその逆である。一塩基多型はまた、基準対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失もしくはヌクレオチドの挿入から生じ得る。
【００４６】
遺伝子型決定とは、ゲノムの１つ以上の部位に個人が保有する遺伝情報の決定をいう。例えば、遺伝子型決定は、単一のＳＮＰに関して個人が保有する対立遺伝子の決定を包含し得るか、または複数のＳＮＰに関して個人が保有する対立遺伝子の決定を包含し得る。遺伝子型は、個人の１つ以上の多型部位に存在する対立遺伝子の同定であり得る。
【００４７】
（ＩＩＩ．転写物の構造を検出する方法）
これらの場合、全長転写物の一部のみが単離されて特徴付けられる場合（例えば、トランスクリプトーム研究からのＥＳＴもしくはトランスフラグ（ｔｒａｎｓｆｒａｇ）（ｗｗｗ．ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ．ｃｏｍ））、全長ｃＤＮＡを得るには、これまでｃＤＮＡクローニングもしくは５’および３’ＲＡＣＥ法の慎重な技術的アプローチの使用を必要とした。ｃＤＮＡおよびＲＡＣＥの成果（ｅｆｆｏｒｔｓ）の産物は、最適には、固有の分子種（すなわち、ゲル上での単一のバンドもしくは１つのライブラリにおけるクローンの大部分）であることを必要とした。このような固有の分子が得られなかった場合、伝統的には、さらなる分析は非生産的であるとみられていた。
【００４８】
ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）は、元々、全長ｃＤＮＡを分析するために発達した技術である。３’ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡにおける天然のポリ（Ａ）尾部のＰＣＲ増幅のための一般的なプライミング部位として活用する。ｍＲＮＡは、逆転写酵素（ＲＴ）およびオリゴｄＴアダプタープライマーを用いてｃＤＮＡに変換される。次いで、特定のｃＤＮＡは、既知の配列領域にアニーリングする遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）、およびポリ（Ａ）尾部領域を標的とするアダプタープライマーを用いて、ＰＣＲによって増幅される。
【００４９】
５’ＲＡＣＥ、もしくは「アンカー」ＰＣＲは、低コピーメッセージからの５’末端の単離及び特徴付けを容易にする技術である（例えば、Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．Ｈ．，Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｓ．，Ｓｃｈａｒｆ，Ｓ．Ｊ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．，Ｈｏｒｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｍｕｌｌｉｓ，Ｋ．Ｂ．，およびＥｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，４８７；Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．，（１９９３）Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  Ｅｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｌｌ−Ｌｅｎｇｔｈ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡｓ：Ｔｈｅｒｍａｌ  ＲＡＣＥ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１８：３４０−３５６を参照のこと、これらは、参考として援用される）。１本鎖ｃＤＮＡ合成は、遺伝子特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＧＳＰ１）を用いて開始される。これは、特定のｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡのファミリーのｃＤＮＡへの転換を可能にし、そしてこのメッセージの５’末端までの完全な伸長の可能性を最大限にする。ｃＤＮＡ合成に続いて、この１本鎖産物は、組み込まれていないｄＮＴＰおよびＧＳＰ１から精製される。ＴｄＴ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ）は、上記ｃＤＮＡの３’末端にホモポリマーの尾部を付加するために使用される。元々のプロトコールでは、尾部の付いたｃＤＮＡは、次に、３種のプライマーの混合物を用いてＰＣＲによって増幅される：ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ２）（これは、ＧＳＰ１の３’にアニーリングする）；および相補的ホモポリマー含有アンカープライマーとそれに対応するアダプタープライマーとの組み合わせ（これは、上記ホモポリマー尾部からの増幅を可能にする）。これは、ＧＳＰ２とｍＲＮＡの５’末端との間の未知配列の増幅を可能にする。同様の方法が、ゲノム配列を分析するために使用され得る。例えば、ゲノムＤＮＡ末端の迅速増幅（Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｎｄｓ）（ＲＡＧＥ）は、ゲノム配列をクローニングし、分析するために使用され得る。例えば、ＸＩＡＮＡＮ  ＬＩＵおよびＷ．ＶＡＮＣＥ  ＢＡＩＲＤ，Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｅｎｄｓ  ｂｙ  Ｎ１ａ  ＩＩＩ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔａｉｌｉｎｇ，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １９：２６１−２６７，２００１、ならびにＭｉｚｏｂｕｃｈｉ，Ｍ，Ｆｒｏｈｍａｎ，ＬＡ（１９９３），Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：２１５−２１６（これらは、本明細書において参考として援用される）を参照のこと。
【００５０】
ＲＡＣＥは、既存のｃＤＮＡライブラリを用いて行われ得る。ランダムヘキサマーにプライミングされるｃＤＮＡもまた、単一の１本鎖合成反応からの複数の遺伝子の増幅およびクローニングのために、５’ＲＡＣＥに適合する。ＲＡＣＥ手順は、エキソントラッピング法とともに利用され得、未知のコーディング遺伝子の増幅および特徴づけを可能にする。例えば、Ｂｕｃｋｌｅｒ，Ａ．Ｊ．，Ｃｈａｎｇ，Ｄ．Ｄ．，Ｇｒａｗ，Ｓ．Ｌ．，Ｂｒｏｏｋ，Ｄ．，Ｈａｂｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｓｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．およびＨｏｕｓｍａｎ，Ｄ．Ｅ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，４００５（参考として援用される）を参照のこと。
【００５１】
本発明の１つの局面において、転写物は、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）を用いて分析され、そしてＲＡＣＥの産物もしくはＲＡＣＥの産物に由来するサンプルは、エキソンを調べるために設計されたアレイにハイブリダイズされる。ＲＡＣＥおよびアレイの使用は、特異的ＲＡＣＥ産物およびより特異的でないＲＡＣＥ産物を作製し（すなわち、混合物）、そしてこのアレイ上で成功裏に分類して特徴付けることを可能にする。このアプローチはまた、複数の転写物と遺伝領域とを、同時に、ハイスループット分析することを可能にする。
【００５２】
ＲＡＣＥは、潜在的にとらえどころのない全長ｃＤＮＡを得るためのプロセスである。例えば、Ｍ．Ａ．Ｆｒｏｈｍａｎら「Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｃＤＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｒａｒｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ：ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８５：８９９８−９００２，１９８８を参照のこと。５’ＲＡＣＥも３’ＲＡＣＥも、転写物の構造を特徴付けるために使用されている。しかし、伝統的ＲＡＣＥプロトコールは、多くの潜在的因子に起因する高いバックグラウンドノイズを伴う。
【００５３】
これまでに特徴付けられていない（ｈｉｔｈｅｒ−ｔｏ−ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）転写物もしくはゲノム構造を検出および特徴付けるための、高密度アレイならびに５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）および３’ＲＡＣＥの直列的な使用。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにおいて実施された実験は、ＲＡＣＥおよびその後のＲＡＣＥ−増殖（ＰＣＲによる）反応産物の質が、電気泳動ゲルもしくはクローニング分析によって、非特異的であると観察され得ることを示す。アレイは、増幅したＲＡＣＥ産物の異種混合物を分類し得、そして完全に特徴付けられた転写物として分析されるべく意図される領域を表示し得る。
【００５４】
図１は、ＲＡＣＥ産物を分析するための例示的プロセスを示す。核酸サンプル（例えば、ＲＮＡ）をＲＡＣＥ反応のためのテンプレートとして、適切なプライマーとともに使用する（１０１）。種々のＲＡＣＥプロトコールが適切である（例えば、ＳＭＡＲＴ法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＡｍｂｉｏｎからのＲＬＭ−ＲＡＣＥ  キット、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭキットが挙げられる）。
【００５５】
ＲＡＣＥ産物またはＲＡＣＥ産物に由来する核酸は、標識され得、伝統的なゲルベースの分析プロセスよりもむしろ、高密度オリゴヌクレオチドプローブを用いて分析され得る（１０２、１０３）。好ましい実施形態において、このプローブはアレイまたはコード化されたビースの集合に固定される。核酸配列を調べるため（例えば、タイル方式（ｔｉｌｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）のため）のこのプローブの選択は、これまで参考として援用したいくつかの出願に記載される。例えば、トランスクリプトームタイル方式アッセイは以下に記載される：米国特許出願番号１０／７３６，０５４、同１０／７１４，２５３、および同１０／７１２，３２２（これら全ては、本明細書において参考として援用される）。トランスクリプトームアレイは、代表的に、１、５、２５、３０、３５塩基のインターバルでゲノム配列を整列配置する（ｔｉｌｅ）。いくつかの場合、上記プローブは、特定の鎖から転写物を標的化し得る。リシークエンシングアレイもまた有用である。ハイブリダイゼーションデータを分析するための種々のアルゴリズムが、これまでに参考として援用された出願において開示されている。特注のリシークエンシングアレイおよびこのアレイを分析するためのソフトウェアが、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から入手可能である。ハイスループットリシークエンシングアレイは、例えば、以下に開示される：米国特許出願番号１０／０２８，４８２および同１０／６５８，８７９（これらは、本明細書において参考として援用される）。
【００５６】
ＲＡＣＥと高密度オリゴヌクレオチドアレイとの結合は、多くの分析を可能にする。上記分析としては、以下が挙げられる：
１）転写物の５’末端および３’末端の位置の同定（代替の５’末端および３’末端の検出および特徴付け）；
２）全長ｃＤＮＡの構造決定；
３）関連する転写物に対する代替的スプライスアイソフォームの検出および特徴付け；
４）転写物の鎖もしくは起源の決定；
５）複数の（＞２）ＲＡＣＥ反応をプールして、ハイスループット様式で遺伝子の発見および特徴付けを可能にする能力の提供；
６）ＲＡＣＥ反応の産物をＰＣＲで増幅することによって低コピー数の転写物を用いて上記５つの課題を実施する能力の提供；
７）互いに遠距離で発生した転写物に由来する転写物（エキソン）の関連を検出する能力の提供；ならびに、
８）拡大解釈すれば、ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いたＲＡＣＥ様反応によって、固有の欠失、転座、および再配置を同定し得る。
【００５７】
図２および３は、１）既に十分特徴付けられている遺伝子の構造を確認するため、および２）新規遺伝子の全長転写物を特徴付けるための、５’ＲＡＣＥおよび３’ＲＡＣＥと高密度アレイとの使用を示す例からのものである。
【００５８】
図２は、第２２番染色体上の十分特徴付けられている遺伝子、ＤＧＳＩの構造を含む、ＵｎｉＢｒｏｗ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）の画面取り込み（ｓｃｒｅｅｎ  ｃａｐｔｕｒｅ）である。この遺伝子は、１０個のエキソンからなり、右から左へ転写される（すなわち、５’末端は右である）。下に列挙されるのは、ＤＧＳＩ−ｒｘ１２およびｒｘ６としてそれぞれ標識された２つのトラックである。反応中、５’末端および３’末端を調べるための２つのＲＡＣＥプライマーが存在した。このプライマーは、逆方向に向けられて、（５’末端から）エキソン６内に位置する。ｒｘ１２トラックは、エキソン６〜１０の同定を示し、そしてｒｘ６トラックは、１−６の同定を示す。興味深いことに、エキソン１は、ＤＧＳＩに関する注釈に記載されるよりも長いエキソンを有するように見える。
【００５９】
図３は、第２２番染色体の領域を含む画面取り込みであり、この領域はトランスクリプトーム計画において、新規遺伝子として検出された。これは、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  Ｍａｙ  ３；２９６：９１６−９１９に報告された。その後、この領域に関するＥＳＴ（ＤＧＣＲ９）が報告されている。ＲＡＣＥとアレイとの実験において、本発明者らは、２つのエキソンを有するプラス鎖転写物を見る（ＤＧＣＲ９ｒｘ５（上トラック）で見られる間隙は、この小領域でのプローブの欠如に起因する）。
【００６０】
上記記載が説明のために意図され、限定のために意図されるものではないことを理解するべきである。上記記載を概観すれば、本発明の多くの改変は、当業者に明らかである。特許文献および非特許文献を含む全引用文献が、あらゆる目的のために、その全体が本明細書において参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
添付の図は、本明細書に援用され本明細書の一部を形成し、本発明の実施の形態を説明し、そして記述と一緒に、本発明の趣旨を説明する機能を果たす。
【図１】図１は、本発明の例示的な分析方法を示す。
【図２】図２は、染色体２２、ＤＧＳＩ上の良く特性決定された遺伝子の構造を示す。上記遺伝子は、１０のエクソンからなり、右から左へ転写される（即ち、５’末端が右側）。
【図３】図３は、ＲＡＣＥおよびアレイ実験を使用して、新規な遺伝子が特性決定された染色体２２の領域を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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