(57)【要約】  １４日間、治療用量より低量のソマトスタチン類似体パシレオチドで処置したサルの組織を用いて遺伝子発現検定を実施した。検定結果を分析することにより、治療適応症との関係におけるパシレオチドの作用モードを確認した。成長ホルモン／ＩＧＦ−１およびグルカゴン／インスリン軸に対する効果は、幾つかの臓器における転写物レベルの変化に反映されていた。発現された遺伝子は、パシレオチドの生物活性の代用マーカーとして、特に下垂体および腎臓におけるＩＧＦ−２についての発見に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者集団が、パシレオチドを投与された患者によるパシレオチド効力を示す遺伝子発現プロファイルに基いて選択される、選択患者集団において増殖調節障害を処置するための医薬の製造におけるパシレオチドの使用。
【請求項２】
増殖調節障害が腫瘍である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
パシレオチドが、患者による遺伝子発現プロファイルの測定前に治療用量で投与される、請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
パシレオチドが、患者による遺伝子発現プロファイルの測定前に治療用量より低量で投与される、請求項１または２記載の使用。
【請求項５】
対象におけるソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体が指示される状態の処置方法であって、
（ａ）対象に化合物を投与し、
（ｂ）対象の遺伝子発現プロファイルを得、ここで、遺伝子発現プロファイルは、１またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含み、１またはそれ以上の遺伝子の該発現パターンは化合物の投与の結果であるものとし、そして
（ｃ）化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルを、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示すバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと比較し、ここで、バイオマーカー遺伝子発現プロファイルと、化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルとの類似性が化合物による処置の効力を示すものとする
段階から成る方法。
【請求項６】
化合物がソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
化合物がパシレオチドである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
対象が哺乳類である、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
哺乳類が霊長類である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
霊長類がカニクイザルまたはヒトである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
バイオマーカー遺伝子発現プロファイルが、化合物投与前の対象の基礎遺伝子発現プロファイルである、請求項５〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
バイオマーカー遺伝子発現プロファイルが、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体を投与された脊椎動物の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子発現プロファイルの平均である、請求項５、６または７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
遺伝子発現プロファイルが、ＰＫＣ阻害剤；ＭＡＰＫＫＫ５；ｒａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、αサブユニット；ＳＨＢアダプタータンパク質（Ｓｒｃ相同性２タンパク質）；二相特異性ホスファターゼ８；ホスファターゼおよびテンシン相同体；可溶性アデニリルシクラーゼ；アデノシントリホスファターゼ、Ｈ＋／Ｋ＋交換、αポリペプチド；Ｋ＋チャネル、サブファミリーＫ、構成員３（ＴＡＳＫ）；Ｋ＋電圧ゲートチャネル、Ｓｈａｂ−関連サブファミリー、構成員１；フォークヘッドボックスＯ３Ａ；フォークヘッドボックスＨ１；サイクリンＦ；ｃｄｋ阻害剤２Ｄ（ｐ１９、ＣＤＫ４を阻害）およびそれらの組合わせから成る群から選択された遺伝子の下垂体における遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＰ−４−ホスファターゼ、１型、イソ型ｂ；ＰＩ−３−キナーゼ、触媒性、δポリペプチド；ＰＩ−３−キナーゼ、触媒性、αポリペプチド；ＰＩ転移タンパク質、β；ＰＬＣ、γ１（以前にはサブタイプ１４８）；Ｒａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼβ、サブユニット；ＲＡＢ５Ｃ、構成員ＲＡＳオンコジーンファミリー；ＰＴＰ、受容体型、Ｔ；ＰＰ１、調節性（阻害剤）サブユニット５；ＳＳＴＲ３；ＧＬＵＲ２、前駆体；アデノシントリホスファターゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送性、β３ポリペプチド；アデノシントリホスファターゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送性、α２（＋）ポリペプチド；推定Ｃａ＋＋輸送性アデノシントリホスファターゼ；コア結合因子、ｒｕｎｔドメイン、αサブユニット２；転移、１；サイクリンＤ−関連；サイクリンＤ３；Ｓ期応答（サイクリン関連）；細胞分裂周期２５Ｂ；ｃｄｋ阻害剤２Ｃ（ｐ１８、ＣＤＫ４を阻害）；ＢＣＬ２−関連アタノジーン（athanogene）；細胞死のＢＣＬ２−アンタゴニスト；Ｂａｘガンマ；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤ−相互作用性タンパク質３；プログラム化細胞死６；神経芽細胞腫−増幅タンパク質およびそれらの組合わせから成る群から選択された遺伝子の下垂体における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦ−２から成る群から選択された遺伝子の下垂体における遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子発現プロファイルが、グルカゴン受容体（ＧＲ）、ＩＧＦＢＰ（酸不安定サブユニット）およびＳＳＴＲ３から成る群から選択された遺伝子の下垂体における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ４から成る群から選択された遺伝子の褐色脂肪における遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＲＳ２およびＳＳＴＲ３から成る群から選択された遺伝子の褐色脂肪における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦ−１の膵臓における遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
遺伝子発現プロファイルが、ＳＳＴＲ２の膵臓における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２から成る群から選択された遺伝子の腎臓における遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦＢＰ２、ＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ２から成る群から選択された遺伝子の膵臓における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
遺伝子発現プロファイルが、インスリンプロモーター因子１、ホメオドメイン転写因子およびＩＧＦ−２から成る群から選択された遺伝子の肝臓における遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦＢＰ２およびグルカゴン受容体（ＧＲ）から成る群から選択された遺伝子の肝臓における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦＢＰ６、ＩＧＦ−１およびＳＳＴＲ２から成る群から選択された遺伝子の脾臓における遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦＢＰ２、およびグルカゴン受容体（ＧＲ）から成る群から選択された遺伝子の脾臓における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦ−１の脾臓における遺伝子発現の増加を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
遺伝子発現プロファイルが、ＩＧＦ−２の遺伝子発現の減少を含む、請求項５〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体が指示される状態についての化合物の効力を測定する臨床試験に含ませる対象の選択方法であって、
（ａ）対象に化合物を投与し、
（ｂ）対象の遺伝子発現プロファイルを得、ここで、遺伝子発現プロファイルは、１またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含み、１またはそれ以上の遺伝子の発現パターンは化合物の投与の結果であるものとし、
（ｃ）化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルを、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示すバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと比較し、
（ｄ）次いで：
（ｉ）化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルが、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示すバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと類似しているときには、対象を臨床試験に含ませ、または
（ii）化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルが、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示すバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと類似していないときには、臨床試験から対象を排除する
段階を含む方法。
【請求項３０】
化合物を治療用量より低量で対象に投与する、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
化合物がソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体と類似した治療効力を有するか否かを測定する方法であって、
（ａ）対象に化合物を投与し、
（ｂ）対象の遺伝子発現プロファイルを得、ここで、遺伝子発現プロファイルは、１またはそれ以上の遺伝子の遺伝子発現パターンを含み、１またはそれ以上の遺伝子の発現パターンは化合物の投与の結果であるものとし、
（ｃ）化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルを、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示すバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと比較し、
（ｄ）次いで：
（ｉ）化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルが、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体が投与された対象のバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと類似しているときには、化合物はソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体と類似した治療効力を有するものと決定し、または
（ii）化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルが、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体が投与された対象のバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと異なるときには、化合物はソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体とは異なる治療効力を有するものと決定する
段階を含む方法。
【請求項３２】
ソマトスタチン類似体がパシレオチドである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
対象が哺乳類である、請求項３１または３２記載の方法。
【請求項３４】
哺乳類が霊長類である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
霊長類がカニクイザルまたはヒトである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
化合物が、治療用量より低量で対象に投与される、請求項３１〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
ある状態、すなわちソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体が指示される状態についての治療戦略を決定する際に使用されるキットであって、
（ａ）ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体処置の効力のバイオマーカー検出用試薬、
（ｂ）試薬用容器、および
（ｃ）上記状態の治療戦略の決定におけるバイオマーカーの使用法を記載した容器上または容器中における説明書
を含むキット。
【請求項３８】
試薬が遺伝子チップである、請求項３７記載のキット。
【請求項３９】
試薬がハイブリダイゼーションプローブである、請求項３７記載のキット。
【請求項４０】
試薬が遺伝子増幅試薬である、請求項３７記載のキット。
【請求項４１】
バイオマーカーが、
（ａ）ＰＫＣ阻害剤；ＭＡＰＫＫＫ５；ｒａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ、αサブユニット；ＳＨＢアダプタータンパク質（Ｓｒｃ相同性２タンパク質）；二相特異性ホスファターゼ８；ホスファターゼおよびテンシン相同体；可溶性アデニリルシクラーゼ；アデノシントリホスファターゼ、Ｈ＋／Ｋ＋交換、αポリペプチド；Ｋ＋チャネル、サブファミリーＫ、構成員３（ＴＡＳＫ）；Ｋ＋電圧ゲートチャネル、Ｓｈａｂ−関連サブファミリー、構成員１；フォークヘッドボックスＯ３Ａ；フォークヘッドボックスＨ１；サイクリンＦ；およびｃｄｋ阻害剤２Ｄ（ｐ１９、ＣＤＫ４を阻害）；
（ｂ）ＩＰ−４−ホスファターゼ、１型、イソ型ｂ；ＰＩ−３−キナーゼ、触媒性、δポリペプチド；ＰＩ−３−キナーゼ、触媒性、αポリペプチド；ＰＩ転移タンパク質、β；ＰＬＣ、γ１（以前にはサブタイプ１４８）；Ｒａｂゲラニルゲラニルトランスフェラーゼβ、サブユニット；ＲＡＢ５Ｃ、構成員ＲＡＳオンコジーンファミリー；ＰＴＰ、受容体型、Ｔ；ＰＰ１、調節性（阻害剤）サブユニット５；ＳＳＴＲ３；ＧＬＵＲ２、前駆体；アデノシントリホスファターゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送性、β３ポリペプチド；アデノシントリホスファターゼ、Ｎａ＋／Ｋ＋輸送性、α２（＋）ポリペプチド；推定Ｃａ＋＋輸送性アデノシントリホスファターゼ；コア結合因子、ｒｕｎｔドメイン、αサブユニット２；転移、１；サイクリンＤ−関連；サイクリンＤ３；Ｓ期応答（サイクリン関連）；細胞分裂周期２５Ｂ；ｃｄｋ阻害剤２Ｃ（ｐ１８、ＣＤＫ４を阻害）；ＢＣＬ２−関連アタノジーン；細胞死のＢＣＬ２−アンタゴニスト；Ｂａｘガンマ；ＢＣＬ２／アデノウイルスＥ１Ｂ １９ｋＤ−相互作用性タンパク質３；プログラム化細胞死６；および神経芽細胞腫−増幅タンパク質；
（ｃ）ＩＧＦ−２；
（ｄ）グルカゴン受容体（ＧＲ）、ＩＧＦＢＰ（酸不安定サブユニット）およびＳＳＴＲ３；
（ｅ）ＩＧＦ−１およびＩＧＦＢＰ４；
（ｆ）ＩＲＳ２；
（ｇ）ＳＳＴＲ２；
（ｈ）ＩＧＦＢＰ２およびＳＳＴＲ２；
（ｉ）インスリンプロモーター因子１およびホメオドメイン転写因子；
（ｊ）グルカゴン受容体（ＧＲ）；
（ｋ）ＩＧＦＢＰ６；および
（ｌ）それらの組合わせ
から成る群から選択される１またはそれ以上の遺伝子を含む、請求項３７〜４０のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、概してインビトロでの組織標本分析試験、さらに具体的には増殖調節に関する遺伝子発現プロファイリングの特徴に関するものである。
【０００２】
背景技術
ソマトスタチン（ＳＳＴ−１４；ＳＲＩＦ）は、３位と１４位の間にジスルフィド架橋を含む環状テトラデカペプチド視床下部ホルモンである。米国特許第６２２５２８４号参照、出典明示により本明細書の一部とする。ソマトスタチンはまた、２８個のアミノ酸ペプチド（ＳＳＴ−２８）としても存在する。その機構の中でも、ソマトスタチンは、成長ホルモン（ＧＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の放出を阻害する、すなわちインスリンおよびグルカゴンの放出を阻害し、胃液分泌を低下させる。アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼによるソマトスタチンの代謝により、短い持続時間の作用が誘導される。ソマトスタチンは、５種の異なる高親和力膜関連受容体（ＳＳＴＲ）サブタイプに、各サブタイプについて比較的高い親和力で結合する。成長ホルモンおよび甲状腺刺激ホルモン分泌は、ソマトスタチン受容体サブタイプＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ５により調節され、ＳＳＴＲ１を介した成長ホルモン分泌に対する追加的効果を伴う。ソマトスタチン受容体ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ５型の活性化は、成長ホルモン抑制およびさらに具体的には成長ホルモン分泌性腺腫（先端巨大症）および甲状腺刺激ホルモン分泌腺腫と関連している。プロラクチンはＳＳＴＲ５により調節される。
【０００３】
臨床的に利用可能なソマトスタチン類似体、オクトレオチド（サンドスタチン（登録商標））およびランレオチドは、成長およびインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）レベルを手術では適正に制御できなかったかまたは手術が禁忌である先端巨大症患者の処置に使用されている。両類似体とも、ソマトスタチン受容体サブタイプ２（ＳＳＴＲ２）についての選択的な高い親和力を呈する。サンドスタチン（登録商標）は、主としてＳＳＴＲ２に、そしてある程度まではＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ５に結合する。
【０００４】
パシレオチド(pasireotide)は、承認されたサンドスタチン（登録商標）適応症用に、インビボでの長い血漿半減期を有する強力なソマトスタチン類似体として開発された。Lewis I et al.、J Med Chem ４６（１２）：２３３４−４４（２００３年６月５日）；Weckbecker G et al.、Endocrinology １４３（１０）：４１２３−３０（２０００年１０月）。他の類似体とは対照的に、パシレオチドは、ＳＳＴＲ４以外の全ソマトスタチン受容体と結合する。種々のソマトスタチン受容体についての結合親和力は、可能性のある新たな臨床適応症の範囲を特定するための基礎となるものであった。Bruns C et al.、Eur J Endocrinol １４３（補遺１）：Ｓ３−７（２０００）；Bruns C et al.、Eur J Endocrinol. １４６（５）：７０７−１６（２００２年５月）。さらに、成長ホルモンおよびＩＧＦ−１調節についてのパシレオチドの活性が改良され、それがインスリンおよびグルカゴン分泌に対して異なる阻害効果を示すことから、可能性のある他の新たな適応症も示唆された。
【０００５】
普遍的な高親和力ソマトスタチン結合性をもつソマトスタチン類似体、例えばパシレオチドは、成長ホルモン阻害についての効力が大きいだけでなく、さらなる下垂体前葉ホルモンの分泌をも調節する。Murray RD et al.、Endocrine Abstracts ５：Ｐ１８６（２００３）。パシレオチドについての明白なサイン（特徴）により、治療用量より低量であっても、パシレオチド類の化合物の既知薬理学的作用と一致するソマトスタチンアゴニスト活性が確認され得る。このサインは、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体により処置された種々の組織における活性を比較するのに使用できる可能性がある。
【０００６】
従って、当業界ではソマトスタチン類似体の活性について生物全体のレベルで理解を深めることが要望されている。
【０００７】
発明の要旨
本発明はまた、対象におけるある状態、すなわちソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体の投与が指示される状態の処置方法を提供する。この方法では、まず、興味の対象である化合物を対象（例、霊長類対象）に投与し、次いで化合物投与後に対象の遺伝子発現プロファイルを得る。対象の遺伝子発現プロファイルを、バイオマーカー遺伝子発現プロファイルと比較する。バイオマーカー遺伝子発現プロファイルは、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示す。一実施態様において、バイオマーカー遺伝子発現プロファイルは、化合物投与前における対象の基礎遺伝子発現プロファイルである。別の実施態様において、バイオマーカー遺伝子発現プロファイルは、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体（例、パシレオチド）が投与された脊椎動物の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子発現プロファイルの平均である。バイオマーカー遺伝子発現プロファイルと、化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルにおける類似性は、化合物による処置の効力を示している。
【０００８】
本発明は、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体効力の生物学的マーカーを提供する。成長ホルモン／ＩＧＦ−１およびグルカゴン／インスリン軸に対する効果は、幾つかの臓器における転写レベル変化で反映されていた。発現された遺伝子は、パシレオチドの生物学的活性の代用マーカーとして、特に下垂体および腎臓におけるＩＧＦ−２についての発見に有用である。バイオマーカーサインは、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体で処置された生物における種々の組織での処置効力を比較するのに使用され得る。
【０００９】
本発明は、処置される対象で発現されたバイオマーカーの分析結果に基いた、臨床試験に含ませる対象の決定方法を提供する。試験される化合物を対象に投与する。一実施態様では、試験される化合物を治療用量より低量で投与する。例えば、パシレオチドについての明白なサイン（特徴）により、治療用量より低量であっても、パシレオチド類の化合物の既知薬理学的作用と一致するソマトスタチンアゴニスト活性が確認され得る。このサインは、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体により処置された種々の組織における活性を比較するのに使用できる可能性がある。次いで、化合物投与後の対象の遺伝子発現プロファイルを得る。化合物が投与された対象の遺伝子発現プロファイルが、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示すバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと類似しているときには、対象は臨床試験に含まれ得る。対象の遺伝子発現プロファイルが、処置の効力を示すバイオマーカー遺伝子発現プロファイルと類似していないときには、対象は臨床試験から排除され得る。上記類似性または非類似性は、当業者であれば観察できるものである。
【００１０】
本発明はまた、選択された患者集団における増殖調節障害の処置を目的とする医薬の製造におけるパシレオチドの使用に関するものである。患者集団は、パシレオチドが投与された患者によるパシレオチド効力を示す遺伝子発現プロファイルに基いて選択される。
【００１１】
本発明はまた、化合物がソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体、例えばパシレオチドの場合と類似した治療効力を有するか否かの決定方法を提供する。化合物を対象に投与し、次いで化合物投与の結果としての対象の遺伝子発現プロファイルを得る。得られた対象の遺伝子発現プロファイルを、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置の効力を示す標準バイオマーカー遺伝子発現プロファイルと比較する。対象の遺伝子発現プロファイルが標準バイオマーカー遺伝子発現プロファイルと類似しているとき、化合物は、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体の場合と類似した治療効力を有するものとして決定されるが、対象の遺伝子発現プロファイルが標準バイオマーカー遺伝子発現プロファイルとは異なるとき、化合物は、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体の場合とは異なる治療効力を有するものとして決定される。
【００１２】
本発明はまた、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体の投与が指示される状態の処置効力を測定するための臨床検定法、キットおよび試薬を提供する。一実施態様では、キットは、ハイブリダイゼーションによる、バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現測定用試薬を含む。別の実施態様では、キットは、ポリメラーゼ連鎖反応による、バイオマーカー遺伝子の遺伝子発現測定用試薬を含む。
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明は、例えばカニクイザルにおける、多臓器マイクロアレイ解析によるソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体の作用モードおよび潜在的治療適応症の識別に関するものである。本発明は、様々な組織の転写プロファイルが、ソマトスタチン、サンドスタチン（登録商標）、または他のソマトスタチン類似体とパシレオチドの薬理学的プロファイルの比較に使用され得る範囲についての評価に関するものである。
【００１４】
本明細書で使用されている遺伝子発現プロファイルは、増加または減少した遺伝子発現が、化合物投与後における基礎遺伝子発現に対する増加または減少（例、少なくとも１.５倍比率の差異）であるときには、処置の効力の測定についての診断的なものである。別法としてまたはさらに、処置対象の遺伝子発現プロファイルが標準バイオマーカー遺伝子発現プロファイルに匹敵するときには、遺伝子発現プロファイルは、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体（例、パシレオチド）の処置と比較した場合の処置効力の測定についての診断的なものである。一実施態様において、標準バイオマーカー遺伝子発現プロファイルは、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体が投与された脊椎動物の遺伝子発現プロファイルまたは遺伝子発現プロファイルの平均であり、このプロファイルまたは標準とされるプロファイルを投与後の対象から得られた結果と比較する。治療および診断の両面を含む上記方法を、当業者の多くは「セラノスティック(theranostic)」と呼ぶ。
【００１５】
一実施態様において、対象は脊椎動物である。一特定実施態様では、脊椎動物は哺乳類である。さらなる一特定実施態様では、哺乳類は霊長類、例えばカニクイザルまたはヒトである。本明細書で使用されている対象または患者への薬剤または薬物の投与は、自己投与および他者による投与を含む。
【００１６】
本明細書で使用されているところによると、遺伝子発現（例、処置対象からの試料における）が、基準試料と比べた場合に発現レベルにおいて１.５倍比率の（すなわち、高い）差異を示すとき、遺伝子発現パターンは「正常より高い」。遺伝子発現（例、処置対象からの試料における）が、基準試料と比べた場合に発現レベルにおいて１.５倍比率の（すなわち、低い）差異を示すとき、遺伝子発現パターンは「正常より低い」。
【００１７】
本発明により報告された遺伝子の遺伝子発現の検出技術には、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、プライマー伸長、リボヌクレアーゼ保護、ＲＮＡ発現プロファイリングおよび関連技術があるが、これらに限定されるわけではない。本発明により報告された遺伝子によりコード化されたタンパク質産物の検出による遺伝子発現の検出技術には、タンパク質産物を認識する抗体、ウエスタンブロット、免疫蛍光、免疫沈降、ＥＬＩＳＡおよび関連技術があるが、これらに限定されるわけではない。これらの技術は、当業者には周知である。Sambrook J et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版（コールドスプリングハーバー・プレス、コールドスプリングハーバー、２０００）。一実施態様において、遺伝子発現検出技術には、遺伝子チップの使用が含まれる。遺伝子チップの構築および使用は当業界では周知である。米国特許第５２０２２３１、５４４５９３４、５５２５４６４、５６９５９４０号、５７４４３０５、５７９５７１６および５８００９９２号参照。また、Johnston,M. Curr Biol ８：Ｒ１７１−１７４（１９９８）；Iyer VR et al.、Science ２８３：８３−８７（１９９９）およびElias P、“New human genome ‘chip’is a revolution in the offing” Los Angeles Daily News（２００３年１０月３日）も参照。
【００１８】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体。ソマトスタチン−１４およびソマトスタチン−２８のペプチドおよび治療上の使用は、当業界では周知である。米国特許第６２２５２８４号；Lewis I et al.、J.Med.Chem.４６（１２）：２３３４−４４（２００３年６月５日）；Weckbecker G et al.、Endocrinology １４３（１０）：４１２３−３０（２００２年１０月）参照、各々出典明示により本明細書の一部とする。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体の遊離形態または医薬上許容される塩および複合体形態は、インビトロおよびインビボ試験で示されている有用な薬理学的特性を呈することから、治療に関して指示される。
【００１９】
本明細書で使用されている「ソマトスタチン類似体」とは、天然に存在するソマトスタチン−１４の構造から誘導された直鎖または環状ペプチドを意味し、その構造では１個またはそれ以上のアミノ酸単位が省略または１個またはそれ以上のアミノ酸基により置換されているか、または１個またはそれ以上の官能基が、１個またはそれ以上の他の官能基により置換されているか、および／または１個またはそれ以上の基が１個または幾つかの他のアイソスター基により置換されている。米国特許第６２２５２８４号参照、出典明示により本明細書の一部とする。環状、架橋環状および直鎖ソマトスタチン類似体は既知化合物である。上記化合物およびそれらの製品は、例えば欧州特許明細書ＥＰ−Ａ−１２９５；２９５７９；２１５１７１；２０３０３１；２１４８７２；２９８７３２；２７７４１９号に記載されている。一般に、「ソマトスタチン類似体」の語は、少なくとも一つのソマトスタチン受容体サブタイプへのｎＭ範囲での結合親和力を有する天然ソマトスタチン−１４の修飾誘導体を全て包含する。
【００２０】
興味の対象である一ソマトスタチン類似体はパシレオチドであり、化学構造シクロ［４−（ＮＨ２−Ｃ２Ｈ４−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ）Ｐｒｏ−Ｐｈｇ−ＤＴｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ（４−Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ］を有するもので、以下の通りである：
【化１】
2007518702.tif 000002
【００２１】
ここで、Ｐｈｇは、−ＨＮ−ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）−ＣＯ−を意味し、Ｂｚｌはベンジルを意味する。ＰＣＴ特許出願ＷＯ０２／１０１９２を参照。パシレオチドは、ソマトスタチン受容体４（ＳＳＴＲ４）以外の５種のソマトスタチン受容体についての結合親和力をもつソマトスタチン類似体である。パシレオチドは、他のソマトスタチン類似体について上記で開示されたものを含む、幾つかの適応症に向けて開発された。Lewis I et al.、J.Med.Chem. ４６（１２）：２３３４−４４（２００３年６月５日）；Weckbecker G et al.、Endocrinology １４３（１０）：４１２３−４１３０（２００２）；Kneissel M et al.、Bone ２８：２３７−２５０（２００１）；および Thomsen JS et al.、Bone ２５：５６１−５６９（１９９９）参照、これらの内容については出典明示により本明細書の一部とする。
【００２２】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）に結合する。ソマトスタチン受容体活性化の細胞効果は、現時点では以下のように理解されている：ソマトスタチン受容体への結合により、ＰＩ３キナーゼシグナリング経路の活性化、アデニリルシクラーゼの阻害、タンパク質チロシンホスファターゼの活性化、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のモジュレーション、内向き整流性Ｋ＋チャネル、電位依存性Ｃａ＋＋チャネル、Ｎａ＋／Ｈ＋交換体、ＡＭＰＡ／カイニン酸グルタミン酸チャネル、ＰＬＣおよびＰＬＡ２へのカップリングが誘導される。Patel YC、Frontiers in Neuroendocrinology ２０：１５７−９８（１９９９）。ソマトスタチン受容体活性化の結果、細胞内ｃＡＭＰおよびＣａ＋＋を阻害することにより、そしてエキソサイトーシスに対する受容体結合遠位効果により細胞分泌が遮断される。ソマトスタチン受容体１、２、４および５（ＳＳＴＲ１、２、４、５）は、ＭＡＰＫのホスホチロシンホスファターゼ依存性モジュレーションにより細胞周期停止を誘導し、網膜芽細胞腫（Ｒｂ）腫瘍サプレッサータンパク質およびｐ２１の誘導を伴う。ＳＳＴＲ３は、ｐ５３およびＢａｘの活性化に伴うホスホチロシンホスファターゼ依存性アポトーシスを誘発する。
【００２３】
霊長類をソマトスタチン、特にソマトスタチン類似体パシレオチドで処置した場合の追加的効果は、下記実施例で提供されている。
【００２４】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、少なくとも一つのソマトスタチン受容体サブタイプに結合する。５種のソマトスタチン受容体サブタイプ、ＳＳＴ−１、ＳＳＴ−２、ＳＳＴ−３、ＳＳＴ−４およびＳＳＴ−５をクローン化し、特性確認した。ヒトソマトスタチン受容体ｈＳＳＴ−１、ｈＳＳＴ−２およびｈＳＳＴ−３およびそれらの配列は、Yamada Y et al.、Proc.Nat.Acad.Sci. U.S.A.８９：２５１−２５５（１９９２）により開示されている。ヒトソマトスタチン受容体ｈＳＳＴ−４およびその配列は、Rohrer L et al.、Proc.Acad.Sci.U.S.A.９０：４１９６−４２００（１９９３）により開示されている。ヒトソマトスタチン受容体ｈＳＳＴ−５およびその配列は、Panetta R et al.、Mol.Pharmacol.４５：４１７−４２７（１９９３）により報告されている。
【００２５】
結合検定法は、ｈＳＳＴ−１、ｈＳＳＴ−２、ｈＳＳＴ−３、ｈＳＳＴ−４またはｈＳＳＴ−５選択的セルライン、例えばｈＳＳＴ−１、ｈＳＳＴ−２、ｈＳＳＴ−３、ｈＳＳＴ−４またはｈＳＳＴ−５を安定して発現するＣＨＯ細胞から調製した膜を用いて実施され得る。米国特許第６２２５２８４号参照。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、ｈＳＳＴ−１、ｈＳＳＴ−２、ｈＳＳＴ−３、ｈＳＳＴ−４および／またはｈＳＳＴ−５に対する上記結合検定法においてｎＭ範囲のＩＣ５０を有する。
【００２６】
さらに、ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、培養下垂体細胞からのインビトロＧＨ放出の阻害により示されている成長ホルモン放出阻害活性を示す。米国特許第６２２５２８４号参照。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、１０−１１〜１０−６Ｍの成長ホルモン濃度依存的放出を阻害する。
【００２７】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体はまた、雄ラットと用いた標準試験で示されたところによると、インスリンおよび／またはグルカゴンの放出を阻害する。米国特許第６２２５２８４号参照。血清インスリンおよびグルカゴンレベルの測定は、ラジオイムノアッセイにより実施される。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、この試験で０.０２〜１０００μｇ／ｋｇ皮下（s.c.）の範囲、例えば、１０μｇ／ｋｇ（s.c.）までの用量で投与されたとき、活性を示す。
【００２８】
しかしながら、上記によると、ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体の投与は、治療用量より低量でも、有効な形でバイオマーカーサイン情報を提供できる。
【００２９】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、成長（ホルモン）分泌過剰を含むかまたはそれに伴う病因を有する疾患の処置、例えば先端巨大症の処置並びに真性糖尿病、特にその合併症（例、血管障害、増殖性網膜症、あけぼの現象およびネフロパシーおよびインスリンまたはグルカゴン放出に関連した他の代謝障害）の処置において有用である。米国特許第６２２５２８４号参照。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体はまた、胃酸分泌、外分泌および内分泌膵臓分泌および胃腸管の様々なペプチドの分泌を阻害する。さらにソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、胃腸障害の処置、例えば胃潰瘍、腸皮および膵皮フィステル、過敏性腸症候群および疾患、ダンピング症候群、水様性下痢症候群、エイズ関連下痢、化学療法誘導下痢、急性または慢性膵炎および胃腸ホルモン分泌腫瘍（例、ビポーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、カルチノイドなど）並びに胃腸出血の処置に有用である。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体はまた、ソマトスタチン受容体陽性の腫瘍、特にヒトソマトスタチン受容体ｈＳＳＴ−１、ｈＳＳＴ−２、ｈＳＳＴ−３、ｈＳＳＴ−４および／またはｈＳＳＴ−５をもつ腫瘍の処置において有効である。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、処置を必要とする対象における過剰の成長ホルモン分泌を含むかまたはそれに伴う病因の処置、胃腸障害の処置、表皮細胞の増殖または角質化の阻止、または変性老人性痴呆の処置に有用である。米国特許第６１２３９１６号参照、出典明示により本明細書の一部とする。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体はまた、結核、サルコイドーシス、悪性リンパ腫、皮膚のメルケル細胞腫、骨肉腫、病巣リンパ球反応、局在化自己免疫疾患および移植後の臓器拒絶を処置するのにも有用である。米国特許第６１２３９１６号参照。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、特にソマトスタチン受容体陽性腫瘍、例えば胸部、前立腺、結腸、膵臓、脳、肺およびリンパ節の癌の処置に指示される。
【００３０】
繰返すことになるが、ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、先端巨大症、真性糖尿病および合併症（例、血管障害、糖尿病性増殖性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ネフロパシー、神経障害、視床下部性または高インスリン血性肥満症）、病的肥満、グレーブス病、多のう胞性腎疾患、胃腸障害（例、過敏性腸症候群および疾患または腸皮および膵皮フィステル）、ダンピング症候群、水様性下痢症候群、エイズ関連下痢、化学療法誘発性下痢、膵炎、消化管ホルモン産生腫瘍（例、ＧＥＰ腫瘍、例えばビポーマ、グルカゴノーマ、インスリノーマ、カルチノイドなど）、ソマトスタチン受容体陽性腫瘍（例、下垂体、胃腸膵臓、カルチノイド、中枢神経系、胸部、前立腺（進行性ホルモン難治性前立腺癌を含む）、卵巣または結腸腫瘍）、小細胞肺癌、悪性腸閉塞、パラガングリオーマ、腎臓癌、皮膚癌、神経芽細胞腫、クロム親和性細胞腫、髄様甲状腺癌、骨髄腫、リンパ腫、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫、骨腫瘍および転移、慢性同種移植拒絶および他の脈管閉塞障害（例、静脈移植狭窄、例えば焼灼術または血管剥離術、例えば経皮経管動脈形成術、レーザー治療または血管内膜または内皮の完全性を破壊する他の侵襲性技法により誘発される、脈管損傷後の再狭窄および／または血管閉塞）、新脈管形成、肝細胞癌並びに消化管出血（例、食道静脈瘤出血）、黄斑浮腫（例、類のう胞黄斑水腫、特発性類のう胞黄斑水腫、滲出性加齢性黄斑変性、脈絡膜新生血管形成関連障害）および増殖性網膜症を含む、幾つかの適応症の処置用に開発され、使用されている。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、下垂体腫瘍のサブタイプである、クッシング病の治療に使用される。ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体はまた睡眠時無呼吸の処置にも使用される。
【００３１】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体の遊離または複合形態は、慣用的経路により、特に腹腔内または静脈内経路により、例えば注射可能溶液または懸濁液の形態で投与され得る。それらはまた、有利には注入、例えば３０〜６０分の注入により投与され得る。腫瘍の部位によっては、それらは例えばカテーテル手段により、腫瘍部位に可能な限り近接して投与され得る。ソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体の遊離または複合形態を、１種またはそれ以上の医薬上許容される担体または希釈剤と一緒に含む医薬組成物は、慣用的方法で製造され得、例えばイメージング用に、キットの形態をとり得る。米国特許第６２２５２８４号参照。
【００３２】
ソマトスタチンおよびソマトスタチン類似体は、他の薬剤、例えばスターリックス（Starlix、登録商標）または他の抗糖尿病薬、または化学療法剤、例えばパクリタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、タキソール、抗アンドロゲン、ミトキサントロン、抗エストロゲン、例えばレトロゾール、抗代謝薬、植物アルカロイド、リンホカイン、インターフェロン、タンパク質チロシンキナーゼおよび／またはセリン／トレオニンキナーゼの阻害剤、エポチロン、または抗血管形成剤と組合わせて投与され得る。
【００３３】
本発明キットは、キット容器上または中に説明書を含み得る。説明書には、患者がソマトスタチンまたはソマトスタチン類似体による処置が指示される場合の化合物で処置されているか否かを測定するためのキットに含まれる試薬の使用方法が記載されている。幾つかの実施態様において、試薬の使用は、本発明方法に準拠したものであり得る。一実施態様では、試薬は、関連性のある遺伝子の遺伝子発現を測定するための遺伝子チップである。
【００３４】
以下、実施例により本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。この実施例は、添付の請求の範囲により特定されている、本発明の範囲を制限するものとしてみなすべきではない。
【００３５】
実施例
サルにおけるパシレオチド誘導遺伝子発現プロファイリング
緒論および要旨。１４日間治療用量より低量のパシレオチドで処置したサルの組織を用いて、マイクロアレイ遺伝子発現検定法を実施した。検定結果を分析することにより、治療適応症との関係におけるパシレオチドの作用モードを確認した。
【００３６】
検査したサル組織は全て（甲状腺、褐色脂肪、下垂体、膵臓、肝臓、腎臓、脾臓）、ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）への天然ソマトスタチン１４（ＳＳＴ−１４）およびソマトスタチン２８（ＳＳＴ−２８）の結合により調節された遺伝子における変化を示していた。転写物プロファイルは、成長ホルモン／インスリン様成長因子１（ＧＨ／ＩＧＦ−１）、グルカゴン／インスリン軸および細胞増殖に対する既知ソマトスタチン作用を反映していた。しかしながら、化合物は、下垂体および腎臓におけるインスリン様成長因子２（ＩＧＦ−２）といった他の関連遺伝子の転写物レベルに著しく影響を及ぼした。タンパク質生合成における変化が血液などの容易に接近できる組織で反映されるならば、これは、薬剤効力の候補生物学的マーカー（バイオマーカー）であり得る。成長因子、免疫系の細胞および心臓血管および腎機能に対するソマトスタチンおよびアゴニストの他の既知効果も、パシレオチドに次ぐこれらの種類の遺伝子のプロファイルにおける変化により反映されていた。
【００３７】
組織の起源および検査分析。雄および雌カニクイザルには、１４日間皮下経路によりパシレオチド（１００μｇ／動物／日）または賦形剤を与えた。１５日目、全動物を殺し、ＲＮＡ抽出用の組織を直ちに急速冷凍し、検査分析するまで−８０℃に保った。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００３８】
ＲＮＡ発現プロファイリングは、主として完全長ヒト遺伝子の検査を行う１２６００個のプローブセットおよび若干の対照プローブセットを含む、ＨＧ−Ｕ９５Ａ遺伝子発現プローブアレイ（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア、米国）の手段により実施された。製造業者の推奨に従って実験を実施した。簡単に述べると、各冷凍組織片からの酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出（トリゾール（登録商標）、インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）により全ＲＮＡを得た。次いで、全ＲＮＡをアフィニティー樹脂（Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）、キアゲン）において精製し、定量した。Ｔ７−（ｄＴ）２４ ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの存在下、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）チョイス・システム（インビトロゲン・ライフ・テクノロジーズ、カールスバッド、カリフォルニア、米国）を用いて約５μｇ完全長全ＲＮＡの出発量で２本鎖ｃＤＮＡを合成した。合成後、ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出およびエタノール沈澱により精製した。次いで、ＢｉｏＡｒｒａｙ（登録商標）ハイ・イールドＲＮＡトランスクリプト・ラベリング・キット（ＥＮＺＯ、ファーミングデール、ニューヨーク、米国）を用いて、精製ｃＤＮＡをインビトロ転写した。次いで、標識ｃＲＮＡをアフィニティー樹脂（Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）、キアゲン）で精製し、定量し、フラグメント化した。約１０μｇ量の標識ｃＲＮＡを、４５℃で１６時間発現プローブアレイとハイブリダイゼーションした。次いで、アレイを洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ４００（アフィメトリックス、サンタクララ、カリフォルニア、米国）を用いて、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（モレキュラー・プローブズ、）で２回染色した。次いで、共焦レーザースキャナー（ＧｅｎｅＡｒｒａｙ（登録商標）スキャナー、アギレント、パロアルト、カリフォルニア、米国）を用いて、アレイを２回走査することにより、一走査画像が得られた。得られたこの「.ｄａｔ−ｆｉｌｅ」を、ＭＡＳ４プログラム（アフィメトリックス）を用いて「.ｃｅｌ−ｆｉｌｅ」へ処理した。「.ｃｅｌ−ｆｉｌｅ」を捉え、アフィメトリックスのＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩＭＳ）へロードした。ＬＩＭＳデータベースを、全プローブセル（ＣＥＬファイル）についての平均強度をＯｒａｃｌｅデータベースへダウンロードさせ得るネットワークファイリングシステム（ＮＰＧＮ）を介してＵＮＩＸ Ｓｕｎ Ｓｏｌａｒｉｓサーバーにつなぐ。１５０の「標的強度」を用いて、未処理データを発現レベルに変換した。データを品質管理について評価し、解析用のＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ（登録商標）ソフトウェア４.２.４（シリコン・ジェネティクス、カリフォルニア、米国）へロードした。
【００３９】
ヒトアフィメトリックスＨＧＵ９５Ａｖ２チップにおいて、個々の遺伝子についてのプローブセットは、２０個のオリゴヌクレオチド対を含んでおり、各々「完全マッチ」２５量体および単一塩基が「完全」マッチオリゴヌクレオチドとは異なる「ミスマッチ」２５−量体により構成されている。プローブ標識、ハイブリダイゼーション、およびレーザー走査後、所定のプローブのオリゴヌクレオチド対により測定されるシグナル強度の差異の平均をとることにより発現レベルを評価した（ＡｖｇＤｉｆｆ値）。選択された遺伝子について、対照および処置群間におけるＡｖｇＤｉｆｆ値の差異から変化比率および方向を計算した。
【００４０】
パシレオチドにより影響される遺伝子を同定するため、データセットを最初にフィルタリングにかけることにより、解析の第一波で、実験ノイズが高い場合に値が系統的に低い発現範囲に含まれる遺伝子を排除する（検定ポイントの最小数の繰返しに対応する若干の検定法において少なくとも８０）。選択の第２ラウンドにおいて、０.０５の閾値ｐ−値（ｔ−検定に基く）により、２成分誤差モデル（グローバル・エラーモデル）に基き処置および未処置群間における差異を同定し、そして可能な場合、多重仮説検定についての補正を段階的に減少させる（BenjaminiおよびHochberg偽発見率）。ある特定遺伝子を保存するか拒絶するかの決定は、比較および統計アルゴリズムにより同定された数値変化と、共通の生物学的テーマを指し示す他のモジュレーションされた遺伝子との関係の連結に基くものであった。関連性のある科学文献の検討を通して分析者がこの関係の重要さを評価した。
【００４１】
本明細書で記載されている検定分析について、（１）特記しない場合、発現の増加および減少は、ＲＮＡ発現レベルに関するものであった。（２）同一遺伝子を示す多数のプローブがある場合には、センス標的について設計されたプローブセットが有利であった。そして（３）遺伝子発現の変化は、個々の遺伝子により示される経路、細胞活性または成分が影響され得ることを示していた。機能的な潜在的関連性についての理解は、転写物レベル変化の生物学的状況に関する入手可能な情報（遺伝子機能、生理学的変化、他の遺伝子変化、組織、化合物など）に依存している。ＲＴ−ＰＣＲを用いることにより、ｍＲＮＡレベルの絶対変化の範囲は同定されるが、この方法では一般に、転写物レベル変化の関連性に関する情報がそれ以上追加されることはない。
【００４２】
１チップにつき１２６００個の遺伝子の中で、約１００個の遺伝子は、特定組織における化合物サインを反映することが見出された。明確にするため、それらを種々のクラスに分割し、重複は多いが、下表における機能的範ちゅうにさらに分割した。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【００４３】
これらの結果は、幾つかのシグナル伝達経路が影響を受けたことを示している。それらは、ホスファチジルイノシトール／ＰＫＣ／ホスホリパーゼ／カルシウム−カルシニューリン−カルモジュリン経路、Ｒａｓ／ＭＡＰＫキナーゼ／ＥＲＫキナーゼ依存性経路、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路、および依存的経路をもつアデニル酸／グアニル酸シクラーゼを含んでいた。細胞表面受容体についての変化には、多数のＧプロテインカップリング受容体、成長因子についての受容体およびグルタミン酸受容体が含まれた。ＡＴＰ−依存性輸送タンパク質の変化には、イオンチャネルおよび関連タンパク質が関与した。化合物はまた、神経メディエーター／神経モジュレーター、膵臓および胃腸分泌、ホルモン、細胞骨格タンパク質および酵素／触媒に影響を与えた。
【００４４】
下垂体における幾つかのＳＳＴＲシグナリング経路を反映する遺伝子の例を表４に示す。一次遺伝子リストから選択された遺伝子は、一連のフィルタリングおよび統計アルゴリズム（ｔ−検定、ｐ値：０.０５）により作成された。数値は、括弧間の観察値の範囲での各検定に関する関連性のあるプローブセットのＡｖｇＤｉｆｆ（上記参照）に対応する。この解析において特に興味深いのは、ＳＳＴＲへの天然ペプチド、ＳＳＴ−１４およびＳＳＴ−２８の結合と密接に関連することが知られている分子に関する転写物レベル変化であった。
【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【００４５】
ＧＨ／ＩＧＦ−１およびグルカゴン／インスリン軸に対する効果（Macaulay VM、Br J Cancer ６５：３１１−２０（１９９２）；Pollak MN および Schally AV、Proc Soc Exp Biol Med ２１７：１４３−５２（１９９８））は、幾つかの臓器における転写物レベル変化で反映されていた。結果を表５に示す。ＩＧＦ−１転写物レベルの予想された変化以外に、血液中で反映されるならばパシレオチド活性の生物マーカーとして有用であり得る（下垂体および腎臓において）ＩＧＦ−２に対する効果も認められた。上記表４に従って遺伝子を選択した。
【表３５】
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【００４６】
興味の対象である他の遺伝子でパシレオチドによる影響を受けたのは、成長因子（ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦβ）の転写物レベル、腫瘍増大および拡散に関与するそれらの受容体および血管形成因子（ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、トロンボスポンジン）であった（Woltering EA et al.、New Drugs １５：７７−８６（１９９７））。ソマトスタチンおよび類似体についても報告されており、変化を被ったのは免疫に関与する遺伝子、すなわちサイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ、ＩＦＮ）、ＴおよびＢ細胞発生および機能のレギュレーター（ＣＤ２抗原、ＩＬ−２受容体、Ｂ−リンパ球チロシンキナーゼ、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ、ｐ５６ｌｃｋ、ＲＡＧ１、ＴＣＲζ鎖前駆体、ＲＡＧ２、ＦＬＴ３リガンド）（van Hagen PM et al. Eur J Clin Invest ２４：９１−９（１９９４））、ならびに血圧コントロールおよび利尿に関与する遺伝子、すなわち心房ナトリウム排泄増加性ペプチドおよびその受容体グアニリルシクラーゼＡ、アルギニンバソプレシンおよびその受容体（Aguilera G et al.、Nature ２９２：２６２−３（１９８１）；Aguilera G et al.、Endocrinology １１１：１３７６−８４(１９８２)；Ray C et al.、Clin Sci （Lond）８４：４５５−６０（１９９３）；Cheng H et al.、Biochem J ３６４：３３−９（２００２））であった。脂肪貯蔵の制御に関与する特異的遺伝子は、褐色脂肪におけるアドレナリン作用性β３受容体である（Bachman E et al.、Science ２９７：８４３−４５（２００２））。
【００４７】
上記遺伝子のタンパク質産物は、パシレオチドの生物学的活性の代用マーカーとして、特に下垂体および腎臓でのＩＧＦ−２に関する発見に有用である。
【００４８】
結論として言えば、治療有効量より少量のパシレオチドで処置したサル組織の遺伝子プロファイリングは、ソマトスタチンについて知られているシグナリングおよびエフェクター経路の感度の良い同定方法である。
【００４９】
本明細書で引用されている参考文献は全て、個々の出版物または特許または特許出願があらゆる目的のために各々具体的かつ個別にそのままの形で説明の一部として示されているのと同程度に、あらゆる目的のために出典明示により完全に本明細書の一部とする。さらに、本明細書で引用されているＧｅｎＢａｎｋ受入番号、Ｕｎｉｇｅｎｅ Ｃｌｕｓｔｅｒ番号およびタンパク質受入番号は、上記の各番号が具体的かつ個別にあらゆる目的のためにそのままの形で説明の一部として示されているのと同程度に、あらゆる目的のために完全に出典明示により本明細書の一部とする。
【００５０】
本発明は、本明細書に記載されている特定の実施態様について限定されるわけではなく、それらは本発明の個々の態様を単に説明しているに過ぎないものとする。当業者には明白なことであるが、発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明には多くの修飾および変形が加えられ得る。本明細書で列挙されているものに加えて、本発明の範囲内における機能的に均等内容である方法および装置も、本明細書の記載および添付の図面から当業者であれば容易に理解できるものである。上記修飾および変形は、添付された請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。本発明は、上記請求の範囲に包含される全範囲の均等内容のものと一緒に、添付された請求の範囲によってのみ制限されるものとする。
【国際調査報告】
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2007518702.tif 000039
2007518702.tif 000040
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