(57)【要約】  毛髪、皮膚、および爪に高親和力で結合するペプチドが同定された。ペプチドベースの毛髪質改良剤、毛髪着色剤、皮膚質改良剤、皮膚着色剤、および爪着色剤について記載されている。ペプチドベースの毛髪質改良剤および毛髪着色剤は、それぞれ毛髪質改良剤または着色剤と共役する毛髪結合ペプチドからなる。ペプチドベースの皮膚質改良剤および皮膚着色剤は、それぞれ皮膚質改良剤または着色剤と共役する皮膚結合ペプチドからなる。ペプチドベースの爪着色剤は、着色剤と共役する爪結合ペプチドからなる。これらの全ての組成物で、ペプチドは活性作用因子と直接に共役していてもよく、またはカップリングはスペーサーを介していてもよい。これらのペプチドベースの質改良剤および着色剤を含有するパーソナルケア組成物についてもまた記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６４、６６、６９、および７０よりなる群から選択される毛髪結合ペプチド。
【請求項２】
配列番号６０に記載の爪結合ペプチド。
【請求項３】
配列番号６１に記載の皮膚結合ペプチド。
【請求項４】
一般構造式、
（ＨＢＰ）ｎ−ＨＣＡ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＣＡは毛髪質改良剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１,０００の範囲である）
を有するジブロックのペプチドベースの毛髪質改良剤。
【請求項５】
一般構造式、
（ＳＢＰ）ｎ−ＳＣＡ
（式中、
ａ）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）ＳＣＡは皮膚質改良剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１,０００の範囲である）
を有するジブロックのペプチドベースの皮膚質改良剤。
【請求項６】
一般構造式、
（ＨＢＰ）ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有するジブロックのペプチドベースの毛髪着色剤。
【請求項７】
一般構造式、
（ＮＢＰ）ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＮＢＰは爪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有するジブロックのペプチドベースの爪着色剤。
【請求項８】
一般構造式、
（ＳＢＰ）ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有するジブロックのペプチドベースの皮膚着色剤。
【請求項９】
一般構造式、
［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−ＨＣＡ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＣＡは毛髪質改良剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１,０００の範囲である）
を有するトリブロックのペプチドベースの毛髪質改良剤。
【請求項１０】
一般構造式、
［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−ＳＣＡ
（式中、
ａ）ＳＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＳＣＡは皮膚質改良剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１,０００の範囲である）
を有するトリブロックのペプチドベースの皮膚質改良剤。
【請求項１１】
一般構造式、
［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有するトリブロックのペプチドベースの毛髪着色剤。
【請求項１２】
一般構造式、
［（ＮＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＮＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有するトリブロックのペプチドベースの爪着色剤。
【請求項１３】
一般構造式、
［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＳＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有するトリブロックのペプチドベースの皮膚着色剤。
【請求項１４】
毛髪結合ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の毛髪に対する結合親和力を有する、請求項４、６、９、または１１のいずれか一項に記載の質改良剤または着色剤。
【請求項１５】
皮膚結合ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の皮膚に対する結合親和力を有する、請求項５、８、１０、または１３のいずれか一項に記載の質改良剤または着色剤。
【請求項１６】
爪結合ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の爪に対する結合親和力を有する、請求項７または１２のいずれか一項に記載の着色剤。
【請求項１７】
毛髪結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーと毛髪サンプルとを接触させて、
（Ａ）ファージ−ペプチド−毛髪複合体、
（Ｂ）非結合毛髪、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のファージ−ペプチド−毛髪複合体を単離し、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（ｉｖ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなるプロセスによって単離される、請求項１４に記載の質改良剤または着色剤。
【請求項１８】
皮膚結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーと皮膚サンプルとを接触させて、
（Ａ）ファージ−ペプチド−皮膚複合体、
（Ｂ）非結合皮膚、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のファージ−ペプチド−皮膚複合体を単離し、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（ｉｖ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなるプロセスによって単離される、請求項１５に記載の質改良剤または着色剤。
【請求項１９】
爪結合ペプチドが、
（ｉ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
（ｉｉ）（ｉ）のライブラリーと爪サンプルとを接触させて、
（Ａ）ファージ−ペプチド−爪複合体、
（Ｂ）非結合爪、および
（Ｃ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）のファージ−ペプチド−爪複合体を単離し、
（ｉｖ）（ｉｉ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）後に残存するファージ−ペプチド−爪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（ｉｖ）後に残存するファージ−ペプチド−爪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなるプロセスによって単離される、請求項１６に記載の着色剤。
【請求項２０】
毛髪結合、皮膚結合、または爪結合ペプチドが約７〜約２０個のアミノ酸である、請求項４〜１３に記載のペプチドベースの質改良剤または着色剤。
【請求項２１】
毛髪結合、皮膚結合、または爪結合ペプチドが約７〜約１２個のアミノ酸である、請求項４〜１３に記載のペプチドベースの質改良剤または着色剤。
【請求項２２】
毛髪結合、皮膚結合、または爪結合ペプチドが、ペプチド配列の少なくとも１つの末端にシステイン残留物をさらに含んでなる、請求項４〜１３に記載のペプチドベースの質改良剤または着色剤。
【請求項２３】
毛髪結合ペプチドが、配列番号１、３〜５９、６４、６６、６９、７０、７６〜９７、および９８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４、６、９または１１に記載のペプチドベースの毛髪質改良剤またはペプチドベースの毛髪着色剤。
【請求項２４】
皮膚結合ペプチドが、配列番号２、６１、９９〜１０３、および１０４よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項５、８、１０または１３に記載のペプチドベースの皮膚質改良剤またはペプチドベースの皮膚着色剤。
【請求項２５】
爪結合ペプチドが、配列番号７、８、１９〜２７、３８〜４０、４３〜４５、４７、５３、５７、５８、５９、および６０よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項７または１２に記載のペプチドベースの爪着色剤。
【請求項２６】
毛髪質改良剤が、オクチルアミン、ステアリルアミン、ベヘニルアルコール、ビニル基で終結するシロキサン、ビニル基で終結するシリコーン、ビニル基で終結するメチルビニルシロキサン、ビニル基で終結するメチルビニルシリコーン、ヒドロキシルで終結するシロキサン、ヒドロキシルで終結するシリコーン、アミノ変性シリコーン誘導体、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシロキサン、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシリコーン、α−トリデシル−ω−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１,２−エタンジイル）、アモジメチコン、およびキトサンよりなる群から選択される、請求項４または９に記載のペプチドベースの毛髪質改良剤。
【請求項２７】
皮膚質改良剤が、ポリサリチル酸、プロピレングリコール、グリセリン、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、グルカル酸、ガラクタル酸、３−ヒドロキシ吉草酸、サリチル酸、および１，３−プロパンジオールよりなる群から選択される、請求項５または１０に記載のペプチドベースの皮膚質改良剤。
【請求項２８】
着色剤が、Ｄ＆Ｃイエロー１、Ｄ＆Ｃイエロー３、ＨＣイエロー６、ＨＣイエロー８、Ｄ＆Ｃブルー１、ＨＣブルー１、ＨＣ褐色２、ＨＣレッド５、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ,Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、カーボンブラック、金属ナノ粒子、および半導体ナノ粒子よりなる群から選択される、請求項６または１１に記載のペプチドベースの毛髪着色剤。
【請求項２９】
着色剤が、Ｄ＆Ｃレッド８、１０、３０、３６号、Ｄ＆Ｃレッド６、９、１２号のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド７、１１、３１、３４号のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド３０号のストロンチウムレーキ、Ｄ＆Ｃオレンジ１７号のストロンチウムレーキ、およびＤ＆Ｃブルー６号のストロンチウムレーキよりなる群から選択される、請求項７または１２に記載のペプチドベースの爪着色剤。
【請求項３０】
着色剤が、Ｄ＆Ｃレッド２１号、Ｄ＆Ｃレッド２７号、Ｄ＆Ｃレッドオレンジ５号、Ｄ＆Ｃレッド２１号、Ｄ＆Ｃオレンジ１０号、二酸化チタン、酸化亜鉛、Ｄ＆Ｃレッド３６号、Ｄ＆Ｃオレンジ１７号、Ｄ＆Ｃレッド７、１１、３１、３４号のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド号１２のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１３号のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー５号のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー６号のアルミニウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド２７号のアルミニウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド２１号のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃブルー１号のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、ウルトラマリンブルー、カーボンブラック、およびジヒドロキシアセトンよりなる群から選択される、請求項８または１３に記載のペプチドベースの皮膚着色剤。
【請求項３１】
スペーサーが、エタノールアミン、エチレングリコール、鎖長が炭素原子６個のポリエチレン、３〜６の反復単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、エチルアルキル鎖、プロピルアルキル鎖、ヘキシルアルキル鎖、ステリルアルキル鎖、セチルアルキル鎖、およびパルミトイルアルキル鎖よりなる群から選択される、請求項９、１０、１１、１２または１３に記載のペプチドベースの質改良剤または着色剤。
【請求項３２】
スペーサーが、グリシン、アラニン、セリン、およびそれらの混合物よりなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるペプチドである、請求項９、１０、１１、１２または１３に記載のペプチドベースの質改良剤または着色剤。
【請求項３３】
スペーサーが、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含んでなるペプチドである、請求項９、１０、１１、１２または１３に記載のペプチドベースの質改良剤または着色剤。
【請求項３４】
請求項４または９に記載の有効量のペプチドベースの毛髪質改良剤を含んでなる、毛髪ケア組成物。
【請求項３５】
請求項５または１０に記載の有効量のペプチドベースの皮膚質改良剤を含んでなる、皮膚ケア組成物。
【請求項３６】
請求項６または１１に記載の有効量のペプチドベースの毛髪着色剤を含んでなる、髪染め組成物。
【請求項３７】
請求項６または１１に記載の有効量のペプチドベースの毛髪着色剤を含んでなる、化粧品組成物。
【請求項３８】
請求項７または１２に記載の有効量のペプチドベースの爪着色剤を含んでなる、マニキュア液組成物。
【請求項３９】
請求項８または１３に記載の有効量のペプチドベースの皮膚着色剤を含んでなる、化粧品組成物。
【請求項４０】
請求項４または９に記載の有効量のペプチドベースの毛髪質改良剤を含んでなる、髪染め組成物。
【請求項４１】
ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
ｂ）（ａ）のライブラリーを毛髪、皮膚、または爪サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−毛髪、ファージ−ペプチド−皮膚、またはファージ−ペプチド−爪複合体、
（ｉｉ）非結合毛髪、皮膚または爪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）のファージ−ペプチド−毛髪、ファージ−ペプチド−皮膚、またはファージ−ペプチド−爪複合体を単離し、
ｄ）（ｂ）のファージ−ペプチド複合体から弱結合したファージ−ペプチドを溶出し、
ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪、ファージ−ペプチド−皮膚、またはファージ−ペプチド−爪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させ、
ｆ）ステップ（ｅ）の感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、
ｇ）ステップ（ｆ）の生育した細胞から毛髪、皮膚、または爪に対する高結合親和力を有するファージ−ペプチドを単離および同定する
ことを含んでなる、高親和力の毛髪、皮膚、または爪結合ペプチドを作り出す方法。
【請求項４２】
請求項２８に記載の組成物を毛髪に塗布し、保護層を形成させることを含んでなる、毛髪上にペプチドベースの質改良剤の保護層を形成する方法。
【請求項４３】
請求項２９に記載の組成物を皮膚または口唇に塗布し、保護層を形成させることを含んでなる、皮膚または口唇上にペプチドベースの質改良剤の保護層を形成する方法。
【請求項４４】
請求項３６または４０に記載の髪染め組成物を毛髪の着色を引き起こすのに十分な時間、毛髪に塗布することを含んでなる、毛髪を染める方法。
【請求項４５】
組成物が約５〜約５０分間毛髪に塗布される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項３８に記載のマニキュア液組成物を爪に塗布することを含んでなる、爪を染める方法。
【請求項４７】
請求項３９の化粧品組成物を皮膚または口唇に塗布することを含んでなる、皮膚または口唇を染める方法。
【請求項４８】
請求項３７に記載の化粧品組成物を眉または睫毛に塗布することを含んでなる、眉または睫毛を染める方法。
【請求項４９】
ａ）ｉ）（ＨＢＰ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−Ｃ
（式中、
１）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される毛髪着色剤を含んでなる髪染め組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の毛髪着色剤をペプチドベースの着色剤が毛髪、眉または睫毛に結合するのに十分な時間、毛髪、眉または睫毛に塗布することを含んでなり、
ここで、毛髪結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを毛髪サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−毛髪複合体、
（ｉｉ）非結合毛髪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−毛髪複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の毛髪に対する結合親和力を有する方法によって選択される、毛髪、眉または睫毛を染める方法。
【請求項５０】
ａ）ｉ）（ＨＢＰ）ｎ−ＨＣＡ、および
ｉｉ）［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−ＨＣＡ
（式中、
１）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
２）ＨＣＡは毛髪質改良剤であり、
３）ｎは１〜約１,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される毛髪質改良剤を含んでなる毛髪ケア組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の毛髪質改良剤を毛髪に塗布して前記保護層を形成させる
ことを含んでなり、
ここで、毛髪結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを毛髪サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−毛髪複合体、
（ｉｉ）非結合毛髪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−毛髪複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の毛髪に対する結合親和力を有する方法によって選択される、ペプチドベースの質改良剤の保護層を毛髪上に形成する方法。
【請求項５１】
ａ）ｉ）（ＳＢＰ）ｎ−ＳＣＡ、および
ｉｉ）［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−ＳＣＡ
（式中、
１）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
２）ＳＣＡは皮膚質改良剤であり、
３）ｎは１〜約１,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される皮膚質改良剤を含んでなる皮膚ケア組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の皮膚質改良剤を皮膚または口唇に塗布して前記保護層を形成させる
ことを含んでなり、
ここで、皮膚結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを皮膚サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−皮膚複合体、
（ｉｉ）非結合皮膚、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−皮膚複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の皮膚に対する結合親和力を有する方法によって選択される、保護層を皮膚または口唇上に形成する方法。
【請求項５２】
ａ）ｉ）（ＳＢＰ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−Ｃ
（式中、
１）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される皮膚着色剤を含んでなる化粧品組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の皮膚着色剤を皮膚または口唇に塗布する
ことを含んでなり、
ここで、皮膚結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを皮膚サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−皮膚複合体、
（ｉｉ）非結合皮膚、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−皮膚複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の皮膚に対する結合親和力を有する方法によって選択される、皮膚または口唇を染める方法。
【請求項５３】
ａ）ｉ）（ＮＢＰ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＮＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−Ｃ
（式中、
１）ＮＢＰは爪結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される爪着色剤を含んでなるマニキュア液組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の爪着色剤を爪に塗布する
ことを含んでなり、
ここで、爪結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを爪サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−爪複合体、
（ｉｉ）非結合爪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−爪複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−爪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−爪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の爪に対する結合親和力を有する方法によって選択される、爪を染める方法。
【請求項５４】
コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーが、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイライブラリーおよびＰｈ．Ｄ．−７ファージディスプレイライブラリーよりなる群から選択される、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関連】
【０００１】
本願明細書は、２００３年９月８日に出願された米国特許仮出願第６０／５０１４９８号および、２００４年４月１５日に出願された米国特許仮出願第６０／５６２６４５号の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、パーソナルケア製品の分野に関する。より具体的には本発明は、特異的皮膚結合、毛髪結合、および爪結合ペプチドをベースとする、皮膚質改良剤、毛髪質改良剤、毛髪着色剤、爪着色剤、および皮膚着色剤に関する。
【背景技術】
【０００３】
膜形成物質は、質改良剤および保湿剤として皮膚および毛髪ケアための組成物において広く使用され、環境および化学的損傷から皮膚および毛髪を保護する。これらの物質は、皮膚または毛髪上に吸着され、および／またはその中に吸収されて保護コーティングを形成する。一般に使用される膜形成物質としては、シリコーン、ポリビニルピロリドン、アクリル酸ポリマーなどの合成ポリマーと、多糖類と、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、カゼイン、絹および大豆タンパク質などのタンパク質とが挙げられる。多くのタンパク質は、特に効果的な膜形成剤であることが知られている。皮膚および毛髪ケア製品で使用される条件におけるそれらの低溶解性のために、タンパク質は一般にタンパク質の加水分解によって形成されるペプチドの形態で使用される。
【０００４】
毛髪ケアおよび髪染め組成物中で、膜形成物質は毛髪表面に保護膜を形成して、グルーミングおよびスタイリング、洗髪、および紫外線およびパーマ剤で一般に使用される反応性化学薬品、髪染め製品、漂白剤、および毛髪ケラチンタンパク質を変性させる毛髪ストレートナーへの曝露による損傷から保護するするために使用される。さらにこれらの膜形成物質は、毛髪の弾性を改善する。毛髪ケア製品で使用されている膜形成物質としては、ケラチン、コラーゲン、大豆および絹タンパク質などのタンパク質およびそれらの加水分解産物、そしてポリアクリレート、長鎖アルキル四級化アミン、およびシロキサンポリマーなどのポリマー材料が挙げられる。例えばカネル（Ｃａｎｎｅｌｌ）らは、特許文献１で、化学的および紫外線損傷から毛髪を処置するための毛髪ケア組成物について述べる。その組成物は、豊富なアニオン性アミノ酸、特に、イオウ含有アミノ酸、および二価のカチオンを有する加水分解タンパク質を含んでなる。その開示では、加水分解タンパク質のアニオン性構成要素が、カチオン性架橋の手段によって毛髪に結合することが提案されている。アミノ酸およびそれらの誘導体もまた、毛髪を質改良および強化するために毛髪ケア組成物で使用されている。例えば、オツール（Ｏ’Ｔｏｏｌｅ）らは特許文献２で、ヒスチジン、リジン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、およびシステイン化合物から選択される４種以上のアミノ酸化合物を含有する毛髪ケア組成物について述べている。
【０００５】
膜形成物質もまた、皮膚に保護膜を形成するために、皮膚ケア組成物で使用されている。これらの膜は皮膚に油分を与え被覆して、水分蒸発を受動的に妨げ、皮膚を滑らかにおよび軟化する役割を果たすことができる。皮膚ケア組成物で一般に使用される膜形成物質としては、加水分解された動物および植物タンパク質（プチャルスキー（Ｐｕｃｈａｌｓｋｉ）らに付与された特許文献３、エルメンショーイ（Ｅｌ−Ｍｅｎｓｈａｗｙ）らに付与された特許文献４、およびコジマ（Ｋｏｊｉｍａ）らに付与された特許文献５）、および絹タンパク質（フィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）らに付与された、特許文献６、およびファーネストック（Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ）らに付与された、同時係属中の特許文献７）が挙げられる。アミノ酸および誘導体もまた、質改良剤として皮膚ケア組成物で使用されている。例えば、コジマ（Ｋｏｊｉｍａ）らは特許文献８で、アミノ酸および／またはそれらの誘導体と、ドコサヘキサエン酸、その塩またはそのエステルとを含有する皮膚ケア組成物について述べる。
【０００６】
髪染め剤は、具体的には、恒久的、半恒久的または直接的、および一時的の３つのカテゴリーに分類されてもよい。恒久的毛髪染料は、概して約４から６週間持続する毛髪色を提供する酸化染料である。これらの酸化毛髪染料は、２つの部分からなり、１つの部分はその他の成分に加えて酸化染料を含有し、他方第２の部分は過酸化水素などの酸化剤を含有する。２つの構成要素は使用直前に混合される。酸化剤は染料前駆物質を酸化し、それは次に一緒になって毛幹内に大型着色分子を形成する。酸化毛髪染料は持続性の色を提供するが、それらが含有する酸化剤は、毛髪損傷を引き起こす。半恒久的または直接毛髪染料は、毛髪に塗布されて、約６回から１２回の洗髪の間、色を提供するあらかじめ成形された染料分子である。このタイプの毛髪染料は過酸化物を含有しないので、毛髪に対してより穏やかであるが、毛髪色は長持ちしない。ヘンセン（Ｈｅｎｓｅｎ）らが特許文献９で述べるように、粒度１０〜５００ｎｍのナノ粒子髪染め材料の使用によって、いくらかの改善された耐久性が達成されている。これらのナノ粒子髪染め材料は、ナノスケールの寸法を与えて毛髪への増大する吸収を示すように処置された従来の直接毛髪染料である。一時的毛髪染料は毛髪表面に塗布され、１回の洗髪で除去される着色剤である。毛髪を損傷する酸化剤の使用なしに、恒久的毛髪染料の耐久性を提供する毛髪着色剤を開発することが望ましいであろう。
【０００７】
現行の皮膚ケアおよび毛髪ケア組成物、非酸化的毛髪染料、ならびに爪着色剤の主要な問題は、持続性効果に要求される必要な耐久性を欠いていることである。この理由で、毛髪、皮膚または爪に対する化粧品の結合を向上させる試みがなされている。例えば、リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）らは特許文献１０で、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）らは特許文献１１で、酵素トランスグルタミナーゼを使用した毛髪、皮膚、および爪に対する、皮膚質改良剤、毛髪質改良剤、着色剤、サンスクリーン、および芳香剤などの化粧品剤の共有結合について述べる。この酵素は、化粧品剤のアミン部分を皮膚、毛髪、および爪のグルタミン残基に架橋する。同様にグリーンら（Ｇｒｅｅｎ）は、特許文献１２で化粧品剤を毛髪、皮膚、および爪に共有結合的に付着するための酵素リジンオキシダーゼの使用について述べる。
【０００８】
別のアプローチでは、化粧品剤がタンパク質またはタンパク質水解物に共有結合的に付着されている。例えばラング（Ｌａｎｇ）らは、特許文献１３で、タンパク質鎖にグラフト化された染料分子残基を含有する、動物または植物タンパク質、またはそれらの加水分解産物を含有する一時的着色組成物について述べる。これらの組成物ではタンパク質は質改良剤としての役割をし、毛髪、皮膚、または爪に対する化粧品剤の結合を向上させない。ホリコシ（Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ）らは特許文献１４で、イガラシ（Ｉｇａｒａｓｈｉ）らは特許文献１５で、染料または顔料に共有結合的に付着する抗ケラチン抗体からなる髪染め剤について述べる。抗体は毛髪に結合し、それによって毛髪に対する毛髪着色剤の結合を向上させる。同様にキザワ（Ｋｉｚａｗａ）らは特許文献１６で、毛髪表面層を認識する抗体、および毛髪処置におけるその使用について述べる。着色ラテックス粒子に共役するその抗毛髪抗体からなる毛髪着色剤についてもまた述べられる。毛髪に対する染料の結合を向上させるための抗体の使用は、髪染めの耐久性を増大させるのに効果的であるが、これらの抗体は製造が困難かつ高価である。テラダ（Ｔｅｒａｄａ）らは特許文献１７で、皮膚および毛髪ケア組成物のための染料、リガンド、および化粧品剤と共役する好ましくは抗ケラチンである一本鎖抗体からなる抱合体の使用について述べる。一本鎖抗体は遺伝工学技術を使用して調製してもよいが、それでもなおそれらは大型サイズのために調製は困難かつ高価である。フィンドレー（Ｆｉｎｄｌａｙ）は特許文献１８で、質改良剤、染料、および芳香剤のための化粧品剤に対する結合領域、および毛髪繊維表面または皮膚表面の少なくとも一部に結合する別の結合領域を含有する、β−ラクトグロブリンなどのカリシンタンパク質の使用について述べる。これらのタンパク質もまた大型であり、製造が困難かつ高価である。
【０００９】
リンター（Ｌｉｎｔｅｒ）は特許文献１９で、脂肪酸鎖にグラフト化されたペプチド、およびそれらの化粧品および皮膚医薬品用途における使用について述べる。その開示で述べられるペプチドは、コラーゲン合成を刺激することから選択され、それらは毛髪および皮膚質改良剤、および毛髪、爪、および皮膚着色剤の耐久性を向上させる特異的結合ペプチドではない。
【００１０】
１９８５年に導入されて以来、ファージディスプレイは、ペプチド、タンパク質、および薬剤標的のための小型分子をはじめとする多様なリガンドを発見するために広く使用されている（非特許文献１）。その用途は、タンパク質の折りたたみ、新しい触媒の活性、新しい特性を有するＤＮＡ結合タンパク質、および組織工学のための新しいペプチドベースの生体材料骨格の研究などのその他の分野に拡大されている（非特許文献２および非特許文献３）。非特許文献４は、無機半導体基材の異なる結晶学的形態に特異的に結合できるペプチド配列を同定するための、ファージディスプレイスクリーニングの使用を開示する。
【００１１】
ペプチドライブラリーと抗標的とを接触させて、抗標的に結合するペプチドを除去し、次に非結合ペプチドを標的に接触させることを含んでなる、修正スクリーニング法について述べられている（エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）らの特許文献２０、マレー（Ｍｕｒｒａｙ）らの特許文献２１、およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らの特許文献２２）。その方法を使用して、毛髪に結合するが皮膚に結合しない配列番号１として示されるペプチド配列、および皮膚に結合するが毛髪に結合しない配列番号２として示されるペプチド配列が同定された。、同一方法を使用してジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら特許文献２３は、その他の皮膚結合および毛髪結合ペプチド、ならびにいくつかの結合モチーフを同定した。これらの開示では、パーソナルケア用途におけるこれらのペプチドの可能な使用が提案されているが、高親和力の毛髪質改良剤、皮膚質改良剤、毛髪着色剤、爪着色剤、および皮膚着色剤を調製するための、着色剤および質改良剤に対するこれらのペプチドの共有結合については述べられていない。高親和力ファージ−ペプチドクローンを同定する方法についてもまた、これらの開示で述べられている。方法はＰＣＲを使用して、酸溶出後に標的に結合したままであるペプチドを同定することを伴う。
【００１２】
非特許文献５は、特異的ヒト組織の成分を標的にするようデザインされたペプチドファミリーが、パーソナルケア用途のために開発されたことを報告する。しかしその公報で、ペプチドベースの質改良剤または着色剤についての記述は開示されていない。
【００１３】
配列番号３として示される本発明のペプチド結合配列の１つが、いくつかのその他の目的のために報告されている。例えばハップ（Ｈｕｐｐ）らは特許文献２４で、哺乳類の細胞サイクルを調節する、または細胞死を誘導または防止するのに有用である、ｐ３００ポリペプチドに対するｐ５３ポリペプチドの結合を調節するのに使用するためのペプチドとして、ペプチド配列配列番号３を開示する。リウ（Ｌｉｕ）らは特許文献２５で、関節炎およびその他の炎症性疾患がある患者において、炎症性変化を防止または逆転するために、腫瘍壊死因子αの受容体に対する結合を阻害する同一ペプチド配列の使用について述べる。配列番号４として示される本発明別のペプチド結合配列は、ジャゴタ（Ｊａｇｏｔａ）らにより特許文献２６で、カーボンナノチューブ結合ペプチドとして報告されている。
【００１４】
上記を鑑み、持続的効果のための改善された耐久性を提供し、調製が容易で安価な毛髪および皮膚質改良剤、および毛髪、爪、および皮膚着色剤に対する必要性が存在する。
【００１５】
出願人は、毛髪、皮膚、および爪に高親和力で特異的に結合するファージディスプレイスクリーニングを使用して、ペプチド配列を同定し、それらを使用して、ペプチドベースの毛髪質改良剤、皮膚質改良剤、毛髪着色剤、爪着色剤、および皮膚着色剤をデザインすることで、既述の要求を満たした。
【００１６】
【特許文献１】米国特許第６,０１３,２５０号明細書
【特許文献２】国際公開第００５１５５６号パンフレット
【特許文献３】米国特許第４,４１６,８７３号明細書
【特許文献４】米国特許第４,４８２,５３７号明細書
【特許文献５】特開平０２３１１４１２号公報
【特許文献６】米国特許第６,２８０,７４７号明細書
【特許文献７】米国特許出願第１０／７０４３３７号明細書
【特許文献８】特開平０６０６５０４９号公報
【特許文献９】国際公開第０１０４５６５２号パンフレット
【特許文献１０】米国特許第５,４９０,９８０号明細書
【特許文献１１】米国特許第６,２６７,９５７号明細書
【特許文献１２】国際公開第０１０７００９号パンフレット
【特許文献１３】米国特許第５,１９２,３３２号明細書
【特許文献１４】特開平０８１０４６１４号公報
【特許文献１５】米国特許第５,５９７,３８６号明細書
【特許文献１６】特開平０９００３１００号公報
【特許文献１７】特開２００２３６３０２６号公報
【特許文献１８】国際公開第０００４８５５８号パンフレット
【特許文献１９】米国特許第６,６２０,４１９号明細書
【特許文献２０】国際公開第０１７９４７９号パンフレット
【特許文献２１】米国特許出願公報第２００２／００９８５２４号明細書
【特許文献２２】米国特許出願公報第２００３／０１５２９７６号明細書
【特許文献２３】国際公開第０４０４８３９９号パンフレット
【特許文献２４】国際公開第０２０６５１３４号パンフレット
【特許文献２５】米国特許第６,３４４,４４３号明細書
【特許文献２６】国際公開第０３１０２０２０号パンフレット
【非特許文献１】ディクシト（Ｄｉｘｉｔ）、Ｊ．ｏｆ  Ｓｃｉ．  ＆  Ｉｎｄ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５７：１７３〜１８３（１９９８）
【非特許文献２】ヘース（Ｈｏｅｓｓ）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０１：３２０５〜３２１８（２００１）
【非特許文献３】ホームズ（Ｈｏｌｍｅｓ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１６〜２１（２００２）
【非特許文献４】ホエーリー（Ｗｈａｌｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：６６５〜６６８（２０００）
【非特許文献５】ライヒ（Ｒｅｉｓｃｈ）、Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ  ８０：１６〜２１（２００２）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、毛髪、皮膚および爪に高親和力で結合するペプチド配列を提供する。本発明はまた、毛髪、皮膚、および爪のためのペプチドベースの質改良剤および着色剤も提供する。一実施態様では、ペプチドベースの質改良剤および着色剤は、ジブロック組成物である。
【００１８】
したがって本発明は、配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６４、６６、６９、および７０よりなる群から選択される毛髪結合ペプチドを提供する。
【００１９】
同様に本発明は、配列番号６０に記載の爪結合ペプチドを提供する。
【００２０】
別の実施態様では、本発明は、配列番号６１に記載の皮膚結合ペプチドを提供する。
【００２１】
好ましい実施態様では、本発明は、一般構造式、
（ＨＢＰ）ｎ−ＨＣＡ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＣＡは毛髪質改良剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０００の範囲である）
を有する、ジブロックのペプチドベースの毛髪質改良剤を提供する。
【００２２】
同様に本発明は、一般構造式、
（ＳＢＰ）ｎ−ＳＣＡ
（式中、
ａ）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）ＳＣＡは皮膚質改良剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０００の範囲である）
を有する、ジブロックのペプチドベースの皮膚質改良剤を提供する。
【００２３】
代案の実施態様では、本発明は、一般構造式、
（ＨＢＰ）ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有する、ジブロックのペプチドベースの毛髪着色剤を提供する。
【００２４】
別の実施態様では、本発明は、一般構造式、
（ＮＢＰ）ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＮＢＰは爪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有する、ジブロックのペプチドベースの爪着色剤を提供する。
【００２５】
別の実施態様では、本発明は、一般構造式、
（ＳＢＰ）ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、そして
ｃ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有する、ジブロックのペプチドベースの皮膚着色剤を提供する。
【００２６】
同様の実施態様では、本発明は、一般構造式、
［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−ＨＣＡ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＨＣＡは毛髪質改良剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０００の範囲である）
を有する、トリブロックのペプチドベースの毛髪質改良剤を提供する。
【００２７】
代案として、本発明は、一般構造式、
［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−ＳＣＡ
（式中、
ａ）ＳＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）ＳＣＡは皮膚質改良剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０００の範囲である）
を有する、トリブロックのペプチドベースの皮膚質改良剤を提供する。
【００２８】
同様に本発明は、一般構造式、
［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有する、トリブロックのペプチドベースの毛髪着色剤を提供する。
【００２９】
別の実施態様では、本発明は、一般構造式、
［（ＮＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＮＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有する、トリブロックのペプチドベースの爪着色剤を提供する。
【００３０】
別の実施態様は、本発明は、一般構造式、
［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ
（式中、
ａ）ＳＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
ｂ）Ｃは着色剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
ｅ）ｎは１〜約１０,０００の範囲である）
を有する、トリブロックのペプチドベースの皮膚着色剤を提供する。
【００３１】
さらに本発明は、
ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
ｂ）（ａ）のライブラリーと毛髪、皮膚、または爪サンプルとを接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−毛髪、ファージ−ペプチド−皮膚、またはファージ−ペプチド−爪複合体、
（ｉｉ）非結合毛髪、皮膚または爪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）のファージ−ペプチド−毛髪、ファージ−ペプチド−皮膚、またはファージ−ペプチド−爪複合体を単離し、
ｄ）（ｂ）のファージ−ペプチド複合体から弱結合したファージ−ペプチドを溶出し、
ｅ）ステップ（ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪、ファージ−ペプチド−皮膚、またはファージ−ペプチド−爪複合体を細菌宿主細胞に直接に感染させ、
ｆ）ステップ（ｅ）の感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、
ｇ）ステップ（ｆ）の生育した細胞から毛髪、皮膚、または爪に対する高結合親和力を有するファージ−ペプチドを単離し同定する
ことを含んでなる、高親和力毛髪、皮膚、または爪結合ペプチドを作り出す方法を提供する。
【００３２】
好ましい実施態様では、本発明は、毛髪に本発明の組成物を塗布して保護層を形成させることを含んでなる、毛髪上にペプチドベースの質改良剤の保護層を形成する方法を提供する。
【００３３】
同様に本発明は、皮膚または口唇に本発明の組成物を塗布して保護層を形成させることを含んでなる、皮膚または口唇上にペプチドベースの質改良剤の保護層を形成する方法を提供する。
【００３４】
別の実施態様では、本発明は、本発明の毛髪、眉、皮膚または爪着色組成物を毛髪、眉、皮膚または爪の着色を引き起こすのに十分な時間、毛髪、眉、皮膚または爪に塗布して、毛髪、眉、皮膚または爪を染める方法を提供する。
【００３５】
好ましい実施態様では、本発明は、
ａ）ｉ）（ＨＢＰ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−Ｃ
（式中、
１）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される毛髪着色剤を含んでなる髪染め組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の毛髪着色剤をペプチドベースの着色剤が毛髪、眉または睫毛に結合するのに十分な時間、毛髪、眉または睫毛に塗布する
ことを含んでなり、
ここで毛髪結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを毛髪サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−毛髪複合体、
（ｉｉ）非結合毛髪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−毛髪複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の毛髪に対する結合親和力を有する方法によって選択される、毛髪、眉または睫毛を染める方法を提供する。
【００３６】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）ｉ）（ＨＢＰ）ｎ−ＨＣＡおよび
ｉｉ）［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−ＨＣＡ
（式中、
１）ＨＢＰは毛髪結合ペプチドであり、
２）ＨＣＡは毛髪質改良剤であり、
３）ｎは１〜約１,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１,０００の範囲である）
よりなる群から選択される毛髪質改良剤を含んでなる毛髪ケア組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の毛髪質改良剤を毛髪に塗布して前記保護層を形成させる
ことを含んでなり、
ここで、毛髪結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを毛髪サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−毛髪複合体、
（ｉｉ）非結合毛髪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−毛髪複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−毛髪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し、残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の毛髪に対する結合親和力を有する方法によって選択される、ペプチドベースの質改良剤の保護層を毛髪上に形成する方法を提供する。
【００３７】
代案として、本発明は、
ａ）ｉ）（ＳＢＰ）ｎ−ＳＣＡ、および
ｉｉ）［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−ＳＣＡ
（式中、
１）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
２）ＳＣＡは皮膚質改良剤であり、
３）ｎは１〜約１,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１,０００の範囲である）
よりなる群から選択される皮膚質改良剤を含んでなる、皮膚ケア組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の皮膚質改良剤を皮膚または口唇に塗布して前記保護層を形成させる
ことを含んでなり、
ここで、皮膚結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを皮膚サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−皮膚複合体、
（ｉｉ）非結合皮膚、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−皮膚複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し、残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の皮膚に対する結合親和力を有する方法によって選択される、保護層を皮膚または口唇上に形成する方法を提供する。
【００３８】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）ｉ）（ＳＢＰ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−Ｃ
（式中、
１）ＳＢＰは皮膚結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される皮膚着色剤を含んでなる化粧品組成物を提供し、そして
ｂ）（ａ）の皮膚着色剤を皮膚または口唇に塗布する
ことを含んでなり、
ここで、皮膚結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを皮膚サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−皮膚複合体、
（ｉｉ）非結合皮膚、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−皮膚複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−皮膚複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し、残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の皮膚に対する結合親和力を有する方法によって選択される、皮膚または口唇を染める方法を提供する。
【００３９】
代案として、本発明は、
ａ）ｉ）（ＮＢＰ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＮＢＰ）ｍ−Ｓ］ｋ−Ｃ
（式中、
１）ＮＢＰは爪結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約５０の範囲であり、そして
６）ｋは１〜約１０,０００の範囲である）
よりなる群から選択される爪着色剤を含んでなる、マニキュア液を提供し、そして、
ｂ）（ａ）の爪着色剤を爪に塗布する
ことを含んでなり、
ここで爪結合ペプチドが、
Ａ）コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを提供し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを爪サンプルと接触させて、
（ｉ）ファージ−ペプチド−爪複合体、
（ｉｉ）非結合爪、および
（ｉｉｉ）非複合ペプチド
を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のファージ−ペプチド−爪複合体を単離し、
Ｄ）（Ｂ）のペプチド複合体から弱結合したペプチドを溶出し、
Ｅ）ステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−爪複合体にポリメラーゼ連鎖反応を直接使用することによって、あるいはステップ（Ｄ）後に残存するファージ−ペプチド−爪複合体を細菌宿主細胞に直接感染させて、感染した細胞を適切な生育培地中で生育させ、生育した細胞からファージ−ペプチドを単離し同定することによって残存する結合したファージ−ペプチドを同定する
ことを含んでなり、
ここで、ファージ−ペプチドが約７〜約２５個のアミノ酸であり、ＭＢ５０として測定すると１０−５Ｍ以下の爪に対する結合親和力を有する方法によって選択される、爪を染める方法を提供する。
【００４０】
配列の簡単な説明
本願明細書の部分を形成する以下の詳細な説明、図、および添付の配列説明から、本発明をより完全に理解できる。
【００４１】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ  −  ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００４２】
配列番号１は、毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号２は、皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号３〜５２、５４〜５９は、本発明の毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号５３は、本発明の毛髪結合および爪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号６０は、本発明の爪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号６１は、本発明の皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号６２は、ファージＤＮＡを配列決定するのに使用されるオリゴヌクレオチドである。
【００４９】
配列番号６３は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイにおいて対照として使用されるペプチドのアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号６４は、システイン付加毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号６５は、カスパーゼ３開裂部位のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号６６、６９、および７０は、洗髪抵抗性毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５３】
配列番号６７および６８は、実施例８で述べる、洗髪抵抗性、毛髪結合ファージペプチドを増幅するのに使用されるプライマーのヌクレオチド配列である。
【００５４】
配列番号７１〜７４は、実施例９で使用されるビオチニル化毛髪結合および皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号７５は、実施例１６で使用される完全に保護されたＤ２１ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号７６〜９８は、毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号９９〜１０４は、皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本発明は、高親和力でヒト毛髪、皮膚、および爪に特異的に結合するペプチド配列を提供する。さらに本発明は、改善された耐久性を有するペプチドベースの毛髪および皮膚質改良剤、および毛髪、爪、および皮膚着色剤を提供する。
【００５９】
ここでは以下の定義が使用され、請求項および明細書の解釈のために参照されるべきである。
【００６０】
「ＨＢＰ」は毛髪結合ペプチドを意味する。
【００６１】
「ＳＢＰ」は皮膚結合ペプチドを意味する。
【００６２】
「ＮＢＰ」は爪結合ペプチドを意味する。
【００６３】
「ＨＣＡ」は毛髪質改良剤を意味する。
【００６４】
「ＳＣＡ」は皮膚質改良剤を意味する。
【００６５】
「Ｃ」は毛髪、皮膚、または爪着色剤を意味する。
【００６６】
「Ｓ」はスペーサーを意味する。
【００６７】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によって互いにつながった２つ以上のアミノ酸を指す。
【００６８】
「毛髪」という用語は、ここでの用法ではヒト毛髪、眉、および睫毛を指す。
【００６９】
「皮膚」という用語は、ここでの用法ではヒト皮膚、またはブタ皮膚、ヒト皮膚代替物であるビトロ−スキン（Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ）（登録商標）およびエピダーム（ＥｐｉＤｅｒｍ）ＴＭを指す。
【００７０】
「爪」という用語は、ここでの用法では、ヒトの手指爪および足指爪を指す。
【００７１】
「ストリンジェンシー」という用語は、本発明の毛髪結合、皮膚結合、および爪結合ペプチドの選択について用いられる場合、毛髪、皮膚、または爪からペプチドを溶出するのに使用される溶出剤（通常洗剤）濃度を指す。より高い溶出剤濃度は、よりストリンジェントな条件を提供する。
【００７２】
「ペプチド−毛髪複合体」という用語は、ペプチド上の結合部位を通じて毛髪繊維に結合するペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００７３】
「ペプチド−皮膚複合体」という用語は、ペプチド上の結合部位を通じて皮膚に結合するペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００７４】
「ペプチド−爪複合体」という用語は、ペプチド上の結合部位を通じて手指爪または足指爪結に結合するペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００７５】
「ペプチド−基質複合体」という用語は、ペプチド−毛髪、ペプチド−皮膚、またはペプチド−爪複合体のいずれかを指す。
【００７６】
「ＭＢ５０」という用語は、実施例９で述べられるように、ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイで得られる最大シグナルの５０％のシグナルを与える結合ペプチドの濃度を指す。ＭＢ５０は、複合体構成要素の結合相互作用または親和力の強度の指標を提供する。ＭＢ５０の値が低いほど、ペプチドとその対応する基質との相互作用はより強力である。
【００７７】
「結合親和力」という用語は、結合すペプチドとそれぞれの基質との相互作用の強度を指す。結合親和力はここではＭＢ５０値で定義され、ＥＬＩＳＡベースの結合アッセイで判定される。
【００７８】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的化学構造単位を指す。具体的なアミノ酸を同定するのに、ここでは以下の略語が使用される。
【００７９】
【表１】
2007505132.tif 000002
【００８０】
「遺伝子」は、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびその後ろの制御配列（３’非コード配列）を含めた特定のタンパクを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」は、それ自体の制御配列を有して自然界に見いだされる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「外来性」遺伝子は、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでなることができる。
【００８１】
「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成してもよい。ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、構成要素ヌクレオチドが生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アセンブルされたことを意味する。ＤＮＡの手動化学合成は確立した手順を使用して達成されても良く、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。したがってヌクレオチド配列の最適化に基づいて、遺伝子を最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みの真価を認める。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づくことができる。
【００８２】
「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【００８３】
「プロモーター」は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってさえよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００８４】
「発現」という用語は、ここでの用法では、発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【００８５】
「形質転換」という用語は、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体ゲノム中への核酸断片の転移を指す。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物体と称される。
【００８６】
「宿主細胞」という用語は、外来性ポリヌクレオチド配列によって、形質転換または形質移入されている、または形質転換または形質移入が可能な細胞を指す。
【００８７】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外因子を指す。このような因子は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。
【００８８】
「ファージ」または「バクテリオファージ」という用語は、細菌に感染するウィルスを指す。本発明の目的では改変形態を使用してもよい。好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３と称される「野生型」ファージから誘導される。Ｍ１３システムは細菌中で生育できるので、感染した細胞を破壊せず、新しいファージを連続的に作らせる。これは一本鎖ＤＮＡファージである。
【００８９】
「ファージディスプレイ」という用語は、バクテリオファージまたはファージミド粒子表面の機能性外来性ペプチドまたは小型タンパク質のディスプレイを指す。遺伝子改変ファージを使用して、ペプチドをそれらの未変性表面タンパク質のセグメントとして提示してもよい。ペプチドライブラリーは、異なる遺伝子配列を有するファージ集団によって生成してもよい。
【００９０】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特異的ＤＮＡセグメントの増幅のために使用される技術である（米国特許第４,６８３,１９５号明細書および米国特許第４,８００,１５９号明細書）。
【００９１】
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（ＮＹ）（１９８９）（以下、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；およびシルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）Ｍ．Ｌ．およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）Ｌ．Ｗ．「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｌｄ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７）で述べられている。
【００９２】
本発明は、特異的毛髪結合、皮膚結合、および爪結合ペプチド、および毛髪、皮膚、および爪用質改良剤および着色剤のためのそれらの使用を含んでなる。
【００９３】
毛髪、皮膚、および爪
ヒト毛髪サンプルは、異なる色、などの褐色、黒、赤、およびブロンドで、そしてアフリカ系アメリカ人、白人、およびアジア系などの様々なタイプで、例えばニューヨーク州ベルロースのインターナショナル・ヘア・インポーツ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ、ＮＹ））から市販される。さらに毛髪サンプルを例えば過酸化水素を使用して処置して、漂白された毛髪を得てもよい。精肉店およびスーパーから入手できるブタ皮膚、コネチカット州ミルフォードのＩＭＳ（ＩＭＳ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ））から入手できるビトロ−スキン（Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ）（登録商標）、およびマサチューセッツ州アッシュランドのマットテック（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．（Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ））から入手できるエピダーム（ＥｐｉＤｅｒｍ）ＴＭは、良好なヒト皮膚代替物である。ヒト手指爪および足指爪はボランティアから得らてもよい。
【００９４】
毛髪結合、皮膚結合、および爪結合ペプチド
ここで定義される毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）、皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）、および爪結合ペプチド（ＮＢＰ）は、高親和力でそれぞれ毛髪、皮膚および爪と特異的に結合するペプチド配列である。本発明の毛髪結合、皮膚結合、および爪結合ペプチドは、約７個のアミノ酸〜約４５個のアミノ酸、より好ましくは約７個のアミノ酸〜約２０個のアミノ酸、最も好ましくは約７個〜約１２個のアミノ酸である。本発明の結合ペプチドは、ＭＢ５０値として測定すると、約１０−２Ｍ以下、約１０−３Ｍ以下、約１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、好ましくは約１０−６Ｍ以下、およびより好ましくは約１０−７Ｍ以下で、それぞれの基質に対する結合親和力を有する。
【００９５】
適切な毛髪結合、皮膚結合、および爪結合ペプチド配列は、技術分野でよく知られている方法を使用して選択してもよい。本発明のペプチドは無作為に作り出され、次に関心のある基質に対するそれらの結合親和力基づいて、特定の毛髪、皮膚、または爪サンプルに対して選択される。ペプチドのランダムライブラリーの作成についてはよく知られており、細菌ディスプレイ（ケンプ（Ｋｅｍｐ），Ｄ．Ｊ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８（７）：４５２０〜４５２４（１９８１）、およびへルマン（Ｈｅｌｆｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０（１）：３１〜３５、（１９８３））、酵母ディスプレイ（チェン（Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８８（２１）：９５７８〜８２（１９９１））、コンビナトリアル固相ペプチド合成（米国特許第５,４４９,７５４号明細書、米国特許第５,４８０,９７１号明細書、米国特許第５,５８５,２７５号明細書、米国特許第５,６３９,６０３号明細書）、およびファージディスプレイ技術（米国特許第５,２２３,４０９号明細書、米国特許第５,４０３,４８４号明細書、米国特許第５,５７１,６９８号明細書、米国特許第５,８３７,５００号明細書）をはじめとする多様な技術によって達成されてもよい。このような生物学的ペプチドライブラリーを作り出す技術については、ダニ（Ｄａｎｉ），Ｍ．、Ｊ．ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ＆Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．、２１（４）：４４７〜４６８（２００１）で述べられる。
【００９６】
ペプチドを無作為に作り出す好ましい方法は、ファージディスプレイによる。ファージディスプレイは、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択技術であり、その中ではペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージの外被タンパク質に遺伝的に融合して、ファージビリオンの外面に融合ペプチドのディスプレイをもたらす一方、融合をコードするＤＮＡはビリオン中に存在する。ディスプレイされるペプチドとそれをコードするＤＮＡの間のこの物理的結合により、「バイオパニング」と称される単純な生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）選択手順によって、それぞれが対応するＤＮＡ配列に結合する膨大な数のペプチドの変異体のスクリーニングができるようになる。その最も単純な形態では、バイオパニングは、ファージディスプレイされた変異体のプールをプレートまたはビーズ上に固定化されている関心のある標的と共にインキュベートして、非結合ファージを洗い流し、ファージと標的間の結合相互作用を中断して特異的に結合したファージを溶出して実施される。次に溶出されたファージを生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で増幅し、プロセスを反復してファージプールの段階的な濃縮をもたらし、最も堅固な結合配列が選択される。３回以上の選択／増幅後、個々のクローンがＤＮＡ配列決定によって特性判定される。
【００９７】
適切なペプチドライブラリーを作り出した後、それらを次に適量の試験基質、具体的は毛髪、皮膚、または爪サンプルと接触させる。溶液中に懸濁しながら、試験基質をペプチドライブラリーに提示する。好ましい溶液は、界面活性剤を含有する緩衝生理食塩水溶液である。適切な溶液は、０．５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０添加トリス−緩衝食塩水（ＴＢＳ）である。毛髪、皮膚、または爪表面へのペプチドの質量移動速度を増大させて、最大結合を得るための所要時間を短縮するために、溶液をあらゆる手段でさらに撹拌してもよい。
【００９８】
接触するといくつかの無作為に作り出されたペプチドは、毛髪、皮膚、または爪基質に結合して、ペプチド−毛髪、ペプチド−皮膚またはペプチド−爪複合体を形成する。洗浄によって非結合ペプチドを除去してもよい。全ての非結合材料を除去した後、様々なストリンジェンシーを有する緩衝液中での選択的洗浄によって、試験基質に対する様々な程度の結合親和性を有するペプチドを分画してもよい。使用する緩衝液のストリンジェンシーを増大させると、ペプチド−基質複合体中のペプチドと基質の間の結合の必要強度が増大する。
【００９９】
酸性ｐＨ（１．５〜３．０）、塩基性ｐＨ（１０〜１２．５）、ＭｇＣｌ２（３〜５Ｍ）およびＬｉＣｌ（５〜１０Ｍ）などの高い塩濃度、水、エチレングリコール（２５〜５０％）、ジオキサン（５〜２０％）、チオシアネート（１〜５Ｍ）、グアニジン（２〜５Ｍ）、尿素（２〜８Ｍ）、そしてＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０などの様々な濃度の異なる界面活性剤をはじめとするが、これに限定されるものではないいくつかの物質を使用して、ペプチド選択における緩衝液溶液のストリンジェンシーを変化させてもよく、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０が好ましい。これらの物質は、トリス−ＨＣｌ、トリス−緩衝食塩水、トリス−ホウ酸、トリス−酢酸、トリエチルアミン、リン酸緩衝液、およびグリシン−ＨＣｌをはじめとするが、これに限定されるものではない緩衝液溶液中で調製されてもよく、トリス−緩衝食塩水溶液が好ましい。
【０１００】
毛髪、皮膚または爪基質に対する増大する結合親和性を有するペプチドは、ストリンジェンシーが増大する緩衝液を使用して、選択プロセスの反復によって溶出してもよいことが理解されるであろう。溶出されたペプチドは、技術分野で知られているあらゆる手段によって同定および配列決定できる。
【０１０１】
したがって本発明の毛髪結合ペプチド、皮膚結合ペプチド、または爪結合ペプチドを作り出すため以下の方法を使用した。コンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを具体的には毛髪、皮膚、または爪サンプルである、関心のある基質と接触させ、ファージ−ペプチド−毛髪、ファージ−ペプチド−皮膚、またはファージ−ペプチド−爪複合体を形成する。ファージ−ペプチド−基質複合体を非複合ペプチドおよび非結合基質から分離し、結合したファージ−ペプチドをファージ−ペプチド−基質複合体から好ましくは酸処置によって溶出する。次に溶出したペプチドを同定および配列決定する。例えば髪に結合するが皮膚には結合しないペプチド、または皮膚に結合するが毛髪には結合しないペプチドのように、１つの基質に結合するが別のものには結合しないペプチド配列を同定するために、サブトラクティブパニングステップを追加する。具体的にはコンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを最初に非標的と接触させて、それに結合するファージ−ペプチドを除去する。次に非結合ファージ−ペプチドを所望の基質と接触させて、上のプロセスに従う。代案としてコンビナトリアルで作り出されたファージ−ペプチドのライブラリーを非標的および所望の基質と同時に接触させてもよい。次にファージ−ペプチド−基質複合体をファージ−ペプチド−非標的複合体から分離し、所望のファージ−ペプチド−基質複合体のために上述の方法に従う。
【０１０２】
本発明の一実施態様は、毛髪、皮膚、または爪に対するより高い親和力有するペプチドを単離するための修正ファージディスプレイスクリーニング法を提供する。修正された方法では、ファージ−ペプチド−基質複合体が上述のように形成される。次にこれらの複合体を溶出緩衝液で処置する。上述の溶出緩衝液のどれでも使用してよい。好ましくは溶出緩衝液は酸性溶液である。次に残存する、溶出抵抗性ファージ−ペプチド−基質複合体を直接使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８などの細菌宿主細胞に感染させる。感染した宿主細胞をＬＢ（ルリア−ベルタニ）媒体などの適切な生育培地で生育させ、この培養物をＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）およびＳ−ＧａｌＴＭ添加ＬＢ培地などの適切な生育培地を含有する寒天上に広げる。生育後、プラークをＤＮＡ単離および配列決定のために採取して、毛髪、皮膚、または爪基質に対する高結合親和力を有するペプチド配列を同定する。
【０１０３】
別の実施態様では、参照によって本書に援用されるジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らに付与された米国特許出願公報第２００３／０１５２９７６号で述べられるように、適切なプライマーを使用してファージ−ペプチド−基質複合体にＰＣＲを直接実施することにより、上述の修正ファージディスプレイスクリーニング法からＰＣＲを使用して、溶出抵抗性ファージ−ペプチドを同定してもよい。
【０１０４】
上の方法を使用して、毛髪結合、皮膚結合、および爪結合ペプチドが同定されている。具体的には配列番号３〜１８、２８〜３８、４０〜５６、および６４として示される標準的褐色毛髪に対する高親和力を有する結合ペプチド、配列番号６６、６９および７０として示される洗髪抵抗性で標準的褐色毛髪に対する高親和力を有する結合ペプチド、配列番号７、８、１９〜２７、３８〜４０、４３、４４、４７、５７、５８、および５９として示される漂白毛髪に対する高親和力を有する結合ペプチド、配列番号５３および６０として示される手指爪に対する高親和力を有する結合ペプチド、および配列番号６１として示される皮膚に対する高親和力を有する結合ペプチドが単離された。さらに手指爪結合ペプチドは漂白毛髪に結合し、本発明のペプチドベースの毛髪質改良剤および毛髪着色剤中で使用してもよいことが分かった。漂白毛髪結合ペプチドは手指爪に結合し、本発明のペプチドベースの爪着色剤中で使用してもよい。
【０１０５】
結合ペプチドの製造
本発明の結合ペプチドは、技術分野でよく知られている標準ペプチド合成法を使用して調製されてもよい（例えばスチュアート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら「固体相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ）、１９８４；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）「ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８４；およびペニングトン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら「ペプチド合成プロトコル（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、１９９４を参照されたい）。さらに多くの会社が、カスタムペプチド合成サービスを提供している。
【０１０６】
代案としては、本発明のペプチドは、組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して調製されてもよい。毛髪結合、皮膚結合または爪結合ペプチドをコードする遺伝子は、異種の宿主細胞中、特に微生物の宿主細胞中で生成されてもよい。
【０１０７】
本発明の結合ペプチドの発現に好ましい異種の宿主細胞は、菌・カビまたは細菌ファミリー内に広く存在して、広範な温度、ｐＨ値、および溶剤耐性で生育する微生物宿主である。転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は、細胞原材料とは無関係に同一であるので、細胞生物体量を作り出すのに使用される炭素原材料とは無関係に、機能性遺伝子が発現される。宿主の例としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの菌・カビ性または酵母菌種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ），チオバシラス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
多様な発現システムを使用して、本発明のペプチドを生成できる。このようなベクターとしては、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、挿入要素由来、酵母エピソーム由来、バキュロウイルスやレトロウィルスなどのウィルス由来のベクターなどの染色体、エピソーム、およびウィルス−由来ベクター、およびコスミドおよびファージミドなどのプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなどのそれらの組み合わせに由来するベクターが挙げられるが、これに限定されるものではない。発現システムコンストラクトは、発現を調節し、ならびに引き起こす調節領域を含有してもよい。一般に、宿主細胞中でポリヌクレオチドまたはポリペプチドを維持、増殖または発現するのに適した、あらゆるシステムまたはベクターをこの関連で発現に使用してもよい。微生物の発現システムおよび発現ベクターは、宿主細胞の生育に比べて外来性タンパク質の高レベル発現を導く制御配列を含有する。制御配列は当業者によく知られており、例としては、例えば転写促進因子配列などのベクター中の調節要素の存在をはじめとする化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子発現をスイッチオンまたはオフするものが挙げられるが、これに限定されるものではない。これらのいずれでも、キメラ遺伝子を構築して本発明のあらゆる結合ペプチドを生成するのに使用できる。次に形質転換を通じて、これらのキメラ遺伝子を適切な微生物中に導入して、ペプチドの高レベル発現を提供できる。
【０１０９】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットについては、技術分野でよく知られている。典型的にベクターまたはカセットは、当該遺伝子の転写および翻訳を導く配列、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカー、および自律性の複製または染色体の組み込みができるようにする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を宿す遺伝子の５'領域、および転写終了を制御するＤＮＡ断片の３'領域を含んでなる。双方の制御領域が形質転換宿主細胞の同族遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は必ずしも産生宿主として選択された特定の種に天然の遺伝子から誘導されなくてよいものと理解される。選択可能なマーカー遺伝子は、形質転換宿主細胞の選択のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン抵抗性などの表現型形質を提供する。
【０１１０】
所望の宿主細胞においてキメラ遺伝子の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみ深い。事実上、遺伝子を駆動できるあらゆるプロモーターが、以下をはじめとするが、これに限定されるものではない、本発明の結合ペプチドを生成するのに適している。ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）、およびｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）、ならびにバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーター。
【０１１１】
終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終了部位は不必要かもしれないが、含まれれば最も好ましい。
【０１１２】
上述のような適切なＤＮＡ配列を含有するベクター、ならびに適切なプロモーターまたは制御配列を用いて、宿主が本発明のペプチドを発現するように、適切な宿主を形質転換してもよい。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを使用して、このようなペプチドを生成するのに、細胞フリーの翻訳システムもまた用いることができる。場合により、形質転換された宿主の分泌生成物として、本遺伝子産物を生成することが所望されるかもしれない。生育培地中への所望のタンパク質の分泌は、簡易化されたより安価な精製手順という利点を有する。分泌シグナル配列は、細胞膜を超えた発現できるタンパク質の能動輸送を促進するのに有用であることが多いことが、技術分野ではよく知られている。分泌できる形質転換された宿主の創造は、産生宿主において機能性である分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列の組み込みによって達成されてもよい。適切なシグナル配列を選択する方法は、技術分野でよく知られている（例えばＥＰ  ５４６０４９号明細書および国際公開第９３２４６３１号パンフレットを参照されたい）。分泌シグナルＤＮＡまたは促進要素は、発現−制御ＤＮＡと本遺伝子または遺伝子断片の間、および後者の同一読み枠内に位置してもよい。
【０１１３】
ペプチドベースの毛髪質改良剤
本発明のペプチドベースの毛髪質改良剤は、毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）と毛髪質改良剤（ＨＣＡ）とをカップリングさせて形成される。質改良剤の毛髪結合ペプチド部分は毛髪に強力に結合するので、持続的質改良剤効果のために質改良剤を毛髪に付着させたままにする。毛髪結合ペプチドとしては、配列番号３〜５９、６４、６６、６９、および７０によって示される本発明の毛髪結合ペプチド配列をはじめとする上述のスクリーニング法によって選択される毛髪結合ペプチド、最も好ましくは毛髪に強力に結合するが皮膚には結合しない、配列番号４６および配列番号６６によって示されるペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにどちらも参照によって本書に援用されるジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らに付与された米国特許出願公報第２００３／０１５２９７６号、およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らの国際公開第０４０４８３９９号パンフレットでそれぞれ述べられる、配列番号１、および配列番号７６〜９８をはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆる既知の毛髪結合ペプチドを使用してもよい。漂白毛髪のためには、配列番号６０として示される手指爪結合ペプチドもまた使用してよい。
【０１１４】
ここでの定義では毛髪質改良剤は、毛髪の外見、手触り、および光沢を改善し、ならびに毛髪のボディまたはしなやかさを増大する作用薬である。本発明のペプチドベースの毛髪質改良剤では、あらゆる既知の毛髪質改良剤を使用してもよい。毛髪質改良剤は技術分野でよく知られており、様々な供給元から市販される。例えば参照によって本書に援用されるグリーン（Ｇｒｅｅｎ）らの国際公開第０１０７００９号パンフレットを参照されたい。毛髪質改良剤の適切な例としては、カチオン化グアーガム、ジアリル四級アンモニウム塩／アクリルアミド共重合体、四級化ポリビニルピロリドンおよびそれらの誘導体、および様々なポリクオタニウム−化合物などのカチオン性ポリマーと、塩化ステアラルコニウム、塩化セントリモニウム、およびサパミン塩酸塩などのカチオン性界面活性剤と、ベヘニルアルコールなどの脂肪アルコールと、ステアリルアミンなどの脂肪アミンと、ワックスと、エステルと、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、およびポリエチレングリコールなどの非イオン性ポリマーと、シリコーンと、デカメチルシクロペンタシロキサンなどのシロキサンと、アモジメチコンなどのポリマーエマルジョンと、例えばキトサンなどのボリューム付与剤が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい毛髪質改良剤は、下で述べるようにアミンまたはヒドロキシル官能基を含有して、毛髪結合ペプチドへのカップリングを容易にする。好ましい質改良剤の例は、オクチルアミン（ＣＡＳ１１１−８６−４号）、ステアリルアミン（ＣＡＳ１２４−３０−１号）、オハイオ州シンチナチのコグニス（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ））からのベヘニルアルコール（ＣＡＳ６６１−１９−８号）、ビニル基で終結するシロキサン、ビニル基で終結するシリコーン（ＣＡＳ６８０８３−１９−２号）、ビニル基で終結するメチルビニルシロキサン、ビニル基で終結するメチルビニルシリコーン（ＣＡＳ６８９５１−９９−５号）、ヒドロキシルで終結するシロキサン、ヒドロキシルで終結するシリコーン（ＣＡＳ８０８０１−３０−５号）、アミノ変性シリコーン誘導体、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシロキサン、［（アミノエチル）アミノ］プロピルヒドロキシルジメチルシリコーン、およびα−トリデシル−ω−ヒドロキシ−ポリ（オキシ−１,２−エタンジイル）（ＣＡＳ２４９３８−９１−８号）である。
【０１１５】
本発明のペプチドベースの毛髪質改良剤は、特異的毛髪結合ペプチドを直接、またはスペーサーを介して毛髪質改良剤に共有結合的に付着させて調製される。あらゆる既知のペプチドまたはタンパク質抱合体化学を使用して、本発明のペプチドベースの毛髪質改良剤を形成してもよい。抱合体化学は技術分野でよく知られている（例えばハマーソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、「生物抱合体技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）参照）。適切なカップリング剤としては、カルボジイミドカップリング剤、ペプチド上の末端アミンおよび／またはカルボン酸末端基と、そして毛髪質改良剤上のアミン、カルボン酸、またはアルコール基と反応性の二酸塩化物、ジイソシアネート、およびその他の二官能性カップリング試薬が挙げられるが、これに限定されるものではない。好ましいカップリング剤は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ,Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）などのカルボジイミドカップリング剤であり、アルコール、およびアミン基へのカップリングの他めにカルボン酸基を活性化するのに使用してもよい。さらにペプチド上の反応性アミンまたはカルボン酸基を保護して、ペプチドベースの毛髪質改良剤のための所望の構造を作り出すことが必要かもしれない。ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）などのアミノ酸のための保護基の使用については、技術分野でよく知られている（例えばスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら（上述）、ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）（上述）、およびペニングトン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら（上述）を参照されたい）。場合によっては、毛髪結合ペプチドへのカップリングのために、毛髪質改良剤上に、カルボン酸、アルコール、アミン、またはアルデヒド基などの反応性基を導入することが必要かもしれない。これらの修飾は、技術分野でよく知られている酸化、還元などの日常的化学反応を使用して行ってもよい。
【０１１６】
スペーサーを介して毛髪結合ペプチドと毛髪質改良剤を結合することもまた望ましかもしれない。スペーサーは、作用薬がペプチドと毛髪との結合を妨げないことを確実にするために、質改良剤をペプチドから隔てる役割をする。スペーサーは、アルキル鎖、フェニル化合物、エチレングリコール、アミド、エステルなどの多様な分子のいずれであってもよい。好ましいスペーサーは親水性であり、１〜約１００個の原子、より好ましくは２〜約３０個の原子の鎖長を有する。好ましいスペーサーの例としては、エタノールアミン、エチレングリコール、鎖長炭素原子６個のポリエチレン、３〜６個の反復単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、およびエチル、プロピル、ヘキシル、ステリル、セチル、およびパルミトイルアルキル鎖が挙げられるが、これに限定されるものではない。スペーサーは、上述のいずれかのカップリング化学反応を使用して、ペプチドおよび毛髪質改良剤に共有結合的に付着させてもよい。スペーサーの組み込みを容易にするために、ペプチドおよび質改良剤へのカップリングのためのスペーサーおよび反応性基を両端に含有する二官能性架橋剤を使用してもよい。適切な二官能性架橋剤は技術分野でよく知られており、１,６−ジアミノヘキサンなどのジアミンと、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドと、エチレングリコール−ビス（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ジスクシンイミジルグルタラート、ジスクシンイミジルスベラート、およびエチレングリコール−ビス（スクシンイミジルスクシナート）などのビスＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと、ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイソシアネートと、１,４ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシランと、スクシニルジサリチレートなどのジカルボン酸などが挙げられるが、これに限定されるものではない。各末端に異なる反応性基を含有するヘテロ二官能性架橋剤もまた使用してよい。ヘテロ二官能性架橋剤の例としては、
【０１１７】
【化１】
2007505132.tif 000003
【０１１８】
（式中、
Ｒ１はＨ、または−ＳＯ３Ｎａ、−ＮＯ２、または−Ｂｒなどの置換基基であり、Ｒ２は−ＣＨ２ＣＨ２（エチル）、−（ＣＨ２）３（プロピル）、または−（ＣＨ２）３Ｃ６Ｈ５（プロピルフェニル）などのスペーサーである）の構造を有する化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。このようなヘテロ二官能性架橋剤の例は、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。これらの試薬のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基は、質改良剤上のアミンまたはアルコール基と反応するのに対し、マレイミド基はペプチド上に存在するチオール基と反応する。チオール基は、結合ペプチド配列の少なくとも１端にシステイン基を付加して、ペプチドに組み込んでもよい。グリシンなどのいくつかのスペーサーアミノ酸残基を結合ペプチド配列と末端システインの間に組み込んで、反応するチオール基を結合配列から隔ててもよい。
【０１１９】
さらにスペーサーは、あらゆるアミノ酸およびそれらの混合物から構成されるペプチドであってもよい。好ましいペプチドスペーサーは、アミノ酸グリシン、アラニン、およびセリン、およびそれらの混合物から構成される。さらにペプチドスペーサーは、配列番号６５によって示される、プロテアーゼカスパーゼ３部位などの特異的酵素開裂部位を含有してもよく、それは毛髪からの質改良剤の酵素的除去を可能にする。ペプチドスペーサーは、１〜約５０個のアミノ酸であってもよく、好ましくは１〜約２０個のアミノ酸である。これらのペプチドスペーサーは、技術分野で既知のあらゆる方法によって、結合ペプチド配列に結合させてもよい。例えば上述の標準ペプチド合成法を使用して、結合ペプチド−ペプチドスペーサージブロックの全体を調製してもよい。さらに結合ペプチドおよびペプチドスペーサーブロックは、カルボジイミドカップリング剤（例えばハマーソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、生物抱合体技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９６）を参照されたい）、およびペプチド上の末端アミンおよび／またはカルボン酸末端基と反応性の二酸塩化物、ジイソシアネート、およびその他の二官能性カップリング試薬を使用して組み合わせてもよい。代案として上述の組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を使用して、結合ペプチド−ペプチドスペーサージブロック全体を調製してもよい。スペーサーはまた、上述の方法を使用して調製されてもよい、ペプチドスペーサーおよび有機スペーサー分子の組み合わせであってもよい。
【０１２０】
複数の毛髪結合ペプチドを毛髪質改良剤に付着させて、ペプチドベースの毛髪質改良剤と毛髪の間の相互作用を向上させることもまた、望ましいかもしれない。同一毛髪結合ペプチドの多重コピー、または異なる毛髪結合ペプチドの組み合わせのどちらかを使用してもよい。大型質改良剤粒子の場合（例えば粒子エマルジョン）、多数、すなわち約１,０００個までの毛髪結合ペプチドが質改良剤に付着していてもよい。より小型の質改良剤分子には、より少数、すなわち約５０個までの毛髪結合ペプチドが付着できる。したがって本発明の一実施態様では、ペプチドベースの毛髪質改良剤は、一般構造式、（ＨＢＰ）ｎ−ＨＣＡ（式中、ｎは１〜約１,０００、好ましくは１〜約５０の範囲である）を有する、毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）および毛髪質改良剤（ＨＣＡ）からなるジブロック組成物である。
【０１２１】
別の実施態様では、ペプチドベースの毛髪質改良剤は、上述のように毛髪結合ペプチドを毛髪質改良剤から隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。毛髪結合ペプチドの多重コピーが、単一スペーサー分子に付着していてもよい。この実施態様では、ペプチドベースの毛髪質改良剤は、一般構造式、［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−ＨＣＡ（式中、ｎは１〜約１,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５０であり、ｍは１〜約５０の範囲であり、好ましくはｍは１〜約１０である）を有する、毛髪結合ペプチド、スペーサー、および毛髪質改良剤からなるトリブロック組成物である。
【０１２２】
本発明のペプチドベースの毛髪質改良剤を毛髪ケアのための組成物中で使用してもよい。毛髪結合ペプチドそれ自体が、毛髪の処置のための質改良剤としての役割を果たすことができることもまた認識される。毛髪ケア組成物はここでは、シャンプー、質改良剤、ローション、エアロゾル、ゲル、ムース、および化粧用に許容可能な媒体中に、有効量のペプチドベースの毛髪質改良剤または異なるペプチドベースの毛髪質改良剤の混合物を含んでなる毛髪染料をはじめとするが、これに限定されるものではない、毛髪処置のための組成物として定義される。毛髪ケア組成物で使用するためのペプチドベースの毛髪質改良剤または毛髪結合ペプチドの有効量は、ここでは、組成物総重量に対して約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５重量％の比率として定義される。毛髪ケア組成物のための化粧用に許容可能な媒体の構成要素については、全て参照によって本書に援用されるフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）らに付与された米国特許第６,２８０,７４７号明細書、およびオムラ（Ｏｍｕｒａ）らに付与された米国特許第６,１３９,８５１号明細書、およびカネル（Ｃａｎｎｅｌｌ）らに付与された米国特許第６,０１３,２５０号明細書で述べられる。例えばこれらの毛髪ケア組成物は、水性、アルコール性または水性−アルコール性溶液であることができ、アルコールは好ましくは水性−アルコール性溶液総重量に対して約１〜約７５重量％の比率のエタノールまたはイソプロパノールである。さらにヘアケア組成物は、抗酸化剤、保存料、充填材、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢサンスクリーン、香料、増粘剤、ウェッティング作用薬およびアニオン性、非イオン性または両性ポリマー、および染料または顔料をはじめとするがこれに限定されるものではない、１つもしくはそれ以上の従来の化粧品または皮膚科的添加剤またはアジュバントを含有してもよい。
【０１２３】
ペプチドベースの皮膚質改良剤
本発明のペプチドベースの皮膚質改良剤は、皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）と皮膚質改良剤（ＳＣＡ）とをカップリングして形成される。質改良剤の皮膚結合ペプチド部分は皮膚に強力に結合するので、持続的質改良剤効果のために、質改良剤が皮膚に付着したままになる。皮膚結合ペプチドとしては、配列番号６１として示される本発明の皮膚結合ペプチド配列をはじめとする、上述のスクリーニング法によって選択される皮膚結合ペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らに付与された米国特許出願公報第２００３／０１５２９７６号、およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らの国際公開第０４０４８３９９号パンフレットでそれぞれ述べられる、配列番号２、および配列番号９９〜１０４をはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆる知られている皮膚結合ペプチドを使用してもよい。
【０１２４】
ここで定義される皮膚質改良剤としては、皮膚を引き締めるアストリンゼン、死滅皮膚細胞を除去するエクスフォリエント、滑らかで柔らかくしなやかな外見の維持を助ける柔軟化粧水、皮膚の最上層の含水量を増大させる保湿剤、皮膚表面からの水蒸発を遅延させる閉鎖剤、および乾燥または損傷した皮膚の外見を向上させ、または剥離を低下させ、しなやかさを復元する種々雑多な化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明のペプチドベースの皮膚質改良剤中では、あらゆる既知の皮膚質改良剤を使用してもよい。皮膚質改良剤は技術分野でよく知られており（例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（上述）を参照されたい）、様々な供給元から市販される。皮膚質改良剤の適切な例としては、α−ヒドロキシ酸、β−ヒドロキシ酸、ポリオール、ヒアルロン酸、Ｄ,Ｌ−パンテノール、ポリサリチル酸、ビタミンＡパルミテート、ビタミンＥアセテート、グリセリン、ソルビトール、シリコーン、シリコーン誘導体、ラノリン、天然油、およびトリグリセリドエステルが挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい皮膚質改良剤は、ポリサリチル酸、ミシガン州ミッドランドのダウ・ケミカル（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ））からのプロピレングリコール（ＣＡＳ  ５７−５５−６号）、オハイオ州シンシナチのプロクター＆ギャンブル（Ｐｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ  Ｃｏ．（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ））からのグリセリン（ＣＡＳ５６−８１−５号）、デラウェア州ウィルミントンのデュポン（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））からのグリコール酸（ＣＡＳ７９−１４−１号）、マサチューセッツ州ワード・ヒルのアルファ・エーサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ、ＭＡ））からの乳酸（ＣＡＳ５０−２１−５号）、アルファ・エーサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）からのリンゴ酸（ＣＡＳ６１７−４８−１号）、アルファ・エーサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）からのクエン酸（ＣＡＳ７７−９２−号９）、アルファ・エーサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）からの酒石酸（ＣＡＳ１３３−３７−９号）、グルカル酸（ＣＡＳ８７−７３−０号）、ガラクタル酸（ＣＡＳ５２６−９９−８号）、３−ヒドロキシ吉草酸（ＣＡＳ１０２３７−７７−１号）、アルファ・エーサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）からのサリチル酸（ＣＡＳ６９−７２−７号）、およびデラウェア州ウィルミントンのデュポン（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ））からの１,３プロパンジオール（ＣＡＳ５０４−６３−２号）である。ポリサリチル酸は、参照によって本書に援用されるホワイトら（Ｗｈｉｔｅ）らに付与された米国特許第４,８５５,４８３号明細書で述べられる方法によって調製してもよい。グルカル酸は、メルボウ（Ｍｅｒｂｏｕｈ）らのＣａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３６：７５〜７８（２００１）で述べられる方法を使用して合成してももよい。３−ヒドロキシ吉草酸は、ブラムッチ（Ｂｒａｍｕｃｃｉ）の国際公開第０２０１２５３０号パンフレットで述べられるようにして調製してもよい。
【０１２５】
本発明のペプチドベースの皮膚質改良剤は、特異的皮膚結合ペプチドを皮膚質改良剤に直接またはスペーサーを介して、共有結合的に付着させて調製される。上述のいずれかのカップリング法を使用してもよい。上述のように、毛髪結合ペプチドにカップリングするために、皮膚質改良剤上にカルボン酸、アルコール、アミン、またはアルデヒド基などの反応性基を導入することが必要かもしれない。複数の皮膚結合ペプチドを皮膚質改良剤に付着させて、ペプチドベースの皮膚質改良剤と皮膚の間の相互作用を向上させることもまた望ましいかもしれない。同一皮膚結合ペプチドの多重コピー、または異なる皮膚結合ペプチドの組み合わせのどちらかを使用してもよい。大型質改良剤粒子の場合、多数、すなわち約１,０００個までの毛髪結合ペプチドが質改良剤に付着していてもよい。より小型の質改良剤分子には、より少数、すなわち約５０個までの毛髪結合ペプチドが付着できる。したがって本発明の一実施態様では、ペプチドベースの皮膚質改良剤は、一般構造式、（ＳＢＰ）ｎ−ＳＣＡ（式中、ｎは１〜約１,０００、好ましくは１〜約５０の範囲である）を有する、皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）および皮膚質改良剤（ＳＣＡ）からなるジブロック組成物である。
【０１２６】
別の実施態様では、ペプチドベースの皮膚質改良剤は、上述のように、皮膚結合ペプチドを皮膚質改良剤から隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。皮膚結合ペプチドの多重コピーが、単一スペーサー分子に付着していてもよい。この実施態様では、ペプチドベースの皮膚質改良剤は、一般構造式、［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−ＳＣＡ（式中、ｎは１〜約１,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５０であり、ｍは１〜約５０の範囲であり、好ましくはｍは１〜約１０である）を有する、毛髪結合ペプチド、スペーサー、および毛髪質改良剤からなるトリブロック組成物である。
【０１２７】
本発明のペプチドベースの皮膚質改良剤を皮膚ケアのための組成物中で使用してもよい。皮膚結合ペプチドそれ自体が、皮膚のための質改良剤としての役割を果たすことができることもまた認識される。皮膚ケア組成物は、ここでは化粧用に許容可能な媒体中に有効量のペプチドベースの皮膚質改良剤、または異なるペプチドベースの皮膚質改良剤混合物を含んでなる組成物と定義される。これらの組成物の用途としては、皮膚ケア、皮膚クレンジング、メイクアップ、およびアンチリンクル製品が挙げられるが、これに限定されるものではない。皮膚ケア組成物のためのペプチドベースの皮膚質改良剤または皮膚結合ペプチドの有効量は、組成物総重量に対して約０．００１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５重量％の比率として定義される。この比率は、皮膚ケア組成物のタイプの関数として変化してよい。化粧用に許容可能な媒体のための適切な組成物は、上述のフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）らによって述べられる。例えば化粧用に許容可能な媒体は、概して組成物総重量に対して約１０〜約９０重量％の比率の脂肪物質を含有する無水組成物であってもよく、ここでは脂肪相は、少なくとも１つの液体、固形または半固形脂肪物質を含有する。脂肪物質としては、油、ワックス、ガム、およびいわゆるペースト状脂肪物質が挙げられるが、これに限定されるものではない。代案として、組成物は、油中水または水中油エマルジョンなどの安定した分散体の形態であってもよい。さらに組成物は、抗酸化剤、保存料、充填材、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢサンスクリーン、香料、増粘剤、ウェッティング剤およびアニオン性、非イオン性または両性ポリマー、および染料または顔料をはじめとするが、これに限定されるものではない、１つもしくはそれ以上の従来の化粧品または皮膚科的添加剤またはアジュバントを含有してもよい。
【０１２８】
ペプチドベースの毛髪着色剤
本発明のペプチドベースの毛髪着色剤は、毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）と着色剤（Ｃ）とをカップリングさせて形成される。ペプチドベースの毛髪着色剤の毛髪結合ペプチド部分は毛髪に強力に結合するので、着色剤が持続的髪染め効果のために毛髪に付着したままになる。毛髪結合ペプチドとしては、配列番号３〜５９、６４、６６、６９、および７０によって示される本発明の毛髪結合ペプチド配列、最も好ましくは、毛髪に強力に結合するが皮膚には結合しない配列番号４６および配列番号６６によって示されるペプチドをはじめとする、上述のスクリーニング法によって選択される毛髪結合ペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らに付与された米国特許出願公報第２００３／０１５２９７６号、およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らの国際公開第０４０４８３９９号パンフレットでそれぞれ述べられる、配列番号１、および配列番号７６〜９８をはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆる既知の皮膚結合ペプチドを使用してもよい。漂白毛髪のためには、配列番号６０として示される手指爪結合ペプチドもまた使用してよい。
【０１２９】
着色剤はここでは、毛髪、皮膚、または爪の色を変化させるのに使用してもよい、あらゆる染料、顔料などとして定義される。本発明のペプチドベースの毛髪着色剤では、あらゆる既知の着色剤を使用してもよい。髪染め剤は技術分野でよく知られており（例えばグリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（上述）、「ＣＦＴＡ国際色ハンドブック（ＣＦＴＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）第二版、Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｎｇｌａｎｄ（１９９２）、および「化粧品ハンドブック（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」米食品医薬品局、ＦＤＡ／ＩＡＳＢｏｏｋｌｅｔ（１９９２）を参照されたい）、例えばペンシルベニア州ピッツバーグのベイヤー（Ｂａｙｅｒ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ））、ニューヨーク州タリータウンのチバ・ガイギー（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ、（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ））、ニュージャージー州ブリッジウォーターのＩＣＩ（ＩＣＩ（Ｂｒｉｄｇｅ  Ｗａｔｅｒ、ＮＪ））、オーストリア国ウィーンのサンドス（Ｓａｎｄｏｚ（Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ））、ニュージャージー州マウントオリブのＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ）、およびドイツ国フランクフルトのヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ））などの様々な供給元から市販される。適切な髪染め剤としては、４−ヒドロキシプロピルアミノ−３−ニトロフェノール、４−アミノ−３−ニトロフェノール、２−アミノ−６−クロロ−４−ニトロフェノール、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ,Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、ヘンナ、ＨＣブルー１、ＨＣブルー２、ＨＣイエロー４、ＨＣレッド３、ＨＣレッド５、分散バイオレット４、分散ブラック９、ＨＣブルー７、ＨＣブルー１２、ＨＣイエロー２、ＨＣイエロー６、ＨＣイエロー８、ＨＣイエロー１２、ＨＣブラウン２、Ｄ＆Ｃイエロー１、Ｄ＆Ｃイエロー３、Ｄ＆Ｃブルー１、分散ブルー３、分散バイオレット１、Ｄ＆Ｃレッド２１号などのエオシン誘導体、およびＤ＆Ｃレッド２７号とＤ＆Ｃレッド２１号とＤ＆Ｃオレンジ１０号と組み合わせたＤ＆Ｃレッドオレンジ５号などのハロゲン化フルオレセイン誘導体などの染料、およびＤ＆Ｃレッド３６号およびＤ＆Ｃオレンジ１７号、そしてＤ＆Ｃレッド７号、１１、３１および３４のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１２号のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１３号のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー５号とＦＤ＆Ｃイエロー６号とＤ＆Ｃレッド２７号とＤ＆Ｃレッド２１号とＦＤ＆Ｃブルー１号のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、二酸化チタン、酸化亜鉛、バリウムオキシド、ウルトラマリンブルー、クエン酸ビスマス、およびカーボンブラック粒子などの顔料が挙げられるが、これに限定されるものではない。本発明の好ましい髪染め剤は、Ｄ＆Ｃイエロー１および３、ＨＣイエロー６および８、Ｄ＆Ｃブルー１、ＨＣブルー１、ＨＣブラウン２、ＨＣレッド５、２−ニトロ−パラフェニレンジアミン、Ｎ,Ｎ−ヒドロキシエチル−２−ニトロ−フェニレンジアミン、４−ニトロ−インドール、およびカーボンブラックである。
【０１３０】
金属および半導体ナノ粒子もまた、それらの強力な発光のために髪染め剤として使用してもよい（ヴィック（Ｖｉｃ）らの米国特許出願公報第２００４／００１０８６４号）。「ナノ粒子」は、ここでは平均粒径１〜１００ｎｍの金属または半導体粒子と定義される。好ましくは粒子の平均粒径は約１〜４０ｎｍである。ここでの用法では、「粒度」および「粒径」は同じ意味を有する。金属ナノ粒子としては、金、銀、白金、パラジウム、イリジウム、ロジウム、オスミウム、鉄、銅、コバルト、およびこれらの金属から構成される合金の粒子が挙げられるが、これに限定されるものではない。「合金」とはここでは均質な２種以上の金属の混合物と定義される。「半導体ナノ粒子」としては、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、硫化銀、硫化カドミウム、酸化亜鉛、硫化亜鉛、セレン化亜鉛、硫化鉛、ヒ化ガリウム、ケイ素、酸化スズ、酸化鉄、およびリン化インジウムの粒子が挙げられるが、これに限定されるものではない。ナノ粒子を適切な有機コーティングまたは単層の使用によって、安定化させ水溶性にできる。ここでの用法では、単層−保護されるナノ粒子は、安定化ナノ粒子の１タイプである。安定化水溶性金属および半導体ナノ粒子を調製する方法は技術分野で知られており、参照によって本書に援用されるファング（Ｈｕａｎｇ）らによって同時係属米国特許出願第１０／６２２８８９号で述べられる。ナノ粒子の色は粒子サイズに依存する。したがってナノ粒子のサイズを調節することで、異なる色を得てもよい。例えばＺｎＳ被覆されたＣｄＳｅナノ粒子は、２〜６ｎｍの粒度範囲にわたって、可視スペクトル全体をカバーする。具体的にはコアサイズ２．３、４．２、４．８、および５．５ｎｍのＣｄＳｅナノ粒子は、それぞれ４８５、５６５、５９０、および６２５ｎｍを中心とする波長で発光する。異なるサイズの水溶性ナノ粒子は、上述のファング（Ｈｕａｎｇ）で述べられるサイズ分画法を使用して、広いサイズ分布のナノ粒子から得てもよい。この方法は、電解質の存在下におけるナノ粒子溶液への水混和性有機溶剤の調節される添加を含んでなる。水混和性有機溶剤の添加を増大させると、減少したサイズのナノ粒子の沈殿がもたらされる。
【０１３１】
本発明のペプチドベースの毛髪着色剤は、特異的毛髪結合ペプチドを着色剤に直接またはスペーサーを介して共有結合的に付着して調製される。上述のいずれかのカップリング法を使用してもよい。上述のように、毛髪結合ペプチドにカップリングするために、着色剤上にカルボン酸、アルコール、アミン、またはアルデヒド基などの反応性基を導入することが必要かもしれない。これらの修飾は、技術分野でよく知られている日常的化学反応を使用して行ってもよい。例えば硝酸、過酸化水素などの過酸化物、または過硫酸アンモニウムなどの無機開始剤を使用してカーボンブラック粒子の表面を酸化して機能性基を作り出してもよい。好ましくは、カラスコ−マリン（Ｃａｒｒａｓｃｏ−Ｍａｒｉｎ）ら（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｆａｒａｄａｙ  Ｔｒａｎｓ．９３：２２１１〜２２１５（１９９７））が述べるように、カーボンブラック表面は過硫酸アンモニウムを使用して酸化される。アミノ官能基は、２,２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミド）−二塩酸塩などの有機開始剤を使用して、カーボンブラック表面に導入してもよい。無機顔料およびナノ粒子を誘導体化して、カルボン酸またはアミノ官能基に同様に導入してもよい。
【０１３２】
複数の毛髪結合ペプチドを着色剤に付着させて、ペプチドベースの毛髪着色剤と毛髪の間の相互作用を向上させることもまた、望ましいかもしれない。同一毛髪結合ペプチドの多重コピー、または異なる毛髪結合ペプチドの組み合わせのどちらかを使用してもよい。大型顔料粒子の場合、多数、すなわち約１０,０００個までの毛髪結合ペプチドが顔料に付着していてもよい。より小型の染料には、より少数、すなわち約５０個までの毛髪結合ペプチドが付着できる。したがって本発明の一実施態様では、ペプチドベースの毛髪着色剤は、一般構造式、（ＨＢＰ）ｎ−Ｃ（式中、ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５００である）を有する、毛髪結合ペプチド（ＨＢＰ）および着色剤（Ｃ）からなるジブロック組成物である。
【０１３３】
別の実施態様では、ペプチドベースの毛髪着色剤は、上述のように、結合ペプチドを髪染め剤から隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。毛髪結合ペプチドの多重コピーが、単一スペーサー分子に付着していてもよい。この実施態様では、ペプチドベースの毛髪着色剤は、一般構造式、［（ＨＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ（式中、ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５００であり、ｍは１〜約５０の範囲であり、好ましくはｍは１〜約１０である）を有する、毛髪結合ペプチド、スペーサー、および着色剤からなるトリブロック組成物である。
【０１３４】
本発明のペプチドベースの毛髪着色剤を髪染め組成物中で、毛髪を染めるために使用してもよい。髪染め組成物は、ここでは化粧用に許容可能な媒体中に有効量のペプチドベースの毛髪着色剤または異なるペプチドベースの毛髪着色剤の混合物を含んでなる、毛髪の着色、染色、または漂白のための組成物と定義される。髪染め組成物中で使用するためのペプチドベースの毛髪着色剤の有効量は、ここでは組成物総重量に対して約０．００１％〜約２０重量％の比率と定義される。髪染め組成物のための化粧用に許容可能な媒体の構成要素については、どちらも参照によって本書に援用されるディアス（Ｄｉａｓ）らに付与された米国特許第６,３９８,８２１号明細書およびドゥーツ（Ｄｅｕｔｚ）らに付与された米国特許第６,１２９,７７０号明細書で述べられる。例えば髪染め組成物は、金属イオン封鎖剤、安定剤、増粘剤、緩衝液、キャリア、界面活性剤、溶剤、抗酸化剤、ポリマー、および質改良剤を含有してもよい。質改良剤は、本発明のペプチドベースの毛髪質改良剤および毛髪結合ペプチドを髪染め組成物総重量に対して約０．０１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５重量％の比率で含んでもよい。
【０１３５】
本発明のペプチドベースの毛髪着色剤はまた、マスカラ、および眉ずみをはじめとするが、これに限定されるものではない、睫毛または眉に塗布される化粧品組成物中の着色剤として使用してもよい。これらは脂肪物質を組成物総重量に対して概して約１０〜約９０重量％の比率で含有する、化粧用に許容可能な媒体を含んでなる、無水メイクアップ製品であってもよく、脂肪相は、上述のように少なくとも１つの液体、固形または半固形脂肪物質を含有する。脂肪物質としては、油、ワックス、ガム、およびいわゆるペースト状脂肪物質が挙げられるが、これに限定されるものではない。代案として、これらの組成物は、上述のように、油中水または水中油エマルジョンなどの安定した分散体の形態であってもよい。これらの組成物中で、ペプチドベースの毛髪着色剤の比率は、組成物総重量に対して概して約０．００１％〜約２０重量％である。
【０１３６】
ペプチドベースの爪着色剤
本発明のペプチドベースの爪着色剤は、爪結合ペプチド（ＮＢＰ）を着色剤（Ｃ）にカップリングして形成される。ペプチドベースの爪着色剤の爪結合ペプチド部分は、手指爪または足指爪に強力に結合することで、着色剤が持続的着色効果のために爪に付着したままになる。爪結合ペプチドとしては、配列番号５３および６０によって示される本発明の爪結合ペプチド配列、最も好ましくは配列番号６０によって示されるペプチドをはじめとする、上述のスクリーニング法によって選択される爪結合ペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに配列番号７、８、１９〜２７、３８、３９、４０、４３〜４５、４７、５７、５８、および５９として示される漂白毛髪結合ペプチドを使用してもよい。
【０１３７】
本発明のペプチドベースの爪着色剤は、上述のいずれかのカップリング法を使用して、特異的爪結合ペプチドを着色剤に直接またはスペーサーを介して共有結合的に付着して調製される。本発明のペプチドベースの爪着色剤中では、上述のいずれかの着色剤を使用してもよい。本発明ペプチドベースの爪着色剤中で使用するのに好ましい着色剤としては、Ｄ＆Ｃレッド８、１０、３０、および３６号、Ｄ＆Ｃレッド６、９、および１２号のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド７、１１、３１、および３４号のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド３０号とＤ＆Ｃオレンジ１７号とＤ＆Ｃブルー６号のストロンチウムレーキが挙げられる。
【０１３８】
複数の爪結合ペプチドを着色剤に付着させて、ペプチドベースの爪着色剤と爪の間の相互作用を向上させることもまた、望ましいかもしれない。同一爪結合ペプチドの多重コピー、または異なる爪結合ペプチドの組み合わせのどちらかを使用してもよい。大型顔料粒子の場合、多数、すなわち約１０,０００個までの爪結合ペプチドが顔料に付着していてもよい。より小型の染料には、より少数、すなわち約５０個までの爪結合ペプチドが付着できる。したがって本発明の一実施態様では、ペプチドベースの爪着色剤は、一般構造式、（ＮＢＰ）ｎ−Ｃ（式中、ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５００である）を有する、爪結合ペプチド（ＮＢＰ）および着色剤（Ｃ）からなるジブロック組成物である。
【０１３９】
別の実施態様では、ペプチドベースの爪着色剤は、上述のように、結合ペプチドを着色剤から隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。爪結合ペプチドの多重コピーが、単一スペーサー分子に付着していてもよい。この実施態様では、ペプチドベースの爪着色剤は、一般構造式、［（ＮＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ（式中、ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５００であり、ｍは１〜約５０の範囲であり、好ましくはｍは１〜約１０である）を有する、爪結合ペプチド、スペーサー、および着色剤からなるトリブロック組成物である。
【０１４０】
本発明のペプチドベースの爪着色剤をマニキュア液組成物中で、手指爪および足指爪を着色するために使用してもよい。マニキュア液組成物は、ここでは化粧用に許容可能な媒体中に、有効量のペプチドベースの爪着色剤または異なるペプチドベースの爪着色剤の混合物を含んでなる爪を処置および着色するための組成物と定義される。マニキュア液組成物中で使用するためのペプチドベースの爪着色剤の有効量は、ここでは組成物総重量に対して約０．００１％〜約２０重量％の比率と定義される。マニキュア液のための化粧用に許容可能な媒体の組成物は、上述のフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）らによって述べられる。マニキュア液組成物は典型的に、溶剤、およびセルロース誘導体、ポリビニル誘導体、アクリルポリマーまたは共重合体、ビニル共重合体、およびポリエステルポリマーなどの膜形成物質を含有する。さらにマニキュア液は、リン酸トリクレシル、ベンジルベンゾエート、リン酸トリブチル、アセチルリシノール酸ブチル、クエン酸トリエチル、アセチルクエン酸トリブチル、フタル酸ジブチルまたはショウノウなどの可塑剤を含有してもよい。
【０１４１】
ペプチドベースの皮膚着色剤
本発明のペプチドベースの皮膚着色剤は、皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）と着色剤（Ｃ）とをカップリングさせて形成される。ペプチドベースの皮膚着色剤の皮膚結合ペプチド部分は皮膚に強力に結合するので、着色剤が持続的皮膚着色効果のために皮膚に付着したままになる。皮膚結合ペプチドとしては、配列番号６１として示される本発明の皮膚結合ペプチド配列をはじめとする、上述のスクリーニング法によって選択される皮膚結合ペプチドが挙げられるが、これに限定されるものではない。さらにジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らに付与された米国特許出願公報第２００３／０１５２９７６号、およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らの国際公開第０４０４８３９９号パンフレットでそれぞれ述べられる、配列番号２、および配列番号９９〜１０４をはじめとするが、これに限定されるものではない、あらゆる既知の皮膚結合ペプチドを使用してもよい。
【０１４２】
本発明のペプチドベースの皮膚着色剤は、上述のいずれかのカップリング法を使用して、特異的皮膚結合ペプチドを着色剤に直接またはスペーサーを介して共有結合的に付着させて調製される。上述のいずれかの着色剤を使用してもよい。本発明のペプチドベースの皮膚着色剤中で使用するのに好ましい着色剤としては、以下の染料が挙げられる。Ｄ＆Ｃレッド２１号などのエオシン誘導体およびＤ＆Ｃレッド２７号などのハロゲン化フルオレセイン誘導体、Ｄ＆Ｃレッド２１号およびＤ＆Ｃオレンジ１０号と組み合わせたＤ＆Ｃレッドオレンジ５号、および顔料、二酸化チタン、酸化亜鉛、Ｄ＆Ｃレッド３６号およびＤ＆Ｃオレンジ１７号、Ｄ＆Ｃレッド７、１１、３１、および３４号のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１２号のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１３号のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー５号とＦＤ＆Ｃイエロー６号とＤ＆Ｃレッド２７号とＤ＆Ｃレッド２１号とＦＤ＆Ｃブルー１号のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、ウルトラマリンブルー、およびカーボンブラック。着色剤はまた、日光への曝露なしに皮膚に日焼けした外見を作り出す、ジヒドロキシアセトンなどのサンレス・タンニング作用薬であってもよい。
【０１４３】
複数の皮膚結合ペプチドを着色剤に付着させて、ペプチドベースの皮膚着色剤と皮膚の間の相互作用を向上させることもまた、望ましいかもしれない。同一皮膚結合ペプチドの多重コピー、または異なる皮膚結合ペプチドの組み合わせのどちらかを使用してもよい。大型顔料粒子の場合、多数、すなわち約１０,０００個までの皮膚結合ペプチドが顔料に付着していてもよい。より小型の染料には、より少数、すなわち約５０個までの皮膚結合ペプチドが付着できる。したがって本発明の一実施態様では、ペプチドベースの皮膚着色剤は、一般構造式、（ＳＢＰ）ｎ−Ｃ（式中、ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５００である）を有する、皮膚結合ペプチド（ＳＢＰ）および着色剤（Ｃ）からなるジブロック組成物である。
【０１４４】
別の実施態様では、ペプチドベースの皮膚着色剤は、上述のように、結合ペプチドを着色剤から隔てるスペーサー（Ｓ）を含有する。皮膚結合ペプチドの多重コピーが、単一スペーサー分子に付着していてもよい。この実施態様では、ペプチドベースの皮膚着色剤は、一般構造式、［（ＳＢＰ）ｍ−Ｓ］ｎ−Ｃ（式中、ｎは１〜約１０,０００の範囲であり、好ましくはｎは１〜約５００であり、ｍは１〜約５０の範囲であり、好ましくはｍは１〜約１０である）を有する、皮膚結合ペプチド、スペーサー、および着色剤からなるトリブロック組成物である。
【０１４５】
本発明のペプチドベースの皮膚着色剤は、ファンデーション、頬紅、口紅、リップライナー、リップグロス、アイシャドウ、およびアイライナーをはじめとするが、これに限定されるものではない、化粧品およびメイクアップ製品中の着色剤として使用してもよい。これらは脂肪物質を含有する、化粧用に許容可能な媒体を含んでなる無水メイクアップ製品であってもよく、またはそれらは上述のように、油中水または水中油エマルジョンなどの安定した分散体の形態であってもよい。これらの組成物では、ペプチドベースの皮膚着色剤の比率は、概して組成物総重量に対して約０．００１％〜約４０重量％である。
【０１４６】
毛髪、皮膚、および爪の処置方法
別の実施態様では、本発明のペプチドベースの質改良剤および着色剤で、毛髪、皮膚、および爪を処置するための方法が提供される。具体的には本発明は、有効量のペプチドベースの皮膚質改良剤またはペプチドベースの毛髪質改良剤を含んでなる上述の組成物の１つを皮膚、毛髪、または口唇に塗布し、保護膜を形成させることで、皮膚、毛髪、または口唇上にペプチドベースの質改良剤の保護膜を形成する方法もまた含んでなる。本発明の組成物は、スプレー、ブラッシング、および手による塗布をはじめとするが、これに限定されるものではない、様々な手段によって皮膚、毛髪、または口唇に塗布してもよい。ペプチドベースの質改良剤組成物は、保護膜を形成するのに十分な時間、好ましくは少なくとも約０．１〜６０分間、皮膚、毛髪、または口唇と接触したままになる。
【０１４７】
本発明はまた、有効量のペプチドベースの毛髪着色剤を含んでなる髪染め組成物を上述の手段によって毛髪に塗布することで、毛髪を染める方法も提供する。髪染め組成物は、毛髪の着色を引き起こすのに十分な時間、好ましくは約５〜約５０分間毛髪と接触したままにされ、次に髪染め組成物を毛髪からすすぎ落としてもよい。
【０１４８】
本発明はまた、有効量のペプチドベースの皮膚着色剤を含んでなる皮膚着色組成物を上述の手段によって皮膚または口唇に塗布することで、皮膚または口唇を染める方法も提供する。
【０１４９】
本発明はまた、有効量のペプチドベースの爪着色剤を含んでなるマニキュア液組成物を上述の手段によって手指爪または足指爪に塗布することで、手指爪または足指爪を染める方法も提供する。
【０１５０】
本発明はまた、有効量のペプチドベースの毛髪着色剤を含んでなる化粧品組成物を上述の手段によって眉および睫毛に塗布することで、眉および睫毛を染める方法も提供する。
【実施例】
【０１５１】
以下の実施例で本発明をさらに明らかにする。これらの実施例は本発明の好ましい実施態様を示しながら、例示のみの目的で提示されるものと理解される。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その精神と範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更をおよび修正を加えて、それを様々な用途および条件に適合できる。
【０１５２】
使用されるの略語の意味は次のとおり。「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」をマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｃｍ」はセンチメートルを意味し、「μｍ」はマイクロメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモル数を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μモル」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｇ」は重力定数を意味し、「ｒｐｍ」は分あたりの回転数を意味し、「ｐｆｕ」はプラークを形成する単位を意味し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味し、「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着アッセイを意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピルb−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味し、「Ａ」は吸収を意味し、「Ａ４５０」は波長４５０ｎｍで測定した吸収を意味し、「ＴＢＳ」はトリス−緩衝食塩水を意味し、「ＴＢＳＴ−Ｘ」はトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０含有トリス−緩衝食塩水を意味して「Ｘ」はトウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０の重量％であり、「Ｘｇａｌ」は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを意味し、「ＳＥＭ」は平均値の標準誤差を意味し、「ＥＳＣＡ」は化学的分析のための電子分光法を意味し、「ｅＶ」は電子ボルトを意味し、「ＴＧＡ」は熱重量分析法を意味し、「ＧＰＣ」はゲル透過クロマトグラフィーを意味し、「ＭＷ」は分子量を意味し、「Ｍｗ」は重量−平均分子量を意味し、「ｖｏｌ％」は容積％を意味する。
【０１５３】
一般方法：
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は技術分野で良く知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．「分子クローン化：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、１９８９、およびＴ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）（１９８４）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）による出版（１９８７）で述べられている。
【０１５４】
細菌培養の維持および生育に適した材料および方法についても、技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップス・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、ワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）Ｄ．Ｃ．（１９９４）またはトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  Ｉｎｃ．：サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）（１９８９）。細菌細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬、制限酵素および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、メリーランド州スパークスのＢＤダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ））、メリーランド州ロックビルのライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ））またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得た。
【０１５５】
実施例１
標準バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を使用した毛髪結合ファージペプチド選択
この実施例の目的は、標準ファージディスプレイバイオパニングを使用して、標準的毛髪および漂白毛髪に結合する毛髪結合ファージペプチドを同定することであった。
【０１５６】
ファージディスプレイペプチドライブラリー：
本発明使用したファージライブラリーであるＰｈ．Ｄ．−１２ＴＭファージディスプレイペプチドライブラリーキットおよびＰｈ．Ｄ．−７ＴＭファージディスプレイライブラリーキットは、マサチューセッツ州のニューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ））から購入した。これらのキットは、Ｍ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合したランダムペプチド７または１２−ｍｅｒのコンビナトリアルライブラリーに基づく。ディスプレイされるペプチドは、シグナルペプチドが切断された後に、外被タンパク質の第１の残基がディスプレイされるペプチドの第１の残基になるように、ｐＩＩＩのＮ−末端に発現する。Ｐｈ．Ｄ．−７およびＰｈ．Ｄ．−１２ライブラリーは、それぞれおよそ２．８×１０９および２．７×１０９個の配列からなる。１０μＬの容積は、各ペプチド配列の約５５個のコピーを含有する。結果にバイヤスが入り込むのを避けるために、製造元が提供するオリジナルのライブラリーを使用して、実験の各１回目を実施した。
【０１５７】
毛髪サンプルの調製
標準的毛髪として使用したサンプルは、ニューヨーク州ベルロースのインターナショナル・ヘア・インポーツ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ、ＮＹ））から得られた６−インチ中程度の褐色のヒト毛髪であった。毛髪を９０％イソプロパノールに室温で３０ｍｉｎ入れて、次に１０ｍｉｎずつ５回脱イオン水で洗浄した。毛髪を一晩室温で風乾させた。
【０１５８】
漂白毛髪サンプルを調製するために、水酸化アンモニウムでｐＨ１０．２に調節した６％Ｈ２Ｏ２に中程度の褐色のヒト毛髪を室温で１０ｍｉｎ入れて、次に次に１０ｍｉｎずつ５回脱イオン水で洗浄した。毛髪を一晩室温で風乾させた。
【０１５９】
標準的および漂白毛髪サンプルを０．５〜１ｃｍの長さに切断し、ブタ皮膚の底部を有するカスタム２４−ウェルバイオパニング器官のウェルに、約５〜１０ｍｇの毛髪を入れた。等しい数のブタ皮膚底部ウェルを空のままにしておいた。ブタ皮膚底部装置は、皮膚に対して親和力を有するファージ−ペプチドを除去するサブトラクティブ手順として使用された。この装置は、ニューハンプシャー州キーンのシュライヒャー＆シュル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ））から得られたドットブロット装置を修正してバイオパニングプロセスに適合させて作り出した。具体的にはドットブロット装置の最上部９６−ウェルブロックを２４−ウェルブロックで置き換えた。４×６インチ処理済みブタ皮膚を２４−ウェルブロックの下に入れて、装置を締め付けることで、ブタ皮膚底部を有するパニングウェルを形成した。ブタ皮膚は地元のスーパーで購入し、−８０℃に保存した。使用前に皮膚を脱イオン水に入れて解凍し、次にペーパータオルを使用しブロッティングして乾燥した。皮膚表面を９０％イソプロパノールで拭い、次に脱イオン水ですすいだ。０．５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０（ＴＢＳＴ−０．５％）を含有するＴＢＳＴ中１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなるブロッキングバッファーを２４−ウェル装置に満たし、４℃で１ｈインキュベートした。ウェルおよび毛髪をＴＢＳＴ−０．５％で５回洗浄した。１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する１ｍｌのＴＢＳＴ−０．５％を各ウェルに添加した。次に毛髪サンプルを含有しないブタ皮膚底部ウェルに、１２−ｍｅｒまたは７−ｍｅｒライブラリーのどちらかである１０μＬのオリジナルのファージライブラリー（２×１０１１ｐｆｕ）を添加し、ファージライブラリーを室温で１５ｍｉｎインキュベートした。毛髪サンプルを含有するブタ皮膚底部ウェルに、次に非結合ファージを移し、室温で１５ｍｉｎインキュベートした。毛髪サンプルおよびウェルをＴＢＳＴ−０．５％で１０回洗浄した。次に毛髪を２４−ウェルプレートの清潔なプラスチック底部ウェルに移し、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ２．２からなる１ｍＬの非特異的溶出緩衝液を各ウェルに添加して１０ｍｉｎインキュベートし、結合ファージを溶出した。次に１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２からなる１６０μＬの中和緩衝液を各ウェルに添加した。各ウェルから溶出されたファージを力価測定および配列決定のために新しい試験管に移した。
【０１６０】
結合したファージを力価測定するために、溶出されたファージをＳＭ緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．３ｍＭ  ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、およびゼラチン０．０１ｗｔ／ｖｏｌ％）で希釈し、１０１〜１０４の連続１０倍希釈液を調製した。ＬＢ培地で２０ｍｉｎ生育させ、次に４５℃で３ｍＬのアガローストップ（５ｍＭ  ＭｇＣｌ２添加ＬＢ培地、および０．７％アガロース）と混合した、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）からの２００μＬの対数増殖期中期大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８と共に、各希釈物の１０μＬアリコートをインキュベートした。この混合物をシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）からのＳ−ＧａｌＴＭ／ＬＢ寒天プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。Ｓ−ＧａｌＴＭ／ＬＢ寒天混合物は、５００ｍＬの蒸留水中に５ｇのトリプトン、２．５ｇの酵母抽出物、５ｇの塩化ナトリウム、６ｇの寒天、１５０ｍｇの３,４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓ−ＧａｌＴＭ）、２５０ｍｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、および１５ｍｇのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有した。Ｓ−ＧａｌＴＭ／ＬＢを１２１〜１２４℃で１５〜２０ｍｉｎ高圧滅菌してプレートを調製した。ＤＮＡの単離および配列分析のために、単一黒色プラークを無作為に選んだ。
【０１６１】
ＬＢ培地中で１：１００に希釈した一晩培養物からの希釈された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８と共に、残存する溶出されたファージを３７℃で４．５ｈインキュベートして増幅した。その後、細胞培養物を３０ｓ遠心分離して、上部８０％の上清を新鮮な試験管に移し、１／６容積のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール−８００、２．５Ｍ塩化ナトリウム）を添加し、ファージを４℃で一晩沈殿させた。沈殿物を４℃、１０,０００×ｇでの遠心分離によって収集し、得られたペレットを１ｍＬのＴＢＳ中に再懸濁した。これが第１回目の増幅されたストックであった。次に増幅された第１回目のファージストックを上述したのと同一方法に従って力価測定した。２回目のバイオパニングのために、第１回目からの２ｘ１０１１ｐｆｕを超えるファージストックを使用した。実験次第で、バイオパニングプロセスを３〜６回反復した。
【０１６２】
製造元ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ）の説明書に従って単一プラーク溶解産物を調製し、カリフォルニア州バレンシアのキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））からのＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３キットを使用して一本鎖ファージゲノムのＤＮＡを精製して、配列番号６２として示される−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を使用してデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）配列決定設備で配列決定した。ディスプレイされるペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置した。
【０１６３】
５回目のバイオパニングから単離された、１２−ｍｅｒライブラリーから溶出された標準的毛髪結合ファージペプチドのアミノ酸配列を表１に示す。５回目のバイオパニングから単離された、１２−ｍｅｒライブラリーから溶出された漂白毛髪結合ファージペプチドのアミノ酸配列を表２に示す。３回目のバイオパニングから単離された、９５個の無作為に選択されたクローンからの７−ｍｅｒライブラリーから溶出された標準的毛髪結合ファージペプチドの反復するアミノ酸配列を表３に示す。
【０１６４】
【表２】
2007505132.tif 000004
【０１６５】
【表３】
2007505132.tif 000005
【０１６６】
【表４】
2007505132.tif 000006
【０１６７】
実施例２
修正法を使用した高親和力毛髪結合ファージペプチドの選択
この実施例の目的は、より高い結合親和力を有する毛髪結合ファージペプチドを同定することであった。
【０１６８】
実施例１で述べたようにして酸性溶出緩衝液で処理した毛髪を、溶出緩衝液でさらに３回洗浄し、次にＴＢＳＴ−０．５％で３回洗浄した。酸抵抗性ファージペプチドがなおも付着したままのこれらの毛髪を使用して、対数増殖期中期細菌宿主細胞であるニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ）からの５００μＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８に直接感染させ、次にそれをＬＢ培地で２０ｍｉｎ生育させ、次に３ｍＬのアガローストップ（５ｍＭＭｇＣｌ２添加ＬＢ培地、および０．７％アガロース）と４５℃で混合した。この混合物をＬＢ培地／ＩＰＴＧ／Ｓ−ＧａｌＴＭ（１５ｇ／Ｌ寒天、０．０５ｇ／ＬＩＰＴＧ、および０．０４ｇ／ＬＳ−ＧａｌＴＭ添加ＬＢ培地）プレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。黒色プラークを計数してファージ力価を計算した。実施例１で述べたようにして、ＤＮＡの単離および配列分析のために、単一黒色プラークを無作為に選んだ。実施例１で述べたようにして、７−ｍｅｒおよび１２−ｍｅｒファージディスプレイライブラリーでスクリーニングした標準的毛髪および漂白毛髪サンプル上でこのプロセスを実施し、これらの高親和力の毛髪結合ファージペプチドのアミノ酸配列を表４−７に示す。
【０１６９】
【表５】
2007505132.tif 000007
【０１７０】
【表６】
2007505132.tif 000008
【０１７１】
【表７】
2007505132.tif 000009
【０１７２】
【表８】
2007505132.tif 000010
【０１７３】
実施例３
高親和力手指爪結合ファージペプチドの選択
この実施例の目的は、手指爪に対する高結合親和力を有するファージペプチドを同定することであった。実施例２で述べた修正バイオパニング法を使用して、高親和力の手指爪結合ファージ−ペプチドクローンを同定した。
【０１７４】
被験者からヒト手指爪を採取した。手指爪を石鹸溶液でブラッシングして清潔にし、脱イオン水ですすいで室温で風乾させた。次に手指爪を液体Ｎ２下で粉末にし、９６−ウェルフィルタープレートの各ウェルに１０ｍｇの手指爪を添加した。手指爪サンプルをＴＢＳＴ−０．５％中の１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなるブロッキングバッファーで１ｈ処理し、次にＴＢＳＴ−０．５％で洗浄した。手指爪サンプルをファージライブラリー（Ｐｈ．Ｄ−１２ファージディスプレイペプチドライブラリーキット）と共にインキュベートし、実施例１で述べたのと同一条件を使用して１０回洗浄した。実施例１で述べた酸性溶出ステップ後、手指爪サンプルを溶出緩衝液でさらに３回洗浄し、次にＴＢＳＴ−０．５％で３回洗浄した。酸抵抗性ファージペプチドがなおも付着したままのこれらの酸処理済み手指爪を使用して、実施例２で述べたようにして、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８細胞を直接感染させた。このバイオパニングプロセスを３回反復した。ＤＮＡ単離および配列分析のために全部で７５個の単一黒色ファージプラークを無作為に選択し、２個の反復するクローンが同定された。これらのファージペプチドのアミノ酸配列を表８に列挙する。これらの手指爪結合ペプチドはまた、漂白毛髪に良好に結合することも分かった。
【０１７５】
【表９】
2007505132.tif 000011
【０１７６】
実施例４
高親和力皮膚結合ファージペプチドの選択
この実施例の目的は、皮膚への高結合親和力を有するファージペプチドを同定することであった。実施例２および４で述べた修正バイオパニング法を使用して、高親和力の皮膚結合ファージ−ペプチドクローンを同定した。ブタ皮膚がプロセスにおけるヒト皮膚モデルとしての役割をした。
【０１７７】
実施例１で述べたようにしてブタ皮膚を調製した。実施例４で述べたのと同一手順を使用して、カスタムのブタ皮膚底部バイオパニング装置で３回のスクリーニングを実施した。ＤＮＡ単離および配列分析のために、全部で２８の単一黒色ファージプラークを無作為に選び、１個の反復するクローンを同定した。２８の配列中に９回出現するこのファージペプチドのアミノ酸配列は、配列番号６１として示されるＴＰＦＨＳＰＥＮＡＰＧＳであった。
【０１７８】
実施例５
毛髪結合ファージクローンの結合親和力の定量的特性決定
この実施例の目的は、力価測定およびＥＬＩＳＡによって、ファージクローン結合親和力を定量することであった。
【０１７９】
毛髪結合ファージクローンの力価測定：
特異的ペプチドをディスプレイするファージクローンを使用して、異なるペプチド配列の結合特性を比較した。力価ベースのアッセイを使用して、ファージ結合を定量化した。このアッセイでは、１０３〜１０４の信号雑音比を有する１０ｍｇの毛髪表面によって保持される出力ｐｆｕを測定した。全てのファージクローンへの入力は１０１４ｐｆｕであった。このアッセイがペプチド結合でなく、むしろペプチド発現ファージ粒子を測定することを強調しなくてはならない。
【０１８０】
標準的毛髪を０．５ｃｍ長さに切断し、１０ｍｇの切断毛髪をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からの９６−ウェルフィルタープレートの各ウェルに入れた。次にウェルにＴＢＳＴ−０．５％中に１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有するブロッキングバッファーを満たして、４℃で１ｈインキュベートした。毛髪をＴＢＳＴ−０．５％で５回洗浄した。次にウェルに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する１ｍＬのＴＢＳＴ−０．５％を満たし、次に精製したファージクローン（１０１４ｐｆｕ）を各ウェルに添加した。毛髪サンプルを室温で１５ｍｉｎインキュベートし、次にＴＢＳＴ−０．５％で１０回洗浄した。毛髪を清潔なウェルに移し、ｐＨ２．２で０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬＢＳＡからなる１．０ｍＬの非特異的溶出緩衝液を各ウェルに添加した。サンプルを１０ｍｉｎインキュベートし、次に１６０μＬの中和緩衝液（１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２）を各ウェルに添加した。各ウェルから溶出されたファージを力価測定および配列分析のために新しい試験管に移した。
【０１８１】
結合したファージの力価を測定するために、溶出されたファージをＳＭ緩衝液で希釈して、１０１〜１０８の連続１０倍希釈を調製した。各希釈物の１０μＬのアリコートをニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｌａｂｓ）からの２００μＬの対数増殖期中期大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８と共にインキュベートして、ＬＢ培地で２０ｍｉｎ生育し、次に４５℃で３ｍＬのアガローストップ（５ｍＭＭｇＣｌ２添加ＬＢ培地、および０．７％アガロース）と混合した。この混合物をＬＢ培地／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート（１５ｇ／Ｌ寒天、０．０５ｇ／ＬＩＰＴＧ、および０．０４ｇ／ＬＸｇａｌ添加ＬＢ培地）上に広げ、３７℃で一晩インキュベートした。青色プラークを計数してファージ力価を計算し、それを表９に示す。
【０１８２】
【表１０】
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【０１８３】
ＥＬＩＳＡによる毛髪結合ファージクローンの特性決定：
酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、選択したファージ−ペプチドクローンの毛髪結合特異性を評価した。無作為に選択した対照Ｇ−Ｆ９、ＫＨＧＰＤＬＬＲＳＡＰＲ（配列番号６３として示される）と共に、実施例１および２で同定したファージ−ペプチドクローンを増幅した。あらかじめブロックした毛髪表面に、１０１４ｐｆｕを超えるファージを添加した。毛髪結合特異性を実証する対照として、あらかじめブロックしたブタ皮膚表面にも同一量のファージを添加した。
【０１８４】
ユニークな毛髪またはブタ皮膚−底部９６−ウェル装置は、ニューハンプシャー州キーンのシュライヒャー＆シュル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ．（Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ））からのミニフォールド（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）Ｉドット−ブロットシステムの最上部９６−ウェルブロックの下に、１層のパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）を張って、パラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）カバー上に毛髪または無毛ブタ皮膚の層を追加し、次に装置を締め付けて作り出した。試験する各クローンについて、毛髪で覆われたウェルをＴＢＳ中の２％脱脂粉乳（シュライヒャー＆シュル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｉｎｃ．））からなる２００μＬのブロッキングバッファーと共に、室温で１ｈインキュベートした。対照の役割をさせるために、ウェルの底部にブタ皮膚がある第２のミニフォールド（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）システムをブロッキングバッファーで同時に処理した。システムを反転させ、ペーパータオルでブロッティングして乾燥させ、ブロッキングバッファーを除去した。システムをＴＢＳＴ−０．０５％からなるウォッシュバッファーで６回すすいだ。ウェルに１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する２００μＬのＴＢＳＴ−０．５％を満たし、次に１０μＬ（１０１２個を超えるコピー）の精製されたファージストックを各ウェルに添加した。サンプルを緩慢に振盪しながら３７℃で１５ｍｉｎインキュベートした。ウェルをＴＢＳＴ−０．５％で１０〜２０回洗浄して非結合ファージを除去した。次にブロッキングバッファーで１：５００に希釈したニュージャージー州ピスカタウェイのアマーシャムＵＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＡ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））からのホースラディシュ・ペルオキシダーゼ／抗Ｍ１３抗体抱合体１００μＬを各ウェルに添加して、室温で１ｈインキュベートした。抱合体溶液を除去し、ウェルをＴＢＳＴ−０．０５％で６回洗浄した。イリノイ州ロックフォードのピアスバイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））から得られたＴＭＢ基質（２００μＬ）を各ウェルに添加し、５〜３０ｍｉｎ、典型的に１０ｍｉｎ室温で発色させた。次に停止液（２００μＬの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、溶液を９６−ウェルプレートに移し、カリフォルニア州サニーベールのモレキュラー・デバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）からのマイクロプレート分光光度計を使用してＡ４５０を測定した。少なくとも３回の測定の平均で報告される得られた吸光度値、および平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表１０に示す。
【０１８５】
【表１１】
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【０１８６】
表１０のデータで示されるように、全ての毛髪結合クローンは、毛髪に対して対照よりも顕著により高い結合親和力を有した。さらに毛髪結合クローンは、ブタ皮膚に比べて、毛髪に対する様々な程度の選択性を示した。クローンＤ２１は、毛髪に対する非常に強い親和力、ブタ皮膚に対する非常に低い親和力を有し、毛髪に対する最も高い選択性を有した。
【０１８７】
実施例６
ペプチド結合特異性および親和力の確認
この実施例の目的は、競合ＥＬＩＳＡを使用して、毛髪結合ペプチドＤ２１のペプチド結合部位の特異性および親和力を試験することである。ＥＬＩＳＡアッセイは、毛髪表面に結合したままであるファージ粒子のみを検出する。したがって合成ペプチドがファージ粒子と毛髪表面の同一結合部位を得るために競合する場合、ペプチド競合のために、合成ペプチドのＥＬＩＳＡシステムへの添加はＥＬＩＳＡ結果を顕著に低下させる。
【０１８８】
配列番号４６として示される合成毛髪結合ペプチドＤ２１は、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））によって合成された。対照として、配列番号６１として示される無関係合成皮膚結合ペプチドをシステムに添加した。実験的条件は、実施例５で述べたＥＬＩＳＡ法で使用したのと同様であった。簡単に述べると、標準的毛髪のサンプルを含有する９６−ウェルフィルタープレートの各ウェルに、１００μＬの結合緩衝液（０．１％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０および１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ添加１×ＴＢＳ）および１０１１ｐｆｕの純粋なＤ２１ファージ粒子を添加した。合成ペプチド（１００μｇ）を各ウェルに添加した（濃度０．８ｍＭに対応する）。反応を穏やかに振盪しながら室温で１ｈ実施し、続いてＴＢＳＴ−０．５％で５回洗浄した。残りのステップは、実施例５で述べたＥＬＩＳＡ法で使用したものと同一であった。４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度で示されるＥＬＩＳＡ結果を表１１に示す。個々のＥＬＩＳＡ試験はそれぞれ三連で実施し、表１１中の値は三連の判定の平均である。
【０１８９】
【表１２】
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【０１９０】
これらの結果は、合成ペプチドＤ２１が、毛髪表面の同一結合部位を得るためにファージクローンＤ２１と競合することを実証する。
【０１９１】
実施例７
バイオパニングを使用した洗髪抵抗性毛髪結合ファージ−ペプチドの選択
この実施例の目的は、シャンプー洗浄と共にバイオパニングを使用して、洗髪抵抗性毛髪結合ファージ−ペプチドを選択することである。
【０１９２】
洗髪抵抗性毛髪結合ペプチドを選択するために、実施例２で述べたようにして、標準的および漂白毛髪に対する１２−ｍｅｒファージペプチドライブラリーを使用したバイオパニング実験を実施した。非結合ファージを洗い落とすのに標準的ＴＢＳＴ緩衝液を使用する代わりに、オハイオ州シンシナチのプロクター＆ギャンブル（Ｐｒｏｃｔｏｒ  ＆  Ｇａｍｂｌｅ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ））からのパンテーンプロＶシャンプー、シアーボリューム、（Ｐａｎｔｅｎｅ  Ｐｒｏ−Ｖ  ｓｈａｍｐｏｏ、Ｓｈｅｅｒ  Ｖｏｌｕｍｅ）１０％、３０％、および５０％のシャンプー溶液で、ファージ−複合体を形成した毛髪を別々の試験管内で５ｍｉｎ洗浄し、続いて６回ＴＢＳ緩衝液で洗浄した。実施例２で述べた修正バイオパニング法で述べるように、洗浄した毛髪を直接使用して宿主細菌細胞を感染させた。
【０１９３】
この方法の潜在的問題は、ファージが細菌宿主細胞に感染する能力に対するシャンプーの影響である。対照実験では、既知量のファージ粒子を１０％のシャンプー溶液に５ｍｉｎ添加し、次に溶液の一部を使用して細菌細胞を感染させた。シャンプー処理済みファージの力価は、未処理ファージよりも９０％低かった。３０％および５０％のシャンプー処理は、ファージが宿主細胞に感染する能力にさらに深刻な損傷を与えた。それにもかかわらず、表１２に示すように２つの洗髪抵抗性毛髪結合ファージ−ペプチドが同定された。
【０１９４】
【表１３】
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【０１９５】
実施例８
ＰＣＲを使用した洗髪抵抗性毛髪結合ファージ−ペプチドの選択
この実施例の目的は、ＰＣＲ法を使用して洗髪抵抗性毛髪結合ファージ−ペプチドを選択し、ファージへのシャンプー誘発性損傷問題を回避することである。このＰＣＲ法の原理は、ファージの生死にかかわらず、ファージ粒子内部のＤＮＡ断片がＰＣＲを使用して回収でき、次に毛髪結合ペプチド配列に対応する回収されたＤＮＡ断片をファージベクター内に再度クローンして、健康なファージ粒子にパッケージングできることである。
【０１９６】
実施例１で述べたようにして、標準的および漂白毛髪に対する７−ｍｅｒおよび１２−ｍｅｒファージ−ペプチドライブラリーを使用して、バイオパニング実験を実施した。最終洗浄後、ファージ処理済み毛髪に５ｍｉｎのシャンプー洗浄、続いて６回のＴＢＳ緩衝液洗浄を施した。シャンプー洗浄した毛髪を１ｍＬの水で満たした新しい試験管に入れ、１５ｍｉｎ煮沸してＤＮＡを放出した。ＤＮＡを含有するこの煮沸した溶液をＰＣＲ反応のためのＤＮＡテンプレートとして使用した。ＰＣＲ反応で使用したプライマーは、配列番号６７として示されるＭ１３ＫＥ−１４１２順方向５’−ＣＡＡＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＣＣＧＡＡＴＡ−３’、および配列番号６８で示されるＭ１３ＫＥ−１７９４逆方向５’−ＣＧＴＡＡＣＡＣＴＧＡＧＴＴＴＣＧＴＣＡＣＣＡ−３’プライマーであった。ＰＣＲ条件は、９６℃で３ｍｉｎの変性、続いて３５サイクルの９４℃で３０ｓｅｃ、５０℃で３０ｓｅｃおよび６０℃で２ｍｉｎであった。ＰＣＲ生成物（約４００ｂｐ）、およびニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）からのＭ１３ＫＥベクターを制限酵素Ｅａｇ  ＩおよびＡｃｃ６５  Ｉで消化した。ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）からのＰｈ．Ｄ．ＴＭペプチドディスプレイクローニングシステムで述べられる、ライゲーションおよび形質転換条件を使用した。得られた洗髪抵抗性毛髪結合ファージ−ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号７０として示されるＮＴＳＱＬＳＴである。
【０１９７】
実施例９
毛髪結合および皮膚結合ペプチドの親和力判定
この実施例の目的は、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＭＢ５０値として測定される、毛髪結合および皮膚結合ペプチドのそれぞれの基質に対する親和力を判定することであった。
【０１９８】
毛髪結合および皮膚結合ペプチドは、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（Ｓｙｎｐｅｐ  Ｉｎｃ．（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））によって合成された。検出目的で、ビオチニル化リジン残基をアミノ酸結合配列のＣ−末端に付加してペプチドをビオチニル化し、アミド化システインを配列のＣ−末端に付加した。表１３に示すように、試験されたペプチドのアミノ酸配列は配列番号７１〜７４として示される。
【０１９９】
毛髪サンプルでは、使用手順は次の通りであった。使用した表面特異的９６−ウェルシステムの設定は、実施例５で述べたのと同一であった。簡単に述べるとイリノイ州ロックフォードのピアスケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ））からのブロッキングバッファー（スーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）ＴＭ）で毛髪またはブタ皮膚表面がある９６−ウェルを室温で１ｈブロックし、続いて室温で２ｍｉｎずつＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。様々な濃度のビオチニル化結合ペプチドを各ウェルに添加し、３７℃で１５ｍｉｎインキュベートし、室温で２ｍｉｎずつＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。次にピアスケミカル（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）からのストレプトアビジン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）抱合体を各ウェルに添加し（ウェルあたり１．０μｇ）、室温で１ｈインキュベートした。インキュベーション後、ウェルを室温で２ｍｉｎずつＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄した。最後に実施例５で述べたようにして、発色および測定を実施した。
【０２００】
ペプチド−皮膚複合体のＭＢ５０測定のために、以下の手順を使用した。最初にブタ皮膚を処理して皮膚中の内在性ビオチンをブロックした。これはストレプトアビジンをブロッキングバッファーに添加して行った。ブタ皮膚サンプルをブロックした後、皮膚をＤ−ビオチンで処置して過剰なストレプトアビジン結合部位をブロックした。残りのステップは、毛髪サンプルで使用したのと同一であった。
【０２０１】
カリフォルニア州サンディエゴのグラフパッド・プリズム・ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）からのグラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）４．０）を使用して、結果をＡ４５０対ペプチド濃度としてプロットした。スキャッチャードプロットからＭＢ５０値を計算して、表１３にまとめる。結果は、毛髪結合ペプチド（Ｄ２１、Ｆ３５、およびＩ−Ｂ５）および皮膚結合ペプチド（配列番号６１）のそれぞれの基質に対する結合親和力が高かった一方、毛髪結合ペプチド（Ｄ−２１およびＩ−Ｂ５）の皮膚に対する結合親和力が比較的低かったことを実証する。
【０２０２】
【表１４】
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【０２０３】
実施例１０
ペプチドベースのカーボンブラック毛髪着色剤の調製
この実施例の目的は、カーボンブラック粒子表面に、配列番号４６として示される毛髪結合ペプチドＤ２１を共有結合的に結合することで、ペプチドベースのカーボンブラック毛髪着色剤を調製することであった。２,２’−アゾビス（２メチルプロピオンアミド）−二塩酸塩との反応によって、カーボンブラック粒子表面に官能性付与して遊離アミノ基を導入した。次に官能性付与カーボンブラック粒子を特異的毛髪結合ペプチドと共有結合的に結合した。
【０２０４】
カーボンブラック表面の官能性付与：
ニュージャージー州アレンデールのデグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ））からの２．０ｇのカーボンブラック（ニペックス（Ｎｉｐｅｘ）（登録商標）１６０−ＩＱ）、およびウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）からの１．０ｇの２,２’−アゾビス（２−メチルプロピオンアミド）二塩酸塩を１００ｍＬ丸底フラスコに入れ、３０ｍＬのジオキサンを添加した。フラスコを窒素で５ｍｉｎパージした。次にフラスコをゴム隔壁で密封し、反応混合物を６５℃で１４ｈ撹拌した。その後、アイオワ州デュビュクのバーンステッド／サーモライン（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ（Ｄｕｂｕｑｕｅ、ＩＡ））、からのナノピュア（Ｎａｎｏｐｕｒｅ）浄水システムで調製した５０ｍＬの脱イオン水を混合物に添加した。希釈溶液を遠心分離して官能性付与カーボンブラック粒子を収集し、有機溶剤および未反応試薬を除去した。カーボンブラック粒子を脱イオン水で洗浄し、遠心分離した。この洗浄および遠心処置プロセスをさらに２回反復した。次に凍結乾燥によって官能性付与カーボンブラック粒子を乾燥させた。
【０２０５】
ファージクローンＤ２１からのｔ−Ｂｏｃ−保護される毛髪結合ペプチドの合成
この反応の目的は、毛髪結合ペプチドのアミノ末端基を保護することであった。２５ｍＬ丸底フラスコ内で、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた、配列番号４６として示されるファージクローンＤ２１（０．２５ｇ）からの毛髪結合ペプチド（純度９５％）を２．５ｍＬの脱イオン水と混合し、次に、２０ｍｇのＮａＯＨおよび０．２５ｍＬのｔ−ブチルアルコールを添加した。混合物を２ｍｉｎ撹拌した後、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）からの０．１２ｇのジ−ｔｅｒｔ−ブチル二炭酸（ｔ−Ｂｏｃ無水物）を滴下して添加した。フラスコをゴム隔壁で密封し、反応混合物を室温で一晩撹拌した。反応混合物は、反応開始時には透明であったのが濁り、次に１ｈ後に沈殿した。水（１０ｍＬ）を添加すると、反応混合物は乳白色のエマルジョンを形成し、次にそれを１回当たり５ｍＬの塩化メチレンで３回抽出した。有機層を１回当たり５ｍＬの脱イオン水で２回洗浄した。透明な水層を全て合わせ、凍結乾燥によって乾燥させて０．２０ｇの綿毛様白色粉末（収率８０％）を得た。生成物を液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）によって分析したところ、純度が９０重量％で１３２３ｇ／モルの分子量を有することが分かった。
【０２０６】
アミノ官能性付与カーボンブラックとｔ−Ｂｏｃ−Ｄ２１−ペプチドとのカップリング：
アミノ官能性付与カーボンブラック（８７ｍｇ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｄ２１−ペプチド（８０ｍｇ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（２２ｍｇ）を３ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に添加した。この混合物を撹拌しながら、数滴のＴＨＦ中のジメチルアミノピリジン（１７μＬ）溶液を滴下して添加した。得られた暗色の懸濁液を撹拌しながら４０℃で６ｈ加熱して、続いて室温で一晩撹拌した。生成物にトリフルオロ酢酸（０．６ｍＬ）を添加し、混合物をさらに６ｈ撹拌した。次に５ｍＬの脱イオン水を反応混合物に添加した。混合物を３,５００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、上清をデカントした。遠心管内に残存する固形物を脱イオン水で洗浄し、再度遠心分離した。上清のｐＨがおよそ６．０に達するまで、この洗浄を反復した。次に凍結乾燥機を使用して暗色の残留物を２日間乾燥させ、暗色の粉末を得た。
【０２０７】
実施例１１
ペプチドベースのカーボンブラック毛髪着色剤を使用した毛染め
この実施例の目的は、実施例１０で調製したペプチドベースのカーボンブラック毛髪着色剤を使用して、天然の白毛のサンプルを染めることである。
【０２０８】
ニューヨーク州ベルロースのインターナショナル・ヘア・インポーツ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ、ＮＹ））からの天然の白毛の束（およそ１００本）を１０ｍＬの５０％イソプロパノールと３０ｍｉｎ混合して、次に少なくとも５回蒸留水で洗浄して清潔にした。風乾後、１０ｍＬの蒸留水に溶解させた、実施例１０で述べた５０ｍｇの毛髪結合Ｄ２１ペプチド−カーボンブラック毛髪着色剤を含有する溶液に、清潔になった毛髪を３０ｍｉｎ浸漬した。乾燥後、毛髪を少なくとも５回蒸留水で洗浄した。オリジナルの天然の白毛は明るい黒色になった。毛髪をシャンプー溶液に浸漬してガラスピペットで撹拌し、染まった毛髪を３０％シャンプー溶液（パンテーンプロＶ（ＰａｎｔｅｎｅＰｒｏ−Ｖ）シャンプー）で３回洗浄した。次に毛髪を蒸留水で少なくとも１０回すすいだ。染まった天然の白毛の最終色は、非常に明るい黒色であった。
【０２０９】
実施例１２
ペプチドベースの毛髪質改良剤の調製
この実施例の目的は、カルボジイミドカップリングを使用して、配列番号４６として示される毛髪結合Ｄ２１ペプチドとベヘニルアルコールを共有結合的に結合することで、ペプチドベースの毛髪質改良剤を調製することであった。
【０２１０】
２５ｍＬ丸底フラスコ内で、２．０ｍＬのＴＨＦに、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）からのベヘニルアルコール８１．７ｍｇ、および６２．０ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を溶解した。２．０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中に、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた配列番号４６の９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）Ｎ−末端保護形態（純度９５％）０．２５ｇを含有する溶液を上の混合物に添加した。次に５０μＬのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を反応混合物に添加した。撹拌しながら、反応混合物を４０℃に３ｈ、次に室温に一晩保った。次に溶剤を室温で４ｈ真空下で蒸発させた。その後、混合物を２５ｍＬの酢酸エチルに溶解し、各抽出で１０ｍＬの脱イオン水を使用して、未反応ペプチドを水で３回抽出した。酢酸エチル相を単離し、回転蒸発器を使用して酢酸エチルを除去した。得られた固形生成物を２．５ｍＬのＴＨＦおよび２．５ｍＬのＤＭＦからなる溶剤に溶解し、１．５ｍＬのピペリジンを添加して、Ｄ２１ペプチドのアミノ基を脱ブロックした。この混合物を室温で２ｈ撹拌し、次に回転蒸発によって真空下で溶剤を除去した。最終生成物をＬＣ／ＭＳによって特性決定した。
【０２１１】
実施例１３
ペプチドベースの毛髪質改良剤の調製
この実施例の目的は、ヘテロ二官能性架橋剤３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用して、配列番号６４として示される毛髪結合システイン付加Ｄ２１ペプチドとオクチルアミンを共有結合的に結合することでペプチドベースの毛髪質改良剤を調製することであった。
【０２１２】
ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から得られたオクチルアミン１１．６ｍｇを０．３ｍＬにＤＭＦに添加して希釈した。５ｍＬ丸底フラスコ内で、この希釈溶液を０．２ｍＬのＤＭＦ中にアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）からの２５ｍｇの３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、およびアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）からの５ｍｇのジイソプロピルエチルアミンを含有する撹拌される溶液に添加した。反応混合物は直ちに濁り、次に数分後透明になった。溶液をさらに４ｈ撹拌した。溶液を次に高真空下で乾燥させた。ニュージャージー州ギブズタウンのＥＭＤケミカルズ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、ＮＪ））（以前のＥＭサイエンス（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ））からのシリカゲル６０カラム、および溶出液としてＤＭＦ／エーテルを使用して、カラムクロマトグラフィーによって、生成物オクチルアミン付加マレイミドプロピオネートを精製した。
【０２１３】
およそ１２ｍｇの上記生成物を５ｍＬ丸底フラスコに入れ、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））から得られた配列番号６４として示される５０ｍｇのシステイン付加Ｄ２１ペプチド、およびｐＨ７．２の０．５ｍＬ  ０．１Ｍリン酸緩衝液を添加した。システイン付加Ｄ２１ペプチドは３個のグリシン残基、および毛髪結合Ｄ２１ペプチド（配列番号４６）のペプチド結合配列の末端に付加されるシステインを有した。この混合物を室温で６ｈ撹拌した。最終生成物Ｃ８−Ｄ２１ペプチド毛髪質改良剤を水／エーテルで抽出して精製した。
【０２１４】
実施例１４
ペプチドベースのカーボンブラック毛髪着色剤の調製
この実施例の目的は、エタノールアミンで官能性付与されたカーボンブラックを使用して、ペプチドベースのカーボンブラック毛髪着色剤を調製することであった。カーボンブラック表面に付加したペプチド数は、化学的分析から推定できた。
【０２１５】
酸官能性付与カーボンブラック粒子の調製：
１,０００ｍＬのビーカー内に、デグサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）からの２５．５ｇのカーボンブラック（Ｎｉｐｅｘ−１６０−ＩＱ）、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）からの１００ｇのアンモニウム過硫酸塩［（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８］（９８％）、およびＥＭＤケミカルズ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からの３３３ｍＬの１．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（９８％、ＧＲ等級）水性溶液を入れた。混合物を磁気撹拌プレートで２４ｈ室温で撹拌した。その後、反応混合物を５００ｍＬのプラスティック遠心管に移し、８,５００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離した。上清は透明になり、除去された。遠心分離を使用して生成物を脱イオン水で６回洗浄し、各洗浄後に生成物を収集した。最終生成物は中性（ｐＨ＝６．０）であり、凍結乾燥によって２４ｈ乾燥させた。ペンシルベニア州モンゴメリービルのマイクロトラックからの（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）からの粒度分析器（マイクロトラック・ウルトラファイン・パーティクル・アナライザー（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ  Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ））を使用して測定した、官能性付与カーボンブラック粒子の平均サイズは、１００ｎｍであった。
【０２１６】
エタノールアミンを使用したアミノ官能性付与カーボンブラックの調製：
２ｇの乾燥させた酸官能性付与カーボンブラック、アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）からの２５ｍＬのエタノールアミン（９９％）、およびＥＭＤケミカルズ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からの１ｍＬの濃Ｈ２ＳＯ４（９８％、ＧＲ等級）を１００ｍＬ丸底フラスコ内で混合した。混合物を磁気撹拌機で迅速に撹拌し、６ｈ還流した。混合物を室温に冷却した後、ＥＭＤケミカルズ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からの十分な量の水酸化アンモニウム（２８．０〜３０．０％のＮＨ３）を混合物添加して、中和した。次に実施例６で述べたようにして混合物を遠心分離し、水で洗浄した。最終生成物は中性（ｐＨ＝６．０）で、凍結乾燥により２４ｈ乾燥させた。乾燥させたアミノ官能性付与カーボンブラックは、容易に水に分散した。
【０２１７】
デュポン・コーポレート分析化学センター（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）において、官能性付与カーボンブラックの表面組成物をＥＳＣＡで分析した。ＥＳＣＡでは、単一エネルギーＸ線を材料表面に集中させて表面原子を励起させる。表面の最上部１０ｎｍ内の元素に特徴的なエネルギーを有するコアおよび原子価殻電子が放出され、それらのエネルギーを分析して、表面組成物に関する定性的および定量的情報を得た。放出された電子の動態学的エネルギーは、表面化学種の官能基および酸化状態に関する情報を提供する。この実施例では、使用したＸ線源は、エネルギー１２５３．６ｅＶを有するマグネシウムアノードであった。サンプルを４５度の出口角（およそ５〜１０ｎｍのサンプリング深度）で分析した。ＥＳＣＡ分析結果を表１４に示す。エタノールアミン官能性付与カーボンブラックでは、表面は、主に未反応−ＣＯＯＨ基および−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基から構成された。アミン（ｙ）とカルボン酸基（ｘ）の比率を計算するためには単純な式を使用し、具体的には、ｙ／（ｘ＋ｙ）＝（Ｎ％／１４）／（Ｏ％／３２）をエタノールアミンのために使用する。結果を表１４に示す。
【０２１８】
【表１５】
2007505132.tif 000017
【０２１９】
アミノ官能性付与カーボンブラックとｔ−Ｂｏｃ−Ｄ２１−ペプチドとのカップリング：
次にアミノ官能性付与カーボンブラック粒子と配列番号４６として示される特異的毛髪結合ペプチドＤ２１とを共有結合的に結合した。ｔ−Ｂｏｃ保護されたＤ２１ペプチドは、実施例１０で述べたようにして合成される。次にアミノ官能性付与カーボンブラック（８７ｍｇ）、ｔ−Ｂｏｃ−Ｄ２１−ペプチド（８０ｍｇ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（２２ｍｇ）を３ｍＬのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に添加した。この混合物を撹拌しながら、数滴のＴＨＦ中のジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１７μＬ）溶液を滴下して添加した。得られた暗色の懸濁液を撹拌しながら４０℃で６ｈ加熱して、続いて室温で一晩撹拌した。Ｄ２１ペプチドからｔ−Ｂｏｃ保護基を除去するために、生成物にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（０．６ｍＬ）を添加して、混合物をさらに６ｈ撹拌した。次に反応混合物に５ｍＬの脱イオン水を添加した。混合物を３,５００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、上清をデカントした。遠心管内に残存する固形物を脱イオン水で洗浄し、再度遠心分離した。上清のｐＨがおよそ６．０に達するまで、この洗浄を反復した。次に凍結乾燥機を使用して暗色の残留物を２日間乾燥させ、暗色の粉末を得た。
【０２２０】
アミノ官能性付与カーボンブラック粒子、およびペプチド結合カーボンブラック粒子をＥＳＣＡ、元素分析、およびＴＧＡ（熱重量分析）によって分析した。分析結果は、エタノールアミンで変性したカーボンブラック上の有機層が、総重量のおよそ１２％であったことを示した。Ｄ２１ペプチドをカーボンブラック粒子に付着させた後、ペプチドの重量百分率は１８〜３０％の範囲であった。したがって１００ｎｍのカーボンブラック粒子あたり、全部で９．５×１０４個の分子がエタノールアミンと反応した後に表面に付着し、全部で７,７００個のＤ２１ペプチド分子がペプチドとの反応後にカーボンブラック表面に付着した。カーボンブラック表面のペプチド密度の計算からは、Ｄ２１ペプチドがそれぞれ４ｎｍ２を占めたことが明らかにされ、これはおよそ１２ｎｍ２であるファージに付着したペプチド密度と比較できる。
【０２２１】
実施例１５
ペプチドベースのカーボンブラック毛髪着色剤の特異性
この実施例の目的は、Ｄ２１ペプチド−カーボンブラック毛髪着色剤の特異性を実証することであった。
【０２２２】
実施例１４で述べたようにして、Ｄ２１ペプチドベースのカーボンブラック着色剤を調製した。
【０２２３】
地元のスーパーから得られた１片のブタ皮膚（１０ｃｍ×１０ｃｍ）を３０ｍＬの３０％イソプロパノールに１０ｍｉｎ混合し、次に少なくとも５回蒸留水で洗浄して清潔にした。風乾後、１０ｍＬの蒸留水に溶解した５０ｍｇのＤ２１ペプチド−カーボンブラック着色剤溶液を含有する複数のウェルがあるプレートホルダーに、清潔になったブタ皮膚を浸漬した。着色剤を塗布して１５ｍｉｎ後、シャンプー溶液をウェルに滴下してデカントし、３０％シャンプー溶液（パンテーンプロＶ（ＰａｎｔｅｎｅＰｒｏ−Ｖ）シャンプー）でブタ皮膚を３回洗浄した。次にブタ皮膚を蒸留水で５回すすいだ。
【０２２４】
ニューヨーク州ベルロースのインターナショナル・ヘア・インポーツ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ、ＮＹ））から得られた標準的白毛サンプルをブタ皮膚と同様に処理した。
【０２２５】
洗浄後、ブタ皮膚がごくわずかな暗色を示したのに対し、毛髪は非常に明るい黒色になった。これらの結果は、Ｄ２１ペプチド−カーボンブラック着色剤が毛髪に対する特異的結合を有するが、皮膚に対しては有さないことを実証する。
【０２２６】
実施例１６
ペプチド−ポリシロキサン毛髪質改良剤の調製
この実施例の目的は、Ｄ２１ペプチド−ポリシロキサン毛髪質改良剤を合成することである。配列番号４６として示されるＤ２１ペプチドの反応性側鎖官能基は、ポリシロキサンとの反応がペプチドのＣ−末端基だけで進行するように、完全に保護された。さらにグリシン残基からなるトリペプチドスペーサーを結合配列のＣ−末端に付加した。
【０２２７】
５ｍＬ丸底フラスコ内で、カリフォルニア州ダブリンのシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ））からの配列番号７８として示される、５０ｍｇの完全に保護されたＤ２１ペプチドＦｍｏｃ−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｔ（ｔＢｕ）Ｎ（Ｔｒｔ）ＡＡＤ（ＯｔＢｕ）Ｈ（Ｔｒｔ）ＰＡＡＶＴ（ｔＢｕ）ＧＧＧ（ここでＦｍｏｃはフルオレニルメトキシルカルボニルを意味し、Ｐｂｆは２,２,６,４,７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルを意味し、ｔＢｕはｔ−ブチルを意味し、Ｔｒｔはトリチルを意味し、Ｏｔｂｕはｔ−ブトキシルを意味する）（ＭＷ  ２５２２、０．０２ｍｍｏｌ、純度９５％）をドイツ国ダルムシュタットのＥ．メルク（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からの１ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した。サンプルバイアル内で、ミシガン州ミッドランドのダウ・コーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ）からのポリシロキサン流体２−８５６６（７７ｍｇ）（Ｎ％＝０．８７５％、０．０２４ｍｍｏｌの−ＮＨ２）をＥ．メルク（Ｅ．Ｍｅｒｃｋ）からの２ｍＬのＴＨＦに溶解し、次にペプチド溶液を含有する丸底フラスコに移した。次に５ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、０．０２４ｍｍｏｌ）および５μＬのジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をフラスコにいれた。フラスコをゴム栓で密封し、反応混合物を５０℃で５ｈ、次に室温で一晩撹拌した。反応が完了した後、溶剤を真空下でくみ出した。乾燥後、１２２ｍｇの固形生成物が得られた。収量は約９０％であった。
【０２２８】
固形生成物をＥＭＤケミカルズ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からのＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）に溶解し、分子量を判定するための屈折率検出を伴うＧＰＣ（ゲル透過クロマトグラフィー）分析のために、ＤＭＡＣ中５ｍｇ／ｍＬの生成物溶液を調製した。オリジナルのポリシロキサン（ダウ・コーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  ２−８５６６））はＤＭＡＣに可溶性でなく、クロマトグラムの分離領域には観察されなかった。Ｄ２１ペプチドは鋭い低分子量ピークを有し、生成物サンプルは、遊離Ｄ２１ペプチドからのピークと、Ｄ２１ペプチドでグラフト化されたポリシロキサンに帰属するとされた幅広いピークとの２つのピークを含有した。重量−平均分子量（Ｍｗ）は、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）標準から計算した。Ｄ２１ペプチドおよびペプチド−ポリシロキサン質改良剤のＭｗは、それぞれ４．７×１０３および４．４×１０４であった。
【０２２９】
トリフルオロ酢酸／Ｈ２Ｏ／チオアニソール／エタンジチオール／フェノール（８５：５：５：２．５：２．５の容積比）の組成を有するシンペップ（ＳｙｎＰｅｐ）により試薬Ｋと称される開裂試薬を使用して、Ｄ２１ペプチドの側鎖官能基から保護基を切断した。試薬Ｋ（１ｍＬ）を−２０℃に予冷し、次に１００ｍｇのＤ２１ペプチド−ポリシロキサン質改良剤に添加した。混合物を室温で３〜４ｈ撹拌し、次に高真空下で試薬Ｋを除去した。次にＤＭＦ中の６１．２ｍｇの２０ｖｏｌ％ピペリジンを混合物に添加して、３０ｍｉｎ撹拌し、続いて高真空下でポンピングして、ペプチドのＮ−末端からＦｍｏｃ保護基を除去した。最終生成物はＴＨＦ、ＤＭＦ、またはＤＭＡＣ中に完全に可溶性でなかった。最終生成物のＧＰＣ分析は、低溶解性のために不可能であった。
【０２３０】
実施例１７
ペプチドベースの毛髪質改良剤の有効性
この実施例の目的は、ヒト毛髪繊維中の摩擦力を低下させる上でのペプチドベースの毛髪質改良剤の有効性を実証して、その性能を市販される質改良剤と比較することであった。繊維摩擦は、毛髪繊維アセンブリー（すなわち複数の繊維）を櫛でとかしたときの動態の顕著な要因である。単一毛髪繊維の摩擦力特性は、毛髪アセンブリーを櫛でとかしたときの動態と関連づけることができる。繊維内摩擦試験では、質改良剤塗布による毛髪表面に対する改善を例証する。繊維間摩擦が低いほど、毛髪は見かけと手触りがより滑らかになり、櫛でとかすのがより容易になる。この実施例で用いた繊維間摩擦測定法は、確かな定量的データを与えるいくつかの毛髪繊維試験の１つであり、概して産業界で受け入れられている。
【０２３１】
配列番号４６として示され、ベヘニルアルコールに共有結合的する毛髪結合ペプチドからなる、実施例１２で述べたペプチドベースの毛髪質改良剤を蒸留水中の０．２５重量％のペプチドベースの質改良剤と、イリノイ州ディケータのＡＭＤレシチン（ＡＤＭ  Ｌｅｃｉｔｈｉｎ（Ｄｅｃａｔｕｒ、ＩＬ））からの１．５重量％のパフォーミックス（Ｐｅｒｆｏｒｍｉｘ）ＴＭレシチンとの混合物からなる調合物中で使用した。マサチューセッツ州のイースト・ロングミードゥのシルバーソン・マシーン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ、Ｉｎｃ．（Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ、ＭＡ））からの一般目的粉砕ヘッドおよび０．９５ｃｍミニマイクロ管状フレーム付きシルバーソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）Ｌ４ＲＴ−Ａ高剪断試験室ミキサーを使用して、水性溶液を７０００ｒｐｍで４ｍｉｎ混合した。ミシガン州ミッドランドのダウ・コーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ））からの市販の質改良剤ダウ・コーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）９２９カチオン性エマルジョンの蒸留水中０．５％溶液を同一混合条件を使用して調製した。
【０２３２】
インターナショナル・ヘア・インポーツ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）からのヨーロッパ人の暗褐色毛髪ヘアピースを試験前にイソプロパノールに３０ｍｉｎ浸漬し、次に蒸留水で１０回洗浄して清潔にした。摩擦試験のために、これらのヘアピースからの単一毛髪繊維をニュージャージー州プリンストンのテキスタイル・リサーチ・インスティティチュート（Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＴＲＩ）（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ））に送った。ＴＲＩでは、毛髪繊維を質改良剤溶液におよそ３５℃で５ｍｉｎ撹拌せずに浸漬した。その後、それらを１ｍｉｎぬるま湯ですすいで、次に２１℃および６５％の相対湿度で一晩乾燥させた。
【０２３３】
カマス（Ｋａｍａｔｈ）ら（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．、８５：３９４〜４１４（２００２））が述べるように、単一繊維摩擦装置を使用して繊維間摩擦試験によって、処理済み毛髪繊維の摩擦力測定を実施した。インストロン張力試験機を使用して、１ｍｍ／ｍｉｎのクロスヘッド速度で、クロム鋼ワイヤに対する高標準力（高負荷）（０．７４ｇ）で毛髪繊維を評価した。低標準力（低負荷）（８．５ｍｇ）は、テキスタイル・リサーチ・インスティティチュート（Ｔｅｘｔｉｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）からのＴＲＩ／ＳｃａｎＴＭ表面力分析器を使用して、別の単一毛髪繊維に対して測定した。この装置は、小さな力をカーン（Ｃａｈｎ）（登録商標）マイクロバランス（質量分解能０．１ｍｇ）で測定し、コンピューター制御ステージを特徴とする。これらの測定結果を表１５に示す。
【０２３４】
【表１６】
2007505132.tif 000018
【０２３５】
いずれの場合でもペプチドベースの質改良剤は、ダウ・コーニング（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）（登録商標）９２９カチオン性エマルジョン質改良剤よりも低い平均摩擦を有した。引き続いて１．５％レシチンの質改良剤サンプルを繊維摩擦（低負荷）について試験したところ、平均摩擦力は３．３６６ｍｇであり、ペプチドベースの質改良剤について観察された質改良剤効果が、調合物中のレシチンの存在に起因するものでないことが示唆された。これらの結果は、ペプチドベースの毛髪質改良剤の有効性を実証する。
【配列表】
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【国際調査報告】
2007505132.tif 000043
2007505132.tif 000044