(57)【要約】本発明は防御抗原によって形成された細孔をふさいで炭疽毒の活動を抑制する低分子量化合物を提供する。この合成物の構造はβ−シクロデキストリンの誘導体である。パー置換されたアルキルアミノ誘導体は抑制活動を示し、炭疽菌致死毒素の活動に対して低いマイクロモル濃度で保護した。また、複数のPAチャネルを持つ二分子層脂質膜へのアルキルアミノ誘導体のうちの一つを追加することで膜透過性に著しい減少を引き起こした。このように、本発明は炭疽菌毒性からの保護も提供する。
2007538112.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表される化合物：  
【化１】
2007538112.tif 000014
式中、
R2はH、OH、OAc、OMe、またはO(CH2CH2O)nであり；
R3はH、OH、OAc、OMe、OSO3NaまたはNH2であり；
R6はH、NH2、SCH2CH2NH2、SCH2CH2CH2NH2、SCH2CH2CH2CH2NH2 、I 、N3、SH、低級アルキル、S-アルキルグアニジル、O-アルキルグアニジル、S-アミノアルキル、O-アミノアルキル、アミノアルキル、アラルキル、アリール、１種または２種以上のヘテロ環、またはOSO3Na
である。
【請求項２】
R6がNH2、SCH2CH2NH2、SCH2CH2CH2NH2、またはSCH2CH2CH2CH2NH2である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
図１に示された化合物の中から選ばれた請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物を細胞に接触せしめることを含む炭疽菌の毒性を細胞の中で抑制する方法。
【請求項５】
請求項２に記載の化合物が細胞に接触することを含む炭疽菌の毒性を細胞の中で抑制する方法。
【請求項６】
請求項３に記載の化合物が細胞に接触することを含む炭疽菌の毒性を細胞の中で抑制する方法。
【請求項７】
置換されたβ−シクロデキストリンを合成する改善された方法であって、前記改善が、β−シクロデキストリンの一次位置に硫黄原子を導入し、続いてハロゲノプロピオニトリルによるメルカプト基の選択的アルキル化を行うことを含む方法。
【請求項８】
七重の対称性を有し、直径が１２Åと３５Åの間の環状化合物を投与することを含む炭疽毒の活性を抑制する方法。
【請求項９】
黄色ブドウ球菌のα毒素のための七重の対称性を持つ膜貫通型チャネルを形成するたんぱく質である病原性因子を抑制する方法であって、請求項１に記載の化合物を細胞に接触せしめることを含む方法。
【請求項１０】
黄色ブドウ球菌のα毒素のための七重の対称性を持つ膜貫通型チャネルを形成するたんぱく質である病原性因子を抑制する方法であって、請求項２に記載の化合物を細胞に接触せしめることを含む方法。
【請求項１１】
黄色ブドウ球菌のα毒素のための七重の対称性を持つ膜貫通型チャネルを形成するたんぱく質である病原性因子を抑制する方法であって、請求項３に記載の化合物を細胞に接触せしめることを含む方法。
【請求項１２】
ヘリコバクターピロリのVac A毒素のための六重の対称性を持つ膜貫通型チャネルを形成するたんぱく質である病原性因子を抑制する方法であって、六量体のβ−シクロデキストリンの誘導体を細胞に接触せしめることを含む方法。
【請求項１３】
Ｃ型肝炎ウイルスのp7たんぱく質のための六重の対称性を持つ膜貫通型チャネルを形成するたんぱく質である病原性因子を抑制する方法であって、六量体のβ−シクロデキストリンの誘導体を細胞に接触せしめることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は下記の仮出願の利益を請求する：米国特許出願第60/539,577号 (2004年1月29日)。この研究はNational Institute of Allergy and Infectious Diseases 許可番号1R43AI052894-01からの保証により支持された。米国政府は本発明についての権利を有する。
【０００２】
本発明は炭疽菌によって媒介される生体毒性からの保護に関する。
【０００３】
炭疽菌はもっとも危険で潜在的な生物兵器の一つである。現在、炭疽菌への曝露直後の抗生物質の投与いがいに、吸入性の炭疽菌への効果的な治療は存在しない。時間の遅れとともに抗生物質の治療の効果は減少する。Dixon et al., Anthrax. N. Engl. J. Med.: 341, 815-826 (1999) は、炭疽菌感染で役割を果たす主な要因は炭疽菌の細胞障害性の影響、酸素と栄養物の欠如を引き起こす菌血症および最終的な臓器障害と死をともなう多様な細菌性および宿主毒性の生成物の蓄積であることを示している。
【０００４】
Brossier et al., Toxicon. 39: 1747-1755 (2001)は、３つの異なるたんぱく質（致死因子(LF)と化合し致死毒素（LeTx）を形成する防御抗原(PA)、または浮腫毒素(EdTx)を形成する浮腫因子(EF)）から二つの炭疽菌毒が形成されることを示している。LFおよびEFは細胞質ゾルの中の基質を標的にする酵素で、PAは７量体の細孔を形成し細胞膜を介する基質の輸送を促進させる。PAは負に荷電した内腔に対して環状形７量体に集まり、LFおよびEFを結合するために疎水性の表面を曝露する。Petosa et al., Nature 385: 833-838 (1997) はPA内腔の三次元構造を示している。
【０００５】
Karginov et al., FEMS Immun.Med. Microb. 40: 71-74 (2004)は、炭疽菌に感染したマウスを抗生物質シプロフロキサシンと部分的に精製された炭疽菌保護抗原に対する抗体を組み合わせた治療は抗体のみでの治療に比べ生存率を劇的に上昇させたことを示している。
【０００６】
抗体は有望ではあるが、潜在的により良い膜の浸透を提供しプロテアーゼに感受性のない低分子量の化合物と比較すると、有効な薬として魅力的とはいえない。
【０００７】
したがって、従来の抗生物質処置を補う新しい安全で効果的な治療が必要とされている。
【０００８】
本発明は従来の抗生物質による処置を補う、安全で効果的な新しい処置を提供する。第一側面では、本発明はPAによって形成された細孔をブロックするようにデザインされた炭疽毒の活性を抑制する低分子量化合物を提供する。本発明による高い親和力のPAの遮断薬は、β−シクロデキストリン誘導体（β−CD）である７つのD−グルコース単位を含み、PA細孔のように７量体対称性を含む環状の分子である。第二側面では、本発明は炭疽菌の毒性を抑制する方法を提供する。本発明のこの側面に記載の方法は本発明の第一側面による化合物を細胞に接触させることを含む。第三側面では、本発明は特定のβ−CDの誘導体を製造する新規な方法を提供する。
【０００９】
本発明は炭疽菌によって媒介される生体毒性からの保護に関する。本発明は従来の抗生物質処置を補う新しい安全で効果的な治療を提供する。ここで引用された引用文献はこの分野における知識の水準を反映し、それらの全体は参照によって取り入れられる。引用文献の教示と本明細書の詳細に矛盾がある場合、いかなる矛盾でも後者に有利なように解決される。
【００１０】
第一側面では、本発明はPAによって形成された細孔をふさぐようにデザインされ、炭疽毒の活動を抑制する低分子量化合物を提供する。本発明の高い親和力のPAの遮断薬は、好ましくはPA細孔のような７つのD−グルコース単位からなっていて、７量体対称性を含む環状の分子のβ−シクロデキストリン誘導体（β−CD）である。あるいはPA細孔のような７量体対称性を持った分子であるβ−CDに類似した分子も使われる。X線分析データによると、β−CDの外側の直径（１５．３Å）は２０〜３５ÅであるPAチャネル内腔の直径に相当し、前記チャネルを通る電流の流れの測定によれば、最も狭い点はおよそ１２Åである。代わりの環状分子は同程度のサイズでなければならない。
【００１１】
好ましいβ−CDの誘導体はβ−シクロデキストリンのヘプタ-６-アルキルアミノ誘導体を含む。前記PA細孔の内腔の大部分は負に荷電しているので、β−CDは多様なサイズの正に荷電した原子団を置換される。また正に荷電した原子団は内腔の内側のpHを局所的変更し、膜貫通型チャネルを形成するために必要な立体配置的な変化を妨げることもある。
【００１２】
好ましい化合物は式：
【化１】
2007538112.tif 000003
式中、
R2はH、OH、OAc、OMe、またはO(CH2CH2O)nであり；
R3はH、OH、OAc、OMe、OSO3NaまたはNH2であり；
R6はH、NH2、SCH2CH2NH2、SCH2CH2CH2NH2、SCH2CH2CH2CH2NH2 、I 、N3、SH、低級アルキル, S-アルキルグアニジル, O-アルキルグアニジル, S-アミノアルキル, O-アミノアルキル、アミノアルキル、アラルキル、アリール、ヘテロシクル酸環、またはOSO3Na
である、
で表される化合物である。
最も好ましくは、R6はH、NH2、SCH2CH2NH2、SCH2CH2CH2NH2またはSCH2CH2CH2CH2NH2である。  
【００１３】
本発明の意図する「低級アルキル」という語は１から７つの炭素原子を持つアルキル基である。「アルキル」および「アリール」の語は置換または未置換のアルキルまたはアリール基を含む。好ましい置換は、好ましくはアルキル基またはアリール基の置換で、一または二置換の、アミノ基を含む、窒素を含んでいる部分の置換を含むが、これに限定されるものではない。また、本発明の意図する「アルキル」という語は１または２以上の窒素原子と残りの炭素原子で１〜７の原子の連鎖を含む。
【００１４】
特に好ましいβ−CDの誘導体は図１に示されている。
【００１５】
第二側面では、本発明は炭疽菌の中毒影響を抑制する方法を提供する。この方法は本発明の第一側面に記載された化合物を細胞に接触させることを含む本発明のこの側面に記載の方法である。前記細胞は、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトの中のものである。
【００１６】
我々の構造にもとづく評価によって提案された４つのβ−シクロデキストリンのヘプタ-6-アルキルアミノ誘導体を合成した。これらおよび我々が合成したか、または他において得られたβ−シクロデキストリンの誘導体（図２に示す）については、それらのマウスのマクロファージ様細胞RAW 264.7へのLeTxの細胞障害性の影響を抑制する能力を調査した。
【００１７】
驚くべきことに、構造にもとづくデザインによって当初に提案されたアルキルアミノ誘導体のみが抑制活性を示し、低いミクロモル濃度（図３）でLeTxに対する保護を示した。これらの実験はこの化合物のIC50が4.4 mMほど低い一方で、２５M濃度までRAW 264.7に対して有毒でないことも示した（図３）。図１に示される残りの化合物は１００mM以下の濃度で抑制活性を示さなかった。
【００１８】
アルキルアミノ誘導体の一つのPrAmBC について平面二分子層油脂膜に再構築したPAチャネルを通るイオンコンダクタンスに対する阻害性を調べた。複数のPAチャネルをもつ二分子層油脂膜へのPrAmBCの膜透過性に著しい段階的な減少が前記化合物の３nM濃度で引き起こされた。
【００１９】
パー置換されたβ−シクロデキストリン誘導体は、７量体膜貫通型チャネルを形成するブドウ球菌溶血毒などの他の毒素を妨げるために利用できる可能性もある。６量体α−シクロデキストリンの誘導体についても、それぞれ消化性潰瘍病とHCV感染の病原性因子であると考えられる、ヘリコバクターピロリのVac A毒素またはＣ型肝炎ウイルスのｐ７たんぱく質などの６量体チャネルを形成し、標的に対する用途が見いだされるかもしれない。
【００２０】
第三側面では、本発明は特定のβ−CDの誘導体を製造する方法を提供する。アルキルアミノ基をβ−シクロデキストリンの一位に導入することは困難であると認証されていた。基本的なアルコラートは除去や分子内の置換を誘発するため、アルコラート求核剤（例えばアジドアルカノールから派生した）による直接のペルヨードβ−シクロデキストリンのアルキル化はいくつかの問題を伴う。パー−ヨード−β−シクロデキストリンからのヨウ化物アニオンスの求核置換は不十分な求核剤または高い温度を利用し分子内の置換反応に対して有利であり、パー−６−ヨード−β−シクロデキストリン内に３，６-アンヒドロ-D-グルコピラノース残基が生成される。酸素原子に対する硫黄原子の高い求核性を利用して、我々は目標の化合物１９の前駆物質を提供するためにハロゲノプロピオニトリルによるメルカプト基のアルキル化をともなうβ−シクロデキストリンの一位に硫黄原子の導入を利用した。この場合、補充的な保護や脱保護の工程は必要でない。
【００２１】
したがって、本発明は置換されたβ−シクロデキストリンを合成するための改善された方法として、ハロゲノプロピオニトリルによるメルカプト基のアルキル化をともなう、β−シクロデキストリンの一位に硫黄原子の導入を含むことによる改善を特徴とする方法を提供する。
【００２２】
以下の例は、本発明の特定の特に好ましい態様を例示することを目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００２３】
例１  β−シクロデキストリンの誘導体の合成
試薬  表１に記載されたβ−シクロデキストリン誘導体１〜７はPinnacle Pharmaceuticals, Inc. (Charlottesville, VA)で合成した。化合物１２および１３はCytrea Ltd (Dublin, Ireland)から購入された。β−シクロデキストリンのスルホ誘導体８〜１１はDr. Gyula Vigh (Texas A&M University, College Station, TX)から提供して頂いた。シクロデキストリン１４はSigma (St. Louis, MO)から購入した。大部分の試薬はAldrich Chemicals or Fisher Scientificから購入され更なる精製なしで使用した。アセトニトリルとジクロロメタンはCaH2から蒸留した。DMFは減圧下でCaH2から蒸留した。トリエチルアミンはP2O5から蒸留した。
【００２４】
分析 1H NMR および13C NMRスペクトルはGeneral Electric QE-300またはVarian 300分光計に記録した。水分に敏感な反応はオーブン乾燥したガラス製品の中のアルゴン下で行った。薄層クロマトグラフィー分析はMerk 60F254プレコートシリカゲルプレートで行った。視覚化は紫外線光によっておよび／またはホスホモリブデン酸または硫酸による染色によって行った。フラッシュクロマトグラフィー（４０〜６０μｍ）はシリカゲルを使っておこなった。
【００２５】
合成  シクロデキストリン２、３、４と５は標準的な手順によって準備した。
【００２６】
(2-フタルイミドエチル)イソチオウロニウム臭化水素酸塩（９）  N-(2-ブロモエチル)フタルイミド（６）（3.0 g、11.8 mmol）とチオ尿素（1.7 g、 22.37 mmol）の懸濁液を無水EtOH（5.7ｍL）の中で生成物が結晶化する18時間、環流で撹拌した。室温への冷却後、生成物はろ過、少量の冷却された無水EtOHでの洗浄、および真空下での乾燥によって集めた。化合物９（4.0 g、定量収率）は無色の結晶として得た。
【化２】
2007538112.tif 000004
【００２７】
(3-フタルイミドプロピル)イソチオウロニウム臭化水素酸塩（１０）  N-(3-ブロモプロピル)フタルイミド（7）(3.0 g、11 mmol)とチオ尿素(1.7 g, 22.37 mmol)の懸濁液を無水EtOH（5.3ｍL）の中で生成物が結晶化する18時間、環流で撹拌した。室温への冷却後、生成物はろ過、少量の冷却された無水EtOH(2 x 10 mL)とエーテル（10ml）での洗浄、および真空下での乾燥によって集めた。合成物１０（3.95g、定量収率）は無色の結晶として得た。
【化３】
2007538112.tif 000005
【００２８】
(4-フタルイミドブチル)イソチオウロニウム臭化水素酸塩（１１）  N-(4-ブロモブチル)フタルイミド（７）(1.0 g、3.5 mmol)とチオ尿素(540 mg、7.08 mmol)の懸濁液を無水EtOH (1.7 mL)の中、環流で撹拌した。予想したとおり、生成物は結晶化しなかった。しかし、室温まで冷却されると同時に、シロップの混合物は早い振動と撹拌の後結晶化を始めた。生成物をろ過および少量の冷却されたEtOHで洗浄することによって集める前にエーテル(4 mL)が加えられ混合物を１５分間撹拌した。化合物１１（1.22 g、96%）は無色の固体として得た。
【化４】
2007538112.tif 000006
【００２９】
ヘプタキス (2,3-ジ-O-アセチル-6-デオキシ-6-ヨード)シクロマルトヘプタオース（１４）  （Baer et al., Carbohydr. Res. 228: 307 1992を参照）。乾燥したピリジン（5ml）の中のパー-6-ヨード-β-シクロデキストリン(2) (1.0 g、0.52 mmol)の溶液にAc2O (7.5 mL)及び触媒の量のDMAP (6.5 mg、0.05 mmol)が加えた。この混合物を室温、アルゴン下で48時間撹拌した。MeOH (15 mL)の追加によって化学反応は消滅し、溶媒は減圧下で蒸発した。少量のMeOH (3 x 4 mL)とトルエン(3 x 4 mL)の共同蒸発は茶色の残留物を生成し、その茶色い残留物はシリカゲルカラム(20 x 3 cm)上で浄化した。グラジエントヘキサンEtOAc (1:1 to 1:4) による溶出はジエチルエーテルによって研和され結晶化した化合物１４(1.06 g、81%)を無色の固形物として生成した。
【化５】
2007538112.tif 000007
【００３０】
ヘプタキス[2,3-ジ-O-アセチル-6-デオキシ-6-(2-フタルイミドエチル)-チオ]シクロマルトヘプタオース（１５）  乾燥したDMF(20ml)の中のヘプタキス(2,3-ジ-O-アセチル-6-デオキシ-6-ヨード)シクロマルトヘプタオース（１４）(0.5 g、0.2 mmol)と(2-フタルイミドエチル)イソチオウロニウム臭化水素酸塩（９）(0.99 g、3.0 mmol)の溶液の中にCs2CO3 (1.63 g、5.0 mmol)を追加し、その混合物を室温、アルゴン下で48時間撹拌した。この混合物を氷(40g)の中にそそぎ、0.5 N HCl (200 mL)を追加した。ジクロロメタン(3 x 50 mL)によって水の層が抽出した。複合有機フェーズは0.5 N HCl (200 mL) とかん水 (100 mL)でうまく洗浄し、乾燥し（MgSO4）、減圧下で蒸発した。その残留物はEtOHで溶出するシリカゲルカラム(21 x 3 cm)で浄化し化合物１５(145 mg, 23%)を無色の固体として生成した。もう一つの画分(165mg)はわずかに混ざり物のある形で生成した。
【化６】
2007538112.tif 000008
【００３１】
ヘプタキス[2,3-ジ-O-アセチル-6-デオキシ-6-(3-フタルイミドプロピル)-チオ]シクロマルトヘプタオース（１６）  乾燥したDMF(10ml)の中のヘプタキス(2,3-ジ-O-アセチル-6-デオキシ-6-ヨード)シクロマルトヘプタオース（１４）(250 mg、0.1 mmol)と（3-フタルイミドプロピル） イソチオウロニウム臭化水素酸塩（１０）(472 mg, 1.37 mmol)の溶液に Cs2CO3 (687 mg、2.11 mmol)を追加し、その混合物を室温、アルゴン下で６８時間撹拌した。この混合物は氷(50g)の中にそそぎ、0.5 N HCl (100 mL)を追加した。ジクロロメタン(3 x 50 mL)によって水の層を抽出した。複合有機フェーズは0.5 N HCl (100 mL) とかん水 (100 mL)でうまく洗浄し、乾燥し（MgSO4）、減圧下で蒸発した。その残留物はEtOHで溶出するシリカゲルカラム(21 x 3 cm)で浄化し、化合物１６を無色の固体として生成した。
【化７】
2007538112.tif 000009
【００３２】
ヘプタキス [2,3-ジ-O-アセチル-6-デオキシ-6-(4-フタルイミドブチル)-チオ]シクロマルトヘプタオース（１７）  乾燥したDMF (16 mL)の中のヘプタキス (2,3-ジ-O-アセチル-6-デオキシ-6-ヨード)シクロマルトヘプタオース（１４）(404 mg, 0.16 mmol)と(4-フタルイミドブチル) イソチオウロニウム臭化水素酸塩（１１）(870 mg、2.42 mmol)の溶液にCs2CO3 (1.32 g、4.04 mmol)を追加し、その混合物を室温、アルゴン下で48時間撹拌した。この混合物を氷(50g)の中にそそぎ、0.5 N HCl (200 mL)を追加した。ジクロロメタン(3 x 50 mL)によって水の層を抽出した。複合有機フェーズは0.5 N HCl (100 mL) とかん水 (100 mL)でうまく洗浄し、乾燥し（MgSO4）、減圧下で蒸発した。その残留物はEtOHで溶出するシリカゲルカラム(18 x 3 cm)で浄化し、化合物１7（125 mg、24%）を無色の固体として生成した。もう一つの画分(132mg)はわずかに混ざり物のある形で生成した。
【化８】
2007538112.tif 000010
【００３３】
パー-6-(2-アミノエチルチオ)-β-シクロデキストリン（１８）  EtOH-H2O 1:1 (1.5 mL)の中で、化合物１５(100 mg、31.92 μmol)とヒドラジン一水和物(1.55 mL、31.92 mmol)の混合物を６０℃で１８時間撹拌した。溶媒は減圧下で蒸発され固形物を生成し、その固形物は1N HCl (5 mL)の中に懸濁され室温で８時間撹拌した。この不溶性の物質はろ過し、濾液は生成物が沈殿するまでアセトン（25ml）で薄めた。この上澄みは遠心分離によって除去し、生成物はアセトン(4 x 25 mL)で洗浄し、真空下で乾燥した。この化合物１８(46 mg、89%)は無色の固形物として得た。
【化９】
2007538112.tif 000011
【００３４】
パー-6-(3-アミノプロピルチオ)-β-シクロデキストリン（１９）  EtOH-H2O 1:1 (1.5 mL)の中で、化合物１６(100 mg、31.38 μmol)とヒドラジン一水和物(1.54 mL、31.78 mmol) の混合物を６０℃で１6時間撹拌した。溶媒は減圧下で蒸発し固形物を生成し、その固形物は1N HCl (5 mL)の中に懸濁し室温で４時間撹拌した。この不溶性の物質はろ過し、濾液は生成物が沈殿するまでアセトン（25ml）で薄めた。この上澄みは遠心分離によって除去し、生成物はアセトン(4 x 25 mL)で洗浄し、真空下で乾燥した。化合物１９(53 mg、85% yield)は無色の固形物として得た。
【化１０】
2007538112.tif 000012
【００３５】
パー-6-(4-アミノブチルチオ)-β-シクロデキストリン（２０）  EtOH-H2O 1:1 (1.2 mL)の中で、化合物１７(80 mg、25.31μmol)とヒドラジン一水和物(1.22 mL、25.31 mmol)の混合物を６０℃で２４時間撹拌した。溶媒は減圧下で蒸発され固形物を生成し、その固形物は1N HCl (5 mL)の中に懸濁し、室温で４時間撹拌した。この不溶性の物質はろ過し、濾液は生成物が沈殿するまでアセトン（25ml）で薄めた。この上澄みは遠心分離によって除去し、生成物はアセトン(4 x 25 mL)で洗浄し、真空下で乾燥した。化合物２０(40 mg、94%)は無色の固形物として得た。
【化１１】
2007538112.tif 000013
【００３６】
例２  細胞毒からの細胞の保護
組み換え型の炭疽菌致死因子（rLF）、浮腫因子（rRF）および防御抗原(rPA)はList Biological Laboratories, Inc. (Campbell, CA)から得た。マウスRAW 264.7単球マクロファージ細胞系ATCC TIB-71はAmerican Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)から得た。細胞は１０％熱不活性ウシ胎児血清100units/ml、100μg/mlペニシリンストレプトマイシン、0.1 mM非必須アミノ酸および0.5 mM2-メルカプトエタノールを補充したフェノールフリーなダルベッコ変法イーグル培地／Ham’s F-12 50/50 Mix (Mediatech, Inc., Herndon, VA, USA)の中で３７℃、二酸化炭素５％の状態で培養した。細胞はMediatech, IncのCellstripperTMを使って採取し、それから非酵素解離溶液を取り除くために培養液で一度洗浄した。RAW 264.7細胞はBecton Dickinson (San Jose, CA, USA)の９６穴平底組織培養プレートの中に105cells/wellの濃度で上に言及されたDMEM培養液に蒔き、二酸化炭素５％、３７℃で一晩培養した。RAW 264.7細胞は検査された化合物の異なる濃度とともに、３７℃、二酸化炭素５％の空気でDMEM培地の中で一時間あらかじめ培養した。そして、DMEM培地または培地の中のLeTx(LF=32ng/ml; PA=500ng/ml)を追加し、プレートは同じ状況下で４時間培養した。細胞生存能力はPromega (Madison, WI, USA)のMTSキットを使って推定した。Bio-Tek Instruments, Inc. (Winooski, VT, USA)のマイクロ定量分析分光光度計をOD570示度を得るために用いた。
【００３７】
例３  イオンコンダクタンスの抑制
イオンコンダクタンス実験はMontal and Mueller [14] with modifications [15,16]にしたがって行った。PAチャネルはDPhPCから生成される平面脂質膜に再構築し、この膜は0.1Mの KClおよび1 mM のEDTAを含んだpH6.6の溶液に浸した。PAチャネルを通るイオンコンダクタンスはPrAmBCの存在下で測った。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本発明に記載の合成物の実例を示す。
【図２】β-CD誘導体によるRAW264.7細胞のLeTxによって誘発される細胞死からの保護を示す。
【図３】抑制剤で処置されていない細胞の中で誘導されたLeTx効果のパーセンテージとして表した、LeTxの細胞変性効果の抑制を示す。
【図４】平面脂質膜に再構築したPAチャネルのイオンコンダクタンスの典型的な軌跡を示す。下向きの矢印は、PrAmBCの膜のシス面への添加を示す。
【図１】
2007538112.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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