(57)【要約】  本発明は前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別のための方法と核酸を提供する。これは、遺伝子パネルまたはそのサブセットの発現状態の分析によって実現される。
2007525208.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別のための、該被検者に由来する生体サンプルから分離したゲノムDNAを、1つまたは1組みの標的核酸の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを弁別しうる少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させ、以って前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別を少なくとも部分的に実現するステップを含む新規な方法であって、該標的核酸は各々、配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群よりそれぞれ選択される遺伝子配列またはゲノム配列の実質的に全部または一部を含み、また該連続ヌクレオチドは少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
被検者の前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別のための、該被検者に由来する生体サンプルから分離したゲノムDNAを、標的核酸たる配列番号1023の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを弁別しうる少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させ、以って前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別を少なくとも部分的に実現するステップを含む新規な方法であって、該連続ヌクレオチドは少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
被検者に由来する生体サンプルから分離したゲノムDNAを、1つまたは複数の標的核酸の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを弁別しうる少なくとも1つの試薬または一連の試薬と接触させるステップをさらに含み、該標的核酸は各々、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群よりそれぞれ選択される遺伝子配列またはゲノム配列の、実質的に全部または一部を含むことを特徴とする、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前立腺がん、前立腺がん腫または前立腺新生物が発見または弁別される請求項1および2に記載の方法。
【請求項５】
被検者の前立腺細胞増殖性疾患を発見および/または弁別するための、次のステップを含む方法: 
-  被検者から被検ゲノムDNAを含む生体サンプルを獲得するステップ; 
-  該ゲノムDNAまたはその断片を、該ゲノムDNAまたはその断片の少なくとも1つの標的配列の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチド配列を弁別するための1つまたは複数の試薬と接触させるステップであって、該標的配列は配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される配列の少なくとも16連続ヌクレオチドを含む配列を含むかまたは該配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることを、また該連続ヌクレオチドは少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むことを、特徴とするステップ; および
-  該弁別に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも1つの標的CpGジヌクレオチド配列のメチル化状態、または複数の標的CpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値を決定し、以って前立腺細胞増殖性疾患の発見を、または発見と弁別を、少なくとも部分的に実現するステップ。
【請求項６】
標的配列の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチド配列を弁別するステップは、該標的配列内の非メチル化シトシン塩基のウラシルへの、またはハイブリダイゼーション特性の点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基への、変換を含む請求項5に記載の方法。
【請求項７】
標的配列の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチド配列を弁別するステップは、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050、および該標的配列に対応するそれらの連続領域からなる群より選択される配列の内部での、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列の、対応する変換または非変換ジヌクレオチド配列へのメチル化状態依存的な変換または非変換のステップを含む、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
生体サンプルは細胞系、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精された精液、尿、血液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項5に記載の方法。
【請求項９】
標的配列の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチド配列を弁別するステップは、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸(PNA)分子の使用を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項１０】
連続配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチド配列を含む請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも2つの核酸分子またはペプチド核酸(PNA)分子の使用を含む請求項9に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも2つの核酸分子またはペプチド核酸(PNA)分子の、プライマーオリゴヌクレオチドとして使用であって、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050; それらの相補体; およびそれらの配列の該プライマーを含むまたは該プライマーとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする領域; からなる群より選択される配列の増幅のための使用を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも4つの核酸分子またはペプチド核酸(PNA)分子の使用を含む請求項9に記載の方法。
【請求項１４】
被検者の前立腺細胞増殖性疾患を発見するまたは発見および弁別するための、次のステップを含む方法:
a.  被検ゲノムDNAを含む生体サンプルを被検者から獲得するステップ; 
b.  該ゲノムDNAを抽出する、または他の方法で分離するステップ; 
c.  ステップb)のゲノムDNAまたはその断片を1つまたは複数の試薬で処理して5位非メチル化シトシン塩基をウラシルへと、またはハイブリダイゼーション特性の点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基へと、変換するステップ; 
d.  該処理ゲノムDNAまたはその処理断片を増幅酵素および少なくとも2つのプライマーと接触させるステップであって、該プライマーは各々、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含むこと、また該処理DNAまたはその断片は増幅されて少なくとも1つの増幅産物を生み出す、または増幅されないことを特徴とするステップ; および
e.  該増幅産物の存否または性質を基に、配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を、または配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される配列の複数のCpGジヌクレオチドの平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値を、決定し、以って前立腺細胞増殖性疾患の発見を、または発見と弁別を、少なくとも部分的に実現するステップ。
【請求項１５】
ステップc)でのゲノムDNAまたはその断片の処理は亜硫酸水素塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩およびそれらの組み合わせからなる群より選択される試薬の使用を含む請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
ステップd)での接触または増幅は、増幅酵素としての耐熱性DNAポリメラーゼの使用; 5’→3’エクソヌクレアーゼ活性を欠く酵素の使用; ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の使用; 検出可能な標識を付けた増幅産物核酸分子の生成; およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの方法の使用を含む請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
検出可能な増幅産物標識は蛍光標識; 放射性核種または放射性標識; 質量分析計で検出しうる増幅産物質量標識; 質量分析計で検出しうるシングルポジティブまたはシングルネガティブな正味電荷をもつ増幅産物、および検出可能な増幅産物断片質量標識; およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
被検者に由来する生体サンプルは細胞系、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精された精液、尿、血液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
ステップd)で、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む核酸分子またはペプチド核酸分子であって、そのハイブリダイゼーション相手となる核酸の増幅を抑制する働きをする少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子の使用をさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項２０】
核酸分子またはペプチド核酸分子は各々、5’→3’エクソヌクレアーゼ活性をもつ酵素による分解を受けないように5’末端が修飾されている請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
核酸分子またはペプチド核酸分子は各々、3’ヒドロキシル基を欠く請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
増幅酵素は5’→3’エクソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼである請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
ステップe)での決定は、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子のハイブリダイゼーションをさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1つのハイブリダイズする核酸分子またはペプチド核酸分子は固相に結合される請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
複数のハイブリダイズする核酸分子またはペプチド核酸分子が、直線状または実質的に直線状のアレイ、六角形または実質的に六角形のアレイ、四角形または実質的に四角形のアレイ、およびそれらの組み合わせからなるアレイ群より選択される核酸またはペプチド核酸アレイの形で固相に結合される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも1つのハイブリダイズした核酸分子を少なくとも1ヌクレオチド塩基分だけ伸張するステップをさらに含む請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
ステップe)での決定は増幅産物の配列決定を含む請求項14に記載の方法。
【請求項２８】
ステップd)での接触または増幅はメチル化特異的プライマーの使用を含む請求項14に記載の方法。
【請求項２９】
ステップd)で、1つまたは複数のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドの使用を含み、またステップe)で、
配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子のハイブリダイゼーション;
配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む、少なくとも1つの、固相に結合された核酸分子のハイブリダイゼーション;
配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む少なくとも1つの核酸分子のハイブリダイゼーション、および少なくとも1つの、そうしたハイブリダイズした核酸分子の少なくとも1ヌクレオチド塩基分の伸長; および
ステップe)での増幅産物の配列決定;
からなる群より選択される少なくとも1つの方法の使用をさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項３０】
ステップd)で、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む核酸分子またはペプチド核酸分子であって、そのハイブリダイゼーション相手となる核酸の増幅を抑制する働きをする少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子の使用を含み、またステップe)で、
配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子のハイブリダイゼーション;
配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む、少なくとも1つの、固相に結合された核酸分子のハイブリダイゼーション;
配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む少なくとも1つの核酸分子のハイブリダイゼーション、および少なくとも1つの、そうしたハイブリダイズした核酸分子の少なくとも1ヌクレオチド塩基分の伸長; および
ステップe)での増幅産物の配列決定;
からなる群より選択される少なくとも1つの方法の使用をさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項３１】
ステップd)で1つまたは複数のCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドによる増幅を含み、またステップe)で、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む少なくとも1つの、検出可能に標識した核酸分子のハイブリダイゼーションをさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項３２】
ステップd)で、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む核酸分子またはペプチド核酸分子であって、そのハイブリダイゼーション相手となる核酸の増幅を抑制する働きをする少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子の使用を含み、またステップe)で、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む少なくとも1つの、検出可能に標識した核酸分子のハイブリダイゼーションをさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項３３】
被検者の前立腺細胞増殖性疾患を発見するまたは発見および弁別するための、次のステップを含む方法:
a.  被検ゲノムDNAを含む生体サンプルを被検者から獲得するステップ; 
b.  該ゲノムDNAを抽出する、または他の方法で分離するステップ; 
c.  配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027、およびストリンジェントな条件の下でそれらとハイブリダイズする配列からなる群より選択される配列の少なくとも16連続ヌクレオチドを含むステップb)由来ゲノムDNAまたはその断片を、1つまたは複数のメチル化感受性制限酵素と接触させるステップであって、該ゲノムDNAがそれによって各切断認識モチーフにおいて消化されて消化断片を生成するか、またはそれによって消化されないことを特徴とするステップ; および
d.  該消化断片の存否または性質を基に、配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される配列の少なくとも1つのCpGジヌクレオチドのメチル化状態を、または配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される配列の複数のCpGジヌクレオチドの平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値を、決定し、以って前立腺細胞増殖性疾患の発見を、または発見と弁別を、少なくとも部分的に実現するステップ。
【請求項３４】
ステップd)での決定に先立って、消化または非消化ゲノムDNAの増幅をさらに含む請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
増幅は、増幅酵素としての耐熱性DNAポリメラーゼの使用; 5’→3’エクソヌクレアーゼ活性を欠く酵素の使用; ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の使用; 検出可能な標識を付けた増幅産物核酸分子の生成; およびそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも1つの方法の使用を含む請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
検出可能な増幅産物標識は蛍光標識; 放射性核種または放射性標識; 質量分析計で検出しうる増幅産物質量標識; 質量分析計で検出しうるシングルポジティブまたはシングルネガティブな正味電荷をもつ増幅産物、および検出可能な増幅産物断片質量標識; およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
被検者に由来する生体サンプルは細胞系、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精された精液、尿、血液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項33に記載の方法。
【請求項３８】
配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171に由来する処理済み核酸であって、該処理は該ゲノムDNA配列の少なくとも1つの非メチル化シトシン塩基をウラシルへと、またはハイブリダイゼーション特性がシトシンとは検出可能に異なる別の塩基へと、変換するのに好適であることを特徴とする処理済み核酸。
【請求項３９】
配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175およびそれらの相補配列からなる群より選択される処理済みゲノムDNA配列の少なくとも16連続ヌクレオチドを含む核酸であって、該処理は該ゲノムDNA配列の少なくとも1つの非メチル化シトシン塩基をウラシルへと、またはハイブリダイゼーション特性がシトシンとは検出可能に異なる別の塩基へと、変換するのに好適であることを特徴とする核酸。
【請求項４０】
連続塩基配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチド配列を含む請求項39および44に記載の核酸。
【請求項４１】
処理は亜硫酸水素塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩およびそれらの組み合わせからなる群より選択される試薬の使用を含む請求項39および44に記載の方法。
【請求項４２】
配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群より選択される処理済みゲノムDNA配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含むオリゴマー。
【請求項４３】
少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチド配列を含む請求項42に記載のオリゴマー。
【請求項４４】
各々請求項42または43のいずれか1項に記載の少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーセット。
【請求項４５】
被検者の前立腺細胞増殖性疾患の発見、または発見と弁別に有用なキットであって、
-  亜硫酸水素塩試薬またはメチル化感受性制限酵素のうちのすくなくとも1つ; および
-  配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的である、または中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を各々含む、少なくとも1つの核酸分子またはペプチド核酸分子;
を含むキット。
【請求項４６】
MS-SNuPE、MSP、MethyLight、HeavyMethyl、核酸配列決定法、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメチル化アッセイ法を実行するための標準試薬類をさらに含む請求項45に記載のキット。
【請求項４７】
請求項1〜37に記載の方法、請求項38〜41に記載の核酸、請求項42および43のいずれか1項に記載のオリゴマー、請求項44に記載のオリゴヌクレオチドセット、および請求項45および46に記載のキットの、前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は前立腺がん患者でヘテロ発現パターンの変化を示すヒトDNA配列に関する。本発明は特定の実施態様において、該疾患を患う個人の診断方法を提供する。
【０００２】
関連出願へのクロスリファレンス
本願は下記の出願について優先権の利益を主張する: 欧州特許出願第03090414.8号(出願日2003年12月01日); 欧州特許出願第04090040.9号(出願日2004年02月10日); 欧州特許出願第04090187.8号(出願日2004年05月10日);および欧州特許出願第04090292.6号(出願日2004年07月21日); 以上の関連出願は参照によりここにその全体が開示される。
【０００３】
配列表
配列表は米連邦規則集第37編1.52条(e)項(5)[37 C.F.R.§1.52(e)(5)]に従って“47675-95 Sequence Listing.txt”という名前の1.64MBテキスト・ファイルとしてコンパクト・ディスク(1/1)に収めた。同ファイルは参照によりここにその全体が開示される。
【背景技術】
【０００４】
異常DNAメチル化とがんの相関:  CpG「島」内の異常DNAメチル化は、広範囲の遺伝子の抑止または過剰発現につながるCpGジヌクレオチド配列の高メチル化または低メチル化を特徴とし、またヒト悪性腫瘍中に見られ該腫瘍と相関する最も初期の、最も一般的な変化の1つである。さらに、異常メチル化はある種の腫瘍に対応する遺伝子のイントロンおよびコード両領域内のCpGリッチ調節配列中に起こることが示されている。たとえば結腸がんでは異常DNAメチル化は最も顕著な変化の1つであり、また特にp14ARF、p16INK4a、THBS1、MINT2、MINT31といった多数のがん抑制遺伝子やhMLH1などのDNAミスマッチ修復遺伝子を不活性化する。
【０００５】
がん細胞では、がん抑制遺伝子の特異的高メチル化に加えてDNA全般の低メチル化を観察することもできる。こうした広範囲の低メチル化は早期に、明らかな腫瘍形成が起こるはるか前に、検出することができる。低メチル化と遺伝子発現増大の間の相関は多数のがん遺伝子で解明されている。
【０００６】
前立腺がん:  前立腺がんは米国では男性の最も一般的な悪性腫瘍であり(新患数は約20万人/年)、全世界では男性がん関連死因の第6位(約20万4,000人/年)を占める。前立腺がんは主に高齢者の疾患であり、60〜79歳の年齢層の男性は約16%がこの疾患をもつ。剖検での若干の推定によれば、80歳超の全男性の80%は何らかの前立腺疾患(がん、BPH、前立腺炎など)をもっている。BPH(良性前立腺肥大)は50歳以上の男性の約50%に、また75歳以上の男性の95%に存在する。これらの報告から明らかなように、前立腺がんは男性の死病というよりも死の道連れであることが多い。最近の証拠が示唆するところでは、前立腺がんの罹患率は実際には低下している模様であり、治療の改善、手術の改善、早期発見などの結果と思われる。
【０００７】
前立腺がんの診断; 分子的アプローチ:  前立腺がん検診に関する米国がん学会の現行ガイドラインは次のような内容となっている: 50歳で前立腺特異抗原(PSA)の血液検査を行い、また直腸指診(DRE)を受けるよう、健康管理の専門家は勧めるのがよい。アフリカ系アメリカ人や前立腺疾患の家族歴がある人々などの高リスク集団は45歳から検診を受け始めるのがよいとされる。前立腺の異常な病変を欠く男性は一般にPSA値が4ng/ml未満である。PSA値が4ng/ml〜10ng/ml(いわゆる「グレーゾーン」)の範囲内なら前立腺がんである確率は25%である。結果として、「DRE異常、PSAグレーゾーン」所見の男性は75%の確率で陰性の、すなわち一見無用の生検を受けることなる。このグレーゾーンを超えると、前立腺がんである確率は高くなり(>67%)、またPSA値の上昇に伴いさらに高まる。種々のPSA(%遊離PSA、PSA増加速度、PSA密度など)測定法があり、各々にがんの存在を発見する精度が対応している。しかし、検出技術の若干の改善や検診絡みの死亡率低下の報告にもかかわらず、偽陽性発生率は相変わらず高い。低特異度はBPHや前立腺炎に伴う血中PSAの上昇に由来する。
【０００８】
TRUSガイド下生検は前立腺がん診断の「至適基準」とみなされている。生検は異常PSA値および/またはDRE異常に基づいて推奨される。PSAには、高い割合の生検が不必要とされるようなグレーゾーンがある。それでも、このグレーゾーン(PSA値4.0〜10ng/ml)のがんの発見は生検抜きには不可能である。こうした低特異度のために、生検を受ける男性の75%はがんをもたない。しかし生検抜きではがんをもつ人々が見逃されるため、結果的に罹患率と死亡率を高めることになる。あいにく無用の生検には高いリスクも伴う。
【０００９】
分子マーカーには、ごく小さなサイズのサンプルおよび/または組織構造がもはや維持されていないサンプルでもきわめて効率的に分析しうるといった利点があろう。この10年間に、多数の遺伝子について良性前立腺肥大と種々の悪性度の前立腺がんの間の発現差が研究されてきた。しかし、前立腺がんの臨床診断に十分であると判明した単一マーカーはまだない。
【００１０】
あるいは、mRNAに基づく高次元アプローチが種々の腫瘍タイプおよび良性、悪性病変を弁別する、より優れた手段をもたらすかもしれない。しかし、臨床環境でのルーチン診断ツールとしてのその応用はmRNAの極端な不安定性、ある種の誘因(たとえばサンプル採取)が作用した後に急速に起こる発現の変化によって、および最も重要なことに、ルーチン生検ではしばしば獲得不可能であるほどの大量のmRNAが分析に必要とされることなどによって、阻まれている(たとえばLipshutz, R.J. et al., Nature Genetics 21:20-24, 1999; Bowtell, D.D.L., Nature Genetics Suppl. 21:25-32, 1999を参照)。
【００１１】
前立腺がんにおける遺伝子の異常メチル化はGstp1、AR、p16 (CDKN2a/INK4a)、CD44、CDH1などを含むいくつかの遺伝子ですでに観測されている。たとえばLINE-1反復配列のゲノム規模での低メチル化もまたすでに腫瘍進行に関連付けられている(Santourlidis, S., et al., Prostate 39:166-74, 1999)。
【００１２】
前立腺がんのメチル化マーカー:  グルタチオンS-トランスフェラーゼP遺伝子(GSTP1; アクセッション番号NM 000852)のコアプロモーター領域は前立腺腫瘍組織中で高メチル化状態にあることが示されている。グルタチオンS-トランスフェラーゼπ酵素は求電子性発がん物質の無害化に関与しており、また酵素活性の障害または低下(GSTP1障害)は新生物の、特に前立腺での発生に関連付けられてきた。GSTP1障害の機序は変異(GSTP*B対立遺伝子はがんリスクの増大に関連付けられてきた)およびメチル化を含む。しかし、Gstp1マーカーの使用に関しては、先行技術はメチル化状態の差異について解析を終えたGstp1プロモーターCpG配列の数に制限される。そのうえ、先行技術にはそうしたマーカーを使用して良性前立腺肥大と種々の悪性度の前立腺がんを弁別するための方法について開示、示唆または教示が何もない。
【００１３】
前立腺がんにおける遺伝子の異常メチル化はAR、p16 (CDKN2a/INK4a)、CD44、CDH1などを含むいくつかの他遺伝子ですでに観測されている。たとえばLINE-1反復配列のゲノム規模での低メチル化もまたすでに腫瘍進行に関連付けられている(Santourlidis, S., et al., Prostate 39:166-74, 1999)。
【００１４】
しかし、診断的に有用な、または他の面で臨床的に有用な、代用または補足マーカーとしてのこれらの遺伝子の、業務環境での使用は可能となるに至っていない。メチル化差異を示す遺伝子を臨床的に利用可能なプラットホームへと適用するには、そうした遺伝子の感度および特異度についての多大の研究がさらになお必要である。たとえば公知の転移抑制CD44遺伝子の場合には、下方制御は高メチル化と関係があった。しかし、この遺伝子は正常組織でもメチル化されるため、業務用マーカーとして使用することは不可能であった(Vis, et al., Mol Urol. 5:199-203, 2001)。
【００１５】
医療検査法の開発:  任意の医療検診および診断検査法に関する2つの評価的尺度は感度と特異度であり、それらは個々の罹患者をすべて正確に例外なく、また対象疾患のない非罹患者を誤って含めることなく、見分けられるという点での検査法の性能(陽性適中率)の尺度である。歴史的には、多数の診断検査法が感度と特異度の低さを批判されてきた。真陽性(TP)は検査が陽性であり、対象疾患も存在する場合である。偽陽性(FP)は検査が陽性であるが、対象疾患は存在しない場合である。真陰性(TN)は検査が陰性であり、対象疾患も存在しない場合である。偽陰性(FN)は検査が陰性であるが、対象疾患は存在しない場合である。
【００１６】
この場合: 感度=TP/(TP+FN); 特異度=TN/(FP+TN); および陽性適中率=TP/(TP+FP)。
【００１７】
感度は、個別患者の対象疾患を正しく発見するという点で検査性能の尺度である。感度の低い検査法では偽陰性すなわち実際には対象疾患があっても結果が陰性と出る患者の比率が高くなる。偽陰性の潜在的な危険は、そうした罹患者がある期間にわたり未診断・未治療状態におかれ、その間に治療が手遅れとなる段階まで疾患が進行しかねないことである。感度の低い検査法の例はタンパク質を基礎にしたHIV血液検査である。この種の検査が低感度であるのは、疾患が十分に確立し相当多数のウイルスが血流中に侵入してしまうまでウイルスの存在を検出できないためである。対照的に感度の高い検査法の例はPCR法を使用するウイルス負荷検査である。高感度になるのは、この種の検査ではごく少量のウイルスの検出が可能なためである。誤った診断を下した結果の重大性が高い場合は、高感度が特に重要である。
【００１８】
他方、特異度は非罹患者を正確に特定するという点での検査性能の尺度である。特異度の低い検査法では偽陽性すなわち実際には対象疾患がなくても陽性と出る患者の比率が高くなる。偽陽性の難点は患者に、患者の健康に悪影響が及びかねない無用の医療処置を、その付帯リスク、精神的経済的負担と共に強いることにある。特異度の高い診断検査法の開発を困難にしている疾患の特徴は、疾患の機序に、特にがんでは、しばしば複数の遺伝子およびタンパク質が絡むことである。また、ある種のタンパク質は病態とは無関係の理由で高レベルとなる場合がある。特異度の高い検査法の例は、p53変異の検出が可能な遺伝子ベースの検査法である。さらなる診断処置またはさらなる医療介入に付随するコストまたはリスクがきわめて高い場合は特異度が特に重要である。
【００１９】
PSA血液検査法は感度73%、特異度60%、陽性適中率31.5%である。PSA感度および特異度は高めることができるが、トレードオフを伴う。PSA感度を高めるには、「正常」PSA値をもっと若い年齢層に対応する低い値へと調整するかまたは個別患者の血清PSA値の経時的変化(PSA増加速度)を追跡すればよい。どちらの方法でもがん発見件数は増加しようが、生検を受ける男性の数も増加しよう。逆に、より高年齢層に対応した「正常」PSA値を採用する、%遊離PSAを採用する、または正常値を前立腺の容積を基準にして調整することにより、PSA感度を高めるという方法もある。これら3つの方法では無用な生検の数は減るが、若干のがんが見逃されるというリスクの増大を招く。
【００２０】
従って、感度、特異度および/または陽性適中率を高めた前立腺がん診断手段が求められていることは明らかである。
【００２１】
針生検による前立腺がん検査における(組織分析抜きの)定量的なメチル化特異的PCR(QMSP)検査法単独での感度と特異度の範囲はそれぞれ30〜89%、100%〜64%となっている(Harden et al. J Natl Cancer Inst 2003; 95: 1634-1637)。しかし、臨床的検診手段としてのこの検査法の陽性適中率は分析されなかった。そのうえ、血清と体液たとえば尿や唾液の遺伝子検査はがん発見のための生検の必要性を低下させ、従って最も効果的な検診または監視手段となろう。しかし、そうした検査法にはきわめて高い感度および特異度が要求されるよう。前立腺がん患者の尿沈渣のGstp1遺伝子高メチル化分析(Cairns, P et al. Clin Cancer Res 7:2727-30, 2001)によれば、生検腫瘍で高メチル化を示した個人22人中わずか6人が尿サンプルでも対応する高メチル化を示したにすぎない。
【００２２】
多面的アプローチ:  がん診断法は伝統的に単一分子マーカー(遺伝子変異、PSAレベルの上昇など)の検出に依存してきた。あいにく、がんは単一分子マーカーでは多数の病態を発見または弁別することに失敗してきた疾患である。こうして、単一マーカーだけを認識するアッセイ法は低い陽性適中率になることが示されてきた。本発明の基本的な面は、メチル化に基づくがん診断法とそうした疾患の検診、診断および治療監視が選り抜きの多重マーカーの使用により、単一マーカーを使用する最先端技術に著しい改善をもたらすと予想されることである。この多重化分析アプローチはがん診断法に特に好適である。がんは単純な疾患でなく、この多面的「パネル」アプローチは、がんの異質性と細胞学的にも臨床的にも整合するからである。
【００２３】
明白な技術的必要性:  前立腺肥大と前立腺がんの罹患率(前立腺肥大は50歳以上の男性の50%、75歳以上の男性の95%; 前立腺がんは10万人あたり180人)考慮すると、前立腺細胞増殖性疾患の早期診断につながる集団検診のための(たとえば生検や経直腸的超音波検査に代わる)高感度、高精度の非侵襲的な方法をもたらすために使用しうる分子マーカーの開発の技術的必要性はきわめて大きい。
【発明の開示】
【００２４】
本発明は前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別のための新規な方法を提供し、以って前立腺細胞増殖性疾患の早期診断特に前立腺がん、前立腺がん腫および前立腺新生物の発見のための新規な手段の必要性という長年の懸案に対処する。
【００２５】
本発明は、その発現が前立腺細胞増殖性疾患またはその特徴の存在を示す表26に記載の遺伝子パネル、ゲノム配列および/またはその調節領域の提供により、こうした年来の技術上の必要性に答える。特にそのCpG位置のメチル化状態は前立腺細胞増殖性疾患またはその特徴の存在を示す。提供されるのは、そのメチル化を分析すれば前立腺細胞増殖性疾患の発見が可能となるような、好ましい選り抜きの、または組み合わせの遺伝子である。
【００２６】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【００２７】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【００２８】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【００２９】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【００３０】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【００３１】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【００３２】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【００３３】
該前立腺細胞増殖性疾患は前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物であるのが特に好ましい。本発明はさらなる実施態様で、非がん性タイプの(BPHと正常前立腺を含む)前立腺組織と前立腺がん腫との弁別を目的とした方法および核酸を提供する。本発明はさらなる実施態様で、前立腺がんと正常前立腺組織、他組織に由来する組織、およびBPHとの弁別を目的とした方法および核酸を提供する。本発明はさらなる実施態様で、前立腺がんと他組織に由来するがんとの弁別を目的とした方法および核酸を提供する。
【００３４】
この分析を可能にするために、本発明は前立腺細胞増殖性疾患の発症に関連する生体サンプルのゲノムメチル化分析方法を提供する。該方法は配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群より選択される少なくとも1つの核酸またはその断片を、該ゲノム配列または関心配列内のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを弁別しうる一試薬または一連の試薬と接触させることを特徴とする。さらに、配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される少なくとも1つの核酸またはその断片を、該ゲノム配列または関心配列内のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを弁別しうる一試薬または一連の試薬と接触させるのが好ましい。
【００３５】
本発明の方法および核酸は前立腺細胞増殖性疾患の発見; 集団検診; 弁別; 監視; 発見および監視のうちの少なくとも1つに利用するのが特に好ましい。
【００３６】
本発明はゲノムDNAの遺伝的および/または非遺伝的パラメーターを解明するための方法を提供する。該方法は前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別の改良に有用である。本発明は最先端技術にいくつかの改善をもたらす。前立腺がん発見のためのメチル化アッセイ法は公知であるものの、前立腺細胞増殖性疾患の発見のための分子クラス分類システムはまだ存在していないし、また前立腺がん腫および新生物を良性疾患から正確に弁別するようなものもまだ存在してない。
【００３７】
検査サンプルの由来源は任意好適の由来源でよい。DNAサンプルの由来源は細胞または細胞系、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精された精液、尿、血液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択するのが好ましい。該由来源は生検、体液、射精された精液、尿または血液であるのが好ましい。
【００３８】
本発明は特に、前立腺細胞増殖性疾患を発見するための、次のステップを含む方法を提供する: ゲノム核酸を含む生体サンプルを獲得するステップ; 該核酸またはその断片を、被検核酸の標的配列内のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチド配列を弁別するに足る1つまたは複数の試薬に接触させるステップであって、該標的配列は配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の少なくとも16連続ヌクレオチドを含む配列を含むかまたは該配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることを、また該連続ヌクレオチドは少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むことを、特徴とするステップ; および該弁別に少なくとも部分的に基づいて、少なくとも1つの標的CpGジヌクレオチド配列のメチル化状態、または複数の標的CpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値を決定するステップ。
【００３９】
該標的配列は配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027の少なくとも16連続ヌクレオチドを含む配列を含むかまたは該配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、また該連続ヌクレオチドは少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むのが特に好ましい。
【００４０】
標的配列内のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチド配列の弁別は好ましくは、少なくとも1つの該CpGジヌクレオチド配列の、配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175、および該標的配列に対応するそれらの隣接領域からなる群より選択される配列内の対応する変換または無変換ジヌクレオチド配列への、メチル化状態依存性の変換または無変換ステップを含む。
【００４１】
追加の実施態様は、前立腺細胞増殖性疾患を発見および/または弁別するための、次のステップを含む方法を提供する: 被検ゲノムDNAを含む生体サンプルを獲得するステップ; 該ゲノムDNAを抽出するステップ; 該ゲノムDNAまたはその断片を1つまたは複数の試薬で処理して5位非メチル化シトシン塩基をウラシルへと、またはハイブリダイゼーション特性の点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基へと、変換するステップ; 該処理ゲノムDNAまたはその処理断片を増幅酵素および少なくとも2つのプライマーと接触させるステップであって、該プライマーは各々、配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的であるまたは中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含み、また該処理DNAまたはその断片は増幅されて増幅産物(an amplificate)を生み出す、または増幅ないことを特徴とするステップ; および該増幅産物の存否または性質を基に、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群より選択される少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を、または複数のCpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値を、決定するステップ。好ましくは、少なくとも1つのそうしたハイブリダイズする核酸分子またはペプチド核酸分子は固相に結合される。好ましくは、決定するステップは下記からなる群より選択される少なくとも1つの方法の使用を含む: 配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的であるまたは中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む少なくとも1つの核酸分子のハイブリダイゼーション; 配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的であるまたは中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む、少なくとも1つの、固相に結合された核酸分子のハイブリダイゼーション; 配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175およびその相補体からなる群より選択される配列と相補的であるまたは中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の連続配列を含む少なくとも1つの核酸分子のハイブリダイゼーション、および少なくとも1つの、そうしたハイブリダイズした核酸分子の少なくとも1ヌクレオチド塩基分の伸長; および増幅産物の配列決定。
【００４２】
さらなる実施態様は前立腺細胞増殖性疾患を分析および/または弁別するための、次のステップを含む方法を提供する: 被検ゲノムDNAを含む生体サンプルを獲得するステップ; 該ゲノムDNAを抽出するステップ; 配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171またはストリンジェントな条件の下でそれとハイブリダイズする配列からなる群より選択される1つまたは複数の配列を含む該ゲノムDNAまたはその断片を、1つまたは複数のメチル化感受性制限酵素と接触させるステップであって、該ゲノムDNAがそれによって消化されて消化断片を生成するか、またはそれによって消化されないことを特徴とするステップ; および少なくとも1つのそうした断片の存否または性質を基に、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群より選択される1つまたは複数の配列の、少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を、または複数のCpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値を、決定するステップ。好ましくは、該消化または非消化ゲノムDNAは該決定ステップの前に増幅する。
【００４３】
追加の実施態様は、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群より選択される配列内のシトシン・メチル化パターンを分析するための新規なゲノム核酸配列および化学修飾核酸配列、ならびにオリゴヌクレオチドおよび/またはPNA-オリゴマーを提供する。
【００４４】
発明の詳細な説明
用語の意味
用語「発現」は本明細書では遺伝子の転写と翻訳を意味するものとする。遺伝子の発現レベルは遺伝子の転写/翻訳レベルに関連する、または転写/翻訳レベルを指示する任意の因子たとえばメチル化、ヘテロ接合性の消失(以下、LOHともいう)、RNA発現レベルおよびタンパク質発現レベルなどのような因子の分析によって決定してもよい。
【００４５】
さらに、転写される遺伝子の活性は(SNPs、点突然変異、欠失、挿入、反復長、転位、および他の多型などを非限定的に含む)遺伝子突然変異を非限定的に含む遺伝的変異による影響を受ける場合もある。
【００４６】
用語「実測/予測比(O/E比)」は特定DNA配列内のCpGジヌクレオチドの出現頻度をいい、 [CpG部位数/(C塩基数×G塩基数)]に対応する。
【００４７】
用語「CpG島」はゲノムDNAの連続領域のうち、 (1) 実測/予測比>0.6に対応するCpGジヌクレオチドの出現頻度、および(2)「GC含量」>0.5という基準を満たすものをいう。CpG島は一般に、常にとは限らないが、鎖長が約0.2kb〜約1kbまたは〜約2kbである。
【００４８】
用語「メチル化状態」はあるDNA配列内の1つまたは複数のCpGジヌクレオチドにおける5-メチルシトシン (5-mCyt)の存否をいう。あるDNA配列内の1つまたは複数の特定CpGメチル化部位(各々2つのCpG CpGジヌクレオチド配列をもつ)におけるメチル化状態には「非メチル化」、「全メチル化」および「ヘミメチル化」がある。
【００４９】
用語「ヘミメチル化」はパリンドローム構造のCpGメチル化部位のメチル化状態であって、パリンドローム構造のCpGメチル化部位の2つのCpGジヌクレオチド配列のうちの一方の単一シトシンだけがメチル化されている状態をいう[たとえば5’-CCMGG-3’(トップ鎖): 3’-GGCC-5(ボトム鎖)]。
【００５０】
用語「AUC」は本明細書では曲線下面積の略語であり、特に受診者動作特性(ROC)曲線下面積をいう。ROC曲線は診断検査法の種々の可能なカットオフポイントに対応する真陽性率と偽陽性率の関係を示す曲線である。それは採用するカットオフポイントに応じた感度と特異度の間のトレードオフ関係を示す(感度の上昇には必ず特異度の低下が伴う)。ROC曲線下面積(AUC)は診断検査法の精度の尺度である(AUCは大きければ大きいほどよく、至適値は1である。無作為検査では面積が0.5になる対角線の上にROC曲線が重なろう; J.P. Egan, Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975を参照)。
【００５１】
用語「高メチル化」は、正常対照DNAサンプル中の対応するCpGジヌクレオチドに見られる5-mCyt量と比較した場合の、検査DNAサンプルのDNA配列内の1つまたは複数のCpGジヌクレオチドにおける5-mCytの存在量の増加に対応する平均メチル化状態をいう。
【００５２】
用語「低メチル化」は、正常対照DNAサンプル中の対応するCpGジヌクレオチドに見られる5-mCyt量と比較した場合の、検査DNAサンプルのDNA配列内の1つまたは複数のCpGジヌクレオチドにおける5-mCytの存在量の減少に対応する平均メチル化状態をいう。
【００５３】
用語「マイクロアレイ」は技術的に認められている広い意味での「DNAマイクロアレイ」と「DNAチップ」の両方をいい、技術的に承認されている諸々の固相担体を包摂し、またそれに核酸分子を付着させるための、またはその表面上で核酸分子を合成するための諸々の方法を包摂する。
【００５４】
「遺伝的パラメーター」は遺伝子およびその調節に必要とされるさらなる配列の突然変異および多型である。突然変異とされるのは特に挿入や欠失、点変異、逆位、多型、および特に好ましくはSNPs(一塩基多型)などである。
【００５５】
「非遺伝的パラメーター」は特にシトシンのメチル化である。さらなる非遺伝的パラメーターの例はヒストンのアセチル化であるが、それは開示の方法を使用して直接分析することができないものの、それはそれでDNAメチル化と相関する。
【００５６】
用語「亜硫酸水素塩試薬」は、本明細書で開示するようなメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチド配列の弁別に有用である、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素またはそれらの組み合わせを含む試薬をいう。
【００５７】
用語「メチル化アッセイ」はあるDNA配列内の1つまたは複数のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態を検定するための任意の方法をいう。
【００５８】
用語「MS-AP-PCR」(Methylation-Sensitive Arbitrarily-Primed Polymerase Chain Reaction)は技術的に認められた技術であって、CpGジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に重点を置くための、CGに富むプライマーの使用による大域的なゲノムスキャンを可能にする、かつGonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997で開示されている技術をいう。
【００５９】
用語「MethyLight（登録商標）」はEads et al., Cancer Res., 59:2302-2306, 1999で開示されている、技術的に認められた蛍光ベースのリアルタイムPCR技術をいう。
【００６０】
用語「HeavyMethyl （登録商標）」アッセイは本明細書で開示した実施態様では、増幅プライマーの間のCpG位置をカバーする、または増幅プライマーによってカバーされる、メチル化特異的ブロッキングプローブ(本明細書ではブロッカーともいう)が核酸サンプルのメチル化特異的選択増幅を可能にするアッセイをいう。
【００６１】
用語「HeavyMethyl （登録商標） MethyLight（登録商標）」アッセイは本明細書で開示した実施態様では、MethyLight（登録商標）アッセイを増幅プライマーの間のCpG位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと結合したMethyLight（登録商標）アッセイの変法であるHeavyMethyl（登録商標）MethyLight（登録商標）アッセイをいう。
【００６２】
用語「Ms-SNuPE」(Methylation-sensitive Single Nucleotide Primer Extension、メチル化感受性一塩基プライマー伸長)は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997で開示されている技術的に認められたアッセイをいう。
【００６３】
用語「MSP」(Methylation-specific PCR、メチル化特異的PCR)はHerman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996および米国特許第5,786,146号明細書で開示されている技術的に認められたアッセイをいう。
【００６４】
用語「COBRA」(Combined Bisulfite Restriction Analysis)はXiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2523-2534, 1997で開示されている技術的に認められたメチル化アッセイをいう。
【００６５】
用語「MCA」(Methylated CpG Island Amplification、メチル化CpG島増幅)はToyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999および国際公開第WO 00/26401A1号明細書で開示されているメチル化アッセイをいう。
【００６６】
用語「ハイブリダイゼーション」は、ワトソン-クリック型塩基対合に沿った、サンプルDNA中のオリゴヌクレオチドとその相補配列との結合による2本鎖構造の形成をいう。
【００６７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は本明細書での定義では、5×SSC/5×デンハーツ溶液/1.0%SDS中68℃でのハイブリダイゼーションと0.2×SSC/0.1%SDS中室温での洗浄、または技術的に認められているその等価物(たとえば2.5×SSCバッファーによる60℃でのハイブリダイゼーション、それに続く低濃度バッファーによる37℃での数回の洗浄、それに続く安定した状態での保持といった条件)を伴う。中程度にストリンジェントな条件は本明細書での定義では、3×SSC中42℃での洗浄または技術的に認められているその等価物を伴う。プローブと標的核酸の間の至適レベルの同一性を達成するためには塩濃度および温度のパラメーターを変えることができる。そうした条件に関する手引きについては、たとえばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; およびAusubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, N.Y.) at Unit 2.10に求めることができる。
【００６８】
用語「アレイ配列番号」、「合成アレイ配列番号」または「合成アレイ配列」は、被検アレイの諸々の個別連続配列の頭尾(5’→3’)線状合成体(たとえば配列番号1〜配列番号71の、同じ順序による頭尾合成体)を含む仮想上または非仮想上の配列をいう。
【００６９】
用語「アレイ配列番号ノード」、「合成アレイ配列番号ノード」または「合成アレイ配列ノード」は「アレイ配列番号」、「合成アレイ配列番号」または「合成アレイ配列」の任意の2連続配列間の接続部をいう。
【００７０】
合成アレイ配列に関連して、語句「連続ヌクレオチド」は合成アレイの任意の個別連続配列の連続配列領域をいうが、合成アレイ配列の前記「ノード」を含む領域は含まない。
【００７１】
概観
本発明は、前立腺細胞増殖性疾患の発症に関連するメチル化パターンの分析に新規な有用性をもつ分子遺伝学的マーカーを提供する。本発明の方法および核酸は前立腺細胞増殖性疾患の発見; 集団検診; 弁別; 監視; 発見および監視のうちの少なくとも1つに利用するのが特に好ましい。
【００７２】
DNAの亜硫酸水素塩修飾は技術的に認められているCpGメチル化状態評価手段である:  5-メチルシトシンは真核細胞DNA中の最も頻繁な共有結合塩基修飾である。それはたとえば転写調節、ゲノムインプリンティングおよび腫瘍形成に関係する。従って、遺伝情報の構成要素としての5-メチルシトシンの同定は大いに重要である。しかし5-メチルシトシンは配列決定によって同定することができない。5-メチルシトシンの塩基対合挙動はシトシンと変わらないからである。しかも、5-メチルシトシンがもっている非遺伝的情報はたとえばPCR時に完全に消失してしまう。
【００７３】
5-メチルシトシンの存否に関するDNA分析に最も頻繁に使用される方法は亜硫酸水素塩のシトシンとの特異的反応に基づくものであり、そこでは後続のアルカリ性加水分解によりシトシンがその塩基対合挙動においてチミンに対応するウラシルに変換される。しかし重要なことに、5-メチルシトシンはこれらの条件下で無変化のままである。結果として元のDNAが変換されて、メチルシトシンがそのハイブリダイゼーション挙動によってシトシンとは本来弁別しえないのに、標準的な、技術的に認められている分子生物学的技法により、たとえば増幅+ハイブリダイゼーション法により、または配列決定法により、唯一の残存シトシンとして検出しうるようになる。これらの技法はみな、今日では十分に生かすことができる差別的な塩基対合特性に基づく。
【００７４】
公知技術は感度の点からは、被検DNAをアガロースマトリックス中に入れて、DNAの拡散および復元を防ぐようにする(亜硫酸水素塩は1本鎖DNAとだけ反応する)ステップ、および諸々の沈殿・精製ステップを高速透析に取り替えるステップを含む方法によって特徴付けられる[Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis(亜硫酸水素塩使用のシトシン・メチル化分析のための改良方法), Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996]。従って、個別細胞についてメチル化状態を分析することが可能であり、該方法の有用性と感度は明らかである。5-メチル化シトシン検出のための技術的に認められている方法の概説はRein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998が行っている。
【００７５】
この亜硫酸水素塩法は少数の例外(Zeschnigk M, et al., Fur J Genet. 5:94-98, 1997)を除いて、現在、研究にしか使用されていない。いずれの場合にも、既知遺伝子の短い特異的断片を亜硫酸水素塩処理後に増幅して、完全な配列決定(Olek & Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997)と1つまたは複数のプライマー伸長反応(Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997; 国際公開第WO 95/00669号明細書; 米国特許第6,251,594号明細書)を行って個別シトシン位置を分析するか、または酵素的消化により処理するかである(Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-34, 1997)。ハイブリダイゼーションによる検出もまた開示されている(Olek et al. 国際公開第WO 99/28498号明細書)。加えて、個別遺伝子に関するメチル化の検出への亜硫酸水素塩法の使用も開示されている(Grigg & Clark, Bioassays, 16:431-6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997; Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994; Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995; 国際公開第WO 9746705号およびWO 9515373号明細書)。
【００７６】
本発明は一態様で、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群に由来する配列内のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態の判定への、亜硫酸水素塩法の、1つまたは複数のメチル化アッセイとの組み合わせによる使用を提供する。
【００７７】
本発明によれば、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群に由来する配列内のCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態の判定は前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別に有用である。
【００７８】
メチル化アッセイ法:  種々のメチル化アッセイ法が技術上周知であり、また本発明と併用可能である。これらのアッセイはあるDNA配列内の1つまたは複数のCpGジヌクレオチドのメチル化状態の判定を可能にする。そうしたアッセイの一例は亜硫酸水素塩処理DNAのDNA配列決定、(配列特異的増幅のための)PCR、サザンブロット法、およびメチル化感受性制限酵素の使用などである。
【００７９】
たとえばゲノム配列決定は亜硫酸水素塩処理の使用により、DNAメチル化パターンおよび5-メチルシトシン分布の分析用に単純化されるに至った(Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992)。加えて亜硫酸水素塩変換DNAに由来するPCR増幅産物の制限酵素消化が使用される。たとえばSadri & Hornsby(Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996)が開示している方法、またはCOBRA(Combined Bisulfite Restriction Analysis) (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-34, 1997)。
【００８０】
COBRA:  COBRA（登録商標）分析は少量のゲノムDNAにおける特定遺伝子座のDNAメチル化度の決定に有用な定量的メチル化アッセイである(Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-34, 1997)。簡単に言えば、亜硫酸水素ナトリウムで処理したDNAのPCR産物におけるメチル化依存性配列差を制限酵素消化により明らかにするものである。まずFrommerら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992) が開示している方法に従って標準亜硫酸水素塩処理によりメチル化依存性配列差をゲノムDNA中に導入する。次に関心CpG島に対して特異的なプライマーを使用して亜硫酸水素塩変換DNAのPCR増幅を行い、以下、制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、および特異的標識ハイブリダイゼーションプローブの使用による検出へと続く。元のDNAサンプルのメチル化度は消化および非消化PCR産物の相対量により、広範囲のメチル化度にわたり、線形定量的に表示する。さらに、この手法はマイクロダイセクションしたパラフィン包埋組織サンプルから得られたDNAに確実に適用することもできる。
【００８１】
COBRA（登録商標）分析用の一般的な試薬[たとえば一般的なCOBRA（登録商標）分析系キットに見られるような試薬]の非限定的な例は特定遺伝子(または亜硫酸水素塩処理DNA配列またはCpG島)用のPCRプライマー; 制限酵素と適切なバッファー; 遺伝子ハイブリダイゼーション用オリゴ; 対照ハイブリダイゼーション用オリゴ; オリゴプローブ用キナーゼ標識キット; および標識ヌクレオチドなどである。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬の例はDNA変性用バッファー; スルホン化用バッファー; DNA回収試薬またはキット(沈殿法、限外ろ過法、アフィニティーカラム法など); 脱スルホン化用バッファー; およびDNA回収用の構成要素などである。
【００８２】
好ましくは、MethyLight（登録商標）(蛍光ベースのリアルタイムPCR法)(Eads et al., Cancer Res., 59:2302-2306, 1999)、Ms-SNuPE（登録商標）(メチル化感受性一塩基プライマー伸長)反応法(Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997)、メチル化特異的PCR法(MSP ; Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 米国特許第5,786,146号明細書)、およびメチル化CpG島増幅法(MCA; Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999)は単独で、またはこれらのうち他の方法と組み合わせて、使用する。
【００８３】
MethyLight（登録商標）: MethyLight（登録商標）法は、PCRステップ後にさらなる操作を必要とする蛍光ベースのリアルタイムPCR法[TaqMan（登録商標）](Eads et al., Cancer Res., 59:2302-2306, 1999)を使用したハイスループットの定量的メルチ化アッセイである。簡単に言えば、MethyLight（登録商標）法ではまず混合ゲノムDNAサンプルを、標準的な方法により亜硫酸水素ナトリウム反応でメチル化依存性配列差のある混合プールへと変換する(亜硫酸水素塩法は非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する)。次いで蛍光ベースのPCRを(既知CpGメチル化部位と重複しないプライマーによる)「バイアスのない」PCR反応または(既知CpGメチル化部位と重複するPCRプライマーによる)「バイアスのある」反応のいずれかで行う。配列差別は増幅法のレベル、蛍光検出法のレベル、または両レベルのいずれで起きてもよい。
【００８４】
MethyLight（登録商標）法はゲノムDNAサンプルのメチル化パターンの定量的検定法として使用してもよい。その場合、配列差別はプローブ・ハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量的検定法では、PCR反応は特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下にバイアスのない増幅をもたらす。インプットDNA量に関するバイアスのない対照は、プライマー、プローブいずれもどのCpGジヌクレオチドとも重ならないような反応によってもたらされる。あるいは定量的なゲノムメチル化検定法は、バイアスのあるPCRプールを、既知メチル化部位を「カバー」しない対照オリゴヌクレオチドでプローブするか(蛍光ベース型のMSP法)、または潜在メチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドでプローブすることにより、実現される。
【００８５】
MethyLight（登録商標）法では増幅法にTaqMan（登録商標）プローブを使用することができる。たとえば2本鎖ゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、TaqMan（登録商標）プローブを使用して2組のPCR反応のうちの1組[たとえばバイアスのあるプライマーとTaqMan（登録商標）プローブを使用する反応またはバイアスのないプライマーとTaqMan（登録商標）プローブを使用する反応]にかける。TaqMan（登録商標）プローブは蛍光「レポーター」および「クエンチャー」分子で二重標識してあり、また比較的高GC含量の領域に対して特異的にし、PCRサイクルにおいて順方向または逆方向プライマーよりも約10℃高温で融解するよう設計してある。これにより、TaqMan（登録商標）プローブはPCRアニーリング/伸長ステップで完全にハイブリダイズした状態を保つことができる。TaqポリメラーゼはPCRで新鎖を酵素的に合成していくと最終的には、アニールしたTaqMan（登録商標）プローブに到達するであろう。するとTaqポリメラーゼ5’→3’エンドヌクレアーゼの作用でTaqMan（登録商標）プローブは消化されて排除されるが、その際に蛍光レポーター分子が放出され、それによってその時点でまだクエンチされていないシグナルが、リアルタイム蛍光検出システムにより定量的に検出されることになる。
【００８６】
MethyLight（登録商標）分析用の一般的な試薬[たとえば一般的なMethyLight（登録商標）分析系キットに見られるような試薬]の非限定的な例は特定遺伝子(または亜硫酸水素塩処理DNA配列またはCpG島)用のPCRプライマー; TaqMan（登録商標）プローブ; 最適化されたPCRバッファーおよびデオキシヌクレオチド; およびTaqポリメラーゼなどである。
【００８７】
Ms-SNuPE:   Ms-SNuPE（登録商標）法は特定CpG部位のメチル化差を、DNAの亜硫酸水素塩処理とそれに続く一塩基プライマー伸長に基づいて評価する方法である(Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997)。簡単に言えば、ゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて非メチル化シトシンをウラシルに変換する一方で、5-メチルシトシンは無変化のままにしておく。次いで亜硫酸水素塩処理DNAに対して特異的なプライマーを使用して所期標的配列の増幅を行い、増幅産物を単離し、関心CpG部位のメチル化分析用鋳型として使用する。少量のDNA(たとえばマイクロダイセクションした病理切片)を分析することができるし、またCpG部位のメチル化状態の判定に制限酵素を使用しないですむ。
【００８８】
Ms-SNuPE（登録商標）分析用の一般的な試薬[たとえば一般的なMs-SNuPE（登録商標）分析系キットに見られるような試薬]の非限定的な例は特定遺伝子(または亜硫酸水素塩処理DNA配列またはCpG島)用のPCRプライマー; 最適化されたPCRバッファーおよびデオキシヌクレオチド; ゲル抽出キット; 陽性対照プライマー; 特定遺伝子用のMs-SNuPE（登録商標）プライマー; 反応バッファー(Ms-SNuPE反応用);および標識ヌクレオチドなどである。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬の例はDNA変性用バッファー; スルホン化用バッファー; DNA回収試薬またはキット(沈殿法、限外ろ過法、アフィニティーカラム法); 脱スルホン化用バッファー; およびDNA回収用成分などである。
【００８９】
MSP:  MSP(メチル化特異的PCR)法はCpG島内のほぼ任意のCpG部位群のメチル化状態の評価を、メチル化感受性制限酵素の使用とは無関係に、可能にする(Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; 米国特許第5,786,146号明細書)。簡単に言えば、DNAを亜硫酸水素ナトリウムで修飾して(メチル化シトシンではなく)非メチル化シトシンをすべてウラシルに変換し、次いでメチル化対非メチル化DNAに対して特異的なプライマーで増幅する。MSP法は少量のDNAを必要とするだけであり、任意のCpG島遺伝子座の0.1%メチル化対立遺伝子に対して感受性があり、またパラフィン包埋サンプルから抽出したDNAにも有効である。MSP分析用の一般的な試薬[たとえば一般的なMSP分析系キットに見られるような試薬]の非限定的な例は特定遺伝子用メチル化および非メチル化PCRプライマー、最適化されたPCRバッファーおよびデオキシヌクレオチド、および特異的プローブなどてある。
【００９０】
MCA:  MCA法はゲノムDNAのメチル化パターンの変化をスクリーニングしこれらの変化に関連する特定配列を単離するために使用しうる方法である(Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999)。簡単に言えば、認識部位のシトシン・メチル化に対する感受性の異なる制限酵素を使用して、原発がん、細胞系、および正常組織に由来するゲノムDNAを消化し、次いでAP(Arbitrarily-Primed)-PCR増幅を行う。PCR産物を高分解能ポリアクリルアミドゲルで分解後に、メチル化差異を示す断片をクローン化し、配列決定する。次いでクローン化断片をサザン分析用のプローブとして使用して、これらの領域のメチル化差異を確認する。MCA分析用の一般的な試薬[たとえば一般的なMCA分析系キットに見られるような試薬]の非限定的な例はゲノムDNAを任意にプライミングするためのPCRプライマー; PCRバッファーおよびヌクレオチド; 制限酵素および適切なバッファー; 遺伝子ハイブリダイゼーション用オリゴまたはプローブ; 対照ハイブリダイゼーション用オリゴまたはプローブなどである。
【００９１】
ゲノム配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171と、配列番号60〜295、配列番号1029〜1076、配列番号1117〜1120、配列番号1172〜1175に対応するその非天然型処理変異体は大腸がん細胞増殖性疾患の発見、クラス分類および/または監視に新規な有用性をもつと判明。
【００９２】
本発明は一実施態様で、被検者の前立腺細胞増殖性疾患を発見および/または発見・弁別する方法を提供する。該方法は次のステップを含む: 
i)  表26に記載の1つまたは複数の遺伝子または遺伝子配列の、および/またはその調節領域の、発現レベルを決定する; 
ii) 該発現レベルに従って前立腺細胞増殖性疾患の存否を決定する。
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【００９３】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【００９４】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【００９５】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【００９６】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【００９７】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【００９８】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【００９９】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１００】
該発現レベルはメチル化、ヘテロ接合性の消失(以下、LOHともいう)、RNA発現レベルおよびタンパク質発現レベルなどの分析を非限定的に含む、技術上の標準となっている任意の手段によって決定してもよい。
【０１０１】
該遺伝子および/または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析によって、mRNA発現分析またはタンパク質発現分析によって可能となろう。しかし、本発明の最も好ましい実施態様では、前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別は、該遺伝子またはゲノム配列およびそのプロモーターまたは調節配列のメチル化状態の分析によって可能となる。遺伝子メチル化の分析方法については本明細書で開示している。
【０１０２】
一実施態様では、該方法は表26に記載の遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子またはゲノム配列の、前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別のためのマーカーとしての使用を含む。
【０１０３】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【０１０４】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【０１０５】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１０６】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１０７】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【０１０８】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１０９】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１１０】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１１１】
該遺伝子および/または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析によって、mRNA発現分析またはタンパク質発現分析によって可能となろう。しかし、本発明の最も好ましい実施態様では、前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別は、該遺伝子またはゲノム配列およびそのプロモーターまたは調節配列のメチル化状態の分析によって可能となる。遺伝子メチル化の分析方法については本明細書で開示している。
【０１１２】
表26記載の遺伝子、ゲノム配列またはゲノム配列によって調節される遺伝子のmRNA異常発現レベルは前立腺細胞増殖性疾患の存在に関連する。従って、該遺伝子または配列の発現レベルの上昇または低下は前立腺細胞増殖性疾患の存在に関連する因子に関連付けることが可能であり、またそうした疾患のサブタイプを示唆する。
【０１１３】
前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別ステップで遺伝子またはゲノム配列をコードするmRNAを検出するために、患者からサンプルを獲得する。該DNAサンプルの由来源は細胞または細胞系、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精された精液、尿、血液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択するのが好ましい。該由来源は生検、体液、射精された精液、尿または血液であるのが好ましい。該サンプルは処理してその中に含まれる核酸を抽出するようにしてもよい。サンプルから得られた核酸はゲル電気泳動法または他の分離法にかける。検出はサンプル中の核酸特にmRNAをハイブリッド2本鎖形成用のプローブとして機能するDNA配列と接触させるステップを含む。ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーはハイブリダイゼーション時および洗浄時の温度、イオン強度、持続時間、ホルムアミド濃度などを含む多数の因子によって決まる。これらの因子についてはたとえばSambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., 1989)で概説されている。形成される2本鎖の検出は通常、標識プローブの使用によって実現される。あるいは、プローブは無標識でも、直接間接に標識したリガンドとの特異的結合により検出しうるようにしてもよい。プローブおよびリガンドを標識するための好適な標識と標識法は技術上周知であり、たとえば公知の方法(たとえばニックトランスレーション法、キナーゼ法)によって導入してもよい放射性標識、ビオチン、蛍光残基、化学発光残基(たとえばジオキシエタン、特にトリガー試薬処理したジオキシエタン)、酵素、抗体などを含む。
【０１１４】
該遺伝子またはゲノム配列から転写されたmRNAの、サンプル中の検出感度を高めには、逆転写-PCR法を用いて該mRNAから転写されたcDNAを増幅することができる。この逆転写-PCR法は技術上周知である(たとえば前掲Watson and Flemingを参照)。
【０１１５】
逆転写-PCR法は次の要領で行うことができる。全細胞RNAをたとえば標準イソチオシアン酸グアニジウム法で単離し、全RNAを逆転写する。この逆転写法は逆転写酵素と3'末端プライマーの使用によるRNA鋳型上でのDNA合成を伴う。一般に、該プライマーはオリゴ(dT)配列を含む。こうして生成したcDNAを次にPCR法とEYA4特異的プライマーを使用して増幅する(Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.152, pp.316-325, 1987。これらは参照をもって開示される)。
【０１１６】
表26記載の遺伝子、ゲノム配列またはゲノム配列よって調節される遺伝子がコードするポリペプチドの異常発現レベルは前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別に関連する。従って、該ポリペプチドの過剰または過少発現は前立腺がん腫、前立腺新生物および他の前立腺細胞増殖性疾患の存在に関連づけることができる。
【０１１７】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【０１１８】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【０１１９】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１２０】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１２１】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【０１２２】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１２３】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１２４】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１２５】
技術上周知の任意のタンパク質検出法が使用できる。そうした検出法の非限定的な例は免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学法、バインダー-リガンド・アッセイ、免疫組織化学法、凝集および補体アッセイなどである。(たとえばBasic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn. pp.217-262, 1991を参照。これは参照をもって開示される。) 好ましいのは、抗体をエピトープと反応させてその標識タンパク質または誘導体と競合的に取って代わるステップを含むバインダー-リガンド・イムノアッセイ法である。
【０１２６】
本発明のある種の実施態様は、表26に記載のゲノム領域の諸々の遺伝子およびゲノム配列からなる群の遺伝子またはゲノム配列によってコードされるポリペプチドに対して特異的な抗体の使用を含む。
【０１２７】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【０１２８】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【０１２９】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１３０】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１３１】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【０１３２】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１３３】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１３４】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１３５】
そうした抗体は、患者の前立腺疾患マーカーの発現レベルを健常者の同じマーカーの発現と比較することによる検出用途に有用であろう。実施態様によっては、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生を、コードされたポリペプチドを抗原として使用することにより、誘発することができる。そうした抗体はヒト疾患マーカーとしての発現タンパク質の検出に使用することができる。末梢血または組織サンプル中のそうしたタンパク質の存在量は慣用の方法により定量化されよう。抗体-タンパク質結合は蛍光または放射性リガンドによる標識などのような、技術上周知の多様な手段によって検出し定量化してよい。本発明はさらに、前述の方法を実行するためのキットを含む。そうしたキットは被検ポリペプチド特異的な抗体を含む。
【０１３６】
多数の競合的および非競合的タンパク質結合イムノアッセイが技術上周知である。そうしたアッセイに使用する抗体は凝集試験の場合のように無標識でもよいし、また多様なアッセイ法の場合のように有標識でもよい。使用可能な標識の例はラジオイムノアッセイ(RIA)用、酵素イムノアッセイたとえば酵素抗体法(ELISA)用、蛍光イムノアッセイ用などの放射性核種、酵素、発蛍光体、化学発光体、酵素基質または補因子、酵素阻害物質、粒子、色素などである。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、またはそのエピトープは技術上周知の多数の方法のうち任意の方法によりイムノアッセイ用につくることができる。あるタンパク質に対する抗体を作製するための1つのアプローチは該タンパク質の一部または全部のアミノ酸配列の選定と作製、該配列の化学合成と然るべき動物通常はウサギまたはマウスへの注入である(Milstein and Kohler, Nature 256:496-497, 1975; Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981. これらは参照により開示される)。ポリペプチドまたはそのエピトープの作製方法の非限定的な例は化学合成、組み換えDNA手法、または生体サンプルからの分離などである。
【０１３７】
特に好ましい実施態様では、表26記載の遺伝子および/またはゲノム配列の発現レベルは該遺伝子、ゲノム配列および/またはその調節領域のメチル化レベルの分析によって決定される。
【０１３８】
該分析は次のステップを含む:
i)  被検者から得られたゲノムDNAに、該ゲノムDNAの少なくとも1つの標的領域の内部のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを弁別しうる少なくとも1つの試薬または一連の試薬を接触させるステップであって、該連続ヌクレオチドは少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含むことを特徴とするステップ;
ii)  i)で分析した該標的列配のメチル化状態に従って前立腺細胞増殖性疾患の存否および/またはそのクラス分類を決定するステップ。
【０１３９】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【０１４０】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【０１４１】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１４２】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１４３】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【０１４４】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１４５】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１４６】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１４７】
該メチル化分析の第1ステップでは、分析対象のゲノムDNAを分離する。ゲノムDNAの分離には市販キットの使用など技術上の標準である任意の手段を用いてよい。簡単に言えば、関心DNAが細胞膜に包まれている場合には、生体サンプルを酵素的、化学的または機械的な手段より破壊し、溶解しなければならない。次いでDNA溶液からタンパク質や他の不純物をプロテイナーゼKによる消化などによって除去し、該溶液からDNAを回収する。これは、塩析、有機抽出または固相担体へのDANの結合などを含む多用な方法で行うことができる。方法の選択は所要時間、費用およびDNA所要量などいくつかの因子により左右されよう。
【０１４８】
DNAサンプルの由来源は細胞または細胞系、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精された精液、尿、血液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択するのが好ましい。該由来源は生検、体液、射精された精液、尿または血液であるのが好ましい。
【０１４９】
次にゲノムDNAサンプルを処理して、5’位がメチル化されていないシトシン塩基がウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動がシトシンとは異なる別の塩基に変換されるようにする。これは本明細書では「処理」として理解されよう。
【０１５０】
前記のゲノムDNA処理は亜硫酸水素塩(亜硫酸水素、二亜硫酸塩)で、次にアルカリ性加水分解で行われ、非メチル化シトシン核酸塩基がウラシルへと、またはシトシンとは塩基対合挙動を異にする別の塩基へと、変換される結果になるのが好ましい。
【０１５１】
次に、処理したDNAを分析して、前立腺細胞増殖性疾患の存在に関連するおよび/またそうした疾患のサブタイプを示唆する1つまたは複数の(処理前の)標的遺伝子配列のメチル化状態を判定するようにする。該標的領域は表26に記載の遺伝子およびゲノム配列からなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子またはゲノム配列の少なくとも16連続ヌクレオチドを含む、または該連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。表26に記載の遺伝子の、添付配列表で開示するような配列を分析するのがさらに好ましい。
【０１５２】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該標的配列は配列番号1023、配列番号57、配列番号20、配列番号36、配列番号1171、配列番号51、配列番号31、配列番号24、配列番号11、配列番号1028、配列番号4、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、配列番号18、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される配列の少なくとも16連続ヌクレオチドを含むかまたは該連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。従って、該配列は処理後に、表26に従う配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの連続領域からなる群より選択される、対応する変換または非変換ジヌクレオチド配列へと変換されるのが好ましい。
【０１５３】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該標的配列は配列番号57と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とからなる群より選択される配列の少なくとも16連続ヌクレオチドを含む配列を含むか、または該配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのも好ましい。
【０１５４】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、配列番号57と配列番号1023を分析するのが特に好ましい。
【０１５５】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１５６】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１５７】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【０１５８】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１５９】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１６０】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１６１】
該分析方法は、本明細書に記載のものを含めた技術上周知の方法から選択してもよい。特に好ましいのは本明細書で開示するようなMethyLight、MSP、およびブロッキングオリゴヌクレオチドの使用である。そうした分析に使用される(プライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチドおよび検出プローブを含む)任意のオリゴヌクレオチドは配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびそれらの相補配列のうちの1つまたは複数の塩基配列の、鎖長16塩基対以上の断片と逆相補的である、同一である、またはストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのがさらに好ましい。そうした分析に使用される(プライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチドおよび検出プローブを含む)任意のオリゴヌクレオチドは配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補配列のうちの1つまたは複数の塩基配列の、鎖長16塩基対以上の断片と逆相補的である、同一である、またはストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのがさらに好ましい。
【０１６２】
表26に記載のものから選択される1つまたは複数の遺伝子またはゲノム配列の異常メチル化特に高メチル化は前立腺細胞増殖性疾患の存在に関連する。1つまたは複数の該配列の分析により前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別が可能となる。
【０１６３】
一実施態様では、該方法は表26に記載の遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子またはゲノム配列の、前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別のためのマーカーとしての使用を含む。
【０１６４】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【０１６５】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【０１６６】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１６７】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０１６８】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【０１６９】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１７０】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１７１】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０１７２】
本発明のある種の実施態様は、生体サンプルの検査による前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別に使用するためのキットである。代表的なキットはmRNAと選択的にハイブリダイズする1つまたは複数の核酸断片と該核酸断片の各々に対応する容器とを含んでもよい。ある種の実施態様では、該核酸断片は単一チューブ中に混合されている。さらなる実施態様では、該核酸断片はさらに、標的mRNAを増幅するためのプライマー対を含んでもよい。そうしたキットはさらに、ハイブリダイゼーション、増幅または検出反応のための、任意の緩衝液、溶液、溶媒、酵素、ヌクレオチド、または他の構成要素を含んでもよい。好ましいキット構成要素は逆転写PCR、in situハイブリダイゼーション、ノーザン法および/またはRPA用の試薬を含む。
【０１７３】
本発明の特定の実施態様は、該配列内のメチル化度および/またはパターンの分析の、前立腺細胞増殖性疾患の早期発見とそれに基づく治療の改善とを可能にする新規用途を提供する。さらに、開示の方法は良性疾患を、悪性の可能性があり、また患者の健康にはるかに重大な影響を及ぼす可能性がある前立腺がん腫および新生物などのような疾患から弁別することを可能にする。前立腺細胞増殖性疾患の治療は早期発見により改善するので、開示の方法は医師と患者による、より良い、より多くの情報に基づく治療法の決定を可能にする。
【０１７４】
さらなる改良
本発明は配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群より選択されるゲノム配列の新規な使用を提供する。追加の実施態様は、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の修飾変異体、ならびにオリゴヌクレオチドおよび/またはPNA-オリゴマーを、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171からなる群内のシトシン・メチル化パターンの分析用に提供する。
【０１７５】
本発明の目的は配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116、配列番号1171およびその相補配列からなる群より選択される少なくとも1つのゲノム配列内の1つまたは複数のCpGジヌクレオチドのメチル化状態の分析を含む。
【０１７６】
開示の発明はゲノム配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171に由来する処理核酸を提供するが、該処理は該ゲノムDNA配列の少なくとも1つの非メチル化シトシン塩基をウラシルに、またはハイブリダイゼーション挙動がシトシンとは明らかに異なる別の塩基に、変換するのに適する。問題のゲノム配列は1つまたは複数の連続した、または任意の、メチル化CpG位置を含んでよい。該処理は亜硫酸水素塩、亜硫酸水素、二亜硫酸塩およびそれらの組み合わせからなる群より選択される試薬の使用を含むのが好ましい。本発明の好ましい実施態様では、該目的は少なくとも1つのCpG、TpAまたはCpAジヌクレオチドを含む配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびその相補配列からなる群より選択される配列のうち鎖長16連続ヌクレオチド塩基以上の配列を含む非天然型修飾塩基の分析を含む。本発明の好ましい、さらなる実施態様では、該目的は少なくとも1つのCpG、TpAまたはCpAジヌクレオチドを含む配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびその相補配列からなる群より選択される配列のうち鎖長16連続ヌクレオチド塩基以上の配列を含む非天然型修飾塩基の分析を含む。配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175の配列は、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の核酸の非天然型修飾体を提供するが、各ゲノム配列の修飾の結果として、ユニークな、次の点で該ゲノム配列とは異なる配列を有する核酸が合成されることになる。各センス鎖ゲノムDNAたとえば配列番号1につき4つの変換体が開示される。第1の変換体: C→TであるがCpGはCpGのままにとどまる(すなわちゲノム配列で、CpGジヌクレオチド配列の全C残基がメチル化されていて、そのために変換を免れる場合に相当); 第2の変換体: 開示ゲノム配列の相補体(すなわちアンチセンス鎖)であり、C→TであるがCpGはCpGのままにとどまる(すなわちCpGジヌクレオチド配列の全C残基がメチル化体であって、そのために変換を免れる場合に相当)。
【０１７７】
別の好ましい実施態様では、そうした分析は配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116、配列番号1171、配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1171〜1175のゲノムまたは処理(非天然型の修飾)DNA内のシトシン・メチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。好ましい実施態様では、そうした分析は配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050のゲノムまたは処理(化学修飾)DNA内のシトシン・メチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。
【０１７８】
該オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは各々、配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1171〜1175の処理核酸配列および/またはその相補配列と、または配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171のゲノム配列および/またはその相補配列と、中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件(前述)下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の核酸配列を含む。
【０１７９】
特に好ましいのは、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050の処理核酸配列および/またはその相補配列と、中程度にストリンジェントなまたはストリンジェントな条件(前述)下でハイブリダイズする、鎖長9ヌクレオチド以上の核酸配列を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーである。
【０１８０】
従って本発明は、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116、配列番号1171、配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175の配列の全部または一部と、またはその相補体と、中程度にストリンジェントなおよび/またはストリンジェントな条件下で、ハイブリダイズする核酸分子[たとえばオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸(PNA)分子(PNA-オリゴマー)]を包含する。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は一般に鎖長が9、15、20、25、30または35ヌクレオチド以上である。しかし、もっと長い分子でも発明の有用性はあり、従って本発明の範囲内に包摂される。
【０１８１】
好ましくは、本発明のハイブリダイズする核酸分子のハイブリダイズする部分は配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175の配列の全部または一部、またはその相補体との同一性が少なくとも95%または少なくとも98%または100%である。
【０１８２】
本明細書で開示するタイプのハイブリダイズする核酸はたとえばプライマー(PCRプライマーなど)として、または診断および/または予後用プローブまたはプライマーとして使用することができる。好ましくは、該オリゴヌクレオチドプローブの核酸サンプルとのハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件の下で行い、プローブは標的配列と100%同一である。核酸2本鎖またはハイブリッド安定性は、プローブが標的DNAから解離する温度である融解温度Tmとして表される。この融解温度は要求されるストリンジェンシー条件の定義に使用される。
【０１８３】
配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の対応する配列と同一であるよりもむしろ該配列に関連する、または該配列と実質的に同一である、標的配列(たとえば対立遺伝子多型およびSNPs)では、特定の塩(SSCまたはSSPEなど)濃度で相同ハイブリダイゼーションだけが起こる最低温度をまず確定するのが好都合である。次いで、1%ミスマッチあたりのTm低下幅を1℃と仮定し、それ応じてハイブリダイゼーション反応の最終洗浄温度を引き下げる(たとえばプローブとの同一性が95%超である配列を求めるのであれば、最終洗浄温度は5℃引き下げる)。実際にはTmの変動幅は1%のミスマッチにつき0.5℃〜1.5℃となる可能性がある。
【０１８４】
たとえば配列番号1に関してポリヌクレオチド位置によって示すような鎖長X(単位: ヌクレオチド)の本発明オリゴヌクレオチドの例は、連続的に重複する鎖長Xのオリゴヌクレオチドのセット(センス鎖およびアンチセンス鎖のセット)に対応するものを含むが、 (任意のX値に対応する)各連続重複セット内のオリゴヌクレオチドはヌクレオチド位置からのZオリゴヌクレオチドのサブセットn〜(n+(X-1))と定義される:
【０１８５】
ただし、n=1,2,3,…(Y-(X-1));
ただしYは配列番号1の鎖長(単位: ヌクレオチドまたは塩基対)に等しい(2299);
【０１８６】
Xは該セット内の各オリゴヌクレオチドの共通鎖長(単位: ヌクレオチド)に等しい(たとえば連続重複20マーのセットならX=20); および
【０１８７】
鎖長Yの任意の配列番号に関する鎖長Xの連続重複オリゴマーの数(Z)はY-(X-1)に等しい。たとえばX=20の場合、配列番号1のセンス鎖またはアンチセンス鎖のセットではZ=2299-19=2280である。
【０１８８】
好ましくは、該セットは少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むオリゴマーのセットに限定される。
【０１８９】
本発明の20マー・オリゴヌクレオチドの例は配列番号1に関するポリヌクレオチド位置によって示される次の2280オリゴマーのセット(およびその相補アンチセンス鎖のセット)を含む:
【０１９０】
1-20, 2-21, 3-22, 4-23, 5-24, ……2280-2299。
好ましくは、該セットは少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むオリゴマーに限定される。
【０１９１】
同様にして、本発明の25マー・オリゴヌクレオチドの例は配列番号1に関するポリヌクレオチド位置によって示される次の2,256オリゴマーのセット(およびその相補アンチセンス鎖のセット)を含む:
【０１９２】
1-25, 2-26, 3-27, 4-28, 5-29, ……2280-2299。
好ましくは、該セットは少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むオリゴマーに限定される。
【０１９３】
本発明は配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116、配列番号1171、配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175(センス鎖およびアンチセンス鎖)の各々について、鎖長X(ただしX=9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30または35ヌクレオチド)のオリゴヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドの多数の連続重複セットを包摂する。
【０１９４】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171に対応するゲノム配列の遺伝的および/または非遺伝的パラメーターを確認するのに役立つ効果的な手段となる。該オリゴマーは少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含むのが好ましい。
【０１９５】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーで特に好ましいのはCpGジヌクレオチド(または対応する変換TpGまたはCpAジヌクレオチド)配列のシトシンが該オリゴヌクレオチドの中間3分の1内に存在するものである。すなわちオリゴヌクレオチドがたとえば鎖長13塩基であれば、CpG、TpGまたはCpGジヌクレオチドが5'末端から5番目〜9番目ヌクレオチドの範囲内に存在するようなオリゴヌクレオチドである。
【０１９６】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、1つまたは複数の残基またはコンジュゲートへと化学的に結合させることによって修飾し、該オリゴヌクレオチドの活性、安定性および検出を高めることができる。そうした残基またはコンジュゲートの例は発色団、蛍光体、脂質たとえばコレステロール、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール(PEG)、パルミチル基、およびたとえば米国特許第5,514,758号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,597,696号および第5,958,773号の各明細書で開示されている他のものなどである。プローブはまた、特に好ましい対合特性をもつPNA(ペプチド核酸)の形で存在してもよい。従って、該オリゴヌクレオチドはペプチドなどのような他の付加基を含んでもよいし、またハイブリダイゼーションを誘因とする切断剤(Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988)またはインターカレート剤(Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988)を含んでもよい。この目的のために、該オリゴヌクレオチドは別の分子たとえば発色団、蛍光体、ペプチド、ハイブリダイゼーションを誘因とする架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーションを誘因とする切断剤などにコンジュゲートしてもよい。
【０１９７】
該オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも1つの、技術的に認められた修飾糖および/または塩基部分を含んでよい、または修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合を含んでもよい。
【０１９８】
本発明の特定の実施態様に従うオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは一般に「セット」で使用されるが、該セットは配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171のゲノム配列およびそれらの相補配列のCpGジヌクレオチドの、または配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175、1017〜配列番号1028およびその相補配列に従う処理核酸配列内の対応するCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドの、各々を分析するための少なくとも1つのオリゴマーを含む。しかし、経済的要因等により、該配列内の限られた特定のCpGジヌクレオチドを分析するのが好ましい場合もあることは想定されるので、その場合は該オリゴヌクレオチドセットの内容もそれに応じて変更されよう。
【０１９９】
従って特定の実施態様では、本発明は処理ゲノムDNA(配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175)またはゲノムDNA(配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171またはその相補配列)のシトシン・メチル化状態の検出に有用である少なくとも2つの(オリゴヌクレオチドおよび/またはPNA-オリゴマー)からなるセットを提供する。これらのプローブは前立腺細胞増殖性疾患の遺伝的および/または非遺伝的パラメーターの診断および/またはクラス分類を可能にする。該オリゴマーセットは処理ゲノムDNA(配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175)またはゲノムDNA(配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171またはその相補配列)の単一塩基多型(SNPs)の検出に使用してもよい。
【０２００】
特に好ましいのは、処理ゲノムDNA(配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050)のシトシン・メチル化状態の検出に有用である少なくとも2つの(オリゴヌクレオチドおよび/またはPNA-オリゴマー)からなるセットである。
【０２０１】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドセットの少なくとも1つの、またなお好ましくはすべての、構成メンバーが固相に結合される。
【０２０２】
さらなる実施態様では、本発明は配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116、配列番号1171、配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびその相補配列のうちの1つのDNA配列を、またはそれらの断片を、増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとして使用される少なくとも2つのオリゴヌクレオチドからなるセットを提供する。
【０２０３】
特に好ましいのは、配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050のうちの1つのDNA配列を増幅するための「プライマー」として使用される少なくとも2つの(オリゴヌクレオチドおよび/またはPNA-オリゴマー)からなるセットである。
【０２０４】
該オリゴヌクレオチドセットは「アレイ」または「DNAチップ」(すなわち固相に結合させた種々のオリゴヌクレオチドおよび/またはPNA-オリゴマー配列の配置)の全部または一部を構成する場合もあるものと想定される。そうした種々のオリゴヌクレオチドおよび/またはPNA-オリゴマー配列のアレイは、たとえば固相上に四角形または六角形の格子状に配置してあることを特徴とする。固相表面はケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金からなってもよい。ペレットまたは樹脂マトリックスの形で存在しうるニトロセルロースとナイロンなどのプラスチックとを使用してもよい。オリゴマー・アレイ製造の公知技術の概要はNature Geneticsの増刊号(Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999)およびその中の引用文献に求めることができる。固定化DNAアレイのスキャニングにはしばしば蛍光標識プローブが使用される。蛍光標識には、特異的プローブの5’-OHに対するCy3およびCy5色素の単純な結合が特に好適である。ハイブリダイズしたプローブの蛍光の検出はたとえば共焦点顕微鏡を使用して行うことができる。Cy3およびCy5色素は他の多数の色素と共に商業的に入手することができる。
【０２０５】
また、該オリゴヌクレオチドセットまたはその中の特定の配列は被分析物の複雑な混合体の分析を目的に、「バーチャルアレイ」の全部または一部を構成し、たとえば多様な特異的標識プローブセットの一部として、またはそうしたセットと組み合わせて、「指定子」として使用される場合もあるものと想定される。そうした方法はたとえば米国出願公開第US 2003/0013091号(米国出願第09/898,743号、2003年1月16日公開)明細書で開示されている。そうした方法では、複雑な混合体中の各核酸(すなわち各被分析物)が特異的標識の特異的結合によって検出されるよう、十分な標識が生成される(各標識は直接計数され、該混合体中の各分子種のデジタル情報が得られる結果となる)。
【０２０６】
本発明のオリゴマーは次のうち少なくとも1の用途に使用するのが特に好ましい: 前立腺細胞増殖性疾患の発見; 集団検診; 弁別; 監視; および発見と監視。これは該セットの、患者から分離した生体サンプル中の前立腺細胞増殖性疾患の発見および/または弁別への使用によって可能となる。特に好ましいのは、次のオリゴヌクレオチドセットのうちの1つより選択される少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含むオリゴマーセットである。
【０２０７】
該方法の一実施態様では、表26に記載の遺伝子および配列、それにその相補体からなる群より選択される遺伝子または配列の少なくと16連続ヌクレオチドを含む、またはその少なくと16の連続ヌクレオチドとストリンジェントな条件の下でハイブリダイズする、少なくとも1つの標的配列のメチル化状態の分析により実現される。
【０２０８】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列は配列番号1023、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択されるのが好ましい。
【０２０９】
該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、該遺伝子および/または配列はGstp1と、配列番号1017〜配列番号1028からなる群より選択される1つまたは複数の配列とであるのも好ましい。該方法の目的が前立腺細胞増殖性疾患(最も好ましくは前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物)の診断である場合には、Gstp1と配列番号1023とを分析するのが特に好ましい。
【０２１０】
該方法の目的が前立腺がん、前立腺がん腫および/または前立腺新生物の診断および/またはそれらと良性前立腺肥大との弁別である場合には、配列番号1023を分析するのが特に好ましい。配列番号1023と、表26より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０２１１】
また、配列番号1023と、GSTP1、プロスタグランジンE2受容体、ヒストンH4、RASSF1A、PR-ドメイン・ジンクフィンガータンパク質16、LIMドメインキナーゼ1、オーファン核受容体NR5A2、配列番号11、配列番号1028、LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9、配列番号1116、配列番号1025、配列番号1020、リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質、配列番号1019および配列番号1027からなる群より選択される1つまたは複数の遺伝子および/または配列とを分析するのも好ましい。
【０２１２】
特に好ましいのは表22および23に記載の遺伝子の組み合わせ、特に配列番号1023とGSTP1との分析である。
【０２１３】
該方法の目的が正常前立腺および/またはBPHのうちの1つと前立腺がんとの弁別である場合には、標的配列は表4に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０２１４】
該方法の目的が正常前立腺、正常組織のうちの1つと他組織との、他組織のがんおよび/またはBPHと前立腺がんとの、弁別である場合には、標的配列は表5に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０２１５】
該方法の目的が前立腺がんと他組織のがんとの弁別である場合には、標的配列は表6に記載の配列の少なくとも16連続ヌクレオチド(であって、CpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを少なくとも1つ含む少なくとも16連続ヌクレオチド)を含む1つまたは複数の配列を含むか、または該1つまたは複数の配列とストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするのが特に好ましい。
【０２１６】
本発明はさらに、被検者内の配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171のゲノム配列の遺伝的および/または非遺伝的パラメーターをシトシン・メチル化と一塩基多型の分析により確認するための方法を提供する。該方法は該被検者から獲得した生体サンプル中の1つまたは複数の配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171を含む核酸に、少なくとも1つの試薬または一連の試薬を接触させるステップを含み、該試薬または一連の試薬で標的核酸内のメチル化および非メチル化CpGジヌクレオチドを弁別することを特徴とする。
【０２１７】
好ましくは、該方法は次のステップを含む: 第1のステップで検査対象組織のサンプルを獲得する。DNAサンプルの由来源は細胞または細胞系、組織スライド、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精された精液、尿、血液、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。該DNA源は生検、体液、射精された精液、尿またき血液であるのが好ましい。
【０２１８】
次に該ゲノムDNAをサンプルから単離する。ゲノムDNAの単離には市販キットの使用など技術上の標準である任意の手段を用いてよい。簡単に言えば、関心DNAが細胞膜に包まれている場合には、生体サンプルを酵素的、化学的または機械的な手段より破壊し、溶解しなければならない。次いでDNA溶液からタンパク質や他の不純物をプロテイナーゼKによる消化などによって除去し、該溶液からDNAを回収する。これは、塩析、有機抽出または固相担体へのDNAの結合などを含む多用な方法で行うことができる。方法の選択は所要時間、費用およびDNA量などいくつかの因子により左右されよう。
【０２１９】
核酸の抽出が済んだら、2本鎖のゲノムDNAを分析に使用する。
該方法の第2ステップでゲノムDNAサンプルを処理して、5’位がメチル化されていないシトシン塩基がウラシル、チミン、またはハイブリダイゼーション挙動がシトシンとは異なる別の塩基に変換されるようにする。これは本明細書では「前処理」または「処理」として理解されよう。
【０２２０】
前記のゲノムDNA処理は亜硫酸水素塩(亜硫酸水素、二亜硫酸塩)で、次にアルカリ性加水分解で行われ、非メチル化シトシン核酸塩基がウラシルへと、またはシトシンとは塩基対合挙動を異にする別の塩基へと、変換される結果になるのが好ましい。
【０２２１】
該方法の第3ステップでは、処理DNAの断片を、本発明のプライマーセットと増幅酵素の使用により増幅する。数DNA断片の増幅は同一反応容器で同時に行うことができる。一般に、この増幅はPCR法で行う。プライマーセットは少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含み、それらの配列が各々、配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびそれらの相補配列のうちの1つまたは複数の塩基配列の、鎖長16塩基対以上の断片と逆相補的である、同一である、またはストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることを特徴とする。
【０２２２】
特に好ましいのは、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含み、それらの配列が配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補配列のうちの1つの塩基配列の、鎖長16塩基対以上の断片と逆相補的である、同一である、またはストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズすることを特徴とするプライマーセットである。
【０２２３】
該方法の別の実施態様では、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171のうちの1つまたは複数の配列を含む核酸配列内の、予め選定したCpG位置のメチル化状態がメチル化特異的プライマーの使用により検出されよう。この手法(MSP)はHermanに付与された米国特許第6,265,171号の明細書で開示されている。亜硫酸水素塩処理DNAの増幅へのメチル化状態特異的プライマーの使用は、メチル化核酸と非メチル化核酸の弁別を可能にする。MSPプライマー対は、亜硫酸水素塩処理CpGジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも1つのプライマーを含む。従って、該プライマー対の配列は少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。非メチル化DNAに対して特異的なMSPプライマーはCpGのCの位置にTを含む。従って好ましくは、該プライマーの塩基配列は配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびそれらの相補配列のうちの1つの処理核酸配列にハイブリダイズする鎖長9ヌクレオチド以上の配列を含む必要があるが、該オリゴマーの塩基配列は少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。
【０２２４】
好ましくは、該プライマーの塩基配列は配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補配列のうちの1つの処理核酸配列にハイブリダイズする鎖長9ヌクレオチド以上の配列を含む必要があるが、該オリゴマーの塩基配列は少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。
【０２２５】
該方法のさらなる好ましい実施態様はブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を含む。そうしたブロッカーオリゴヌクレオチドの使用についてはYu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997で開示されている。ブロッキングプローブ・オリゴヌクレオチドはPCRプライマーと共に亜硫酸水素塩処理核酸にハイブリダイズさせる。該核酸のPCR増幅は該ブロッキングプローブの5’位で終了する。すなわち核酸増幅はブロッキングプローブに対する相補配列が存在する位置で抑制されるようにする。該プローブは亜硫酸水素塩処理核酸にメチル化状態特異的にハイブリダイズするよう設計してもよい。たとえば非メチル化核酸セット内のメチル化核酸の検出では、メチル化核酸の増幅の抑制が求められる場合、問題の位置が非メチル化状態にある核酸の増幅の抑制は問題の位置にCpGではなくCpAまたはTpAを含むブロッキングプローブを使用することによって行われよう。
【０２２６】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するPCR法では、ポリメラーゼ介在性増幅を効率的に妨げるにはブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼによる伸長を被らないようにする必要がある。好ましくは、これはブロッカー(すなわち3’-デオキシオリゴヌクレオチド、または「遊離」OH基以外により3'位で誘導体化したオリゴヌクレオチド)の使用により実現される。たとえば3’-O-アセチルオリゴヌクレオチドは好ましい種類のブロッカー分子の代表である。
【０２２７】
加えて、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ介在性分解は妨げるのがよい。好ましくは、そうした妨害は5’-3’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用、またはたとえばブロッカー分子をヌクレアーゼ耐性にするチオアート架橋を5’末端に有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を含む。用途によっては、ブロッカーのそうした5'修飾を必要としない場合もあろう。たとえばブロッカー結合部位とプライマー結合部位が重複し、そのために(たとえば過剰ブロッカーにより)プライマーの結合が妨げられる場合には、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解は大幅に妨げられよう。ポリメラーゼがプライマーを、ブロッカーの方に、さらにはブロッカーを通り抜けるように(5’-3’方向に)、伸長すること(通常、ハイブリダイズしたブロッカーオリゴヌクレオチドを分解させる結果となるプロセス)はないためである。
【０２２８】
本発明のための、また本明細書で開示するような、特に好ましいブロッカー/PCR実施態様はペプチド核酸(PNA)オリゴマーの、ブロッキングオリゴヌクレオチドとしての使用を含む。そうしたPNAブロッカーオリゴマーがふさわしいのは、ポリメラーゼによる分解も伸長も被らないためである。
【０２２９】
従って好ましくは、該ブロッキングオリゴヌクレオチドの塩基配列は配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびそれらの相補配列のうちの1つの処理核酸配列にハイブリダイズする鎖長9ヌクレオチド以上の配列を含む必要があるが、該オリゴヌクレオチドの塩基配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【０２３０】
さらに好ましくは、該ブロッキングオリゴヌクレオチドの塩基配列は配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補配列のうちの1つの処理核酸配列にハイブリダイズする鎖長9ヌクレオチド以上の配列を含む必要があるが、該オリゴヌクレオチドの塩基配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【０２３１】
増幅によって得られた断片は直接的または間接的に検出可能な標識をもつことができる。好ましいのは蛍光標識、放射性核種、または質量分析計で検出しうる標準的な質量をもつ分離可能な分子断片といった形態の標識である。該標識が質量標識である場合には、標識増幅産物は質量分析計による検出能が高まるよう単一の正または負の正味電荷をもつのが好ましい。検出はたとえばMALDI(マトリックス支援レーザー脱離イオン化)質量分析またはエレクトロンスプレー質量分析(ESI)により実行し視覚化することができる。
【０２３２】
MALDI-TOF(飛行時間型)質量分析はきわめて効率的な生体分子分析手段である(Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988)。被分析物を光吸収性マトリックス中に埋め込む。該マトリックスを短いレーザーパルスで蒸発させ、被分析物分子を断片化することなく気化させる。被分析物はマトリックス分子との衝突によりイオン化される。該イオンを印加電圧で加速して電場のない飛行管へと導く。イオンは質量差に応じて異なる加速度で加速する。より小さいイオンは大きいイオンよりも速く検出器に到達する。MALDI-TOF質量分析はペプチドやタンパク質の分析に好適である。核酸の分析はそれよりもやや困難である(Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995)。核酸分析の感度はペプチドの場合の100分の1程度であり、また断片サイズの増大に伴い不釣合いに低下する。そのうえ、多重負荷電骨格をもつ核酸ではマトリックスを介したイオン化法はかなり低効率である。MALDI-TOF質量分析ではマトリックスの選定が著しく重要な意味をもつ。ペプチドの脱離に関しては、超微結晶を生み出すいくつかのきわめて効率的なマトリックスが発見されている。今日DNA用の応答性マトリックスがいくつか存在しているが、ペプチドと核酸の間の感度の差は縮小していない。しかし、この感度差はDNAを化学修飾してペプチドとの類似性を高めることにより、小さくすることができる。たとえば骨格のリン酸基をチオリン酸基で置換してあるホスホロチオアート核酸は、単純なアルキル化反応を利用して電荷中性DNAへと変換することができる(Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995)。この修飾DNAに荷電タグをカップリングするとMALDI-TOF感度がペプチドの場合と同じレベルへと上昇する結果になる。荷電タグ付加のさらなる利点は被分析物の不純物に対する安定性の向上であるが、これは非修飾基質の検出を一段と困難にしている問題である。
【０２３３】
該方法の第4ステップでは、第3ステップで獲得した増幅産物を分析して、処理前のCpGジヌクレオチドのメチル化状態を確認する。
【０２３４】
増幅産物がMSP増幅で獲得される実施態様では、増幅産物の存否それ自体が、プライマーによってカバーされるCpG位置のメチル化状態を該プライマーの塩基配列に従って示す。
【０２３５】
標準PCRとメチル化特異的PCRの両方で獲得される増幅産物は、アレイ技術やプローブ系技術、それに配列決定や鋳型依存的伸長の技法などを非限定的に含むハイブリダイゼーションに基づく方法によりさらに分析してもよい。
【０２３６】
該方法の一実施態様では、ステップ3で合成した増幅産物を後でオリゴヌクレオチドおよび/またはPNAプローブのアレイまたはセットとハイブリダイズさせる。その場合、ハイブリダイゼーションは次の要領で起こる: ハイブリダイゼーションに使用するプローブセットは好ましくは少なくとも2つのオリゴヌクレオチドまたはPNA-オリゴマーからなる; ハイブリダイゼーション過程では増幅産物は、あらかじめ固相に結合させておいたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして機能する; ハイブリダイズしなかった断片は除去する; 該オリゴヌクレオチドは、本発明の配列表に記載の塩基配列の断片と逆相補的な、または同一の、鎖長9ヌクレオチド以上の塩基配列を少なくとも1つ含む; 該断片は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【０２３７】
好ましい実施態様では、該ジヌクレオチドは該オリゴマーの中間3分の1内に存在する。たとえば該オリゴマーが1つのCpGジヌクレオチドを含む場合、該ジヌクレオチドは好ましくは13マーの5'末端から5番目〜9番目ヌクレオチドの範囲内に存在する。1つのオリゴヌクレオチドは、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の配列内の、また配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175内の等価位置の、各CpGジヌクレオチドの分析のために存在する。
【０２３８】
該オリゴヌクレオチドはペプチド核酸の形で存在してもよい。ハイブリダイズしていない増幅産物は除去し、次いでハイブリダイズした増幅産物を検出する。この場合、増幅産物に付着させる標識はオリゴヌクレオチド配列が位置する固相上の各位置で検出しうるのが好ましい。
【０２３９】
該方法のさらに別の実施態様では、CpG位置のゲノム・メチル化状態を、オリゴヌクレオチドプローブを用いて確認するが、該プローブはPCR増幅プライマー(該プライマーはメチル化状態特異的プライマーでも標準プライマーでもよい)と共に、亜硫酸水素塩処理DNAにハイブリダイズする。
【０２４０】
該方法の特に好ましい実施態様は二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブによる蛍光リアルタイム定量PCR [TaqMan（登録商標）PCR法; ABI Prism 7700配列検出システム(Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California)]の使用である(Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996; および米国特許第6,331,393号明細書をも参照)。TaqMan（登録商標）PCR法はTaqMan（登録商標）プローブという非伸長性の問い合わせオリゴヌクレオチドの使用を含むが、該プローブは好ましい実施態様では順方向および逆方向プライマーの間に位置するCpGリッチ配列とハイブリダイズするように設計する。該プローブはさらに、TaqMan（登録商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合したリンカー部分(ホスホロアミダイトなど)に蛍光「レポーター部分」と「クエンチャー部分」とを共有結合させて含む。MethylLight（登録商標）アッセイともいう亜硫酸水素塩処理後の核酸内のメチル化の分析では、(本明細書で参照によりその全体が開示される)米国特許第6,331,393号明細書で開示されているように、該プローブはメチル化特異的でなければならない。開示の発明との併用にやはり好適であるTaqMan（登録商標）検出法の変法は、二重プローブ法[Lightcycler（登録商標）]または蛍光増幅プライマー[Sunrise（登録商標）法]の使用を含む。これらの手法はどちらも亜硫酸水素塩処理DNAへの使用に、さらにはCpGジヌクレオチド内のメチル化分析に、適合させるようにしてもよい。
【０２４１】
亜硫酸水素塩処理核酸の分析によるメチル化評価へのプローブオリゴヌクレオチドの使用のためのさらなる好適な方法。該方法のさらなる好ましい実施態様では、該方法の第4ステップはGonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997で開示されているMS-SNuPEなどのように、鋳型依存的伸長法の使用を含む。
【０２４２】
該方法の別のさらなる実施態様では、該方法の第4ステップは該方法の第3ステップで生成した増幅産物の配列決定とそれに続く配列分析を含む(Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977)。
【０２４３】
最善の態様  
本発明の最も好ましい実施態様では、前述の方法の最初の3ステップに従って、すなわち
ａ）被検者より、被検ゲノムDNAを含む生体サンプルを獲得するステップ;
ｂ）該ゲノムDNAを抽出する、または他の方法で分離するステップ;
ｃ）のゲノムDNAまたはその断片を1つまたは複数の試薬で処理して、5位が非メチル化状態にあるシトシン塩基をウラシルへと、またはハイブリダイゼーション特性の点でシトシンとは検出可能に異なる別の塩基へと変換するステップ;
に従ってゲノム核酸を単離し処理するが、その特徴は
ｄ）c)における処理の後にメチル化特異的に、すなわちメチル化特異的プライマーまたはブロッキングオリゴヌクレオチドの使用により、増幅を行い、またさらに
ｅ）増幅産物の検出を、前述のようなリアルタイム検出法により行う
ことにある。
【０２４４】
好ましくは、d)における後続の増幅は前述のようにメチル化特異的プライマーの使用によって行う場合に、該メチル化特異的プライマーは配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびそれらの相補配列のうちの1つの処理核酸配列にハイブリダイズする鎖長9ヌクレオチド以上の配列を含み、該オリゴマーの塩基配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【０２４５】
さらに好ましくは、d)における後続の増幅は前述のようにメチル化特異的プライマーの使用によって行う場合に、該メチル化特異的プライマーは配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050およびそれらの相補配列のうちの1つの処理核酸配列にハイブリダイズする鎖長9ヌクレオチド以上の配列を含み、また該オリゴマーの塩基配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【０２４６】
該方法の別の最も好ましい実施態様では、d)における後続の増幅は前述のようなブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下に行う。該ブロッキングオリゴヌクレオチドは配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175およびそれらの相補配列のうちの1つの処理核酸配列にハイブリダイズする鎖長9ヌクレオチド以上の配列を含み、また該オリゴマーの塩基配列は少なくとも1つのCpG、TpGまたはCpAジヌクレオチドを含む。
【０２４７】
該方法のステップe)、すなわち配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の1つまたは複数のCpG位置のメチル化状態を示す特異的増幅産物の検出は、前述のようなリアルタイム検出法によって行う。
【０２４８】
本発明の追加的実施態様は本発明のゲノムDNA(配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171およびその相補体)のメチル化状態の、前処理を必要としない分析方法を提供する。
【０２４９】
そうした追加的実施態様の第1ステップでは、ゲノムDNAサンプルをその由来組織または細胞から分離する。好ましくは、そうした由来源は細胞系、組織スライド、体液、またはパラフィン包埋組織を含む。第2ステップでは、該ゲノムDNAを抽出する。抽出は界面活性剤溶解物の使用、ソニフィケーションおよびガラスビーズ使用のボルテックス処理を非限定的に含む技術上標準の手段によって行ってよい。核酸を抽出したら、ゲノム2本鎖DNAを分析に使用する。
【０２５０】
好ましい実施態様では、DNAは処理前に切断してもよいが、これにはメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼなどを含む技術上標準の手段を用いてよい。
【０２５１】
第3ステップではDNAを1つまたは複数のメチル化感受性制限酵素で消化する。この消化は制限部位でのDNAの加水分解が特定CpGジヌクレオチドのメチル化状態を示すように行われる。
【０２５２】
第4ステップは随意の、だが好ましい実施態様であり、そこでは制限断片を増幅する。これはPCR法で行うのが好ましく、またその増幅産物は前述のような好適な検出可能標識すなわち蛍光標識、放射性核種および質量標識を含んでもよい。
【０２５３】
第5ステップでは増幅産物を検出する。検出にはゲル電気泳動分析、ハイブリダイゼーション分析、PCR産物内への検出可能タグの導入、DNAアレイ分析、MALDIまたはESI分析などを含む技術上標準の手段を用いてよい。
【０２５４】
ゲノム核酸のメチル化状態の判定に続き、配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の少なくとも1つのCpGジヌクレオチド配列のメチル化状態、または配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116および配列番号1171の複数のCpGジヌクレオチド配列の平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値に基づいて前立腺細胞増殖性疾患の存否またはサブクラスを推定する。
【０２５５】
キット
さらに、本発明の追加的な態様はキットであり、該キットはたとえば次のものを含む: 亜硫酸水素系試薬; 各々が配列番号1〜59、配列番号1017〜1028、配列番号1116、配列番号1171、配列番号60〜295、1029〜1076、1117〜1120、1172〜1175の配列の鎖長16塩基断片と対応する、相補的である、またはストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするような配列を有する、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドセット; オリゴヌクレオチドおよび/またはPNAオリゴマー; それに開示の方法に関する実施と評価のための説明書。さらなる好ましい実施態様では、該キットはCpG位置特異的メチル化分析のための標準試薬をさらに含むが、該分析はMS-SNuPE、MSP、MethyLight（登録商標）、HeavyMethyl（登録商標）、COBRAおよび核酸配列決定法のうちの1つまたは複数を含むことを特徴とする。
【０２５６】
さらに好ましくは、該(キット)は亜硫酸水素系試薬; 各々が配列番号1043、1044、172、173、98、99、130、131、1172、1173、160、161、120、121、106、107、80、81、1051、1052、66、67、1117、118、1045、1046、1035、1036、94、95、1033、1034、1049、1050の配列の鎖長16塩基断片と対応する、相補的である、またはストリンジェントなまたは高度にストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするような配列を有する、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドセット; オリゴヌクレオチドおよび/またはPNAオリゴマー; それに開示の方法に関する実施と評価のための説明書を含む。さらなる好ましい実施態様では、該キットはCpG位置特異的メチル化分析のための標準試薬をさらに含むが、該分析はMS-SNuPE、MSP、MethyLight（登録商標）、HeavyMethyl（登録商標）、COBRAおよび核酸配列決定法のうちの1つまたは複数を含むことを特徴とする。
【０２５７】
しかし、本発明に従うキットは前記の構成要素のうちの一部分だけを含んでもよい。
【０２５８】
以上、本発明をある種の好ましい実施態様に従って具体的に開示してきたが、以下の実施例はもっぱら本発明の説明に資するものであり、本発明を最広義の解釈とその等価形態の原理と範囲の内部に限定するものではない。
【実施例】
【０２５９】
以下の実施例では、uLは「マイクロリットル」すなわち10-6リットルを、またuMは「マイクロモル」を、それぞれ表す。
【０２６０】
AP-PCRおよびMCAという探索手法を使用してゲノムDNAプールを分離し分析した(実施例1)。これらの手法は、メチル化感受性酵素の使用によりCpG部位のメチル化と非メチル化を弁別する。一般にまず全ゲノムDNAを消化して管理性を高め、次いでメチル化感受性制限酵素でさらに消化する。非メチル化断片は該部位のために増幅を阻まれるため、メチル化断片が選択的に増幅される。これらの手法を用いて弁別されたメチル化差異のある断片の配列を決定し(実施例2)、EnsemblデータベースのBLAST検索を用いてヒトゲノムと比較する。サンプルセットは診断上解決するべき当初の課題、すなわち前立腺がん腫の発見と正常または良性状態からの弁別の改善に基づいて選定した。3×「全がん」前立腺がんサンプルプール(各プールのサンプル数n=10, 10, 20)、2×BPH(良性前立腺肥大)サンプルプール(n=10)、3×低グレード前立腺がんサンプルプール(n=10)、3×高グレード前立腺がんサンプルプール(n=10)、および1×末梢血リンパ球(PBL)プール(n=9)を使用して以下の比較を行った:
【０２６１】
・  BPH対全がん(高&低Gleasonスコア(GS); 移行域(TZ)および末梢域(PZ)、2回比較)
・  BPH対低Gleasonスコア(GS<6、TZ & PZの数は記載のとおり、2回比較)
・  BPH対高Gleasonスコア(GS>7、TZ & PZの数は記載のとおり、2回比較)
・  低Gleasonスコア対高Gleasonスコア(MCAによる; 各プールをテスターおよびドライバーとして使用)
・  BPH対PBLs
・  全がん対PBLs
BPH対PBLs比較はAP-PCRでは行わなかった。
がんサンプルを含むMCA比較では常に、がんはテスターであった。低対高Gleasonスコア比較は、低Gleasonスコアをテスターとする比較と高Gleasonスコアをテスターとする比較を1回ずつ、計2回行ったが、各回の合計比較件数は10であった。PBLsによる実験ではPBLサンプルはドライバーであった。表1を参照。
【０２６２】
【表１】
2007525208.tif 000003
【０２６３】
実施例1  MCAおよびAP-PCR
以下の研究の狙いは、全ゲノム内の、またはその代表的断片内の、少なくとも1つのメチル化差異CpGジヌクレオチド配列を弁別するのに好適な対照アッセイ法を用いて1つまたは複数のprimaryなメチル化差異CpGジヌクレオチド配列を弁別することであった。
【０２６４】
すべての手順をプールサンプルおよび/または個別サンプルを対象に行い、分析は2つの探索手法すなわちメチル化CpG増幅(MA)法とarbitrarily-primed PCR(AR-PCR)法を用いて行った。
【０２６５】
AP-PCR:  AP-PCR法はゲノムDNAのサンプルクラスを対象に次の要領で行った: 
1.  DNAの分離: 市販Wizard（登録商標）キットを使用してサンプルクラスからゲノムDNAを分離した;
2.  制限酵素による消化: 3つの異なる制限酵素セットRsaI(認識部位: GTAC); RsaI(認識部位: GTAC)プラスHpaII(認識部位: CCGG; メチル化感受性); およびRsaI(認識部位: GTAC)プラスMspI(認識部位: CCGG; メチル化非感受性)により各DNAサンプルプールを37℃で16時間消化した;
3.  AP-PCR分析: 制限酵素で消化した各DNAサンプルを表2に記載のプライマーにより、40℃のアニーリング温度で、また表3に記載のプライマーセット中の33P-dATPにより、増幅した;
4.  ポリアクリルアミドゲル電気泳動: 各AP-PCRサンプル1.6 □lを5%ポリアクリルアミド配列決定ゲル上に添加し、電気泳動を130Wで4時間行った。ゲルをクロマトグラフィーペーパーに移し、サランラップでカバーし、ゲルドライヤーで約1時間乾燥させた;
5.  オートラジオグラフィー: 乾燥ゲルをマイナス80℃で20時間オートラジオグラフィー用フィルムに密着露出させ、次いで現像した。乾燥ゲルにGlogosIIAutoradマーカー(Stratagene)を添加し、新しいフィルムで露出を繰り返した。最初のオートラジオグラフィー画像は控えとして残し、二番目の画像をバンドの切り出しに使用した; 次いで
6.  メチル化差異に対応するバンドがゲル上で視覚的に確認された。そうしたバンドを切り出し、その中のDNAを分離し、クローニングした(Invitrogen TA Cloning Kitを使用)。
【０２６６】
【表２】
2007525208.tif 000004
【０２６７】
【表３】
2007525208.tif 000005
【０２６８】
【表４】
2007525208.tif 000006
【０２６９】
【表５】
2007525208.tif 000007
【０２７０】
【表６】
2007525208.tif 000008
【０２７１】
MCA:  MCA法はあるゲノムDNA集団内の、第2集団との比較で見た高メチル化配列を、高メチル化領域を含まない配列を選択的に除外することにより、弁別するために使用した。これは、前述のように、ゲノムDNAを、非メチル化制限領域を平滑末端に切断するメチル化感受性酵素で消化することにより、次いでメチル化非感受性であって付着末端を生じるイソ制限酵素で切断することにより、実現される。これには、アダプターライゲーション、アンプリコンの生成、およびテスター集団のドライバー集団とのサブトラクティブハイブリダイゼーションが続く。
【０２７２】
最初の制限酵素消化反応溶液は次の成分を含んだ:
ドライバー:
DNA            510uL
緩衝液4          60uL
100×BSA          6uL
SmaI (20 U/uL)    2uL
テスター:
DNA              68uL
緩衝液4          10uL
10×BSA          10uL
SmaI (20 U/uL)    2uL
反応混合物は終夜、室温でインキュベートした。
【０２７３】
次いでプールをXmaI(2uL=100U)により、37℃で6時間、さらに消化した。XmaIは各テスター消化物に2uL (20 U)加え、また各ドライバー消化物に8uL (80 U)加えた。
【０２７４】
消化物は洗浄後、アダプター-プライマーRXMA24 + RXMA12 (配列: RXMA24: AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAC(配列番号952); RXMA12: CCGGGTCGGTGA(配列番号953))にライゲートした。これらを70℃に加熱し、次いで室温(RT)へと徐冷することにより、ハイブリダイズしてアダプターを作製した。これには次の30uL反応溶液を使用した:
【０２７５】
各DNA                                33uL
T4緩衝液                              6uL
RXMAアダプター-プライマー(100uM)    20uL
リガーゼ                                1uL
【０２７６】
この反応溶液を終夜、室温でインキュベートした。
出発アンプリコンを生成させるための最初の各PCRには、テスター、ドライバー両集団用のライゲーションミックス3uLを使用した。反応溶液の組成は次のとおりであった:
【０２７７】
テスター:
100uM RXMA24  1uL
PCR緩衝液      10uL
25mM dNTPs    1.2uL
ddH2O          68.8uL
Titanium Taq    1uL
100%DMSO      2uL
5Mベタイン    10uL
各97uLのテスターカクテルに3uLのライゲーション済みテスターDNAを加えた。
【０２７８】
ドライバー:
ドライバーの増幅にはdTTPの代りにdUTPを使用した:
100uM RXMA24  1uL
PCR緩衝液      10uL
25mM dNTPs    1.2uL(dATP, dCTP, dGTP, dUTP各25uM)
ddH2O          68.8uL
Titanium Taq    1uL
100%DMSO      2uL
5Mベタイン      10uL
各97uLのテスターカクテルに3uLのライゲーション済みテスターDNAを加えた。
【０２７９】
PCR条件:
72℃  5分
30サイクル:
95℃  1分
72℃  3分
最終伸長:
72℃  10分。
次いで、テスターアンプリコンをXmaIで消化して突出末端を生じさせ、またドライバーアンプリコンをSmaIで消化して平滑末端断片を生じさせた。
【０２８０】
ドライバー(SmaI):
DNA            500uL
緩衝液4        100uL
100×BSA        10uL
H2O            340uL
SmaI (20 U/uL)  50uL
合計容量: 1mL。終夜、室温でインキュベート。
【０２８１】
テスター(XmaI):
DNA            20uL
緩衝液4          10uL
10×BSA          10uL
H2O              59uL
XmaI (50 U/uL)    1uL
合計容量: 100uL。終夜、37℃でインキュベート。
【０２８２】
このテスターには新しいアダプター-プライマー(前記RXMAプライマーの場合と同様にしてハイブリダイズした)セットJXMA24 + JXMA12 (配列: JXMA24: ACCGACGTCGACTATCCATGAACC (配列番号954); JXMA12: CCGGGGTTCATG(配列番号955))をライゲートしたが、このライゲーションはThermocyclerを使用して次の反応溶液により、16℃で2時間行った:
【０２８３】
DNA                        16uL
T4緩衝液                    3uL
JXMA-Pアダプター(100uM)  10uL
T4リガーゼ(400U/uL)        1uL
【０２８４】
消化後のテスターアンプリコンとドライバーアンプリコンは一緒にハイブリダイズした。選択的PCR反応にはプライマーJXMA24 (配列番号954)を使用した。反応溶液の組成は次のとおりであった:
【０２８５】
JXMA24                    0.5uL
taq緩衝液                  5uL
dNTPs                      0.6uL
ddH2O                    27.4uL
ベタイン                    5uL
DMSO                    1uL
Titanium Taq              0.5uL
DNA                      10uL
PCR条件:
72℃  8分(末端の陥没部分を埋め込む)
5サイクル:
95℃  1分
72℃  3分
最終伸長:
72℃  10分。
【０２８６】
次に、20uLのMung Bean(緑豆)由来エンドヌクレアーゼ緩衝液+10uLのMung Bean由来エンドヌクレアーゼを加えて37℃で30分間インキュベートした。この反応混合物を洗浄し、+25サイクルの、次の反応溶液中での、JXMA24プライマー使用のPCRのための鋳型として使用した:
【０２８７】
JXMA24              1uL
taq緩衝液           10uL
dNTPs       1.2uL
ddH2O       27uL
ベタイン            10uL
DMSO        2uL
Titanium Taq 1uL
DNA         48uL
【０２８８】
PCR条件:
95℃  2分
30サイクル:
95℃  1分
72℃  3分
【０２８９】
最終伸長:
72℃  10分
4℃に保持。
生成したPCR産物(テスター)は、XmaIを使用して再び消化した:
DNA         45uL
緩衝液4             15uL
10×BSA             15uL
H2O         71uL
XmaI        4uL
終夜、37℃でインキュベート。
【０２９０】
第3のアダプターセットNXMA24 (AGG CAA CTG TGC TAT CCG AGT GAC; 配列番号956) + NXMA12 (CCGGGTCACTCG; 配列番号957)をライゲートした。このテスター(500ng)の、当初の消化済みドライバー(40ng)に対する2回目のハイブリダイゼーションを、4uL EE (30mM EPPS, 3mM EDTA) + 1uL 5M NaCl中、67℃で20時間行った。選択的PCRはNXMA24プライマーを使用して次の要領で行った:
【０２９１】
反応溶液:
JXMA24              0.5uL
taq緩衝液           5uL
dNTPs       0.6uL
ddH2O       27.4uL
ベタイン            5uL
DMSO        1uL
Titanium Taq 0.5uL
DNA         10uL
【０２９２】
PCR条件:
72℃  8分(末端の陥没部分を埋め込む)
8サイクル:
95℃  1分
72℃  3分
最終伸長:
72℃  10分。
反応溶液を4℃に保持。
【０２９３】
次に、20uLのMung Bean由来エンドヌクレアーゼ緩衝液+ 10uLのMung Bean由来エンドヌクレアーゼを加えて30℃で30分間インキュベートした。この反応混合物を洗浄し、次の要領による+25サイクルの、NXMA24プライマー使用のPCRのための鋳型として使用した:
【０２９４】
反応溶液:
NXMA24              1uL
taq緩衝液           10uL
dNTPs       1.2uL
ddH2O       27uL
ベタイン            10uL
DMSO        2uL
Titanium Taq 1uL
DNA         48uL
【０２９５】
PCR条件:
95℃  2分
30サイクル:
95℃  1分
72℃  3分
最終伸長:
72℃  10分
4℃に保持。
生成したPCR産物はXmaIで消化した:
【０２９６】
反応溶液:
DNA         38uL
緩衝液4             5uL
10×BSA             5uL
H2O         71uL
XmaI        4uL
終夜、37℃でインキュベート。
【０２９７】
次にDNA消化物を、予めXmaIで消化しホスファターゼで処理しておいたベクターpBC Sk中にライゲートした(675ng)。このライゲーション混合物5uLを使用して、ケミカリーコンピテントTOP（登録商標）細胞をメーカーの説明書に従って形質転換した。形質転換細胞をLB/XGal/IPTG/CAMプレート上にプレーティングした。インサートを含む特定コロニーを実施例2に従って配列決定した。
【０２９８】
実施例1では潜在的なアッセイマーカー候補となるきわめて多数のユニーク配列がもたらされる結果となった。これらの配列のうちの一部は反復配列の比率が高い(>50%)ため、除外した。この研究のための比較では合計480個のユニーク配列が特定された。これらの配列から、次の評価法を用いて、サブセットをさらに選別した:
【０２９９】
多数の方法による出現頻度
多数のプール中の出現頻度
CpG島内に位置
遺伝子のプロモーター領域内に位置
予測または既知遺伝子の近傍または内部に位置
疾患に関連することが判明している
遺伝子のクラス(転写因子、増殖因子など)
反復配列(マイナス評価)
【０３００】
この評価システムでは、MeST配列は前記の各評価基準につき1点の評価を得るが、反復配列比率が50%を超えるとマイナス8点の評価となる。最高は7点、最低はマイナス8点の評価となる。評点はプロプライエタリ・データベースを用いて自動的に生成される。当初セットの480個のMeST配列のうち277個は評点が0またはそれよりも高かった。上記の評価基準と手作業による再吟味に基づき、候補MeSTの数をさらに絞って126個のユニーク配列とした。
【０３０１】
次に、亜硫酸水素塩法による配列分析を目的に、この126配列のPCRプライマーの設計を開始した。そのうち35配列は、好適なプライマーの設計が不可能である、対照DNAからの増幅に失敗した、または配列のさらなる吟味またはEnsemblデータベースの更新により質の悪さまたは反復配列の存在が新たに判明したなどを含む種々の理由から、除外した。
【０３０２】
実施例2  亜硫酸水素塩法による配列分析
【０３０３】
亜硫酸水素塩配列分析法用に、可能な場合には各特定MeST配列をカバーするように、またはその上流側または下流側の1000bp隣接配列の一部をカバーするように、PCRプライマーを設計した。この研究段階では、実施例1で使用したサンプルを増幅産物の産生に利用した。各サンプルを亜硫酸水素ナトリウムで処理し、配列分析を行った。配列データはABI 3700配列分析技術を用いて獲得した。Epigenomics社独自のESME亜硫酸水素塩配列分析法用トレース解析プログラムを用いて、獲得した配列トレースデータを正規化しメチル化率を計算した。
【０３０４】
亜硫酸水素塩法による配列分析の結果
次の特質が認められた:
1.  亜硫酸水素塩法による配列分析は特定サンプルクラス間のCpG部位のメチル化差異を指示する(Fisherスコア法)。
2.  同時メチル化が観測される。
3.  1部位だけFisherスコアが>1なら、周囲にFisherスコア>0.5の追加部位が存在するか。
次いで、これらの基準による評価で有意の同時メチル化を示すとみなされたゲノム領域をさらに調べた。
【０３０５】
図1〜3は、Epigenomics社のプロプライエタリ・ソフトウェア(詳しくは国際公開第WO 2004/000643号明細書を参照)で分析した亜硫酸水素塩法による配列分析データから生成した順位付けマトリックスを示す。マトリックス全体が一関心領域に対応する配列データを表す。マトリックスの各行は該断片内の単一CpG部位を表し、また各列は個別DNAサンプルを表す。左側の棒はメチル化率の物差しであり、メチル化の度合いが列内の各位置の濃淡で示されるが、黒は100%メチル化を、薄い灰色は0%メチル化を、それぞれ表す。白の位置に該当するデータは得られなかった。
【０３０６】
図1は遺伝子「プロスタグランジンE2受容体、EP4サブタイプ」の断片に関する配列分析データである。この場合、亜硫酸水素塩法による配列分析は、サンプル間でメチル化パターンに、差異が、非決定的ではあれ、存在することを示した。アレイ法(実施例3)を使用して、もっと大きなサンプルセットを対象に、この遺伝子をさらに調べた。この遺伝子のマーカーとしての精度は他遺伝子と組み合わせて分析すれば、さらに高めることができると見られたからである。
【０３０７】
図2は遺伝子「オーファン核受容体」の断片(a-1Fetoprotein転写因子)の配列分析データである。この場合、亜硫酸水素塩法による配列分析は、サンプルタイプ間のメチル化または同時メチル化差異を示した。
【０３０８】
図3は遺伝子「1-アシル-SN-グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼγ」の断片の配列データである。これは低品質の読み取り配列しか得られなかったROIs(関心領域)サブセットを代表しており、該遺伝子はアレイ法によって初めて意味のある分析が可能になった(実施例3)。
【０３０９】
実施例3  アレイ分析
特定のメチル化差異ゲノム領域をハイスループット・アレイ分析法でさらに分析した。診断/クラス分類スクリーニングテストに適した最も有用な最終アッセイ法は体液たとえば血清、血漿または尿沈渣の分析を可能にする(侵襲的な方法が不要となる)。従って、サンプルセットは、高感度アッセイに適した一段と特異的なマーカーセットを提供する意味で、血液中に存在する可能性のある他のがんに由来するDNAサンプルを包含した。
【０３１０】
マイクロアレイ分析用のサンプルセットの説明
マイクロアレイ分析用のサンプルセットを、マーカー候補の感度と特異度の両方に関する情報が得られるように、設計した。前立腺がん、BPHおよび正常前立腺に由来する多数のサンプル(表7)をスクリーニングした。前立腺がんサンプルはGleasonスコア別(高(≧8)、中(7)、低(≦6))および領域別(末梢域、移行域)にグループ分けした。BHPサンプルの分布はランダムであったが、ほとんどのBHPは移行域に由来するので、ほとんどのサンプルもまた移行域に由来すると想定することができる。前立腺に対する特異度を調べる検査には前立腺サンプルに加えて、多数の他タイプのがんも含めた。PBLサンプルは、これらのマーカーの血液検査への使用の可能性を調べるために含めた。正常肝および肝がんサンプルも含めたが、その理由はこれらのサンプルではGSTP1のメチル化が観測されたことにある。
【０３１１】
【表７】
2007525208.tif 000009
【０３１２】
DNA抽出
サンプルは凍結組織かまたは抽出ゲノムDNAか、いずれかの形で受領した。DNAサンプルはみなQiagen Genomic Tip-500カラムまたはMagnaPure装置を使用して抽出した。
【０３１３】
亜硫酸水素塩処理とmPCR
全サンプルの全ゲノムDNAを亜硫酸水素塩処理し、非メチル化シトシンをウラシルへと変換した。メチル化シトシンはそのままに留まった。亜硫酸水素塩処理はEpigenomics社独自の亜硫酸水素塩処理法を使用して行った。患者サンプルあたり2回の独立した亜硫酸水素塩処理反応を行った。亜硫酸水素塩化の後、各DNAサンプル10ngを、6〜8プライマー対を含む後続のマルチプレックスPCR(mPCR)反応溶液に使用した。
【０３１４】
ハイブリダイゼーション
各反応溶液は次のものを含んだ:
各0.4mMのdNTPs
1単位のTaqポリメラーゼ
2.5μlのPCR緩衝液
3.5mMのMgCl2
80nMのプライマーセット(12〜16プライマー)
11.25ngのDNA(亜硫酸水素塩処理済み)
プライマーの詳細は表1に示すとおりである。
【０３１５】
40サイクルを次の要領で行った: 変性95℃で15分間、アニーリング55℃で45秒間、プライマー伸長65℃で2分間。最終伸長は65℃で10分間行った。
【０３１６】
ハイブリダイゼーション:
次に、各個別サンプルに由来するすべてのPCR産物を、各被検CpG位置に対応する一対の固定化オリゴヌクレオチドを有するガラススライドにハイブリダイズした。これらの検出用オリゴヌクレオチドは各々、元は非メチル化体(TG)またはメチル化体(CG)のいずれかであった1つのCpG部位の近くの亜硫酸水素塩変換配列にハイブリダイズするよう設計した。使用した諸々の(有益、非有益ないまぜの)ハイブリダイゼーション用オリゴヌクレオチドのさらなる詳細については表2を参照。ハイブリダイゼーション条件は、TGおよびCG変異体の単一塩基差異の検出を可能にするように選定した。
【０３１７】
mPCR産物各5uLを10×SSARC緩衝液で希釈した。次いで反応混合物を検出用オリゴヌクレオチドと次の要領でハイブリダイズさせた。95℃で変性、10℃に冷却、42℃で一晩ハイブリダイゼーション、次いで10×SSARCおよびdH2Oにより42℃で洗浄。
【０３１８】
ハイブリダイゼーション用オリゴヌクレオチドのさらなる詳細は表9に示す。
ハイブリダイズした各オリゴヌクレオチドからの蛍光シグナルは、GenePixスキャナー+ソフトウェアを用いて検出した。2シグナル(各CpG位置の分析に使用したCGオリゴヌクレオチドとTGオリゴヌクレオチドに由来)の比を、蛍光シグナル強度の比較を基に計算した。
【０３１９】
各患者につき2分量のDNAを亜硫酸水素塩処理し、また各亜硫酸水素塩処理DNAサンプルにつき2回のハイブリダイゼーションを行った。これは、各患者につき合計4チップを処理したことを意味する。ハイブリダイゼーションでは、サンプルを2処理ラウンドにグループ分けして、潜在的な処理バイアスを防ぐようにした。前述のように、該2ラウンドは各々、各DNAサンプルにつき重複度が2、各患者につき重複度が4となる。サンプルは性、診断、組織および亜硫酸水素塩処理バッチについてランダム化した112サンプルのバッチでハイブリダイズした。
【０３２０】
データ分析方法
チップデータの分析:
チップデータの分析には、メチル化アレイデータを分析し視覚化するための多様な統計用ツールおよび新規な機械学習方法を包含するEpigenomics社のプロプライエタリ・ソフトウェアEpiScape（登録商標）を使用した。以下、このデータ分析に使用した最も重要なデータ分析手法を要約する。
【０３２１】
生のハイブリダイゼーション強度/メチル化比より:
各CpG位置の対数メチル化比[log(CG/TG)]は次のステップを含む標準化された前処理パイプラインに従って決定される。この対数比は、ハイブリダイゼーション・ノイズの分散が可能なメチル化率の全範囲にわたってほぼ一定となるような特性をもつ。
【０３２２】
仮説検定
その主課題はサンプルのクラス予測に有意の寄与をなしうるようなマーカーの弁別である。本発明の「特に好ましい実施態様」では、有意の寄与が検出されるのは、該マーカーを含む予測モデルを、該マーカーを欠くモデルと比較してクラス分類性能は改善しないとする帰無仮説がp<0.05で棄却される場合である。この検定を全潜在マーカーセットに適用したため、p値は多重検定用に補正した。これは、単一マーカーのp値に被検潜在マーカー数を掛けるだけの保守的なBonferroni補正の適用によって行った。また、それほど保守的ではないFDR (false discovery rate)法の適用によっても結果を出した。
【０３２３】
この実施例では終始、マーカー(場合によっては単に遺伝子またはアンプリコンともいう)はゲノム関心領域(ROI)ともいう。マーカーは該ゲノム領域内にいくつかのCpG位置を含む。マーカーには予測力がないという帰無仮説を検定するために、ロジスティック回帰モデルの尤度比検定を用いた。単一マーカーに関するロジスティック回帰モデルは反復ROI内の全CpG位置に由来するメチル化測定値の線形結合である。あてはめロジスティック回帰モデルを、メチル化とは無関係でありかつ帰無仮説を表す不変確率モデルと比較する。マーカーのp値は尤度比検定で計算した。
【０３２４】
マーカーに関する有意のp値は、このROIのメチル化が2クラスによって与えられるような関心問題に対して何らかの系統的な相関性をもつことを意味する。一般に、有意のp値は優れたクラス分類性能を必ずしも示唆しない。しかし、ロジスティック回帰では線形予測子を検定統計量の基礎として使用するため、小さなp値は優れた臨床性能を示唆する。
【０３２５】
教師付き学習によるクラスの予測
異なる組織クラスを特定マーカーのCpGアンサンブルがどこまでうまく弁別しうるかについて確かな推定を下すためには、その予測精度をクラス分類によって決定することができる。その目的のために、メチル化プロファイルに基づく予測関数を、固有のクラス標識を付けたある種の組織サンプルセットを使用して計算した。このステップはトレーニングといい、データ標識によって表される事前知識を利用する。次いで独立サンプルセットを対象に、該関数の予測精度を検定した。好ましい方法として、予測関数の学習にはサポートベクターマシン(SVM)アルゴリズムを使用した。この分析では感度と特異度のウェイトを等しくした。これを実現するには、偽陽性および偽陰性のクラス分類に付随するリスクをそれぞれのクラスサイズと反比例するように設定することができる。生成する分類子の感度と特異度はほぼ等しくなると予測しうる。このウェイト付けは臨床条件に応じて調節することができる。
【０３２６】
組織クラス予測性能の推定: 相互検証法
小さなサンプルサイズの場合、相互検証法は弁別関数の予測精度に関する有効確実な推定値をもたらす。従って、マーカーの有意性に加えて相互検証の精度、感度および特異度の推定値ももたらされる。各クラス分類課題では、サンプルをほぼ等しいサイズの5群に分けた。次いでこれら5群のうちの4群を利用して学習アルゴリズムをトレーニングした。この方法で得られた予測子を次に、残りの独立試験サンプル群を利用して検定した。該独立試験サンプル群の諸々の可能な選択肢について事前知識を一切使わず該学習アルゴリズムを10回実行し、そのときの正しい陽性および陰性クラス分類の件数を数えた。該サンプルセットの10ランダム順列を対象にこの手順を繰り返すことにより、サンプルを1つのトレーニングサンプルセットと1つの独立検定セットへと単純に分割する場合よりも優れた予測性能の推定が得られるようにした。
【０３２７】
データ分析の結果
アレイデータ分析の最初のステップは、諸々の前立腺由来組織の比較研究で弁別力のあるマーカーに目を向けることであった。まず、正常およびBPH前立腺組織を前立腺がん組織と比較したが、この研究に使用したマーカーには望ましい基準を満たすp値を示すものも多かった(図4)。次に、前立腺がん組織を、この研究に使用した他の諸々の組織クラスと比較した(図7)。このサンプルセットではほぼすべてのマーカーが既定の統計基準を満たした。GSTP1遺伝子は前立腺がんでは高メチル化していることが知られているが、他タイプのがんでもまた高メチル化を示す。そこで、最終的に前立腺がん対他タイプのがん比較でメチル化レベルを詳しく調べることにした。
【０３２８】
前立腺正常およびBPH vs前立腺がん
この比較では、陰性クラスは正常前立腺およびBPHに由来する91のサンプルからなった。陽性クラスは99の前立腺がんサンプルからなった。ほとんどのマーカーはp値<0.05の基準を満たした(図4)。この分析のp値、精度、感度および特異度を表4に示す。図5に示すのは、そのうちの最優良12マーカーである。
【０３２９】
前立腺正常および他組織vs前立腺がん
次に、完全なサンプルセットを対象に比較を行った。陰性群は、表7に記載の他臓器由来の正常組織および前立腺以外のがんを包含するよう拡大した。この陰性クラスは正常前立腺、BPH、および他の正常およびがん組織に由来する254のサンプルからなった。陽性クラスは99の前立腺がんサンプルからなった。ほとんどのマーカーはやはりp値≦0.05の有意水準を満たす(表5)。最高性能マーカーの精度は約86%である(図6および/または表5を参照)。この分析のp値、精度、感度および特異度を表5に示す。図7に示すのは、そのうちの最優良12マーカーである。
【０３３０】
他のがんvs前立腺がん
GSTP1(最先端をいくメチル化前立腺がんマーカー)の高メチル化は前立腺特異的ではないので、前立腺がんと他のがんのメチル化状態をもっと詳しく調べてみた。図16は、GSTP1(配列番号57)が肝がんで高度に高メチル化し、また乳がんでもある程度高メチル化していることを示す。それにもかかわらず、他のいくつかの最優良マーカーは前立腺がんと肝がんを十分に弁別する。この分析のp値、精度、感度および特異度を表6に示す。図8に示すのは、そのうちの最優良12マーカーである。
【０３３１】
表4〜6は次のような組織比較に際しての全マーカーの性能特性をまとめたものである: 正常前立腺およびBPH vs.前立腺がん(表4); 正常前立腺、BPH および他組織vs.前立腺がん(表5); および他のがん組織vs.前立腺がん(表6)。
【０３３２】
表4および5の分析は、分析群にBHPおよび正常前立腺サンプルを含んでいた。正常前立腺およびBPH vs.前立腺がんの分析は前立腺特異的環境でのマーカーの性能を測定するのが狙いであった。がん、正常の両方を含む他組織を絡めた分析(正常前立腺、BPH および他組織vs.前立腺がん)は、遠隔サンプル中のマーカーの総合的な性能を向上または変化させる可能性のあるバックグラウンドと併せてマーカー性能を考察したものである。
【０３３３】
GSTP1は複数タイプのがんでメチル化される傾向があるため、がんのタイプ(表6)の比較も行った。こうした特異度の欠如は体液ベースのアッセイではマーカーの性能にマイナスの影響を及ぼしかねない。GSTP1(配列番号57)は前立腺がんで高メチル化しているが、予想どおり肝がんでも高メチル化している。肝がんではIGF2(配列番号58)も同様にメチル化している。図8に示すマーカーの大多数は、前立腺がんを除くほとんどのタイプのがんで非メチル化状態にある。図4〜8からは、有益かつ正確なマーカーとしての可能性を秘めた多数の候補が存在することが分かる。高感度と高特異度を確保するには複数のマーカーを組み合わせるのがよいであろう。
【０３３４】
【表８】
2007525208.tif 000010
【０３３５】
【表９】
2007525208.tif 000011
【０３３６】
【表１０】
2007525208.tif 000012
【０３３７】
【表１１】
2007525208.tif 000013
【０３３８】
【表１２】
2007525208.tif 000014
【０３３９】
表7は実施例3の冒頭に収めた。
【０３４０】
【表１３】
2007525208.tif 000015
【０３４１】
【表１４】
2007525208.tif 000016
【０３４２】
【表１５】
2007525208.tif 000017
【０３４３】
【表１６】
2007525208.tif 000018
【０３４４】
【表１７】
2007525208.tif 000019
【０３４５】
【表１８】
2007525208.tif 000020
【０３４６】
【表１９】
2007525208.tif 000021
【０３４７】
【表２０】
2007525208.tif 000022
【０３４８】
【表２１】
2007525208.tif 000023
【０３４９】
【表２２】
2007525208.tif 000024
【０３５０】
【表２３】
2007525208.tif 000025
【０３５１】
【表２４】
2007525208.tif 000026
【０３５２】
【表２５】
2007525208.tif 000027
【０３５３】
【表２６】
2007525208.tif 000028
【０３５４】
【表２７】
2007525208.tif 000029
【０３５５】
【表２８】
2007525208.tif 000030
【０３５６】
【表２９】
2007525208.tif 000031
【０３５７】
【表３０】
2007525208.tif 000032
【０３５８】
【表３１】
2007525208.tif 000033
【０３５９】
【表３２】
2007525208.tif 000034
【０３６０】
【表３３】
2007525208.tif 000035
【０３６１】
【表３４】
2007525208.tif 000036
【０３６２】
【表３５】
2007525208.tif 000037
【０３６３】
【表３６】
2007525208.tif 000038
【０３６４】
【表３７】
2007525208.tif 000039
【０３６５】
【表３８】
2007525208.tif 000040
【０３６６】
【表３９】
2007525208.tif 000041
【０３６７】
【表４０】
2007525208.tif 000042
【０３６８】
【表４１】
2007525208.tif 000043
【０３６９】
【表４２】
2007525208.tif 000044
【０３７０】
【表４３】
2007525208.tif 000045
【０３７１】
【表４４】
2007525208.tif 000046
【０３７２】
【表４５】
2007525208.tif 000047
【０３７３】
【表４６】
2007525208.tif 000048
【０３７４】
【表４７】
2007525208.tif 000049
【０３７５】
【表４８】
2007525208.tif 000050
【０３７６】
【表４９】
2007525208.tif 000051
【０３７７】
【表５０】
2007525208.tif 000052
【０３７８】
【表５１】
2007525208.tif 000053
【０３７９】
【表５２】
2007525208.tif 000054
【０３８０】
【表５３】
2007525208.tif 000055
【０３８１】
【表５４】
2007525208.tif 000056
【０３８２】
【表５５】
2007525208.tif 000057
【０３８３】
【表５６】
2007525208.tif 000058
【０３８４】
【表５７】
2007525208.tif 000059
【０３８５】
【表５８】
2007525208.tif 000060
【０３８６】
【表５９】
2007525208.tif 000061
【０３８７】
【表６０】
2007525208.tif 000062
【０３８８】
【表６１】
2007525208.tif 000063
【０３８９】
【表６２】
2007525208.tif 000064
【０３９０】
【表６３】
2007525208.tif 000065
【０３９１】
【表６４】
2007525208.tif 000066
【０３９２】
【表６５】
2007525208.tif 000067
【０３９３】
実施例4
次の分析では、次の表10に記載の遺伝子のメチル化状態を、表10に記載のプライマーを使用するMSP(メチル化特異的PCR)法により分析した。
【０３９４】
この研究は前立腺がん、BHPの各組織サンプル50個を対象に行った。ゲノムDNAは亜硫酸水素塩法で処理した後にMSP法で分析した。この処理により、非メチル化シトシンはウラシルに変換されたが、メチル化シトシンはそのままに留まった。亜硫酸水素塩処理はOlek et al. (1996)で開示されているプロトコールに若干の変更を加えて行った。次いで、メチル化特異的プライマーを用いて関心配列を増幅し、増幅産物をTaqmanプローブ(表10)により検出した。
【０３９５】
【表６６】
2007525208.tif 000068
【０３９６】
用語「BHQ」はBlack Hole Quencher(BHQ（登録商標）)色素を意味し、また「FAM」は常用の蛍光色素である。
【０３９７】
試薬:
MSP法の確立と鋳型の増幅には標準的な試薬/サイクル条件を使用する。標準条件の概要は表11および12に示す。生体サンプルに取り掛かる前に、100ピコグラムの完全メチル化DNAを陽性対照として、また100ナノグラムの非メチル化DNAを陰性対照として、それぞれ使用して、アンプリコンを作製した。また、50ngの非メチル化DNAをバックグラウンドに50pgのメチル化DNAを使用して、相対感度の点から反応条件もチェックした。試薬濃度は表11のとおりであり、ABI 7700で使用されるサイクル条件は表12のとおりである。
【０３９８】
【表６７】
2007525208.tif 000069
【０３９９】
【表６８】
2007525208.tif 000070
【０４００】
データの分析
教師付き学習によるクラス予測
【０４０１】
異なる組織クラスを特定マーカーのCpGアンサンブルがどこまでうまく弁別しうるかについて確かな推定を下すためには、その予測精度をクラス分類によって決定することができる。その目的のために、メチル化プロファイルに基づく予測関数を、固有のクラス標識を付けたある種の組織サンプルセットを使用して計算した。このステップはトレーニングといい、データ標識によって表される事前知識を利用する。次いで独立サンプルセットを対象に、該関数の予測精度を検定した。好ましい方法として、予測関数の学習にはサポートベクターマシン(SVM)アルゴリズムを使用した(たとえばCristiannini, N. and Shawe-Taylor, J., An introduction to support vector machines, Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2000; Duda, R.O., Hart, P. E., and Stock, D.G., Pattern Classification, New York: John Wiley & Sons, 2001を参照)。この分析では感度と特異度のウェイトを等しくした。これを実現するには、偽陽性および偽陰性のクラス分類に付随するリスクをそれぞれのクラスサイズと反比例するように設定することができる。生成する分類子の感度と特異度はほぼ等しくなると予測しうる。このウェイト付けは臨床条件に応じて調節することができる。
【０４０２】
結果
該マーカーの感度と特異度を求めるために、定期済みのパラメーターを使用して前立腺がん、BHPの各50サンプルをスクリーニングした。サンプルはメチル化DNA対非メチル化DNAの技術的な基準に従ってプレスクリーニングしておいたものである。MethyLightリアルタイムPCR法によるアッセイを、メチル化DNAに対して特異的であり、通常の非メチル化DNAは増幅しないことを確認したうえで、TaqManプラットホーム(ABI7900)で行った。最終的なアッセイ成績は表13のとおりである。AUCと対応する感度および特異度の値はSVMアルゴリズムを使用して計算した。
【０４０３】
【表６９】
2007525208.tif 000071
【０４０４】
実施例5
以下の研究の目的は、種々の体液サンプル中の前立腺がんマーカーのメチル化状態を分析し、好ましい選択肢の体液サンプル(尿か血清か)、好ましいマーカー、マーカー類またはマーカーの組み合わせを特定することであった。研究には、種々の人種(コーカシアン、アフリカ系アメリカンなど)を代表する平均年齢65歳の患者80人に由来する、対応付けした血清および尿沈渣サンプルを使用した。いずれの場合も、ゲノムDNAを亜硫酸水素塩で処理した後にHeavyMethyl法またはMSP法で分析した。
【０４０５】
尿沈渣は次の要領で分析用に調製し、亜硫酸水素塩で処理した:
・Magnapure DNA抽出キットを使用して200uLの尿沈渣を溶出液量100uLに精製した
・Magnapure溶出液を対象に5uL HD6 PCRを行い、DNA濃度を求めた
・DNA溶液100uLを、亜硫酸水素塩法で処理した
・10uL C3亜硫酸水素塩処理特異的定量的PCR
・5uLの「Merck亜硫酸塩テスト」
血清は次の要領で分析用に調製し、亜硫酸水素塩で処理した:
・Magnapure DNA Large Volume Total核酸を使用して1mLの血清サンプルを溶出液量100uLに精製した
・Magnapure溶出液を対象に5uL HD6 PCRを行い、DNA濃度を求めた
・DNA溶液100uLを、独自の亜硫酸水素塩法で処理した
・10uL C3亜硫酸水素塩処理特異的定量的PCR
・5uLの「Merck亜硫酸塩テスト」
HD6は非亜硫酸水素塩変換DNAを増幅するゲノムアッセイである。抽出後のDNAの定量に使用する。βグロブリン遺伝子特異的である。
【０４０６】
C3はGSTP1遺伝子のエクソン4の近傍に位置する亜硫酸水素塩特異的アッセイである。亜硫酸水素塩変換DNAの定量にも使用される発明者らのHB14アッセイと同じ要領で使用した。
【０４０７】
どちらのアッセイも標準曲線を使用する必要があり、増幅曲線の位置と対応する濃度からDNAサンプルの定量値を求める。
【０４０８】
後述の要領で、各マーカーにつきサンプルあたり10uLの亜硫酸水素塩処理DNAを対象に1回のPCRを行った。
【０４０９】
GSTP1遺伝子のHeavyMethylアッセイ  
【０４１０】
ここでは、次の表1に記載のプライマーを使用したメチル化特異的増幅法により遺伝子GSTP1のメチル化状態を分析した。
【０４１１】
関心配列の増幅にはメチル化特異的プライマーと、非メチル化DNAの非特異的増幅を抑えるためのブロッカーオリゴヌクレオチドとを使用する。次いで、メチル化特異的Lightcyclerプローブにより増幅産物を検出する。
【０４１２】
【表７０】
2007525208.tif 000072
【０４１３】
反応条件:
PCRプログラム
95℃での変性処理
95℃       10分
50サイクル                        勾配
95℃での変性処理         10秒(1℃/秒)
56℃でのアニーリング      30秒(1℃/秒)  検出
72℃での鎖伸長           10秒(1℃/秒)
【０４１４】
遺伝子「ヒストンH4」のMSP分析
ここでは、次の表15に記載のプライマーを使用したメチル化特異的増幅法により遺伝子「ヒストンH4」のメチル化状態を分析した。
【０４１５】
関心配列の増幅にはメチル化特異的プライマーを使用し、次いでメチル化特異的Taqmanプローブにより増幅産物を検出する。
【０４１６】
【表７１】
2007525208.tif 000073
【０４１７】
反応条件:
PCRプログラム
95℃での変性処理
95℃       10分
50サイクル                        勾配
95℃での変性処理         10秒(20℃/秒)
60℃でのアニーリング      45秒(20℃/秒)  検出
【０４１８】
遺伝子「プロスタグランジンE2受容体」のMSP分析
ここでは、次の表16に記載のプライマーを使用したメチル化特異的増幅法により遺伝子「プロスタグランジンE2受容体」のメチル化状態を分析した。
【０４１９】
関心配列の増幅にはメチル化特異的プライマーを使用し、次いでメチル化特異的Taqmanプローブにより増幅産物を検出する。
【０４２０】
【表７２】
2007525208.tif 000074
【０４２１】
PCRプログラム
95℃での変性処理
95℃       10分
50サイクル                        勾配
95℃での変性処理         10秒(20℃/秒)
60℃でのアニーリング      45秒(20℃/秒)  検出
遺伝子「オーファン核受容体NR5A2」のMSP分析
ここでは、次の表16に記載のプライマーを使用したメチル化特異的増幅法により遺伝子「オーファン核受容体NR5A2」のメチル化状態を分析した。
【０４２２】
関心配列の増幅にはメチル化特異的プライマーを使用し、次いでメチル化特異的Taqmanプローブにより増幅産物を検出する。
【０４２３】
【表７３】
2007525208.tif 000075
【０４２４】
PCRプログラム
95℃での変性処理
95℃       10分
50サイクル                        勾配
95℃での変性処理         10秒(20℃/秒)
60℃でのアニーリング      45秒(20℃/秒)  検出
【０４２５】
マーカー分析
C3亜硫酸水素塩特異的PCRを用いて、結果をそれぞれ、増幅の+/-評価により定性的に、また全DNAに占めるメチル化DNAの比率の決定により定量的に、分析した。各アッセイでは全メチル化DNAを測定するために、100%メチル化標準(Chemicon SSS1処理DNA)曲線を使用した。
【０４２６】
結果
【０４２７】
各マーカーについて、アッセイの受診者動作特性曲線(ROC曲線)を決定した。ROCは診断検査法で種々の可能なカットオフポイントに対応する真陽性率と偽陽性率の関係を示す曲線である。そこでは採用するカットオフポイントに応じた感度と特異度の間のトレードオフ関係が示される(感度の上昇には必ず特異度の低下を伴う)。ROC曲線下面積(AUC)は診断検査法の精度の尺度である(AUCは大きければ大きいほどよく、至適値は1である。無作為検査では面積が0.5になる対角線の上にROC曲線が重なろう; J.P. Egan, Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975を参照)。
【０４２８】
得られたAUCの値:
血清:
マーカー: HeavyMethyl GSTP1
AUC:  0.51
マーカー: MSP ヒストンH4
AUC:  0.59
マーカー: MSP プロスタグランジンE2受容体
AUC:  0.52
マーカー: MSP オーファン核受容体NR5A2
AUC:  0.50
尿:
マーカー: HeavyMethyl GSTP1
AUC:  0.58
マーカー: MSP ヒストンH4
AUC:  0.5
【０４２９】
マーカー: MSP プロスタグランジンE2受容体
AUC:  0.49
マーカー: MSP オーファン核受容体NR5A2
AUC:  0.56
【０４３０】
前立腺がんを正確に発見するには、複数のマーカー(すなわち遺伝子パネル)の総合的な分析を行うのが好ましい。尿系サンプルの分析では、マーカーの好ましい組み合わせはGSTP1、「プロスタグランジンE2受容体」および「オーファン核受容体NR5A2」の組み合わせである(感度0.37、特異度0.72)。血清系サンプルの分析では、好ましい組み合わせはGSTP1、「ヒストンH4」および「オーファン核受容体NR5A2」の組み合わせである(感度0.35、特異度0.75)。
【０４３１】
表18に記載の遺伝子のMSP分析
【０４３２】
ここでは、表18に記載の特定遺伝子のメチル化状態を、次の表6に記載のプライマーおよびプローブを使用したMSP TaqManアッセイ法で分析した。
【０４３３】
使用したサンプルの内訳は前立腺がん腫組織×10、良性前立腺肥大(BPH)組織×10、および正常前立腺組織×5であった。ゲノムDNAは亜硫酸水素塩処理後にMSP法で分析した。すべてのサンプルの全ゲノムDNAを亜硫酸水素塩処理すると、非メチル化シトシンはウラシルに変換された。メチル化シトシンはそのままに留まった。亜硫酸水素塩処理はOlek et al. (1996)で開示されているプロトコールに若干の変更を加えて行った。
【０４３４】
次いで、亜硫酸水素塩処理DNAに対して特異的なプライマーを用いて関心配列を増幅し、TaqManおよび/またはLightcyclerプラットホームを用いてTaqmanプローブにより増幅産物を検出した。結果を次の表20に示す。
【０４３５】
試薬とサイクル条件は次のとおりであった:
【０４３６】
【表７４】
2007525208.tif 000076
【０４３７】
【表７５】
2007525208.tif 000077
【０４３８】
【表７６】
2007525208.tif 000078
【０４３９】
【表７７】
2007525208.tif 000079
【０４４０】
【表７８】
2007525208.tif 000080
【０４４１】
【表７９】
2007525208.tif 000081
【０４４２】
実施例6
はじめに
【０４４３】
GSTPi遺伝子は解析が最も進んでいる前立腺診断メチル化マーカーの1つである。以下の研究は、GSTPiの異常メチル化を示さないような前立腺がんを弁別しうる前立腺診断メチル化マーカーの特定が狙いである。特定されるマーカーは、前立腺がんの診断および/または検査のための、GSTPiを含む遺伝子パネルのメンバーとして特に有用であろうと期待される。
【０４４４】
全ゲノム的なメチル化分析実験により、GSTP1遺伝子では異なるDNAメチル化プロファイルを示すような、前立腺がんサブタイプ間でメチル化差異を生じる配列候補を特定するようにした。この研究には全ゲノム的メチル化分析法であるAP-PCRおよびMCAを使用した。実験計画に記載の要領で、AP-PCR法で2件の比較を、MCA法で3件の比較を、それぞれ行った。
【０４４５】
比較は実施例1に記載のプロトコールに従って行った。
実験計画
この研究には次の4サンプルプールを使用した。
【０４４６】
【表８０】
2007525208.tif 000082
【０４４７】
AP-PCRでは、3サンプルプール(プール# 1、2および4)を実験し、多重比較が行えるようにした。次の3件の比較を行ったGSTP1(+)対GSTP1(-)、GSTP1(+)対GSTP1(?)およびGSTP1(-)対GSTP1(?)。同じゲル上で同じ泳動速度を示したバンドは、メチル化差異があっても同じ配列を有するものとみなし、従って1回だけクローニングし、配列分析した。しかし、メチル化差異のあるどのバンドにも一意のMeST IDを割り当てた。
【０４４８】
MCAでは2件の比較を行った。どちらの比較でもGSTP1(+)サンプルプール(プール# 1)をテスターとして、GSTP1(-)サンプルプール(プール#2またはプール#3)をドライバーとして、使用した。
【０４４９】
実験結果の要約
・96の非重複、メチル化差異配列が特定された
・96配列のうち39配列はAP-PCR法によって特定された
・96配列のうち57配列はMCA法によって特定された
・非重複、メチル化差異配列のうち61配列は評点が0以上であった
両法を使用して現れた配列はなかった
方法別の評点:
【０４５０】
【表８１】
2007525208.tif 000083
【０４５１】
メチル化差異を示す興味深い候補配列
96の非重複、メチル化差異配列の評価には次のパラメーターを使用した:
%反復配列−メチル化差異配列の3’または5’側1000bp隣接領域内の反復配列の百分率;
%CpG島−メチル化差異配列の上流、下流いずれかの側に隣接するCpG島の百分率;
プロモーター内−メチル化差異配列がエクソン1の上流5000bp内に認められる;
遺伝子内−メチル化差異配列が隣接エクソン間のどこかに認められる。
【０４５２】
これらの配列のうち、配列番号1017〜1028を選別してさらに分析したが、特に興味深いのは配列番号1023であった。配列番号1017〜1028は、次の実施例7に記載の高感度アッセイでさらに詳しく調べた。
【０４５３】
実施例7
はじめに
ここでは、表21に記載の遺伝子のメチル化状態を、実施例4に記載の方法とサンプルを使用するメチル化特異的PCR法で分析した。
【０４５４】
この研究は前立腺がん、BHPの各組織サンプル50個を対象に行った。ゲノムDNAは亜硫酸水素塩法で処理した後にMSP法で分析した。この処理により、非メチル化シトシンはウラシルに変換されたが、メチル化シトシンはそのままに留まった。亜硫酸水素塩処理はOlek et al. (1996)で開示されているプロトコールに若干の変更を加えて行った。次いで、メチル化特異的プライマーを用いて関心配列を増幅し、増幅産物をTaqmanプローブ(表21を参照)により検出した。
【０４５５】
【表８２】
2007525208.tif 000084
【０４５６】
結果:
使用した統計手法は実施例4で説明したとおりである。
【０４５７】
【表８３】
2007525208.tif 000085
【０４５８】
実施例8
パネル
実施例1〜7から推測したアッセイ成績で見た最優良マーカーを表25に示す。
前立腺がんの発見という点でのマーカーの性能を最大限に高めるために、実施例4および7に記載のMSPアッセイ済みマーカーを2遺伝子および3遺伝子からなる遺伝子パネルとして組み合わせた。表22〜24はMSPアッセイ済みマーカーの組み合わせの前立腺がん発見における感度と特異度を示す。
【０４５９】
【表８４】
2007525208.tif 000086
【０４６０】
【表８５】
2007525208.tif 000087
【０４６１】
実施例9
前記MSPアッセイ法の代替アッセイ法としてHeavyMethylアッセイ法をさらに確立した。使用プライマーおよびブロッカーを表24に示す。
【０４６２】
【表８６】
2007525208.tif 000088
【０４６３】
GSTP1 LightCyclerプログラム:
活性化:  95℃  10分
50サイクル:
95℃  10秒(20℃/秒)
56℃  30秒(20℃/秒)
72℃  10秒(20℃/秒)  検出
融解曲線:
95℃  10秒  20
40℃  10秒  20
70℃  0秒   0.1
冷却:  40℃  5秒
【０４６４】
配列番号20、配列番号24および配列番号36 LightCyclerプログラム:
活性化:  95℃  10分
55サイクル:
95℃  10秒(20℃/秒)
56℃  30秒(20℃/秒)
72℃  10秒(20℃/秒)  検出
融解:
95℃  10秒  20
35℃  20秒  20  検出
95℃  0秒   0.1
【０４６５】
【表８７】
2007525208.tif 000089
【０４６６】
【表８８】
2007525208.tif 000090
【０４６７】
【表８９】
2007525208.tif 000091
【０４６８】
【表９０】
2007525208.tif 000092
【０４６９】
表26に記載の遺伝子の名前(表では「ゲノム配列」と明記しているが、その特定配列にマップされた遺伝子は現在存在しない。)
【０４７０】
NM 014242: LIM/ホメオボックスタンパク質LHX9
NM 003352: ユビキチン様タンパク質SMT3C前駆体(ユビキチンホモロジードメインタンパク質PIC1)(ユビキチン様タンパク質UBL1)(ユビキチン関連タンパク質SUMO-1)(GAP修飾タンパク質1)(GMP1)(セントリン)
【０４７１】
NM 003458: Bassoon; ジンクフィンガータンパク質231; ニューロンダブルジンクフィンガータンパク質
【０４７２】
NM 013312: HOOK2タンパク質
NM 006762: リソソーム関連多数回膜貫通タンパク質(レチノイン酸誘導性E3タンパク質)(HA1520) LAM5
【０４７３】
NM 005539: type 1イノシトール-1,4,5-三リン酸5-ホスファターゼ(EC 3.1.3.56) (5PTASE)
【０４７４】
NM 000958: プロスタグランジンE2受容体EP4サブタイプ(プロスタノイドEP4受容体)(PGE受容体EP4サブタイプ)
【０４７５】
NM 004955: 拡散型ヌクレオシドトランスポーター1(拡散型ニトロベンジルメルカプトプリンリボシド感受性ヌクレオシドトランスポーター)(拡散型NBMPR感受性ヌクレオシドトランスポーター)( ヌクレオシドトランスポーター、ES型)
【０４７６】
NM 003822: オーファン核受容体NR5A2(α-1-フェトプロテイン転写因子)(肝細胞転写因子)(B1結合因子)(HB1F)(CYP7Aプロモーター結合因子)
【０４７７】
NM 032526: タンパク質-チロシンホスファターゼX前駆体(EC 3.1.3.48)(膵島自己抗原関連タンパク質)(ICAAR) (IAR)(ホグリン)
【０４７８】
NM 004565: ペルオキソーム膜タンパク質PEX14(ペルオキシン14)(ペルオキソーム膜アンカータンパク質PEX14)(PTS1受容体ドッキングタンパク質)
【０４７９】
NM 156037: ホメオボックスタンパク質HOX-B6 (HOX-2B) (HOX-2.2)
NM 002314: LIMドメインキナーゼ1(EC 2.7.1.37) (LIMK-1)
NM 021642: 低親和性免疫グロブリンγ Fc受容体II-A前駆体(Fc-γ RII-A)(FCRII-A)(IGG Fc受容体II-A)(Fc-γ RIIA) (CD32) (CDW32)
【０４８０】
NM 020132: 1-アシル-SN-グリセロール-3-ホスファターゼアシルトランスフェラーゼγ(EC 2.3.1.51) (1-AGPアシルトランスフェラーゼ3)(1-AGPAT 3)(リソホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼγ)(LPAAT-γ) (1-アシルグリセロール-3-リン酸O-アシルトランスフェラーゼ3)
【０４８１】
NM 133267: ホメオボックスタンパク質GSH-2
NM 003495: ヒストンH4
NM 004518: 電位依存性カリウムチャンネル・サブファミリーKQTメンバー2 (神経芽細胞腫特異的カリウムチャンネルKQT様2)
【０４８２】
NM 003916: アダプター関連タンパク質複合体1 σ 1Bサブユニット(σ-アダプチン1B)(アダプタータンパク質複合体AP-1 σ-1Bサブユニット)(ゴルジアダプターHA1/AP1アダプチンσ-1Bサブユニット)(クラスリン集合タンパク質複合体1 σ-1B小鎖)(AP-1クラスリンのσ-1Bサブユニット) (DC22)
【０４８３】
NM 002705: ペリプラキン(195kDaコーニファイドエンベロープ前駆体) (195kDa腫瘍随伴性天疱瘡抗原)
【０４８４】
NM 030928: DNA複製因子; ショウジョウバエdouble parkedホモログ
NM 022114: PRドメインジンクフィンガータンパク質16(転写因子MEL1)
NM 002555: 腫瘍抑制サブトランスファラブル候補5; P45 Beckwith-Wiedemann領域1A; Beckwith-Wiedemann症候群染色体領域1、候補A; 異物排出輸送体様タンパク質; 有機カチオン輸送体様2; 腫瘍抑制STF CDNA 5; 刷り込まれた多数回膜貫通型多特異性輸送体関連タンパク質
【０４８５】
NM 000044: AR
NM 004360: CDH1
NM 000077: CDKN2a
NM 000610: CD44
NM 000852: GSTP1
NM 000612: IGF2
NM 080552: VIAAT
AF102770: RAFF1A
【図面の簡単な説明】
【０４８６】
【図１】図１から３は亜硫酸水素塩法による配列分析データから生成した順位付けマトリックスを示す。マトリックス全体が一断片に対応する配列データを表す。マトリックスの各行は該断片内の単一CpG部位を表し、また各列は個別サンプルを表す。左側の棒はメチル化率の物差しであり、メチル化の度合いが列内の各位置の濃淡で示されるが、黒は100%メチル化を、薄い灰色は0%メチル化を、それぞれ表す。白の位置に該当するデータは得られなかった。
【０４８７】
図1は遺伝子「プロスタグランジンE2受容体、EP4サブタイプ」の断片に関する配列分析データである(配列分析サンプルは前立腺がん腫に由来する)。
【図２】遺伝子「オーファン核受容体」の断片a-1Fetoprotein転写因子の配列分析データである(配列分析サンプルは前立腺がん腫に由来する)。
【図３】遺伝子「1-アシル-SN-グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼγ」の断片の配列データである。
【図４】実施例3に基づく正常前立腺およびBPH vs.前立腺がんマーカー順位を示す。各個別関心領域がポイントとして表わされている。左側のグラフはgenewiseロジスティック回帰モデルからの非補正p値を与える。上下の点線は5% BonferroniおよびFDR限界をそれぞれ示す。X軸は個別CpG位置に対応するp値を示す。p値は実測される分布がデータセット中で偶然に起こる確率である。右側のグラフはすべてのオリゴヌクレオチドからのメチル化測定値をトレーニングデータとした線形SVMの精度、感度および特異度を与える。各ゲノム領域の精度は黒の四角で、特異度は白抜きのひし形で、また感度は白抜きの四角で、それぞれ表している。X軸で示す精度は正しくクラス分類されたサンプルの割合である。
【図５】実施例3に基づく正常前立腺およびBPH vs.前立腺がん弁別用の最良12マーカーを示す。正常前立腺およびBPHサンプルは左側に、前立腺がんは右側に、それぞれ示す。各列は1サンプルを表し、各行は1オリゴヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチドは候補マーカーごとにグループ分けしてある。表示のマーカーは上から下へと順に精度が高まる。各マーカーの右側に記載してあるのはBonferroni補正p値である。メチル化データは個別オリゴヌクレオチドに関する1標準偏差を基準に中心化および標準化している。色はオリゴヌクレオチドメチル化状態の平均値からの相対距離を表す。緑は任意のオリゴヌクレオチド内の低メチル化CpGを表し、赤は任意のオリゴヌクレオチド内の高メチル化CpGを表す。
【図６】実施例3に基づく正常前立腺、BPHおよび他組織 vs.前立腺がんマーカー順位を示す。各個別関心領域がポイントとして表されている。左側のグラフはgenewiseロジスティック回帰モデルからの非補正p値を与える。上下の点線は5% BonferroniおよびFDR限界をそれぞれ示す。X軸は個別CpG位置に対応するp値を示す。p値は実測される分布がデータセット中で偶然に起こる確率である。右側のグラフはすべてのオリゴヌクレオチドからのメチル化測定値をトレーニングデータとした線形SVMの精度、感度および特異度を与える。各ゲノム領域の精度は黒の四角で、特異度は白抜きのひし形で、また感度は白抜きの四角で、それぞれ表している。X軸で示す精度は正しくクラス分類されたサンプルの割合である。
【図７】実施例3に基づく正常前立腺、BPHおよび他組織 vs.前立腺がん弁別用の最良12マーカーを示す。正常前立腺、BPHおよび他組織サンプルは左側に示す。「他組織」は、表7に記載の他臓器に由来する正常組織および前立腺以外の臓器のがんを含んだ。前立腺がんは右側に示す。各列は1サンプルを表し、各行は1オリゴヌクレオチドを表す。オリゴヌクレオチドは候補マーカーごとにグループ分けしてある。表示のマーカーは上から下へと順に精度が高まる。各マーカーの右側に記載してあるのはBonferroni補正p値である。メチル化データは個別オリゴヌクレオチドに関する1標準偏差を基準に中心化および標準化している。色はオリゴヌクレオチドメチル化状態の平均値からの相対距離を表す。緑は任意のオリゴヌクレオチド内の低メチル化CpGを表し、赤は任意のオリゴヌクレオチド内の高メチル化CpGを表す。
【図８】実施例3に基づく正常前立腺、BPHおよび他組織 vs.前立腺がんマーカー順位を示す。各個別関心領域がポイントとして表されている。左側のグラフはgenewiseロジスティック回帰モデルからの非補正p値を与える。上下の点線は5% BonferroniおよびFDR限界をそれぞれ示す。X軸は個別CpG位置に対応するp値を示す。p値は実測される分布がデータセット中で偶然に起こる確率である。次のがんが左から右へと順に示されている: 膀胱、メラノーマ、精巣、腎、子宮内膜がん、肺、乳、膵、肝、卵巣、唾液腺、および前立腺。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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