(57)【要約】トランス分化の原因である遺伝子としてのプレイオトロフィン（「ＰＴＮ」）を本発明者らが同定したことに基づく、内皮細胞へ単球／マクロファージをトランス分化する方法を、本明細書中に記載する。さらに、ＰＴＮの調節に基づいた新生血管形成の促進または阻害のための治療上の方法論を記載する。具体的には、本発明は、単球細胞を内皮細胞へトランス分化させる方法であって、単球細胞を提供する工程；および該単球細胞が内皮細胞へトランス分化するように、該単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程、を包含する、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球細胞を内皮細胞へトランス分化させる方法であって、該方法は、以下：
単球細胞を提供する工程；および
該単球細胞が内皮細胞へトランス分化するように、該単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程は、該単球細胞をＰＴＮを発現するレトロウイルスで形質導入する工程を包含する、方法。
【請求項３】
前記レトロウイルスは二重シストロン性レトロウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単球細胞は、ＲＡＷ細胞またはＴＨＰ−１細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
単球細胞を提供する工程；および
該単球細胞が内皮細胞へトランス分化するように、該単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程、
を包含する方法により、生成される内皮細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の内皮細胞であって、ここで前記単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程は、該単球細胞をＰＴＮを発現するレトロウイルスで形質導入する工程を包含する、内皮細胞。
【請求項７】
前記レトロウイルスは二重シストロン性レトロウイルスである、請求項６に記載の内皮細胞。
【請求項８】
前記単球細胞は、ＲＡＷ細胞またはＴＨＰ−１細胞である、請求項５に記載の内皮細胞。
【請求項９】
新生血管形成を阻害する方法であって、該方法は、以下：
プレイオトロフィン（ＰＴＮ）の生物学的活性を阻害する化合物を提供する工程；および
新生血管形成が阻害されるように、治療有効量の該化合物を哺乳動物に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０】
新生血管形成を促進する方法であって、該方法は、以下：
プレイオトロフィン（ＰＴＮ）の生物学的活性を増強または促進する化合物を提供する工程；および
新生血管形成が促進されるように、治療有効量の該化合物を哺乳動物に投与する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新生血管形成が、疾患の病理要素である疾患、ならびに新生血管形成の促進が所望される疾患の診断、処置および予防に関連する。より詳細には、本発明は、プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）の作用に関連した新生血管形成に関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
血管増殖の生理的調節因子の同定および特徴づけに関する最近の知見の急増は、血管増殖を調節することを目標とする治療上のとりくみの再評価（生理的調節因子が、虚血性組織に再び血液を供給するために、新しい血管新生を促進すること、腫瘍増殖を鈍らせるために、血管増殖をブロックすること、あるいは炎症または他の病理学的環境中の損傷血管および漏出性血管を修復することに関与するかどうか）の必要性を示す。単球／マクロファージは、炎症組織および腫瘍中の新生血管の発生に中心的な役割を果たす。単球の持続的な増加および単球の常在性のマクロファージへの転換は、慢性炎症の顕著な特徴である。この蓄積は、循環する単球の大きな増加または常在性の単球／マクロファージの増殖のいずれかから生じる。最近の研究では、プレイオトロフィン（「ＰＴＮ」）が、末梢血由来の単球および組織マクロファージの増殖を刺激することが示された。例えば、Ａ．Ａｃｈｏｕｒら、「Ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｆｆｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＨＡＲＰ）  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ」，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）４７  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｐｕｂ，ＯＬ７３−７（２００１）；Ｔ．Ｐｕｆｅら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ，ａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ，ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ」，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ４８，６６０−７（２００３）を参照のこと。ＰＴＮは、分泌された増殖因子であり、いくつかの原発性ヒト組織において高度に発現し、腫瘍増殖、侵入、および転移における律速脈管形成因子とみなされている。Ｔ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，「Ｍｉｄｋｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ：ｔｗｏ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｓｕｒｖｉｖａｌ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１３２，３５９−７１（２００２）。ＰＴＮが、腫瘍血管新生を促進するという機構は、知られていない。
【０００３】
単球／マクロファージは、無数の脈管形成因子およびサイトカインを放出することによって、新生血管形成を促進すると考えられている。内皮細胞は、２つの起源：前から存在する内皮細胞の遊走および増殖（新脈管形成）、ならびに循環する内皮前駆細胞の増加、からの脈管形成因子によって漸増する。これらの後者の細胞は、ＣＤ３４＋細胞の一次濃縮、その後のフィブロネクチンでコーティングされた組織培養皿での付着性の分離によって単離され得る。例えば、Ｔ．Ａｓａｈａｒａら、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５，９６４−７（１９９７）；Ｃ．Ｋａｌｋａら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，３４２２−７（２０００）；およびＭ．Ｎｉｅｄａら、「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ａｒｅ  ｎｏｒｍａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ」，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９８，７７５−７（１９９７）を参照のこと。このような研究において、ヒト末梢血単核細胞は、開始群として使用される。しかしながら、これらの調製は、細胞外マトリックスに付着する高い能力を有する単球の数を変化させることを包含する。従って、単球もまた、内皮前駆細胞に起因する新生血管形成の原因であり得る可能性がある。
【０００４】
この可能性を支持して、いくつかのグループは、脈管形成因子の存在下において、ヒト末梢血から単離される単球が、内皮様細胞へトランス分化（ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）し得ることを報告している。例えば、Ａ．Ｓｃｈｍｅｉｓｓｅｒら、「Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｏｒｍ  ｃｏｒｄ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｕｎｄｅｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．４９，６７１−８０（２００１）；Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ｐｕｊｏｌら、「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ１４  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ」，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ６５，２８７−３００（２０００）；Ｊ．Ｒｅｈｍａｎら、「Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  「ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ」  ａｒｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７，１１６４−９（２００３）；およびＣ．Ｕｒｂｉｃｈら、「Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ」，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８，２５１１−６（２００３）を参照のこと。しかし、このような主要な細胞調製は、内皮細胞へ分化する能力を有する細胞が夾雑することを包含する。Ｙ．Ｚｈａｏら、「Ａ  ｈｕｍａｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｂｓｅｔ  ａｃｔｓ  ａｓ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １００，２４２６−３１（２００３）を参照のこと。この論点はさらに、培養中に単球と自発的に融合することによる他の細胞型の表現型を取り込む（ａｄｏｐｔ）するための単球の能力によって困惑させられる。Ｎ．Ｔｅｒａｄａら、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ａｄｏｐｔ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ  ４１６，５４２−５（２００２）を参照のこと。さらに、最近の研究では、移植した骨髄に由来する循環細胞が、インビボで心筋細胞、プルキンエ（Ｐｕｒｋｉｎｊｅ）細胞、および肝細胞と融合し得ることが示され、骨髄由来細胞に関連するトランス分化研究の有効性についての関心を高めている。Ｍ．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｏｌａｄｏら、「Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ−ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｎｅｕｒｏｎｓ，ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  ４２５，９６８−７３（２００３）を参照のこと。単一の造血幹細胞は、致死的に照射されたマウスにおける造血組織の再増殖を完成し得るので、少しでもそのような細胞夾雑物を含む調製は、トランス分化研究において得られたデータの解釈を、理論上、困惑させ得る。Ａ．Ｊ．Ｗａｇｅｒｓら、「Ｌｉｔｔｌｅ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７，２２５６−９（２００２）を参照のこと。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の説明）
本発明は、プレイオトロフィン（「ＰＴＮ」）が新生血管形成に関連するという本発明者らの驚くべき発見に基づく。ＰＴＮは、内皮細胞へのマクロファージおよび単球細胞のトランス分化を少なくとも部分的に担う形成原性（ｐｌａｓｔｏｇｅｎｉｃ）の因子であると考えられている。実際に、本発明者らは、血管形成に必要とされる内皮細胞が、既に存在する内皮細胞由来である必要も、それらの前駆体由来である必要もない；むしろ、内皮細胞は、他の細胞型から新たに生成され得るという驚くべき発見をした。以下に詳細に記載される本発明の種々の実施形態は、この知見に基づいている。
【０００６】
本発明の一実施形態において、ＰＴＮの活性またはその効果を阻害することにより新生血管形成を阻害するための方法が提供される。これは、新生血管形成が、疾患病理の構成要素である疾患の処置または予防において特に有利であり得る。このような疾患としては、非限定的な例として、癌（例えば、腫瘍増殖および転移）、糖尿病性網膜症および慢性関節リウマチが挙げられ得る。
【０００７】
逆に、本発明の別の実施形態において、ＰＴＮの活性またはその効果を増強／促進することにより、新生血管形成を促進するための方法が提供される。これは、疾患（例えば、虚血および虚血組織の発生が挙げられるが、これらに限定されない）の処置において特に有利であり得る。ＰＴＮの阻害はまた、血管の疾患の処置において有利であり得る。なぜなら、プラーク構造内に存在する内皮細胞を通じて、プラーク発達において役割を果たすと考えられるからである。
【０００８】
ＰＴＮの活性または効果を阻害し得る方法が多くあり、これらの方法は、当業者に容易に明らかである。例示によって、（例えば、ＰＴＮ自体をブロックすることによって、またはそのレセプターをブロックすることによって）ＰＴＮの作用を、細胞シグナル伝達カスケードを通じてブロックする、薬物またはペプチドが投与され得る。あるいは、ＰＴＮの作用または効果は、合成分子、ＲＮＡベースの技術またはリボザイムで阻害され得る。１つの特定の実施形態において、干渉ＲＮＡ（「ＲＮＡｉ」）技術を使用して、ＰＴＮの遺伝的活性を阻害し得る。
【０００９】
ＰＴＮの活性をアップレギュレートし得るか、増強し得るかまたは促進し得る方法もまた、多く存在する。例えば、ＰＴＮ遺伝子のインビボでの発現を引き起こすかまたは促進する、多くの遺伝子治療技術のいずれかが採用され得る。このような遺伝子治療アプローチは、ベクターが移植され得るが、必ずしも必要であるわけではない。あるいは、ＰＴＮの機能を模倣する、低分子、ペプチドまたは他の薬物が、ＰＴＮ自体のプロモーターの代わりに投与され得る。さらに、ＰＴＮ細胞シグナル伝達カスケードにおける種々の成分を同定することによって、代わりに、従来の方法によって（例えば、このカスケードに存在する化合物を投与して、シグナル伝達を増大させることによるか、またはこのカスケードを通じてＰＴＮの効果を抑えるかまたは別の方法で低下させる化合物のレベルを減少させることによって）、そのカスケードが増強され得る。さらなる実施形態において、ＰＴＮに対する抗体が投与され得、その効果に対して個体を「免疫し得る」。
【００１０】
本発明の化合物または他の生成物のいずれかの送達は、予防または処置しようとしている疾患の性質および当業者に容易に明らかな他の要因に依存して、局所的にまたは全身で行われ得る。本発明のなおさらなる実施形態において、ＰＴＮは、非遺伝子細胞治療を通じて促進またはアップレギュレートされ得る。この実施形態において、ＰＴＮは、例えば、幹細胞または樹状細胞において過剰発現され得る。次いで、この細胞は、被験体に移植され得る。この被験体においてこの細胞は、局所的組織の一部（例えば、血管）になる。
【００１１】
トランス分化研究の解釈を苦しめた混乱する変数を除去するために、クローン性ヒトＴＨＰ−１単球細胞株およびマウスＲＡＷ単球細胞株を使用して、ＰＴＮの存在下で、単球細胞は内皮様細胞へトランス分化し、虚血組織の新生血管形成に寄与するという仮説を試験した。ＴＨＰ−１細胞およびＲＡＷ細胞を、ＰＴＮおよび緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）を発現する二重シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）レトロウイルスで形質導入し、単球細胞の表現型を、半定量ＲＴ−ＰＣＲにより試験した。予測されるように、非感染ＴＨＰ−１細胞（図１Ａ、レーン２）またはＰＭＡ処理細胞（レーン３）は、単球細胞マーカーであるｃ−ｆｍｓおよびＣＤ６８を発現した。同様に、ＴＨＰ−１細胞における、ＧＦＰの発現（レーン４）またはＰＴＮアンチセンス鎖の発現（レーン６）は、単球細胞／マクロファージマーカーの発現に何ら影響なかった。対照的に、ＰＴＮセンス鎖を発現するＴＨＰ−１細胞において、ｃ−ｆｍｓ発現は検出できず、ＣＤ−６８発現は、顕著にダウンレギュレートされた（レーン５）。陰性コントロールであるヒト冠状動脈内皮細胞は、単球細胞マーカーを発現しなかった（レーン７）。ＧＡＰＤＨ増幅は、このＲＴ−ＰＣＲ反応が全ての試験したサンプルについて効率的に進行することを示した。
【００１２】
この表現型調節をさらに調査するために、本発明者らは、ＣＤ１４の発現をＦＡＣＳによって試験した。ＦＡＣＳ分析により、陽性コントロールであるＴＨＰ−１細胞の８５±４％が、ＣＤ１４を発現することが明らかになった（図１Ｂ、ＴＨＰ−１）。ＧＦＰを発現するレトロウイルスベクターで形質導入した細胞は、７５±４％  ＣＤ１４陽性を示した（図１Ｂ、ＧＦＰ）。対照的に、ＣＤ１４の発現は、ＰＴＮを発現するレトロウイルスで形質導入したＴＨＰ−１細胞においてダウンレギュレートされた（１９±４％）（図１Ｂ、ＰＴＮ）。このレベルのＣＤ１４発現は、ヒト冠状動脈内皮細胞におけるＣＤ１４の発現レベルに類似である（１５±３％）（図１Ｂ、内皮）。
【００１３】
このＲＴ−ＰＣＲ結果を確認するために、ＣＤ６８に特異的なプライマーセットを用いて、定量リアルタイムＰＣＲ分析を行った。このデータを、非感染ＴＨＰ−１  ＲＮＡに由来する同じ遺伝子に対して正規化した倍数誘導を、それぞれのグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼと比較することによって、得た。ＣＤ６８の発現は、アンチセンスＰＴＮもしくはＧＦＰを発現するＴＨＰ−１細胞、またはＰＭＡ処理非感染ＴＨＰ−１細胞もしくはＰＭＡ非処理ＴＨＰ−１細胞と比較して、約６．４〜７．６倍、ＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞においてダウンレギュレートした（図１Ｃ）。ＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞におけるＣＤ６８発現のレベルは、ヒト内皮細胞のレベルに近い（図１Ｃ）。同様の結果を、ｃ−ｆｍｓのリアルタイムＰＣＲ分析で得た（示さず）。まとめると、このＰＣＲデータおよびフローサイトメトリーの結果は、単球細胞によるＰＴＮの発現が、単球細胞マーカーのダウンレギュレーションを導くことを実証する。
【００１４】
形質導入された単球細胞が内皮様表現型に進んだか否かを評価するために、本発明者らは、半定量ＰＣＲによって、内皮細胞マーカーの発現についてこれらの細胞を評価した。マウス単球ＲＡＷ細胞（図２Ａ、レーン１）、ヒト単球ＴＨＰ−１細胞（レーン２）、およびヒト前単球Ｕ９３７細胞（レーン３）は、内皮細胞マーカーを発現しなかった。しかし、ＰＴＮセンス鎖を感染させたＴＨＰ−１細胞（レーン９）は、陽性コントロールであるヒト冠状動脈内皮細胞（レーン６）のと同様に、血管内皮細胞増殖因子レセプター−２（「Ｆｌｋ−１」）、Ｔｉｅ−２、血管内皮細胞カドヘリン（「ＶＥ−ｃａｄ」）、血小板内皮細胞接着分子−１（「ＰＥＣＡＭ−１」）、内皮細胞一酸化窒素シンターゼ（「ｅＮＯＳ」）、およびフォン・ビルブラント因子（「ｖＷｆ」）を発現した。対照的に、ＰＴＮアンチセンス鎖を感染させたＴＨＰ−１細胞（レーン１０）またはＧＦＰコントロールベクターを感染させたＴＨＰ−１細胞（レーン１１）は、内皮細胞マーカーを発現しなかった。同様に、内皮細胞マーカーは、非単球細胞（例えば、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（レーン４）、ヒト平滑筋細胞（レーン５）、ＲＰＭＩ  ８２２６  Ｂリンパ球プラズマ細胞腫細胞株（レーン７）、およびヒト皮膚線維芽細胞（レーン８））において検出されなかった。平滑筋細胞におけるＦＬＫ−１の弱い発現（レーン５）は、ヒト平滑筋細胞におけるこの内皮細胞マーカーの発現と一致している。例えば、Ａ．Ｉｓｈｉｄａら，「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８８，３５９−６８（２００１）を参照のこと。さらに、ＲＡＷ細胞およびＴＨＰ−１細胞（非感染およびＰＴＮ感染）は、ＣＤ３４マーカーも、ＣＤ１３３マーカーも発現しなかった。まとめると、これらのデータは、ＰＴＮの発現が、ＴＨＰ−１単球細胞またはＲＡＷ単球細胞における内皮細胞マーカーのアップレギュレーションを導くことを実証する。
【００１５】
単球細胞における内皮マーカーの発現を確認するために、リアルタイムＰＣＲ分析を、ＶＥ−カドヘリン、ｖＷｆ、およびＰＥＣＡＭ−１について行った（図２Ｂ）。これらのデータを、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ標準曲線に対する比較によって正規化した。この計算された遺伝子発現レベル（それぞれ、１．１×１０５コピー／１００ｎｇ  ＲＮＡ、２．９×１０５コピー／１００ｎｇ  ＲＮＡ、および０．７×１０５コピー／１００ｎｇ  ＲＮＡ、Ｐ値は全て＜０．００１）は、陽性コントロールであるヒト内皮細胞においてこれらのマーカーの発現レベルに類似である（１．５×１０５コピー／１００ｎｇ、３．２×１０５コピー／１００ｎｇ、および０．１×１０５コピー／１００ｎｇの内皮細胞ＲＮＡ、Ｐ値は全て＜０．００１）。これらのデータは、図２Ａに示される半定量データを確認する。
【００１６】
トランス分化した細胞のさらなる分析を行って、内皮細胞マーカーの空間的分布を調べた。ＦＬＫ−１免疫染色により、ＧＦＰを発現するレトロウイルスに感染させたＴＨＰ−１細胞は、抗ＦＬＫ−１抗体で染色されないことが示された（図２Ｃ）。対照的に、ＰＴＮを発現する細胞は、この抗体で強く染色され、この染色は、ＦＬＫ−１の細胞分布に従って、膜において濃かった（図２Ｃ）。さらなる染色により、ＶＥ−カドヘリンは、細胞膜で発現されることが明らかになったが、ｖＷｆ発現は、細胞質全体に散在していることが分かった（示さず）。さらに、本発明者らは、ＴＨＰ−１細胞におけるＴｉｅ−２の空間分布を、フローサイトメトリーにより決定した。ＦＡＣＳ分析により、ＧＦＰを発現する細胞の７±３％（図２Ｄ、上パネル）と比較して、ＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞の７２±５％がＴｉｅ−２を発現することが分かった（図２Ｄ、下パネル）。従って、リアルタイムＰＣＲおよびフローサイトメトリーにより、半定量ＲＴ−ＰＣＲによって得られたトランス分化データの信頼性が確認された。
【００１７】
トランス分化した細胞が血管の細胞外マトリクスタンパク質と相互作用する能力を決定するために、aｖβ３インテグリンの発現を試験した。ＦＡＣＳ分析により、ＧＦＰを発現するＴＨＰ−１細胞の１±３％（図２Ｆ、左上パネル）と比較して、ＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞の８０±４％がaｖβ３について陽性であることが明らかになった（図２Ｆ、左下パネル）。ＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞におけるaｖβ３インテグリンのレベル（８０±４％）は、ヒト冠状動脈内皮細胞のレベルに類似である（図２Ｆ、右下パネル）。抗aｖβ３抗体を省略すると、４±３％まで陽性が低下した（図２Ｆ、右上パネル）。
【００１８】
次に、本発明者らは、ＰＴＮによる単球細胞の表現型調節が、転写レベルで調節されるか否かを試験した。内皮細胞の多くのマーカーの発現は、ＧＡＴＡ−２ジンクフィンガー転写因子およびＧＡＴＡ−３ジンクフィンガー転写因子により調節される。例えば、Ｍ．Ｅ．Ｌｅｅら，「Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＡＴＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈａｔ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１６１８８−９２（１９９１）；Ｒ．Ｊ．Ｇｕｍｉｎａら，「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｔｅｌｅｔ／ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＧＡＴＡ−２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｂｌｏｏｄ  ８９，１２６０−９（１９９７）；Ｎ．ＪａｈｒｏｕｄｉおよびＤ．Ｃ．Ｌｙｎｃｈ，「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４，９９９−１００８（１９９４）；ならびにＰ．Ｊ．Ｃｏｗａｎら，「Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩＣＡＭ−２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｉｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｓｐ１  ａｎｄ  ＧＡＴＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ」，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，１１７３７−４４（１９９８）を参照のこと。従って、これらの因子の発現を、半定量ＰＣＲによって試験した。単球ＲＡＷ細胞、単球Ｕ９３７細胞、および単球ＴＨＰ−１細胞（図３Ａ、レーン１〜３）、ならびにＰＴＮアンチセンス鎖に感染させたＴＨＰ−１細胞（レーン１０）またはＧＦＰコントロールベクターに感染させたＴＨＰ−１細胞（レーン１１）は、転写因子を発現しなかった。同様に、非単球ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（レーン４）、平滑筋細胞（レーン５）、ＲＰＭＩ  ８２２６  Ｂリンパ球プラズマ細胞腫細胞（レーン７）、およびヒト皮膚線維芽細胞（レーン８）は、ＧＡＴＡ−２もＧＡＴＡ−３も発現しなかった。対照的に、ＰＴＮの発現は、コントロールヒト内皮細胞に匹敵するレベルで（レーン６）、ＴＨＰ−１細胞においてＧＡＴＡ−２転写因子およびＧＡＴＡ−３転写因子の両方のアップレギュレーションを導いた（レーン９）。
【００１９】
本発明者らが使用した単球細胞株は、多能細胞の能力を示さない、公知の単球細胞の特徴を有する樹立細胞株である。上記のＲＴ−ＰＣＲ研究の結果は、造血幹細胞マーカー（Ｔｉｅ−２）または内皮前駆細胞マーカー（ＣＤ３４）のいずれの発現も欠いていることにより実証されるように、この概念を支持する。例えば、Ｐ．Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ」，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９，６５３−６０（２００３）を参照のこと。さらに、ＲＡＷ細胞は、マウス胚性内皮細胞の決定的なマーカーであるＰＥＣＡＭ−１を発現しなかった。例えば、Ａ．Ｖｅｃｃｈｉら，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ．  Ｔｈｅｉｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ」，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６３，２４７−５４（１９９４）を参照のこと。さらに、ＴＨＰ−１細胞は、ＶＥＧＦレセプターＦＬＫ−１（分化していない多能性内皮細胞のマーカーである）を発現しなかった。例えば、Ｄ．Ｓ．Ｋａｕｆｍａｎら，「Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８，１０７１６−２１（２００１）；Ｓ．Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇら，「Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９，４３９１−６（２００２）を参照のこと。まとめると、これらのデータは、単球細胞が、多能性細胞の特徴を示さなかったことを実証する。しかし、単球細胞の多能性の能力をさらに調べるために、本発明者らは、Ｏｃｔ−４（多能性についてのマーカーである）の発現を決定した。例えば、Ｊ．Ｎｉｃｈｏｌｓら，「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｍｂｒｙｏ  ｄｅｐｅｎｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＰＯＵ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｏｃｔ４」，Ｃｅｌｌ  ９５，３７９−９１（１９９８）；Ｙ．Ｉ．Ｙｅｏｍら，「Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｏｃｔ−４  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｙｃｌｅ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃｅｌｌｓ」，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２，８８１−９４（１９９６）を参照のこと。ＰＣＲ分析により、試験した単球細胞のいずれも、Ｏｃｔ−４を発現しないことが明らかになった（図３Ａ、レーン１−３、６、９〜１１）。同様に、コントロール非単球細胞（例えば、平滑筋細胞（レーン５）、内皮細胞（レーン６）、およびヒト線維芽細胞（レーン８））は、Ｏｃｔ−４を発現しなかった。興味深いことに、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（レーン４）およびＲＰＭＩ  ８２２６  Ｂリンパ球プラズマ細胞腫細胞株（レーン７）は、Ｏｃｔ−４を発現した。
【００２０】
さらなる分析を行って、免疫染色および共晶点顕微鏡により、転写因子の分布と内皮細胞マーカーとの間の関係を決定した。ＶＥ−カドヘリン発現は、ＰＴＮ発現ＲＡＷ細胞の表面に局在している（図３Ｂ、赤色）が、ＧＡＴＡ−２発現は、核において濃い（図３Ｂ、青色）ことが分かった。その重ね合わせにより、２つの内皮細胞マーカーの同時発現が示された。このような発現パターンは、ＧＦＰコントロールベクターに感染させた細胞において検出されなかった（示さず）。まとめると、このＰＣＲ結果および免疫染色データは、ＰＴＮが形成原性の活性を有し、ＴＨＰ−１単球細胞およびＲＡＷ単球細胞において、おそらく転写レベルで内皮細胞表現型をアップレギュレートすることを実証する。
【００２１】
最後に、本発明者らは、インビトロおよびインビボでトランス分化した細胞の機能的活性を調査した。単球細胞がインビトロで管状構造を形成する能力を、三次元フィブリンマトリクスにより評価した。単球細胞をフィブリンゲル上で培養し、それらの形態をモニターした。そのＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞は、フィブリンマトリクスに入り込み、培養して４日程度で三次元ゲル中で管状構造を形成し始め、これが１０〜２０日までに観察された。その後、その構造体は無秩序（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ）になり、多重の細い鎖からより太いひも様構造体および管状構造体まで形成する（図４、ＰＴＮ）。これらの複雑な鎖は、互いに接触した多重列の細長い細胞からなっていた。ひも形成は、１５〜２０日までにわたって複雑さが増大し続けた。対照的に、ＧＦＰコントロールベクターに感染させたＴＨＰ−１細胞は、フィブリンマトリクスの上部にとどまり、何のネットワーク様構造体も観察することができなかった（図４、ＧＦＰ）。陽性コントロールのヒト冠動脈内皮細胞は、ＰＴＮセンス鎖に感染させたＴＨＰ−１細胞と同様に、フィブリンゲル中に管状構造体を形成した（示さず）。同様の結果が、ＲＡＷ細胞でも観察された（示さず）。これらのデータは、ＰＴＮ発現により、内皮細胞と同様に、ＴＨＰ−１細胞およびＲＡＷ細胞が、細胞質が伸びてフィブリンゲル中で再配置され、そして周りの細胞と相互作用する能力が付与されることを実証する。
【００２２】
トランス分化した細胞がインビボで新生血管形成を継続するか否かを決定するために、本発明者らは、ウズラ漿尿膜（ＣＡＭ）、ニワトリ−マウスキメラ、およびマウス後肢虚血アッセイを用いた。ニホンウズラの受精卵を、卵から培養した。例えば、Ｐ．Ｐａｒｓｏｎｓ−Ｗｉｎｇｅｒｔｅｒら，「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｓｓａｙ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｑｕａｉｌ  ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂＦＧＦ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｆｒａｃｔａｌ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｉｄ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ」，Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．５５，２０１−１４（１９９８）を参照のこと。次いで、ＰＴＮ発現ＲＡＷ細胞を、Ｅ７胚のＣＡＭに移植した（図５Ａ、パネルａ）。ＲＡＷ細胞またはＧＦＰを発現する２９３細胞を、ＰＢＳに加えて、コントロールとして使用した。３日後、Ｅ１０（図５Ａ、パネルｂ）において、ＣＡＭを固定し、解剖し、スライド硝子の上に載せ、蛍光顕微鏡および共晶点顕微鏡で画像を分析した。ＰＴＮ／ＧＦＰの両方を発現するＲＡＷ細胞を移植すると、９／１２の胚において新たに発生したウズラ血管樹へとその統合を導いた［図５Ａ、パネルｃ（２×倍率）；パネルｄ（１０×倍率）；パネルｅ（２０×倍率）］。さらに、図５Ａは、ＰＴＮ発現細胞が、種々の分枝において大血管および小血管に組み込まれたことを示す。類似の結果を、ＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞の移植により得た（示さず）。対照的に、ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞は、試験した８／１０の胚において、新たに発生した血管に全く組み込まれなかった（図５Ａ、パネルｆ）。さらに、２９３細胞またはＰＢＳのいずれかを胚に添加した場合にも、蛍光は全く観察されなかった（示さず）。
【００２３】
この新たに形成された蛍光標識血管の共晶点画像を、干渉コントラスト差画像（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ｉｍａｇｅ）（「ＤＩＣ」）と重ね合わせて、ＧＦＰ標識細胞の血管への組み込みを観察するために、発生している血管樹の完全な調査に関連して、コントラストを改善した。このＤＩＣ画像は、ＧＦＰを発現する単球細胞が、血管へ組み込まれないことを示した（図５Ａ、パネルｇ）。対照的に、ＰＴＮ発現ＲＡＷ細胞は、新たに発生した血管のいくらかに組み込まれ（図５Ａ、パネルｈ）、キメラウズラ−マウス血管を生成した。まとめると、この共晶点画像は、トランス分化した単球細胞が、この発生している血管にホーミングし、この発生している血管に組み込まれるために全ての必要な生物学的情報を有することを明らかに示す。
【００２４】
トランス分化した細胞が血管系に組み込まれる能力は、これらの細胞が複数の器官の発生している血管に組み込まれる能力によってさらに理解される。ＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞（１×１０６）を、ステージ１６〜１７のニワトリ胚の胃内部に注射し、これらの細胞がたどる結末を、抗ＧＦＰ抗体を注射して２〜３日後に決定した。得られた免疫陽性の大部分は、頭部、眼、および体節中胚葉内（ｉｎｔｅｒｓｏｍｉｔｉｃ）領域（図５Ｂ、ＰＴＮパネル）における血管にそって現れ、ＰＴＮ／ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞を注射した胚においてネットワーク構造を形成した。対照的に、ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞を注射した胚は、染色されなかった（図５Ｂ、ＧＦＰパネル）。ＣＡＭデータと合わせて考えると、どんな特定の理論にとらわれることも望まないが、本発明者らは、ＰＴＮ発現ＲＡＷ細胞（ＧＦＰ発現細胞ではない）が、これらの細胞が異なる器官において新たに発生した血管に組み込まれることを可能にする基本的な生物学的情報を有すると結論づけた。
【００２５】
過去の研究では、ＰＴＮ  ｍＲＮＡが、急性虚血脳傷害後の発生している微小血管系において見出されるマクロファージでアップレギュレートされることが示された。例えば、Ａ．Ｔａｋｅｄａら，「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｉｎｊｕｒｙ」，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ６８，５７−６４（１９９５）；Ｈ．Ｊ．Ｙｅｈら，「Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ａｎｄ  ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｊｕｒｙ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８，３６９９−７０７（１９９８）を参照のこと。このことは、虚血組織の新生血管形成におけるマクロファージ由来のＰＴＮについての役割を示唆する。虚血組織の灌流において、トランス分化した単球ＲＡＷ細胞についての機能的証拠を提供するために、軽度の後肢の虚血を、Ｔ．Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌら，「Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ」，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２，１６６７−１６７９（１９９８）において記載される方法に従って、ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおいて誘導し、手術の７日後、１４日後、および２１日後に、レーザードップラー灌流画像化により血流をモニターした。ＢＡＬＢ／Ｃバックグラウンドマウスをこの実験のために選択した。なぜなら、ＲＡＷ細胞は、このマウス系統に対して類遺伝子性であり、従って、潜在的な対宿主性移植片合併症が避けられるからである。片方の後肢の虚血を作製して１日後、ＰＴＮを発現する５×１０５  ＲＡＷ細胞を、尾静脈に注射した。ＰＢＳ注射をコントロールとして使用した。血流を、手術前および手術後の種々の時間で、レーザードップラー灌流画像化により測定した。ＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞を注射したマウスの７日目の代表的なレーザードップラー灌流画像を、図５Ｃに示す。ＰＴＮ発現ＲＡＷ細胞を受けているマウスにおける後肢血流の回復は、コントロールマウスより有意に高かった。参照後肢と比較すると、ＰＴＮ発現ＲＡＷ細胞を注射したＢＡＬＢ／Ｃマウスは、類似の時点でＰＢＳを注射したコントロール動物と比較すると、７日で７０±３％、１４日で５０±４％、および２１日で３０±３％の血流増大を有した（図５Ｃ）。
【００２６】
まとめると、本発明者らは、単球細胞が、内皮細胞にトランス分化する能力を有するという仮説を試験するために、いくつかの実験的アプローチを用いた。本発明者らの知見により、単球細胞によるＰＴＮの発現は、細胞に対するオートクラインの影響を有し、これは、単球細胞マーカーのダウンレギュレーションおよび内皮細胞特徴のアップレギュレーションをもたらすことが示唆される。ＰＴＮを発現する培養細胞（コントロール細胞ではない）は、フィブリンゲル中に管状構造体を形成した。インビボでの機能研究により、ＰＴＮ発現単球が、新たに発生している血管にホーミングし、これらの血管に組み込まれることが明らかにされた。さらに、トランス分化した単球は、虚血組織の灌流を促進する。単球／マクロファージは、他の細胞型と自発的に融合する能力を有し、それらの表現型を取り込む（ａｄｏｐｔ）する能力があるので、同種の細胞を用いると、内皮細胞への単球のトランス分化が、細胞融合によって媒介されないことを実証することが可能になる。例えば、Ｎ．Ｔｅｒａｄａら，「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ａｄｏｐｔ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ  ４１６，５４２−５（２００２）を参照のこと。まとめると、これらの知見は、新生血管形成における単球の役割が、直接的（内皮細胞へのトランス分化）および間接的（増殖因子およびサイトカインの放出）の両方であることを示唆する。
【００２７】
本発明者らは、単球のトランス分化がＰＴＮ発現に完全に依存することを見出した。このことは、細胞ではなく遺伝子が表現型の変換を調節することを示唆し；従って、ＰＴＮ遺伝子の新たな形成原性の役割を同定した。過去の研究により、ＰＴＮは末梢血由来単球および組織マクロファージの増殖を刺激することが示され、このことは、ＰＴＮが、以下の２つの異なる機構を介して新生血管形成を促進し得ることを示唆した：１）多くの脈管形成因子およびサイトカインを放出する、存在する単球／マクロファージの増殖を刺激する、および２）内皮細胞への単球のトランス分化。以前の研究はまた、腫瘍細胞が内皮様細胞特徴を呈し得ることを示した。例えば、ＶＥＧＦ、Ｆｌｋ−１、およびＦｌｔ−１の発現は、非内皮起源の種々のヒト腫瘍細胞において検出されてきた。例えば、Ｒ．Ｍａｓｏｏｄら，「Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）  ｉｓ  ａｎ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ」，Ｂｌｏｏｄ  ９８，１９０４−１３（２００１）を参照のこと。これらには、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌腫、および乳癌が含まれた。腫瘍細胞のこの表現型の調節に寄与する機構についての情報は何らないが、これらの腫瘍細胞におけるＰＴＮ合成と内皮細胞マーカーの発現との間には良好な相関があることに注意することは重要である；例えば、高レベルのＰＴＮ発現は、黒色腫細胞、膵臓癌、前立腺癌、および乳房腫瘍において検出された。例えば、Ｆ．Ｃｚｕｂａｙｋｏら，「Ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，１４７５３−１４７５８（１９９６）；Ｄ．Ｗｅｂｅｒら，「Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｒａｔｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，５２８４−８（２０００）；Ｆ．Ｖａｃｈｅｒｏｔら，「Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｆｆｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３８，１２６−３６（１９９９）；ならびにＡ．Ｔ．ＲｉｅｇｅｌおよびＡ．Ｗｅｌｌｓｔｅｉｎ，「Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ」，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．３１，３０９−１４（１９９４）を参照のこと。本発明者らの知見に鑑みると、ＰＴＮが一部、これらの腫瘍における内皮細胞マーカーのアップレギュレーションを担い得ることを示唆しようとしたくなる。
【００２８】
まとめると、本発明者らのＰＴＮ媒介性トランス分化データは、炎症を新生血管形成に直接関連づける新規な新生血管形成パラダイムを同定し、２つの公知の内皮細胞供給源（すなわち、新脈管形成および内皮前駆細胞）に加えて、新生血管形成の間の内皮細胞についての新たな供給源を示唆する。これらの結果は、ヒト腫瘍および炎症疾患において潜在的に幅広く重要である「脈管形成スイッチ」を同定し、脈管形成の理解を進め、治療介入のための部位の同定を支持すると考えられる。
【実施例】
【００２９】
（全長ヒトＰＴＮのクローニング）
本発明者らは、全長ヒトＰＴＮオープンリーディングフレーム（アクセッション番号ＮＭ＿００２８２５）を使用して、ＰＣＲおよびＰＴＮについての特異的プライマー［５’ＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＧＴ（配列番号１）および５’ＴＧＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴＣＣＴＴＴ（配列番号２）］を用いて全長ｃＤＮＡをクローニングした。クローニングした生成物の正確性を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００３０】
（レトロウイルスを用いた、安定に形質導入したＴＨＰ−１細胞およびＲＡＷ細胞の生成）
二重シストロン性レトロウイルスベクターを、ｐＬＰ−ＥＧＦＰ−Ｃ１レトロウイルス発現系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した）から構築した。ＣＭＶプロモーターの制御下で増強されたＧＦＰ遺伝子を含むこのｐＬＰ−ＥＧＦＰ−Ｃ１プラスミドを、内部リボソーム進入部位（「ＩＲＥＳ」）配列をＧＦＰセグメントの後ろに付加することにより改変した。ヒトＰＴＮの全長ｃＤＮＡを、ｐＬＰ−Ｃ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＢａｍＨ／Ｎｏｔｌ部位にクローニングした。このレトロウイルスを、２９３パッケージング細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手した）を用いてパッケージした。パッケージング細胞をトランスフェクトした後に、ウイルスを回収し、１×１０６ｃｆｕ／ｍｌと２×１０７ｃｆｕ／ｍｌとの間のレトロウイルス力価を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞での限界希釈により決定した。感染のために、４×１０５のＴＨＰ−１細胞またはＲＡＷ細胞を、通常増殖培地（ＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ）中で感染させる前に、２５ｃｍ２フラスコ中で２４時間プレートして、指数関数的に増殖する培養物を得た。標準的なプロトコルを用いて、この細胞をトランスフェクトした（およそ２．５〜２５ｃｆｕ／細胞のＭＯＩ）。低レベルまたは高レベルのＥＧＦＰレセプター遺伝子を発現する細胞のポリクローナル集団（各３×１０５）を、次いで、フローサイトメトリーにより単離した。ソート直後の分析により、ＧＦＰ発現に基づいて、細胞の別個の集団の単離が確認された（示さず）。細胞を、さらに継代するために継代培養し、フローサイトメトリーによりＧＦＰレセプター遺伝子の発現について、ウェスタンブロット分析によりＰＴＮの発現について分析した。
【００３１】
（ＥＬＩＳＡアッセイ）
形質導入された細胞により分泌されたＰＴＮのレベルを測定するために、プレートしてから２４時間後、４８時間後および７２時間後にＴＨＰ−１細胞の培地を回収し、標準的ＥＬＩＳＡアッセイによりＰＴＮの濃度を測定した。２５ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−aで処理したＴＨＰ−１細胞から回収した培地を、陽性コントロールとして使用した。ＰＴＮの濃度は時間とともに増大し（４８時間で５±２ｎｇ／ｍｌおよび７２時間で１２±４ｎｇ／ｍｌ）、示された時間でＴＮＦ−aにより誘導されたＰＴＮレベルよりもわずかに低かった（１０±３ｎｇ／ｍｌおよび２０±４ｎｇ／ｍｌ）。
【００３２】
（ＲＴ−ＰＣＲ分析）
逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲの条件は、以下の通りであった：ＲＴおよび活性化：３０oＣで３０分、９５oＣで１５分；増幅：９４oＣで１分、５５oＣで１分、７２oＣで１分；および最終伸長：７２oＣで１０分。
【００３３】
最適細胞サイクル数を、各遺伝子について決定して、条件がＰＣＲ増幅の線形範囲にあることを確実にした。これらのサイクル数を、プライマー配列とともに、以下の表１に示す。
【００３４】
【表１】
2007531498.tif 000002
上記の説明は、本発明の特定の実施形態に言及しているが、多くの改変が、本発明の範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解される。添付の特許請求の範囲は、このような改変を網羅することが意図され、このような改変は、本発明の真の範囲および趣旨の範囲内にある。従って、本明細書に開示される実施形態は、全ての局面において、例示とみなされるのであって、限定するとは見なされない。本発明の範囲は、前述の説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等の範囲内にある全ての変更は、よって、本発明に包含されると意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】図１は、本発明の１つの実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞マーカーのダウンレギュレーションを示す。図１Ａは、ＴＨＰ−１細胞および内皮細胞による単球細胞マーカーの半定量的な逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）解析を示す。全ＲＮＡを、１０％血清中で増殖したＴＨＰ−１細胞から抽出し（レーン２）、２５ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡの添加によってマクロファージ様細胞へ分化するように誘導し（レーン３）、以下を発現するレトロウイルス二重シストロン性ベクターで形質導入し（緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）（レーン４）、ＰＴＮセンス鎖（レーン５）、ＰＴＮアンチセンス鎖（レーン６））、その後、ＰＭＡで処理した。指数関数的に増殖するヒト冠状動脈内皮細胞（レーン７）を、ネガティブコントロールとして使用した。解析した単球細胞マーカーは、ｃ−ｆｍｓおよびＣＤ−６８であり、９７−ｂｐＤＮＡフラグメントおよび１３２−ｂｐＤＮＡフラグメントを、それぞれ増幅させるために予測したプライマーを用いた。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（「ＧＡＰＤＨ」）プライマーを、ＲＴ−ＰＣＲ反応のためのコントロールとして使用した。レーン１は、ＤＮＡラダーマーカーである。
【図１Ｂ】図１は、本発明の１つの実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞マーカーのダウンレギュレーションを示す。図１Ｂは、単球細胞によるＣＤ１４の発現を示す。フローサイトメトリー解析を、ＰＥ標識した抗ＣＤ−１４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから得た）と、５×１０５個のＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞（ＰＴＮ）またはＧＦＰを発現するＴＨＰ−１細胞（ＧＦＰ）をインキュベートすることによって行った。ヒト冠状動脈内皮細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。非感染性のＴＨＰ−１細胞（ＴＨＰ−１）を、ポジティブコントロールとして使用し、ヒト冠状内皮細胞（内皮）を、ネガティブコントロールとして使用した。蛍光細胞分析分離装置（「ＦＡＣＳ」）解析を、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。各実験を３回繰り返し、各棒グラフは、３回の実験の平均±ＳＥＭを表す。
【図１Ｃ】図１は、本発明の１つの実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞マーカーのダウンレギュレーションを示す。図１Ｃは、単球細胞におけるＣＤ６８発現についての増幅プロットを示す。ＣＤ６８遺伝子についてのオリゴヌクレオチドプライマー対ならびに５’末端にレポーター蛍光色素および３’末端にクエンチャー蛍光色素で標識したオリゴヌクレオチドプローブを、Ｏｌｉｇｏ４．０ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮから入手可能である）を使用して設計した。デオキシリボヌクレアーゼＩ処理した全ＲＮＡを、ＲＴ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから得た）およびオリゴ（ｄＴ）１５プライマー（Ｐｒｏｍｅｇａから得た）で第１鎖（ｆｉｒｓｔ−ｓｔａｎｄ）ｃＤＮＡを合成するために使用した。全ＲＮＡ（５０ｎｇ）を、製造業者のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、５０μｌのＲＴ−ＰＣＲ反応混合物に添加した。ＲＴ反応の生成物を、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（内部コントロール）および３回繰り返した個々の標準曲線と比較することによるＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用することによってリアルタイムＰＣＲに供給するために使用した。熱サイクル条件は、４８℃、３０分間で１サイクル、９５℃、１０分間で１サイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間アニーリングを４０サイクル、最終的に２５℃で２分間保持を含む。各遺伝子の発現についての標準曲線を、培養した単球または内皮細胞から単離された全ＲＮＡの標準的な調製物の連続希釈によって得た。
【図２Ａ】図２は、本発明の実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞における内皮細胞マーカーの発現を示す。図２Ａは、内皮細胞マーカーの半定量的なＰＣＲ解析を示す。ＲＮＡを、アガロースゲル電気泳動によって単離して、分離した。マウスＲＡＷ単球細胞（レーン１）、ヒトＴＨＰ−１単球細胞（レーン２）、およびヒトＵ９３７単球細胞（レーン３）を試験した。非単球細胞であるＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（レーン４）、ヒト冠状動脈平滑筋細胞（レーン５）、ＲＰＭＩ  ８２２６  Ｂリンパ球プラズマ細胞腫細胞株（レーン７）、およびヒト皮膚線維芽細胞（レーン８）を、ネガティブコントロールとして使用した。ヒト冠状動脈内皮細胞（レーン６、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．から得た）を、ポジティブコントロールとして使用した。さらに、ＲＮＡを、ＰＴＮセンス鎖（レーン９）、ＰＴＮアンチセンス鎖（レーン１０）、またはＧＦＰ（レーン１１）を内部に含む二重シストロン性レトロウイルスベクターで形質導入した。ＲＮＡを、血管内皮増殖因子レセプター２（Ｆｌｋ−１）［Ｔ．Ｐ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、「ｆｌｋ−１，ａｎ  ｆｌｔ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ」，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８，４８９−９８（１９９３）を参照のこと］、チロシンキナーゼレセプターＴｉｅ−２［Ｔ．Ｎ．Ｓａｔｏら、「Ｔｉｅ−１  ａｎｄ  ｔｉｅ−２  ｄｅｆｉｎｅ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｙｓｔｅｍ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０，９３５５−８（１９９３）を参照のこと］、血管内皮カドヘリン（ＶＥ−ｃａｄ）［Ｍ．Ｇ．Ｌａｍｐｕｇｎａｎｉら、「Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔａｃｔｓ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１８，１５１１−２２（１９９２）を参照のこと］、ＰＥＣＡＭ−１［Ｈ．Ｍ．ＤｅＬｉｓｓｅｒら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ＰＥＣＡＭ−１／ＣＤ３１」，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １５，４９０−５（１９９４）を参照のこと］、内皮一酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）［Ｓ．Ｍｏｎｃａｄａら、「Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ：ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ」，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．４３，１０９−４２（１９９１）を参照のこと］、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷｆ）［Ｉｄ．］、ＣＤ３４［Ｐ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら、「Ｔｈｅ  ｓｉａｌｏｍｕｃｉｎ  ＣＤ３４  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｖｅｓｓｅｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，Ｂｌｏｏｄ  ８５，９６−１０５（１９９５）を参照のこと］、ならびにＡＣ１���３／ＣＤ１３３（血管／造血幹細胞および前駆細胞の細胞表面マーカーである）［Ｍ．Ｐｅｉｃｈｅｖら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥＧＦＲ−２  ａｎｄ  ＡＣ１３３  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４（＋）  ｃｅｌｌｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ」，Ｂｌｏｏｄ  ９５，９５２−８（２０００）を参照のこと］に特異的なプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。ＲＴ−ＰＣＲ解析の半定量的な結果を確実にするために、プライマーの各セットについてのＰＣＲサイクルの数を、増幅の直線的な範囲にあるようにチェックした。さらに、全てのＲＮＡサンプルを、調整して、内部標準としてのＧＡＰＤＨと等価な増幅を得た。増幅した生成物を、１．２％アガロースゲル上で分離して、エチジウムブロマイドで染色した。
【図２Ｂ】図２は、本発明の実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞における内皮細胞マーカーの発現を示す。図２Ｂは、単球細胞におけるＶＥ−カドヘリン、ｖＷｆ、およびＰＥＣＡＭ−１の発現についての増幅プロットを示す。全ＲＮＡを上記のように調製した。プローブを、それぞれ、３’および５’末端にてクエンチャーおよび蛍光色素６−ＦＡＭで標識した。３つの異なるＲＮＡ調製物から逆転写したｃＤＮＡ逆転写は、以下；ＰＴＮセンス鎖で感染されたＴＨＰ−１細胞（青、濃青色、赤紫）、ヒト冠状動脈内皮細胞（濃緑色、藍色、および薄赤色）、およびＧＦＰ遺伝子を内部に含むレトロウイルスで感染したＴＨＰ−１細胞（黄色、薄緑色、および暗赤色）から単離されたことを示す。
【図２Ｃ】図２は、本発明の実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞における内皮細胞マーカーの発現を示す。図２Ｃは、単球細胞における内皮細胞マーカーの空間分布を示す。ＧＦＰ発現ＴＨＰ−１細胞（上のパネル）またはＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞（下のパネル）を、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳの存在下で、カバーガラス上で培養し、続いて、上記のＰＭＡを添加した。細胞を、２０℃で５分間、メタノール、または室温で３％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドで固定し、抗ヒトＦＬＫ−１マウスモノクローナル（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から得た）で３０分間、染色した。二次抗体は、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から得た）であった。その抗体を、製造業者によって推奨された希釈液で使用した。
【図２Ｄ】図２は、本発明の実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞における内皮細胞マーカーの発現を示す。図２Ｄは、単球細胞におけるＴｉｅ−２発現のフローサイトメトリー解析を示す。５×１０５個のＧＦＰ発現ＴＨＰ−１細胞（上のパネル）またはＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞（下のパネル）を、氷上で３０分間、抗ヒトＴｉｅ−２ウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から得た）の１：１００希釈液とともにインキュベートした。洗浄後、細胞を、氷上で１５分間、ＰＥ−標識した抗ウサギ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから得た）の１：５００希釈液とともにインキュベートして、その後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＦＡＣＳ解析を、上記のように行った。図は、３つの異なるＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞で繰り返した代表的な実験を示す。ｘ軸上のチェックマークは、蛍光強度の対数増加を示す。
【図２Ｅ】図２は、本発明の実施形態に従って、内因的に産生されたＰＴＮによる単球細胞における内皮細胞マーカーの発現を示す。図２Ｅは、単球細胞によるαｖβ３インテグリン発現のフローサイトメトリー解析を示す。ＧＦＰ発現ＴＨＰ−１細胞（左上パネル）またはＰＴＮ発現ＴＨＰ−１細胞（左下パネル）を、抗ヒトαｖβ３マウス抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｃｏから得た）の１：１００希釈液とともにインキュベートした。洗浄後、細胞を、ＰＥ標識抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａから得た）の１：５００希釈液とともにインキュベートして、固定し、上記のＦＡＣＳによって解析した。さらに、抗αｖβ３抗体の非存在下（右上パネル）または存在下（右下パネル）でヒト冠状動脈内皮細胞を、ポジティブコントロールとして使用した。
【図３Ａ】図３は、本発明の実施形態に従って、内因的に産生したＰＴＮによる単球のトランス分化の転写調節を示す。図３Ａは、単球細胞におけるＧＡＴＡ−２およびＧＡＴＡ−３の発現についての半定量的なＲＴ−ＰＣＲを示す。細胞から単離した全ＲＮＡを、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３、およびＯｃｔ−４転写因子に特異的なプライマーを使用して、上記の半定量的なＲＴ−ＰＣＲ解析に供した。増幅したＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動によって解析した。
【図３Ｂ】図３は、本発明の実施形態に従って、内因的に産生したＰＴＮによる単球のトランス分化の転写調節を示す。図３Ｂは、共焦点顕微鏡観察を示し、二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３  ヤギ抗ウサギ抗体（青）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  ヤギ抗マウス抗体（赤））を、製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって推奨された１：５００希釈液で使用した。間接的な免疫標識の後、細胞を、Ｆｌｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから得た）の検鏡板に固定し、従来の蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎから得た）、またはＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０共焦点顕微鏡で検査した。
【図４】図４は、本発明の実施形態に従って、トランス分化した単球細胞のインビトロでの活性を示す。フィブリンゲルを、Ｐ．Ｋｏｏｌｗｉｊｋら、「Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＴＮＦａｌｐｈａ，ｂＦＧＦ，ａｎｄ  ＶＥＧＦ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｂｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ｆｉｂｒｉｎ  ｍａｔｒｉｘ．Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３２，１１７７−８８（１９９６）に記載されたように本質的に調製した。ＧＦＰ発現ＲＡＷ細胞またはＰＴＮ発現ＲＡＷ細胞（５×１０５）を、フィブリンマトリックス上に接種して、３７℃で１８日間、インキュベートし、管状構造の形成を、位相差顕微鏡で解析した。
【図５Ａ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラの漿尿膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図５Ｂ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラのしょうにょう膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図５Ｃ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラのしょうにょう膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図５Ｄ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラのしょうにょう膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図５Ｅ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラのしょうにょう膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図５Ｆ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラのしょうにょう膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図５Ｇ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラのしょうにょう膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図５Ｈ】図５は、本発明の実施形態に従って、ウズラのしょうにょう膜（「ＣＡＭ」）研究においてトランス分化した単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ニホンウズラの受精卵（Ｂｏｙｄ’ｓ  Ｂｉｒｄ  Ｃｏ．，Ｐｕｌｌｍａｎ，ＷＡから得たＣｏｔｕｒｎｉｘ  ｃｏｔｕｒｎｉｘ  ｊａｐｏｎｉｃａ）を、５６時間、大気圧の下で３７℃で孵卵して、次いで、孵卵の３日目の胚（Ｅ３）を開けて、６ウェルプレート中でさらに３７℃で培養した。Ｅ７（図５Ａ）の時点で、予熱したＰＢＳ（２００μｌ）中の１×１０６ＲＡＷまたはまたは２９３細胞を、各ＣＡＭの表面に滴下して適用した。胚をさらに、３７℃で７２時間、孵卵し（図５Ｂ）、その時間に、胚を４％パラホルムアルデヒド／２％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ中で固定した。ＣＡＭの中央領域由来の末端動脈血管の蛍光画像および共焦点画像を、２倍（図５Ｃ）、１０倍（図５Ｄ）、および２０倍（図５Ｅ）の全拡大率ならびに１ピクセルあたり１３μｍの解像度にてグレースケールで得た。１０倍と比較した場合、２０倍の全拡大率での血管密度において有意な増加はなかった。合計６０のＣＡＭの試料を使用した（１グループにつき１２のＣＡＭ）。５回の独立した実験：処理グループとしてＰＴＮを発現するＲＡＷ細胞またはＰＴＮを発現するＴＨＰ−１細胞、を行った。ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（図５Ｆ）を、コントロールグループとして使用した。蛍光画像で、固定したＣＡＭを、４倍の拡大率にてＤＩＣ（それぞれ、図５Ｇおよび５Ｈ）画像で重ね合わせた。
【図６】図６は、本発明の実施形態に従って、ニワトリマウスキメラにおけるトランス分化単球細胞のインビボでの機能活性を示す。ＰＴＮおよびＧＦＰを発現するマウス単球ＲＡＷ細胞（２〜４μｌ  ＰＢＳ中の１〜２×１０５個の細胞）を、ステージ１６〜１７のニワトリ胚の心臓に注射した。胚を注射の２〜３日後に殺し、固定して、ＯＴＣに包埋し、冷凍した切片を、切り出して、抗ＧＦＰポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から得た）で染色した。免疫陽性（茶色）を、ＰＴＮ／ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞を注射した胚で観察した。陽性は、頭、目、および体節中胚葉内（ｉｎｔｅｒｓｏｍｉｔｉｃ）領域において発達している血管に沿って局在した（右パネル）。対照的に、ＧＦＰ遺伝子を発現するＲＡＷ細胞を注射した胚の免疫染色は、染色を示さなかった（左パネル）。いくつかの場合において、かすかな染色を、羊膜腔のまわりに検出した。
【図７Ａ】図７は、本発明の実施形態に従って、後肢の虚血を示す。ＢＡＬＢ／Ｃ雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た；１２週齢）を、落ち着かせて、長軸方向の切開を、鼡径靭帯より下方の大腿部から膝蓋に近い点までの内側に作製した。右大腿動脈を、軽い虚血を誘発するために、腸骨動脈からその近接した点、ならびに膝窩と伏在動脈中の分岐点の遠位にて、６−０絹縫合糸で結紮した。ＰＴＮ／ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（２００μＰＢＳ／マウスにおける１×１０６個の細胞）を、外科手術の２４時間後、静脈内（尾静脈）に注射した（１グループにつき８匹のマウス）。２００μｌのＰＢＳを注射したマウスを、コントロールとして使用した（１グループにつき８匹のマウス）。目的の領域上の後肢（膝蓋から足の中央まで）の血流測定を、繰り返して、基線、Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから得た）によって、外科手術後すぐ、および連続して３週間、得た（図７Ａ）。灌流を、右肢（虚血性）と左肢（正常）との比として表す。外科手術の７日後に、赤血球速度を反映する代表的な色でコードした画像（赤は最も速い速度であり、緑は中間、および青は最も遅い速度である）を示す。上の４つのパネルは、ＰＢＳを注射したＢＡＬＢ／Ｃマウスを示し、下の４つのパネルは、ＰＴＮ／ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞を注射した動物を示す。外科手術の２１日後に観察したマウスのグループについての蓄積結果を、各時点（日数）での虚血性の肢の血流と非虚血性の肢の血流との比としてグラフで示す（図７Ｂ）。
【図７Ｂ】図７は、本発明の実施形態に従って、後肢の虚血を示す。ＢＡＬＢ／Ｃ雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから得た；１２週齢）を、落ち着かせて、長軸方向の切開を、鼡径靭帯より下方の大腿部から膝蓋に近い点までの内側に作製した。右大腿動脈を、軽い虚血を誘発するために、腸骨動脈からその近接した点、ならびに膝窩と伏在動脈中の分岐点の遠位にて、６−０絹縫合糸で結紮した。ＰＴＮ／ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞（２００μＰＢＳ／マウスにおける１×１０６個の細胞）を、外科手術の２４時間後、静脈内（尾静脈）に注射した（１グループにつき８匹のマウス）。２００μｌのＰＢＳを注射したマウスを、コントロールとして使用した（１グループにつき８匹のマウス）。目的の領域（膝蓋から足の中央まで）上の後肢の血流測定を繰り返して、Ｌａｓｅｒ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｍｏｏｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓから得た）によって、基線、外科手術後すぐ、および連続して３週間の血流を得た（図７Ａ）。灌流を、右肢（虚血性）と左肢（正常）との比として表す。外科手術の７日後に、赤血球速度を反映する代表的な色でコードした画像（赤は最も速い速度であり、緑は中間、および青は最も遅い速度である）を示す。上の４つのパネルは、ＰＢＳを注射したＢＡＬＢ／Ｃマウスを示し、下の４つのパネルは、ＰＴＮ／ＧＦＰを発現するＲＡＷ細胞を注射した動物を示す。外科手術の２１日後に観察したマウスのグループについての蓄積結果を、各時点（日数）での虚血性の肢の血流と非虚血性の肢の血流との比としてグラフで示す（図７Ｂ）。
【図１Ａ】
2007531498.tif 000003
【図１Ｂ】
2007531498.tif 000004
【図１Ｃ】
2007531498.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2007531498.tif 000009
【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
2007531498.tif 000013
【図５Ａ】
2007531498.tif 000014
【図５Ｂ】
2007531498.tif 000015
【図５Ｃ】
2007531498.tif 000016
【図５Ｄ】
2007531498.tif 000017
【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
2007531498.tif 000020
【図５Ｈ】
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【図６】
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【図７Ａ】
2007531498.tif 000023
【図７Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月31日(2006.1.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球細胞を内皮細胞へトランス分化させる方法であって、該方法は、以下：
単球細胞を提供する工程；および
該単球細胞が内皮細胞へトランス分化するように、該単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程は、該単球細胞をＰＴＮを発現するレトロウイルスで形質導入する工程を包含する、方法。
【請求項３】
前記レトロウイルスは二重シストロン性レトロウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単球細胞は、ＲＡＷ細胞またはＴＨＰ−１細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
以下の工程：
単球細胞を提供する工程；および
該単球細胞が内皮細胞へトランス分化するように、該単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程、
を包含する方法により、生成される内皮細胞。
【請求項６】
請求項５に記載の内皮細胞であって、ここで前記単球細胞におけるＰＴＮの発現を人工的に増大させる工程は、該単球細胞をＰＴＮを発現するレトロウイルスで形質導入する工程を包含する、内皮細胞。
【請求項７】
前記レトロウイルスは二重シストロン性レトロウイルスである、請求項６に記載の内皮細胞。
【請求項８】
前記単球細胞は、ＲＡＷ細胞またはＴＨＰ−１細胞である、請求項５に記載の内皮細胞。
【請求項９】
新生血管形成を阻害するための組成物であって、該組成物は、以下：
新生血管形成が阻害されるように、治療有効量のプレイオトロフィン（ＰＴＮ）の生物学的活性を阻害する化合物
を含む、組成物。
【請求項１０】
新生血管形成を促進するための組成物であって、該組成物は、以下：
新生血管形成が促進されるように、治療有効量のプレイオトロフィン（ＰＴＮ）の生物学的活性を増強または促進する化合物
を含む、組成物。
【国際調査報告】
2007531498.tif 000025
2007531498.tif 000026
2007531498.tif 000027