(57)【要約】ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦアイソフォーム、ＰＤＧＦレセプター、ＶＥＧＦ、およびＶＥＧＦレセプター、またはそれらの任意の組み合わせに、高い親和性および特異性で結合することが可能である腫瘍治療剤として有用なアプタマーを製造および使用するための物質および方法が提供される。本発明の組成物は、固形腫瘍の治療において特に有用であり、かつ固形腫瘍の治療のために、単独でまたは既知の細胞傷害剤と組み合わせて使用され得る。そこに組み込まれるかまたはそこに付加される１つ以上のＣｐＧモチーフを有するアプタマーもまた、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号３８、配列番号５０、配列番号５４〜配列番号９０、および配列番号９４〜配列番号９９からなる群より選択される配列を含む、ＰＤＧＦに結合するアプタマー。
【請求項２】
２’フルオロ置換基を有する７個未満のヌクレオチドを含む配列を含む、ＰＤＧＦに結合するアプタマー。
【請求項３】
第１の標的に結合可能である第１の配列、および第２の標的に結合可能である第２の配列を含むアプタマー。
【請求項４】
前記第１の標的がＰＤＧＦ、ＰＤＧＦアイソフォーム、およびＰＤＧＦレセプターからなる群より選択され、かつ前記第２の標的がＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターからなる群より選択される、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項５】
配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号３８、配列番号５０、配列番号５４〜配列番号９０、および配列番号９４〜配列番号９９からなる群より選択される配列を含む、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
前記ＰＤＧＦアイソフォームがＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＰＤＧＦ  ＡＢ、ＰＤＧＦ  ＣＣ、およびＰＤＧＦ  ＤＤである、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項７】
前記第１の標的が前記アプタマーの結合の際に免疫応答を刺激せず、さらに前記第２の標的が該アプタマーの結合の際に免疫応答を刺激する、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項８】
前記第２の標的がｔｏｌｌ様レセプターからなる群より選択される、請求項７に記載のアプタマー。
【請求項９】
前記第２の配列が免疫刺激配列である、請求項３に記載のアプタマー。
【請求項１０】
免疫刺激配列がＣｐＧモチーフである、請求項９に記載のアプタマー。
【請求項１１】
前記第１の配列が、ＰＤＧＦ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  ＦｃεＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＦｃＲＩＩＢ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＣＤ１１ｃ、ＢＡＦＦ、Ｂ７−Ｘ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、およびＣＤ３３からなる群より選択される標的に結合可能である、請求項９に記載のアプタマー。
【請求項１２】
前記第１の配列がＰＤＧＦに結合可能である、請求項９に記載のアプタマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のうちのいずれかに記載のアプタマーおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のうちのいずれかに記載のアプタマー、細胞傷害剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項１５】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載のアプタマー、ＶＥＧＦに結合するアプタマー、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１８】
細胞傷害剤をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１２のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を投与する工程を包含する、癌を治療する方法。
【請求項２２】
請求項１３、１４、および１８のうちのいずれかに記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、癌を治療する方法。
【請求項２３】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１２のうちのいずれか一項に記載のアプタマーの治療有効量を投与する工程を包含する、腫瘍の増殖を阻害する方法。
【請求項２６】
請求項１３、１４、および１８のうちのいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、腫瘍の増殖を阻害する方法。
【請求項２７】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１２のうちのいずれか一項に記載のアプタマーの治療有効量を投与する工程を包含する、固形腫瘍におけるＩＦＰを減少させる方法。
【請求項３０】
請求項１３、１４、および１８のうちのいずれかに記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、固形腫瘍におけるＩＦＰを減少させる方法。
【請求項３１】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１２のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を投与する工程を包含する、細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させる方法。
【請求項３４】
請求項１３、１４、および１８のうちのいずれか一項に記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させる方法。
【請求項３５】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜１２のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を投与する工程を包含する、腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的発現を減少させる方法。
【請求項３８】
請求項１３、１４、および１８のうちのいずれかに記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的活性化を減少させる方法。
【請求項３９】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜１２のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を投与する工程を包含する、固形腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させる方法。
【請求項４２】
請求項１３、１４、および１８のうちのいずれかに記載の組成物の治療有効量を投与する工程を包含する、固形腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させる方法。
【請求項４３】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、およびＤＮＡ修飾剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記癌または腫瘍がＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である、請求項２１〜４４のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍が、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、および軟部組織肉腫からなる群より選択される、請求項２１〜４４のうちのいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には核酸の分野に関し、より詳細には、腫瘍学および／またはＰＤＧＦが関与している他の疾患もしくは障害における治療学として有用な血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）に結合可能であるアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、古典的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成以外の相互作用を通して分子に対する特異的結合親和性を有する核酸分子である。
【０００３】
アプタマーは、ファージ提示法またはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によって生成されるペプチドと同様に、選択された標的に特異的に結合することが可能であり、かつ結合を通して、それらの標的が機能する能力をブロックする。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロ選択プロセスによって作製されるので（図１）、アプタマーは、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含む１００種を超えるタンパク質について生成されてきた。典型的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル濃度以下の親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的に対して区別する（例えば、典型的には、同じ遺伝子ファミリーからの他のタンパク質を結合しない）。一連の構造研究は、アプタマーが、抗体−抗原複合体において親和性および特異性を駆動するのと同じ型の結合相互作用（水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体障害など）を使用することが可能であることを示してきた。
【０００４】
アプタマーは、治療剤（および診断剤）としての使用のための多数の望ましい性質（高い特異性および親和性、生物学的効力、および優秀な薬理学的特性を含む）を有する。さらに、アプタマーは、抗体および他のタンパク質生物製剤を超えた特定の競合的な利点を提供し、これらは例えば以下の点である：
１）速度および制御。アプタマーは、完全にインビトロプロセスによって製造され、最初の（治療的）リードの迅速な生成を可能にする。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性を強固に制御することを可能にし、毒性標的と非免疫原性標的の両方に対してリードの生成を可能にする。
【０００５】
２）毒性および免疫原性。クラスとしてのアプタマーは、毒性または免疫原性がほとんどないか、または全くないことが実証されている。高濃度のアプタマー（毎日１０ｍｇ／ｋｇ、９０日間）を用いるラットまたはウッドチャックの長期的投薬において、いかなる臨床的、細胞的、または生化学的な尺度によっても毒性は観察されない。多くのモノクローナル抗体の効力が抗体自体に対する免疫応答によって厳しく制限され得るのに対して、アプタマーに対する抗体を誘発することは極めて困難である（おそらく、アプタマーはＭＨＣを介してＴ細胞によって提示されることができないず、および免疫応答は一般的に核酸フラグメントを認識するようには訓練されていないという可能性が高い）。
【０００６】
３）投与。現在認可されているすべての抗体治療剤は静脈内注入（典型的には、２〜４時間より長く）によって投与されるのに対して、アプタマーは皮下注射によって投与され得る。この違いは、主として、大部分の治療的ＭＡｂについては比較的溶解性が低く、そのために大量に必要であることに起因する。良好な溶解性（＞１５０ｍｇ／ｍｌ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）では、アプタマーの１週間の投薬量は０．５ｍｌ未満の体積での注射によって送達され得る。皮下投与を介するアプタマーの生物学的利用能は、サルの研究においては＞８０％である（Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２，１９９９）。さらに、小さなサイズのアプタマーは、これらを、抗体または抗体フラグメントが浸透することを不可能にするコンホメーション的な圧縮の領域に浸透することを可能にし、アプタマーに基づく治療剤または予防剤のさらに別の利点を提供する。
【０００７】
４）拡張性およびコスト。治療用アプタマーは化学合成され、結果的に製造需要に合致するのに必要とされるように容易に規模を拡張され得る。製造の規模を拡張することの困難さは、現在ではある生物製剤の利用可能性を制限しており、かつ大規模のタンパク質製造工場の資本コストが膨大であるのに対して、単一の大規模合成機は、年間あたり１００ｋｇ以上のオリゴヌクレオチドを製造可能であり、かつ比較的高くない初期の投資を必要とする。キログラムスケールでのアプタマー合成のための物品の現在のコストは＄５００／ｇであり、高度に最適化された抗体についてのそれと比較可能である。プロセス開発における継続的な投資は、５年間で＜＄１００／ｇまでの物品のコストを低下させると予測される。
【０００８】
５）安定性。治療用アプタマーは化学的に堅固である。これらは、熱、変性などにさらされた後に活性を回復するように固有に適応し、かつ凍結乾燥粉末として室温で長期間（＞１年間）保存可能である。対照的に、抗体は冷蔵保存されなければならない。
【０００９】
（間質液圧）
癌治療の３つの最も一般的な型は、癌組織の外科的除去、癌組織を破壊するための放射線治療、および化学療法である。これらの治療は、癌組織もしくは癌細胞を除去すること、または治療剤もしくは他の薬剤を用いて身体中の癌組織もしくは癌細胞を破壊することを目的とする。化学療法は、固形腫瘍の主要な治療様式であり続けている。毒性の副作用を潜在的に減少するために、およびより高い効力の化学療法剤を達成するために、正常組織と腫瘍との間の薬物の分布を改善するためのストラテジーが多く望まれている。
【００１０】
固形腫瘍の治療における主要な障害は、腫瘍組織への治療剤の取り込みの制限である。間質液圧（「ＩＦＰ」）の上昇は、健常結合組織とは異なる固形腫瘍を生理学的に区別できる特性の１つであり、かつ固形腫瘍治療剤の自由拡散を制限する主要な障害であると考えられている。ＰＤＧＦレセプター、特にＰＤＧＦ−βは、ＩＦＰの調節に関与している。腫瘍が過剰増殖状態に入るときに、酸素および他の栄養を供給する血液は、腫瘍の需要についていくことができず、低酸素状態が生じる。低酸素状態は、「血管形成スイッチ」の引き金を引き、これは、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦを含むいくつかの因子の発現をアップレギュレートし、これは次には、血管形成を開始するように働く。しかし、生じる血管形成は異常な腫瘍血管構造を形成する。この腫瘍血管構造は、間質からの過剰な液体を十分に排出させることが不可能である程度にまで損なわれ、液体の蓄積は弾性間質マトリックスを膨張させ、圧力の増加を引き起こす。圧力が毛細管壁の抵抗性を超える場合、圧縮が起こりかつ血流の抵抗性が増大する。
【００１１】
大部分の固形腫瘍のこの特性−腫瘍間質の過度の圧力またはＩＦＰの増加−は、腫瘍薬物の取り込みを増大させる試みにおいて潜在的な標的として示唆されてきた（Ｊａｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：３０３９−３０５１）。ＩＦＰの増加は、腫瘍の経血管輸送のための障壁として作用する（Ｊａｉｎら（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６：７１−９０）。腫瘍ＩＦＰを減少させること、または微小血管の圧力の調節は、腫瘍標的化抗体または低分子量トレーサー化合物の経血管輸送を増加させることが示されてきた（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，２９２９−２９３４）。腫瘍における間質の過度の圧力の病因論はほとんど理解されていない。１つの提案された理論は、腫瘍におけるリンパ管の欠如が腫瘍ＩＦＰの増加に対して寄与する因子であることである（Ｊａｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：３０３９−３０５１）。別の提案された理論は、微小血管構造および支持間質区画が腫瘍ＩＥＰのための重要な決定基である可能性があることである（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５４７６−５４８４）。蓄積している証拠は、腫瘍間質の過度の圧力を調節するための薬理学的治療剤のための潜在的な標的として、膜貫通ＰＤＧＦβ−レセプターチロシンキナーゼを指摘する。とりわけ潜在的な標的は、ＰＤＧＦβ−レセプターに結合する増殖因子である。
【００１２】
（ＰＤＧＦが媒介する癌）
ＩＦＰおよび治療剤を用いて腫瘍に浸透することの困難に加えて、癌治療における別の障害は、ＰＤＧＦが媒介する癌による特定の型の癌における変異であり、これはＰＤＧＦの構成的発現をもたらす。これらの変異は、図３において示されるような種々の型の癌を生じる、異常な細胞の増殖を駆動する（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，２９２９−２９３４）。遺伝子変異は、高度の膠芽細胞腫においてＰＤＧＦα−レセプターの増幅を生じる。慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）において、ＰＤＧＦ−βの構成的発現は、ＰＤＧＦ以外のタンパク質とのβ−レセプターの融合を引き起こす変異から生じる（Ｇｏｌｕｂら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７，３０７−３１６、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  １００，６２３−６２６）。活性化点範囲に起因するＰＤＧＦ−α−レセプターの構成的活性化もまた、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を有する患者において同定されてきた（Ｈｅｉｎｒｅｉｃｈら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９，７０８−７１０）。隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）は、ＰＤＧＦ−ＢＢにプロセスされる融合タンパク質の構成的産生と関連する（Ｏ’Ｂｒｉａｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ２３，１８７−１９３；Ｓｈｉｍｉｚｉｕら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３７１９−３７２３；Ｓｉｍｏｎら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５，９５−９８）。変異に起因するＰＤＧＦのリガンド／レセプターの構成的活性化に加えて、アップレギュレーションが軟部組織肉腫および神経膠腫において示されてきた（ＯｓｔｍａｎおよびＨｅｌｄｉｎ（２００１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８０，１−３８）。
【００１３】
（ＰＤＧＦ）
増殖因子は、細胞または組織に対して細胞増殖性効果を有する物質である。いずれの所定の増殖因子も、１つ以上のレセプターを有し得るか、または１つ以上の細胞株もしくは組織において細胞増殖を誘導し得る。ＰＤＧＦは、システイン−ｋｎｏｔ増殖因子ファミリーに属し、元来細胞の分裂促進的および移動性活性を促進するために血小板から単離された。ＰＤＧＦは強力な分裂促進因子であり、かつ線維芽細胞、平滑筋細胞、神経膠細胞、および結合組織細胞などの通常細胞の増殖の調節において中心的な役割を有する。さらに、ＰＤＧＦは、例えば増殖性障害において病理学的な細胞増殖を媒介し、かつ血管形成において役割を果たす。腫瘍の血管形成に関与する別の増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。
【００１４】
４つのＰＤＧＦポリペプチド鎖が同定されており、これらは現在、５つのダイマー性ＰＤＧＦアイソフォーム：ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤ、および−ＡＢを形成することが知られている。最も豊富に存在する種はＰＤＧＦ  ＡＢおよびＢＢである。ＰＤＧＦアイソフォームはαおよびβチロシンキナーゼレセプターに結合する。ＰＤＧＦレセプターは、腫瘍内の多くの異なる細胞型によって発現される。それらのコグネイトレセプターへのＰＤＧＦアイソフォームの結合は、ダイマー化ならびに引き続いてレセプターの細胞内チロシンキナーゼドメイン内の特定の残基のリン酸化およびシグナル伝達経路の活性化を誘導する。ＰＤＧＦアイソフォーム−ＡＡ、−ＢＢ、−ＣＣ、および−ＡＢはＰＤＧＦαレセプターダイマー化を誘導する。ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤはＰＤＧＦβレセプターダイマー化を活性化する。ＰＤＧＦ−ＡＡ以外のＰＤＧＦのすべてのアイソフォームは、両方のレセプター型を同時発現する細胞においてαとβの両方のレセプターを活性化する（図２）。これらは強力な分裂促進因子であるので、ＰＤＧＦアイソフォームは、増殖性疾患、例えば、癌、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、および再狭窄などの治療剤の開発のために標的とされてきた。
【００１５】
内皮細胞によって分泌されるＰＤＧＦは、線維芽細胞のための直接的な分裂促進因子として作用し、かつ血管平滑筋細胞を刺激する。多くの固形腫瘍は、腫瘍の間質においてＰＤＧＦのパラクリン性シグナル伝達を示す。ＰＤＧＦは、コラーゲンの合成をアップレギュレートすること、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分とのインテグリンなどのアンカータンパク質の相互作用を媒介することが知られている。結合組織、ＥＣＭ、および細胞内アクチンフィラメント系との間のＰＤＧＦの相互作用は、高ＩＦＰに寄与する抗張力の増加を引き起こす。高ＩＦＰは腫瘍の部位に局在し、かつヒトの癌において乏しい予後を伴う。これは腫瘍のサイズおよび重篤度、ならびに悪性度を増大させるからである。種々の固形腫瘍でのＩＦＰおよびアップレギュレートされた発現の制御におけるＰＤＧＦの役割は、ＰＤＧＦシグナル伝達の阻害がＩＦＰを減少させ得、それによって固形腫瘍への薬物の取り込みを増加させるか否かの研究を促した。以前の研究は、低分子レセプターアンタゴニストおよびＰＤＧＦ特異的アプタマーを用いるＰＤＧＦシグナル伝達の阻害が間質液圧を減少させ、かつ固形腫瘍への化学療法剤の取り込みを増加させることを実証した（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，２９２９−２９３４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、腫瘍ＩＦＰを減少するため、腫瘍の血管形成を減少するため、およびＰＤＧＦの構成的発現による変異の有害な効果を減少するために、発現腫瘍学において新規な物質および方法を有することは有益である。本発明は、これらの必要性および他の必要性に合致する物質および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、それらのアイソフォーム、それらのレセプター、またはこれらの組み合わせに高い親和性および特異性で結合可能であり、従って、癌の病因論における結合リガンドの生物学的役割を阻害することが可能であるアプタマーまたはアプタマー組成物の治療有効量の患者への投与による、癌、特に固形腫瘍癌の治療のための物質および方法を提供する。本発明のアプタマーは、既知の化学療法剤とともに使用され得、かつそこに組み込まれたかまたはそれに付随された１つ以上のＣｐＧモチーフを含み得る。
【００１８】
本発明はＰＤＧＦに結合するアプタマーを提供する。１つの実施形態において、ＰＤＧＦに結合するアプタマーは、配列番号１から配列番号３、配列番号９から配列番号３８、配列番号５０、配列番号５４から配列番号９０、および配列番号９４から配列番号９９からなる群より選択される核酸配列を含む。１つの実施形態において、アプタマーのオリゴヌクレオチド配列は、２’フルオロ置換基を有する７個未満のヌクレオチドを含む配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、第１の標的に結合可能である第１の配列、および第２の標的に結合可能である第２の配列を含むアプタマーを提供する。１つの実施形態において、第１の標的はＰＤＧＦ、ＰＤＧＦアイソフォーム、およびＰＤＧＦレセプターであり、かつ第２の標的はＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターである。ＰＤＧＦアイソフォームは、例えば、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＰＤＧＦ  ＡＢ、ＰＤＧＦ  ＣＣ、およびＰＤＧＦ  ＤＤである。１つの実施形態において、ＰＤＧＦに結合するアプタマーは、配列番号１から配列番号３、配列番号９から配列番号３８、配列番号５０、配列番号５４から配列番号９０、および配列番号９４から配列番号９９から選択される核酸配列を含む。
【００２０】
１つの実施形態において、第１の標的はアプタマーの結合の際に免疫応答を刺激せず、さらに第２の標的はアプタマーの結合の際に免疫応答を刺激しない。１つの実施形態において、第２の標的はｔｏｌｌ様レセプターである。別の実施形態において、第２の配列は免疫刺激配列である。１つの実施形態において、免疫刺激配列はＣｐＧモチーフである。
【００２１】
１つの実施形態において、第１の配列は、以下の標的：ＰＤＧＦ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  ＦｃεＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＦｃＲＩＩＢ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＣＤ１１ｃ、ＢＡＦＦ、Ｂ７−Ｘ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、およびＣＤ３３の１つに結合可能である。１つの実施形態において、第１の配列はＰＤＧＦに結合可能である。
【００２２】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマー、細胞傷害剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。１つの実施形態において、細胞傷害剤は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤などの細胞傷害剤のクラスに属する。１つの実施形態において、細胞傷害剤は、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００２４】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマー、ＶＥＧＦ結合アプタマー、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。１つの実施形態において、これらの組成物もまた、細胞傷害剤を含む。適切な細胞傷害剤には、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤などの細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤が含まれる。この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００２５】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって癌を治療する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって癌を治療する方法を提供する。
【００２６】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００２８】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって固形腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって固形腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。
【００２９】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００３１】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって固形腫瘍中のＩＦＰを減少させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって固形腫瘍中のＩＦＰを減少させる方法を提供する。
【００３２】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００３４】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させる方法を提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００３７】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的発現を減少させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的発現を減少させる方法を提供する。
【００３８】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００４０】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させる方法を提供する。
【００４１】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は以下の付随する記載に示される。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価ないかなる方法および材料も本発明の実施および試験において使用され得るが、好ましい方法および材料は本明細書に記載される。他の特徴、目的、および利点は本明細書の記載から明らかである、本明細書において、文脈が明確に他を示していない限りは、単数形はまた複数形も含む。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。競合する場合には本明細書が優先する。
【００４４】
（ＳＥＬＥＸＴＭ法）
アプタマーを生成するための適切な方法は、図１において一般的に示される「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（「ＳＥＬＥＸＴＭ」）」と呼ばれるプロセスを用いてである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、標的分子への高度な特異的結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、現在は放棄された１９９０年６月１１日に出願された米国特許出願シリアル番号０７／５３６，４２８号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号、および「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ  ９１／１９８１３もまた参照されたい）において記載されている。各々のＳＥＫＥＸ−によって同定された核酸リガンドは、所定の標的の化合物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成する十分な能力を、ならびにモノマー性であるかまたはポリマー性であるかに関わらず、実質的に任意の化学化合物を有するリガンドとして作用する（すなわち、特異的結合対を形成する）、それらのモノマー中で利用可能である十分な化学的汎用性を有するという独特な洞察に基づいている。任意のサイズまたは組成の分子が標的として役立ち得る。
【００４５】
ＳＥＬＥＸＴＭは、開始点として、標準的なＤＮＡ合成機上での化学合成に由来するランダム化配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドテンプレートの大きなライブラリーに依存する。ある例において、１００％ランダムなオリゴヌクレオチドの集団がスクリーニングされる。他の例では、集団中の各ヌクレオチドは、ランダム配列、ならびにオリゴヌクレオチド集団のすべての分子によって共有される配列を含むその５’および／または３’末端における少なくとも１つの固定された配列を含む。固定された配列は、例えば、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、ＳＰ６など）、制限部位、またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡもしくはポリＴトラクト）、触媒性コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位、および目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にするための他の配列なとの配列を含む。
【００４６】
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は任意の長さのものであり得、かつリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、かつ修飾されたまたは非天然のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８５号；同第５，９５８，６９１号；同第５，８１７，６３５号；および同第５，６７２，６９５を参照されたい。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である固相合成後ヌクレオチド合成技術を使用してホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成され得る（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６））。オリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法などの固相方法を使用して合成され得る（Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２８：２４４９（１９７８））。自動ＤＮＡ合成装置上で実行される典型的な合成は、１０１５〜１０１７分子を生じる。配列設計におけるランダム配列の十分に大きな領域は、各々の合成された分子が独特な配列を表し得る可能性を増大させる。
【００４７】
ランダム化された配列を合成するために、４種すべてのヌクレオチドの混合物は、合成プロセスの間の各ヌクレオチド付加工程において加えられ、ヌクレオチドのランダムな取り込みを可能にする。１つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含む；しかし、他の実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでないかまたは部分的にランダムな配列のストレッチを含み得る。部分的にランダムな配列は、各付加工程で異なるモル濃度比で４種のヌクレオチドを加えることによって作製され得る。
【００４８】
テンプレート分子は、典型的には、３０〜５０のランダムヌクレオチドの領域に隣接する固定された５’および３’末端配列を含む。標準的な（１μモル）スケール合成は、大部分のＳＥＬＥＸ実験に十分な１０１５〜１０１６の個別のテンプレート分子を生じる。ＲＮＡライブラリーは組換えＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によってこの開始ライブラリーから生成される。次いで、結合親和性および選択性の実質的に任意の望ましい判断基準を達成するために、このライブラリーは結合のために好ましい条件下で標的と混合され、同じ一般的な選択スキームを使用して、結合の段階的な反復、分配、および増幅に供される。好ましくは、ランダム化された配列のセグメントを含む、核酸の混合物から開始して、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、以下の工程を包含する：結合のための好ましい条件下で標的と混合物を接触させる工程、標的分子に特異的に結合した核酸から未結合の核酸を分配する工程、核酸−標的複合体を解離させる工程、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド−富化混合物を生じる工程、次いで、標的分子に対して高い特異性、高い親和性の核酸リガンドを生じるために望ましい回数のサイクルを通して、結合、分配、解離、および増幅の工程を反復する工程。
【００４９】
多くの可能な配列および構造を含む核酸混合物の中で、所定の標的に対する広範な結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は、４２０通りの候補の可能性を有し得る。標的に対してより高い親和性定数を有するものは、標的に結合する可能性が最も高い。分配、解離、および増幅の後、第２の核酸混合物が生成され、より高い結合親和性候補について富化される。さらなる選択のラウンドは、得られる核酸混合物が優先的に１種または数種の配列からなるまで、最良のリガンドを進行的に優先する。次いでこれらは、クローニングされ、配列決定され、純粋なリガンドとして結合親和性について個別に試験され得る。
【００５０】
選択および増幅のサイクルは、望ましい目的が達成されるまで反復される。最も一般的な場合では、選択／増幅は、結合強度の顕著な改善がサイクルの反復で達成されなくなるまで継続される。この方法は、約１０１８個の異なる核酸種と同じ数まで試料に対して使用され得る。試験混合物の核酸は、好ましくは、ランダム化された配列部分ならびに有効な増幅のために必要である保存配列を含む。核酸配列変異体は、ランダム化核酸配列の合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む、多数の方法において産生され得る。変異体配列部分は、完全にまたは部分的にランダムな配列を含み得る；これはまた、ランダム化された配列が組み込まれた保存性配列のサブ部分を含み得る。試験核酸における配列のバリエーションは、選択／増幅反復の前またはその間に、変異誘発によって導入または増加され得る。
【００５１】
ＳＥＬＥＸＴＭの１つの実施形態において、選択プロセスは、選択される標的に最も強力に結合する核酸リガンドを単離する際にあまりにも効率的なので、１サイクルの選択および増幅のみが必要である。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフィー型プロセスにおいて起こり得、ここでは、カラム上で結合した標的と解離する核酸の能力は、カラムが最高の親和性の核酸リガンドの分離および単離を十分に可能にし得るような様式で作用する。
【００５２】
多くの場合において、単一の核酸リガンドが同定されるまで、ＳＥＬＥＸＴＭの反復工程を実行することは必ずしも必要ではない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多数の保存性配列および標的への核酸リガンドの親和性に有意な変化を与えることなく置換され得るかまたは加えられ得る多数のの配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスを完了の前に終了することによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。
【００５３】
種々の核酸の一次構造、二次構造、および三次構造が存在することは公知である。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称バルジ、シュドノット、および無数のこれらの組み合わせであるといわれる。このようなモチーフのほぼすべての公知の事例は、これらが３０ヌクレオチドを超えない核酸配列中で形成され得ることを示唆する。この理由のために、連続したランダム化セグメントを用いるＳＥＬＥＸ手順は、約２０〜５０ヌクレオチドの間のランダム化セグメントを含む核酸配列で開始されることがしばしば好ましい。
【００５４】
コアＳＥＬＥＸＴＭ法は、多数の特定の目的を達成するために改変されてきた。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、特定の構造特性を有する核酸分子、例えば、ベントＤＮＡを選択するためにゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸＴＭの使用を記載している。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子を結合し、および／または光架橋し、および／または光不活性化することが可能である光反応基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸＴＭに基づく方法を記載している。米国特許第５，５６７，５８８号および「Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ  ＳＥＬＥＸ」という表題の１９９７年１月３１日に出願された米国特許出願番号０８／７９２，０７５は、標的分子に対して高い親和性および低い親和性を有するオリゴヌクレオチド間での効率の高い分配を達成する、ＳＥＬＥＸＴＭに基づく方法を記載している。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸＴＭ手順が実行された後で改善された核酸リガンドを得るための方法を記載している。米国特許第５，７０５，３３７号は、その標的へのリガンドの共有結合のための方法を記載している。
【００５５】
ＳＥＬＥＸＴＭはまた、標的分子上の１つより多くの部位に結合する核酸リガンドを得るため、および標的上の特異的部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために使用され得る。ＳＥＬＥＸＴＭは、タンパク質（核酸結合タンパク質とそれらの生物学的機能の一部として核酸を結合することが知られていないタンパク質の両方を含む）、共同因子、および他の低分子を含む生体高分子および生体低分子を含む、任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。例えば、カフェインおよび密接に関連するアナログであるテオフィリンに対して高い親和性で結合可能である、ＳＥＬＥＸＴＭを通して同定された核酸配列を開示する米国特許第５，５８０，７３７号を参照されたい。
【００５６】
カウンターＳＥＬＥＸＴＭは、１つ以上の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって標的分子への核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。カウンターＳＥＬＥＸＴＭは以下の工程からなる：ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；ｂ）標的と候補混合物を接触させる工程（ここで候補混合物と比較して標的に対して親和性の増加を有する核酸は候補混合物の残りから区分けされ得る）；ｃ）候補混合物の残りから親和性が増加している核酸を区分けする工程；ｄ）非標識分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように、１つ以上の非標識分子と、親和性が増加した核酸を接触させる工程；およびｅ）標的分子に対して特異的親和性を有する核酸を増幅して、標的分子への結合について比較的より高い親和性および特異性を有する核酸配列について富化された核酸の混合物を得る工程。
【００５７】
治療剤およびワクチンとしての核酸の使用における１つの潜在的な問題は、それらのホスホジエステル型にあるオリゴヌクレオチドが、所望の効果が明らかになる前にエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内酵素および細胞外酵素によって体液中で迅速に分解され得ることである。従って、ＳＥＬＥＸ法は、リガンドに対して改善された性質（例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達性質）を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を含む。このような修飾の例は、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置での化学的置換を含む。ＳＥＬＥＸ同定された核酸リガンド含有修飾ヌクレオチドは米国特許第５，６６０，９８５号に記載され、これは、リボースの２’位、ピリミジンの５位、およびプリンの８位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している。米国特許第５，７５６，７０３号は、種々の２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載している。米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載している。
【００５８】
本発明において意図される核酸リガンドの修飾は、核酸リガンド塩基に、または全体としての核酸リガンドに、さらなる電荷、分極、疎水性、水素結合、静電的相互作用、および機能性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を組み込む他の化学基を供給するものを含むが、これに限定されない。このような修飾には、２’位糖置換、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換；バックボーン修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルリン酸修飾、メチル化、一般でない塩基対の組み合わせ、例えばイソ塩基イソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるがこれらに限定されない。修飾はまた、キャッピングなどの３’および５’修飾を含み得る。
【００５９】
修飾は、ＳＥＬＥＸプロセスの前または後の修飾であり得る。ＳＥＬＥＸプロセス前修飾は、それらのＳＥＬＥＸ標的についての特異性と、改善されたインビボ安定性の両方を有する核酸リガンドを生じる。２’−ＯＨ核酸リガンドに作製されるＳＥＬＥＸ後修飾は、核酸リガンドの結合能力に有害な影響を与えることなく、インビボ安定性の改善を生じ得る。
【００６０】
他の修飾は当業者に公知である。このような修飾はＳＥＬＥＸ後プロセス（以前に同定された非修飾リガンドの修飾）で作製され得るか、またはＳＥＬＥＸプロセスへに組み込みによって作製され得る。
【００６１】
ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号において記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能的単位と組み合わせる工程を包含する。ＳＥＬＥＸ法はさらに、米国特許第６，０１１，０２０号に記載されているように、診断用または治療用複合体中で、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性高分子量化合物と組み合わせる工程を包含する。診断用または治療用複合体中で、親油性化合物、例えば、ジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールと結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許第５，８５９，２２８号に記載されている。
【００６２】
親油性化合物（例えば、グリセロール脂質）、または非免疫原性高分子量化合物（例えば、ポリアルキレングリセロール）と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドは、さらに米国特許第６，０５１，６９８号に記載されている。非免疫原性、高分子量化合物、または親油性化合物が結合されたＶＥＧＦ核酸リガンドは、さらにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／１８４８０において記載されている。これらの特許および特許出願は、他の分子の望ましい性質との、オリゴヌクレオチドの、形状および他の特性、ならびに効率的な増幅および複製の特性の広範なアレイの組み合わせを可能にする。
【００６３】
ＳＥＬＥＸ法を介する、小さな、柔軟性のあるペプチドへの核酸リガンドの同定もまた、開発された。小さなペプチドは柔軟性のある構造を有し、かつ複数の配座異性体の平衡状態で溶液中に存在し、従って、結合親和性は、柔軟性のあるペプチドを結合する際に失われた配座エントロピーによって制限され得ると最初は考えられていた。しかし、溶液中の小さなペプチドへの核酸リガンドの実行可能性は米国特許第５，６４８，２１４号において実証された。この特許において、サブスタンスＰ（１１アミノ酸ペプチド）への高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。
【００６４】
ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するために、修飾オリゴヌクレオチドが使用され得、かつ１つ以上の置換ヌクレオチド結合、糖の変化、塩基の変化、またはそれらの組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）によって置換されるオリゴヌクレオチドが提供され、ここで各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキルである。連結基は−Ｏ−、−Ｎ−、または−Ｓ−連結を通して隣接するヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチドにおいてすべての連結が同一であることが必要なわけではない。
【００６５】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは修飾糖基を含み、例えば、１つ以上の水酸基はハロゲン、脂肪族基で置換されるか、またはエーテルもしくはアミンとして官能基化される。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル基、Ｏ−アルキル基、Ｓ−アリル基、またはハロ基のいずれかによって置換される。２’修飾糖の合成の方法は、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）において記載されている。２−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー分子は、標的分子に対する核酸分子の感受性を、非置換リボ−またはデオキシリボオリゴヌクレオチドを使用して生成されたものよりも１０から１００倍増大させ得（Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７））このことは、標的分子とのさらなる結合相互作用を提供し、かつ核酸分子の二次構造の安定性を増加させる（Ｋｒａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０：５２０９−５２１２（１９９８）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−３１７（１９９１）；Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５５２９−５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：６８−７３（１９９７））。
【００６６】
核酸アプタマー分子は、一般的に、５〜２０サイクルの手順において選択される。１つの実施形態において、不均一性は最初の選択段階においてのみ導入され、かつ複製プロセスを通しては存在しない。
【００６７】
ＤＮＡ配列の開始ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置上での自動化化学合成によって生成される。この配列のライブラリーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＲＮＡに転写され、かつ精製される。１つの例において、５’−固定化：ランダム：３’−固定化配列は、３０〜５０ヌクレオチドを有するランダム配列によって分離される。
【００６８】
本発明の標的に対して特異性および結合親和性を有するアプタマーは、上記のＳＥＬＥＸプロセスによって選択される。ＳＥＬＥＸプロセスの一部として、標的に結合するように選択される配列は、次いで、必要に応じて、結合親和性を有する最小限の配列を決定するために最小化され、かつ親和性の増加が結合活性のために必須であるか、または代替的には配列中のどの位置が結合活性のために必須であるかを決定するために、最小化された配列のランダム変異誘発または部位特異的変異誘発を実行することによって最適化される。さらに、選択は、インビボでの分解に対してアプタマー分子を安定化させるために修飾配列を取り込む配列を用いて実行され得る。
【００６９】
（２’修飾ＳＥＬＥＸＴＭ）
さらに、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、２００２年１２月３日に出願された米国シリアル番号６０／４３０，７６１、２００３年７月１５日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６０／４８７，４７４、および２００３年１１月４日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６０／５１７，０３９、および２００３年１２月３日に出願された米国特許出願番号１０／７２９，５８１（これらの各々はその全体が参照として本明細書に援用される）に記載されるような２’修飾アプタマーを生成するために実行され得る。
【００７０】
アプタマーが治療剤としての使用のために適切であるために、インビボで安全かつ安定に合成することが高価でないことが好ましい。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、典型的には、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感受性のために、インビボでは安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は、２’位において修飾基の導入によって非常に増大し得る。フルオロ基およびアミノ基は、アプタマーが引き続いて選択されるオリゴヌクレオチドライブラリーに首尾よく組み込まれてきた。しかし、これらの修飾は、得られるアプタマーの合成のコストを非常に増大し、かつ安全性の心配を持ち込み得る。なぜなら、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの分解、およびＤＮＡ合成のための基質としてのヌクレオチドの引き続く使用によって、宿主ＤＮＡによってリサイクルされ得る可能性があるからである。
【００７１】
２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチドを含むアプタマーは、これらの欠点の多くを克服する。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であり、かつ合成することが高価ではない。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは生物系に遍在しているが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下では基質として２’−Ｏ−メチルＮＴＰを受容せず、従って、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの宿主ＤＮＡへのリサイクルに対する安全性の心配は存在しない。
【００７２】
本発明はまた、非修飾オリゴヌクレオチドよりも安定なオリゴヌクレオチドを作製する修飾ヌクレオチド（例えば、２’位に修飾を有するヌクレオチド）を含む安定化されたオリゴヌクレオチド（例えば、アプタマーを含む）を製造するための材料および方法を提供する。本発明の材料および方法によって製造された安定化オリゴヌクレオチドはまた、酵素的分解および化学的分解ならびに熱分解および物理的分解に対してより安定である。例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であり、かつ合成することが高価ではない。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは生物系に遍在しているが、天然のポリメラーゼは生理学的条件下では基質として２’−Ｏ−メチルＮＴＰを受容せず、従って、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの宿主ＤＮＡへのリサイクルに対する安全性の心配は存在しない。
【００７３】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰのヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、および２’−ＯＭｅの修飾の組み合わせを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰのヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２、および２’−メトキシエチルの修飾の組み合わせを提供する。１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰのヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、および２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２、および２’−メトキシエチルの修飾の５６通りの組み合わせを提供する。
【００７４】
本発明の２’修飾アプタマーは、フラノース２’位においてかさばる置換基を有する修飾ヌクレオチドの取り込みの割合が野生型ポリメラーゼよりも高い修飾ポリメラーゼ（例えば、修飾Ｔ７ポリメラーゼなど）を使用して作製される。例えば、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位においてヒスチジンからのアラニンまたは他の小さなアミノ酸残基を有する二重Ｔ７ポリメラーゼ変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）は、かさばる２’置換基の取り込みについて記載され、かつ修飾ピリミジンＮＴＰを取り込むために使用された。７８４残基においてヒスチジンからのアラニン残基を有する単一変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載された（Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８）。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体とＨ７８４Ａ単一変異体の両方のＴ７ポリメラーゼにおいて、より小さなアミノ酸残基への変化は、よりかさばるヌクレオチド基質、例えば、２’−Ｏメチル置換ヌクレオチドの取り込みを可能にする。
【００７５】
２’−修飾アプタマーの製造における別の重要な要因は、転写混合物における二価のマグネシウムとマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの異なる濃度の組み合わせは、２’−Ｏ−メチル化転写物の収率に影響を与えることが見い出されており、その塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンと錯体形成するＮＴＰの転写反応混合物の濃度に依存する。
【００７６】
ＧＭＰまたはグアノシンを用いて転写を開始することもまた重要である。この効果は、開始ヌクレオチドについてのポリメラーゼの特異性から生じる。結果として、この様式において生成されるいずれかの転写物の５’−末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇである可能性が高い。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、さらにより好ましくは１ｍＭである。転写反応物にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を含めることは、修飾ヌクレオチドの取り込みを最大化するために有用であることもまた見い出されている。
【００７７】
文献において２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例が存在し、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６８３−６９５，１９９５を参照されたい。これらは、Ｃ残基およびＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、Ａ残基およびＧ残基が２’−ＯＨ置換された修飾転写物のライブラリーのインビトロ選択によって生成された。一旦機能的配列が同定されると、各Ａ残基およびＧ残基は２’−ＯＭｅ置換に対する耐容性について試験され、２’−ＯＭｅ残基としての２’−ＯＭｅ置換に耐容性を示したすべてのＡ残基およびＧ残基を有するアプタマーが再合成された。この２段階様式において生成されたアプタマーの大部分のＡ残基およびＧ残基は２’−Ｍｅ残基と用いる置換に耐容性を示したが、平均して約２０％が耐容性を示さなかった。結果として、この方法を使用して生成されたアプタマーは２〜４個の２’−ＯＨ残基を含む傾向があり、安定性および合成のコストは結果として損なわれた。アプタマーがＳＥＬＥＸＴＭ（および／またはそのバリエーションおよび改善のいずれか、以下に記載されるものを含む）によってそこから選択されかつ富化されたオリゴヌクレオチドライブラリーにおいて使用された安定化されたオリゴヌクレオチドを生成する転写反応に修飾ヌクレオチドを取り込むことによって、本発明の方法は、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化させる必要性を除外する（例えば、修飾ヌクレオチドを用いてアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することによって）。
【００７８】
さらに、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、選択プロセスが完了した後でさらに安定化され得る（短縮化、欠失、および修飾を含む「ＳＥＬＥＸＴＭ後修飾」を参照のこと）。
【００７９】
ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するために、修飾ヌクレオチドが使用され得、かつ１つ以上の置換ヌクレオチド結合、糖の変化、塩基の変化、またはそれらの組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）によって置換されるオリゴヌクレオチドが提供され、ここで各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキルである。連結基は−Ｏ−、−Ｎ−、または−Ｓ−連結を通して隣接するヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチドにおいてすべての連結が同一であることが必要なわけではない。
【００８０】
本発明のアプタマーへの修飾ヌクレオチドの取り込みは、選択プロセスの前に（プレ−選択プロセスで）達成される（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾）。必要に応じて、修飾ヌクレオチドがＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって取り込まれている本発明のアプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾（すなわち、ＳＥＬＥＸＴＭ前修飾の後でのＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾）によってされに修飾され得る。ＳＥＬＥＸＴＭ前修飾はＳＥＬＥＸＴＭ標識に対する特異性、およびまた改善されたインビボ安定性を有する修飾核酸リガンドを生じる。ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって取り込まれたヌクレオチドを有する以前に同定されたリガンドの修飾）は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって取り込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に有害な影響を与えることなく、インビボ安定性の改善を生じ得る。
【００８１】
（修飾ポリメラーゼ）
６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化している単一変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、基質として２’デオキシ、２’アミノ、および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を容易に利用し、種々の用途のための修飾ＲＮＡを合成するために広範に使用されてきた。しかし、この変異体Ｔ７ポリメラーゼは、報告されたところによれば、よりかさばる２’置換基、例えば２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基または２’−アジド（２’−Ｎ３）置換基を有するＮＴＰを利用（例えば、取り込み）することは容易にはできない。かさばる２’置換基の取り込みのために、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位においてヒスチジンからのアラニンまたは他の小さなアミノ酸残基を有する二重Ｔ７ポリメラーゼ変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が記載され、かつ修飾ピリミジンＮＴＰを取り込むために使用された。７８４残基においてヒスチジンからのアラニン残基を有する単一変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載された（Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８）。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体とＨ７８４Ａ単一変異体の両方のＴ７ポリメラーゼにおいて、より小さなアミノ酸残基への変化は、よりかさばるヌクレオチド基質、例えば、２’−Ｏメチル置換ヌクレオチドの取り込みを可能にする。
【００８２】
本発明は、フラノース２’位においてかさばる置換基を有する修飾ヌクレオチドの取り込みの割合が野生型ポリメラーゼよりも高いこれらのおよび他の修飾Ｔ７ポリメラーゼを使用するための方法および条件を提供する。一般的に、本明細書に開示される条件下では、Ｙ６９３Ｆ単一変異体はＧＴＰ以外のすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用され得、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体はＧＴＰを含むすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用され得る。本明細書に開示される条件下で使用される場合、Ｈ７８４Ａ単一変異体は同様の特性を有することが予測される。
【００８３】
本発明は、Ｔ７ポリメラーゼが修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに酵素的に取り込むための方法および条件を提供する。このようなオリゴヌクレオチドの全体の修飾ヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドのサブセットが合成され得る。修飾は同じであるかまたは異なり得る。すべてのヌクレオチドが修飾され得るか、およびすべてが同じ修飾を含み得る。すべてのヌクレオチドが修飾され得るが、異なる修飾を含み得、例えば、同じ塩基を含むすべてのヌクレオチドが同じ型の修飾を有し得るのに対して、他の塩基を含むヌクレオチドは異なる型の修飾を有し得る。すべてのプリンヌクレオチドは１つの型の修飾を有し得る（または修飾されない）のに対して、すべてのピリミジンヌクレオチドは、別の異なる型の修飾を有する（または修飾されない）。このようにして、転写物または転写物のライブラリーは、修飾の任意の組み合わせ、例えば、リボヌクレオチド、（２’−ＯＨ、「ｒＮ」）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ、および２’−ＯＭｅのヌクレオチドを使用して生成される。２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵならびに２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含む混合物は「ｒＲｍＹ」と呼ばれ；デオキシ  ＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＵおよびＣを含む混合物は「ｄＲｍＹ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、およびＵ、ならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む混合物は「ｒＧｍＨ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびに２’−Ｆ  Ｇを代替的に含む混合物は「トグル（ｔｏｇｇｌｅ）」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、Ｃ、およびＧ（ここでＧの１０％までがデオキシである）を含む混合物は「ｒ／ｍＧｍＨ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびに２’−Ｆ  Ｇを含む混合物は「ｆＧｍＨ」と呼ばれ；そしてデオキシＡ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｇ、およびＵを含む混合物は「ｄＡｍＢ」と呼ばれる。
【００８４】
好ましい実施形態は、２’−ＯＨヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、および２’−ＯＭｅヌクレオチドのいずれかの組み合わせを含む。より好ましい実施形態は、ピリミジンが２’−ＯＭｅ（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＮ、またはｄＧｍＨ）である２’−デオキシヌクレオチドおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドのいずれかの組み合わせを含む。
【００８５】
（２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドＳＥＬＥＸＴＭ）
本発明は、その条件下でポリメラーゼが２’−修飾ＮＴＰを受容する条件で、２’−修飾（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のライブラリーを生成するための方法を提供する。好ましくは、ポリメラーゼはＹ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体またはＹ６９３Ｆ単一変異体である。他のポリメラーゼ、特にかさばる２’−置換基についての高い耐容性を示すものもまた、本発明において使用され得る。このようなポリメラーゼは、本明細書に開示される転写条件下で修飾ヌクレオチドを取り込むそれらの能力をアッセイすることによってこの可能性についてスクリーニングされ得る。多数の要因が、本明細書に開示される方法において有用である転写条件について重要であると決定されてきた。例えば、得られる転写物の少なくとも最初の約６残基がプリンであるようにリーダー配列がＤＮＡ転写テンプレートの５’末端における固定化配列の５’末端に取り込まれる場合に、修飾転写物の収率の大きな増加が観察される。
【００８６】
修飾ヌクレオチドを取り込む転写物を得る際の別の重要な要因は、２’−ＯＨ  ＧＴＰの存在または濃度である。転写は、２つのフェーズに分けられ得る：第１のフェーズは開始であり、その間、ＮＴＰはＧＴＰの３’−ヒドロキシル末端（または別の置換グアノシン）に加えられてジヌクレオチドを産生し、これは次いで約１０〜１２ヌクレオチド伸長され、第２のフェーズは伸長であり、この間、転写は最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加を超えて進行する。過剰の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰを含む転写混合物に加えられた少量の２’−ＯＨ  ＧＴＰは、ポリメラーゼが２’−ＯＨ  ＧＴＰを使用する転写を開始することを可能にするのに十分であることが見い出されたが、一旦転写が伸長フェーズに入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ  ＧＴＰの間の区別の減少、および２’−ＯＨ  ＧＴＰを超えた過剰の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰは、主に２’−ＯＭｅ  ＧＴＰの取り込みを可能にする。
【００８７】
転写物２’−Ｍｅの取り込みにおける別の重要な要因は、転写混合物における二価のマグネシウムとマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの異なる濃度の組み合わせは、２’−Ｏ−メチル化転写物の収率に影響を与えることが見い出されており、その塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンと錯体形成するＮＴＰの転写反応混合物の濃度に依存する。最大限に２’置換されたＯ−メチル化転写物（すなわち、Ａヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、およびＵヌクレオチドのすべて、ならびに約９０％のＧヌクレオチド）の最大の収率を得るために、約５ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭ  塩化マンガンの濃度が、各ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合に好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合に、約６．５ｍＭ  塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭ  塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合に、約９．６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび２．９ｍＭ  塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合においても、これらの濃度の２倍までからの逸脱は、修飾転写物の有意な量をなお与える。
【００８８】
ＧＭＰまたはグアノシンを用いて転写を開始することもまた重要である。この効果は、開始ヌクレオチドについてのポリメラーゼの特異性から生じる。結果として、この様式において生成されるいずれかの転写物の５’−末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇである可能性が高い。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、さらにより好ましくは１ｍＭである。転写反応物にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ８０００を含めることは、修飾ヌクレオチドの取り込みを最大化するために有用であることもまた見い出されている。
【００８９】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）、およびＧＴＰ（〜９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の最大の取り込みのために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（６．５ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は１．０ｍＭである）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（２．０ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は１．０ｍＭである）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＴＰ  ３０μＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  ５００μＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。本明細書中で使用される場合、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、または本明細書に特定される他の任意の変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの１単位は、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で１ｎモルの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを転写物に取り込むために必要とされる酵素の量として定義される。本明細書中で使用される場合、無機ピロホスファターゼの１単位は、ｐＨ  ７．２で２５℃において、１分間あたり１．０モルの無機ピロリン酸を遊離させる酵素の量として定義される。
【００９０】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（９．６ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（２．９ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９１】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（９．６ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（２．９ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９２】
転写物へのデオキシＡＴＰおよびＧＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミンまたはスペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９３】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰおよび２’−Ｆ  ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９４】
転写物へのデオキシＡＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９５】
上記の各々について、（１）約３０℃から約４５℃までの温度でかつ少なくとも２時間の時間で好ましく実行され、（２）５０〜３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ転写テンプレートが使用される（２００ｎＭテンプレートが多様性を増加させるためにラウンド１のために使用され（３００ｎＭテンプレートはｄＲｍＹ転写のために使用され）、引き続くラウンドのためには、約５０μＭ、最適化ＰＣＲ反応の１／１０希釈が、本明細書に記載される条件を使用して使用された）。好ましいＤＮＡ転写テンプレートは以下に記載される（この場合、ＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６はすべての２’−ＯＭｅ条件下で転写され、ＡＲＣ２５５はｒＲｍＹ条件下で転写される）。
【００９６】
【化１】
2007525177.tif 000002
本発明のｒＮ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジン、および２’−ＯＨウリジンの実質的にすべてを含む。ｒＮ転写の好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のより好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチド１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
【００９７】
本発明のｒＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−ＯＨシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−ウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏメチルシチジン、および２’−Ｏメチルウリジンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチド１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００９８】
本発明のｄＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシプリン三リン酸および２’−Ｏ−メチルピリミジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−デオキシプリンおよび２’−Ｏ−メチルピリミジンを含む。好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのプリンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシプリンであり、かつすべてのピリミジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのプリンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシプリンであり、かつすべてのピリミジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのプリンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシプリンであり、かつすべてのピリミジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。
【００９９】
本発明のｒＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、および２’−Ｏ−メチルアデノシンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。
【０１００】
本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、およびデオキシグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を使用して産生された、得られた修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンの実質的にすべてを含み、ここでグアノシンヌクレオチドの集団は最大で約１０％のデオキシグアノシンを有する。好ましい実施形態において、得られる本発明のｒ／ｍＧｍＨ修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１０％を超えないグアノシンヌクレオチドがデオキシグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１０％を超えないグアノシンヌクレオチドがデオキシグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１０％を超えないグアノシンヌクレオチドがデオキシグアノシンである配列を含む。
【０１０１】
本発明のｆＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｆグアノシンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
【０１０２】
本発明のｄＡｍＢ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１０３】
各々の場合において、次いで、転写産物は、アプタマーを同定するため、および／または所定の標的に対する結合特異性を有する配列の保存性モチーフを決定するためにＳＥＬＥＸＴＭプロセスにおいてライブラリーとして使用され得る。得られる配列はすでに安定化され、安定化されたアプタマー配列に到達するためにプロセスからこの工程を除外し、結果としてより高度に安定化されたアプタマーを与える。２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの別の利点は、得られる配列は、配列中に必要とされる２’−ＯＨヌクレオチドが少ない可能性、おそらく、それがない可能性があることである。
【０１０４】
以下に記載されるように、２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドを完全に取り込んでいる低いがなお有用である転写物の収率は、上記に記載される最適化条件以外の条件下で得られ得る。例えば、上記の転写条件に対するバリエーションは以下を含む。
【０１０５】
ＨＥＰＥＳ緩衝液濃度は０から１Ｍの範囲であり得る。本発明はまた、５から１０の間のｐＫａ値を有する他の緩衝剤、例えば、非限定的に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの使用を意図する。
【０１０６】
ＤＴＴ濃度は０から４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の還元剤、例えば、非限定的に、メルカプトエタノールの使用を提供する。
【０１０７】
スペルミジンおよび／またはスペルミンの濃度は０から２０ｍＭの範囲であり得る。
【０１０８】
ＰＥＧ−８０００濃度は０から５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の親水性ポリマー、例えば、非限定的に、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールの使用を提供する。
【０１０９】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０から０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の非イオン性界面活性剤、例えば、非限定的に、他のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ界面活性剤を含む他の界面活性剤の使用を提供する。
【０１１０】
ＭｇＣｌ２濃度は０．５ｍＭから５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ２濃度は０．１５ｍＭから１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ２とＭｎＣｌ２の両方が記載された範囲内で存在しなければならず、好ましい実施形態においては、約１０から約２のＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２比であり、好ましくはこの比率は約３〜５、より好ましくは、この比率は約３〜約４である。
【０１１１】
２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ濃度（各ＮＴＰ）は５μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１１２】
２’−ＯＭｅ  ＧＴＰ濃度は０μＭ〜３００μＭの範囲であり得る。
【０１１３】
２’−ＯＭｅ  ＧＭＰ濃度は０μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１１４】
ｐＨ範囲はｐＨ６からｐＨ９までの範囲であり得る。本発明の方法は、修飾ヌクレオチドを取り込む大部分のポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で実施され得る。さらに、本発明の方法は、転写反応条件におけるキレート剤、例えば、非限定的に、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＴＴの任意的な使用を提供する。
【０１１５】
以下の実施例に記載されるような生物学的アッセイによって実証された場合の最大の親和性および特異的結合を有する選択されたアプタマーは、標的が病原に関与する状態を処置するための適切な治療剤である。
【０１１６】
（アプタマー治療剤）
アプタマーは前臨床的および臨床的な開発における現在のところ将来性のあるクラスの治療剤を表す。生物製剤、例えば、ペプチドまたはモノクローナル抗体と同様に、アプタマーは分子標的に特異的結合可能であり、結合を通して、標的の機能を阻害する。典型的なアプタマーは１０〜１４ｋＤａのサイズ（すなわち、３０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的とナノモル以下の親和性で結合し、密接に関連する標的の間を区別する（例えば、典型的には、同じ遺伝子ファミリーからの他のタンパク質に結合しない）（Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：２５−３１；Ｊｅｎｉｓｏｎら（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８（４）：２６５−７９；Ｂｅｌｌら（１９９９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３５（９）；５３３−４２；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５；Ｄａｎｉｅｌｓら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０５（２）：２１４−２６；Ｃｈｅｎら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１６）：９２２６−３１；Ｋｈａｔｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２３）：１２６９２−８；Ｖａｉｓｈら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（２９）：８８４−５１）。ランダム配列オリゴヌクレオチドのライブラリーから完全なインビトロ選択プロセス（ＳＥＬＥＸＴＭ）によって作製されるので、アプタマーは、治療的関心対象の多数のタンパク質（増殖因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含む）に対して生成されてきた（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６（６２８７）：８１８−２２；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（４９６８）：５０５−５１０）。
【０１１７】
アプタマーは、治療剤としての使用のために多数の魅力的な特徴を有する。高い標的親和性および特異性に加えて、アプタマーは、標準的アッセイにおいて毒性または免疫原性をほとんど示さないか、または全く示さない（Ｗｌｏｔｚｋａら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（１３）：８８９８−９０２）。いくつかの治療用アプタマーが前臨床的開発の種々の段階（例えば、薬物動態学的分析、細胞および動物疾患モデルにおける生物学的効力の特徴付け、および予備的な安全性薬理学評価）を通して最適化および進歩されてきた（ＲｅｙｄｅｒｍａｎおよびＳｔａｖｃｈａｎｓｋｙ（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５（６）：９０４−１０；Ｔｕｃｋｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５）。
【０１１８】
すべてのオリゴヌクレオチドに基づく治療剤（アプタマーを含む）についての薬物動態学的特性は、所望の薬学的適用に合致するように変更されることが重要である。細胞外標的を指向するアプタマーは細胞内送達に付随する困難さに苦しむことはないが（アンチセンスおよびＲＮＡｉに基づく治療剤の場合）、このようなアプタマーは、標的の器官および組織に分配可能でなくてはならず、かつ所望の投薬計画と一致して一定の時間の間、（修飾なしで）身体に残存しなくてはならない。核酸ベースの治療剤についての初期の研究は、非修飾オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ消化によって急速に分解されるが、糖の２’位の保護的修飾および逆方向末端キャップ構造（例えば［３’−３’ｄＴ］）の使用は、インビトロおよびインビボで核酸の安定性を劇的に改善することを示した（Ｇｒｅｎｎら（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（１０）：６８３−９５；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４（３６）：１１３６３−７２；Ｒｕｃｋｍａｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３２）：２０５５６−６７；Ｕｈｌｍａｎｎら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３：２６８ー８６）。あるＳＥＬＥＸ選択において（すなわち、ＳＥＬＥＸ実験または選択）、アプタマーがそこから選択される核酸の開始プールは、ヌクレアーゼ攻撃に対するアプタマーの耐性を増強するために、典型的には化学修飾、によって、例えば、２’ーフルオロピリミジン（２’−Ｆ）置換ヌクレオチドの取り込みによってあらかじめ安定化される。２’−Ｏ−メチルプリン（２’−Ｏ−Ｍｅプリン）置換ヌクレオチドを取り込んでいるアプタマーもまた、ＳＥＬＥＸ後修飾工程を通して、またはより最近、上記のように、ＳＥＬＥＸプロセスそれ自体の内在性成分として２’−ＯＭｅ含有ランダム配列ライブラリーの合成を可能にすることによって開発された。
【０１１９】
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療剤は、腎臓濾過を介する除去に供される。このようにして、静脈内投与されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、ブロックされることが可能でない限り、＜１０分のインビボ半減期を示す。これは、血流からの組織への迅速な分布を容易にすることによって、または糸球体についての有効なサイズカットオフ上のオリゴヌクレオチドの見かけの分子量を増加させることによってのいずれかで達成され得る。以下に記載される、ＰＥＧポリマーへの低分子治療剤の結合体化（ＰＥＧ化）は、循環中でのアプタマーの存在時間を劇的に延長し得、それによっ、投薬頻度を減少し、かつ血管標的に対する有効性を増強する。動物における以前の研究は、ＰＥＧ結合体化アプタマーの血漿薬物動態学的特性を試験した（ＲｅｙｄｅｒｍａｎおよびＳｔａｖｃｈａｎｓｋｙ（１９８８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５（６）：９０４−１０；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５）。アプタマー治療剤（修飾部分に結合体化されたかまたは修飾ヌクレオチドを含むアプタマー治療剤を含む）の血管外遊出を測定すること、特に、疾患を有する組織（例えば、炎症の部位または腫瘍の内部）に接近するアプタマーまたはそれらの修飾型の潜在能力を測定することは、アプタマー介入のための治療的機会の範囲をより良好に限定する。
【０１２０】
本発明のアプタマー組成物の薬物動態学的プロフィールは「可変性」を有する（すなわち、アプタマー薬物動態学を調節する能力）。アプタマー薬物動態学の可変性は、例えば、アプタマーへの修飾部分（例えば、ＰＥＧポリマー）の結合体化を通して、および／または核酸の化学的組成物を変化させるための修飾ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロおよび／または２’−ＯＭｅ置換基）の取り込みを通して達成される。
【０１２１】
さらに、アプタマー薬物動態学の可変性は、被験体におけるアプタマー治療剤の生物分布を改変するために使用される。例えば、ある治療的適用において、特定の型の組織または特定の器官（または器官のセット）を標的とするための試みにおいてアプタマー治療剤の生物分布を変化させることが望ましくあり得る。これらの適用において、アプタマー治療剤は特定の組織または器官に優先的に蓄積する。他の治療的適用において、所定の疾患、細胞損傷、または他の異常な病理と関連する細胞マーカーまたは徴候を示す標的組織を標的とすることが望ましくあり得、その結果、アプタマー治療剤は罹患した組織に優先的に蓄積する。例えば、２００４年３月５日に出願され、かつ「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」という表題の同時係属仮出願ＵＳＳＮ  ６０／５５０  ７９０に記載されているように、アプタマー治療剤のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを用いるＰＥＧ化）は、標的の炎症性組織を標的とするために使用され、その結果、ＰＥＧ化アプタマー治療剤は炎症性組織に優先的に蓄積する。
【０１２２】
アプタマー治療剤の薬物動態学および生物分布プロフィールは、種々のパラメーターをモニターすることによって決定される。このようなパラメーターには、例えば、半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布の体積（ＶＳＳ）、濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ）、最大観察血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）、およびアプタマー組成物の平均存在時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＵＣ」とは、アプタマー治療剤の血漿濃度対アプタマー投与後の時間のプロットの下の面積をいう。ＡＵＧ値は、所定のアプタマー治療剤の、生物学的利用能（すなわち、アプタマー投与後の循環中での投与されたアプタマー治療剤のパーセンテージ）および／または全体のクリアランス（Ｃｌ）（すなわち、アプタマー治療剤が循環から除去される速度）を見積もるために使用される。分布の体積は、アプタマー治療剤の血漿濃度を、身体に存在するアプタマーの量と関連付ける。Ｖｓｓが大きいほど、より多くのアプタマーが血漿の外部に見い出される（すなわち、より多くの血管外遊出）。
【０１２３】
（腫瘍治療剤としてのＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ−ＶＥＧＦ特異的結合アプタマー）
異なるＰＤＧＦアイソフォームに特異的に結合しかつこれを阻害することが可能であるアプタマーは本明細書に記載される。これらのアプタマーには、ＰＤＧＦにのみ結合するアプタマー、ＰＤＧＦとＶＥＧＦの両方に結合するアプタマーが含まれ、そこに組み込まれるＣｐＧモチーフを有する上記のアプタマーのいずれもが、低毒性、安全、かつ大部分のＰＤＧＦ媒介腫瘍（非限定的に、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、および他の軟部組織肉腫を含む）の進行を阻害することの有効な様式を提供する。
【０１２４】
腫瘍治療剤としての使用のためのＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ−ＶＥＧＦ特異的結合アプタマーの例には以下の配列が含まれる。
【０１２５】
（ＰＤＧＦ結合アプタマー：）
【０１２６】
【化２】
2007525177.tif 000003
（スクランブル制御アプタマー：）
【０１２７】
【化３】
2007525177.tif 000004
ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦに結合する他のアプタマーは、以下、例えば、表２および実施例１２に記載される。
【０１２８】
低分子レセプターアンタゴニストを用いるＰＤＧＦシグナル伝達の阻害は、間質液圧を減少し、かつ固形腫瘍への化学療法剤の取り込みを増加することが実証されてきた。Ｐｉｅｔｒａｓらは、ＰＤＧＦ−ＢがＩＦＰに関与し、かつＰＤＧＦ−Ｂ機能をブロックすることは腫瘍への化学療法剤の取り込みの増加をもたらし得るという仮説を確証した（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ第３巻、４３９−４４３頁）。既知のＰＤＧＦパラクリンシグナル伝達特性を有するＫＡＴ−４甲状腺癌モデルを使用して、Ｐｉｅｔｒａｓら、ＫＡＴ−４腫瘍が間質においてＰＤＧＦ  β−レセプターを発現すること、およびＰＤＧＦ−ＢがＫＡＴ−４細胞をインビトロで結合することを実証した。次に、Ｐｉｅｔｒａｓらは、ＫＡＴ−４腫瘍におけるＰＤＧＦ−Ｂシグナル伝達をブロックするために薬物ＳＴＩ５７１（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））を阻害するチロシンキナーゼを使用し、かつこの処理がインビボで腫瘍ＩＦＰを有意に減少し、これがタキソールの取り込みの増加をもたらすことを示した。しかし、ＳＴＩ５７１は、チロシンキナーゼＫｉｔ、Ａｂｌ、およびＡｒｇと同様に、ＰＤＧＦαとβの両方を標的とし、ＳＴＩ５７１の効果がＰＤＧＦ−Ｂのブロック単独に起因したのか否かを知ることは不可能であった。この不明確さは、同様の実験においてＰＤＧＦ−Ｂをブロックするために高度に特異的なアプタマーを使用することによって解決された。このアプタマーは、ＰＤＧＦ−Ｂについては１００ｐＭの親和性を有し、ＰＤＧＦ−Ａ配列については評価できるほどの親和性を有しなかった。ＳＴＩ５７１と同様に、ＰＥＧ−結合体化ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーを用いるＫＡＴ−４異種移植片の処理は、ＩＦＰを低下させ、腫瘍のタキソールの取り込みを劇的に増加させた。最も重要なことに、アプタマー処理は、腫瘍増殖を阻害するタキソールの能力を強力に増強した。さらに、現在上市されている癌治療剤である、ＰＤＧＦレセプターアンタゴニストＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、腫瘍ＩＦＰを減少させる際に、および細胞毒（例えば、タキソール）と組み合わせて使用されるときに腫瘍の細胞毒の取り込みを増加させる際に、有効であることが示されてきた。従って、本発明の方法および物質は、ＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性ならびに腫瘍発生におけるその病因ならびに化学療法剤の取り込みおよび効力を増強することによって増殖を阻害するために使用される。
【０１２９】
換言すれば、本発明のＰＤＧＦ特異的アプタマーを細胞傷害剤と組み合わせる、すなわち、ＰＤＧＦ特異的アプタマーを他の既知の細胞毒と組み合わせる本発明の組み合わせ療法は、腫瘍血管におけるＩＦＰを選択的に低下させることによって、腫瘍の部位に薬物を特異的に送達する効果的な方法を提供し、これは次には、腫瘍血管構造を通して腫瘍への細胞毒の取り込みの増加を可能にする。図４は、本発明の方法による、ＰＤＧＦアンタゴニストあるなしでの腫瘍血管構造を横切る細胞毒の輸送の模式図である（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、第３巻、４３９−４４３頁）。
【０１３０】
本発明のＰＤＧＦアプタマーは、腫瘍ＩＦＰを低下させるための種々の既知の細胞毒性または細胞増殖抑制性（集合的に「細胞毒性」）剤と組み合わせて使用され得、それによって、すべての固形腫瘍への細胞傷害剤の送達および腫瘍の取り込みを増加させる。適切な細胞毒性または細胞増殖抑制剤には、チューブリン安定化剤／不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、およびＤＮＡアルキル化剤または他のＤＮＡ修飾剤が含まれ、それらには以下が含まれるがこれらに限定されない：パクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標））、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、エポチロン、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−Ｕ、カリケアマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ＡｒａＣ（シタラビン）、ビンブラスチン、ダウノルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イフロサミド、ファーマルビシン、エピルビシン、ビンフルニン、オブリメルセンナトリウム、パーメトケセド、キナーゼ阻害剤（ＥＧＦレセプターキナーゼ、ＶＥＧＦレセプターキナーゼ、オーロラキナーゼを単独でまたは任意のその組み合わせで含む）。本発明のＰＤＧＦアプタマーは、種々の既知の血管標的化薬剤と組み合わせて使用され得、ここで、「血管標的化剤」とは、腫瘍への血流およびリンパ流を支持する既存の血管構造および新生血管構造を修飾する低分子治療剤（例えば、イリノテカン）、タンパク質治療剤（例えば、ベビシズマブ）、および／またはオリゴヌクレオチド治療剤（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子）を意味する。本発明のＰＤＧＦアプタマーは、結合または標的化部分、および細胞毒性部分を含む結合体治療剤と組み合わせて使用され得、ここで、結合または標的化部分は、アプタマー、抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲムツズマブ、ベビシズマブ、およびトシツモマブを含むがこれらに限定されない）、血管標的化剤、または葉酸化合物であるがこれらに限定されず、ここで、細胞傷害剤部分は、チューブリン安定化剤／不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、およびＤＮＡアルキル化剤、他のＤＮＡ修飾剤、または血管破壊剤（例えば、フラボノイド）の細胞傷害剤のクラスに、単独でまたはその任意の組み合わせで属する。本発明の物質および方法は、種々の癌（結腸直腸、膵臓、乳房、肺、前立腺、および卵巣の癌を含むがこれらに限定されない）を生じる固形腫瘍形成を阻害するために既知の化学療法剤を投与するより有効な方法を提供する。
【０１３１】
さらに、本発明のＰＤＧＦアプタマー組成物は、周皮細胞を標的とすることによって腫瘍血管構造の形成を阻害するために抗血管形成剤として使用され得る。代替的には、ＰＤＧＦアプタマー組成物は、ＰＤＧＦアプタマー治療剤またはＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト治療剤いずれか単独よりも、腫瘍血管形成を阻害するより有効な方法を提供するために、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦに特異的なアプタマーと組み合わせて使用され得る。本発明のＰＤＧＦ−Ｂ−およびＶＥＧＦ−標的化剤の利点は、本発明の治療組成物がいかなる標的を外れたチロシンキナーゼ活性も示すことがないらしいことである。なぜなら、これらは、それらの標的リガンドに非常に特異的であり、かつそれらの生物学的機能を誘発するために細胞に侵入するように設計されていないからである。対照的に、現在上市されている低分子キナーゼ阻害剤治療剤、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、高い標的を外れた活性を示す。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、チロシンキナーゼＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｃ−ｋｉｔ、およびＡｒｇに加えて、αとβの両方のチロシンキナーゼレセプターを標的とする。低分子キナーゼ阻害剤、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、固形腫瘍の処置において使用される場合、それらの最大耐容性用量で、またはその近傍で投与される。ＧＥＥＶＥＣ（登録商標）およびチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の毒性は、メカニズム関連の副作用とメカニズムに関連しない（標的を外れた）副作用の両方によって制限される可能性がある。従って、標的を外れた活性は、一般的に、低分子量インヒビターの開発に対する主要な障害である。ＡＲＣ１２７（５’−［４０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）およびＡＲＣ３０８（５’−［３０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）を用いるインビボ実験に基づくと、用量制限副作用は明らかではない。さらなる利点は、本発明のアプタマー治療剤組成物は、静脈内、皮下、または腹腔内の経路を介して投与され得、これは投与の容易さを意味する。モノクローナル抗体癌治療と比較して、アプタマーは非免疫原性であり、従って、薬物に対する反応または薬物に対する耐性は問題ではない。
【０１３２】
（ＰＤＧＦおよびＰＤＧＦアイソフォームに対するアプタマー）
本発明の物質は、一連の３１〜３５ヌクレオチド長の核酸アプタマー（配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号３８、配列番号５０、配列番号５４〜配列番号９０、および配列番号９４〜配列番号９９）を含み、これはインビトロでＰＤＧＦ−Ｂタンパク質に特異的に結合し、かつインビボおよび細胞に基づくアッセイにおいてＰＤＧＦ−ＢＢの活性を機能的にブロックする。本発明の抗ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー配列は、７つの個々の２’Ｆ含有残基を含む親の分子ＡＲＣ１２６（５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）に由来する。２’Ｆ含有残基はＡＲＣ１２６に取り込まれて、血清エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼによるその分解をブロックすることによって、治療用アプタマーのインビトロ血清およびインビボの安定性を増大させた。ＡＲＣ１２６抗ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーにおける潜在的に毒性の２’Ｆ含有ヌクレオチド残基を置換する試みにおいて、新たな一連の完全に２’Ｆフリーのアプタマーが同定された。本発明のこの新規なアプタマーは、インビトロ結合活性および抗増殖性活性を保持し、かつ天然に存在する２’デオキシまたは２’ＯＭｅ置換ヌクレオチドを含む。本発明のこれらの新規なアプタマーはまた、４８時間までの間に検出される分解を伴うことなく、インビトロ安定性アッセイにおいてヌクレアーゼ分解に対する耐性を通して決定されるように、実質的な血清安定性を保持する。
【０１３３】
本発明のアプタマー治療剤は、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦアイソフォーム、およびＰＤＧＦレセプターに対して高い親和性および特異性を有する一方、このアプタマー治療剤が患者または被験体の身体において分解するときに、天然に存在しないヌクレオチド置換基からの有害な副作用を減少する。本発明のアプタマー治療剤を含む治療組成物はフッ素化ヌクレオチドを含まないか、またはその量が減少している。
【０１３４】
（抗腫瘍剤の効力を増加させるための物質および方法）
本発明の物質および方法はさらに、本発明のアプタマー、すなわち、ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ３０８を用いる二重治療によって抗腫瘍剤の効力を増大させるための方法をさらに含む。さらに、本発明の方法は、結腸直腸ＬＳ１７４ｔ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにイリノテカンと同時投与されたときに、ＰＤＧＦ−Ｂ特異的アプタマー、ＡＲＣ１２７（すなわち、ＡＲＣ１２６＋４０Ｋ  ＰＥＧ）およびＡＲＣ３０８（すなわち、ＡＲＣ１２６＋３０Ｋ  ＰＥＧ）が活性な抗腫瘍剤であることを実証した。本発明の癌治療方法の使用は、ＡＲＣ１２７とＡＲＣ３０８の両方が単独で投与される場合に安全な非細胞傷害剤であるが、他の細胞傷害剤と組み合わせると、ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ３０８は新規な作用のメカニズムを通してそれらの抗腫瘍効果を強化することを示した。本発明の方法はさらに、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、または腹腔内の注射によってマウスに投与されるときに、血清由来ＡＲＣ１２７は完全な生物学的活性を保持していることを実証する。
【０１３５】
（ＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦに特異的なアプタマー−キメラ）
本発明の物質および方法は、ＰＤＧＦ−ＢとＶＥＧＦの両方を標的とする二機能性アプタマー−キメラをさらに提供する。本発明のＰＤＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦアプタマーキメラＴＫ．１３１．１２．Ａ（配列番号９）およびＴＫ．１３１．１２．Ｂ（配列番号１０）は、癌の治療のためにＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦを同時に標的とすることを可能にする。キメラ分子において使用されるＰＤＧＦ−Ｂアプタマーは、ＡＲＣ１２７アプタマー配列に由来する。キメラ分子において使用されたＶＥＧＦアプタマーは、ＡＲＣ２４５（配列番号７）アプタマー配列に由来する。本発明のアプタマー−キメラは、ＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ結合アプタマーの任意のセットから構築され得る。本発明のＰＤＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦキメラは、新生血管構造を支持するための高度な新生血管形成ならびに周皮細胞補充もまた示す、ＶＥＧＦ−依存性固形腫瘍の治療において有用である。
【０１３６】
ＲｉｐＴａｇ膵臓マウス腫瘍モデルからの最近の抗腫瘍データは、抗ＶＥＧＦ剤または抗ＰＤＧＦＲ剤のいずれかが単独で加えられるときよりも、抗ＶＥＧＦ治療および抗ＰＤＧＦＲ治療が同時に実行されるときに、腫瘍増殖のより高いブロックの付与が存在することを示唆する（Ｂｅｒｇｅｒｓら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１１：９、１２８７−１２９５頁）。抗ＰＤＧＦＲ治療がすべてのレセプター媒介シグナル伝達事象をブロックするので、その効果は非特異的であると予測され得る。本発明におけるＰＤＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦキメラは、腫瘍における正確なＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ標的化を提供する。
【０１３７】
本発明のアプタマー治療剤は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターに対する高い親和性および特異性を有する一方、アプタマー治療剤が患者または被験体の身体において分解するときに、天然に存在しないヌクレオチド置換基からの有害な副作用を減少する。本発明のアプタマー治療剤の治療用組成物は、フッ素化ヌクレオチドを含まないか、またはその量が減少している。
【０１３８】
（免疫刺激モチーフを有するアプタマー）
脊椎動物免疫系による細菌ＤＮＡの認識は、非メチル化ＣＧジヌクレオチド、特に配列の文脈（「ＣｐＧモチーフ」）の認識に基づく。このようなモチーフを認識する１つのレセプターは、Ｔｏｌｌ用レセプター９（「ＴＬＲ９」）であり、これは、個別の微生物成分を認識することによって固有の免疫応答に関与するＴｏｌｌ様レセプターのファミリー（〜１０メンバー）の１つのメンバーである。ＴＬＲ９は、配列特異的な様式で、非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）ＣｐＧ配列に結合する。ＣｐＧモチーフの認識は、先天的および最終的に獲得された免疫応答をもたらす防御メカニズムを誘発する。例えば、マウスにおけるＴＬＲ９の活性化は、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のアップレギュレーション、ならびに重要な同時刺激分子およびサイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を含む）の発現を誘導する。この活性化は、直接的と間接的の両方で、Ｂ細胞およびＴ細胞の応答を増強し、これには、ＴＨ１  サイトカインγの強固なアップレギュレーションが含まれる。集合的に、ＣｐＧ配列への応答は以下をもたらす：感染性疾患に対する防御、ワクチンに対する免疫応答の改善、喘息に対する効果的な応答、および抗体依存性細胞媒介細胞毒性の改善。従って、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染性疾患に対する防御を提供し得、免疫アジュバントまたは癌治療剤（単独療法またはｍＡｂもしくは他の治療法との組み合わせ）として機能し得、喘息およびアレルギー性応答を減少し得る。
【０１３９】
１つ以上のＣｐＧモチーフを含むアプタマーは、例えば、本明細書に記載されるＳＥＬＥＸＴＭプロセスを使用する、種々のストラテジーによって同定または生成され得る。一般的には、このストラテジーは２つのグループに分けられ得る。第１のグループにおいては、ストラテジーは、複数のＣｐＧモチーフおよび１つのＣｐＧモチーフを認識するもの以外の両方の結合部位を含むアプタマーを同定または生成することに向けられる。これらのストラテジーは以下の通りである：（ａ）ＣｐＧモチーフが、固定化領域とし、または固定化領域の一部として、各プールのメンバーに取り込まれているオリゴヌクレオチドプールを使用して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを実行する工程；（ｂ）ＳＥＬＥＸＴＭを使用して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得る工程、および次いで、ＣｐＧモチーフを５’末端および／もしくは３’末端に付加するか、またはＣｐＧモチーフを、アプタマーの領域、好ましくは必須でない領域に操作する工程；（ｃ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得る工程、ここで、プールの合成の間の種々のヌクレオチドのモル濃度比は、プールの各メンバーのランダム化領域がＣｐＧモチーフで富化されるように、１つ以上のヌクレオチド付加工程において偏っている；ならびに（ｄ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程。
【０１４０】
第２の段階において、ストラテジーは、ＣｐＧモチーフおよび／もしくはＣｐＧモチーフについてのレセプター（例えば、ＴＬＲ９または他のｔｏｌｌ様レセプター）によって結合され、かつ渇仰に際して免疫応答を刺激する他の配列を含むアプタマーを同定または生成することに向けられる。これらのストラテジーは以下の通りである：（ｉ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激するすることが知られている標的に対するアプタマーをオリゴヌクレオチドプールを使用して得る工程、ここで、ＣｐＧモチーフは、例えば、プールメンバーのランダム化された領域において、固定化領域として、または固定化領域の一部として、プールの各メンバーに取り込まれている；（ｉｉ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激するすることが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、および次いで、ＣｐＧモチーフを５’末端および／もしくは３’末端に付加するか、またはＣｐＧモチーフを、アプタマーの領域、好ましくは必須でない領域に操作する工程；（ｉｉｉ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、ここで、プールの合成の間に、種々のヌクレオチドのモル濃度比は、プールの各メンバーのランダム化領域がＣｐＧモチーフで富化されるように、１つ以上のヌクレオチド付加工程において偏っている；（ｉｖ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含むこれらのアプタマーを同定する工程；ならびに（ｖ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含まない、結合に際して免疫応答を刺激するこれらのアプタマーを同定する工程。
【０１４１】
種々の異なるＣｐＧモチーフのクラスが同定されており、各々は、異なるカスケードの事象における認識、サイトカインおよび他の分子の放出、および特定の細胞型の活性化に際して生じる。例えば、ＣｐＧ  Ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２０：７０９−７６０（参考として本明細書に援用される）を参照のこと。さらなる免疫刺激モチーフは、以下の米国特許：６，２０７，６４６；６，２３９，１１６；６，４２９，１９９；６，２１４，８０６；６，６５３，２９２；６，４２６，４３４；６，５１４，９４８および６，４９８，１４８（参考として本明細書に援用される）に開示される。これらのＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激モチーフのいずれかはアプタマーに取り込まれ得る。アプタマーの選択は、治療される疾患または障害に依存する。好ましい免疫刺激モチーフは以下の通りであり（左から右に５’〜３’を示す）、ここで「ｒ」はプリンを示し、「ｙ」はピリミジンを示し、「Ｘ」は任意のヌクレオチドを示す：ＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧ（配列番号３７）；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＣＧＴ；ｒＣＧｙ；ｒｒＣＧｙｙ、ＸＣＧＸ、ＸＸＣＧＸＸ、およびＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２ここでＸ１はＧまたはＡであり、Ｘ２はＣではなく、Ｙ１はＧではなく、かつＹ２は好ましくはＴである。
【０１４２】
ＣｐＧモチーフが、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合の際に免疫応答を刺激することが知られている標的以外の特異的標的（「非ＣｐＧ」標的）に結合するアプタマーに取り込まれているこれらの例において、ＣｐＧは、アプタマーの非必須領域に優先的に局在化される。アプタマーの非必須領域は、部位特異的変異誘発、欠失分析、および／または置換分析によって同定され得る。しかし、非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力を有意に妨害しない任意の位置が使用され得る。アプタマー配列中に組み込まれることに加えて、ＣｐＧモチーフは、５’末端と３’末端のいずれかもしくはその両方に付加され得るか、またはさもなくばアプタマーに結合され得る。非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力が有意に妨害されない限り、結合の任意の位置または手段が使用され得る。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、「免疫応答の刺激」とは、（１）特定の応答の誘導（例えば、Ｔｈ１応答の誘導）または特定の分子の産生の誘導、あるいは（２）特定の応答の阻害もしくは抑制（例えば、Ｔｈ１応答の阻害もしくは抑制）または特定の分子の阻害もしくは抑制のいずれかを意味し得る。
【０１４４】
ＣｐＧモチーフは、任意の標的に対するアプタマーに取り込まれるか、または付加され得、この標的には、ＰＤＧＦ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  ＦｃεＲ１、ＴＮＦ−α、ＰＳＭＡ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＦｃＲＩＩＢ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＢＡＦＦ、Ｂ７−Ｘ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、およびＣＤ３３が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４５】
固形腫瘍を特異的に標的とするアプタマーにＣｐＧモチーフを取り込むことによって、これらのアプタマーは、腫瘍由来物質を取り込んだ抗原提示細胞の補充を通して免疫系を活性化するため、それらの成熟および局所的リンパ節への移動を増強するため、および腫瘍特異的Ｔ細胞のプライミングを増強するために使用され得る。これはとりわけ、アプタマーが細胞毒性ペイロードを送達し、かつ細胞死を生じる場合に関連する（例えば、ＣｐＧモチーフを含むＰＳＭＡアプタマー）。このようなＣｐＧモチーフ含有アプタマーはまた、腫瘍特異的記憶応答を誘導し得る（予防的使用）。さらに、ＣｐＧ投与の際に観察される免疫応答の増加と組み合わせたＰＤＧＦ−ＢアプタマーのＩＦＰ低下効果および周皮細胞補充ブロッキング効果は、癌のための強力な治療性を表す。従って、取り込まれ、付加され、または組み込まれたＣｐＧモチーフを有するアプタマーは、抗癌化合物の新規なクラスを表し、その結果、投与されたときに、これらは、２つのメカニズム；第１に腫瘍ベッド内での腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化、第２にアプタマーファーマコフォアの意図的なメカニズムに基づく作用を通して、腫瘍の有意な大きさの減少をもたらし得る。
【０１４６】
（薬学的組成物）
本発明はまた、アプタマー分子を含む薬学的組成物を含む。ある実施形態において、この組成物は内部使用のために適切であり、かつ本発明の薬学的に活性な化合物の有効量を、単独で、または１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。この組成物は、これらが、もしあれば、非常に低い毒性を有するという点でとりわけ有用である。
【０１４７】
本発明の組成物は、疾患もしくは障害などの病理を治療もしくは予防するために、または患者におけるこのような疾患もしくは障害の徴候を緩和するために使用され得る。本発明の組成物は、アプタマーが特異的に結合する標的に関連するか、またはそれに由来する疾患または障害に罹患しているか、またはその素因を有する被験体への投与のために有用である。
【０１４８】
例えば、標的は病理と関連するタンパク質であり、例えば、その標的タンパク質がその病理を引き起こす。例えば、標的は、固形腫瘍の発症および進行においてＰＤＧＦに関連する。
【０１４９】
本発明の組成物は、病理を有する患者または被験体を治療するための方法において使用され得る。この方法は、病理と関連する標的（例えば、タンパク質）を結合するアプタマーを含む組成物を患者または被験体に投与する工程を包含し、その結果、標的へのその組成物の結合が、標的の生物学的機能を変化させ、それによって病理を治療する。
【０１５０】
病理を有する患者または被験体、例えば、本発明の方法によって治療される患者または被験体は、哺乳動物、またはより特定すると、ヒトであり得る。
【０１５１】
実際上、組成物またはそれらの薬学的に受容可能な塩は、それらの所望の生物学的活性を発揮するために十分である量で投与され、例えば、そのレセプターに対するサイトカインの結合を阻害する。
【０１５２】
本発明の１つの局面は、癌または癌関連障害のための他の治療と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のこのアプタマー組成物は、例えば、１つより多くのアプタマーを含み得る。ある例において、本発明のアプタマー組成物は、１つ以上の本発明の化合物を含み、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤などの別の有用な組成物と組み合わせて投与される。さらに、本発明の化合物は、上記のような、細胞毒性、細胞増殖抑制性、または化学療法剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、分裂抑制因子、または細胞毒性性抗生物質と組み合わせて投与され得る。一般的に、このような組成物における使用のために現在使用可能な投薬型の既知の治療剤が適切である。
【０１５３】
「組み合わせ治療」（または「同時治療」）は、これらの治療剤の同時作用からの有益な効果を提供するために、本発明のアプタマー組成物、および意図される特異的治療計画の一部として少なくとも第２の薬剤の投与を含む。組み合わせ治療の有益な効果には、治療剤の組み合わせから生じる薬物動態学的または薬力学的な同時作用が含まれるがこれに限定されない。これらの治療剤の組み合わせでの投与は、典型的には、規定された時間の期間にわたって実行される（選択された組み合わせに依存して、通常、数分間、数時間、数日間、または数週間）。
【０１５４】
「組み合わせ治療」は、本発明の組み合わせにおいて偶発的にまたは任意に生じる個別の単独療法計画の一部としてこれらの治療剤の２つ以上の投与を含むことを意図し得るが、一般的にはそうではない。「組み合わせ治療」は、連続的な様式でこれらの治療剤の投与を含むことが意図される。すなわち、ここでは、各治療剤が異なる時間に投与され、ならびに、これらの治療剤の投与、または少なくとも２つの治療剤は、実質的に同時の様式である。実質的に同時の投与は、例えば、各治療剤を固定された比率で有する単一のカプセル、または治療剤の各々についての単一のカプセルを複数、投与することによって達成され得る。
【０１５５】
各治療剤の連続的または実質的に同時の投与は、任意の適切な経路によってもたらされ得、これには例えば、局所的経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通した直接吸収が含まれるがこれらに限定されない。治療剤は、同じ経路または異なる経路によって投与され得る。例えば、選択された組み合わせの第１の治療剤は注射によって投与され得るのに対して、その組み合わせの他の治療剤は局所的に投与され得る。
【０１５６】
代替的には、例えば、すべての治療剤は局所的に投与され得るか、またはすべての治療剤は注射によって投与され得る。治療剤が投与される順番は、決定的ではないとは言えない。「組み合わせ治療」はまた、他の生物学的に活性な成分とさらに組み合わせた上記のような治療剤の投与を含み得る。組み合わせ治療がさらに非薬物治療を含む場合、その非薬物治療は、治療薬剤および非薬物治療の組み合わせの同時作用からの有益な効果が達成される限り、任意の適切な時点で実行され得る。例えば、適切な場合において、有益な効果は、非薬物治療は治療剤の投与から、おそらく数日間または数週間でさえ離される場合になお達成される。本発明の化合物および他の薬理学的に活性な薬剤が、同時に、連続的に、または組み合わせて患者に投与され得る。本発明の組み合わせを使用するときに、本発明の化合物および他の薬理学的に活性な薬剤が同じ薬学的に受容可能なキャリア中にあり得、それゆえに同時に投与されることが理解される。これらは、同時に摂取される慣用的な経口投薬形態などの別個の薬学的キャリア中にあってもよい。用語「組み合わせ」はさらに、化合物が別々の投薬形態中に提供され、かつ連続して投与される場合をいう。
【０１５７】
本発明の治療用または薬学的組成物は、一般的に、薬学的に受容可能な媒体中に溶解されるかまたは分散される治療の活性成分の有効量を含む。薬学的に受容可能な媒体またはキャリアは、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗微生物剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。補助的な活性成分もまた、本発明の治療組成物に組み込まれ得る。
【０１５８】
薬学的または薬理学的組成物の調製は、本開示に鑑みて当業者には公知である。典型的には、このような組成物は、注射液として、液体溶液もしくは懸濁液のいずれかとして；注射の前の液体である溶液もしくは懸濁液の中に入れるのに適切な固体形態；経口投与のための錠剤もしくは他の固体として；時間放出カプセルとして；または現在使用されているいずれかの他の形態（点眼薬、クリーム、ローション、軟膏、吸入剤などを含む）で調製され得る。手術の分野において特定の区域を処理するための、外科医、内科医、または医療従事者による滅菌製剤の使用、例えば、生理食塩水ベースの洗浄剤もまた、特に有用であり得る。組成物はまた、マイクロデバイス、微粒子、またはスポンジを介して送達され得る。
【０１５９】
製剤の際に、治療剤は、投薬製剤と適合可能な様式で、かつ薬理学的に有効であるような量で投与される。処方は、種々の投薬量形態、例えば、上記の注射可能な溶液の型で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた利用され得る。
【０１６０】
この文脈において、活性成分の量および投与される組成物の量は、治療される宿主動物に依存する。投与のために必要とされる活性化合物の正確な量は実施者の判断に依存し、かつ各固体に固有である。
【０１６１】
活性化合物を分散するために必要とされる組成物の最小量が典型的には利用される。投与のために適切な計画もまた変動可能であるが、典型的には、最初に化合物を投与することおよび結果をモニターすること、次いでさらなる間隔でさらなる制御用量を与えることによる。
【０１６２】
例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与のために、活性薬物成分が、経口の、非毒性の、薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と合わせられ得る。さらに、望ましいかまたは必要である場合、適切な結合剤、崩壊剤、および冷却剤もまた、混合物に組み込まれ得る。適切な結合剤には、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンのり、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン、天然の糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース）、コーン甘味料、天然または合成のガム（例えば、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウム）、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの投薬形態において使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウム塩またはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが含まれる。崩壊剤には、非限定的に、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または発泡性混合物などが含まれる。希釈剤には、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシンが含まれる。
【０１６３】
注射可能組成物は、好ましくは等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、有利には脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から調製される。組成物は滅菌され得、および／またはアジュバント（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤）を含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。これらの組成物は、従来的な混合、顆粒化、またはコーティングの方法にそれぞれ従って調製され、活性成分の約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％を含む。
【０１６４】
本発明の化合物はまた、時限的放出または持続放出性の錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、シロップ、およびエマルジョンのような経口投薬形態で投与され得る。
【０１６５】
液体、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの薬学的に純粋な溶媒中に、またはそれとともに混合され、注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射の前に液体中に溶解するための適切な固体形態が製剤化され得る。注射可能な組成物は、好ましくは、等張性水溶液または水性懸濁液である。これらの組成物は、滅菌され得、および／またはアジュバント（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤）を含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。
【０１６６】
本発明の化合物は、静脈内（ボーラスと注入の両方）、腹腔内、皮下、または筋肉内の形態で投与され得、すべての使用する形態は薬学分野における当業者に周知である。注射剤は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、従来的な形態で調製され得る。
【０１６７】
非経口注射可能投与は、一般的には、皮下、筋肉内、または静脈内の注射または注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、遅延放出または持続放出系の移植を利用し、これは、一定のレベルの投薬が維持されることを保証し、米国特許第３，７１０，７９５号（参考として本明細書に援用される）に従う。
【０１６８】
さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻内ビヒクルの局所的使用を介して鼻内形態で、またはその分野における当業者に周知の経皮パッチの形態を使用する経皮経路を使用して投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬量投与は、当然、投薬計画の全体を通して断続的であるよりは連続的である。他の好ましい局所的調製物には、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー、およびゲルが含まれ、ここで活性成分の濃度は、０．０１％〜１５％、ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲である。
【０１６９】
固体組成物のために、賦形剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含み、これらが使用され得る。上記に規定した活性化合物はまた、坐剤として、例えば、ポリアルキレングリコールを使用して、例えば、キャリアとしてプロピレングリコールを使用して製剤され得る。ある実施形態において、坐剤は、脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。
【０１７０】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達系、例えば、小さな単層ベシクル、大きな単層ベシクル、および多層ベシクルの形態で、投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質（コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンを含む）から形成され得る。ある実施形態において、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、脂質成分のフィルムが薬物の水溶液と水和され、薬物をカプセル化する脂質層を形成する。例えば、本明細書に記載されるアプタマー分子は、当該分野において公知である方法を使用して構築された、親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供され得る。核酸結合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供される。
【０１７１】
本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして可溶性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェニール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール、またはポリエチレンオキシドポリリジン（パルミトイル残基で置換されている）を含み得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成する際に有用である生物分解可能なポリマーのクラス（例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオストエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、および架橋されたかもしくは両親媒性のハイドロゲルのブロックコポリマー）にカップリングされ得る。
【０１７２】
所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の物質、例えば、酢酸ナトリウム、およびオレイン酸トリエタノールアミンなどの少量の非毒性補助物質を含み得る。
【０１７３】
化合物を利用する投薬計画は、患者の型、人種、年齢、体重、性別、および医学的状態；治療される状態の重篤度；投与の経路；患者の腎臓および肝臓の機能；および利用される特定の化合物またはその塩を含む種々の要因に従って選択される。当該分野の医師および獣医師は、状態の進行を予防、これに退行、またはこれを停止させるために必要とされる薬物の有効量を容易に決定および処方することが可能である。
【０１７４】
本発明の経口投薬は、示される効果のために使用される場合、約０．０５〜５０００ｍｇ／日、経口の間の範囲である。本発明の組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０、および１０００．０ｍｇの活性成分を含む、量が明示された錠剤の形態で好ましく提供される。本発明の化合物の有効な血清濃度は、体重ｋｇあたり１日あたり０．００２〜５０ｍｇの範囲である。
【０１７５】
本発明の化合物は、単一の１日用量で投与され得、または全体の１日の投薬量は、１日に２回、３回、または４回の分割用量で投与され得る。
【０１７６】
（アプタマー治療剤の薬物動態学および生物分布の調節）
本発明は、アプタマー組成物の薬物動態学、および特にアプタマー薬物動態学を調節する能力（すなわち、「可変性」）に影響を与える物質および方法を提供する。アプタマー薬物動態学の可変性は、核酸の化学組成を変化させるために、アプタマーに対する修飾部分の結合体化および／または修飾ヌクレオチドの取り込みを通して達成される。アプタマー薬物動態学を調節する能力は、既存の治療的適用において、または代替的には新たな治療的適用の開発において使用される。例えば、ある治療的適用において、例えば、迅速な薬物クリアランスまたは停止が所望され得る抗新生物性または救急治療の設定において、循環中のアプタマーの存在時間を減少させることが望ましい。代替的には、他の治療的適用、例えば、治療剤の全身性循環が所望される維持治療において、循環中のアプタマーの坐存在時間を増加させることが所望され得る。
【０１７７】
さらに、アプタマー薬物動態学の可変性は、被験体におけるアプタマー治療剤の生物分布を改変するために使用される。例えば、ある治療的適用において、特定の組織の型または特定の器官（または器官のセット）を標的とする試みにおいて、アプタマー治療剤の生物分布を変化させることが所望され得る。これらの適用において、アプタマー治療剤は、特定の組織または器官に優先的に蓄積する。他の治療的適用において、所定の疾患、細胞損傷、または他の異常な病理と関連する細胞マーカーまたは徴候を示す組織を標的とすることが所望され得、その結果、アプタマー治療剤は罹患した組織に優先的に蓄積する。例えば、本明細書に記載されるように、アプタマー治療剤のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａポリマーを用いるＰＥＧ化）が炎症性組織を標的とするために使用され、その結果、ＰＥｇ化アプタマー治療剤が炎症性組織に優先的に蓄積する。
【０１７８】
アプタマー治療剤の薬物動態学的および生物分布プロフィール（例えば、アプタマー結合体または修飾ヌクレオチドなどの変化した化学的部分を有するアプタマー）は、種々のパラメーターをモニターすることによって決定される。このようなパラメーターには、例えば、例えば、半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布の体積（ＶＳＳ）、濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ）、最大観察血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）、およびアプタマー組成物の平均存在時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＵＣ」とは、アプタマー治療剤の血漿濃度対アプタマー投与後の時間のプロットの下の面積をいう。ＡＵＧ値は、所定のアプタマー治療剤の、生物学的利用能（すなわち、アプタマー投与後の循環中での投与されたアプタマー治療剤のパーセンテージ）および／または全体のクリアランス（Ｃｌ）（すなわち、アプタマー治療剤が循環から除去される速度）を見積もるために使用される。分布の体積は、アプタマー治療剤の血漿濃度を、身体に存在するアプタマーの量と関連付ける。Ｖｓｓが大きいほど、より多くのアプタマーが血漿の外部に見い出される（すなわち、より多くの血管外遊出）。
【０１７９】
循環から迅速にクリアされ、かつ組織（ここで代謝的分解の結果として、除去がゆっくりと起こる）に分布する、ホスホロチオエート含有アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性および生物分布特性は、当該分野において記載されている（例えば、ＳｒｉｎｉｖａｓａｎおよびＩｖｅｒｓｅｎ（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．９（２）：１２９−３７；ＡｇｒａｗａｌおよびＺｈａｎｇ（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：６０−７５，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７５−８；ＡｋｈｔａｒおよびＡｇｒａｗａｌ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８（１）：１２−８；Ｃｒｏｏｋｅ（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：１−４９；Ｇｒｉｎｄｅｌら（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８（１）４３−５２；ＭｏｎｔｅｉｔｈおよびＬｅｖｉｎ（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７（１）：８−１３；Ｐｅｎｇら（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１１（１）：１５−２７を参照のこと）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む初期の研究は、細胞内部または特定の組織型内でインビボでそれらの作用の部位にアンチセンス分子を送達を増加させることを究極の目標として、薬物動態学および生物分布に対する種々の結合体化学性質の効果を探求した（Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５９８−６０６；Ｚｕｂｉｎら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５６（１）：５９−６２；Ａｓｔｒｉｂ−Ｆｉｓｈｅｒら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０（１）：８３−９０；Ｌｅｂｅｄｅｖａら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０（１）：１０１−１９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ（２００２）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２（２）：１０３−２８）。例えば、コレステロールとの結合体化は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの循環半減期を増加することが報告されており、これはおそらく、血漿リポタンパク質との結合を通して、肝臓の取り込みを促進している可能性がある（ｄｅ  Ｓｍｉｄｔら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１７）：４６９５−４７００）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む初期の研究は、非特異的タンパク質結合相互作用が、循環からのホスホロチオエート含有アンチセンスオリゴヌクレオチドの迅速な損失および組織への分布における重要な役割を果たすことを示した（例えば、ＳｒｉｎｉｖａｓａｎおよびＩｖｅｒｓｅｎ（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．９（２）：１２９−３７；ＡｇｒａｗａｌおよびＺｈａｎｇ（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：６０−７５，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７５−８；ＡｋｈｔａｒおよびＡｇｒａｗａｌ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８（１）：１２−８；Ｃｒｏｏｋｅ（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：１−４９；Ｇｒｉｎｄｅｌら（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８（１）４３−５��；ＭｏｎｔｅｉｔｈおよびＬｅｖｉｎ（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７（１）：８−１３；Ｐｅｎｇら（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１１（１）：１５−２７を参照のこと）。
【０１８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと対照的に、アプタマーはより長く（３０〜４０対１０〜２０ヌクレオチド）、異なる型の化学修飾（糖修飾、例えば、２’−Ｆ、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−ＮＨ２対バックボーン修飾）を有し、分解に対してより耐性である三次構造を保証する。アプタマーは、多くの点において、核酸よりも球状タンパク質の三次元型により類似している。これらの顕著な違いがあるので、アプタマーのインビボ配置は、アンチセンスの結果からは容易には予測可能でない。
【０１８１】
より最近、細胞膜を横切って大きな極性高分子（オリゴヌクレオチドを含む）を運搬するための送達ペプチドが、アンチセンスおよび他の治療剤の適用の範囲を隠微日で増強するための手段として探求されてきた。これらの結合体の例には、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質の１３アミノ酸フラグメント（Ｔａｔ）（Ｖｉｖｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔ）ｈｏｍｏｅｔｉｃタンパク質の第３ヘリックス由来の１６アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（１１−１２）：１３９７−４０５）、およびポリアルギニン（Ａｒｇ７）からなる短い、正に荷電した細胞浸透ペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊら（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８）が含まれる。例えば、ＴＡＴペプチドは、米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に記載されている。
【０１８２】
本発明は、低分子、ペプチド、またはポリマー末端基などの調節部分にアプタマーを結合体化させることによって、またはアプタマーに修飾ヌクレオチドを取り込むことによって、制御された様式で、安定化されたアプタマー組成物の薬物動態学および生物分布をインビボで調節するための物質および方法を提供する。生物学的サンプル中のアプタマー結合体の薬物動態学および生物分布は、ラジオメトリーによって、および酵素結合蛍光の読み取りを用いるハイブリダイゼーションに基づく二重捕捉アッセイによって定量される。本明細書に記載されるように、修飾部分の結合体化および／またはヌクレオチド化学組成を変化させることは、循環中のアプタマー存在時間および組織への分布をの基本的な局面を変化させる。
【０１８３】
アプタマーは、種々の修飾部分、例えば、高分子量ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、ペプチド（例えば、Ｔａｔ、Ａｎｔ、およびＡｒｇ７）、および低分子（例えば、コレステロールなどの親油性化合物）などに結合体化される。本明細書で示されるように、２’Ｆと２’０ＯＭｅの両方の安定化修飾を含む混合組成物アプタマーは、２’−Ｏ−メチル化組成物よりも血流中に有意に長く持続した。本発明の物質および組成物に従って調製された結合体の間で、アプタマーのインビボ特性は、ＰＥＧ基との複合体化によって最も大きく変化された。例えば、混合した２’Ｆおよび２’−ＯＭｅ修飾されたアプタマー治療剤の２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとの複合体化は、腎臓濾過を妨害しかつ健常組織と炎症組織の両方へのアプタマー分布を促進した。さらに、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー−アプタマー結合体は、アプタマーの腎臓濾過を妨害する際に４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとほぼ同程度に効果的であることが判明した。ＰＥＧ化の１つの効果はアプタマークリアランスに対するものであったが、２０ｋＤａ部分の存在によって提供される全身露出の延長はまた、組織、特に高度に灌流された器官および炎症の部位における組織へのアプタマーの分布を容易にする。アプタマー−２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー結合体（ＡＲＣ１２０）は炎症の部位へのアプタマー分布を指向し、その結果、ＰＥＧ化アプタマーは炎症性組織に優先的に蓄積した。ある場合において、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマー結合体は、例えば、腎臓細胞などの細胞の内部を横切ることが可能であった。
【０１８４】
全体として、コレステロールおよび細胞浸透性ペプチドを含む低分子量修飾部分によって産生されるアプタマー薬物動態学および組織分布に対する効果は、ＰＥＧ化またはヌクレオチドの修飾の結果として産生されるもの（例えば、化学組成の変化）よりも明らかではなかった。コレステロールに結合体化されたアプタマーは、結合体化されていないアプタマーと比較してより迅速な血漿クリアランス、およびある程度のアプタマー血管外遊出を示唆する大量の分布を示した。この結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿半減期を有意に延長するためのコレステロールタグの能力を実証する公開されたデータと対照的であるようである（ｄｅ  Ｓｍｉｄｔら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１７）：４６９５−４７００）。理論によって束縛されることは意図しないが、本明細書に提供されるこの結果は、アンチセンス結合体の場合に起こることが仮定されている血漿リポタンパク質とのコレステロール媒介結合が、アプタマー−コレステロール結合体のフォールディングされた構造の特定の文脈において除外され、および／またはコレステロール基の親油性性質の局面に関連することを示唆し得る。コレステロールと同様に、Ｔａｔペプチドタグの存在は、血流からのアプタマーのクリアランスを促進し、これは４８時間での腎臓における比較的高いレベルの結合体を伴った。インビトロで細胞膜を横切る高分子の通過を媒介すると当該分野において報告されている他のペプチド（例えば、Ａｎｔ、Ａｒｇ７）は、循環からのアプタマークリアランスを促進しないようであった。しかし、Ｔａｔと同様に、Ａｎｔ結合体は、他のアプタマーと比較して腎臓において有意に蓄積した。理論によって束縛されることは意図しないが、三次元的にフォールディングされたアプタマーの文脈において、ＡｎｔおよびＡｒｇ７ペプチド修飾部分の好ましくない提示は、アプタマー輸送特性に影響を与えるこれらのペプチドの能力をインビボで損なった可能性がある。
【０１８５】
本明細書に記載される本発明に先立って、２’−ＯＭｅ化学組成を有するオリゴヌクレオチドの薬物動態学および生物分布に関してはほとんど知られていなかった（Ｔａｖｉｔｉａｎら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４（４）：４６７−７１）。いくつかの理由のために、２’−ＯＭｅ置換基の取り込みは、ヌクレアーゼ攻撃に対してアプタマーを安定化させるための特に魅力的な手段である。１つの属性は安全性である：２’−Ｏ−メチル化は、真核生物のリボソームＲＮＡおよび細胞ＲＮＡにおいて天然に存在しかつ豊富な化学修飾として知られている。ヒトｒＲＮＡは、リボソームあたりおよそ１００個の２’−Ｏ−メチル化糖を含むと見積もられている（ＳｍｉｔｈおよびＳｔｅｉｔｚ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９（５）：６６９−７２）。従って、２’−ＯＭｅ置換基を組み込むアプタマー組成物は非毒性であると予測される。この観点を支持するものとして、インビトロおよびインビボ研究は、２’−ＯＭｅヌクレオチドが、ヒトＤＮＡポリメラーゼ（αもしくはγ）によって、またはヒトプライマーゼによって容易にはポリマー化されず、従って、ゲノムＤＮＡへの取り込みのリスクは低いことを示す（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９（９）：１０４５−５２；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５（７）：９２２−６）。さらに、物品のコストの観点から、２’−ＯＭｅ含有オリゴヌクレオチドの合成のためのグラムあたりの費用は、２’−Ｆと２’−ＯＨの両方を含有するＲＮＡについてのグラムあたりの費用よりも低い。
【０１８６】
混合２’Ｆ／２’−ＯＭｅ組成アプタマーおよび結合体化アプタマーの比較が、血漿クリアランスを決定するためにインビボで実行された。２’−Ｆと２’−ＯＨの両方の安定化化学成分を組み込む非結合体化試験アプタマーは、典型的な現在の世代のアプタマーである。なぜなら、これはインビトロおよびインビボの両方において高度なヌクレアーゼ安定性を示すからである。２’Ｆ／２’−ＯＭｅ組成アプタマーと比較すると、非修飾アプタマーは、腎俗な血漿からの損失（すなわち、迅速な血漿クリアランス）、および組織、主に腎臓への迅速な分布を示した。
【０１８７】
完全な２’−ＯＭｅ修飾アプタマーの疎水性性質が、オリゴヌクレオチドに血漿または細胞の成分との非特異的結合を与える傾向がより強いか否か（アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合において）を決定するための試験が実行され得る。さらに、２’−ＯＭｅ−修飾アプタマーのタンパク質結合特性を規定するための実験が実行され得る。理論によって束縛されることは意図しないが、バックグラウンドよりも上の全長のすべての２’−Ｏ−メチル置換アプタマーの濃度が、いくつかの組織、腎臓、肝臓、および脾臓において、投薬後４８時間においてさえ、おそらくヌクレアーゼ消化に対する完全な２’−ＯＭｅアプタマーの極度な強固さに起因して検出された。この例においては、血漿クリアランスプロフィールおよび腎臓への分布と一致して、完全な２’−ＯＭｅアプタマーが尿を介して迅速に除去された。
【０１８８】
投与された用量のパーセントとして表現された場合、本発明で試験されたすべてのアプタマーまたは結合体は、腎臓、肝臓、および胃腸管への有意な濃度の分布を示した。器官／組織重量について補正された場合、最高のアプタマーの重量標準化濃度は、高度に灌流された器官（腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺）、および予想に反してに縦隔リンパ節おいて観察された。アプタマーは皮下注射後に生物利用可能であるので（８０％まで）（Ｔｕｃｋｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２）、これらは、この投与の経路を通してリンパ系における標的に接近することが予測される。静脈内投与を介するリンパ管への即時的接近は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどの感染性疾患兆候のためにアプタマー治療剤を開発することの観点から関心がある。従って、修飾部分に結合体化されたアプタマー治療剤および変化した化学成分（例えば、修飾ヌクレオチドを含む）を有するアプタマーは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどの感染性疾患の治療において有用である。
【０１８９】
その増強された血漿薬物動態学と一致して、高度に灌流された器官中で検出された２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーの濃度は、アッセイされた他のアプタマーよりも高かった。一般的な傾向として、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーを例外として（ここでは濃度が時間を経過してもほぼ一定のままであった）、腎臓において測定されるアプタマー濃度は時間とともに減少する。逆に、肝臓においては、すべてのアプタマーの濃度はほぼ一定であり、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーが例外である（ここでは濃度が時間とともに減少した）。これらの違いは、２０ｋＤａ  ＰＥＧ結合体の血漿半減期の延長、および高度に灌流された器官におけるその取り込みの増加によって理解され得る。２０ｋＤａ  ＰＥＧ修飾部分との複合体形成の効果の１つはアプタマー結合体の腎臓濾過を保持することであったのに対して、十分に灌流された器官において測定された２０ｋＤａ  ＰＥＧ結合体の、他のアプタマーまたは結合体と比較して比較的高い濃度は、ＰＥＧ化が組織へのアプタマー分布を調節し得、ならびに血漿半減期（ｔ１／２）の延長を促進し得ることを示唆した。本明細書に記載されるように、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマー−結合体は組織へのアプタマー分布を調節した。炎症性組織において検出された２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーの濃度は、アッセイされた他のアプタマーよりも高く、ある例においては、アプタマーは細胞（例えば、腎臓細胞）の内部に接近することが可能であった。
【０１９０】
理論によって束縛されることは意図しないが、血流中での存在の延長は組織への結合体化アプタマーの露出を増加させ、取り込みの増加をもたらし、これは、高度に灌流された器官および炎症性組織の場合にもっとも顕著であることが推測される。残渣の血液中でのアプタマーの存在は、本明細書に示される灌流された器官および炎症性組織において２０ｋＤａアプタマー結合体の濃度の増加の原因であり得るが、これで完全に説明できるわけではないらしい。灌流された器官および炎症性組織へのＰＥＧ化アプタマーの分布の増強は、トリチウム化された２０ｋＤａ  ＰＥＧ結合体を投与されたマウスにおける実験（ここでは、［３Ｈ］シグナルが肝臓と腎臓の両方の細胞において見られた）（以下に提供される実施例を参照のこと）によって示唆されるように、血管外遊出を表す。アプタマー治療剤に関する初期の研究は、腎臓濾過を回避する試みにおいて高分子量（４０ｋＤａ）ＰＥＧ種と複合体化されたアプタマーの開発に主として焦点を当てていた（ＲｅｙｄｅｒｍａｎおよびＳｔａｖｃｈａｎｓｋｙ（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５（６）：９０４−１０；Ｔｕｃｋｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５；Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら（２００３）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４（１）：２９０−９）。本発明は、より小さな、例えば、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーとの複合体形成が、多くの治療的兆候のために腎臓濾過からアプタマーベースの薬物を保護することを示す。より小さなＰＥＧ（例えば、１０ｋＤａ〜２０ｋＤａのＰＥＧ部分）もまた、より大きなＰＥＧと比較した場合に、合成の容易さおよび物品のコストの減少の付属的な利点を提供する。
【０１９１】
（ＰＥＧ誘導体化核酸）
高分子量非免疫原性ポリマーでの核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的特性および薬力学的特性を変化させ、それらをより有効な治療剤にする潜在能力を有する。好ましい活性の変化は、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性、腎臓を通しての濾過の減少、免疫系に対する露出の減少、および身体を通しての治療剤の分布の変化を含み得る。
【０１９２】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）部分で誘導体化され得る。ＰＡＧ誘導体化核酸の例は、２００３年１１月２１日に出願された米国特許出願シリアル番号１０／７１８，８３３（これは参考としてその全体が本明細書に援用される）において見い出される。本発明において使用される典型的なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としてもまた知られる、およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が含まれる。さらに、異なるアルキレンオキサイド（例えば、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド）のランダムまたはブロックコポリマーが、多くの適用において使用され得る。その最も一般的な型において、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、各末端においてヒドロキシル基で終結している直鎖状ポリマーである：ＯＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ。このポリマー、α−、ω−ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）はまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表され得、ここで、−ＰＥＧ−記号は、以下の構造単位：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を表すことが理解され、ここでｎは、典型的には、約４〜約１０，０００までの範囲である。
【０１９３】
示されるように、ＰＥＧ分子は二官能性であり、時折「ＰＥＧジオール」といわれる。ＰＥＧ分子の末端部分は比較的反応性でないヒドロキシル部分、−ＯＨであり、これは、化合物上の反応性部位において他の化合物に対するＰＥＧの結合のために、活性化または官能基部分に転換され得る。このような活性化ＰＥＧジオールは、本明細書では二活性化ＰＥＧと呼ばれる。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、比較的反応性でないヒドロキシル部分、−ＯＨの置換によるアミノ部分との選択的反応のために、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドからのスクシニミジル活性エステル部分を用いて、活性カルボン酸エステルとして官能基化された。
【０１９４】
多くの適用において、ＰＥＧ分子が単官能性であるように（または単活性化されるように）、本質的に反応性でない部分と１つの末端上でＰＥＧ分子をキャップすることが望ましい。活性化ＰＥＧのための複数の反応部位を一般的に示すタンパク質治療剤の場合、二官能性活性化ＰＥＧは広範な架橋をもたらし、乏しい機能的凝集体を生じる。単活性化ＰＥＧを生成するために、ＰＥＧジオール分子の末端上の１つのヒドロキシル部分が典型的には非反応性メトキシ末端部分、−ＯＣＨ３で置換される。ＰＥＧ分子のキャップされていない他方の末端は、典型的には反応性部分に変換され、これは表面の反応性部位またはタンパク質などの分子上の反応部位での結合のために活性化され得る。
【０１９５】
ＰＡＧは、典型的には、毒性を欠き、かつ免疫原性を欠く水および多くの有機溶媒中で溶解性の特性を有するポリマーである。ＰＡＧの１つの用途は、得られるＰＡＧ−分子「結合体」を可溶性にするために、不溶性分子に対してポリマーを共有結合させることである。例えば、水不溶性薬物パクリタキセルは、ＰＥＧとカップリングされたときに水溶性になることが示されてきた。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧ結合体はしばしば、溶解性および安定性を増強するためのみならず、分子の血液循環半減期を延長するために使用される。
【０１９６】
本発明のポリアルキル化化合物は、典型的には、５〜８０ｋＤの間のサイズである。他の本発明のＰＡＧ化合物は、１０〜８０ｋＤの間のサイズである。なお他の本発明のＰＡＧ化合物は、１０〜６０ｋＤの間のサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤのサイズであり得る。このようなポリマーは直鎖状または分枝状であり得る。
【０１９７】
生物学的に発現されたタンパク質治療剤とは対照的に、核酸治療剤は、典型的には、活性化されたモノマーヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同じ反復性モノマー合成を使用してＰＥＧを取り込むことによって調製され得る。例えば、ホスホルアミダイト型への転換によって活性化されたＰＥＧは、固相オリゴヌクレオチド合成に組み入れられ得る。代替的には、オリゴヌクレオチド合成は、反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的な取り込みを用いて完了され得る。最も一般的には、これは、５’末端への遊離の一級アミンの付加によって達成されてきた（固相合成の最終カップリング工程において修飾ホスホルアミダイトを使用して取り込まれる）。このアプローチを使用して、反応性ＰＥＧ（例えば、アミンと反応しかつ結合を形成するように活性化されるもの）は、精製オリゴヌクレオチドと合わされ、カップリング反応が溶液中で実行される。
【０１９８】
治療剤の生物分布を変化させるＰＥＧ結合体化の能力は、結合体の見かけのサイズ（例えば、流体力学的半径によって測定される）を含む多数の要因に関連する。より大きな結合体（＞１０ｋＤａ）は、腎臓を介する濾過をより効果的にブロックすること、および小さな高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を結果的に増大することが知られている。ＰＥＧ結合体が濾過をブロックする能力は、５０ｋＤａまでの見かけのＰＥＧサイズで増大することが示されてきた（さらなる増加は最小限の有利な効果を有する。なぜなら、半減期は腎臓を通しての除去よりもマクロファージ媒介代謝によって規定されるようになるからである）。
【０１９９】
高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の製造は、困難、非効率的、かつ高価であり得る。高分子量ＰＥＧ−核酸結合体の合成に向かう経路として、以前の研究は、高分子量活性化ＰＥＧの生成に向けて焦点を当てていた、このような分子を生成するための１つの方法は、分枝活性化ＰＥＧの形成を含み、ここでは、２つ以上のＰＥＧが活性化基を有する中心コアに結合される。これらの高分子量ＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的反応性でないヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、化合物上の反応性部位での他の分子への１つ以上のＰＥＧの結合のために、活性化される得るか、または官能基部分に転換され得る。分枝活性化ＰＥＧは、２つより多くの末端を有し、２つ以上の末端が活性化される場合において、このような活性化高分子量ＰＥＧ分子は、本明細書では多活性化ＰＥＧと呼ばれる。いくつかの場合において、分子ＰＥＧ分子中のすべての末端が活性化されるわけではない。分枝ＰＥＧ分子の任意の２つの末端が活性化される場合において、このようなＰＥＧ分子は、二活性化ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧ分子における１つの末端のみが活性化されるいくつかの場合において、このようなＰＥＧ分子は単活性化されたといわれる。このアプローチの１つの例において、反応のために引き続いて活性化されるリジンコアへの２つのモノメトキシＰＥＧの結合によって調製される活性化ＰＥＧは記載されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第２巻：２１３−２２１，２００３）。
【０２００】
本発明は、複数のＰＥＧ化核酸を含む高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体の合成に至る別のコスト効果の高い経路を提供する。本発明はまた、ＰＥＧ−結合マルチマー性オリゴヌクレオチド、例えば、ダイマー性アプタマーを含む。本発明はまた、高分子量組成物に関し、ここでＰＥＧ安定化部分はアプタマーの異なる部分を分離するリンカーであり、例えば、ＰＥＧは単一のアプタマー配列中で結合体化され、その結果、高分子量アプタマー組成物の直線状配列は、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸である。
【０２０１】
本発明の高分子量組成物には、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものが含まれる。組成物は、典型的には、１０〜８０ｋＤの間のサイズの分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、少なくとも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａのサイズである。
【０２０２】
安定化部分は分子または分子の一部であり、これは、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態学的特性および薬力学的特性を改善する。いくつかの場合において、安定化部分は分子または分子の一部であり、これは、２つ以上のアプタマー、またはアプタマードメインを近位に移動させ、または本発明の高分子量アプタマー組成物の全体の回転自由度の減少を提供する。安定化部分は、直鎖状または分枝状の、ホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）であり得る。他の安定化部分には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーが含まれる。オリゴヌクレオチドはまた、安定化部分であり得る；このようなオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、および／または修飾結合、例えば、ホスホロチオエートを含み得る。安定化部分はアプタマー組成物の内部部分であり得、すなわちこれはアプタマーに共有結合される。
【０２０３】
本発明の組成物は高分子量アプタマー組成物を含み、ここで２つ以上の核酸部分が少なくとも１つのポリアルキレングリセロール部分に共有結合される。このポリアルキレン部分は、安定化部分として働く。ポリアルキレングリコール部分がアプタマーにいずれかの末端で共有結合され、その結果ポリアルキレングリコールが１つの分子中で核酸部分を一緒に結合する組成物において、ポリアルキレングリコールは連結部分であるといわれる。このような組成物において、共有結合分子の一次構造は、直鎖状配置核酸−ＰＡＧ−核酸を含む。１つの例は、一次構造核酸−ＰＥＧ−核酸を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸の直鎖状配列である。
【０２０４】
核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を産生するために、核酸は、元来、それが単一の反応部位を有するように合成される（例えば、これは単活性化される）。好ましい実施形態において、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成における最終段階として、修飾剤ホスホルアミダイトの付加によって５’末端に導入されるアミノ基である。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後で、これは、活性化ＰＥＧの自発的加水分解を最小化する溶液中の高濃度で再構成される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構成濃度溶液は２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３−緩衝液、ｐＨ  ８．３を含む。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧのゆっくりとした段階的な付加によって開示される。好ましい実施形態において、ＰＥＧジオールは、プロピオン酸スクシニミジルとの誘導体化によって両方の末端で活性化される（二活性化される）。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、完全に結合体化された種、部分的に結合体化された種、および結合体化されていない種を分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。連結された複数のＰＡＧ分子（例えば、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーとして）またはより小さなＰＡＧ鎖が、種々の長さ（または分子量）を達成するために連結され得る。非ＰＡＧリンカーは、種々の長さのＰＡＧ鎖間で使用され得る。
【０２０５】
２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ修飾は、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化し、かつインビボでその半減期を増大させる。３’−３’−ｄＴキャップもまた、エキソヌクレアーゼ耐性を増大させる。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；および同第６，２２９，００２号（これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと。
【０２０６】
（反応性核酸のＰＡＧ誘導体化）
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、１つより多くの反応性部位を含む核酸との単官能性活性化ＰＥＧの反応によって調製され得る。１つの実施形態において、核酸は二反応性であるかまたは二活性化され、従来的なホスホルアミダイト合成、例えば：図２２に図示されるような３’−５’−ジＰＥＧ化を通してオリゴヌクレオチドに導入された２つの反応性部位：５’−アミノ基および３’−アミノ基を含む。代替的な実施形態において、反応性部位は、一級アミンの結合のための部位として、例えば、ピリミジンの５位、プリンの８位、またはリボースの２’位を使用して、内部部位に導入され得る。このような実施形態において、核酸は、いくつかの活性化されたかまたは反応性の部位を有し得、複数部位が活性化されるといわれる。合成および精製の後、修飾オリゴヌクレオチドは、自発的加水分解を最小化しながらオリゴヌクレオチド反応部位との反応部位を促進する条件下で、単活性化ＰＥＧと合わせられる。好ましい実施形態において、モノメトキシ−ＰＥＧはプロピオン酸スクシニミジルで活性化され、カップリング反応はｐＨ  ８．３で実行される。二置換ＰＥＧの合成を駆動するために、オリゴヌクレオチドと比較して化学量論的に過剰のＰＥＧを供給する。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、完全に結合体化された種、部分的に結合体化された種、および結合体化されていない種を分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。
【０２０７】
連結されたドメインはまた、それに連結される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有し得る。このようなＰＡＧは、種々の長さであり得、かつ組成物の所望の分子量を達成するために適切な組み合わせで使用され得る。
【０２０８】
特定のリンカーの効果は、その化学組成と長さの両方によって影響され得る。長すぎるか、短すぎるか、または望ましくない立体的および／もしくはイオン性相互作用を形成するリンカーは、アプタマーと標的の間の複合体の形成を妨害する。核酸間の距離にわたるのに必要であるよりもより長いリンカーは、リガンドの有効な濃度を減少することによって結合安定性を減少し得る。従って、標的へのアプタマーの親和性を最大化するためにリンカー組成および長さを最適化することがしばしば必要である。
【０２０９】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許文書は、あたかも各々のこのような刊行物または文書が具体的かつ個別に参考として本明細書に援用されるかのように、参考として本明細書に援用される。刊行物および特許文書の引用は、いずれも適切な先行技術であるであることの認可ではなく、またこの引用がこれらの内容または日付に関してのいかなる認可をも構成するものではない。本発明はここで書かれた説明によって記載されてきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、ならびに上記の記載および以下の実施例が例示目的であって、上記の特許請求の範囲の限定ではないことを理解している。
【実施例】
【０２１０】
（実施例１）
（大規模アプタマー合成および結合体化）
ＡＲＣ１２６（５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）は、ＰＤＧＦに特異的な２９ヌクレオチドアプタマー（３’末端における逆方向Ｔを除く）であり、これは、ヌクレアーゼ攻撃に対する安定性の増強のために３’逆方向ｄＴキャップを含む。ＰＥＧ部分は、引き続く結合体化反応のための５’アミノ末端修飾基を使用することによってＡＲＣ１２６に結合体化され得る。合成は、標準的な固相ホスホルアミダイトケミストリーを使用して実行した。オリゴヌクレオチドは、室温で１２時間、水酸化アンモニウム／メチルアミン（１：１）を用いて脱保護し、イオン交換ＨＰＬＣによって精製した。ＡＲＣ１２８（５’−（配列番号４）−ＨＥＧ−（配列番号５）−ＨＥＧ−（配列番号６）−３’ｄＴ−３’）（もはやＰＤＧＦに結合しない不活性変異体）は同じ方法を使用して合成した。
【０２１１】
ＡＲＣ１２６は、いくつかの異なるＰＥＧ部分に結合体化した：２０ｋＤａ  ＰＥＧ（ＡＲＣ２４０（５’−［２０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’））；３０ｋＤａ  ＰＥＧ（ＡＲＣ３０８（５’−［３０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’））；４０ｋＤａ  ＰＥＧ（ＡＲＣ１２７（５’−［４０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’））。ＡＲＣ１２６を、１００ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ８．５に２ｍＭまで溶解し、等量のアセトニトリル中の、２．５モル濃度過剰のｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ  ２０ｋＤａ）またはｍＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ＭＷ  ４０ｋＤａ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と１時間、および３．５モル濃度過剰のｍＰＥＧ−ｎＰＮＣ（ＭＷ  ３０ｋＤａ）（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）（２４時間の間）と、１時間反応させた。次いで、得られる生成物を、ＮａＣｌ水溶液を溶離剤として使用する５０ｍｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上のイオン交換ＨＰＬＣによって精製した。次いで、結合体化オリゴヌクレオチドを、水／アセトニトリルグラジエントを使用する１００ｍｌ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｓ（Ｔｏｓｏｈ）カラム上で脱塩した。アプタマー結合体は保存のために凍結乾燥した。
【０２１２】
動物モデルにおいてＡＲＣ１２７を使用することを可能にするために、合成された物質の品質は、エンドトキシン濃度について試験することを必要とした。合成されたＡＲＣ１２７のエンドトキシン含量はＬＡＬ試験を使用して決定した（Ｎｅｌｓｏｎ  Ｌａｂｓ，ＡＺによって実施された）。エンドトキシン試験についての結果を以下の表１に示す。検出されたエンドトキシンの量は、滅菌洗浄溶液のためのＩＳＯ標準（０．５ＥＵ／ｍＬ）より下であり、すなわち、ＩＶ投与のために許容されている濃度より下であった。このことは、ＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７の調製物が滅菌されており、かつ動物の効力モデルに進むことが可能であることを示した。
【０２１３】
【表１】
2007525177.tif 000005
脱フッ素化ＡＲＣ−１２６アプタマー変異体の小規模合成は、標準的な固相ホスホルアミダイトケミストリーおよびベンダーの推奨するカップリングプロトコールを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ’  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）シンセサイザー上で行った。アプタマーを、２５０μＬの水酸化アンモニウム／４０％メチルアミン水溶液（１：１）をカラム支持体に加えることによって切断および脱保護化し、３０分間６５℃の加熱ブロック中に配置した。アプタマーをＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）中で乾燥させ、次いで２００μＬ  ｄｉＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＨＰＬＣ精製を、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＷＡＶＥ  ＨＰＬＣ（Ｏｍａｈａ，ＮＥ）上で実行した。イオン交換のために使用したカラムはＤＮＡＰＡＣ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＲｅｓｏｕｒｃｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。緩衝液Ａ：２５ｍＭ  リン酸ナトリウム／２５％  アセトニトリル；緩衝液Ｂ：２５ｍＭ  リン酸ナトリウム／４００ｍＭ  過塩素酸ナトリウム／２５％  アセトニトリル、０〜８０％のグラジエントを使用した。次いで、精製した画分をプールし、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ中で乾燥させ、２００μＬ  ｄｉＨ２Ｏ中に再懸濁した。
【０２１４】
（実施例２）
（フッ素化アプタマーを用いる安定性研究）
研究室内で新鮮に合成したＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７を、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）によって合成され、−２０℃で２年間凍結乾燥状態で保存されたＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７（レガシーアプタマー）と比較した。
【０２１５】
研究室内で合成されたＡＲＣ１２７およびレガシーＡＲＣ１２７は、分析のためにイオン交換ＨＰＬＣカラムを通過させた。図５Ａは、新鮮に合成されたＡＲＣ１２７およびレガシーＡＲＣ１２７のイオン交換ＨＰＬＣ分析の追跡であり、−２０℃で凍結保存状態で２年間の保存後、比較的レガシーＡＲＣ１２７の分解がないことが検出された。
【０２１６】
２年間−２０℃で保存されたレガシーＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７のアプタマーはまた、３Ｔ３細胞増殖アッセイを使用して、効力について試験し、研究室内で新鮮に合成したＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７と比較した（実施例３）。図５Ｂは、効力についての細胞に基づくアッセイ結果が、−２０℃で２年間の凍結乾燥および保存の後でさえ、レガシーアプタマーは、研究室内で新規に合成したＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７と全く同程度の強度であったことを示す。
【０２１７】
（実施例３）
（ＡＲＣ１２６変異体の組成および配列）
ＡＲＣ１２６と名付けられた抗ＰＤＧＦアプタマーの配列および二次構造を図６Ａに示す。２’−フルオロ置換基を有するヌクレオチドが置換されているＡＲＣ１２６の誘導体の配列および二次構造を図６Ｂに示す。２つの内部ステムの末端に示されるループはポリエチレングリコール−６（ＰＥＧ−６）スペーサーであり、かつ修飾ヌクレオチドは以下によって表される：ｄＡ＝デオキシアデノシン；ｄＧ＝デオキシグアノシン；ｍＡ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｄＴ＝デオキシチミジン；ｄＣ＝デオキシシトシン；ｍＴ＝２’−Ｏ−メチルチミジン；ｍＧ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｍＣ＝２’−Ｏ−メチルシトシン；［３’Ｔ］＝逆方向デオキシチミジン；ｆＣ＝２’−フルオロシトシン；およびｆＵ＝２’−フルオロウリジン。
【０２１８】
図６Ａに示されるように、ＡＲＣ１２６の２９ヌクレオチド組成物は７つの２’−フルオロ残基を含む（３つの２’−フルオロウリジンおよび４つの２’−フルオロシトシン）。分解産物の遺伝毒性を含む配慮に起因して、ＡＲＣ１２６の組成の最適化は、既存の分子の効力または安定性を損なうことなく、２’−フルオロ残基のすべてまたは大部分を除去するように配列組成を改変する目的を伴う。２’−フルオロ残基の除去のための１つの手段は、７つすべての２’−フルオロ残基のデオキシ残基への単純置換からなる。このようなすべてのＤＮＡのＡＲＣ１２６の変異体（ＡＲＣ２９９と名付けられた）（配列番号５９−ＰＥＧ−配列番号６０−ＰＥＧ−配列番号６１、ここでＰＥＧ＝ＰＥＧ−６スペーサー）を合成し、インビトロ生化学的結合および細胞ベースの増殖アッセイにおいて試験した。これらの実験は、ＡＲＣ１２６の２９マー組成物におけるすべての２’−フルオロ残基のデオキシ残基への単純置換が、中央および上部のステム中で不安定性を誘導し、活性／効力の有意な減少をもたらしたことを示した。
【０２１９】
ＡＲＣ１２６からの２’−フルオロ残基の除去をもたらすために取られる第２のアプローチは、すべてのデオキシ組成物で観察された中央および上部のステムにおける塩基対の比較的な不安定さを緩和するための、単独でまたはブロックでのいずれかにおける、２’−フルオロ残基の代わりに２’−Ｏ−メチル残基での置換であった。多数の組成変異体が合成され、これは、２’−フルオロ残基の代わりの２’−Ｏ−メチルまたはデオキシ残基の単一点置換を表し（ＡＲＣ２７７、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’）、ならびに２’−フルオロ残基の代わりの２’−Ｏ−メチル残基のブロック置換を表し（ＡＲＣ３３７、５’−（配列番号５９）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号６９）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３８、５’−（配列番号７０）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号７１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３９、５’−（配列番号６５）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号７２）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４０、５’−（配列番号６７）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号６９）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３７、５’−（配列番号５９）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号６９）−３’Ｔ−３’）、単一置換とブロック置換の組み合わせ（ＡＲＣ３４１、５’−（配列番号９９）−ＰＥＧ−（配列番号５４）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４２、５’−（配列番号７３）−ＰＥＧ−（配列番号５）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４４、５’−（配列番号７４）−ＰＥＧ−（配列番号５４）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４５、５’−（配列番号９９）−ＰＥＧ−（配列番号７５）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４６、５’−（配列番号９９）−ＰＥＧ−（配列番号７６）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４７、５’−（配列番号７７）−ＰＥＧ−（配列番号７８）−ＰＥＧ−（配列番号７９）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６２、５’−（配列番号９９）−ＰＥＧ−（配列番号５４）−ＰＥＧ−（配列番号８０）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６３、５’−（配列番号８１）−ＰＥＧ−（配列番号５４）−ＰＥＧ−（配列番号８２）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６４、５’−（配列番号６７）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号８３）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６５、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８３）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６６、５’−（配列番号８４）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８３）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０４、５’−（配列番号７３）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０５、５’−（配列番号７４）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０６、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号７５）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０７、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号７６）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０８、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８０）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０９、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号５）−ＰＥＧ−（配列番号８１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４１０、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号６９）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８７）−３’Ｔ−３’）；ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８８）−３’Ｔ−３’）；ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８９）−３’Ｔ−３’）；およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号９０）−３’Ｔ−３’）ならびに最後に、すべて２’−Ｏ−メチルの組成物（ＡＲＣ３００（または３００Ｂ）５’−（配列番号６２）−ＰＥＧ−（配列番号６３）−ＰＥＧ−（配列番号６４）−３’Ｔ−３）を表す。他の組成物変異体には以下が含まれる：ＡＲＣ２７６、５’−（配列番号９９）−ＰＥＧ−（配列番号５４）−ＰＥＧ−（配列番号５５）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３５、５’−（配列番号６５）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号６６）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３６、５’−（配列番号６７）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号６８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４３、５’−（配列番号７０）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−３’Ｔ−３’。
【０２２０】
以下の表２は、合成されかつ試験されたすべてのＡＲＣ１２６変異体の配列および組成を要約する。示される配列は、表の左から右に、５’→３’の方向で列挙される。表２はまた、実施例５において以下に記載されるインビトロアッセイ（競合結合アッセイおよび３Ｔ３増殖アッセイ）において合成されかつ試験されたすべてのＡＲＣ１２６変異体の組成の同一性ならびに平均親和性および活性を要約する。この表において、ｄ＝デオキシ残基；ｆ＝２’−フルオロ残基；ｍ＝２’−Ｏ−メチル残基；ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６）スペーサー；３Ｔ＝逆方向デオキシチミジンである。
【０２２１】
【表２】
2007525177.tif 000006
合成後、これらの組成の変異体を、本明細書に記載されるインビトロ生化学的結合および細胞に基づく増殖アッセイにおいて試験する。これらの実験は、インビトロ競合結合アッセイにおいて広範な親和性を、および細胞に基づく増殖アッセイにおいて同様に広範な活性を示した（結果は以下に記載される）。最大濃度の結合親和性および細胞に基づくアッセイ活性を示した組成変異体は、図６Ｂにおいて示されるＡＲＣ５１３〜５１６のシリーズによって例示される。図６Ｂは、最適組成のＡＲＣ１２６の変異体：ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８７）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８８）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８９）−３’ｄＴ−３’）、およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号９０）−３’ｄＴ−３’）を示す。図６Ｂから、すべての最適組成変異体は、ＡＲＣ１２６と比較して、２塩基対延長されたステム、上部のステムにおいては、２’−フルオロ残基の代わりの２’−Ｏ−メチル残基の点置換、およびＡＲＣ１２６からの既存の２’−Ｏ−メチル残基の共通のセットからなる。組成変異体ＡＲＣ５１３〜５１６は２つの点においてのみ異なる：（１）中央ステムにおける３つの３’末端グアノシン残基のデオキシまたは２’フルオロの同一性；および（２）３’側の中央ステムの上部のシトシン残基のデオキシまたは２’−Ｏ−メチルの同一性。
【０２２２】
ＰＤＧＦについての最適組成変異体のインビトロ結合親和性は、図７Ａにおいて示される。この図において示されるデータは競合結合アッセイに由来し、ここでは非標識のコンペティターアプタマーの示される濃度が、固定量の（＜０．１ｎＭ）アプタマーのコグネイト標的（ＰＤＧＦ−ＢＢ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含む緩衝液中の固定量（＜０．１ｎＭ）の３２Ｐ放射性標識ＡＲＣ１２６アプタマーに対して、別々の反応において力価測定した。ＡＲＣ１２６は、３２Ｐ−ＡＴＰ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）およびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（「ＮＥＢ」），Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）とのインキュベーションによって５’末端で放射性標識した。結合反応は、０．２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＮＥＢ）および０．０２ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で実行した。反応は、室温で１５〜３０分間の時間で平衡に達し、次いで、ニトロセルロース（Ｐｒｏｔａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびナイロン（Ｈｙｂｏｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のメンブレンのサンドイッチを通して濾過し、遊離アプタマーから標的結合アプタマーを分離した。引き続く、各濃度の非標識アプタマーに対応するフィルターメンブレンのオートラジオグラフィー分析は、非標識アプタマーによる３２Ｐ−ＡＲＣ１２６の競合的置き換えの程度を示した。このデータは図７に示され、ここでは、ＡＲＣ１２８（５’−（配列番号４）−ＨＥＧ−（配列番号５）−ＨＥＧ−（配列番号６）−３’）が、ＡＲＣ１２６が配列スクランブル、つまり、ＡＲＣ１２６の不活性変異体を表す。
【０２２３】
図７Ｂは、ＡＲＣ１２６のいくつかの組成変異体の活性を示す、３Ｔ３細胞に基づくインビトロ増殖アッセイのデータを示す。ラット線維芽細胞細胞株である３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中でのアッセイの開始の１日前に、９６ウェルプレート中に３，０００細胞／ウェルでプレートした。翌日、細胞を、ストレートＤＭＥＭで１回洗浄し、次いで７５μｌ  ＤＭＥＭ／０．８％  ＦＣＳを各ウェルに加えた。次いで２５μｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、５０ｎｇ／ｍｌ＋／−ＡＲＣ１２６変異体の最終濃度（６点、０〜２００ｎＭの最終濃度）で各ウェルに加えた。細胞を３日間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ  ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに加え、さらに１．５時間インキュベートした。次いで培地を除去し、２００μｌイソプロパノール（２−プロパノール）を各ウェルに加え、細胞を徹底的に再懸濁させ、５７０ｎｍにおける吸収を９６ウェルプレートリーダーで読み取った。図７Ｂにおいて示されるように、以下のことが明確である（１）示されるすべての組成変異体が活性であること；および（２）ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８７）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８８）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８９）−３’ｄＴ−３’）、およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号９０）−３’ｄＴ−３’）の相対活性の順位は同様である。
【０２２４】
インビボでの薬物動態学的特性および生物分布特性の最適化。標的結合親和性およびインビトロでの細胞に基づくアッセイ活性に関するＡＲＣ１２６の配列組成の最適化に加えて、以前に記載した抗ＰＤＧＦアプタマーについての最適配列組成の、インビボでの薬物動態学的（ＰＫ）半減期、ｔ１／２、および生物分布特性を最適化することが望ましい。アプタマー組成の薬物動態学的特性および生物分布特性の調節は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（１つもしくは複数）との、３’もしくは５’末端、または内部部位（１つもしくは複数）の結合体化（すなわち、ＰＥＧ化）（範囲は〜２ｋＤ〜１００ｋＤ、典型的には、２ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、５０ｋＤの分子量を有するＰＥＧ）を介して遂行され得る（２００３年１１月２１日に出願された米国シリアル番号１０／７１８，８３３、および２００４年３月５日に出願された米国シリアル番号６０／６６０，７９０を参照のこと）。
【０２２５】
所定のＰＥＧ化アプタマー配列組成を使用することの実行可能性を確立するために、推定のＰＥＧ化が、インビトロ結合および細胞に基づく増殖アッセイにおいてアプタマーの活性を有意に妨害しないことを確認することが必要であった。図８Ａは、ＮＨ２−ＡＲＣ１２６（５’−アミン−修飾ＡＲＣ１２６、ＰＥＧなし）、ならびに３０ｋＤ（ＡＲＣ３０８）までおよび４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）までのＰＥＧ基をそれぞれ５’結合体化した２つの変異体についての競合結合アッセイ曲線を示す。競合結合アッセイは、５’−３２Ｐ−ＡＲＣ１２６ではなく３’−３２Ｐ標識ＮＨ２−ＡＲＣ１２６を使用した以外は本明細書に記載したように実行および分析した（ＡＲＣ１２６ヌクレオチド配列は３’末端に逆方向チミジンを取り込み、これは、ポリヌクレオチドキナーゼによって触媒される放射性標識反応のための基質である）。
【０２２６】
図８Ａは、ＡＲＣ１２６ならびに３０ｋＤ（ＡＲＣ３０８）までおよび４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）までのＰＥＧ基を５’結合体化した２つの変異体についての競合結合アッセイのプロットである。図８Ｂは、５’ＰＥＧ基結合体化（ＡＲＣ１２６＋３０ｋＤ＝ＡＲＣ３０８、およびＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ＝ＡＲＣ１２７）の関数としてのＡＲＣ１２６についてのインビトロ３Ｔ３細胞に基づく増殖アッセイデータを示す。図８Ｂに示されるデータは、３０ｋＤおよび４０ｋＤのＰＥＧ基へのＡＲＣ１２６の５’結合体化が、アプタマーのインビトロ活性においてわすかな減少をもたらすらしいこと、ＰＥＧ基の存在の効果が、ＰＥＧ化されていないアプタマー、ＡＲＣ１２６と比較して２倍未満であることを実証する。図８Ｂにおいて示されるデータはまた、３０ｋＤおよび４０ｋＤのＰＥＧ基へのＡＲＣ１２６の５’結合体化が、ＡＲＣ１２６の組成と比較して、アプタマーのインビトロ活性を有意に減少しないことを実証する。
【０２２７】
図９Ａは、５’ＰＥＧ基結合体化の関数としてのＡＲＣ１２６のインビボ薬物動態学を示す。研究は、実施例１０に記載されるようなＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において行われた。図より、末端クリアランス半減期、ｔ１／２が、アプタマーに結合体化された５’ＰＥＧ基のサイズによって強く影響されることが明白である。
【０２２８】
図９Ａに示される薬物動態学（ＰＫ）データは、業界標準ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用する非区画分析（ＮＣＡ）に供した。以下の表３は、マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇでの静脈内（ＩＶ）投与後のＡＲＣ１２６＋２０ｋＤ（ＡＲＣ２４０）、＋３０ｋＤ（ＡＲＣ３０８）、および＋４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）ＰＥＧ基についての主要なＮＣＡ由来のインビボ薬物動態学（ＰＫ）パラメーターを列挙する。表３に示されるデータは、ＡＲＣ１２６のインビボ薬物動態学クリアランス半減期、ｔ１／２が、２０ｋＤ〜４０ｋＤまでのアプタマーに結合体化された５’ＰＥＧ基のサイズによって影響された、アプタマーに結合体化された５’ＰＥＧ基のサイズを変化させることによって≧４倍調節されることを実証する。図９Ｂは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度で、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、および皮下（ＳＣ）での投与後の、ＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）のインビボ薬物動態学プロフィールを示す。図９Ｂにおいて示される薬物動態学（ＰＫ）データは、業界標準ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用する非区画分析（ＮＣＡ）に供した。
【０２２９】
【表３】
2007525177.tif 000007
以下の表４は、マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇの投与の経路の関数としての、ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧについての一次ＮＣＡ由来のインビボ薬物動態学（ＰＫ）パラメーターを列挙する。図９Ｂにおいて示される薬物動態学（ＰＫ）データは、業界標準ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用する非区画分析（ＮＣＡ）に供した。
【０２３０】
【表４】
2007525177.tif 000008
図９Ｂに示されるデータから、２つの主要な点が明白である：（１）マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度で、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、および皮下（ＳＣ）での投与後、ＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）の薬物動態学は、〜１μＭの血漿濃度が投薬２４時間後に存在していること；および（２）ＡＲＣ１２７の全身性生物学的利用能、Ｆは、腹腔内（ＩＰ）投与後にかなり高い（〜６３％）のに対し、皮下（ＳＣ）投与については生物学的利用能は、臨床的適用のための考慮を保証するためになお十分である（〜２４％）。
【０２３１】
ＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）の血漿薬物動態学とインビボ生物活性の両方の第２の試験として、図７を参照すると上記に記載されている競合結合アッセイを使用して、図９Ｂに示されるデータを生成するために使用されたのと同じ血漿サンプルをアッセイした。血漿サンプルの段階的な１：１０希釈を、リン酸緩衝化生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で調製し、固定濃度の３２Ｐ−ＡＲＣ１２６と混合し、次いでヒトＰＤＧＦ−ＢＢに加えた。各アッセイにおけるＰＤＧＦの最終濃度は０．１ｎＭであり、３２Ｐ−ＡＲＣ１２６の最終濃度は＜０．１ｎＭであった。この実験において、血漿試料を、１×ＰＢＳ中の既知のＡＲＣ１２７濃度のサンプルを用いて生成した標準曲線との比較によって分析した。参照標準との比較によって、各血漿サンプル中の活性アプタマーの有効濃度が計算され得る。血漿ＰＫサンプルの競合結合アッセイ分析の結果を使用して計算されるような活性アプタマーの有効濃度は、図９Ｃに示される。図９Ｃは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度での静脈内（ＩＶ）投与後のＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧの生物活性プロフィールを示す。従って、このエキソビボ分析は、（１）ｔ＝投薬後４８時間におけるマウスモデルの血漿においてアプタマーが存在しかつ活性であったこと；および（２）蛍光に基づく薬物動態学アッセイから計算された血漿濃度が正確であることの確証を提供する。
【０２３２】
（実施例４）
（ＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７の種交差活性）
ＡＲＣ１２６が結合するＰＤＧＦのアイソフォームを決定するための研究を実行した。ヒトＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−ＡＢ（すべてＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪより）への結合についてＡＲＣ１２６を試験するために、以前に記載されたドットブロット分析を使用する競合結合アッセイを設定した。競合結合アッセイの結果は、ＡＲＣ１２６（配列番号４）が約１００ｐＭのＫｄでＰＤＧＦ−ＢＢに結合し、約１００ｐＭのＫｄでＰＤＧＦ−ＡＢに結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＡに結合しないことを示す（図１０Ａ）。次に、ＡＲＣ１２６がヒト以外の種のＰＤＧＦ−ＢＢと交差反応するか否かを決定するための研究を行った。ヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を使用する、以前に記載されたようなドットブロット分析によって競合結合アッセイを設定した。競合結合アッセイの結果は、ＡＲＣ１２６が、ヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢと等しい親和性で結合することを示す（図１０Ｂ）。
【０２３３】
（実施例５）
（３Ｔ３細胞増殖アッセイ）
ＡＲＣ１２６はヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢと交差反応することが示されたので、ラット線維芽細胞由来である３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、すべてのアプタマー（脱フッ素化効果の一部として得られたアプタマーを含む）の効力を試験するための増殖アッセイにおいて使用し得る。３Ｔ３線維芽細胞はそれらの細胞表面にＰＤＧＦレセプターを有し、かつ分裂促進因子、例えば、増殖によるＰＤＧＦ刺激に応答する。アッセイを以下のように実行した：３Ｔ３細胞を、１００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中でのアッセイ開始の１日前に９６ウェルプレート中に３，０００細胞／ウェルでプレートした。翌日、細胞を、ストレートＤＭＥＭで１回洗浄し、次いで７５μｌ  ＤＭＥＭ／０．８％  ＦＣＳを各ウェルに加えた。次いで２５μｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、５０ｎｇ／ｍｌ最終濃度で、試験される各ウェル＋／−アプタマー条件に加えた。各プレートには以下の条件を３連で含めた：分裂促進因子を伴わない増殖に対応するＰＤＧＦなし（ネガティブコントロール）、増殖速度に対する効果が観察されないスクランブルアプタマーコントロール（ＡＲＣ１２８）（ネガティブコントロール）、最大増殖がＰＤＧＦアプタマーの非存在下で観察されるポジティブコントロール、およびそこから良好なＩＣ５０曲線が計算され得る一連の機能的ＰＤＧＦアプタマー希釈。機能的ＰＤＧＦアプタマー希釈は、通常２倍の段階希釈の６点からなる。
【０２３４】
細胞を３日間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ  ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに加え、さらに１．５時間インキュベートした。次いで培地を除去し、２００μｌイソプロパノール（２−プロパノール）を各ウェルに加え、細胞を徹底的に再懸濁させ、５７０ｎｍにおける吸収を９６ウェルプレートリーダーで読み取った。本実施例は、図１１Ａに示されるように、ＰＤＧＦ中和ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の効力とのＰＤＧＦアプタマーＡＲＣ１２７の効力の比較を示す。図１１Ａにおけるデータは、アプタマーがポリクローナル抗体よりも良好な効力を示すことを実証する。
【０２３５】
３Ｔ３細胞増殖アッセイを、ＡＲＣ１２６、ＡＲＣ１２７、ＡＲＣ１２８、および上記の実施例１に記載されるように得られた他のすべてのＰＤＧＦアプタマー誘導体を用いて実行した。ＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７は、日常的に＜２０ｎＭのＩＣ５０値を示し、ここでスクランブルコントロールＡＲＣ１２８は３Ｔ３細胞増殖を全く示さなかった。以下の表５は３Ｔ３増殖アッセイにおけるＡＲＣ１２６変異体のＩＣ５０を示す。
【０２３６】
【表５】
2007525177.tif 000009
ＡＲＣ１２７ＰＤＧＦアプタマーはまた、化合物ＡＧ１２９５およびＡＧ１４３３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの既知のチロシンキナーゼ阻害剤よりも良好に３Ｔ３細胞の増殖をブロックした。アッセイ条件は、上記と正確に同じであった。ＡＲＣ１２７は、ＰＤＧＦによって駆動される増殖の増加を、３０ｎＭまで低い濃度においてバックグラウンド濃度にまで低下させた。両方のＡＧ化合物は、ＡＲＣ１２７と比較してはるかに悪い効力を示した。ＡＧ−１４３３は、マイクロモル濃度濃度で非特異的な毒性効果を有するようであった。この効果は、シグナル濃度が処理なし単独サンプルよりも低い３００ｎＭから見られ、ＡＧ化合物の存在下のみでの細胞の致死性に起因するシグナルの損失に対応する（図１１Ｂ）。
【０２３７】
（実施例６）
（３Ｔ３細胞生存率アッセイ）
ＡＲＣ１２６、ＡＲＣ１２７、および他の活性なＰＤＧＦアプタマー誘導体の付加に際して実施例５において記載された細胞増殖アッセイにおいて観察された３Ｔ３細胞の増殖の減少は、潜在的にはアプタマーの毒性効果に起因し得る。この可能性を試験するために、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ細胞生存率アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を実行した。３Ｔ３細胞を３，０００細胞／ウェルでプレートし、種々の濃度のＰＤＧＦアプタマーで処理し、４０μＭまでを２４時間および４８時間試験した。ＴＮＦα（１００ｐｇ／ｍｌ）を供給し、アポトーシスを誘導するためのポジティブコントロールとして使用した。インキュベーション後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭを製造業者の推奨する指示書に従って調製し、３０分間インキュベートし、蛍光シグナル強度を９６ウェルプレートリーダー上で測定した。ＡＲＣ１２７に起因する３Ｔ３細胞のアポトーシス速度の増加は観察されなかった（図１２）。
【０２３８】
（実施例７）
（３Ｔ３またはＲＰＥ細胞移動アッセイ）
ＰＤＧＦは強力な分裂促進因子ならびに化学誘引物質である。２４ウェル形式と９６ウェル形式の両方で実行される移動アッセイを、ＡＲＣ１２７の効力を試験するためのさらなる機能的アッセイとして選択した。細胞移動アッセイにおいて、８０，０００細胞３Ｔ３ラット線維芽細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓｓａｓ，ＶＡ）またはＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓｓａｓ，ＶＡ）を８ミクロンフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を伴う２４ウェルプレートにウェルあたりでプレートした。０．５ｍｌ  ＤＭＥＭ／０．２％  ＦＣＳをトップチャンバーに加え、０．８ｍｌ  ＤＭＥＭ／０．２％ＦＣＳをボトムチャンバーに加えた。系を３７℃で４時間インキュベートすることにより平衡化した。ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）（ＲＰＥ細胞について）またはラットＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）（３Ｔ３細胞について）をボトムチャンバーに加えた（最終濃度０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）。系を４時間〜１２時間インキュベートした。細胞を、Ｑ−チップを用いてフィルターの上端からかき取った。フィルターの底に移動した細胞を、冷５０％メタノール／５０％アセトンの混合物で３分間固定した。
【０２３９】
インキュベーション後、フィルターを１×ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｅｍｓａ  Ｓｔａｉｎ（Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｃｏｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ）で１〜２時間染色し、移動を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡で写真撮影することによって可視化した。具体的には、４つの異なる条件下での移動を可視化した：（１）ＰＤＧＦの非存在下で観察されたバックグラウンド移動；（２）５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢの存在下で観察された移動；（３）５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢおよび１００ｎＭ  機能的アプタマーＡＲＣ１２７の存在下で観察された移動；ならびに（４）５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢおよび１００ｎＭ  ＡＲＣ１２８スクランブルコントロールアプタマーの存在下で観察された移動。可視化された移動の結果は、バックグラウンド濃度の３Ｔ３細胞またはＲＰＥ細胞の移動によって示される、１００ｎＭ  ＡＲＣ１２７の存在が５ｎＭ  ＰＤＧＦ−ＢＢの効果を阻害することを示す。ＡＲＣ１２８スクランブルコントロールは活性を示さず、この条件において観察される移動は、５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢ単独で観察されるものと等しい。
【０２４０】
図１３は、ＱＣＭ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（＃ＥＣＭ  ５１０）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を使用して９６ウェル形式で実行された細胞移動実験の結果を示す。９６ウェル形式は、より定性的であった２４ウェル形式よりも細胞移動のより定量的な分析を可能にした。９６ウェルアッセイは、プレートおよび試薬を室温に移すことによって開始した。１５０μｌのＤＭＥＭ／０．２％  ＦＢＳを、化学誘引物質のあるなしでウェルのフィーダートレイに加えた。１００μｌ培地ＤＭＥＭ／０．２  ＦＢＳ中の２００，０００細胞ＲＰＥ細胞を移動チャンバーに加え、３７℃で１〜２４時間インキュベートした。
【０２４１】
インキュベーション後、移動チャンバーを除去し、非移動細胞を破棄した。移動細胞の数を冷蔵業者の推奨する指示書に従って定量した。手短に述べると、上部側からの培地を、残りの細胞懸濁液を反転することによって除去し、１５０μｌのあらかじめ温めた細胞脱離溶液を含む新たなフィーダートレイに配置した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ  Ｄｙｅ  １：７５を４×溶解緩衝液で希釈し、５０μｌの溶解緩衝液／色素溶液を、移動細胞を含む１５０μｌの溶液を含む各ウェルに加えた。この混合物をさらに、室温で１５分間インキュベートし、次いで、新鮮な９６ウェルプレートに移し、９６ウェルプレートリーダー上で４８０／５２０ｎｍにおいて吸収を読み取った。
【０２４２】
この９６ウェル形式細胞移動実験において得られた結果（図１３）は、２４ウェル形式において行われた細胞移動実験を確証した。ＡＲＣ１２７は移動レベルをバックグラウンドまで減少させ、ＡＲＣ１２８スクランブルアプタマーは移動に影響を与えなかった。図１３はまた、細胞数または加えられた分裂促進因子の濃度の関数として、観察された移動が直線的に増加することを示す。
【０２４３】
（実施例８）
（クローン原性増殖アッセイ）
Ｕ８７膠芽細胞腫（ＡＴＣＣ）を、分裂促進因子、ならびにパネルに示されるようなアプタマーの存在下または非存在下で増殖させた。Ｕ８７細胞を、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で、１００ｍｍディッシュ中の５０％コンフルエントまで、プレートした。細胞がコンフルエントとして現れるまで（１〜２日間）、細胞を、ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｔｏＴｅｃｈ）＋／−ＡＲＣ１２７とともにインキュベートした。最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＢＢ単独の付加は、高度に連結された三次元細胞クラスターの出現を生じた。５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢおよび１０ｎＭ〜１００ｎＭの機能的アプタマーＡＲＣ１２７の付加は、クラスターの発生をバックグラウンド濃度にまで減少した。アプタマーの存在は、ＭＴＴアッセイによって決定される細胞の増殖速度に効果を有しなかった。従って、アプタマーは、ＰＤＧＦが駆動するオートクラインループを有することが知られているＵ８７細胞の細胞対細胞接着をブロックした。ＡＲＤ１２７は、細胞対細胞接着によって示されるような、細胞表面に表示されるリガンドの別の細胞のレセプターへの結合をブロックしているらしい。
【０２４４】
（実施例９）
（ＰＤＧＦ駆動ＥＬＫルシフェラーゼアッセイ）
ＡＲＣ１２７  ＰＤＧＦアプタマーの活性をさらに検証するために、機構的Ｅｌｋルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを設定した。１０，０００  ３Ｔ３細胞を、９６ウェルプレート中のＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中にプレートした。これらに、ＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、３：１の比率で、５ｎｇのＥＬＫ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および２０ｎｇのｐＦＲ−ルシフェラーゼプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をトランスフェクトした。ＰＤＧＦを３Ｔ３細胞に５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加える場合、レポーター遺伝子に対する分裂促進因子の効果に対応するルシフェラーゼシグナルの増加が観察され得る。定常Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、ルシフェラーゼを検出するために使用した。これらの結果は、３ｎＭまで低いＡＲＣ１２７の濃度が、分裂促進因子がない濃度までルシフェラーゼシグナルを減少させることを示す。この分析から導き出されたＡＲＣ１２７のＩＣ５０は、＜２ｎＭである。図１４。
【０２４５】
（実施例１０）
（ＨＴ−２９およびＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおけるインビボデータ）
ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ３０８を用いるＰＤＧＦ−ＢＢおよび／またはそのレセプターの阻害が細胞毒性薬物の効力を増大するという仮説を試験するために、インビボ効力研究を確立した。
【０２４６】
実験の概要。ヒトＨＴ−２９またはＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片を、胸腺欠損ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において、マウスに１×１０７ＨＴ２９細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）または２×１０６ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を皮下注射すること、および５日間腫瘍を増殖させることによって樹立した。５日目に、樹立した腫瘍の二次元的測定を、デジタルカリパーによって取った。一旦腫瘍測定が取られたら、マウスを、平均腫瘍サイズが各群間で同じであるようにランダムに群に分けた。一旦ランダム化されたら、マウスをイリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）で処理した。イリノテカンは、ＰＤＧＦ遮断が細胞毒性薬物の効力を増加するか否かを決定するために、ＰＤＧＦ特異的アプタマーまたは他の低分子阻害剤を使用して、ＰＤＧＦ遮断の存在下または非存在下で結腸癌に対する効力を有することが示された細胞毒性薬物である。
【０２４７】
材料および方法。実験（実験１）を、ＨＴ２９結腸癌異種移植片モデルにおける用量最適化研究において、既知の化学療法剤ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）およびイリノテカンの組み合わせを試験するように設計した。以下の表６は、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用し、週に１回、腹腔内注射を介して１５０ｍｇ／ｋｇで投与される細胞傷害剤イリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）、ならびに毎日２回（月曜日から金曜日）経口的に５０ｍｇ／ｋｇで投与されるＰＤＧＦシグナル伝達をブロックする薬物ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いる、実験１の実験設計を要約する。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）の作用の様式は、ＰＤＧＦレセプター機能ならびに他の増殖因子の他のレセプターをブロックすることが知られているが、その効果は必ずしもＰＤＧＦ特異的である必要はない。この実験の結果を図１５Ａに示し、これは、イリノテカン毎週１５０ｍｇ／ｋｇ、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）５０ｍｇ／ｋｇ経口ＢＩＤ  Ｑｄ５、およびイリノテカン１５０ｍｇ／ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）５０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  Ｑｄ５組み合わせ治療の各々の治療計画についての移管の関数としての、群平均腫瘍直径（ｍｍ）のプロットを示す。これらのデータは、ＨＴ２９結腸癌異種移植片モデルにおいてＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）がイリノテカン単独の効力を増大することを示す。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）媒介ＰＤＧＦ遮断は、イリノテカン単独で治療した動物と比較した場合に、腫瘍増殖の速度の減少によって実証されるように、イリノテカン治療の効力を増強した。これらの結果は統計学的に有意であった（両側スチューデントＴ−検定）。
【０２４８】
【表６】
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別の実験（実験２）を、ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用する結腸癌異種移植片モデルにおいて、ＡＲＣ１２７およびイリノテカンを試験するために設計した。細胞毒性薬物、イリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）を、腹腔内送達を介して週に１回、１５０ｍｇ／ｋｇで投薬した。ＰＤＧＦシグナル伝達をブロックするために使用されるＡＲＣ１２７を、腹腔内送達を介して週に１回、５０ｍｇ／ｋｇで、およびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、経口的に１００ｍｇ／ｋｇで、１日１回（月曜日〜金曜日）で投薬した。ＡＲＣ１２７は、ＰＤＧＦ−ＢＢがＰＤＧＦレセプターに結合することを妨害し；かつ４０Ｋ  ＰＥＧが結合している。以下の表７は実験２についての実験設計を要約する。実験２からの結果を図１５Ｂに示し、これは、ＡＲＣ１２７が、イリノテカン単独で治療した動物と比較して、腫瘍増殖の速度の減少によって実証されるように、イリノテカン治療の効力を増強することを実証した。これらの結果は統計学的に有意であった（両側スチューデントＴ−検定）。データは、ＡＲＣ１２７が、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおいて、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／イリノテカン組み合わせ治療と、イリノテカン単独の両方よりも良好に、イリノテカンの効力を増大することを示す。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）投薬計画（１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回、月曜日〜金曜日、Ｐ．Ｏ．）は動物を瀕死状態にし、これらの群は実験の初期において終了した（図１５Ｂ）。
【０２４９】
【表７】
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第３の実験（実験２）を、ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ）を使用する結腸癌異種移植片モデルにおいて、ＡＲＣ３０８／イリノテカンおよびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／イリノテカンを試験するために設計した。細胞毒性薬物、イリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）を、腹腔内送達を介して週に１回、１５０ｍｇ／ｋｇで投薬した。ＡＲＣ３０８を、腹腔内送達を介して週に１回、５０ｍｇ／ｋｇで、およびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）を、経口的に５０ｍｇ／ｋｇで、１日１回（月曜日〜金曜日）で投薬した。ＡＲＣ３０８は、ＰＤＧＦ−ＢＢがＰＤＧＦレセプターに結合することを妨害し；この分子は結合した３０Ｋ  ＰＥＧを有する。実験３からの結果を図１６に示し、これは、ＡＲＣ３０８が、イリノテカン単独で治療した動物と比較して、腫瘍増殖の速度の減少によって実証されるように、イリノテカン治療の効力を増強することを実証した（図１６）。対照的に、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）投薬計画（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、月曜日〜金曜日、Ｐ．Ｏ．）はイリノテカンの効力を増強しなかった。これらの結果は統計学的に有意であった（両側スチューデントＴ−検定）。表８は実験３についての実験設計を要約する。
【０２５０】
【表８】
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要約すると、ＨＴ−２９およびＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおけるこれらのインビボ研究は、本発明の治療用アプタマーによってもたらされるＰＤＧＦ遮断がイリノテカン治療の効力を増大させ得ることを確証する。
【０２５１】
（実施例１１）
（腫瘍治療剤としてのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ二機能性アプタマー）
組み合わせ治療は、本発明のアプタマーを用いて結腸癌異種移植片において示されたように（実施例１０）、固形腫瘍の治療において単一薬剤治療を超えた利点を有する。同様に、固形腫瘍癌に関与する標的の１つより多くに結合することが可能であるアプタマーもまた、個々の治療薬剤の治療的効果を強化する際に有効である。このようなアプタマーは複数のタンパク質（または他の標的）を阻害し得、それゆえに化合物の組み合わせと実質的に等価な様式で作用する単一の化合物を提供する。他機能性アプタマーは、例えば、既知のアプタマーの組み合わせから操作され得る。これらの他機能性アプタマーは、複数の標的に結合することが示され得、固相化学合成によって直接的に、または対応するＤＮＡテンプレートからの転写によってのいずれかで生成され得る。このような他機能アプタマーの例には、癌の兆候のためにＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合可能なアプタマーが含まれる。
【０２５２】
以前に同定されたアプタマー（アプタマーの領域）から他機能アプタマーを設計するために、標的とは接触しない個々のアプタマーの領域を介して個々のアプタマーを結合させることが重要である。これは、典型的には、大部分のまたはすべての位置で個々のヌクレオチドの置換に耐容性である二次構造の領域を同定することによって達成され得る。ステムなどの構造単位が必要である場合、これらは、最終設計において保存され得る。さらに、個々のアプタマーの各々の構造的完全性が最終的なフォールディングした構造において保存されることが重要である。このことは、ｍｆｏｌｄなどのアルゴリズムを使用して元来のアプタマー配列の二次構造を予測すること、および次いで、それらが結合した構造の一部である場合には、同じアルゴリズムに従って、これらの予測二次構造がほぞんされていることを保証することによって最も容易に達成され得る。複数の最適および次善の二次構造を決定するための一般的なｍｆｏｌｄアルゴリズムは、プログラムの著者、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｋｅｒによって記載されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，４８−５２（１９８９））。アルゴリズムにおいて使用されるフォールディングパラメーターの記載は、Ｊａｅｇｇｅｒ、Ｔｕｒｎｅｒ、およびＺｕｋｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６，７７０５−７７１０において提示される（Ｍ．Ｚｕｋｅｒら、Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｉｎ  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．ＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＢ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ編、ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）もまた参照のこと）。核酸配列の二次構造を得るために本発明の方法に従って使用され得る他のプログラムには、非限定的に、ＲＮＡＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．：Ｓａｂｉｎａ，Ｊ．；Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．；およびＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．「Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８８，９１１−９４０（１９９９））およびＲｎａ  Ｖｉｚ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｎｏｖ．１５；２５（２２）：４６７９−８４（１９９７））が含まれる。
【０２５３】
二次構造モチーフおよび要素アプタマーの単位を決定すると、これらは、構成アプタマーの各々の機能を保存する様式でフォールディングする単一のオリゴヌクレオチドに合わせられる。結果として、他機能アプタマーは複数の標的に結合することが可能であり、かつ固相化学合成によって直接的に、または対応するＤＮＡテンプレートからの転写によってのいずれかで生成され得る。
【０２５４】
ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ二機能性アプタマー。本発明の方法を、ＰＤＧＦ  ＢＢにおよびＶＥＧＦに結合特異性を有するアプタマーを生成するために適用した。この多機能アプタマーを、ＳＥＬＥＸを使用して個々に同定される２つのアプタマー−１つ（ＡＲＣ２４５、配列番号７）（これはＶＥＧＦを認識するがＰＤＧＦを認識しない（図１７Ａを参照のこと））および１つ（ＡＲＣ１２６、５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）（これはＰＤＧＦを認識するがＶＥＧＦを認識しない（図１７Ｂを参照のこと））を連結することによって生成した。ＡＲＣ２４５（配列番号７）は、約２ｎＭのＫＤでＶＥＧＦに結合特異性を有する完全に２’Ｏメチル化された（２’−ＯＭｅ）アプタマーである。多価アプタマーにおいて使用されるＡＲＣ１２６は、約１００ｐＭのＫＤでＰＤＧＦに結合特異性を有する完全なＤＮＡである。
【０２５５】
この組み合わせから生じるＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに結合可能である多価アプタマーの構造および配列の図式、配列ＴＫ．１３１．０１２．Ａ（配列番号９）は図１８Ａに示される。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合可能である第２の多価アプタマー、配列ＴＫ．１３１．０１２．Ｂ（配列番号１０）もまた、ＡＲＣ２４５（配列番号７）およびＡＲＣ１２６を合わせることによって形成された。図１８Ｂに示されるように、このＶＥＧＦ−ＰＤＧＦ多価アプタマーにおいては、ＡＲＣ２４５のステムの最初のｍＡ−ｍＵ対が、ＡＲＣ２４５およびすべてのデオキシＡＲＣ１２６を連結するまえに徐供された。各々の場合において、図１８に示されるように、ＡＲＣ１２６  ＰＥＧリンカーの１つがＶＥＧＦ特異的アプタマーの付加のために除去され、他方は配列ｄＧｄＡｄＡｄＡを有するオリゴヌクレオチドリンカーで置換された。
【０２５６】
構成アプタマーおよび多価アプタマーについての結合データを、ドットブロットアッセイによって収集し、ここでは、放射性標識されたアプタマーがタンパク質標的とともにインキュベートされ、次いで、ナイロンの上のニトロセルロースのサンドイッチを通され、結果は図１９に示される。タンパク質結合放射性標識はニトロセルロースメンブレンに捕捉されるのに対して、放射性標識のバランスはナイロンメンブレン上に捕捉される。放射性標識データはホスホルイメージングプレート上に捕捉される。次いで、このデータを使用して結合定数を計算する。多価アプタマーＴＫ．１３１．０１２．Ａ（配列番号９）およびＴＫ．１３１．０１２．Ｂ（配列番号１０）は合成的に作製された。
【０２５７】
配列ＴＫ．１３１．０１２．Ａ（配列番号９）を有する多価アプタマーは、ＰＤＧＦについて約１０ｎＭ、およびＶＥＧＦについての約１０ｎＭのＫＤを示す。配列ＴＫ．１３１．０１２．Ｂ（配列番号１０）を有する多価アプタマーは、ＰＤＧＦについて約１０ｎＭ、およびＶＥＧＦについての約５ｎＭのＫＤを示す。
【０２５８】
（実施例１２）
（免疫刺激モチーフを含むＰＤＧＦおよびＶＥＧＦアプタマー）
ＣｐＧモチーフを含むアプタマーが固有の免疫応答を刺激する能力を試験するために、マウスＣｐｇモチーフを、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的なアプタマーに操作した。次いで、これらのアプタマーを、ＣｐＧモチーフの機能性（例えば、ＩＬ−６およびＴＮＦαの放出の刺激）を確証するために、インビトロマウス細胞ベースのアッセイにおいて使用した。これらのアプタマーをまた、その標的（この場合はＰＤＧＦ−Ｂ）へのアプタマーの結合の際のアプタマーを含むＣｐＧモチーフの機能性を確証するために、アプタマーメカニズムに基づく生物学的活性アッセイにおいて使用した（ＥＲＫリン酸化のＰＤＧＦ−Ｂ活性化に対するＣｐＧ−ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーの効果によって測定されるような、ＭＡＰＫ経路を通してのＰＤＧＦ−Ｂシグナル伝達）。
【０２５９】
組み込まれたかまたは付加されたＣｐＧモチーフを有する本明細書に開示されたアプタマーを生成するために、ＣｐＧモチーフ（「ＩＳＳ−ＯＤＮ」または「ＯＤＮ」）を含む、以前に同定された免疫刺激性オリゴヌクレオチドの配列を、約１００ｐｍのＫＤでＰＤＧＦ  ＡＢおよびＢＢに結合する、ＳＥＬＥＸプロセスを通して同定されたアプタマーであるＡＲＣ１２４に操作した。ＡＲＣ１２４の配列を以下に示す。
【０２６０】
（ＡＲＣ１２４）
【０２６１】
【化４】
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種々のＯＤＮ配列、全長とフラグメントの両方、またはその誘導体を、左から右に、５’→３’で以下に示す（ここで、＊はホスホロチオエート結合を示し、３ＩｎｖｄＴは３’位における逆方向Ｔを示す）。これらのＯＤＮ配列またはそのフラグメントはＰＤＧＦアプタマーに操作されるのに加えて、これらはまた、これらのアプタマーが免疫応答を刺激する能力をアッセイする際のコントロールとして使用された。
【０２６２】
【化５】
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ＩＳＳ−ＯＤＮは、Ｍａｒｔｉｎ−Ｏｒｚｃｏら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９．１１（７）：１１１１−１１１８から同定した。ＩＳＳ−ＯＤＮ２〜５はＩＳＳ−ＯＤＮのフラグメントである。ＯＤＮ２００６はＨａｒｔｍａｎｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．２００３．３３：１６３３−１６４１から同定した。ＯＤＮ２００６．２および２００６．３はＯＤＮ２００６のフラグメントである。
【０２６３】
ＣｐＧモチーフを含むＰＤＧＦアプタマーの配列を、左から右に、５’→３’で以下に示す（ここで、＊はホスホロチオエート結合を示し、３ＩｎｖｄＴは３’位における逆方向Ｔを示す）。これらのアプタマーの配列および二次構造の模式図を図２０に示す。
【０２６４】
【化６】
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上記に示されるように、ＩＳＳ−ＯＤＮおよびＯＤＮ  ２００６は、ＭＥＮＥ器刺激性であると報告されており、かつそれらの配列が文献に由来するホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドの短縮型バージョンは、それらの５’末端と３’末端の両方からそれらを短縮化することによって設計された。得られる構築物は、ＩＳＳ−ＯＤＮ２から５および２００６．２〜３である。新規に設計された構築物の各々が、免疫刺激能力に対する効果を評価するためにＩＬ−６放出アッセイにおいて試験された。ＩＬ−６放出を誘導する能力をなお保持していた短縮型構築物を、ＡＲＣ１２４の５’または３’末端のいずれかに付加される配列について選択した。ＣｐＧＣｐＧＡＲＣ１２４ショートａ．ｋ．ａ．ショートＡＲＣ１２４、ロングＣｐＧＡＲＣ１２４ａ．ｋ．ａ．ロングＡＲＣ１２４、および全長ＣｐＧＡＲＣ１２４ａ．ｋ．ａ．全長ＡＲＣ１２４と呼ばれる構築物は、ＩＳＳ−ＯＤＲ４がＡＲＣ１２４の５’−末端に付加されている構築物に対応する。これらの構築物は、それらの３’末端における逆方向のＴに加えて、それらの５’末端および３’末端にホスホロチオエート化された結合を有し、細胞に基づくアッセイにおける十分な安定性を保証するが、ＡＲＣ１２４に対応するコア中間部分はホスホロチオエート結合を含まない。
【０２６５】
ＡＲＣ１２４は、８〜９位および１３〜１４位において２つの天然に存在するＣｐＧアイランドを有する。トランスＡＲＣ１２４．１からトランスＡＲＣ１２４．１１の名称を有する構築物は、これらの２つの天然に存在するＣｐＧ配列を利用して免疫刺激配列を作製した構築物に対応し、この免疫刺激配列は、様々な長さのＴにおいて組み込まれているＣｐＧモチーフが最大の免疫刺激効果を作り出すという文献中の報告に基づいて、ＣｐＧ応答を最大化する。従って、ＡＲＣ１２４上で実行された変化は、１０〜１２位における非必須ＧＣＡバルジを種々のＴ残基で置換することからなる。免疫刺激効果に対する種々のＴバルジの効果、ならびに構築物の安定性に対するホルホロチオエートの付加の効果は、本明細書に記載されるように、ＩＬ−６放出アッセイおよびＥＲＫのリン酸化を用いて評価される。
【０２６６】
ネガティブコントロールのために、ＡＲＣ１２４を、ＣｐＧモチーフを除去するように操作した。これらのコントロール配列を以下に示す。
【０２６７】
【化７】
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本発明のＣｐＧアイランドを含むＰＤＧＦアプタマーの活性を、細胞に基づくアッセイにおいて試験した。Ｊ７７４Ａ．１細胞（ＴＩＢ細胞）（マウスマクロファージ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６７））の上清は、ＣｐＧモチーフの存在下では、ＣｐＧアイランドの存在下にない細胞よりも、より多くのＩＬ−６およびＴＮＦαを含む。従って、ＩＬ−６およびＴＮＦα固相ＥＬＩＳＡを使用して、ＣｐＧ配列を含む種々のオリゴヌクレオチドへの曝露の際に上清に放出されたＩＬ−６およびＴＮＦα（両方ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の濃度を定量した。ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡについては、マウスＩＬ−６に特異的なモノクローナル抗体を、９６ウェルマイクロプレートにプレコートした。マウスＩＬ−６に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を使用して、細胞上清から結合したあらゆるＩＬ−６を検出した。ＴＮＦαＥＬＩＳＡについては、マウスＴＮＦαに特異的なアフィニティー精製されたポリクローナル抗体を、９６ウェルプレートにプレコートした。マウスＴＮＦαに特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を使用して、細胞上清から結合したあらゆるＴＮＦαを検出した。両方のＥＬＩＳＡは、分光光度法によって定量される比色定量的な読み取りを使用した。
【０２６８】
Ｊ７７４Ａ．１細胞（ＴＩＢ細胞）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１００，０００細胞を、２４ウェルプレート上、適切な数のウェルに、実験の１日前にプレートした。ＣｐＧ組み込みＰＤＧＦアプタマーを、細胞とともに２４〜４８時間、３７℃、５％ＣＯＹでインキュベートした。アプタマーの最終濃度は１μＭおよび１０μＭであった。上清を、インキュベートの時間の点で収集し、８分間、５，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。遠心分離した上清を、ＩＬ−６またはＴＮＦα  ＥＬＩＳＡにおける使用まで、−２０℃で凍結した。両方の両方のＥＬＩＳＡを、製造業者の推奨に従って使用した。以前に免疫刺激性であると報告されたＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ  ＯＤＮおよびＯＤＮ２００６）をポジティブコントロールとして使用し、ＣｐＧを含有しないアプタマーをネガティブコントロールとして使用した。図２１Ａは、ポジティブコントロールとして標準ＯＤＮのみを使用し、ＣｐＧアイランドを含まないアプタマーをアッセイにおいてネガティブコントロールとして使用する、ＴＩＢ細胞中のＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡの結果を示す。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのみは、このアッセイがＣｐＧ誘導性ＩＬ−６を測定するために十分に強固であるか否かを確立するためにこの実験において使用した。図２１Ｂに示されるデータは、ＩＳＳ  ＯＤＮおよび短縮化バージョンのＩＳＳ  ＯＤＮが、ＯＤＮ２００６およびその短縮化バージョンよりも良好に、ＴＩＢ細胞中でＩＬ−６放出を誘導することを実証する。図２１Ｃは、ＣｐＧモチーフが組み込まれた、ＡＲＣ１２４のショート、ロング、および全長バージョンが、ＩＳＳ  ＯＤＮと同様にＴＩＢ細胞中でＩＬ−６放出を誘導することを示す。図２１Ｄに示されるデータは、トランスＡＲＣ１２４．１〜トランスＡＲＣ１２４．７（配列番号２３〜配列番号２９）がＴＩＢ細胞中でＩＬ−６放出を誘導することを示す。図２１Ｅに示されるデータは、トランスＡＲＣ１２４．１〜トランスＡＲＣ１２４．７がＴＩＢ細胞中でＴＮＦα放出を誘導することを示す。
【０２６９】
ＩＬ−６放出およびＴＮＦα放出のアッセイの結果は、ＣｐＧモチーフが既存のアプタマー（この場合はＡＲＣ１２４）に組み込まれる場合、そのアプタマーはＣｐＧ応答を誘発することが可能であることを示す。
【０２７０】
（実施例１３）
（ＥＲＫリン酸化アッセイにおけるＣｐＧアイランド含有ＰＤＧＦ）
ＥＲＫリン酸化を使用して、ＡＲＣ１２４（配列番号１１）がアプタマー配列へのＣｐＧモチーフの取り込み後にその機能を保持しているか否かを試験した。１５０，０００の３Ｔ３細胞（ＰＤＧＦ−Ｒを含むマウス線維芽細胞株）を、実験の１日前に、１２ウェルプレートの適切な数のウェルにプレートし、０．５％  ＦＢＳ中で、一晩、血清飢餓とした。細胞を、ＣｐＧアイランド含有ＰＤＧＦアプタマーの存在下または非存在下で、１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で３０分間処理した。細胞を収集し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１２５％  んＰ−４０、０．８７５％  Ｂｒｉｊ  ９７、１．５ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、および１つのｍｉｎｉ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔを含む溶解緩衝液で溶解させた。細胞溶解物中のタンパク質濃度は、製造業者の推奨に従って、ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイ試薬を使用して決定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。溶解物は、ＮｕＰａｇｅ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４×を、０．１Ｍ  ＤＴＴとともに、１×の最終濃度まで加えることによって調製し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、７０℃で７分間インキュベートした。４０μｇの全タンパク質をＮｕＰａｇｅ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の各ウェルにロードした。ゲルを１００ｍＡｍｐで１時間泳動した。次いで、ゲルをＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に。２５０ｍＡｍｐで３時間転写した。転写後、ニトロセルロースを、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、室温で１時間ブロックした。ニトロセルロースメンブレンを、ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ニトロセルロースメンブレンを、１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３×洗浄し、次いで、抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ−結合体化抗体とともに１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、ニトロセルロースメンブレンを、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３×洗浄した。メンブレンを、製造業者の推奨に従って、ＥＣＬ＋Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して発色させ、ＳＴＯＲＭ  ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してスキャンした。アプタマーなしでのＰＤＧＦ−ＢＢの存在下での３Ｔ３細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【０２７１】
結果は、ショートＡＲＣ１２４およびロングＡＲＣ１２４（両方とも既知のＣｐＧモチーフを有するＰＤＧＦアプタマーである）がなお機能的に活性であり、かつＰＤＧＦへの結合の際にＥＲＫのリン酸化をブロックし得ることを示す。
【０２７２】
集合的に、このデータは、ＣｐＧモチーフが既存のアプタマーに組み入れられるときに、このアプタマーはＣｐＧ応答を誘発することが可能であり、かつ非ＣｐＧ標的（例えば、ＰＤＧＦ）によって駆動される効果（例えば、ＥＲＫ−ＭＡＰＫリン酸化）を、ネイティブなアプタマーと同じ効力でブロックする能力をなお維持していることを示す。
【０２７３】
（実施例１４）
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  選択）
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  選択の概要）
ショート型のＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）についての１つの選択は、２−フルオロピリミジン含有プールを使用して完了する。選択のラウンド１は、α３２Ｐ  ＡＴＰボディー標識プールのスパイクを含む、２×１０１４分子の２’Ｆピリミジン修飾ＡＲＣ２１２プール（５’ＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＵＣＡＵＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡ−Ｎ４０−ＧＣＵＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡ）の、５０ｐモルのＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質との、最終濃度１００μＬ、室温で１時間のインキュベーションで開始した。選択を、１×ＳＨＭＣＫ緩衝液、ｐＨ  ７．４（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で実行した。ＲＮＡ：ＰＤＧＦ−ＡＡ複合体および遊離のＲＮＡ分子を、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）からの０．４５μｍニトロセルローススピンカラムを使用して分離した。カラムを１ｍｌ  １×ＳＨＭＣＫであらかじめ洗浄し、次いでＲＮＡ：タンパク質−含有溶液をカラムに加え、遠心分離機で１５００ｇ、２分間遠心分離した。緩衝液洗浄を実行して、フィルターから非特異的結合物を除去した（ラウンド１、２×５００μＬ  １×ＳＨＭＣＫ）。より後のラウンドでは、よりストリンジェントな洗浄（洗浄の数および量を増やす）を使用して特異的結合物を富化させ、次いでフィルターに結合したＲＮＡ：タンパク質結合体を、溶出緩衝液（７Ｍウレア、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、あらかじめ９５℃に加熱）の２×２００μｌ洗浄（より後のラウンドでは２×１００μＬ洗浄）で溶出させた。溶出したＲＮＡをフェノール：クロロホルム抽出し、次いで沈殿させた（４０μｇグリコゲン、１容量イソプロパノール）。ＲＮＡを、それらの指示書に従って、プライマーＫＭＴ。１０８．３８．Ｃ（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＧＡ３’）（配列番号９２）およびＫＭＴ。１０８．３８．Ｄ（５’ＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ３’）（配列番号９３）を使用して、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ（登録商標）システムを用いて逆転写し、その後にＰＣＲ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭ  ＫＭＴ．１０８．３８．Ｃ、０．５μＭ  ＫＭＴ．１０８．３８．Ｄ、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））による増幅を行った。ＰＣＲテンプレートはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。テンプレートを、３７℃で一晩のα３２Ｐ  ＡＴＰボディー標識（４％  ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、３ｍＭ  ２’ＯＨプリン、３ｍＭ２’Ｆピリミジン、２５ｍＭ  ＤＴＴ、無機ピロホスファターゼ、Ｔ７  Ｙ６３９Ｆ単一変異ＲＮＡポリメラーゼ、５μＣｉ  α３２Ｐ  ＡＴＰ）を使用して転写した。反応物を、製造業者の指示書に従ってＢｉｏ  Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して脱塩した。
【０２７４】
続くラウンドは、ラウンド１と同じ方法を使用して反復したが、ネガティブ選択工程を加えた。タンパク質標的とのインキュベーションの前に、プールＲＮＡを、０．４５ミクロンニトロセルロースを通して、フィルターに結合する配列を除去し、次いで、濾過をポジティブ選択工程で行った。代替的なラウンドにおいて、プールＲＮＡをゲル精製した。転写反応を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて停止させ、エタノール沈殿を行い、次いで１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍウレア、１０％アクリルアミド、１９：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上で精製した。プールＲＮＡを、Ｅｌｕｔｒａｐ（登録登録商標）装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）中での電気溶出（１×ＴＢＥ（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ  ホウ酸、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、２２５Ｖ、１時間）によってゲルから取り出した。溶出した物質を３００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２．５体積のエタノールの添加により沈殿させた。
【０２７５】
タンパク質濃度は最初の４ラウンドでは５００ｎＭであり、次いで連続するラウンドにわたって次第に低下した。コンペティターｔＲＮＡを、ラウンド２で開始して０．１ｍｇ／ｍＬで結合反応に加えた。全体で１１ラウンドが完了し、結合アッセイを選択ラウンドで実行した。表９は選択の詳細を含み、これは、各ラウンドで使用したプールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度、およびｔＲＮＡ濃度を含む。結合アッセイに伴う溶出値（タンパク質結合ＲＮＡ対フィルターカラムからの全体のＲＮＡの流出のＣＰＭの比率）を使用して、選択の進行をモニターした。
【０２７６】
【表９】
2007525177.tif 000017
（タンパク質結合分析）
ドットブロットアッセイを、プールのタンパク質結合親和性をモニターするために選択を通して実行した。痕跡量の３２Ｐ標識ＲＮＡをＰＤＧＦ−ＡＡと合わせて、１×ＳＨＭＣＫおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ中で、２０μｌの最終容量で、室温で３０分間インキュベートした。反応物をドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ）に加え、（上から下に）ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロットメンブレンを用いて組み立てた。タンパク質に結合したＲＮＡはニトロセルロースフィルターに捕捉されるのに対して、非タンパク質結合ＲＮＡはナイロンフィルターに捕捉される。ＰＤＧＦ−ＡＡの非存在下に対してＰＤＧＦ−ＡＡの存在下で、有意にポジティブなＲＮＡの結合の比率が見られた場合、プールを、製造業者の指示書に従ってＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してクローニングした。ラウンド１０プールテンプレートをクローニングし、１７個の配列が得られた。５個の異なる配列のみが見られ、これは２つの主要なファミリーおよび１つの独特な配列であった（２つのファミリーではなかった）。Ｋｄ決定のために、クローンＲＮＡ転写物をγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識した。Ｋｄ値を。ドットブロットアッセイを使用し、得られるデータに対して１：１  ＲＮＡ：タンパク質複合体を示す式にフィットさせて決定した（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ、図２３Ａおよび２３Ｂ）。タンパク質結合特徴付けの結果を表１０に集計する。ＰＤＧＦ−ＡＡに対して高い親和性を有するクローンを準備し、細胞に基づくアッセイにおいて機能性についてスクリーニングした。
【０２７７】
【表１０】
2007525177.tif 000018
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  アプタマー）
本発明のＰＤＧＦ−ＡＡショート型アプタマーの配列を表１１に提示する。
【０２７８】
【表１１】
2007525177.tif 000019
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  アプタマーを用いる細胞に基づくアッセイ）
インビトロ結合を示したＰＤＧＦ−ＡＡ  アプタマーを、それらがＰＤＧＦ−ＡＡ誘導性の３Ｔ３細胞増殖を阻害する能力について、３Ｔ３増殖アッセイにおいて試験した。アッセイを、以前に記載されたように、一定の濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）のＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマー（０〜１μＭ）の力価測定を使用して設定した。図２４に示される結果は、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーＡＲＸ３３Ｐ１．Ｄ２、ＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ５、およびＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ１０はＰＤＧＦ−ＡＡ誘導性３Ｔ３細胞増殖を阻害したが、さほど強力ではなかった。図２５は、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーがＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性３Ｔ３細胞増殖に効果を有しないことを示し、このことは、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーはＰＤＧＦ−ＡＡアイソフォームに高度に特異的であることを示す。
【０２７９】
本発明はここで書かれた説明および実施例によって記載されてきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、ならびに上記の記載および実施例が例示目的であって、上記の特許請求の範囲の限定ではないことを理解している。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ（登録商標））プロセスの模式図である。
【図２】図２は、ＰＤＧＦのアイソフォームＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、およびＡＢならびにコグネイトレセプターの模式図である。
【図３】図３は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、および他の軟部組織肉腫において見い出された癌細胞における構成的ＰＤＧＦレセプターシグナル伝達を生じる遺伝子変異の模式図である。
【図４】図４は、本発明の方法によるＰＤＧＦアンタゴニストありまたはアンタゴニストなしでの、腫瘍血管構造を横切る細胞毒の輸送の模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、新規に合成し、および−２０℃で２年間保存したＡＲＣ１２７（５’−［４０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）のイオン交換ＨＰＬＣ分析のプロットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、新規に合成し、および−２０℃で２年間保存したＡＲＣ１２６（５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）およびＡＲＣ１２７についての３Ｔ３細胞増殖アッセイの結果の棒グラフである。
【図６】図６Ａは、ＡＲＣ１２６の２’−フルオロ含有ＰＤＧＦアプタマー組成物の配列および二次構造の模式図である；図６Ｂは、ＡＲＣ１２６変異体、ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８７）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８８）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号８９）−３’ｄＴ−３’）、およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号８６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号９０）−３’ｄＴ−３’）の配列および二次構造の模式図である。
【図７】図７Ａは、ＡＲＣ１２６および組成変異体ＡＲＣ１２８（５’−（配列番号４）−ＨＥＧ−（配列番号５）−ＨＥＧ−（配列番号６）−３’）、ＡＲＣ５１３、ＡＲＣ５１４、ＡＲＣ５１５、ＡＲＣ５１６についての競合結合アッセイの結果のプロットである；図７ＢはＡＲＣ１２６のいくつかの組成変異体の活性を示す、インビトロ３Ｔ３細胞に基づく増殖アッセイデータのプロットである。
【図８】図８Ａは、ＡＲＣ１２６ならびに３０ｋＤのＰＥＧ基（ＡＲＣ３０８、５’−［３０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）および４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）のＰＥＧ基に５’結合体化されている２つの変異体についての競合結合アッセイのプロットである；図８Ｂは、５’ＰＥＧ基結合体化（ＡＲＣ１２６＋３０ｋＤ＝ＡＲＣ３０８、およびＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ＝ＡＲＣ１２７）の関数としてのＡＲＣ１２６についてのインビトロ３Ｔ３細胞に基づく増殖アッセイデータのプロットである。
【図９】図９Ａは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇでのＩＶ投与後のＡＲＣ１２６の５’コグネイトの薬物動態学的プロフィールのプロットである；図９Ｂは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度での静脈内（ＩＶ）投与、腹腔内（ＩＰ）投与、および皮下（ＳＣ）投与の後のＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）のインビボ薬物動態学的プロフィールのプロットである；図９Ｃは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度での静脈内（ＩＶ）投与後のＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ（すなわち、ＡＲＣ１２７）の生物活性プロフィールのプロットである。
【図１０】図１０Ａは、ＡＲＣ１２６がＰＤＧＦ−ＢＢと約１００ｐＭのＫｄで結合し、かつＰＤＧＦ−ＡＢと約１００ｐＭのＫｄで結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＡとは結合しないことを示す競合結合アッセイのプロットである；図１０Ｂは、ＡＲＣ１２６がヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢと約１００ｐＭの等しい親和性で結合することを示す競合結合アッセイのプロットである。
【図１１】図１１Ａは、ＡＲＣ１２７がＰＤＧＦ中和抗体よりも良好に３Ｔ３細胞増殖を阻害することを示す３Ｔ３細胞増殖アッセイの結果のプロットである；図１１Ｂは、ＡＲＣ１２７が、試験された既知のチロシンキナーゼインヒビターよりも良好に３Ｔ３細胞増殖を阻害することを示す３Ｔ３細胞増殖アッセイの結果のプロットである。
【図１２】図１２は、ＡＲＣ１２７単独が３Ｔ３細胞に対していかなる毒性効果も有さないことを示す細胞生存率アッセイの結果のプロットである。
【図１３】図１３は、ＱＣＭ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（＃ＥＣＭ  ５１０）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を使用する９６ウェル形式で実行された細胞移動アッセイデータのプロットであり、観察された移動シグナルがプレートされた細胞の数またはＰＤＧＦ濃度の増加の関数として増加することを示す。
【図１４】図１４は、ＡＲＣ１２７が２ｎＭのＩＣ５０を示すことを示す、ＰＤＧＦ駆動Ｅｌｋルシフェラーゼアッセイの結果のプロットである。
【図１５】図１５Ａは、ＨＴ２９結腸癌異種移植片モデルにおけるＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／イリノテカン用量最適化の下でのＮｕ／Ｎｕヌードマウスにおける腫瘍直径対時間のプロットである；図１５Ｂは、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおけるＡＲＣ１２７／イリノテカン研究の下でのＮｕ／Ｎｕヌードマウスにおける腫瘍直径対時間のプロットである。
【図１６】図１６は、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおける効力研究でのイリノテカン、およびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／ＡＲＣ３０８投薬計画の下のＮｕ／Ｎｕヌードマウスにおける腫瘍直径対時間のプロットである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＶＥＧＦに結合するがＰＤＧＦ−ＡＲＣ２４５（配列番号７）には結合しないアプタマーの配列および二次構造の模式図である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＰＤＧＦに結合するがＶＥＧＦには結合しないアプタマー（本明細書ではＡＲＣ１２６といわれる）の配列および二次構造の模式図である。
【図１８】図１８は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ（配列ＴＫ．１３１．０１２．Ａ、配列番号９）に結合する二価アプタマーの配列および二次構造の模式図である；図１８Ｂは、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ（配列ＴＫ．１３１．０１２．Ｂ、配列番号１０）に結合する第２の二価アプタマーの配列および二次構造の模式図である。
【図１９】図１９は、構成的アプタマーならびにＰＤＧＦ  ＢＢ（パネル１）およびＶＥＧＦ（パネル２）に対する多価アプタマーについてのドットブロットアッセイ結合データのプロットである。
【図２０】図２０は、そこに組み込まれたかまたは組み込まれたＣｐＧアイランドおよびモチーフを有するＰＤＧＦアプタマーの配列および二次構造の模式図（ホスホロチオエート結合の表示が存在しない）である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、アッセイにおけるポジティブコントロールとして既知のＯＤＮを、およびネガティブコントロールとしてＣｐＧアイランドを含まないアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＩＳＳ  ＯＤＮおよびＩＳＳ  ＯＤＮの短縮型を使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、ＣｐＧモチーフが組み込まれているＰＤＧＦアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、ＣｐＧモチーフが組み込まれているさらなるＰＤＧＦアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、ＣｐＧモチーフが組み込まれている図２１Ｄにおけるものと同じＰＤＧＦアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＴＮＦＡ放出を測定するＴＮＡａ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２２】図２２は、高分子量ＰＥＧ核酸結合体の合成のための種々のストラテジーを示す図である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、クローンＲＮＡ転写物についてのドットブロット結合分析を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、クローンＲＮＡ転写物についてのドットブロット結合分析を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ＰＤＧＦ−ＡＡ誘導３Ｔ３細胞増殖に対する種々の本発明のＰＤＧＦ−ＡＡアプタマー（ＡＲＸ３３Ｐ１．Ｄ２、ＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ５、およびＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ１０）の阻害効果を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導３Ｔ３細胞増殖に対するＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーの阻害効果を示すグラフである。
【図１】
2007525177.tif 000020
【図２】
2007525177.tif 000021
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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2007525177.tif 000036
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2007525177.tif 000039
【図２１】
2007525177.tif 000040
2007525177.tif 000041
【図２２】
2007525177.tif 000042
2007525177.tif 000043
【図２４】
2007525177.tif 000044
【図２５】
2007525177.tif 000045
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月27日(2005.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2007525177.tif 000046
【図５Ａ】
2007525177.tif 000047
【図５Ｂ】
2007525177.tif 000048
【図６】
2007525177.tif 000049
【図７】
2007525177.tif 000050
【図８】
2007525177.tif 000051
【図９】
2007525177.tif 000052
【図１０】
2007525177.tif 000053
【図１１】
2007525177.tif 000054
【図１２】
2007525177.tif 000055
【図１３】
2007525177.tif 000056
【図１４】
2007525177.tif 000057
【図１５】
2007525177.tif 000058
【図１６】
2007525177.tif 000059
【図１７Ａ】
2007525177.tif 000060
【図１７Ｂ】
2007525177.tif 000061
【図１８】
2007525177.tif 000062
【図１９】
2007525177.tif 000063
【図２０】
2007525177.tif 000064
【図２１Ａ】
2007525177.tif 000065
【図２１Ｂ】
2007525177.tif 000066
【図２１Ｃ】
2007525177.tif 000067
【図２１Ｄ】
2007525177.tif 000068
【図２１Ｅ】
2007525177.tif 000069
【図２２】
2007525177.tif 000070
【図２３Ａ】
2007525177.tif 000071
【図２３Ｂ】
2007525177.tif 000072
【図２４】
2007525177.tif 000073
【図２５】
2007525177.tif 000074
【図１】
2007525177.tif 000075
【図２】
2007525177.tif 000076
【図３】
2007525177.tif 000077
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月20日(2007.4.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の標的に結合可能である第１の配列および第２の標的に結合可能である第２の配列を含むアプタマーであって、該第２の配列が、免疫刺激性ＣｐＧモチーフであり、該ＣｐＧモチーフが、配列番号１２〜配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
【請求項２】
第１の標的に結合可能である第１の配列および第２の標的に結合可能である第２の配列を含むアプタマーであって、該第２の配列が、免疫刺激性モチーフであり、該アプタマーが、さらに、高分子量の非免疫原性化合物を含む、アプタマー。
【請求項３】
請求項２に記載のアプタマーであって、前記非免疫原性化合物が、ポリエチレングリコールである、アプタマー。
【請求項４】
請求項３に記載のアプタマーであって、前記ポリエチレングリコールが、２ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲である、アプタマー。
【請求項５】
請求項３に記載のアプタマーであって、前記ポリエチレングリコールが、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ、および２０ｋＤａからなる群より選択される分子量を有する、アプタマー。
【請求項６】
少なくとも２つの別個の免疫刺激性モチーフを含む、アプタマー。
【請求項７】
請求項６に記載のアプタマーであって、前記免疫刺激性モチーフが、同一である、アプタマー。
【請求項８】
請求項６に記載のアプタマーであって、前記免疫刺激性モチーフが、異なる、アプタマー。
【請求項９】
請求項６に記載のアプタマーであって、前記免疫刺激性モチーフが、ＣｐＧモチーフである、アプタマー。
【請求項１０】
請求項９に記載のアプタマーであって、前記ＣｐＧモチーフが、配列番号１２〜配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
【請求項１１】
請求項６に記載のアプタマーであって、高分子量の非免疫原性化合物をさらに含む、アプタマー。
【請求項１２】
請求項１１に記載のアプタマーであって、前記非免疫原性化合物が、ポリエチレングリコールである、アプタマー。
【請求項１３】
請求項１２に記載のアプタマーであって、前記ポリエチレングリコールが、２ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲である、アプタマー。
【請求項１４】
請求項１２に記載のアプタマーであって、前記ポリエチレングリコールが、６０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ、および２０ｋＤａからなる群より選択される分子量を有する、アプタマー。
【請求項１５】
免疫刺激性モチーフを含む、アプタマー。
【請求項１６】
請求項１５に記載のアプタマーであって、前記免疫刺激性モチーフが、ＣｐＧモチーフである、アプタマー。
【請求項１７】
請求項１６に記載のアプタマーであって、前記ＣｐＧモチーフが、配列番号１２〜配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、アプタマー。
【請求項１８】
配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号３８、配列番号５０、配列番号５４〜配列番号９０、および配列番号９４〜配列番号９９からなる群より選択される配列を含む、ＰＤＧＦに結合するアプタマー。
【請求項１９】
２’フルオロ置換基を有する７個未満のヌクレオチドを含む配列を含む、ＰＤＧＦに結合するアプタマー。
【請求項２０】
第１の標的に結合可能である第１の配列、および第２の標的に結合可能である第２の配列を含むアプタマー。
【請求項２１】
前記第１の標的がＰＤＧＦ、ＰＤＧＦアイソフォーム、およびＰＤＧＦレセプターからなる群より選択され、かつ前記第２の標的がＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターからなる群より選択される、請求項２０に記載のアプタマー。
【請求項２２】
配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号３８、配列番号５０、配列番号５４〜配列番号９０、および配列番号９４〜配列番号９９からなる群より選択される配列を含む、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２３】
前記ＰＤＧＦアイソフォームがＰＤＧＦ  ＡＡ、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＰＤＧＦ  ＡＢ、ＰＤＧＦ  ＣＣ、およびＰＤＧＦ  ＤＤである、請求項２１に記載のアプタマー。
【請求項２４】
前記第１の標的が前記アプタマーの結合の際に免疫応答を刺激せず、さらに前記第２の標的が該アプタマーの結合の際に免疫応答を刺激する、請求項２０に記載のアプタマー。
【請求項２５】
前記第２の標的がｔｏｌｌ様レセプターからなる群より選択される、請求項２４に記載のアプタマー。
【請求項２６】
前記第２の配列が免疫刺激配列である、請求項２０に記載のアプタマー。
【請求項２７】
免疫刺激配列がＣｐＧモチーフである、請求項２６に記載のアプタマー。
【請求項２８】
前記第１の配列が、ＰＤＧＦ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  ＦｃεＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＦｃＲＩＩＢ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＣＤ１１ｃ、ＢＡＦＦ、Ｂ７−Ｘ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、およびＣＤ３３からなる群より選択される標的に結合可能である、請求項２６に記載のアプタマー。
【請求項２９】
前記第１の配列がＰＤＧＦに結合可能である、請求項２６に記載のアプタマー。
【請求項３０】
請求項１８〜２９のうちのいずれかに記載のアプタマーおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項３１】
請求項１８〜２９のうちのいずれかに記載のアプタマー、細胞傷害剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物。
【請求項３２】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
請求項１８に記載のアプタマー、ＶＥＧＦに結合するアプタマー、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項３５】
細胞傷害剤をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
請求項１８〜２９のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を含有する、癌を治療するための組成物。
【請求項３９】
請求項３０、３１、および３５のうちのいずれか一項に記載の、癌を処置するための組成物であって、該組成物が、治療有効量である、組成物。
【請求項４０】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項１８〜２９のうちのいずれか一項に記載のアプタマーの治療有効量を含有する、腫瘍の増殖を阻害するための組成物。
【請求項４３】
請求項３０、３１、および３５のうちのいずれか一項に記載の、腫瘍の増殖を阻害するための組成物であって、該組成物が、治療有効量である、組成物。
【請求項４４】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項１８〜２９のうちのいずれか一項に記載のアプタマーの治療有効量を含有する、固形腫瘍におけるＩＦＰを減少させるための組成物。
【請求項４７】
請求項３０、３１、および３５のうちのいずれかに記載の、固形腫瘍におけるＩＦＰを減少させるための組成物であって、該組成物が、治療有効量である、組成物。
【請求項４８】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項５０】
請求項１８〜２９のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を含有する、細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させるための組成物。
【請求項５１】
請求項３０、３１、および３５のうちのいずれか一項に記載の、細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させるための組成物であって、該組成物が、治療有効量である、組成物。
【請求項５２】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項５４】
請求項１８〜２９のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を含有する、腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的発現を減少させるための組成物。
【請求項５５】
請求項３０、３１、および３５のうちのいずれかに記載の、腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的活性化を減少させるための組成物であって、該組成物が、治療有効量である、組成物。
【請求項５６】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５８】
請求項１８〜２９のうちのいずれかに記載のアプタマーの治療有効量を含有する、固形腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させるための組成物。
【請求項５９】
請求項３０、３１および３５のうちのいずれかに記載の、固形腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させるための組成物であって、該組成物が、治療有効量である、組成物。
【請求項６０】
前記細胞傷害剤が、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、およびＤＮＡ修飾剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記細胞傷害剤が、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
前記癌または腫瘍がＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である、請求項３８〜６１のうちのいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍が、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、および軟部組織肉腫からなる群より選択される、請求項３８〜６１のうちのいずれかに記載の組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には核酸の分野に関し、より詳細には、腫瘍学および／またはＰＤＧＦが関与している他の疾患もしくは障害における治療学として有用な血小板由来増殖因子（「ＰＤＧＦ」）に結合可能であるアプタマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
アプタマーは、古典的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成以外の相互作用を通して分子に対する特異的結合親和性を有する核酸分子である。
【０００３】
アプタマーは、ファージ提示法またはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）によって生成されるペプチドと同様に、選択された標的に特異的に結合することが可能であり、かつ結合を通して、それらの標的が機能する能力をブロックする。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロ選択プロセスによって作製されるので（図１）、アプタマーは、増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含む１００種を超えるタンパク質について生成されてきた。典型的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤａのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル濃度以下の親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的に対して区別する（例えば、典型的には、同じ遺伝子ファミリーからの他のタンパク質を結合しない）。一連の構造研究は、アプタマーが、抗体−抗原複合体において親和性および特異性を駆動するのと同じ型の結合相互作用（水素結合、静電的相補性、疎水性接触、立体障害など）を使用することが可能であることを示してきた。
【０００４】
アプタマーは、治療剤（および診断剤）としての使用のための多数の望ましい性質（高い特異性および親和性、生物学的効力、および優秀な薬理学的特性を含む）を有する。さらに、アプタマーは、抗体および他のタンパク質生物製剤を超えた特定の競合的な利点を提供し、これらは例えば以下の点である：
１）速度および制御。アプタマーは、完全にインビトロプロセスによって製造され、最初の（治療的）リードの迅速な生成を可能にする。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性を強固に制御することを可能にし、毒性標的と非免疫原性標的の両方に対してリードの生成を可能にする。
【０００５】
２）毒性および免疫原性。クラスとしてのアプタマーは、毒性または免疫原性がほとんどないか、または全くないことが実証されている。高濃度のアプタマー（毎日１０ｍｇ／ｋｇ、９０日間）を用いるラットまたはウッドチャックの長期的投薬において、いかなる臨床的、細胞的、または生化学的な尺度によっても毒性は観察されない。多くのモノクローナル抗体の効力が抗体自体に対する免疫応答によって厳しく制限され得るのに対して、アプタマーに対する抗体を誘発することは極めて困難である（おそらく、アプタマーはＭＨＣを介してＴ細胞によって提示されることができないず、および免疫応答は一般的に核酸フラグメントを認識するようには訓練されていないという可能性が高い）。
【０００６】
３）投与。現在認可されているすべての抗体治療剤は静脈内注入（典型的には、２〜４時間より長く）によって投与されるのに対して、アプタマーは皮下注射によって投与され得る。この違いは、主として、大部分の治療的ＭＡｂについては比較的溶解性が低く、そのために大量に必要であることに起因する。良好な溶解性（＞１５０ｍｇ／ｍｌ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤａ；抗体：１５０ｋＤａ）では、アプタマーの１週間の投薬量は０．５ｍｌ未満の体積での注射によって送達され得る。皮下投与を介するアプタマーの生物学的利用能は、サルの研究においては＞８０％である（Ｔｕｃｋｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２，１９９９）。さらに、小さなサイズのアプタマーは、これらを、抗体または抗体フラグメントが浸透することを不可能にするコンホメーション的な圧縮の領域に浸透することを可能にし、アプタマーに基づく治療剤または予防剤のさらに別の利点を提供する。
【０００７】
４）拡張性およびコスト。治療用アプタマーは化学合成され、結果的に製造需要に合致するのに必要とされるように容易に規模を拡張され得る。製造の規模を拡張することの困難さは、現在ではある生物製剤の利用可能性を制限しており、かつ大規模のタンパク質製造工場の資本コストが膨大であるのに対して、単一の大規模合成機は、年間あたり１００ｋｇ以上のオリゴヌクレオチドを製造可能であり、かつ比較的高くない初期の投資を必要とする。キログラムスケールでのアプタマー合成のための物品の現在のコストは＄５００／ｇであり、高度に最適化された抗体についてのそれと比較可能である。プロセス開発における継続的な投資は、５年間で＜＄１００／ｇまでの物品のコストを低下させると予測される。
【０００８】
５）安定性。治療用アプタマーは化学的に堅固である。これらは、熱、変性などにさらされた後に活性を回復するように固有に適応し、かつ凍結乾燥粉末として室温で長期間（＞１年間）保存可能である。対照的に、抗体は冷蔵保存されなければならない。
【０００９】
（間質液圧）
癌治療の３つの最も一般的な型は、癌組織の外科的除去、癌組織を破壊するための放射線治療、および化学療法である。これらの治療は、癌組織もしくは癌細胞を除去すること、または治療剤もしくは他の薬剤を用いて身体中の癌組織もしくは癌細胞を破壊することを目的とする。化学療法は、固形腫瘍の主要な治療様式であり続けている。毒性の副作用を潜在的に減少するために、およびより高い効力の化学療法剤を達成するために、正常組織と腫瘍との間の薬物の分布を改善するためのストラテジーが多く望まれている。
【００１０】
固形腫瘍の治療における主要な障害は、腫瘍組織への治療剤の取り込みの制限である。間質液圧（「ＩＦＰ」）の上昇は、健常結合組織とは異なる固形腫瘍を生理学的に区別できる特性の１つであり、かつ固形腫瘍治療剤の自由拡散を制限する主要な障害であると考えられている。ＰＤＧＦレセプター、特にＰＤＧＦ−βは、ＩＦＰの調節に関与している。腫瘍が過剰増殖状態に入るときに、酸素および他の栄養を供給する血液は、腫瘍の需要についていくことができず、低酸素状態が生じる。低酸素状態は、「血管形成スイッチ」の引き金を引き、これは、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦを含むいくつかの因子の発現をアップレギュレートし、これは次には、血管形成を開始するように働く。しかし、生じる血管形成は異常な腫瘍血管構造を形成する。この腫瘍血管構造は、間質からの過剰な液体を十分に排出させることが不可能である程度にまで損なわれ、液体の蓄積は弾性間質マトリックスを膨張させ、圧力の増加を引き起こす。圧力が毛細管壁の抵抗性を超える場合、圧縮が起こりかつ血流の抵抗性が増大する。
【００１１】
大部分の固形腫瘍のこの特性−腫瘍間質の過度の圧力またはＩＦＰの増加−は、腫瘍薬物の取り込みを増大させる試みにおいて潜在的な標的として示唆されてきた（Ｊａｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：３０３９−３０５１）。ＩＦＰの増加は、腫瘍の経血管輸送のための障壁として作用する（Ｊａｉｎら（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２６：７１−９０）。腫瘍ＩＦＰを減少させること、または微小血管の圧力の調節は、腫瘍標的化抗体または低分子量トレーサー化合物の経血管輸送を増加させることが示されてきた（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，２９２９−２９３４）。腫瘍における間質の過度の圧力の病因論はほとんど理解されていない。１つの提案された理論は、腫瘍におけるリンパ管の欠如が腫瘍ＩＦＰの増加に対して寄与する因子であることである（Ｊａｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：３０３９−３０５１）。別の提案された理論は、微小血管構造および支持間質区画が腫瘍ＩＥＰのための重要な決定基である可能性があることである（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６２：５４７６−５４８４）。蓄積している証拠は、腫瘍間質の過度の圧力を調節するための薬理学的治療剤のための潜在的な標的として、膜貫通ＰＤＧＦβ−レセプターチロシンキナーゼを指摘する。とりわけ潜在的な標的は、ＰＤＧＦβ−レセプターに結合する増殖因子である。
【００１２】
（ＰＤＧＦが媒介する癌）
ＩＦＰおよび治療剤を用いて腫瘍に浸透することの困難に加えて、癌治療における別の障害は、ＰＤＧＦが媒介する癌による特定の型の癌における変異であり、これはＰＤＧＦの構成的発現をもたらす。これらの変異は、図３において示されるような種々の型の癌を生じる、異常な細胞の増殖を駆動する（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，２９２９−２９３４）。遺伝子変異は、高度の膠芽細胞腫においてＰＤＧＦα−レセプターの増幅を生じる。慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）において、ＰＤＧＦ−βの構成的発現は、ＰＤＧＦ以外のタンパク質とのβ−レセプターの融合を引き起こす変異から生じる（Ｇｏｌｕｂら（１９９４）Ｃｅｌｌ  ７７，３０７−３１６、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  １００，６２３−６２６）。活性化点範囲に起因するＰＤＧＦ−α−レセプターの構成的活性化もまた、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を有する患者において同定されてきた（Ｈｅｉｎｒｅｉｃｈら（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２９９，７０８−７１０）。隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）は、ＰＤＧＦ−ＢＢにプロセスされる融合タンパク質の構成的産生と関連する（Ｏ’Ｂｒｉａｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ  Ｃｈｒｏｍ．Ｃａｎｃｅｒ  ２３，１８７−１９３；Ｓｈｉｍｉｚｉｕら（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９，３７１９−３７２３；Ｓｉｍｏｎら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１５，９５−９８）。変異に起因するＰＤＧＦのリガンド／レセプターの構成的活性化に加えて、アップレギュレーションが軟部組織肉腫および神経膠腫において示されてきた（ＯｓｔｍａｎおよびＨｅｌｄｉｎ（２００１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８０，１−３８）。
【００１３】
（ＰＤＧＦ）
増殖因子は、細胞または組織に対して細胞増殖性効果を有する物質である。いずれの所定の増殖因子も、１つ以上のレセプターを有し得るか、または１つ以上の細胞株もしくは組織において細胞増殖を誘導し得る。ＰＤＧＦは、システイン−ｋｎｏｔ増殖因子ファミリーに属し、元来細胞の分裂促進的および移動性活性を促進するために血小板から単離された。ＰＤＧＦは強力な分裂促進因子であり、かつ線維芽細胞、平滑筋細胞、神経膠細胞、および結合組織細胞などの通常細胞の増殖の調節において中心的な役割を有する。さらに、ＰＤＧＦは、例えば増殖性障害において病理学的な細胞増殖を媒介し、かつ血管形成において役割を果たす。腫瘍の血管形成に関与する別の増殖因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）である。
【００１４】
４つのＰＤＧＦポリペプチド鎖が同定されており、これらは現在、５つのダイマー性ＰＤＧＦアイソフォーム：ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＢＢ、−ＣＣ、−ＤＤ、および−ＡＢを形成することが知られている。最も豊富に存在する種はＰＤＧＦ  ＡＢおよびＢＢである。ＰＤＧＦアイソフォームはαおよびβチロシンキナーゼレセプターに結合する。ＰＤＧＦレセプターは、腫瘍内の多くの異なる細胞型によって発現される。それらのコグネイトレセプターへのＰＤＧＦアイソフォームの結合は、ダイマー化ならびに引き続いてレセプターの細胞内チロシンキナーゼドメイン内の特定の残基のリン酸化およびシグナル伝達経路の活性化を誘導する。ＰＤＧＦアイソフォーム−ＡＡ、−ＢＢ、−ＣＣ、および−ＡＢはＰＤＧＦαレセプターダイマー化を誘導する。ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＤＤはＰＤＧＦβレセプターダイマー化を活性化する。ＰＤＧＦ−ＡＡ以外のＰＤＧＦのすべてのアイソフォームは、両方のレセプター型を同時発現する細胞においてαとβの両方のレセプターを活性化する（図２）。これらは強力な分裂促進因子であるので、ＰＤＧＦアイソフォームは、増殖性疾患、例えば、癌、糖尿病性網膜症、糸球体腎炎、および再狭窄などの治療剤の開発のために標的とされてきた。
【００１５】
内皮細胞によって分泌されるＰＤＧＦは、線維芽細胞のための直接的な分裂促進因子として作用し、かつ血管平滑筋細胞を刺激する。多くの固形腫瘍は、腫瘍の間質においてＰＤＧＦのパラクリン性シグナル伝達を示す。ＰＤＧＦは、コラーゲンの合成をアップレギュレートすること、および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分とのインテグリンなどのアンカータンパク質の相互作用を媒介することが知られている。結合組織、ＥＣＭ、および細胞内アクチンフィラメント系との間のＰＤＧＦの相互作用は、高ＩＦＰに寄与する抗張力の増加を引き起こす。高ＩＦＰは腫瘍の部位に局在し、かつヒトの癌において乏しい予後を伴う。これは腫瘍のサイズおよび重篤度、ならびに悪性度を増大させるからである。種々の固形腫瘍でのＩＦＰおよびアップレギュレートされた発現の制御におけるＰＤＧＦの役割は、ＰＤＧＦシグナル伝達の阻害がＩＦＰを減少させ得、それによって固形腫瘍への薬物の取り込みを増加させるか否かの研究を促した。以前の研究は、低分子レセプターアンタゴニストおよびＰＤＧＦ特異的アプタマーを用いるＰＤＧＦシグナル伝達の阻害が間質液圧を減少させ、かつ固形腫瘍への化学療法剤の取り込みを増加させることを実証した（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１，２９２９−２９３４）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従って、腫瘍ＩＦＰを減少するため、腫瘍の血管形成を減少するため、およびＰＤＧＦの構成的発現による変異の有害な効果を減少するために、発現腫瘍学において新規な物質および方法を有することは有益である。本発明は、これらの必要性および他の必要性に合致する物質および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、それらのアイソフォーム、それらのレセプター、またはこれらの組み合わせに高い親和性および特異性で結合可能であり、従って、癌の病因論における結合リガンドの生物学的役割を阻害することが可能であるアプタマーまたはアプタマー組成物の治療有効量の患者への投与による、癌、特に固形腫瘍癌の治療のための物質および方法を提供する。本発明のアプタマーは、既知の化学療法剤とともに使用され得、かつそこに組み込まれたかまたはそれに付随された１つ以上のＣｐＧモチーフを含み得る。
【００１８】
本発明はＰＤＧＦに結合するアプタマーを提供する。１つの実施形態において、ＰＤＧＦに結合するアプタマーは、配列番号１から配列番号３、配列番号９から配列番号３５、配列番号３６〜７３、配列番号７７〜８１、および配列番号８５からなる群より選択される核酸配列を含む。１つの実施形態において、アプタマーのオリゴヌクレオチド配列は、２’フルオロ置換基を有する７個未満のヌクレオチドを含む配列を含む。
【００１９】
本発明はまた、第１の標的に結合可能である第１の配列、および第２の標的に結合可能である第２の配列を含むアプタマーを提供する。１つの実施形態において、第１の標的はＰＤＧＦ、ＰＤＧＦアイソフォーム、およびＰＤＧＦレセプターであり、かつ第２の標的はＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターである。ＰＤＧＦアイソフォームは、例えば、ＰＤＧＦ  ＢＢ、ＰＤＧＦ  ＡＢ、ＰＤＧＦ  ＣＣ、およびＰＤＧＦ  ＤＤである。１つの実施形態において、ＰＤＧＦに結合するアプタマーは、配列番号１から配列番号３、配列番号９から配列番号３５、配列番号３６〜７３、配列番号７７〜８１、および配列番号８５から選択される核酸配列を含む。
【００２０】
１つの実施形態において、第１の標的はアプタマーの結合の際に免疫応答を刺激せず、さらに第２の標的はアプタマーの結合の際に免疫応答を刺激しない。１つの実施形態において、第２の標的はｔｏｌｌ様レセプターである。別の実施形態において、第２の配列は免疫刺激配列である。１つの実施形態において、免疫刺激配列はＣｐＧモチーフである。
【００２１】
１つの実施形態において、第１の配列は、以下の標的：ＰＤＧＦ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  ＦｃεＲ１、ＰＳＭＡ、ＣＤ２２、ＴＮＦ−α、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＦｃＲＩＩＢ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＣＤ１１ｃ、ＢＡＦＦ、Ｂ７−Ｘ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、およびＣＤ３３の１つに結合可能である。１つの実施形態において、第１の配列はＰＤＧＦに結合可能である。
【００２２】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマー、細胞傷害剤、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。１つの実施形態において、細胞傷害剤は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤などの細胞傷害剤のクラスに属する。１つの実施形態において、細胞傷害剤は、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００２４】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマー、ＶＥＧＦ結合アプタマー、および薬学的に受容可能なキャリアを含む組成物を提供する。１つの実施形態において、これらの組成物もまた、細胞傷害剤を含む。適切な細胞傷害剤には、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤などの細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤が含まれる。この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕからなる群より選択される１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００２５】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって癌を治療する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって癌を治療する方法を提供する。
【００２６】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００２８】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって固形腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって固形腫瘍の増殖を阻害する方法を提供する。
【００２９】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００３１】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって固形腫瘍中のＩＦＰを減少させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって固形腫瘍中のＩＦＰを減少させる方法を提供する。
【００３２】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００３４】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって細胞傷害剤に対する固形腫瘍の浸透性を増加させる方法を提供する。
【００３５】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００３７】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的発現を減少させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって腫瘍中での血小板由来増殖因子の構成的発現を減少させる方法を提供する。
【００３８】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００３９】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【００４０】
本発明はまた、本発明のＰＤＧＦ結合アプタマーの治療有効量を投与することによって腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させる方法を提供する。本発明はまた、本発明の組成物の治療有効量を投与することによって腫瘍中での血管形成および新生血管形成を減少させる方法を提供する。
【００４１】
１つの実施形態において、癌または腫瘍はＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍である。１つの実施形態において、ＰＤＧＦ媒介性の癌または腫瘍は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病、隆起性皮膚線維肉腫、消化管間質腫瘍、または軟部組織肉腫である。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明の組成物は、チューブリン安定化剤、チューブリン不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、ＤＮＡアルキル化剤、ＤＮＡ修飾剤、および血管破壊剤からなる群より選択される細胞傷害剤のクラスに属する細胞傷害剤を含む。１つの実施形態において、この細胞傷害剤は、カリケアマイシン、ドキソルビシン、タキソール、メトトレキサート、ゲムシタビン、シタラビン、ビンブラスチン、ダウノルビシン、ドセタキセル、イリノテカン、エポチロンＢ、エポチロンＤ、シスプラチン、カルボプラチン、および５−フルオロ−Ｕなどの１つ以上の細胞傷害剤を単独でまたは組み合わせて使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は以下の付随する記載に示される。本明細書に記載されるものと同様のまたは等価ないかなる方法および材料も本発明の実施および試験において使用され得るが、好ましい方法および材料は本明細書に記載される。他の特徴、目的、および利点は本明細書の記載から明らかである、本明細書において、文脈が明確に他を示していない限りは、単数形はまた複数形も含む。他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。競合する場合には本明細書が優先する。
【００４４】
（ＳＥＬＥＸＴＭ法）
アプタマーを生成するための適切な方法は、図１において一般的に示される「指数関数的富化によるリガンドの系統的進化（「ＳＥＬＥＸＴＭ」）」と呼ばれるプロセスを用いてである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、標的分子への高度な特異的結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、現在は放棄された１９９０年６月１１日に出願された米国特許出願シリアル番号０７／５３６，４２８号、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号、および「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，２７０，１６３号（ＷＯ  ９１／１９８１３もまた参照されたい）において記載されている。各々のＳＥＫＥＸ−によって同定された核酸リガンドは、所定の標的の化合物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスは、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成する十分な能力を、ならびにモノマー性であるかまたはポリマー性であるかに関わらず、実質的に任意の化学化合物を有するリガンドとして作用する（すなわち、特異的結合対を形成する）、それらのモノマー中で利用可能である十分な化学的汎用性を有するという独特な洞察に基づいている。任意のサイズまたは組成の分子が標的として役立ち得る。
【００４５】
ＳＥＬＥＸＴＭは、開始点として、標準的なＤＮＡ合成機上での化学合成に由来するランダム化配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドテンプレートの大きなライブラリーに依存する。ある例において、１００％ランダムなオリゴヌクレオチドの集団がスクリーニングされる。他の例では、集団中の各ヌクレオチドは、ランダム配列、ならびにオリゴヌクレオチド集団のすべての分子によって共有される配列を含むその５’および／または３’末端における少なくとも１つの固定された配列を含む。固定された配列は、例えば、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、ＳＰ６など）、制限部位、またはホモポリマー配列（例えば、ポリＡもしくはポリＴトラクト）、触媒性コア、アフィニティーカラムへの選択的結合のための部位、および目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を容易にするための他の配列なとの配列を含む。
【００４６】
オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は任意の長さのものであり得、かつリボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得、かつ修飾されたまたは非天然のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログを含み得る。例えば、米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８５号；同第５，９５８，６９１号；同第５，８１７，６３５号；および同第５，６７２，６９５を参照されたい。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知である固相合成後ヌクレオチド合成技術を使用してホスホジエステル結合ヌクレオチドから合成され得る（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８（１９８６））。オリゴヌクレオチドはまた、トリエステル合成法などの固相方法を使用して合成され得る（Ｓｏｏｄら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２８：２４４９（１９７８））。自動ＤＮＡ合成装置上で実行される典型的な合成は、１０１５〜１０１７分子を生じる。配列設計におけるランダム配列の十分に大きな領域は、各々の合成された分子が独特な配列を表し得る可能性を増大させる。
【００４７】
ランダム化された配列を合成するために、４種すべてのヌクレオチドの混合物は、合成プロセスの間の各ヌクレオチド付加工程において加えられ、ヌクレオチドのランダムな取り込みを可能にする。１つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは完全にランダムな配列を含む；しかし、他の実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、ランダムでないかまたは部分的にランダムな配列のストレッチを含み得る。部分的にランダムな配列は、各付加工程で異なるモル濃度比で４種のヌクレオチドを加えることによって作製され得る。
【００４８】
テンプレート分子は、典型的には、３０〜５０のランダムヌクレオチドの領域に隣接する固定された５’および３’末端配列を含む。標準的な（１μモル）スケール合成は、大部分のＳＥＬＥＸ実験に十分な１０１５〜１０１６の個別のテンプレート分子を生じる。ＲＮＡライブラリーは組換えＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によってこの開始ライブラリーから生成される。次いで、結合親和性および選択性の実質的に任意の望ましい判断基準を達成するために、このライブラリーは結合のために好ましい条件下で標的と混合され、同じ一般的な選択スキームを使用して、結合の段階的な反復、分配、および増幅に供される。好ましくは、ランダム化された配列のセグメントを含む、核酸の混合物から開始して、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、以下の工程を包含する：結合のための好ましい条件下で標的と混合物を接触させる工程、標的分子に特異的に結合した核酸から未結合の核酸を分配する工程、核酸−標的複合体を解離させる工程、核酸−標的複合体から解離した核酸を増幅して、核酸のリガンド−富化混合物を生じる工程、次いで、標的分子に対して高い特異性、高い親和性の核酸リガンドを生じるために望ましい回数のサイクルを通して、結合、分配、解離、および増幅の工程を反復する工程。
【００４９】
多くの可能な配列および構造を含む核酸混合物の中で、所定の標的に対する広範な結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドランダム化セグメントを含む核酸混合物は、４２０通りの候補の可能性を有し得る。標的に対してより高い親和性定数を有するものは、標的に結合する可能性が最も高い。分配、解離、および増幅の後、第２の核酸混合物が生成され、より高い結合親和性候補について富化される。さらなる選択のラウンドは、得られる核酸混合物が優先的に１種または数種の配列からなるまで、最良のリガンドを進行的に優先する。次いでこれらは、クローニングされ、配列決定され、純粋なリガンドとして結合親和性について個別に試験され得る。
【００５０】
選択および増幅のサイクルは、望ましい目的が達成されるまで反復される。最も一般的な場合では、選択／増幅は、結合強度の顕著な改善がサイクルの反復で達成されなくなるまで継続される。この方法は、約１０１８個の異なる核酸種と同じ数まで試料に対して使用され得る。試験混合物の核酸は、好ましくは、ランダム化された配列部分ならびに有効な増幅のために必要である保存配列を含む。核酸配列変異体は、ランダム化核酸配列の合成およびランダムに切断された細胞核酸からのサイズ選択を含む、多数の方法において産生され得る。変異体配列部分は、完全にまたは部分的にランダムな配列を含み得る；これはまた、ランダム化された配列が組み込まれた保存性配列のサブ部分を含み得る。試験核酸における配列のバリエーションは、選択／増幅反復の前またはその間に、変異誘発によって導入または増加され得る。
【００５１】
ＳＥＬＥＸＴＭの１つの実施形態において、選択プロセスは、選択される標的に最も強力に結合する核酸リガンドを単離する際にあまりにも効率的なので、１サイクルの選択および増幅のみが必要である。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフィー型プロセスにおいて起こり得、ここでは、カラム上で結合した標的と解離する核酸の能力は、カラムが最高の親和性の核酸リガンドの分離および単離を十分に可能にし得るような様式で作用する。
【００５２】
多くの場合において、単一の核酸リガンドが同定されるまで、ＳＥＬＥＸＴＭの反復工程を実行することは必ずしも必要ではない。標的特異的核酸リガンド溶液は、多数の保存性配列および標的への核酸リガンドの親和性に有意な変化を与えることなく置換され得るかまたは加えられ得る多数のの配列を有する核酸構造またはモチーフのファミリーを含み得る。ＳＥＬＥＸＴＭプロセスを完了の前に終了することによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。
【００５３】
種々の核酸の一次構造、二次構造、および三次構造が存在することは公知である。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称バルジ、シュドノット、および無数のこれらの組み合わせであるといわれる。このようなモチーフのほぼすべての公知の事例は、これらが３０ヌクレオチドを超えない核酸配列中で形成され得ることを示唆する。この理由のために、連続したランダム化セグメントを用いるＳＥＬＥＸ手順は、約２０〜５０ヌクレオチドの間のランダム化セグメントを含む核酸配列で開始されることがしばしば好ましい。
【００５４】
コアＳＥＬＥＸＴＭ法は、多数の特定の目的を達成するために改変されてきた。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、特定の構造特性を有する核酸分子、例えば、ベントＤＮＡを選択するためにゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸＴＭの使用を記載している。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子を結合し、および／または光架橋し、および／または光不活性化することが可能である光反応基を含む核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸＴＭに基づく方法を記載している。米国特許第５，５６７，５８８号および「Ｆｌｏｗ  Ｃｅｌｌ  ＳＥＬＥＸ」という表題の１９９７年１月３１日に出願された米国特許出願番号０８／７９２，０７５は、標的分子に対して高い親和性および低い親和性を有するオリゴヌクレオチド間での効率の高い分配を達成する、ＳＥＬＥＸＴＭに基づく方法を記載している。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸＴＭ手順が実行された後で改善された核酸リガンドを得るための方法を記載している。米国特許第５，７０５，３３７号は、その標的へのリガンドの共有結合のための方法を記載している。
【００５５】
ＳＥＬＥＸＴＭはまた、標的分子上の１つより多くの部位に結合する核酸リガンドを得るため、および標的上の特異的部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために使用され得る。ＳＥＬＥＸＴＭは、タンパク質（核酸結合タンパク質とそれらの生物学的機能の一部として核酸を結合することが知られていないタンパク質の両方を含む）、共同因子、および他の低分子を含む生体高分子および生体低分子を含む、任意の想定可能な標的に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。例えば、カフェインおよび密接に関連するアナログであるテオフィリンに対して高い親和性で結合可能である、ＳＥＬＥＸＴＭを通して同定された核酸配列を開示する米国特許第５，５８０，７３７号を参照されたい。
【００５６】
カウンターＳＥＬＥＸＴＭは、１つ以上の非標的分子に対する交差反応性を有する核酸リガンド配列を除去することによって標的分子への核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。カウンターＳＥＬＥＸＴＭは以下の工程からなる：ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；ｂ）標的と候補混合物を接触させる工程（ここで候補混合物と比較して標的に対して親和性の増加を有する核酸は候補混合物の残りから区分けされ得る）；ｃ）候補混合物の残りから親和性が増加している核酸を区分けする工程；ｄ）非標識分子に対して特異的親和性を有する核酸リガンドが除去されるように、１つ以上の非標識分子と、親和性が増加した核酸を接触させる工程；およびｅ）標的分子に対して特異的親和性を有する核酸を増幅して、標的分子への結合について比較的より高い親和性および特異性を有する核酸配列について富化された核酸の混合物を得る工程。
【００５７】
治療剤およびワクチンとしての核酸の使用における１つの潜在的な問題は、それらのホスホジエステル型にあるオリゴヌクレオチドが、所望の効果が明らかになる前にエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼなどの細胞内酵素および細胞外酵素によって体液中で迅速に分解され得ることである。従って、ＳＥＬＥＸ法は、リガンドに対して改善された性質（例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達性質）を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性核酸リガンドの同定を含む。このような修飾の例は、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基の位置での化学的置換を含む。ＳＥＬＥＸ同定された核酸リガンド含有修飾ヌクレオチドは米国特許第５，６６０，９８５号に記載され、これは、リボースの２’位、ピリミジンの５位、およびプリンの８位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載している。米国特許第５，７５６，７０３号は、種々の２’−修飾ピリミジンを含むオリゴヌクレオチドを記載している。米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含む高度に特異的な核酸リガンドを記載している。
【００５８】
本発明において意図される核酸リガンドの修飾は、核酸リガンド塩基に、または全体としての核酸リガンドに、さらなる電荷、分極、疎水性、水素結合、静電的相互作用、および機能性（ｆｌｕｘｉｏｎａｌｉｔｙ）を組み込む他の化学基を供給するものを含むが、これに限定されない。このような修飾には、２’位糖置換、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、環外アミンの修飾、４−チオウリジンの置換、５−ブロモまたは５−ヨードウラシルの置換；バックボーン修飾、ホスホロチオエートまたはアルキルリン酸修飾、メチル化、一般でない塩基対の組み合わせ、例えばイソ塩基イソシチジンおよびイソグアニジンなどが含まれるがこれらに限定されない。修飾はまた、キャッピングなどの３’および５’修飾を含み得る。
【００５９】
修飾は、ＳＥＬＥＸプロセスの前または後の修飾であり得る。ＳＥＬＥＸプロセス前修飾は、それらのＳＥＬＥＸ標的についての特異性と、改善されたインビボ安定性の両方を有する核酸リガンドを生じる。２’−ＯＨ核酸リガンドに作製されるＳＥＬＥＸ後修飾は、核酸リガンドの結合能力に有害な影響を与えることなく、インビボ安定性の改善を生じ得る。
【００６０】
他の修飾は当業者に公知である。このような修飾はＳＥＬＥＸ後プロセス（以前に同定された非修飾リガンドの修飾）で作製され得るか、またはＳＥＬＥＸプロセスへに組み込みによって作製され得る。
【００６１】
ＳＥＬＥＸ法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号において記載されているように、選択されたオリゴヌクレオチドを、他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチド機能的単位と組み合わせる工程を包含する。ＳＥＬＥＸ法はさらに、米国特許第６，０１１，０２０号に記載されているように、診断用または治療用複合体中で、選択された核酸リガンドを親油性または非免疫原性高分子量化合物と組み合わせる工程を包含する。診断用または治療用複合体中で、親油性化合物、例えば、ジアシルグリセロールまたはジアルキルグリセロールと結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許第５，８５９，２２８号に記載されている。
【００６２】
親油性化合物（例えば、グリセロール脂質）、または非免疫原性高分子量化合物（例えば、ポリアルキレングリセロール）と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドは、さらに米国特許第６，０５１，６９８号に記載されている。非免疫原性、高分子量化合物、または親油性化合物が結合されたＶＥＧＦ核酸リガンドは、さらにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９８／１８４８０において記載されている。これらの特許および特許出願は、他の分子の望ましい性質との、オリゴヌクレオチドの、形状および他の特性、ならびに効率的な増幅および複製の特性の広範なアレイの組み合わせを可能にする。
【００６３】
ＳＥＬＥＸ法を介する、小さな、柔軟性のあるペプチドへの核酸リガンドの同定もまた、開発された。小さなペプチドは柔軟性のある構造を有し、かつ複数の配座異性体の平衡状態で溶液中に存在し、従って、結合親和性は、柔軟性のあるペプチドを結合する際に失われた配座エントロピーによって制限され得ると最初は考えられていた。しかし、溶液中の小さなペプチドへの核酸リガンドの実行可能性は米国特許第５，６４８，２１４号において実証された。この特許において、サブスタンスＰ（１１アミノ酸ペプチド）への高親和性ＲＮＡ核酸リガンドが同定された。
【００６４】
ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するために、修飾オリゴヌクレオチドが使用され得、かつ１つ以上の置換ヌクレオチド結合、糖の変化、塩基の変化、またはそれらの組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）によって置換されるオリゴヌクレオチドが提供され、ここで各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキルである。連結基は−Ｏ−、−Ｎ−、または−Ｓ−連結を通して隣接するヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチドにおいてすべての連結が同一であることが必要なわけではない。
【００６５】
さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは修飾糖基を含み、例えば、１つ以上の水酸基はハロゲン、脂肪族基で置換されるか、またはエーテルもしくはアミンとして官能基化される。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位は、Ｏ−メチル基、Ｏ−アルキル基、Ｓ−アリル基、またはハロ基のいずれかによって置換される。２’修飾糖の合成の方法は、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：５１３８−５１４５（１９７３）において記載されている。２−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー分子は、標的分子に対する核酸分子の感受性を、非置換リボ−またはデオキシリボオリゴヌクレオチドを使用して生成されたものよりも１０から１００倍増大させ得（Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７））このことは、標的分子とのさらなる結合相互作用を提供し、かつ核酸分子の二次構造の安定性を増加させる（Ｋｒａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６０：５２０９−５２１２（１９９８）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４−３１７（１９９１）；Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：５５２９−５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５：６８−７３（１９９７））。
【００６６】
核酸アプタマー分子は、一般的に、５〜２０サイクルの手順において選択される。１つの実施形態において、不均一性は最初の選択段階においてのみ導入され、かつ複製プロセスを通しては存在しない。
【００６７】
ＤＮＡ配列の開始ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置上での自動化化学合成によって生成される。この配列のライブラリーは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼまたは修飾Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＲＮＡに転写され、かつ精製される。１つの例において、５’−固定化：ランダム：３’−固定化配列は、３０〜５０ヌクレオチドを有するランダム配列によって分離される。
【００６８】
本発明の標的に対して特異性および結合親和性を有するアプタマーは、上記のＳＥＬＥＸプロセスによって選択される。ＳＥＬＥＸプロセスの一部として、標的に結合するように選択される配列は、次いで、必要に応じて、結合親和性を有する最小限の配列を決定するために最小化され、かつ親和性の増加が結合活性のために必須であるか、または代替的には配列中のどの位置が結合活性のために必須であるかを決定するために、最小化された配列のランダム変異誘発または部位特異的変異誘発を実行することによって最適化される。さらに、選択は、インビボでの分解に対してアプタマー分子を安定化させるために修飾配列を取り込む配列を用いて実行され得る。
【００６９】
（２’修飾ＳＥＬＥＸＴＭ）
さらに、ＳＥＬＥＸＴＭ法は、２００２年１２月３日に出願された米国シリアル番号６０／４３０，７６１、２００３年７月１５日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６０／４８７，４７４、および２００３年１１月４日に出願された米国仮特許出願シリアル番号６０／５１７，０３９、および２００３年１２月３日に出願された米国特許出願番号１０／７２９，５８１（これらの各々はその全体が参照として本明細書に援用される）に記載されるような２’修飾アプタマーを生成するために実行され得る。
【００７０】
アプタマーが治療剤としての使用のために適切であるために、インビボで安全かつ安定に合成することが高価でないことが好ましい。野生型ＲＮＡおよびＤＮＡアプタマーは、典型的には、ヌクレアーゼによる分解に対するそれらの感受性のために、インビボでは安定ではない。ヌクレアーゼ分解に対する耐性は、２’位において修飾基の導入によって非常に増大し得る。フルオロ基およびアミノ基は、アプタマーが引き続いて選択されるオリゴヌクレオチドライブラリーに首尾よく組み込まれてきた。しかし、これらの修飾は、得られるアプタマーの合成のコストを非常に増大し、かつ安全性の心配を持ち込み得る。なぜなら、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの分解、およびＤＮＡ合成のための基質としてのヌクレオチドの引き続く使用によって、宿主ＤＮＡによってリサイクルされ得る可能性があるからである。
【００７１】
２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ヌクレオチドを含むアプタマーは、これらの欠点の多くを克服する。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であり、かつ合成することが高価ではない。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは生物系に遍在しているが、天然のポリメラーゼは、生理学的条件下では基質として２’−Ｏ−メチルＮＴＰを受容せず、従って、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの宿主ＤＮＡへのリサイクルに対する安全性の心配は存在しない。
【００７２】
本発明はまた、非修飾オリゴヌクレオチドよりも安定なオリゴヌクレオチドを作製する修飾ヌクレオチド（例えば、２’位に修飾を有するヌクレオチド）を含む安定化されたオリゴヌクレオチド（例えば、アプタマーを含む）を製造するための材料および方法を提供する。本発明の材料および方法によって製造された安定化オリゴヌクレオチドはまた、酵素的分解および化学的分解ならびに熱分解および物理的分解に対してより安定である。例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ耐性であり、かつ合成することが高価ではない。２’−Ｏ−メチルヌクレオチドは生物系に遍在しているが、天然のポリメラーゼは生理学的条件下では基質として２’−Ｏ−メチルＮＴＰを受容せず、従って、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドの宿主ＤＮＡへのリサイクルに対する安全性の心配は存在しない。
【００７３】
１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰのヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、および２’−ＯＭｅの修飾の組み合わせを提供する。別の実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰのヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２、および２’−メトキシエチルの修飾の組み合わせを提供する。１つの実施形態において、本発明は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、およびＵＴＰのヌクレオチドの、２’−ＯＨ、２’−Ｆ、２’−デオキシ、および２’−ＯＭｅ、２’−ＮＨ２、および２’−メトキシエチルの修飾の５６通りの組み合わせを提供する。
【００７４】
本発明の２’修飾アプタマーは、フラノース２’位においてかさばる置換基を有する修飾ヌクレオチドの取り込みの割合が野生型ポリメラーゼよりも高い修飾ポリメラーゼ（例えば、修飾Ｔ７ポリメラーゼなど）を使用して作製される。例えば、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位においてヒスチジンからのアラニンまたは他の小さなアミノ酸残基を有する二重Ｔ７ポリメラーゼ変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）は、かさばる２’置換基の取り込みについて記載され、かつ修飾ピリミジンＮＴＰを取り込むために使用された。７８４残基においてヒスチジンからのアラニン残基を有する単一変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載された（Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８）。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体とＨ７８４Ａ単一変異体の両方のＴ７ポリメラーゼにおいて、より小さなアミノ酸残基への変化は、よりかさばるヌクレオチド基質、例えば、２’−Ｏメチル置換ヌクレオチドの取り込みを可能にする。
【００７５】
２’−修飾アプタマーの製造における別の重要な要因は、転写混合物における二価のマグネシウムとマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの異なる濃度の組み合わせは、２’−Ｏ−メチル化転写物の収率に影響を与えることが見い出されており、その塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンと錯体形成するＮＴＰの転写反応混合物の濃度に依存する。
【００７６】
ＧＭＰまたはグアノシンを用いて転写を開始することもまた重要である。この効果は、開始ヌクレオチドについてのポリメラーゼの特異性から生じる。結果として、この様式において生成されるいずれかの転写物の５’−末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇである可能性が高い。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、さらにより好ましくは１ｍＭである。転写反応物にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ−８０００を含めることは、修飾ヌクレオチドの取り込みを最大化するために有用であることもまた見い出されている。
【００７７】
文献において２’−ＯＭｅ含有アプタマーのいくつかの例が存在し、例えば、Ｇｒｅｅｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２，６８３−６９５，１９９５を参照されたい。これらは、Ｃ残基およびＵ残基が２’−フルオロ（２’−Ｆ）置換され、Ａ残基およびＧ残基が２’−ＯＨ置換された修飾転写物のライブラリーのインビトロ選択によって生成された。一旦機能的配列が同定されると、各Ａ残基およびＧ残基は２’−ＯＭｅ置換に対する耐容性について試験され、２’−ＯＭｅ残基としての２’−ＯＭｅ置換に耐容性を示したすべてのＡ残基およびＧ残基を有するアプタマーが再合成された。この２段階様式において生成されたアプタマーの大部分のＡ残基およびＧ残基は２’−Ｍｅ残基と用いる置換に耐容性を示したが、平均して約２０％が耐容性を示さなかった。結果として、この方法を使用して生成されたアプタマーは２〜４個の２’−ＯＨ残基を含む傾向があり、安定性および合成のコストは結果として損なわれた。アプタマーがＳＥＬＥＸＴＭ（および／またはそのバリエーションおよび改善のいずれか、以下に記載されるものを含む）によってそこから選択されかつ富化されたオリゴヌクレオチドライブラリーにおいて使用された安定化されたオリゴヌクレオチドを生成する転写反応に修飾ヌクレオチドを取り込むことによって、本発明の方法は、選択されたアプタマーオリゴヌクレオチドを安定化させる必要性を除外する（例えば、修飾ヌクレオチドを用いてアプタマーオリゴヌクレオチドを再合成することによって）。
【００７８】
さらに、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、選択プロセスが完了した後でさらに安定化され得る（短縮化、欠失、および修飾を含む「ＳＥＬＥＸＴＭ後修飾」を参照のこと）。
【００７９】
ヌクレアーゼおよび加水分解に対して耐性であるオリゴヌクレオチド集団を生成するために、修飾ヌクレオチドが使用され得、かつ１つ以上の置換ヌクレオチド結合、糖の変化、塩基の変化、またはそれらの組み合わせを含み得る。１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）または３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）によって置換されるオリゴヌクレオチドが提供され、ここで各ＲまたはＲ’は独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換アルキルである。連結基は−Ｏ−、−Ｎ−、または−Ｓ−連結を通して隣接するヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチドにおいてすべての連結が同一であることが必要なわけではない。
【００８０】
本発明のアプタマーへの修飾ヌクレオチドの取り込みは、選択プロセスの前に（プレ−選択プロセスで）達成される（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾）。必要に応じて、修飾ヌクレオチドがＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって取り込まれている本発明のアプタマーは、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾（すなわち、ＳＥＬＥＸＴＭ前修飾の後でのＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾）によってされに修飾され得る。ＳＥＬＥＸＴＭ前修飾はＳＥＬＥＸＴＭ標識に対する特異性、およびまた改善されたインビボ安定性を有する修飾核酸リガンドを生じる。ＳＥＬＥＸＴＭプロセス後修飾（例えば、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって取り込まれたヌクレオチドを有する以前に同定されたリガンドの修飾）は、ＳＥＬＥＸＴＭプロセス前修飾によって取り込まれたヌクレオチドを有する核酸リガンドの結合能力に有害な影響を与えることなく、インビボ安定性の改善を生じ得る。
【００８１】
（修飾ポリメラーゼ）
６３９位のチロシン残基がフェニルアラニンに変化している単一変異Ｔ７ポリメラーゼ（Ｙ６３９Ｆ）は、基質として２’デオキシ、２’アミノ、および２’フルオロ−ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を容易に利用し、種々の用途のための修飾ＲＮＡを合成するために広範に使用されてきた。しかし、この変異体Ｔ７ポリメラーゼは、報告されたところによれば、よりかさばる２’置換基、例えば２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基または２’−アジド（２’−Ｎ３）置換基を有するＮＴＰを利用（例えば、取り込み）することは容易にはできない。かさばる２’置換基の取り込みのために、Ｙ６３９Ｆ変異に加えて、７８４位においてヒスチジンからのアラニンまたは他の小さなアミノ酸残基を有する二重Ｔ７ポリメラーゼ変異体（Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ）が記載され、かつ修飾ピリミジンＮＴＰを取り込むために使用された。７８４残基においてヒスチジンからのアラニン残基を有する単一変異体Ｔ７ポリメラーゼ（Ｈ７８４Ａ）もまた記載された（Ｐａｄｉｌｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，３０：１３８）。Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体とＨ７８４Ａ単一変異体の両方のＴ７ポリメラーゼにおいて、より小さなアミノ酸残基への変化は、よりかさばるヌクレオチド基質、例えば、２’−Ｏメチル置換ヌクレオチドの取り込みを可能にする。
【００８２】
本発明は、フラノース２’位においてかさばる置換基を有する修飾ヌクレオチドの取り込みの割合が野生型ポリメラーゼよりも高いこれらのおよび他の修飾Ｔ７ポリメラーゼを使用するための方法および条件を提供する。一般的に、本明細書に開示される条件下では、Ｙ６９３Ｆ単一変異体はＧＴＰ以外のすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用され得、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体はＧＴＰを含むすべての２’−ＯＭｅ置換ＮＴＰの取り込みのために使用され得る。本明細書に開示される条件下で使用される場合、Ｈ７８４Ａ単一変異体は同様の特性を有することが予測される。
【００８３】
本発明は、Ｔ７ポリメラーゼが修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに酵素的に取り込むための方法および条件を提供する。このようなオリゴヌクレオチドの全体の修飾ヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドのサブセットが合成され得る。修飾は同じであるかまたは異なり得る。すべてのヌクレオチドが修飾され得るか、およびすべてが同じ修飾を含み得る。すべてのヌクレオチドが修飾され得るが、異なる修飾を含み得、例えば、同じ塩基を含むすべてのヌクレオチドが同じ型の修飾を有し得るのに対して、他の塩基を含むヌクレオチドは異なる型の修飾を有し得る。すべてのプリンヌクレオチドは１つの型の修飾を有し得る（または修飾されない）のに対して、すべてのピリミジンヌクレオチドは、別の異なる型の修飾を有する（または修飾されない）。このようにして、転写物または転写物のライブラリーは、修飾の任意の組み合わせ、例えば、リボヌクレオチド、（２’−ＯＨ、「ｒＮ」）、デオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ）、２’−Ｆ、および２’−ＯＭｅのヌクレオチドを使用して生成される。２’−ＯＭｅ  ＣおよびＵならびに２’−ＯＨ  ＡおよびＧを含む混合物は「ｒＲｍＹ」と呼ばれ；デオキシ  ＡおよびＧならびに２’−ＯＭｅ  ＵおよびＣを含む混合物は「ｄＲｍＹ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、およびＵ、ならびに２’−ＯＨ  Ｇを含む混合物は「ｒＧｍＨ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｃ、ＵおよびＧ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびに２’−Ｆ
Ｇを代替的に含む混合物は「トグル（ｔｏｇｇｌｅ）」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、Ｕ、Ｃ、およびＧ（ここでＧの１０％までが２’−ＯＨである）を含む混合物は「ｒ／ｍＧｍＨ」と呼ばれ；２’−ＯＭｅ  Ａ、ＵおよびＣ、ならびに２’−Ｆ  Ｇを含む混合物は「ｆＧｍＨ」と呼ばれ；そしてデオキシＡ、ならびに２’−ＯＭｅ  Ｃ、Ｇ、およびＵを含む混合物は「ｄＡｍＢ」と呼ばれる。
【００８４】
好ましい実施形態は、２’−ＯＨヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、および２’−ＯＭｅヌクレオチドのいずれかの組み合わせを含む。より好ましい実施形態は、ピリミジンが２’−ＯＭｅ（例えば、ｄＲｍＹ、ｍＮ、またはｄＧｍＨ）である２’−デオキシヌクレオチドおよび２’−ＯＭｅヌクレオチドのいずれかの組み合わせを含む。
【００８５】
（２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドＳＥＬＥＸＴＭ）
本発明は、その条件下でポリメラーゼが２’−修飾ＮＴＰを受容する条件で、２’−修飾（例えば、２’−ＯＭｅ）ＲＮＡ転写物のライブラリーを生成するための方法を提供する。好ましくは、ポリメラーゼはＹ６９３Ｆ／Ｈ７８４Ａ二重変異体またはＹ６９３Ｆ単一変異体である。他のポリメラーゼ、特にかさばる２’−置換基についての高い耐容性を示すものもまた、本発明において使用され得る。このようなポリメラーゼは、本明細書に開示される転写条件下で修飾ヌクレオチドを取り込むそれらの能力をアッセイすることによってこの可能性についてスクリーニングされ得る。多数の要因が、本明細書に開示される方法において有用である転写条件について重要であると決定されてきた。例えば、得られる転写物の少なくとも最初の約６残基がプリンであるようにリーダー配列がＤＮＡ転写テンプレートの５’末端における固定化配列の５’末端に取り込まれる場合に、修飾転写物の収率の大きな増加が観察される。
【００８６】
修飾ヌクレオチドを取り込む転写物を得る際の別の重要な要因は、２’−ＯＨ  ＧＴＰの存在または濃度である。転写は、２つのフェーズに分けられ得る：第１のフェーズは開始であり、その間、ＮＴＰはＧＴＰの３’−ヒドロキシル末端（または別の置換グアノシン）に加えられてジヌクレオチドを産生し、これは次いで約１０〜１２ヌクレオチド伸長され、第２のフェーズは伸長であり、この間、転写は最初の約１０〜１２ヌクレオチドの付加を超えて進行する。過剰の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰを含む転写混合物に加えられた少量の２’−ＯＨ  ＧＴＰは、ポリメラーゼが２’−ＯＨ  ＧＴＰを使用する転写を開始することを可能にするのに十分であることが見い出されたが、一旦転写が伸長フェーズに入ると、２’−ＯＭｅと２’−ＯＨ  ＧＴＰの間の区別の減少、および２’−ＯＨ  ＧＴＰを超えた過剰の２’−ＯＭｅ  ＧＴＰは、主に２’−ＯＭｅ  ＧＴＰの取り込みを可能にする。
【００８７】
転写物２’−Ｍｅの取り込みにおける別の重要な要因は、転写混合物における二価のマグネシウムとマンガンの両方の使用である。塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの異なる濃度の組み合わせは、２’−Ｏ−メチル化転写物の収率に影響を与えることが見い出されており、その塩化マグネシウムおよび塩化マンガンの最適濃度は、二価金属イオンと錯体形成するＮＴＰの転写反応混合物の濃度に依存する。最大限に２’置換されたＯ−メチル化転写物（すなわち、Ａヌクレオチド、Ｃヌクレオチド、およびＵヌクレオチドのすべて、ならびに約９０％のＧヌクレオチド）の最大の収率を得るために、約５ｍＭ  塩化マグネシウムおよび１．５ｍＭ  塩化マンガンの濃度が、各ＮＴＰが０．５ｍＭの濃度で存在する場合に好ましい。各ＮＴＰの濃度が１．０ｍＭである場合に、約６．５ｍＭ  塩化マグネシウムおよび２．０ｍＭ  塩化マンガンの濃度が好ましい。各ＮＴＰの濃度が２．０ｍＭである場合に、約９．６ｍＭ  塩化マグネシウムおよび２．９ｍＭ  塩化マンガンの濃度が好ましい。いずれの場合においても、これらの濃度の２倍までからの逸脱は、修飾転写物の有意な量をなお与える。
【００８８】
ＧＭＰまたはグアノシンを用いて転写を開始することもまた重要である。この効果は、開始ヌクレオチドについてのポリメラーゼの特異性から生じる。結果として、この様式において生成されるいずれかの転写物の５’−末端ヌクレオチドは、２’−ＯＨ  Ｇである可能性が高い。ＧＭＰ（またはグアノシン）の好ましい濃度は０．５ｍＭであり、さらにより好ましくは１ｍＭである。転写反応物にＰＥＧ、好ましくはＰＥＧ８０００を含めることは、修飾ヌクレオチドの取り込みを最大化するために有用であることもまた見い出されている。
【００８９】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ（１００％）、ＵＴＰ（１００％）、ＣＴＰ（１００％）、およびＧＴＰ（〜９０％）（「ｒ／ｍＧｍＨ」）の最大の取り込みのために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（６．５ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は１．０ｍＭである）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（２．０ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は１．０ｍＭである）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、１．０ｍＭ）、２’−ＯＨ  ＧＴＰ  ３０μＭ、２’−ＯＨ  ＧＭＰ  ５００μＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。本明細書中で使用される場合、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、または本明細書に特定される他の任意の変異体Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの１単位は、ｒ／ｍＧｍＨ条件下で１ｎモルの２’−ＯＭｅ  ＮＴＰを転写物に取り込むために必要とされる酵素の量として定義される。本明細書中で使用される場合、無機ピロホスファターゼの１単位は、ｐＨ  ７．２で２５℃において、１分間あたり１．０モルの無機ピロリン酸を遊離させる酵素の量として定義される。
【００９０】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰ（「ｒＧｍＨ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（９．６ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（２．９ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９１】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｒＲｍＹ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ５ｍＭ（９．６ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ
ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、ＭｎＣｌ２  １．５ｍＭ（２．９ｍＭ、この場合各２’−ＯＭｅ  ＮＴＰの濃度は２．０ｍＭである）、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）５００μＭ（より好ましくは、２．０ｍＭ）、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ／Ｈ７８４Ａ  Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９２】
転写物へのデオキシＡＴＰおよびＧＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＵＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＲｍＹ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミンまたはスペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９３】
転写物への２’−ＯＭｅ  ＡＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰおよび２’−Ｆ  ＧＴＰ（「ｆＧｍＨ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９４】
転写物へのデオキシＡＴＰおよび２’−ＯＭｅ  ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ（「ｄＡｍＢ」）の最大取り込み（１００％）のために、以下の条件が好ましい：ＨＥＰＥＳ緩衝液２００ｍＭ、ＤＴＴ４０ｍＭ、スペルミジン２ｍＭ、ＰＥＧ−８０００  １０％（ｗ／ｖ）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．０１％（ｗ／ｖ）、ＭｇＣｌ２  ９．６ｍＭ、ＭｎＣｌ２  ２．９ｍＭ、２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ（各）２．０ｍＭ、ｐＨ  ７．５、Ｙ６３９Ｆ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ１５単位／ｍｌ、無機ピロホスファターゼ５単位／ｍｌ、および少なくとも８ヌクレオチド長のすべてプリンのリーダー配列。
【００９５】
上記の各々について、（１）約３０℃から約４５℃までの温度でかつ少なくとも２時間の時間で好ましく実行され、（２）５０〜３００ｎＭの二本鎖ＤＮＡ転写テンプレートが使用される（２００ｎＭテンプレートが多様性を増加させるためにラウンド１のために使用され（３００ｎＭテンプレートはｄＲｍＹ転写のために使用され）、引き続くラウンドのためには、約５０μＭ、最適化ＰＣＲ反応の１／１０希釈が、本明細書に記載される条件を使用して使用された）。好ましいＤＮＡ転写テンプレートは以下に記載される（この場合、ＡＲＣ２５４およびＡＲＣ２５６はすべての２’−ＯＭｅ条件下で転写され、ＡＲＣ２５５はｒＲｍＹ条件下で転写される）。
【００９６】
【化１】
2007525177.tif 000078
本発明のｒＮ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−ＯＨグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、２’−ＯＨシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｏ−ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｒＮ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−ＯＨシチジン、および２’−ＯＨウリジンの実質的にすべてを含む。ｒＮ転写の好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。ｒＮ転写のより好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。ｒＮ転写の最も好ましい実施形態において、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチド１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨウリジンである配列を含む。
【００９７】
本発明のｒＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨアデノシン三リン酸、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−ＯＨシチジン三リン酸、および２’−Ｏ−ウリジン三リン酸を含む。本発明のｒＲｍＹ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨアデノシン、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏメチルシチジン、および２’−Ｏメチルウリジンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチド１００％が２’−ＯＨアデノシンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【００９８】
本発明のｄＲｍＹ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシプリン三リン酸および２’−Ｏ−メチルピリミジン三リン酸を含む。本発明のｄＲｍＹ転写条件を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、実質的にすべての２’−デオキシプリンおよび２’−Ｏ−メチルピリミジンを含む。好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのプリンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシプリンであり、かつすべてのピリミジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのプリンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシプリンであり、かつすべてのピリミジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、本発明の得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのプリンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシプリンであり、かつすべてのピリミジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルピリミジンである配列を含む。
【００９９】
本発明のｒＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−ＯＨグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、および２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸を含む。本発明のｒＧｍＨ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−ＯＨグアノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、および２’−Ｏ−メチルアデノシンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−ＯＨグアノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンである配列を含む。
【０１００】
本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸、および２’−ＯＨグアノシン三リン酸を含む。本発明のｒ／ｍＧｍＨ転写混合物を使用して産生された、得られた修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンの実質的にすべてを含み、ここでグアノシンヌクレオチドの集団は最大で約１０％の２’−ＯＨグアノシンを有する。好ましい実施形態において、得られる本発明のｒ／ｍＧｍＨ修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１０％を超えないグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１０％を超えないグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１０％を超えないグアノシンヌクレオチドが２’−ＯＨグアノシンである配列を含む。
【０１０１】
本発明のｆＧｍＨ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−Ｏ−メチルアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、および２’−Ｆグアノシン三リン酸を含む。本発明のｆＧｍＨ転写条件を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルアデノシン、２’−Ｏ−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、および２’−Ｆグアノシンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルアデノシンであり、すべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、かつすべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｆグアノシンである配列を含む。
【０１０２】
本発明のｄＡｍＢ転写条件下で、転写反応混合物は、２’−デオキシアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、２’−Ｏ−メチルシチジン三リン酸（ＣＴＰ）、２’−Ｏ−メチルグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、および２’−Ｏ−メチルウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を含む。本発明のｄＡｍＢ転写混合物を使用して産生された修飾オリゴヌクレオチドは、２’−デオキシアデノシン、２’−Ｏ−メチルシチジン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、および２’−Ｏ−メチルウリジンの実質的にすべてを含む。好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。より好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの少なくとも９０％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。最も好ましい実施形態において、得られる修飾オリゴヌクレオチドは、すべてのアデノシンヌクレオチドの１００％が２’−デオキシアデノシンであり、すべてのシチジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルシチジンであり、すべてのグアノシンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルグアノシンであり、かつすべてのウリジンヌクレオチドの１００％が２’−Ｏ−メチルウリジンである配列を含む。
【０１０３】
各々の場合において、次いで、転写産物は、アプタマーを同定するため、および／または所定の標的に対する結合特異性を有する配列の保存性モチーフを決定するためにＳＥＬＥＸＴＭプロセスにおいてライブラリーとして使用され得る。得られる配列はすでに安定化され、安定化されたアプタマー配列に到達するためにプロセスからこの工程を除外し、結果としてより高度に安定化されたアプタマーを与える。２’−ＯＭｅ  ＳＥＬＥＸＴＭプロセスの別の利点は、得られる配列は、配列中に必要とされる２’−ＯＨヌクレオチドが少ない可能性、おそらく、それがない可能性があることである。
【０１０４】
以下に記載されるように、２’−ＯＭｅ置換ヌクレオチドを完全に取り込んでいる低いがなお有用である転写物の収率は、上記に記載される最適化条件以外の条件下で得られ得る。例えば、上記の転写条件に対するバリエーションは以下を含む。
【０１０５】
ＨＥＰＥＳ緩衝液濃度は０から１Ｍの範囲であり得る。本発明はまた、５から１０の間のｐＫａ値を有する他の緩衝剤、例えば、非限定的に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンの使用を意図する。
【０１０６】
ＤＴＴ濃度は０から４００ｍＭの範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の還元剤、例えば、非限定的に、メルカプトエタノールの使用を提供する。
【０１０７】
スペルミジンおよび／またはスペルミンの濃度は０から２０ｍＭの範囲であり得る。
【０１０８】
ＰＥＧ−８０００濃度は０から５０％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の親水性ポリマー、例えば、非限定的に、他の分子量のＰＥＧまたは他のポリアルキレングリコールの使用を提供する。
【０１０９】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００濃度は０から０．１％（ｗ／ｖ）の範囲であり得る。本発明の方法はまた、他の非イオン性界面活性剤、例えば、非限定的に、他のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ界面活性剤を含む他の界面活性剤の使用を提供する。
【０１１０】
ＭｇＣｌ２濃度は０．５ｍＭから５０ｍＭの範囲であり得る。ＭｎＣｌ２濃度は０．１５ｍＭから１５ｍＭの範囲であり得る。ＭｇＣｌ２とＭｎＣｌ２の両方が記載された範囲内で存在しなければならず、好ましい実施形態においては、約１０から約２のＭｇＣｌ２：ＭｎＣｌ２比であり、好ましくはこの比率は約３〜５、より好ましくは、この比率は約３〜約４である。
【０１１１】
２’−ＯＭｅ  ＮＴＰ濃度（各ＮＴＰ）は５μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１１２】
２’−ＯＭｅ  ＧＴＰ濃度は０μＭ〜３００μＭの範囲であり得る。
【０１１３】
２’−ＯＭｅ  ＧＭＰ濃度は０μＭ〜５ｍＭの範囲であり得る。
【０１１４】
ｐＨ範囲はｐＨ６からｐＨ９までの範囲であり得る。本発明の方法は、修飾ヌクレオチドを取り込む大部分のポリメラーゼの活性のｐＨ範囲内で実施され得る。さらに、本発明の方法は、転写反応条件におけるキレート剤、例えば、非限定的に、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＤＴＴの任意的な使用を提供する。
【０１１５】
以下の実施例に記載されるような生物学的アッセイによって実証された場合の最大の親和性および特異的結合を有する選択されたアプタマーは、標的が病原に関与する状態を処置するための適切な治療剤である。
【０１１６】
（アプタマー治療剤）
アプタマーは前臨床的および臨床的な開発における現在のところ将来性のあるクラスの治療剤を表す。生物製剤、例えば、ペプチドまたはモノクローナル抗体と同様に、アプタマーは分子標的に特異的結合可能であり、結合を通して、標的の機能を阻害する。典型的なアプタマーは１０〜１４ｋＤａのサイズ（すなわち、３０〜４５ヌクレオチド）であり、その標的とナノモル以下の親和性で結合し、密接に関連する標的の間を区別する（例えば、典型的には、同じ遺伝子ファミリーからの他のタンパク質に結合しない）（Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７（１）：２５−３１；Ｊｅｎｉｓｏｎら（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８（４）：２６５−７９；Ｂｅｌｌら（１９９９）Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．３５（９）；５３３−４２；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５；Ｄａｎｉｅｌｓら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０５（２）：２１４−２６；Ｃｈｅｎら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１６）：９２２６−３１；Ｋｈａｔｉら（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２３）：１２６９２−８；Ｖａｉｓｈら（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２（２９）：８８４−５１）。ランダム配列オリゴヌクレオチドのライブラリーから完全なインビトロ選択プロセス（ＳＥＬＥＸＴＭ）によって作製されるので、アプタマーは、治療的関心対象の多数のタンパク質（増殖因子、酵素、免疫グロブリン、およびレセプターを含む）に対して生成されてきた（ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６（６２８７）：８１８−２２；ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４９（４９６８）：５０５−５１０）。
【０１１７】
アプタマーは、治療剤としての使用のために多数の魅力的な特徴を有する。高い標的親和性および特異性に加えて、アプタマーは、標準的アッセイにおいて毒性または免疫原性をほとんど示さないか、または全く示さない（Ｗｌｏｔｚｋａら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９（１３）：８８９８−９０２）。いくつかの治療用アプタマーが前臨床的開発の種々の段階（例えば、薬物動態学的分析、細胞および動物疾患モデルにおける生物学的効力の特徴付け、および予備的な安全性薬理学評価）を通して最適化および進歩されてきた（ＲｅｙｄｅｒｍａｎおよびＳｔａｖｃｈａｎｓｋｙ（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５（６）：９０４−１０；Ｔｕｃｋｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５）。
【０１１８】
すべてのオリゴヌクレオチドに基づく治療剤（アプタマーを含む）についての薬物動態学的特性は、所望の薬学的適用に合致するように変更されることが重要である。細胞外標的を指向するアプタマーは細胞内送達に付随する困難さに苦しむことはないが（アンチセンスおよびＲＮＡｉに基づく治療剤の場合）、このようなアプタマーは、標的の器官および組織に分配可能でなくてはならず、かつ所望の投薬計画と一致して一定の時間の間、（修飾なしで）身体に残存しなくてはならない。核酸ベースの治療剤についての初期の研究は、非修飾オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼ消化によって急速に分解されるが、糖の２’位の保護的修飾および逆方向末端キャップ構造（例えば［３’−３’ｄＴ］）の使用は、インビトロおよびインビボで核酸の安定性を劇的に改善することを示した（Ｇｒｅｎｎら（１９９５）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（１０）：６８３−９５；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４（３６）：１１３６３−７２；Ｒｕｃｋｍａｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（３２）：２０５５６−６７；Ｕｈｌｍａｎｎら（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３：２６８ー８６）。あるＳＥＬＥＸ選択において（すなわち、ＳＥＬＥＸ実験または選択）、アプタマーがそこから選択される核酸の開始プールは、ヌクレアーゼ攻撃に対するアプタマーの耐性を増強するために、典型的には化学修飾、によって、例えば、２’ーフルオロピリミジン（２’−Ｆ）置換ヌクレオチドの取り込みによってあらかじめ安定化される。２’−Ｏ−メチルプリン（２’−Ｏ−Ｍｅプリン）置換ヌクレオチドを取り込んでいるアプタマーもまた、ＳＥＬＥＸ後修飾工程を通して、またはより最近、上記のように、ＳＥＬＥＸプロセスそれ自体の内在性成分として２’−ＯＭｅ含有ランダム配列ライブラリーの合成を可能にすることによって開発された。
【０１１９】
ヌクレアーゼによるクリアランスに加えて、オリゴヌクレオチド治療剤は、腎臓濾過を介する除去に供される。このようにして、静脈内投与されたヌクレアーゼ耐性オリゴヌクレオチドは、ブロックされることが可能でない限り、＜１０分のインビボ半減期を示す。これは、血流からの組織への迅速な分布を容易にすることによって、または糸球体についての有効なサイズカットオフ上のオリゴヌクレオチドの見かけの分子量を増加させることによってのいずれかで達成され得る。以下に記載される、ＰＥＧポリマーへの低分子治療剤の結合体化（ＰＥＧ化）は、循環中でのアプタマーの存在時間を劇的に延長し得、それによっ、投薬頻度を減少し、かつ血管標的に対する有効性を増強する。動物における以前の研究は、ＰＥＧ結合体化アプタマーの血漿薬物動態学的特性を試験した（ＲｅｙｄｅｒｍａｎおよびＳｔａｖｃｈａｎｓｋｙ（１９８８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５（６）：９０４−１０；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５）。アプタマー治療剤（修飾部分に結合体化されたかまたは修飾ヌクレオチドを含むアプタマー治療剤を含む）の血管外遊出を測定すること、特に、疾患を有する組織（例えば、炎症の部位または腫瘍の内部）に接近するアプタマーまたはそれらの修飾型の潜在能力を測定することは、アプタマー介入のための治療的機会の範囲をより良好に限定する。
【０１２０】
本発明のアプタマー組成物の薬物動態学的プロフィールは「可変性」を有する（すなわち、アプタマー薬物動態学を調節する能力）。アプタマー薬物動態学の可変性は、例えば、アプタマーへの修飾部分（例えば、ＰＥＧポリマー）の結合体化を通して、および／または核酸の化学的組成物を変化させるための修飾ヌクレオチド（例えば、２’−フルオロおよび／または２’−ＯＭｅ置換基）の取り込みを通して達成される。
【０１２１】
さらに、アプタマー薬物動態学の可変性は、被験体におけるアプタマー治療剤の生物分布を改変するために使用される。例えば、ある治療的適用において、特定の型の組織または特定の器官（または器官のセット）を標的とするための試みにおいてアプタマー治療剤の生物分布を変化させることが望ましくあり得る。これらの適用において、アプタマー治療剤は特定の組織または器官に優先的に蓄積する。他の治療的適用において、所定の疾患、細胞損傷、または他の異常な病理と関連する細胞マーカーまたは徴候を示す標的組織を標的とすることが望ましくあり得、その結果、アプタマー治療剤は罹患した組織に優先的に蓄積する。例えば、２００４年３月５日に出願され、かつ「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｐｔａｍｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」という表題の同時係属仮出願ＵＳＳＮ  ６０／５５０  ７９０に記載されているように、アプタマー治療剤のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーを用いるＰＥＧ化）は、標的の炎症性組織を標的とするために使用され、その結果、ＰＥＧ化アプタマー治療剤は炎症性組織に優先的に蓄積する。
【０１２２】
アプタマー治療剤の薬物動態学および生物分布プロフィールは、種々のパラメーターをモニターすることによって決定される。このようなパラメーターには、例えば、半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布の体積（ＶＳＳ）、濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ）、最大観察血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）、およびアプタマー組成物の平均存在時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＵＣ」とは、アプタマー治療剤の血漿濃度対アプタマー投与後の時間のプロットの下の面積をいう。ＡＵＧ値は、所定のアプタマー治療剤の、生物学的利用能（すなわち、アプタマー投与後の循環中での投与されたアプタマー治療剤のパーセンテージ）および／または全体のクリアランス（Ｃｌ）（すなわち、アプタマー治療剤が循環から除去される速度）を見積もるために使用される。分布の体積は、アプタマー治療剤の血漿濃度を、身体に存在するアプタマーの量と関連付ける。Ｖｓｓが大きいほど、より多くのアプタマーが血漿の外部に見い出される（すなわち、より多くの血管外遊出）。
【０１２３】
（腫瘍治療剤としてのＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ−ＶＥＧＦ特異的結合アプタマー）
異なるＰＤＧＦアイソフォームに特異的に結合しかつこれを阻害することが可能であるアプタマーは本明細書に記載される。これらのアプタマーには、ＰＤＧＦにのみ結合するアプタマー、ＰＤＧＦとＶＥＧＦの両方に結合するアプタマーが含まれ、そこに組み込まれるＣｐＧモチーフを有する上記のアプタマーのいずれもが、低毒性、安全、かつ大部分のＰＤＧＦ媒介腫瘍（非限定的に、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、および他の軟部組織肉腫を含む）の進行を阻害することの有効な様式を提供する。
【０１２４】
腫瘍治療剤としての使用のためのＰＤＧＦおよびＰＤＧＦ−ＶＥＧＦ特異的結合アプタマーの例には以下の配列が含まれる。
【０１２５】
（ＰＤＧＦ結合アプタマー：）
【０１２６】
【化２】
2007525177.tif 000079
（スクランブル制御アプタマー：）
【０１２７】
【化３】
2007525177.tif 000080
ＰＤＧＦおよび／またはＶＥＧＦに結合する他のアプタマーは、以下、例えば、表２および実施例１２に記載される。
【０１２８】
低分子レセプターアンタゴニストを用いるＰＤＧＦシグナル伝達の阻害は、間質液圧を減少し、かつ固形腫瘍への化学療法剤の取り込みを増加することが実証されてきた。Ｐｉｅｔｒａｓらは、ＰＤＧＦ−ＢがＩＦＰに関与し、かつＰＤＧＦ−Ｂ機能をブロックすることは腫瘍への化学療法剤の取り込みの増加をもたらし得るという仮説を確証した（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ第３巻、４３９−４４３頁）。既知のＰＤＧＦパラクリンシグナル伝達特性を有するＫＡＴ−４甲状腺癌モデルを使用して、Ｐｉｅｔｒａｓら、ＫＡＴ−４腫瘍が間質においてＰＤＧＦ  β−レセプターを発現すること、およびＰＤＧＦ−ＢがＫＡＴ−４細胞をインビトロで結合することを実証した。次に、Ｐｉｅｔｒａｓらは、ＫＡＴ−４腫瘍におけるＰＤＧＦ−Ｂシグナル伝達をブロックするために薬物ＳＴＩ５７１（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標））を阻害するチロシンキナーゼを使用し、かつこの処理がインビボで腫瘍ＩＦＰを有意に減少し、これがタキソールの取り込みの増加をもたらすことを示した。しかし、ＳＴＩ５７１は、チロシンキナーゼＫｉｔ、Ａｂｌ、およびＡｒｇと同様に、ＰＤＧＦαとβの両方を標的とし、ＳＴＩ５７１の効果がＰＤＧＦ−Ｂのブロック単独に起因したのか否かを知ることは不可能であった。この不明確さは、同様の実験においてＰＤＧＦ−Ｂをブロックするために高度に特異的なアプタマーを使用することによって解決された。このアプタマーは、ＰＤＧＦ−Ｂについては１００ｐＭの親和性を有し、ＰＤＧＦ−Ａ配列については評価できるほどの親和性を有しなかった。ＳＴＩ５７１と同様に、ＰＥＧ−結合体化ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーを用いるＫＡＴ−４異種移植片の処理は、ＩＦＰを低下させ、腫瘍のタキソールの取り込みを劇的に増加させた。最も重要なことに、アプタマー処理は、腫瘍増殖を阻害するタキソールの能力を強力に増強した。さらに、現在上市されている癌治療剤である、ＰＤＧＦレセプターアンタゴニストＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、腫瘍ＩＦＰを減少させる際に、および細胞毒（例えば、タキソール）と組み合わせて使用されるときに腫瘍の細胞毒の取り込みを増加させる際に、有効であることが示されてきた。従って、本発明の方法および物質は、ＰＤＧＦ−Ｂの生物学的活性ならびに腫瘍発生におけるその病因ならびに化学療法剤の取り込みおよび効力を増強することによって増殖を阻害するために使用される。
【０１２９】
換言すれば、本発明のＰＤＧＦ特異的アプタマーを細胞傷害剤と組み合わせる、すなわち、ＰＤＧＦ特異的アプタマーを他の既知の細胞毒と組み合わせる本発明の組み合わせ療法は、腫瘍血管におけるＩＦＰを選択的に低下させることによって、腫瘍の部位に薬物を特異的に送達する効果的な方法を提供し、これは次には、腫瘍血管構造を通して腫瘍への細胞毒の取り込みの増加を可能にする。図４は、本発明の方法による、ＰＤＧＦアンタゴニストあるなしでの腫瘍血管構造を横切る細胞毒の輸送の模式図である（Ｐｉｅｔｒａｓら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ、第３巻、４３９−４４３頁）。
【０１３０】
本発明のＰＤＧＦアプタマーは、腫瘍ＩＦＰを低下させるための種々の既知の細胞毒性または細胞増殖抑制性（集合的に「細胞毒性」）剤と組み合わせて使用され得、それによって、すべての固形腫瘍への細胞傷害剤の送達および腫瘍の取り込みを増加させる。適切な細胞毒性または細胞増殖抑制剤には、チューブリン安定化剤／不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、およびＤＮＡアルキル化剤または他のＤＮＡ修飾剤が含まれ、それらには以下が含まれるがこれらに限定されない：パクリタキセル（タキソール（ＴＡＸＯＬ）（登録商標））、ドセタキセル、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、エポチロン、シスプラチン、カルボプラチン、５−フルオロ−Ｕ、カリケアマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、ＡｒａＣ（シタラビン）、ビンブラスチン、ダウノルビシン、オキサリプラチン、シクロホスファミド、イフロサミド、ファーマルビシン、エピルビシン、ビンフルニン、オブリメルセンナトリウム、パーメトケセド、キナーゼ阻害剤（ＥＧＦレセプターキナーゼ、ＶＥＧＦレセプターキナーゼ、オーロラキナーゼを単独でまたは任意のその組み合わせで含む）。本発明のＰＤＧＦアプタマーは、種々の既知の血管標的化薬剤と組み合わせて使用され得、ここで、「血管標的化剤」とは、腫瘍への血流およびリンパ流を支持する既存の血管構造および新生血管構造を修飾する低分子治療剤（例えば、イリノテカン）、タンパク質治療剤（例えば、ベビシズマブ）、および／またはオリゴヌクレオチド治療剤（例えば、アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ分子）を意味する。本発明のＰＤＧＦアプタマーは、結合または標的化部分、および細胞毒性部分を含む結合体治療剤と組み合わせて使用され得、ここで、結合または標的化部分は、アプタマー、抗体（トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ゲムツズマブ、ベビシズマブ、およびトシツモマブを含むがこれらに限定されない）、血管標的化剤、または葉酸化合物であるがこれらに限定されず、ここで、細胞傷害剤部分は、チューブリン安定化剤／不安定化剤、代謝拮抗物質、プリン合成阻害剤、ヌクレオシドアナログ、およびＤＮＡアルキル化剤、他のＤＮＡ修飾剤、または血管破壊剤（例えば、フラボノイド）の細胞傷害剤のクラスに、単独でまたはその任意の組み合わせで属する。本発明の物質および方法は、種々の癌（結腸直腸、膵臓、乳房、肺、前立腺、および卵巣の癌を含むがこれらに限定されない）を生じる固形腫瘍形成を阻害するために既知の化学療法剤を投与するより有効な方法を提供する。
【０１３１】
さらに、本発明のＰＤＧＦアプタマー組成物は、周皮細胞を標的とすることによって腫瘍血管構造の形成を阻害するために抗血管形成剤として使用され得る。代替的には、ＰＤＧＦアプタマー組成物は、ＰＤＧＦアプタマー治療剤またはＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト治療剤いずれか単独よりも、腫瘍血管形成を阻害するより有効な方法を提供するために、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦに特異的なアプタマーと組み合わせて使用され得る。本発明のＰＤＧＦ−Ｂ−およびＶＥＧＦ−標的化剤の利点は、本発明の治療組成物がいかなる標的を外れたチロシンキナーゼ活性も示すことがないらしいことである。なぜなら、これらは、それらの標的リガンドに非常に特異的であり、かつそれらの生物学的機能を誘発するために細胞に侵入するように設計されていないからである。対照的に、現在上市されている低分子キナーゼ阻害剤治療剤、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、高い標的を外れた活性を示す。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、チロシンキナーゼＢＣＲ−Ａｂｌ、Ｃ−ｋｉｔ、およびＡｒｇに加えて、αとβの両方のチロシンキナーゼレセプターを標的とする。低分子キナーゼ阻害剤、例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）は、固形腫瘍の処置において使用される場合、それらの最大耐容性用量で、またはその近傍で投与される。ＧＥＥＶＥＣ（登録商標）およびチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）の毒性は、メカニズム関連の副作用とメカニズムに関連しない（標的を外れた）副作用の両方によって制限される可能性がある。従って、標的を外れた活性は、一般的に、低分子量インヒビターの開発に対する主要な障害である。ＡＲＣ１２７（５’−［４０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）およびＡＲＣ３０８（５’−［３０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）を用いるインビボ実験に基づくと、用量制限副作用は明らかではない。さらなる利点は、本発明のアプタマー治療剤組成物は、静脈内、皮下、または腹腔内の経路を介して投与され得、これは投与の容易さを意味する。モノクローナル抗体癌治療と比較して、アプタマーは非免疫原性であり、従って、薬物に対する反応または薬物に対する耐性は問題ではない。
【０１３２】
（ＰＤＧＦおよびＰＤＧＦアイソフォームに対するアプタマー）
本発明の物質は、一連の３１〜３５ヌクレオチド長の核酸アプタマー（配列番号１〜配列番号３、配列番号９〜配列番号３５、配列番号３６〜７３、配列番号７７〜８１、および配列番号８５）を含み、これはインビトロでＰＤＧＦ−Ｂタンパク質に特異的に結合し、かつインビボおよび細胞に基づくアッセイにおいてＰＤＧＦ−ＢＢの活性を機能的にブロックする。本発明の抗ＰＤＧＦ−Ｂアプタマー配列は、７つの個々の２’Ｆ含有残基を含む親の分子ＡＲＣ１２６（５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）に由来する。２’Ｆ含有残基はＡＲＣ１２６に取り込まれて、血清エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼによるその分解をブロックすることによって、治療用アプタマーのインビトロ血清およびインビボの安定性を増大させた。ＡＲＣ１２６抗ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーにおける潜在的に毒性の２’Ｆ含有ヌクレオチド残基を置換する試みにおいて、新たな一連の完全に２’Ｆフリーのアプタマーが同定された。本発明のこの新規なアプタマーは、インビトロ結合活性および抗増殖性活性を保持し、かつ天然に存在する２’デオキシまたは２’ＯＭｅ置換ヌクレオチドを含む。本発明のこれらの新規なアプタマーはまた、４８時間までの間に検出される分解を伴うことなく、インビトロ安定性アッセイにおいてヌクレアーゼ分解に対する耐性を通して決定されるように、実質的な血清安定性を保持する。
【０１３３】
本発明のアプタマー治療剤は、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦアイソフォーム、およびＰＤＧＦレセプターに対して高い親和性および特異性を有する一方、このアプタマー治療剤が患者または被験体の身体において分解するときに、天然に存在しないヌクレオチド置換基からの有害な副作用を減少する。本発明のアプタマー治療剤を含む治療組成物はフッ素化ヌクレオチドを含まないか、またはその量が減少している。
【０１３４】
（抗腫瘍剤の効力を増加させるための物質および方法）
本発明の物質および方法はさらに、本発明のアプタマー、すなわち、ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ３０８を用いる二重治療によって抗腫瘍剤の効力を増大させるための方法をさらに含む。さらに、本発明の方法は、結腸直腸ＬＳ１７４ｔ腫瘍異種移植片を有するヌードマウスにイリノテカンと同時投与されたときに、ＰＤＧＦ−Ｂ特異的アプタマー、ＡＲＣ１２７（すなわち、ＡＲＣ１２６＋４０Ｋ  ＰＥＧ）およびＡＲＣ３０８（すなわち、ＡＲＣ１２６＋３０Ｋ  ＰＥＧ）が活性な抗腫瘍剤であることを実証した。本発明の癌治療方法の使用は、ＡＲＣ１２７とＡＲＣ３０８の両方が単独で投与される場合に安全な非細胞傷害剤であるが、他の細胞傷害剤と組み合わせると、ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ３０８は新規な作用のメカニズムを通してそれらの抗腫瘍効果を強化することを示した。本発明の方法はさらに、非経口的に、すなわち、静脈内、皮下、または腹腔内の注射によってマウスに投与されるときに、血清由来ＡＲＣ１２７は完全な生物学的活性を保持していることを実証する。
【０１３５】
（ＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦに特異的なアプタマー−キメラ）
本発明の物質および方法は、ＰＤＧＦ−ＢとＶＥＧＦの両方を標的とする二機能性アプタマー−キメラをさらに提供する。本発明のＰＤＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦアプタマーキメラＴＫ．１３１．１２．Ａ（配列番号９）およびＴＫ．１３１．１２．Ｂ（配列番号１０）は、癌の治療のためにＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦを同時に標的とすることを可能にする。キメラ分子において使用されるＰＤＧＦ−Ｂアプタマーは、ＡＲＣ１２７アプタマー配列に由来する。キメラ分子において使用されたＶＥＧＦアプタマーは、ＡＲＣ２４５（配列番号７）アプタマー配列に由来する。本発明のアプタマー−キメラは、ＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ結合アプタマーの任意のセットから構築され得る。本発明のＰＤＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦキメラは、新生血管構造を支持するための高度な新生血管形成ならびに周皮細胞補充もまた示す、ＶＥＧＦ−依存性固形腫瘍の治療において有用である。
【０１３６】
ＲｉｐＴａｇ膵臓マウス腫瘍モデルからの最近の抗腫瘍データは、抗ＶＥＧＦ剤または抗ＰＤＧＦＲ剤のいずれかが単独で加えられるときよりも、抗ＶＥＧＦ治療および抗ＰＤＧＦＲ治療が同時に実行されるときに、腫瘍増殖のより高いブロックの付与が存在することを示唆する（Ｂｅｒｇｅｒｓら（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１１：９、１２８７−１２９５頁）。抗ＰＤＧＦＲ治療がすべてのレセプター媒介シグナル伝達事象をブロックするので、その効果は非特異的であると予測され得る。本発明におけるＰＤＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦキメラは、腫瘍における正確なＰＤＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ標的化を提供する。
【０１３７】
本発明のアプタマー治療剤は、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦレセプターに対する高い親和性および特異性を有する一方、アプタマー治療剤が患者または被験体の身体において分解するときに、天然に存在しないヌクレオチド置換基からの有害な副作用を減少する。本発明のアプタマー治療剤の治療用組成物は、フッ素化ヌクレオチドを含まないか、またはその量が減少している。
【０１３８】
（免疫刺激モチーフを有するアプタマー）
脊椎動物免疫系による細菌ＤＮＡの認識は、非メチル化ＣＧジヌクレオチド、特に配列の文脈（「ＣｐＧモチーフ」）の認識に基づく。このようなモチーフを認識する１つのレセプターは、Ｔｏｌｌ用レセプター９（「ＴＬＲ９」）であり、これは、個別の微生物成分を認識することによって固有の免疫応答に関与するＴｏｌｌ様レセプターのファミリー（〜１０メンバー）の１つのメンバーである。ＴＬＲ９は、配列特異的な様式で、非メチル化オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）ＣｐＧ配列に結合する。ＣｐＧモチーフの認識は、先天的および最終的に獲得された免疫応答をもたらす防御メカニズムを誘発する。例えば、マウスにおけるＴＬＲ９の活性化は、抗原提示細胞の活性化、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子のアップレギュレーション、ならびに重要な同時刺激分子およびサイトカイン（ＩＬ−１２およびＩＬ−２３を含む）の発現を誘導する。この活性化は、直接的と間接的の両方で、Ｂ細胞およびＴ細胞の応答を増強し、これには、ＴＨ１  サイトカインγの強固なアップレギュレーションが含まれる。集合的に、ＣｐＧ配列への応答は以下をもたらす：感染性疾患に対する防御、ワクチンに対する免疫応答の改善、喘息に対する効果的な応答、および抗体依存性細胞媒介細胞毒性の改善。従って、ＣｐＧ  ＯＤＮは、感染性疾患に対する防御を提供し得、免疫アジュバントまたは癌治療剤（単独療法またはｍＡｂもしくは他の治療法との組み合わせ）として機能し得、喘息およびアレルギー性応答を減少し得る。
【０１３９】
１つ以上のＣｐＧモチーフを含むアプタマーは、例えば、本明細書に記載されるＳＥＬＥＸＴＭプロセスを使用する、種々のストラテジーによって同定または生成され得る。一般的には、このストラテジーは２つのグループに分けられ得る。第１のグループにおいては、ストラテジーは、複数のＣｐＧモチーフおよび１つのＣｐＧモチーフを認識するもの以外の両方の結合部位を含むアプタマーを同定または生成することに向けられる。これらのストラテジーは以下の通りである：（ａ）ＣｐＧモチーフが、固定化領域とし、または固定化領域の一部として、各プールのメンバーに取り込まれているオリゴヌクレオチドプールを使用して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得るためにＳＥＬＥＸＴＭを実行する工程；（ｂ）ＳＥＬＥＸＴＭを使用して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得る工程、および次いで、ＣｐＧモチーフを５’末端および／もしくは３’末端に付加するか、またはＣｐＧモチーフを、アプタマーの領域、好ましくは必須でない領域に操作する工程；（ｃ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得る工程、ここで、プールの合成の間の種々のヌクレオチドのモル濃度比は、プールの各メンバーのランダム化領域がＣｐＧモチーフで富化されるように、１つ以上のヌクレオチド付加工程において偏っている；ならびに（ｄ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、特異的標的（ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的以外）、好ましくは、抑制された免疫応答が疾患の発症と関連している標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含むアプタマーを同定する工程。
【０１４０】
第２の段階において、ストラテジーは、ＣｐＧモチーフおよび／もしくはＣｐＧモチーフについてのレセプター（例えば、ＴＬＲ９または他のｔｏｌｌ様レセプター）によって結合され、かつ渇仰に際して免疫応答を刺激する他の配列を含むアプタマーを同定または生成することに向けられる。これらのストラテジーは以下の通りである：（ｉ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激するすることが知られている標的に対するアプタマーをオリゴヌクレオチドプールを使用して得る工程、ここで、ＣｐＧモチーフは、例えば、プールメンバーのランダム化された領域において、固定化領域として、または固定化領域の一部として、プールの各メンバーに取り込まれている；（ｉｉ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激するすることが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、および次いで、ＣｐＧモチーフを５’末端および／もしくは３’末端に付加するか、またはＣｐＧモチーフを、アプタマーの領域、好ましくは必須でない領域に操作する工程；（ｉｉｉ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、ここで、プールの合成の間に、種々のヌクレオチドのモル濃度比は、プールの各メンバーのランダム化領域がＣｐＧモチーフで富化されるように、１つ以上のヌクレオチド付加工程において偏っている；（ｉｖ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含むこれらのアプタマーを同定する工程；ならびに（ｖ）ＳＥＬＥＸＴＭを実行して、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合に際して免疫応答を刺激することが知られている標的に対するアプタマーを得る工程、およびＣｐＧモチーフを含まない、結合に際して免疫応答を刺激するこれらのアプタマーを同定する工程。
【０１４１】
種々の異なるＣｐＧモチーフのクラスが同定されており、各々は、異なるカスケードの事象における認識、サイトカインおよび他の分子の放出、および特定の細胞型の活性化に際して生じる。例えば、ＣｐＧ  Ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，２０：７０９−７６０（参考として本明細書に援用される）を参照のこと。さらなる免疫刺激モチーフは、以下の米国特許：６，２０７，６４６；６，２３９，１１６；６，４２９，１９９；６，２１４，８０６；６，６５３，２９２；６，４２６，４３４；６，５１４，９４８および６，４９８，１４８（参考として本明細書に援用される）に開示される。これらのＣｐＧモチーフまたは他の免疫刺激モチーフのいずれかはアプタマーに取り込まれ得る。アプタマーの選択は、治療される疾患または障害に依存する。好ましい免疫刺激モチーフは以下の通りであり（左から右に５’〜３’を示す）、ここで「ｒ」はプリンを示し、「ｙ」はピリミジンを示し、「Ｘ」は任意のヌクレオチドを示す：ＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧ（配列番号８５）；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＣＧＴ；ｒＣＧｙ；ｒｒＣＧｙｙ、ＸＣＧＸ、ＸＸＣＧＸＸ、およびＸ１Ｘ２ＣＧＹ１Ｙ２ここでＸ１はＧまたはＡであり、Ｘ２はＣではなく、Ｙ１はＧではなく、かつＹ２は好ましくはＴである。
【０１４２】
ＣｐＧモチーフが、ＣｐＧモチーフに結合し、かつ結合の際に免疫応答を刺激することが知られている標的以外の特異的標的（「非ＣｐＧ」標的）に結合するアプタマーに取り込まれているこれらの例において、ＣｐＧは、アプタマーの非必須領域に優先的に局在化される。アプタマーの非必須領域は、部位特異的変異誘発、欠失分析、および／または置換分析によって同定され得る。しかし、非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力を有意に妨害しない任意の位置が使用され得る。アプタマー配列中に組み込まれることに加えて、ＣｐＧモチーフは、５’末端と３’末端のいずれかもしくはその両方に付加され得るか、またはさもなくばアプタマーに結合され得る。非ＣｐＧ標的に結合するアプタマーの能力が有意に妨害されない限り、結合の任意の位置または手段が使用され得る。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、「免疫応答の刺激」とは、（１）特定の応答の誘導（例えば、Ｔｈ１応答の誘導）または特定の分子の産生の誘導、あるいは（２）特定の応答の阻害もしくは抑制（例えば、Ｔｈ１応答の阻害もしくは抑制）または特定の分子の阻害もしくは抑制のいずれかを意味し得る。
【０１４４】
ＣｐＧモチーフは、任意の標的に対するアプタマーに取り込まれるか、または付加され得、この標的には、ＰＤＧＦ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  ＦｃεＲ１、ＴＮＦ−α、ＰＳＭＡ、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＦｃＲＩＩＢ、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＢＡＦＦ、Ｂ７−Ｘ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２５、およびＣＤ３３が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４５】
固形腫瘍を特異的に標的とするアプタマーにＣｐＧモチーフを取り込むことによって、これらのアプタマーは、腫瘍由来物質を取り込んだ抗原提示細胞の補充を通して免疫系を活性化するため、それらの成熟および局所的リンパ節への移動を増強するため、および腫瘍特異的Ｔ細胞のプライミングを増強するために使用され得る。これはとりわけ、アプタマーが細胞毒性ペイロードを送達し、かつ細胞死を生じる場合に関連する（例えば、ＣｐＧモチーフを含むＰＳＭＡアプタマー）。このようなＣｐＧモチーフ含有アプタマーはまた、腫瘍特異的記憶応答を誘導し得る（予防的使用）。さらに、ＣｐＧ投与の際に観察される免疫応答の増加と組み合わせたＰＤＧＦ−ＢアプタマーのＩＦＰ低下効果および周皮細胞補充ブロッキング効果は、癌のための強力な治療性を表す。従って、取り込まれ、付加され、または組み込まれたＣｐＧモチーフを有するアプタマーは、抗癌化合物の新規なクラスを表し、その結果、投与されたときに、これらは、２つのメカニズム；第１に腫瘍ベッド内での腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化、第２にアプタマーファーマコフォアの意図的なメカニズムに基づく作用を通して、腫瘍の有意な大きさの減少をもたらし得る。
【０１４６】
（薬学的組成物）
本発明はまた、アプタマー分子を含む薬学的組成物を含む。ある実施形態において、この組成物は内部使用のために適切であり、かつ本発明の薬学的に活性な化合物の有効量を、単独で、または１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。この組成物は、これらが、もしあれば、非常に低い毒性を有するという点でとりわけ有用である。
【０１４７】
本発明の組成物は、疾患もしくは障害などの病理を治療もしくは予防するために、または患者におけるこのような疾患もしくは障害の徴候を緩和するために使用され得る。本発明の組成物は、アプタマーが特異的に結合する標的に関連するか、またはそれに由来する疾患または障害に罹患しているか、またはその素因を有する被験体への投与のために有用である。
【０１４８】
例えば、標的は病理と関連するタンパク質であり、例えば、その標的タンパク質がその病理を引き起こす。例えば、標的は、固形腫瘍の発症および進行においてＰＤＧＦに関連する。
【０１４９】
本発明の組成物は、病理を有する患者または被験体を治療するための方法において使用され得る。この方法は、病理と関連する標的（例えば、タンパク質）を結合するアプタマーを含む組成物を患者または被験体に投与する工程を包含し、その結果、標的へのその組成物の結合が、標的の生物学的機能を変化させ、それによって病理を治療する。
【０１５０】
病理を有する患者または被験体、例えば、本発明の方法によって治療される患者または被験体は、哺乳動物、またはより特定すると、ヒトであり得る。
【０１５１】
実際上、組成物またはそれらの薬学的に受容可能な塩は、それらの所望の生物学的活性を発揮するために十分である量で投与され、例えば、そのレセプターに対するサイトカインの結合を阻害する。
【０１５２】
本発明の１つの局面は、癌または癌関連障害のための他の治療と組み合わせた本発明のアプタマー組成物を含む。本発明のこのアプタマー組成物は、例えば、１つより多くのアプタマーを含み得る。ある例において、本発明のアプタマー組成物は、１つ以上の本発明の化合物を含み、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗ウイルス剤などの別の有用な組成物と組み合わせて投与される。さらに、本発明の化合物は、上記のような、細胞毒性、細胞増殖抑制性、または化学療法剤、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、分裂抑制因子、または細胞毒性性抗生物質と組み合わせて投与され得る。一般的に、このような組成物における使用のために現在使用可能な投薬型の既知の治療剤が適切である。
【０１５３】
「組み合わせ治療」（または「同時治療」）は、これらの治療剤の同時作用からの有益な効果を提供するために、本発明のアプタマー組成物、および意図される特異的治療計画の一部として少なくとも第２の薬剤の投与を含む。組み合わせ治療の有益な効果には、治療剤の組み合わせから生じる薬物動態学的または薬力学的な同時作用が含まれるがこれに限定されない。これらの治療剤の組み合わせでの投与は、典型的には、規定された時間の期間にわたって実行される（選択された組み合わせに依存して、通常、数分間、数時間、数日間、または数週間）。
【０１５４】
「組み合わせ治療」は、本発明の組み合わせにおいて偶発的にまたは任意に生じる個別の単独療法計画の一部としてこれらの治療剤の２つ以上の投与を含むことを意図し得るが、一般的にはそうではない。「組み合わせ治療」は、連続的な様式でこれらの治療剤の投与を含むことが意図される。すなわち、ここでは、各治療剤が異なる時間に投与され、ならびに、これらの治療剤の投与、または少なくとも２つの治療剤は、実質的に同時の様式である。実質的に同時の投与は、例えば、各治療剤を固定された比率で有する単一のカプセル、または治療剤の各々についての単一のカプセルを複数、投与することによって達成され得る。
【０１５５】
各治療剤の連続的または実質的に同時の投与は、任意の適切な経路によってもたらされ得、これには例えば、局所的経路、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、および粘膜組織を通した直接吸収が含まれるがこれらに限定されない。治療剤は、同じ経路または異なる経路によって投与され得る。例えば、選択された組み合わせの第１の治療剤は注射によって投与され得るのに対して、その組み合わせの他の治療剤は局所的に投与され得る。
【０１５６】
代替的には、例えば、すべての治療剤は局所的に投与され得るか、またはすべての治療剤は注射によって投与され得る。治療剤が投与される順番は、決定的ではないとは言えない。「組み合わせ治療」はまた、他の生物学的に活性な成分とさらに組み合わせた上記のような治療剤の投与を含み得る。組み合わせ治療がさらに非薬物治療を含む場合、その非薬物治療は、治療薬剤および非薬物治療の組み合わせの同時作用からの有益な効果が達成される限り、任意の適切な時点で実行され得る。例えば、適切な場合において、有益な効果は、非薬物治療は治療剤の投与から、おそらく数日間または数週間でさえ離される場合になお達成される。本発明の化合物および他の薬理学的に活性な薬剤が、同時に、連続的に、または組み合わせて患者に投与され得る。本発明の組み合わせを使用するときに、本発明の化合物および他の薬理学的に活性な薬剤が同じ薬学的に受容可能なキャリア中にあり得、それゆえに同時に投与されることが理解される。これらは、同時に摂取される慣用的な経口投薬形態などの別個の薬学的キャリア中にあってもよい。用語「組み合わせ」はさらに、化合物が別々の投薬形態中に提供され、かつ連続して投与される場合をいう。
【０１５７】
本発明の治療用または薬学的組成物は、一般的に、薬学的に受容可能な媒体中に溶解されるかまたは分散される治療の活性成分の有効量を含む。薬学的に受容可能な媒体またはキャリアは、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗微生物剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野において周知である。補助的な活性成分もまた、本発明の治療組成物に組み込まれ得る。
【０１５８】
薬学的または薬理学的組成物の調製は、本開示に鑑みて当業者には公知である。典型的には、このような組成物は、注射液として、液体溶液もしくは懸濁液のいずれかとして；注射の前の液体である溶液もしくは懸濁液の中に入れるのに適切な固体形態；経口投与のための錠剤もしくは他の固体として；時間放出カプセルとして；または現在使用されているいずれかの他の形態（点眼薬、クリーム、ローション、軟膏、吸入剤などを含む）で調製され得る。手術の分野において特定の区域を処理するための、外科医、内科医、または医療従事者による滅菌製剤の使用、例えば、生理食塩水ベースの洗浄剤もまた、特に有用であり得る。組成物はまた、マイクロデバイス、微粒子、またはスポンジを介して送達され得る。
【０１５９】
製剤の際に、治療剤は、投薬製剤と適合可能な様式で、かつ薬理学的に有効であるような量で投与される。処方は、種々の投薬量形態、例えば、上記の注射可能な溶液の型で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどもまた利用され得る。
【０１６０】
この文脈において、活性成分の量および投与される組成物の量は、治療される宿主動物に依存する。投与のために必要とされる活性化合物の正確な量は実施者の判断に依存し、かつ各固体に固有である。
【０１６１】
活性化合物を分散するために必要とされる組成物の最小量が典型的には利用される。投与のために適切な計画もまた変動可能であるが、典型的には、最初に化合物を投与することおよび結果をモニターすること、次いでさらなる間隔でさらなる制御用量を与えることによる。
【０１６２】
例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与のために、活性薬物成分が、経口の、非毒性の、薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と合わせられ得る。さらに、望ましいかまたは必要である場合、適切な結合剤、崩壊剤、および冷却剤もまた、混合物に組み込まれ得る。適切な結合剤には、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンのり、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、および／またはポリビニルピロリドン、天然の糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース）、コーン甘味料、天然または合成のガム（例えば、アカシア、トラガカント、またはアルギン酸ナトリウム）、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの投薬形態において使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウム塩またはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが含まれる。崩壊剤には、非限定的に、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム、デンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩、または発泡性混合物などが含まれる。希釈剤には、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシンが含まれる。
【０１６３】
注射可能組成物は、好ましくは等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、有利には脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から調製される。組成物は滅菌され得、および／またはアジュバント（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤）を含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。これらの組成物は、従来的な混合、顆粒化、またはコーティングの方法にそれぞれ従って調製され、活性成分の約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％を含む。
【０１６４】
本発明の化合物はまた、時限的放出または持続放出性の錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、エリキシル、チンキ剤、懸濁液、シロップ、およびエマルジョンのような経口投薬形態で投与され得る。
【０１６５】
液体、特に注射可能な組成物は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの薬学的に純粋な溶媒中に、またはそれとともに混合され、注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射の前に液体中に溶解するための適切な固体形態が製剤化され得る。注射可能な組成物は、好ましくは、等張性水溶液または水性懸濁液である。これらの組成物は、滅菌され得、および／またはアジュバント（例えば、保存剤、安定剤、湿潤剤、または乳化剤、溶液促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／または緩衝剤）を含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。
【０１６６】
本発明の化合物は、静脈内（ボーラスと注入の両方）、腹腔内、皮下、または筋肉内の形態で投与され得、すべての使用する形態は薬学分野における当業者に周知である。注射剤は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、従来的な形態で調製され得る。
【０１６７】
非経口注射可能投与は、一般的には、皮下、筋肉内、または静脈内の注射または注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、遅延放出または持続放出系の移植を利用し、これは、一定のレベルの投薬が維持されることを保証し、米国特許第３，７１０，７９５号（参考として本明細書に援用される）に従う。
【０１６８】
さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻内ビヒクルの局所的使用を介して鼻内形態で、またはその分野における当業者に周知の経皮パッチの形態を使用する経皮経路を使用して投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬量投与は、当然、投薬計画の全体を通して断続的であるよりは連続的である。他の好ましい局所的調製物には、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルスプレー、およびゲルが含まれ、ここで活性成分の濃度は、０．０１％〜１５％、ｗ／ｗまたはｗ／ｖの範囲である。
【０１６９】
固体組成物のために、賦形剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含み、これらが使用され得る。上記に規定した活性化合物はまた、坐剤として、例えば、ポリアルキレングリコールを使用して、例えば、キャリアとしてプロピレングリコールを使用して製剤され得る。ある実施形態において、坐剤は、脂肪性エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。
【０１７０】
本発明の化合物はまた、リポソーム送達系、例えば、小さな単層ベシクル、大きな単層ベシクル、および多層ベシクルの形態で、投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質（コレステロール、ステアリルアミン、またはホスファチジルコリンを含む）から形成され得る。ある実施形態において、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、脂質成分のフィルムが薬物の水溶液と水和され、薬物をカプセル化する脂質層を形成する。例えば、本明細書に記載されるアプタマー分子は、当該分野において公知である方法を使用して構築された、親油性化合物または非免疫原性の高分子量化合物との複合体として提供され得る。核酸結合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供される。
【０１７１】
本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして可溶性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェニール、ポリヒドロキシエチルアスパンアミドフェノール、またはポリエチレンオキシドポリリジン（パルミトイル残基で置換されている）を含み得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成する際に有用である生物分解可能なポリマーのクラス（例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオストエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、および架橋されたかもしくは両親媒性のハイドロゲルのブロックコポリマー）にカップリングされ得る。
【０１７２】
所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および他の物質、例えば、酢酸ナトリウム、およびオレイン酸トリエタノールアミンなどの少量の非毒性補助物質を含み得る。
【０１７３】
化合物を利用する投薬計画は、患者の型、人種、年齢、体重、性別、および医学的状態；治療される状態の重篤度；投与の経路；患者の腎臓および肝臓の機能；および利用される特定の化合物またはその塩を含む種々の要因に従って選択される。当該分野の医師および獣医師は、状態の進行を予防、これに退行、またはこれを停止させるために必要とされる薬物の有効量を容易に決定および処方することが可能である。
【０１７４】
本発明の経口投薬は、示される効果のために使用される場合、約０．０５〜５０００ｍｇ／日、経口の間の範囲である。本発明の組成物は、好ましくは、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００．０、２５０．０、５００．０、および１０００．０ｍｇの活性成分を含む、量が明示された錠剤の形態で好ましく提供される。本発明の化合物の有効な血清濃度は、体重ｋｇあたり１日あたり０．００２〜５０ｍｇの範囲である。
【０１７５】
本発明の化合物は、単一の１日用量で投与され得、または全体の１日の投薬量は、１日に２回、３回、または４回の分割用量で投与され得る。
【０１７６】
（アプタマー治療剤の薬物動態学および生物分布の調節）
本発明は、アプタマー組成物の薬物動態学、および特にアプタマー薬物動態学を調節する能力（すなわち、「可変性」）に影響を与える物質および方法を提供する。アプタマー薬物動態学の可変性は、核酸の化学組成を変化させるために、アプタマーに対する修飾部分の結合体化および／または修飾ヌクレオチドの取り込みを通して達成される。アプタマー薬物動態学を調節する能力は、既存の治療的適用において、または代替的には新たな治療的適用の開発において使用される。例えば、ある治療的適用において、例えば、迅速な薬物クリアランスまたは停止が所望され得る抗新生物性または救急治療の設定において、循環中のアプタマーの存在時間を減少させることが望ましい。代替的には、他の治療的適用、例えば、治療剤の全身性循環が所望される維持治療において、循環中のアプタマーの坐存在時間を増加させることが所望され得る。
【０１７７】
さらに、アプタマー薬物動態学の可変性は、被験体におけるアプタマー治療剤の生物分布を改変するために使用される。例えば、ある治療的適用において、特定の組織の型または特定の器官（または器官のセット）を標的とする試みにおいて、アプタマー治療剤の生物分布を変化させることが所望され得る。これらの適用において、アプタマー治療剤は、特定の組織または器官に優先的に蓄積する。他の治療的適用において、所定の疾患、細胞損傷、または他の異常な病理と関連する細胞マーカーまたは徴候を示す組織を標的とすることが所望され得、その結果、アプタマー治療剤は罹患した組織に優先的に蓄積する。例えば、本明細書に記載されるように、アプタマー治療剤のＰＥＧ化（例えば、２０ｋＤａポリマーを用いるＰＥＧ化）が炎症性組織を標的とするために使用され、その結果、ＰＥｇ化アプタマー治療剤が炎症性組織に優先的に蓄積する。
【０１７８】
アプタマー治療剤の薬物動態学的および生物分布プロフィール（例えば、アプタマー結合体または修飾ヌクレオチドなどの変化した化学的部分を有するアプタマー）は、種々のパラメーターをモニターすることによって決定される。このようなパラメーターには、例えば、例えば、半減期（ｔ１／２）、血漿クリアランス（Ｃｌ）、分布の体積（ＶＳＳ）、濃度−時間曲線の下の面積（ＡＵＣ）、最大観察血清または血漿濃度（Ｃｍａｘ）、およびアプタマー組成物の平均存在時間（ＭＲＴ）が含まれる。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＵＣ」とは、アプタマー治療剤の血漿濃度対アプタマー投与後の時間のプロットの下の面積をいう。ＡＵＧ値は、所定のアプタマー治療剤の、生物学的利用能（すなわち、アプタマー投与後の循環中での投与されたアプタマー治療剤のパーセンテージ）および／または全体のクリアランス（Ｃｌ）（すなわち、アプタマー治療剤が循環から除去される速度）を見積もるために使用される。分布の体積は、アプタマー治療剤の血漿濃度を、身体に存在するアプタマーの量と関連付ける。Ｖｓｓが大きいほど、より多くのアプタマーが血漿の外部に見い出される（すなわち、より多くの血管外遊出）。
【０１７９】
循環から迅速にクリアされ、かつ組織（ここで代謝的分解の結果として、除去がゆっくりと起こる）に分布する、ホスホロチオエート含有アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性および生物分布特性は、当該分野において記載されている（例えば、ＳｒｉｎｉｖａｓａｎおよびＩｖｅｒｓｅｎ（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．９（２）：１２９−３７；ＡｇｒａｗａｌおよびＺｈａｎｇ（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：６０−７５，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７５−８；ＡｋｈｔａｒおよびＡｇｒａｗａｌ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８（１）：１２−８；Ｃｒｏｏｋｅ（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：１−４９；Ｇｒｉｎｄｅｌら（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８（１）４３−５２；ＭｏｎｔｅｉｔｈおよびＬｅｖｉｎ（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７（１）：８−１３；Ｐｅｎｇら（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１１（１）：１５−２７を参照のこと）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む初期の研究は、細胞内部または特定の組織型内でインビボでそれらの作用の部位にアンチセンス分子を送達を増加させることを究極の目標として、薬物動態学および生物分布に対する種々の結合体化学性質の効果を探求した（Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０（４）：５９８−６０６；Ｚｕｂｉｎら（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５６（１）：５９−６２；Ａｓｔｒｉｂ−Ｆｉｓｈｅｒら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６０（１）：８３−９０；Ｌｅｂｅｄｅｖａら（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０（１）：１０１−１９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ（２００２）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１２（２）：１０３−２８）。例えば、コレステロールとの結合体化は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの循環半減期を増加することが報告されており、これはおそらく、血漿リポタンパク質との結合を通して、肝臓の取り込みを促進している可能性がある（ｄｅ  Ｓｍｉｄｔら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１７）：４６９５−４７００）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む初期の研究は、非特異的タンパク質結合相互作用が、循環からのホスホロチオエート含有アンチセンスオリゴヌクレオチドの迅速な損失および組織への分布における重要な役割を果たすことを示した（例えば、ＳｒｉｎｉｖａｓａｎおよびＩｖｅｒｓｅｎ（１９９５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．９（２）：１２９−３７；ＡｇｒａｗａｌおよびＺｈａｎｇ（１９９７）Ｃｉｂａ  Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ．２０９：６０−７５，ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ７５−８；ＡｋｈｔａｒおよびＡｇｒａｗａｌ（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．１８（１）：１２−８；Ｃｒｏｏｋｅ（１９９７）Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：１−４９；Ｇｒｉｎｄｅｌら（１９９８）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．８（１）４３−５��；ＭｏｎｔｅｉｔｈおよびＬｅｖｉｎ（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．２７（１）：８−１３；Ｐｅｎｇら（２００１）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１１（１）：１５−２７を参照のこと）。
【０１８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドと対照的に、アプタマーはより長く（３０〜４０対１０〜２０ヌクレオチド）、異なる型の化学修飾（糖修飾、例えば、２’−Ｆ、２’−Ｏ−Ｍｅ、２’−ＮＨ２対バックボーン修飾）を有し、分解に対してより耐性である三次構造を保証する。アプタマーは、多くの点において、核酸よりも球状タンパク質の三次元型により類似している。これらの顕著な違いがあるので、アプタマーのインビボ配置は、アンチセンスの結果からは容易には予測可能でない。
【０１８１】
より最近、細胞膜を横切って大きな極性高分子（オリゴヌクレオチドを含む）を運搬するための送達ペプチドが、アンチセンスおよび他の治療剤の適用の範囲を隠微日で増強するための手段として探求されてきた。これらの結合体の例には、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質の１３アミノ酸フラグメント（Ｔａｔ）（Ｖｉｖｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（２５）：１６０１０−７）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎａｐｅｄｉａ（Ａｎｔ）ｈｏｍｏｅｔｉｃタンパク質の第３ヘリックス由来の１６アミノ酸配列（Ｐｉｅｔｅｒｓｚら（２００１）Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（１１−１２）：１３９７−４０５）、およびポリアルギニン（Ａｒｇ７）からなる短い、正に荷電した細胞浸透ペプチド（Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６（１１）：１２５３−７；Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊら（２００２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５（１７）：３６１２−８）が含まれる。例えば、ＴＡＴペプチドは、米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に記載されている。
【０１８２】
本発明は、低分子、ペプチド、またはポリマー末端基などの調節部分にアプタマーを結合体化させることによって、またはアプタマーに修飾ヌクレオチドを取り込むことによって、制御された様式で、安定化されたアプタマー組成物の薬物動態学および生物分布をインビボで調節するための物質および方法を提供する。生物学的サンプル中のアプタマー結合体の薬物動態学および生物分布は、ラジオメトリーによって、および酵素結合蛍光の読み取りを用いるハイブリダイゼーションに基づく二重捕捉アッセイによって定量される。本明細書に記載されるように、修飾部分の結合体化および／またはヌクレオチド化学組成を変化させることは、循環中のアプタマー存在時間および組織への分布をの基本的な局面を変化させる。
【０１８３】
アプタマーは、種々の修飾部分、例えば、高分子量ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、ペプチド（例えば、Ｔａｔ、Ａｎｔ、およびＡｒｇ７）、および低分子（例えば、コレステロールなどの親油性化合物）などに結合体化される。本明細書で示されるように、２’Ｆと２’０ＯＭｅの両方の安定化修飾を含む混合組成物アプタマーは、２’−Ｏ−メチル化組成物よりも血流中に有意に長く持続した。本発明の物質および組成物に従って調製された結合体の間で、アプタマーのインビボ特性は、ＰＥＧ基との複合体化によって最も大きく変化された。例えば、混合した２’Ｆおよび２’−ＯＭｅ修飾されたアプタマー治療剤の２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとの複合体化は、腎臓濾過を妨害しかつ健常組織と炎症組織の両方へのアプタマー分布を促進した。さらに、２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー−アプタマー結合体は、アプタマーの腎臓濾過を妨害する際に４０ｋＤａ  ＰＥＧポリマーとほぼ同程度に効果的であることが判明した。ＰＥＧ化の１つの効果はアプタマークリアランスに対するものであったが、２０ｋＤａ部分の存在によって提供される全身露出の延長はまた、組織、特に高度に灌流された器官および炎症の部位における組織へのアプタマーの分布を容易にする。アプタマー−２０ｋＤａ  ＰＥＧポリマー結合体（ＡＲＣ１２０）は炎症の部位へのアプタマー分布を指向し、その結果、ＰＥＧ化アプタマーは炎症性組織に優先的に蓄積した。ある場合において、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマー結合体は、例えば、腎臓細胞などの細胞の内部を横切ることが可能であった。
【０１８４】
全体として、コレステロールおよび細胞浸透性ペプチドを含む低分子量修飾部分によって産生されるアプタマー薬物動態学および組織分布に対する効果は、ＰＥＧ化またはヌクレオチドの修飾の結果として産生されるもの（例えば、化学組成の変化）よりも明らかではなかった。コレステロールに結合体化されたアプタマーは、結合体化されていないアプタマーと比較してより迅速な血漿クリアランス、およびある程度のアプタマー血管外遊出を示唆する大量の分布を示した。この結果は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿半減期を有意に延長するためのコレステロールタグの能力を実証する公開されたデータと対照的であるようである（ｄｅ  Ｓｍｉｄｔら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（１７）：４６９５−４７００）。理論によって束縛されることは意図しないが、本明細書に提供されるこの結果は、アンチセンス結合体の場合に起こることが仮定されている血漿リポタンパク質とのコレステロール媒介結合が、アプタマー−コレステロール結合体のフォールディングされた構造の特定の文脈において除外され、および／またはコレステロール基の親油性性質の局面に関連することを示唆し得る。コレステロールと同様に、Ｔａｔペプチドタグの存在は、血流からのアプタマーのクリアランスを促進し、これは４８時間での腎臓における比較的高いレベルの結合体を伴った。インビトロで細胞膜を横切る高分子の通過を媒介すると当該分野において報告されている他のペプチド（例えば、Ａｎｔ、Ａｒｇ７）は、循環からのアプタマークリアランスを促進しないようであった。しかし、Ｔａｔと同様に、Ａｎｔ結合体は、他のアプタマーと比較して腎臓において有意に蓄積した。理論によって束縛されることは意図しないが、三次元的にフォールディングされたアプタマーの文脈において、ＡｎｔおよびＡｒｇ７ペプチド修飾部分の好ましくない提示は、アプタマー輸送特性に影響を与えるこれらのペプチドの能力をインビボで損なった可能性がある。
【０１８５】
本明細書に記載される本発明に先立って、２’−ＯＭｅ化学組成を有するオリゴヌクレオチドの薬物動態学および生物分布に関してはほとんど知られていなかった（Ｔａｖｉｔｉａｎら（１９９８）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４（４）：４６７−７１）。いくつかの理由のために、２’−ＯＭｅ置換基の取り込みは、ヌクレアーゼ攻撃に対してアプタマーを安定化させるための特に魅力的な手段である。１つの属性は安全性である：２’−Ｏ−メチル化は、真核生物のリボソームＲＮＡおよび細胞ＲＮＡにおいて天然に存在しかつ豊富な化学修飾として知られている。ヒトｒＲＮＡは、リボソームあたりおよそ１００個の２’−Ｏ−メチル化糖を含むと見積もられている（ＳｍｉｔｈおよびＳｔｅｉｔｚ（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８９（５）：６６９−７２）。従って、２’−ＯＭｅ置換基を組み込むアプタマー組成物は非毒性であると予測される。この観点を支持するものとして、インビトロおよびインビボ研究は、２’−ＯＭｅヌクレオチドが、ヒトＤＮＡポリメラーゼ（αもしくはγ）によって、またはヒトプライマーゼによって容易にはポリマー化されず、従って、ゲノムＤＮＡへの取り込みのリスクは低いことを示す（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５９（９）：１０４５−５２；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１５（７）：９２２−６）。さらに、物品のコストの観点から、２’−ＯＭｅ含有オリゴヌクレオチドの合成のためのグラムあたりの費用は、２’−Ｆと２’−ＯＨの両方を含有するＲＮＡについてのグラムあたりの費用よりも低い。
【０１８６】
混合２’Ｆ／２’−ＯＭｅ組成アプタマーおよび結合体化アプタマーの比較が、血漿クリアランスを決定するためにインビボで実行された。２’−Ｆと２’−ＯＨの両方の安定化化学成分を組み込む非結合体化試験アプタマーは、典型的な現在の世代のアプタマーである。なぜなら、これはインビトロおよびインビボの両方において高度なヌクレアーゼ安定性を示すからである。２’Ｆ／２’−ＯＭｅ組成アプタマーと比較すると、非修飾アプタマーは、腎俗な血漿からの損失（すなわち、迅速な血漿クリアランス）、および組織、主に腎臓への迅速な分布を示した。
【０１８７】
完全な２’−ＯＭｅ修飾アプタマーの疎水性性質が、オリゴヌクレオチドに血漿または細胞の成分との非特異的結合を与える傾向がより強いか否か（アンチセンスオリゴヌクレオチドの場合において）を決定するための試験が実行され得る。さらに、２’−ＯＭｅ−修飾アプタマーのタンパク質結合特性を規定するための実験が実行され得る。理論によって束縛されることは意図しないが、バックグラウンドよりも上の全長のすべての２’−Ｏ−メチル置換アプタマーの濃度が、いくつかの組織、腎臓、肝臓、および脾臓において、投薬後４８時間においてさえ、おそらくヌクレアーゼ消化に対する完全な２’−ＯＭｅアプタマーの極度な強固さに起因して検出された。この例においては、血漿クリアランスプロフィールおよび腎臓への分布と一致して、完全な２’−ＯＭｅアプタマーが尿を介して迅速に除去された。
【０１８８】
投与された用量のパーセントとして表現された場合、本発明で試験されたすべてのアプタマーまたは結合体は、腎臓、肝臓、および胃腸管への有意な濃度の分布を示した。器官／組織重量について補正された場合、最高のアプタマーの重量標準化濃度は、高度に灌流された器官（腎臓、肝臓、脾臓、心臓、肺）、および予想に反してに縦隔リンパ節おいて観察された。アプタマーは皮下注射後に生物利用可能であるので（８０％まで）（Ｔｕｃｋｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２）、これらは、この投与の経路を通してリンパ系における標的に接近することが予測される。静脈内投与を介するリンパ管への即時的接近は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどの感染性疾患兆候のためにアプタマー治療剤を開発することの観点から関心がある。従って、修飾部分に結合体化されたアプタマー治療剤および変化した化学成分（例えば、修飾ヌクレオチドを含む）を有するアプタマーは、ＨＩＶ／ＡＩＤＳなどの感染性疾患の治療において有用である。
【０１８９】
その増強された血漿薬物動態学と一致して、高度に灌流された器官中で検出された２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーの濃度は、アッセイされた他のアプタマーよりも高かった。一般的な傾向として、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーを例外として（ここでは濃度が時間を経過してもほぼ一定のままであった）、腎臓において測定されるアプタマー濃度は時間とともに減少する。逆に、肝臓においては、すべてのアプタマーの濃度はほぼ一定であり、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーが例外である（ここでは濃度が時間とともに減少した）。これらの違いは、２０ｋＤａ  ＰＥＧ結合体の血漿半減期の延長、および高度に灌流された器官におけるその取り込みの増加によって理解され得る。２０ｋＤａ  ＰＥＧ修飾部分との複合体形成の効果の１つはアプタマー結合体の腎臓濾過を保持することであったのに対して、十分に灌流された器官において測定された２０ｋＤａ  ＰＥＧ結合体の、他のアプタマーまたは結合体と比較して比較的高い濃度は、ＰＥＧ化が組織へのアプタマー分布を調節し得、ならびに血漿半減期（ｔ１／２）の延長を促進し得ることを示唆した。本明細書に記載されるように、２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマー−結合体は組織へのアプタマー分布を調節した。炎症性組織において検出された２０ｋＤａ  ＰＥＧ化アプタマーの濃度は、アッセイされた他のアプタマーよりも高く、ある例においては、アプタマーは細胞（例えば、腎臓細胞）の内部に接近することが可能であった。
【０１９０】
理論によって束縛されることは意図しないが、血流中での存在の延長は組織への結合体化アプタマーの露出を増加させ、取り込みの増加をもたらし、これは、高度に灌流された器官および炎症性組織の場合にもっとも顕著であることが推測される。残渣の血液中でのアプタマーの存在は、本明細書に示される灌流された器官および炎症性組織において２０ｋＤａアプタマー結合体の濃度の増加の原因であり得るが、これで完全に説明できるわけではないらしい。灌流された器官および炎症性組織へのＰＥＧ化アプタマーの分布の増強は、トリチウム化された２０ｋＤａ  ＰＥＧ結合体を投与されたマウスにおける実験（ここでは、［３Ｈ］シグナルが肝臓と腎臓の両方の細胞において見られた）（以下に提供される実施例を参照のこと）によって示唆されるように、血管外遊出を表す。アプタマー治療剤に関する初期の研究は、腎臓濾過を回避する試みにおいて高分子量（４０ｋＤａ）ＰＥＧ種と複合体化されたアプタマーの開発に主として焦点を当てていた（ＲｅｙｄｅｒｍａｎおよびＳｔａｖｃｈａｎｓｋｙ（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５（６）：９０４−１０；Ｔｕｃｋｅｒら（１９９９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ．７３２：２０３−２１２；Ｗａｔｓｏｎら（２０００）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０（２）：６３−７５；Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏら（２００３）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４（１）：２９０−９）。本発明は、より小さな、例えば、２０ｋＤａのＰＥＧポリマーとの複合体形成が、多くの治療的兆候のために腎臓濾過からアプタマーベースの薬物を保護することを示す。より小さなＰＥＧ（例えば、１０ｋＤａ〜２０ｋＤａのＰＥＧ部分）もまた、より大きなＰＥＧと比較した場合に、合成の容易さおよび物品のコストの減少の付属的な利点を提供する。
【０１９１】
（ＰＥＧ誘導体化核酸）
高分子量非免疫原性ポリマーでの核酸の誘導体化は、核酸の薬物動態学的特性および薬力学的特性を変化させ、それらをより有効な治療剤にする潜在能力を有する。好ましい活性の変化は、ヌクレアーゼによる分解に対する耐性、腎臓を通しての濾過の減少、免疫系に対する露出の減少、および身体を通しての治療剤の分布の変化を含み得る。
【０１９２】
本発明のアプタマー組成物は、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）部分で誘導体化され得る。ＰＡＧ誘導体化核酸の例は、２００３年１１月２１日に出願された米国特許出願シリアル番号１０／７１８，８３３（これは参考としてその全体が本明細書に援用される）において見い出される。本発明において使用される典型的なポリマーには、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）としてもまた知られる、およびポリプロピレングリコール（ポリイソプロピレングリコールを含む）が含まれる。さらに、異なるアルキレンオキサイド（例えば、エチレンオキサイドおよびプロピレンオキサイド）のランダムまたはブロックコポリマーが、多くの適用において使用され得る。その最も一般的な型において、ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）は、各末端においてヒドロキシル基で終結している直鎖状ポリマーである：ＯＨ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ。このポリマー、α−、ω−ジヒドロキシポリ（エチレングリコール）はまた、ＨＯ−ＰＥＧ−ＯＨとして表され得、ここで、−ＰＥＧ−記号は、以下の構造単位：−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を表すことが理解され、ここでｎは、典型的には、約４〜約１０，０００までの範囲である。
【０１９３】
示されるように、ＰＥＧ分子は二官能性であり、時折「ＰＥＧジオール」といわれる。ＰＥＧ分子の末端部分は比較的反応性でないヒドロキシル部分、−ＯＨであり、これは、化合物上の反応性部位において他の化合物に対するＰＥＧの結合のために、活性化または官能基部分に転換され得る。このような活性化ＰＥＧジオールは、本明細書では二活性化ＰＥＧと呼ばれる。例えば、ＰＥＧジオールの末端部分は、比較的反応性でないヒドロキシル部分、−ＯＨの置換によるアミノ部分との選択的反応のために、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドからのスクシニミジル活性エステル部分を用いて、活性カルボン酸エステルとして官能基化された。
【０１９４】
多くの適用において、ＰＥＧ分子が単官能性であるように（または単活性化されるように）、本質的に反応性でない部分と１つの末端上でＰＥＧ分子をキャップすることが望ましい。活性化ＰＥＧのための複数の反応部位を一般的に示すタンパク質治療剤の場合、二官能性活性化ＰＥＧは広範な架橋をもたらし、乏しい機能的凝集体を生じる。単活性化ＰＥＧを生成するために、ＰＥＧジオール分子の末端上の１つのヒドロキシル部分が典型的には非反応性メトキシ末端部分、−ＯＣＨ３で置換される。ＰＥＧ分子のキャップされていない他方の末端は、典型的には反応性部分に変換され、これは表面の反応性部位またはタンパク質などの分子上の反応部位での結合のために活性化され得る。
【０１９５】
ＰＡＧは、典型的には、毒性を欠き、かつ免疫原性を欠く水および多くの有機溶媒中で溶解性の特性を有するポリマーである。ＰＡＧの１つの用途は、得られるＰＡＧ−分子「結合体」を可溶性にするために、不溶性分子に対してポリマーを共有結合させることである。例えば、水不溶性薬物パクリタキセルは、ＰＥＧとカップリングされたときに水溶性になることが示されてきた。Ｇｒｅｅｎｗａｌｄら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：３３１−３３６（１９９５）。ＰＡＧ結合体はしばしば、溶解性および安定性を増強するためのみならず、分子の血液循環半減期を延長するために使用される。
【０１９６】
本発明のポリアルキル化化合物は、典型的には、５〜８０ｋＤの間のサイズである。他の本発明のＰＡＧ化合物は、１０〜８０ｋＤの間のサイズである。なお他の本発明のＰＡＧ化合物は、１０〜６０ｋＤの間のサイズである。例えば、ＰＡＧポリマーは、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤのサイズであり得る。このようなポリマーは直鎖状または分枝状であり得る。
【０１９７】
生物学的に発現されたタンパク質治療剤とは対照的に、核酸治療剤は、典型的には、活性化されたモノマーヌクレオチドから化学合成される。ＰＥＧ−核酸結合体は、同じ反復性モノマー合成を使用してＰＥＧを取り込むことによって調製され得る。例えば、ホスホルアミダイト型への転換によって活性化されたＰＥＧは、固相オリゴヌクレオチド合成に組み入れられ得る。代替的には、オリゴヌクレオチド合成は、反応性ＰＥＧ結合部位の部位特異的な取り込みを用いて完了され得る。最も一般的には、これは、５’末端への遊離の一級アミンの付加によって達成されてきた（固相合成の最終カップリング工程において修飾ホスホルアミダイトを使用して取り込まれる）。このアプローチを使用して、反応性ＰＥＧ（例えば、アミンと反応しかつ結合を形成するように活性化されるもの）は、精製オリゴヌクレオチドと合わされ、カップリング反応が溶液中で実行される。
【０１９８】
治療剤の生物分布を変化させるＰＥＧ結合体化の能力は、結合体の見かけのサイズ（例えば、流体力学的半径によって測定される）を含む多数の要因に関連する。より大きな結合体（＞１０ｋＤａ）は、腎臓を介する濾過をより効果的にブロックすること、および小さな高分子（例えば、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の血清半減期を結果的に増大することが知られている。ＰＥＧ結合体が濾過をブロックする能力は、５０ｋＤａまでの見かけのＰＥＧサイズで増大することが示されてきた（さらなる増加は最小限の有利な効果を有する。なぜなら、半減期は腎臓を通しての除去よりもマクロファージ媒介代謝によって規定されるようになるからである）。
【０１９９】
高分子量ＰＥＧ（＞１０ｋＤａ）の製造は、困難、非効率的、かつ高価であり得る。高分子量ＰＥＧ−核酸結合体の合成に向かう経路として、以前の研究は、高分子量活性化ＰＥＧの生成に向けて焦点を当てていた、このような分子を生成するための１つの方法は、分枝活性化ＰＥＧの形成を含み、ここでは、２つ以上のＰＥＧが活性化基を有する中心コアに結合される。これらの高分子量ＰＥＧ分子の末端部分、すなわち、比較的反応性でないヒドロキシル（−ＯＨ）部分は、化合物上の反応性部位での他の分子への１つ以上のＰＥＧの結合のために、活性化される得るか、または官能基部分に転換され得る。分枝活性化ＰＥＧは、２つより多くの末端を有し、２つ以上の末端が活性化される場合において、このような活性化高分子量ＰＥＧ分子は、本明細書では多活性化ＰＥＧと呼ばれる。いくつかの場合において、分子ＰＥＧ分子中のすべての末端が活性化されるわけではない。分枝ＰＥＧ分子の任意の２つの末端が活性化される場合において、このようなＰＥＧ分子は、二活性化ＰＥＧと呼ばれる。分枝ＰＥＧ分子における１つの末端のみが活性化されるいくつかの場合において、このようなＰＥＧ分子は単活性化されたといわれる。このアプローチの１つの例において、反応のために引き続いて活性化されるリジンコアへの２つのモノメトキシＰＥＧの結合によって調製される活性化ＰＥＧは記載されている（Ｈａｒｒｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、第２巻：２１３−２２１，２００３）。
【０２００】
本発明は、複数のＰＥＧ化核酸を含む高分子量ＰＥＧ−核酸（好ましくは、アプタマー）結合体の合成に至る別のコスト効果の高い経路を提供する。本発明はまた、ＰＥＧ−結合マルチマー性オリゴヌクレオチド、例えば、ダイマー性アプタマーを含む。本発明はまた、高分子量組成物に関し、ここでＰＥＧ安定化部分はアプタマーの異なる部分を分離するリンカーであり、例えば、ＰＥＧは単一のアプタマー配列中で結合体化され、その結果、高分子量アプタマー組成物の直線状配列は、例えば、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸である。
【０２０１】
本発明の高分子量組成物には、少なくとも１０ｋＤａの分子量を有するものが含まれる。組成物は、典型的には、１０〜８０ｋＤの間のサイズの分子量を有する。本発明の高分子量組成物は、少なくとも、１０、２０、３０、４０、５０、６０、または８０ｋＤａのサイズである。
【０２０２】
安定化部分は分子または分子の一部であり、これは、本発明の高分子量アプタマー組成物の薬物動態学的特性および薬力学的特性を改善する。いくつかの場合において、安定化部分は分子または分子の一部であり、これは、２つ以上のアプタマー、またはアプタマードメインを近位に移動させ、または本発明の高分子量アプタマー組成物の全体の回転自由度の減少を提供する。安定化部分は、直鎖状または分枝状の、ホモポリマーまたはヘテロポリマーであり得る、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）であり得る。他の安定化部分には、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのポリマーが含まれる。オリゴヌクレオチドはまた、安定化部分であり得る；このようなオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、および／または修飾結合、例えば、ホスホロチオエートを含み得る。安定化部分はアプタマー組成物の内部部分であり得、すなわちこれはアプタマーに共有結合される。
【０２０３】
本発明の組成物は高分子量アプタマー組成物を含み、ここで２つ以上の核酸部分が少なくとも１つのポリアルキレングリセロール部分に共有結合される。このポリアルキレン部分は、安定化部分として働く。ポリアルキレングリコール部分がアプタマーにいずれかの末端で共有結合され、その結果ポリアルキレングリコールが１つの分子中で核酸部分を一緒に結合する組成物において、ポリアルキレングリコールは連結部分であるといわれる。このような組成物において、共有結合分子の一次構造は、直鎖状配置核酸−ＰＡＧ−核酸を含む。１つの例は、一次構造核酸−ＰＥＧ−核酸を有する組成物である。別の例は、核酸−ＰＥＧ−核酸−ＰＥＧ−核酸の直鎖状配列である。
【０２０４】
核酸−ＰＥＧ−核酸結合体を産生するために、核酸は、元来、それが単一の反応部位を有するように合成される（例えば、これは単活性化される）。好ましい実施形態において、この反応性部位は、オリゴヌクレオチドの固相合成における最終段階として、修飾剤ホスホルアミダイトの付加によって５’末端に導入されるアミノ基である。修飾オリゴヌクレオチドの脱保護および精製の後で、これは、活性化ＰＥＧの自発的加水分解を最小化する溶液中の高濃度で再構成される。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの濃度は１ｍＭであり、再構成濃度溶液は２００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３−緩衝液、ｐＨ  ８．３を含む。結合体の合成は、高度に精製された二官能性ＰＥＧのゆっくりとした段階的な付加によって開示される。好ましい実施形態において、ＰＥＧジオールは、プロピオン酸スクシニミジルとの誘導体化によって両方の末端で活性化される（二活性化される）。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、完全に結合体化された種、部分的に結合体化された種、および結合体化されていない種を分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。連結された複数のＰＡＧ分子（例えば、ランダムコポリマーまたはブロックコポリマーとして）またはより小さなＰＡＧ鎖が、種々の長さ（または分子量）を達成するために連結され得る。非ＰＡＧリンカーは、種々の長さのＰＡＧ鎖間で使用され得る。
【０２０５】
２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ修飾は、ヌクレアーゼに対してアプタマーを安定化し、かつインビボでその半減期を増大させる。３’−３’−ｄＴキャップもまた、エキソヌクレアーゼ耐性を増大させる。例えば、米国特許第５，６７４，６８５号；同第５，６６８，２６４号；同第６，２０７，８１６号；および同第６，２２９，００２号（これらの各々はその全体が参考として本明細書に援用される）を参照のこと。
【０２０６】
（反応性核酸のＰＡＧ誘導体化）
高分子量ＰＡＧ−核酸−ＰＡＧ結合体は、１つより多くの反応性部位を含む核酸との単官能性活性化ＰＥＧの反応によって調製され得る。１つの実施形態において、核酸は二反応性であるかまたは二活性化され、従来的なホスホルアミダイト合成、例えば：図２２に図示されるような３’−５’−ジＰＥＧ化を通してオリゴヌクレオチドに導入された２つの反応性部位：５’−アミノ基および３’−アミノ基を含む。代替的な実施形態において、反応性部位は、一級アミンの結合のための部位として、例えば、ピリミジンの５位、プリンの８位、またはリボースの２’位を使用して、内部部位に導入され得る。このような実施形態において、核酸は、いくつかの活性化されたかまたは反応性の部位を有し得、複数部位が活性化されるといわれる。合成および精製の後、修飾オリゴヌクレオチドは、自発的加水分解を最小化しながらオリゴヌクレオチド反応部位との反応部位を促進する条件下で、単活性化ＰＥＧと合わせられる。好ましい実施形態において、モノメトキシ−ＰＥＧはプロピオン酸スクシニミジルで活性化され、カップリング反応はｐＨ  ８．３で実行される。二置換ＰＥＧの合成を駆動するために、オリゴヌクレオチドと比較して化学量論的に過剰のＰＥＧを供給する。反応後、ＰＥＧ−核酸結合体は、完全に結合体化された種、部分的に結合体化された種、および結合体化されていない種を分離するために、ゲル電気泳動または液体クロマトグラフィーによって精製される。
【０２０７】
連結されたドメインはまた、それに連結される１つ以上のポリアルキレングリコール部分を有し得る。このようなＰＡＧは、種々の長さであり得、かつ組成物の所望の分子量を達成するために適切な組み合わせで使用され得る。
【０２０８】
特定のリンカーの効果は、その化学組成と長さの両方によって影響され得る。長すぎるか、短すぎるか、または望ましくない立体的および／もしくはイオン性相互作用を形成するリンカーは、アプタマーと標的の間の複合体の形成を妨害する。核酸間の距離にわたるのに必要であるよりもより長いリンカーは、リガンドの有効な濃度を減少することによって結合安定性を減少し得る。従って、標的へのアプタマーの親和性を最大化するためにリンカー組成および長さを最適化することがしばしば必要である。
【０２０９】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許文書は、あたかも各々のこのような刊行物または文書が具体的かつ個別に参考として本明細書に援用されるかのように、参考として本明細書に援用される。刊行物および特許文書の引用は、いずれも適切な先行技術であるであることの認可ではなく、またこの引用がこれらの内容または日付に関してのいかなる認可をも構成するものではない。本発明はここで書かれた説明によって記載されてきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、ならびに上記の記載および以下の実施例が例示目的であって、上記の特許請求の範囲の限定ではないことを理解している。
【実施例】
【０２１０】
（実施例１）
（大規模アプタマー合成および結合体化）
ＡＲＣ１２６（５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）は、ＰＤＧＦに特異的な２９ヌクレオチドアプタマー（３’末端における逆方向Ｔを除く）であり、これは、ヌクレアーゼ攻撃に対する安定性の増強のために３’逆方向ｄＴキャップを含む。ＰＥＧ部分は、引き続く結合体化反応のための５’アミノ末端修飾基を使用することによってＡＲＣ１２６に結合体化され得る。合成は、標準的な固相ホスホルアミダイトケミストリーを使用して実行した。オリゴヌクレオチドは、室温で１２時間、水酸化アンモニウム／メチルアミン（１：１）を用いて脱保護し、イオン交換ＨＰＬＣによって精製した。ＡＲＣ１２８（５’−（配列番号４）−ＨＥＧ−（配列番号５）−ＨＥＧ−（配列番号６）−３’ｄＴ−３’）（もはやＰＤＧＦに結合しない不活性変異体）は同じ方法を使用して合成した。
【０２１１】
ＡＲＣ１２６は、いくつかの異なるＰＥＧ部分に結合体化した：２０ｋＤａ  ＰＥＧ（ＡＲＣ２４０（５’−［２０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’））；３０ｋＤａ  ＰＥＧ（ＡＲＣ３０８（５’−［３０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’））；４０ｋＤａ  ＰＥＧ（ＡＲＣ１２７（５’−［４０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’））。ＡＲＣ１２６を、１００ｍＭ  炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ８．５に２ｍＭまで溶解し、等量のアセトニトリル中の、２．５モル濃度過剰のｍＰＥＧ−ＳＰＡ（ＭＷ  ２０ｋＤａ）またはｍＰＥＧ−ＮＨＳエステル（ＭＷ  ４０ｋＤａ）（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）と１時間、および３．５モル濃度過剰のｍＰＥＧ−ｎＰＮＣ（ＭＷ  ３０ｋＤａ）（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）（２４時間の間）と、１時間反応させた。次いで、得られる生成物を、ＮａＣｌ水溶液を溶離剤として使用する５０ｍｌ  Ｓｕｐｅｒ  Ｑ  ５ＰＷカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上のイオン交換ＨＰＬＣによって精製した。次いで、結合体化オリゴヌクレオチドを、水／アセトニトリルグラジエントを使用する１００ｍｌ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ  ＣＧ３００Ｓ（Ｔｏｓｏｈ）カラム上で脱塩した。アプタマー結合体は保存のために凍結乾燥した。
【０２１２】
動物モデルにおいてＡＲＣ１２７を使用することを可能にするために、合成された物質の品質は、エンドトキシン濃度について試験することを必要とした。合成されたＡＲＣ１２７のエンドトキシン含量はＬＡＬ試験を使用して決定した（Ｎｅｌｓｏｎ  Ｌａｂｓ，ＡＺによって実施された）。エンドトキシン試験についての結果を以下の表１に示す。検出されたエンドトキシンの量は、滅菌洗浄溶液のためのＩＳＯ標準（０．５ＥＵ／ｍＬ）より下であり、すなわち、ＩＶ投与のために許容されている濃度より下であった。このことは、ＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７の調製物が滅菌されており、かつ動物の効力モデルに進むことが可能であることを示した。
【０２１３】
【表１】
2007525177.tif 000081
脱フッ素化ＡＲＣ−１２６アプタマー変異体の小規模合成は、標準的な固相ホスホルアミダイトケミストリーおよびベンダーの推奨するカップリングプロトコールを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ’  Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）シンセサイザー上で行った。アプタマーを、２５０μＬの水酸化アンモニウム／４０％メチルアミン水溶液（１：１）をカラム支持体に加えることによって切断および脱保護化し、３０分間６５℃の加熱ブロック中に配置した。アプタマーをＳｐｅｅｄ  Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ）中で乾燥させ、次いで２００μＬ  ｄｉＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＨＰＬＣ精製を、Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  ＷＡＶＥ  ＨＰＬＣ（Ｏｍａｈａ，ＮＥ）上で実行した。イオン交換のために使用したカラムはＤＮＡＰＡＣ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）およびＲｅｓｏｕｒｃｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。緩衝液Ａ：２５ｍＭ  リン酸ナトリウム／２５％  アセトニトリル；緩衝液Ｂ：２５ｍＭ  リン酸ナトリウム／４００ｍＭ  過塩素酸ナトリウム／２５％  アセトニトリル、０〜８０％のグラジエントを使用した。次いで、精製した画分をプールし、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ中で乾燥させ、２００μＬ  ｄｉＨ２Ｏ中に再懸濁した。
【０２１４】
（実施例２）
（フッ素化アプタマーを用いる安定性研究）
研究室内で新鮮に合成したＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７を、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）によって合成され、−２０℃で２年間凍結乾燥状態で保存されたＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７（レガシーアプタマー）と比較した。
【０２１５】
研究室内で合成されたＡＲＣ１２７およびレガシーＡＲＣ１２７は、分析のためにイオン交換ＨＰＬＣカラムを通過させた。図５Ａは、新鮮に合成されたＡＲＣ１２７およびレガシーＡＲＣ１２７のイオン交換ＨＰＬＣ分析の追跡であり、−２０℃で凍結保存状態で２年間の保存後、比較的レガシーＡＲＣ１２７の分解がないことが検出された。
【０２１６】
２年間−２０℃で保存されたレガシーＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７のアプタマーはまた、３Ｔ３細胞増殖アッセイを使用して、効力について試験し、研究室内で新鮮に合成したＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７と比較した（実施例３）。図５Ｂは、効力についての細胞に基づくアッセイ結果が、−２０℃で２年間の凍結乾燥および保存の後でさえ、レガシーアプタマーは、研究室内で新規に合成したＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７と全く同程度の強度であったことを示す。
【０２１７】
（実施例３）
（ＡＲＣ１２６変異体の組成および配列）
ＡＲＣ１２６と名付けられた抗ＰＤＧＦアプタマーの配列および二次構造を図６Ａに示す。２’−フルオロ置換基を有するヌクレオチドが置換されているＡＲＣ１２６の誘導体の配列および二次構造を図６Ｂに示す。２つの内部ステムの末端に示されるループはポリエチレングリコール−６（ＰＥＧ−６）スペーサーであり、かつ修飾ヌクレオチドは以下によって表される：ｄＡ＝デオキシアデノシン；ｄＧ＝デオキシグアノシン；ｍＡ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン；ｄＴ＝デオキシチミジン；ｄＣ＝デオキシシトシン；ｍＴ＝２’−Ｏ−メチルチミジン；ｍＧ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン；ｍＣ＝２’−Ｏ−メチルシトシン；［３’Ｔ］＝逆方向デオキシチミジン；ｆＣ＝２’−フルオロシトシン；およびｆＵ＝２’−フルオロウリジン。
【０２１８】
図６Ａに示されるように、ＡＲＣ１２６の２９ヌクレオチド組成物は７つの２’−フルオロ残基を含む（３つの２’−フルオロウリジンおよび４つの２’−フルオロシトシン）。分解産物の遺伝毒性を含む配慮に起因して、ＡＲＣ１２６の組成の最適化は、既存の分子の効力または安定性を損なうことなく、２’−フルオロ残基のすべてまたは大部分を除去するように配列組成を改変する目的を伴う。２’−フルオロ残基の除去のための１つの手段は、７つすべての２’−フルオロ残基のデオキシ残基への単純置換からなる。このようなすべてのＤＮＡのＡＲＣ１２６の変異体（ＡＲＣ２９９と名付けられた）（配列番号４２−ＰＥＧ−配列番号４３−ＰＥＧ−配列番号４４、ここでＰＥＧ＝ＰＥＧ−６スペーサー）を合成し、インビトロ生化学的結合および細胞ベースの増殖アッセイにおいて試験した。これらの実験は、ＡＲＣ１２６の２９マー組成物におけるすべての２’−フルオロ残基のデオキシ残基への単純置換が、中央および上部のステム中で不安定性を誘導し、活性／効力の有意な減少をもたらしたことを示した。
【０２１９】
ＡＲＣ１２６からの２’−フルオロ残基の除去をもたらすために取られる第２のアプローチは、すべてのデオキシ組成物で観察された中央および上部のステムにおける塩基対の比較的な不安定さを緩和するための、単独でまたはブロックでのいずれかにおける、２’−フルオロ残基の代わりに２’−Ｏ−メチル残基での置換であった。多数の組成変異体が合成され、これは、２’−フルオロ残基の代わりの２’−Ｏ−メチルまたはデオキシ残基の単一点置換を表し（ＡＲＣ２７７、５’−（配列番号３９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’）、ならびに２’−フルオロ残基の代わりの２’−Ｏ−メチル残基のブロック置換を表し（ＡＲＣ３３７、５’−（配列番号４２）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３８、５’−（配列番号５２）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号４４）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３９、５’−（配列番号４８）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号５３）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４０、５’−（配列番号５０）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号５４）−３’Ｔ−３’；単一置換とブロック置換の組み合わせ（ＡＲＣ３４１、５’−（配列番号３６）−ＰＥＧ−（配列番号３７）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４２、５’−（配列番号５５）−ＰＥＧ−（配列番号３７）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４４、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号３７）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４５、５’−（配列番号３６）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４６、５’−（配列番号３６）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４７、５’−（配列番号５９）−ＰＥＧ−（配列番号６０）−ＰＥＧ−（配列番号６１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６２、５’−（配列番号３６）−ＰＥＧ−（配列番号３７）−ＰＥＧ−（配列番号６２）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６３、５’−（配列番号６３）−ＰＥＧ−（配列番号３７）−ＰＥＧ−（配列番号６４）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６４、５’−（配列番号５０）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号６５）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６５、５’−（配列番号３９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３６６、５’−（配列番号６６）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号６５）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０４、５’−（配列番号５５）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０５、５’−（配列番号５６）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０６、５’−（配列番号３９）−ＰＥＧ−（配列番号５７）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０７、５’−（配列番号３９）−ＰＥＧ−（配列番号５８）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０８、５’−（配列番号３９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号６２）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４０９、５’−（配列番号３９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号６７）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ４１０、５’−（配列番号３９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号６８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７０）−３’Ｔ−３’）；ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７１）−３’Ｔ−３’）；ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７２）−３’Ｔ−３’）；およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７３）−３’Ｔ−３’）ならびに最後に、すべて２’−Ｏ−メチルの組成物（ＡＲＣ３００（または３００Ｂ）５’−（配列番号４５）−ＰＥＧ−（配列番号４６）−ＰＥＧ−（配列番号４７）−３’Ｔ−３）を表す。他の組成物変異体には以下が含まれる：ＡＲＣ２７６、５’−（配列番号３６）−ＰＥＧ−（配列番号３７）−ＰＥＧ−（配列番号３８）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３５、５’−（配列番号４８）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号４９）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３３６、５’−（配列番号５０）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号５１）−３’Ｔ−３’；ＡＲＣ３４３、５’−（配列番号５２）−ＰＥＧ−（配列番号４３）−ＰＥＧ−（配列番号４１）−３’Ｔ−３’。
【０２２０】
以下の表２は、合成されかつ試験されたすべてのＡＲＣ１２６変異体の配列および組成を要約する。示される配列は、表の左から右に、５’→３’の方向で列挙される。表２はまた、実施例５において以下に記載されるインビトロアッセイ（競合結合アッセイおよび３Ｔ３増殖アッセイ）において合成されかつ試験されたすべてのＡＲＣ１２６変異体の組成の同一性ならびに平均親和性および活性を要約する。この表において、ｄ＝デオキシ残基；ｆ＝２’−フルオロ残基；ｍ＝２’−Ｏ−メチル残基；ＰＥＧ＝ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−６）スペーサー；３Ｔ＝逆方向デオキシチミジンである。
【０２２１】
【表２】
2007525177.tif 000082
合成後、これらの組成の変異体を、本明細書に記載されるインビトロ生化学的結合および細胞に基づく増殖アッセイにおいて試験する。これらの実験は、インビトロ競合結合アッセイにおいて広範な親和性を、および細胞に基づく増殖アッセイにおいて同様に広範な活性を示した（結果は以下に記載される）。最大濃度の結合親和性および細胞に基づくアッセイ活性を示した組成変異体は、図６Ｂにおいて示されるＡＲＣ５１３〜５１６のシリーズによって例示される。図６Ｂは、最適組成のＡＲＣ１２６の変異体：ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７０）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７１）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７２）−３’ｄＴ−３’）、およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７３）−３’ｄＴ−３’）を示す。図６Ｂから、すべての最適組成変異体は、ＡＲＣ１２６と比較して、２塩基対延長されたステム、上部のステムにおいては、２’−フルオロ残基の代わりの２’−Ｏ−メチル残基の点置換、およびＡＲＣ１２６からの既存の２’−Ｏ−メチル残基の共通のセットからなる。組成変異体ＡＲＣ５１３〜５１６は２つの点においてのみ異なる：（１）中央ステムにおける３つの３’末端グアノシン残基のデオキシまたは２’フルオロの同一性；および（２）３’側の中央ステムの上部のシトシン残基のデオキシまたは２’−Ｏ−メチルの同一性。
【０２２２】
ＰＤＧＦについての最適組成変異体のインビトロ結合親和性は、図７Ａにおいて示される。この図において示されるデータは競合結合アッセイに由来し、ここでは非標識のコンペティターアプタマーの示される濃度が、固定量の（＜０．１ｎＭ）アプタマーのコグネイト標的（ＰＤＧＦ−ＢＢ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を含む緩衝液中の固定量（＜０．１ｎＭ）の３２Ｐ放射性標識ＡＲＣ１２６アプタマーに対して、別々の反応において力価測定した。ＡＲＣ１２６は、３２Ｐ−ＡＴＰ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）およびポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（「ＮＥＢ」），Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）とのインキュベーションによって５’末端で放射性標識した。結合反応は、０．２ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＮＥＢ）および０．０２ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）中で実行した。反応は、室温で１５〜３０分間の時間で平衡に達し、次いで、ニトロセルロース（Ｐｒｏｔａｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）およびナイロン（Ｈｙｂｏｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のメンブレンのサンドイッチを通して濾過し、遊離アプタマーから標的結合アプタマーを分離した。引き続く、各濃度の非標識アプタマーに対応するフィルターメンブレンのオートラジオグラフィー分析は、非標識アプタマーによる３２Ｐ−ＡＲＣ１２６の競合的置き換えの程度を示した。このデータは図７に示され、ここでは、ＡＲＣ１２８（５’−（配列番号４）−ＨＥＧ−（配列番号５）−ＨＥＧ−（配列番号６）−３’）が、ＡＲＣ１２６が配列スクランブル、つまり、ＡＲＣ１２６の不活性変異体を表す。
【０２２３】
図７Ｂは、ＡＲＣ１２６のいくつかの組成変異体の活性を示す、３Ｔ３細胞に基づくインビトロ増殖アッセイのデータを示す。ラット線維芽細胞細胞株である３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中でのアッセイの開始の１日前に、９６ウェルプレート中に３，０００細胞／ウェルでプレートした。翌日、細胞を、ストレートＤＭＥＭで１回洗浄し、次いで７５μｌ  ＤＭＥＭ／０．８％
ＦＣＳを各ウェルに加えた。次いで２５μｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、５０ｎｇ／ｍｌ＋／−ＡＲＣ１２６変異体の最終濃度（６点、０〜２００ｎＭの最終濃度）で各ウェルに加えた。細胞を３日間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ  ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに加え、さらに１．５時間インキュベートした。次いで培地を除去し、２００μｌイソプロパノール（２−プロパノール）を各ウェルに加え、細胞を徹底的に再懸濁させ、５７０ｎｍにおける吸収を９６ウェルプレートリーダーで読み取った。図７Ｂにおいて示されるように、以下のことが明確である（１）示されるすべての組成変異体が活性であること；および（２）ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７０）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７１）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７２）−３’ｄＴ−３’）、およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７３）−３’ｄＴ−３’）の相対活性の順位は同様である。
【０２２４】
インビボでの薬物動態学的特性および生物分布特性の最適化。標的結合親和性およびインビトロでの細胞に基づくアッセイ活性に関するＡＲＣ１２６の配列組成の最適化に加えて、以前に記載した抗ＰＤＧＦアプタマーについての最適配列組成の、インビボでの薬物動態学的（ＰＫ）半減期、ｔ１／２、および生物分布特性を最適化することが望ましい。アプタマー組成の薬物動態学的特性および生物分布特性の調節は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖（１つもしくは複数）との、３’もしくは５’末端、または内部部位（１つもしくは複数）の結合体化（すなわち、ＰＥＧ化）（範囲は〜２ｋＤ〜１００ｋＤ、典型的には、２ｋＤ、１０ｋＤ、２０ｋＤ、３０ｋＤ、４０ｋＤ、５０ｋＤの分子量を有するＰＥＧ）を介して遂行され得る（２００３年１１月２１日に出願された米国シリアル番号１０／７１８，８３３、および２００４年３月５日に出願された米国シリアル番号６０／６６０，７９０を参照のこと）。
【０２２５】
所定のＰＥＧ化アプタマー配列組成を使用することの実行可能性を確立するために、推定のＰＥＧ化が、インビトロ結合および細胞に基づく増殖アッセイにおいてアプタマーの活性を有意に妨害しないことを確認することが必要であった。図８Ａは、ＮＨ２−ＡＲＣ１２６（５’−アミン−修飾ＡＲＣ１２６、ＰＥＧなし）、ならびに３０ｋＤ（ＡＲＣ３０８）までおよび４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）までのＰＥＧ基をそれぞれ５’結合体化した２つの変異体についての競合結合アッセイ曲線を示す。競合結合アッセイは、５’−３２Ｐ−ＡＲＣ１２６ではなく３’−３２Ｐ標識ＮＨ２−ＡＲＣ１２６を使用した以外は本明細書に記載したように実行および分析した（ＡＲＣ１２６ヌクレオチド配列は３’末端に逆方向チミジンを取り込み、これは、ポリヌクレオチドキナーゼによって触媒される放射性標識反応のための基質である）。
【０２２６】
図８Ａは、ＡＲＣ１２６ならびに３０ｋＤ（ＡＲＣ３０８）までおよび４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）までのＰＥＧ基を５’結合体化した２つの変異体についての競合結合アッセイのプロットである。図８Ｂは、５’ＰＥＧ基結合体化（ＡＲＣ１２６＋３０ｋＤ＝ＡＲＣ３０８、およびＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ＝ＡＲＣ１２７）の関数としてのＡＲＣ１２６についてのインビトロ３Ｔ３細胞に基づく増殖アッセイデータを示す。図８Ｂに示されるデータは、３０ｋＤおよび４０ｋＤのＰＥＧ基へのＡＲＣ１２６の５’結合体化が、アプタマーのインビトロ活性においてわすかな減少をもたらすらしいこと、ＰＥＧ基の存在の効果が、ＰＥＧ化されていないアプタマー、ＡＲＣ１２６と比較して２倍未満であることを実証する。図８Ｂにおいて示されるデータはまた、３０ｋＤおよび４０ｋＤのＰＥＧ基へのＡＲＣ１２６の５’結合体化が、ＡＲＣ１２６の組成と比較して、アプタマーのインビトロ活性を有意に減少しないことを実証する。
【０２２７】
図９Ａは、５’ＰＥＧ基結合体化の関数としてのＡＲＣ１２６のインビボ薬物動態学を示す。研究は、実施例１０に記載されるようなＣＤ−１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において行われた。図より、末端クリアランス半減期、ｔ１／２が、アプタマーに結合体化された５’ＰＥＧ基のサイズによって強く影響されることが明白である。
【０２２８】
図９Ａに示される薬物動態学（ＰＫ）データは、業界標準ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用する非区画分析（ＮＣＡ）に供した。以下の表３は、マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇでの静脈内（ＩＶ）投与後のＡＲＣ１２６＋２０ｋＤ（ＡＲＣ２４０）、＋３０ｋＤ（ＡＲＣ３０８）、および＋４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）ＰＥＧ基についての主要なＮＣＡ由来のインビボ薬物動態学（ＰＫ）パラメーターを列挙する。表３に示されるデータは、ＡＲＣ１２６のインビボ薬物動態学クリアランス半減期、ｔ１／２が、２０ｋＤ〜４０ｋＤまでのアプタマーに結合体化された５’ＰＥＧ基のサイズによって影響された、アプタマーに結合体化された５’ＰＥＧ基のサイズを変化させることによって≧４倍調節されることを実証する。図９Ｂは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度で、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、および皮下（ＳＣ）での投与後の、ＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）のインビボ薬物動態学プロフィールを示す。図９Ｂにおいて示される薬物動態学（ＰＫ）データは、業界標準ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用する非区画分析（ＮＣＡ）に供した。
【０２２９】
【表３】
2007525177.tif 000083
以下の表４は、マウスにおける１０ｍｇ／ｋｇの投与の経路の関数としての、ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧについての一次ＮＣＡ由来のインビボ薬物動態学（ＰＫ）パラメーターを列挙する。図９Ｂにおいて示される薬物動態学（ＰＫ）データは、業界標準ソフトウェアパッケージＷｉｎＮｏｎＬｉｎ（登録商標）ｖ．４．０（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用する非区画分析（ＮＣＡ）に供した。
【０２３０】
【表４】
2007525177.tif 000084
図９Ｂに示されるデータから、２つの主要な点が明白である：（１）マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度で、静脈内（ＩＶ）、腹腔内（ＩＰ）、および皮下（ＳＣ）での投与後、ＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）の薬物動態学は、〜１μＭの血漿濃度が投薬２４時間後に存在していること；および（２）ＡＲＣ１２７の全身性生物学的利用能、Ｆは、腹腔内（ＩＰ）投与後にかなり高い（〜６３％）のに対し、皮下（ＳＣ）投与については生物学的利用能は、臨床的適用のための考慮を保証するためになお十分である（〜２４％）。
【０２３１】
ＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）の血漿薬物動態学とインビボ生物活性の両方の第２の試験として、図７を参照すると上記に記載されている競合結合アッセイを使用して、図９Ｂに示されるデータを生成するために使用されたのと同じ血漿サンプルをアッセイした。血漿サンプルの段階的な１：１０希釈を、リン酸緩衝化生理食塩水（１×ＰＢＳ）中で調製し、固定濃度の３２Ｐ−ＡＲＣ１２６と混合し、次いでヒトＰＤＧＦ−ＢＢに加えた。各アッセイにおけるＰＤＧＦの最終濃度は０．１ｎＭであり、３２Ｐ−ＡＲＣ１２６の最終濃度は＜０．１ｎＭであった。この実験において、血漿試料を、１×ＰＢＳ中の既知のＡＲＣ１２７濃度のサンプルを用いて生成した標準曲線との比較によって分析した。参照標準との比較によって、各血漿サンプル中の活性アプタマーの有効濃度が計算され得る。血漿ＰＫサンプルの競合結合アッセイ分析の結果を使用して計算されるような活性アプタマーの有効濃度は、図９Ｃに示される。図９Ｃは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度での静脈内（ＩＶ）投与後のＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧの生物活性プロフィールを示す。従って、このエキソビボ分析は、（１）ｔ＝投薬後４８時間におけるマウスモデルの血漿においてアプタマーが存在しかつ活性であったこと；および（２）蛍光に基づく薬物動態学アッセイから計算された血漿濃度が正確であることの確証を提供する。
【０２３２】
（実施例４）
（ＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７の種交差活性）
ＡＲＣ１２６が結合するＰＤＧＦのアイソフォームを決定するための研究を実行した。ヒトＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、およびＰＤＧＦ−ＡＢ（すべてＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪより）への結合についてＡＲＣ１２６を試験するために、以前に記載されたドットブロット分析を使用する競合結合アッセイを設定した。競合結合アッセイの結果は、ＡＲＣ１２６（配列番号４）が約１００ｐＭのＫｄでＰＤＧＦ−ＢＢに結合し、約１００ｐＭのＫｄでＰＤＧＦ−ＡＢに結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＡに結合しないことを示す（図１０Ａ）。次に、ＡＲＣ１２６がヒト以外の種のＰＤＧＦ−ＢＢと交差反応するか否かを決定するための研究を行った。ヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を使用する、以前に記載されたようなドットブロット分析によって競合結合アッセイを設定した。競合結合アッセイの結果は、ＡＲＣ１２６が、ヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢと等しい親和性で結合することを示す（図１０Ｂ）。
【０２３３】
（実施例５）
（３Ｔ３細胞増殖アッセイ）
ＡＲＣ１２６はヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢと交差反応することが示されたので、ラット線維芽細胞由来である３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、すべてのアプタマー（脱フッ素化効果の一部として得られたアプタマーを含む）の効力を試験するための増殖アッセイにおいて使用し得る。３Ｔ３線維芽細胞はそれらの細胞表面にＰＤＧＦレセプターを有し、かつ分裂促進因子、例えば、増殖によるＰＤＧＦ刺激に応答する。アッセイを以下のように実行した：３Ｔ３細胞を、１００μｌ  ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ中でのアッセイ開始の１日前に９６ウェルプレート中に３，０００細胞／ウェルでプレートした。翌日、細胞を、ストレートＤＭＥＭで１回洗浄し、次いで７５μｌ  ＤＭＥＭ／０．８％  ＦＣＳを各ウェルに加えた。次いで２５μｌのＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）を、５０ｎｇ／ｍｌ最終濃度で、試験される各ウェル＋／−アプタマー条件に加えた。各プレートには以下の条件を３連で含めた：分裂促進因子を伴わない増殖に対応するＰＤＧＦなし（ネガティブコントロール）、増殖速度に対する効果が観察されないスクランブルアプタマーコントロール（ＡＲＣ１２８）（ネガティブコントロール）、最大増殖がＰＤＧＦアプタマーの非存在下で観察されるポジティブコントロール、およびそこから良好なＩＣ５０曲線が計算され得る一連の機能的ＰＤＧＦアプタマー希釈。機能的ＰＤＧＦアプタマー希釈は、通常２倍の段階希釈の６点からなる。
【０２３４】
細胞を３日間インキュベートした。インキュベーション後、１０μｌ  ＭＴＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を各ウェルに加え、さらに１．５時間インキュベートした。次いで培地を除去し、２００μｌイソプロパノール（２−プロパノール）を各ウェルに加え、細胞を徹底的に再懸濁させ、５７０ｎｍにおける吸収を９６ウェルプレートリーダーで読み取った。本実施例は、図１１Ａに示されるように、ＰＤＧＦ中和ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の効力とのＰＤＧＦアプタマーＡＲＣ１２７の効力の比較を示す。図１１Ａにおけるデータは、アプタマーがポリクローナル抗体よりも良好な効力を示すことを実証する。
【０２３５】
３Ｔ３細胞増殖アッセイを、ＡＲＣ１２６、ＡＲＣ１２７、ＡＲＣ１２８、および上記の実施例１に記載されるように得られた他のすべてのＰＤＧＦアプタマー誘導体を用いて実行した。ＡＲＣ１２６およびＡＲＣ１２７は、日常的に＜２０ｎＭのＩＣ５０値を示し、ここでスクランブルコントロールＡＲＣ１２８は３Ｔ３細胞増殖を全く示さなかった。以下の表５は３Ｔ３増殖アッセイにおけるＡＲＣ１２６変異体のＩＣ５０を示す。
【０２３６】
【表５】
2007525177.tif 000085
ＡＲＣ１２７ＰＤＧＦアプタマーはまた、化合物ＡＧ１２９５およびＡＧ１４３３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの既知のチロシンキナーゼ阻害剤よりも良好に３Ｔ３細胞の増殖をブロックした。アッセイ条件は、上記と正確に同じであった。ＡＲＣ１２７は、ＰＤＧＦによって駆動される増殖の増加を、３０ｎＭまで低い濃度においてバックグラウンド濃度にまで低下させた。両方のＡＧ化合物は、ＡＲＣ１２７と比較してはるかに悪い効力を示した。ＡＧ−１４３３は、マイクロモル濃度濃度で非特異的な毒性効果を有するようであった。この効果は、シグナル濃度が処理なし単独サンプルよりも低い３００ｎＭから見られ、ＡＧ化合物の存在下のみでの細胞の致死性に起因するシグナルの損失に対応する（図１１Ｂ）。
【０２３７】
（実施例６）
（３Ｔ３細胞生存率アッセイ）
ＡＲＣ１２６、ＡＲＣ１２７、および他の活性なＰＤＧＦアプタマー誘導体の付加に際して実施例５において記載された細胞増殖アッセイにおいて観察された３Ｔ３細胞の増殖の減少は、潜在的にはアプタマーの毒性効果に起因し得る。この可能性を試験するために、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ細胞生存率アッセイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を実行した。３Ｔ３細胞を３，０００細胞／ウェルでプレートし、種々の濃度のＰＤＧＦアプタマーで処理し、４０μＭまでを２４時間および４８時間試験した。ＴＮＦα（１００ｐｇ／ｍｌ）を供給し、アポトーシスを誘導するためのポジティブコントロールとして使用した。インキュベーション後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した。Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭを製造業者の推奨する指示書に従って調製し、３０分間インキュベートし、蛍光シグナル強度を９６ウェルプレートリーダー上で測定した。ＡＲＣ１２７に起因する３Ｔ３細胞のアポトーシス速度の増加は観察されなかった（図１２）。
【０２３８】
（実施例７）
（３Ｔ３またはＲＰＥ細胞移動アッセイ）
ＰＤＧＦは強力な分裂促進因子ならびに化学誘引物質である。２４ウェル形式と９６ウェル形式の両方で実行される移動アッセイを、ＡＲＣ１２７の効力を試験するためのさらなる機能的アッセイとして選択した。細胞移動アッセイにおいて、８０，０００細胞３Ｔ３ラット線維芽細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓｓａｓ，ＶＡ）またはＲＰＥ（網膜色素上皮）細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓｓａｓ，ＶＡ）を８ミクロンフィルター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を伴う２４ウェルプレートにウェルあたりでプレートした。０．５ｍｌ  ＤＭＥＭ／０．２％  ＦＣＳをトップチャンバーに加え、０．８ｍｌ  ＤＭＥＭ／０．２％ＦＣＳをボトムチャンバーに加えた。系を３７℃で４時間インキュベートすることにより平衡化した。ヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｅｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）（ＲＰＥ細胞について）またはラットＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）（３Ｔ３細胞について）をボトムチャンバーに加えた（最終濃度０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）。系を４時間〜１２時間インキュベートした。細胞を、Ｑ−チップを用いてフィルターの上端からかき取った。フィルターの底に移動した細胞を、冷５０％メタノール／５０％アセトンの混合物で３分間固定した。
【０２３９】
インキュベーション後、フィルターを１×ＰＢＳで洗浄し、Ｇｉｅｍｓａ  Ｓｔａｉｎ（Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｃｏｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｌｌ）で１〜２時間染色し、移動を、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡で写真撮影することによって可視化した。具体的には、４つの異なる条件下での移動を可視化した：（１）ＰＤＧＦの非存在下で観察されたバックグラウンド移動；（２）５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢの存在下で観察された移動；（３）５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢおよび１００ｎＭ  機能的アプタマーＡＲＣ１２７の存在下で観察された移動；ならびに（４）５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢおよび１００ｎＭ
ＡＲＣ１２８スクランブルコントロールアプタマーの存在下で観察された移動。可視化された移動の結果は、バックグラウンド濃度の３Ｔ３細胞またはＲＰＥ細胞の移動によって示される、１００ｎＭ  ＡＲＣ１２７の存在が５ｎＭ  ＰＤＧＦ−ＢＢの効果を阻害することを示す。ＡＲＣ１２８スクランブルコントロールは活性を示さず、この条件において観察される移動は、５ｎＭ  ＰＤＧＦ  ＢＢ単独で観察されるものと等しい。
【０２４０】
図１３は、ＱＣＭ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（＃ＥＣＭ  ５１０）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を使用して９６ウェル形式で実行された細胞移動実験の結果を示す。９６ウェル形式は、より定性的であった２４ウェル形式よりも細胞移動のより定量的な分析を可能にした。９６ウェルアッセイは、プレートおよび試薬を室温に移すことによって開始した。１５０μｌのＤＭＥＭ／０．２％  ＦＢＳを、化学誘引物質のあるなしでウェルのフィーダートレイに加えた。１００μｌ培地ＤＭＥＭ／０．２  ＦＢＳ中の２００，０００細胞ＲＰＥ細胞を移動チャンバーに加え、３７℃で１〜２４時間インキュベートした。
【０２４１】
インキュベーション後、移動チャンバーを除去し、非移動細胞を破棄した。移動細胞の数を冷蔵業者の推奨する指示書に従って定量した。手短に述べると、上部側からの培地を、残りの細胞懸濁液を反転することによって除去し、１５０μｌのあらかじめ温めた細胞脱離溶液を含む新たなフィーダートレイに配置した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＣｙＱｕａｎｔ  ＧＲ  Ｄｙｅ  １：７５を４×溶解緩衝液で希釈し、５０μｌの溶解緩衝液／色素溶液を、移動細胞を含む１５０μｌの溶液を含む各ウェルに加えた。この混合物をさらに、室温で１５分間インキュベートし、次いで、新鮮な９６ウェルプレートに移し、９６ウェルプレートリーダー上で４８０／５２０ｎｍにおいて吸収を読み取った。
【０２４２】
この９６ウェル形式細胞移動実験において得られた結果（図１３）は、２４ウェル形式において行われた細胞移動実験を確証した。ＡＲＣ１２７は移動レベルをバックグラウンドまで減少させ、ＡＲＣ１２８スクランブルアプタマーは移動に影響を与えなかった。図１３はまた、細胞数または加えられた分裂促進因子の濃度の関数として、観察された移動が直線的に増加することを示す。
【０２４３】
（実施例８）
（クローン原性増殖アッセイ）
Ｕ８７膠芽細胞腫（ＡＴＣＣ）を、分裂促進因子、ならびにパネルに示されるようなアプタマーの存在下または非存在下で増殖させた。Ｕ８７細胞を、ＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中で、１００ｍｍディッシュ中の５０％コンフルエントまで、プレートした。細胞がコンフルエントとして現れるまで（１〜２日間）、細胞を、ＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰｅｐｔｏＴｅｃｈ）＋／−ＡＲＣ１２７とともにインキュベートした。最終濃度５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  ＢＢ単独の付加は、高度に連結された三次元細胞クラスターの出現を生じた。５０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢおよび１０ｎＭ〜１００ｎＭの機能的アプタマーＡＲＣ１２７の付加は、クラスターの発生をバックグラウンド濃度にまで減少した。アプタマーの存在は、ＭＴＴアッセイによって決定される細胞の増殖速度に効果を有しなかった。従って、アプタマーは、ＰＤＧＦが駆動するオートクラインループを有することが知られているＵ８７細胞の細胞対細胞接着をブロックした。ＡＲＤ１２７は、細胞対細胞接着によって示されるような、細胞表面に表示されるリガンドの別の細胞のレセプターへの結合をブロックしているらしい。
【０２４４】
（実施例９）
（ＰＤＧＦ駆動ＥＬＫルシフェラーゼアッセイ）
ＡＲＣ１２７  ＰＤＧＦアプタマーの活性をさらに検証するために、機構的Ｅｌｋルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを設定した。１０，０００  ３Ｔ３細胞を、９６ウェルプレート中のＤＭＥＭ／１０％  ＦＢＳ中にプレートした。これらに、ＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、３：１の比率で、５ｎｇのＥＬＫ−１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）および２０ｎｇのｐＦＲ−ルシフェラーゼプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ，Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をトランスフェクトした。ＰＤＧＦを３Ｔ３細胞に５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で加える場合、レポーター遺伝子に対する分裂促進因子の効果に対応するルシフェラーゼシグナルの増加が観察され得る。定常Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、ルシフェラーゼを検出するために使用した。これらの結果は、３ｎＭまで低いＡＲＣ１２７の濃度が、分裂促進因子がない濃度までルシフェラーゼシグナルを減少させることを示す。この分析から導き出されたＡＲＣ１２７のＩＣ５０は、＜２ｎＭである。図１４。
【０２４５】
（実施例１０）
（ＨＴ−２９およびＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおけるインビボデータ）
ＡＲＣ１２７およびＡＲＣ３０８を用いるＰＤＧＦ−ＢＢおよび／またはそのレセプターの阻害が細胞毒性薬物の効力を増大するという仮説を試験するために、インビボ効力研究を確立した。
【０２４６】
実験の概要。ヒトＨＴ−２９またはＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片を、胸腺欠損ヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕマウス、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）において、マウスに１×１０７ＨＴ２９細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）または２×１０６ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を皮下注射すること、および５日間腫瘍を増殖させることによって樹立した。５日目に、樹立した腫瘍の二次元的測定を、デジタルカリパーによって取った。一旦腫瘍測定が取られたら、マウスを、平均腫瘍サイズが各群間で同じであるようにランダムに群に分けた。一旦ランダム化されたら、マウスをイリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）で処理した。イリノテカンは、ＰＤＧＦ遮断が細胞毒性薬物の効力を増加するか否かを決定するために、ＰＤＧＦ特異的アプタマーまたは他の低分子阻害剤を使用して、ＰＤＧＦ遮断の存在下または非存在下で結腸癌に対する効力を有することが示された細胞毒性薬物である。
【０２４７】
材料および方法。実験（実験１）を、ＨＴ２９結腸癌異種移植片モデルにおける用量最適化研究において、既知の化学療法剤ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）およびイリノテカンの組み合わせを試験するように設計した。以下の表６は、ヒト結腸癌細胞株ＨＴ２９（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用し、週に１回、腹腔内注射を介して１５０ｍｇ／ｋｇで投与される細胞傷害剤イリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）、ならびに毎日２回（月曜日から金曜日）経口的に５０ｍｇ／ｋｇで投与されるＰＤＧＦシグナル伝達をブロックする薬物ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いる、実験１の実験設計を要約する。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）の作用の様式は、ＰＤＧＦレセプター機能ならびに他の増殖因子の他のレセプターをブロックすることが知られているが、その効果は必ずしもＰＤＧＦ特異的である必要はない。この実験の結果を図１５Ａに示し、これは、イリノテカン毎週１５０ｍｇ／ｋｇ、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）５０ｍｇ／ｋｇ経口ＢＩＤ  Ｑｄ５、およびイリノテカン１５０ｍｇ／ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）５０ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＤ  Ｑｄ５組み合わせ治療の各々の治療計画についての移管の関数としての、群平均腫瘍直径（ｍｍ）のプロットを示す。これらのデータは、ＨＴ２９結腸癌異種移植片モデルにおいてＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）がイリノテカン単独の効力を増大することを示す。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）媒介ＰＤＧＦ遮断は、イリノテカン単独で治療した動物と比較した場合に、腫瘍増殖の速度の減少によって実証されるように、イリノテカン治療の効力を増強した。これらの結果は統計学的に有意であった（両側スチューデントＴ−検定）。
【０２４８】
【表６】
2007525177.tif 000086
別の実験（実験２）を、ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用する結腸癌異種移植片モデルにおいて、ＡＲＣ１２７およびイリノテカンを試験するために設計した。細胞毒性薬物、イリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）を、腹腔内送達を介して週に１回、１５０ｍｇ／ｋｇで投薬した。ＰＤＧＦシグナル伝達をブロックするために使用されるＡＲＣ１２７を、腹腔内送達を介して週に１回、５０ｍｇ／ｋｇで、およびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、経口的に１００ｍｇ／ｋｇで、１日１回（月曜日〜金曜日）で投薬した。ＡＲＣ１２７は、ＰＤＧＦ−ＢＢがＰＤＧＦレセプターに結合することを妨害し；かつ４０Ｋ  ＰＥＧが結合している。以下の表７は実験２についての実験設計を要約する。実験２からの結果を図１５Ｂに示し、これは、ＡＲＣ１２７が、イリノテカン単独で治療した動物と比較して、腫瘍増殖の速度の減少によって実証されるように、イリノテカン治療の効力を増強することを実証した。これらの結果は統計学的に有意であった（両側スチューデントＴ−検定）。データは、ＡＲＣ１２７が、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおいて、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／イリノテカン組み合わせ治療と、イリノテカン単独の両方よりも良好に、イリノテカンの効力を増大することを示す。ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）投薬計画（１００ｍｇ／ｋｇ、１日１回、月曜日〜金曜日、Ｐ．Ｏ．）は動物を瀕死状態にし、これらの群は実験の初期において終了した（図１５Ｂ）。
【０２４９】
【表７】
2007525177.tif 000087
第３の実験（実験２）を、ヒト結腸癌細胞株ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ）を使用する結腸癌異種移植片モデルにおいて、ＡＲＣ３０８／イリノテカンおよびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／イリノテカンを試験するために設計した。細胞毒性薬物、イリノテカン（Ｐｆｉｚｅｒ，ＮＹ，ＮＹ）を、腹腔内送達を介して週に１回、１５０ｍｇ／ｋｇで投薬した。ＡＲＣ３０８を、腹腔内送達を介して週に１回、５０ｍｇ／ｋｇで、およびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）を、経口的に５０ｍｇ／ｋｇで、１日１回（月曜日〜金曜日）で投薬した。ＡＲＣ３０８は、ＰＤＧＦ−ＢＢがＰＤＧＦレセプターに結合することを妨害し；この分子は結合した３０Ｋ  ＰＥＧを有する。実験３からの結果を図１６に示し、これは、ＡＲＣ３０８が、イリノテカン単独で治療した動物と比較して、腫瘍増殖の速度の減少によって実証されるように、イリノテカン治療の効力を増強することを実証した（図１６）。対照的に、ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）投薬計画（５０ｍｇ／ｋｇ、１日１回、月曜日〜金曜日、Ｐ．Ｏ．）はイリノテカンの効力を増強しなかった。これらの結果は統計学的に有意であった（両側スチューデントＴ−検定）。表８は実験３についての実験設計を要約する。
【０２５０】
【表８】
2007525177.tif 000088
要約すると、ＨＴ−２９およびＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおけるこれらのインビボ研究は、本発明の治療用アプタマーによってもたらされるＰＤＧＦ遮断がイリノテカン治療の効力を増大させ得ることを確証する。
【０２５１】
（実施例１１）
（腫瘍治療剤としてのＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ二機能性アプタマー）
組み合わせ治療は、本発明のアプタマーを用いて結腸癌異種移植片において示されたように（実施例１０）、固形腫瘍の治療において単一薬剤治療を超えた利点を有する。同様に、固形腫瘍癌に関与する標的の１つより多くに結合することが可能であるアプタマーもまた、個々の治療薬剤の治療的効果を強化する際に有効である。このようなアプタマーは複数のタンパク質（または他の標的）を阻害し得、それゆえに化合物の組み合わせと実質的に等価な様式で作用する単一の化合物を提供する。他機能性アプタマーは、例えば、既知のアプタマーの組み合わせから操作され得る。これらの他機能性アプタマーは、複数の標的に結合することが示され得、固相化学合成によって直接的に、または対応するＤＮＡテンプレートからの転写によってのいずれかで生成され得る。このような他機能アプタマーの例には、癌の兆候のためにＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合可能なアプタマーが含まれる。
【０２５２】
以前に同定されたアプタマー（アプタマーの領域）から他機能アプタマーを設計するために、標的とは接触しない個々のアプタマーの領域を介して個々のアプタマーを結合させることが重要である。これは、典型的には、大部分のまたはすべての位置で個々のヌクレオチドの置換に耐容性である二次構造の領域を同定することによって達成され得る。ステムなどの構造単位が必要である場合、これらは、最終設計において保存され得る。さらに、個々のアプタマーの各々の構造的完全性が最終的なフォールディングした構造において保存されることが重要である。このことは、ｍｆｏｌｄなどのアルゴリズムを使用して元来のアプタマー配列の二次構造を予測すること、および次いで、それらが結合した構造の一部である場合には、同じアルゴリズムに従って、これらの予測二次構造がほぞんされていることを保証することによって最も容易に達成され得る。複数の最適および次善の二次構造を決定するための一般的なｍｆｏｌｄアルゴリズムは、プログラムの著者、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｚｕｋｅｒによって記載されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，４８−５２（１９８９））。アルゴリズムにおいて使用されるフォールディングパラメーターの記載は、Ｊａｅｇｇｅｒ、Ｔｕｒｎｅｒ、およびＺｕｋｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６，７７０５−７７１０において提示される（Ｍ．Ｚｕｋｅｒら、Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ
Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｉｎ  ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊ．ＢａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉおよびＢ．Ｆ．Ｃ．Ｃｌａｒｋ編、ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）もまた参照のこと）。核酸配列の二次構造を得るために本発明の方法に従って使用され得る他のプログラムには、非限定的に、ＲＮＡＳｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．：Ｓａｂｉｎａ，Ｊ．；Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．；およびＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｈ．「Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２８８，９１１−９４０（１９９９））およびＲｎａ
Ｖｉｚ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，Ｎｏｖ．１５；２５（２２）：４６７９−８４（１９９７））が含まれる。
【０２５３】
二次構造モチーフおよび要素アプタマーの単位を決定すると、これらは、構成アプタマーの各々の機能を保存する様式でフォールディングする単一のオリゴヌクレオチドに合わせられる。結果として、他機能アプタマーは複数の標的に結合することが可能であり、かつ固相化学合成によって直接的に、または対応するＤＮＡテンプレートからの転写によってのいずれかで生成され得る。
【０２５４】
ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦ二機能性アプタマー。本発明の方法を、ＰＤＧＦ  ＢＢにおよびＶＥＧＦに結合特異性を有するアプタマーを生成するために適用した。この多機能アプタマーを、ＳＥＬＥＸを使用して個々に同定される２つのアプタマー−１つ（ＡＲＣ２４５、配列番号７）（これはＶＥＧＦを認識するがＰＤＧＦを認識しない（図１７Ａを参照のこと））および１つ（ＡＲＣ１２６、５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）（これはＰＤＧＦを認識するがＶＥＧＦを認識しない（図１７Ｂを参照のこと））を連結することによって生成した。ＡＲＣ２４５（配列番号７）は、約２ｎＭのＫＤでＶＥＧＦに結合特異性を有する完全に２’Ｏメチル化された（２’−ＯＭｅ）アプタマーである。多価アプタマーにおいて使用されるＡＲＣ１２６は、約１００ｐＭのＫＤでＰＤＧＦに結合特異性を有する完全なＤＮＡである。
【０２５５】
この組み合わせから生じるＰＤＧＦおよびＶＥＧＦに結合可能である多価アプタマーの構造および配列の図式、配列ＴＫ．１３１．０１２．Ａ（配列番号９）は図１８Ａに示される。ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに結合可能である第２の多価アプタマー、配列ＴＫ．１３１．０１２．Ｂ（配列番号１０）もまた、ＡＲＣ２４５（配列番号７）およびＡＲＣ１２６を合わせることによって形成された。図１８Ｂに示されるように、このＶＥＧＦ−ＰＤＧＦ多価アプタマーにおいては、ＡＲＣ２４５のステムの最初のｍＡ−ｍＵ対が、ＡＲＣ２４５およびすべてのデオキシＡＲＣ１２６を連結するまえに徐供された。各々の場合において、図１８に示されるように、ＡＲＣ１２６  ＰＥＧリンカーの１つがＶＥＧＦ特異的アプタマーの付加のために除去され、他方は配列ｄＧｄＡｄＡｄＡを有するオリゴヌクレオチドリンカーで置換された。
【０２５６】
構成アプタマーおよび多価アプタマーについての結合データを、ドットブロットアッセイによって収集し、ここでは、放射性標識されたアプタマーがタンパク質標的とともにインキュベートされ、次いで、ナイロンの上のニトロセルロースのサンドイッチを通され、結果は図１９に示される。タンパク質結合放射性標識はニトロセルロースメンブレンに捕捉されるのに対して、放射性標識のバランスはナイロンメンブレン上に捕捉される。放射性標識データはホスホルイメージングプレート上に捕捉される。次いで、このデータを使用して結合定数を計算する。多価アプタマーＴＫ．１３１．０１２．Ａ（配列番号９）およびＴＫ．１３１．０１２．Ｂ（配列番号１０）は合成的に作製された。
【０２５７】
配列ＴＫ．１３１．０１２．Ａ（配列番号９）を有する多価アプタマーは、ＰＤＧＦについて約１０ｎＭ、およびＶＥＧＦについての約１０ｎＭのＫＤを示す。配列ＴＫ．１３１．０１２．Ｂ（配列番号１０）を有する多価アプタマーは、ＰＤＧＦについて約１０ｎＭ、およびＶＥＧＦについての約５ｎＭのＫＤを示す。
【０２５８】
（実施例１２）
（免疫刺激モチーフを含むＰＤＧＦおよびＶＥＧＦアプタマー）
ＣｐＧモチーフを含むアプタマーが固有の免疫応答を刺激する能力を試験するために、マウスＣｐｇモチーフを、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的なアプタマーに操作した。次いで、これらのアプタマーを、ＣｐＧモチーフの機能性（例えば、ＩＬ−６およびＴＮＦαの放出の刺激）を確証するために、インビトロマウス細胞ベースのアッセイにおいて使用した。これらのアプタマーをまた、その標的（この場合はＰＤＧＦ−Ｂ）へのアプタマーの結合の際のアプタマーを含むＣｐＧモチーフの機能性を確証するために、アプタマーメカニズムに基づく生物学的活性アッセイにおいて使用した（ＥＲＫリン酸化のＰＤＧＦ−Ｂ活性化に対するＣｐＧ−ＰＤＧＦ−Ｂアプタマーの効果によって測定されるような、ＭＡＰＫ経路を通してのＰＤＧＦ−Ｂシグナル伝達）。
【０２５９】
組み込まれたかまたは付加されたＣｐＧモチーフを有する本明細書に開示されたアプタマーを生成するために、ＣｐＧモチーフ（「ＩＳＳ−ＯＤＮ」または「ＯＤＮ」）を含む、以前に同定された免疫刺激性オリゴヌクレオチドの配列を、約１００ｐｍのＫＤでＰＤＧＦ  ＡＢおよびＢＢに結合する、ＳＥＬＥＸプロセスを通して同定されたアプタマーであるＡＲＣ１２４に操作した。ＡＲＣ１２４の配列を以下に示す。
【０２６０】
（ＡＲＣ１２４）
【０２６１】
【化４】
2007525177.tif 000089
種々のＯＤＮ配列、全長とフラグメントの両方、またはその誘導体を、左から右に、５’→３’で以下に示す（ここで、＊はホスホロチオエート結合を示し、３ＩｎｖｄＴは３’位における逆方向Ｔを示す）。これらのＯＤＮ配列またはそのフラグメントはＰＤＧＦアプタマーに操作されるのに加えて、これらはまた、これらのアプタマーが免疫応答を刺激する能力をアッセイする際のコントロールとして使用された。
【０２６２】
【化５】
2007525177.tif 000090
ＩＳＳ−ＯＤＮは、Ｍａｒｔｉｎ−Ｏｒｚｃｏら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９．１１（７）：１１１１−１１１８から同定した。ＩＳＳ−ＯＤＮ２〜５はＩＳＳ−ＯＤＮのフラグメントである。ＯＤＮ２００６はＨａｒｔｍａｎｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．２００３．３３：１６３３−１６４１から同定した。ＯＤＮ２００６．２および２００６．３はＯＤＮ２００６のフラグメントである。
【０２６３】
ＣｐＧモチーフを含むＰＤＧＦアプタマーの配列を、左から右に、５’→３’で以下に示す（ここで、＊はホスホロチオエート結合を示し、３ＩｎｖｄＴは３’位における逆方向Ｔを示す）。これらのアプタマーの配列および二次構造の模式図を図２０に示す。
【０２６４】
【化６】
2007525177.tif 000091
上記に示されるように、ＩＳＳ−ＯＤＮおよびＯＤＮ  ２００６は、ＭＥＮＥ器刺激性であると報告されており、かつそれらの配列が文献に由来するホスホロチオエート化オリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドの短縮型バージョンは、それらの５’末端と３’末端の両方からそれらを短縮化することによって設計された。得られる構築物は、ＩＳＳ−ＯＤＮ２から５および２００６．２〜３である。新規に設計された構築物の各々が、免疫刺激能力に対する効果を評価するためにＩＬ−６放出アッセイにおいて試験された。ＩＬ−６放出を誘導する能力をなお保持していた短縮型構築物を、ＡＲＣ１２４の５’または３’末端のいずれかに付加される配列について選択した。ＣｐＧＣｐＧＡＲＣ１２４ショートａ．ｋ．ａ．ショートＡＲＣ１２４、ロングＣｐＧＡＲＣ１２４ａ．ｋ．ａ．ロングＡＲＣ１２４、および全長ＣｐＧＡＲＣ１２４ａ．ｋ．ａ．全長ＡＲＣ１２４と呼ばれる構築物は、ＩＳＳ−ＯＤＲ４がＡＲＣ１２４の５’−末端に付加されている構築物に対応する。これらの構築物は、それらの３’末端における逆方向のＴに加えて、それらの５’末端および３’末端にホスホロチオエート化された結合を有し、細胞に基づくアッセイにおける十分な安定性を保証するが、ＡＲＣ１２４に対応するコア中間部分はホスホロチオエート結合を含まない。
【０２６５】
ＡＲＣ１２４は、８〜９位および１３〜１４位において２つの天然に存在するＣｐＧアイランドを有する。トランスＡＲＣ１２４．１からトランスＡＲＣ１２４．１１の名称を有する構築物は、これらの２つの天然に存在するＣｐＧ配列を利用して免疫刺激配列を作製した構築物に対応し、この免疫刺激配列は、様々な長さのＴにおいて組み込まれているＣｐＧモチーフが最大の免疫刺激効果を作り出すという文献中の報告に基づいて、ＣｐＧ応答を最大化する。従って、ＡＲＣ１２４上で実行された変化は、１０〜１２位における非必須ＧＣＡバルジを種々のＴ残基で置換することからなる。免疫刺激効果に対する種々のＴバルジの効果、ならびに構築物の安定性に対するホルホロチオエートの付加の効果は、本明細書に記載されるように、ＩＬ−６放出アッセイおよびＥＲＫのリン酸化を用いて評価される。
【０２６６】
ネガティブコントロールのために、ＡＲＣ１２４を、ＣｐＧモチーフを除去するように操作した。これらのコントロール配列を以下に示す。
【０２６７】
【化７】
2007525177.tif 000092
本発明のＣｐＧアイランドを含むＰＤＧＦアプタマーの活性を、細胞に基づくアッセイにおいて試験した。Ｊ７７４Ａ．１細胞（ＴＩＢ細胞）（マウスマクロファージ細胞株（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６７））の上清は、ＣｐＧモチーフの存在下では、ＣｐＧアイランドの存在下にない細胞よりも、より多くのＩＬ−６およびＴＮＦαを含む。従って、ＩＬ−６およびＴＮＦα固相ＥＬＩＳＡを使用して、ＣｐＧ配列を含む種々のオリゴヌクレオチドへの曝露の際に上清に放出されたＩＬ−６およびＴＮＦα（両方ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）の濃度を定量した。ＩＬ−６  ＥＬＩＳＡについては、マウスＩＬ−６に特異的なモノクローナル抗体を、９６ウェルマイクロプレートにプレコートした。マウスＩＬ−６に特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を使用して、細胞上清から結合したあらゆるＩＬ−６を検出した。ＴＮＦαＥＬＩＳＡについては、マウスＴＮＦαに特異的なアフィニティー精製されたポリクローナル抗体を、９６ウェルプレートにプレコートした。マウスＴＮＦαに特異的な酵素結合ポリクローナル抗体を使用して、細胞上清から結合したあらゆるＴＮＦαを検出した。両方のＥＬＩＳＡは、分光光度法によって定量される比色定量的な読み取りを使用した。
【０２６８】
Ｊ７７４Ａ．１細胞（ＴＩＢ細胞）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１００，０００細胞を、２４ウェルプレート上、適切な数のウェルに、実験の１日前にプレートした。ＣｐＧ組み込みＰＤＧＦアプタマーを、細胞とともに２４〜４８時間、３７℃、５％ＣＯＹでインキュベートした。アプタマーの最終濃度は１μＭおよび１０μＭであった。上清を、インキュベートの時間の点で収集し、８分間、５，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。遠心分離した上清を、ＩＬ−６またはＴＮＦα  ＥＬＩＳＡにおける使用まで、−２０℃で凍結した。両方の両方のＥＬＩＳＡを、製造業者の推奨に従って使用した。以前に免疫刺激性であると報告されたＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ  ＯＤＮおよびＯＤＮ２００６）をポジティブコントロールとして使用し、ＣｐＧを含有しないアプタマーをネガティブコントロールとして使用した。図２１Ａは、ポジティブコントロールとして標準ＯＤＮのみを使用し、ＣｐＧアイランドを含まないアプタマーをアッセイにおいてネガティブコントロールとして使用する、ＴＩＢ細胞中のＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡの結果を示す。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロールのみは、このアッセイがＣｐＧ誘導性ＩＬ−６を測定するために十分に強固であるか否かを確立するためにこの実験において使用した。図２１Ｂに示されるデータは、ＩＳＳ  ＯＤＮおよび短縮化バージョンのＩＳＳ  ＯＤＮが、ＯＤＮ２００６およびその短縮化バージョンよりも良好に、ＴＩＢ細胞中でＩＬ−６放出を誘導することを実証する。図２１Ｃは、ＣｐＧモチーフが組み込まれた、ＡＲＣ１２４のショート、ロング、および全長バージョンが、ＩＳＳ  ＯＤＮと同様にＴＩＢ細胞中でＩＬ−６放出を誘導することを示す。図２１Ｄに示されるデータは、トランスＡＲＣ１２４．１〜トランスＡＲＣ１２４．７（配列番号２３〜配列番号２９）がＴＩＢ細胞中でＩＬ−６放出を誘導することを示す。図２１Ｅに示されるデータは、トランスＡＲＣ１２４．１〜トランスＡＲＣ１２４．７がＴＩＢ細胞中でＴＮＦα放出を誘導することを示す。
【０２６９】
ＩＬ−６放出およびＴＮＦα放出のアッセイの結果は、ＣｐＧモチーフが既存のアプタマー（この場合はＡＲＣ１２４）に組み込まれる場合、そのアプタマーはＣｐＧ応答を誘発することが可能であることを示す。
【０２７０】
（実施例１３）
（ＥＲＫリン酸化アッセイにおけるＣｐＧアイランド含有ＰＤＧＦ）
ＥＲＫリン酸化を使用して、ＡＲＣ１２４（配列番号１１）がアプタマー配列へのＣｐＧモチーフの取り込み後にその機能を保持しているか否かを試験した。１５０，０００の３Ｔ３細胞（ＰＤＧＦ−Ｒを含むマウス線維芽細胞株）を、実験の１日前に、１２ウェルプレートの適切な数のウェルにプレートし、０．５％  ＦＢＳ中で、一晩、血清飢餓とした。細胞を、ＣｐＧアイランド含有ＰＤＧＦアプタマーの存在下または非存在下で、１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で３０分間処理した。細胞を収集し、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ７．５、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１２５％  んＰ−４０、０．８７５％  Ｂｒｉｊ  ９７、１．５ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、および１つのｍｉｎｉ−ＥＤＴＡ  ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔを含む溶解緩衝液で溶解させた。細胞溶解物中のタンパク質濃度は、製造業者の推奨に従って、ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイ試薬を使用して決定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）。溶解物は、ＮｕＰａｇｅ
ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  ４×を、０．１Ｍ  ＤＴＴとともに、１×の最終濃度まで加えることによって調製し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、７０℃で７分間インキュベートした。４０μｇの全タンパク質をＮｕＰａｇｅ１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の各ウェルにロードした。ゲルを１００ｍＡｍｐで１時間泳動した。次いで、ゲルをＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に。２５０ｍＡｍｐで３時間転写した。転写後、ニトロセルロースを、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で、室温で１時間ブロックした。ニトロセルロースメンブレンを、ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）とともに４℃で一晩インキュベートした。ニトロセルロースメンブレンを、１％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３×洗浄し、次いで、抗ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ−結合体化抗体とともに１時間インキュベートした。１時間のインキュベーション後、ニトロセルロースメンブレンを、Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３×洗浄した。メンブレンを、製造業者の推奨に従って、ＥＣＬ＋Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して発色させ、ＳＴＯＲＭ  ８６０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してスキャンした。アプタマーなしでのＰＤＧＦ−ＢＢの存在下での３Ｔ３細胞をポジティブコントロールとして使用した。
【０２７１】
結果は、ショートＡＲＣ１２４およびロングＡＲＣ１２４（両方とも既知のＣｐＧモチーフを有するＰＤＧＦアプタマーである）がなお機能的に活性であり、かつＰＤＧＦへの結合の際にＥＲＫのリン酸化をブロックし得ることを示す。
【０２７２】
集合的に、このデータは、ＣｐＧモチーフが既存のアプタマーに組み入れられるときに、このアプタマーはＣｐＧ応答を誘発することが可能であり、かつ非ＣｐＧ標的（例えば、ＰＤＧＦ）によって駆動される効果（例えば、ＥＲＫ−ＭＡＰＫリン酸化）を、ネイティブなアプタマーと同じ効力でブロックする能力をなお維持していることを示す。
【０２７３】
（実施例１４）
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  選択）
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  選択の概要）
ショート型のＰＤＧＦ−ＡＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）についての１つの選択は、２−フルオロピリミジン含有プールを使用して完了する。選択のラウンド１は、α３２Ｐ  ＡＴＰボディー標識プールのスパイクを含む、２×１０１４分子の２’Ｆピリミジン修飾ＡＲＣ２１２プール（５’ＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＵＣＡＵＡＣＡＣＡＡＧＡＡＧＡ−Ｎ４０−ＧＣＵＣＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＣＣＧＡＧＡＡ）（配列番号７４）の、５０ｐモルのＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質との、最終濃度１００μＬ、室温で１時間のインキュベーションで開始した。選択を、１×ＳＨＭＣＫ緩衝液、ｐＨ  ７．４（２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）中で実行した。ＲＮＡ：ＰＤＧＦ−ＡＡ複合体および遊離のＲＮＡ分子を、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ（Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）からの０．４５μｍニトロセルローススピンカラムを使用して分離した。カラムを１ｍｌ  １×ＳＨＭＣＫであらかじめ洗浄し、次いでＲＮＡ：タンパク質−含有溶液をカラムに加え、遠心分離機で１５００ｇ、２分間遠心分離した。緩衝液洗浄を実行して、フィルターから非特異的結合物を除去した（ラウンド１、２×５００μＬ  １×ＳＨＭＣＫ）。より後のラウンドでは、よりストリンジェントな洗浄（洗浄の数および量を増やす）を使用して特異的結合物を富化させ、次いでフィルターに結合したＲＮＡ：タンパク質結合体を、溶出緩衝液（７Ｍウレア、１００ｍＭ  酢酸ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、あらかじめ９５℃に加熱）の２×２００μｌ洗浄（より後のラウンドでは２×１００μＬ洗浄）で溶出させた。溶出したＲＮＡをフェノール：クロロホルム抽出し、次いで沈殿させた（４０μｇグリコゲン、１容量イソプロパノール）。ＲＮＡを、それらの指示書に従って、プライマーＫＭＴ。１０８．３８．Ｃ（５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＡＧＣＧＡＡＴＣＡＴＡＣＡＣＡＡＧＡ３’）（配列番号７５）およびＫＭＴ．１０８．３８．Ｄ（５’ＴＴＣＴＣＧＧＴＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣ３’）（配列番号７６）を使用して、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ（登録商標）システムを用いて逆転写し、その後にＰＣＲ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．４、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μＭ  ＫＭＴ．１０８．３８．Ｃ、０．５μＭ  ＫＭＴ．１０８．３８．Ｄ、０．５ｍＭ  各ｄＮＴＰ、０．０５単位／μＬ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））による増幅を行った。ＰＣＲテンプレートはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。テンプレートを、３７℃で一晩のα３２Ｐ  ＡＴＰボディー標識（４％  ＰＥＧ−８０００、４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  スペルミジン、０．００２％  Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ−１００、３ｍＭ  ２’ＯＨプリン、３ｍＭ２’Ｆピリミジン、２５ｍＭ  ＤＴＴ、無機ピロホスファターゼ、Ｔ７  Ｙ６３９Ｆ単一変異ＲＮＡポリメラーゼ、５μＣｉ  α３２Ｐ  ＡＴＰ）を使用して転写した。反応物を、製造業者の指示書に従ってＢｉｏ  Ｓｐｉｎカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用��て脱塩した。
【０２７４】
続くラウンドは、ラウンド１と同じ方法を使用して反復したが、ネガティブ選択工程を加えた。タンパク質標的とのインキュベーションの前に、プールＲＮＡを、０．４５ミクロンニトロセルロースを通して、フィルターに結合する配列を除去し、次いで、濾過をポジティブ選択工程で行った。代替的なラウンドにおいて、プールＲＮＡをゲル精製した。転写反応を、５０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて停止させ、エタノール沈殿を行い、次いで１．５ｍｍ変性ポリアクリルアミドゲル（８Ｍウレア、１０％アクリルアミド、１９：１アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上で精製した。プールＲＮＡを、Ｅｌｕｔｒａｐ（登録登録商標）装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）中での電気溶出（１×ＴＢＥ（９０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９０ｍＭ  ホウ酸、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中、２２５Ｖ、１時間）によってゲルから取り出した。溶出した物質を３００ｍＭ酢酸ナトリウムおよび２．５体積のエタノールの添加により沈殿させた。
【０２７５】
タンパク質濃度は最初の４ラウンドでは５００ｎＭであり、次いで連続するラウンドにわたって次第に低下した。コンペティターｔＲＮＡを、ラウンド２で開始して０．１ｍｇ／ｍＬで結合反応に加えた。全体で１１ラウンドが完了し、結合アッセイを選択ラウンドで実行した。表９は選択の詳細を含み、これは、各ラウンドで使用したプールＲＮＡ濃度、タンパク質濃度、およびｔＲＮＡ濃度を含む。結合アッセイに伴う溶出値（タンパク質結合ＲＮＡ対フィルターカラムからの全体のＲＮＡの流出のＣＰＭの比率）を使用して、選択の進行をモニターした。
【０２７６】
【表９】
2007525177.tif 000093
（タンパク質結合分析）
ドットブロットアッセイを、プールのタンパク質結合親和性をモニターするために選択を通して実行した。痕跡量の３２Ｐ標識ＲＮＡをＰＤＧＦ−ＡＡと合わせて、１×ＳＨＭＣＫおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ中で、２０μｌの最終容量で、室温で３０分間インキュベートした。反応物をドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ  Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１  Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ，Ａｃｒｙｌｉｃ）に加え、（上から下に）ニトロセルロース、ナイロン、およびゲルブロットメンブレンを用いて組み立てた。タンパク質に結合したＲＮＡはニトロセルロースフィルターに捕捉されるのに対して、非タンパク質結合ＲＮＡはナイロンフィルターに捕捉される。ＰＤＧＦ−ＡＡの非存在下に対してＰＤＧＦ−ＡＡの存在下で、有意にポジティブなＲＮＡの結合の比率が見られた場合、プールを、製造業者の指示書に従ってＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用してクローニングした。ラウンド１０プールテンプレートをクローニングし、１７個の配列が得られた。５個の異なる配列のみが見られ、これは２つの主要なファミリーおよび１つの独特な配列であった（２つのファミリーではなかった）。Ｋｄ決定のために、クローンＲＮＡ転写物をγ−３２Ｐ  ＡＴＰで５’末端標識した。Ｋｄ値を。ドットブロットアッセイを使用し、得られるデータに対して１：１  ＲＮＡ：タンパク質複合体を示す式にフィットさせて決定した（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ、図２３Ａおよび２３Ｂ）。タンパク質結合特徴付けの結果を表１０に集計する。ＰＤＧＦ−ＡＡに対して高い親和性を有するクローンを準備し、細胞に基づくアッセイにおいて機能性についてスクリーニングした。
【０２７７】
【表１０】
2007525177.tif 000094
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  アプタマー）
本発明のＰＤＧＦ−ＡＡショート型アプタマーの配列を表１１に提示する。
【０２７８】
【表１１】
2007525177.tif 000095
（ＰＤＧＦ−ＡＡ  アプタマーを用いる細胞に基づくアッセイ）
インビトロ結合を示したＰＤＧＦ−ＡＡ  アプタマーを、それらがＰＤＧＦ−ＡＡ誘導性の３Ｔ３細胞増殖を阻害する能力について、３Ｔ３増殖アッセイにおいて試験した。アッセイを、以前に記載されたように、一定の濃度（５０ｎｇ／ｍｌ）のＰＤＧＦ−ＡＡタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマー（０〜１μＭ）の力価測定を使用して設定した。図２４に示される結果は、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーＡＲＸ３３Ｐ１．Ｄ２、ＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ５、およびＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ１０はＰＤＧＦ−ＡＡ誘導性３Ｔ３細胞増殖を阻害したが、さほど強力ではなかった。図２５は、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーがＰＤＧＦ−ＢＢ誘導性３Ｔ３細胞増殖に効果を有しないことを示し、このことは、ＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーはＰＤＧＦ−ＡＡアイソフォームに高度に特異的であることを示す。
【０２７９】
本発明はここで書かれた説明および実施例によって記載されてきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態において実施され得ること、ならびに上記の記載および実施例が例示目的であって、上記の特許請求の範囲の限定ではないことを理解している。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】図１は、ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールからのインビトロアプタマー選択（ＳＥＬＥＸ（登録商標））プロセスの模式図である。
【図２】図２は、ＰＤＧＦのアイソフォームＡＡ、ＢＢ、ＣＣ、ＤＤ、およびＡＢならびにコグネイトレセプターの模式図である。
【図３】図３は、膠芽細胞腫、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、および他の軟部組織肉腫において見い出された癌細胞における構成的ＰＤＧＦレセプターシグナル伝達を生じる遺伝子変異の模式図である。
【図４】図４は、本発明の方法によるＰＤＧＦアンタゴニストありまたはアンタゴニストなしでの、腫瘍血管構造を横切る細胞毒の輸送の模式図である。
【図５Ａ】図５Ａは、新規に合成し、および−２０℃で２年間保存したＡＲＣ１２７（５’−［４０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）のイオン交換ＨＰＬＣ分析のプロットである。
【図５Ｂ】図５Ｂは、新規に合成し、および−２０℃で２年間保存したＡＲＣ１２６（５’−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）およびＡＲＣ１２７についての３Ｔ３細胞増殖アッセイの結果の棒グラフである。
【図６】図６Ａは、ＡＲＣ１２６の２’−フルオロ含有ＰＤＧＦアプタマー組成物の配列および二次構造の模式図である；図６Ｂは、ＡＲＣ１２６変異体、ＡＲＣ５１３（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７０）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１４（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７１）−３’ｄＴ−３’）、ＡＲＣ５１５（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７２）−３’ｄＴ−３’）、およびＡＲＣ５１６（５’−（配列番号６９）−ＰＥＧ−（配列番号４０）−ＰＥＧ−（配列番号７３）−３’ｄＴ−３’）の配列および二次構造の模式図である。
【図７】図７Ａは、ＡＲＣ１２６および組成変異体ＡＲＣ１２８（５’−（配列番号４）−ＨＥＧ−（配列番号５）−ＨＥＧ−（配列番号６）−３’）、ＡＲＣ５１３、ＡＲＣ５１４、ＡＲＣ５１５、ＡＲＣ５１６についての競合結合アッセイの結果のプロットである；図７ＢはＡＲＣ１２６のいくつかの組成変異体の活性を示す、インビトロ３Ｔ３細胞に基づく増殖アッセイデータのプロットである。
【図８】図８Ａは、ＡＲＣ１２６ならびに３０ｋＤのＰＥＧ基（ＡＲＣ３０８、５’−［３０Ｋ  ＰＥＧ］−（配列番号１）−ＨＥＧ−（配列番号２）−ＨＥＧ−（配列番号３）−３’ｄＴ−３’）および４０ｋＤ（ＡＲＣ１２７）のＰＥＧ基に５’結合体化されている２つの変異体についての競合結合アッセイのプロットである；図８Ｂは、５’ＰＥＧ基結合体化（ＡＲＣ１２６＋３０ｋＤ＝ＡＲＣ３０８、およびＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ＝ＡＲＣ１２７）の関数としてのＡＲＣ１２６についてのインビトロ３Ｔ３細胞に基づく増殖アッセイデータのプロットである。
【図９】図９Ａは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇでのＩＶ投与後のＡＲＣ１２６の５’コグネイトの薬物動態学的プロフィールのプロットである；図９Ｂは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度での静脈内（ＩＶ）投与、腹腔内（ＩＰ）投与、および皮下（ＳＣ）投与の後のＡＲＣ１２７（ＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ）のインビボ薬物動態学的プロフィールのプロットである；図９Ｃは、マウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量濃度での静脈内（ＩＶ）投与後のＡＲＣ１２６＋４０ｋＤ  ＰＥＧ（すなわち、ＡＲＣ１２７）の生物活性プロフィールのプロットである。
【図１０】図１０Ａは、ＡＲＣ１２６がＰＤＧＦ−ＢＢと約１００ｐＭのＫｄで結合し、かつＰＤＧＦ−ＡＢと約１００ｐＭのＫｄで結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＡとは結合しないことを示す競合結合アッセイのプロットである；図１０Ｂは、ＡＲＣ１２６がヒト、ラット、およびマウスのＰＤＧＦ−ＢＢと約１００ｐＭの等しい親和性で結合することを示す競合結合アッセイのプロットである。
【図１１】図１１Ａは、ＡＲＣ１２７がＰＤＧＦ中和抗体よりも良好に３Ｔ３細胞増殖を阻害することを示す３Ｔ３細胞増殖アッセイの結果のプロットである；図１１Ｂは、ＡＲＣ１２７が、試験された既知のチロシンキナーゼインヒビターよりも良好に３Ｔ３細胞増殖を阻害することを示す３Ｔ３細胞増殖アッセイの結果のプロットである。
【図１２】図１２は、ＡＲＣ１２７単独が３Ｔ３細胞に対していかなる毒性効果も有さないことを示す細胞生存率アッセイの結果のプロットである。
【図１３】図１３は、ＱＣＭ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ９６  Ｗｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（＃ＥＣＭ  ５１０）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を使用する９６ウェル形式で実行された細胞移動アッセイデータのプロットであり、観察された移動シグナルがプレートされた細胞の数またはＰＤＧＦ濃度の増加の関数として増加することを示す。
【図１４】図１４は、ＡＲＣ１２７が２ｎＭのＩＣ５０を示すことを示す、ＰＤＧＦ駆動Ｅｌｋルシフェラーゼアッセイの結果のプロットである。
【図１５】図１５Ａは、ＨＴ２９結腸癌異種移植片モデルにおけるＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／イリノテカン用量最適化の下でのＮｕ／Ｎｕヌードマウスにおける腫瘍直径対時間のプロットである；図１５Ｂは、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおけるＡＲＣ１２７／イリノテカン研究の下でのＮｕ／Ｎｕヌードマウスにおける腫瘍直径対時間のプロットである。
【図１６】図１６は、ＬＳ１７４Ｔ結腸癌異種移植片モデルにおける効力研究でのイリノテカン、およびＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）／ＡＲＣ３０８投薬計画の下のＮｕ／Ｎｕヌードマウスにおける腫瘍直径対時間のプロットである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＶＥＧＦに結合するがＰＤＧＦ−ＡＲＣ２４５（配列番号７）には結合しないアプタマーの配列および二次構造の模式図である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＰＤＧＦに結合するがＶＥＧＦには結合しないアプタマー（本明細書ではＡＲＣ１２６といわれる）の配列および二次構造の模式図である。
【図１８】図１８は、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ（配列ＴＫ．１３１．０１２．Ａ、配列番号９）に結合する二価アプタマーの配列および二次構造の模式図である；図１８Ｂは、ＰＤＧＦおよびＶＥＧＦ（配列ＴＫ．１３１．０１２．Ｂ、配列番号１０）に結合する第２の二価アプタマーの配列および二次構造の模式図である。
【図１９】図１９は、構成的アプタマーならびにＰＤＧＦ  ＢＢ（パネル１）およびＶＥＧＦ（パネル２）に対する多価アプタマーについてのドットブロットアッセイ結合データのプロットである。
【図２０】図２０は、そこに組み込まれたかまたは組み込まれたＣｐＧアイランドおよびモチーフを有するＰＤＧＦアプタマーの配列および二次構造の模式図（ホスホロチオエート結合の表示が存在しない）である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、アッセイにおけるポジティブコントロールとして既知のＯＤＮを、およびネガティブコントロールとしてＣｐＧアイランドを含まないアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、ＩＳＳ  ＯＤＮおよびＩＳＳ  ＯＤＮの短縮型を使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、ＣｐＧモチーフが組み込まれているＰＤＧＦアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、ＣｐＧモチーフが組み込まれているさらなるＰＤＧＦアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＩＬ−６放出を測定するＩＬ−６  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、ＣｐＧモチーフが組み込まれている図２１Ｄにおけるものと同じＰＤＧＦアプタマーを使用する、ＴＩＢ細胞におけるＴＮＦＡ放出を測定するＴＮＡａ  ＥＬＩＳＡアッセイの結果のプロットである。
【図２２】図２２は、高分子量ＰＥＧ核酸結合体の合成のための種々のストラテジーを示す図である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、クローンＲＮＡ転写物についてのドットブロット結合分析を示すグラフである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、クローンＲＮＡ転写物についてのドットブロット結合分析を示すグラフである。
【図２４】図２４は、ＰＤＧＦ−ＡＡ誘導３Ｔ３細胞増殖に対する種々の本発明のＰＤＧＦ−ＡＡアプタマー（ＡＲＸ３３Ｐ１．Ｄ２、ＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ５、およびＡＲＸ３３Ｐ１．Ｅ１０）の阻害効果を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＰＤＧＦ−ＢＢ誘導３Ｔ３細胞増殖に対するＰＤＧＦ−ＡＡアプタマーの阻害効果を示すグラフである。
【国際調査報告】
2007525177.tif 000096
2007525177.tif 000097
2007525177.tif 000098
2007525177.tif 000099