(57)【要約】本発明は、細胞増殖性疾患を治療するための治療的化合物およびこれらの治療的化合物の使用の方法に関する。本発明はまた、ポロ様キナーゼの3次元構造、およびこれらの構造を用いて小分子阻害剤を設計または選択するための方法、およびそのような化合物の治療的使用を提供する。本発明はまた、新規なリンペプチド結合ドメインを同定するための方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のものをその中に保存している、メモリーと通信するプロセッサーを含むコンピューター：
(i)ポロボックスドメイン（Polo-box domain）の以下の残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491のそれぞれについての表5からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または3Å未満の該座標の標準偏差を有する原子座標；および
(ii)該座標の3次元モデルを作成するためのプログラム。
【請求項２】
前記座標がヘテロ原子についてである、請求項1記載のコンピューター。
【請求項３】
前記座標が側鎖原子についてである、請求項1記載のコンピューター。
【請求項４】
前記座標が側鎖およびヘテロ原子についてである、請求項1記載のコンピューター。
【請求項５】
以下のものをその中に保存している、メモリーと通信するプロセッサーを含むコンピューター：
(i)ポロボックスドメインの残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491の非水素原子の少なくとも1つについてのX線回折データ、または3Å未満の該残基のバックボーン原子からの標準偏差を有するアミノ酸についてのX線回折データ；および
(ii)ポロボックスドメインの3次元モデルを作成するためのプログラム。
【請求項６】
メモリーと通信するプロセッサーを含むコンピューターであって、メモリーがその中に、ポロボックスドメインを結合するリンペプチドのファルマコフォアモデル、および該モデルを示すためのプログラムを保存しており、該モデルが以下の少なくとも1つを含むコンピューター：
(i)少なくとも1つの水素結合相互作用に関与するトレオニンにおけるリン酸基；および
(ii)pThr-1位におけるセリンであって、Ser-1側鎖がPlk1表面へ向けられている、セリン。
【請求項７】
前記セリンが以下の少なくとも2つに関与する、請求項6記載のコンピューター：
(i)PBDのTrp-414主鎖原子との水素結合相互作用；
(ii)PBDのLeu-491主鎖カルボニルとの水素結合相互作用；および
(iii)PBDのTrp-414インドール側鎖からのCδ1とのファンデルワールス相互作用。
【請求項８】
前記モデルがpThr+1位にプロリンをさらに含み、該プロリンが、pThr+2主鎖アミノ基がPBDと接触するのを可能にするねじれを導入する、請求項6記載のコンピューター。
【請求項９】
以下の段階を含む、ポロボックスドメインの候補リガンドを選択または設計する方法：
(a)以下の残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491のそれぞれについての表5からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または3Å未満の該座標からの標準偏差を有する原子座標を有するポロボックスドメインの3次元構造を作成する段階；および
(b)水溶液においてポロボックスドメインを結合するのに該構造に相補的な十分な表面を有する候補リガンドを選択または設計する段階。
【請求項１０】
以下の段階を含む、ポロボックスドメインリガンドを製造するための方法：
(a)リガンドを有するポロボックスドメインの少なくとも1つの残基の原子座標を得る段階；
(b)修飾されるべき該リガンドにおける1つまたは複数の部分を決定する段階であって、該修飾されたリガンドが該ポロボックスドメインを結合する能力を維持している、段階；および
(c)該決定に基づいて該リガンドを修飾する段階。
【請求項１１】
ポロボックスドメインをリガンドと共に結晶化する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記リガンドがポロボックスドメインを特異的に結合する、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
修飾が前記リガンドのポロボックスドメインへの親和力を増加させる、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
修飾が前記リガンドの溶解性を増加させる、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
修飾がインビボで前記リガンドの半減期を増加させる、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
ポロボックスドメインを結合するリガンドを製造する段階を含む、ポロボックスドメインリガンドを製造するための方法であって、該リガンドが、ポロボックスドメインの少なくとも一部の原子座標のモデルを用いて得られる情報に基づいて設計または選択される、方法。
【請求項１７】
以下の段階を含む、候補リガンドの、ポロボックスドメインを結合する能力を評価する方法：
(a)以下の残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491のそれぞれについての表5からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または3Å未満の該座標からの標準偏差を有する原子座標を有するポロボックスドメインの3次元構造を作成する段階；および
(b)候補リガンドと該ポロボックスドメインとの間の相互作用を測定する手段を使用する段階。
【請求項１８】
以下の段階を含む、ポロボックスドメインの候補リガンドを同定する方法：
(a)請求項6のコンピューターを用いてポロボックスドメインリガンドの3次元ファルマコフォアモデルを作成する段階；および
(b)該ファルマコフォアモデルの基準を満たす候補リガンドを選択する段階。
【請求項１９】
前記候補リガンドの、インビトロまたはインビボでポロボックスドメインを結合する能力を測定する段階をさらに含む、請求項10、16、17または18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
前記候補リガンドの、インビトロまたはインビボでポロボックスドメインの酵素活性を変化させる能力を測定する段階をさらに含む、請求項10、16、17または18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
前記3次元構造が、残基：His-538、Lys-540、Trp-414またはLeu-491の水素原子をさらに含む、請求項10、16、17または18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
リンペプチド複合体に結合したポロボックスドメインを含む、ポロ様キナーゼ複合体の結晶。
【請求項２３】
前記ポロ様（Polo-like）キナーゼがPlk-1である、請求項22記載の結晶。
【請求項２４】
Plk-1がSEQ ID NO:1の少なくともアミノ酸1位〜603位を含む、請求項22記載の結晶。
【請求項２５】
Plk-1が少なくともアミノ酸95位〜603位を含む、請求項24記載の結晶。
【請求項２６】
Plk-1が少なくともアミノ酸326位〜603位を含む、請求項22記載の結晶。
【請求項２７】
Plk-1が少なくともアミノ酸367位〜603位を含む、請求項22記載の結晶。
【請求項２８】
リンペプチドがアミノ酸配列
2007525143.tif 000104
を含み、ここでφが疎水性アミノ酸を表している、請求項22記載の結晶。
【請求項２９】
リンペプチドがアミノ酸配列
2007525143.tif 000105
を含む、請求項22記載の結晶。
【請求項３０】
前記ポロ様キナーゼがPlk-2である、請求項22記載の結晶。
【請求項３１】
ポロ様キナーゼがPlk-3である、請求項22記載の結晶。
【請求項３２】
表5における原子座標の少なくとも一部および対象となるポロボックスドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部を用い、それにより対象となるポロボックスドメインのモデルを作成する相同性モデリングを含む、対象となるポロボックスドメインの構造的モデルを得る方法。
【請求項３３】
以下の段階を含む、対象となるポロボックスドメイン/リンペプチド複合体の3次元構造を測定する方法：
(a)対象となるポロボックスドメイン/リンペプチド複合体を結晶化する段階；
(b)対象となる結晶化ポロボックスドメインからX線回折パターンを作成する段階；および
(c)対象となるポロボックスドメイン/リンペプチド複合体の少なくとも一部の3次元電子密度図を作成するために、表5における電子座標の少なくとも一部を該回折パターンに適用する段階。
【請求項３４】
Xが任意のアミノ酸である、S-[pS/pT]-P/Xを含むリンペプチドと複合した、ヒトPlk-1 ポロボックスドメインの残基367位〜603位を含む、単離された、ポロボックスドメインの完全長未満の断片。
【請求項３５】
Xが任意のアミノ酸である、S-[pS/pT]-P/Xを含むリンペプチドと複合した、ヒトPlk-2 ポロボックスドメインの残基500位〜685位を含む、単離された、ポロボックスドメインの完全長未満の断片。
【請求項３６】
Xが任意のアミノ酸である、S-[pS/pT]-P/Xを含むリンペプチドと複合した、ヒトPlk-3 ポロボックスドメインの残基421位〜607位を含む、単離された、ポロボックスドメインの完全長未満の断片。
【請求項３７】
以下の突然変異を含む、単離されたポロボックスドメインタンパク質またはその断片：
(a)ポロボックスドメインの結晶化する能力を増強する突然変異；
(b)組換え発現に用いられる生物体において別なふうに翻訳後修飾される残基の突然変異；
(c)ポロボックスドメインのNH2もしくはCOOH末端残基の突然変異；
(d)リンペプチドへのポロボックスドメインの親和力を増加させるもしくは減少させる突然変異；または
(e)ポロボックスドメインの折り畳みを変化させる突然変異。
【請求項３８】
His-538、Lys-540、Trp-414またはLeu-491に突然変異をさらに含む、請求項34記載のタンパク質または断片。
【請求項３９】
請求項34〜38のいずれか一項記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項４０】
φが疎水性アミノ酸を表している、アミノ酸配列
2007525143.tif 000106
を含むリンペプチド。
【請求項４１】
Pro-Met-Gln-Ser-pThr-Pro-Leuを含むリンペプチドであって、該リンペプチドがヒトPlk-1を結合する、請求項40記載のリンペプチド。
【請求項４２】
アミノ酸配列、
2007525143.tif 000107
を含むリンペプチドであって、pSerおよびpThrがリン酸化セリンおよびリン酸化トレオニンであり、P-3、P-2またはP-1に指定されたアミノ酸が天然または非天然のアミノ酸でありうる、リンペプチド。
【請求項４３】
アミノ酸配列、
2007525143.tif 000108
をさらに含むリンペプチドであって、X1aaおよびX2aaが任意のアミノ酸であり、かつpSerおよびpThrがリン酸化セリンおよびリン酸化トレオニンである、請求項40記載のリンペプチド。
【請求項４４】
X1aaがプロリンであり、かつX2aaが任意のアミノ酸である、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項４５】
X1aaが任意のアミノ酸であり、かつX2aaがアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項４６】
X2aaがロイシンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項４７】
P-3位のアミノ酸がメチオニンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項４８】
P-2位のアミノ酸がグルタミンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項４９】
P-1位のアミノ酸がセリンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項５０】
P0位のアミノ酸がリン酸化セリンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項５１】
P0位のアミノ酸がリン酸化トレオニンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項５２】
P+1位のアミノ酸がプロリンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項５３】
アミノ酸配列が
2007525143.tif 000109
であり、ここでX1aaが任意のアミノ酸であり、かつpThrがリン酸化トレオニンであり、かつpSerがリン酸化セリンである、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項５４】
前記リンペプチドが25個のアミノ酸残基を超えない、請求項42記載のリンペプチド。
【請求項５５】
前記リンペプチドが15個のアミノ酸残基を超えない、請求項54記載のリンペプチド。
【請求項５６】
リンペプチドが10個のアミノ酸残基を超えない、請求項53記載のリンペプチド。
【請求項５７】
請求項40〜56のいずれか一項記載のリンペプチドのうちの任意のリンペプチドの治療的有効量、および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物であって、該薬学的組成物が、不適当な細胞周期調節により特徴付けられる疾患の治療のために有用である、薬学的組成物。
【請求項５８】
細胞増殖性疾患が新生物である、請求項57記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
第二の化学療法薬をさらに含む、請求項57記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
第二の化学療法薬がパクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン（altretamine）、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン（cytoxan）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン（fludarabine）、ゲンツツマブ（gentuzumab）、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ（alemtuzumab）、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド（temozolomide）、テニポシド（teniposide）、6-チオグアニン、トポテカン（topotecan）、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラク（etodolac）およびビノレルビン（vinorelbine）からなる群より選択される、請求項59記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
請求項16記載のリンペプチドの薬学的組成物を投与する段階を含む、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するための方法であって、該リンペプチドが、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量である、方法。
【請求項６２】
第二の化学療法薬を投与する段階を含み、リンペプチドおよび該化学療法薬が患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量であり、かつ該化学療法薬が同時に、または14日間のリンペプチド投与の間に投与される、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
第二の化学療法薬がパクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツツマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクおよびビノレルビンからなる群より選択される、請求項62記載の方法。
【請求項６４】
細胞増殖性疾患が新生物である、請求項61、62または63のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
ポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法であって、以下の段階：
(a)請求項1記載のリンペプチドおよびポロボックスドメイン(PBD)ポリペプチドを、該リンペプチドと該PBDとの間で複合体を形成するように接触させる段階；
(b)該複合体を候補化合物と接触させる段階；ならびに
(c)PBDからの該リンペプチドの置換を測定する段階
を含み、ここでPBDからの該リンペプチドの該置換が、候補化合物がポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している、方法。
【請求項６６】
ポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法であって、以下の段階：
(a)候補化合物の存在下において、請求項1記載のリンペプチドおよびPBDを接触させる段階；ならびに
(b)該リンペプチドとPBDの結合を測定する段階
を含み、ここで候補化合物の非存在下における該リンペプチドとポリペプチドの結合量と比較した結合量の低下が、候補化合物がポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している、方法。
【請求項６７】
前記リンペプチドまたはPBDが検出可能に標識されている、請求項65または66記載の方法。
【請求項６８】
前記リンペプチドおよびPBDが異なって標識されている、請求項65または66記載の方法。
【請求項６９】
PBDが、Cdc5、Plo-1、Polo、Plx-1、Plx-2、Plx-3、Plk-1、Prk/Fnk、SnkおよびCnkのPBDからなる群より選択される、請求項65または66記載の方法。
【請求項７０】
PBDがPlk-1 PBDである、請求項69記載の方法。
【請求項７１】
Plk-1 PBDがヒトPlk-1 PBDである、請求項69記載の方法。
【請求項７２】
以下の段階を含む、ペプチドおよびペプチド結合ドメインからなる結合ペアを同定するための方法：
(a)各ペプチドが、位置が不変である少なくとも2つの既知のアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定されたペプチドの集合を含む偏ったペプチドライブラリーを提供する段階；
(b)プールされたcDNAライブラリーを提供する段階であって、cDNAライブラリーがタンパク質発現について位置している、段階；
(c)検出可能な標識の存在下において、プールされたcDNAライブラリーを発現させる段階；
(d)ペプチドライブラリーおよび発現されたcDNAライブラリーを接触させる段階；ならびに
(e)ペプチドとペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階であって、相互作用がペプチドとペプチド結合ドメインの結合ペアを同定する、段階。
【請求項７３】
前記偏ったペプチドライブラリーが固体支持体に共有結合的に結合している、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
前記偏ったペプチドライブラリーが固体支持体に非共有結合的に結合している、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
ペプチドがリンペプチドであり、かつペプチド結合ドメインがリンペプチド結合ドメインである、請求項72記載の方法。
【請求項７６】
以下の段階を含む、リンペプチドおよびリンペプチド結合ドメインを含む結合ペアを同定するための方法：
(a)各ペプチドが、位置が不変である少なくとも2つの既知のアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定されたペプチドの集合を含む偏ったリンペプチドライブラリーを提供する段階であって、各リンペプチドがアミノ末端のビオチン基に共有結合的に連結している、段階；
(b)プールされたcDNAライブラリーを提供する段階であって、プールされたcDNAライブラリーがタンパク質発現について位置している、段階；
(c)検出可能な標識の存在下において、プールされたcDNAライブラリーを発現させる段階；
(d)該リンペプチドライブラリーおよび該発現されたcDNAライブラリーを接触させる段階；ならびに
(e)リンペプチドとリンペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階であって、相互作用の存在がリンペプチドとリンペプチド結合ドメインを同定する、段階。
【請求項７７】
以下の段階：
(f)段階(a)の非リン酸化ペプチドを提供する段階、および
(g)ペプチドとリンペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階
をさらに含み、相互作用の非存在が、リンペプチドとリンペプチド結合ドメインの相互作用が信頼できることを示している、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
以下の段階を含む、ペプチドおよびペプチド結合ドメインからなる結合ペアを同定するための方法：
(a)各ペプチドが、位置が不変である少なくとも2つの既知のアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定されたペプチドの集合を含む偏ったペプチドライブラリーを提供する段階；
(b)偏ったペプチドライブラリーを検出可能に標識されたペプチドライブラリーと接触させる段階；ならびに
(c)偏ったペプチドと検出可能に標識されたペプチドの相互作用を検出する段階であって、相互作用がペプチドとペプチド結合ドメインの結合ペアを同定する、段階。
【請求項７９】
以下の段階を含む、リンペプチド結合モジュールを同定するための方法：
(a)固定化リンペプチドライブラリーおよび固定化ペプチドライブラリーを提供する段階；
(b)該ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに
(c)優先的な結合を検出する段階であって、該ペプチドライブラリーと比較した該リンペプチドライブラリーへの優先的結合が、ポリペプチドまたはポリペプチド断片をリンペプチド結合モジュールとして同定する、段階。
【請求項８０】
以下の段階を含む、非リンペプチド結合モジュールを同定するための方法：
(a)固定化変性リンペプチドライブラリーおよび固定化ペプチドライブラリーを提供する段階；
(b)該ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに
(c)優先的な結合を検出する段階であって、該リンペプチドライブラリーと比較した該ペプチドライブラリーへの優先的結合が、該ポリペプチドまたはポリペプチド断片を非リンペプチド結合モジュールとして同定する、段階。
【請求項８１】
以下の段階を含む、DNA損傷応答経路におけるリンペプチド結合モジュールを同定するための方法：
(a)固定化pSerまたはpThr変性リンペプチドライブラリーおよび固定化SerまたはThrペプチドライブラリーを提供する段階；
(b)該ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに
(c)示差的結合を検出する段階であって、該ペプチドライブラリーと比較した該リンペプチドライブラリーへの優先的結合がポリペプチドまたはポリペプチド断片をリンペプチド結合モジュールとして同定する、段階。
【請求項８２】
前記リンペプチドまたはペプチドライブラリーが、該ライブラリーにおいて変性した位置にアミノ酸Arg、LysまたはHisをもたない、請求項81記載の方法。
【請求項８３】
ポリペプチドまたはポリペプチド断片がインビトロ翻訳(IVT)ポリペプチドである、請求項81記載の方法。
【請求項８４】
BRCTドメインを結合するpSerまたはpThrを含む変性リンペプチド。
【請求項８５】
pSerまたはpThr +3位に芳香族または脂肪族残基をさらに含む、請求項84記載の変性リンペプチド。
【請求項８６】
pSerもしくはpThr +3または+5位に芳香族または脂肪族残基をさらに含む、請求項84記載の変性リンペプチド。
【請求項８７】
+1位にGlnまたは芳香族もしくは脂肪族残基をさらに含む、請求項84記載の変性リンペプチド。
【請求項８８】
ポリペプチドがアミノ酸配列Y-D-I-(pSerまたはpThr)-Q-V-F-P-Fを含む、請求項87記載の変性リンペプチド。
【請求項８９】
BRCTタンデムドメインを含む、リンペプチド結合モジュール。
【請求項９０】
BRCTタンデムドメインがPTIPの第三および第四のBRCTドメインの少なくとも100個のアミノ酸を含む、請求項89記載のリンペプチド結合モジュール。
【請求項９１】
BRCTペアがBRCA1のBRCTドメインの少なくとも100個のアミノ酸を含む、請求項89記載のリンペプチド結合モジュール。
【請求項９２】
前記タンデムドメインがリンペプチド結合において単一モジュールとして機能する、請求項89記載のBRCTタンデムドメイン。
【請求項９３】
pSerまたはpThrアミノ酸を含むリンペプチドと複合したPTIPのタンデムBRCTドメインの単離された断片。
【請求項９４】
タンデムBRCTリンペプチド結合モジュール、およびpSerまたはpThrを含むリンペプチドを含む複合体。
【請求項９５】
タンデムBRCTリンペプチド結合モジュールがリンペプチドと複合したPTIPの断片である、請求項94記載の複合体。
【請求項９６】
前記リンペプチドが(pSerまたはpThr)+3位に芳香族または脂肪族残基をさらに含む、請求項94記載の複合体。
【請求項９７】
前記リンペプチドが(pSerもしくはpThr)+3位または+5位に芳香族または脂肪族残基をさらに含む、請求項94記載の複合体。
【請求項９８】
前記リンペプチドが+1位にGlnまたは芳香族もしくは脂肪族残基をさらに含む、請求項94記載の複合体。
【請求項９９】
前記リンペプチドがアミノ酸配列Y-D-I-(pSerまたはpThr)-Q-V-F-P-Fをさらに含む、請求項94記載の複合体。
【請求項１００】
新形成の治療または予防のための候補化合物を同定するための方法であって、該方法が、該候補化合物の存在下においてリンペプチド結合モジュールのリンペプチドへの結合を検出する段階を含み、ここで該結合を調節する候補化合物が新形成の治療または予防に有用な化合物である、方法。
【請求項１０１】
前記結合が免疫学的アッセイ、酵素的アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いて検出される、請求項100記載の方法。
【請求項１０２】
リンペプチド結合モジュールまたはその断片が単離されたリンペプチド結合モジュールである、請求項100記載の方法。
【請求項１０３】
リンペプチドがpSerまたはpThrを含む単離されたリンペプチドである、請求項100記載の方法。
【請求項１０４】
リンペプチドが固体支持体に固定されている、請求項100記載の方法。
【請求項１０５】
リンペプチド結合モジュールがタンデムBRCT結合ドメインである、請求項100記載の方法。
【請求項１０６】
リンペプチド結合モジュールが固体支持体に固定されている、請求項100記載の方法。
【請求項１０７】
結合が免疫学的アッセイ、酵素的アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いてアッセイされる、請求項100記載の方法。
【請求項１０８】
前記候補化合物がリンペプチド結合モジュールとプレインキュベートされる、請求項100記載の方法。
【請求項１０９】
前記候補化合物がリンペプチドとプレインキュベートされる、請求項100記載の方法。
【請求項１１０】
リンペプチド結合モジュールおよびリンペプチドが、前記候補化合物と接触する前に複合体を形成する、請求項100記載の方法。
【請求項１１１】
前記候補化合物、リンペプチドおよびリンペプチド結合モジュールが同時に接触する、請求項100記載の方法。
【請求項１１２】
以下の段階を含む、対象において新形成を治療または予防するのに有用な候補化合物を同定するための方法：
(a)リンペプチド結合モジュールまたはその断片、およびpSerもしくはpThrを含むリンペプチドを発現させる細胞を提供する段階；
(b)該細胞を候補化合物と接触させる段階；ならびに
(c)該候補化合物と接触した該細胞におけるリンペプチド結合モジュールおよび該リンペプチドの結合を、対照細胞における該結合と比較する段階であって、該結合の調節が該候補化合物を、対象において新形成を治療または予防するのに有用な化合物として同定する、段階。
【請求項１１３】
リンペプチド結合モジュールおよび前記リンペプチドがインビトロで原核細胞または真核細胞において発現される、請求項112記載の方法。
【請求項１１４】
リンペプチド結合モジュールが前記細胞により内因的に発現される、請求項112記載の方法。
【請求項１１５】
リンペプチド結合モジュールが組換えタンパク質として発現される、請求項112記載の方法。
【請求項１１６】
前記細胞が新生物細胞である、請求項112記載の方法。
【請求項１１７】
新生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項112記載の方法。
【請求項１１８】
新生物細胞がヒト細胞である、請求項112記載の方法。
【請求項１１９】
前記候補化合物が前記結合の親和力を減少させる、請求項112記載の方法。
【請求項１２０】
(i)pSerまたはpThrを含むリンペプチドおよび(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物であって、該リンペプチドが、対象に投与される場合、新生物疾患を改善させる量で存在している、薬学的組成物。
【請求項１２１】
第二の化学療法薬をさらに含む、請求項120記載の薬学的組成物。
【請求項１２２】
第二の化学療法薬がパクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツツマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクおよびビノレルビンからなる群より選択される、請求項120記載の薬学的組成物。
【請求項１２３】
請求項120記載のリンペプチドの薬学的組成物を投与する段階を含む、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するための方法であって、該リンペプチドが患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量である、方法。
【請求項１２４】
第二の化学療法薬を投与する段階を含む、方法であって、前記リンペプチドおよび該化学療法薬が患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量であり、かつ該化学療法薬が同時に、または14日間のリンペプチド投与の間に投与される、請求項123記載の方法。
【請求項１２５】
第二の化学療法薬がパクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツツマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクおよびビノレルビンからなる群より選択される、請求項123記載の方法。
【請求項１２６】
細胞増殖性疾患が新生物である、請求項123記載の方法。
【請求項１２７】
以下の段階を含む、BRCT生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法：
(a)リンペプチドとPBDの間に複合体を形成するように請求項1記載のリンペプチドおよびBRCT結合ドメインドメインポリペプチドを接触させる段階；
(b)該複合体を候補化合物と接触させる段階；ならびに
(c)該リンペプチドのBRCT結合ドメインからの置換を測定する段階であって、該リンペプチドのBRCT結合ドメインからの該置換が、候補化合物がBRCT結合ドメイン生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している、段階。
【請求項１２８】
以下の段階を含む、BRCT結合ドメイン生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法：
(a)候補化合物の存在下において、請求項1記載のリンペプチドおよびBRCT結合ドメインを接触させる段階；ならびに
(b)該リンペプチドとBRCT結合ドメインの結合を測定する段階であって、候補化合物の非存在下における該リンペプチドとポリペプチドの結合量と比較した結合量の低下が、候補化合物がBRCT結合ドメイン生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している、段階。
【請求項１２９】
前記リンペプチドまたはBRCT結合ドメインが検出可能に標識される、請求項127または128記載の方法。
【請求項１３０】
前記リンペプチドおよびBRCT結合ドメインが異なって標識される、請求項127または128記載の方法。
【請求項１３１】
BRCT結合ドメインがBRCA1およびPTIPからなる群より選択される、請求項127または128記載の方法。
【請求項１３２】
BRCT結合ドメインがヒトBRCA1のドメインである、請求項127または128記載の方法。
【請求項１３３】
BRCT結合ドメインがヒトPTIPのドメインである、請求項127または128記載の方法。
【請求項１３４】
(i)BRCT結合ドメインを結合する小分子、および(ii)該小分子を、新形成と診断されたまたは新形成を発生する傾向がある患者へ投与するための説明書を含む、キット。
【請求項１３５】
第二の化学療法化合物をさらに含む、請求項134記載のキット。
【請求項１３６】
患者試料においてBRCT結合ドメイン核酸分子またはポリペプチドの発現のレベルを測定する段階を含む、新形成を有する、または発生する傾向があると患者を評価する方法であって、対照試料における発現のレベルと比較した発現のレベルの増加が、該患者が新形成を有する、または発生する傾向があることを示している、方法。
【請求項１３７】
患者試料が血液または組織試料である、請求項136記載の方法。
【請求項１３８】
BRCT結合ドメイン核酸分子の発現のレベルを測定する段階を含む、請求項136記載の方法。
【請求項１３９】
BRCT結合ドメインポリペプチドの発現のレベルを測定する段階を含む、請求項136記載の方法。
【請求項１４０】
発現のレベルが免疫学的アッセイにおいて測定される、請求項132記載の方法。
【請求項１４１】
患者を、新形成を有すると診断するために用いられる、請求項132記載の方法。
【請求項１４２】
以下の段階を含む、ペプチド結合モジュールを同定するための方法：
(a)固定化修飾ペプチドライブラリーおよび固定化ペプチドライブラリーを提供する段階；
(b)該ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに
(c)優先的な結合を検出する段階であって、該ペプチドライブラリーと比較した該修飾ペプチドライブラリーへの優先的結合が、ポリペプチドまたはポリペプチド断片を修飾ペプチド結合モジュールとして同定する、段階。
【請求項１４３】
以下の段階を含む、修飾ペプチドおよびペプチド結合ドメインからなる結合ペアを同定するための方法：
(a)各ペプチドが、位置が不変である1つのアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定された修飾ペプチドの集合を含む偏ったペプチドライブラリーを提供する段階；
(b)プールされたcDNAライブラリーを提供する段階であって、cDNAライブラリーがタンパク質発現について位置している、段階；
(c)検出可能な標識の存在下において、プールされたcDNAライブラリーを発現させる段階；
(d)ペプチドライブラリーおよび発現されたcDNAライブラリーを接触させる段階；ならびに
(e)修飾ペプチドとペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階であって、相互作用が修飾ペプチドとペプチド結合ドメインの結合ペアを同定する、段階。
【請求項１４４】
アミノ酸が天然または非天然である修飾を含む、請求項138または139記載の修飾ペプチド。
【請求項１４５】
修飾がメチル化、アセチル化、ユビキチン化、グリコシル化、スモーレーション（sumolation）もしくはアルセニル化（arsenylation）からなる群より選択される、請求項140記載の修飾ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本発明は、細胞増殖性疾患を抑制する化合物(例えば、ペプチド模倣体および非ペプチド)およびそのような疾患を治療する方法に関する。本発明はまた、ポロ様（Polo-like）キナーゼの3次元構造およびこれらの構造を用いる小分子阻害剤を設計または選択するための方法を提供する。望ましくは、これらの化合物は、化合物が特定のアミノ酸残基と相互作用するのを可能にする特定の構造的、物理的および空間的特徴を有する。
【０００２】
サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)が、細胞周期の主要な制御因子であると長い間、考えられてきたが、細胞周期進行の重要な要素として、多様なタンパク質キナーゼの数の増加が、今、明らかになりつつある。これらの中には、有糸分裂のすべての段階中に、および遺伝毒性ストレスに対する細胞周期チェックポイント応答において、重要な役割を果たすポロ様キナーゼファミリー(Plk)のメンバーがある。多くのタンパク質キナーゼは、一部、その後にホスホセリン/トレオニン結合タンパク質により認識される基質においてホスホセリン/トレオニン含有配列モチーフを生成することにより、細胞周期制御機能に関与した。これらは、有糸分裂進行を制御するPin1のWWおよびプロリンイソメラーゼドメイン、DNA損傷に応答してのG2/M転移を調節する14-3-3タンパク質、ならびにS期移行を制御するCdc4pのWD40反復を含む。
【０００３】
いくつかの例において、リンペプチド結合ドメインおよびキナーゼドメインは、単一分子内に結合されており、SH2ドメイン含有SrcキナーゼおよびFHAのRad53p/Chk2ファミリードメイン含有キナーゼにより最も良く例証される。これらのタンパク質において、リンペプチド結合ドメインは、キナーゼをリン酸化前の(準備された)部位へ向け、単一基質内の複数の部位において前進的リン酸化を媒介する、またはキナーゼ活性化を促進する。ポロ様キナーゼは、保存されたSer/Thrキナーゼドメイン、およびポロボックスと呼ばれる2つの相同性〜70個から80個までの残基セグメントから構成される非触媒性C末端領域の存在により識別される。
【０００４】
ヒト、マウスおよびカエルは、それぞれ、Plk1、Plk2/SnkおよびPlk3/Fnk/Prkと表示される3つのPlk相同体を有するが、出芽酵母、分裂酵母およびハエは、それぞれ、Cdc5p、Plo1およびPoloと表示される単一のPlkファミリーメンバーのみを含む。さらに、ヒトおよびマウスは、単一のポロボックスのみを含み、かつ正準のPBDを欠損している、Plkファミリーの極めて規準からはずれたメンバーである、セリン/トレオニンキナーゼを有する。
【０００５】
最も幅広く研究されたポロ様キナーゼ、Plk1およびCdc5p、はG2-M転移におけるCdc25CおよびCdc2-サイクリンBの活性化、中心体成熟および紡錘体集合、姉妹染色分体分離中でのコヒーシン遊離/切断、有糸分裂退出中の後期促進複合体(APC)活性化、ならびに細胞質分裂中のセプチン制御を含む、多数の有糸分裂過程に結びつけられた。対照的に、ヒトPlk2およびPlk3は、異なる機能を果たしているように思われる。Plk2は、初期G1にピークの発現および活性を示すが、Plk3は、DNA損傷および紡錘体破壊を含むいくつかのストレス応答経路により活性化される。実際、Plk3は、Plk1機能に直接的に拮抗しうるいくつかの役割を果たしている。例えば、DNA損傷は、Plk1を直接的に阻害するが、Plk3を毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子(ATM)依存性様式で活性化する。これらの結果と一致して、Plk1過剰発現は、NIH 3T3細胞において発癌性転換を引き起こすが、Plk3の過剰発現は、アポトーシスを誘導する。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明者らは、シグナル伝達経路においてキナーゼの下流で標的を同定するためのプロテオミクスアプローチを開発した。本発明者らのストラテジーは、キナーゼリン酸化モチーフに偏っている、部分的に変性したリンペプチドの固定化されたライブラリーを用いて、そのキナーゼの基質により標的にされる相互作用するエフェクタータンパク質を単離することを含む。このアプローチをサイクリン依存性キナーゼに利用して、本発明者らは、細胞周期制御キナーゼのカルボキシ末端領域、Plk-1、がこのタンパク質の非キナーゼ領域(アミノ酸326位〜603位)からなるリンペプチド認識ドメインをコードすることを発見した。このリンペプチド認識ドメインは、ポロボックスドメイン(Polo-box domain：PBD)と呼ばれ、配列特異的関係において、ホスホセリンおよびホスホトレオニン残基を結合する。具体的には、このPBDは、コアのリンペプチド配列セリン-ホスホセリンまたはセリン-ホスホトレオニンを認識し、かつそれに結合する。
【０００７】
本発明者らは、すべての3つのヒトPlk相同体由来のPBD、加えてアフリカツメガエル由来のplk1オルソログ体Plx1、および出芽酵母由来のCdc5pにおいて指向型ペプチドライブラリースクリーニングを行った。細胞機能における差異にもかかわらず、本発明者らは、すべてのPBDがコア配列S-[pSer/pThr]-P/Xについて強力に保存された選択を示すことを見出した。
【０００８】
PBD活性の構造的基盤を決定するために、その最適なホスホトレオニン含有ペプチドと複合したヒトPlk1 PBDの結晶構造を測定した。本発明者らは、構造的に特徴付けられるホスホ依存性結合タンパク質/分子の間で独特であり、かつインビトロおよびインビボの両方において基質へ向けるPBDにとって重要である、リンペプチド結合の様式を同定した。Plk1 PBDの構造は、正式のPBDを欠くマウスSak由来の単一のポロボックスのホモ二量体について最近観察されたもの(Leung et al., Nat. Struct. Biol. 9:719-724, 2002)とは、有意に異なる。Plk1 PBDは、新しいタンパク質折り畳みを示している。重要なホスホトレオニン結合残基の構造的同定に基づく部位特異的突然変異誘発により、PBDによるホスホ依存性基質認識が本来の有糸分裂進行に必要であることを実証することが可能になった。さらになお、最適なPlk1リンペプチドの、完全長Plk1におけるPBDへの結合が、キナーゼドメインのインビトロ活性を促進し、PBDによるキナーゼの分子内阻害がPBD-リガンド結合により軽減されるPlk制御についてのモデルへ導く。本発明者らは、ホスホセリン/トレオニン依存性結合が、Plkファミリー全体に渡るPBD活性の一般的な特徴であり、ポロ様キナーゼのターゲティングおよび制御においてこのドメインの機能にとって非常に重要であると結論づける。これらの研究は、不適当な細胞周期制御または不適当な細胞死により特徴付けられる病気または疾患を治療するのに有用な治療用物質の設計において標的にされうる部位を同定した。
【０００９】
本発明者らは、同じプロテオミクス的アプローチを、DNA損傷応答経路におけるリンペプチド結合モジュール媒介性シグナル伝達事象を同定するために適用した。ホスホイノシチド様キナーゼATMおよびATRのリン酸化モチーフに似ているように偏った、部分的に変性したリンペプチドのライブラリーを用いて、本発明者らは、γ線照射後にATM(毛細血管拡張性運動失調症変異遺伝子)およびATR(毛細血管拡張性運動失調症およびRAD3関連遺伝子)リン酸化基質のサブセットを認識するホスホセリン(pSer)またはホスホトレオニン(pThr)特異的結合モジュールとしてPTIPおよびBRCA1におけるタンデムBRCTドメインを同定した。PTIPタンデムBRCTドメインは、53BP1-およびホスホ-H2AX(＿-H2AX)含有核病巣、DNA損傷のマーカー、へのリン酸化依存性タンパク質局在化の原因である。これらの発見は、DNA損傷に対するシグナル伝達応答におけるBRCTドメイン機能についての新しい分子的原理を提供し、なぜ、BRCA1 BRCTドメイン突然変異Met1775 3 Argは、リンペプチドを結合することができないが、女性を乳癌および卵巣癌に罹りやすくするのかを説明するのを助ける可能性がある。
【００１０】
一つの局面において、本発明は、一般的に、メモリーと通信するプロセッサーを含むコンピューターを特徴とし；メモリーはその中に、(i)ポロボックスドメインの以下の残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491のそれぞれについての表5からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または3Å未満の座標の標準偏差を有する原子座標；および(ii)座標の3次元モデルを作成するためのプログラムを保存している。一つの態様において、座標は、ヘテロ原子についてである。もう一つの態様において、座標は、側鎖原子についてである。もう一つの態様において、座標は、側鎖およびヘテロ原子についてである。
【００１１】
もう一つの局面において、本発明は、一般的に、メモリーと電気通信するプロセッサーを含むコンピューターを特徴とする；メモリーはその中に、(i)Plk1 ポロボックスドメインの残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491の原子についての表5に示される原子座標もしくはその代用物、または1、2、3、4もしくは5Å未満の残基の座標からの標準偏差を有する原子座標；および(ii)ポロボックスドメインの3次元モデルを示すためのプログラムを保存している。
【００１２】
もう一つの局面において、本発明は、メモリーと通信するプロセッサーを含むコンピューターを提供する；メモリーはその中に、(i)ポロボックスドメインの残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491の非水素原子の少なくとも1つについてのX線回折データ、または1、2、3、4もしくは5Å未満の残基のバックボーン原子からの標準偏差を有するアミノ酸についてのX線回折データ；および(ii)ポロボックスドメインの3次元モデルを作成するためのプログラムを保存している。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、メモリーと通信するプロセッサーを含むコンピューターを提供する；メモリーはその中に、ポロボックスドメインを結合するリンペプチドのファルマコフォアモデル、およびモデルを示すためのプログラムを保存しており、モデルが以下の少なくとも1つを含む：少なくとも1つの水素結合相互作用に関与するトレオニンにおけるリン酸基；およびpThr-1位におけるセリンであって、Ser-1側鎖がPlk1表面へ向けられている、セリン。一つの態様において、セリンは、以下の少なくとも2つに関与する：(i)PBDのTrp-414主鎖原子との水素結合相互作用；(ii)PBDのLeu-491主鎖カルボニルとの水素結合相互作用；および(iii)PBDのTrp-414インドール側鎖由来のCδ1とのファンデルワールス相互作用。一つの態様において、モデルは、pThr+1位にプロリンをさらに含み、プロリンは、pThr+2主鎖アミノ基がPBDと接触するのを可能にするねじれを導入する。
【００１４】
もう一つの局面において、本発明は、ポロボックスドメインの候補リガンドを選択または設計する方法を提供し、本方法は、以下の段階を含む：(a)以下の残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491のそれぞれについての表5からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または1、2、3、4もしくは5Å未満の座標からの標準偏差を有する原子座標を有するポロボックスドメインの3次元構造を作成する段階；および(b)水溶液においてポロボックスドメインを結合するのに十分なその構造に相補的な表面を有する候補リガンドを選択または設計する段階。もう一つの局面において、本発明は、ポロボックスドメインリガンドを作製するための方法を提供し、本方法は、以下の段階を含む：(a)ポロボックスドメインの少なくとも1つの残基のリガンドとの原子座標を得る段階；(b)修飾されるべきリガンドにおける1つまたは複数の部分を決定する段階であって、修飾されたリガンドはポロボックスドメインを結合する能力を維持している、段階；および(c)その決定に基づいてリガンドを修飾する段階。一つの態様において、方法は、リガンドとのポロボックスドメインを結晶化する段階をさらに含む。もう一つの態様において、リガンドは、ポロボックスドメインを特異的に結合する。もう一つの態様において、修飾は、ポロボックスドメインへのリガンドの親和力を増加させる。もう一つの態様において、修飾はリガンドの溶解性を増加させる。もう一つの態様において、修飾は、インビボでのリガンドの半減期を増加させる。
【００１５】
もう一つの局面において、本発明は、ポロボックスドメインリガンドを作製するための方法を提供し、本方法は、ポロボックスドメインを結合するリガンドを作製する段階を含む；リガンドは、ポロボックスドメインの少なくとも一部の原子座標のモデルを用いて得られる情報に基づいて設計または選択される。
【００１６】
もう一つの局面において、本発明は、候補リガンドの、ポロボックスドメインを結合する能力を評価する方法を提供し、本方法は以下の段階を含む：(a)以下の残基：His-538、Lys-540、Trp-414もしくはLeu-491のそれぞれについての表5からの少なくとも1つの原子座標もしくはその代用物、または1、2、3、4もしくは5Å未満の座標からの標準偏差を有する原子座標を有するポロボックスドメインの3次元構造を作成する段階；および(b)候補リガンドとポロボックスドメインの間の相互作用を測定する手段を使用する段階。
【００１７】
もう一つの局面において、本発明は、ポロボックスドメインの候補リガンドを同定する方法を提供し、本方法は以下の段階を含む：(a)前の局面のコンピューターを用いてポロボックスドメインリガンドの3次元ファルマコフォアモデルを作成する段階；および(b)ファルマコフォアモデルの基準を満たす候補リガンドを選択する段階。任意の前の局面の様々な態様において、方法は、候補リガンドの、インビトロまたはインビボでポロボックスドメインを結合する能力を測定する段階をさらに含む。他の態様において、本方法は、候補リガンドの、インビトロまたはインビボでポロボックスドメインの酵素活性を変化させる能力を測定する段階をさらに含む。他の態様において、3次元構造は、残基：His-538、Lys-540、Trp-414またはLeu-491の水素原子をさらに含む。
【００１８】
上の局面の様々な態様において、座標は、ヘテロ原子、もしくは側鎖原子、または側鎖およびヘテロ原子についてである。他の態様において、メモリーは、His-538についての少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個の座標またはそれらの代用物；Lys-540についての少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8もしく9個の座標またはそれらの代用物；Trp-414についての少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13もしくは14個の座標またはそれらの代用物；または、Leu-491についての少なくとも1、2、3、4、5、6、7もしくは8個の座標またはそれらの代用物を保存する。他の態様において、座標は、表5における原子座標のいずれか1つまたはすべてである。前の局面の他の態様において、座標は、ポロボックスドメインの生物活性に、またはリンペプチドもしくはペプチド模倣体を結合するのに必要とされる任意の残基についてである。上の局面のいずれかの他の態様において、座標の標準偏差は、1、2、3、4、5、6もしくは7Å未満である。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明は、リンペプチドに結合したポロボックスドメインを含むポロ様キナーゼ複合体の結晶を特徴とする。一つの態様において、ポロ様キナーゼは、Plk-1である。もう一つの態様において、Plk-1は、SEQ ID NO:1の少なくともアミノ酸1位〜603位を含む。もう一つの態様において、Plk-1は、少なくともアミノ酸95位〜603位を含む。もう一つの態様において、Plk-1は、少なくともアミノ酸326位〜603位を含む。もう一つの態様において、Plk-1は、少なくともアミノ酸367位〜603位を含む。もう一つの態様において、リンペプチドは、アミノ酸配列
2007525143.tif 000002
を含み、ここでφは疎水性アミノ酸を表す。もう一つの態様において、リンペプチドは、アミノ酸配列
2007525143.tif 000003
を含む。もう一つの態様において、ポロ様キナーゼは、Plk-2である。もう一つの態様において、ポロ様キナーゼは、Plk-3である。
【００２０】
もう一つの局面において、本発明は、対象となるポロボックスドメインの構造的モデルを得る方法を提供し、本方法は、表5における原子座標の少なくとも一部および対象となるポロボックスドメインのアミノ酸配列の少なくとも一部を用いて、それにより対象となるポロボックスドメインのモデルを作成する相同性モデリングを含む。
【００２１】
もう一つの局面において、本発明は、対象となるポロボックスドメイン/リンペプチド複合体の3次元構造を測定する方法を提供し、本方法は、以下の段階を含む：(a)対象となるポロボックスドメイン/リンペプチド複合体を結晶化する段階；(b)対象となる結晶化ポロボックスドメインからX線回折パターンを作成する段階；および(c)対象となるポロボックスドメイン/リンペプチド複合体の少なくとも一部の3次元電子密度図を作成するために表5における電子座標の少なくとも一部を回折パターンに適用する段階。
【００２２】
もう一つの局面において、本発明は、S-[pS/pT]-P/X(Xは任意のアミノ酸である)を含むリンペプチドと複合した、ヒトPlk-1 ポロボックスドメインの残基367位〜603位を含む、単離された、ポロボックスドメインの完全長未満の断片を特徴とする。
【００２３】
もう一つの局面において、本発明は、S-[pS/pT]-P/X(Xは任意のアミノ酸である)を含むリンペプチドと複合した、ヒトPlk-2 ポロボックスドメインの残基500位〜685位を含む、単離されたポロボックスドメインの完全長未満の断片を特徴とする。
【００２４】
もう一つの局面において、本発明は、S-[pS/pT]-P/X(Xは任意のアミノ酸である)を含むリンペプチドと複合した、ヒトPlk-3 ポロボックスドメインの残基421位〜607位を含む、単離されたポロボックスドメインの完全長未満の断片を特徴とする。
【００２５】
もう一つの局面において、本発明は、突然変異を含む、単離されたポロボックスドメインタンパク質またはその断片を特徴とし、突然変異は、(a)ポロボックスドメインの結晶化する能力を増強する突然変異；(b)組換え発現に用いられる生物体において別なふうに翻訳後修飾される残基の突然変異；(c)ポロボックスドメインのNH2もしくはCOOH末端残基の突然変異；(d)リンペプチドへのポロボックスドメインの親和力を増加させるもしくは減少させる突然変異；または(e)ポロボックスドメインの折り畳みを変化させる突然変異である。一つの態様において、PBDは、His-538、Lys-540、Trp-414またはLeu-491において突然変異をさらに含む。他の態様において、核酸は、任意の前の局面のタンパク質をコードする。
【００２６】
もう一つの局面において、本発明は、アミノ酸配列
2007525143.tif 000004
(φは疎水性アミノ酸を表す)を含むリンペプチドを特徴とする。一つの態様において、リンペプチドは、Pro-Met-Gln-Ser-pThr-Pro-Leuを含み、リンペプチドがヒトPlk-1を結合する。
【００２７】
もう一つの局面において、本発明は、アミノ酸配列、
2007525143.tif 000005
を含むリンペプチドを特徴とし、pSerおよびpThrは、リン酸化セリンおよびリン酸化トレオニンであり、P-3、P-2またはP-1に指定されたアミノ酸は、天然または非天然のアミノ酸でありうる。一つの態様において、前の局面のリンペプチドは、アミノ酸配列
2007525143.tif 000006
をさらに含み、X1aaおよびX2aaは任意のアミノ酸であり、pSerおよびpThrはリン酸化セリンおよびリン酸化トレオニンである。もう一つの態様において、X1aaはプロリンであり、X2aaは任意のアミノ酸である。もう一つの態様において、X1aaは任意のアミノ酸であり、X2aaはアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンである。もう一つの態様において、X2aaはロイシンである。もう一つの態様において、P-3位のアミノ酸はメチオニンである。もう一つの態様において、P-2位のアミノ酸はグルタミンである。もう一つの態様において、P-1位のアミノ酸はセリンである。もう一つの態様において、P0位のアミノ酸はリン酸化セリンである。もう一つの態様において、P0位のアミノ酸はリン酸化トレオニンである。もう一つの態様において、P+1位のアミノ酸はプロリンである。もう一つの態様において、アミノ酸配列は、
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であり、X1aaは任意のアミノ酸であり、pThrはリン酸化トレオニンであり、pSerはリン酸化セリンである。もう一つの態様において、リンペプチドは25個のアミノ酸残基を超えない。もう一つの態様において、リンペプチドは15個のアミノ酸残基を超えない。もう一つの態様において、リンペプチドは10個のアミノ酸残基を超えない。
【００２８】
もう一つの局面において、本発明は、前の局面のリンペプチドのいずれかの治療的有効量および薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を特徴とし、薬学的組成物は、不適当な細胞周期制御により特徴付けられる疾患の治療に有用である。一つの態様において、細胞増殖性疾患は、新生物である。もう一つの態様において、組成物は、第二の化学療法薬をさらに含む。もう一つの態様において、第二の化学療法薬は、パクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン（altretamine）、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン（cytoxan）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン（fludarabine）、ゲンツツマブ（gentuzumab）、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ（alemtuzumab）、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド（temozolomide）、テニポシド（teniposide）、6-チオグアニン、トポテカン（topotecan）、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラク（etodolac）およびビノレルビン（vinorelbine）からなる群より選択される。
【００２９】
もう一つの局面において、本発明は、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するための方法を特徴とし、本方法は、前の局面のリンペプチドの薬学的組成物を投与する段階を含み、リンペプチドは、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量である。一つの態様において、方法は、第二の化学療法薬を投与する段階を含み、リンペプチドおよび化学療法薬は、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量であり、化学療法薬は、同時に、または1、2、3、5、7、10、14もしくは28日間のリンペプチド投与の間に投与される。もう一つの態様において、第二の化学療法薬は、パクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツツマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクおよびビノレルビン、または当技術分野において公知の任意の他の化学療法薬からなる群より選択される。他の態様において、細胞増殖性疾患は、新生物である。
【００３０】
もう一つの局面において、本発明は、ポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階：(a)前の局面のリンペプチドおよびポロボックスドメイン(PBD)ポリペプチドを、リンペプチドとPBDが複合体を形成するように接触させる段階；(b)複合体を候補化合物と接触させる段階；ならびに(c)PBDからのリンペプチドの置換を測定する段階を含み、PBDからのリンペプチドの置換が、候補化合物がポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している。
【００３１】
もう一つの局面において、本発明は、ポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法を提供し、本方法は以下の段階：(a)候補化合物の存在下において、前の局面のリンペプチドおよびPBDを接触させる段階；ならびに(b)リンペプチドとPBDの結合を測定する段階、を含み、候補化合物の非存在下におけるリンペプチドとポリペプチドの結合量と比較した結合量の低下が、候補化合物がポロ様キナーゼ生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している。一つの態様において、リンペプチドまたはPBDは検出可能に標識される。もう一つの態様において、リンペプチドおよびPBDは異なって標識される。もう一つの態様において、PBDは、Cdc5、Plo-1、Polo、Plx-1、Plx-2、Plx-3、Plk-1、Prk/Fnk、SnkおよびCnkのPBDからなる群より選択される。もう一つの態様において、PBDはPlk-1 PBDである。もう一つの態様において、Plk-1 PBDはヒトPlk-1 PBDである。
【００３２】
もう一つの局面において、本発明は、ペプチドおよびペプチド結合ドメインからなる結合ペアを同定するための方法を提供し、本方法は、以下の段階を含む：(a)各ペプチドが、位置が不変である少なくとも2つの既知のアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定されたペプチドの集合を含む偏ったペプチドライブラリーを提供する段階；(b)プールされたcDNAライブラリーを提供する段階であって、cDNAライブラリーがタンパク質発現について位置している段階；(c)検出可能な標識の存在下において、プールされたcDNAライブラリーを発現させる段階；(d)ペプチドライブラリーおよび発現されたcDNAライブラリーを接触させる段階；ならびに(e)ペプチドとペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階であって、相互作用がペプチドとペプチド結合ドメインの結合ペアを同定する段階。一つの態様において、偏ったペプチドライブラリーは、固体支持体に共有結合的に結合している。もう一つの態様において、偏ったペプチドライブラリーは、固体支持体に非共有結合的に結合している。もう一つの態様において、ペプチドはリンペプチドであり、ペプチド結合ドメインはリンペプチド結合ドメインである。
【００３３】
もう一つの局面において、本発明は、リンペプチドおよびリンペプチド結合ドメインを含む結合ペアを同定するための方法を提供し、本方法は、以下の段階を含む：(a)各ペプチドが、位置が不変である少なくとも2つの既知のアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定されたペプチドの集合を含む偏ったリンペプチドライブラリーを提供する段階であって、各リンペプチドがアミノ末端にビオチン基を共有結合的に連結している段階；(b)プールされたcDNAライブラリーを提供する段階であって、プールされたcDNAライブラリーがタンパク質発現について位置している段階；(c)検出可能な標識の存在下において、プールされたcDNAライブラリーを発現させる段階；(d)リンペプチドライブラリーおよび発現されたcDNAライブラリーを接触させる段階；ならびに(e)リンペプチドとリンペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階であって、相互作用の存在がリンペプチドとリンペプチド結合ドメインを同定する段階。一つの態様において、方法は、(f)段階(a)の非リン酸化ペプチドを提供する段階、および(g)ペプチドとリンペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階をさらに含み、相互作用の非存在が、リンペプチドとリンペプチド結合ドメインの相互作用が信頼できることを示している。
【００３４】
もう一つの局面において、本発明は、ペプチドおよびペプチド結合ドメインからなる結合ペアを同定するための方法を提供する；本方法は、以下の段階を含む：(a)各ペプチドが、位置が不変である少なくとも2つの既知のアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定されたペプチドの集合を含む偏ったペプチドライブラリーを提供する段階；(b)偏ったペプチドライブラリーを検出可能に標識されたペプチドライブラリーと接触させる段階；ならびに(c)偏ったペプチドと検出可能に標識されたペプチドの相互作用を検出する段階であって、相互作用がペプチドとペプチド結合ドメインの結合ペアを同定する段階。
【００３５】
もう一つの局面において、本発明は、リンペプチド結合モジュールを同定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：(a)固定化リンペプチドライブラリーおよび固定化ペプチドライブラリーを提供する段階；(b)ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに(c)優先的な結合を検出する段階であって、ペプチドライブラリーと比較したリンペプチドライブラリーへの優先的結合が、ポリペプチドまたはポリペプチド断片をリンペプチド結合モジュールとして同定する段階。
【００３６】
もう一つの局面において、本発明は、非リンペプチド結合モジュールを同定するための方法を提供し、本方法は以下の段階を含む：(a)固定化変性リンペプチドライブラリーおよび固定化ペプチドライブラリーを提供する段階；(b)ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに(c)優先的な結合を検出する段階であって、リンペプチドライブラリーと比較したペプチドライブラリーへの優先的結合が、ポリペプチドまたはポリペプチド断片を非リンペプチド結合モジュールとして同定する段階。
【００３７】
もう一つの局面において、本発明は、DNA損傷応答経路におけるリンペプチド結合モジュールを同定するための方法を提供し、本方法は以下の段階を含む：(a)固定化pSerまたはpThr変性リンペプチドライブラリーおよび固定化SerまたはThrペプチドライブラリーを提供する段階；(b)ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに(c)示差的結合を検出する段階であって、ペプチドライブラリーと比較したリンペプチドライブラリーへの優先的結合がポリペプチドまたはポリペプチド断片をリンペプチド結合モジュールとして同定する段階。一つの態様において、リンペプチドまたはペプチドライブラリーは、ライブラリーにおいて変性した位置にアミノ酸Arg、LysまたはHisをもたない。もう一つの態様において、ポリペプチドまたはポリペプチド断片は、インビトロ翻訳(IVT)ポリペプチドである。
【００３８】
もう一つの局面において、本発明は、BRCTドメインを結合するpSerまたはpThrを含む変性リンペプチドを特徴とする。一つの態様において、リンペプチドは、pSerまたはpThr +3位に芳香族または脂肪族残基；pSerもしくはpThr +3または+5位に芳香族または脂肪族残基；+1位にGlnまたは芳香族もしくは脂肪族残基；またはアミノ酸配列Y-D-I-(pSerまたはpThr)-Q-V-F-P-Fをさらに含む。
【００３９】
もう一つの局面において、本発明は、BRCTタンデムドメインを含むリンペプチド結合モジュールを特徴とする。一つの態様において、BRCTタンデムドメインは、PTIPの第三および第四のBRCTドメインの少なくとも100個のアミノ酸を含む。もう一つの態様において、BRCTペアは、BRCA1のBRCTドメインの少なくとも100個のアミノ酸を含む。もう一つの態様において、タンデムドメインは、リンペプチド結合において単一モジュールとして機能する。
【００４０】
もう一つの局面において、本発明は、pSerもしくはpThrアミノ酸を含むリンペプチドと複合したPTIPまたはBRCA1のタンデムBRCTドメインの単離された断片(例えば、50、100、150、200、250または300個のアミノ酸)を特徴とする。
【００４１】
もう一つの局面において、本発明は、タンデムBRCTリンペプチド結合モジュールおよびpSerまたはpThrを含むリンペプチドを含む複合体を特徴とする。一つの態様において、タンデムBRCTリンペプチド結合モジュールは、リンペプチドと複合したPTIPの断片である。もう一つの態様において、リンペプチドは、(pSerまたはpThr)+3位に芳香族または脂肪族残基；(pSerもしくはpThr)+3または+5位に芳香族または脂肪族残基；+1位にGlnまたは芳香族もしくは脂肪族残基；またはアミノ酸配列Y-D-I-(pSerまたはpThr)-Q-V-F-P-Fをさらに含む。もう一つの局面において、本発明は、新形成の治療または予防のための候補化合物を同定するための方法を提供し、方法は、候補化合物の存在下においてリンペプチド結合モジュールのリンペプチドへの結合を検出する段階を含み、その結合を調節する候補化合物が新形成の治療または予防に有用な化合物である。一つの態様において、結合は、免疫学的アッセイ、酵素的アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いて検出される。もう一つの態様において、リンペプチド結合モジュールまたはその断片は、単離されたリンペプチド結合モジュールである。もう一つの態様において、リンペプチド結合モジュールまたはその断片は、pSerまたはpThrを含む単離されたリンペプチドである。一つの態様において、リンペプチドは、固体支持体に固定されている。もう一つの態様において、リンペプチド結合モジュールは、タンデムBRCT結合ドメインである。もう一つの態様において、リンペプチド結合モジュールは、固体支持体に固定されている。もう一つの態様において、結合は、免疫学的アッセイ、酵素的アッセイまたはラジオイムノアッセイを用いてアッセイされる。もう一つの態様において、候補化合物は、リンペプチド結合モジュールとプレインキュベートされる。もう一つの態様において、候補化合物は、リンペプチドとプレインキュベートされる。もう一つの態様において、リンペプチド結合モジュールおよびリンペプチドは、候補化合物と接触する前に複合体を形成する。もう一つの態様において、候補化合物、リンペプチドおよびリンペプチド結合モジュールは、同時に接触する。
【００４２】
もう一つの局面において、本発明は、対象において新形成を治療または予防するのに有用な候補化合物を同定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：(a)リンペプチド結合モジュールまたはその断片、およびpSerまたはpThrを含むリンペプチドを発現させる細胞を提供する段階；(b)細胞を候補化合物と接触させる段階；ならびに(c)候補化合物と接触した細胞におけるリンペプチド結合モジュールとリンペプチドの結合を対照細胞における結合と比較する段階であって、結合の調節が、候補化合物を、対象において新形成を治療または予防するために有用な化合物として同定する段階。一つの態様において、リンペプチド結合モジュールおよびリンペプチドは、インビトロでの原核細胞または真核細胞において発現される。もう一つの態様において、リンペプチド結合モジュールは、細胞により内因的に発現される。もう一つの態様において、リンペプチド結合モジュールは、組換えタンパク質として発現される。もう一つの態様において、細胞は、新生細胞である。もう一つの態様において、新生細胞は、哺乳動物細胞である。もう一つの態様において、新生細胞は、ヒト細胞である。もう一つの態様において、候補化合物は、結合の親和力を減少させる。
【００４３】
もう一つの局面において、本発明は、(i)pSerまたはpThrを含むリンペプチド、および(ii)薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を特徴とし、リンペプチドが、対象に投与された場合、新生物疾患を寛解させる量で存在している。一つの態様において、組成物は第二の化学療法薬を含む。もう一つの態様において、第二の化学療法薬は、パクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツツマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクおよびビノレルビンからなる群より選択される。
【００４４】
もう一つの局面において、本発明は、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するための方法を提供し、本方法は、前の局面のリンペプチドの薬学的組成物を投与する段階を含み、リンペプチドが患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量である。一つの態様において、方法は、第二の化学療法薬を投与する段階を含み、リンペプチドおよび化学療法薬は、患者において細胞増殖性疾患を治療または抑制するのに十分な量であり、かつ化学療法薬は、同時に、または14日間のリンペプチド投与の間に投与される。もう一つの態様において、第二の化学療法薬は、パクリタクセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ビンブラスチン、エトポシド、5-フルオロウラシル、カルボプラチン、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アザシチジン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、2-クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、リン酸エストラムスチン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲンツツマブ、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファレン、6-メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ペントスタチン、プロカルバジン、アレムツツマブ、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、6-チオグアニン、トポテカン、トラスツツマブ、ビンクリスチン、ビンデシン、ロフェコキシブ、セレコキシブ、エトドラクおよびビノレルビンからなる群より選択される。もう一つの態様において、細胞増殖性疾患は、新生物である。
【００４５】
もう一つの局面において、本発明は、BRCT生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：(a)特許請求の範囲または前の局面のリンペプチドおよびBRCT結合ドメインポリペプチドを、リンペプチドとBRCTの複合体を形成するように接触させる段階；(b)複合体を候補化合物と接触させる段階；ならびに(c)BRCT結合ドメインからのリンペプチドの置換を測定する段階であって、BRCT結合ドメインからのリンペプチドの置換が、候補化合物がBRCT結合ドメイン生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している段階。
【００４６】
もう一つの局面において、本発明は、BRCT結合ドメイン生物活性を調節するペプチド模倣化合物を同定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：(a)候補化合物の存在下において、前の局面のリンペプチドおよびBRCT結合ドメインを接触させる段階；ならびに(b)リンペプチドとBRCT結合ドメインの結合を測定する段階であって、候補化合物の非存在下におけるリンペプチドとポリペプチドの結合量と比較した結合量の低下が、候補化合物がBRCT結合ドメイン生物活性を調節するペプチド模倣化合物であることを示している段階。一つの態様において、リンペプチドまたはBRCT結合ドメインは検出可能に標識される。もう一つの態様において、リンペプチドおよびBRCT結合ドメインは、異なって標識される。他の態様において、BRCT結合ドメインは、BRCA1またはPTIPである。もう一つの態様において、BRCT結合ドメインは、ヒトBRCA1のドメインである。一つの態様において、BRCT結合ドメインは、ヒトPTIPのドメインである。
【００４７】
もう一つの局面において、本発明は、(i)BRCT結合ドメインを結合する小分子、および(ii)新形成と診断された、または新形成を発生する傾向がある患者へ小分子を投与するための説明書を含むキットを特徴とする。一つの態様において、キットは、第二の化学療法化合物をさらに含む。
【００４８】
もう一つの局面において、本発明は、新形成を有する、または発生する傾向がある、と患者を評価する方法を特徴とし、本方法は、患者試料においてBRCT結合ドメイン核酸分子またはポリペプチドの発現のレベルを測定する段階を含み、対照試料における発現のレベルと比較した発現のレベルの増加が、患者が新形成を有する、または発生する傾向があることを示している。一つの態様において、患者試料は、血液または組織試料である。もう一つの態様において、本方法は、BRCT結合ドメイン核酸分子の発現のレベルを測定する段階を含む。もう一つの態様において、本方法は、BRCT結合ドメインポリペプチドの発現のレベルを測定する段階を含む。もう一つの態様において、発現のレベルは、免疫学的アッセイにおいて測定される。もう一つの態様において、本方法は、患者を、新形成を有すると診断するのに用いられる。
【００４９】
もう一つの局面において、本発明は、ペプチド結合モジュールを同定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：(a)固定化修飾ペプチドライブラリーおよび固定化ペプチドライブラリーを提供する段階；(b)ライブラリーをポリペプチドまたはポリペプチド断片と接触させる段階；ならびに(c)優先的な結合を検出する段階であって、ペプチドライブラリーと比較した修飾ペプチドライブラリーへの優先的結合が、ポリペプチドまたはポリペプチド断片を修飾ペプチド結合モジュールとして同定する段階。
【００５０】
もう一つの局面において、本発明は、修飾ペプチドおよびペプチド結合ドメインからなる結合ペアを同定するための方法を特徴とし、本方法は以下の段階を含む：(a)各ペプチドが、位置が不変である1つのアミノ酸残基を有する、固体支持体に固定された修飾ペプチドの集合を含む偏ったペプチドライブラリーを提供する段階；(b)プールされたcDNAライブラリーを提供する段階であって、cDNAライブラリーがタンパク質発現について位置している段階；(c)検出可能な標識の存在下において、プールされたcDNAライブラリーを発現させる段階；(d)ペプチドライブラリーおよび発現されたcDNAライブラリーを接触させる段階；ならびに(e)修飾ペプチドとペプチド結合ドメインの相互作用を検出する段階であって、相互作用が修飾ペプチドとペプチド結合ドメインの結合ペアを同定する段階。一つの態様において、アミノ酸は、天然または非天然である修飾を含む。もう一つの態様において、修飾は、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、グリコシル化、スモーレーション（sumolation）もしくはアルセニル化（arsenylation）、または当業者に公知の任意の他の修飾からなる群より選択される。
【００５１】
上の局面のいずれかの様々な態様において、ペプチドは本明細書に記載されているような非天然アミノ酸を含む。
【００５２】
「類似体」とは、同一ではないが、類似した特徴をもつ分子を意味する。例えば、ペプチド類似体は、天然に存在するペプチドと比較して類似体機能を増強する特定の生化学的修飾を有するが、対応する天然に存在するペプチドの生物活性を保持する。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合を変化させることなく、類似体プロテアーゼ耐性、膜透過性または半減期を増加させるものと思われる。類似体は、非天然アミノ酸を含みうる。
【００５３】
もう一つの例において、核酸類似体は、天然に存在する核酸と比較して類似体機能を増強する特定の生化学的修飾を有するが、天然に存在する対応する核酸配列にハイブリダイズする能力を保持する。いくつかの核酸類似体において、ヌクレオチド単位の糖および/またはヌクレオシド間結合、すなわちバックボーンは新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。ペプチドおよび核酸修飾は、ペプチドまたは核酸の、断片、類似体またはそれらの誘導体への誘導体化について当技術分野において公知の技術のいずれかにより達成されうる。そのような用語および、特に、「類似体」はまた、具体的には、ポロ様キナーゼ核酸またはペプチド模倣体として機能する、ペプチド、非ペプチド、ペプチド/核酸ハイブリッド分子、小分子、および他の化合物を含む。
【００５４】
「アポトーシス」とは、死にかけている細胞が、細胞膜小疱形成、細胞体収縮、クロマチン凝縮またはDNAラダーを含むよく特徴付けられた生物学的顕著な特徴のセットの少なくとも1つを示す、細胞死の過程を意味する。
【００５５】
「偏ったリンペプチドライブラリー」とは、ホスホセリン、ホスホトレオニンおよび/またはホスホチロシンの変性したペプチドライブラリーであって、リンペプチドの特定のアミノ酸残基が、特定のライブラリーにおけるすべてのリンペプチドにおいて発現されるように固定されている、リンペプチドライブラリーを意味する。例えば、偏ったリンペプチドライブラリーは、コア配列Ser-pSer-ProまたはSer-pThr-Proを含むように合成されうる。望ましい態様において、ホスホセリン、ホスホトレオニンまたはホスホチロシンに隣接したアミノ酸残基は固定されている。
【００５６】
「アミノ酸断片」とは、そのαカルボキシル、そのα窒素、または両方を通してペプチド鎖に組み入れられているアミノ酸残基を意味する。末端アミノ酸は、アミノ末端またはカルボキシ末端における任意の天然または非天然のアミノ酸残基である。内部アミノ酸は、末端アミノ酸ではない任意の天然または非天然のアミノ酸残基である。
【００５７】
本明細書に用いられる場合、用語「アルキル」および接頭辞「アルク(alk-)」は、直鎖および分枝鎖の両方の基、ならびに環式基、すなわち、シクロアルキル基およびシクロアルケニル基、を含む。環式基は、単環式または多環式であり、好ましくは、3〜8個の環炭素原子(両端を含めて)を有しうる。例示的な環式基は、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基およびアダマンチル基を含む。
【００５８】
「芳香族残基」とは、共役π電子を有する環系をもつ芳香族基を意味する(例えば、フェニルまたはイミダゾール)。アリール基の環は、好ましくは5〜6原子である。芳香族環は、独占的に炭素原子だけから構成されうる、または炭素原子およびヘテロ原子の混合物から構成されうる。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、イオウおよびリンを含む。アリール基は、任意には、各環が好ましくは5員または6員を有する、単環式、二環式、または三環式の環でありうる。アリール基は置換される場合もあり、置換されない場合もある。例示的置換基は、アルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルフヒドリル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ハロ基、フルオロアルキル基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、アミノ基、アミノアルキル基、一置換アミノ基、二置換アミノ基、および第4級アミノ基を含む。
【００５９】
「アリール」とは、炭素環式芳香族環または環系を意味する。他に規定がない限り、アリール基は6個から18個までの炭素である。アリール基の例は、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、フルオレニル基およびインデニル基を含む。
【００６０】
「ヘテロアリール」とは、少なくとも1個の環ヘテロ原子(例えば、O、S、N)を含む芳香族環または環系を意味する。別に規定がない限り、ヘテロアリール基は、1個から9個までの炭素である。ヘテロアリール基は、フラニル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、トリアゾリル基、オキサジアゾリル基、オキサトリアゾリル基、ピリジル基、ピリダジル基、ピリミジル基、ピラジル基、トリアジル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、インドール基、インダゾリル基、インドリジニル基、ベンズイソオキサゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、シノリニル基、キナゾリニル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、フェナントロリニル基、プリニル基、およびカルバゾリル基を含む。
【００６１】
「複素環式」とは、少なくとも1個の環ヘテロ原子(例えば、O、S、N)を含む非芳香族環または環系を意味する。他に規定がない限り、複素環式基は1個から9個までの炭素である。複素環式基は、例えば、ジヒドロピロリル基、テトラヒドロピロリル基、ピペラジニル基、ピラニル基、ジヒドロピラニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、ジヒドロチオフェン基、テトラヒドロチオフェン基、およびモルホリニル基を含む。
【００６２】
「ハロゲン化物」または「ハロゲン」または「ハロ」とは、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素を意味する。
【００６３】
アリール基、ヘテロアリール基および複素環式基は、置換されない場合もあるし、C1-5アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキルチオ、トリハロメチル、C1-5アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ニトリル、C1-5アルコキシカルボニル、オキソ、アリールアルキル(アルキル基は1個から5個までの炭素原子を有する)およびヘテロアリールアルキル(アルキル基は1個から5個までの炭素原子を有する)からなる群より選択される1個または複数の置換基により置換される場合もある。
【００６４】
「偏ったリンペプチドライブラリー」とは、ホスホセリン、ホスホトレオニンおよび/またはホスホチロシンの変性したペプチドライブラリーであって、リンペプチドの特定のアミノ酸残基が、特定のライブラリーにおけるすべてのリンペプチドにおいて発現されるように固定されている、リンペプチドライブラリーを意味する。例えば、偏ったリンペプチドライブラリーは、コア配列Ser-pSer-ProまたはSer-pThr-Proを含むように合成されうる。望ましい態様において、ホスホセリン、ホスホトレオニンまたはホスホチロシンに隣接したアミノ酸残基は固定されている。
【００６５】
「アミノ酸断片」とは、そのαカルボキシル、そのα窒素、または両方を通してペプチド鎖に組み入れられているアミノ酸残基を意味する。末端アミノ酸は、アミノ末端またはカルボキシ末端における任意の天然または非天然のアミノ酸残基である。内部アミノ酸は、末端アミノ酸ではない任意の天然または非天然のアミノ酸残基である。
【００６６】
本明細書に用いられる場合、用語「アルキル」および接頭辞「アルク(alk-)」は、直鎖および分枝鎖の両方の基、ならびに環式基、すなわち、シクロアルキル基およびシクロアルケニル基、を含む。環式基は、単環式または多環式であり、好ましくは、3〜8個の環炭素原子(両端を含めて)を有しうる。例示的な環式基は、シクロプロピル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基およびアダマンチル基を含む。
【００６７】
「芳香族残基」とは、共役π電子を有する環系をもつ芳香族基を意味する(例えば、フェニルまたはイミダゾール)。アリール基の環は、好ましくは5〜6原子である。芳香族環は、独占的に炭素原子だけから構成されうる、または炭素原子およびヘテロ原子の混合物から構成されうる。好ましいヘテロ原子は、窒素、酸素、イオウおよびリンを含む。アリール基は、任意には、各環が好ましくは5員または6員を有する、単環式、二環式、または三環式の環でありうる。アリール基は置換される場合もあり、置換されない場合もある。例示的置換基は、アルキル基、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、スルフヒドリル基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ハロ基、フルオロアルキル基、カルボキシル基、カルボキシアルキル基、アミノ基、アミノアルキル基、一置換アミノ基、二置換アミノ基、および第4級アミノ基を含む。
【００６８】
「アリール」とは、炭素環式芳香族環または環系を意味する。他に規定がない限り、アリール基は6個から18個までの炭素である。アリール基の例は、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、フルオレニル基およびインデニル基を含む。
【００６９】
「BRCA1核酸」とは、BRCA1をコードする、もしくはGenBankアクセッション番号：30039658と実質的に同一である、核酸、またはその類似体を意味する。
【００７０】
「BRCA1ポリペプチド」とは、BRCA1 GenBankアクセッション番号：30039659と実質的に同一であり、かつBRCA1生物活性を有する、ポリペプチドまたはその類似体を意味する。
【００７１】
「BRCA1生物活性」とは、DNA損傷応答経路またはリンペプチド結合における機能を意味する。
【００７２】
「BRCT核酸」とは、タンデムBRCTドメインをコードする核酸または核酸類似体を意味する。例えば、PTIP BC033781[21707457]またはNM_007349(PAX転写活性化ドメイン相互作用タンパク質1 mRNA)またはGenBankアクセッション番号：AY273801[30039658]と実質的に同一である核酸。
【００７３】
「タンデムBRCTポリペプチド」とは、少なくとも2つのタンデムBRCTドメインを有するタンパク質を意味する。例えば、AAH33781、NP_031375、GenBankアクセッション番号：30039659と実質的に同一であるタンパク質。
【００７４】
「候補化合物」とは、本明細書に記載されたアッセイ方法の1つを用いることにより、遺伝子もしくはタンパク質発現レベル、または遺伝子もしくはタンパク質の生物活性を変化させる能力についてアッセイされる、任意の核酸分子、ポリペプチドまたは他の小分子を意味する。候補化合物は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成された有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子、およびそれらの成分を含む。
【００７５】
「検出可能に標識された」とは、分子、例えば、PBDと相互作用するリンペプチド、PBD、その同じものをコードする核酸、ペプチド模倣小分子、の存在を印付けし、かつ同定するための任意の手段を意味する。分子を検出可能に標識するための方法は、当技術分野においてよく知られており、限定されるものではないが、放射性核種(例えば、32P、33P、125Iまたは35Sのような同位元素で)および非放射性標識(例えば、化学ルミネセンス標識またはフルオレセイン標識)を含む。
【００７６】
必要とされる場合には、分子は、多様に異なる分子の存在を区別できるマーカーを用いて異なって標識されうる。例えば、PBDドメインと相互作用するリンペプチドはフルオレセインで標識されうり、PBDドメインポリペプチドは、テキサスレッドで標識されうる。リンペプチドの存在は、PBDの存在と同時にモニターされうる。
【００７７】
「不適当な細胞周期制御により特徴付けられる病気または疾患」とは、細胞増殖において異常な増加または減少がある任意の病的状態を意味する。不適当な細胞周期制御により特徴付けられる例示的な病気または疾患は、癌もしくは新生物、炎症性疾患、または肥厚化(例えば、ある種の高血圧症、前立腺肥大)を含む。
【００７８】
「不適当な細胞死により特徴付けられる病気または疾患」とは、アポトーシスにおいて異常な増加がある任意の病的状態を意味する。不適当な細胞死により特徴付けられる例示的な病気または疾患は、神経変性疾患(例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病)、心疾患(例えば、鬱血性心不全および心筋梗塞)、糖尿病性網膜症、および加齢性黄斑変性症を含む。
【００７９】
「断片」とは、参照タンパク質または核酸と実質的に同一であり、かつ本明細書に記載されているようなモルティングアッセイを用いる参照タンパク質または核酸の生物活性の少なくとも50%もしくは75%、より好ましくは80%、90%もしくは95%、または99%までも保持している、タンパク質(50、100、150、175、200、300または400個のアミノ酸)または核酸(50、100、150、175、200、300または400個の核酸)の部分を意味する。
【００８０】
「ヘテロアリール」とは、少なくとも1個の環ヘテロ原子(例えば、O、S、N)を含む芳香族環または環系を意味する。別に規定がない限り、ヘテロアリール基は、1個から9個までの炭素である。ヘテロアリール基は、フラニル基、チエニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、オキサゾリル基、イソオキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、トリアゾリル基、オキサジアゾリル基、オキサトリアゾリル基、ピリジル基、ピリダジル基、ピリミジル基、ピラジル基、トリアジル基、ベンゾフラニル基、イソベンゾフラニル基、ベンゾチエニル基、インドール基、インダゾリル基、インドリジニル基、ベンズイソオキサゾリル基、キノリニル基、イソキノリニル基、シノリニル基、キナゾリニル基、ナフチリジニル基、フタラジニル基、フェナントロリニル基、プリニル基、およびカルバゾリル基を含む。
【００８１】
「複素環式」とは、少なくとも1個の環ヘテロ原子(例えば、O、S、N)を含む非芳香族環または環系を意味する。他に規定がない限り、複素環式基は1個から9個までの炭素である。複素環式基は、例えば、ジヒドロピロリル基、テトラヒドロピロリル基、ピペラジニル基、ピラニル基、ジヒドロピラニル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、ジヒドロチオフェン基、テトラヒドロチオフェン基、およびモルホリニル基を含む。
【００８２】
「ハロゲン化物」または「ハロゲン」または「ハロ」とは、臭素、塩素、ヨウ素またはフッ素を意味する。
【００８３】
アリール基、ヘテロアリール基および複素環式基は、置換されない場合もあるし、C1-5アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、C1-5アルコキシ、C1-5アルキルチオ、トリハロメチル、C1-5アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ニトリル、C1-5アルコキシカルボニル、オキソ、アリールアルキル(アルキル基は1個から5個までの炭素原子を有する)およびヘテロアリールアルキル(アルキル基は1個から5個までの炭素原子を有する)からなる群より選択される1個または複数の置換基により置換される場合もある。
【００８４】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来している生物体の天然に存在するゲノムにおいて、その遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸(例えば、DNA)を意味する。その用語は、それゆえに、例えば、ベクターに；自己複製プラスミドもしくはウイルスに；または、原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み入れられている；または他の配列とは無関係で別個の分子として存在している(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化により産生された、cDNA、またはゲノムもしくはcDNA断片)組換えDNAを含む。さらに、その用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、加えて、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【００８５】
「単離されたポリペプチド」とは、自然にそれに付随する構成要素から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが自然に付随しているタンパク質および天然に存在する有機分子を含まず重量で少なくとも60%である場合、単離されている。好ましくは、本発明のポリペプチドの調製は、重量で少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%、および最も好ましくは少なくとも99%である。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出により、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により；またはタンパク質を化学合成することにより、得ることができる。純度は、任意の適当な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、またはHPLC分析により、測定されうる。
【００８６】
「調節する」とは、減少または増加のような変化を意味する。望ましくは、変化は、参照と比較して、または対照の発現もしくは活性、例えば、天然に存在するポロ様キナーゼの発現もしくは生物活性、と比較して、発現または生物活性における少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは95%の増加または減少のいずれかである。
【００８７】
「新形成」とは、細胞または組織の病的増殖、およびその後の、他の組織もしくは器官への移動または浸潤の特徴がある疾患を意味する。新形成増殖は、典型的には、制御されておらず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しないまたは休止を引き起こす条件下で生じる。新形成は、限定されるものではないが、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、神経膠、食道、フォロピーオ管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、および膣、またはそれらの組織もしくは細胞型からなる群より選択される器官を含む、様々な細胞型、組織または器官に影響を及ぼしうる。新形成は、肉腫、癌腫または形質細胞腫のような癌を含む(例えば、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫ホジキン病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、睾丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上皮細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、之突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、または網膜芽細胞腫)。
【００８８】
「核酸」とは、リボ核酸もしくはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマー、またはその類似体を意味する。この用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間(バックボーン)結合からなるオリゴマー、加えて同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴマーを含む。そのような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、しばしば、例えば、細胞の取り込みの増大およびヌクレアーゼの存在下における安定性の増加のような性質のために天然型を超えて好ましい。
【００８９】
本発明のために構想されるいくつかの好ましい核酸の具体的な例には、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式糖間結合を含みうる。最も好ましいのは、
2007525143.tif 000008
を含むものである。モルホリノバックボーン構造を有するオリゴヌクレオチドもまた好ましい(Summerton, J.E. and Weller, D.D., U.S. Pat. No.: 5,034,506)。他の好ましい態様において、タンパク質-核酸(PNA)バックボーンのような、オリゴヌクレオチドのホスホジエステルバックボーンは、ポリアミドバックボーンで置換されうり、塩基は、ポリアミドバックボーンのアザ窒素原子へ直接的にまたは間接的に結合している(P.E. Nielsen et al. Science 199:254, 1997)。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、2'位に以下のうちの1つを含むアルキルおよびハロゲン置換糖部分を含みうる：OH、SH、SCH3、F、OCN、O(CH2)nNH2もしくはO(CH2)nCH3、nは1から約10までである；C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリルもしくはアラルキル；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-もしくはN-アルキル；O-、S-もしくはN-アルケニル；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；RNA切断基；結合体；受容体基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基；またはオリゴヌクレオチドおよび同様の性質をもつ他の置換体の薬力学的性質を改善するための基。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖模倣体を有しうる。
【００９０】
他の好ましい態様は、少なくとも1つの修飾塩基型を含みうる。そのような修飾塩基のいくつかの特定の例は、2-(アミノ)アデニン、2-(メチルアミノ)アデニン、2-(イミダゾリルアルキル)アデニン、2-(アミノアルキルアミノ)アデニン、または他のヘテロ置換アルキルアデニンを含む。
【００９１】
「Pax2トランス活性化ドメイン相互作用タンパク質(PTIP)核酸」とは、GenBankアクセッション番号：21707457もしくはNM_007349に実質的に同一の、核酸またはその類似体を意味する。
【００９２】
「Pax2トランス活性化ドメイン相互作用タンパク質(PTIP)」とは、GenBankアクセッション番号：AAH33781.1またはNP_031375に実質的に同一であり、かつPTIP生物活性を有する、ポリペプチドまたはその類似体を意味する。
【００９３】
「PTIP生物活性」とは、DNA損傷応答経路またはリンペプチド結合における機能を意味する。
【００９４】
「薬学的に許容される賦形剤」とは、それが投与される対象に対して生理学的に許容され、かつそれと共に投与される化合物の治療的性質を保存する担体を意味する。1つの例示的な薬学的に許容される賦形剤は、生理食塩水である。他の生理学的に許容される賦形剤およびそれらの製剤は、当業者に公知であり、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」 (第20版、ed. A.R. Gennaro AR, 2000, Lippincott Williams & Wilkins)。
【００９５】
「ペプチド模倣体」とは、天然の親ペプチドの生物学的作用を模倣するまたは拮抗することができる化合物を意味する。ペプチド模倣体は、非ペプチド構造要素、非天然ペプチド、合成有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子およびそれらの成分を含みうる。ペプチド模倣体の同定は、結合ペアを取り込み、その結合ペアを置換する化合物を同定するスクリーニング方法により達成されうる。または、ペプチド模倣体は、既知のタンパク質-タンパク質相互作用、例えば、本発明のリンペプチドとPBDの相互作用の分子モデリングにより、コンピューター内に設計されうる。望ましくは、ペプチド模倣体は、同じ結合界面を占有することにより結合ペアの1つのメンバーを置換する。より望ましくは、ペプチド模倣体は、結合界面に対してより高い結合親和性を有する。
【００９６】
「ポロ様キナーゼ(PLK)核酸分子」とは、ポロ様キナーゼポリペプチドをコードする核酸または核酸類似体を意味する。例えば、Plk-1核酸分子は、GenBankアクセッション番号X73458またはNM_005030と実質的に同一である；Plk-2/SNK核酸分子は、NM_006622と実質的に同一である；Plk-3核酸分子は、NM_004073と実質的に同一である；Plx-1核酸配列は、GenBankアクセッション番号U58205と実質的に同一である；およびポロ核酸分子は、GenBankアクセッション番号AY095028またはNM_079455と実質的に同一である。
【００９７】
「ポロ様キナーゼ」とは、セリン/トレオニンキナーゼ活性を有し、かつ2つのポロボックスからなる少なくとも1つのポロボックスドメインを有する、ポロ様キナーゼアミノ酸配列と実質的に同一のポリペプチドを意味する。例示的ポロ様キナーゼポリペプチドは、Plk-1(GenBankアクセッション番号NP_005021、SEQ ID NO:1)；Plk-2(GenBankアクセッション番号NP_006613、SEQ ID NO:4)；およびPlk-3(GenBankアクセッション番号NP_004064、SEQ ID NO:5)を含む。追加のポロ様キナーゼポリペプチドは、GenBankアクセッション番号P53350およびQ07832を含む。
【００９８】
構造的に、ポロまたはポロ様キナーゼは、固有のアミノ末端、続いて、セリン/トレオニンキナーゼドメイン、リンカー領域、ポロボックス(PB1)、リンカー配列、第二ポロボックス(PB 2)、およびカルボキシ末端に12〜20個のアミノ酸のわずかな伸長を有する(図2A参照)。
【００９９】
望ましい態様において、ポロ様キナーゼは、サッカロマイセス  セレビシエ、Cdc5、シゾサッカロマイセス  ポンベ(Schizosaccaromyces pombe)、Plo-1、キイロショウジョウバエ、Polo、アメリカツメガエル)、Plx(Plx-1、-2、-3)、ならびに哺乳動物Plk-1、Prk/Fnk、SnkおよびCnkを含む。ポロボックスは、長さが約70個のアミノ酸であり、図2Bに示されている(太線で示されている)。
【０１００】
「ポロ様キナーゼ生物活性」とは、セリン/トレオニンキナーゼ活性のようなポロ様キナーゼに関連した任意の生物活性を意味する。ポロ様キナーゼの他の生物活性は、中心体、紡錘体装置、および微小管形成中心(MOC)へのキナーゼの局在化を含む。
【０１０１】
「ポリペプチド」とは、翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)にかかわらず、少なくとも2個の天然に存在するアミノ酸または非天然のアミノ酸(例えば、天然に存在しないアミノ酸)の任意の鎖を意味し、本明細書に記載されているような、天然に存在するもしくは非天然のポリペプチドまたはペプチドの、すべてまたは一部を構成する。天然に存在するアミノ酸は、以下のアラニン(AまたはAla)、システイン(CまたはCys)、アスパラギン酸(DまたはAsp)、グルタミン酸(EまたはGlu)、フェニルアラニン(FまたはPhe)、グリシン(GまたはGly)、ヒスチジン(HまたはHis)、イソロイシン(IまたはIle)、リシン(KまたはLys)、ロイシン(LまたはLeu)、メチオニン(MまたはMet)、アスパラギン(NまたはAsn)、オルニチン(OまたはOrn)、プロリン(PまたはPro)、ヒドロキシプロリン(Hyp)、グルタミン(QまたはGln)、アルギニン(RまたはArg)、セリン(SまたはSer)、トレオニン(TまたはThr)、バリン(VまたはVal)、トリプトファン(WまたはTrp)、またはチロシン(YまたはTyr)のいずれか1つである。
【０１０２】
「ペプチド」とは、化学的に結合した、アミノ酸、アミノ酸類似体から構成される任意の化合物を意味する。一般的に、アミノ酸は、アミド結合(CONH)を介して化学的に結合される；しかしながら、アミノ酸は、当技術分野において公知の他の化学結合により結合されうる。例えば、アミノ酸はアミン結合により結合されうる。本明細書に用いられる場合のペプチドは、アミノ酸、アミノ酸類似体のオリゴマー、またはポリペプチドを含む、小さなおよび大きなペプチドを含む。
【０１０３】
ポリペプチドまたはそれらの誘導体は、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合ポリペプチドのように、別のタンパク質またはペプチドに融合または付着している場合がある。他の一般に用いられる融合ポリペプチドは、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質、黄色ブドウ球菌プロテインA、フラグ-タグ、HA-タグ、緑色蛍光タンパク質(例えば、eGFP、eYFP、eCFP、GFP、YFP、CFP)、赤色蛍光タンパク質、ポリヒスチジン(6xHis)、およびセルロース結合タンパク質を含む。
【０１０４】
「リンペプチド」または「ホスホタンパク質」とは、1つまたは複数のリン酸部分が、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、ヒスチジンのアミノ酸残基またはアミノ酸類似体に共有結合している、ペプチドまたはタンパク質を意味する。ペプチドは、存在しているセリン、トレオニン、チロシン、またはヒスチジンアミノ酸残基の数の程度までリン酸化されうる。望ましくは、リンペプチドは、4個の独立したSer/Thr/Tyr残基において、3個の独立したSer/Thr/Tyr残基において、または2個の独立したSer/Thr/Tyr残基においてリン酸化される。最も望ましくは、リンペプチドは、複数個のSer、Thr、またはTyr残基の存在にかかわらず、1個のSer/Thr/Tyr残基においてリン酸化されている。
【０１０５】
典型的には、リンペプチドは、適切な条件下で原核細胞もしくは真核細胞における発現により、またはペプチドが実質的に単離され、適切なキナーゼを用いてリン酸化されている翻訳抽出物において生成される。または、リンペプチドは、標準的な化学的方法により、例えば、N-α-FMOC保護アミノ酸(適切なホスホアミノ酸を含む)を用いて合成されうる。望ましい態様において、非加水分解性リン酸類似体の使用が、非加水分解性リンペプチドを生成するために組み入れられうる(Jenkins et al., J. Am. Chem. Soc., 124:6584-6593, 2002；参照により本明細書に組み入れられる)。タンパク質合成のそのような方法は、一般に用いられ、分子生物学およびタンパク質生化学における標準的方法により実施される(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, 1994, J. Smbrook and D. Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Woodbury NY, 2000)。望ましくは、本発明に用いられるリンペプチドは、一般的に、長さが100アミノ酸残基より長くない、望ましくは50残基未満、より望ましくは25残基未満、20残基未満、15残基未満である。最も望ましくは、リンペプチドは、2、3、4、5、6、7、8、9または10アミノ酸残基長である。
【０１０６】
「実質的に同一の」とは、参照アミノ酸または核酸配列に対して少なくとも75%であるが、好ましくは85%、より好ましくは90%、最も好ましくは95%、または99%までもの同一性を示すポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについて、比較配列の長さは、一般的に、少なくとも35個のアミノ酸、好ましくは少なくとも45個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも55個のアミノ酸、および最も好ましくは70個のアミノ酸である。核酸について、比較配列の長さは、一般的に、少なくとも60個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも90個のヌクレオチド、およびより好ましくは少なくとも120個のヌクレオチドである。
【０１０７】
配列同一性は、典型的には、そこで特定化されたデフォルトパラメーターを有する配列解析ソフトウェアを用いて測定される(例えば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Comupter Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)。このソフトウェアプログラムは、様々な置換、欠失および他の改変に相同性の程度を割り当てることにより類似した配列を整合させる。保存的置換は、典型的には、以下の群内での置換を含む：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１０８】
「非天然アミノ酸」とは、天然のアミノ酸と類似した構造を有する有機化合物を意味し、それは、天然のアミノ酸の構造および反応性を模倣する。本明細書に定義された非天然アミノ酸は、一般的に、非天然アミノ酸が、天然のアミノ酸に対して置換されるかまたはペプチドに取り込まれるかのいずれかの場合、ペプチドの性質(例えば、選択性、安定性、結合親和力)を増加または増強させる。
【０１０９】
そのようなアミノ酸を含む非天然アミノ酸およびペプチドは、米国特許第6,566,330号および6,555,522号に記載されている。
【０１１０】
本発明の他の特徴および利点は、それらの望ましい態様の以下の記載から、および特許請求の範囲から、明らかであると思われる。
【０１１１】
発明の説明
本発明は、キナーゼの標的、例示的キナーゼの標的である、ポロ様キナーゼのポロボックスドメイン、およびポロ様キナーゼによるシグナル伝達を妨げる例示的なペプチド模倣体を同定する方法を特徴とする。
【０１１２】
本発明者らは、バイアスをかけたペプチドライブラリーとポリペプチド発現ライブラリーとを同時にスクリーニングすることにより、実質的にいかなるペプチド結合ドメインの同定も可能にする、プロテオミクスアプローチを開発した。本発明者らは、この方法を用いて、例えばシグナル伝達経路においてキナーゼの下流にある標的を同定した。
【０１１３】
この戦略は、キナーゼのリン酸化モチーフに対してバイアスをかけた部分的縮重リンペプチドの固定化ライブラリーを用いて、そのキナーゼの基質によって標的化される相互作用エフェクタータンパク質を単離する段階を含む。本発明者らは、このアプローチをサイクリン依存性キナーゼについて使用し、ホスホセリン/トレオニン結合ドメインとして有糸分裂キナーゼPlk-1のポロボックスドメイン(PBD)を同定した。ポロ様キナーゼ(Plk)は、細胞周期の進行および有糸分裂の複数の段階において重要な機能を担う。Plkは、ポロボックスドメイン(PBD)と称する、2つのタンデムポロボックスを含むC末端の非触媒領域の存在を特徴とする。
【０１１４】
さらに本発明者らは、ヒト、アフリカツメガエル、および酵母PlkのPBDがすべて、同様のホスホセリン/トレオニン含有モチーフを認識することを見出した。ヒトPlk1 PBD-リンペプチド複合体の1.9Å X線構造から、ポロボックスがβ6α構造であることが示される。これらは会合して新規の12本鎖βサンドイッチドメインを形成し、リンペプチドはこのポロボックス界面の一端に位置する保存された正荷電の溝の内部に結合する。リン酸依存的相互作用を特異的に破壊するように設計した変異により、細胞周期依存的な局在化が消失し、PBD-ホスホリガンド結合が適切な有糸分裂の進行に必要であるという有力な表現型による証拠が提供される。さらに、PBDにリンペプチドが結合することにより、全長Plk1のキナーゼ活性が促進され、これにより、Plk制御のための高次構造転換機構およびPBDの二重機能性が示唆される。総合すると、本発明者らのデータから、Plkのすべてとは言えないにしても多くの細胞機能における、PBD-リンタンパク質相互作用の中心的役割が明らかになる。この知見により、特定の部位でのCdkリン酸化に応答して、いかにしてPlk-1が細胞内のそのような部位に局在するかということについての構造的な説明が提供される。
【０１１５】
真核生物におけるシグナル伝達カスケードの活性化には、細胞内の特定部位におけるタンパク質-タンパク質複合体の定方向の会合が関与する。この過程は、セリン、トレオニン、および/またはチロシン残基上でのタンパク質リン酸化によって調節を受け、このリン酸化が、多くの場合モジュラー結合ドメインの作用を介して、タンパク質-タンパク質相互作用を直接的または間接的に制御する。歴史的に、リン酸結合ドメインの研究は、特定のホスホチロシン含有配列モチーフに結合するSH2およびPTBドメインに重点をおいてきた。最近まで、セリンおよびトレオニン残基上でのタンパク質のリン酸化は、モジュラー結合ドメインとの直接的な相互作用には関与しておらず、むしろ高次構造変化を誘導して機能を制御すると考えられていた。しかし、多くのドメイン（14-3-3タンパク質、FHAドメイン、Fボックスタンパク質のWD40リピート、MH2ドメイン、およびプロリルイソメラーゼPin1のWWドメイン）が、短いホスホセリンまたはホスホトレオニン含有配列に直接結合して、細胞周期の進行を調節し、DNA損傷に対する応答を統合し、アポトーシスを制御することが同定された。
【０１１６】
細胞内タンパク質の大部分は、その寿命期間中のある時点でセリンまたはトレオニン残基がリン酸化される。さらに、既知ホスホセリン/トレオニン結合ドメインは多様な構造群を構成しており、多岐にわたる三次折りたたみが進化を通してリン酸依存的結合機能を獲得したことが実証される。PfamおよびSMARTにより配列相同性に基づいて同定されたモジュラータンパク質ドメインの約3分の1は、機能が不明である。本発明者らの方法により、セリン/トレオニン残基を標的化するさらなるリンペプチド結合モジュールの同定が可能になる。
【０１１７】
2x2バイアスをかけたライブラリーのスクリーニング
新規ホスホセリン/トレオニン結合モジュールを同定し得る一般的なプロテオミクススクリーニングを設計するため、プロテインキナーゼとリンペプチド結合ドメインが同時進化して重複する配列モチーフを認識するようであるという知見を活用した（Yaffe et al., Nat. Biotechnol. 19:348-353, 2001；Obata et al., J. Biol. Chem. 275:36108-36115, 2000）。例えば、好塩基性プロテインキナーゼ、AktはコアモチーフRXRSX[S/T]を含む部位で基質をリン酸化し、14-3-3タンパク質は至適モチーフRSX[pS/pT]XPを有するこれらのリン酸化部位のサブセットに結合する。サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)は[S/T]PXRモチーフにおいて基質をリン酸化し、プロリンイソメラーゼPin1のWWドメインはリン酸化型のこれらの[pS/pT]P部位を認識して、プロリン残基の異性化を媒介する。重要なことには、キナーゼのモチーフとリン酸結合モチーフとの間のこの明らかな重複は、完全ではない。それどころか、限定された重複により、特定のキナーゼの基質と下流の結合モジュールとの間の相互作用の組み合わせが可能となる。
【０１１８】
pSer/Thr結合ドメインを同定するためのモチーフに基づく本発明者らの戦略は、キナーゼのリン酸化モチーフを目指して部分的縮重リンペプチドのライブラリーにバイアスをかける段階、および次の、cDNAライブラリーからインビトロで翻訳されたタンパク質との相互作用に関するスクリーニングにおけるベイトとして、固定化形態のこのライブラリーを使用する段階を含んだ。
【０１１９】
サイクリン依存性キナーゼ(Cdk)によりリン酸化されるモチーフに対してバイアスをかけたリンペプチドのライブラリーを使用し、特異的リンペプチド認識モジュールとして、ヒトポロ様キナーゼ、Plk-1のC末端ポロボックス含有領域を同定した。この非触媒領域は、ポロキナーゼの細胞内局在性ならびに酵母およびヒト細胞における適切な有糸分裂の進行のいずれにも重要であることが、以前に示されている。本発明者らの知見により、これらの極めて重要な有糸分裂機能をPlk-1が行う生化学的機構の記述が初めて提供される。さらに、pSer/Thr結合ドメインの増大するスーパーファミリーの最新メンバーとして、保存されたPlk-1 PBDが同定されたことから、リン酸特異的結合が、真核生物の生物学におけるSer/Thrキナーゼシグナル伝達の一般的機構であることが示唆される。
【０１２０】
細胞周期の制御に関与するpSer/Thr結合ドメインを同定するため、サイクリン依存性キナーゼおよびMAPキナーゼの作用により生成され、さらにそのpSer/Thr結合モチーフを本発明者らが以前に決定した有糸分裂リンタンパク質特異的モノクローナル抗体MPM-2によって認識されるモチーフに類似させるように、バイアスをかけたpThr-Pro配向性ペプチドライブラリーを設計した（Yaffe et al., Science 278:1957-1960, 1997）。ライブラリーは柔軟なリンカーおよびN末端ビオチンタグを付加して構築し、このライブラリーの固定化型を、インビトロ発現クローニングによって産生されるタンパク質のライブラリーに対する相互作用スクリーニングのベイトとして用いることが可能になった（Lustig et. al., Methods Enzymol 283:83-99, 1997；図1A）。
【０１２１】
このライブラリー対ライブラリースクリーニングアプローチは、至適結合モチーフを明らかにするために、縮重ペプチドライブラリーに対して単一の精製ドメインをアッセイする従来のペプチドライブラリースクリーニングとは反対である。本明細書に示すアプローチでは、縮重させるがモチーフにバイアスをかけたペプチドライブラリーを用いて、新規結合ドメインをスクリーニングする。プロテインキナーゼスーパーファミリーのモチーフに対してバイアスをかけたペプチドコレクションを用いることにより、このスクリーニングは、単一のペプチドのみをベイトとして使用する場合に可能となる網よりも大きな網を放つことになる。リン酸非依存的なペプチド結合を制御するため、固定化したpThr残基をThrで置換して同一のライブラリーを作製した（図1A）。
【０１２２】
pThr-Pro配向性ペプチドライブラリーおよびその非リン酸化Thr-Proライブラリー対応物をストレプトアビジンビーズに固定化し、インビトロ翻訳された[35S]標識タンパク質の680の個々のプールに対して同時にスクリーニングした。各プールは、SDS-PAGE/オートラジオグラフィーで検出可能な約30個の放射標識タンパク質/プールを含む（図1B、「プール」レーン）。図1Bに示すように、インビトロ翻訳により産生されたタンパク質は、多くの場合、いずれのライブラリーにも全く結合しなかったか、または非リン酸化ペプチドライブラリー含有ビーズにより強く結合した。しかし、本発明者らは、Thr-Proライブラリーと比較してpThr-Proに優先的に結合する放射標識翻訳産物を含む7つの異なるプールを同定した（図1B中の星印）。
【０１２３】
これらの陽性スコアのヒットを含むプラスミドプールを徐々に細分していき、個々のクローンが単離および配列決定されるまで、リン酸結合に関して再スクリーニングした。7個の陽性クローンのうち3個の回収に成功したが、本明細書ではそのうちの2個について報告する。そのクローンのうちの1個、109-B7は、モノクローナル抗体MPM-2により認識されるpThr-Proモチーフと結合し異性化することが知られているプロリルイソメラーゼPin1をコードすることが判明した。したがって、この単離により、本発明者らのスクリーニングアプローチが実行可能であることが立証された。
【０１２４】
2つ目の陽性スコアのヒットである、クローン407-C6は、有糸分裂キナーゼPlk-1のC末端80%(ポロ様キナーゼ-1、アミノ酸95〜603位)をコードすることが判明した。このクローンは、グリシンリッチループ（アミノ酸60〜66位）および不変のリジン(K82)を含むPlk-1キナーゼドメインの重要な成分を欠いており、リンペプチドとの結合がPlk-1キナーゼ活性とは無関係であることを意味した。この不完全なPlk-1クローンの全長転写産物によるリン酸特異的結合は、Pin1による結合よりも顕著ではなかった（図1B）。このクローンから生じた部分的翻訳産物またはタンパク質分解断片（図1B、矢印）は、リン酸化ペプチドライブラリーに対して顕著な識別を示し、これらの断片が機能的なリンペプチド結合ドメインを含むことが示唆された。
【０１２５】
リンペプチド認識モジュールとしてのポロボックスドメインの同定
ポロキナーゼファミリーの顕著な特徴は、保存されたアミノ末端キナーゼドメインの下流に高度に保存されたC末端領域が存在することである（図2AおよびB）。この領域は、ポロボックスと称される、相同性の強い2つのブロックを含む。リン酸特異的結合に関与するPlk-1の限界断片を同定するため、ヒトPlk-1、アフリカツメガエルPlk-1、ショウジョウバエPolo（図2B）のC末端領域のアラインメントに基づいて、一連の欠失構築物を作製し、これらの欠失断片をリンペプチド特異的結合に関して解析した。図2Aに示すように、キナーゼドメインの直後から始まりタンパク質の最終残基まで及ぶ構築物（残基326〜603位）は、非リン酸化対照と比較して、ホスホトレオニン-プロリンペプチドライブラリーに対する強力かつ特異的な結合を示した。特に、この構築物は、リンペプチドについての識別において親クローン407-C6よりも優れていた。個々のポロボックスのみ（PB1およびPB2と表示）および両ポロボックスを含むがキナーゼドメインとPB1とのリンカー領域を欠失する構築物はいずれも、リンペプチドと結合できなかった（図2A）。さらに、リンカー領域およびPB1を含むがPB2を含まない構築物もまた、リンペプチドと結合できなかった。したがって、リンカー領域および両ポロボックスが共に一体となって単一のリンペプチド結合モジュールとして機能すると考えられ、よって本発明者らはこの領域をポロボックスドメイン(PBD)と称することを提唱する。興味深いことに、両ポロボックスを含むこの領域は、Plk-1の、分裂前期における中心体および動原体への、ならびに有糸分裂の後期における中央体への局在化を制御することが以前に示されている。注目に値すべきは、ポロボックスのみではいずれもこの局在化機能に十分ではなく、PB1内の変異は局在化機能を阻止するのに十分であった。
【０１２６】
Plk-1ポロボックスドメイン共通モチーフ
リンペプチド結合ドメインに関する本発明者らのスクリーニングの最も大事な特徴は、リンペプチドライブラリー固定化ビーズとの相互作用を介して同定されたpSer/Thr結合ドメインに対して、標準的な「順方向」ペプチドライブラリースクリーニングアプローチを用いて、引き続いてその至適結合モチーフを決定することができることである。したがって、Plk-1 PBDのGST融合タンパク質を細菌で発現させ、グルタチオンビーズに固定化し、固定したpThr-Proモチーフ（図3A）およびpSer-Proモチーフ（図3B）に配向した縮重リンペプチドライブラリーと共にインキュベートした。十分に洗浄した後、PBDに結合したペプチドを溶出して配列決定し、すべての縮重位置のそれぞれのアミノ酸の量を出発ライブラリー混合物中に存在するアミノ酸の量と比較して、アミノ酸選択比を導いた。驚いたことに、Plk-1 PBDは、pThr-Proライブラリーを用いた場合、pThr-1位においてSerに対する非常に強力かつ新規な選択を示した。Serに対する非常に強力な選択は、固定したpSer-Proライブラリーを用いてPBDをアッセイした場合にも、その-1位において認められた。リンペプチド結合モジュールの少なくとも1つの他のファミリー、FHAドメインはホスホトレオニン含有モチーフにのみ結合するようであることから、PBDがホスホセリン含有ペプチドライブラリーに結合することは、それ自体注目に値する。pThr-1位またはpSer-1位のSerに対して得られた相対選択値、それぞれ5.9および8.1は、ペプチドライブラリースクリーニングによりその特異性が以前に決定されたドメインについて本発明者らが得た値の中で最も大きいものである。
【０１２７】
Plk-1 PBDがpThr-Proモチーフに結合するドメインのスクリーニングにおいて単離されたため、PBD認識に関してpThr+1位におけるProの相対的重要性を決定することが重要となった。これを達成するため、固定したpThr残基、固定したpSer残基、固定したSer-pThr残基、または固定したSer-pSer残基を含むライブラリーを用いて、ペプチドライブラリーのスクリーニングを行った（表1、図3C、および3D）。pThr/pSer-1位にセリンを固定しなかった場合、pThr/pSer+1位にプロリンの選択はほとんど認められなかった（表1）。しかし、Ser-pThr配向性ライブラリーにおいてこの位置にセリンを含めると、pThr+1におけるプロリンの中程度の選択(1.7)が明らかになった（図3Cおよび表1）。Ser-pSer配向性ライブラリーを用いた場合にも、この位置においてプロリンの選択(1.8)が明らかになった（図3Dおよび表1）。特に、セリンとプロリン間の相乗的選択は逆の場合でも認められ、ペプチドライブラリーに固定したPro残基を含めることによって、セリンのより高い選択がもたらされた（表1）。
【０１２８】
以下の表1に、リンペプチドモチーフ選択スクリーニングから得られた結果をまとめる。
【０１２９】
（表１）Plk-1 ポロボックスドメインによるpTおよびpSペプチドモチーフの選択
2007525143.tif 000009
【０１３０】
Plk-1 ポロボックスドメインのGST融合物を、配列
2007525143.tif 000010
（XはCys以外のすべてのアミノ酸を示す）を含む6つのリンペプチドライブラリーへの結合に関してスクリーニングした。強力な濃縮を示す残基に下線を引いた。X4SpTX4およびX4SpSX4のスクリーニングでは、-4位にPro(1.4)の選択が認められた。ほとんどのスクリーニングにおいて、+2位に脂肪族残基および芳香族残基のわずかな選択が認められた。いずれのスクリーニングにおいても、-5、+3、+4、または+5位では選択はほとんど認められなかった。
【０１３１】
これらの結果から、pThr/pSer+1位のProの存在は、役立ってはいるが、結合に絶対的に必要ではないことが示唆された。このことと一致して、Plk-1 PBDは、固定したpThr-Proジペプチドまたは単独のpThrのみを含むビーズ固定化ペプチドライブラリーに、リン酸特異的な様式で結合した（図3E）。一方、本発明者らのスクリーニングで単離された他のタンパク質である全長pin1は、pThr-Proペプチドライブラリービーズにのみ結合した。
【０１３２】
配向性ペプチドライブラリースクリーニングの結果を検証するため、個々のリンペプチドのPlk-1 PBDへの結合を等温滴定熱量測定により測定した（図4Aおよび4B）。ペプチドライブラリースクリーニングに由来するコア配列Met-Gln-Ser-ホスホThr-Pro-Leuを含む至適リンペプチドリガンド（ポロボックスチド(PoloBoxtide)至適）は、解離定数280 nMでPlk-1 PBDに強固に結合した。さらに、これは1:1タンパク質/ペプチド複合体を形成し、個々のリンペプチドがPBD内の2つのポロボックスのそれぞれと同時に相互作用しないことが示唆された。ホスホトレオニンをトレオニンに置換すると（ポロボックスチド8T）、結合が完全に消失し、相互作用がリン酸基の存在に絶対的に依存することがあらためて明らかになった。至適PBDモチーフ内のホスホトレオニンをホスホセリンに置換してもPlk-1 PBDへのペプチド結合は維持され、親和性は1/7に減少したが、ペプチドライブラリースクリーニングの結果と一致した。対照的に、ホスホトレオニンをホスホチロシンで置換すると結合は完全に消失し、Plk-1 PBDがpThr/pSer特異的な結合ドメインであることが完全に実証された。Plk-1 PBD結合モチーフ内のpThr/pSer-1位においてSerについて観察された非常に強力な選択は、一連の変異ペプチドを用いて確認された。このSerを立体的に小さいアミノ酸AlaもしくはGlyのいずれか、ヒドロキシル含有アミノ酸Thr、または同族アミノ酸Cysで置換した場合、ペプチド結合は検出されなかった。pThr/pSer+1位におけるProの中程度の選択は、この位置のProを別のβターン形成残基、Asnで置換した場合に、Kdが5倍を超えて上昇したことから確認された。配向性ペプチドライブラリースクリーニングのデータ（図3、表1）およびこれらのITC結果に基づき、本発明者らはPlk-1 PBDによって認識されるコア共通モチーフはS-[pT/pS]-(P/X)であると提唱する。
【０１３３】
PBDの生理学的基質
もともと有糸分裂HeLa細胞抽出物に対して作製されたモノクローナル抗体MPM-2（有糸分裂リンタンパク質モノクローナル-2）は、様々な有糸分裂構造に局在化する約50のリンタンパク質上に存在する、保存されたpSer/pThr-Proエピトープを認識する。Plk-1 PBDを同定した最初のスクリーニングでは、MPM-2エピトープに類似するように部分的にバイアスをかけたペプチドライブラリーを使用した。この抗体によって認識される、Cdc25、Wee1、Myt1、トポイソメラーゼIIα、および内部中心体タンパク質(INCENP)を含む多くの重要な有糸分裂制御因子は、S-[pS/pT]-P PBD結合モチーフとの1つまたは複数の正確な一致を含む。したがって、Plk-1 PBDがMPM-2反応性タンパク質に結合するかどうかについて検討した。HeLa細胞をG1/S停止を誘導するためにアフィディコリンで処理するか、またはG2/M停止を誘導するためにノコダゾールで処理し、細胞溶解産物を免疫ブロッティングにより解析した（図5A）。予想通り、MPM-2反応性タンパク質の数は有糸分裂停止細胞において非常に増加した。これらのMPM-2反応性有糸分裂リンタンパク質の多くにPlk-1 PBDが特異的に結合することから、プロリン依存性有糸分裂キナーゼによるこれらのタンパク質のリン酸化によってPBD結合部位が生じたことが示唆された。さらに、Plk-1 PBDは、Pin1に結合するMPM-2エピトープ含有タンパク質のサブセットとは異なる、いくらか小さなサブセットに結合したが（図5A）、MPM-2エピトープモチーフがPlk-1 PBDの至適共通モチーフよりもPin1の至適共通モチーフに極めて類似していることから考えれば、このことは予測通りであった。
【０１３４】
Plk-1 PBDがそのリンペプチド結合ポケットを介してMPM-2エピトープと結合するのかどうかを判定するため、ペプチド競合アッセイ法を行った。Plk-1 PBDをその至適リンペプチドリガンドと共にプレインキュベートすると、MPM-2エピトープへの結合が劇的に阻害された（図5B、「opt」）。一方、非リン酸化類似体（「8T」）またはpT-1位においてSerに対して置換したValを有するペプチド（「7V」）は、影響を及ぼさなかった。
【０１３５】
Plk-1およびそのアフリカツメガエル相同体によってリン酸化され制御されることでも知られている1つの特定のMPM-2抗原は、細胞周期に制御されるタンパク質ホスファターゼCdc25である。したがって、Cdc25Cが、細胞周期に制御される様式およびリン酸特異的様式で、Plk-1 PBDと結合するかどうかについて検討した。有糸分裂の過程で、Cdc25Cは、そのN末端における高度のリン酸化により、ゲル移動度の劇的な減少を起こす。Plk-1 PBDは、Cdc25Cのこの有糸分裂時の上方にシフトした型とのみ相互作用することが認められた（図6A）。Plk-1 PBDをその至適リンペプチドリガンドとプレインキュベートすると、この結合が完全に妨げられるが、8Tまたは7V変異ペプチドとのインキュベーションでは結合は妨げられず、結合がPlk-1のリンペプチド結合ポケットにより媒介されることが示唆された。有糸分裂の過程において、Cdc25Cは、そのN末端内の保存された5つのSer/Thr-Pro部位でリン酸化されることが知られている。これらの部位のうちの1つ、Thr130（アフリカツメガエルCdc25CのThr138に相当する）は、保存されたPlk-1 PBD共通モチーフを含む（図6B）。この部位がCdc25C-Plk-1の相互作用に重要であるかどうかを調べるため、HeLa細胞に、HAタグ標識野生型Cdc25C、またはPBD結合モチーフを破壊することが予測されるCdc25CのThr130AlaもしくはSer129Val点変異体をトランスフェクションした。ノコダゾールで有糸分裂を停止させたところ、Plk-1 PBDは野生型タンパク質のみに強く結合し、点変異体のいずれにも非常に弱くしか結合しておらず、Plk-1 PBDリンペプチド結合ポケットとCdc25C内の有糸分裂時にリン酸化されるPBD共通モチーフとの直接的な相互作用が示された（図6C）。さらに、低いパーセンテージのゲルで解析した場合、これらの点変異体のいずれもが電気泳動移動度シフトの減少を示し（図6D）、Plk-1 PBDとの結合が損なわれた変異体は、インビボでのCdc25Cリン酸化が不完全であることが示唆された。
【０１３６】
Plk-1 PBDの中心体局在化は、そのリンペプチド結合ポケットを介して起こる。
Plk-1は、分裂前期には中心体および動原体へ、有糸分裂の後期には紡錘体マッドストーン(mudstone)に局在化する。中心体への局在化は、PB1領域およびPB2領域の両方を必要とするが、リン酸転移を媒介するLys82をMetに変異させた場合に局在化が維持されるように、キナーゼ活性を必要としないことが示されている。Plk-1 PBDのリンペプチド結合機能が中心体局在化に必須であるかどうかを調べるため、U2OS細胞をノコダゾールで処理して有糸分裂を停止させ、ストレプトリジン-Oで透過処理し、ペプチド競合物の非存在下または存在下においてGST-Plk-1 PBDと共にインキュベートした。抗γ-チューブリン抗体での共染色によって検証されるように、Plk-1 PBDは、分裂前期の後期静止細胞の中心体に局在化することが認められた（図7A）。
【０１３７】
この中心体局在化は、至適Plk-1 PBDリンペプチドの存在下で有意に阻止されたが、同じ濃度の非リン酸化ペプチド類似体を用いてアッセイ法を行った場合には、局在化は影響を受けなかった（図7Aおよび7B）。この知見と、ポロ様キナーゼのC末端がそのインビボでの機能に必須であることを示す公表されたデータから、重要な基質に対するPlk-1の細胞内標的が、PBDリンペプチドポケットと有糸分裂構造内のリン酸化モチーフとの相互作用により媒介されることが強く示唆された。
【０１３８】
Plk-1 PBDとサイクリン依存性キナーゼのプライミング（priming）による有糸分裂進行の制御
本発明者らが新規ホスホセリン/トレオニン結合ドメインとしてPlk-1 PBDを同定したことにより、pSer/Thr結合モジュールの増大するスーパーファミリーにもう1つのメンバーが加えられ、またプロテインキナーゼの下流で機能する新規シグナル伝達ドメインを発見し機能的に特徴づけるための、本発明者らのリン酸モチーフに基づくアフィニティースクリーニングの一般的有用性が実証される。このスクリーニング法を用いて、リン酸化モチーフが既知である任意のキナーゼの基質と相互作用する結合モジュールを同定することができる。ベイト配列の多様なコレクションの信頼できるかつ構成的なリン酸化が必要であるため、酵母ツーハイブリッドおよびファージディスプレイアプローチのようなタンパク質-タンパク質およびタンパク質-ペプチド相互作用を同定する他の方法は、リン酸結合ドメインのスクリーニングには使用することができない。本発明者らの方法のさらなる長所は、ビーズ固定化ペプチドライブラリーを用いたスクリーニングを通して単離された任意のドメインから、そのドメインを次に従来のペプチドライブラリースクリーニングにより解析した場合に至適共通結合モチーフが得られる点である。これにより、データベース検索およびタンパク質配列解析において、pSer/Thr結合ドメインに対するモチーフを、潜在的リン酸化キナーゼのモチーフと組み合わせることが可能となり、共通のシグナル伝達経路におけるリガンドのプロテオーム規模での予測が容易になるはずである。
【０１３９】
ポロ様キナーゼのC末端領域は、有糸分裂および細胞質分裂におけるそのインビボ機能に必須であると長い間認識されているが、その構造的機能は依然として謎のままである。Plk-1およびそのS. セレビシエ(cerevisiae)相同体、Cdc5のこの領域を変異させると、十分に機能的なキナーゼドメインが存在するにもかかわらず、cdc5の温度感受性変異体をレスキューする能力が消失する。単独で発現させた場合、ポロ様キナーゼのC末端ドメインは、全長キナーゼと同様に中心体および紡錘体ミッドゾーン（midzone）に局在化し、またその過剰発現により有糸分裂および細胞質分裂が停止する。
【０１４０】
本発明者らは、Plk-1のC末端ドメインがホスホセリン/トレオニン結合モジュールであり、そのリン酸結合ポケットが既知のポロ基質に結合し、内因性ポロキナーゼが見出される細胞内部位内への局在化を媒介することを示した。基礎状態において、PBDはキナーゼドメインに結合し、そのリン酸転移活性を阻害している。この阻害を抑えることに加えて、キナーゼドメインの最大活性化にも、xPlkk1/SLK等の上流キナーゼによるその活性化ループにおけるリン酸化が必要である。基質のプライミングリン酸化および活性化ループのリン酸化の両方のこの必要性により、細胞周期の別個の段階でPlk-1キナーゼ機能を制御する分子スイッチが提供される。さらに、活性化ループのリン酸化も基質のプライミングリン酸化もインビボにおけるポロキナーゼの適切な活性化に十分ではないため、その必要性によって有糸分裂チェックポイントを調節する潜在的手段が提供される。
【０１４１】
Plk-1のPBD、SrcファミリーキナーゼのSH2ドメイン、およびRad53/Chk2ファミリーのチェックポイントキナーゼのFHAドメイン間の顕著な類似点が数多く明らかである。Plk-1 PBDと同様に、SrcファミリーキナーゼのSH2ドメインもまた、不活性な状態においてキナーゼ活性を阻害しており、Srcキナーゼがその活性化ループのリン酸化によって活性化された場合に、基質の標的化が促進される。Srcキナーゼでは、阻害の機構には、キナーゼドメインの末端のpTyrモチーフに対するSH2ドメインの分子内結合が関与している。PBDによるポロキナーゼファミリーの阻害に内部pSer/pThr部位との同様の相互作用が関与しているのか、または別のPBD表面が関与しているのかは依然として未知である。Chk2キナーゼファミリーのメンバーは、キナーゼモジュールの他に、1つまたは複数のpThr結合FHAドメインを含む。FHAドメインは、DNA損傷に応答した適切なChk2機能、およびChk2の、活性化が起こるより大きな多分子複合体へのリン酸依存的な標的に必須である。
【０１４２】
本発明者らは、Plk-1 PBD結合の至適モチーフがS-[pS/pT]-P/Xであることを見出した。pSer/Thr位置に隣接するアミノ酸に対するPBD選択性の相違は、インビボにおけるポロキナーゼとその基質との相互作用にとって生物学的に重要である可能性がある。+1 Proの主要な役割は、リン酸依存的なPBD結合を、モチーフをリン酸化するサイクリン依存性キナーゼの活性化につなげ、有糸分裂過程におけるポロ様キナーゼの作用を時間的かつ空間的に制御する手段を提供する可能性がある。-1位のSerに対する絶対的な必要条件により、Plk-1が有糸分裂キナーゼ基質の限られたサブセットのみに結合するための強力な識別が可能となる。さらに、本発明者らは、Plk-1 PBDによって認識されるモチーフが、有糸分裂時にリン酸化される多くのタンパク質と反応するモノクローナル抗体MPM-2によって認識されるプロリン依存性配列モチーフと部分的に重複していることを見出し、また有糸分裂細胞抽出物を用いたプルダウン実験において、PBDリン酸結合ポケットとMPM-2反応性タンパク質との直接的な相互作用を実証した。この発見により、MPM-2免疫反応性の蓄積の進行および成熟中心体に認められるポロキナーゼの局在化に関する的確な説明が提供され、Cdkおよび他の有糸分裂キナーゼによるMPM-2エピトープの生成によって、ポロキナーゼの特定の有糸分裂構造へのPBDを介した動員が誘発されることが示唆される。
【０１４３】
CdkおよびポロキナーゼのどちらもホスファターゼCdc25の活性化に関与しており、Cdc2/サイクリンBの脱リン酸化および活性化ならびに有糸分裂の進行をもたらす。しかし、Cdc25の活性化におけるCdkおよびポロキナーゼの相対的役割は、まだ議論の余地が残されている。Plk-1 PBDがCdc25C上の1つまたは複数の重要なCdk部位に結合するという本発明者らの知見から、Cdc2/サイクリンB活性の自己増幅を駆動すると仮定されているCdc25の2段階の活性化の分子レベルでの理論的根拠が示唆される。分裂前期では、低レベルのCdc2/サイクリンB活性はCdc25を十分に活性化するには不十分であるが、PBDと相互作用するためのCdc25のリン酸化のプライミングを可能にする。Plkk1/SLK等の活性化ループキナーゼによる、有糸分裂のその後のポロキナーゼの引き続いて起こる活性化により、Cdc25活性化の初期変動が起こり、これがさらなるCdc2/サイクリンB活性を生じ、ポロ様キナーゼによる活性化のためのさらなるCdc25分子をプライミングし、その結果、さらなるCdc2/サイクリンB活性の産生に関する正のフィードバックループが生じる（図8）。このモデルは、構成的に活性のあるPlk-1の存在下においてさえも、Cdc25の最大の細胞内の標的化および活性化は、サイクリンB1の共発現をなお必要とするという、Toyoshima-Morimoto et al.（EMBO Rep., 3:341-348, 2002）の結果を説明することができる。
【０１４４】
Plk発現のレベルの増加が、様々なヒト腫瘍および腫瘍細胞株で検出され、高レベルの発現は予後不良と関連がある。PBDは、その小さなトリペプチド結合モチーフが小分子ペプチド模倣体の設計に特に適している可能性があることから、抗増殖性化学療法薬を設計するための魅力的な標的であると考えられる。
【０１４５】
ヒトPlkファミリーの全メンバー、アフリカツメガエルPlx1、およびサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevesiae）Cdc5pのPBDの至適リンペプチド結合モチーフを、上記のような配向性ペプチドライブラリースクリーニングにより決定した。本発明者らは最初に、pThr-Pro含有モチーフを認識するドメインの探索においてPlk1 PBDを単離したため、両側に4つの縮重位置が隣接した、固定したpThr-Proコアを含むペプチドライブラリーを用いて初期スクリーニングを行った。表2および3に見られるように、調べた5つのPBDはそれぞれ、異なるが大部分が重複したモチーフを選択した。
【０１４６】
（表２）ヒトポロキナーゼファミリーPBDによるホスホトレオニンペプチドモチーフの選択
2007525143.tif 000011
hPlk1、hPlk2、およびhPlk3のポロボックスドメイン(PBD)のGST融合物を、配列MAXXXXpTPXXXXAKKKおよびMAXXXXSpTXXXXAKKK（XはCys以外のすべてのアミノ酸を示す）を含むリンペプチドライブラリーに対する結合に関してスクリーニングした。強力な濃縮を示す残基に下線を引いている。
【０１４７】
（表３）ポロキナーゼPBDオーソログによるホスホトレオニンペプチドモチーフの選択
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アフリカツメガエルPlx1およびS. セレビシエCdc5pのポロボックスドメイン(PBD)のGST融合物を、配列MAXXXXpTPXXXXAKKKおよびMAXXXXSpTXXXXAKKK（XはCys以外のすべてのアミノ酸を示す）を含むリンペプチドライブラリーに対する結合に関してスクリーニングした。強力な濃縮を示す残基に下線を引いている。
【０１４８】
PBDのすべてが、3.0〜7.5の選択比（すなわち、PBD結合ペプチドのpThr-1位におけるSerのmol% / 出発ライブラリー混合物のpThr-1位におけるSerのmol%）で、pThr-1位においてSerに対する明白な選択を示した。これらのPBDはアミノ酸配列がかなり異なり、またそれぞれのヒトPlkは多様な細胞機能を行うにもかかわらず、モチーフの類似性が見いだされる。PBDは集団として、pThr-2位においてThr、His、Gln、およびMetの中程度の選択を一貫して示した。すべてのPBD間でpThr-3、pThr-4、およびpThr+2位での脂肪族および芳香族残基の一般的選択が存在したが、Cdc5pはpThr-3位におけるAlaの非常に強力かつ特有の選択を示し、一方Plk2はこの位置においてGlnの強力かつ特有の選択を示した。Cdc5p以外のすべてのPBDはまた、pThr-4位でProを、およびpThr+2位でLysを選択した。
【０１４９】
これらのデータに基づき、固定したSer-pThrコアを含む二次ペプチドライブラリーを用いて、モチーフをさらに精密化し、pThr+1位のProの相対的重要性について検討した。これらのスクリーニングにより、すべてのPBDについて1.4〜1.9の選択比でのpThr+1位におけるProの中程度の選択が示された（表2および3）。それぞれのPBDについての他のモチーフ位置における選択は、pThr-Proライブラリーを用いて得られた選択と一致したが、ここでpThr-5位でのProおよびPheの有意でありかつ保存された選択を認めることができた。（pT-5はSer-pThrライブラリーでは縮重であるが、pThr-Pro配向性ライブラリーでは固定したAla残基であった）。したがって、従来のヒトPlk相同体を含む調べたすべてのPlkのPBDは、共通配列：
2007525143.tif 000013
（Фは疎水性アミノ酸を示す）
によって最も一般的に表され得る類似のモチーフを選択すると考えられる。
【０１５０】
すべてのPBDでのpThr-1位のSerに認められる顕著な選択を、ヒトPlk1 PBDに関して詳細に調べたが、これはKd 280 nMでその至適モチーフ、
2007525143.tif 000014
に結合する（図9A）。
【０１５１】
したがって、pThr-1位を様々な小さな側鎖のアミノ酸で置換し、等温滴定熱量測定(ITC)によりPlk1 PBDに対するペプチド結合を測定した（図9A）。驚いたことに、SerをGly、Ala、ヒドロキシル含有アミノ酸Thr、またはSer同配体Cysで置換すると、Plk1 PBD-リンペプチド結合は完全に消失した。本発明者らは以前に、pThr-1位のSerをこの位置で最も低い選択を示すアミノ酸であるValで置換することが、ペプチド結合を消失させるのに十分であることを観察した（Elia et al., Science 299:1228-1231, 2003）。それでもやはり、様々な化学的に類似したアミノ酸によるSerの置換によっても、PBDと溶液中の遊離リンペプチドとの相互作用が完全に阻止されることは予想外であった。
【０１５２】
この解析を進めるため、至適Plk1 PBD結合モチーフ内のホスホトレオニンに隣接する8つの位置のそれぞれのアミノ酸を、固定化リンペプチドの固相アレイを用いて、残りの19個の天然アミノ酸で置換した（図9B）。これにより、pThr-1位ではSerのみが許容されることが決定的に実証された（図9B）。他の位置における選択性は、配向性ペプチドライブラリースクリーニングの結果とおおむね一致した。しかし、固定化リンペプチドアッセイ法では、pThr+1位において、CysおよびGlyが少なくともProと同程度に強く選択された。架橋および酸化の影響を最小限に抑えるため、Cysは配向性ペプチドライブラリーの構築時には通常除外される。液相ペプチドライブラリーアッセイ法よりも固相ペプチドの状況においてGlyの相対的選択が高いのは、ひとつには、ペプチドの両端が遊離している場合、Pro残基と比較して、順序づけたGly残基に関連するエントロピーペナルティーが高いためかもしれない。または、これらのわずかな相違は、ペプチドフィルターアッセイ法が単一のアミノ酸配列の状況において個々の点変異を試験するのに対して、配向性ペプチドライブラリースクリーニングは配列モチーフの全集合を同時に試料抽出するという事実を反映しているのかもしれない。いずれにせよ、PBD結合に必要なリン酸化事象はCdkおよびMAPキナーゼ等のPro依存性キナーゼによって主に触媒される可能性が高いため、おそらくProがpThr+1位の最も「生理学的な」アミノ酸を示す。
【０１５３】
Plk1 PBDの全体的構造
Plk1およびCdc5pのC末端領域内の最小PBDの限界を、限定タンパク質分解および質量分析により決定した。V8プロテアーゼ（図10A）およびトリプシン（データは示さず）を用いた研究から、キナーゼドメインと1つ目のポロボックスとの間のリンカーの最後の45残基のみがPBDの一部として構築されることが示された（図10A）。Cdc5pのC末端領域を用いても同様の結果が得られた（データは示さず）。本発明者らは、このさらなる領域の先頭をポロキャップ(Polo-cap)(Pc)と称する。Plk1およびCdc5pに関して、本発明者らは、全C末端領域またはタンパク質分解により確定したPBDを含む断片のリンペプチド結合親和性に顕著な相違がないことを見出し、これにより、キナーゼとPcの間の最初の40アミノ酸はペプチド結合において主要な役割を果たしていないことが示された。ポロボックスのみを含みPcを欠失する、Plk1およびCdc5pのより短い断片は大腸菌において不溶性であり、この領域における2つのタンパク質間に十分な配列相同性がないにもかかわらず、両タンパク質におけるPcの明確な構造的役割が示された。
【０１５４】
タンパク質分解により確定したPlk1 PBD（残基367〜603位）の組換え型の、その「至適」リンペプチドとの複合体におけるX線構造を、Se-Met含有タンパク質を用いた多波長異常分散法(MAD)により解析し、ネイティブデータを精密化して1.9Åの解像度まで拡張した（表4）。
【０１５５】
（表４）結晶解析
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1Nobs/Nunique
2Rsys=Sj|<I>-Jj|S<I>  ここで、Ljはj番目の反射強度であり、<I>は平均強度である。
3バイフット（Bijvoet）分離で計算
4Rcryst=Shkl|Fobs-Fcalc|/Shkl Fobs
5Rfree−精密化データを除外したデータの5％を計算するがRcystについて
【０１５６】
構造（図10B）から、PBDが、配列プロファイルによって同定される2つのポロボックス領域（PB1および2）を含む2つのβ6αモチーフを含むことが示される。任意の1つのPlk内の2つのポロボックスのアミノ酸配列が約20〜25%の配列同一性を示すのみであるという事実にもかかわらず、2つのモチーフの構造は非常に類似している（77個のCα原子の二乗平均平方根(rms)偏差は1.6Å；図10B）。2つのポロボックスは共に小さくたたまれ、3つのαヘリックス領域が隣接した12本鎖のβサンドイッチを形成する（図10C）。ポロボックス構造に類似しているモチーフはタンパク質データバンクに示されているが、全ドメイン構造により新たなタンパク質の折りたたみが示される。
【０１５７】
Pcは、αヘリックス領域αA、ループ、および約10残基のリンカー領域(L1)を介してポロボックス1のN末端β鎖(β1)につながっている短い310ヘリックスからなる。Pcは、ポロボックス2の周りを、これをポロボックス1に繋ぎ止めるフックのように覆っている。αAは、逆平行コイルドコイルの配置で、PB2に由来するαCに逆らって小さくたたまれ、310ヘリックスはより短いαC'に逆らって小さくたたまれている。2つのポロボックスは、部分的に保存された、約30残基の第2のリンカー配列(L2)によりつながっている。L1およびL2は、2つのポロボックスβシートの間を逆平行方向に走っている。したがって、PB1に由来するβ1/β2およびPB2に由来するβ6/β7に主に位置する高度に保存された非極性残基の直接的相互作用、および間に介入しているリンカー領域との相互作用の配置から、疎水性コアが形成される。
【０１５８】
新規なPBD-リンペプチド相互作用は特異性に重要である
リンペプチドは、大部分が伸張した高次構造内で、2つのポロボックス間に形成される浅い溝の一端に位置する正電荷の領域に結合する（図10）。全体として、約1000Å2の溶媒露出表面は、本発明者らの電子密度図で明らかな7個のリンペプチド残基の結合により埋もれている。結合は、PBDのペプチド結合表面上に独占的に位置する、広範囲に及ぶ高度に保存された表面の一部が関与する（図11A、11B）。この保存された表面は、PBD全体内の正の静電ポテンシャルの顕著な領域とのみ一致する（図11C）。全体として、リンペプチドは、PB1に由来するβ1、L2のN末端、ならびにPB2に由来するβ8および9と主に相互作用する。ペプチドの側鎖および主鎖原子と形成される水素結合相互作用は、2つのポロボックス内の残基間である程度互い違いになっており、PB1/PB2界面の縁部においてジッパー様構造を形成している（図11D）。
【０１５９】
リン酸部分に対するPBDの結合には、タンパク質側鎖との直接的接触、およびその多くが完全に水素結合している水分子の詳細に明らかにされた格子を介した広範囲に及ぶ間接的相互作用との組み合わせが関与する（図11E）。全体として、リン酸基は8つの水素結合相互作用に関与し、この相互作用は、結合に対するペプチドリン酸化への決定的な依存が説明されている（Elia et al., Science 299:1228-1231, 2003）。リン酸基と直接接触する唯一の残基は、PB2に由来するHis-538およびLys-540であり、その側鎖は、O1、O3、およびOγリン酸酸素をキレートするハサミ(pincer)様の配置を形成する。
【０１６０】
pThr-1位におけるセリンに対する非常に高い選択性の構造的基盤は、pSer/pThr結合タンパク質の2つの主要なクラスである14-3-3タンパク質およびFHAドメインのリンペプチド複合体と比較した場合の、結合したリンペプチドの配向の大きな相違に起因する（Durocher et al., Mol. Cell. 6:1169-82, 2000；Yaffe et al., Cell 91:961-971, 1997）。これらの構造では、pThr-1側鎖は溶媒に露出されており、この位置において選択はほとんど認められない。一方、Plk1複合体のペプチドの配向は、Ser-1側鎖がPlk1表面に向くように逆さにされている（図11B）。この配向において、それは、Trp-414主鎖原子との2つの水素結合、および水分子を介したLeu-491主鎖カルボニルとの1つの水素結合に関与する（図11C）。注目に値すべきは、Ser-1 Cβ原子は、Trp-414インドール側鎖のCδ1と有利なファンデルワールス相互作用を形成する。これによって、この位置におけるSerのThrによる保存的置換によってさえもペプチド結合が消失する理由（図9A）が説明され、これはおそらくはトレオニンγ-メチル置換基のTrp-414との立体的衝突に起因する。
【０１６１】
本発明者らの結晶構造（図11D）により明らかとなったリガンド結合におけるTrp-414の重要な役割から、W414F変異により、Plk1の中心体への局在化およびCdc5-1 ts変異体を相補する能力が消失するという知見が説明される（Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9301-9306, 1998）。これらの影響はいずれも、PBDとの重要なSer-1相互作用の破壊に少なくともある程度は起因し得る可能性がある。これと一致して、W414F置換を含む変異体PBDは、ITCによって測定される親和性>100μMを有して、リンペプチドとの結合が大きく損なわれる。変異体PBDは、far UV CDスペクトルから判断して（データは示さず）野生型タンパク質と類似した二次構造内容を示すため、結合の消失はポロボックス折りたたみの全体の構造的撹乱に起因するとは考えにくい。さらに、ポロボックス1のTrp-414は、野生型S. ポンベ(pombe)Plo1 PBDおよびS. セレビシエCdc5p PBDのPB2ではチロシンに置換されており、類似の置換は関連構造内容において天然に許容されることが示される。
【０１６２】
配向性ライブラリー選択と一致して、タンパク質-ペプチド界面はPBDとpThrおよびSer-1との相互作用によって占められている（図11C、11D）。本発明者らはpThr+1位におけるProの中程度の選択を認めたが、これはProが結合界面に大きく寄与していない構造によるらしく、この位置での複数の置換がペプチドの結合に許容される（図9B）。PBD構造において、トランス-プロリンはSer-pThrの後にねじれを導入し、ペプチド骨格を結合表面の方向に向きを変えさせ、pThr+2主鎖アミノ基のPBDとの接触を可能にする。したがって、+1 Proは、この有利な骨格接触を生じるためのエントロピーペナルティーを減少させることにより、結合親和性を増大させる可能性がある。これは、Pro+1側鎖が疎水ポケットに挿入し、埋もれたトリプトファンと共平面の相互作用を生じるPin1 WWドメインおよびCdc4 WD40ドメインのpSer-Proペプチド複合体の構造とは対照的である（Leung et al., Nat. Struct. Biol. 9:719-724, 2002；Verdecia et al., Nat Struct Biol 7: 639-643, 2000）。
【０１６３】
Plk1およびSakのポロボックスは構造的に異なる - 1つのモチーフ、2つの折りたたみ
ヒトPlkファミリーには標準的なキナーゼ(Plk 1〜3)およびSakが含まれ、Sakは高度に相同的なSer/Thrキナーゼドメインを含むが、単一の異なるポロボックスしか含まない。最近の構造データから、マウスSakから単離されたポロボックスが分子間二量体を形成することが示され、これにより、Plk1関連Plk内のタンデムポロボックスが、関連した分子内「二量体」構造を形成するという示唆がもたらされた（Leung et al., Nat. Struct. Biol. 9:719-724, 2002）。本発明者らの構造から、この概念がおおむね正しいことが示される。いずれの場合も、ポロボックス反復は、6本鎖βシートおよびαヘリックスを含む。この構造単位は、Plk1およびSakにおいてそれぞれ分子内または分子間相互作用を介して第2のポロ反復と会合し、βサンドイッチドメイン構造を形成する。しかし、より厳密な試験により、2つの構造の機構間の顕著な相違が明らかになった（図12Aおよび12B）。Plk1ポロボックスのβ6αトポロジーが、Sakでは環状に順序が変わったβ5αβトポロジーに置き換えられる。したがって、Plk1β1はSakポロボックス配列内に等価物を有さず、代わりにSakβ6と構造的に重複する。さらに、Sakβシートは、単量体間のβ4および5の「領域交換」により完成される。最も顕著なことには、2つのポロボックスの会合は完全に異なり、Sakホモ二量体においてポロ反復間の界面を形成する残基は、大部分がPlk1βサンドイッチの外部に位置し、それらの残基はそこで隣接するαヘリックス領域と共に部分的に界面を形成する。
【０１６４】
His-Lysハサミ構造の変異により、インビトロにおけるリンペプチド結合、インビボにおけるCdc25結合、およびPlk-1 PBDの中心体局在化が消失する
X線結晶構造で同定された重要なホスホトレオニン相互作用残基が、実際にインビトロおよびインビボにおいてリン酸依存的相互作用の媒介に関与することを検証するため、pThrハサミモチーフのHis-538およびLys-540をそれぞれAlaおよびMet、またはGluおよびMetに変異させた。これらの変異は、ビーズ固定化pThr-Pro配向性ライブラリーに対するインビトロ翻訳されたPlk1 PBDの結合の減少（図13A）、およびITC（図13B）から判断して、溶液中でのリンペプチド結合を大幅に阻止した。
【０１６５】
有糸分裂に入る過程において、Cdc2/サイクリンBおよびPlk1は協力し、Cdc2/サイクリンB活性化の増幅ループの一部としての、N末端の大規模なリン酸化を介して、二重特異性ホスファターゼCdc25を活性化する（Abrieu et al., J. Cell. Sci. 111:1751-1757, 1998；Hoffmann et al., EMBO J. 12:53-63, 1993；Izumi et al., Mol. Biol. Cell 4:1337-1350, 1993；Izumi et al., Mol. Biol. Cell 6:215-226, 1995；Kumagai et al., Cell 70:139-151, 1992；Kumagai et al., Science 273:1377-1380, 1996；Qian et al., Mol. Cell. Biol. 19:8625-8632, 1999；Qian et al., Mol. Biol. Cell 12:1791-1799, 2001）。有糸分裂時にリン酸化されたCdc25Cは、SDS-PAGE上で大きな移動度シフトを示す（Kumagai et al., Cell 70:139-151, 1992）。Cdc25Cは、インビトロにおいてCdc2/サイクリンBにより少なくとも5箇所のSer/Thr-Pro部位でリン酸化される（Izumi et al., Mol. Biol. Cell 4:1337-1350, 1993；Strausfeld et al., J. Biol. Chem. 269:5989-6000, 1994）。これらの部位のうちの1つ、Thr-130は、至適に近いPBD結合モチーフ、Leu-Leu-Cys-Ser-pThr-Pro-Asn内に存在する。本発明者らは以前に、単離したPBDのGST融合物は、有糸分裂時に停止させたHeLa細胞溶解物に由来する野生型Cdc25Cを損ない得るものの、T130AまたはS129V Cdc25C変異体は損ない得ないことを観察した。これらのデータから、Thr-130のCdkによるプライミングによりPlk1 PBDの結合部位が生じ、次のPlk1媒介性リン酸化によるCdc25Cの完全な活性化が促進されることが強く示唆された（Elia et al., Science 299:1228-1231, 2003）。図13Cに示すように、His-Xpressタグ標識野生型Plk1 PBDをインビボで発現させると、ノコダゾールで停止させたHeLa細胞において有糸分裂時リン酸化型の内因性Cdc25Cとの強い相互作用が起こった。しかし、His-538/Lys-540ハサミ構造変異体を発現させるとCdc25Cとの結合は消失し、これは、2つ目のポロボックスを欠失するPBD構築物をトランスフェクションした細胞においても観察された。
【０１６６】
PBDが全長Plk1の状況においても同様に基質標的化の役割を果たすかどうかを調べるため、全長Plk1のmycタグ標識野生型または変異型構築物をHeLa細胞にトランスフェクションし、免疫沈降法およびウエスタンブロッティング法により、ノコダゾールで停止させた細胞においてPlk1と内因性Cdc25Cとの相互作用を試験した（図13D）。停止させた細胞において、有糸分裂時に上方に移動した形態の内因性Cdc25Cと全長Plk1との間に強いインビボ相互作用が認められたが、幾分か驚いたことには、キナーゼが不活化されたPlk1変異体(K82R)、またはキナーゼ結合溝をより露出するためのTループにおけるT210D変異を取り込んだ二重変異体を基質トラップとして用いた場合にもこれは増加しなかった。逆に、全長Plk1内のHis-538/Lys-540リン酸ハサミ機構を変異させると、Plk1とCdc25Cとのインビボ相互作用は完全に阻止され、G2/M停止細胞における全長Plk1と全長Cdc25Cとの相互作用が、PBDに付随したキナーゼドメインではなく、主にPBDにより媒介されることが実証された。この結果は、全長Plk1分子との関連で、基質の標的化におけるPBDリンペプチド結合の必要性を直接実証することから、重要である。
【０１６７】
最終的に本発明者らは、His-538/Lys-540ハサミ構造の変異により、透過性有糸分裂前期停止細胞においてPlk1 PBDの中心体への標的化が行われなくなることを観察した（図6）。この知見から、インビボで観察されるPlk1の中心体への局在化が（Jang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1984-1989, 2002；Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:901-9306, 1998）、PBDとリン酸化された中心体成分との直接的相互作用に起因することが示唆される。要約すると、図13および図14の結果から、インビトロにおいてリンペプチド結合の媒介に関与する、構造的に確定したHis-538/Lys-540ハサミ機構は、インビボにおける基質標的においても同様の重要な役割を果たすことが結論として示される。
【０１６８】
単離されたPlk1 PBDによる有糸分裂進行の阻止には、リン酸依存的基質認識が必要である
プライミングされた基質にPlk1を標的化するためにはPBDが必要であるため、その過剰発現はドミナントネガティブ様式で作用して、内因性Plk1の正確な局在化を阻害し、ひいてはインビボにおけるPlk1機能を阻止することが予測される。実際に、Plk1のC末端の過剰発現は、有糸分裂の停止を起こし、無作為な方向に向いた無秩序な紡錘体を誘導することが示されている（Jang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1987-1989；Seong et al., J. Biol. Chem. 277:32282-32293, 2002）。PBD-リンペプチド複合体のX線構造により、この表現型におけるリン酸特異的結合の役割を詳細に調べるすることができるようになる。以前の研究と一致して、本発明者らは、HeLa細胞におけるPlk1 PBDのGFP融合物の過剰発現により、G2/Mにある細胞の集団が劇的に増加することを見出した（GFP発現細胞では17%であるのに対し、PBD-GFP発現細胞では60%）（図15）。重要なことには、有糸分裂細胞のこの蓄積は、His-538およびLys-540の変異により消失した（G2/Mは23%）。さらに、野生型PBD-GFP構築物の発現により、HeLa細胞においてDNA含量>4Nを有する細胞のピークとして明白な異数体が誘導され、LaneおよびNiggにより報告された抗Plk1抗体マイクロインジェクション研究と一致した（Lane et al., J. Cell. Biol. 135:1701-1713, 1996）。しかし、この影響はHis/Lysハサミ構造変異体を用いた場合に、完全に消失した。ドミナントネガティブ効果から、全長Plk1内のPBDによるリンペプチド結合が、通常、適切な有糸分裂の進行および同等の染色体分離を確実にするための機能的な二極性紡錘体の確立において役割を果たすことが強く示唆される。
【０１６９】
PBDに対するリンペプチド結合がPlk1キナーゼ活性を促進する
LeeおよびErikson（Lee et al. Mol. Cell. Biol. 17:3408-3417, 1999）ならびにMundt et al.（Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:377-385, 1997）は、Plk1のC末端を欠失させるとキナーゼ活性が約3倍増加することを観察し、Jang et al（Jang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1984-1989, 2002）は、単離されたPlk1 C末端が単離されたキナーゼと相互作用し、内因性基質カゼインに対するキナーゼの活性を阻害することを見出した。本発明者らは、相補的な結果、すなわちキナーゼドメインがPBDによるリンペプチド結合を阻害するらしいという結果を観察した。単離されたPlk1 PBDはpSer/pThr含有ペプチドに強くかつ特異的に結合するが（図13A）、全長Plk1内のPBDによるリンペプチド結合は少なくとも10倍減少し、リン酸依存性はかなり低い（図16A、wtレーン）。全長Plk1のリン酸特異的結合成分は、明らかにPBDにより媒介される（図16A、wt pTPおよびTPレーンをH538A/K540M pTPおよびTPレーンと比較）。これにより、全長Plk1内のPlk1 PBDとキナーゼドメインとの間に、相互に抑制的な相互作用が存在することが示唆される。
【０１７０】
本発明者らは、PBDのリンペプチドに対する結合が、この分子内相互作用を軽減し、キナーゼドメインの内因性基質に対する活性を促進するのに十分であるのかどうか疑問に思った。そこで、バキュロウイルスで産生させたPlk1を至適PBDリンペプチドまたはその非リン酸化対応物と共にインキュベートし、カゼインに対するキナーゼ活性をSDS-PAGE/オートラジオグラフィーにより測定した。図16Bに示すように、至適PBDリンペプチドの添加によりPlk1キナーゼ活性は2.6倍増加したのに対し、非リン酸化ペプチドの添加は影響を及ぼさなかった。この結果は、全長Srcファミリーキナーゼをその至適SH2結合ホスホチロシンペプチドとインキュベートして、キナーゼドメインのSH2による阻害を軽減させた場合に認められた、SrcおよびHckキナーゼ活性の約2.5倍の促進と非常に都合よく匹敵する（Liu et al., Oncogene 8:1119-1126, 1993；Moarefi et al., Nature 385:650-653, 1997）。したがって、Plk1に関する本発明者らの結果により、プライミングされたリン酸化部位に対するPBDの結合は、キナーゼドメインを基質に対して標的化する働きをするばかりでなく、同時に抑制的な分子内相互作用を軽減することにより基質のリン酸化に関してキナーゼドメインを活性化することが示唆される（図16C）。
【０１７１】
本研究において、本発明者らは、ヒトPlkファミリーの標準的なすべてのメンバー、アフリカツメガエルPlx1、およびS. セレビシエCdc5pのPBDによって認識される保存されたリンペプチド結合モチーフを明らかにした。至適ホスホトレオニンペプチドに結合したポロボックスドメインの高解像度X線構造により、モチーフ選択の分子根拠が提供され、新たなタンパク質折りたたみが明確になり、秩序だった溶媒分子および保存されたHis/Lysハサミモチーフの関与を含むリン酸依存的リガンド結合の特有の機構が説明される。本発明者らは、PBDによるキナーゼの細胞内抑制が、PBDとリン酸化前の結合標的との相互作用により軽減されるという、Plk活性化のpSer/pThr依存的機構を同定した。
【０１７２】
ポロボックスドメインの構造定義：一般的リンタンパク質認識モジュール
以前の報告では、ポロ様キナーゼのC末端領域内に1〜3個のポロボックスが存在することが記載されている（Glover et al., Genes Dev. 12:3777-3787, 1998；Glover et al., J. Cell. Biol. 135:1681-1684, 1996；Nigg, Curr. Opin. Cell. Biol. 10:776-783, 1998；Seong et al., J. Biol. Chem. 277:32282-32293, 2002）。本発明者らの構造により、PBDが2つの保存されたポロボックス配列に相当する2つの構造的に相同的な領域からなることが決定的に示される。リンペプチド結合は2つのポロボックスの界面で起こり、PBD/リガンド結合の1:1化学量論の知見（図5B）、およびインビボでのPlk1の効率的な細胞内局在化に対する両ポロボックスの必要性が理論的に解釈される（Seong et al., J. Biol. Chem. 277:32282-32293, 2002）。今、14-3-3タンパク質、WW、FHA、WD40、およびSmad MH2ドメインを含むホスホセリン/ホスホトレオニン結合ドメインの拡大するファミリーにポロボックスドメイン(PBD)が加えられる（Yaffe et al., Curr Opin Cell Biol 13:131-138, 2001；Yaffe et al., Structure 9:R33-38,2001）。他のより偏在的なリン酸依存的結合モジュールとは対照的に、PBDはポロ様キナーゼにのみ存在し、Plkを特定の細胞内小器官および有糸分裂構造に局在化させ（Jang et al., 2002；Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9301-9306, 1998；Lee et al., Mol Cell Biol 17, 3408-3417, 1999）、事前のリン酸化によりプライミングされた基質にキナーゼを標的化する。
【０１７３】
PBDファミリーによる共通のリンペプチドモチーフ選択
高等真核生物において、異なるPlkファミリーメンバーは細胞周期の異なる時点で働く（Donaldson et al., 2001；Glover et al., Genes Dev 12:3777-3787, 1998；Glover et al., J Cell Biol 135, 1681-1684, 1996；Ma et al., Mol Cancer Res 1, 376-384, 2003；Nigg, Curr Opin Cell Biol 10:776-783, 1998）、またはDNA損傷に応答して拮抗的な役割を果たす（Bahassi et al., Oncogene 21, 6633-6640, 2002；Smits et al., Nat Cell Biol 2:672-676, 2000；Xie et al., Cell Cycle 1:424-429, 2002）。これらの3つのタンパク質に関する、Ser-pSer/pThr-Pro/Xコアを有するモチーフの選択における類似性を考えると、単一生物内でPlkを区別する潜在的機構により基質特異性が達成され、これにはそのそれぞれのキナーゼドメインによる異なる基質の選択性、上流キナーゼによるPlkの時間的に限定された活性化、またはPlk1およびPlk2発現の十分に立証された細胞周期制御が含まれ得る（Golsteyn et al., Cell Sci 107:1509-1517, 1994；Lee et al., 1995；Ma et al., Mol Cancer Res 1:376-384, 2003）。Plk1がDNA損傷により阻害されるのに対して（Smits et al., Nat Cel Biol 2:672-676, 2000）、Plk3は活性化されるように見えることから（Xie et al., Cell Cycle 1:424-429, 2002）、そのような特異性が重要であるに相違ない1つの経路はDNA損傷応答である。
【０１７４】
セリンに対するpThr-1選択性に加えて、本発明者らが試験したPBDはすべてpThr+1位におけるプロリンの中程度の選択性を示し、Plk1標的のための基質のプライミングにおけるCDKおよび他のプロリン依存性キナーゼの中心的役割が重要視される。いくつかの系統の証拠から、このモデルが支持される。例えば、Cdc25のPlk1に誘導される最大活性化およびCdc25の最大の核移行は、サイクリンB共発現を必要とすることが示されている（Toyoshima-Morimoto et al., EMBO Rep. 3:341-348, 2002）。さらに、精製APCの活性の完全な再構成には、事前のCdc2およびPlk1の両方によるAPCの相乗的リン酸化が必要である（Golan et al., J. Biol. Chem. 277:15552-15557, 2002）。興味深いことに、Plk1が結合したリンペプチド内のトランスプロリンの骨格ねじれ角は、三元サイクリンA3/CDK2/ペプチド複合体構造における同等のPro残基の骨格のねじれ角と非常に類似している（Brown et al., Nat. Cell. Biol. 1:438-443, 1999）。したがって、PBD複合体内のペプチドの高次構造は、Plk相互作用の構造的必要条件のみならず、最初のプライミングリン酸化の構造的必要条件も反映する。
【０１７５】
それにもかかわらず、プロリン以外の残基が明らかに許容されることから、他の有糸分裂キナーゼもまたプライミング剤として働き得ることが示される。この関連で、S. ポンベにおいて、NIMA関連キナーゼFin1がスピンドル極体に対するPlo1親和性を増大させることが最近示された（Grallert et al., EMBO J. 21:3096-3107, 2002）。したがって、Plkファミリーメンバーの基質、および基質のプライミングに関与するキナーゼの同定が重要である。
【０１７６】
リンペプチド結合の構造的基盤
PBDは、他のタンパク質-リンペプチド複合体の構造でこれまでに観察された方法とは異なる方法で、リン酸化されたエピトープに結合する（Yaffe et al., Structure 9:R33-38, 2001）。これらの相違には、His/Lysハサミ構造、架橋する水分子の重要な寄与、およびタンパク質結合表面に向いたpThr-1残基の特異な配置が含まれる。立体特異的な溶媒媒介性結合は他の系でも記載されているが、リン酸基との「溶媒架橋」相互作用は、今日までに報告されているタンパク質-リンペプチド複合体のいずれの構造においても認められていない。むしろ、リン酸部分は常に、最も多くの場合には高度に保存されたアルギニン側鎖との直接的相互作用により保持される（Eck et al, Nature 362:87-91, 1993；Waksman et al., Nature 358:646-653, 1992；Yaffe et al., Structure 9:R33-38, 2001）。Plk1 PBD構造におけるHis/Lysハサミ構造の重要性は、その変異により、インビトロにおけるPBDによるリンペプチド結合、インビボにおけるCdc25Cに対するPlk1の標的、および中心体への局在化が消失する、ならびに単離されたPBDがG2/M停止および異常な紡錘体機能を誘導する能力が阻止されるという本発明者らの知見により例証される。
【０１７７】
構造に基づく配列アラインメント（図12B）から、2つのポロボックスの界面で形成される結合表面が、PBDにおける唯一完全に保存された領域であることが示され、異なるPlkのPBDが一般に非常に類似した至適リンペプチド結合モチーフを選択するという本発明者らの知見がさらに支持される。Plk1のTrp-414との重要な水素結合相互作用およびファンデルワールス接触により、(pThr/pSer)-1位におけるセリンの強力な選択およびTrp-414の変異によりインビボでのPlk1機能が阻止されるという事実の両方が理論的に解釈される（Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9301-9306, 1998）。Trp-414の絶対的保存から、ファミリーメンバーのすべてが同じセリン選択を示すはずであることが予測され、本発明者らはこれが事実であることを今示す。従来、Trp-414を囲む10アミノ酸配列は、ポロファミリーキナーゼの非触媒領域の特徴あるモチーフであると見なされていた（Golsteyn et al., Cell Sci. 107:1509-1517, 1994）。
【０１７８】
Plk1 PBDとSakポロボックス構造の比較
Plk1 PBDおよびSakポロボックス構造から、関連した配列モチーフがいかにして顕著に異なるタンパク質折りたたみを形成し得るのかが重要視される。相同的なタンパク質間の顕著な構造的相違は、極めて稀にかつ最も顕著には小RNA結合ドメインのKHファミリーに見られる（Grishin, Nucleic Acids Res. 29:638-643. 2001およびその中の参考文献）。この場合、いずれも関連した疎水性コアおよび類似の全体的な三次構造を共有するが、2つの異なるサブファミリーの構造は、αおよびβ二次構造エレメントの異なるトポロジーによって識別することができる。Plk1 PBDおよびSakポロボックス間の相違はさらに極端であり、これにより、関連した配列モチーフがいかにして顕著に異なるタンパク質折りたたみを形成し得るのかが重要視される。このことはまた、モチーフに基づく構造予測および明白に相同的なタンパク質の構造から生物学的機能を描く試みにもかなりの影響を有する。
【０１７９】
これらの予想外の構造的相違は、いかにしてPlk1におけるPBD機能およびSakサブファミリーPlkにおけるポロボックス機能と関連するのであろうか？Plk1によるリンペプチド結合に最も密接に関与する残基（例えば、His-538/Lys-540、Trp-414）はSakでは保存されていないため、極めて異なる構造はリンタンパク質結合機能の保存と相反する。さらに、Sakポロボックス二量体の静電ポテンシャル表面の試験から、通常であればリン酸依存性結合タンパク質に共通している正電荷の有意な領域は示されない（データは示さず）。
【０１８０】
Plkキナーゼ活性のホスホリガンド誘導による促進に関するモデル
リンペプチド結合ドメインによるキナーゼ活性の分子内制御に関する2つの別のモデルが、SrcファミリーキナーゼおよびSHPファミリーチロシンホスファターゼにおけるSH2ドメイン媒介性阻害の機構により例証される。Src型モデルでは、SH2ドメインのリンペプチド結合溝が、分子のC末端において内部ホスホチロシンモチーフに結合し、キナーゼドメインを不活性型構造に保つ（Sicheri et al., Nature 385:602-609, 1997；Xu et al., Nature 385:595-602, 1997）。Plk1は内部に至適PBD結合部位を有しておらず、またPBDのPlk1キナーゼドメインとの相互作用はリン酸化依存的ではないため、Plk1はこの機構を通じて機能しているのではないと本発明者らは考えている（Jang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1984-1989, 2002）。実際、キナーゼ活性化ループリン酸化の模倣体としてThr-210をAspに変異させると、実際にPBD結合が消失する（Jang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:1984-1989, 2002）。さらに、ポロボックス1内のTrp-414を変異させても、Plk1キナーゼ活性の基礎レベルには影響を及ぼさないことが示されている（Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:9301-9306, 1998）。この位置での変異はリン依存的PBD相互作用を阻止するため、キナーゼの制御はPBDのリン非依存的結合機構を介して起こると考えられる。
【０１８１】
SHP2モデルでは、ホスファターゼドメインに対するN末端SH2ドメインの裏面の結合が、触媒溝を部分的に塞ぎ、同時にSH2ドメインの結合ポケットを変形させ、リンペプチドリガンドに対するその親和性が減少する（Hof et al., Cell 92:441-450, 1998）。これは、全長Plk1の状況におけるPBDに関して本発明者らが認めたリンペプチド結合の減少と完全に一致する（図8A、8C）。SHP2の場合、局所的に高濃度のホスホチロシンリガンドがN末端SH2ドメインに結合することができ、同時にSH2結合溝の構造再構成が誘導され、これがそのホスファターゼ相互作用表面に伝えられ、触媒能力のあるホスファターゼドメインが遊離される。本発明者らは、Plkが関連した機構により制御され得ると考えている（図8C）。SHP様の機構に関するいくつかの支持は、広範囲に及ぶ格子接触に関与していない結晶学的非対称単位中の1分子のN末端ポロボックスは、そのC末端対応物よりも顕著に高い温度要因を示す（58Å2 対 37Å2）という本発明者らの知見に起因する。これは2つのポロボックスのかなり動的な結合を意味しており、リンペプチドリガンドの非存在下でより明白である可能性がある。本発明者らの現在のモデルでは、N末端とC末端ポロモチーフとの間におけるリンペプチドの結合が構造転換の機能を果たし、キナーゼドメインとの結合に不適当なPBDの構造を安定化させる。次いで、上流キナーゼによる次のT210Dリン酸化が、PBDのキナーゼに対する再結合を阻止することにより活性化状態を維持する働きをする。この機構の決定的証拠には、全長Plkおよびその複合体の構造の決定が必要となる。この研究は進行中である。
【０１８２】
適切な有糸分裂の進行には、CDKと、オーロラ(Aurora)、NIMA、およびポロ様キナーゼ等の様々な他のプロテインキナーゼとの間の高度に制御された相互作用が必要であることは明らかであるが、これら酵素の多くの活性の根拠をなす分子事象は大部分が未知である。本発明者らの総合的な生化学的、構造的、および細胞生物学的アプローチの結果により、ポロボックスモチーフの細胞機能を理解し得る枠組みが今提供される。Plk1は種々のヒト腫瘍において過剰発現し（Strebhardt et al., JAMA 283:479-480, 2000；Takai et al., Cancer Lett. 169:41-49, 2001）、またヒトPlk1の下方制御が培養腫瘍細胞の増殖を阻害することが示されており（Elez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 269:352-356, 2000；Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:5789-5794, 2003）、Plkが治療的介入の潜在的に重要な標的であることが示唆される。本発明者らはここに、Plk1 PBDが、他のタンパク質-リンペプチド複合体の構造でこれまでに見られたいずれの方法とも異なる方法で、リン酸化されたエピトープに結合することを示した。Ser-pThrジペプチドとの相互作用の特有のパターンから、このモチーフが、特にポロボックスドメインを対象とした抗増殖阻害剤を設計するための有用な鋳型として利用できることが示唆される。上記の実験は、以下の方法を用いて行った。
【０１８３】
ホスホセリン/トレオニン結合ドメインのリン酸モチーフスクリーニング
リン酸モチーフにバイアスをかけたペプチドライブラリーおよびその非リン酸化対応物は、以下のように構築した。
2007525143.tif 000016
ここで、pThrはホスホトレオニンであり、Zはアミノヘキサン酸を示し、XはCys以外のすべてのアミノ酸を表し、Bはアミノ酸P、L、I、V、F、M、Wのバイアスをかけた混合物である。ストレプトアビジンビーズ（Pierce、75 pmol/μLゲル）を5倍モル過剰の各ビオチン化ライブラリーと共に、20 mM Tris/HCl (pH 7.5)、125 mM NaCl、0.5% NP-40、1 mM EDTA中でインキュベートし、同じ緩衝液で4回洗浄して非結合リガンドを除去した。ビーズ固定化ライブラリー（30μLゲル）を、200μL結合緩衝液（20 mM Tris/HCl (pH 7.5)、125 mM NaCl、0.5% NP-40、1 mM EDTA、1 mM DTT、4μg/mLペプスタチン、4μg/mLアプロチニン、4μg/mLロイペプチン、200μM Na3VO4、 50 mM NaF）中、インビトロ翻訳された[35S]標識タンパク質プール6μLに添加した。各プールは、pCDNA3.1中の一方向性でありかつオリゴdTプライミングしたHeLa細胞ライブラリーに由来する約100個のcDNAクローンを含むプラスミドプールの、共役インビトロ転写/翻訳（Promega）により産生した約30の放射標識タンパク質からなるものであった（Kanai et al., EMBOJ 19:6778-6791, 2000）。4℃で2〜3時間インキュベートした後、直ちに結合緩衝液でビーズを4回洗浄し、次いでSDS-PAGE (11.4%)により分離しオートラジオグラフィーに供した。プール内の陽性スコアのヒットは、非リン酸化対応物と比較してリン酸化固定化ライブラリーとより強く相互作用するタンパク質バンドとして認められた。陽性スコアクローンを含むプールを、96穴型式を用いて徐々に細分していき、単一のクローンが単離されDNA配列決定により同定されるまで、リン酸結合に関して再スクリーニングした。
【０１８４】
Plk-1 PBDタンパク質のクローニング、発現、および精製
PBDの欠失マッピングのため、Plk-1のC末端断片をPCRにより作製し、pCDNA3.1（Invitrogen）のEcoRIおよびXhoI部位にクローニングした。細菌において組換えPBDをGST融合物として産生させるため、Plk-1の326〜603断片をpGEX-4T（Pharmacia）のEcoRIおよびXhoI部位に連結し、BL21に形質転換し、対数後期の細胞を0.4 mM IPTGの存在下で37℃で3.5時間誘導した。ITCによるペプチド結合親和性の測定には、グルタチオンアガロースを用いて細菌溶解産物からGST-Plk-1 (326〜603)を単離し、トロンビン(10 U/mL)を用いてGSTから切断し、陰イオン交換クロマトグラフィー（QセファロースHP、Pharmacia）により精製した。
【０１８５】
ペプチドライブラリーのスクリーニング
配列
2007525143.tif 000017
を含むホスホトレオニンおよびホスホセリン配向性縮重ペプチドライブラリーを、N-α-FMOC保護アミノ酸および標準的なBOP/HOBtカップリング化学法を用いて合成した。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、YaffeおよびCantley（Methods Enzymol., 328:157-170, 2000）に記載されている通りに、飽和量のGST-Plk-1（残基326〜603位）融合タンパク質（約1〜1.5 mg）を含むグルタチオンビーズ100μlを用いて行った。ビーズを1 mLカラムに充填し、PBS（150 mM NaCl、3 mM KCl 、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.2）中、ペプチドライブラリー混合物0.5 mgと共に室温で10分間インキュベートした。0.5% NP-40を含むPBSで速やかに2回、次いでPBSで2回洗浄し、カラムから非結合のペプチドを除去した。30%酢酸を室温で10分間作用させて結合ペプチドを溶出し、凍結乾燥し、H2Oに再懸濁し、Prociseタンパク質マイクロシークエンサーで自動化エドマン分解により配列決定した。各アミノ酸の選択値は、回収されたペプチド中の特定の配列決定サイクルにおける各アミノ酸の相対存在量（モル百分率）を、同じ位置における元のペプチドライブラリー混合物中の各アミノ酸の相対存在量と比較することにより決定した。
【０１８６】
等温滴定熱量測定法
ペプチドは、溶解度を増大させるために2つのC末端リジンを付加して固相法により合成し、脱保護した後に逆相HPLCにより精製し、MALDI-TOF 9マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-飛行時間型質量分析法により確認した。吸光度による濃度測定を容易にするため、いくつかのペプチドにはさらなるチロシン残基を含めた。熱量測定は、VP-ITCマイクロ熱量計（MicroCal Inc、カリフォルニア州、スタジオシティ）を用いて行った。実験は、50 mM Tris/HCl (pH 8.1)、 200 mM NaCl、2 mM TCEPに溶解した15μM Plk-1 PBD（残基326〜603位）を含む試料セルに、ペプチド溶液(150μM〜180μM)を10μL注入する段階を含む。240 sの間隔をあけ、参照電力25μCal/sで、注入を30回行った。Originソフトウェア（MicroCal Inc、カリフォルニア州、スタジオシティ）を用いて、結合等温線をプロットし、解析した。
【０１８７】
細胞基質に対するPlk-1 PBD結合
HeLa細胞をアフィディコリン(5μg/mL)またはノコダゾール(50 ng/mL)で16時間処理することにより、それぞれ間期またはG2/Mで停止させた。125 mM NaCl、0.5% NP-40、5 mM EDTA、2 mM DTT、4μg/mLペプスタチン、4μg/mLアプロチニン、4μg/mLロイペプチン、1 mM Na3VO4、 50 mM NaF、および1μMマイクロシスチンを含む25mM Tris/HCl (pH 7.5)中で細胞を溶解し、溶解産物150μgを、2〜5μgのGST-Plk-1（残基326〜603位）、GST-Pin1、またはGSTを含むグルタチオンアガロースビーズ10μLと共に4℃で30分間インキュベートした。ビーズを、溶解緩衝液で4回洗浄した。沈殿したタンパク質を同じ緩衝液中に溶出し、モノクローナルMPM-2（Upstate Biotechnology, Inc.）またはポリクローナル抗Cdc-25C（Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州、サンタクルーズ）を用いてブロッティングすることにより検出した。ペプチド競合実験では、GST-Plk-1（残基326〜603位）をグルタチオンビーズに固定化し、320μMのポロボックスチド至適、-8T、または-7Vと共に4℃で45分間プレインキュベートした。変異体cdc25Cを含む結合実験では、Superfect（Qiagen、カリフォルニア州、バレンシア）を用いて、pECE中の野生型および変異型のHAタグ標識Cdc25CをHeLa細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションしてから17時間後にノコダゾール(50 ng/mL)を添加し、細胞をさらに14時間インキュベートしてこれをG2/Mで停止させた。Cdc25Cの点変異体は、クイックチェンジ(QuickChange)部位特異的変異誘発システム（Stratagene）を用いて構築し、DNA配列決定により確認した。
【０１８８】
Plk-1 PBDの中心体局在化
U2OS細胞を8穴チャンバースライドで培養し、ノコダゾール(50 ng/mL)で14時間処理することによりG2/Mで停止させた。PBSでリンスした後、細胞を、透化処理緩衝液（25 mM HEPES (pH 7.9)、100 mM KCl、3 mM NaCl、200 mMショ糖、20 mM NaF、1 mM NaOVO4）中、4μM GST-Plk-1 PBD（残基326〜603位）およびストレプトリジン-O (1 U/ml)と共に37℃で20分間インキュベートした。細胞を3%パラホルムアルデヒド/2%ショ糖で室温で10分間固定し、20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、50 mM NaCl、300 mMショ糖、および3 mM MgCl2を含む0.5% Triton X-100溶液を用いてRTで10分間抽出した。スライドをAlexa Fluor 488結合抗GST抗体（Molecular Probes、オレゴン州、ユージーン）およびモノクローナル抗γ-チューブリン抗体（Sigma、ミズーリ州、セントルイス）を用いて4℃で一晩染色し、次いでテキサスレッド(Texas Red)結合抗マウス二次抗体を用いて室温で60分間染色し、4μg/ml DAPIで対比染色した。SPOT RTカメラおよびソフトウェア（Diagnostic Instruments、スコットランド、リビングストーン）を備えたNikon Eclips E600蛍光顕微鏡を用いて、細胞を調べた。NIHイメージ(Image)を用いて画像を解析した。ペプチド競合実験では、使用前に、GST-Plk-1 PBD溶液を250μMのその至適リンペプチドリガンド（ポロボックスチド至適）またはその非リン酸化対応物（ポロボックスチド-8T）と共に室温で15分間プレインキュベートした。
【０１８９】
γ-チューブリンに対するGst-Plk-1 PBDの中心体局在化を定量するため、Alexa Fluorおよびテキサスレッドについて比較可能な全体的強度を示す単一細胞の白黒画像を選択し、グレースケール値20（1=白、255=黒）になるように調節した。バックグラウンドよりも高い中心体特異的Alexa Fluor 488染色（N.I.AF488）またはテキサスレッド染色（N.I.TR）の標準化強度を、（[I中心体-I細胞]/I細胞）（式中、I中心体は中心体に対して平均化したAlexa-Fluor 488またはテキサスレッドの蛍光強度を示し、I細胞は細胞全体に対して平均化した全体の蛍光強度を示す）と定義した。次に、相対的なGST-PBD/γ-チューブリン特異的染色をN.I.AF488/N.I.TRとして算出した。
【０１９０】
新規結合対を同定するためのスクリーニング
本発明の方法により、新規結合対を同定することができる。例えば、新規pSer-Pro結合ポリペプチドのスクリーニングで使用するために、MAPキナーゼおよび細胞周期依存性キナーゼ(Cdk)共通リン酸化部位（すなわち、pSer-Pro）を含むようにバイアスをかけたリンペプチドを作製する。そのようなスクリーニングは、さらなる結合対を同定するために容易に適合化することができる。プロテインキナーゼとリンペプチド結合ドメインが同時進化して重複する配列モチーフを認識するようであるという知見を活用することにより、特定のプロテインキナーゼ基質に従ってリンペプチドを作製することができる。このようにして、RXRSX[pS/pT]（Rはアルギニン、pSはホスホセリン、pTはホスホトレオニン、Xは任意のアミノ酸である）を含むコア配列を有する好塩基性リンペプチドを用いて、キナーゼ、Aktに従属している新規結合パートナーを同定することができる。プロテインキナーゼC (PKC)、cAMP依存性プロテインキナーゼ(PKA)、β-ARK等のGタンパク質共役受容体キナーゼの共通リン酸化配列に基づく、他の潜在的好塩基性キナーゼ基質を用いることも可能である。
【０１９１】
共通キナーゼ基質を同定するためのいくつかの方法が、当技術分野で周知であり、例えばU.S.P.N. 5,532,167、U.S.P.N. 6,004,757、およびWO 98/54577に記載されている。したがって、共通キナーゼ基質ペプチドモチーフに基づいて、縮重リンペプチドを作製することができる。使用し得る例示的なキナーゼ基質ペプチドモチーフには、セリン/トレオニンキナーゼ、Ca2+/カルモジュリン依存性キナーゼ(CaMK)、チェックポイントキナーゼ（例えば、CHK、Rad53）、ミオシン軽鎖キナーゼ、DRAK、Trio、カゼインキナーゼ1、細胞周期依存性キナーゼ（CDK、例えばCdc2、Cdk4、Cdk6）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ(GSK)、MAPキナーゼ（例えば、Jnk、Erk、p38）、STEファミリーキナーゼ（例えば、PAK、GCK/MAP4K）、MAPキナーゼ活性化キナーゼ（例えばMnk）、eIF2αキナーゼ（例えば、PERK、PKR、HRI、GCN2）、Rafキナーゼ（例えば、A-Raf、B-Raf）、カゼインキナーゼII、オーロラ/ポロキナーゼ、混合系列(mixed lineage)キナーゼ（例えば、MLK1、MLK2、MLK3）、AKAP、アクチビン受容体様キナーゼ(Kir4)、CAK、Mos、Pim、およびKsrの共通配列に由来するリンペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明で使用し得る他のキナーゼ基質由来リンペプチド配列には、二重特異性キナーゼ、WEE-1、MEK、DYRK、Tesk、Clk、HIPK、Mps-1、TSK、およびC-TAKに由来するリンペプチド配列が含まれる。二重特異性キナーゼにはまた、脂質キナーゼFRAP、p110 PI3キナーゼ、ATM、ATR、およびDNA-PKに関連するポリペプチドが含まれる。
【０１９２】
プロテインチロシンキナーゼ基質ペプチドモチーフもまた本発明において使用することができ、これには、EGF-Rファミリー（例えば、EGF-R、Her2/Neu）、PDGF-R、CSF-R、IGF-R、VEGF-R（例えば、Flk/Kdr、Flt）、HGF-R (Met)、NGF-R（例えば、TrkA、-B、-C）、FGF-R、ROR、Tie-1、Tie-2/Tek、Eph（例えば、EphA1-8、EphB1-6）、Rik、Ron、Ros、Retを含む受容体チロシンキナーゼ、Srcファミリー（例えば、Src、Lck、Lyn、Fyn、Hck、Yes）、Abl、Csk、CTK、JAKs、FAK、ITK、BTK、Ack/Pyk、Tec、Tyk、Syk、Zap70、Fer、およびFes/Fpsを含む細胞質チロシンキナーゼの共通基質配列に由来するリンペプチドが含まれる。
【０１９３】
同定される結合対は、リンペプチド結合ドメインを含む結合対に限定されない。本発明の方法を用いて実質的に任意のペプチド結合ドメインを同定することができ、ドメインは、バイアスをかけたペプチドライブラリーを用いたタンパク質/ポリペプチド発現ライブラリーの同時スクリーニングにより同定される。例えば、結合対のスクリーニングを行い、ペプチド結合ドメイン、例えば、PDZ、SH3、またはWWペプチド結合ドメインが同定される。「ベイト」ペプチドライブラリーは、少なくとも2つまたはそれ以上の固定した残基に配向したペプチドの縮重集団を含む。そのようなスクリーニングの実施例を図9Bの左上パネルに提供するが、非リンペプチドライブラリーとは結合するが、リンペプチドライブラリーとは結合しない約24 kDaのバンドが存在し、これがBxTPモチーフに対する結合に特異的であることが示唆される。
【０１９４】
PBDタンパク質のクローニングおよび発現
ヒトPlk1（残基326〜603位）、ヒトPlk2（残基355〜685位）、ヒトPlk3（残基335〜646位）、アフリカツメガエルPlx1（残基317〜598位）、およびサッカロミセス・セレビシエCdc5p（残基357〜705位）のC末端断片を、PCRによりIMAGE cDNAクローンからまたはS. セレビシエ染色体DNAから直接増幅し、適切に切断したpGEX4T-3、またはpGEX-6P1（Pharmacia）に連結した。大腸菌BL21 (DE3)細胞でタンパク質を発現させ、グルタチオン-アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ペプチド結合親和性の測定およびドメインマッピング実験には、トロンビンまたはウイルスプロテアーゼ3C（Pharmacia-LKB、ニュージャージー州、ピーパック）を用いてGSTからタンパク質を切断し、陰イオン交換クロマトグラフィー（QセファロースHP、Pharmacia）またはゲルろ過（スーパーデックス(Superdex) S-75、Pharmacia、ニュージャージー州、ピーパック）によりさらに精製した。
【０１９５】
配向性ペプチドライブラリーのスクリーニング
配列
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を含むホスホトレオニン配向性縮重ペプチドライブラリーを、N-α-FMOC保護アミノ酸および標準的なBOP/HOBtカップリング化学法を用いて合成した。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、以前に記載されている通りに、飽和量（約1〜1.5 mg）のGST-hPlk1、GST-hPlk2、GST-hPlk3、GST-Plx1、またはGST-Cdc5pを含むグルタチオンビーズ100μlを用いて行った（Yaffe et al., Methods Enzymol., 328:157-170, 2000）。
【０１９６】
ペプチド結合測定
ペプチドは、溶解度を増大させるために2つのC末端リジンを付加して固相法により合成した。吸光度による濃度測定を容易にするため、いくつかのペプチドにはさらなるチロシン残基を含めた。等温滴定熱量測定は、VP-ITCマイクロ熱量計（MicroCal Inc、カリフォルニア州、スタジオシティ）を用いて、開始体積1.4〜2.0 mlで150〜400μMペプチドを30 x 10μl注入し、PBDタンパク質の15〜40μM溶液を滴定することにより行った。Originソフトウェア（MicroCal Inc、カリフォルニア州、スタジオシティ）を用いて、結合等温線をプロットし、解析した。インビトロ翻訳されたPlk1 PBD（野生型および変異体）のビーズ固定化pTPおよびTPペプチドライブラリーに対する結合は、以前に記載されている通りに行った（Elia et al., Science 299:1228-1231, 2003）。pTPおよびTPは、それぞれペプチドライブラリー
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（pThrはホスホトレオニンであり、Zはアミノヘキサン酸であり、XはCys以外のすべてのアミノ酸を表し、Bはアミノ酸P、L、I、V、F、M、Wのバイアスをかけた混合物である）を示す。
【０１９７】
ペプチドスポットアレイ
コンピュータ制御のGilson希釈装置および液体処理ロボットを備えたABIMEDペプチドアレイヤーを用いて、N-α-FMOC保護アミノ酸およびDIC/HOBTカップリング化学法により、ペプチドをアミノ-PEGセルロース膜上に合成した。膜を5%ミルク/TBS-T (0.1%)中で室温で2時間ブロッキングし、5%ミルク、50 mM Tris/HCl (pH 7.5)、150 mM NaCl、2 mM EDTA、2 mM DTTに溶解した0.1μM GST-Plk1 PBD（残基326〜603位）と共に室温で1時間インキュベートし、TBS-T (0.1%)で洗浄した。次いで、5%ミルク/TBS-T (0.1%)に溶解した抗GST結合HRPと共に室温で1時間インキュベートし、TBS-T (0.1%)で洗浄し、化学発光に供した。
【０１９８】
ドメインマッピングおよびタンパク質精製
トリプシンおよびエンドプロテアーゼGlu-C（Promega）を用いて、Plk1（残基326〜603位）およびCdc5pの限定タンパク質分解を行った。エドマン配列決定およびエレクトロスプレー質量分析により、N末端およびC末端限界を決定した。タンパク質分解により確定したドメインをコードするDNA配列をPCRにより増幅し、連結非依存的クリーニングを可能にし、またTEVプロテアーゼによる融合タンパク質の切断を可能にするpGEX-6P1 (Cdc5p)または改変型にクローニングした（Stols et al., Pro. Expr. Purif. 25:8-15 2002）（SJS - 未発表データ）。次いで、組換えPBDを上記のように発現させ、精製した。
【０１９９】
結晶化および構造決定
結晶化には、リンペプチド
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をPlk1 PBD断片と化学量論的に過剰である1.5:1で混合し、20 mM Tris.HCl pH8.0/500 mM NaCl、1 mM EDTA、3 mM DTTを含む緩衝液中で、約0.2 mMになるまで濃縮した。Douglas Instruments IMPAX 1-5結晶化ロボットを用いて、18℃でマイクロバッチ法により結晶を作製したが、これは非対称単位当たり2つの複合体を有して、単斜空間群P21（a=62.4Å、b=79.5Å、c=62.0Å、β=93.26°）に属する。100°Kで凍結保存した結晶を使用し、SRS Daresburyのステーション14.1でネイティブデータを収集した。処理ソフトウェアのHKL suiteを用いて、全データを縮小した（Otwinowski et al., Meth. Enzymol. 276:307-326, 1997）。位相情報は、リンペプチドとの複合体中のSe-メチオニン置換PBDの単結晶を用いて、3波長MAD実験から導いた。SRS、Daresbury、英国のステーション14.2で、名目上3.0Åの間隔まで各波長のデータを収集した。非対称単位中、単量体当たり5部位に相当する10箇所のSe部位の位置が示され、SOLVEにより位相を精密化した（Terwilliger et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr 55:849-861,1999）。RESOLVEの溶媒平滑化と共に実空間非結晶学的対称平均を用いて、位相をネイティブデータに対して約2.5Åまで拡張した（Terwilliger et al., Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr 55:849-861,1999）。これらのマップは容易に解釈でき、「O」を用いてリンペプチドの7残基を伴うPBDの部分的モデルを作製することができた（Jones et al., Acta Crystallogr. A 47:110-119, 1991）。次の、ネイティブデータを用いた1.9Åへの精密化は、CNS（Brunger et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 54:905-921, 1998）およびCCP4 suiteのREFMAC 5.0 ARP/wARPにより行った。構造の解析および精密化の統計の要約を表5に示す。太字の残基：His538、Lys540、Trp414、およびLeu491。
【０２００】
（表５）
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【０２０１】
図は、Ribbons（Carson, J. Appl. Crystallogr. 24:958-961, 1991）またはSPOCKを用いて作製した。
【０２０２】
細胞基質に対するPlk1 PBD結合
HeLa細胞に、His/Xpressタグ標識Plk1（残基326〜603位または326〜506位）またはmycタグ標識Plk1（全長）をトランスフェクションした。17時間後に細胞を回収し、次いでノコダゾール(50 ng/mL)で14時間処理することによりG2/Mで停止させた。125 mM NaCl、0.5% NP-40、5 mM EDTA、2 mM DTT、4μg/mLペプスタチン、4μg/mLアプロチニン、4μg/mLロイペプチン、1 mM Na3VO4、 50 mM NaF、および1μMマイクロシスチンを含む25mM Tris/HCl (pH 7.5)中で細胞を溶解した。溶解産物を、5μL Ni2+ビーズまたは5μL α-myc結合ビーズ（Santa Cruz Biotechnology）と共に4℃で90分間インキュベートした。ビーズを、溶解緩衝液で4回洗浄した。沈殿したタンパク質を試料緩衝液中に溶出し、ポリクローナル抗Cdc-25C（Santa Cruz Biotechnology）を用いてブロッティングすることにより検出した。Plk1の点変異体は、クイックチェンジ部位特異的変異誘発システム（Stratagene、カリフォルニア州、ラホーヤ）を用いて構築し、DNA配列決定により確認した。
【０２０３】
Plk-1 PBDの中心体局在化
U2OS細胞を8穴チャンバースライドで培養し、ノコダゾール(50 ng/mL)で14時間処理することによりG2/Mで停止させた。PBSでリンスした後、細胞を、透化処理緩衝液（25 mM HEPES (pH 7.9)、100 mM KCl、3 mM NaCl、200 mMショ糖、20 mM NaF、1 mM NaOVO4）中、4μM GST-Plk-1 PBD（残基326〜603位）およびストレプトリジン-O (1 U/ml)と共に37℃で20分間インキュベートした。細胞を3%パラホルムアルデヒド/2%ショ糖で室温で10分間固定し、20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、50 mM NaCl、300 mMショ糖、および3 mM MgCl2を含む0.5% Triton X-100溶液を用いて室温で10分間抽出した。スライドをAlexa Fluor 488結合抗GST抗体（Molecular Probes、オレゴン州、ユージーン）およびモノクローナル抗γ-チューブリン抗体（Sigma）を用いて4℃で一晩染色し、次いでテキサスレッド結合抗マウス二次抗体を用いて室温で60分間染色し、4μg/ml DAPIで対比染色した。SPOT RTカメラおよびソフトウェア（Diagnostic Instruments、スコットランド、リビングストーン）を備えたNikon Eclips E600蛍光顕微鏡を用いて、細胞を調べた。NIHイメージを用いて画像を解析した。
【０２０４】
細胞周期解析
HeLa細胞に、野生型および変異型のGFPタグ標識Plk-1（残基326〜603位）を32時間トランスフェクションした。浮遊細胞を含む培地はそのままにし、接着細胞をトリプシン処理によりプレートから回収した。2つの細胞集団を混合し、PBSで洗浄し、DMEM/10%FBS中、Hoechst 33342 (10μg/mL)により37℃で30分間染色した（1 x 106細胞/mL）。ヨウ化プロピジウム(5μg/mL)と共に4℃で5分間インキュベートすることにより、死細胞を染色した。Cell Quest ソフトウェアを用いて、FAC Star Plus（Becton Dickinson、ニュージャージー州、フランクリンレイクス）セルソーティング機で、GFP、Hoechst 33342、およびヨウ化プロピジウム蛍光シグナルを定量化した。全生細胞集団（ヨウ化プロピジウム染色されない）およびGFP発現生細胞（ヨウ化プロピジウム染色されずかつGFP陽性）の細胞周期解析を、Modfit 2.0を用いて行った。
【０２０５】
Plk1キナーゼアッセイ法
バキュロウイルスGST-Plk1（全長）を感染させたSF9細胞を、20 mM Hepes/KOH (pH 7.5)、135 mM NaCl、1% NP40、5 mM EGTA、5μMβ-メルカプトエタノール、35 mM NaF、0.5 mM Na3VO4、20 mM β-グリセロールリン酸、3μMマイクロシスチン、1μMオカダ酸、10μg/mLペプスタチン、10μg/mLロイペプチン、および10μg/mLアプロチニン中で溶解した。溶解産物をグルタチオンビーズと共に4℃で2時間インキュベートし、次いで、20 mM Hepes/KOH (pH 7.5)、415 mM NaCl、0.1% CHAPS、5 mM EGTA、5μMβ-メルカプトエタノール、35 mM NaF、および0.5 mM Na3VO4で4℃で5回洗浄した。結合したペプチドを、30 mMグルタチオン、50 mM Hepes/KOH (pH 8.0)、25 mM NaCl、2 mM MgCl2、1 mM EGTA、および5μMβ-メルカプトエタノールを含む緩衝液で溶出し、10 mM Hepes、10 mM NaCl、1 mM EGTA、1 mM DTTに対して4℃で3時間透析した。キナーゼ反応は、20 mM Hepes/KOH (pH 7.5)、15 mM KCl、10 mM MgCl2、1 mM EGTA、100μM ATP、5μCiγ-[32P]-ATP、1 mM DTT、および0.1μg/μgLカゼイン中、30℃で15分間行った。反応分割量を様々な時点で採取し、試料緩衝液に添加し、煮沸してリン酸化を停止した。SDS-PAGE電気泳動、オートラジオグラフィー、およびImageQuantソフトウェア（Molecular Dynamics）を用いた濃度測定により、カゼインへの32P-取り込みを測定した。ペプチド活性化実験では、250μMのPBD至適リンペプチド
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またはその非リン酸化対応物
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をGST-Plk1と共に、室温で5分間プレインキュベートした。
【０２０６】
コンピュータでの分子モデリング
本発明は、例示的な結晶化PBD-リンペプチド複合体、およびこの複合体の原子構造座標を提供する。複合体の重要な構造的特徴、特に基質結合部位の形状は、Plk-1等のポロ様キナーゼポリペプチドの選択的阻害剤を設計または同定する方法において、および類似の特徴を有する他のタンパク質の構造の解析において有用である。構造の図式的三次元表示および新規阻害剤のコンピュータ支援による分子設計を目的としてコンピュータを用いた使用のために、この複合体の構造座標をデータ記憶媒体にコード化し、本明細書に添えて提出する。PLK-1と既知構造を有する関連タンパク質との三次元構造の相違を用いて、PBDの阻害剤の選択性を最適化することができる。本明細書に記載する構造的相違に加えて、Plk-1と他のタンパク質との他の相違もまた、当業者によって同定され得る。
【０２０７】
本明細書に報告した三次元原子構造は、結合界面に「適合」するように設計される、小分子またはペプチド模倣体等の選択的タンパク質阻害剤の鋳型として直ちに使用することができる。合理的な薬剤設計によりペプチド模倣体を設計する方法は当業者に周知であり、例えば、米国特許第6,225,076号；米国特許第6,171,804号；およびHan et al.（Bioorg Med Chem. Lett, 10:39-43, 2000に記載されている。複合体の形成を阻害し得るペプチド模倣体は、例えば、GRAM、DOCK、またはAUTODOCK等のドッキングプログラムを用いたコンピュータモデリングを利用して同定することができる（Dunbrack et al., Folding & Design, 2:27-42, 1997）。この手順は、潜在的リガンドの形状および化学構造が、ポリペプチド構造へのリガンドの結合を許容するかどうかを判定するための、特定のポリペプチドの結合界面に対する候補化合物のコンピューターフィッティングを含み得る。この目的のためには、高速形状照合(fast shape matching)（Dock [Kuntz et al., J.Mol. Biol., 161:269-288, 1982]；Eudock [Perola et al.,J. Med. Chem., 43:401-408, 2000]）、インクリメンタル構成(incremental construction)（FlexX [Rarey et al., J Mol Biol, 261, 470-89, 1996]；HAMMERHEAD [Welch et al., Chem. Biol., 3, 449-462, 1996]）、TABU探索（Pro_Leads [Baxter et al., Proteins 33:367-382, 1998]；SFDock [Hou et al., Protein Eng. 12:639-647, 1999]）、遺伝子アルゴリズム（GOLD [Gold et al., J. Mol. Biol. 267:727-748, 1997]；AutoDock 3.0 [Morris et al., J. Comput. Chem., 19:1639-1662, 1998]；Gambler [Charifson et al., J. Med. Chem., 42:5100-5109, 1999]）、進化的プログラミング[Gehlhaar et al., Chem. Biol. 2:317-324, 1995]、模擬アニーリング（AutoDock 2.4 [Goodsell et al., Proteins,8:195-202, 1990]）、モンテカルロ・シミュレーション（MCDock [Liu et al., J. Comput.-Aided Mol. Des., 13:435-451, 1999]；QXP [McMartin et al., J. Comput.-Aided Mol. Des., 11:333-344, 1997]）、および距離幾何学法（Dockit [Metaphorics LLC, Piemont, CA 94611 www.metaphorics.com]）等の、しかしこれらに限定されない多くの方法を使用することができる。
【０２０８】
当業者は、ヒットとして多くの小分子または断片を容易に同定し得る。必要に応じて、上記の手順により同定された異なる官能基または小分子を連結して、単一のより大きな分子にすることができる。生じた分子は、より強力でありかつより高い特異性を有する可能性がある。標的タンパク質と相互作用するであろうさらなる原子または断片を付加することにより、ヒットの親和性および/または特異性を改良することもできる。必要なさらなる拡大部分を得るために、最初に同定された標的部位を容易に拡大することができる。選択された化合物をコンピュータモデリングプログラムにより系統的に修飾し、最も優れた治療の可能性を有するペプチド模倣体を同定してもよい。または、候補化合物は化学ライブラリーから選択するか、または新たに合成する。
【０２０９】
本明細書で開示した構造解析およびコンピュータモデリングを併用して、有限の数の合理的化学修飾の選択が可能になる。したがって、本明細書に開示する複合体構造およびコンピュータモデリングを用いて、多数の候補化合物をコンピュータで迅速にスクリーニングすることができ、最も有望な化合物を同定することができる。次に、例えばPBD/リンペプチド結合、ポロ様キナーゼ生物活性、細胞周期制御、アポトーシス、または細胞増殖に及ぼす候補化合物の効果を判定することにより、ペプチド模倣体等の候補化合物をインビトロまたはインビボで検証する。
【０２１０】
pSer/pThr結合ドメインは、遺伝毒性ストレスに対する細胞応答において機能する
真核生物におけるプロテインキナーゼによるシグナル伝達により、細胞内の特定の位置において多タンパク質複合体の定方向会合が起こる（Pawson et al., Science 300:445-52, 2003）。この過程はDNA損傷後に特に明白であり、DNA損傷キナーゼの活性化によって、核内の個々の点でタンパク質-タンパク質複合体の形成が起こる（Zhou et al., Nature 408:433-9, 2000）。
【０２１１】
多くの場合、キナーゼは、特定のリン酸化モチーフ配列を生じることによりこれらの多タンパク質複合体の形成を直接調節し；次いで、モジュラー結合ドメインがこれらの短いリン酸モチーフを認識して、タンパク質-タンパク質相互作用を媒介する。最初のリンペプチド結合モジュールはSH2ドメインおよびPTBドメインであると認識されているが、これらはpTyr含有配列に特異的に結合する（Pawson et al., Science 278:2075-80, 1997；Kuriyan et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct 26:259-88, 1997；Yaffe, Nat Rev Mol Cell Biol 3:177-86, 2002）。先に詳述したように、短いpSer/pThr含有配列を特異的に認識する多くのモジュラードメインが同定されており、これには14-3-3タンパク質、WWドメイン、FHAドメイン、およびポロ様キナーゼのC末端ドメインをが含まれる（Yaffe et al., Structure 9:R33-8, 2001；Yaffe et al., Curr Opin Cell Biol 13:131-8, 2001；Elia et al., Science 299:1228-31, 2003）。これらのpSer/pThr結合ドメインはすべて、細胞周期制御および遺伝毒性に対する細胞応答に関与する。
【０２１２】
PTIPのタンデムC末端BRCT対は、リン酸特異的結合に必要かつ十分である
本明細書に記載するプロテオミクススクリーニングアプローチを使用して（Elia et al., Science 299:1228-31, 2003）、本発明者らは今ここに、DNA損傷応答に関与する新規なモジュラーpSer/pThr結合ドメインを同定した。γ線照射後、ATM/ATRおよびDNA-PKを含むホスホイノシチド様キナーゼは、転写因子、DNA修復タンパク質、プロテインキナーゼ、ならびにSer-GlnおよびThr-Glnモチーフ上の骨格をリン酸化する（Abraham, Genes Dev 15:2177-96, 2001）。そこで、ATMおよびATRによって作製される(pSerまたはpThr)-Glnモチーフに類似するようにバイアスをかけた配向性ペプチドライブラリーを構築した（Kim et al., J Biol Chem 274:37538-43, 1999；O'Neill et al., J Biol Chem 275:22719-27, 2000）（図17Aの説明）。固定化型のこのライブラリーを、インビトロ発現クローニングにより産生されるタンパク質のライブラリーに対する相互作用スクリーニングに使用した（Lustig et al., Methods Enzymol 283:83-99, 1997）。AKT、PKA、およびPKC等のキナーゼにより作製される好塩基性モチーフを標的化する14-3-3等のリンペプチド結合ドメインが同定される可能性を減少させるため、アミノ酸、Arg、Lys、およびHisをペプチドライブラリーの縮重位置から意図的に除外した。リン酸非依存的な結合を制御するため、(pSerまたはpThr)-Glnを(SerまたはThr)-Glnで置換して同一のペプチドライブラリーを構築した。
【０２１３】
リン酸化および非リン酸化ペプチドライブラリーをストレプトアビジンビーズに固定化し、インビトロ翻訳された(IVT)約96,000個のポリペプチド（それぞれ約100個の転写産物をコードする960プール）に対して、ハイスループットアプローチにより10週間にわたりスクリーニングした。IVT産物の大部分は固定化ペプチドライブラリーのいずれにも結合しないか、または非リン酸化対照の方にわずかに強く結合した（図17A）。いくつかのプールが、(pSerまたはpThr)-Glnライブラリーに優先的に結合するタンパク質をコードするcDNAを含むことが認められた。プールEE11は最も強いリンペプチド結合クローンを含み、同胞選択した場合に、E11-9がヒトPax2トランス活性化ドメイン相互作用タンパク質(PTIP)のC末端70%をコードすることが見出された（図17B）（Lechner et al., Nucleic Acids Res 28:2741-51, 2000；Cho et al., Mol Cell Biol 23:1666-73, 2003）。PTIPはもとはベイトとしてPax2を用いた酵母ツーハイブリッドスクリーニングで同定され（Lechner et al., Nucleic Acids Res 28:2741-51, 2000）、DNA損傷応答経路において（Cho et al., Mol Cell Biol 23:1666-73, 2003）、およびTGF-β-Smad2シグナル伝達の下流の転写応答の促進において（Shimizu et al., Mol Cell Biol 21:3901-12, 2001）重要な役割を果たすと考えられる。
【０２１４】
全長PTIP転写産物もまた(pSerまたはpThr)-Glnペプチドに対する優先的な結合を示すが、差次的結合が幾分かあまりはっきりせず、PTIPのC末端断片が分離したリンペプチド結合モジュールを含む可能性があることが示唆された。ヒトPTIPは、Glnに富んだ領域に加えて4つのBRCTドメインを含み、これらのドメインは、多くのDNA損傷応答タンパク質および細胞周期チェックポイントタンパク質zに存在する既知のタンパク質-タンパク質相互作用モジュールである（Huyton et al., Mutant Res 460:319-32, 2000）。そこで、一連の欠失構築物を作製し、リンペプチド特異的結合について解析した（図17B）。3番目および4番目のタンデムBRCTドメインのみを含む構築物は、(pSerまたはpThr)-Glnライブラリーに対する強力かつ特異的な結合を示した。これらのドメインの両方を欠失するPTIT構築物は、結合もリン酸の識別もできなかった。さらに、3番目または4番目のBRCTドメインのみではいずれもリンペプチドに結合せず、PTIPのタンデムC末端BRCT対が、リン酸特異的結合に必要かつ十分である単一のモジュールとして機能することが示唆された。
【０２１５】
タンデムBRCTドメインは、リンペプチド結合を媒介する単一単位として機能する
BRCTドメインは、タンデム対またはタンデム対の複数コピーとして見出される場合が多い。(pSerまたはpThr)結合がこれらのドメインの一般的特徴であるのかどうかを調べるため、多くの他のDNA損傷タンパク質に由来するタンデムBRCT対をスクリーニングした（図18A）。PTIPと同様に、BRCA1 C末端BRCTドメインもまたリン酸特異的結合を示した。BRCA1 BRCTドメイン単独ではいずれもリン酸特異的相互作用には十分ではなく、やはりタンデムBRCTドメインが単一の単位として機能することが示唆された。この知見は、タンデムBRCA1 BRCTドメインが内部のドメインリンカーと一体となって単一の安定した断片として働くという、限定的タンパク質分解研究およびX線結晶学研究と非常によく一致する（Williams et al., Nat Struct Biol 8:838-42, 2001）。PTIPおよびBRCA1とは対照的に、MDC1または53BP1のタンデムBRCTドメインに対するリン酸特異的結合は認められず、Rad9についてはごくわずかのリン酸特異的結合が検出されたにすぎず、リンペプチド結合機能がタンデムBRCTドメインのサブセットのみに存在することが示唆された。
【０２１６】
至適なタンデムBRCTドメイン結合ペプチドの同定
ビーズ固定化リンペプチドライブラリーに対する結合によって同定されたモジュラードメインに対して、従来のペプチドライブラリースクリーニングにより直接その至適結合モチーフを決定することができる（Yaffe et al., Methods Enzymol 328:157-70, 2000；Elia et al., Science 299:1228-31, 2003）。(pSerまたはpThr)-Gln、pSer、およびpThr含有ペプチドライブラリーを用いて、PTIPおよびBRCA1のタンデムC末端BRCTに対して至適pSer/pThr結合モチーフを決定した（図18Bおよび18C、表4）。
【０２１７】
（表６）PTIPおよびBRCA1のタンデムBRCTモチーフによるホスホセリンおよびホスホトレオニンペプチドモチーフの選択
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PTIPまたはBRCA1のタンデムBRCTドメインのGST融合物を、配列GAXXXB(pS/pT)QJXXXAKKK、GAXXXXpSXXFXXAYKKK、MAXXXXpTXXXXAKKK、およびMAXXXXSpXXXXXAKKK（XはCys以外のすべてのアミノ酸を示す）を含む4つのリンペプチドライブラリーに対する結合に関してスクリーニングした。MAXXXB(pS/pT)QJXXXAKKKライブラリーでは、BはA、I、L、M、N、P、S、T、Vを示し、Jは25% E、75% Xのバイアスをかけた混合物を表し、Xはこのライブラリーのすべての位置についてArg、Cys、His、Lys以外のすべてのアミノ酸を示す。強力な濃縮を示す残基に下線を引いている。
【０２１８】
表6は、PTIPおよびBRCA1のタンデムBRCTドメインによるホスホセリンおよびホスホトレオニンモチーフの選択の結果を示す。PTIPまたはBRCA1のタンデムBRCTドメインのGST融合物を、配列
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（XはCys以外のすべてのアミノ酸を示す）を含む3つのリンペプチドライブラリーに対する結合に関してスクリーニングした。ライブラリー
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では、BはA、I、L、M、N、P、S、T、Vを示し、Jは25% E、75% Xのバイアスをかけた混合物を表し、XはArg、Cys、His、Lys以外のすべてのアミノ酸を示す。強力な濃縮を示す残基（比率>3）に下線を引いている。
【０２１９】
PTIPおよびBRCA1のBRCTは、(pSerまたはpThr)-Glnライブラリーに対してスクリーニングした場合に、(pSerまたはpThr)+3位においてそれぞれ芳香族/脂肪族残基および芳香族残基を非常に強く選択して、類似しているが同一ではないモチーフを示した。顕著なアミノ酸選択はまた(pSerまたはpThr)+2位および+5位においても認められ、他の位置ではより穏やかな選択が認められた。BRCTドメインは(pSerまたはpThr)-Glnモチーフに結合するドメインのスクリーニングで単離されたため、個別のpThrまたはpSer配向性ペプチドライブラリーを用いて、(pSerまたはpThr)+1位におけるGlnの相対的重要性について検討した。この解析から、縮重+1位におけるGlnの中程度の選択が示された。さらに、+1位に固定したGlnが存在しないことで、+3位および+5位での芳香族残基および脂肪族残基の選択が減少し、(pSerまたはpThr)+1位のGlnは必須ではないが、明らかに好ましい残基であることが示唆された。この知見と一致して、固定したpSerモチーフのみを含むライブラリーと比較してビーズ固定化(pSerまたはpThr)-Glnライブラリーに対して、タンデムBRCTドメインが大幅に強く結合することを観察した（図18A）。
【０２２０】
ペプチドライブラリーのデータに基づき、至適タンデムBRCTドメイン結合ペプチドをY-D-I-(pSerまたはpThr)-Q-V-F-P-Fと定義した。等温滴定熱量測定(ITC)から、至適ホスホセリン含有ペプチドは解離定数280 nMでPTIPのタンデムC末端BRCTに、解離定数400 nMでBRCA1のBRCTドメインに結合することが示された（表7）。
【０２２１】
（表７）タンデムBRCTドメインのペプチド結合親和性
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等温滴定熱量測定(ITC）を用いて結合定数(Kd)を決定した。観察された結合化学量論はすべて、タンパク質とリンペプチドとの1:1複合体と一致した。N.D.B.は、タンデムBRCTドメインと少なくとも150μMのpSおよびpT（それぞれ、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを示す）について、ITCにより検出可能な結合がないことを示す。
【０２２２】
PTIPおよびBRCA1のタンデムBRCTドメインは、GST融合タンパク質として大腸菌から精製し、等温滴定熱量測定により個々のペプチドに対する結合を測定した。結合化学量論は、タンパク質およびリンペプチドの1:1複合体と一致した。pSerをpThrに置換するとPTIP BRCTドメインに対するペプチドの親和性が減少し、pThrをThrに置換すると結合は完全に消失した。
【０２２３】
モチーフの選択をさらに検証するため、至適BRCTチド(BRCTtide)内のpThr-Glnコアに隣接する（図18Dおよび18E）またはpSerに隣接する（図18Fおよび18G）各アミノ酸を変更して、固定化リンペプチドの固相アレイに対するタンデムBRCTドメインの結合を行った。得られた選択性は一般に、溶液中で配向性ペプチドライブラリーを用いて得られた結果と一致した。pThrをpSerに置換すると、PTIPおよびBRCA1のいずれについても結合が有意に増加し、PTIPに関するITCの結果と一致した。pThrをpTyrに置換すると結合が完全に消失し、タンデムBRCTドメインがpSer/pThr特異的結合モジュールであることが確認された。予想した通り、pThrをThr、Ser、またはTyrで置換すると、タンデムBRCTドメインの結合は消失した。
【０２２４】
(pSerまたはpThr)-Glnペプチドライブラリーとのプレインキュベーションにより消失するタンデムBRCTドメインの結合
DNA損傷後のATM/ATR/ATXリン酸化タンパク質への結合におけるタンデムBRCTドメインの役割を調べるため、10 Gyのγ線照射前後のU2OS細胞溶解産物を、GST-(BRCT)2融合タンパク質と共にインキュベートし、ATMおよびATRにより作製されるリン酸化モチーフに対して作製された抗(pSerまたはpThr)-Glnモチーフ抗体（Cell Signaling Technologies）でブロッティングした（図19A〜19D）。γ線照射後、PTIPおよびBRCA1のどちらのタンデムC末端BRCTも、抗ATM/ATRリン酸化モチーフ抗体により認識される多くのタンパク質に結合した（図19A）。タンデムBRCTドメインを(pSerまたはpThr)-Glnペプチドライブラリーとプレインキュベートすると、この相互作用は阻害され得たが、pThr-Proライブラリーまたは非リン酸化(SerまたはThr)-Glnライブラリーとでは阻害されなかった。経時的解析から、DNA損傷を起こしてから0.5時間後および2時間後の照射細胞溶解産物における、PTIPおよびBRCTA1 BRCTドメインの(pSerまたはpThr)-Gln含有タンパク質に対する至適結合が明らかになった（図19Bおよび19D）。結合は至適BRCTチド(opt)によりおおむね消失したが、その非リン酸化類似体(7T)によっては消失せず、またはγ線照射前にATMおよびATRを阻害するために細胞をカフェインで前処理しても結合はおおむね消失した。リン酸特異的相互作用が消失するいずれの場合においても、PTIP BRCTドメインプルダウンでは約170 kDaの免疫反応性バンドが認められたが、BRCT1プルダウンでは認められなかった；このバンドはおそらく、PTIP BRCTドメインとの、そのリンペプチド結合ポケットと異なる部位での相互作用に起因すると考えられる。
【０２２５】
タンデムC末端BRCTドメインは、DNA損傷後の核フォーカス(foci)の形成に必要かつ十分である
γ線照射に応答して、DNA損傷タンパク質53BP1はATMによるリン酸化を受け、さらなる細胞基質をリン酸化するATMの能力を促進する（Schultz et al., J Cell Biol 151:1381, 2000；Rappold et al., J Cell Biol 153:613-20, 2001；Anderson et al., Mol Cell Biol 21:1719-29, 2001；Abraham, Nat Cell Biol 4:E277-9, 2002；Wang et al., Science 298:1435-8, 2002；Fernandez-Capetillo et al., Nat Cell Biol 4:993-7, 2002；DiTullio, Jr. et al., Nat Cell Biol 4:998-1002, 2002）。53BP1は図19Aおよび19Bの1つまたは複数のバンドと類似したMrで移動し、至適なPTIPタンデムBRCT結合モチーフと密接に一致する複数の潜在的Ser/Thr-Gln ATM/ATRリン酸化部位を含む。U2OS細胞溶解産物に由来する内因性53BP1は、DNA損傷後のみ、PTIPのタンデムC末端BRCTドメインに結合した（図19C）。(pSerまたはpThr)-Glnモチーフ抗体を用いて得られた結果と同様に、HAタグ標識53BP1をトランスフェクションした細胞の経時変化から、γ線照射してから0.5時間後および2時間後の至適結合が示された。この結合は至適BRCTチドとのプレインキュベーションにより阻害されたが、その非リン酸化対応物とのプレインキュベーションでは消失しなかった。タンデムBRCTドメインを(pSerまたはpThr)-Glnペプチドライブラリーとプレインキュベートすることによっても結合は消失したが、pThr-Proライブラリーまたは非リン酸化(SerまたはThr)-Glnライブラリーとのプレインキュベーションでは消失せず、またγ線照射前にカフェインで処理しても、または照射後にλホスファターゼで溶解産物を処理しても結合は消失した。
【０２２６】
PTIPはもとは転写調節タンパク質として同定されたが、最近のデータから、DNA損傷シグナル伝達にも関与することが示唆される（Cho et al., Mol Cell Biol 23:1666-73, 2003）。PTIPヌル対立遺伝子に関してホモ接合性のマウスは、大規模なDNA損傷および遊離DNA末端の存在という証拠を残して、E9.5で胚性致死を起こす。PTIPヌルマウスに由来する線維芽細胞も胚性幹細胞も培養で増殖することができず、栄養膜細胞は一般に生存度の減少を示し、低線量の電離放射線に対する感受性の増加を示した（Cho et al., Mol Cell Biol 23:1666-73, 2003）。このデータと、PTIPのC末端のタンデムBRCTドメインがATM/ATRリン酸化タンパク質に結合するという本発明者らの知見から、全長PTIPがインビボにおいてDNA損傷の部位に局在化することが示唆された。
【０２２７】
これについて検討するため、全長PTIP、最後の2つのC末端BRCTドメインを欠失するPTIP、または単離されたタンデムC末端BRCTドメインのみのGFP融合物を、U2OS細胞にトランスフェクションした（図20A〜20C）。照射しない場合、PTIPは少量サイトゾル染色されて核に拡散した。DNA損傷から2時間後、PTIPは離散性の核フォーカスに再局在化し、これはATM/ATRホスホエピトープ、53BP1、およびホスホ-H2AXと有意に共局在化した（図20A）。PTIPからC末端BRCTを欠失させると、構成的な拡散性の核および細胞質局在化を起こし、DNA損傷後にフォーカスを形成し得なかった（図18B）。単離されたPTIP C末端タンデムBRCTドメインは、DNA損傷のない場合には主に核に拡散しているが、γ線照射後には全長PTIPと同様に点状の核フォーカスに効率的に再局在化した（図18C）。したがって、PTIPのタンデムC末端BRCTドメインは、溶液中での(pSerまたはpThr)-Glnペプチドへの結合に必要かつ十分であるが、DNA損傷後の全長PTIPによる核フォーカスの形成にも必要かつ十分である。
【０２２８】
カフェインにより、電離放射線に応答したDNA損傷フォーカスへのPTIPの動因が減少する（図21Aおよび21B）。全長PTIP-GFP cDNAをトランスフェクションしたU20S細胞を、10Gy電離放射線に曝露する70分前に、10 mMカフェインで偽処理または前処理した。IR電離照射腺に応答して、偽処理したU20S細胞はPTIP（緑色）およびH2AXp（赤色）を含む核フォーカスを形成した；これらの2つのタンパク質はDNA損傷の部位に共局在化する（融合）。IRに応答して、カフェイン処理したU20S細胞は減少した数の核フォーカスを形成した；PTIPは誤った局在化をし、離散性の核フォーカスを形成せず（緑色）、減少した数のH2AXp（赤色）含有フォーカスが存在した。これらの結果から、カフェインで前処理することにより、PTIPおよびH2AXpの共局在化（融合）が効率的に消失することが実証される。
【０２２９】
本発明者らが、ATMおよびATRリン酸化モチーフを標的化する新たなpSer/pThr結合モジュールとしてタンデムBRCTドメインを同定したことにより、DNA損傷シグナル伝達に応答して、このドメインによって補助される機能の範囲が拡大する。タンデム対のみでもこの能力において機能することが認められ、PTIPおよびBRCA1のBRCTドメインを含む、BRCTドメインのあるサブセットのみがリン酸特異的結合を示すと考えられる。タンデムBRCTドメインのリン酸結合モジュールとしての重要な役割は、BRCA1の約80%の生殖系列突然変異が、BRCT領域を含むC末端の切断を起こし、女性の乳癌および卵巣癌の素因になるという知見により強調される（Huyton et al., Mutat Res 460:319-32, 2000）。興味深いことに、重要なBRCA1タンパク質相互作用を消失する、(BRCT)2モジュールにおけるBRCA1癌関連突然変異、Met17753Arg (M1775R)は、M1775R結晶構造が野生型(BRCT)2の構造とほぼ同一であるにもかかわらず、リンペプチドに結合できない（図2A）。WWドメイン、14-3-3タンパク質、FHAドメイン、およびポロボックスドメインがpSerペプチドよりもpThrペプチドにより強く結合するか、またはpSerペプチドには全く結合しないことから、BRCTドメインがpThr含有ペプチドよりもpSer含有ペプチドにより強く結合するという知見は新規である（Verdecia et al., Nat Struct Biol 7:639-43, 2000；Durocher et al., Mol Cell, 6:1169-1182, 2000；Elia et al., Science 299:1228-31, 2003）。興味深いことに、ATMおよびATRは、Thr-GlnモチーフよりもSer-Glnモチーフを優先的にリン酸化し（Kim et al., J Biol Chem 274:37538-43, 1999）、ホスホイノシチド様キナーゼにより作製されるモチーフとBRCTドメインにより認識されるモチーフとの間の機能的収束が示唆される。結合される基質内の(pSerまたはpThr)+3位および+5位において観察された、BRCTドメインによる芳香族残基および脂肪族残基の選択は、+1位のGlnに対する中程度の選択を超える。したがって、あるサブセットのATM/ATRリン酸化基質のみが、高親和性で結合する可能性がある。Gln依存性キナーゼ以外のキナーゼもまた、潜在的BRCTドメイン結合モチーフを生じる。さらに、本発明者らのスクリーニングの結果から、大規模な未修復のDNA末端を有するPTIPノックアウトマウスの初期胚性致死性の分子根拠が提供される。PTIPのC末端タンデムBRCTドメインがATM/ATRリン酸化モチーフに結合し、全長PTIPがDNA損傷の部位に強く局在化するという知見から、PTIPがDNA損傷応答の重要な成分として機能することが示唆される。DNA損傷シグナル伝達の正常な過程の障害は、腫瘍形成のみならず、癌細胞の残存する遺伝的背景に応じて化学療法薬により誘導された大規模なDNA損傷に直面した腫瘍細胞死にも関与する（Scully et al., Nature 408:429-32, 2000）。DNA損傷シグナル伝達を妨げる薬剤は、照射および化学療法によって死滅する腫瘍細胞の感受性を増強する。したがって、タンデムBRCTドメインのリンペプチド結合ポケットは、抗癌剤開発の有望な標的を構成する。
【０２３０】
ホスホセリン/トレオニン結合ドメインのATM/ATR/ATXリン酸モチーフスクリーニング
ATM/ATRキナーゼのリン酸化モチーフに対してバイアスをかけた配向性(pSer/pThr)リンペプチドライブラリーおよびその非リン酸化対応物は、以下のように構築した。
2007525143.tif 000089
ここで、pSはホスホセリンを示し；pTはホスホトレオニンを示し；Zはアミノヘキサン酸を示し；Bはアミノ酸A、I、L、M、N、P、S、T、Vのバイアスをかけた混合物であり；Jは25% E、75% Xのバイアスをかけた混合物を表し、ここで「X」はArg、Cys、His、Lys以外のすべてのアミノ酸を示す。ストレプトアビジンビーズ（Pierce、75 pmol/μLゲル）を10倍モル過剰の各ビオチン化ライブラリーと共に、50 mM Tris/HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、0.5% NP-40、1 mM EDTA、2 mM DTT中でインキュベートし、同じ緩衝液で5回洗浄して非結合ペプチドを除去した。ビーズ固定化ライブラリー（10μLゲル）を、150μL結合緩衝液（50 mM Tris/HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、0.5% NP-40、1 mM EDTA、2 mM DTT、8μg/mLペプスタチン、8μg/mLアプロチニン、8μg/mLロイペプチン、800μM Na3VO4、 25 mM NaF）中、インビトロ翻訳された[35S]標識タンパク質プール10μLに添加した。各プールは、PROTEOLINKインビトロ発現クローニングシステム（Promega、ウィスコンシン州、マディソン）により産生した約100個の放射標識タンパク質からなった。4℃で3時間インキュベートした後、直ちに結合緩衝液200μLでビーズを3回洗浄し、次いでSDS-PAGE (12.5%)およびオートラジオグラフィーに供した。陽性スコアのヒットは、非リン酸化対応物と比較してリン酸化固定化ライブラリーとより強く相互作用するタンパク質バンドとして同定した。陽性スコアクローンを含むプールを徐々に細分していき、単一のクローンが単離されDNA配列決定により同定されるまで、リン酸結合に関して再スクリーニングした。
【０２３１】
PTIPおよびBRCA1のクローニング、発現、および精製
PTIPおよびBRCA1 BRCTリン酸結合領域の欠失マッピングのため、ならびにMDC1、53BP1、およびRad9の発現のため（図17〜18）、PCRによりインビトロ転写/翻訳用の断片を作製し、pCDNA3.1発現ベクター（Invitrogen、カリフォルニア州、サンディエゴ）にクローニングした。組換えGST-PTIP BRCTドメインおよびGSTBRCA1 BRCTドメインを産生するため、PTIPの残基550〜757位およびBRCA1の残基1634〜1863位を、pGEX-4T1（Pharmacia、ニュージャージー州、ピーパック）のEcoRIおよびNot1部位に連結し、次いでDH5a大腸菌に形質転換した。タンパク質の誘導は、0.4 mM IPTGの存在下で37℃で4時間、または25℃で16時間行った。ペプチドフィルターブロット解析およびITCによるペプチド結合親和性の測定には、グルタチオンアガロースを用いて細菌溶解産物からGSTPTIP BRCTドメイン（残基550〜757位）およびGST-BRCA1 BRCTドメイン（残基1634〜1863位）を単離し、40 mMグルタチオンを用いて溶出し、50 mM Tris/HCl (pH 8.1)、300 mM NaClに透析した。GFP-PTIP構築物FL（残基1〜757位）、!BRCT（残基1〜550位）、または(BRCT)2（残基550〜757位）は、pEGFP-C2（BD Biosciences Clontech、ニュージャージー州、フランクリンレイクス）発現ベクターのEcoRIおよびSal1部位にクローニングした。
【０２３２】
ペプチドライブラリーのスクリーニング
配列
2007525143.tif 000090
（pSはホスホセリンであり、pTはホスホトレオニンであり；XはCys以外のすべてのアミノ酸を示す）からなるホスホセリンおよびホスホトレオニン配向性縮重ペプチドライブラリー。(pSer/pThr)-Glnライブラリーでは、Bはアミノ酸A、I、L、M、N、P、S、T、Vのバイアスをかけた混合物であり、Jは25% E、75% Xのバイアスをかけた混合物を表し、ここでXはArg、Cys、His、Lys以外のすべてのアミノ酸を示す。ペプチドは、N-α-FMOC保護アミノ酸および標準的なBOP/HOBtカップリング化学法を用いて合成した。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、YaffeおよびCantley（Methods Enzymol., 328:157-70, 2000）に記載されている通りに、飽和量のGST-PTIP BRCTドメインまたはGST-BRCA1 BRCTドメイン（約1〜1.5 mg）を含むグルタチオンビーズ125μlを用いて行った。ビーズを1 mLカラムに充填し、PBS（150 mM NaCl、3 mM KCl 、10 mM Na2HPO4、2 mm KH2HPO4、pH 7.6）中、ペプチドライブラリー混合物0.45 mgと共に室温で10分間インキュベートした。1.0% NP-40を含むPBSで2回、次いでPBSで2回洗浄し、カラムから非結合のペプチドを除去した。30%酢酸を室温で10分間作用させて結合ペプチドを溶出し、凍結乾燥し、H2Oに再懸濁し、PROCISEタンパク質マイクロシークエンサー（Perkin-Elmer Corporation、コネチカット州、ノーウォーク）で自動化エドマン分解により配列決定した。各アミノ酸の選択値は、回収されたペプチド中の特定の配列決定サイクルにおける各アミノ酸の相対存在量（モル百分率）を、同じ位置における元のペプチドライブラリー混合物中の各アミノ酸の相対存在量と比較することにより決定した。
【０２３３】
等温滴定熱量測定法
ペプチドは、溶解度を増大させるために3つのC末端リジンを付加して固相法により合成した。次いで、ペプチドを脱保護した後に逆相HPLCにより精製し、MALDI-TOF質量分析法により確認した。熱量測定は、VP-ITCマイクロ熱量計（MicroCal Inc、カリフォルニア州、スタジオシティ）を用いて行った。実験は、50 mM Tris/HCl (pH 8.1)、 300 mM NaClに溶解した15μM GST-PTIP BRCTドメイン（残基550〜757位）または15μM GST-BRCA1 BRCTドメイン（残基1634〜1863位）を含む試料セルに、ペプチド溶液(20μM〜150μM)を連続して10μLずつ注入する段階を含む。注入と注入の間に240秒の間隔をあけ、参照電力25μCal/sで、注入を20回行った。ORIGINソフトウェア（MicroCal Inc、カリフォルニア州、スタジオシティ）を用いて、結合等温線をプロットし、解析した。
【０２３４】
ペプチドフィルターアレイ
コンピュータ制御Gilson希釈装置および液体処理ロボットを備えたABIMEDペプチドアレイヤー（Abimed GmbH、ドイツ、ドュッセルドルフ）を用いて、N-a-FMOC保護アミノ酸およびDIC/HOBTカップリング化学法により、ペプチドをアミノ-PEGセルロース膜上に合成した。膜を5%ミルク/TBS-T (0.1%)中で室温で1時間ブロッキングし、5%ミルク、50 mM Tris/HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、2 mM EDTA、2 mM DTTに溶解した0.05μM GST-PTIP BRCTドメイン（残基550〜757位）またはGST-BRCA1 BRCTドメイン（残基1634〜1863位）と共に室温で1時間インキュベートし、TBS-T (0.1%)で4回洗浄した。次いで、5%ミルク/TBS-T (0.1%)に溶解した抗GST結合HRP（Amersham）と共に室温で1時間インキュベートし、TBS-T (0.1%)で5回洗浄し、化学発光に供した。
【０２３５】
細胞基質に対するPTIP BRCTドメインおよびBRCA1 BRCTドメインの結合
U2OS細胞を10 Gyの電離放射線で処理するか、またはU2OS細胞に擬似放射をし、30〜120分間回復させた。次に、50mM Tris/HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、1.0% NP-40、5 mM EDTA、2 mM DTT、8μg/mLペプスタチン、8μg/mLアプロチニン、8μg/mLロイペプチン、2 mM Na3VO4、 10 mM NaF、1μMマイクロシスチン中で細胞を溶解した。溶解産物(0.5〜2 mg)を、10〜20μgのGST-PTIP BRCTドメイン（残基550〜757位）、GST-BRCA1 BRCTドメイン（残基1634〜1863位）、またはGSTを含むグルタチオンビーズ20μLと共に4℃で120分間インキュベートした。ビーズを、溶解緩衝液で3回洗浄した。沈殿したタンパク質を同じ緩衝液中に溶出し、抗ATM/ATR基質(pSer/pThr)Gln抗体（CELL SIGNALING TECHNOLOGY, Inc、マサチューセッツ州、ベバリー）、ポリクローナル抗53BP1（ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS、カリフォルニア州、サンディエゴ 92121）、またはモノクローナル抗HA（COVANCE Inc、ニュージャージー州、プリンストン）を用いてブロッティングすることにより検出した。ペプチド競合実験では、GST-PTIP BRCTドメインまたはGST BRCA1 BRCTドメインをグルタチオンビーズに固定化し、350μMのBRCTチド至適、7pT、7T、pSQライブラリー、SQライブラリー、またはpTPライブラリーと共に4℃で1時間プレインキュベートし、溶解緩衝液で3回洗浄した。
【０２３６】
免疫蛍光法および顕微鏡検査
U2OS細胞を18 mm2カバースリップに播種し、FUGENE6トランスフェクション試薬（Roche、スイス、バーゼル）を用いて製造業者の手順に従って、GFP-PTIP構築物FL（残基1〜757位）、!BRCT（残基1〜550位）、または(BRCT)2（残基550〜757位）をトランスフェクションした。トランスフェクションしてから24時間後、細胞を10Gyの電離放射線で処理するかまたは細胞に擬似放射し、120分間回復させた。細胞を3%パラホルムアルデヒド/2%ショ糖で室温で15分間固定し、20 mM Tris-HCl (pH 7.8)、75 mM NaCl、300 mMショ糖、および3 mM MgCl2を含む0.5% Triton X-100溶液を用いて室温で15分間抽出した。スライドを一次抗体を用いて4℃で一晩染色し、次いでテキサスレッド結合抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体（Molecular Probes、オレゴン州、ユージーン）を用いて室温で60分間染色した。使用した一次抗体は、ウサギ抗53BP1（Oncogene Research Products、カリフォルニア州、サンディエゴ）、マウス抗g-H2AX（Upstate、バージニア州、シャーロッツビル）、およびウサギ抗(pS/pT)Q（Cell Signaling Technology, Inc、マサチューセッツ州、ベバリー）であった。画像をデルタビジョン(Deltavision)顕微鏡（CarlZeiss、ニューヨーク州、ソーンウッド）に収集し、SOFTWORK画像処理ソフトウェア（SGI、CSIF、カリフォルニア州、スタンフォード）を用いてデジタル処理により解析した。
【０２３７】
ペプチド模倣体
ペプチド誘導体（例えばペプチド模倣体）には、環状ペプチド、対応するD-立体異性体または非天然アミノ酸残基による天然アミノ酸残基の置換により得られるペプチド、ペプチドの化学的誘導体、二重ペプチド、ペプチドの多量体、および他のタンパク質または担体に融合したペプチドが含まれる。本発明のペプチドの環状誘導体とは、環化に適した1つまたは複数のさらなるアミノ酸残基を有するペプチドである。これらの残基は、カルボキシル末端およびアミノ末端に付加される場合が多い。ペプチド誘導体は、対応するD-アミノ酸残基により置換された1つまたは複数のアミノ酸残基を有し得る。一例挙げると、本発明のペプチドまたはペプチド誘導体は、全てがL-ペプチド、全てがD-ペプチド、または混合D,L-ペプチドである。別の例では、アミノ酸残基は、非天然アミノ酸残基により置換される。非天然または誘導体化非天然アミノ酸の例には、Nα-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、およびβ-メチルアミノ酸が含まれる。
【０２３８】
本発明のペプチドの化学的誘導体には、これに限定されないが、通常ペプチドの一部ではないさらなる化学的成分を含む誘導体が含まれる。そのような誘導体の例には以下のものが含まれる。(a) アシル基が、例えばアセチル、ヘキサノイル、オクタノイル等のアルカノイル基、例えばベンゾイル等のアロイル基、またはFmoc（フルオレニルメチル-O--CO--)、カルボベンゾキシ（ベンジル-O--CO--）、モノメトキシスクシニル、ナフチル-NH--CO--、アセチルアミノ-カプロイル、アダマンチル-NH--CO--等の保護基のいずれかであってよい、アミノ末端または別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体；(b) カルボキシ末端または別の遊離カルボキシ基もしくは遊離ヒドロキシル基のエステル；(c) アンモニアまたは適切なアミンとの反応により産生される、カルボキシル末端または別の遊離カルボキシル基のアミド；(d) グリコシル化誘導体；(e) リン酸化誘導体；(f) 例えばカプロイル、ラウリル、ステアロイル等の親油性成分に結合した誘導体、および(g) 抗体または他の生物学的リガンドに結合した誘導体。例えば、(a) --CH2--NH--への還元；(b) --CO--N(アルキル)--へのアルキル化；および(c) --NH--CO--への反転による、ペプチド結合--CO--NH--の修飾によって得られる誘導体もまた、化学的誘導体に含まれる。
【０２３９】
本発明の二重ペプチドは、直接またはスペーサーを介して相互に共有結合した、本発明の2つの同じまたは2つの異なるペプチドからなる。
【０２４０】
本発明の多量体は、多くの同じもしくは異なるペプチドまたはその誘導体から形成される高分子からなる。
【０２４１】
一例を挙げると、ペプチド誘導体は、対応する非誘導体化ペプチドよりもタンパク質分解に対してより抵抗性である。例えば、1つまたは複数のL-アミノ酸残基の代わりにD-アミノ酸置換を有するペプチド誘導体は、タンパク質分解による切断に抵抗性である。
【０２４２】
別の例では、ペプチド誘導体は、対応する非誘導体化ペプチドよりも高い細胞膜透過性を有する。例えば、ペプチド誘導体は、アミノ末端および/またはカルボキシル末端および/または内部に結合した親油性成分を有し得る。そのような誘導体は、所望の機能活性を維持するのであれば、細胞内のタンパク質-タンパク質相互作用を標的化する場合に非常に好ましい。
【０２４３】
別の例では、ペプチド誘導体は、リガンド（例えばポロボックスドメイン）により高い親和性で結合する。
【０２４４】
本発明のペプチドまたはペプチド誘導体は、合成法および組換え法を含む、当業者に周知であるペプチド合成の任意の方法によって得られる。例えば、ペプチドまたはペプチド誘導体は固相ペプチド合成によって得ることができ、これは要するに、C末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂にカップリングする段階、およびN-α保護アミノ酸を順次付加していく段階からなる。保護基は、当技術分野において周知の任意の基であってよい。伸長鎖に新たな各アミノ酸を付加する前に、鎖に付加された前のアミノ酸の保護基を除去する。適切な樹脂へのアミノ酸のカップリングは、Rivier et al.（米国特許第4,244,946号）に記載されている。そのような固相合成は、例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1964；Vale et al., Science 213:1394-1397, 1984；Marki et al., J. Am. Chem. Soc. 10:3178, 1981、ならびに米国特許第4,305,872号および同第4,316,891号に記載されている。好ましい局面においては、自動ペプチド合成機を使用する。
【０２４５】
合成したペプチドまたはペプチド誘導体の精製は、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイズ排除クロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、疎水性差を含む標準的な方法、またはタンパク質を精製するための他の標準的な方法によって行う。1つの態様においては、薄層クロマトグラフィーを用いる。別の態様においては、逆相HPLC（高速液体クロマトグラフィー）を用いる。
【０２４６】
最終的に、本発明のペプチド、ペプチド誘導体、および他の小分子の構造-機能の関係性を利用して、同様の特性を有する類似の分子構造を調製することもできる。したがって、本発明は、本明細書に明確に開示した分子に加えて、本明細書で例証した特定の態様の構造、疎水性、電荷の特徴、および側鎖の特性を共有する分子を含むことを意図する。
【０２４７】
1つの例では、所望の結合活性を有する誘導体または類似体を、任意のポロボックスドメイン等の関心対象の分子または他の標的に対する結合に用いることができる。所望の関心対象の特性を維持する、または別法として欠失するもしくは阻害する（例えば、天然リガンドに対するPBDの結合を阻害する）誘導体または類似体を用いて、ポロ様キナーゼ（例えば、Plk-1、2、または3）の生物活性を阻害することができる。
【０２４８】
具体的には、ペプチド誘導体は、機能的に同等な分子または要望通りに機能が増強もしくは低下した分子を提供する置換、付加、または欠失によってアミノ酸配列を変更することによって作製される。遺伝暗号の縮重により、実質的に同じアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を、組換えペプチドの産生に用いることも可能である。これらには、配列内の機能的に同等なアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、これによりサイレントな変化を生じる、本発明のペプチドのすべてまたは一部を含むヌクレオチド配列が含まれるが、これに限定されない。
【０２４９】
本発明の誘導体および類似体は、当技術分野において周知の様々な方法によって産生することができる。その産生をもたらす操作は、遺伝子またはタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローニングされた核酸配列を、当技術分野で周知の多くの戦略のいずれかにより修飾することができる（Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）。インビトロにおいて、制限酵素エンドヌクレアーゼにより適切な部位で配列を切断し、次いで、必要に応じてさらに酵素により修飾し、単離し、連結することができる。
【０２５０】
修飾リンペプチド
本発明のリンペプチドは、これに限定されないが、式(III)の非天然N末端アミノ酸を含み得る。
2007525143.tif 000091
式中、A1はαアミノ基を介して結合したアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立して水素、C1〜5分岐または直鎖C1〜5アルキル、C1〜5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり、そのそれぞれは置換されないかまたは以下より選択される置換基で置換され：1〜3個のC1〜5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、または-N(R5)SO2R6；R5、R6、およびR7は、水素、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3〜7シクロアルキルから独立して選択され、2つのC1〜5アルキル基が1つの原子上に存在する場合、それらは任意に結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成し；R2は水素、F、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリルであり；またはR2およびR1は結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成するか、もしくはR2およびR3は結合して、任意にヒドロキシルで置換され、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含んで（R7は水素またはC1〜5アルキルである）C3〜8環を形成し；R2は、水素、F、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリルであり；R4は、水素、C1〜5直鎖または分岐C1〜5アルキル、C1〜5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり、そのそれぞれは置換されないかまたは以下より選択される置換基で置換され：1〜3個のC1〜5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5（mは0〜2である）、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-N(R5)C(O)(OR6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、または-N(R5)SO2R6、R5、R6、およびR7は、水素、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3〜7シクロアルキルから独立して選択され、2つのC1〜5アルキル基が1つの原子上に存在する場合、それらは任意に結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成する。
【０２５１】
本発明のリンペプチドは、以下の式の内部非天然内部アミノ酸もまた含み得る。
2007525143.tif 000092
式中、A2はαカルボキシ基を介して結合したアミノ酸またはペプチド鎖であり；A1はαアミノ基を介して結合したアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立して水素、C1〜5分岐または直鎖C1〜5アルキル、C1〜5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり、そのそれぞれは置換されないかまたは以下より選択される置換基で置換され：1〜3個のC1〜5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5（mは1〜2である）、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、または-N(R5)SO2R6；R5、R6、およびR7は、水素、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3〜7シクロアルキルから独立して選択され、2つのC1〜5アルキル基が1つの原子上に存在する場合、それらは任意に結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成し；R2は水素、F、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリルであり；またはR2およびR1は結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成するか、もしくはR2およびR3は結合して、任意にヒドロキシルで置換され、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含んで（R7は水素またはC1〜5アルキルである）C3〜8環を形成する。
【０２５２】
本発明はまた、以下の式の内部非天然内部アミノ酸が存在する、本発明のリンペプチドの修飾もまた含む。
2007525143.tif 000093
式中、A2はαカルボキシ基を介して結合したアミノ酸またはペプチド鎖であり；A1はαアミノ基を介して結合したアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立して水素、C1〜5分岐または直鎖C1〜5アルキル、およびC1〜5アルカリルであり；R2は水素、F、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリルであり；またはR2およびR1は結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成し；XはOまたはSであり；R5およびR6は、水素、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3〜7シクロアルキルから独立して選択され、2つのC1〜5アルキル基が1つの原子上に存在する場合、それらは任意に結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成し；またはR5およびR6は結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成する。
【０２５３】
本発明のリンペプチドは、以下の式のC末端非天然内部アミノ酸もまた含み得る。
2007525143.tif 000094
式中、A2はαカルボキシ基を介して結合したアミノ酸またはペプチド鎖であり；R1およびR3は独立して水素、C1〜5分岐または直鎖C1〜5アルキル、C1〜5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり、そのそれぞれは置換されないかまたは以下より選択される置換基で置換され：1〜3個のC1〜5アルキル、1〜3個のハロゲン、1〜2個の-OR5、N(R5)(R6)、SR5、N-C(NR5)NR6R7、メチレンジオキシ、-S(O)mR5、1〜2個の-CF3、-OCF3、ニトロ、-N(R5)C(O)(R6)、-C(O)OR5、-C(O)N(R5)(R6)、-1H-テトラゾール-5-イル、-SO2N(R5)(R6)、-N(R5)SO2アリール、または-N(R5)SO2R6；R5、R6、およびR7は、水素、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3〜7シクロアルキルから独立して選択され、2つのC1〜5アルキル基が1つの原子上に存在する場合、それらは任意に結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成し；R2は水素、F、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリルであり；またはR2およびR1は結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成するか、もしくはR2およびR3は結合して、任意にヒドロキシルで置換され、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含んで（R7は水素またはC1〜5アルキルである）C3〜8環を形成し；R2は、水素、F、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリルであり；QはOH、OR5、またはNR5R6であり、R5、R6は、水素、C1〜5直鎖または分岐アルキル、C1〜5アルカリル、アリール、ヘテロアリール、およびC3〜7シクロアルキルから独立して選択され、2つのC1〜5アルキル基が1つの原子上に存在する場合、それらは任意に結合して、任意に酸素、硫黄、またはNR7を含み（R7は水素またはC1〜5アルキルである）、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成する。当技術分野において周知のペプチド修飾法は、例えば「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（20th ed., ed., A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia）に見出される。
【０２５４】
治療用途
ペプチド合成および結合
本発明のリンペプチドは、先に詳述したように調製する。または、リンペプチドは、塩化2-クロロトリチル樹脂上での標準的なFMOC化学法により調製することもできる（Int. J. Pept. Prot. Res. 38, 1991, 555-61）。樹脂からの切断は、側鎖の保護を維持するジクロロメタン(DCM)に溶解した20%酢酸を用いて行う。次いで、室温において、ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解した過剰のジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を用いて、遊離末端カルボキシル化ペプチドを4'(アミノメチル)フルオレセイン（Molecular Probes、A-1351、オレゴン州、ユージーン）にカップリングする。蛍光N-C保護ペプチドをシリカゲルクロマトグラフィー（DCMに溶解した10%メタノール）により精製する。次に、DMFに溶解したピペリジン(20%)を用いてN末端FMOC基を除去し、N遊離ペプチドをシリカゲルクロマトグラフィー（DCM、0.5% HOAcに溶解した20%メタノール）により精製する。最終的に、2.5%水および2.5%トリイソプロピルシランを含む95%トリフルオロ酢酸を用いて、t-ブチル側鎖保護基を除去する。そのような方法で得られたペプチドは、HPLCにより単一ピークを示すはずであり、以下に説明するアッセイ法を行うのに十分純粋である。
【０２５５】
リンペプチド修飾
本発明のリンペプチドのアミノ酸残基に修飾を行い、リンペプチドの治療効力および/または生物学的利用能を増強するまたは持続させることができる。したがって、以下の一般式(I)を有するα-アミノ酸に様々な修飾を行うことができる。
2007525143.tif 000095
式中、Rは特定のアミノ酸残基を規定する。α-アミノ酸の例示的な修飾には、これに限定されないが、以下の式(II)が含まれる。
2007525143.tif 000096
R1、R2、R3、R4、およびR5は、独立して水素、ヒドロキシ、ニトロ、ハロ、C1〜5分岐または直鎖アルキル、C1〜5アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールであり；アルキル、アルカリル、ヘテロアリール、およびアリールは置換されなくても、またはC1〜5アルキル、ヒドロキシ、ハロ、ニトロ、C1〜5アルコキシ、C1〜5アルキルチオ、トリハロメチル、C1〜5アシル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、ニトリル、C1〜5アルコキシカルボニル、オキソ、アリールアルキル（アルキル基は1〜5個の炭素原子を有する）、およびヘテロアリールアルキル（アルキル基は1〜5個の炭素原子を有する）からなる群より選択される1つもしく複数の置換基で置換されてもよく；または、R1およびR2は結合して、任意に酸素、硫黄、もしくは水素、またはC1〜5アルキルを含み、任意にヒドロキシルで置換されたC3〜8環を形成し；またはR2およびR3は結合して、任意にヒドロキシルで置換され、任意に酸素、硫黄、C1〜5アミノアルキル、またはC1〜5アルキルを含んでC3〜8環を形成する。当技術分野において周知である修飾法は、例えば、参照により本明細書により組み入れられる「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（20th ed., ed., A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins）に見出される。
【０２５６】
アッセイ法およびハイスループットアッセイ法
小分子ペプチド模倣体を同定するための置換アッセイ法において、蛍光偏光アッセイ法を用いることができる。以下は蛍光偏光法を使用する例示的方法であり、決して限定と見なされるべきではない。スクリーニングでは、すべての試薬を適切な濃度に希釈し、希釈溶液は氷上で維持する。GSTおよびGST融合タンパク質の希釈保存濃度は約4 ng/μLであり、フルオレセイン標識リンペプチドは1.56 fmol/μLの濃度で使用することができ、一方、非標識リンペプチドおよびペプチドは25 pmol/μLで使用し得る。試料を、黒色平底プレート、Biocoat、#359135低結合（BD BioSciences；マサチューセッツ州、ベッドフォード）中、ウェル当たり全量200μLでインキュベートする。Labsystem Multi-Drop 96/384装置（Labsystem；マサチューセッツ州、フランクリン）を用いて、10% DMSOに希釈した試験化合物50μL（平均濃度28μM）、50 mM MES-pH 6.5 50μL、フルオレセイン-リンペプチド50μL、GST-Plk-1 PBD 50μLを順次添加して、アッセイ法を開始する。非標識リンペプチドまたは非リン酸化ペプチド50μLを、陰性対象として使用し得る。添加した時点で、すべてのプレートを4℃に置く。4℃で一晩インキュベートした後、ポラリオン(Polarion)プレートリーダー（Tecan、ノースカロライナ州、リサーチトライアングルパーク）を用いて蛍光偏光を測定する。キセノン閃光ランプに、485 nmの励起フィルタおよび535 nmの吸収フィルタを備えつける。閃光数は30に設定する。次いで、生データを全相互作用の割合に変換し得る。さらなる解析はすべて、SPOTFIREデータ解析ソフトウェア（SPOTFIRE、マサチューセッツ州、サマービル）を用いて行い得る。
【０２５７】
活性化合物の選択では、フルオレセインクエンチング効果のみならずヒットについての自己蛍光を測定するが、2000またはそれ以上の単位の測定値は自己蛍光を示し、50単位の測定値はクエンチング効果を示す。次に、再確認のために、確認されたヒットを用量反応曲線(IC50)で解析し得る。次いで、用量反応曲線において最も優れたヒットを、GST-Plk-1 PBDを用いて等温滴定熱量測定法により評価し得る。
【０２５８】
別の結合および置換アッセイ法
蛍光偏光アッセイ法は、スクリーニング戦略においてリンペプチド-タンパク質相互作用を測定する1つの手段にすぎない。リンペプチド-タンパク質相互作用を測定する別の方法は、当業者に周知である。そのような方法には、これらに限定されないが、質量分析法（Nelson and Krone, J. Mol. Recognit., 12:77-93, 1999）、表面プラスモン共鳴法（Spiga et al., FEBS Lett., 511:33-35, 2002；Rich and Mizka, J. Mol. Recognit., 14:223-8, 2001；Abrantes et al., Anal. Chem., 73:2828-35, 2001）、蛍光共鳴エネルギー移動法(FRET)（Bader et al., J. Biomol. Screen, 6:255-64, 2001；Song et al., Anal. Biochem. 291:133-41, 2001；Brockhoff et al., Cytometry, 44:338-48, 2001）、生物発光共鳴エネルギー移動法(BRET)（Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:3684-9, 2000；Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96:151-6, 1999）、蛍光クエンチング法（Engelborghs, Spectrochim. Acta A. Mol. Biomol. Spectrosc., 57:2255-70, 70；Geoghegan et al., Bioconjug. Chem. 11:71-7, 2000）、蛍光活性化細胞スキャニング/ソーティング法（Barth et al., J. Mol. Biol., 301:751-7, 2000）、ELISA法、および放射免疫アッセイ法(RIA)が含まれる。
【０２５９】
試験抽出物および化合物
一般に、リンペプチド-タンパク質相互作用に影響を及ぼすペプチド模倣体化合物は、当技術分野において周知の方法に従って、天然物、合成（または半合成）抽出物の大きなライブラリー、または化学ライブラリーから同定される。
【０２６０】
当業者は、試験抽出物または化合物の明確な提供源が本発明のスクリーニング手順に重要ではないことを理解すると考えられる。したがって、本明細書に記載する例示的な方法を用いて、実質的にあらゆる化学抽出物または化合物をスクリーニングすることができる。そのような抽出物または化合物の例には、これらに限定されないが、植物、真菌、原核生物、または動物に基づく抽出物、発酵培養液、および合成化合物、ならびに既存の化合物の修飾物が含まれる。糖類、脂質、ペプチド、および核酸に基づく化合物を含むがこれらに限定されない、多数の化合物のランダム合成または定方向合成（例えば、半合成または全合成）を行うための多くの方法もまた利用できる。合成化合物ライブラリーは、例えばBrandon Associates（ニューハンプシャー州、メリマク）およびAldrich Chemical（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から市販されている。
【０２６１】
または、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物ライブラリーは、Biotics（英国、サセックス）、Xenova（英国、スラウ）、Harbor Branch Oceangraphics Institute（フロリダ州、フォートピアス）、およびPharmaMar, U.S.A.（マサチューセッツ州、ケンブリッジ）を含むがこれらに限定されない多くの提供源から市販されている。さらに、必要に応じて、当技術分野において周知の方法（例えば、コンビナトリアルケミストリー法、または標準的な抽出および分画法）を用いて、天然および合成ライブラリーを作製する。さらに、必要に応じて、標準的な化学的、物理的、または生化学的方法を用いて、任意のライブラリーまたは化合物を容易に修飾することも可能である。
【０２６２】
リンペプチドおよびペプチド模倣体小分子の投与
本発明のリンペプチドまたはその誘導体もしくはペプチド模倣体は、リンタンパク質がその結合部位を介してその天然パートナーに結合するのを選択的に阻止するまたは妨げることにより、ポロ様キナーゼの生物活性または生物機能を有意に変更することができる。したがって、本発明のリンペプチドまたはその誘導体を、不適切な細胞周期制御またはアポトーシスを特徴とする疾患または障害の治療に用いることができる。
【０２６３】
不適切な細胞周期制御を特徴とする疾患または障害には、新形成等の過剰増殖性疾患が含まれる。新生物の例には、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、ならびに肉腫および癌腫等の固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞腫、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、子宮癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６４】
不適切なアポトーシスを起こす細胞には、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、または発作）を有する患者のニューロン、および心筋細胞（例えば、心筋梗塞後、またはうっ血性心不全の経過に伴う）が含まれる。本発明の粗製物、すなわちPlk-3の阻害剤は、不適切なアポトーシスを起こす細胞の治療に有用である可能性がある。
【０２６５】
Plk-1 PBD結合リンペプチドまたはペプチド模倣体小分子は、単位用量形態で、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤に含めて投与し得る。従来の薬事行為により適切な製剤または組成物を提供して、過剰な細胞増殖によって起こる疾患を患う患者に化合物を投与することができる。投与は、患者が症状を示す前に開始してよい。任意の適切な投与経路を用いることができ、例えば、投与は非経口、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼、脳室内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、エアロゾル、坐剤、または経口投与であってよい。例えば、治療用製剤は溶液または懸濁液の形態であってよく；経口投与には、製剤は錠剤またはカプセルの形態であってよく；鼻腔内製剤では、製剤は粉末、点鼻薬、またはエアロゾルの形態であってよい。
【０２６６】
本発明の薬学的組成物は、例えば従来の溶解、凍結乾燥、混合、造粒、または糖衣過程により、それ自体周知の方法で調製される。当技術分野において周知である製剤作製法は、例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」（20th ed., ed., A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia）に見出される。
【０２６７】
活性成分の溶液およびその懸濁液、特に等張水溶液または懸濁液を使用することが好ましく、例えば、単独でまたはマンニトールのような担体とともに活性成分を含む凍結乾燥組成物の場合、そのような溶液または懸濁液は使用前に作製することが可能である。薬学的組成物は滅菌してもよく、および/または、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤および/または乳化剤、可溶化剤、浸透圧を制御するための塩、および/または緩衝液といった賦形剤を含んでもよく、これらは、例えば従来の溶解または凍結乾燥過程をにより、それ自体周知の方法で調製される。そのような溶液または懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、またはゼラチン等の増粘物質を含んでもよい。
【０２６８】
油中懸濁液は、油性成分として、通例注射目的に、植物油、合成油、または半合成油を含む。そのような例としては特に、酸性成分として8〜22個、特に12〜22個の炭素原子を有する長鎖脂肪酸、例えばラウリン酸、トリデシリン酸、ミリスチン酸、ペンタデシリン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、または対応する不飽和酸、例えばオレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、ブラシジン酸、またはリノレン酸を含む液体脂肪酸エステルが挙げられ、必要に応じて、例えばビタミンE、β-カロチン、または3,5-ジ-tert-ブチル-4-ヒドロキシトルエンのような抗酸化剤が加えられていてもよい。それら脂肪酸エステルのアルコール成分は最大6個の炭素原子を有し、一価または多価アルコール、例えば一価、二価、または三価アルコールであり、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、もしくはペンタノール、またはそれらの異性体であるが、特にグリコールおよびグリセロールが適している。したがって、以下の例の脂肪酸エステルが挙げられる。オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、「ラブラフィル(Labrafil) M 2375」（トリオレイン酸ポリオキシエチレングリセロール、Gattefoss、パリ）、「ミグリオール(Miglyol) 812」（C8〜C12の長鎖を有する飽和脂肪酸のトリグリセリド、Huls AG、ドイツ）、しかし特に、綿実油、アーモンド油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、ダイズ油等の植物油、とりわけラッカセイ油が適している。
【０２６９】
注射組成物は無菌条件下において従来の方法で製造され、また組成物をアンプルまたはバイアルに導入し、その容器を密封する過程にも、従来と同じ方法が適用される。
【０２７０】
経口投与用の薬学的組成物は、活性成分を固形担体と混合することによって得られ、望ましい場合には得られた混合物を顆粒化し、望ましい場合にはまたは必要に応じて、適切な賦形剤を添加した後に混合物を錠剤、糖剤核(drage core)、またはカプセルに加工する。活性成分が一定量拡散するまたは放出されることを可能にするプラスチック担体を、薬学的組成物に含めることも可能である。
【０２７１】
適した担体は、例えばラクトース、サッカロース、マンニトール、またはソルビトールといった糖質、セルロース調製物、および/または例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウムといったリン酸カルシウム等の充填剤、例えばトウモロコシ、小麦、米、またはジャガイモデンプンを用いたデンプンのり、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドン等の結合剤、および/または必要に応じて、上記のデンプン、またカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸塩等の分解剤である。賦形剤は、特に、例えばケイ酸、タルク、ステアリン酸、またはステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム等のステアリン酸塩、および/またはポリエチレングリコールといった流動調節剤および潤滑剤である。糖剤核は、任意に腸溶性である適切なコーティングによって提供され、とりわけ、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、および/または二酸化チタンを含み得る濃縮糖溶液、もしく適切な有機溶媒に溶解したコーティング溶液、または腸溶性コーティングの調製には、エチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等の適切なセルロース調製物の溶液が用いられる。カプセルは、ゼラチンからなる乾燥充填カプセル、およびゼラチンとグリセロールまたはソルビトール等の可塑剤からなる密封されたソフトカプセルである。乾燥充填カプセルは、顆粒の形態で、例えば、ラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤、および/またはタルクもしくステアリン酸マグネシウム等の流動促進剤と共に、また必要に応じて安定化剤と共に、活性成分を含み得る。軟カプセルでは、活性成分は、脂肪油、パラフィン油、または液体ポリエチレングリコール等の適切な油性賦形剤中に溶解または懸濁されることが好ましく、安定化剤および/または抗菌剤を添加することもまた可能である。例えば識別の目的で、または活性成分の異なる用量を示すために、錠剤または糖剤コーティングまたはカプセル鋳造物に着色料や色素を添加してもよい。
【０２７２】
薬学的組成物は、約1%〜約95%、好ましくは約20%〜約90%の活性成分を含む。本発明による薬学的組成物は、例えば、アンプル、バイアル、坐剤、糖剤、錠剤、またはカプセルの形態等の単位用量形態であってよい。
【０２７３】
製剤は、治療有効量（例えば、真核宿主生物において疾患、障害、または感染の発症または進行を減少させる、抑制する、減衰する、軽減する、抑止する、または安定化する量）でヒト患者に投与し得る。投与する治療薬の好ましい用量は、障害の種類および程度、特定の患者の全般的な健康状態、化合物賦形剤の製剤形態、ならびにその投与経路のような変量に依存する可能性が高い。
【０２７４】
上記した適用方法のいずれかに関して、Plk-1 PBD相互作用小分子を、治療事象を必要とする部位に（例えば注射による）、または治療事象が予定される近傍の組織に、または強化した治療を必要とすることが予測される細胞に提供する血管に適用することができる。
【０２７５】
Plk-1 PBD相互作用小分子の用量は、個々の患者の大きさおよび健康を含む多くの要因に依存するが、一般に、任意の薬学的に許容される製剤形態に1日当たり0.1 mg〜1000 mgを含めて、成人に投与される。さらに、本明細書に記載したアプローチのいずれかによる治療は、より伝統的な治療法と併用してもよい。
【０２７６】
併用療法
必要に応じて、Plk-1 PBD相互作用小分子による治療は、手術、または例えば以下のものを含む化学療法薬もしくは他の抗癌剤の投与等の、増殖性疾患のより伝統的な治療法と併用してもよい：γ線照射、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、トロホスファミド(trofosfamide)、およびクロランブシル等のナイトロジェンマスタード；カルムスチンおよびロムスチン等のニトロソ尿素；ビサルファン(bisulfan)およびトレオサルファン等のアルキルスルホン酸；ダカルバジン等のトリアゼン；シスプラチンおよびカルボプラチン等の白金含有化合物）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、無水ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、パクリタクセル、およびドセタキセル）、DNAトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシド、トポテカン、9-アミノカンプトセシン、(カンプト)イリノテカン、およびクリスナトール）、マイトマイシン（例えばマイトマイシンC）、葉酸代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、トリメトレキセート、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、EICAR、ヒドロキシ尿素、およびデフェロキサミン）、ウラシル類似体（5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、およびラルチトレキセド）、シトシン類似体（シタラビン、シトシンアラビノシド、およびフルダラビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリンおよびチオグアニン）、ホルモン療法（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、メゲストロール、ゴセレリン、酢酸ロイプロリド、フルタミド、およびビカルタミド）、ビタミンD3類似体（EB 1089、CB 1093、およびKH 1060）、ベルトポルフィン(vertoporfin)、フタロシアニン、光増感剤Pc4、デメトキシ-ハイポクレリン(hypocrellin) A、インターフェロンα、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子、ロバスタチン、1-メチル-4-フェニルピリジニウムイオン、スタウロスポリン、アクチノマイシンD、ダクチノマイシン、ブレオマイシンA2、ブレオマイシンB2、アドリアマイシン、ペプロマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、およびベラパミル。
【０２７７】
他の態様
前述の説明から、本明細書に記載した発明に変更および修飾を行い、これを様々な使用法および条件に適合化し得ることは明らかである。そのような態様もまた、特許請求の範囲の範囲内である。
【０２７８】
本明細書に引用した特許および出版物はすべて、第60/426,132号を含めて、個々の出版物または特許出願が詳細にかつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
出願ファイルは、カラーで製作された図面を含む(図10、11、12、14および21)。カラー図面を含む本特許または特許出願のコピーは、要請および必要手数料の支払いに応じて特許庁より提供される。
（図１）図1Aおよび1Bは、ホスホセリン/トレオニン結合ドメインを同定するための新規なホスホモチーフに基づいたライブラリー対ライブラリースクリーンを描く。図1Aは、サイクリン依存性キナーゼおよびMAPキナーゼについてのリン酸化モチーフに、ならびにモノクローナル抗体MPM-2のエピトープに偏り、かつストレプトアビジンビーズに固定化された、ホスホトレオニン-プロリン指向型リンペプチドのライブラリーを描く。このライブラリーおよびその非リン酸化対応物は、インビトロ翻訳35S-Met標識タンパク質の680個のプールに対してスクリーニングされた。pTはホスホトレオニンを表す。Bは、アミノ酸P、L、I、V、F、M、Wの偏った混合物を表す。図1Bは、4つのSDS-PAGE/オートラジオグラフのセットである。アスタリスクで示された、WWドメイン含有タンパク質Pin1および有糸分裂キナーゼPlk-1の断片は、固定化ペプチドライブラリーのリン酸化型と優先的に会合したクローンとして2つのプールから単離された。各パネルにおいて、第一レーンは、入力放射標識タンパク質プールの10%を示すが、第二および第三レーンは、それぞれ、リン酸化および非リン酸化の固定化ライブラリーへのこのプール内のタンパク質の結合を示す。Pin1およびPlk1の同定は、それらのそれぞれのプールの単一クローンへの段階的細分化を通して行われた(右側のパネル)。矢じり形は、単離されたPlk1断片の完全長転写産物より劇的なホスホ識別を示すPlk1の部分的翻訳またはタンパク質分解的分解産物を示し、完全長転写産物がより小さい離散したホスホ結合ドメインを含む可能性が高いことを示唆している。
（図２）図2Aは、インビトロで翻訳され、図1Aのリン酸化ペプチドライブラリーへの、その非リン酸化対応物を超える選択的結合についてアッセイされた、Plk-1の様々なC末端切断を示す概略図である。Plk-1のC末端における2つの網掛け領域は、Pfamにより定義されたそのポロボックス(PB1およびPB2)に対応する。切断された構築物は、Pfamが線引きしたポロボックスの境界よりむしろポロ様キナーゼファミリー内の配列相同性の境界に従って設計された。クローン407-C6は、図1Aおよび1Bに描かれたスクリーンから単離されたPlk-1の断片である。図2Bは、ヒトPlk-1、アフリカツメガエルPlx-1およびショウジョウバエPoloのC末端非触媒性領域のアミノ酸配列アラインメントを示す。太線は、Pfamにより定義されている、Plk-1の指定されたポロボックス(PB1およびPB2)を示す。
（図３）図3A〜3Dは、Plk-1 ポロボックスドメイン(PBD)の結合比率を示すヒストグラムである。Plk-1のポロボックスドメイン(PBD、残基326位〜603位)は、GST融合タンパク質として発現され、グルタチオン-アガロースビーズ上に固定化され、配列
2007525143.tif 000097
(XはCysを除くすべてのアミノ酸を示す)
からなるホスホトレオニン/セリン指向型変性ペプチドライブラリーとインキュベートされた。広範な洗浄後、結合したペプチドは溶出され、配列決定された。棒グラフは、配列決定の所定のサイクルにおける各アミノ酸の、出発ペプチドライブラリー混合物におけるその量と比較した相対的量を示す。Plk-1 PBDは、pThr/Ser-1位におけるセリンについて強く(5.9または8.1)、pThr/Ser+1位におけるプロリンについて中程度に(1.6または1.8)、選択する。図3Eは、オートラジオグラフである。Pin1(3E)は、pThr+1位におけるプロリンの絶対必要条件を示しているが、Plk-1のPBDは示していない。完全長Pin1およびPlk-1のPBD(残基326位〜603位)は、35S-メチオニンの存在下でインビトロで翻訳され、リン酸化状態および/またはpThr+1位におけるプロリンの存在により異なる4つの固定化ペプチドライブラリーへの結合について試験された。
2007525143.tif 000098
pTはホスホトレオニンであり、Zはアミノヘキサン酸を示し、XはCysを除くすべてのアミノ酸を表し、Bはアミノ酸P、L、I、V、F、M、Wの偏った混合物である。
（図４）図4Aは、等温滴定熱量計結果を示す。これらの結果は、Plk1 PBDが高親和性および高特異性でその最適なリンペプチドリガンドを結合することを示している。図4Bは表である。等温滴定熱量計(ITC)が、Plk-1 PBD（残基326〜603位）の、その最適なリンペプチドリガンドとの、およびこのペプチドの9つの突然変異型との、会合についての結合定数(Kd)を測定するために用いられた。すべての観察された結合化学量論性は、PBDとリンペプチドの1:1複合体と一致した。N.D.B.は、少なくとも150 μMのPlk-1 PBD濃度についてITCによる検出可能な結合がないことを示す。pT、pSおよびpYは、それぞれ、ホスホトレオニン、ホスホセリンおよびホスホチロシンを表す。
（図５）図5A上部パネルは、下に示されたプルダウンアッセイ法に用いられたヒト細胞のFACS(蛍光活性化細胞ソーター)トレースを示す。上部左パネルは、G1においてアフィジコリンで停止した細胞のFACSプロファイルを示し(そのため、全DNA含有量は1Nである(N=二倍体ヒト細胞におけるDNAの正常量))、細胞がG1にあることを実証している。右のトレースは、G2/Mで捕捉するノコダゾールで停止した細胞のFACSプロファイルを示し、それらのDNA含有量が2Nであることを示し、それらがG2/Mで停止していることを実証している。図5A(下部パネル)および5Bは、Plk-1 PBDがHeLa細胞において有糸分裂ホスホタンパク質と会合することを示すイムノブロットである。アフィジコリンで間期において、またはノコダゾールでG2/Mにおいて停止した、HeLa細胞由来の溶解産物は、GST、GST-Pin1、およびGST-Plk-1 PBD(残基326位〜603位；図5A)とインキュベートされた。これらのGST融合体と共沈澱した有糸分裂ホスホタンパク質は、pSer-Pro特異的モノクローナル抗体MPM-2とのブロッティングにより検出された。GST-Plk-1 PBD(残基326位〜603位)の、ノコダゾール停止HeLa細胞由来有糸分裂ホスホタンパク質との相互作用は、GST-Plk-1 PBDと、その最適なリンペプチドリガンド、
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とのプレインキュベーションにより妨害されたが、非リン酸化等価ペプチド、
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でも、pThr-1におけるセリンがバリンへ変異しているリンペプチド(ポロボックスチド-7V；図5B)でも妨害されなかった。
（図６）図6A、6Cおよび6Dは、Plk-1 PBDがHeLa細胞由来の有糸分裂依存性リン酸化Cdc25CのThr130と相互作用することを示すイムノブロットである。図6Aは、アフィジコリンで間期において、またはノコダゾールでG2/Mにおいて停止させられ、Plk-1 PBD(残基326位〜603位)のGST融合体とインキュベートされた、HeLa細胞由来の溶解産物における抗CDC25ウエスタンブロットである。有糸分裂溶解産物由来の内因性Cdc25Cは、GST-Plk-1 PBDで沈澱し、抗Cdc25C(Santa Cruz Biotechnology)により検出された。GST-Plk-1 PBDのCdc25Cとの相互作用は、図5Bのように、GST-Plk-1 PBDと、その最適なリンペプチドリガンド(ポロボックスチド-最適)とのプレインキュベーションにより妨害されたが、ポロボックスチド-8Tまたは-7Vとでは妨害されなかった。図6Bは、Plk-1のポロボックスドメインについてのコンセンサスモチーフがヒトとアフリカツメガエルCdc25Cの間で保存されていることを示す配列アラインメントである。ヒトおよびアフリカツメガエルCdc25CのT130ならびにT138は、それぞれ、有糸分裂中にリン酸化されることが知られている(図6B)。溶解産物は、野生型、T130A、またはS129V HA-Cdc25C(ヒト)のいずれかでトランスフェクションされたHeLa細胞から調製され、G2/Mにおいてノコダゾールで停止させられ、有糸分裂的にシフトアップ型の同等負荷に対して標準化された。GST-Plk-1 PBD(残基326位〜603位)の、これらの溶解産物由来の有糸分裂的にリン酸化されたCdc25Cとの相互作用は、グルタチオンビーズでのプルダウン、11.4% SDS-PAGEおよび抗HAブロッティングによる分離により検出された(図6C)。図6Dは、溶解産物が、9% SDS-PAGEにより分析されて、Cdc25Cの過剰リン酸化(P)型の、部分的リン酸化および非リン酸化(U)型からの分離を向上させていることを示す。
（図７）図7Aは、蛍光顕微鏡を用いて可視化された1組の顕微鏡写真である。図7Bは、中心体のγ-チューブリンに対するGST-PBDによる中心体の局在化の比率を示すヒストグラムである。U2OS細胞は、G2/Mにおいてノコダゾールで停止させられ、その後、ペプチド無し(上部パネル)、250 μMの最適なリンペプチド(最適、中央パネル)、または250 μMの対応する非リン酸化類似体(8T、下部パネル)の存在下において、1 U/ml ストレプトリシン-Oを含む細胞透過化処理緩衝液中で4 μM GST-Plk-1 PBD(残基326位〜603位)とインキュベートされた。インキュベーション後、細胞は、広範に洗浄され、パラホルムアルデヒドで固定され、トリトンX-100で抽出され、GSTおよびγ-チューブリンについて免疫染色され、核を可視化するためにDAPIで対比染色された。GST(アレクサフルオール488(Alexa Fluor 488))およびγ-チューブリン(テキサスレッド)シグナルの重複は、一番右寄りの列における併合した図に示されている(図7A)。中心体のγ-チューブリンレベルに対するGST-PBDによる中心体局在化の比率は、図7Bに示されている。
（図８）Plk-1を通してのCdc25およびCdc2/サイクリンBの自己活性化の2段階活性化についてのモデルを示す概略図である。少量の抑制解除されたCdc2/サイクリンBまたは有糸分裂初期の別のプロリン方向性キナーゼのいずれかによる、Cdc25の2、3個の分子のリン酸化は、PBDを介するPlk-1の結合のためにそれらのCdc25分子を準備する。Plkk1によるPlk-1キナーゼドメインの活性化は、Cdc25活性化の第一波を生じ、Cdc2/サイクリンBをより脱リン酸化し、次にPlk-1 PBDとの相互作用のためにさらなるCdc25分子をリン酸化する。最終結果は、Cdc2/サイクリンB活性化についての正のフィードバックループである(丸で囲んで示した)。
（図９）図9Aは、溶液においてPlk1 PBD/ペプチドの結合を消失させるpT-1位のセリンにおける保存的突然変異を示す表である。等温滴定熱量計が、結合親和力を測定するために用いられた。Plk1 PBD(残基326位〜603位)は、GST融合体として大腸菌に発現され、グルタチオンアガロース上で精製され、GSTからタンパク質分解的に消化され、陰イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製された。N.D.B.は、少なくとも150 μMのPlk1 PBD濃度について検出可能な結合がないことを示す。pTは、ホスホトレオニンを表す。図9Aおよび9Bを通して、ドメインは以下のように描かれている：キナーゼ：白色；PC：灰色；PB1：赤色；PB2：青色。図9Bは、Plk1 PBD最適リンペプチド(右欄)の単一点突然変異体を含むペプチドスポットへのGST-Plk1 PBD(残基326位〜603位)の結合を示すフィルターアレイである。結合したGST-Plk1は、HRP結合型抗GST抗体でのブロッティングにより検出された。
（図１０）図10Aは、タンパク質限定加水分解によるPBDの境界を示す概略図である。完全長Plk1および安定な断片のドメイン構造(左)が、V8プロテアーゼ消化の時間経過(右)と共に示されている。限定ドメインの分子量およびアミノ酸境界は、質量分析法により測定された。図10Bは、(A)におけるように色を付けられた、ポロボックス1およびポロボックス2β6α構造が重ね合わされて示されることを示す概略図である。図10Cは、黄色のボールおよび棒の表示として示されたホスホトレオニン含有ペプチドと複合したPlk1 PBDの構造のRIBBONS表示(Carson, 1991)である。ポロボックスおよびポロキャップ領域は(A)におけるように色を付けられている。リンペプチドは、2つのポロボックスの間に形成されたポケットの一方の端に結合する。
（図１１）図11Aは、ポロボックスドメインファミリーの構造に基づく配列アラインメントを示す。100%保存をもつ残基は、紫色で網掛けされ、高度に保存された残基は、シアンブルー色で網掛けされている。図11Bは、X線結晶学により決定された構造に基づくPBDの分子表面の画像である。保存された残基に対応する表面位置は、図11Aにおいてのように色を付けられている。Plk1 PBD内の最も高度に保存された残基は、PBDのペプチド結合表面上に独占的に位置している。配色は11Aにおいてのとおりである。図11Cは、リンペプチドが棒の表示(酸素原子、赤色；窒素原子、青色)で重ね合わされた、GRASP(Nicholls et al., 1991)を用いて計算されたPBDリンペプチドポケットの静電位を描く概略図である。PBD表面の負電位は赤色に、正電位は青色に色を付けられている。図11Dは、リンペプチド(青色)とPlk1 PBDの間の相互作用の略図である。水素結合、ファンデルワールス相互作用、および水分子は、それぞれ、点線、紫色の三日月形、および緑色の円により表されている。図11Eは、リン酸とPlk1 PBDの間の直接的および間接的水素結合(点線)の略図である。水素結合の長さは、オングストロームで与えられている。
（図１２）図12Aは、Plk1 PBDとSak ポロボックス二量体のβ-サンドイッチ折り畳みの比較を示す概略図である。三次構造が、下部の二次構造トポロジー(三角形、β鎖；長方形、α-ヘリックス)と共に、上部に示されている。Plk1のPB1およびPB2は、それぞれ、赤色および紫色で表され、Plk1のPcは緑色で示されている。二量体内の別々のSak分子由来のポロボックスは、同様に、赤色および紫色で表されている。Sak βサンドイッチは、二量体内の別々のポロボックス間での鎖交換を含む。図12Bは、Plk1およびSak由来のポロボックスの配列アラインメントである。Plk1は、β6α二次トポロジーをもち、一方、Sakは、円形的変化したβ5αβトポロジーをもつ。β-シートおよびα-ヘリックス表記はPB1に従う；PB2についての対応する要素は、β7〜β12およびαCである。Sak構造的解析で最初に観察された保存された塩橋相互作用(Leung et al., Nat. Struct. Biol. 9:719-724, 2002)は、青色の角型括弧により示されている。保存された非極性残基は、青色で強調され、SakとPlk1 PBDの少なくとも1つの間で保存された残基は四角で囲われている。
（図１３）図13Aはオートラジオグラフである。野生型および突然変異体Plk1 PBD(残基326位〜603位)は、35S-メチオニンの存在下でインビトロで翻訳され、固定化されたpThr-Pro指向型ライブラリーおよびその非リン酸化対応物への結合について調べられた。
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、pTはホスホトレオニンであり、Zはアミノヘキサン酸であり、XはCysを除くすべてのアミノ酸であり、Bは、アミノ酸P、L、I、V、F、M、Wの偏った混合物を表わしている。図13Bは、等温滴定熱量計結果を示す線図である。Plk1 PBDのH538A/K540M突然変異は、等温滴定熱量計により測定されたように、その最適なリンペプチドへの結合を消失させる。図13Cは、H538/K540ピンサー（pincer）の突然変異が、単離されたPlk1 PBDのCdc25との相互作用をインビボで妨害することを示すウエスタンブロットである。HeLa細胞は、His-Xpressタグ化Plk1 PBD構築物(残基326位〜603位)の野生型および突然変異型で、または第二のポロボックス(残基326位〜506位)を欠損する対照Plk1 PBD構築物でトランスフェクションされ、G2/Mにおいてノコダゾールで停止させられた。Plk PBDは、Ni2+ビーズでプルダウンされ、結合した内因性タンパク質は、SDS-PAGEにより分析され、Cdc25についてブロッティングされた。図13Dは、Plk1 PBDにおけるH538/K540ピンサーの突然変異が、インビボで、完全長Plk1のCdc25との相互作用を妨害することを示すウエスタンブロットである。HeLa細胞は、野生型および完全長mycタグ化Plk1の突然変異型でトランスフェクションされ、G2/Mにおいてノコダゾールで停止させられた。Plk-mycは、抗myc結合ビースとともに免疫沈降し、Plk1に結合しているCdc25は、図13Cにおいてのように分析された。
（図１４）H538/K540ピンサー配列の突然変異がHeLa細胞におけるPlk1 PBDの中心体の局在化を消失させることを示す一連の顕微鏡写真である。U2OS細胞は、G2/Mにおいてノコダゾールで停止させられ、その後、1 U/ml ストレプトリシン-Oを含む細胞透過化処理緩衝液において4 μM 野生型または突然変異体GST-Plk1 PBD(残基326位〜603位)とインキュベートされた。インキュベーション後、細胞は広範に洗浄され、パラホルムアルデヒドで固定され、トリトンX-100で抽出され、GSTおよびγ-チューブリンについて免疫染色され、核を可視化するためにDAPIで対比染色された。GST(アレクサフルオール488(Alexa Fluor 488))およびγ-チューブリン(テキサスレッド)シグナルの重複は、一番右寄りの列における併合した図に示されている。
（図１５）FACS分析の結果を示す一連の線図である。HeLa細胞は、野生型および突然変異体GFPタグ化Plk1（残基326〜603位）で32時間、トランスフェクションされた。細胞は収集され、Hoechst 33342で染色され、全細胞集団におけるDNA含有量を測定するためにFACSにより分析された(左パネル)。トランスフェクションされた細胞集団に限定された同様の分析が、GFP発現細胞においてのみゲーティングすることにより行われた(右パネル)。G2/M集団パーセンテージは、3つの独立した実験からの平均である。
（図１６）図16Aは、完全長Plk1によるリンペプチド結合が、単離されたPlk1 PBDについての結合と比較して低下しているウエスタンブロットである。入力完全長Plk1(残基1位〜603位)の約10%は、非リン酸化ライブラリー類似体に対してわずかに優先して、固定化pThr-Pro指向型ライブラリーと相互作用した。His538/K540Mピンサーの突然変異により除去されるが、結合のリン酸化依存性構成要素はPBDから起こった。対照的に、単離されたPBD（図13A）によるリンペプチド結合は、10倍大きく、非常に、よりホスホ依存性であった。図16Bは、最適なPBDリンペプチドが完全長Plk1キナーゼ活性を刺激することを示すグラフである。GST-Plk1(SF9細胞において調製された)は、ATPの添加によりキナーゼ反応を開始する前に、ペプチドなしで(黒丸)、250 μMの最適なPBDリンペプチドと(白四角)、または250 μMの非リン酸化最適ペプチド対応物と(黒四角)、5分間、室温でプレインキュベートされた。カゼインへの[32P]-取り込みは、SDS-PAGE電気泳動、オートラジオグラフィーおよびデンシトメトリーにより測定された。最適なPBDリンペプチドリガンドとのプレインキュベーションは、3つの独立した実験から測定される場合、2.6の因数だけ、Plk1によるカゼインリン酸化の速度を増加させた。図16Cは、PBDによるPlk1制御についてのモデルを描く概略図である。PB1およびPB2はオレンジ色に、キナーゼドメインはシアンブルー色、リンペプチドは紫色で、リン酸を赤色にして、網掛けされている。基礎的状態におけるPBDとキナーゼドメインの間の抑制性相互作用(左)は、リンペプチド結合により解放され、また、2つのポロボックスの会合を安定化しうる(右)。
（図１７）図17Aは、ATM/ATRモチーフライブラリーを用いるホスホSer/Thr結合ドメインの同定を示すオートラジオグラフである。ATM/ATRキナーゼについてのリン酸化モチーフへ偏った、指向型(pSer/pThr)リンペプチドライブラリーは、ストレプトアビジンビーズ上に固定化された。このリンペプチドライブラリー
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およびその非リン酸化対応物は、インビトロ翻訳35S-Met標識タンパク質に対してスクリーニングされた。(pS/pT)は、50%ホスホセリンおよび50%ホスホトレオニンを表す；Zは、アミノヘキサン酸を示す；Bは、アミノ酸A、I、L、M、N、P、S、T、Vの偏った混合物を表す；およびJは25% E、75% X(Xは、Arg、Cys、HisおよびLysを除くすべてのアミノ酸を示す)の偏った混合物を表す。矢印で示されたPTIPは、固定化ペプチドライブラリーのリン酸化型と優先的に会合するクローンとしてプールEE11から単離された。各パネルにおいて、第一および第二レーンは、それぞれ、プール内のタンパク質の、リン酸化ライブラリーおよび非リン酸化ライブラリーへの結合を示す。PTIPの同定は、EE11プールの単一クローンへの段階的細分化を通して行われた(アスタリスクにより示された右側のパネル)。より長い曝露により、またホスホ識別を示すPTIPの部分的翻訳またはタンパク質分解的分解産物が明らかにされ、完全長転写産物がより小さい離散したホスホ結合ドメインを含む可能性が高いことを示唆した。最上部のバンドは、ベクターにおける上流ATGでの翻訳開始から結果として生じるベクター配列を含むPTIPの融合人工産物である。図17Bは、PTIPのホスホ結合ドメインの欠失マッピングを示すオートラジオグラフである。PTIPの切断は、インビトロで翻訳され、図17Aにおいてのように、リン酸化ペプチドライブラリーへの選択的結合についてアッセイされた。PTIPのC末端における網掛け領域は、そのBRCTドメインに対応している。切断構築物は、BRCTドメイン内の配列相同性の境界、配列アラインメントから、およびPfamが線引きしたBRCTドメインからの境界に従って設計された(Bateman et al., Nucleic Acids Res 27:260-262, 1999)。
（図１８）図18Aは、オートラジオグラフである。PTIP、BRCA1、MDC1、53BP1およびRad9タンデムBRCTドメインは、35S-メチオニンの存在下でインビトロで翻訳され、図17Aに記載されているように、固定化されたリンペプチドおよび非リンペプチドのライブラリーへの結合について試験された。用いられるペプチドライブラリーは、図17Aに定義されているpSQであった。
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、pSはホスホセリンであり、pTはホスホトレオニンであり、Zはアミノヘキサン酸を示し、XはCysを除くすべてのアミノ酸を表す。PTIPおよびBRCA1の両方のタンデムBRCTドメインは、非ホスホライブラリーと比較してpSQおよびpSライブラリーへのより強い結合を示す。ドメイン境界：図1に示されているPTIP(SEQ ID NO:26)；BRCT1および2；SEQ ID NO:27のアミノ酸1634位〜1863位；BRCT1単独：SEQ ID NO:27のアミノ酸1634位〜1751位；BRCT2単独：SEQ ID NO:27の1725位〜1863位；MDC1：SEQ ID NO:28(NP_055456.1)のアミノ酸1880位〜2089位；53BP1：SEQ ID NO:29(NP_005648.1)のアミノ酸1700位〜1972位；Rad9：SEQ ID NO:30(NP_010503.1)のアミノ酸1025位〜1309位。図18BおよびCは、PTIPおよびBRCA1 BRCTドメインが、それぞれ、(pSer/pThr)Gln+3位におけるPheに対して強い選択(7.0または7.5)を示すことを示しているオートラジオグラフである。PTIPおよびBRCA1のタンデムBRCTドメインは、グルタチオンビーズ上にグルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合タンパク質として固定化され、図17Aに記載された指向型変性リンペプチドライブラリーの非ビオチン化型とインキュベートされた。広範な洗浄後、結合したペプチドは溶出され、配列決定された。棒グラフは、(Yaffe et al., Methods Enzymol 328:157-70, 2000)に記載されているように、配列決定の所定のサイクルにおける各アミノ酸の、出発ペプチドにおける量と比較した、相対的量を示す。図18D、18E、18Fおよび18Gは、GST-PTIPおよびBRCA1タンデムBRCTドメインの、最適なBRCTドメインリンペプチド(左欄)の単一点突然変異体を含むペプチドスポットのフィルターアレイへの結合を示す。結合したGST-BRCTドメインは、HRP結合型抗GST抗体でのブロッティングにより検出された。その結果生じたコンセンサス結合モチーフは、右欄に示されている；Xは優位な選択がないことを表し、φは脂肪族または芳香族側鎖をもつ残基を表し、角括弧で囲われた文字は特に除外される。一番上の行は、最適なアミノ酸に対して置換されたアミノ酸を示す。pThrに対するpSerの置換は、PTIPおよびBRCA1の両方のBRCTドメインについての結合を増強させ、ITC結果と一致している。pThrに対するpTyrの置換は、全く結合を排除し、タンデムBRCTドメインがpSer/pThr特異的結合分子であることを立証した。Thr、SerまたはTyrでのpThrの置換は、タンデムBRCTドメイン結合を排除した。左側のpTQ指向型ブロットは、PTIPおよびBRCA1の両方のBRCTドメインについてのいくつかの位置において強い選択を示している；特に、指向型ペプチドライブラリースクリーニングデータに一致して、+3位におけるPheについてである。右側のpS指向型ブロットは、+3位がペプチド選択について最も重要な位置であることを示している。
（図１９）図19Aはウエスタンブロットである。U2OS細胞由来の溶解産物を、細胞が10 Gyの電離放射線(IR)に曝露される前、および2時間後に得た。溶解産物はGST-PTIPタンデムBRCTドメインとインキュベートされ、結合したタンパク質は、抗ATM/ATRホスホエピトープモチーフ抗体とのブロッティングにより検出された。PTIP BRCTドメインの、IR処理された細胞由来のこれらのホスホタンパク質との相互作用は、pSQペプチドライブラリーとのプレインキュベーションにより妨害されたが、SQペプチドライブラリーまたはpTPライブラリーとでは妨害されなかった。図19Bは、PTIP BRCTドメインの、IR処理されたU2OS細胞由来のDNA損傷誘導性ホスホタンパク質との相互作用が、IR曝露前のカフェイン(25 mM)で細胞を前処理することにより、または最適なBRCT結合ペプチド(BRCTチド-最適)とビーズをプレインキュベートすることにより、妨害されたが、ペプチドの非リン酸化対応物(BRCTチド-7T)とビーズをプレインキュベートすることによっては妨害されなかった。図19Cは、PTIPのタンデムBRCTドメインがDNA損傷後に53BP1と相互作用することを示しているウエスタンブロットである。IR処理されたU2OS細胞由来の内因性53BP1は、GST-PTIPタンデムBRCTドメインで沈澱し、抗53BP1抗体とインキュベートすることにより検出された。GST-PTIPタンデムBRCTドメインの、HAタグ化53BP1との相互作用は、その後、抗HAブロッティングにより検出された。この相互作用は、溶解産物をラムダホスファターゼで処理することにより、ビーズを最適なBRCT結合ペプチド(BRCTチド-最適)(しかし、その非リン酸化対応物(BRCTチド-7T)とではなかった)とプレインキュベートすることにより、またはビーズをpSQライブラリーとプレインキュベートすることにより、消失したが、SQライブラリーまたはpTPライブラリーとプレインキュベートすることによっては消失しなかった。25 mM カフェインでの細胞の処理もまた、その相互作用を妨害した。図19Dは、ウエスタンブロットである。IRから2時間後のU2OS細胞由来の溶解産物は、GST-BRCA1タンデムBRCTドメインとインキュベートされた。DNA損傷誘導性ホスホタンパク質は、抗ATM/ATRホスホエピトープモチーフ抗体とのブロッティングにより検出された。GST-BRCA1タンデムBRCTドメインのホスホタンパク質との相互作用は、パネルBにおけるように妨害された。これらの結果は、タンデムPTIPおよびBRCA1のBRCTドメインがそれらのリンペプチド結合ポケットを通してDNA損傷誘導性ホスホタンパク質と会合することを示している。
（図２０）図20A〜Cは、完全長PTIPが、DNA損傷誘導性病巣を形成し、(pSer/pThr)-Glnタンパク質、53BP1、およびγ-H2AXと共局在化することを実証しているU2OS細胞における免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。図20Aは、完全長PTIP-GFP構築物(PTIP-FL残基1位〜757位)でトランスフェクションされたU2OS細胞を示す。図20Bは、最後の2つのBRCTドメインが除去されたPTIP欠失構築物(PTIP-ΔBRCT、残基1位〜550位)でトランスフェクションされたU2OS細胞を示す。図20Cは、最後の2つのBRCTドメインのみを含むPTIP構築物((BRCT)2、残基550位〜757位)でトランスフェクションされたU2OS細胞を示す。図20A〜20Cにおいて、トランスフェクションから24時間後、細胞を10 Gyの電離放射線で処理するか、または偽照射するかのいずれかであり、2時間回復させ、染色し、免疫蛍光顕微鏡により分析した。
（図２１）図21AおよびBは、カフェインが、電離放射線に応答したDNA損傷病巣に対するPTIPの補充を減ずることを実証する、U2OS細胞における免疫蛍光を示す顕微鏡写真である。完全長PTIP-GFP cDNAでトランスフェクションされたU2OS細胞は、10 Gy 電離放射線への曝露の前に、偽処理された、または70分間10 mM カフェインで前処理された。(A)IRに応答して、偽処理されたU2OS細胞は、PTIP(緑色)およびH2AXp(赤色)を含む核病巣を形成した；これらの2つのタンパク質はDNA損傷の部位で共局在化する(併合)。(B)IRに応答して、カフェイン処理されたU2OS細胞は、核病巣の数を減少させた；PTIPは誤った局在化をして、離散的な核病巣(緑色)を形成せず、病巣を含むH2AXp(赤色)の数が減少した；カフェインでの前処理は、PTIPおよびH2Axp(併合)の共局在化を効果的に消失させた。
（図２２）PTIPアミノ酸配列を示す。
（図２３）PTIP核酸配列を示す。
（図２４）BRCA1アミノ酸配列を示す。
（図２５）BRCA1核酸配列を示す。
（図２６）MDC1アミノ酸配列を示す。
（図２７）MDC1核酸配列を示す。
（図２８）53BP1アミノ酸配列を示す。
（図２９）53BP1核酸配列を示す。
（図３０）Rad9アミノ酸配列を示す。
（図３１）Rad9核酸配列を示す。
【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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