(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は婦人科細胞増殖障害の検出、区別および予後のための方法に関し、次の工程：ａ）個体から頚膣部分泌検体を得る、ｂ）少なくとも１つまたはそれ以上のＣｐＧ位のメチル化状態を測定する、ｃ）このメチル化状態からこの個体における婦人科細胞増殖障害の存在、分類および／または予後を決定することを含む。さらに、本発明は本方法を実施するためのキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
ａ）個人から頚膣部分泌検体を得る；
ｂ）少なくとも１つまたはそれ以上のＣｐＧ位のメチル化状態を測定する；
ｃ）そのメチル化状態から前記個人の婦人科細胞増殖障害の存在、分類および／または予後を決定する；
ことを含む婦人科細胞増殖障害の検出、判別および予後のための方法。
【請求項２】
前記ＣｐＧ位はＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５、ＣＣＮＤ２、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ｈＭＬＨ１、ＨＳＰＡ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＴＩＭＰ３およびｈＴＥＲＴからなる群から選ばれる１つまたはそれ以上の遺伝子から選択される、請求項１に記載される方法。
【請求項３】
前記ＣｐＧ位は配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７からなる群から選ばれる１つまたはそれ以上の配列から選択される、請求項１に記載される方法。
【請求項４】
工程ａ）では、検体は次の方法：婦人科綿棒、吸引、頚膣部洗浄およびタンポンによる採取のうちの１つまたはそれ以上によって得る、請求項１に記載される方法。
【請求項５】
婦人科細胞増殖障害は無形成異常または低度扁平上皮内損傷、高度扁平上皮内損傷、子宮頚癌、子宮体癌およびグレード１〜３の子宮頚部上皮内異常増殖からなる群から選択される、請求項１または２に記載される方法。
【請求項６】
前記遺伝子の高メチル化は予後が悪いことに関連する、請求項１に記載される方法。
【請求項７】
工程ｂ）は、次の工程：
ａ）５−位非メチル化シトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーション特性においてシトシンと検出可能に異なる他の塩基に変換する１つまたはそれ以上の試薬で、ゲノムＤＮＡまたはその断片を処理する；
ｂ）それぞれのケースで、処理されたゲノムＤＮＡまたはその処理された断片を増幅酵素および標的核酸に相補的であるか、あるいは中低度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする長さが少なくとも９つのヌクレオチドの近接配列を含む少なくとも２つのプライマーに接触させる；
ｃ）前記増幅産物の有無またはその特性に基づいて、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態または複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態またはそれを反映する値を測定し、それによって婦人科細胞増殖障害を検出するか、あるいは婦人科細胞増殖障害を判別するか、あるいは少なくとも部分的に予後を提供することの少なくとも１つが行われる；
ことを含む、請求項１に記載される方法。
【請求項８】
工程ｂ）では、標的核酸は配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選択される、請求項７に記載される方法。
【請求項９】
それぞれのケースで、配列番号１〜５５および配列番号６４〜８３からなる群から選択される配列又はそれらの相補鎖に相補的であるか、あるいは中低度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする少なくとも９つのヌクレオチドの近接配列を含む核酸分子またはペプチド核酸分子。
【請求項１０】
前記配列は配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選択される、請求項９に記載される核酸。
【請求項１１】
前記核酸分子は、配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７に記載される対応する未処理核酸分子がＣｐＧジヌクレオチドを含む位置に、少なくとも１つのＴｐＡまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む、請求項１０に記載される核酸。
【請求項１２】
それぞれのケースで少なくともの１つの重亜硫酸塩試薬、またはメチル化高感度制限酵素：および配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選択される配列又はそれらの相補鎖に相補的であるか、あるいは中程度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件でハイブリダイズする少なくとも９つのヌクレオチドの近接配列を含む少なくとも１つの核酸分子またはペプチド核酸分子を含む被検者の婦人科細胞増殖障害を検出するか、あるいは判別するために有用なキット。
【請求項１３】
さらに、ＭＳＰ、MethyLightおよびHeavyMethylおよびこれらの組合せからなる群から選択されるメチル化分析を実施するための標準試薬を含む、請求項１２に記載されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は婦人科細胞増殖障害の検出、判別および予後のための方法に関し、次の工程：ａ）個人から頚膣部分泌検体を得る；ｂ）少なくとも１つまたはそれ以上のＣｐＧ位のメチル化状態を測定する；ｃ）このメチル化状態からこの個人における婦人科細胞増殖障害の存在、分類および／または予後を決定することを含む。さらに、本発明は本方法を実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮体癌
子宮体癌は世界中の女性の最も共通する生殖癌の１つである。最高の発生率が西洋および北アメリカで観察されている。子宮体癌の周知の危険因子としては、肥満、II型糖尿病および高血圧が挙げられる。さらに、排卵停止およびホルモン補充療法におけるエストロゲンの長期使用が子宮体癌の危険性を増加させる。子宮体癌の遺伝的原因は、遺伝性非ポリープ症大腸癌症候群の関与が存在するけれども稀であり、個人の危険性は７０歳代では累積的発生が４０％にまで昇る。２００１年にアメリカ癌学会は、エストロゲンの長期使用療法、出産未経験、不妊症または排卵不全、肥満、糖尿病または高血圧の経歴による平均的な危険性または増加する危険性をもつ女性における子宮体癌のスクリーニングを推奨するには、証拠が不十分であると結論付けた。無症候性の閉経後の女性における子宮体癌腫のスクリーニング方法の試験研究では、危険性の徴候として超音波診断により測定された子宮内膜の厚さを使用している。子宮体疾患検出のための子宮内膜生検と比較される経膣的超音波検査では、感度が９０％および特異性が４８％であって、異常性を検出するにはわずか９％の陽性予測値を示した（Langer, R.D., Pierce, J.J., O'Hanlan, K.A., Johnson, S.R., Espeland, M.A., Trabal. J.F., Barnabei, V.M., Merino, M.J., およびScully, R.E.「子宮体疾患の検出における子宮体生検に比較される経膣的超音波検査」非特許文献１）。高い危険性の女性における高感度でかつ特異的なスクリーニングテストの必要性が存在する。遺伝的異常性が子宮体癌を検出するために使用され得ることが示されている。ＤＮＡメチル化状態の変化とは、ヒト異常増殖の最も共通した分子変化である（Jones, P.A. 「ＤＮＡメチル化エラーと癌」、非特許文献２）。正常組織でメチル化されていない多数の遺伝子のＣｐＧアイランドは、複数の型のヒト癌において、種々の程度にまでメチル化されていることが、ここ４、５年にわたって著しく認識されてきている（Jones, P.A.およびLaird, P.W.「癌後生学は十分に発達している」、非特許文献３）。Ｅ−カドヘリン、大腸腺腫症ポリープ（ＡＰＣ）、ＭＬＨ１、ｐ１６、エストロゲン受容体、プロゲストロン受容体およびＰＴＥＮ（ＭＭＡＣ１）などの数種の遺伝子のプロモーター領域内のＣｐＧアイランドの異常なメチル化は、子宮体癌組織において確認されている。現在まで、子宮体癌患者の頚膣部分泌物から得られたＤＮＡのメチル化状態を評価する研究は行われていない。
【０００３】
子宮体癌の増加する危険性をもつ長期間タモキシフェン使用者は、このような癌において悪い予後を示す。これは予後良好群がより低く、かつステージがより高いことによるようである。これは特に、この下位集団の女性では、子宮体癌の早期検出の単純でかつ非侵襲性手段が緊急に必要であることを示す。
【０００４】
子宮頚癌
子宮頚部の癌は世界中の女性の重要な死因である。スクリーニングプログラムへのＰＡＰ塗抹標本の導入以来、子宮頚癌の発生率と死亡率は劇的に減少している。しかしながら、成功するスクリーニング法は、集団の適用範囲とスクリーニングテストの感度と特異性に大きく依存している。子宮頚癌およびその前駆体の検出のためのパップテスト(pap test)を調査する研究のメタアナリシスは、感度が３０％〜８７％であり、特異性が８６％〜１００％にわたることを明らかにした。疫学的および分子的研究から得た証拠を一点に集めることは、生殖ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ３）の感染が偶然にも子宮頚癌の発症に結びついていることを示唆する。したがって、ＨＰＶ ＤＮＡに関するテストが子宮頚癌スクリーニングを改良するために評価されている。多くの研究は子宮頚癌とその前駆体を検出するＨＰＶテストにおいて高い感度を示すが、特異性は通常、組織診断学に比べて低かった。繰り返し医者へ出かけるわずらわしさと費用を軽減するために、女性達が自らＨＰＶ ＤＮＡ分析のための頚膣部検体を集め、できればスクリーニングプログラムの適用範囲を増加させることが提案されている。
【０００５】
いくつかの研究は、自己採取試料と医師採取試料との間のＨＰＶ ＤＮＡ検出率を、２つの異なった採取方法間の一致点を変動させて調査した。ＨＰＶ関連病変をもつ多数の患者は浸潤癌に進行しないことから、ＨＰＶ感染に加えて他の要因もまた頚部発癌に関与することが明らかである。ＤＮＡメチル化状態の変化は、ヒト異常増殖における最も共通した分子変性である。最近、病理学的変化が増加するにつれてメチル化が増加する傾向をもって、異常なメチル化パターンが子宮頚癌の多段階病原中で見出されている（Virmani, A.K., Muller, C., Rathi, A., Zoechbauer-Mueller, S., Mathis, M., およびGazdar, A.F.「子宮頚部発癌中の異常なメチル化」、非特許文献４）。
【０００６】
Kinneyらの研究では、浸潤性子宮頚癌を有すると診断された女性の６０％以上は、健康維持機関（health  maintenance  organization）への登録にもかかわらず、スクリーニングされなかった。繰り返し医者へ通う煩わしさと費用を軽減するために、女性が自ら頚膣部検体を採取することが提案されていて、できれば、スクリーニングプラグラムの適用範囲を増加することが望まれている。自己採取試料と医師採取試料との間のＨＶＰ ＤＮＡ検出率を調査する先の研究は、２つの異なった採取方法間の種々の一致を記述していた。最近、タンポンにより採取された検体に比べて、医師指導による塗抹は２８％までのＨＰＶ−陽性女性を検出することが示された。多くの研究が医師採取試料のＨＶＰ ＤＮＡテストにより、ＳＩＬおよび子宮頚癌の検出において、ほぼ１００％の感度を明らかにしていることから見て、タンポンによる検体採取はＨＰＶ ＤＮＡ検出に適する方法ではないようである。
【０００７】
ＨＰＶ感染のほかに、遺伝的または後成的変異が悪性表現型を維持するために必要であることが提案されている。ＤＮＡメチル化状態の変化はヒト腫瘍形成の最も共通した分子変異である。最近、異常なメチル化が子宮頚部発癌において、ある役割を果たしていることが示唆されている（Virmani, A.K., Muller, C., Rathi, A., Zoechbaur-Mueller, S., Mathis, M., およびGazdar, A.F.「子宮頚部発癌中の異常なメチル化」、非特許文献５）。
【０００８】
子宮頚癌は女性の癌による死亡の主要な原因である。５年生存率は、病気の程度に依存して、１５〜８０％の範囲である。最近、いくつかの研究は子宮頚癌の再発および死亡の危険性の有意な低下を示した。これは化学療法および放射線治療の同時使用により達成された。再発の新規な予測マーカーは再発の高い危険性をもつ患者の治療を改善することによって生存率を増加させるであろう。
【０００９】
いくつかの臨床的および病理学的特性、すなわち、腫瘍段階、リンパ節転移および血管性浸潤は、再発性疾患の予後徴候要因であることが示されている。しかしながら、高リスク患者の認定および治療のための新規かつ生化学的アプローチが生存率を改善し、かつ低リスク患者の過剰治療を避けるために必要である。ＣＤＨ１およびＣＤＨ１３の遺伝子産物、すなわち、Ｅ−カドヘリンおよびＨ−カドヘリンは細胞−細胞接着において重要な役割を果たす。細胞−細胞および細胞−マトリックス接着における変化は、良性腫瘍から浸潤性悪性癌への変化、続いて腫瘍細胞の転移性播種を伴う。Ｅ−カドヘリン発現の減少または消失は、子宮頚癌を含む多くのヒト上皮性癌における共通した発見である。カドヘリン仲介細胞接着システムはいくつかのメカニズムでもって不活性化され得る。Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）ならびにＨ−カドヘリン（ＣＤＨ１３）プロモーターまたは５'−領域のＣｐＧアイランドの異常なメチル化は、減少したＥ−カドヘリンおよびＨ−カドヘリン発現となることが報告されている。多くの研究は種々の悪性度を有する患者の血漿または血清から回収したＤＮＡの腫瘍特異的変化、すなわち分子的診断と予後の潜在性を有する知見を示している。
【００１０】
Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）およびＨ−カドヘリン（ＣＤＨ１３）のような細胞接着分子発現の異常は種々の腫瘍性疾患において生じ、これらの異常は子宮頚癌を含むある種の腫瘍の進行では意味がある。腫瘍低酸素血症および壊死、ＥＧＦまたはＴＧＦ−αによる上皮生長因子受容体（ＥＧＦＲ）の刺激およびＣＤＨ１遺伝子の変異のようないくつかのメカニズムがカドヘリン下流制御において提唱されている。最近、ＣＤＨ１およびＣＤＨ１３の異常なプロモーターメチル化がＥ−カドヘリンおよびＨ−カドヘリン発現の消失または減少を生じるメカニズムの１つであると記載されている。Ｅ−カドヘリン発現の減少は、増強された転移活性またはより攻撃的な悪性腫瘍に関連していることが示されている。
【００１１】
メチル化ＤＮＡは数種の体液中の腫瘍性疾患の可能性あるスクリーニングマーカーとして研究されている（Muller, H.M.およびWidschwendter, M.「数種の体液中の腫瘍性疾患の可能性あるスクリーニングマーカーとしてのメチル化ＤＮＡ」、非特許文献６）。しかしながら、婦人科細胞増殖障害を有する患者の評価における子宮頚部分泌物から得たＤＮＡのメチル化状態を評価する研究は今までに行われていない。
【００１２】
子宮内膜疾患検出のための子宮内膜の組織診に比べて、子宮体癌診断の現在の方法、すなわち経膣的超音波検査は感度が９０％および特異性が４８％であって、異常性を検出するにはたった９％の陽性予測値を示すと推定されている。高い危険性をもつ女性のための高感度かつ特異性あるスクリーニングテストの必要性が当該分野には存在している。
【００１３】
子宮頚癌の標準的なスクリーニングテストはＰＡＰ塗抹である。有効なスクリーニングは母集団の適用範囲割合およびスクリーニングテストの感度および特異性に強く依存している。子宮頚癌およびその前駆体の検出のためのＰＡＰテストを調査する研究のメタアナリシスは、感度３０％〜８７％および特異性８６％〜１００％を明らかにした。しかしながら、前癌性状態（形成異常）を検出し、それらが進行する前にそれらを治療することを目的とするスクリーニングプログラムの成功は、しばしば社会経済的な要因によって限定されている。過去５年間に先進国ではほぼ４０％〜５０％の女性が子宮頚部形成異常においてスクリーニングされていたのに比べて、発展途上国ではたった約５％の女性がスクリーニングされていると推定される。子宮頚癌の集団、特に低い社会経済的状態の高リスク集団のスクリーニングを成功させるには、高感度、特異性、対費用効果の高いかつ自己管理可能な子宮頚癌テストが必要である。
【００１４】
子宮頚癌は多くの場合、治療可能な疾患であるが、予後がよくないこれらの患者において、再発および死亡のリスクの有意な低下が化学療法および放射線治療の同時使用により達成され得る。しかしながら、現在の予後マーカー、おもに組織学的マーカーは患者の予後の限られた徴候を示すに過ぎない。さらに、アジュバント治療により再発の危険性がない患者の治療は、不必要な副作用となりうる。したがって、子宮頚癌の検出および予後の改良された自己管理可な手段の必要性が当該分野には存在する。
【００１５】
本明細書中に使用されるように、「予後」との用語は、疾患進行の予測を意味すると解釈される。これは生存率を含む適当なパラメーターにより測定されるが、これに限定されない。これは好ましくは疾患プロセスの固有な不均一性から生じる患者の死の危険性の高低を定義することに役たつように使用される。
【００１６】
本明細書中に使用されるように、「生存」との用語は、死亡までの生存（ここで、この死亡とは関連する婦人科細胞増殖障害関連の原因に係わらない）；再発がない生存（ここで、再発との用語は局在化再発と遠隔再発の両者を含む）；転移がない生存および疾患がない生存（ここで、疾患との用語は婦人科細胞増殖障害およびこれに関連した疾患を含む）を含むと解釈される。これらの生存の長さは使用者の規定された開始点（例えば、診断または治療の開始の時点）および終止点（例えば、死亡、再発または転移）を参考にして計算される。
本明細書中に記載されるように、「頚膣部分泌物」との用語は、細胞、腺または器官から頚部または膣部領域へ分泌される全ての物質を意味すると解釈される。
【非特許文献１】Postmenopausal Estrogen/Progestin Interventions Trial. N. Engl. J. Med., 337:1792-1798, 1997
【非特許文献２】Cancer Res., 56; 2463-2467, 1996
【非特許文献３】Nat. Genet., 21; 163-167, 1999
【非特許文献４】Clin. Cancer Res., 7:584-589, 2001
【非特許文献５】Clin. Cancer Re., 7: 584-589, 2001
【非特許文献６】Expert Rev Mol Diagn, 3: 443-458, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は婦人科細胞増殖障害の検出、判別および予後のための方法に関し、次の工程：ａ）個人から頚膣部分泌検体を得る；ｂ）少なくとも１つまたはそれ以上のＣｐＧ位のメチル化状態を測定する；ｃ）このメチル化状態からこの個人における婦人科細胞増殖障害の存在、分類および／または予後を決定することを含む。さらに、本発明は本方法を実施するためのキットに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の方法は頚膣部分泌物の分析による婦人科細胞増殖障害の検出、判別および予後のための新規な高感度および特異性ある手段を提供する。これによって、本方法は医者の助けを必要とすることなく、患者による検体採取を可能とする。さらなる態様では、本発明は種々の婦人科細胞増殖障害に関連するゲノムのメチル化態様のための前記検体、特に子宮内膜または子宮頚部のものを分析する方法を提供する。さらなる態様では、本発明は婦人科細胞増殖障害の検出、判別および予後を可能とする頚膣部分泌検体の分析のための新規な核酸を提供する。さらに、本発明は婦人科細胞増殖障害の検出、判別および予後を可能とするメチル化態様の分析のための頚膣部分泌物の分析のためのキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の方法は、次の工程：
ａ）個人から頚膣部分泌検体を得る；
ｂ）少なくとも１つまたはそれ以上のＣｐＧ位のメチル化状態を測定する；
ｃ）その個人の婦人科細胞増殖障害の存在、分類および／または予後をそのメチル化状態から決定する
ことを含む。
【００２０】
頚膣部分泌物は婦人科塗抹、吸引および頚膣部洗浄を含む当該技術分野の標準的手段によって得るが、これらに限定されない。しかしながら、これらの方法のうち最も好ましい実施態様では、前記検体は個人の膣通路中へ挿入されたタンポンによって採取される。次いでタンポンを緩衝液または他の適当な溶液中に貯蔵することが好ましい。本発明の特に好ましい実施態様では、本方法のこの工程を医師あるいは他の保健専門家の助けを受けることなく前記個人によって実施する。頚膣部から得たＤＮＡを含む溶質は、次いで本方法の次の工程にて使用する。
【００２１】
自己管理された頚膣部検体採取法の利用は、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）、子宮頚癌の指標のテストとして十分に確立している。米国での研究（Harper DM, Hildesheim A, Cobb JL, Greenberg M, Vaught J, Lorincz AT, 「ヒトパピローマウイルスの採取器具」J Fam Pract. 1999, Jul; 48(7): 531-5）では、膣部タンポンを使用する医師により採取された検体と患者により採取された検体との間に診断一致率８０％が示されていた。しかしながら、この患部組織自体の分析におけるこの技術の利用は今までに発表されていない。
【００２２】
頚膣部検体またはこれらの溶液は、次いで婦人科細胞増殖障害の発生に関与する異常なメチル化パターンを検出するためにメチル化分析によって分析される。これは１つまたはそれ以上のＣｐＧ位を分析することにより可能であり、その異常なメチル化は婦人科細胞増殖障害の一態様またはその予後の徴候である。本方法の最終工程で、婦人科細胞増殖障害の存在、分類および／または予後は１つまたはそれ以上のＣｐＧ位の測定されたメチル化状態から決定される。
【００２３】
本方法の好ましい実施態様では、婦人科細胞増殖障害は無形成異常または低度の扁平上皮内病変、高度の扁平上皮内病変、子宮頚癌、子宮体癌およびグレード１〜３の子宮頚部上皮内異常増殖からなる群から選択される。
【００２４】
本方法の１つの実施態様では、前記ＣｐＧ位は、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１３、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ｈＭＬＨ１、ＨＳＰＡ２、ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ＴＩＭＰ３、ｈＴＥＲＴ、ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５およびＣＣＮＤ２および／またはそれらのプロモーター、イントロン、第１エクソン、制御因子および／またはエンハンサーからなる群から選ばれる１つまたはそれ以上の遺伝子から選択される。これらの遺伝子の配列は表７に記載される配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７からなる群から選択されることもまた本発明の別の態様である。
【００２５】
本方法の１つの実施態様では、子宮体癌は遺伝子ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５、ＣＣＮＤ２、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ｈＭＬＨ１、ＣＤＨ１３、ＨＳＰＡ２およびＳＯＣ２の１つまたはそれ以上のＣｐＧ位の分析によって他の婦人科細胞増殖障害から検出または判別される。本方法のさらなる実施態様では、これらの遺伝子の配列は表７に記載される配列番号２、３、４、５、７、６４、６５、６６および６７から選択される。
【００２６】
本方法の１つの実施態様では、子宮頚癌は遺伝子ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５、ＣＣＮＤ２、ＳＯＣＳ１、ＣＤＨ１、ＴＩＭＰ３、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ｈＴＥＲＴ、ＣＤＨ１３、ＨＳＰＡ２、ＭＬＨ１、ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＳＯＣＳ２の１つまたはそれ以上のＣｐＧ位の分析によって、他の婦人科細胞増殖障害から検出または判別される。本方法のさらなる実施態様では、これらの遺伝子の配列は表７に記載される配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７から選択される。
【００２７】
本方法のさらなる実施態様では、子宮頚癌の患者の予後は遺伝子ＣＤＨ１およびＣＤＨ１３ののうちの１つまたは両者の分析によって決定される。本方法のさらなる実施態様では、遺伝子の配列は表７に記載される配列番号１および２から選択される。遺伝子の高メチル化は患者の平均余命の悪い予後に関連している。
【００２８】
頚膣部分泌検体が本方法の工程ａ）にて患者から得られると、すぐにゲノムＤＮＡが単離される。これは市販のキットの使用を含む当該技術分野で標準的な手段によって行われる。簡単には、ここで目的のＤＮＡは細胞膜に封入されていて、生物学的試料を酵素的、化学的または機械的手段によって破壊または溶解しなければならない。次いで、ＤＮＡ溶液は例えば、プロテナーゼＫを使用する消化によってタンパクまたは他の不純物を除去する。次いで、ゲノムＤＮＡを溶液から回収する。これは塩析、有機溶媒抽出または固体相支持体へのＤＮＡの結合を含む種々の方法によって実施してもよい。方法の選択は時間、費用および要求されるＤＮＡの量を含むいくつかの要因により影響されるであろう。
【００２９】
単離されたゲノムＤＮＡは、次いでＣｐＧジヌクレオチドの異常なメチル化について分析される。これはメチル化感受性制限酵素の使用を含む当該技術分野で標準的な手段で行う。しかしながら、試料中には患部組織から得たほんの微量のＤＮＡが存在するにすぎないので、高感度の可能性ある方法を使用することが要求される。したがって、本方法の工程ｂ）は、５−位の非メチル化シトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーション特性において検出可能にシトシンと異なる他の塩基に変換する１つまたはそれ以上の試薬でゲノムＤＮＡまたはその断片を処理して実施する。この処理は好ましくは重亜硫酸塩試薬（重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩またはそれらの組合せ）により、続いてアルカリ加水分解によって実施する。分析されるべき配列は配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選ばれることが本方法の別の実施態様である。
【００３０】
処理されたゲノムＤＮＡまたはその処理された断片は、次いで好ましくは増幅酵素およびそれぞれ標的核酸に相補的であるか、あるいは中程度にストリンジェントな、あるいはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする長さが少なくとも９つのヌクレオチドである近接配列を含む少なくとも２つのプライマーと接触させる。さらに、分析されるべき配列は配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選ばれることが本方法の別の実施態様である。本方法の最終工程では、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列または複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態または平均メチル化状態を反映する値を、前記増幅産物の有無またはその特性に基づいて測定し、それによって婦人科細胞増殖障害の検出、婦人科細胞増殖障害の判別または少なくとも部分的に予後を提供することの少なくとも１つが行われる。
【００３１】
これは非メチル化ＤＮＡの高いバックグランドに対する少量のメチル化ＤＮＡの検出を可能とする当該技術分野で標準的な方法で実施される。特に、ＭＳＰ、HeavyMethyl（オリゴヌクレオチドでブロッキング）およびRealTimes分析（LightcyclerおよびMethyLight分析を含むがこれらに限定されない。）およびこれらの可能性ある組合せの全てが好ましい。
【００３２】
「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）との用語は、Hermanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826, 1996に記載される当該技術分野で認められているメチル化分析をいう。ＭＳＰ適用では、重亜硫酸塩処理ＤＮＡの増幅においてメチル化状態特異的プライマーの使用により、メチル化核酸および非メチル化核酸の判別を行うことができる。ＭＳＰプライマー対は、予め定められているメチル化状態の重亜硫酸塩処理ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、これらのプライマーの配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧジヌクレオチドのＣ−位置の３'位置に「Ｔ」を含む。増幅産物の検出からメチル化核酸の存在を決定できる。それによってＭＳＰの使用はもう一方のメチル化核酸のバックグランドに対して増幅された前もって定められたメチル化状態の核酸の検出を可能とする（本明細書の図８およびその説明を参照）。
【００３３】
HeavyMethylＲ技術では、ポリメラーゼ増幅はブロッキングオリゴヌクレオチドの使用によって助けられる。この技術は１つのメチル化状態の標的核酸の増幅をブロックするために使用され、他のメチル化状態の増幅産物核酸の相対的割合を増加させる。プライマーはメチル化特異的（「ＭＳＰ」）であるか、または非−ＣｐＧ処理標的核酸に特異的である。重亜硫酸塩処理ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、ポリメラーゼの作用によって置換されず、したがって配列の増幅をブロックするオリゴヌクレオチドブロッキングプローブによって測定される（図９）。ブロッキングオリゴヌクレオチドの非置換は５'−３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼの使用によって、ペプチド核酸オリゴマーを使用して、あるいは適当な変性オリゴヌクレオチド（例えば、遊離３'−ヒドロキシル基を欠くＤＮＡオリゴマー）を使用して実施してもよい。
【００３４】
図９はHeavyMethylＲ技術を使用したＣｐＧリッチゲノム配列に対応する重亜硫酸塩処理ＤＮＡ（「３」）のポリメラーゼ媒介増幅分析を示す。処理されたＤＮＡ（「３」）の増幅はもしもブロッキングオリゴヌクレオチド（「５」）が、実施例ケース「Ｂ」において示されるように処理されたＤＮＡにアニールするなら不可能となる。矢印（「１」）はプライマーを示し、重亜硫酸塩処理核酸鎖（「３」）上の黒丸マーカー位置（「２」）はメチル化重亜硫酸塩変換ＣｐＧ位を示す。一方、白丸マーカー位置（「４」）は非メチル化重亜硫酸塩変換位置を示す。ブロッキングオリゴヌクレオチド（ブロッカー）は黒矢印（「５」）で示される。実施例ケースＡでは、全ての被検者のゲノムＣｐＧ位はともにメチル化され、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両者はアニールして、対応する処理された核酸（「３」）の妨害を受けない増幅をもたらす。第２実施例ケース「Ｂ」では、被検者のゲノムＣｐＧ位のすべてがメチル化されず、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両者が処理ＤＮＡ配列（「３」）にアニールするが、配列を増幅することができない。なぜなら、相補鎖の合成は被検者のゲノムＤＮＡの非メチル化ＣｐＧ配列を含む相補的位置にアニールするブロッキングオリゴヌクレオチド（「５」）によってブロックされているから。
【００３５】
「リアルタイム」に基づく方法は、ＰＣＲ増幅中に処理された標的核酸にハイブリダイズする検出プローブを使用し、それによって増幅産物核酸の検出を可能とする。検出プローブは１つまたはそれ以上のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＧジヌクレオチドを含むことによってメチル化特異的標的配列にハイブリダイズするように設計してもよい。好適なリアルタイムＰＣＲに基づく方法は、当該技術分野で認められている蛍光系リアルタイムＰＣＲ技術MethyLightＴＭ（Eadsら、Cancer Res. 59:2302-2306, 1999；Lairdら、米国特許第6,331,393号；およびHeidら、Genome Res. 6:986-994, 1996）およびTaqMan分析を含む。特に好ましい態様は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチオプローブ（ＡＢＩプリズム７７００配列決定システム(Perkin Elmer Applied Biosystems, Forster City, California)を使用するTaqManＴＭＰＣＲ）を使用する蛍光系リアルタイム定量ＰＣＲ（Heidら、Genome Res. 6:986-994, 1996）の使用を含む。TaqManＴＭＰＣＲ反応は、フォワード増幅プライマーおよびリバース増幅プライマーの間に位置するＣｐＧリッチ配列にハイブリダイズするように設計されているTaqManＴＭプローブと呼ばれる非伸長性インターロゲイティング(interrogating)オリゴヌクレオチドを使用する。TaqManＴＭプローブはさらに蛍光「リポーター分子」およびTaqManＴＭオリゴヌクレオチドのヌクレオチドに結合するリンカー分子（例えば、ホスフォアミダイト）に共有結合する「失活剤分子」を含む。重亜硫酸塩処理に続く核酸内のメチル化分析では、プローブは好ましくはMethylLightＲ分析として公知である米国特許第6,331,393号（本明細書中に参考として挿入する）に記載されるようにメチル化特異的である。記載される発明に使用するのに適しているTaqManＴＭ検出方法における変更は、二重プローブ技術（LightcyclerＴＭ）または蛍光増幅プライマー（SunriseＴＭ技術）の使用を含む。
【００３６】
記載される発明はゲノム配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７から誘導される処理核酸を提供する。ここで、処理はゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの非メチル化シトシン塩基をウラシルまたはハイブリダイゼーションにおいてシトシンと検出可能に異なる他の塩基に変換するのに適している。問題であるゲノム配列は１つまたはそれ以上の連続するかあるいはランダムなメチル化ＣｐＧ位を含んでいてもよい。この処理は好ましくは、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩およびそれらの組合せからなる群から選択された試薬の使用を含む。本発明の好ましい実施態様では、対象物は配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選択される長さが少なくとも１６の隣接ヌクレオチド塩基配列を含む非天然変性核酸の分析を含む。ここで、この配列は少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＡまたはＣｐＡジヌクレオチドおよびそれらに相補的な配列を含む。配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３の配列は、配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７および配列番号６４〜配列番号６７に記載される核酸の非天然変性物を提供する。ここで、各ゲノム配列の変性は結果として、特殊であってかつ次のようにこのゲノム配列から判別される配列を有する核酸の合成となる。各センス鎖ゲノムＤＮＡ、例えば配列番号１では、４つの変換されたバージョンが記載される。第１バージョンは「Ｃ」が「Ｔ」に変換されるが、「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」のままで残る（すなわち、ゲノム配列では、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化され、したがって変換されていないケースに相当する）。第２バージョンは記載されるゲノムＤＮＡ配列の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）を記載し、ここで「Ｃ」は「Ｔ」に変換されるが、「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」のまま残る（すなわち、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化され、したがって変換されていないケースに相当する）。配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７の「アップメチル化」変換配列は配列番号１２〜配列番号３３および配列番号６８〜配列番号７５に相当する。各ゲノム配列の第３の化学的変換バージョンが提供され、ここで、「Ｃ」は「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含めて全ての「Ｃ」残基において「Ｔ」に変換され（すなわち、ゲノム配列において、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基が非メチル化されているケースに相当する）、各配列の最後の化学的変換バージョンは記載されるゲノムＤＮＡ配列の相補鎖（すなわち、アンチセンス鎖）を記載し、ここで、「Ｃ」は「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含めて全ての「Ｃ」残基において「Ｔ」に変換される（すなわち、各ゲノム配列の相補鎖（アンチセンス）において、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基が非メチル化されている）。配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７の「ダウンメチル化」変換配列は配列番号３４〜配列番号５５および配列番号７６〜配列番号８３に相当する。
【００３７】
別の好ましい実施態様では、このような分析はゲノムまたは配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３に記載される処理された（化学的に変性された）ＤＮＡ内のシトシンメチル化状態を検出するオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。これらのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３に記載される処理された核酸配列および／またはそれらに相補的な配列、または配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７および配列番号６４〜配列番号６７に記載されるゲノム配列および／またはそれらに相補的な配列に、中程度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件（上記定義される）にハイブリダイズする長さが少なくとも９つのヌクレオチドを有する核酸配列を含む。
【００３８】
すなわち、本発明は配列番号１〜配列番号５５および配列番号６４〜配列番号８３の配列の全てまたは一部分またはそれらの相補鎖に中程度にストリンジェントな、および／またはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ＰＮＡ−オリゴマー））を含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、通常、長さが少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０または３５のヌクレオチドである。しかしながら、より長い分子も有用性を有し、したがって本発明の範囲内に包含される。
【００３９】
好ましくは、本発明のハイブリダイズする核酸のハイブリダイゼーション部分は、配列番号１〜配列番号５５および配列番号６４〜配列番号８３の配列またはそれらの一部、またはそれらの相補鎖と少なくとも９５％または少なくとも９８％または１００％同一である。
【００４０】
本明細書中に記載されるタイプのハイブリダイズする核酸は、例えばプライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）、または診断および／または予後プローブまたはプライマーとして使用できる。好ましくは、核酸試料へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で実施され、プローブは標的配列と１００％同一である。核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性は融点またはＴｍとして表される。これはプローブが標的ＤＮＡから解離する温度である。この融点は要求されるストリンジェント条件を定義するために使用される。
【００４１】
好ましい実施態様では、本発明は配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選択される配列およびそれらの相補鎖に相補的であるか、あるいは中程度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする少なくとも９つのヌクレオチドの近接配列をそれぞれの場合に含む核酸分子を含み、ここで、核酸分子は配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７に記載される対応する未処理核酸分子がＣｐＧジヌクレオチドを含む位置に少なくとも１つのＴｐＡまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。このような核酸分子の好ましい長さは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５ヌクレオチドである。
【００４２】
配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７および配列番号６４〜配列番号６７の対応する配列に同一であるよりむしろ関連するか、あるいは実質的に同一である標的配列（アレル変異体またはＳＮＰなど）では、まず、均質ハイブリダイゼーションのみが特定濃度の塩（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）で生じる最低温度を確定することが有用である。それから、１％ミスマッチングはＴｍが１℃減少となると仮定して、ハイブリダイゼーション反応の最終洗浄温度をそれに合わせて低下させる（例えば、もしもプローブと＞９５％の同一性を有する配列を求めるなら、最終洗浄温度を５℃減少させる）。実際にＴｍの変化は１％ミスマッチ当たり、０．５℃〜１．５℃である。
【００４３】
例えば、配列番号１を参照するポリヌクレオチド位置によって示されるように、長さＸ（ヌクレオチド）の本発明のオリゴヌクレオチドの例としては、長さＸの連続重複オリゴヌクレオチドのセット（センスとアンチセンス）に対応するものが挙げられる。各連続重複セット内のオリゴヌクレオチド（所与のＸ値に対応）は、ヌクレオチドの位置からＺ個のオリゴヌクレオチドの有限セットとして定義される：
ｎ〜（ｎ＋（Ｘ−１））；
ここで、ｎ＝１、２、３、．．．（Ｙ−（Ｘ−１））；
ここで、Ｙは配列番号１の長さ（ヌクレオチドまたは塩基対）に等しい（３１９０）；
ここで、Ｘはセット中の各オリゴヌクレオチドの共通の長さ（ヌクレオチド）（例えば、連続重複２０−ｍｅｒのセットではＸ＝２０）；および
ここで、長さＹの所与の配列番号において長さＸの連続的重複オリゴマーの数（Ｚ）はＹ−（Ｘ−１）に等しい。例えば、配列番号１のセンスまたはアンチセンスセットのいずれかは、Ｚ＝３１９０−１９＝３１７１、ここで、Ｘ＝２０である。
好ましくは、このセットは少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含むこれらのオリゴマーに限定される。
【００４４】
本発明の２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１のポリヌクレオチドの位置によって示される次のオリゴマー：１〜２０、２〜２１、３〜２２、４〜２３、５〜２４、．．．３１７１〜３１９０のセット（およびそれらに相補的なアンチセンスセット）が挙げられる。
好ましくは、このセットは少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含むこれらのオリゴマーに限定される。
同様に、本発明の２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１のポリヌクレオチドの位置によって示される次のオリゴマー：１〜２５、２〜２６、３〜２７、４〜２８、５〜２９、．．．．．３１６４〜３１９０のセット（およびそれらに相補的なアンチセンスセット）が挙げられる。
好ましくは、このセットは少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含むこれらのオリゴマーに限定される。
【００４５】
本発明は、配列番号１〜配列番号５５および配列番号６４〜配列番号８３のそれぞれ（センスまたはアンチセンス）において、長さＸのオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの複数の連続重複セットを包含する。ここで、例えば、Ｘ＝９、１０、１７、２０、２２、２３、２５、２７、３０または３５ヌクレオチドである。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７および配列番号６４〜配列番号６７に対応するゲノム配列の遺伝的および後成的パラメーターを確認するための有用な効果的ツールを構成する。
【００４７】
特に本発明の好ましいオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチド配列（または対応する変換されたＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチド）のシトシンがオリゴヌクレオチドの３分の１の中間内に存在するものである。すなわち、オリゴヌクレオチドが例えば長さ１３塩基である場合、ＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドは５'−末端から５番目から９番目のヌクレオチド内に位置する。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた１つまたはそれ以上の分子または共役体にオリゴヌクレオチドを化学的に結合して、オリゴヌクレオチドの活性、安定性または検出を増強するように変性され得る。このような分子または共役体としては、発色団、蛍光団、コレステロールなどの脂質、コール酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル分子などが挙げられる。プローブはまた、特に好ましい対形成特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在してもよい。すなわち、オリゴヌクレオチドはペプチドなどの他の付属基を含んでいてもよく、ハイブリダイゼーション誘因開裂試薬（Krolら、BioTechniques 6:958-976, 1988）、あるいは挿入試薬（Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988）を含んでいてもよい。この目的には、オリゴヌクレオチドは他の分子、例えば発色団、蛍光団、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘因架橋剤、輸送試薬、ハイブリダイゼーション誘因開裂試薬などと結合していてもよい。
オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの当該技術分野で認められている変性糖および／または塩基分子を含んでいてもよく、または変性バックボーンまたは非天然ヌクレオシド内架橋を含んでいてもよい。
【００４９】
本発明の特定の実施態様ではオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは通常、配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７のゲノム配列またはそれらに相補的である配列のＣｐＧジヌクレオチド、または配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３に記載される処理された核酸の配列またはそれらの相補的な配列内の対応するＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＧジヌクレオチオドのそれぞれの分析のための少なくとも１つのオリゴマーを含む「セット」で使用される。しかしながら、経済的または他の要因から、これらの配列内のＣｐＧジヌクレオチドの限定された選択を分析することが好ましく、オリゴヌクレオチドのセットの内容はしたがって変化することが予期される。
【００５０】
したがって、特定の実施態様では、本発明は処理されたゲノムＤＮＡ（配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３）、またはゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７およびそれらに相補的な配列）のシトシンメチル化状態を検出するために有用である少なくとも２つ（オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー）のセットを提供する。これらのプローブは肺細胞増殖障害の遺伝的および後成的パラメーターの診断および／または分類を可能とする。オリゴマーのセットは処理されたゲノムＤＮＡ（配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３）、またはゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号１１および配列番号６４〜配列番号６７およびこれらに相補的な配列）中の一塩基多型（SNPs）を検出するために使用してもよい。
【００５１】
好ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドのセットの少なくとも１つまたはそれ以上、好ましくは、全てのものは固相に結合される。
別な実施態様では、本発明は配列番号１〜配列番号５５および配列番号６４〜配列番号８３の１つのＤＮＡ配列およびそれらに相補的な配列、またはそれらのセグメントを増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとして使用される少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットを提供する。
【００５２】
オリゴヌクレオチドは、「アレー」または「ＤＮＡチップ」の全てまたは一部（すなわち、固相に結合された異なったオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマーの配列）を構成すると予期される。異なったオリゴヌクレオチド−および／またはＰＮＡ−オリゴマー配列を有するこのようなアレーは、例えば、長方形または六角形の格子状の固相上に配列されることを特徴とする。固相表面はシリコーン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀または金から構成される。ペレット状でまたは樹脂マトリックスとして存在する、ニトロセルロースならびにナイロンなどのプラスチックも使用される。オリゴマーアレー製造の技術状態の概観は、Nature Geneticsの特別号 (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999、およびそこに引用される文献)から収集できる。蛍光標識プローブは固定化ＤＮＡアレーのスキャニングにしばしば使用される。Ｃｙ３およびＣｙ５染料の特定プローブの５'−ＯＨへの単純な結合は、蛍光標識に特に適している。ハイブリダイズしたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡により実施される。Ｃｙ３およびＣｙ５染料、さらに他の多くのものは市販されている。
【００５３】
オリゴヌクレオチドまたはそれらの特定配列は、「仮想的なアレー」の全てまたは一部を構成することも予期される。その際、オリゴヌクレオチドまたはそれらの特定配列は、例えば分析物の複雑な混合物を分析するための特殊な標識プローブの多様な集団の一部として、または組み合わせて、「指定子(specifier)」として使用される。このような方法は例えば、米国特許公開番号2003/0013091（米国出願番号09/898,743、公開日2003年１月16日）に記載される。このような方法では、十分な標識が生成し、その結果、複雑な混合物（すなわち、各分析物）中のそれぞれの核酸は固有標識に独自に結合され、したがって検出される（各標識は直接にカウントされて、混合物中の各分子種のデジタル出力となる）。本方法の最終工程では、存在の有無、分類または予後が分析されたＣｐＧ位のメチル化状態によって決定される。これは各疾患の表現型へのメチル化パターンの特徴を定義する既存のデータセットを参照して実施される。好ましくは、マーカーＣｐＧ位のメチル化状態と表現型パラメーターの相関関係が人を介在しないで実質的に見られる。機械学習アルゴリズムは実験データを自動的に分析し、その中に系統的構造を発見し、そして情報価値のないものと関連パラメーターを判別する。
【００５４】
機械学習予知者(predictor)は公知表現型分類と試料の調査されたＣｐＧ部位のメチル化パターンについて訓練されている。識別的であることを証明するＣｐＧ位は、参考データセットを規定するために使用される。この方法は癌分類において成功している（Model, F., Adorjan, P., Olek, A., およびPiepenbrock, C., Bioinformatics, 17 Suppl 1:157-164, 2001）。
【００５５】
本発明の別な態様は、被検者の婦人科細胞増殖障害を判別して検出するのに有用であるキットであり、少なくとも１つの重亜硫酸塩試薬、またはメチル化感受性制限酵素；およびそれぞれの場合、配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３からなる群から選択される配列およびそれらに相補鎖に相補的であるか、あるいは中程度にストリンジェントな、またはストリンジェントな条件下にハイブリダイズする少なくとも９つのヌクレオチドの連続した配列を含む少なくとも１つの核酸分子またはペプチド核酸分子を含む。キットはさらに、ＭＳＰ、MethylLightＲ、HeavyMethylおよびこれらの組合せからなる群から選択されるメチル化分析を実施するための標準的試薬を含む。付加的な成分としては、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドであって、それぞれの場合、これらの配列は配列番号１〜配列番号５５および配列番号６４〜配列番号８３、好ましくは配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３の配列のうち、１６ｂｐ長セグメントに相補的であるか、あるいはストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする。
【００５６】
さらに、本発明のさらなる態様は、例えば、重亜硫酸塩含有試薬；その配列が配列番号１〜配列番号５５および配列番号６４〜配列番号８３（最も好ましくは配列番号１２〜配列番号５５および配列番号６８〜配列番号８３）の配列のうち、１６−塩基長セグメントに相補的であるか、あるいはストリンジェントな、または高度にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット；オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡ−オリゴマー；ならびに記載される方法を実施し、評価する指示書を含むキットである。さらに好ましい実施態様では、前記キットはさらに、ＣｐＧ位−特異的メチル化分析を達成するための標準的試薬を含む。ここで、この分析法は１つまたはそれ以上の下記技術：ＭＳＰ、MethyLightＲ、HeavyMethylTMを含む。しかしながら、本発明に従うキットは前記成分のただ一部だけをも含んでいてもよい。
【００５７】
MethyLightＲ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なMethyLightＲ系キットに見出されるであろう）は、特定遺伝子（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）のためのＰＣＲプライマー；TaqManRプローブ；至適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド；およびＴａｑポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
ＭＳＰ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なＭＳＰ系キットに見出されるであろう）は、特定遺伝子（またはメチル化変性ＤＮＡ配列またはＣｐＧアイランド）のためのメチル化または非メチル化ＰＣＲプライマー、至適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、および特定プローブを含むが、これらに限定されない。
【００５９】
HeavyMethylＲ分析のための典型的な試薬（例えば、典型的なHeavyMethylＲ系キットに見出されるであろう）は、特定遺伝子（またはメチル化変性ＤＮＡまたはＣｐＧアイランド）のためのＰＣＲプライマー、HeavyMethylブロッキングオリゴヌクレオチド、至適化されたＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、およびポリメラーゼを含むが、これらに限定されない。
【００６０】
さらに、重亜硫酸塩変換試薬はＤＮＡ変性緩衝液；スルホン化緩衝液；ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、親和性カラム）；脱スルホン化緩衝液；およびＤＮＡ回収成分を含んでいてもよい。
【００６１】
本発明は添付する図面および配列プロトコールに関する下記実施例においてさらに記載されるであろうが、これらに限定されない。本明細書中に引用される全ての刊行物はここに参考として導入される。
【実施例１】
【００６２】
次の研究は、子宮頚膣部分泌物中のメチル化ＤＮＡを分析して子宮体癌を検出できるかどうかを決定するために実施された。
患者および試料  この研究に１２４名の患者を募った：１５名の患者は子宮体癌であり、一方、非子宮体癌群は５名の浸潤性子宮頚癌の患者、３５名の頚膣部上皮内腫瘍症の患者（ＣＩＮＩ、３例、ＣＩＮ II、１９例、ＣＩＮ III、１３例）および６９名の良性子宮疾患の患者を含んでいた。試料採取はオーストリア、インスブルック大学病院、産婦人科学部で、２００３年１月１日と２００３年５月３１日の間に行った。組織学的診断を含み、翌日に子宮の外科手術を行う予定であった患者全てに本研究に参加するように依頼した。患者の同意を得た後、試料と臨床データを集めた。標準化された試料採取を確実にするために、検鏡試験の後、医師により患者へタンポンを挿入し、３０分間、膣内に保持した。試料調製は図１に示す。
【００６３】
ＤＮＡ単離とメチル化分析  十分な量のＤＮＡを得るためにＤＮＡ抽出カラムの複数のローディングをいくつか変更する製造者のプロトコールに従い、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を使用して、試料からゲノムＤＮＡを単離した。重亜硫酸ナトリウム処理したゲノムＤＮＡを先に記載したように、MethyLight、蛍光系リアルタイムＰＣＲ分析によって分析した。簡単には、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的に設計された２つのセットのプライマーとプローブを使用した：インプットＤＮＡを基準化するために、目的遺伝子のメチル化セットと参照セット、β−アクチン（ＡＣＴＢ）を使用した。メチル化ＤＮＡの反応特異性は、ＳｓｓＩ (New England Biolabs)−処理ヒト白血球ＤＮＡ（高度メチル化）を使用して別個に確認した。特異的座位の完全メチル化分子のパーセントは、ＳｓｓＩ−処理白血球ＤＮＡのＧＥＮＥ：ＡＣＴＢ割合で、試料のＧＥＮＥ：ＡＣＴＢ割合を割り、１００倍して計算した。略語ＰＭＲ（完全メチル化基準のパーセント）はこの測定値を示す。もしもＰＭＲが＞０であるなら、遺伝子はメチル化されたと判断される。メチル化ＤＮＡに特異的であって、MethyLight反応に使用されたプライマーとプローブは、表１に示される。
【００６４】
反応条件  反応は次の分析条件で実施した：反応溶液は３００ｎＭフォワードプライマー、３００ｎＭリバースプライマーおよび１００ｎＭプローブ；プラス塩化マグネシウム；ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＤＮＡを最終反応容量３０μｌに含んでいた；サイクリング条件：９５℃、１０分間、次いで、９５℃、１５秒間を５０回、６０℃、１分間。
【００６５】
統計分析  カテゴリー変数間の関連はカイ二乗(Chi-Square)検定を使用して試験した。年齢の中央値の差は、マン・ホワイトニー(Mann-Whitney)Ｕ検定を使用し、２つ以上のグループ間の差は、クラスカル・ワーリス(Kruskal Wallis)検定を使用して試験した。子宮体癌患者群と非子宮体癌患者群の間の有意な年齢差により、整合割合１：２でもって非子宮体癌患者群の年齢整合群をランダムに選択した。整合群の計算はＭＡＴＬＡＢ  Ｒ１２（www.mathworks.com）を使用して実施した。診断の正確性を決定するために、一次元内挿を使用するノンパラメトリック受信者動作曲線（ＲＯＣ）分析を実施した。０．０５以下のＰ−値を統計的に有意であると見なした。全ての統計的計算はＳＰＳＳ、Windowsのバージョン１１．０を使用して実施した。
【００６６】
結果
子宮体癌の最初の５名の患者および良性疾患の最初の４名の患者の膣分泌物から得たＤＮＡの３８遺伝子の異常なメチル化を分析して、さらなる研究のための適当な遺伝子を決定した。我々のさらなる分析のための最も適切な遺伝子は、子宮の良性疾患患者と子宮体癌患者との間のＰＭＲ値の最も大きな差異を明らかにするものであると決定した（図２）。５つの遺伝子、すなわちＲＡＳＳＦＩＡ、ｈＭＬＨ１、ＣＤＨ１３、ＨＳＰＡ２およびＳＯＣＳ２をさらなる研究のために選択した。これらの５つの遺伝子の３つまたはそれ以上のＤＮＡメチル化は子宮体癌の５名の患者全ての頚膣部分泌物に観察された。一方、子宮体癌でない４名の患者全てはメチル化された遺伝子を全く示さないか、あるいは３つ以下の遺伝子を示した。したがって、本発明者らは５つの調査した遺伝子のうち、３つまたはそれ以上の陽性メチル化を非子宮体癌と子宮体癌の間のカットオフ値に決定した。
【００６７】
子宮体癌でない圧倒的多数の患者（１０９名のうち、９９名）は、メチル化遺伝子を全く示さなかったか、あるいは３つ以下であった。一方、１５名の子宮体癌患者の全てはその膣部分泌物に３つ以上のメチル化遺伝子を有していた（図３、Ｐ＜０．００１、カイ２検定）。３つ以上のメチル化遺伝子を有する非子宮体癌患者群の１０名の患者の組織学的試験は、浸潤性子宮頚癌（４例）、ＣＩＮ III（１例）、子宮内膜ポリープ（４例）および子宮筋腫（１例）を示した。一次外科手術（掻爬術、頚部の穿刺生検または子宮鏡手術）の後であって、二次外科手術（子宮切除）の前に、１２４名の患者のうち、１６名の試料を採取した；９／１６名の患者は子宮体癌患者であり、３／１６名はＣＩＮ IIIであり、そして４／１６名は子宮内膜の良性疾患であった。９名の子宮体癌患者の全ては、３つ以上のメチル化遺伝子を有し、３名のＣＩＮ III患者はメチル化遺伝子を示さず、良性疾患の患者のうち、１名は１つのメチル化遺伝子を示した。外科手術の前に収集された膣部分泌物の患者群中には、１名の患者が断層撮影により検出されたセロメトラ(serometra)により、頚部子宮卵管の完全な狭窄を示した。この患者は５つの試験した遺伝子のうち、３つのメチル化を示した。同定された５つの遺伝子のうちＤＮＡメチル化は統計的には有意でないが（データは示されない）、年齢とともに増加するようである。１５名全ての子宮体癌の事例と１０９名のコントロールを使用すると、ＲＯＣ曲線下の領域は０．９７３（データは示されない）であった。異常なＤＮＡメチル化が癌特異的マーカーよりもむしろ年齢の単なる代わりである可能性を除外するために、本発明者らは各子宮体癌事例における２つの非子宮体癌コントロールをランダムに年齢整合した。これらの４５名の患者の頚膣部分泌物中のＤＮＡメチル化の調査は、なおも１００％の感度および８０％の特異性を示す子宮体癌患者と子宮体癌でない患者に識別できた（Ｐ＜０．００１、カイ２検定）。
【００６８】
ＣＩＮ IIIまたは子宮頚癌の患者を除いた年齢５０歳から７５歳の患者全てを分析すると、感度は１００％であり、特異性は９７．２％まで上昇した（図４）。この群では３５の試料のうち、たった１つが擬陽性であった。
我々の研究では、子宮体癌患者の全てがメチル化された５つの調査遺伝子のうち、３つまたはそれ以上を明らかにし、一方、子宮体癌でない１０９名の患者のうち、９９名が全くメチル化された遺伝子を示さないか、あるいは３つ以下のメチル化遺伝子を示した。３つまたはそれ以上のメチル化遺伝子をもつ非子宮体癌群では、１０名の患者のうち、４名が浸潤性子宮頚癌を有していた。これらの事例はいくつかの子宮頚癌患者もこの分析では確認することができることを示す。
【００６９】
いくつかの事例（１２４のうち１６）では、試料を一次外科手術の後で、二次外科手術の前に採取した。この群では子宮体癌患者の全てが３つまたはそれ以上のメチル化遺伝子を有していた。これらの結果は異常なメチル化分析が一次外科手術の後ですら、子宮体癌を検出できることを証明する。
【００７０】
子宮体癌は高齢の婦人においてより流行性であり、非悪性組織の異常なメチル化は年齢とともに増加するから（１８）、本発明者らはこのプロジェクト内で特にこの問題を解決するために努力した。子宮体癌患者の頚膣部分泌物と年齢相当の非子宮体癌コンロトールとのＤＮＡメチル化の比較が、これらの２つの群の間の大きく有意な差異を明らかにした。
【００７１】
子宮体癌はほとんどの事例では閉経後に生じる。したがって、本発明者らはＣＩＮ IIIまたは浸潤性子宮頚癌の患者を除く年齢５０歳から７５歳の全ての患者を分析した。これらの患者は子宮体癌スクリーニングテストから恩恵を受ける群を代表する。これらの群では、子宮体癌の患者を検出する感度と特異性はそれぞれ１００％および９７．２％であった。
【００７２】
子宮体癌の増加する危険性を有する長期タモキシフェン使用者は、このような癌では予後が悪い。これは良い組織像が小さく、かつ段階が高いことによるようである。これは特にこのサブグループの婦人では、子宮体癌の早期検出の簡単で非侵襲性方法が緊急に必要であることを示す。
【実施例２】
【００７３】
本研究の目的は、ＨＰＶ ＤＮＡ試験およびタンポンにより採取された頚膣部試料から得たＤＮＡのメチル化分析が、浸潤性子宮頚癌患者を検出できるか否か、およびこれらの変化が前駆的病変にすでに存在しているか否かを試験することであった。
患者および試料  膣部上皮内異常増殖の患者３４名および浸潤性子宮頚癌の患者５名をこの研究に含めた。患者は異常なＰＡＰ塗沫または自明な膣部病変ゆえに、さらなる治療のために我々の病院へ委ねられた。患者は組織学的診断を得るために膣部の外科的組織削除(conisation)を受けるか、あるいは自明な癌性病変の事例では頚部組織診を受けた。さらに、膣部の形成異常がないが子宮筋腫ゆえに子宮切除を受けた患者１０名を調査した。全ての患者はタンポンにより採取された頚膣部検体のメチル化ＤＮＡを分析して子宮体癌を検出することが可能であるか否かを決定するために実施された先の研究（実施例１）から選ばれた。
【００７４】
試料採取
試料と臨床データは説明による同意を得た後、採取した。標準的試料採取を確実に行うために、タンポンを外科手術の前（前日）の検鏡試験後に医師によって膣中に挿入し、３０分間、膣内に保持した。試料の調製は実施例１および図１に記載した。簡単には、タンポンを除去後に５０ｍｌ試験管に移し、ＰＢＳ１．２ｍｌをタンポンに加えた。１０分間、１０００ｇで遠心分離して上清とペレットを産生した。上清の一定分量（０．２ｍｌ）をHigh Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)のワーキングソリューション０．２ｍｌと混合し、ＤＮＡ単離まで−３０℃で貯蔵した。
【００７５】
ＤＮＡ単離とメチル化分析  
十分な量のＤＮＡを得るためにＤＮＡ抽出カラムの複数負荷においていくらか変更する製造者のプロトコールに従って、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を使用して、試料からゲノムＤＮＡを単離した。重亜硫酸ナトリウム変換後、１１個の遺伝子（ＳＯＣＳ１、ＣＤＨ１、ＴＩＭＰ３、ＧＳＴＰ１、ＤＡＰＫ、ｈＴＥＲＴ、ＣＤＨ１３、ＨＳＰＡ２、ＭＬＨ１、ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＳＯＣＳ２）を先に記載したように蛍光系リアルタイムＰＣＲ MethyLight分析によるメチル化分析に付した。簡単には、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的に設計されたプライマーとプローブの２セット：目的遺伝子のためのメチル化セットおよびインプットＤＮＡを基準化するための参照セット、β−アクチン（ＡＣＴＢ）を使用した。メチル化ＤＮＡの反応特異性はＳｓｓＩ (New England Biolabs)−処理ヒト白血球ＤＮＡ（高度メチル化）を使用して別々に確認した。特異的座位の完全メチル化分子のパーセントは、ＳｓｓＩ−処理ＤＮＡのＧＥＮＥ−ＡＣＴＢ割合により試料のＧＥＮＥ−ＡＣＴＢ割合を割り、１００倍かけて計算した。その結果はＰＭＲ（percent of fully methylated reference, 完全メチル化基準のパーセント）として示される。もしもＰＭＲ値が＞０ならば、遺伝子はメチル化されたとみなされる。MethyLight反応に使用したプライマーとプローブは表２に示される。
【００７６】
MethyLight反応条件  
反応は次の分析条件により行った：反応溶液は３００ｎＭフォワードプライマー、３００ｎＭリバースプライマーおよび１００ｎＭプローブ；プラス塩化マグネシウム、ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＤＮＡを最終反応容量３０μｌ中に含む；サイクリング条件：９５℃、１０分間、次いで、９５℃、１５秒間を５０回；６０℃、１分間。
【００７７】
ＨＰＶ ＤＮＡ分析
ＨＰＶ ＰＣＲ酵素免疫分析（ＰＣＲ−ＥＩＡ）はJacobs, M.V., Snijders, P.J., van den Brule, A.J., Helmerhorst, T.J., Meijer, C.J.,およびWalboomers, J.M.「頚部擦過物における１４高−リスクおよび６低−リスクのヒトパピローマウイルス遺伝子型の迅速検出のための一般的プライマーＧＰ＋５／ＧＰ６（＋）仲介ＰＣＲ酵素免疫分析法」、J. Clin. Microbiol., 35:791-795, 1997に記載するようにして実施した。簡単には、精製された全細胞ＤＮＡ１０μｌをコンセンサスプライマーＧＰ５＋／ｂｉｏＧＰ６＋を用いるＰＣＲに使用した。反応混合物は５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１Ｕの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ、Roche, Vienna, Austria）およびそれぞれ５０ｐｍｏｌのＧＰ５＋（5-TTTGTTACTGTGGTAGATATACTAC-3、配列番号５６）およびｂｉｏＧＰ６＋プライマー（5-GAAAAATAAACTGTAAATCATATT-3、配列番号５６）のプライマー（MWG-Biotech, Ebersberg, Germany）を含んでいた。ＰＣＲサイクラー（Gene Amp PCR Cystem 9600, Perkin Elmer, Norwalk, USA）中で４０回、増幅した後、９４℃で４分間の変性工程を行った。ＨＰＶ型を決定するためにＰＣＲ産物を、Jacobsらが記載するように（上記したように）、１４の異なった高−リスクＨＰＶ型を認識する酵素免疫分析（ＥＩＡ）に付した。
【００７８】
統計的分析  
カテゴリー変数間の関連性は、ピアソンのカイ二乗（Pearson's chi square）検定（またはフィッシャーの正確確率(Fischer's exact)検定）およびマンテル・ヘンゼル(Mantel-Haenzel)検定を使用して試験した。順序変数間の相関関係は、スピアマン(Spearman)の順位相関係数を使用して評価した。臨床事例と遺伝子の無管理(unsupervised)階層クラスタリングでは、本発明者らは完全連鎖集合体法とマンハッタン距離函数を使用した。
全ての統計的計算はＳＰＳＳ、Windows用バージョン１１．０および遺伝子発現類似性パッケージソフト（http://genome.tugraz.at/Software/Genesis/Genesis.html）を使用して実施した。
【００７９】
結果
本研究は頚部形成異常のない患者、低度および高度ＳＩＬの患者および浸潤性子宮頚癌患者への膣内タンポン適用により採取した頚膣部検体をＨＰＶ ＤＮＡおよび１１遺伝子の異常メチル化について調査した。高−リスクＨＰＶ ＤＮＡは低度ＳＩＬ、高度ＳＩＬおよび浸潤性子宮頚癌でそれぞれ、２／３、２１／３１および３／５にて検出された（表３）。頚部形成異常のない患者はＨＰＶ感染を示さなかった。３種のＨＰＶ−陽性子宮頚癌は、大きな細胞扁平上皮癌であったが、一方、ＨＰＶ−陰性事例の両者は小さな細胞子宮頚癌であった。非形成異常群と低度ＳＩＬ群間の調査遺伝子のメチル化の差異は、統計的に有意でなかった。したがって、これらの２つの群から得た結果は高度ＳＩＬおよび浸潤性癌群と組み合わせて比較した。メチル化遺伝子の頻度の概要は表３に示される。ＧＳＴＰ１およびＳＯＣＳ２を除く全ての調査遺伝子は、非形成異常／低度ＳＩＬ群に比べて高度ＳＩＬおよび／または浸潤性癌で有意により頻繁にメチル化されていた。ＣＤＨ１およびＳＯＣＳ２は非形成異常／低度ＳＩＬ患者のほぼ１／４でメチル化されると判断されたが、ｈＴＥＲＴは子宮頚癌患者から得た検体でもっぱらメチル化されていた。非メチル化遺伝子はそれぞれ、非形成異常／低度ＳＩＬおよび高度ＳＩＬの患者から得た頚膣部検体の６１％および４２％に見出されたが、子宮頚癌患者は各調査試料中で５つまたはそれ以上のメチル化遺伝子を明らかにした。メチル化陽性試料のパーセントは、図５に示すように非形成異常／低度ＳＩＬから浸潤性子宮頚癌まで有意に増加する傾向を示した。ＨＰＶ陽性およびと異常な高メチル化の有意な相関性は観察されなかった（ｐ＝０．２９５、フィッシャー正確確率(Fischer's exact)検定）。ＨＰＶ ＤＮＡ−陽性試料および／または少なくとも１つのメチル化遺伝子は試料の４６％（７／１３；非形成異常／低度ＳＩＬ）、９４％（２９／３１；高度ＳＩＬ）および１００％（５／５；浸潤性癌）であった（表３）。
２つのクラスターが、試験された１１遺伝子のＤＮＡメチル化についての情報をもっぱら使用する無管理(unsupervised)階層クラスター分析によって形成された。２つのクラスターのうち、１つは５つの浸潤性癌の全てならびに２つの高度ＳＩＬを含んでいた（図３）。
【００８０】
ｈＴＥＲＴは頚部上皮内異常増殖でメチル化されると判断されなかったが、子宮頚癌患者から得た検体の８０％がメチル化されていた。この発見はｈＴＥＲＴのメチル化が頚部発癌では遅発型事象であることを示唆する。ＳＯＣＳ２およびＣＤＨ１は非形成異常／低度ＳＩＬ群の患者のほぼ１／４でメチル化され、これらの遺伝子のメチル化は頚部発癌の早期事象であることを示す。我々の結果は、メチル化陽性試料の増加するパーセントが子宮頚部の大きな病理学的変化に関連していることを明白に示し（図５）、ＨＰＶ感染に加えてメチル化が頚部発癌の重要な因子であることを示唆する。ＨＰＶ ＤＮＡ−陽性試料および／または少なくとも１つのメチル化遺伝子は高度ＳＩＬの患者試料の９０％以上、浸潤性子宮頚癌の患者では１００％に見出された。ＨＰＶ陽性と異常な高度メチル化との間の有意な相関性は観察されなかった。ＨＰＶ感染の有無にかかわらず女性の異常なメチル化は、病理学的進行または癌発生における大きなリスクをもつサブグループを同定することに役たつと推測され得る。我々の研究はタンポンで採取した試料から得たＤＮＡの種々の遺伝子のＨＰＶおよび異常な高度メチル化を検出することが可能であることを示す。本発明者らは浸潤性子宮頚癌を同定することができた。両者を組み合わせた方法は高度頚部病変を検出する。
【実施例３】
【００８１】
下記の研究では、本発明者らは予後マーカーとしての利用について、子宮頚癌患者の血清試料中のＣＤＨ１およびＣＤＨ１３のメチル化状態を調査した。
患者および試料
１９９０年〜１９９８年にインスブルック大学病院の産婦人科学部で治療した合計で９３名の浸潤性子宮頚癌患者全てをこの研究に含めた。血清試料は診断の日であって、初期治療の前に採取した。これらの血清試料は子宮頚癌患者の血清ヒトパピローマウイルスＤＮＡの存在下に調査する先の研究から得た。
【００８２】
主要な臨床的および病理学的特徴を持つ患者を表４に示す。治療は国際標準に従った。患者のいずれも併用する化学療法および放射線治療を受けなかった。我々の部門での一次治療後、すなわち、３ケ月から１年の増加する間隔で死亡または研究の最後まで全ての患者を経過観察した。経過観察期間は１ケ月から１２．４年間（平均３．５年間）にわたった。
【００８３】
ＤＮＡ単離とメチル化分析
血清試料（３００μｌ）を５５℃、一夜、ＳＤＳおよびプロテナーゼＫ（３００μｌの１％ＳＤＳ、５００μｇ／ｍｌプロテナーゼＫ）で処理した後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。ＤＮＡを８０μｌのＬｏＴＥ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび０．３ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁した。ゲノムＤＮＡの重亜硫酸ナトリウム変換は先に記載したようにして実施した。１２  重亜硫酸ナトリウム処理ゲノムＤＮＡは先に記載したように、MethyLight、蛍光系リアルタイムＰＣＲ分析によって分析した。簡単には、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的であるように設計された２セットのプライマーおよびプローブ：目的の遺伝子のためのメチル化セットおよびインプットＤＮＡを基準化するための参照セット、β−アクチン（ＡＣＴＢ）を使用した。メチル化ＤＮＡの反応の特異性はＳｓｓＩ（New England Labs）−処理ヒト白血球ＤＮＡ（高度メチル化）を使用して、別個に確認した。特異的座位で完全にメチル化された分子のパーセントは、ＳｓｓＩ−処理白血球ＤＮＡのＧＥＮＥ：ＡＣＴＢ割合でもって試料のＧＥＮＥ：ＡＣＴＢ割合を割って、１００倍して計算した。略語ＰＭＲ（percentage of fully methylated reference、完全メチル化基準のパーセント）はこの測定値を示す。各MethyLight反応では、１０μｌの重亜硫酸塩処理ゲノムＤＮＡを使用した。もしもＰＭＲ値が＞０であるなら、遺伝子はメチル化されていると判断される。各分析の再現性を証明するために、標準試料の規準値（Ｇｅｎｅ：ＡＣＴＢ）を異なったＰＣＲ流れの間で比較した。次のプライマーおよびプローブをMethyLight反応に使用した：
ＣＤＨ１：
5'-AATTTTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3'  配列番号５８（フォワードプライマー）
5'-TCCCCAAAACGAAACTAACGAC-3'  配列番号５９（リバースプライマー）
5´-FAM-CGCCCACCCGACCTCGCAT-BHQ-1-3'  配列番号６０（プローブ）
ＣＤＨ１３：
5´-AATTTCGTTCGTTTTGTGCGT-3'  配列番号６１（フォワードプライマー）
5´-CTACCCGTACCGAACGATCC-3'  配列番号６２（リバースプライマー）
5´-FAM-AACGCAAAACGCGCCCGACA-BHQ-1-3'  配列番号６３（プローブ）
【００８４】
MethyLight反応条件
反応を次の分析条件で実施した：反応溶液は３００ｎＭフォワードプライマー；３００ｎＭリバースプライマーおよび１００ｎＭプローブ；プラス塩化マグネシウム；ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＤＮＡを最終反応容量３０μｌに含む；サイクリング条件：９５℃、１０分間、次いで９５℃、１５秒間を５０回、６０℃、１分間。
【００８５】
統計分析
カテゴリー変数間の関連性をピアソンのカイ(Pearson's chi)二重検定を使用して試験した。カプラン・マイヤー(Kaplan-Meier)法を単変量生存率分析のために使用し、対数順位検定を生存曲線間の差異を評価するために使用した。コックス（Cox）比例ハザード解析を種々の変量の予後効果を評価するために使用した。０．０５以下のＰ値を統計的に有意であると見なした。これらの統計的計算はＳＰＳＳ、Windows用バージョン１１．０を使用して実施した。
【００８６】
結果
ＣＤＨ１およびＣＤＨ１３の異常なプロモーター高度メチル化は、それぞれ、４２％（９３のうち、３９）および４％（９３のうち、４）で観察された（表４）。ＣＤＨ１３メチル化陽性血清試料のうち、３つもまた、ＣＤＨ１メチル化を明らかにした。したがって、本発明者らはさらなる分析のためにＣＤＨ１および／またはＣＤＨ１３メチル化を崩壊した。ＣＤＨ１メチル化は主にＦＩＧＯ段階IIIで観察されたが、他の臨床的および病理学的パラメーター内のＣＤＨ１およびＣＤＨ１３メチル化の分布は有意な差異を示さなかった（表４）。
【００８７】
予後の有意性がＣＤＨ１および／またはＣＤＨ１３メチル化の差異に関連しているか否かを決定するために、本発明者らは子宮頚癌患者の臨床結果をＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化状態と比較した。メチル化ＣＤＨ１／ＣＤＨ１３を有する患者では、全体的生存率は低い傾向が観察された（Ｐ＝０．０９）（図７Ｂ）。治療前に採取された血清試料中にメチル化ＣＤＨ１／ＣＤＨ１３を有しない子宮頚癌患者は、メチル化ＣＤＨ１／ＣＤＨ１３を有する患者に比べて、統計的に有意な良好な無病生存期間を明らかにした（Ｐ＝０．０３）（図７Ａ）。ＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化陰性および陽性患者の平均的無病生存期間は、それぞれ、４．３年および１．２年であった。
【００８８】
非依存性の予後の有意性を評価するために、コック(Cox)比例ハザードモデル解析を、腫瘍段階、組織学、分化の程度、年齢およびＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化状態を含めて実施した。腫瘍段階および年齢に加えて、ＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化状態（Ｐ＝０．００５）のみが子宮頚癌患者の無病および全体的生存時間において非依存性の予後の有意性を有することが判明した（表５および６）。血清ＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化陽性患者はＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化陰性患者よりも再発および死亡の危険性が２倍以上であった。
【００８９】
臨床的および組織学的パラメーター内のＣＤＨ１メチル化とＣＤＨ１３メチル化の分布は、ＣＤＨ１メチル化が主に進行性ＦＩＧＯ段階で観察されたことを除いて有意な差異を示さなかった。したがって、ＦＩＧＯ段階でのＣＤＨ１メチル化の差異は観察されなかった。我々の研究で、腫瘍段階の増大に伴うＣＤＨ１のより高いメチル化頻度と再発頻度の増加に伴う血清試料中のＣＤＨ１メチル化とＣＤＨ１３メチル化の関連が、これらの結果を確認した。今まで、上記したメカニズムのみまたはこれらのメカニズムの組合せのいずれがカドヘリン発現の損失を引き起こすか否かは調査されてこなかった。種々の悪性腫瘍の患者の血漿または血清から回収したＤＮＡは一次腫瘍のメチル化のような腫瘍特異性遺伝的および後成的変化を映し出す（Ziegler A, Zangemeister-Wittke U, Stahel RA. 「循環するＤＮＡ：新規な診断の宝庫？」Cancer Treat REv 2002;28:255-71）。MethyLightのような高処理能力分析と組み合わせた簡単な採血手法がこれらのマーカーの可能性ある日常的な使用のための実現可能な入口を開く。異常なメチル化によって引き起こされるカドヘリン仲介細胞接着システムの不活性化は、ヒトの癌で共通した所見である。したがって、種々の悪性腫瘍の患者から得た血清試料中の予後パラメーターとして、ＣＤＨ１およびＣＤＨ１３メチル化の調査は興味深いであろう。我々の研究は、ＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化が子宮頚癌患者の無病および全体的生存期間の両者の非依存性予後パラメーターであることを明らかにした。
【実施例４】
【００９０】
次の研究は、遺伝子ＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５およびＣＣＮＤ２の頚膣部分泌物中のメチル化ＤＮＡを分析して、子宮体癌、卵巣癌および浸潤性子宮頚癌を検出することができるか否かを決定するために実施した。
【００９１】
患者と試料  
この研究に全体で２４名の患者を募った：４名の患者は子宮体癌であり、２名の患者は卵巣癌であり、かつ、６名の患者は子宮頚癌であった。標準化された試料採取を確保するために、検鏡検査の後、医師によりタンポンを患者中に挿入し、３０分間、膣内に保持した。試料の調製は図１に示される。
【００９２】
ＤＮＡ単離およびメチル化分析  
十分な量のＤＮＡを得るためにＤＮＡ抽出カラムの複数のローディングをいくつか変更する製造者のプロトコールに従い、High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を使用して、試料からゲノムＤＮＡを単離した。重亜硫酸ナトリウム処理したゲノムＤＮＡを先に記載したように、MethyLight、蛍光系リアルタイムＰＣＲ分析によって分析した。簡単には、重亜硫酸塩変換ＤＮＡに特異的に設計された２つのセットのプライマーとプローブを使用した：目的遺伝子のメチル化セットとインプットＤＮＡを基準化するために参照セット、β−アクチン（ＡＣＴＢ）を使用した。メチル化ＤＮＡの反応特異性は、ＳｓｓＩ (New England Biolabs)−処理ヒト白血球ＤＮＡ（高度メチル化）を使用して別個に確認した。特異的座位の完全メチル化分子のパーセントは、ＳｓｓＩ−処理白血球ＤＮＡのＧＥＮＥ：ＡＣＴＢ割合で試料のＧＥＮＥ：ＡＣＴＢ割合を割り、１００倍して計算した。略語ＰＭＲ（完全メチル化基準のパーセント）はこの測定値を示す。もしもＰＭＲ値が＞０であるなら、遺伝子はメチル化されたと判断される。メチル化ＤＮＡに特異的であって、MethyLight反応に使用されたプライマーとプローブは、表８に示される。
【００９３】
MethyLight反応条件  
この反応は次の分析条件で実施した：反応溶液は３００ｎＭフォワードプライマー、３００ｎＭリバースプライマーおよび１００ｎＭプローブ；プラス塩化マグネシウム；ｔａｑポリメラーゼ、ｄＮＴＰおよびＤＮＡを最終反応容量３０μｌに含んでいた；サイクリング条件：９５℃、１０分間、次いで、９５℃、１５秒間を５０回、６０℃、１分間。
【００９４】
統計分析  
カテゴリー変数間の関連はカイ二乗(Chi-Square)検定を使用して試験した。年齢の中央値の差は、マン・ホワイトニー(Mann-Whitney)Ｕ検定を使用し、２つ以上のグループ間の差は、クラスカル・ワーリス(Kruskal Wallis)検定を使用して試験した。子宮体癌患者群と非子宮体癌患者群の間の有意な年齢差により、整合割合１：２でもって非子宮体癌患者群の年齢整合群をランダムに選択した。整合群の計算はＭＡＴＬＡＢ  Ｒ１２（www.mathworks.com）を使用して実施した。診断の正確性を決定するために、一次元内挿を使用するノンパラメトリック受信者動作曲線（ＲＯＣ）分析を実施した。０．０５以下のＰ−値を統計的に有意であると見なした。全ての統計的計算はＳＰＳＳ、Windowsのバージョン１１．０を使用して実施した。
【００９５】
結果  
結果としては、表９参照。全ての卵巣癌患者はパネルＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５およびＣＣＮＤ２の少なくとも１つの遺伝子のメチル化を示した。全ての子宮頚癌患者はパネルＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５およびＣＣＮＤ２の少なくとも２つの遺伝子のメチル化を示し、２名の患者は全ての遺伝子のメチル化を示した。全ての子宮体癌患者はパネルＳＦＲＰ２、ＳＦＲＰ４、ＳＦＲＰ５およびＣＣＮＤ２の少なくとも２つの遺伝子のメチル化を示した。
【００９６】
【表１】
2007531512.tif 000002
【００９７】
【表２】
2007531512.tif 000003
【００９８】
【表３】
2007531512.tif 000004
【００９９】
【表４】
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【０１００】
【表５】
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【０１０１】
【表６】
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【０１０２】
【表７】
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【０１０３】
【表８】
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【０１０４】
【表９】
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【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１はタンポン挿入および試料調製手順のフローチャートを示す。Ａ−タンポン挿入Ｂ−５０ｍｌ試験管中へのタンポンの移動Ｃ−タンポン上への１．２ｍｌＰＢＳ緩衝液の添加Ｄ−１０分間、１０００ｇでの遠心分離Ｅ−（１）は上清を示し、（２）はペレットを示す。Ｆ−上清画分の０．２ｍｌの一定分量をそれぞれHigh Pure Viral Nucleic Acidキットのワーキングソリューション０．２ｍｌと混合し、ＤＮＡ単離まで−３０℃で貯蔵した。
【図２Ａ】図２A-２Jは子宮体癌でない患者（Ｎ＝４）および子宮体癌の患者（Ｎ＝５）の３８遺伝子のＰＭＲ値を示す。遺伝子ＲＡＳＳＦ１Ａ、ｈＭＬＨ１、ＣＤＨ１３、ＨＳＰＡ２およびＳＯＣＳ２は矢印で強調される。
【図２Ｂ】同上
【図２Ｃ】同上
【図２Ｄ】同上
【図２Ｅ】同上
【図２Ｆ】同上
【図２Ｇ】同上
【図２Ｈ】同上
【図２Ｉ】同上
【図２Ｊ】同上
【図３Ａ】図３A〜Kは５つの調査した遺伝子のメチル化状態（完全ボックス＝メチル化、空ボックス＝非メチル化）、状態（子宮体癌または非子宮体癌）および年齢を示す。＊は頚部上皮内異常増殖グレードIII（ＣＩＮ III）；†は浸潤性子宮頚癌を示す。
【図３Ｂ】同上
【図３Ｃ】同上
【図３Ｄ】同上
【図３Ｅ】同上
【図３Ｆ】同上
【図３Ｇ】同上
【図３Ｈ】同上
【図３Ｉ】同上
【図３Ｊ】同上
【図３Ｋ】同上
【図４】図４は年齢５０〜７５歳の患者（ＣＩＮ IIIまたは子宮頚癌の患者を除く）の膣分泌物から得たＤＮＡのメチル化分析によって子宮体癌の検出におけるＲＯＣを示す。曲線下の領域は０．９８８である。
【図５】図５は低度ＳＩＬから浸潤性子宮頚癌へ増大するメチル化の傾向を示す。組織学的タイプとメチル化遺伝子の数との統計的有意な関係（r＝０．４７、Ｐ＝０．００１）が見出された。１０または１１メチル化遺伝子の例はなかった。図５Ｂは高度ＳＩＬ（ｎ＝３１）を示す。図５Ａは低度／無形成異常ＳＩＬ（ｎ＝１３）を示し、図５Ｃは浸潤性子宮頚癌（ｎ＝５）を示す。Ｘ軸目盛りはメチル化陽性試料のパーセントを示し、Ｙ軸はメチル化遺伝子の数を示す。
【図６】図６はMethyLight技術を用いて分析された４９子宮頚膣部試料中の１１遺伝子のＤＮＡメチル化状態を示す。１つの遺伝子はもしもＰＭＲ値が＞０（材料と方法、白およびピンクはそれぞれ非メチル化およびメチル化を示す）であるなら、メチル化されていると判断される。患者群は試料群とＣｐＧ領域に対して非管理集積組織階級的クラスター分析（平均結合、マンハッタン距離）を使用して決定した。遺伝子名は図の上部に記載する。発明者らは２つのクラスター：１（赤）、２（青）を観察した。子宮頚癌の患者全ては１つのクラスター（青）にともにグループ化される。
【図７】図７は血清試料中のＣＤＨ１／ＣＤＨ１３メチル化状態によって、疾患なし（Ａ）および全体的生存（Ｂ）を示す。低部点線はメチル化試料を示し、破線上部線は非メチル化試料を示す。
【図８】図８は４つの代表的重亜硫酸塩処理ＤＮＡ鎖上で、メチル化特異的プライマーを使用してＣｐＧ−リッチ配列のポリメラーゼ媒介増幅を示す（試料事例「Ａ」〜「Ｄ」）（「ＭＳＰ増幅」）。メチル化特異的フォワードおよびリバースプライマー（「１」）はそれぞれの場合、もしも対応する目的のゲノムＣｐＧ配列がメチル化されていたなら、重亜硫酸塩処理ＤＮＡ鎖（「３」）にアニールすることができる。重亜硫酸塩処理ＤＮＡ鎖（「３」）は図の上部の代表的事例［Ａ］中に示されるように、もしもフォワードおよびリバースプライマー（「１」）がアニールするなら増幅され得る。
【図９】図９はMethyLightＲ技術を用いてＣｐＧ−リッチゲノム配列に対応する重亜硫酸塩処理ＤＮＡ（「３」）のポリメラーゼ媒介増幅分析を示す。処理ＤＮＡ（「３」）の増幅は試料事例「Ｂ」において示されるように、もしもブロッキングオリゴヌクレオチド（「５」）が処理ＤＮＡにアニールするなら除外される。
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2007531512.tif 000041
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