(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞を保存するための方法に関し、ここで、上記細胞は、基本栄養培地およびリポソームを含有する組成物中に、−１９６℃〜３７℃の範囲の温度にて保存される。上記方法は、上記リポソームが１種以上のステロールを含み、そして上記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞を保存するための簡単かつ有効な方法に関し、ここで、上記細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、本質的に分解されず、その結果、上記ＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、保存後に分析され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を保存するための方法であって、ここで、該細胞は、基本栄養培地およびリポソームを含有する組成物中に、−１９６℃〜３７℃の範囲の温度にて保存され、該方法は、該リポソームが１種以上のステロールを含み、そして該細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記細胞が、少なくとも１日間、前記組成物中に保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、少なくとも１週間、前記組成物中に保存される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、少なくとも１ヶ月間または少なくとも数ヶ月間、前記組成物中に保存される、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、少なくとも１年間または少なくとも数年間、前記組成物中に保存される、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡが、保存の間に本質的に分解されない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、保存後に、組織学的染色またはインサイチュハイブリダイゼーションによって分析され得る、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、保存後に増殖可能である。請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍組織が、前記組成物中に、４℃〜３７℃の範囲の温度にて、好ましくは室温にて保存される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、最初に、前記組成物中に室温にて保存され、そして続いて、該組成物中に−１９６℃〜０℃の範囲の温度にて保存される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、前記組成物中に室温にて少なくとも１日間保存され、そして続いて、該組成物中に−１９６℃〜０℃の範囲の温度にて少なくとも１ヶ月間保存され、そして該細胞における前記ＲＮＡおよび／またはＤＮＡが、保存の間に本質的に分解されない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞を凍結するための方法であって、ここで、該細胞は、基本栄養培地およびリポソームを含有する組成物中で凍結され、該方法は、該リポソームが１種以上のステロールを含むことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
前記基本栄養培地が、アミノ酸、塩、ビタミン、ヌクレオチド、炭水化物および抗酸化剤を含有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記基本栄養培地が、抗細菌剤を含有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポソームが、コレステロールを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、少なくとも０．００５２５ｇ／Ｌのコレステロールを含有し、そして該組成物が、酸素を用いて濃縮される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リポソームが、１種以上の増殖因子を含み、好ましくは該増殖因子が、上皮性増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来の上皮性増殖因子および／または血管内皮性増殖因子を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍細胞が、腫瘍細胞株または腫瘍組織である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍組織が、腫瘍生検または腫瘍外植片である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、ヒトまたは哺乳動物に由来する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、
（ａ）腫瘍生検がヒトに由来し；
（ｂ）該生検が、コレステロールを含むリポソームを含有する組成物中に、室温にて１〜１４日間保存され：そして
（ｃ）該生検が、続いて、該組成物中に、−１９６℃〜０℃の範囲の温度にて少なくとも１ヶ月間、好ましくは数年間保存され；
ここで、前記細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、保存の間に本質的に分解されない、
方法。
【請求項２３】
前記細胞が、保存の後に増殖可能である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を保存するための組成物の使用であって、ここで、該組成物は、基本栄養培地およびリポソームを含有し、該使用は、該リポソームが１種以上のステロールを含み、そして該細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする、使用。
【請求項２５】
腫瘍細胞、基本栄養培地およびリポソームを含有する組成物であって、該リポソームは１種以上のステロールを含む、組成物。
【請求項２６】
前記腫瘍細胞が、腫瘍生検である、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記腫瘍細胞が、腫瘍生検であり、前記リポソームが、コレステロール、ならびに１種以上の増殖因子、好ましくは上皮性増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来の上皮性増殖因子および／または血管内皮性増殖因子を含み、そして前記栄養ベースの培地が、アミノ酸、塩、ビタミン、ヌクレオチド、炭水化物、抗酸化剤を含有する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
腫瘍生検のライブラリーであって、該腫瘍生検は、別々の容器中に保存された請求項２７に記載の多くの異なる組成物を含む、腫瘍生検のライブラリー。
【請求項２９】
請求項２８に記載の腫瘍生検のライブラリーの使用であって、該ライブラリーの使用は、診断用スクリーニング法、薬物効力バリデーションのための使用および／または抗腫瘍薬物標的を同定するためにおける、使用。
【請求項３０】
腫瘍の処置のための薬学的組成物の調製のためのプロセスであって、該プロセスは、活性抗腫瘍物質のスクリーニングのための請求項２９に記載の腫瘍生検のライブラリー由来の腫瘍生検の使用を包含し、そして、従って、薬学的組成物を得るために適切な薬学的添加剤またはキャリアと同定された該活性物質を処方する工程を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、腫瘍細胞（例えば、組織サンプル、生検または外植片）を保存するための方法に関する。より詳細には、本発明は、腫瘍細胞を保存する簡単かつ有効な方法に関し、ここで、上記細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、本質的に分解されず、その結果、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、保存の後に分析され得る。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
腫瘍生検は、多くの場合、診断目的のために、および潜在的に有効な治療についての情報を得るために使用される。例えば、特定の薬物に応答する可能性のある患者は、腫瘍細胞の遺伝子発現レベルまたはパターンを分析することによって同定され得る。腫瘍成長の原因である、潜在的な変異が特徴付けられ得る。多くの試験において、腫瘍由来のＲＮＡは、例えば、逆転写酵素のポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する分析のための出発材料として使用される。しかし、残念なことに、ＲＮＡは特に不安定であることが公知である。
【０００３】
腫瘍サンプル（例えば、生検）を得た直後に必要な試験全てを行うことは必ずしも可能でないので、上記サンプルを保存する方法が必要とされる。いくつかの場合において、特定の試験のために必要なことは、しばらく後になってのみ明らかになるか、または、以前の腫瘍の分析について使用することが望まれる新たな試験が利用可能になった後にのみ明らかになる。長期間にわたって腫瘍生検を保存することが所望される。
【０００４】
従って、いくつかのアプローチが、腫瘍細胞サンプルを保存するために開発されてきた。ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅を可能にする１つの方法は、細胞または組織を液体窒素中に浸漬することによってそれらを深く凍結し、−８０℃で保存することである。ＲＮａｓｅによる分解を防止するために、上記組織は、ＲＮＡ抽出緩衝液と混合される前に凍結状態でホモジナイズされなければならない。液体窒素に対するストリンジェントな必要要件によって、上記方法は、労働集約的であり、臨床的環境で得られた組織サンプルを保存するには不適切である。
【０００５】
多くの場合、病理学的サンプルが、ホルマリン固定され、パラフィン包埋（ＦＳＰＥ）される。これらのサンプルは、組織学的分析のために使用され得るが、ＲＮＡの分析は問題を提起する。このような組織からＲＮＡを抽出するために特別な方法が開発されてきた（例えば、Ｋ．Ｄａｎｎｅｎｂｅｒｇらによって開発された方法（米国特許第６，２４８，５３５号および同第６，４２８，９６３号））。さらに、腫瘍細胞の保存方法およびＲＮＡまたはＤＮＡの回収は、非常に労働集約的である。
【０００６】
水中での保存は、タンパク質の免疫組織学的分析を可能にするが、ＲＮＡはすぐに分解されてしまう。
【０００７】
腫瘍細胞（例えば、腫瘍生検）の保存のための標準的な方法のうちの１つは、液体組成ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＡｍｂｉｏｎまたはＱｉａｇｅｎから市販されている）を使用する。米国特許第６，５２８，６４１号に記載されるように、このＲＮＡ保存培地は、サンプルおよびサンプルタンパク質におけるＲＮＡを沈殿させ、従って、ＲＮａｓｅからそのＲＮＡを保護する。この沈殿は、高塩濃度、代表的には硫酸アンモニウムによって引き起こされる。
【０００８】
ＲＮＡｌａｔｅｒは、組織からＲＮＡを抽出してその後に分析するために適切（Ｗ−Ｈ．Ｗａｎｇら（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，第７巻：８９〜９４）なだけでなく、組織学的にまたは免疫組織学的に分析されなければならない組織サンプルを保存することにもまた適切である（Ｓ．Ｒ．Ｆｌｏｒｅｌｌら（２００１），Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，第１４（２）巻：１１６〜１２８）。しかし、これらのアプローチは、保存されるサンプル中で細胞を直接的に死滅させる。
【０００９】
細胞の生存度を維持することは、例えば、得られた組織サンプルのサイズの限界を克服するために有用である。培養物中に細胞を入れることは、その細胞を増殖することを可能にする。それから、細胞の生物学的機能を、後ほどの時点で（上記培養物から直接的にか、またはさらなる培養のために細胞を凍結および解凍した後のいずれか）アッセイを行うこともまた、可能である。
【００１０】
生存度を維持することは、移植用の器官を保存するために非常に重要である。器官の灌流および保存のために開発された溶液のいくつかもまた、組織を保存するか、または細胞を培養するのに適切であり得ると認識された。例えば、米国特許第５，５９９，６５９号は、例えば、網膜由来の線維芽細胞増殖因子、シクロデキストリンおよびコンドロイチン硫酸を含有する、化学的に定義された細胞培養培地が、器官または組織、または血管内皮細胞の培養物の保存のために使用され得ると開示する。
【００１１】
ＷＯ９３／０９２２０は、必要に応じて成長促進剤（例えば、ヘム、ヘミン、ＩＬ−３、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＧＦまたはレチノイド）を含む、定義された基本培養培地を言及し、上記成長促進剤は、造血性前駆細胞または白血病細胞の維持および成長のために使用され得る。
【００１２】
米国特許第６，００４，５７９号および同第６，４９５，５３２号は、アポトーシスの阻害のために、リゾフォスファチジン酸を有するリポソームを含有する液体組成物を使用することを提唱する。しかし、これらの組成物は、腫瘍細胞を保存するためには理想的でなく、そしてさらに欠点（例えば、組織へのリン脂質の取り込み）を有する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
さらに、一方で器官、健康または病理学的な組織サンプルおよび他方で細胞は、酸素に対する必要条件において異なり、そして器官の生存度を維持するために必要とされる部分酸素圧は、組織サンプルまたは細胞をかなり損傷し得る。従って、本発明の根底にある課題は、腫瘍細胞を保存するために容易かつ有効な方法であって、保存後に腫瘍細胞の分析を可能にする方法を提供することに存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（本発明）
従って、本発明は、細胞を保存するための方法を提供し、ここで、上記細胞は、ベースの栄養倍地およびリポソームを含有する組成物中で−１９６℃〜３７℃の範囲の温度にて保存され、上記方法は、上記リポソームが１種以上のステロールを含み、そして上記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする。
【００１５】
本発明は、驚くべきことに、腫瘍細胞が、１種以上のステロールを含むリポソームを含有する基本栄養培地中で長期間、上記細胞を本質的に損傷することも上記細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡを分解することもなく、保存され得ることを見出した。本発明の方法は、腫瘍細胞（例えば、腫瘍生検）が、単一の組成物中で、室温にて、数日間および数週間までも保存され得るという、特別な利点を有する。従って、患者から得られた腫瘍生検は、長期間保存され得、そして分析され得る。腫瘍生検はさらに、同じ組成物中に凍結状態で保存され得る。これは、腫瘍生検のライブラリーの作成を可能にし、これは、薬物標的同定および種々の薬学的研究目的のために使用され得る。腫瘍ライブラリーの作成は、例えば、特定の薬物処置で処置された患者の応答と腫瘍サンプルの詳細な分子分析とを相関させる。これは、同じ腫瘍型を有する他の患者に対して最適な処置方針を有意に簡潔にする。
【００１６】
上記細胞は、本発明の方法に従う組成物中で、長期間保存され得るが、好ましくは、少なくとも１日間、または数日間から数年間までの期間、保存される。
【００１７】
本発明の特別に好ましい実施形態に従って、上記細胞は、本願方法で、細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡが保存の間に本質的に分解されない様式で、保存され得る。これは、腫瘍細胞の発現パターンの完全な分析、および腫瘍型の分類を可能にする。本願適用に従って、用語「細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、保存の間に本質的に分解されない」とは、保存後の細胞と保存前の細胞とにおけるそれぞれの分子型の比較は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの６０％よりも多くが、そのときでもまだ分析され得ることを示すことを意味する。例えば、ＲＴ−ＰＣＲにより、特定のＲＮＡ（例えば、目的の組織において発現される公知のハウスキーピング遺伝子をコードするＲＮＡ）の濃度の分析によって、保存される前の腫瘍サンプルの性質を分析することが可能である。保存の後に、上記試験が繰り返される。上記分析が、保存後の増幅産物が保存前の増幅産物の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％になると明らかにする場合、上記ＲＮＡは、本出願中のこの用語の使用に従って、保存の間に本質的に分解されていない。
【００１８】
あるいはまたはさらに、上記細胞のタンパク質発現プロファイルは、当該分野で公知のタンパク質を分析するための多くの方法のうちの任意のものを使用して分析され得る。さらに、上記タンパク質は、保存の間に実質的に分解されないことが好ましい。上記細胞は、保存後に、組織学的染色またはインサイチュハイブリダイゼーションによって、さらに分析され得る。
【００１９】
本発明の特に好ましい実施形態に従って、上記腫瘍細胞は、それらが保存後もまだなお増幅可能であるような様式で保存され得る。この目的のために、上記腫瘍細胞は、必要に応じて組織から単離され得、そして周知の技術に従って、細胞培養倍地中で増殖され得る。腫瘍細胞の保存のために使用される組成物は、有利に、腫瘍細胞の増殖のためにも使用され得る。
【００２０】
本発明の１つの局面に従って、細胞を保存するための方法は、上記細胞が最初に上記組成物中で室温にて保存され、そして続いて上記組成物中で−１９６℃〜０℃の範囲の温度にて保存される工程を包含する。さらに好ましい実施形態に従って、上記細胞は、上記組成物中で室温にて１〜１４日間保存され、続いて上記組成物中で−１９６℃〜０℃の範囲の温度にて少なくとも１ヶ月間、好ましくは数年間保存され、ここで、上記細胞におけるＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、保存の間に本質的に分解されない。室温での保存の間、上記組成物は、上記栄養分が使い果たされた場合（例えば、３日毎）に交換され得、これは、上記細胞の生存度を高める。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、任意の細胞型の細胞を凍結するため、およびそれらを凍結状態で保存するための方法を提供し、ここで、上記細胞は、基本栄養培地およびリポソームを含有する組成物中で凍結され、上記方法は、上記リポソームが１種以上のステロールを含むことを特徴とする。細胞をすぐに本願組成物中で凍結することは、上記細胞の生存度に実質的に影響を与えることなく可能である。なぜなら、おそらく、上記組成物が、上記細胞の結晶化を阻害または低減するからである。この理由のために、ＤＭＳＯまたはＨＥＳのような添加剤が、凍結または解凍の間に上記細胞の生存度を維持するために上記組成物に添加される必要はない。これは、上記方法を、ＤＭＳＯの毒性が問題となる場合（例えば、感受性の細胞に対して）に特に適切にする。
【００２２】
従って、上記組成物は、好ましくは、凍結防止剤（例えば、ＨＥＳ（ヒドロキシエチルデンプン）、グリセロール、アラビノガラクタン、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはエチレングリコール）を含有しない。好ましくは、上記組成物は、血清または不確定のタンパク質を含まない。
【００２３】
好ましい実施形態において、凍結の前に、上記細胞は、室温にて、上記組成物中で、１週間までまたは７２時間まで保存される。あるいは、上記細胞はまた、凍結の前に４℃にて保存され得る。
【００２４】
上記細胞は、当業者に一般的に使用される方法によって、凍結または解凍され得る。従って、本発明の方法を実施するためには特別な凍結プロトコルまたは解凍プロトコルは必要でないが、上記細胞は、好ましくは、６０分間にわたって−１２０℃に凍結され、次いで、液体窒素に移される。好ましい実施形態に従って、上記細胞は、以下の凍結プロトコルによって、コンピュータ制御の冷却ブロックを使用して、凍結される：最初に、上記組織は１５分間４℃で保持され、その後、−９９℃／分の速度で−５℃に、−０．５℃／分で−７℃に、−３０℃／分で−６０℃に、−８．４℃／分で−１８℃に凍結され、−１８℃で３分間保持され、−２℃／分で−４０℃に、−４℃／分で−８０℃に、−１０℃／分で−１２０℃に凍結され、その後、液体窒素中で、−１７０℃と−１９６℃との間の温度に凍結される。
【００２５】
好ましくは、上記組成物中での細胞の長期間の保存のための温度は、−１７０℃〜−１９６℃である。細胞は、好ましくは、例えば、「Ｂｉｏｓａｆｅ」凍結タンク中の液体窒素中で保存される。
【００２６】
本発明に従って、用語「基本栄養培地」とは、アミノ酸、塩、ビタミン、ヌクレオチド、炭水化物および／または抗酸化剤を含有する組成物をいう。上記基本栄養培地は、代表的には、液体組成物である。
【００２７】
本発明の方法で使用される培地は、さらに、任意の数の化合物を含み、この化合物もまた、腫瘍細胞の保存に適切である。詳細には、上記培地は、１種以上の抗細菌剤および／または増殖因子を含むことが好ましい。さらに好ましい実施形態に従って、上記増殖因子は、上皮性増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来の上皮性増殖因子および／または血管内皮性増殖因子を含む。上記組成物は、好ましくは、いかなるリゾホスホチジン酸を含まない。
【００２８】
水ベースの溶液中のリポソームは、上で述べたように、脂質ベシクルとして存在し、同心性脂質二重層が親水性コアを包んでいる（Ｅｄ．：Ｆａｌｂｅ，Ｒｅｇｉｔｚ，Ｒｏｍｐｐ−Ｃｈｅｍｉｅ−Ｌｅｘｉｋｏｎ，１９９０，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）。
【００２９】
本発明の方法で使用される組成物中のリポソームは、１種以上のステロールを含む。好ましくは、上記ステロールは、コレステロールを含む。
【００３０】
特に好ましい実施形態に従うと、本発明の方法は、Ｌｉｆｏｒｌａｂ組成物（以下の表１〜４に記載されるような物質を含有する）を使用して実行される。
【００３１】
上記腫瘍細胞は、腫瘍細胞株、または腫瘍組織（例えば、腫瘍生検または腫瘍外植片）に由来する腫瘍細胞のような任意の腫瘍細胞であり得る。好ましい実施形態に従うと、上記腫瘍細胞は、腫瘍生検である。
【００３２】
上記腫瘍細胞は、好ましくは、ヒトまたは哺乳動物に由来し、上記腫瘍は、好ましくは、固形腫瘍（例えば、メラノーマまたは腎臓細胞、胃癌、乳癌、食道癌または結腸癌）である。
【００３３】
さらに好ましい実施形態に従うと、本発明の方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）腫瘍生検は、ヒトに由来する；
（ｂ）上記生検は、室温で１〜１４日間、コレステロールを含むリポソームを含有する組成物中に保存される；そして
（ｃ）上記生検は、−１９６℃および０℃の範囲の温度で少なくとも１ヶ月間（好ましくは、数年間）上記組成物中に実質的に貯蔵される；工程、
であって、細胞内のＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、貯蔵の間本質的に分解されない、工程。好ましくは、上記細胞は、貯蔵後も依然増殖し得る。
【００３４】
このような手順は、外植した直後に腫瘍生検の特に好都合な収集、宅配便または普通郵便（室温で）を通じた診断試験室への上記腫瘍生検の運送および／または凍結状態での上記腫瘍生検の長期貯蔵、ならびに腫瘍型を、特定の薬物処置に応答する患者に関係づけるための腫瘍型の分析を可能とする。
【００３５】
このような貯蔵のさらなる利点は、これにより、同一個体の可能性がある補充した非腫瘍組織と比較して腫瘍サンプルのゲノム分析およびプロテオーム分析がなされるということである。非腫瘍組織は、新しい生検からのものでもよいし、腫瘍サンプルと同時に貯蔵されるものでもよい。
【００３６】
さらなる局面に従うと、本発明は、貯蔵細胞のための組成物の使用に関し、ここで、上記組成物は、上で規定されるような基本栄養培地およびリポソーム（これは、上記リポソームが１種以上のステロールを含み、かつ上記細胞は腫瘍細胞であることを特徴とする）を含有する。
【００３７】
さらなる局面において、本発明は、腫瘍細胞、基本栄養培地およびリポソーム（このリポソームは、１種以上のステロールを含む）を含有する組成物に関する。この組成物中の腫瘍細胞は、好ましくは、腫瘍生検である。
【００３８】
好ましい実施形態に従うと、上記組成物は、腫瘍生検、リポソーム（これは、コレステロールおよび１種以上の増殖因子（好ましくは、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来上皮増殖因子および／または血管内皮増殖因子）を含む）および基本栄養培地（これは、アミノ酸、塩、ビタミン、ヌクレオチド、炭水化物、酸化防止剤を含む）を含有する。
【００３９】
関連する局面において、本発明は、上で規定されるような組成物中に多くの種々の生検を含む腫瘍生検のライブラリーに関し、このライブラリーは、別々の容器に貯蔵される。
【００４０】
本発明は、さらに、診断スクリーニング法、薬物効力の確証および／または抗腫瘍薬の標的を同定するための方法のための、各々の腫瘍生検ライブラリーの使用に関する。
【００４１】
例えば、腫瘍生検のライブラリーからの細胞は、解凍され得、培養にしかけられ得、ヌードマウスに移植され得る。従って、これらの細胞は、一方で、特定の薬物がこの特定の腫瘍で有効であるか否かを試験するための、他方で、特定の腫瘍に対して潜在的な活性物質のライブラリーをスクリーニングするための薬物スクリーニングに利用可能である。薬物は、上記腫瘍（例えば、上記腫瘍の増殖が遅い場合）に対して有効であると考えられ、上記薬物で処置されないコントロール動物と比較した場合、転移数はより少ないか、上記腫瘍はマウスの有意な割合において、部分的または全体的に退縮する。
【００４２】
この実施形態に従うと、本発明は、腫瘍の処置のための薬学的組成物の調製のためのプロセスに関し、このプロセスは、活性のある抗腫瘍物質をスクリーニングするための請求項２８に記載の腫瘍生検のライブラリーに由来する腫瘍生検の使用、および適切な薬学的添加物またはキャリアとともに、このようにして同定される活性物質を処方して薬学的組成物を得ることを包含する。
【００４３】
一般的な局面において、本発明は、腫瘍組織を貯蔵し、安定化するための２相液体組成物の使用を提供し、ここで、この液体組成物の第一相は、基本栄養培地を含み、第二相は、リポソームを含む。この基本栄養培地は、生理学的に適合性のある濃度の水溶性栄養物または水分散性栄養物および生理学的な塩（例えば、アミノ酸、塩、ビタミン、ヌクレオチド、炭水化物および酸化防止剤）を含む。第二相のリポソームは、ステロール（好ましくは、コレステロール）および必要に応じて、脂肪酸および細胞増殖因子を含むナノ粒子である。上記リポソームの想定される構造は、外側の親油性被覆と内側の親水性コアとを備える。
【００４４】
本発明において使用される上記２相組成物は、少なくとも約３００ｍＯＳＭ／ｋｇの浸透圧を有する。好ましくは、上記２相組成物は、約３８５〜４２５ｍＯＳＭ／ｋｇの範囲の浸透圧を有する。上記２相組成物のｐＨは、好ましくは、約７．２〜約７．４である。上記ナノ粒子は、好ましくは、約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、より好ましくは、約１００ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。
【００４５】
本発明で使用される組成物は、水溶性培地で溶解されたか、または分散された、微量元素、単純炭水化物、緩衝液、血漿増量剤、エネルギー基質、キサンチンオキシダーゼインヒビターなどを含有し得る。
【００４６】
好ましい実施形態において、上記基本栄養培地は、生理学的に適切な濃度の、塩、水溶性ビタミン、アミノ酸およびヌクレオチドを含む。これらは、単純に一例として、限定するわけではないが、アデノシンおよびそのリン酸塩、ウリジンおよびそのリン酸塩、他のヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチド；ビタミンＢ（例えば、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸など）；ビタミン補酵素およびビタミン補助因子（例えば、ニコチンアミドおよびフラビンアデニンジヌクレオチド、ならびにそれらの各々のリン酸塩、補酵素Ａなど）；種々の生理学的な塩および微量無機化合物（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、銅、亜鉛および鉄の塩）；必須アミノ酸（全部で２０種の天然に存在するアミノ酸）を含み得、そして／または必要に応じて、これらの誘導体が含まれ得る。この基本培地はまた、例えば、ｐＨ緩衝液（例えば、リン酸緩衝液およびＮ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（「ＨＥＰＥＳ」）緩衝液）；単糖（例えば、グルコース）；浸透圧増強剤（例えば、任意の適切なデキストラン、マンノースなど）；ならびに任意のその他の成分（例えば、アロプリノール、コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｔｉｎ）、コカルボキシラーゼ、生理学的な有機酸（例えば、ピルビン酸）、および必要に応じて、天然の供給源からの栄養抽出物（例えば、酵母ビタミン抽出物））を含み得る。
【００４７】
従って、上記基本栄養培地は、血中、血清、血漿および／または正常な体内組織で見出される濃度と類似の濃度の、多くの栄養物および無機化合物因子を含むが、これらの特定のものは、天然の血中成分ではない。
【００４８】
必要に応じて、本発明において使用される組成物は、さらに、抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗細菌剤、特定の抗体ならびに／または器官、組織および／もしくは細胞において微生物混入を制御するための他の公知の薬剤）を含有し得る。最も公知の抗微生物剤は、ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第１０版，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，特に第４３〜５１章によって詳細に参照される。
【００４９】
上記組成物はさらに、抗凝血剤、血栓溶解（ｔｈｒｏｍｂｏｌｉｔｉｃ）薬および／または抗血小板薬（例えば、ヘパリンおよび関連するグリコサミングリカン、ジクマロール、フェンプロクモン（ｐｈｅｎｐｒｏｃｏｕｍｏｎ）、アセノクマロールおよびビスクマ酢酸エチル、インダンジオン（ｉｎｄａｎｄｉｏｎｅ）、およびこれらの誘導体）、およびアスピリンならびにジピリダモールなどを含有し得る。非ステロイド性抗炎症剤もまた、必要に応じて、含まれる。
【００５０】
１つの代替的な実施形態において、ビタミンＣ（アスコルビン酸塩）は、必要に応じて、生理学的濃度または生理学的濃度より高い濃度で含まれる。
【００５１】
多くの市販されている細胞または組織の培養培地製品（未定義の、タンパク質または動物血清を含まない）は、基本栄養培地、または本発明の組成物を調製するための開始点として役立つために適用され得る。ただし、このような培地は、上記組成物を使用するための特定の必要条件と適合性がある。
【００５２】
上記組成物の第二相は、親油性外側層および親水性コアを有することが想定されるリポソームまたはナノスケールの粒子を含む液体の水性エマルジョンである。概して、第二相は、外側の親油性層（これは、例えば、コレステロール、ホスファチジルコリン、ビタミンＥ、タラ肝油などを含む）を形成および安定化し得る親油性成分を含む。さらなる成分は、脂質ベースのエネルギー供給源（生理学的に適合性量の遊離脂肪酸を含む）を含む。
【００５３】
好ましくは、上記二つの相の組成物のリポソームは、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸またはステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサン酸、およびこれらの組合わせからなる群より選択される遊離脂肪酸を含む。
【００５４】
好ましくは、上記二つの相組成物は、薬学的に有意な量のホスファチジン酸もしくは糖、またはリゾホスファチジン酸もしくは糖を含まない。
【００５５】
別の好ましい実施形態において、第二相は、親水性支持的エンドクリン因子（例えば、ヒドロコルチゾン、チロキシンまたはその誘導体など）を含む。さらなる支持的成分は、細胞増殖因子（例えば、上皮増殖因子および内皮増殖因子）を含み、生理学的に適合性の量の、血管内皮増殖因子、血小板由来内皮増殖因子、上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来内皮増殖因子などを含む。必要に応じて、上記第二相に含まれることが企図される他の因子としては、細胞性メッセンジャー（例えば、プロスタグランジン（例えば、プロスタグランジンＥ１））が挙げられる。好ましくは、生理学的に適合性のある界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）および洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）としてはまた、例えば、１種以上の水溶性界面活性剤、好ましくは、数千ダルトンの分子量を有する両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックコポリマー界面活性剤（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８；ＢＡＳＦから））および／または非イオンの界面活性剤が挙げられる。適切な非イオン性界面活性剤としては、例えば、ソルビトールエステルのポリオキシエチレン誘導体（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート界面活性剤（これは、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（Ａｔｌａｓ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））として市販されている）が挙げられる。ＴＷＥＥＮ  ８０（登録商標）は、特に、好ましい。
【００５６】
リポソームと関連すると想定される酸素は、上記細胞の代謝を高めたままにするのに重要な役割を果たす。注目すべきことは、酸素を用いて濃縮するさらなる工程は、本発明の方法のために必要ではないが、このような濃縮は、腫瘍細胞（特に、早い増殖速度または高い代謝回転を有する腫瘍細胞）の生存性を増強するために有益であり得る。従って、上記組成物中に含まされる酸素含有量は、種々の腫瘍に最適化され得る。
【００５７】
酸素は、空気を泡立てるかまたは溶液に酸素を通すことによって濃縮され得る。上記組成物によって取り込まれる酸素量は、この組成物中に含有されるステロールまたはコレステロールの量に依存する。リポソーム中のステロール量、リポソームの量、または、これらの両方は、種々の腫瘍に最適の結果をもたらすように変動され得る。本発明の好ましい実施形態において、上記組成物は、酸素で濃縮される。上記組成物は、例えば、少なくとも、０，００４７５ｇ／Ｌコレステロール、特に、少なくとも、０，００５２５ｇ／Ｌコレステロールを含み、酸素で濃縮される。好ましくは、それが、酸素で飽和するまで、組成物中を通して泡立てられる。最適な最小量および最大量のコレステロールならびに最小量および最大量の酸素は、種々の腫瘍組織について容易に試験され得る。
【００５８】
（組成物の調製）
米国仮特許出願番号６０／４６９，２００は、本発明の方法において使用される組成物は、器官および組織の生存性を保持するように使用され得ることを開示する。
【００５９】
本発明において使用するための組成物は、概して、２工程のプロセスによって製造される。第一工程は、第一層についてのプレミックス（これは、本明細書中でプレミックス―Ｉとして命名される、上記の基本栄養培地である）を調製すること、および第二層についてのプレミックス（これは、本明細書中でプレミックス―ＩＩとして命名される）を調製することであり、ここで、所望の成分は、水中で、プレミックスされ、溶解され、そして／または懸濁される。次いで、上記プレミックス−ＩＩ組成物は、細かく分離されたエマルジョン（例えば、ナノ粒子スケールのエマルジョン）を提供するために効果的な条件下で、ミクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）または同様のこのような装置によって加工される。次いで、生じたエマルジョン組成物は、プレミックス−Ｉ（これは、種々の微量栄養物、および他の成分を提供する）とともに混同されて、本発明の組成物の製造が完了する。
【００６０】
（プレミックス組成物の調製）
以下の表１〜４は、一緒に列挙される、プレミックス−Ｉおよびプレミックス−ＩＩについての好ましい成分ならびに重量範囲をまとめている。表１〜４に列挙される上記組成物は、全加工工程が完了した後に、１Ｌの最終組成物の中に見出される量である。これらの成分は、上記組成物が本明細書中以下で考察される実施例において調製される方法によって、上記成分をグループ化するために、記載の都合上、これらの表に分別される。他に示されない限り、表１〜４に示される全ての量は、１Ｌの最終組成物（すなわち、水層およびエマルジョン層の両方を含む組成物）あたりのグラムである。
【００６１】
表１〜４によって示される成分の量は、１Ｌの全バッチ容量に基づく。本明細書中に例示されるように、１Ｌのバッチ容量は、プレミックス−Ｉおよびプレミックス−Ｉの両方が混合された後の最終容量であり、ここで、プレミックス−ＩＩは、ミクロスケールまたはナノスケールのエマルジョンへ加工されている。当業者は、記載されるプロセスが、必要に応じて、より小さいバッチサイズまたはより大きなバッチサイズのために、容易にスケールアップされるか、またはスケールダウンされることを理解する。
【００６２】
上記組成物を調製する際に使用される全ての化学物質は、実質的に純粋であり、生化学物質の商業的供給者の多くから市販されている。好ましくは、これらは、ＵＳＰグレードであるか、これと同等である。水は、ＷＦＩ（注射用の水）グレード、好ましくは、ＵＳＰグレードであるべきである。当業者は、使用する化学物質が、必要に応じて、実質的に等価な化学物質（同一の純度および活性を示す）によって代用されることを理解する。
【００６３】
【表１】
2007524368.tif 000002
【００６４】
【表２−１】
2007524368.tif 000003
【００６５】
【表２−２】
2007524368.tif 000004
【００６６】
【表２−３】
2007524368.tif 000005
【００６７】
【表３】
2007524368.tif 000006
【００６８】
【表４】
2007524368.tif 000007
（プレミックス−Ｉを作製するためのプロセス）
プレミックス−Ｉは、所望しない反応または不溶性の複合体の形成を回避しながら、均一かつ透明な水性組成物を達成するために有効である順序で成分を溶解すること、または分散することによって調製される。この理由のために、プレミックス−Ｉ中の成分は、好ましくは、全てが水中に完全に溶解または分散されるまで、一緒に混合されない。好ましくは、本明細書中に例示されている場合、表１、２Ａ〜２Ｃおよび表３によって列挙される成分は、各々、３つの異なる出発溶液へ加工されるが、当業者は、この基本組成物が、必要に応じて、例示されるスキームへの変化によって、調製されることを理解する。
【００６９】
次いで、上記出発溶液は、プレミックス−Ｉ（これは、１相（すなわち、非エマルジョンの基本栄養培地）を構成する）を調製するために組合わされる。
【００７０】
（プレミックス−ＩＩを作製するためのプロセス）
プレミックス−ＩＩは、上記組成物のエマルジョン形成成分を含む。広義に、これらは、生じるエマルジョン粒子の親水性層（例えば、細胞内に送達されることが望ましい成分）を含む。プレミックス−ＩＩはまた、生じるエマルジョン粒子の疎水性層（例えば、親水性コアの内容物（支持的内分泌因子、乳化を補助する適切な薬剤（例えば、湿潤剤および／またはブロックコポリマー洗剤）および疎水性相の成分（例えば、コレステロールおよび／または亜リン酸由来の脂質）を含む）を送達するために生細胞膜と融合させることが想定される親油性外層）を形成する成分を含む。好ましくは、これらは、前述の表４に列挙されるとおりであり、以下の実施例によって記載されるように組合わされる。
【００７１】
（ミクロフルイデーション（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄａｔｉｏｎ））
５０００ｐｓｉ（３４４７５０ｈＰａ）の圧力、または５０００ｐｓｉを上回る圧力で、高圧のホモジナイゼーション技術は、「ミクロフルイデーション」として当業者に公知である。このプロセスは、平均直径が２００ｎｍ未満の均一なサイズの分布で、リポソームまたはナノ粒子を作製するために使用された。ミクロフルイデーションに加え、他の標準的な乳化法が、必要に応じて、使用される（例えば、超音波処理、バルブホモジナイゼーション［Ｔｈｏｒｎｂｅｒｇ  Ｅ．およびＬｕｎｄｈ，Ｇ．（１９７８）Ｊ．Ｆｏｏｄ．Ｓｃｉ．４３：１５５３］およびブレード撹拌など）。望ましくは、水溶性界面活性剤、好ましくは、数千ダルトンの分子量を有する両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイドブロックコポリマー界面活性剤）（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８）および／またはＴＷＥＥＮ  ８０）が、それらが形成する凝集に対して被覆された粒子を安定化するために水溶液に添加される。上記界面活性剤はまた、上記方法が使用される場合、（ウルトラ）超音波処理の効果を増強するために役立つ。
【００７２】
例示されるようなミクロフルイデーションについての好ましい装置は、カプセル化された空気圧縮機（例えば、Ｓｕｌｌａｉｒ−Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃｉｔｙ，Ｉｎｄｉａｎａ）からの番号ＥＳ−６）によって供給される圧縮される空気を使用する、ミクロフルイダイザー番号ＨＣ５０００Ｖ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）である。上記の装置は、プレミックス−ＩＩ組成物を処理し、乳化するために、高圧ホモジナイゼーションおよび高剪断のホモジナイゼーションを使用する。
【００７３】
簡単には、上記プレミックス−ＩＩ組成物は、ミクロフルイダイザーを使用して高圧ホモジナイゼーションによって加工された。このプレミックス−ＩＩは、高い剪断ストレスおよびキャビテーション力が、非常に細かいエマルジョンを形成した場合、連続様式でミクロフルイダイザーリザーバに添加され、特別に設計されたキャビテーションまたは相互作用チャンバに強制的に入れられる。複数回のサイクルを通じて、平均の液滴またはリポソームの、サイズ、分布、および成分の組合わせは、所望の最終産物（例えば、好ましいナノ粒子）を生じる。
【００７４】
さらに、ミクロフルイダイザーモデル番号ＨＣ５０００Ｖの操作の詳細は、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからカタログ番号８５．０１１２として入手可能である製造者の操作マニュアルによって提供される。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は、本発明を例示する。
【００７６】
（実施例１）
（液体組成物Ｌｉｆｏｒｌａｂの調製）
（プレミックス−Ｉの調製）
（１．溶液１の調製）
適切な秤を使用して、前述の表１によって列挙される各成分の１０，０００×濃度を、調製した。都合上、いくつかのこれらの成分についてのストック溶液を以下のとおり事前に調製し、適切な量のストック溶液を溶液１に混合した。
【００７７】
（１００，０００×濃度の硫酸銅ストック溶液）
０．１３０ｇの硫酸銅を秤量し、１０００ｍｌのＷＦＩグレードの水中に混合した。必要な場合、溶解が完了するまで、混合しながら５Ｎ  ＨＣｌを滴下した。溶解するまで、これを混合し、−２０℃で貯蔵した。
【００７８】
（１０，０００×濃度の硫酸第二鉄ストック溶液、硝酸酸化鉄ストック溶液、および硫酸亜鉛ストック溶液）
１Ｌのバッチ（最終生成物の最終体積）あたり０．１ｍＬを使用する。１０００ｍＬのＷＦＩグレードの水中に５．０ｇの硫酸第二鉄、０．５ｇの硝酸酸化鉄、および４．３ｇの硫酸亜鉛を量り分けることによって、上記ストック溶液を調製した。必要な場合、５Ｎ  ＨＣｌを滴下することによって、溶解が完了するまで溶解を補助するためにｐＨを低下した。この溶液を−２０℃で貯蔵した。
【００７９】
（１００，０００×濃度のビオチンストック溶液）
最終溶液において、１Ｌあたり０．０１ｍＬを使用する。
【００８０】
５ｍＬのＷＦＩグレードの水中に０，０４０ｇのビオチンを量り分けることによって、上記ビオチン溶液を調製した。溶解が完了するまで、必要な場合、混合しながら５Ｎ  ＨＣｌを滴下した。１０００ｍＬに合わせ、−２０℃で貯蔵した。
【００８１】
（ビタミンＢ１２およびチミジンの１０００倍ストック溶液）
１Ｌの最終溶液あたり１ｍＬを使用する。
【００８２】
このストック溶液を、０．６７０ｇのビタミンＢ１２および０．３７０ｇのチミジンを、１０００ｍＬのＷＦＩグレードの水中に秤量し、完全に溶解するまで混合することにより調製し、−２０℃で保存した。
【００８３】
一旦全てのストック濃縮物を作製すると、それらを、それらの濃度と合わせた体積で（例えば、１Ｌあたり１０００倍ストック溶液＝１ｍＬなど）、溶液２に添加した。次いで、添加成分を１０００ｍＬのＷＦＩグレードの水に添加し、完全に溶解するまで磁気攪拌プレートで混合した。生じた溶液を、以下に記載するように、１Ｌの最終バッチ体積（最終産物）あたり０．１ｍＬの割合で溶液２に添加した。
【００８４】
（２．溶液２の調製）
適切な天秤を使用して、表２Ａ、２Ｂおよび２Ｃに列挙される各成分を秤量し、最終バッチ体積中、最終体積の約５０％のＷＦＩグレードの水に添加した。すなわち、１Ｌの最終バッチについて、約５００ｍＬのＷＦＩグレードの水に溶液２を調製した。これを、完全に溶解するまで混合した。
【００８５】
（３．溶液３の調製）
適切な天秤を使用して、表３に列挙される各成分を秤量し、総バッチ体積の５％のＷＦＩグレードの水を含む、適切な大きさの混合容器に添加した。５Ｎ  ＮａＯＨを、その混合物が、完全に溶解したことを示す透明になるまで混合しながら滴下様式で添加した。
【００８６】
次いで、溶液１を利用し、１Ｌの最終バッチ体積（最終産物）あたり０．１ｍＬの割合で、溶液１を溶液２と混合しながら合わせ、合わせた（１＋２）溶液を形成することにより、プレミックス−Ｉを調製した。次いで、溶液３のバッチ全体を、（１＋２）溶液と混合し、プレミックス−Ｉを生成した。これは、ただちに使用され得るか、または保存され得る。
【００８７】
（プレミックス−ＩＩの調製）
プレミックス−ＩＩに対する成分量は、表４（前出）に示したとおりであった。便宜上、プレミックス−２の多数の成分を最初にストック溶液として調製し、次いで、プレミックス−ＩＩの調製のために、適切な体積で使用した。このストック溶液は、以下の溶液である。
【００８８】
（内分泌因子の１０，０００倍ストック溶液）
１Ｌの最終溶液あたり０．１ｍＬを使用する。
【００８９】
このストック溶液を、０．０５２ｇのＨＧＦ、０．０５０ｇのトリヨード−Ｌ−チロキシン、０．０５０ｇのＶＥＧＦおよび０．０３０ｇのＥＧＦを、１０００ｍＬのＷＦＩグレードの水中に秤量し、完全に溶解するまで混合することにより調製した。バッチの大きさを、×０．１ｍＬで計算し、工程４／処理４で溶液に添加した。−２０℃で保存した。
【００９０】
（ヒドロコルチゾンの１０００倍ストック溶液）
１Ｌの最終溶液あたり１ｍＬを使用する。
【００９１】
このストック溶液を、０．９５ｇのヒドロコルチゾンを、１０ｍＬの９５％  ＥｔＯＨ中に秤量し、完全に溶解するまで混合することにより調製した。バッチの大きさを、×１ｍＬで計算し、ストック溶液を以下の工程２の溶液に添加した。２〜８℃で保存した。
【００９２】
（プロスタグランジンＥ１（「ＰＧＥ１」）の１０００倍ストック溶液）
１Ｌの最終溶液あたり１ｍＬを使用する。
【００９３】
０．０３４ｇのＰＧＥ１を、１０００ｍＬのＷＦＩグレードの水中に秤量し、完全に溶解するまで混合することにより調製した。バッチの大きさを、×１ｍＬで計算し、ストック溶液を以下の工程４の溶液に添加した。−２０℃で保存した。
【００９４】
（ＰＤＧＦの１００，０００倍ストック溶液）
１Ｌの最終溶液あたり０．０１ｍＬを使用する。
【００９５】
このストック溶液を、０．０９５ｇのＰＤＧＦを、１０００ｍＬのＷＦＩグレードの水中に秤量し、完全に溶解するまで混合することによって調製した。バッチの大きさを、×０．０１ｍｌで計算し、以下の工程４の溶液に添加した。−２０℃で保存した。
【００９６】
次いで、プレミックス−ＩＩを、表４（前出）に示した成分を用いて、以下の工程によって調製した。
【００９７】
１．Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８溶液を、総バッチ体積の５０％未満（１Ｌのバッチの最終産物に基づいて、これは、５００ｍＬ未満）のＷＦＩグレードの水に、１ｇを秤量することによって調製した。これを弱く加熱して（１００℃未満）約１時間混合した。完全に溶解するまで混合を継続した。生じた水性組成物を、使用前に、約３５〜４０℃に冷却した。
【００９８】
２．１０ｍＬの９５％  ＥｔＯＨをガラス混合容器中に測定し、磁気攪拌プレート上に配置した。ホスファチジルコリンを、表３に従って計量し、この溶液に添加し、その後１時間混合した。
【００９９】
３．コレステロール、リノール酸、リノレン酸、ビタミンＥ、ＴＷＥＥＮ８０、タラ肝油、ヒドロコルチゾンおよびオレイン酸を、表４に従って秤量した。好ましくは、これらを最初に、所望の作用濃度を達成するための１０，０００倍濃度のストック溶液として調製し得る。これらを、工程２の溶液に添加し、１時間混合した。
【０１００】
４．工程２および３の溶液を、工程１の溶液に添加し、１時間混合した。生じた組成物は、不透明で濁っているようであった。
【０１０１】
５．肝細胞増殖因子（「ＨＧＦ」）、トリヨード−Ｌ−チロキシン、プロスタグランジンＥ１、血管内皮増殖因子（「ＶＥＧＦ」）、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）、血小板由来の内皮増殖因子（「ＰＤＧＦ」）を、示したとおりに秤量した。好ましくは、これらを、これらの化学物質の作用ストック溶液として調製する。
【０１０２】
６．工程５の成分を工程４の溶液に添加し、１時間混合してプレミックス−ＩＩ液体組成物を生成した。
【０１０３】
（Ｌｉｆｏｒｌａｂ：微小流動化によるコレステロールベースのナノ粒子）
Ｌｉｆｏｒｌａｂ溶液を、以下のようにして、プレミックス−Ｉ組成物およびプレミックス−ＩＩ組成物（前出）から調製した：
１．ミクロフルイダイザーの空気圧縮機を作動させ、ライン圧力を、１００ＣＦＭで１２０ＰＳＩ（２．８３ｍ３／分で８２７４ｈＰａ）に調整した。これにより、ミクロフルイダイザーの圧力チャンバーを圧縮空気で自動的に充填した。
【０１０４】
２．ミクロフルイダイザーの圧力を、５０００ＰＳＩ（３４４７５０ｈＰａ）に調整した。
【０１０５】
３．調製したプレミックス−ＩＩを機械レザバに添加し、ミクロフルイダイザー制御を、完全に作動設定に変えた。
【０１０６】
４．プレミックス−ＩＩを動作中のキャビテーションチャンバーを通過させ、収集容器中に排出した。
【０１０７】
５．全てのプレミックス−ＩＩを処理し、収集したときに、１サイクルが完了した。
【０１０８】
６．工程（１）〜（５）を４回、および／または、処理した液体組成物が、透明な外観で収集容器中に現れるまで、繰り返した。
【０１０９】
７．次いで、液体組成物を、０．２ミクロンの膜フィルターを通して無菌的にろ過し、使用まで４〜８℃で保存した。
【０１１０】
８．次いで、上記工程７の産物を、発泡および化学成分の分離を避けるように、調製したプレミックス−Ｉとゆっくり混合した。
【０１１１】
９．最終溶液を、表１〜４に基づいて所望のバッチ体積までＷＦＩグレードの水で満たした。最終バッチ体積は、１Ｌであった。
【０１１２】
ｐＨを７．２±０．２に調整した。
【０１１３】
次いで、最終の本発明の組成物を、保存のために、０．２ミクロンの膜を通して、滅菌容器中に無菌的にろ過した。
【０１１４】
それは、粒子状の物質を全く含まない不透明な乳白色の溶液のようであった。小胞の大きさは、ナノ粒子分散物の光学上の外観に大きく影響する。粒子がより小さければ、溶液は、より透明に見えるようになる。
【０１１５】
（実施例２）
（腫瘍外殖片または腫瘍生検を保存するための溶液としてのＬｉｆｏｒｌａｂとＲＮＡｌａｔｅｒとの比較）
実施例１で調製したＬｉｆｏｒｌａｂの、室温での細胞の生命力の維持に対する有効性を、確認し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）の維持特性と比較して評価する。
【０１１６】
（サンプル）
調製直後に、異なる腫瘍の生検または動物から外殖した腫瘍を、少なくとも１ｍｌのＬｉｆｏｒｌａｂまたはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｎｅｕｓｓ）中で保存する。必要な場合、組織生検を切断し得る。好ましくは、組織片は、最大０．５ｃｍ３の大きさを有するので、薬剤は、組織に迅速に拡散し得る。好ましくは、その組織は、０．１２５ｃｍ３の大きさを有する。
【０１１７】
（方法）
腫瘍組織を、規定した時間（例えば、３日間）Ｌｉｆｏｒｌａｂ溶液またはＲＮＡｌａｔｅｒ溶液中で保存する。
【０１１８】
次いで、この溶液と一緒に、腫瘍組織をガラスホモジナイゼーター（ｈｏｍｏｇｅｎｉｓａｔｏｒ）またはテーパー組織グラインダー（ｔａｐｅｒｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｉｎｄｅｒ）（例えば、Ｗｈｅａｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）中で機械的に均質化する。均質化した組織を完全培地（例えば、１０％  不活性化ＦＣＳ、１％  非必須アミノ酸（１００×、例えば、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ、Ｂｅｒｌｉｎ）、０．０５％グルコース、０．００１１％  炭酸水素ナトリウム、Ｃｉｐｒｏｂａｙ２００）を含むＬ１５培地）（３×４ｍｌ）を含む１５ｍｌ管に移し、洗浄した（１５０×ｇで、室温で、１０分間遠心分離）。
【０１１９】
次いで、細胞の懸濁液を、底面を覆うのに十分な培地を含む細胞培養フラスコ（５０ｍｌ、１７．５ｃｍ２）中に移す。その細胞を、培地を交換することなく、インキュベーター内で、５％  ＣＯ２下で、３７℃で、少なくとも３日間培養する。培地の色が赤色から黄色に変化する場合、目視による管理後、培地を取り替える。細胞が十分に高密度になると、付着した細胞をトリプシン処理し、継代する。
【０１２０】
トリプシン処理については、培地をデカントし、まだ付着している細胞を、ＰＢＳでリンスする。２ｍｌのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を添加し、インキュベーター内で、３７℃で５分間インキュベートする。底を穏やかに叩くことにより、フラスコの底から細胞を分離し、それらを、１０ｍｌの培地を含む１５ｍｌ管に移す。一度培地で洗浄した後、細胞を再度培地に移し得る。三代の継代の後、細胞を凍結保存し得る。
【０１２１】
（結果）
Ｌｉｆｏｒｌａｂ溶液中に保存した組織を、穏やかに、ゆっくりとホモジナイズした。細胞を、ホモジナイズして濁った溶液にした。ＲＮＡｌａｔｅｒ中に保存した組織は、固形物であり、硬く、ホモジナイズするのが困難であった。細胞の凝集物は、溶液中で容易に目視された。
【０１２２】
一週間後、Ｌｉｆｏｒｌａｂ細胞は、良好に増殖したのに対して、ＲＮＡｌａｔｅｒ細胞はなお、培地の表面で浮遊していた。Ｌｉｆｏｒｌａｂ中で保存した細胞を恒常的に６週間継代し、増殖させた。その細胞を冷却したバイアル中で凍結させた。
【０１２３】
細胞がまだ培地の表面で浮遊し、細胞がなお増殖することが期待されなかったので、ＲＮＡｌａｔｅｒ細胞を培養する試みを、１２日後に中止した。その細胞の形態は、均質ではなかった（断片化した細胞）。その細胞は、生存していなかった。
【０１２４】
（要旨）
ＲＮＡｌａｔｅｒに保存された腫瘍移植物由来の細胞と比較して、Ｌｉｆｏｒｌａｂに保存された腫瘍移植物由来の細胞は、生存し、なお増殖し得た。
【０１２５】
（実施例３）
（腫瘍細胞の保存、およびＤＮＡの安定化に対するＬｉｆｏｒｌａｂおよびＲＮＡｌａｔｅｒの効果の比較）
腫瘍組織由来のＤＮＡの定量的分析により、この実験は、Ｌｉｆｏｒｌａｂが、ＲＮＡｌａｔｅｒと同等にＤＮＡを保護し得ることを立証する。
【０１２６】
（サンプル）
調製直後に、ヌードマウスから外移植したＨＣＴ８細胞から産生した腫瘍の生検を、少なくとも１ｍｌのＬｉｆｏｒｌａｂまたはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中で保存する。組織片は、好ましくは、最大０．５ｃｍ３の大きさを有するので、薬剤は、組織に迅速に拡散し得る。好ましくは、その組織は、０．１２５ｃｍ３の大きさを有する。
【０１２７】
（従来方法を用いたＤＮＡの単離）
（方法）
（溶解）
組織サンプル、５００μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ  ｐＨ８〜８．２、オートクレーブ済み）および２０μＬのＲＮａｓｅＡ（２０ｍｇ／ｍＬ）を、ガラスホモジナイゼーターに移し、組織を可能な範囲でホモジナイズする。ホモジネートを、５０ｍＬのファルコンチューブに移す。ホモジナイゼーターを、５００μＬの溶解緩衝液で２度洗浄する。この洗浄液をホモジネートに添加し、穏やかにボルテックスする。１００μＬの１０％  ＳＤＳを添加し、穏やかにボルテックスし、次いで２５μＬのプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、穏やかにボルテックスする。
【０１２８】
上記混合物を、５５℃で２時間、または、より良くは、３７℃で一晩、水浴中でインキュベートする。消化後、５００μＬの５Ｍ  ＮａＣｌを（タンパク質の塩析沈殿のために、約１．２ｍｏｌ／Ｌ）添加する。上記混合物を中程度のレベルで約５秒間ボルテックスする。
【０１２９】
冷却遠心分離機（４℃）中で、３４１０ｇで１４分間遠心した後、ＤＮＡを含む上清を取り除き、新しい１５ｍＬのポリプロピレン遠心管に移す。不注意によりペレットからの細胞の破片のいくらかが、ピペット中に吸い上げられる場合、上記サンプルを再度遠心分離して上清の残りを取り除く。
【０１３０】
（沈殿）
上記上清を、２〜２．５倍の体積の１００％エタノールと混合する。上記サンプルを、−２０℃で３０〜６０分間保存し、その後、４℃で、３４１０ｇで１０〜１５分間遠心分離する。ＤＮＡが明白に沈殿する場合、−２０℃での保存は必要ではない。上記上清を注意深くデカントし、デカント工程で上清が失われ得ないようにペレットが上側の壁に位置するように注意する。上記ＤＮＡを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄する。次いで、それを、オートクレーブした、新しい７０％エタノールを入れた１．５ｍＬの管に移す。上記サンプルを４℃で、３４１０ｇで、５〜１０分間遠心し、上清を除去し、再度ペレットを求める。上記サンプルを再度７０％エタノール中で洗浄し、遠心分離し、上清を除去する。組織を有する管の内側の領域の上部を、注意深く乾燥し得る。上記ペレットを、ひっくり返した管中で風乾すべきである。上記ＤＮＡを５００μＬの水性注射可能媒体（ａｑｕａ  ｉｎｊｅｃｔａｂｉｌａ）中に入れる。よりよく溶解させるために、上記ペレットを５６℃で１０分間インキュベートし得る。次いで、上記サンプルを４℃で保存する。
【０１３１】
（２．Ｑｉａｇｅｎを用いたＤＮＡの単離）
（方法）
２５ｍｇまでの保存した生検を、清潔なスライド上で切断し、重量を記録し、ＤＮｅａｓｙ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて動物組織に対するＤＮｅａｓｙプロトコルに従って、上記組織を調製する。
【０１３２】
（ＤＮＡ量の光度計による分析）
光度計による分析のために、１：１０の希釈物を調製し、２６０ｎｍ、２８０ｎｍおよび３２０ｎｍで吸光度を測定する。２８０ｎｍでの吸光度に対する２６０ｎｍでの吸光度の比は、ＤＮＡの精製度を規定し、その値は、１．４と１．８との間であるべきである。収率を以下の式：
吸光度（２６０ｎｍ）×５０μｇ／ｍｌ×希釈率＝μｇ／ｍｌ  ＲＮＡ
に従って計算する。
【０１３３】
（結果）
従来の方法を用いて調製したＤＮＡの定量化：
肩の皮下局部から外移植した腫瘍に関しては、６日間室温で保存した後に、次いで４℃で保存し、Ｌｉｆｏｒｌａｂを用いて生じたｍｇ組織あたりの収量は、５．５６μｇであり、ＲＮｌａｔｅｒを用いた収量は、６．３６μｇであった。腋窩の皮下局部から外移植し、４℃で保存した腫瘍について、Ｌｉｆｏｒｌａｂに関する収量は、６．４４μｇであり、ＲＮＡｌａｔｅｒに関する収量は、４．９４μｇであった。結果を、ＤＮＡゲル電気泳動により確認した。
【０１３４】
（実施例４）
（ヒト生検の保存およびＲＮＡの安定化に対するＬｉｆｏｒｌａｂおよびＲＮＡｌａｔｅｒの有効性の比較）
腫瘍組織由来のＲＮＡの定量的分析により、上記実験は、Ｌｉｆｏｒｌａｂが、ＲＮＡｌａｔｅｒと同等にＲＮＡを保護し得ることを立証する。
【０１３５】
（サンプル）
調製後ただちに、異なるヒト腫瘍の生検を、少なくとも１ｍｌのＬｉｆｏｒｌａｂまたはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中に保存する。組織片は、好ましくは、最大０．５ｃｍ３の大きさを有するので、薬剤は、組織に迅速に拡散し得る。好ましくは、その組織は、０．１２５ｃｍ３の大きさを有する。
【０１３６】
夾雑を防ぐために、上記Ｌｉｆｏｒｌａｂ溶液にペニシリン／ストレプトマイシンを添加することが好ましくあり得る。
【０１３７】
（方法）
（１．調製）
調製の際に、使用前に、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイゼーターの切断領域を、７０％エタノールの超音波浴で３０秒間清潔にする。スライドおよびピンセットを、７０％エタノールできれいにする。上記手順をとおして、手袋を着用する。
【０１３８】
２．腫瘍サンプルを、規定した時間（例えば、室温、次いで４℃で６日間）保存する。２５ｍｇまでの保存した生検を清潔なスライド上で切断し、５ｍｌの冷却バイアルに移し、重量を記録する。キットの６００μＬのＲＬＴ緩衝液を、β−メルカプトエタノールなしで添加する。上記サンプルを氷上で、ウルトラターラックス（ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ）中で、１５秒間×３回ホモジナイズし、そして超音波で、レベル３で、５秒間×４回処理する。全てのサンプルが終わった後、装置を７０％エタノールで洗浄する。ホモジネートをピペットでＲＮａｓｅを含まない１．５ｍｌの管に移し、「動物組織サンプルからの総ＲＮＡの単離のためのＲＮｅａｓｙミニプロトコル」（Ｑｉａｇｅｎ、２００２年４月）に従って処理する。ポイント５で、ＲＮＡを単離し、１〜２個の３０μｌのＲＮａｓｅを含まない水に採取する。
【０１３９】
（３．ＲＮＡの定量分析）
溶液中のＲＮＡの定量分析のために二つの方法：光度計分析およびリアルタイムＰＣＲを用いる。
【０１４０】
（３．１  光度計分析）
光度計分析のために、１００分の１溶液（５μｌのサンプル＋４９５μｌの水）を作製し、純度および収率を分析するために、２６０ｎｍ、２８０ｎｍおよび３２０ｎｍにおける吸光度を測定する。３２０ｎｍにおける吸光度は、０でなければならない。２６０ｎｍ：２８０ｎｍの比は、１．６と２．２との間であるべきである。収量を以下の式：
吸光度（２６０ｎｍ）×４０μｇ／ｍｌ×希釈＝μｇ／ｍｌ  ＲＮＡ
に従って計算する。
【０１４１】
（３．２  リアルタイムＰＣＲ）
ハウスキーピング酵素ＧＡＰＤＨについてのＲＮＡの量を、ＧＡＰＤＨの増幅により分析し、この分析は、Ａ．Ｈ．Ｅｌｍａａｇａｃｌｉら、（２００１）、Ｂｒｉｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、１１３巻、１０７２〜１０７５に詳細に記載される方法に従う。
【０１４２】
要約すると、ｃＤＮＡ合成反応とＰＣＲとを、最終体積１０μｌのキャピラリーを用いて、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた単一の工程で行なった。ＲＴ−ＰＣＲ混合物については、市販の緩衝キット（逆転写酵素、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｄＮＴＰ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、６μＭ  ＭｇＳＯ４、０．１４μｌ  ＲＮａｓｅインヒビター（Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、１０ｐｍｏｌのプライマーおよび４ｐｍｏｌのハイブリダイゼーションプローブを含む）を用いた。ＲＴ反応を、５５℃で２０分間行なった。９５℃で２０秒間の内部変性の後、９５℃で１秒間、５６℃で１５秒間および７２℃で１８秒間を５５サイクル行なうことにより増幅を継続した。
【０１４３】
結果の例を、次ページの表１に示す。
【０１４４】
（実施例５）
（腫瘍外移植物／生検の保存に対するＬｉｆｏｒｌａｂと水との比較）
ヒト壊死組織またはヒト胃癌上皮組織由来の腫瘍生検を、水またはＬｉｆｏｒｌａｂ中で、２４時間、４８時間、７２時間または１２８時間保存した。切片を切断し、ＨＥＳで染色した。
【０１４５】
上記結果は、Ｌｉｆｏｒｌａｂが、水よりもはるかに良く組織の構造を安定化することを示す。上記結果の例を、図１〜４に示す。図３において、水中での胃の上皮組織の７２時間の保存の後、上記組織は、壊死を起こし、分解するが、図４に示すように、Ｌｉｆｏｒｌａｂ中での保存の後、組織の構造が保存されていることが特に明らかである。
【０１４６】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、拡大率４００×での胃癌の上皮組織からの腫瘍生検のＨＥＳ染色を示す。切断する前の２４時間、サンプルを水中で貯蔵した。
【図２】図２は、拡大率４００×での胃癌の上皮組織からの腫瘍生検のＨＥＳ染色を示す。切断する前の２４時間、サンプルをＬｉｆｏｒｌａｂ中で貯蔵した。
【図３】図３は、拡大率４００×での胃癌の上皮組織からの腫瘍生検のＨＥＳ染色を示す。切断する前の７２時間、サンプルを水中で貯蔵した。
【図４】図４は、拡大率４００×での胃癌の上皮組織からの腫瘍生検のＨＥＳ染色を示す。切断する前の７２時間、サンプルをＬｉｆｏｒｌａｂ中で貯蔵した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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