(57)【要約】  本発明は、可溶性ＣＬＣＡ１の阻害物質を投与することで、可溶性ＣＬＣＡ１の発現または活性がアップレギュレートされるところの、疾患または症状を治療する方法に関する。本発明はまた、体液から可溶性ＣＬＣＡ１を単離する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患または症状でない個体と比べて、対象におけるＣＬＣＡ１の発現または活性が高い疾患または症状の対象を治療する方法であって、治療上有効量の、可溶性ＣＬＣＡ１と細胞膜との結合を阻害または防止する、少なくとも１つの作用物質を該対象に投与し、それにより該疾患または症状を治療することを含む、方法。
【請求項２】
さらに治療上有効量の第二の作用物質を投与することを含む方法であって、その第二の作用物質が該疾患または症状を効果的に治療するのが知られている作用物質であり、可溶性ＣＬＣＡ１と細胞膜との結合を阻害または防止しないところの、請求項１記載の方法。
【請求項３】
疾患または症状が喘息であるところの、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
疾患または症状がＣＯＰＤであるところの、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの作用物質が蛋白であるところの、請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの作用物質が抗体であるところの、請求項１記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの作用物質が小分子であるところの、請求項１記載の方法。
【請求項８】
対象から流体を得；その流体をＣＬＣＡ１の特異的結合パートナーと接触させて、ＣＬＣＡ１とその特異的結合パートナーとの間で複合体を形成させ；ＣＬＣＡ１とそのＣＬＣＡ１の特異的結合パートナーとの複合体を該流体より単離し；ＣＬＣＡ１が単離されるようにＣＬＣＡ１とそのＣＬＣＡ１の特異的結合パートナーとの複合体を切断することを含む、ＣＬＣＡ１を単離する方法。
【請求項９】
流体が体液であるところの、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
体液が唾液であるところの、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
体液が粘膜面より得られるところの、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
流体が気管支肺胞洗浄液であるところの、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
特異的結合パートナーが蛋白であるところの、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
特異的結合パートナーが抗体であるところの、請求項８記載の方法。
【請求項１５】
特異的結合パートナーが固体支持体に連結されているところの、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、出典明示により本明細書の一部とする、２００３年５月２８日付け出願の米国仮出願番号６０／４７４１７４に対して優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は可溶性カルシウム活性化クロライドチャネル１（ＣＬＣＡ１）および可溶性ＣＬＣＡ１の活性を阻害するアンタゴニストに関する。本発明は、一部、可溶性ＣＬＣＡ１を単離および使用する方法、ならびにＣＬＣＡ１の異常活性に付随する疾患または障害を治療するための可溶性ＣＬＣＡ１に対するアンタゴニストに関する。
【０００３】
（従来技術）
原形質膜を通過するイオン輸送は細胞の正常な生理機能を維持するのに重要である。原形質膜を通過するイオン輸送は種々の膜結合蛋白（チャネルおよびポンプとして作用する）により媒介される。イオンチャネルまたはポンプの機能不全は病態に至るであろう。嚢胞性線維症はｃＡＭＰ介在性クロライドチャネル、ＣＦＴＲの異常に由来する疾患である（Welshら、１９９３、Cell ７３：１２５１）。嚢胞性線維症の生理学的徴候として、粘度の高い粘液が肺の気道および消化管に分泌されることに由来する気道閉塞、および病原性微生物による肺気道のその後のコロニー形成（Clarkeら、１９９２、Science  ２５７：１１２５；Clarkeら、１９９４、Proc Natl Acad Sci USA  ９１：４７９；Engら、１９９６、Ped Pulmonol  ２１：７７）および消化管の膵管の粘液閉塞（ＷＯ  ０１／５４６８５）が挙げられる。嚢胞性線維症を異常なイオン輸送と結びつけることで、リード研究員は、イオン輸送の機能不全を徴候の類似する他の疾患と関連付けることができると仮定する。かくして、イオン輸送の機能不全は、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、すなわち、気腫および慢性気管支炎などの疾患と関連付けられる。
【０００４】
ＣＬＣＡ１およびそのネズミ同族体であるｇｏｂ−５は推定カルシウム活性化クロライドチャネルである（ＷＯ  ９９／４４６２０）。共に喘息に伴う病状に関与する。喘息は環境アレルゲンに対する過敏性で特徴付けられ、炎症応答およびムチンの産生の増加に関与する（ＷＯ  ０１／５４６８５；ＷＯ  ９９／４４６２０）。ＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の発現はアレルゲン攻撃に対する応答においてアップレギュレートされる。発現はまた、ムチンの過剰産生と関連付けられる（Hoshinoら、２００２、Am J Respir Crit Care Med  １６５：１１３２）。ＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の過剰発現は、粘膜表皮細胞系におけるＭＵＣ５ＡＣ、ムチン遺伝子の発現を誘発することが明らかにされた。加えて、アデノウイルス介在のアンチセンス療法は、インビボでのマウス実験におけるｇｏｂ−５の過敏反応性およびムチン産生の効果を無効にした（Nakanishiら、２００１、Proc Natl Acad Sci USA  ９８：５１７５）。
【０００５】
ＣＬＣＡ１が１２５ｋＤ先駆体として発現され、それが分割して９０ｋＤと３７ｋＤのサブユニットを形成し、それが細胞表面に結びついて活性なイオンチャネルを形成することが示唆されている。また、９０ｋＤのサブユニットが４回膜貫通ドメインを形成することも示唆されている。さらには、ＣＬＣＡ１の発現が原形質膜を通過するクロライドイオン流出と関係し、ニフルム酸、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸およびジチオスレイトールなどの非選択的クロライドチャネル阻害剤がこの作用を無効とするであろうと示唆されている（Gruberら、１９９９、Genomics  ５４：２００）。
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、幾分、ＣＬＣＡ１が細胞外分子、例えば細胞膜または細胞膜結合分子と相互作用、例えば結合しうる分泌蛋白であるという知見に基づいている。ＣＬＣＡ１は分泌蛋白であるため、それはＣＬＣＡ１の発現または活性の増加に付随する疾患、例えば喘息またはＣＯＰＤ様疾患などの、高レベルのムチンにより特徴付けられるアトピー性疾患を治療するための都合のよい標的を提供する。
【０００７】
本発明は、疾患または症状でない個体と比べて、対象におけるＣＬＣＡ１の発現または活性が高い疾患または症状の対象を治療する方法であって、治療上有効量の、可溶性ＣＬＣＡ１の細胞外分子との相互作用または結合、例えば、細胞膜分子との結合を阻害または防止する、少なくとも１つの作用物質を該対象に投与し、それにより該疾患または症状を治療することを含む、方法に関する。したがって、本発明は、喘息などのアトピー性疾患または症状またはＣＯＰＤなどの疾患を治療する新規な方法を提供する。
【０００８】
本発明は、細胞におけるＣＬＣＡ１の発現または活性を調節する、例えば、ＣＬＣＡ１の発現または活性を減少させる方法であって、治療上有効量の、可溶性ＣＬＣＡ１の細胞外分子との相互作用または結合、例えば、細胞膜分子との結合を阻害または防止する、少なくとも１つの作用物質を投与し、それによりＣＬＣＡ１の発現または活性を減少させることを含む、方法に関する。
【０００９】
該作用物質はＣＬＣＡ１に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；小分子；ペプチドまたはペプチド模倣物とすることができる。
【００１０】
本発明は、さらには、対象から流体を得；その流体をＣＬＣＡ１と特異的結合パートナーと接触させ、ＣＬＣＡ１とその特異的結合パートナーとの間で複合体を形成させ；ＣＬＣＡ１とそのＣＬＣＡ１と特異的結合パートナーとの複合体を単離し；ＣＬＣＡ１が単離されるようにＣＬＣＡ１とそのＣＬＣＡ１と特異的結合パートナーとの複合体を切断することを含む、ＣＬＣＡ１を単離する方法に関する。
【００１１】
本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載にて説明されており、その記載から明らかであるか、または本発明を実施することで学習することができる。本発明の目的および利点は、添付した特許請求の範囲にて特に指摘されている要素および組合せによって理解され、かつ達成されるであろう。
【００１２】
上記した一般的記載および下記の詳細な記載は単なる例示にすぎず、特許請求に係る発明を限定するものではないと、理解されるべきである。
【００１３】
（図面の簡単な記載）
図１はヒトＣＬＣＡ１の一次アミノ酸配列を示す。ＶＷＡ領域に下線を付し、推定Ｎ−連結の糖鎖付加部位に星印を付す。シグナル配列をＳＳ（配列番号１０）で示す。
【００１４】
図２はＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の両方の蛋白が該蛋白を発現するようにトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から分泌されることを示す。
【００１５】
図３は、ＣＬＣＡ１を発現するようにトランスフェクトされた細胞の、馴化培地（conditioned media）、細胞ライゼートおよび膜調製物中のＣＬＣＡ１の存在を示すウェスタンブロットである。
【００１６】
図４はコンピュータープログラムＴＭＨＭＭを用いて他の既知の膜結合および分泌蛋白と比較したＣＬＣＡ１の疎水性分析を示す。ＣＬＣＡ１は膜貫通アルファへリックスを全く含有しない。
【００１７】
図５はコンピュータープログラムＳｐｌｉｔ４．０を用いて他の既知の膜結合および分泌蛋白と比較したＣＬＣＡ１の疎水性分析を示す。ＣＬＣＡ１は膜貫通アルファへリックスを全く含有しない。
【００１８】
図６はＣＬＣＡ１が多量体として分泌されたことを示すウェスタンブロットである。
【００１９】
図７はＣＬＣＡ１が高度に糖鎖付加されていることを示す。ＰＮＧａｓｅ処理は分泌蛋白の大きさを減少させる。
【００２０】
図８はＣＬＣＡ１のサブユニットがジスルフィド結合で連結されていないことを示すウェスタンブロットである。
【００２１】
図９はＣＬＣＡ１が喘息および非喘息患者のＢＡＬ流体中に存在することを示す。
【００２２】
図１０はＣＬＣＡ１が用量依存的様式でＭＵＣ５ＡＣプロモーターを活性化することを示す。
【００２３】
図１１はＶＷＡ領域、ＭＩＤＡＳ領域の残基および提案されている切断部位の位置を示すＣＬＣＡ１欠失変異体の模式図を示す。
【００２４】
図１２ａはＡ５４９細胞中のＣＬＣＡ１またはｇｏｂ−５の過剰発現によるＭＵＣ５ＡＣ−ルシフェラーゼ受容体の誘発を示す。ＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５はベクタートランスフェクトされた対照と比べて２倍のＭＵＣ５ＡＣ−ルシフェラーゼ受容体活性の誘発を示す。図１２ｂはＨＥＫ２９３細胞にて同様の結果を示す。
【００２５】
図１３はＨＥＫ２９３およびＡ５４９細胞中一時的に発現されるＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の全細胞パッチクランプ法を示す。図１３（ａ）は、０．５Ｍの遊離Ｃａ２＋のピペット液中、ＨＥＫ２９３細胞（左パネル）およびＡ５４９細胞（右パネル）にて一時的に発現されるＣＬＣＡ１の電流−電圧の関係を示す（各群においてｎ＝６−８）。図１３（ｂ）はｈＣＬＣＡ１（左パネル）およびｇｏｂ−５(右パネル）を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞における全細胞電流密度のカルシウム依存的倍数増加を示す（各群においてｎ＝３−８）。同様のデータがＡ５４９で観察された（データは図示せず）。
【００２６】
図１４はＨＥＫ２９３細胞とＡ５４９細胞中のＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５発現を示すウェスタンブロットである。
【００２７】
（実施形態の記載）
本明細書にて使用される抗体は免疫グロブリンまたはその一部を意味し、供給源、製法または他の特徴と関係なく、抗原結合部位を含むいずれのポリペプチドも包含する。該用語は、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、モノ特異的、ポリ特異的、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異およびＣＤＲ−グラフト抗体を包含する。抗体の一部は、抗原と結合しうるいずれのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖを包含しうる。
【００２８】
本明細書で使用される「ＣＬＣＡ１」なる語は膜貫通蛋白以外の蛋白をいう。膜または膜結合分子あるいは分泌分子と共有または非共有結合しうる。
【００２９】
本明細書で使用されるＣＬＣＡ１活性はイオンチャネル、例えばクロライドチャネルの調節をいう。
【００３０】
本明細書で使用される「ムチン」なる語は、流体、例えば炭水化物に富む糖蛋白を含有する分泌物をいう。ムチンは腸の胚細胞、顎下腺または他の腺細胞より分泌されうる。
【００３１】
本明細書で使用される「小分子」は分子量が２５ｋＤ未満のいずれの分子をもいう。
【００３２】
本明細書で使用される「特異的結合パートナー」は、第二の分子と特異的に相互作用する第一の分子を意味する。相互作用は共有結合または非共有結合、例えば、イオン結合、電荷−電荷相互作用、疎水性相互作用、水素結合またはファン・デア・ワールス力の結果とすることができる。
【００３３】
本明細書で使用される「対象」なる語は、ヒトまたはヒト以外の哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ヒト以外の霊長類を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される「治療する」、「治療」および「治療している」なる語は、以下：疾患または症状の重度の減少；疾患の経過期間の減少；疾患または症状に付随する１またはそれ以上の徴候の改善；必ずしも疾患または症状を治癒するわけではないが、疾患または症状の対象に対する有益な効果の付与；疾患または症状に付随する１またはそれ以上の徴候の予防、のいずれをも意味する。
【００３５】
本明細書で使用される「アップレギュレートされた」なる語は、疾患または症状のある対象で、疾患または症状のない個体にて同じ蛋白のレベルよりも大きなレベルで発現される蛋白をいう。
【００３６】
治療方法
本発明はＣＬＣＡ１の発現または活性がアップレギュレートされている疾患または症状の治療方法であって、細胞膜の分子と結合するＣＬＣＡ１を阻害または防止する少なくとも一つの作用物質を投与することを含む方法に関する。
【００３７】
ＣＬＣＡ１はムチンのアップレギュレーションに伴って生じる疾患または症状、例えば、喘息などのアトピー症状に関与する細胞蛋白である（図１；ＷＯ９９／４４６２０）。本発明は、少なくとも一部は、ＣＬＣＡ１が細胞外分子、例えば細胞膜または細胞膜結合分子と相互作用、例えば結合しうる分泌蛋白であるという知見に基づいている。ＣＬＣＡ１と膜分子との結合を阻害または防止する、すなわちムチン産生を増加させる可能性のある作用物質を提供することで、本発明はムチンのアップレギュレーションにより特徴付けられる疾患または症状の治療方法を提供する。
【００３８】
かくして、本発明は、ＣＬＣＡ１発現または活性が亢進、例えばアップレギュレートされる疾患または症状の治療方法に関する。該疾患または症状はアトピーまたはアレルギー障害、例えば喘息とすることができる。該疾患または症状は、ムチンレベルが向上する、例えばムチン産生および／または分泌がアップレギュレートされる、いずれの疾患または症状とすることもできる。該疾患または症状は嚢胞性線維症またはＣＯＰＤ、すなわち、気腫、慢性気管支炎とすることができる。該疾患または症状は粘膜表面、例えば肺表面または消化管表面に影響を及ぼすものとすることができる。該疾患または症状は感染症、例えばウイルス感染または細菌感染とすることができる。該疾患または症状は慢性または急性のいずれとすることもできる。
【００３９】
本発明の方法は、ＣＬＣＡ１、例えば可溶性ＣＬＣＡ１の活性を特異的に阻害する作用物質を利用する。一の実施形態において、該作用物質はＣＬＣＡ１、例えば可溶性ＣＬＣＡ１に直接結合する。もう一つ別の実施形態において、該作用物質は、ＣＬＣＡ１、例えば可溶性ＣＬＣＡ１と、細胞外分子、例えば膜結合蛋白または脂質との結合を阻害、減少または防止する。
【００４０】
ＣＬＣＡ１活性を阻害する作用物質として、蛋白または蛋白フラグメント、例えばペプチドを挙げることができるが、これに限定されるものではない。蛋白または蛋白フラグメントは、既知の技法を用いて、組換え操作を行うことで産生することができる。例えば、Sambrookら、１９８９、Molecular Cloning：A Laboratory Manual、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照のこと。また、蛋白または蛋白フラグメントは既知の操作を用いて、化学合成を行うことで製造することもできる。例えば、Merrifield  １９７３、Chemical Polypeptides（Katsoyannis and Panayotis編）３３５−６１頁；Merrifield  １９６３、J. Am. Chem. Soc. ８５：２１４９；Davisら、１９８５、Biochem. Intl.   １０：３９４；Finnら、１９７６、The Proteins（第三版）２：１０５；Eriksonら、１９７６、The Proteins（第二版）２：２５７；米国特許第３９４１７６３号を参照のこと。蛋白または蛋白フラグメントは誘導化、例えばペギレート化（pegylated）されうる。蛋白または蛋白フラグメントを別の蛋白に融合し、融合蛋白、例えばＧＳＴ融合蛋白、Ｆｃ融合蛋白を製造することができる。蛋白または蛋白フラグメントは糖蛋白またはリポ蛋白とすることができる。一の実施形態において、ＣＬＣＡ１活性を阻害する作用物質はＣＬＣＡ１特異的結合パートナーである。
【００４１】
ＣＬＣＡ１活性を阻害する作用物質は小分子とすることもできる。小分子は有機分子であっても無機分子とすることもできる。小分子は既知の合成技法を用いて合成することができる。例えば、MorrisonおよびBoyd、１９８７、Organic Chemistry Fifth Edition、Allyn and Bacon、Newton、MAを参照のこと。
【００４２】
一の特定の実施形態において、作用物質は抗体または抗体のフラグメントである。抗体のフラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、または一本鎖Ｆｖを挙げることができるが、これらに限定されない。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とすることができる。一般に、抗体は、例えば、伝統的ハイブリドーマ技法（KohlerおよびMilstein、１９７５、Nature  ２５６：４９５）、組換えＤＮＡ法（米国特許第４８１６５６７号）または抗体ライブラリーで行われるファージ提示（Clacksonら、１９９１、Nature  ３５２：６２４；Marksら、１９９１、J Mol Biol、２２２：５８１）を用いて製造できる。他の抗体産生技法として、例えば、Antibodies：A Laboratory Manual、Harlowら編、１９８８、Cold Spring Harbor Laboratoryを参照のこと。
【００４３】
インビトロ系を設計して、例えばＣＬＣＡ１に結合することで、ＣＬＣＡ１活性の阻害能を有する化合物を同定してもよい。該アッセイは、複合体を形成するのに十分な時間などの条件下、ＣＬＣＡ１と試験化合物の反応混合物を調製することを含みうる。その複合体は一時的な複合体とすることができ、該複合体は除去または反応混合物にて検出することができる。ＣＬＣＡ１を固相、例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレートに固定し、ついで試験物質および検出される複合体と反応させる。別法として、試験物質を固相に固定し、ＣＬＣＡ１および検出される複合体と反応させる。未反応の試薬は洗い流すことができる。固定されていない種は直接または間接的に標識しうる。標識として、例えば、色素、発色団または放射活性を挙げることができるが、これらに限定されない。標識は試験物質またはＣＬＣＡ１に特異的な抗体とコンジュゲートしうる。
【００４４】
一の実施形態において、試験ＣＬＣＡ１阻害物質の存在または不存在下、ムチン産生を用いてＣＬＣＡ１活性を測定することができる。ムチン産生は粘膜−表皮細胞系、例えば、ヒトＣＬＣＡ１遺伝子でトランスフェクトされたＮＣＩ−Ｈ２９２を用いてインビトロにて測定することができる（Nakanishiら、２００１、Proc Natl Acad Sci USA  ９８（９）：５１７５を参照のこと）。試験物質の阻害剤を培地に加え、ムチン産生をモニター観察しうる。ムチン産生は当該分野にて周知の技法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはウェスタンブロットを用いてモニターすることができる。
【００４５】
ＣＬＣＡ１阻害物質は静脈内、皮下、舌下、筋肉内、経口、バッカル、経鼻、経直腸的に、あるいは肺経路を介して投与することができる。ＣＬＣＡ１阻害物質は、キメラ蛋白の遅延放出を可能とする生体高分子の固体支持体に埋め込むことも、連結させることもできる。
【００４６】
ＣＬＣＡ１阻害物質は疾患または症状の治療の分野にて公知の第二の作用物質の治療学的に効果的な量と組み合わせて投与することができる。一例として、限定するものではないが、ＣＬＣＡ１阻害物質とベータ受容体アゴニストまたはコルチコステロイドで喘息を治療することができる。
【００４７】
ＣＬＣＡ１阻害物質の用量は対象および利用される個々の投与形路に応じて変化するであろう。投与量は体重１ｋｇ当たり０．１ないし１０００００μｇの範囲とすることができる。一の実施形態において、用量範囲は１−１０ｍｇ／ｋｇである。ＣＬＣＡ１阻害物質は連続的にまたは特定の間隔で投与することができる。インビトロアッセイを利用して最適用量の範囲および／または投与計画を決定してもよい。加えて、有効量は、例えばネズミ喘息での動物実験（Nakanishiら、２００１、Proc Natl Acad Sci USA、９８（９）：５１７５）より得られる用量応答曲線から推定してもよい。
【００４８】
本発明はまた、ＣＬＣＡ１阻害物質および医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。適当な医薬担体の例がRemington's Pharmaceutical SciencesにE.W. Martinによって記載されている。賦形剤の例として、澱粉、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、粉乳、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脂肪粉乳、グリセロール、水、エタノール等を挙げることができる。組成物はまた、ｐＨ緩衝試薬および湿潤または乳化剤を含有しうる。
【００４９】
経口投与の場合、医薬組成物は通常の手段により調製される錠剤またはカプセル剤の形態を取ることができる。組成物は液体、例えばシロップまたは懸濁液として調製することができる。液体は懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または硬化食用油）、乳化剤（レシチンまたはアカシア）、非水性ビヒクル（例えば、落花生油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）および保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルまたはプロピルあるいはソルビン酸）を包含しうる。調製物はまた、矯味矯臭剤、着色剤および甘味剤を包含しうる。また、組成物は水あるいは別の適当なビヒクルで復元する乾燥製品として提供することもできる。
【００５０】
バッカルおよび舌下投与の場合、組成物は通常のプロトコルに従って錠剤またはロゼンジの形態を取ってもよい。
【００５１】
吸入投与の場合、本発明に従って使用される化合物は、都合よくは、エアロゾル形態、例えば適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いる加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーにてデリバリーされる。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、バルブを設け、計量された量をデリバリーすることにより決定されうる。吸引器または吸入器にて使用される、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、化合物とラクトースまたは澱粉などの適当な粉末基剤との粉末混合物を含有するように処方することができる。
【００５２】
医薬組成物はボーラス注射による非経口投与（すなわち、静脈内または筋肉内）用に処方しうる。注射用処方は、単位剤形にて、例えばアンプルにて、あるいは保存剤を添加した複数回投与用の容器にて提供されうる。組成物はかかる剤形を油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとすることができ、懸濁化、安定化および／または分散化剤などの処方剤を含有しうる。また、活性成分は適当なビヒクル、例えば発熱物質不含水で復元される粉末形態とすることもできる。
【００５３】
医薬組成物はまた、例えばカカオ脂または他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含有する坐剤または停留浣腸として経直腸投与用に処方しうる。
【００５４】
ＣＬＣＡ１の単離方法
ＣＬＣＡ１は分泌可溶化蛋白である。したがって、該蛋白はそれを含有する流体をＣＬＣＡ１の特異的結合パートナーと接触させることで、該流体より容易に単離される。
【００５５】
ＣＬＣＡ１は生体流体より単離されうる。生体流体は体液または分泌液を包含しうる。一の実施形態において、ＣＬＣＡ１は唾液より単離される。もう一つ別の実施形態において、ＣＬＣＡ１は気管支肺胞洗浄液より単離される。体液は粘膜表面より単離されうる。一の実施形態において、粘膜面は肺面または直腸面である。
【００５６】
特異的結合パートナーは、蛋白または蛋白フラグメント、例えばペプチドを包含しうるが、これに限定されない。蛋白または蛋白フラグメントは誘導化、例えばＰＥＧ化（pegylated）されうる。蛋白または蛋白フラグメントは融合蛋白、例えばＧＳＴ融合蛋白、Ｆｃ融合蛋白の一部とすることができる。蛋白または蛋白フラグメントは糖蛋白またはリポ蛋白でありうる。特異的結合パートナーは小分子でありうる。小分子は有機分子または無機分子でありうる。一の具体的な実施形態において、作用物質は抗体または抗体のフラグメントである。抗体のフラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２または一本鎖Ｆｖが挙げられるが、これに限定されない。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でありうる。
【００５７】
可溶性ＣＬＣＡ１は、それを特異的結合パートナーと、ＣＬＣＡ１と特異的結合パートナーの間で複合体を形成するような第１の一連の条件下で反応させることによって単離されうる。反応は液相にて起こり、複合体を特異的結合パートナーを認識する抗体と接触させることで該複合体が単離されうる。別に、特異的結合パートナーは、その特異的結合パートナーを認識する抗体により、直接的または間接的のいずれかで、固体支持体に連結されうる。固体支持体は、例えば、ビーズ、マイクロタイタープレート、カラムのマトリックス、膜またはモノリスとすることができるが、これに限定されない。一旦、複合体が形成されれば、例えば、ｐＨを、あるいは該複合体を含有する溶液の塩の濃度を複合体が切断されるような一連の第２の条件に変えることで、反応条件を変えることができる。特異的結合パートナーは固体支持体との結合を維持しており、そうして単離したＣＬＣＡ１が含まれる溶液が得られる。
【００５８】
（実施例）
実施例１：  ＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５のＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３細胞中での一時的発現
ＣＯＳおよびＨＥＫ２９３細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２ｍＭのグルタミンを補足したダルベッコ修飾イーグル（ＤＭＥ）培地に維持し、湿った雰囲気下、３７℃で増殖させた。トランスフェクションを行う１６時間前に、ＣＯＳ細胞を４ｘ１０６細胞／皿で１００ｍｍの組織培養液で処理した皿に播種した。細胞が約７０％の集密に達した後、製造者の指示に従って、１０μｇのＤＮＡをリポフェクタミン２０００試薬（Invitrogen, Carlsbad、CA）とＯｐｔｉ−ＭＥＭ血清不含培地（Life Technologies、Carlsbad、CA）中にて混合した。リポフェクタミン２０００／ＤＮＡの混合物をＣＯＳ細胞の培地に添加し、３７℃にて６時間維持した。そのインキュベーション期間の経過後、プレートの培地を完全培地（ＤＭＥ１０％ＦＣＳ）と置き換えた。細胞を３７℃で２４−４８時間インキュベートさせ、その後、生体化学分析のために馴化培地および細胞ライゼートを収穫した。
【００５９】
実施例２：  放射性の異種発現した蛋白への取り込み
ＣＬＣＡ１、ｇｏｂ−５またはｐｃＤＮＡ３．１ベクター対照でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞単層を血清不含ＤＭＥ中システインまたはメチオニンなしで２０分間インキュベートした。ついで、１００ｍｍの皿当たり３００μＣｉのＰｒｏｍｉｘ（Amersham、Piscataway、NJ）、３５Ｓ標識化システインおよびメチオニンの混合物で細胞を３０分間標識化した。放射性アミノ酸含有の培地を取り出し、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。原子力規制委員会の指針に従って放射性廃棄物を処分した。１０％ｖ／ｖウシ胎児血清を含むＤＭＥを加え、細胞を３７℃で２ないし６時間インキュベートした。これらの時点で、馴化培地および細胞ライゼートを収穫した。組み込まれた放射活性をＴＣＡ沈降により以下のように測定した。各サンプルについて、１μｌをＷｈａｔｍａｎｎ３ＭＭペーパーの小片にブロットした。サンプルのペーパーを氷冷した１０％ｗ／ｖトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）中に１０分間浸した。該サンプルを氷冷エタノールで各々５分間３回連続して洗浄し、ついで風乾させた。一度乾燥させた後、ペーパーサンプルをシンチレーションバイアル中の１０ｍｌのＳｃｉｎｔｉ−Ｓａｆｅ（Fisher Scientific、Hanover Park、IL）シンチレーション流体に添加した。放射活性のレベルをＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒにて測定した。
【００６０】
実施例３：  細胞ライゼートの収穫
細胞の単層を氷冷したカルシウムおよびマグネシウム不含のリン酸緩衝セイライン（ＰＢＳ）で２回洗浄した。０．２５％（ｖ／ｖ）のトリプシン−ＥＤＴＡ（Gibco、Carlsbad、CA）を用いて皿から細胞を取り出し、血球計を用いて計数した。細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上にて１５分間、ＮＰ−４０溶解緩衝液（１％のＮＰ−４０、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール）に１０μｌの溶解緩衝液当たり０．５ｘ１０６細胞の濃度で溶菌させた。得られたライゼートを１５０００ＲＰＭで１５分間マイクロ遠心分離に付して不純物を除去し、ついでウェスタンブロットに用いるまで−８０℃で貯蔵した。
【００６１】
実施例４：  膜調製物
１００ｍｍの組織培養液で処理した皿にて増殖したＣＯＳ細胞を実施例１に記載されるようにトランスフェクトした。４８時間トランスフェクトした後、トリプシンを用いて該プレートから細胞を取り出し、５０ｍｌのチューブ中、冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を４ｍｌの１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）に再び懸濁させて氷上に２０分間放置した。その細胞懸濁液をクリーン・ダウンス・ホモジナイザー（clean dounce homogenizer）で１０回ストロークに付して均質化させた。ついでサンプルをＳｏｒｖａｌｌ  Ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴテーブルトップ遠心分離機を用い２０００ｇで１０分間回転させた。上澄を超遠心分離管に移し、１０００００ｇで１時間、超遠心分離により回転させた。得られたペレットを１００μｌのＮＰ４０溶解緩衝液に懸濁させた。
【００６２】
実施例５：  ウェスタンブロッティング
サンプルをβ−メルカプトエタノールを含む２ｘＳＤＳサンプル緩衝液と合わせ、２分間沸騰させた。沸騰させた後、サンプルを４−２０％勾配ゲルまたは６％ＳＤＳゲルのいずれかの上にローディングした。ついで、ゲルをインビトロゲンにより提供されるインビトロゲン・ブロッティング装置（Invitrogen、Carlsbad、CA）およびトランスファー緩衝液（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いてニトロセルロースに移した。ゲルを、一定電流の下、３０Ｖで２時間移動させた。ニトロセルロースブロットを、５％脱脂粉乳中、室温にて１時間遮断した。該ブロットを０．５μｇ／ｍＬのポリペプチドポリクローナル抗体と一緒に４℃で一夜インキュベートした。一次抗体と一緒にインキュベートした後、ブロットを洗浄バッファー（ＰＢＳ中１％トリトンＸ１００（ｖ／ｖ）、０．１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、カルシウムおよびマグネシウム不含）中にて各々１０分間で３回洗浄し、ついでホースラディシュ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたマウス抗ラビットＩｇＧ（Santa Cruz Biotech、Santa Cruz、CA）と共に３０分間インキュベートした。該ブロットを洗浄バッファー中にて各々１０分間で３回洗浄し、化学発光試薬、ＥＣＬ（Amersham、Piscataway、NJ）で発色させた。該ブロットをコダックフィルムに曝し、フィルム現像剤を用いて現像した。
【００６３】
実施例６：  構築物の生成
ＣＬＣＡ１をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてヒト結腸ｃＤＮＡより単離した。この反応に用いた５’アンカープライマーは次のとおりであった：
５’−ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧ  ＧＧＡＴＧＧＧＧＣＣ  ＡＴＴＴＡＡＧＡＧＴ  ＴＣＴＧＴＧＴＴＣ−３’（配列番号１）。下線を付した配列はＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を表す。構築物はすべてこの５’プライマーを用いた。欠失構築物にて用いた３’プライマーは以下のとおりであった：（１−７０８）５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴ  ＣＡＣＴＡＣＴＴＡＴ  ＴＡＡＴＴＴＣＡＧＧ  ＴＣＴＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号２）、（１−６６０）５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴ  ＣＡＣＴＡＣＣＴＴＧ  ＡＧＴＡＧＡＣＡＣＣ  ＧＴＣＡＴＣＣＴＴＡ  Ｇ−３’（配列番号３）および（１−４６２）５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴ  ＣＡＣＴＡＴＴＧＡＴ  ＣＴＧＡＡＧＣＡＴＡ  ＴＧＴＣＴＧＴＡＡＡ  ＣＣＴＣＣＣＴＧ−３’（配列番号４）。ＰＣＲ産物を忠実度の高いＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Invitrogen、Carlsbad、CA）で増幅させた。欠失産物は鋳型として野生型ＣＬＣＡ１を用いた。該鋳型を９６℃で２分間変性させ、ついで反応を以下のように進行させた：ＤＮＡを９４℃で３０秒間変性させ、６５℃で１分間アニールさせ、７２℃で１分間伸長させた。このサイクルを２０サイクル繰り返した。得られた産物をＨｉｎｄＩＩＩで消化させた。ｐｃＤＮＡ３．１をＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、仔ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（New England Biolabs、Beverly、MA）で脱リン酸化した。該フラグメントをラピッドＤＮＡライゲーションキット（Roche、Basel、Switzerland）を用いてライゲートし、ついでワンショットケミカルコンピテント・イー・コリ（Invitrogen、Carlsbad、CA）で形質転換した。
【００６４】
実施例７：  ポリクローナル抗体の生成
ペプチドポリクローナル抗体の生成を、記載のプロトコルに従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad、CA）を用いて行った。ニュージランド・ホワイトラビット（３−９月齢）にフロイントアジュバントに乳化させたＫＬＨ−ペプチド（下記参照）を３個所の背部位にて皮下注射すること（免疫処理につき０．１ｍｇのペプチド）で免疫処理を行った。動物を関節の動脈付近で出血させた。血清を集め、力価をフリーペプチドＥＬＩＳＡを介して測定した。前に記載されるように（Nakanishiら、２００１、Proc Natl Acad Sci USA  ９８：５１７５）、細胞外ドメインを基礎として５つの親水性ペプチドを選択した。その親水性ペプチドは、アミノ酸１２４−１４０、Gly Glu Lys Gly Glu Arg Ile His Leu Thr Pro Asp Phe Ile Ala（配列番号５）に対応する１ＣＬＣ、アミノ酸２０２−２１７、Glu Gln Asn His Asn Lys Glu Ala Pro Gln Lys Gln Asn Gln Lys（配列番号６）に対応する２ＬＣＬ；アミノ酸４７８−４９５、Gly Gln Gly Val Ser Gln Arg Ser Ile Gln Leu Glu Ser Lys Gly Leu Thr（配列番号７）に対応する３ＬＣＬ；アミノ酸７０２−７１９、Ile Glu Asn Asp Glu Ile Gln Trp Asn Pro Pro Arg Pro Glu Ile（配列番号８）に対応する４ＬＣＬ；およびアミノ酸８１９−８３３、Lys Glu Ala Asn Ser Glu Glu Val Phe Leu Phe Lys Pro Glu Asn（配列番号９）に対応する５ＬＣＬを包含する。
【００６５】
実施例８：  ＰＮＧaseフラグメント
ＰＮＧａｓｅ  Ｆをニュージランド・バイオラボ（New England Biolabs）（Beverly、MA）より入手し、製造者の指示に従って用いた。サンプルを還元バッファー中にて５分間沸騰させた。エチルフェニル−ポリエチレングリコール（ＮＰ−４０）を１ｘＧ７反応バッファー（New England Biolabs、Beverly、MA）と一緒に１％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加した。１μｌのＰＮＧａｓｅ  Ｆを添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。ついで、２ｘサンプルバッファー（Invitrogen、Carlsbad、CA）を添加し、実施例５に記載されるようにサンプルをトリス−グリシンゲル上で分散させた。
【００６６】
実施例９：  ＭＵＣ５ＡＣレポーターアッセイ
ＭＵＣ５ＡＣプロモーターの１．６キロ塩基のフラグメントをレポーター（ＭＵＣ５ＡＣ−ｌｕｃ）として用いられる蛍ルシフェラーゼ遺伝子に融合させた。ウェル当たり合計２μｇを用いて、Ａ５４９細胞を、６−ウェルの組織培養処理プレートにて、FuGeneトランスフェクション試薬（Roche、Basel、Switzerland）でトランスフェクトした。ウェル当たり０．５μｇのＭＵＣ５ＡＶ−ｌｕｃ構築物を用いた。種々の濃度のＣＬＣＡ１または欠失構築物を用いて用量応答を確立した。ベクターＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１）を用いてＤＮＡの合計を２μｇの完全なものとした。細胞を２回洗浄し、血清不含Ｈａｍｓ／Ｆ１２培地（Life Technologies、Carlsbad、CA）中にて６時間トランスフェクトした。６時間後、培地を血清含有、すなわち１０％血清Ｈａｍｓ／Ｆ１２に変えた。ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega、Madison、WI）が供給されている細胞溶解溶液に細胞を溶菌させ、製造主の指示に従った。サンプルを３通りにて９６−ウェルプレートに移し、９６−ウェル照度計（Turner Biosystems、Sunnyvale、CA）上で読み取った。
【００６７】
実施例１０：  ＣＬＣＡ１のコンピューター分析
ＣＬＣＡ１は９個の推定Ｎ−連結糖鎖形成部位を含有する９１４個のアミノ酸ポリペプチドである（図１）。疎水性の２１残基の伸長はアルゴリズムＳｉｇＣｌｅａｖｅによれば分泌シグナル配列であると予想される。ＣＬＣＡ１ポリペプチド配列を用いてさらに、ＮＣＢＩ保存ドメインデータベース（http://www.ncbi.gov）をクエリーし、２７０個のアミノ酸に及ぶセントラル・フォン・ヴィレブランド因子Ａ−ドメイン（ＶＷＡ）を含有することを見出した。ＣＬＣＡ１のＶＷＡドメインは、二価の金属カチオンの結合に関与する一連の所定のアミノ酸である無傷のＭＩＤＡＳモチーフを含有する。
【００６８】
ＣＬＣＡ１を膜貫通秘密マルコフモデル（transmembrane hidden Markov model）（ＴＭＨＭＭ）（Sonnhamerら、１９９８、Proc Sixth Int Conf on Intelligent Systems for Molecular Biology、AAAI Press）を用いて評価した。該モデルは膜貫通アルファへリックスを解析し、膜貫通セグメントだけでなく、その上に膜トポロジーをも予測するための手段として開発された。ＴＭＨＭＭはＣＬＣＡ１が分泌蛋白、血清アルブミンと同様に膜貫通セグメントを有しないであろうことを示唆する（図４）。該モデルが予測的であることを保証するために、十分に理解されている他の蛋白、膜貫通トポロジーまたは解決されている結晶構造を解析した。該モデルはイー・コリから由来のＣＦＴＲの１２個の疎水性セグメントおよびＣＬＣの所定の疎水性ストレッチを確実に予測した（Riordanら、１９８９、Science  ２５４：１６０６；Dutzlerら、２００２、Nature  ４１５：２８７）。もう一つ別の疎水性モデル、スプリット（Split）４.０（http://pref.etfos.hr/split-4.0/）に基づいて、ＣＬＣＡ１はまた、可溶性蛋白であると予測される（図５）。
【００６９】
実施例１１：  ＣＬＣＡ１の異種発現
その細胞局在を試験するために、ＣＬＣＡ１を哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１およびｐＤＥＳＴ１２．２を用いてＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ２９３細胞にて異種発現させた。ＣＬＣＡ１の過剰発現は３５Ｓｃｙｓ−ｍｅｔの放射性取り込みによって測定すると培地において予想外の１２０ｋＤの種を生成した（図２）。培地でのこれらのバンドの存在はＣＬＣＡ１が分泌されていることを示唆する。ＣＬＣＡ１の同一性を確認するために、ウェスタンブロット分析にて用いるための、Gruber（Gruberら、１９９９、Genomics  ５４：２００）により示唆されている細胞外ドメインに相当するペプチドに拮抗するペプチドポリクローナル抗体を生成した。分泌表現型を、実際に、ＣＯＳ−７トランスフェクト細胞およびＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞の馴化培地での１２０ｋＤのＣＬＣＡ１免疫反応性バンドを示す、ウェスタンブロット分析により確認した（図３Ａ）。全長ＣＬＣＡ１の存在を馴化培地にて確認した。１２０ｋＤバンドおよび３７ｋＤバンドもまた、ウェスタンブロットによる細胞溶菌において認められた（図３Ｂ）。これらのバンドは標準ベクターでトランスフェクトされた細胞では存在しなかった。
【００７０】
細胞ライゼートに存在するバンドが分泌経路に由来するのか、膜に関連するのかどうかを試験するために膜調製物を分析した。１２０ｋＤと３７ｋＤの両方が膜と関連する（図３Ｃ）。ベクターおよびＣＬＣＡ１トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地のサンプルをマススペクトルで分析し、そのポリクローナル抗体の特異性を確認した。ウェスタンブロットにおけるＣＬＣＡ１免疫活性バンドは全長ＣＬＣＡ１であることを確認した。
【００７１】
ＣＯＳおよびＨＥＫ２９３の両方のトランスフェクトからの馴化培地を、還元および非還元条件下でウェスタンブロットにより分析し、ＣＬＣＡ１が分泌される環境下で多量体として存在するかどうかを評価した。還元条件下では、約１２０ｋＤの大きさのＣＬＣＡ１が移動する。非還元条件下では、二量体の形成と一致するより高分子量の種が明らかとなる（図６）。これらの観察は４−２０％勾配のトリス−グリシンＳＤＳゲルを用いてなされた。解像度を上げるために、６％トリス−グリシンゲルを用いた。非還元条件下では、二量体および多量体の形成と一致する大きさのＣＬＣＡ１が移動した。
【００７２】
一次蛋白配列を基礎として、ＣＬＣＡ１が約１００ｋＤの分子量を有すると予測する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、馴化培地中、１２０ｋＤで移動する種を明示する。ＣＬＣＡ１は９個の推定Ｎ−連結糖鎖形成部位を有する（図１）。分泌されたサンプルをＮ−グリコシダーゼＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理し、Ｎ−連結糖の分子量の違いに対する寄与を決定した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理することでその大きさは期待される１００ｋＤにまで減少した（図７）。このことはＣＬＣＡ１が９個の推定Ｎ−連結糖鎖形成部位を有し（図１）、高度に糖鎖形成されている可能性があるという事実と一致する。
【００７３】
Gruberらは、ＣＬＣＡ１がその全長が１２０ｋＤの生成物から切断され、ジスルフィド結合により結合されている、９０ｋＤと３７ｋＤの生成物を生成すると示唆する（Gruberら、１９９９、Genomics  ５４：２００）。２つのサブユニットがジスルフィド結合により連結されているかどうかを試験するために、ライゼートを、還元条件および非還元条件下、ウェスタンブロットで作動させた（図８）。非還元条件下では、３７ｋＤ種はなおも存在する。この観察はジスルフィド結合が低分子量のサブユニットと関連していないことを示唆する。
【００７４】
実施例１２：  可溶性ＣＬＣＡ１の自然発現
ＣＬＣＡ１の分泌された表現型は主に過剰発現系にて見られるため、その現象が異常な細胞プロセッシングのアーチファクトであるとの懸念があった。遺伝子発現の研究はＣＬＣＡ１が抗原攻撃の後に肺で発現されることを示唆した。結果として、アスカリス・スーム（Ascaris suum）の抗原投与を行ったカニクイザルからの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）を可溶性ＣＬＣＡ１の存在についてウェスタンブロットにより試験した。９０ｋＤおよび１２０ｋＤの免疫反応性のバンドが、同じ動物の抗原投与していない状態と投与した状態の両方のＢＡＬから検出された。
【００７５】
次に、喘息および非喘息患者からのヒトＢＡＬのサンプルを試験した。そのヒトサンプルから得られた結果はサルＢＡＬサンプルから得られた結果と類似した。一貫して、９０と１２０ｋＤに２つのバンドがあった。患者間でバラツキがあるが、全体として喘息と非喘息サンプルの間で蛋白発現において違いがあるとは思えなかった（図９）。
【００７６】
発現実験およびＣＬＣＡ１を誘発することで粘液の生成が得られるという生理学的観察（Hoshinoら、２００２、Am J Respir Crit Care Med  １６５：１１３２；Nakanishiら、２００１、Proc Natl Acad Sci USA ９８：５１７５）に基づき、蛍ルシフェラーゼ遺伝子に融合したＭＵＣ５ＡＣ遺伝子プロモーターをアッセイリードアウトとして用いるレポーターアッセイが開発された。Ａ５４９細胞は粘膜表皮および気道を起源とするため、該細胞を使用した。Ａ５４９細胞におけるＣＬＣＡ１の過剰発現は、ルシフェラーゼ活性で測定した場合、ＭＵＣ５ＡＣ遺伝子転写の用量依存性上昇をもたらす（図１０）。
【００７７】
実施例１３：  構築物の生成
欠失および変異構築物がＣＬＣＡ１の機能性決定因子を同定するのに造られるであろう（図１１）。Ｃ−末端欠失構築物はアミノ酸７０９−９１４および６６１−９１４を欠失しており、Gruberらにより提案されている（Gruberら、１９９９、Genomics  ５４：２００）ところの推定切断産物に相当する。構築物１−４６２はＶＷＡドメインを含むＮ−末端からなっているであろう。ＶＷＡｄｅｌはＶＷＡドメインの欠失した完全な分子からなっているであろう。これはＣＬＣＡ１の機能についてＶＷＡドメインの必要性を試験するであろう。加えて、二価のカチオン結合に不可欠な、ＶＷＡドメインのＭＩＤＡＳモチーフが、その結合を排除するのに変異させられるであろう。
【００７８】
実施例１４：  ＨＥＫ２９３およびＡ５４９細胞におけるＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の発現
肺細胞系Ａ５４９および胚腎細胞系ＨＥＫ２９３を、各々、ＣＬＣＡ１またはｇｏｂ−５のいずれかをコードするように遺伝子操作したプラスミド、ｐｃＤＮＡ３でトランスフェクトした。ウェスタンブロットで発現を確認した。サンプルをβ−メルカプトエタノールを含む２ｘＳＤＳサンプル緩衝液と合し、２分間沸騰させた。沸騰させた後、サンプルを４−２０％勾配または６％ＳＤＳのゲル上にローディングした。ついで、Invitrogenブロッティング装置およびトランスファー緩衝液（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いてゲルをニトロセルロースに移した。一定電流の下、３０Ｖで２時間ゲルを移動させた。ニトロセルロースのブロットを、５％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳中、室温にて１時間ブロックした。ＣＬＣＡ１またはｇｏｂ−５のＮまたはＣ末端のいずれかを認識するペプチドポリクローナル抗体と一緒にブロットを４℃にて一夜インキュベートした。一次抗体と一緒にインキュベーションした後、ブロットを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ１００、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、カルシウムおよびマグネシウム不含）中、各々を１０分間、３回洗浄し、ついでホースラディシュ・ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたマウス抗ウサギＩｇＧと一緒に３０分間インキュベートした。ブロットを洗浄バッファー中にて各々１０分間で３回洗浄し、化学発光試薬（ＥＣＬ試薬）（Amersham、Uppsala、Sweden）で発色させた。ブロットをコダックフィルムに曝し、フィルム現像剤を用いて現像した。結果はＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の両方が発現することを示した（図１４）。
【００７９】
実施例１５：  ＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５のＭＵＣ５ＡＣ遺伝子転写の誘発
レポーティング遺伝子、ルシフェラーゼの上流に融合したＭＵＣ５ＡＣプロモーターの１．６ｋｂフラグメントを含む構築物（ＭＵＣ５ＡＣ−ｌｕｃ）を用いてＣＬＣＡ１またはｇｏｂ−５の過剰発現がムチンプロモーターの制御下で遺伝子発現を誘発しうるかどうかを測定した。
【００８０】
Ａ５４９またはＨＥＫ２９３細胞を６−ウェル組織培養液
ウェル当たり合計４μｇを用いて、Ａ５４９またはＨＥＫ２９３細胞を、６−ウェルの組織培養処理プレートにて、TransITトランスフェクション試薬（Mirus Corp.、Madison、WI）でトランスフェクトした。ＭＵＣ５ＡＶ−ルシフェラーゼ構築物（０．２ｍｇ／ウェル）をＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトした。Ａ５４９細胞にはウェル当たり１ｍｇのＭＵＣ５ＡＣ−ルシフェラーゼ構築物を用いた。トランスフェクションから２４時間後、ルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega、Madison、WI）が供給されている細胞溶解溶液に細胞を溶菌させ、製造主の指示に従った。サンプルを３通りにて９６−ウェルプレートに移し、９６−ウェル照度計（Turner Biosystems、Sunnyvale、CA）上で読み取った。得られたルシフェラーゼデータをβ−ガラクトシダーゼ発現（ＨＥＫ２９３細胞）または総蛋白のｍｇ当たり（Ａ５４９細胞）について正規化した。
【００８１】
結果はＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５が共に負の対照（空のプラスミド）と比較して遺伝子の転写の２倍増を誘発したことを示した（図１２ａ：Ａ５４９細胞、および図１２ｂ：ＨＥＫ２９３細胞）。
【００８２】
実施例１６：  生理学的カルシウムレベルを用いる全細胞クロライド電流誘導の測定
Ａ５４０細胞およびＨＥＫ２９３細胞を、各々、緑色発光蛋白、およびＣＬＣＡ１またはｇｏｂ−５のいずれかをコードするプラスミドでトランスフェクトした。緑色を発光する個々の細胞を電気生理学的測定のために選択し、生理学的レベルのカルシウムの存在下、ＣＬＣＡ１およびＧｏｂ−５が全細胞クロライド電流を確立しうるかどうかを測定した。
【００８３】
ＡｘｏＰａｔｃｈ２００Ｂ増幅器（Axon Instruments、Foster City、CA）を用いてすべての電気生理学的実験を行った。電圧固定法およびデータ収集はｐＣｌａｍｐ８ソフトウェア（Axon Instruments）で制御した。アナログのデータをデジタイザーＤＩＧＩＤＡＴＡ１３２１Ａ（Axon Instruments、Union City、CA）を用いて１ｋＨｚでフィルター処理に付し、ついで１０ｋＨｚでデジタル化した。すべての実験は室温で行った。
【００８４】
一価のカチオンをセシウムと置き換えることで原形質膜を通過する全細胞Ｃｌ−電流を薬理学的に単離した。膜斑の破裂を介する従来の全細胞を記録する場合、浴溶液は：１４５ｍＭ  ＣｓＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１３ｍＭ  グルコースおよび１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４を含有した。ピペット溶液は：１４５ｍＭ  ＣｓＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、２ｍＭ  ＢＡＰＴＡ（または１μＭの遊離Ｃａ２＋に対して１ｍＭ  ジブロモ−ＢＡＰＴＡ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．２および０．１と１μＭの間の遊離［Ｃａ２+］が得られるように、適当な濃度のＣａＣｌ２（MaxChelatorソフトウェア、Stanford University、Palo Alto、CAを用いて評価した）を含有した。
【００８５】
全細胞Ｃｌ−電流を０ｍＶで３０ミリ秒（ｍｓ）間電圧を固定することで開始するプロトコルでモニター観察した。ついで、電圧を−１００ｍＶで２００ｍｓに切り替え、０ｍＶで３０ｍｓに戻し、ついで１００ｍＶで２００ｍｓに進め、最後に０ｍＶに戻した。この順序の電圧工程を５秒ごとに５分間繰り返し、電流の進展経過をモニターした。Ｃａ２＋活性化全細胞Ｃｌ−電流のＩ／Ｖの関係を以下のプロトコルを用いて得た：膜電位を０ｍＶに維持し、その場合０で、−１００ｍＶから＋１００ｍＶまでの範囲にある３００ｍｓの試験パルス（２０ｍＶづつ増加）まで段階的に進め、０ｍＶに戻した。試験パルスの終わりまで報告されている電流はすべて５ｍｓで測定し、細胞電気容量で正規化した。図１３ａに示される結果は、ＨＥＫ２９３およびＡ５４９細胞におけるｈＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５過剰発現がカルシウムの生理学的レベルの下では全細胞クロライド電流を発生させないことを示した。その上、カルシウムの濃度の増加に対して電流密度の用量応答も見られなかった（図１３ｂ）。
【００８６】
本明細書中に引用される文献は、たとえ、個々の刊行物または特許もしくは特許出願が具体的かつ個別的に出典を明示することでその内容を本明細書の一部とすることを意図としているとしても、その同じ内容で出典明示により本明細書の一部とされる。出典明示により本明細書の一部とされる刊行物および特許または特許出願が本明細書の開示と相反する場合には、本願明細書の記載はその相反する事項に優先および／または勝ることを意図とする。
【００８７】
本願明細書および特許請求の範囲にて使用される成分量、反応条件などを示す数はすべて、「約」なる語で修飾されていると理解すべきである。したがって、そうでないと示されない限り、明細書および特許請求の範囲に示される数値パラメーターは、本発明により得られると考えられる所望の特性に応じて変化しうる概算値である。少なくとも、均等論の原理を特許請求の範囲に適用することを限定する試みとしてではなく、数値パラメーターは有効数字または通常の丸み付け手段（例えば、四捨五入）を考慮して解釈されるべきである。
【００８８】
本願発明の精神および範囲を逸脱することなく、その多くの修飾および変形が可能であることは、当業者に明らかであろう。本明細書に開示されている特定の実施形態は単なる例示として示されているものであり、何ら限定することを意図とするものではない。明細書および実施例は単なる例示であると考えられ、真の本願発明の範囲および精神は添付した特許請求の範囲により示されるものである。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図１はヒトＣＬＣＡ１の一次アミノ酸配列を示す。ＶＷＡ領域に下線を付し、推定Ｎ−連結の糖鎖付加部位に星印を付す。シグナル配列をＳＳ（配列番号１０）で示す。
【図２】図２はＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の両方の蛋白が該蛋白を発現するようにトランスフェクトされたＣＯＳ細胞から分泌されることを示す。
【図３】図３は、ＣＬＣＡ１を発現するようにトランスフェクトされた細胞の、馴化培地（conditioned media）、細胞ライゼートおよび膜調製物中のＣＬＣＡ１の存在を示すウェスタンブロットである。
【図４】図４はコンピュータープログラムＴＭＨＭＭを用いて他の既知の膜結合および分泌蛋白と比較したＣＬＣＡ１の疎水性分析を示す。ＣＬＣＡ１は膜貫通アルファへリックスを全く含有しない。
【図５】図５はコンピュータープログラムＳｐｌｉｔ４．０を用いて他の既知の膜結合および分泌蛋白と比較したＣＬＣＡ１の疎水性分析を示す。ＣＬＣＡ１は膜貫通アルファへリックスを全く含有しない。
【図６】図６はＣＬＣＡ１が多量体として分泌されたことを示すウェスタンブロットである。
【図７】図７はＣＬＣＡ１が高度に糖鎖付加されていることを示す。ＰＮＧａｓｅ処理は分泌蛋白の大きさを減少させる。
【図８】図８はＣＬＣＡ１のサブユニットがジスルフィド結合で連結されていないことを示すウェスタンブロットである。
【図９】図９はＣＬＣＡ１が喘息および非喘息患者のＢＡＬ流体中に存在することを示す。
【図１０】図１０はＣＬＣＡ１が用量依存的様式でＭＵＣ５ＡＣプロモーターを活性化することを示す。
【図１１】図１１はＶＷＡ領域、ＭＩＤＡＳ領域の残基および提案されている切断部位の位置を示すＣＬＣＡ１欠失変異体の模式図を示す。
【図１２】図１２ａはＡ５４９細胞中のＣＬＣＡ１またはｇｏｂ−５の過剰発現によるＭＵＣ５ＡＣ−ルシフェラーゼ受容体の誘発を示す。ＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５はベクタートランスフェクトされた対照と比べて２倍のＭＵＣ５ＡＣ−ルシフェラーゼ受容体活性の誘発を示す。図１２ｂはＨＥＫ２９３細胞にて同様の結果を示す。
【図１３】図１３はＨＥＫ２９３およびＡ５４９細胞中一時的に発現されるＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５の全細胞パッチクランプ法を示す。図１３（ａ）は、０．５Ｍの遊離Ｃａ２＋のピペット液中、ＨＥＫ２９３細胞（左パネル）およびＡ５４９細胞（右パネル）にて一時的に発現されるＣＬＣＡ１の電流−電圧の関係を示す（各群においてｎ＝６−８）。図１３（ｂ）はｈＣＬＣＡ１（左パネル）およびｇｏｂ−５(右パネル）を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞における全細胞電流密度のカルシウム依存的倍数増加を示す（各群においてｎ＝３−８）。同様のデータがＡ５４９で観察された（データは図示せず）。
【図１４】図１４はＨＥＫ２９３細胞とＡ５４９細胞中のＣＬＣＡ１およびｇｏｂ−５発現を示すウェスタンブロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年1月24日(2006.1.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2007505162.tif 000023
2007505162.tif 000024
2007505162.tif 000025
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