(57)【要約】  チオールのホメオスタシスを回復させるための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するための、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の使用を記載する。更に、それを必要とする被検体においてチオールのホメオスタシスを回復させるための方法であって、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の効果的な量を前記被検体に投与することを含む方法を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオールのホメオスタシスを回復させるための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するための、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の使用。
【請求項２】
アルコール消費の効果を防止および/または低減するための請求項１に記載の使用。
【請求項３】
二日酔いを防止および/または低減するための請求項２に記載の使用。
【請求項４】
顔面紅潮を防止および/または低減するための請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
バイタリティーを増強するための請求項１に記載の使用。
【請求項６】
疲労を防止および/または低減するための請求項６に記載の使用。
【請求項７】
睡眠を改良するための請求項１に記載の使用。
【請求項８】
代謝症候群（Metabolic Syndrome）、とりわけインスリン非依存性糖尿病の症状の発症を防止および/または低減するための請求項１に記載の使用。
【請求項９】
心血管性疾患、とりわけアテロスクレロパシー（atheroscleropathy）の発症を防止および/または低減するための請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
血圧を低下させるための請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１１】
薬剤誘発性毒性を防止および/または治療するための請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
皮膚の色を薄くする（lighten）ための請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
炎症を低減するための請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
先行する請求項の何れか１項に記載の使用であって、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物が、以下の工程を含む方法により得られる使用：
ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに切断する工程；
ｂ）ペプチド中のシステインの位置でその作用が少なくとも弱められ、それにより末端システインを有する消化ペプチドを形成するエキソペプチダーゼにより、工程ａ）で得られたペプチドを消化する工程；
ｃ）消化ペプチドを精製する工程。
【請求項１５】
それを必要とする被検体においてチオールのホメオスタシスを回復させるための方法であって、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の効果的な量を前記被検体に投与することを含む方法。
【請求項１６】
それを必要とする被検体においてアルコール消費の効果を防止および/または低減するための請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
二日酔いを防止および/または低減するための請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
顔面紅潮を防止および/または低減するための請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
バイタリティーを増強するための請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
疲労を防止および/または低減するための請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
睡眠を改良するための請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
代謝症候群、とりわけインスリン非依存性糖尿病の症状の発症を防止するための請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
心血管性疾患、とりわけアテロスクレロパシー（atheroscleropathy）の発症を防止および/または低減するための請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
血圧を低下させるための請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
薬剤誘発性毒性を防止および/または治療するための請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
皮膚の色を薄くするための請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
炎症を低減するための請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１４〜２５の何れか１項に記載の方法であって、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物が、以下の工程を含む方法により得られる方法：
ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに切断する工程；
ｂ）ペプチド中のシステインの位置でその作用が少なくとも弱められ、それにより末端システインを有する消化ペプチドを形成するエキソペプチダーゼにより、工程ａ）で得られたペプチドを消化する工程；
ｃ）消化ペプチドを精製する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チオールのホメオスタシスを回復させるための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するための、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の使用に関する。
【０００２】
酵素を含む多くの必須タンパク質の生理学的活性は、酸化還元感受性チオール基の酸化還元状態、すなわちこれらチオール基が還元（-SH）状態で存在するか酸化（-S-S-）状態で存在するかに依存する。かかるタンパク質は、その周囲環境の酸化還元電位の非常に小さな変化に反応する。非タンパク質のバイオチオール（biothiol）抗酸化剤、抗酸化ビタミンおよび抗酸化酵素のネットワーク全体が、タンパク質の構造を維持したり、各ターゲットへの酸化還元シグナルの伝達を確立したりするのに重要である。
【０００３】
いわゆる身体のチオールバッファーには、GSH、GSH前駆体およびシステイン、並びに実際には、タンパク質中の酸化還元感受性チオール基のすべてが含まれる。これらチオールは、多くの抗酸化酵素とともに、酵素等のタンパク質の構造および機能を担う還元反応と酸化反応の非常に複雑な平衡を維持する。酸化還元鎖は、たとえば、NF-kB/p50システムなどのある種のシグナル伝達鎖、レセプターの機能、プロテインキナーゼおよびホスファターゼ、（たとえば脂肪酸に対する）血清アルブミンの輸送機能、チオールへの結合によるNOの寿命、およびおそらくアポトーシス機構を調節する幾つかのタンパク質にも影響を及ぼす。
【０００４】
現代の日常生活では、ほぼすべての人が、毎日、外来性化合物に晒されている。大気汚染、車の排気ガスへの暴露、喫煙、麻薬の乱用、飲酒、およびコーヒーおよび/または医薬の摂取はすべて、体内における外来性化合物の高いレベルにつながる。細胞内チオールは、このような外来性化合物の高いレベルによりもたらされる負の身体効果を効果的に除去するために、分子的に、酸化還元状態を通じて、最も重要である。
【０００５】
チオール介在性の酸化還元の状態および平衡に関与する上記メカニズムは、「チオールのホメオスタシス」の用語に包含される。前記用語は、当該技術分野において充分認識されている（たとえば、D.M. Townsend, K.D. Tew and H. Tapiero, Biomed. Pharmacother. 2004, vol 58(1): 47-55を参照）。
【０００６】
ペプチド産物のタンパク質部分で計算されると少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物が、一または複数の病的症状に罹患していようと、表面上かなり健康な状態であろうと、任意の被検体においてチオールのホメオスタシスを回復させるために非常に効果的であることが驚くべきことに見出された。本明細書で使用される%wtは、ペプチドの混合物内のペプチド全重量におけるシステインの重量に関する。後者は、当該技術分野で一般に使用される公知の方法により、すなわちペプチド混合物中の窒素の全重量パーセントに係数6.38をかけることにより、簡便に計算される。
【０００７】
よって、本発明は、チオールのホメオスタシスを回復させるための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するための、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の使用に関する。被検体、とりわけ50才を超える被検体において、前記ペプチドの混合物により与えられるかかるチオールのホメオスタシスの回復は、エネルギーおよびバイタリティーの改良、疲労およびストレスの軽減、睡眠の質の改良、および精神の機敏性（mental alertness）の増大により顕在化することが見出された。
【０００８】
本明細書で使用されるペプチドは、一または複数のタンパク質に由来するアミノ酸鎖として定義され；ペプチドの重量は、好ましくは200 Da〜11,000 Da、より好ましくは300 Da〜6,000 Da、更に好ましくは400 Da〜5,000 Daである。
【０００９】
前記ペプチドの混合物においてペプチドは、少なくとも6.5 %wt、より好ましくは少なくとも6.7 %wt、更に好ましくは少なくとも6.9 %wt、最も好ましくは少なくとも7 %wtのシステインを含む。実験室の規模では、ペプチドのシステイン含量は、20 %wtまで高くすることができるが；現在の技術を用いた大規模な調製では、6.5-7.5 %wt、すなわち現在好ましい範囲のシステイン含量を有するペプチド混合物が得られる。しかし、ペプチドのシステイン含量は、適用および投与において更なる柔軟性を提供するために、できるだけ高くすることが好ましい。
【００１０】
医薬またはサプリメントでの使用において、前記調製物は、所望の投与形態の医薬を得るために、任意の適切なキャリア、希釈剤、アジュバント、賦形剤などと組合せることができる。都合よくは、前記医薬またはサプリメントは、経口投与される。「サプリメント」の用語は、食品サプリメント、並びに健康製品、たとえば健康ドリンクを含むことを意味する。
【００１１】
意図した用途において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、単独で投与されてもよいし、薬学的に許容可能なキャリアと混合して投与されてもよい。
【００１２】
周知の方法および賦形剤を用いて調製され得る前記製剤の例、たとえば「Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook」、Mack Pub. Co., N.Y. U.S.A.に記載されるものは、経口投与のための錠剤、カプセル、シロップなどであり、一方、非経口投与のための適切な形態は、許容可能な液体中の無菌の液剤または懸濁剤、移植片などである。
【００１３】
飲料または食品での使用において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、任意の通常の食品成分と組合せることができる。「飲料」の用語は、コーディアルおよびシロップ、並びに水またはインスタントドリンク調製用の別の飲料に溶解されるドライ粉末の調合物を含むことを意味する。
【００１４】
好ましい態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、サプリメント、飲料または食品を製造するために使用される。サプリメント、飲料または食品は、システインの用量が、10〜1000 mg、好ましくは50〜600 mg、より好ましくは80〜300 mg、最も好ましくは100〜200 mgとなる量で毎日投与される。前記ペプチドの混合物の投与により、表面上健康な状態であるか、または特定の健康状態に苦しんでいるか何れかの前記被検体は、元気になったと感じ、全体的に体調がよいと感じることが見られる。
【００１５】
好ましい態様において、ペプチドの少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％が、少なくとも一の末端システインを含み、この末端システインは、そのままヒトまたは動物の体において、チオールのホメオスタシスを回復させるために容易に利用可能である。このため、ペプチドの少なくとも70％、好ましくは少なくとも80％が、一つまたは二つの末端システインを有することが意図される。末端システインの含量は、当該技術分野で公知のとおり、たとえばN-末端アミノ酸配列決定により決定することができる。
【００１６】
有利なことに、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％の、シスチンの形態で存在するシステインを含む。本明細書で使用される「シスチン」は、酸化形態のシステインに対する用語であり、すなわち、一つのシステイン残基が別のシステイン残基に硫黄架橋により結合している。本明細書を通して「システイン」の用語は、還元形態（遊離のSH基を有する）および酸化（シスチン）形態の両方のシステインを指す。システインなどの遊離のチオールは、体内で容易に酸化され、遊離のラジカルの生成に至る。よって、高い用量の遊離のチオールが血流に入ると、酸化促進剤（pro-oxidant）として作用することができる。したがって、前記混合物に存在するシステイン残基は、酸化形態が化学的に反応性が低く、被検体に投与されたときに遊離のシステインと比較して安全であるため、大部分が酸化形態で存在することが好ましい（たとえばBiothiols in Health and Disease, L. Packer and E. Cadenas (eds.), Marcel Dekker Inc., New York, Basel, Hongkong (1995) を参照）。
【００１７】
別の態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、アルコール消費の効果を防止および/または低減するために使用される。アルコールの変換経路における重要な中間体は、アセトアルデヒドであり、これは、タンパク質、DNAおよび脂質に対してin vivoで高い化学反応性を有する毒性の高い化合物であり、この化合物は身体を危険にさらす（compromise）。アセトアルデヒドの形成は、長期的にも短期的にも身体に対して負の効果を有する。チオール基は、アセトアルデヒドと直接、非酵素的に反応することが可能であるため、前記毒性化合物の除去を保証し、これにより、身体に対するその重大な結果を低減すると考えられる。システインリッチなペプチドの混合物の投与により、酸化還元の回復およびチオールのホメオスタシスという結果に至り、その結果、チオール基が、毒性アセトアルデヒドを除去するために直ちに利用可能であると考えられる。これは、二日酔いおよび顔面紅潮などのアルコール消費の短期効果を防止または低減するだけでなく、肝機能障害などの長期効果を防止または低減すると考えられる。
【００１８】
よって、更なる態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、二日酔いを防止および/または低減するために使用される。本発明のシステインリッチのペプチドの混合物を摂取した結果、チオールのホメオスタシスが回復され、それにより存在するチオール基とアセトアルデヒドとが反応することにより、後者の化合物が効果的に除去され、その結果、身体に対するその必然的結果、とりわけ二日酔いが減少すると考えられる。
【００１９】
更に別の態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、顔面紅潮を防止および/または低減するために使用される。多くのヒト、とりわけアジア系のヒトは、アルコールの毒性代謝物であるアセトアルデヒドの酸化を担う酵素アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）の活性に関して、遺伝的な独自性を有する。そのため、彼らはALDHを欠損しており、これにより体内にアセトアルデヒドの蓄積を起こし、顔面紅潮およびその他の心血管性症状を引き起こす（H.M. Chao, Alcohol Clin. Exp. Res. 1995, vol. 19(1): 104-109）。影響を受ける被検体は、少量のアルコールを摂取した後でも顔面が紅潮し、これによりかなり気恥ずかしい体験をする。前記ペプチドの混合物の摂取により、ALDH欠損により引き起こされる顔面紅潮およびその他の効果の発生が防止および/または低減され、その結果、被検体は、公共の場で自信に満ち、気恥ずかしくないと感じることができることが見出された。
【００２０】
また更なる態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、バイタリティーを増強するための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するために使用される。前記ペプチドの混合物の摂取後、被検体は、健康な状態と診断されていない被検体でさえ、活力を取り戻したと感じることが驚くべきことに見出された。前記被検体は、一般に健康であり活気に満ちていると感じ、総体的に人生に自信を感じる。この増強したバイタリティーおよび増大したエネルギーは、障害の起きた（compromised）チオールおよび酸化還元のホメオスタシスを中和したことによるものと考えられる。
【００２１】
更なる態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、疲労を防止および/または低減するための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するために使用される。上述のとおり、被検体は、一般に活気に満ちていて疲労が少ないと感じる。魅力的な態様において、本発明のペプチドの混合物は、慢性疲労の症状を低減するためにも使用される。
【００２２】
また更なる態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、睡眠を改良するための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するために使用される。前記ペプチドの混合物を摂取した被検体は、おそらく回復されたチオールのホメオスタシスにより化学物質の不均衡が効果的に除去されたことにより、よく眠れたと感じた。
【００２３】
更に別の態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、代謝症候群の症状の発症を防止するため、とりわけインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）の症状の発症を防止するための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するために使用される。代謝症候群は、遺伝的性質とライフスタイル選択、たとえば食事および身体活動レベルとの組合せにより引き起こされると考えられる。通常、この症候群に関連した医学上の問題は、時間をかけて発生する。被検体が肥満であり、高血圧であるときに、代謝症候群を更に発達させる危険性が既にある。血液からグルコースを体細胞に吸収させる能力をインスリンが失って、その結果グルコースレベルが永久に高いままのときに、代謝症候群は始まる。永久に高い血中グルコースレベルの結果、被検体は、インスリン非依存性糖尿病を最終的に発症する危険性がある。NIDDMの種々の段階である、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能障害、空腹時グルコース障害およびβ細胞機能の重大な損失（顕性NIDDM）は、多種多様な毒性を伴う。本発明のペプチドの混合物の投与により、チオールのホメオスタシスは回復し、これにより、代謝症候群におけるインスリン抵抗性の毒性、とりわけチオール介在性のタンパク質の架橋結合またはDNAの改変による毒性を防止および/または低減すると考えられる（M.R. Hayden and S.C. Tyagi, J. of Pancreas 2002, vol. 3(4): 86-108）。
【００２４】
更なる態様において、本発明のペプチドの混合物は、心血管性疾患、とりわけアテロスクレロパシー（atheroscleropathy）の発症、すなわち、代謝症候群におけるアテローム性動脈硬化症の急速性発症、および顕性NIDDMの途中の中間的症状を防止および/または低減するために使用される。これは、上述のとおりNIDDMの多種多様な毒性により引き起こされる（M.R. Hayden and S.C. Tyagi, Atheroscleropathy Cardiovasc. Diabetol. 2002, vol. 1(1): 3）。
【００２５】
別の態様において、本発明のペプチドの混合物は、血圧を低下させるために使用される。ACEは、アンギオテンシンIをアンギオテンシンIIに変換する。後者は、効力のある血管収縮薬であり、これは、調節障害（dysregulation）の場合に血圧の増大につながる。チオールのホメオスタシスの回復により、ACE活性が阻害され、その結果、アンギオテンシンIIの形成が減少し、これが確実に血圧を低下させるか、または血圧増大を防止すると現在考えられている。そのため、本発明のペプチドの混合物の使用は、代謝症候群の更なる発生を防止することにも寄与し得る（R. Bataller, R.F. Schwabe, Y.H. Choi, L. Yang, Y.H. Paik, J. Lindquist, T. Qian, R. Schoonhoven, C.H. Hagedorn, J.J. Lemasters, and D.A. Brenner. J.Clin.Invest. 2003, vol. 112 (9): 1383-1394）。
【００２６】
別の態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、薬剤誘発性毒性を防止および/または治療するための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するために使用される。酵素および低分子量バイオチオールを、チオールおよび酸化還元ホメオスタシスの回復により適当な酸化還元状態で維持することにより、肝臓に影響を及ぼす薬剤が迅速に除去され、その結果、薬剤誘発性毒性の発生が回避および/または治療されると考えられている。
【００２７】
前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、皮膚の色を薄くするための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するために使用することもできる。皮膚の色を決定する主要な因子は、被検体のメラノサイトにおけるメラニンの濃度およびメラニンの混合タイプ、すなわち、ユーメラニン（黒色/茶色の色素）およびフェオメラニン（琥珀色/赤色の色素）である。前記ペプチドの混合物は、メラニンへの経路における初期の酵素の一つであるチロシナーゼの活性を調整し、その結果、メラニンの産生が減少し、皮膚の色が薄くなると現在考えられている。更に、細胞内チオール基は、明るい色素を生じるフェオメラニンを優先して、ユーメラニンとフェオメラニンの比を調整できると考えられている。また、前記ペプチドの混合物は、細胞内でチオールの濃度を増大させるため、明るい色素フェオメラニンの方向にメラニンの合成をシフトさせることができる。両色素の比が約1:1の皮膚タイプでは、目に見える効果がとりわけ期待される。また、本発明のペプチドの混合物は、挫瘡などの炎症後の黒っぽい皮膚タイプにおいて瘢痕形成の間に起こり得る局所的な皮膚褪色を経口治療するために使用され得る（R.M. Halder, H.L. Brooks, and V.D. Callender, Dermatol. Clin. 2003, vol. 21 (4): 609-615）。
【００２８】
更に別の態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、炎症を低減するために使用される。炎症プロセス自体は、急性期タンパク質の合成および免疫細胞の活性を維持するため、炎症によるフリーラジカルの生成に対抗するため、後に損傷組織を回復させるため、含硫アミノ酸に対する高い要求を伴う。慢性炎症は、チオールおよび酸化還元のホメオスタシスの一貫した調節障害（dysregulation）につながり、その結果、重篤な全身の影響につながり得る。本発明のペプチドの混合物は、関節炎、慢性炎症性腸症候群、挫瘡および敗血症などの炎症状態に有益な効果を示すと考えられる（F. Santangelo, Curr. Med. Chem. 2003, vol. 10(23): 2599-2610）。
【００２９】
好ましい態様において、前述の少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、以下の工程を含む方法により得られる：
ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに切断する工程；
ｂ）ペプチド中のシステインの位置でその作用が少なくとも弱められ、それにより末端システインを有する消化ペプチドを形成する少なくとも一のエキソペプチダーゼにより、工程ａ）で得られたペプチドを消化する工程；
ｃ）消化ペプチドを精製する工程。
【００３０】
第一の工程ａ）において、タンパク質源のタンパク質は小さなペプチドに切断される。この切断は、当該技術分野で公知の切断反応により行うことができ；好ましくは、切断は、たとえばエンドペプチダーゼによるタンパク質のペプチド結合の酵素的加水分解により行われ、およそ所望の長さのペプチドが得られ、これによりエキソペプチダーゼに対する基質の量が増大する。本目的のために適したエンドペプチダーゼの例は、Novo Nordiskのアルカラーゼ（Alcalase）である。
【００３１】
第二の工程において、切断反応により得られたペプチドは、少なくとも一のエキソペプチダーゼにより消化される。「少なくとも一のペプチダーゼ」とは、消化反応を一または複数の様々なエキソペプチダーゼにより行うことができることを意味する。エキソペプチダーゼは、ペプチドの末端から単一のアミノ酸を放出する。エキソペプチダーゼおよび消化反応条件は、エキソペプチダーゼの作用が、ペプチド中のシステインの位置で少なくとも弱められるように選択される。「少なくとも弱められる」とは、エキソペプチダーゼが、選択された反応条件においてペプチドからシステインを除去しないか、またはシステインの切断に対して非常に低い選択性を示すことにより、前記切断反応を、他のアミノ酸のペプチドからの切断と比較して、非常に遅くすることを意味する。かかるエキソペプチダーゼおよび条件の使用により、末端のアミノ酸が、前記末端に最も近いシステイン残基まで除去されたペプチドが生成される。当業者であれば、エキソペプチダーゼ機能を有する商業的に入手可能な酵素が、システインにおいて作用が弱められる条件を見出すことができるでしょう。ペプチドが、システイン残基のジスルフィド架橋により互いに連結された一または複数のアミノ酸鎖を、前記アミノ酸鎖中に有していてもよいことが理解されるでしょう。したがって、「末端システインを有する消化ペプチド」は、かかる複数鎖ペプチドの末端の少なくとも一つが、末端システインを有しているという事実を表す。当然、かかるペプチドは、二以上の末端システインを含有していてもよい。好ましくは、その酵素活性は、精製工程の前に、たとえばｐＨシフトまたは加熱不活性化処理により不活性化される。
【００３２】
カルボキシペプチダーゼY（E.C.3.4.16.1.）が、システイン残基において非常に効果的に弱められ、これにより末端システイン残基を有するペプチドを産生することができることが見出されているため、好ましくは、エキソペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼY（E.C.3.4.16.1.）を含む。
【００３３】
切断工程ａ）および消化工程ｂ）は、たとえば同一の反応条件で機能するエンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼを用いることにより、同時に行うことができる。また、エンドペプチダーゼ活性およびエキソペプチダーゼ活性の両方を有する酵素調製品を使用することができる。
【００３４】
最後に、これら消化ペプチドは精製される。エキソペプチダーゼにより放出された遊離アミノ酸から消化ペプチドを分離する適切な方法は、当該技術分野で公知である。システイン含有ペプチドとエキソペプチダーゼの作用により放出された遊離アミノ酸との間に分子量の差が生じるため、この差を用いてシステインリッチのペプチドを精製することができる。この目的のために、当該お技術分野で公知の幾つかの技術を使用することができる。好ましくは、遊離アミノ酸および他の低分子量化合物は、メンブレンプロセス、好ましくは限外濾過、ダイアフィルトレーションまたはナノフィルトレーションを用いて除去される。また、精製工程は、有利には、Kronina et al., Journal of Chromatography A, 852 (1999) pp 261-272に従って、固定化金属アフィニティークロマトグラフィーステップ（IMAC）の使用を含むこともできる。その後、システインリッチのペプチドを乾燥させることができる。
【００３５】
特別な態様において、工程ｂ）におけるエキソペプチダーゼおよび切断反応は、エキソペプチダーゼが、ペプチド中のシステインの位置において少なくとも弱められるように選択される。これにより、末端システインを主として有する消化ペプチドが得られる。
【００３６】
タンパク質源は、それがシステイン含有タンパク質を含む限り任意の供給源であってもよい。また、タンパク質源は、本発明の方法を行う前に、たとえば切断工程の前またはその間に二以上のタンパク質源により調製することもできる。
【００３７】
好ましくは、タンパク質源は食用タンパク質から構成され、その結果、消化ペプチドは、食品添加物として使用することができる。非常に特別な態様において、タンパク質源は、乳漿蛋白単離物（WPI）および/または乳漿蛋白濃縮物（WPC）を含む。「乳漿蛋白単離物」および「乳漿蛋白濃縮物」の用語は、当該技術分野で公知である。乳漿蛋白濃縮物は、35-80 w/w%タンパク質を有する乳漿蛋白産物であり、乳漿蛋白単離物は、90 w/w%以上のタンパク質含量を有する。WPC 80の例は、Tatua（ニュージーランド）のAlacen 132であり；WPIの例は、Davisco Foods International (USA)のBipro、またはARLA Foods、デンマークの酸性乳漿蛋白単離物（Acid Whey Protein Isolate）である。乳漿蛋白単離物は、非常に適切なシステインリッチのタンパク質、たとえばアルブミン、とりわけα−ラクトアルブミン、およびウシ血清アルブミンを含む。前記タンパク質は、本発明の方法の出発タンパク質源において、または出発タンパク質源として有利に使用される。
【００３８】
別の好ましい態様において、タンパク質源は、アルブミン、とりわけα−ラクトアルブミン、ウシ血清アルブミン、卵タンパク質（たとえばオボアルブミン、シスタチン）、小麦グルテン、トウモロコシタンパク質単離物、γ−コングルチン（ルピン）、およびナタネアルブミンからなる群の一または複数を含む。
【００３９】
好ましくは、工程ａ）およびｂ）は、タンパク質源中のタンパク質に存在するシステイン残基の間の硫黄架橋が、できるだけ多く酸化形態で維持され得る条件下で行われる。このようにして、システインリッチのペプチド混合物が得られ、ここではシステイン残基のほとんどが酸化され、ジスルフィド架橋を介して他のペプチドに連結されている。前記ペプチド混合物の酸化形態は、反応性が低く、このため適用の際に安定である。更なる利点は、エキソペプチダーゼ活性を有する多くの酵素が、酸化システインを切断しないが、還元形態のシステインは、相対的に低い活性を備えた前記酵素でもペプチドから切断され得るという事実である。ペプチド混合物において側鎖の修飾を避けるためには、工程a)およびｂ）は、ｐＨ2〜8で好ましくは行われる。
【００４０】
加水分解プロセスを酸性環境において行うことが好ましい。酸性ｐＨにおいて、システイン中のジスルフィド架橋は、塩基性ｐＨにおいてよりも安定である［Creighton, T.E., 1993, Proteins: Structures and Molecular Properties. 2nd Ed.; Freeman and Company, New York］。
【００４１】
非常に魅力的な態様において、エンドペプチダーゼ機能を有する酵素は、エキソペプチダーゼ機能も有し、そのエキソペプチダーゼ機能は、システインの位置において弱められる。かかる酵素は、当該技術分野で公知であり、その利点は、工程ａ）およびｂ）を同時に行うことができることである。エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼの両機能を有する好ましい酵素の例は、フレーバーザイム（Flavourzyme）（NOVO Nordisk）、酸性プロテアーゼA（Acid Protease A）、プロテアーゼM、プロテアーゼ2A、プロテアーゼB（Amano Enzyme）、コロラーゼPN-L（Corolase PN-L）（AB Enzymes, UK）、エンゼコ酸性真菌類プロテアーゼ（Enzeco Acid Fungal Protease）（EDC, USA）またはその二以上の組合せである。
【００４２】
好ましくは、調製物のペプチドの、少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％は、末端システインを含み、これは、ヒトまたは動物の体にとって容易に利用可能である。これら末端システインは、上述のとおり、エキソペプチダーゼの使用により得られる。
【００４３】
更なる側面において、本発明は、それを必要とする被検体においてチオールのホメオスタシスを回復させるための方法であって、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の効果的な量を前記被検体に投与することを含む方法に関する。前記方法は、上述の理由のため有利である。
【００４４】
好ましい態様において、前記方法は、それを必要とする被検体においてアルコール消費の効果を防止および/または低減するためのものであり、とりわけ、二日酔いを防止および/または低減するため、および顔面紅潮を防止および/または低減するためのものである。前記方法は、上述の理由のため有利である。
【００４５】
別の態様において、前記方法は、上述の理由により、バイタリティーを増強するためのものであり、とりわけ、疲労、特に慢性疲労の症状を防止および/または低減するためのものである。
【００４６】
また前記方法は、睡眠を改良するために有利に採用することもできる。少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の効果的な量を投与された被検体は、上述されるとおり、よく眠ることができることが見出された。
【００４７】
あるいは、前記方法は、上述の理由により、代謝症候群、とりわけインスリン非依存性糖尿病（NIDDM）の症状の発症を防止するため、並びに心血管性疾患、とりわけアテロスクレロパシー（atheroscleropathy）の発症を防止および/または低減するために適用することができる。
【００４８】
更に別の態様において、前記方法は、血圧を低下させるために採用することができる。前記方法は、上述の理由のため有利である。
【００４９】
また、前記方法は、上述のとおり、薬剤誘発性毒性を防止および/または治療するために使用することもできる。
【００５０】
更なる態様において、前記方法は、上述のとおり、皮膚の色を薄くするために使用され得る。
【００５１】
また更なる態様において、前記方法は、たとえば挫瘡などにおいて、炎症を低減するために使用され得る。
【００５２】
上記方法において、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物は、以下の工程を含む方法により得られることが好ましい：
ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに切断する工程；
ｂ）ペプチド中のシステインの位置でその作用が少なくとも弱められ、それにより末端システインを有する消化ペプチドを形成するエキソペプチダーゼにより、工程ａ）で得られたペプチドを消化する工程；
ｃ）消化ペプチドを精製する工程。
【００５３】
チオールのホメオスタシスの回復に関して生物学的に容易に利用することができる末端システイン残基を高比率で有する非常に有利なペプチドの混合物が得られる。前記方法は、上述の態様の何れかを用いて実施することができる。
【００５４】
本発明は、以下の非限定的な実施例により更に詳細に説明される。ここで示されるパーセンテージは、特段の記載がない限り重量パーセンテージである。
【実施例】
【００５５】
例１．システインリッチのペプチドの調製方法
乳漿蛋白単離物（WPI; 典型的にはBipro, Davisco）の5 %wt分散物を、予め加熱した脱塩水にWPIを添加し、その後処理温度（50℃）に加熱することにより作成した。30 %硫酸を添加することによりpHをpH3に調整した。ENZECO真菌類酸性プロテアーゼ（EDC, U.S.）を添加することにより加水分解を開始した。酵素/タンパク質の比は、タンパク質乾燥物に基いて、典型的に2 %wtであった。適切な加水分解時間の後、典型的には20 h後、pHが6.5に達するまでNaOH（33 %）を添加し、その後その混合物を104℃に加熱し、その温度を3分間保持した。Nadir SS NF-PES-10 3838 Bメンブレンモデュールを用いて、体積縮小およびナノフィルトレーションの後に、加水分解物に、50℃で脱塩水でのダイアフィルトレーション（典型的には300 %、任意に200 %）を行った。ナノフィルトレーションは、50℃で処理した。典型的に25 %の乾燥物に達したときに、残留物をスプレー乾燥した。
【００５６】
例２．典型的な分析
分析は、認可された商業実験室（CCL Nutricontrol, Veghel, オランダ）により行った。方法：ペプチドのHCL加水分解の前の、過ギ酸によるサンプル中のシステインの酸化、ニンヒドリンによるポストカラム誘導体化の後の、遊離アミノ酸のイオン交換クロマトグラフィー（ECガイドライン3-9-1998の98/64/EG；19-9-1998付けの出版物L257/14-23に従う）。
【００５７】
典型的
全固形物                              %       95.1
タンパク質（N*6.38）                  %       83.4
タンパク質（N*6.62）                  %       86.0
システイン                            g/kg    65.50
システイン                            %/Prot   7.9%
アミノ酸
アラニン                              g/kg    37.0
アルギニン                            g/kg    18.6
アスパラギン酸                        g/kg   146.9
グルタミン酸                          g/kg   186.4
グリシン                              g/kg    17.7
ヒスチジン                            g/kg    19.6
イソロイシン                          g/kg    43.0
ロイシン                              g/kg    59.4
リジン                                g/kg    89.8
メチオニン                            g/kg    12.2
フェニルアラニン                      g/kg    18.4
プロリン                              g/kg    37.6
セリン                                g/kg    43.3
トレオニン                            g/kg    47.3
トリプトファン（酵素的加水分解後）    g/kg    11.4
チロシン                              g/kg    18.6
バリン                                g/kg    45.6
トータルa.a.                                915.29。
【００５８】
ペプチド中の遊離のチオール基を、NaBH4による還元を用いて、尿素の存在下でDTNB（エルマンの試薬）により測定した。SH/SSの比を、還元前の利用可能なチオールの濃度/還元後のチオールの全濃度により計算し、6.5 %であることが分かった。
【００５９】
例３．分子量の分布
方法：
HPLC−システム：  UV検出器、オートサンプラー、Waters Millenium Data 
Acquisition Softwareを備えたイソクラティックHPLCシステム
カラム：          Progel TSK-G2000SWXL 7.8 mm×30 cm (Supelco), 
ガードカラム：Progel TSK SWXL (Supelco)
溶出液：          30 %アセトニトリル/H2O/0.1 % TFA
流速：            1 mL/分
検出：            214 nm
キャリブレーション：HPLCスタンダード（Sigma）：炭酸脱水酵素、
リボヌクレアーゼＡ、アプロチニン、インスリン、
バシトラシン、フェニルアラニン。
【００６０】
分子量の分布は、以下のとおりであることが分かった：
ＭＷ−範囲（Ｄ）        エリア％
＞10.000                  17.5
10.000−5.000              3.7
5.000−2.000               6.6
2.000−1.000              12.1
1.000−500                20.2
＜500                     39.9。
【００６１】
例４．システインリッチのペプチドを含む錠剤の調製
投与量：４錠剤/日、ペプチド混合物の形態で200 mg L-システイン/日をデリバーする。
【００６２】
錠剤重量  850 mg
100 gあたり
システインリッチのペプチド        88.24 g
微結晶性セルロース 1              10.59 g
二酸化ケイ素 2                     0.47 g
ステアリン酸マグネシウム           0.35 g
ステアリン酸                       0.35 g
1 Avicel PH-102 - FMC
2 CAB-O-SIL M-5。
【００６３】
粉末は予め混合したが、ステアリン酸Mgは混合の最後の瞬間まで保留した。錠剤は、直接圧縮（圧力20 kN、硬度：160 N）により調製した。
【００６４】
例５．システインリッチのペプチドを含むチョコレートキャラメルバーの調製
1本のバーは、システインリッチのペプチド混合物の形態で200 mg L-システインをデリバーする。
【００６５】
100 gあたり     1人分(40 g)あたり
システインリッチのペプチド          8.30 g            3.32 g
マルチトールシロップ1              66.01 g           26.41 g
カゼインカルシウム                 10.65 g            4.26 g
チョコレートリカー                  8.52 g            3.41 g
カゼイン酸ナトリウム、顆粒状        4.26 g            1.70 g
カカオバター                        2.13 g            0.85 g
無塩バター                          0.11 g            0.04 g
レシチン                            0.01 g          0.0043 g
バニラ香料                          0.01 g          0.0043 g
1 Lycasin 85 %溶液。
【００６６】
例６．システインリッチのペプチドを含む加熱処理ヨーグルトドリンクの調製
100 gあたり     L-システイン/1人分
システインペプチド                    0.86 g            0.05 g
スキムミルク                            55 g
砂糖                                     6 g
マルチトール1                            3 g
乳酸                                 0.002 g
ペクチン2                              0.3 g
香料                                 0.055 g
水                                    34.6 g
接種物3                                0.2 g
1  C*maltidex 16385 Cerestar
2  Genu Pectine YM-115-H CP Kelco
3  YC-X11 Christian Hansen。
【００６７】
ミルクは水と混合した。システインリッチのペプチド、砂糖およびマルチトールを添加し、連続的に攪拌しながら溶解させ、その後低温殺菌（90℃、5分）で処理した。発酵温度（42℃）に冷却した後、接種物を添加した。発酵は、pHが4.3に達するまで行った。乳酸を用いてpHを3.8-4.0に下げた。ペクチンを、激しく攪拌しながら添加した。その混合物を70℃に加熱し、120/20 barでホモジナイズし、香料を添加した。充填後、生成物を低温殺菌（80℃/3分）で処理した。
【００６８】
例７．システインリッチのペプチドを含む肝臓クレンジングドリンクの調製
100 gあたり  1人分(250 ml)あたり  L-システイン/1人分
システインペプチド      0.43 g              1.08            0.06 g
デキストロース           4.4 g              11 g
フルクトース             3.6 g               9 g
香料リンゴ             0.055 g              0.14
香料バナナ             0.037 g              0.09
ペクチン1               0.15 g              0.37
水                     91.33 g             228.36
1  Genu Pectine YM-115-H CP Kelco。
【００６９】
すべてのドライ成分を水に溶解し、pHを、クエン酸（全体に対し+/- 0.14 %）を用いてpH 3.8までまず調整し、その後、リンゴ酸（全体に対し+/- 0.66 %）を用いてpH 3.5まで調整した。溶液を70℃に予め加熱し、その後ペクチンプレミックス（水中4 %）を添加した。ホモジナイズ（150 bar）した後、生成物を充填して低温殺菌で処理するか、あるいは低温殺菌で処理して無菌的に充填した。
【００７０】
例８．システインリッチのペプチドの投与後のパラセタモールの肝毒性の低下
メインテナンス濃度の硫黄含有アミノ酸（38 mg/kg）を含有する等カロリーおよび等窒素（isonitrogenic）の食事またはシステインリッチのペプチド（62 mg/kg）に富んだ各食事を、ラットに14日間与えた。14日後、各食事グループの動物を、アセトアミノフェンで攻撃し（経口、300 mg/kg体重、コーンオイル中）、次の12時間、食事を与えなかった。攻撃の直後、12時間後、24時間後、各グループの6匹のラット（t=0）および9匹のラット（t=12hおよびt=24h）を屠殺し、生化学的分析および組織学的調査のために肝臓を採取した。血漿肝臓マーカー酵素の分析のために血液サンプルを採取した。コントロールグループおよびシステインリッチのペプチドを受け取ったグループの両方において、パラセタモールにより肝臓組織の損傷に至ったが、システインリッチのペプチドを継続して与えると、ラットの肝臓の能力は改良され、コントロールグループと比べて有意にその構造の完全性が回復した。
【００７１】
肝臓アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASAT）［U/L］
肝臓酵素アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの比活性は、肝臓損傷の関連インジケーターである。この酵素の活性レベルが増大すると、これは肝臓の損傷を示す。
【００７２】
攻撃後の            カゼイン食事              システインリッチの
時間                                        ペプチドに富んだ食事
0                  69+/-2                      78+/-6
12                 126+/-14                     93+/-15
24                 120+/-16                    109+/-16
上記表は、パラセタモールによる肝臓損傷が、システインリッチのペプチドに富んだ食事を取ることにより実質的に低減することを明らかに示す。
【００７３】
壊死細胞［細胞/20視野］の顕微鏡による組織学的調査
攻撃後の            カゼイン食事              システインリッチの
時間                                        ペプチドに富んだ食事
平均値  最小値  最大値          平均値  最小値  最大値
0          2.5       0       4               4       1      14
12           51       2     229              61       1     376
24           16       0      89               3       1       9
上記表から、コントロール（カゼイン）グループと比較して、システインリッチのペプチドに富んだ食事グループでは、壊死細胞の数が、最初の上昇後、ずっと低いレベルにまで最終的に低下することを観察することができ、これは、バイオチオールのホメオスタシスが回復した結果、組織の完全性が迅速に回復したことを示す。
【００７４】
空胞のある細胞［細胞/20視野］の顕微鏡による組織学的調査
攻撃後の            カゼイン食事              システインリッチの
時間                                        ペプチドに富んだ食事
平均値  最小値  最大値        平均値  最小値  最大値
0           16       1     146             4       0      13
12           80      16     824           419      10     618
24           11       2     141             7       0      32
空胞のある細胞は、細胞損傷のはじまりを示し、最終的に細胞の壊死に至る。細胞の空胞形成は、可逆的プロセスである。上記表から、システインリッチのペプチドに富んだ食事により、正常な状態に迅速に戻ると結論づけることができる。
【００７５】
例９．システインリッチのペプチドのACE阻害活性
ACE阻害アッセイは、基質としてのフリルアクリロイル-フェニルアラニル-グリシル-グリシン（FAPGG）の加水分解に基くものであり、Maguire and Price (Ann. Clin. Biochem. 1985, vol. 22: 204-210) をマイクロタイター手法に適合させたものに従う。ウサギの肺からのACE（nr. A6778）、FAPGG（nr F7131）およびCaptopril（登録商標）（nr. C8856）は、Sigmaから得た。様々な濃度の試験物質（阻害剤）を基質溶液（0.145 mmol）に添加し、反応を酵素（ACE, 0.145 U）の添加により開始した。340 nmにおける吸光度の低下を、10分間1分間隔で、Bio-Tek instrumentsからのμQuantプレートリーダーを用いて測定した。阻害剤濃度vs. ACE阻害（%）のプロットからIC50を得た。乳漿蛋白単離物（Bipro, Davisco）をネガティブコントロールとして使用した。IC50は、ACEの50％阻害を引き起こす阻害剤の濃度として定義される。
【００７６】
結果：
IC 50
システインリッチのペプチド：
−加水分解物の300 %ダイアフィルトレーション(ex.1)    203.23 mg/mL
−加水分解物の200 %ダイアフィルトレーション(ex.1)    133.47 mg/mL
Captopril（登録商標）                                ＜2 mg/L
乳漿蛋白単離物（Bipro, Davisco）                     阻害なし
CE 90 B                                              80 mg/L
Captopril（登録商標）は、周知のACE阻害剤である。リファレンスCE 90 Bは、ACE阻害活性を示すDMV International（オランダ）からのカゼイン加水分解物である。
【００７７】
例１０．システインリッチのペプチドの効果のヒト研究
50＋年齢の13人のヒトに、システインペプチドのピルを、200 mgシステイン/日に相当する3.3 gのシステインリッチのペプチドの混合物の用量で4週間摂取するように依頼した。試験の前後に、健康上の関心事および健康状態を、質問表およびインタービューにより調査した。
【００７８】
9人のヒトが調査を終えた。そのうち7人に後述のポジティブ効果が観察された：
・エネルギーの自然レベルの増大
・睡眠の質の改良（朝の爽快さの増大）
・精神の機敏性（mental alertness）の改善、注意力の改良
・血圧の上昇した調査中の3人は、減少が報告され、これは例８の結果と一致する。
【００７９】
エネルギーの増大の効果は、摂取開始から4〜5日後に記録され、エネルギーレベルは、ピルの摂取を停止した後に低下することが報告された。
【００８０】
様々な年齢（30-50）であるが高いストレスレベルに晒されている10人は、同じ用量のシステインリッチのペプチドの混合物を摂取したが、詳細な調査はされなかった。被検者により報告された観察は、睡眠の改良（朝の爽快さの増大）、および日中のエネルギーの増大であった。
【００８１】
二日酔い感受性であるといわれているアジア出身の5人の成人は、アルコール消費の直前に、（6.5 %wtシステインを含む）システインリッチのペプチドの混合物0.8−1.6 gを摂取した。被検者全員が、二日酔いにならず、気恥ずかしい顔面紅潮を体験しないことが報告された。
【００８２】
アジア出身の2人の成人は、少なくとも4週間、（6.5 %wtシステインを含む）システインリッチのペプチドの混合物0.8−1.6 gを摂取した。被検者は、皮膚の状態および皮膚のパターンが良くなること（挫瘡が減少すること）が報告された。更に、被検者は、エネルギーが増大し、よく眠れることが報告された。
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月7日(2006.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオールのホメオスタシスを回復させるための医薬、サプリメント、飲料または食品を製造するための、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物の使用。
【請求項２】
アルコール消費の効果を防止および/または低減するための請求項１に記載の使用。
【請求項３】
二日酔いを防止および/または低減するための請求項２に記載の使用。
【請求項４】
顔面紅潮を防止および/または低減するための請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
バイタリティーを増強するための請求項１に記載の使用。
【請求項６】
疲労を防止および/または低減するための請求項６に記載の使用。
【請求項７】
睡眠を改良するための請求項１に記載の使用。
【請求項８】
代謝症候群（Metabolic Syndrome）、とりわけインスリン非依存性糖尿病の症状の発症を防止および/または低減するための請求項１に記載の使用。
【請求項９】
心血管性疾患、とりわけアテロスクレロパシー（atheroscleropathy）の発症を防止および/または低減するための請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
血圧を低下させるための請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１１】
薬剤誘発性毒性を防止および/または治療するための請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
皮膚の色を薄くする（lighten）ための請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
炎症を低減するための請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
先行する請求項の何れか１項に記載の使用であって、少なくとも6.5 %wtのシステインを含むペプチドの混合物が、以下の工程を含む方法により得られる使用：
ａ）タンパク質源のタンパク質をペプチドに切断する工程；
ｂ）ペプチド中のシステインの位置でその作用が少なくとも弱められ、それにより末端システインを有する消化ペプチドを形成するエキソペプチダーゼにより、工程ａ）で得られたペプチドを消化する工程；
ｃ）消化ペプチドを精製する工程。
【国際調査報告】
2007522208.tif 000002
2007522208.tif 000003
2007522208.tif 000004
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