(57)【要約】  本発明は一般式１で表示されるリグナン系化合物を利用したニキビ治療方法及び組成物に関するもので、より詳しくは、一般式１で表示されるリグナン系化合物を含むニキビ誘発菌抗菌用組成物及びこれを利用したニキビ治療方法に関する。本発明の一般式１で表示されるリグナン系化合物はニキビ誘発菌の成育を阻害する抗菌活性が優れ、熱安定性が優れていることでニキビ誘発菌に対する抗菌剤及びニキビ治療剤に有効に用いられる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含むプロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌からなるグループより選ばれたニキビ誘発菌抗菌用組成物。
【化１】
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(R1、R2はC1-5のアルコキシ又はヒドロキシグループであり、R3は下記式Ａ又は式Ｂである）
【化２】
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【請求項２】
前記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含むニキビ治療用組成物。
【請求項３】
第１項又は第２項において、前記R1はメトキシグループ、R2はヒドロキシグループ、R3は式Ａであることを特徴とする組成物。
【請求項４】
前記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物の有効量を、それらを必要とする個体に投与してプロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌からなるグループより選ばれたニキビ誘発菌の成育を抑制する方法。
【請求項５】
前記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物の有効量を、それらを必要とする個体に投与してニキビを治療する方法。
【請求項６】
第４項又は第５項において、前記R1はメトキシグループ、R2はヒドロキシグループ、R3は式Ａであることを特徴とする方法。
【請求項７】
プロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌の中より選ばれたニキビ誘発菌抗菌剤を製造する為の前記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物の用途。
【請求項８】
ニキビ治療剤を製造する為の前記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物の用途。
【請求項９】
第７項又は第８項において、前記R1はメトキシグループ、R2はヒドロキシグループ、R3は式Ａであることを特徴とする用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は下記一般式１で表示されるリグナン系化合物を利用したニキビ治療方法及び組成物に関する。より詳しくは一般式１で表示されるリグナン系化合物を含むニキビ誘発菌抗菌用組成物及びこれを利用したニキビ治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニキビは毛皮脂腺の炎症性疾患に起因し、思春期と若い年齢層の顔面皮膚毛嚢に炎症を起こす極めてありふれた皮膚疾患である。しかしながら、最近は空気汚染、性ホルモン不均衡、薬物濫用、ストレス、内臓疾患等によりニキビが吹出す年齢層が広まりつつある。思春期になれば男女共に男性ホルモン分泌が旺盛になり、毛嚢のそばに付いている皮脂線を刺激するようになり、その結果皮脂線が大きくなり多くの皮脂が分泌される。これと共に、毛孔の入口の角質層が厚くなり接着力が強くなり、毛孔が狭くなるか又は塞がれてしまう。その結果毛嚢内に皮脂が詰まり毛嚢内に棲息している細菌が繁殖して炎症に発展するようになる。
【０００３】
ニキビと炎症を起こす微生物はプロピオニバクテリウムアクネスと黄色葡萄状球菌であるステピロコカスアウレウスとステピロコカスエピダミス等がある。（Raman  A.  et  al.,  Lett.  Appl.  Microbiol.,  21：242-245,  1995）これらは正常的な皮膚内にも存在し、特に、プロピオニバクテリウムアクネスがニキビを起こす主原因菌である。前記微生物が先ず毛嚢管を通じて毛嚢の中に侵入し毛嚢深く棲息しながら皮脂を分解して遊離脂肪酸（free  fatty  acid）を生成し、ここに葡萄状球菌が２次感染すると赤く腫れ上がり膿が生ずるようになる。
【０００４】
今まではこのようなニキビと毛皮脂腺の炎症性皮膚疾患を起こす原因菌を抑制するために、ベンゾイルパオキサイド（benzoyl  peroxide）、サリチル酸（salicylic  acid）、塩化ベンズアルコニウム（benzalkonium  chloride）、フェノール（phenol）、テトラサイクリン又はエリスロマイシン（erythromycin）等の抗生剤を利用する方法等が用いられている。しかしながら、テトラサイクリン等の抗生物質利用方法は皮膚治療には効果的であるものの、プロピオニバクテリウムに耐性を有する菌株の出現、光過敏作用等の副作用を誘発する可能性が高いことが知られている。（Gollnick,  H.  et  al.,  Dermatology.,  196：119-125,  1998）。さらに、ケラチンの除去を主効能とするサリチル酸製剤は化膿性皮膚炎に使用が不可能で皮膚発赤及び紅斑を起こし得る。化膿菌を抑制するベンゾイルパーオキサイド製剤はアレルギー性皮膚炎及び紅斑が発生する等の副作用が多く報告されていて、効能面でもニキビを完治できないものとして知られている。
【０００５】
さらに、最近では茶の木油(tee  tree  oil)、ローヤルゼリー（royal  jelly  extract）、人参抽出物（ginseng  extract）等天然物を利用してニキビを治療しているものの、前記天然物は殆どが単一物質でないので皮膚外用剤や化粧品として剤型化する時、添加される他の物質により抗菌活性が急激に低下することもあり、さらに、抗菌活性スペクトルが広くないのでニキビを誘発する葡萄状球菌には効果的に抗菌作用を表せない問題点があった。特に、天然物由来抗菌物質は加熱の際有効成分の相当部分が蒸発により消失するか、又は熱安定性が弱く抗菌活性が急激に落ちる傾向があって、剤型化し難い問題があった。（Higaki,  S.  et  al.,  J.  Dermatology.,  23：310-314,  1996）
【０００６】
リグナンはｎ−フェニルプロパンがｎ−プロフィル側鎖のβ座で結合した天然物を総称したものであり、その薬学的効能に関し血糖降下効能（大韓民国公開公報第2003-0064919号）、消炎効能（大韓民国公開公報第2003-0035124号）等が開示されている。メイスリグナン（macelignan）はミリスチカフラグランス（Myristica  fragrans）より発見される代表的なリグナン系化合物にして（Tuchinda  P.  et  al.,  Phytochemistry,  59：169-173,  2002）細胞自己死滅（apoptosis）を誘導するカスパーゼ（caspase）-３増進作用（Park  B.Y.  et  al.,  Biol.  Pharm.  Bull.,  27(8)：1305-1307,  2004）及び抗酸化作用（Sadhu,  S.K.  et  al.,  Chem.  Pharm.  Bull.,  51(9)：595-598,  2003）に対する活性等が報告されている。しかしながら、前記メイスリグナンを始め下記一般式１のリグナン系化合物のニキビ誘発菌に対する抗菌活性に対しては今まで全く報告された例がない。
【発明の開示】
【０００７】
ここに、本発明者等は前記ニキビ誘発菌に強力な抗菌活性を有する天然物由来化合物を見出す為、長期間探索した結果、ミリスチカフラグランス（Myristica  fragrance）から分離されたリグナン系化合物がニキビ誘発菌に卓越な抗菌活性及び熱安定性を示すことを確認して本発明を完成した。
【０００８】
本発明はニキビ誘発菌に優れた抗菌活性を示す下記一般式１で表示されるリグナン系化合物を提供し、前記化合物を含むニキビ誘発菌抗菌用組成物及びニキビ治療用組成物を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は下記一般式１で表示されるリグナン系化合物をそれらが必要な個体に投与してニキビ誘発菌の成育を抑制する方法及びニキビを治療する方法を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は下記一般式１で表示されるリグナン系化合物を利用したニキビ誘発菌抗菌剤及びニキビ治療剤を製造する為の、用途を提供することを目的とする。
前記の技術的課題を達成する為に、本発明はプロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌からなるグループより選ばれたニキビ誘発菌に抗菌活性を表す下記一般式１で表示されるリグナン（lignan；2,3-dibenzylbutane）系化合物又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む抗菌用組成物及びニキビ治療用組成物を提供する。
【００１１】
【化３】
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（前記一般式１で、R1,  R2はC1-5のアルコキシ又はヒドロキシグループであり、R３は下記式Ａ又は式Ｂである）
【化４】
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【００１２】
さらに、本発明は前記一般式１で表示されるリグナン(lignan)系化合物の有効量を、それらを必要とする個体に投与してプロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌より選ばれたニキビ誘発菌の成育を抑制する方法及びニキビを治療する方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明はプロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌からなるグループより選ばれたニキビ誘発菌抗菌剤及びニキビ治療剤を製造する為の前記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物の用途を提供する。
【００１４】
本発明において、“有効量とは”本発明のリグナン系化合物が投与対象である個体内でニキビ誘発菌に対する抗菌活性を表して効果的にニキビを治療できる量を意味する。さらに、本発明において、“個体（subject）”とは哺乳動物、特に人間を含む動物を意味する。前記個体は治療が必要な患者（patient）の場合もある。
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は一般式１で表示されるリグナン系化合物のニキビ誘発菌に対する抗菌活性用途を提供することにその特徴がある。
本発明に係るリグナン系化合物は下記一般式１で表示される。
【００１６】
【化５】
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（R1,  R2はC1-5のアルコキシ又はヒドロキシグループで、R3は下記式Ａ又は式Ｂである）
【化６】
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【００１７】
本発明の好ましいリグナン系化合物は前記  R1がメトキシグループ、R2がヒドロキシグループ、R3が式Ａである下記の化学式１のメイスリグナン[(8R,  8'S)-7-(3,4-methylenedioxyphenyl)-7'-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-8,8'-  dimethylbutane)]であることもあり得る。
【００１８】
【化７】
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【００１９】
本発明に係るリグナン系化合物は塩、好ましくは薬学的に許容可能な塩の形態として用いられる。前記塩には薬学的に許容可能な遊離酸(free  acid)により形成された酸付加塩が好ましい。前記遊離酸には有機酸と無機酸が用いられる。前記有機酸はこれに制限されるものではないものの、クエン酸、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、ホルム酸、プロピオン酸、オキサル酸、トリフルオロアセト酸、ベンゾ酸、グルコン酸、メタスルホン酸、グリコール酸、スクシン酸、4-トルエンスルホン酸、グルタム酸及びアスファルト酸を含む。さらに、前記無機酸はこれに制限されるものではないものの、塩酸、ブロム酸、硫酸及びリン酸を含む。
【００２０】
本発明のリグナン系化合物は従来の物質を抽出して分離する方法を利用して植物又は植物の一部から収得することができる。茎、根又は葉は目的とする抽出物を獲得する為に、適宜脱水して浸軟（macerated）するか又は単に脱水して目的とする抽出物は本発明が属する技術分野の当業者に公知された精製方法を利用して精製する。さらに、前記一般式１で表示されるリグナン系化合物に相応する合成化合物又はこれらの誘導体は一般的に購買可能な物質であるか、又は公知の合成方法を利用して化学的に製造できる。
【００２１】
前記一般式１で表示される本発明のリグナン系化合物はミリスチカフラグランス（Myristica  fragnance  Houtt.）から分離、精製できる（Jung  Yun  Lee  et  al.,  Kor.  J.  Pharmacogn.  21(4)：270-273,  1990）。好ましくは肉豆蒄（nutmeg）や仮種皮（aril）から分離、精製され得る。前記肉豆蒄はミリスチカフラグランスの成熟した果実又は果実の中にある種子を言う。さらに、本発明リグナン系化合物は肉豆蒄を圧搾して得た油から分離、精製できる。さらに、他の肉豆蒄科植物のミリスチカアルゲンチアワルブ（Myristica  argentea  Warb）等でも分離、精製できる。（Filleur,  F.  et  al.,  Natural  Product  Letters,  16：1-7,  2002）さらに、厚朴（Machilus  thunbergii）（Park  B.Y.  et  al.,  Biol.  Pharm.  Bull.,  27(8)：1305-1307,  2004）、レウカスアスペラ（Leucas  aspera）からも分離、精製できる（Sadhu,  S.K.  et  al.,  Chem.  Pharm.  Bull.,  51(9)：595-598,  2003）。
【００２２】
本発明のリグナン系化合物の分離の為の抽出溶媒としては水又はC1-C6の有機溶媒が用いられる。好ましくは、精製水、メタノール（methanol）、エタノール（ethanol）、プロパノール（propanol）、イソプロパノール（isopropanol）、ブタノール（butanol）、アセトン（acetone）、エーテル（ether）、ベンゼン（benzene）、クロロホルム（chloroform）、エチルアセテート（ethyl  acetate）、メチレンクロライド（methylene  chloride）、ヘキサン（hexane）、シクロヘキサン（cyclohexane）、石油エーテル（petroleum  ether）等の各種溶媒を単独或いは混合して用いられる。ミリスチカフラグランス抽出物から本発明のリグナン系化合物の分離及び精製はシリカゲル（silica  gel）又は活性アルミナ（alumina）等の各種合成樹脂を充填したカラムクロマトグラフィ（column  chromatography）及び高速液体クロマトグラフィ（HPLC）等を単独で或いは併行して使用できる。しかしながら、有効成分の抽出及び分離精製方法は必ずしも前記の方法に限定されるものではない。
【００２３】
このように、本発明のリグナン系化合物は純粋に分離、精製された化合物の形態で用いることができ、さらに、これを含む抽出物の形態でも用いられる。例えば、前記記載の通り、ミリスチカフラグランスの種子、果実又は仮種皮抽出物やミリスチカフラグランスの種子を圧搾して得た油の形態でも用いられる。前記抽出物は前記の通り、ミリスチカフラグランスを水又はC1-C6の有機溶媒で抽出して得られる。好ましくは、ミリスチカフラグランスの種子、つまり、肉豆蒄肉豆蒄抽出物の場合もあり得る。
【００２４】
本発明の一実施例において、ミリスチカフラグランス（Myristica  fragrance）の実（肉豆蒄）のエタノール抽出物から前記一般式１で表示されるリグナン系化合物の中で代表的な化合物である前記化学式１で表示されるメイスリグナン（macelignan）を分離、精製した（実施例１参照）。
【００２５】
本発明の一般式１で表示されるリグナン系化合物はプロピオニバクテリウムアクネス等ニキビ誘発菌に関して卓越な抗菌活性を表し、熱安定性に優れ加熱してもその抗菌活性が維持される（実施例３参照）。
【００２６】
本発明のリグナン系化合物がニキビを起こす原因菌であるプロピオニバクテリウムアクネス、ステピロコカスアウレウスとステピロコカスエピダミスに対して抗菌活性があるか否かを調査した結果、高い抗菌活性のあることが分かった（図６及び表２参照）。とくに、ニキビの主原因菌として知られたプロピオニバクテリウムアクネスに対する最小阻止濃度（MIC）が２μg/mlであると確認され、従来ニキビ治療剤として多く用いられた薬剤よりも抗菌活性が優れたものとして示された。つまり、従来ニキビ治療剤として用いられたベンゾイルファオキサイドプロピオニバクテリウムアクネスに対する最小阻止濃度（MIC）が500〜1000μg/ml  (Decker,  LC.  et  al.,  Antimicro.  Agents.  Chemother.,  33(3)：326-330,  1989)であり、塩化ベンザルコニウムの最小阻止濃度（MIC)が200〜300μg/ml（Gloor,  M.  et  al.,  Arch.  Dermatol.  Res.,  265(2)：207-212,  1979)であり、茶の木の油成分であるterpinen-4-olの最小阻止濃度（MIC）が300〜500μg/ml（Raman,  A.  et  al.,  Lett.  Appl.  Microbiol.,  21(4)：242-245,  1995)と知られているので、本発明のリグナン系化合物は前記公知されたニキビ治療剤よりもニキビ誘発菌に対して遥かに優れた抗菌活性を表すことが分かった。さらに、本発明のリグナン系化合物はプロピオニバクテリウムアクネスに対する最小阻止濃度が64μg/mlである肉豆蒄粗抽出物に比べても約30倍以上抗菌活性が優れていることを確認した（下記比較例１参照）。さらに、本発明のリグナン系化合物を含む化粧水及びクリームを製造して抗菌活性実験をした結果、ニキビ誘発菌に対する抗菌活性が極めて優れていることが確認できた（表５及び表７参照）。
【００２７】
このような結果等は本発明のリグナン系化合物がニキビを起こす原因菌であるプロピオニバクテリウムアクネス、ステピロコカスアウレウスとステピロコカスエピダミスに対して抗菌活性が優れ、ニキビ治療効果があることを意味する。このような一般式１で表示される本発明のリグナン系化合物のニキビ誘発菌に対する抗菌活性は本発明で初めて判明した。さらに、本発明のリグナン系化合物は従来ニキビ治療剤として用いられた化合物よりは抗菌活性が遥かに高く、従来のニキビ治療剤よりはより優れた効果を有するニキビ治療剤であることが分かった。
【００２８】
従って、本発明の前記一般式１で表示されるリグナン系化合物又は、その薬学的に許容可能な塩を有効成分とする抗菌用組成物及びニキビ治療用組成物は臨床投与の際、経口又は非経口投与が可能で一般的な医薬品製剤の形態でも用いられる。
【００２９】
一般的な医薬品の形態で製剤化する場合には、普通に用いられる充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤等の希釈剤又は賦型剤を用いて調剤される。経口投与の為の固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等が含まれ、このような固形製剤は前記リグナン系化合物に少なくとも一つ以上の賦型剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロス又はラクトース、ゼラチン等を混合して調剤する。
【００３０】
さらに、単なる賦型剤以外にマグネシウムスチレートタルクのような潤滑剤等も用いられる。経口投与の為の液状製剤には懸濁剤、耐溶液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、当該液状製剤には広く用いられる単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に多様な賦型剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤等が含まれる。非経口投与の為の製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、軟膏剤、クリーム剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。
【００３１】
さらに、本発明の抗菌用組成物及びニキビ治療用組成物は非経口投与することができ、非経口投与は皮下注射、静脈注射、筋肉内注射又は胸部内注射注入方式による。非経口投与用剤型に製剤化する為には前記一般式１のリグナン系化合物を安定剤又は緩衝剤と共に、水中で混合して溶液又は懸濁液に製造し、これをアンプル又はバイアルの単位投与形に製剤化する。投薬単位は例えば、個別投薬量の1、2、3又は4倍に、1/2、1/3又は1/4倍を含有する。個別投薬量は好ましくは有効薬物が１回に投与される量を含み、これは通常１日投与量の全部、1/2、1/3又は1/4倍に該当する。
【００３２】
本発明の一般式１で表示されるリグナン系化合物の有効容量は１回の服用量が0.1-50mg/kgで、好ましくは1-10mg/kgであり、１日1-3回投与することができる。特定患者に対する投与量水準は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率、疾患の重症度等により変化する。
【００３３】
本発明の一般式１で表示されるリグナン系化合物をマウスに経口投与し、毒性実験を行った結果、経口毒性実験による50％致死量（LD50）は2,000mg/kg以上であると表れた。
【００３４】
とくに、本発明の一般式１で表示されるリグナン系化合物を含む抗菌用組成物及びニキビ治療用組成物は皮膚塗布用医薬品、つまり、軟膏、クリームの形態に製剤化することができ、製剤物総重量に対して0.001-10.0重量％、望ましくは0.001〜5.0重量％の範囲内で剤型により適宜配合できる。0.001重量％未満で添加する場合には抗菌活性が低くなり、10.0重量％を超えて添加する場合には添加量が多くなるだけで抗菌活性において大差がない。
【００３５】
本発明の前記一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物を含むニキビ誘発菌抗菌剤及びニキビ治療剤にはニキビ皮膚用化粧品を含む。前記ニキビ皮膚用化粧品には石鹸等の洗浄剤及びクリーム、化粧水等を含む。
【００３６】
本発明の一般式１で表示されるリグナン（lignan）系化合物を含む化粧品は石鹸、液状及びクリーム形態の洗顔剤等の多様な形態の洗浄剤又はクリーム、化粧水、ゲル、水溶性リキッド、エッセンス、水中油型及び油中水型等多様な形態で剤型化されて用いられる。如何なる剤型で製造して用いるかは本発明が属する技術分野の当業者により極めて容易に決定できる。さらに、クレンジングフォーム、乳液、エッセンス等の基礎化粧品に気軽に添加してニキビ皮膚用化粧品として用いられる。
【００３７】
本発明の一般式１で表示されるリグナン系化合物は洗浄剤又は化粧品総重量に対して0.001-10.0重量％好ましくは0.001-5.0重量％の範囲内で剤型により適宜配合できる。0.001重量％未満で添加する場合には抗菌活性が低くなり、10.0重量％を超えて添加する場合は添加量が多くなるだけで抗菌活性において大差がない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明する。
ただし、下記実施例は本発明を例示するのみで、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。さらに、下記実施例及び実験例等で特に嵩％であることを明示していない％は重量％を示す。さらに、全ての活性分析は全部で３回以上繰返し実施し、その結果は平均値±標準偏差で示した。さらに、統計分析はStudents's  t-testを利用して行い、ｐ値は＜0.05以下の場合に統計的に有意なものと判定した。
【００３９】
＜実施例１＞  肉豆蒄よりリグナン系化合物の分離及び精製
＜1-1＞  メイスリグナンの分離及び精製
乾燥粉砕した肉豆蒄100g（乾燥重量）に75嵩％エタノールを400mlを加え、常温で二日間放置した後、その溶液をワットマン(Whatman)濾過紙第２番を利用して濾過した。前記過程を２回繰返した後、エタノール濾過液を真空濃縮して凍結乾燥後シリカゲルカラムクロマトグラフィ法を利用してヘキサンとエチルアセテートを20：1の比率で混合した溶媒で溶出させ、真空回転濃縮器で溶媒を完全に除去し、肉豆蒄の粗抽出物を製造した。前記肉豆蒄の粗抽出物をTLCプレート上でヘキサンとエチルアセテートを10：1で混合した溶媒システムを用いて分離させ、これをTLCプレート分析法により確認した。TLCプレート分析法により確認された抽出物の抗菌活性物質をヘキサンとエチルアセテートを10：1で混合した溶媒システムを用いて溶媒が展開された距離と抗菌活性物質が展開された距離の比率を0.2に調節し、再びメタノールと水をそれぞれ8：2(v/v)の展開溶媒で薄層クロマトグラフィ(TLC,  RP-18gel  60F254,  Merck)してRf=0.2の値を有し、紫外線(254,  365nm,  VL-6-LC,  Vilber  lourmat)において強力な吸収帯を有する単一物質を分離した。
【００４０】
＜1-2＞  構造分析
実施例＜1-1＞で分離された単一物質の構造決定の為、1H-NMRスペクトルと13C-NMRスペクトルをそれぞれ600MHzと150MHz（溶媒：DMSO）で測定し、それぞれ図１と図２に示した。13C-NMRスペクトルと1H-NMRスペクトルの結果を基に1H-1Hの相関関係と1H-13Cの相関関係を測定する為に、1H-1H  COSYスペクトルと1H-13C  HMBCスペクトルを測定してその結果を図３と図４に示した。1H-NMR、13C-NMR、1H-1H  COSY、1H-13C  HMBCの結果を総合的に分析して表１に示す。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
＜1-3＞  質量分析
さらに、前記分離された単一物質の質量分析の為、測定したEI/MSの結果を図５に示した。本化合物はEI/MSより［M]+がm/z328より観測され分子量が328と判明され分子式はC20H24O4であった。
以上の１H-NMR、13C-NMR、1H-1H  COSY、1H-13C  HMBC及びEI/MSに対する結果と既に発表された研究報告（Woo,  W.S.  et  al.,  Phytochemistry,  26：1542-1543,  1987）を比較分析して同定した結果、実施例＜1-1＞で分離された単一物質は前記化学式１で示されるメイスリグナン（macelignan）化合物と確認された。
【００４３】
＜実施例２＞  抗菌活性調査
＜2-1＞  リグナン系化合物の生菌数測定法によるニキビ誘発菌成育抑制効果測定
前記実施例＜1-1＞で製造されたメイスリグナン化合物をジメチルスルホキシドに溶解させ、0.002％、0.001％、0.0005％濃度の試料を製造した。製造した試料にプロピオニバクテリウムアクネスを2×105CFU/mlで希釈し、それぞれの試験管に100μl添加して37℃でそれぞれ２時間、４時間、８時間、12時間、16時間、20時間、24時間反応させた後、各試料を順次10倍ずつ希釈して流動プレート法（pour  plate  method）を実施し、これを37℃のインキュベータで培養して代表的なニキビ誘発菌であるプロピオニバクテリウムアクネスの生菌数を測定した。その結果を図６のグラフに図示した。
【００４４】
図６のグラフから分かる通り、生菌数測定法により生菌数を測定した結果、メイスリグナン化合物の濃度が0.002％（20μg/ml)の場合、２時間以内に、0.001％（10μg/ml）の場合、８時間以内に菌が殆ど死滅すると示された。この結果は飲み薬の場合、普通８時間おきに服用し、軟膏や貼り薬の場合、２〜４時間内外で使用することを勘案すると、メイスリグナン化合物を素材にした薬や擦り付けニキビ治療剤として用いる場合、代表的なニキビ誘発菌であるプロピオニバクテリウムアクネスに対し極めて効果的な殺菌活性を表すことを意味する。
【００４５】
＜2-2＞  リグナン系化合物の最小阻止濃度（Minimum  Inhibitory  Concentration,  MIC）測定
実施例＜1-1＞で製造したメイスリグナン化合物を0.5％メタノールに溶解させ、準備された試験管等に血液平板培地をそれぞれ1mlずつ入れ、最初試験管にのみメイスリグナン系化合物を2％濃度でそれぞれ１mlずつ入れ、順次２倍ずつ希釈した。この希釈液にプロピオニバクテリウムアクネス100μlを2×105CFU/mlになるようにそれぞれの試験官に添加し、37℃で24時間以上培養し、濁度を示さない最小阻止濃度を測定して表２に示す。同一な方法でステピロコカスアウレウス、ステピロコカスエピダミスに対する最小阻止濃度を測定し、その結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
2007524666.tif 000009
【００４７】
＜比較例１＞  肉豆蒄粗抽出物の抗菌活性調査
前記実施例＜1-1＞のメイスリグナンを分離する過程で製造された肉豆蒄粗抽出物に対して前記実施例＜2-1＞に開示された方法でニキビ誘発菌に対する成育抑制効果を測定して図７に示した。さらに、実施例＜2-1＞に開示された方法で肉豆蒄粗抽出物のニキビ誘発菌に関する最小阻止濃度を測定した結果、プロピオニバクテリウムアクネス、ステピロコカスアウレウス、ステピロコカスエピダミスに対する最小阻止濃度はそれぞれ64μg/ml、250μg/ml、250μg/mlと確認された。
【００４８】
＜実施例３＞  リグナン系化合物の熱安定性
前記実施例＜1-1＞で製造されたメイスリグナン化合物をジメチルスルホキシドに溶解させ、0.1％濃度の試料を製造し、それぞれ60℃、70℃、80℃、90℃、100℃及び121℃で30分間それぞれ熱処理後、ウェル拡散分析法で抗菌活性を測定した結果を下記表３に示す。
【００４９】
【表３】
2007524666.tif 000010
【００５０】
前記表３の結果から分かるように、60℃から121℃までの範囲の熱処理後にも抗菌活性の減少が殆ど生じなかった。従って、本発明のリグナン系化合物は高温処理過程においても安定していることが確認できた。
【００５１】
＜実施例４＞  メイスリグナン含有化粧水の製造及びその抗菌活性調査
＜4-1＞  メイスリグナン含有化粧水の製造
本発明のメイスリグナン化合物を利用した下記表４の組成を有する化粧水を製造した。実施例＜1-1＞で分離したメイスリグナン化合物を1.0、0.1、0.01、0.001％の４種の濃度にして、それぞれ一定量の水に溶解後リン酸水溶液と混合した。エタノールとグリセリン、プロピレングリコールを混合して上記製造した混合物を入れ、混合しながら香料、保存料を追加し、精製水で重量を調整して満遍なく混和した。
【００５２】
【表４】
2007524666.tif 000011
【００５３】
＜4-2＞  抗菌活性調査
前記実施例＜4-1＞で製造したメイスリグナンを含有した化粧水をそれぞれ濃度別に４mlずつ含まれたテストチューブにプロピオニバクテリウムアクネス等ニキビ誘発菌含有液１mlを添加してチューブを揺さぶりながら培養し、24時間後に生菌数を測定した。その結果を下記表５に示す。
【００５４】
【表５】
2007524666.tif 000012
【００５５】
前記表５の結果から分かるように、本発明に係る薬用化粧水はメイスリグナン化合物を含まない化粧水と比較すると、プロピオニバクテリウムアクネス等ニキビ誘発菌に対する抗菌活性が極めて高かった。
【００５６】
＜実施例５＞  メイスリグナン含有クリームの製造及びその抗菌活性調査
＜5-1＞  メイスリグナン含有クリームの製造
本発明のメイスリグナン化合物を利用した下記表６の組成を有するクリームを製造した。先ず、Ｂで表示された物質等を75〜80℃で溶解させ、Ｃで表示された物質の内セチルアルコールと保存料を同じ温度で溶解させた。ＣをＢ溶液中で油化させ、Ａで表示されたメイスリグナン化合物を3.0、0.1、0.01、0.001％の濃度でそれぞれ入れて混合後、最後に香料を入れ精製水で定量を合わせて製造した。
【００５７】
【表６】
2007524666.tif 000013
【００５８】
＜5-2＞  抗菌活性調査
前記実施例＜5-1＞で製造されたメイスリグナン化合物を含むクリームがそれぞれの濃度別に４mlずつ含まれたテストチューブにプロピオニバクテリウムアクネス等ニキビ誘発菌含有液１mlを添加してチューブを揺さぶりながら培養し、24時間後に生菌数を測定して抗菌活性を測定した。その結果を下記表７に示す。
【００５９】
【表７】
2007524666.tif 000014
【００６０】
前記表７の結果から分かるように、本発明に係る実施例のクリームはメイスリグナンを含まないクリームと比較すると、プロピオニバクテリウムアクネス等ニキビ誘発菌に対する抗菌活性が極めて高かった。
【００６１】
＜実施例６＞  リグナン系化合物のニキビ患者に対する臨床実験
＜6-1＞  経口投与
実施例＜1-1＞で分離精製されたメイスリグナンを用いてニキビ治療に対する臨床実験を実施した。実験対象者はニキビで苦しむ10代中盤から30代中盤の男女30名を選定して、600mgずつ１日２回４週間投与した後、その結果を表８に示した。投与前の病変の個数に比べて投与４週後の病変の数は著しく減少し、これは統計学的に有意であった。（p-value  <0.05）
【００６２】
【表８】
2007524666.tif 000015
【００６３】
＜6-2＞  皮膚適用
前記実施例＜5-1＞で製造したメイスリグナン含有クリームを用いてニキビ予防及び治療に関する臨床実験を実施した。実験対象者はニキビで苦しむ10代中盤から30代中盤の男女30名を選定して、定量ずつ１日２回４週間皮膚適用後、その結果を表９に示した。研究開始前病変の個数に比べて投与４週後の病変の数は著しく減少し、これは統計学的に有意であった。（p-value  <0.05）
【００６４】
【表９】
2007524666.tif 000016
【００６５】
＜製造例１＞  本発明に係るニキビ治療剤の製造
＜1-1＞  錠剤の製造
本発明のメイスリグナン25mgを賦型剤直打用ラクトース26mgとアビセル（未結晶セルロース）3.5mg、崩解補助剤であるナトリウム澱粉グリコネート1.5mg、さらに、結合剤である直打用L-HPC（low-hydrosyprophylcellulose）8mgと共にＵ型混合機に入れて20分間混合した。混合完了後活濁剤としてマグネシウムステアレート１mgを追加添加し、３分間混合した。定量試験と抗湿度試験を経て打錠し、フィルムコーティングして錠剤を製造した。
【００６６】
＜1-2＞  シロップ剤の製造
本発明のメイスリグナン又はその薬学的に許容される塩を有効成分２％(W/V)を含むシロップは下記のような方法で製造した：本発明のメイスリグナンの酸付加塩２g、サッカリン0.8g及び糖25.4gを温水80gに溶解させた。前記溶液を冷却後これにグリセリン8.0g、香味料0.04g、エタノール4.0g、ソルブ酸0.4g及び適量の蒸留水を混合した。前記混合物に水を添加して100mlになるようにした。
【００６７】
＜1-3＞  カプセル剤の製造
本発明のメイスリグナン50mg、乳糖50mg、澱粉46.5mg、タルク1mg及び適量のステアリン酸マグネシウムを混合してこれを硬質ゼラチンカプセルに充填することによりカプセル剤を製造した。
【００６８】
＜1-4＞  注射液剤の製造
有効成分10mgを含む注射液剤は下記の方法で製造した。本発明のメイスリグナンの塩酸塩1g、塩化ナトリウム0.6g及びアスコルビン酸0.1gを蒸留水に溶解させ100ml溶液を製造した。前記溶液を瓶に入れ20℃で30分間加熱滅菌した。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
以上察したとおり、本発明の一般式１で表示されるリグナン系化合物はプロピオニバクテリウムアクネス（Propionibacterium  acnes）、ステピロコカスエピダミス（Staphylococcus  epidermis）、ステピロコカスアウレウス（Staphylococcus  aureus）等のニキビ誘発菌に対する抗菌活性が優れ、熱安定性が優れている。従って、本発明のリグナン系化合物はニキビ誘発菌に対する抗菌剤及びニキビ治療剤として極めて有用に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は本発明のリグナン系化合物の13C-NMRスペクトルである。
【図２】図２は本発明リグナン系化合物の1H-NMRスペクトルである。
【図３】図３は本発明リグナン系化合物の1H-1H  COSYスペクトルである
【図４】図４は本発明リグナン系化合物の1H-13C  HMBCスペクトルである。
【図５】図５は本発明リグナン系化合物のEI-Massスペクトルである。
【図６】図６は本発明リグナン系化合物のプロピオニバクテリウムアクネスに対する抗菌活性を生菌数測定法により測定した結果を示したグラフ（◆は対照群のジメチルスルホキシド、■は0.002％濃度の試料、▲は0.001％濃度の試料、●は0.0005％濃度のメイスリグナン試料を示す)。
【図７】図７は本発明の肉豆蒄粗抽出物のプロピオニバクテリウムアクネスに対する抗菌活性を生菌数測定法により測定した結果を示したグラフ（◆は対照群のジメチルスルホキシド、■は0.02％濃度の試料、▲は0.01％濃度の試料、●は0.005％濃度の肉豆蒄粗抽出物試料を示す）。
【図１】
2007524666.tif 000019
【図２】
2007524666.tif 000020
【図３】
2007524666.tif 000021
【図４】
2007524666.tif 000022
【図５】
2007524666.tif 000023
【図６】
2007524666.tif 000024
【図７】
2007524666.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成17年11月8日(2005.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１で表示されるメイスリグナン又はその薬学的に許容可能な塩を含むプロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌からなるグループより選ばれたニキビ誘発菌抗菌用組成物。
【化１】
2007524666.tif 000026
【請求項２】
下記化学式１で表示されるメイスリグナン又はその薬学的に許容可能な塩を含むニキビ治療用組成物。
【化２】
2007524666.tif 000027
【請求項３】
下記化学式１で表示されるメイスリグナンの有効量を、それらを必要とする個体に投与してプロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌からなるグループより選ばれたニキビ誘発菌の成育を抑制する方法。
【化３】
2007524666.tif 000028
【請求項４】
下記化学式１で表示されるメイスリグナンの有効量を、それらを必要とする個体に投与してニキビを治療する方法。
【化４】
2007524666.tif 000029
【請求項５】
プロピオニバクテリウムアクネス菌、ステピロコカスエピダミス菌及びステピロコカスアウレウス菌の中より選ばれたニキビ誘発菌抗菌剤を製造する為の下記化学式１で表示されるメイスリグナンの用途。
【化５】
2007524666.tif 000030
【請求項６】
ニキビ治療剤を製造する為の下記化学式１で表示されるメイスリグナンの用途。
【化６】
2007524666.tif 000031
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【化７】
2007524666.tif 000032
（前記一般式１で、Ｒ１，Ｒ２はＣ１−５のアルコキシ又はヒドロキシグループであり、Ｒ３は下記式Ａ又は式Ｂである）
【化８】
2007524666.tif 000033
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【化９】
2007524666.tif 000034
（前記一般式１で、Ｒ１，Ｒ２はＣ１−５のアルコキシ又はヒドロキシグループであり、Ｒ３は下記式Ａ又は式Ｂである）
【化１０】
2007524666.tif 000035
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
【化１１】
2007524666.tif 000036
【国際調査報告】
2007524666.tif 000037
2007524666.tif 000038