(57)【要約】【課題】多剤耐性遺伝子の発現を抑制して、該遺伝子の発現によって生じるタンパク質の製造を抑制し、それにより、癌治療のための化学療法薬の有効性を高める方法の提供。【解決手段】本発明は、１つの観点において、動物細胞における多剤耐性遺伝子の発現を抑制する方法であって、該方法は、動物に少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法を提供する。他の観点において、本発明は、動物細胞における多剤耐性遺伝子によって発現されるタンパク質の製造を抑制する方法であって、動物に少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法を提供する。他の観点において、本発明は、癌を有する動物における化学療法薬の有効性を高めるための方法であって、前記動物に化学療法薬及び少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法を提供する。更に、少なくとも１種の化学療法薬及び少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤を含む癌治療に使用するための組成物及びキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞における多剤耐性遺伝子の発現を抑制する方法であって、該方法は、動物に少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法。
【請求項２】
前記動物細胞が、多剤耐性遺伝子の過剰発現のため、化学療法薬に非感受性の腫瘍細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記コレステロール吸収抑制剤が、天然又は人工合成形態のステロール又はスタノール又はそれらの混合物である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記コレステロール吸収抑制剤が、いずれか１種の異性体形態のステロール又はスタノールである請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール（ジヒドロブラシカステロールを含む）、デスモステロール、カリノステロール（ｃｈａｌｉｎｏｓｔｅｒｏｌ）、ポリフェラステロール（ｐｏｒｉｆｅｒａｓｔｅｒｏｌ）、クリオナステロール（ｃｌｉｏｎａｓｔｅｒｏｌ）、エルゴステロール、コプロステロール、コジステロール（ｃｏｄｉｓｔｅｒｏｌ）、イソフコステロール（ｉｓｏｆｕｃｏｓｔｅｒｏｌ）、フコステロール（ｆｕｃｏｓｔｅｒｏｌ）、クレロステロール（ｃｌｅｒｏｓｔｅｒｏｌ）、ナービステロール（ｎｅｒｖｉｓｔｅｒｏｌ）、ラトステロール（ｌａｔｈｏｓｔｅｒｏｌ）、ステラステロール（ｓｔｅｌｌａｓｔｅｒｏｌ）、スピナステロール、コンドリラステロール（ｃｈｏｎｄｒｉｌｌａｓｔｅｒｏｌ）、ぺポステロール（ｐｅｐｏｓｔｅｒｏｌ）、アヴェナステロール（ａｖｅｎａｓｔｅｒｏｌ）、イソアヴェナステロール（ｉｓｏａｖｅｎａｓｔｅｒｏｌ）、フェコステロール（ｆｅｃｏｓｔｅｒｏｌ）及びポリナスタステロールからなる群から選択されるステロールである請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトスタノール、カンペスタノール、スチグマスタノール、ブラシカスタノール（ジヒドロブラシカスタノールを含む）、デスモスタノール、カリノスタノール（ｃｈａｌｉｎｏｓｔａｎｏｌ）、ポリフェラスタノール（ｐｏｒｉｆｅｒａｓｔａｎｏｌ）、クリオナスタノール（ｃｌｉｏｎａｓｔａｎｏｌ）、エルゴスタノール、コプロスタノール、コジスタノール（ｃｏｄｉｓｔａｎｏｌ）、イソフコスタノール（ｉｓｏｆｕｃｏｓｔａｎｏｌ）、フコスタノール（ｆｕｃｏｓｔａｎｏｌ）、クレロスタノール（ｃｌｅｒｏｓｔａｎｏｌ）、ナービスタノール（ｎｅｒｖｉｓｔａｎｏｌ）、ラトスタノール（ｌａｔｈｏｓｔａｎｏｌ）、ステラスタノール（ｓｔｅｌｌａｓｔａｎｏｌ）、スピナスタノール、コンドリラスタノール（ｃｈｏｎｄｒｉｌｌａｓｔａｎｏｌ）、ぺポスタノール（ｐｅｐｏｓｔａｎｏｌ）、アヴェナスタノール（ａｖｅｎａｓｔａｎｏｌ）、イソアヴェナスタノール（ｉｓｏａｖｅｎａｓｔａｎｏｌ）、フェコスタノール（ｆｅｃｏｓｔａｎｏｌ）及びポリナスタスタノールからなる群から選択されるスタノールである請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、脂肪族エステル、芳香族エステル、フェノール酸エステル、ケイ皮酸エステル、フェルラ酸エステル、グリコシド、アシル化グリコシド及びアシルグリコシドからなる群から選択されるステロール誘導体又はスタノール誘導体である請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ステロール又はスタノール（その生物学的に許容可能な塩を含む。）を含む１種以上の化合物であって、１つ以上の以下の式
【化１】
2007524651.tif 000010
（式中、Ｒは、ステロール又はスタノール部分を表わし、Ｒ4は、アスコルビン酸から誘導され、かつｎ＝１−５。）を有する化合物（その全ての生物学的に許容可能な塩又は溶媒和物、又は少なくとも１種の該化合物の又はその塩の又はその溶媒和物のプロドラッグを含む。）である請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェートからなる二ナトリウムアスコルビルスタニルホスフェート組成物である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ヒドロキシ置換アゼチジノンである請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記コレステロール吸収抑制剤が、式
【化２】
2007524651.tif 000011
（式中、
Ａｒ1及びＡｒ2は、独立して、アリール基及びＲ4−置換アリール基からなる群から選択され；
Ａｒ3は、アリール基又はＲ5−置換アリール基を表わし；
Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して、−ＣＨ2−、−ＣＨ（低級アルキル）−及び−Ｃ（ジ低級アルキル）−からなる群から選択され；
Ｒ及びＲ2は、独立して、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9及び−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7からなる群から選択され；
Ｒ1及びＲ3は、独立して、水素原子、低級アルキル基及びアリール基からなる群から選
択され；
少なくとも１つのｑ及びｒが１を表わし、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計は、２、３、４、５又は６であるという条件及びｐが０を表わし、かつｒが１を表わす場合、ｍ、ｑ及びｎの合計は、１、２、３、４又は５であるという条件で、ｑは、０又は１を表わし；ｒは、０又は１を表わし；ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０、１、２、３又は４を表わし；
Ｒ4は、低級アルキル基、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＮＯ2及びハロゲン原子からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ5は、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、独立して、水素原子、低級アルキル基、アリール基及びアリール置換低級アルキル基からなる群から選択され；
Ｒ9は、低級アルキル基、アリール基又はアリール置換低級アルキル基を表わす。）で表わされるヒドロキシ置換アゼチジノン化合物、又はその生物学的に許容可能な塩である請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記化合物において、Ａｒ1がフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、Ａｒ2がフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、かつＡｒ3がＲ5−置換フェニル基を表わす請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物において、Ａｒ1がＲ4−置換フェニル基（ここで、Ｒ4はハロゲン原子を表わす。）を表わし、Ａｒ2がＲ4−置換フェニル基［ここで、Ｒ4はハロゲン原子又は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わし、かつＡｒ3がＲ5−置換フェニル基［ここで、Ｒ5は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わす請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物において、Ｘ、Ｙ及びＺが、それぞれ、−ＣＨ2−を表わし、Ｒ1及びＲ3が、それぞれ、水素原子を表わし、Ｒ及びＲ2が、それぞれ、−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は、水素原子を表わす。）を表わし、かつｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計が２、３又は４である請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物において、ｍ、ｎ及びｒが、それぞれ、０を表わし、ｑが１を表わし、かつｐが２を表わす請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物において、ｐ、ｑ及びｎが、それぞれ、０を表わし、ｒが１を表わし、かつｍが２又は３を表わす請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｒ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｓ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（３Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｒ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（ＲＳ）−ヒドロキシ−３−［４−（メトキシメトキシ）−フェニル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル）］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−［４−（フェニルメトキシ）フェニル］−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；及び、
１−（４−フルオロフェニル）−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（１Ｒ）
−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−アゼチジノンからなる群から選択される請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
前記コレステロール吸収抑制剤が、アンドロスタン及び／又はアンドロステン誘導体［ここで、アンドロスタン及び／又はアンドロステンは、アスコルビン酸と結合しており、及び１つ以上の一般式
【化３】
2007524651.tif 000012
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6は、個々に、水素原子、ＯＨ、カルボニル基及びアスコルビル部分から選択され得り、Ｒ7は、水素原子又はいずれかのハロゲン原子を表わし得る。）で表わされる。］である請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記アンドロスタン又はアンドロステン群からの化合物と結合される前記アスコルビル部分が、１つ以上の以下の構造
【化４】
2007524651.tif 000013
【化５】
2007524651.tif 000014
【化６】
2007524651.tif 000015
【化７】
2007524651.tif 000016
【化８】
2007524651.tif 000017
（式中、Ｍ＋は、いずれかの金属、アルカリ土類金属又はアルカリ金属を表わす。）から個々に選択される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記コレステロール吸収抑制剤が、胆汁酸輸送又は胆汁酸再吸収の抑制剤であり、かつ全ての回腸輸送抑制剤、アピカル輸送抑制剤及び肝輸送抑制剤からなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項２２】
癌を有する動物における化学療法薬の有効性を高めるための方法であって、前記動物にａ）化学療法薬、及び
ｂ）少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤
の有効量を投与することからなる方法。
【請求項２３】
前記コレステロール吸収抑制剤が、天然又は人工合成形態のステロール又はスタノール又はそれらの混合物である請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記コレステロール吸収抑制剤が、いずれか１種の異性体形態のステロール又はスタノールである請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール（ジヒドロブラシカステロールを含む）、デスモステロール、カリノステロール、ポリフェラステロール、クリオナステロール、エルゴステロール、コプロステロール、コジステロール、イソフコステロール、フコステロール、クレロステロール、ナービステロール、ラトステロール、ステラステロール、スピナステロール、コ
ンドリラステロール、ぺポステロール、アヴェナステロール、イソアヴェナステロール、フェコステロール及びポリナスタステロールからなる群から選択されるステロールである請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトスタノール、カンペスタノール、スチグマスタノール、ブラシカスタノール（ジヒドロブラシカスタノールを含む）、デスモスタノール、カリノスタノール、ポリフェラスタノール、クリオナスタノール、エルゴスタノール、コプロスタノール、コジスタノール、イソフコスタノール、フコスタノール、クレロスタノール、ナービスタノール、ラトスタノール、ステラスタノール、スピナスタノール、コンドリラスタノール、ぺポスタノール、アヴェナスタノール、イソアヴェナスタノール、フェコスタノール及びポリナスタスタノールからなる群から選択されるスタノールである請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記コレステロール吸収抑制剤が、脂肪族エステル、芳香族エステル、フェノール酸エステル、ケイ皮酸エステル、フェルラ酸エステル、グリコシド、アシル化グリコシド及びアシルグリコシドからなる群から選択されるステロール誘導体又はスタノール誘導体である請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ステロール又はスタノール（その生物学的に許容可能な塩を含む。）を含む１種以上の化合物であって、１つ以上の以下の式
【化９】
2007524651.tif 000018
（式中、Ｒは、ステロール又はスタノール部分を表わし、Ｒ4は、アスコルビン酸から誘導され、かつｎ＝１−５。）を有する化合物（その全ての生物学的に許容可能な塩又は溶媒和物、又は少なくとも１種の該化合物の又はその塩の又はその溶媒和物のプロドラッグを含む。）である請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
前記コレステロール吸収抑制剤が、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェートからなる二ナトリウムアスコルビルスタニルホスフェート組成物である請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ヒドロキシ置換アゼチジノンである請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
前記コレステロール吸収抑制剤が、式
【化１０】
2007524651.tif 000019
（式中、
Ａｒ1及びＡｒ2は、独立して、アリール基及びＲ4−置換アリール基からなる群から選択され；
Ａｒ3は、アリール基又はＲ5−置換アリール基を表わし；
Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して、−ＣＨ2−、−ＣＨ（低級アルキル）−及び−Ｃ（ジ低級アルキル）−からなる群から選択され；
Ｒ及びＲ2は、独立して、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9及び−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7からなる群から選択され；
Ｒ1及びＲ3は、独立して、水素原子、低級アルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
少なくとも１つのｑ及びｒが１を表わし、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計は、２、３、４、５又は６であるという条件及びｐが０を表わし、かつｒが１を表わす場合、ｍ、ｑ及びｎの合計は、１、２、３、４又は５であるという条件で、ｑは、０又は１を表わし；ｒは、０又は１を表わし；ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０、１、２、３又は４を表わし；
Ｒ4は、低級アルキル基、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＮＯ2及びハロゲン原子からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ5は、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、独立して、水素原子、低級アルキル基、アリール基及びアリール置換低級アルキル基からなる群から選択され；
Ｒ9は、低級アルキル基、アリール基又はアリール置換低級アルキル基を表わす。）で表わされるヒドロキシ置換アゼチジノン化合物、又はその生物学的に許容可能な塩である請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物において、Ａｒ1がフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、Ａｒ2がフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、かつＡｒ3がＲ5−置換フェニル基を表わす請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物において、Ａｒ1がＲ4−置換フェニル基（ここで、Ｒ4はハロゲン原子を表わす。）を表わし、Ａｒ2がＲ4−置換フェニル基［ここで、Ｒ4はハロゲン原子又は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わし、か
つＡｒ3がＲ5−置換フェニル基［ここで、Ｒ5は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わす請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物において、Ｘ、Ｙ及びＺが、それぞれ、−ＣＨ2−を表わし、Ｒ1及びＲ3が、それぞれ、水素原子を表わし、Ｒ及びＲ2が、それぞれ、−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は、水素原子を表わす。）を表わし、かつｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計が２、３又は４である請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記化合物において、ｍ、ｎ及びｒが、それぞれ、０を表わし、ｑが１を表わし、かつｐが２を表わす請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物において、ｐ、ｑ及びｎが、それぞれ、０を表わし、ｒが１を表わし、かつｍが２又は３を表わす請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物が、
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｒ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｓ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（３Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｒ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（ＲＳ）−ヒドロキシ−３−［４−（メトキシメトキシ）−フェニル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−
３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−［４−（フェニルメトキシ）フェニル］−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；及び、
１−（４−フルオロフェニル）−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（１Ｒ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−アゼチジノンからなる群から選択される請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、アンドロスタン及び／又はアンドロステン誘導体［ここで、アンドロスタン及び／又はアンドロステンは、アスコルビン酸と結合しており、及び１つ以上の一般式
【化１１】
2007524651.tif 000020
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6は、個々に、水素原子、ＯＨ、カルボニル基及びアスコルビル部分から選択され得り、Ｒ7は、水素原子又はいずれかのハロゲン原子を表わし得る。）で表わされる。］である請求項２２記載の方法。
【請求項３９】
前記アンドロスタン又はアンドロステン群からの化合物と結合される前記アスコルビル部分が、１つ以上の以下の構造
【化１２】
2007524651.tif 000021
【化１３】
2007524651.tif 000022
【化１４】
2007524651.tif 000023
【化１５】
2007524651.tif 000024
【化１６】
2007524651.tif 000025
（式中、Ｍ＋は、いずれかの金属、アルカリ土類金属又はアルカリ金属を表わす。）から個々に選択される請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、胆汁酸輸送又は胆汁酸再吸収の抑制剤であり、かつ全ての回腸輸送抑制剤、アピカル輸送抑制剤及び肝輸送抑制剤からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項４１】
動物細胞によって示される多剤耐性表現型を逆転させるための方法であって、前記細胞を少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量に曝露することからなる方法。
【請求項４２】
前記動物細胞が、多剤耐性遺伝子の過剰発現のため、化学療法薬に非感受性の腫瘍細胞である請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記コレステロール吸収抑制剤が、天然又は人工合成形態のステロール又はスタノール又はそれらの混合物である請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
前記コレステロール吸収抑制剤が、いずれか１種の異性体形態のステロール又はスタノール又はそれらの混合物である請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール（ジヒドロブラシカステロールを含む）、デスモステロール、カリノステロール、ポリフェラステロール、クリオナステロール、エルゴステロール、コプロステロール、コジステロール、イソフコステロール、フコステロール、クレロステ
ロール、ナービステロール、ラトステロール、ステラステロール、スピナステロール、コンドリラステロール、ぺポステロール、アヴェナステロール、イソアヴェナステロール、フェコステロール及びポリナスタステロールからなる群から選択されるステロールである請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトスタノール、カンペスタノール、スチグマスタノール、ブラシカスタノール（ジヒドロブラシカスタノールを含む）、デスモスタノール、カリノスタノール、ポリフェラスタノール、クリオナスタノール、エルゴスタノール、コプロスタノール、コジスタノール、イソフコスタノール、フコスタノール、クレロスタノール、ナービスタノール、ラトスタノール、ステラスタノール、スピナスタノール、コンドリラスタノール、ぺポスタノール、アヴェナスタノール、イソアヴェナスタノール、フェコスタノール及びポリナスタスタノールからなる群から選択されるスタノールである請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
前記コレステロール吸収抑制剤が、脂肪族エステル、芳香族エステル、フェノール酸エステル、ケイ皮酸エステル、フェルラ酸エステル、グリコシド、アシル化グリコシド及びアシルグリコシドからなる群から選択されるステロール誘導体又はスタノール誘導体である請求項４１記載の方法。
【請求項４８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ステロール又はスタノール（その生物学的に許容可能な塩を含む。）を含む１種以上の化合物であって、１つ以上の以下の式
【化１７】
2007524651.tif 000026
（式中、Ｒは、ステロール又はスタノール部分を表わし、Ｒ4は、アスコルビン酸から誘導され、かつｎ＝１−５。）を有する化合物（その全ての生物学的に許容可能な塩又は溶媒和物、又は少なくとも１種の該化合物の又はその塩の又はその溶媒和物のプロドラッグを含む。）である請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
前記コレステロール吸収抑制剤が、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェートからなる二ナトリウムアスコルビルスタニルホスフェート組成物である請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ヒドロキシ置換アゼチジノンである請求項４１記載
の方法。
【請求項５１】
前記コレステロール吸収抑制剤が、式
【化１８】
2007524651.tif 000027
（式中、
Ａｒ1及びＡｒ2は、独立して、アリール基及びＲ4−置換アリール基からなる群から選択され；
Ａｒ3は、アリール基又はＲ5−置換アリール基を表わし；
Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して、−ＣＨ2−、−ＣＨ（低級アルキル）−及び−Ｃ（ジ低級アルキル）−からなる群から選択され；
Ｒ及びＲ2は、独立して、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9及び−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7からなる群から選択され；
Ｒ1及びＲ3は、独立して、水素原子、低級アルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
少なくとも１つのｑ及びｒが１を表わし、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計は、２、３、４、５又は６であるという条件及びｐが０を表わし、かつｒが１を表わす場合、ｍ、ｑ及びｎの合計は、１、２、３、４又は５であるという条件で、ｑは、０又は１を表わし；ｒは、０又は１を表わし；ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０、１、２、３又は４を表わし；
Ｒ4は、低級アルキル基、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＮＯ2及びハロゲン原子からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ5は、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、独立して、水素原子、低級アルキル基、アリール基及びアリール置換低級アルキル基からなる群から選択され；
Ｒ9は、低級アルキル基、アリール基又はアリール置換低級アルキル基を表わす。）で表わされるヒドロキシ置換アゼチジノン化合物、又はその生物学的に許容可能な塩である請求項４１記載の方法。
【請求項５２】
癌治療における使用のための組成物であって、少なくとも１種の化学療法薬及び少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤を含む組成物。
【請求項５３】
前記コレステロール吸収抑制剤が、天然又は人工合成形態のステロール又はスタノール又はそれらの混合物である請求項５２記載の組成物。
【請求項５４】
前記コレステロール吸収抑制剤が、いずれか１種の異性体形態のステロール又はスタノール又はそれらの混合物である請求項５２記載の組成物。
【請求項５５】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール（ジヒドロブラシカステロールを含む）、デスモステロール、カリノステロール、ポリフェラステロール、クリオナステロール、エルゴステロール、コプロステロール、コジステロール、イソフコステロール、フコステロール、クレロステロール、ナービステロール、ラトステロール、ステラステロール、スピナステロール、コンドリラステロール、ぺポステロール、アヴェナステロール、イソアヴェナステロール、フェコステロール及びポリナスタステロールからなる群から選択されるステロールである請求項５２記載の組成物。
【請求項５６】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトスタノール、カンペスタノール、スチグマスタノール、ブラシカスタノール（ジヒドロブラシカスタノールを含む）、デスモスタノール、カリノスタノール、ポリフェラスタノール、クリオナスタノール、エルゴスタノール、コプロスタノール、コジスタノール、イソフコスタノール、フコスタノール、クレロスタノール、ナービスタノール、ラトスタノール、ステラスタノール、スピナスタノール、コンドリラスタノール、ぺポスタノール、アヴェナスタノール、イソアヴェナスタノール、フェコスタノール及びポリナスタスタノールからなる群から選択されるスタノールである請求項５２記載の組成物。
【請求項５７】
前記コレステロール吸収抑制剤が、脂肪族エステル、芳香族エステル、フェノール酸エステル、ケイ皮酸エステル、フェルラ酸エステル、グリコシド、アシル化グリコシド及びアシルグリコシドからなる群から選択されるステロール誘導体又はスタノール誘導体である請求項５２記載の組成物。
【請求項５８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ステロール又はスタノール（その生物学的に許容可能な塩を含む。）を含む１種以上の化合物であって、１つ以上の以下の式
【化１９】
2007524651.tif 000028
（式中、Ｒは、ステロール又はスタノール部分を表わし、Ｒ4は、アスコルビン酸から誘導され、かつｎ＝１−５。）を有する化合物（その全ての生物学的に許容可能な塩又は溶媒和物、又は少なくとも１種の該化合物の又はその塩の又はその溶媒和物のプロドラッグ
を含む。）である請求項５２記載の組成物。
【請求項５９】
前記コレステロール吸収抑制剤が、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェートからなる二ナトリウムアスコルビルスタニルホスフェート組成物である請求項５２記載の組成物。
【請求項６０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ヒドロキシ置換アゼチジノンである請求項５２記載の組成物。
【請求項６１】
少なくとも２種の別の成分
ａ）少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤を含む組成物、及び
ｂ）少なくとも１種の化学療法薬を含む組成物
を、各組成物の投与を説明する使用説明書と共に含むキット。
【請求項６２】
動物細胞における多剤耐性遺伝子によって発現されるタンパク質の産生を抑制する方法であって、動物に少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法。
【請求項６３】
前記コレステロール吸収抑制剤が、天然又は人工合成形態のステロール又はスタノール又はそれらの混合物である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記コレステロール吸収抑制剤が、いずれか１種の異性体形態のステロール又はスタノールである請求項６２記載の方法。
【請求項６５】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール（ジヒドロブラシカステロールを含む）、デスモステロール、カリノステロール、ポリフェラステロール、クリオナステロール、エルゴステロール、コプロステロール、コジステロール、イソフコステロール、フコステロール、クレロステロール、ナービステロール、ラトステロール、ステラステロール、スピナステロール、コンドリラステロール、ぺポステロール、アヴェナステロール、イソアヴェナステロール、フェコステロール及びポリナスタステロールからなる群から選択されるステロールである請求項６２記載の方法。
【請求項６６】
前記コレステロール吸収抑制剤が、シトスタノール、カンペスタノール、スチグマスタノール、ブラシカスタノール（ジヒドロブラシカスタノールを含む）、デスモスタノール、カリノスタノール、ポリフェラスタノール、クリオナスタノール、エルゴスタノール、コプロスタノール、コジスタノール、イソフコスタノール、フコスタノール、クレロスタノール、ナービスタノール、ラトスタノール、ステラスタノール、スピナスタノール、コンドリラスタノール、ぺポスタノール、アヴェナスタノール、イソアヴェナスタノール、フェコスタノール及びポリナスタスタノールからなる群から選択されるスタノールである請求項６２記載の方法。
【請求項６７】
前記コレステロール吸収抑制剤が、脂肪族エステル、芳香族エステル、フェノール酸エステル、ケイ皮酸エステル、フェルラ酸エステル、グリコシド、アシル化グリコシド及びアシルグリコシドからなる群から選択されるステロール誘導体又はスタノール誘導体である請求項６２記載の方法。
【請求項６８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ステロール又はスタノール（その生物学的に許容可能な塩を含む。）を含む１種以上の化合物であって、１つ以上の以下の式
【化２０】
2007524651.tif 000029
（式中、Ｒは、ステロール又はスタノール部分を表わし、Ｒ4は、アスコルビン酸から誘導され、かつｎ＝１−５。）を有する化合物（その全ての生物学的に許容可能な塩又は溶媒和物、又は少なくとも１種の該化合物の又はその塩の又はその溶媒和物のプロドラッグを含む。）である請求項６２記載の方法。
【請求項６９】
前記コレステロール吸収抑制剤が、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェートからなる二ナトリウムアスコルビルスタニルホスフェート組成物である請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、ヒドロキシ置換アゼチジノンである請求項６２記載の方法。
【請求項７１】
前記コレステロール吸収抑制剤が、式
【化２１】
2007524651.tif 000030
（式中、
Ａｒ1及びＡｒ2は、独立して、アリール基及びＲ4−置換アリール基からなる群から選択され；
Ａｒ3は、アリール基又はＲ5−置換アリール基を表わし；
Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して、−ＣＨ2−、−ＣＨ（低級アルキル）−及び−Ｃ（ジ低級アルキル）−からなる群から選択され；
Ｒ及びＲ2は、独立して、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9及び−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7からなる群から選択され；
Ｒ1及びＲ3は、独立して、水素原子、低級アルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
少なくとも１つのｑ及びｒが１を表わし、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計は、２、３、４、５又は６であるという条件及びｐが０を表わし、かつｒが１を表わす場合、ｍ、ｑ及びｎの合計は、１、２、３、４又は５であるという条件で、ｑは、０又は１を表わし；ｒは、０又は１を表わし；ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０、１、２、３又は４を表わし；
Ｒ4は、低級アルキル基、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＮＯ2及びハロゲン原子からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ5は、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、独立して、水素原子、低級アルキル基、アリール基及びアリール置換低級アルキル基からなる群から選択され；
Ｒ9は、低級アルキル基、アリール基又はアリール置換低級アルキル基を表わす。）で表わされるヒドロキシ置換アゼチジノン化合物、又はその生物学的に許容可能な塩である請求項６２記載の方法。
【請求項７２】
前記化合物において、Ａｒ1がフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、Ａｒ2がフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、かつＡｒ3がＲ5−置換フェニル基を表わす請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記化合物において、Ａｒ1がＲ4−置換フェニル基（ここで、Ｒ4はハロゲン原子を表わす。）を表わし、Ａｒ2がＲ4−置換フェニル基［ここで、Ｒ4はハロゲン原子又は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わし、かつＡｒ3がＲ5−置換フェニル基［ここで、Ｒ5は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わす請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
前記化合物において、Ｘ、Ｙ及びＺが、それぞれ、−ＣＨ2−を表わし、Ｒ1及びＲ3が、それぞれ、水素原子を表わし、Ｒ及びＲ2が、それぞれ、−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は、水素原子を表わす。）を表わし、かつｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計が２、３又は４である請求項７１記載の方法。
【請求項７５】
前記化合物において、ｍ、ｎ及びｒが、それぞれ、０を表わし、ｑが１を表わし、かつｐが２を表わす請求項７１記載の方法。
【請求項７６】
前記化合物において、ｐ、ｑ及びｎが、それぞれ、０を表わし、ｒが１を表わし、かつｍが２又は３を表わす請求項７１記載の方法。
【請求項７７】
前記化合物が、
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｒ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メト
キシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｓ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（３Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｒ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（ＲＳ）−ヒドロキシ−３−［４−（メトキシメトキシ）−フェニル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−［４−（フェニルメトキシ）フェニル］−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；及び、
１−（４−フルオロフェニル）−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（１Ｒ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−アゼチジノンからなる群から
選択される請求項７１記載の方法。
【請求項７８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、アンドロスタン及び／又はアンドロステン誘導体［ここで、アンドロスタン及び／又はアンドロステンは、アスコルビン酸と結合しており、及び１つ以上の一般式
【化２２】
2007524651.tif 000031
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6は、個々に、水素原子、ＯＨ、カルボニル基及びアスコルビル部分から選択され得り、Ｒ7は、水素原子又はいずれかのハロゲン原子を表わし得る。）で表わされる。］である請求項６２記載の方法。
【請求項７９】
前記アンドロスタン又はアンドロステン群からの化合物と結合される前記アスコルビル部分が、１つ以上の以下の構造
【化２３】
2007524651.tif 000032
【化２４】
2007524651.tif 000033
【化２５】
2007524651.tif 000034
【化２６】
2007524651.tif 000035
【化２７】
2007524651.tif 000036
（式中、Ｍ＋は、いずれかの金属、アルカリ土類金属又はアルカリ金属を表わす。）から個々に選択される請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、胆汁酸輸送又は胆汁酸再吸収の抑制剤であり、かつ全ての回腸輸送抑制剤、アピカル輸送抑制剤及び肝輸送抑制剤からなる群から選択される請求項６２記載の方法。
【請求項８１】
前記多剤耐性遺伝子が、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ−１）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＢ２（ＴＡＰ）、ＡＢＣＢ３（ＴＡＰ）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）及びＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３）からなる群の１つ以上から選択される請求項１記載の方法。
【請求項８２】
前記多剤耐性遺伝子が、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ−１）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＢ２（ＴＡＰ）、ＡＢＣＢ３（ＴＡＰ）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）及びＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３）からなる群の１つ以上から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項８３】
前記多剤耐性遺伝子が、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ−１）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＢ２（ＴＡＰ）、ＡＢＣＢ３（ＴＡＰ）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）及びＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３）からなる群の１つ以上から選択される請求項４１記載の方法。
【請求項８４】
前記多剤耐性遺伝子が、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ−１）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＢ２（ＴＡＰ）、ＡＢＣＢ３（ＴＡＰ）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）及びＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３）からなる群の１つ以上から選択される請求項５２記載の組成物。
【請求項８５】
前記多剤耐性遺伝子が、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ−１）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＢ２（ＴＡＰ）、ＡＢＣＢ３（ＴＡＰ）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）及びＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３）からなる群の１つ以上から選択される請求項６２記載の方法。
【請求項８６】
前記コレステロール吸収抑制剤が、リポソームの形態で提供される請求項１記載の方法。
【請求項８７】
前記コレステロール吸収抑制剤が、リポソームの形態で提供される請求項２２記載の方法。
【請求項８８】
前記コレステロール吸収抑制剤が、リポソームの形態で提供される請求項４１記載の方法。
【請求項８９】
前記コレステロール吸収抑制剤が、リポソームの形態で提供される請求項５２記載の組成物。
【請求項９０】
前記コレステロール吸収抑制剤が、リポソームの形態で提供される請求項６１記載のキット。
【請求項９１】
前記コレステロール吸収抑制剤が、リポソームの形態で提供される請求項６２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌治療の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
特定の化学療法薬を用いたヒトの悪性腫瘍の治療は、しばしば、内因性の又は後天性の腫瘍細胞耐性のために効果がないことが発見されている。該問題は、腫瘍細胞耐性の機構の多くが結果として異なる作用機構を有する広範囲の構造的に無関係な化学療法薬への付随的な耐性をもたらすため、更に深刻である。この状態は、多剤耐性として言及される。これは、癌治療における重大な問題であり、現在の化学療法薬を用いた治癒率の増加の主要な障害であると思われる。
【０００３】
７カ国の主要な世界的規模の薬剤市場のみでも（アメリカ合衆国、日本国、ドイツ国、イタリア国、フランス国、スペイン国、イギリス国）1、約２．０４百万の癌の新症例が、毎年、報告されている。不幸にも、これらの５−１０％にしか、化学療法がうまく効果を示さないだろう。約４０−４５％の、又は８００，０００人以上の患者が、毎年、１つ以上の化学療法プログラムに対して多剤耐性を発現するだろう。多剤耐性の発現が、世界中の癌の化学療法を成功させるための主要な障害であると言っても過言ではない。それは、これまでうまく解決されていない問題である。
【０００４】
分子及び細胞レベルにおけるいくつかの機構により、多剤耐性は適切に説明される。示唆された、様々な化学療法薬に対する腫瘍細胞の薬剤耐性の発現における細胞機構は、薬物取り込みの減少又は薬物流出の増加、酸化還元電位の変化、ＤＮＡ修復の増強、薬剤隔離機構（ｄｒｕｇ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）又は薬剤標的タンパク質の増幅を含む。
【０００５】
今日まで、多剤耐性輸出タンパク質をエンコードする２つの遺伝子がヒトゲノム中で同定されている。これらのうちの一方、ＭＤＲ１は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送タンパク質スーパーファミリーに属する１７０ｋＤａのマルチスパン膜貫通タンパク質であるところのｐ−糖タンパク質をエンコードする2。腫瘍細胞がＭＤＲを獲得するところの１つの機構は、ｐ−糖タンパク質（Ｐｇｐ）の過剰発現によることが示唆されている3、4、5、6。
【０００６】
ｐ−糖タンパク質は、恐らく、腫瘍細胞の外へ疎水性の化学療法薬を速やかに送り出すことによって作用し、それによって、それらの細胞増殖抑制濃度未満に、特定の化学療法薬の細胞内蓄積を減少させる。１つの生体外の解決策は、化学療法薬の濃度を増加させることである。しかしながら、癌の化学療法薬は、既に、生体内に、それらの最大許容範囲において投与されているため、投与量の増加は、大抵の場合において、極度の毒性を導くために、受け入れられない解決策である7、8。
【０００７】
ｐ−糖タンパク質は、構造的には、主要な組織適合性複合体−結合ペプチド輸送体である嚢胞性線維症輸送タンパク質及び非−ｐ−糖タンパク質に関連した多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）に類似している9、10、11、12。ｐ−糖タンパク質は、正常なヒトの副腎皮質、管腔状の毛細胆管及び結腸上皮、腎尿細管上皮及び血液脳関門及び血液精巣隔壁の内皮細胞を含む様々な部位で発現する。これらの部位におけるｐ−タンパク質の機能は不明で
あるが、おそらく、ホルモンの分泌及び毒素に対する保護に関連した広い特異性を持つエネルギー依存ポンプとして機能していると思われる。ｐ−糖タンパク質の発現は、アドリマイシン（ドキソルビシン）、コルチシン、コルセミド、エトポシド、パクリタクセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン並びに他ものを含む多くの疎水性で複素環式の癌の化学療法薬を活発に流出させ得る。
【０００８】
ｐ−糖タンパク質は、高度に保存された遺伝子ファミリーによってエンコードされる13。ＭＤＲ−１遺伝子は、ヒトにおいて多剤耐性を与えるクラスＩ  ｐ−糖タンパク質をエンコードする14。ハムスターにおけるｐｇｐ−１及びｐｇｐ−２遺伝子及びマウスにおけるｍｄｒ−３及びＭＤＲ−１遺伝子は、クラスＩ及びＩＩのタンパク質をエンコードし、その双方は、齧歯類に多剤耐性を与える15。
【０００９】
いくつかの一連の証拠は、生体外におけるｐ−糖タンパク質の増加と多剤耐性間の因果関係を裏付ける。タンパク質の構造的特徴は、エネルギー依存流出ポンプの特性にある16。タンパク質の過剰発現は、多剤耐性に関連している17。ｐ−糖タンパク質の発現度と多剤耐性表現型間の正相関もまた発見されている18。
【００１０】
大腸癌、腎臓癌、乳癌、副腎皮質癌及び肝臓癌は、しばしば、その患者が、以前に、抗癌剤で治療したことがない場合でさえも、診断において、高レベルのｐ−糖タンパクを示す17。様々な腫瘍型において、初回化学療法後の再発又は疾患の進行は、治療が無効となり、しばしば、ＭＤＲ及びＭＤＲ−１のより高いレベルの発現を含む18。薬剤耐性は、遺伝子コピー数の減少として細胞中に現れ得り、そしてそれは、転写レベル、翻訳レベル又は翻訳後のレベルにおける調節のためであり得る。生体外における研究は、しばしば、薬剤耐性の原因としてＭＤＲ−１の増幅を示すけれども19、遺伝子コピー数が増加することは、ヒトの腫瘍においては、明かに稀である20。
【００１１】
多くのヒトの腫瘍研究において、ＭＤＲ−１遺伝子産物又はそのｍＲＮＡの増加レベルは、不良な予後に関連している。乳癌の臨床研究は、かなりの割合の患者が高レベルのｐ−糖タンパク質を発現し、ｐ−糖タンパク質の発現が低レベルの患者は、発現が高レベルの患者よりも化学療法に対する非常に良好な奏功率及び無増悪生存率を有したことを示した21、22。大腸癌の遡及的研究において腫瘍の６８％は、高レベルのｐ−糖タンパク質を発現し、悪性度と関連した過剰発現が血液細胞浸潤及び転移によって評価された23。急性骨髄性白血病を含む３つの臨床研究において、ＭＤＲ−１陰性群は、全て、ＭＤＲ−１陽性群よりも、より高い完全寛解の割合及びより長期間の無病生存率を有した24、25、26。
【００１２】
神経芽細胞腫における３つの研究において、治験責任医師は、ＭＤＲ−１発現が、しばしば、非局所的な治療後の腫瘍において起こり、かつ不良な予後と関連していることを示した27、28、29。同様に、横紋筋肉腫において、ｐ−糖タンパク質レベルは増加した悪性の病期に関連し、かつｐ−糖タンパク質陰性群の患者は、ｐ−糖タンパク質陽性群の患者よりも、かなり良好な奏功率並びにより長期間の無再発生存率及び全生存率を有した30。ｐ−糖タンパク質発現はまた、進行性及び難治性の骨髄腫と大いに関連している31。これらのデータは、様々なヒトの悪性腫瘍において、ｐ−糖タンパク質発現と臨床予後は関連があることを示唆している。
【００１３】
ＭＤＲを逆転させる薬剤は、薬物流出を減少させるところの機構を有することが示されてきた（例えば、カルシウムチャンネル遮断薬、ベラパミル、ジルチアゼム及びニカルジピジン32、カルモデュリン抑制剤、レセルピン、キニジン又はキネイン33、シクロスポリンＡ、シクロスポリン誘導体35、又はＦＫ５０６及びラパマイシン36）。大抵のこれら薬剤での臨床治療における耐性の逆転は、主に、耐性の逆転を達成するために必要とされる臨床的な毒素濃度レベルのために、制限されてきた。
【００１４】
多剤耐性遺伝子の発現、それらのタンパク質生成物の産生及びＭＤＲ表現型の獲得が、臨床医学者が利用可能な化学療法の選択をかなり制約し、かつ患者の予後をかなり悪化させることは明かである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
それ故、より効果的な非毒性のＭＤＲ逆転及び／又は抑制薬剤を発見することが技術的に必要とされている。
【００１６】
ＭＤＲを解消するために使用されている既知の化合物の欠点を軽減し得る又は取り除き得る新規化合物を提供することは、本発明の目的である。
【００１７】
ＭＤＲを解消するために使用されている既知の組成物の欠点を軽減し得る又は取り除き得る新規組成物を提供することは、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
発明の概要
本発明は、１つの観点において、動物細胞における多剤耐性遺伝子の発現を抑制する方法であって、該方法は、動物に少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法を提供する。
【００１９】
本発明は、他の観点において、癌を有する動物において化学療法薬の有効性を高めるための方法であって、前記動物に少なくとも１種の化学療法薬及び少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法を提供する。
【００２０】
本発明は、更なる他の観点において、動物細胞によって示される多剤耐性表現型を逆転させるための方法であって、前記細胞を少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量に曝露することからなる方法を提供する。
【００２１】
本発明は、更なる他の観点において、動物細胞における多剤耐性遺伝子によって発現されるタンパク質の産生を抑制する方法であって、動物に少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法を提供する。
【００２２】
本発明は、更なる他の観点において、癌治療における使用のための組成物であって、少なくとも１種の化学療法薬及び少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤を含む組成物を提供する。
【００２３】
本発明は、更なる他の観点において、少なくとも２種の別の成分
ａ）少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤を含む組成物、及び
ｂ）少なくとも１種の化学療法薬を含む組成物
を、各組成物の投与を説明する使用説明書と共に含むキットを提供する。
【００２４】
本発明の核心は、コレステロール吸収抑制剤と化学療法薬の供給及び共投与にある（しかし、同時又は連続である必要はない。）。コレステロール吸収抑制剤が、効果的に、多剤耐性遺伝子の発現を抑制することが発見された。これらの遺伝子によって発現されるタンパク質の製造の減少は、動物細胞からの癌化学療法薬の流出を防止し、それらの効果を最大化すること示唆する。これは、多剤耐性機構によって、従来、保証された化学療法薬の効果が、事実上、無効になることに関連する実証問題のために重要である。
【００２５】
本発明の好ましいコレステロール吸収抑制剤のいくつか（式（ｉ）ないし（ｉｖ）で表わされるものを含む下記したもの）は、アスコルビル部分を含む。これらの特定の化合物は、多くの更なる利点を有する。特に、水等の水溶液に対する溶解性がアスコルビル部分によって改善され、それによって、ぞれ自体を経口投与することが可能である。同様に、他の投与方法も容易となる。従って、本発明のこれらの選択された化合物は、そのようなものとして製造かつ使用され得るか、又は、それらは、医薬品が水性であるかどうかにかかわらず、任意に、選択された化学療法薬と共に医薬品中に容易に処方され得る。この高められた溶解性は、一般的に、所望の治療効果を達成するために、化合物の投与量を減少させる。
これらの効果及び他の重要な利点は以下に示し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図面の簡単な説明
本発明は、以下の限定されない図面によって説明される：
【図１】図１は、ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）を用いた１週間の処理後のＣａＣｏ２細胞中のＭＤＲ−１発現レベル（ＭＤＲ−１／ＧＡＰＤＨの標準比；‘‘ＧＡＰＤＨ’’又はグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ）を示す棒グラフである。
【図２】図２は、ＧＡＰＤＨのプライマー滴における滴定を示すグラフである。
【図３】図３は、ＭＤＲ−１、ＧＡＰＤＨにおけるポリメラーゼ鎖反応（１．５％  アガロースゲル）ゲル電気泳動の結果を示す。
【図４】図４は、ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）を用いたＣａＣｏ２細胞の処理後の、ＭＴＳ−及びＬＤＨ−分析による細胞の生存率を示す棒グラフである。
【図５】図５は、ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）を用いたＣａＣｏ２細胞の処理後の、ＢＣＡ−分析によるタンパク質濃度を示す棒グラフである。
【図６】図６は、ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）を用いた１週間の処理後のＣａＣｏ２細胞中のＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）発現レベル（ＭＲＰ−１／ＧＡＰＤＨの標準比）を示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＭＤＲ−１、ＧＡＰＤＨにおけるポリメラーゼ鎖反応（１．５％  アガロースゲル）ゲル電気泳動の結果；ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）のリポソーム製剤を用いたＣａＣｏ２細胞の処理後の、ＴＲＩＺＯＬを用いたＲＮＡ分離→ＲＴ−ＰＣＲ→ＰＣＲを示す。
【図８】図８は、ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つを用いた１週間の処理後のＣａＣｏ２細胞中のＭＤＲ−１発現レベル（ＭＤＲ−１／ＧＡＰＤＨの標準比）［‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステルのリポソーム製剤（２．５、５及び１０μＭ）、対照及びからのリポソームの比較］を示す棒グラフである。
【図９】図９は、ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）を用いた培養後のＣａＣｏ２細胞中のｐ−糖タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。
【図１０】図１０は、試料ＰＣＲ生成物の電気泳動ゲルプロフィル（ＦＭ−ＶＰ４  １０μＭを用いた時間依存性処理の効果としての、ＣａＣｏ２細胞中のｍｄｒ−１遺伝子の発現プロフィルの測定）を示す。
【図１１】図１１は、紫外線（ＵＶ−Ｅｐｉ  Ｃｈｅｍ  ＩＩ）下で画像化され、かつＵＶＰ−ラボワークス  ソフトウェアによって定量化された図１０のＰＣＲ生成物の蛍光バンドを示す棒グラフである。
【図１２】図１２は、Ｃａｃｏ−２単層中のＲｈ１２３の蓄積に対する１週間、ＦＭ−ＶＰ４を用いた前培養の効果を示す棒グラフである。データは、平均±ＳＤを示す。*ｐ＜０．００２、**ｐ＜０．０００１。
【図１３】図１３は、Ｃａｃｏ−２単層を通りぬけたＲｈ１２３のＰ−ｇｐ輸送（側底面から先端面へ）に対する１週間、ＦＭ−ＶＰ４を用いた前培養の効果を示す棒グラフである。データは、３±ＳＤの平均を示す。*ｐ＜０．０７、**ｐ＜０．００９。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の好ましい態様
下記の詳細な説明は、本発明を実施するにあたり当業者を助けるために提供される。しかしながら、この詳細な説明は、本発明の範囲を不当に限定するものと解釈されるべきではない。本明細書中で論じられている実施態様の改良及び変形は、本発明の精神及び範囲を離れることなく当業者により行われ得る。
【００２８】
ここで使用される‘‘動物’’は、全ての哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む動物界のいかなるものも意味する。家畜用もまた意図される。
【００２９】
ここで使用される用語‘‘化合物’’は、用語‘‘誘導体’’、‘‘構造体’’及び‘‘類似体’’と置き換え可能である。
【００３０】
ここで使用される用語‘‘効果的な’’又は‘‘治療に効果的な’’は、化合物又は組成物を投与する人が求める細胞、組織、システム、動物又は哺乳類における生物学的又は医学的反応を発現させるために、動物、特にヒトへ投与される前記化合物又は組成物の量であって、１つ以上の以下の目的を達成する量を限定することを意図する；
ａ）癌を治療又は軽減すること、
ｂ）腫瘍の成長を予防、治療又は軽減させること、
ｃ）１つ以上の多剤耐性遺伝子の発現を抑制又は減少させること、
ｄ）多剤耐性遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質の産生を抑制又は減少させること、
ｅ）癌治療における化学療法薬の有効性を高めること、及び、
ｆ）１つ以上の化学療法薬に対して細胞を感受性にすること。
【００３１】
ここで使用される用語‘‘胆汁酸輸送体’’又は‘‘ＩＢＡＴ’’は、アピカルナトリウム共依存性胆汁酸輸送体（ａｐｉｃａｌ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｏ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）又はＡＳＢＴと同義語である。
【００３２】
ここで使用される用語‘‘ベンゾチエピンＩＢＡＴ抑制剤’’は、２，３，４，５−テトラヒドロ−１−ベンゾチエピン１，１−ジオキシド構造を含む治療用化合物を含む回腸の胆汁酸輸送体抑制剤を意味する。
【００３３】
ここで使用される用語‘‘多剤耐性遺伝子’’又はそのあらゆる略語は、以下の遺伝子、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ−１）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＢ２（ＴＡＰ）、ＡＢＣＢ３（ＴＡＰ）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）及びＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３）の１つ以上を言及する。
【００３４】
ここで使用される用語‘‘プロドラッグ’’は、薬剤前駆物質である化合物であって、患者への投与後、何らかの化学的又は生理学的なプロセス（例えば、生理学的なｐＨががもたらされるか、又は酵素反応によって、プロドラッグが目的とする薬剤形態へ変換される。）を介して体内で薬剤が放出される化合物を言及する。
【００３５】
ここで使用される用語‘‘溶媒和物’’は、溶媒の分子又はイオンと溶質（例えば、式ａ）ないしｆ）の化合物又は化合物ａ）ないしｆ）のプロドラッグ。）からなる分子複合体又はイオン複合体を言及する。限定されない有用な溶媒の例は、水及び／又はアルコール（例えばメタノール）等の極性、プロトン性溶媒を含む。
【００３６】
ここで使用される用語‘‘ステロール’’は、限定無く全てのステロール、例えば、（あらゆる供給源からのあらゆる形態（α、β及びγ）の）シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール（ジヒドロブラシカステロールを含む）、デスモステロール、カリノステロール（ｃｈａｌｉｎｏｓｔｅｒｏｌ）、ポリフェラステロール（ｐｏｒｉｆｅｒａｓｔｅｒｏｌ）、クリオナステロール（ｃｌｉｏｎａｓｔｅｒｏｌ）、エルゴステロール、コプロステロール、コジステロール（ｃｏｄｉｓｔｅｒｏｌ）、イソフコステロール（ｉｓｏｆｕｃｏｓｔｅｒｏｌ）、フコステロール（ｆｕｃｏｓｔｅｒｏｌ）、クレロステロール（ｃｌｅｒｏｓｔｅｒｏｌ）、ナービステロール（ｎｅｒｖｉｓｔｅｒｏｌ）、ラトステロール（ｌａｔｈｏｓｔｅｒｏｌ）、ステラステロール（ｓｔｅｌｌａｓｔｅｒｏｌ）、スピナステロール、コンドリラステロール（ｃｈｏｎｄｒｉｌｌａｓｔｅｒｏｌ）、ぺポステロール（ｐｅｐｏｓｔｅｒｏｌ）、アヴェナステロール（ａｖｅｎａｓｔｅｒｏｌ）、イソアヴェナステロール（ｉｓｏａｖｅｎａｓｔｅｒｏｌ）、フェコステロール（ｆｅｃｏｓｔｅｒｏｌ）、ポリナスタステロール、コレステロール及びそれらの全ての天然又は合成形態及びその誘導体（異性体を含む）を含む。
【００３７】
用語‘‘スタノール’’は、例えば、（あらゆる供給源からのあらゆる形態（α、β及びγ）の）全ての天然又は合成形態及びそれらの誘導体及び異性体を含む飽和又は水素化ステロール、例えばシトスタノール、カンペスタノール、スチグマスタノール、ブラシカスタノール（ジヒドロブラシカスタノールを含む）、デスモスタノール、カリノスタノール（ｃｈａｌｉｎｏｓｔａｎｏｌ）、ポリフェラスタノール（ｐｏｒｉｆｅｒａｓｔａｎｏｌ）、クリオナスタノール（ｃｌｉｏｎａｓｔａｎｏｌ）、エルゴスタノール、コプロスタノール、コジスタノール（ｃｏｄｉｓｔａｎｏｌ）、イソフコスタノール（ｉｓｏｆｕｃｏｓｔａｎｏｌ）、フコスタノール（ｆｕｃｏｓｔａｎｏｌ）、クレロスタノール（ｃｌｅｒｏｓｔａｎｏｌ）、ナービスタノール（ｎｅｒｖｉｓｔａｎｏｌ）、ラトスタノール（ｌａｔｈｏｓｔａｎｏｌ）、ステラスタノール（ｓｔｅｌｌａｓｔａｎｏｌ）、スピナスタノール、コンドリラスタノール（ｃｈｏｎｄｒｉｌｌａｓｔａｎｏｌ）、ぺポスタノール（ｐｅｐｏｓｔａｎｏｌ）、アヴェナスタノール（ａｖｅｎａｓｔａｎｏｌ）、イソアヴェナスタノール（ｉｓｏａｖｅｎａｓｔａｎｏｌ）、フェコスタノール（ｆｅｃｏｓｔａｎｏｌ）及びポリナスタスタノールを言及する。
【００３８】
ステロール及びスタノールの変性、すなわち、側鎖を組み込むこともまた本発明の範囲に含まれると理解される。明細書全体に渡って判別がつかず、そして特に規定がなければ、用語‘‘ステロール’’はステロール及びスタノールの双方を包含する。用語‘‘フィトステロール’’及び‘‘フィトスタノール’’もまた使用され得、それぞれ植物由来のステロール又はスタノールを言及する。
【００３９】
本発明による誘導体の形成に使用するステロール及びスタノールは、様々な天然源から入手され得、あるいは、それらは人工的に合成され得る。例えば、それらは、コーン油及び他の植物油、小麦胚種油、大豆抽出、米抽出、米ぬか、菜種油、ひまわり油、ごま油等の植物油（水生植物を含む）並びに魚（及び他の海洋原料）油の加工から得られ得る。それらはまた、酵母やエルゴステロール等の菌類に由来し得る。したがって、本発明は、特定のステロール源に限定されない。米国特許第４，４２０，４２７号明細書は、メタノール等の溶媒を用いた植物油汚泥からのステロール製造法を教示する。また、フィトステロール及びフィトスタノールは、参照としてここに組み込まれる、米国特許第５，７７０，
７４９号明細書に記載されたように林業業務の副生産物であるトール油ピッチ又は石鹸から得られ得る。トール油ピッチからステロール及びスタノールを抽出するさらなる方法は、１９９８年２月２０日に出願されたカナダ国特許出願第２，２３０，３７３号明細書（１９９９年２月１９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＣＡ９９／００１５０号に対応）、及び、２００２年１月２８日に出願された米国特許出願第１０／０６０，０２２号明細書に記載され、それらの内容の全てが参照としてここに組み込まれる。
【００４０】
従って、遊離ステロール及びスタノール、脂肪酸又は芳香族酸とのエステル化ステロール及びスタノール（その結果、それぞれ脂肪酸エステル又は芳香族酸エステルを形成する）、フェノール酸エステル、ケイ皮酸エステル、フェルラ酸エステル、フィトステロール及びフィトスタノールグリコシド及びアシル化グリコシド又はアシルグリコシドを含むがこれに限定されない、最大限に可能な定義が、本明細書において用語‘‘ステロール’’及び‘‘スタノール’’に与えられると理解される。それ故、用語‘‘ステロール’’及び‘‘スタノール’’は、あらゆる類似体を包含し、それらは、多くの天然ステロールのように環状ユニット中の５位に二重結合をさらに有し得、又は環の他の位置（例えば６，７，８（９），８（１４），１４  ５／７など）に１つ以上の二重結合を有し得、又はスタノールのように環状ユニット中に二重結合を有さなくても良い。さらに、例えばα1−シトステロールのように更なるメチル基が存在し得る。
【００４１】
ステロールは、多くの重要な細胞機能を果たす天然由来の化合物である。植物中のカンペステロール、スチグマステロール及びβ−シトステロール、菌類中のエルゴステロール、並びに動物中のコレステロール等のステロール類はそれぞれ、各々の細胞タイプにおいて細胞膜及び細胞内膜の各主要成分である。フィトステロールは、特に、ヒトを含む多くの哺乳類種に供給した場合、血清コレステロール値を下げる能力によって、多くの注目を集めている。
【００４２】
所望により、本発明の化合物は、天然由来の又は人工的に合成されたβ−シトステロール、カンペスタノール、シトスタノール及びカンペステロールから形成され、このようにして形成されたこれら化合物の各々は、その後、様々な比率における配送の前に、医薬組成物中に混合される。最も好ましい形態において、本発明の化合物は、２つの主成分、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート（‘‘ＤＡＣＰ’’）及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェート（‘‘ＤＡＳＰ’’）からなる１つ以上の二ナトリウムアスコルビルフィトスタニルホスフェート（ここでは、‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’として言及される。）間に化学結合を含む。
【００４３】
本発明の範囲内において、‘‘コレステロール吸収抑制剤’’は、どのような機構によっても、コレステロール輸送、取り込み又は吸収に対して悪影響を有するあらゆる化合物を言及し、胆汁酸の再吸収又は輸送を抑制するあらゆる化合物を含む。
【００４４】
好ましくは、コレステロール吸収抑制剤は、ここに記載されたステロール、スタノール又はそれらの混合物又はそれらの誘導体を１つ以上含む。上記の一般性を制限することなく、これは、すべての遊離ステロール及びスタノール、及び全てのステロール及びスタノールの脂肪族エステル及び芳香族エステル、ステロール及びスタノールのフェノール酸エステル、ステロール及びスタノールのケイ皮酸エステル、ステロール及びスタノールのフェルラ酸エステル、ステロール及びスタノールのグリコシド、ステロール及びスタノールのアシル化グリコシド又はアシルグリコシドを含む。
【００４５】
最も好ましい形態において、コレステロール吸収抑制剤は、ステロール又はスタノール（その生物学的に許容可能な塩を含む。）を含む１種以上の誘導体又は化合物であって、１つ以上の以下の式
【化１】
2007524651.tif 000002
（式中、Ｒは、ステロール又はスタノール部分を表わし、Ｒ4は、アスコルビン酸から誘導され、かつｎ＝１−５。）を有する誘導体又は化合物（その全ての生物学的に許容可能な塩又は溶媒和物、又は少なくとも１種の該化合物の又はその塩の又はその溶媒和物のプロドラッグを含む。）である。
【００４６】
好ましくは、コレステロール吸収抑制剤は、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェートの混合物からなる二ナトリウムアスコルビルスタニルホスフェート組成物である。
【００４７】
式ｉ）ないしｉｖ）の化合物は、例えば、以下の方法及び国際出願ＰＣＴ／ＣＡ００／００７３０号（２０００年６月２０日出願、米国特許出願第０９／３３９，９０３号（１９９９年６月２３日出願）による優先権を主張）に記載されているような既知の方法にて製造され得、その全ての内容が参照としてここに組み込まれる。
【００４８】
一般に、式ｉ）ないしｉｖ）の化合物は以下のように製造され得る。選択されたステロール又はスタノール（又はそれらのハロホスフェート、ハロカーボネート又はハロ−オキサレート誘導体）及びアスコルビン酸を、‘‘酸’’部分と‘‘アルコール’’（ステロール）との縮合ができる反応条件下で一緒に混合する。こうした条件は、酸成分及びアルコール成分が直接、又は、鉱酸、硫酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の適切な酸触媒の存在下で反応することができる、フィッシャーエステル化プロセス等の他の一般的なエステル化反応で用いられるものと同様である。前記エステル化反応に一般に用いられる有機溶媒は、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等のエーテル、又はベンゼン、トルエン又は類似の芳香族系溶媒であり、反応を起こす反応物質の反応性によって温度は室温から高温まで様々であり得る。
【００４９】
好ましい態様において、エステルを形成するプロセスは、エステル（例えば酢酸エステルなど）又はエーテル（例えばメチエルエーテル）としてアスコルビン酸又はそれらの誘導体の水酸基を‘‘保護すること’’、そしてそれから保護されたアスコルビン酸を、適切な反応条件下で、ステロール／スタノール  ハロホスフェート、ハロカーボネート又はハロ−オキサレートと縮合させることを含む。一般に、前記縮合反応はジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、又はベンゼン、トルエン又は類似の芳香族系溶媒等の有機溶媒中
で行われる。反応物質の種類及び反応性に応じて、反応温度は低温（−１５度）から高温まで様々であり得る。
【００５０】
より詳細には、下記事項が式ｉ）ないしｉｖ）、とりわけ式ｉ）の化合物を製造する１つの好ましい方法である：最初に、５，６−イソプロピリデン−アスコルビン酸の形成によってアスコルビン酸を分解から保護する。これは、アセトンをアスコルビン酸並びに硫酸又は塩酸等の酸性触媒と適切な反応条件下で混合することによって達成され得る。フィトスタノールクロロホスフェートは、トルエン及びピリジン（とはいえ例えば脂肪族又は芳香族アミン等の他の窒素塩基を代わりに使用し得る）中でフィトスタノール溶液を形成すること、そしてこの溶液をオキシ塩化リン等のリン誘導体で処理することによって、製造される。母液の濾過及び濃縮後に形成された残留物がフィトスタノールクロロホスフェートである。後者は次に５，６−イソプロピリデン−アスコルビン酸と混合され、エタノール等の適切なアルコールとＨＣｌを加えた後、濃縮される。あるいは、ピリジン／ＴＨＦが加えられ得、生成物を濃縮する。最終洗浄及び乾燥の後、得られた新規生成物がスタノール−ホスフェート−アルコルベートである。
【００５１】
式ｉ）ないしｉｖ）の化合物を製造するプロセスの他の好ましい形態は、アスコルビン酸が、５，６−イソプロピリデン−アスコルビン酸としてではなく、エステル（例えばアセテート、ホスフェート等の）として水酸基位置において保護される。後者は、次に上述の通り誘導体化されたステロール又はスタノールと既知のエステル化手法を用いて縮合され得、最終的に前記化合物が生成する。アスコルビン酸のモノホスフェート及びジホスフェートの形成は文献に完全に記載されている。例えば、参照としてここに組み込まれる、米国特許第４，９３９，１２８号明細書（カトウら）、はアスコルビン酸のリン酸エステルの形成を教示する。同様に、参照としてここに組み込まれる、米国特許第４，９９９，４３７号明細書（ドブラーら）、はアスコルビン酸  ２−ホスフェートの製造法を記載する。ドブラーらにおいて、第三アミンの存在下におけるアスコルビン酸又はアスコルビン酸誘導体のＰＯＣｌ３でのリン酸化のコア反応（独国特許出願公開第２，７１９，３０３号明細書に開示）は、反応溶液にマグネシウム化合物、好ましくはマグネシウム化合物水溶液を加えることによって改善される。いずれの既知のアスコルビン酸誘導体も使用され得る。
【００５２】
より詳細には、下記事項が、式ｉ）ないしｉｖ）、とりわけ式ｉｉ）の化合物を製造する別の好ましい方法である：‘‘保護された’’アスコルビン酸を準備し、上記に詳細に説明されたものと同様のプロセスが続く；しかしながら、オキシ塩化リンが塩化オキサリルに置き換わることによって、スタノール−オキサレート−アスコルベートが生じる。
【００５３】
好ましい形態において、本発明のコレステロール吸収抑制剤は、２つの主成分、二ナトリウムアスコルビルカンペスタニルホスフェート（‘‘ＤＡＣＰ’’）及び二ナトリウムアスコルビルシトスタニルホスフェート（‘‘ＤＡＳＰ’’）からなる１つ以上の二ナトリウムアスコルビルフィトスタニルホスフェート（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’として言及される。）を含む。
【００５４】
さもなければ、本発明の他の好ましい形態において、コレステロール吸収抑制剤は、ヒドロキシ置換アゼチジノンのファミリー由来の化合物を含む。もっとも好ましくは、該アゼチジノンは、式
【化２】
2007524651.tif 000003
（式中、
Ａｒ1及びＡｒ2は、独立して、アリール基及びＲ4−置換アリール基からなる群から選択され；
Ａｒ3は、アリール基又はＲ5−置換アリール基を表わし；
Ｘ、Ｙ及びＺは、独立して、−ＣＨ2−、−ＣＨ（低級アルキル）−及び−Ｃ（ジ低級アルキル）−からなる群から選択され；
Ｒ及びＲ2は、独立して、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9及び−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7からなる群から選択され；
Ｒ1及びＲ3は、独立して、水素原子、低級アルキル基及びアリール基からなる群から選択され；
少なくとも１つのｑ及びｒが１を表わし、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計は、２、３、４、５又は６であるという条件及びｐが０を表わし、かつｒが１を表わす場合、ｍ、ｑ及びｎの合計は、１、２、３、４又は５であるという条件で、ｑは、０又は１を表わし；ｒは、０又は１を表わし；ｍ、ｎ及びｐは、独立して、０、１、２、３又は４を表わし；
Ｒ4は、低級アルキル基、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6、−ＣＦ3、−ＣＮ、−ＮＯ2及びハロゲン原子からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ5は、−ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）Ｒ6、−Ｏ（ＣＯ）ＯＲ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-5ＯＲ6、−Ｏ（ＣＯ）ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）Ｒ7、−ＮＲ6（ＣＯ）ＯＲ9、−ＮＲ6（ＣＯ）ＮＲ7Ｒ8、−ＮＲ6ＳＯ2Ｒ9、−ＣＯＯＲ6、−ＣＯＮＲ6Ｒ7、−ＣＯＲ6、−ＳＯ2ＮＲ6Ｒ7、Ｓ（Ｏ）0-2Ｒ9、−Ｏ（ＣＨ2）1-10−ＣＯＯＲ6、−Ｏ（ＣＨ2）1-10ＣＯＮＲ6Ｒ7、−（低級アルキレン）ＣＯＯＲ6及び−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＯＯＲ6からなる群から独立して選択される１ないし５つの置換基を表わし；
Ｒ6、Ｒ7及びＲ8は、独立して、水素原子、低級アルキル基、アリール基及びアリール置換低級アルキル基からなる群から選択され；
Ｒ9は、低級アルキル基、アリール基又はアリール置換低級アルキル基を表わす。）で表わされるヒドロキシ置換アゼチジノン化合物、又はその生物学的に許容可能な塩である。
【００５５】
より好ましくは、式Ｖで表わされる化合物において、Ａｒ1はフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、Ａｒ2はフェニル基又はＲ4−置換フェニル基を表わし、かつＡｒ3はＲ5−置換フェニル基を表わす。
【００５６】
式Ｖの他の態様において、Ａｒ1はＲ4−置換フェニル基（ここで、Ｒ4はハロゲン原子を表わす。）を表わし、Ａｒ2はＲ4−置換フェニル基［ここで、Ｒ4はハロゲン原子又は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わし、かつＡｒ3はＲ5−置換フェニル基［ここで、Ｒ5は−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は低級アルキ
ル基又は水素原子を表わす。）を表わす。］を表わす。
【００５７】
式Ｖの他の態様において、化合物におけるＸ、Ｙ及びＺは、それぞれ、−ＣＨ2−を表わし、Ｒ1及びＲ3は、それぞれ、水素原子を表わし、Ｒ及びＲ2は、それぞれ、−ＯＲ6（ここで、Ｒ6は、水素原子を表わす。）を表わし、かつｍ、ｎ、ｐ、ｑ及びｒの合計は２、３又は４である。
【００５８】
式Ｖの他の態様において、化合物におけるｍ、ｎ及びｒは、それぞれ、０を表わし、ｑは１を表わし、かつｐは２を表わす。
【００５９】
式Ｖの他の態様において、化合物におけるｐ、ｑ及びｎは、それぞれ、０を表わし、ｒが１は表わし、かつｍは２又は３を表わす。
【００６０】
式Ｖの好ましい態様において、該化合物は、
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｒ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（２（Ｒ）−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｓ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｓ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（３Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［（Ｒ）−ヒドロキシ−（２−ナフタレニル）メチル］−４（Ｓ）−（４−メトキシフェニル）−１−フェニル−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（ＲＳ）−ヒドロキシ−３−［４−（メトキシメトキシ）−フェニル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−３（Ｒ）−（３（Ｓ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−１−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
１−（４−フルオロフェニル）−３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（４−フルオロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−４（Ｓ）−［４−（フェニルメトキシ）フェニル］−２−ア
ゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−フェニルプロピル］−１，４（Ｓ）−ビス−（４−メトキシフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−フルオロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−フルオロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｒ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；
３（Ｒ）−［３（Ｓ）−（アセチルオキシ）−３−（４−クロロフェニル）プロピル］−４（Ｓ）−［４−（アセチルオキシ）フェニル］−１−（４−クロロフェニル）−２−アゼチジノン；及び、
１−（４−フルオロフェニル）−４（Ｓ）−（４−ヒドロキシフェニル）−３（１Ｒ）−（１（Ｒ）−ヒドロキシ−３−フェニルプロピル）−２−アゼチジノンからなる群から選択される。
【００６１】
このようなヒドロキシ置換アゼチジノンは、シェーリング  コーポレーションによる米国特許第５，８４６，９６６号明細書及び米国特許第５，７６７，１１５号明細書に記載及び特許請求され、それらの内容の全てがここに参照として組み込まれる。特に、‘‘エゼチミベ（Ｅｚｅｔｉｍｉｂｅ）’’として言及され、かつゼティア（登録商標：Ｚｅｔｉａ）の登録商標名下でシェーリング  コーポレーションから販売されている２−アゼチジノン誘導抑制剤がここでの使用に好ましい。
【００６２】
他の態様において、本発明の範囲内のコレステロール吸収抑制剤は、胆汁酸輸送又は胆汁酸再吸収の抑制剤であり得り、回腸輸送抑制剤、アピカル輸送抑制剤及び肝輸送抑制剤を含むが、これらに制限されない。
【００６３】
腸管の内腔からの胆汁酸の再循環と血清コレステロールの減少との因果関係が発見されており、回腸胆汁酸輸送抑制剤‘‘ＩＢＡＴｓ’’は、現在、コレステロールの低下及びアテローム性動脈硬化症の治療におけるそれらの役割のため、広く研究されている。ステドロンスキー37は、胆汁酸及びコレステロールを取り囲む生化学、生理学及び既知の活性剤を議論している。
【００６４】
本発明において有用ないくつかのＩＢＡＴ抑制剤は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０８６３号に開示され、その内容はここに参照として組み込まれる。より多くのＩＢＡＴ抑制剤は、ここに参照として組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０４０７６号に開示されている。また、本発明において有用な更なるＩＢＡＴ抑制剤は、ここに参照として組み込まれる米国特許出願第０８／８１６，０６５号に記載されている。本発明において有用なより多くのＩＢＡＴ抑制剤化合物は、ここに参照として組み込まれる国際公開第９８／４０３７５号パンフレットに記載されている。本発明において有用な多くの更なるＩＢＡＴ抑制剤化合物は、米国特許第５，９９４，３９１号明細書に記載されており、これもまた、ここに参照として組み込まれる。
【００６５】
更なるＩＢＡＴは、胆汁酸輸送抑制化合物を開示する様々なヘキスト  アクチエンゲゼルシャフトの特許出願によって開示され、以下に、それぞれ別々に列挙される：
Ｈ１．カナダ国特許出願第２，０２５，２９４号明細書。
Ｈ２．カナダ国特許出願第２，０７８，５８８号明細書。
Ｈ３．カナダ国特許出願第２，０８５，７８２号明細書。
Ｈ４．カナダ国特許出願第２，０８５，８３０号明細書。
Ｈ５．欧州特許第０３７９１６１号明細書。
Ｈ６．欧州特許第０５４９９６７号明細書。
Ｈ７．欧州特許第０５５９０６４号明細書。
Ｈ８．欧州特許第０５６３７３１号明細書。
【００６６】
本発明の範囲内において、他の胆汁酸輸送抑制剤は、国際公開第９３／３２１１４６号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０４０７６号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１０８６３号、欧州特許第５０８４２５号明細書、フランス国特許第２６６１６７６号明細書、国際公開第９９／３５１３５号パンフレット、国際公開第９２／１８４６２号パンフレット及び米国特許第５，９９４，３９１号明細書（リーら）に開示されたもの等の選択されたベンゾチエピンを含む。
【００６７】
ザ  ウェルカム  ファンデーション  リミテッド社による国際公開第９２／１６０５５号パンフレットは、多くの適当なベンゾチアゼピン化合物を記載している。更なる脂質低下薬としてのベンゾチアゼピン化合物（特に、２，３，４，５−テトラヒドロベンゾ−１−チ−４−アゼピン化合物）は、国際公開第９６／０５１８８号パンフレット及び国際公開第９６／１６０５１号パンフレットに開示されている。
【００６８】
更なるＩＢＡＴ抑制剤化合物は、Ｔ．イチハシらによってＪ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８４（１），４３−５０（１９９８）に記載されたナフタレン化合物類を含む。この場合、Ｓ−８９２１（メチル１−（３，４−ジメトキシフェニル）−３−（３−エチルバレリル）−４−ヒドロキシ−６，７，８−トリメトキシ−２−ナフトエート）が特に有用である。Ｓ−８９２１の構造は、該出版物の式Ｂ−２０で示される。更なるナフタレン化合物又はリグニン誘導体は、国際公開第９４／２４０８７号パンフレットに記載されている。
【００６９】
他のＩＢＡＴは、例えば、ファーマシア  コーポレーション、イル  アンド  モンサント、ＭＯによって開発されたＳＣ−６３５、グラキソ  スミスクラインによって開発された２６４Ｗ９４、シオンギによって開発されたＳ−８９２１及び（３Ｒ，５Ｒ）−３−ブチル−３−エチル−２，３，４，５−テトラヒドロ−７，８−ジメトキシ−５−フェニル−１−４−ベンゾチアゼピン１，１−ジオキシドを含む。
【００７０】
他の態様において、本発明の範囲内のコレステロール吸収抑制剤は、アンドロスタン及び／又はアンドロステン誘導体［ここで、アンドロスタン及び／又はアンドロステンは、アスコルビン酸と結合しており、及び１つ以上の一般式
【化３】
2007524651.tif 000004
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6は、個々に、水素原子、ＯＨ、カルボニル基及びアスコルビル部分から選択され得り、Ｒ7は、水素原子又はいずれかのハロゲン原子を表わし得る。）で表わされる。］であり得る。
【００７１】
最も好ましくは、アンドロスタン又はアンドロステン群からの化合物と結合されるアスコルビル部分は、１つ以上の以下の構造
【化４】
2007524651.tif 000005
【化５】
2007524651.tif 000006
【化６】
2007524651.tif 000007
【化７】
2007524651.tif 000008
【化８】
2007524651.tif 000009
（式中、Ｍ＋は、いずれかの金属、アルカリ土類金属又はアルカリ金属を表わす。）から個々に選択される。
【００７２】
式ｉｘ）ないしｘｘ）で表わされるアスコルビル結合を１つ以上組み込まれた式ｖｉ）ないしｖｉｉｉ）で表わされるアンドロスタン／アンドロステン化合物は、既知の方法、例えば、その内容が参照としてここに組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＣＡ０３／００８２４号に記載された方法によって製造され得るか、又は式ｉ）ないしｉｖ）で表わされる化合物の製造のための上記方法を修正した方法によって製造され得る。
【００７３】
塩類
ここで使用される用語‘‘生物学的に許容可能な塩’’は、本明細書に説明された化合物の所望の生物学的及び／又は生理学的活性を保有し、わずかな好ましくない毒性効果しか示さない、あらゆる塩を言及する。従って、ここの全ての化合物への参照は、無機及び／又は有機酸及び塩基と共に形成されたそれらの各々の酸性及び／又は塩基性塩への参照を含む。
【００７４】
典型的な酸付加塩としてはアセテート（酢酸又はトリハロ酢酸、例えば、トリフルオロ酢酸と形成されたものなど）、アジペート、アルギネート、アスコルベート、アスパルテート、ベンゾエート、ベンゼンスルホネート、ビスルフェート、ボレート、ブチレート、シトレート、カンホレート、カンファースルホネート、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ドデシルスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ヒドロクロリドシロブロミド、ヒドロアイオダイド、２−ヒドロエタンスルホネート、ラクテート、マレート、メタンスルホネート、２−ナフタレンスルホネート、ニコチネート、ニトレート、オキサレート、ペクチネート、パースルホネート、３−フェニルプロピロネート、ホ
スフェート、ピクレート、ピバレート、プロピオネート、サリチレート、スクシネート、スルフェート、スルホネート、タートレート、チオシアネート、トルエンスルホネート、ウンデカノエート等を含む。
【００７５】
酸部分を含むこれら化合物は、様々な有機塩基及び無機塩基と塩を形成し得る。
【００７６】
従って、本発明は、例えば、選択されたステロール及び／又はスタノールを含む親化合物を包含するだけでなく、可能であれば（すなわち、親化合物が遊離水酸基を含めば）、本発明は開示された化合物の生物学的に許容可能な金属、アルカリ土類金属又はアルカリ金属塩をも包含する。
【００７７】
ここに記載される塩類は、対応する親化合物よりはるかに水溶性であり、それ故、生体外及び生体内の双方におけるそれらの有効性及び評価を高められ得る。
【００７８】
本発明の化合物の塩形成は、例えば、一連の塩基（例えばナトリウムメトキシド又は他の金属アルコキシドなど）で遊離ＯＨ基を含むいずれかの親化合物を処置することによって容易に実行可能であり、対応するアルカリ金属塩が生成する。カルシウム、マグネシウム、マンガン、銅、亜鉛等の他の金属塩は、親化合物を適切な金属アルコキシドと反応させることによって生成され得る。
【００７９】
これら誘導体の形成に関して、選択された合成プロセスが説明されてはいるが、開示及び特許請求された各種誘導体を製造し得る多くの他の手法が存在することが理解される。ひとたび特定の誘導体が選択されれば、当技術分野で一般に利用可能な技術を用いて合成を行うことは、十分に当化学分野における当業者の活動範囲内にある。このため、特許請求されたありとあらゆる誘導体の合成一式は説明されない。
【００８０】
本明細書に説明される化合物及びそれらの塩がそれらの互変異性型で存在し得る場合、全ての前記互変異性型が本明細書中の本発明の一部として考えられる。
【００８１】
鏡像異性形態（非対称の炭素原子の不在下でも存在し得る）及びジアステレオマー形態を含む、様々な構成要素における非対称の炭素原子によって存在し得る立体異性体等の、本発明の化合物の全ての立体異性体が、本発明の範囲内に考えられる。本発明の化合物の個々の立体異性体は、例えば、ラセミ化合物として混合され得、又は他の全ての若しくは他の選択された立体異性体と混合され得る。化合物のキラル中心は、ＩＵＰＡＣ１９７４勧告によって定義されたＳ配置又はＲ配置を有する。該立体異性体は、慣用の技術を使用して、鏡像異性形態の出発材料を反応させることによって、又は本発明の化合物の異性体を分離することによって製造され得る。ジアステレオマー形態の又は鏡像異性形態の生成物が製造される場合、それらは、慣用の方法、例えば、クロマトグラフィー結晶化又は分別結晶化によって分離され得る。
【００８２】
異性体は、幾何異性体、例えば、二重結合をはさんでシス−異性体又はトランス異性体を含み得る。該異性体の全ては、本発明における有用な化合物の中にあると考慮される。
【００８３】
本発明において有用な化合物はまた、互変異性体も含む。
【００８４】
本発明は、以下の多剤耐性遺伝子、ＡＢＣＢ１（ＭＤＲ−１）、ＡＢＣＡ２（ＡＢＣ２）、ＡＢＣＢ２（ＴＡＰ）、ＡＢＣＢ３（ＴＡＰ）、ＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）、ＡＢＣＣ３（ＭＲＰ−３）の発現の抑制を十分に補う一方、ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤が、その遺伝子産物としてＰ−糖タンパク質を有するＭＤＲ−１（ＡＢＣＢ１）の発現の抑制において、特に有用であることを発見した。更に、ここに記載されたコレス
テロール吸収抑制剤がＭＤＲ−１遺伝子によって発現されるＰ−糖タンパク質の産生の抑制において、特に有用であることを発見した。
【００８５】
使用方法
本発明の１つの観点に従って、動物細胞における多剤耐性遺伝子の発現を抑制する方法であって、該方法は、動物に少なくとも１種のここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法が提供される。
【００８６】
本発明の他の観点に従って、癌治療における使用のための組成物であって、少なくとも１種の化学療法薬及び少なくとも１種のここに記載されたコレステロール吸収抑制剤を含む組成物が提供される。
【００８７】
本発明の更なる他の観点に従って、癌を有する動物における化学療法薬の有効性を高めるための方法であって、前記動物に化学療法薬、及び少なくとも１種のここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法が提供される。
【００８８】
本発明の更なる他の観点に従って、動物細胞によって示される多剤耐性表現型を逆転させるための方法であって、前記細胞を少なくとも１種のここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の有効量に曝露することからなる方法が提供される。
【００８９】
本発明の更なる他の観点に従って、動物細胞における多剤耐性遺伝子によって発現されるタンパク質の産生を抑制する方法であって、動物に少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤の有効量を投与することからなる方法が提供される。
【００９０】
本発明の更なる観点に従って、少なくとも２種の別の成分
ａ）少なくとも１種のここに記載されたコレステロール吸収抑制剤を含む組成物、及び
ｂ）少なくとも１種の化学療法薬を含む組成物
を、各組成物の投与を説明する使用説明書と共に含むキットが提供される。
【００９１】
本発明の方法、組成物及びキットは、一般に、乳癌、前立腺癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、腸癌、結腸癌、肺癌、脳腫瘍、副腎皮質癌、骨髄癌、胚幹細胞癌、実質細胞癌、上皮癌、リンパ種の癌（悪性リンパ腫及び非悪性リンパ腫を含む。）、骨癌、精巣癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、口腔癌及び皮膚癌を含むが、これらに制限されない癌の治療における使用において適当である。
【００９２】
患者が、以前に、化学療法薬（１種以上の抗癌剤の組み合わせ）で治療したことがない場合でさえも、診断において、しばしば、高レベルのＰ−糖タンパク質を示すこれらの癌の治療において、著しい成功が得られ得るかもしれない。このような癌は、結腸癌、腎臓癌、乳癌、副腎皮質癌及び肝臓癌を含むが、これらに制限されない。
【００９３】
本発明の方法、組成物及びキットは、いかなる特定の癌の化学療法薬又は化学療法薬の組み合わせに制限されることを意図しない。しかしながら、好ましい化学療法薬は、アドリマイシン（ドキソルビシン）、ホスフェート、コルセミド、エトポシド、パクリタクセル、ビサンテン（ｂｉｓａｎｔｅｎ）、ビンクリスチン及びビンブラスチン等の疎水性で複素環式の癌の化学療法薬全てを含むが、これらに制限されない。
【００９４】
本発明の組成物は、コレステロール吸収抑制剤と選択された化学療法薬が、例えば、固定比率の有効成分を有する単一錠剤又はカプセルなどにて、実質的に同時の方法で共投与されるか、又は、各部分毎に複数分離投与される、‘‘併用療法’’を可能にする。この分離投与は連続投与形態を含む。
【００９５】
より明確には、この‘‘併用投与’’は、固定比率の有効成分を有する単一の投与形態又は各治療薬毎の複数の分離投与形態のような実質的に同時の方法におけるこれらの治療薬の共投与を含む。更に、このような投与はまた、連続方法における各種薬剤の使用も含む。いずれにしても、治療処方計画は、ここにまとめられた１つ以上の治療目的の達成において、薬剤の併用により有益な効果を提供し得る。
【００９６】
従って、本発明は、１つ以上の以下の治療目的を達成する様々な手段を提供する：
ａ）癌を治療又は軽減すること、
ｂ）腫瘍の成長を予防、治療又は軽減させること、
ｃ）１つ以上の多剤耐性遺伝子の発現を抑制又は減少させること、
ｄ）多剤耐性遺伝子によって発現された１つ以上のタンパク質の産生を抑制又は減少させること、
ｅ）癌治療における化学療法薬の有効性を高めること、及び、
ｆ）１つ以上の化学療法薬に対して細胞を感受性にすること。
該手段は、動物又は該動物から誘導された細胞又は該動物内の細胞に、ここに記載された少なくとも１種のコレステロール吸収抑制剤及び少なくとも１種の癌の化学療法薬の非毒性の治療有効量を投与することからなる。本発明は、更に、ここに記載されたあらゆる適応のための、より特には上記で定義された１つ以上の治療目的の達成における使用のための、開示されたあらゆる化合物及び組成物の使用を含む。
【００９７】
特に、及びより明確には、コレステロール吸収抑制剤と化学療法薬の共投与（しかし、同時又は連続である必要はない。）が、効果的に、多剤耐性遺伝子の発現を抑制し、それにより、その特定のタンパク質、例えば、Ｐ−糖タンパク質の産生を減少させることが発見された。このような減少は、動物細胞からの癌の化学療法薬の流出を防止し、それらの効果を最大化する。
【００９８】
これまで、多剤耐性に対するコレステロール吸収抑制剤の有意義な効果の認識はなかった。該薬剤耐性を解消するためのこの分野における研究はあったが、焦点は、例えば、ＭＤＲ−１遺伝子に選択的に結合する化合物を設計することによって、Ｐ−糖タンパク質の抑制又はＭＤＲの発現のいずれかにおける他の化合物の効果を調節することにあった。決して完全ではないが、このような研究の概説を下記する。
【００９９】
国際公開第０２１３８１５号パンフレットは、それ自体は薬理活性を有さないが、腸壁中に存在するＰ−糖タンパク質を抑制することによって、他の有効成分の生物学的利用能を高めるとされる選択された化合物（ここに記載された式Ｉで表わされる。）を含む医薬組成物を開示している。他の方法ではあまり吸収されない有効成分（例えば、抗癌剤）の吸収を可能にする。
【０１００】
国際公開第０２０３４２９１号パンフレットは、ＭＤＲ−１遺伝子に結合し、選択的に、遺伝子発現を抑制する分子を開示している。これらの薬剤の配送システムは、脂質を含む非ポリマーシステムを含む。また、ＭＤＲポリペプチドをエンコードする核をＨＩＦ−１  ＳＵＭＯ−１複合遮断薬と接触させることからなるＭＤＲ遺伝子発現を抑制する方法も対象とする。
【０１０１】
国際公開第０１６０３４９号パンフレットは、ピコリン酸、フザリン酸及びそれらの誘導体を含む薬剤を開示している。フザリン酸成分は、高レベルのＰ−糖タンパク質を有する細胞の成長の調節において、効果的であることが発見された。フザリン酸が、ＭＤＲ−関連薬剤に対して耐性がある腫瘍の治療において、ある程度役割を有し得ることが示唆される。同じ発明者による国際公開第０２２０４８６号パンフレットが同様の情報を開示す
ることもまた、注目される。
【０１０２】
国際公開第００４８５７１号パンフレットは、ｎ−ベンゾイル−スタウロスポリンを含む医薬組成物及び抗腫瘍剤、抗増殖剤としてのそれらの使用を開示している。国際公開第０２２６２０８号パンフレットは、化学療法薬の配送のためのトコールベースの微粒子エマルジョンを開示している。エマルジョンは、１種以上のトコール、界面活性剤、任意の補助溶媒、及び化学療法薬を含む。
【０１０３】
米国特許第５，６３９，８８７号明細書は、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びビサントレン（ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）等の化学療法薬に対して多剤耐性細胞を再び感受性にするのに効果的な様々な二環式アミンを記載している。米国特許第５，６７０，５０７号明細書は、２つの開示された化学式から選択された長鎖アミノアルコール化合物の有効量を投与することからなる、ｍｄｒ−１の過剰発現のために疎水性の化学療法薬に対して非感受性の腫瘍において、ＭＤＲ表現型を逆転させる方法を教示している。
【０１０４】
米国特許第５，８６６，６９９号明細書は、ＭＤＲ−１遺伝子の少なくとも一部分（ここで、一部分は、ヌクレオシド結合部分をエンコードする。）を補うヌクレオチドシークエンス又はその転写物を有する合成オリゴヌクレオチドを開示している。このようなオリゴヌクレオチドを含む医薬品製剤、及びＭＤＲ癌細胞を治療する方法、細胞におけるＰ１７０の発現を防止する方法、及び癌細胞におけるＭＤＲの誘導を防止する方法もまた、開示している。
【０１０５】
米国特許第５，８７４，５６７号明細書は、細胞によって示された多剤耐性表現型の発現を抑制するために、ヒトのＭＤＲ−１遺伝子の補完的シークエンス及びその対立遺伝子多型を有するヒトの細胞において特異的にハイブリダイズするシークエンスを有する、長さが１５ないし３０のヌクレオチドからなる修飾オリゴヌクレオチドを教示している。補完的シークエンスは、（ここに記載された）ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏｓ：１０３、１０４及び１０５からなる群から選択され、該修飾は、ジチオエート、メチルホスホネート、モルホリノ、ポリアミド又はそれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択された骨格修飾を含む。
【０１０６】
米国特許第６，１６２，６１６号明細書は、異常なＭＲＰ−βの減少における使用のための組成物を開示している。ＭＲＰ−βを含む遺伝子発現、タンパク質産生及び／又はタンパク質機能。プローブ及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む核酸、ＭＲＰ−β。ポチペプチド及び抗体、ＭＲＰ−β。宿主細胞の発現、及びＭＲＰ−βのためのヒト以外のトランスジェニック又は零染色体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ）の哺乳動物。
【０１０７】
ＭＤＲの解消におけるコレステロール吸収抑制剤の使用は更なる利点がある。ここに記載された幾つかのコレステロール吸収抑制剤（式ｉ）ないしｉＶ）を有する上記された化合物）は、アスコルビル部分を含む。これらの特定の化合物は、多くの更なる利点を有する。何よりもまず、水性溶液及び油及び脂肪等の非水性媒体の両方において、該化合物の溶解性が非常に高められる。このより高い溶解性により、効果的な治療用量と共にコストを減少できる。第二に、これらの誘導体は、いくつかの加工機構において必須の熱安定性（酸化及び加水分解に対する安定性）を有する。
【０１０８】
ここに記載された所望の効果は、多くの様々な方法において達成され得る。コレステロール吸収抑制剤及び化学療法薬は、別々に又は一緒に、調合薬、即ち薬学的に許容可能な担体と併用するために利用可能ないかなる慣用な手段によっても投与され得る。医薬組成物は、約１ないし９９％の‘‘有効’’成分、好ましくは約５ないし９５％の有効成分を含み得る。
【０１０９】
製剤及び医薬組成物は、慣用の薬学的に利用可能な賦形剤及び添加剤を使用して、慣用の技術によって製造され得る。このような薬学的に許容可能な賦形剤及び添加剤は、非毒性で適合性の充填剤、結合剤、錠剤分解物質、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、滑剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤等を含む。
【０１１０】
所望の効果を達成するために必要とされるコレステロール吸収抑制剤の正確な投与量及び用量は、当然、選択される特定の化合物又は組成物、投与される化合物又は組成物の有効性、投与されるところの製剤、投与方法及び患者の年齢、体重、状態及び反応等の多くの要因に依存し得る。特に、これら要因の全てが、各個体又は患者の主治医によって考慮され得る。
【０１１１】
一般に、式ｉ）−ｖｉｉｉ）の１つを有し、かつステロール及び／又はスタノールを含むコレステロール吸収抑制剤の総１日用量は、単一投与又は複数の分割投与にて、１日当り１０ｍｇないし約２０ｇ、より好ましくは１０ｍｇないし１．５ｇ、最も好ましくは８００ｍｇまでの１日用量の範囲において投与され得る。
【０１１２】
化合物又は誘導体の遊離形態であろうと一部であろうと、選択されたコレステロール吸収抑制剤がステロール又はスタノールである場合、それは、１日当り６ｇまでのステロール及び／又はスタノールを含む形態において投与され得る。過剰量は単に正常な排出チャンネルを通過し得るため、ステロール、スタノール及びそれらの誘導体の１日用量より多くの用量での供給は、動物宿主に有害ではないと認識されるべきである。コレステロール吸収抑制剤が置換アゼチジノンである場合、それは、１日当り体重の約０．１ないし約３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．１ないし約１５ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは１０ｍｇ／ｋｇまでの１日用量で投与され得る。それ故、７０ｋｇの平均体重において、好ましくは、単一投与又は２ないし４回の分割投与にて与えられる用量レベルは、１日当り約５ｍｇないし約１０００ｍｇの薬剤である。
【０１１３】
コレステロール吸収抑制剤が、胆汁酸の再吸収を抑制するいずれかの化合物である場合、それは、個々の動物の体重１ｋｇ当り約０．００３ｍｇ−２０ｍｇの用量で投与され得る。一般に、ＩＢＡＴ抑制剤の総１日用量は、約０．０１ないし約１０００ｍｇ／日、好ましくは約０．１ないし約５０ｍｇ／日、より好ましくは約１ないし約１０ｍｇ／日の範囲であり得る。
【０１１４】
コレステロール吸収抑制剤及び化学療法薬が別々に投与される場合、投与回数及び１日当たり与えられる各成分の用量の総量は、同じである必要ない。例えば、コレステロール吸収抑制剤は、化学療法薬よりも１日当たりより多数の投与を要求することができ、及び／又はより大量の用量を要求することができる。
【０１１５】
これらのコレステロール吸収抑制剤の１日用量は、必要とするならば、単一投与又は複数投与にて個体に投与され得る。持続放出用量が使用され得る。
【０１１６】
体内投与に好適な用量における本発明の実施のために、本明細書に開示された化合物及び組成物を処方するための薬学的に許容可能な担体の使用は、本発明の範囲内である。適当な担体の選択と好適な製造の実施によって、本発明の化合物及び組成物は、とりわけ、溶液として処方されたものは、静脈注射などによって非経口の投与をなされ得る。本化合物及び組成物は当業者に既知の薬学的に許容可能な担体を用いて、経口投与に好適な製剤に容易に処方できる。前記担体は、本発明の化合物及び組成物が、治療される患者による経口摂取のために、錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として処方されることを可能にする。
【０１１７】
１つ以上の本発明の化合物を含む医薬組成物は、有効成分がそれらの本来意図した目的を達成するに効果的な量で含まれている組成物を含む。有効量の決定は、特にここに提供された詳細な開示を踏まえて、当業者の能力の十分範囲内にある。
【０１１８】
有効成分に加え、これら医薬組成物は、薬剤的に使用でき、製剤中において活性化合物の処理を促進する賦形剤及び補助剤を含む、薬剤的に許容可能な好適な担体を含み得る。経口投与用に処方された製剤は、錠剤、糖衣錠、カプセル又は溶液の形態にあり得る。
【０１１９】
好ましい形態において、コレステロール吸収抑制剤は、リポソームの形態で投与される。リポソームは、１つ以上の二重脂質層からなる中空ミクロスフェアである。それらは、まず、３０年以上前に、様々な薬剤物質のための賦形剤として使用され、そしてその後、生体外におけるそれらの挙動の知識により、特定の疾患の特異的治療法に焦点を合せたより合理的な設計が可能となった。
【０１２０】
薄い脂質膜が水和される場合、リポソームの形成が起こる。水和脂質シートは、攪拌及び自己閉鎖（ｓｅｌｆ−ｃｌｏｓｅ）中に分離し、多層状の小嚢を形成する。
【０１２１】
従来技術において、リポソームを製造するための多くの方法が知られ、広く実施されている。ドキソルビシン等の化学療法薬は、しばしば、確立した方法を使用して、リポソーム中に封入される。
【０１２２】
典型的には、直径１００ｎｍのリポソームは、様々な脂質混合物のクロロホルム溶液を高真空に曝露し、その後、結果として生じた脂質膜（ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ、ＥＰＣ／ＣＨＯＬ、ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−ＰＥ／ＣＨＯＬ）をｐＨ４の緩衝剤を用いて水和させ、凍結及び解凍手段の後、ポリカーボネートフィルターを通してそれらを押出すことによって製造される。その後、アルカリ化剤の添加により小嚢外の媒体のｐＨを７．５まで調整することによって、膜透過ｐＨ勾配が形成される。該技術は、弱塩基の能力を利用して、［薬剤］流入／［薬剤］流出＝［Ｈ+］流入／［Ｈ+］流出のｐＨ勾配を示す膜の全域を再分配する。
【０１２３】
その後、高温において、少量のアリコートで、薬剤溶液を小嚢溶液へ添加することによって、選択された薬剤は封入され、リポソーム内に蓄積される。封入効率は、ゲル濾過用カラム上でリポソームから封入薬剤を分離除去し、液体シンチレーション計測法、蛍光分光法又はＵＶ−ＶＩＳ分光法によって、脂質及び薬剤含有量のための２つの画分を定量化することによって決定される。その後、これらのリポソームは、粒度分布（準弾性光散乱、走査電子顕微鏡）、薬剤取り込み及び放出研究、安定性、及び生体内の腫瘍標的効率性を評価される。
【０１２４】
好ましくは、リポソームの製造における使用方法は、以下の実施例に記載されるが、これに制限されない。
【０１２５】
より明確には、本発明の医薬組成物は、それ自体が既知のあらゆる方法、例えば、慣用の混合方法、溶解方法、粒状化方法、糖衣錠製造方法、ゲル状化方法、乳化方法、カプセル化方法、封入方法又は凍結乾燥方法によって製造され得る。
【０１２６】
非経口投与用の医薬品製剤は、水溶性形態の活性化合物の水溶液を含む。更に、活性化合物の懸濁液は適当な油性の注射用懸濁液として製造され得る。好適な親油性溶媒又は賦形剤は、ごま油等の脂肪油、又はエチルオレート又はトリグリセリド等の合成脂肪酸エステル、又はリポソームを含む。水性の注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させるカルボ
キシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の物質を含み得る。所望により、懸濁液はまた、化合物の溶解度を増加させて高濃度溶液の製造を可能にする適当な安定剤又は薬剤を含み得る。
【０１２７】
経口用の医薬品製剤は活性化合物を固形賦形剤と組み合わせ、所望により、得られた混合物を粉砕し、適当な補助剤を加えた後、顆粒状の混合物を加工することよって得られ得、必要ならば錠剤又は糖衣錠コアを得る。好適な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、とうもろこしでんぷん、小麦でんぷん、米でんぷん、じゃがいもでんぷん、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含む。必要に応じて、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウム等のそれらの塩等の崩壊剤が添加され得る。
【０１２８】
糖衣錠コアは適当なコーティングを施される。この目的のために、濃縮砂糖溶液が使用され得、それらは所望によりアラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液、及び適当な有機溶剤又は溶剤混合物を含み得る。識別のため、又は活性化合物用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、染料又は顔料が錠剤又は糖衣錠のコーティングに添加され得る。
【０１２９】
経口使用され得る医薬品製剤は、ゼラチンで作られた押し込み型カプセル、並びに、ゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等の可塑剤で作られた密封ソフトカプセルを含む。押し込み型カプセルは、ラクトース等の充填剤、でんぷん等の結合剤、及び／又は、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の滑剤、所望による安定剤との混合物中に活性成分を含み得る。ソフトカプセルにおいて、活性化合物は脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコール等の好適な液体中に溶解又は懸濁され得る。更に、安定剤もまた添加され得る。
【０１３０】
経口液体製剤は、エマルジョン、シロップ又はエリキシル剤等の形態であり得るか、又は使用前に水又は他の適当な賦形剤とともに再構成される乾燥製品として提示される。該液体製剤は、懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、水素化食用脂；乳化剤、例えばレシチン、ソルビタンモノオレート又はアカシア；非水性賦形剤（食用油を含み得る）、例えばアーモンド油、分画ヤシ油、グリセリン、プロピレングリコール又はエチルアルコールのエステル等の油性エステル；防腐剤、例えばメチル又はプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、又はソルビン酸；及び所望により従来の香味料又は着色剤等の慣用の添加剤を含み得る。
【０１３１】
本発明は、一緒に又は別々に投与され得る活性成分の組み合わせを有する組成物に関するため、該目的のためのキットもまた提供する。キットは二つの別々のユニット：ここに記載される少なくとも一種のコレステロール吸収抑制剤を含む医薬組成物、及び、少なくとも一種の癌の化学療法薬を含む別の医薬組成物：を組み合わせることが意図される。キットは、好ましくは、別々の成分の投与のための説明書を含む。このキット型の配置は、別々の成分が異なる投与形態（例えば、経口及び非経口及び静脈注射）で投与されねばならない場合、又は、異なる投与間隔で投与される場合、又は、異なる投与量で投与される場合、特に有用である。
【０１３２】
更なる詳細な説明はなしに、前述の記載が本発明を十分に説明しているため、他者は、現在又は将来の知識を応用して、ここに説明され特許請求される様々な状況下での使用のために、本発明を適合させ得る。
【実施例】
【０１３３】
実施例１− ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’としてここで言及されるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）の形成
工程１：アスコルビン酸の保護
発煙硫酸（２４％、８．３ｇ）をアセトン（５０ｍＬ）に滴下添加した。アスコルビン酸（１２ｇ）を０℃において混合物へ導入し、反応混合物を０℃において６時間攪拌した。得られた結晶を吸引下で濾去し、濾過ケークを加圧して乾燥させ、その後、アセトン（３０ｍＬ）で洗浄した。生成物、５，６−イソプロピリデンアスコルビン酸（１４ｇ）を得た。
工程２：フィトスタノールへの結合
トルエン（５００ｍＬ）及びピリジン（２５ｍＬ）中フィトスタノール混合物（カンペステロール：３６．４％；シトスタノール：６２．３％）（２４ｇ）の溶液を、０℃においてトルエン（２００ｍＬ）中オキシ塩化リン（９ｍＬ）の混合物へ滴下添加した。混合物を室温において３時間攪拌した。ピリジン塩酸塩を濾去し、その母液を濃縮しトルエンを回収した。残渣を乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中に溶解し、乾燥ＴＨＦ（４００ｍＬ）中上記で製造した保護されたアスコルビン酸（１４ｇ）の溶液を０℃において滴下添加した。室温で１時間攪拌した。溶液を濃縮し、溶媒を除去した。エタノール（４００ｍＬ）及び３Ｎ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃まで３０分間加熱し、濃縮した。酢酸エチル（６００ｍＬ）を添加し、結果として生じた溶液を水で洗浄し（３×３００ｍＬ）、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、生成物（フィトスタノール−ホスフェート−アスコルベート）を、白色粉末として２２ｇ得た。
工程３：ナトリウム塩への転換
上記で製造した酸（１７ｇ）をエタノール（１００ｍＬ）中に溶解し、エタノール（５０ｍＬ）中ナトリウムメトキシド（２．７ｇ）の溶液を、室温における攪拌下において添加した。添加後、攪拌を３０分間続けた。結果として生じた白色ケークを濾去し、乾燥させ、計量し、白色粉末（フィトスタノール−ホスフェート−アスコルビン酸ナトリウム）を２０ｇ得た。
【０１３４】
実施例２：ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（デヒドロイソアンドロステロンの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステル）の形成
アセトン（１５０ｍＬ）及びＬ−アスコルビン酸（５０ｇ）を、０℃において乾燥丸底フラスコへ添加した。塩化アセチル（７．５ｍＬ）を、滴下漏斗を通して１０分間で滴下添加した。反応混合物を０℃において２４時間攪拌した。沈殿物を濾去し、アセトンで洗浄した（３×２０ｍＬ）。白色生成物、５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸を真空下で１．５時間乾燥させ、収率８５％で乾燥粉末（５２ｇ）を得た。
乾燥３つ口丸底フラスコに撹拌子、アルゴン注入口及び滴下漏斗を備えさせた。無水ＴＨＦ（１５ｍＬ）及びピリジン（２．４ｍＬ）中デヒドロイソアンドロステロン（１．７３ｇ、６ｍｍｏｌ）の溶液を、無水ＴＨＦ（１２ｍＬ）及びＰＯＣｌ3（０．７ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）の混合物へ０℃において１０分間にわたり滴下添加した。白色沈殿物が直ちに形成された。懸濁液を０℃において４０分間、室温において１時間４０分間撹拌した。
無水ピリジン（３ｍＬ）及びＴＨＦ（３０ｍＬ）中５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸（３．６ｇ、１６．６７ｍｍｏｌ）の溶液を上記懸濁液へ０℃において２０分間にわたり滴下添加した。懸濁液を０℃において３０分間、室温において１．５時間撹拌した。形成された塩化ピリジニウムを濾去し、ＴＨＦで２度洗浄した。溶媒を４０℃における減圧下で蒸発させ、残渣を得た。
残渣をＴＨＦ（４０ｍＬ）中に溶解し、２Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）を一度に添加した。混合物を室温において８時間攪拌した。ＴＨＦを減圧下で蒸発させた。水層を酢酸エチルで抽出した（４×５０ｍＬ）。１つにまとめた酢酸エチル溶液を塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣を得た。残渣をＣＨＣｌ3中に溶解し、その後、ヘキサンを添加し、生成物を沈殿させた。沈殿固体を濾去し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥させた（２．４３ｇ、粗生成物、収率：７７％）。ホスフェートエステルの精製を逆相Ｃ−１８クロマトグラフィー（ウォータズ社製、水／メタノール＝９０／１０ないし６０／４０）によって行った。純粋な化合物４（図１、３９ｍｇ）を粗生成物５０ｍｇから分離した。全収率（デヒドロイソアンドロステロンに基づく）は６０％であった。
デヒドロイソアンドロステロンのアスコルビルホスフェートエステル（０．５ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を、室温においてメタノール（３ｍＬ）中に溶解し、その後、メタノール中ナトリウムメトキシド（１ｍＬ、２０％）を添加した。懸濁液を室温において３０分間攪拌した。沈殿固体を濾去し、メタノール、アセトン及びヘキサンで洗浄した。母液を２ｍＬまで濃縮し、アセトンを添加し、生成物を沈殿させた。更なる白色固体が得られた。１つにまとめた固体を室温における真空下で乾燥させた。デヒドロイソアンドロステロンの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステル（０．４９ｇ、収率９１％）を得た。
【０１３５】
実施例３：ここに記載された他のコレステロール吸収抑制剤（５α−アンドロスタン−３β−オール−１７−オンの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステル）の合成
５α−アンドロスタン−３β−オール−１７−オン（１．０ｇ、３．４ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（８．６ｍＬ）及びピリジン（１．３８ｍＬ）を乾燥丸底フラスコへ添加した。透明溶液が得られるまで、混合物を室温において攪拌した。ＴＨＦ（６．９ｍＬ）及びＰＯＣｌ3（０．４ｍＬ、４．２５ｍｍｏｌ）を他の乾燥丸底フラスコへ添加し、０℃において５分間攪拌した。上記で製造した５α−アンドロスタン−３β−オール−１７−オン溶液を、アルゴン雰囲気下において１０分間にわたりこの混合物へ滴下添加した。添加後、白色懸濁液を、０℃において３５分間、室温において２時間攪拌した。反応を停止させ、白色懸濁液を、濾過なしでカップリング反応ために使用した。
５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸（２．０ｇ、９．５２ｍｍｏｌ）をピリジン（１．７１ｍＬ）及びＴＨＦ（１７ｍＬ）中に溶解した。予め製造した白色懸濁液を含む丸底フラスコを氷−水バスに浸した。上記で製造した５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸のＴＨＦ溶液を、この混合物へ０℃において１５分間にわたり攪拌下で滴下添加した。添加後、混合物を０℃において２５分間、室温において２時間攪拌した。白色固体の塩化ピリジニウムを濾去し、ＴＨＦ（８ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し、ＴＨＦ及び過剰のピリジンを除去し、残渣（２．３８ｇ）を得た。
残渣をＴＨＦ（３０ｍＬ）中に溶解し、１Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）を一度に添加した。混合物を室温において１６時間４５分攪拌した。１２Ｎ  ＨＣｌ（４ｍＬ）を室温において反応混合物へ添加した。反応混合物を室温において更に４時間４５分攪拌した。ＴＨＦを減圧下で蒸発させた。水層を酢酸エチルで抽出した（３×６０ｍＬ）。１つにまとめた酢酸エチル溶液を塩水（６０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。抽出物を約３ｍＬまで濃縮した。ヘキサン（１５ｍＬ）を添加し、生成物を沈殿させた。沈殿固体を濾去し、ヘキサンで洗浄し、減圧下で乾燥させた（１．４８ｇ）。
５α−アンドロスタン−３β−オール−１７−オンのアスコルビルホスフェートエステル（０．５ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を室温においてメタノール（３ｍＬ）中に溶解し、その後、メタノール中ナトリウムメトキシド（１．５ｍＬ、２０％）を添加した。懸濁液を室温において２５分間攪拌した。沈殿固体を濾去し、メタノール、アセトン及びヘキサンで洗浄した。母液を２ｍＬまで濃縮し、アセトンを添加し、生成物を沈殿させた。更なる生成物が得られた。１つにまとめた固体を室温における減圧下で乾燥させ、５α−アンドロスタン−３β−オール−１７−オンの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステル
（０．３８ｇ）を得た。全収率は５７％であった（５α−アンドロスタン−３β−オール−１７−オンに基づく）。
【０１３６】
実施例４：ここに記載された他のコレステロール吸収抑制剤（アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステル）の合成
３β−アセトキシアンドロスト−５−エン−１７β−オール（１．０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、無水ＴＨＦ（６．３ｍＬ）及びピリジン（０．７３ｍＬ）を乾燥丸底フラスコへ添加した。透明溶液が得られるまで、混合物を室温において攪拌した。ＴＨＦ（２ｍＬ）及びＰＯＣｌ3（０．３５ｍＬ、３．２２ｍｍｏｌ）を他の乾燥丸底フラスコへ添加し、−５〜−１０℃において５分間攪拌した。上記で製造した３β−アセトキシアンドロスト−５−エン−１７β−オール溶液を、アルゴン雰囲気下において２０分間にわたりこの混合物へ滴下添加した。添加後、白色懸濁液を、室温において１時間攪拌した。混合物を濃縮し、ＴＨＦ及び過剰なＰＯＣｌ3を除去し、残渣を得た。
５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸（０．９８ｇ、４．５５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（０．７０ｍＬ）及びＴＨＦ（６．２ｍＬ）中に溶解した。残渣を乾燥ＴＨＦ（４ｍＬ）中に溶解した。上記で製造した５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸のＴＨＦ溶液をこの混合物へ０℃において２０分間にわたり攪拌下で滴下添加した。添加後、混合物を室温において１時間２５分攪拌した。白色固体の塩化ピリジニウムを濾去し、ＴＨＦ（６ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し、ＴＨＦ及び過剰のピリジンを除去し、残渣を得た。
残渣をエタノール（１２．５ｍＬ）及び１Ｎ  ＨＣｌ（１２．５ｍＬ）の混合物中に溶解した。混合物を、５０℃〜５５℃において、更に３時間４５分攪拌し続けた（ＴＬＣ  モニタリング）。混合物を酢酸エチル（６０ｍＬ）で抽出し、１０％ＮａＣｌ水溶液で２度洗浄し（３０ｍＬ、２０ｍＬ）、Ｎａ2ＳＯ4（１０ｇ）で１．５時間乾燥させた。濾過後、濾液を５ｍＬまで濃縮した。ヘキサン（１０ｍＬ）を添加し、生成物を沈殿させた。沈殿物を収集し、ヘキサン（１０ｍＬ）で洗浄し、減圧下で乾燥させ、わずかに黄色の粉末を得た（０．９５ｇ、粗生成物、収率６０％）。純粋な生成物を分取ＨＰＬＣによって得た。
装置は、ウォーターズ  デルタ  プレパラティブ  ４０００ＨＰＬＣシステムを使用した。カラムは、ウォーターズ  シンメトリー  Ｃ１８，５μＭ，３０×１００ｍｍを使用した。移動相は、水及びアセトニトリル中Ｈ3ＰＯ4０．１％を使用した。水及びアセトニトリルはＨＰＬＣグレード又は等価のものである。
粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物を収集し、回転エバポレーターで蒸発させ、アセトニトリルを除去した。水溶液を酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させ、濃縮し、減圧下で乾燥させ、白色粉末の生成物を得た。この生成物にＮＭＲ及び質量スペクトル解析を受けさせた。両方のスペクトルは、生成物がアンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールのアスコルビルホスフェートエステルであることを示した。
アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステル（５、図３）の製造は、実施例３に記載された方法と同様である。
【０１３７】
実施例５：ここに記載された他のコレステロール吸収抑制剤（アンドロスト−５−エン−１７β−オールの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステル）の合成
無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中デヒドロイソアンドロステロン（１．４４ｇ、５ｍｍｏｌ）を、０℃において１０分間にわたり無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中ピリジン（０．４１ｍＬ）及び１，２−フェニレンホスホロクロリダイト（０．６ｍＬ、５ｍｍｏｌ）の溶液へ滴下添加した。反応混合物を０℃において３０分間、室温において４時間攪拌した。反応をＴＬＣ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝２／１）を用いて観察した。形成された塩化ピリジニウム
を濾去し、ＴＨＦで洗浄した。溶媒を４０℃において蒸発させ、白色粉末を得た。
粗ホスフェートエステルを塩化メチレン（２５ｍＬ）中に溶解させ、ヨウ素（１．２７ｇ）を用いて室温で４時間処理した。反応混合物を塩化メチレン（７５ｍＬ）で希釈し、１Ｎ  ＮａＯＨ（２×５０ｍＬ）及び水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を除去し、生成物（１．４ｇ、収率７１％）を塩化メチレン及びメタノールから再結晶化した。
３β−ヨードアンドロスト−５−エン−１７−オン（１．２７ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）を、５０−５５℃において氷酢酸（４０ｍＬ）中に溶解させ、活性亜鉛粉（２．７ｇ）を一度に添加した。混合物を５０℃〜５５℃において２時間攪拌し、亜鉛粉を濾去し、塩化メチレンで洗浄した。溶液を塩化メチレン（１２０ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、１Ｎ  ＮａＯＨ（２×１００ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を除去し、白色粉末を得た。白色粉末を真空下で乾燥させ、アンドロスト−５−エン−１７−オン（０．８３ｇ、収率９５％）を得た。
アンドロスト−５−エン−１７−オン（０．６５ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）を室温においてメタノール（２５ｍＬ）中に溶解させた。溶液を０℃まで冷却し、ＮａＢＨ4（５０ｍｇ）を一度に添加した。混合物を０℃において３時間攪拌し、ＴＬＣ（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝３／１）を用いて観察した。３時間後、ＮａＢＨ4のもう１部（２０ｍｇ）を添加し、反応混合物を０℃において更に３０分間攪拌した。ＮＨ4Ｃｌ水溶液（５％、２５ｍＬ）及びＨＣｌ（６Ｎ、５ｍＬ）を０℃においてゆっくりと添加し、１時間攪拌した。水（１００ｍＬ）を添加し、生成物を完全に沈殿物させた。沈殿固体を濾去し、水で洗浄し、真空下で乾燥させた。純粋な生成物（０．６２ｇ、収率９５％）を、カラムクロマトグラフィーによって得た。
無水ＴＨＦ（８ｍＬ）及びピリジン（１ｍＬ）中アンドロスト−５−エン−１７β−オール（０．６３ｇ、２．３ｍｍｏｌ）の溶液を、０℃において５分間にわたり、無水ＴＨＦ（６ｍＬ）及びＰＯＣｌ3（０．２８ｍＬ、３ｍｍｏｌ）の混合物へ滴下添加した。懸濁液を、０℃において５０分間、その後、室温において１時間攪拌した。
無水ピリジン（１．２ｍＬ）及びＴＨＦ（１２ｍＬ）中５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸（１．３８ｇ）の溶液を、０℃において１５分間にわたり、上記懸濁液へ滴下添加した。懸濁液を、０℃において１．５時間、その後、室温において一晩攪拌した。形成されたピリジン塩酸塩を濾去し、ＴＨＦで２度洗浄した。溶媒を４０℃における減圧下で蒸発させ、残渣を得た。
その後、残渣をＴＨＦ（３５ｍＬ）中に溶解し、２Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）を一度に添加した。混合物を室温において一晩攪拌した。ＴＨＦを減圧下で蒸発させた。水層を酢酸エチルで抽出した（３×１００ｍＬ）。１つにまとめた酢酸エチル溶液を塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣を得た。残渣をアセトン中に溶解し、ヘキサンを添加し、生成物を沈殿させた。白色の沈殿固体を濾去し、ヘキサンで洗浄し、真空下で乾燥させた（０．８２ｇ、粗生成物、収率：７０％）。
アンドロスト−５−エン−１７β−オールの二ナトリウムアスコルビルホスフェートエステルの製造は、実施例２と同様である。
【０１３８】
実施例６：ここに記載された他のコレステロール吸収抑制剤（３β−アセトキシアンドロスト−５−エン−７β，１７β−ジオールの四ナトリウムモノアスコルビルジホスフェートエステル）の合成
３β−アセトキシアンドロスト−５−エン−７β，１７β−ジオール（０．５ｇ、１．４３ｍｍｏｌ）、ピリジン（０．８３ｍＬ）及びＴＨＦ（４ｍＬ）を乾燥丸底フラスコへ添加した。透明溶液が得られるまで、混合物を室温において攪拌した。ＴＨＦ（５ｍＬ）及びＰＯＣｌ3（０．３３ｍＬ）を他の乾燥丸底フラスコへ添加し、−５℃〜０℃において５分間攪拌した。上記で製造した３β−アセトキシアンドロスト−５−エン−７β，１７β−ジオール溶液を、アルゴン雰囲気下において１５分間にわたりこの混合物へ滴下添
加した。添加後、白色懸濁液を、室温において２時間４５分攪拌した。反応を停止させ、白色懸濁液を、濾過なしでカップリング反応ために使用した。
５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸（１．３０ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）をピリジン（１．１６ｍＬ）及びＴＨＦ（５．８ｍＬ）中に溶解した。予め製造した白色懸濁液を含む丸底フラスコを氷−水バスに浸した。上記で製造した５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸のＴＨＦ溶液を、この混合物へ０℃において１５分間にわたり攪拌下で滴下添加した。添加後、混合物を０℃において４０分間、室温において１７時間攪拌した。白色固体の塩化ピリジニウムを濾去し、ＴＨＦ（５ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し、ＴＨＦ及び過剰のピリジンを除去し、残渣（２．７６ｇ）を得た。
この化合物の粗生成物をＴＨＦ（３０ｍＬ）及び１Ｎ  ＨＣｌ（３０ｍＬ）の混合物中に溶解した。混合物を室温において３．５時間攪拌し続けた（ＴＬＣ  モニタリング）。もう１部の１Ｎ  ＨＣｌ（１０ｍＬ）を添加した。混合物を更に１８．５時間攪拌した。反応混合物中のＴＨＦを、減圧下で除去した。水懸濁液を酢酸エチル及びｎ−ブタノール（１：１、１１０ｍＬ）で抽出した。有機層を蒸留水（１１ｍＬ）で洗浄した。有機層を回転エバポレーターで濃縮し、残渣を得た。この残渣をヘキサンで洗浄し（２×１０ｍＬ）、減圧下で乾燥させ、粗生成物（１．１５ｇ）を得た。
この化合物のナトリウム塩の製造は、実施例３と同様である。
【０１３９】
実施例７：ここに記載された他のコレステロール吸収抑制剤（アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールの四ナトリウムジアスコルビルジホスフェートエステル）の合成
乾燥丸底フラスコ中で、アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオール（１．５ｇ、５．１７ｍｍｏｌ）をピリジン（３．０ｍＬ）及びＴＨＦ（１５ｍＬ）中に溶解した。ＴＨＦ（２０ｍＬ）及びＰＯＣｌ3（１．１７ｍＬ、１２．５６ｍｍｏｌ）を他の丸底フラスコ中へ添加した。アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールを２０分間にわたり添加する前に、後者を−５℃において５分間攪拌した。−５℃の該添加の直後及び反応開始から２０分後に、白色沈殿物が観察され、反応は室温において２．５時間続けられた。
その後、フラスコを０℃まで冷却し、ピリジン（３ｍＬ）及びＴＨＦ（１５ｍＬ）中５，６−イソプロピリジンアスコルビン酸（３．１９ｇ、１４．７８ｍｍｏｌ）の溶液を、強攪拌下で２０分間にわたり滴下添加した。反応を更に２時間続けた。その後、反応混合物を濾過し、濾液を高粘度のシロップまで濃縮した。ヘプタンを添加し、混合物を減圧下で蒸留した。固体粗生成物を得た。
粗生成物をＴＨＦ／１Ｎ  ＨＣｌ（１：１、１５０ｍＬ）中に溶解し、加水分解を、強攪拌下で室温において行った。１２時間の反応の後、ＴＬＣ試験は、加水分解が完了したことを示した。反応混合物中のＴＨＦを、室温における減圧下で除去し、抽出のために、ｎ−ブタノール及び酢酸エチル（１：１、１００ｍＬ）を使用した。有機層を水で洗浄し（２×２０ｍＬ）、その後、濃縮し、アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールのジアスコルビルジホスフェートエステルの粗生成物（３．０ｇ）を得た。
アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールのジアスコルビルジホスフェートエステルの粗生成物（４００ｍｇ）をメタノール（５ｍＬ）中に溶解した。メタノール（２０％、ｗ／ｖ）中ナトリウムメトキシド２ｍＬを、電磁攪拌下でこの溶液へ添加した。白色沈殿物がナトリウムメトキシドメタノール溶液の添加によって観察された。それを濾過し、メタノール及びアセトンで洗浄する前に、懸濁液を３０分間攪拌した。固体生成物を高真空下で乾燥させ、アンドロスト−５−エン−３β，１７β−ジオールのの四ナトリウムジアスコルビルジホスフェートエステル（３３０ｍｇ）を得た。
【０１４０】
実施例８：１週間、ＦＭ−ＶＰ４で処理した後のＣａＣｏ２細胞におけるＭＤＲ−１発現の測定
Ｔ−７５フラスコ中のコンフレントのＣａＣｏ２細胞（Ｐ３３−３９）を様々な量のＦＭ−ＶＰ４（０．５μＭ、１．０μＭ、５．０μＭ及び１０．０μＭ）で１週間処理した。培地及び処理物を１日おきに交換した。７日後、細胞を回収し、全てのＲＮＡをＴＲＩＺＯＬ（登録商標：ＴＲＩＺＯＬ）で分離した。分析を、ポリメラーゼ鎖反応を使用した逆転写→ｃＤＮＡによって行った。
ＧＡＰＤＨ法のプライマー滴における滴定：
５０ｎｇ  ｃＤＮＡ（ＣａＣＯ２細胞）
０．５μＭ  ＭＤＤＲ＿１  フォワード及び０．５μＭ  ＭＤＲ−１  リバース
ＰＣＲプログラム：９４℃で５分間、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分３０秒間、２９回以上ステップ２から繰返し、７２℃で１０分間、４℃。
プライマー滴の周期：０、６、９、１２、１６、２０、２３、２６、２８及び３０
図１は、これらの結果を示すグラフであり、この結果からコレステロール吸収抑制剤の濃度が増加するほど、ＭＤＲ−１遺伝子の発現が著しく減少することが明らかである。更に、これらの結果の裏付けを、図２（ＧＡＰＤＨのプライマー滴における滴定を示すグラフ）及び図３（ＭＤＲ−１及びＧＡＰＤＨにおけるポリメラーゼ鎖反応（１．５％  アガロースゲル）ゲル電気泳動プレートの結果を示す）に示す。
１０μＭのＦＭ−ＶＰ４を用いた培養は、明らかに、ＭＤＲ−１の著しい抑制（ダウンレギュレーション）をもたらした。
【０１４１】
実施例９：１週間、ＦＭ−ＶＰ４で処理した後のＣａＣｏ２細胞におけるＭＲＰ−１発現の測定
ＭＤＲ−１遺伝子に関して実施例８で示した全プロトコルを使用して、他の多剤耐性遺伝子（ＭＲＰ−１）の発現に対するコレステロール吸収抑制剤の効果を確認した。
図６、１週間、ＦＭ−ＶＰ４で処理した後のＣａＣｏ２細胞中のＡＢＣＣ１（ＭＲＰ−１）発現レベル（ＭＲＰ−１／ＧＡＰＤＨの標準比）を示す棒グラフの結果は、明らかに、遺伝子発現に対する抑制効果を証明した。
【０１４２】
実施例１０：細胞毒性の研究；試験したコレステロール吸収抑制剤の非毒性をＭＴＳ、ＬＤＨ及びＢＣＡ分析によって証明した。
ＣａＣｏ２細胞を、４８−又は９６−ウェルプレート中に接種した。成長培地を２−３日おきに吸引し、新しい培地に置き換えた。細胞を５％ＣＯ2の湿潤雰囲気中で３７℃において維持した。その後、細胞を媒体、０．１％トリトンＸ−１００（毒性のための正の対照として）、ＦＭ−ＶＰ４、選択されたコレステロール吸収抑制剤で処理した。
２４時間後、各ウェル５０ｍＬを新しい９６−ウェルプレート中に移し、ＬＤＨ−分析を行った。ＭＴＳ−分析［セルタイター  ９６  アクエアス  ワン  ソリューション  キット（プロメガ（登録商標：Ｐｒｏｍｅｇａ））］は、元々のプレート上で行った。
細胞の生存は、ミトコンドリアの完全性に反映され得る。ＭＴＳ分析は処理後の生菌細胞数（細胞毒性）を決定するための比色法である。ＭＴＳ試薬（テトラゾリウム塩）が生きている細胞に適用された場合、それは、４９２ｎｍの光の照射によって、着色化合物（ホルマザン）に転換される。細胞の生存は、ミトコンドリアの完全性に反映され得る。
該分析を行った後、培地及び溶液を吸引し、細胞をＰＢＳで３度洗浄し、ＢＣＡタンパク質分析（ＰＩＥＲＣＥ）のために溶解した。この特異的な比色試験は、特定のペプチド結合を同定することによって、総タンパク質量を測定する。タンパク質濃度は、タンパク質標準（ウシ血清アルブミン又は‘‘ＢＳＡ’’）を用いて作図された較正曲線から計算した。
ＬＤＨ−分析は、細胞膜の完全性を調べ、化学物質又は他の薬剤によって介在された細胞毒性のために使用され得る。細胞損傷は、細胞内の漏出、細胞質の含有物及びラクテー
トデヒドロゲナーゼ又は‘‘ＬＤＨ（安定な細胞質内酵素）’’に関連し、この事象のためにリポーター分子として使用され得る。細胞から培地中へ放出されるＬＤＨは、プロメガ（登録商標：Ｐｒｏｍｅｇａ）社製のキット（サイトトキシ９６  ノン−ラジオアクティブ  サイトトキシティ  アッセイ）を使用した測定した。該方法は、一連の連鎖酵素反応に基づき、最終反応は、４９２ｎｍにおいて測定され得る着色した不溶性のホルマザン生成物へのテトラゾリウム塩の還元である。単なる培地及び処理した培地からのバックグラウンド吸収は、測定値から引き、値を補正する。
図４は、‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’でＣａＣｏ２を処理した後の、ＭＴＳ−及びＬＤＨ−分析による細胞の生存率を示す棒グラフである。図５は、 ‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’でＣａＣｏ２を処理した後の、ＢＣＡ−分析によるタンパク質濃度を示す棒グラフである。
試験したコレステロール吸収抑制剤、ＦＭ−ＶＰ４は、処理が２４時間（細胞の生存：９０．９＋／−９．８％）であるか９６時間（細胞の生存：９４．６＋／−４．４％）であるかにかかわらず、１００ｍＭまでの濃度範囲においていかなる毒性（ミトコンドリア活性）も示さなかった。２５０ｍＭにおける２４時間処理では、細胞の生存は、５９．２＋／−８．１％まで低下し、９６時間処理では、１９．３＋／−７．６％まで低下した。ＦＭ−ＶＰ４  ７５ｍＭの最も高いの試験濃度では、２４時間後に１８．５＋／−５．８％の細胞の生存及び２２．１＋／−１．６％の細胞の生存を示した。
これらの結果は、処理後のタンパク質濃度と一致した。それは、ＭＴＳ−分析で見られたものと同様の傾向を示した。
【０１４３】
実施例１１：ＦＭ−ＶＰ４を用いた培養後のＣａＣｏ２細胞中のｐ−糖タンパク質のウエスタンブロット分析（→タンパク質発現）
実験：
＞Ｃａｃｏ２細胞が入った１０個のフラスコ（Ｔ７５）
＞接種後２８日までの細胞を２群に分けた（Ｉ及びＩＩ）
＞両方の群に１週間、同じ処理を受けさせ、その後、分析のために分離した。
＞Ｉ群の処理：ＴＲＩＺＯＬを用いたＲＮＡ分離→ＲＴ−ＰＣＲ→ＰＣＲ→ｍｄｒ−１発現
＞ＩＩ群の処理：タンパク質分離→ＳＤＳ−ページゲル→ウェスタンブロット→Ｐ−糖タンパク質発現
Ｉ群から細胞を回収し、全細胞のＲＮＡを、プロトコルに従って、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標：ＴＲＩＺＯＬ）を用いて抽出した。ＲＮＡを逆転写し、ｃＤＮＡに変換し、特定のプライマーを使用してＭＤＲ−１の発現レベルを評価した。内部コントロールは、ＧＡＰＤＨ（プライマー滴）を使用して行った。各ＰＣＲ生成物からの試料に、１．５％アガロースゲル（エチジウムブロマイドを含む）上での電気泳動を受けさせた。１００ｂｐ標準を用いて生成物のサイズを同定した。蛍光バンドを紫外線（ＵＶＰ−Ｅｐｉ  Ｃｈｅｍｉ
ＩＩ  Ｄａｒｋｒｏｏｍ）下で画像化し、ＵＶＰ−ラボワークス  ソフトウェアで定量化した。
ＩＩ群からの細胞にタンパク質抽出法を受けさせた。濃度は、ＰＩＥＲＣＥ  ＢＣＡ  プロテイン  アッセイ  リエージェント  キットを使用して測定した。各試料からの１５μｇの全タンパク質が１１％ＳＤＳページ  ゲル上で電気泳動させられ、ＰＶＤＦ膜に移動した（湿式移動）。Ｐ−ｇｐの同定は免疫ブロット法を使用して行った。Ｐ−ｇｐのために使用したモノクローナル抗体は、ＪＳＢ−１であり、第２抗体は、ホースラディッシュ  ペルオキシド  ウサギ抗マウス抗体（ジャクソン  イムノ  リサーチ  ラボラトリー
インコーポレーテッド）である。分析を最適化した後、抗体溶液のための最良の希釈は、第１抗体において１：２００、第２抗体において１：１０００であることが判った。タンパク質バンドを、パーキンエルマー社製の化学発光キットを使用して視覚化し、Ｘ線フィルムを膜上に置いた。該フィルムを１分間曝露し、その後、現像した。
図９は、選択されたコレステロール吸収抑制剤（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’）を用いた培養後のＣａＣｏ２細胞中のｐ−糖タンパク質のウエスタンブロット分析を示す。
ＦＭ−ＶＰ４を用いた培養は、明らかに、ＭＤＲ−１のダウンレギュレーションをもたらした。言い換えると、ｍｄｒ−１によってエンコードされる低レベルのＰ−糖タンパク質しか検出されなかった。ＦＭ−ＶＰ４  １０μＭを用いた７日間の培養は、ｍｄｒ−１のダウンレギュレーションをもたらした（先の試験で確認）。タンパク質レベルもまた、この結果と関連があった。ＭＤＲ−１によってエンコードされる低レベルのＰ−糖タンパク質しか検出されなかった。
これらのデータは、ｍｄｒ−１遺伝子発現における変化が、ｍｄｒ−１によってエンコードされるＰ−ｇｐのタンパク質レベルに関連した変化をもたらすことを示唆した。
【０１４４】
実施例１２：ＦＭ−ＶＰ４  リポソームを用いた処理後のＣａＣｏ２細胞中のＭＤＲ−１遺伝子発現
目的は、多剤耐性遺伝子の遺伝子発現に対するコレステロール吸収抑制剤（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’）のコレステロール非含有リポソーム製剤の影響を確認することである。
水中ＦＭ−ＶＰ４の希釈物をＣａｃｏ２細胞に適用した。興味深いのは、コレステロール非含有リポソーム製剤中のリポソームＦＭ−ＶＰ４の影響である（ＤＭＰＣ  １００：０、比  １０：１  ＤＭＰＣ：ＦＭ−ＶＰ４）。ＦＭ−ＶＰ４リポソームは３つの異なる濃度で利用した（ＦＭ−ＶＰ４：２．５、５及び１０μＭ）。
方法：Ｃａｃｏ２細胞を、Ｔ−７５フラスコ中（コーニング社製）に１０，０００細胞／ｃｍ2において接種した。成長培地を１日おきに交換した。細胞を５％ＣＯ2の湿潤雰囲気中で３７℃において維持した。処理群は、２．５、５及び１０μＭのコレステロール非含有リポソームＦＭ−ＶＰ４並びにＦＭ−ＶＰ４なしのからのコレステロール非含有リポソームを含む。細胞を、１週間の処理後に回収し、全てのＲＮＡを、プロトコルに従って、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標：ＴＲＩＺＯＬ）を用いて分離した。その後、ＲＴ−ＰＣＲを行い、特定のプライマーを使用してＭＤＲ−１の発現レベルを評価した。ＰＣＲ生成物を、１．５％アガロースゲル（エチジウムブロマイドを含む）上での電気泳動によって分離し、蛍光バンドを紫外線下で画像化し、ＵＶＰ−ラボワークス  ソフトウェアを使用して定量化した。
図７は、ＭＤＲ−１、ＧＡＰＤＨにおけるポリメラーゼ鎖反応（１．５％  アガロースゲル）ゲル電気泳動の結果；ここに記載されたコレステロール吸収抑制剤の１つ（‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’と呼ばれるアスコルビルスタニルホスフェートエステル）のリポソーム製剤を用いたＣａＣｏ２細胞の処理後の、ＴＲＩＺＯＬを用いたＲＮＡ分離→ＲＴ−ＰＣＲ→ＰＣＲを示す。
図８は、対照及びからのリポソームと比較したリポソームＦＭ−ＶＰ４（２．５、５及び１０μＭ）を用いた１週間の処理後のＣａＣｏ２細胞中のＭＤＲ−１発現レベル（ＭＤＲ−１／ＧＡＰＤＨの標準比）を示す棒グラフである。
３つの試験濃度全てが、ＭＤＲ−１遺伝子のダウンレギュレーションをもたらした。からのリポソームを用いた培養は、仮説通りいかなる効果も示さず、対照として使用され得た。ダウンレギュレーションは、コレステロール吸収抑制剤を水に溶解する場合よりも、著しく効果的であった。
つまり、低濃度のリポソームＦＭ−ＶＰ４を用いた処理後のＣａｃｏ２細胞のＭＤＲ−１遺伝子発現は、非リポソーム製剤を用いた場合よりも、低濃度においてかなり減少した。
【０１４５】
実施例１３：コレステロール吸収抑制剤を含むリポソームの製造
標準プロトコル
乾燥脂質膜の作製
１．クロロホルム中で脂質の原液を調製した（ＤＭＰＣ：コレステロールのモル比＝５
５：４５）。
２．試験管に適当量の原液を移した。
３．乾燥溶媒を窒素ガス流下で乾燥させた。
４．窒素を停止した。
５．脂質をほぼ乾燥させた後、それを真空装置中に置き、少なくとも２時間、残存クロロホルムを除去した。
６．乾燥脂質膜をキャッピングし、冷凍庫に置くことにより貯蔵した。
脂質の水和
１．水浴を５５℃に設定した。
２．ＨＢＳを温めるか又は選択されたコレステロール吸収抑制剤（例えば、ＦＭ−ＶＰ４）を水浴中のＨＢＳ中に溶解した。
３．試験管へ適当量のＨＢＳ又はＨＢＳ中ＦＭ−ＶＰ４を添加した。
４．攪拌した。
５．それを水浴中で温めた。
凍結融解サイクル
１．液体窒素をデュアー瓶に充填した。
２．脂質混合物をプラスチック製冷凍チューブ中に移した。
３．冷凍チューブをクレーンに取り付けた。
４．試料を液体窒素中で凍結し、その後、水浴中で融解した。これを５度繰返した。
５．試料を冷凍庫中に貯蔵した。
押出し／小嚢のサイズ調整
１．水浴を５５℃に設定した。
２．押出機を組み立てた。
３．窒素、その後にＨＢＳを用いて押出機を試験した。
４．３００−６００ｐｓｉまで圧力を上げた。
５．試料を押出す前に、５００μＬに等分し、それをエッペンドルフに移し、ＢＥでラベルした。
６．脂質懸濁液をポリカーボネートフィルター２枚に通した。
７．０．１μＭフィルターを使用して、試料を押出し、１００ｎｍのサイズとした。
８．試料を１０分間押出した。
９．５００μＬに等分し、それをＡＥでラベルした。
１０．透析後、５００μＬに等分し、それをＡＤでラベルした。
【０１４６】
実施例１４：コレステロール吸収抑制剤を用いた処理後のＣａｃｏ２細胞中のＭＤＲ−１遺伝子発現
目的：コレステロール吸収抑制剤を用いた処理後のＣａｃｏ２細胞中のｍｄｒ−１遺伝子発現の時間依存性の研究
試験方法：Ｃａｃｏ２細胞をＴ−７５フラスコ中（コーニング社製）に１０，０００細胞／ｃｍ2において接種した。１０％の熱活性ウシ胎仔血清、２９２μｇ／ｍＬのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのグルタミンを含む成長培地（ダルベッコ最小基本培地−ＤＭＥＭ）を１日おきに交換した。細胞を５％ＣＯ2の湿潤雰囲気中で３７℃において維持した。細胞を、上記した‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’１０μＭで処理し、それらが約９５％のコンフレントに達した場合、水に溶解した。対照群は培地のみである。
細胞を、６０分後、９０分後、６時間後、２４時間後及び４８時間後に回収した。全Ｒ
ＮＡを、ＴＲＩＺＯＬ試薬を使用して分離し、その後、逆転写し、一本鎖ｃＤＮＡに変換した。ＰＣＲ反応を、ｍｄｒ−１のための特定のプライマー及び内部コントロールのためのハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨを用いて行った。各ＰＣＲ生成物からの試料に１．５％アガロースゲル上での電気泳動を受けさせた。蛍光バンドを紫外線（ＵＶ−Ｅｐｉ
Ｃｈｅｍｉ  ＩＩ）下で視覚化し、ＵＶＰ−ラボワークス  ソフトウェアを使用して定量化した。
図１０及び１１：ＦＭ−ＶＰ４  １０μＭを用いた時間依存性処理の効果として、ＣａＣｏ２細胞中のｍｄｒ−１遺伝子の発現プロフィルを試験した。各ＰＣＲ生成物からの試料に１．５％アガロースゲル上での電気泳動を受けさせた（図１０）。蛍光バンドを紫外線（ＵＶ−Ｅｐｉ  Ｃｈｅｍ  ＩＩ）下で画像化し、ＵＶＰ−ラボワークス  ソフトウェアで定量化した（図１１）。
【０１４７】
実施例１５：Ｃａｃｏ２細胞によるローダミン１２３の細胞内蓄積に対するコレステロール吸収抑制剤の効果
目的：多剤排出輸送体、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の活性指標であるローダミンの蓄積に関する研究。Ｐ−ｇｐ活性の低下は細胞中にローダミン１２３の蓄積をもたらす。
ローダミン１２３は、Ｐ−ｇｐ基質（蛍光色素）であり、Ｐ−ｇｐの機能活性を測定するために、プローブ基質として使用されてきた。励起波長は４８５ｎｍであり、発光波長は５２０ｎｍである。細胞を、ここに記載される‘‘ＦＭ−ＶＰ４’’を用いて培養し、ローダミン１２３を側底面に添加した。細胞を溶解した後、ローダミン１２３の含有量を測定した。
Ｃａｃｏ２細胞を、直径１２ｍｍのポリカーボネートフィルター挿入口（トランスウェル  コスター社製）上に、４００００細胞／ｃｍ2の密度で接種した。１０％の熱活性ウシ胎仔血清、２９２μｇ／ｍＬのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのグルタミンを含む成長培地（ダルベッコ最小基本培地−ＤＭＥＭ）を１日おきに交換した。細胞を５％ＣＯ2の湿潤雰囲気中で３７℃において維持した。処理試験のため、異なる濃度において、ＦＭ−ＶＰ４を培地へ添加し、トランスウェルプレートの先端面及び側底面上に適用した。単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定し、単層の完全性を確認した。その後、４００Ω／ｃｍ2以上のＴＥＥＲ値を有するＣａｃｏ２細胞をＰ−ｇｐの研究のために使用した。
処理から１週間後、細胞を、ｐＨ７．４のヘペスを１０ｍＭ含むＨＢＳＳ（フェノールレッドなし）で、数回洗浄し、ＨＢＳＳ及びヘペス１０ｍＭ中でＦＭ−ＶＰ４を用いて、１時間前培養した。ＴＥＥＲ値を測定し、単層の完全性を確認した。ＴＥＥＲ値が４００Ω／ｃｍ2未満のトランスウェルを試験から除外した。対照ウェルは培地のみを含み、Ｐ−ｇｐの抑制のための正の対照はベラパミルであった。ローダミン１２３  ５μＭを側底面に添加し、３７℃において３時間後、培地を除去し、細胞を氷冷ＰＢＳで３度洗浄した。その後、膜を切取り、１．５ｍＬエッペンドルフ管中に移し、１％  トリトンＸ−１００  ２５０μＬを添加し、攪拌した。室温において１０分間後、５分間の遠心分離工程で細胞残屑を除去し、２５μＬ（３つ）を９６−ウェルプレート中に移し、蛍光発光（励起：４８５ｎｍ；発光：５３０ｎｍ）を測定した。最終的に、タンパク質含有量をＢＣＡタンパク質分析（ＰＩＥＲＣＥ）を使用して測定し、ローダミン１２３蓄積を標準化した。
図１２：Ｃａｃｏ−２単層中のＲｈ１２３の蓄積に対する１週間、ＦＭ−ＶＰ４を用いた前培養の効果。データは、平均±ＳＤを示す。*ｐ＜０．００２、**ｐ＜０．０００１。
ベラパミル１００μＭを用いたＰ−ｇｐ抑制のための正の対照は、タンパク質１ｍｇ当りローダミン１２３  １６０４ｐｍｏｌの蓄積であった。５μＭ以上の濃度のＦＭ−ＶＰ４を７日間使用することにより、Ｐ−ｇｐ基質、ローダミン１２３の細胞内蓄積が高められたため、Ｐ−ｇｐ活性の減少が観察され得た。
【０１４８】
実施例１６：多剤排出輸送体、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の機能活性に対するコレステロール吸収抑制剤の影響
ＦＭ−ＶＰ４を用いた処理後のＣａｃｏ２細胞中のＰ−ｇｐの活性を測定するために、試験を行った。上記試験において、１週間のＦＭ−ＶＰ４（１０μＭ）の投与後、ＦＭ−ＶＰ４はｍｄｒ−１（Ｐ−ｇｐをエンコードする）の遺伝子発現を減少させることが確認されている。ｍｄｒ−１のダウンレギュレーションは、ウエスタンブロット分析に示されるように、Ｐ−ｇｐのタンパク質発現レベルの低下をもたらす。
ヒトの腸管上皮単層、Ｃａｃｏ２細胞は、それらのアピカル膜上にＰ−ｇｐを発現する。単層を通りぬける先端面及び側底面輸送を測定し、かつ特定物質の浸透性を決定するための良好なシステムは、トランスウェルプレートである。細胞を２つのチャンバ間に置かれる半浸透膜上で成長させた。Ｃａｃｏ２細胞は、高機能化上皮バリアーに分化する。形態学的かつ生化学的に、それは、小腸の円柱上皮に類似している。
腸環境様の薬剤吸収を測定するために、物質を先端面に与え、側底面の濃度を測定した。これは腸内吸収を示す。物質が側底面上に添加され、かつ先端チャンバへの輸送が測定される場合、分泌輸送が決定され得る。Ｐ−ｇｐのために良好な基質はローダミン１２３であり、それは、Ｐ−ｇｐの機能活性を測定するために、プローブとして使用されてきた。それは蛍光色素である。ローダミン１２３は、５１１ｎｍにおいて８５，２００Ｍ-1ｃｍ-1のモル吸光係数を有する。
Ｃａｃｏ２細胞を、直径１２ｍｍのポリカーボネートフィルター挿入口（トランスウェル  コスター社製）上に接種した。１０％の熱活性ウシ胎仔血清、２９２μｇ／ｍＬのグルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのグルタミンを含む成長培地（ダルベッコ最小基本培地−ＤＭＥＭ）を１日おきに交換した。細胞を５％ＣＯ2の湿潤雰囲気中で３７℃において維持した。処理試験のため、異なる濃度において、ＦＭ−ＶＰ４を培地へ添加し、トランスウェルプレートの先端面及び側底面上に１週間適用した。対照ウェルは培地のみを含む。Ｐ−ｇｐの抑制のための正の対照はベラパミル（カルシウムチャンネル遮断薬）であった。
単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定し、単層の完全性を確認した。その後、４００Ω／ｃｍ2以上のＴＥＥＲ値を有するＣａｃｏ２細胞を輸送研究のために使用した。分泌輸送（側底面から先端面へ）を測定するために、ローダミン５μＭを側底面チャンバ中に添加した。時間依存性の手段において、試料を先端面から取りだし、蛍光発光を決定した。直ちに、試料を新しい受容培地（ｆｒｅｓｈ  ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｍｅｄｉｕｍ）（培地、培地＋ＦＭ−ＶＰ４又は培地＋Ｐ−ｇｐ抑制剤）に置き換えた。
要するに、図１３に示されるように、Ｃａｃｏ２細胞トランスウェルシステムにおいて、ローダミン１２３の先端面（アピカル）取り込みに対するコレステロール吸収抑制剤の効果が観察され得た。両面（先端面並びに側底面）において培養された場合、有意なＰ−ｇｐ抑制が、ＦＭ−ＶＰ４  ２５μＭの濃度において起こった。
【０１４９】
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２６．Ｃａｍｐｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７９：４７３，１９９２
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２８．Ｂｏｕｒｈｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ． ８１：１４０１，１９８９
２９．Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：１２８，１９９０）
３０．Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．８：６８９  １９９０
３１．Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７４：９１３−９１７，１９８９
３２．Ｔｓｕｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：２９０５，１９８３）
３３．Ｋａｎａｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１：８４４，１９８９
３４．Ｔｗｅｎｔｙｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５６：５５，１
９８７
３５．Ｂｏｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１９６：２６−３２，１９９１
３６．Ａｒｃｅｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８０：１５２８−１５３６，１９９２
３７．Ｓｔｅｄｒｏｎｓｋｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２１０，２５５−２８７（１９９４）
【図１】
2007524651.tif 000037
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2007524651.tif 000047
【図１２】
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【図１３】
2007524651.tif 000049
【国際調査報告】
2007524651.tif 000050
2007524651.tif 000051
2007524651.tif 000052
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