(57)【要約】  本発明は、標的部分を含有する可能性のある試料中の標的部分を定量するための提示システムおよび方法を提供する。本方法は、提示システムによって作成される信号と試料によって作成される信号を比較するための手段を提供する比較ポイントまたは検量線を作成するために、特定の濃度を使用するステップまたは提示システムの濃度を変化させるステップを含む。本提示システムは、標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーを備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に存在する標的部分の量を定量する際に使用するための提示システムであって、この提示システムは、結合パートナーによって認識されうる標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーと、前記標的部分に共有結合している骨格の少なくとも１つのドメインとを備えており、このドメインは、前記標的部分またはその一部に特異的な結合パートナーと無反応性である、提示システム。
【請求項２】
前記標的部分またはその一部のコピーが、ＤＮＡもしくはＲＮＡの配列、ペプチド、抗原構造または化学物質または部分を含む群から選択される請求項１に記載の提示システム。
【請求項３】
前記標的部分が、さらに、サッカライド、代謝産物補助因子、ハプテンまたはホスフェート、ニトロシル基、硫酸基もしくはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基による修飾を含む請求項１または請求項２のどちらかに記載の提示システム。
【請求項４】
前記提示システムの骨格材料が制御可能な特性を有する請求項１〜３のいずれかに記載の提示システム。
【請求項５】
前記制御可能な特性が、相対的分子質量（Ｍｒ）もしくは分子量（Ｍｗｔ）または等電点（ｐＩ）である請求項４に記載の提示システム。
【請求項６】
前記骨格材料がタンパク質である請求項１〜５のいずれかに記載の提示システム。
【請求項７】
前記骨格材料が、残基の側鎖内に少なくとも１つ以上の化学基を有する少なくとも１つの天然型または非天然型アミノ酸を含む請求項１〜６のいずれかに記載の提示システム。
【請求項８】
化学的反応性がある酸性基が、グルタミン酸、アスパラギン酸のカルボニル、チロシン、システインおよびリジンのヒドロキシルを含む群から選択される請求項７に記載の提示システム。
【請求項９】
前記骨格が、１つ以上の化学的反応性があるシステインおよび／またはリジンアミノ酸残基を含む請求項１〜８のいずれかに記載の提示システム。
【請求項１０】
前記反応性システインおよび／またはリジン残基の数が、望ましい数の反応性システインおよび／またはリジン基を含有する天然起源から骨格タンパク質を選択することによって、またはタンパク質配列に反応性残基を導入またはタンパク質から反応性残基を脱離させて選択的に突然変異することによって、および／または選択した骨格タンパク質の反応性システインおよび／またはリジン残基の任意の１つ以上を無効にすることによって、制御される請求項９に記載の提示システム。
【請求項１１】
前記骨格が、タイチンのＩ２７ドメイン、スプライシングファクター３ｂのサブユニット（サブユニット５）であるＩ３９ドメイン、コルチ器官のタンパク質（Ｍｕｓ筋）、ヒートショックタンパク質、ミトコンドリア（Ｍｕｓ筋）、スプライシングファクター３Ｂサブユニット５（Ｍｕｓ筋）、ユビキノール−チトクロームＣ還元酵素複合体ユビキノン−結合タンパク質、Ｅ１Ｂタンパク質（ヒトアデノウイルスタイプ１１）、シャペロニン（アラビトプシス  サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、光化学系ＩＩ反応中心Ｈタンパク質（アラビトプシス  サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシリダクターゼサブユニット、ミトコンドリア［前駆体］（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、信号認識粒子タンパク質（Ｍｕｓ筋）、ＤＮＡポリメラーゼδサブユニット（Ｍｕｓ筋）を含む群から選択される請求項１〜１０のいずれかに記載の提示システム。
【請求項１２】
請求項１１に記載の骨格の任意の１つ以上の組み合わせを含む請求項１１に記載の提示システム。
【請求項１３】
複数の同一の骨格を含む請求項１１に記載の提示システム。
【請求項１４】
複数の同一または同一でないドメインを混合物またはブレンドとして含む請求項１１に記載の提示システム。
【請求項１５】
タイチンの複数の骨格Ｉ２７ドメインを含み、少なくとも１つのドメインまたは単位は、ペプチド結合のために１つのシステイン残基を有するように工作されているが、他の全てのまたは選択した数のＩ２７ドメインまたは単位は、リジン、グルタメートおよびアスパルテートを含む基から選択される他の反応性残基を欠損している請求項１１に記載の提示システム。
【請求項１６】
スプライシングファクター３ｂのサブユニット（サブユニット５）である少なくとも１つ以上の骨格Ｉ３９ドメインを含む請求項１１に記載の提示システム。
【請求項１７】
前記骨格ドメインが約１０ｋＤａである請求項１〜１６のいずれかに記載の提示システム。
【請求項１８】
前記骨格の直鎖状単位またはドメインがタンデムに接続されている請求項１〜１７のいずれかに記載の提示システム。
【請求項１９】
少なくとも１つの生物または非生物ポリマーを含む請求項１〜１８のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２０】
前記非生物ポリマーがＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である請求項１９に記載の提示システム。
【請求項２１】
前記標的部分のコピーが、システイン残基のチオール基による共有結合を使用して提示システムに組み込まれている、または標的部分がタンパク質もしくはペプチドであり、提示システムもタンパク質もしくはペプチドである場合には、標的部分をコードするＤＮＡセグメントが提示システムをコードするＤＮＡに組み込まれており、結果として提示システムと共に発現される請求項１〜２０のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２２】
前記提示システムのドメインが、前記標的部分またはその一部のコピーとは別に、実質的に不活性であるかまたは前記試料の標的部分またはその一部の特異的な結合パートナーに無反応性である請求項１〜２１のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２３】
前記標的部分またはその一部のコピーが、前記試料に存在する標的部分と同一でない請求項１〜２２のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２４】
前記標的部分の複数のコピーを含む請求項１〜２３のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２５】
前記標的部分またはその一部のコピーが提示システム内で直鎖状または分岐鎖状である請求項１〜２４のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２６】
前記共有結合が骨格材料の側鎖によるように、前記標的部分のコピーが分岐鎖状である請求項２５に記載の提示システム。
【請求項２７】
前記結合パートナーが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはペプチドアプタマーまたは他の抗体等価物、染料、薬物および金属キレートを含む群から選択される請求項１〜２６のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２８】
少なくとも１つのＩ２７ドメインおよび／または少なくとも１つのＩ３９ドメインおよびＡ１、ＰＳ−３８またはＰＴ１７ペプチドを含む群から選択される標的部分を含む請求項１〜２７のいずれかに記載の提示システム。
【請求項２９】
試料中に存在する可能性のある標的部分の量を定量するための産物の使用であって、この産物は複数の提示システムを含み、これら各提示システムは、標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーと、前記標的部分のコピーに共有結合している少なくとも１つのドメインとを備えており、このドメインは、前記標的部分またはその一部のコピーに対して特異的な結合パートナーに無反応性であり、さらに前記各提示システムは、他の提示システムとは前記産物において異なる分子量を有する、使用。
【請求項３０】
陽性対照もしくは内部標準としての、または検量線を作成するための請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
試料の標的部分の量を定量するためのキットであって、請求項１〜２８のいずれかに記載の提示システムを含むキット。
【請求項３２】
標的部分を含有する可能性のある試料における標的部分の量を定量する方法であって、
ａ）結合パートナーによって認識可能な標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーと、前記結合パートナーに無反応性の少なくとも１つのドメインとを備え、前記標的部分の少なくとも１つのコピーが骨格の少なくとも１つのドメインに共有結合している、
提示システムを提供するステップと、
ｂ）特定の量で存在する前記提示システムに分離検出法を実施するステップと、
ｃ）前記提示システムの量に対する前記提示システムによって形成される信号の強度を含む少なくとも１つの比較ポイントを作成するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
前記提示システムが１つの特定の量で存在する請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
提示システムが一連の種々の量で存在する請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記種々の量が、ブロットの同じまたは異なるレーンまたはチャネルに存在する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記比較ポイントが、一体として検量線を提供する複数の比較ポイントである請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記比較ポイントを前記試料と比較して、この試料に存在する標的部分の量を定量するステップをさらに含む請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記提示システムが既知の分子量またはｐＩのものである、請求項３２〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記提示システムが非生物ポリマー、核酸分子、ペプチド、タンパク質またはそれらの組み合わせを含む、請求項３２〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記提示システムがタンデムに接続されている複数のドメインを含む、請求項３２〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記提示システムが、同じ単位もしくはドメインまたは同じでない単位もしくはドメインを含む、請求項３２〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記提示システムの単位が、前記標的部分またはその一部に特異的な結合パートナーに無反応性である請求項３２〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記標的部分またはその一部のコピーが、ＤＮＡ、ＲＮＡの配列、タンパク質またはペプチド、サッカライド、ハプテン、ホスフェート、ニトロシル基、硫酸基、ＧＰＩ基、エピトープ、抗原構造物または化学物質を含む請求項３２〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記標的部分のコピーが、ＳＥＲＣＡ２ａまたはセリン−３８がリン酸化されているＳＥＲＣＡ２ａを含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記提示システムが異なる標的部分またはその一部を含む請求項３２〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記標的部分またはその一部のコピーが前記提示システム内で直鎖状または分岐鎖状である、請求項３２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記特異的な結合パートナーが、前記標的部分に特異的な結合親和性を有し、且つそれに結合することができる分子を含む請求項３２〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記結合パートナーが、抗体、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、染料、金属キレートまたは薬物分子を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記分離検出法が、ドットブロット、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、蛍光偏光、ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット法、サザンブロット法、ＰＣＲ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動、１Ｄ電気泳動、等電点電気泳動法、質量分析法または上記の組み合わせを含む請求項３２〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記提示システムが、試料における標的部分の有無を検出するための陽性対照として作用する請求項３２〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記提示システムが、１ポイントキャリブレーションを提供することによって内部標準として作用する請求項３２〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記提示システムが、検量線を提供するために、多数の比較ポイントを作成するために使用される請求項３２〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記提示システムが、免疫沈降の効率および／または免疫沈降過程の段階をモニターするために使用される請求項３２〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
請求項２〜２８に記載の特徴の任意の１つ以上をさらに含む請求項３２〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
試料のタンパク質エピトープの量を定量する方法であって、
ａ）タンパク質エピトープの少なくとも１つのコピーと、少なくとも１つのさらに別のタンパク質ドメインとを備え、且つ既知の分子量を有するタンパク質提示システムを提供するステップと、
ｂ）前記提示システムにウェスタンブロット実験を実施するステップであって、前記提示システムが特定の濃度で存在し、前記ウェスタンブロット実験が標的部分に特異的な結合パートナーを使用し、さらに前記提示システムのタンパク質ドメインが前記結合パートナーに無反応性であるステップと、
ｃ）前記提示システムの濃度に対する前記技法において前記提示システムによって形成される信号の強度を含む比較ポイントを作成するステップと
を含む方法。
【請求項５６】
請求項２〜２８に記載の特徴の任意の１つ以上をさらに含む請求項５５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ある薬剤の特定の結合パートナーに対する結合を定量または数値化するための薬剤およびその方法、並びにその較正結果および使用に関する。本発明は、限定を意図するものではないが、特に、ブロットに基づいた検出法に使用するためのものであり、試料中の薬剤の量の定量に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブロットを使用する技法などの分離法を使用して、試料中の特定の標的分子の存在を同定することができる。ブロットを使用する技法の１つであるウェスタンブロット法を使用して、特定のタンパク質に特異的な抗体との相互作用により、試料中のそのタンパク質の存在を同定することができる。試料のタンパク質は電気泳動によって互いに分離し、好適な膜支持体に移し、次いで特異的な抗体を用いて調べる。タンパク質への抗体の結合は膜の「スポット」として可視化され、その存在および位置としての情報を提供する。この位置はタンパク質の物理的な状態、例えば、グリコシル化、リン酸化またはタンパク質分解についての情報を提供することができる。
【０００３】
ウェスタンブロット法および他の免疫学的技法の欠点は、作成されるデータは定性的（単位なし）であり、実験で得られる情報を制限し、単位を含む定量的な結果を提供しないことである。さらに、感度の大きな日間変動が観察され、別個の日時に実施される実験間の容易な比較、特に実験が異なる研究者によって実施される場合の容易な比較を妨害する。従って、実験間の比較を困難にし、不正確にする大きな実験間変動が存在する。これらの短所は、得られる情報の質および技法の再現性を制限する。
【０００４】
種々の他のブロットを使用する検出法がある。サザンブロット法は、特定のＤＮＡ配列の存在を検出するために使用される技法であるが、ノーザンブロット法は混合物内の特定のＲＮＡ配列を位置決めするために使用される。ＥＬＩＳＡ法は感度が高く、従って試料中の非常に少量のタンパク質または他の抗原物質を検出することができる。この方法の基礎は、プレート表面に接続されている抗体による抗原の結合である。免疫複合体の形成は、抗体に結合されているペルオキシダーゼの使用によって検出され、ペルオキシダーゼは増幅的な呈色反応を形成するために使用される。しかし、ＥＬＩＳＡは、高感度性にもかかわらず、試料中に存在するタンパク質または抗原の量を定量しない。従って、ウェスタンブロット法に関連して記載される欠点は他のブロットを使用する検出法にも関連する。
【０００５】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および等電点電気泳動法などの他の分離を使用する技法がある。等電点電気泳動法は、タンパク質の等電点の差を使用する、タンパク質を分離するために使用される技法である。タンパク質の等電点は、タンパク質が正味荷電を持たないｐＨである。そのような環境下では、タンパク質は電場中で移動しない。等電点電気泳動技法は、陰極と陽極の間に設定されるｐＨ勾配を使用しており、タンパク質は各々の等電点方向に移動する。等電点電気泳動技法は真に定量的な結果を提供しない。
【０００６】
従って、簡単で、効果的に再現可能な較正技術が記載されている短所を修正し、実験間で容易に比較可能な定量的データを提供することが長い間望まれている。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、骨格材料の少なくとも１つ以上の制御された数の部位またはドメインへの標的部分の共有結合にあり、骨格材料は制御された特性を有する。この方法では、標的部分および骨格材料は、陽性対照、内部標準として使用してもまたは検量線を作成するために使用してもよい提示システムを含む。
【０００８】
本発明はまた、標的部分を含有する可能性のある試料において標的部分を定量する方法であって、提示システムによって作成される信号と試料によって作成される信号を比較する手段を提供する比較ポイントまたは検量線を作成するために、提示システムの特定の量を使用するステップまたは提示システムの量を変更するステップを含み、提示システムは標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーを含む方法も提供する。
【０００９】
以下の明細書および特許請求の範囲において、内容がそうでないことを要求しない限り、「含む」という用語または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、記載されている整数または整数群を含むが、任意の他の整数または整数群を除外しないことを示すことが理解される。
【００１０】
本発明の第一の態様によると、試料に存在する標的部分の量を定量する際に使用するための提示システムであって、結合パートナーによって認識されうる標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーおよび標的部分に共有結合している骨格の少なくとも１つのドメインを含み、ドメインは標的部分またはその一部に特異的な結合パートナーと無反応性である提示システムが提供される。
【００１１】
本明細書における標的部分またはその一部への言及は、ＤＮＡもしくはＲＮＡの配列、タンパク質またはペプチド、抗原構造または化学物質または部分を含むが、これらに限定されない。標的部分は、さらに、サッカライド、代謝産物補助因子、ハプテンまたは修飾基を含んでもよい。修飾基は、ホスフェート、ニトロシル基、硫酸基またははグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）基を含んでもよい。
【００１２】
好ましくは、提示システムの骨格材料は制御可能な特性を有し、好ましくは、この特性は、相対的分子質量（Ｍｒ）もしくは分子量（Ｍｗｔ）または溶液中の所定の物質の等電点のためのｐＨ値（ｐＩ）である。
【００１３】
好ましくは、骨格材料はタンパク質である。
【００１４】
好ましくは、骨格材料は、好ましくは、残基の側鎖内に少なくとも１つ以上の化学的に反応性の基を有する少なくとも１つの天然型または非天然型アミノ酸を含む。
【００１５】
好ましくは、骨格は、１つ以上の化学的に反応性の基、例えば、グルタミン酸もしくはアスパラギン酸のカルボニル、チロシンのヒドロキシルを含み、さらに好ましくは、少なくとも１つのシステインおよび／またはリジンアミノ酸基を含む。従って、骨格材料はチオールまたは一級アミンまたは標的部分と共有結合するのに利用可能なアスパラギン酸、グルタミン酸、システインおよび／またはリジン基などの好適な反応性の側鎖基が存在する任意の他のタンパク質であってもよいことが考えられる。骨格ドメインの化学的に反応性の基への標的部分の共有結合は制御可能であることが望ましい。
【００１６】
好ましくは、反応性システインおよび／またはリジン残基の数は、望ましい数の反応性システインおよび／またはリジン基を含有する天然起源から骨格タンパク質を選択することによって制御することができる。
【００１７】
好ましくは、骨格タンパク質は、２つのシステイン残基を含有するタイチンのＩ２７、１つのシステイン残基を含有するスプライシングファクター３ｂのサブユニット（サブユニット５）であるＩ３９ドメイン、１つのシステインおよび１つのリジン残基を含有するコルチ器官のタンパク質（Ｍｕｓ筋）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｑ８Ｒ４４８；１１のリジン残基を含有するヒートショックタンパク質、ミトコンドリア（Ｍｕｓ筋）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｑ６４４３３；１つのシステインおよび５つのリジン残基を含有するスプライシングファクター３Ｂサブユニット５（Ｍｕｓ筋）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｑ９２３Ｄ４；１つのシステインおよび６つのリジン残基を含有するユビキノール−チトクロームＣ還元酵素複合体ユビキノン−結合タンパク質ＱＰ−Ｃ（シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｍｅ））Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ５０５２３；１つのシステイン残基を含有するＥ１Ｂタンパク質（ヒトアデノウイルスタイプ１１）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｑ８Ｂ８Ｕ６；９のリジン残基を含有するシャペロニン（アラビトプシス  サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ３４８９３；３つのリジン残基を含有する光化学系ＩＩ反応中心Ｈタンパク質（アラビトプシス  サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ５６７８０；１つのシステインおよび９のリジン残基を含有するＮＡＤＨ−ユビキノンオキシリダクターゼサブユニット、ミトコンドリア［前駆体］（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ５６１８１；２つのシステインおよび８つのリジン残基を含有する信号認識粒子タンパク質（Ｍｕｓ筋）；２つのシステインおよび６つのリジン残基を含有するＤＮＡポリメラーゼδサブユニット（Ｍｕｓ筋）を含む群から選択される。
【００１８】
従って、本発明の提示システムは標的部分に共有結合するための数多くの部位を提供することができることおよび骨格はユーザーの要求により選択することができることが考慮される。例えば、１つのシステインおよび９のリジン残基を含有するミトコンドリア［前駆体］（ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｐ５６１８１を１つのシステイン残基に標的部分のコピーを結合するために選択しても、または１つのシステインおよび１つのリジン残基を含有するコルチ器官のタンパク質（Ｍｕｓ筋）Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  Ｑ８Ｒ４４８を、システインもしくはリジン残基のどちらかに標的部分のコピーを結合するために選択してもよく、これに関しては、本発明の提示システムは、骨格タンパク質における反応性残基の提示を低下することにフレキシブルである。反応性残基部位を調整するさらに別の手段を本明細書の以下に記載する。
【００１９】
特定の実施態様において、提示システムは、タイチン由来のＩ２７などの１つ以上のドメインを含んでもよい。タイチンは、Ｉｇファミリーに属する数多くのβ−サンドイッチドメインを含有する。Ｉ２７ドメインは、通常、２つのシステイン残基を含有し、１０ｋＤａの安定な構造を形成するように折りたたむ。本来Ｉ２７ドメインは２つのシステイン残基（ペプチドの共有結合するための部位）を含有するが、これらのシステイン残基の例えばセリンへの突然変異はドメインの折りたたみに適合する。従って、分子量ステップサイズが適当な単位（１０ｋＤａステップ）であり、ペプチド結合のための１つのシステイン残基を有するように１単位（または必要な場合にはそれ以上）を工作することができるが、Ｉ２７の他の全ての単位はシステイン残基を欠損するＩ２７の提示システムを形成することができる。別の実施態様において、Ｉ２７の単位は他の反応性残基を欠損してもよい。これらの残基には、リジン、グルタメートおよびアスパルテートを挙げることができるが、それに限定されるわけではない。Ｉ２７のコピーはこれらの反応性残基の１つ以上を含有し、標的部分の共有結合のための制御された数の部位を提供してもよい。
【００２０】
好ましくは、反応性システインおよび／またはリジン基の数は、反応性システインおよび／またはリジン残基の任意の１つ以上を付加もしくは脱離することによってまたは無効にすることによって選択的に突然変異することによって上記の骨格タンパク質のいずれかを改変することによって制御することができる。
【００２１】
または、システイン残基を１つ有するまたはシステイン残基を持たないようにタイチンドメインの１つ以上を突然変異することができる。一実施態様において、提示システムは、１つ以上のＩ２７ドメインおよび標的部分のコピーを含み、Ｉ２７ドメインの１つは１つのシステイン残基を含み、他のＩ２７ドメインはシステイン残基を欠損する。好ましい実施態様において、提示システムは５つのＩ２７ドメインを含む。
【００２２】
別の実施態様において、提示システムのドメインは、スプライシング因子３ｂのサブユニット（サブユニット５）であるＩ３９ドメインを含んでもよい。Ｉ３９ドメインは１０ｋＤａドメインである。
【００２３】
以前に考察されているように、一実施態様において、提示システムは同じでないドメインを含んでもよい。例えば、提示システムは、少なくとも１つのＩ３９ドメインおよび少なくとも１つのＩ２７ドメインまたは標的部分もしくはその一部の少なくとも１つのコピー以外に上記の骨格タンパク質ドメインの任意の１つ以上を含んでもよい。一実施態様において、提示システムは、４つのＩ２７ドメインおよび１つのＩ３９ドメインまたは本明細書において先に記載する骨格タンパク質由来の上記のドメインから選択される任意の１つを含む任意の他の組み合わせを含んでもよい。
【００２４】
好ましくは、本発明のドメインまたは骨格タンパク質は適当な分子量であり、典型的には、利便性のために１０ｋＤａとして選択される。
【００２５】
好ましくは、提示システムは、異なる種類の単位もしくはドメインまたは数多くの同じドメインの混合物を含んでもよい。単位またはドメインは既知の分子量および／またはｐＩであってもよく、標的部分またはその一部に特異的な結合パートナーにブラインド（ｂｌｉｎｄ）、すなわち、無−反応であってもよく、従って提示システムの単位またはドメインは、それらが絶対的もしくは相対的に「免疫学的にブラインド」または「反応的に不活性」または実質的にそうであるように、識別することができると考えることができる。好ましい実施態様において、少なくとも１つのドメインは、標的部分またはその一部と異なる分子由来であるまたは異なる種である。
【００２６】
本明細書における提示システムへの言及は、タンデムに接続されている１つ以上の直鎖状の単位またはドメインを含む分子を含むが、これらに限定されないことが意図されている。
【００２７】
さらに別の実施態様において、提示システムは少なくとも１つの生物または非生物ポリマーを含んでもよい。非生物ポリマーの一例はＰＥＧ（ポリエチレングリコール）である。この実施態様において、提示システムは、従って、ペグ化されていると考えることができる。標的部分がペプチドまたはタンパク質である実施態様において、ＰＥＧポリマーは、少なくとも１つの標的部分のアミノ酸配列の官能基に結合されていてもよい。または、ＰＥＧポリマーは、提示システムの標的部分の少なくとも１つのコピー内に含有される糖鎖に結合されていてもよい。
【００２８】
種々の既知の方法を使用して、標的部分を提示システムに組み込むことができる。例えば、システイン残基のチオール基による共有結合。特定の態様において、標的部分を提示システムに結合してもよい。または、標的部分がタンパク質またはペプチドであり、提示システムもタンパク質またはペプチドである場合には、標的部分をコードするＤＮＡセグメントを提示システムをコードするＤＮＡに組み込み、その後既知のタンパク質発現方法を使用して提示システムと共に発現してもよい。
【００２９】
一実施態様において、提示システムがタンパク質またはペプチドである場合には、それは、安定した状態で折りたたまれている数多くのタンパク質ドメインを含んでもよい。提示システムの分子量を変更するために、ドメインの数を変更してもよい。好ましい実施態様において、少なくとも１つのドメインは、標的部分またはその一部からの共有結合を受容することができるアミノ酸を含有する。別の実施態様において、少なくとも１つのドメインまたは標的部分もしくはその一部の少なくとも１つのコピーは共有結合を提供するように改変してもよい。提示システムのドメインは、標的部分またはその一部は別として、不活性である、すなわち、これらのドメインは標的部分またはその一部の特異的な結合パートナーに無反応性である。「不活性な」ドメインは提示システムの分子量を制御して、試料の多重化を容易にする。本明細書における多重化への言及は、試験および提示システム試料の混合物を使用して、試験成分から誘導される信号および提示システムから誘導される信号を得る手法から誘導される情報の容易なデコンボリューションを意味する。
【００３０】
提示システムが取る形態は、検出および定量される標的部分の形態に依存する。例えば、定量される標的部分が核酸である場合には、提示システムは核酸の配列を含むことができる。提示システムは、既知の分子量のＤＮＡ単位またはドメインの配列を含んでもよい。または、提示システムはＲＮＡ単位を含んでもよい。または、標的部分がペプチドエピトープまたはタンパク質である場合には、提示システムもペプチド単位またはドメインを含み、ウェスタンブロット法またはＥＬＩＳＡを使用して、試料に存在する標的部分の量を定量することができる。ヘテロコンビネーションが提示システムを形成する、すなわち、提示システムはペプチドおよび核酸を含んでもよいことも想定される。
【００３１】
標的部分またはその一部はペプチドまたはタンパク質配列であってもよい。別の方法としてまたは追加として、標的部分またはその一部はエピトープまたは抗原配列であってもよい。提示システムの直鎖状配列内の標的部分またはその一部の位置は変わってもよい。本発明の一実施態様において、提示システムは、配列内に存在する標的部分またはその一部の１つのコピーを有してもよい。別の実施態様において、提示システムは、標的部分またはその一部の２つ以上のコピーを含んでもよい。特定の実施態様において、提示システムは異なる標的部分またはその一部を含んでもよい。例えば、一実施態様において、提示システムはタンパク質配列および金属または染料も含んでもよい。一実施態様において、標的部分の１つはＨｉｓ−タグであってもよく、別の標的部分はペプチドエピトープであってもよい。これらの実施態様において、標的部分またはその一部は、試料に存在する可能性のある標的部分でなくてもよい。
【００３２】
標的部分またはその一部は、提示システム内で直鎖状または分岐鎖状であってもよい。すなわち、標的部分は、骨格材料の側鎖を介する共有結合を有してもよい。本明細書における「分岐鎖状」への言及は非−直鎖状であることおよびポリマーは、ペプチド鎖の骨格ではなく側鎖または核酸の等価物を介する共有結合によって形成されることを意味する（骨格は、リボース／デオキシリボース環の炭素３と５の間のホスホジエステル結合によって形成される、核酸の他の部位への標的部分の共有結合は本明細書において分岐鎖状構造と同じである）。
【００３３】
本明細書におけるタンパク質または産物への言及は：タンパク質複合体または断片、酵素、酵素産物または結合物、一次代謝物、ホルモンまたは抗体を含むことが意図されている。
【００３４】
提示システムおよび／または標的部分がタンパク質またはペプチドである場合には、等電点（ｐＩ）は制御可能となりうる。この特定の実施態様は、使用する分離法が２−Ｄ電気泳動である場合に特定の利点を提供する。
【００３５】
本発明の特定の実施態様において、標的部分はタンパク質ＳＥＲＣＡ２ａを含む。提示システムはＳＥＲＣＡ２ａのエピトープを含んでもよい。ＳＥＲＣＡ２ａは、筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅファミリーの心筋アイソフォームである。好ましい実施態様において、ＳＥＲＣＡ２ａのエピトープはアミノ酸配列ＣＬＥＰＡＩＬＥを含む。
【００３６】
別の実施態様において、標的部分は、セリン−３８がリン酸化されているタンパク質ＳＥＲＣＡ２ａである。好ましくは、提示システムはこのタンパク質由来のエピトープを含む。好ましくは、エピトープはアミノ酸配列31ＫＬＫＥＲＷＧＳ（ＰＯ4）ＮＥＬ41を含む。
【００３７】
本明細書における特異的な結合パートナーへの言及は、標的部分のコピーに特異的な結合親和性を有し、それに結合することができる任意の分子をいう。
【００３８】
好ましくは、結合パートナーは、抗体、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはペプチドアプタマーまたは他の抗体等価物、染料、薬物および金属キレートを含む群から選択される。結合パートナーは標的部分と同じ種であってもよく、例えば、ポリペプチドのペプチドへの結合または核酸ポリマーの核酸ポリマーへの結合であってもよい。または、特異的な結合パートナーは標的部分と異なる種であってもよく、例えば、核酸ポリマーのペプチド／ポリペプチドへの結合、染料のペプチド／ポリペプチドへの結合であってもよい。標的部分が抗体である場合には、それはモノクローナルであってもよく、例えば、Ａ１または抗−ｈｉｓ６であってもよいが、これに限定されず、標的がポリクローナル抗体である場合には、それは例えば、ＰＳ−３８、ＰＴ−１７、ＣＬＥＰまたは抗−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ抗体であってもよいが、これに限定されない。結合パートナーが抗体である場合には、それは、ペプチドエピトープまたは染料エピトープを含む標的部分に特異的に結合することができる。特異的な結合パートナーが金属キレートである場合には、それは例えば、Ｎｉ＋ペルオキシダーゼの形態のニッケルイオンであってもよいが、これに限定されない。
【００３９】
本発明の特定の実施態様において、提示システムは少なくとも１つのＩ２７ドメインおよび／または少なくとも１つのＩ３９ドメインを含み、標的部分は、Ａ１（ＬＴＲＳＡＩＲＲＡＳ）、ＰＳ−３８（すでに規定されている）またはＰＴ１７ペプチド（ＲＳＡＩＲＲＡＳＴ（ＰＯ4）ＩＥＹ）から選択される。
【００４０】
従って、本発明は、単純で、信頼性があり、別個に実施された実験の結果の正確な比較も可能にする較正標準をさらに提供する。
【００４１】
本発明のさらに別の態様において、試料中に存在する可能性のある標的部分の量を定量する際に使用する産物であって、産物は複数の提示システムを含み、各提示システムは標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーおよび標的部分に共有結合している少なくとも１つのドメインを含み、ドメインは標的部分またはその一部の特異的な結合パートナーに無反応性であり、さらに各提示システムは、産物の他の提示システムと異なる分子量を有する産物が提供される。
【００４２】
本発明のよりさらに別の態様において、試料中の標的部分の量を定量するためのキットであって、キットが提示システムを含み、提示システムは本明細書において先に記載されているキットを提供する。必要に応じて、キットは、標的部分またはその一部に特異的な結合パートナーをさらに含む。提示システムのドメインは結合パートナーに「不活性」またはブラインドであってもよく、すなわち結合パートナーに結合しない。必要に応じて、キットは使用するための取扱説明書を含んでもよい。
【００４３】
本発明の一実施態様において、提示システムは陽性対照試料としてキットに提供される。キットは、抗体産物をさらに含。抗体産物は結合パートナーであってもよい。提示システムは、抗体結合パートナーと反応し、従って陽性対照を提供する標的部分またはその一部を含む。
【００４４】
本発明のよりさらに別の態様において、試料中に存在する可能性のある標的部分の量を定量するための、本明細書の先に記載されている産物（提示システム）の使用が提供される。
【００４５】
本発明のさらに別の態様において、標的部分を含有する可能性のある試料における標的部分の量を定量する方法であって、
ａ）結合パートナーによって認識可能な標的部分またはその一部の少なくとも１つのコピーおよび結合パートナーに無反応性の少なくとも１つのドメインを含み、標的部分の少なくとも１つのコピーが骨格の少なくとも１つのドメインに共有結合している提示システムを提供するステップと、
ｂ）特定の量で存在する提示システムに分離検出法を実施するステップと、
ｃ）提示システムによって形成される信号の強度対提示システムの量を含む少なくとも１つの比較ポイントを作成するステップ
を含む方法が提供される。
【００４６】
好ましくは、本発明の方法は、本明細書に先に記載されている特徴の任意の１つ以上を含む。
【００４７】
本明細書において分離に基づいた検出実験または技法の言及は、提示システムまたは試料のどちらかに存在する場合に、標的部分を特異的に認識する抗体または他の種類の特異的な結合パートナーによる検出に基づいた免疫学的アッセイなどの検出法を含むが、これらに限定されないと考えることができる。このようなアッセイには、ドットブロット、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、免疫沈降および蛍光偏光が挙げられる。または、本発明の方法は、ノーザンブロット法もしくはサザンブロット法などの他のブロットに基づいた検出実験もしくは技法またはＰＣＲを使用してもよい。分離に基づいた技法には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動、質量分析法および等電点電気泳動および上記の組み合わせ（例えば、２Ｄ電気泳動、ＨＰＬＣ−ＭＳ）も挙げることができる。本発明の方法は、ＥＬＩＳＡなどの技法に使用することもできることが想定される。別の実施態様において、質量分析法は、単離またはＨＰＬＣなどの他の検出方法との組み合わせにおいて検出方法として使用してもよい。技法の選択は、ユーザーの結合パートナーおよび標的部分の選択に依存し、本発明の範囲を限定することは意図されていない。分離法の適当な選択は本発明の以下におよび実施例に提供されている。
【００４８】
好ましくは、本発明の方法は、比較ポイントまたは多数の比較ポイントを試料と比較して、試料中に存在する標的部分の量を定量するステップをさらに含む。好ましくは、提示システムは既知の分子量のものである。別の方法としてまたは追加として、提示システムは既知のｐＩのものである。提示システムと、標的部分またはその一部を含有する可能性のある試料を比較するために、提示システムの分子量がわかることが特に有利である。一実施態様において、提示システムは１つの量で存在する。この実施態様において、１つの比較ポイントが作成される。従って、この実施態様において、提示システムは内部標準として使用することができると思われる。これは、標的分子の検出が適切に実施されたことを確認するために使用することができると思われ、提示システムは陽性対照および基準信号として作動する。標的分子が試料に存在しない状況においてこれは特に重要である（図２の例参照）。
【００４９】
本明細書において「提示システムの量」という用語の言及は、いくつかの態様において、提示システムが使用される濃度をいうことが考慮されうる。他の実施態様において、「提示システムの量」という用語は、提示システムが試料中に存在する密度をいうことが考慮されうる。密度は、いくつかの方法を使用して、例えば、試料の蛍光強度または光強度を検出して数値化することができる。
【００５０】
本発明の実施態様は、異なる生理的状態（例えば、発生の状態、疾病対対照等）から誘導される試料間でなされる、細胞または組織の一部または全てのタンパク質レパートリーを比較する際に使用することができることが想定される。リンタンパク質および糖タンパク質などのある形態のタンパク質の翻訳後修飾を染色することが今や可能である。好適に修飾されたペプチド構造（ホスホペプチド、グリコペプチドまたは他の修飾ペプチド）である標的部分を含む提示システムを含む内部標準を実験デザインに組み入れることによりデータの定量を改善すると思われ、平行して実施された実験間または別個に実施された実験間の結果の容易な比較を可能にすると思われる。
【００５１】
好ましくは、提示システムは一連の種々の量で存在する。この実施態様において、多数の比較ポイントを作成することができ、従って検量線を作成することができる。
【００５２】
一実施態様において、次いで作成された比較ポイントまたは検量線を使用して、試料中の標的部分の量を定量することができる。特に、本発明によって作成される比較ポイントまたは検量線は、提示システムの一部としての標的部分または一部によって作成される信号強度を提示システムの濃度に対してプロットする。次いで、さらに別の分離を使用する検出法を、標的部分を含有する可能性のある試料に実施することができる。または、さらに別の分離を使用する技法を、提示システムと同時に試料に実施することができる。任意の信号が観察される場合には、次いで信号の強度を求めることができる。次いで、比較ポイントを使用して、較正点または検量線において標的の量と比較して試料中の標的部分の量を表し、試料に存在する標的部分の量を求めることができる。試料または提示システムによって形成される信号は、例えば、化学発光であってもよいが、これに限定されない。他の検出方法には、ペルオキシダーゼに基づいた抗−ＩｇＧの４−メトキシ−ナフトール／Ｈ2Ｏ2などの不溶性着色産物である酵素触媒による検出のための発色基質または抗体もしくはプロテインＡもしくはプロテインＧなどの検出試薬に結合しているフルオロフォアを使用する蛍光に基づいた検出システムが挙げられる。放射能125Ｉ標識抗体またはプロテインＡもしくはプロテインＧ。別の実施態様において、提示システムへの染料の結合に関係する検出方法を使用してもよい。使用することができると思われる染料には、リン酸化アミノ酸を含有するタンパク質の染料であるＰｒｏ−Ｑダイアモンド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）および炭水化物を含有する部分の染料であるＰｒｏ−Ｑエメラルド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ＯＲ，  ＵＳＡ）が挙げられるが、それに限定されるわけではない。他の結合パートナーが、薬物または候補薬物分子などの他の化学分子であってもよい。
【００５３】
この実施態様または他の実施態様において、検出法はＩＮＤＩＡ（登録商標）ＨｉｓＰｒｏｂｅ（登録商標）−ＨＲＰ化学を使用するステップを含んでもよい。Ｐｅｒｂｉｏ（登録商標）ＩＮＤＩＡ  ＨｉｓＰｒｏｂｅ（登録商標）−ＨＲＰプローブは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）のニッケル（Ｎｉ2+）−活性化誘導体である。活性リガンドは、標的部分のその後の相互作用および検出のためにＮｉ2+を活性型で結合させることができる三座配位子キレート剤である。活性なキレート剤は、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に長い間使用されているイミノ二酢酸について報告されているものと同様の結合能力を有する。ＩＮＤＩＡ（登録商標）ＨｉｓＰｒｏｂｅ（登録商標）−ＨＲＰ化学以外に、さらに別の検出法、例えば、化学発光基質技術を使用してもよい。または、他の分離法を使用してもよい。
【００５４】
提示システムが、試料のＳＥＲＣＡ２ａと別個である十分に集束されているまたは異なったバンドとして移動するように、分離法、例えば、ブロットに基づいた技法を提示システムに実施することができる。分離法が実施されたら、本発明の方法により、ユーザーは試料から提示システムを明らかに誘導することができる。これは多重化の一例である。従って、本発明は、分離法実験からの真の定量データの作成を可能にする方法を提供する。
【００５５】
一実施態様において、２つ以上の提示システムを使用して、試料中の標的部分の量を定量することができる。この実施態様において、各提示システムは、使用する他の提示システムと異なる分子量を有してもよい。例えば、１つだけのドメインを含む提示システムを、２、３、４、５またはそれ以上のドメインを含有する提示システムと同じレーンまたはチャネルに置き、異なる分子量の提示システムの「ラダー」を提供してもよい。好ましくは、提示システムの各々は、標的部分を含有する可能性のある試料との比較を容易にするために、同じ標的部分またはその一部のコピーを有する。
【００５６】
この実施態様において、各提示システムは、他の提示システムと異なる濃度または量で存在してもよい。または提示システムは同じ濃度または量で存在してもよい。１つ以上の分離を使用する検出法を、複数の提示システムに実施してもよい。次いで、分離を使用する検出法の結果を使用して、試料中に存在する標的部分の量を求めるために使用することができる検量線を作成することができる。
【００５７】
従って、一実施態様において、提示システムはブロットの１チャネルに存在し、標的部分を含む可能性のある試料は別のチャネルに存在する。異なる分子量の複数の提示システムを使用する実施態様では、提示システム試料の全てを１つのチャネルにロードして、１つのレーンにいくつかの基準ポイントを提供することができる。同様に、異なる濃度で存在する複数の提示システムを含有する試料を使用する実施態様において、特定の提示システムを含有する各試料を同じレーンにロードして、１つのレーンに異なる濃度の例を提供することができる。本発明のこのような実施態様では、本発明の方法により、提示システムおよび標的部分を含有する可能性のある試料の１つの実験における同時の調査が可能になる。この実施態様は、有利なことに、分離を使用する技法が同時に両方に実施されるにもかかわらず、提示システムと試料間の明白な区別を提供する。
【００５８】
または、提示システムおよび試料はブロットの同じチャネルまたはレーンに存在してもよい。
【００５９】
実施態様は、特異的な結合パートナーである薬物分子に結合することができる標的部分またはその一部を含む提示システムを提供する。次いで、提示システムによって作成される信号の強度を、試料の信号強度と比較することができる。
【００６０】
別の実施態様において、結合パートナーは染色液または染料であってもよい。１つのこのような染色液は、標的部分またはその一部が糖タンパク質である場合に結合パートナーとなりうるＰｒｏ−Ｑエメラルド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）である。結合パートナーとしての染色液のさらに別の例は、リンタンパク質を含む標的部分に結合することができるＰｒｏ−Ｄダイヤモンド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）である。結合パートナーが染料または染色液である場合には、提示システムのドメインは実質的に「サイレント（ｓｉｌｅｎｔ）」であるべきであり、染料または染色液によって強力に認識または検出されてはいけない。
【００６１】
好ましくは、結合パートナーはアプタマーである。アプタマーは、アミノ酸、薬物、タンパク質および他の分子に対して作製することができる人工核酸リガンドと規定されている新規合成ＤＮＡまたはＲＮＡリガンドである。アプタマーは２本鎖ＤＮＡリガンドまたは１本鎖ＲＮＡリガンドであってもよい。それらは、吸着、回収および増幅の反復プロセスによって合成核酸の複雑なライブラリーから単離される（ＳＥＬＥＸ）。ＲＮＡアプタマーは、特異的な標的分子に対する親和性を有する核酸分子である。それらは、リガンド結合特性のために核酸抗体に結合している（ｌｉｋｅｎｅｄ）。
【００６２】
提示システムは、タグまたは検出可能な分子をさらに含んでもよい。タグは、提示システムの精製の機能を実施することができる。タグの位置は、提示システムのアミノ酸配列に関してアミノ末端もしくはカルボキシ末端であってもよくまたは内部に挿入されてもよいことが考慮される。タグまたは検出可能な分子の他の例には、ポリＨｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ、ＳＴＲＥＰ、ＧＳＴまたはＧＦＰなどの蛍光標識を挙げることができるが、それに限定されるわけではない。別の実施態様において、タグは提示システムの標的部分またはその一部を含んでもよい。
【００６３】
別の実施態様において、免疫沈降を分離方法として使用してもよい。免疫沈降は、抗体を形成した特異的なタンパク質の精製を可能にする技法である。従って、免疫沈降は、提示システムの一部を形成する標的部分またはその一部に対する抗体を使用して提示システムを単離するために使用することができ、次いで存在する場合には、試料から標的部分を単離するために使用することもできる。免疫沈降に次いで、分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット法を実施することができる。本発明のこの実施態様において、免疫沈降の派生物である、特定の標的材料の「プル−ダウン」を可能にするアフィニティー相互作用、例えば、（ｈｉｓ）6タグ化タンパク質をプルダウンするＮｉ−ＮＴＡビーズ、ＧＳＴ−タグ化タンパク質をプルダウンするグルタチオンビーズを使用してプロセスにおける段階の効率をモニターすることができる。
【００６４】
本発明は、提示システムの制御された予測可能な製造を提供する。さらに、それは、提示システムのほぼ一様な電気泳動挙動ならびに試験試料および提示システム試料の多重化を含む高品質の特徴を示す較正標準を提供する。これは、試料スループットの増加という利点を有する。
【００６５】
本発明のよりさらに別の態様において、試料中のＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の量を定量する方法であって、
ａ）抗体によって認識可能なＳＥＲＣＡ２ａのエピトープの少なくとも１つのコピーおよび抗体に無反応性のタイチンタンパク質由来の少なくとも１つのＩ２７ドメインを含み、既知の分子量のものであるタンパク質を提供するステップ、
ｂ）特定の濃度で存在するタンパク質にウェスタンブロットを実施するステップ、
ｃ）タンパク質によって作成される信号強度対タンパク質の濃度を含む少なくとも１つの比較ポイントを作成するステップ
を含む方法が提供される。
【００６６】
好ましくは、タンパク質は一連の異なる濃度で存在し、比較ポイントは複数の比較ポイントを含み、検量線を提供する。好ましくは、次いで、比較ポイントまたは検量線を使用して、試料によって作成される信号強度と検量線を比較することによって、試料に存在するＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の量を求める。好ましい実施態様において、エピトープはアミノ酸配列ＹＬＥＰＡＩＬＥを含む。
【００６７】
別の実施態様において、ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質はセリン−３８がリン酸化されている。好ましくは、タンパク質は、リン酸化ＳＥＲＣＡ２ａタンパク質のエピトープを含む。特定の実施態様において、エピトープはアミノ酸配列31ＫＬＫＥＲＷＧＳ（ＰＯ4）ＮＥＬ41を含む。
【００６８】
本発明のよりさらに別の態様において、試料のタンパク質エピトープの量を定量するための方法であって、
（ｂ）タンパク質エピトープの少なくとも１つのコピーおよび少なくとも１つのさらに別のタンパク質ドメインを含み、既知の分子量のタンパク質提示システムを提供するステップ、
ｂ）提示システムにウェスタンブロット実験を実施するステップであって、提示システムが特定の濃度で存在し、ウェスタンブロット実験が標的部分に特異的な結合パートナーを使用し、さらに提示システムのタンパク質ドメインが結合パートナーに無反応性であるステップと、および
ｃ）技法において提示システムによって形成される信号強度対提示システムの濃度を含む比較ポイントを作成するステップ
を含む方法が提供される。
【００６９】
好ましくは、提示システムは一連の異なる量で存在し、比較ポイントは、検量線を作成するために使用することができる複数の比較ポイントである。一実施態様において、提示システム内の標的部分の数の制御は、望ましい数の反応性残基を有するタンパク質を選択することによってまたはタンパク質エピトープの共有結合のための限られた数のアクセプター部位を含有するようにタンパク質の配列を工作することによって実施することができる。好ましい実施態様において、共有結合のための部位は１つだけである。別の実施態様において、タンパク質ドメインに結合して、提示システムを形成するためのタンパク質エピトープの部位は２つ以上であってもよい。本発明の利点は、提示システムの分子量は制御可能であるということである。これは、安定した状態で折りたたまされている数多くのドメインから作成される提示システムを使用することによって達成される。この実施態様において、ドメインはタンパク質ドメインである。提示システムにおけるドメインの数を変更することによって、提示システムの分子量を変更することができる。好ましい実施態様において、これらのドメインの１つは、修飾されているエピトープタンパク質からの共有結合を受容することができるアミノ酸を含有する。他のドメインはこの意味において不活性であるが、提示システムの分子量を制御するために存在し、試料の多重化を容易にし、多数の要素が存在する場合には、多数の提示システム要素の分離を容易にする（例えば、本明細書において以下に記載するシングルショットアプリケーション、２Ｄ電気泳動の内部標準）。
【００７０】
本発明は、有利なことに、広いＭｒ範囲において（１０ｋＤａ〜２５０ｋＤａまたはそれ以上、または必要がある場合にはそれ以下）提示システムの分子量の正確な制御を可能にする。結果として、本発明は、標準および試験試料の多重化にフレキシビリティを提供する。それはまた、「シングルショット」における較正基準範囲の分注を可能にし、エンド−ユーザーの利便性を最大にする、較正基準技術の先端的なフォーマットの開発を可能にする。好ましい実施態様において、異なる分子量を有してもよい一連の提示システムに、分離法を実施すると同時に１つのチャネルにロードする。この実施態様は、必要がある場合には、試料と比較するための種々の較正基準をユーザーに提供する。好ましい実施態様において、本発明の方法は、１つの実験で使用されて範囲を提供することができる複数の提示システムを使用する。複数の提示システムは異なる分子量であってもよく、特定のモル比で混合またはブレンドされて、１つの分離を使用する実験に使用することができるある範囲の提示システムを作成してもまたは２つの検出を同じ提示システムにおいて実施してもよい。
【００７１】
本発明は、例にすぎないものとして添付の図面を参照することによってここで説明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
（構築物Ａ：−（Ｉ２７）5）
タイチンのＩ２７ドメインに関しては、システイン残基Ｃ４７はエピトープペプチドの共有結合部位である。（実施例２、セクション「タイチンＩ２７ドメインを含む骨格タンパク質を含む提示システムの実施態様の製造（詳細は（Ｉ２７）5と示されている）参照）。連続するＩ２７の５つのコピーをコードする合成遺伝子を構築した。Ｉ２７のコピー１、２、４および５はシステイン残基を欠損するが、コピー３はペプチド結合のために１つのｃｙｓを保持する。（Ｈｉｓ）６モジュールは産物の精製のために含まれる。リンカー領域は独自の配列および制限部位を含有する（図４Ａ参照）。
【００７３】
ヒトタイチン分子の５つのＩ２７ドメインを含む構築物をｐＥＴ３ｄのＨｉｓ６タグの下流に挿入した。ドメインＩ２７1、Ｉ２７2、Ｉ２７4、Ｉ２７5はシステイン残基が以下の突然変異Ｃ４７ＳおよびＣ６７Ｓで脱離されている。ドメインＩ２７３は６３位（Ｃ６３Ｓ）のシステイン残基が脱離されているが、４７位にシステイン残基を保持する（図４Ａ参照）。
【００７４】
ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞系統（Ｎｏｖａｇｅｎ）において構築物を発現し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導の４時間後に細胞を回収した。（Ｉ２７）5構築物の略図は図４Ａ参照。構築に使用される独自の制限部位を図４Ａに示す。
【００７５】
（構築物Ｂ：−Ｉ３９（Ｉ２７）4）
「Ｉ３９」という用語は、マウススプライシング因子３ｂ、サブユニット５遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＢＣ００６６０３）のＩＭＡＧＥコンソーシアムによって提供されるｃＤＮＡクローンであるＩＭＡＧＥクローン３９６５９５１の略語として使用されている。マウススプライシング因子３ｂ、サブユニット５遺伝産物は、１つのシステイン残基を含有する１０ｋＤａタンパク質である。
【００７６】
Ｉ３９  ｃＤＮＡを増幅し、隣接する制限酵素認識部位、ＢｓｓＨＩＩ（５−ｐｒｉｍｅ）およびＳａｃＩ（３−プライム）の付加を工作するためにＰＣＲを使用した。これらの２つの制限酵素を使用して、（Ｉ２７）5構築物の中心のＩ２７3ドメイン（図４Ａ）をＩ３９  ｃＤＮＡ配列と置換して、Ｉ３９（Ｉ２７）4構築物（図４Ｂ）を作製した。図４Ｂは、構築に使用される独自の制限部位を示す。
【００７７】
ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞系統（Ｎｏｖａｇｅｎ）においてＩ３９（Ｉ２７）4構築物を発現し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導の１時間後に細胞を回収した。
【００７８】
（構築物Ｃ：−Ｉ３９ｐＥＴ１４ｂ）
「Ｉ３９」という用語は、上記に考察するように、マウススプライシング因子３ｂ、サブユニット５遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＢＣ００６６０３）のＩＭＡＧＥコンソーシアムによって提供されるｃＤＮＡクローンであるＩＭＡＧＥクローン３９６５９５１の略語として使用されている
【００７９】
Ｉ３９  ｃＤＮＡを増幅し、隣接する制限酵素認識部位、ＢａｍＨＩ（５−ｐｒｉｍｅ）およびＢｌｐＩ（３−ｐｒｉｍｅ）の付加を工作するためにＰＣＲを使用した。これらの２つの制限酵素を使用して、発現ベクターｐＥＴ１４ｂ（Ｖｏｖａｇｅｎ）の相反部位にＰＣＲ産物をクローニングした。構築目的のために、タンパク質のＣ−末端残基を改変した、Ｎ１１１Ｔ。Ｉ３９ｐＥＴ１４ｂ構築物をロゼッタ−ガミ（Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ）Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞系統（Ｎｏｖａｇｅｎ）において発現し、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導の４時間後に細胞を回収した。
【実施例１】
【００８０】
本発明の方法を使用して、試料中のタンパク質ＳＥＲＣＡ２ａを検出した。ＳＥＲＣＡ２ａのＣ−末端を認識する抗体α−ＣＬＥＰＡＩＬＥの提示システム（較正基準）は、０．１マイクロモルのペプチドＹＬＥＰＡＩＬＥ（１文字コード）を５マイクロモルのスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）と反応させ、ゲルろ過クロマトグラフィーによってペプチド−クロス−リンク複合体を精製し、９Ｍ尿素の存在下において（Ｉ２７）5（０．０２マイクロモル)と共にペプチド−クロス−リンク産物をインキュベーションすることによって較正ＳＥＲＣＡ−ＰＳ３８について記載するように構築した。実施例２のセクション「構成基準（提示システム）のＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８認識」に詳細に記載するように、産物を水で透析し、ＢＣＡアッセイおよび質量分析を使用してタンパク質濃度を求めた。
【００８１】
（心筋筋小胞体試料におけるＳＥＲＣＡの定量）
心臓筋小胞体（１０μg）および較正−ＣＬＥＰＡＩＬＥ基準（１５〜０．０５ｐｍｏｌ）を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの個々のレーンで分離した。試料をＰＶＤＦ膜に移し、ＳＥＲＣＡ２ａ配列ＬＥＰＡＩＬＥ（１：５０００希釈）に特異的な抗体でプロービングした。ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ペルオキシダーゼおよび市販の化学発光基質調製物（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してエピトープに結合する抗体を検出した。ＣＣＤカメラを使用して化学発光を検出した（図３）。
【００８２】
試料中のＳＥＲＣＡ２ａの量の定量は、デンシトメトリーによる試料の分析バンド強度および構成基準によって実施することができる。提示システム（較正基準）の量に対する光学密度（バックグラウンド信号を補正）のプロットを作成するべきである。このプロットは較正基準曲線であると考えられる。試料のＳＥＲＣＡ２ａタンパク質含量は、このプロットから試料の光学密度信号（バックグラウンドを補正済み）をエピトープのｐｍｏｌｅに変換することによって、較正基準曲線を使用して算出することができる。
【００８３】
上記の実施例は、本発明の提示システムおよび方法を使用して試料中の標的部分をポジティブに同定し、試料中の標的部分の量を定量することができる方法を示す。
【実施例２】
【００８４】
実施例２は、提示システムおよび本発明の方法を使用して試料中の標的部分をネガティブに同定することができる方を示す法、すなわち標的部分が試料中に存在しない。
【００８５】
筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）のセリン−３８のリン酸化を検出するために本発明の方法を使用した。標準的なウェスタンブロット方法は、キナーゼ処理した筋小胞体小胞および単離ラット心室筋細胞においてセリン−３８リン酸化Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅを検出しなかった。
【００８６】
心筋アイソフォームの筋小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）のセリン−３８のリン酸化は、酵素活性をかなり大きく増強することができる通常の事象と記載されている。これらの観察の直接確認は現れそうにない。Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅのリン酸化セリン−３８エピトープに完全に特異的であるポリクローナル抗体を使用して、単離筋小胞体小胞および単離心室筋細胞におけるＳＥＲＣＡ２ａのリン酸化を評価した。定量的なウェスタンブロット方法は、キナーゼ処理した筋小胞体小胞または好適に刺激した心筋細胞においてセリン−３８リン酸化Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅを検出しなかった。本発明の提示システムは、アッセイの検出感度（０．０３〜０．１ｐｍｏｌ）はＣａ２＋−ＡＴＰａｓｅ分子のセリン−３８のわずか１％のリン酸化を検出するのに十分であることを確認した。１００ｋＤａのリンタンパク質はウサギ心臓ＳＲ調製物において明らかであったが、それはホスホ−セリン−３８特異的抗体（２）によって認識されなかった。
【００８７】
（ホスホ−特異的抗体の作製）
ペプチド31ＫＬＫＥＲＷＧＳＮＥＬ41のＣａＭＫＩＩリン酸化によって、Ｓｅｒ−３８残基がリン酸化されたＣａ2+−ＡＴＰａｓｅペプチド（31ＫＬＫＥＲＷＧＳ(ＰＯ４)ＮＥＬ41）を作製した。逆相高速液体クロマトグラフィーによってホスホペプチドを均一になるまで精製した。カルボジイミド架橋（３）を使用して、ペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合し、緩衝液（５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．２、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ）で十分に透析した。ニュージーランドシロウサギ成獣を〜１５０μgのＫＬＨで免疫し、６週間隔でペプチドを付着し、免疫化後１１日めに免疫血清を回収した。血清を調製し、−７０℃で保存した。ポリクローナル抗血清は本明細書に記載されている。ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８はリン酸化ペプチドに対して形成された。
【００８８】
（タイチンＩ２７ドメインを含む骨格タンパク質を含む提示システムの実施態様の製造（（Ｉ２７）5と示す））
タイチンのＩ２７の突然変異型のコンカテマーをコードする遺伝子を使用した。構築物は、２つのＣ−末端システイン残基が欠損しているという点においてＢｒｏｃｋｗｅｌｌら（４）に記載されているものと異なる。それは本発明の検討において（Ｉ２７）5と呼ぶ。Ｂｒｏｃｋｗｅｌｌら（４）に記載されているように、（Ｉ２７）5を発現し、精製した。
【００８９】
（提示システム：コンカテマーに結合したペプチドを含む実施態様）
０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有する緩衝液ｐＨ７．２中で、精製したリン酸化Ｓｅｒ−３８ペプチド（31ＫＬＫＥＲＷＧＳ(ＰＯ4)ＮＥＬ41）（０．１μｍｏｌ）を過剰量のスルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）架橋剤（５μｍｏｌ）と混合した。室温において１時間インキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ＨＲ  １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用するゲルろ過クロマトグラフィーによってマレイミド−活性化ペプチドを精製した。クロマトグラフィーは、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２および流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎを使用して実施した。関心対象の分画をプールし、尿素を分画に添加して、最終尿素濃度を９Ｍにした。（Ｉ２７）5コンカテマー（０．１μｍｏｌ）を混合物に添加し、室温において２時間インキュベーションした。結合物を水で十分に透析した。最終産物（本発明による提示システム）を−２０℃において保存した。同じ手法を実施してＳＥＲＣＡ２ａペプチド（ＹＬＥＰＡＩＬＥ）を（Ｉ２７）5コンカテマーに結合して、別の提示システムを製造した。ＢＣＡアッセイ（５）によってタンパク質濃度を求めた。
【００９０】
（イムノブロット分析）
Ｌａｅｍｍｌｉ（８）によって記載されているように、１０％および１５％ポリアクリルアミドゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって心筋タンパク質を分離した。分離後、セミドライブロッティングによってタンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ  ＢｉｏＳｕｐｐｏｒｔ，  Ｐｏｒｔｍｏｕｔｈ，  ＵＫ）に移し、５％ドライミルクおよびＴｒｉｓ−緩衝生理食塩液（ｐＨ  ７．４）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を使用して室温において２〜４時間非特異的結合部位をブロックした。膜を一次抗体：Ｔｈｒ−１７リン酸化型のホスホランバンのＰＴ−１７（１：５０００）（６）；ＳＥＲＣＡ２ａのα−ＣＬＥＰ（１：５０００）（１６）；およびＳｅｒ−３８リン酸化型のＣａ2+−ＡＴＰａｓｅに特異的なＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８（１：５０００）抗血清で４℃において終夜プロービングした。ウサギにおいて形成した西洋ワサビペルオキシダーゼ−標識二次抗体（ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；ロットナンバー３８１７９）またはプロテインＡペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）を２つの高感度化学発光検出システム（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＳｕｂｓｔｒａｔｅおよびＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，Ｐｉｅｒｃｅ）と併用使用して、一次抗体を可視化した。Ｆｕｊｉ  ＬＡＳ−１０００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＣＣＤ  Ｃａｍｅｒａ（分析用ＡＩＤＡソフトウェア）を使用してデータを捕獲した。
【００９１】
ＳＥＲＣＡ２のＳｅｒ−３８のリン酸化は、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ活性をかなり大きく活性化することができる通常の特徴と記載されている。この部位は、ＳＥＲＣＡ２に独自であるが、ＳＥＲＣＡ１とＳＥＲＣＡ２の間で、特に残基３９の前方で高度に保存されているタンパク質セグメント内に含有される。従って、２つのタンパク質はこの領域において同等の構造を示す可能性がある。２つの高解像度構造が存在するＳＥＲＣＡ１との類似によって、ＳＥＲＣＡ２のリン酸化のＳｅｒ−３８部位は、タンパク質の表面に露出している可動性の大きいセグメントであることが予測される。このセグメントは、酵素の配座の両極端（Ｅ１、Ｅ２）において溶媒露出を維持し、これらの状態においてキナーゼおよびホスファターゼに接近しやすいと思われる。これらの特性により、表面に露出しているとき、部位に抗体を結合させ、可動性を大きくする。本発明者らは、心筋におけるＳｅｒ−３８リン酸化の頻度および役割を規定する目的で、この特徴に対するリン酸化−部位特異的抗体を作製した。ポリクローナル抗体を配列31ＫＬＫＥＲＷＧＳ(ＰＯ４)ＮＥＬ41に対して作製し、示すようにＳｅｒ−３８をリン酸化した。ホスホペプチドは抗原に結合する抗体の強力な阻害剤でったが（ＩＣ５０  １８  ｎＭ）、等価な脱リン酸ペプチドは抗体：抗原認識を妨害することができなかったので、このポリクローナル抗血清、ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８はリン酸化ペプチドに完全に特異的であった。
【００９２】
（較正基準（提示システム）のＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８認識）
ポリクローナル抗体ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８がリン酸化Ｓｅｒ−３８エピトープに完全に特異的であることを確認し、本発明者らは、ＣａＭＫＩＩに心臓ＳＲ小胞を接触後、ＳＥＲＣＡのこの残基のリン酸化状態を調査した。ＳＥＲＣＡはこれらのウェスタンブロット実験において検出されなかった。ネガティブな結果は、抗体または実験の技術的な失敗を記録するのではなく、Ｓｅｒ−３８リン酸化の頻度に関する情報を提供していることを確実にするために、このネガティブな結果の基礎を確立することが重要であった。このために、本発明者らは、既知の分子量の不活性な骨格タンパク質に結合している標的部分、この場合には、ホスホペプチドエピトープを含む提示システムを構築した。この骨格タンパク質は、ペプチド結合のための１つの部位を含有し（図１Ａ）、正確な定量に理想的なエピトープペプチドの提示のための均一な構造を提供するので、選択した。
【００９３】
使用した提示システムは、コンカテマー配列から１つ以外の全てのシステイン残基を脱離させるように突然変異された、タイチン由来のドメイン（Ｉ２７）の５つのコピーからなるコンカテマーを含んだ（図１Ａ）。標的部分、この場合には、精製ホスホエピトープペプチドを、タンパク質のシステイン残基のみを介して（Ｉ２７）5コンカテマーに結合し（図１Ａに略図で示す、Ｉ２７ドメイン３のＣ４７）、ペプチドの共有結合の化学量論は質量分析によって評価した。コンカテマーへのペプチド結合の低い化学量論（最終産物の質量５４１２４Ｄａ、標識較正−３８、図１Ｂ）がこの場合に観察され、総調製物の５．４％を含む。にもかかわらず、コンカテマーへの結合はこのような低いレベルでも免疫検出に十分であることが証明された（図１Ｃ）。抗体ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８は関連するホスホペプチド（較正−３８）で修飾されたコンカテマー産物を認識したが、６０ｐｍｏｌのコンカテマーが提供された場合でも、関係のないペプチド（較正−αＣＬＥＰ）で修飾された同じコンカテマー（Ｉ２７）5を認識しなかったことを図１Ｃは示している。較正基準は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて〜６０ｋＤａの単一の分子種として移動する。さらに、リン酸化エピトープは、標準的な（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ，Ｐｉｅｒｃｅ）ＥＣＬ基質を使用すると、抗体ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８によって高感度で、０．１ｐｍｏｌエピトープペプチドの下限まで検出された（図１Ｃ）。
【００９４】
較正基準（較正−３８）は若干の少量の夾雑物を含有した。質量スペクトルに見られる５１２３０Ｄａの夾雑物はペプチドを受容するとは思われない（ウェスタンブロット実験では検出されない、図１Ｃ）。この物質は、総タンパク質にかなり寄与したので、産物（較正−３８）の割合の算出に含まれた。（Ｉ２７）5調製物の第２の夾雑物はペプチドによって共有結合により標識される。それは高Ｍｒ（〜２５０ｋＤａ、図１Ｃ）の複合体の免疫染色に内在する。この産物は質量スペクトルにおいて検出されず、較正−３８調製物において低量が存在する。それは総タンパク質に大きな寄与をせず、この検討において実施される定量における考慮から除外された。
【００９５】
従って、ＳＥＲＣＡリン酸化は、すべてに生ずる場合には、検討した細胞（１０，０００の生筋細胞）において０．０３ｐｍｏｌ未満のＳｅｒ−３８リン酸化を形成すると本発明者らは結論づける。以前の検討において、同様の介入後の筋細胞におけるホスホランバンのＳｅｒ−１６リン酸化は８．５ｐｍｏｌ／１，０００細胞であると定量されており（７）、本発明の検討の１０，０００細胞において少なくとも８５ｐｍｏｌのホスホランバンが存在することを示す。ホスホランバンおよびＳＥＲＣＡは心筋において同様の量で発現されるので（ＳＥＲＣＡあたり２ホスホランバン、（１））、本発明者らは、実施した実験において４２ｐｍｏｌのＳＥＲＣＡを予測してもよい。本明細書に記載する抗体でＳｅｒ−３８ホスホタンパク質を検出できなかったのは、ＣａＭＫＩＩ刺激物質で処理したラット心筋細胞ではＳＥＲＣＡは０．１％未満しかリン酸化されないことを示唆している。本発明の検討は、ＳＥＲＣＡ２のリン酸化Ｓｅｒ−３８エピトープに完全に特異的なポリクローナル抗体を記載している。抗体は、較正基準のリン酸化エピトープを高感度（０．０３〜０．１ｐｍｏｌ）で検出することができた。しかし、大量のＳＥＲＣＡ（１０〜６０ｐｍｏｌ）の提示および１００ｋＤａのホスホタンパク質の存在にもかかわらず、それは種々の動物種由来の心臓ＳＲ試料においてＳＥＲＣＡ２を認識しなかった。ＳＥＲＣＡはＳｅｒ−３８がリン酸化されないことまたはＳＥＲＣＡ分子は少量しか（すなわち、〜１％）Ｓｅｒ−３８がリン酸化されないことをこれは示している。単離心筋細胞のＣａＭＫＩＩ活性化は、４つの独立した刺激を使用して実施し、ホスホランバンはＴｈｒ−１７がリン酸化された。同じ実験において較正基準の免疫検出は０．０３ｐｍｏｌであるにもかかわらず、これらはどれもこの抗体を使用して検出可能なＳＥＲＣＡのＳｅｒ−３８リン酸化を生じなかった。無傷の心筋細胞におけるＣａＭＫＩＩ活性化刺激に応答して、ＳＥＲＣＡ分子の０％〜０．１％がＳｅｒ−３８がリン酸化されていることをこれは示している。この検討は、ＳＥＲＣＡ２ａのＳｅｒ−３８リン酸化は心筋細胞または心臓ＳＲ調製物において重要な事象であるという証拠を提供していない。
【実施例３】
【００９６】
図５に示すように、３つの異なるペプチド（ＰＳ−３８、ＰＴ−１７およびＡ１）を、チオール特異的なマレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）反応基を介して同じ構築物および同じでない構築物の遊離チオール基に結合した。（Ａ）＝（Ｉ２７）5＋ＰＳ−３８、ＰＴ１７またはＡ１。（Ｂ）＝Ｉ３９−（Ｉ２７）4＋ＰＳ−３８、ＰＴ１７またはＡ１（Ａ＝マーカー、ｋＤａ＝キロダルトン）。
【００９７】
結合反応は、ＧＭＢＳ−修飾ペプチド（Ｈ2Ｏに溶解）に対するコンカテマー（同じおよび同じでない）（２０ｍＭ  ＮａＰＯ4、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび８Ｍ尿素を含有する結合緩衝液に溶解）のモル比１：１００を混合するによって実施した。ＧＭＢＳはヘテロ二官能性架橋剤である。本明細書において使用するとき、それはチオール指向性反応性基を含有する。ＧＭＢＳのアミン反応基は、ペプチドの化学合成中にペプチドのＮ−末端に分子を結合するために使用された。混合物を室温において２時間放置した。
【００９８】
各反応の試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ウェスタンブロットのために終夜移動させた。各ペプチドに特異的な抗体を使用して、結合物を検出する。
ＰＳ−３８一次抗体＝ウサギ抗−ＰＳ−３８ポリクローナル（５０００倍希釈）。
ＰＴ１７一次抗体＝ウサギ抗−ＰＴ１７ポリクローナル（５０００倍希釈）。
Ａ１一次抗体＝マウス抗−Ａ１モノクローナル（５０００倍希釈）。
【００９９】
二次抗体を使用して一次抗体の信号を増幅する。ウサギ一次抗体には、ヤギ−抗−ウサギＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）二次抗体を使用する（５０００倍希釈）。マウス一次抗体には、ヤギ−抗−マウスＨＲＰ二次抗体を使用する（５０００倍希釈）ブロットは、Ｐｅｒｂｉｏ  ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔキット（反応の詳細は上記参照）を使用して画像化した。
【実施例４】
【０１００】
（関連のない抗体との結合は交差−認識がない）
（実施例３と同様に）Ａ１、ＰＳ−３８またはＰＴ１７ペプチドに結合した（Ｉ２７）5およびＩ３９−（Ｉ２７）4の試料ならびにネイキッド（未結合）コンカテマー骨格を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにトリプリケートで泳動させた。次いで、ウェスタンブロットのための膜にゲルを終夜移動させた。次いで、膜を３つに分割し、各ペプチドのエピトープに特異的な抗体でプロービングした。従って、抗体は特異的なエピトープだけを認識し、異なるペプチドのエピトープまたはコンカテマー自身の任意の部分を認識しないはずである。各抗体は、形成されたペプチドの特異的なエピトープだけを認識し、任意の他のペプチドのエピトープを認識しないことを示すウェスタンブロット（データは示していない）を本発明者らは作製した。また、抗体はネイキッドコンカテマー（標的部分を含有しない提示システム）自体を認識せず、結合しない。
【実施例５】
【０１０１】
（異なるサイズの結合物（提示システム）のブレンド）
同じ試料中の少なくとも２つの異なるサイズの結合物の混合物を泳動し、明確に分離し、プロービングすることができることを示すために、実施例３に記載するように作製した、（Ｉ２７）5およびＩ３９−（Ｉ２７）4とＡＩペプチドの結合ならびに（Ｉ２７）1とＡ１ペプチドの結合物をブレンドした（それぞれ、Ａ１−（Ｉ２７）5＋Ａ１−（Ｉ２７）1およびＡ１−Ｉ３９−（Ｉ２７）4＋Ａ１−（Ｉ２７）1）。このブレンドは、同じコンカテマードメインに基づいた結合物に限定されず、結合物の１つが異なる官能性ドメインを有する場合（Ｉ３９−（Ｉ２７）4）にも有効となりうる。図６参照。
【実施例６】
【０１０２】
（ホスホタンパク質特異的染料による較正基準／結合物の染色）
結果は図７および図８参照。ＰＳ−３８−（Ｉ２７）5、ＰＴ１７−（Ｉ２７）5およびＡ１−（Ｉ２７）5の試料を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、Ｐｒｏ−Ｑダイヤモンド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と呼ばれるホスホタンパク質特異的染料で染色した。ＰＳ−３８およびＰＴ１７だけがリン酸化されているので、ＰＳ−３８−（Ｉ２７）5およびＰＴ１７−（Ｉ２７）5だけが検出されるはずである。Ａ１はリン酸化されていない、従ってＡ１−（Ｉ２７）5は検出されない。全ての試料および手法は、染料製造業者の取扱説明書により実施した。
【０１０３】
使用したマーカーはＰｅｐｐｅｒｍｉｎｔＳｔｉｃｋホスホタンパク質分子量標準（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であり、４５（卵白アルブミン＝リン酸化されている）および２３．５ｋＤａ（β−カゼイン＝リン酸化されている）の陽性対照も含有する。ＰＳ−３８−（Ｉ２７）5は、それぞれ、４０および２０μｌの２つの異なる容量をロードした。
【０１０４】
Ｐｒｏ−Ｑ染色ゲル（図７の左側）は、未リン酸化結合物またはタンパク質とは明白にリン酸化結合物を主に検出することを示している。これは、リン酸化タンパク質の光学密度は、若干のバックグラウンド蛍光（ＰｅｐｐｅｒｍｉｎｔＳｔｉｃｋホスホタンパク質の非−ホスホタンパク質要素でも見られる）を有する未リン酸化タンパク質より大きいことによってもわかる。
【実施例７】
【０１０５】
（結合物の完全な定量および較正基準の作成）
フルオロフォア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を使用すると、結合実験において作製される結合物（提示システム）の正確な量を求めることができた。製造業者の取扱説明書により、（Ｉ２７）5および（Ｉ２７）1を１００倍過剰モルのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８と反応させた。図１０参照。結合混合物を水で透析して、過剰の未結合のフルオロフォアを除去した。フルオリメータ（結合物によって放射される蛍光を測定する）、分光光度計（総タンパク質含量を測定するＡ280nm、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８含量を測定するＡ493nm）およびフルオロフォアの製造業者（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）によって提供される式を使用して結合の程度を求めた。（Ｉ２７）5とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の結合は１００％（Ａｌｅｘａ−（Ｉ２７）5を作製する）であり、（Ｉ２７）1とＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の結合は１２％（Ａｌｅｘａ−（Ｉ２７）1を作製する）であることが算出された。標識化の程度が判定されたので、結合物の正確で真の較正を作成することができると思われる。
【０１０６】
検量線用のＡｌｅｘａ−（Ｉ２７）5結合物を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにトリプリケートでロードし、ウェスタンブロットのために移し、次いで抗−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ウサギポリクローナルＩｇＧ分画）一次抗体（３０００倍希釈）、次いでヤギ−抗−ウサギＨＲＰ二次抗体（５０００倍希釈）を使用してプロービングした。次いで、先に記載されているように、ブロットを展開した。また、Ａｌｅｘａ−（Ｉ２７）5およびＡｌｅｘａ−（Ｉ２７）1の３つの異なるブレンドもロードし、結合物のブレンド能力は、コンカテマーに結合する物質による影響または決定を受けないことを示している。ウェスタンブロット（示していない）は、コンカテマーに結合されている部分はペプチドに限定されないことを実証している。
【０１０７】
検量線を作成する７つの異なる量のキャリブラント：５ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、１．２５ｐｍｏｌ、０．６３ｐｍｏｌ、０．３１ｐｍｏｌ、０．１６ｐｍｏｌおよび０．０８ｐｍｏｌのＡｌｅｘａ−（Ｉ２７）5をトリプリケートでロードした。
【０１０８】
各量のＡｌｅｘａ−（Ｉ２７）5の各バンドの光学密度を測定し、同様の量を平均し、エクセルにプロットして検量線を作成した（図１２、平均＋／−標準偏差）。次いで、この検量線を使用して、以前には未知の量の試料を求めることができる。
【実施例８】
【０１０９】
（イヌ筋小胞体のホスホランバン量を求めるためのＡ１−（Ｉ２７）5の検量線の使用）
先に記載されているように、検量線用の５ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、１．２５ｐｍｏｌ、０．６３ｐｍｏｌ、０．３１ｐｍｏｌ、０．１６ｐｍｏｌおよび０．０８ｐｍｏｌのＡ１−（Ｉ２７）5を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにトリプリケートでロードし、ウェスタンブロットのために移し、Ａ１エピトープについてプロービングした。Ａ１エピトープは、筋小胞体（ＳＲ）膜に存在するホスホランバン（ＰＬＢ）と呼ばれるタンパク質由来である。イヌ筋小胞体（ＣＳＲ）の３つの試料もゲル／ブロットにロードし、試料中のＰＬＢ量を、ＣＳＲのＰＬＢのＡ１エピトープ（Ａ１−（Ｉ２７）5結合物を作製するために使用したＡ１ペプチドに存在する同じＡ１エピトープ）を認識する抗−Ａ１（マウスモノクローナル）一次抗体を使用して求めた。
【０１１０】
検量線（図１２）を作成する７つの異なる量のキャリブラント：５ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、１．２５ｐｍｏｌ、０．６３ｐｍｏｌ、０．３１ｐｍｏｌ、０．１６ｐｍｏｌおよび０．０８ｐｍｏｌのＡ１−（Ｉ２７）5をトリプリケートでロードした。各量のＡ１−（Ｉ２７）5の各バンドの光学密度を測定し、同様の量を平均し、エクセルにプロットして（図１２参照、平均±標準偏差）、検量線を作成した。この検量線を使用して、各ＣＳＲ試料の以前には未知の量のＰＬＢの量を求めることができる。図１２の線を使用して、各ＣＳＲ試料のＰＬＢのｐｍｏｌ量を算出した。
【実施例９】
【０１１１】
（２つの異なる検出方法および２つの異なる認識エピトープを使用するＰＳ−３８−（Ｉ２７）5構築物の検出）
図１３に関して、レーン１〜４は、２０、１５、１０および５ｐｍｏｌのＰＳ−３８−（Ｉ２７）5結合物のロードを示す。パネルＡでは、ブロットをＰｅｒｂｉｏ（商標）ＩＮＤＩＡ  ＨｉｓＰｒｏｂｅ（商標）−ＨＲＰプローブでプロービングした。剥離後、ブロットを、ＰＳ−３８結合ペプチドに特異的なポリクローナル抗体で再プロービングした、パネルＢ。ブロットを再度は栗し、Ｈｉｓ−６タグに対するモノクローナル抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して最後のプロービングを実施した、パネルＣ。
【０１１２】
図１３のパネルＡは、Ｈｉｓ６タグエピトープを認識する非−抗体媒介Ｐｅｒｂｉｏ（商標）ＩＮＤＩＡ  ＨｉｓＰｒｏｂｅ（商標）−ＨＲＰプローブを使用したＰＳ−３８−（Ｉ２７）5構築物の検出を示す。従って、Ｈｉｓ−６タグは、この実施態様において標的部分の１つであると考えられる。
【０１１３】
図１３のパネルＢは、ＰＳ−３８ペプチドに対して形成された一次抗体を使用したＰＳ−３８−（Ｉ２７）5構築物の検出を示す。（パネルＢの約１５０ｋＤａにおける追加のバンドは、構築物のオリゴマーであると考えられるが、夾雑物である可能性もある）。
【０１１４】
図１３のパネルＣは、Ｈｉｓ６タグに対して形成された一次抗体を使用したＰＳ−３８−（Ｉ２７）5構築物の検出を示す。従って、一次抗体は特異的な結合パートナーであると考えられ、Ｈｉｓ６タグは標的部分である。
【０１１５】
パネルＡ、ＢおよびＣは、提示システムは異なる検出方法によって、異なる結合パートナーを使用して、すなわち、修飾酵素（パネルＡ）および抗体（パネルＢおよびＣ）によって認識されうることを示している。さらに、同じ提示システムの異なる標的部分を検出に使用することができる：Ｈｉｓ６エピトープ（パネルＡおよびＣ）およびＰＳ−３８ペプチドのエピトープ（パネルＢ）。
【実施例１０】
【０１１６】
図１５に関して、Ｉ２７モジュールを含有しない（Ｉ３９）1ドメインが示されている。室温において１００過剰モルのＧＭＢＳ−ＰＴ１７を用いて（Ｉ３９）1への結合を実施した。先に記載されているように、試料を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、ウェスタンブロットのために移し、抗−ＰＴ１７抗体でプロービングした。ブロットは、室温における結合後にＰＴ１７−（Ｉ３９）1の検出を示す。
【実施例１１】
【０１１７】
（Ａ１−（Ｉ２７）1およびＡ１−（１２７）5結合物の免疫沈降）
標準的なプロトコールを使用して、抗−Ａ１特異的モノクローナル抗体を用いてＡ１−（Ｉ２７）1結合物を免疫沈降させた。回収した試料をウェスタンブロットで分析することによって（異なる量）、Ａ１−（Ｉ２７）1の検量線を使用して回収された量を求めることができる。この実験では免疫沈降は成功せず、回収されたＡ１−（Ｉ２７）1は０％であった（データは示していない）。
標準的なプロトコールを使用して、抗−Ａ１特異的モノクローナル抗体を用いてＡ１−（１２７）5結合物を沈降させた。回収した試料をウェスタンブロットで分析することによって（異なる量）、検量線を使用して回収された量を求めることができる。図１７は、Ａ１−（１２７）5ＩＰ試料およびＡ１−（１２７）5キャリブラントのウェスタンブロットを示す。７つの異なる量のキャリブラントは検量線を作成する：５ｐｍｏｌ、２．５ｐｍｏｌ、１．２５ｐｍｏｌ、０．６３ｐｍｏｌ、０．３１ｐｍｏｌ、０．１６ｐｍｏｌおよび０．０８ｐｍｏｌのＡ１−（１２７）5。
【０１１８】
各量のＡ１−（１２７）5キャリブラントの各バンドの光学密度を測定し、エクセルにプロットして、図１８の線を作成した。この検量線を使用して、ＩＰによりＡ１−（１２７）5の回収された量を求めた。グラフを使用して、ＩＰにより回収されたＡ１−（１２７）5のｐｍｏｌ量を以下に算出した。
【０１１９】
Ａ１−（１２７）5は明らかに免疫沈降されたが（レーンＡ１回収試料２）、プロテインＡビーズ単独ではほとんど沈降しなかった（対照回収）。検量線試料および免疫沈降試料のデンシトメトリーは、免疫沈降において０．５３ｐｍｏｌのＡ１−（１２７）5の算出を可能にした。効率１００％である場合には、３０ｐｍｏｌのＡ１−（１２７）5が回収されたと思われ、従ってこのプロセスは効率１．７７％であった。
【０１２０】
データはまた、プロセスのどこで効率の悪さが導入されたかの同定を可能にする。対照試料上清およびＡ１上清の定量により、免疫沈降過程の最終段階においてＡ１抗体によって除去されるＡ１−（１２７）5材料の記載を可能にする。これは、可能性のある１００ｐｍｏｌのうちの５０ｐｍｏｌであり、すなわち効率５０％であった。免疫沈降後の種々の洗浄ステップは産物のかなりの損失の原因となっており、最終収率（または効率）は１．７７％であった。この定量的なアプローチは、実験（または産業）プロセスの個々のステップの有効性の記載を可能にする。
【０１２１】
従って、この実施例において、本発明の提示システムおよび方法は、プロセスのどのポイントが最も効率が悪く／良く、改善により利益を生じると思われることを評価するために、ＩＰ技法の効率を全ての段階においてモニターするために使用することもできることが考慮される。本発明の提示システムおよび方法は他の技法の効率をモニターするためにも使用することができると考えられる。
【０１２２】
参照文献
【表１】
2007518088.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】セリン−３８提示システムの特異的な認識を示す図である（較正基準）。図１Ａは、較正基準の略図を示す（較正−３８と呼ぶ）。参照文献９に記載する（Ｉ２７）5コンカテマーの第３ドメインのシステイン残基にエピトープペプチドを共有結合した。図１Ｂは、エレクトロスプレー質量分析によって記載される較正−３８組成を示す。産物（較正−３８）を基板（Ｉ２７）5要素および夾雑物から分離する。*で印をつけた要素は産物の収率（５．４％）の算出に含まれた。Ｃ）較正−３８（０．０６〜３．２ｐｍｏｌ）および較正−αＣＬＥＰ（０．３〜６０ｐｍｏｌ  総（Ｉ２７）５タンパク質）を、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる電気泳動後に、抗体ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８（１：５０００希釈）を用いるウェスタンブロット法で分析した。ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８は、０．１ｐｍｏｌ以上のロード量で較正−３８産物（〜６０ｋＤａ）を検出した。図１Ｃは、較正−３８だけが抗−ＳＥＲＣＡ−３８抗体によって認識されることを示しており、提示システムは免疫学的にサイレントであることを確認している。
【図２】抗体ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８によって検出されないラット心筋細胞におけるＳＥＲＣＡリン酸化を示す図である。従って、図２は陰性の結果である。単離したラット心室筋細胞は、特に記載しない限り、０．５Ｈｚで５分間電気的に鼓動させた。細胞（Ａ；１０，０００；Ｂ；２，５００；棒状体細胞計数）は、さらに介入しないで（対照レーン１）または１μＭイソプロテレノールで処理し（レーン２）、増加的な刺激頻度に暴露し（２．５Ｈｚ；レーン３）、２．５ｍＭの細胞外カルシウムに暴露し（レーン４）、または１μＭカリクリンＡに暴露した（レーン５）。Ａ）較正−３８（濃度範囲０．０１〜３．２ｐｍｏｌ）およびラット筋細胞にＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）を実施し、ＰＶＤＦ膜に移した。ブロットを抗体ＳＥＲＣＡ  ＰＳ−３８（１：５０００）でプロービングし、ヤギ抗−ウサギＩｇＧペルオキシダーゼおよび高感度化学発光基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  Ｐｉｅｒｃｅ）で可視化した。Ｂ）平行実験において、筋細胞を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。抗体ＰＴ−１７（１：５０００）を使用してスレオニン１７リン酸化ホスホランバンを検出した。
【図３】異なるレーンにＳＥＲＣＡ２ａタンパク質の種々の濃度の提示システムおよびＳＥＲＣＡ２ａタンパク質を含む試料を含有する１つのレーンを保有するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。図３は、陽性対照として使用される本発明の実施態様を示す。
【図４Ａ】５つの同じＩ２７ドメインを有する（Ｉ２７）5構築物の略図である。ドメイン３は、チオール特異的反応基を有するペプチドの共有結合のための遊離チオール基（Ｃ４７）を含有する。図４Ａはまた、対応する遺伝子の独自の制限部位の位置も示す。
【図４Ｂ】４つの同じＩ２７ドメインおよび同じでないＩ３９ドメインを有するＩ３９−（Ｉ２７）4構築物の略図であり、同じでないドメインを含む提示システムを示す。Ｉ３９ドメインは、チオール特異的反応基を有するペプチドの共有結合のための遊離チオール基（Ｃ４１）を含有する。図４Ｂはまた、対応する遺伝子の独自の制限部位の位置も示す。
【図５】チオール特異的マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）反応基を介する同じおよび同じでないコンカテマーの遊離チオール基への３つの異なるペプチド（ＰＳ−３８、ＰＴ１７およびＡ１）の結合の成功を示す図である。（Ａ）＝（Ｉ２７）5＋ＰＳ−３８／ＰＴ１７またはＡ１。（Ｂ）＝Ｉ３９−（Ｉ２７）4＋ＰＳ−３８／ＰＴ１７またはＡ１。（Ｍ＝マーカー、ｋＤａ＝キロダルトン）。実施例６参照。
【図６】Ａ１−（Ｉ２７）5およびＡ１−Ｉ３９（Ｉ２７）4は共に異なる比でＡ１−（Ｉ２７）1とブレンドが成功して、較正基準の「ラダー」を示すことができることを示すウェスタンブロットである。（Ａ）＝Ａ１−（Ｉ２７）5とＡ１−（Ｉ２７）1のブレンド。（Ｂ）＝Ａ１−Ｉ３９−（Ｉ２７）4とＡ１−（Ｉ２７）1のブレンド。試料は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動する。結合およびウェスタンブロットは先に記載するように実施した。
【図７】リン酸化結合物の特異的な検出を示すＰｒｏ−Ｑ染色ゲル（図７Ａ）および、右側には（図７Ｂ）、各試料の総タンパク質含量を示すクーマシー染色ゲルを示す図である。マーカーは、４５ｋＤａ（卵白アルブミン＝リン酸化）および２３．６ｋＤａ（β−カゼイン＝リン酸化）の陽性対照も含有する、ＰｅｐｐｅｒｍｉｎｔＳｔｉｃｋリンタンパク質分子量標準（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）である。ＰＳ−３８−（Ｉ２７）5は、それぞれ、４０および２０μlの２つの異なる容量をロードした。
【図８】総タンパク質クーマシー染色に対する割合として表すＰｒｏ−Ｑ染色リンタンパク質の光学密度（ＡＩＤＡ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｅｒ（Ｒａｙｔｅｓｔ）を使用して測定）を示す棒グラフである。図８は、リン酸化結合物の光学密度は、ネイキッド未結合コンカテマー骨格および非リン酸化結合物の固有のバックグラウンド蛍光より有意に高いことを示している。
【図９】試料容量が変化するときの光学密度の比例的な変化を示す棒グラフである。リン酸化結合物の試料容量を半分にすることによって、試料の光学密度も約半分低下する。従って、コンカテマー／結合物は、染料の較正基準として使用することができる。
【図１０Ａ】Ａｌｅｘａ−（Ｉ２７）5（実施例７参照）の略図であり、図１０ＢはＡｌｅｘａ−（Ｉ２７）1（実施例８参照）の略図である。
【図１１】Ａｌｅｘａ−（Ｉ２７）5結合物（提示システム）の検量線を示す図である（実施例７参照）。
【図１２】Ａ１−（Ｉ２７）5結合物（提示システム）の検量線である。
【図１３】２つの異なる検出方法および２つの異なる認識エピトープを使用するＰＳ−３８−（Ｉ２７）5構築物の検出を実証する図である。
【図１４】同一分子の２つの別個のエピトープを使用するＰＴ１７−（Ｉ２７）5構築物を検出した図である。レーン１は、Ｈｉｓ６タグエピトープに対する一次モノクローナル抗体を使用する５ｐｍｏｌのＰＴ１７−（Ｉ２７）5の検出を示す。レーン２は、剥離し、ＰＴ１７ペプチドに対して形成された抗体で再−プロービングした同じブロットを示す。
【図１５】（Ｉ３９）1へのＰＴ１７ペプチドの結合を示す図である。
【図１６】室温において（Ｉ１３９）1へのＰＴ１７ペプチドの結合を示すウェスタンブロットである。
【図１７】Ａ１−（Ｉ２７）5結合物の免疫沈降を示す図である。
【図１８】Ａ１−（Ｉ２７）5結合物の免疫沈降を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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