(57)【要約】  本発明は、ニューモウイルスの感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムを含むニューモウイルスビリオンに関し、ここで、その変異はそのウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させ、そのビリオンは、そのビリオンの感染性に必要な形及び量のそのタンパク質を含む。本発明は、ニューモウイルスビリオンを産生するための方法並びにニューモウイルスの感染及び疾患の治療又は予防にそのビリオンを使用するための方法に関する。好ましいニューモウイルスビリオンは、好ましくは、Ｇ付着タンパク質に関する遺伝子が不活性化されてトランスに相補された呼吸器合胞体ウイルスのビリオンである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューモウイルスの感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムを含む前記ニューモウイルスのビリオンであって、前記変異が前記ウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させ、前記ビリオンが前記ビリオンの感染性に必要な形及び量の前記タンパク質を含むビリオン。
【請求項２】
ニューモウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、請求項１に記載のビリオン。
【請求項３】
遺伝子がＧ付着タンパク質をコードする、請求項１又は２に記載のビリオン。
【請求項４】
変異がウイルスゲノムのみから産生されたウイルスからタンパク質を欠如させる、請求項１から３のいずれか一項に記載のビリオン。
【請求項５】
変異がタンパク質をコードする配列の欠失を含む、請求項１に記載のビリオン。
【請求項６】
ビリオンが、ニューモウイルスのインビボ感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムを含むニューモウイルスビリオンを産生する方法であって、前記変異が前記ウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させ、前記ビリオンが前記ビリオンの感染性に必要な形及び量の前記タンパク質を含み、
（ａ）前記変異を有するウイルスゲノムを含むニューモウイルスを第１宿主細胞の培養物に感染させる段階であって、前記宿主細胞が、前記ビリオンの感染性に必要な形及び量の前記タンパク質の、前記宿主細胞における発現を指令する発現ベクターを含むステップと
（ｂ）感染した前記宿主細胞培養物から前記ビリオンを回収するステップと
を含む方法。
【請求項７】
第１宿主細胞培養の培養物に感染させるために使用されるニューモウイルスが産生される方法であって、
（ａ）第２宿主細胞における、
ｉ）前記ニューモウイルスの（in vivo）感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムＲＮＡであって、前記変異が前記ウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させる、ウイルスゲノムＲＮＡと、
ii）ニューモウイルスポリメラーゼ酵素複合体と、場合によっては１つ又は複数のさらなるウイルスタンパク質と
の発現を指令する１つ又は複数の発現ベクターを前記第２宿主細胞に提供するステップと、
（ｂ）ビリオンを産生するために前記第２宿主細胞を培養するステップと
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第２宿主細胞により産生されたビリオンを、前記第２宿主細胞と同一又は異なる宿主細胞を用いる１つ又は複数のさらなる細胞感染ステップにより増幅することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ウイルスゲノムＲＮＡが、バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモータの制御下にあるウイルスＤＮＡコピーから転写され、宿主細胞に、前記宿主細胞における前記バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現を指令する発現ベクターを提供する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
バクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ニューモウイルスポリメラーゼ酵素複合体が少なくともＬ、Ｐ、Ｎタンパク質を含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１つ又は複数のさらなるウイルスタンパク質がニューモウイルスマトリックス膜タンパク質、好ましくはＭ２−１タンパク質である、請求項７から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ニューモウイルスが呼吸器合胞体ウイルスである、請求項６から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子が、Ｇ付着タンパク質をコードする遺伝子である、請求項６から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から５のいずれか一項に記載のビリオン、又は請求項６から１４のいずれか一項に記載の方法で得ることができるビリオンと、薬学的に許容できる担体とを含む組成物。
【請求項１６】
ニューモウイルス感染の予防又は治療のための薬剤を製造における、請求項１から５のいずれか一項に記載のビリオンの使用。
【請求項１７】
薬剤が鼻腔内投与のための製剤である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
請求項１から５のいずれか一項に記載のビリオンを、ニューモウイルス感染を予防又は治療するための有効量で含む組成物を対象に投与するステップを含む、前記感染を予防又は治療する方法。
【請求項１９】
組成物が鼻腔内投与される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種の分野、さらに具体的には、例えば呼吸器合胞体ウイルス(Respiratory Syncytial Virus;ＲＳＶ)のようなニューモウイルスによって起こる疾患に対するワクチンに関する。本発明は、感染性に不可欠な遺伝子が不活性化されたＲＳＶゲノムを保持する一方で、対応する野生型遺伝子産物がＲＳＶビリオンにトランスに相補されたビリオンに関係する。本発明はさらに、そのようなＲＳＶビリオンを産生する方法、並びにワクチンへのそれらの使用及びニューモウイルスに対するワクチン接種の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト呼吸器合胞体ウイルスは、パラミクソウイルス科ニューモウイルス属に分類される。このウイルスは、乳児、高齢者及び易感染性個体における重症下気道疾患の主原因である。このウイルスは、年長児及び成人での上気道疾患の重大な要因でもある。現在のところ、当技術分野で利用できる有効なｈ−ＲＳＶワクチンは存在しない。
【０００３】
ＲＳＶは、表面に２つの主抗原、すなわち付着タンパク質Ｇ及び融合タンパク質Ｆを発現するエンベロープＲＮＡウイルスである。両タンパク質は防御抗体をもたらすと考えられる。Ｇは２つの公知のｈ−ＲＳＶ亜群であるＡ及びＢの決定基である。これら２つの群には抗原の差異が見られる。Ｇタンパク質は、Ａ群及びＢ群の間ではわずか５３％のアミノ酸相同性しか有さない高度の変異を、Ａ群内ではＧタンパク質の配列に２０％までの差異を示す(Mufson 1988, Cane 1991)。
【０００４】
ＲＳＶ強化免疫グロブリン(Respigam)又はＦに対する合成ヒト化モノクローナル抗体（パリビズマブ）を用いた受動免疫は、ＲＳＶ感染に対してある疾病素質を有する新生児（例えば低出生体重児）を治療及び防御するために現在使用されている(Robinson 2000, Greenough 2000)。ＲＳＶの病態は２つの主な側面、すなわちウイルス自体によって起こる細胞損傷及び過剰反応する免疫系によって起こる組織損傷を有する。ワクチンの設計にあたり、後者は大いに面倒な要因である。
【０００５】
ＲＳＶ感染は、冬季限定の季節性であり、北半球では年末あたりにピークとなる。ＲＳＶは、２歳までに、ほとんどの場合は２回、あらゆる小児に感染する。それよりも年齢の高い個体は、生活環境に応じて平均して隔年感染する。乳児及び小児と密接に接触する者は５０％の危険度を有する。このウイルスは、飛沫に入って、又は汚染した表面を介して密接な接触によって蔓延する。ＲＳＶは、エーロゾルを介しては効率的に蔓延しない。すなわち、ウイルス粒子は比較的不安定である。上気道（ＵＲＴ）から下気道（ＬＲＴ）へのウイルスの内部蔓延は、一次感染でＵＲＴ上皮中に産生されたウイルス粒子の吸入により主に起こる。合胞体の形成（ウイルスの病理性質の１つがウイルスにその名を与えた）を介した蔓延の可能性を排除できず、その蔓延はＬＲＴ感染に二次的な役割を果たすことがある。
【０００６】
一般に、ＲＳＶの病理はＵＲＴで開始する。侵入口は鼻であり、それ程ではないが眼であることもあり、口ではない。ＵＲＴ組織に限ると、疾患は感冒に限られるが、成人では時に重症である。しかし、ウイルスがＬＲＴに達し得る場合は、細気管支炎及び肺炎が無防御の個体に続発することがある。年少乳児では、これは致死的な場合があり、約１／１００が入院及び機械換気を要し、これらのうち１％が死亡する可能性がある。高齢者ではＲＳＶが誘導するＬＲＴ疾患は入院の主原因であり、ＲＳＶがインフルエンザ様疾患の２５％を引き起こすと推測されている。
【０００７】
ＲＳＶに対する免疫応答は複雑である。一般に、ｈ−ＲＳＶ の曝露はＬＲＴ疾患を防御する応答を築くであろう。この応答は高齢では減弱し、高齢集団がＲＳＶに対してより高い感受性を示す原因となる。ＵＲＴ疾患に対する有効な長期防御は実行不可能と考えられる。同じ季節内でさえも再感染することが非常に多く、これはウイルスの変異によって起こるわけではない。ＲＳＶ感染に対する防御は、血中を循環しているウイルスタンパク質Ｆ及びＧに対する抗体を伴い、それらの抗体はＬＲＴ疾患を予防できる。ＵＲＴ感染は、Ｆ及びＧに対する粘膜抗体によって防除してもよいが、これらの寿命は限られている。まだ未同定のウイルスタンパク質に対するＣＤ８＋Ｔ細胞が、感染組織からウイルスを浄化するために必要であるが、それらの細胞は短命であるか、又はレザバーから非効率的に動員されると考えられる。多分、これはＲＳＶによって発現される、Ｇ遺伝子にコードされている可能性がある因子によって起こる(Srikiatkhachorn, 1997a)。
【０００８】
ＲＳＶ疾患の重大な側面は、免疫による病態の増強である。限られた場合では、細胞性免疫応答は、感染組織に及ぼす、過剰に誘引された顆粒球から放出されたサイトカインの作用により、ＲＳＶ疾患を悪化させることがある。宿主の疾病素質がこの反応に関与するが、生後最初のＲＳＶ感染のタイミングも関与する可能性がある。不幸にも、ホルマリン不活化ＲＳＶを用いた初期のワクチン治験は、これらのワクチン接種の設定では野生型感染に応答して免疫増強した病態が優勢であることを示した(Kim 1969)。ＲＳＶに含まれる因子がこの現象を担うと考えられ、その因子はどうやらホルマリン処理により放出されたようである。それから４０年の間に、ウイルスＧタンパク質がこれらの問題の有力な介在因子であることが徐々に示されたが、そのメカニズムは不明なままである(Srikiatkhachorn 1997b)。どんな場合でも、ビリオンと関連しない（すなわち、膜に正しく包埋していない発現産物としての不活化ウイルス製剤中の、又はペプチドの形の）Ｇタンパク質を用いたワクチン接種は、モデル系において免疫増強を引き起していると思われる。このように、ＧはＲＳＶ免疫にある程度貢献するが、その性質はワクチンの設計を複雑にもする。
【０００９】
当初のＲＳＶ生ワクチンの候補には、低温継代変異体又は温度感受性変異体が存在した。前者は、徐々に低い温度で培養することにより弱毒化し、成長に関して低温依存性に至っているが、後者の変異体は、化学又は放射線変異誘発によって、複製に関して特異的温度、通常は高温に依存性となった。これらのウイルス生ワクチンの候補は、過少弱毒化又は過剰弱毒化のいずれかを受けていると思われた(Crowe 1998)。
【００１０】
サブユニットワクチンの候補は、中和抗体の主標的であるＲＳＶ−Ｆ又はＧタンパク質のいずれかから得られる。精製されたＦタンパク質である候補サブユニットワクチンＰＦＰ２は、ＲＳＶ血清陽性患者に安全であるが、ＬＲＴ感染及び関連疾患に対して完全な防御はもたらさなかった(Gonzalez 2000)。別のサブユニットワクチンの取り組みはＢＢＧ２Ｎａであり、それは、ｈ−ＲＳＶ−Ｇのアミノ酸１３０〜２３０と連鎖球菌Ｇタンパク質のアルブミン結合ドメインとが融合したものを含むポリペプチドから成る(Power 1997)。ＢＢＧ２Ｎａは、新生マウスにＴヘルパー２型応答を誘導し、肺の免疫病態を誘発しない(Siegrist 1999)。防御に関するデータはまだ存在しない。均衡の取れた体液性及び細胞性免疫応答のための新しいアジュバントの使用は、動物モデルで現在検討中である(Plotnicky 2003)。
【００１１】
ワクチン候補としてＲＳＶ−Ｆ及びＧ抗原をコードするプラスミドＤＮＡベクターの使用が動物モデルで研究された。これらのワクチンは、げっ歯類に防御応答を誘導する(Li 2000)が、１つの研究では、ＲＳＶ−Ｆ  ＤＮＡワクチン候補を免疫したマウスは、野生型ウイルスを攻撃した後にやや増強した肺炎症応答を発生した(Bembridge 2000)。ヒトにプラスミドＤＮＡワクチンを使用する実行可能性はまだ公知ではなく、この取り組みが特に新生児に関して十分に研究され、さらに重要なことには許容されるまでに少なくとも１５年かかりそうである。ベクター送達系を基本とする候補ワクチンは、ＲＳＶタンパク質を発現している生きた組換えベクターから構成される。例えば、ＲＳＶ−Ｆ及びＧを発現している組換えワクシニアウイルスは、マウスに防御をもたらすが、チンパンジーにはこの効果を欠如している(Collins 1990)。疑問点は、これらの系が、その地域のポックスウイルスに対する現存する（母親の）抗体を考慮して、新生児である主標的群に安全であり（特にワクシニアウイルス）、実行可能であるかどうかである。
【００１２】
幾つかのワクチン候補は、逆遺伝学によって発生した組換え生ＲＳＶに基づく。一筋の研究は、低温適応及び温度感受性を担う個別の又は組合せの変異を組換えウイルスに導入することにより、これらのウイルスを弱毒化することに焦点を当てている。過剰又は過少弱毒化のいずれかが原因で、これらのワクチン候補のどれも使用不可能であった。別の一筋の研究は、１つ又は複数のウイルス非構造遺伝子の欠失に焦点を当てている。モデル系ではこれらのウイルスの挙動に関して限定されたデータしか入手できない(Jin 2003)。
【００１３】
ＲＳＶワクチンの開発への代替的な取り組みは、ウシＲＳＶの使用である。ヒトＦタンパク質単独、又はヒトＦ及びＧタンパク質の両方のいずれかとのキメラウシＲＳＶが、チンパンジーでの効力を評価された。このワクチン候補は、複製が限定されているため、野生型ｈ−ＲＳＶの攻撃後に動物は防御されなかった(Buchholtz 2000)。
【非特許文献１】Mufson 1988, Cane 1991
【非特許文献２】Robinson 2000, Greenough 2000
【非特許文献３】Srikiatkhachorn, 1997a
【非特許文献４】Kim 1969
【非特許文献５】Srikiatkhachorn 1997b
【非特許文献６】Crowe 1998
【非特許文献７】Gonzalez 2000
【非特許文献８】Power 1997
【非特許文献９】Siegrist 1999
【非特許文献１０】Plotnicky 2003
【非特許文献１１】Li 2000
【非特許文献１２】Bembridge 2000
【非特許文献１３】Collins 1990
【非特許文献１４】Jin 2003
【非特許文献１５】Buchholtz 2000
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
このように、目下、当技術分野で利用できる有効なｈ−ＲＳＶワクチンは存在しない。動物モデルで検査された全てのＲＳＶワクチン候補は、ヒトに使用不可能である。このように、有効かつ安全なＲＳＶワクチンに関して当技術分野では長い間の切実な必要性が存在し、そのようなワクチンを提供することが本発明の目的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
定義
本文書及びその特許請求の範囲において、動詞「含む」及びその同根語は、非限定的な意味で使用されて、その後に続く項目が含まれるが、具体的に挙げられていない項目が除外されるわけではないことを意味する。さらに、情況が１つの要素及び複数の要素のうちわずか１つが存在することを明らかに必要としない限り、不定冠詞「a」又は「an」による要素の参照は、その要素の１以上の数が存在する可能性を除外しない。このように不定冠詞「a」又は「an」は、通常は「少なくとも１つ」を意味する。
【００１６】
本明細書に使用するような用語「ビリオン」は、ウイルス構造糖タンパク質を含有する脂質エンベロープにヌクレオキャプシドタンパク質、ウイルスゲノム及びレプリカーゼ複合体を含有するウイルス粒子を指す。
【００１７】
用語「ウイルスの感染性」、「感染性ウイルス」、「感染性ウイルス粒子」又は「感染性ビリオン」は、感染性である新しいウイルスの産生に至るか至らないかを問わず、適当な宿主細胞に侵入してウイルス複製サイクルを開始可能なウイルス、ウイルス粒子又はビリオンを示す。
【００１８】
本発明の第１の態様は、ニューモウイルスのビリオンに関する。そのビリオンは、ニューモウイルスの感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異（mutation）を有するウイルスゲノムを含み、ここで、その変異はそのウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させ、そのビリオンはそのビリオンの感染性に必要な形及び量のそのタンパク質を含む。
【００１９】
ニューモウイルスは、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス(ＲＳＶ)であり、さらに好ましくはヒト又はウシＲＳＶである。ヒトＲＳＶは亜群Ａ又はＢウイルスのいずれかでありえ、好ましくは臨床単離体であり、さらに好ましくはインビトロで広く継代されていない（好ましくは実施例に記載するように１０、８、６又は５回未満継代された）単離体である。よって、任意のＲＳＶ株又は単離体を本発明に関連して使用でき、ここで、本発明はＲＳＶ単離体Ｘと称される特定のヒトＲＳＶ単離体９８−２５１４７−Ｘによってのみ例示されると了解されている。ウイルスが最近の臨床単離体であることがさらに好ましく、ここで、最近は１０、８、６、４、３又は２年前未満に最初に単離されたと定義される。ビリオンのヌクレオチド配列が最近の単離体のヌクレオチド配列と対応する必要はないが、好ましくは、本発明のビリオンに存在するタンパク質のアミノ酸配列は、最近の臨床単離体に存在するタンパク質と等しいことが了解されているであろう。
【００２０】
そのウイルスゲノムは、ニューモウイルスの感染性に不可欠なタンパク質をコードする少なくとも１つのウイルス遺伝子に少なくとも１つの変異を含み、ここで、ウイルスの感染性は上に定義されたとおりである。このように、ニューモウイルスの感染性に不可欠なタンパク質は、本発明のビリオンが適当な宿主細胞に侵入してウイルス複製サイクルを開始可能であるために不可欠なタンパク質であり、ここで、その複製サイクルは新しい感染性ビリオンの産生に必ずしも至らない。本発明の好ましいビリオンでは、変異はそのビリオンからインビボで、すなわち適当な宿主生物における感染性を欠如させ、ここで、そのビリオンはインビトロ培養された適当な宿主細胞に依然として感染性であり得る。
【００２１】
本発明の好ましいビリオンでは、ニューモウイルスの感染性に不可欠なタンパク質をコードする変異した遺伝子は、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子である。ニューモウイルスの構造タンパク質は、本明細書において野生型感染性ウイルスのビリオンに存在するタンパク質であることは当然である。本発明のビリオンにおいて変異するに好ましい、構造タンパク質をコードする遺伝子は、付着タンパク質Ｇ及び／又は融合タンパク質Ｆをコードする遺伝子であり、ここで、Ｇタンパク質が最も好ましい。Ｇタンパク質をコードする遺伝子の欠失及び／又は機能不活性化は、幾つかの目的を果たし、現行のＲＳＶワクチン候補の多数の問題及び面倒な事態を防止する。一目的はワクチンの安全性である。Ｇタンパク質を有さないＲＳＶは、宿主細胞に効率的に感染できないであろうことが原因で、宿主内では極めて弱毒化されている(Karron 1997, Schmidt 2002)。１つの面倒な事態は、Ｇタンパク質が、免疫病態の増強(Alwan 1993, Srikiatkhachorn 1997b)及びある遺伝的素質下でアレルギー（及び喘息）促進状態に免疫系が傾く可能性(Openshaw 2003, Peebles 2003)を含めた望まれない免疫応答を起こすのに関係していると強くみなされていることである。これは、Ｇ遺伝子の欠失又は不活性化により防止されるであろう。Ｇ付着タンパク質をコードする遺伝子に不活性化変異を有するウイルスゲノムを含み、そのビリオンの感染性に必要な形及び量のＧ付着タンパク質を含む本発明のニューモウイルスビリオンは、「ΔＧ＋Ｇ」（ニューモ）ウイルス又はビリオンと称される。同様に、Ｇ付着タンパク質をコードする遺伝子の不活性化変異を有するが、機能的な量のＧタンパク質でトランスに相補されないビリオンは、「ΔＧ」（ニューモ）ウイルス又はビリオンと称される。
【００２２】
本発明のニューモウイルスビリオンは、このように感染に不可欠な、外部にコードされたタンパク質で一過性かつ機能的に再構成されている。好ましくは、その感染に不可欠な、外部にコードされたタンパク質は、付着タンパク質Ｇ及び／又は融合タンパク質Ｆであり、ここで、Ｇタンパク質が最も好ましい。好ましくは、その感染に不可欠な、外部にコードされたタンパク質は、そのビリオンに存在するゲノムと同じウイルス亜群（Ａ又はＢ）のものである。さらに好ましくは、その感染に不可欠な、外部にコードされたタンパク質は、そのビリオンに存在するゲノムと相同であり、ここで、そのタンパク質は、そのウイルスの不活性化前にそのウイルスのゲノムにコードされていたアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有することが意味される。或いは、これは、その外部にコードされたタンパク質が野生型ビリオンに存在するのと同じアミノ酸配列を有することを意味する場合があり、その野生型ビリオンのうち１つ又は複数の内部にコードされたタンパク質に伴うアミノ酸配列は、本発明のビリオンにおける同等物と１００％の同一性を有する。
【００２３】
本発明のビリオンでは、不可欠な構造タンパク質の遺伝子での変異は、そのウイルスゲノムのみから産生されたウイルスからそのタンパク質を欠如させるか、又は生物学的に不活性なタンパク質を発現させる変異である。そのウイルスゲノムのみからのウイルスの産生は、そのビリオンに存在するようなウイルスゲノムのみから、そのウイルスゲノムをトランスに相補する任意のコード配列の不在下で産生したウイルスを意味することが了解されている。そのビリオンに存在するようなウイルスゲノムは、このように不可欠な構造タンパク質の発現を指令することが不可能である。これは、例えば翻訳開始コドンの不活性化、コードされたタンパク質のＮ末端近くへの停止コドンの導入、１つ又は複数のフレームシフト変異、その遺伝子からの１つ又は複数の断片の欠失を含めた、当業者に公知の多様な方法で実現してもよい。好ましくは、その遺伝子は、不可欠な構造タンパク質をコードする配列の少なくとも１０、２０、５０、７５、９０又は９５％の欠失により不活性化されている。しかし、変異がそのタンパク質をコードする（全）配列の欠失を含むビリオンが最も好ましい。
【００２４】
本発明に明確に含まれるのは、１以上の変異が存在するビリオンである。特に、ウイルスタンパク質をコードする１以上の遺伝子は、問題のタンパク質の機能を不活性化若しくは改変するか、又はそのタンパク質を上記のようなビリオンから欠如させる変異を含んでいてもよい。例えば、当技術分野で公知のような低温継代又は熱感受性変異を、上記本発明に開示されたような不可欠な構造タンパク質の不活性化と組み合わせることができる。
【００２５】
感染した宿主生物からのＲＳＶのようなニューモウイルスの浄化は、適正な細胞性免疫を必要とし、その細胞性免疫はウイルスが上皮細胞に感染することなしには効果的に備えられないであろう。しかし、本発明の変異ニューモウイルスは、宿主細胞のインビボ感染に不可欠なタンパク質に関する遺伝情報を欠如している。よって、本発明は変異ニューモウイルスを産生する方法を開示し、その方法は感染に不可欠なタンパク質の不在を（トランスに）相補する細胞での変異ニューモウイルスの複製を含む。
【００２６】
このように別の態様では、本発明は上に定義した変異ニューモウイルスビリオンを産生するための方法に関係する。本方法は、ニューモウイルスビリオンを産生するための方法であり、ここで、そのビリオンはそのニューモウイルスのインビボ感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムを含み、ここで、その変異は、そのウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させ、ここで、そのビリオンはそのビリオンの感染性に必要な形及び量のそのタンパク質を含む。本方法は、（ａ）第１宿主細胞の培養物に、上に定義したような変異を有するウイルスゲノムを含むニューモウイルスを感染させるステップであってその宿主細胞は、そのビリオンの感染性に必要な形及び量のそのタンパク質の、その宿主細胞における一過性発現又は構造性発現のいずれかを指令する発現ベクターを含むステップと、（ｂ）感染した宿主細胞培養物からそのビリオンを回収するステップとを含む。感染した宿主細胞培養物からのビリオンの回収としては、培地からの回収と細胞からの回収のいずれか又は両方がある。
【００２７】
第１宿主細胞は、そのビリオンの感染性に必要なタンパク質のトランスでの同時発現を有するか、又は有さない任意の宿主細胞であり得る。この目的に適した宿主細胞は、例えば（Ｖｅｒｏ、ＥＣＡＣＣロット１０−８７、１３４回目の継代、１９９０、ＥＭＥＡ承認のような）アフリカミドリザル腎細胞培養物である。
【００２８】
本発明の好ましい方法では、第１宿主細胞培養の培養物を感染させるのに使用されるニューモウイルスは、（ａ）第２宿主細胞における（ｉ）そのニューモウイルスのインビボ感染性に不可欠なタンパク質をコードする遺伝子に変異を有するウイルスゲノムＲＮＡであって、その変異はそのウイルスゲノムのみから産生されたウイルスから感染性を欠如させるウイルスゲノムＲＮＡと（ii）ニューモウイルスポリメラーゼ酵素複合体と、場合によっては１つ又は複数のさらなるウイルスタンパク質との発現を指令する１つ又は複数の発現ベクターを第２宿主細胞に提供するステップ、並びに（ｂ）ビリオンを産生するために、その第２宿主細胞を培養するステップを含む方法で産生される。好ましい方法では、第２宿主細胞により産生されたビリオンは、その第２宿主細胞と同一又は異なる宿主細胞を採用する１つ又は複数のさらなる細胞感染ステップにより増幅される。
【００２９】
第２宿主細胞は、そのビリオンの感染性に必要なタンパク質のトランスでの同時発現を有するか、又は有さない任意の宿主細胞でありえ、その宿主細胞でニューモウイルスは複製可能である。本目的に適した宿主細胞は、例えば（Ｖｅｒｏ、ＥＣＡＣＣロット１０−８７、１３４回目の継代、１９９０、ＥＭＥＡ承認のような）アフリカミドリザル腎細胞培養物又はＨｅｐ−２細胞である。第２宿主細胞は第１宿主細胞と同一であっても異なっていてもよい。
【００３０】
本発明の方法では、ウイルスゲノムＲＮＡはバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモータの制御下にあるウイルスＤＮＡコピーから転写され、ここで、その（第２）宿主細胞には、その宿主細胞におけるバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現を指令する発現ベクターが提供される。好ましくは、そのバクテリオファージＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼはＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼである。
【００３１】
第２宿主細胞において１つ又は複数の発現ベクターから発現されるニューモウイルスポリメラーゼ酵素複合体には、発現ベクターでの対応する遺伝子又はｃＤＮＡから発現されるＬ、Ｐ、Ｎタンパク質を少なくとも含む。ウイルスの集合及び裸のウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングの効率の改善のために、場合によっては第２宿主細胞に１つ又は複数のさらなるウイルスタンパク質が発現される。本目的に好ましいウイルスタンパク質には、ウイルスマトリックス膜タンパク質があり、その中でＭ２−１タンパク質が特に好ましい。Ｌ、Ｐ、Ｎ、Ｍ２−１、Ｇ又はＦタンパク質は、その宿主細胞に導入され発現される、ウイルス単離体のウイルスゲノムから好ましくは得られるが、その代わりに他の異種ウイルス又は非ウイルス起源からの相同タンパク質も使用できる。
【００３２】
当業者は、ウイルスゲノムＲＮＡ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ニューモウイルスポリメラーゼ酵素複合体及び任意選択のさらなるウイルスタンパク質、並びに不可欠な構造タンパク質を第１及び／又は第２宿主細胞に発現させるために、当技術分野で広範囲の発現ベクター及び（プロモータのような）調節配列が利用できることを認識しているであろう（例えばSambrook and Russell (2001) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York参照）。
【００３３】
ＲＮＡウイルスの逆遺伝学のために、すなわち本発明のビリオンのような組換えＲＮＡウイルスの発現のために、ウイルスゲノムＲＮＡのｃＤＮＡコピーがプラスミドにクローニングされ、ある条件でそのＤＮＡからＲＮＡの合成を可能にするであろう配列の制御下に配置される。一般に、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ）のためのプロモータ配列は、ＲＮＡゲノムのＤＮＡコピー上流に配置されるが、ＲＮＡポリメラーゼに適したターミネータは、ゲノムの下流に配置される。自己切断型リボザイム配列は、ターミネータ配列の上流に配置され、正しい末端ヌクレオチドを有するＲＮＡの合成を可能にする。正しい末端配列は、合成ＲＮＡからウイルスをレスキューするために一般に必要である。非分節ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスに関して、ゲノム又は抗ゲノムＲＮＡと共にポリメラーゼ酵素複合体（パラミクソウイルスに関してはＮ、Ｐ及びＬタンパク質）が共発現することは、（Neumann 2002に総説され本明細書の実施例に例示された）組換えウイルスを得るために必要である。
【００３４】
他の好ましい方法は、本発明のビリオンを単離及び／又は精製し、及び／又はこれらのビリオンを医薬組成物に配合するさらなるステップを含んでもよい。ビリオンを単離及び／又は精製するための方法は、熟練したウイルス学者には周知である。そのような方法には、例えば様々な遠心分離法（例えば分画遠心分離又は密度遠心分離）又はクロマトグラフィー法がある。医薬組成物に本発明のビリオンを配合するための方法は、ビリオンを以下に定義されるような薬学的に許容できる担体と混合するステップを少なくとも含む。
【００３５】
さらなる態様では、本発明は上に定義されたようなビリオン、又は上に定義されたような方法で得ることができるビリオンと、薬学的に許容できる担体とを含む組成物に関する。その組成物は、ワクチンとしての使用に好ましくは適した好ましくは医薬組成物であり、すなわち、その組成物は好ましくはワクチンである。
【００３６】
なお別の態様では、本発明は、有効成分として本発明に記載のビリオンと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容できる安定化剤、浸透物質、緩衝剤、分散剤などもその医薬組成物に混和することができる。好ましい形は、意図される投与様式及び治療適用に依存する。その薬学的担体は、再構成したウイルス膜を患者に送達するのに適した任意の適合性の無毒物質であってよい。鼻腔内送達用の薬学的に許容できる担体としては、水、緩衝生理食塩水、グリセリン、ポリソルベート２０、クレモフォールＥＬ（cremophor EL、及び（カプリル／カプリン酸）グリセリルの水性混合物があり、緩衝剤で処理して中性ｐＨ環境をもたらすことができる。
【００３７】
吸入による投与のために、本発明の医薬組成物は加圧パック又はネブライザーからのエーロゾルスプレーの形で好都合に送達され、ここで、そのビリオンは鼻腔内送達に関して記載されたような担体中に存在するが、適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当な気体の使用を伴う。加圧エーロゾルの場合、定量を送達するために弁を提供することによって投薬単位を決定できる。
【００３８】
鼻腔内組成物又は吸入組成物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば（全ての目的に関してその全体が参照により組み込まれている）Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing, Easton, PA, 1980)を含めた様々な情報源にさらに詳細に記載されている。このように、ビリオンはワクチン接種のための任意の製剤中に活性構成要素として配合してもよく、その製剤は、個体、好ましくはヒトと（ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジのような）家畜若しくは農用動物とにワクチン接種するための製剤の効果的な投与を可能にするか又は助ける、当技術分野で公知の、例えば担体、アジュバント、安定化剤、可溶化剤、保存料及び他の賦形剤をさらに含んでもよい。
【００３９】
さらなる態様では、本発明はニューモウイルス感染に対するワクチン接種のための、又はその予防若しくは治療（予防若しくは治療）のための方法に関し、その方法は、上に定義されたような、又は上に定義されたように得ることができる治療又は予防有効量の本発明のビリオン（を含む医薬組成物）を、予防又は治療を必要とする対象に投与することによる。好ましくは、そのビリオンは鼻腔内投与される。
【００４０】
本発明は、薬剤、好ましくはニューモウイルス感染に対するワクチン接種のための、又はその予防若しくは治療のための薬剤として使用するための、上に定義されたような、又は上に定義されたように得ることができる本発明のビリオンに同様に関する。本発明は、ニューモウイルス疾患若しくは感染に対するワクチン接種のための、又はその予防若しくは治療のための薬剤の製造への、本発明のビリオンの使用にさらに関する。好ましくは、その薬剤は鼻腔内投与用製剤である。
【００４１】
ワクチン接種のための本発明のビリオンを含む組成物は、適当な宿主に好ましくは鼻腔内投与される。一実施形態では、仔ウシをｂ−ＲＳＶ感染から防御することができる。なお別の実施形態では、ヒト、その中で好ましくは乳児及び高齢者又は易感染性個体がｈ−ＲＳＶ感染から防御される。製剤は、好ましくは点鼻薬又はスプレー、好ましくは鼻腔スプレーとしての投与に適した製剤を含む。組成物中のΔＧ＋Ｇニューモウイルス粒子は、上気道の上皮細胞に１回だけ感染するであろう。それは、最初に感染したＵＲＴ上皮細胞から産生された第２世代のビリオンは、Ｇ付着タンパク質を欠如しているからであり、そのタンパク質に関してコード配列はゲノムから除去されている。これらのΔＧビリオンは、よってインビボで宿主生物に非感染性である。しかし、最初の１サイクルの感染で、ニューモウイルス、又は特にＲＳＶに対して備える適当な細胞性免疫（野生型ウイルスの感染を浄化可能な応答）の発生が可能となるが、Ｆに対する防御抗体、すなわち下気道感染を予防するであろう抗体は、そのワクチン及び非感染性後代により誘発されるであろう。Ｆに対するヒト化モノクローナル抗体であるパリビムザブ(palivimuzab)治療の有効性によって示されるように、抗Ｆ抗体はＲＳＶ感染を限定するのに有効である。これは、本発明の組換え弱毒化ニューモウイルス生ワクチンの効力の基礎となっている。これらのウイルス生ワクチンは、現在のニューモウイルスワクチン候補と関連する多数の問題を解決する。ビリオンとの自然の関連でＧタンパク質が存在することは、適当な細胞性免疫の発生を可能にするのに対して、ウシ及びヒトそれぞれでの免疫によるｂ−ＲＳＶ及びｈ−ＲＳＶの病態促進を大きく担う、単離されたＧタンパク質に対する免疫の望ましくない効果が回避される。
【００４２】
表Ｉ．ＲＴ−ＰＣＲによるＲＳＶ単離体Ｘのクローニングに使用したプライマー。
表II．ヘルパープラスミドのクローニングのために、及び安定な細胞系の構築に使用したプラスミドのために使用したプライマー。
表III．ＲＳＶに感染したＶｅｒｏ細胞由来ＲＮＡに関する診断ＲＴ−ＰＣＲに使用したプライマー。
表IV．コットンラット免疫実験の結果。ΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘの免疫による、ＲＳＶ感染及びＲＳＶ誘導性病態に対する防御。
【実施例】
【００４３】
本発明は、本発明の具体的な実施形態を説明するために単に使用され、本発明の全般的な範囲又は任意の態様を限定するものとして読まれてはならない以下の非限定的な実施例により説明される。
【００４４】
実施例１
ウイルス単離体、ウイルスの単離、増殖及び保存
組換えｈ−ＲＳＶクローンに関する基礎は、ライデン大学医療センター診断研究室から得られた臨床ＲＳＶ単離体である。このウイルスは、それが単離された患者にちなんで９８−２５１４７−Ｘとコードを付けられたが、１９９８年１２月２１〜２４日の期間にＨｅｐ−２細胞を用いた診断検査から得られた。このウイルスは、その後亜群Ａ単離体であると決定され、ＲＳＶ単離体Ｘと称される。そのウイルスを、ＤＭＥＭ(Gibco)、１０％ＦＣＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕを入れたＴ７５ボトルでＨｅｐ−２細胞を用いて４回、その後、ＤＭＥＭ(Gibco)、１０％ＦＣＳ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕを入れたＴ７５ボトルでＶｅｒｏ細胞を用いて５回継代した。結果として生じたＲＳＶ単離体Ｘウイルスを作業用保存株として使用し、２５％又は４５％スクロース中で−１３５℃で保存した。
【００４５】
実施例２
ＲＳＶ−Ｘ  ｃＤＮＡをコードするウイルスゲノムの構築
保存株ＲＳＶ単離体Ｘに感染したＶｅｒｏ細胞のフェノール−グアニジンイソチオシアネート抽出(トリゾール、Invitrogen)により総ＲＮＡを得た。ランダムヘキサマープライマーを用いたサーモスクリプト(Invitrogen)逆転写酵素を使用した逆転写によりｃＤＮＡを調製した。制限酵素認識部位（表Ｉ及び配列表）を含む特異的プライマーを用いた高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ(Invitrogen)を使用したＰＣＲ用のテンプレートとしてこのｃＤＮＡを使用した。ＲＳＶ−Ａ２(Genbankアクセッション番号Ｍ７４５６８)及びＲＳＶ−ＲＳＳ２(Genbankアクセッション番号Ｕ３９６６２)の公表された配列に基づいて、プライマーを設計した。
【００４６】
種々のベクターでＰＣＲ産物を最初個別にクローニングした。プライマー対、ベクター、制限酵素認識部位及び結果として生じたベクター名を下に挙げる
RSV021/RSV047：pCAPベクター(Roche)、Mlu N1に平滑的に導入、pCAP3(ＳＨ／Ｍ／Ｐ領域)
RSV018/019：pCAPベクター、Mlu N1に平滑的に導入、pCAP2（Ｇ領域）
RSV016/RSV017：PUC21、Mlu I/Bam HI、pUK5(Ｍ２−２／Ｍ２−１／Ｆ領域)
RSV024/RSV025a：PUC21、Bam HI/Afl II、pUK1(ＮＳ２／ＮＳ１領域)
RSV022/RSV023：PUC21、EcoR V、pUK4(Ｎ領域)
RSV014/RSV015：PUC21、Kpn I/Mlu I、pUK2(Ｌ領域)
【００４７】
２つの独立したｃＤＮＡテンプレートから得られる少なくとも２つの個別のクローンを配列決定し、２つのクローンの間に差を含む領域を３番目のクローンに関して配列決定した。必要ならば、当業者に公知である標準的な分子生物学の技法を使用してクローンを修復した。クローニングに使用されるプライマーの結合部位を包含する追加のＰＣＲ産物を得て、配列決定した。ゲノムＲＮＡのポリアデニル化によりゲノム５’末端を決定してから、プライマーALG018：
TTAAAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTと、
ＮＳ１遺伝子プライマーRSV126：
AATTCTGCAGGCCCATCTCTAACCAAAGGAGT
とを含むオリゴ（ｄ）ＴでＲＴ−ＰＣＲを行った。この断片をHind III/Pst Iを用いてpUC21にクローニングした。ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）連結ＰＣＲによりその３’末端を決定した。全ての配列を組み立ててＲＳＶ−Ｘコンセンサス配列を得た（配列番号１）。
【００４８】
全ての配列を、BigDyeターミネータキット(Applied Biosystems)を用いたＰＣＲサイクル配列決定により確認し、ABI Prism 310遺伝子解析装置により解析した。
【００４９】
実施例３
ΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘ全長プラスミドの構築
ＲＳＶ単離体Ｘの全ゲノムにわたる全長ｃＤＮＡをＰＣＲ断片の逐次連結によって組み立てた（図１）。バクテリオファージＴ７ポリメラーゼに関するプロモータは、「トレイラー」末端に先行する。正確な３’末端を発生させるために、ｃＤＮＡ「リーダー」末端を、肝炎デルタウイルスリボザイム（ＨＤＶＲ）の後にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの転写ターミネータと融合させる（図１参照）。
【００５０】
まず、ＨＤＶＲ及びＴ７ターミネータをコードする２組の相補性オリゴマーであるRSV026/RSV027オリゴ及びRSV028/029オリゴをＴ４  ＤＮＡキナーゼでリン酸化し、ハイブリダイズし、Rsr II/Not Iを介してクローンpUK1（遺伝子NS1/NS2を含む）に連結し、プラスミドpUK3を得た。次に、Ｎを含むクローンpUK4のXma I/SexA I断片をXma I/SexA Iを介してプラスミドpUK3に連結した。このプラスミド(pUK6)は、Ｎ遺伝子から３’リーダー配列までの領域がＨＤＶＲ及びＴ７ターミネータに融合したものを含む。
【００５１】
次に、プラスミドpCAP3のXma I/Eco RV断片を、Xma I及び平滑にした（filled-in）Hind III部位を使用してプラスミドpUK5に挿入した。これによりプラスミドpUK8を得た。次に、pUK8をBssH II及びBsiW Iで消化し、末端をクレノーポリメラーゼで平滑にして再連結した。このプラスミドは、遺伝子Ｍ２−２、Ｍ２−１、Ｆ、ＳＨ、Ｍ及びＰを含み、pUK9と名付ける。
【００５２】
ＲＳＶ単離体ＸのｃＤＮＡについての低コピー数ベクターを合成するために、２つの相補性オリゴマーであるRSV011:AGCTTGCGGCCGCGTCGACCCGGGACGCGTCGATCGGGTACCAT及びRSV012:CGATGGTACCCGATCGACGCGTCCCGGGTCGACGCGGCCGCAをＴ４  ＤＮＡキナーゼでリン酸化し、ハイブリダイズした。そして、アルカリホスファターゼで処理してCla I/Hind IIIで消化したプラスミドpACYC184 (New England Biolabs)に挿入した。結果として生じたプラスミドはpACYC184-MCSと名付ける。その後、Ｔ７プロモータ及びＬ遺伝子を含有するpUK2のMlu I-Knp I断片を挿入した。この中間体プラスミドをpACYC1と名付ける。次に、ＨＤＶＲ及びＴ７ターミネータの融合配列を含む、Ｎ遺伝子から３’リーダー配列までのpUK6の領域を、Xma I/Not Iを用いてpACYC1に付加した。これにより中間体プラスミドpACYC2を得る。最後に、Ｍ２−２、Ｍ２−１、Ｆ、ＳＨ、Ｍ及びＰ遺伝子を含有するpUK9のXma I/Mlu I断片をpACYC2に挿入し、Ｇ遺伝子を欠如したＸ株のＲＳＶゲノム全体を含むプラスミドpACYC3をもたらす。後者のプラスミドの配列解析から、ＨＤＶＲ領域での欠失が明らかとなった。その欠失を修復し、結果として生じたプラスミドをpRSVXΔGと名付ける。
【００５３】
構築体pRSVXΔG以外に、ＲＳＶ単離体Ｘのゲノム挿入物を逆ＰＣＲによって逆相補する構築体pACYC24を発生させた。この構築体から抗ゲノムＲＳＶ  ＲＮＡを合成できる。pACYC24では、Ｔ７プロモータは３’リーダー配列に先行するが、ＨＤＶＲ及びＴ７ターミネータは５’トレイラー配列に融合している。
【００５４】
pRSVXΔGを構築するために使用した全ての制限酵素認識部位はＲＳＶ遺伝子間領域内に局在し、（図２に示すように）コード配列を変更せず、転写シグナルにも影響しない。
【００５５】
実施例４
ヘルパープラスミドの構築
数個のＲＳＶタンパク質を発現しているヘルパープラスミドを以下のように構築した。全ての必要な遺伝子は、研究室株ＲＳＶ−Ａ２(ＡＴＣＣ番号ＶＲ１３０２)から得られる。ウイルスをＨｅｐ−２細胞を用いてプラーク精製し、その後Ｖｅｒｏ細胞を感染させるために使用した。フェノール−グアニジンイソチオシアネート抽出(トリゾール、Invitrogen)によってこれらの細胞から総ＲＮＡを単離し、高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ(Invitrogen)と、ＲＳＶ遺伝子であるＬ、Ｐ、Ｎ及びＭ２−１それぞれに特異的な１組のプライマーとを使用したＲＴ−ＰＣＲに供した（表II参照）。それから、表IIに示すように制限酵素認識部位を使用してＰＣＲ産物を発現プラスミドpcDNA3、pcDNA6又はpCIにクローニングした。クローンの配列をBigDyeターミネータキット(Applied Biosystems)を使用したＰＣＲサイクル配列決定により確認し、ABI Prism310遺伝子解析装置で解析した。
【００５６】
実施例５
Ｇ産生性Ｖｅｒｏ細胞系の構築
ＲＳＶ−Ｇタンパク質を産生する細胞系を幾つかの方法を使用して構築した。方法１では、ＲＳＶ−Ａ２若しくはＲＳＶ単離体Ｘのいずれか由来のＧ遺伝子、又はプライマーRSV033及びRSV034を用いた修飾により内部翻訳開始コドンを無能にしたＲＳＶ−Ａ２由来Ｇ遺伝子を、表IIに示すようなプライマーを使用して、ＲＳＶ−Ａ２由来又はＲＳＶ単離体Ｘに感染したＶｅｒｏ細胞由来ＲＮＡに対するＲＴ−ＰＣＲを用いて発現ベクターpcDNA3又はpcDNA6(Invitrogen)にクローニングした。プラスミドをリポソーム系の共沈化学薬剤ＣａＣｌ２又はエレクトロポレーションのいずれかを使用してＶｅｒｏ細胞に導入した(Ausubel 1989)。安定な細胞系を単離するための２つの方法を使用した。第１の方法では、トランスフェクションの７２時間後に、選択培地と、pcDNA3についてはゼオシンと、pcDNA6についてはブラスチシジンとを含有する新鮮培地に種々に希釈したものを使用して細胞を分けた。細胞増殖巣が同定されるまで細胞に選択培地を３〜４日毎に供給した。単コロニーを釣り上げ、９６ウェルプレートに移すか、又は様々な希釈を行って蒔き、９６ウェルプレート中に単細胞を得た。抗生物質耐性コロニーについて、ＲＳＶ  Ｇ特異的抗体を使用した免疫染色法又はＦＡＣＳによってＲＳＶ−Ｇの発現を検査した。Ｇを発現しているコロニーを継代し、Ｇを発現している安定細胞系と称した。第２の方法は、トランスフェクションの７２時後にＲＳＶ−Ｇ特異的抗体を使用してＦＡＣＳソーティングすることを含む。ＲＳＶ−Ｇ発現細胞を系列希釈して蒔き、９６ウェルプレート中に単細胞を得て、選択培地で培養した。単細胞コロニーを選択培地で継代してからＲＳＶ−Ｇの発現を再度検査し、ＲＳＶ−Ｇを発現している細胞系をもたらした。
【００５７】
方法２では、Flp-Inシステム(Invitrogen)を使用して、種々のレベルの標的遺伝子の発現を可能にする染色体の位置に標的遺伝子挿入部位を有するＶｅｒｏ細胞を産生する。方法１のプラスミドからであるが、Ｇ翻訳開始コドン周辺配列の修飾（プライマーRSV151を使用して導入、表II）を有してより高い翻訳レベルが可能になったＲＳＶ−Ｇ遺伝子をシステムジェネリックメソッドを使用してこれらの細胞系のそれぞれに挿入し、種々のレベルのＧタンパク質を安定発現しているＶｅｒｏ細胞系をもたらした。
【００５８】
方法３では、方法１からのＧ遺伝子を含有する発現プラスミドを用いたトランスフェクション又はＧタンパク質を発現している修飾ワクシニアウイルスAnkara（ＭＶＡ）(Sutter 1992)又は鶏痘ウイルス(Spehner 1990)のいずれかを感染させることにより、Ｖｅｒｏ細胞にＧタンパク質を一過性に発現させた。
【００５９】
実施例６
バクテリオファージＴ７ポリメラーゼ産生細胞系の構築
バクテリオファージＴ７ポリメラーゼ遺伝子を、プライマーALG022及びALG023（表II）を用いてその遺伝子を含むプラスミドpPRT7(van Gennip 1997)からＰＣＲ増幅する。Hind III/Xba Iを用いてＰＣＲ産物をpcDNA6bベクターにクローニングしてプラスミドpc6T7polをもたらす。製造業者(Invitrogen)が勧めるようにリポフェクタミン２０００を使用してＶｅｒｏ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後に細胞を分け、ブラスチシジンを含有する新鮮培地中で成長させた。細胞に３〜４日毎に新鮮培地を供給し、２回分けて、さらに大きい培養容積を得る。トランスフェクションの２０日後に、リポフェクタミン２０００を使用してブラスチシジン耐性細胞にレポータープラスミドpT7-IRES2-EGFPをトランスフェクトした。プラスミドpT7-IRES2-EGFPの構築のために、 Hind III/Bam HIを介してプラスミドp-EGFP-N1(Clonetech)に、Ｔ７プロモータ配列をコードする１組の相補性オリゴマー(ALG32:AGCTAATACGACTCACTATAGGGAGACGCGT及びALG33:GATCACGCGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATT)を挿入することにより、第１プラスミドpT7-EGFPを構築した。次に、Xma I-Not Iを介してプラスミドp-IRES2-EGFPにプラスミドpT7-EGFPのT7-EGFP断片をクローニングすることによってプラスミドpT7-IRES2-EGFPを構築した。EGFPを発現している細胞をFACSでソーティングし、限界希釈して成長させて単細胞コロニーを得た。安定性に関してＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現している単コロニーを検査し、より大きな培養容積まで成長させ保存した。
【００６０】
実施例７
組換えΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘウイルスを産生する方法
Ｈｅｐ−２細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）＋ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン中で培養した。一方、Ｖｅｒｏ細胞及びその誘導体をＭ１９９＋５％ＦＣＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕ中で培養する。細胞を３７℃で１０ｍｍ２の皿で８０％の集密度になるまで一晩成長させた。Ｖｅｒｏ及びＨｅｐ−２細胞については、修飾ウイルスAnkara-T7（ＭＶＡ−Ｔ７）(Sutter 1992, Wyatt 1995)又は鶏痘Ｔ７ウイルス(Britton 1996)をＭＯＩ＝３（感染多重度３）で細胞に感染させ、トランスフェクション前に３２℃で６０分間インキュベートしてバクテリオファージＴ７ポリメラーゼの発現を可能にした。細胞（Ｈｅｐ−２、Ｖｅｒｏ又はＶｅｒｏ−Ｔ７細胞）をOptimem培地(glutamaxを加えたOptimem1、Invitrogen)で洗浄してから、Optimemに溶かしたリポフェクタミン２０００(Invitrogen)（合計体積５００μｌ）を使用して、ＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｌ及びＭ２．１遺伝子をコードするヘルパープラスミド及びプラスミドpRSVXΔGをトランスフェクトした。次の量のプラスミドを添加した：pRSVXΔGを１．６μｇ、pcDNA6-A2-Nを１．６μｇ、pcDNA3-Pを１．２μｇ、pcDNA6-A2-Lを０．４μｇ、pcDNA6-A2-M2.1を０．８μｇ。３２℃で３〜４時間インキュベートした後で、２％ＦＣＳを加えたOptimem培地５００μｌを添加して、細胞を３２℃で３日間インキュベートした。次に、細胞を剥がし、剥がれた細胞とレスキューされたウイルスを含有する培地との混合物を使用してＤＭＥＭ＋２％ＦＣＳ＋ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／ｇｌｕ中で成長したＶｅｒｏ又はＨｅｐ−２細胞の新鮮培養物に感染させた。後者の手順を４〜５回繰り返して高力価のウイルス保存株を得た。
【００６１】
ΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘに感染したＶｅｒｏ細胞から単離したＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲと、独特の制限酵素の認識部位をpRSVXΔGに導入してその制限酵素で得られた産物の消化とによって、ΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘウイルスの同一性を確認した（図２）。ＲＳＶ単離体Ｘを対照として使用した。
【００６２】
ＲＳＶでの配列マーカの同定のために、Ｖｅｒｏ細胞にＲＳＶ単離体Ｘ又はΔＧ−ＲＳＶ単離体ＸをＭＯＩ＝０．１で感染させた。感染の７２時間後に培養上清からＲＮＡを単離して、ＲＴ−ＰＣＲ用のテンプレートとして使用した。組換えΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘウイルスに挿入された配列マーカに隣接するようにプライマーを設計した。ＲＴ−ＰＣＲの後で、得られた産物を適当な制限酵素で消化した。以下の消化産物が得られた（図３）。
ａ）プライマーRSV065(GTCCATTGTTGGATTTAATC)及びRSV093(CAAGATAAGAGTGTACAATACTGTC)を用いたＰＣＲ並びにMlu-Iを用いた消化は、ＲＳＶ単離体Ｘに関して９３７ｂｐ、並びにΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘに関して４５９及び４７８ｂｐの予想される断片をもたらした。
ｂ）プライマーRSV105(GTTGGATTGAGAGACACTT)及びRSV113(AGTATTAGGCAATGCTGC)を用いたＰＣＲに続くXma-Iを用いた消化は、ＲＳＶ単離体Ｘに関して８８０ｂｐ、並びにΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘに関して６５６及び２２４ｂｐの予想される断片をもたらした。
ｃ）プライマーRSV112(CCCAGTGAATTTATGATTAG)及びRSV160(AATTGGATCCATGGACACAACCCACAATGA)を用いたＰＣＲ並びにSexA-Iを用いた消化は、ＲＳＶ単離体Ｘに関して６９４ｂｐ、並びにΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘに関して４９２及び２０２ｂｐの予想される断片をもたらした。
ｄ）プライマーRSV098(TGGTAGTTCTCTTCTGGCTCG)及びRSV114(ATCCCCAAGTCATTGTTCA)を用いたＰＣＲに続くSnaB-Iを用いた消化は、ＲＳＶ単離体Ｘに関して１８２０ｂｐ、並びにΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘに関して５０７及び３８７ｂｐの予想される断片をもたらした。
【００６３】
ＲＳＶ単離体Ｘと比較したΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘの成長特性をＶｅｒｏ細胞及びＨｅｐ−２細胞を用いて決定した（図４）。
【００６４】
2007516721.tif 000002
【００６５】
実施例８
組換えΔＧ＋Ｇ−ＲＳＶ単離体Ｘウイルスを産生する方法
トランスフェクトされたＶｅｒｏ細胞から得られたΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘウイルスを数回継代して少なくとも１０５ｐｆｕ／ｍｌ（ｍｌあたりのプラーク形成単位）の力価を得た。次に、このウイルスの種々のＭＯＩを用いてＲＳＶ−Ｇタンパク質を産生しているＶｅｒｏ細胞系に感染させた。結果として生じたΔＧ＋Ｇ−ＲＳＶ単離体Ｘを培地及び／又は細胞から採集し、免疫検出法によりビリオンでのＧタンパク質の存在に関して分析した。Ｖｅｒｏ又はＨｅｐ−２細胞を用いて感染性力価を決定し、ΔＧ＋Ｇ−ＲＳＶ単離体Ｘウイルスを感染させた細胞から抽出したウイルスＲＮＡについて、ＲＴ−ＰＣＲを用いてΔＧゲノムの完全性を決定した。ウイルスを２５％又は４０％スクロース中で−１３５℃で保存した。
【００６６】
実施例９
ΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘの免疫によりコットンラット動物モデルでＲＳＶ感染及びＲＳＶ誘導性病態に対して防御する方法
コットンラット(Sigmodon hispidus、５〜６週齢、１群４〜６匹、雌雄)で防御実験を実施した。最初の実験では、この動物はＲＳＶ感染に感受性であること及びPrince, 2001に記載されたように、ヒトの状況を厳密に模倣する重症のワクチン介在性肺病態を呈することが示された。ＲＳＶの鼻腔内適用後に、肺の病態は気管支／細気管支内及びその周囲の炎症性浸潤と上皮の過形成とを特徴とした。ホルマリン不活化ＲＳＶ−Ａ２を筋肉内免疫後に、ＲＳＶ−Ａ２の鼻腔内攻撃を行うことに対応して、さらに重症の病態が見られた。上に言及した病態以外に、免疫介在性病態の特徴である血管周囲及び気管支周囲の浸潤並びに肺胞炎が観察された。これらの観察を、全ての免疫及び攻撃実験に関する「内部」基準として使用した。ＲＳＶ製剤を用いたコットンラットの感染及び免疫を両方の鼻孔の鼻腔内で行った。病態に関してコットンラットの肺を光学顕微鏡的に検診し、肺ホモジネートの系列希釈を使用して、Ｖｅｒｏ細胞に関して、ＣＣＩＤ５０力価を得るためのＲＳＶ特異的ＥＬＩＳＡ及びｐｆｕ力価を得るためのＲＳＶ特異的抗体を使用した免疫染色で、攻撃後又は感染／免疫後の種々の時点でウイルス力価を決定した。ΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘで２回免疫後に、コットンラットは肺でのＲＳＶ単離体Ｘによって引き起こされる感染及び病態に対して完全に防御された。数回の実験からの結果を表IVにまとめる。
【００６７】
2007516721.tif 000003
【００６８】
（参考文献）
2007516721.tif 000004
2007516721.tif 000005
2007516721.tif 000006
2007516721.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】pRSVXΔGの構築の概念図である。上の線は、各遺伝子を表示したＲＳＶ単離体ＸのゲノムＲＮＡを表す。下の四角は、構築に使用されたＲＴ−ＰＣＲ産物及びオリゴヌクレオチド二本鎖を表す。四角の中の数字は、表Ｉに挙げたようなオリゴヌクレオチドの番号を表示する。クローニングのために導入した制限部位を表示する。最終的なクローニングスキームを下に表示し、円はプラスミドであり、矢印はクローニングの順番を示す。
【図２】ＲＳＶ単離体ＸとpRSVXΔGとの配列の差異を示すアラインメントである。ゲノムのセンスのアラインメントとして配列を示す。pRSVXΔGに関して、ＲＳＶ単離体Ｘと異なるヌクレオチドのみを表示する。類似の配列を点（・）表示し、ギャップを（−）で表示する。遺伝子開始シグナルに一重下線、遺伝子停止シグナルに二重下線を付し、遺伝子を見出しに示す。四角で、導入されたヌクレオチド変化に起因する制限酵素認識部位がはっきりとする。
【図３】ａ）Mlu I、ｂ）Xma I、ｃ）SexA-I、ｄ）SnaB-Iで消化したＲＳＶ  ＲＴ−ＰＣＲ増幅産物の消化物中の配列マーカーの同定を示す図である。
【図４】ＲＳＶ単離体Ｘ及びΔＧ−ＲＳＶ単離体Ｘの成長曲線を示す図である。Ｖｅｒｏ（実線）及びＨｅｐ−２細胞（点線）にＭＯＩ＝０．１でウイルスを感染させ、細胞を３７℃でインキュベートした。表示した時点で細胞を採集して、Ｖｅｒｏ細胞を用いてＣＣＩＤ５０力価を決定した。
【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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