(57)【要約】  本発明は、感染性疾患、特に、脂質含有感染性ウイルス生物が血液等の生体流体中で見出される感染性疾患の発生及び重篤性を減少させる方法に関する。本発明は、脂質含有感染性ウイルス生物から脂質を抽出するのに有用な溶媒を利用し、それにより低い感染力及び増強された抗原性を有する改変されたウイルス粒子を作成する。本発明は、患者における１つ又は複数のウイルス疾患の予防及び／又は処置のための薬剤の調製における、これらの改変されたウイルス粒子の使用を提供する。本発明は、低い感染力及び増強された抗原性を有するこれらの改変されたウイルス粒子を含むワクチン組成物を、任意に薬学的に許容可能な担体又は免疫刺激剤と組み合わせて、提供する。ワクチン組成物は、患者に投与され、脂質含有感染性ウイルス生物に対する防御を付与する。本発明のワクチン組成物は、１つ又は複数のウイルス菌株及び／又は１つ又は複数のタイプのウイルスから得られる改変されたウイルス粒子の組み合わせワクチンを含む。
2007524383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的に脱脂されたウイルス粒子を少なくとも含む改変されたウイルス粒子であって、該部分的に脱脂されたウイルス粒子が、
患者内において陽性免疫応答を開始し、且つ
該患者内において感染性生物に対する防御を誘発する、
改変されたウイルス粒子。
【請求項２】
前記改変されたウイルス粒子が、改変されていないウイルス粒子よりも低いコレステロール含量を有する、請求項１に記載の改変されたウイルス粒子。
【請求項３】
前記改変されたウイルス粒子が、改変されていないウイルス粒子とは異なる浮遊密度を有する、請求項１に記載の改変されたウイルス粒子。
【請求項４】
部分的に脱脂されたウイルス粒子を少なくとも含む改変されたウイルス粒子であって、
改変されていないウイルス粒子よりも低いコレステロール含量、及び
改変されていないウイルス粒子とは異なる浮遊密度
を有する、改変されたウイルス粒子。
【請求項５】
改変されたウイルス粒子を作成する方法であって、
流体中で、脂質含有ウイルスエンベロープをそれぞれ有する、複数のウイルス粒子を入手し、
前記ウイルス粒子を脱脂過程に供し、そして
前記ウイルス粒子を部分的に脱脂すること
を含み、前記脱脂過程は、少なくとも部分的に前記ウイルスエンベロープの脂質含量を低減して、それにより前記改変されたウイルス粒子を作成し、前記改変されたウイルス粒子が、患者に投与されると免疫応答を誘発することができる、方法。
【請求項６】
抗原送達ビヒクルを作成する方法であって、
流体中で、脂質含有ウイルスエンベロープをそれぞれ有する、複数のウイルス粒子を入手し、
前記ウイルス粒子を脱脂過程に供し、そして
前記ウイルス粒子を部分的に脱脂して、それにより抗原送達ビヒクルとして作用する改変されたウイルス粒子を作成すること
を含み、前記脱脂過程は、前記ウイルスエンベロープの脂質含量を少なくとも部分的に低減して、それにより少なくとも１つのウイルス抗原を露出させ、露出された前記少なくとも１つのウイルス抗原が、患者内において免疫応答を誘発することができる、方法。
【請求項７】
脱脂されていないウイルス粒子においては露出されていなかった少なくとも１つの露出ウイルス抗原を有する部分的に脱脂されたウイルス粒子を少なくとも含む、改変されたウイルス粒子を含み、任意に薬学的に許容可能な担体を含む、ワクチン組成物であって、
前記部分的に脱脂されたウイルス粒子が、患者に投与されると免疫応答を誘発することができる、ワクチン組成物。
【請求項８】
前記免疫応答が、Ｔ細胞によるインターフェロンγ生産の増強、又は免疫系の細胞の増殖である、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項９】
患者に感染性ウイルス粒子に対する防御を付与する方法であって、
有効量の請求項７に記載の前記ワクチン組成物を該患者に投与することを含み、
前記量が、前記患者における感染性ウイルス粒子による感染に対する防御効果を付与す
るのに有効な量である、方法。
【請求項１０】
複数の脂質含有ウイルス粒子を有する患者において免疫応答を誘発する方法であって、
該患者から前記脂質含有ウイルス粒子を含有する流体を得、
前記脂質含有ウイルス粒子を含有する前記流体と、前記脂質含有ウイルス粒子から脂質を抽出することができる第１の有機溶媒とを接触させ、
前記流体と前記第１の有機溶媒とを混合し、
有機相と水相とを分離させ、
脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を含有する前記水相を回収し、そして
前記脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を含有する前記水相を前記患者内に導入すること
を含み、前記脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子が前記患者内において免疫応答を誘発する、方法。
【請求項１１】
前記改変されたウイルス粒子を含有する前記水相と、前記第１の有機溶媒を除去することができる炭とを接触させ、そして
この水相を回収し、前記改変されたウイルス粒子を含有するこの水相を前記患者に導入する前に、低レベルの前記第１の有機溶媒を含有する前記水相を、前記炭から溶出すること
をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
患者内のウイルス感染を処置する方法であって、
該患者から、複数の、脂質を含有する感染性ウイルス粒子を含有する血液を抜き取り、
前記脂質を含有する感染性ウイルス粒子を含有する血漿を、前記血液から得、
前記脂質を含有する感染性ウイルス粒子を含有する前記血漿と、前記脂質を含有する感染性ウイルス粒子から脂質を抽出することができる第１の有機溶媒とを接触させ、それにより脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を生産し、
前記血漿と前記第１の有機溶媒とを混合し、
有機相と水相とを分離させ、
前記改変されたウイルス粒子を含有する前記水相を回収し、そして
前記改変されたウイルス粒子を含有する前記水相を前記患者内に導入すること
を含み、前記改変されたウイルス粒子が前記複数の脂質を含有する感染性ウイルス粒子においては露出されていなかった少なくとも１つの露出されたウイルス抗原を有し、前記改変されたウイルス粒子が患者において免疫応答を誘発する、方法。
【請求項１３】
前記改変されたウイルス粒子が免疫不全ウイルスであり、前記改変されたウイルス粒子がタンパク質をさらに含み、該タンパク質がｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｐ２４又はｐ２７タンパク質のうちの少なくとも１つである、請求項１、４、５、６、７、１０又は１２のいずれか１項に記載の改変されたウイルス粒子。
【請求項１４】
前記改変されたウイルス粒子が、免疫不全ウイルス、肝炎ウイルス、ペスチウイルス又はコロナウイルスである、請求項１、４、５、６、７、１０又は１２のいずれか１項に記載の改変されたウイルス粒子。
【請求項１５】
前記改変されたウイルス粒子がＨＩＶ、ＳＩＶ、ＳＡＲＳ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス又はＢＶＤＶである、請求項１、４、５、６、７、１０又は１２のいずれか１項に記載の改変されたウイルス粒子。
【請求項１６】
前記第１の有機溶媒がアルコール、エーテル、アミン、炭化水素、エステル、界面活性剤又はこれらの組み合わせである、請求項１０又は１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の有機溶媒がアルコールと組み合わせたエーテルであり、該エーテルがＣ４〜Ｃ８のエーテルであり、該アルコールがＣ１〜Ｃ８のアルコールである、請求項１０又は１２に記載の方法。
【請求項１８】
１つより多いウイルス菌株又は１つより多いタイプのウイルスから得られる部分的に脱脂されたウイルス粒子を含む、請求項７に記載のワクチン組成物。
【請求項１９】
患者への投与の後、感染性ウイルス生物に対する防御を患者に付与するのに有用な薬剤の調製における、請求項１、４、７又は１８のいずれか１項に記載の改変されたウイルス粒子の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスから脂質を抽出し、それにより改変されたウイルス粒子を作成するのに有用な溶媒系を利用する脱脂法に関する。本発明の溶媒系は、ウイルスの脱脂の際に、ウイルス粒子が実質的に無傷で残るように最適に設計される。本発明の方法を用いてウイルス粒子を取り囲んでいる脂質エンベロープを溶解することにより、得られた改変されたウイルス粒子は、ヒト又は動物内に導入されたときに細胞応答及び抗体生産を助長且つ促進する露出抗原（又はエピトープ）を有する。本発明の得られた改変されたウイルス粒子は、再導入された種において、陽性（positive）免疫原性応答を開始する。本発明は、特異的患者からのウイルスを該患者への将来的な再導入のために脱脂すること、ストックウイルス又は特異的ウイルスをワクチンをして使用するために脱脂すること、又は非患者特異的ウイルス及び患者特異的ウイルスの両方を療法用カクテル（cocktail）を作成するために脱脂及び組み合わせることに、適用することができる。
【背景技術】
【０００２】
序文
多様な病原のウイルスは、毎年数十億の動物及びヒトに影響を与え、社会に莫大な経済的負担を負わせている。多くのウイルスは、それらを取り囲む膜の主要成分として脂質を含有する。ウイルスは動物及びヒトに影響を与え、極度の苦痛、病的状態及び死亡を引き起こす。これらのウイルスは、血液、腹水、リンパ液、胸膜液、心嚢液、脳脊髄液及び生殖器系の様々な流体等の生体流体中で体内を循環する。任意の部位での流体の接触は、疾患の伝染を促進する。他のウイルスは主に種々の器官系及び特異的組織に常在し、増殖し、次いで循環系内に進入して遠隔部位にある他の組織及び器官に接近する。これらの病原体に対して体が陽性免疫応答を示さないと、体内の多くの細胞型に感染し、これらの細胞がその正常な機能を行うことを阻害する。
【０００３】
ヒトの免疫系は、種々のウイルスから共同して体を防御する様々な細胞型から構成される。免疫系は、主に抗原の認識及び排除に関与している、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答を含む、外的要素を標的化及び排除するための複数の手段を提供する。外的要素に対する免疫応答は、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）又はＴリンパ球（Ｔ細胞）の存在が、通常はマクロファージ又は樹状細胞である抗原提示細胞（ＡＰＣ）と組み合わせて必要である。ＡＰＣは、抗原を捕捉する特殊化した免疫細胞である。一旦ＡＰＣ内部に入ると、抗原はエピトープ（抗原表面により運搬される独特のマーカ）と呼ばれるより小さいフラグメントに分解される。これらのエピトープは、続いてＡＰＣの表面上に表示（display）され、感染の防御における抗体応答を誘因する（triggering）ことに関与する。
【０００４】
体液性免疫応答において、体に対して外的であるＡＰＣ表示抗原（独特のエピトープマーカの型）が認識されると、Ｂ細胞は活性化され、増殖し、抗体を生産する。これらの抗体はウイルス上に存在する抗原と特異的に結合する。抗体が付着した後、ＡＰＣは抗原全体を飲み込み、これを殺す。このタイプの抗体免疫応答は、主にウイルス感染の予防に関与する。
【０００５】
細胞性免疫応答において、Ｔ細胞はＡＰＣ上に表示された抗原を認識する際に活性化される。細胞性免疫応答には２つのステップが存在する。第一の工程は、増殖して抗原を特異的に提示する標的細胞を殺す、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）又はＣＤ８+キラーＴ細胞の活性を伴なう。第二の工程は、抗体の生産及びＣＤ８+細胞の活性を制御する、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）又はＣＤ４+Ｔ細胞を伴なう。ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＣＤ８+細胞を増殖
させ、且つ効率的に機能させる成長因子をＣＤ８+細胞に与える。
【０００６】
ある感染性病原体は、その構造に応じて「慢性的」であると見なされる。例えばいくつかのウイルスは、それらの抗原のいくつかを免疫系から隠す能力のため、免疫応答を回避することが可能である。ウイルスは、出芽過程中、宿主の細胞膜に由来する脂質及び脂肪から成る外側エンベロープを含有する。ウイルスは、タンパク質コート（coat）に取り囲まれたビリオン（ただ１つの型の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらか）から成る非細胞性感染性物質）を含む。ウイルスを被覆している外側タンパク質はカプシドと呼ばれ、カプソマーと呼ばれる繰り返しサブユニットから成る。
【０００７】
ウイルスは非代謝性であるため、生きている宿主細胞内でしか繁殖しない。ウイルスはウイルスエンベロープのタンパク質をコードする一方、宿主細胞は脂質及び炭水化物をコードする。したがって、所定のウイルスエンベロープ中の脂質及び炭水化物含量は、特定の宿主に依存する。したがって、エンベロープされたウイルス粒子は、脂質及び炭水化物含有物を介して、宿主細胞の同一性を部分的に取り入れ、通常は免疫応答を開始しているであろう、それらと関連する抗原を隠匿することができる。代わりに、ウイルス粒子は、宿主組織の成分を含有する抗原複合体を宿主に提示することにより、宿主の免疫系を混乱させ、宿主の免疫系により部分的に「自己」及び部分的に「外性」であると感知させる。免疫系は、ウイルス粒子を破壊しない「日和見的」非効率的な抗体を生産させられ、宿主細胞を破壊しながら、ウイルスを繁殖させ、徐々に体に重篤な損傷を引き起こしてしまう。
【０００８】
免疫系に影響を与える最近の伝染病は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）により引き起こされると考えられている後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む。近縁のウイルスが、例えばサル及びネコ等の動物種に影響を与えている（それぞれＳＩＶ及びＦＩＶ）。他の主なウイルス性感染症は、髄膜炎、サイトメガロウイスル及び様々な型の肝炎ウイルスを含むが、これらに限定されない。
【０００９】
現在の処置方法
多様な病因のウイルスを処置する従来技術の方法の一つは、薬物療法を介する。ほとんどの抗ウイルス薬物療法は、ウイルスの複製を予防又は阻害することを目的としており、Ｔ４リンパ球又はマクロファージへのウイルスの最初の付着、ウイルスＲＮＡのウイルスＤＮＡへの転写、及び複製中の新規のウイルスの組み立てに焦点が当てられているように見える。様々な菌株が抗ウイルス薬物療法に対して耐性となるため、ウイルスの高い突然変異率（特にＨＩＶの場合）は、現存する処置における主な問題である。さらに、抗ウイルス薬物療法処置は、ウイルスの耐性菌株の進化を引き起こし得る。薬物療法に対する他の難点は、望ましくない副作用及び患者の順守要件（patient compliance requirements）である。加えて、多くの個体は複数のウイルス感染（ＨＩＶと肝炎の組み合わせ等）により悩まされている。このような個体は、疾患の進行を相殺するために、より積極的且つ高価な投薬計画が必要である（これはより重大な副作用及びより高い複数の薬物耐性の可能性を引き起こす）。ＨＩＶを処置する現在最も有効的なアプローチは、高価で、患者に対して毒性であり、且つウイルスを根絶しない、高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の使用である。ＨＡＡＲＴ処方計画の厳守はいまだに大きな障害であり、順守の欠落は爆発的なウイルス複製及び薬物耐性菌株の選択を導く。加えて、ＨＡＡＲＴの長期間の使用は、リポジストロフィー、糖代謝異常並びに血漿中のコレステロール及びトリグリセリドの増大等の副作用と関連する。したがって、予防及び療法用のワクチンのいずれかの型でのさらなる療法、又はＨＡＡＲＴを増補する免疫調節剤への差し迫った必要性が存在する。ＨＩＶワクチン開発への現在のアプローチは、Mwau他（２００３年、A review of vaccines for HIV prevention. J Gene Med 5: 3）により論評されている。簡便には、戦略として、様々な発現ベクター、ＤＮＡベースの組み換えワクチン、ＤＮＡベースワクチ
ンの組み合わせ、及びアジュバント有り又は無しのウイルスタンパク質追加免疫（boosts)を含む。例えば、タイ国における組み換えｇｐ１２０ワクチンを使用する最近の第三フェーズ臨床試験は、成功しなかった（Cohen, Ｊ. 2003.Public health. AIDS vaccine still alive as booster after second failure in Thailand.Science 302： 1309）。おそらくこれは、適切な免疫応答が生じるためには、組み換えウイルスタンパク質が正確な構成（correct configuration）である必要があるためである。明らかに、ウイルス抗原に対する免疫応答を増強する他の新規のアプローチが評価される必要がある。
【００１０】
ワクチン接種の使用を介する疾患の予防も従来技術において知られている。ワクチンは単独で、いくつものヒト病原体に対する免疫応答を授与することに関与してきた。ワクチンは免疫系を刺激して、様々なウイルス感染に対して防御するように設計されている。包括的に、ワクチンは、病原（disease-causing）微生物から単離又は生産される抗原から生産され、免疫応答を誘発することができる。有効的な免疫応答を創出する予防的対策としてワクチンが血流中に注射されると、血流中のＢ細胞が、ワクチンに含有される抗原を外的又は「非自己」であると感知し、抗原と結合してそれらを不活化する抗体を生産することで対応する。それによりメモリ細胞が生産され、同じ病原物質によるその後の感染に対する、迅速な防御免疫応答をすぐに備えることができる状態に留まる。したがって、ワクチンと類似した抗原を含有する感染性病原体が体内に侵入すると、免疫系がタンパク質を認識し、感染に対して有効的な防衛を推進する。
【００１１】
現在のワクチン接種法は欠点を有し、特定の病原体（特にＨＩＶ）に対して個体に免疫性を与えることは、最適に望ましいものであるとは決して言えない。現存するワクチン戦略は、感染性病原体と関連する抗原に対して体を露出させ、体がこれらの病原体に対して免疫応答を構築するできるようにすることを目的とする。例えば、Ｂ型肝炎及びＨＩＶの病原体は、免疫応答があるにもかかわらず、ヒトの体内で生存且つ増殖することができる。従来技術において提示される１つの説明では、これら微生物の抗原は絶えず変化し、そのため抗原が突然変異すると、特定抗原に応じて生産される抗体はもはや有効的ではないとされる。ＡＩＤＳウイルスはこの抗原変異を受けると考えられている。抗原変異は薬物又は抗原の組み合わせの使用により試みられてきたが、従来技術のワクチンはＨＩＶ等の慢性的感染症への取り組みに成功していない。
【００１２】
多様な病因のウイルスを処置する別のアプローチは、ウイルスを不活化することである。化学薬品を使用してウイルスを不活化する従来技術の方法は、クロロホルム又はグルタルアルデヒド等の有機溶媒に頼ってきた。ウイルスの不活化はウイルス感染に対する防御免疫応答を付与しないため、ウイルス不活化は現在も問題である。加えて、これの大部分はウイルスタンパク質を変性させることに合わせられているため、ウイルス粒子の構造を破壊する。つまり、従来技術法の大部分は、免疫応答を生産するため、ウイルス粒子を好適に改変するのではなく破壊することに焦点が当てられている。
【００１３】
ウイルス処置剤及び医薬品の現在の製造方法
ウイルス不活化（又は化学的殺傷）
従来技術には、ウイルス粒子を有機溶媒及び高温で処置し、それにより脂質エンベロープを溶解し、続いてウイルスを不活化する方法が記載されている。これらの方法において、血液は患者から抜き取られ、２つの相に分離される。赤血球及び血小板を含む第１相並びに血漿、白血球及び無細胞ウイルス（ビリオン）を含む第２相である。第２相は、有機溶媒で処置され、感染細胞及びビリオンを殺傷し、続いて患者内に再導入される。ウイルスの脂質エンベロープを溶解することに加えて、高い有機溶媒濃度は、細胞死を引き起こし抗原を傷つける。原則的に、この方法は細胞の「化学的殺傷」をもたらす。
【００１４】
グルタルアルデヒドは、約１：２５０のグルタルアルデヒド希釈溶液による固定により
当業者に既知であるように、細胞不活化が達成されるような溶媒の１つである。グルタルアルデヒドでのウイルスの処置は有効的にウイルスを脱脂するが、コア（core）も破壊する。核の破壊は、レシピエント内で免疫応答を誘導するのに有用な改変されたウイルス粒子を生産するのに望ましくない。
【００１５】
クロロホルムは別のこのような溶媒である。しかし、クロロホルムは多くの血漿タンパク質を変性させるため、動物又はヒトに再導入されるであろう生体流体との使用に好適でない。クロロホルムにより有害な影響を与えられるこれらの血漿タンパク質は、凝集、ホルモン応答及び免疫応答を含む重要な生物学的機能を果たす。これらの機能は生命に不可欠であり、したがってこれらのタンパク質の損傷は患者の健康に悪影響を与え、死にいたらしめるかもしれない。
【００１６】
Ｂ−プロピオラクトン、ＴＷＥＥＮ−８０、及びジアルキル又はトリアルキルリン酸などの他の溶媒又は洗剤（detergent）が、単独で又は組み合わせて使用されてきた。これらの方法の多く、特に界面活性剤を包含するものは、動物又はヒトに処置血漿試料が再導入される前に、界面活性剤の除去を確実にする面倒な手順を必要とする。さらに、従来技術に記載される多くの方法は、遊離したウイルス及び感染細胞を殺傷するために、高められた温度に広範囲にわたってさらすことを包含する。高められた温度は、血漿などの生体流体中に含有されるタンパク質に対して有害な影響を有する。
【００１７】
現在のワクチン製造方法
現在まで、いくつかの製造方法が、感染性病原物質に対して個体に免疫性を与える安全且つ有効的なワクチンの探索に利用されてきた。特異的病原性感染から個体を保護するために、感染性病原体と関連する標的タンパク質又は抗原が個体に投与される。これは、タンパク質を、非感染性（不活化）又は感染性の小さい（弱毒化）物質として、又は別個のタンパク質組成物として提示することを含む。当業者には、以下の種々のタイプのワクチンが知られている：生弱毒化ワクチン（live attenuated vaccines）、完全不活化ワクチン（whole inactivated vaccines）、ＤＮＡワクチン、組み合わせワクチン、組み換えワクチン、生組み換えベクターワクチン（live recombinant vector vaccines）、ウイルス様粒子及び合成ペプチドワクチン。
【００１８】
生弱毒化ワクチンにおいて、ウイルスゲノムの特異的遺伝子操作又はある種の組織培養系における継代のいずれかにより、ウイルスは宿主に対する病原性が弱くなる。遺伝子操作を達成するためには、非必須遺伝子を欠失するか、ウイルス中の１つ又は複数の必須遺伝子を部分的に損傷させる。遺伝子操作の際、ウイルス粒子は有毒性が弱くなるが、抗原特性は保有している。生弱毒化ワクチンは、他の遺伝子への「ワクチンベクター」としても使用することができ、ここでワクチンは防御を必要とする第二のウイルス（又は他の病原体）からの遺伝子のキャリアーとして作用する。しかし、弱毒化ワクチン（感染性は弱いが不活化されてない）は、いくつかの問題を提起する。第一に、いつ弱毒化ワクチンが最早病原性でなくなるかを突き止めることが難しい。有効的な弱毒化を適切に試験するためには、ワクチンからのウイルス感染の危険性が大きすぎる。加えて、弱毒化ワクチンは、病原体の有毒型へ逆戻りする危険性を抱えている。
【００１９】
完全不活化ワクチンは、殺傷又は不活化したウイルスを導入して個体の免疫系へ病原体タンパク質を導入することにより、感染に対する免疫性を与えることが当該技術分野において知られている。熱的又は化学的手段により殺傷又は不活化した病原体を個体へ投与することは、個体の免疫系へ病原体を非感染的型で導入し、それにより免疫応答防御を開始する。完全不活化ワクチンは、病原体免疫原に対する細胞性及び体液性免疫応答を直接生じさせることにより防御を付与する。ウイルス病原体は殺傷されるか不活化されているため、感染のおそれはほとんどない。
【００２０】
サブユニットワクチンは、当業者によく知られているさらなる別のワクチン接種の型である。サブユニットワクチンは、病原体に由来する、１つ又は複数の単離タンパク質から成る。これらのタンパク質は、免疫応答が示される標的抗原として作用する。サブユニットワクチンに選択されたタンパク質は、病原体により提示され、病原体による個体の感染の際、個体の免疫系はその病原体を認識し、免疫応答を推進する。サブユニットワクチンは、完全感染性物質ではなく、したがって感染性になることが不可能である。サブユニットワクチンはＡＩＤＳＶＡＸ（ヒトにおける有効性を試験された初めてのＨＩＶワクチンであり、ｇｐ１２０と呼ばれる、ＨＩＶ外表面（エンベロープ）タンパク質の一部を含有する）の土台である。
【００２１】
ＤＮＡワクチンは、当該分野において既知であり、病原体の実際の遺伝物質を使用する、別のタイプである。加えて、合成ペプチドワクチンは、ペプチドと呼ばれる、合成及び化学的操作されたＨＩＶタンパク質の部分から作られる。これらは、抗ＨＩＶ免疫応答を達成する、特異的に選択されたＨＩＶタンパク質の断片から成る。また、互いに併せて使用されると、幅広い範囲（spectrum）の免疫応答を生じる、組み合わせワクチンも従来技術において言及されている。組み合わせウイルスの一例は、ＨＩＶエンベロープ及びＳＩＶコアから作られる合成ウイルスであるＳＨＩＶが挙げられる。
【００２２】
防御免疫応答を開始することができる患者特異的ウイルス抗原を、患者に付与する、療法の方法及びシステムが必要とされている。したがって、処置される生体試料からのタンパク質を大量に（appreciably）変性又は抽出しない、簡便且つ有効的な方法が求められている。また、ウイルス粒子を破壊するのではなく改変することによる、有効的な脱脂過程が必要とされており、それによってそのウイルス粒子の感染力を減少及び／又は消失させ、且つ患者特異的自己免疫応答を引き起こし、さらにウイルス感染を現象させかつ更なる感染を予防する。
【００２３】
また、ウイルスの突然変異により個体特有のウイルス病原体感染に対して、個体を免疫化する有効的な手段も必要とされている。好ましくは、上記手段は、個体が感染する危険性を最小限にして、幅広い防御免疫応答を誘発するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
発明の概要
本発明は、簡便、有効的且つ効率的なウイルス感染を処置及び予防する方法を提供することにより、上述した問題を解決する。本発明の方法は、効率的な溶媒系を使用してウイルスの脂質エンベロープに影響を与えるが、ウイルスを変性又は破壊しない。本発明は、脱脂を介して、患者に投与されると陽性免疫応答を生じる、脂質エンベロープが少なくとも部分的に除去された、非合成の、宿主由来又は非宿主由来の改変されたウイルス粒子を作成するのに最適な溶媒及びエネルギー系を利用し、それによりその患者にウイルスに対するある程度の防御を付与する。これらの改変されたウイルス粒子は、脱脂過程の前には露出されていなかった、少なくとも１つの露出抗原を有すると考えられる。また本発明は、患者への医薬品の投与に続いて、感染性ウイルス生物に対する患者の防御を付与するのに有用な医薬品の調製における、これらの改変されたウイルス粒子の使用も提供する。また本発明は、患者への医薬品の投与に続いて、１つ又は複数の感染性ウイルス生物菌株に対する患者の防御、又は１つ又は複数タイプのウイルスに対する防御を付与するのに有用な、組み合わせワクチンとして知られる医薬品の調製において、種々のウイルス菌株又は種々のウイルスからの、１つ又は複数のこれらの改変されたウイルス粒子の使用を提供する。また本発明は、患者への医薬品の投与に続いて、感染性ウイルス生物により引き起こされるウイルス感染を有する患者を処置するのに有用な医薬品の調製における、これらの
改変されたウイルス粒子の使用を提供する。この処置は、ウイルス感染の重篤性を減少させる。また本発明は、患者への医薬品の投与に続いて、１つ又は複数のウイルス性生物菌株により引き起こされるウイルス感染を有する患者を処置するのに、及び１つより多いウイルス感染を有する患者を処置するのに有用な組み合わせワクチンとして知られる医薬品の調製において、種々のウイルス菌株又は種々のウイルスからの１つ又は複数のこれらの改変されたウイルス粒子の使用も提供する。
【００２５】
また本発明は、ウイルスが改変型（減少した感染力）で存在するように、且つ低脂質含量の流体を患者に再導入する際に免疫応答が開始されるように、ウイルスを含有する生体流体を処置することによって、ウイルスに対する自己の、患者特異的療法用ワクチンの生産においても有効的である。この自己方法は、患者特異的抗原（例えば患者特異的ウイルス抗原）が、それが得られたのと同じ患者に導入され、免疫応答を誘導することを確実にする。このことは、患者の生理機能が、ウイルス等の感染性生物中に存在する抗原を改変し得るため、重要な特色である。ワクチンを作成するためには、生体流体（例えば血液）を患者から抜き取り、血漿を血液から分離し、最適溶媒系を用いて血漿中のウイルスの脂質含量を減少させる。感染力を減少させ、且つ脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を作成するためにこのように処置した脂質含有ウイルスを、任意に薬学的に許容可能な担体と共に、動物又はヒト等の患者に投与し、その動物又はヒトにおける免疫応答を開始させ、改変されたウイルス粒子の露出エピトープと結合する抗体を作らせる。アジュバントを、改変されたウイルス粒子と共に、薬学的に許容可能な担体中とともに又は別々に投与することもできる。
【００２６】
また本発明は、非自己ワクチンを生産するのにも利用され、ここで少なくとも１つの動物又はヒトからの脂質含有ウイルスを有する生体流体は、種々（非自己）の動物又はヒトへ投与するための改変されたウイルス粒子を生産するのに処置される。また本発明は、本方法を用いて動物又はヒトから得られる血漿等の生体流体を処置し、この流体中及び流体中のウイルスの脂質レベルを減少させることによって、ウイルスに対する非自己ワクチンを生産するのに有効的である。低脂質レベルを有し、低脂質レベルを有する改変されたウイルスを含有する、このように処置された流体を、処置された生体流体源ではない別の動物又はヒトへ導入してもよい。この非自己方法は、レシピエント動物又はヒトをウイルス等の１つ又は複数の感染性生物に対してワクチン接種することに利用される。生体流体は、ウイルス等の１つ又は複数の感染性生物に感染した動物又はヒトからのものを使用してよく、生体流体を本方法で処置して、レシピエント動物又はヒトへの投与用のワクチンを生産してもよい。代替として、又は加えて、生体流体を本発明の方法で処置してワクチンを作成する前に、様々なウイルス保存供給源を流体に添加してもよい。
【００２７】
本発明は、同じ感染性生物の１つより多い菌株、例えば、ＨＩＶウイルスの１つより多いクレード（例えば、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２）を含む、本発明の脱脂法で作られたワクチンを包含する。このようなワクチンは、同じ感染性生物の１つより多い菌株に対する免疫応答を付与する。同じウイルスのいかなる数の異なる感染性菌株又はクレードを選択してもよく、本発明の脱脂法で処置して多数のワクチンを形成してもよい。代替として、又は加えて、ウイルスの種々の菌株又はクレードの様々なストック供給源を、流体を本発明の方法で処置して免疫応答を生じることが可能なワクチンを作成する前に、生体流体に加えてもよい。１つ又は複数のウイルス製剤のストックは、１つ又は複数のウイルスを対象とする非自己ワクチンを作るのに利用され得る。このようにして、ウイルスの複数の菌株若しくはクレード、又は複数のウイルスに対する防御を付与する組み合わせワクチンは生産される。
【００２８】
本発明は、１つより多いウイルス等の１つより多い感染性生物を含む、本発明の脱脂方法を用いて作られるワクチンを包含する。このような組み合わせワクチンは、例えばＨＩ
Ｖや肝炎ウイルスのような１つより多い感染性生物に対する免疫応答を付与する。いかなる数の異なる感染性生物を選択し、且つ本発明の脱脂法を用いて処置して、多数の組み合わせワクチンを形成してもよい。
【００２９】
このように、脂質エンベロープから脂質を除去すること、及び脂質エンベロープ内又は脂質エンベロープ表面の下に隠されている抗原を露出させることにより、患者に再導入されると免疫応答を生じる新規なワクチンを、脂質含有ウイルスから開発することができる有効的な方法が提示される。
【００３０】
本発明は、部分的に脱脂されたウイルス粒子を少なくとも含む改変されたウイルス粒子であって、該部分的に脱脂されたウイルス粒子は、患者内において陽性免疫応答を開始し、且つ上記患者内において感染性生物に対する防御を誘発する、部分的に脱脂されたウイルス粒子を少なくとも含む改変されたウイルス粒子を提供する。
【００３１】
本発明は、改変されたウイルス粒子を作成する方法であって、流体中で、脂質含有ウイルスエンベロープをそれぞれ有する、複数のウイルス粒子を入手し、上記ウイルス粒子を脱脂過程に供し、そして上記ウイルス粒子を部分的に脱脂することを含み、上記脱脂過程は、少なくとも部分的に上記ウイルスエンベロープの脂質含量を低減して上記改変されたウイルス粒子を作成し、且つ上記改変されたウイルス粒子は、患者に投与されると陽性免疫応答を誘発することができる、改変されたウイルス粒子を作成する方法を提供する。
【００３２】
また本発明は、抗原送達ビヒクル、及び抗原送達ビヒクルを作成する方法であって、流体中において、ウイルスエンベロープをそれぞれ有する、複数のウイルス粒子を受け取ること、上記ウイルス粒子を脱脂過程に供し、そして上記ウイルス粒子を部分的に脱脂して、抗原送達ビヒクルとして作用する改変されたウイルス粒子を作成する、部分的に脱脂することを含み、上記脱脂過程は、上記ウイルスエンベロープを少なくとも部分的に除去して少なくとも１つのウイルス抗原を露出させ、且つ上記少なくとも１つの抗原は、患者内において陽性免疫応答を誘発することができる、抗原送達ビヒクルを作成する方法を提供する。
【００３３】
本発明の改変されたウイルス粒子は、部分的に脱脂されたウイルス粒子を少なくとも含み、上記部分的に脱脂されたウイルス粒子は、脱脂されていないウイルス粒子を脱脂過程に供することにより生産され、上記部分的に脱脂されたウイルス粒子は、上記脱脂されていないウイルス粒子においては露出されていなかった少なくとも１つの露出された患者特異的抗原を含む。
【００３４】
また本発明は、患者特異的ウイルス抗原を有する部分的に脱脂されたウイルス粒子、及び任意に薬学的に許容可能な担体を少なくとも含む、ワクチン組成物であって、上記部分的に脱脂されたウイルス粒子は、上記組成物が患者に投与されると陽性免疫応答を誘発することができる、ワクチン組成物を提供する。
【００３５】
また本発明は、ワクチンを作成する方法であって、流体中の脂質含有ウイルス粒子と、該脂質含有ウイルス粒子から脂質を抽出することができる第１の有機溶媒とを接触させること、上記脂質含有ウイルス粒子から脂質を抽出するのに十分な時間、上記流体と上記第１の有機溶媒とを混合すること、有機相と水相とを分離させること、及び脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を含有する上記水相を回収することを含み、上記改変されたウイルス粒子は、患者に投与されると陽性免疫応答を誘発することができる、ワクチンを作成する方法を提供する。
【００３６】
また本発明は、感染性ウイルス粒子から患者を防御する方法であって、改変されたウイ
ルス粒子を含有する有効的な量の組成物及び任意に薬学的に許容可能な担体を上記患者に投与することを含み、上記改変は、上記感染性ウイルス粒子の脂質エンベロープの部分的除去を少なくとも含み、上記量は、動物又はヒトにおける感染性ウイルス粒子による感染に対する防御効果を付与するのに有効的である、防御する方法を提供する。
【００３７】
また本発明は、複数の脂質含有ウイルス粒子を有する患者において陽性免疫応答を誘発する方法であって、上記患者から上記脂質含有ウイルス粒子を含有する流体を得ること、上記脂質含有ウイルス粒子を含有する上記流体と、上記脂質含有ウイルス粒子から脂質を抽出することができる第１の有機溶媒とを接触させること、上記流体と上記第１の有機溶媒とを混合すること、有機相と水相とを分離させること、脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を含有する上記水相を回収すること、及び上記脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を含有する上記水相を動物又はヒト内に導入することを含み、上記脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子は動物又はヒト内において陽性免疫応答を誘発する、免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００３８】
また本発明は、患者内のウイルス感染を処置する方法であって、上記患者から、複数の脂質含有感染性ウイルス粒子を含有する血液を抜き取ること、上記脂質含有感染性ウイルス粒子を含有する血漿を、上記血液から得ること、上記脂質含有感染性ウイルス粒子を含有する上記血漿と、上記脂質含有感染性ウイルス粒子から脂質を抽出することができる第１の有機溶媒とを接触させ、脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を生産する、接触させること、上記血漿と上記第１の有機溶媒とを混合すること、有機相と水相とを分離させること、上記改変されたウイルス粒子を含有する上記水相を回収すること、上記水相から残余溶媒を除去すること、及び上記改変されたウイルス粒子を含有する上記水相を上記患者内に導入することを含み、上記改変されたウイルス粒子は上記複数の脂質含有感染性ウイルス粒子においては露出されていなかった少なくとも１つの露出患者特異的抗原ウイルス抗原を有する、ウイルス感染を処置する方法を提供する。これらの改変されたウイルス粒子の患者への投与は、ウイルス感染の重篤性を処置又は減少する免疫応答を産出する。
【００３９】
また本発明は、患者内におけるウイルス感染を処置する方法であって、複数の患者から、複数の脂質含有感染性ウイルス粒子を含有する血液を得ること、上記脂質含有感染性ウイルスと、好適な生物学的に許容可能な担体とを任意に組み合わせること、上記脂質含有感染性ウイルス粒子を含有する流体と、上記脂質含有感染性ウイルス粒子から脂質を抽出することができる第１の有機溶媒とを接触させ、脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を生産する、接触させること、上記担体と上記第１の有機溶媒とを混合すること、有機相と水相とを分離させること、上記改変されたウイルス粒子を含有する上記水相を回収すること、及び上記改変されたウイルス粒子を含有する上記水相を種々の患者内に導入することを含み、上記改変されたウイルス粒子は上記複数の脂質含有感染性ウイルス粒子においては露出されていなかった少なくとも１つの露出ウイルス抗原を有する、ウイルス感染を処置する方法を提供する。この実施の形態において、上記脂質含有感染性ウイルス粒子は、１つ又は複数のウイルス菌株、又は１つ又は複数タイプのウイルスを提示し、且つ患者特異的ではない。これらの改変されたウイルス粒子の患者への投与は、ウイルス感染の重篤性を処置又は減少する免疫応答を産出する。
【００４０】
以下に記載されるように、改変されたウイルス粒子の特徴は、ワクチン接種されると陽性免疫応答を有するマウスと、完全不活化ワクチン接種したマウスとを比較した実験データにより示される。加えて、タンパク質回収を示すデータは、ウイルス粒子の構造的完全性の保持を示し、これはこのウイルス粒子の脂質含有エンベロープのみが除去されていることを示す。
【００４１】
本発明の方法を用いて処置され得る流体は、血漿；血清；リンパ液；脳脊髄液；腹水；胸膜液；心嚢液；精液、射精液、卵胞液及び羊水を含むが、これらに限定されない生殖系の様々な流体；正常血清、ウシ胎仔血清又は任意の他の動物若しくはヒトに由来する血清等の細胞培養試薬；及び抗体及びサイトカインの様々な製剤等の免疫学的試薬を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明の方法は、ウイルスエンベロープ中に脂質を含有するウイルスを処置するのに使用され得る。本発明の方法を用いて処置される好ましいウイルスは、ヒト（ＨＩＶ）並びにＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２等のサブタイプ及びクレード、サル（ＳＩＶ）、ネコ（ＦＩＶ）を含む様々な免疫不全ウイルス（これらに限定されない）、並びに任意の他の型の免疫不全ウイルスを含む。本発明の方法を用いて処置される他の好ましいウイルスは、肝炎ウイルス及びその様々な型を含むがこれらに限定されない。本発明の方法を用いて処置される別の好ましいウイルスは、ウシペスチウイルスである。本発明の方法を用いて処置される別の好ましいウイルスは、コロナウイルスＳＡＲＳである。本発明は、上記のリストに提供されたウイルスに限定されないことが理解されるべきである。さらなる具体的なウイルスは、本出願の詳細な説明において記載される。特にウイルスエンベロープ中に、脂質を含有する全てのウイルスが、本発明の範囲内に包含される。
【００４３】
したがって、本発明の目的は、改変されたウイルス粒子を作成するために、脂質含有ウイルスを処置する方法を提供することである。
【００４４】
本発明の目的は、改変されていないウイルス粒子と比較したとき、タンパク質レベルを実質的に影響せずに、脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を作成するために、脂質含有ウイルスを処置する方法を提供することである。
【００４５】
本発明のさらなる別の目的は、改変されていないウイルス粒子と比較したとき、実質的に影響されないタンパク質レベルを有し、脂質含量の低減した、且つ改変されていないウイルス粒子においては実質的に露出されていなかったウイルス粒子と関連する少なくとも１つの露出抗原を有する、改変されたウイルス粒子を作成するために、脂質含有ウイルスを処置する方法を提供することである。
【００４６】
本発明のさらなる別の目的は、低脂質含量、及び改変されていないウイルス粒子においては実質的に露出されていなかったウイルス粒子と関連する少なくとも１つの露出抗原を有する改変されたウイルス粒子を、患者に投与することにより、ウイルス疾患を処置又は予防する方法を提供することである。
【００４７】
本発明の別の目的は、生体流体中に含有される感染性ウイルス生物の感染力を減少又は消失させるために、生体流体を処置する方法を提供することである。
【００４８】
本発明のさらなる別の目的は、生体流体中に、改変されていないウイルス粒子と比較したとき、実質的に影響されないタンパク質レベルを有するかなりの割合のウイルス粒子を有する、低脂質含量の分布を有する複数の改変脂質含有ウイルス粒子を作成する方法を提供することである。
【００４９】
本発明のさらなる目的は、流体中に含有されるタンパク質に対する有害な影響を最小限にする、流体中の脂質含有ウイルスを処置する方法であって、それにより患者内において陽性免疫応答を開始することができる特性を有する改変されたウイルス粒子を作成する、処置する方法を提供することである。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、流体中に含有されるタンパク質に対する有害な影響を最小限
にする、流体中の脂質含有ウイルスを処置する方法であって、それにより患者特異的ウイルス抗原を有する改変されたウイルス粒子を作成する、処置する方法を提供することである。
【００５１】
本発明の別の目的は、ウイルスの感染力を減少させる方法であって、本方法は、改変されたウイルス粒子上に抗原決定基を露出させる、減少させる方法を提供することである。
【００５２】
本発明の別の目的は、ウイルス粒子を完全に又は部分的に脱脂することであって、ウイルス粒子は免疫不全ウイルス、様々な型の肝炎ウイルス、コロナウイルス、又は任意の他の脂質含有ウイルスを含み、それにより改変されたウイルス粒子を作成する、脱脂することである。
【００５３】
本発明のさらなる目的は、ウイルス粒子を完全に又は部分的に脱脂することであって、ウイルス粒子は免疫不全ウイルス、様々な型の肝炎ウイルス、コロナウイルス、又は任意の他の脂質含有ウイルスを含むが、ウイルスの構造タンパク質核は保持する、脱脂することである。
【００５４】
本発明の別の目的は、ウイルスの感染力を減少させる方法であって、新たに形成されたウイルス粒子は抗原送達ビヒクルとして使用することができる、減少させる方法を提供することである。
【００５５】
本発明のさらなる別の目的は、本発明の方法を用いて感染性生物を処置することであって、それらの感染力を減少させ、且つ任意に薬学的に許容可能な担体及び任意に免疫刺激化合物と共に、動物又はヒトに投与され得る脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を含むワクチンを提供し、それによりウイルスに露出された後に患者内における疾患の臨床兆候を予防又は最小限にする、処置することである。
【００５６】
本発明のさらなる別の目的は、本発明の方法を用いて感染性生物を処置することであって、それらの感染力を減少させ、且つ任意に薬学的に許容可能な担体及び任意に免疫刺激化合物と共に、動物又はヒトに投与され得る脂質含量の低減した改変されたウイルス粒子を含むワクチンを提供し、それにより動物又はヒトにおいて陽性免疫応答を開始することである。
【００５７】
本発明の別の具体的な目的は、抗ウイルスワクチンを提供することである。
【００５８】
本発明の別の具体的な目的は、免疫系の細胞において細胞性応答を誘導する抗ウイルスワクチンを提供することであって、上記細胞性応答は、細胞の増殖及びインターフェロンγ等の免疫系分子の生産を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明のさらなる具体的な目的は、任意に薬学的に許容可能な担体と組み合わされる、本発明の方法を用いて処置されたウイルスを含む組成物を含むワクチンを受け取る動物又はヒトにおける、脂質含有ウイルスにより引き起こされた疾患の重篤性を減少させることである。
【００６０】
本発明の別の目的は、患者特異的抗原を有する脂質含量の低減したウイルス粒子と、脂質含量の低減した脱脂株ウイルス粒子とを組み合わせ、それにより１つより多いウイルス疾患を処置又は予防する療法用組み合わせワクチンを作成することである。
【００６１】
本発明のこれら及び他の特色及び利点は、以下の開示された実施の形態の図面及び詳細な説明を検討することにより明らかとなるであろう。記述された実施の形態への様々な変
形は、当業者には容易に明らかであろう。本明細書中に述べられた開示は、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、他の実施の形態及び用途に利用可能であり得る。
【００６２】
添付の図面（援用され、本明細書の一部を形成する）は、本発明の好ましい実施の形態を説明する。
【００６３】
定義
「流体（fluid）」という用語により、感染性生物を含有する任意の流体を意味し、動物又はヒト等の生物から得られる生体流体を含むが、これらに限定されない。本発明の方法を用いて処置される好ましい感染性生物はウイルスである。生物から得られるこのような生体流体は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液、腹水、卵胞液、羊水、胸膜液、心嚢液、生殖器液、及び生物中に含有される任意の他の流体を含むが、これらに限定されない。他の流体は、任意の選択された液体に懸濁された感染性生物を含有する実験室試料を含んでよい。他の流体は、細胞培養試薬を含み、これの多くは生きた生物から得られる流体等の生物学的化合物を含み、様々な動物から得られ、且つ細胞及び組織培養用途において成長培地として使用される「正常血清」を含むがこれらに限定されない。
【００６４】
「第１の溶媒」又は「第１の有機溶媒」又は「第１の抽出溶媒」という用語により、１つ又は複数の溶媒を含む、流体又はその流体中の脂質含有生物学的生物から脂質の抽出を容易にするのに使用される溶媒を意味する。この溶媒は流体中に進入し、それが除去されるまで流体中に残る。好適な第１の抽出溶媒は、アルコール類、炭化水素類、アミン類、エーテル類、及びこれらの組み合わせを含む（これらに限定されない）、脂質を抽出又は溶解する溶媒を含む。第１の抽出溶媒は、アルコール類とエーテル類との組合せであってよい。第１の抽出溶媒は、ｎ−ブタノール、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）、ジエチルエーテル、及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００６５】
「第２の抽出溶媒」という用語は、第１の抽出溶媒の一部の除去を容易にするのに利用され得る１つ又は複数の溶媒により定義される。好適な第２の抽出溶媒は、流体からの第１の抽出溶媒の除去を容易にする任意の溶媒を含む。第２の抽出溶媒は、第１の抽出溶媒の除去を容易にする任意の溶媒を含み、エーテル類、アルコール類、炭化水素類、アミン類及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。好ましい第２の抽出溶媒は、流体からｎ−ブタノールなどのアルコール類の除去を容易にする、ジエチルエーテル及びジイソプロピルエーテルを含む。「解乳化剤」という用語は、水相中のエマルジョン中に存在し得る第１の溶媒の除去を支援する第２の抽出溶媒である。
【００６６】
「脱脂」という用語は、流体中又は脂質含有生物中の脂質の総濃度の少なくとも一部を除去する過程を示す。脂質含有生物は、さらなる脂質を含有しなくても、含有していてもよい流体中に見出され得る。
【００６７】
「薬学的に許容可能な担体」又は「薬学的に許容可能なビヒクル」という用語は、本明細書中で使用される場合、水又は生理食塩水、ゲル、軟膏、溶媒、希釈剤、液体軟膏剤ベース、リポソーム、ミセル、巨大ミセル等を含む（これらに限定されない）任意の液体を意味し、不都合な生理学的応答を引き起こすことなく生きている動物又はヒト組織と接触させて使用するのに好適であり、且つ組成物の他の成分と有害な様式で相互作用しない。
【００６８】
「患者」という用語は、動物及びヒトを示す。
【００６９】
「患者特異的抗原」という用語は、患者内に導入されると、患者特異的免疫応答を誘導することができる抗原を示す。このような患者特異的抗原はウイルス抗原であってよい。患者特異的抗原は、例えば、患者内で改変又は影響されたウイルス抗原のような任意の抗
原を含む。
【００７０】
改変されたウイルス粒子
ウイルスの脂質含量を減少させる本発明の方法の実践により、改変されたウイルス粒子が作成される。これらの改変されたウイルス粒子は、低レベルのコレステロールを有し、且つ免疫原性である。本発明は、非処置ウイルスにより通常は免疫系に対して提示されないエピトープを露出させる。改変されたウイルス粒子内では構造変化が起こり、ウイルス表面の上、中、又は近くにあるタンパク質が改変されて立体構造変化が起こる。これらのタンパク質のいくつかは、改変されたウイルス粒子から分離もし得る。ＨＩＶウイルス粒子の概略的描写（schematic representation）は、宿主細胞に由来する脂質含有エンベロープ又は二重膜、表面糖タンパク質、膜貫通タンパク質、カプシド、カプシドタンパク質及び核物質を含有し、Robbins Pathologic Basis of Disease（Cotran他、eds 6th edition, W. B. Saunders Co., 1999）の２３８ページに提示されている。本発明の脱脂過程は、ウイルス粒子を改変する。改変されたウイルス粒子は、エンベロープ中に低脂質含量を有し、改変タンパク質を表示し、感染力が低下し、且つ免疫原性である。
【００７１】
脂質含有生物からの脂質の除去により得られる改変されたウイルス粒子
本発明の方法は、従来技術法が遭遇した多数の問題を解決する。ウイルスの脂質エンベロープを実質的に除去すること、及びウイルス粒子を無傷に保つことにより、本発明の方法は付加的な抗原を露出させる。宿主の免疫系はウイルス粒子を外的として認識する。本発明の方法を使用すると、抗原コアが無傷で残った改変されたウイルス粒子が作成され、それにより実際のウイルス粒子のエピトープを使用して、再導入された患者内における陽性免疫応答を開始する。加えて、本発明の方法は、タンパク質回収により計測される、他の血漿タンパク質への有害な影響を減少させ、血漿を患者に再導入することができる。
【００７２】
この改変されたウイルス粒子を作成においては、導入された種においてウイルス粒子に対する防御を誘導する患者特異的抗原も作成される。本発明の方法は、個体にウイルス病原体感染に対する免疫性を与え、且つ個体を感染させる危険性無しに幅広い生物学的に活性な防御免疫応答を誘発する有効的な手段を創出する。新規なワクチンは、ある脂質含有ウイルスから、脂質エンベロープを除去すること、及びエンベロープの下に隠されている抗原を露出させること、それにより陽性免疫応答を生じることにより開発することができる。これらの「自己ワクチン」は、抗原を露出させる及び／又はウイルスタンパク質構造中の構造改変を強いる好適な溶媒系（粒子内に含有される抗原に損傷を与えないもの）を用いて、脂質エンベロープの部分的除去により作成することができ、体内に導入されると有効的な免疫応答を誘発する。また非自己ワクチンも本発明において作成され、脱脂されるウイルス源とは異なる患者に投与される。また複数のウイルスを対象とする組み合わせワクチンも、本発明の範囲内である。このような組み合わせワクチンは、様々な生体流体から、複数のウイルス（例えばＨＩＶ、肝炎ウイルス及びＳＡＲＳ）のストック供給源から、及び／又はウイルスの複数の菌株若しくはクレード（例えばＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）から作られてもよい。
【００７３】
本発明を用いて処置される感染性生物
本発明の方法を用いて処置される好ましい感染性生物はウイルスである。本発明により脱脂されて改変されたウイルス粒子を形成し得るウイルス性感染性生物は、以下の属の脂質含有ウイルスを含むが、これらに限定されない：アルファウイルス属（アルファウイルス）、ルビウイルス属（風疹ウイルス）、フラビウイルス属（フラビウイルス）、ペスチウイルス属（粘膜病ウイルス）、（無名のＣ型肝炎ウイルス）、コロナウイルス属（コロナウイルス）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、トロウイルス属（トロウイルス）、アルテリウイルス属（アルテリウイルス）、パラミクソウイルス属（パラミクソウイルス）、ルブラウイルス属（ルブラウイルス）、麻疹ウイルス属（Morbillivirus）（麻疹ウ
イルス）、ニューモウイルス亜科（ニューモウイルス）、ニューモウイルス属（ニューモウイルス）、ベシクロウイルス属（ベシクロウイルス）、リッサウイルス属（リッサウイルス）、エファメロウイルス属（Ephemerovirus）（エファメロウイルス）、サイトラブドウイルス属（植物ラブドウイルスＡ群）、ヌクレオラブドウイルス属（植物ラブドウイルスＢ群）、フィロウイルス属（フィロウイルス）、インフルエンザ属ウイルスＡ、Ｂ（Ａ型及びＢ型インフルエンザウイルス）、インフルエンザ属ウイルスＣ（Ｃ型インフルエンザウイルス）、（無名のトゴト様ウイルス）、ブンヤウイルス属（Bunyavirus）（ブンヤウイルス）、フレボウイルス属（フレボウイルス）、ナイロウイルス属（ナイロウイルス）、ハンタウイルス属（ハンタウイルス）、トスポウイルス属（トスポウイルス）、アレナウイルス属（アレナウイルス）、無名の哺乳類Ｂ型レトロウイルス、無名の哺乳類及び爬虫類Ｃ型レトロウイルス、無名のＤ型レトロウイルス、レンチウイルス属（レンチウイルス）、スプマウイルス属（スプマウイルス）、オルソヘパドナウイルス属（哺乳類のヘパドナウイルス）、トリヘパドナウイルス属（鳥類のヘパドナウイルス）、シンプレックスウイルス属（シンプレックスウイルス）、ワリセロウイルス属（ワリセロウイルス）、ベータヘルペスウイルス亜科（サイトメガロウイルス）、サイトメガロウイルス属（サイトメガロウイルス）、ムロメガロウイルス属（Muromegalovirus）（マウスのサイトメガロウイルス）、ロゼオロウイルス属（ヒトヘルペスウイルス６、７、８）、ガンマヘルペスウイルス亜科（リンパ球関連ヘルペスウイルス）、リンホクリプトウイルス属（エプスタインバールエプスタインバール様ウイルス）、ラジノウイルス属（Rhadinovirus）（サイミリ−アテレス様ヘルペスウイルス（saimiri-ateles-like herpes viruses））、オルソポックスウイルス属（オルソポックスウイルス）、パラポックスウイルス属（パラポックスウイルス）、アヴィポックスウイルス属（鶏痘ウイルス）、カプリポックスウイルス属（羊痘様ウイルス）、レポリポックスウイルス属（粘液腫ウイルス）、スイポックスウイルス属（豚痘ウイルス）、モラシポックスウイルス属（伝染性軟属腫ウイルス）、ヤタポックスウイルス属（ヤタポックス及びタナポックスウイルス）、無名のアフリカ豚コレラ様ウイルス、イリドウイルス属（小イリデセント昆虫ウイルス）、ラナウイルス属（前の（front）イリドウイルス）、リンホシスティウイルス属（魚のリンパ膿腫ウイルス）、トガウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、エナブドウイルス（Enabdoviridae）科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、アレナウイルス科、レトロウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、及び任意の他の脂質含有ウイルス。
【００７４】
これらのウイルスは、以下のヒト及び動物の病原体を含む：ロスリバーウイルス、熱ウイルス、デング熱ウイルス、マレーリバー脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ヨーロッパ及び極東ダニ媒介性脳炎ウイルス、カリフォルニア脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、サシチョウバエ熱ウイルス、ヒトコロナウイルス２２９−Ｅ及びＯＣ４３、並びに風邪、上気道感染症（おそらく肺炎及び場合により胃腸炎）を引き起こすその他を含む）、ヒトパラインフルエンザウイルス１及び３、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス２、４ａ及び４ｂ、はしかウイルス、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス及びＢ型インフルエンザウイルス、アレナウイルス属：リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）ウイルス；ラッサ熱ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１及び２、若しくは任意の他の免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｇ型肝炎ウイルス、亜科：ヒトヘルペスウイルス１及び２、ヘルペスウイルスＢ、エプスタインバールイルス）、（天然痘）ウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、黄熱病ウイルス、ポリオウイルス、ノーウォークウイルス、オルフウイルス、並びに他の脂質含有ウイルス。
【００７５】
改変されたウイルス粒子の製造方法
本発明の範囲の元に利用される複数の脱脂過程が存在することを当業者は理解するであ
ろう。好ましい実施形態において、溶媒系は、例えば機械的混合システムのような適用エネルギーと共に、ウイルス粒子を実質的に脱脂するのに使用される。脱脂過程は、溶媒の総量及びシステム内に投入されるエネルギーに応じる。様々な溶媒レベル及び混合方法は、以下に記載されるように、過程の全体的な枠組みに応じて使用されてよい。単一の溶媒又は複数の溶媒がウイルスの脱脂に使用され得るが、ウイルス粒子を破壊及び変性する可能性が低いことから、単一の溶媒が好ましい。
【００７６】
ウイルスからの脂質の除去に使用され、ウイルス粒子の完全性を維持するのに有効的である例示的溶媒系
脂質含有生物を部分的又は完全に脱脂する過程において利用される溶媒又は溶媒の組み合わせは、改変されたウイルス粒子が構造的完全性（一実施形態においてはタンパク質回収を介して計測される）を保持していながら、ウイルスエンベロープ中の脂質を溶解するのに有効的な任意の溶媒又はその組み合わせであり得る。本発明の範囲に含まれる脱脂過程は、エネルギー投入及び溶媒の最適な組み合わせを使用して、ウイルス粒子が無傷であることを維持しながら脱脂する。好適な溶媒は、炭化水素類、エーテル類、アルコール類、フェノール類、エステル類、ハロ炭化水素類、ハロカーボン類、アミン類、及びこれらの混合物を含む。芳香族、脂肪族又は脂環式の炭化水素類も使用してよい。本発明で使用され得る他の好適な溶媒は、アミン類及びアミン類の混合物を含む。一つの溶媒系は、濃縮又は水若しくは生理学的に許容可能な緩衝液等の緩衝液で希釈された、ＤＩＰＥである。一つの溶媒組み合わせは、アルコールとエーテルとを含む。別の溶媒は、エーテル又はエーテルの組み合わせを、対称エーテル、非対称エーテル又はハロゲン化エーテルの型のいずれかで含む。
【００７７】
最適な溶媒系は、２つの目的を達成するものである：第一に、感染性生物又はウイルス粒子を少なくとも部分的に脱脂すること；及び第二に、他の血漿タンパク質への有害な影響が少ないか、又はないような条件セットを利用すること。加えて、溶媒系は、ウイルス粒子が患者内の免疫応答を開始するのに使用することができるように、ウイルス粒子の完全性を維持すべきである。したがって、特定の溶媒、溶媒組み合わせ及び溶媒濃度は、化学的殺傷をもたらすため、本発明において使用するには激しすぎる（too harsh）ことが留意されるべきである。
【００７８】
溶媒又は溶媒の組み合わせは、真空による除去を容易にするため、及びウイルス粒子の抗原コアを破壊することなく加熱されるよう、比較的低い沸点を有することが好ましい。また、溶媒又は溶媒の組み合わせは、熱は血漿等の生体流体中に含有されるタンパク質へ有害な影響を与えるため、低温で使用されることが好ましい。溶媒又は溶媒の組み合わせは、ウイルス粒子を少なくとも部分的に脱脂することが好ましい。
【００７９】
液体炭化水素は、感染性生物のウイルスエンベロープ中に見られる脂質等の、極性の低い化合物を溶解する。ウイルス粒子の脂質膜を分解するのに特に有効的なものは、ほぼ水非混和性であり、３７℃で液体である炭化水素類である。好適な炭化水素類は、以下の、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等のＣ5〜Ｃ20の脂肪族炭化水素類；クロロホルム、１，１，２−トリクロロ−１，２，２−トリフルオロエタン、１，１，１−トリクロロエタン、トリクロロエチレン、テトラクロロエチレン、ジクロロメタン及び四塩化炭素などのハロ脂肪族炭化水素類；それぞれ直鎖状、分枝状又は環状の、飽和又は不飽和のチオ脂肪族炭化水素類；ベンゼン等の芳香族炭化水素類；ケトン類；トルエン等のアルキルアレーン類；ハロアレーン類；ハロアルキルアレーン類；及びチオアレーン類を含むが、これらに限定されない。また他の好適な溶媒は、ピリジン等の飽和又は不飽和の複素環式化合物及び脂肪族のそのチオ−又はハロ−誘導体も含む。
【００８０】
本発明に使用される好適なエステルは、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル及びプ
ロピオン酸エチルを含むが、これらに限定されない。使用され得る好適な洗剤／界面活性剤は、以下の、スルフェート類、スルフォネート類、フォスフェート類（リン脂質を含む）、カルボキシレート類及びスルホスクシネートを含むが、これらに限定されない。本発明で有用ないくつかのアニオン性両親媒性材料は、以下の、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デシル硫酸ナトリウム、ビス−（２−エチルヘキシル）ナトリウムスルホスクシネート（ＡＯＴ）、コレステロール硫酸及びラウリン酸ナトリウムを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
溶媒は、脱脂したウイルス混合物が、さらなる溶媒を使用して除去されてよい。例えば、エーテル等の解乳化剤は、アルコール等の第１の溶媒をエマルジョンから除去するのに使用されてよい。溶媒の除去は、さらなる溶媒を利用しない他の方法を介しても達成され得、炭の使用を含むがこれに限定されない。炭は、混合物が加えられるスラリー内、又は代替としてはカラム内で使用され得る。炭は、溶媒を除去する好ましい方法である。また浸透気化法も、１つ又は複数の溶媒を脱脂したウイルス混合物から除去するのに利用することができる。
【００８２】
本発明において脂質含有生物から脂質を除去するのに使用される好適なアミン類の例は、水中で実質的に非混和性であるものである。典型的なアミン類は、少なくとも６個の炭素原子の炭素鎖を有する、脂肪族アミン類である。このようなアミンの非限定的な例は、Ｃ6Ｈ13ＮＨ2である。
【００８３】
エーテルは、本発明の方法において使用される好ましい溶媒である。特に好ましいのは、Ｃ4〜Ｃ8含有エーテル類であり、エチルエーテル、ジエチルエーテル及びプロピルエーテル（ジイソプロピルエーテルを含むがこれに限定されない）を含むが、これらに限定されない。非対称エーテル類も利用することができる。ハロゲン化対称及び非対称エーテル類も利用することができる。
【００８４】
低濃度のエーテルは、単独で使用され、且つ他の溶媒と組み合わせて使用されない場合、脂質を除去するのに利用され得る。例えば、低濃度のエーテルの範囲は、０．５％〜３０％である。利用されるようなエーテルの濃度は、以下の、０．６２５％、１．０％、１．２５％、２．５％、５．０％、１０％又はそれ以上であるが、これらに限定されない。エーテルの希釈溶液が有効的であると観察された。このような溶液は水性溶液又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの水性緩衝液の溶液であり得る。重炭酸、クエン酸、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ及びＴｒｉｚｍａ等の他の生理学的緩衝液を使用してもよいが、これらに限定されない。好ましいエーテルは、ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）及びジエチルエーテル（ＤＥＥ）である。低濃度のエーテルは、アルコール類（例えば、ｎ−ブタノール）と組み合わせて使用してもよい。
【００８５】
本発明において使用される場合、適切なアルコール類とは、血漿又は他の生体流体と大量に混和性でないものである。このようなアルコール類は、ペンタノール類、ヘキサノール類、ヘプタノール類、オクタノール類及びこれより多い数の炭素を含有するアルコール類を含む、直鎖及び分枝鎖アルコール類を含むが、これらに限定されない。
【００８６】
アルコール類が別の溶媒（例えば、エーテル、炭化水素、アミン又はこれらの組み合わせ）と組み合わせて使用される場合、Ｃ1〜Ｃ8含有アルコール類を使用してよい。別の溶媒と組み合わせて使用するアルコール類は、Ｃ4〜Ｃ8含有アルコール類を含む。したがって、本発明の範囲内に含まれるアルコール類は、ブタノール類、ペンタノール類、ヘキサノール類、ヘプタノール類及びオクタノール類並びにこれらのアイソフォームであり、特にはＣ4アルコール類又はブタノール類（１−ブタノール及び２−ブタノール）である。具体的なアルコール選択は、利用される第２の溶媒に応じる。
【００８７】
エーテル類及びアルコール類は、脂質含有ウイルスを含有する流体又はウイルス粒子を処置するための第１の溶媒として、組み合わせて使用することができる。血漿タンパク質に有害な影響を与えることなく、感染性生物から脂質を少なくとも部分的に除去するのに有効的である場合に、アルコールとエーテルとの任意の組合せが使用され得る。一実施形態において、脂質は感染性生物のウイルスエンベロープから除去される。アルコール及びエーテルが、流体中に含有される感染性生物を処置する第１の溶媒として組み合わされる場合、この溶媒中のアルコールのエーテルに対する比は、約０．０１アルコール部：９９．９９エーテル部から６０アルコール部：４０エーテル部の範囲であり、具体的な比は、約１０アルコール部：９０エーテル部から５アルコール部：９５エーテル部の範囲、具体的な比は、約１０アルコール部：９０エーテル部から５０アルコール部：５０エーテル部の範囲、具体的な比は、約２０アルコール部：８０エーテル部から４５アルコール部：５５エーテル部の範囲、具体的な比は、約２５アルコール部：７５エーテル部の範囲である。
【００８８】
アルコールとエーテルとの１つの組み合わせは、ブタノールとジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）との組み合わせである。ブタノールとＤＩＰＥが、流体中に含有される感染性生物を処置する第１の溶媒として組み合わされる場合、この溶媒中のブタノールのＤＩＰＥに対する比は、約０．０１ブタノール部：９９．９９ＤＩＰＥ部から６０ブタノール部：４０ＤＩＰＥ部であり、具体的な比は、約１０ブタノール部：９０ＤＩＰＥ部から５ブタノール部：９５ＤＩＰＥ部の範囲、具体的な比は、約１０ブタノール部：９０ＤＩＰＥ部から５０ブタノール部：５０ＤＩＰＥ部の範囲、具体的な比は、約２０ブタノール部：８０ＤＩＰＥ部から４５ブタノール部：５５ＤＩＰＥ部の範囲、具体的な比は、約２５ブタノール部：７５ＤＩＰＥ部の範囲である。
【００８９】
アルコールとエーテルとの別の組み合わせは、ブタノールとジエチルエーテル（ＤＥＥ）との組み合わせである。ブタノールとＤＥＥが第１の溶媒として組み合わされる場合、ブタノールのＤＥＥに対する比は、約０．０１ブタノール部：９９．９９ＤＥＥ部から６０ブタノール部：４０ＤＥＥ部であり、具体的な比は、約１０ブタノール部：９０ＤＥＥ部から５ブタノール部：９５ＤＥＥ部の範囲、具体的な比は、約１０ブタノール部：９０ＤＥＥ部から５０ブタノール部：５０ＤＥＥ部の範囲、具体的な比は、約２０ブタノール部：８０ＤＥＥ部から４５ブタノール部：５５ＤＥＥ部の範囲、具体的な比は、約４０ブタノール部：６０ＤＩＰＥ部の範囲である。約４０％のブタノールと約６０％のＤＥＥ（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のこの組み合わせは、例えば米国特許第４，８９５，５５８号に示されるように、様々な生化学的及び血液学的な血液パラメータに著しい効果を示さなかった。
【００９０】
生体流体、及び感染性脂質含有生物の感染力を減少させるためのその処置
上述したように、生体流体中の脂質含有生物の感染力レベルを減少させるため、及び改変されたウイルス粒子を作成するために、様々な生体流体を本発明の方法を用いて処置してもよい。好ましい実施形態において、血漿中の脂質含有感染性生物の濃度及び／又は感染力を減少させるため、及び改変されたウイルス粒子を作成するために、動物又は人から得られた血漿は本発明の方法を用いて処置される。本実施形態において、血漿は動物又は人の患者から、よく知られている方法を用いて患者から血液を抜き取ること、及びこの血液を、血漿から血液の細胞成分（赤血球及び白血球）を分離するために処置することにより、得られ得る。血液を処置するこのような方法は、当業者に既知であり、遠心分離及びろ過を含むが、これらに限定されない。当業者は、赤血球及び白血球からこのような脂質含有生物を分離するための適切な遠心分離条件を理解している。本発明の使用は、他の血漿タンパク質への有害な影響を与えることなく、ウイルスコアの完全性を維持しながら、脂質含有生物（例えば、血漿中に見られるもの）の処置を可能にする。
【００９１】
血漿中のウイルスは、本発明の方法での血漿の処置に影響される。脂質含有ウイルス性生物は、当業者に既知である技術を用いて赤血球及び白血球から分離され得る。
【００９２】
生体流体は、様々なウイルス株並びに種々のタイプのウイルスを含むウイルス製剤のストックを含む。本発明の方法でのこのような生体流体の処置は、非自己ワクチンとして患者に投与され得る改変されたウイルス粒子を生産する。このような非自己ワクチンは、１つより多いウイルス株に対する、及び／又は１つより多いタイプのウイルスに対する防御を付与する。脂質含有生物の処置は、血液及び血漿以外の生体流体中で起きてもよい。例えば、腹水を、タンパク質成分への有害な影響無しに、脂質含有生物の完全性のレベルに影響を与えるため、本発明で処置してもよい。処置した流体は、続いて、それが得られた動物又はヒトへ再導入され得る。非血液型の流体の処置は、流体中の脂質含有生物（ウイルス等）に影響を与える。
【００９３】
血漿等の生体流体がこのようなやり方で、又は例えば血漿バッグを収容している保管設備から得られたら、血漿を上述したように、脂質含有感染性生物中の脂質を溶解することができる第１の有機溶媒と接触させる。第１の有機溶媒を、第１の溶媒が感染性生物中の脂質を実質的に溶解する（例えば、ウイルスを取り囲む脂質エンベロープを溶解する）のに有効的な量で存在するような比で、血漿と混ぜ合わせる。例示的な第１の溶媒の血漿に対する比（第１の有機溶媒対血漿の比で示される）は、以下の範囲で記載される：０．５〜４．０：０．５〜４．０；０．８〜３．０：０．８〜３．０；及び１〜２：０．８〜１．５。様々な他の比を、生体流体の性質に応じて適用してよい。例えば、細胞培養液の場合、以下の範囲が、第１の有機溶媒対細胞培養液の比として利用され得る：０．５〜４．０：０．５〜４．０；０．８〜３．０：０．８〜３．０；及び１〜２：０．８〜１．５。
【００９４】
上述したように感染性生物を含有する流体と第１の溶媒とを接触させた後、第１の溶媒及び流体を、以下の好適な混合方法の１つを用いて混合するが、これらに限定されない：穏やかな攪拌；激しい攪拌；ボルテックス；回旋（swirling）；ホモジェナイゼーション；及び転倒型回転。
【００９５】
第１の溶媒と流体とを十分に混合するのに必要な時間量は、利用した混合方法に関係する。有機相と水相との間の密接な接触を容認するのに十分な期間、および第１の溶媒が、少なくとも部分的に又は完全に感染性生物中に含有される脂質を溶解するまで、流体を混合する。典型的には、混合は、利用した混合方法に応じて、約１０秒〜約２４時間の期間起こり、約１０秒〜約２時間であり得、およそ１０秒〜およそ１０分間であり得、又は約３０秒〜約１時間であり得る。種々の方法に伴なう混合期間の非限定例は、１）約１０秒〜約２４時間の期間の穏やかな攪拌及び転倒型回転、２）約１０秒〜約３０分間の期間の激しい攪拌及びボルテックス、３）約１０秒〜約２時間の期間の回旋、又は４）約１０秒〜約１０分間の期間のホモジェナイゼーションを含む。
【００９６】
溶媒の分離
第１の溶媒と流体とを混合した後、溶媒を、処置された流体から分離する。有機相及び水相は、当業者に既知の任意の好適な様式により分離してよい。第１の溶媒は典型的には水相中で非混和性であることから、２つの層を分離することができ、非所望の層を除去する。非所望の層は、溶解脂質を含有する有機相であって、その同定は、当業者に既知である通り、溶媒が水相よりも多かれ少なかれ濃いかどうかに応じる。この様式における分離の利点は、溶媒層中の溶解脂質が除去され得るということである。
【００９７】
加えて、分離は以下を含む手段（これらに限定されない）により達成され得る：ピペッティングによって非所望の層を除去すること；遠心分離に続いて分離される層を除去すること；層を有する試験管の底に経路又は穴を作り、下層を通り抜けさせること；槽の長軸
に沿って特異的長さに位置するバルブ又は開口を備える槽を使用して、特異的層の接近及び除去を容易にすること；及び当業者に既知である任意の他の手段。層を分離する別の方法は、特に溶媒層が揮発性である場合は、任意に穏やかな加熱を組み合わせた、減圧下での蒸留又は室温での蒸発である。遠心分離を利用する一実施形態においては、比較的低いｇ力、例えば９００×ｇを約５〜１５分間利用して、相を分離する。
【００９８】
溶媒を除去する好ましい方法は、炭、好ましくは活性炭の使用である。炭は任意にカラム中に含有される。代替としては、炭はスラリー状で使用されてよい。様々な生分解性型の炭を、これらのカラム中で使用してよい。浸透気化法及び溶媒を除去する炭の使用は、溶媒を除去する好ましい方法である。
【００９９】
処置した流体からの第１の溶媒の分離に続いて、第１の溶媒のいくらかは、エマルジョンとして水性層中に捕獲されたまま残り得る。第１の溶媒又は解乳化剤を除去する好ましい方法は、炭等の吸着剤の使用である。炭は、活性炭であることが好ましい。この炭は、上述したように、任意にカラム中に含有される。溶媒を除去するさらなる別の方法は、中空糸接触器（hollow fiber contactors）の使用である。溶媒を除去するための浸透気化法及び炭吸着剤法が好ましい。さらなる別の実施形態においては、捕獲された第１の溶媒の除去を容易にするのに解乳化剤を利用する。解乳化剤は、第１の溶媒の除去を容易にするのに有効的ないかなる剤であってよい。好ましい解乳化剤はエーテルであり、より好ましい解乳化剤はジエチルエーテルである。解乳化剤は、流体又は流体の代替物に添加され得、流体が解乳化剤中に分散され得るようする。ワクチン製剤において、約０．５〜４．０部のアルカン類対約１部のエマルジョン（ｖｏｌ：ｖｏｌ）が、解乳化剤として利用され得、続いてワクチンを調製するのに使用された残っている脱脂生物から、残余アルカンを除去するために洗浄する。好ましいアルカン類は、ペンタン、ヘキサン及び高級の直鎖又は分枝鎖アルカン類を含むが、これらに限定されない。
【０１００】
エーテル等の解乳化剤は、前段落で記載したような手段を含む、当業者に既知の手段により除去され得る。エーテル等の解乳化剤を系から除去する１つの便利な方法は、稼動する排気フード（running fume hood）で、又は環境から解乳化剤を回収及び除去するのに好適な他の装置で、エーテルを系から蒸発させることである。加えて、解乳化剤は、約１０〜２０ｍｂａｒの圧力有り又は無しで、高温、例えば約２４〜３７℃の適用を介して除去され得る。解乳化剤を除去する別の方法は、遠心分離による分離を包含し、続いて吸引による有機溶媒の除去、さらに減圧下（例えば、５０ｍｂａｒ）での蒸発又は蒸発を助けるために液化点を越える、窒素等の不活性ガスのさらなる供給が続く。
【０１０１】
生体流体を処置する方法（脱脂）
本発明の方法は、連続的な又は断続的な様式のいずれかにおいて利用され得るということが理解される。すなわち、連続的様式において、流体は、次に流体と混合される第１の溶媒を使用する系へ供給され得、分離され、任意にさらに、解乳化剤の適用を介して除去される。また連続的方法は、脱脂感染性生物を含有する流体を、所望の位置へ続いて返還することを容易にする。このような位置は、このような処置流体の受け取り及び／又は保管のための槽であり得、ヒト若しくは動物の血管系、又は胸膜腔、心膜腔及び腹骨盤腔等の、ヒト又は動物の他の体区画も含み得る。
【０１０２】
本発明の連続的方法の一実施形態において、生体流体（例えば血液）は、カテーテル等の当業者に既知の手段を用いて動物又はヒトから抜き取られる。ヘパリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）又は酢酸等の、当業者に既知である適切な抗凝固因子が利用される。次にこの血液を、遠心分離を用いて細胞成分及び血漿成分に分離する。次に血漿を、第１の溶媒と接触させ、第１の溶媒と混合し、血漿中に含有される感染性生物からの脂質除去を達成する。処置血漿からの第１の溶媒の分離に続いて、炭、浸透気化剤又は解乳化
剤を任意に利用し、捕獲された第１の溶媒を除去する。許容可能なレベル（非毒性）の第１の溶媒又は解乳化剤（利用したなら）を確認した後、任意に、血漿と血液から予め分離された細胞とを組み合わせ、少なくとも部分的に脱脂されたウイルス粒子（本明細書中においては改変されたウイルス粒子とも呼ばれる）を含有する新たな血液試料を形成する。
【０１０３】
本発明の実施を介して、感染性生物の感染力は大きく減少するか、又は消失する。もともとは血液から分離された細胞との組み換えに続いて、低脂質レベルを有し、且つ脂質含量の低減したウイルスを含有する流体が、血管系又はヒト若しくは動物の他の系のいずれかへ再導入され得る。ヒト又は動物から抜き取られた血漿のこのような処置の効果、並びに部分的に若しくは完全に脱脂された感染性生物を含有する試料又は改変されたウイルス粒子のヒト若しくは動物への返還は、ヒト又は動物の血管系に含有される感染性生物の完全性の正味の減少を引き起こす。また改変されたウイルス粒子は、患者に投与されたとき、患者内において自己免疫応答を開始する役割を果たす。この動作形態（mode of operation）において、本発明の方法は、ヒト又は動物がこのような処置のための体外装置に接続される間、連続的な様式で流体を処置するのに利用される。
【０１０４】
さらなる別の実施形態において、断続的な又はバッチ形態において、ヒト又は動物は、本発明の方法で流体を処置するための体外装置へ接続されない。断続的動作形態において、本発明は、ヒト又は動物から予め得た流体を利用し、これは血漿、リンパ液又は卵胞液を含み得るが、これらに限定されない。流体は、血液バンクに含有されていても、又は代替として、方法の適用前にヒト若しくは動物から取り出してもよい。流体は生殖器液又は人工授精若しくは体外受精の過程において使用される任意の流体であってよい。また流体は、ヒト又は動物から直接的に得られるものでなくてもよいが、細胞培養液等の潜在的に感染性生物を含有する任意の流体でよい。ウイルスの様々な菌株及びクレードのストック、及び複数ウイルスストックが、ワクチンを生産する本方法において使用することができる。この動作形態において、この流体を本発明の方法を用いて処置し、少なくとも部分的に又は完全に脱脂された感染性生物若しくは改変されたウイルス粒子を含有する低脂質レベルの新たな流体を生産する。本発明のこの形態の一実施形態は、他の動物又はヒトから事前に得られた血漿試料を処置し、続く輸液（transfusion）のために血液バンク内に貯蔵することにある。これは、ワクチン防御を付与する非自己方法である。これらの試料は、生体試料からの、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、及び／又はサイトメガロウイルス等の１つ又は複数の感染性疾患を処置又は予防する、本発明の方法で処置され得る。
【０１０５】
感染性生物の脱脂は、様々な手段により達成される。バッチ法は、新鮮な又は貯蔵された生体流体（例えば、新鮮な冷凍血漿）に対して使用することができる。この場合、様々な記載した有機溶媒又はその混合物が、ウイルス不活化に使用することができる。抽出時間は、溶媒又はその混合物、及び利用された混合手順に応じる。
【０１０６】
本発明の方法の使用を介して、流体中の脂質含有ウイルス中の脂質レベルは減少し、流体（例えば、改変されたウイルス粒子を含有する脱脂血漿）が患者へ投与され得る。このような流体は低い感染力を有する改変されたウイルス粒子を含有し、ワクチンとして作用し、免疫応答を生じること、及び疾患の重篤性を減少させることにより、患者にウイルスに対する防御を付与、又は感染患者における処置を提供する。これらの改変されたウイルス粒子はレシピエント中において免疫応答を誘導し、改変されたウイルス粒子上のエピトープを露出させる。代替として、改変されたウイルス粒子は薬学的に許容可能な担体、任意にアジュバントと組み合わせてもよく、ヒト又は動物へワクチン組成物として投与され、レシピエント内において免疫応答を誘導してもよい。
【０１０７】
ワクチン生産
１つの実施形態において、少なくとも部分的に若しくは実質的に脱脂され、且つ免疫原
性特性を有する改変されたウイルス粒子は、任意に、薬学的に許容可能な担体と組み合わされ、ワクチンを含む組成物を作る。好ましい実施形態において、改変されたウイルス粒子は、血漿等の生体流体中に、低脂質レベルで保持され、ワクチンとして患者へ投与される。このワクチン組成物は、任意に、アジュバント又は免疫刺激剤と組み合わされ、動物又はヒトへ投与される。組み合わせワクチンを含む自己ワクチン及び非自己ワクチンの両方が、本発明の範囲内である。１つより多いウイルス菌株又はワクチン接種後の１つより多いウイルス性疾患に対する防御を付与するために、ワクチン組成物は、１つより多いタイプの改変されたウイルス粒子又はその成分を含有し得ることが理解される。このような組み合わせは、所望の免疫性に従って選択され得る。例えば、好ましい組み合わせは、ＨＩＶ及び肝炎、又はインフルエンザ及び肝炎を含むが、これらに限定されない。より具体的には、ワクチンは、患者特異的抗原を有する複数の改変されたウイルス粒子、及び非患者特異的抗原を有する改変されたウイルス粒子、又は本発明の脱脂過程を受けたストックウイルス粒子を含むことができる。生物の、残りの改変されたウイルス粒子は、脱脂生体流体中に保持され、動物又はヒトへ再導入されるとき、おそらく貧食細胞により摂取され、免疫応答を生じる。
【０１０８】
本発明の方法を用いて生産されたワクチンの投与
脱脂感染性生物（例えば、抗原決定基が露出した改変されたウイルス粒子の型のもの）が動物又はヒトに投与される場合、任意に薬学的に許容可能な担体と組み合わせてワクチンを生産し、任意に当業者に既知であるアジュバント又は免疫刺激剤と組み合わせる。ワクチン配合物は、都合よく、単位投与形態で提示され得、当業者に既知である従来の薬学的技術により調製され得る。このような技術は、有効成分及び液体担体（薬学的担体（複数可）又は賦形剤（複数可））と均一且つ親密に関連付けられる。非経口投与に好適な配合物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び配合物を対象とするレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有してよい水性及び非水性滅菌注射液；並びに懸濁剤及び増粘剤を含んでよい水性及び非水性滅菌懸濁液を含む。
【０１０９】
配合物は、例えば密封アンプル及びバイアルのような、単位用量又は複数回投与槽において提示され得、使用直前に例えば注射用の水のような滅菌液体担体の添加のみを必要とするように、冷凍乾燥（凍結乾燥）条件で貯蔵され得る。ワクチンは、約４℃〜−１００℃の温度で貯蔵され得る。またワクチンは、室温を含む種々の温度で凍結乾燥状態で貯蔵され得る。即時調製注射液及び懸濁液は、当業者により一般に使用される滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、調製され得る。ワクチンは、当業者に既知の従来手段を介して滅菌され得る。このような手段は、ろ過、放射線及び熱を含むがこれらに限定されない。本発明のワクチンは、細菌の成長を阻害するために、チメロサールなどの静菌剤と組み合わせてもよい。
【０１１０】
好ましい単位用量配合物は、投与された成分（ingredient）の用量若しくは単位を含有するもの、又はその適切な画分である。特に上記で述べた成分に加えて、本発明の配合物は、当業者により一般に使用される他の剤も含み得ることが理解されるべきである。
【０１１１】
ワクチンは、経口等の種々の経路（頬側若しくは舌下、直腸、非経口、エアロゾル、経鼻、筋肉内、皮下、内皮、静脈内、腹腔内及び局所的）を介して投与され得る。またワクチンは、リンパ組織の付近、例えば腋窩、鼠経、又は頚部リンパ節などのリンパ節への投与を介して、投与される。
【０１１２】
本発明のワクチンは、溶液、エマルジョン及び懸濁液、ミクロスフィア、粒子、微小粒子、ナノ粒子並びにリポソームを含む、種々の型で投与され得るが、これらに限定されない。一免疫化投与計画当たり約１〜５用量が必要であり得ることが推定される。ワクチンを投与する医学又は獣医学の当業者は、必要な場合、例えば患者の年齢及び大きさを考慮
して、初回注射及び追加免疫注射において投与されるワクチンの量はなじみがあるであろう。初回注射は、全ウイルスタンパク質に基づいて、約１ｎｇ未満〜１グラムの範囲であり得る。非限定的な範囲は、１ｍｌ〜１０ｍｌであり得る。投与の容積は、投与経路に応じて異なってよい。
【０１１３】
ワクチン接種スケジュール
本発明のワクチンは、感染の前、最中、又は後に投与され得る。本発明のワクチンは、ヒト又は動物のいずれかに投与され得る。一実施形態において、ヒト又は動物のウイルス量（１つ又は複数のウイルス）は、血漿の脱脂処置により減少され得る。同一個体は、１つ又は複数のウイルスを対象としたワクチンを受け取ってよく、これにより免疫系を刺激して個体中に残るウイルスに対して闘う。初回感染前のワクチン投与の時間は、当業者に既知である。しかし、疾患進行を改善するため、又は疾患を処置するために、初回感染の後にワクチンを投与してもよい。
【０１１４】
アジュバント
当業者に既知である様々なアジュバントを、ワクチン組成物中の改変されたウイルス粒子と併せて投与してもよい。このようなアジュバントは以下を含むが、これらに限定されない：重合体、ポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体等の共重合体、ブロック共重合体を含む；ポリマーＰ１００５；モノチドＩＳＡ７２；フロイント完全アジュバント（動物用）；フロイント不完全アジュバント；モノオレイン酸ソルビタン；スクワレン；ＣＲＬ−８３００アジュバント；ミョウバン（alum）；ＱＳ２１、ムラミルジペプチド；トレハロース；マイコバクテリア抽出物を含む細菌抽出物；解毒エンドトキシン；膜脂質；油中水混合物、水中油中水混合物又はこれらの組み合わせ。
【０１１５】
懸濁化液体（suspending fluid）及び担体
当業者に既知である様々な懸濁化液体又は担体を、ワクチン組成物を懸濁するのに利用してよい。このような液体は限定されずに以下を含む：滅菌水、生理食塩水、緩衝剤、又は成長培地に由来する複合液体若しくは他の生体流体。当業者に既知である保存剤、安定剤及び抗生物質を、ワクチン組成物中に利用してよい。
【０１１６】
以下の実験例は、ウイルス粒子の脱脂過程が起こったこと、及び特にウイルス粒子が改変され、それが由来する種において陽性免疫原性応答を示すことを説明している。他の実施形態及び使用が当業者に明らかであり、本発明はこれらの具体的説明的な実施例又は好ましい実施形態に限定されないことが理解されるであろう。
【実施例１】
【０１１７】
Ａ．血清の脱脂は、感染力が低減されたアヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）を生産する
１０6のＩＤ50用量のＤＨＢＶを含有する標準的なアヒル血清プールを（Camden）使用した。ＩＤ50は、上記用量で処置した動物の５０％を感染するのに有効な感染投与量（ＩＤ）として当業者に既知である。２１羽のアヒルの子が、孵化の日にＤＨＢＶ陰性群として得られた。これらのアヒルの子は、ドットブロットハイブリダイゼーションにより、購入時に試験して、ＤＨＢＶ  ＤＮＡ陰性であると示された。
【０１１８】
有機溶媒系は、ジイソプロピルエーテル６０部に対してブタノール４０部の比で混合した。混合した有機溶媒系（４ｍｌ）を標準的な血清プール（２ｍｌ）と混合して、室温で１時間、穏やかに回転させた。混合物を４００×ｇで１０分間遠心分離して、下部水相（血漿を含有する）を室温で取り出した。続いて、水相を等容量のジエチルエーテルと混合して、上述のように遠心分離して、任意の残存脂質／溶媒混合物を除去した。水相を再び取り出して、等容量のジエチルエーテルと混合して、再度遠心分離した。水相を取り出して、ヒュームキャビネット中で室温で約１時間、空気に当てることにより、任意の残留ジ
エチルエーテルを除去した。脱脂された血漿（ウイルス粒子有り又は無し）を−２０℃で保管した。
【０１１９】
陽性及び陰性の対照アヒル血漿をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈した。陽性対照：１０6のＩＤ50用量のＤＨＢＶを含有するプールされた血清２ｍｌを、ＰＢＳ４ｍｌと混合した。陰性対照：プールされたＤＨＢＶ陰性血清２ｍｌを、ＰＢＳ４ｍｌと混合した。残留感染力を、試験試料（ｎ＝７）、陰性（ｎ＝７）又は陽性（ｎ＝７）対照のいずれか１００μｌを、産後１日目のアヒルの腹膜腔へ接種することにより試験した。対照は、有機溶媒で処置したＤＨＢＶ陰性血清を用いて実施し、続いてＰＢＳと混合して、レシピエントアヒルへ注射した。
【０１２０】
陽性対照アヒルのうちの１羽は、４日齢〜６日齢で死亡したため、さらなる分析から排除した。さらなる３羽の陽性対照アヒルは、９日齢〜１０日齢で死亡し、処置２羽及び陰性対照１羽は、１１日目に死亡した。実験を終結させることに決めた。残りのアヒルの子は、１２日目にペントバルビトンナトリウム（静脈内）を用いて安楽死させ、それらの肝臓を、Deva他(J. Hospital Infection 33:119-130, 1996)に記載されるように、ＤＨＢＶ
ＤＮＡ分析用に取り出した。７羽の陰性対照アヒルはすべて、ＤＨＢＶ陰性のままであった。６羽の陽性対照アヒルすべての肝臓は、ＤＨＢＶ陽性であった。７羽の試験アヒルは、それらの肝臓においてＤＨＢＶ  ＤＮＡに関して陰性のままであった。
【０１２１】
上記溶媒系を用いた血清の脱脂は、感染力が低減されたＤＨＢＶをもたらした。処置血清を投与したアヒルの子はいずれも、感染しなかった。実験は、１４日でなく１２日で終結されなくてはならなかったが、残りの陽性対照アヒルは、ＤＨＢＶに関して陽性であった（３／３は、１０日目にはＤＨＢＶ陽性であった）。これは、肝臓においてＤＨＢＶ陽性となるのに十分な時間が、処置したアヒルに関して経過していたこと、及び実験の早期終了は、結果に関係しなかったことを示唆する。
【０１２２】
Ｂ．ＤＨＢＶ感染を防止するワクチンとしての脱脂されたＤＨＢＶ陽性血清
アヒルＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）に対する患者特異的「自己」ワクチンを提供するための脱脂手順の有効性を検査した。およそ１６羽の北京交雑アヒル（Pekin cross ducklings）が、孵化の日にＤＨＢＶ陰性群として得られた。アヒルの子は、ドットブロットハイブリダイゼーションを用いたＤＨＢＶ  ＤＮＡの分析により、試験して、ＤＨＢＶ  ＤＮＡ陰性であると決定された。アヒルは、以下の３つの群に分けられた：
【０１２３】
【表１】
2007524383.tif 000003
【０１２４】
１．グルタルアルデヒド不活化
グルタルアルデヒド不活化は、約１：２５０でのグルタルアルデヒドの希釈溶液による
固定により、当業者に既知であるように達成された。グルタルアルデヒドは、よく知られた架橋剤である。
【０１２５】
２．脱脂手順
有機溶媒系を用いて、血清の脱脂を実施した。溶媒系は、４０％のブタノール（分析用試薬等級）及び６０％のジイソプロピルエーテルから構成され、２：１の比で血清と混合した。したがって、有機溶媒４ｍｌを血清２ｍｌと混合して、１時間回転させた。この混合物をおよそ４００×ｇで１０分間、遠心分離した後、水相を取り出した。続いて、水相を等容量のジエチルエーテルと混合して、４００×ｇで１０分間、遠心分離した。次に、水相を取り出して、等容量のジエチルエーテルと混合して、３０ｒｐｍで約１時間、転倒させて回転させ、４００×ｇで１０分間遠心分離した。水相を取り出して、残留ジエチルエーテルを、ヒュームキャビネット中でおよそ１０〜３０分間、蒸発により除去した。処置した血清は、ジエチルエーテルの除去後に残り、ワクチンを生産するのに使用した。脱脂手順の対照は、ＤＨＢＶ陽性血清と同じ脱脂手順に、ＤＨＢＶ陰性血清をさらすことを包含した。
【０１２６】
【表２】
2007524383.tif 000004
【０１２７】
４．実験手順
孵化後２９日目に、アヒルをＤＨＢＶ陽性血清（血清プール２０．１．９７）１，００００μｌで曝露した。血清プール２０．１．９７は、ドットブロットハイブリダイゼーションにより、１．８×１０10のゲノム当量（ｇｅｖ）／ｍｌを有することが示された。１ゲノム当量（ｇｅｖ）は、およそウイルス粒子１個である。１日目及び１０日目に完全なワクチン接種前に、１７日目及び２３日目に曝露前に、並びに３７日目、４３日目及び５２日目に曝露後に、アヒルを出血させた。それらの血清を、Deva他（１９９５年）により
記載されるように、ドットブロットハイブリダイゼーションにより、ＤＨＢＶ  ＤＮＡに関して試験した。アヒルを５８日目に安楽死させて、それらの肝臓を取り出し、ＤＮＡを抽出して、Deva他（１９９５年）により記載されるように、ドットブロットハイブリダイゼーションにより、ＤＨＢＶの存在に関して試験した。
【０１２８】
５．結果の分析
ａ．試験アヒル。試験ワクチンをワクチン接種した６羽の試験アヒルは、曝露後に血清及び肝臓において、ＤＨＢＶ  ＤＮＡに関して陰性のままであった。試験アヒル１羽は、曝露後にＤＨＢＶに関して陽性となった。
【０１２９】
ｂ。擬（シャム）（sham）ワクチン接種アヒル。グルタルアルデヒド不活化血清をワクチン接種したアヒル４羽はすべて、ＤＨＢＶでの曝露後にＤＨＢＶ陽性となった。
【０１３０】
ｃ．偽（モック）（Mock）ワクチン接種アヒル。６羽の偽ワクチン接種陰性対照アヒルのうち６羽すべてが、曝露後にＤＨＢＶ陽性となった。
【０１３１】
カイ二乗分析を用いて、処置間の差を比較した。かなり多くの対照アヒル（偽ワクチン接種）が、脱脂された血清をワクチン接種したアヒルよりも曝露後にＤＨＢＶ陽性となった（ｐ＜０．０５）。
【０１３２】
上記プロトコルを用いた脱脂されたＤＨＢＶ陽性血清によるアヒルの子のワクチン接種は、６羽のアヒルの子のうち５羽において、ＤＨＢＶ陽性血清による曝露後に、ＤＨＢＶ感染の防止をもたらした。これは、脱脂された血清ワクチンが、ワクチン接種したアヒルにおいて陽性免疫原性応答を誘導することが可能であることを示唆する。さらに、脱脂過程は、これまでに露出されていなかった患者特異的抗原を露出させ、及び／又はウイルス粒子構造における構造変化を引き起こし、陽性免疫原性応答を可能にさせたと考えられる。相対的に、６羽の偽（モック）ワクチン接種アヒルのうちの６羽及び４羽の擬（シャム）ワクチン接種アヒルのうちの４羽は、ワクチン接種後にＤＨＢＶ陽性となり、免疫応答の欠如に起因して、これらのアヒルにおける免疫性の誘導が無かったことを示唆した。
【実施例２】
【０１３３】
Ａ．Ｃ型肝炎に関するモデルとしてのウシペスチウイルス(Cattle Pestivirus)（ウシウイルス性下痢ウイルス、ＢＶＤＶ）の脱脂
標準的なウシペスチウイルス単離物（ＢＶＤＶ）をこれらの実験で使用した。この単離物「ヌメレラ(Numerella)」ＢＶＤウイルスは、オーストラリアのニューサウスウェールズ州（ＮＳＷ）のビーガ地域の農場での「粘膜病」の典型的な事例から提出された診断用検体から１９８７年に単離された。このウイルスは、非細胞変性であり、タイピング試薬としてのオーストラリアＮＳＷ州のthe Elizabeth Macarthur Agricultural Institute（ＥＭＡＩ）で産生したモノクローナル抗体のパネルの１２個すべてと反応する。したがって、このウイルスは、オーストラリアＢＶＤウイルスの「標準的な株」を表す。
【０１３４】
ヌメレラウイルスを、外来性ウイルス剤（ＢＶＤＶを含む）を含まないで試験されるウシＭＤＢＫ細胞中で成長させた。ウイルス成長に使用した培地は、ＥＭＡＩのウシから得られる１０％成体ウシ血清を含有しており、そのすべてが、ＢＶＤＶウイルス及びＢＶＤＶ抗体を含まないで試験された。この血清補充物は、確実に試験ウイルスが培養系において唯一のウイルスであるように予防措置を講じない世界中の研究室での一般的な欠点である、試験系の外来性ＢＶＤＶ混入の可能性を排除するのに長年使用されている。これらの試験培養系を使用することにより、ウイルスの高レベルの複製及び感染性ウイルスの高収率が保証された。ＭＤＢＫ細胞における５日間の成長後の最終的なウイルス収率の滴定は、清澄化（遠心分離）した培地１ｍｌ当たり１０6.8個の感染性ウイルス粒子の力価を示
した。
【０１３５】
１．感染ＢＶＤＶの処置
１０6.8個のウイルス粒子／ｍｌを含有する組織培養上清１００ｍｌを、１５０ｃｍ2の組織培養フラスコから回収した。遠心分離により上清を清澄化し（３，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で細胞片をペレット化）、１０ｍｌを、動物接種用の陽性対照（未処置ウイルス）として取っておいた。１０7.75個の感染性ウイルスを含有する残りの９０ｍｌを、以下のプロトコルを使用して処置した：溶媒混合物ブタノール：ジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）（２：１）１８０ｍｌを、５００ｍｌの三角フラスコへ添加して、回旋させることにより混合した。続いて、混合物を、オービタルシェーカーで室温で３０ｒｐｍにて６０分間振とうした。次に、それを４℃で４００×ｇにて１０分間、遠心分離し、その後、有機溶媒相を除去して廃棄した。続く工程では、底部層（水相）を有機相の下から取り出して、かなり収率を改善させた。
【０１３６】
ブタノール：ＤＩＰＥ処置後、水相を等容量の新鮮なジエチルエーテル（ＤＥＥ）で４回洗浄して、混入する微量のブタノールすべてを除去した。各洗浄後、フラスコの内容物を回旋させて、水相及び溶媒相の両方の均等な混合を確実にした後、上述のように遠心分離した（４００×ｇ、１０分、４℃）。４回の洗浄後、混入を防止するためにゴムバンドでビーカーの最上部に固定された滅菌組織で覆われた滅菌ビーカー中に水相を入れて、連続的に稼動するヒュームフード中に一晩（１６時間）入れ、残存する揮発性エーテル残留物すべてを不活化ウイルス調製物から除去した。処置した材料の続く培養は、混入を示さなかった。次に、任意の残存感染性ウイルスに関して試験するために組織培養又は動物へ接種するまで、処置したウイルス調製物を滅菌条件下にて４℃で保管した。
【０１３７】
２．処置したＢＶＤＶ調製物の試験
ａ．組織培養接種
約１０7.1のウイルス当量を含有すると予測される、溶媒で処置したウイルス調製物２ミリリットルを、１０％の試験されていない（tested-free）成体ウシ血清を含有する組織培養培地最小イーグル培地（ＭＥＭ）８ｍｌと混合し、２５ｃｍ2の組織培養フラスコ中でＭＤＢＫ細胞の単層上へ６０分間吸着させた。陽性対照として、未処置、すなわち実質的に脂質を含有する感染性ウイルス（同様に約１０7.1のウイルス当量を含有する）２ｍｌを、同様に２５ｃｍ2の組織培養フラスコ中でＭＤＢＫ細胞上へ吸着させた。６０分後、上清を両方のフラスコから除去して、正常成長培地（＋１０％ＡＢＳ）と入れ換えた。続いて、細胞を標準的な条件下で５日間成長させた後、ＭＤＢＫ細胞を固定させて、標準的なイムノペルオキシダーゼプロトコルを用いて、６個のＢＶＤＶ特異的モノクローナル抗体の混合物（ＥＭＡＩパネル、２つの異なるＢＶＤウイルスタンパク質と反応性を有する）で染色した。
【０１３８】
有機溶媒で処置したウイルスを接種したＭＤＢＫ細胞の単層中に感染細胞は存在しなかた。対比して、対照フラスコ（非不活化ＢＶＤＶを接種した）中の細胞のおよそ９０％は、規模の大きな特異的なイムノペルオキシダーゼ染色により示されるように、ウイルスに関して陽性であった。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験条件下では、処置した少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤＶ調製物には感染性ウイルスは残存しなかったことを示した。
【０１３９】
ｂ．動物接種
未処置（抗体陰性）ウシに少なくとも部分的に脱脂されたウイルス調製物を接種することは、ｉｎ  ｖｉｖｏでより一層感受性が高い試験である。ウイルスの細胞への侵入及び複製がＢＶＤＶに関して極めて効率的であることを考慮すると、かかる動物において皮下注射したわずか１個の感染性ウイルス粒子は、感染性ウシ用量であるとみなされる。１０
頭の抗体陰性去勢ウシ（１０〜１２月齢）の群を無作為に３つの群に配分した。
【０１４０】
６頭の去勢ウシの第１の群を用いて、ＢＶＤＶが低減された感染力を有するかどうかを試験した。上述したのと同じ少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤＶの調製物をこの実施例で使用した。ワクチン群用の陽性対照として作用するように、２頭の去勢ウシに、少なくとも部分的に脱脂されたウイルス粒子を有するワクチンを接種した。これらの２頭の陽性対照動物を別個の隔離条件下で実施して、それらが感染後に（通常、生ＢＶＤＶウイルスを施した４〜７日後）一過性のウイルス血症を発症した場合に、それらが他の動物に感染するのを防止した。２頭の残りの去勢ウシは、動物のワクチン接種群内で天然に存在しないペスチウイルス伝染が確実に存在しないように、陰性「歩哨」動物として作用した。ＥＭＡＩで開発された確証された競合ＥＬＩＳＡを用いて、１０頭すべての動物において抗体レベルを測定した。この試験は、別個にCSL Ltdにより確証されており、ヨーロッパではIDEXX Scandinaviaにより売買される。
【０１４１】
第１の群における６頭の動物それぞれに、市販のアジュバントに組み込まれた少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤＶ調製物４．５ｍｌの皮下注射を施した。少なくとも部分的に脱脂された調製物の各ｍｌは、１０6.8のウイルス当量を含有していたため、脱脂過程前の総ウイルス量は、１０7.4の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）50であった。陽性対照動物に、第１の群と同様の方法で皮下注射された脱脂されていない調製物それぞれ５ｍｌ、すなわち１０7.5のＴＣＩＤ50を施した。残りの２つの「歩哨」動物にはいかなるウイルス抗原を付与せず、試行が行われる間、群に存在する天然のペスチウイルス活性が確実に見られないように、試行の間中、第１の群の動物とともに放牧させた。
【０１４２】
第２の用量のワクチンを付与するまで、少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤウイルスを施したワクチン接種去勢ウシのいずれにおいても抗体発現は見られなかった。したがって、単回用量の２週及び４週後に、６頭の去勢ウシは抗体陽転(seroconvert)せず、少なくとも部分的に脱脂されたウイルス調製物総容量２７ｍｌ中に感染性ウイルスは残っていなかったことを示す。これは、１０8.2のＴＣＩＤ50の総不活化に相当する。対比して、脱脂前にウイルス調製物それぞれ５ｍｌを施した２頭の去勢ウシにおいては、接種の２週及び４週後の両方で、高レベルの抗Ｅ２抗体（中和抗体）及び抗ＮＳ３抗体両方が存在した。これにより、脱脂前のウイルスの感染性質が確認された。これらのｉｎ  ｖｉｖｏの結果により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織培養試験の見解が確認される。２頭の「歩哨」動物は、終始血清陰性のままであり、群れは天然のペスチウイルス感染のないままであることを示した。
【０１４３】
使用したモノクローナル抗体のパネルは、無傷ウイルスの脂質エンベロープ中に組み込まれる糖タンパク質である主要エンベロープ糖タンパク質（Ｅ２）に対して向けられる宿主抗体を検出した。試験系はまた、ウイルスにより感染された細胞内で作製される非構造タンパク質ＮＳ３に対して向けられる抗体を検出した。このタンパク質は、ウイルス複製において主要な調節の役割を有し、感染性ウイルス内には存在しない。ワクチン接種去勢ウシにおいて感染性ウイルスが存在するという徴候は見られず、感染性ウイルス粒子すべてが破壊されたことを示した。ペスチウイルスはすべて、ＲＮＡウイルスである。したがって、脱脂された調製物中にウイルスＤＮＡは存在しなかった。これらの結果は、脱脂されたウイルスを施した動物中で実質的に感染性ウイルスが見られないように、少なくとも部分的にウイルスを脱脂する本発明の方法の有効性を実証する。
【０１４４】
Ｂ．去勢ウシにおけるワクチンとしての脱脂されたＢＶＤＶ調製物
セクションＡで上述した少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤＶ調製物４．５ｍｌの初回用量を施した６頭の去勢ウシすべてに、第１の初回刺激用量の４週後に、同様の用量を再び皮下注射した。このとき、初回用量後に抗体応答は見られなかった。動物が第２の用
量後に反応することは正常である。抗Ｅ２抗体レベル（血清中和抗体ＳＮＴに相当する）に対する強力な二次抗体応答が、６頭のうち３頭において、少なくとも部分的に脱脂されたウイルスの第２の用量の２週後に観察された。この応答は、競合ＥＬＩＳＡにおいて７０％を上回る阻害であった。残りの３頭の動物は、弱い抗体応答を示した（２３〜３１％阻害）。
【０１４５】
抗Ｅ２抗体応答と対比して、少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤＶの第２の用量の２週後に、たった１頭の動物が、強力な抗ＮＳ３抗体応答（９３％阻害）を発現した。第２の動物は、弱い抗ＮＳ３応答（２９％阻害）を有し、４頭の動物は、２回用量の投与後に抗体を示さなかった。少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤＶワクチンの投与後の類似の応答がこれまでに観察されていたため、これは意外ではなかった。抗Ｅ２抗体レベルが第２の用量の２週後に６頭のワクチン接種去勢ウシすべてにおいて測定可能であったため、少なくとも部分的に脱脂されたＢＶＤＶ調製物の２回用量後の去勢ウシにおける抗体レベルは、ワクチンとしてのその潜在性を明示する。
【実施例３】
【０１４６】
マウスにおいてＳＩＶ特異的体液性応答及びＣＤ４+Ｔ細胞記憶応答を誘導又は増強するための脱脂されたＳＩＶの使用−レンチウイルス感染に対する新たな自己ワクチン接種戦略のモデル
以下の研究は、ＳＩＶと称されるヒトＨＩＶのサル等価体に焦点を当てた。目的は、脱脂されたＳＩＶｍａｃ２５１（ＳＩＶのクローニングされていない高度に病原性の単離体）を利用して、マウスにおける脱脂されたウイルスの相対免疫原性を決定するための研究を行うことであった。マカクのサル免疫不全ウイルスの感染クローン（ＳＩＶｍａｃ２３９）の完全ヌクレオチド配列は決定されている。この分子クローンから生産されるウイルスは、研究室の研究に適した時間枠で、アカゲザルにおいてＡＩＤＳを引き起こす。両方の末端反復配列を含むプロウイルスゲノムは、１０，２７９塩基対であり、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｔａｔ、ｒｅｖ及びｅｎｖに対するオープンリーディングフレームを含有する。ｎｅｆ遺伝子は、９２番目のコドンの後に、インフレームの中途終止を含有する。ヌクレオチドレベルで、ＳＩＶｍａｃ２３９は、ＳＩＶｍａｃ２５１（９８％）及びＳＩＶｍａｃ１４２（９６％）に密接に関連する(Regier DA, Desrosiers Annual Review Immunology. 1990; 8:557-78)。
【０１４７】
実験を実施して、予め初回刺激されたＢａｌｂ／ｃマウスにおいてウイルス特異的体液性及び／又は細胞性免疫応答の容易に認識可能な追加免疫を生じる、脱脂されたサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の最小用量を決定した。実験はすべて、ＢＳＬ３施設で行った。
【０１４８】
脱脂されたウイルス調製物の免疫原性を、その自然形態の同じウイルスの分取量と比較した。同等のタンパク質量の脱脂されていないウイルス調製物及び脱脂されたウイルス調製物によるマウスの免疫化により誘導される、抗体の質（抗体の力価、抗体の立体構造的及び線状エピトープ特異性、抗体のアイソタイプ含有量並びに抗体の機能）及び抗体の量は、以下に記載するように確認された。野生型ウイルスの分取量からの総タンパク質及び同じ分取量のウイルスの脱脂後に回収されるタンパク質は、標準的な定量的タンパク質アッセイを用いて決定された（Biorad、ＢＣＡキットアッセイ、Rockford, Illinois）。総タンパク質プロファイルは、野生型ウイルス及び脱脂されたウイルス調製物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて決定され、相対的エピトープ保存は、野生型と脱脂されたウイルスのウェスタンブロット比較により確認された。
【０１４９】
同等なタンパク質量の化学的に処置した野生型及び脱脂されたウイルスは、マウスの群においてウイルス特異的免疫応答を追加免疫するそれらの能力に関して分析された。これらの免疫化マウスからの血清は、未処置野生型に対する反応性に関して、及び脱脂された
ウイルス調製物との比較用に、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析によりアッセイされた。脾臓細胞は、以下に概要するように、それらのＣＤ４及びＣＤ８  ＳＩＶウイルスｅｎｖ及びｇａｇ特異的免疫応答増強能力に関してアッセイされた。標準的な統計学的解析をデータ解析のために実施した。
【０１５０】
４〜６週齢の健常な雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをからthe Jackson labs, Bar Harbor, Me購入して、Emory UniversityにあるＢＳＬ２／３マウス収容施設に収容した。２０匹のＢａｌ／ｃマウスをそれぞれ、等容量のフロイント不完全アジュバントに組み込まれた２−２ジチオピリジン不活化ＳＩＶｍａｃ２５１のタンパク質２５μｇで皮下的に免疫化した。
【０１５１】
十分量のＳＩＶｍａｃ２５１を脱脂して、１回のスケジュールにつきこれらのマウスを追加免疫するのに必要とされる量を提供した。脱脂は、ＳＩＶｍａｃ２５１をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ＤＩＰＥとともにインキュベートすることから構成された。ＰＢＳ中の１０％ＤＩＰＥ溶液１．０ｍｌを調製して、それが濁って見えてくるまでボルテキサーで混合した。
【０１５２】
ウイルス調製物：Advanced BiotechnologiesのＳＩＶｍａｃ２５１の１ｍｌチューブを種ストックとして使用した（ショ糖勾配精製したウイルス１ｍｇ／ｍｌ）。供給業者は、総タンパク質１．０７４ｍｇ／ｍｌ（PierceのＢＣＡタンパク質法）及びウイルス粒子カウント６．９５10／ｍｌ（ＥＭ）を有する力価１０6.7を報告した。ウイルスは、最初は迅速アッセイとしてＣＥＭｘ１７４を用いて、二度目は四重培養／希釈で、力価１０7.0を有していることが確認された。この調製物におけるｐ２７の測定は、１０６μｇ／ｍｌの値を示した。次に、無希釈ウイルスストック２５μｌを、０．６ｍｌの透明なスナップキャップポリエチレンエッペンドルフチューブ１へ導入した。続いて、１０％ＤＩＰＥ溶液２．５μｌを、ウイルスを含有するエッペンドルフチューブへ添加して、１５秒間ボルテックスした。チューブを室温で１，０００×ｇにて２分間回転させた（エッペンドルフ５８１０Ｒ遠心機を用いて）。大半の溶媒は除去されなかった。溶媒を２，０００ｒｐｍで加熱無しで３０分間真空遠心分離（Speedvacの濃縮装置モデルＳＶＣ２００Ｈ）により除去した。チューブ内の容量をＰＢＳで２５μｌに調節した。総タンパク質の回収を、PierceのＢＣＡプロトコルを用いて測定した。ゲル（１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を特異的タンパク質の回収（ｅｎｖタンパク質、ｐｏｌタンパク質、ｇｐ４１、ｐ２７及びｇａｇタンパク質）に使用して、クマシーブルーで染色して、ＯＤを用いて半定量的な結果を提供した。ウェスタンブロットは、ＳＩＶ感染サルからの血清を用いて実施され、エンベロープタンパク質、ｇｐ６６、ｇｐ４１、ｐ２７、ｇａｇ及びｐ６  ｇａｇを測定した。調製物のウイルス感染力は、ルシフェラーゼアッセイ及びＣＥＭ−１７４細胞を用いて決定した。ウイルス力価は１０4.5であり、脱脂されていないストックで測定したものから２．５ｌｏｇ減少した。この脱脂されたＳＩＶ調製物は、９０％を上回るＳＩＶｍａｃ２５１の主要タンパク質構成成分（例えば、ｇａｇ及びｅｎｖタンパク質）を保持するようである。
【０１５３】
次に、改変されたウイルス調製物の免疫原性は、２−２ジチオピリジン不活化ＳＩＶｍａｃ２５１のタンパク質２５μｇで皮下的にそれぞれ免疫化した、上述の２０匹の成体雌Ｂａｌｂ／ｃマウスで決定された。１４日目に、群３〜６を、生理食塩水０．５ｍｌ中の脱脂されたウイルス１０μｇ〜０．０１μｇ（ストックの総タンパク質に基づいて）で追加免疫した。推定される実際のウイルスタンパク質含有量は、ストック中の総タンパク質／ｐ２７タンパク質の比に基づいて、総タンパク質の１／１０のウイルスタンパク質含有量に等しかった。マウスに以下のような脱脂されたワクチン組成物を注射した：
【０１５４】
【表３】
2007524383.tif 000005
【０１５５】
追加免疫注射の４日後、マウスに麻酔をかけて、眼窩後穿刺及び心臓内穿刺により血液を回収した。主に心臓内穿刺から、血液約０．５ｍｌを各マウスから回収した。血液を室温で凝固させた。各マウスの脾臓を無菌的に取り出して、二重袋収納下で研究室に輸送した。各マウスからの凝固血液を、室温で約４５０×ｇで遠心分離して、血清をチューブから回収して、滅菌チューブに移して、使用するまで−７０℃で保管した。ＥＬＩＳＡを実施して、各血清試料に関して、ＳＩＶに対する抗体力価を決定した。
【０１５６】
ＳＩＶ  ＥＬＩＳＡプロトコル
陽性及び陰性血清並びに試験されるべき流体のストックを分取量で凍結して、あらゆるプレート上で使用して、各実行を標準化した。
【０１５７】
コーティングされたCorningのＥａｓｙプレートをＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）１ｍｌ当たり１０μｇの濃度で、ウェル１つにつきポリ−ｌ−リシン１００μｌで洗浄した。プレートをカバーして、４℃で一晩インキュベートした。幾つかのプレートを一度にコーティングして、続く使用のために保管した。次に、過剰量のポリリシンを除去して、プレートを数分間乾燥させた。２％トリトン−Ｘ約１００μｌを、ストックＡＢＩ  ＳＩＶｍａｃ２５１  １００μｌに添加して、試料を５分間置いた。次に、ｐＨ９．６のコーティング緩衝液５０μｌを添加した。次に、ウイルス抗原１００μｌを５つのプレートの各ウェルに添加して、それらのプレートをカバーして、４℃で一晩インキュベートした。
【０１５８】
一晩のインキュベーション後、ウェルをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。続いて、ウェルに、ウェル１つにつきＰＢＳ中の２％脱脂粉乳２００μｌを室温で１時間入れて、非特異的結合をブロックした。過剰量の液体を除去した。１０％子ウシ血清を伴う１０％ＲＰＭＩ１６４０又はＰＢＳ中で１／１００に希釈された試験又は対照血清１００μｌを二重ウェルに添加して、３７℃で２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。次に、Southern Biotech（Fisherから）のアルカリホスファターゼ抗マウスＩｇＧ（１０％子ウシ血清を伴う培地又はＰＢＳ中で１／８００に希釈）１００μｌを添加して、３７℃で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。
【０１５９】
BIORADのアルカリホスファターゼ基質キットを使用して、反応生成物を展開させた。基質錠剤を１×緩衝液５ｍｌそれぞれに関して添加して、混合した。次に、ウェル１つにつき、１００μｌを添加して、約５、１０、１５、３０分で、続いて１時間間隔で発色を評価した。
【０１６０】
血清に関して、陽性対照が１．５００以上であり、陰性対照が０．１００〜０．２００である場合に、ブランク読取りが培地対照から得られた。続いて、結果を記録して、陰性対照、陽性対照及び実験試料の平均値並びに標準偏差を算出した。陰性カットオフ値は、陰性対照の平均値＋０．１５０であった。
【０１６１】
免疫原性の結果
マウスにおける脱脂されたＳＩＶウイルス調製物の免疫原性は、ＥＬＩＳＡアッセイで検査した。平均光学密度（Ｏ．Ｄ．）は、様々な希釈の血清で４０５ｎｍで検査した。表４は、血清試料に関するＥＬＩＳＡ試験の結果を提供する。
【０１６２】
【表４】
2007524383.tif 000006
【０１６３】
免疫化マウスから得られる解離脾臓細胞の応答の分析
脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、脾臓被膜をやさしく掻き裂くこと、及び細胞に２５ゲージの針を通すことにより、個々のマウスそれぞれから調製した。脾臓細胞を、培地（１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＲＰＭＩ  １６４０）中で単一細胞懸濁液へ解離させ、培地中で２回洗浄し、続いて１，０００万個の細胞／ｍｌに調節した。各マウスからのこの細胞懸濁液０．１ｍｌを、培地を含有する９６穴丸底マイクロタイタープレートの各ウェルへ分配した。残りの細胞は凍結保存した。続いて、標準的な細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣ）及びフローサイトメトリーにより、これらの脾臓細胞培養物を、ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の、ＩＦＮ−γを合成する能力に関して評価した。
【０１６４】
個々のマウスからの二重細胞培養物を含有する２つの別個のウェルには、ａ）プールに応じて、１つのプールにつき８〜９個のペプチドの範囲のＳＩＶエンベロープ（ＳＥ）ペプチドのプールのそれぞれ２μｇ／ｍｌを含有する培地０．１ｍｌ（ｎ＝１７プール）、又はｂ）プールに応じて、１つのプールにつき７〜８個のペプチドの範囲のＳＩＶｇａｇ（ＳＧ）ペプチドのプールのそれぞれ２μｇ／ｍｌを含有する培地０．１ｍｌ（ｎ＝１６プール）のいずれかを入れた。対照は、培地単独（バックグラウンド対照）又は最大ＩＦＮ−γ染色に関して予め決定された最適濃度のホルボールミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ  １μｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（０．２５μｇ／ｍｌ）（陽性対照）を入れた脾臓細胞培養物から構成された。ＳＩＶ  ｅｎｖペプチド（ｎ＝７２の別個のペプチド）は、８×９行列の格子様式で混合し、ＳＩＶ  ｇａｇペプチド（ｎ＝６２のペプチド、ペプチドをそれぞれ欠落している２つのプール及び２つのペプチドを欠落している１つのプールを有す
る）は、８×８行列の格子様式で混合し、個々のペプチド特異的免疫応答の同定を可能にした。ＳＩＶ  ｇａｇペプチドは概して、１２個のアミノ酸が互いに重複し、完全ＳＩＶｇａｇ配列を包含する合成２０量体ペプチドであった。ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドは概して、１３個のアミノ酸が互いに重複し、完全ＳＩＶ  ｅｎｖ配列を包含する合成２５量体ペプチドであった。ペプチドプールは、各ペプチド２．０μｇ／ｍｌを含有するように作製された。各脾臓細胞調製物に関して、３６ウェルの培養が存在した。ｅｎｖ及びｇａｇ重複ペプチドのプールの構成成分を以下に記載する。ＳＩＶｍａｃ２３９ｇａｇ（ＳＧ）及びｅｎｖ（ＳＥ）内の各々の位置において、プールを構成するペプチドを示す。
【０１６５】
【表５】
2007524383.tif 000007
【０１６６】
【表６】
2007524383.tif 000008
【０１６７】
【表７−１】
2007524383.tif 000009
【０１６８】
【表７−２】
2007524383.tif 000010
【０１６９】
【表７−３】
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【０１７０】
【表８−１】
2007524383.tif 000012
【０１７１】
【表８−２】
2007524383.tif 000013
【０１７２】
培養物を７％ＣＯ2加湿雰囲気中で３７℃にて一晩インキュベートした。各ウェルからの細胞を優しく取り出して、５．０ｍｌのＦＡＣＳ試験管へ移して、洗浄した。１組の細胞を抗ＣＤ３+抗ＣＤ４+で染色した。他の二重組は、抗ＣＤ３+抗ＣＤ８+で染色した（以下を参照）。続いて、これらの細胞表面染色細胞を透過処置して、標準的な細胞内染色プロトコルを用いて、抗ＩＦＮ−γ染色抗体を使用して、ＩＦＮ−γの細胞内含有量に関して染色した。次に、染色した細胞集団それぞれ（各管から約１０，０００個の細胞）を、ＦＡＣＳフローサイトメーターを用いて分析し、ＩＦＮ−γを合成するＣＤ３+ＣＤ４+及びＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞の頻度を決定した。陰性対照及び陽性対照は、バックグラウンド対照参照用及び陽性対照参照用に利用した。この実験の間にこの様式で、約１，０００回の分析を実施した。
【０１７３】
ＳＩＶ  ｅｎｖペプチド（１７プール）及びＳＩＶ  ｇａｇペプチド（１６プール）のプールに応答して、マウスの６つの群からの脾臓細胞によりＩＦＮ−γを発現するＣＤ４+Ｔ細胞の頻度（ｙ軸）を決定した。同様に、ＳＩＶ  ｅｎｖペプチド及びＳＩＶ  ｇａｇペプチドのプールに応答して、マウスの同じ６つの群からの脾臓細胞によりＩＦＮ−γを発現するＣＤ８+Ｔ細胞の頻度（ｙ軸）も決定した。データは、４匹のマウス／群から
の平均値であった。これらの初期研究の結果により、１０μｇ又は１．０μｇの用量の脱脂されたＳＩＶｍａｃ２５１は、予め初回刺激されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＳＩＶ特異的体液性応答の顕著な増強を招くことを示した。０．１μｇ（５×１０6個のウイルス粒子）の用量でさえも、これらのマウスにおいて、ＳＩＶ特異的体液性応答の検出可能な増強を招いた。１．０μｇの用量は、予め初回刺激されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩＦＮ−ｇ合成により測定されるように、際立って広範囲の幅のＳＩＶ  ｅｎｖ及びＳＩＶ  ｇａｇペプチド特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を招いたが、１０μｇの用量はそれらを招かなかった。
【実施例４】
【０１７４】
ＨＩＶ−１の直接的な脱脂、及び炭カラムによる溶媒の除去及びＨＩＶタンパク質の保持
１，０００×ＨＩＶ−１  ＩＩＩＢ約２５μｌを、１）無し、２）ブタノール／ＤＩＰＥ（２５：７５）１２．５μｌ、３）１００％ＤＩＰＥ  ２．５μｌ又は４）ＰＢＳ中１％ＤＩＰＥ  １２．５μｌと混合して、試料を１５秒間ボルテックスした。炭カラム（０．５ｍｌ）は、Whatmanのフィルターフリットを含有する３ｍｌのBD LuerLockのシリンジに、ＰＢＳで洗浄したHemasorbaの炭２ｍｌを装填することにより生成した。カラムを５％グルコース／ＰＢＳ（５〜１０倍カラム容量）で洗浄した。カラムを５％グルコース／ＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。このカラムを使用して、処置した血漿から溶媒を除去した。ウイルス溶媒混合物を個別のカラム上へ装填した。カラムを１ｍｌのＰＢＳで押し流した。溶出容量を測定して、試料をＥＬＩＳＡによりｐ２４タンパク質に関してアッセイし、ウェスタンブロット法に付した。
【０１７５】
１％ＤＩＰＥで処置した試料は、対照と比較して、優れたｐ２４回収を示した。１０％ＤＩＰＥ又はブタノール／ＤＩＰＥで処置した試料は、わずかに劣るｐ２４回収を示した。総タンパク質回収は、対照に対する割合に関して、１％ＤＩＰＥ、１０％ＤＩＰＥ又はブタノール／ＤＩＰＥで得られるｐ２４の結果に類似していた。
【０１７６】
この実施例で以下に提供するプロトコルに類似した様式で実施されるウェスタンブロット分析は、ブタノール／ＤＩＰＥ、１０％ＤＩＰＥ又は１％ＤＩＰＥ溶媒処置を用いた場合に、抗ＨＩＶ  ＩｇＧでプローブした際に無数の免疫反応性バンドを明らかにした。ウェスタンブロット分析はまた、ブタノール／ＤＩＰＥ、１０％ＤＩＰＥ又は１％ＤＩＰＥを用いた場合に、ｐ２４に相当する陽性免疫反応性バンドも明らかにした。陽性免疫反応性バンドは、１０％ＤＩＰＥ又は１％ＤＩＰＥを用いて、ｇｐ４１に関して観察された。さらなる陽性免疫反応性バンドは、ブタノール／ＤＩＰＥ、１０％ＤＩＰＥ又は１％ＤＩＰＥを用いた場合にｇｐ１２０に関して観察されたが、染色の強度は、１０％ＤＩＰＥ又は１％ＤＩＰＥを用いた場合のほうが高かった。
【０１７７】
ＳＩＶ及びＨＩＶウェスタンブロット分析
比較用の試薬は、脱脂されたＳＩＶｍａｃ２５１、熱失活ＳＩＶｍａｃ２５１及び全ＳＩＶに対するウサギポリクローナル抗体(the AIDS reagent repository, Rockville, MDから入手可能）を含んでいた。ウェスタンブロットにおいてＳＩＶバンドの大部分を可視化させるには、タンパク質約１μｇが必要とされた。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）をウイルス溶解物に関して実施した（溶解物緩衝液：５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１％ＮＰ−４０、０．２５％デオキシコール酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、アプロチニン、ロイペプチン及びペプスタチンそれぞれ１μｇ／ｍｌ、１ｍＭ  バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ  ＮａＦ）。
【０１７８】
銀染色を用いて、分子量標準物質に対して脱脂後に存在する様々なウイルスタンパク質を明らかにするバンドを可視化させた。熱失活ＳＩＶｍａｃ２５１タンパク質を、ゲル上
で脱脂されたＳＩＶｍａｃ２５１タンパク質と比較した。同様のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、タンパク質をニトロセルロースに転写する。ブロットされたニトロセルロースを水で二度洗浄した。脱脂されたＳＩＶｍａｃ２５１及び熱失活ＳＩＶｍａｃ２５１に関する最低それぞれ３つのブロットを行った。
【０１７９】
ブロットされたニトロセルロースを、３％脱脂粉乳（ＭＬＫ）を含む調製したばかりのＰＢＳ中で２０〜２５℃で２０分間、一定攪拌しながらブロックした。ニトロセルロースストリップを、調製したばかりの既定最適濃度のウサギポリクローナル抗ＳＩＶ抗血清（ＰＢＳ−ＭＬＫ中で１：１，０００希釈の抗血清約５ｍｌ）とともに、攪拌しながら一晩インキュベートした。ニトロセルロースストリップを水で二度洗浄した。ストリップを、ＰＢＳ−ＭＬＫ中のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ１：３００希釈とともに、室温で９０分間、攪拌しながらインキュベートした。ニトロセルロースを水で二度、続いてＰＢＳ−０．０５％ツイーン２０で３〜５分間洗浄した。ニトロセルロースストリップを、水を４〜５回変えながら洗浄した。展開したバンドの検出は、展開したバンドの検出により達成した。熱失活ＳＩＶを用いた場合の展開したバンドを、脱脂されたＳＩＶを用いた場合のバンドと比較した。
【０１８０】
炭カラムに通し、且つｐ２４、ｇｐ４１、ｇｐ１２０に関してプローブした溶媒処置ＨＩＶ−１のウェスタンブロット分析に対して、及びさらにはヒト抗ＨＩＶ  ＩｇＧを用いたＨＩＶ抗原に関して同様のアプローチが使用された。ウェスタンブロット法は、ニトロセルロース膜上へ転写されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離ウイルス試料に関して実施した。膜は、ウイルスタンパク質に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を用いてプローブし、ペルオキシダーゼと結合させた二次抗体で展開して、化学発光試薬を増強した。
【実施例５】
【０１８１】
ワクチンとして使用するための改変ＳＡＲＳウイルス粒子の開発
Ａ．ＳＡＲＳウイルスに関する溶媒処置方法の最適化
ウイルスの種ウイルス生産。ＳＡＲＳウイルスストック（検体番号８０９９４０株２００３００５９２）は、疾病対策センター（ＣＤＣ）から得られた。ウイルスは、Ｖｅｒｏ
Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８６）において成長させる。ウイルス試料を解凍して、０．１ｍｌをピペットで、増殖培地（１０％ウシ胎児血清を有するアール平衡塩類溶液中の９０％イーグル最小必須培地）約２ｍｌを含有するＶｅｒｏ  Ｅ６細胞の５つの試験管それぞれに接種する。ウイルス試料の残りは、−８０℃で保管する。各管中の細胞シートの７５〜１００％が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示したら、細胞を、凍結すること及び掻爬することにより回収して、１ｍｌ分取量でプールして、−８０℃で凍結させた。ウイルスは、ＴＣＩＤ50法によりＶｅｒｏ  Ｅ６細胞の試験管中で滴定する（ウイルスの連続１：１０希釈を四重で）。
【０１８２】
ウイルスの溶媒処置。ＳＡＲＳウイルスは、本明細書中に記載するようにＳＩＶ、ＤＨＢＶ及びＢＶＤＶに関して使用される様々な方法により溶媒処置して、最大エンベロープタンパク質回収及び最小残存感染力のための過程を最適化する。ＳＡＲＳウイルス溶媒処置に関して探索されるパラメータは、溶媒のタイプ又は組合せ、溶媒比、溶媒対ウイルス比、処置時間、処置温度、混合方法及び溶媒除去過程である。ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中のＳＡＲＳウイルスストック調製物を、約２，０００〜１０，０００ｐｐｍをもたらすＤＩＰＥと組み合わせて、転倒型回転により２０〜６０分間混合した後、１，０００×ｇで２分間遠心分離した。残留溶媒は、真空蒸発又は活性炭への吸着のいずれかにより除去される。さらに、ＤＩＰＥ及びｎ−ブタノールの組合せを、総溶媒濃度約２００〜４０，０００ｐｐｍをもたらす６０：４０〜９５：５（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で試験して、転倒させて２０〜６０分間混合した後、１，０００×ｇで２分間遠心分離した。残留溶媒は、活性炭への吸着により除去される。
【０１８３】
上述の様々な処置方法からの試料すべては、ウェスタンブロットを含むＰＡＧＥにより特性化されて、ウイルスタンパク質及び総タンパク質の存在を決定する。特異的ウイルス抗原及びタンパク質の定量化は、ＥＬＩＳＡのような免疫特異的アッセイにより評価される。感染力は、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞変性アッセイを用いて評価される(Reed and Muench; Am. J. Hygiene 1938; 27: 493-497)。回収された最大標的ウイルスタンパク質、マウスにおける感染力及び免疫原性の最大の低減に基づいて、溶媒処置の最も有効的な方法に関して選択が行われる。
【０１８４】
Ｂ．既知のウイルス失活剤に基づくＳＡＲＳに関する化学的処置方法の最適化
本発明の方法が、ワクチンとしては不十分なレベルに感染力を低減する状況では、溶媒処置したウイルスの化学的失活が必要とされ得る。化学的失活は、感染力が６ｌｏｇ減少する場合に、成功したとみなされる。
【０１８５】
方法。光活性化架橋試薬ソラレンが使用される。ソラレン三環式平面環構造は、一重鎖ＲＮＡへインターカレートし、光活性化される。ＮＨＳ−ソラレン(Pierce Biochemicals, Rockford IL)をＤＭＳＯに溶解した後、水性反応混合物へ添加する。ＮＨＳエステルは、ｐＨ７〜９で第一アミンに架橋する。溶媒処置したウイルス溶液と、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）中のＮＨＳ−ソラレン（１５０ｍＭ）を混合する。光反応性カップリングは、３５０ｎｍを上回る光に３０分間、又は３ジュール／ｃｍ2に露光させることにより達成される。
【０１８６】
Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞における細胞変性終点（ＣＰＥ）は通常、接種後５日目に確認される。それは、細胞剥離が続く罹患細胞における細胞の丸み及び屈折性を伴う外観に焦点を当てる。ＣＰＥは、迅速に拡がって、２４〜４８時間以内に全細胞単層を包含する。したがって、細胞完全性が破壊されると、それはウイルスが感染していることを示す。
【０１８７】
Ｃ．未処置のウイルスタンパク質構造及び処置後のウイルスエンベロープ変化の評価
ウイルスタンパク質に対する溶媒処置の影響を評価するために、ウイルス試料を、ウェスタンブロットを含む未変性ＰＡＧＥにより特性化して、未処置のウイルスタンパク質の存在を決定する。総可溶性タンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて測定する。溶媒処置の最も有効的な方法は、回収された最大標的ウイルスタンパク質及び感染力の最大の低減に基づいて選択される。二重抗体サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ＳＡＲＳ抗体を検出する(Current Protocols in Immunology, Vol1, supp. 8, 1991, John E Coligan, et al. eds.; Richard Coico, series ed., publisher: Current Protocols, John Wiley and Sons)。ポリクローナル抗ＳＡＲＳ抗体をビオチン化して、ＳＡＲＳウイルス抗原を、ＳＡＲＳウイルスストックから生産する。
【０１８８】
ネイティブゲル電気泳動。ネイティブゲル電気泳動は、ポリアクリルアミドゲル中で室温にて実施され、タンパク質は、銀染色で可視化されるか、あるいは標識ヤギ抗マウス抗体による検出のためにニトロセルロースへ転写される（ウェスタンブロット）。溶媒処置前及び後のＳＡＲＳウイルスの試料は、標準物質としてＳＡＲＳウイルスタンパク質のプールを用いて分析される。
【０１８９】
ウェスタンブロット。ゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜へ転写する。高分子量タンパク質に関しては、転写時間は、少なくとも９０分である。ＢＳＡ及び乳でブロックした後、ニトロセルロースを、ＳＡＲＳウイルススパイク及び膜タンパク質に対するポリクローナル抗体とともにインキュベートする。マウス抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体で可視化される。市販のＳＡＲＳウイルスポリクローナル抗体を購入する。代替としては、抗体は、以下に簡単に記載する方法により離乳したＢ
ＡＬＢ／ｃマウスにおいて生産される。
【０１９０】
マウス抗ＳＡＲＳ抗体の生産。ＳＡＲＳポリクローナル抗体が市販されていない場合、マウスに、ショ糖密度勾配遠心分離により精製した濃縮ソラレン処置ウイルスストック調製物を注射する。失活は、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞で確認される。２２匹の離乳ＢＡＬＢ／マウスを、それぞれ８匹のマウスを有する２つの群に分けて、残りの６匹のマウスを対照とする。それぞれ８匹のマウスを有する２つの群に、ＭＰＬ（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノマイコレート、ＲｉＢｉアジュバント系、Corixa Corp. Hamilton, MT）と混合した１０μｇ（低）又は５０μｇ（高）用量のウイルスプレップを皮下（ｓｃ）接種する。６匹の対照マウスには、アジュバントと混合した等量の細胞培地を接種する。接種を、２週目及び４週目に繰り返す。６週目に、マウスに麻酔をかけて、眼窩後出血＋心臓内穿刺により血液を抜く。各群からの血清をプールして、中和抗体に関して滴定する。
【０１９１】
ＳＡＲＳウイルススパイク及び膜タンパク質がそれらの自然立体構造で存在する場合、マウスにおいてこれらの無傷タンパク質に対して産生される抗体は、ウェスタンブロットで認識される。銀染色したゲルは、タンパク質がこの方法によりもはや検出され得ないように溶媒処置がタンパク質を変性させる点に至るまで、ウイルスタンパク質の保持を示すと予測される。
【０１９２】
さらなる方法及び代替的方法。さらなる方法を用いて、ウェスタンブロットからの結果を確認する。電子顕微鏡法を用いて、ウイルス構造の完全性を評価し、溶媒処置前及び前の変化を比較する(Graham DR, et al., (2003) J Virol. 77(15): 8237-8248)。ウイルスは、ＢＳＬ−３設備から取り出される前に、グルタルアルデヒドで不活化される。
【実施例６】
【０１９３】
溶媒及び化学的に処置したＳＡＲＳ粒子の、マウスにおいて免疫応答を生じる能力
低度〜高度の脂質除去を生じる様々な濃度の溶媒、混合時間及びエネルギー並びに溶媒の組合せを用いた溶媒処置方法からのウイルス調製物を動物にワクチン接種する。ワクチン接種した動物における各方法からの結果の比較を使用して、どのウイルスプレップが最良の免疫学的応答を付与するかを決定する。ワクチンとして有用であるためには、溶媒処置したＳＡＲＳウイルスは、抗体生産により分かるように、ともに抗原性でなくてはならず、サイトカイン生産の増加を引き起こさなければならない。
【０１９４】
Ａ．抗体生産のための、及び中和抗体の誘発に関して試験するための、溶媒及び化学的に処置したＳＡＲＳウイルス粒子のマウスへの注射
予め初回刺激したＢａｌｂ／ｃマウスを使用して、Ansari A.他により記載される方法(J. Virology 76(4): 1731-1743, 2002)を用いて、これらのマウスにおいて容易に認識可能なウイルス特異的体液性又は細胞性免疫応答を招く溶媒処置ＳＡＲＳウイルスの最小用量を決定する。２０匹の成体雌Ｂａｌｂ／ｃマウスそれぞれに、等容量のアジュバントに組み込まれた化学的に失活させたＳＡＲＳウイルスタンパク質２５μｇを皮下注射する。４匹のマウスは、対照非免疫化マウスとして利用する（群１）。
【０１９５】
十分なＳＡＲＳウイルスを実施例５に記載する方法に従って処置し、その結果、スケジュール１回につきこれらのマウスを追加免疫するのに必要とされる量が得られる。初めの初回刺激の１４日後、１群当たり４匹のマウスを有する５つの群を以下のように処置する：群２−−生理食塩水０．５ｍｌ、群３−−溶媒処置ウイルス１０μｇを含有する生理食塩水０．５ｍｌ、群４−−溶媒処置したウイルス１μｇを含有する生理食塩水０．５ｍｌ、群５−−溶媒処置したウイルス０．１μｇを含有する生理食塩水０．５ｍｌ、群６：溶媒処置したウイルス０．０１μｇを含有する生理食塩水０．５ｍｌ。追加免疫の４日後、
すべてのマウスに麻酔をかけて、眼窩後穿刺により血液を回収する。回収した血液から血清が得られる。脾臓細胞調製用に、各試験マウスから脾臓を回収する（以下を参照）。これらのマウスから回収した血清及び脾臓細胞は、この実施例で以下に記載するような分析に関する基礎として使用する。
【０１９６】
Ｂ．Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞の細胞変性アッセイを用いた血清におけるマウス中和抗体の生産に関する試験
処置したウイルス調製物が、ＳＡＲＳウイルス中和抗体を産生することが可能であるかどうかを決定するために、マウス免疫化から回収された血清試料を試験して、それらが、細胞溶解からＶｅｒｏ  Ｅ６細胞を保護することが可能であるかどうかを評価する。
【０１９７】
ビリオンの精製。簡潔に述べると、ウイルスは、２５〜５０％ショ糖密度勾配での２回連続した超遠心分離により、清澄化した細胞培養上清から単離される。ウイルス含有画分は、２５４及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収により同定される。ピークのＵＶ吸収画分をプールして、ＴＮＥ緩衝液（０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．２］、０．１Ｍ  ＮａＣｌ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡ）によりショ糖２０％以下にまで希釈し、ペレットへと超遠心分離して、ＴＮＥ緩衝液中に再懸濁させる。試料は、−８０℃で保管する。処置されたウイルスは、適切なインキュベーション条件下で、適切な作用物質の存在下で、指示された濃度のキャプシドタンパク質でウイルスをインキュベートすることにより調製される。続いて、ウイルスは、４℃で１００，０００×ｇにて１時間、遠心分離することにより、２０％ショ糖パッドを介して再精製される。
【０１９８】
ウイルス中和アッセイ。ＣＤＣから得られるＳＡＲＳウイルスストックを、３７℃で７日間、集密したばかりのＶｅｒｏ  Ｅ６細胞の試験管中で四重で滴定して、ＣＰＥの外観に基づいてＴＣＩＤ50／０．１ｍｌを得る。失活マウス抗ＳＡＲＳ抗血清を、血清無しの細胞培地を用いて１：１０に連続希釈する。等容量の希釈した特異的抗血清を１００ＴＣＩＤ50のＳＡＲＳウイルスストックと混合して、１時間インキュベートする。Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞の二重管に各ウイルス抗血清希釈混合物０．２ｍｌを接種して、７日間インキュベートする。この滴定を、各中和アッセイで繰り返す。ＣＰＥの外観に基づいて少なくとも１００ＴＣＩＤ50のウイルスを中和する抗血清の希釈は、１抗体単位を表す。さらなる中和アッセイでは、ＳＡＲＳとして確認されるべきウイルスの連続１：１０希釈及び２０個の抗体単位の特異的免疫血清を等容量で使用する。
【０１９９】
感染力アッセイ。ＳＡＲＳウイルスの溶媒処置した試料それぞれを、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞の２個又は４個の管に接種して、少なくとも７日間インキュベートして、ＣＰＥＮの存在を検出する。非溶媒処置ＳＡＲＳウイルスストックを対照として上述のように接種する。ウイルス力価は、ＴＣＩＤ50により算出される。ＳＡＲＳウイルスは、２４〜４８時間のうちに、細胞に丸みを帯びさせ、屈折性となるようにさせ、且つ細胞を剥離させると予測される。中和抗体が存在する場合、細胞は無傷のままである。試験血清における中和抗体は、細胞を１００ＴＣＩＤ50のウイルスから保護すべきである。Ｖｅｒｏ細胞タンパク質に対するマウス抗体が生産される場合、Ｖｅｒｏ  Ｅ６細胞を始めとする偽ウイルス調製物を注射したマウスからの血清を対照として使用する。必要である場合、抗Ｖｅｒｏ細胞抗体は、アフィニティ精製によりマウス血清から除去される。
【０２００】
Ｃ．溶媒処置したＳＡＲＳウイルス粒子によるワクチン接種に関するマウス細胞性応答の評価
サイトカインは、免疫応答を編成するのに重要である。細胞性応答は、他のコロナウイルスワクチンを用いた場合に見られる一過性の免疫性の問題に対処するのに大いに関連する。マウス細胞性免疫応答の指標として、この実施例で上述する方法からのワクチン接種したマウスにおいてレトロウイルスに使用したように、サイトカインγインターフェロン
及びインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）が測定される。
【０２０１】
脾臓細胞の回収及び細胞内サイトカイン染色分析。脾臓細胞は、無菌的に回収して、細いゲージ針に押し込めることにより、単一細胞懸濁液を作製する。細胞計数が実施される。細胞をＲＰＭＩ  １６４０完全培地（ＲＰＭＩ  １６４０＋１００Ｕ／ｍｌのペニシリン＋１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン＋２ｍＭ  Ｌ−グルタミン＋１０％のウシ胎児血清の選択ロット）中に１００万個の細胞／ｍｌで再懸濁させる。細胞懸濁液（１００，０００個の細胞）を９６ウェルプレートのウェルに分配する。培地を三連のウェルに添加して（陰性対照）、ホルボールミリスチン酸酢酸（ＰＭＡ  ５０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）を３つのさらなるウェルに添加する（陽性対照）。続いて、ウイルス構造遺伝子に関するある特定のＳＡＲＳコード配列（Ｅ、Ｍ及びＳタンパク質配列）を網羅するための重複ペプチドのＳＡＲＳプール（格子として調整）を適切なウェルに添加する。培地カクテルを添加して、一晩インキュベートする。ブレフェルジンＡ溶液の添加に適切である場合、ＦＡＣＳ洗浄液中のＰｅｒＣＰ標識したＣＤ４及びＦＩＴＣ標識したＣＤ８の抗体カクテルを添加し、インキュベートし、除去して、洗浄する。各ウェルの内容物をＦＡＣＳチューブに移した後、ｐｅｒｍ／ｆｉｘを添加する。Ｐｅｒｍ  Ｗａｓｈで洗浄した後、フィコエリトリン（ＰＥ）抗ヒトＩＦＮ−γを添加する。インキュベーションを繰り返し、洗浄して、洗浄溶液を除去する。新鮮な１％パラホルムアルデヒドを添加して、分析する準備が整うまで、試料を暗所で冷蔵する。試料すべてに関するデータを収集して、培地対照及びＰＭＡ＋イノマイシンを用いた場合に得られるシグナルに基づいて、閾値が引き出される。約１００，０００回の事象からのデータが収集される。重複ペプチドに対して陽性インターフェロンγ応答又はインターロイキン応答を誘導するペプチドが同定される。サイトカイン陽性細胞の存在により、溶媒処置したＳＡＲＳウイルスは、細胞性免疫応答を誘発するのに有効であることが示される。
【実施例７】
【０２０２】
マウスに投与されると、低減された感染力を示し、且つＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞免疫応答を誘発する脱脂されたＳＩＶウイルス
本発明に従って脱脂されたＳＩＶを用いたプライム・ブースト免疫化戦略は、アルドリチオール−２（ＡＴ−２）処置又は生ウイルスよりも、マウスにおいてより広範囲のＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答（インターフェロンγ生産）を誘発する。より具体的には、本発明は、脱脂されていないウイルス粒子と比較した場合に、より広範囲の一連の抗原に対する改善された免疫応答を引きこす。本発明は具体的には、脱脂されていないウイルス粒子と比較した場合に、より広範囲の抗原（例えば、最低５％以上の抗原の範囲）に対して増加された免疫応答を有する改変されたウイルス粒子を包含する。
【０２０３】
この実施例では、ＳＩＶｍａｃ２５１の脱脂は、主要ＳＩＶタンパク質（ｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ）を保持しながら、ウイルス感染力を低減した。研究は、皮下的に（ｓｃ）ＡＴ−２処置したウイルス＋アジュバントで免疫化し、ＡＴ−２処置ウイルス、生ウイルス又は脱脂ウイルスのいずれかで追加免疫したＢａｌｂ／ｃマウスで行った。投与経路及び初回刺激と追加免疫との間の間隔及び用量レベルを評価した。脾臓細胞を回収して、ｅｎｖ及びｇａｇに関する完全ＳＩＶアミノ酸配列を網羅する重複ＳＩＶ  ｅｎｖ及びｇａｇペプチドの個々のプールとともに培養した。脾臓細胞の、（インターフェロン）ＩＦＮ−γを合成する能力を、標準的な細胞内サイトカイン染色（ＩＣＣ）及びフローサイトメトリーにより測定した。脱脂は、１％ＤＩＰＥを用いて行った。
【０２０４】
材料及び方法：ＳＩＶｍａｃ２５１抗原処置
ＡＴ−２不活化：第一次免疫化並びに追加免疫対照の目的で、ショ糖によりバンド採取された(banded)ＳＩＶｍａｃ２５１の分取を、これまでに記載されるようにＡＴ−２での処置により失活させた(Rossio et al., J. Viorl. 72:7992, 1998)。簡潔に述べると、Ａ
Ｔ−２(Aldrich, Milwaukee, WI)の１００ｍＭ  ストック溶液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で新たに調製した。続いて、ＡＴ−２を最終濃度３００μＭでウイルスに直接添加して、３７℃で１時間インキュベートした後、ウイルスを分取して、免疫化用に使用するまで、それを−７０℃で保管した。
【０２０５】
ＤＩＰＥ溶媒処置：２００μｇ分取量のショ糖精製されたＳＩＶｍａｃ２５１総タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で希釈して、エッペンドルフ微量遠心チューブ中で総用量が１ｍＬになるように、様々な量のジイソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）(VWR, West Chester, PA)を添加して、様々なＤＩＰＥ濃度を達成した。ウイルス抗原調製物の溶媒処置は、室温で２０分間行った。試料をチューブの底部へ回収するための短時間の遠心分離後、溶媒をＳｅｅｄｖａｃエバポレータ(Savant)において室温で９０分間、蒸発させた。この手順の最後に、注射等級の水を用いて、容量を１ｍｌへ再構成させた。溶媒処置した試料２５μＬを、蒸留水７５μＬで希釈して、ガスクロマトグラフィ分析に付して、溶媒の除去を確認した。免疫化に使用される任意の試料中の残留ＤＩＰＥ溶媒の許容限界は、２５ｐｐｍ以下であった。続いて、各試料をブースター免疫化用に適切な量で分取して、−７０℃で保管した。
【０２０６】
ウイルスタンパク質回収及び感染力アッセイ
ＳＩＶｍａｃ２５１の溶媒処置の影響を、ＢＣＡ(Pierce, Rockford, IL)及びＬｏｗｒｙアッセイ(Biorad, Hercules, CA)、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、続く銀染色を用いた総タンパク質分析により、及びＳＩＶ反応性サル血清のプールを用いたウェスタンブロット分析により確認した。さらに、ＳＩＶｇａｇ  ｐ２７回収は、ＥＩＡ(Coulter Immunotech, Hialeh, FL)により試験し、ウイルスＲＮＡは、実時間増幅(Amara et al., Science 92: 69, 2001)により試験した。残存ウイルス感染力は、ＣＥＭｘ１７４細胞における標準的な滴定及び個々のウェルの上清液体におけるｐ２７生産のモニタリングにより、処置された分取量それぞれで評価した。感染力価は、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法に従って算出した。
【０２０７】
等密度勾配遠心分離
ウイルス密度プロファイルは、ウイルスを等密度勾配遠心分離に付すことにより評価した。簡潔に述べると、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２０％〜６０％のショ糖それぞれ１．３ｍｌを、ショ糖濃度を８％ずつ増加させながら重ねた。底部での６０％ショ糖から最上部での２０％ショ糖まで、６つのショ糖濃度を層にした。ＰＢＳ  ７５０μｌ中のウイルス試料（２０％ショ糖クッションを介してペレット化した後に調製）を、２０％ショ糖の上に慎重に重ねた。チューブすべてを、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８超遠心機用の８０Ｔｉローター中で、４０，０００ｒｐｍで、４℃にて１６時間回転させた。最上部からはじまって、チューブ１つ当たり５２５μｌの１７個の画分が回収された。ウイルス濃度は、市販のＳＩＶ  Ｇａｇ  ｐ２７  ＥＬＩＳＡキット(Coulter, CA)を用いて分析した。
【０２０８】
高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）ウイルス分析
脱脂されたウイルスは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＦＰＬＣシステムにおいてＦＰＬＣによりさらに分析した。ウイルス試料（２００μｌ）をＳｕｐｅｒｏｓｅ６  ＨＲ  １０／３０(Pharmacia, Sweden)カラムに注入した。それぞれ５００μｌを有する６０個の画分を、Ｃａ及びＭｇ無しのＰＢＳ中で、流速０．４ｍｌ／分で回収した。画分中のＳＩＶの存在は、ｐ２７  ＥＬＩＳＡ(Coulter, CA)により検出された。ウイルス画分中のコレステロールの量は、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ総コレステロールアッセイにより、製造業者の指示書(Molecular Probes, OR)に従って分析した。
【０２０９】
マウスの免疫化
４〜６匹の１０週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、フロイント不完全アジュバント（ＩＦ
Ａ）中で乳化され、且つ皮下（ｓｃ）投与される、ショ糖によりバンド採取したＡＴ−２失活ＳＩＶｍａｃ２５１(ABI, Columbia, MD)１０μｇによる第一次免疫化を施した。対照の目的で、数匹のマウスは、ＩＦＡのみで初回刺激した。続いて、６匹の動物を有する群に、２週間後に、非処置ＳＩＶｍａｃ２５１に対する処置ＳＩＶｍａｃ２５１の可変用量を用いて、静脈内でブースター免疫化を施した。次に、追加免疫の４日後に、動物を屠殺して、血液及び脾細胞を回収して、以下に記載する免疫分析を実施した。
【０２１０】
細胞媒介性応答の細胞内ＩＦＮ−γ応答評価
これらの分析は、５μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ並びにそれぞれ１μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ２８及びＣＤ４９ｄモノクローナル抗体の存在下での短期間の抗原特異的再刺激後の細胞内サイトカイン（ＩＣＣ）分析、続くＩＦＮ−γ生産ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の頻度の評価を用いて実施した。標準的なプロトコルは、完全ＳＩＶｇａｇ（１６個のペプチドプール、１２個の残基が重複している２０量体）及びＳＩＶ  ｅｎｖ（１７個のペプチドプール、１３個の残基が重複している２５量体）を包含するペプチドのプール（それぞれ２μｇ／ｍｌの個々のペプチドを含有する）（プールはそれぞれ、７〜９個のペプチドを含有する）による１×１０6個の脾細胞の１２時間の再刺激から構成された。陽性対照試料は、分裂促進因子ＰＭＡ／イノマイシン及びＰＨＡで刺激した脾細胞から構成され、陰性対照は、ペプチド刺激無しであり、オボアルブミン特異的ペプチドＳＹＮＦＥＫＬ（配列番号１３６）による刺激である。培養を２時間行った後、サイトカインの排出を防止して、その細胞内蓄積を促進するように設計されたブレフェルジンＡを添加した。続いて、再刺激した脾細胞をＣＤ４+、ＣＤ８+及び細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した。ＩＮＦ−γ陽性ＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞の頻度の評価は、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ(Beckton Dickinson, Mountain View, CA)を用いて、約２００，０００事象／試料を計数することにより分析した。
【０２１１】
血清学
ＳＩＶ  ＥＩＡ：血清試料は、日常的なＥＩＡ及びウェスタンブロット分析を用いて、ウイルスエピトープに対する抗体に関して滴定した。簡潔に述べると、ポリ−Ｌ−リシン（ＰＢＳ  １ｍｌ当たり１０μｇ）でコーティングしたＥＬＩＳＡマイクロプレートに、精製ＳＩＶｍａｃ２５１  ２μｇ／ウェルを、標準的な重炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中で４℃にて一晩吸着させた。ＰＢＳ／ツイーン２０で３回洗浄した後、プレートを、２％脱脂粉乳を含有するＰＢＳを用いて室温で１時間ブロックした。続いて、順次２倍血清希釈液をプレート並びに二連の陽性及び陰性対照試料へ添加して、３７℃で２時間インキュベートした。未結合の抗体を洗浄した後、プレートをアルカリホスファターゼ−抗マウスＩｇＧ結合体(Southern Biotech, Birmingham, AL)とともに３７℃で１時間インキュベートした後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート(BioRad)を用いて室温で展開した。ＥＬＩＳＡリーダー(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて、４５０ｎｍ波長で、プレートを読取った。
【０２１２】
ＳＩＶウェスタンブロット：ウェスタンブロット分析に関しては、市販のＳＩＶウェスタンブロットキット(Zeptometrix, Buffalo, NY)を、製造業者の指示書に従って、１：１００希釈したマウス血清に対して利用して、展開させた。
【０２１３】
結果
ウイルスの脱脂は、ウイルスタンパク質の損失無しでコレステロールの除去をもたらす
本発明者等の以前の最適化手順は、ＤＩＰＥ処置がウイルスタンパク質の著しい損失無しでＨＩＶを効果的に脱脂するという見解につながった（データは示さず）。本発明者等は、これらの見解を拡張させて、この方法がＳＩＶ−ｍａｃ２５１を脱脂することができるかどうかを評価した。ＳＩＶ−ｍａｃ２５１は、総タンパク質又はウイルスタンパク質（ｐ２７）に著しく影響を及ぼすことなく、ＤＩＰＥを用いて脱脂された。総ウイルスタ
ンパク質及びウイルスｇａｇ  ｐ２７の回収は、生ＳＩＶと比較した場合とは、有意に異ならなかった。これらの見解は、ＳＩＶの銀染色及びウェスタンブロット分析により確認された。脱脂されたウイルスは、感染力において再現性のある２ｌｏｇの減少を示した（図７）。本発明者等の方法を用いてウイルスからコレステロールを除去することにより、ウイルスＲＮＡ又はウイルスタンパク質を損失することなく、ＨＩＶ−１におけるコレステロールのβ−ＣＤ除去(Nguyan et al., J. Immunol. 168:4121, 2000; Graham et al.,
J. Virol. 77:8237, 2003)に類似した様式で感染力を減少させる。処置したウイルスの物理特性に対して脂質の損失をさらに特性化するために、本発明者等は、高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によりウイルス粒子プロファイルを評価した（図５）。対照及びアルドリチオール−２（ＡＴ−２）処置したウイルスのＦＰＬＣプロファイルは類似していた（データは示さず）。しかしながら、ＤＩＰＥ処置したビリオンは、生対照ビリオンと比較して、それらの構造プロファイルを変化させた。本発明者等の脱脂手順がコレステロールの除去を導くかどうかを評価するために、本発明者等は、ＦＰＬＣ分離後にＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイを用いて、コレステロールに関して処置したウイルスを分析した。ＤＩＰＥ処置したウイルスは、コレステロール／ｇａｇ  ｐ２７タンパク質比として表す場合に、対照ウイルスよりもおよそ８０％少ないコレステロールを有した。ウイルスはさらに、等密度勾配遠心分離により分析して、粒子密度を評価した。脱脂は、ビリオンの浮力を変化させて、ウイルス粒子の密度範囲のシフトをもたらした（図４）。
【０２１４】
脱脂されたウイルスは、追加免疫中に、より幅広い細胞媒介性免疫応答を誘発することが可能である
脱脂されたウイルスが、細胞媒介性免疫応答を追加免疫する際に免疫原性を高めたかどうかを評価するために、本発明者等は、対照及び脱脂されたウイルスにより、ＡＴ−２失活させたＳＩＶで初回刺激したマウスを追加免疫した(Rossio et al., J. Virol. 72: 7992, 1998; Arthur et al., AIDS Res. Human Retroviruses 14: Suppl. 3. S311, 1998)。２週間後に、免疫化したマウス群（１群当たり６匹のマウス）を生ＳＩＶ、ＡＴ−２失活させたＳＩＶ又はＤＩＰＥで脱脂されたＳＩＶのいずれかの総ウイルスタンパク質１μｇで追加免疫した。Ｔ細胞応答をＳＩＶ  Ｇａｇ及びＳＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープ重複ペプチドプールを用いて評価して、応答細胞は、細胞内インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）フローサイトメトリー（ＩＣＣ）により検出した。ＤＩＰＥ脱脂されたウイルスブースターは、対照又はＡＴ−２群と比較して、より幅広いＣＤ４+及びＣＤ８+応答を誘発した（図８Ａ及び図８Ｂ）。特異的ＩＦＮ−γペプチドはまた、ペプチドプール格子から決定され、ペプチドプールを分析する場合に見られるパターンと類似のパターンを生じた。ＤＩＰＥ処置したＳＩＶはまた、他の群と比較して、新たなペプチドプール認識パターンを誘発した（表９）。データは、ｅｎｖペプチドプールに対するＣＤ４+応答に関して特に顕著であった。ＤＩＰＥ群は、生ＳＩＶで追加免疫した群と（ｐ＝０．００６）、及びＡＴ−２処置したＳＩＶで追加免疫した群と（ｐ＝０．０００１）と比較して、統計学的に有意な応答の増加を有した。同様の動向が、ＣＤ８+  ｅｎｖペプチドプール応答に関してＤＩＰＥ処置したＳＩＶで観察された（生群に対してｐ＝０．００１、及びＡＴ−２群に対してｐ＝０．０２）。ＣＤ４+  ｇａｇ応答も同様に、有意に増加された（ＡＴ−２群に対してｐ＝０．０３）。ＤＩＰＥ処置したＳＩＶで追加免疫した群はまた、他の２つの群よりも多くのＩＦＮ−γ陽性細胞を有した。抗原投与量試験により、驚くべきほど低用量であるＤＩＰＥで脱脂されたウイルス１μｇ（これは、ＳＩＶ  ｐ２７およそ２００ｎｇに相当する）が、ｇａｇ及びｅｎｖの両方に対して幅広いＣＤ４+及びＣＤ８+免疫応答を誘発するのに十分であることが示された。ｅｎｖ及びｇａｇペプチドプールに対する幅広いＣＤ４+及びＣＤ８+応答が、ＡＴ−２処置したウイルス又は生ウイルス追加免疫と比較した場合に、脱脂されたウイルスで追加免疫したマウスで観察された（ｐ＞０．００１）。
【０２１５】
主にＣＤ４+Ｔ細胞応答は、アジュバント無しでＩＶ投与された脱脂されたウイルスの
０．０５μｇ程度と低い抗原用量で観察されたのに対して、ＡＴ−２又は生ＳＩＶタンパク質にはより高い用量が必要であった。予備抗体応答は、脱脂されたウイルスが、同様に抗体応答を刺激していることを示す。これらの見解は、非常に低い追加免疫濃度の本発明の方法で脱脂されたウイルスにより誘発される幅広い一連のＳＩＶ抗原に対するＣＤ４+及びＣＤ８+細胞性応答を示す。
【０２１６】
以下の数段落では、応答は操作上、インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ４+細胞の割合に関して、ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対するＣＤ４細胞性応答として定義される。応答を誘発するペプチドプール、及び幾つかの範囲の応答（インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ４+細胞の割合）が示される。
【０２１７】
ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対するＣＤ４細胞性応答は、生ウイルス５μｇで処置したマウスにおいて顕著ではなかった。様々な量の１％ＤＩＰＥで脱脂されたウイルスの投与後に、ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対するＣＤ４細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、応答は、３個のｅｎｖペプチドプール５（０．１３〜０．２２％）、６（−０．３〜０．１３％）及び１３（０．１３〜０．２２％）から誘発された。用量１．０μｇでは、幅広い応答が、数個を上回るｅｎｖペプチドプール（３、４、５（０．０６〜０．２３％）、８、１１、１２（０．１９〜０．４５％）、１３（０．１３〜０．３９％）、１４（０．１３〜０．３４％）、１５（−０．０３〜０．２４％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、応答は、ｅｎｖペプチドプール５（０．１７〜０．２３％）で観察された。
【０２１８】
様々な量のＡＴ−２処置したウイルスで追加免疫するためのＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対するＣＤ４細胞性応答は、制限された応答を示した。用量０．０５μｇでは、応答は、１個のｅｎｖペプチドプール（１０（０．１７〜０．２５％））から誘発された。用量１．０μｇでは、応答は、約１個のｅｎｖペプチドプール（１０（０．０８〜０．２２％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、ＣＤ４細胞性応答は、顕著でなかった。
【０２１９】
様々な量の生ＳＩＶウイルスで追加免疫するためのＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対するＣＤ４細胞性応答は、用量０．０５μｇで、プール１（−０．０５〜０．２３％）、８（０．１３〜０．２１％）、１２（０．１１〜０．２１％）及び１４（−０．０３〜０．２５％）から応答を示した。用量１．０μｇでは、応答は、３個のｅｎｖペプチドプール（８（０．２２〜０．３６％）、１２（０．１２〜０．５８％）及び１３（−０．０９〜０．３３％）））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、ＣＤ４細胞性応答は、顕著でなかった。
【０２２０】
以下の数段落では、応答は操作上、インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ８+細胞の割合に関して、ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対するＣＤ８+細胞性応答として定義される。応答を誘発するペプチドプール、及び幾つかの範囲の応答（インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ８+細胞の割合）が示される。
【０２２１】
様々な量の１％ＤＩＰＥで脱脂されたウイルスの投与後に、ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対するＣＤ８細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、応答は、２個のｅｎｖペプチドプール５（０．２２〜１．２２％）及び１３（０．４３〜０．９２％）から誘発された。用量１．０μｇでは、幅広い応答が、数個のｅｎｖペプチドプール（２（０．１８〜０．３４％）、３（−０．０６〜０．３５％）、４（−０．０３〜０．１５％）、５（０．０６〜０．２５％）、９（０．２４〜０．４１％）、１０（０．３４〜０．８７％）、１１（０．２２〜０．７１％）、１２（０．１９％〜０．５３％）、１３（０．１１〜０．３５％）、１４（０．１９〜０．３２％）、１５（０．９８〜１．３５％）及び１６（０．１１〜０．３１％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、応答は、ｅｎ
ｖペプチドプール１３（０．２７〜０．４１％）、１４（０．２８〜０．４８％）及び１５（０．３１〜０．３５％）で観察された。
【０２２２】
様々な量のＡＴ−２処置したウイルスの投与後に、ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対する制限されたＣＤ８細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、ＣＤ８細胞性応答は、ｅｎｖペプチドプール１６（０．０８〜０．４５％）から誘発された。用量１．０μｇでは、応答は、ｅｎｖペプチドプール７（０．１８〜０．３３％）及び１６（０．２９〜０．８８％）から誘発された。より高い用量の５μｇでは、ＣＤ８細胞性応答は、顕著でなかった。
【０２２３】
様々な量の生ＳＩＶの投与後に、ＳＩＶ  ｅｎｖペプチドに対する制限されたＣＤ８細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、ＣＤ８細胞性応答は、ペプチドプール１（−０．０５〜０．２３％）、８（０．１３〜０．２％）、１２（０．１１〜０．２１％）及び１４（−０．０３〜０．２５％）から誘発された。用量１．０μｇでは、応答は、ペプチドプール８（０．２２〜０．３６％）、１２（０．１２〜０．５８％）及び１３（−０．０２〜０．３３％）から誘発された。より高い用量の５μｇでは、ＣＤ８細胞性応答は、顕著でなかった。
【０２２４】
以下の数段落では、応答は操作上、インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ４+細胞の割合に関して、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対するＣＤ４細胞性応答として定義される。応答を誘発するペプチドプール、及び幾つかの範囲の応答（インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ４+細胞の割合）が示される。
【０２２５】
様々な量の１％ＤＩＰＥで脱脂されたウイルスの投与後に、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対するＣＤ４細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、応答は、ｇａｇペプチドプール５（０．２２〜１．２２％）及び１３（０．４３〜０．９２％）から誘発された。用量１．０μｇでは、幅広い応答が、約５個のｇａｇペプチドプール（３（０．１９〜０．７２％）、５（０．１５〜０．７１％）、７（０．１２〜０．７７％）、１０（０．１９〜０．９２％）及び１５（０．４２〜１．３５％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、応答は、約４個のｇａｇペプチドプール３（０．１２〜０．４９％）、５（−０．０４％〜０．４８％）、１０（０．１１〜０．５２％）、１４（−０．０３〜０．５２％）及び１５（０．１８〜０．５６％）に対して減少した。
【０２２６】
様々な量のＡＴ−２処置したウイルスの投与後に、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対する制限されたＣＤ４細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、ＣＤ４細胞性応答は、３個のｇａｇペプチドプール（１０（０．１９〜０．５９％）、１１（０．１１〜０．３９％）及び１３（−０．０３〜０．３１％））から誘発された。用量１．０μｇでは、制限された応答が、ｇａｇペプチドプール７（−０．０５〜０．２７％）から誘発された。より高い用量の５μｇでは、ＣＤ４細胞性応答は、顕著でなかった。
【０２２７】
様々な量の生ＳＩＶの投与後に、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対するＣＤ４細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、ＣＤ４細胞性応答は、約２個のｇａｇペプチドプール（２（０．５９〜１．２３％）及び９（０．３４〜１．１％））から誘発された。用量１．０μｇでは、応答は、約４個のｇａｇペプチドプール（２（０．３９〜１．１２％）、３（０．１１〜０．５１％）、６（０．２１〜０．７２％）及び９（０．１５〜０．５１％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、応答は、約２個のｇａｇペプチドプール（２（０．１６〜０．５１％）及び６（−０．０５〜０．２３％））から誘発された。
【０２２８】
以下の数段落では、応答は操作上、インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ８
+細胞の割合に関して、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対するＣＤ８細胞性応答として定義される。応答を誘発するペプチドプール、及び応答の幾つかの範囲（インターフェロンガンマに対して陽性であるＣＤ８+細胞の割合）が示される。
【０２２９】
様々な量の１％ＤＩＰＥで脱脂されたウイルスの投与後に、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対するＣＤ８細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、応答は、約５個のｇａｇペプチドプール（２（０．１９〜０．９２％）、３（０．１９〜０．９４％）、４（０．１８〜０．９５％）、６（０．２８〜０．４９％）及び１３（０．２９〜０．８８％））から誘発された。用量１．０μｇでは、応答は、約６個のｇａｇペプチドプール（２（０．０１〜１．０１％）、３（０．０３〜０．４９％）、６（０．０１〜０．９９％）、７（０．０２〜０．３７％）、１０（０．０１〜０．９２％）及び１５（０．０５〜０．６５％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、応答は、約７個のｇａｇペプチドプール（２（０．１１〜０．３７％）、３（０．１６〜０．５４％）、４（０．１８〜０．９１％）、５（０．１８〜０．７１％）、１０（０．１３〜０．２３）、１４（０．１３〜０．８１％）及び１５（０．２〜０．５６％）から誘発された。
【０２３０】
様々な量のＡＴ−２処置したウイルスの投与後に、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対するＣＤ８細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、ＣＤ８細胞性応答は、５個のｇａｇペプチドプール（１０（０．２８〜０．７１％）、１１（０．３〜０．９１％）、１２（０．２３〜０．７６％）、１３（０．１５〜０．６１％）及び１４（０．１９〜０．７２％））から誘発された。用量１．０μｇでは、応答は、約３個のｇａｇペプチドプール（１０（０．０１〜０．７３％）、１１（−０．０２〜１．１％）及び１２（−０．０５〜０．７２％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、応答は、約１個のｇａｇペプチドプール（１０（０．０７〜０．２７％）から誘発された。
【０２３１】
様々な量の生ＳＩＶの投与後に、ＳＩＶ  ｇａｇペプチドに対するＣＤ８細胞性応答が観察された。用量０．０５μｇでは、ＣＤ８細胞性応答は、約３個のｇａｇペプチドプール（２（０．２８〜０．９２％）、９（０．３２〜０．８２％）及び１５（０．２１〜０．４３％））から誘発された。用量１．０μｇでは、応答は、約５個のｇａｇペプチドプール（２（０．０１〜０．９１％）、３（０．０３〜０．６７％）、６（０．０１〜０．７１％）、９（−０．２５〜０．８％）及び１２（−０．０５〜０．３９％））から誘発された。より高い用量の５μｇでは、応答は、約３個のｇａｇペプチドプール（２（０．１９〜０．７１％）、９（０．１９〜０．５３％）及び１２（０．０４〜０．８７％））から誘発された。
【０２３２】
総括すると、これらのデータにより、ＡＴ−２処置したＳＩＶウイルスで免疫化したマウスは、ＡＴ−２処置したウイルス又は生ＳＩＶウイルスによる追加免疫と比較した場合に、脱脂されたＳＩＶウイルスによる追加免疫に対して、増強された免疫応答を示すことが実証される。脱脂されたＳＩＶウイルスは、増強されたＩＦＮ−γ染色とともに、ＣＤ４+及びＣＤ８+の割合に関して、ＡＴ−２処置したウイルスよりも高い免疫原性であった。
【０２３３】
本発明者等のデータにより、脱脂されたウイルスが、アジュバントを使用せずに、強力なＴ−細胞媒介性免疫応答を誘発したことが示される。全体的な細胞媒介性免疫応答の幅及び強度の増加が、生及びＡＴ−２処置群と比較して、ＤＩＰＥで追加免疫したマウス群において観察された。表９及び表１０は、これらの結果の概要を示す。
【０２３４】
【表９】
2007524383.tif 000014
【０２３５】
【表１０】
2007524383.tif 000015
【０２３６】
抗体力価は、ＤＩＰＥ処置したＳＩＶで追加免疫した群において増強される
全ビリオンに対する抗体（Ａｂ）力価を各群に関して決定した。ＳＩＶ  ｇｐ１２０に対する抗体力価は、ＤＩＰＥで追加免疫した群と比較して、ＡＴ−２で追加免疫した群では有意に低かった（ｐ＝０．０２）（図９）。概して、ＤＩＰＥで追加免疫したマウスは、生又はＡＴ−２のいずれかで追加免疫した群と比較した場合、ＳＩＶ  ｇｐ１２０及び
ＳＩＶ  Ｇａｇの両方に関して、より高いＡｂ読取りを与えた（図１０）。Ａｂ力価が４週目に、その後の実験で測定された場合、追加免疫が群すべてに関して観察された（データは示さず）。ＥＬＩＳＡ（吸光度４５０ｎｍで）により測定されるｇａｇ（ｐ５５）抗体力価は、生又はＡＴ−２処置したＳＩＶのいずれかで追加免疫した群よりも、脱脂されたＳＩＶｍａｃ２５１で追加免疫したマウスからの血清でより高かった。ウェスタンブロット分析は、より広範囲のｐ２７バンドが、生又はＡＴ−２処置したマウス血清と比較して、脱脂されたＳＩＶで追加免疫した血清により観察されたことから、抗体ＥＬＩＳＡデータを支持した。これは、脱脂されたＳＩＶで追加免疫されたマウスからのｇａｇ抗体によるより幅広いｐ２７エピトープ認識を示す。ｇａｇ及びｅｎｖの両方に対する抗体応答の成熟は、初回刺激後２週間目の追加免疫と比較して、初回刺激の４週間後にマウスを追加免疫した場合に観察された。投与経路（皮下（ｓｃ）又は静脈内（ｉｖ））は、抗体（ＥＬＩＳＡ）力価に影響を及ぼさなかった。生又はＡＴ−２処置したウイルスの追加免疫と比較して、脱脂されたウイルスで追加免疫したマウスにおいて、ＣＤ４+Ｔ−細胞とＳＩＶｍａｃ２５１ｇａｇ及びｅｎｖタンパク質の両方に対する抗体応答との間で、より強力な相関が見られる。
【０２３７】
ＣＤ４応答と抗体応答との間の強力な相関
本発明者等は、ｇａｇ及びｅｎｖプールに対するＣＤ４+応答を、組換えｇａｇ及びｅｎｖに対する抗体応答と比較することにより、免疫化の影響を決定した。細胞性応答（ＣＤ４）と体液性応答（抗体応答）との間に強力な相関が観察され（図１１）、増強された細胞媒介性免疫応答のさらなる有益性を示した。
【０２３８】
ＤＩＰＥ処置は、アジュバントの非存在下で、強烈な細胞媒介性免疫応答及び良好な体液性応答を創出した。意味深いことに、有効な追加免疫は、ＳＩＶ  ｐ２７約２００ｎｇに相当する、１ｍｇ程度と少ないＤＩＰＥ処置したＳＩＶの総ウイルスタンパク質により達成された。
【０２３９】
１μｇ程度と少ない総ウイルスタンパク質によりウイルスペプチド特異的免疫応答を誘発する本発明の能力は、驚くべきことであり、且つ予期せぬことであった。アジュバントの同時投与無しで単回ＩＶ追加免疫により達成されるこのレベルの免疫応答は、脱脂されたウイルスの生化学的性質が、生又はＡＴ−２処置したＳＩＶにより誘発されるものと異なるより多数のウイルスペプチドの効率的なプロセッシング及び提示、又は認識を誘導するのに十分変更されていることを示唆する。
【０２４０】
最後に、本発明者等は、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、生ＳＩＶ、ＡＴ−２処置したＳＩＶ及び脱脂されたＳＩＶ（ＤＩＰＥ）の免疫原性を比較して、ＤＩＰＥで処置したウイルスで追加免疫した群からの細胞媒介性免疫応答の有意な増強を観察した。驚くべきことに、有効的な追加免疫は、非常に低用量である総ウイルスタンパク質１μｇ（これは、ＳＩＶ  ｐ２７約２００ｎｇに相当する）で達成された。これらの結果は、アジュバントを使用せずに、追加免疫用量で得られ、免疫原性において実質的な増加を示した。本発明者等の結果は、ウイルスを脱脂することにより、その感染力を有意に減少させながら、ウイルスの抗原性を増強したことを示す。本発明者等の結果は、ＨＩＶのコレステロール欠乏は、β−ＣＤ処置したウイルスがウイルスＲＮＡ及びウイルスタンパク質の劇的な損失をもたらし、したがって感染力の損失に寄与したため、ウイルスの感染力を劇的に減少させるという従来の見解(Nguyan et al., J. Immunol. 168: 4121, 2002; Graham et al., J.
Virol. 77: 8237; Liao et al., AIDS Res. Human Retroviruses 19:675, 2003)と異なる。脱脂されたウイルスは、ウイルスＲＮＡ及びウイルスタンパク質の無視し得る損失を有する。
【０２４１】
以下の記述により拘束されることを望まないが、脱脂過程は、抗原提示細胞により、よ
り良好にプロセッシング又は提示されるウイルス粒子を創出する可能性があり、観察される幅広いペプチドプール応答につながると考えられる。さらに、ウイルスの脱脂は、ＭＨＣ  ＩＩ分子のようなより多くの細胞抗原（感染ＣＥＭｘ１７４細胞から発芽されると、ウイルスにより採取される）を露出することができ、これは、細胞応答を増強する際にアジュバントとして作用することができる。血清Ａｂ力価及びＡｂ血清プロファイルのウェスタンブロット分析は、ＤＩＰＥ処置したＳＩＶで追加免疫した群において、増強された抗Ｅｎｖ抗体、及びＳＩＶ  ｇａｇ特異的抗体応答の一貫した広がりを示し、おそらく抗ｐ２７Ａｂ力価の増加、又はウイルスタンパク質に対するＡｂアビディティの増加を示した。これらの結果は、ＳＩＶのＤＩＰＥ脱脂が、マウスにおいてウイルスの免疫原性に影響を及ぼすことを実証する。この新規脱脂方法は、ＨＩＶ療法用ワクチン設計及び開発に寄与すると考えられる。
【実施例８】
【０２４２】
様々な脱脂手順で処置したＨＩＶウイルスにおける総タンパク質及びｐ−２４タンパク質回収
本出願人等は、総タンパク質回収及びｐ２４タンパク質回収の度合いにより測定されるように、上述の脱脂過程が無傷のウイルス粒子を生産することが可能であることを見出した。
【０２４３】
ＨＩＶウイルスを含有する試料を、転倒型回転を用いて、室温で２０分間、速度７０％で、溶媒と混合した。次に、試料を１，０００×ｇで２分間遠心分離した後、炭カラムに通した。総タンパク質をＢｉｏＲａｄアッセイにより測定した。ウイルスｐ２４は、ｐ２４サンドイッチＥＬＩＳＡ(Coulter)により測定した。
【０２４４】
１％ＤＩＰＥ、１％ブタノール／ＤＩＰＥ、１％ブタノール、２％ブタノール及び５％ブタノールを用いた脱脂過程に関する総タンパク質回収は、対照の１０％以内であり、具体的には総インプットの６３〜７５％の範囲である。１％ＤＩＰＥ、１％ブタノール／ＤＩＰＥ、１％ブタノール、２％ブタノール及び５％ブタノールを用いた脱脂過程に関するｐ２４タンパク質回収は、対照の４０％以内であり、２％ブタノールは、およそ８３％の対照回収割合に対しておよそ７８％のｐ２４タンパク質回収割合をもたらす。
【実施例９】
【０２４５】
様々な脱脂手順で処置したＨＩＶ及びＳＩＶ粒子の浮遊密度及び免疫反応性（ｇｐ１２０及びｐ２４）
上述の脱脂過程は、ウイルス粒子の浮遊密度を変更させた。密度の変化は、ウイルス粒子からの脂質の除去がタンパク質対脂質の比、結果として粒子密度を変化させるため、首尾よい脱脂の有用な指標である。この実施例では、対照並びに溶媒処置したＨＩＶ及びＳＩＶ粒子の等密度を決定して、密度の変化を、対照及び処置したウイルスの測定脂質含有量と相関させた。
【０２４６】
溶媒処置は、ＨＩＶ及びＳＩＶ粒子の密度範囲を広げ、高溶媒濃度は、ウェスタンブロット分析及びタンパク質プロファイルに基づいて、ウイルスをより高い全体密度へとシフトさせ、これは、脂質の損失と一致する。具体的には、図１は、対照群と一緒に、１％ＤＩＰＥ、１％ブタノール／ＤＩＰＥ、１％ブタノール、２％ブタノール及び５％ブタノールを用いた脱脂に付したウイルス粒子の画分番号に対する密度のグラフ表示により示されるようなショ糖勾配画分の密度を表す。ＨＩＶを脱脂して、ショ糖精製した。ウイルスをショ糖勾配上へ充填して、平衡密度に達するまで遠心分離した。図２は、画分番号それぞれに関するｐ２４タンパク質の濃度を表す。予想通り、対照群に関するタンパク質濃度は、比較的高い濃度のｐ２４を示すが、対照よりも高い密度で記録される１％ブタノール／ＤＩＰＥとともに最も高かった。他の密度変更されたｐ２４濃度は、５％ブタノール、２
％ブタノール、１％ブタノール及び１％ＤＩＰＥに関して示された。密度変更は、ウイルス粒子を脱脂する際の成功度を示す。
【０２４７】
ＨＩＶ−１ウイルスをショ糖勾配上に流して、様々な画分を回収した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上へ流して、膜へ転写して、ＨＩＶ−１感染個体からの陽性対照血清を用いてブロットした。
【０２４８】
ウェスタンブロット分析は、各脱脂過程から得られる様々な密度画分に対するエンベロープタンパク質ｇｐ１２０及びカプシドタンパク質ｐ２４に対する抗体、及びＨＩＶ−１ウイルス粒子に対する対照を用いて行った。対照試料のウェスタンブロット分析は、予想した密度画分で、ｐ２４タンパク質及びｇｐ１２０タンパク質の強力なバンドを現した。大部分の無傷ビリオンは、画分５〜７で溶出した。様々な脱脂過程は、ｐ２４及びｇｐ１２０免疫反応性画分の位置の変化をもたらし、処置されたウイルス粒子の密度の変更を示した。１％ＤＩＰＥによるＨＩＶ−１の処置は、より高密度画分への免疫反応性バンドのシフトをもたらした。１％ＤＩＰＥ／ブタノールによる、及び独立して１％ブタノールによるＨＩＶ−１の処置もまた、より高密度画分への免疫反応性バンドのシフトをもたらした。２％ブタノールによるＨＩＶ−１の処置は、ｐ２４タンパク質及びｇｐ１２０タンパク質の減少を含む多くのタンパク質の損失、並びにウイルス粒子の密度の増加を生じた。５％ブタノールによるＨＩＶ−１の処置は、ｐ２４タンパク質及びｇｐ１２０タンパク質免疫反応性のほぼ完全な損失、並びにウイルス粒子の密度の顕著な増加を生じた。
【０２４９】
図３では、画分番号に対する総回収ｐ２４タンパク質の割合のグラフ表示により示される、脱脂されたＨＩＶの等密度勾配分析が示される。脱脂過程に付した試料に関する総回収ｐ２４タンパク質の相当量は、より高密度で見出される。１％ＤＩＰＥ、１％ブタノール／ＤＩＰＥ、１％ブタノール、２％ブタノール及び５％ブタノールで脱脂した試料それぞれに関して、より多くの量のｐ２４タンパク質が、対照群と比較した場合、より高い画分番号（より高い密度）で回収された。この密度シフトは、図４でさらに示しており、ここでは、画分番号に対するｇａｇ  ｐ２７濃度のグラフにより示される、ＳＩＶ−ｍａｃ２５１の等密度が表される。対照に対して、１％ＤＩＰＥ及び１％ブタノールの両方に関する脱脂試料が、密度のシフトを示した。
【実施例１０】
【０２５０】
脱脂手順を受けたＨＩＶ及びＳＩＶウイルス粒子のコレステロール含有量の減少
本出願人等は、上述の脱脂過程が、ウイルス粒子においてコレステロールの度合いを変更させることを見出した。コレステロールの変化は、ウイルス粒子からの脂質の除去が、コレステロールの量及びコレステロール対タンパク質の比を変化させるため、首尾よい脱脂の有用な指標である。ＨＩＶ及びＳＩＶ粒子を有機溶媒に曝露させることにより、タンパク質を保存しながら脂質が除去され、それにより、粒子の免疫原性を維持又は増強しながら、ウイルスの感染力の損失をもたらす。
【０２５１】
表１１では、対照と一緒に、１％ＤＩＰＥ、１％ブタノール、１％ブタノール／ＤＩＰＥ、２％ブタノール及び５％ブタノールにより脱脂されたウイルス粒子のコレステロール対総タンパク質の比が示される。ＨＩＶを脱脂して、２０％ショ糖で精製した。コレステロールは、Molecular Probes, Inc.のような製造供給元からの市販のバイオアッセイであるＡｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイで測定し、総タンパク質を測定した。データは、脱脂された試料それぞれに関して、総タンパク質対して減少されたコレステロール含有量を示す。
【０２５２】
【表１１】
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【０２５３】
ＳＩＶを脱脂して、２０％ショ糖で精製した。コレステロールは、Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄアッセイで測定し、Ｇａｇ  ｐ２７タンパク質を測定した。データは、コレステロール対Ｇａｇ  ｐ２７タンパク質の比として表す。ＤＩＰＥ処置したウイルスは、対照よりも８０％少ないコレステロールを有し、有効な脱脂を示した。同様に、対照に対して、１％ＤＩＰＥ試料は、減少したコレステロール対タンパク質の比を有した。１％ＤＩＰＥ処置は、ｐ２７回収により測定されるウイルスの構造的完全性を維持しながら、８０％コレステロールを効果的に除去した。５％ＤＩＰＥ：ｎ−ブタノール処置は、ウイルスタンパク質、総タンパク質及びコレステロールの劇的な損失を招いた。この方法は、厳しすぎた。１％ブタノール処置は、測定されるコレステロールの量が依然として変わっていなかったため、ウイルスを脱脂するのには効果的ではなかった。総コレステロールの回収は、１％ブタノール及び１％ＤＩＰＥに関しては、それぞれ約３７％及び７８％であり、ｐ２７タンパク質の相当する回収は、それぞれ約９０％及び１５％であり、かかるウイルス粒子の相当部分が依然として無傷のままでのウイルス粒子の首尾よい脱脂をさらに示す。図５及び図６を参照して、画分したＳＩＶ−ｍａｃ２５１のＦＰＬＣプロファイルを、Ｇａｇ  ｐ２７及びコレステロールに関して示す。１％ＤＩＰＥ脱脂に関して、ｇａｇ  ｐ２７の濃度は、より高濃度の画分番号で対照と実質的に異なるのに対して、コレステロールの濃度は、ほぼすべての画分に関して、対照より実質的に低いことが、グラフにより実証される。
【実施例１１】
【０２５４】
脱脂されたＨＩＶで追加免疫したサルは、生ＨＩＶで追加免疫した群と比較して、より高いＡｂ力価を有する
４匹のサルを不完全フロイントアジュバント中のｐ２４  ＨＩＶ−ＩＩＩＢ  ５μｇの等価物で初回刺激した。続いて、サルを２匹のサルを有する２つの群に分けた。群１（ＲＩｌ＆ＲＦｏ）には、ＤＩＰＥで脱脂されたＨＩＶ−ＩＩＩＢ  １μｇを毎月施し、群２（ＲＦｔ＆Ｒｏｍ）には、生ＨＩＶ−ＩＩＩＢ  １μｇを毎月施した。細胞パラメータを、免疫細胞化学により測定した。追加免疫の７日後に、染色を行った一方で、Ａｂ力価及び中和Ａｂは、追加免疫の４週間後に測った。全ＨＩＶ−ＩＩＩＢ溶解物に対するＡｂ力価を測定した。群１の動物（これらには、脱脂されたウイルスを施した）は、群２の２匹の対照サルよりも高いＡｂ力価を有した。脱脂されたウイルスの追加免疫は、完全ビリオンに対するＡｂ力価を増強した（データは示さず）。
【０２５５】
ペプチドプールすべてに対するプールされたＣＤ４  Ｔ細胞応答を表１２に表示する。概して、動物は、ＧＡＧペプチドプールに対してよりもＥＮＶペプチドプールに対してよ
り良好な応答を示した。群１の動物（ＲＩｌ及びＲＦｏ）はともに、Ｇａｇ（１．５％より大きい）及びＥｎｖ（１．５％より大きい）に対して累積応答を有した。対照群２中のたった１匹の動物（ＲＦｔ）が、Ｇａｇ（０．５％より大きい）及びＥｎｖ（１．５％より大きい）に対して、感知可能な応答を有した。他方の対照動物であるＲｏｍは、ペプチドプールに対して非常に低い応答を有した。
【０２５６】
概して、脱脂されたウイルスを施したサルは、より良好な細胞媒介性免疫応答（ＩＣＣにより測定）を示した。Ａｂデータは、ＣＤ４＋ＩＣＣデータと十分相関する。ＩＣＣ応答を示す動物はまた、良好なＡｂ力価を有する。ウェスタンブロットデータもまた、Ａｂデータ及びＩＣＣの結果の両方と十分相関する。
【実施例１２】
【０２５７】
脱脂されたＳＩＶに曝露させた樹状細胞は、生ウイルスに曝露させた樹状細胞と比較して、増強されたＣＤ４+増殖を刺激する
長期非進行型(non-progressor)サルからのＰＢＭＣを使用した。ＰＢＭＣは、フィコール分離を用いて単離し、単球は、ＲＰＭＩ−１０％ＦＣＳ中で３×１０7個のＰＢＭＣのプラスチック接着性を利用して、３７℃で２時間培養した。非接着細胞を除去して、フラスコを温１×ＰＢＳで穏やかに洗浄した。単球を１，０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４及び１，０００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦとともに、ＲＰＭＩ−１５％ＦＣＳ中で４日間インキュベートした。この手順により、未熟樹状細胞（ＤＣ）が作成された。
【０２５８】
未熟ＤＣ（２×１０3個）を、ＡＴ−２処置したＳＩＶ、脱脂されたＳＩＶ（転倒型混合を用いて２０分間の１％ＤＩＰＥ）又は生ＳＩＶ  ５０ｎｇで、３７℃にて３時間、パルス処置した。細胞を広範囲にわたって洗浄して、過剰のウイルスを排除して、残留ウイルスの量に関して、ＳＩＶ  ｐ２７により検査した。ＤＣ（２×１０3個）を、１００Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−ａ、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦを有するＲ−１５中で３日間、再懸濁させて、ＤＣ成熟を誘導した。次に、２×１０6個の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）をＤＣ培養物に２４〜３６時間添加した後、ｃｙＱＵＡＮＴ細胞増殖アッセイキット(Molecular Probes)を用いて増殖アッセイを行った［注記：ＣＤ８+細胞は、使用前にＰＢＬから枯渇させた］。増殖アッセイは、製造業者のプロトコル（ｃｙＱＵＡＮＴ−Molecular Probes）に従って実施した。簡潔に述べると、細胞をペレット化して、上清を除去した。続いて、ペレットを約１時間凍結させて、４×ＣｙＱＵＡＮＴ色素濃縮物をペレットに添加した。溶解させた細胞の上清を約１０分間静置させた後、励起に関しては波長４８０、及び放出に関して波長５２０で、蛍光プレートを読取った。
【０２５９】
増殖割合は以下のように算出した：[（試験増殖−対照増殖）／（対照増殖）]×１００。対照増殖は、バックグラウンドノイズを提供するために、抗原無しのＰＢＭＣ＋ＤＣの増殖である。
【０２６０】
樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ２０  Ｂ−細胞に対する強烈な抗原提示細胞である。脱脂されたＳＩＶでパルス処置した樹状細胞（ＤＣ）は、生ウイルスでパルス処置したＤＣと比較して、ＣＤ４+細胞において、１６％より良好な増殖性応答を誘発した（脱脂されたウイルスによる２０８６７２対生ウイルスによる１６５６１６）ことが、結果により実証される。このことは、ＤＣによる脱脂されたウイルスのより良好なプロセッシング／提示を強く支持する。
【０２６１】
ＣＤ４増殖は、所定のエピトープに対するＣＤ４応答の機能的指標である。ＨＩＶ感染した人々において、彼等のＣＤ４細胞は、抗原に応答してＩＦＮ−γを生産するが増殖しないため、ＣＤ４増殖は、ＩＦＮ−γ分泌よりも特異的な読取りである。
【０２６２】
本発明の方法で脱脂されたウイルスは、抗原特異的ＣＤ４+細胞の増殖を増加させることができ、ＣＤ８+細胞のより効率的な成熟及び血漿細胞（抗原特異的Ａｂを生産するＢ細胞）の成熟につながる。ウイルス感染の制御は、ＣＤ４+細胞増殖に依存するため、本発明の方法は、有効的な機能的ワクチンを提供する。
【０２６３】
上記引用した特許、刊行物及びアブストラクトはすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。当然のことながら、上述の事項は、本発明の好ましい実施形態のみに関するものであり、添付の特許請求の範囲に記載するような本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、無数の修正又は変更が本発明においてなされ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２６４】
【図１】対照群と一緒に、１％ＤＩＰＥ、１％ブタノール／ＤＩＰＥ、１％ブタノール、２％ブタノール及び５％ブタノールを用いた脱脂に付したＨＩＶウイルス粒子の画分番号に対する密度のグラフ表示により示されるようなショ糖勾配画分の密度を表す図である。
【図２】図１に示されるそれぞれの画分番号に関するｐ２４タンパク質濃度（ｎｇ／ｍｌ）を表す図である。
【図３】図２と同様であり、対照群と一緒に、画分番号に対する総回収ｐ２４タンパク質の割合としてのｐ２４レベルとしてグラフ表示により示される、１％ＤＩＰＥ、１％ブタノール／ＤＩＰＥ、１％ブタノール、２％ブタノール及び５％ブタノールを用いた脱脂に付した脱脂されたＨＩＶの等密度勾配分析の概略図である。
【図４】１％ＤＩＰＥ、５％ＤＩＰＥ：ｎ−ブタノール（７５：２５）及び１％ｎ−ブタノールの脱脂条件の後の画分番号に対するｇａｇ  ｐ２７濃度（ｎｇ／ｍｌ）のグラフ図により示される、脱脂されたＳＩＶ−ｍａｃ２５１の等密度勾配分析の概略図である。
【図５】各画分番号のｐ２７  ｇａｇレベル（μｇ／ｍｌ）を示す、対照及び１％ＤＩＰＥ処理したＳＩＶ  ｍａｃ５２１の高速液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）の概略図である。
【図６】図５に示される画分のコレステロールレベル（ｎｇ／ｍｌ）を示す図である。
【図７】生ウイルスでの１％ＤＩＰＥ処理後、及びＡＴ−２処理後のＳＩＶ  ｍａｃ５２１感染力（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）対ウイルスＲＮＡコピー数（コピー／ｍｇ）の概略図である。
【図８】ＡとＢは、生ウイルス、ＡＴ−２不活化ウイルス又は脱脂したウイルス（１％ＤＩＰＥ）で追加免疫したＡＴ−２不活化ＳＩＶ初回刺激マウスからの１００万個のＰＭＢＣ中の、ＳＩＶ  ｅｎｖ（８Ａ）ペプチドプールおよびＳＩＶ  ｇａｇペプチドプール（８Ｂ）に対するＣＤ４+及びＣＤ８+Ｔ細胞応答（％インターフェロンガンマ陽性細胞）を示す図である。６匹のマウスの平均（＋ＳＥＭ又は−ＳＥＭ）が示される。＊＊＝ｐ値＜０．０１、＊＝ｐ値＜０．０５。
【図９】ＡＴ−２処置ウイルス（ＳＩＶ  ｍａｃ  ２５１）で免疫化し、生ウイルス（ＳＥＶ  ｍａｃ  ２５１）、ＡＴ−２不活化ウイルス又は脱脂したウイルス（１％ＤＩＰＥ）の総ウイルスタンパク質１μｇで追加免疫したマウスの、ＳＩＶ  ｅｎｖ  ｇｐ１２０抗体力価（４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．）の概略図である。マウス血漿の連続希釈液は、組み換えＳＩＶ  ｍａｃ２５１  ｇｐ１２０  ｅｎｖタンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート中で測定した。
【図１０】ＡＴ−２処置ウイルスで免疫化し、生ウイルス（ＳＥＶ  ｍａｃ  ２５１）、ＡＴ−２不活化ウイルス又は脱脂したウイルス（１％ＤＩＰＥ）の総ウイルスタンパク質１μｇで追加免疫したマウスの、ＳＩＶ  ｇａｇ  ｐ５５抗体力価（４５０ｎｍでのＯ．Ｄ．）の概略図である。マウス血漿の連続希釈液は、組み換えＳＩＶ  ｍａｃ２５１  ｐ５５  ｇａｇタンパク質でコーティングしたＥＬＩＳＡプレート中で測定した。
【図１１】ＳＩＶ  ｍａｃ２５１  Ｇａｇ及びＥｎｖペプチドプールに対するＣＤ４+応答（％ＩＦＮガンマ細胞）と、組換えＧａｇ及びＥｎｖに対する抗体応答（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ）との相関曲線の概略図である。ＳＩＶ  ｍａｃ２５１  ｇａｇに対する細胞性応答（ＣＤ４）と抗ｇａｇ抗体応答との間に強力な相関（Ｒ2＝０．９９９３）が観察された。ＳＩＶ  ｍａｃ２５１  ｅｎｖに対する細胞性応答（ＣＤ４+）と抗ｅｎｖ抗体応答との間に良好な相関（Ｒ2＝０．９５３）が観察された。
【図１２】不完全フロイントアジュバント中のｐ２４  ＨＩＶ−ＩＩＩＢ  ５μｇの等価物でそれぞれ初回刺激し、その後ＤＩＰＥで脱脂されたＨＩＶ−ＩＩＩＢ  １μｇを毎月（ＲＩｌ＆ＲＦｏ）、又は生ＨＩＶ−ＩＩＩＢ  １μｇを毎月（ＲＦｔ＆Ｒｏｍ）追加免疫した、４匹のサルのｇａｇ又はｅｎｖペプチドプールに応じる、ＩＦＮガンマに対する細胞免疫反応性ＣＤ４+の割合を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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