(57)【要約】  サンプルの蛍光減衰特性を迅速かつ鋭敏に定量分析する装置及び方法が提供される。反復パルス化励起光源が、サンプルにおいてパルス化蛍光を生成する。蛍光波長選択装置が、サンプルから生じるパルス化蛍光の一部を受け取り、波長が指定波長範囲内にある蛍光光子を出力する。光検出器が、蛍光波長選択装置から入力として指定波長範囲内に蛍光光子を受け取り、時間依存電気信号を出力する。メモリ要素のアレイが、アナログ電圧又は電荷の時系列として時間依存電気信号の表示を記憶する。アレイの連続要素が、４ｎｓより大きくない時間増分に対応する。アナログ・デジタル変換器が、アナログ電圧又は電荷の時系列を対応するデジタル化蛍光波形に変換する。
2007501414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの蛍光減衰特性の迅速かつ鋭敏な定量分析を提供する装置であって、
出力が前記サンプルにおいてパルス化蛍光を生成する、励起光パルスを生成する反復パルス化励起光源と、
前記サンプルから生じる前記パルス化蛍光の一部を入力として受け取り、波長が指定波長範囲内にある蛍光光子を出力する蛍光波長選択装置と、
前記蛍光波長選択装置から入力として前記指定波長範囲内の前記蛍光光子を受け取り、時間依存電気信号を出力する光検出器と、
アナログ電圧又は電荷の時系列として前記時間依存電気信号の表示を記憶し、アレイの連続要素が４ｎｓより大きくない時間増分に対応する、メモリ要素のアレイと、
アナログ電圧又は電荷の前記時系列を対応するデジタル化蛍光波形に変換するアナログ・デジタル変換器と、
を備える装置。
【請求項２】
前記励起光パルスの持続時間が１ｎｓ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記光源が、毎秒１００以上のパルスを放出するように適合される、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記光源が、パルス化レーザ、受動的にＱ切り替えされるパルス化レーザ、単一モードであるパルス化レーザの少なくとも１つである、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記蛍光波長選択装置が、線形可変フィルタを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記蛍光波長選択装置が、前記線形可変フィルタに結合され、前記指定波長範囲内において前記線形可変フィルタによって伝達される蛍光の波長を変化させるように、前記線形可変フィルタを移動させる作動装置を更に備える、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記蛍光波長選択装置が、１セットの離散フィルタを備え、前記セットの離散フィルタのそれぞれが、異なる波長において前記サンプルによって放出される蛍光光子を送達するように作用する、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記セットの離散フィルタが、前記指定波長範囲において前記サンプルによって放出される蛍光光子を選択するように、前記離散フィルタのそれぞれを個々に位置決めするホルダにおいて構成される、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記蛍光波長選択装置が、音響光学同調可能フィルタ、モノクロメータ、及びスペクトルグラフの１つを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１０】
前記蛍光波長選択装置が、スペクトログラフと、前記スペクトログラフの出口焦平面から前記光検出器に蛍光光子を伝達するようにそれぞれが結合された複数の光ファイバとを備え、各ファイバが、前記指定波長範囲の異なる波長を伝達し、前記ファイバが、前記光検出器において前記異なる波長の前記蛍光光子の到来を時間的に分離するように異なる長さを有する、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記光検出器が、光電子倍増管、マルチアノード光電子倍増管、マイクロチャネル・プレート光電子倍増管、フォトダイオード、及びアバランシェ・フォトダイオードの１つを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
光学要素が、前記サンプルから放出された光を前記蛍光波長選択装置に集中させるために使用される、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
前記光源が、様々な励起波長において前記励起光パルスを選択的に出力するために、入力パルス化レーザ及び励起波長変換器を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記光源が、様々な励起波長において前記励起光パルスを選択的に出力するために、入力パルス化レーザ、励起波長変換器、及び励起波長選択装置を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記サンプルと前記光検出器との間に配置される偏光子を更に備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記パルス化光源と前記サンプルとの間に配置される波長板を更に備える、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
サンプルの蛍光減衰特性の迅速かつ鋭敏な定量分析を提供する装置であって、
励起光パルスを生成し、出力が、前記サンプルにおいてパルス化蛍光を生成する反復パルス化励起光源と、
前記サンプルから生じる前記パルス化蛍光の一部を入力として受け取り、波長が指定範囲内にある蛍光光子を出力する蛍光波長選択装置と、
前記蛍光波長選択装置から入力として前記指定波長範囲内にある前記蛍光光子を受け取り、時間依存電気信号を出力する光検出器と、
アナログ電圧又は電荷の時系列として前記時間依存電気信号の表示を記憶し、アレイの連続要素が４ｎｓより大きくない時間増分に対応する、メモリ要素のアレイと、
アナログ電圧又は電荷の前記時系列を対応するデジタル化蛍光波形に変換するアナログ・デジタル変換器と、
前記アナログ・デジタル変換器からデジタル化蛍光波形を受け取り、少なくとも２つの放出波長又は少なくとも２つの励起波長、或いは前記励起パルスの偏光に対する少なくとも２つの蛍光偏光子配向についての蛍光減衰曲線を含む２次元パラメータ時間行列を出力する記録装置と、
前記記録装置から前記波長時間行列を受け取り、前記２次元パラメータ時間行列内に含まれるデータに対する少なくとも１つの蛍光成分の寄与の数値を出力する分析装置と、
を備える装置。
【請求項１８】
前記励起光パルスの持続時間が、１ｎｓ未満である、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記光源が、毎秒１００以上のパルスを放出するように適合される、請求項１７に記載の装置。
【請求項２０】
前記光源が、パルス化レーザ、受動的にＱ切り替えされるパルス化レーザ、単一モードであるパルス化レーザの少なくとも１つである、請求項１７に記載の装置。
【請求項２１】
前記蛍光波長選択装置が、線形可変フィルタを備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２２】
前記蛍光波長選択装置が、前記線形可変フィルタに結合され、かつ前記指定波長範囲内において前記線形可変フィルタによって送達される蛍光の波長を変化させるように、前記線形可変フィルタを移動させるアクチュエータを更に備える、請求項１８に記載の装置。
【請求項２３】
前記蛍光波長選択装置が、１セットの離散フィルタを備え、前記セットの前記離散フィルタのそれぞれが、異なる波長において前記サンプルによって放出される蛍光光子を送達するように作用する、請求項１７に記載の装置。
【請求項２４】
前記離散フィルタの前記セットが、前記指定波長範囲において前記サンプルによって放出される蛍光光子を選択するように、前記離散フィルタのそれぞれを個々に位置決めするホルダにおいて構成される、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
前記蛍光波長選択装置が、音響光学同調可能フィルタ、モノクロメータ、及びスペクトログラフの１つを備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２６】
前記蛍光波長選択装置が、スペクトログラフと、前記スペクトログラフの出口焦平面から前記光検出器に蛍光光子を送達するようにそれぞれが結合される複数の光ファイバとを備え、各ファイバが、前記指定波長範囲の異なる波長を送達し、前記ファイバが、前記光検出器において前記異なる波長の前記蛍光光子の到来を時間的に分離するように異なる長さを有する、請求項１７に記載の装置。
【請求項２７】
前記光検出器が、光電子倍増管、マルチアノード光電子倍増管、マイクロチャネル・プレート光電子倍増管、フォトダイオード、及びアバランシェ・フォトダイオードの１つを備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項２８】
光学要素が、前記サンプルから放出される光を前記蛍光波長選択装置に集中させるために使用される、請求項１７に記載の装置。
【請求項２９】
前記光源が、様々な励起波長において前記励起光パルスを選択的に出力するために、入力パルス化レーザ及び励起波長変換器を備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項３０】
前記光源が、様々な励起波長において前記励起光パルスを選択的に出力するために、入力パルス化レーザ、励起波長変換器、及び励起波長選択装置を備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項３１】
前記サンプルと前記光検出器との間に配置される偏光子を更に備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項３２】
前記パルス化光源と前記サンプルとの間に配置される波長板を更に備える、請求項１７に記載の装置。
【請求項３３】
サンプルにおいてパルス化蛍光を励起する複数の前記光パルスでサンプルを照射するステップと、
指定波長範囲内において前記サンプルから前記パルス化蛍光の一部を選択するステップと、
前記パルス化蛍光の前記選択部分に基づいて、時間依存電気信号を生成するステップと、
メモリ要素のアレイにおいてアナログ電圧又は電荷の時系列として前記時間依存電気信号の表示を記憶し、前記アレイの連続要素が４ｎｓより大きくない時間増分に対応するステップと、
アナログ電圧又は電荷の前記時系列を対応するデジタル化蛍光波形に変換するステップと、
少なくとも２つの放出波長、又は少なくとも２つの励起波長、或いは励起パルスの偏光に対する少なくとも２つの蛍光偏光子配向についてデジタル化蛍光波形のパラメータ時間行列を記録するステップと、
前記サンプルの少なくとも１つの蛍光成分について、濃度、蛍光寿命、又は回転相関時間の数値を決定するために、前記パラメータ時間行列のデータを分析するステップと、
を備える蛍光方法。
【請求項３４】
前記パラメータ時間行列を分析するステップが、対象化合物について基準パラメータ時間行列を使用するステップを備える、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記パラメータ時間行列を分析するステップが、非負最小２乗方法を使用して、前記基準パラメータ時間行列を前記パラメータ時間行列にはめ込むステップを備える、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記パラメータ時間行列を分析するステップが、２つの行列の積として前記パラメータ時間行列内に含まれるデータを表すステップを備え、それにより、一方の行列が、前記サンプルの化学成分の蛍光の波長又は偏光依存性に関する情報を含み、他方の行列が、前記サンプルにおいて前記化学成分の蛍光減衰特性に関する情報を含む、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００１年４月１６日に出願された米国出願０９／８３５８９４の一部継続であり、この出願は、参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、一般的には、蛍光分析の分野に関し、具体的には、パルス化励起源によって生成される蛍光減衰データを迅速に収集する装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
精確な蛍光強度データを収集するように設計される器具は、蛍光計と一般に呼ばれる（フルオリメータとしても知られる）。高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、毛細電気泳動（ＣＥ）、及び自動ＤＮＡ塩基配置決定器具において見られる蛍光計は、単に蛍光検出器とも呼ばれる。概念的に同様の蛍光検出器が、マイクロウエル・プレート読取り装置及びマイクロアレイ・スキャナにおいて使用される。蛍光計の他の定量分析の応用例には、フロー血球計算を介して細胞をカウントすること、サンプルのＤＮＡ又はＲＮＡの量を決定すること、酵素活性を測定すること、及び水の炭水化物及び葉緑素の濃度を決定することがある。
【０００４】
蛍光装置は、サンプルの性質、サンプルが蛍光計に提示される方式、及び収集される蛍光データのタイプによって区別することができる。本発明及びその意義を完全に理解するために、蛍光計の多くの既知の変形形態の強み及び弱みを認識して理解しなければならない。最小限、各蛍光計は、サンプルにおいて蛍光を誘起するように作用する励起光源、指定波長範囲を有する蛍光光子のみを隔離する手段、及び選択波長内の蛍光光束をアナログ電気信号に変換する光検出器を組み込む。多くの蛍光計は、アナログ電気信号をデジタル表示に変換するために提供され、デジタル表示は、その後のデータ分析のために視覚的に読み取ることができる、又は記憶することができる。
【０００５】
蛍光のプロセスは、サンプルの分子が光源から光子を吸収するとき、開始される。励起光子によって搬送されたエネルギーは、分子に伝達され、それにより、電子励起分子のポピュレーションを創出する。分子は、そのうちの１つが光子放出（蛍光）であるいくつかの可能な脱励起経路のために、これらの励起状態に無期限に留まることはできない。光子吸収（励起）と光子放出（蛍光）との作用の間で生じるある振動緩和及び内部変換プロセスのために、放出光子の平均波長は、光子吸収により励起状態を創出するために使用された励起波長より常に長い。励起状態分子が創出される時間の数ピコ秒以内に、励起状態分子は、第１励起１重状態に緩和され、この状態から蛍光が生じる。第１励起１重状態における分子の平均滞在時間は、通常、約０．１〜１００ナノ秒の大きさである。任意の特定の化合物の蛍光スペクトルの形状（全強度ではない）は、励起波長の選択に関係なく、ほぼ同じである。同様に、任意の特定の化合物の励起スペクトル（全強度ではない）の形状は、放出が監視される波長の選択に関係なく、ほぼ同じである。
【０００６】
多くの異なる励起源が、サンプルにおいて蛍光を励起（誘起）するために必要とされる光のある程度単色の入射ビームを供給することができる。タングステン・ランプ又は石英ハロゲン・ランプ、キセノン・アーク・ランプ、及びキセノン・フラッシュランプを含めて、いくつかの励起光源が、干渉フィルタ、モノクロメータ、又は他の波長選択装置が励起光源とサンプルとの間に挿入されることを必要とするような広範な範囲波長にわたって光子を放出する。励起波長選択装置の主な目的は、波長が対象蛍光信号と同じである散乱励起光子が検出システムに入るのを防止することである。中圧又は高圧のキセノン・アーク・ランプ及びキセノン・フラッシュランプの出力は、真空紫外線（２００ｎｍより短い波長）から紫外線及び可視領域を経て近赤外線を網羅する。したがって、励起光源から生じる光子の９９％以上を破棄しなければならないという代償にもかかわらず、励起波長選択装置を適切に選択することによって、本質的にあらゆる望ましい波長を得ることができる。発光ダイオード（ＬＥＤ）が、５０〜１００ｎｍの比較的より狭い波長範囲の光子を提供し、これにより、出力をろ波する波長のタスクが容易になる。約３６０ｎｍから近赤外線の波長範囲を網羅する安価なＬＥＤが、市販されている。
【０００７】
レーザ励起源が、蛍光計の応用分野に非常に有利であることがあるが、その理由は、出力が非常に高度に単色であり、レーザ光を容易に望ましいサンプル位置に向けて、集束させることができるからである。ほぼすべての自動ＤＮＡ分析装置及びほとんどのマイクロアレイ読取り装置において見られるレーザ源は、一般に、単一の非常に狭い波長範囲の光子を提供する。励起波長に対する蛍光強度の依存性に固有の価値ある情報の少なくとも一部を保持するために、そのような機器は、いくつかの固定波長レーザ源を組み込むことが可能であるが、これにより、複雑さ、コスト、及び測定時間が増大する。同調可能レーザ又は光源パラメータ・オシレータ（ＯＰＯ）は、出力波長が連続的に可変であるコヒーレントな源であるが、一般に大型で高価でもある。
【０００８】
蛍光強度は、単一放出波長範囲内において、いくつかの離散放出波長において、又は波長の連続範囲において、監視することができる。放出監視波長を選択するために誘電体干渉フィルタ又はガラス・カットオフ・フィルタを使用する機器は、一般に、蛍光計又はフルオリメータと呼ばれる。オペレータは、放出が監視される波長が変化するたびに、異なるフィルタを選択して、機器に装備することが必要である可能性がある。手動で制御することができる、又はモータに添付することができるいくつかのフィルタが回転可能フィルタ・ホイールにおいて、又はフィルタ・スライドの上に装備されているバージョンが、より好都合である。モノクロメータは、波長の選択について、非常に適応的で多目的な機器である。モノクロメータ内の格子又はプリズムの位置を調節することにより、通過帯域波長の連続変化が可能になる。通過帯域の幅は、入り口及び出口のスリット幅を制御することにより、同様に調節可能である。放出波長、又は励起波長及び放出波長の両方の連続変化のために走査モノクロメータを組み込む蛍光測定機器は、一般に、分光蛍光計又はスペクトロフルオリメータと呼ばれる。他の選択肢は、蛍光スペクトル全体を一度に収集するために、電化結合素子（ＣＣＤ）カメラなどのアレイ検出器を使用する。この場合、蛍光を分散させる（空間的に分離させる）ために使用されるモノクロメータは、一般にスペクトログラフと呼ばれる。測定システムの波長依存性について実験放出スペクトル及び励起スペクトルを補正するために、周知の手続きを適用することができる。したがって、補正されたスペクトルは、分子の基本的な蛍光特性を表すが、これらの特性は、分子環境に対するある依存性を提示する可能性がある。例えば、蛍光スペクトルは、溶媒の極性が変化する場合、波長がシフトすることがある。蛍光分光法の実施及び原理は、多くのテキストブック及び参考文献に記載されている。
【０００９】
蛍光の寿命は別の分子特性であり、これは、スペクトルの場合より測定システムの詳細によって受ける影響が少ない。例えば、蛍光の寿命は、励起波長が変化した後、サンプルに向けられる光の量が中性密度フィルタでは低減されるとき、又は光源のパルス反復周波数が変化しても、変化しない。同一に準備された分子のポピュレーションの個々の励起状態維持時間は、統計的に分布するが、集団的な励起状態ポピュレーションの減衰は、いわゆる１次動態又は指数関数的減衰に従う。寿命は、励起状態のポピュレーションが初期ポピュレーションの１／ｅ＝３６．８％に降下する時間間隔である。励起状態の寿命は、励起状態を非活動化するすべてのプロセスの率定数に関係するが、一般に蛍光寿命と呼ばれる。その理由は、蛍光は、励起状態ポピュレーションの変化を追跡するのに格段に好都合な方式であるからである。
【００１０】
サンプルの上に向けられる励起ビームの強度が本質的に一定である場合、わずかな蛍光寿命情報しか得ることができない、又は全く得ることができない。寿命情報を得る１つの手段は、通常は正弦波パターンにおいて、励起光の強度を時間的に変調させるものである。サンプルの放出応答は、励起と同じ変調周波数を必然的に有する。しかし、励起プロセスと放出プロセスとの間の固有時間遅延は、蛍光寿命に数学的に関係する位相シフトを誘起する。そのような技法は、一般に周波数領域分光法と呼ばれる。
【００１１】
概念的により簡単な手法は、持続時間の短い光パルスで蛍光を励起して、その後の蛍光の時間パターンを測定する。蛍光減衰曲線全体は、単一レーザ励起パルスに続いて、デジタル・オシロスコープ又は遷移デジタイザで測定することができ、この機能は、近接時間間隔において光電子倍増管又は他の光検出器の出力を追跡する。励起状態ポピュレーションが生成される時間に対して表される蛍光強度対時間間隔のプロットは、一般に蛍光減衰曲線と呼ばれる。時間の関数としての遷移信号のデジタル表示は、一般に波形又はプロファイルとも呼ばれる。励起パルスの持続時間（パルス幅）が蛍光減衰時間よりはるかに短い理想的な場合、寿命は、Ｉｔをレーザ・パルスに対する時間ｔにおける蛍光強度として、Ｉｔ対ｔのプロットから決定することができる。多くの数学的デコンボルーションの技法が、励起パルス持続時間が蛍光寿命と比較して無限小には短くはない状況について利用可能である。デコンボルーションの技法は、強度が、励起パルス及びその後の蛍光パルスの両方について、時間の関数として測定されることを必要とする。相対的に対象ではない乗算ファクタとは別に、蛍光と励起波形との数学的関係は、単一パラメータ、すなわち蛍光寿命を含む。各デコンボルーションの手続きは、同じ目的を有する、すなわち、観測蛍光減衰曲線と予測蛍光減衰曲線との最適な適合を与える寿命の値を決定するという目的を有する。
【００１２】
蛍光寿命が放出監視波長から独立であるという上記の記述は、混合物について必ずしも真ではない。見かけの蛍光寿命は、サンプルが異なる寿命並びに異なる励起スペクトル及び放出スペクトルを有する複数の放出種を含む場合、励起波長又は蛍光波長に依存する。そのような場合、双指数関数的減衰又は多重指数関数的減衰を観測することが予期される。励起波長又は放出波長に対する蛍光寿命の不変性は、サンプルの純度の試験であり、放出監視波長に対する励起スペクトルの不変性及び励起波長に対する放出スペクトルの不変性に基づく試験と同様である。デコンボルーションを含めて、数学的データ処理技法は、複数の放出種を計数するように容易に一般化される。
【００１３】
蛍光減衰曲線（及びデコンボルーションが必要であれば、レーザ励起パルス形状）を収集する従来の方式は、時間補正単一光子カウント（ＴＣＳＰＣ）による。ＴＣＳＰＣでは、サンプルは反復して励起され、サンプルが励起されるときと第１蛍光光子が検出されるときとの間の時間間隔のヒストグラムが生成される。ヒストグラムは、一時デジタイザで測定することができる蛍光減衰曲線に機能的に等価である。ＴＣ−ＳＰＣヒストグラムに含まれるデータは、いわゆるポアソン統計に従う。一方、ポアソン統計の条件を達成するために、測定条件は、実際のデータ（ヒストグラムの１点）が、レーザ・パルスのわずかに１又は２パーセントについて収集されるように、構成されなければならない。したがって、データ収集は、長くかつ非効率的なプロセスである。
【００１４】
蛍光分析法は、他の機器技法と比較して、より高い測定感度及び特定性、より容易な動作、より迅速な測定時間、又はより低い機器使用コストをしばしば提供する。蛍光分光法は、本質的に鋭敏であるが、その理由は、対象信号が、低い（理想的にはゼロ）背景信号で測定されるからである。対照的に、吸収分光法は、検出限界又は定量限界付近において動作するとき、鋭敏さが劣るが、その理由は、大きな光信号の非常にわずかな減少が決定されなければならないからである。各蛍光化合物によって所有される励起スペクトル、放出スペクトル、及び寿命時間の固有の組合せが、特定性を提供する。
【００１５】
蛍光信号強度は、とりわけ、サンプル・ボリューム内の励起光子のフラックス、及びボリューム内の蛍光体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の数に依存する。蛍光強度全体に影響を与える他のファクタは、波長分析装置及び光検出器の波長依存応答、励起光をサンプルに送達するために使用される光学機器、放出された光の一部を光検出器より前に波長分析装置に送達するために使用される光学機器、並びに光源、励起光学機器、収集光学機器、及び波長分析装置の具体的な幾何学的構成である。したがって、蛍光強度は、潜在的な蛍光分子（蛍光体）の固有分光特性、蛍光体の濃度、及び測定システム自体の特性に依存する。
【００１６】
測定システムの特性を特徴付ける手続きは、冗長で時間がかかる。したがって、定量分析の目的では、一般に、濃度が既知である基準サンプル又は標準サンプルの蛍光強度とサンプルの蛍光強度を比較する。サンプルが流体溶液からなる場合、濃度は、一般に、単位体積当たりの質量として表される。表面上に配列された蛍光種の場合、量は、単位面積当たりの質量で表されることが多い。したがって、サンプルにおいて誘起される蛍光により、蛍光化合物がサンプルに存在するかを識別し（定性分析）、そうである場合、濃度又は量（定量分析）を決定することが可能になる。
【００１７】
サンプルの蛍光強度が単一の既知の化合物から生じることが既に分かっている場合、定量分析技法の実施及びデータの解釈は、直接的である。サンプルが未知又は予期されない蛍光種を含む場合、或いは蛍光データが干渉背景信号によって汚染される場合、分析の質及び値は損なわれる。蛍光は、上記で記述されたように、理想的にはゼロ背景技法であるが、ある量の背景信号が、不可避的に存在する。背景信号の源は多く、望ましい蛍光監視波長における迷走励起光、サンプルの不純物に由来する蛍光、及びサンプル容器の干渉蛍光が含まれる。
【００１８】
高いデータ獲得率が、ほとんどのクロマトグラフィ分析、マイクロプレート又はマイクロアレイ走査、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）光学診断、及びサンプル組成が迅速に変化する、又は多くの異なるサンプルが試験されなければならない多くの他の手続きについて必須である。背景信号を計数する方式及び２つ以上の種が蛍光信号に寄与しているときを感知する方式は、一般的なテーマ及び課題である。離散サンプリングに依拠する技法による確認化学分析は、非常に時間がかかるので、迅速な測定率に対する要求と全く両立しない。
【００１９】
クロマトグラフィのある値を有する最初期の手法は、連続溶出時間における強度のパターンを調査する。種が溶出する際の種の蛍光強度は、ゼロから最大値まで非常に滑らかに変化し、次いでゼロに戻ることが予期される。様々な数学的定式が、正規（ガウス型）又は対数正規などの用語で呼ばれるピークの形状に当てはまることが前提とされた。サンプルが注入された後、同程度の時間間隔において溶出する化合物の特徴的な形状から十分に大きく逸脱することにより、ピークが重なっている２つ以上の蛍光体が存在することが示される。サンプルの濃度が、エネルギーの移送及び消光プロセスが無視可能であるように十分小さい限り、蛍光強度全体は、サンプルにおける個々の蛍光化合物からの寄与の合計によって厳密に近似される。ＤＮＡシーケンス分析及び多くの他の蛍光手続きについて、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）及び毛細電気泳動（ＣＥ）に適用されるサンプル条件は、希釈サンプル条件の要件を満たす。したがって、重なりピークを解明することを試みることができるが、線の形状のみに基づいてそれを実施することを試みる手続きは、不正確であることが周知である。また、そのような分析は、干渉蛍光体の化学的強度に関する情報を提供しない。背景信号が一定である、又は緩慢に変化すると想定する背景減算技法が同様に適用され、同様の制限を有する。
【００２０】
ピークの純度について試験するより精巧な方式において分光データを使用する先例がある。例えば、単一波長における吸収とは対照的に、完全吸収スペクトルを測定することができるフォトダイオード・アレイ（ＰＤＡ）検出器が、クロマトグラフィにおいて周知である。ピークは、暫定的に割り当てることができ、ピークの純度は、所与の溶出時間における測定スペクトルを既知の標準スペクトルのデータベースのエントリと比較することによって評価される。ピーク純度指標が、データベースにおいて最も密接な整合を有する未知のスペクトルの重なり程度から導出される。しかし、ピーク純度指標が低い場合、２つ以上の放出化合物がサンプルに存在することを示唆し、背景信号を含めて、全スペクトルを化合物にどのように割り当てるかの問題は、依然として存在する。したがって、ＰＤＡ検出器は、所与の量の実験時間において得ることができる情報量を増大させる場合より多く誤った割当てを回避するために使用される。
【００２１】
ピーク純度試験手続きの厄介な性質、及び重なりピークを個々の種の寄与に精確に分離することができる、容易に適用されるアルゴリズムの欠如により、２種類以上の種が所与の時間に検出器ボリュームにある確率を低減するようクロマトグラフィ分離条件を構成するために、多大な努力が行われる。残念ながら、これらの条件は、溶媒の溶出強度及び流量などの変数を慎重に最適化及び調節することを必要とし、必然的に、溶出時間ははるかにより長くなり、生産性は低下する。
【００２２】
実際、クロマトグラフィに使用されるほぼすべての蛍光検出器、マイクロプレート読取り装置、マイクロアレイ読取り装置、定量ＰＣＲ装置などは、各サンプルの組成又は位置について単一励起波長及び単一放出波長で測定することに依存するが、その理由は、これが、高データ獲得率と共存可能な唯一の手法であるからである。そのような測定からのデータは、例えば電流、電圧、カウントなど、それが表される単位に関係なく、単に数値であることを認識しなければならない。データは、数学的には次元はゼロ次である。この数値を異なる蛍光体又は１つの蛍光体及び背景の別々の寄与に明確に分離することは不可能であることが明らかなはずである。純度の観点から、純度指標を個々の測定に数学的に割り当てることは、同様に不可能である。
【００２３】
１秒未満など、密接な間隔の時間間隔において完全蛍光スペクトルを規定どおりに収集する蛍光検出器のみが、非常に高価な自動ＤＮＡシーケンサにおいて見られる。これらのシーケンサの最も精巧なものは、スペクトログラフの出口焦平面に配置されたＣＣＤカメラで蛍光スペクトル全体を収集するが、ほとんどのスペクトル情報は、データ処理ステップにおいて破棄される。他のバージョンは、様々な波長範囲の光を複数の検出器に向けるために、フィルタ・ホイールの迅速な回転又は２色フィルタを使用することにより、複数の波長において測定する（４つの染料が１レーンＤＮＡ塩基配置決定において使用されるので、通常４つである）。あるマイクロプレート及びマイクロアレイ読取り装置により、完全スペクトルを生成するために、放出モノクロメータ又は励起モノクロメータを走査することが可能になるが、これらのモードは、ほとんどの応用分野にとって遅過ぎる。
【００２４】
蛍光は、ＨＰＬＣの吸収検出におけるＰＤＡの使用と類似する、信頼性試験についての多くの異なる選択肢（どれも通常は使用されない）を潜在的に提供する。類似性は、完全蛍光スペクトルがクロマトグラムにおいて各溶出時間に測定される場合に最も近く、ゲート光学マルチチャネル分析装置（ＯＭＡ）とも呼ばれる強化フォトダイオード・アレイ（ＩＰＤＡ）で達成することができる。代替として、完全蛍光スペクトルを収集するために、スペクトル分散方向に垂直な軸に沿って対にされた要素を有するＣＣＤカメラ検出器を使用することができる。そのような実施は文献に記載されているが、高コスト及び他の理由のために、使用は、研究目的に限定されていた。
【００２５】
多次元蛍光分析が、特定性及び感度の両方について、対応する１次元スペクトル技法よりはるかに多くの情報をもたらすことが、多くの文献において実証され、また研修者の間で広く合意されている。しかし、多次元技法の使用は、研究調査にほぼ限定されてきた。その理由は、１）データが収集されて処理される割合が、一般的にあらゆる現実の商用応用分野について過度に緩慢である；２）必要な速度を達成することができる技法が、法外に高価である；３）堅牢で迅速なデータ分析方法が、データに固有に含まれる情報を使用するために利用可能ではない。技術及び方法の商業化の試行は、これらの障害によって阻害されてきた。
【００２６】
蛍光は、多次元データの可能出力について、分光技法の中でも特有であり、蛍光強度データは、励起波長、放出波長、及び蛍光減衰時間の３つの重要な分光座標の少なくとも２つに沿って測定される。ほとんどの熟知されている多次元蛍光表示は、励起放出行列（ＥＥＭ）の表示である。ＥＥＭは、異なる励起波長において得られる一連の放出スペクトルとして最も一般的に生成される。代替として、及び同様に、一連の励起スペクトルは、異なる放出監視波長について収集することができ、同じ結果をもたらす。まさにその性質によって、ＥＥＭは、励起スペクトル又は放出スペクトルのみにおいて利用可能である場合より多くの情報を包含する。内視鏡検査により腫瘍を診断する、又は石油流出源を特定する目的でのＥＥＭの潜在的利点は、認識されていた。しかし、ＥＥＭの実際の使用は、ＥＥＭを得なければならない長く冗長のため方式によって制限されてきた。
【００２７】
ラーマン・シフトに基づいて複数波長励起源を使用してＥＥＭが収集されるプロセスを高速化する少なくとも２つのグループが提案されていた。しかし、これらは、各励起波長についての別々の対の光ファイバ、及び高価なＣＣＤカメラを必要とする複雑な機器である。更に、ラーマン・シフト・プロセスにより、レーザ励起パルス・エネルギーは大きく揺らぎ、信号対雑音は低下する。ビデオ蛍光計として知られる古い技術を組み込む市販のフルオリメータをある会社が最近導入し、それにより、１秒程度の短時間においてＥＥＭを収集することが可能になる。しかし、迅速な測定時間は、測定感度を１０倍以上代償とし、データをどのように分析するかの問題は依然として存在する。
【００２８】
サンプルの全放出スペクトル又は全励起スペクトルを様々な成分からの寄与に分解することは、困難である。十分に短い持続時間のパルス化励起源が使用される場合、波長時間行列（ＷＴＭ）の形態で秒の大きさのデータを収集することができる。最も簡単に具体化されるＷＴＭは、一連の放出波長又は励起波長において測定された蛍光減衰曲線からなる。情報は、２次元データ・アレイに組み立てることができ、この場合、列は、異なる波長を表し（励起又は放出）、行は、蛍光が短い持続時間のレーザ・パルスで励起された時間に対する異なる時間増分を表す。ＷＴＭは、文献ではＥＥＭよりはるかに少ない減衰を受け取るが、蛍光減衰曲線をレーザ励起波形に数学的に関係付けることができる方式のために、ある利点を有する。
【００２９】
ＥＥＭ又はＷＴＭがシーケンス・モードにおいて収集される場合、すなわち、１つの放出スペクトル又は１つの蛍光減衰曲線が一度に収集される場合、ひずみを回避するために、条件が、全シーケンス中可能な限り一定に保持されることが非常に重要である。蛍光減衰曲線の測定時間が短くなると、一定サンプル条件の場合に近づくことが容易になる。２つの可能性の高いひずみ源は、レーザ・パワーの揺らぎ又はサンプルの低質化である。例えば、レーザ強度がＥＥＭの収集中に着実に降下する場合、ＥＥＭにわたって対称的なエラーが存在する。光化学又は他のプロセスがデータ収集中にサンプルの蛍光体濃度を変化させる場合、同じタイプの振舞いとなる。これらの問題は、ＥＥＭ全体又はＷＴＭ全体を同時に収集することができる場合、回避される。
【００３０】
これまで、ＷＴＭを生成するために使用される機器は、過度に緩慢で不安定であったので、流れる流体の分析又はサンプル表面の迅速な走査を含めて、特性が時間及び空間について迅速に変化するサンプルの分析など、多くの分析プロセスには有用ではなかった。この状況の理由は、多くかつ多様であるが、ショットごとのレーザの揺らぎ、緩慢な反復率及びレーザの費用、より迅速な反復率を有するレーザとデジタイザが歩調をそろえることができないこと、生成データのボリュームを扱う方法論の欠如、並びにデータを分析する堅牢なアルゴリズムの欠如を含む。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３１】
本発明は、サンプルが複数の蛍光化合物を包含するという一般的で困難な状況に関する多くの問題を解決する。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
本発明の一実施態様は、サンプルの蛍光減衰特性の迅速かつ鋭敏な定量分析を提供する装置を提供する。装置は、励起光パルスを生成する反復パルス化励起光源を有し、その出力が、サンプルにおいてパルス化蛍光を生成する。また、蛍光波長選択装置が含まれ、これは、サンプルから生じるパルス化蛍光の一部を入力として受け取り、波長が指定波長範囲内にある蛍光光子を出力する。光検出器が装置に含まれ、光検出器は、蛍光波長選択装置から指定波長範囲内の蛍光光子を入力として受け取り、時間依存電気信号を出力する。装置は、時間依存電気信号の表示をアナログ電圧又は電荷の時系列として記憶するメモリ要素のアレイを含む。アレイにおける連続要素が、４ｎｓより大きくない時間増分に対応する。装置は、アナログ電圧又は電荷の時系列を対応するデジタル蛍光波形に変換するアナログ・デジタル変換器を更に含む。
【実施例】
【００３３】
以下の詳細な記述では、本発明の一部を形成し、かつ本発明が実施されることが可能である特定の例示的な実施例を示す添付の図面を参照する。これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのを可能にするように十分に詳細に記述される。他の実施例が使用されることが可能であり、また、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、論理的、数学的、及び電気的な変更を実施することが可能であることを理解されたい。したがって、以下の詳細な記述は、限定的な意味で取られるべきではない。
【００３４】
図１に示される装置１００は、本発明の一実施例を示す。装置１００は、光パルスのそれぞれのストリームとしてビーム１０４を放出するパルス化光源１０２を含む。ビーム１０４の波長は、サンプルにおいて蛍光を励起させるのに適切である。光パルスの持続時間は、最大強度の半分におけるパルスの完全時間幅によって測定され、１ナノ秒未満である。パルス・エネルギーの最小２乗平均偏差は、一般にショットごとの揺らぎとも言われ、パルス化光源１０２の１パーセントより大きくない。パルス化光源１０２は、毎秒１００以上のパルスを放出するように適合される。
【００３５】
一実施例では、パルス化光源１０２は、単一モード・パルス化レーザであり、例えば、受動Ｑスイッチ固体状態Ｎｄ：リットン・エアトロン・シノプティクス（Ｌｉｔｔｏｎ  Ａｉｒｔｒｏｎ  Ｓｙｎｏｐｔｉｃｓ（モデルＭＬ−０００２４）又はＪＤＳユニフェーズ（Ｕｎｉｐｈａｓｅ）（ナノレーザ）によって製造されるＹＡＧレーザである。励起光源１０２は、当業者には使用が熟知されている適切な非線形光学材料の補助で、第２高調波（５３２ｎｍ）、第３高調波（３５５ｎｍ）、又は第４高調波（２６６ｎｍ）として光を出力するように適合させることができる。この文脈における単一モードは、縦方向モード構造を指す。単一モードが望ましいが、その理由は、光パルスの強度が時間的に滑らかであるからである。すなわち、強度が、最大値まで単調に増加し、次いで、第２強度最大値又は最小値を提示せずに、単調に減少するからである。
【００３６】
他の実施例では、パルス化光源１０２は、使用者によって選択することができる様々な波長の励起ビーム１０４を選択的に出力するように適合される。図２ａに示される実施例では、パルス化光源１０２は、ポンプ・ビーム２０４ａを励起波長変換器２０６ａに向ける入力パルス化レーザ２０２ａを含む。励起波長変換器２０６ａは、波長λポンプにおいてビーム２０４ａの光子を受け取り、受け取った光子の一部分を異なる波長λ励起に変換する。様々な波長が、励起波長変換器２０６ａにおいてλ励起について異なる値を選択することによって、選択的に出力される。励起波長変換器２０６は、染料レーザ、固体状態バイブロニック・レーザ、光学パラメータ・オシレータなどとすることができる。
【００３７】
他の実施例では、図２ｂに示されるように、パルス化光源１０２は、入力パルス化レーザ２０２ｂ、励起波長変換器２０６ｂ、及び励起波長選択装置２０８ｂを含む。励起波長変換器２０６ｂは、入力パルス化レーザ２０２ｂからポンプ・ビーム２０４ｂを受け取り、ポンプ・ビーム２０４ｂによってポンピングされるとき（又はポンプ・ビーム２０４ｂの一部）、複数の波長λ１、λ２、λ３において同時に光子を生成する。励起波長変換器２０６ｂは、複数の波長の光子を励起波長選択装置２０８ｂに送達する。励起波長選択装置２０８ｂは、励起波長変換器２０６ｂから複数の波長の光子を受け取り、出力をビーム１０４において一度に１つの波長（λ励起）に限定するように作用する。
【００３８】
一実施例では、励起波長変換器２０６ｂは、いくつかの異なる波長において同時に光子を生成するラーマン・シフト・セルを含む。波長選択装置２０８ｂの行為は、プリズム、モノクロメータ、一連のフィルタなどで達成することができる。入力パルス化レーザ２０２ｂは、単一モード・パルス化レーザとすることができ、例えば、受動Ｑスイッチ固体状態Ｎｄ：リットン・エアトロン・シノプティクス（モデルＭＬ−０００２４）によって製造されるＹＡＧレーザである。
【００３９】
ビーム１０４は、芳香族炭化水素、クロロフィル、蛍光トレーサ染料、蛍光タグと反応したＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を含むが、これに限定されない、蛍光化合物又は蛍光化合物の混合物を含む。他の実施例では、ビーム１０４は、レンズ、湾曲ミラー、又は光ビームを集中させるように作用する他の光学機器で、サンプル１０８の上において集束される。ビーム１０４はサンプル１０８を照射し、それにより、サンプル１０８は、蛍光ビーム１１０を放出する。蛍光ビーム１１０は、蛍光パルスの反復ストリームからなり、１つの蛍光パルスは、サンプル１０８に当たる各励起光パルスについて生成される。蛍光ビーム１１０は、光検出器１２６に向けられる。一実施例では、蛍光波長選択装置１１８は、蛍光ビーム１１０と光検出器１２６との間に挿入される。一実施例では、蛍光ビーム１１０は、レンズ１１２を通過し、レンズ１１２は、蛍光ビーム１１０を蛍光波長選択装置１１８の上に集中させる。他の実施例では、サンプル１０８からの蛍光ビーム１１０は、光ファイバ１１４を介して蛍光波長選択装置に向けられる。他の実施例では、レンズ１１２及び光ファイバ１１４は、図１に示されるように共に使用される。
【００４０】
他の実施例では、ビーム１０４は、波長板１０６を通過し、その後サンプル１０８に到達する。波長板１０６は、ビーム１０４の極性特性を回転させる、又は変化させる。これにより、異なる励起極性の光ビームが、サンプル１０８に適用されることが可能になる。一実施例では、波長板１０６は、例えば水平偏光角度から垂直偏光角度まで様々な角度に偏光角度を回転させる１／２波長板である。
【００４１】
他の実施例では、膜又はプリズム偏光子などの偏光子（又は放出偏光子）１１６が、サンプル１０８と光検出器１２６との間に挿入される。一実施例では、偏光子１１６は、例えば蛍光分子遷移双極子の向きを再配向させる視準に関連する過渡的な影響を除去するために、ビーム１０４の偏光面に対して、５４．７度など、第１偏光角度に配向される。いくつかの実施例では、偏光子１１６は、これらの偏光角度において蛍光波長を集光するために、他の偏光角度に配向される。これにより、回転相関時間及び遷移異方性を決定することが可能になる。回転相関時間は、蛍光分子の配向が無作為になる特徴的な時間間隔である。一実施例では、サンプル１０８からの蛍光は、回転相関及び異方性を分析又は決定するために、平行に配向された偏光子１１６で測定され、次いで、ビーム１０４の偏光に対して垂直に偏光される。
【００４２】
蛍光波長選択装置１１８は、入力として蛍光ビーム１１０を受け取る。蛍光波長選択装置１１８は、規定波長範囲内にある入力蛍光の大部分をビーム１２０ｊ（ｊは１からＮまでの指標であり、選択することができる様々な可能な放出波長をラベル付けする）として出力する。蛍光の当業者なら、ストリーム１２０ｊは、波長が中心波長λｊの周りの範囲にある蛍光光子を備えることを理解するであろう。
【００４３】
放出波長時間行列を生成するための蛍光放出波長の変形形態を含む実施例では、蛍光波長選択装置１１８は、２つ以上の放出波長λｊ、λｋなどにおいて、ビーム１２０ｊ、１２０ｋを順次出力する。パルス化光源１０２が２つ以上の励起波長においてビーム１０４を選択的に出力する実施例では、蛍光波長選択装置１１８が、単一波長λｊにおいてストリーム１２０ｊを出力する。
【００４４】
放出波長選択装置１１８によって確立される放出波長の特定の値は、特定の応用分野につき選択される。例えば、サンプルに意図的に追加された分子の蛍光を含む応用分野では、放出波長は、染料分子の既知の蛍光スペクトルを考慮した後に選択することができる。当業者なら、散乱励起光子からの干渉を最小限に抑えるために、又は他の理由で、強度が最大であるものとは異なる放出波長を選択することが可能であることを理解するであろう。
【００４５】
一実施例では、蛍光波長選択装置１１８は、図３に示されるように、線形可変フィルタ３１８である。線形可変フィルタ３１８の波長通過帯域は、全長に沿って連続的に徐々に変化するが、複数のセグメント３１８ｊ、ｊ＝１からＮを含むかのように機能する。各セグメント３１８ｊは、ほぼ単一の対応する波長λｊの蛍光がそのセグメントを通過することを可能にし、それにより、波長選択蛍光ビーム１２０ｊを創出する。線形可変フィルタ３１８から出力される波長λｊで蛍光を選択するために、線形可変フィルタ３１８は、線形可変フィルタの適切なセクションがビーム１１０を傍受するように配置される。一実施例では、線形可変フィルタ３１８は、図３に示されるように、ステッパ・モータなどの作動装置３２４によって駆動される送りねじ３２２を使用して作動される。他の実施例では、線形可変フィルタ３１８は、３８０から７２０ナノメートルの波長を通過させる。
【００４６】
他の実施例では、コンピュータ・プログラムから入力を受け取る制御回路が、作動装置３２４を制御する。この実施例では、使用者は、１セットの波長を選択し、作動装置３２４は、選択波長が線形可変フィルタ３１８の適切な領域を通過するように、線形可変フィルタ３１８を位置決めする。別の実施例では、制御回路はまた光源１０２からの入力を受け取る。この実施例では、使用者は、データが各波長において収集される光パルスの望ましい波長及び数を選択する。選択された数のパルスが線形可変フィルタ３１８の適切な領域を通過した後、作動装置３２４は、異なる望ましい波長範囲の蛍光を隔離するように、線形可変フィルタを位置決めする。
【００４７】
他の実施例では、蛍光波長選択装置１１８は、１セットの離散フィルタを含む。一実施例では、離散フィルタ４１８１から４１８Ｎのセットは、ホルダにおいて構成され、ホルダは、ほぼ単一の対応する波長のサンプルによって放出される蛍光光子を選択するように、望ましい離散フィルタを位置決めすることができる。例えば、一実施例では、離散フィルタ４１８１から４１８Ｎは、図４に示されるように、フィルタ・ホイール４１８の上に構成される。一実施例では、フィルタは、全蛍光放出の予期される波長分布に基づいて選択される。フィルタ・ホイール４１８から出力される波長λｊの蛍光を選択するために、フィルタ・ホイール４１８は、離散フィルタ４１８ｊがストリーム１１０に含まれるパルス化蛍光の一部を受け取るように作動される。波長λｊを有する蛍光は、離散フィルタ４１８ｊを通過し、ストリーム１２０ｊとして出力される。一実施例では、フィルタ・ホイール４１８は、ステッパ・モータを使用して作動される。
【００４８】
他の実施例では、蛍光波長選択装置１１８は、音響光学同調可能フィルタである。他の実施例では、蛍光波長選択装置１１８は、モノクロメータである。
【００４９】
他の実施例では、図５に示すように蛍光波長選択装置１１８は、スペクトログラフ５１８及び光ファイバ５１８１から５１８Ｎを備える。光ファイバ５１８１から５１８Ｎのそれぞれは、スペクトルグラフ５１８の出口焦平面５２２の位置から光検出器１２６にほぼ単一波長の蛍光光子を送達するように結合される（図１参照）。光ファイバ５１８１から５１８Ｎは、望ましい波長λ１からλＮの光子を含む信号１２０１から１２０Ｎをそれぞれ出力する。
【００５０】
光ファイバ５１８１から５１８Ｎのそれぞれは、光検出器１２６において光子信号１２０ｊの到来を時間的に分離するために、異なる長さを有する。例えば、光子信号１２０１は、時間的に信号１２０２より早く光検出器１２６に到来するが、その理由は、光ファイバ５１８１が光ファイバ５１８２より短いからである。このようにして、蛍光波長は選択される。蛍光の波長を選択するためにスペクトログラフ及び光ファイバを使用する詳細は、米国特許第５８２８４５２号、名称ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＩＣ  ＳＹＳＴＥＭ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＳＩＮＧＬＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＤ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＲＥＭＯＶＩＮＧ  ＯＶＥＲＬＡＰ  ＩＮ  ＴＩＭＥ  ＯＦ  ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＥＭＩＳＳＩＯＮＳ、１９９８年１０月２７日出願に記載されており、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００５１】
ｊを１とＮとの間の２以上の整数のいずれかとすることができるｊ番目の波長に注目すると、光検出器１２６は、図１に示されるように、蛍光波長選択装置１１８から入力としてビーム１２０ｊを受け取る。光検出器１２６は、ビーム１２０ｊを時間依存アナログ電気信号１２８ｊに変換して、時間依存アナログ電気信号１２８ｊを出力する。他の実施例では、光検出器１２６は、光電子倍増管、フォトダイオード、アバランシェ・フォトダイオードなどである。
【００５２】
信号プロセッサ１３０が、入力として時間依存アナログ電気信号１２８ｊを受け取る。より具体的には、信号プロセッサ１３０のデジタイザ１３２が、入力としてアナログ時間依存電気信号１２８ｊを受け取る。
【００５３】
図７は、本発明の他の実施例によるデジタイザ１３２を示す。デジタイザ１３２は、時間依存アナログ電気信号１２８ｊをサンプリングするサンプラ１４２を含む。一実施例では、トリガ信号１４０が、サンプラ１４２を作動させる。他の実施例では、サンプラ１４２は、トリガ信号１４０の受信に応答して１つ又は複数のサンプリング・ストローブを生成する。各サンプリング・ストローブにより、サンプラ１４２は、信号１２８ｊのサンプル１４４を得て、サンプル１４４をアナログ・メモリ（又は記憶装置）１４６に記憶する。各サンプル１４４は、信号１２８ｊに比例する電圧又は電荷である。いくつかの実施例では、アナログ・メモリ１４６は、キャパシタなど、時間依存電気信号１２８ｊの表示をアナログ電圧又は電荷の時系列として記憶するメモリ要素（図示せず）のアレイを含む。具体的には、アレイの各要素が、サンプル１４４を記憶する。他の実施例では、アレイの連続要素は、１ｎｓより大きくない時間増分に対応する。一実施例では、Ａ／Ｄ変換器１４８が、アナログ・メモリ１４６に結合される。Ａ／Ｄ変換器１４８は、デジタル・メモリ１５０に記憶されているデジタル蛍光減衰波形表示１３４ｊを生成するために、アナログ・メモリ１４６のアナログ・データに対して動作する。いくつかの実施例では、単一アレイのための信号Ａ／Ｄ変換器、アレイの各要素のための単一Ａ／Ｄ変換器などが存在する。
【００５４】
他の実施例では、複数の入力信号が、デジタイザ１３２において受信される。この実施例では、各ストローブにより、サンプラ１４２は、入力信号のそれぞれのサンプルを得て、サンプルをアナログ・メモリ１４６に記憶する。一実施例では、アナログ・メモリ１４６は、それぞれが入力信号のそれぞれの１つからサンプルを受信する複数のアレイを有する。アレイのそれぞれのための単一Ａ／Ｄ変換器、又はアレイのすべてのための単一Ａ／Ｄ変換器などとすることができる。一実施例では、複数の入力信号は、互いのコピーであり、互いに関して時間について遅延される。他の実施例では、複数入力信号のそれぞれは、増幅又は減衰される。
【００５５】
記録装置１３６が、少なくとも２つの放出波長、又は少なくとも２つの励起波長、或いは励起パルスの偏光に対する少なくとも２つの蛍光偏光子の配向について、デジタイザ１３２からデジタル化蛍光減衰曲線１３４ｊを受け取り、デジタル化蛍光波形のパラメータ時間行列を記録及び出力する。一実施例では、パラメータ時間行列は、放出波長時間行列、励起波長時間行列、又は偏光子配向時間行列である。
【００５６】
蛍光波長選択装置１１８が一度に単一の波長を出力する実施例では、デジタル化信号１３４ｊは、放出波長λｊに対応するデジタル化蛍光減衰曲線を備える。デジタル化蛍光減衰曲線が、パルス化光源１０２の各パルスについて得られる。放出波長時間行列を生成するための放出波長の変形を含む実施例では、記録装置１３６は、少なくとも２つの放出波長について、デジタル化蛍光減衰曲線１３４ｊをデジタイザ１３２から受け取り、放出波長時間行列を出力する。一実施例では、記録装置１３６は、複数のレーザ・ショットのデジタル蛍光減衰曲線を合計して、合計された蛍光減衰曲線をレーザ・ショットの数で除算することによって、各ｊ値（放出波長）において蛍光減衰曲線を平均する。記録装置１３６の出力は、したがって少なくとも２つの放出波長の平均蛍光減衰曲線を含む放出波長時間行列を備え、その後の数学的処理及び分析に適切である。
【００５７】
図５の実施例では、デジタル化信号１３４は、一連の放出波長λｊについて蛍光減衰曲線を組み込み、蛍光減衰曲線の成分は、光ファイバ５１８１から５１８Ｎにわたって進行する光によって創出される遅延によって互いに時間について分離される。一実施例では、記録装置１３６は、複数のレーザ・ショットのデジタル蛍光減衰曲線を合計して、合計された蛍光減衰曲線をレーザ・ショットの数で除算することによって、いくつかの放出波長の寄与を含むデジタル蛍光減衰曲線を平均する。次いで、記録装置１３６の出力は、少なくとも２つの放出波長の平均蛍光減衰曲線を含み、かつ、その後の数学的処理及び分析に適切である放出波長時間行列を生成するように、処理することができる。放出波長時間行列が、光ファイバ遅延線によって課された遅延を除去することによって生成される手段は、米国特許第５８２８４５２号、名称ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＩＣ  ＳＹＳＴＥＭ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＳＩＮＧＬＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＲＥＭＯＶＩＮＧ  ＯＶＥＲＬＡＰ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＯＦ  ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＥＭＩＳＳＩＯＮＳ、１９９８年１０月２７日出願に記載されており、参照によって上記で組み込まれている。他の実施例では、いくつかの放出波長についての寄与を含むデジタル蛍光減衰曲線は、基本設定方法（ｂａｓｉｓ  ｓｅｔ  ｍｅｔｈｏｄ）によって直接分析することができる。
【００５８】
パルス化光源１０２が励起波長時間行列を生成するために２つ以上の励起波長においてビーム１０４を選択的に出力する実施例では、記録装置１３６は、単一放出波長λｊにおいてデジタイザ１３２からデジタル化信号１３４ｊを受け取り、少なくとも２つの励起波長の蛍光減衰曲線を含む励起は長時間行列を出力する。一実施例では、記録装置１３６は、複数レーザ・ショットのデジタル蛍光減衰曲線を合計し、合計された蛍光減衰曲線をレーザ・ショットの数で除算することによって、各励起波長においてデジタル蛍光減衰曲線を平均する。記録装置１３６の出力は、したがって少なくとも２つの励起波長についての平均傾向減衰曲線を含む励起波長時間行列を備え、その後の数学的処理及び分析に適切である。
【００５９】
他の実施例では、偏光子１１６は、偏光子配向時間行列を生成するために、２つ以上の偏光子配向においてビームを選択的に出力する。この実施例では、記録装置１３６は、単一放出波長λｊにおいてデジタイザ１３２からデジタル化信号１３４ｊを受け取り、少なくとも２つの偏光子配向の蛍光減衰曲線を含む偏光子配向時間行列を出力する。一実施例では、記録装置１３６は、複数レーザ・ショットのデジタル蛍光減衰曲線を合計し、合計された蛍光減衰曲線をレーザ・ショットの数によって除算することによって、各偏光子配向においてデジタル蛍光減衰曲線を平均する。記録装置１３６の出力は、したがって少なくとも２つの偏光子配向の平均蛍光減衰曲線を含む偏光子配向時間行列を備え、その後の数学的処理及び分析に適切である。
【００６０】
サンプル１０８は、不変な組成の物質を意味すると解釈されるべきではない。サンプル１０８の組成及び性質は、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のカラムから材料が溶出する場合、又はサンプルが化学反応を受ける場合など、時間と共に変化することがある。他の実施例では、サンプル１０８は、地面表面（ｇｒｏｕｎｄ  ｌｅｖｅｌ）より下の異なる深さにおいて探査される１セットの土壌サンプル、マイクロプレートの壁にある１セットの離散サンプル、ある程度平坦な表面上における１セットの様々な位置などを実際に表す。これらの場合、パラメータ時間行列は、データ・セットの各要素について得て、処理することができ、例えば、パラメータ時間行列が反復して得られ、各個々のパラメータ時間行列は、様々な溶出時間、地面表面より下の深さ、マイクロプレートの壁、表面上の位置などに対応する指標によってラベル付けされる。
【００６１】
図１及び６に示されるプロット１３８は、ＨＰＬＣについて、波長時間行列などの例示的なセットのパラメータ時間行列のグラフ表示である。プロット１３８は、実施例を意図し、放出波長時間行列が、光ファイバ遅延線を使用することにより、単一強度対時間記録について符号化される実施例のグラフ表示として見ることができる。異なるサンプル指標は、異なる溶出時間に対応する。
【００６２】
信号プロセッサ１３０の分析装置１４０は、記録装置からパラメータ時間行列を受け取り、パラメータ時間行列（励起波長又は放出波長或いは偏光子配向）内に含まれるデータに対する少なくとも１つの蛍光構成要素の寄与の数値を出力する。一実施例では、分析装置１４０は、パラメータ時間行列内に含まれるデータを解釈するために、ＳＩＭＰＬＥＸアルゴリズムなどのアルゴリズムを実施するＭＡＴＬＡＢなどのコンピュータ・プログラムである。
【００６３】
パラメータ時間行列は、ｍ×ｎ行列［Ｄ］として表すことができ、ｍは行列の行の数、ｎは行列の列の数である。一実施例では、ｍは各蛍光減衰曲線の減衰時間増分の数、ｎは放出波長の数である。他の実施例では、ｍは各蛍光減衰曲線の減衰時間増分の数、ｎは励起波長の数である。他の実施例では、ｍは各蛍光減衰曲線の減衰時間増分の数、ｎは偏光子配向の数である。分析のために、行列［Ｄ］は、２つの行列の積として表すことができる。
［Ｄ］＝［Ａ］×［Ｃ］  （１）
上式で、Ａは、列がサンプル１０８のｐ放出成分の蛍光スペクトルを含むｍ×ｐ行列、［Ｃ］は、行がｐ放出成分の蛍光減衰曲線を含むｐ×ｎ行列である。式（１）に示される積の表示は、線形検出器応答の想定に基づき、サンプルの各成分の応答とは独立である。
【００６４】
行列［Ｄ］を成分［Ａ］及び［Ｃ］に分解することによって、分析装置１４０は、サンプル１０８の個々の成分を特定し、蛍光スペクトル及び減衰動態の表示を構築する。一実施例では、分析装置１４０は、式（２）のようにモデル行列［Ｄ’］を構築することによって行列［Ｄ］を分解する。
［Ｄ’］＝［Ａ’］×［Ｃ’］  （２）
【００６５】
一実施例では、分析装置１４０は、以下の式（３）を使用することによって［Ｃ’］を構築する。
【００６６】
【数１】
2007501414.tif 000003
上式で、ｑはｑ番目のデジタル化間隔、Ｅｑはｑ番目のデジタル間隔におけるビーム１０４のパルスの強度、τｓはサンプル１０８のｓ番目の成分の寿命、Δｔはデジタル化時間間隔である。分析装置１４０は、τｓ値の試行セットに基づいて成分［Ｃ’］を計算する。
【００６７】
分析装置１４０は、下式から［Ａ’］を決定する。
［Ａ’］＝［Ｄ］［Ｃ’］Ｔ（［Ｃ’］［Ｃ’］Ｔ）−１  （４）
上式で、上付き文字Ｔは、対応する行列の転置を表す。
【００６８】
分析装置１４０は、［Ｃ’］及び［Ａ’］を使用して式（２）から［Ｄ’］を決定する。分析装置１４０は、下式から［Ｄ’］の成分と［Ｄ］の対応する成分との差の２乗の合計を計算することによって、［Ｄ’］を［Ｄ］と比較する。
【００６９】
【数２】
2007501414.tif 000004
上式でＤｑ，ｒ及びＤ’ｑ，ｒは、［Ｄ］及び［Ｄ’］のｑ−ｒ成分によってそれぞれ表される。χ２の値は、τｓ値の試行セットに依存することに留意されたい。分析装置１４０は、χ２が最小になるまで、τｓ値の試行セットを変化させる。
【００７０】
χ２が最小であるとき、τｓ値の対応するセットは、サンプル１０８のそれぞれの成分の寿命を表す。更に、χ２の最小値に対応する［Ａ］行列は、成分の濃度に関係するスケーリング・ファクタによって乗算されたサンプル１０８のそれぞれの成分のスペクトルを与える。
【００７１】
サンプル１０８が変化している実施例では、１つが各離散サンプル、溶出時間、深さ、表面上の位置などについてである、一連のパラメータ時間行列を収集することが好都合かつ適切である。一連の各要素は、サブサンプルと呼ばれる。各サブサンプルのパラメータ時間行列は、上述された方式で独立に分析することができる。しかし、所与の成分が、サブサンプルの多く、おそらくは更にはすべてに存在することがある。成分の蛍光スペクトル及び寿命は、サブサンプルごとに変化しないことが予期されるが、濃度は変化する。
【００７２】
一実施例では、パラメータ時間行列が、既知の組成の基準サンプルについて測定される。測定されたパラメータ時間行列は、基準パラメータ時間行列と非負最小２乗はめ込みアルゴリズムとの線形組合せとして表すことができる。
【００７３】
他の実施例では、分析装置１４０は、サンプル１０８から得られる各パラメータ時間行列を単一列ベクトルｄとして書く。一実施例では、サンプル１０８から得られるパラメータ時間行列は、放出波長時間行列である。他の実施例では、サンプル１０８から得られるパラメータ時間行列は、励起波長時間行列である。他の実施例では、パラメータ時間行列は、偏光子配向時間行列である。分析装置１４０は、式（６）のように、未知の列ベクトルｃと行列［Ｂ］との積として列ベクトルを表す。
ｄ＝ｃ×［Ｂ］  （６）
式（６）において、行列［Ｂ］は、１セットの対象成分の測定パラメータ時間行列である。
【００７４】
行列［Ｂ］の各列は、対象成分の１つの減衰プロファイルである。各減衰プロファイルは、装置１００のサンプル１０８を対象化合物と置き換えることによって得られる。各対象化合物は、サンプル１０８に存在することが既知である、又は推測される。
【００７５】
他の実施例では、［Ｂ］の第１列は、［Ｂ］の他の列と比較可能な強度にスケーリングされた背景プロファイルである。背景プロファイルは、最低強度を有するサブサンプルのパラメータ時間行列の完全データ・セットを調査することによって選択される。これらの低強度サンプルのパラメータ時間行列は、平均され、平均は、背景プロファイルとして扱われる。
【００７６】
分析装置１４０は、ベクトルｄの観測減衰プロファイルを生成するために、［Ｂ］からの各減衰プロファイルがどの程度必要であるかを示す１セットの係数をベクトルｃにおいて生成するために、式（６）を解く。これにより、サンプル１０８の化合物及びその濃度の特定が可能になる。一実施例では、分析装置１４０は、混合物に存在し得る基準化合物の減衰プロファイルに基づいて観測減衰プロファイルを複製するために、曲線近似手順を使用する。他の実施例では、分析装置１４０は、ベクトルｃの値を見つけるために、非負最小２乗手法を使用する。ベクトルｃの値を見つけるために、行列［Ｂ］を形成し、非負最小２乗手法を使用して式（６）を解く詳細は、米国特許第５８２８４５２号、名称ＳＰＥＣＴＲＯＳＣＯＰＩＣ  ＳＹＳＴＥＭ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＳＩＮＧＬＥ  ＣＯＮＶＥＲＴＥＲ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＲＥＭＯＶＩＮＧ  ＯＶＥＲＬＡＰ  ＩＮ  ＴＩＭＥ  ＯＦ  ＤＩＲＥＣＴＥＤ  ＥＭＩＳＳＩＯＮＳ、１９９８年１０月２７日出願において与えられており、参照によって本明細書に組み込まれている。
【００７７】
本発明の実施例が記述された。実施例は、これまで利用不可能であった速度及び精度のレベルにおいて、蛍光減衰曲線及び２次パラメータ時間行列を生成する手段を提供する。
【００７８】
特定の実施例が本明細書において示され、記述されたが、当業者なら、同じ目的を達成するために計算されるあらゆる構成が、示されている特定の実施例について代用されることが可能であることを理解するであろう。本明細書は、本発明のあらゆる適合又は変形を網羅することを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の一実施例を示すブロック図である。
【図２ａ】本発明の教示によるパルス化光源の実施例を示すブロック図である。
【図２ｂ】本発明の教示によるパルス化光源の実施例を示すブロック図である。
【図３】本発明の教示による蛍光波長選択装置の実施例を示す図である。
【図４】本発明の教示による蛍光波長選択装置の実施例を示す図である。
【図５】本発明の教示による蛍光波長選択装置の実施例を示す図である。
【図６】本発明の教示による波長時間行列の例示的なセットを示すグラフである。
【図７】本発明の一実施例によるデジタイザを示す図である。
【図１】
2007501414.tif 000005
【図２ａ】
2007501414.tif 000006
【図２ｂ】
2007501414.tif 000007
【図３】
2007501414.tif 000008
【図４】
2007501414.tif 000009
【図５】
2007501414.tif 000010
【図６】
2007501414.tif 000011
【図７】
2007501414.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年1月25日(2006.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルの蛍光減衰特性の迅速かつ鋭敏な定量分析を提供する装置であって、
出力が前記サンプルにおいてパルス化蛍光を生成する、励起光パルスを生成する反復パルス化励起光源と、
前記サンプルから生じる前記パルス化蛍光の一部を入力として受け取り、波長が指定波長範囲内にある蛍光光子を出力する蛍光波長選択装置と、
前記蛍光波長選択装置から入力として前記指定波長範囲内の前記蛍光光子を受け取り、時間依存電気信号を出力する光検出器と、
アナログ電圧又は電荷の時系列として前記時間依存電気信号の表示を記憶し、アレイの連続要素が４ｎｓより大きくない時間増分に対応する、メモリ要素のアレイと、
アナログ電圧又は電荷の前記時系列を対応するデジタル化蛍光波形に変換するアナログ・デジタル変換器と、
を備える装置。
【請求項２】
前記励起光パルスの持続時間が１ｎｓ未満である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記光源が、毎秒１００以上のパルスを放出するように適合される、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記蛍光波長選択装置が、音響光学同調可能フィルタ、モノクロメータ、及びスペクトルグラフの１つを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記光検出器が、光電子倍増管、マルチアノード光電子倍増管、マイクロチャネル・プレート光電子倍増管、フォトダイオード、及びアバランシェ・フォトダイオードの１つを備える、請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記光源が、様々な励起波長において前記励起光パルスを選択的に出力するために、入力パルス化レーザ及び励起波長変換器を備える、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記サンプルと前記光検出器との間に配置される偏光子を更に備える、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
前記パルス化光源と前記サンプルとの間に配置される波長板を更に備える、請求項１に記載の装置。
【請求項９】
サンプルにおいてパルス化蛍光を励起する複数の前記光パルスでサンプルを照射するステップと、
指定波長範囲内において前記サンプルから前記パルス化蛍光の一部を選択するステップと、
前記パルス化蛍光の前記選択部分に基づいて、時間依存電気信号を生成するステップと、
メモリ要素のアレイにおいてアナログ電圧又は電荷の時系列として前記時間依存電気信号の表示を記憶し、前記アレイの連続要素が４ｎｓより大きくない時間増分に対応するステップと、
アナログ電圧又は電荷の前記時系列を対応するデジタル化蛍光波形に変換するステップと、
少なくとも２つの放出波長、又は少なくとも２つの励起波長、或いは励起パルスの偏光に対する少なくとも２つの蛍光偏光子配向についてデジタル化蛍光波形のパラメータ時間行列を記録するステップと、
前記サンプルの少なくとも１つの蛍光成分について、濃度、蛍光寿命、又は回転相関時間の数値を決定するために、前記パラメータ時間行列のデータを分析するステップと、
を備える蛍光方法。
【請求項１０】
前記パラメータ時間行列を分析するステップが、対象化合物について基準パラメータ時間行列を使用するステップを備える、請求項９に記載の方法。
【国際調査報告】
2007501414.tif 000013
2007501414.tif 000014