(57)【要約】本発明は、腫瘍指向性の幹細胞（特に、神経幹細胞）、ならびに、新生物形成の病巣への治療遺伝子産物のための送達ビヒクルとしてのその使用に関する。腫瘍指向性ポテンシャルを有する幹細胞は、幹細胞のＣＸＣＲ４レセプターまたはケモカインＳＤＦ−１に対する親和性の提示に基づいて選択される。幹細胞は、さらに、星状細胞前駆体に特徴的なマーカーを提示し得る。幹細胞は、ケモカインＳＤＦ−１を含む処置レジメンの一部として投与され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された幹細胞であって、該幹細胞は、該幹細胞がＣＸＣＲ４レセプターを提示すること、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を示すこと、またはそれら両方に基づいて該幹細胞を選択する工程を包含する方法によって単離される、単離された幹細胞。
【請求項２】
前記単離された幹細胞は、星状細胞に分化した幹細胞の前駆体に特徴的なマーカーを提示する、請求項１に記載の単離された幹細胞。
【請求項３】
前記単離された幹細胞は、Ａ２Ｂ５星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項２に記載の単離された幹細胞。
【請求項４】
前記単離された幹細胞は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項２に記載の単離された幹細胞。
【請求項５】
前記単離された幹細胞は、異種遺伝子を含む、請求項１に記載の単離された幹細胞。
【請求項６】
前記異種遺伝子は、疾患状態の処置において治療的に使用するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の単離された幹細胞。
【請求項７】
前記ポリペプチドは細胞傷害性である、請求項６に記載の単離された幹細胞。
【請求項８】
前記ポリペプチドは免疫応答に関与する、請求項６に記載の単離された幹細胞。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、ＩＬ−１２である、請求項８に記載の単離された幹細胞。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、ＩＬ−４である、請求項８に記載の単離された幹細胞。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）である、請求項８に記載の単離された幹細胞。
【請求項１２】
前記単離された幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項１に記載の単離された幹細胞。
【請求項１３】
幹細胞の腫瘍指向性ポテンシャルを評価するための方法であって、該方法は、
幹細胞を提供する工程；
該幹細胞によるＣＸＣＲ４の発現レベル、該幹細胞によるケモカインＳＤＦ−１に対する親和性、またはそれら両方を決定する工程；および
該ＣＸＣＲ４の発現レベル、該ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性、またはそれら両方に基づいて該幹細胞の腫瘍指向性ポテンシャルを評価する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記幹細胞が、星状細胞に分化した幹細胞の前駆体に特徴的なマーカーを提示する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が、Ａ２Ｂ５星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞が、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物において疾患状態を処置するための方法であって、該方法は、
ＣＸＣＲ４レセプターを提示する幹細胞、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を示す幹細胞、またはそれら両方の幹細胞を提供する工程；
該幹細胞を該疾患状態を処置するのに十分な量で該哺乳動物に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記幹細胞が、星状細胞前駆体細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記幹細胞が、星状細胞に分化した幹細胞の前駆体に特徴的なマーカーを提示する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記幹細胞が、Ａ２Ｂ５星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記幹細胞が、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記幹細胞が、異種遺伝子を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記異種遺伝子が、前記疾患状態の処置において治療的に使用するポリペプチドをコードする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが細胞傷害性である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、免疫応答に関与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、ＩＬ−１２である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、ＩＬ−４である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾患状態が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、星状細胞腫、上衣細胞腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫ならびに未分化神経外胚葉性腫瘍からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
前記幹細胞を投与する工程が、ビヒクル、添加剤、薬学的補助剤、治療用化合物、キャリア、疾患状態の処置に有用な因子およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分をさらに含む組成物中に、該幹細胞を投与する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
一定量のケモカインＳＤＦ−１を前記哺乳動物に投与する工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項３３】
前記幹細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項３４】
キットであって、
ＣＸＣＲ４レセプターを提示する一定量の幹細胞、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を示す一定量の幹細胞、またはそれら両方の幹細胞；ならびに
哺乳動物における疾患状態の処置において該一定量の幹細胞を使用するための指示書
を備える、キット。
【請求項３５】
前記一定量の幹細胞が、ビヒクル、添加剤、薬学的補助剤、治療用化合物、キャリア、疾患状態の処置に有用な因子およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分をさらに含む組成物中に含まれる、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記疾患状態が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、星状細胞腫、上衣細胞腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫ならびに未分化神経外胚葉性腫瘍からなる群より選択される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
前記幹細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
一定量のケモカインＳＤＦ−１、および前記疾患状態の処置において該一定量のケモカインＳＤＦ−１を使用するための指示書をさらに備える、請求項３４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本明細書中に記載される本発明は、少なくとも部分的に、セダーズ−シナイ  メディカル  センターに対して、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより与えられた助成金番号ＮＳ０２２３２の下で生じたものである。政府は、本発明に特定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、癌のような種々の疾患状態を処置および予防することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
グリア新生物としても知られている、中枢神経系（ＣＮＳ）の癌は、研究の優先事項であり続けている。グリア新生物としては、多くの異種性腫瘍（例えば、星状細胞腫、上衣細胞腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫および未分化神経外胚葉腫瘍）が挙げられる。悪性の神経膠腫の発生率は、癌の他の形態と比較して低いものの、グリア新生物は、致死的であり、かつ処置が困難である。さらに、外科的技術およびアジュバント療法における進歩にも関わらず、悪性のグリア腫瘍を有する患者の予後は、暗いままである。例えば、悪性の神経膠腫、多形性神経膠芽細胞腫の最も一般的かつ活動的な形態は、１年生存率および２年生存率が０に近づく、診断後のメジアン生存時間を有する（非特許文献１）。
【０００４】
外科的な切除とそれに続く照射および／または化学療法を中心とする、現在使用されている治療的アプローチの失敗は、これらの腫瘍の非常に播種性の性質に根ざしている。高いグレードの神経膠腫は、高度に浸潤性の新生物であり、単発性の腫瘍細胞または新生物細胞のクラスターが、脳全体にわたって、しばしば中心的な腫瘍から有意な距離まで移動する。積極的な治療にもかかわらず、これらの腫瘍病巣の全てを首尾よく排除することはほぼ不可能であり、この病巣は、最終的に、この病巣の近くでの普遍的な腫瘍再発のためのリザーバとして機能し；それにより、この疾患の不可避な死亡率に寄与する。
【０００５】
照射および化学療法を含む標準的なアジュバント治療は、長期の生存に小幅の効果を有するが、患者の予後に意味のあるあらゆるインパクトを達成することができていない。悪性の神経膠腫のための首尾よい治療様式の開発は、従って、原発性の腫瘍塊の外科的な切除後に、全ての生存可能な頭蓋内の新生物リザーバを排除する手段を考案する能力が、中心となる。今のところ、これは、疾患プロセスの非常に播種性の性質、そして、現在、残っている腫瘍細胞ごとを適切に可視化し、治療的に標的化することができていないことを考慮すると、困難な課題のままである。
【０００６】
移動した腫瘍サテライトに対して特別に指向させた処置の１つの有望な手段は、神経幹細胞（ＮＳＣ）の使用を包含する。ＮＳＣは、中枢神経系の多能性前駆体細胞またはニューロンのグリア前駆体であり、胚性、胎児、新生児、または成人の組織に由来し得、そして、長期の持続的なインビトロ増殖、およびニューロンまたはグリアの発生運命への最終的な分化が可能である（非特許文献２）。さらに、ＮＳＣは、げっ歯類において確立された頭蓋内神経膠腫に接種されたとき、インビボで神経膠腫細胞を播種させるための強力な指向性を示す。具体的には、ＮＳＣは、注射の最初の部位から離れて移動し、原発性の腫瘍塊から離れて広がった腫瘍サテライトと共に散らばるか、またはその近位へと追跡し、これらを薬物／処置送達のための第一の候補とする（非特許文献３；非特許文献４）。さらに、他の型の幹細胞を使用する癌の処置がまた、成功することが実証されている。例えば、造血幹細胞が、卵巣癌のような婦人科系の固形腫瘍の処置のための治療ストラテジーを作るために使用されている（非特許文献５）。
【０００７】
腫瘍傷害性ケモカインを分泌するように遺伝子操作された幹細胞は、この様式で、有意な生物活性を有するこれらの治療的タンパク質を、直接これらの播種した新生物病巣に送達し得る。特に、免疫刺激性サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）−１２およびＩＬ−４、ならびに、アポトーシス促進性タンパク質腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）を分泌する特定のＮＳＣ集団は、腫瘍ポケットの移動を標的化するために使用され、腫瘍負荷の減少および生存の延長をもたらしている（非特許文献４；非特許文献６；非特許文献７）。さらに、幹細胞の治療送達用ビヒクルとしての使用は、有望な前臨床の結果を提示している。
【０００８】
しかし、患者におけるこの技術の使用は、有意な制限である鍵（中でも、臨床的に利用可能であり、かつ法律的に利用可能な腫瘍指向性ニューロン前駆体の供給源の単離である）により、なおも妨げられている。しかし、この分野は、多能性のニューロン前駆体が由来し得る、代替的な組織供給源に関する近年の報告により例示されるように、発展している（非特許文献８；非特許文献９）。
【０００９】
さらなる問題は、幹細胞の指向性挙動を支配する正確な機構がほとんど理解されていないという事実にある。初期の観察は、多くの腫瘍内接種された幹細胞が、強い移動活性および腫瘍追跡能を示したが、かなりの集団の移植された幹細胞は、この挙動を示さず、最初に頭蓋内注射した部位に局在し続けたことを実証している（非特許文献４）。高いグレードの神経膠腫に付随するひどい予後を鑑みると、トランスレーショナルポテンシャル（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を用いた新規治療を開発する、急を要する必要性が存在する。従って、当該分野では、浸潤性の新生物を処置および予防する方法に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｓｕｒａｗｉｃｚ，Ｔ．Ｓ．ら、「Ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．，（１９９８）Ｖｏｌ．４０，ｐ．１５１−１６０
【非特許文献２】Ｃａｉ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｆｅｔａｌ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（ＮＥＰ  ｃｅｌｌ）」，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，（２００２）Ｖｏｌ．２５１，ｐ．２２１−２４０
【非特許文献３】Ａｂｏｏｄｙ，Ｋ．Ｓ．ら、「Ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｂｒａｉｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（２０００）Ｖｏｌ．９７，Ｎｏ．２３  ｐ．１２８４６−１２８５１
【非特許文献４】Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（２００２）Ｖｏｌ．６２，ｐ．５６５７−５６６３
【非特許文献５】Ｐｅｒｉｌｌｏ，Ａ．ら、「Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ」，Ｐａｎｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄ．，（２００４）Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．１，ｐ．４９−５９
【非特許文献６】Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，Ｓ．ら、「Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ」，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，（２０００）Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．４  ｐ．４４７−４５０
【非特許文献７】Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２００２）Ｖｏｌ．６２，ｐ．７１７０−７１７４
【非特許文献８】Ｊｉａｎｇ，Ｙ．ら、「Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｍａｒｒｏｗ」，Ｎａｔｕｒｅ，（２００２）Ｖｏｌ．４１８，ｐ．４１−４９
【非特許文献９】Ｋａｂｏｓ，Ｐ．ら、「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｗｈｏｌｅ  ａｄｕｌｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ」，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，（２００２）Ｖｏｌ．１７８，ｐ．２８８−２９３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
哺乳動物における疾患状態を処置するために有用な単離された幹細胞が本明細書中に記載される。この幹細胞は、ＣＸＣＲ４レセプター、星状細胞に分化した幹細胞に特徴的なマーカーおよび／またはケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を提示し、そして、任意の従来の手段（例えば、腫瘍内接種）によって哺乳動物に投与され得る。この幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）であり得る。さらに、本発明の幹細胞は、疾患状態の処置のために細胞傷害性サイトカインを分泌するように遺伝子操作され得る。本発明の幹細胞を含有する組成物は、さらに、アジュバントのようなさらなる成分を含有して、治療的に簡便な処方を提供し、そして／または、幹細胞の生化学的送達および効率を高め得る。さらに、本発明の幹細胞を用いて癌を処置または予防する方法が提供される。なおさらに、本発明の幹細胞を用いて癌を処置または予防する方法は、必要に応じて、ケモカインＳＤＦ−１を用いる現行の処置を包含し得る。
【００１１】
本発明の実施形態は、腫瘍指向性ポテンシャルを有する幹細胞を選択するための方法を提供する。本発明の方法は、幹細胞のＣＸＣＲ４レセプターおよび／またはケモカインＳＤＦ−１に対する親和性の提示に基づいて幹細胞を選択する工程を包含する。さらに、本発明の種々の実施形態に従って腫瘍指向性ポテンシャルを有する幹細胞を選択するための方法は、星状細胞前駆体に特徴的なマーカーのようなさらなるマーカー（例えば、Ａ２Ｂ５またはグリア繊維状酸性タンパク質（ＧＦＡＰ））の存在に基づいて選択する工程をさらに包含し得る。
【００１２】
本発明の実施形態は、さらに、本発明の幹細胞を使用することによって、哺乳動物において疾患状態を処置する方法を提供する。本発明の方法は、任意の従来の手段（例えば、腫瘍内接種）によって幹細胞を投与する工程を包含する。さらに、本発明の方法は、ＣＸＣＲ４レセプター、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性、および必要に応じて、星状細胞に分化した幹細胞に特徴的なマーカーを提示する幹細胞の投与を包含し得る。この幹細胞は、アジュバントのようなさらなる成分と共に投与されて、治療に簡便な処方を提供するか、そして／または組成物の生化学送達および効力を高め得る。本発明の方法は、ケモカインＳＤＦ−１の投与を包含し得る。なおさらに、本発明の方法は、癌のような種々の疾患状態の処置に有用であり得る。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態は、本発明の幹細胞を用いて哺乳動物を処置する際に使用するためのキットを提供する。本発明のキットは、本発明の方法と整合性の取れた様式で使用するための指示書と共に一定量の本発明の幹細胞を包含する。さらに、本発明のキットは、一定量のケモカインＳＤＦ−１を包含し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
（Ａ．定義）
特に定義されない限り、本明細書中で使用される科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）；Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  第４版  Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）；ならびに、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２００１）は、本願において使用される用語の多くに対する一般的なガイドを当業者に提供する。
【００１５】
当業者は、本明細書中に記載される方法および材料に類似するかまたは等価である多くの方法および材料を認識し、これらは、本発明を実施する際に使用され得る。実際、本発明は、決して記載される方法および材料に限定されない。本発明の目的のために、以下の用語が、以下に定義される。
【００１６】
特定の癌および／またはその病理を「緩和する」とは、腫瘍を分解すること、例えば、腫瘍の構造完全性または結合組織を崩壊させて、その結果、処置前の腫瘍サイズと比べて腫瘍サイズが減少することを包含する。癌の転移を「緩和する」とは、癌が他の器官に広がる速度を低下させることを包含する。
【００１７】
「有益な結果」とは、疾患状態の重篤度を減少または緩和させること、疾患状態が悪化することを防ぐこと、疾患状態を治癒すること、および患者の生命または余命を延長することが挙げられ得るがこれらに限定されない。疾患状態は、中枢神経系に関連し得るか、または中枢神経系により調節され得る。
【００１８】
「癌」および「癌性」とは、代表的には、制御されていない細胞の増殖により特徴付けられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。癌の例としては、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、および脳腫瘍（星状細胞腫、上衣細胞腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫、および未分化神経外胚葉腫瘍が挙げられるがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、「状態」および「疾患状態」としては、任意の形態の癌；特に、星状細胞腫、上衣細胞腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫、および未分化神経外胚葉腫瘍が挙げられ得るがこれらに限定されない。
【００２０】
癌を「治癒する」とは、腫瘍が処置後に検出され得ないように腫瘍を分解することを包含する。腫瘍は、例えば、血液供給の欠如による萎縮によってか、または、本発明に従って投与される１つ以上の成分により攻撃もしくは分解させることによって、サイズが減少し得るか、または検出できなくなり得る。
【００２１】
「サイトカイン」は、細胞内メディエーターとして別の細胞に作用する、１つの細胞集団により放出されるタンパク質についての一般的な用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ））；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミューラー阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経増殖因子（ＮＧＦ）（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板増殖因子；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、および−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ））；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β）；ならびに他のポリペプチド因子（ＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む）である。本明細書中で使用される場合、サイトカインとの用語は、天然の供給源に由来するタンパク質、または組換え細胞培養物に由来するタンパク質、および、ネイティブな配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を包含する。
【００２２】
「提示する」または「提示すること」は、一般に、何かの外向きな存在または表示をいう。例えば、この用語は、細胞表面マーカーまたは膜貫通マーカーの存在または表示を指し得る。
【００２３】
本明細書中で使用される場合「単離された」は、組換え技術により製造された場合に他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まないか、または、化学的に合成された場合に化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない、純化された神経幹細胞を包含する。
【００２４】
本明細書中で使用される場合「哺乳動物」は、Ｍａｍｍａｌｉａ網に入る全てのメンバーを指し、これらとしては、ヒトおよび非ヒト霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿、およびサル種）；家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ）；家庭の哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）；実験動物（マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む）などが挙げられるがこれらに限定されない。この用語は、特定の年齢または性別は意味しない。従って、成人および新生児の被験体、ならびに胎児は、雄性であれ雌性であれ、この用語の範囲内に包含されることが意図される。
【００２５】
「神経幹細胞」および「神経前駆体」またはＮＳＣは、より多くの細胞を生じる、大規模な増殖能力を有する多能性の未分化細胞、ならびに、最終的にはニューロンおよび支持グリア細胞の両方に分化し得る前駆体を指す。
【００２６】
癌の「病理」とは、患者の健康を損なう全ての現象を包含する。病理としては、異常または制御不能な細胞増殖、転移、隣接する細胞の正常な機能の干渉、異常なレベルでのサイトカインもしくは他の分泌生成物の放出、炎症性もしくは免疫学的な応答の抑制または悪化、新生物形成、前癌状態、悪性腫瘍、周囲もしくは遠隔の組織もしくは器官（例えば、リンパ節）の浸潤などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２７】
「幹細胞」は、多くの細胞を生じる、大規模な増殖能を有する、あらゆる組織に由来する全能性の未分化細胞、ならびに、最終的にあらゆる組織（例えば、神経幹細胞を含む）に分化し得る前駆体を指す。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、「処置」および「処置すること」は、治療的処置および予防的な処置の両方を指し、ここで、目的は、その処置が最終的には失敗に終わったとしても、標的とする病理学的状態または障害を、予防または減速（軽減）させることである。処置を必要とする被験体としては、すでに障害を有する被験体、ならびに、障害を有しがちな被験体、または障害が予防されるべき被験体が挙げられる。腫瘍（すなわち、癌）の処置において、治療因子は、腫瘍細胞の病理を直接減少し得るか、または、他の治療因子（例えば、照射および／または化学療法）による処置に対して腫瘍細胞をより感受性にし得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、悪性であれ良性であれ、全ての新生物細胞の増殖および過形成（ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、そして、全ての前癌および癌性細胞および組織を指す。
【００３０】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明は、頭蓋内神経膠腫の治療モデルにおいて利用される幹細胞集団の腫瘍指向性成分が、有意なレベルのＣＸＣケモカインレセプター４（ＣＸＣＲ４）を発現する星状細胞前駆体を含むという、驚くべき発見に基づいている。このＣＸＣＲ４は、発生段階の脳におけるニューロンおよびグリア前駆体を含む、種々の細胞型において細胞の移動を支配し、帰巣させると考えられている、ケモカインレセプターである。ＣＸＣＲ４に対する唯一の公知のリガンドである間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）の神経膠腫細胞による産生が、組織学的グレード、腫瘍細胞の生存、および侵襲性と相関したことが、近年報告された（Ｒｅｍｐｅｌ，Ｓ．Ａ．ら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＳＤＦ１  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＸＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４，ｔｏ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ」，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６，ｐ．１０２−１１１（２０００）；Ｂａｒｂｅｒｏ，Ｓ．ら、「Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ  １／２  ａｎｄ  Ａｋｔ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６３，ｐ．１９６９−１９７４（２００３））。本発明の方法が基づくデータは、少なくとも部分的に、「探し求め、破壊する」という腫瘍指向性の移動という治療的に関連する挙動を示す、全身性の幹細胞集団における特定の細胞の重要な特徴を描写する。これらの特徴は、Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  Ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ．５６５７−５６６３（２００２）、およびＥｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｇｌｉｏｍａ  Ｔｒｏｐｉｃ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ  Ａｓｔｒｏｃｙｔｉｃ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｉｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＸＣＲ４」，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．３，ｐ．２８７−２９３（２００４）に記載されている。これらの刊行物は、その全体が、本明細書中で、本明細書により参考として援用される。これらのマーカーの使用、およびこれらの移動性下位集団の特徴づけに関するさらなる研究は、肝細胞の下位集団を純化することを可能にし、このことは、インビボで播種性の腫瘍サテライトに対する指向性を支配し、従って、この設定において幹細胞の治療ポテンシャルの最適化を可能にするキューに対してますます応答性にする。
【００３１】
幹細胞の接種は、腫瘍指向性活性、および幹細胞が接種の地点に局所的に留まることにより特徴付けられる。これは、インビボで接種された幹細胞集団における異なる表現型プロフィールの結果である。この文脈において、幹細胞接種材料において観察される腫瘍指向性能は、分化の特定の段階にある幹細胞の特定の下位集団により提示される。インビボ神経膠腫追跡幹細胞は、発生段階の脳における幹細胞の移動に関連する公知の化学走性のキューに対して応答性を示す、ケモカインレセプターのような表現型マーカーを発現する。悪性の神経膠腫にもまた特異的である、ケモカインレセプターを提示するこれらの追跡幹細胞は、癌、および幹細胞に対して受容性である他の状態の処置に特に有効であり得る。
【００３２】
本発明の１つの実施形態において、悪性の神経膠腫に指向性の単離された幹細胞としては、ＣＸＣＲ４レセプターを提示する幹細胞が挙げられる。さらに、単離された幹細胞としては、さらに、ケモカインＳＤＦ−１に対して親和性を提示する幹細胞が挙げられ得る。単離されたＮＳＣは、本発明のこれらの実施形態と関連して、特に有用であり得る。本発明の別の実施形態において、本発明と関連して使用される単離された腫瘍指向性の幹細胞はまた、星状細胞または星状グリア細胞に分化した幹細胞に特徴的なマーカーを提示し得る；これらの幹細胞は、さらに腫瘍指向性ポテンシャルを有する。ここでも、ＮＳＣは、本発明のこの実施形態に関連して、特に適切な幹細胞であり得る。マーカーとしては、Ａ２Ｂ５および／またはＧＦＡＰが挙げられ得るが、また、Ｓｏｘ−２、段階特異的胚性抗原（ＳＳＥＡ）−１、Ｓ−１００、Ｈｅｓ−１、Ｎｏｔｃｈ−１、４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、神経細胞表面分子の胚形態（Ｅ−ＮＣＡＭ）、興奮性アミノ酸トランスポーター（ＥＡＡＴ）１、ＥＡＡＴ２、血小板由来増殖因子レセプター−α（ＰＤＧＦＲα）、サイクリック２’，３’−ヌクレオチド−３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、およびβ−ＩＩＩチューブリンが挙げられ得るがこれらに限定されない；当業者に容易に理解されるように、他の機能的に関連するマーカーが、追加しておよび／または代わりに存在し得、そして、多くのさらなるマーカーがまた存在し得る。
【００３３】
さらに、本発明の別の実施形態において、ＣＸＣＲ４レセプターおよび／または星状細胞の分化に特徴的な他のマーカーを提示する単離された幹細胞は、幹細胞のこれらのレセプターおよびマーカーの提示に基づいて選択され得る。なおさらに、単離された幹細胞は、幹細胞のケモカインＳＤＦ−１に対する親和性の提示に基づいて選択され得る。これらのレセプターおよびマーカー、またはケモカインに対する親和性の存在に基づく、これらの幹細胞の選択は、過度の実験を行なうことなく、当業者により簡便な方法により容易に達成され得る。例えば、選択の方法は、蛍光細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）、親和性カラム、親和性ビーズ、または、特定の細胞表面分子に選択的に結合する任意の方法を含み得る。あるいは、上記方法は、幹細胞によって発現されない細胞表面分子を使用して所望されない細胞を選択的に除去または殺傷し、そして、このやり方で、所望の細胞を富化し得る。あるいは、上記方法は、幹細胞に選択的に結合する磁気ビーズの使用を包含し得る。
【００３４】
単離された幹細胞は、当業者により容易に認識されるように、単一の因子としての使用、併用療法における使用、または、本明細書中に列挙されないさらなる成分との使用に適切であり得る。
【００３５】
幹細胞が特定の因子と接触したときに、分化が生じる。例えば、幹細胞が、ウシ胎仔血清、または他の形態形成因子の存在下で増殖するとき、幹細胞は、これらに種々の細胞型、または分化度の低い幹細胞に分化し得る。例えば、ＮＳＣは、神経細胞またはグリア細胞（ニューロン、グリア細胞、希突起神経膠細胞、および星状細胞を含む）に分化する。
【００３６】
幹細胞を、特定の型の神経細胞または他の型の前駆体に分化させ得る多くの分化因子が当業者に公知である。従って、本明細書において単離された幹細胞が、当業者に公知の任意に手段によって分化され得ることが想定される。分化因子のいくつかの例としては、インターフェロン−γ、ウシ胎仔血清、神経増殖因子、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を取り除くこと、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を取り除くこと、ニューロジェニン（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ）、脳に由来する神経指向性因子（ＢＤＮＦ）、甲状腺ホルモン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、超音波ヘッジホッグ（ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）（ｓｈｈ）、グリア細胞株由来の神経指向性因子（ＧＤＮＦ）、脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン、インターフェロン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、アクチビン、インヒビン、ケモカイン、レチノイン酸および毛様体の神経指向性因子（ＣＮＴＦ）が挙げられるがこれらに限定されない。さらに、幹細胞は、永久的または一過性に分化され得る。例えば、幹細胞は、そのマーカーを識別のために使用するために、一過性に分化させてそのマーカーを発現させ得、その後、分化因子を取り除いて、マーカーがもはや発現しないようにし得る。しかし、分化の文脈において、インターフェロン−γのような因子は、異なるマーカーの発現を誘導するものの、古典的な分化因子としては分類され得ないことが理解されるべきである。
【００３７】
当業者に公知の任意の抗分化因子が使用され得ることもまた理解されるべきであり、これらの抗分化因子としては、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、ＴＧＦ−α、ＥＧＦ、ＦＧＦおよびデルタ（ｎｏｔｃｈリガンド）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、本発明と関連して使用される、単離された腫瘍指向性幹細胞は、例えば、癌の処置に関与する細胞傷害性ポリペプチドをコードする異種性遺伝子を発現するように改変され得る。例えば、α−、β−、またはγ−インターフェロンのサイトカイン（ＩＬ−１２、ＩＬ−４および腫瘍壊死因子を含む）、アポトーシスタンパク質（ＴＲＡＩＬを含む）、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、および上記のいずれかについての細胞レセプターが含まれる。これらの異種性の遺伝子はまた、アミノ酸の生合成または分解、プリンまたはピリミジンの生合成または分解、および神経伝達物質（例えば、ドパミン）またはこのような経路の調節に関与するタンパク質（例えば、プロテインキナーゼおよびプロテインホスファターゼ）の生合成または分解に関与する酵素をコードし得る。この異種性の遺伝子はまた、その調節に関与する転写因子もしくはタンパク質、膜タンパク質、または構造タンパク質をコードし得る。
【００３９】
１つの実施形態において、異種性の遺伝子は、疾患状態を緩和、治癒または処置するのに有益な、治療的な使用のためのポリペプチドをコードする。例えば、上記のサイトカインおよびタンパク質の中で、ＩＬ−１２およびＩＬ−４は、腫瘍内のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞の浸潤を有意に増加するインターロイキンであり、そして、アポトーシスタンパク質であるＴＲＡＩＬは、固形腫瘍および造血系起源の腫瘍上に発現されるＴＲＡＩＬレセプタータンパク質に特異的に結合して、アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死により殺傷する、アゴニスト的なヒトモノクローナル抗体である。これらの分子をコードする異種性の遺伝子は、本発明に従って使用される場合、特に有益であり得る。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、単離された腫瘍指向性幹細胞は、癌の処置に関与する化学療法剤を発現するように改変され得る。「化学療法剤」とは、癌の処置に有用な化合物である。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｅｙｅｒｓ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹより入手可能なＣＹＴＯＸＡＮ））；アルキルスルホン酸塩（例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ）；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン（ａｌｔｒｅｔａｍｉｎｅ）、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミンが挙げられる）；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；抗生物質（例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アゼセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン）；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎因子（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充因子（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグルコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミド；デメコルシン；ジアジコン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エルフオルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリピチニウム��ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エトグルシド（ｅｔｏｇｌｕｃｉｄ）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン（ｎｉｔｒａｃｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ポリサッカリド−Ｋ（Ｋｕｒｅｈａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｊａｐａｎから入手可能なＰＳＫ）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン（ｔｒｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール（ｍｉｔｏｂｒｏｎｉｔｏｌ）；ミトラクトール（ｍｉｔｏｌａｃｔｏｌ）；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（Ｕｐｊｏｈｎ  ＧｍｂＨ；Ｈｅｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能なＡｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン（例えば、パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪから入手可能なＴＡＸＯＬ）およびドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ；Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅから入手可能なＴＡＸＯＴＥＲＥ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（ｘｅｌｏｄａ）；イダンドロネート（ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）；カペシタビン；および上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体。また、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびトレミフェン（Ｏｒｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．；Ｆｉｎｌａｎｄから入手可能なＦＡＲＥＳＴＯＮ）が挙げられる）；および抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン）；ならびに上記のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸、または誘導体のような、細胞におけるホルモン作用を調節または阻害するように機能する、抗ホルモン因子がこの定義に含まれる。
【００４１】
幹細胞を、幹細胞のゲノムとは別個の異種性遺伝子、または化学療法剤のいずれかを発現するように遺伝子操作することは、当業者に容易に理解される多数の方法で実施され得る。例えば、１つの一般的な方法は、目的の異種性の遺伝子をパッケージングする複製欠損型アデノウイルスでの幹細胞のインビトロ感染を包含する（Ｌｉｕ，Ｙ．ら、「Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９，ｐ．９−１５（２００２）；Ｓｃｈａａｃｋ，Ｊ．ら、「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｂｙ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｐｒｅｓｓ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ」，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．６９，ｐ．３９２０−３９２３（１９９５））。レトロウイルスおよび他の慣用的な感染因子を使用するなお他の方法が存在する（Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ．５６５７−５６６３（２００２）；Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉ，Ｓ．ら、「Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ」，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．６，ｐ．４４７−４５０（２０００）；Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ．７１７０−７１７４（２００２）；Ｃａｉ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｆｅｔａｌ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（ＮＥＰ  ｃｅｌｌ）」，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２５１，ｐ．２２１−２４０（２００２））。上記の参考文献の各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、腫瘍指向性ポテンシャルを有する幹細胞または幹細胞の下位集団の識別のために、ＣＸＣＲ４レセプター、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性、および／または、星状細胞マーカーを使用する方法が存在する。この方法は、幹細胞を提供する工程、および当業者に容易に認識される標準的な免疫組織化学プロトコールを組み込んだ、選択プロセスを実施する工程を包含し得る。この免疫組織学プロトコールとしては、一次抗体、ケモカインレセプター、および他の機能的に関連するマーカーが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００４３】
例えば、上記方法は、蛍光細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）、親和性カラム、親和性ビーズ、または、特定の細胞表面分子に選択的に結合する任意の方法を包含し得る。あるいは、上記方法は、幹細胞によって発現されない細胞表面分子を使用して、所望されない細胞を選択的に除去または殺傷し、このやり方で、所望の細胞を富化し得る。あるいは、上記方法は、幹細胞に選択的に結合する磁気ビーズの使用を包含し得る。
【００４４】
さらに、種々の実施形態において、本発明の幹細胞は、１つ以上のさらなる成分と組合せられ得、これらとしては、ビヒクル、添加剤、薬学的補助剤、治療用化合物、キャリア、および癌または他の疾患状態の処置に有用な因子、ならびにこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。一旦そのように組み合わされると、幹細胞は、疾患状態を処置するための哺乳動物への投与に適切であり得るが；このようなさらなる成分との処方は、投与に必要とされるわけではない。なおさらに、種々の実施形態において、本発明の幹細胞は、ケモカインＳＤＦ−１を含む処置レジメンの一部であり得、この処置レジメンは、疾患状態を処置するための哺乳動物への投与に適切であり得る。
【００４５】
さらに、１つの実施形態において、ケモカインＳＤＦ−１は、局所投与に適切であり得る。ＳＤＦ−１のようなタンパク質の局所送達は、選択したタンパク質を、特定のレセプター特異性を有する生体適合性または生分解性の高分子（例えば、生体高分子、脂質、多糖、タンパク質（アルブミンおよび免疫グロブリンを含む））と結合体化することによって達成され得る。このやり方で、タンパク質は、特定のタンパク質を用いた処置に供される人体の特定の部分に移され得る。あるいは、局所送達機構は、キャリア物質と結合した標的化因子を含有し得、この標的化因子は、個体の中の特定の部位に結合し得る。この標的化因子は、レセプター抗体、抗腫瘍抗体、または白血球抗体のようなタンパク質または抗体であり得る。本発明によれば、ＳＤＦ−１は、カテーテルベースの脈管内もしくは経皮送達系、コーティングステント、非経口、または肺送達により投与され得る。他の全身投与法としては、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内投与、皮内および経皮拡散、鼻腔内および他の粘膜の経路が挙げられ得る。カテーテルによる局所静脈内投与は、医療の実務において一般的な技術である。例えば、二重バルーン、多孔性バルーン、微小孔性バルーン、バルーン内のステント、ヒドロゲル、急送（ｄｉｓｐａｔｃｈ）およびイオン泳動のようなカテーテルが、当業者により理解されるように使用され得る。
【００４６】
なおさらに、種々のタンパク質が、ステントコーティングを調製するために使用され得、これらとしては、ゼラチン、コラーゲン、アルブミンなどが挙げられるがこれらに限定されない。コーティングの適用は、溶剤（水、グリセリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられるがこれらに限定されない）により達成され得る。本発明の代替的な実施形態において、コーティング中に１つ以上の添加剤を組み込むことが望ましくあり得る。例としては、界面活性剤、水溶性薬物、生物製剤、抗菌剤などが挙げられる。界面活性剤は、基質のタンパク質溶液の伝播特性を改善し得る。有用な界面活性剤としては、以下が挙げられる：カチオン性界面活性剤（例えば、アルキル四級アンモニウム塩）；アニオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム）；および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリ（オキシエチレンソルビタンモノオレエート））。基質が、血管内に挿入されるデバイス（例えば、静脈内ステント、カテーテルまたは血管形成術用バルーン）である場合、添加剤として、ヘパリンのような血栓形成因子を有することが望ましくあり得る。安息香酸ナトリウムのような抗菌剤の添加剤は、基質上または基質の周りでの微生物の増殖を防ぎ得る。
【００４７】
本発明の別の実施形態において、ＣＸＣＲ４レセプターおよび／またはケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を提示する幹細胞、ならびに、例えば、疾患状態の処置におけるその使用のための指示書を備えるキットが包含される。本発明のキットを構成する要素の正確な性質は、その意図される目的、および使用される特定の方法論に依存する。例えば、このキットのいくつかの実施形態は、被験体において癌を緩和、治癒または処置する目的のために構成される。１つの実施形態において、キットは、特に、ヒト被験体においてグリア新生物形成に対する治療処置を送達する目的のために構成される。
【００４８】
使用のための指示書が、キットと共に包含され得る。「使用のための指示書」は、代表的には、被験体に幹細胞を接種するための工程、および／または治療システムにおいてこの幹細胞を使用するための工程を記載する、具体的な表示を含む。必要に応じて、このキットはまた、他の有用な成分（例えば、希釈剤、緩衝剤、薬学的に受容可能なキャリア、検体コンテナ、シリンジ、ステント、カテーテル、ピペッティングまたは測定のためのツールなど）を含む。
【００４９】
キット内に集められる材料または成分は、その操作性および有用性を保存する、任意の簡便かつ適切な方法で格納されて開業医に提供され得る。例えば、成分は、溶解されたか、脱水されたか、または凍結乾燥された形態であり得る；これらは、室温、冷蔵温度、または凍結温度にて提供され得る。
【００５０】
これらの成分は、代表的には、適切なパッケージング材料内に含まれる。本明細書中で使用される場合、句「パッケージング材料」とは、キットの内容物を収容するために使用される１つ以上の物理的な構造体を指す。パッケージング材料は、周知の方法によって構築され、好ましくは、無菌かつ汚染のない環境を提供する。キット内で使用されるパッケージング材料は、当該分野で慣習的に利用されるものである。本明細書中で使用される場合、用語「パッケージ」とは、個々のキット成分を保持し得る、ガラス、プラスチック、紙、箔などのような適切な固体マトリクスまたは材料を指す。従って、例えば、パッケージは、幹細胞の適切な量を含むために使用されるガラスバイアルであり得る。パッケージング材料は、一般に、キットの内容物および／もしくは目的、そして／またはその成分を示す外側ラベルを有する。
【００５１】
上記の開示は、一般に、本発明を説明し、そして、本開示において引用される全ての特許および特許出願、ならびに刊行物は、明白に本明細書中に参考として援用される。より完全な理解が、以下の実施例を参照することにより得られ得、以下の実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明の範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【００５２】
以下の実施例は、グリア新生物の処置のための腫瘍指向性幹細胞を選択するため、および、本発明の種々の実施形態に従って、患者を処置するために使用され得る腫瘍指向性幹細胞療法の効率を評価するために使用され得る手順の代表例である。これらの実施例の改変は、状態が本明細書中に記載されるものと異なる患者を処置することを求める当業者には容易に明らかである。
【００５３】
（実施例１  細胞および培養手順）
ヒトＵ８７ＭＧ細胞株、マウスＧＬ２６神経膠腫細胞株、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞株、および２９３ヒト胚性腎臓細胞株を、それぞれ、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；Ｃａｌａｂａｓａｓ，ＣＡから入手）、Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を補充した、ＤＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）およびダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）中で培養した。Ｕ８７ＭＧ培養物、ＧＬ２６培養物、ＮＩＨ  ３Ｔ３培養物または２９３培養物からの馴化培地を、ほぼ同数の細胞で９６時間前に撒いた、コンフルエントな７５ｃｍ２培養フラスコから得た。凍結保存したヒト胎性ＮＳＣを、Ｃａｍｂｒｅｘ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得、マウスＮＳＣを、Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ．５６５７−５６６３（２００２）に記載されたように、１５日齢のマウス胎仔の前頭領域から回収した。ＮＳＣを、Ｂ−２７増殖因子（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）、２０〜３０ｎｇ／ｍｌのヒトまたはマウスの上皮増殖因子、２０〜３０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、および２ｍｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充したＤＭ／Ｆ１２培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）中で培養した。マウスＮＳＣを、Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ．５６５７−５６６３（２００２）に記載されるように、ＬａｃＺ遺伝子を有する複製欠損型アデノウイルスを用いたインビトロインフェクションによりβガラクトシダーゼを発現するように遺伝子操作した。
【００５４】
（実施例２  インビボ神経膠腫モデルの確立と、ＮＳＣ接種）
６〜８週齢のＣ５７Ｂ１／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから入手）を、ケタミンおよびキシラジンで腹腔内麻酔し、Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９，ｐ．９２５−９３４（２００２）に報告されたように、右線条体に、１．２％メチルセルロース／ＭＥＭ中５×１０４個のＧＬ２６細胞（３μｌ）を定位に播種した。移植から７日後に、動物に、血清およびウイルスを含まない培地中２×１０５のＮＳＣ−ＬａｃＺ（５μｌ）の腫瘍内接種を、同じバーの穴および定位座標を用いて、確立された腫瘍内に直接注射して与えた。
【００５５】
（実施例３  神経膠腫指向性ＮＳＣ表現型の免疫組織化学分析）
ＮＳＣ−ＬａｃＺを播種した腫瘍を有する動物から回収した脳を、ドライアイス上で凍結し、クリオスタットを用いて切片作製し、スライド上にマウントして、風乾させた。ＬａｃＺを発現するＮＳＣの組織学的な可視化のために、切片を、慣用的なプロトコールによりＸ−ｇａｌで染色し、次いで、ニュートラルレッドで対比染色した。隣接する組織切片を、アセトンで固定した。β−ガラクトシダーゼ、Ｓｏｘ−２、ＳＳＥＡ−１、Ａ２Ｂ５、Ｅ−ＮＣＡＭ、β−ＩＩＩチューブリン、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＣＮＰａｓｅ、ＰＤＧＦＲα（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｔｅｍａｃｕｌａ，ＣＡから入手）、ＣＸＣＲ４（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手）、ＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡから入手）を使用する、標準的な免疫組織化学プロトコールを用いて、染色を実施した。フルオロフォアＦＩＴＣまたはＣｙ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎから入手）と結合体化した抗体を使用して、二次染色を行なった。染色の後、スライドを水性マウンティング培地（ＩＣＮ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手）内にマウントし、蛍光顕微鏡下で可視化した。
【００５６】
（実施例４  インビトロ化学走性実験）
全ての化学走性実験を、５μｍ孔のポリカーボネート膜で分離された一対の培養ウェルから構成される化学走性チャンバシステム（Ｎｅｕｒｏ  Ｐｒｏｂｅ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手）を使用して実施した。下側のウェルに、上記のように回収したＧＬ２６馴化培地またはＵ８７ＭＧ馴化培地のいずれかを充填した。１０％  ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、新しいＤＭＥＭを、非馴化培地コントロールとして使用した。介在性の孔性膜を置いた後、約１．５×１０５個のバラバラにしたヒトまたはマウスのＮＳＣを、上のチャンバに添加した。チャンバシステムを、３７℃で４時間インキュベートし、その後、下側ウェルからの培地を回収し、規定された数の蛍光ビーズ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手）に対して、フローサイトメトリーを使用して、細胞含有量について定量的に分析した。このことにより、下側のチャンバに移動した、上側のチャンバの各々に添加された細胞の百分率の定量を可能にした。中和アッセイのために、抗ＳＤＦ−１（２５０μｇ／ｌ）（このケモカインの公知のαアイソフォームおよびβアイソフォームの療法を中和する）および抗ＣＸＣＲ４（４０μｇ／ｍｌ）モノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから入手）を、アッセイ前に、それぞれ、腫瘍馴化培地またはＮＳＣと共に、室温にて２０分間インキュベートした。コントロールサンプルを、非特異的抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手）にマッチする、同一の濃度のアイソタイプと共にインキュベートした。全ての実験を、三連で行なった。
【００５７】
（実施例５  ＮＳＣ分化サブタイプの分析）
広がった腫瘍の部位に移動するＮＳＣは、星状細胞前駆体を含む。ＮＳＣ−ＬａｃＺの腫瘍内接種を与えた後に、神経膠腫を有する動物からの脳組織を組織化学的に分析した。慣用的なＸ−ｇａｌ染色により、以前に報告された知見（Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ．５６５７−５６６３（２００２））と同様に、正常な脳実質に、または正常な脳実質を通って広がった、腫瘍細胞の島の近くの接種部位から離れて移動した（ニュートラルレッドの対比染色後に容易に識別可能）、β−ガラクトシダーゼポジティブな細胞の優位な割合が明らかになった。同時に、ＮＳＣ−ＬａｃＺの残りの集団は、最初の接種部位に局在化したままであり、この移動および腫瘍指向性活性は示さなかった。上で言及したサンプルの良く似た切片（すなわち、Ｘ−ｇａｌ染色で可視化した最初のサンプルから多くて２０〜３０μｍ離れた、類似の組織学的サンプル）を、次いで、ＮＳＣ分化の種々の段階において発現するタンパク質を反映するマーカーに特異的な抗体のパネルを用いた免疫蛍光組織化学に供した。これらは、中立の神経前駆体（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｎｅｕｒａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）において発現することが知られている、転写因子Ｓｏｘ−２および細胞表面段階特異的胚性抗原−１（ＳＳＥＡ−１）；それぞれ、星状細胞運命およびニューロン細胞運命に向かう分化経路を開始したＮＳＣの指標である、Ａ２Ｂ５および神経細胞表面分子の胚性形態（Ｅ−ＮＣＡＭ）；星状グリア細胞系統の細胞において発現される、ＧＦＡＰ；機能的な分化した星状グリア細胞において見られるグルタミン酸トランスポーター関連タンパク質である、興奮性アミノ酸トランスポーター遺伝子（ＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２）；希突起神経膠細胞前駆体において発現される、血小板由来増殖因子レセプターα（ＰＤＧＦＲα）；分化した希突起神経膠細胞に見られる２’，３’−サイクリックヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）；ならびに、前駆体および分化した神経細胞において発現される、β−ＩＩＩチューブリンを含んだ（Ｃａｉ，Ｊ．ら、「Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｆｅｔａｌ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ（ＮＥＰ  ｃｅｌｌ）」，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２５１，ｐ．２２１−２４０（２００２）；Ｒａｏ，Ｍ．Ｓ．，「Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，Ｖｏｌ．２５７，ｐ．１３７−１４８（１９９９）；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｍ．Ｌ．ら、「Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｚｏｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＮＳ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１６，ｐ．２１９１−２２０７（１９９６）；Ｃａｉ，Ｊ．ら、「Ｉｄｅｎｔｉ��ｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．，Ｖｏｌ．３１，ｐ．１８−２７（２００３）；Ｃａｐｅｌａ，Ａ．およびＳ．Ｔｅｍｐｌｅ，「ＬｅＸ／ｓｓｅａ−１  ｉｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ＣＮＳ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｔｈｅｍ  ａｓ  ｎｏｎｅｐｅｎｄｙｍａｌ」，Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．３５，ｐ．８６５−８７５（２００２））。これより前のＸ−ｇａｌ染色した良く似た切片において観察されたように、最初に接種した管から広がり、ここでは、広がった腫瘍サテライトと一緒にか、またはその近くに移動した、ＮＳＣ−ＬａｃＺにおけるこれらのマーカーの発現に焦点を当てた。知見（表１にまとめた）は、Ｓｏｘ−２およびＳＳＥＡ−１を発現するＮＳＣの集団は、最初に注射した管の近くに存在したが、神経膠腫の増殖およびサテライトに伴って移動が見られる、β−ガラクトシダーゼを発現するＮＳＣの大半は、これらのマーカーに対して陰性であった（示さず）ことを示す。表１は、インビボ腫瘍内接種後の、分化の種々の段階におけるＮＳＣｓ−ＬａｃＺに関連するタンパク質マーカーの発現を詳述する。
【００５８】
【表１】
2007516698.tif 000002
さらに、これらの腫瘍指向性ＮＳＣ集団は、Ａ２Ｂ５およびＧＦＡＰに対して強くポジティブであったのに対し（図２）、希突起神経膠細胞関連タンパク質であるＰＤＧＦＲαおよびＣＮＰａｓｅ（示さず）ならびにニューロンマーカーであるβ−ＩＩＩチューブリン（示さず）に対してはネガティブであり、これは、明らかに、分化が星状細胞系統に向かっていることを示す。同時に、これらの細胞は、分化した星状細胞において発現することが知られている、グリア特異的グルタミン酸トランスポーター関連タンパク質であるＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２に対してネガティブであった（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｍ．Ｌ．ら、「Ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｍＲＮＡ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｚｏｎｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＮＳ」，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．１６，ｐ．２１９１−２２０７（１９９６））。逆に、ＧＦＡＰおよびＡ２Ｂ５と共にＥＡＡＴ１およびＥＡＡＴ２を発現した、分化した形態を有するβ−ガラクトシダーゼポジティブな細胞は、原発性の腫瘍塊内の最初に注射した管の近くに観察され得（示さず）、これは、接種した前駆体の星状細胞への完全な分化が実際に起こったことを確認する。しかし、β−ガラクトシダーゼポジティブな細胞集団を追跡する神経膠腫におけるＥＡＡＴ１／ＥＡＡＴ２の発現がなく、かつ、Ａ２Ｂ５の発現があり、そして、完全に分化した形態が明らかにない場合、腫瘍指向性の細胞集団が、正常細胞への分化に向かう経路を開始したが、完了しなかった、前駆体細胞から構成されることを示す。
【００５９】
（実施例６  腫瘍レセプターと神経膠腫の追跡との間の相関）
腫瘍を追跡するＮＳＣは、ＣＸＣＲ４を強く発現する。腫瘍の侵襲性および生存を促進する際に、実証される侵襲性の神経膠腫細胞からのＳＤＦ−１分泌能力（Ｂａｒｂｅｒｏ，Ｓ．ら、「Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １  ａｌｐｈａ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅｓ  １／２  ａｎｄ  Ａｋｔ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６３，ｐ．１９６９−１９７４（２００３）；Ｚｈｏｕ，Ｙ．ら、「ＣＸＣＲ４  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｏｎ  ｇｌｉｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｓｕｒｖｉｖａｌ」，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２７７，ｐ．４９４８１−４９４８７（２００２））、ならびに、発生中の脳においてニューロン前駆体およびグリア前駆体の移動を支配する際の、このケモカインおよびそのレセプターであるＣＸＣＲ４の確立された役割（Ｌａｚａｒｉｎｉ，Ｆ．ら、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＤＦ−１）  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｔｕｒｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」，Ｇｌｉａ，Ｖｏｌ．４２，ｐ．１３９−１４８（２００３）；Ｒｅｉｓｓ，Ｋ．ら、「Ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｉｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ｍｅｎｉｎｇｅａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｃｔｓ  ａｓ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｇｒａｎｕｌａｒ  ｌａｙｅｒ」，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．１１５，ｐ．２９５−３０５（２００２））に基づいて、腫瘍を追跡するＮＳＣ−ＬａｃＺ集団がＣＸＣＲ４を発現したかどうかを調査した。弱いＣＸＣＲ４の発現が、神経膠腫細胞、および原発性の腫瘍塊に残るＮＳＣ−ＬａｃＺ集団（示さず）の両方で目に見えたのに対して、腫瘍の過剰増殖およびサテライトを追跡するＮＳＣ−ＬａｃＺが、このタンパク質を強く発現し（図２）、このことは、神経膠腫の複雑な化学走性キューに対するＮＳＣの応答性の支配におけるこのレセプターの可能な役割を示唆する。
【００６０】
（実施例７  インビトロでの腫瘍馴化培地に向かうＮＳＣの移動は、ＮＳＣ表面ＣＸＣＲ４レセプターをブロッキングすることによって阻害され得る）
腫瘍指向性ＮＳＣ集団が、インビボでＣＸＣＲ４を強く発現したという観察に基づいて、このレセプターが、ＮＳＣの神経膠腫に向かう化学走性において役割を果たしたということを決定した。腫瘍馴化培地が、多孔性膜によって、ヒトおよびマウスのＮＳＣから分離されている２チャンバベースの実験システムにおいて、ＮＳＣの神経膠腫上清に向かう移動が、正常な培地に向かう観察される移動よりも有意に高かったことが観察され（図３）、これは、腫瘍馴化培地中に存在する可溶性因子に向かう化学走性を示唆する。腫瘍上清におけるＳＤＦ−１の中和が、ＮＳＣの神経膠腫馴化培地へ向かう移動を疎外するかどうかを決定する目的で、抗ＳＤＦ−１抗体を、ヒトＵ８７ＭＧ神経膠腫腫瘍上清と共にインキュベートし、次いで、ヒト胎性ＮＳＣと共に化学走性アッセイにおいて利用した。非特異的なＩｇＧアイソタイプ抗体と共にインキュベートしたＵ８７ＭＧ上清に向かうことが見られる有意なＮＳＣの化学走性と比較して、抗ＳＤＦ−１中和抗体の添加は、ＮＳＣの移動を顕著に減少したが（図３Ａ）、この差は、統計的有意差を満たさなかった（Ｐ＝０．０９；ｔ検定）。このことは、より効率的な細胞表面ＣＸＣＲ４のブロッキングに対する可溶性ケモカインの最適以下の中和に関する技術的問題を表し得るか、または、これらの知見は、ＣＸＣＲ４に対するまだ識別されていない可溶性リガンドのような、ＳＤＦ−１の、本発明者らが中和したαおよびβサブタイプとは異なる、追加の可能性のあるさらなるアイソフォーム改変体に対する役割を提示し得る。しかし、抗ＣＸＣＲ４ブロッキング抗体とのインキュベーションの後、ＮＳＣの神経膠腫馴化培地に向かう移動の有意な減少は、マウス（図３Ｂ）およびヒト（示さず）の胎性ＮＳＣ（それぞれ、Ｐ＝０．０２２およびＰ＝０．００３；ｔ検定）の両方の場合において見られた。対照的に、アイソタイプとマッチする非特異的抗体と共にインキュベートしたＮＳＣは、未処理のＮＳＣと比べたときに、腫瘍馴化培地に向かう移動の減少を示さなかった（図３Ｂ）。これらのデータは、ＣＸＣＲ４のブロッキングが、ＮＳＣの神経膠腫上清に向かう走性を有意に阻害することを示し、これは、これらの細胞により提示される腫瘍指向性挙動におけるこのレセプターの重要な役割を示唆する。しかし、腫瘍上清におけるＳＤＦ−１の中和の後に、統計的に検証可能な差を観察できないことは、可溶性ケモカインの最適以下の中和、または、ＣＸＣＲ４経路を通る化学走性を誘導し得る二次リガンドの腫瘍馴化培地内の存在のいずれかを示唆し得る。
【００６１】
インビトロにおいて、神経膠腫馴化培地に向かうことが観察されるＮＳＣの移動レベルは、以前に記載されたインビボの移動パターンに基づいて定性的に予測可能なものよりも有意に低かった（Ｅｈｔｅｓｈａｍ，Ｍ．ら、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １２−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｎｅｕｒａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．６２，ｐ．５６５７−５６６３（２００２））。しかし、これは、腫瘍指向性の挙動が、星状細胞への分化に向かって進行している細胞により主に提示されるという知見と組み合わされる。インビトロ実験において利用される細胞は、主として、未分化状態の維持を支持するように設計された条件において培養されたＮＳＣを含有するので、最終的な神経またはグリアの方向性の早期の徴候は、なお識別可能であり得るが（Ｒａｏ，Ｍ．Ｓ．，「Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．，Ｖｏｌ．２５７，ｐ．１３７−１４８（１９９９））、傾倒し、かつ積極的に分化する星状細胞前駆体のより低い割合が、これらの集団において期待される。しかし、インビボ移植の後に、ＮＳＣは、線条体に固有に存在する膠細胞生成のキューに対して優勢に応答し、広がった腫瘍細胞から発される化学走性シグナルに対して応答性である可能性のある、星状細胞前駆体の数を増加させる。
【００６２】
原発性のマウス胎性ＮＳＣは、ヒト胎性ＮＳＣとは対照的に、未馴化培地に向かってさえ、有意に多い移動を提示したという知見もまた興味深い。これは、これらの培養物の異なる起源により説明され得る。マウスＮＳＣが、原発性の胎性組織に由来するのに対して、ヒト胎性ＮＳＣは、数年齢間凍結保存された、市販のストックから培養した。長期の低温保存の後に生物学的活性が妨害され得るヒトＮＳＣとは対照的に、新たに生成した原発性のマウス細胞は、より活性な移動能力を提示する可能性がある。
【００６３】
上記の説明は、本発明の特定の実施形態を参照するが、本発明の精神から逸脱することなく多くの改変がなされ得ることが理解される。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の範囲および精神の範囲内に入るような改変を網羅することが意図される。それゆえ、本明細書により開示された実施形態は、全ての点において、例示的であり、限定的ではないものとして考慮されるべきであり、本発明の範囲は、上記の説明ではなく、添付の特許請求の範囲により示され、従って、特許請求の範囲の等価物の目的および範囲は、特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
本特許出願は、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含む。この特許のカラー図面のコピーは、特許商標局に要請し、必要な費用を支払えば、特許商標局により提供される。
【図１】カラーで作成された図１は、本発明の種々実施形態に従って、インビボで神経膠腫を広めるためのＮＳＣ指向性を図示する。ＮＳＣｓ−ＬａｃＺを、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいて確立された頭蓋内ＧＬ２６腫瘍内に接種した。次いで、組織学的な脳の切片を、慣用的なＸ−ｇａｌ染色で処理し、ＮＳＣ−ＬａｃＺ内に青色〜暗青色の沈殿の発色を生じた。次いで、切片を、ニュートラルレッドで対比染色した。腫瘍組織は、新生物の核の鮮やかな赤い染色と、腫瘍細胞の眼に見える密集した凝集により識別され得る。Ｔは腫瘍を表し、Ｎは正常組織を表す。図１Ａは、矢印により境界を定められた、主な腫瘍塊（Ｔ）内の非移動性のＮＳＣ−ＬａｃＺの存在を例示する低拡大画像である。図１Ｂは、主な腫瘍塊から移動し、灰白質／白質の境界に沿って、おそらくは白質管に沿って移動する腫瘍細胞島の近くに移動するＮＳＣ−ＬａｃＺを例示する（挿入ボックス）。移動性のＮＳＣ−ＬａｃＺは、神経領域様の蓄積（ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｌｉｋｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ）においてなお凝集していることに注意されたい。図１Ｃは、図１Ｂの挿入ボックスの高拡大倍率を表す。暗青色のＮＳＣ−ＬａｃＺの凝集が、広がった腫瘍サテライト（Ｔ）の直ぐ近くにはっきりと見える。図１Ｄは、原発性腫瘍部位から有意に離れた距離にある独立した腫瘍サテライト（矢印の先により境界を定める）の高拡大倍率である。青色のＮＳＣ−ＬａｃＺは、腫瘍内に見え、これは、ＮＳＣ−ＬａｃＺが、インビボにおいて広範囲に移動し得、そして、広がった腫瘍島内にインターカレートし得ることを示す。
【図２】カラーで作成された図２は、本発明の種々の実施形態に従って、ＮＳＣを発現するβ−ガラクトシダーゼ（ＮＳＣｓ−ＬａｃＺ）の腫瘍内接種を受けた、神経膠腫を有する動物からの脳組織を組織化学的に分析した結果を図示する。ＮＳＣｓ−ＬａｃＺが追跡した、広がった神経膠腫を、慣用的なＸ−ｇａｌ染色に供し、これにより、接種されたＮＳＣの有意な割合が、接種の部位から離れて移動したことが明らかとなった。次いで、これらの染色と良く似た切片を、種々の段階のＮＳＣ分化において発現されるタンパク質を反映するマーカーに特異的な抗体のパネルを用いて、免疫蛍光組織化学に供した。図２Ａは、腫瘍内接種された腫瘍指向性ＮＳＣｓ−ＬａｃＺの指標である、ＧＦＡＰマーカーの間の正の相関を示す。図２Ｂは、腫瘍の微小サテライトにおけるＡ２Ｂ５マーカーと腫瘍指向性ＮＳＣ−ＬａｃＺとの間の正の相関を示す。図２Ｃは、ＣＸＣＲ４マーカーと、腫瘍内接種された腫瘍指向性ＮＳＣｓ−ＬａｃＺとの間の正の相関を示す。Ａ２Ｂ５およびＧＦＡＰマーカーは、星状細胞および星状グリア系統に向かう分化経路が開始された、ＮＳＣの指標である。全ての画像は、４００倍の倍率を表す。
【図３】図３は、本発明の種々の実施形態に従って、インビトロで神経膠腫馴化培地に向かうＮＳＣ移動指向性のグラフ表示である。ヒトおよびマウスの胎性ＮＳＣを、複数の５ミクロン孔のポリカーボネート膜により種々の培地／培養上清を含む下側のウェルから分離された、２ウェル化学走性チャンバシステムの上側のウェルに入れた。３７℃で４時間インキュベーションした後、下側のチャンバからの培地を回収して、細胞を定量した。Ｙ軸は、下側のチャンバに移動したＮＳＣの百分率を図示する。図３Ａは、ヒトの胎性ＮＳＣが、正常な非馴化培地に向かう最小の移動活性を示すのに対し、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫上清に向かう移動は、有意により高かった（Ｐ＝０．００５、ｔ検定）ことを示す。神経膠腫培地の希釈は、ＮＳＣ化学走性の有意な減少を生じ（図示せず）、これは、ＮＳＣの転移が、おそらく腫瘍の精密な可溶性因子に起因するものであったことを示す。このような潜在的な因子の１つである、間質細胞由来因子（ＳＤＦ）−１に対する中和抗体の添加は、アイソタイプＩｇＧで処理したＮＳＣと比較して顕著に化学走性を減少したが、それにもかかわらず、統計的に有意な程度ではなかった（Ｐ＝０．０９、ｔ検定）。図３Ｂは、マウスの胎性ＮＳＣが、コントロール培地と比較して、ＧＬ２６馴化培地に向かう移動活性の増強を示した（Ｐ＝０．０００１；ｔ検定）ことを示す。抗ＣＸＣＲ４中和抗体の添加は、アイソタイプＩｇＧで処理したＮＳＣと比べて、神経膠腫馴化培地に向かうＮＳＣの転移を有意に減少した（Ｐ＝０．００３；ｔ検定）。
【図１】
2007516698.tif 000003
【図２】
2007516698.tif 000004
【図３】
2007516698.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月5日(2006.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された幹細胞であって、該幹細胞は、該幹細胞がＣＸＣＲ４レセプターを提示すること、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を示すこと、またはそれら両方に基づいて該幹細胞を選択する工程を包含する方法によって単離される、単離された幹細胞。
【請求項２】
前記単離された幹細胞は、星状細胞に分化した幹細胞の前駆体に特徴的なマーカーを提示する、請求項１に記載の単離された幹細胞。
【請求項３】
前記単離された幹細胞は、Ａ２Ｂ５星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項２に記載の単離された幹細胞。
【請求項４】
前記単離された幹細胞は、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項２に記載の単離された幹細胞。
【請求項５】
前記単離された幹細胞は、異種遺伝子を含む、請求項１に記載の単離された幹細胞。
【請求項６】
前記異種遺伝子は、疾患状態の処置において治療的に使用するポリペプチドをコードする、請求項５に記載の単離された幹細胞。
【請求項７】
前記ポリペプチドは細胞傷害性である、請求項６に記載の単離された幹細胞。
【請求項８】
前記ポリペプチドは免疫応答に関与する、請求項６に記載の単離された幹細胞。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、ＩＬ−１２である、請求項８に記載の単離された幹細胞。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、ＩＬ−４である、請求項８に記載の単離された幹細胞。
【請求項１１】
前記ポリペプチドは、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）である、請求項８に記載の単離された幹細胞。
【請求項１２】
前記単離された幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項１に記載の単離された幹細胞。
【請求項１３】
幹細胞の腫瘍指向性ポテンシャルを評価するための方法であって、該方法は、
幹細胞を提供する工程；
該幹細胞によるＣＸＣＲ４の発現レベル、該幹細胞によるケモカインＳＤＦ−１に対する親和性、またはそれら両方を決定する工程；および
該ＣＸＣＲ４の発現レベル、該ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性、またはそれら両方に基づいて該幹細胞の腫瘍指向性ポテンシャルを評価する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
前記幹細胞が、星状細胞に分化した幹細胞の前駆体に特徴的なマーカーを提示する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞が、Ａ２Ｂ５星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞が、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物において疾患状態を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、
ＣＸＣＲ４レセプターを提示する幹細胞、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を示す幹細胞、またはそれら両方の幹細胞を含み
該疾患状態を処置するのに十分な量で該哺乳動物に投与するために処方されている、薬学的組成物。
【請求項１９】
前記幹細胞が、星状細胞前駆体細胞である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記幹細胞が、星状細胞に分化した幹細胞の前駆体に特徴的なマーカーを提示する、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記幹細胞が、Ａ２Ｂ５星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記幹細胞が、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）星状細胞前駆体マーカーを提示する、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
前記幹細胞が、異種遺伝子を含む、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記異種遺伝子が、前記疾患状態の処置において治療的に使用するポリペプチドをコードする、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが細胞傷害性である、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、免疫応答に関与する、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、ＩＬ−１２である、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、ＩＬ−４である、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ）である、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記疾患状態が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、星状細胞腫、上衣細胞腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫ならびに未分化神経外胚葉性腫瘍からなる群より選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
ビヒクル、添加剤、薬学的補助剤、治療用化合物、キャリア、疾患状態の処置に有用な因子およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分をさらに含む、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
一定量のケモカインＳＤＦ−１をさらに含む、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記幹細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
キットであって、
ＣＸＣＲ４レセプターを提示する一定量の幹細胞、ケモカインＳＤＦ−１に対する親和性を示す一定量の幹細胞、またはそれら両方の幹細胞；ならびに
哺乳動物における疾患状態の処置において該一定量の幹細胞を使用するための指示書
を備える、キット。
【請求項３５】
前記一定量の幹細胞が、ビヒクル、添加剤、薬学的補助剤、治療用化合物、キャリア、疾患状態の処置に有用な因子およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるさらなる成分をさらに含む組成物中に含まれる、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
前記疾患状態が、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、星状細胞腫、上衣細胞腫瘍、多形性神経膠芽細胞腫ならびに未分化神経外胚葉性腫瘍からなる群より選択される、請求項３４に記載のキット。
【請求項３７】
前記幹細胞が、神経幹細胞（ＮＳＣ）である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３８】
一定量のケモカインＳＤＦ−１、および前記疾患状態の処置において該一定量のケモカインＳＤＦ−１を使用するための指示書をさらに備える、請求項３４に記載のキット。
【国際調査報告】
2007516698.tif 000006
2007516698.tif 000007
2007516698.tif 000008