(57)【要約】  本発明は、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される完全長Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有し、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を有し、この変化のために、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が本コード配列から削除される、改変された核酸分子に関する。本発明はまた、過半数が完全長であるＨＣＶ糖タンパク質を細胞表面および偽ビリオンで発現させるための方法にも関する。本発明はさらに、このような糖タンパク質を発現する細胞および偽ビリオン提供する。本発明はまたさらに、薬剤が標的細胞とのＨＣＶ融合および標的細胞への侵入を阻害するか否かを決定するための方法を提供する。本発明はまた、標的細胞とのＨＣＶ融合および標的細胞への侵入を阻害する薬剤を提供する。本発明はさらに、ＨＣＶ関連疾患に罹患した対象を治療するための、対象においてＨＣＶ感染を予防するための、および対照においてＨＣＶ関連疾患の発症を抑制するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される、完全長Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する連続したヌクレオチドを含み、少なくとも一つのヌクレオチドの変化を有する改変された核酸であって、前記変化に起因して、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が、前記コード配列から削除されている改変された核酸。
【請求項２】
前記核酸が単離された核酸である、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項３】
前記削除が、前記コード配列からイントロンが切除される程度を減少する、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項４】
前記削除が前記コード配列からのイントロンの切除を妨げる、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項５】
配列番号２中のヌクレオチド位８８７のスプライス受容部位が削除されるように、前記変化がＨＣＶ  Ｅ１コード配列中にＡ８８６Ｃ変異を含む（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項６】
配列番号２中のヌクレオチド位６７５のスプライス供与部位が削除されるように、前記変化がＨＣＶ  Ｅ１コード配列中にＧ６７５Ａ変異を含む（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項７】
配列番号２中のヌクレオチド位８８７のスプライス受容部位が削除されるように、前記変化がＨＣＶ  Ｅ１コード配列中にＧ８８８Ｔ変異を含む（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項８】
配列番号２中のヌクレオチド位８８７のスプライス受容部位が削除されるように、前記変化がＨＣＶ  Ｅ１コード配列中にＡ８８６Ｃ変異およびＧ８８８Ｔ変異を含む（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項９】
配列番号２中のヌクレオチド位２１８３のスプライス受容部位が削除されるように、前記変化が、Ｅ２コード配列中にＡ２１８３Ｔ変異を含む、（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項１０】
配列番号２中のヌクレオチド位８８７および２１８３のスプライス受容部位が削除されるように、前記変化が、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中にＡ８８６Ｃ変異を含み、およびＥ２コード配列中にＡ２１８３Ｔ変異を含む（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項１１】
配列番号２中のヌクレオチド位８８７および２１８３のスプライス受容部位が削除されるように、前記変化が、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中にＧ８８８Ｔ変異を含み、およびＥ２コード配列中にＡ２１８３Ｔ変異を含む（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項１２】
配列番号２中のヌクレオチド位８８７および２１８３のスプライス受容部位が削除されるように、前記変化が、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中にＡ８８６Ｃ変異およびＧ８８８Ｔ変異を含み、並びにＥ２コード配列中にＡ２１８３Ｔ変異を含む（前記変異は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１に記載の改変された核酸。
【請求項１３】
末端切断されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する連続配列を含み、Ｅ１をコードするコード配列中のヌクレオチド位６７５から８８７までのヌクレオチドが欠失されている（前記ヌクレオチド位は配列番号２を基準にして付番されている。）、改変された核酸。
【請求項１４】
前記核酸が単離された核酸である、請求項１３に記載の改変された核酸。
【請求項１５】
ＨＣＶ  Ｅ２遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有する連続したヌクレオチドであって、Ｅ２コード配列中のヌクレオチド位２１８３のスプライス受容部位が削除されるようにＡ２１８３Ｔ変異を含む変化を含むヌクレオチドをさらに含む（前記ヌクレオチド位は配列番号２を基準にして付番されている。）、請求項１３に記載の改変された核酸。
【請求項１６】
請求項１から１５の何れか１項に記載の改変された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載の発現ベクターをその中に含有する宿主細胞。
【請求項１８】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（該糖タンパク質の過半数は完全長である。）を細胞表面上に発現させるための方法であって、前記糖タンパク質が細胞表面上に発現されるように、改変されたコード配列の核転写に適した条件下で、Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コード配列からなる群から選択される改変されたＨＣＶコード配列を含む発現ベクターを用いて細胞にトランスフェクションを行うことを含み、前記改変されたコード配列からのイントロン切除の程度を減少させるために、前記改変されたコード配列中の少なくとも１個のヌクレオチド変化が、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位を削除する方法。
【請求項１９】
ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中のヌクレオチド位８８７のスプライス受容部位がＡ８８６Ｃ変異の導入によって削除され、前記ヌクレオチド位置および変異が配列番号２を基準として付番されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中のヌクレオチド位８８７のスプライス受容部位がＧ８８８Ｔ変異の導入によって削除され、前記ヌクレオチド位置および変異が配列番号２を基準として付番されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中のヌクレオチド位６７５のスプライス供与部位がＧ６７５Ａ変異の導入によって削除され、前記ヌクレオチド位置および変異が配列番号２を基準として付番されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中のヌクレオチド位８８７のスプライス受容部位がＡ８８６Ｃ変異およびＧ８８８Ｔ変異の導入によって削除されており、前記ヌクレオチド位置および変異が配列番号２を基準として付番されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中のヌクレオチド位８８７およびＥ２コード配列中のヌクレオチド位２１８３のスプライス受容部位が、それぞれＡ８８６Ｃ変異およびＡ２１８３Ｔ変異の導入によって削除されており、前記ヌクレオチド位置および変異が配列番号２を基準として付番されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中のヌクレオチド位８８７およびＥ２コード配列中のヌクレオチド位２１８３のスプライス受容部位が、それぞれＧ８８８Ｔ変異およびＡ２１８３Ｔ変異の導入によって削除されており、前記ヌクレオチド位置および変異が配列番号２を基準として付番されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＣＶ  Ｅ１コード配列中のヌクレオチド位８８７およびＥ２コード配列中のヌクレオチド位２１８３のスプライス受容部位が、それぞれＡ８８６Ｃ変異、Ｇ８８８Ｔ変異およびＡ２１８３Ｔ変異の導入によって削除されており、前記ヌクレオチド位置および変異が配列番号２を基準として付番されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
糖タンパク質の７０％超が完全長であるように、前記改変されたＨＣＶコード配列からのイントロンの切除が十分に減少される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
糖タンパク質の９０％超が完全長であるように、前記改変されたＨＣＶコード配列からのイントロンの切除が十分に減少される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその細胞表面上に発現し、前記糖タンパク質が、請求項１８から２７の何れか一項に記載の方法に従って、改変されたＨＣＶコード配列から発現される、細胞。
【請求項２９】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択され、前記糖タンパク質が請求項１８から２７の何れか一項に記載の方法に従って、改変されたＨＣＶコード配列から発現される、細胞表面に局在化されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質。
【請求項３０】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその細胞表面上に発現し、前記糖タンパク質の過半数が完全長である偽ビリオンを作製する方法であって、
（ａ）（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターと、（２）Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コード配列からなる群から選択される改変されたＨＣＶコード配列を含むベクターコンストラクトとを用いて、細胞に共トランスフェクションを行うことと（ここで、前記改変されたコード配列からイントロン切断の程度を低下させるために、前記コード配列中の少なくとも１個のヌクレオチド変化が、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位を前記改変されたコード配列から削除する。）；
（ｂ）偽ビリオンを含有するウイルス性上清を回収することと、を含む方法。
【請求項３１】
糖タンパク質の７０％超が完全長であるように、前記改変されたＨＣＶコード配列からのイントロンの切除が十分に減少される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
糖タンパク質の９０％超が完全長であるように、前記改変されたＨＣＶコード配列からのイントロンの切除が十分に減少される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ビリオンパッケージング機能を提供し、レポーター遺伝子を発現する前記少なくとも一つのベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
単一のパッケージングベクターがビリオンパッケージング機能を提供し、およびレポーター遺伝子を発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記パッケージングベクターが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記パッケージングベクターがｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−であり、該ｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−がルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ビリオンパッケージング機能を提供し、レポーター遺伝子を発現する前記少なくとも一つのベクターが、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）に由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
パッケージングベクターがビリオンパッケージング機能を提供し、別個の移入ベクターがレポーター遺伝子を発現する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３９】
前記移入ベクターが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記パッケージングベクターがｐＣＭＶ−ＨＴ１またはｐＣＭＶ−ＨＴ−Δｅｎｖである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記移入ベクターが、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａ、ｐＨＴＣ−ｅＹＦＰまたはｐＨＴＣ−ｅＹＦＰ−ｔｓａである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
ビリオンパッケージング機能を提供し、レポーター遺伝子を発現する前記少なくとも一つのベクターが、トリＣ型レトロウイルスに由来する、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記パッケージングベクターがｐＲＤ１３６である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記移入ベクターがｐＣＸＬである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が２９３Ｔ細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４６】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその細胞表面上に発現し、前記糖タンパク質の過半数が完全長である偽ビリオン。
【請求項４７】
前記糖タンパク質の７０％超が完全長である、請求項４６に記載の偽ビリオン。
【請求項４８】
前記糖タンパク質の９０％超が完全長である、請求項４６に記載の偽ビリオン。
【請求項４９】
請求項４６から４８の何れか一項に記載の偽ビリオンを含む免疫原。
【請求項５０】
請求項４６から４８の何れか一項に記載の偽ビリオンと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項５１】
アジュバントをさらに含む、請求項５０に記載の薬学的組成物。
【請求項５２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するポリクローナル抗体を産生する方法であって、
（ａ）対象に一次免疫応答を誘導するために、該対象にＨＣＶ偽ビリオンを含む免疫原を注射することと；
（ｂ）前記対象に偽ビリオンの少なくとも１回のブースター注射を投与することと；
（ｃ）ＨＣＶに特異的に結合するポリクローナル抗体を該対象の血清から精製することと、を含む方法。
【請求項５３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するポリクローナル抗体。
【請求項５４】
前記抗体がＨＣＶを中和する、請求項５３に記載のポリクローナル抗体。
【請求項５５】
前記抗体が標的細胞とのＨＣＶの融合および標的細胞中への侵入を阻害する、請求項５３に記載のポリクローナル抗体。
【請求項５６】
前記抗体がトランス感染を阻害する、請求項５３に記載のポリクローナル抗体。
【請求項５７】
前記抗体がＥ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２に結合し、ＨＣＶに感染した細胞でのウイルス量を減少させる、請求項５３に記載のポリクローナル抗体。
【請求項５８】
前記抗体が、請求項１から１５の何れかに記載の改変された核酸から発現された、Ｅ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２に結合する、請求項５３に記載のポリクローナル抗体。
【請求項５９】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）対象に一次免疫応答を誘導するために、該対象にＨＣＶ偽ビリオンを含む免疫原を注射することと；
（ｂ）前記対象に偽ビリオンの少なくとも１回のブースター注射を投与することと；
（ｃ）前記対象から抗体産生リンパ細胞を回収することと
（ｄ）（ｃ）で得た単一の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマを作製することと；
（ｅ）ＨＣＶに特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体を同定するために前記ハイブリドーマからのハイブリドーマ上清をスクリーニングすることと、を含む、方法。
【請求項６０】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するモノクローナル抗体。
【請求項６１】
前記抗体がＨＣＶを中和する、請求項６０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６２】
前記抗体が標的細胞とのＨＣＶの融合および標的細胞中への侵入を阻害する、請求項６０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６３】
前記抗体がトランス感染を阻害する、請求項６０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６４】
前記抗体がＥ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２に結合し、ＨＣＶに感染した細胞でのウイルス量を減少させる、請求項６０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６５】
前記抗体が、請求項１から１５の何れかに記載の改変された核酸から発現された、Ｅ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２に結合する、請求項６０に記載のモノクローナル抗体。
【請求項６６】
前記抗体がヒト化されている、請求項６０から６５の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６７】
前記抗体がヒト抗体である、請求項６０から６５の何れかに記載のモノクローナル抗体。
【請求項６８】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそれらの断片をコードする核酸分子。
【請求項６９】
前記コードされるモノクローナル抗体またはその断片がヒト化されている、請求項６８に記載の核酸分子。
【請求項７０】
前記コードされるモノクローナル抗体またはその断片がヒト抗体である、請求項６８に記載の核酸分子。
【請求項７１】
改変されたＥ１糖タンパク質および改変されたＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される改変されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を細胞中で発現させるための方法であって、産生される糖タンパク質が、アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む）の欠失により均一に末端切断されており（前記アミノ酸残基は、配列番号３を基準として付番されている。）、前記アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む。）を欠失する均一に末端切断された糖タンパク質を発現するように、ヌクレオチド位置６７５と８８７（両端を含む。）との間の推定上のイントロンに対応するヌクレオチド配列が欠失された改変コード配列（前記ヌクレオチド位置は、配列番号２を基準として付番されている。）を含む発現ベクターを用いて、ベクターにコードされる糖タンパク質の発現に適切な条件下で、細胞にトランスフェクションすることを含む、方法。
【請求項７２】
改変されたＥ１糖タンパク質および改変されたＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択され、前記改変された糖タンパク質が、２２６から２９６までのアミノ酸残基の欠失によって均一に末端切断されており、前記アミノ酸残基が配列番号３を基準として付番されている、改変されたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質。
【請求項７３】
ＨＣＶとの融合が可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を薬剤が阻害するか否かを決定するための方法であって、
（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；
（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に接触細胞を曝露することと；
（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと、を含み、
薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少が、標的細胞へのＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す、方法。
【請求項７４】
前記薬剤が、標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することが予め知られていない、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と融合可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を阻害する少なくとも１つの薬剤を同定するために、このような融合を阻害することが知られていない複数の薬剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）複数の薬剤の非存在下でその表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、複数の薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；
（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、前記接触された細胞を曝露することと；
（ｃ）前記複数の薬剤の非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、複数の薬剤の存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと；
（ｄ）共鳴エネルギー移動が複数の薬剤存在下で減少する場合、標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害する少なくとも１つの薬剤をそれにより同定するために、前記複数の薬剤の中に存在するどの薬剤が共鳴エネルギー移動の減少を生じさせるかを個別に調べることと、を含む方法。
【請求項７６】
その表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞、標的細胞または標的細胞およびその表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞の両方に、前記薬剤が前記添加される、請求項７３または７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記標的細胞が、Ｈｕｈ−７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ１０８０、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ−７、Ｕ１１８、２９３ＴおよびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される肝細胞である、請求項７３または７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記標的細胞が、成人ヒト肝臓の生検から単離された、新鮮なヒト肝細胞または凍結保存されたヒト肝細胞である、請求項７３または７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記第一の色素がローダミン部分を含有する分子であり、前記第二の色素がフルオロセイン部分を含有する分子である、請求項７３または７５に記載の方法。
【請求項８０】
ローダミン部分を含有する分子がオクタデシルローダミンＢクロリドであり、フルオロセイン部分を含有する分子がフルオロセインオクタデシルエステルである、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記第一の色素がフルオロセイン部分を含有する分子であり、前記第二の色素がローダミン部分を含有する分子である、請求項７３または７５に記載の方法。
【請求項８２】
ローダミン部分を含有する分子がオクタデシルローダミンＢクロリドであり、フルオレセイン部分を含有する分子がフルオレセインオクタデシルエステルである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
ＨＣＶとの融合が可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を阻害する薬剤。
【請求項８４】
前記薬剤が抗体またはその断片である、請求項８３に記載の薬剤。
【請求項８５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項８６】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項８７】
前記抗体がヒト化抗体またはその断片である、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項８８】
前記抗体がヒト化抗体またはその断片である、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項８９】
前記断片が抗体の軽鎖を含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９０】
前記断片が抗体の重鎖を含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９１】
前記断片が抗体のＦａｂ断片を含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９２】
前記断片が抗体の（Ｆａｂ’）２断片を含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９３】
前記断片が抗体のＦｄ断片を含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９４】
前記断片が抗体のＦｖ断片を含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９５】
前記断片が抗体の可変ドメインを含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９６】
前記断片が抗体の一または複数のＣＤＲドメインを含む、請求項８４に記載の薬剤。
【請求項９７】
前記薬剤がペプチドである、請求項８３に記載の薬剤。
【請求項９８】
前記薬剤がペプチド結合を含む、請求項８３に記載の薬剤。
【請求項９９】
前記薬剤が非ペプチド薬剤である、請求項８３に記載の薬剤。
【請求項１００】
前記薬剤が小分子または低分子量分子である、請求項８３に記載の薬剤。
【請求項１０１】
前記分子が５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１００に記載の薬剤。
【請求項１０２】
請求項８３から１０１の何れか一項に記載の薬剤と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１０３】
少なくとも一つの慣用の抗ウイルス剤をさらに含む、請求項１０２に記載の薬学的組成物。
【請求項１０４】
前記抗ウイルス剤が、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびラバビリンからなる群から選択される、請求項１０３に記載の薬学的組成物。
【請求項１０５】
ＨＣＶによる感染が起こりやすい標的細胞中へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を薬剤が阻害するか否かを決定するための方法であって、
（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤の存在下および非存在下で、（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面上に発現する偽ビリオン（前記Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数は完全長である。）を（２）標的細胞に個別に接触させることと；
（ｂ）前記接触された標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと、
を含み、薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少が、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す、方法。
【請求項１０６】
前記薬剤が、標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することが以前に知られていない、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
Ｃ型肝炎ウイルスに感染しやすい標的細胞中へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を阻害する少なくとも１つの薬剤を同定するために、このような侵入を阻害することが知られていない複数の薬剤をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）複数の薬剤の非存在下で標的細胞中への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、複数の薬剤の存在下および非存在下で、（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面上に発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を（２）標的細胞に個別に接触させることと；
（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、複数の薬剤の非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、複数の薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと；
（ｃ）レポーター遺伝子活性が複数の薬剤存在下で減少する場合、標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害する少なくとも１つの薬剤をそれにより同定するために、前記複数の薬剤の中に存在するどの薬剤がレポーター遺伝子活性を減少させるかを個別に調べることと、を含む方法。
【請求項１０８】
前記薬剤が、標的細胞、偽ビリオンまたは標的細胞および偽ビリオンの両方に添加される、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
標的細胞が偽ビリオンに接触した後であるが、ウイルス侵入前に、前記薬剤が添加される請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記標的細胞が、Ｈｕｈ−７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ１０８０、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ−７、Ｕ１１８、２９３ＴおよびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される肝細胞である、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１１】
前記標的細胞が、成人ヒト肝臓の生検から単離された、新鮮なヒト肝細胞または凍結保存されたヒト肝細胞である、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１２】
ビリオンパッケージング機能を提供し、レポーター遺伝子を発現する前記少なくとも一つのベクターが、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に由来する、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１３】
単一のパッケージングベクターがビリオンパッケージング機能を提供し、およびレポーター遺伝子を発現する、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１４】
前記パッケージングベクターが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１５】
前記パッケージングベクターがｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−であり、該ｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−がルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
ビリオンパッケージング機能を提供し、レポーター遺伝子を発現する前記少なくとも一つのベクターが、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）に由来する、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１７】
パッケージングベクターがビリオンパッケージング機能を提供し、別個の移入ベクターがレポーター遺伝子を発現する、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１１８】
前記移入ベクターが、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記パッケージングベクターがｐＣＭＶ−ＨＴ１またはｐＣＭＶ−ＨＴ−Δｅｎｖである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
前記移入ベクターが、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａ、ｐＨＴＣ−ｅＹＦＰまたはｐＨＴＣ−ｅＹＦＰ−ｔｓａである、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２１】
ビリオンパッケージング機能を提供し、レポーター遺伝子を発現する前記少なくとも一つのベクターが、トリＣ型レトロウイルスに由来する、請求項１０５または１０７に記載の方法。
【請求項１２２】
前記パッケージングベクターがｐＲＤ１３６である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２３】
前記移入ベクターがｐＣＸＬである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
ＨＣＶによる感染が起こりやすい標的細胞中へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を阻害する薬剤。
【請求項１２５】
前記薬剤が抗体またはその断片である、請求項１２４に記載の薬剤。
【請求項１２６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１２８】
前記抗体がヒト化抗体またはその断片である、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１２９】
前記抗体がヒト抗体またはその断片である、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３０】
前記断片が抗体の軽鎖を含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３１】
前記断片が抗体の重鎖を含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３２】
前記断片が抗体のＦａｂ断片を含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３３】
前記断片が抗体の（Ｆａｂ’）２断片を含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３４】
前記断片が抗体のＦｄ断片を含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３５】
前記断片が抗体のＦｖ断片を含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３６】
前記断片が抗体の可変ドメインを含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３７】
前記断片が抗体の一または複数のＣＤＲドメインを含む、請求項１２５に記載の薬剤。
【請求項１３８】
前記薬剤がペプチドである、請求項１２４に記載の薬剤。
【請求項１３９】
前記薬剤がペプチド結合を含む、請求項１２４に記載の薬剤。
【請求項１４０】
前記薬剤が非ペプチド薬剤である、請求項１２４に記載の薬剤。
【請求項１４１】
前記薬剤が小分子または低分子量分子である、請求項１２４に記載の薬剤。
【請求項１４２】
前記分子が５００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１４１に記載の薬剤。
【請求項１４３】
請求項１２４から１４２の何れか一項に記載の薬剤と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項１４４】
少なくとも一つの慣用の抗ウイルス剤をさらに含む、請求項１４３に記載の薬学的組成物。
【請求項１４５】
前記抗ウイルス剤が、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびラバビリンからなる群から選択される、請求項１４４に記載の薬学的組成物。
【請求項１４６】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患した対象を治療するための方法であって、前記治療は、前記ウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することにより実施され、前記方法が前記対象に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、
（１）（ａ）薬剤の非存在下でその表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、前記薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；
（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、前記接触された細胞を曝露することと；
（ｃ）薬剤の非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤の存在下での共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤の存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞へのＨＣＶの融合を前記薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することが決定され、並びに
（２）前記対象を治療するために治療的有効量で投与される、方法。
【請求項１４７】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患した対象を治療するための方法であって、前記治療が前記ウイルスによる感染が起こりやすい標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することにより実施され、前記方法は前記対象に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、
（１）（ａ）薬剤の非存在下での標的細胞中への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面上に発現する偽ビリオン（前記Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数は完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；
（ｂ）前記接触された標的細胞を溶解し、薬剤の非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤の存在下でのレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤の存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、前記標的細胞中へのＨＣＶの侵入を前記薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；
（２）前記対象を治療するために治療的有効量で投与される、方法。
【請求項１４８】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法であって、前記予防が前記ウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することにより実施され、前記方法が前記対象に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、
（１）（ａ）薬剤の非存在下でその表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；
（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、前記接触された細胞を曝露することと；
（ｃ）薬剤の非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤の存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤の存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞に対するＨＣＶの融合を前記薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することが決定され、並びに
（２）前記対象においてＨＣＶ感染を予防するために予防的有効量で投与される、方法。
【請求項１４９】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法であって、前記抑制が前記ウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することにより実施され、前記方法が前記対象に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、
（１）（ａ）薬剤の非存在下でその表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；
（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、前記接触された細胞を曝露することと；
（ｃ）前記薬剤の非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、前記薬剤の存在下での共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤の存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、前記標的細胞に対するＨＣＶの融合を前記薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することが決定され、並びに
（２）前記対象に予防効果を有する予防的有効量で投与される、方法。
【請求項１５０】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法であって、前記予防が前記ウイルスに感染しやすい標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することにより実施され、前記方法が前記対象に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、
（１）（ａ）薬剤の非存在下での標的細胞中への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面上に発現する偽ビリオン（前記Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；
（ｂ）前記接触された標的細胞を溶解し、前記薬剤の非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、前記薬剤の存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤の存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、前記標的細胞中へのＨＣＶ侵入を前記薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；並びに
（２）前記対象においてＨＣＶ感染を予防するために予防的有効量で投与される、方法。
【請求項１５１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法であって、前記抑制が前記ウイルスに感染しやすい標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することにより実施され、前記方法が前記対象に薬剤を投与することを含み、前記薬剤が、
（１）（ａ）薬剤の非存在下での標的細胞中への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製され、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面上に発現する偽ビリオン（前記Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；
（ｂ）前記接触された標的細胞を溶解し、薬剤の非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、前記薬剤の存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（前記薬剤の存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、前記標的細胞中へのＨＣＶ侵入を前記薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；並びに、
（２）前記対象において予防効果を有する予防的有効量で投与される、方法。
【請求項１５２】
少なくとも一つの慣用の抗ウイルス剤の投与をさらに含む、請求項１４６から１５１の何れかに記載の方法。
【請求項１５３】
前記抗ウイルス剤が、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびラバビリンからなる群から選択される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法であって、前記予防が前記対象を免疫することにより実施され、
（ａ）Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその表面上に発現するＨＣＶ偽ビリオンを含む薬学的組成物（前記糖タンパク質の過半数は完全長である。）を前記対象に注射することと；それにより（ｂ）前記対象において防御的ＨＣＶ免疫応答を誘発することと、を含む、方法。
【請求項１５５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法であって、前記抑制が該対象を免疫することにより実施され、
（ａ）Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（該糖タンパク質の過半数は、完全長である。）をその表面上に発現するＨＣＶ偽ビリオンを含む薬学的組成物を前記対象に注射し、それにより、
（ｂ）前記対象において防御的ＨＣＶ免疫応答を誘発することと、を含む方法。
【請求項１５６】
Ｅ１糖タンパク質、Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体およびその免疫原断片からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を、前記対象中に注射することをさらに含む、請求項１５４から１５５の何れかに記載の方法。
【請求項１５７】
Ｅ１糖タンパク質、Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体およびその免疫原断片からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を発現することが可能な核酸ベクターを、前記対象中に注射することをさらに含む、請求項１５４から１５５の何れかに記載の方法。
【請求項１５８】
少なくとも一つの慣用の抗ウイルス剤をさらに含む、請求項１５４から１５５の何れかに記載の方法。
【請求項１５９】
前記抗ウイルス剤が、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびラバビリンからなる群から選択される、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
請求項５３および５５から５７の何れか一項に記載の抗体と、ヒト組織においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するために前記抗体を用いるための使用説明書とを備える、診断キット。
【請求項１６１】
前記使用説明書が免疫アッセイ用の本抗体の使用を記載する、請求項１６０に記載のキット。
【請求項１６２】
前記抗体が固相支持体に固定化されている、請求項１６１に記載のキット。
【請求項１６３】
前記固相支持体が、多糖ポリマー、フィルターペーパー、ニトロセルロース膜、ポリエチレン、ポリスチレンおよびポリプロピレンからなる群から選択される、請求項１６２に記載のキット。
【請求項１６４】
請求項１から１２の何れか一項の請求項に記載の改変された核酸分子をその中に含有するパッケージング材料と、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（発現される前記糖タンパク質の過半数は完全長である。）を表面上に発現させるために前記改変された核酸を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品。
【請求項１６５】
請求項１から１２の何れか一項の請求項に記載の改変された核酸分子をその中に含有するパッケージング材料と、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（発現される前記糖タンパク質の過半数は完全長である。）をその表面上に発現する偽ビリオンを生成させるために前記改変された核酸を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を備える製品。
【請求項１６６】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（該糖タンパク質の過半数は完全長である。）を細胞表面上に発現する細胞をその中に含有するパッケージング材料と、前記ウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害する薬剤を同定するために前記細胞を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品。
【請求項１６７】
Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（該糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面上に発現する偽ビリオンをその中に含有するパッケージング材料（該糖タンパク質の過半数完全長である。）と、前記ウイルスに感染しやすい標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害する薬剤を同定するために前記偽ビリオンを使用するための使用説明書を提供するラベルと、を備える製品
【請求項１６８】
請求項８３から１０１の何れか一項に記載の薬剤をその中に含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患している対象を治療するために前記薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルとを備え、前記ウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することにより前記治療が実施される、製品。
【請求項１６９】
請求項１２４から１４２の何れか一項に記載の薬剤をその中に含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患している対象を治療するために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルとを備え、前記ウイルスに感染しやすい標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することにより前記治療が実施される、製品。
【請求項１７０】
請求項８３から１０１の何れか一項に記載の薬剤をその中に含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するために前記薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルとを備え、前記ウイルスと融合可能な標的細胞中へのＨＣＶの融合を阻害することにより前記抑制が実施される、製品。
【請求項１７１】
請求項１２４から１４２の何れか一項に記載の薬剤をその中に含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を前記対象において抑制するために前記薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルとを備え、前記ウイルスに感染しやすい標的細胞中へのＨＣＶの侵入を阻害することにより前記抑制が実施される、製品。
【請求項１７２】
請求項４６から４８の何れか一項に記載の偽ビリオンをその中に含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するために前記偽ビリオンを使用するための使用説明書を提供するラベルとを備え、前記対象中に防御的免疫反応を惹起するために、前記偽ビリオンを免疫原として使用することによって前記抑制が実施される、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において開示される発明は、National Institutes of Health, U.S. Department of Health and Human Servicesからの助成金番号ＡＩ０５１１３４のもと、アメリカ合衆国政府の支援によりなされた。従って、アメリカ合衆国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本願を通して、様々な公表物が、括弧内に挿入された著者名および日付によって参照される。これらの公表物の完全な引用は、本明細書の最後に見出すことができる。本明細書中で記載され主張される本発明の日付において当業者に公知の技術の状態をより完全に記載するために、これら刊行物の開示の全体を、本明細書の一部として本願に援用する。しかしながら、本明細書中の参考文献の引用は、かかる文献が本発明に対する先行技術であるということの承認として解釈されるべきものではない。
【背景技術】
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルスは、１９８９年に最初に認知された。これは肝臓に感染し、非Ａ、非Ｂ型肝炎の殆どの原因である（ＡｌｔｅｒおよびＳｅｅｆ、１９９３）。感染は、典型的には慢性で、生涯にわたるものであり；多くの感染個体は数十年にわたって健康で影響を受けないのに対して、慢性肝炎または肝硬変を発症するものもおり、後者では肝細胞癌を引き起こすことが多い（Ｆｒｙ  ａｎｄ  Ｆｌｉｎｔ，１９９７；ＬａｕｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、２００１）。血液供給のスクリーニングにより、新たなウイルス伝染は激減したが、今後数十年において治療を必要とするであろう感染個体の大規模な集団が存在する。一部の報告では、世界人口の３％近く、または世界中で約１７０，０００，０００人（米国における約４，０００，０００人を含む。）が、ＨＣＶに感染していると推定されている（Ａｎｏｎ、１９９９）。
【０００４】
ＨＣＶ感染およびその臨床的な続発症は、米国における肝移植の主要な原因である。現在利用できるワクチンはなく、どちらも作用メカニズムが完全に分かっていない非特異的抗ウイルス剤であるインターフェロンαおよびリバビリンの２種類の認可治療のみが、若干の効果を示す（ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎら、１９９８）。従って長期奏功率が最大となるのは、インターフェロンα−２ｂとリバビリンとの組み合わせであるが、この組み合わせで治療を行った患者のうち、治療停止から６ヶ月後に血清ＨＣＶのＲＮＡが全く検出されないという所望の結果を達成するのは、少数のみである（ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎら、１９９８）。さらに、これらの薬物は、好中球減少症、溶血性貧血および重篤な鬱を含む重篤かつ生命を脅かす毒性を示す。従って、ＨＣＶ感染に立ち向かう新しい治療アプローチおよび薬剤の開発が緊急に必要とされている。
【０００５】
ＨＣＶ感染に対する新しい治療の開発は、ウイルスがどのように細胞膜に接着し融合するか、どのように標的細胞に侵入し、そこで複製し、隣接する細胞に感染し、疾病症候を誘発するかということに関する詳細な知識により促進されよう。しかし、第一に実験モデルおよびキーとなる試薬が欠けているために、ＨＣＶ複製および病理の基本的な理解さえ今だ乏しい。従って、このウイルスの生活環および疾病の原因の様々な局面の基礎となるメカニズムの解明を促進する、より優れたモデル系の開発は、重要なステップである。
【０００６】
ＨＣＶゲノムは、９．６ｋｂのポジティブセンスの、感染細胞の細胞質でのみ複製する一本鎖ＲＮＡ分子である（Ｒｉｃｅ  １９９６）。このゲノムＲＮＡは、プロセシングされて少なくとも１０個のタンパク質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂと呼ばれる。）を生じる、〜３０００アミノ酸ポリタンパク質をコードする（Ｇｒａｋｏｕｉら、１９９３；Ｒｉｃｅ、１９９６；ＬａｕｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、２００１）。このＣタンパク質は、ヌクレオキャプシッドを構成し；Ｅ１およびＥ２は、膜貫通エンベロープ糖タンパク質であり；ｐ７は、機能未知の膜貫通タンパク質であり；種々の非構造（ＮＳ）タンパク質は、複製機能を有する（ＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒおよびＬｏｈｍａｎｎ、２０００；Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋら、２００１）。
【０００７】
エンベロープ糖タンパク質は、ウイルス感染性において、ビリオンのパッケージング、標的細胞へのビリオンの接着、これらの細胞との融合およびこれらの細胞への侵入ならびに別の細胞感染周期が開始できるようになる前の細胞膜からのウイルスの出芽を含む様々なプロセスにおけるそれらの直接的効果を介して重要な役割を果たすと考えられている。標的細胞へのＨＣＶ侵入は、特に抗ウイルス療法のための魅力的な標的であるが、これは、侵入阻害剤が、形質膜を横切り、または細胞内で修飾される必要がないためである。さらに、ウイルスの侵入は、一般にウイルスエンベロープおよび細胞膜上の保存的構造によって媒介される律速段階である。その結果、ウイルス侵入阻害剤は、ウイルス複製を強力かつ長期的に抑制することができる。
【０００８】
宿主細胞へのＨＣＶの侵入には、細胞表面へのウイルス粒子の付着、続いて細胞膜とのウイルスエンベロープの融合が必要である。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質であるＥ１およびＥ２は、感受性標的細胞へのウイルス侵入を媒介することに関与すると考えられている。哺乳類細胞に基づいた発現系において、成熟した、完全長Ｅ１の分子量は、〜３５ｋＤであり、Ｅ２は、〜７２ｋＤである（Ｇｒａｋｏｕｉら、１９９３；Ｍａｔｓｕｕｒａら、１９９４；Ｓｐａｅｔｅら、１９９２）。Ｅ１およびＥ２は、ウイルス表面において非共有結合へテロ二量体として存在し（本明細書で以後、Ｅ１／Ｅ２と呼ぶ。）、Ｎ連結グリコシル化による大規模な翻訳後修飾を受ける（ＬａｕｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、２００１）。
【０００９】
ＨＣＶ構造タンパク質、Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７の、細胞への侵入に続き、小胞体（ＥＲ）への移動が起こり、その際、ＥＲ残留シグナルペプチダーゼにより内部シグナル配列が切断される（ＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒおよびＬｏｈｍａｎｎ、２０００；Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋら、２００１；ＲｅｅｄおよびＲｉｃｅ  ２０００）。ＨＣＶは、ＥＲへ出芽し、細胞質性小胞を介して移動により成熟する（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、１９９１）。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の細胞内局在およびインビトロでのトランスフェクションまたは感染細胞における粒子の研究から、小胞を利用したＨＣＶの形態形成が示唆される（Ｄａｓｈら、１９９７；Ｅｇｇｅｒら、２００２；Ｇｒｅｉｖｅら、２００２；Ｉｏｃｏｖａｃｃｉら、１９９７；Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、２００２；Ｓｅｒａｆｉｎｏら、１９９７；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９６）。しかし、ＨＣＶ様粒子が感染患者からの肝細胞の細胞質において検出され（ＤｅＶｏｓら、２００２）、このことから、ＨＣＶの出芽および成熟プロセスがまだ説明されてはいないが、原形質膜における出芽が示唆される。
【００１０】
ウイルス侵入の最もよく知られている２つの実験モデルは、受容体−とエンベロープ糖タンパク質発現細胞との間の細胞−細胞膜融合および異種エンベロープ糖タンパク質を用いてシュードタイピングした「レポーター」ウイルスの侵入である。両システムとも、機能的エンベロープ糖タンパク質の細胞表面結合発現に依存する。しかし、細胞表面におけるＥ１およびＥ２の発現の達成は困難であることが明らかであり、様々な研究から、ＴＭドメインの修飾が必要とされ得ることが示唆されている。２つのグループ（Ｌａｇｇｉｎｇら、１９９８；Ｔａｋｉｋａｗａら、２０００）が、ＶＳＧ  Ｇエンベロープ糖タンパク質のＴＭドメインに融合したＥ１およびＥ２細胞外ドメインにより媒介される融合および侵入について述べている。しかし、ＶＳＶ  ＧのＴＭドメインは、二量体化機能が知られておらず、Ｅ１およびＥ２は、別々のｍＲＮＡから発現され、さらにネイティブのヘテロ二量体を形成する可能性が小さくなる。特異性を表すキーとなる対照が欠落していたので、融合および侵入が実際にＥ１およびＥ２により媒介されるか否かは、これらの報告からは不明確である。
【００１１】
報告された結果において、幾つかの矛盾もあり、あるグループが、ウイルスシュードタイプのｐＨ依存的侵入がＥ１またはＥ２のいずれかにより媒介されることを示した（Ｌａｇｇｉｎｇら、１９９８；Ｍｅｙｅｒら、２０００；Ｌａｇｇｉｎｇら、２００２）が、その一方、他のグループは、ｐＨ依存的融合には両方の糖タンパク質が必要であることを示した（Ｔａｋｉｋａｗａら、２０００；Ｍａｔｓｕｕｒａら、２００１）。さらに、ＨＣＶ−ＶＳＶキメラエンベロープ糖タンパク質が機能的ではないという最近の報告（Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅら、２００２）は、先行研究の結果を否定する。従って、キメラＶＳＶ  Ｇ系は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質媒介細胞融合および侵入を再生的に模っていないと思われる。
【００１２】
細胞表面におけるＥ１／Ｅ２ヘテロ二量体の明らかな欠如およびゴルジ酵素によるＮ−グリカン修飾の欠如から、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質がＥＲにおいて残留することが示唆される（Ｄｕｖｅｔら、１９９８；Ｍａｒｔｉｒｅら、２００１；Ｍｉｃｈａｌａｋら、１９９７；Ｐａｔｅｌら、２００１；Ｓｅｌｂｙら、１９９４）。Ｅ１／Ｅ２のＥＲ残留およびこれらの糖タンパク質のヘテロ二量体化の両方が、Ｅ１およびＥ２のＴＭドメインにより媒介されると考えられ（Ｃｏｃｑｕｅｒｅｌら、１９９９；Ｃｏｃｑｕｅｒｅｌら、１９９８；Ｃｏｃｑｕｅｒｅｌら、２０００；ＦｌｉｎｔおよびＭｃＫｅａｔｉｎｇ、１９９９；Ｆｌｉｎｔら、１９９９；（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｙｄｅｒら、１９９７；Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎら、１９９４；Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋら、２０００；Ｐａｔｅｌら、１９９９；Ｒａｌｓｔｏｎら、１９９３；Ｓｅｌｂｙら、１９９４）、これにより細胞表面で発現されるＥ１／Ｅ２ヘテロ二量体の生成が困難となる。しかし、このような表面発現Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体を生成させるための実験系は、非常に価値があり、例えば、細胞膜融合および偽ビリオン侵入の程度を測定するためのアッセイの開発および感受性細胞へのＨＣＶ侵入を阻害する薬剤の同定ならびにモノクローナル抗体およびワクチンの産生のための開発において用途がある。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される、完全長Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する連続したヌクレオチドを含有する改変された核酸を提供するが、この核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を有し、この変化のために、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が本コード配列から削除される。
【００１４】
本発明はまた、短縮型Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する連続したヌクレオチドを含有する改変された核酸も提供するが、ここで、Ｅ１をコードするコード配列におけるヌクレオチド位置６７５から８８７（両端を含む。）にわたるヌクレオチドが欠失している（配列番号２を参照することにより付番する。）。
【００１５】
本発明はさらに、本明細書中に記載の改変された核酸のいずれか１個を含有する発現ベクターを提供する。
【００１６】
本発明はまたさらに、上述の発現ベクターをその中に含有する宿主細胞を提供する。
【００１７】
本発明はまた、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の過半数が完全長である。）を細胞表面上に発現させるための方法を提供するが、本方法は、この糖タンパク質が細胞表面で発現されるように、本改変コード配列の核転写に適した条件下で、Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コード配列からなる群から選択される改変ＨＣＶコード配列（本改変コード配列からのイントロン切除の程度を減少させるために、本改変コード配列における少なくとも１個のヌクレオチド変化により、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が削除される。）を含有する発現ベクターを用いて細胞に対してトランスフェクションを行うことを含む。
【００１８】
本発明はさらに、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその細胞表面上に発現する細胞を提供するが、この糖タンパク質は、本明細書中に記載の方法のいずれかに従い、改変ＨＣＶコード配列から発現される。
【００１９】
本発明は、さらに、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される、細胞表面局在Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を提供するが、この糖タンパク質は、本明細書中に記載の方法のいずれかに従い、改変ＨＣＶコード配列から発現される。
【００２０】
本発明はまた、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその表面で発現する偽ビリオンを作製するための方法も提供するが、この糖タンパク質の殆どは完全長であり、本方法は、（ａ）（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターおよび（２）Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コード配列からなる群から選択される改変ＨＣＶコード配列を含有するベクターコンストラクトを用いて、細胞に対して共トランスフェクションを行うことと（ここで、この改変コード配列からイントロン切断の程度を低下させるために、本コード配列における少なくとも１個のヌクレオチド変化により、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が本改変コード配列から削除される。）；（ｂ）偽ビリオンを含有するウイルス性上清を回収することと、を含む。
【００２１】
本発明はさらに、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面で発現する偽ビリオンを提供する。
【００２２】
本発明はまたさらに、本明細書中に記載のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）偽ビリオンのいずれか１つを含有する免疫原を提供する。
【００２３】
本発明はまた、本明細書中に記載のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）偽ビリオンのいずれか１つと薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、（ａ）対象において一次免疫応答を誘導するために、該対象にＨＣＶ偽ビリオンを含有する免疫原を注射することと；（ｂ）該対象に偽ビリオンの少なくとも１回のブースター注射を投与することと；（ｃ）ＨＣＶに特異的に結合するポリクローナル抗体を該対象の血清から精製することと、を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するポリクローナル抗体を産生するための方法を提供する。
【００２５】
本発明はまたさらに、ＨＣＶに特異的に結合するポリクローナル抗体を提供する。
【００２６】
本発明はまた、（ａ）対象において一次免疫応答を誘導するために、該対象にＨＣＶ偽ビリオンを含有する免疫原を注射することと；（ｂ）該対象に偽ビリオンの少なくとも１回のブースター注射を投与することと；（ｃ）該対象から抗体産生リンパ細胞を回収することと；（ｄ）（ｃ）で得た１個の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマを作製することと；（ｅ）ＨＣＶに特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体を同定するためにこれらのハイブリドーマからのハイブリドーマ上清をスクリーニングすることと、を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための方法を提供する。
【００２７】
本発明はさらに、ＨＣＶに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
【００２８】
本発明はまたさらに、ＨＣＶに特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその断片をコードする核酸分子を提供する。
【００２９】
さらに、本発明は、改変Ｅ１糖タンパク質および改変Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される改変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を細胞において発現させるための方法を提供するが、産生される糖タンパク質は、アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む）の欠失により均一に短縮されており（これらのアミノ酸残基を配列番号３を参照することにより付番する。）、この方法は、アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む。）を欠失する均一に短縮された糖タンパク質（これらのアミノ酸残基を配列番号３を参照することにより付番する。）を発現するように、改変コード配列（ヌクレオチド位置６７５と８８７（両端を含む。）との間の推定上のイントロンに対応するヌクレオチド配列が欠失しており、これらのヌクレオチド位置を配列番号２を参照することにより付番する。）を含有する発現ベクターを用いて、ベクターにコードされる糖タンパク質の発現に適切な条件下で細胞にトランスフェクションすることを含む。
【００３０】
本発明はまた、改変Ｅ１糖タンパク質および改変Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される改変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質も提供するが、この改変糖タンパク質は、アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む）の欠失により均一に短縮されている（これらのアミノ酸残基を配列番号３を参照することにより付番する。）。
【００３１】
本発明はさらに、ＨＣＶとの融合が可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を薬剤が阻害するか否かを決定するための方法を提供するが、この方法は、（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に接触細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞へのＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）、を含む。
【００３２】
本発明はまたさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と融合可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を阻害する少なくとも１つの薬剤を同定するために、このような融合を阻害することが知られていない複数の薬剤をスクリーニングするための方法を提供するが、この方法は、（ａ）複数の薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、複数の薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）複数の薬剤の非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、複数の薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと；（ｄ）共鳴エネルギー移動が複数の薬剤存在下で減少する場合、標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害する少なくとも１つの薬剤をそれにより同定するために、この複数の薬剤の中に存在するどの薬剤が共鳴エネルギー移動減少を生じさせるかを個別に調べることと、を含む。
【００３３】
本発明はさらに、ＨＣＶとの融合が可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を阻害する薬剤を提供する。
【００３４】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤のいずれかと薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。
【００３５】
本発明はさらに、ＨＣＶによる感染が起こりやすい標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を薬剤が阻害するか否かを決定するための方法を提供するが、この方法は、（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤の存在下および非存在下で、（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を（２）標的細胞に個別に接触させることと、（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）、を含む。
【００３６】
本発明はまたさらに、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を阻害する少なくとも１つの薬剤を同定するために、このような侵入を阻害することが知られていない複数の薬剤をスクリーニングするための方法を提供するが、この方法は、（ａ）複数の薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、複数の薬剤の存在下および非存在下で、（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を（２）標的細胞に個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、複数の薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、複数の薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと；（ｃ）レポーター遺伝子活性が複数の薬剤存在下で減少する場合、標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害する少なくとも１つの薬剤をそれにより同定するために、この複数の薬剤の中に存在するどの薬剤がレポーター遺伝子活性を減少させるかを個別に調べることと、を含む。
【００３７】
さらに、本発明は、ＨＣＶによる感染が起こりやすい標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を阻害する薬剤を提供する。
【００３８】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤のいずれかと薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患した対象を治療するための方法を提供するが、この治療は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより達成され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞に対するＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することが決定され、（２）その対象を治療するために治療的有効量で投与される。
【００４０】
本発明はまたさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患した対象を治療するための方法を提供するが、その治療は、このウイルスによる感染が起こりやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより達成され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；（２）その対象を治療するために治療的有効量で投与される。
【００４１】
本発明はさらに、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法を提供するが、この予防は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより達成され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞に対するＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することが決定され、（２）その対象においてＨＣＶ感染を予防するために予防的有効量で投与される。
【００４２】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法を提供するが、この抑制は、、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより達成され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞に対するＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することが決定され、（２）その対象に予防効果を有する予防的有効量で投与される。
【００４３】
本発明はさらに、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法を提供するが、この予防は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより達成され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；（２）その対象においてＨＣＶ感染を予防するために予防的有効量で投与される。
【００４４】
本発明はまたさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法を提供するが、この抑制は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより達成され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製され、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；（２）その対象において予防効果を有する予防的有効量で投与される。
【００４５】
本発明はまた、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法を提供するが、この予防は、該対象を免疫することにより達成され、本方法は、（ａ）Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその表面で発現するＨＣＶ偽ビリオンを含む薬学的組成物（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）を該対象に注射することと；それにより（ｂ）該対象において防御的ＨＣＶ免疫応答を誘発することと、を含む。
【００４６】
本発明はさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法を提供するが、その抑制は、該対象を免疫することにより達成され、本方法は、（ａ）Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその表面で発現するＨＣＶ偽ビリオンを含む薬学的組成物（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）を該対象に注射することと；それにより（ｂ）該対象において防御的ＨＣＶ免疫応答を誘発することと、を含む。
【００４７】
本発明はまたさらに、本明細書中に記載の抗体と、ヒト組織においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するためにこの抗体を用いるための使用説明書とを含む診断キットを提供する。
【００４８】
本発明はまた、本明細書中に記載の改変された核酸分子をその中に含有するパッケージング材料と、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この発現糖タンパク質の殆どは完全長である。）を表面で発現させるために該改変された核酸を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、本明細書中に記載の改変された核酸分子をその中に含有するパッケージング材料と、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この発現糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面で発現する偽ビリオンを生成させるために該改変された核酸を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【００５０】
本発明はまたさらに、細胞表面でＥ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）を発現する細胞をその中に含有するパッケージング材料と、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害する薬剤を同定するために該細胞を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【００５１】
さらに、本発明は、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面で発現する偽ビリオンをそこに含有するパッケージング材料（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）と、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害する薬剤を同定するために該偽ビリオンを使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【００５２】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤をそこに含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患している対象を治療（この治療は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより達成される。）するために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品も提供する。
【００５３】
本発明はさらに、本明細書中に記載の薬剤をそこに含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患している対象を治療する（この治療は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより達成される。）ために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【００５４】
本発明はまたさらに、本明細書中に記載の薬剤をそこに含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制する（この抑制は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することにより達成される。）ために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品も提供する。
【００５５】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤をそこに含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制する（この抑制は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより達成される。）ために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品も提供する。
【発明の詳細な説明】
【００５６】
＜定義＞
本明細書中で使用される場合、本明細書中で別段の断りがない限り、次の各用語は、下記で定義する意味を有するものとする。
【００５７】
「投与する」とは、当業者にとって公知の様々な方法および送達システムのいずれかを使用して成し遂げられ、または行われる様式で送達されることを意味する。投与は、例えば、局所的、静脈内、心嚢、経口、非経口、移植を介して、経粘膜的、経皮的、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、リンパ内、病巣内または硬膜外的に行い得る。薬剤または組成物はまた、肺および／または鼻腔内送達など、エアロゾルで投与し得る。投与はまた、例えば、単回もしくは複数回、および／または１もしくは複数の長期間、行い得る。
【００５８】
ＨＣＶまたは偽ビリオンの標的細胞への「接着」とは、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の、ＨＣＶ感染しやすい細胞の表面に存在する、例えばＬ−ＳＩＧＮなどのリガンドへの結合により媒介されるプロセスを意味する。このプロセスは、ＨＣＶもしくは偽ビリオンの、標的細胞との融合または標的細胞への侵入とは区別される。「融合」とは、哺乳類細胞またはＨＣＶなどのウイルスで見られる脂質二重膜の連結または癒合を意味する。ＨＣＶ感染しやすい細胞の細胞膜の、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質＋細胞膜との融合とは、両方の細胞膜の成分を含むハイブリッド膜を形成するための、感染しやすい細胞の細胞膜の、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質＋膜との疎水性連結および統合を意味する。ある実施形態において、宿主細胞は、ヒト対象者からなどの対象からの身体の細胞である。「侵入」とは、それによりウイルスの遺伝情報が宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。宿主細胞へのＨＣＶの侵入は、細胞表面にウイルス粒子が前もって接着することと、それに続く、細胞膜とのウイルスエンベロープの融合を必要とする。ＨＣＶ接着、融合および侵入の全体的なプロセスの結果、宿主細胞の「ＨＣＶ感染」が起こる。感染は通常、必ずしもそうではないが、対象における疾患症候の誘発を伴う。
【００５９】
「細胞」という用語は、例えば生物学的細胞、例えばＨｅＬａ細胞および非生物学的細胞、例えばリン脂質液胞またはビリオンを含む。「ＨＣＶ感染しやすい細胞」はまた、「標的細胞」を意味し、ＨＣＶにより感染する、もしくはＨＣＶと融合することができる細胞またはＨＣＶ感染細胞を含み得る。
【００６０】
「完全長」Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質とは、対応する非改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質コード配列によりコードされるポリペプチドと、アミノ酸長および配列が同一のものである。特に、このような完全長ＨＣＶ糖タンパク質は、対応する非改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質コード配列から、何らかの推定イントロン配列が切除された結果として短縮されていない。
【００６１】
「完全長ヒト」抗体とは、アミノ酸全てがヒト免疫グロブリン分子のアミノ酸と対応する抗体を意味する。
【００６２】
「ヒト化」抗体とは、相補性決定領域（ＣＤＲ）の外側のアミノ酸の一部、殆どまたは全てが、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換されている抗体を意味する。
【００６３】
「ＨＣＶ」とは、米国特許第６，５７２，８６４号および同第５，８８２，８５２号に記載されているような株、サブタイプまたは遺伝子型に限定されない、Ｃ型肝炎ウイルスを意味する。ＨＣＶには、これらに限定されないが、細胞外のウイルス粒子、およびＨＣＶが結合した、および／またはＨＣＶが感染した細胞において見られる形態が含まれる。
【００６４】
偽ビリオンなどの免疫原の「免疫原的有効量」とは、対象において防御的免疫応答を誘導するのに十分な量である。
【００６５】
ＨＣＶ、ＨＣＶ偽ビリオンまたはＨＣＶエンベロープ糖タンパク質＋細胞の、ＨＣＶ感染しやすい細胞との「融合を阻害する」とは、（ａ）少なくとも５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、ＨＣＶエンベロープ、ＨＣＶ偽ビリオンまたはＨＣＶエンベロープ糖タンパク質＋細胞の細胞膜との、ＨＣＶ感染しやすい細胞の細胞膜の融合速度を低下させること、および／または（ｂ）少なくとも５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、融合のエンドポイントにより起こる、ＨＣＶエンベロープ、ＨＣＶ偽ビリオンまたはＨＣＶエンベロープ糖タンパク質＋細胞の細胞膜との、ＨＣＶ感染しやすい細胞の細胞膜の融合の総量を低下させることを意味する。細胞膜融合速度とは、時間単位あたりの融合した細胞膜の総量を意味する。融合のエンドポイントとは、ＨＣＶ感染が起こりやすい細胞の細胞膜の、生じ得るＨＣＶエンベロープ糖タンパク質＋細胞膜との全融合が起こった時間点を意味する。
【００６６】
宿主細胞へのＨＣＶまたはＨＣＶ偽ビリオンの「侵入を阻害する」とは、例えば阻害剤なしで導入されるであろう量と比較して、宿主細胞へ導入されるウイルス性遺伝情報の量が減少することを意味する。ある実施形態において、「阻害する」とは、宿主細胞に導入されるウイルス性遺伝情報の量が、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％減少することを意味する。好ましい実施形態において、宿主細胞に導入されるウイルス性遺伝情報の量は、１００％減少する。
【００６７】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質の「過半数」が完全長である、とは、糖タンパク質の５０％超が完全長分子からなることを意味する。
【００６８】
「薬学的に許容される担体」は、当業者にとって周知であり、これらに限定されないが、０．０１Ｍから０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％  生理食塩水が含まれる。さらに、このような薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液および乳液であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝溶媒を含む、水、アルコール性／水溶液、乳液および懸濁液が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸添加リンガー液および不揮発油が含まれる。静脈注射用ビヒクルには、体液および栄養素補液、リンガーデキストロースに基づいたものなどの電解質補充剤などが含まれる。固体組成物には、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースもしくはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウムなどの非毒性の固体担体が含まれ得る。肺および／または鼻腔内送達など、エアロゾルでの投与の場合、薬剤または組成物は、好ましくは、非毒性界面活性剤、例えばＣ６からＣ２２脂肪酸のエステルもしくは部分エステルまたは天然のグリセリドおよびプロペラントとともに処方される。鼻腔内送達を促進するために、レシチンなどのさらなる担体が含まれ得る。上述の担体に加えて、ワクチンは、さらに、例えば、サイログロブリン、アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（Ｄ−リジンおよびＤ−グルタミン酸のポリマーなど）、不活化インフルエンザウイルスおよびＢ型肝炎ウイルス組み換えタンパク質などの、当技術分野で公知の担体を含み得る。このワクチンはまた、不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＱＳ２１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を含むサポニン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｅｉｇら、１９９５）、モンタニド、ビタミンＥおよび、スクアレンなどの生体内分解性油から調製される様々な油中水滴乳液および／またはトコフェロール、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１およびそれらの組み合わせなどの何らかの周知のアジュバントを含み得る。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども上記の担体全てとともに含まれ得る。
【００６９】
「予防的有効量」とは、疾患に罹患しやすい対象に投与した際、その疾患の発症を抑制するあらゆる薬剤の量である。疾患の発症を「抑制する」とは、疾患の発症の可能性を低下させるか、または疾患の発症を完全に予防するかのいずれかを意味する。好ましい実施形態において、疾患の発症を抑制する、とは、その発症を完全に予防することを意味する。
【００７０】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する「防御的免疫応答」とは、感染を予防するか、または対象がウイルスに最初に曝露された後、細胞から細胞への感染の拡大を抑える免疫応答を意味する。例えばＨＣＶ偽ビリオンの投与により誘発されるこのような応答には、抗−ＨＣＶ抗体の生成および／または細胞性免疫応答の生成（例えば細胞毒性Ｔリンパ球の活性化）が含まれ得る。
【００７１】
「対象」とは、あらゆる動物、例えば、これらに限定されないがヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類（マウス、ラットまたはモルモットなど）、シチメンチョウもしくはニワトリを含む、哺乳類または鳥類などを意味する。好ましい実施形態において、該対象はヒトである。
【００７２】
「治療的有効量」とは、その薬剤が有効である疾患に罹患している対象に投与した際に、対象が治療されることとなる薬剤のあらゆる量である。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）偽ビリオン免疫原の投与に関して、治療的有効量とは、ＨＣＶの拡大を抑える（例えば、慢性的感染を制限する。）のに有効であり、従って、症候を軽減するか、または肝臓組織のさらなる損傷を防ぐ、偽ビリオンのあらゆる量を意味する。
【００７３】
疾患に罹患している対象を「治療する」とは、対象において該疾患および／またはその症候の緩和または消退を引き起こすことを意味する。ある実施形態において、疾患および／またはその症候の再発が予防される。好ましい実施形態において、該対象は、疾患および／またはその症候が治癒する。
【００７４】
「適切な条件」とは、この用語が使用される文脈に依存して意味を有する。一般に、それは、何かを行うことが可能な薬剤が、意図する事を行う条件を意味する。ある実施形態において、「適切な条件」という用語は、本明細書中で使用される場合、生理的条件を意味する。
【００７５】
「非改変」ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質コード配列とは、野生型ＨＣＶゲノムでそれらが生じているような、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７コンセンサス遺伝子配列を意味する。「改変」ＨＣＶ糖タンパク質遺伝子配列とは、Ｅ１（Ａ８８６Ｃおよび／またはＧ８８８Ｔ；Ｅ１＊と称する改変配列）またはＥ２（Ａ２１８３Ｔ；Ｅ２＊と称する改変配列）のスプライス受容部位を除去する保存的変異、またはヌクレオチド位置６７５と８８７との間でＥ１における推定イントロンを除去する欠失突然変異（Ｅ１Δと称する改変配列）を含有するインビトロ突然変異のあるＨＣＶ  Ｈ７７遺伝子配列を意味するものとする。ヌクレオチド位置および突然変異は、配列番号２を参照して付番する。トランスフェクション細胞においてこれらの遺伝子を発現させるためのコンストラクトは、改変または非改変ＨＣＶ糖タンパク質遺伝子配列を単独で、または様々な組み合わせで含有し得る。
【００７６】
＜発明の実施形態＞
感染しやすい細胞のＨＣＶ複製および感染の基本的局面における研究は、キーとなる試薬および実験系が欠けていることが障害となっている。本ウイルスは、インビトロであまり複製しないか、または全く複製せず、ＥＲにおいてＨＣＶエンベロープ糖タンパク質が明らかに残留することから、細胞表面における機能的エンベロープ糖タンパク質の発現に依存する膜融合および偽ビリオン侵入分析を開発するための努力が妨げられている。本発明は、細胞表面での完全長ＨＣＶ糖タンパク質の発現のための系を提供することにより、これらの障害を乗り越える一助となる。本明細書中に記載のように、これらの系により、順に、ＨＣＶ融合および侵入アッセイならびに、標的細胞とのＨＣＶ融合および標的細胞への侵入を阻害する化学物質を同定するためのアッセイの開発が可能となった。
【００７７】
特に、本発明は、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される、完全長Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する連続したヌクレオチドを含有する改変された核酸を提供するが、この核酸は、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を有し、この変化のために、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が本コード配列から削除される。ある実施形態において、改変された核酸は単離核酸である。別の実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡスプライス受容部位またはスプライス供与部位の除去により、コード配列からイントロンが削除される程度が低下する。好ましい実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡスプライス受容部位またはスプライス供与部位の除去により、コード配列からのイントロンの削除が妨げられる。
【００７８】
この改変された核酸の別の実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置８８７でのスプライス受容部位が削除されるように、この変化には、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列におけるＡ８８６Ｃ突然変異が含まれる（この突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。さらなる実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置８８７でのスプライス受容部位が削除されるように、この変化には、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列におけるＧ８８８Ｔ突然変異が含まれる（この突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。またさらなる実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置６７５でのスプライス供与部位が削除されるように、この変化には、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列におけるＧ６７５Ａ突然変異が含まれる（この突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。別の実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置８８７でのスプライス受容部位が削除されるように、この変化には、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列におけるＡ８８６Ｃ突然変異およびＧ８８８Ｔ突然変異が含まれる（これらの突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。また別の実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置２１８３でのスプライス受容部位が削除されるように、この変化には、Ｅ２コード配列におけるＡ２１８３Ｔ突然変異が含まれる（この突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。さらなる実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置８８７および２１８３でのスプライス受容部位が削除されるように、この変化には、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列におけるＡ８８６Ｃ突然変異およびＨＣＶ  Ｅ２コード配列におけるＡ２１８３Ｔ突然変異が含まれる（これらの突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。またさらなる実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置８８７および２１８３でのスプライス受容部位が削除されるように、この変化には、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列におけるＧ８８８Ｔ突然変異およびＥ２コード配列におけるＡ２１８３Ｔ突然変異が含まれる（これらの突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。別の実施形態において、配列番号２のヌクレオチド位置８８７および２１８３でのスプライス受容部位が削除されるように、この変化には、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列におけるＡ８８６Ｃ突然変異およびＧ８８８Ｔ突然変異、ならびにＥ２コード配列におけるＡ２１８３Ｔ突然変異が含まれる（これらの突然変異は、配列番号２を参照して付番される。）。
【００７９】
本発明はまた、短縮型Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１糖タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する連続したヌクレオチドを含有する改変された核酸も提供するが、Ｅ１をコードするコード配列において、ヌクレオチド位置６７５から８８７（両端を含む。）にわたるヌクレオチドが欠失している（配列番号２を参照することにより付番する。）。ある実施形態において、本改変された核酸は、単離核酸分子である。別の実施形態において、本改変された核酸分子はさらに、ＨＣＶ  Ｅ２遺伝子をコードし、Ｅ２コード配列のヌクレオチド位置２１８３のスプライス受容部位が削除されるようなＡ２１８３Ｔ突然変異を含む変異があるヌクレオチド配列を含有する（ヌクレオチド位置を配列番号２を参照することにより付番する。）。
【００８０】
本発明はさらに、本明細書中に記載の改変された核酸分子のいずれか１個を含有する発現ベクターを提供する。
【００８１】
本発明はまたさらに、上述の発現ベクターをその中に含有する宿主細胞を提供する。
【００８２】
本発明はまた、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の過半数が完全長である。）を細胞表面上に発現させるための方法を提供するが、本方法は、この糖タンパク質が細胞表面で発現されるように、本改変コード配列の核転写に適した条件下で、Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コード配列からなる群から選択される改変ＨＣＶコード配列（本改変コード配列からのイントロン切除の程度を減少させるために、本改変コード配列における少なくとも１個のヌクレオチド変化により、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が削除される。）を含有する発現ベクターを用いて細胞に対してトランスフェクションを行うことを含む。ある実施形態において、Ａ８８６Ｃ突然変異の導入により、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列のヌクレオチド位置８８７でのスプライス受容部位を削除する（このヌクレオチド位置および突然変異を配列番号２を参照することにより付番する。）。別の実施形態において、Ｇ８８８Ｔ突然変異の導入により、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列のヌクレオチド位置８８７でのスプライス受容部位を削除する（このヌクレオチド位置および突然変異を配列番号２を参照することにより付番する。）。さらなる実施形態において、Ｇ６７５Ａ突然変異の導入により、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列のヌクレオチド位置６７５でのスプライス供与部位を削除する（このヌクレオチド位置および突然変異を配列番号２を参照することにより付番する。）。またさらなる実施形態において、Ａ８８６Ｃ突然変異およびＧ８８８Ｔ突然変異の導入により、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列のヌクレオチド位置８８７でのスプライス受容部位を削除する（これらのヌクレオチド位置および突然変異を配列番号２を参照することにより付番する。）。さらなる実施形態において、Ａ８８６Ｃ突然変異およびＡ２１８３Ｔ突然変異の導入により、それぞれ、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列のヌクレオチド位置８８７およびＥ２コード配列の２１８３でのスプライス受容部位を削除する（これらのヌクレオチド位置および突然変異を配列番号２を参照することにより付番する。）。また別の実施形態において、Ｇ８８８Ｔ突然変異およびＡ２１８３Ｔ突然変異の導入により、それぞれ、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列のヌクレオチド位置８８７およびＥ２コード配列の２１８３でのスプライス受容部位を削除する（これらのヌクレオチド位置および突然変異を配列番号２を参照することにより付番する。）。さらなる実施形態において、Ａ８８６Ｃ突然変異、Ｇ８８８Ｔ突然変異およびＡ２１８３Ｔ突然変異の導入により、それぞれ、ＨＣＶ  Ｅ１コード配列のヌクレオチド位置８８７およびＥ２コード配列の２１８３でのスプライス受容部位を削除する（これらのヌクレオチド位置および突然変異を配列番号２を参照することにより付番する。）。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、本改変ＨＣＶコード配列からのイントロン削除は、本糖タンパク質の７０％を超えるものが完全長となるように、十分低下される。さらなる実施形態において、本改変ＨＣＶコード配列からのイントロン削除は、本糖タンパク質の９０％を超えるものが完全長となるように、十分低下される。
【００８４】
本発明はまたさらに、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその表面において発現する細胞を提供するが、この糖タンパク質は、本明細書中に記載の方法のいずれかに従い、改変ＨＣＶコード配列から発現される。
【００８５】
本発明は、さらに、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される、細胞表面局在Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を提供するが、この糖タンパク質は、本明細書中に記載の方法のいずれかに従い、改変ＨＣＶコード配列から発現される。
【００８６】
本発明はさらに、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面で発現する偽ビリオンを作製するための方法も提供するが、本方法は、（ａ）（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターおよび（２）Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コード配列からなる群から選択される改変ＨＣＶコード配列を含有するベクターコンストラクトを用いて、細胞に対して共トランスフェクションを行うことと（ここで、この改変コード配列からイントロン切断の程度を低下させるために、本コード配列における少なくとも１個のヌクレオチド変化により、ＲＮＡスプライス受容部位およびＲＮＡスプライス供与部位からなる群から選択される少なくとも１つのＲＮＡスプライス部位が本改変コード配列から削除される。）；（ｂ）偽ビリオンを含有するウイルス性上清を回収することと、を含む。
【００８７】
この方法のある実施形態において、本糖タンパク質の７０％を超えるものが完全長となるように、本改変ＨＣＶコード配列からのイントロン削除を十分低下させる。別の実施形態において、本糖タンパク質の９０％を超えるものが完全長となるように、本改変ＨＣＶコード配列からのイントロン削除を十分低下させる。
【００８８】
ある実施形態において、パッケージングベクターは、好ましくは、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／０２４９０４で記載されているベクターの１つのような、レトロウイルス性パッケージングベクターである。さらなる実施形態において、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）由来である。またさらなる実施形態において、１個のパッケージングベクターは、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する。また別の実施形態において、このパッケージングベクターは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する。好ましい実施形態において、このパッケージングベクターは、ｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−であり、ここで、ｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。
【００８９】
さらなる実施形態において、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターは、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１（ＨＴＬＶ−１）由来である。別の実施形態において、パッケージングベクターは、ビリオンパッケージング機能を与え、別のトランスファーベクターが、レポーター遺伝子を発現する。また別の実施形態において、このトランスファーベクターは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する。好ましい実施形態において、このパッケージングベクターは、ｐＣＭＶ−ＨＴ１またはｐＣＭＶ−ＨＴ−Δｅｎｖである。別の好ましい実施形態において、このトランスファーベクターは、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａ、ｐＨＴＣ−ｅＹＦＰまたはｐＨＴＣ−ｅＹＦＰ−ｔｓａである。
【００９０】
別の実施形態において、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターは、鳥類Ｃ型レトロウイルス由来である。好ましい実施形態において、このパッケージングベクターは、ｐＲＤ１３６である。別の好ましい実施形態において、このトランスファーベクターは、ｐＣＸＬである。
【００９１】
さらなる実施形態において、細胞は、２９３Ｔ細胞である。
【００９２】
本発明はまた、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面で発現する偽ビリオンを提供する。ある実施形態において、その糖タンパク質の７０％を超えるものが完全長である。別の実施形態において、その糖タンパク質の９０％を超えるものが完全長である。
【００９３】
本発明はさらに、本明細書中に記載のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）偽ビリオンのいずれか１つを含有する免疫原を提供する。
【００９４】
本発明はまた、本明細書中に記載のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）偽ビリオンのいずれか１つと薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。ある実施形態において、この薬学的組成物はさらにアジュバントを含む。
【００９５】
本発明の偽ビリオンは、ＨＣＶに結合するか、またはヒトにおいて防御的免疫応答を生み出すために有用な抗体を産生するために使用し得る。ヒト組織においてＨＣＶを検出するための診断キットに有用な抗−ＨＣＶ抗体はまた、周知の技術を用いて、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはウマなどの動物において容易に産生され得る。ヒト患者またはボランティアを免疫することにより偽ビリオンに結合するヒト抗体を同様にして産生させることができることを理解されたい。
【００９６】
従って、本発明は、（ａ）対象に一次免疫応答を誘導するために、該対象にＨＣＶ偽ビリオンを含む免疫原を注射することと；（ｂ）前記対象に偽ビリオンの少なくとも１回のブースター注射を投与することと；（ｃ）ＨＣＶに特異的に結合するポリクローナル抗体を該対象の血清から精製することと、を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するポリクローナル抗体を産生するための方法を提供する。
【００９７】
偽ビリオンは、通常、一次免疫応答を誘導するためにこの粒子  約１０から１００μｇ、好ましくは約５０μｇを最初にその動物に投与し、次いで約２週間から１２ヶ月の期間にわたり、偽ビリオン  １０から１００μｇを１回から約５回ブースター注射するという手段を用いて、その対象を免疫するために使用することができる。この偽ビリオンを投与する動物の大きさに依存して、当業者により容易に決定され得るよう、投与量は変化し得る。具体的にはブースター注射のタイミングおよび投与量は、当業者に周知の方法を用いて、その動物において検出される免疫応答に基づいて決定される。この偽ビリオンは、好ましくは、多岐にわたる入手可能なアジュバントも適切であるが、フロイント完全または不完全アジュバントなどのアジュバントを含む懸濁液として皮下投与される。偽ビリオンに対する一次応答後に誘導されたポリクローナル抗体は通常ＩｇＭであり、一方、その後のブースター注射後に産生されるのは通常ＩｇＧであり、通常、１から１０ｍｇ／ｍｌ（血清）の濃度に達する。
【００９８】
本発明はさらに、ＨＣＶに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。ある実施形態において、本抗体は、ＨＣＶを中和する。別の実施形態において、本抗体は、標的細胞とのＨＣＶ融合および標的細胞への侵入を阻害する。さらなる実施形態において、本抗体はトランス感染（ｔｒａｎｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を阻害する。またさらなる実施形態において、本抗体は、Ｅ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２と結合し、ＨＣＶに感染した細胞でのウイルス量を減少させる。また別の実施形態において、本抗体は、本明細書中に記載の改変された核酸のいずれかから発現されるＥ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２と結合する。
【００９９】
モノクローナル抗体を産生するための方法は、当技術分野で周知である（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５を参照のこと。）。本発明はさらに、（ａ）対象において一次免疫応答を誘導するために、該対象にＨＣＶ偽ビリオンを含有する免疫原を注射することと；（ｂ）前記対象に偽ビリオンの少なくとも１回のブースター注射を投与することと；（ｃ）前記対象から抗体産生リンパ細胞を回収することと；（ｄ）（ｃ）で得た１個の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることによりハイブリドーマを作製することと；（ｅ）ＨＣＶに特異的に結合する少なくとも１つのモノクローナル抗体を同定するためにこれらのハイブリドーマからのハイブリドーマ上清をスクリーニングすることと、を含む、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的に結合するモノクローナル抗体を作製するための方法を提供する。
【０１００】
本発明はまたさらに、ＨＣＶに特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。ある実施形態において、本抗体は、ＨＣＶを中和する。別の実施形態において、本抗体は、標的細胞とのＨＣＶ融合および標的細胞への侵入を阻害する。さらなる実施形態において、本抗体は、トランス感染（ｔｒａｎｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を阻害する。またさらなる実施形態において、本抗体は、Ｅ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２と結合し、ＨＣＶに感染した細胞でのウイルス量を減少させる。また別の実施形態において、本抗体は、本明細書中に記載の改変された核酸のいずれかから発現されるＥ１、Ｅ２またはＥ１／Ｅ２と結合する。
【０１０１】
ある実施形態において、本抗体は、ヒト化されている。さらなる実施形態において、本抗体は、ヒト抗体である。
【０１０２】
本抗体のヒト化形態のある実施形態において、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、殆どまたは全てが、ヒト免疫グロブリン分子からのアミノ酸で置換されているが、１または複数のＣＤＲ領域内の一部、殆どまたは全てのアミノ酸が変化していない。ある一定の抗原への本抗体の結合能を無効にしない限り、アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または改変が許される。適切なヒト免疫グロブリン分子には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭ分子が含まれる。ヒト化抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持し、つまり、これは、本発明において、これらの細胞の感染を阻害または予防するための、ＨＣＶへの結合能、ＨＣＶの融合または細胞への侵入の阻害能である。
【０１０３】
本発明のヒト化抗体の作製方法は当業者にとって公知である。様々な公表物（いくつかを本願に参照して組み込む。）もまた、ヒト化抗体の作製方法を記載している。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法により、ある抗体の可変領域と別の抗体の定常領域を有するキメラ抗体の作製が可能となる。米国特許第５，２２５，５３９号は、ヒト化抗体の作製のための別のアプローチを記載している。このアプローチにおいて、そのヒト化抗体が所望する標的を認識するが、そのヒト対象者の免疫系により著しく認識されないように、ある免疫グロブリンの可変領域のＣＤＲが異なる特異性を有する免疫グロブリン由来のＣＤＲで置換されているヒト化抗体を作製するために組み換えＤＮＡ技術を使用する。具体的に、フレームワークにＣＤＲを移植するために部位特異的突然変異誘発法を使用する。
【０１０４】
抗体のヒト化のための他のアプローチは、ヒト化免疫グロブリン作製法を記載している、米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６１号およびＷＯ  ９０／０７８６１において記載されている。これらは、ドナー免疫グロブリンからの１または複数のＣＤＲおよびあり得る追加的アミノ酸と、受容するヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域を有する。これらの特許は、所望する抗原に対する抗体の親和性を向上させるための方法を記載する。このフレームワークにおけるいくつかのアミノ酸は、受容側におけるよりむしろドナー側のそれらの位置のアミノ酸と同じであるように選択される。具体的に、これらの特許は、マウスモノクローナル抗体のＣＤＲをヒト免疫グロブリンフレームワークおよび定常領域と組み合わせることによる、受容体に結合するヒト化抗体の調製を記載している。ヒトフレームワーク領域は、マウス配列とのホモロジーを最大にするように選択することができる。ＣＤＲまたは特異的抗原と相互作用すると思われるフレームワーク領域におけるアミノ酸を同定するためにコンピューターモデルを使用することができ、次に、ヒト化抗体を作製するために、これらの位置においてマウスアミノ酸を使用することができる。ヒト化抗体の可変領域は、少なくとも、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の一部に連結し得る。ある実施形態において、このヒト化抗体は、軽鎖および重鎖定常領域の両方を含有する。この重鎖定常領域は通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および時にＣＨ４領域を含む。
【０１０５】
ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分に対するトランスジェニックであるマウスを免疫することによっても、完全ヒトモノクローナル抗体を調製することができる（例えば、米国特許第５，５９１，６６９号；同第５，５９８，３６９号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５４５，８０７号；同第６，１５０，５８４号およびこれらにおいて引用されている参考文献を参照のこと。この内容を本明細書中に参照して組み込む。）。これらの動物は、内因性（例えばマウス）抗体の産生において機能的欠失があるように遺伝的に改変されている。これらの動物はさらに、完全ヒト抗体を産生するよう、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するように改変されている。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ｒ）、Ａｂｇｅｎｉｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ；ＨｕＭａｂ−Ｍｏｕｓｅ（Ｒ）、Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）の免疫の後、標準的ハイブリドーマ技術に従い（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）、モノクローナル抗体を調製する。
【０１０６】
本発明はさらに、ＨＣＶに特異的に結合する、モノクローナル抗体またはその断片をコードする核酸分子を提供する。ある実施形態において、コードされるモノクローナル抗体またはその断片をヒト化する。別の実施形態において、コードされるモノクローナル抗体またはその断片は完全にヒトである。
【０１０７】
本核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡであり得る。ある実施形態において、本核酸分子は、軽鎖をコードする。別の実施形態において、本核酸分子は、重鎖をコードする。さらなる実施形態において、本核酸は、重鎖および軽鎖の両方をコードする。またさらなる実施形態において、１または複数の核酸分子がＦａｂ部分をコードする。さらなる実施形態において、１または複数の核酸分子がＣＤＲ部分をコードする。別の実施形態において、本核酸分子は、可変ドメインをコードする。さらなる実施形態において、本核酸分子は、可変ドメインおよび１または複数の定常ドメインをコードする。
【０１０８】
さらに、本発明は、改変Ｅ１糖タンパク質および改変Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される改変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を細胞において発現させるための方法を提供するが、産生される糖タンパク質は、アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む）の欠失により均一に短縮されており（これらのアミノ酸残基を配列番号３を参照することにより付番する。）、この方法は、アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む。）を欠失する均一に短縮された糖タンパク質（これらのアミノ酸残基を配列番号３を参照することにより付番する。）を発現するように、改変コード配列（ヌクレオチド位置６７５と８８７（両端を含む。）との間の推定上のイントロンに対応するヌクレオチド配列が欠失しており、これらのヌクレオチド位置を配列番号２を参照することにより付番する。）を含有する発現ベクターを用いて、ベクターにコードされる糖タンパク質の発現に適切な条件下で細胞にトランスフェクションすることを含む。
【０１０９】
本発明はまた、改変Ｅ１糖タンパク質および改変Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択される改変Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質も提供するが、この改変糖タンパク質は、アミノ酸残基２２６から２９６（両端を含む）の欠失により均一に短縮されている（これらのアミノ酸残基を配列番号３を参照することにより付番する。）。
【０１１０】
本発明はさらに、ＨＣＶとの融合が可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を薬剤が阻害するか否かを決定するための方法を提供するが、この方法は、（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に接触細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞へのＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）、を含む。本方法のある実施形態において、前記薬剤は、標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することが予め知られていない。
【０１１１】
本発明はまたさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と融合可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を阻害する少なくとも１つの薬剤を同定するために、このような融合を阻害することが知られていない複数の薬剤をスクリーニングするための方法を提供するが、この方法は、（ａ）複数の薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、複数の薬剤の存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）複数の薬剤の非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、複数の薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと；（ｄ）共鳴エネルギー移動が複数の薬剤存在下で減少する場合、標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害する少なくとも１つの薬剤をそれにより同定するために、この複数の薬剤の中に存在するどの薬剤が共鳴エネルギー移動減少を生じさせるかを個別に調べることと、を含む。
【０１１２】
上記方法のある実施形態において、本薬剤は、その表面上にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞、標的細胞または標的細胞およびその表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞の両方に添加される。別の実施形態において、この標的細胞は、Ｈｕｈ−７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ１０８０、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ−７、Ｕ１１８、２９３ＴおよびＶｅｒｏ細胞からなる群から選択される肝細胞である。さらなる実施形態において、この標的細胞は、成人ヒト肝臓の生検から単離した、新鮮であるか、または凍結保存されたヒト肝細胞である。別の実施形態において、前記第一の色素は、ローダミン部分を含有する分子であり、前記第二の色素は、蛍光部分を含有する分子である。さらなる実施形態において、このローダミン部分を含有する分子は、オクタデシルローダミンＢクロリドであり、この蛍光部分を含有する分子は、フルオレセインオクタデシルエステルである。またさらなる実施形態において、前記第一の色素は、フルオレセイン部分を含有する分子であり、前記第二の色素は、ローダミン部分を含有する分子である。また別の実施形態において、このローダミン部分を含有する分子は、オクタデシルローダミンＢクロリドであり、このフルオレセイン部分を含有する分子は、フルオレセインオクタデシルエステルである。
【０１１３】
本発明はさらに、ＨＣＶとの融合が可能な標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の融合を阻害する薬剤を提供する。ある実施形態において、本薬剤は、抗体またはその断片である。別の実施形態において、本抗体は、モノクローナル抗体である。また別の実施形態において、本抗体は、ポリクローナル抗体である。さらなる実施形態において、本抗体は、ヒト化抗体またはその断片である。またさらなる実施形態において、本抗体は、ヒト抗体またはその断片である。ある実施形態において、本抗体の断片は、抗体の軽鎖を含む。別の実施形態において、本抗体の断片は、抗体の重鎖を含む。また別の実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦａｂ断片を含む。さらなる実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦ（ａｂ’）２断片を含む。またさらなる実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦｄ断片を含む。ある実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦｖ断片を含む。別の実施形態において、本抗体の断片は、抗体の可変ドメインを含む。さらなる実施形態において、本抗体の断片は、抗体の１または複数のＣＤＲドメインを含む。
【０１１４】
別の実施形態において、本薬剤は、ペプチドである。またさらなる実施形態において、本薬剤は、ペプチド結合を含む。さらなる実施形態において、本薬剤は、非ペプチジル薬剤である。またさらなる実施形態において、本薬剤は、小分子または低分子量分子である。別の実施形態において、本分子は、５００ダルトン未満の分子量を有する。
【０１１５】
ＨＣＶまたは細胞の表面成分に結合し、細胞膜とのＨＣＶの融合を阻害するか、または細胞へのＨＣＶ侵入を阻害する本明細書中に記載の化学物質の設計および合成は、従来の医薬品化学およびコンビナトリアル化学の最新技術（両者ともコンピューターを利用した分子モデリングにより支援され得る。）を含む当技術分野で周知の実験的アプローチにより容易になり得る。このようなアプローチにより、化学者および薬理学者が、例えばＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体などの表面分子の構造のそれらの知識を使用し、その表面分子に結合するであろうさらなる様々な薬剤を設計し合成するために、薬剤がこのような分子と結合することを調べる。
【０１１６】
コンビナトリアル化学には、様々な化学的基本要素の様々な組み合わせを使用してそれらを組み立てることによる様々な新規薬剤の自動合成が含まれる。この技術の使用により、薬剤生成のプロセスが大幅に加速される。得られた一連の薬剤は、ライブラリーと呼ばれ、関心のある分子での十分な結合レベルを示す薬剤（「リード薬剤」）のスクリーニングを行うために使用される。コンビナトリアル化学を使用して、標的分子に対して非常に偏っていることが期待される薬剤の「集中（ｆｏｃｕｓｅｄ）」ライブラリーを合成することができる。
【０１１７】
リード薬剤が同定されたら、コンビナトリアル化学または従来の医薬品化学その他を使用して、化学構造、標的分子に対する結合親和性および生物学的または機能的活性（これは、本明細書中に記載の方法における、標的細胞へのＨＣＶ融合に対する、または細胞へのＨＣＶ侵入に対する薬剤の阻害能である。）との間の関係の理解を促進するために、様々な同族体および類似対を調製する。これらの研究から、構造活性関係（ＳＡＲ）を明らかにし、次にそれを、有効性、選択性および薬物動態特性が向上した薬物を設計するために使用する。コンビナトリアル化学はまた、リード化合物の最適化のための様々な構造を素早く生成させるためにも使用される。１個ずつ薬剤を合成することを必要とする従来の薬品化学はまた、さらなる改良のために、および自動化技術により合成することができない薬剤を生成させるために使用される。そのような薬物を定義したら、製薬および化学業界を通じて使用されている標準的化学製造法を用いて、製造スケールを大きくする。
【０１１８】
所望する機能的特性を有する薬剤に対するスクリーニングのために、多くの非ペプチジル小分子が様々な市販ソースから入手可能である。例えば、ＣｈｅｍＤｉｖ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、３，５００，０００種類を超える化学物質から選択される１５０，０００種類を超える小分子を含む小分子のＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙコレクションおよび「プローブ」薬剤の２０００を超える一連のライブラリーのＣｏｍｂｉＬａｂを有する。各ライブラリーは、有効なテンプレート、一連の対応する基礎的構造、ＳＡＲ合成のための置換基、オフシェルフプローブ（ｏｆｆ−ｓｈｅｌｆ  ｐｒｏｂｅ）化合物セットおよび完全な合成プロトコールにより表される。全てのテンプレートは、プローン（ｐｒｏｎｅ）である。
【０１１９】
ＣｏｍｂｉＬａｂのライブラリーの全体の実行可能な化学スペースは、１０，０００，０００，０００構造を超え、これらのうち２５０，０００は、プローブセットにより代表される。これらのライブラリーでは、化学的新規性、薬物およびリード類似性、潜在的治療標的として同定される特定のタンパク質ファミリー、好都合な予想される吸収、分布、代謝および排出（ＡＤＭＥ）および毒性特性、ならびに合成の実現可能性および費用に重点がおかれる。化合物は全て、液相パラレル合成により、＞１５０ｍｇの量が生成され、＞９０％純度の閾値に合致するよう個別に精製される。全最終化合物および重要な中間体は全て、ＬＣ−ＭＳまたは４００ＭｈｚでのＮＭＲにより分析する。
【０１２０】
ＣｈｅｍＤｉｖは、本明細書中に記載のスクリーニング法において薬剤の化学構造を同定し最適化するための基礎的構造として使用できる多数の小分子を有する。次に挙げるものは、カスタム合成に利用可能な基礎的構造分子の例である：
【化１】
2007514413.tif 000002
【０１２１】
Ｓ００５０１、Ｓ００５０３、Ｓ００５０４：Ｒ１＝Ｈ、ＣＨ３、Ｃｌ、ＣＦ３およびその他；Ｒ２＝アルキル、アリール、ヘテロアリールおよびその他；Ｒ２＋Ｒ３＝（ＣＨ２）ｍ；Ｒ４、Ｒ５＝Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリルおよびその他；ｍ＝０、１−４；ｎ＝１−３である。
【０１２２】
Ｓ００５０７、Ｓ００５０８：Ｒ＝Ｈ、アルキル、アルコキシ、Ｃｌおよびその他である。
【０１２３】
基礎的構造のライブラリーには、いくつかの反応中心を有する骨格が含有される。次に挙げるものはその例である：
【化２】
2007514413.tif 000003
【０１２４】
Ｓ００１０４：Ｒ１、Ｒ２＝Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリルおよびその他；ｎ＝０、１−５；Ｒ１−Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−Ｒ２＝複素環である。
【０１２５】
Ｓ００１０５：Ｒ＝Ｈ、アルキルオキシアルキル、アルキルチオアルキル、アリール、ヘテロシクリルおよびその他である。
【０１２６】
Ｓ００１０６：Ｒ＝Ｈ、アルキル、アルキルオキシ、Ｆ、Ｃｌおよびその他である。
【化３】
2007514413.tif 000004
【０１２７】
これらの各骨格は、一連の様々なコンビナトリアルライブラリーを作るために使用し得る。例えば、以下のスキームは、様々なコンビナトリアルライブラリーに属するいくつかの薬剤を表すが、これらは、フルオロニトロベンゼン部分を含有する骨格を用いて生成させることができる。
【化４】
2007514413.tif 000005
【０１２８】
化合物Ｉは、Ｏｕｙａｎｇら、（１９９９ａ）により、ＶＩＩは、Ｏｕｙａｎｇら、（１９９９ｂ）により、ＶＩＩＩは、Ｏｕｙａｎｇら、（１９９９ｃ）により記載されている。化合物ＩＩは、Ｗｅｉら（１９９８）により記載されている。化合物ＩＩＩは、Ｋｉｓｅｌｙｏｖら（１９９９ａ）により；ＩＶは、Ｋｉｓｅｌｙｏｖら（１９９８）により；ＶＩは、Ｋｉｓｅｌｙｏｖら（１９９９ｂ）により記載されている。化合物Ｖは、Ｇｏｌｄｂｅｒｇら（１９９９）により記載されている。
【０１２９】
本発明における使用のための非ペプチジル小分子薬剤のライブラリーはまた、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。あるＣｈｅｍｂｒｉｄｇｅライブラリーである、ＰＨＡＲＭＡＣＯｐｈｏｒｅの多様な組合せのライブラリーは、複数の化学的に多様なライブラリー／テンプレートを含む６０，０００を超える化合物を有する。ライブラリー／テンプレートあたりの平均化合物数は、２０００未満であり、各個別のライブラリー内部に複数の化学モチーフを有する。ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅから入手可能な別のライブラリーには、５０，０００種類の化合物を含有するＤＩＶＥＲＳｅｔが含まれる。
【０１３０】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤のいずれかと薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物を提供する。ある実施形態において、本薬学的組成物はさらに、少なくとも１つの従来の抗ウイルス剤を含む。さらなる実施形態において、この抗ウイルス剤には、これらに限定されないが、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびリバビリンからなる群が含まれる。
【０１３１】
薬学的に許容される担体は、当業者にとって周知であり、これらに限定されないが、０．０１Ｍから０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％  生理食塩水が含まれる。さらに、このような薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液および乳液であり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝溶媒を含む、水、アルコール性／水溶液、乳液および懸濁液が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸添加リンガー液および不揮発油が含まれる。静脈注射用ビヒクルには、体液および栄養素補液、リンガーデキストロースに基づいたものなどの電解質補充剤などが含まれる。固体組成物には、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロースもしくはセルロース誘導体、炭酸ナトリウムおよび炭酸マグネシウムなどの非毒性の固体担体が含まれ得る。肺および／または鼻腔内送達など、エアロゾルでの投与の場合、薬剤または組成物は、好ましくは、非毒性界面活性剤、例えばＣ６からＣ２２脂肪酸のエステルもしくは部分エステルまたは天然のグリセリドおよびプロペラントとともに処方される。鼻腔内送達を促進するために、レシチンなどのさらなる担体が含まれ得る。上述の担体に加えて、ワクチンは、さらに、例えば、サイログロブリン、アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（Ｄ−リジンおよびＤ−グルタミン酸のポリマーなど）、不活化インフルエンザウイルスおよびＢ型肝炎ウイルス組み換えタンパク質などの、当技術分野で公知の担体を含み得る。このワクチンはまた、不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＱＳ２１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を含むサポニン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｅｉｇら、１９９５）、モンタニド、ビタミンＥおよび、スクアレンなどの生体内分解性油から調製される様々な油中水滴乳液および／またはトコフェロール、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１およびそれらの組み合わせなどの何らかの周知のアジュバントを含み得る。防腐剤およびその他の添加剤、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども上記の担体全てとともに含まれ得る。
【０１３２】
本発明はさらに、ＨＣＶによる感染が起こりやすい標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を薬剤が阻害するか否かを決定するための方法を提供するが、この方法は、（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤の存在下および非存在下で、（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を（２）標的細胞に個別に接触させることと、（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）、を含む。本発明のある実施形態において、本薬剤は標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することが予め知られていない。
【０１３３】
本発明はまたさらに、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を阻害する少なくとも１つの薬剤を同定するために、このような侵入を阻害することが知られていない複数の薬剤をスクリーニングするための方法を提供するが、この方法は、（ａ）複数の薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、複数の薬剤の存在下および非存在下で、（１）ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を（２）標的細胞に個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、複数の薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、複数の薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと；（ｃ）レポーター遺伝子活性が複数の薬剤存在下で減少する場合、標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害する少なくとも１つの薬剤をそれにより同定するために、この複数の薬剤の中に存在するどの薬剤がレポーター遺伝子活性を減少させるかを個別に調べることと、を含む。
【０１３４】
上記方法のある実施形態において、本薬剤は、標的細胞、偽ビリオンまたは標的細胞および偽ビリオンの両方に添加される。別の実施形態において、本薬剤は、標的細胞が偽ビリオンに接触した後であるが、ウイルス侵入前に添加される。さらなる実施形態において、この標的細胞は、Ｈｕｈ−７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、Ｃａｃｏ−２、ＨＴ１０８０、ＨＴ−２９、ＬｏＶｏ、ＭＣＦ−７、Ｕ１１８、２９３ＴおよびＶｅｒｏ細胞からなる肝細胞の群から選択される。別の実施形態において、この標的細胞は、成人ヒト肝臓の生検から単離した新鮮な、または凍結保存ヒト肝細胞である。
【０１３５】
ある実施形態において、パッケージングベクターは、好ましくは、ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／０２４９０４で記載されているベクターの１つのような、レトロウイルス性パッケージングベクターである。さらなる実施形態において、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターは、ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）由来である。またさらなる実施形態において、１個のパッケージングベクターが、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する。
【０１３６】
ある実施形態において、このパッケージングベクターは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する。好ましい実施形態において、このパッケージングベクターは、ｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−であり、ここで、ｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。
【０１３７】
別の実施形態において、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターは、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１（ＨＴＬＶ−１）由来である。さらなる実施形態において、パッケージングベクターは、ビリオンパッケージング機能を与え、別のトランスファーベクターが、レポーター遺伝子を発現する。また別の実施形態において、このトランスファーベクターは、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質またはβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を発現する。好ましい実施形態において、このパッケージングベクターは、ｐＣＭＶ−ＨＴ１またはｐＣＭＶ−ＨＴ−Δｅｎｖである。別の好ましい実施形態において、このトランスファーベクターは、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａ、ｐＨＴＣ−ｅＹＦＰまたはｐＨＴＣ−ｅＹＦＰ−ｔｓａである。
【０１３８】
さらなる実施形態において、ビリオンパッケージング機能を与え、レポーター遺伝子を発現する少なくとも１個のベクターは、鳥類Ｃ型レトロウイルス由来である。好ましい実施形態において、このパッケージングベクターは、ｐＲＤ１３６である。別の好ましい実施形態において、トランスファーベクターは、ｐＣＸＬである。
【０１３９】
さらに、本発明は、ＨＣＶによる感染が起こりやすい標的細胞へのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の侵入を阻害する薬剤を提供する。ある実施形態において、本薬剤は、抗体またはその断片である。別の実施形態において、本抗体は、モノクローナル抗体である。またさらなる実施形態において、本抗体は、ポリクローナル抗体である。さらなる実施形態において、本抗体は、ヒト化抗体またはその断片である。またさらなる実施形態において、本抗体は、ヒト抗体またはその断片である。ある実施形態において、本抗体の断片は、抗体の軽鎖を含む。別の実施形態において、本抗体の断片は、抗体の重鎖を含む。また別の実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦａｂ断片を含む。さらなる実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦ（ａｂ’）２断片を含む。またさらなる実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦｄ断片を含む。ある実施形態において、本抗体の断片は、抗体のＦｖ断片を含む。別の実施形態において、本抗体の断片は、抗体の可変ドメインを含む。さらなる実施形態において、本抗体の断片は、抗体の１または複数のＣＤＲドメインを含む。
【０１４０】
別の実施形態において、本薬剤は、ペプチドである。また別の実施形態において、本薬剤は、ペプチド結合を含む。さらなる実施形態において、本薬剤は、非ペプチジル薬剤である。またさらなる実施形態において、本薬剤は、小分子または低分子量分子である。別の実施形態において、本分子は、５００ダルトン未満の分子量を有する。
【０１４１】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤のいずれかと薬学的に許容される担体とを含有する薬学的組成物を提供する。ある実施形態において、本薬学的組成物はさらに、少なくとも１つの従来の抗ウイルス剤を含む。さらなる実施形態において、この抗ウイルス剤には、これらに限定されないが、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびリバビリンからなる群が含まれる。
【０１４２】
本明細書中に記載の様々な方法において、病原体関連疾患に罹患した対象を治療するための、またはそのような疾患の発症を抑制するためのそれぞれの治療的または予防的有効量で、標的細胞とのＨＣＶ融合または標的細胞への侵入を阻害することが同定された薬物を使用する。特に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患した対象を治療するための方法を提供するが、この治療は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより実施され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞に対するＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することが決定され、（２）その対象を治療するために治療的有効量で投与される。
【０１４３】
本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患した対象を治療するための方法を提供するが、その治療は、このウイルスによる感染が起こりやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより実施され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；（２）その対象を治療するために治療的有効量で投与される。
【０１４４】
本発明はさらに、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法を提供するが、この予防は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより実施され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞に対するＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することが決定され、（２）その対象においてＨＣＶ感染を予防するために予防的有効量で投与される。
【０１４５】
本発明はまたさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法を提供するが、この抑制は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより実施され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下でその表面にＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体を発現する細胞への標的細胞の融合が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、第一の色素と第二の色素との間の共鳴エネルギー移動が可能となるようにそれらの色素を選択し、その表面でＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体を発現する細胞（ＨＣＶ糖タンパク質発現細胞は第二の色素で標識されている。）と、第一の色素で標識されている標的細胞を個別に接触させることと；（ｂ）融合が起こった場合、共鳴エネルギー移動が起こる条件に、接触させた細胞を曝露することと；（ｃ）薬剤非存在下での共鳴エネルギー移動と比較して、薬剤存在下で共鳴エネルギー移動の減少があるか否かを決定することと（薬剤存在下での共鳴エネルギー移動の減少は、標的細胞に対するＨＣＶの融合をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて、ＨＣＶと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することが決定され、（２）その対象に予防効果を有する予防的有効量で投与される。
【０１４６】
本発明はさらに、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法を提供するが、この予防は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより実施され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製される、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；（２）その対象においてＨＣＶ感染を予防するために予防的有効量で投与される。
【０１４７】
本発明はまたさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法を提供するが、この抑制は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより実施され、本方法は、その対象へ薬剤を投与することを含み、この薬剤は、（１）（ａ）薬剤非存在下での標的細胞への偽ビリオンの侵入が正常に行われる条件にて、薬剤存在下および非存在下で、レポーター遺伝子を発現するパッケージングベクターを用いて作製され、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体をその表面で発現する偽ビリオン（このＥ１／Ｅ２糖タンパク質の過半数が完全長である。）を、標的細胞と個別に接触させることと；（ｂ）接触させた標的細胞を溶解し、薬剤非存在下でのレポーター遺伝子活性と比較して、薬剤存在下でレポーター遺伝子活性が減少しているか否かを決定することと（薬剤存在下でのレポーター遺伝子活性の減少は、標的細胞へのＨＣＶ侵入をその薬剤が阻害することを示す。）を含む方法を用いて標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することが決定され；（２）その対象において予防効果を有する予防的有効量で投与される。
【０１４８】
本明細書中に記載の薬剤および組成物の治療的または予防的有効量の決定は、日常的な計算法を用いて動物データに基づいて行われ得る。この有効量は、とりわけ、その薬剤の大きさ、形態、生体内分解性、生物活性およびバイオアベイラビリティーに基づく。説明のために、本薬剤が速やかに分解せず、バイオアベイラビリティーがあり、非常に活性が高い場合、効果的であるために必要なのは少量である。
【０１４９】
本方法のある実施形態において、治療的または予防的有効量には、ポリペプチドまたは非ペプチジル薬剤  約０．０００００１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０００ｍｇ／ｋｇ体重の間が含有される。別の実施形態において、本有効量には、ポリペプチドまたは非ペプチジル薬剤  約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重から約２５０ｍｇ／ｋｇ体重の間が含有される。さらなる実施形態において、本有効量には、ポリペプチドまたは非ペプチジル薬剤  約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重の間が含有される。またさらなる実施形態において、本有効量には、ポリペプチドまたは非ペプチジル薬剤  約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重の間が含有される。別の実施形態において、本有効量には、ポリペプチドまたは非ペプチジル薬剤  約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重から約２．５ｍｇ／ｋｇ体重の間が含有される。また別の実施形態において、本有効量には、ポリペプチドまたは非ペプチジル薬剤  約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の間が含有される。
【０１５０】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患した対象を治療するための方法およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法の上述の実施形態はさらに、少なくとも１つの従来の抗ウイルス剤の投与を含む。さらなる実施形態において、この抗ウイルス剤には、これらに限定されないが、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびリバビリンからなる群が含まれる。
【０１５１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療はまた、偽ビリオンを含有する薬学的組成物を用いて行われ得る。偽ビリオンの送達のための適切な形態は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８５）で見出すことができる。これらの薬学的組成物は、様々な薬物送達系での使用に適切である（ｓｅ  Ｌａｎｇｅｒ，１９９０）。組成物中の偽ビリオンは、単回投与または一連の接種（例えば初回免疫と、その後の、抗−ＨＣＶ免疫応答強化のためのそれに続く接種）において適切である。本薬学的組成物は、非経口、局所または経口投与を意図するものである。非経口投与は好ましくは静脈内、皮下、皮内、腹腔内または筋肉内投与により行われる。非経口投与は、優先的に、肝動脈または胆管へのカテーテルによるものなど、患者の肝臓に向けられ得る。非経口投与に対して、本組成物は、当技術分野で周知のような、水、水性緩衝液、０．４％食塩水、０．３％  グリシン、ヒアルロン酸または非毒性非イオン性界面活性剤の乳液などの適切な滅菌担体に懸濁された偽ビリオンを含むことができる。本組成物は、さらに、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、酢酸ナトリウムおよび乳酸ナトリウムなどの緩衝剤および湿潤剤といった、生理的状態に近付けるための物質を含み得る。偽ビリオンの水性懸濁液は、保存のために凍結乾燥させることができ、投与前に滅菌水で適切に再結合することができる。従来の非毒性固体担体中に偽ビリオンを含む固体組成物を使用し得る。固体組成物の経口投与の場合、本偽ビリオンは、好ましくは、本組成物の１０％から９５％、より好ましくは２５％から７５％を占める。
【０１５２】
非毒性界面活性剤、プロペラントおよび当技術分野で周知の可能なその他の担体とともに処方される偽ビリオンはまた、肺および／または鼻腔内送達など、エアロゾルにおいて投与することもできる。
【０１５３】
偽ビリオンは、ＨＣＶ感染を妨げるためのワクチンとして予防的に使用することができる。従って、本発明はまた、対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を予防するための方法を提供するが、この予防は、該対象を免疫することにより実施され、本方法は、（ａ）Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質をその表面で発現するＨＣＶ偽ビリオンを含む薬学的組成物（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）を該対象に注射することと；それにより（ｂ）該対象において防御的ＨＣＶ免疫応答を誘発することと、を含む。
【０１５４】
本発明はさらに、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制するための方法を提供するが、その抑制は、該対象を免疫することにより実施され、本方法は、（ａ）ＨＣＶ偽ビリオンを含む薬学的組成物を該対象に注射することと；それにより（ｂ）該対象において防御的ＨＣＶ免疫応答を誘発することと、を含む。本免疫方法のある実施形態は、さらに、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体およびその免疫原断片からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質を該対象に注射することを含む。別の実施形態において、本方法はさらに、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体およびその免疫原断片からなる群から選択されるＨＣＶ糖タンパク質の発現が可能な核酸ベクターを、該対象に注射することを含む。さらなる実施形態において、本方法はさらに、少なくとも１つの従来の抗ウイルス剤の投与を含む。また別の実施形態において、この抗ウイルス剤には、これらに限定されないが、インターフェロン−α、インターフェロン−α−２Ｂおよびリバビリンからなる群が含まれる。
【０１５５】
偽ビリオンを含有するワクチンは、上述のものなどの薬学的に許容される担体と混合された粒子の免疫原的有効量を含有する。本ワクチンは、さらに、例えば、サイログロブリン、アルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（Ｄ−リジンおよびＤ−グルタミン酸のポリマーなど）、不活化インフルエンザウイルスおよびＢ型肝炎ウイルス組み換えタンパク質などの、当技術分野で公知の担体を含み得る。本ワクチンはまた、不完全フロイントアジュバント、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＱＳ２１（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）を含むサポニン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｋｒｅｉｇら、１９９５）、モンタニド、ビタミンＥおよびスクアレンなどの生体内分解性油から調製される様々な油中水滴乳液および／またはトコフェロール、Ｑｕｉｌ  Ａ、Ｒｉｂｉ  Ｄｅｔｏｘ、ＣＲＬ−１００５、Ｌ−１２１およびそれらの組み合わせなどの何らかの周知のアジュバントを含み得る。偽ビリオンに対して生じる免疫応答には、抗−ＨＣＶ抗体の生成および／または細胞性免疫応答の発生（例えば、細胞毒性Ｔリンパ球またはＣＴＬの活性化）が含まれ得る。
【０１５６】
ＨＣＶ偽ビリオンを含有するワクチン組成物は、ＨＣＶに対する防御的免疫応答を誘発するための免疫原的有効量で患者に投与される。この免疫原的有効量は、本ワクチンの組成物（例えば、アジュバントを含有するか否か。）、投与様式、患者の体重、全般的健康および処方医療機関の判断に依存して様々となろう。初回のワクチン接種の場合、投与されるワクチン中の偽ビリオンの一般的範囲は、７０ｋｇの患者あたり１００μｇから約１ｇであり；免疫応答を強化するためのそれに続く接種には、７０ｋｇの患者あたり偽ビリオン  １００μｇから約１ｇの範囲で偽ビリオンが含まれる。初回ワクチン接種から約２週間から約６ヶ月の期間にわたり、単回または複数回のブースト免疫を投与する。処方医療機関は、周知の免疫プロトコールおよび免疫接種に対する個々の患者の反応（例えば、抗−ＨＣＶ抗体に対するアッセイによりモニタリングする。）を基にブースター免疫の回数およびタイミングを決定し得る。
【０１５７】
ＨＣＶに感染した患者の治療の場合、送達されるべき偽ビリオンの量は、送達方法、投与回数およびその組成物を受容する個人の状態（例えば、年齢、体重、ＨＣＶ感染の重篤度、ＨＣＶ感染の活動性または慢性状態および全般的な健康状態）によって様々となろう。治療的投与の前に、その患者は、ＨＣＶ感染しているものとして既に診断されており、症状を示すかまたは示さないものであり得る。一般に、偽ビリオンの治療的有効量は、７０ｋｇの患者あたり、約１ｍｇから約１０ｇ／日、好ましくは約５０ｍｇから約５ｇ／日、最も好ましくは約１００ｍｇから約１ｇ／日の範囲となろう。本偽ビリオンは、プライムおよび／またはブーストとして、単独または、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ１／Ｅ２糖タンパク質二量体もしくはその免疫原性部分または上述のような糖タンパク質をコードする核酸分子とともに様々なプライムおよび／またはブーストの組み合わせで、投与し得る。
【０１５８】
本発明はまたさらに、本明細書中に記載の抗体と、ヒト組織においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を検出するためにこの抗体を用いるための使用説明書とを含む診断キットを提供する。ある実施形態において、この使用説明書は、免疫アッセイ用の本抗体の使用を記載する。別の実施形態において、本抗体は、固相支持体に固定化されている。さらなる実施形態において、本固相支持体は、多糖ポリマー（米国特許第３，６４２，８５２号を参照）、フィルターペーパー、ニトロセルロース膜、ポリエチレン、ポリスチレンおよびポリプロピレンからなる群から選択される。
【０１５９】
本発明はまた、本明細書中に記載の改変された核酸分子をその中に含有するパッケージング材料と、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この発現糖タンパク質の殆どは完全長である。）を表面で発現させるために該改変された核酸を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【０１６０】
本発明はさらに、本明細書中に記載の改変された核酸分子をその中に含有するパッケージング材料と、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この発現糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面で発現する偽ビリオンを生成させるために該改変された核酸を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【０１６１】
本発明はまたさらに、細胞表面でＥ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）を発現する細胞をその中に含有するパッケージング材料と、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害する薬剤を同定するために該細胞を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【０１６２】
さらに、本発明は、Ｅ１糖タンパク質およびＥ１／Ｅ２糖タンパク質ヘテロ二量体からなる群から選択されるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）糖タンパク質（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）をその表面で発現する偽ビリオンをそこに含有するパッケージング材料（この糖タンパク質の殆どは完全長である。）と、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害する薬剤を同定するために該偽ビリオンを使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品を提供する。
【０１６３】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤をその中に含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患している対象を治療（この治療は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶ融合を阻害することにより達成される。）するために前記薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品も提供する。
【０１６４】
本発明はさらに、本明細書中に記載の薬剤をそこに含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患に罹患している対象を治療する（この治療は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより達成される。）ために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品も提供する。
【０１６５】
本発明はまたさらに、本明細書中に記載の薬剤をそこに含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制する（この抑制は、このウイルスと融合可能な標的細胞へのＨＣＶの融合を阻害することにより達成される。）ために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品も提供する。
【０１６６】
本発明はまた、本明細書中に記載の薬剤をそこに含有するパッケージング材料と、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）関連疾患の発症を対象において抑制する（この抑制は、このウイルスに感染しやすい標的細胞へのＨＣＶの侵入を阻害することにより達成される。）ために該薬剤を使用するための使用説明書を提供するラベルと、を含む製品も提供する。
【実験の詳細】
【０１６７】
次の実験の詳細は、本発明の理解を促進するために説明するものであり、この後に続く請求項で記載される本発明を何ら限定するものではなく、そのように解釈されるべきでない。
【０１６８】
本発明においてヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供するための例として使用されるＨＣＶ分離株は、本発明の範囲を限定するものでなく、タイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１またはＨＣＶのあらゆる他の新しい遺伝子型からのいずれのＨＣＶ分離株も、本発明の実行のためのＥ１および／またはＥ２配列の適切なソースであることも理解されたい。スプライス供与部位および／またはスプライス受容部位の存在を同定するために、スプライス部位ニューラルネットワーク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌ）によるＨＣＶのいずれかの遺伝子型からの全体のＨＣＶ配列の分析を使用し、本発明の改変された核酸分子を生じさせるために、保存的突然変異誘発を行う。
【０１６９】
＜材料および方法＞
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の発現用ＤＮＡコンストラクト
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の様々な組み合わせの発現用ベクターを構築するために使用される配列は、完全長ＨＣＶコンセンサス配列由来であった（Ｙａｎａｇｉら、１９９７；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号；ＡＦ０１１７５１）。このゲノム配列（配列番号１）を図１ａ−ｃで示し、ＨＣＶ構造タンパク質をコードする配列（配列番号２）を図２で示し、ＨＣＶポリタンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号３）を図３ａおよびｂで示す。コンセンサスＨＣＶ  Ｈ７７（１ａ遺伝子型）配列（Ｋｏｙｋｈａｌｏｖら、１９９７）の完全長ｃＤＮＡを発現する、ｐＢＲクローニングベクター誘導体、ｐ９０／ＨＣＶ  ＦＬ−ｌｏｎｇ  ｐＵは、ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（カタログ番号７６７２）から入手可能である。
【０１７０】
各コンストラクトにおけるＨＣＶ挿入物の末端付近に翻訳開始および停止コドン、および５’および３’末端それぞれに、隣接ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を挿入するために、ＰＣＲクローニングを使用した。非改変ＨＣＶ構造タンパク質をコードする配列を包含するＰＣＲ断片を生成させるために、太字でＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を示す次のプライマーペアを使用した：
５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＸｂａＩ−３’配列（図４）の構築のために使用した上流（Ｕ）および下流（Ｄ）プライマー：
Ｕ：５’−ａａａａａａａａｇｃｔｔａｔｇａｇｃａｃｇａａｔｃｃｔａａａｃｃｔｃ−３’（配列番号１１）
Ｄ：５’−ａａａａａａｔｃｔａｇａｔｔａｔｇｃｇｔａｔｇｃｃｃｇｃｔｇａｇｇｃａ−３’（配列番号１２）
５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ＸｂａＩ−３’配列（図５）の構築のために使用したプライマー：
Ｕ：５’−ａａａａａａａａｇｃｔｔａｔｇａｇｃａｃｇａａｔｃｃｔａａａｃｃｔｃ−３’（配列番号１３）
Ｄ：５’−ａａａａａａｔｃｔａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｃｇｃｔｔｇ−３’（配列番号１４）
５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ΔＣ−Ｅ１＊−Ｅ２＊−ＸｂａＩ−３’配列（図６）の構築のために使用したプライマー：
Ｕ：５’−ａａａａａａａａｇｃｔｔａｔｇｇａｃｃｔｃａｔｇｇｇｇｔａｃａｔａ−３’（配列番号１５）
Ｄ：５’−ａａａａａａｔｃｔａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｃｇｃｔｔｇ−３’（配列番号１６）
５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＸｂａＩ−３’配列（図７）の構築のために使用したプライマー：
Ｕ：５’−ａａａａａａａａｇｃｔｔａｔｇｇｇｔｔｇｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔａｔｃ−３’（配列番号１７）
Ｄ：５’−ａａａａａａｔｃｔａｇａｔｔａｔｇｃｇｔａｔｇｃｃｃｇｃｔｇａｇｇｃａ−３’（配列番号１８）
５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−Ｅ２−ＸｂａＩ−３’配列（図８）の構築のために使用したプライマー：
Ｕ：５’−ａａａａａａａａｇｃｔｔａｔｇｇｇｔｔｇｃｔｃｔｔｔｃｔｃｔａｔｃ−３’（配列番号１９）
Ｄ：５’−ａａａａａａｔｃｔａｇａｔｔａｃｇｃｃｔｃｃｇｃｔｔｇ−３’（配列番号２０）。
【０１７１】
ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩを用いた二重消化により、５’および３’末端にそれぞれＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ粘着末端を有する非改変ＨＣＶ糖タンパク質配列をコードする断片を作製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ−二重消化ｐｃＤＮＡ−３．１＋発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションした。ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｒ）ＤＨ５αＴＭ  化学的コンピーテント細胞（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、ライゲーション産物を形質転換した。アンピシリン耐性クローンを選択し、ＱＩＡｐｒｅｐ（Ｒ）  Ｓｐｉｎ  Ｍｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。ＤＮＡ配列決定により、組み換えベクターコンストラクトを確認した。
【０１７２】
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、保存的突然変異により（Ａ８８６→Ｃ８８６およびＡ２１８３→Ｔ２１８３置換）、Ｅ１およびＥ２配列における推定スプライスドナーおよび／またはスプライス受容部位（配列番号１のヌクレオチド位置８８７、８８８および２１８２）を改変した。例として、Ａ８８６ＣおよびＡ２１８３Ｔ二重突然変異を有する５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＸｂａＩ−３’コンストラクトの配列（配列番号９）を図９に示す。Ｅ１における予想されるイントロン（配列番号１のヌクレオチド位置６７３と８８７との間）を制限酵素で切除し、次いで欠失させるべき配列に隣接する制限部位をＰＣＲで生成させた。イントロンが欠失した５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−ＸｂａＩ-３’コンストラクトの配列（配列番号１０）を図１０に示す。同じヌクレオチド置換およびイントロン欠失改変を、上述のように、Ｃおよびｐ７とともに、または無しで、Ｅ１／Ｅ２をコードするコンストラクトに導入した。
【０１７３】
細胞からのウイルスＲＮＡの抽出
ＱＩＡｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を改変して用いて、ウイルスＲＮＡを細胞から抽出した。簡潔に述べると、各ウェルに対して細胞溶解緩衝液  ２８０μｌで２回の抽出を行い、１．７ｍｌ試験管に移した。空のプレートをカルシウムおよびマグネシウムを含有するダルベッコのリン酸緩衝食塩水  １４０μｌで洗浄し、同じ試験管に集めた。製造者の使用説明書に従い、ＲＮＡ抽出およびスピンカラムへの結合を行った。洗浄緩衝液での洗浄後、製造者の使用説明書に従い、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて処理することにより、カラムにおける混入ＤＮＡを除去した。結合したＲＮＡを洗浄し、溶出緩衝液をそれぞれ３０μｌおよび４０μｌを用いて２段階でカラムから溶出し、溶出物を合わせた。
【０１７４】
リバーストランスクリプターゼポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
製造者の使用説明書に従い、ＲＮｅａｓｙ（Ｒ）  Ｐｒｏｔｅｃｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてトータルＲＮＡを細胞から単離した。製造者の使用説明書に従い、ＳｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ワンチューブＲＴ−ＰＣＲ反応においてそのＲＮＡを使用した。
【０１７５】
ＰＣＲ反応において配列番号１９および２０を含むプライマーペアを使用して、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２  エンベロープ糖タンパク質をコードするＤＮＡを特異的に増幅し、それにより増幅ＤＮＡの５’および３’末端に、それぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｂａＩ部位が置かれ（図８参照）、述べたようにＨｉｎｄＩＩＩ/ＸｂａＩ−で二重消化したｐｃＤＮＡ−３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へのクローニングが促進された。
【０１７６】
ＨｅＬａ細胞におけるＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の一時的発現
ＨｅＬａ細胞を一晩、ガラス製のカバースリップ上に播種し、３７℃にて１時間、組み換えＴ７ポリメラーゼ発現ワクシニアウイルスベクター、ｖＴＦ７．３（ＥａｒｌおよびＭｏｓｓ、１９９１）  細胞あたり５プラーク形成単位を用いて感染させ、次いで、Ｅ１−Ｅ２遺伝子コンストラクトを用いてリポフェクション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を行った。
【０１７７】
あるいは、Ｅ１−Ｅ２コンストラクトを含有するプラスミドベクターを用いて細胞に対してリポフェクションを行った。これらの各手段の後、抗−Ｅ１または抗−Ｅ２  ＭＡｂを用いて、免疫蛍光染色により、感染２４時間後にタンパク質発現を分析した。細胞を３％  ホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定するか、またはメタノールで−２０℃にて２０分間固定／透過処理を行い、次いで、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の２％  ゼラチンで洗浄した。次に、抗−Ｅ１  ＭＡｂ、Ａ４（１：１００；Ｄｒ．Ｊｅａｎ  Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎより提供。）または抗−Ｅ２、ＭＡｂ  Ｈ５３（１：１００；Ｄｒ．Ｊｅａｎ  Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎより提供。）とともに固定した細胞をインキュベーションし、洗浄し、フィコエリスリン（ＰＥ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：１００；Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともにインキュベーションした。Ｍｏｖｉｏｌ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐ．Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）とともにスライド上にカバースリップを置き、蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１７８】
哺乳類細胞におけるＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の安定的発現
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質遺伝子コンストラクトを含有する様々な組み換えプラスミドベクターを用いて、ＨｅＬａ細胞に対してリポフェクションを行い、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を含有する培地に置いた。Ｇ４１８耐性細胞を集め、抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ｈ５３で標識した。ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて１０％の最も強く標識された細胞を選別し、クローン集団を得るために限界希釈によりサブクローニングした。Ｅ１発現安定細胞株の場合は、Ｇ４１８選択直後に細胞をサブクローニングし、免疫ブロッティングにより、Ｅ１発現について個々のクローンを試験した。抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ａ１１または抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４を用いて、全細胞溶解液からのタンパク質を免疫ブロッティングにより分析した。
【０１７９】
細胞で発現されるＨＣＶタンパク質の免疫ブロット分析
ワクシニアまたはプラスミドに基づく発現系を用いて、ＨｅＬａ細胞において、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を発現させた。プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含有する１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ（Ｒ）Ｐ４０（ＮＰ４０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液中で細胞を溶解した。細胞溶解液の分画をエンドグリコシダーゼＨ  ０．２５ユニット／ｍｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で、３７℃にて一晩処理した。１０％または１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によりタンパク質を分離し、次いで、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  ニトロセルロース膜（ＢｉｏＲａｄ）に転写した。抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ａ１１（１：１０００）または抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４（１：１０００）のいずれかを用いて、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１０，０００、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いてその膜をプローブ処理し、化学発光基質（Ｖｉｓｔｒａ  ＥＣＦＴＭ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともにインキュベーションした。
【０１８０】
細胞表面局在ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質のビオチン化およびストレプトアビジン捕捉
細胞溶解前に、ＬｕおよびＫｉｅｌｉａｎ（２０００）により述べられているようにして、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を安定的に発現するＨｅＬａ細胞の細胞表面タンパク質に、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてタグ付加した。ストレプトアビジン−カップリングアガロースビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに１時間、４℃にて細胞溶解液をインキュベーションし、次いで、細胞溶解緩衝液で３回洗浄することによりビオチン化タンパク質を回収した。Ｅ１タンパク質の検出のために、抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４を用いて回収タンパク質を免疫ブロットした。示すような様々な抗−Ｅ２  ＭＡｂで細胞を標識した後、フローサイトメトリー分析により、ＨｅＬａまたはＮＫＮＴ３細胞における表面結合Ｅ２タンパク質を検出した。
【０１８１】
細胞表面局在Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体のＧタンパク質免疫沈降
改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質発現用のコンストラクトを用いて、ＨｅＬａ細胞に対して安定的トランスフェクションを行った。そのままのトランスフェクション細胞を抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ｈ５３（１：１００）とともにインキュベーションし、細胞溶解し、Ｇタンパク質カップリングアガロースビーズ（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）とともに４℃にて一晩インキュベーションし、次いで、細胞溶解緩衝液で３回洗浄した。抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４を用いて、免疫ブロッティングによりＥ１の存在を検出し、抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ａ１１を用いて、免疫ブロッティングによりＥ２の存在を検出した。
【０１８２】
改変ＨＣＶ糖タンパク質遺伝子を発現するＨＣＶ偽ビリオンの作製
記載（Ｂａｒｔｏｓｃｈら、２００３；Ｈｓｕら、２００３）のように、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質ベクターコンストラクトおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＨＩＶ−１に基づくパッケージングベクター、ｐＮＬ４．３−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−との共トランスフェクションにより、２９３Ｔ細胞においてＨＣＶシュードタイプ粒子を作製した。簡潔に述べると、トランスフェクション前日に２９３Ｔ細胞を１０ｃｍプレートあたり１，５００，０００細胞の密度に播種した。標準的リン酸カルシウム沈殿法を用いて、プレートあたりｐｃＤＮＡ−３．１−ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質コンストラクト  １５μｇおよびｐＮＬ−Ｌｕｃ＋ｅｎｖ−ＤＮＡ  ５μｇの混合物を用いて細胞にトランスフェクションした。翌日、新鮮な培地  ７ｍｌで培地交換し、細胞をさらに２４時間インキュベーションした。ウイルス性上清を回収し、４，０００ｒｐｍで１０分間遠心するか、または０．２μｍ膜を介して濾過し、−７０℃で凍結させるか、または標的細胞を感染させるために直接使用した。
【０１８３】
ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ１（ＨＴＬＶ−１）に基づくパッケージング系（例えば、Ｄｅｒｓｅら、２００１）もまた、ＨＣＶシュードタイプ粒子を調製するために使用できる。この系で使用されるベクターの例は、Ｄｅｒｓｅら（２００１）により詳細に記載されている。簡潔に述べると、５’−ＬＴＲおよび５’−非翻訳領域を、ＬＴＲのＲ領域からの断片に連結させたＣＭＶプロモーターで置き換えることにより、ＨＴＬＶ−１の感染性クローン（ｐＣＳ−ＨＴＬＶ；Ｄｅｒｓｅら、１９９５）から、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター制御下でＧａｇ−Ｐｏｌおよび他のＨＴＬＶ−１付属タンパク質をコードする、一次パッケージングプラスミド、ｐＣＭＶＨＴ１を構築した。ｐＣＭＶＨＴ１は、マイナス鎖プライマー結合部位を欠き、ビリオンＲＮＡ−パッケージング要素がない。ｐＣＭＶＨＴ１の誘導体は、ｐＣＭＶＨＴ１のｅｎｖ遺伝子のＸｈｏＩ断片（位置５７７９から６４９７）の欠失により作製されたｐＣＭＶＨＴ−Δｅｎｖおよびインテグラーゼコード領域における停止コドン（ヌクレオチド位置４７００）を作るための部位特異的突然変異によるｐＣＭＶＨＴ−Δｅｎｖ由来のｐＣＭＶＨＴ−Ｉｎｔ−を含む。ＣＭＶプロモーター制御下に５’および３’ＬＴＲ、ｐｓｉキャプシド形成要素およびホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するトランスファーベクター、ｐＨＴＣ−ｌｕｃは、ｐＣＳ−ＨＴＬＶ由来であり、それぞれ位置１２３２および７４８２のＮｃｏＩとＭｌｕＩ部位との間の配列を、ルシフェラーゼ遺伝子に連結したＣＭＶ前初期プロモーターを含有するカセットで置換することにより得られた。このベクターの改変型、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａは、ＣＭＶプロモーターのすぐ上流のＨＴＬＶ−１  ｔａｘ／ｒｅｘスプライス受容部位（位置６７３１から７４３６）を含有する断片を挿入することにより作製した。ｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａは、ＣＭＶプロモーターから上流にスプライス受容部位が存在するため、導入効率がより優れていると思われる。その他のトランスファーベクター、ｐＨＴＣ−ｅＹＦＰおよびｐＨＴＣ−ｅＹＦＰ−ｔｓａは、ｐＨＴＣ−ｌｕｃおよびｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａ由来であり、それぞれ、ルシフェラーゼ遺伝子を高活性黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）遺伝子で置換することにより得られた（Ｄｅｒｓｅら、２００１）。
【０１８４】
ＨＣＶシュードタイプ粒子は、１０ｃｍプレートに３，０００，０００細胞で前日に播種した２９３Ｔ細胞を、本明細書中に記載のいずれかのＨＣＶエンベロープ糖タンパク質発現ベクター、ｐＣＭＶＨＴ１、ｐＣＭＶＨＴ−Δｅｎｖまたは同様のＧａｇ−Ｐｏｌおよび他のＨＴＬＶ−１付属タンパク質をコードするパッケージングベクター、およびｐＨＴＣ−ｌｕｃ、ｐＨＴＣ−ｌｕｃ−ｔｓａ、ｐＨＴＣ−ｅＹＦＰ、ｐＨＴＣ−ｅＹＦＰ−ｔｓａまたは同様の少なくとも５’および３’ＬＴＲ、ｐｓｉ、エンキャプシド形成要素およびレポーター遺伝子を含有するトランスファーベクター  各１０μｇで共トランスフェクションすることにより作製する。リン酸カルシウム沈殿法により細胞にトランスフェクションする。共トランスフェクションから１６時間後、培地を交換し、１２時間後にウイルス含有上清を回収する。低速遠心によりウイルス性上清から不要物を除去し、０．４５μｍのフィルターを介して濾過した。
【０１８５】
ＨＣＶシュードタイプ粒子を調製するために使用することができる別のレトロウイルス性パッケージング系は、脾臓壊死ウイルス（ｓｐｌｅｅｎ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＮＶ）、鳥類Ｃ型レトロウイルス（Ｐａｒｖｅｅｎら、２０００）由来である。このパッケージング系は、レトロウイルス性タンパク質コード配列の代わりに挿入された、５’および３’ＬＴＲ、キャプシド形成配列および細菌性β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）レポーター遺伝子を含有するＳＮＶベクターである、トランスファーベクター、ｐＣＸＬを用いる。パッケージングベクター、ｐＲＤ１３６は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）Ｕ３プロモーターからＳＮＶ野生型Ｇａｇ−Ｐｏｌ遺伝子を発現し、遺伝子発現促進のためのプロモーターの下流にアデノウイルスのトリパータイトリーダー配列（ＡＶｔ１）を含有する。ポリアデニル化は、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナル配列により媒介される（Ｐａｒｖｅｅｎら、２０００）。基本的に、本明細書中で開示するいずれかのＨＣＶエンベロープ糖タンパク質発現ベクター、ｐＲＤ１３６もしくはＧａｇ−Ｐｏｌをコードする同様のパッケージングベクターおよびｐＣＸＬもしくはレポーター遺伝子を含有する同様のトランスファーベクターでの２９３Ｔ細胞の共トランスフェクションにより、ＨＩＶ−１およびＨＴＬＶ−１に基づくパッケージング系に対して述べたようにして、ＨＣＶをシュードタイピングした粒子を作製する。
【０１８６】
ＨＣＶ偽ビリオンを用いた細胞の感染
感染１日前に、ウェルあたり４０，０００細胞の密度で標的細胞を２４ウェルプレートに播種した。感染当日に、ウイルス性上清（５００μｌ）を細胞に直接適用し、３７℃にて一晩インキュベーションした。次に、培地を交換し、細胞をさらに２４時間インキュベーションした。細胞を溶解し、製造者の推奨に従い、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてルシフェラーゼ活性を定量した。
【０１８７】
標的細胞へのＨＣＶ融合の阻害の同定のためのアッセイ
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質媒介膜融合を定量し、標的細胞へのＨＣＶ融合の阻害剤を同定するために、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）技術（Ｌｉｔｗｉｎら、１９９６）を使用し得る。簡潔に述べると、一方の融合パートナー（例えばＥ１／Ｅ２発現細胞株）をオクタデシルフルオレセイン（Ｆ１８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）などの蛍光色素で標識し、他方の融合パートナー（例えば、ＨＣＶと融合可能な標的細胞）をオクタデシルローダミン（Ｒ１８；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）などの色素で標識する。これらのプローブのオクタデシル形は、Ｌｉｔｗｉｎら（１９９６）により述べられている標識プロトコールを用いて細胞の原形質膜に自発的に挿入される。一方（Ｆ１８）の発光スペクトルが第二の色素（Ｒ１８）の励起スペクトルと重複するように蛍光色素を選択する。
【０１８８】
５から１０ｍｇ／ｍｌになるようにＦ１８またはＲ１８をエタノールに溶解し、適切な細胞培養培地で約１００倍に希釈する。培地中の正確な濃度を、５０６ｎｍで０．３４のＯＤ（Ｆ１８）または５６５ｎｍで１．０４（Ｒ１８）になるように調整する。次に、標識した細胞を、細胞融合が可能な条件下で接触させる。適切な培地とともに一晩、細胞単層をインキュベーションし、次に洗浄し、計数する。各型  １００，０００細胞を２４ウェル組織培養プレートのウェル中で一緒に混合し、３７℃にてインキュベーションする。混合後、一定間隔で、その細胞をＥＤＴＡで除去し、洗浄し、蛍光光度計キュベットに入れる。
【０１８９】
細胞融合時、Ｆ１８刺激の結果、Ｒ１８への共鳴エネルギー移動およびＲ１８発光波長での発光が起こるよう十分に、Ｆ１８およびＲ１８が密接に会合する。表１に示す波長で色素が励起し、ＬＳ５０蛍光光度計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて、指示された発光波長（表１）において蛍光を測定する。
【０１９０】
表１．ＲＥＴアッセイで用いる励起および発光波長
【表１】
2007514413.tif 000006
【０１９１】
＊Ｒｅｔの計算には、最初に、４５０ｎｍでの励起および５９０ｎｍでの発光の後、直接Ｆ１８およびＲ１８蛍光による蛍光を差し引く必要がある。蛍光測定値は、各色素で別々に標識した細胞の蛍光を測定することにより決定される。Ｌｉｔｗｉｎら（１９９６）により述べられているようにして計算されるＲＥＴ値を総Ｒ１８蛍光で割って、％ＲＥＴ値を算出する。
【０１９２】
標的細胞へのＨＣＶ侵入の阻害剤同定のためのアッセイ
上述のように、標的細胞を感染させるために改変ＨＣＶ糖タンパク質を発現するＨＣＶ偽ビリオンを使用する。ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ−ＨＢ−８０６５）から入手可能な、ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞を含む、一連の肝臓標的細胞株を使用する。あるいは、ヒト成人肝臓生検から単離した新鮮な、または凍結保存ヒト肝細胞（Ｃａｍｂｒｅｘ／Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）を使用し得る。侵入阻害活性についてアッセイする薬剤存在下または非存在下それぞれで二重に感染を行う。本薬剤を標的細胞、偽ビリオンまたは両方に添加し、０から４時間インキュベーションする。あるいは、標的細胞を偽ビリオンに接触させた後であるがウイルス侵入前に、本薬剤を添加する。その薬剤非存在下で観察されるレベルと比較した、阻害薬剤存在下で測定されるルシフェラーゼ活性の低下として、阻害の程度を定量する。
【０１９３】
＜結果＞
プラスミドに基づく発現により、Ｅ１およびＥ２の細胞表面局在が起こる。
【０１９４】
感染性ＨＣＶ単離株、Ｈ７７（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら、１９９７）の完全長ゲノムに対応するｃＤＮＡ挿入物を含有するｐ９０／ＨＣＶ  ＦＬ−ｌｏｎｇ  ｐＵのＰＣＲ増幅由来のＨＣＶエンベロープ糖タンパク質遺伝子配列を用いて、完全長非改変ＨＣＶ  Ｅ１（Ｅ１）、Ｅ２（Ｅ２）およびＥ１／Ｅ２（Ｅ１−Ｅ２）の発現のために、コンストラクトを作製した。キャプシド（Ｃ）開始コドンの第一のヌクレオチドは、ＨＣＶゲノムにおける位置＋１として定義される（配列番号１；図１参照）。従って、Ｃは、ヌクレオチド＋１から５１０（両端を含む。）にわたり、Ｅ１は、５１１から１１４９にわたり、Ｅ２は、ヌクレオチド１１１１から２２８３にわたり、Ｅ１−Ｅ２は、ヌクレオチド５１１から２２３８にわたり、ｐ７は、ヌクレオチド２２３８から２４２７にわたる。
【０１９５】
様々な発現プラスミドのＨｅＬａ細胞へのリポフェクションにより、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の一時的発現を行った。あるいは、Ｔ７ポリメラーゼを発現するｖＴＦ７．３、ワクシニアウイルスベクターを用いてＨｅＬａ細胞を感染させ、次いで、ＨＣＶ  Ｅ１／Ｅ２発現プラスミドを用いてリポフェクションした（その結果、ｐｃＤＮＡ３．１＋でのＴ７プロモーターからの細胞質転写が起こった。）。
【０１９６】
ワクシニアウイルスにより駆動されるＥ１−Ｅ２発現後、免疫蛍光法により、細胞内にあり細胞表面結合しないＥ１およびＥ２を検出した（図１１ａ−ｄ）。一方、Ｅ１−Ｅ２コンストラクトのプラスミドを用いた発現後、細胞内および細胞表面両方でＥ１およびＥ２を検出した（図１１ｅ−ｈ）。エンベロープ糖タンパク質の細胞内の染色は、この２つの発現系で同等であり（図１１ａ、ｂ、ｅ、ｆ）、このことから、両系においてＥ１およびＥ２発現レベルが同様のレベルとなったが、細胞表面への輸送がワクシニアに基づく発現系では起こっていなかったことが示された。１個のタンパク質（Ｅ１およびＥ２）として、またはＥ１−Ｅ２ポリタンパク質の一部（Ｅ１−Ｅ２、データは示さない。）として発現されたエンベロープ糖タンパク質間では発現レベルの違いは観察されなかった。ヘパトーマ細胞株、ＨｅｐＧ２でのワクシニアおよびプラスミドに基づく系によるＥ１およびＥ２の一時的発現後、同様の発現パターンが得られた（データは示さない。）。
【０１９７】
ＨｅＬａ細胞で発現されたＨＣＶエンベロープ糖タンパク質のサイズ不均一性
非改変Ｅ２およびＥ１−Ｅ２コンストラクトＨＣＶのワクシニアベクターおよびプラスミドベクターに基づく発現により、６２ｋＤａの見かけの分子量を有する主要なＥ２タンパク質種が常に生成された（図１２ａ、ｂ）。しかし、非改変Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コンストラクトのワクシニア発現により、１８、２１、２４および２７ｋＤａの見かけの分子量の４種類のＥ１タンパク質種が生成された（図１２ｃ）。エンドグリコシダーゼＨで細胞溶解液を処理することにより、脱グリコシル化Ｅ１タンパク質コアに相当する１個の低分子量バンドが得られた（図１２ｃ）。従って、２７ｋＤａ種は、完全グリコシル化Ｅ１タンパク質に相当し、より低分子量の種は、不完全グリコシル化産物に相当する。その一方、プラスミドに基づくＥ１−Ｅ２発現により、２７および２０ｋＤａの見かけの分子量のＥ１タンパク質が生成された（図１２ｄ）。２種類のＥ１タンパク質種が細胞溶解液のエンドグリコシダーゼＨ処理後も依然として存在していたことから、この２０ｋＤａ  Ｅ１種は、グリコシル化の低下によるものではなかった（図１２ｄ、下記参照）。
【０１９８】
推定イントロンは、細胞核において転写されるＥ１遺伝子から切除される。
【０１９９】
ワクシニアウイルスに基づく異種遺伝子発現は、細胞質での転写に依存する。それに対して、プラスミドベクターからの一時的および安定的発現には、核での転写と、それに続くｍＲＮＡ成熟および細胞質への輸送が必要である。ＲＮＡ修飾は、プラスミドベクターにより発現されるＥ１種が様々なものになる主な原因であると思われる。従って、Ｅ１を安定的に発現するＨｅＬａ細胞のＲＮＡ抽出物においてＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の配列解析から、Ｅ１リーディングフレームを保存するが、その結果として７１個のアミノ酸が欠失したタンパク質となる、ヌクレオチド６７５と８８７（両端を含む。）との間の欠失が検出された（図１３ａおよびデータを示さない。）。この欠失は、組み込まれたＥ１コンストラクトを含有するゲノムＤＮＡの増幅由来のＰＣＲ産物にはなかった（データを示さない。）。
【０２００】
スプライス部位予想ニューラルネットワーク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ／ｓｅｑ＿ｔｏｏｌｓ／ｓｐｌｉｃｅ．ｈｔｍｌで利用可能）による全ＨＣＶゲノム配列の解析から、推定スプライス供与部位がＥ１の位置６７５に存在し、一方、推定スプライス受容部位がＥ１の位置８８７およびＥ２の２１８３で見出されることが明らかになった（図１４ａ参照）。これらの知見から、位置６７５と８８７との間の推定イントロンスプライシングの結果、Ｅ１およびＥ１−Ｅ２コンストラクトの一時的発現後に観察された２０ｋＤａ種に相当する、短縮型Ｅ１タンパク質が発現されることが示唆された。位置６７５と２１８３との間のヌクレオチドに相当するより大きな欠失がないことから、位置２１８３のスプライス受容体が機能的でないことが示唆される。
【０２０１】
改変Ｅ１遺伝子から発現されるＥ１タンパク質の性質
Ａ８８６ＧＧからＣ８８６ＧＴへの保存的置換によりＥ１のスプライス受容部位が除去された（Ｅ１＊）か、位置６７５と８８７との間の推定イントロンをコードする配列が欠失した（Ｅ１Δ）、Ｅ１発現コンストラクトを作製した。Ｅ１およびＥ１Δ両方の、プラスミドに基づく一時的発現により、１個の２０ｋＤａタンパク質種が生成された（図１３ｂ）。Ｅ１＊により１個の２７ｋＤａタンパク質種が生成されたが、スプライス受容部位で突然変異があった（図１３ｂ）。従って、非改変Ｅ１により生成されるその２０ｋＤａタンパク質種は、Ｅ１  ｍＲＮＡスプライシングの結果であり、一方、２７ｋＤａタンパク質種は、完全長Ｅ１に相当する。二次構造は、部分的に、Ｅ１の完全長（２７ｋＤａ）ならびに短縮型（２０ｋＤａ）の発現を導く、Ｅ１−Ｅ２  ｍＲＮＡにおけるスプライス部位を妨害している可能性がある（図１２ｄのＥ１−Ｅ２レーンを参照）。
【０２０２】
全コンストラクトにおいて、スプライシングが確実に起こらないようにするために、位置８８７の推定スプライス受容部位もまた、保存的突然変異により削除した。位置８８７から削除された上流スプライス受容体非存在下で機能的となる、Ｅ２の位置２１８３のスプライス受容部位を避けるために、保存的なＡ２１８３からＴ２１８３の置換により、推定スプライス受容部位をまた改変した。改変Ｅ１、Ｅ２またはＥ１−Ｅ２を発現するコンストラクト（「＊」により示す、つまり、Ｅ１＊、Ｅ２＊またはＥ１＊−Ｅ２＊）をＨｅＬａ細胞に安定的にトランスフェクションした。機能未知のＨＣＶ構造タンパク質、ｐ７（ヌクレオチド５１１から２４２７にわたる。）と連結してＥ１／Ｅ２を発現するコンストラクトを用いて安定的クローンをまた得た。ＲＮＡ抽出物のＲＴ−ＰＣＲ分析から、転写物の長さがコード配列の完全長に合致することが分かり、このことから、推定イントロンスプライシングが起こらなかったことが示唆された（データを示さない）。Ｅ２＊およびＥ１＊−Ｅ２＊発現により、Ｅ２に相当する主要な６２ｋＤａのタンパク質が生成された（図１４ａ）。免疫ブロッティングから、Ｅ１＊およびＥ１＊−Ｅ２＊コンストラクトにより、１個の２７ｋＤａ種としてＥ１が直ちに発現されたことが分かった（図１４ｂ）。
【０２０３】
細胞表面局在Ｅ１およびＥ２の免疫学的検出
安定的ＨｅＬａクローンのいずれにおいても、２種類の異なる抗−Ｅ１  ＭＡｂ、Ａ４（Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎら、１９９４）および０８１−５（Ａｕｓｔｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）を用いたフローサイトメトリーにより細胞表面結合Ｅ１タンパク質は検出できなかった（データを示さない）。このことから、これらのＭＡｂにより認識されるＥ１エピトープが完全長タンパク質において接近しにくい可能性があることが示唆される。しかし、細胞表面ビオチン化とそれに続くストレプトアビジン捕捉およびＥ１＊−Ｅ２＊およびＥ１＊−Ｅ２＊−ｐ７−発現細胞の、抗−Ｅ１  ＭＡｂを用いた免疫ブロッティングにより、細胞表面結合Ｅ１が容易に検出された（図１５ａ）。Ｅ１が単独で発現された場合、細胞表面でそれを検出することができなかったが、このことから、Ｅ１の原形質膜への効率的な輸送にはＥ２の共発現が必要であることが示唆される（図１５ａ）。
【０２０４】
Ｅ２＊−、Ｅ１＊−Ｅ２＊−ならびにＥ１＊−Ｅ２＊−ｐ７−発現細胞を４種類の異なる抗−Ｅ２  ＭＡｂで標識した後、フローサイトメトリーにより、安定的ＨｅＬａクローンにおいて細胞表面結合Ｅ２を検出した（図１５ｂおよびデータを示さない）。Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体を認識することが報告されているＭＡｂ  Ｈ２は、細胞表面Ｅ２を認識しなかったが、この抗体はまた、患者血清中のＨＣＶ粒子にも反応性がない（Ｄｅｌｅｅｒｓｎｙｄｅｒら、１９９７）。肝臓ＮＫＮＴ３細胞においてもＥ１＊−Ｅ２＊およびＥ１＊−Ｅ２＊−ｐ７がまた安定的に発現された。これらの細胞は、肝実質細胞の形態的特性を示し、肝臓代謝のキーとなる遺伝子を発現し、ＳＣＩＤマウスにおいて発癌性ではない（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、２０００；２００１）。ＮＫＮＴ３細胞表面でＥ２が容易に検出されたことから、原形質膜局在が、それらが発現される細胞株特有の性質というよりむしろ、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の特有の性質であることが示唆される（図１５ｃ）。Ｅ１／Ｅ２のｐ７との共発現は、エンベロープ糖タンパク質のプロセシングおよび細胞表面局在に影響しないと思われた。
【０２０５】
Ｅ１およびＥ２は、細胞膜において非共有結合ヘテロ二量体を形成する。
【０２０６】
細胞表面結合Ｅ１およびＥ２の、非共有結合ヘテロ二量体形成能を分析した。Ｅ１、Ｅ２およびｐ７の様々な組み合わせを安定的に発現するＨｅＬａ細胞を抗−Ｅ２  ＭＡｂとともにプレインキュベーションし、Ｇタンパク質カップリングアガロースビーズを用いて細胞溶解液の免疫沈降によりタンパク質−抗体複合体を回収した。このように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗−Ｅ１  ＭＡｂを用いた免疫ブロッティングによる分析のために、細胞表面結合エンベロープ糖タンパク質を選択した。Ｅ１は、Ｅ１＊−Ｅ２＊を発現する細胞においてのみ、および細胞を抗−Ｅ２  ＭＡｂとともにプレインキュベーションした場合のみ、Ｅ２とともに容易に共免疫沈降した（図１６ａ）。同様に、Ｅ２＊、Ｅ１＊−Ｅ２＊またはＥ１＊−Ｅ２＊−ｐ７を発現する細胞において、細胞を抗−Ｅ２  ＭＡｂとプレインキュベーションした場合のみ、Ｅ２が検出しされた（図１６ｂ）。従って、原形質膜と会合したＥ１およびＥ２タンパク質もまた非共有結合ヘテロ二量体を形成する。
【０２０７】
改変ＨＣＶ糖タンパク質を発現する偽ビリオンの予備評価
突然変異Ｅ１−Ｅ２  スプライス受容部位があるエンベロープコンストラクトにより、非突然変異Ｅ１−Ｅ２配列よりもＨＣＶ偽ビリオンの濃度が高くなった（データを示さない）。シュードタイピングのために使用するＥ１およびＥ２タンパク質が、改変ヌクレオチド配列から翻訳されるにもかかわらず、ネイティブＨＣＶ糖タンパク質と長さおよびアミノ酸配列が同一であるので、これは重要な発見である。しかし、ＤＮＡプラスミドから改変遺伝子配列が発現される場合、均一なタンパク質が得られる。従って、Ｅ１およびＥ２における核酸改変は、コードされるタンパク質のより効率的なフォールディングを誘導し得、それにより、偽ビリオンのパッケージング、アセンブリー、出芽および究極的には安定性が促進される。キャプシド、Ｃの全てまたは一部を含むことにより偽粒子産生がさらに促進され、このことから、Ｃ領域がタンパク質フォールディングを安定化し得ることが示唆される。重要なことに、これらの偽粒子が融合に適していることが分かり、高効率で肝細胞株に侵入することが明らかとなった。従って、それらは、細胞へのＨＣＶ接着、融合および侵入ならびにＨＣＶ病理のその他の側面の基礎となる分子メカニズムを明らかにするのを促進する強力なツールを提供する。これらの偽ビリオンはまた、ＨＣＶ侵入の阻害剤を同定するためのアッセイにおいて使用することもできる。
【０２０８】
＜考察＞
ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２は、ＨＣＶ出芽が起こると考えられているＥＲに残留する、膜に固定された非共有結合ヘテロ二量体を形成することが以前に記載されている（Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋら、２００１）。ヘテロ二量体形成およびＥ１およびＥ２のＴＭドメインの残基に対するＥＲ残留シグナルの共局在から、この２つの機能が切り離せないことが示唆された（Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋら、２００１）。このように、細胞融合および侵入アッセイの開発およびウイルスシュードタイプの作製に対して非常に有益なＥ１／Ｅ２ヘテロ二量体の細胞表面結合変異体を得るのは困難である。このような変異体を作製する試みは、これまで、Ｅ１およびＥ２細胞外ドメインを、水疱性口炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）ＧのＴＭドメインまたはインフルエンザ  ＨＡエンベロープ糖タンパク質（これらは二量体形成機能が知られていない。）に融合させることに着目して行われてきた（Ｆｌｉｎｔら、１９９９；Ｌａｇｇｉｎｇら、１９９８；Ｔａｋｉｋａｗａら、２０００）。さらに、これらの先行研究において、別々のｍＲＮＡからキメラＥ１およびＥ２タンパク質を翻訳させたが、これは、それらがネイティブヘテロ二量体を形成する可能性をさらに小さくしたかもしれない。Ｅ２−ＨＡキメラに対してｐＨ依存性立体構造変化を施し、インフルエンザウイルス粒子に組み込んだにもかかわらず、それらは標的細胞との融合を誘導しなかった（Ｆｌｉｎｔら、１９９９）。ＨＣＶ−ＶＳＶキメラエンベロープ糖タンパク質もまた、再生可能にＨＣＶ融合および侵入を模っていないと思われた（Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅら、２００２；Ｌａｇｇｉｎｇら、１９９８；Ｌａｇｇｉｎｇら、２００２；Ｍａｔｓｕｕｒａら、２００１；Ｍｅｙｅｒら、２０００；Ｔａｋｉｋａｗａら、２０００を参照のこと。）。
【０２０９】
本研究の当初の目標は、Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体として細胞表面で発現され、偽ビリオン上に組み込まれ、ＨＣＶ標的細胞への侵入を媒介するキメラＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を作製することであった。従って、ＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２の細胞外ドメインが、関連αウイルス、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｖｉｒｕｓ）（ＳＦＶ）からのＥ１およびＥ２のＴＭドメインと融合するというストラテジーを選択した。このＳＦＶエンベロープ糖タンパク質は、宿主細胞へのそれらの侵入を媒介するために効率的に異種ウイルスヌクレオキャプシドをシュードタイピングする細胞表面結合ヘテロ二量体を形成する。細胞表面でキメラＨＣＶ−ＳＦＶエンベロープ糖タンパク質が発現され、大きさおよび翻訳後プロセシングの点で非改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質に似ていたことが分かった。しかし、細胞表面での非改変ＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２の発現は、驚くべき発見であり、研究の焦点を変えるものであった。
【０２１０】
４種類の異なる抗−Ｅ２  ＭＡｂを用いて、フローサイトメトリーにより、細胞表面でＥ２を検出した。肝細胞株で細胞表面結合Ｅ２発現も検出し、これはｐ７の存在による影響を受けなかった。ビオチンタグ付加細胞表面タンパク質により、完全長Ｅ１もまた原形質膜に会合されることが明らかになった。最も重要なのは、Ｅ１タンパク質が抗−Ｅ２  ＭＡｂとともに特異的に共免疫沈降され得ることが分かったことであり、このことから細胞表面結合Ｅ１およびＥ２が非共有結合ヘテロ二量体を形成することが示された。
【０２１１】
正しくフォールディングされ機能的なＥ１およびＥ２の同定における複雑な要素の１つは、これらのタンパク質を研究するために使用される多数の発現系であり、文献を慎重に調査すると、Ｅ１およびＥ２に相当するタンパク質種の数および大きさが非常に多岐にわたることが明らかとなる。本研究において、非改変およびキメラエンベロープ糖タンパク質が２種類の発現系を使用して得られた。ワクシニアに基づく発現の使用は、ＨＣＶ複製が行うようにそれが核を回避するという前提において筋が通っている。この発現系において、Ｅ１およびＥ２は細胞内に残っている。しかし、ワクシニア複製は、内部の細胞膜ならびに翻訳機構を修飾することが知られており（Ｐｅｒｓｏｎ−ＦｅｒｎａｎｄｅｚおよびＢｅａｕｄ，１９８６；Ｐｌｏｕｂｉｄｏｕら、２０００；ＲｉｃｅおよびＲｏｂｅｒｔｓ，１９８３；Ｒｉｓｃｏら、２００２：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、１９９７；Ｓａｎｇｅｒら、２００１）、細胞内側のＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の見かけの捕捉は、これらのワクシニア誘導性修飾の偽りの構造であり得る。実際に、ワクシニアに基づく発現は、他のウイルス性エンベロープ糖タンパク質のＥＲ残留を引き起こすことが示されている（Ｓａｎｇｅｒら、２００１；Ｓｚｅｐａｎｓｋｉら、１９９４）。
【０２１２】
ワクシニアに基づく発現により、グリコシル化が少ないＥ１タンパク質が生成されたという観察から、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を発現させるための、代替的な、プラスミドに基づく系の使用が促された。タンパク質のプラスミドに基づく発現は通常、細胞性タンパク質合成に悪影響を与えないが、ＨＣＶ複製の自然の部分ではない核転写を含む。実際、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質のプラスミドに基づく発現の結果、Ｅ１  ｍＲＮＡにおいて推定イントロンが切除され、次いで短縮型タンパク質を与えるように翻訳されることが明らかに示された。この発見により、ＤＮＡに基づく発現系によるＲＮＡウイルスタンパク質発現における固有の複雑さが強調される。
【０２１３】
結果として不均一なＥ１タンパク質が産生されるＥ１遺伝子からの潜在的なイントロンの切除の問題を回避するために、部位特異的突然変異を使用してＥ１およびＥ２コード配列に保存的突然変異を導入した。これらの突然変異により、推定イントロン受容部位が削除され、イントロン切除を防いだが、コードされるＥ１およびＥ２タンパク質の配列には変化がなかった。このように、ネイティブＨＣＶ糖タンパク質と同一であるＥ１およびＥ２タンパク質を細胞で発現させ、これらのタンパク質が原形質膜に局在することが分かった。ＨＣＶ糖タンパク質をコードする改変された核酸分子は、ある面で適用できる可能性がある。第一に、例えば、突然変異が起こっているコンストラクトから翻訳されるエンベロープ糖タンパク質は、ネイティブＨＣＶエンベロープ糖タンパク質と同一のアミノ酸配列を有するにもかかわらず、ｍＲＮＡの翻訳およびそのタンパク質の共翻訳的フォールディングは、非改変ＨＣＶ糖タンパク質とは異なり得る。さらに、改変ＤＮＡ配列から生成されるエンベロープタンパク質の均一性は、非改変コード配列からの完全長および短縮型タンパク質の混合物の合成と比較して有利であり得る。これらの相違により、Ｅ１およびＥ２のヘテロ二量体形成をより効率的にすることができる可能性があり、ビリオンのパッケージングが促進される。あるいは、ＨＣＶエンベロープ複合体の他の成分（Ｃ、ｐ７）との相互作用が、ネイティブＨＣＶコード配列からよりも、改変コード配列から合成されたエンベロープ糖タンパク質によって、効率的となり得る。
【０２１４】
第二に、エンベロープタンパク質をコードする改変された核酸により、一時的発現系において、またはパッケージング細胞株において、ウイルスシュードタイプ粒子の生成がより効率的になり得る。それらはまた、ＨＣＶレプリコンをパッケージングすることが可能であり得るか（Ｂｌｉｇｈｔら、２０００）、または感染性のある複製に適したＨＣＶの培養において有用であり得る。さらに、それらは、核酸ベクター（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ウイルス）またはタンパク質を使用したワクチンの製造を促進し得る。
【０２１５】
第三に、改変ＨＣＶ糖タンパク質配列は、偽ビリオン系および共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）アッセイの使用を含む新規ＨＣＶ融合および侵入アッセイの開発において、ならびに膜からのウイルス出芽およびウイルス粒子形成の研究において、非常に有益なものであり得る。それらはさらに、ＨＣＶまたは他のウイルス由来の非構造タンパク質ベクターを用いた新規ウイルスレプリコンパッケージング系の開発において有用であり得る。
【０２１６】
第四に、均一なＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の産生は、これらの糖タンパク質が、ネイティブＨＣＶに対する中和抗体を誘発することができるエピトープを含有し得るので、ワクチン設計において、またはＨＣＶに対するモノクローナル抗体の作製において有用であり得る。
【０２１７】
第五に、細胞表面に局在する、完全長ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を発現させるためのこれらの新規の系により、ＨＣＶ融合および細胞への侵入を阻害する薬剤を同定するためのスクリーニングアッセイの設計が可能になる。
【０２１８】
最近、２つのグループが、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質がレトロウイルス粒子をシュードタイピングすることができ、標的細胞へのそれらの侵入を媒介することを報告した（Ｂａｒｔｏｓｃｈら、２００３；Ｈｓｕら、２００３）。両グループとも、非改変コード配列からＥ１／Ｅ２を発現させるためにプラスミドベクターを使用しており、従って、シュードウイルスの（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒａｌ）エンベロープは、完全長および短縮型Ｅ１タンパク質両方を含有したと思われる。本研究は、非改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質がレトロウイルスのシュードタイプの、いくつかの肝細胞および非肝細胞株ならびに初代肝細胞への侵入を媒介することができることを確認した。シュードウイルスエンベロープでの短縮型Ｅ１種の存在が、様々な標的細胞への侵入にどのように影響するかを調べるために、研究が進行中である。これらの研究により、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質により媒介される偽ビリオン侵入が最適化され、それによりＨＣＶエンベロープ糖タンパク質の構造／機能研究ならびにＨＣＶ受容体および標的細胞の同定が促進されるであろう。
【０２１９】
ウイルス複製サイクルにおいて細胞表面結合Ｅ１／Ｅ２ヘテロ二量体が何らかの生理的関連性を有するか否かはまだ分かっていない。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質が、初代肝細胞に非常に似ている細胞表面上に発現されるという観察から、肝細胞においてＨＣＶエンベロープ糖タンパク質に対する特異的な残留メカニズムがないことが示唆される。仮想ＨＣＶ複製サイクルは、非常に関連の深いフラビウイルスおよびペストウイルスとの類似性に基づいており、一般に、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）が小胞体に出芽し、細胞質性小胞への移動により成熟すると推測される（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、１９９１）。これまでのところ、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質および粒子の細胞局在は、インビトロでトランスフェクションまたは感染させた細胞において主に研究されてきた。ウイルス様粒子は、主に細胞質性小胞において生じ、このことから、ＨＣＶを利用した形態形成が示唆される（Ｄａｓｈら、１９９７；Ｅｇｇｅｒら、２００２；Ｇｒｅｉｖｅら、２００２；Ｉａｃｏｖａｃｃｉら、１９９７；Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎら、２００２；Ｓｅｒａｆｉｎｏら、１９９７；Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９６）。しかし、今までの研究において、ＨＣＶの出芽および成熟プロセスを明確に証明したものはなく、それはおそらく、ＨＣＶの出芽が標準的技術により検出することが困難な、非常に稀な事象である可能性もあるが、現在利用可能な実験系においてはそれらが起こらないからである。進行中の研究により、ヒト初代肝細胞においてＥ１／Ｅ２エンベロープ糖タンパク質を発現することによりこれらの疑問に取り組むことになろう。
【参考文献】
【０２２０】
U.S. Patent No. 3,645,852 issued to Axen et al. on February 29, 1972.
U.S. Patent No. 4,816,567 issued to Cabilly et al. on March 28, 1989.
U.S. Patent No. 5,225,539 issued to Winter on July 6, 1993.
U.S. Patent No. 5,545,806 issued to Lonberg et al. on August 13, 1996.
U.S. Patent No. 5,545,807 issued to Surani et al. on August 13, 1996.
U.S. Patent No. 5,585,089 issued to Queen et al. on December 17, 1996.
U.S. Patent No. 5,591,669 issued to Krimpenfort et al. on January 7, 1997.
U.S. Patent No. 5,598,369 issued to Chen et al. on January 28, 1997.
U.S. Patent No. 5,693,761 issued to Queen et al. on December 2, 1997.
U.S. Patent No. 5,882,852 issued to Bukh et al. on March 16, 1999.
U.S. Patent No. 6,150,584 issued to Kucherlapati et al. on November 21, 2000.
U.S. Patent No. 6,572,864 issued to Bukh et al. on June 3, 2003.
PCT International Application No. PCT/US89/05857, filed December 28, 1989, International Publication No. WO 90/07861, published July 26, 1990.
PCT International Application No. PCT/IB2003/003882, filed eptember 12, 2003, International Publication No. WO 2004/024904 A2, published March 25, 2004.
Alter, H.J. and L.B. Seef (1993) Transfusion-associated hepatitis. In “Viral Hepatitis” (Z.A. Thomas, ed.).  Churchill Livingstone, Edinburgh.
Anonymous (1999) Global surveillance and control of hepatitis C. Report of a WHO Consultation organized in collaboration with the Viral Hepatitis Prevention Board, Antwerp, Belgium. J. Viral. Hepat. 6: 35-47.
Bartenschlager, R. and V. Lohmann (2000) Replication of hepatitis C virus. J. Gen. Virol. 81: 1631-1648.
Bartosch, B., J. Dubuisson and F.L. Cosset (2003) Infectious hepatitis c virus pseudo-particles containing functional E1- E2 envelope protein complexes.  J. Exp. Med. 197: 633-642.
Blight, K.J., A.A. Kolykhalov and C.M. Rice (2000) Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.  Science 290: 1972-1974.
Buonocore, L., K.J. Blight, C.M. Rice and J.K. Rose (2002) Characterization of vesicular stomatitis virus recombinants that express and incorporate high levels of hepatitis C virus glycoproteins.  J. Virol. 76: 6865-6872.
Charloteaux, B., L. Lins, H. Moereels and R. Brasseur (2002) Analysis of the C-terminal membrane anchor domains of hepatitis C virus glycoproteins E1 and E2: toward a topological model.  J. Virol. 76: 1944-1958.
Cocquerel, L., S. Duvet, J. C. Meunier, A. Pillez, R. Cacan, C. Wychowski and J. Dubuisson (1999) The transmembrane domain of hepatitis C virus glycoprotein E1 is a signal for static retention in the endoplasmic reticulum.  J. Virol. 73: 2641-2649.
Cocquerel, L., J.C. Meunier, A. Op de Beeck, D. Bonte, C. Wychowski and J. Dubuisson (2001) Coexpression of hepatitis C virus envelope proteins E1 and E2 in cis improves the stability of membrane insertion of E2.  J. Gen. Virol. 82: 1629-1635.
Cocquerel, L., J.C. Meunier, A. Pillez, C. Wychowski and J. Dubuisson (1998) A retention signal necessary and sufficient for endoplasmic reticulum localization maps to the transmembrane domain of hepatitis C virus glycoprotein E2.  J. Virol. 72: 2183-2191.
Cocquerel, L., A. Op de Beeck, M. Lambot, J. Roussel, D. Delgrange, A. Pillez, C. Wychowski, F. Penin and J. Dubuisson (2002) Topological changes in the transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins. EMBO J. 21: 2893-2902.
Cocquerel, L., C. Wychowski, F. Minner, F. Penin and J. Dubuisson (2000) Charged residues in the transmembrane domains of hepatitis C virus glycoproteins play a major role in the processing, subcellular localization, and assembly of these envelope proteins.  J. Virol. 74: 3623-3633.
Dash, S., A.B. Halim, H. Tsuji, N. Hiramatsu and M.A. Gerber (1997) Transfection of HepG2 cells with infectious hepatitis C virus genome.  Am. J. Pathol. 151: 363-373.
Deleersnyder, V., A. Pillez, C. Wychowski, K. Blight, J. Xu, Y.S. Hahn, C.M. Rice and J. Dubuisson (1997) Formation of native hepatitis C virus glycoprotein complexes.  J. Virol. 71: 697-704.
Derse, D., J. Mikovits, M. Polianova, B.K. Felber and F. Ruscetti (1995) Virions released from cells transfected with a molecular clone of human T-cell leukemia virus type I give rise to primary and secondary infections of T cells. J. Virol. 69: 1907-1912.
Derse, D., S.A. Hill, P.A. Lloyd, , H.K. Chung and B.A. Morse (2001) Examining human T-lymphotropic virus type 1 infection and replication by cell-free infection with recombinant virus vectors.  J. Virol. 75: 8461-8468.
De Vos, R., C. Verslype, E. Depla, J. Fevery, B. Van Damme, V. Desmet and T. Roskams (2002) Ultrastructural visualization of hepatitis C virus components in human and primate liver biopsies.  J. Hepatol. 37: 370.
Dubuisson, J., S. Duvet, J. C. Meunier, A. Op De Beeck, R. Cacan, C. Wychowski and L. Cocquerel (2000) Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 is dependent on the presence of a downstream sequence on the viral polyprotein.  J. Biol. Chem. 275: 30605-30609.
Dubuisson, J., H.H. Hsu, R.C. Cheung, H.B. Greenberg, D.G. Russell and C.M. Rice (1994) Formation and intracellular localization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia and Sindbis viruses.  J. Virol. 68: 6147-6160.
Duvet, S., L. Cocquerel, A. Pillez, R. Cacan, A. Verbert, D. Moradpour, C. Wychowski and J. Dubuisson (1998) Hepatitis C virus glycoprotein complex localization in the endoplasmic reticulum involves a determinant for retention and not retrieval.  J. Biol. Chem. 273: 32088-32095.
Earl, P.L. and B. Moss (1991) Generation of recombinant vaccinia viruses. In “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith and K. Struhl (eds.), Greene Publishing Associates/Wiley Interscienc, New York, pp. 16.17.1-16.17.16.
Egger, D., B. Wolk, R. Gosert, L. Bianchi, H.E. Blum, D. Moradpour and K. Bienz (2002) Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex.  J. Virol. 76: 5974-5984.
Flint, M. and J. A. McKeating (1999) The C-terminal region of the hepatitis C virus E1 glycoprotein confers localization within the endoplasmic reticulum.  J. Gen. Virol. 80: 1943-1947.
Flint, M., J.M. Thomas, C.M. Maidens, C. Shotton, S. Levy, W.S. Barclay and J.A. McKeating (1999) Functional analysis of cell surface-expressed hepatitis C virus E2 glycoprotein.  J. Virol. 73: 6782-6790.
Fry, D.E. and L.M. Flint (1997) Hepatitis: an overview of important issues.  Bull. Am. Coll. Surg.  82: 8-13.
Gardner, J., R.J. Durso, R.R. Arrigale, G.P. Donovan, P.J. Maddon, T. Dragic and W.C. Olson (2003) L-SIGN is a liver-specific capture receptor for hepatitis C virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 4498-4503.
Goldberg, M., L. Smith, II, N. Tamayo and A.S. Kiselyov (1999) Solid support synthesis of 14- macrocycles containing 4-hydroxyproline structural unit via SNAr methodology.  Tetrahedron 55: 13887-13898.
Grakoui, A., C. Wychowski, C. Lin, S.M. Feinstone and C.M. Rice (1993) Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J. Virol. 67: 1385-1395.
Greive, S.J., R.I. Webb, J.M. Mackenzie and E.J. Gowans (2002) Expression of the hepatitis C virus structural proteins in mammalian cells induces morphology similar to that in natural infection.  J. Viral Hepat. 9: 9-17.
Hsu, M., J. Zhang, M. Flint, C. Logvinoff, C. Cheng-Mayer, C.M. Rice and J.A. McKeating (2003) Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 7271-7276.
Iacovacci, S., A. Manzin, S. Barca, M. Sargiacomo, A. Serafino, M.B. Valli, G. Macioce, H.J. Hassan, A. Ponzetto, M. Clementi, C. Peschle and G. Carloni (1997) Molecular characterization and dynamics of hepatitis C virus replication in human fetal hepatocytes infected in vitro.  Hepatology 26: 1328-1337.
Kiselyov, A., S. Eisenberg and Y. Luo (1998) Solid support synthesis of 14-membered macrocycles containing the thioether bridge via SNAr methodology.  Tetrahedron 54: 10635-10640.
Kiselyov, A., S. Eisenberg and Y. Luo (1999a) Tetrahedron Lett. 40: 2465-2468.
Kiselyov, A., L. Smith, II and P. Tempest (1999b) Solid support synthesis of 14- and 17-membered macrocycles via the SNAr methodology.  Tetrahedron 55: 14813-14822.
Kobayashi, N., T. Fujiwara, K.A. Westerman, Y. Inoue, M. Sakaguchi, H. Noguchi, M. Miyazaki, J. Cai, N. Tanaka, I.J. Fox and P. Leboulch (2000) Prevention of acute liver failure in rats with reversibly immortalized human hepatocytes.  Science 287: 1258-1262.
Kobayashi, N., H. Noguchi, K.A. Westerman, T. Watanabe, T. Matsumura, T. Totsugawa, T. Fujiwara, P. Leboulch and N. Tanaka (2001) Cre/loxP-based reversible immortalization of human hepatocytes.  Cell Transplant. 10: 383-386.
Kohler, G. and C. Milstein (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.  Nature 256: 495-497.
Kolykhalov, A.A., E.V. Agapov, K.J. Blight, K. Mihalik, S. M. Feinstone and C.M. Rice (1997) Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA.  Science 277: 570-574.
Krieg, A.M., A.K. Yi, S. Matson, T.J. Waldschmidt, G.A. Bishop, R. Teasdale, G.A. Koretzky and D.M. Klinman (1995) CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation.  Nature 374: 546-549.
Lagging, L.M., K. Meyer, R.J. Owens and R. Ray (1998) Functional role of hepatitis C virus chimeric glycoproteins in the infectivity of pseudotyped virus. J. Virol. 72: 3539-3546.
Lagging, L.M., K. Meyer, J. Westin, R. Wejstal, G. Norkrans, M. Lindh and R. Ray (2002) Neutralization of pseudotyped vesicular stomatitis virus expressing hepatitis C virus envelope glycoprotein 1 or 2 by serum from patients.  J. Infect. Dis. 185: 1165-1169.
Langer R. (1990) New methods of drug delivery.  Science 249: 1527-1533.
Lauer, G.M. and B.D. Walker (2001) Hepatitis C virus infection. New Engl. J. Med. 345: 41-52.
Litwin, V., K.A. Nagashima, A.M. Ryder, C.H. Chang, J.M. Carver, W.C. Olson, M. Alizon, K.W. Hasel, P.J. Maddon and G.P. Allaway (1996) Human immunodeficiency virus type 1 membrane fusion mediated by a laboratory-adapted strain and a primary isolate analyzed by resonance energy transfer.  J. Virol. 70: 6437-6441.
Lu, Y.E. and M. Kielian (2000) Semliki forest virus budding: assay, mechanisms, and cholesterol requirement. J Virol. 74: 7708-7719.
Martire, G., A. Viola, L. Iodice, L.V. Lotti, R. Gradini and S. Bonatti (2001) Hepatitis C virus structural proteins reside in the endoplasmic reticulum as well as in the intermediate compartment/cis-Golgi complex region of stably transfected cells.  Virology 280: 176-182.
Matsuura, Y., H. Tani, K. Suzuki, T. Kimura-Someya, R. Suzuki, H. Aizaki, K. Ishii, K. Moriishi, C.S. Robison, M.A. Whitt and T. Miyamura (2001)  Characterization of pseudotype VSV possessing HCV envelope proteins. Virology 286: 263-275.
Matsuura, Y., T. Suzuki, R. Suzuki, M. Sato, H. Aizaki, I. Saito and T. Miyamura (1994) Processing of E1 and E2 glycoproteins of hepatitis C virus expressed in mammalian and insect cells. Virology 205: 141-150.
McHutchison, J.G., S.C. Gordon, E.R. Schiff, M.L. Shiffman, W.M. Lee et al. (1998) Interferon alpha-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis Interventional Therapy Group. New Engl. J. Med. 339: 1485-1492.
Meyer, K., A. Basu and R. Ray (2000) Functional features of hepatitis C virus glycoproteins for pseudotype virus entry into mammalian cells.  Virology 276: 214-226.
Michalak, J.P., C. Wychowski, A. Choukhi, J.C. Meunier, S. Ung, C.M. Rice and J. Dubuisson (1997) Characterization of truncated forms of hepatitis C virus glycoproteins.  J. Gen. Virol. 78: 2299-2306.
Op De Beeck, A., L. Cocquerel and J. Dubuisson (2001) Biogenesis of hepatitis C virus envelope glycoproteins. J. Gen. Virol. 82: 2589-2595.
Op De Beeck, A., R. Montserret, S. Duvet, L. Cocquerel, R. Cacan, B. Barberot, M. Le Maire, F. Penin and J. Dubuisson (2000) The transmembrane domains of hepatitis C virus envelope glycoproteins E1 and E2 play a major role in heterodimerization. J. Biol. Chem. 275: 31428-31437.
Ouyang, X., N. Tamayo and A.S. Kiselyov (1999a) Solid support synthesis of 2-substituted dibenz[b,f]oxazepin-11(10H)-ones via SNAr methodology on AMEBA resin.  Tetrahedron 55: 2827-2834.
Ouyang, X. and A.S. Kiselyov (1999b) Fast and efficient synthesis of substituted dibenz[b,f]oxazocines on solid support.  Tetrahedron 55: 8295-8302.
Ouyang, X. and A.S. Kiselyov (1999c) Novel synthesis of dibenzo[b,g]1,5-oxazocines.  Tetrahedron Lett. 40: 5827-5830.
Parveen, Z., A. Krupetsky, M. Engelstadter, K. Cichutek, R.J. Pomerantz and R.Dornburg (2000) Spleen necrosis virus-derived C-type retroviral vectors for gene transfer to quiescent cells.  Nat. Biotechnol. 18: 623-629.
Patel, J., A. H. Patel and J. McLauchlan (1999) Covalent interactions are not required to permit or stabilize the non-covalent association of hepatitis C virus glycoproteins E1 and E2. J. Gen. Virol. 80: 1681-1690.
Patel, J., A.H. Patel and J. McLauchlan (2001) The transmembrane domain of the hepatitis C virus E2 glycoprotein is required for correct folding of the E1 glycoprotein and native complex formation.  Virology 279: 58-68.
Person-Fernandez, A. and G. Beaud (1986) Purification and characterization of a protein synthesis inhibitor associated with vaccinia virus.  J. Biol. Chem. 261: 8283-8289.
Pettersson, R.F. (1991) Protein localization and virus assembly at intracellular membranes.  Curr. Top. Microbiol. Immunol. 170: 67-106.
Pietschmann, T., V. Lohmann, A. Kaul, N. Krieger, G. Rinck, G. Rutter, D. Strand and R. Bartenschlager (2002) Persistent and transient replication of full-length hepatitis C virus genomes in cell culture.  J. Virol. 76: 4008-4021.
Ploubidou, A., V. Moreau, K. Ashman, I. Reckmann, C. Gonzalez and M. Way (2000) Vaccinia virus infection disrupts microtubule organization and centrosome function.  EMBO J. 19: 3932-3944.
Ralston, R., K. Thudium, K. Berger, C. Kuo, B. Gervase, J. Hall, M. Selby, G. Kuo, M. Houghton and Q. L. Choo (1993) Characterization of hepatitis C virus envelope glycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia viruses.  J. Virol. 67: 6753-6761.
Reed, K.E. and C.M. Rice (2000) Overview of hepatitis C virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 242: 55-84.
Remington’s Pharmaceutical Sciences (1985) 17th ed., Mack Publishing Co., Philadelphia, PA.
Rice, C.M. (1996) Flaviviridiae: The viruses and their replication. 3rd ed. In “Fields Virology” (B.N. Fields, Ed.) pp. 931-1034. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia.
Risco, C., J.R. Rodriguez, C. Lopez-Iglesias, J.L. Carrascosa, M. Esteban and D. Rodriguez (2002) Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment membranes and vimentin filaments participate in vaccinia virus assembly.  J. Virol. 76: 1839-1855.
Rodriguez, J.R., C. Risco, J.L. Carrascosa, M. Esteban and D. Rodriguez (1997) Characterization of early stages in vaccinia virus membrane biogenesis: implications of the 21-kilodalton protein and a newly identified 15-kilodalton envelope protein.  J. Virol. 71: 1821-1833.
Sanger, C., E. Muhlberger, H.D. Klenk and S. Becker (2001) Adverse effects of MVA-T7 on the transport of Marburg virus glycoprotein.  J. Virol. Methods 91: 29-35.
Selby, M.J., E. Glazer, F. Masiarz and M. Houghton (1994) Complex processing and protein:protein interactions in the E2:NS2 region of HCV.  Virology 204: 114-122.
Serafino, A., M.B. Valli, A. Alessandrini, A. Ponzetto, G. Carloni and L. Bertolini. (1997) Ultrastructural observations of viral particles within hepatitis C virus-infected human B lymphoblastoid cell line.  Res. Virol. 148: 153-159.
Shimizu, Y.K., S.M. Feinstone, M. Kohara, R.H. Purcell and H. Yoshikura. (1996) Hepatitis C virus: detection of intracellular virus particles by electron microscopy.  Hepatology 23: 205-209.
Spaete, R.R., D. Alexander, M.E. Rugroden, Q.L. Choo, K. Berger et al. (1992) Characterization of the hepatitis C virus E2/NS1 gene product expressed in mammalian cells. Virology 188: 819-830.
Szepanski, S., M. Veit, S. Pleschka, H.D. Klenk, M.F. Schmidt and G. Herrler (1994) Post-translational folding of the influenza C virus glycoprotein HEF: defective processing in cells expressing the cloned gene.  J. Gen. Virol. 75: 1023-1030.
Takikawa, S., K. Ishii, H. Aizaki, T. Suzuki, H. Asakura, Y. Matsuura and T. Miyamura (2000) Cell fusion activity of hepatitis C virus envelope proteins. J. Virol. 74: 5066-5074.
Wei, G.P. and G.B. Phillips (1998) Solid phase synthesis of benzimidazolones.  Tetrahedron Lett. 39: 179-182.
Yanagi, M., R.H. Purcell, S.U.Emerson and J. Bukh (1997) Transcripts from a single full-length cDNA clone of hepatitis C virus are infectious when directly transfected into the liver of a chimpanzee.  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 8738-8743.
Young, K.K., R.M. Resnik and T.W. Myers (1993) Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription-polymerase chain reaction assay.  J. Clin. Microbiol. 31: 882-886.
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１ａ】ＨＣＶゲノムの完全長コンセンサス配列。（ａ）から（ｃ）に示すゲノム配列（配列番号１）は、Ｙａｎａｇｉら（１９９７）から取る（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号；ＡＦ０１１７５１）。非コード配列に下線を付す。
【図１ｂ】図１ａの続き。
【図１ｃ】図１ｂの続き。
【図２】ＨＣＶ構造タンパク質をコードするコンセンサス配列。この配列（配列番号２）は、Ｃ、Ｅ１、Ｅ２およびｐ７タンパク質をコードする。Ｃ（キャプシド）タンパク質をコードする翻訳開始コドンの最初のヌクレオチドに１の番号を付す。
【図３ａ】完全長ＨＣＶコンセンサスアミノ酸配列。（ａ）および（ｂ）で示すこの配列（配列番号３）は、コンセンサスＨＣＶゲノム配列（配列番号１）のコドン領域から推定されるアミノ酸配列である。
【図３ｂ】図３ａの続き。
【図４】５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＸｂａＩ−３’コンストラクトのヌクレオチド配列。制限部位は、斜字体で示し、翻訳開始および停止コドンは、太字で下線を付す。示される配列は、配列番号４と呼ぶ。
【図５】５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ＸｂａＩ−３’コンストラクトのヌクレオチド配列。制限部位は、斜字体で示し、翻訳開始および停止コドンは、太字で下線を付す。示される配列は、配列番号５と呼ぶ。
【図６】５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−ΔＣ−Ｅ１＊−Ｅ２＊−ＸｂａＩ−３’コンストラクトのヌクレオチド配列。このコンストラクトは、シグナル配列として作用する野生型ＨＣＶコアタンパク質のＮ−末端の短縮部分（ΔＣ）をコードする配列（ＰＣＴ国際公開ＷＯ２０４／０２４９０４に記載。）および、位置６７５、８８７および２１８３において推定スプライス部位の突然変異がある改変Ｅ１およびＥ２遺伝子（「＊」により示す。）を含有する。コアタンパク質からの野生型ＨＣＶシグナル配列は、Ｅ１／Ｅ２タンパク質の正しいフォールディングに必要とされると考えられる。制限部位は、斜字体で示し、翻訳開始および停止コドンは、太字で下線を付す。示される配列は、配列番号６と呼ぶ。
【図７】５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＸｂａＩ−３’コンストラクトのヌクレオチド配列。制限部位は、斜字体で示し、翻訳開始および停止コドンは、太字で下線を付す。示される配列は、配列番号７と呼ぶ。
【図８】５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−Ｅ２−ＸｂａＩ−３’コンストラクトのヌクレオチド配列。制限部位は、斜字体で示し、翻訳開始および停止コドンは、太字で下線を付す。示される配列は、配列番号８と呼ぶ。
【図９】Ａ８６６ＣおよびＡ２１８３Ｔの二重突然変異を含有する５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＸｂａＩ−３’コンストラクトのヌクレオチド配列。制限部位は、斜字体で示す。翻訳開始および停止コドンならびに部位特異的突然変異により変化したヌクレオチドは太字で下線を付す。示される配列は、配列番号９と呼ぶ。
【図１０】推定イントロンが欠失している５’−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅ１−ＸｂａＩ−３’コンストラクトのヌクレオチド配列。制限部位は、斜字体で示し、翻訳開始および停止コドンは、太字で下線を付す。示される配列は、配列番号１０と呼ぶ。
【図１１】Ｅ１およびＥ２の細胞表面発現。ワクシニアウイルスベクター系（ａ−ｄ）またはプラスミドＤＮＡコンストラクトを用いたリポフェクション（ｅ−ｈ）のいずれかを用いて、ＨｅＬａ細胞において非改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質遺伝子を一時的に発現させ、感染から２４時間後にタンパク質発現を分析した。室温にて２０分間、３％  ホルムアルデヒド中で細胞を固定するか（ｃ、ｄ、ｇ、ｈ）、または２０℃にて２０分間、メタノールで固定／透過処理を行った（ａ、ｂ、ｅ、ｆ）。抗−Ｅ１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、Ａ４（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）または抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ｈ５３（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）とともにインキュベーションすることにより、細胞表面におけるＥ１およびＥ２の発現を検出し、蛍光顕微鏡下で化学蛍光により視覚化した（詳細は方法を参照）。
【図１２】Ｅ１およびＥ２タンパク質の特性。非改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質遺伝子（Ｅ１、Ｅ２およびＥ１−Ｅ２）をワクシニア−（ａ、ｃ）またはプラスミドによる系（ｂ、ｄ）を用いてＨｅＬａ細胞で発現させ、抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ａ１１（ａ、ｂ）または抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４（ｃ、ｄ）を用いて、細胞溶解液の免疫ブロッティングによりタンパク質発現を分析した（詳細は方法を参照）。Ｍ、ｋＤａでサイズを示す分子量マーカー；３．１、発現ベクター  ｐｃＤＮＡ−３．１＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてトランスフェクションを行った細胞からの細胞溶解液；ｅｎｄｏＨ、エンドグリコシダーゼＨ処理細胞溶解液。矢印はこのブロットにおけるＥ１およびＥ２タンパク質の位置を示す。
【図１３】Ｅ１  ｍＲＮＡの推定イントロンの切除により、欠失のあるタンパク質が生じる。ＨＣＶゲノムをスプライス部位予想ニューラルネットワークにより分析した。（ａ）機能的スプライスドナー（ＳＤ）および受容（ＳＡ）部位である、＞８０％の可能性を有するＥ１−Ｅ２−ｐ７コード領域における配列を示す。スプライシングは、ヌクレオチド位置６７５と８８７との間で起こり、アミノ酸２３０から２９２にわたる欠失があるＥ１タンパク質が生じる。（ｂ）リポフェクションにより、非改変Ｅ１（Ｅ１）、突然変異のあるスプライシング受容体部位を有するＥ１（Ｅ１＊）または推定イントロンが欠失しているＥ１（Ｅ１ΔＨＣＶ）をＨｅＬａ細胞において一時的に発現させ、抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４を用いて免疫ブロッティングにより分析した。黒矢印は、完全長Ｅ１の位置を示し、白矢印は、欠失のあるＥ１タンパク質種の位置を示す。
【図１４】推定スプライス受容部位を欠失しているＥ１およびＥ２の安定的発現。改変Ｅ１、Ｅ２またはＥ１−Ｅ２遺伝子（「＊」により示される。）を含む様々なコンストラクトを用いて安定的にトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞の全細胞溶解液からのタンパク質を、抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ａ１１（ａ）または抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４（ｂ）を用いて免疫ブロッティングにより分析した。Ｍ、ｋＤａでサイズを示す分子量マーカーを示す。矢印は、完全長Ｅ１およびＥ２タンパク質の位置を示す。
【図１５】推定スプライス受容部位を欠失したＥ１およびＥ２の細胞表面発現。（ａ）改変Ｅ１＊、Ｅ１＊−Ｅ２＊およびＥ１＊−Ｅ２＊−ｐ７を安定的に発現するＨｅＬａ細胞の細胞表面タンパク質に、細胞溶解前にビオチンタグを付加した。細胞溶解後、抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４を用いてビオチン化タンパク質の免疫ブロッティングを行った。矢印はＥ１タンパク質の位置を示す。（ｂ）細胞を５種類の様々な抗−Ｅ２  ＭＡｂ、Ｈ２、Ｈ５２、Ｈ５３、Ｈ６０および０９１ｂ−５または対照マウスＩｇＧで標識した後、Ｅ１＊−Ｅ２＊およびＥ１＊−Ｅ２＊−ｐ７の安定発現により生じる細胞表面結合Ｅ２タンパク質をフローサイトメトリーアナライザーにより検出した。（ｃ）ＮＫＮＴ３細胞においてＥ１＊−Ｅ２＊およびＥ１＊−Ｅ２＊−ｐ７の安定発現により生じる細胞表面結合Ｅ２タンパク質を、抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ｈ５３により検出した。
【図１６】細胞表面におけるＥ１およびＥ２のヘテロ二量体化。改変ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を安定的に発現するＨｅＬａ細胞を、抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ｈ５３とともにインキュベーションし、細胞溶解し、Ｇタンパク質カップリングアガロースビーズとともにインキュベーションした。マウス免疫グロブリン（ｍＩｇＧ）（Ｈ５３ではない。）で処理した細胞からのマウス細胞溶解液を対照として使用した。Ｅ１は、抗−Ｅ１  ＭＡｂ  Ａ４（ａ）を用いて免疫ブロッティングにより検出し、一方Ｅ２は、抗−Ｅ２  ＭＡｂ  Ａ１１（ｂ）を用いて免疫ブロッティングにより検出した。矢印は、完全長Ｅ１＊およびＥ２＊タンパク質の位置を示す。
【図１ａ】
2007514413.tif 000007
【図１ｂ】
2007514413.tif 000008
【図１ｃ】
2007514413.tif 000009
【図２】
2007514413.tif 000010
【図３ａ】
2007514413.tif 000011
【図３ｂ】
2007514413.tif 000012
【図４】
2007514413.tif 000013
【図５】
2007514413.tif 000014
【図６】
2007514413.tif 000015
【図７】
2007514413.tif 000016
【図８】
2007514413.tif 000017
【図９】
2007514413.tif 000018
【図１０】
2007514413.tif 000019
【図１１】
2007514413.tif 000020
【図１２】
2007514413.tif 000021
【図１３】
2007514413.tif 000022
【図１４】
2007514413.tif 000023
【図１５】
2007514413.tif 000024
【図１６】
2007514413.tif 000025
【配列表】
2007514413000001.app
【国際調査報告】
2007514413.tif 000026