(57)【要約】  本発明はポリヌクレオチドと多糖の複合体を製造する方法に関し、該方法は以下の段階：ａ）多糖もしくはその誘導体のアルドン酸を準備する段階；ｂ）アルドン酸をアルコール誘導体、好ましくはアルコールのカーボネート誘導体と反応させてアルドン酸エステル、好ましくは活性化アルドン酸エステルを生成せしめる段階；およびｃ）アルドン酸エステルをポリヌクレオチドと反応させる段階（該ポリヌクレオチドは、官能性アミノ基を含んでなる）を含んでなる。アルドン酸は、乾燥した非プロトン性極性溶媒中で段階（ｂ）においてアルコール誘導体と反応させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）多糖のもしくはその誘導体のアルドン酸を準備する段階；
ｂ）アルドン酸をアルコール誘導体、好ましくはアルコールのカーボネート誘導体と反応させてアルドン酸エステル、好ましくは活性化アルドン酸エステルとする、段階；および
ｃ）アルドン酸エステルをポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは官能性アミノ基を示す）と反応させる段階
を含んでなり、段階ｂ）におけるアルドン酸とアルコール誘導体との反応を乾燥した非プロトン性極性溶媒の中で行うことを特徴とする、ポリヌクレオチドと多糖からの複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の製造方法。
【請求項２】
溶媒がジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジメチルアセトアミドを含んでなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
アルドン酸エステルを精製され、そして次に段階ｃ）において使用することを特徴とする請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項４】
段階ｂ）からの反応チャージ（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｈａｒｇｅ）を段階ｃ）において直接アルドン酸エステルで用いることを特徴とする請求項１もしくは２に記載の方法。
【請求項５】
段階ｃ）を７〜９、好ましくは７．５〜９、そしてより好ましくは８．０〜８．８のｐＨ範囲で実施することを特徴とする請求項１〜４の１項に記載の方法。
【請求項６】
段階ｃ）を約８．４のｐＨで実施することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
アルドン酸対アルコール誘導体のモル比が約０．９〜１．１、好ましくは約１であることを特徴とする請求項１〜６の１項に記載の方法。
【請求項８】
アルコールがＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド、スルホン化Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、フェノール誘導体およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールを含んでなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜７の１項に記載の方法。
【請求項９】
多糖がデキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉および分岐澱粉画分を含んでなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜８の１項に記載の方法。
【請求項１０】
多糖がヒドロキシエチル澱粉であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒドロキシエチル澱粉が約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜６０，０００の重量平均分子量（ｗｅｉｇｈｔ−ａｖｅｒａｇｅｄ  ｍｅａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を示すことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヒドロキシエチル澱粉が約２，０００〜５０，０００ダルトンの数平均分子量（ｎｕｍｂｅｒ  ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｔｎｅ  ｍｅａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を示すことを特徴とする請求項１０もしくは１１の１項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒドロキシエチル澱粉が約１．０５〜１．２０の重量平均分子量対数平均分子量の比を示すことを特徴とする請求項１０〜１２の１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロキシエチル澱粉が０．１〜０．８の、好ましくは０．４〜０．７のモル置換を示
すことを特徴とする請求項１０〜１３の１項に記載の方法。
【請求項１５】
ヒドロキシエチル澱粉が約２〜１２、好ましくは約３〜１０のＣ２／Ｃ６比として表される置換サンプルを示すことを特徴とする請求項１０〜１４の１項に記載の方法。
【請求項１６】
ポリヌクレオチドが官能性核酸であることを特徴とする請求項１〜１５の１項に記載の方法。
【請求項１７】
官能性核酸がアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）もしくはシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリヌクレオチドが３００〜５０，０００Ｄａ、好ましくは４，０００〜２５，０００Ｄａ、そしてより好ましくは７，０００〜１６，０００Ｄａの分子量を示すことを特徴とする請求項１〜１７の１項に記載の方法。
【請求項１９】
官能性アミノ基が第一級もしくは第二級アミノ基、好ましくは第一級アミノ基であることを特徴とする請求項１〜１６の１項に記載の方法。
【請求項２０】
官能性アミノ基がポリヌクレオチドの末端リン酸エステルに結合していることを特徴とする請求項１〜１９の１項に記載の方法。
【請求項２１】
官能性アミノ基がリンカーを介してリン酸基に結合していることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
官能性アミノ基が５−アミノヘキシル基であることを特徴とする請求項１〜２１の１項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２の１項に記載の方法に従って得られる、多糖とポリヌクレオチドの複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドと多糖からの複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）の製造方法、そしてこのタイプの方法に従って得られる複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリエチレングリコール誘導体（「ＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」）またはデキストランもしくは特にヒドロキシエチル澱粉のような多糖（「ＨＥＳ化（ＨＥＳｙｌａｔｉｏｎ）」）と特にタンパク質の製薬学的有効成分との結合は、バイオテクノロジー研究からの製薬学的タンパク質の増加とともに近年重要性を増している。
【０００３】
例えばタンパク質のような製薬学的活性化合物のＰＥＧ化もしくはＨＥＳ化の効果は、とりわけ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ）のような上記のポリマーにタンパク質をカップリングすることにより、十分な製薬学的能力を生じるには低すぎるそれらの短い生物学的半減期を特に延長できることにある。しかしながら、タンパク質の抗原特性もまた、カップリングによりポジティブに（ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ）影響を受けることができる。他の製薬学的有効成分の場合、カップリングにより水溶性を大幅に増加することができる。製薬学的有効成分のＨＥＳ化の例は、例えば、特許文献１にもしくは特許文献２に記述されている。
【０００４】
例えばアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）と呼ばれるＤ−オリゴヌクレオチドもしくはシュピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）と呼ばれるＬ−オリゴヌクレオチドのような、高親和性結合オリゴヌクレオチドの生物学的標的分子の分野におけるさらに最近の進展もまた、薬物動態学的プロフィールおよび生物学的利用能を有利なように変えるためにポリエチレングリコールのようなポリマーへの結合の可能性を利用する（非特許文献１）。
【０００５】
ＨＥＳは、ワックス状トウモロコシ澱粉（ｗａｘ  ｍａｉｚｅ  ｓｔａｒｃｈ）に９５％を超えて存在するグルコースポリマーアミロペクチンのヒドロキシエチル化誘導体である。アミロペクチンは、α−１，４−グリコシド結合において存在しそしてα−１，６−グリコシド分岐を示すグルコース単位からなる。ＨＥＳは有利なレオロジー特性を示し、そして現在、容積代替物（ｖｏｌｕｍｅ  ｒｅｐｌａｃｅｒ）としてそして血液希釈治療に臨床的に使用される（非特許文献２および非特許文献３）。
【０００６】
特許文献３および特許文献４において、ヘモグロビンもしくはアンホテリシンＢの遊離アミノ基とヒドロキシエチル澱粉の対応するアルドン酸ラクトンを介して無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）においてヒドロキシエチル澱粉とのカップリングをどのようにして実施することができるかに関して、特にヘモグロビンもしくはアンホテリシンＢについて方法が記述されている。
【０００７】
特にタンパク質の場合、溶解性の理由で、またタンパク質を変性するという理由でも、無水非プロトン性溶媒で作業することは可能でないことが多いので、水和媒質におけるＨＥＳとのカップリング方法もまた文献に記述されている。従って、例えば特許文献５は、水溶性カルボジイミドＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド）を用いて鎖の還元末端でアルドン酸に選択的に酸化するヒドロキシエチル澱粉のカップリングを開示する。しかしながら、カルボジイミドは二次反応としてタンパク質の分子間もしくは分子内架橋反応を引き起こすことが非常に多いので、カルボジイミドの使用は不都合と関連することが非常に多い。
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ  ０２／０８０９７９  Ａ２明細書
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ  ０３／０００７３８  Ａ２明細書
【特許文献３】ＤＥ  １９６  ２８  ７０５明細書
【特許文献４】ＤＥ  １０１  ２９  ３６９明細書
【特許文献５】国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ  ０２／０２９２８明細書
【非特許文献１】Ｂ．Ｗｌｏｔｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  １３，ｖｏｌ．９９（２００２）８８９８−８９０２頁
【非特許文献２】Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｒａｎｋｅｎｈａｕｓｐｈａｒｍａｚｉｅ，ｖｏｌ．８（１９８７）２７１−２７８頁
【非特許文献３】Ｗｅｉｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，４１（１９９１）４９４−４９８頁
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、ポリヌクレオチドと多糖からの複合体の製造方法を提供するという問題に基づく。
【０００９】
本発明によれば、該問題は、第一の態様として：
ａ）多糖のもしくはその誘導体のアルドン酸を準備する段階；
ｂ）アルドン酸をアルコール誘導体、好ましくはアルコールのカーボネート誘導体と反応させてアルドン酸エステル、好ましくは活性化アルドン酸エステルとする段階；および
ｃ）アルドン酸エステルをポリヌクレオチド（ここで、ポリヌクレオチドは官能性アミノ基を示す）と反応させる段階
を含んでなり、段階ｂ）におけるアルドン酸とアルコール誘導体との反応を乾燥した非プロトン性極性溶媒において行うことを特徴とする、ポリヌクレオチドと多糖からの複合体の製造方法により解決される。
【００１０】
１つの態様として、溶媒はジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドおよびジメチルアセトアミドを含んでなる群から選択される。
【００１１】
１つの態様として、アルドン酸エステルは精製され、そして次に段階ｃ）において使用される。
【００１２】
別の態様として、段階ｂ）からの反応チャージ（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｃｈａｒｇｅ）は、段階ｃ）において直接アルドン酸エステルで用いられる。
【００１３】
１つの態様として、段階ｃ）は７〜９、好ましくは７．５〜９、そしてより好ましくは８．０〜８．８のｐＨ範囲で実施される。
【００１４】
好ましい態様として、段階ｃ）は約８．４のｐＨで実施される。
【００１５】
１つの態様として、アルドン酸対アルコール誘導体のモル比は約０．９〜１．１、好ましくは約１である。
【００１６】
１つの態様として、アルコールはＮ−ヒドロキシ−スクシンイミド、スルホン化Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、フェノール誘導体およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールを含んでなる群から選択される。
【００１７】
１つの態様として、多糖はデキストラン、ヒドロキシエチル澱粉、ヒドロキシプロピル澱粉および分岐澱粉画分を含んでなる群から選択される。
【００１８】
１つの態様として、多糖はヒドロキシエチル澱粉である。
【００１９】
好ましい態様として、ヒドロキシエチル澱粉は約３，０００〜１００，０００ダルトン、好ましくは約５，０００〜６０，０００の重量平均分子量（ｗｅｉｇｈｔ−ａｖｅｒａｇｅｄ  ｍｅａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を示す。
【００２０】
さらなる好ましい態様として、ヒドロキシエチル澱粉は約２，０００〜５０，０００ダルトンの数平均分子量（ｎｕｍｂｅｒ  ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）を示す。
【００２１】
１つの態様として、ヒドロキシエチル澱粉は約１．０５〜１．２０の重量平均分子量対数平均分子量の比を示す。
【００２２】
１つの態様として、ヒドロキシエチル澱粉は０．１〜０．８の、好ましくは０．４〜０．７のモル置換を示す。
【００２３】
１つの態様として、ヒドロキシエチル澱粉は約２〜１２の、好ましくは約３〜１０のＣ２／Ｃ６比として表される置換サンプルを示す。
【００２４】
１つの態様として、ポリヌクレオチドは官能性核酸である。
【００２５】
好ましい態様として、官能性核酸はアプタマーもしくはシュピーゲルマーであることが提供される。
【００２６】
１つの態様として、ポリヌクレオチドは３００〜５０，０００Ｄａ、好ましくは４，０００〜２５，０００Ｄａ、そしてより好ましくは７，０００〜１６，０００Ｄａの分子量を示すことが提供される。
【００２７】
１つの態様として、官能性アミノ基は第一級もしくは第二級アミノ基、好ましくは第一級アミノ基であることが提供される。
【００２８】
１つの態様として、官能性アミノ基はポリヌクレオチドの末端リン酸エステルに結合していることが提供される。
【００２９】
好ましい態様として、官能性アミノ基はリンカーを介してリン酸基に結合していることが提供される。
【００３０】
１つの態様として、官能性アミノ基は５−アミノヘキシル基であることが提供される。
【００３１】
第二の態様として、該問題は、本発明の第一の態様の方法に従って得られる、多糖とポリヌクレオチドの複合体により本発明に従って解決される。
【００３２】
本発明は、例えば、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような乾燥した非プロトン性極性溶媒において、アルコールと、特にアルコールのカーボネート、例えばＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドのようなアルコールと二酸化炭素とのジエステルと例えばワキシーコーンスターチ分解画分のような、ヒドロキシエチル澱粉アルドン酸および他の多糖のアルドン酸から、対応するアルドン酸エステルを製造することができ、それをより安定なアミドにポリヌクレオチドからの求核アミノ基と水性媒質において都合よく反応させることができるという驚くべき認識に基づく。遊離アルドン酸へのそして遊離アルコールへの水でのアルドン酸エステルの鹸化は、二次反応として起こる。
【００３３】
驚くべきことに、従って、アンヒドログルコース単位のヒドロキシル基の活性化は起こらず、その代わりに特にアルドン酸のカルボキシル基の活性化が起こり、ただし、反応物質のモル比は約１：１に設定される。
【００３４】
本発明は、この点において先行技術にこれまで記述されている教示からそれるか、もしくは先行技術に記述されている異なる方法がポリヌクレオチドと多糖の複合体の効率のよい製造に適当でないという認識に基づく。
【００３５】
従って、Ｌ−５’−アミノ−機能化オリゴヌクレオチドは、可能な反応パラメーターおよび反応物質比率のバリエーションにもかかわらず、カルボジイミド（ＥＤＣ）により媒介される５’アミノ基とのアミド結合の形成によってＨＥＳアルドン酸と反応できないこともまた本発明者により驚くべきことに見出された。
【００３６】
実際に、リン酸エステルおよびリン酸基を含有する化合物は、しばしば全く劇的に、カルボジイミドの喪失を増すが、大過剰のＥＤＣでさえ、この場合、測定可能な反応生成物をもたらさなかったことが既知である（Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ−Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９９３）１９９頁）。
【００３７】
さらに、ＥＤＣを水性媒質において使用してアミノ官能基を含有する分子をオリゴヌクレオチドの末端リン酸基にカップリングしてホスホルアミデート結合を形成できることが既知である。従って、実施する反応条件下で、内部リン酸基は反応しない。このようにして、特に５’リン酸基を特異的に修飾することができる（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ｔｏｋｙｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ（１９９６）５２頁）。
【００３８】
さらに、ヒドロキシエチル澱粉誘導体について文献に記述されている他の確立したカップリング方法もまた、５−アミノ−機能化Ｌ−オリゴヌクレオチドでうまく使用できないことが驚くべきことに見出された。従って、中間段階としてアミド結合の形成という意味において酸アミドの製造のために酸から反応性酸イミダゾリドを形成し、そして次にこの活性アシル化剤で、イミダゾールを遊離して対応するアミドへのアミンの反応を実施することは一般的な方法である。
【００３９】
ＨＥＳアルドン酸の場合、反応性ＨＥＳイミダゾリドの製造は成功した。しかしながら、これは、実際により求核性の５−アミノ−機能化ポリヌクレオチドとのカップリングを伴わずに、調べた全てのｐＨ値および反応物質比率で水溶液における反応中にイミダゾールとＨＥＳ酸に分解した。
【００４０】
さらなる可能性として、ＥＤＣ活性化によってもしくは無水媒質におけるヒドロキシスクシンイミドとＨＥＳラクトンとの反応により文献明細書に従って無水媒質においてあらかじめ製造した、ＨＥＳ酸の活性ヒドロキシスクシンイミドエステルを介してカップリングを目指した。しかしながら、２つの方法のいずれも成功しなかった。
【００４１】
還元的アミノ化という意味でアミノ機能化ポリヌクレオチドと唯一の還元末端基を介したＨＥＳの反応もまた、非常に長い反応時間にもかかわらず、不成功であった。
【００４２】
ポリヌクレオチドと多糖からの複合体の本発明の製造の反応スキームを図１に示し、こ
こで、図１Ａは多糖のアルドン酸のアルドン酸基の構造を示し、そして図１Ｂは反応経路を明らかにする。実施例４〜１４の主題である図２における反応式は、ポリヌクレオチドと多糖から複合体を製造しようとする成功しなかった試みを要約する。
【００４３】
本発明の方法は、原則として、ある種の多糖に限定されないが、ヒドロキシエチル澱粉は特に好ましい多糖である。しかしながら、例えばヒドロキシプロピル澱粉のような他の澱粉誘導体を使用することもまた本発明の枠組み内である。同様に、本発明の枠組み内で、独国特許出願１０２  １７  ９９４に記述されている超分岐澱粉画分、特に１０ｍｏｌ％より大きい、好ましくは１０ｍｏｌ％より大きくそして１６ｍｏｌ％より小さい分岐度を有する超分岐澱粉画分を使用することができる。
【００４４】
ＨＥＳは、本質的に重量平均分子量Ｍｗ、数平均分子量Ｍｎ、分子量分布および置換度を特徴とする。従って、エーテル結合におけるヒドロキシエチル基での置換は、アンヒドログルコース単位の炭素原子２、３および６上で可能である。従って、置換サンプルは、Ｃ６置換に対するＣ２の比率（Ｃ２／Ｃ６比）として記述される。従って、置換度は、全てのグルコース単位の置換されたグルコース分子の含有量をさすＤＳ（「置換度」の英語）としてもしくはグルコース単位当たりのヒドロキシエチル基の平均数がそれにより示されるＭＳ（「モル置換」の英語）として記述することができる。
【００４５】
科学文献において、また本明細書にもおけるように、キロダルトン単位の分子量Ｍｗは置換度ＭＳと一緒にヒドロキシエチル澱粉について略語として示される。従って、ＨＥＳ１０／０．４は、１０，０００の分子量Ｍｗのそして０．４の置換度ＭＳのヒドロキシエチル澱粉を示す。
【００４６】
本発明に従って使用するアルドン酸エステルの製造は、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）もしくはジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）のような乾燥した非プロトン性溶媒において多糖もしくはその誘導体のアルドン酸とアルコール成分のカーボネートを反応させることにより行われる。本明細書に記述されるアルドン酸は先行技術から既知であり、そして例えば独国特許出願ＤＥ  １９６  ２８  ７０５の開示に従って製造することができる。
【００４７】
アルコール誘導体、特にそれぞれ使用するアルコールのカーボネートとアルドン酸との反応において、過剰のカーボネートで、アルコール誘導体により提供される場合、多糖のＯＨ基は選択的に活性化され、そしてより少ないと、過剰の酸官能基が反応されないので、モル比は約０．９〜１．１、好ましくは約１．０である。
【００４８】
本発明の枠組み内で特に好ましいアルコールは、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、スルホン化Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド、フェノール誘導体およびＮ−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールである。適当なフェノール誘導体は、とりわけ、塩素化、フッ素化もしくはニトロ化化合物を含んでなり、ここで、これらは、特に上記の求電子基により、１回もしくは数回活性化することができる。相応して、モノもしくはポリ塩素化フェノール、モノもしくはポリフッ素化フェノールまたはモノもしくはポリニトロ化フェノールを使用することは、本発明の枠組み内である。
【００４９】
本発明に従って使用するアルドン酸エステルは、乾燥したエタノール、イソプロパノールもしくはアセトンによりＤＭＦにおいて溶液から沈殿させ、そして該方法を数回繰り返すことにより精製するかもしくは濃縮することができる。次に、そのようなアルドン酸エステルを多糖へのカップリングに実質的に単離して使用することができる。しかしながら、不活性非極性溶媒における反応生成物の溶液はまた、多糖へのカップリングに活性アルドン酸エステルを単離せずに、直接再使用することもできる。
【００５０】
原則として、任意のタイプのポリヌクレオチドを多糖と結合することは本発明の範囲内である。従って、ポリヌクレオチドはＬ−ヌクレオシドもしくはＤ−ヌクレオシドまたはその混合物から製造することができ、ここで、これらは例えば生物系における安定性を増すための修飾のような他の修飾を個々にもしくは全体で示すことができる。このタイプの修飾は、例えば、ヌクレオチドもしくはヌクレオシドの糖構成要素の２’位でのフッ素化である。従って、ポリヌクレオチドを形成するヌクレオチドの糖構成要素の少なくとも一部は、リボースもしくはデオキシリボース以外の糖を示すことができることもまた、本発明の枠組み内である。例えば、このタイプの糖は、例えばアラビノースのような他のペントース、またヘキソースもしくはテトロースでもあることができる。このタイプの糖はまた、例えばアザもしくはチオ糖におけるような、窒素原子もしくは硫黄原子を含有することもでき、そして／またはポリヌクレオチドの糖含有量をモルホリノ環で少なくとも部分的に置換することができる。さらに、ポリヌクレオチドは、ロックされた核酸（ＬＮＡ）もしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）として少なくとも部分的に開発することができる。ポリヌクレオチドの骨格を形成する分子構成要素のＯＨ基は、適当なＮＨ２、ＳＨ、アルデヒド、カルボン酸、リン酸、ヨウ素、臭素もしくは塩素基で化学的に修飾することができる。
【００５１】
さらに、ポリヌクレオチドはリボ核酸もしくはデオキシリボ核酸またはその組み合わせ（すなわち、個々もしくは一群のヌクレオチドはＲＮＡとして存在し、そして核酸を形成する他のヌクレオチドはＤＮＡとして存在し、そしてその逆の場合もそうである）であることは、本発明の枠組み内である。Ｌ−核酸という用語は、本明細書においてＬ−オリゴヌクレオチドもしくはＬ−ポリヌクレオチドという用語と同義的に使用され、そしてとりわけ、Ｌ−デオキシリボ核酸とＬ−リボ核酸の両方およびその組み合わせ、すなわち、個々もしくは一群のヌクレオチドはＲＮＡとして存在し、そして核酸を形成する他のヌクレオチドはＤＮＡとして存在し、そしてその逆の場合もそうであることをさす。従って、デオキシリボースもしくはリボースの代わりに他の糖がヌクレオチドの糖成分を形成することもまた予想される。さらに、ＮＨ２、ＯＭｅ、ＯＥｔ、Ｏアルキル、ＮＨアルキルのような２’位での他の修飾を有するヌクレオチドの使用および例えばイソシチジンおよびイソグアノシンのような天然のもしくは非天然の核酸塩基の使用を含んでなる。従って、Ｌ−核酸がいわゆる脱塩基位置、すなわち、核酸塩基がないヌクレオチドを示すこともまた、本発明の枠組み内である。このタイプの脱塩基位置は、Ｌ−核酸のヌクレオチド配列の内部および一方もしくは両方の末端（すなわち、５’および／もしくは３’末端）の両方で配置することができる。
【００５２】
さらに、ポリヌクレオチドは一本鎖として存在することは本発明の枠組み内であり、しかしながら、ここで、これが二本鎖として存在することもまた本発明の枠組み内である。典型的に、本発明に従って使用するポリヌクレオチドは一本鎖Ｌ−核酸であり、しかしながら、それはその一次配列の結果として特定の二次構造そしてまた三次構造も生じることができる。二次構造において、Ｌ−核酸の多重度とともに、二本鎖部分もまた存在する。
【００５３】
本明細書に記述される結合核酸は、好ましくは、いわゆるシュピーゲルマーである。最初にすでに記載したように、シュピーゲルマーは官能性Ｌ−核酸もしくはＬ−ポリヌクレオチド、すなわち、標的分子もしくはその一部に結合するような核酸であり、そして標的分子と特に統計的核酸ライブラリーの核酸ライブラリーを接触させることの結果である。
【００５４】
まず第一に、組み合わせＤＮＡライブラリーを官能性核酸の開発のための選択方法のために製造する。通例、これは２つのプライマー結合領域が５’および３’末端隣接する一連の１０〜１００のランダム化ヌクレオチドを主として含有するＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成である。このタイプの組み合わせライブラリーの製造は、例えば、Ｃｏｎｒａｄ
，Ｒ．Ｃ．，Ｇｉｖｅｒ，Ｌ．，Ｔｉａｎ，Ｙ．ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．，１９９６，Ｍｏｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖｏｌ．２６７，３３６−３６７に記述されている。そのような化学的に合成した一本鎖ＤＮＡライブラリーをポリメラーゼ連鎖反応によって二本鎖ライブラリーに転化することができ、それはそれ自体で実際に選択に使用することができる。しかしながら、通例、それがＤＮＡ選択（Ｂｏｃｋ，Ｌ．Ｃ．，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｌ．Ｃ．，Ｌａｔｈａｍ，Ｊ．Ａ．，Ｖｅｒｍａａｓ，Ｅ．Ｈ．ａｎｄ  Ｔｏｏｌｅ，Ｊ．Ｊ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３５５，５６４−５６６）である場合にインビトロ選択方法に使用する個々の鎖ライブラリーを再び得ることができるように個々の鎖の分離を適当な方法で実施することができる。しかしながら、化学的に合成したＤＮＡライブラリーをインビトロ選択に直接含むこともまた可能である。さらに、ＲＮＡライブラリーは、原則として、Ｔ７プロモーターが前もって導入される場合に、従って、適当なＤＮＡ依存性ポリメラーゼ、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって、二本鎖ＤＮＡから製造することができる。記述される方法を用いて１０１５以上のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子のライブラリーを製造することが可能である。このライブラリーからの各分子は、異なる配列およびその結果として異なる三次元構造を有する。
【００５５】
インビトロ選択方法によって、次に、記載のライブラリーから、数サイクルの選択および増幅ならびに場合により突然変異を通して、既定の標的に対する有意な結合特性を示す１個もしくは数個のＤＮＡ分子を単離することが可能である。標的は、例えば、ウイルス、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物のような小分子、製薬学的有効成分もしくはその代謝産物または例えばＧｏｌｄ，Ｌ．，Ｐｏｌｉｓｋｙ，Ｂ．，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ，Ｏ．ａｎｄ  Ｙａｒｕｓ，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｖｏｌ．６４，７６３−７９７およびＬｏｒｓｃｈ，Ｊ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，１９９６，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｅｄ．Ｒｉｃｃａｒｄｏ  Ｃｏｒｔｅｓｅ，Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎに記述されているような他の化学的、生化学的もしくは生物学的成分であることができる。該方法は、結合ＤＮＡもしくはＲＮＡ分子が最初に使用するライブラリーから単離され、そしてポリメラーゼ連鎖反応を用いて選択段階の後に増幅されるように実施される。ＲＮＡ選択において、逆転写はポリメラーゼ連鎖反応による増幅段階に前連結されるべきである。第一の選択ラウンド後に濃縮されたライブラリーは、次に、第一の選択ラウンドにおいて濃縮された分子が選択および増幅で再び成功しそしてさらなる選択ラウンドにさらにより多くの娘分子とともに進む機会を有するように新たな選択ラウンドにおいて使用することができる。同時に、ポリメラーゼ連鎖反応段階は、例えば塩濃度のバリエーションにより、増幅中に新たな突然変異を導入する可能性を広げる。十分な数の選択および増幅ラウンドの後に、結合分子は継承している（ｈａｖｅ  ｓｕｃｃｅｅｄｅｄ）。濃縮されたプールをこのようにして製造し、その代表をクローニングにより単離し、そして次にＤＮＡの配列決定の一般的な方法でその一次構造において決定することができる。次に、得られる配列を標的に関するそれらの結合特性について調べる。従って、このタイプのアプタマーの製造方法はＳＥＬＥＸ方法と呼ばれ、そして例えばＥＰ  ０  ５３３  ８３８に記述されており、その開示は引用することにより本明細書に含まれる。
【００５６】
最も良い結合分子は、それらの必須結合ドメインまで一次配列を短縮することにより短くし、そして化学もしくは酵素合成により表すことができる。
【００５７】
そのような程度まで製造可能なアプタマーの特定の形態は、それらが非天然のＬ−ヌクレオチドで少なくとも部分的に、好ましくは完全に構築されることを実質的に特徴とするいわゆるシュピーゲルマーである。このタイプのシュピーゲルマーの製造方法は、ＰＣＴ／ＥＰ９７／０４７２６に記述されており、その開示は引用することにより本明細書に含まれる。そこに記述される方法の特性は、鏡像異性体核酸分子の、すなわち、天然の標的
（すなわち、天然の形態もしくは立体配置で存在する）もしくはこのタイプの標的構造に結合するＬ−核酸分子の製造にある。上記のインビトロ選択方法を用いて鏡像異性体、すなわち、天然に存在する標的の天然に存在しない構造に対して、例えば標的分子がタンパク質である場合にはＤタンパク質に対して結合核酸もしくは配列をまず第一に選択する。このようにして得られる結合分子（Ｄ−ＤＮＡ、Ｄ−ＲＮＡもしくは対応するＤ−誘導体）をそれらの配列において決定し、そして次に同一配列を鏡像ヌクレオチドビルディングブロック（Ｌ−ヌクレオチドもしくはＬ−ヌクレオチド誘導体）で合成する。このようにして得られる鏡像、鏡像異性体核酸（Ｌ−ＤＮＡ、Ｌ−ＲＮＡもしくは対応するＬ−誘導体）、いわゆるシュピーゲルマーは、対称性の理由で、鏡像三次構造およびその結果として天然の形態もしくは立体配置で存在する標的に対する結合特性を有する。
【００５８】
本明細書に記述される選択および短縮方法において得られるようなポリヌクレオチド、特にアプタマーもしくはシュピーゲルマーのような官能性核酸は、約３００Ｄａ〜５０，０００Ｄａの分子量を有する。好ましくは、これらは４，０００Ｄａ〜２５，０００Ｄａ、より好ましくは７，０００〜１６，０００Ｄａの分子量を示す。
【００５９】
標的とも呼ばれる上記の標的分子は、分子もしくは構造、従って、例えばウイルス、ウイロイド、細菌、細胞表面、細胞小器官、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物のような小分子、製薬学的有効成分もしくはその代謝産物または他の化学的、生化学的もしくは生物学的成分であることができる。
【００６０】
本発明の方法によれば、ポリヌクレオチドは、好ましくはポリヌクレオチドのリン酸基上に、アルドン酸エステルが反応して複合体を形成する求核基を示す。従って、この求核基が官能性アミノ基、好ましくは第一級アミノ基（ＮＨ２基）であることは本発明の枠組み内で特に好ましい。従って、アルドン酸エステルと反応するポリヌクレオチドが官能性第二級アミノ基、イミノ基を含有することは、本発明の枠組み内である。
【００６１】
しかしながら、求核基が、好ましくはポリヌクレオチドのリン酸基上で結合して存在する第一級アミノ基であることは、本発明の枠組み内で特に好ましい。アミノ基は、好ましくは、ポリヌクレオチドの５’もしくは３’末端のリン酸基上に、従って、末端リン酸基上に存在する。従って、アミノ基は、１つの態様としてリン酸基に直接もしくはリン酸基にリンカーを介して結合することができる。このタイプのリンカーは、先行技術から既知である。好ましいリンカーは、１〜８、好ましくは２〜６Ｃ原子の長さを有するアルキル基である。特に、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドのアルドン酸エステルを用いる場合、核酸におけるプリンもしくはピリミジン塩基のような、ポリヌクレオチドにさらに存在する求核基は、反応しない。
【００６２】
オリゴヌクレオチドをポリヌクレオチドの代わりに使用することは、本発明の枠組み内である。１つの態様として、ポリヌクレオチドは、本明細書において用いる場合、オリゴヌクレオチドである。
【００６３】
本発明は、以下の図面および実施例を用いて説明され、それらから本発明の他の特徴、態様および利点が得られる。
【実施例１】
【００６４】
シュピーゲルマーおよびヒドロキシエチル澱粉からの複合体の製造
【００６５】
使用するＨＥＳｙｌａｔｅ
還元鎖末端でカルボン酸に酸化した分子パラメーターＭｗ１１０９２Ｄ、ＭＳ０．４およびＣ２／Ｃ６＞８を有するＨＥＳ１０／０．４を使用した。ＨＥＳ酸の製造の記述は、
例えば、独国特許出願ＤＥ  １９６  ２８  ７０５に開示される。
【００６６】
ＮＨＳエステルの製造
ＨＥＳｙｌａｔｅのＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステルを以下のように製造した：
０．２ｇ（０．０５ｍＭｏｌ）の無水ＨＥＳ酸１０／０．４を１ｍｌの乾燥したジメチルホルムアミドに溶解し、そして等モル量のＮ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（１２．８ｍｇ）と室温で１．５時間反応させる。
【００６７】
シュピーゲルマーＨＥＳｙｌａｔｅの製造
５ｍｇ（１．３μｍｏｌに対応する）の配列番号１の５’−アミノヘキシル機能化ＲＮＡ−シュピーゲルマーを８．４のｐＨを有する０．７ｍｌの０．３モルジカーボネート溶液に溶解する。上記のように製造した活性エステルをこの溶液に直接加え、そして室温で２時間反応させる。
【００６８】
ＲＮＡ−シュピーゲルマーは、以下の配列を示す：
５’−アミノヘキシル−ＵＧＡＧＵＧＡＣＵＧＡＣ−３’（配列番号１）
【００６９】
そのように製造した複合体の分析
複合体は、低圧ＧＰＣにより検出される。従って、使用した分析条件は下記の事項であり、分析結果を図３に示す：
カラム：Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  １２  ＨＲ  １０／３０、３００ｍｍｘ１０ｍｍ  ｉ．ｄ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ａｒｔ．ｎｏ．１７−０５３８−０１）
移動溶媒：リン酸バッファー  ｐＨ７．０
（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中２７．３８ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１２．６２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５％  ＮａＮ３）
流速：０．４ｍｌ／分
検出：ＵＶ２８０ｎｍ
実行時間：７０分
注入容量：２０μｌの最初のチャージ
【００７０】
反応チャージは、６２％（クロマトグラムを参照して垂直で）もしくはテーリングピーク評価で７７％の収率をもたらした。
【００７１】
上記の反応を以下の分子パラメーター：Ｍｗ：５４１１０Ｄ、Ｍｓ：０．７およびＣ２／Ｃ６：〜５を示す別の形態のヒドロキシエチル澱粉（５０／０．７）で実施した。
【００７２】
その他の点では同一の反応方法で、５３％の収率が得られた。反応生成物の対応するＧＰＣクロマトグラムを図４に示す。
【実施例２】
【００７３】
複合体の収率を上げること
実施例１に記述される方法に基づいて、試験ＲＮＡ−シュピーゲルマーに少しずつ加える活性化アルドン酸エステルの比率を２：１もしくは３：１に増加した。比率の倍増の場合、９５％より大きい収率が得られ、そして活性化アルドン酸エステルの過剰の３倍増で、実質的に定量的収率（＞９８〜９９％）が得られた。
【実施例３】
【００７４】
グレリン結合ＨＥＳ化および非ＨＥＳ化シュピーゲルマーによるグレリン誘発カルシウム放出の阻害の比較
グレリンのヒト受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）を発現する安定にトランスフェクションされた（ｔｒａｎｓｆｉｘｅｄ）ＣＨＯ細胞（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ，Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手）を透明な底を有する黒色９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェル当たり５〜７ｘ１０４の数で接種し、そして１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌのゲネチシンおよび２．５μｇ／ｍｌのファンギゾンをさらに含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）において３７℃および５％  ＣＯ２で一晩培養した。
【００７５】
配列番号２の内部基準ＳＯＴ−Ｂ１１を有するグレリン結合シュピーゲルマーの実施例１に従って製造した非ＨＥＳ化および５’−ＨＥＳ化形態を０．２ｍｌの「薄型９６チューブ」プレートにおいて５ｍＭのプロベネシドおよび２０ｍＭのＨＥＰＥＳを加えたＵｌｔｒａＣＨＯ培地（ＣＨＯ−Ｕ＋）中でヒトもしくはラットグレリン（Ｂａｃｈｅｍ）と一緒にＲＴもしくは３７℃で１５〜６０分間インキュベーションする。これらの刺激溶液は、ＣＨＯ−Ｕ＋において１０倍濃縮溶液として調製する。
【００７６】
ＳＯＴ−Ｂ１１の配列：５’−ＣＧＵ  ＧＵＧ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＵＡＡ  ＡＡＣ  ＵＵＡ  ＡＧＵ  ＣＣＧ  ＡＡＧ  ＧＵＡ  ＡＣＣ  ＡＡＵ  ＣＣＵ  ＡＣＡ  ＣＧ−３’（配列番号２）
カルシウム指示色素Ｆｌｕｏ−４を加える前に、細胞をそれぞれ２００μｌのＣＨＯ−Ｕ＋で１ｘ洗浄する。次に、５０μｌの指示色素溶液（ＣＨＯ−Ｕ＋中１０μＭのＦｌｕｏ−４（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）、０．０８％のＰｌｕｒｏｎｉｃ  １２７（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ））を加え、そして３７℃で６０分間インキュベーションする。次に、細胞をそれぞれ１８０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋で３ｘ洗浄する。次に、ウェル当たり９０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋を加える。
【００７７】
蛍光シグナルの測定は、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａマルチディテクションプレートリーダー（ＢＭＧ）において４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長で実施する。
【００７８】
グレリンにより引き起こされるカルシウム濃度の変化の時間的経過の正確な分析のために刺激溶液を細胞に加える。９６ウェルプレートの縦列（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｅｒｉｅｓ）のウェルは、いくつかのサンプルの平行測定のために一緒に測定される。このために、３つの測定値がベースラインを決定するために４秒の間隔でまず最初に記録される。次に、測定を中断し、プレートをリーダーから取り除き、そしてマルチチャンネルピペットで、プレインキュベーションを実施した「薄型９６チューブ」プレートからの１０μｌの刺激溶液を測定する列のウェルに加える。次に、プレートを機械に再び挿入し、そして測定を続ける（４秒離して合計２０の測定）。
【００７９】
得られる測定曲線から、最大蛍光シグナルと刺激前の蛍光シグナルとの差を各個々のウェルについて決定し、そしてグレリンの濃度に対して、もしくはシュピーゲルマーでのカルシウム放出の阻害についての試験では、シュピーゲルマーの濃度に対してプロットする。
【００８０】
ＨＥＳ化シュピーゲルマーの効率を示すために、グレリン受容体を発現する細胞を５ｎＭのグレリンまたは異なる量のＨＥＳ化もしくは非ＨＥＳ化シュピーゲルマーと一緒にプレインキュベーションしたグレリンで刺激した。測定される蛍光シグナルをシュピーゲルマーなしに得られるシグナルに標準化した。ＨＥＳ化シュピーゲルマーは約６．５ｎＭのＩＣ５０でグレリン誘発Ｃａ＋＋放出を阻害し、一方、非ＨＥＳ化シュピーゲルマーは約５ｎＭのＩＣ５０で阻害する。結果を図５に示す。
【実施例４】
【００８１】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
０．２５ｇのＨＥＳ１０／０．４アルドン酸（６２．５μｍｏｌ）を攪拌しながら１０ｍＬの水に溶解する。９．９５ｍｇ（２．５μｍｏｌ）の配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーを室温で溶液に加える。次に、１ｍＬの水に溶解した５０ｍｇのＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（２６１μｍｏｌ）を攪拌しながら室温で２時間にわたって少しずつ加える。塩酸もしくは水酸化ナトリウム溶液の添加により５のｐＨを一定に保つ。反応が完了すると、チャージを室温でもう２時間さらに攪拌する。低圧ＧＰＣによる反応チャージの確認により、１％未満の使用したシュピーゲルマーの反応転化が示された。
【実施例５】
【００８２】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
１５０ｍｇのＥＤＣを実施例４におけるようなＨＥＳ１０／０．４アルドン酸と配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーの混合物に室温でそして攪拌しながら３時間にわたって加える。反応転化を分析低圧ＧＰＣにより決定することはできなかった。
【実施例６】
【００８３】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
１．０ｇのＨＥＳ１０／０．４アルドン酸（２４０μｍｏｌ）を攪拌しながら熱で１０ｍＬの水に溶解する。室温に冷却した後に、１０ｍｇの配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーをチャージに加える。次に、１ｍＬの水に溶解した５０ｍｇのＥＤＣ（２６０μｍｏｌ）を攪拌しながら室温で２時間にわたって少しずつ加え、塩酸もしくは水酸化ナトリウム溶液でｐＨを５で一定に保つ。
【００８４】
さらなる２時間の反応時間の後に、低圧ＧＰＣを用いてチャージを分析する。反応生成物を検出することはできなかった。
【実施例７】
【００８５】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
実施例６のチャージを繰り返し、ここで、この場合には１００ｍｇのＥＤＣを３時間にわたって加えた。
【００８６】
反応が完了した時に、反応生成物を検出することはできなかった。
【実施例８】
【００８７】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
実施例６および７を４．０および６．０のｐＨ値で繰り返した。
【００８８】
低圧ＧＰＣを用いて２つの反応チャージにおいて反応生成物を検出することはできなかった。
【実施例９】
【００８９】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
実施例４を４℃および３７℃の反応温度で繰り返した。
【００９０】
両方の場合において、反応生成物は検出されなかった。
【実施例１０】
【００９１】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
３０３．７ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）のスクシンイミドおよび０．５０２ｇのＨＥＳ１０／０．４アルドン酸（０．１２５ｍｍｏｌ）を室温で１０ｍＬの乾燥したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。
【００９２】
次に、５０ｍｇのＥＤＣ（０．２５ｍｍｏｌ）を加え、そしてチャージを一晩攪拌する。
【００９３】
５ｍｇ（１．３μｍｏｌに対応する）の配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーを１０ｍＬの水に溶解し、そしてｐＨを水酸化ナトリウム溶液で８．５に設定するか、もしくは１０ｍＬのｐＨ８．４の０．３モル重炭酸バッファーに溶解する。
【００９４】
それぞれ５ｍＬの上記のジメチルスルホキシド溶液を２つの部分チャージに加え、第一の部分チャージの水溶液のｐＨを水酸化ナトリウム溶液の添加によりｐＨ８．５で一定に保つ。
【００９５】
チャージを室温で一晩攪拌した。分析低圧ＧＰＣは、２つの部分チャージにおいていかなる反応生成物ももたらさなかった。
【実施例１１】
【００９６】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
３００ｍｇ（２．６ｍｍｏｌ）のスクシンイミドを１０ｍＬの乾燥したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、そして０．５ｇ（０．１２５ｍｍｏｌ）の乾燥したＨＥＳ１０／０．４アルドン酸を８０℃で一晩加えて対応するラクトンを生成せしめる。チャージは、７０℃で一晩反応する。
【００９７】
次に、溶液を１０ｍＬのｐＨ８．４の０．３モル重炭酸バッファー中５ｍｇの配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーの溶液の５ｍＬに室温で加え、そして室温で４時間攪拌する。分析低圧ＧＰＣを用いて反応生成物は見出されなかった。
【実施例１２】
【００９８】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
５．０ｇのＨＥＳ１０／０．４アルドン酸（１．２ｍｍｏｌ）を３０ｍＬの乾燥したジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解する。１９５ｍｇ（１．２ｍｍｏｌ）のカルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を溶液に加え、そして室温で２時間攪拌する。
【００９９】
５ｍｇの配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーを５ｍＬの水に溶解する。１０ｍＬのイミダゾリル−ＨＥＳアルドン酸１０／０．４の上記の溶液をこの溶液に加え、そしてｐＨを水酸化ナトリウム溶液で７．５に設定する。室温で一晩攪拌した後に、低圧ＧＰＣを用いてチャージを反応生成物に関して調べた。ごく微量の反応生成物が決定された。
【実施例１３】
【０１００】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造
５ｍｇの配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーを１２．５ｍＬのｐＨ８．４の０．３Ｍ重炭酸バッファーに溶解する。チャージを氷水で０℃に冷却し、そして８．５ｍＬの実施例１２に記載するＤＭＦ中のＨＥＳ１０／０．４アルドン酸−イミダゾリルの溶液と混合する。０℃で２時間そして室温でさらに２時間後に、チャージを反応生成物について調べた。生成物を検出することはできなかった。
【実施例１４】
【０１０１】
先行技術の方法を用いたポリヌクレオチドとＨＥＳからの複合体の製造
１ｇのＨＥＳ１０／０．４（０．２５ｍｍｏｌ）を熱で５ｍＬのＨ２Ｏに溶解する。冷却後に溶液に１０ｍｇ（２．５μｍｏｌに対応する）の配列番号１のＲＮＡ−シュピーゲルマーを加え、そしてｐＨを水酸化ナトリウム溶液で７．５に設定する。次に、２００μｌのボラン−ピリジン錯体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、そしてチャージを暗所において室温で１０日間攪拌する。次に、チャージを低圧ＧＰＣによりあらゆる反応生成物について調べる。使用したシュピーゲルマーに基づき＜３％の転化のみを検出することができた。
【０１０２】
先の記述に開示される本発明の特徴、請求項および図面は、本発明をその異なる態様において行うために個々のそしてまた任意の組み合わせの本質的に両方であることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】ＨＥＳアルドン酸のアルドン酸基の化学構造。
【図１Ｂ】アルドン酸エステルへのアルコールのカーボネート誘導体とＨＥＳアルドン酸との本発明による活性化および官能性アミノ基を保有するポリヌクレオチドとのその反応の反応スキーム。
【図２Ａ】先行技術に従った、特に実施例４〜９に従ったポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造の反応スキーム。
【図２Ｂ】先行技術に従った、特に実施例１０に従ったポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造の反応スキーム。
【図２Ｃ】先行技術に従った、特に実施例１１に従ったポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造の反応スキーム。
【図２Ｄ】先行技術に従った、特に実施例１２〜１３に従ったポリヌクレオチドとＨＥＳアルドン酸からの複合体の製造の反応スキーム。
【図２Ｅ】先行技術に従った、特に実施例１４に従ったポリヌクレオチドとＨＥＳからの複合体の製造の反応スキーム。
【図３】本発明に従った、特に実施例１に従ったシュピーゲルマーのＨＥＳ化の反応チャージの結果のクロマトグラム。
【図４】本発明に従った、特に実施例１に従ったシュピーゲルマーのＨＥＳ化のさらなる反応チャージの結果のクロマトグラム。
【図５】グレリン誘発カルシウム２＋放出のＨＥＳ化シュピーゲルマーもしくは非ＨＥＳ化シュピーゲルマーによりもたらされる阻害の図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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