(57)【要約】  本発明は、新規なジヒドロテトラベナジン異性体、個々の鏡像異性体およびその混合物を提供し、ここで、このジヒドロテトラベナジンは３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンである。また、これら新規な異性体の製造方法、それらを含有する医薬組成物、ならびにハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック、遅発性ジスキネジアおよびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の処置におけるそれらの使用も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン。
【請求項２】
実質的に純粋な形態、例えば９０％より高い、一般に９５％より高い、より好ましくは９８％より高い、異性体純度の３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン。
【請求項３】
（＋）−異性体型である、請求項１または２に記載の３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン。
【請求項４】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを含んでなる組成物であって、実質的に３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンを含まない、組成物。
【請求項５】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを含んでなり、かつ、５％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、好ましくは３％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、より好ましくは１％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンしか含まない、組成物。
【請求項６】
３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンが（＋）−異性体である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
下式（Ｉａ）を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体：
【化１】
2007522193.tif 000035
【請求項８】
下式（Ｉｂ）を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体：
【化２】
2007522193.tif 000036
【請求項９】
下式（Ｉｃ）を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体：
【化３】
2007522193.tif 000037
【請求項１０】
下式（Ｉｄ）を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体：
【化４】
2007522193.tif 000038
【請求項１１】
メタノール中、２１℃で測定した場合に−１１４．６°のＯＲＤ［αＤ］を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン異性体。
【請求項１２】
メタノール中、２１℃で測定した場合に、約＋１２３°のＯＲＤ［αＤ］値を有する、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン異性体。
【請求項１３】
メタノール中、２１℃で測定した場合に、＋１５０．９°のＯＲＤ［αＤ］値を有する、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン異性体。
【請求項１４】
メタノール中、２１℃で測定した場合に、−１４５．７°のＯＲＤ［αＤ］値を有する、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジン異性体。
【請求項１５】
明細書の表１に示される分光学的特性と、明細書の表３に示されるクロマトグラフィー特性および必要によりＯＲＤ特性とを有する、ジヒドロテトラベナジン異性体。
【請求項１６】
明細書の表２に示される分光学的特性と、明細書の表４に示されるクロマトグラフィー特性および必要によりＯＲＤ特性とを有する、ジヒドロテトラベナジン異性体。  
【請求項１７】
明細書の表１に示される分光学的特性と、明細書の表３に示されるクロマトグラフィー特性とを有し、かつ、左旋光学活性を有する、ジヒドロテトラベナジン異性体Ａ。
【請求項１８】
明細書の表１に示される分光学的特性と、明細書の表３に示されるクロマトグラフィー特性とを有し、かつ、右旋光学活性を有する、ジヒドロテトラベナジン異性体Ｂ。
【請求項１９】
明細書の表２に示される分光学的特性と、明細書の表４に示されるクロマトグラフィー特性とを有し、かつ、右旋光学活性を有する、ジヒドロテトラベナジン異性体Ｃ。
【請求項２０】
明細書の表２に示される分光学的特性と、明細書の表４に示されるクロマトグラフィー特性とを有し、かつ、左旋光学活性を有する、ジヒドロテトラベナジン異性体Ｄ。
【請求項２１】
遊離塩基の形態である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジン。
【請求項２２】
酸付加塩の形態である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジン。
【請求項２３】
前記塩がメタンスルホン酸塩である、請求項２２に記載のジヒドロテトラベナジン。
【請求項２４】
薬剤または療法、例えば、ハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック、遅発性ジスキネジアおよびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の処置、または鬱病の処置に用いるための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジン。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジンと医薬上許容される担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２６】
ハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック、遅発性ジスキネジアおよびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の処置、または鬱病の処置を目的とした薬剤の製造のための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジンの使用。
【請求項２７】
予防または処置を必要とする患者における、ハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック、遅発性ジスキネジアおよびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の予防もしくは処置、または鬱病の処置のための方法であって、有効予防または治療量の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる、方法。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジンを製造する方法であって、式（II）：
【化５】
2007522193.tif 000039
の化合物を、式（II）の化合物の２，３−二重結合を水和するのに好適な試薬と反応させ、その後必要に応じて、目的のジヒドロテトラベナジン異性体型を分離および単離することを含んでなる、方法。
【請求項２９】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載のジヒドロテトラベナジンを製造する方法であって、式（III）：
【化６】
2007522193.tif 000040
の化合物を、式（III）の化合物の２，３−エポキシド基を開環するための条件に置き、その後必要に応じて、目的のジヒドロテトラベナジン異性体型を分離および単離することを含んでなる、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の式（III）の化合物を製造する方法であって、
請求項２７に記載の式（II）のアルケン化合物を、エポキシド基を形成するのに好適な酸化剤（ペルオキシ酸など）と反応させることを含んでなる、方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の式（II）の化合物を製造する方法であって、
３，１１−トランス−ジヒドロテトラベナジンを、ハロゲン化リンまたはオキシハロゲン化リンなどの脱水剤で脱水することを含んでなる、方法。
【請求項３２】
下式（II）の化合物：
【化７】
2007522193.tif 000041
【請求項３３】
下式（III）の化合物：
【化８】
2007522193.tif 000042
【請求項３４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の化合物の、モッシャー（Mosher）の酸エステル。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規なジヒドロテトラベナジン（dihydrotetrabenazine）異性体、それらを含有する医薬組成物、それらの製造方法およびそれらの治療的使用に関する。
【０００２】
背景技術
テトラベナジン（tetrabenazine）（化学名：１，３，４，６，７，１１ｂ−ヘキサヒドロ−９，１０−ジメトキシ−３−（２−メチルプロピル）−２Ｈ−ベンゾ（ａ）キノリジン−２−オン）は、１９５０年代の終盤以来、医薬として用いられてきた。テトラベナジンは、当初は抗精神病薬として用いられたが、現在では、ハンチントン病、片側バリスム（hemiballismum）、老年舞踏病、チック（tic）、遅発性ジスキネジア（tardive dyskinesia）およびトゥーレット症候群（Tourette's disease）などの運動亢進性運動障害（hyperkinetic movement disorders）を処置するために用いられている。例えば、Jankovic et al., Am. J. Psychiatry. (1999) Aug; 156(8): 1279-81およびJankovic et al., Neurology (1997) Feb; 48(2): 358-62参照。
【０００３】
テトラベナジンの主要な薬理作用は、ヒト小胞モノアミン輸送体イソ型２（ｈＶＭＡＴ２）を阻害することにより中枢神経系におけるモノアミン類の（例えば、ドーパミン、セロトニンおよびノルエピネフリン）の供給量を減らすことである。この薬物はまた、シナプス後ドーパミン受容体を遮断する。
【０００４】
テトラベナジンは、種々の運動亢進性運動障害の処置に効果的かつ安全な薬物であり、典型的な神経抑制薬とは対照的に、遅発性ジスキネジアを引き起こすことは示されていない。しかしながらやはり、テトラベナジンは、鬱病、パーキンソン病、傾眠、神経質または不安、不眠症、およびまれにではあるが神経抑制悪性症候群（neuroleptic malignant syndrome）をはじめとするいくつかの用量関連の副作用を示す。
【０００５】
テトラベナジンの中心的作用はレセルピンの場合とよく似ているが、ＶＭＡＴ１輸送体における活性を欠いているという点でレセルピンとは異なる。ＶＭＡＴ１輸送体における活性の欠如とは、テトラベナジンはレセルピンよりも末梢活性が低く、結果として、低血圧症などのＶＭＡＴ１関連副作用を生じないことを意味する。
テトラベナジンの化学構造は下記Ｆｉｇ．１に示す通りである。
【化１】
2007522193.tif 000002
Ｆｉｇ．１    テトラベナジンの構造
【０００６】
この化合物は３位と１１ｂ位の炭素原子にキラル中心を持ち、ゆえに、理論的には、下記Ｆｉｇ．２に示すように全部で４種類の異性体型で存在し得る。
【化２】
2007522193.tif 000003
Ｆｉｇ．２    存在し得るテトラベナジン異性体
【０００７】
前記Ｆｉｇ．２において、各異性体の立体化学は、Cahn, Ingold and Prelogにより開発された「ＲおよびＳ」命名法を用いて定義される（Advanced Organic Chemistry by Jerry March, 4th Edition, John Wiley & Sons, New York, 1992, pages 109-114参照）。Ｆｉｇ．２および本特許出願の他所において、「Ｒ」または「Ｓ」の表示は炭素原子の位置番号の順に示されている。従って、例えば、ＲＳは３Ｒ，１１ｂＳの省略表記である。同様に、下記のジヒドロテトラベナジンのようにキラル中心が３つ存在する場合には、「Ｒ」または「Ｓ」の表示は炭素原子２、３および１１ｂの順に挙げられている。従って、２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲ異性体は、省略形ＳＲＲで示されるなどである。
【０００８】
市販のテトラベナジンはＲＲ異性体とＳＳ異性体のラセミ混合物であり、ＲＲ異性体とＳＳ異性体（以下、３位と１１ｂ位の水素原子がトランス相対配向を有することから、個々に、またはひとまとめにしてトランス−テトラベナジンと呼ぶ）は最も熱力学的に安定な異性体であることが明らかである。
【０００９】
テトラベナジンはやや不十分で変動のあるバイオアベイラビリティを有する。それは初回通過代謝により大部分代謝され、一般に尿では未変性のテトラベナジンはほとんど、またはまったく検出されない。主要な代謝産物は、テトラベナジンの２−ケト基の還元により生じるジヒドロテトラベナジン（化学名：２−ヒドロキシ−３−（２−メチルプロピル）−１，３，４，６，７，１１ｂ−ヘキサヒドロ−９，１０−ジメトキシ−ベンゾ（ａ）キノリジン）であり、この薬物の活性を主として担うものと考えられている（Mehvar et al., Drug Metab. Disp, 15, 250-255 (1987)およびJ. Pharm. Sci., 76, No. 6, 461-465 (1987)参照）。
【００１０】
これまでに４種類のジヒドロテトラベナジン異性体が確認および同定されており、その総てがより安定な本発明のテトラベナジンのＲＲおよびＳＳ異性体に由来するものであり、３位と１１ｂ位の水素原子の間にトランス相対配向を有する（Kilbourn et al., Chirality, 9:59-62 (1997)およびBrossi et al., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp1793-1806 (1958)参照）。これら４種類の異性体は、（＋）−α−ジヒドロテトラベナジン、（−）−α−ジヒドロテトラベナジン、（＋）−β−ジヒドロテトラベナジンおよび（−）−β−ジヒドロテトラベナジンである。これら４種類の既知のジヒドロテトラベナジン異性体の構造は、下記Ｆｉｇ．３に示されている通りと考えられる。
【化３】
2007522193.tif 000004
Ｆｉｇ．３    ジヒドロテトラベナンの既知異性体の構造
【００１１】
Kilbourn et al.,（Eur. J. Pharmacol., 278:249-252 (1995)およびMed. Chem. Res., 5:113-126 (1994)参照）は、意識のあるラットの脳において個々に放射性標識したジヒドロテトラベナジン異性体の特異的結合を検討した。彼らは、（＋）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン（２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＲ）異性体が、高濃度の神経膜ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）および胞モノアミン輸送体（ＶＭＡＴ２）と関連のある脳領域に蓄積することを見出した。しかしながら、本質的に不活性な（−）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体は脳内にほぼ一様に分布しており、このことはＤＡＴおよびＶＭＡＴ２との特異的結合が起こっていなかったことを示唆する。これらのin vivo研究は、（＋）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体が、（−）−α−［１１Ｃ］ジヒドロテトラベナジン異性体のＫｉよりも２０００倍を超えて高い、［３Ｈ］メトキシテトラベナジンに対するＫｉを示すことを実証したin vitro研究と関連づけられた。
【００１２】
これらの出願が認識する限り、これまでに、テトラベナジンの不安定なＲＳおよびＳＲ異性体（以下、３位と１１ｂ位の水素原子がシス相対配向を有することから、個々に、またはひとまとめにしてシス−テトラベナジンと呼ぶ）に由来するジヒドロテトラベナジン異性体が単離および同定されたことはなく、これらの化合物の生物活性はこれまでに公表されたことはない。
【発明の概要】
【００１３】
今般、テトラベナジンの不安定なＲＳおよびＳＲ異性体（「シス異性体」）に由来するジヒドロテトラベナジン異性体が安定なばかりか、予期しないほど良好な生物特性を有することが見出された。特に、これらの異性体のうち特定のものは、現行使用のＲＲ／ＳＳテトラベナジンに優るいくつかの利点を示す受容体活性特性を有する。例えば、これらの異性体のいくつかのものは、ＶＭＡＴ２に高い親和性を有するが、ドーパミン受容体の結合の著しい低下を示すか、または無視できるほどのドーパミン受容体の結合しか示さず、このことは、それらがテトラベナジンで出くわすドーパミン作動性の副作用を生じにくいことを示す。これらの異性体の中でドーパミン輸送体（ＤＡＴ）の阻害を示したものはなかった。さらに、ラットにおけるこれらの異性体のいくつかに対する研究では、それらにテトラベナジンに関連する望ましくない鎮静副作用がないことが示された。鎮痛活性がないのは、これらの異性体のいくつかのものの、アドレナリン受容体に対する極めて低い親和性によるためであり得る。さらに、テトラベナジンの副作用の１つが抑鬱であるが、これらのジヒドロテトラベナジン異性体のいくつかのものは、セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）タンパク質に対して親和性を示し、このことは、それらが抗鬱活性を持ち得ることを示す。
【００１４】
よって、第１の態様において、本発明は、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
もう１つの態様において、本発明は、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンと医薬上許容される担体とを含んでなる医薬組成物を提供する。
【００１５】
本発明はまた、実質的に純粋な形態、例えば、９０％より高い、一般に９５％より高い、より好ましくは９８％より高い、異性体純度の３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンも提供する。
【００１６】
本明細書において「異性体純度」とは、総ての異性体型のジヒドロテトラベナジンの総量または総濃度に対して存在する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの量を意味する。例えば、その組成物中に存在する総ジヒドロテトラベナジンの９０％が３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンであれば、その異性体純度は９０％である。
【００１７】
本発明はさらに、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを含んでなり、かつ、実質的に３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンを含まない、好ましくは５％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、より好ましくは３％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジン、もっとも好ましくは１％未満の３，１１ｂ−トランス−ジヒドロテトラベナジンしか含まない組成物を提供する。
【００１８】
もう１つの態様において、本発明は、薬剤または療法、例えば、ハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック、遅発性ジスキネジアおよびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の処置、または鬱病の処置に用いるための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンを提供する。
【００１９】
さらなる態様において、本発明は、ハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック、遅発性ジスキネジアおよびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の処置、または鬱病の処置を目的とした薬剤の製造のための３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの使用を提供する。
【００２０】
なおさらなる態様において、本発明は、そのような予防または処置を必要とする患者における、ハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック、遅発性ジスキネジアおよびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の予防もしくは処置、または鬱病の処置のための方法であって、有効予防または治療量の３，１１−シス−ジヒドロテトラベナジンを投与することを含んでなる方法を提供する。
【発明の具体的説明】
【００２１】
本明細書において「３，１１ｂ−シス−」とは、ジヒドロテトラベナジン構造の３位と１１ｂ位の水素原子がシス相対配向にあることを意味する。よって、本発明の異性体は式（Ｉ）の化合物またはその対掌体（鏡像）である。
【化４】
2007522193.tif 000005
【００２２】
存在し得るものとして３，１１ｂ−シス配置を有するジヒドロテトラベナジンの４種類の異性体があり、これらは２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体、２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体、２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体および２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体である。これら４種類似体の異性体はすでに単離および同定されており、別の態様において、本発明は、３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの個々の異性体を提供する。特に、本発明は、
ａ）下式（Ｉａ）を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体：
【化５】
2007522193.tif 000006
ｂ）下式を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体（Ｉｂ）：
【化６】
2007522193.tif 000007
ｃ）下式（Ｉｃ）を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体：
【化７】
2007522193.tif 000008
、および
ｄ）下式（Ｉｄ）を有する３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体：
【化８】
2007522193.tif 000009
を提供する。
【００２３】
本発明の個々の新規な異性体は分光分析的特性、光学的特性およびクロマトグラフィー的特定によって同定することができる。
好ましい異性体は右旋（＋）異性体である。
【００２４】
特定の絶対的配置または立体化学を含まず、これら４種類の新規な異性体は次のように同定することができる。
異性体Ａ
ＯＲＤ（メタノール、２１℃）で測定した場合の光学活性：左旋（−）ＩＲスペクトル（固体ＫＢｒ）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表１に記載の通り。
異性体Ｂ
ＯＲＤ（メタノール、２１℃）で測定した場合の光学活性：右旋（＋）ＩＲスペクトル（固体ＫＢｒ）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表１に記載の通り。
異性体Ｃ
ＯＲＤ（メタノール、２１℃）で測定した場合の光学活性：右旋（＋）ＩＲスペクトル（固体ＫＢｒ）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表２に記載の通り。
【００２５】
異性体Ｄ
ＯＲＤ（メタノール、２１℃）で測定した場合の光学活性：左旋（−）ＩＲスペクトル（固体ＫＢｒ）、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣｌ３）は実質的に表２に記載の通り。
【００２６】
各異性体のＯＲＤ値は以下の例に示されているが、このような値は例として示されるものであり、異性体の純度、ならびに温度の変動および残留溶媒分子の影響などの他の変数の影響によって異なる場合がある。
【００２７】
鏡像異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは各々、実質的に鏡像異性体的に純粋な形態で存在してもよいし、あるいは本発明の他の鏡像異性体との混合物として存在してもよい。
【００２８】
本明細書において「鏡像異性体純度」および「鏡像異性体的に純粋な」とは、総ての鏡像異性体型および異性体型のジヒドロテトラベナジンの総量または総濃度に対して存在するする示された３，１１ｂ−シス−ジヒドロテトラベナジンの鏡像異性体量を意味する。例えば、その組成物中に存在する総ジヒドロテトラベナジンの９０％が単一の鏡像異性体の形態であれば、その異性体純度は９０％である。
【００２９】
例として、本発明の各態様および実施形態において、異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤから選択される各個の鏡像異性体は、少なくとも５５％（例えば、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または１００％）の鏡像異性体純度で存在し得る。
【００３０】
本発明の異性体はまた、異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの１以上の混合物の形態でも存在し得る。このような混合物はラセミ混合物であっても非ラセミ混合物であってもよい。ラセミ混合物の例としては、異性体Ａと異性体Ｂのラセミ混合物および異性体Ｃと異性体Ｄのラセミ混合物が挙げられる。
【００３１】
医薬上許容される塩
特に断りのない限り、本願においてジヒドロテトラベナジンおよびその異性体という場合には、その範囲内に、ジヒドロテトラベナジンの遊離塩基だけでなく、その塩、特に酸付加塩も含む。
【００３２】
酸付加塩が形成される特定の酸としては、ｐＫａ値が３．５未満、より通常には３未満の酸が挙げられる。例えば、酸付加塩は、ｐＫａ値が＋３．５〜−３．５の範囲の酸から形成することができる。
【００３３】
好ましい酸付加塩としては、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸およびナフタレンスルホン酸などのスルホン酸を伴って形成されるものが挙げられる。
酸付加塩が形成され得る１つの特定の酸としては、メタンスルホン酸である。
【００３４】
酸付加塩は、本明細書に記載の方法またはPharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. Heinrich Stahl (Editor), Camille G. Wermuth (Editor), ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388 pages, August 2002に記載の方法などの従来の化学法によって作製することができる。一般に、このような塩は、遊離塩基型の化合物を、水中、または有機溶媒中、あるいは両者の混合物中（一般には、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が用いられる）で好適な塩基または酸と反応させることにより作製することができる。
【００３５】
これらの塩は一般に医薬上許容される塩である。しかしながら、医薬上許容されない塩も中間体として作製してよく、次にこれを医薬上許容される塩に変換すればよい。このような医薬上許容されない塩も本発明の一部をなす。
【００３６】
ジヒドロテトラベナジン異性体の製造方法
さらなる態様において、本発明のジヒドロテトラベナジンを製造する方法（方法Ａ）が提供され、その方法は、式（II）：
【化９】
2007522193.tif 000010
の化合物を、式（II）の化合物の２，３−二重結合を水和するのに好適な試薬と反応させ、その後必要に応じて、目的のジヒドロテトラベナジン異性体型を分離および単離することを含んでなる。
【００３７】
２，３−二重結合の水和は、ジボランまたはボラン−エーテル（例えば、ボラン−テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））などのボラン試薬を用いたヒドロホウ素化により中間体アルキルボラン付加物を得た後、このアルキルボラン付加物の酸化および塩基の存在下での加水分解を行うことにより実施することができる。ヒドロホウ素化は一般にエーテル（例えば、ＴＨＦ）などの乾燥極性非プロトン性溶媒中、通常、非高温、例えば室温で行う。このボラン−アルケン付加物を一般に、水酸化アンモニウムまたはアルカリ金属水酸化物、例えば、水酸化カリウムもしくは水酸化ナトリウムなどの水酸化物イオンの供給源となる塩基の存在下、過酸化水素などの酸化剤を用いて酸化する。方法Ａの反応の一連のヒドロホウ素化−酸化−加水分解から一般に、２位と３位の水素原子がトランス相対配向を有するジヒドロテトラベナジン異性体が得られる。
【００３８】
式（II）の化合物は、テトラベナジンを還元してジヒドロテトラベナジンを得た後、そのジヒドロテトラベナジンの脱水を行うことにより製造することができる。テトラベナジンの還元は、水素化リチウムアルミニウムなどの水素化アルミニウム試薬、または水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウムもしくは水素化ホウ素誘導体、例えば、トリ−ｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素リチウムなどの水素化ホウ素アルキルといった水素化ホウ素試薬を用いて達成できる。あるいは、この反応工程は、例えば、ラネーニッケルまたは酸化白金触媒などの触媒的水素化を用いて行うこともできる。この反応工程を行うのに好適な条件は下記でよりさらに詳しく記載され、あるいは米国特許第２，８４３，５９１号(Hoffmann-La Roche)およびBrossi et al., Helv. Chim. Acta., vol. XLI, No. 193, pp1793-1806 (1958)に見出せる。
【００３９】
この還元反応の出発材料として用いられるテトラベナジンは一般にＲＲ異性体とＳＳ異性体の混合物（すなわち、トランス−テトラベナジン）であるので、この還元工程により生じるジヒドロテトラベナジンは３位および１１ｂ位について同じトランス配置を有し、上記Ｆｉｇ．３に示されている既知のジヒドロテトラベナジン異性体の１以上の形態をとる。よって、プロセスＡは、ジヒドロテトラベナジンの既知の異性体を考慮して、それらを脱水してアルケン（II）を形成した後、必要な本発明の新規なシスジヒドロテトラベナジン異性体を得る条件を用いて、そのアルケン（II）を「再水和する」ことを含み得る。
【００４０】
ジヒドロテトラベナジンのアルケン（II）への脱水は、アルコールを脱水してアルケン（II）を形成するための標準的な種々の条件を用いて行うことができる（例えば、J. March (idem) pages 389-390およびその中の参照文献参照）。このような条件の例としては、ハロゲン化リンまたはオキシハロゲン化リン、例えば、ＰＯＣｌ３およびＰＣｌ５などのリン系脱水剤の使用が挙げられる。直接的な脱水の代わりとして、ジヒドロテトラベナジンのヒドロキシル基をハロゲン（例えば、塩素または臭素）などの脱離基Ｌに変換した後、Ｈ−Ｌを除去する条件に置くことができる。ヒドロキシル基のハリドへの変換は、熟練の化学者に周知の方法を用い、例えば、トリフェニルホスフィンまたはトリブチルホスフィンなどのトリアルキルまたはトリアリールホスフィンの存在下で四塩化炭素または四臭化炭素と反応させることによって達成することができる。
【００４１】
ジヒドロテトラベナジンを得るための還元の出発材料として用いるテトラベナジンは、商業的に入手可能であるか、または米国特許第２，８３０，９９３号(Hoffmann-La Roche)に記載の方法によって合成することができる。
【００４２】
本発明はまた、本発明のジヒドロテトラベナジンを製造する方法（方法Ｂ）を提供し、その方法は式（III）：
【化１０】
2007522193.tif 000011
の化合物を、式（III）の化合物の２，３−エポキシド基を開環する条件下に置いた後、必要に応じて、目的のジヒドロテトラベナジン異性体型を分離および単離することを含む。
【００４３】
この開環は、エポキシドの開環に関して知られている方法に従って達成することができる。しかしながら、現在のところ好ましいエポキシドの開環方法は、ボラン−ＴＨＦなどの還元剤を用いて達成できる還元的開環である。ボラン−ＴＨＦとの反応は、通常、周囲温度でエーテル（例えば、テトラヒドロフラン）などの極性非プロトン性溶媒中で行うことができ、このようにして形成されたボラン複合体は、次に、水および塩基の存在下、溶媒の還流温度に加熱することによって加水分解される。方法Ｂから、一般に、２位と３位の水素原子がシス相対配向を有するジヒドロテトラベナジン異性体が得られる。
【００４４】
式（III）のエポキシド化合物は、上記式（II）のアルケンのエポキシド化によって製造できる。このエポキシ化反応は、熟練の化学者に周知の条件および試薬を用いて行うことができる（例えば、J. March (同書), pages 826-829およびその中の参照文献参照）。一般に、エポキシ化を行うためには、メタ−クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）などの過酸、または過酸と過塩素酸などのさらなる酸化剤との混合物が使用できる。
【００４５】
上記方法ＡおよびＢの出発材料が鏡像異性体混合物である場合には、それらの方法の生成物は一般に、鏡像異性体対、例えば、ジアステレオ異性体不純物を伴うラセミ混合物となる。望まないジアステレオ異性体はクロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）などの技術によって除去することができ、個々の鏡像異性体は、熟練の化学者に知られている種々の方法によって分離することができる。例えば、それらは、
（ｉ）キラルクロマトグラフィー（キラル支持体上でのクロマトグラフィー）；または
（ii）光学的に純粋なキラル酸を用いて塩を形成し、２種類のジアステレオ異性体の塩を分別結晶により分離した後、その塩からジヒドロテトラベナジンを遊離させること；または
（iii）光学的に純粋なキラル誘導体化剤（例えば、エステル化剤）を用いて誘導体（エステルなど）を形成し、得られたエピマーを分離し（例えば、クロマトグラフィーによる）、その後、その誘導体をジヒドロテトラベナジンに変換すること
によって分離することができる。
【００４６】
方法ＡおよびＢの各々から得られ、特に有効であることが分かった鏡像異性体を分離する１つの方法として、以下に示すＲ（＋）異性体などの光学的に活性な形態のモッシャー（Mosher）の酸、またはその活性型を用いてジヒドロテトラベナジンのヒドロキシル基をエステル化するものがある。
【化１１】
2007522193.tif 000012
【００４７】
得られたこのジヒドロベナジンの２つの鏡像異性体のエステルは、次に、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）により分離することができ、分離されたエステルを、メタノールなどの極性溶媒中、アルカリ金属水酸化物（例えば、ＮａＯＨ）などの塩基を用いて加水分解して個々のジヒドロベナジン異性体を得ることができる。
【００４８】
方法ＡおよびＢの出発材料として鏡像異性体混合物を用い、その後、鏡像異性体の分離を行う代わりに、方法ＡおよびＢを各々、単一の鏡像異性体出発材料で行い、単一の鏡像異性体が優勢となる生成物を得ることもできる。アルケン（II）の単一の鏡像異性体は、ＲＲ／ＳＳテトラベナジンに対して、トリ−ｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素リチウムを用いて立体選択的還元を行ってジヒドロテトラベナジンのＳＲＲおよびＲＳＳ鏡像異性体の混合物を得、これらの鏡像異性体を分離し（例えば、分別結晶による）、その後、分離されたジヒドロテトラベナジンの単一の鏡像異性体を脱水して、式（II）の化合物の単一の鏡像異性体を優先的または排他的に製造することができる。
方法ＡおよびＢはそれぞれ、スキーム１および２にさらに詳細に示されている。
【化１２】
2007522193.tif 000013
【００４９】
スキーム１は、２位と３位に結合している水素原子がトランス相対配向にある２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有する個々のジヒドロテトラベナジン異性体の製法を示している。この反応スキームは、上記で定義した方法Ａを含む。
【００５０】
スキーム１の一連の反応の出発点は、テトラベナジンのＲＲおよびＳＳ光学異性体のラセミ混合物である市販のテトラベナジン（IV）である。ＲＲおよびＳＳ異性体の各々において、３位および１１ｂ位の水素原子はトランス相対配向にある。市販の化合物を用いる代わりに、テトラベナジンは、米国特許第２，８３０，９９３号に記載の手順に従って合成することができる（特定の実施例１１参照）。
【００５１】
ＲＲおよびＳＳテトラベナジンのラセミ混合物を、水素化ホウ素還元剤であるトリ−ｓｅｃ−ブチル水素化ホウ素リチウム（「Ｌ−セレクトリド」）を用いて還元し、ジヒドロテトラベナジンの既知の２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲ異性体と２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ異性体の混合物（Ｖ）を得るが、簡略化して、このうちの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲ異性体のみを示す。水素化ホウ素還元剤として水素化ホウ素ナトリウムよりもより立体要求性の高いＬ−セレクトリドを用いることで、ジヒドロテトラベナジンのＲＲＲおよびＳＳＳ異性体の形成が最小限となるか、または抑制される。
【００５２】
ジヒドロテトラベナジン異性体（Ｖ）を、塩素化炭化水素（例えば、クロロホルムまたはジクロロメタン、好ましくは、ジクロロメタン）などのプロトン性溶媒中、五塩化リンなどの脱水剤と反応させ、鏡像異性体対として不飽和化合物（II）を形成するが、このスキームではそのうちＲ−鏡像異性体のみを示す。この脱水反応は一般に、室温より低い温度、例えば、０〜５℃前後で行う。
【００５３】
次に、この不飽和化合物（II）に対して立体選択的再水和を行って、３位と１１ｂ位の水素原子がシス相対配向にあり、２位と３位の水素原子がトランス相対配向にあるジヒドロテトラベナジン（VI）およびその鏡像または対掌体（示されていない）を生成する。立体選択的再水和は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中ボラン−ＴＨＦを用いたヒドロホウ素化を行って中間体ボラン複合体（示されていない）を形成した後、これを水酸化ナトリウムなどの塩基の存在下、過酸化水素で酸化することによって達成される。
【００５４】
その後、最初の精製工程（例えば、ＨＰＬＣによる）を行って、この一連の再水和反応の生成物（Ｖ）を、その２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の混合物として得、２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体のみ示した。これらの異性体を分離するため、この混合物を、ジクロロメタン中、塩化オキサリルおよびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下でＲ（＋）モッシャーの酸で処理し、ジアステレオ異性体エステル（VII）対を得（そのうち１つのジアステレオ異性体のみを示す）、次に、これをＨＰＬＣにより分離することができる。次に、この個々のエステルを、水酸化ナトリウムなどのアルカリ金属水酸化物を用いて加水分解し、単一の異性体（VI）を得ることができる。
【００５５】
スキーム１で示した一連の工程のバリエーションでは、ＲＲ／ＳＳテトラベナジンの還元の後、得られたジヒドロテトラベナジン（Ｖ）の鏡像異性体混合物を分離して、個々の鏡像異性体を分離することができる。分離は、（＋）または（−）カンファースルホン酸などのキラル酸で塩を形成し、得られたジアステレオ異性体を分別結晶により分離して単一の鏡像異性体の塩を得た後、その塩から遊離の塩基を遊離させることによって行うことができる。
【００５６】
分離されたジヒドロテトラベナジン鏡像異性体を脱水して、アルケン（II）の単一の鏡像異性体を得ることができる。次に、アルケン（II）の再水和を行い、優先的または排他的にシス−ジヒドロテトラベナジン（VI）の単一の鏡像異性体を得ることができる。
本発明の利点は、モッシャーの酸エステルの形成を含まず、従って、モッシャーの酸エステルの分離に一般に用いられるクロマトグラフィー的分離を避けられるということである。
【００５７】
スキーム２は、２位と３位に結合している水素原子がシス相対配向にある、２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置を有する個々のジヒドロテトラベナジン異性体の製造を示す。この反応スキームは、上記で定義された方法Ｂを含む。
【化１３】
2007522193.tif 000014
【００５８】
スキーム２において、この不飽和化合物（II）は、テトラベナジンを還元してジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ異性体（Ｖ）を得、スキーム１で上記したようにＰＣｌ５で脱水することにより製造される。しかしながら、化合物（II）をヒドロホウ素化する代わりに、２，３−二重結合は、メタ−クロロ過安息香酸（ＭＣＰＢＡ）および過塩素酸との反応によりエポキシドに変換される。このエポキシ化反応は、一般に室温前後で、メタノールなどのアルコール溶媒中で行うのが便宜である。
【００５９】
次に、このエポキシド（VII）に対し、求電子還元剤としてボラン−ＴＨＦを用いて還元的開環を行い、中間体ボラン複合体（示されていない）を得、次にこれを酸化し、水酸化ナトリウムなどのアルカリの存在下、過酸化水素で開裂させ、ジヒドロテトラベナジン（VIII）を２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲ異性体と２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の混合物として得るが、簡略化して、このうちの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲのみを示す。この異性体混合物（VIII）を、ジクロロメタン中、塩化オキサリルおよびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下、Ｒ（＋）モッシャーの酸で処理し、エピマーエステル（IX）対を得（そのうち１つのエピマーのみ示す）、次にこれをクロマトグラフィーにより分離し、スキーム１に関して上記したように、水酸化ナトリウムで加水分解することができる。
【００６０】
化学中間体（II）および（III）は新規なものであり、本発明のさらなる態様をなすものであると考えられる。
【００６１】
生物学的特性および治療的使用
テトラベナジンは、脳において小胞モノアミン輸送体ＶＭＡＴ２を阻害することにより、およびシナプス前ドーパミン受容体とシナプス後ドーパミン受容体の双方を阻害することにより、その治療効果を発揮する。
【００６２】
本発明のこの新規なジヒドロテトラベナジン異性体はまたＶＭＡＴ２の阻害剤でもあり、異性体ＣおよびＢが最大の阻害程度を示す。テトラベナジン同様、本発明の化合物は、末梢組織および数種の内分泌細胞に見られるＶＭＡＴイソ型であるＶＭＡＴ１に対して低い親和性しか持たず、それにより、それらがレセルピンに関連する副作用を生じないはずであることを示唆する。化合物ＣおよびＢはまた、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、モノアミンオキシダーゼイソ型ＡおよびＢ、ならびに５−ヒドロキシトリプタミンイソ型Ｉｄおよび１ｂに対して阻害活性を全く示さない。
【００６３】
驚くべきことに、異性体ＣおよびＢはまたＶＡＭＴ２の著しい分離とドーパミン受容体活性を示し、ＶＭＡＴ２の結合において活性が高いが、両化合物とも、弱いドーパミン受容体結合活性しか持たないか、またはドーパミン受容体結合活性は存在せず、ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）結合活性を欠いている。実際に、これらの異性体で、有意なＤＡＴ結合活性を示すものはない。このことは、これらの化合物が、テトラベナジンによって生じるドーパミン副作用がない可能性があることを示唆している。異性体ＣおよびＢはまた、アドレナリン受容体の阻害剤としての活性が弱いか、または不活性であり、このことは、これらの化合物がテトラベナジンを用いた場合に出くわすことの多いアドレナリン作動性の副作用がない可能性があることを示唆している。実際、ラットで行った運動研究では、テトラベナジンは、用量に関連する鎮静作用を示したが、本発明のジヒドロテトラベナジン異性体ＢおよびＣの投与後に鎮静作用は見られなかった。
【００６４】
さらに、異性体Ｃおよび異性体Ｂはセロトニン輸送体タンパク質ＳＥＲＴの有力な阻害剤である。ＳＥＲＴの阻害は、フルオキセチン（Prozac（商標））などの抗鬱薬がそれらの治療効果を発揮する１つの機構である。よって、抑鬱が十分認知された副作用であるテトラベナジンとは明らかに対照的に、異性体ＣおよびＢの、ＳＥＲＴを阻害する能力は抗鬱薬として作用する可能性がある。
【００６５】
これまでに行われた研究に基づけば、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物は、現在テトラベナジンが用いられている、または提案されている病態および症状の予防または処置に有用であると考えられる。よって、限定されるものではないが、例として、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物は、ハンチントン病、片側バリスム、老年舞踏病、チック障害、遅発性ジスキネジア、失調症およびトゥーレット症候群などの運動亢進性運動障害の処置に使用可能である。
【００６６】
また、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物が鬱病の処置に有用であり得るとも考えられる。
【００６７】
これらの化合物は一般に、このような投与を必要とする対象、例えば、ヒトまたは動物患者、好ましくは、ヒトに投与される。
【００６８】
これらの化合物は一般に、治療上または予防上有用であって無毒な量で投与される。しかしながら、ある状況では、本発明のジヒドロテトラベナジン化合物を投与する利益は、毒性作用または副作用の不利益にまさると考えられ、その場合、化合物を毒性適度と関連する量で投与することが望ましいと考えられる。
【００６９】
この化合物の通常の一日量は、０．０２５ミリグラム〜５ミリグラム／体重キログラムの範囲、例えば、３ミリグラム／体重キログラムまで、より一般には、０．１５ミリグラム〜５ミリグラム／体重キログラムであり得るが、必要があれば、それより高い用量または低い用量を投与してもよい。
【００７０】
例として、初期出発用量１２．５ｍｇを１日２〜３回投与すればよい。この用量は、各個に対して医師が決定したような最大許容有効量まで、２〜３日ごとに１日１２．５ｍｇだけ増量することができる。最終的に、投与する化合物の量は、処置する疾病または病態の性質および所定の投与計画によってもたらされる治療利益と副作用の有無に比例し、医師の裁量下にある。
【００７１】
医薬処方物
本発明はまた、医薬組成物の形態の、以上で定義したジヒドロテトラベナジン化合物も提供する。
これらの医薬組成物は、経口投与、非経口投与、局所投与、鼻腔内投与、気管支内投与、眼内投与、耳内投与、直腸投与、膣内投与または経皮投与に好適ないずれの形態であってもよい。これらの組成物が非経口投与を意図する場合、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下投与用、または注射、注入もしくは他の送達手段による標的器官または組織への直接送達用に処方することができる。
【００７２】
経口投与に好適な医薬投与形としては、錠剤、カプセル剤、キャプレッツ、丸剤、トローチ剤、シロップ剤、溶液、噴霧剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤および懸濁液、舌下錠剤、噴霧剤、カシェ剤またはパッチ剤および口内パッチ剤が挙げられる。
【００７３】
本発明のジヒドロテトラベナジン化合物を含有する医薬組成物は、既知の技術に従って処方することができる（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA参照）。
【００７４】
よって、錠剤組成物は、単位用量の有効化合物を、糖または糖アルコール（例えば、ラクトース、スクロース、ソルビトールまたはマンニトール）などの不活性希釈剤または担体；および／または炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、タルク、炭酸カルシウム、またはセルロースもしくはその誘導体（例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）などの非糖由来の希釈剤、およびコーンスターチなどのデンプン類とともに含有し得る。錠剤はまた、ポリビニルピロリドンなどの結合および造粒剤、崩壊剤（例えば、架橋カルボキシメチルセルロースなどの膨潤性架橋ポリマー）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸塩）、保存剤（例えば、パラベン）、抗酸化薬（例えば、ＢＨＴ）、緩衝剤（例えば、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファー）、およびクエン酸／重炭酸混合物などの発泡剤といった標準的な成分を含み得る。このような賦形剤は周知のものであり、ここで詳細に述べる必要はない。
【００７５】
カプセル処方物は、硬ゼラチン種または軟ゼラチン種であってもよく、固体、半固体または液体の形態の有効化合物を含むことができる。ゼラチンカプセルは動物性ゼラチンまたはその合成もしくは植物由来の等価物からなり得る。
【００７６】
固体投与形投与形（例えば、錠剤、カプセル剤など）はコーティングしてもしなくてもよいが、一般には、例えば、保護膜コーティング（例えば、ワックスまたはワニス）または徐放性コーティングなどのコーティングを施す。コーティング（例えば、Eudragit（商標）型ポリマー）は、胃腸管内の目的の位置で有効成分を放出するように設計することができる。よって、コーティングは、胃腸管内の特定のｐＨ条件下で崩壊するように選択することで、胃内または回腸もしくは十二指腸内で化合物を選択的に放出することができる。
【００７７】
コーティングの代わりに、またはコーティングに加えて、薬剤は放出制御剤、例えば、胃腸管内の酸度またはアルカリ度が変化する条件下で化合物を選択的に放出するようにすることができる放出遅延剤を含んでなる固体マトリックスにて提供することができる。あるいは、このマトリックス材料または放出遅延コーティングは、投与形が胃腸管を通過するにつれ実質的に連続的に腐食する腐食性ポリマー（例えば、無水マレイン酸ポリマー）の形態をとってもよい。
【００７８】
局所用組成物としては、軟膏、クリーム、噴霧剤、パッチ剤、ゲル剤、滴剤、およびインサート（例えば、眼内インサート）が挙げられる。このような組成物は既知の方法に従って処方することができる。
【００７９】
非経口投与用組成物としては、一般に、無菌水性もしくは油性溶液、または微細懸濁液として提供されるか、または無菌注射水で即時調合するための無菌微細粉末で提供してもよい。
【００８０】
直腸または膣内投与用処方物の例としては、例えば有効化合物を含有する鋳型可能な、またはワックス材料から形成し得る膣坐剤および坐剤が挙げられる。
【００８１】
吸入投与用組成物は、吸入可能な粉末組成物または液体もしくは粉末噴霧剤の形態をとってもよく、粉末吸入ディバイスまたはエアゾールディスペンスディバイスを用いる標準的な形態で投与することができる。このようなディバイスは周知のものである。吸入による投与では、粉末状の処方物に、一般に、有効成分をラクトースなどの不活性な固体粉末希釈剤とともに含む。
【００８２】
本発明の化合物は通常、単位投与形で提供され、それ自体、一般に、所望のレベルの生物活性をもたらすに十分な化合物を含む。例えば、経口投与を意図した処方物は、２ミリグラム〜２００ミリグラム、より通常には１０ミリグラム〜１００ミリグラム、例えば、１２．５ミリグラム、２５ミリグラムおよび５０ミリグラムの有効成分を含んでよい。
【００８３】
この化合物は所望の治療効果を達成するのに十分な量で、それを必要とする患者（例えば、ヒトまたは動物患者）に投与する。
【００８４】
【実施例】
【００８５】
以下、限定されるものではないが、実施例によって本発明のジヒドロテトラベナジン化合物の合成および特性を例示する。
【００８６】
実施例１
ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の製造
１Ａ．  ＲＲ／ＳＳテトラベナジンの還元
【化１４】
2007522193.tif 000015
【００８７】
０℃にて、エタノール（７５ｍｌ）およびテトラヒドロフラン（７５ｍｌ）中、テトラベナジンＲＲ／ＳＳラセミ化合物（１５ｇ，４７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、テトラヒドロフラン中１ＭのＬ−セレクトリド(Selectride)（商標）（１３５ｍｌ，１３５ｍｍｏｌ，２．８７当量）を３０分かけてゆっくり加えた。添加が完了した後、この混合物を０℃で３０分間攪拌した後、室温まで温めた。
【００８８】
この混合物を砕氷（３００ｇ）に注ぎ、水（１００ｍｌ）を加えた。この溶液をジエチルエーテル（２×２００ｍｌ）で抽出し、合わせたエーテル抽出液を水（１００ｍｌ）で洗浄し、無水炭酸カリウム上で部分乾燥した。無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥を完了させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去し（遮光、浴温＜２０℃）、淡黄色固体を得た。
この固体を石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリーとし、白色粉末固体を得た（１２ｇ，８０％）。
【００８９】
１Ｂ．  還元型テトラベナジンの脱水
【化１５】
2007522193.tif 000016
【００９０】
０℃にて、ジクロロメタン（２００ｍｌ）中、実施例１Ａから得られた還元型のテトラベナジン生成物（２０ｇ，６２．７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、五塩化リン（３２．８ｇ，１５７．５ｍｍｏｌ，２．５当量）を３０分かけて少量ずつ加えた。添加が完了した後、反応混合物を０℃でさらに３０分間攪拌し、この溶液を砕氷（０℃）を含む２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液にゆっくり注いだ。最初の酸素ガスの発生が終わったところで、この混合物を、固体炭酸ナトリウムを用いて塩基性とした（約ｐＨ１２）。
【００９１】
このアルカリ溶液を、酢酸エチル（８００ｍｌ）を用いて抽出し、合わせた有機抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させた。濾過後、減圧下で溶媒を除去して褐色の油状物を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル）により精製し、半精製アルケンを黄色固体として得た（１０．８７ｇ，５８％）。
【００９２】
１Ｃ．  実施例１Ｂから得られた粗アルケンの水和
【化１６】
2007522193.tif 000017
【００９３】
室温にて、乾燥ＴＨＦ（５２ｍｌ）中、実施例１Ｂから得られた粗アルケン（１０．８７ｇ，３６．１１ｍｍｏｌ）の溶液を、１Ｍボラン−ＴＨＦ（１５５．６ｍｌ，１５５．６ｍｍｏｌ，４．３０当量）で滴下処理した。この反応物を２時間攪拌し、水（２０ｍｌ）を加え、この溶液を３０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１２まで塩基性化した。
【００９４】
このアルカリ性の攪拌反応混合物に３０％過酸化水素水溶液（３０ｍｌ）を加え、この溶液を１時間還流加熱した後、室温にした。水（１００ｍｌ）を加え、この混合物を酢酸エチル（３×２５０ｍｌ）で抽出した。有機抽出液を合わせ、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去し、黄色油状物を得た（９ｇ）。
【００９５】
この油状物を、分取ＨＰＬＣ（カラム：Lichrospher Si60，５μｍ，２５０×２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：エタノール：ジクロロメタン（８５：１５：５）；ＵＶ２５４ｎｍ，流速：１０ｍｌ／分）を用い、３５０ｍｇ／インジェクションで精製した後、真空下で目的画分を濃縮した。次に、この生成油状物をエーテルに溶解し、真空下で再び濃縮し、上記に示されるジヒドロテトラベナジンラセミ化合物を黄色泡沫として得た（５．７６ｇ，５０％）。
【００９６】
１Ｄ．  １２．モッシャーのエステル誘導体の製造
【化１７】
2007522193.tif 000018
【００９７】
Ｒ−（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸（５ｇ，２１．３５ｍｍｏｌ）、塩化オキサリル（２．０２ｍｌ）およびＤＭＦ（０．１６ｍｌ）を無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に加え、この溶液を室温で４５分間攪拌した。この溶液を減圧下で濃縮し、残渣をもう一度無水ジクロロメタン（５０ｍｌ）に取った。得られた溶液を、氷水浴を用いて冷却し、ジメチルアミノピリジン（３．８３ｇ，３１．３４ｍｍｏｌ）を加えた後、実施例１Ｃの固体生成物（５ｇ，１５．６ｍｍｏｌ）の、無水ジクロロメタン中溶液を予め乾燥したもの（４オングストロームシーブス上）を加えた。室温で４５分間攪拌した後、水（２３４ｍｌ）を加え、この混合物をエーテル（２×２００ｍｌ）で抽出した。エーテル抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、シリカパッドを通し、エーテルを用いて生成物を溶出した。
【００９８】
回収したエーテル溶出液を減圧下で濃縮して油状物を得、これをカラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：エーテル（１０：１））を用いて精製した。回収した目的のカラム画分を蒸発させ、減圧下で溶媒を除去して固体を得、これを、カラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：酢酸エチル（１：１））を用いてさらに精製して３種類の主成分を得、これをモッシャーのエステルピーク１と２に部分的に分解した。
【００９９】
これらの３成分について分取ＨＰＬＣ（カラム：２×Lichrospher Si60，５μｍ，２５０×２１．２０ｍｍ，移動相：ヘキサン：イソプロパノール（９７：３），ＵＶ２５４ｎｍ；流速：１０ｍｌ／分）をロード量３００ｍｇで行った後、目的画分を減圧下で濃縮し、純粋なモッシャーのエステル誘導体を得た。
ピーク１（３．８９ｇ，４６．５％）
ピーク２（２．７８ｇ，３３％）
【０１００】
これら２つのピークに相当する画分に対して加水分解を行い、異性体ＡおよびＢと同定および特性決定される個々のジヒドロテトラベナジン異性体を遊離させた。異性体ＡおよびＢは各々、次の構造：
【化１８】
2007522193.tif 000019
のうちの１つを有すると考えられる。
【０１０１】
ＩＥ．  ピーク１の加水分解による異性体Ａの取得
メタノール（２６０ｍｌ）中、モッシャーのエステルピーク１（３．８９ｇ，７．２７ｍｍｏｌ）の溶液に、２０％水酸化ナトリウム水溶液（８７．５ｍｌ）を加え、この混合物を攪拌し、１５０分間還流加熱した。室温まで冷却した後、水（２００ｍｌ）を加え、この溶液をエーテル（６００ｍｌ）で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で濃縮した。
【０１０２】
残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）を用いて溶解し、この溶液を水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で濃縮し、黄色泡沫を得た。この材料をカラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル：ヘキサン（１：１）〜酢酸エチルの勾配溶出）により精製した。目的の画分を合わせ、減圧下で溶媒を除去した。残渣をエーテルに取り、もう一度、減圧下で溶媒を除去し、異性体Ａを灰白色泡沫として得た（１．１ｇ，４７％）。
【０１０３】
異性体Ａは２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ配置のいずれかを有すると考えられており（絶対的立体配置は決定されていない）、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤにより特性決定した。異性体ＡのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータを表１に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータを表３に示す。
【０１０４】
１Ｆ．  ピーク２の加水分解による異性体Ｂの取得
メタノール（１８５ｍｌ）中、モッシャーのエステルピーク２（２．７８ｇ，５．１９  ｍｍｏｌ）の溶液に、２０％水酸化ナトリウム水溶液（６２．５ｍｌ）を加え、この混合物を攪拌し、１５０分還流加熱した。室温まで冷却した後、水（１４２ｍｌ）を加え、この溶液をエーテル（４４０ｍｌ）で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で濃縮した。
【０１０５】
残渣を酢酸エチル（２００ｍｌ）を用いて溶解し、この溶液を水（２×５０ｍｌ）で洗浄し、有機相を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で濃縮した。この残渣に石油エーテル（３０〜４０℃）を加え、この溶液を、もう一度、真空下で濃縮し、異性体Ｂを白色泡沫として得た（１．３４ｇ，８１％）。
【０１０６】
異性体Ｂは２Ｓ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｒ，３Ｒ，１１ｂＳ配置のいずれかを有すると考えられており（絶対的立体配置は決定されていない）、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤにより特性決定した。異性体ＢのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータを表１に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータを表３に示す。
【０１０７】
実施例２
ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体の製造
２Ａ．  ２，３−デヒドロテトラベナジンの製造
テトラヒドロフランにおいてＲＲおよびＳＳテトラベナジン鏡像異性体のラセミ混合物（１５ｇ，４７ｍｍｏｌ）を含有する溶液を、実施例１Ａの方法により、Ｌ−セレクトリド（商標）で還元し、ジヒドロテトラベナジンの２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＲおよび２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＳ鏡像異性体の混合物を白色粉末固体として得た（１２ｇ，８０％）。次に、この部分精製されたジヒドロテトラベナジンを、実施例１Ｂの方法に従い、ＰＣｌ５を用いて脱水し、２，３−デヒドロテトラベナジンの１１ｂＲおよび１１ｂＳ異性体の半純粋混合物（そのうち、１１ｂＲ鏡像異性体を下記に示す）を黄色固体として得た（１２．９２ｇ，６８％）。
【化１９】
2007522193.tif 000020
【０１０８】
２Ｂ．  実施例２Ａから得られた粗Ｅアルケンの酸化
【化２０】
2007522193.tif 000021
【０１０９】
メタノール（２１５ｍｌ）中、実施例２Ａから得られた粗アルケン（１２，９２ｇ，４２．９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、メタノール（２１５ｍｌ）中、７０％過塩素酸（３．７０ｍｌ，４３ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。この反応物に７７％の３−クロロペルオキシ安息香酸（１５．５０ｇ，６５ｍｍｏｌ）を加え、得られた混合物を遮光して室温で１８時間攪拌した。
【０１１０】
この反応混合物を飽和亜硫酸ナトリウム水溶液（２００ｍｌ）に注ぎ、（２００ｍｌ）を加えた。得られたエマルションにクロロホルム（３００ｍｌ）を加え、この混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（４００ｍｌ）で塩基性とした。
【０１１１】
有機層を回収し、水相をさらなるクロロホルム（２×１５０ｍｌ）で洗浄した。合わせたクロロホルム層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去し、褐色の油状物を得た（１４．３５ｇ，収率＞１００％−生成物中にはおそらく溶媒が残留）。この材料をさらに精製することなく用いた。
【０１１２】
２Ｃ．  ２Ｂから得られたエポキシドの還元的開環
【化２１】
2007522193.tif 000022
【０１１３】
乾燥ＴＨＦ（８０ｍｌ）中、実施例２Ｂから得られた粗エポキシド（１４．３５ｇ，４２．９ｍｍｏｌ，推定収率１００％）の攪拌溶液を、１５分かけて１Ｍボラン／ＴＨＦ（１８４．６ｍｌ，１８４．６ｍｍｏｌ）でゆっくり処理した。反応物を２時間攪拌し、水（６５ｍｌ）を加え、この溶液を３０分間攪拌しながら還流加熱した。
【０１１４】
冷却後、反応混合物に３０％水酸化ナトリウム溶液（９７ｍｌ）を加えた後、３０％過酸化水素溶液（４８．６ｍｌ）を加え、この反応物を攪拌し、さらに１時間する還流加熱した。
【０１１５】
冷却した反応混合物を酢酸エチル（５００ｍｌ）で抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去して油状物を得た。この油状物にヘキサン（２３０ｍｌ）を加え、この溶液を減圧下で再濃縮した。
【０１１６】
この油状残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル）により精製した。目的の画分を合わせ、減圧下で溶媒を除去した。この残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン〜エーテル勾配）を用いてもう一度精製した。目的の画分を合わせ、減圧下で溶媒を蒸発させ、淡黄色固体を得た（５．１８ｇ，３８％）。
【０１１７】
２Ｄ．  ジヒドロテトラベナジンの２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲおよび２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ異性体のモッシャーのエステル誘導体の製造
【化２２】
2007522193.tif 000023
【０１１８】
Ｒ−（＋）−α−メトキシ−α−トリフルオロメチルフェニル酢酸（４．６８ｇ，１９．９８ｍｍｏｌ）、塩化オキサリル（１．９０ｍｌ）およびＤＭＦ（０．１３ｍｌ）を無水ジクロロメタン（４６ｍｌ）に加え、この溶液を室温で４５分間攪拌した。溶液を減圧下で濃縮し、残渣をもう一度、無水ジクロロメタン（４０ｍｌ）に取った。得られた溶液を、氷水浴を用いて冷却し、ジメチルアミノピリジン（３．６５ｇ，２９．８７ｍｍｏｌ）を加えた後、無水ジクロロメタン（２０ｍｌ）中、実施例２Ｃの固体生成物（４．６８ｇ，１４．６ｍｍｏｌ）の溶液を予め乾燥させたもの（４オングストロームシーブス）を加えた。室温で４５分間攪拌した後、水（２３４ｍｌ）を加え、混合物をエーテル（２×２００ｍｌ）で抽出した。このエーテル抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、シリカパッドを通し、エーテルを用いて生成物を溶出した。
【０１１９】
回収したエーテル溶出液を減圧下で濃縮して油状物を得、これを、カラムクロマトグラフィー（シリカ，ヘキサン：エーテル（１：１））を用いて精製した。回収した目的のカラム画分を蒸発させ、減圧下で溶媒を除去し、ピンク色の固体を得た（６．５３ｇ）。
【０１２０】
この固体に対して分取ＨＰＬＣ（カラム：２×Lichrospher Si60，５μｍ，２５０×２１．２０ｍｍ；移動相  ヘキサン：イソプロパノール（９７：３）；ＵＶ２５４ｎｍ；流速：１０ｍｌ／分）をロード量１００ｍｇで行った後、目的の画分を真空下で濃縮して固体を得、これを石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリーとし、濾取し、純粋なモッシャーのエステル誘導体を得た。
ピーク１（２．３７ｇ，３０％）
ピーク２（２．４２ｇ，３０％）
【０１２１】
これら２つのピークに相当する画分に対して加水分解を行い、異性体ＣおよびＤと同定および特性決定される個々のジヒドロテトラベナジン異性体を遊離させた。異性体ＣおよびＤは各々、次の構造：
【化２３】
2007522193.tif 000024
のうちの１つを有すると考えられる。
【０１２２】
２Ｆ．  ピーク１の加水分解による異性体Ｃの取得
メタノール（１５８ｍｌ）中、モッシャーのエステルピーク１（２．３７ｇ，４．４３  ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、２０％水酸化ナトリウム水溶液（５３ｍｌ）を加え、この混合物を１５０分攪拌還流した。冷却後、この反応混合物に水（８８ｍｌ）を加え、得られた溶液をエーテル（５７６ｍｌ）で抽出した。有機抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去した。残渣に酢酸エチル（２００ｍｌ）を加え、この溶液を水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去した。
【０１２３】
この残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）で処理し、得られた懸濁固体を濾取した。濾液を減圧下で濃縮し、第二のバッチの懸濁固体を濾取した。回収した両固体を合わせ、減圧下で乾燥させ、異性体Ｃを得た（１．０ｇ，７０％）。    異性体Ｃは２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置のいずれかを有すると考えられており（絶対的立体配置は決定されていない）、
【０１２４】
１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤにより特性決定した。異性体ＣのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータを表２に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータを表４に示す。
【０１２５】
２Ｇ．  ピーク２の加水分解による異性体Ｄの取得
メタノール（１５８ｍｌ）中、モッシャーのエステルピーク２（２．４２ｇ，４．５２  ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、２０％水酸化ナトリウム水溶液（５３ｍｌ）を加え、この混合物を１５０分攪拌還流した。冷却後、この反応混合物に水（８８ｍｌ）を加え、得られた溶液をエーテル（５７６ｍｌ）で抽出した。有機抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去した。残渣に酢酸エチル（２００ｍｌ）を加え、この溶液を水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過後、減圧下で溶媒を除去した。
【０１２６】
この残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）で処理し、得られた橙色の懸濁固体を濾取した。この固体を酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５）に溶解し、カラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル：ヘキサン（１５：８５）〜酢酸エチルの勾配）により精製した。目的の画分を合わせ、減圧下で溶媒を除去した。残渣を石油エーテル（３０〜４０℃）でスラリーとし、得られた懸濁物を濾取した。回収した固体を減圧下で乾燥させ、異性体Ｄを白色固体として得た（０．９３ｇ，６４％）。
【０１２７】
異性体Ｄは２Ｒ，３Ｓ，１１ｂＲまたは２Ｓ，３Ｒ，１１ｂＳ配置のいずれかを有すると考えられており（絶対的立体配置は決定されていない）、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、ＩＲ、質量分析、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤにより特性決定した。異性体ＤのＩＲ、ＮＭＲおよびＭＳデータを表２に示し、キラルＨＰＬＣおよびＯＲＤデータを表４に示す。
【０１２８】
表１および２では、赤外線スペクトルはＫＢｒディスク法を用いて測定した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Varian Gemini NMR分光計（２００ＭＨｚ）を用い、重水素化クロロホルム中の溶液で測定した。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Varian Gemini NMR分光計（５０ＭＨｚ）を用い、重水素化クロロホルム中の溶液で測定した。質量スペクトルは、Micromass Platform II（ＥＳ＋条件）分光計を用いて得た。表３および４では、旋光分散図は、メタノール溶液中２４℃で、Optical Activity PolAAr 2001装置を用いて得た。ＨＰＬＣ保持時間の測定は、ＵＶ検出を備えたＨＰ１０５０  ＨＰＬＣクロマトグラフを用いて行った。
【０１２９】
【表１】
2007522193.tif 000025
【０１３０】
【表２】
2007522193.tif 000026
【０１３１】
【表３】
2007522193.tif 000027
【０１３２】
【表４】
2007522193.tif 000028
【０１３３】
実施例３
異性体Ｂの製造の別法およびメシル酸塩の製造
３Ａ．  ＲＰ／ＳＳテトラベナジンの還元
【化２４】
2007522193.tif 000029
【０１３４】
冷却した（氷浴）、テトラヒドロフラン（５６ｍｌ）中、テトラベナジンラセミ化合物（１５ｇ，４７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、テトラヒドロフラン中１ＭのＬ−セレクトリド（商標）（５２ｍｌ，５２ｍｍｏｌ，１．１当量）を３０分かけてゆっくり加えた。添加が完了した後、この混合物を室温まで温め、さらに６時間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）によれば、出発材料は極めて低量でしか残留していないことが示された。
【０１３５】
この混合物を、砕氷（１１２ｇ）、水（５６ｍｌ）および氷酢酸（１２．２ｇ）の攪拌混合物に注いだ。得られた黄色溶液をエーテル（２×５０ｍｌ）で洗浄し、固体炭酸ナトリウム（約１３ｇ）をゆっくり加えることで塩基性とした。この混合物に攪拌しながら石油エーテル（３０〜４０℃）（５６ｍｌ）を加え、粗β−ＤＨＴＢＺを白色固体として濾取した。
【０１３６】
この粗固体をジクロロメタン（約１５０ｍｌ）に溶解し、得られた溶液を水（４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、濾過し、減圧下で約４０ｍｌまで濃縮した。白色固体の粘稠な懸濁液が生じた。石油エーテル（３０〜４０℃）（５６ｍｌ）を加え、この懸濁液を実験室温度で１５分間攪拌した。生成物を濾取し、フィルター上で石油エーテル（３０〜４０℃）を用いて（４０〜６０ｍｌ）スノーホワイトとなるまで洗浄した後、室温で風乾し、β−ＤＨＴＢＺ（１０．１ｇ，６７％）を白色固体として得た。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）によれば、一成分のみであることが示された。
【０１３７】
３Ｂ．  ラセミβ−ＤＨＴＢＺのカンファースルホン酸塩の製造および分別結晶
実施例３Ａの生成物および１当量の（Ｓ）−（＋）−カンファー−１０−スルホン酸を、最少量のメタノールに加熱しながら溶解した。得られた溶液を冷却した後、生じる固体沈殿の形成が完了するまでエーテルでゆっくり希釈した。得られた白色結晶性固体を濾取し、エーテルで洗浄した後、乾燥させた。
【０１３８】
このカンファースルホン酸塩（１０ｇ）を、エタノール（１７０ｍｌ）とメタノール（３０ｍｌ）の混合物に溶解した。得られた溶液を攪拌し、冷却した。２時間後、生じた沈殿を白色結晶性固体として濾取した（２．９ｇ）。この結晶性材料のサンプルを過剰量の飽和炭酸ナトリウム水溶液およびジクロロメタンの入った分液漏斗内で振盪した。有機相を分離し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル（３０〜４０℃）を用いてトリチュレートし、その有機溶液をもう一度濃縮した。Ｃｈｉｒｅｘ（Ｓ）−ＶＡＬおよび（Ｒ）−ＮＥＡ  ２５０×４．６ｍｍカラムとヘキサン：エタノール（９８：２）溶離剤を用い、流速１ｍｌ／分で、この塩のキラルＨＰＬＣ分析を行ったところ、単離されたβ−ＤＨＴＢＺは１つの鏡像異性体が富化されていたことが示された（ｅ．ｅ．約８０％）。
【０１３９】
富化されたこのカンファースルホン酸塩（１４ｇ）を無水エタノール（１４０ｍｌ）に溶解し、プロパン−２−オール（４２０ｍｌ）を加えた。得られた溶液を攪拌したところ、１分以内に沈殿が生じ始めた。この混合物を室温まで冷却し、１時間攪拌した。生じた沈殿を濾取し、エーテルで洗浄し、乾燥させ、白色結晶性固体を得た（１２ｇ）。
【０１４０】
この結晶性材料を過剰量の飽和炭酸ナトリウム水溶液およびジクロロメタンの入った分液漏斗内で振盪した。有機相を分離し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、石油エーテル（３０〜４０℃）を用いてトリチュレートし、その有機溶液をもう一度濃縮して得た（真空乾燥の後）。（＋）−β−ＤＨＴＢＺ（６．６ｇ，ＯＲＤ＋１０７．８°）。単離された鏡像異性体はｅ．ｅ．＞９７％であった。
【０１４１】
３Ｃ．  異性体Ｂの製造
ジクロロメタン（９０ｍｌ）中、実施例３Ｂの生成物（６．６ｇ，２０．６ｍｍｏｌ）の冷却（氷水浴）攪拌溶液に、ジクロロメタン（５５ｍｌ）中、五塩化リン（４．５ｇ，２１．６ｍｍｏｌ，１．０５当量）の溶液を、１０分間かけて一定に加えた。添加が完了したところで、得られた黄色溶液をさらに１０分間攪拌した後、水（９０ｍｌ）中炭酸ナトリウム（１５ｇ）と砕氷（９０ｇ）の攪拌混合物に手早く注いだ。この混合物をさらに１０分間攪拌し、分液漏斗に移した。
【０１４２】
相が分かれたところで、褐色のジクロロメタン層を取り出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、粗アルケン中間体を褐色油状物として得た（約６．７ｇ）。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）によれば、この粗生成物中には（＋）−β−ＤＨＴＢＺの残留はないことが示された。
【０１４３】
この粗アルケンを無水テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）に取り（乾燥窒素雰囲気）、ＴＨＦ中ボランの溶液（１Ｍ溶液，２．５当量，５２ｍｌ）を攪拌しながら１５分かけて加えた。次に、この反応混合物を室温で２時間攪拌した。ＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）によれば、この反応混合物中にアルケン中間体の残留はないことが示された。
【０１４４】
この攪拌反応混合物水に、（１０ｍｌ）中、水酸化ナトリウム（３．７ｇ）の溶液を加えた後、過酸化水素水溶液（５０％，約７ｍｌ）を加え、生じた２相混合物を還流下で１時間攪拌した。このときの有機相のＴＬＣ分析（シリカ，酢酸エチル）によれば、異性体Ｂに関して予測されるＲｆ値を有する生成物の出現が示された。特徴的な非極性成分も見られなかった。
【０１４５】
この反応混合物を室温まで冷却し、分液漏斗に注いだ。上部の有機層を取り出し、減圧下で濃縮し、大部分のＴＨＦを除去した。残渣をエーテル（安定化したもの（ＢＨＴ），７５ｍｌ）に取り、水（４０ｍｌ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮し、淡黄色の油状物を得た（８．１ｇ）。
【０１４６】
この黄色油状物を、カラムクロマトグラフィー（シリカ，酢酸エチル：ヘキサン（８０：２０），１００％酢酸エチルまで増す）を用いて精製し、所望のカラム画分を回収し、合わせ、減圧下で濃縮して薄青い油状物を得、これをエーテル（安定化したもの，１８ｍｌ）で処理し、減圧下で濃縮し、異性体Ｂを淡黄色固体泡沫として得た（２．２ｇ）。
【０１４７】
実施例３Ｂで示した条件を用いたキラルＨＰＬＣによれば、異性体Ｂが９７％を超える鏡像異性体過剰（ｅ．ｅ．）で産生されたことが確認された。
旋光度はBellingham Stanley ADP220偏光計を用いて測定し、［αＤ］＋１２３．５°であった。
【０１４８】
３Ｄ．  異性体Ｂのメシル酸塩の製造
実施例３Ｃから得られた１当量の異性体Ｂと１当量のメタンスルホン酸の混合物を最少量のエタノールに溶解した後、ジエチルエーテルを加えることにより、メタンスルホン酸塩を製造した。結果として生じた白色沈殿を濾取し、真空乾燥し、メシル酸塩を収率約８５％、純度（ＨＰＬＣによる）約９６％で得た。
【０１４９】
実施例４
［３Ｈ］ジヒドロテトラベナジン結合アッセイを用いたＶＭＡＴ−２結合活性のスクリーニング
ジヒドロテトラベナジンは極めて強力かつ選択性のあるＶＭＡＴ−２の阻害剤であり、この小胞輸送体と高い親和性（ｎＭ範囲）で結合する。［３Ｈ］ジヒドロ−テトラベナジンは、長年、ヒト、ウシおよび齧歯類の脳においてＶＭＡＴ−２を標識するための放射性リガンドとして首尾良く用いられてきた（例えば、Scherman et al. J. Neurochem. 50, 1131-1136 (1988); Near et al. Mol. Pharmacol. 30, 252-257 (1986); Kilbourn et al. Eur. J. Pharmacol. 278, 249-252 (1995);およびZucker et al. Life Sci. 69, 2311-2317 (2001)参照）。
【０１５０】
４種類のジヒドロテトラベナジン異性体Ａ，Ｂ，ＣおよびＤを、上記のアッセイを用い、ＶＭＡＴ−２輸送体を阻害する能力に関して試験した。
【０１５１】
方法および材料
成体ラット（Ｗｉｓｔａｒ系統）前脳膜を、本質的にChazot et al. (1993) Biochem. Pharmacol. 45, 605-610に記載のように調製した。成体ラット線条体小胞膜を、本質的にRoland et al. (2000), JPET 293, 329-335に記載のように調製した。１０μｇの膜を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０（アッセイバッファー）中、２５℃でえ６０分間、［３Ｈ］ジヒドロテトラベナジン（１８〜２０ｎＭ）とともにインキュベートし、結合した放射性リガンドを、ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルター上、真空下で迅速濾過することで回収した。並行して、２μＭの非標識テトラベナジンの存在下のサンプルで非特異的結合を測定した。放射能は、β−カウンターにて、シンチレーション液中で計数した。４種類の試験化合物（異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）の前濃度範囲（ｌｏｇおよびｈａｌｆ−ｌｏｇ単位）を三回アッセイした（範囲：１０−１１〜１０−４Ｍ）。試験化合物およびテトラベナジンを原液濃度１０ｍＭとしてＤＭＳＯに溶解した後、アッセイバッファーで希釈液を作製した。各化合物について独立した試験を３回行った。データを解析し、GraphPad Prism3.2パッケージを用いて曲線の当てはめを行った。
【０１５２】
結果
まず、成体ラット前脳Ｐ２膜調製物(Chazot et al., 1993)を調製し、原著のプロトコールに記載のようにアッセイした。これによれば、極めて低いレベルの特異的結合活性が示された。
【０１５３】
次に、成体ラット線条体小胞調製物を調製し、これにより、有意なレベルの、安定な特異的［３Ｈ］ジヒドロテトラベナジン結合部位が得られた（５〜６ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質）。これは公開されているデータ(Roland et al., 2000)に十分匹敵するものであった。この調製物をその後の総てのアッセイに用いた。
【０１５４】
【表５】
2007522193.tif 000030
【０１５５】
データは３回の独立した試験の平均値±ＳＤである。ＫＩ値は公開されているラット線条体ＫＤ値１．２ｎＭ(Roland et al., 2000)に基づくものである。
総合ＫＩ値に関する総合薬理特定は、異性体Ｃ＞異性体Ｂ＞異性体Ｄ＞＞異性体Ａである。
注目すべきは、異性体Ｂおよび異性体Ａの双方で浅い競合曲線となり、２部位結合モデルに最も良く当てはまった。
【０１５６】
異性体Ａは高親和性部位（ＫＩ＝５９ｎＭ）と低親和性部位（親和性ＫＩ＜５．９μＭ）を示し、各々、全部位の約５０％を占めていた。このことは、異性体Ａが種々の線条体ＶＭＡＴ−２結合部位間で区別可能であることを示す。
【０１５７】
実施例５
ＶＭＡＴ機能アッセイ
Ａ．  ＶＭＡＴ２機能アッセイ
ラット線条体シナプス小胞は、本質的に実施例３に記載のように調製した。よって、ラット線条体Ｐ２膜調製物(Chazot et al., 1993)を氷冷蒸留水に再懸濁させ、ホモジナイズした。２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１００ｍＭ酒石酸カリウム（ｐＨ７．５，４℃）を添加することで浸透圧を元に戻した。次に、この調製物を２０，０００ｘｇ（４℃）で２０分間遠心分離した。得られたＳ３画分を取り出し、硫酸マグネシウムを加え（終濃度１ｍＭとする，ｐＨ７．５，４℃）、この混合物を１００，０００ｘｇで４５分間遠心分離した。最終的なＰ４画分に、アッセイ用のシナプス小胞が含まれる。
【０１５８】
１００μｌアリコート（約２．５μｇタンパク質）のシナプス小胞を、３０分間、試験化合物ＣおよびＢ（ＤＭＳＯ中１０−２Ｍ原液として新しく調製）の濃度を増しつつ（濃度範囲１０−９Ｍ〜１０−４Ｍ）プレインキュベートした後、３０℃にて、アッセイバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ酒石酸カリウム，１．７ｍＭアスコルビン酸，０．０５ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＡＴＰ−Ｍｇ２＋，ｐＨ７．５）中、［３Ｈ］ドーパミン（終濃度３０ｎＭ）の存在下で３分間プレインキュベートした。次に、２ｍＭ  ＡＴＰ−Ｍｇ２＋の代わりに２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する氷冷アッセイバッファーｐＨ７．５を添加し、０．５％ポリエチレンイミンに浸したワットマン濾紙で迅速濾過を行うことで反応を停止させた。これらの濾紙を、ブランデル・ハーベスターを用いて冷バッファーで３回洗浄した。濾紙に捕捉された放射能を、液体シンチレーションカウンターを用いて計数し、４℃での小胞［３Ｈ］ドーパミン取り込みにより測定することによって非特異的結合を求めた。この方法は、Ugarte YV et al. (2003) Eur. J. Pharmacol. 472, 165-171に記載のものに基づくものである。選択的ＶＭＡＴ−２取り込みは、１０μＭテトラベナジンを用いて決定した。
【０１５９】
化合物Ｃ（見掛けのＩＣ５０＝１８±２ｎＭ）および化合物Ｂ（見掛けのＩＣ５０＝３０±３ｎＭ）は双方とも、［３Ｈ］ジヒドロテトラベナジン結合アッセイを用いて判定されたそれらの個々の結合親和性と同程度の機能的親和性（特性Ｃ＞Ｂ）を有するＶＭＡＴ−２輸送体を介してラット線条体小胞への［３Ｈ］ドーパミン取り込みを阻害した。
【０１６０】
Ｂ．  ＶＭＡＴ１の機能アッセイ
ＶＭＡＴ２とは独立にＶＭＡＴ１単独を有する天然組織は非常に限られている。しかしながら、テトラベナジンはＶＭＡＴ１に比べてＶＭＡＴ２に対して少なくとも２００倍高い親和性を示し、この違いを用いて、機能アッセイにおけるＶＭＡＴ２の影響を遮断することができる(Erickson et al. (1996) PNAS (USA) 93, 5166-5171)。本質的にMoshharov et al. (2003) J Neurosci. 23, 5835-5845に記載のように、若い成体ＳＤラットから副腎クロム親和細胞を単離した。このように、副腎を氷領ＰＢＳ中で切開し、副腎の皮膜と皮質を除去し、残りの髄質を細かく刻んだ。ＰＢＳで何回か洗浄した後、組織を、Ｃａ２＋フリーコラゲナーゼＩＡ溶液（２５０Ｕ／ｍｌ）とともに、緩やかに攪拌しながら３０℃で３０分間インキュベートした。消化された組織を３回すすぎ、解離した細胞を３０００ｒｐｍで遠心分離してペレットとし、これをＰＢＳに再懸濁した。小胞画分を、脳調製物に関して記載されているものと同様にして単離した。
【０１６１】
１００μｌ（約２．５μｇタンパク質）のシナプス小胞を、３０分間、試験化合物（結合アッセイに関して前記したように調製）の濃度を増しつつ（濃度範囲１０−９Ｍ〜１０−４Ｍ）プレインキュベートした。アッセイは、３０℃にて、アッセイバッファー（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１００ｍＭ酒石酸カリウム，１．７ｍＭアスコルビン酸，０．０５ｍＭ  ＥＧＴＡ，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２ｍＭ  ＡＴＰ−Ｍｇ２＋，ｐＨ７．５）中、［３Ｈ］ドーパミン（終濃度３０ｎＭ）の存在下で３分間行った。［３Ｈ］ドーパミンの取り込みは、１０μＭテトラベナジン（この濃度でＶＭＡＴ２を選択的に遮断する）の存在下で測定した。非特異的取り込みは、４℃にて小胞［３Ｈ］ドーパミン取り込みを測定することによって測定した。次に、２ｍＭ  ＡＴＰ−Ｍｇ２＋の代わりに２ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含有する氷冷アッセイバッファーｐＨ７．５を添加し、０．５％ポリエチレンイミンに浸したワットマン濾紙で迅速濾過を行うことで反応を停止させた。これらの濾紙を、ブランデル・ハーベスターを用いて冷バッファーで３回洗浄し、濾紙に捕捉された放射能を、液体シンチレーションカウンターを用いて計数した。
【０１６２】
１０μＭテトラベナジンの存在下で、化合物Ｂおよび化合物Ｃは双方とも、［３Ｈ］ドーパミンの取り込みをあまり阻害せず、両化合物のＩＣ５０値は１０−５Ｍを上回った。このことは、両化合物がＶＭＡＴ−１に対して低い親和性を有することを示す。さらに、このデータは、この両化合物がＶＭＡＴ−１よりもＶＭＡＴ−２に対して少なくとも２オーダーの選択性を有することを示す。
【０１６３】
実施例６
受容体および輸送体タンパク質結合研究
４種類のジヒドロテトラベナジン異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの、下記の受容体および輸送体タンパク質と結合する能力を調べるため、特異的結合アッセイを行った。結果を表６に示す。
【０１６４】
（ａ）アドレナリン作動性α２Ａ受容体：
参照文献：  S. Uhlcn et al. J. Pharmacol. Exp. Tlier., 271:1558-1565 (1994)
起源：  ヒト組換え昆虫Ｓｆ９細胞
リガンド：  １ｎＭ［３Ｈ］ＭＫ−９１２
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ６０分、２５℃
インキュベーションバッファー：  ７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＥＤＴＡ
非特異的リガンド：  １０μＭ  ＷＢ−４１０１
Ｋｄ：  ０．６ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ４．６ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ９５％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１６５】
（ｂ）アドレナリン作動性α２Ｂ受容体：
参照文献：  S. Uhlen et al., Eur. J. Pharmacol., 33(1): 93-1-1 (1998)
起源：  ヒト組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞
リガンド：  ２．５ｎＭ［３Ｈ］Rauwolscine
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ６０分、２５℃
インキュベーションバッファー：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ  ７．４，０．２％ＢＳＡ、２５℃
非特異的リガンド：  １０μＭプラゾシン
Ｋｄ：  ２．１ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ２．１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ９０％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１６６】
（ｃ）ドーパミンＤ１受容体：
参照文献：  Dearry et al., Nature, 347: 72-76, (1990)
起源：  ヒト組換えＣＨＯ細胞
リガンド：  １．４ｎＭ［３Ｈ］ＳＣＨ−２３３９０
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ２時間、３７Ｃ℃
インキュベーションバッファー：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｎＭ  ＮａＣｌ，１．４ｎＭアスコルビン酸，０．００１％ＢＳＡ
非特異的リガンド：  １０μＭ（＋）ブタクラモール
Ｋｄ：  １．４ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ０．６３ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ９０％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１６７】
（ｄ）ドーパミンＤ２Ｌ受容体：
参照文献：  Bunzo et al., Nature, 336:783-787(1988)
起源：  ヒト組換えＣＨＯ細胞
リガンド：  ０．１６ｎＭ［３Ｈ］スピペロン
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ２時間、２５℃
インキュベーションバッファー：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｎＭ  ＮａＣｌ，１．４ｎＭアスコルビン酸，０．００１％ＢＳＡ
非特異的リガンド：  １０μＭハロペリドール
Ｋｄ：  ０．０８ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ０．４８ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ８５％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１６８】
（ｅ）ドーパミンＤ３受容体：
参照文献：  Sokoloff et al., Nature, 347:146-151, (1990)
起源：  ヒト組換えＣＨＯ細胞
リガンド：  ０．７ｎＭ［３Ｈ］スピペロン
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ２時間、３７℃
インキュベーションバッファー：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｎＭ  ＮａＣｌ，１．４ｎＭアスコルビン酸，０．００１％ＢＳＡ
非特異的リガンド：  ２５μＭ  Ｓ（−）−スルピリド
Ｋｄ：  ０．３６ｎＭ
Ｂｍａｘ：  １．１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ８５％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１６９】
（ｆ）イミダゾリンＩ２（中枢）受容体：
参照文献：  Brown et al., Brit. J. Pharmacol., 99:803-809, (1990)
起源：  Ｗｉｓｔａｒラット大脳皮質
リガンド：  ２ｎＭ［３Ｈ］イダゾキサン
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ３０分、２５℃
インキュベーションバッファー：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４，２５℃
非特異的リガンド：  １μＭイダゾキサン
Ｋｄ：４ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ０．１４ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ８５％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７０】
（ｇ）シグマσ１受容体：
参照文献：  Ganapathy et al., Pharmacol. Exp. Ther., 289:251-260, (1999)
起源：  ヒトｊｕｒｋａｔ細胞
リガンド：  ８ｎＭ［３Ｈ］ハロペリドール
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ４時間、２５℃
インキュベーションバッファー：  ５ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４／ＫＨ２ＰＯ４バッファー  ｐＨ７．５
非特異的リガンド：  １０μＭハロペリドール
Ｋｄ：  ５．８ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ０．７１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ８０％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７１】
（ｈ）シグマσ２受容体：
参照文献：  Hashimoto et al., Eur. J. Pharmacol., 236:159-163, (1993)
起源：  Ｗｉｓｔａｒラット脳
リガンド：  ３ｎＭ［３Ｈ］イフェンプロジル
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ６０分、３７℃
インキュベーションバッファー：  ５０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４
非特異的リガンド：  １０μＭイフェンプロジル
Ｋｄ：  ４．８ｎＭ
Ｂｍａｘ：  １．３ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ８５％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７２】
（ｉ）セロトニン輸送体（ＳＥＲＴ）：
参照文献：  Gu et al., J. Biol. Chem., 269(10):7124-7130, (1994)
起源：  ヒト組換えＨＥＫ−２９３細胞
リガンド：  ０．１５ｎＭ［１２５Ｉ］ＲＴＩ−５５
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ３時間、４℃
インキュベーションバッファー：  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，１μＭロイペプチン，１０μＭ  ＰＭＳＦ，ｐＨ７．４
非特異的リガンド：  １０μＭイミプラミン
Ｋｄ：  ０．１７ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ０．４１ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ９５％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７３】
（ｊ）ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）：
参照文献：  Giros et al., Trends Pharmacol. Sci., 14, 43-49 (1993) Gu et al., J. Biol. Chem., 269(10):7124-7130 (1994)
起源：  ヒト組換えＣＨＯ細胞
リガンド：  ０．１５ｎＭ［１２５Ｉ］ＲＴＩ−５５
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  ３時間、４℃
インキュベーションバッファー：  １００ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ，１μＭロイペプチン，１０μＭ  ＰＭＳＦ，ｐＨ７．４
非特異的リガンド：  １０μＭノミフェンシン
Ｋｄ：  ０．５８ｎＭ
Ｂｍａｘ：  ０．０４７ｐｍｏｌ／ｍｇタンパク質
特異的結合：  ９０％
定量方法：  放射性リガンド結合
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７４】
【表６】
2007522193.tif 000031
【０１７５】
実施例７
酵素アッセイ
異性体ＢおよびＣの、ＣＮＳにおいてモノアミン類のプロセシングに関与する酵素、すなわち、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）、モノアミンオキシダーゼＡおよびモノアミンオキシダーゼＢを阻害する能力を調べた。用いたアッセイ方法を以下に記載し、結果を表７に示す。
【０１７６】
（ａ）カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）阻害
起源：  ブタ肝臓
基質：  ３ｍＭカテコール＋Ｓ−アデノシル−Ｌ−［３Ｈ］メチオニン
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
プレインキュベーション時間／温度：  なし
インキュベーション時間：  ６０分、３７℃
インキュベーションバッファー：  １２単位／ｍｌのアデノシンデアミナーゼを含有する１００ｍＭリン酸カリウム，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ７．４
定量方法：  ［３Ｈ］グアイアコール(guiacol)の定量有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７７】
（ｂ）モノアミンオキシダーゼＭＡＯ−Ａ阻害
起源：  ヒト組換え体
基質：  ５０μＭキヌラミン
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
プレインキュベーション時間／温度：  １５分、３７℃
インキュベーション時間：  ６０分、３７℃
インキュベーションバッファー：  １００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４
定量方法：  ４−ヒドロキシキノリン分光蛍光分析的定量
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７８】
（ｃ）モノアミンオキシダーゼＭＡＯ−Ｂ阻害
起源：  ヒト組換え体
基質：  ５０μＭキヌラミン
ビヒクル：  １％ＤＭＳＯ
プレインキュベーション時間／温度：  １５分、３７℃
インキュベーション時間：  ６０分、３７℃
インキュベーションバッファー：  １００ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．４
定量方法：  ４−ヒドロキシキノリンの分光蛍光分析的定量
有意性判定基準：  最大刺激または阻害の５０％以上
【０１７９】
【表７】
2007522193.tif 000032
【０１８０】
実施例８
細胞アッセイ
異性体ＢおよびＣの、ヒト胎児腎細胞によるセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）の取り込みを阻害する能力を、次のアッセイ条件を用いて測定した。
対象：  ヒトＨＥＫ−２９３細胞
ビヒクル：  ０．４％ＤＭＳＯ
インキュベーション時間／温度：  １０分、２５℃
インキュベーションバッファー：  ５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，７．５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１２０ｍＭ  ＮａＣｌ，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１．２ｍＭ  ＣａＣｌ２，１．２ｍＭ  ＭｇＳＯ４，５ｍＭグルコース，１ｍＭアスコルビン酸，ｐＨ７．１
定量方法：  ［３Ｈ］セロトニン取り込みの定量
有意性判定基準：  フルキセチン応答に対して［３Ｈ］セロトニン取り込みの５０％以上の阻害
【０１８１】
結果
化合物Ｂはアンタゴニストであることが示され、１０ａμＭ濃度でセロトニン取り込み  の５６％阻害をもたらした。化合物ＢのＩＣ５０は７．５３μＭであった。
化合物Ｃはアンタゴニストであることが示され、１０ａμＭ濃度でセロトニン取り込み  の８６％阻害をもたらした。化合物ＢのＩＣ５０は１．２９μＭであった。
【０１８２】
実施例９
５−ＨＴ１Ｄ／１Ｂ結合アッセイ
化合物Ｂおよび化合物Ｃの、５−ＨＴ１Ｄ／１Ｂ受容体と結合する能力を、Millan, MJ et al. (2002) Pharmacol. Biochem. Behav. 71, 589-598に記載のものに基づくアッセイを用いて調べた。［Ｎ−メチル３Ｈ］ＧＲ−１２５７４３を、５−ＨＴ１Ｄ受容体および５−ＨＴ１Ｂ受容体双方の放射性リガンドとして用いた。成体ＳＤラット前脳Ｐ２膜(Chazot et al., 1993)をアッセイに用いた。用いたアッセイバッファーは、４ｍＭ塩化カルシウム、０．１％アスコルビン酸および１０μＭパルギリンを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．７（室温）であった。５−ＨＴ（１０μＭ）を用いて非特異的結合を定義した。１ｎＭ［３Ｈ］ＧＲ−１２５７４３とのインキュベーションを室温で１時間行い、ブランデル・ハーベスターを用い、０．１％ポリエチレンイミンに予め浸したＧＦ／Ｂ濾紙で迅速濾過することで反応を停止させた後、氷冷バッファー（０．１％ＢＳＡを添加）で３回洗浄した。用量範囲１０−１０〜−１０−４Ｍを用いた。得られた競合曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４パッケージを用いて解析した。
【０１８３】
化合物ＢおよびＣは双方とも、ラット前脳膜に対する［３Ｈ］［Ｎ−メチル］ＧＲ−１２５７４３の結合の置換をあまり示さなかったが（ＩＣ５０値＞１０−４Ｍ）、このことはＢおよびＣの双方が５−ＨＴ１Ｄ／Ｂ受容体に対して低い親和性しか持たないことを示唆する。
【０１８４】
実施例１０
Ｃａｃｏ−２吸収アッセイを用いた、ジヒドロテトラベナジン異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤの腸管浸透性の測定
Ｃａｃｏ−２吸収アッセイは、薬物のin vivo腸管吸収のin vitro評価用に十分確立された系である−Meunier et al., Cell Biology and Toxicology, 11:187-194、Wils et al., Cell Biology and Toxucology, 10:393-397、およびGres et al., Pharm Sci, 15(5):726-732参照。
【０１８５】
このアッセイは、Ｃａｃｏ−２細胞の、微孔質フィルター上で約２１日培養した際に腸細胞への分化する能力に頼ったものである。この培養期間中、Ｃａｃｏ−２細胞は自発的な形態的および生化学的変化を受け、十分定義された管腔側表面の刷子縁ならびに細胞のタイトジャンクションを有する、極性のある単層を生じる。従って、これらの細胞は薬物の透過性の分析用のin vitroモデルとして使用できる。
【０１８６】
Ｃａｃｏ−２単層を通過する吸収は、管腔側から基底側または基底側から管腔側の二方向で、それぞれ管腔側または基底側のチャンバーに化合物を加えることで測定することができる。種々の時点で、単層を通過する見掛けの透過係数によって測定されるような吸収速度分析のために受容チャンバーからサンプルを回収する。
【０１８７】
このＰａｐｐ値は、細胞内経路（細胞膜を通る）と細胞間経路（細胞間のタイトジェンクションを通る）の双方による試験品の透過性を組み合わせたものを反映する。これらの経路の相対的関与はｐＫａ、分配係数（ｌｏｇ Ｄ）、分子半径、および所定のｐＨで試験品の変化によって異なる。次に、Ｐａｐｐ値を用いて、化合物をＣａｃｏ−２単層透過性に関してランク付けすることができる。
【０１８８】
４種類のヒドロテトラベナジン異性体Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ５０μＭにおける見掛けの透過係数（Ｐａｐｐ）を、このＣａｃｏ−２吸収モデルを用いて測定し、対照化合物について透過性が低い、中程度、高いのランク付けを行った。放射性標識した対照標品マンニトール（低）、サリチル酸（中程度）およびテストステロン（高）を用いて透過性のランク付けを確定した。１時間後の供与コンパートメントおよび受容コンパートメントにおけるその濃度を測定することで、各ジヒドロテトラベナジン試験品のＰａｐｐ値を評価した。吸収として、ｐＨ７．４において、細胞単層の管腔側から基底側の方向を測定した。Ｐａｐｐ値を評価するのに用いたＣａｃｏ−２細胞は、１２穴プレート内のトランスウェルインサート上で２６日間増殖させたものであった。系上皮電気抵抗値（Ｏｈｍ−ｃｍ２）およびルシファー・イエローの方法により、吸収アッセイの前後で単層の完全性を確認した。
【０１８９】
材料および方法
マンニトール、サリチル酸およびテストステロンの原液は、メタノール中５０ｍＭとして作製した。アッセイ当日、対照標品をハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ），ｐＨ７．４で希釈し、終濃度５０μＭとした。次に、放射性標識した１４Ｃ−マンニトール、３Ｈ−テストステロンおよび１４Ｃ−サリチル酸を、それらの対応する非標識培地に加え、最終的な比活性を０．３５〜０．６５μＣｉ／ｍＬとした。ジヒドロテトラベナジン異性体サンプルを、ＤＭＳＯ中５０ｍＭの濃度で作製した。各原液をＨＢＳＳバッファー（ｐＨ７．４）でさらに希釈し、最終実施濃度５０μＭとした。
【０１９０】
Ｃａｃｏ−２細胞懸濁液は次のように調製した。バイアル１本の、継代番号２９のＣａｃｏ−２一次細胞ＩＤ  Ｎｏ．Ｃａｃｏ−２９−０８０２９９(American Type Culture Collection (VA, USA)を解凍し、Ｃａｃｏ−２培養培地の入った１５０ｃｍ２フラスコで培養した。密集したら、培養培地を除去し、細胞を５ｍｌのＰＢＳで洗浄した。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（２．０ｍｌ／フラスコ）を加え、３７℃で約１０分間インキュベートし、細胞を解離させた。細胞の解離は顕微鏡下でモニタリングし、１０ｍＬのＣａｃｏ−２培養培地を加えることで停止させた。細胞の生存率および濃度をトリパンプルー排除法によって評価した。細胞の密度と生存率が求められたところで、Ｃａｃｏ−２細胞を培養培地で希釈して最終的な実施濃度２．０×１０５細胞／ｍｌとした。Ｃａｃｏ−２培養培地は、ダルベッコの改変イーグル培地、１０％ウシ胎児血清、１００μＭ非必須必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含んだ。
【０１９１】
Ｃｏｓｔａｒポリカーボネートメンブラン（孔径０．４μｍ）を３７℃、５％ＣＯ２のウォータージャケット式インキュベーター内で１時間、Ｃａｃｏ−２培養培地で予め平衡化した。管腔側チャンバーの内容物を除き、Ｃａｃｏ−２細胞懸濁液（２００  ０００細胞／ｍｌ）５００μｌに置き換えた。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２のウォータージャケット式インキュベーター内でさらに２６日間培養維持した。
【０１９２】
アッセイ前、総ての単層をＨＢＳＳで２回洗浄し、それらの経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）をMillicell-ERSメーターで測定した。細胞の不在下で得られたＴＥＥＲ値をバックグラウンドシグナルとして差し引いた。１５０Ｏｈｍ−ｃｍ２を超えるＴＥＥＲ値を有する単層だけを吸収アッセイ実験に用いた。
吸収実験は総て、ｐＨ７．４で３回行った。各対照標品およびジヒドロテトラベナジン試験品の吸収速度を、管腔側から基底側の方向で評価した。各実施溶液のアリコート（１００μｌ）（対照標品および試験品５０μＭ）をアッセイのはじめに最初の濃度（Ｃ０）の測定のためにとっておいた。
【０１９３】
吸収実験は、供与チャンバーの内容物を試験品または対照化合物を含有するハンクス平衡塩溶液５００μｌに置き換えることで始めた。吸収アッセイのため、細胞をＣＯ２インキュベーターに戻した。１時間後、受容チャンバーおよび供与チャンバーからサンプルを採取し、これを用いて回収率％を求めた。放射性標識した対照標品マンニトール、サリチル酸およびテストステロンを品質対照として、また、ジヒドロテトラベナジン試験品の比較ランキングのために用いた。
【０１９４】
吸収実験の終了時に、各細胞単層の完全性を、管腔側から基底側へのルシファー・イエローの漏出ｗモニタリングすることにより評価した。管腔側チャンバーおよび基底側チャンバーから総ての溶液を除去した。基底側チャンバーに再び１．５ｍｌの新鮮なＨＢＳＳを満たし、一方、管腔側チャンバーには０．５ｍｌの１２０μｇ／ｍｌルシファー・イエロー溶液を満たした。細胞を１時間インキュベーターに戻し、その後、サンプル１００μｌを採取し、SpectraMax 340PC-プレートリーダーにて４２８ｎｍで分光分析的に定量した。
【０１９５】
各２０μｌ量の放射性標識サンプルをシンチレーションカクテル１０ｍｌ（ScintiSafe３０％）に加え、液体シンチレーションアナライザー（1900CA Tri-Carb）で最大５分間計数した。
【０１９６】
Ｃａｃｏ−２細胞のインキュベーションを、液体クロマトグラフィー直列／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法を用い、ジヒドロテトラベナジンの存在に関して分析した。
【０１９７】
見掛けの透過係数は、方程式Ｐａｐｐ＝ｄＱ／ｄｔ×１／Ａ×１／Ｃ０（ｃｍ／秒）｛式中、ｄＱ／ｄｔは化合物の拡散速度（μｇ／秒または積分面積／秒）であり、Ａは全細胞膜表面積（ｃｍ２）であり、Ｃ０は最初の濃度（μｇ／ｍＬまたは積分面積／秒）である｝を用いて算出した。
【０１９８】
種々のジヒドロテトラベナジン試験品の管腔側から基底側に向かってのＰａｐｐ値を、対照標品について測定されたＰａｐｐ値と比較した。結果を表８に示す。ジヒドロテトラベナジンの化合物Ｃ、ＤおよびＡのＰａｐｐ値はそれぞれ、２１．１４×１０−６、２４．８７×１０−６および２５．５２×１０−６ｃｍ／秒であり、これはテストステロン対照標品に匹敵するものである。
化合物ＢのＰａｐｐ値は１１．９８×１０−６ｃｍ／秒であり、これはサリチル酸対照標品に匹敵するものである。
【０１９９】
【表８】
2007522193.tif 000033
【０２００】
化合物Ｃ、ＤおよびＡのＰａｐｐ値はテストステロン値に近く、このことは、これらの化合物がｃａｃｏ−２モデルにおいて高い透過性を有することを示し、一方、化合物ＢのＰａｐｐ値はサリチル酸値とテストステロン値の間であり、このことは、Ｃａｃｏ−２モデルにおいて中程度の透過性を有することを示す。これらの結果は、これら４種類のジヒドロテトラベナジン異性体がin vivoにおいて腸管上皮からよく吸収されるはずであることを示唆する。
【０２０１】
実施例１１
テトラベナジンおよびジヒドロテトラベナジン異性体ＢおよびＣの鎮静特性の比較
本発明のジヒドロテトラベナジン異性体が鎮静特性を有するかどうかを調べるため試験を行った。ラットの自発的運動活性に対するこれらの異性体の作用を、以下に示す方法を用い、テトラベナジンおよびハロペリドールによってもたらされた作用と比較した。
【０２０２】
方法
試験の開始時に体重２００〜２５０ｇの雄Sprague-Dawleｙラット(Charles River Laboratories, Saint-Germain/L’Arbresle, France)を試験に用いた。これらのラットは、次の環境条件：温度２０±２℃、湿度最小４５％、換気１時間当たり＞１２回、明／暗周期１２時間／１２時間［午前７：００に点灯］に設定した室内で、Ｍａｋｒｏｌｏｎ  III型ケージに１ケージ当たり２または３匹で飼育した。ラットを試験開始前少なくとも５日間それらの条件に順応させた。ラットには食餌(Dietex, Vigny, France, ref. 811002)および水（ボトル中の水道水）を自由に摂らせた。
【０２０３】
コーン油中、各試験化合物の溶液を試験当日に新たに調製した。ハロペリドールは、脱イオン水０．５％のヒドロキシエチルセルロースで調製した。ビヒクルまたは試験化合物のいずれかを１回用量として投与した（０．３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇ、２ｍＬ／ｋｇ腹腔内）。対照化合物ハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した（２ｍＬ／ｋｇ）。
【０２０４】
動物を、光度の弱い（最大５０ルクス）の室内の、ビデオカメラ下、プレクスガラスケージ内に入れた。投与後４５分および３時間に、ビデオ画像解析装置(Videotrack, View Point, France)を用い、２０分間、運動活性を調べた。投与後１時間の対照群（ハロペリドール）の運動活性を記録した。歩行移動の回数と時間および不動期の時間を測定した。運動活性の測定の終了時（４５分および３時間）に、プレクスガラスケージ内で次のように、眼瞼閉鎖や覚醒状態のスコアをとった。
【０２０５】
眼瞼閉鎖：
０：（正常）眼瞼全開
１：眼瞼やや下垂
２：眼瞼下垂、眼瞼がおよそ半分下垂
３：眼瞼完全閉鎖
【０２０６】
覚醒状態：
１：極めて低い、昏迷、昏睡、ほとんど応答がないか全く応答がない
２：低い、時には昏迷、＜＜感覚鈍麻（dulled）＞＞、時折頭や身体を動かす
３：やや低い、やや昏迷、時折探索活動をとるが、不動期がある
４：正常、機敏、探索活動／ゆっくり動きを止める
５：やや高い、やや興奮、緊張、突然動き出したり、動きを止めたりする
６：極めて高い、極めて機敏、突然発作的に走り出したり、身体を動かしたりする
【０２０７】
歩行移動（距離）の回数と時間（秒）および不動期の時間（秒）を、ビデオ画像解析装置(Videotrack, ViewPoint, Lyon, France)を用い、２０分間２回（投与後４５分および３時間）測定した。プレクスガラスケージ上に設置したビデオカメラを用いて画像追跡を行い、総ての運動活性を記録した。ビデオカメラで記録した画像をデジタル化し、デジタル画像スポットの重力中心の移動を追跡し、次の方法を用いて解析した：スポットの重力中心の移動速度を測定し、移動のタイプを定義するため、閾値１（高速）および閾値２（低速）の２つの閾値を設定した。動物の移動およびスポットの重力中心の移動速度が閾値１を超えれば、歩行移動とみなした。動物が不動のままであり、その速度が閾値２未満であれば、不動とみなした。
【０２０８】
結果は１２の個々の値の平均値±ＳＥＭで表した。統計解析は、ＡＮＯＶＡ（片側）およびダネット（Dunnett）のｔ検定を用い、クラスカル−ウォリス（Kruskal-Wallis）のノンパラメトリック検定の後、鎮静評価(sedation cotation)に関してマン・ホイットニー（Mann & Whiteney）のＵ検定を行った。ｐ＜０．０５のｐ値は有意性を示すと考えられた。
【０２０９】
プロトコール
群の大きさｎ＝１２
第１群：対照ハロペリドール（１ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第２群：ビヒクル対照群（２ｍｌ／ｋｇ腹腔内）
第３群：テトラベナジン（０．３ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第４群：テトラベナジン（１ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第５群：テトラベナジン（３ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第６群：テトラベナジン（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第７群：異性体Ｃ（０．３ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第８群：異性体Ｃ（１ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第９群：異性体Ｃ（３ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第１０群：異性体Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第１１群：異性体Ｂ（０．３ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第１２群：異性体Ｂ（１ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第１３群：異性体Ｂ（３ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
第１４群：異性体Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）
【０２１０】
【表９】
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これらの結果は、テトラベナジンが投与後４５分および３時間に用量依存性の鎮静作用をもたらし、一方、異性体Ｂおよび異性体Ｃはどの時点でも鎮静作用を示さないが、異性体Ｃは投与後３時間に、有意でない若干の運動亢進を示すことを実証する。
【０２１１】
実施例１２
医薬組成物
（ｉ）錠剤処方物−Ｉ
本発明のジヒドロテトラベナジンを含有する錠剤組成物は、ジヒドロテトラベナジン５０ｍｇと希釈剤としてのラクトース（ＢＰ）１９７ｍｇおよび滑沢剤としてのステアリン酸マグネシウム３ｍｇとを混合し、公知の方法で打錠することにより製造した。
（ii）錠剤処方物−II
本発明のジヒドロテトラベナジンを含有する錠剤組成物は、化合物（２５ｍｇ）と酸化鉄、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、トウモロコシデンプンおよびタルクとを混合し、公知の方法で打錠することにより製造した。
（iii）カプセル処方物
カプセル処方物は、本発明のジヒドロテトラベナジン１００ｍｇとラクトース１００ｍとを混合し、得られた混合物を標準的な不透明ゼラチン硬カプセル剤に充填することにより製造した。
【０２１２】
均等性
上記の本発明の特定の実施形態に対して、本発明の基礎にある原理から逸脱することなく、多くの変形や変更を行えることが容易に分かるであろう。このような変形や変更は総て本願に含まれるものとする。
【国際調査報告】
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