(57)【要約】  本発明は、血清産物の調製方法、血清産物および血清産物を含む医薬組成物ならびにてんかん性発作および溢血を含む種々の疾患および症状の処置におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を包含する、生物学的活性血清の製造方法：
ａ）非ヒト動物を電気刺激する工程；
ｂ）動物から血液を採取する工程；
ｃ）血液から血清を単離する工程、および；
ｄ）血清をγ線照射する工程。
【請求項２】
非ヒト動物が哺乳動物および鳥類からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
鳥類がニワトリ、アヒル、ガチョウ、ダチョウおよびウズラからなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）において頭部、頸部、胴体および／または１つ以上の肢、好ましくは頭部が電気刺激される、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
電気刺激が１〜６０秒、好ましくは１〜３０秒、より好ましくは２〜１０秒の期間実施される、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
電気刺激が５０Ｖ〜１５０Ｖ、好ましくは８０Ｖ〜１２０Ｖ、より好ましくは１１０Ｖ〜１２０Ｖの範囲の電圧を用いて実施される、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
電気刺激が０．０１Ａ〜０．４Ａ、好ましくは０．０２Ａ〜０．１Ａ、より好ましくは０．０４Ａ〜０．０６Ａの範囲の電流を用いて実施される、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
電気刺激が１０〜２００Ｈｚの範囲、好ましくは２０〜１００Ｈｚの範囲、より好ましくは４５〜５５Ｈｚの範囲の振動数を用いて実施される、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
γ線照射が１５〜３５ｋＧｙ、好ましくは２０〜３０ｋＧｙの吸収放射線量を用いて施される、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
γ線照射の線源が６０Ｃｏ、１３７Ｃｓ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１９２Ｉｒ、９９ｍＴｃおよび１７０Ｔｍからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）の前に血液をインキュベートする工程をさらに包含する、請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
工程ｄ）の前に血清を凍結乾燥する工程をさらに包含する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
血液が動脈血および／または静脈血である、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法によって製造される血清。
【請求項１５】
請求項１４記載の血清ならびに１つ以上の医薬上許容される希釈剤；担体；賦形剤（充填剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、崩壊剤、吸着剤を含む）；および／または保存剤を含む医薬組成物。
【請求項１６】
シロップ、注入溶液もしくは注射溶液、錠剤、カプセル、カプセレット、ロゼンジ、リポソーム、坐剤、プラスター、バンドエイド、遅延カプセル、粉剤、または徐放製剤として製剤化される、請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
希釈剤が水、緩衝液、緩衝化塩溶液または塩溶液である、請求項１５または１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
担体がココアバターおよびビテベソールからなる群より選択される、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１９】
処置を必要とする対象の脳におけるサイクリックアデノシン一リン酸含量の増加によって影響され得る疾患または症状の処置のための医薬の製造における請求項１４記載の血清または請求項１５〜１８のいずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項２０】
認知および／または学習機能の改善、特に長期記憶の改善のための医薬の製造における請求項１４記載の血清または請求項１５〜１８のいずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
発作、特にてんかん性発作の処置のための医薬の製造における請求項１４記載の血清または請求項１５〜１８のいずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項２２】
神経疾患の処置のための医薬の製造における請求項１４記載の血清または請求項１５〜１８のいずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
増殖性疾患および溢血の処置のための医薬の製造における請求項１４記載の血清または請求項１５〜１８のいずれか１項記載の医薬組成物の使用。
【請求項２４】
増殖性疾患が以下からなる群より選択される、請求項２３記載の使用：胃腸管または結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、前立腺、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、子宮、精巣、皮膚、口腔の悪性腫瘍；黒色腫；形成異常口腔粘膜；浸潤口腔ガン；小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン；乳ガン、特にホルモン依存性乳ガンおよびホルモン非依存性乳ガン；移行扁平上皮ガン；神経悪性腫瘍（神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨肉腫、髄膜腫を含む）；軟部組織肉腫；血管腫および内分泌腫瘍。
【請求項２５】
増殖性疾患が以下に類似する細胞を含む、請求項２３記載の使用：ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、ヒト黒色腫細胞株Ｂｒｏ、ヒト子宮頸部ガン細胞株ＨｅＬａ、ヒト腺ガン細胞株ＭＣＦ−７、骨肉腫細胞株Ｍｇ６３、線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０、神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２および肝臓ガン細胞株ＨｅｐＧ２。
【請求項２６】
処置を必要とする対象に、５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは９０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で医薬が投与される、請求項１９〜２５のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血清産物の調製方法、血清産物および血清産物を含む医薬組成物ならびにてんかん性発作および溢血を含む種々の疾患および症状の処置におけるその使用に関する。
【０００２】
発明の背景
血清からの活性物質の調製方法は当該分野において公知である。１つは、ヒトまたは動物からの採血、続くインキュベーションおよび活性物質の分離、ならびに最終的な物質の保存に基づく（例えば、JP 2123287、EP 0 542 303、RU 2096041、RU 2120301参照）。この先行技術の方法は、気圧、気温、重力、光など、ならびに空腹、口渇、睡眠および性的欲求などの外因性および内因性要因についての身体の抵抗性を改善する血清の調製に関する。血清は、事前に特定の機能的状態に置かれたドナーから採取され、機能的状態の適用の長さおよび機能的状態の種類（例えば、睡眠遮断、アルコール乱用、ニコチン乱用など）に応じて、異なる生物学的活性を有する血清を得ることができる。これらは、マイトジェン性、睡眠原性、眼原性、聴活性、熱活性、食事活性、性的活性、抗低酸素、抗アルコールおよび抗ニコチン活性を示す。
【０００３】
異なる方法がEP 1 283 047に開示されている。これは血清産物の生物学的活性を増加させる目的でのγ腺照射による動物血清の処理に関する。
【０００４】
現在、多くの研究が、異なるヒト組織の細胞増殖を調節するメカニズムに集中している。この関連で、正常および病理学的に異常な体細胞（神経細胞を含む）の増殖の刺激剤および阻害剤の両方が研究されている（例えば、Aschmarin, I.P. “Neurochemistry”, Moskwa, Publishers of the Biomedical Chemical Institute of the Russian Academy of Science”, 1996参照）。
【０００５】
ペプチド増殖因子は、その一般的な活性化機能（例えば、有糸分裂の刺激、異なる型の正常組織の細胞分化および細胞増殖、創傷治癒の増加）とは別に、腫瘍の形成および成長を引き起こし得ることが観察されている（例えば、Bouneres, P. (1993), Horm. Res. 40: 31; Robinson, C., (1993) Ann. Med. 25: 535; Dignez, C. and Casanueva F. (1995) Trends Endocrin. Metab. 6: 55, Menster D. et al. (1995) Clin. Exp. Metastasis 13: 67参照）。
【０００６】
例えば、副甲状腺ペプチド、ガストリンまたはボンベシンのようなペプチドは、腫瘍細胞の発達ならびに乳ガン、骨ガンおよび結腸ガンの発達を助長する（例えば、Kitazawa S. and Maeda S. (1995) Clin. Orthop. 312: 45-50 and Kaji et al. (1995) Endocrinology 136: 842参照）。
【０００７】
いくつかのペプチドは正常細胞分裂を促進し、ヒトおよび動物のための刺激剤であるが、その使用が腫瘍細胞の発達、そして最終的にガンの発達を導く危険性が存在する。
【０００８】
初期の実験によって、電気での動物の刺激が血中βエンドルフィンレベルの増加を導くことが示されている（例えば、Litvinova S.V. et al. (1990) Biomed. Sci. 5: 471参照）。Udovitschenko, W.I.による参考研究において、種々の原因による刺激またはショックの結果に関する多くのデータが提供されている。例えば、電気ショックが血中のβエンドルフィン、ｍｅｔａ−およびｌｅｕ−エンセファリン（encephaline）の濃度の顕著な増加を導くことが示されている（Udowitschenko, W.I. (1989) “Xenogenic Opioid System in Shock” Pathiological Physiology and Experimental Therapy” 6: 72-77参照）。
【０００９】
発明の要旨
本発明の目的は、動物の血液から生物学的活性血清を調製するための新規な方法を開発することである。驚くべきことに、本発明の方法によって調製された生物学的活性血清が新たな治療的特性を示すことが見出された。
【００１０】
本発明の１つの局面は、以下の工程を包含する、生物学的活性血清の製造方法である：
ａ）非ヒト動物を電気刺激する工程；
ｂ）動物から血液を採取する工程；
ｃ）血液から血清を単離する工程、および；
ｄ）血清をγ線照射する工程。
【００１１】
好ましい実施態様において、非ヒト動物は哺乳動物および鳥類、好ましくは家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ダチョウおよびウズラ）からなる群より選択される。
【００１２】
電気刺激は身体のいずれの部分に対しても用いることができるが、本発明の方法の工程ａ）が動物の頭部、頸部、胴体および／または１つ以上の肢に適用されることが好ましい。これらの中で、動物の頭部が電気刺激されることが好ましい。本発明に関して、電気刺激および電気ショックなる用語は互換的に使用される。
【００１３】
本発明の方法の好ましい実施態様において、電気刺激は１〜６０秒、好ましくは１〜３０秒、より好ましくは２〜１０秒の期間実施される。電気刺激が５０Ｖ〜１５０Ｖの範囲、好ましくは８０Ｖ〜１２０Ｖの範囲、より好ましくは１１０Ｖ〜１２０Ｖの範囲の電圧を用いて実施されることもまた好ましい。電気刺激の実施の間、特定の電流が好ましく、好ましくは電気刺激は０．０１Ａ〜０．４Ａの範囲、好ましくは０．０２Ａ〜０．１Ａの範囲、より好ましくは０．０４Ａ〜０．０６Ａの範囲の電流を用いて実施される。
【００１４】
本発明の方法の好ましい実施態様において、電気刺激は１０〜２００Ｈｚの範囲、好ましくは２０〜１００Ｈｚの範囲、より好ましくは４５〜６５Ｈｚの範囲の振動数を用いて実施される。
【００１５】
本発明の方法のさらなる好ましい実施態様において、γ線照射は１０〜４０ｋＧｙ、好ましくは１５〜３５ｋＧｙ、より好ましくは２０〜３０ｋＧｙの吸収放射線量を用いて施される。γ線照射の線源はいずれの線源でもあり得るが、好ましいγ線照射の線源は６０Ｃｏ、１３７Ｃｓ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１９２Ｉｒ、９９ｍＴｃおよび１７０Ｔｍからなる群より選択される。
【００１６】
本発明の方法のさらなる好ましい実施態様において、方法は工程ｃ）の前に血液をインキュベートする工程をさらに包含する。
【００１７】
本発明の方法のさらなる好ましい実施態様において、方法は工程ｄ）の前に血清を凍結乾燥する工程をさらに包含する。
【００１８】
本発明の方法の好ましい実施態様において、血液は動脈血および／または静脈血である。
【００１９】
本発明の別の局面は、本発明の方法によって製造される生物学的活性血清である。
【００２０】
本発明のさらなる局面は、本発明の血清ならびに１つ以上の医薬上許容される希釈剤；担体；賦形剤（充填剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、崩壊剤、吸着剤を含む）；および／または保存剤を含む医薬組成物である。
【００２１】
本発明の医薬組成物の好ましい実施態様において、組成物はシロップ、注入溶液もしくは注射溶液、錠剤、カプセル、カプセレット、ロゼンジ、リポソーム、坐剤、プラスター、バンドエイド、遅延カプセル、粉剤、または徐放製剤として製剤化される。好ましくは、希釈剤は水、緩衝液、緩衝化塩溶液または塩溶液であり、担体は好ましくはココアバターおよびビテベソール（vitebesole）からなる群より選択される。
【００２２】
本発明のさらなる局面は、処置を必要とする対象の脳におけるサイクリックアデノシン一リン酸含量の増加によって影響され得る疾患または症状の処置のための医薬の製造における本発明の血清または本発明の医薬組成物の使用である。
【００２３】
本発明の別の局面は、認知および／または学習機能の改善、特に長期記憶の改善のための医薬の製造における本発明の血清または本発明の医薬組成物の使用である。
【００２４】
本発明の別の局面は、発作、特にてんかん性発作の処置のための医薬の製造における本発明の血清または本発明の医薬組成物の使用である。
【００２５】
本発明のさらなる局面は、増殖性疾患および溢血の処置のための医薬の製造における本発明の血清または本発明の医薬組成物の使用である。
【００２６】
本発明の使用の好ましい実施態様において、増殖性疾患は以下からなる群より選択される：胃腸管または結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、前立腺、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、子宮、精巣、皮膚、口腔の悪性腫瘍；黒色腫；形成異常口腔粘膜；浸潤口腔ガン；小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン；乳ガン、特にホルモン依存性乳ガンおよびホルモン非依存性乳ガン；移行扁平上皮ガン；神経悪性腫瘍（神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨肉腫、髄膜腫を含む）；軟部組織肉腫；血管腫および内分泌腫瘍、特に下垂体腺腫、クロム親和細胞腫、傍神経節腫、血液学的悪性腫瘍、特にリンパ腫および白血病。
【００２７】
本発明の使用のさらなる好ましい実施態様において、増殖性疾患は以下に類似する細胞を含む：ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、ヒト黒色腫細胞株Ｂｒｏ、ヒト子宮頸部ガン細胞株ＨｅＬａ、ヒト腺ガン細胞株ＭＣＦ−７、骨肉腫細胞株Ｍｇ６３、線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０、神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２および肝臓ガン細胞株ＨｅｐＧ２。
【００２８】
本発明の使用のさらなる好ましい実施態様において、処置を必要とする対象に、５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは９０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で医薬が投与される。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明者らは、動物、特にニワトリの電流での刺激および血液から得られた血清のγ線照射でのさらなる処理が、血清産物の生物学的活性の有意な増加を導くことを驚くべきことに見出した。得られた産物は、患者の種々の身体機能、症状および疾患に正の影響を与えることができる。
【００３０】
電気ショックおよびγ線照射で処理した血清の有益な効果は２つの理由で驚くべきことである。第１に、生物内の全ての生命機能および系、特に中枢神経系、血液および循環系ならびに呼吸系の重篤な障害が電気ショックによって引き起こされることが先行技術においてが知られている（例えば、Orlow, A.N. et al. (1977) Medicine参照）。第２に、血液および血液から調製された血清が照射に対して感受性であり、イオン化照射下で不安定であり不活化されることもまた見出されていた（例えば、Radiomedicine - M. Atomisdat (1972) 123-125およびGergely, J. et al. (1967) Radiosterilization of Medical Products 115-124参照）。
【００３１】
これらの研究は本発明の結果を導かず、電気ショックとγ線照射処理との組み合わせを介して生物学的活性血清を得ることは可能ではないことを示唆する。従って、グレードＩＩ〜グレードＩＩＩの電気ショックおよびγ線照射で処理した動物、特にニワトリから採取した動脈血および／または静脈血が生物学的活性血清を生じることは驚くべきことであった。このようにして得られた血清の具体的な活性を以下でより詳細に記載する。
【００３２】
本発明の第１の局面は、以下の工程を包含する、生物学的活性血清の製造方法である：
ａ）非ヒト動物を電気刺激する工程；
ｂ）動物から血液を採取する工程；
ｃ）血液から血清を単離する工程、および；
ｄ）血清をγ線照射する工程。
【００３３】
種々の動物を本発明の方法において使用することができるが、哺乳動物および鳥類からなる群より非ヒト動物を選択することが好ましい。その容易な利用可能性の故に、家禽（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ダチョウおよびウズラ）のような飼育動物を使用することが特に好ましい。本発明の方法において使用できる特に好ましい動物はニワトリである。本発明の方法において使用できる哺乳動物の種類には特に制限はなく、限定するものではないが、齧歯類（例えば、ハムスターおよびラット）、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ウシおよびヤギを含む。
【００３４】
電気刺激が動物内での特定の化合物の放出を導き、これが本発明の生物学的活性血清の驚くべき治療効果を引き起こしそして／またはそれに寄与することが考えられる。非ヒト動物を身体の異なる領域において刺激することができる。好ましくは、電気刺激を頭部、頸部、胴体および／または１つ以上の肢で実施する。身体を一カ所のみでまたは数カ所で同時に刺激することができる。電気刺激に特に好ましい身体部分はそれぞれの動物の頭部である。鳥類、特にニワトリを刺激する場合、頭部を電気刺激することが好ましい。
【００３５】
電気刺激を公知の方法によって、好ましくは金属電極または水浴（例えば、家畜の間引きまたは家禽の感電死の間に使用されるような）を使用して実施することができる。好ましくは、電気刺激は１〜６０秒、好ましくは１〜３０秒、より好ましくは２〜１０秒、さらに好ましくは３〜４秒の期間実施される。期間の長さは大型動物を電気刺激する場合はより長くし、小型動物を電気刺激する場合はより短くすることができる。例えば、ニワトリ頭部の刺激のためには、特に好ましい電気刺激の期間は２〜１０秒、より好ましくは３〜４秒である。動物の電気刺激の間に適合させ得るその他の変数は電圧、電流および電流の振動数であり、本発明者らはこれらのパラメーターについて特定の好ましい範囲を規定している。選択される実際のパラメーターは、動物の大きさおよび刺激しようとする動物の領域に部分的に依存する。一般に、より大きな動物およびより大きな領域にはより高い電圧および電流が必要とされる。従って、電気刺激は好ましくは５０ボルト〜１５０ボルト、好ましくは８０ボルト〜１２０ボルト、より好ましくは１１０ボルト〜１２０ボルトの範囲の電圧を用いて実施される。適用できる電流の範囲は０．０１Ａ〜０．４Ａ、好ましくは０．０２Ａ〜０．１Ａ、より好ましくは０．０４Ａ〜０．０６Ａ、さらに好ましくは約０．０５Ａである。好ましくは、電圧、電流および適用時間は、１〜１０００Ｗｓの範囲、好ましくは１０〜２００Ｗｓの範囲、より好ましくは１５〜１００Ｗｓの範囲のエネルギーを与えるように選択される。
【００３６】
好ましい動物、すなわちニワトリの刺激のために、電気刺激を８０ボルト〜１２０ボルト、より好ましくは１１０ボルト〜１２０ボルトの範囲の電圧を用いて実施することが好ましい。さらに、０．０４Ａ〜０．０６Ａの範囲、特に０．０５Ａの電流が鳥類、特にニワトリの電気刺激に関して好ましい。
【００３７】
本発明の方法の特定の好ましい実施態様において鳥類、特にニワトリの電気刺激は、３〜４秒間、８０Ｖ〜１２０Ｖ、特に１１０Ｖ〜１２０Ｖの電圧で実施される。この好ましい実施態様において、電流は好ましくは０．０４Ａ〜０．０６Ａ、より好ましくは約０．０５Ａである。
【００３８】
電気刺激の振動数は特に重要ではないかもしれないが、好ましくは１０〜２００ヘルツの範囲、より好ましくは４５〜６５Ｈｚの範囲、さらに好ましくは約５０Ｈｚである。
【００３９】
本発明の方法の工程ｄ）の間での血清のγ線照射を、Ｘ線源および放射性核種を含むいずれかのγ線源を用いて実施することができる。γ線照射源は好ましくは、規定されたγ線照射パターンを有する放射性核種である。γ線照射のための好ましい線源は６０Ｃｏ、１３７Ｃｓ、６７Ｃｕ、６７Ｃａ、１１１Ｉｎ、１９２Ｉｒ、９９ｍＴｃおよび１７０Ｔｍからなる群より選択される。これらの中で、本発明の方法において使用するために、６０Ｃｏ、１３７Ｃｓ、１９２Ｉｒおよび１７０Ｔｍが特に好ましく、６０Ｃｏが最も好ましいγ線照射源である。血清によって吸収される放射線量は１０〜４０ｋＧｙの範囲、好ましくは１５〜３５ｋＧｙの範囲、より好ましくは２０〜３０ｋＧｙの範囲、すなわち２５±５ｋＧｙである。
【００４０】
動物からの採血をいずれかの公知の方法によって行うことができ、シリンジならびに動脈もしくは静脈の穿刺または断頭（特に鳥類からの採血に関して）が含まれる。血液の一部のみを採取すること、または動物の血液を完全に採取することが可能である。致死量の電気を動物に適用した場合には後者の使用が好ましい。採取する血液は動脈血および／または静脈血であり得る。
【００４１】
ろ過、沈降および遠心分離を含むいずれかの公知の方法によって血液から血清を単離することができる。しかし、４〜７２時間、低温（例えば２〜１０℃、好ましくは４〜８℃）で血液をインキュベートして、血液凝固（これはさらなる因子の血中への放出を導く）をさせることが好ましい。従って、本発明の方法の好ましい実施態様において、方法は、動物からの採血の後かつ血液からの血清の単離の前に、例えば４〜７２時間、低温（例えば２〜１０℃、好ましくは４〜８℃）で血液をインキュベートする工程をさらに包含する。
【００４２】
本発明の方法のさらなる好ましい実施態様において、方法は照射工程ｄ）の前に血清を凍結乾燥する工程をさらに包含する。凍結乾燥は、照射の間の血清のより容易な取り扱いを可能にし、血清成分による照射の吸収を至適化する。
【００４３】
本発明のさらなる局面は、本発明の方法によって製造される生物学的活性血清自体である。これは本発明の方法の工程を用いない従来技術の血清とは異なる。このことは従来技術の血清産物によっては示されないその特定の治療効果によって立証される。
【００４４】
本発明の生物学的活性血清が特定の治療効果（例えば、抗増殖活性または抗てんかん活性）を与えることが驚くべきことに見出されたので、本発明のさらなる局面は、本発明の方法によって製造される生物学的活性血清を含む医薬組成物である。そのような医薬組成物には、１つ以上の医薬上許容される希釈剤；担体；賦形剤（充填剤、結合剤、潤滑剤、滑剤、崩壊剤、吸着剤を含む）；および／または保存剤をさらに含めることができる。
【００４５】
本発明の医薬組成物を、経口および非経口投与を含む種々の周知の経路（例えば、静脈内、筋肉内、鼻内、皮内、皮下および類似の投与経路）によって投与することができる。非経口投与および特定の静脈内投与が好ましい。投与経路に依存して、異なる医薬製剤が必要とされ、それらのいくつかには保護的コーティングを薬物製剤に施して（例えば消化管における）生物学的活性血清の分解を防止することが必要とされ得る。
【００４６】
従って、本発明の医薬組成物は好ましくは、シロップ、注入溶液もしくは注射溶液、錠剤、カプセル、カプセレット、ロゼンジ、リポソーム、坐剤、プラスター、バンドエイド、遅延カプセル、粉剤、または徐放製剤として製剤化される。
【００４７】
特に好ましい医薬形態は、注射用途に適切な形態であり、無菌水溶液または分散液、および無菌注射溶液または分散液の即時調合用の無菌粉剤を含む。全ての場合において、最終的な溶液または分散液形態は無菌かつ流動性でなければならない。代表的には、そのような溶液または分散液は、溶媒または分散媒を含む。これは例えば、水−緩衝化水溶液、例えば、生体適合性緩衝液、エタノール、ポリオール、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、その適切な混合物、界面活性剤または植物油を含む。本発明の生物学的活性血清を、特に非経口投与のために、リポソーム中に製剤化することもできる。リポソームは、遊離の薬物と比較した場合の、循環中での半減期の増加、および封入した薬物のより均一な放出の延長の利点を提供する。
【００４８】
注入溶液または注射溶液の滅菌を、当該分野において認識される技術（限定するものではないが、抗菌剤または抗真菌剤のような保存剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸またはチメロサールの添加を含む）のいずれかによって達成することができる。さらに、糖または塩、特に塩化ナトリウムのような等張剤を注入溶液または注射溶液中に組み込んでもよい。
【００４９】
生物学的活性血清を含有する無菌注射溶液の製造は、必要とされる量の生物学的活性血清を、適切な溶媒中に、必要に応じて上記に列挙する種々の成分とともに組み込み、次いで滅菌することによって達成される。無菌粉剤を得るために、必要に応じて上記の溶液を真空乾燥または凍結乾燥する。本発明の好ましい希釈剤は水、生理学的上許容される緩衝液、生理学的上許容される緩衝化塩溶液または塩溶液である。本発明の好ましい担体はココアバターおよびビテベソールである。種々の医薬形態の生物学的活性血清とともに使用することができる賦形剤は以下の非限定的なリストから選択することができる：
ａ）ラクトース、マンニトール、結晶ソルビトール、二塩基性リン酸、リン酸カルシウム、糖、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのような結合剤；
ｂ）ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、水素添加植物油、ロイシン、グリセリドおよびステアリルフマル酸ナトリウムのような潤滑剤；
ｃ）デンプン、クロスカラメロース（croscaramellose）、メチルセルロースナトリウム、寒天、ベントナイト、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどのような崩壊剤。
【００５０】
その他の適切な賦形剤を、the Handbook of Pharmaceutical Excipients, the American Pharmaceutical Association出版（出典明示で援用する）中に見出すことができる。
【００５１】
本発明のさらなる局面は、処置される対象の脳におけるサイクリックアデノシン一リン酸含量の増加によって影響され得る疾患または症状の処置のための医薬の製造における本発明の血清または医薬組成物の使用である。
【００５２】
本発明の別の局面は、処置される対象の向知、認知および／または学習機能の改善、特に長期記憶の改善のための医薬の製造における本発明の生物学的活性血清または医薬組成物の使用である。この適応症のための有用性は、本発明の血清または医薬組成物が処置される対象の学習能力を増加させるという知見に基づいている。
【００５３】
さらに、血清または医薬組成物は、いずれかの型の発作の処置、特にてんかん性発作の処置のために使用することができる。特に、重篤なてんかん性形態において、そして大発作の間に、本発明の生物学的活性血清または医薬組成物の投与は、時折重篤な発作に関連する死亡を防止することができる。本発明をてんかん性発作の処置のために使用することができるという観察に関連して、本発明の血清または医薬組成物を、限定するものではないが、双極性障害、うつ病、不安関連障害、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、末梢神経障害、脳アミロイド血管障害、神経変性障害および脊髄損傷を含む神経疾患の処置に使用することができることもまた見出された。
【００５４】
本発明のさらなる局面は、増殖性疾患および溢血の処置のための医薬の製造における本発明の血清または医薬組成物の使用である。インビトロにおいて種々の腫瘍細胞株について試験した場合に、本発明の生物学的活性血清または医薬組成物が顕著な抗増殖効果を示したことは特に驚くべきことであった。それゆえ、本発明の生物学的活性血清または医薬組成物が増殖性疾患の処置に特に適切であると思われ、本発明の使用により処置可能な好ましい増殖性疾患は以下からなる群より選択される：胃腸管または結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、甲状腺、前立腺、子宮内膜、子宮頸部、卵巣、子宮、精巣、皮膚、口腔の悪性腫瘍；黒色腫；形成異常口腔粘膜；浸潤口腔ガン；小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン；乳ガン、特にホルモン依存性乳ガンおよびホルモン非依存性乳ガン；移行扁平上皮ガン；神経悪性腫瘍（神経芽腫、神経膠腫、星状細胞腫、骨肉腫、髄膜腫を含む）；軟部組織肉腫；血管腫および内分泌腫瘍、特に下垂体腺腫、クロム親和細胞腫、傍神経節腫、血液学的悪性腫瘍、特にリンパ腫および白血病。
【００５５】
本発明の生物学的活性血清または本発明の医薬組成物の抗増殖効果は種々の腫瘍細胞株について最初に確立されたので、それらの実験において使用された腫瘍細胞株に類似の細胞および／または当該細胞を含む腫瘍組織を含む増殖性疾患の処置に特に適切である。従って、生物学的活性血清または生物学的活性血清を含む医薬組成物を用いて処置可能な好ましい増殖性疾患は以下に類似する細胞を含む：ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔ、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ、ヒト黒色腫細胞株Ｂｒｏ、ヒト子宮頸部ガン細胞株ＨｅＬａ、ヒト腺ガン細胞株ＭＣＦ−７、骨肉腫細胞株Ｍｇ６３、線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０、神経芽腫細胞株ＩＭＲ−３２および肝臓ガン細胞株ＨｅｐＧ２。この関連で、用語「類似する細胞」は、それぞれの細胞株と同じ起源（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞または神経系列）を有し、細胞の増殖活性に寄与する同じもしくは機能的に等価な遺伝子に変異（例えば、ｐ５３、ｐＲｂ、ｃｄｃ２、ｃｄｋ４、サイクリンＡ、サイクリンＢ、ｐ２１ｒａｓ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、ｐ１０７、ｐ１３０などにおける変異）を有するか；同じもしくは機能的に類似した外来遺伝子を有するか（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｅ６もしくはＥ７、Ｂ型肝炎ウイルスによるサイクリンＢプロモーター中への挿入など）；または同じ染色体再配列もしくは異常（すなわち、欠失、染色体多重など）を有する細胞である。
【００５６】
動物および細胞培養物における結果に基づき、特定量の生物学的活性血清が、そのために血清および医薬組成物を用いることができる疾患および症状の処置のために好ましい。しかし、それぞれの症状および処置しようとするそれぞれの患者に依存して（すなわち、疾患または症状の重篤度、患者の一般健康状態などに依存して）、異なる用量の生物学的活性血清または医薬組成物が治療効果を誘発するために必要とされることが理解される。適切な用量の決定は、担当医の裁量内にある。本発明の治療方法における生物学的活性血清の投与量が１ｋｇ体重当たり約０．１ｍｇ〜約２００ｍｇ血清の範囲であるべきことが意図される。しかし、本発明の好ましい使用において、５０〜１５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、好ましくは９０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で、生物学的活性血清はそれを必要とする対象に投与される。生物学的活性血清での治療期間は、処置される疾患の重篤度ならびに個々の患者の症状および特異体質応答に依存して変動する。
【００５７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様を実証するために含まれる。下記の実施例に開示する技術が、本発明の実施において良好に機能と本発明者らによって見出された技術を表し、従ってその実施にために好ましい様式であると考えることができることを、当業者は理解する。しかし、本開示を考慮し、添付の請求の範囲に記載される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施態様において多くの変更をなし得ることを、当業者は理解する。引用する全ての参考文献を出典明示で援用する。
【００５８】
実施例
実施例１
電気ショックによって処理したニワトリ血液の取得方法
ニワトリからの血清の調製のために、ニワトリをグレードＩＩ〜ＩＩＩの電気ショック（電圧：８０〜１２０Ｖ、電流０．０５Ａ、振動数５０Ｈｚ、適用時間：頭部に３〜４秒）で処理した。次いで、血液を頸動脈から採取し、４〜８℃の温度で１８〜２４時間、ポリエチレンフラスコ中でさらにインキュベートした。完全な血餅退縮の後、フラスコを３０００ｒｐｍで２０〜３０分間スピンした。血清を血餅から分離し、公知の条件下で凍結乾燥した。凍結乾燥した血清を含むフラスコをＲＺ−１００−Ｍ装置で２０〜３０ｋＧｙ、好ましくは約２５ｋＧｙで６０Ｃｏをγ線照射源として使用して処理した。処理した血清をその後の使用のために４〜８℃の温度で貯蔵した。
【００５９】
電気ショックで処理したニワトリ血清の刺激効果の証拠
平均体重２８０〜３００ｇの雄性Ｗｉｓｔａｒラットを用いて以下の実験を実施した。動物を、各々ラット１０匹の群４つにランダムに割り当てた。第１群には１．０ｍｌの生理塩溶液を投与した。第２群には１００±５．０ｍｇ／ｋｇ体重の用量の本発明の血清を１．０ｍｌの溶液内で投与した。注射の３０分後にラットを断頭した。１ｍｌの生理塩溶液を第３群のラットに投与し、第４群のラットには生物学的活性血清（１００±５ｍｇ／ｋｇ体重）を１．０ｍｌ溶液量中で与えた。注射の３０分後に、尾におもり（ラットの体重の１０％）を付けた動物を水（２５℃）を入れた洗面器中に入れた。最初のアゴニーの徴候の後、動物を水から取り出し、断頭した。
【００６０】
脳、心臓、肝臓（全て、極限適合の過程において大きなエネルギー負担にさらされる器官である）ならびに骨格筋（主に影響を受ける器官として）をさらなる分析のための試料として取り出した。各々のラットの組織試料を秤量し、等張ＮａＣｌ溶液を用いて冷却し、液体窒素中で迅速に凍結した。「ストレス」の適用と試料の最終処理との間に経過した全時間は最大５〜６分の範囲であった。
【００６１】
ラットの骨格筋中のアデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸およびアデノシン一リン酸の量を測定した。Ａｎｉｏｎｉｔ  Ｄｏｗｅｘ  １を用いるカラムでのイオン交換クロマトグラフィーによってヌクレオチドを分離した。アデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸およびアデノシン一リン酸の定量を２５６ｎｍ範囲で分光光度的に実施した（分光光度計  Ｈｉｔａｃｈｉ−５５７）。エネルギーポテンシャルを以下の式に従って決定した
（ＡＴＰ−０．５ＡＤＦ）／（ＡＴＰ＋ＡＤＰ＋ＡＭＰ）。
【００６２】
脳、心臓および肝臓中のサイクリックアデノシン一リン酸の定量は、公知の放射免疫分析を使用し、Amersham（Great Britain）の検出装置を用いて実施した。
【００６３】
標識アデノシン一リン酸の測定は公知の方法を使用し、シンチレーションカウンターＧＳ−８を用いて実施した。
【００６４】
結果
種々の量のアデノシン三リン酸、アデノシン二リン酸およびアデノシン一リン酸、ならびにエネルギーポテンシャルの増加が、第３群を対照群１または第２群のいずれかと比較した場合（ｐ＜０．０５）および第４群を対照群１または第２群のいずれかと比較した場合（ｐ＜０．０５）の両方、さらに第３群および第４群を互いに比較した場合（ｐ＜０．０５）で明らかである（表１参照）。
【００６５】
【表１】
2007514706.tif 000002
【００６６】
活動期の間、注射による穏和なストレスの３０分後に測定したアデノシンリン酸の量により（対照群Ｉ）、血清の影響下においてアデノシン三リン酸およびアデノシン二リン酸の量の混合が筋肉組織における上限標準値で生じ、一方同時にアデノシン一リン酸の量が減少することが確認される。
【００６７】
これらの結果を、生物学的活性血清が筋肉組織におけるエネルギーポテンシャルの増加を推進するというように解釈することができる。エネルギーポテンシャルの算出によってこの傾向が確認される。
【００６８】
第３群における極限水泳ストレスの影響下では（生理塩溶液＋水泳）、対照群との関係でのアデノシン三リン酸の減少ならびにアデノシン二リン酸およびアデノシン一リン酸含量の増加が測定された。
【００６９】
第４群のラットの極限ストレス下では（血清＋水泳）、第３群において観察されたアデノシン三リン酸、二リン酸および一リン酸の量の変化の一般的傾向は同様のままであったが、アデノシン三リン酸の量は有意により高く留まり、エネルギーポテンシャルを算出すると、第３群と比較して４３％のエネルギーポテンシャルの増加が観察された（ｐ＜０．０５）。
【００７０】
第１群および第２群のラットの心臓および肝臓組織ならびに脳組織におけるサイクリックアデノシン一リン酸の比較分析によって、血清の影響下では、サイクリック一リン酸量の増加を脳組織において検出することができるが（ｐ＜０．０１）、心臓および肝臓組織においては対照群と比較して有意な差異は測定されないことが実証された（表２参照）。
【００７１】
【表２】
2007514706.tif 000003
【００７２】
極限ストレスの影響下では、サイクリックアデノシン一リン酸量の有意な減少（ｐ＜０．０５）が第３群（生理塩溶液＋水泳）および第４群（血清＋水泳）のラットの全ての組織において観察された。しかし、この減少は、生物学的活性血清の影響下で縮小した。脳組織におけるアデノシン一リン酸量は、第３群の量より９２％高く（ｐ＜０．０５）、心臓組織において９６％高く、肝臓組織において２５．７％高かった。
【００７３】
従って、電気ショックおよびγ線照射で処理した本発明の血清はラットの骨格筋におけるエネルギーポテンシャルを増加させ、安静期の間および極限身体ストレス下の両方で脳組織におけるサイクリックアデノシン一リン酸の量を増加させ、ラットの身体ストレス後の心臓および肝臓組織におけるサイクリックアデノシン一リン酸の増加を促進する。
【００７４】
実施例２
長期記憶
本実験において１５０匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを使用した。全てのラットを古典的な「オープンフィールド」試験を用いて事前に試験し、活動性に従って以下の３つの群に割り当てた：積極的、中程度に積極的および消極的。
【００７５】
状況反射の確立のために、ラットを、定温制御洗面器内に配置した円筒中に入れた。円筒を３つの支持体上に置き、動物を円筒の下端の下に飛び込んで、円筒の外側に配置したプラットフォームに達するようにさせた。
【００７６】
第１の実験の潜伏期、ならびに閉鎖室からのそして水からの「逃避」の課題の最終解決の潜伏期が決定可能であった。
【００７７】
状況反射を確立した際に、ラットを以下の３つの群に分けた：
−「早いダイバー」：最初の１分以内に出口を見つけることができたラット
−「遅いダイバー」：２〜３分後にしか出口を探し始めなかったラット
−１０分以内に問題を解決しようとしなかったラット
【００７８】
生物学的活性血清を腹腔中に実験開始の３０分前に１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で注射した。１ｍｌの生理塩溶液を対照動物に投与した。翌日、状況反射行動を試験し、その後ラットに４０日間の休止を与えた。
【００７９】
この方法に従って１２０匹のラット−対照の６０匹のラットおよび生物学的活性血清を与えた６０匹のラット−を「教育」した。ラットを上記のように３つの群（すなわち、積極的、中程度に積極的および消極的）に事前に割り当て（各群内に２０匹の動物）、さらにこの分析のために「早い」および「遅い」ダイバーに細分化した。
【００８０】
結果
いくつかのラットは「飛び込み反射」を全く示さなかった（表３）。対照群内で、積極的なラットおよび中程度に積極的なラットの６匹、ならびに消極的な群の１２匹の動物が「飛び込み反射」を全く示さなかった。第２日に、積極的なラットおよび中程度に積極的なラットについてこの数は同じままであったが、消極的な動物については７に低下した。４２日後に、消極的な群の同じ１１匹のラットが円筒の端の下に飛び込むことを拒否した（１匹のラットは実験の間に死亡した）。
【００８１】
生物学的活性血清を与えたラットの積極的なラットについて、第２日に問題解決を辞退したラットが１匹のみならず存在した。中程度に積極的なラットの全てについて、３匹が第１日に問題の解決を拒否したが、それにもかかわらず第２日にそれを解決し、４２日後にもこの能力を有し続けた。血清を与えたラットの消極的なラットのうち、４匹のラットは問題を解決しようとしなかったが、第２日にこの量は２に減少し、４２日後でも一定のままであった。
【００８２】
【表３】
2007514706.tif 000004
【００８３】
「早いダイバー」の群内で、４０日の実験の期間内での単回の血清注射は有意な状況反射維持の変化を示さなかった。
【００８４】
「遅いダイバー」については、極限状況からの逃避経路を迅速に見出す能力を維持する統計的に有意な能力が存在した（表４）。対照群および試験群の両方について、第２日の反射形成の時間は第１日に比較して減少した。対照群において、これらの反射は４２日後に完全に消滅したが、生物学的活性血清の注射を与えた動物については、反射は完全に存続した。さらに、反射に必要とされる時間の差異も存在し、これは対照ラットについて２〜３倍高かった（ｐ＜０．０１）。
【００８５】
【表４】
2007514706.tif 000005
【００８６】
情報の形成および長期維持の間、Ｈコリン受容性メカニズムに有意な役割の原因があると考えられる。「ベル」の下に飛び込む方法を５日間教えられた３０匹の動物を３つの群に細分化した。
【００８７】
ザイチシン（zytisin）（脳のＨコリン受容性アンタゴニスト）の生理溶液を１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で第１群の動物の試験３０分前に腹腔中に注射した。
【００８８】
生物学的活性血清を１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で第２群の動物（ラット１０匹）に投与し、３０分後にザイチシン溶液を１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与した。
【００８９】
第３の動物群（対照−ラット１０匹）には生理塩溶液を１ｍｌ注射した。
【００９０】
動物の複雑な行動を、上記の方法に従って、示した物質の注射の４８時間後に試験した。この生物試験はザイチシン適用の４８時間後に閉鎖室からの「逃避反応」の顕著な減速、すなわち対照動物に比較して３倍の減速を示した。
【００９１】
ザイチシン注射前の血清の投与は、このアンタゴニストの効果を軽減しただけでなく、対照群に比較して２０％の「逃避」反応の増加も導き、生物学的活性血清の効果全体はアンタゴニストの効果を５倍上回った。
【００９２】
【表５】
2007514706.tif 000006
【００９３】
結果に基づき、脳Ｈコリン受容体が、動物の複雑な行動のモデリングに関連した「逃避反応」の回復における役割を担い、生物学的活性血清が学習低下確立を防止することが決定された。
【００９４】
それゆえ、生物学的活性血清は長期記憶の形成を刺激し、この効果を特に閉鎖室および水からの逃避反応の減速した動物において示す。さらに、Ｈコリン受容性脳メカニズムは、長期記憶の維持において重要な役割を担い、Ｈコリン受容性脳メカニズムに負に影響する物質の効果を、本発明の生物学的活性血清によってアンタゴナイズすることができるようである。
【００９５】
実施例３
てんかん
毒性投与量のショウノウが中枢神経系の運動野の活性化過剰を導き、これが強直性けいれんの発達を引き起こすことが当該分野において知られている。このことの故に、ショウノウはけいれんの発生の動物モデルにおいてコラゾール（corazole）に加えて使用される。投与するショウノウの用量に依存して、大発作を含む小および大てんかん性発作の全ての様相を引き起こすことが可能である。
【００９６】
実験において、ラットの腹腔中にショウノウを注射することによって誘発されたてんかん活性に対する生物学的活性血清の影響を研究した。体重１９０〜２１０ｇの雄性Ｗｉｓｔａｒラット４０匹を本実験に使用した。ショウノウ油の溶液（２０％）を腹腔中に０．２５〜０．５ｍｌの量で注射した（２０匹のラットを使用）。血清を１００±５．０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で注射した（２０匹のラットを使用）。
【００９７】
発作を観察し、専門家が評価した。以下のパラメーターを評価した。反応の潜伏期、けいれん反応の型（強直−間代性、大および小発作）、てんかん性発作の長さおよびその間隔、正常移動性の喪失ならびに最終結果（動物の死亡または病理学的状態からの回復）。結果を表６にまとめる。
【００９８】
【表６】
2007514706.tif 000007
【００９９】
１００ｍｇ／ｋｇの投与量の生物学的活性血清を、ショウノウの注射によって引き起こされたてんかん性発作の潜伏期に投与し、発作活性の全ての徴候が減少した：発作活性の潜伏期が増加し、正常移動性の喪失なしに間代性けいれんがより重篤でなくなり、さらに電気ショックで処理した血清は重篤なてんかんのモデルの動物の死亡を防止した（全ての動物が２０％ショウノウ溶液０．５ｍｌの投与を生き延びた）。
【０１００】
実施例４
ヒト細胞増殖に対する本発明の血清の効果
本発明の血清はグレードＩＩ〜ＩＩＩの電気ショックおよびγ線照射で処理した凍結乾燥ニワトリ血液である。生物学的活性血清を以下の２つの製剤型で使用した：（ｉ）１００ｍｇ／ｍｌの濃度で水に再懸濁した血清（試験画分１）および（ｉｉ）水中１００ｍｇ／ｍｌの生物学的活性血清の懸濁物を１００００×ｇで３分間遠心分離した後の懸濁物の上清（試験画分２）。
【０１０１】
細胞培養
ＪｕｒｋａｔおよびＲａｊｉ細胞株の細胞ならびにヒト末梢血リンパ球はプラスチック組織培養プレート（NuncまたはFalcon）で１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Gibco）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有する１６４０−ＲＰＭＩ培地（Sigma）中、温度３７℃、ＣＯ２含量５％および湿度９５％で培養した。細胞株Ｂｒｏ、ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、Ｍｇ６３、ＨＴ１０８０、ＩＭＲ−３２およびＨｅｐＧ２は上記のように培養したが、１６４０−ＲＰＭＩ培地の代わりにＤＭＥＭ培地（Sigma）を使用した。
【０１０２】
Boyumの方法による単核白血球（ＭＬ）の単離
単核白血球をBoyum A.（Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood, 1968, Cand. J. Lab. Clin. Invest., 120 (97): 9-18）よって記載される方法に従って単離した。
【０１０３】
１５ｍｌのFicoll-pack溶液を２本の円錐試験管（Falcon）のそれぞれに入れ、次いでリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈した血液２５ｍｌをFicollにアプライした。次いで、試験管を４００×ｇ、２０℃で３０分間Baket-Rotor中でスピンした。血漿を含む上相は使用しなかった。
【０１０４】
血漿と分離媒体との間の界面に濃縮された単核白血球（ＭＬ）をピペットを用いて慎重に吸い取り、遠心管中に採集した。その後、細胞を２５０×ｇで１０分間スピンし、最後にそれを培養培地中に懸濁することによって細胞をＰＢＳで２回洗浄した。この画分は１０〜３０％の単球および８０〜９０％のリンパ球（以下「リンパ球」と称する）を含んでいた。リンパ球の一部を本発明の生物学的活性血清のマイトジェン活性を研究するために使用し、他を増殖の研究のために使用した。この目的で、フィトヘマグルチニンを２０ｍｇ／ｍｌの濃度で細胞懸濁物に添加した。
【０１０５】
細胞中のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）合成量の評価
ＤＮＡの合成を評価するために、３Ｈチミジンを細胞に添加し、取り込まれたカウントについて酸不溶性画分を評価した。簡潔に記載すると、リンパ球を９６ウェルプレート中で２００〜８００×１０３細胞を含む２００μｌの培地を用いてインキュベートした。各々のウェルに異なる濃度の本発明の生物学的活性血清を添加した。３Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル、４０ｍＣｉ／ｍｍｏｌ）をインキュベーション停止の２時間前に添加した。放射測定アッセイのために、細胞収集のための自動化装置を用いて細胞をフィルター上に収集した。酸可溶性物を５％トリフルオロ酢酸（Ｈ２Ｏ）を用いて洗浄除去し、保持された物質の放射能をシンチメーター（scintimeter）を用いて測定した。ＤＮＡ生合成量をカウント／分で測定した。
【０１０６】
ＭＴＴ試験を使用した異なる物質とのインキュベーション後の細胞生存の測定
Mosmann T.（Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays (1983) J. Immunol. Meth. 65: 55-63）によって記載されるようにＭＴＴ試験を実施した。
【０１０７】
試験を実施するために、細胞を対数増殖期で採集した（接着細胞を、それらが組織培養プレートの約半分を満たした時点で採集した）。これをGorjaewチャンバー中の増殖培地に入れ、計数し、次いで培地に５０〜１００×１０６／ｍｌの濃度で再懸濁した。種々の濃度の試験画分を総量１００μｌ中で添加した後、細胞溶液を９８ウェルプレート中に入れた。生存細胞を計数するために、培養培地中の３−４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の溶液５０μｌを、インキュベーション停止後に、異なる９６ウェルプレートの各々に添加した。ＭＴＴ溶液の調製のために、１ｍｌのＭＴＴストック溶液を４ｍｌの培養培地と混合した。ＭＴＴストック溶液の調製は、ＭＴＴをＰＢＳ（ＰＢＳは０．０１ｍｍｏｌ／ｌのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４を０．１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌとともに含む）中に５ｍｇ  ＭＴＴ／ｍｌの濃度で溶解し、その後ポアサイズ０．４５μｍのフィルターを通してろ過することによって実施した。ストック溶液を＋４℃で１ヶ月まで貯蔵した。ＭＴＴ溶液の添加後、組織培養プレートをさらに４時間インキュベーター中で同一条件下でインキュベートした。次工程として、培養培地をポンプを用いた吸引により除去し、１５０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を各々のウェルに添加して、形成されていた青色のホルマザン結晶を溶解し、各々のウェル中の溶液の光学濃度を５４０ｎｍの波長でマイクロプレートリーダーを有するマルチチャンネル分光光度計（Labsystem）を用いて検出した。添加した試験画分１および２それぞれの濃度に関連しての細胞の生存率を、対照細胞の生存の百分率で示す。データをコンピューターソフトウェア「Origin」を用いて処理した。
【０１０８】
結果および考察
結果を図１〜８に示す。これらの結果から以下を導くことができる：高濃度の本発明の生物学的活性血清（２．５〜２０ｍｇ／ｍｌ）は全ての細胞株に対して阻害効果を有したが、試験画分１および２それぞれに対する異なる組織型由来の細胞の反応は異なる。ＩＣ５０用量（５０％の細胞阻害を導く物質の濃度）は、試験物質１については２．２（Ｊｕｒｋａｔ）〜＞２０ｍｇ／ｍｌ（Ｍｇ６３）の範囲で、本発明の血清の可溶性画分（試験画分２）については３．６（末梢血リンパ球）〜＞２０ｍｇ／ｍｌ（Ｍｇ６３およびＨｅＬａ）の範囲で、細胞株間で実質的に異なる。全ての細胞株について、出発物質（試験画分１）の傷害性は、可溶性物質（試験画分２）の傷害性より高かった。しかし、個々の細胞株について観察された傷害性は両方の試験画分についてほぼ同じであり（Ｍｇ６３、Ｒａｊｉｉ、末梢血リンパ球）、他（Ｊｕｒｋａｔ、ＭＣＧ−７、ＩＭＲ−３２）についても２〜３倍のＩＣ５０の差が存在したことに言及すべきである。一般的なガン剤ドキソルビシンに比較しての試験画分に対する細胞の感受性を表７に示す。
【０１０９】
【表７】
2007514706.tif 000008
【０１１０】
さらに、０．３〜３ｍｇ／ｍｌの濃度範囲で、細胞株および物質の形態（すなわち、試験画分１または試験画分２）に依存して、薬剤がいくつかの細胞に対して刺激効果を有することが観察された。本発明の血清の刺激効果が、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｂｒｏ  Ｂ−１９、Ｍｇ６３、ＨＴ１０８０およびＨｅｐＧ２細胞について観察された。刺激効果は有意ではなかったが（１０、２０、４０％）、試験物質の両方の形態について存在した。細胞株ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、ＪＭＲ−３２の細胞および末梢血リンパ球については刺激は観察されなかった。その第１形態の試験物質の刺激効果は、可溶性画分（試験画分２）についてよりずっと低い濃度で観察できた。おそらく、この刺激の理由は、増殖の刺激自体ではなく、むしろ、これもまた細胞生存率の評価に使用したＭＴＴ法で検出可能である細胞の呼吸の増加である。観察された刺激効果が増殖の刺激に起因するのか、または呼吸の増加に起因するのかどうかの疑問は、いくらかのさらなる研究を必要とした。
【０１１１】
異なる物質と免疫適格細胞との間の相互作用を研究する場合、一般に少なくとも以下の２つの疑問を考察しなければならない：
１．試験物質がマイトジェン活性を有するか、すなわち、それがリンパ球増殖を刺激する能力を有するか（この場合、物質の量の増加は通常リンパ球のＤＮＡ生合成の増加を導き、これは３Ｈチミジンの取り込みによって評価することができる）。
２．試験物質が傷害性効果を有するか（この疑問は通常マイトジェンで事前に刺激したリンパ球について、取り込まれる３Ｈチミジンの量によってまたはＭＴＴタイプの生命染色を使用してアッセイされるリンパ球増殖の阻害によって決定される）。
【０１１２】
さらに、非活性化リンパ球は培養物中で増殖せず、増殖の量は培養培地に添加したマイトジェン量の増加とともにのみ増加することに言及しなければならない。これは放射性標識ＤＮＡの増加に反映される。
【０１１３】
投与用量に関連してのリンパ球に対するマイトジェンの効果をいわゆる「ベル曲線（bell curve）」によって示すことができる（図９参照）。ベル曲線の第１区域は、マイトジェンの増加が増殖の増加（ＤＮＡ生合成により測定される）を導き、それゆえマイトジェン濃度と増殖との間の直接的関係が存在するマイトジェン濃度の範囲を反映する。曲線の第２区域（２）は、マイトジェン濃度のさらなる増加が増殖のさらなる増加を導かない、すなわちマイトジェンがすでにその最大効果を誘起している飽和効果示す。細胞傷害活性は未だ観察されない。区域（３）は、マイトジェンがリンパ球に対して漸増する細胞傷害効果を発揮するマイトジェン濃度の範囲を示す。
【０１１４】
試験画分１および２のマイトジェン活性の評価を以下の２つの実験において実施した：
１．本実験の課題は、非活性化ヒト末梢血リンパ球に対する試験画分の効果の決定であった。この目的のために、増殖活性（すなわち効果）の投与用量との相関関係を決定した。
２．本実験の課題は、第２期においてフィトヘマグルチニン（ＦＨＡ  ２０μｇ／ｍｌ）により活性化されるリンパ球のＤＮＡ合成量に対する試験物質の効果の決定であった。
【０１１５】
物質を検討した場合、マイトジェン活性は観察されなかった。すなわち、０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの物質濃度範囲内では、末梢血リンパ球のＤＮＡ生合成の刺激は観察されなかった（図１０）。
【０１１６】
試験画分の用量の増加の際に、抹消血リンパ球数は有意には変化しなかった。リンパ球（次いで２０ｍｇ／ｍｌ  ＦＨＡで活性化した）に対する試験画分の効果を評価すると、試験画分による活性化リンパ球の阻害が観察された。
【０１１７】
実験において、試験画分が刺激リンパ球のＤＮＡ生合成を０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で阻害することが決定された（図１１）。しかし、作用メカニズムはなお決定する必要がある。それゆえ、細胞分裂抑制および細胞傷害効果を解明するためのさらなる実験が重要である。
【０１１８】
細胞培養において得られた結果がヒト対象の処置にどのように関係するかを決定するために、動物実験における異なる器官または組織中の物質濃度を決定することが重要である。これに関して、本発明の生物学的活性血清の異なる濃度のどれが、リンパ球生成に関与する器官におけるＤＮＡ合成に影響し得るかを研究することが重要である。従って、特に、マウスの骨髄、脾臓および胸腺における生物学的活性血清の濃度を決定することが重要である。
【０１１９】
リンパ球とは別に、本発明の血清の細胞傷害活性もまた、単細胞層に広げたヒト乳腺ガン細胞株ＭＣＦ−７の細胞を使用して研究した。接触阻害の故に、細胞に増殖は観察されなかった。そのようなモデルにおいて、物質の傷害効果を決定することができる。すなわち、細胞傷害効果を細胞分裂抑制効果から区別することができる。このモデルを使用した場合、本発明の血清が細胞傷害効果を、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、本発明の血清の不溶性画分が除去されたか否かの事実にかかわらず、すなわち試験画分１または２を使用したかどうかにかかわらず有することが決定された。
【０１２０】
本発明の血清を増殖細胞とともにインキュベートした場合に傷害効果が顕著に低下することは注目に値する。このことは、効果が増殖細胞の場合のような投与の７２時間後ではなく投与の２４時間後に測定されたという事実に潜在的に関連する（単層細胞のインキュベーションの延長は対照細胞の死滅を導き得る）。
【０１２１】
上記の結果は、本発明の生物学的活性血清が細胞分裂抑制効果および細胞傷害活性の両方を有することを示す。しかし、細胞傷害活性は、同じ濃度で観察はされたが、細胞傷害および細胞分裂抑制活性の合計ほど顕著ではなかった。
【０１２２】
総合すると、グレードＩＩ〜ＩＩＩの電気ショックで処理した動物由来の血清および次いで調製した生物学的活性物質は、対照群と比較した場合、ヒト細胞株Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ、Ｂｒｏ  Ｂ−１９、Ｍｇ６３、ＨＴ１０８０およびＨｅｐＧ２の増殖の１０〜４０％の増加を導く。ＨｅＬａ、ＭＣＦ−７、ＪＭＲ−３２および末梢血リンパ球において、本発明の生物学的活性血清は、より高い投与量（２．５〜２０ｍｇ／ｍｌ）で全ての試験したヒトガン細胞株の有意な増殖阻害を示した。本発明の生物学的活性血清に対する細胞の感受性は、広く使用されている抗ガン剤ドキソルビシンに対する感受性よりずっと強い。さらに、マーカーとして３Ｈチミジン取り込みによって評価されるＤＮＡ生合成を使用する場合、本発明の物質は細胞分裂抑制および細胞傷害効果の両方を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｊｕｒｋａｔに対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図２】Ｒａｊｉ細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＢ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｊｉに対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。Ｒａｊｉ細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図３】Ｂｒｏ  Ｂ−１９細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株Ｂｒｏ  Ｂ−１９に対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。Ｂｒｏ  Ｂ−１９細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図４】ＨｅＬａ細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＨｅＬａに対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。ＨｅＬａ細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図５】ＭＣＦ−７細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＭＣＦ−７に対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。ＭＣＦ−７細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図６】ＩＭＲ−３２細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＩＭＲ−３２に対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。ＩＭＲ−３２細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図７】ＨＴ１０８０細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＨＴ１０８０に対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。ＨＴ１０８０細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図８】ＨｅｐＧ２細胞に対する２つの医薬調製物の細胞傷害効果。ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株ＨｅｐＧ２に対する細胞傷害効果を、種々の濃度の本発明の生物学的活性血清を含む２つの異なる医薬調製物について示す。ＨｅｐＧ２細胞の生存率をｙ軸に百分率で示し、生物学的活性血清の量をｘ軸にｍｇ／ｍｌで示す。
【図９】マイトジェンで処理した細胞の増殖活性の「ベル」曲線。リンパ球の増殖活性の曲線をＤＮＡ生合成量に基づいてマイトジェンの濃度との関連でアッセイする。ＤＮＡ生合成活性を放射能取り込み量および酸不溶性カウント毎分によって測定する。
【図１０】薬理学的組成物のマイトジェン活性。０．１〜１００．０ｍｇ／ｍｌの物質濃度範囲内でのＤＮＡ生合成量に対する医薬組成物のマイトジェン効果を示す。ＤＮＡ合成量をＤＮＡ中に取り込まれる放射能量に基づいて評価する。
【図１１】ＭＣＦ−７細胞に対する薬学的組成物の効果。ヒト乳腺ガン細胞株ＭＣＦ−７におけるＤＮＡ合成量を薬理学的組成物中に含まれる生物学的活性血清の量との関連で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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