(57)【要約】  本発明はホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の診断に加えて、ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患を予防および／または治療する薬剤の製造におけるＥＲβモジュレータの使用に関する。本発明はホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の予防および／または治療におけるそれらの使用のための薬剤のスクリーニング法をも教示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患を予防および／または治療する薬剤の製造におけるエストロゲン受容体β（ＥＲβ）モジュレータの使用。
【請求項２】
ＥＲβモジュレータがＥＲβに拮抗する／または作用する請求項１における使用。
【請求項３】
ＥＲβモジュレータがＥＲβアゴニストである請求項１における使用。
【請求項４】
ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患を予防および／または治療する薬剤の製造における７‐ヒドロキシステロイドおよび／または７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の使用。
【請求項５】
７‐ヒドロキシステロイドが７α‐ヒドロキシステロイドおよび／または７β‐ヒドロキシステロイドである請求項４における使用。
【請求項６】
ステロイドが以下の化合物からなるグループから選択される請求項５における使用；
i）７α‐ヒドロキシ‐ＤＨＥＡ（７ＤＨ）
ii）７α‐ヒドロキシ‐プレグネノロン
iii）７α‐ヒドロキシ‐β‐エストラジオール
iv）７α，３β，１７β‐アンドロステントリオール
v）７α，３β，１７β‐アンドロスタントリオール
vi）７α‐ヒドロキシコレステロール
vii）７α‐２５‐ヒドロキシコレステロール
viii）７α‐２４‐ヒドロキシコレステロール
ix）７α‐２７‐ヒドロキシコレステロールおよび
x）他の７α‐ジ‐ヒドロキシ型および７α‐マルチ‐水酸化型コレステロール。
【請求項７】
薬剤を薬剤学的に許容しうる担体または希釈剤とともに投与する先行するいずれかの請求項における使用。
【請求項８】
薬剤を直接または局所的に前立腺および／または乳房に投与する請求項１−４における使用。
【請求項９】
ホルモン依存性腫瘍が前立腺癌あるいは乳癌である請求項１−４における使用。
【請求項１０】
増殖性疾患が前立腺あるいは乳房の疾患である請求項１−４における使用。
【請求項１１】
前立腺の疾患が前立腺の発達または前立腺加齢の疾患である請求項１０における使用。
【請求項１２】
前立腺の疾患が良性前立腺肥大症（ＢＨＰ）および／または前立腺炎である請求項１０における使用。
【請求項１３】
７‐ヒドロキシステロイドを生成する酵素がオキシステロール７α‐ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ｂ）である請求項４における使用。
【請求項１４】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素が改変されている請求項４における使用。
【請求項１５】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素が基質親和性を改善するように改変されている請求項１４における使用。
【請求項１６】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素が遺伝子組換えまたは合成によって生成されたものである請求項４における使用。
【請求項１７】
前記７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素を適切な基質と接触させることにより７‐ヒドロキシステロイドを供給する請求項４における使用。
【請求項１８】
前記７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素を含む細胞を適切な基質と接触させることにより７‐ヒドロキシステロイドを供給する請求項４における使用。
【請求項１９】
細胞が前記７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素をコードする遺伝子を含むベクターにより形質転換されたものである請求項１８における使用。
【請求項２０】
適切な基質が７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素により７‐ヒドロキシステロイドに変換され得る化合物である請求項１７と１８における使用。
【請求項２１】
適切な基質が以下の化合物からなるグループから選択される請求項２０における使用；
i）デヒドロエピアンドステロン（ＤＨＥＡ）
ii）３β‐アンドロスタンジオール
iii）３β‐アンドロステンジオール；および
iv）β‐エストラジオール
【請求項２２】
ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患を治療する薬剤の製造における７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素をコードする核酸の使用。
【請求項２３】
核酸が核酸ベクター内に含まれている請求項２２における使用。
【請求項２４】
薬剤を薬剤学的に許容しうる担体とともに投与する請求項２２における使用。
【請求項２５】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素がオキシステロール７α‐ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ｂ）である請求項２２における使用。
【請求項２６】
７‐ヒドロキシステロイドの濃度または７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度を検出するまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素をコードする塩基配列における変異を検出する以下のステップを含む方法；
d)患者由来サンプルの提供；
e)７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度検出あるいは前記酵素をコードする核酸の塩基配列の確認；および
f)前記検出濃度または前記核酸の塩基配列の正常濃度または正常塩基配列との比較。
【請求項２７】
ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の治療に用いられる薬剤の効力の検出に用いる請求項２６による方法。
【請求項２８】
腫瘍の進行段階の確認に用いる請求項２６の方法。
【請求項２９】
患者が健康な人、ホルモン依存性腫瘍または他の増殖性疾患の罹患が疑われる人、それらに罹患する素因のある人、または罹患している人である請求項２６の方法。
【請求項３０】
サンプルが生検である請求項２６の方法。
【請求項３１】
生検が前立腺生検または乳房組織生検である請求項３０の方法。
【請求項３２】
サンプルが体液である請求項２６の方法。
【請求項３３】
サンプルが以下のものからなるグループから選択される請求項３２の方法；
i）血液；
ii）尿；および／または
iii）精液。
【請求項３４】
正常塩基配列が７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる機能性酵素をコードする請求項２６の方法。
【請求項３５】
正常塩基配列が前記機能性酵素に影響する変異を含まない塩基配列である請求項２６の方法。
【請求項３６】
７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度を免疫学的検出技術によって検出する請求項２６の方法。
【請求項３７】
７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度をエライザ法によって検出する請求項３６の方法。
【請求項３８】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度をウエスタンブロット法によって検出する請求項２６の方法。
【請求項３９】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度をＰＣＲおよび関連技術、例えばＲＴ‐ＰＣＲ、定量的ＰＣＲおよび定量的ＲＴ‐ＰＣＲによって検出する請求項２６の方法。
【請求項４０】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度を分光光度分析および酵素反応によって検出する請求項２６の方法。
【請求項４１】
患者において、７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素と相互作用できる分子を患者へ投与し、前記分子及び前記７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素からなる複合体を検出することからなる、７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素を検出する方法
【請求項４２】
７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素と相互作用できる分子が抗体である請求項４１の方法。
【請求項４３】
分子または抗体がさらに放射性標識を含む請求項４１と４２の方法。
【請求項４４】
分子または抗体がさらに放射性同位元素を含む請求項４１と４２の方法
【請求項４５】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の活性をモジュレートすることのできる薬剤を同定する以下のステップを含む方法：
c)薬剤を前記酵素によって７‐ヒドロキシステロイドに変換され得る基質の存在下、７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素を含む前立腺細胞と接触させる；および
d)前記酵素によって７‐ヒドロキシステロイドに変換され得る基質の量を検出し前記濃度を正常濃度と比較する。
【請求項４６】
ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の治療および／または予防のための請求項４５の方法によって同定された薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の診断に加えて、ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患を予防および／または治療する薬剤の製造におけるＥＲβモジュレータの使用に関する。本発明はホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の予防および／または治療におけるそれらの使用のための薬剤のスクリーニング法をも教示する。
【背景技術】
【０００２】
アンドロゲン（androgens)は多くの腺、例えば乳房、脳および前立腺の発達と機能に重要な役割を果たし、またホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患例えば、前立腺癌（PCa）および良性前立腺肥大症（BPH）の発症と維持にも関わっている（非特許文献１）。動物モデルとヒトでの最近の研究では、エストロゲン（estrogens）を含む他のステロイドホルモンも前立腺のような腺の成育と疾患にも関わることを示している（非特許文献２、３）。年齢と共に低下する精巣機能は血漿中テストステロン（testosterone：T）の濃度低下をもたらす（非特許文献４）。しかしながら、エストロゲン（17β-エストラジオール：E2）の濃度は脂肪組織のような末梢組織における副腎アンドロゲン、特にデヒドロエピアンドステロン（dehydroepiandosterone：DHEA）（非特許文献５）（図１を参照）の芳香族化（aromatisation）の促進により維持される（非特許文献６）。よって高齢男性においては、遊離Ｅ2と遊離Ｔとの比率は４０％まで増大する（非特許文献７）。中年での内分泌変化は長期間観察され、５０歳代以降の前立腺のような腺にみられる病理と関連している可能性がある（非特許文献１、８、９）。
【０００３】
前立腺において、エストロゲンは２種類のエストロゲン受容体（ER）、ＥＲαおよびＥＲβと相互に作用しあう。この２種類の受容体は種々のエストロゲン様化合物に対するそれらの結合親和性、およびヒト前立腺におけるそれらの局在化において異なる（非特許文献１０〜１３）。ＥＲαは低濃度でのみ発現し、かつ間質に限られ、パラクリン様式で上皮の成育に影響を及ぼす（非特許文献１４）。対照的に、ＥＲβは前立腺上皮に高度に発現される（非特許文献１３）。ヒト前立腺におけるＥＲβの役割は明らかではない。ある研究において、ＥＲβノックアウトマウスが、年齢とともに前立腺肥大症を発症することが報告され（非特許文献１５）ていることから、抗増殖機能が示されている。しかしながら、他のＥＲβノックアウトモデルはこの前立腺表現型を有していない。たとえこれらの研究がＥＲαおよびＥＲβの明らかな役割を示すとしても、これらエストロゲン様作用の原因であるリガンドの同定には至っていない。一方Ｅ2はほとんどの標的細胞においてＥＲβの主要なリガンドであり、ヒト前立腺でのＥ2濃度は非常に低いので、おそらく受容体を活性化できない（非特許文献１６）。このことは前立腺において局所的に生成される他のエストロゲン様リガンドがＥＲβのエストロゲン様活性の原因である可能性を高めている。実際、局所でのステロイド代謝が種々の器官におけるステロイド作用の重要な決定因子である（非特許文献１７）。このように、前立腺における局所での代謝が、ステロイドの生物学的活性の鍵である可能性がある。
【０００４】
最近、げっ歯類の海馬において同定され、かつＤＨＥＡの７α‐ヒドロキシＤＨＥＡ（7HD）への７α‐水酸化を触媒する新規なチトクロームＰ４５０であるオキシステロール７α‐ヒドロキシラーゼ（CYP7B）（非特許文献１８、１９）がげっ歯類の前立腺に高度に発現していることが判明した（非特許文献２０）。ＣＹＰ７Ｂノックアウト動物によって確かめられたように（非特許文献２１、２２、２３）、ＣＹＰ７ＢはＤＨＥＡの７α‐水酸化にとって唯一の経路であり、前立腺と脳においてはＤＨＥＡの７α‐水酸化の残渣すらみられない（非特許文献２２）。Ｐ４５０の中でも肝臓よりも特異な肝外組織、特に海馬および前立腺（非特許文献１９）において高度に発現されているという点でＣＹＰ７Ｂは通常とは異なっている。７α‐ヒドロキシラーゼ活性はヒトでも報告されているが（非特許文献２４）、ほとんどの組織においてこの反応原因となる酵素は不明である。
【０００５】
特許文献１（国際特許ＷＯ９７／３７６６４号公報）は神経精神疾患、免疫疾患または内分泌疾患を治療するために７α‐置換ステロイドおよび酵素ＣＹＰ７Ｂの使用を開示しているが、前立腺疾患の治療におけるこのようなステロイドまたは酵素ＣＹＰ７Ｂの使用の記載は開示されていない。
本発明はヒト前立腺におけるＣＹＰ７Ｂの発現が７αＨＤを産生するＤＨＥＡ代謝にとって主要経路であるという本発明者らによる観察に基づいている。
【０００６】
【特許文献１】国際特許ＷＯ９７／３７６６４号公報
【非特許文献１】Bosland MC 2000 The role of steroid hormones in prostate carcinogenesis. J Natl Cancer Inst Monogr 27: 39-66
【非特許文献２】Schweikert HU, Tunn UW, Habenicht UF, Arnold J, Senge T, Schulze H, Schoder FH, Blom JHM, Ennemoser O, Horniger W, Bartsch G 1993 Effects of estrogen deprivation on human benign prostatic hyperplasia. J Steroid Biochem Mol Biol 44: 573-576
【非特許文献３】Jarred RA, Cancilla B, Prins GS, Thayer KA, Cunha GR, Risbridger GP 2000 Evidence that estrogens directly alter androgen-regulated prostate development. Endocrinology 141: 3471-3477
【非特許文献４】Ferrini RL, Barett-Connor E 1998 Sex hormones and age: a cross-sectional study of testosterone and estradiol and their bioavailable fractions in community-dwelling men. Am. J Epidemiol 147: 750-754
【非特許文献５】Labrie C, Belanger A, Labrie F 1988 Androgenic activity of dehydroepiandrosterone and androsterone in the rat ventral prostate. Endocrinology 123: 1412-1417
【非特許文献６】Nelson LR, Bulun SE 2001 Estrogens production and actions. J Am Acad Dermatol 45: S116-124
【非特許文献７】Ekman P 2000 The prostate as an endocrine organ: Androgens and estrogens. Prostate 10: 14-18
【非特許文献８】Risbridger G P, Bianco JJ, Ellem SJ, McPherson SJ 2003 International congres on hormonal steroids and hormones ans cancer: Estrogens and prostate cancer. End Related Cancer 10: 187-191
【非特許文献９】Leav I, Ho SM, Ofner P, Merk FB, Kwan PW, Damassa D 1988 Biochemical alterations in sex hormone-induced hyperplasia and dysplasia of the dorsolateral prostates of Noble rats. J Nat Cancer Inst 80: 1045-1053
【非特許文献１０】Kuiper GG, Carlsson B, Grandien K, Enmark E, Haggblad J, Nilsson S, Gustafsson JA 1997 Comparison of the ligand binding specificity and transcript tissue distribution of estrogen receptor α and β. Endocrinology 138: 863-870
【非特許文献１１】Brolin J, Skoog L, Ekman P 1992 Immunohistochemistry and biochemistry in detection of androgen, progesterone, and estrogen receptors in benign and malignant human prostatic tissue. Prostate 20: 281-295
【非特許文献１２】Horvath LG, Henshall SM, Lee CS, Head DR, Quinn DI, Makela S, Delprado W, Golovsky D, Brenner PC, O'Neill G, Kooner R, Stricker PD, Grygiel JJ, Gustafsson JA, Sutherland RL 2001 Frequent loss of estrogen receptor-β expression in the prostate cancer. Cancer Res 61: 5331-5335
【非特許文献１３】Leav I, Lau KM, Adams JY, McNeal JE, Taplin ME, Wang J, Singh H, Ho SM 2001 Comparative studies of the estrogen receptors beta and alpha and the androgen receptor in normal human prostate glands, dysplasia, and in primary and metastatic carcinoma. Am J Pathol. 159: 79-92
【非特許文献１４】Risbridger G, Wang H, Young P, Kurita T, Wang YZ, Lubahn D, Gustafsson JA, Cunha G, Wong YZ 2001 Evidence that epithelial and mesenchymal estrogen receptor-alpha mediates effects of estrogen on prostatic epithelium. Dev Biol 229: 432-442
【非特許文献１５】Weihua Z, Makela S, Andersson LC, Salmi S, Saji S, Webster JI, Jensen EV, Nilsson S, Warner M, Gustafsson JA 2001 A role for estrogen receptor beta in the regulation of growth of the ventral prostate. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 6330-6335
【非特許文献１６】Ghanadian R, Puah CM 1981 Relationships between oestradiol-17 beta, testosterone, dihydrotestosterone and 5 alpha-androstane-3 alpha, 27 beta-diol in human benign hypertrophy and carcinoma of the prostate. J Endocrinol 88: 255-262
【非特許文献１７】Seckl JR, Walker BR 2001 Steroid metabolism. Bailliere's Clinical Endocrinology and Metabolism. Vol 15.1 Bailliere Tindall, London; 122
【非特許文献１８】Stapleton G, Steel M, Richardson M, Mason JO, Rose KA, Morris RG, Lathe R 1995 A novel cytochrome P450 expressed primarily in the brain. J Biol Chem 270: 29739-45
【非特許文献１９】Rose KA, Stapleton G, Dott K, Kieny MP, Best R, Schwarz M, Russell DW, Bjoorkheim I, Seckl JR, Lathe R 1997 Cyp7b, a novel brain cytochrome P450, catalyses the synthesis of neurosteoids 7α-hydroxy-DHEA and 7α-hydroxy-PREG. Proc Natl Acad Sci USA 94: 4925-4930
【非特許文献２０】Martin C, Bean R, Rose K, Habib FK, Seckl JR 2001 CYP7B1 catalyses the 7α-hydroxylation of dehydroepiandrosterone and 25-hydroxycholesterol in rat prostate. Biochem J 355: 509-515
【非特許文献２１】Li-Hawkins J, Lund EG, Turley SD, Russell DW 2000 Disruption of the oxysterol 7alpha-hydroxylase gene in mice. J Biol Chem 275: 16536-16542
【非特許文献２２】Rose K, Allan A, Gauldie S, Stapleton G, Dobbie L, Dott K, Martin C, Wang L, Hedlund E, Gustafsson JA, Seckl J, Lathe R 2001 Targeting the gene encoding mouse neurosteroid hydroxylase CYP7B: vivid reporter activity in dentate gyrus and abolition of a major pathway of steroid and oxysterol hydrolation. J Biol Chem 276: 23937-23944
【非特許文献２３】Weihua Z, Lahe R, Warner M, Gustafsson JA 2002 An endocrine pathway in the prostate, ERbeta, AR, 5alpha-androstane-3beta, 17beta-diol, and CYP7B1, regulates prostate growth. Proc Natl Acad Sci USA 99: 13589-13594
【非特許文献２４】Li K Foo T, Adams JB 1978 Products of dehydroepiandrosterone metabolism by human mammary tumors and their influence on estradiol receptor binding. Steroids 31: 113-127
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
つまり本発明はＥＲβの活性をモジュレートする薬剤に関する。さらに詳細にいえば本発明はＥＲβをモジュレートできる７‐ヒドロキシステロイドおよび７‐ヒドロキシステロイドを生成する酵素に関する。７‐ヒドロキシステロイド生成を触媒することのできる酵素の濃度が低下している時（例えば老人あるいは前立腺疾患の患者において）、前立腺におけるエストロゲンとアンドロゲンとの間のバランスはアンドロゲン経路に有利に変化し、７‐ヒドロキシステロイド（ERβアゴニスト）の生成低下をもたらす。それに付随して７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の発現低下は、強力なアンドロゲンの合成にとって前立腺内の例えばネイティブＤＨＥＡの利用可能性を高める。
【０００８】
ＥＲβはＥＲαの転写活性を抑制する能力を有するとされる。さらにＥＲβへの結合によって、７‐ヒドロキシステロイドは間質区画のＥＲα活性をモジュレートすることができしたがって間質細胞の発育をコントロールできる。また、ＥＲβは前立腺の発癌およびアンドロゲン依存性腫瘍発育両者の初期相のモジュレートに加えて、前立腺細胞の分化と増殖において役割を果たしている。このように、７‐ヒドロキシステロイドおよび７‐ヒドロキシステロイド生成を触媒することのできる酵素は活性ステロイドの前立腺内濃度の制御において重要な役割を果たしており、ホルモン依存性癌および他の増殖性疾患例えば前立腺疾患の予防または臨床での治療において有用なツールである可能性がある。
【０００９】
７‐ヒドロキシステロイドはエストロゲン受容体ＥＲβに対するアゴニストであると考えられる。ＥＲβの発現は多くの組織例えば脳、乳房および特に前立腺の上皮において観察される（非特許文献１３）。in vivoにおいて同様に分布するもう一種のエストロゲン受容体のＥＲαも前立腺の間質に低濃度で発現される。活性化に際し、ＥＲβはＥＲαの転写活性を抑制する能力を有することが判明した。７‐ヒドロキシステロイドが前立腺上皮において選択的に結合してＥＲβをモジュレートすることは本発明者らの観察である。このような７‐ヒドロキシステロイドはＥＲαの転写活性を抑制する効果を有するので、その結果間質細胞の発育をコントロールできる。それ故７‐ヒドロキシステロイドまたは上皮においてＥＲβに結合しその活性をモジュレートする他の化合物はホルモン依存性腫瘍およびその他の増殖性疾患例えば、前立腺癌（PCa）および良性前立腺肥大症（BPH）の治療および／または予防に有用と思われる。
【００１０】
このように第一にホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患を予防および／または治療する薬剤の製造に対しＥＲβの使用を提供する。
【００１１】
モジュレータという場合、ＥＲβに拮抗するかまたは作用する薬剤を意味する。モジュレータは好ましくはＥＲβアゴニストである。
【００１２】
さらに、本発明はホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患を予防および／または治療する薬剤の製造に対し７‐ヒドロキシステロイドおよび／または７‐ヒドロキシステロイドを生成する酵素の使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
このような薬剤の製造において好ましいステロイドは７α‐ヒドロキシステロイドおよび７β‐ヒドロキシステロイド、より具体的には例えば、７α‐ヒドロキシ‐ＤＨＥＡ（7DH）、７α‐ヒドロキシ‐プレグネノロン、７α‐ヒドロキシ‐β‐エストラジオール、７α，３β，１７β‐アンドロステントリオール、７α，３β，１７β‐アンドロスタントリオール、プラス  ７α‐ヒドロキシコレステロール、７α‐２５‐ヒドロキシコレステロール、７α‐２４‐ヒドロキシコレステロール、７α‐２７‐ヒドロキシコレステロールおよび他の７α‐ジ‐ヒドロキシ型および７α‐マルチ‐水酸化型コレステロールを含む。
【００１４】
このような治療は、薬剤学的に許容しうる担体または希釈剤とともに７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒できる酵素の、患者への投与を含む。これはホルモン依存性腫瘍または他の増殖性疾患の予防および／または治療にこのような治療の必要な患者に対して、例えば消化管投与（例えば経口投与）、経粘膜投与、非経口投与、経皮投与、吸入または局所投与または座薬としての投与にと、それぞれ適切な剤形に調剤できる。好ましい投与経路は適切な腺、例えば７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒できる酵素に対する標的として前立腺が好都合である。
【００１５】
ＥＲβをモジュレートできる化合物、７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒できる酵素の患者への投与効果は、罹患した前立腺においてエストロゲンとアンドロゲン間のバランスを是正する効果およびＥＲα活性をモジュレートする、例えば、前立腺における間質細胞の発育をコントロールする効果と考えられる。例えば前立腺疾患の治療の場合、身体の他の部位、例えば脳で形成される７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒できる酵素に影響しないようにまたは影響が最小限となるように、前立腺または前立腺の近傍への直接投与または局所投与が好ましい。
【００１６】
上述薬剤／製剤により治療できる可能性のあるホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の例は乳癌のような疾患に加えて前立腺の疾患、例えば良性前立腺肥大症（BPH）、前立腺炎および前立腺癌（PCa）、前立腺の成育および前立腺加齢の疾患を含む。
【００１７】
望ましい様式で機能する酵素の例は熟練した読者に明白な国際特許ＷＯ９７／３７６６４号公報で開示されているように、Ｐ４５０チトクローム酵素の一種であるＣＹＰ７Ｂを含む。しかしながら十分確立した技術を用いる当業者は、酵素活性を改変する多くの方法で前記酵素を操作し得るであろうと理解される。酵素改変の例は基質に対してより大きな親和性を与えるための、活性部位でのアミノ酸の改変を含む。このことは部位特異的突然変異誘発または他のＰＣＲに基づいた方法（マニアティス（Maniatis）ら、1989年）のような当該技術においてよく知られた技術を用いて達成できる。このような改変法の詳細は国際特許ＷＯ９７／３７６６４号公報においても示されている。
【００１８】
酵素に関していえば、酵素が蛋白質、ペプチド、それらの断片または一部、および前記蛋白質、ペプチド、それらの断片または一部をコードする核酸を含むであろうことは、無論のこと言うまでもない。蛋白質、ペプチド、それらの断片または一部、例えばＣＹＰ７Ｂが７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することもできることは、無論のこと言うまでもない。
【００１９】
ここで述べたすべての蛋白質、ペプチド、それらの断片または一部は、例えば遺伝子組換えによって発現させることができる。すなわち前記蛋白質、ペプチド、それらの断片または一部をコードする発現可能な核酸を細菌、例えば大腸菌および真核生物、例えば、酵母、昆虫または哺乳類の細胞のような適切な細胞に導入することができる。前記蛋白質は当該技術において知られた適切な技術を用いて、適切な細胞から精製することもできる。当業者は７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の生成を可能にする国際特許ＷＯ９７／３７６６４号公報の教示を理解することができるであろう。具体的には国際特許ＷＯ９７／３７６６４号公報は本発明者らの観察の結果として、ホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の治療に有用な可能性のある７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素ＣＹＰ７Ｂの生成を容易にする情報を当業者に提供する。
【００２０】
ホルモン依存性腫瘍または他の増殖性疾患の治療および／または予防において用いられるステロイドは、７‐ヒドロキシステロイド、好ましくは７α‐ヒドロキシステロイド、具体的には例えば、７α‐ヒドロキシ‐ＤＨＥＡ（7DH）、７α‐ヒドロキシ‐プレグネノロン、７α‐ヒドロキシ‐β‐エストラジオール、７α，３β，１７β‐アンドロステントリオール、７α，３β，１７β‐アンドロスタントリオール、それらのすべての７β‐水酸化型、プラス  ７α‐ヒドロキシコレステロール、７α‐２５‐ヒドロキシコレステロール、７α‐２４‐ヒドロキシコレステロール、７α‐２７‐ヒドロキシコレステロールおよびコレステロールの他の７α‐ジ‐ヒドロキシ型および７α‐マルチ‐水酸化型である。このようなステロイドは合成によって、または例えば、遺伝子組換えによって生成された前記７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素、例えばＣＹＰ７Ｂを用いることによって生成することができる。７‐ヒドロキシステロイドを生成するために、適切な基質、例えば直接に前記酵素、または例えば細胞培養などに添加される。前記細胞培養等は、前記基質から７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することもできる前記酵素あるいは蛋白質、ペプチド、それらの断片、あるいは一部をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換した細胞からなる。
【００２１】
基質に関しては、７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素によって７‐ヒドロキシステロイドに変換され得る化合物を意味する。例えばプレグネノロン、デヒドロエピアンドステロン（DHEA）、３β‐アンドロスタンジオール、３β‐アンドロステンジオールおよびβ‐エストラジオールは、７‐ヒドロキシステロイド生成を触媒することのできる酵素によって、７‐ヒドロキシステロイドに変換され得る、いずれも適切な基質である。本発明の他の態様として、７‐ヒドロキシステロイドおよび／または７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の有効量を、それらを必要とする患者に投与することからなるホルモン依存性腫瘍または他の増殖性疾患に罹患している、または罹患する素因を有する患者における治療法および／または予防法を提供する。
【００２２】
本発明のさらに別の態様として、７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素をコードする機能異常遺伝子を有する患者の治療手段を提供する。“異常”という場合正常な腺、例えば前立腺において発現される遺伝子と異なる様式で、ある手段、例えば抑圧によって前記遺伝子の、例えば変異またはダウンレギュレーションの結果として機能する遺伝子を意味する。このような治療は前記酵素をコードし、正常に機能する遺伝子を含む適切なベクターの腺への投与からなる。“正常に機能する”という場合正常な腺において、発現する遺伝子と同様の様式で機能する遺伝子を意味する。適切なベクターの例は、適切な基質から７‐ヒドロキシステロイドの産生を触媒することのできる機能性酵素を発現することのできる遺伝子を含むように改変されたプラスミド、リポソーム、アデノウイルス、ワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルスのベクターを含む。
【００２３】
例えば、７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素をコードする変異遺伝子、またはあるメカニズムによりダウンレギュレートされるようになった前記酵素をコードする遺伝子から生じるホルモン依存性腫瘍、および他の増殖性疾患の治療において利用する遺伝子療法ベクターを、好ましくは好都合な標的が適切な腺であるように投与すべきである。ベクターは例えば局所投与、経粘膜投与、非経口投与、経皮投与、消化管投与（経口投与）、または吸入に適切な製剤で薬学的に許容できる担体とともに投与される。有効な投与はベクターが腺に直接または近傍に伝達されるように、非経口投与、局所投与または経粘膜投与の方法による。
【００２４】
もう一つの態様として本発明は、患者における７‐ヒドロキシステロイドの濃度、または７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度の診断法、または７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素をコードする塩基配列における突然変異の、以下のステップからなる検出法を提供する：
ａ）患者からサンプルを採取する；
ｂ）７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度を検出する、または前記酵素をコードする核酸の塩基配列を確かめる；および
ｃ）前記検出濃度または前記核酸の塩基配列を正常濃度あるいは正常配列と比較する。
患者に関しては健常人、ホルモン依存性腫瘍または他の増殖性疾患の疑われる人、これらを発症または罹患する素因を有する人を意味する。
【００２５】
サンプルは生検の形、例えば前立腺生検、または適切なサンプルに血液、尿または精液サンプルを含む。例えば、血液は一般にサンプル採取時における、身体の７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度を検出する手段を提供する。例えば前述したタイプの前立腺疾患に罹患し、サンプルを採取し、かつ前述したアッセイにより検査した患者に、血液中の７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の異常濃度がみられ、前記アッセイにより検出された異常濃度が明確に前立腺の疾患によるものかどうかを確認するため、さらに検査することが望ましい。前立腺疾患の場合、前立腺生検または尿サンプルは、前立腺における７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度を最も正確に測定できることが考えられる。
【００２６】
異常濃度は、健康な患者から測定されたときの正常濃度に比べた場合、高濃度または低濃度であると解釈される。もし患者で検出された濃度と正常濃度間に違いがあれば、その場合患者には適切な治療薬、例えば７‐ヒドロキシステロイドまたは他の適切な薬剤または７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素を投与するか、またはさらなる検査にまわされる。
【００２７】
正常な塩基配列とは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる機能的な酵素をコードする塩基配列、または前記の機能的な酵素の発現に影響を及ぼす変異を構成しない塩基配列であると解釈される。変異は欠失、置換、逆位あるいは転座であると解釈される。
【００２８】
７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素濃度を検出するのに用いられる方法の例は捕捉、直接または間接酵素免疫検査法（ELISA法）を含み、ＥＬＩＳＡ法において、例えば７‐ヒドロキシステロイドに特異的な抗体あるいは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素、例えばＣＹＰ７Ｂに反応する抗体を、マイクロタイタープレート、または他の適切なものに結合させ、分析するサンプルを適切な時間、接触させる。適切な時間とは抗体とそのエピトープとの間で相互作用が生じるような長さである。７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の捕捉後、前記ステロイド、または前記酵素に特異的な二次抗体を適切な時間、接触させる。抗原抗体相互作用はそこで、二次抗体と相互作用できる抗体の使用によって検出され、カラーメトリック化学ルミネセンス反応を経て濃度を伝達できる酵素と共役する。このような共役酵素はセイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）およびアルカリ性ホスファターゼ（AlkP）を含むが、これらに限定されない。他のタイプの共役分子は蛍光抗体または放射性同位元素で標識した抗体を含む。
【００２９】
７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度を検出する他の手段は、当業者に良く知られた、ウエスタンブロットおよび他の関連技術、ＲＴ‐ＰＣＲ、ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ（マニアティス（Maniatis）において規定されている）、分光光度分析および酵素反応を含む。
異常な塩基配列の検出は良く知られた技術、例えばアガロースゲル電気泳動、ＰＣＲおよび関連技術、ＲＴ‐ＰＣＲ、サザンブロッティング（Southern blotting）、ノーザンブロッテイング（Northern blotting）、制限酵素分析およびＤＮＡ塩基配列決定を含む。
【００３０】
本発明のさらなる態様として、７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒する酵素を患者において検出する方法を提供し、その方法は７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素と相互作用でき、および前記抗体あるいは分子、および前記７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの産生を触媒することのできる酵素からなる複合体を検出できる抗体、または分子を患者に投与することからなる。
【００３１】
前記複合体の検出は例えば、放射性同位元素によりラベルされた前記抗体、または分子、または例えば炭素１３のようなアイソトープからなる前記抗体または分子の使用を含む。体内、例えば前立腺における７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度は例えば、磁気共鳴イメージング（MRI）、磁気共鳴スペクトロスコピー（MRS）あるはコンピュータ体軸断層（CAT）走査によって測定される。
【００３２】
もう一つの実施態様において、７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素と相互作用できる一次抗体または分子は患者に投与可能であり、前記一次抗体または分子と相互作用できる二次抗体または分子を用いて検出できる。この詳細な実施態様において二次抗体または分子は放射性同位元素によりラベルされているかまたはＭＲＩまたはコンピュータ体軸断層撮影法（CATスキャン）により検出できるように炭素１３のような同位元素を含むことが望ましい。
【００３３】
このような方法は例えば前立腺において、７‐ヒドロキシステロイドまたは７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素濃度の検出を可能にする。このような検査の結果から患者が健康である、ホルモン依存性腫瘍または他の増殖性疾患に罹患している、罹患しやすいまたは快方に向かっていることを指摘することができる。
【００３４】
ここで述べられた酵素は、薬剤評価試験において用いられる。本発明のこの点での態様において、細胞、または正常組織、または病変組織から得られた細胞は、７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の発現をモジュレートする薬剤のアッセイにおける基剤として用いられる。健康な組織または病変組織由来の細胞株が有利に用いられる。このようなアッセイに対する適切な細胞株の例として、例えば正常なヒト前立腺細胞株ＰＮＴ２（ECCAC No:95012613）、ヒト前立腺腺癌細胞株ＰＣ‐３（ECCAC No:90112714）または前立腺癌細胞株ＬＮＣapクローンＦＧＣ（ECCAC No:89110211）を含む。このようなアッセイは薬剤、例えば、７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の活性または発現をモジュレートできる低分子の有機分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定することができる。前記アッセイによって同定された薬剤は単独でまたは７‐ヒドロキシステロイドの産生を触媒することのできる酵素またはin vivoで前記酵素の活性または発現がモジュレートできるようにin vivoで７‐ヒドロキシステロイドに変換しうる基質とともに投与できる可能性がある。
【００３５】
このようにさらなる点において７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の活性をモジュレートできる薬剤の同定における以下のステップからなるアッセイを提供する：
a)  前記酵素によって７‐水酸化ヒドロキシステロイドに変換しうる基質の存在下、薬剤を７‐水酸化ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素からなる前立腺細胞と接触させ；および
b)  前記酵素によって７‐水酸化ヒドロキシステロイドに変換された基質の量を検出し、前記濃度を正常濃度と比較する。
【００３６】
基質の７‐ヒドロキシステロイドへの変換に有利な条件の基質の存在下において、選択した細胞または細胞株に薬剤を接触させる必要があることは無論である。
【００３７】
７‐ヒドロキシステロイドに変換された基質の量を検出するために用いられる方法の例としては、免疫学に基づいたアッセイ方法、例えば前述したようなＥＬＩＳＡ法または変換基質の濃度を適切に表す他の化学ルミネセンスアッセイ法、蛍光アッセイ法または分光光度分析または例えば薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーおよびガスクロマトグラフィー質量分析のようなアッセイの使用を含む。
【００３８】
このような方法によって同定できる薬剤は低分子の有機分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００３９】
“正常濃度”は正常組織、非病変組織またはそれら由来の細胞／細胞株における７‐ヒドロキシステロイドの生成を触媒することのできる酵素の濃度として測定できる。
【００４０】
もう一つの点においてホルモン依存性腫瘍および他の増殖性疾患の治療および／または予防に対する上記方法により同定された薬剤の使用を提供する。そのような薬剤は７‐ヒドロキシステロイドの産生を触媒することのできる酵素の活性をモジュレートできる低分子の有機分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【実施例】
【００４１】
材料および方法
実験対象
ＢＰＨ患者からのパラフィン包埋前立腺組織が病理部門（Western General Hospital、エディンバラ）によって提供された。ＣＹＰ７Ｂ活性の測定と細胞培養のために、新鮮な前立腺サンプルがホルモン除去による治療を受けず前立腺の経尿道切除術（TRUP）を受けている患者（年齢56〜70歳）から得られた。本研究では生検サンプルは用いられなかった。各検体の無作為に選択した前立腺小片をそれらの良性状態および肥大の存在を確認するために組織病理学的に評価した。インフォームドコンセントを得て採取したサンプルのみについて研究し、我々のプロトコールは地元の研究倫理委員会によって承認された。
【００４２】
ステロイド
[1，2，6，7-3Ｈ]4‐ＤＨＥＡ（60Ci/mmol）、[4‐14Ｃ]‐ＤＨＥＡ（53.8mCi/mmol）および[1，2-3Ｈ]2‐５α‐アンドロステンジオール（A/エンジオール）（42Ci/mmol）を米国ボストンのＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社（NEN Life Science Products社）から購入し、[2，4，6,7‐3Ｈ]4‐Ｅ2を米国ボストンのパーキンエルマーライフサイエンス社（Perkin Elmer Life Sciences社）から購入した。非放射性ステロイドとクロトリマゾールは英国プールのシグマアルドリッチ社（Sigma‐Aldrich社）から得られた。７ＤＨは米国ニューポートのステロイドインコーポレーション社（Steraloids Inc社）から購入した。トリロスタンは英国ニューカースルのさのふぃウィンスロップディベロップメントセンター（Sanofi Winthrop Development Centre）によって快く提供され、ＩＣＩ１８２，７８０は英国ブリストルのトクリス社（Tocris社）から購入した。
【００４３】
７α‐ヒドロキシラーゼ活性
７α‐ヒドロキシラーゼ活性は全ヒト前立腺片で測定した。外科用ＢＰＨサンプルを５％活性炭処理血清（DCC-FCS）と０．３μＭ濃度の放射性同位体で標識されたステロイド基質を補足したＢＰＭＩ１６４０培地中で、４８時間まで３７℃でインキュベートした。ステロイドを酢酸エチルにより培地から抽出し、乾燥し、分析まで−２０℃で貯蔵した。回収は〜９０％であった（Martin C, Bean R, Rose K, Habib FK, Seckl JR 2001 CYP7B1 catalyses the 7α-hydroxylation of dehydroepiandrosterone and 25-hydroxycholesterol in rat prostate. Biochem J 355: 509-515）。７ＨＤへのＤＨＥＡの変換は以前に述べたように（Martin C, Bean R, Rose K, Habib FK, Seckl JR 2001 CYP7B1 catalyses the 7α-hydroxylation of dehydroepiandrosterone and 25-hydroxycholesterol in rat prostate. Biochem J 355: 509-515）ＴＬＣで評価し、ホスフォイメージャー（FLA-2000、フジフィルム）を用いて定量した。
【００４４】
高速液体クロマトグラフィー
オンラインシンチレーション計数（Berthold）による高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）（Waters）を、７ＨＤおよびＤＨＥＡに対しそれぞれ７分および２４分の保持時間を与える移動相（水、メタノールおよびアセトニトリル、容積が55:25:20、１ml／分で）を用いて逆相Ｃ１８カラム（Luna,Phenomenex）で行なった（Martin C, Bean R, Rose K, Habib FK, Seckl JR 2001 CYP7B1 catalyses the 7α-hydroxylation of dehydroepiandrosterone and 25-hydroxycholesterol in rat prostate. Biochem J 355: 509-515）。
【００４５】
ＲＮＡ抽出
以前に述べたようにヒト前立腺組織および細胞から全ＲＮＡを単離し（Chomczynski P, Sacchi N 1987 Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162: 156-159）、ＲＮａｓｅフリー水に再懸濁し、−７０℃で貯蔵した。全サンプルをアガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色（ethidium bromide staining）により判定したとき、無傷の１８ＳＲＮＡｓと２８ＳＲＮＡｓを有していた。
【００４６】
オリゴヌクレオチドプライマー、逆転写およびＣＹＰ７ＢｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
ＰＣＲのための５’プライマーおよび３’プライマー（オズウェルDNAサービス（Oswel DNA Service）、英国サザンプトン）はヒトＣＹＰ７ＢｃＤＮＡのヌクレオチド３２９−３４７および１００６−１０２５にそれぞれ相当する５’‐ｄＡＡＧＣＣＴＡＡＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＣＣ‐３’および５’‐ｄＧＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＴＴＡＣＧ‐３’とした（Wu Z, Martin KO, Javitt NB, Chiang JYL 1999 Structure and functions of human oxysterol 7alpha-hydroxylase cDNAs and gene CYP7B1. J Lipid Res 40: 2195-2203）。逆転写（ＲＴ）は１０ｍＭのTris‐塩酸（pH9.0）、５０ｍＭの塩化カリウム、２５ｍＭの塩化マグネシウム、０．１％（w／v）TritonＸ‐１００、１ｍＭのｄＮＴＰｓ、１０単位のＲＮasin(プロメガ社（Promega社）、英国サザンプトン)、１μｇの全ＲＮＡ、１２単位のＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ社（Promega社）、英国サザンプトン）および０．１nmolの３’ＰＣＲプライマーを含む２０μｌで行なった。反応は室温で１０分、続いて４２℃で３０分それから９５℃で５分（逆転写酵素を失活させるため）インキュベートした。その後のＰＣＲ増幅は５０ｍＭの塩化カリウム、１０ｍＭのTris‐塩酸（pH9.0）、２．５ｍＭの塩化マグネシウム、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ、０．１nＭの５’ＰＣＲプライマーおよび２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（プロメガ社（Promega社）、英国サザンプトン）を含む８０μｌのバッファーを加えて行なった。９４℃で５分の“ホットスタート”後、３０サイクルのＰＣＲを行なった：９４℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分引き続いて７２℃で１０分。増幅産物を１％（w／v）アガロースゲルで電気泳動により分析した。逆転写酵素を除いた反応では産生物は検出されなかった。
【００４７】
クローニングおよびＲＴ‐ＰＣＲ産生物の塩基配列決定
ＰＣＲ産生物はｐＧＥＭ‐（Ｔ）easy(プロメガ社（Promega社）、英国サザンプトン)にサブクローニングされ、両鎖について塩基配列決定が行われた。
【００４８】
ｍＲＮＡ in situ ハイブリダイゼーションに対するＣＹＰ７Ｂプローブ
ｐＧＥＭ‐（T）ＥａｓｙにサブクローニングしたＣＹＰ７ＢのＰＣＲ断片を以前に述べたように“アンチセンス”および“センス”ｃＲＮＡプローブを生成させるためにＳＰ６またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼに対する鋳型として用いた（Habib FK, Ross M, Bayne CW, Grigor K, Buck AC, Bollina P, Chapman K 1998 The localisation and expression of 5α-reductase types I and II mRNAs in human hyperplastic prostate and in prostate primary cultures. J Endocrinol 156: 509-517）。
【００４９】
ＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡin situハイブリダイゼーション
パラフィン包埋切片（5μm）をキシレン中でパラフィン除去し、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）に浸し、ＰＢＳ中プロテイナーゼＫ（20mg/ml）で３７℃で１０分間処理した。切片を４％のパラホルムアルデヒド（v/v）中で２０分間固定し、それから０．１Ｍのトリエタノールアミン中０．２５％の無水酢酸（v/v）で１０分処理した。湿室におけるジゴキシゲニン標識リボプローブ（DIG）との５０℃、１４−１６時間のハイブリダイゼーション、ＲＮase Ａ処理および洗浄は以前に述べたとおりであった（Habib FK, Ross M, Bayne CW, Grigor K, Buck AC, Bollina P, Chapman K 1998 The localisation and expression of 5α-reductase types I and II mRNAs in human hyperplastic prostate and in prostate primary cultures. J Endocrinol 156: 509-517）。
【００５０】
ハイブリダイゼーション後、ＤＩＧ標識リボプローブは室温で３０分ＤＩＧ‐アルカリホスファターゼ共役抗体１：２５００（ベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannheim社））を用いて視覚化し、洗浄しベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannheim社）の現像液を用いて一夜現像した。非特異的ハイブリダイゼーションは同一条件下でＤＩＧ標識“センス”プローブとのインキュベーションにより測定した。
【００５１】
ＥＲβの免疫組織化学
免疫組織化学的研究はヒトＥＲβに対する市販のモノクローナル抗体（セロテック社（Serotec社）、英国オックスフォード）を用いて、以前に記述されているように（Saunders PT, Millar MR, Williams K, Macpherson S, Harkiss D, Anderson RA, Orr B, Groome NP, Scobie G, Fraser HM 2000 Differential expression of estrogen receptor-α and β and androgen receptor in the ovaries of marmosets and humans. Biol Reprod 63: 1098-1105）行なった。
【００５２】
前立腺の初代細胞培養
分離した間質細胞および上皮細胞の初代培養を確立するために、ＢＰＨ小片を用いた（Chaproniere DM, McKeelan WL 1986 Serial culture of single adult human prostatic epithelial cells in serum-free medium containing low calcium and a new growth factor from bovine brain. Cancer Res 46: 819-824、Habib FK, Ross M, Bayne CW 2000 Development of a new in vitro model for the study of benign prostatic hyperplasia. Prostate 9: 15-20）。上皮細胞と間質細胞の共培養は以前に記述されているとおりであった（Habib FK, Ross M, Bayne CW 2000 Development of a new in vitro model for the study of benign prostatic hyperplasia. Prostate 9: 15-20）。
【００５３】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ＣＯＳ‐１細胞とＨｅｐＧ２細胞をペニシリン（25単位/ml）、ストレプトマイシン（25μg/ml）および１０％のウシ胎児血清（v/v）を含む高グルコースのデルベコ（Dulbeco’s）最小必須培地中で保存した。細胞は５ｘ１０5細胞／ディッシュの密度で接種し、接着させるために一夜放置した。形質導入当日に、培地を１０％のＤＣＣ‐ＦＣＳ（v/v）を追加したフェノールレッドを除いたＤＭＥＭで置換した。形質移入は標準方法に従い、リン酸カルシウム法を用いて１０μｇのＤＮＡ（1μgの発現プラスミド、1-5μgのレポータープラスミド、内部コントロールとして用いたβ‐ガラクトシダーゼをコードする1μgのｐCH110（Phrmcia社）および3-7μgのpGEM3）により行なった。発現プラスミドは、マウスのＥＲα受容体（mERαは英国ロンドンのM.パーカー（M.Parker）教授から贈られた（White R, Lees JA, Ham J, Parker M 1987 Structural organization and expression of the mouse estrogen receptor. Mol Endo 1: 735-744））、ヒトＥＲβ受容体（hERβ；英国ロンドンのR.ホワイト（R.White）教授から（Cowley SW, Parker MJ 1999 A comparison of transcriptional activation by ER alpha and ER beta. J Steroid Biochem Mol Biol 69: 165-175））およびヒトアンドロゲン受容体（pSVARo；オランダロッテルダムのA.ブリンクマン（A.Brinkman）教授）とした。マウスのＥＲα受容体はヒトＥＲβと８８％の一致を示し、両種は大多数のステロイドに対して同じ選択性を示す。レポータープラスミドは、エストロゲン反応性に対し（ERE）‐ＴＫ‐Ｌｕｃ（カナダモントリオールのV.ジゲール（V.Giguere）博士から贈られた）、およびアンドロゲン反応性に対しＰＳＡ（PSA61-luc、オランダロッテルダムのJ.トラップマン（J.Trapman）教授）とした。２４時間後、培地を変え細胞をステロイド（E2、DHT、7HDまたは適切な濃度のエタノール）で処理した。細胞溶解後、ルシフェラーゼとβ‐ガラクトシダーゼの活性を（Leckie C, Chapman KE, Edwards CR, Seckl JR 1995 LLC-PK1 cells model 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 regulation of glucocorticoid access to renal mineralocorticoid receptors. Endocrinology 136: 5561-5569）で述べたように測定した。データを相対的なルシフェラーゼ／β‐ガラクトシダーゼとして表わし、少なくとも３回の独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（標準誤差）である。
【００５４】
リガンド競合試験
ヒトＥＲβクローンを製造者の指示（プロメガ社（Promega社）、英国サザンプトン）に従い、ＴｎＴ‐共役網状赤血球溶解システムを用いてin vitroで合成した。翻訳反応の混合物をＴＥＤＧＭoバッファー（40mMのトリス/塩酸、pH7.4/1mMのEDTA/10％（v/v）のグリセロール/10mMのＮa2MｏO4/10mMのDTT）で５倍に希釈しその０．１ｍｌを０、１、５、１０、２０、５０および２５０μＭの７ＤＨのいずれかの存在下で、４℃で１６時間０．５nＭの[2，4，6，7‐3Ｈ]4‐Ｅ2（比放射能89Ci/mmol）とともにインキュベートした。結合および非結合ステロイドをろ過により分離した。
【００５５】
統計解析
統計的比較（シグマスタット（Sigma Stat）を用いた）は分散分析（ANOVA）および順位和検定によった。有意差はｐ＜０．０５と設定した。
【００５６】
実施例１：ヒト前立腺によるＤＨＥＡからのＰ４５０に依存した７ＨＤの生成
ヒト前立腺にＣＹＰ７Ｂ活性が存在するかどうかを明らかにするため、全前立腺小片でＤＨＥＡの代謝を測定した。ＤＨＥＡはin vitroで遺伝子組換えＣＹＰ７Ｂに対する最良の基質であると、以前に報告されていた（Rose KA, Stapleton G, Dott K, Kieny MP, Best R, Schwarz M, Russell DW, Bjoorkheim I, Seckl JR, Lathe R 1997 Cyp7b, a novel brain cytochrome P450, catalyses the synthesis of neurosteoids 7α-hydroxy-DHEA and 7α-hydroxy-PREG. Proc Natl Acad Sci USA 94: 4925-4930）。ＤＨＥＡおよびＡ／エンジオールの７α‐水酸化が、全ヒト前立腺の小片において明確に検出可能で、それは時間に依存した（図２）。
【００５７】
“Ｅ”（図２）の印を付けた放射性化合物は、非標識である市販の対照化合物であるの７α‐ヒドロキシＤＨＥＡ、遺伝子組換えＣＹＰ７Ｂを形質導入したＨｅＬａ細胞由来の蛋白抽出物によるＤＨＥＡ代謝の主要産生物、さらには以前に記述されているように（Martin C, Bean R, Rose K, Habib FK, Seckl JR 2001 CYP7B1 catalyses the 7α-hydroxylation of dehydroepiandrosterone and 25-hydroxycholesterol in rat prostate. Biochem J 355: 509-515）ＤＨＥＡ代謝のラット前立腺産生物とも同様に共に移動した（データは示していない）。Ａ／エンジオール、Ａ／エンジオン（共にスポット“Ｂ”）も前立腺組織において以前に報告されているように（Mitamura K, Nakagawa T, Shimada K, Namiki M, Koh E, Mizokami A, Honma S 2002 Identification of dehydroepiandrosterone metabolites formed from human prostate homogenate using liquid chromatography-mass spectrometry and gas chromatography-mass spectrometry. J Chromatogr A. 961: 97-105）、ＤＨＥＡから生成された。反応中に生じた異なる標識化合物のより良い分離のために、非標識ステロイドの標準品を用いてＨＰＬＣにより、それらを分析した。ＨＰＬＣにより検出されたＤＨＥＡ代謝体全体の５０％以上は、ＣＹＰ７Ｂの産生物で（9％がA/エントリオールを表す）、３７％のみが３β‐ＨＳＤおよび１７β‐ＨＳＤの産生物であった（結果は示していない）。ヒト前立腺小片によるＤＨＥＡの７α‐水酸化は、クロトリマゾール（1μM）によって阻害され７ＨＤの産生がＰ４５０依存性であることが確認された（図２）。少量の生成物である“Ｃ”および“Ｄ”の生成もクロトリマゾールの存在下で低下し、このことはそれらもＰ４５０酵素の生成物であることを示唆する。特異的に３β‐ＨＳＤ活性を阻害するトリロスタンは、首尾よくＡ／アンジオンの産生をブロックしたにもかかわらず、放射性７ＨＤの産生を４０％増大させた（図２）。少量の生成物である“Ｃ”および“Ｄ”はトリロスタンにより影響を受けなかった。ヒト前立腺で観察されたＤＨＥＡの７α‐水酸化はＣＹＰ７Ｂ代謝の生成物であるものと矛盾しなかった。
【００５８】
実施例２：ヒト前立腺においてＣＹＰ７Ｂが発現される。
前立腺でのＣＹＰ７Ｂの発現を立証するために、４種類の異なるヒト前立腺サンプル由来のＲＮＡについてＲＴ‐ＰＣＲを行なった。ＣＹＰ７Ｂに特異的なプライマーは予想通り６９６ｂｐの断片を増幅した（図３）。ＰＣＲ産生物が同一であることは、予測断片を生じたＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐｓｔ１およびＳｓｐ１による消化によって立証された（図３）。スブクローニングされたＰＣＲ産生物の塩基配列決定は、ヒトＣＹＰ７Ｂとしてその同一性を確認した（Wu Z, Martin KO, Javitt NB, Chiang JYL 1999 Structure and functions of human oxysterol 7alpha-hydroxylase cDNAs and gene CYP7B1. J Lipid Res 40: 2195-2203）。
【００５９】
実施例３：ＣＹＰ７ＢｍＲＮＡはヒト前立腺においてＥＲβ免疫反応性と共に局在する。
ヒト前立腺におけるＣＹＰ７ＢｍＲＮＡの発現部位を決定するために、サブクローニングしたＰＣＲ産生物から作成されたｃＲＮＡプローブを用いて、前立腺のパラフィン包埋切片についてin situ ｍＲＮＡハイブリダイゼーションを行なった。ＣＹＰ７ＢｍＲＮＡは間質と脈管構造にはほとんど発現はされず、上皮において高度に発現していた（図４Ａ）。“センス”ＲＮＡプローブにハイブリダイズした対照切片はハイブリダイゼーションの背景レベルは低かった（図４Ｂ）。我々は特異的なＥＲβ抗体を用いて、ヒト前立腺サンプルにおいてＥＲβの局在をも決定した（図４Ｃ）。興味深いことに、ＥＲβは高分子量のサイトケラチン標識により確かめられたように、上皮細胞（主として上皮の基底領域）においても発現された。この結果はＥＲβのＣＹＰ７Ｂとの共発現を示唆する。
【００６０】
実施例４：ＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡ発現は、上皮細胞の初代培養において維持され、間質の上皮細胞との共培養によって増加する。
ＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡと７α‐ヒドロキシラーゼ活性の両者はヒト前立腺上皮細胞の初代培養において検出された（図５）。さらに、上皮のＣＹＰ７Ｂ活性は上皮細胞と間質細胞との共培養の５日後に促進され（p＜0.001；図５Ｃ）、このことはＣＹＰ７Ｂの上皮での高発現が間質細胞と上皮細胞との共培養により生じた拡散性因子に依存することを示唆する。間質細胞だけにＣＹＰ７ＢｍＲＮＡが認められず、ＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡが上皮に限られるin situハイブリダイゼーションの知見と矛盾しない。
【００６１】
実施例５：７ＨＤはＥＲβを活性化するが、ＥＲαあるいはＡＲは活性化しない。
ＣＹＰ７Ｂ産生物の７ＨＤの可能な機能をさらに評価するために、エストロゲンおよびアンドロゲンに反応するレポーター遺伝子によるコトランスフェクションアッセイにおいてＥＲα、ＥＲβおよびＡＲをトランスアクティベートするその能力を分析した。ＣＯＳ‐１細胞とＨｅｐＧ２細胞の両方を用い、これら両細胞株は、アンドロゲン（PSA）またはエストロゲン（ERE）に反応するレポーター遺伝子を活性化するためには外因性のＡＲ、ＥＲαおよびＥＲβを必要とする。最初の実験において、Ｅ2によるＥＲαの最大の活性化は１０nMのＥ2で認められ、一方ＥＲβの最大の活性化は５０nMのＥ2で得られた。７ＨＤも著しくＥＲβを活性化した（図６Ａおよび図６Ｂ）。７ＨＤは６．２μＭのＥＣ50でＥＲβを介した転写を有意に活性化した。７ＨＤの転写活性効果はＥ2の最小限以下の投与量（0.1nM;p<0.01)に付加的なものであった（図６Ｂ）。この効果はＥＲαの最小の非特異的活性化のみによりもたらされ、７ＨＤの同様の濃度のようにＥＲβに対して特異的であった（図６Ｃ）。さらに、７ＨＤはＰＳＡ‐ルシフェラーゼレポーターのアンドロゲン受容体依存転写を活性化できなかった。一方５α‐ＤＨＴは明らかに強力な活性化をもたらした（図６Ｄ）。７ＨＤがＥＲを介して転写を活性化することを確かめるために、特異的抗アンドロゲンのＩＣＩ１８２，７８０を用いた。期待したように、ＩＣＩ１８２，７８０（1μM）単独ではＥＲα活性またはＥＲβ活性を刺激できなかったが、ＥＲα受容体またはＥＲβ受容体でコトランスフェクトした細胞において、Ｅ2誘導および７ＨＤ誘導ルシフェラーゼの転写を完全に消失させた（図６Ｂ）。
【００６２】
[3H]‐Ｅ2結合を阻害する７ＨＤの能力は、ＴｎＴ‐共役網状赤血球溶解システムを用いる我々のヒトＥＲβクローン（hERβ）からin vitroで合成したヒトＥＲβ受容体を用いた競合結合アッセイによっても測定された（図７）。我々の競合試験において、７ＨＤはＥＲβ受容体と相互作用し、[3H]‐Ｅ2結合を用量依存的に阻害した。
【００６３】
オキシステロールである７α‐ヒドロキシラーゼ（CYP7B）はヒト前立腺において発現し、この反応経路は本器官におけるＤＨＥＡ代謝の５０％以上の原因となる。対照的に、古くから知られているアンドロゲンおよびエストロゲンへのＤＨＥＡの代謝は比較的副次的な経路を形成している。さらに、７ＨＤはＥＲβに対する特異的アゴニストであるが、ＥＲαまたはＡＲに対しては異なることが本発明者らによって示され、このことはヒト前立腺において７ＨＤはＥＲβに対する内因性リガンドとして作用する可能性を示唆している。同時にデータはＣＹＰ７Ｂが前立腺内の活性ステロイドを生成し、それらがイントラクリンであるエストロゲン：アンドロゲンのバランス、および潜在的な病因に影響を与えるという見方を裏付けている。
【００６４】
ヒトにおけるＤＨＥＡの７α‐水酸化は、最初は尿中７ＨＤの同定（Schneider JJ, Lewbart ML 1959 Fractionation and isolation of steroid conjugates. Recent Prog Horm Res 15: 201-230、Okada M, Fukushima DK, Gallagher TF 1959 Isolation and characterisation of 3β-hydroxyΔ5steroids in adrenal carcinoma. J Biol Chem 234: 1688-1692）により、その後の皮膚、脳、乳房組織および胎児組織における７ＨＤ生成の検出（Farendin I, Fazekas AG, Toth I, Kokai K, Julesz M 1969 Transformation in vitro of [4-14C]-dehydroepiandrosterone into 7-oxygenated derivates by normal human male and female skin tissue. J Invest Derm 52:357-361、Sulcova J, Capkova A, Jirasek JE, Starka L 1968 7-hydroxylation of dehydroepiandrosterone in human foetal liver, adrenals and chorion in vitro. Acta Endocrinol 7: 591-599）により長年知られていた。前立腺における３β‐ヒドロキシステロイドの７α‐水酸化については以前に述べたが、原因となる酵素は今まで同定されなかった（Li K Foo T, Adams JB 1978 Products of dehydroepiandrosterone metabolism by human mammary tumors and their influence on estradiol receptor binding. Steroids 31: 113-127，Sundin M, Warner M, Haaparanta T, Gustafsson JA 1987 Isolation and catalytic activity of cytochrome P-450 from ventral prostate of control rats. J Biol Chem 262: 12293-12297）。本発明において、我々はその機能的酵素活性に加えて、ＣＹＰ７ＢｍＲＮＡが上皮に局在することを示すためにＲＴ‐ＰＣＲ、in situハイブリダイゼーション、生化学的および細胞培養アプローチを組み合わせて利用した。本発明はＣＹＰ７Ｂが前立腺において７α‐水酸化を触媒する最も有力な酵素であることを確認したものの、他の酵素もおそらく含まれる可能性がある。しかしながら、ＣＹＰ７Ｂを欠くマウスは前立腺においてＤＨＥＡの７α‐（または7β-）水酸化の残渣をまったく示さず（Rose K, Allan A, Gauldie S, Stapleton G, Dobbie L, Dott K, Martin C, Wang L, Hedlund E, Gustafsson JA, Seckl J, Lathe R 2001 Targeting the gene encoding mouse neurosteroid hydroxylase CYP7B: vivid reporter activity in dentate gyrus and abolition of a major pathway of steroid and oxysterol hydrolation. J Biol Chem 276: 23937-23944）ＣＹＰ７Ｂは関連する唯一の酵素であることが確認された。
【００６５】
ＤＨＥＡの７α‐水酸化はin vivoとin vitroにおいて前立腺上皮に限られる。これは前立腺組織の一部にのみ関連したステロイドの代謝酵素であることを結びつけ、７ＨＤ活性はもっぱら上皮に限られる可能性を提起した最初の報告である。我々のコトランスフェクションアッセイは、７ＨＤが上皮にも局在するＥＲβを活性化することができることを示す（Horvath LG, Henshall SM, Lee CS, Head DR, Quinn DI, Makela S, Delprado W, Golovsky D, Brenner PC, O'Neill G, Kooner R, Stricker PD, Grygiel JJ, Gustafsson JA, Sutherland RL 2001 Frequent loss of estrogen receptor-β expression in the prostate cancer. Cancer Res 61: 5331-5335、Leav I, Lau KM, Adams JY, McNeal JE, Taplin ME, Wang J, Singh H, Ho SM 2001 Comparative studies of the estrogen receptors beta and alpha and the androgen receptor in normal human prostate glands, dysplasia, and in primary and metastatic carcinoma. Am J Pathol. 159: 79-92）。Ｅ2の最小濃度以下において、ＥＲβに対する７ＨＤの効果はＥ2に相加的である。７ＨＤは明らかにＥ2より有効ではなかったが、ＥＲβの同様の最大の活性となった。ＤＨＥＡおよびその硫酸塩がマイクロモル濃度で循環する一方、血清エストロゲンがピコモル濃度であるとすれば、ＣＹＰ７Ｂは前立腺上皮内においてＥＲβを活性化するのに十分な７ＨＤを生成し、そのうえ前立腺内Ｅ2の非常に低い濃度を達成した明らかな可能性がある（Voigt KD, Bartsch W 1986 Intratissular androgens in benign prostatic hyperplasia and prostatic cancer. J Steroid Biochem 25: 749-757）。実際、７ＨＤはＥ2それ自身より重要なＥＲβリガンドであると考えられる。同様な提案が前立腺において局所的に生成されたＥＲβリガンドでもあるＡ／アンジオールに対してなされた（Weihua Z, Lahe R, Warner M, Gustafsson JA 2002 An endocrine pathway in the prostate, ERbeta, AR, 5alpha-androstane-3beta, 17beta-diol, and CYP7B1, regulates prostate growth. Proc Natl Acad Sci USA 99: 13589-13594、Weihua Z, Makela S, Andersson LC, Salmi S, Saji S, Webster JI, Jensen EV, Nilsson S, Warner M, Gustafsson JA 2001 A role for estrogen receptor β in the regulation of growth of the ventral prostate. Proc Natl Acad Sci USA 98: 6330-6335）。ここに報告されたデータはＤＨＥＡはプロホルモンであり、７ＨＤはその活性代謝体であるという見方を裏付けている。ＣＹＰ７Ｂの存在下、ＤＨＥＡは前立腺の成育および病因に影響を及ぼすＥＲβアゴニスト、７ＨＤとして作用するエストロゲン様ステロイドに代謝される。
【００６６】
興味深いことに、上皮のＣＹＰ７Ｂ活性は上皮細胞と間質細胞の共培養により高められる。このことが共培養における上皮の分化の結果を反映するのか、あるいは間質細胞と上皮細胞との間の“クロストーク(crosstalk）”シグナル伝達の結果であるか否かは不明である。前立腺の共培養する前の特徴は、１つのタイプの細胞により生成された拡散性因子の存在を示唆し、次に他のタイプの細胞の分化と遺伝子発現に影響を及ぼすことを示唆する（Habib FK, Ross M, Bayne CW 2000 Development of a new in vitro model for the study of benign prostatic hyperplasia. Prostate 9: 15-20、Bayne WC, Donnelly F, Chapman K, Bollina P, Buck C, Habib FK 1998 A novel co-culture model for benign prostatic hyperplasia expressing both isoforms of 5α-reductase. J Clin Endocrinol Meta 83: 206-213、Bayne CW, Ross M, Inglis NF 2003 Induction of 5a-reductse type II mRNA transcription in primary cultured prostate epithelial cells by a soluble factor produced by primary cultured prostate fibroblast cells. Eur J Cancer 39: 1004-1011）。前立腺の間質成分と上皮成分との間の“クロストーク(crosstalk）”がＤＨＥＡ代謝の重要なレギュレーターであり、その結果腺のホルモン状態を調整する。
【００６７】
前立腺および他の組織における７ＨＤに対する生物学的役割の実際はこれまで確認されておらず、この問題を解明する試みは７ＨＤに対する確立した受容体がないため妨げられていた。最近の研究はＣＹＰ７Ｂの発現がげっ歯動物の発育中に低下したり（Bean R, Seckl JR, Lathe R, Martin C 2001 Ontogeny of the neurosteroid enzyme Cyp7b in the mouse. Mol Cell Endocrinol 174: 137-144）、ストレスとアルツハイマー病によっても変わることを示しており（Graham M, Noble J, Andrew R, Rasmuson S, Olsson T, Seckl J, Yau J 2000 Regulation of Cyp7b expression during stress and ageing in rats and Alzheimer's disease in humans. Eur J Neuroscience 12: p184.01 (Abstract)、Yau J, Rasmuson S, Andrew R, Graham M, Noble J, Olsson T, Fuchs E, Lathe R, Seckl JR Dehydroepiandrosterone 7-hydroxylase CYP7B: predominant expression in primate hippocampus and reduced expression in Alzheimer's disease. Neuroscience, in press.）、ＣＹＰ７Ｂの発現は環境シグナルに反応し、少なくとも脳での老化中に変化することを示唆する。前立腺ＣＹＰ７Ｂの減量は選択的ＥＲβ‐アゴニストの合成を減少させることで、エストロゲン経路よりもアンドロゲン経路に有利であるように、エストロゲンとアンドロゲンとの間のバランスを変える。それに付随して、ＣＹＰ７Ｂの発現の低下は、強力なアンドロゲンの合成にとって前立腺内のネイティブＤＨＥＡの利用可能性を増す。ヒト前立腺上皮と全前立腺に関しＥＲβに結合する７ＨＤの正確な効果は、未だ知られていない。骨組織に示されるように、ＥＲβに対して果たす役割の一つとしては、ＥＲαを介する遺伝子転写をモジュレートすることである（Lindberg MK, Moverare S, Skrtic S, Gao H, Dahlman-Wright K, Gustafsson JA, Ohlsson C 2003 Estrogen receptor (ER)-β reduces ERα-regulated gene transcription, supporting a "ying yang" relationship between ERα and ERβ in mice. Mol Endocrinol 17:203-208）。レポーター遺伝子アッセイは、ＥＲβがＥＲαの転写活性を抑制する能力のあることを証明した（Hall JM, McDonnell DP 1999 The estrogen receptor b-isoform (ERβ) of the human estrogen receptor modulates ERα transcriptional activity and is a key regulator of the cellular response to estrogens and antiestrogens. Endocrinology 140 :5566-5578）。７ＨＤはＥＲβへの結合により、間質区画におけるＥＲα活性をモジュレートすることができ、それにより間質細胞の発育をコントロールできる。また、ＥＲβは前立腺発癌およびアンドロゲン依存性腫瘍発育の両者の初期相のモジュレートに加えて、前立腺細胞の分化と増殖において役割を果たすことが示唆される（Signoretti S, Loda M 2001 Estrogen receptor beta in prostate cancer: brake pedal or accelerator? Am J Pathol 159:13-1）。このように、ＣＹＰ７Ｂは活性ステロイドの前立腺内濃度の制御において重要な役割を果たし、前立腺疾患の予防または臨床治療において有用なツールとなる。
【００６８】
結論として、ＣＹＰ７Ｂはヒト乳房と前立腺の両者において高度に発現する。さらに、ＣＹＰ７ＢｍＲＮＡは乳癌および前立腺癌に特異に発現し、ＣＹＰ７Ｂが性ステロイド感受性癌組織において重要な役割のあることを示唆する。ＣＹＰ７Ｂ測定は腫瘍の病期分類および治療の手引きにおける診断または予後において有効である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】ＤＨＥＡのステロイド経路を示す模式図。    図中３β‐ＨＳＤ、３β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ；１７β‐ＨＳＤ、１７β‐ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ；７ＨＤ、７α‐ヒドロキシＤＨＥＡ；Ａ／エンジオン、５α‐アンドロステンジオン；Ａ／エンジオール、５α‐アンドロステンジオール；Ａ／アンジオール、５α‐アンドロスタンジオール；Ｅ1，エストロン；Ｅ2、１７β‐エストラジオールおよびＤＨＴ、５α‐ジヒドロテストステロンを示す。
【図２】７ＨＤはヒト前立腺の小片においてＤＨＥＡから生成されることを示す図。    （Ａ）トリロスタン無し（レーン１）または１μＭのトリロスタン（レーン２）；または１μＭのクロトリマゾール（レーン３）；または１μＭのクロトリマゾールプラス１μＭのトリロスタン（レーン４）の存在下培地中２４時間インキュベーション後ヒト前立腺小片におけるＤＨＥＡ産生物のＴＬＣ分析の図。（Ｂ）ヒト前立腺サンプル（n=2-7）による[14C]‐７ＨＤ産生のタイムコースを示すグラフ。
【図３】ヒト前立腺におけるＣＹＰ７ＢｍＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲ分析図。
【図４】ＣＹＰ７ＢｍＲＮＡとＥＲβはヒト前立腺上皮において、ともに局在していることを示す顕微鏡写真。ＢＰＨ切片におけるＣＹＰ７Ｂ（Ａ）をコードするｍＲＮＡin -situハイブリダイゼーションおよびＥＲβ（Ｃ）の免疫染色の代表的な高分解像。ＣＹＰ７ＢｍＲＮＡに対する代表的な“センス”対照切片、およびＥＲβに対する対照切片（一次抗体のない）はそれぞれ（Ｂ）および（Ｄ）に示される。
【図５】ＣＹＰ７Ｂは上皮細胞の初代培養において発現され、間質細胞との共培養によって増加することを示す図。  （Ａ）全ヒト前立腺（WP、レーン１）、初代間質細胞（St、レーン２）および上皮細胞（Ep、レーン３）におけるＣＹＰ７ＢｍＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲによる検出のための泳動図。Ｍは分子量マーカー。（Ｂ）間質細胞（St）、上皮細胞（Ep）の初代培養または上皮細胞と間質細胞の共培養（Ep+St）の[14C]‐ＤＨＥＡとの２４時間のインキュベーションにより生じた生成物のＴＬＣ分離を示す図。矢印は７ＨＤを示す。（Ｃ）上皮細胞（Ep）、間質細胞（St）および上皮細胞または間質細胞の共培養による２４時間でのＤＨＥＡからの[14C]‐７ＨＤの生成量を示すグラフ。＊、ｐ＜０．００１、Ｅｐ対Ｓｔ＋Ｅｐ。
【図６】７ＨＤによるＥＲβ（Ａ，Ｂ）、ＥＲα（Ｃ）およびアンドロゲン受容体（AR:D）のトランスアクチベーションを示すグラフ。    示された数値はそれぞれ３回行なわれた３〜５個の独立した実験の平均である。（Ａ）と（Ｂ）はＨｅｐＧ２細胞におけるＥＲβによる（ERE）‐ＴＫ‐Ｌｕｃのトランスアクチベーション、（Ｃ）はＣＯＳ細胞におけるＥＲαによる（ERE）‐ＴＫ‐Ｌｕｃのトランスアクチベーションおよび（Ｄ）はｈＡＲを含むＣＯＳ‐１細胞におけるＰＳＡ‐Ｌｕｃレポーターコンストラクトのトランスアクチベーション。データは２０nＭのＥ2（hERβ;対照と比較してｘ４倍の誘導；ＡとＢ）、１０nMのＥ2（mERα;対照と比較してｘ７倍の誘発量；Ｃ）および１０nMのＤＨＴ（hAR;対照と比較してｘ１７倍の誘発量）で得られた最大誘発量の百分率として表す。＊、ｐ＜０．００１；φ、ｐ＜０．０５；７ＨＤ対７ＨＤ無しの対照；γ、ｐ＜０．０１、Ｅ2対７ＨＤ＋Ｅ2。
【図７】in vitroで合成されたＥＲβ蛋白に結合する[3H]‐Ｅ2に対する７ＨＤによる競合割合を示すグラフ。    ＥＲβ蛋白を含む網状赤血球分解物は５nMの[3H]‐Ｅ2および指示された倍率の過剰の７ＨＤで１６時間平衡に達した。データは７ＨＤ（0-250μM）の存在下、結合した[3H]‐Ｅ2を表す。７ＨＤ無しでの[3H]‐Ｅ2結合を１００％と設定した。＊、ｐ＜０．００１およびγ、ｐ＜０．０１；７ＨＤ対７ＨＤ無しの対照。
【図８】ヒト乳房においてＣＹＰ７Ｂが発現されることを示す泳動図。    ヒト乳房におけるＣＹＰ７Ｂの発現を立証するために、４個の異なるヒト乳房サンプル由来のＲＮＡについてＲＴ‐ＰＣＲを行なった：正常組織の１サンプルおよびエストロゲン受容体陽性（ER+）またはエストロゲン受容体陰性（ER-）の乳癌の３サンプル。ヒト前立腺（BPH）由来の全ＲＮＡをＰＣＲに対するポジティブコントロールとして用い、ｃＤＮＡの水による置換を汚染を調べるためのネガティブコントロールとして用いた。ＣＹＰ７Ｂ特異的プライマーは水を除いた全サンプルにおいて期待された６９６ｂｐ断片を増幅した（図１を参照）。ヒト乳房サンプルにおけるＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡの濃度は高いが、乳癌サンプルの１つは他のサンプルよりもＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡ濃度がはるかに低く、このことは乳癌においてＣＹＰ７Ｂの発現が異なることを示唆する。乳癌において前駆体の性ステロイド代謝／活性化の濃度が変動しやすいことを意味する。このことは診断／予後テストの開発を可能にする。レーン２：対照の正常乳房組織（0.2μg）；レーン３：エストロゲン受容体陽性（ER+）腫瘍（0.2μg）；レーン４：もう一つのＥＲ＋腫瘍（0.2μg）；レーン５：ＥＲ陰性腫瘍（0.2μg）。レーン１：ヒト前立腺由来のポジティブコントロールＲＮＡ（1μg）；レーン６：ネガティブコントロールの水。注；ＥＲ＋およびＥＲ−乳癌におけるＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡの明確な発現。
【図９】乳房組織と乳癌におけるＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡの発現を示すグラフ。    乳癌におけるＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡ発現の変化を検出するためにリアルタイムＰＣＲを用いた。標準法によってランダムプライマーおよびＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写キット（Qiagen社）を用いて全ＲＮＡの０．２μｇ（乳房）から最初のストランドｃＤＮＡを産生させた。それから内部標準（いずれもApplied Biosystems）としてＧＡＰＤＨに対するＴａｑｍａｎプライマーに加えてヒトＣＹＰ７Ｂ（Hs00191385＿ml）に対するＴａｑｍａｎ Ｍａｓｔｅｒ ＭｉｘおよびＴａｑｍａｎ特異的プライマーを用いてリアルタイムＲＴ‐ＰＣＲの鋳型としてｃＤＮＡ反応（0.2μl）を用いた。各サンプルのＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡ発現濃度を施設管理（不変の）転写物としてＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡと比較した。リアルタイムＰＣＲのデータを分析し、ｐ＜０．０５が有意と考えられた。ＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡ発現は正常乳房組織の対照と比べてＥＲ＋およびＥＲ−の両腫瘍の乳癌においてダウンレギュレートしていた。アロマターゼ阻害剤による２週間の乳癌治療はＣＹＰ７ＢｍＲＮＡを変えなかった。ＣＹＰ７ＢｍＲＮＡは無傷の乳房におけるよりたとえ低濃度でも乳癌で発現していることをデータは示している。ＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡは明らかに正常な乳房組織において検出され、乳癌においては有意に低い濃度で検出された。乳癌におけるＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡの発現は変動し、エストロゲン受容体（ER）の状態と関係はなかった。ＣＹＰ７Ｂ ｍＲＮＡはアロマターゼ阻害剤（AR Inh）による２週間の治療によって変わらなかった、＊ｐ＜０．００５。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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