(57)【要約】捕捉されたジヒドロ葉酸還元酵素を収容する、ゾル−ゲル由来のモノリシックシリカカラムを、低分子混合物のフロンタルアフィニティクロマトグラフィーのために使用した。このカラムからの出力を、マトリックス分子（ＨＣＣＡ）を含有する第二のストリームと組み合わせ、そして従来のＭＡＬＤＩプロ−と上に直接沈着させ、このＭＡＬＤＩプレートを、コンピュータ制御されるｘ−ｙステージを介してカラムに対して移動させ、ＦＡＣ実行の半永久的な記録を作成した。ＭＡＬＤＩ  ＭＳの使用は、ＦＡＣ法とＭＳ法との切り離しを可能にし、かなり高いイオン強度の緩衝液が、ＦＡＣ研究のために使用されることを可能にし、これにより、複数の実行にわたるタンパク質活性のより良好な保持が可能になった。
2007538235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学サンプルを分析するためのシステムであって、該システムは、ＭＡＬＤＩ質量分析系と連動するフロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ）カラムを備える、システム。
【請求項２】
前記ＦＡＣカラムからの溶出物ストリームが、ＭＡＬＤＩマトリックス材料と混合され、そして該混合物が、ＭＡＬＤＩ−ＭＳプレート上に沈着される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記混合物が、不連続なスポットとしてか、または連続的なトラックとして沈着される、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記混合物が、連続的なトラックとして沈着される、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
前記混合物が、ＭＡＬＤＩ沈着の前の画分収集；毛管からのスポットまたはトラックの直接的な沈着；電気動力学的な荷電液滴処理；加熱された液滴界面を使用する沈着；圧電フロースルー微小分配減圧により補助される沈着、電場により駆動される液滴沈着、エレクトロスプレー沈着、あるいは毛管噴霧器スプレーによって沈着される、請求項２に記載のシステム。
【請求項６】
前記ＭＡＬＤＩプレートが、コンピュータの制御下で移動される、請求項２〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
前記ＦＡＣカラムが、バイオアフィニティ毛管カラムである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項８】
前記ＦＡＣカラムが、モノリシックなシリカマトリックスを収容する、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
前記モノリシックなシリカマトリックスが、ゾル−ゲル技術を使用して調製される、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記モノリシックなシリカマトリックスが、生体分子適合性の技術を使用して調製される、請求項８または９に記載のシステム。
【請求項１１】
前記ＦＡＣカラムが、該カラムの内部に捕捉されたか、または該カラムの表面に固定された、１つ以上の生物学的分子を備える、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
前記化学サンプルが、化合物のライブラリーまたは天然供給源からの抽出物を含有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ）からの化学サンプルを分析する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＦＡＣカラムからの溶出物を、マトリックスと混合する工程；
（ｂ）該（ａ）における混合物を、表面に沈着させる工程；および
（ｃ）該沈着された混合物を、ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して分析する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、クロマトグラフィー分析からの化合物を、特に、質量分析を使用して分析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
バイオアフィニティクロマトグラフィーは、サンプルの精製および浄化１、キラル分離２、タンパク質のオンラインタンパク質分解消化３、支持された生体触媒の開発４、およびより最近は、フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ）方法を介する化合物ライブラリーのスクリーニング５、６のために、広範に使用されている。ＦＡＣの基本的な前提は、化合物の連続的な注入が、遊離状態と結合状態との間でのリガンドの平衡を可能にし、ここで、遊離リガンドの正確な濃度が既知であることである。この場合、この化合物の漏出時間は、固定された生体分子に対するリガンドの親和性に対応する。より高い親和性を有するリガンドは、より遅く漏出する。
【０００３】
このカラムから溶出する化合物の検出は、蛍光７、放射能６、またはエレクトロスプレー質量分析５のような方法を使用して、達成され得る。前者２つの方法は、通常、標識されたライブラリー、または標識された指示薬化合物を使用する。この標識された指示薬化合物は、より強い結合リガンドが存在する場合、より早く交換されることに関して、既知の非標識化合物と競合する。しかし、いずれの場合にも、これらの方法は、標識された化合物を得る必要性、およびアッセイにおいて使用される化合物の事前の知識に対する必要性に起因して、制限された汎用性を有する。なぜなら、構造の情報が、検出器によって提供されないからである。従って、蛍光測定法および放射線測定法は、異なる化合物の分析のためのみに、有用である傾向がある。
【０００４】
他方で、ＦＡＣをＥＳＩ−ＭＳと連動させることは、化合物の混合物をスクリーニングするための、非常に汎用性のある方法であることが示された５。ＭＳ、および特に、ＭＳ／ＭＳ検出の使用は、種々の化合物についての構造の情報を同時に得る機会を提供する。混合物中の化合物の正体が既知である場合、これらの分析物は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを使用して、同時に、そして定量的な様式で検出され得、その方法のスループットを改善する。ＦＡＣ／ＭＳ技術のこの独特の局面は、化合物混合物のハイスループットのスクリーニング５、８のような用途のための主要な利点であると考えられるが、質量分析計への化合物の導入のためにエレクトロスプレーイオン化を使用する結果として生じる、いくつかの潜在的な欠点が存在する。例えば、安定なエレクトロスプレーを得ることは、低いイオン強度の溶出物の使用を必要とし、このことは、いくつかの場合において、カラムに固定されたタンパク質の活性を維持することと、両立しないかもしれない９。低いイオン強度はまた、効果的ではない二重層をもたらし得、これは、化合物とシリカカラムとの静電相互作用を介して、かなりの非選択的結合を引き起こし得る。さらに、ＥＳＩ／ＭＳを使用する場合、分析の１つのモードのみが、１回のクロマトグラフィーの実行について可能である。最後に、分析物のレベルは、エレクトロスプレーにおいて、大きいイオン電流を引き起こし得、これは、イオン抑制をもたらし得る１０。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
バイオアフィニティカラムから溶出する化合物を検出するための、より適合性活より効率的な手段に対する必要性が、残っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
バイオアフィニティカラムから溶出する化合物を検出する、現在使用される方法に付随する、上に列挙された問題を克服するために、質量分析工程をオフラインで実施することにより、クロマトグラフィーと質量分析とを切り離すことが、有利である。このことは、フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ）を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＭＳと組み合わせることによって、最も効率的に達成される。その一般的なアプローチは、ＭＡＬＤＩ標的にＦＡＣ溶出物を沈着させ、その後、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ分析を行うことである。ＥＳＩと比較して、ＭＡＬＤＩ分析は、緩衝液に対するより高い許容性、１つの分析物あたりのより低いサンプル消費、および減少した分析時間という利点を有する。ＳＭ工程とＭＳ工程との分離はまた、各分析物についてのＭＳ検出パラメータの、独立した最適化を可能にする。
【０００７】
本発明者らは、ＦＡＣを、新たに開発されたゾル−ゲル由来のモノリシックバイオアフィニティカラム９を使用して、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳ検出に統合し、そして異なるイオン強度での溶出を使用して、小さい酵素インヒビターが捕捉されたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）と相互作用する能力を試験することによって、その作動を、ＦＡＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳと比較した。この連動は、カラム溶出物を、適切なマトリックスと混合すること、引き続いて、噴霧器により補助される、この混合物のＭＡＬＤＩプレート上へのエレクトロスプレー沈着を包含する。このＭＡＬＤＩプレートは、コンピュータ制御されるｘ−ｙ並進ステージ上に存在する。クロマトグラフィーの残りを、半永久的にＭＡＬＤＩプレート上に沈着させ、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳによる、オフラインでの引き続く分析物を可能にする。カラムによって沈着されたトラックの上をレーザーで操作し、一方で、溶出した化合物をＭＲＭモードでモニタリングすることによって、フロンタルクロマトグラムが直接再構築され、各分析物についての漏出曲線を与え得る。ＦＡＣのための検出方法として、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳは、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳと比較して、多数の利点を有することが示される。例えば、高いイオン強度の溶出緩衝液に対するより良好な許容（これは、カラム内のタンパク質の活性を維持することを補助し、そして非特異的な結合を減少させる）；ＦＡＣの実行後ほんの数分での、１つのプレートからの十分な多重ＭＳ走査の能力；およびイオン抑制効果が制限された状態での、高いレベルの潜在的なインヒビターを検出する能力が挙げられる。これらの結果は、ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳが、化合物混合物のハイスループットスクリーニングに十分に適していることを示す。
【０００８】
従って、本発明は、化学サンプルを分析するためのシステムを包含し、このシステムは、ＭＡＬＤＩ質量分析計と連動する、フロンタルアフィニティクロマトグラフィーカラムを備える。
【０００９】
本発明はまた、フロンタフアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ）からのサンプルを分析する方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ＦＡＣカラムからの溶出物をマトリックスと混合する工程；
（ｂ）（ａ）における混合物を表面に沈着させる工程；および
（ｃ）ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して、沈着された混合物を分析する工程。
【００１０】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、これらは、例示のみとして与えられることが理解されるべきである。なぜなら、本発明の精神および範囲に入る種々の変更および改変が、この詳細な明細書から、当業者に明らかになるからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明が、ここで、図面に関連して記載される。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
ＦＡＣ／ＭＳ研究のための新たなプラットフォームとしての、ＭＡＬＤＩ／ＭＳとバイオアフィニティカラムとの連動が、本明細書中に記載される。捕捉されたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を収容する毛管カラムを、低分子混合物のフロンタルアフィニティクロマトグラフィーのために使用した。このカラムからの出力が、メタノール中にマトリックス分子であるα−シアノ−ヒドロキシコハク酸（ＣＨＣＡ）を含有する第二のストリームと混合され、そして噴霧器により補助されるエレクトロスプレー法を使用して、従来のＭＡＬＤＩプレート上に沈着され、このプレートは、コンピュータ制御されるｘ−ｙステージを介してカラムに対して移動し、ＦＡＣ実行の半永久的な記録を作成した。ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳの使用は、ＦＡＣ法とＭＡ方途の切り離しを可能にし、かなり高いイオン強度の緩衝液が、ＦＡＣ研究のために使用されることを可能にし、これによって、イオン性化合物の非特異的な結合が減少し、そして複数の実行にわたって、タンパク質活性のより良好な保持が可能になった。沈着後、ＭＡＬＤＩ分析は、クロマトグラフィーの実行時間の一部のみを必要とし、そして沈着したトラックは、複数回にわたって再実行され得、イオン化パラメータを最適化し、そして信号対雑音を改善するために、信号の平均化を可能にした。さらに、高レベルの潜在的なインヒビターが、制限されたイオン抑制効果で、ＭＡＬＤＩを介して検出され得た。同じイオン強度条件が使用された場合、ＭＡＬＤＩベースの分析とＥＳＩベースの分析との両方が、化合物混合物中に存在するインヒビターの、類似の保持を示した。これらの結果は、ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩ−ＭＳが、化合物混合物のハイスループットのスクリーニングについて、ＦＡＣ／ＥＳＩ−ＭＳより優れた利点を提供することを示す。
【００１３】
従って、本発明は、化学サンプルを分析するためのシステムを包含し、このシステムは、ＭＡＬＤＩ質量分析計と連動する、フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ）を備える。
【００１４】
用語「分析（する）」とは、本明細書中で使用される場合、化学サンプル中の１つ以上の化合物についての情報が、そのシステムを使用して得られることを意味する。このような情報としては、化合物の実体（分子量および断片化パターンを介する）、ならびにカラム中の生物学的材料とのその化合物の相互作用に関連する親和性、反応性、および他の速度論的定数（すなわち、カラム上での保持時間）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００１５】
「連動（する）」とは、ＦＡＣカラムからの溶出物ストリームが、例えば、別のストリームからのＭＡＬＤＩマトリックス材料と混合され、そしてこの混合物が、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ検出のための任意の適切な表面（例えば、標準的なＭＡＬＤＩ−ＭＳプレート）上に沈着することを意味する。この混合物は、任意の適切な方法（例えば、ＭＡＬＤＩ沈着の前の画分収集１１；毛管からのスポット１２、１３、１４またはトラック１５、１６の、噴霧器により補助される直接的な沈着；電気力学的荷電液滴処理１７；加熱された液滴界面を使用する沈着１８；微小分配を介する圧電フロースルー１９、２０；減圧により補助される沈着２１；電場により駆動される液滴沈着２２；エレクトロスプレー沈着２３；または毛管噴霧器スプレー２４、２５であるが、これらに限定されない）を使用して、不連続なスポットとしてか、または連続的なトラックとして、沈着され得る。本発明の１つの実施形態において、沈着は、噴霧器により補助される、トラックの直接的な沈着である。
【００１６】
本発明の１つの実施形態において、沈着の間のプレートの動きは、コンピュータによって制御される。
【００１７】
本発明のシステムの例示的な実施形態が、図１に示されている。ＭＡＬＤＩプレート上への沈着のために、カラム（１０）からの溶出物が、ＭＡＬＤＩマトリックス（２０）と混合され得る。次いで、得られる全体の流れが、ＭＡＬＤＩプレート（３０）上に、任意の公知の沈着方法（例えば、連続的な沈着）を使用して、沈着され得る。プレートの、Ｘ−Ｙ−Ｚ並進ステージ内での移動は、コンピュータ（４０）によって制御され得る。これらの並進ステージは、Ｘ−Ｙ面内での沈着運動、およびＭＡＬＤＩプレートからのＺ軸に沿ったスプレー器の分離を制御する。３つ全ての軸内での動きと一緒に、高電圧および噴霧器ガスの流れの適用もまた、１つのコンピュータ（４０）によって制御され得る。カラムの流れは、マトリックスと混合されて、Ｔ字型接合部（５０）を通って、流れを形成し得る。この混合された流れは、例えば、融解シリカチュービングによって運ばれ、ステンレス鋼電極（６０）を通過する。この電極自体は、噴霧器の内部にある。融解シリカとステンレス鋼の電極との両方が、ノズル（７０）からわずかに突出する。別の混合用Ｔ字管（８０）が、この噴霧器を設置し、そして不活性ガス（９０）（例えば、Ｎ２）を導入するために、使用される。エレクトロスプレー電圧と噴霧器の気体の流れとの両方が、手動で調節され得、そして指で作動され得る。
【００１８】
当該分野において公知の方法を使用して、沈着パラメータ（プレートの上方へのスプレー器の距離、噴霧器の気体の流れ、および電場が挙げられる）が、最大のトラック均質性および最小のトラック幅を得るために、最適化され得る。プレートが沈着チップの下で移動される並進速度もまた、最適なトラックの厚さを提供し、同時に必要なクロマトグラフィー分解能を維持するために、最適化され得る。
【００１９】
本発明のシステムは、タンデムで実行される複数のＦＡＣカラムを使用する、化学サンプルの分析に適用され得る。複数のＦＡＣカラムとＭＳプレートとの間の界面の例示的な実施形態を示す概略が、図２に示される。
【００２０】
沈着されたプレートは、ＭＡＬＤＩイオン源を備える任意の質量分析計を使用して、当該分野において公知の技術を使用して、分析され得る。
【００２１】
ＦＡＣカラムは、ＦＡＣが使用される任意の用途において固体支持体として使用される、任意の型のカラムであり得る。本発明の１つの実施形態において、ＦＡＣカラムは、バイオアフィニティ毛管カラムである。本発明のさらなる実施形態において、ＦＡＣカラムは、モノリシックなシリカマトリックスを収容する。適切には、このモノリシックなシリカマトリックスは、ゾル−ゲル技術を使用して調製される。本発明の複数の実施形態において、このモノリシックなシリカマトリックスは、生体分子適合性の技術を使用して、調製される。「生体分子適合性」とは、その技術が、タンパク質および／または他の生体分子を安定化するか、あるいはこれらの変性を促進しないことを意味する。ＦＡＣのために適切な、生体分子適合性のシリカマトリックスを調製するための方法は、Ａｈａｎｇら、米国特許出願公開番号ＵＳ−２００４−０２４９０８２−Ａ１（２００４年１２月９日公開）において報告されている。
【００２２】
化学サンプルは、任意の数の化学的実体を含有する溶液であり得る。１つの実施形態において、この方法は、モジュレーター、基質、および／もしくは生物学的分子（例えば、タンパク質、ペプチドもしくは核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる）または生物学的材料（例えば、細胞および組織）に結合する他の化合物についての、ハイスループットのスクリーンにおいて使用され、ここで、この生物学的分子または生物学的材料は、カラムのマトリックス内に捕捉されるか、またはこのカラムの表面に他の様式で固定される。このサンプルは、例えば、化合物のライブラリーまたは天然供給源からの抽出物を含有し得る。この方法はまた、全ての化学的実体（酵素反応の基質および産物が挙げられる）をモニタリングしながら、推定酵素モジュレーターのスクリーニングのために使用され得る（例えば、ハイスループットの酵素反応の特徴付け、または他の生体分子反応において）。
【００２３】
用語「生体分子」または「生物学的材料」とは、本明細書中で使用される場合、シリカ内に捕捉され得る、広範な種々のタンパク質、酵素および他の感受性生体高分子（ＤＮＡおよびＲＮＡ）ならびにこれらの誘導体、ならびに複雑な系（植物全体、動物全体、および微生物細胞全体が挙げられる）の、天然に存在するものと合成によるものとの両方のいずれかを包含し、そしてこれらを意味する。生体分子は、適切な溶媒（例えば、水性緩衝溶液）に溶解され得る。本発明の１つの実施形態において、生物学的物質は、その活性形態にある。
【００２４】
本発明はまた、フロンタルアフィニティクロマトグラフィー（ＦＡＣ）からの化学サンプルを分析する方法を包含し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）ＦＡＣカラムからの溶出物をマトリックスと混合する工程；
（ｂ）（ａ）における混合物を表面に沈着させる工程；および
（ｃ）この沈着した混合物を、ＭＡＬＤＩ質量分析を使用して分析する工程。
【００２５】
このマトリックスは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて使用される任意の材料であり得る。本発明の１つの実施形態において、このマトリックスは、メタノールに溶解した、α−シアノ−ヒドロキシコハク酸（ＣＨＣＡ）である。適切には、このＣＨＣＡ溶液の濃度は、０．０１Ｍ〜約０．１Ｍ、より適切には、約０．０３Ｍ〜約０．０５Ｍであり得る。
【００２６】
溶出物とマトリックスとは、約１：５〜約５：１の体積比、適切には、約１：２〜２：１の体積比で、混合され得る。１つの実施形態において、溶出物とマトリックスとは、約１：１の体積比で混合される。
【００２７】
ＦＡＣカラムからの溶出物は、溶出液と、必要に応じて、サンプル由来の１種以上の化合物とを含有する。ＦＡＣのために適切な任意の溶出液および使用される特定のカラムが、使用され得る。溶出液が、高いイオン強度の溶出緩衝液（例えば、１０ｎＭより大きいイオン強度を有する緩衝液）が使用され得ることは、本発明の特定の利点である。
【００２８】
当業者は、適切な流量、溶出液および他のクロマトグラフィーパラメータを、例えば、カラムの大きさ、カラム材料およびサンプルの実体に基づいて、当該分野において公知の方法を使用して、決定し得る。
【実施例】
【００２９】
（化学物質）
テトラエチルオルトシリケート（ＴＥＯＳ、９９．９９９％）および３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）をＡｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から入手した。ジグリセリルシラン前駆体を、ＴＥＯＳから、他の箇所２６に記載されるように調製した。トリメトプリム、ピリメタミン、葉酸、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ／ＰＥＯ，ＭＷ１０ｋＤａ）およびフルオレセインを、Ｓｉｇｍａ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から入手した。ＭＡＬＤＩマトリックス溶液（メタノール中６．２ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−ヒドロキシコハク酸、ＣＨＣＡ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ（部品番号Ｇ２０３７Ａ）から入手した。組換えジヒドロ葉酸還元酵素（Ｅ．ｃｏｌｉ由来）（これを、メトトレキサートカラムでアフィニティ精製した）を、Ｅｒｉｃ  Ｂｒｏｗｎ教授（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から入手した２７。融解シリカ毛管チュービング（内径２５０μｍ、外径３６０μｍ、ポリイミドコーティング）を、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）から入手した。全ての水を、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ合成Ａ１０水精製システムを使用して、蒸留および脱イオンした。他の全ての試薬は、分析等級のものであり、そして入手した状態のままで使用した。
【００３０】
（器具）
（ＦＡＣ／ＭＳシステム）
ＦＡＣ／ＥＳＩ−ＭＳ研究のために使用したシステムを、図３に示す。シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｍｏｄｅｌ  ２２）を使用して、溶液を送達し、そして流れ切り換え弁を使用して、アッセイ緩衝液と、化合物混合物を含有する溶液との間を切り替えた。次いで、この溶液を、カラムに通してポンプ送達し、平衡に達せさせた。溶出物を、適切な有機改変剤と混合して、三重四重極ＭＳシステム（ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ３０００ＴＭ）を使用する、安定なエレクトロスプレーの発生およびスプレーされる成分の検出可能性を補助した。Ｒｈｅｏｄｙｎｅ  ８１２５インジェクタ弁を使用して、操作の間、緩衝液ストリームから、緩衝液＋分析物のストリームに切り替えた。カラムを、ルアー毛管アダプタ（ルアーアダプタ、Ｕｐｃｈｕｒｃｈ製のＦｅｒｒｕｌｅ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍｉｃｒｏｔｉｇｈｔ  Ｓｌｅｅｖｅ（Ｐ−６５９，Ｍ−１００，Ｆ−１８５Ｘ））を使用して、ＦＡＣシステムと連動させた。構成要素間の他の全ての接続を、融解シリカチュービングを使用して達成した。
【００３１】
ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳのための器具が、図１に示される。ＭＡＬＤＩプレート上への沈着のために、カラムの溶出物を、メタノール中のα−シアノ−ヒドロキシコハク酸（ＣＨＣＡ）ＭＡＬＤＩマトリックス（５μＬ／分で流れる）と、１：１の体積比で混合した。次いで、得られた流れ全体を、ＭＡＬＤＩプレート上に、連続沈着プロセスを使用して沈着させた。この実験において、誂えで組み立てた、噴霧器で補助されるエレクトロスプレーシステムを使用して、コンピュータ制御されるＸ−Ｙ並進ステージ上に設置されたＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＬＤＩサンプルプレート（Ｏｐｔｉ−ＴＯＦＴＭシステム）上に、トラックを沈着させた。この並進ステージは、４０４シリーズの軸からなる３軸位置決めシステムの一部であり、Ｐａｒｋｅｒ  Ｈａｎｉｆｉｎ製のＡｒｉｅｓ制御器およびＣｏｍｐｕｍｏｔｏｒｓ製のＡＣＲ  ＰＩＣ制御カードが、Ｘ−Ｙプレート内での沈着の動き、およびＺ軸に沿ったＭＡＬＤＩプレートからのスプレー器の分離を制御する。３つ全ての軸、および高電圧（誂えで組み立てた、指で制御される高電圧電源、４ｋＶ）の印加、および噴霧器の気体の流れ（Ｃｌｉｐｐａｒｄ  ｍｉｎｉｍａｔｉｃｓ弁Ｅｔ−２Ｍ）を、１つのＤｅｌｌ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ３４０コンピュータから、ＡＣＲ制御カードを介して制御した。カラムの流れを、Ｖａｌｃｏ製のステンレス鋼製のＴ字型接合部において、ＣＨＣＡ形成流れと混合した。この混合した流れを、融解シリカチュービング（外径／内径２００μｍ／１００μｍ）によって運び、ステンレス鋼製の電極に通した。この電極自体は、噴霧器の内部に存在した。融解シリカとステンレス鋼電極との両方は、ノズル（内径０．６ｍｍ）からわずかに（１ｍｍ）突出した。混合用のＴ字管を使用して、噴霧器を設置し、そしてこの噴霧器に、Ｎ２ガスを導入した。エレクトロスプレー電圧と噴霧器の気体の流れとの両方を、手動で調節し、そして指で作動させた。
【００３２】
沈着パラメータ（プレート上のスプレー器の距離、噴霧器の気体の流れ、および電場が挙げられる）を、最大のトラック均質性および最小のトラック幅を得るために、最適化した。沈着チップの下方でプレートを移動させる並進速度もまた、必要なクロマトグラフィー分解能を維持しながら最適なトラック厚さを提供するために、最適化した。エレクトロスプレーチップの最適な高さは、サンプルプレートの８ｍｍ上方であり、一方で、気体の流れ（１．５Ｌ／分の窒素）と電場（エレクトロスプレーチップとＭＡＬＤＩプレートとの間で３ｋＶ）との組み合わせを使用して、トラックを沈着させた。この作業のために、ＭＡＬＤＩプレートを、静止した沈着チップに対して、０．２ｍｍ／秒で移動させた。
【００３３】
沈着させたプレートを、ＡＢ／Ｓｃｉｅｘ  ｏＭＡＬＤＩＴＭイオン源およびＪＤＳ  Ｕｎｉｐｈａｓｅ製の高反復速度（１．４ｋＨｚ）ＰｏｗｅｒＣｈｉｐ  Ｎａｎｏｌａｓｅ（３５５ｎｍ）を備えるＡＢ／Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００ＴＭ三重四重極質量分析計を使用して分析した。減圧に基づくｏＭＡＬＤＩＴＭイオン源で、ＡＰＩ  ４０００ＴＭとそのＴｕｒｂｏ  ＶＴＭ源との通常のオリフィス／界面アセンブリを置き換え、これによって、ＭＡＬＤＩサンプルプレートを、界面減圧ポンプによって排気された領域内に、図４に示されるように、分析器の軸に対して直交する配向で配置した。通常の供給源パラメータを使用して、ｏＭＡＬＤＩＴＭイオン源を設定および制御した。供給源の内部で、ＭＡＬＤＩプレートを、スキマー（ｓｋｉｍｍｅｒ）のオリフィスの前方で、Ｘ−Ｙ併進ステージ上に保持した。スキマーは、このＭＡＬＤＩプレートを分析器から隔離する。改変したＡＰＩ  ４０００ＴＭは、走査モードと走査速度とのその全能力を維持した。他に言及されない限り、ＭＡＬＤＩ分析の間、沈着されたトラック（プレート）を、ＭＡＬＤＩ源Ｘ−Ｙステージによって、３．８ｍｍ／秒の一定の速度で、脱離用レーザービームに対して移動させた。この脱離用レーザービームは、トラック表面に、１８０μｍ×２３０μｍのスポットの焦点を合わせた。
【００３４】
（手順）
（カラムの準備）
捕捉されたＤＨＦＲを収容するマクロ細孔シリカカラムを、他の箇所９に詳細に記載されるように、準備した。簡単に言えば、内径２５０μｍの毛管を、最初に、ＡＰＴＥＳの層でコーティングし、モノリシックなシリカカラムの静電的結合を容易にした。シリカゾルを、最初に、１ｇのＤＧＳ（微細に粉砕した固体）と９９０μＬのＨ２Ｏと混合して、１分間〜２５分間の超音波処理後に約１．５ｍＬの加水分解したＤＧＡを得ることによって、調製した。ｐＨ７．５の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳの第二の水溶液（１６％（ｗ／ｖ）のＰＥＯ（ＭＷ＝１０ｋＤａ）および０．６％（ｖ／ｖ）のＡＰＴＥＳを含有する）を調製した。この水溶液はまた、約２０μＭのＤＨＦＲを含有した。１００μＬの緩衝液／ＰＥＧ／ＡＰＴＥＳ／ＤＨＦＲ溶液を、１００μＬの加水分解したＤＧＳと混合し、そしてこの混合物を、シリンジポンプを介して、融解シリカ毛管（約２ｍ長）に即座に装填した。この溶液の最終濃度は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中、８％  ｗ／ｖ  ＰＥＯ（１０ｋＤａ）、０．３％  ｖ／ｖ  ＡＰＴＥＳおよび１０μＭ  ＤＨＦＲであった。この混合物は、シリカの重合（約１０分間）の約２分〜３分の前の、１秒間〜３秒間にわたるスピノダール分解（相分離）に起因して曇り、捕捉されたタンパク質を収容する水和マクロ細孔モノリシックカラムが得られる。ゾル−ゲル混合物の装填後、これらのモノリシックカラムを、４℃で２日間〜５日間熟成させ、次いで、使用前に５ｃｍの長さに切断した。これらのカラムは、５ｃｍの中に、２５ｐｍｏｌの活性ＤＨＦＲを最初に装填され、このうちの約６ｐｍｏｌが活性であり、そしてこのカラムの中でアクセス可能であった９。
【００３５】
（ＦＡＣ／ＭＳ研究）
代表的なＦＡＣ／ＭＳ実験は、５０ｎＭの各化合物を含有し、空隙マーカーとしてのＮ−アセチルグルコサミンおよび／またはフルオレセイン、葉酸（マイクロモル濃度の基質）ならびにピリメタミンおよびトリメトプリム（ｎＭのインヒビター）を含有する、化合物の混合物の注入を包含した。最初の実行の前に、カラムを、５０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ緩衝液（ｐＨ６．６、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で、３０分間、５μＬ／分の流量でフラッシュし、あらゆるグリセロールおよび捕捉されていないタンパク質を除去し、次いで、０〜１００ｍＭ  ＨＨ４ＯＡｃで、３０分間、５μＬ／分で平衡化した。試験した全ての化合物は、０〜１００ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ中に存在し、そしてシリンジポンプを使用して、５μＬ／分の速度で送達された。形成流れ（安定なエレクトロスプレーイオン化の発生を補助するために使用した）は、１０％（ｖ／ｖ）のＮＨ４ＯＨ緩衝液（２ｍＭ）からなり、５μＬ／分で送達され、ＥＳＩ質量分析形に入る、１０μＬ／分の総流量を得た。ＭＡＬＤＩについては、この形成流れを、５μＬ／分のマトリックスの流れ（ＣＨＣＡ、メタノール中６．２ｍｇ／ｍＬ）で置き換えた。ＥＳＩ質量分析計を、ＭＲＭモードで作動させ、ｍ／ｚ  ２２２→ｍ／ｚ  ２０４（Ｎ−アセチルグルコサミンＣＥ１５ｅＶ）；ｍ／ｚ  ２４９→ｍ／ｚ  ２３３（ピリメタミンＣＥ４２ｅＶ）；ｍ／ｚ  ２９１→ｍ／ｚ  ２３０（トリメトプリムＣＥ３５ｅＶ）；ｍ／ｚ  ３３３→ｍ／ｚ  ２０２（フルオレセインＣＥ１５ｅＶ）およびｍ／ｚ  ４４２→ｍ／ｚ  ２９５（葉酸）を、同時に検出した。ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ分析をまた、ＭＲＭ走査モードを使用して実施したが、ＭＡＬＤＩ脱離プロセスの間の断片化に起因して、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび葉酸についての遷移は、それぞれ、ｍ／ｚ  ２０４→ｍ／ｚ  １３８（ＣＥ１８ｅＶ）およびｍ／ｚ  ２９５→ｍ／ｚ  ２７６（ＣＥ３０ｅＶ）に変化した。
【００３６】
ＭＡＬＤＩを使用して達成可能な、ずっと短い分析時間は、十分なサンプリング頻度を維持するために、信号蓄積ビン持続時間（滞留時間）の減少を必要にする。ＥＳＩに基づくＭＲＭ分析は、１０００ｍｓの滞留時間を使用し、一方で、ＭＡＬＤ  ＭＲＭの滞留時間は、１つの遷移あたり４０ｍｓに減少した。従って、定常状態のＭＲＭ信号変動を、２つのイオン化方法の間で比較する場合、ＭＡＬＤＩ信号のより高い雑音レベルは、蓄積した計数の通常の統計学的変動の増加（減少した滞留時間の副作用）、およびトラックの均質性の変動に起因する（ＥＳＩは、プレートが全ての分析物を捕捉する時間（あらゆる一時的な変動および乾燥／結晶化の変動を含む）にわたって安定なスプレーの少量をサンプリングする）。
【００３７】
（酢酸アンモニウム中でのＤＨＦＲの安定性）
ＤＨＦＲを、２ｍＭまたは１００ｍＭの酢酸アンモニウム（これは、３μＭのＨＥＰＥＳおよび２μＭのＮａＣｌを含有した）中に、４０ｎＭに希釈し、そして２４時間までの種々の時間にわたって、インキュベートした。特定の間隔で、１００μＬのアリコートを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ＝７．５）、２ｍＭ  ＤＴＴ、１００μＭ  ＮＡＤＰＨおよび１００μＭ  ＤＨＦを含有する１００μＬの溶液と混合した。ＤＨＦＲ活性を、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅマイクロプレートリーダーを使用して、３４０ｎｍの吸光度の減少をモニタリングすることにより、測定した。活性データを、２ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨｃＬ（ｐＨ７．５）中に希釈したＤＨＦＲサンプルから得られた活性に対して報告する。
【００３８】
（結果）
（実施例１：ＦＡＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）
図５は、ＤＨＦＲインヒビターとコントロール化合物との混合物の、タンパク質を含まない（パネルＡ）か、または２５ｐｍｏｌの活性ＤＨＦＲの初期装填を含む（パネルＢ）、ＤＧＳ／ＰＥＯ／ＡＰＥＳカラムを通しての溶出から得られた、ＦＡＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳトレースを示す。ブランクカラムは、最初の数分間（１分と４分との間）における全ての化合物の、予測されたバックグラウンドを示すが、ピリメタミンとトリメトプリムとの両方は、陽イオン性であるが、陰イオン性の化合物であるフルオレセインおよび葉酸よりわずかに長く保持された。保持（これは、２ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液を使用する場合に存在する）は、陽イオン性化合物と陰イオン性のシリカカラムとの間の、非選択的な相互作用を示し、このことは、順相シリカクロマトグラフィーが、低いイオン強度において、完全には抑制されないことを示す。パネルＢは、２つのＤＨＦＲインヒビター（トリメトプリム（Ｋｄ＝４ｎＭ、溶出時間２２分）およびピリメタミン（Ｋｄ＝４５ｎＭ、保持時間２８．５分））のかなり長い保持、弱い基質のより短い保持（葉酸、Ｋｄ＝１１μＭ、保持時間＝３分）、およびＤＨＦＲ装填されたカラム上の非選択的リガンド（フルオレセイン、Ｎ−アセチル−グルコンアミド、保持時間＝１．５分）の保持がないことを示す。この結果は、ＤＨＦＲが、カラム内に捕捉される場合に活性であることを示し、このことは、ＤＧＳ由来の材料を捕捉する場合のＤＨＦＲの良好な活性を示す最近の結果９、２８と一致する。ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ由来のクロマトグラムの興味深い局面は、ピリメタミンの溶出の際の、トリメトプリムについてのイオン電流の大きい減少である。このような効果は、以前には、「ロールアップ」現象と関連付けられていた。この現象において、より強く結合する化合物は、より弱い結合因子の効力をなくし、より弱く結合するリガンドの一時的な過剰濃縮を引き起こす５。しかし、本発明の場合、イオン電流の損失は、ロールアップ効果に起因するのではなく、むしろ、トリメトプリムのイオン電流の抑制（これは、この研究において使用されるインヒビター濃度（５０ｎＭ）において、優勢である）に起因する。これらの化合物を低レベル（２０ｎＭ）で使用する、以前のＦＡＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ研究は、このような効果を示さなかった９。イオン抑制効果は、以下に提供されるＦＡＣ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳデータによって、さらに確認される。
【００３９】
トリメトプリムとピリメタミンとの、（それぞれのＫｄ値に基づいて）予測される溶出時間の逆転は、以前に報告されていた９が、現時点では完全には理解されていない。この現象は、オン速度とオフ速度との差に関連し得、これは、カラム表面の化合物の全体の保持時間を決定する際に、重要な役割を果たすようであることが、考えられる。
【００４０】
（実施例２：ＦＡＣ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ）
（ａ）ＭＡＬＤＩ  ＭＲＭ遷移の最適化：
ＭＡＬＤＩによるオフラインＭＳ分析の有用な特徴は、サンプルトラックを複数回再実行し、異なるＭＳデータを獲得することを可能にする能力である。これにより、ＭＲＭパラメータの最適化が可能になる。図６は、４つの標的分析物（葉酸、ピリメタミン、トリメトプリムおよびフルオレセイン）の混合物の、適切なバックグラウンドを減算してＣＨＣＡバックグラウンド信号を減少させた後の、ＭＡＬＤＩ  Ｑ１スペクトルを示す。ピークは、これらの４つの化合物の各々について明らかである。しかし、葉酸についての主要なピークは、ｍ／ｚ  ４４２ではなくｍ／ｚ  ２９５で起こる。このことは、断片イオンが、この化合物について存在する主要な種であることを示す。葉酸に焦点を当てると、ｍ／ｚ  ２９５の親イオンを使用して同じトラックから得られた生成物イオンの走査は、ｍ／ｚ  １７６に極大ピークを示し、その強度は、５．５×１０５ｃｐｓである。ｍ／ｚ  ４４２の親イオンから得られる、最も多い生成物イオンは、ｍ／ｚ  ２９５→ｍ／ｚ  １７６のイオン対の強度のほんの１５％であった。このことは、ＥＳＩの場合とは対照的である。ＥＳＩの場合、ｍ／ｚ  ４４２→ｍ／ｚ  ２９５の遷移が、最大の強度を示し、そしてＭＲＭ遷移をＭＡＬＤＩプレート上で直接最適化し得ることの重要性を強調する。
【００４１】
（ｂ）ＭＡＬＤＩパラメータの最適化：
ＭＡＬＤＩプレート上に沈着したトラックの分析は、本発明の沈着パラメータを使用して得られた代表的なトラック幅が、約２．５ｍｍであったことを示す。レーザーのスポットサイズは、１８０μｍ×２３０μｍであり、これは、沈着したトラックの幅の約１０％のトラックの燃焼をもたらす。ＭＡＬＤＩの獲得の間の、少量のみの沈着サンプルの利用は、方法の設定において利点を与える。ここで、ＭＲＭ選択および分析器の最適化が、トラック／スポットの再実行を介して、ＥＳＩ（約１０ｐｇ）と比較して、少量のサンプル（約１０ｐｇ）で達成され得る。
【００４２】
生じる問題は、トラックの特定の領域が再実行され得る回数である。なぜなら、この回数は、トラックのすでにサンプリングされた部分を再実行する能力を、どのように最もよく利用し、これによって、検出プロセスの効率を増加させるかを決定るからである。トラックが再実行され得る回数は、レーザーがこのサンプルにわたって並進される周波数および速度に依存する。ＭＡＬＤＩプロセスについて使用されるレーザーの周波数は、３μＪ／パルスに設定された。この値は、トラック表面の熱分解を最小にしながら、信号対雑音比を最適化し、これによって、最大のサンプル利用を可能にした。トラックのある領域にわたる、可能な再実行の数に対する、サンプリング速度の影響が、図７に示される。サンプルの消費は、レーザーがトラックを横断する速度に依存することが明らかである。より大きい速度は、より少ないサンプル消費を引き起こし、より多くの再実行を可能にする。ＭＡＬＤＩ源ステージの最大速度（３．８ｍｍ／秒）は、トラックの所定の領域において起こるサンプルの排出の前に、約３０回の再実行を可能にする。この領域において、信号の大部分が、最初の１５回の通過の間に脱離する。しかし、トラック全体のうちのほんの小さい部分（約１０％）のみがサンプリングされるので、１つのトラックあたり７個〜８個までの異なる領域がサンプリングされるようであり、従って、実際に、１つの沈着されたトラックが、１００回にわたってサンプリングされ得る。光源によって可能にされる値にわたって、レーザーの併進速度を変化させることにより（０．５ｍｍ／秒、１ｍｍ／秒、および３．８ｍｍ／秒）、より低い速度で最大の信号強度がかなり増加するが、なされ得る再実行の数が減少することが示される。従って、所定のサンプル領域の完全な排出によって得られる全信号は、比較的一定なままであり、そしてデータが生成される速度とは無関係である。高い併進速度を使用することにより、解釈可能な信号の最速の獲得が与えられ、従って、スループットが最大になる。
【００４３】
分析物：マトリックスの比もまた、３：１〜１：３（ｖ：ｖ）の範囲で変動させて、上記４つの化合物についての最適な検出を達成した。その結果を、信号を、１ユニットの分析物あたりのバックグラウンドで除算したものとして表現して、表１にまとめる。最適な比は、化合物に特異的であることが明らかである。しかし、１：１（ｖ：ｖ）の使用は、全ての化合物を検出する全体的な感度と能力との間の、最もよい妥協を与える。実際に、フルオレセインの検出は、１：１の分析物：マトリックスの比のみで可能であった。なぜなら、ｍ／ｚ  ３３３→ｍ／ｚ  ２０２の遷移についてのマトリックスのバックグラウンドは、極端に高く、そして他の分析物：マトリックスの比でのフルオレセイン信号を圧倒した。高い緩衝液濃度でのＭＡＬＤＩの性能は、わずかに高いＣＨＣＡ含有量により改善されることもまた、観察された。このことは、結晶化と荷電のための競合との両方を改善し得る。
【００４４】
（ｃ）ＦＡＣ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ分析：
図８は、ブランクカラム（図８ａ）またはＤＨＦＲカラム（図８ｂ）からの溶出物が、実行緩衝液として２ｍＭ酢酸アンモニウムを使用して沈着された、ＭＡＬＤＩプレートからの沈着に関して得られた、ＦＡＣトレースを示す。図８において、化合物は、ＭＡＬＤＩプレート上に沈着した最初の２つのトレースにおいて溶出する（矢印は、分析されたトレースを示す）。図８の下の目盛は、ＭＡＬＤＩの分析時間を示し、これは、沈着速度対レーザー読み取り速度の比（これは、この場合には、１９である）を倍率因子として使用して、ＬＣ溶出時間に変換され得る。ＦＡＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳについての場合と同様に、フルオレセイン、Ｎ−アセチルグルコサミンおよび葉酸が、最初に溶出し（１．５分間のＬＣ時間）、引き続いて、トリメトプリム（３分間のＬＣ時間）およびピリメタミン（３．５分間のＬＣ時間）が溶出した。ここでまた、低いイオン濃度の緩衝液を使用する場合の、分析物の非特異的な結合が示される。このことは、驚くべきことではない。なぜなら、溶出時間は、検出のために使用されるＭＳの特定の型ではなく、カラムによって決定されるからである。より興味深いことには、プレート上のトレースを分析するために必要とされるＭＳの分析時間は、実際のＬＣ時間の８分間と比較して、０．５分未満である。従って、ＬＣ沈着時間は、両方の方法について類似であるが、同じサンプルを解釈するためにＭＳの複数のモードを使用することが、可能である（図７を参照のこと）。各モードは、実行のために数分しか必要としない。
【００４５】
図８ｂは、ＤＨＦＲを装填されたカラムから得られたデータを示す。ここでまた、２ｎＭのインヒビターは、かなり長い保持を示し、保持時間は、ＦＡＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳから得られた保持時間と類似である（トリメトプリム；ｔ−ｔ０＝２０分、ピリメタミン；ｔ−ｔ０＝２８．５分）。ＥＳＩ／ＭＳと比較してわずかに長い溶出時間は、ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩ研究のために使用されたカラムが、ＦＡＣ／ＥＳＩのために使用されたカラムよりわずかに長かったという事実を反映する。ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩ分析からの重要な知見は、低いイオン抑制であり、これは、ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ法の別の重要な利点を示す。このことは、ＭＡＬＤＩイオン化の性質が、ＥＳＩよりも化学イオン化（およびＡＰＣＩ）により近いことに起因し得る。ＭＡＬＤＩの場合、レーザーにより脱離された種は、表面から発生した煙の内部での、ＣＨＣＡイオンとの相互作用によってイオン化される。このような場合、それらの結果は、ＡＰＣＩプロセスにおける減少したイオン抑制の十分に確立された観察１０、２９、３０と一致する。高レベルの不純物に起因するＭＡＬＤＩ信号抑制は、Ｋｒａｕｓｅ３１およびＧｈａｒａｈｄｉ３２によって報告されているが、これは、サンプルの結晶化の変化（この場合、このような条件下でのウェットスポット結晶化は、不均質な縁付きのスポットを生じる）によって、または不十分なＣＨＣＡがサンプル中に存在することによって、よりよく引き起こされ得る。このような場合、レーザービームに対する表面の不透明性が、乾燥の際に生じる。本発明の沈着方法において、結晶化プロセスとＣＨＣＡ量との両方が、小さい結晶（ほぼ乾燥したスプレーがＭＡＬＤＩプレートに衝突する）の高密度のトラックを、高い表面対体積比（ＭＡＬＤＩのような表面で駆動されるプロセスについて重要なパラメータ）で生じるために最適化された。
【００４６】
表２は、ＭＡＬＤＩについては２ｍＭと１００ｍＭとの酢酸アンモニウム（ＡＡ）緩衝液レベル、そしてＥＳＩについては２ｍＭを使用して、ＥＳＩ方法とＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ方法とから得られた、信号対バックグラウンドレベルを比較し、そして標準化されたプロットの、絶対計数への変換のための手段を提供する。ＥＳＩ実験およびＭＡＬＤＩ実験の各々が、異なる質量分析器（それぞれ、ＡＰＩ  ３０００ＴＭおよびＡＰＩ  ４０００ＴＭ）を使用してなされたにもかかわらず、一般的な比較（指標のみと指定とされる）が可能であることが留意されるべきである。なぜなら、ＭＡＬＤＩの作動についてのＡＰＩ  ４０００ＴＭを、ｏＭＡＬＤＩＴＭ源を取り付けることによって変換することにより、その通常のオリフィス／界面およびＴｕｒｂｏ  ＶＴＭ源が除去されるからである。これらの構成要素が、約５０μＬ／分の流量でのＡＰＩ  ３０００ＴＭより優れた有意な性能増強を提供する。これらのデータは、ＭＡＬＤＩが、１００ｍＭの緩衝液を用いて、ＥＳＩが２ｍＭの緩衝液を用いて与える信号とおよそ同じレベルの信号を与えるものの、ＭＡＬＤＩは、２ｍＭのＡＡ緩衝液を用いて、感度のかなりの増加を与えることを示す。この結果は、表３に示されるように、２つの技術によって一定量のサンプルについて発生した全信号を比較することによって、さらに確実にされる。２ｍＭ  ＡＡ緩衝液中の各分析物の５０ｎＭの溶液のＭＡＬＤＩ分析は、ＥＳＩから得られる全信号の約２０倍から１００倍を生成する。ＥＳＩプロセスについて、非常に少量のスプレーされたサンプルのみが、実際に分析器に入り、そして検出され、ここで、ＭＡＬＤＩトラックは、サンプルの全てを捕捉し、そしてトラックおよび捕捉されたサンプルの繰り返しの分析を可能にする。
【００４７】
ＭＡＬＤＩにおける信号レベルは、ＥＡＩにおける信号レベルより高いが、ＭＡＬＤＩの獲得は、ＥＳＩについての１０００ｍｓに対して４０ｍｓというより短い滞留時間、およびトラックにおける不均一性に起因するさらなる雑音に起因して、より大きい雑音に悩まされる。そうであっても、ＭＡＬＤＩプロセスは、トラックの多数の再実行からの信号を組み合わせることによって、その雑音を低下させる能力を与える。信号の平均により得られる雑音減少は、データ解釈のために必要とされる所望のレベルに達するまで適用され得る。トラックの迅速なレーザー再実行および合計の選択的な適用は、時間感受性の様式で、一定量のサンプルの効率的な使用を可能にする。
【００４８】
ＭＡＬＤＩ分析が、１００ｍＭのＡＡ緩衝液を用いてさえ可能であるとして、イオン強度も、ＦＡＣプロセスに対する影響を調査した。図９は、イオン強度の、非特異的結合の程度に対する影響を、ブランクのモノリシックカラムを使用して示す。この場合には、葉酸、ピリメタミンおよびトリメトプリムのみが溶出し、葉酸が、空隙マーカーとして働いた。全てのデータを、同じカラムで実行し、低いイオン強度から開始し、１００ｍＭのイオン強度まで増加させた。０ｍＭのイオン強度において、カラムでの全ての分析物がかなり長い時間保持され、そしてより興味深いことには、溶出が、非常に広い時間範囲にわたって広がる。このことは、かなりの量の非特異的結合を示す。２ｍＭのイオン強度の使用（上記を参照のこと）は、より鋭利な溶出プロフィールをもたらすが、化合物（葉酸を含めて）の、数分間までのかなり長い保持を引き起こす。他方で、５０ｍＭまたは１００ｍＭのいずれかのイオン強度が使用される場合、化合物は、より早い時点で（全強度の５０％に達する時間に基づく）、ずっと狭い範囲にわたって、溶出する。このことは、非特異的な結合が抑制されたことを示す。これらの実験からの重要な点は、１００ｍＭのイオン強度においてさえも、噴霧器により補助されるエレクトロスプレー方法を使用して、ＬＣ溶出物を満足に沈着させることが可能であったことである。さらに、緩衝液としての酢酸アンモニウムの使用は、有意な付加イオンを生成せず、同じＭＲＭ遷移が、使用される緩衝液の濃度にかかわらず使用されることを可能にした。他方で、１００ｍＭのサンプルの不連続なスポッティングは、マトリックス／緩衝液のほとんどを、スポットの縁部に沈着させ（データは示さない）、ＭＡＬＤＩ分析のための信号レベルと雑音レベルの、有意な非再現性をもたらす。
【００４９】
イオン強度に依存する別の要因は、捕捉されるタンパク質の活性の維持であり、これは、バイオアフィニティカラムが再使用され得るか否かを決定する。ＤＨＦＲカラムを備えるＦＡＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳを使用した、以前の研究は、２ｍＭのイオン強度の使用が、２ｍＭの酢酸アンモニウム中でのＤＨＦＲの低い安定性に起因して、カラム性能の有意な低下を生じたことを示した９。図１０は、ＤＨＦＲタンパク質が、１００ｍＭの酢酸アンモニウム中での２時間のインキュベーション後に、完全な活性を保持するが、２ｍＭの酢酸アンモニウムの存在下では、類似の時間の後に、その初期の活性の半分未満を維持することを示す。５時間後、タンパク質は、１００ｍＭの緩衝液中で、８０％を超える活性を保持するが、２ｍＭの緩衝液中では、１０％未満の活性を保持する。これらのインキュベーション時間は、ＦＡＣに通常関連する最も長い実行時間に対応し、そして明らかに、ＭＡＬＤＩ／ＭＳのみと適合性である高いイオン強度の緩衝液の使用が、ＦＡＣ実験の必要とされる実行時間にわたって、活性を保持する結果となるべきことを実証する。
【００５０】
図１１は、モノリシックなＤＨＦＲカラムの再使用可能性に対する、高いイオン強度の影響を示す。パネルＡは、１０ｍＭの酢酸アンモニウム中５０ｎＭの葉酸、ポリメタミンおよびトリメトプリムを使用して、カラムの初期の実行について得られた、ＦＡＣ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳトレースを示す。パネルＢは、１００ｍＭの酢酸アンモニウムを使用して得られた回復実行を示し、そしてパネルＣは、パネルＡにおいて使用された条件と同じ条件下での、同じカラムの２回目の実行を示す。１回目の実行と２回目の実行との間の保持時間が、わずかに減少しているが、１００ｍＭのイオン強度を使用する場合のカラムの全体の性能は、２ｍＭのイオン強度を使用する場合に得られる性能よりはるかに優れている。例えば、トリメトプリムとピリメタミンとの両方についての保持時間は、１００ｍＭのイオン強度にて、２０％のみ減少するが（トリメトプリムについて１１．５分から１０分、ピリメタミンについて１６．５分から１３．５分）、一方で、ほぼ８５％の保持時間の減少が、２ｍＭのイオン強度にて得られた９。１００ｍＭのイオン強度における全ての化合物についての保持時間が、２ｍＭにおいて得られた保持時間より有意に短かったこともまた、価値あることである。このことは、部分的に、後者の実験についてのより短いカラムの使用（６ｃｍに対して５ｃｍ）に起因したが、おそらく、より低い非特異的結合、およびより高いイオン強度の結果として起こったかもしれない脱離定数の変化にもまた、起因した。実行の間での保持時間の２０％の移動は、比較的大きいが、このような損失は、タンパク質の変性よりもむしろ、ゆるく捕捉されたタンパク質のゆっくりした漏出に起因し得る。細孔型態の観点でのカラムのさらなる最適化は、カラムの再使用のさらなる改善を可能にし得、そしてＦＡＣ研究を高いイオン強度で実行する能力と組み合わせられる場合（上で実証されたように）、このようなカラムを数回再使用することが可能であり得る。
【００５１】
（実施例１および実施例２についての考察）
毛管規模のメソ細孔／マクロ細孔ゾル−ゲルベースのモノリシックバイオアフィニティカラムは、理想的には、混合物中の特定の化合物の同定のための、フロンタルアフィニティクロマトグラフィーを質量分析検出と一緒に使用する、化合物混合物のスクリーニングのために適切である。ゾル−ゲル由来のカラムの特定の利点は、それらの種々の異なるタンパク質との良好な適合性である。本研究は、可溶性酵素の捕捉に焦点を当てたが、本明細書中において使用されるゾル−ゲル方法は、広範な重要な薬物標的（膜結合タンパク質２８およびレセプター３３、ならびに全細胞３４さえもが挙げられる）の捕捉にもまた、適用可能である。さらに、ＤＧＡ由来のメタノールへの捕捉は、他の方法によって固定することが困難な不安定な酵素（例えば、第Ｘａ因子およびＣｏｘ−ＩＩ２８）の固定を可能にする。従って、モノリシックカラムは、広範な種々の有用な標的に対する、化合物混合物のスクリーニングにおいて、用途を見出し得る。
【００５２】
内径が小さいモノリシックカラムの別の利点は、毛管カラムを、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩ質量分析計と直接連動させる能力であり、このことは、おそらく、これらのカラムを、ＦＡＣ／ＭＳを使用する化合物のＨＴＳのために適切にする。具体的には、本発明のモノリシックカラムの小さい内径は、これらのカラムが、分析物の比較的薄いストリームをＭＡＬＤＩプレート上に沈着させることを可能にし、高密度（１つのプレートあたり１２のトレースまで）の沈着を可能にする。ＭＡＬＤＩプレートの時間容量は、沈着されたトラックの幅、およびその沈着速度によって、決定される。沈着速度を低下させることにより、プレート容量が増加するが、これはまた、任意の瞬間において溶出する材料が有限領域（スプレー直径によって与えられる）およびにわたって沈着される場合に、ＬＣ分解能を損ない、そして２つの隣接する事象の重なりが増加する。スプレー直径は、プレートの容量とクロマトグラフィー記録の正確さとの両方に直接影響を与えるので、この直径を、可能な限り小さく維持することが重要である。実用的に言えば、許容され得るクロマトグラフィー分解能の損失は、最低沈着速度を決定する。ＬＣの実行および分析は、ここで２つの時間に依存しない事象として切り離されたので、沈着速度と問い合わせ速度との間の比が、１つのトラックにわたって一度に、いかに多くの再実行および異なる分析実験が実施され得、ＬＣの再実行にわたってかなりの時間を節約し得るかを決定する。
【００５３】
本明細書中に報告されたＦＡＣ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳに伴う特定のパラメータは、性能を増強するために最適化され得る。例えば、より狭い、より少ない沈着トレースを生じ得る沈着方法は、プレート上でのより高密度の分析物を提供する３５。このことは、レーザービーム内のより高い分析物濃度、および従って、より良好なＬＯＤをもたらすはずである。より小さい直径のカラムは、より低い流量での、より迅速なＬＣ分離を可能にし得、このことは、ＭＡＬＤＩ標的上の薄いトラックの沈着と両立する。より細いカラムに加えて、ＭＡＬＤＩマトリックスから固有のバックグラウンドを抑制する方法は、分析物信号からバックグラウンド信号を減算する必要性を最小にする。このことは、ＭＲＭモードを使用する場合にはさほど問題にならず、実際に、現在の研究においては必要とされないが、このような方法は、現在使用されているＭＡＬＤＩマトリックス種と構造が類似している生成物イオンを有する薬物化合物に関して、使用され得る。
【００５４】
ＦＡＣ研究のためのＥＳＩ／ＭＳと比較したＭＡＬＤＩ／ＭＳの利点は、より高いイオン強度の緩衝液を、ＦＡＣ実行の間に使用する能力である。タンパク質の活性は、溶液のｐＨおよびイオン強度のような要因に非常に依存することが公知であり、そしてほとんどの場合には、最大の活性は、生理学的条件を模倣する緩衝液（すなわち、２０〜５０ｍＭの緩衝液、１００ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ約７．４）を使用して得られる。さらに、高いイオン強度は、より効果的な二重層を提供し、これは、陰イオン性シリカ表面の電荷をより良好にスクリーニングし、従って、荷電分析物とシリカ表面との間の静電相互作用を減少させる。本発明の研究において、Ｎａ＋およびＫ＋は、付加イオン形成に付随する問題を回避するために、回避された。実際に、酢酸アンモニウム（これは、揮発性緩衝液である）が、イオン強度を調節するために選択された。この緩衝液の使用は、付加イオンの形成をもたらさず、そして１００ｍＭの濃度でさえも、ＬＣ沈着に適用可能な条件を提供した。より高レベルの酢酸アンモニウムが、ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩのために使用されることが可能であるが、このようなレベルは、この研究においては試験されなかった。上で示されたように、高いイオン強度の使用は、非特異的結合の予測された減少をもたらし、そしてまた、カラムの繰り返しの使用の際の、タンパク質活性のより良好な維持を生じた。このことは、明らかに、ＭＡＬＤＩ／ＭＳの使用が、タンパク質をドープされたカラムを使用するＦＡＣ研究のために、ＥＳＩ／ＭＳより優れたかなりの利点を有することを示す。
【００５５】
ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳの使用は、フロンタルアフィニティクロマトグラフィー研究のための、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳの使用より優れた、かなりの利点を提供する。ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳは、高いイオン強度の緩衝液のより良好な許容性、低いイオン抑制、より速いＭＳ分析時間、１回のＬＣ実行あたりのより多くのＭＳ分析のモードへのアクセスを提供し、そして異なる質量分析器（三重−四重極、ＴＯＦ、ＴＯＦ−ＴＯＦ、Ｑ−ＴＯＦ、イオントラップ、ＦＴ−ＭＳ）を使用して、同じサンプルからデータを獲得する能力を潜在的に与える。このことは、より高い分子量の種が分析される場合に、有利であり得る。これらの利点は、フロンタルアフィニティクロマトグラフィーを、生理学的条件をよりよく模倣する条件下で実施する能力をもたらし、固定されたタンパク質についての活性のより良好な保持をもたらし、そしておそらく、より信頼性のある結合定数データを提供する。１回のＬＣ実行に付き複数のＭＳ分析を実行する能力は、低濃度の分析物の検出を最適化するため、または天然産物のライブラリーもしくは類似の化合物混合物中に存在し得る未知の化合物を同定するために、有利に使用され得る。ＥＳＩ／ＭＳにおいて、化合物のＭＲＭ遷移、および従って実体は、ＦＡＣの実行の前に既知でなければならない。さもなければ、未知の化合物は、「ロールアップ」モードで、指示薬化合物を使用して間接的に、化合物の同定をオフラインで実施して、同定されなければならない。本明細書中に示されるように、このようなロールアップ効果は、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳを使用する場合、イオン抑制を妨げ得、指示薬モードを使用する場合に、真の「ヒット」を同定する際に困難を生じる。ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳは、これらの問題を最少にし、指示薬モードをより信頼性のあるものにし、そしてまた、沈着した分析物の完全なＭＳ分析を可能にし、未知のものの同定を補助する。全体として、本研究の結果は、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳが、ＦＡＣと組み合わせて使用される場合に、ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳより優れた多数の利点を提供し得、ＬＣ／ＭＳに基づくハイスループットのスクリーニングのための、改善された方法を提供する。
【００５６】
本発明が、上記実施例を参照して記載されたが、本発明は、開示された実施例に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる、種々の改変および等価な配置を網羅することが意図される。
【００５７】
全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許または特許出願の各々が、その全体が本明細書中に参考として援用されると具体的かつ個々に示されると同程度まで、その全体が本明細書中に参考として援用される。本願中の用語が、本明細書中に参考として援用された文献において、異なって記載されていることが見出される場合、本明細書中に提供される定義が、その用語についての定義として働くべきである。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
【表２】
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【００６０】
【表３】
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【００６１】
【表４】
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【００６２】
【表５】
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【００６３】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は、ＦＡＣ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳのために使用される、本発明の１つの実施形態を図示する、システムの概略図である。カラム出口は、噴霧器内に直接流れるＭＡＬＤＩマトリックス溶液の添加のための、混合用Ｔ字管に接続され、この混合物を、ＭＡＬＤＩプレート上にスプレーすることを可能にする。このＭＡＬＤＩプレートは、カラムの出口の下で、コンピュータ制御されるＸ−Ｙ並進ステージ上を移動する。
【図２】図２は、複数のＦＡＣカラムとＭＡＬＤＩ−ＭＳプレートとの連動の例示的な実施形態を示す概略図である。
【図３】図３は、ＦＡＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳのために使用される、先行技術のシステムの概略図である。切り換え弁が、緩衝液から、緩衝液＋分析物に切り替えるために使用され、このカラムへの、分析物の連続的な注入を可能にする。カラムの出口は、補給緩衝液の添加のための混合用Ｔ字管に接続される。この緩衝液は、ＰＥ／Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ３０００三重四重極質量分析計に直接流入する。
【図４】図４は、ＡＰＩ  ４０００の、減圧に基づくｏＭＡＬＤＩＴＭイオン源アセンブリを示す概略である。ＡＰＩ  ４０００は、ＭＡＬＤＩサンプルプレートを、界面減圧ポンプによって排気された領域に、分析器の軸に対して直交する配向で配置する。
【図５】図５は、タンパク質を充填されたカラムおよびブランクのＤＧＳ／ＰＥＯ／ＡＰＴＥＳモノリシックカラムを使用して得られた、代表的なＦＡＣ−ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳトレースを示す。パネルＡ：タンパク質を含まないブランクカラム；パネルＢ：２５ｐｍｏｌのＤＨＦＲ（初期充填）を含むカラム。Ｎ−アセチルグルコサミン、フルオレセイン、葉酸、ポリメタミンおよびトリメトプリムを、５０ｎＭで注入した。トレースは、実際のイオン電流を示し、イオン抑制効果のより明瞭な指標を提供する。
【図６】図６は、ＭＡＬＤＩ／ＭＳを使用する、葉酸のＭＲＭ遷移の多経路選択を示す。パネルＡは、葉酸、フルオレセイン、ポリメタミンおよびトリメトプリム（各々５０ｎＭ）の、ＭｅＯＨ中６．２ｍｇ／ｍＬのＣＨＣＡと１：１（ｖ：ｖ）で混合した、ＭＡＬＤＩプレート上に沈着した混合物の、Ｑ１全走査を示す。Ｑ１スペクトルは、減算によって除かれたマトリックスから生じるバックグラウンド信号を有した。パネルＢは、ｍ／ｚが４４２の親イオンから生じるＱ３生成物イオン走査を示す。パネルＣは、ｍ／ｚ  ２９５の親イオンから生じるＱ３生成物イオン走査を示す。全ての走査は、中程度のレーザー並進速度（１ｍｍ／秒）を使用して得られ、そして所定のサンプル領域にわたる５回の再実行の平均である。
【図７】図７は、遅い並進速度（０．５ｍｍ／ｓ、黒三角）、中程度の並進速度（１ｍｍ／ｓ、黒四角）、および速い並進速度（３．８ｍｍ／ｓ、黒丸）について、所定の領域の再実行の回数の関数としての、ＭＡＬＤＩ／ＭＳ信号の強度を示す。ピーク値とは、トラックにわたる最初の通過について得られた計数をいい、合計値とは、特定の速度で所定のトラックにわたる全ての実行から得られる全計数をいう。
【図８】図８は、タンパク質を装填されたカラムおよびブランクのＤＧＳ／ＰＥＯ／ＡＰＴＥＳモノリシックカラムを使用して得られた、ＦＡＣ−ＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳトレースを示す。パネルＡ：タンパク質を含まないブランクカラム；パネルＢ：２５ｐｍｏｌのＤＨＦＲ（初期充填）を含むカラムであって、早期時点でのＮ−アセチルグルコサミン、フルオレセインおよび葉酸、トリメトプリムおよび最後にポリメタミンの漏出を示す。全ての化合物を、５０ｎＭで注入した。全てのトレースを、化合物の漏出後に得られた最大信号に対して標準化する。ＭＡＬＤＩ分析時間は、ＬＣ沈着時間より１９倍速いことに留意のこと。全てのＦＡＣトレースを、高速レーザー遷移速度（３．５ｍｍ／秒）を使用して得、そしてこれらは、所定のサンプル領域にわたる５回の再実行の平均である。
【図９】図９は、ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩによって分析された、ブランクのモノリシックカラムに対して、化合物の非特異的結合に対するイオン強度の結果を示す。ＭＡＬＤＩ  ＭＲＭトレースは、ａ）２ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液、ｂ）５０ｍＭの緩衝液およびｃ）１００ｍＭの緩衝液を使用して、最初の葉酸、トリメトプリムおよびピリメタミン（各々５０ｎＭ）の実行について、示される。全てのデータを、同じカラムにおいて、化合物の導入の前に適切な緩衝液中でカラムを予備インキュベートして実行した。全てのＦＡＣトレースを、高速レーザー遷移速度（３．８ｍｍ／秒）を使用して得、そしてこれらは、所定のサンプル領域にわたる５回の再実行の平均である。
【図１０】図１０は、２ｍＭおよび１００ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝溶液中でのインキュベーション時間の関数としての、ＤＨＦＲの活性を示す。
【図１１】図１１は、ＦＡＣ／ＭＡＬＤＩを使用する、モノリシックＤＨＦＲカラムの再使用に対するイオン強度の影響を示す。パネルＡは、葉酸、トリメトプリムおよびピリメタミン（各々５０ｎＭ）について、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を使用して最初の実行から得られた、ＭＡＬＤＩ  ＭＲＭトレースを示す。パネルＢは、１００ｍＭの酢酸アンモニウムを使用するカラムの回復の際の、溶出物の沈着の間に、プレートから得られたＭＡＬＤＩ  ＭＲＭトレースを示す。パネルＣは、同じモノリシックカラムを通しての、上に列挙された化合物の２回目の実行の間の、カラム溶出物の沈着によって形成されたプレートからの、ＭＡＬＤＩ  ＭＲＭトレースを示す。注記：全実行時間は、５μＬ／分において１２０分であり、これは、１２２カラム体積に対応する。全てのＦＡＣトレースは、より速いレーザー遷移速度（３．８ｍｍ／秒）を使用して得られ、そしてこれらは、所定のサンプル領域にわたる５日の再実行の平均である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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