(57)【要約】  グルカゴン様ペプチドを含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法であって、中性ｐＨより高いｐＨで乾燥させたペプチド産物から調製する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルカゴン様ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．０を超えるｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法。
【請求項２】
グルカゴン様ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．１から１２．５の範囲のｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法。
【請求項３】
上記ｐＨが８．５から１０．５の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記ｐＨが９．０から１０．５の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記ｐＨが８．５から９．６の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
上記原体ペプチド産物が、１０分から５時間の範囲の時間、約５℃から約２５℃の温度で、特定された範囲のｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造したものである、請求項１ないし５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記原体ペプチド産物が、１分から３０分の範囲の時間、約５℃から約２５℃の温度で、特定された範囲のｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造したものである、請求項１ないし６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記乾燥が凍結乾燥である、請求項１ないし７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
上記薬学的組成物が溶液である、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
上記薬学的組成物が懸濁液である、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
上記薬学的組成物が固形である、請求項１ないし８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
上記薬学的組成物を、注射用水又は他の適切な溶媒で再構成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記薬学的組成物のｐＨが、乾燥される原体ペプチドの溶液又は懸濁液のｐＨより低い、請求項１ないし１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
上記薬学的組成物のｐＨが、乾燥される原体ペプチドの溶液又は懸濁液のｐＨより少なくとも０．８ｐＨ単位低い、請求項１ないし１３の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
上記薬学的組成物のｐＨが、乾燥される原体ペプチドの溶液又は懸濁液のｐＨより少なくとも１．５ｐＨ単位低い、請求項１ないし１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
薬学的組成物が、例えば注射又は点滴による、非経口投与に適している、請求項１ないし１５の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
上記薬学的組成物又は上記薬学的組成物の再構成溶液のｐＨがｐＨ７．０からｐＨ８．０、好ましくはｐＨ７．２からｐＨ７．８である、請求項１ないし１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
上記グルカゴン様ペプチドの等電点が３．０から７．０、好ましくは４．０から６．０である、請求項１ないし１７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
上記グルカゴン様ペプチドが、グルカゴン、グルカゴンアナログ又はその誘導体である、請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
上記グルカゴン様ペプチドが、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１の誘導体又はＧＬＰ-１アナログの誘導体である、請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
上記ＧＬＰ-１アナログが、Ｇｌｙ８-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｇｌｙ８-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ａｓｐ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ａｓｐ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）  、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド  、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｌｙｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ｌｙｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ａｒｇ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ａｒｇ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｈｉｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ｈｉｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１９Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｙｒ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｌｅｕ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｙｒ１８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｈｉｓ３７-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５-ＧＬＰ-１（７-３７）、及びそれらのアナログからなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＬＰ-１アナログの上記誘導体がＡｒｇ３４，Ｌｙｓ２６(Ｎε-(γ-Ｇｌｕ(Ｎα-ヘキサデカノイル)))-ＧＬＰ-１（７−３７）である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
薬学的組成物中の上記グルカゴン様ペプチドの濃度が、０．１ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬ、又は３ｍｇ／ｍＬから８ｍｇ／ｍＬである、請求項１９ないし２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
上記グルカゴン様ペプチドが、ＧＬＰ-２、ＧＬＰ-２アナログ、ＧＬＰ-２の誘導体又はＧＬＰ-２アナログの誘導体である、請求項１ないし１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
上記ＧＬＰ-２の誘導体又はＧＬＰ-２アナログの誘導体が一のリジンのようなリジン残基を有し、スペーサーを介していてもよい親油性置換基が上記リジンのεアミノ基に結合している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
薬学的組成物中の上記グルカゴン様ペプチドの濃度が、０．１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬ、又は１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬである、請求項２４ないし２５の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
上記グルカゴン様ペプチドが、エキセンディン-４、エキセンディン-４アナログ、エキセンディン-４の誘導体又はエキセンディン-４アナログの誘導体である、請求項１ないし１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
上記ペプチドがエキセンディン-４である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記ペプチドが安定なエキセンディン-４化合物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
上記ペプチドがＤＰＰ-ＩＶ保護エキセンディン-４化合物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
上記ペプチドが免疫調節されたエキセンディン-４化合物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
上記ペプチドがＺＰ-１０、つまり［Ｓｅｒ３８Ｌｙｓ３９］エキセンディン-４（１−３９）ＬｙｓＬｙｓＬｙｓＬｙｓＬｙｓ-アミドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
薬学的組成物中の上記ペプチドの濃度が、５μｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬから３ｍｇ／ｍＬ、又は０．２ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬである、請求項２７から３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
上記バッファーが、オルト-ホスフェート、ＴＲＩＳ、グリシン、Ｎ-グリシルグリシン、シトレートナトリウムアセテート、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、リン酸ナトリウム、及びクエン酸ナトリウム又はそれらの混合物から選択される、請求項１ないし３３の何れか一項に記載の方法。
【請求項３５】
上記保存料が、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチオメロサル、又はそれらの混合物から選択される、請求項１ないし３４の何れか一項に記載の方法。
【請求項３６】
等張剤を含有する、請求項１ないし３５の何れか一項に記載の方法。
【請求項３７】
上記等張剤が、塩化ナトリウム、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、グルコース、マルトース、スクロース、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン、ジメチルスルホン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はそれらの混合物である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
界面活性剤を含む、請求項１ないし３７の何れか一項に記載の方法。
【請求項３９】
グルカゴン様ペプチドを含有する薬学的組成物において、請求項１ないし３８の何れか一項に記載の方法に従って調製されることを特徴とする薬学的組成物。
【請求項４０】
約７．２から約７．８のｐＨを有する薬学的組成物であって、グルカゴン様ペプチドと少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有し、該組成物が、３７℃で一ヶ月の組成物の貯蔵後に組成物中に含まれるグルカゴン様ペプチドのチオフラビンＴ試験で測定した蛍光増加が２倍未満の貯蔵安定性である薬学的組成物。
【請求項４１】
請求項３９ないし４０の何れか一項に記載の薬学的組成物の有効量を非経口投与することを含んでなる高血糖の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は薬学的組成物の分野に関する。より詳細には、本発明は中性ｐＨを超えるｐＨで乾燥された原体(バルク)ペプチド産物から調製する安定な薬学的組成物の製造方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
治療用ペプチドは医療において広く使用されている。かかる治療用ペプチドの薬学的組成物は一般的な所用に適したものとするためには数年の有効期間を有していることが必要とされる。しかしながら、ペプチド組成物は化学的及び物理的変性に対する感受性のため本来的に不安定である。化学的変性は、共有結合の変化、例えば酸化、加水分解、ラセミ化又は架橋を含む。物理的変性はペプチドの未変性構造、つまり二次及び三次構造に対する高次構造の変化、例えば凝集、沈殿又は表面への吸着を含む。
【０００３】
グルカゴンは糖尿病の医療に数十年使用されてきており、幾つかのグルカゴン様ペプチドが様々な治療適応症に対して開発されている。プレプログルカゴン遺伝子はグルカゴン並びにグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ-１）及びグルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ-２）をコードしている。ＧＬＰ-１アナログ及び誘導体並びに相同のトカゲペプチドのエキセンディン-４が２型糖尿病における高血糖の治療のために開発されている。ＧＬＰ-２は胃腸疾患の治療に潜在的に有用である。しかしながら、２９−３９のアミノ酸を包含するこれら全てのペプチドは高度の相同性を持っており、多くの性質、特に凝集し、不溶性のフィブリルを形成する傾向を共有している。この性質は支配的なα-へリックス高次構造からβシートへの転移を包含していると思われる（Blundell T.L. (1983) The conformation of glucagon. :Lefebvre P.J. (編) Glucagon I. Springer Verlag, pp37-55, Senderoff R.I.等, J. Pharm. Sci. 87 (1998)183-189, 国際公開第０１／５５２１３号）。グルカゴン様ペプチドの凝集は、主にペプチド溶液が撹拌又は振盪されるときに、溶液と気相（空気）の間の界面と、テフロン(登録商標)のような疎水性表面との接触箇所に見られる。
【０００４】
よって、グルカゴン様ペプチドの薬学的組成物にはその安定性を改善するために様々な賦形剤を加えなければならないことがよくある。これらのペプチドの液体非経口製剤の有効期間は少なくとも一年で、好ましくは更に長期でなければならない。製品を輸送し、室温で毎日振盪する場合がある使用中の期間は好ましくは数週間でなければならない。従って、改善された安定性を有するグルカゴン様ペプチドの薬学的組成物に対する必要性が存在している。
【０００５】
我々は、予期せぬことに、８．０を超えるｐＨを有する原体ペプチド産物の溶液又は懸濁液を乾燥させることによって調製した原体ペプチド産物がこれら原体ペプチド産物から調製した薬学的組成物の安定性を増加させることを見出した。
【０００６】
定義
次は、本明細書において使用される用語の詳細な定義である。
ここで使用される「有効量」という用語は無治療の場合と比較して患者の治療に対して十分に効果的な用量を意味する。
薬学的組成物について言及するここで使用される「再構成された」という用語は、活性な薬学的成分を含む固形物質に水又は適切な水溶液を添加することによって形成された水性組成物を意味する。再構成のための薬学的組成物は許容可能な有効期間を持つ液体組成物を製造することができない場合に利用される。再構成された薬学的組成物の例は、凍結乾燥された組成物に水又は適切な水溶液を添加する場合に生じる溶液である。その溶液はしばしば非経口投与のためのもので、よって注射用の水又は任意の他の適切な溶媒が固形物質を再構成するために使用される。
【０００７】
ここで使用される「疾患の治療」という用語は疾患、症状又は障害を持つ患者の管理及びケアを意味する。治療の目的は、疾患、症状又は障害と闘うことである。治療は疾患、症状又は障害を排除し又はコントロールするため、並びに疾患、症状又は障害に伴う徴候又は合併症を軽減するための活性化合物の投与を含む。
ここで使用される「グルカゴン様ペプチド」という用語は、プレプログルカゴン遺伝子から誘導される相同のペプチド、エキセンディン、及びそのアナログ及び誘導体を意味する。プレプログルカゴン遺伝子から誘導されるペプチドはグルカゴン、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ-１）、グルカゴン様ペプチド２（ＧＬＰ-２）及びオキシントモデュリン（ＯＸＭ）である。アメリカドクトカゲに見出されるエキセンディンはＧＬＰ-１に相同であり、またインスリン分泌促進効果を奏する。エキセンディンの例はエキセンディン-４及びエキセンディン-３である。
【０００８】
グルカゴン様ペプチドは次の配列を有している：
2007524592.tif 000002
【０００９】
ペプチドに関してここで使用される「アナログ（類似体）」という用語は、ペプチドの一又は複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されている、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失している、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基がペプチドに付加されている、修飾されたペプチドを意味する。そのようなアミノ酸残基の付加又は欠失はペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端で起こりうる。二つの異なった簡単な系がしばしばアナログを記述するために使用される：例えばＡｒｇ３４-ＧＬＰ-１（７−３７）又はＫ３４Ｒ-ＧＬＰ-１（７−３７）は１−６位のアミノ酸残基が欠失されたＧＬＰ-１を標記し、３４位の天然に生じるリジンがアルギニン（ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ命名法に従ったアミノ酸の標準的な一文字省略形）に置換されている。
【００１０】
親ペプチドに関してここで使用される「誘導体」という用語は、少なくとも一の置換基は親タンパク質又はそのアナログには存在していない化学的に修飾された親タンパク質又はそのアナログを意味し、つまり共有結合的に修飾された親タンパク質である。典型的な修飾はアミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、ペグ化等である。ＧＬＰ-１（７−３７）の誘導体の例はＡｒｇ３４，Ｌｙｓ２６(Ｎε-(γ-Ｇｌｕ(Ｎα-ヘキサデカノイル)))-ＧＬＰ-１（７−３７）である。
【００１１】
ここで使用される「ＧＬＰ-１ペプチド」という用語は、ＧＬＰ-１（７−３７）、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１誘導体又はＧＬＰ-１アナログの誘導体を意味する。
ここで使用される「ＧＬＰ-２ペプチド」という用語は、ＧＬＰ-２（１−３３）、ＧＬＰ-２アナログ、ＧＬＰ-２誘導体又はＧＬＰ-２アナログの誘導体を意味する。
ここで使用される「エキセンディン-４ペプチド」という用語は、エキセンディン-４（１−３９）、エキセンディン-４アナログ、エキセンディン-４誘導体又はエキセンディン-４アナログの誘導体を意味する。
ここで使用される「安定なエキセンディン-４化合物」という用語は化学的に修飾されたエキセンディン-４（１−３９）、つまり次の方法によって定量した場合に、ヒトにおいて少なくとも１０時間のインビボ血漿排出半減期を示すアナログ又は誘導体を意味する。ヒトにおいてエキセンディン-４の血漿排出半減期を定量するための方法は次の通りである：化合物を等張バッファー、ｐＨ７．４、ＰＢＳ又は任意の他の好適なバッファーに溶解させる。用量を末梢的に、好ましくは腹部又は上部大腿に注射する。活性化合物の定量のための血液試料を頻繁な間隔でまた終端排除部分をカバーするのに十分な期間 (例えば、投薬前、投薬後１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１２、２４（２日目）、３６（２日目）、４８（３日目）、６０（３日目）、７２（４日目）及び８４（４日目）時間）、採取する。活性化合物の濃度の定量はWilken等, Diabetologia 43(51):A143, 2000に記載されているようにして実施する。誘導された薬物動態学的パラメータは、市販のソフトWinNonlinのバージョン２．１(Pharsight, Cary, NC, USA)を使用し、非コンパートメント法の使用により、各個体被検者の濃度-時間データから計算する。終端排出速度定数は濃度-時間曲線の終端対数線形部分での対数線形回帰によって推定し、排出半減期を計算するために使用する。
【００１２】
ここで使用される「ＤＰＰ-ＩＶ保護されたエキセンディン-４化合物」という用語は、血漿ペプチダーゼジペプチジルアミノペプチダーゼ-４（ＤＰＰ-ＩＶ）に対して耐性を有するように化学的に修飾されたエキセンディン-４化合物を意味する。
ここで使用される「免疫調節されたエキセンディン-４化合物」という用語は、エキセンディン-４（１−３９）と比較した場合にヒトにおける免疫反応が低減させられたエキセンディン-４（１−３９）のアナログ又は誘導体であるエキセンディン-４化合物を意味する。免疫反応を評価する方法は患者の治療の４週間後にエキセンディン-４化合物に反応性である抗体の濃度を測定することである。
ここで使用される「原体(バルク)産物」又は「原体ペプチド産物」という用語は薬学的組成物の製造に使用されることになる精製されたペプチド産物を意味する。よって、原体産物は最終の精製、乾燥又は条件付け工程からの産物として通常は得られる。原体産物は血漿、沈殿物、溶液又は懸濁液でありうる。原体はまた当該分野で製剤原料として知られている。
【００１３】
ここで用いられる「等電点」という用語は、ペプチドのような巨大分子の全体の正味の電荷がゼロであるｐＨ値を意味する。ペプチドには、多くの荷電基が存在し得、等電点では、これら電荷の全ての合計がゼロである。つまり、負の電荷が正の電荷の数に平衡する。等電点を超えるｐＨでは、ペプチドの全体の正味の電荷は負であり、等電点より低いｐＨ値ではペプチドの全体の正味の電荷は正である。ペプチドの等電点は等電点電気泳動法によって定量することができ、又は当該分野で知られているコンピュータプログラムによってペプチド配列から推定することができる。
【００１４】
発明の記載
一態様では、本発明は、グルカゴン様ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．０を超えるｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法に関する。
他の態様では、本発明は、グルカゴン様ペプチド及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．０を超えるｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法に関する。
別の態様では、本発明は、ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．０を超えるｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法に関する。
別の態様では、本発明は、ペプチド及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．０を超えるｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法に関する。
【００１５】
他の態様では、本発明は、グルカゴン様ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．１から１２．５の範囲のｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法に関する。
他の態様では、本発明は、ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、８．１から１２．５の範囲のｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法に関する。
他の態様では、本発明は、グルカゴン様ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物の有効期間を増大させる方法において、上記薬学的組成物を、９．０から１０．５の範囲のｐＨを有する上記グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造した原体ペプチド産物から調製することを特徴とする方法に関する。
【００１６】
一実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．１から１２．０の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．１から１１．５の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．１から１１．０の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．１から１０．７の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．５から１２．０の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．５から１１．５の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．５から１１．０の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．５から１０．７の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．５から１０．５の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは９．０から１２．５の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは９．０から１２．０の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは９．０から１１．５の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは９．０から１１．０の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは９．０から１０．７の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは９．０から１０．５の範囲のｐＨで乾燥されている。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは８．５から９．６の範囲のｐＨで乾燥されている。
【００１７】
本発明の他の実施態様では、原体ペプチド産物は、約１分から約２４時間の時間、原体ペプチドの核形成温度（不均一又は均一核形成の何れか）より高い温度から約２５℃の温度で、特定された範囲のｐＨを有するグルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造したものである。
本発明の他の実施態様では、原体ペプチド産物は、約１分から約３０分の時間、約５℃から約２５℃の温度で、特定された範囲のｐＨを有するグルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させることによって製造したものである。
【００１８】
本発明はｐＨ値、温度及び時間の様々な組合せによって実施することができることが理解される。これらの三種の変数は上述の範囲内で組み合わせることができる。しかしながら、変数の一又は二についてその範囲の上限値が選択される一方、残りの一又は二の変数は典型的にはより低い。例えば、ｐＨ１０のような高いｐＨ値が使用される場合、低温度、例えば約５−１０℃及び／又は約１分から約６時間より少ない時間のように短い時間と組み合わせるのが好ましい。変数の有用な組合せは次の通りである：約３時間、５℃でｐＨ１０．０；約１時間、１５℃でｐＨ１０．０、又は約１時間、５℃でｐＨ１１．０。
単結晶としてであろうと多結晶としてであろうと、氷晶の成長は初期の核形成プロセスであり、遅い凍結及び迅速な凍結の何れにおいても、低圧での水又は水溶液の凍結で氷だけが生成される。溶液の核形成は溶質濃度及び温度に依存して二方法で起こりうる。飽和溶液が冷却されるならば、氷相に対して過冷状態になるばかりではく、溶質に対してもまた過冷状態になる。適切な凍結核が存在しないと、溶液は過冷されうる。従って、高ｐＨでのペプチドの処理の間に使用される温度は一般的な条件でペプチドの核形成温度を超えて維持されなければならない。核形成温度は当業者に知られており、異なった温度での実験によって関連するペプチドに対して常套的に決定することができる。
【００１９】
グルカゴン様ペプチドの溶液又は懸濁液を乾燥させるために多くの乾燥技術を利用することができる。凍結乾燥による乾燥は薬学的ペプチドを乾燥させる一般的な方法である。他の乾燥技術は噴霧乾燥及び真空乾燥である。好適な実施態様では、グルカゴン様ペプチドは凍結乾燥により乾燥される。
一実施態様では、薬学的組成物は溶液である。
他の実施態様では、薬学的組成物は懸濁液である。
他の実施態様では、薬学的組成物は固形、例えば、医師又は患者が使用前に溶媒を添加する凍結乾燥製剤である。再構成に使用される溶媒は、注射用水又は他の適切な溶媒でありうる。
他の実施態様では、薬学的組成物のｐＨは、乾燥される原体ペプチドの溶液又は懸濁液のｐＨよりも低い。
他の実施態様では、薬学的組成物のｐＨは、乾燥される原体ペプチドの溶液又は懸濁液のｐＨより少なくとも０．８ｐＨ単位低い。
他の実施態様では、薬学的組成物のｐＨは、原体ペプチドの溶液又は懸濁液のｐＨより少なくとも１．５ｐＨ単位低い。
【００２０】
本発明の薬学的組成物は活性化合物又はその塩を、一又は複数の薬学的賦形剤、例えばバッファー、保存料、等張剤及び／又は安定剤と共に含有する。本発明に係るグルカゴン様ペプチドを含有する薬学的組成物は、治療を必要とする患者に非経口的に投与されうる。非経口投与は、皮下注射、筋肉内注射、又は静脈内注射で、シリンジ、場合によってはペン状シリンジによるものによって実施することができる。他の投与は注入、例えば注入ポンプの使用によることができる。
一実施態様では、上記薬学的組成物又は上記薬学的組成物の再構成溶液のｐＨはｐＨ７．０からｐＨ８．０、好ましくはｐＨ７．２からｐＨ７．８である。
他の実施態様では、上記薬学的組成物又は上記薬学的組成物の再構成溶液のｐＨはｐＨ７．２からｐＨ７．６である。他の実施態様では、上記薬学的組成物又は上記薬学的組成物の再構成溶液のｐＨはｐＨ７．４からｐＨ７．８である。
他の実施態様では、上記グルカゴン様ペプチドの等電点は３．０から７．０、好ましくは４．０から６．０である。
一実施態様では、上記グルカゴン様ペプチドは、グルカゴン、グルカゴンアナログ又はその誘導体である。
他の実施態様では、上記グルカゴン様ペプチドはオキシンソモジュリン（oxynthomodulin）である。
【００２１】
一実施態様では、上記グルカゴン様ペプチドが、ＧＬＰ-１、ＧＬＰ-１アナログ、ＧＬＰ-１の誘導体又はＧＬＰ-１アナログの誘導体である。
他の実施態様では、上記ＧＬＰ-１アナログは、Ｇｌｙ８-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｇｌｙ８-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ａｓｐ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ａｓｐ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）  、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド  、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｌｙｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ｌｙｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ａｒｇ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ａｒｇ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｈｉｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３６）-アミド、Ｖａｌ８Ｈｉｓ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１９Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｙｒ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｌｅｕ１６Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｙｒ１８Ｇｌｕ２２-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｈｉｓ３７-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５Ｉｌｅ３３-ＧＬＰ-１（７-３７）、Ｖａｌ８Ｔｒｐ１６Ｇｌｕ２２Ｖａｌ２５-ＧＬＰ-１（７-３７）、及びそれらのアナログからなる群から選択される。
【００２２】
他の実施態様では、ＧＬＰ-１アナログの上記誘導体はＡｒｇ３４，Ｌｙｓ２６(Ｎε-(γ-Ｇｌｕ(Ｎα-ヘキサデカノイル)))-ＧＬＰ-１（７−３７）である。
ＧＬＰ-１、そのアナログ並びにＧＬＰ-１誘導体の製造方法は例えば国際公開第９９／４３７０６号、国際公開第００／５５１１９号、国際公開第００／３４３３１号及び国際公開第０３／１８５１６号に見出すことができる。
他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドはＧＬＰ-１ペプチドであり、薬学的組成物中又はその再構成された組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬから５０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬ、又は３ｍｇ／ｍＬから８ｍｇ／ｍＬのグルカゴン様ペプチドの濃度を有している。
【００２３】
一実施態様では、グルカゴン様ペプチドは、ＧＬＰ-２、ＧＬＰ-２アナログ、ＧＬＰ-２の誘導体又はＧＬＰ-２アナログの誘導体である。
他の実施態様では、ＧＬＰ-２の誘導体又はＧＬＰ-２アナログの誘導体は一のリジンのようなリジン残基を有し、スペーサーを介していてもよい親油性置換基が上記リジンのεアミノ基に結合している。
ＧＬＰ-２、そのアナログ並びにＧＬＰ-２誘導体の製造方法は例えば国際公開第９９／４３３６１号及び国際公開第００／５５１１９号に見出すことができる。
他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドはＧＬＰ-２ペプチドであり、薬学的組成物中又はその再構成された組成物は、０．１ｍｇ／ｍＬから１００ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬ、又は１ｍｇ／ｍＬから２５ｍｇ／ｍＬのグルカゴン様ペプチドの濃度を有している。
【００２４】
一実施態様では、グルカゴン様ペプチドは、エキセンディン-４、エキセンディン-４アナログ、エキセンディン-４の誘導体又はエキセンディン-４アナログの誘導体である。
他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドはエキセンディン-４である。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは安定なエキセンディン-４化合物である。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドはＤＰＰ-ＩＶ保護エキセンディン-４化合物である。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドは免疫調節されたエキセンディン-４化合物である。他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドはＺＰ-１０（［Ｓｅｒ３８Ｌｙｓ３９］エキセンディン-４（１−３９）ＬｙｓＬｙｓＬｙｓＬｙｓＬｙｓ-アミド）である。
エキセンディン-４、そのアナログ並びにエキセンディン-４誘導体の製造方法は例えば国際公開第９９／４３７０８号、国際公開第００／４１５４６号及び国際公開第００／５５１１９号に見出すことができる。
他の実施態様では、グルカゴン様ペプチドはエキセンディン-４ペプチドであり、薬学的組成物中又はその再構成された組成物は、５μｇ／ｍＬから１０ｍｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬから３ｍｇ／ｍＬ、又は０．２ｍｇ／ｍＬから１ｍｇ／ｍＬのグルカゴン様ペプチドの濃度を有している。
【００２５】
薬学的組成物において使用するのに適したバッファーは当業者に知られており、限定するものではないが、オルト-ホスフェート、ＴＲＩＳ（トリス）、グリシン、Ｎ-グリシルグリシン、シトレートナトリウムアセテート、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、ヒスチジン、リジン、アルギニン、リン酸ナトリウム、及びクエン酸ナトリウム又はそれらの混合物を含む。一実施態様では、薬学的組成物はＴｒｉｓであるバッファーを含む。他の実施態様では、薬学的組成物はビシン（Bicine）であるバッファーを含む。
薬学的組成物に使用される保存料は当業者に知られており、限定するものではないが、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール及びチオメロサル（thiomerosal）、又はそれらの混合物を含む。
【００２６】
一実施態様では、薬学的組成物は等張剤を含有する。
他の実施態様では、薬学的組成物は、塩化ナトリウム、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、グルコース、マルトース、スクロース、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン、ジメチルスルホン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はそれらの混合物である等張剤を含有する。
【００２７】
本発明の他の実施態様では、薬学的組成物は安定剤を更に含有する。
本発明の更なる実施態様では、製剤は高分子量ポリマー又は低分子化合物の群から選択される安定剤を更に含有する。
本発明の更なる実施態様では、安定剤は、ポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、異なった塩（例えば塩化ナトリウム）、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリオプトファン、スレオニン及びそれらの混合物から選択される。これらの特定の安定剤のそれぞれが本発明の他の実施態様を構成する。本発明の好適な実施態様では、安定剤はＬ-ヒスチジン、イミダゾール及びアルギニンからなる群から選択される。
本発明の他の実施態様では、安定剤は、ＰＥＧ３３５０、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシ-メチルセルロース、塩化ナトリウム、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、イミダゾール、Ｌ-アルギニン、Ｌ-リジン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-アスパラギン酸、Ｌ-トリオプトファン、Ｌ-スレオニン及びそれらの混合物から選択される。
本発明の更なる実施態様では、製剤はキレート剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸及びアスパラギン酸、及びそれらの混合物から選択される。これらの特定のキレート剤のそれぞれが本発明の他の実施態様を構成する。
【００２８】
本発明の他の実施態様では、薬学的組成物は界面活性剤を更に含有する。本発明の更なる実施態様では、界面活性剤は、洗浄剤、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポロキサマー、例えば１８８及び４０７、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン誘導体、例えばアルキル化及びアルコキシル化誘導体（トゥイーン、例えばＴｗｅｅｎ-２０、又はＴｗｅｅｎ-８０）、モノグリセリド又はそのエトキシル化誘導体、ジグリセリド又はそのポリオキシエチレン誘導体、グリセロール、コール酸又はその誘導体、レシチン、アルコール及びリン脂質、グリセロリン脂質（レシチン、ケファリン、ホスファチジルセリン）、グリセロ糖脂質（ガラクトピラノシド）、スフィンゴリン脂質（スフィンゴミエリン）、及びスフィンゴ糖脂質（セラミド、ガングリオシド）、ＤＳＳ（ドキュセートナトリウム、ＣＡＳ登録番号［５７７−１１−７］）、ドキュセートカルシウム、ＣＡＳ登録番号［１２８−４９−４］）、ドキュセートカリウム、ＣＡＳ登録番号［７４９１−０９−０］）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム又はラウリル硫酸ナトリウム）、ホスファチジン酸ジパルミトイル、カプリル酸ナトリウム、胆汁酸とその塩及びグリシン又はタウリンコンジュゲート、ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、Ｎ-ヘキサデシル-Ｎ,Ｎ-ジメチル-３-アンモニオ-１-プロパンスルホネート、アニオン性（アルキル-アリール-スルホネート）一価界面活性剤、パルミトイルリゾホスファチジル-Ｌ-セリン、リゾリン脂質（例えば、エタノールアミンの１-アシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスフェートエステル、コリン、セリン又はスレオニン）、リゾホスファチジルコリン及びホスファチジルコリンのアルキル、アルコキシル（アルキルエステル）、アルコキシ（アルキルエーテル）-誘導体、例えばリゾホスファチジルコリンのラウロイル及びミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びコリンである極性ヘッド部の修飾体、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトール、及び正に荷電したＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＣＰ、ＢＩＳＨＯＰ、リゾホスファチジルセリン及びリゾホスファチジルスレオニン、双性イオン性界面活性剤（例えば、Ｎ-アルキル-Ｎ,Ｎ-ジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート、３-コラミド-１-プロピルジメチルアンモニオ-１-プロパンスルホネート、ドデシルホスホコリン、ミリストイルリゾホスファチジルコリン、ニワトリ卵リゾレシチン）、カチオン性界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えばセチル-トリメチルアンモニウムブロミド、セチルピリジニウムクロリド）、非イオン性界面活性剤、ポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックコポリマー（Pluronics/Tetronics、トリトン(Triton)Ｘ-１００、ドデシルβ-Ｄ-グルコピラノシド）又はポリマー性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ-４０、Ｔｗｅｅｎ-８０、Ｂｒｉｊ-３５）、フシジン酸誘導体-（例えばタウロ-ジヒドロフシジン酸ナトリウム等）、長鎖脂肪酸とその塩でＣ６−Ｃ１２のもの（例えばオレイン酸及びカプリル酸）、アシルカルニチンと誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジンのＮα-アシル化誘導体、又はリジン又はアルギニンの側鎖アシル化誘導体、リジン、アルギニン又はヒスチジン及び中性又は酸性アミノ酸の任意の組合せを含むジペプチドのＮα-アシル化誘導体、中性アミノ酸と二つの電荷を持つアミノ酸の任意の組合せを含むトリペプチドのＮα-アシル化誘導体から選択され、又は界面活性剤はイミダゾリン誘導体、又はその混合物の群から選択されうる。これらの特定の界面活性剤のそれぞれが本発明の他の実施態様を構成する。
薬学的組成物中における保存料、等張剤及び界面活性剤のような賦形剤の使用は当業者によく知られている。簡便には、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19版 1995を参考にすることができる。
【００２９】
更なる態様では、本発明は、グルカゴン様ペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物において、本発明に係る方法によって調製されることを特徴とする薬学的組成物に関する。
更なる態様では、本発明は、約７．２から約７．８のｐＨを有する薬学的組成物であって、グルカゴン様ペプチドと少なくとも一種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有し、該組成物が、３７℃で一ヶ月の組成物の貯蔵後に組成物中に含まれるグルカゴン様ペプチドのチオフラビンＴ試験で測定した蛍光増加が２倍未満の貯蔵安定性である薬学的組成物に関する。
更なる態様では、本発明はペプチド、薬学的に許容可能なバッファー及び薬学的に許容可能な保存料を含有する薬学的組成物において、本発明に係る方法によって調製されることを特徴とする薬学的組成物に関する。
更なる態様では、本発明は本発明に係る薬学的組成物の有効量を非経口投与することを含んでなる高血糖の治療方法に関する。
【００３０】
親のグルカゴン様ペプチドはペプチド合成、例えばｔ-Ｂｏｃ又はＦ-Ｍｏｃ化学又は他の十分に確立された技術を使用する固相ペプチド合成法によって製造することができる。親グルカゴン様ペプチドはまたポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、ペプチドの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中にポリペプチドを発現することができる宿主細胞を培養し、その後に得られたペプチドを培養物から回収する方法によって製造することができる。
細胞を培養するために使用される培地は、適切な補助物質を含む最少又は複合培地のような、宿主細胞を成長させるのに適した任意の一般的な培地でありうる。好適な培地は商業的供給者から入手することができ、又は公開された処方（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログ）に従って調製することができる。ついで、細胞によって産生されたペプチドは、対象ペプチドのタイプに応じて、遠心分離又は濾過によって培地から宿主細胞を分離し、上清又は濾液のタンパク様成分を塩、例えば硫酸アンモニウムによって沈殿させ、様々なクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することを含む一般的な手順によって培養培地から回収することができる。
【００３１】
親ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、好適には、例えば標準的な方法に従ってゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを調製し、合成オリゴヌクレオチドプローブを使用してハイブリダイゼーションによってペプチドの全て又は一部をコードするＤＮＡ配列をスクリーニングすることによって得られる、ゲノム又はｃＤＮＡ由来のものでありうる（例えば、Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989を参照のこと）。ペプチドをコードするＤＮＡ配列はまた確立された標準的な方法、例えばBeaucage及びCaruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869によって記載された亜リン酸アミダイト法、又はMatthes等, EMBO Journal 3 (1984), 801-805によって記載された方法によって合成的に調製することもできる。ＤＮＡ配列はまた例えば米国特許第４６８３２０２号又はSaiki等, Science 239 (1988), 487-491に記載されたように、特異的プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって調製することもできる。
【００３２】
ＤＮＡ配列は組換えＤＮＡ手順に簡便に使用することができる任意のベクターに挿入することができ、ベクターの選択はしばしばそれが導入される宿主細胞に依存する。よって、ベクターは、自己複製ベクター、つまり染色体外体として存在し、その複製が染色体複製に独立であるベクター、例えばプラスミドでありうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたときに宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体（群）と共に複製されるものであってもよい。
ベクターは好ましくはペプチドをコードするＤＮＡ配列がプロモーターのようなＤＮＡの転写に必要とされる更なるセグメントに作用可能に結合している発現ベクターである。プロモーターは選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であり得、宿主細胞に相同的又は異種性のタンパク質コード遺伝子から誘導されうる。様々な宿主細胞において本発明のペプチドをコードするＤＮＡの転写を指示する好適なプロモーターの例は、例えば上掲のSambrook等において公知である。
【００３３】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列はまた、必要に応じて、好適なターミネーター、ポリアデニル化シグナル、転写促進配列、及び翻訳促進配列に作用可能に結合されうる。本発明の組換えベクターは更に対象の宿主細胞においてベクターが複製することを可能にするＤＮＡ配列を含みうる。
ベクターはまた選択可能マーカー、例えばその産物が宿主細胞における欠陥を補完する遺伝子、又は薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキセートに対する耐性を賦与するものを含んでいてもよい。
本発明の親ペプチドを宿主細胞の分泌経路中に向けるために、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）を組換えベクター中に配することができる。分泌シグナル配列は正しい読み枠にあるペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合される。分泌シグナル配列は一般にペプチドをコードするＤＮＡ配列の５'に位置している。分泌シグナル配列はペプチドに通常関連するものであってもよく、又は他の分泌タンパク質をコードする遺伝子由来のものであってもよい。
【００３４】
本発明のペプチドをコードしているＤＮＡ配列とプロモーターと場合によってはターミネーター及び／又は分泌シグナル配列をそれぞれ結合させ、複製のために必要な情報を含んでいる適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される手順は当業者によく知られている（例えば上掲のSambrook等を参照）。
ＤＮＡ配列又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本ペプチドを生成可能な任意の細胞であり得、細菌、酵母菌、真菌及び高等真核細胞を含む。よく知られ当該分野で使用される好適な宿主細胞の例は限定するものではないが、大腸菌、サッカロマイセス・セレヴィシエ、又は哺乳動物ＢＨＫ又はＣＨＯ株価細胞である。
【００３５】
本発明を次の実施例によって更に説明するが、これら実施例は保護範囲を限定するものと考えてはいけない。次の説明及び次の実施例において開示されている特徴は、別個にもその組合せでも、本発明をその様々な形で実現するための材料でありうる。
【実施例】
【００３６】
以下において、「化合物１」は次のものを意味することを意図する：Ａｒｇ３４，Ｌｙｓ２６(Ｎε-(γ-Ｇｌｕ(Ｎα-ヘキサデカノイル)))-ＧＬＰ-１（７−３７）。
ペプチドの溶液又は懸濁液を凍結乾燥する前に、それを目標のｐＨに調節した。凍結乾燥後、薬学的製剤を一般手順１及び２に従って調製した。
一般手順１
保存料、等張剤及びバッファーを水に溶解させ、ｐＨを７．４に調節した。その後に、凍結乾燥ペプチドをゆっくり撹拌しながら溶解させた。水酸化ナトリウム及び／又は塩酸を使用してｐＨを７．４に調節した。最後に、製剤を０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
一般手順２
保存料、等張剤及びバッファーを水に溶解させ、ｐＨを７．４に調節した。ペプチドをゆっくり撹拌しながら水に溶解させた。二種の溶液を混合し、水酸化ナトリウム及び／又は塩酸を使用してｐＨを７．４に調節した。最後に、製剤を０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
【００３７】
製剤の物理的安定性を、チオフラビンＴ試験によって評価する。異なった製剤の物理的安定性はフィブリルを形成するその傾向によって特徴付けられる。フィブリルの存在を決定する方法はチオフラビンＴ試験である。組織学的チアゾール染料チオフラビンＴ（ＴｈＴ）を、アミロイドフィブリルの形成の指標として使用する。この方法は、ＴｈＴの蛍光特性に基づいている。アミロイドフィブリルが存在すると、ＴｈＴの蛍光は４５０ｎｍで最大励起を、４８２ｎｍで向上した発光を示す。ＴｈＴ蛍光強度はアミロイドフィブリル濃度の増加と線形関係になることが示されている。製剤の物理的安定性は、製剤をガラスカートリッジに上部から充填した後の様々な時点でＴｈＴ試験によって評価される。
【００３８】
凍結乾燥前に中性ｐＨ（＞８）を越えるｐＨに調節した製剤原料で製造した薬学的製剤の結果
開始時点（ｔ＝０）と３７℃での１ヶ月の保存後のＴｈＴ試験の結果は表１に見ることができる。
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凍結乾燥前にｐＨ９．５及び１１．５に調節した化合物１で製造した薬学的製剤は、凍結乾燥前にｐＨ８．０に調節した化合物１で製造した薬学的製剤（ＴｈＴの増加が見られる）と比較して、３７℃での１週間及び１ヶ月の貯蔵後により物理的に安定している（ＴｈＴの増加は見られない）ことが分かる。
【国際調査報告】
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