(57)【要約】  本発明は、インターフェロン−αの投与によって上方制御され、配列番号１に示されるｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子の同定に関する。この遺伝子の発現産物の決定は、インターフェロン−αや１型インターフェロン受容体で作用する他のインターフェロンでの処置に対する応答性の予測に利用できると推奨されている。同遺伝子がコードする蛋白質の治療用途も認識されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｉ）その変異体であって、免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性から選択された実質的に類似した機能を有する変異体、或いは
（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の断片であって、免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性から選択された実質的に類似した機能を保持する断片、
を含む単離ポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２の全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列と９８％超の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２内に示したアミノ酸配列によって規定されるポリペプチド及び／又はその天然産生変異体に対する特異的抗体を産生するのに適当な前記ポリペプチドの変異体又は断片。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
ｃＤＮＡである請求項４記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号１の核酸配列又はそのコード配列及び／又はそれに相補的な配列、
（ｂ）（ａ）に規定された配列とハイブリッド形成する配列、
（ｃ）遺伝暗号の結果として、（ａ）又は（ｂ）に規定された配列に縮重している配列、或いは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に規定された配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列、
を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含み、請求項１、２又は３に記載のポリペプチドを発現できる発現ベクター。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターを含有する宿主細胞。
【請求項９】
請求項１、２又は３に記載のポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載のポリペプチドのインビボ発現を誘導する単離ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ヒト又は非ヒト動物の治療的処置に使用するための、請求項１記載のポリペプチド又は請求項１０記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１記載のポリペプチド又は請求項１０記載のポリヌクレオチドと、医薬として許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１３】
抗ウイルス性又は抗腫瘍性又は免疫調節性の薬剤として治療に使用するための薬物の調製における、請求項１記載のポリペプチド又は請求項１０記載のポリヌクレオチドの使用。
【請求項１４】
１型インターフェロンで処置可能な疾患を有する患者を処置するための方法であって、請求項１記載のポリペプチド又は請求項１０記載のポリヌクレオチドを、前記患者に有効量投与することを含む方法。
【請求項１５】
請求項１、２又は３に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの発現を実現し、前記ポリペプチドを単離するのに適当な条件下で、請求項８記載の宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項１６】
免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性を有する化合物を同定する方法であって、配列番号２のポリペプチド又はその天然産生変異体を発現できる細胞を用意すること、前記細胞を試験用の化合物と共にインキュベートすること及び前記ポリペプチド又は変異体をコードする遺伝子の上方制御を求めて監視すること、を含む方法。
【請求項１７】
配列番号２によって規定されるアミノ酸配列のためのコード配列又は前記コード配列の天然産生変異体に対して、アンチセンス配列をインビボで発現できる、ヒト又は非ヒト動物の治療的処置に使用するためのポリヌクレオチド。
【請求項１８】
治療的処置に使用するための請求項９記載の抗体。
【請求項１９】
請求項５記載のｃＤＮＡ内の配列を標的とする、核酸増幅用のプライマーの１セット。
【請求項２０】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに由来する核酸プローブ。
【請求項２１】
固体支持体に結合している請求項２０記載のプローブ。
【請求項２２】
１型インターフェロンでの処置に対する患者の応答性を予測する方法であって、前記患者からの細胞試料において、配列番号２に示すアミノ酸配列によって規定される蛋白質又はその天然産生変異体又は対応するｍＲＮＡのレベルを決定することを含み、前記試料は、１型インターフェロンの投与後に前記患者から得るか、又はインビトロで１型インターフェロンを用いて前記決定の前に処理する方法。
【請求項２３】
前記試料を得る前に投与するか、又はインビトロで前記試料を処理するために使用するインターフェロンは、前記患者の処置のために推奨したインターフェロンである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記患者の血液試料から単離した末梢血単核細胞を含む試料を、インビトロで１型インターフェロンで処理する請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記決定が、配列番号２に示した配列によって規定される蛋白質又は前記蛋白質の天然産生変異体をコードする、ｍＲＮＡのレベルを決定することを含む請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項１記載のポリペプチドを発現できる非ヒトトランスジェニック動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのコード配列がこれまでに未知であると思われるインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）の投与によって上方制御（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）されるヒト遺伝子の同定に関する。この遺伝子の発現産物の検出は、ＩＦＮ−αや、１型インターフェロン受容体に作用する他のインターフェロンに対する応答性の予測に利用し得る。同遺伝子にコードされる単離された新規蛋白質の治療用途も予見される。
【背景技術】
【０００２】
ＩＦＮ−αは、いくつかの障害の処置のために広く用いられている。ＩＦＮ−αを用いて処置し得る障害は、白血病、リンパ腫及び固形腫瘍などの腫瘍性疾患、エイズ関連カポジ肉腫、及び慢性肝炎などのウイルス感染症を含む。ＩＦＮ−αについてはまた、自己免疫性、ミコバクテリア性、神経変質性、寄生生物性及びウイルス性の疾患の処置のために口腔粘膜経路を介して投与することが推奨されている。特に、ＩＦＮ−αは、例えば、多発性硬化症、らい病、結核、脳炎、マラリア、子宮頚癌、陰部ヘルペス、Ｂ及びＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ並びにＨＳＶ−ｌ及び２型の処置のために推奨されてきた。また、関節炎、狼瘡及び糖尿病の処置のためにも提言されてきた。多発性骨髄腫、毛様細胞白血病、慢性骨髄性白血病、ローグレードリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚癌、カポジ肉腫を含む肉腫、腎臓腫瘍、腎細胞癌腫や肝細胞癌腫や上咽頭癌腫を含む癌腫、血液悪性腫瘍、結腸直腸癌、グリア芽細胞腫、喉頭乳頭腫、肺癌、大腸癌、悪性黒色腫及び脳腫瘍などの腫瘍性疾患はまた、口腔粘膜経路すなわち口経路又は鼻経路を介したＩＦＮ−αの投与によって処置されるものとして提言されている。
【０００３】
ＩＦＮ−αは、１型インターフェロンファミリーの一員であり、１型インターフェロン受容体との相互作用を通じてその特徴的生物活性を及ぼす。他の１型インターフェロンは、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω及びＩＦＮ−τを含む。
【０００４】
残念ながら、インターフェロン−αなどの１型インターフェロンでの処置に対する潜在的な患者、特に、例えば、慢性ウイルス性肝炎、腫瘍性疾患や再発寛解型多発性硬化症に苦しむ患者のうち、全員が１型インターフェロン治療に好適に応答するわけではなく、しかも応答する者のうちの一部のみが長期的な利点を示す。１型インターフェロン処置の治療結果を医師が確信して予測することができないということは、高価な生物薬剤の無駄や治療で失われる時間という観点におけるだけでなく、患者が曝される重大な副作用という観点においても、該治療の費用対利益比に関して重大な懸念を引き起こす。さらに、ＩＦＮ−αの異常な生産が、いくつかの自己免疫疾患に関連していることが示されている。これらの理由により、１型インターフェロンが、いくつかの遺伝子の発現を調節することによってその治療的作用を及ぼすことから１型インターフェロン応答性遺伝子を同定することに多大な関心が存在する。確かに、１型インターフェロン処置によって誘発される遺伝子発現の特異的パターンこそが、その処置に対して患者が好適に応答するか否かを決定するのである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
あるヒト遺伝子ｃＤＮＡが、口腔粘膜経路を介した又は腹腔内へのＩＦＮ−αの投与によって上方制御されるマウス遺伝子に対応するものとして今や確認されており、新規のＤＮＡを表すものと考えられる。したがって、この対応するヒト遺伝子も、今やＩＦＮ−α上方制御型遺伝子（ＩＦＮ−α  ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）と称する。
【０００６】
同遺伝子によってコードされる蛋白質は、１９８ｋＤａの分子量を持ち、下記ではＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質という。この蛋白質及びその機能的な変異体は現在、特に、抗ウイルス性、抗腫瘍性又は免疫調節性の薬剤としての使用のための治療薬剤として予見されている。例えば、それらは、自己免疫性、ミコバクテリア性、神経変質性、寄生生物性又はウイルス性の疾患、関節炎、糖尿病、狼瘡、多発性硬化症、らい病、結核、脳炎、マラリア、子宮頚癌、陰部ヘルペス、Ｂ又はＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ−１又は２、或いは、多発性骨髄腫、毛様細胞白血病、慢性骨髄性白血病、ローグレードリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚癌、カポジ肉腫を含む肉腫、腎臓腫瘍、腎細胞癌腫や肝細胞癌腫や上咽頭癌腫を含む癌腫、血液悪性腫瘍、大腸癌、グリア芽細胞腫、喉頭乳頭腫、肺癌、大腸癌、悪性黒色腫又は脳腫瘍などの腫瘍性疾患の処置に使用してもよい。換言すれば、該蛋白質は、１型インターフェロンで処置可能な任意の疾患の処置にも利用し得る。
【０００７】
１型インターフェロンで処置された患者、例えば、口腔粘膜経路を介した又は静脈内的な方法などで、ＩＦＮ−αで処置した患者の細胞試料におけるＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体又は対応ｍＲＮＡのレベルの決定は、該処置に対する応答性を予測するためにも用いることができる。或いは、そしてより好ましくは、該応答性は、例えば、ヒト末梢血単核細胞の試料をインビトロにおいて１型インターフェロンで処置して、ＨｕＩＦＲＧ１９８遺伝子に対応する発現生成物、好ましくはｍＲＮＡの上方制御（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）又は下方制御（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を探すことによって判断してもよいこともまた見出されている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明の第１の態様によれば、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列、
（ｉｉ）その変異体であって、例えば、免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性であるところの実質的に類似した機能を有する変異体、或いは、
（ｉｉｉ）例えば、免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性であるところの実質的に類似した機能を保持する（ｉ）又は（ｉｉ）の断片
を含む単離ポリペプチドが提供される。
【０００９】
一般に、最も関心のある蛋白質は、配列番号２の全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列と９８％超の同一性を有するものである。
【００１０】
本発明はまた、ヒト又は非ヒト動物の治療的処置に使用するため、より詳細には、抗ウイルス性、抗腫瘍性又は免疫調節性の薬剤として使用するための該蛋白質を提供する。上記に示したように、該使用は、１型インターフェロンで処置可能な任意の疾患に広げてもよい。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、上記で規定した本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、又はその相補体が提供される。該ポリヌクレオチドは典型的には、
（ａ）配列番号１の核酸又はそのコード配列及び／又はそれに相補的な配列、
（ｂ）（ａ）に規定された配列に対して相補的な配列と、例えば、ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）な条件下で、ハイブリッド形成する配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に規定された配列に対して、遺伝暗号の結果として縮重している配列、或いは
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に規定された配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列
を含む配列を含む。
【００１２】
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号２の全長にわたり、配列番号２の配列と９８％超の同一性を有するポリペプチドをコードするものである。
【００１３】
本発明はまた、
−  本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現できる発現ベクター、
−  本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞、
−  本発明のポリペプチドに対して特異的な抗体、
−  １型インターフェロンで処置可能な疾患を有する対象を処置する方法であって、前記患者に、有効量のＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその機能的変異体を投与することを含む該方法、
−  抗ウイルス性又は抗腫瘍性又は免疫調節性の薬剤として治療に使用するため、より詳細には、１型インターフェロンで処置可能な疾患の処置に使用するための薬物の製造における該ポリペプチドの使用、
−  本発明のポリペプチドと、医薬として許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物、
−  本発明のポリペプチドを生産する方法であって、前記ポリペプチドの発現を実現し該ポリペプチドを単離するのに適当な条件下で本発明の宿主細胞を保つことを含む該方法、
−  ヒト又は非ヒト動物の治療的処置に使用するため、より詳細には、抗ウイルス性、抗腫瘍性又は免疫調節性の薬剤として使用するために、上記に規定されたポリペプチドのインビボ発現を誘導する、例えば発現ベクター形態の、本発明のポリヌクレオチド、
−  該ポリヌクレオチドと、医薬として許容可能な担体又は希釈剤とを含む医薬組成物、
−  １型インターフェロンで処置可能な疾患を有する被験体を処置する方法であって、該ポリヌクレオチドを前記患者に有効量投与することを含む該方法、
−  抗ウイルス性、抗腫瘍性又は免疫調節性の薬剤として治療に使用するため、より詳細には、１型インターフェロンで処置可能な疾患の処置に使用するための薬物、例えば、ベクター製剤の製造における該ポリヌクレオチドの使用、並びに
−  免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性を有する化合物を同定する方法であって、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体を発現できる細胞を用意することと、前記細胞を試験用の化合物と共にインキュベートすることと、ＨｕＩＦＲＧ１９８遺伝子発現の上方制御を求めて監視することとを含む方法、
を提供する。
【００１４】
また別の態様では、本発明は、１型インターフェロンでの処置、例えば、ＩＦＮ−α処置（口腔粘膜経路又は非経口的経路、例えば、静脈内、皮下又は筋肉内によるＩＦＮ−α処置など）に対する患者の応答性を予測する方法であって、前記患者からの細胞試料、例えば、血液試料における、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体、例えば、対立遺伝子の変異体、又は対応するｍＲＮＡのレベルを決定することを含み、前記試料は、１型インターフェロン、例えば、ＩＦＮ−αの口腔粘膜経路を介した又は静脈内への投与後に前記患者から得るか、或いはインビトロでＩＦＮ−αなどの１型インターフェロンを用いて、前記決定の前に処理される方法を提供する。本発明はまた、該試験を実行するためのキットまで広がる。
【００１５】
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒト蛋白質ＨｕＩＦＲＧ１９８のアミノ酸配列とそのコードｃＤＮＡである。
配列番号２は、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質のアミノ酸配列のみである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
上記に示したように、ヒト蛋白質ＨｕＩＦＲＧ１９８及びその機能的変異体は現在、治療に有用な薬剤として、より詳細には、抗ウイルス性、抗腫瘍性又は免疫調節性の薬剤として使用するためのものとして認識される。
【００１７】
この目的のためのＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の変異体は、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質と実質的に同じ機能的活性を有し、ＩＦＮ−αの投与に応答して上方制御される天然産生変異体であってもよく、対立遺伝子変異体又は種変異体のいずれでもよい。或いは、治療に使用するＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の変異体は、配列番号２から変化しているが、非天然変異体である配列を含んでもよい。
【００１８】
用語「機能的変異体」は、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の同じ必須形質又は基本的機能を有するポリペプチドを指す。ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の必須形質は、免疫調節性ペプチドとしてみなしてもよい。機能的変異体ポリペプチドは、追加的に又は代わりに抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性を示してもよい。
【００１９】
望ましい抗ウイルス活性は、例えば、次のように試験又は監視してもよい。試験される変異体をコードする配列を、ウイルス性のパッケージングシグナルΨ及び薬物耐性マーカを含有するモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）に由来するレトロウイルスベクターなどのレトロウイルスベクター内でクローニングする。次いで、高力価感染性複製能力のないウイルスを生産するために、ウイルス性ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含有する汎親和性パッケージング細胞系に、組換え型のレトロウイルスベクターと、水疱性口内炎ウイルス外被糖蛋白質を含有するプラスミドｐＶＳＶ−Ｇとを同時形質移入する（Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４、５２３２〜５２３６頁）。次いで、該感染性の組換えウイルスを使って、インターフェロン感受性線維芽細胞又はリンパ芽球腫細胞に形質移入し、さらに上記変異体蛋白質を安定して発現する細胞系を、標準的なインターフェロンバイオアッセイでウイルス感染に対する抵抗性について試験する（Ｔｏｖｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ、２７１、６２２〜６２５頁、１９７８年）。標準的な増殖アッセイを用いた増殖阻害（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６５、５５〜６３頁、１９８３年）、及び標準的な技法を用いたＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ抗原の発現も判定できる。
【００２０】
ＨｕＩＦＲＧ１９８の望ましい機能的変異体は、本質的には、配列番号２の配列からなっていてもよい。配列番号２の機能的変異体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して、その少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、少なくとも１００個の連続するアミノ酸の領域又は配列番号２の全長にわたって、少なくとも６０％から７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％又は少なくとも９０％及び特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドであってもよい。ある好ましい態様では、本発明は、配列番号２の全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列に対して９８％超の同一性、好ましくは少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有する配列番号２の機能的変異体に関する。蛋白質同一性を決定する方法は、当該技術分野においてよく知られている。
【００２１】
アミノ酸置換は、例えば１個、２個又は３個から１０個、２０個又は３０個の置換として行ってもよい。保存的置換は、例えば下記の表にしたがって行ってもよい。第２列の同一ブロック内のアミノ酸及び好ましくは第３列の同一行内のアミノ酸は、互いに置換してもよい。
【表１】
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【００２２】
本発明による治療に使用する変異体ポリペプチド配列は、より短いポリペプチド配列でもよく、例えば、長さにして少なくとも２０個のアミノ酸から５０、６０、７０、８０、１００、１５０又は２００個のアミノ酸のペプチドは、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の適切な生物活性を保持していれば、本発明の範囲内にあるものと考えられる。特に、しかし排他的なものではないが、本発明のこの態様は、上記変異体が、完全な天然の天然産生蛋白質配列の断片である状況を包含する。
【００２３】
抗ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質抗体を産生するために用いることができるＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の修飾された形態及びその断片も、本発明に包含される。該変異体は、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質のエピトープを含むであろう。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、化学的に修飾されてもよく、例えば、ポスト翻訳的に修飾してもよい。例えば、それらは、グリコシル化されてもよく、且つ／又は修飾アミノ酸残基を含んでもよい。それは、Ｎ末端及び／又はＣ末端へのある配列の付加によって修飾されてもよく、例えば、それらの精製を支援するためにＴ７タグ又はヒスチジン残基を提供すること、或いは細胞膜への挿入を促進するためにシグナル配列を付加することによって修飾してもよい。該修飾ポリペプチドは、本発明の用語「ポリペプチド」の範囲内にある。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、検出用標識で標識してもよい。検出用標識は、上記ポリペプチドの検出を可能にするいかなる適当な標識でもよい。適当な標識は、１２５Ｉ、３５Ｓなどの放射性同位体、又は酵素、抗体、ポリヌクレオチド、及びビオチンなどのリンカーを含む。本発明の標識ポリペプチドは、アッセイに用いてもよい。該アッセイにおいては、固体支持体に結合したポリペプチドを用意することが好ましいことがある。本発明はまた、容器内にキットの形態で包装した該標識付き及び／又は固定化ポリペプチドに関する。該キットは、他の適当な試薬、対照又は指示書などを選択的に含有していてもよい。
【００２６】
本発明のポリペプチドは、合成的に又は組換え手段によって作ることができる。本発明の該ポリペプチドは、非天然産生アミノ酸、例えば、Ｄアミノ酸を含むように修飾してもよい。本発明の変異体ポリペプチドは、インビトロ及び／又はインビボでの安定性を増すような修飾を有していてもよい。上記ポリペプチドが合成的手段で生産される場合、該修飾を生産中に導入してもよい。上記ポリペプチドはまた、合成的又は組換え的な生産に続いて修飾してもよい。
【００２７】
いくつかの側鎖修飾が、蛋白質修飾技術分野において知られており、本発明のポリペプチドにおいても存在していてもよい。そのよう修飾は、例えば、アルデヒドとの反応と後に続くＮａＢＨ４を用いた還元による還元的アルキル化、メチルアセチミデートを用いたアミジン化、又は無水酢酸を用いたアシル化によるアミノ酸の修飾を含む。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離された形態である。該ポリペプチドは、該ポリペプチドの意図した目的を妨げることのない担体又は希釈剤と混ぜてもよく、それでも実質的に単離されているとみなされることが理解されるであろう。本発明のポリペプチドは、実質的に精製された形態であってもよく、その場合、一般に製剤中に該ポリペプチドを含み、該製剤中のポリペプチドに対して重量百分率で９０％超、例えば、９５％、９８％又は９９％超が本発明のポリペプチドである。
【００２９】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその変異体をコードするヌクレオチド配列、及びそれに相補的である単離されたヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また一本鎖でも二本鎖でもよく、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡやｃＤＮＡを含む。好ましくは、上記ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列であり、最も好ましくは、ｃＤＮＡ配列である。
【００３０】
上記に示したように、該ポリヌクレオチドは、典型的には
（ａ）配列番号１の核酸又はそのコード配列及び／又はそれに相補的な配列、
（ｂ）（ａ）に規定された配列に対して相補的な配列と、例えば、ストリンジェントな条件下で、ハイブリッド形成する配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）に規定された配列に対して、遺伝暗号の結果として縮重している配列、
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に規定された配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する配列
を含む配列を含む。
【００３１】
好適な態様では、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２のＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質、又は配列番号２の全長にわたる配列番号２の配列と９８％超の同一性を有する前記ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の変異体をコードする。該ポリヌクレオチドは、配列番号２の全長にわたり、配列番号２のアミノ酸配列と９８％超の同一性、好ましくは少なくとも９８．５％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％の同一性を有する配列番号２の機能的変異体をコードしていてもよい。
【００３２】
適切なコード配列を含むポリヌクレオチドは、ヒト細胞から単離したり、また当該技術分野においてよく知られている方法にしたがって合成することができ、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）の分子クローニング：実験室マニュアル、第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、その内部に合成又は修飾されたヌクレオチドを含んでいてもよい。ポリヌクレオチドに対するいくつかの異なるタイプの修飾が当該技術分野において知られている。これらは、メチルホスホネート及びホスホチオエートバックボーン、該分子の３’及び／又は５’末端でのアクリジン又はポリリジン鎖の付加を含む。該修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性又は寿命を増強するために実行してもよい。
【００３４】
典型的には、本発明のポリヌクレオチドは、選択的条件下で配列番号１のコード配列又はコード配列の相補配列とハイブリッド形成できる、好ましくはヌクレオチドの連続配列であるヌクレオチドの配列を含むことになろう。該ハイブリッド形成は、バックグランドよりも有意に高いレベルで発生する。バックグランドのハイブリッド形成は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーに他のｃＤＮＡが存在することから、発生する。本発明のポリヌクレオチドと、配列番号１のコード配列又はコード配列の相補配列との間の相互作用によって発生されるシグナルレベルは、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列との間の相互作用に対して典型的には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍の強度であろう。相互作用の強度は、例えば、プローブを放射性標識することによって、例えば３２Ｐを用いて、決定することができる。選択的ハイブリッド形成は、典型的には、低い厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）（０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約４０℃）、中程度の厳密性（例えば、０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約５０℃）又は高い厳密性（例えば、０．０３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、約６０℃）の条件を用いて達成される。
【００３５】
配列番号１のコード配列は、ヌクレオチド置換、例えば１個、２個又は３個から１０個、２５個、５０個又は１００個の置換によって修飾されていてもよい。縮重置換を行ってもよく、且つ／又は例えば上記の表に示されるように、修飾された配列が翻訳される場合には保存的アミノ酸置換となるような置換を行ってもよい。配列番号１のコード配列は、その代わり又は追加として、１個又は複数の挿入及び／又は欠失によって、及び／又は一方又は両方の端での伸長によって修飾されてもよい。
【００３６】
配列番号１から選択されるＤＮＡ配列に対して選択的にハイブリッド形成することが可能な本発明のポリヌクレオチド、そのコード配列及びそれに相補的なＤＮＡ配列は、標的配列に対して、一般に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０又は９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％又は９７％で相同であろう。この相同性は、典型的には、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば、少なくとも４０個、６０個又は１００個以上の連続するヌクレオチドの領域にわたっている。
【００３７】
上記の相同性の度合と最小サイズ化とのいかなる組合せも、本発明のポリヌクレオチドを規定するために使用することができるが、よりストリンジェントな組合せ（即ち、より長い長さにわたるより高い相同性）が好ましい。したがって、例えば、２５個好ましくは３０個のヌクレオチドの形態にわたって少なくとも８０％相同なポリヌクレオチドは、４０個のヌクレオチドにわたって少なくとも９０％相同なポリヌクレオチドと同様に好適であることが判るであろう。
【００３８】
ここで言及されるポリヌクレオチド又は蛋白質の配列の相同体は、相同性計算のよく知られた手段にしたがって求めてもよく、例えば、蛋白質相同性は、アミノ酸同一性（ときには「ハード（ｈａｒｄ）な相同性」といわれる）を基に計算してもよい。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するために用いることができ、例えば、そのデフォルト設定で用いられることができるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（１９８４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２、３８７〜３９５頁）。ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴアルゴリズムを、相同性を計算する又は配列を並べるため、或いは同等又は対応配列を同定するために用いることができ、典型的には、それらのデフォルト設定で、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３年）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６、２９０〜３００頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５、４０３−１０に記載されたように用いることができる。
【００３９】
ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公然と入手できる。このアルゴリズムでは、初めに、データベース配列内のＷの長さの短い文字列に並置したときに何らかの正の値の閾値スコアＴに一致する又はこれを満たす問い合わせ配列内の同長さの短い文字列を同定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定する。Ｔは、近接文字列スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期近接文字列ヒットは、それらを含有するＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして働く。文字列ヒットは、各配列に沿って両方向に、累積アラインメントスコアが増大できる限り伸長される。文字列ヒットの各方向への伸長は次の場合に停止される。累積アラインメントスコアが、その最大到達値から量Ｘだけ減少した場合、１つ又は複数の負のスコアの残存アラインメントの累積が原因で累積スコアが零又はそれよりも下になった場合、或いはどちらかの配列の末端に到達した場合である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムでは、デフォルトとしては、文字列長さ（Ｗ）として１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１０９１５〜１０９１９頁を見られたい））アラインメント（Ｂ）として５０、期待値（Ｅ）として１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較が用いられる。
【００４０】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、二つの配列の間の類似度の統計解析を行う。例えば、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５８７３〜５７８７頁を見られたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の一尺度は、最小和確率（ｔｈｅ  ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２個のヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、ある配列が別の配列に類似しているとみなされるのは、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小和確率が、約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合である。
【００４１】
本発明によるポリヌクレオチドは、インビトロでも、インビボでも、またエキソビボでも行うことができる本発明による蛋白質の生産において有用性を有する。該ポリヌクレオチドにおいて、本発明の望ましい蛋白質に対するコード配列は、選ばれた宿主細胞において該望ましい蛋白質の発現を誘導できるプロモーター配列に作動的に連結されるであろう。該ポリヌクレオチドは、一般に発現ベクター形態で存在するであろう。免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性を有する本発明のポリペプチドのインビボでの発現を誘導する、例えば発現ベクター形態にある本発明のポリヌクレオチドもまた、治療薬剤として用いてもよい。
【００４２】
該目的のための発現ベクターは、組換えＤＮＡ技術の分野における従来の実行態様にしたがって構築してもよい。それらは、例えば、プラスミドＤＮＡの使用をともなってもよい。それらは複製開始点を備えてもよい。該ベクターは、１種又は複数の選択可能な標識遺伝子、例えば、細菌性プラスミドの場合におけるアンピシリン抵抗性遺伝子を含有する。本発明のベクターの他の特徴は、蛋白質発現を可能にするために、適切なイニシエーター、エンハンサー、及び例えば、望ましいものであり且つ適正な配向に位置決めされたポリアデニル化シグナルなどの他の要素を含んでもよい。他の好適な非プラスミドベクターは、当該分野の熟練者には明らかであろう。この点におけるさらなる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年（上記）を再び参照されたい。該ベクターは、さらに、例えば、ウイルス性ベクターを含む。好適なウイルス性ベクターの例は、単純ヘルペスウイルス性ベクター、そして、レンチウイルスを含む複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ＨＰＶウイルス（ＨＰＶ−１６やＨＰＶ−１８など）、及び弱毒化したインフルエンザウイルスベクターを含む。
【００４３】
プロモーター及び他の発現制御シグナルは、発現が設計される対象である宿主細胞に適合するように選択してもよい。例えば、酵母プロモーターは、Ｓ．セレビシエ（ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４及びＡＤＨプロモーター、Ｓ．ポンベ（ｐｏｍｂｅ）ｎｍｔ１及びａｄｈプロモーターを含む。哺乳動物プロモーターは、カドミウムなどの重金属やβ−アクチンプロモーターに応答して誘発することができるメタロチオネインプロモーターを含む。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターやアデノウイルスプロモーターなどのウイルス性プロモーターを用いてもよい。使用してもよいウイルス性のプロモーターの他の例は、モロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＬＶＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーター、及びＨＰＶプロモーター、特に、ＨＰＶ上流調節領域（ＵＲＲ）を含む。他の好適なプロモーターは、組換えＤＮＡ技術分野における熟練者によく知られているものであろう。
【００４４】
本発明の発現ベクターは、本発明の望ましいポリペプチドに対するコード配列の側方に位置する配列をさらに含んでもよく、真核生物のゲノム配列、好ましくは哺乳動物のゲノム配列、又はウイルスのゲノム配列に相同な配列を提供する。これは、本発明の該ポリヌクレオチドを真核細胞のゲノム又はウイルス内へ相同的組換えによって導入することを可能にする。特に、ウイルスの配列が側方に位置している発現カセットを含むプラスミドベクターは、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するために適当なウイルスベクターを調製するために用いることができる。
【００４５】
本発明はまた、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその変異体を発現するように変更されたインビトロの細胞、例えば、原核又は真核細胞を含む。該細胞は、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主ゲノムに組み込まれている安定した、例えば真核生物の、細胞系を含む。本発明の宿主細胞は、哺乳動物の細胞又は昆虫の細胞、又は酵母などの下等な真核細胞、又は細菌細胞などの原核細胞であってもよい。本発明によるポリペプチドをコードするベクターの挿入によって変更してもよい細胞の特定の例は、哺乳動物のＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＣＯＳ細胞を含む。好ましくは、安定しているだけでなく、ポリペプチド成熟グリコシル化を可能にする細胞系を選んでもよい。発現は、例えば、形質転換された卵母細胞内で達成してもよい。
【００４６】
本発明のポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞において発現してもよい。本発明のポリペプチドを発現できるトランスジェニック非ヒト動物は、本発明の範囲に含まれる。
【００４７】
本発明によるポリヌクレオチドは、アンチセンス配列の生産を可能にするために、アンチセンス配向で上述したようなベクター内に挿入してもよい。アンチセンスＲＮＡ又は他のアンチセンスポリヌクレオチドは、合成手段によって生産してもよい。
【００４８】
ヒト又は非ヒト動物の治療的処置において使用するための、配列番号２で規定するアミノ酸配列に対するコード配列のアンチセンス配列をインビボで発現できる、例えば、発現ベクター形態にあるポリヌクレオチド、又はその天然産生変異体はまた、本発明の別の態様を構成するものと認識される。該ポリヌクレオチドは、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質の上方制御に関連した疾患の処置において利用できよう。
【００４９】
本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲ増幅のためのプライマー対などの、本発明のポリペプチドに対するｃＤＮＡ内の配列を標的とする核酸増幅用のプライマーのセットにまで広がる。本発明はまた、検出用標識、例えば、放射性標識、又は酵素やビオチンなどの非放射性標識で標識付けしてもよい、本発明のポリペプチドに対するｃＤＮＡ又はＲＮＡ内の配列を標的にするのに適当なプローブを提供する。該プローブは、固体支持体に結合してもよい。該固体支持体は、別の核酸、例えば、他の１型インターフェロン上方制御型遺伝子、例えば、ＩＦＮ−αの口腔粘膜の又は静脈内の投与に応答して上方制御されるとして同定されるような遺伝子に対応するｍＲＮＡ又はその増幅産物に対するプローブを担持するマイクロアレイ（又は一般には核酸、プローブ又はＤＮＡチップと呼ばれる）でもよい。該マイクロアレイを構築するための方法はよく知られている（例えば、Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎ．Ｖ．のＥＰ−Ｂ０４７６０１４と０６１９３２１と「チッピング予報（Ｔｈｅ  Ｃｈｉｐｐｉｎｇ  Ｆｏｒｅｃａｓｔ）」という表題のＮａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｊａｎｕａｒｙ  １９９９年を見られたい）。
【００５０】
該プライマー又はプローブの核酸配列は、好ましくは長さにして少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５又は少なくとも２０、例えば、少なくとも２５、少なくとも３０又は少なくとも４０個のヌクレオチドであろう。しかし、４０、５０、６０、７０、１００又は１５０個のヌクレオチドまでの長さ又はそれを超える長さでもよい。
【００５１】
本発明の別の態様は、ＨｕＩＦＲＧ１９８遺伝子内の突然変異、例えば一塩基多型（ＳＮＰ）を同定するための本発明のプローブ又はプライマーの使用である。
【００５２】
上記に示したように、さらに別の態様では、本発明は、免疫調節活性及び／又は抗ウイルス活性及び／又は抗腫瘍活性を有する化合物を同定するための方法であって、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体を発現できる細胞を用意することと、前記細胞を試験用の化合物と共にインキュベートすることと、ＨｕＩＦＲＧ１９８遺伝子発現の上方制御を求めて監視することとを含む方法を提供する。該監視は、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体をコードするｍＲＮＡをプローブすることによってもよい。或いは、ＨｕＩＦＲＧ１９８及びその天然産生変異体のうちの１種又は複数に特異的に結合できる抗体又は抗体断片を使用してもよい。
【００５３】
抗体
別の態様によれば、本発明はまた、従来の技法で得られ且つ本発明のポリペプチドに対して特異的である抗体（例えば多クローン又は好ましくは単クローンの抗体、キメラ抗体、ヒト化された抗体及び抗原結合能を保持するその断片）に関する。該抗体は、例えば、免疫沈降をともなう精製、単離又はスクリーニング方法に有用であり、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその変異体の機能をさらに解明するための道具として用いてもよい。それらは、それ自体で治療薬剤としてもよい。該抗体は、本発明による蛋白質の特異的エピトープに対して作成してもよい。抗体は、その特異性を示す蛋白質に高親和性で結合するときにその蛋白質に特異的に結合するが、他の蛋白質には結合しないか又は僅かに低い親和性で結合するに過ぎない。抗体の特異的結合能を決定するための競合的結合又は免疫放射定量アッセイのための多様なプロトコルはよく知られている。
【００５４】
医薬組成物
本発明のポリペプチドは、典型的に、医薬として許容可能な担体又は希釈剤とともに投与するために調合される。製薬的な担体又は希釈剤は、例えば、等張液であってもよい。例えば、固体経口形態は、活性化合物とともに、希釈剤、例えば、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモ澱粉；滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、及び／又はポリエチレングリコール；結合剤；例えば、澱粉、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；分離防止剤、例えば、澱粉、アルギン酸、アルギネート又はナトリウム澱粉グリコレート；発泡性混合物；染料；甘味料；レシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸などの湿潤剤；、及び一般には、製薬調合物において用いられる無毒性で薬理学的に不活性な物質を含んでもよい。該医薬製剤は、知られている方法、例えば、混合、顆粒化、錠剤化、糖衣、又は被膜の各方法によって製造してもよい。
【００５５】
経口投与用の分散液は、シロップ、乳濁液及び懸濁液であってもよい。シロップは、担体として、例えば、ショ糖又はグリセリン添加のショ糖及び／又はマンニトール及び／又はソルビトールを含有してもよい。
【００５６】
懸濁液及び乳濁液は、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含有してもよい。筋肉内注射用の懸濁液又は溶液は、活性化合物とともに、医薬として許容可能な担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、及び所望に応じて、適量の塩酸リドカインを含有してもよい。
【００５７】
静脈内投与若しくは注入用の溶液は、担体として、例えば、滅菌水を含有してもよく、又は好ましくは、滅菌した等張食塩水溶液の形態であってもよい。
【００５８】
本発明により使用するＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその機能的な類似体の適当な用量は、種々のパラメータ、特に、使用している当該物質、処置される患者の年齢、体重及び状態、投与の経路、及び必要とする投与計画にしたがって決定できる。繰り返すが、医師は、いかなる特定の患者に対しても、要求される投与経路及び用量を決定することができる。典型的な一日の用量は、特異的阻害剤の活性、処置される対象の年齢、体重及び状態、及び投与の頻度と経路に応じて、体重比で毎ｋｇあたり約０．１から５０ｍｇ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。好ましくは、一日の用量レベルは、５ｍｇから２ｇであってもよい。
【００５９】
治療用途に適当な本発明のポリヌクレオチドはまた、典型的には、医薬として許容可能な担体又は希釈剤とともに投与するために調合される。該ポリヌクレオチドは、所望のポリペプチドの発現がインビボで達成され得るいかなる既知の技法によって投与してもよい。例えば、ポリヌクレオチドは、注射、好ましくは皮内、皮下又は筋肉内への注射によって導入してもよい。或いは、該核酸を、粒子媒介送達装置を用いて皮膚を通して直接的に送達してもよい。治療的核酸に適当な本発明のポリヌクレオチドは、或いは、口腔粘膜の表面に、例えば鼻腔内又は経口投与によって投与してもよい。
【００６０】
治療用途に適当な本発明の非ウイルス性ベクターは、例えば、リポソーム内に又は界面活性剤含有ベクター送達粒子内に収容してもよい。本発明の核酸構築物の取り込みは、いくつかの既知の形質移入技法、例えば形質移入剤の使用を含む技法によって促進してもよい。これらの薬剤の例は、陽イオン性薬剤、例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥデキストラン及びリポフェクタント、例えばリポフェクタム及びトランスフェクタム、を含む。投与される核酸の用量は、変更することができる。典型的に、該核酸は、粒子介在遺伝子送達の場合には１ｐｇから１ｍｇ、好ましくは１ｐｇから１０μｇの範囲の核酸であり、他の経路の場合には１０μｇから１ｍｇの範囲で投与される。
【００６１】
１型インターフェロン応答性の予測
やはり上記に示したように、さらに別の態様では、本発明は、１型インターフェロンでの処置、例えば、口腔粘膜経路又は静脈内でのＩＦＮ−α処置などのＩＦＮ−α処置に対する患者の応答性を予測する方法であって、前記患者からの細胞試料においてＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体、或いは対応するｍＲＮＡのレベルを決定することを含み、前記試料は、１型インターフェロンの投与後に前記患者から得るか、又はインビトロで１型インターフェロンを用いて前記決定の前に処置する方法を提供する。
【００６２】
好ましくは、応答性を試験するための１型インターフェロンは、処置のために選択される１型インターフェロンである。それは、推奨した処置経路及び推奨した処置用量で投与してもよい。好ましくは、その後の分析試料は、例えば、血液試料又は血液試料から単離される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試料であってもよい。
【００６３】
より好都合及び好ましくは、血液から単離されたＰＢＭＣを含む患者から得られる試料は、インビトロで、例えば、約１から１０，０００ＩＵ／ｍｌの用量範囲の１型インターフェロンで処置してもよい。該処置は、何時間かの期間、例えば約７から８時間の間、行ってもよい。該インビトロ試験のための好適な処置条件は、正常なドナーから取られたＰＢＭＣを同インターフェロンで試験し、適切な発現産物の上方制御を探すことによって決定してもよい。繰り返すが、使用される１型インターフェロンは、好ましくは、患者の処置のために推奨した１型インターフェロン、例えば組換え型ＩＦＮ−αであろう。該試験のためのＰＢＭＣは、フィコール−ハイパーク密度勾配を用いて血液試料から従来の方法で単離してもよい。１型インターフェロン応答性の該インビトロ試験のための適当なプロトコルの例は、下記実施例３に提供されている。
【００６４】
上記試料は、１型インターフェロンでのインビトロ処置の後で適切であれば、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体のレベルを求めて解析してもよい。これは、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質及びその天然産生変異体、例えばその対立遺伝子変異体の１種又は複数に特異的に結合できる１種又は複数の抗体を用いて行ってもよい。しかし、好ましくは、上記試料は、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質又はその天然産生変異体をコードするｍＲＮＡを求めて解析される。該ｍＲＮＡ解析は、ｍＲＮＡの検出で知られる技法、例えばノーザンブロット検出やｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイのうちどれを使用してもよい。多様な既知の核酸増幅プロトコルを、試料内に存在するいかなる関心対象のｍＲＮＡ、又はその一部を検出前に増幅するために使用してもよい。関心対象のｍＲＮＡ又は対応する増幅核酸は、固体支持体に結合した核酸プローブを用いてプローブしてもよい。該固体支持体は、先に上述したように、１型インターフェロン上方制御型遺伝子、例えば、ＩＦＮ−αの口腔粘膜の又は静脈内の投与に応答して上方制御されるとして同定されるような遺伝子、に対応する別のｍＲＮＡ又はその増幅産物のレベルを決定するためのプローブを担持するマイクロアレイでもよい。
【００６５】
次の実施例は本発明を例示する。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
先の実験は、Ｐ２０エッペンドルフマイクロピペットを用いて５μｌのクリスタルバイオレットを正常な成体マウスの各鼻孔に塗布すると、ほぼ直ちにその染料が口咽頭腔の全表面に分配されるという結果になることを示した。口咽頭腔の染色は、上記染料の塗布後ほぼ３０分してもなお見た目に明らかであった。これらの結果は、同様に塗布した１２５Ｉ標識組換えヒトＩＦＮ−α１〜８を用いて確認した。同じ投与法を、下記に説明される研究において口腔粘膜投与を行うために使用した。
【００６７】
６週齢のオスのＤＢＡ／２マウスを、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃから購入した組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）１００，０００ＩＵを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃから購入した組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）１０μｇ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１００μｇ／ｍｌを含有するＰＢＳで処置するか、又は未処置のままとした。８時間後、マウスを頸椎脱臼によって犠牲にし、その口咽頭腔からリンパ組織を外科的に取り出して、すぐさま液体窒素中で冷凍し、−８０℃で保存した。上記リンパ組織からＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉ、１９８７年の方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６〜１５９頁）で抽出し、ｍＲＮＡディファレンシャルディスプレイ解析（Ｌａｎｇ，Ｐ．とＰａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５７、９６７〜９７１頁）にかけた。
【００６８】
ディファレンシャルディスプレイ解析
ディファレンシャルディスプレイ解析は、ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの「Ｍｅｓｓａｇｅ  Ｃｌｅａｎ」と「ＲＮＡ  ｉｍａｇｅ」の各キットを用いて、本質的には製造元による記述のように実行した。簡単に述べると、ＲＮＡをＲＮアーゼ（ＲＮａｓｅ）を含まないＤＮアーゼ（ＤＮａｓｅ）で処理して、１μｇを、３個の一塩基アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ又はＧのうちのいずれかを用いて１００μｌの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９個の二塩基アンカーオリゴ（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのうちのいずれかを用いて逆転写した。比較する全ての試料は、同じ実験で逆転写し、一定分量に分けて冷凍した。増幅は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとα−３３Ｐ  ｄＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）とを含有する増幅混合液１０μｌ中で逆転写試料１μｌだけで実行した。８０個の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ又はＧＣプライマーのそれぞれと組み合わせて用いた。そして、試料を７％変性ポリアクリルアミドゲルに流し、オートラジオグラフィーにかけた。推定上の示差発現バンドを切り出し、供給元の指示書に従って再増幅し、さらにプローブとして用いて、ＩＦＮ処置、ＩＬ−１５処置及び賦形剤処置した動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリッド形成させた。
【００６９】
クローニングと配列決定
ディファレンシャルディスプレイのスクリーンからの再増幅バンドをｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｆｒ１部位でクローニングするとともに、ｃＤＮＡ末端の高速増幅から増幅されたｃＤＮＡをｐＣＲ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＴＡクローニングによって単離した。ＤＮＡを、自動ジデオキシ配列決定装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７）を用いて配列決定した。
【００７０】
ヒトｃＤＮＡの単離
ディファレンシャルディスプレイスクリーンから同定したマウスの示差発現３’配列を、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋ（商標）のｄｂＥＳＴデータベースに存在するランダムヒト発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較した。ディファレンシャルディスプレイスクリーンから単離されたマウスＥＳＴに潜在的に関連する配列は、コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）内に組み合わせ、推定上のｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築するのに用いられた。該ｃＤＮＡの１つは、６０４５ヌクレオチド長さであることが見出された。これは、その発現が、ＩＦＮ−αの口腔粘膜の投与に続いて、マウスの口腔のリンパ組織において約３倍に増大されることが見出されたマウス遺伝子に対応していた。
【００７１】
該推定上のｃＤＮＡが真正のヒト遺伝子に対応することを証明するために、コンセンサス配列の５’及び３’末端に由来のプライマーを用いて、特異的逆転写とＰＣＲ増幅とによってヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。予測された大きさの独特のｃＤＮＡ断片が得られ、クローニングして、配列決定した（配列番号１）。このヒトｃＤＮＡは、１７１２個のアミノ酸の蛋白質（配列番号２）をコードする位置２４３から５３８１にある長さ５１３９ｂｐの翻訳領域（ＯＲＦ）を含む。
【００７２】
（実施例２）
ＩＦＮ−αの静脈内の投与
オスＤＢＡ／２マウスに、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．から購入した組換えマウスＩＦＮ−αの１００，０００ＩＵを含むＰＢＳ２００μｌを腹腔内注射するか、又は等しい体積のＰＢＳのみの処置を施した。８時間後、該動物を頸椎脱臼によって犠牲にし、脾臓を従来の手順を用いて取り出した。全ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７年）１６２、１５６〜１５９頁）で抽出し、１試料あたり全ＲＮＡ１０．０μｇを、グリオキサールの存在下でノーザンブロットにかけ、Ｄａｎｄｏｙ−Ｄｒｏｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８年）２７３、７６９１〜７６９７頁）に記載されたようにＨｕＩＦＲＧ１９８ｍＲＮＡを求めてｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。ブロットをまずオートラジオグラフィーにかけ、そしてＰｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒを製造元の指示書にしたがって用いて定量した。賦形剤だけで処置した動物に比べてＩＦＮ−α処置動物の脾臓から抽出されたＲＮＡの試料においては、ＨｕＩＦＲＧ１９８蛋白質に対するｍＲＮＡの増大されたレベル（概ね４倍）が検出された。
【００７３】
（実施例３）
インビトロでの１型インターフェロン応答性の試験
ヒトＤａｕｄｉ又はＨｅＬａ細胞をインビトロで組換えヒトＩＦＮ−α２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−ＰｌｏｕｇｈからのＩｎｔｒｏｎ  Ａ）１０，０００ＩＵを含むＰＢＳで、又は等しい体積のＰＢＳだけで処置した。８時間後、該細胞を遠心分離（８００×ｇで１０分間）し、細胞ペレットを回収した。全ＲＮＡを、該細胞ペレットから、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法で抽出し、試料あたり全ＲＮＡの１０．０μｇを、グリオキサールの存在下でノーザンブロットにかけ、先に上記実施例２に記載されたようにＨｕＩＦＲＧ１９８ｍＲＮＡを求めてｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成させた。ＰＢＳだけで処置した試料に比べてＩＦＮ−α処置Ｄａｕｄｉ又はＨｅＬａ細胞から抽出されたＲＮＡの試料においては、ＨＵＩＦＲＧ１９８蛋白質に対するｍＲＮＡの増大されたレベル（概ね３倍）が検出された。
【００７４】
同じ手順を、１型インターフェロンで処置されることを勧められた患者から取られたＰＢＭＣを用いて１型インターフェロン応答性を予測するために用いてもよい。
【配列表】
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【国際調査報告】
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