(57)【要約】本開示は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞のＧＡＢＡ作動性ニューロンなどの神経前駆細胞および分化神経細胞を効率的に生産するための改善方法に関する。開示された本法を用いて、高比率のＧＡＢＡ作動性ニューロンを含有する細胞集団が単離された。本開示の神経前駆細胞および終末分化細胞は大量に生成でき、したがって、脳卒中、虚血、癲癇、およびハンチントン舞踏病などの神経変性障害およびニューロン疾患における細胞置換療法のための優れた供給源として役立ち得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス多能性幹細胞を分化させる工程により得られるインビトロ培養物中の分化細胞集団であって、少なくとも６０％の該分化細胞が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、分化細胞集団。
【請求項２】
前記マウス多能性幹細胞が、マウス胚性幹細胞である、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項３】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、ＧＡＤ６５を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項４】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、ＧＡＤ６７を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項５】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、ＧＡＢＡ−Ａ受容体を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項６】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、ＧＡＢＡ−Ｂ受容体を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項７】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンが、ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体を発現する、請求項１に記載の細胞集団。
【請求項８】
マウス多能性幹細胞を分化させる工程により得られるインビトロ培養物中の分化細胞集団であって、少なくとも６０％の該分化細胞が、γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する、分化細胞集団。
【請求項９】
前記マウス多能性幹細胞が、マウス胚性幹細胞である、請求項８に記載の細胞集団。
【請求項１０】
哺乳動物の多能性幹細胞から分化神経細胞集団を産生する方法であって、以下の工程：
（ａ）多能性幹細胞の培養物を展開する工程；
（ｂ）該多能性幹細胞を培養してネスチンに対して陽性である神経前駆細胞を選択する工程；
（ｃ）該ネスチン陽性神経前駆細胞を展開する工程；および
（ｄ）シトシンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含有する分化培地中で該ネスチン陽性細胞を培養する工程により該ネスチン陽性細胞を分化させて分化細胞集団を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
前記哺乳動物の多能性幹細胞が、マウス胚性幹細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物の多能性幹細胞が、ヒト胚性幹細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記分化細胞集団が、少なくとも約６０％のＧＡＢＡ作動性ニューロンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記分化細胞集団が、少なくとも約１５％のドーパミン作動性ニューロンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記分化細胞集団が、少なくとも約１０％のグルタミン酸作動性ニューロンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記分化細胞集団が、少なくとも約５％のセロトニン作動性ニューロンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記分化細胞集団が、少なくとも約５％の希突起膠細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記分化細胞集団が、少なくとも約５％の星状細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
ネスチンに対して陽性である前記神経前駆細胞が、無血清培地中で前記幹細胞を培養する工程によって選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
前記無血清培地が、ＩＴＳＦｎ無血清限定培地である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞を、前記ＩＴＳＦｎ無血清限定培地中で、６〜１０日間成長させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群より選択される１つ以上の可溶性因子を含有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｂ）の前記哺乳動物の多能性幹細胞を培養して胚様体を形成させる工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
前記胚様体は、ネスチンに対して陽性である神経前駆細胞を選択するために培養される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経前駆細胞が、少なくとも約９０％のネスチン陽性細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ネスチンに対して陽性である前記神経前駆細胞は、無血清培地中で前記胚様体を培養する工程により選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記無血清培地が、ＩＴＳＦｎ無血清限定培地である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記無血清培地が、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群より選択される１つ以上の可溶性因子を含有する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＮＳ展開培地中で、工程（ｃ）の前記ネスチン陽性神経前駆細胞を展開する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ネスチン陽性神経前駆細胞が、ポリ−Ｌ−オルニチンまたはラミニンによりプレコートされた培養皿にプレートされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＮＳ展開培地が、Ｎ２補充物、Ｂ２７補充物、および神経誘導因子からなる群より選択される１つ以上の可溶性因子を含有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記神経誘導因子が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＮＳ展開培地中で、前記細胞を、６〜１０日間成長させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記分化培地が、Ｎ２補充物、Ｂ２７補充物、またはその両方を含有するが、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を含有しない、請求項１０に記載の方法。
【請求項３５】
前記分化培地中で、前記細胞を、２日間以上成長させる、請求項１０に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｄ）の前記分化細胞集団を、シトシンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含有しない第２の分化培地中で培養する工程によってさらに分化させる工程（ｅ）をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の分化培地中で、前記分化細胞集団を、８〜１６日間成長させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
哺乳動物神経前駆細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成させる方法であって、ネスチンに対して陽性である細胞について該神経前駆細胞を濃縮する工程、およびシトシンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）の存在下で、該ネスチン陽性細胞を培養する工程により該ネスチン陽性細胞を分化させ、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成させる工程を包含する、方法。
【請求項３９】
神経細胞のためのインビトロ移植モデルを作製する方法であって、以下の工程：
（ａ）成体の海馬細胞を単離する工程；
（ｂ）該海馬細胞を分離し、培養して海馬細胞培養物を生成させる工程
；および
（ｃ）該海馬細胞培養物で神経細胞を培養する工程；
を包含し、該海馬細胞培養物における該神経細胞の生存が評価される、方法。
【請求項４０】
前記成体海馬細胞が、マウスから単離される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記神経細胞が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＧＡＢＡ作動性ニューロンの９０％より多くが、培養１週後に生存している、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記神経細胞と前記海馬培養物との間のシナプス形成を評価する工程をさらに包含する、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
適用せず
（連邦後援研究または開発に関する供述）
適用せず
（「マイクロフィッシュ添付文書」に対する参照）
適用せず
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本開示は、マウス胚性幹細胞またはヒト胚性幹細胞などの多能性幹細胞のＧＡＢＡ作動性ニューロンなどの終末分化神経細胞を生産する改善された方法に関する。本開示により生成したＧＡＢＡ作動性ニューロンは、例えば、脳卒中、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、癲癇、およびハンチントン舞踏病などの神経変性障害およびニューロン疾患における細胞置換療法の優れた供給源として役立ち得る。
【背景技術】
【０００２】
（２．関連技術の記載）
γアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）における主要な抑制性神経伝達物質であり、脳全体に広く分布しており、局所回路を調節している介在ニューロンにおいて発現する。ＧＡＢＡを産生するＧＡＢＡ作動性ニューロンは、哺乳動物ＣＮＳにおける主な抑制性ニューロンであり、ＣＮＳの全シナプスのおよそ６０〜７５％がＧＡＢＡ作動性である（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｄ．、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：３３６９−７５頁）。ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、海馬、小脳、大脳皮質、および視床下部に局在しており、ＤＡＢＡは、ＧＡＢＡ−ＡやＧＡＢＡ−Ｂなどの少なくとも３種の受容体に結合する。ＧＡＢＡ−Ａ受容体は、急速な抑制性シナプス伝達、ニューロン興奮、および発作閾値、不安、パニック、およびストレスへの応答（すなわち、「闘争または逃走」応答）などの急速な気分の変化を媒介する。ＧＡＢＡ−Ａ受容体はまた、ベンゾジアゼピン類、エタノール、バルビツール酸類、および神経ステロイドに対する結合部位でもある。ＧＡＢＡ−Ｂ受容体は、緩徐な抑制性伝達を媒介し、記憶、気分、および痛みにおいて重要であると考えられる。
【０００３】
癲癇のいくつかの形態、慢性痛、不安、および他の気分障害を含むいくつかの神経性障害の病因は、ＧＡＢＡ作動性神経伝達の低下に関係していると思われる。例えば、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）試験により、パニック障害に罹っている患者では、ＧＡＢＡ−Ａ受容体結合が低下していることが示された（Ｍａｌｉｚｉａら、１９９８年、Ａｒｃｈ．Ｇｅｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５５：７１５−２０頁）。また、低ＧＡＢＡ血漿は、気分障害に罹っている患者のサブグループに特徴的であると考えられる（Ｂｒａｍｂｉｌｌａら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ８：７２１−３７頁）。ＧＡＢＡ活性を高めるベノジアゼピン類、バルプロ酸、フェノバルビタールなどの一定の薬物は、これらの障害の治療に有効であることが示されている。
【０００４】
パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、脳虚血および脳卒中などの中枢神経系（ＣＮＳ）の多くの疾患は、脳および脊髄領域におけるニューロンの変性を特徴とする。変性または他に損傷した細胞またはニューロンは、身体によって内因的に置換または修復されず、永久的または非可逆的な損傷に至り得る（Ｄｕｒｉｎｇら、２００１年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１５８９−１５９１頁）。脳卒中または脳虚血は、血餅が血管または動脈を遮断し、脳領域への血流を妨げる場合に起こり得、直接的遮断領域において脳細胞の死をもたらす。梗塞を起こした脳細胞は、脳卒中または脳虚血後、通常、数分から数時間以内に死滅する。これらの細胞の死滅は、「虚血カスケード」と呼ばれる連鎖反応を引き起こす化学物質の放出を導き得、これにより、血液供給が損なわれた脳組織のより広範な周囲領域の脳細胞を危険に晒す。迅速な医療処置がなされなければ、このより広範な脳細胞領域もまた死滅して、さらにいっそう深刻で長期の損傷が脳に生じ得る。虚血カスケードの速度が高いことを考えれば、介入処置のための「チャンス」は、わずか６時間である。このチャンスの時間を超えると、血流を再確立しても、神経保護剤を投与しても役に立たないおそれがあり、脳機能にさらなる損傷を生じさせる可能性があり得る（Ｐａｄｏｓｃｈら、２００１年、Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉｓｔ  ５０：９０５−９２０頁；ＮｉｓｈｉｎｏおよびＢｏｒｌｏｎｇａｎ、２０００年、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２７：４６１−４７６頁）。
【０００５】
脳卒中が生じると、脳への血流阻害が、個々のニューロンまたはニューロン群に有害な、場合によっては致命的な影響を及ぼす。脳虚血により脳の特定領域における多数のニューロンが酸素不足および重要な栄養不足となり、患者の機能的能力の重度の損失に至り得る。例えば、脳卒中の患者には、発話、記憶、認識の喪失、運動性低下、またはさらに麻痺が現れる可能性がある。十分な血液供給が無いと、脳細胞はエネルギー、特にアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の生産能力を失う。もし、このエネルギー不足が臨界閾値になると、脳細胞は損傷して死滅する。エネルギーの不足に続いて、極めて多くの機序が脳細胞の損傷および死滅を引き起こすが、これらの機序の各々が治療的介入につながる可能性ある手段を指し示していると多数の研究者は考えている。
【０００６】
エネルギー不足によって生じる脳細胞の応答の１つに、細胞内カルシウムの濃度の上昇がある。これらの濃度は、脳細胞が過剰量の神経伝達物質、グルタミン酸を放出する興奮毒性と呼ばれる過程によって危険なレベルにまで至り得、脳の海馬、皮質、および視床領域に位置する重要な細胞の減損および破壊へと至る（ＮｉｓｈｉｎｏおよびＢｏｒｌｏｎｇａｎ、２０００年、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２７：４６１−４７６頁）。また、脳の海馬領域におけるＧＡＢＡ産生細胞は、脳卒中後に変性することが多い（ＮｉｓｈｉｎｏおよびＢｏｒｌｏｎｇａｎ、２０００年、Ｐｒｏｇ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２７：４６１−４７６頁）。神経組織学的および神経心理学的研究に基づき、脳虚血または脳卒中に関連した神経性障害を治療するために、ＧＡＢＡ作動性アゴニスト、カルシウムアンタゴニスト、グルタミン酸アンタゴニスト、および抗酸化剤などのいくつかの神経保護薬物療法が開発されている（Ｓｔｕｔｚｍａｎｎら、２００２年、ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．８：１−３０頁；Ｒｏｃｈｅｌｌｅら、２００１年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：３５３−３７１頁；Ｂｌｅｚｅｒら、２００２年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４４：７５−８１頁）。脳卒中の予防および急性介入処置のために、現在、様々な開発段階における数百種の薬剤および化合物がある（Ｒｏｃｈｅｌｌｅら、２００１年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．７７：３５３−３７１頁）。これらの薬剤のうち数種は、ＦＤＡ承認に提出されることが予想されており、多くはすでに臨床試験の最終相に入っている。これらの中でも、ＧＡＢＡ作動性薬は、脳虚血または脳卒中に関連した神経性障害の治療に特別有効であることが判明している。
【０００７】
しかし、虚血性脳細胞損傷の多次元性を考慮すると、単一薬剤ベース療法では脳卒中時および脳卒中後、脳を完全に保護することはできないであろうと専門家は予測している。脳虚血または脳卒中に関連した損傷が、現在採り得る療法によっては十分に治療されていないため、種々の神経変性障害および神経疾患に対する別の療法の開発に大きな関心が持たれている。細胞ベースの療法は、そのような事象によって生じた損傷を包括的に治療するために利用できる唯一の手段であると思われる。多くの神経性疾患および病態は、脳および脊髄領域における神経細胞の損失によって引き起こされる。限定はしないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、および脊髄障害など、これらの広範囲な神経性疾患および病態は、細胞ベース療法により治療可能であるだろう。例えば、パーキンソン病に罹っている患者が、個々の患者の脳にドーパミン作動性ニューロンを移植することによって、好結果で治療された（Ｇｒｉｓｏｌｉａ、２００２年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｕｌｌ  ５７：８２３−８２６頁）。したがって、脳虚血または脳卒中の患者において、ＧＡＢＡ産生細胞が悪影響を受けているか損傷している場合、これらの損傷したＧＡＢＡ産生細胞を、新しい健康的なＧＡＢＡ産生細胞に置き換えることが、脳虚血または脳卒中の治療のための理想的な療法になると考えられる。
【０００８】
神経変性障害およびニューロン疾患に対する治療オプションとしての細胞移植が抱える１つの大きな問題は、大量に必要な神経細胞が胎児または成人の供給源から分離することが難しいことである。このジレンマに対する１つの解決法は、無制限数の終末分化細胞タイプを生成させるために使用できる多能性幹細胞の有用性にある。多能性胚性幹（ＥＳ）細胞は、種々の神経変性障害およびニューロン疾患の治療に使用できる神経細胞の実現可能な代替源である。ＥＳ細胞は、未分化状態で無期限に増殖でき、多能性であるが、このことは、ＥＳ細胞が、身体に存在するほとんど全ての細胞タイプに分化する能力を有していることを意味する。ＥＳ細胞は身体のほとんど全ての特異化細胞になる能力があるため、心臓、膵臓、神経組織、筋肉、軟骨などの広範囲の組織および臓器のための置換細胞を生み出す可能性を有している。ＥＳ細胞は、着床前に生じる胎児発生の一段階である胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）から取り出すことができる。ヒトＥＳ細胞は、受精４日目から７日目の間の胎児発生の初期におけるヒト胚盤胞から取り出すことができる。ＩＣＭから取り出したＥＳ細胞をインビトロで培養すると、適切な条件下で無期限に増殖する。
【０００９】
ＥＳ細胞系は、マウス（Ｅｖａｎｓら、１９８１年、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４〜１５６頁）、ラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら、１９９４年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６３：２８８−２９２頁）、ブタ（Ｅｖａｎｓら、１９９０年、Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ  ３３：１２５−１２８頁；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９０年、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｕｐｐｌ．４１：５１−６頁）、ヒツジおよびヤギ（Ｍｅｉｎｅｃｋｅ−ＴｉｌｌｍａｎｎおよびＭｅｉｎｅｃｋｅ、１９９６年、Ｊ．Ａｎｉｍａｌ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１３：４１３−４２６頁；Ｎｏｔａｒｉａｎｎｉら、１９９１年、Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｕｐｐｌ．４３：２５５−６０頁）、ウサギ（Ｇｉｌｅｓら、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３６：１３０−１３８頁；Ｇｒａｖｅｓら、１９９３年、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．３６：４２４−４３３頁）、ミンク（Ｓｕｋｏｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．１９９２年、３３：４１８−４３１頁）、ハムスター（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、１９８８年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１２７：２２４−２２７頁）、家禽（Ｐａｉｎら、１９９６年、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２（８）：２３３９−４８頁）、霊長類（米国特許第５，８４３，７８０号）およびヒト（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７頁；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９−４０３頁）などの多数の種に関して良好な結果で確立されている。他の哺乳動物ＥＳ細胞と同様に、ＥＳ細胞を免疫欠損マウスに注入すると分化して、３つの全胚葉体組織を形成し、それらの多能性を証明している。刊行された報告によると、ヒトＥＳ細胞は、培養液中に１年以上維持され、その間、それらの多能性、自己複製能力、および正常な核型を保持したことが示されている（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年、ＰＮＡＳ  ９２：７８４４−７８４８頁）。
【００１０】
ＥＳ細胞は、インビトロモデル（Ｂａｉｎら、１９９５年、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６８：３４２−３５７頁）ならびにインビボモデル（Ｂｒｕｔｌｅら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７５４−５６頁）の双方において、ニューロンおよびグリア細胞に分化することが示されている。同様に、胞胚期幹細胞は、移植後ドーパミン作動性およびセロトニン作動性ニューロンへと分化できる（Ｄｅａｃｏｎら、１９９８年、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４９：２８−４１頁）。ヒトおよびげっ歯類の幹細胞は、発生中の中枢神経系に移植された場合（Ｆｌａｘら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１０３３−３９頁；Ｂｒｕｓｔｌｅら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１０４０−４４頁；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２００１年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１０３４−４０頁）も、成体ＣＮＳの神経生成領域に移植された場合（Ｆｒｉｃｋｅｒら、１９９９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５９９０−６００５頁；Ｓｈｉｈａｂｕｄｄｉｎら、２０００年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０：８７２７−３５頁）も、特定のニューロンタイプへ分化することができる。
【００１１】
未熟神経細胞からＧＡＢＡ産生細胞を生成させる方法が報告されている（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら、米国特許第６，６０２，６８０号、参照として本明細書に組み込まれている）。Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎらは、未熟神経細胞におけるＤＬＸ遺伝子、例えば、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２またはＤＬＸ５の活性を増大させることによるＧＡＢＡ作動性細胞の産生を報告している。ＤＬＸ活性を増大させると、未熟神経細胞が、ＧＡＢＡ作動性表現型を有する細胞へと分化する。マウス胚性幹細胞からＧＡＢＡ産生細胞を誘導する方法も報告されているが（Ｈａｎｃｏｃｋら、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７１（２）：４１８−２１頁；Ｗｅｓｔｍｏｒｅｌａｎｄら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８４（３）：６７４−８０頁；米国特許出願公開第２００３／００３６１９５号、各々具体的には、参照として本明細書に組み込まれている）が、これらの方法では、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは高いパーセンテージで生成されていない。細胞置換療法には、多数のＧＡＢＡ作動性ニューロンが必要であるため、多能性幹細胞から多数のＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成させる、さらなるインビトロ法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ＧＡＢＡ作動性ニューロンを高収率で生成できる方法は、細胞移植療法にとって、特に脳虚血または脳卒中に罹っている患者にとって、大きな臨床的意義を有している。今日まで、脳虚血または脳卒中に関連した神経疾患を治療するために利用できる療法は極めて限られており、代替療法の開発には大きな関心が持たれている。細胞ベースの療法は、治療に多数の細胞またはニューロンを必要とするが、細胞またはニューロンに利用できる唯一の供給源が胎児または成体の組織のみである場合は、このような療法は不可能である。例えば、運動機能の機能回復を試験するためのパーキンソン病動物モデル１個体に、約１００万個のドーパミン産生細胞を移植しなければならない（Ｇｒｉｓｏｌｉａ、２００２年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．５７：８２３−８２６頁）。胎児材料を用いてそのように多数の細胞を得ることは、多くの倫理的問題を引き起こす。多能性幹細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成させれば、細胞ベース療法に用いるＧＡＢＡ作動性ニューロンを無制限に供給する可能性が提供される。しかし、特にこれらの細胞を利用する治療法には、恐らく多数のＧＡＢＡ作動性ニューロンが必要になるため、この供給源を実用的にするためには、高いパーセンテージのＧＡＢＡ作動性ニューロンを生み出す方法が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（本発明の概要）
本開示は、胚性幹（ＥＳ）細胞などの多能性幹細胞から、神経前駆細胞ならびに終末分化ニューロン細胞またはグリア細胞を産生させる改善された方法に関する。好ましい実施形態において、多能性幹細胞またはＥＳ細胞は、マウス細胞である。ここで生成される細胞としては、限定はしないが、神経前駆細胞の表現型特徴を有する細胞、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンなどのニューロン細胞ならびに希突起膠細胞および星状細胞などのグリア細胞が挙げられる。本開示は、多能性幹細胞、例えば、マウスＥＳ細胞が、高比率（例えば、少なくとも６０％）のＧＡＢＡ作動性ニューロンへ分化できることを証明している。本開示の方法によって生成したＧＡＢＡ作動性ニューロンのパーセンテージは、先に記載された方法よりも高い。ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、多くの可能性が見込まれる細胞ベース療法、例えば、細胞置換療法のために、または例えば、脳卒中、脳虚血、てんかん、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、慢性痛、不安および他の気分障害などの神経変性障害および神経疾患の治療に利用できる。
【００１４】
本開示は、分化多能性幹細胞によって得られたインビトロ培養物における分化神経細胞の少なくとも６０％がＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型を示す細胞、またはγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）を産生する細胞である分化細胞集団を提供する。ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７、ＧＡＢＡ−Ａ受容体、またはＧＡＢＡ−Ｂ受容体またはそれらの組合せを発現することが好ましい。他の実施形態において、分化細胞の少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％がＧＡＢＡ作動性ニューロンであるか、またはＧＡＢＡを産生する。ＧＡＢＡ作動性ニューロンまたはＧＡＢＡを産生する細胞は、ＥＳ細胞から誘導されることが好ましく、ヒトまたはマウスのＲＳ細胞から誘導されることがより好ましい。他の実施形態において、分化細胞集団はまた、少なくとも約１５％のドーパミン作動性ニューロン、少なくとも約１０％のグルタミン酸作動性ニューロン、少なくとも約５％のセロトニン作動性ニューロン、少なくとも約５％の希突起膠細胞、少なくとも約５％の星状細胞またはこれらの量の組合せを含んでなる。
【００１５】
また、本開示は、以下の工程を含んでなる、多能性幹細胞から分化細胞集団を生成させる方法を提供する：
（ａ）多能性幹細胞の培養物を展開させること；
（ｂ）多能性幹細胞を培養し、ネスチンに陽性の神経前駆細胞を選択すること；
（ｃ）ネスチン陽性神経前駆細胞を展開させること；および
（ｄ）シトシンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含んでなる分化培地中、前記細胞を培養することによりネスチン陽性細胞を分化させ、分化細胞集団を生成させること。
【００１６】
好ましい実施形態において、多能性幹細胞はＥＳ細胞であり、より好ましくは、ヒトまたはマウスのＥＳ細胞である。
【００１７】
他の実施形態において、上記の方法は、工程（ｂ）の多能性幹細胞を培養して、胚葉体を形成させる工程をさらに含む。好ましくは、これらの胚葉体は、ネスチンに陽性な神経前駆細胞を選択する条件下、例えば、多能性幹細胞または胚葉体を無血清培地で、好ましくは６〜１０日間の培養により培養する。好ましい実施形態において、無血清培地は、ＩＴＳＦｎ無血清限定培地であり、これは、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフェリン、およびフィブロネクチンからなる群より選択される１種以上の可溶性因子を含むことが好ましい。ＩＴＳＦｎ無血清限定培地は、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、およびフィブロネクチンを含んでなることが好ましい。好ましい実施形態において、これらの方法により、神経前駆細胞が生成されるが、これらは、好ましくは少なくとも約６０〜７５％のネスチン陽性細胞、より好ましくは、約８０〜９０％のネスチン陽性細胞、最も好ましくは、約９５〜９９％のネスチン陽性細胞を含んでなる。
【００１８】
一定の実施形態において、前記方法は、工程（ｃ）のネスチン陽性神経前駆細胞をＣＮＳ展開培地で、好ましくは、６〜１０日間展開させる工程をさらに含む。ＣＮＳ展開培地は、ＮＳ添加物、Ｂ２７補充物、および神経誘導因子からなる群より選択される１種以上の可溶性因子を含んでなることが好ましい。好ましい一実施形態において、神経誘導因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。他の好ましい一実施形態において、ポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−ラミニンまたは双方の組合せでプレコートされた培養皿にネスチン陽性神経前駆細胞をまく。ネスチン陽性神経前駆細胞を培養物中で展開させ、１回以上の集団倍化の間、連続的に継代培養する。これらの細胞を、液体窒素中で凍結保存もできる。
【００１９】
ネスチン陽性神経前駆細胞は、上記方法の工程（ｄ）に記載されたとおり、分化培地で２日間以上増殖させることが好ましい。分化培地は、また、Ｎ２サプリメント、Ｂ２７サプリメント、または双方を含み、塩基性線維芽成長因子（ｂＦＧＦ）を含まないことが好ましい。好ましい実施形態において、シトシンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含有する分化培地で神経前駆細胞を増殖させた後、該細胞を、Ａｒａ−Ｃ無しの分化培地で、好ましくは、８日〜１６日間、より好ましくは１２日間、さらに培養する。
【００２０】
また、本開示は、ネスチン陽性細胞に関して神経前駆細胞を濃縮し、Ａｒａ−Ｃの存在下、該細胞を培養することにより、ネスチン陽性細胞を分化させて、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成させることを含んでなる神経前駆細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成させる方法を提供する。ネスチン陽性細胞を、Ａｒａ−Ｃを有する分化培地で培養した後、それらを、Ａｒａ−Ｃ無しの分化培地で、さらに分化させることが好ましい。この方法を用いて、少なくとも約４０〜９９％のネスチン陽性細胞がＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化することが好ましい。
【００２１】
好ましい実施形態において、上記の開示された方法を用いて好ましくは約６０〜８０％のＧＡＢＡ作動性ニューロン、より好ましくは７５〜９０％のＧＡＢＡ作動性ニューロン、最も好ましくは約９５〜９９％のＧＡＢＡ作動性ニューロンを含んでなる分化細胞集団を生成させる。他の実施形態において、これらの方法を用いて好ましくは約１５〜３０％のドーパミン作動性ニューロン、より好ましくは約２０〜４０％のドーパミン作動性ニューロン、最も好ましくは２５〜５０％のドーパミン作動性ニューロンを含んでなる分化細胞集団を生成させる。一定の実施形態において、好ましくは約５〜２０％のセロトニン作動性またはグルタミン酸作動性ニューロン、より好ましくは約１０〜２５％のセロトニン作動性またはグルタミン酸作動性ニューロン、最も好ましくは約１５〜３０％のセロトニン作動性またはグルタミン酸作動性ニューロンを含んでなる分化細胞集団を生成させるために、これらの方法が用いられる。他の実施形態において、好ましくは約５〜２０％の希突起膠細胞または星状細胞、より好ましくは約１０〜２５％の希突起膠細胞または星状細胞、最も好ましくは約１５〜３０％の希突起膠細胞または星状細胞を含んでなる分化細胞集団を生成させるために、これらの方法が用いられる。
【００２２】
本開示はさらに、脳環境などの宿主様環境における分化細胞、好ましくは、ニューロン細胞または神経細胞の有効性、生存力、および機能性を試験するためのインビトロ移植モデルを提供する。例えば、本明細書に記載されているＧＡＢＡ作動性ニューロンを、成体の脳細胞、好ましくは神経細胞または海馬細胞と共に培養する。ＧＡＢＡ作動性ニューロンを成体の海馬細胞に塗布することが好ましい。該細胞を一緒に、少なくとも３〜２０日間、より好ましくは１週間、培養し、ニューロン細胞または神経細胞の生存率を測定する。好ましくはニューロン細胞または神経細胞の少なくとも約８０％、より好ましくは該細胞の約９０〜９９％が生存する。高生存率により、該細胞が、成体の脳環境において機能している可能性が高いこと、そして神経変性障害またはニューロン疾患の治療に使用し得ることが示される。
【００２３】
また、本開示は、神経変性障害またはニューロン疾患に罹っている対象に、多能性幹細胞、例えば、本明細書に記載されているマウスまたはヒトのＥＳ細胞から誘導した神経前駆細胞または分化ニューロン細胞を投与することにより、対象を治療するための方法を提供する。本明細書の誘導細胞はまた、対象の細胞置換療法にも用いられる。例えば、分化ニューロン細胞集団は、以下のとおり誘導できる：
（ａ）多能性幹細胞の培養物を展開させること；
（ｂ）多能性幹細胞を培養し、ネスチン陽性の神経前駆細胞を選択すること；
（ｃ）ネスチン陽性神経始原細胞を展開させること；および
（ｄ）シスチンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含んでなる分化培地でネスチン陽性細胞を培養することにより、該細胞を分化させ、分化細胞集団を生成させること。
【００２４】
他の好ましい実施形態において、工程（ｄ）の分化細胞を、Ａｒａ−Ｃ無しの分化培地でさらに分化させる。好ましい実施形態において、対象は患者であり、より好ましくはヒト患者である。多能性幹細胞から誘導した神経前駆細胞または分化ニューロン細胞は、対象と組織適合性であることが好ましく、例えば、神経前駆細胞または分化ニューロン細胞は、本質的に、対象と同じゲノムを有する場合である。
【００２５】
一定の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性のニューロン、ならびに希突起膠細胞および星状細胞などのグリア細胞が分化ニューロン細胞集団から単離され、患者に投与される。好ましい実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが対象に投与される。これらの細胞、ならびに神経前駆細胞または分化ニューロン細胞の集団を、限定はしないが、脳卒中、脳虚血、癲癇、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、癲癇、および他のＣＮＳ疾患、ならびに慢性痛、不安、および他の気分障害などの種々の神経変性障害またはニューロン疾患を治療するために、対象に投与できる。これらの対象はまた、細胞置換療法によって治療され得る。該細胞は、移植によって、例えば、対象の脳に所望の細胞を移植することによって、投与することが好ましい。
【００２６】
本開示の他の実施形態は、以下の工程：
（ａ）多能性幹細胞の培養物を展開させること；
（ｂ）多能性幹細胞を培養し、ネスチン陽性の神経前駆細胞を選択すること；
（ｃ）ネスチン陽性神経始原細胞を展開させること；および
（ｄ）シスチンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含んでなる分化培地でネスチン陽性細胞を培養することにより、該細胞を分化させ、分化細胞集団を生成させること；および
（ｅ）分化神経細胞集団の治療的有効量を、患者の中枢神経系に移植することを含んでなる、神経変性障害またはニューロン疾患に罹っている対象を治療する方法である。
【００２７】
好ましい一実施形態において、多能性幹細胞は、マウスまたはヒトのＥＳ細胞である。他の好ましい実施形態において、対象は患者であり、より好ましくは、ヒト患者である。分化神経細胞集団は、患者と組織適合性であることが好ましい。他の実施形態において、工程（ｄ）は、分化培地で２日間以上、該細胞を分化し、引き続き、シスチン−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）を含有しない第２の分化培地で該細胞を分化させることをさらに含んでなる。好ましい実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを分化神経細胞集団から単離し、対象に、例えば、対象の脳に、好ましくは移植により投与する。一定の実施形態において、神経変性障害または神経疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、レービー体認知症、多発性硬化症、小脳性運動失調、進行性核上性不随、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、癲癇、脳卒中、および虚血からなる群より選択される。
【００２８】
他の実施形態において、本明細書に記載された、多能性幹細胞から誘導された神経前駆細胞集団または分化神経細胞を、細胞集団、特に、分化神経細胞またはグリア細胞に対する、またはこれらの細胞の活性に対する効果に関して、化合物、例えば、小型分子および薬物を選別するために、使用することができる。また、化合物を、神経細胞の毒性または調節に関して選別できる。例えば、化合物をＧＡＢＡ作動性ニューロンなどの分化神経細胞の集団に加え、該細胞の生存率、形態、表現型、機能活性、または他の特性を、同様な条件下で培養し、該化合物には曝露しなかった分化神経細胞と比較することによって、該化合物を評価できる。例えば、該化合物が、神経伝達物質の合成、放出、または細胞による取り込みにおける変化をもたらすかどうかを決定するために、該化合物を選別できる。
【００２９】
本開示の他の実施形態は、
（ａ）成体の海馬細胞を単離する工程；
（ｂ）該海馬細胞を分離し培養して、海馬細胞培養物を生成させる工程；および
（ｃ）海馬細胞培養物で神経細胞を培養する工程
を含んでなる、神経細胞に関するインビトロ移植モデルを生成させる方法であって、該方法において、海馬細胞培養物での神経細胞の生存率が評価される。他の実施形態において、神経細胞と海馬細胞培養物との間のシナプス形成が評価される。本開示の一実施形態において、成体海馬細胞はマウスから単離される。一定の実施形態において、海馬細胞培養物で培養された神経細胞は、例えば、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、またはグルタミン酸作動性のニューロンである。他の実施形態において、希突起膠細胞および星状細胞などのグリア細胞が、海馬細胞培養物で培養される。海馬細胞培養物で培養された神経細胞またはグリア細胞は、本明細書に開示された方法を用いて、誘導できるか、または当業者に周知の他の方法により、誘導または単離できる。好ましくは、海馬細胞培養物で培養した神経細胞の少なくとも約５０％、より好ましくは、約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％が、少なくとも１週間生存する。好ましい一実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの約９０％超が、培養１週間後、生存できる。
【００３０】
（図面のいくつかの図の簡単な説明）
以下の図面は、本明細書の一部を形成しており、本開示の一定の態様をさらに示すために含まれており、これらの図面の１つ以上を、本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と合わせて参照することにより、本開示の発明をより十分に理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（本発明の詳細な説明）
本開示は、多能性幹細胞から分化する神経系細胞の効率的な生成法を提供する。本明細書で生成される細胞としては、限定はしないが、神経始原細胞、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、およびグルタミン酸作動性のニューロン、ならびに希突起膠細胞および星状細胞などのグリア細胞の表現型特性を有する細胞が挙げられる。本明細書で生成される細胞は、表現型特性、形態学的特性、および／またはこのような細胞を評価する当業者に容易に理解される細胞マーカーによって同定される。本明細書で用いられる用語の「神経前駆細胞」は、神経の、またはニューロンの前駆細胞、ならびに、神経の、またはニューロンの前駆体細胞、という用語と交換可能であり、神経細胞の前駆体、神経細胞、またはニューロンなどの神経細胞か、またはグリア前駆体、星状細胞、または希突起膠細胞などのグリア細胞である後代を生成できる細胞を言う。本明細書に開示された方法は、細胞を神経系の細胞に分化させることを促進する可溶性因子および環境条件と組み合わせて、細胞を培養することを含む。本明細書に開示された方法は、多能性幹細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンを誘導するために用いることが好ましい。
【００３２】
これらの前駆体および分化神経細胞は、治療的適用および実験的適用、ならびに、インビトロの薬物開発、および神経細胞毒性または神経細胞の機能を調節する能力に関する化合物のスクリーニングなどのスクリーニングなど、多数の適用に用いることができる。多能性幹細胞から、前駆体、およびＧＡＢＡ作動性ニューロンなどの分化神経細胞、ならびに他の特殊化神経細胞タイプを生成させることは、これらニューロンを無制限に供給する可能性を提供し、限定はしないが、脳卒中、虚血、ハンチントン舞踏病、癲癇、慢性痛、不安、および他の気分障害などの衰弱性神経変性障害および神経疾患に罹っている個体に莫大な利益を提供する可能性がある。本明細書に記載された前駆体細胞および分化神経細胞は、典型的には、それらが誘導された細胞集団の後代であり、したがって、遺伝子を変化、転換、または移入された親集団などの親集団と同じゲノムを、本質的に有することになる。
【００３３】
本開示の好ましい実施形態は、多能性幹細胞、好ましくは、哺乳動物の胚性幹（ＥＳ）細胞または哺乳動物の胚芽（ＥＧ）細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンを生成させる改善法に関する。特に好ましい実施形態において、哺乳動物のＥＳまたはＥＧ細胞は、マウスまたはヒトのＥＳまたはＥＧ細胞である。これらのニューロンは、多能性幹細胞から、一定の可溶性因子および環境条件下で該細胞を培養することにより、誘導される。
【００３４】
本明細書に用いられる用語の「ＧＡＢＡ作動性ニューロン」とは、神経伝達物質、ＧＡＢＡを発現、産生、または分泌する神経細胞を言う。ＧＡＢＡ作動性ニューロンの終末分化は、ＧＡＢＡ合成、ならびにベシクルパッケージングおよび放出に必要な遺伝子の活性化および調節を含むことが好ましい。他の好ましい実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体の双方を発現する。ＧＡＢＡは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の化学ファミリーに属し、ＧＡＤは、ＧＡＢＡ合成における主要酵素である。哺乳動物種は、ＧＡＤ１およびＧＡＤ２と称されるＧＡＤの２種の異性体を発現し、それらは、種々の脳領域において、種々の濃度で発現する。ＧＡＤ１およびＧＡＤ２は、それぞれ、それらのｋＤａにおける相対的分子量を示すＧＡＤ６７およびＧＡＤ６５としても知られている。ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７は、ＧＡＢＡを合成する酵素であるため、双方ともＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定するマーカーとして用いることができる。また、ベシクル抑制アミノ酸トランスポーター（ＶＩＡＡＴ）は、ＧＡＢＡのシナプスパッケージングに必要であり、やはり、ＧＡＢＡ作動性ニューロンを同定するマーカーである。いくつかの形態の脳卒中、虚血、ハンチントン舞踏病、癲癇、慢性痛、不安、および他の気分障害などのいくつかの神経変性障害または神経疾患の病因は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの損失、またはＧＡＢＡ作動性神経伝達の低下に関係していると思われる。
【００３５】
本開示は、多能性幹細胞を、神経前駆細胞、ならびに、神経系の細胞に類似した表現型、分子特性、および／または細胞特性を有する神経細胞の分化集団へと分化させる改善された方法に関する。好ましい実施形態において、多能性幹細胞は、特定の培養条件を用いて神経細胞、好ましくはＧＡＢＡ作動性ニューロンへと分化させるマウスまたはヒトのＥＳ細胞である。また本開示は、開示された本法により作成される細胞または細胞集団に関する。一定の実施形態において、開示された本法は、以下の工程を含んでなる：
１．多能性幹細胞の集団を単離する；多能性幹細胞は、マウスまたはヒトのＥＳ細胞であることが好ましい。
【００３６】
２．多能性幹細胞を展開させて十分な出発材料を提供する。
【００３７】
３．多能性幹細胞を懸濁液中培養して、胚葉体を生成させる。
【００３８】
４．胚葉体を基質に再びまいて、神経前駆細胞に関して選択する無血清培地中で培養する。
【００３９】
５．神経系に関連する可溶性因子を含んでなる展開培地中で、神経前駆細胞を展開させる。
【００４０】
６．好ましくは、神経系に関連する可溶性因子、ならびにシトシンβ−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）の組み合わせを含んでなる分化培地中、神経前駆細胞を成熟ニューロンへと分化させる。
【００４１】
（多能性幹細胞源）
多能性幹細胞から神経系の細胞を分化させるための本明細書に開示された方法は、著しく高比率の多能性幹細胞の、特定の神経細胞タイプへの分化を方向づける特定の培養条件の使用を含む。多能性幹細胞は、受精後、任意の時期に、前胚芽、胚芽、または胎児の組織から誘導し、それらを、適切な条件下、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）全ての誘導体である数種の異なった細胞タイプへと分化することができる。神経系の細胞はまた、神経系の細胞へと分化するか、または再プログラム化される能力を有する胎児または成体の組織から単離された幹細胞から誘導することもできる。多能性幹細胞としては、限定はしないが、哺乳動物のＥＳ細胞およびＥＧ細胞、好ましくは、マウスのＥＳ細胞およびＥＧ細胞、または霊長類またはヒトのＥＳ細胞およびＥＧ細胞が挙げられる。未分化多能性幹細胞は、培養液中で、無期限に分割し増殖する能力を有することが好ましい。本明細書に用いられている用語の「分化」とは、未分化多能性幹細胞または前駆体細胞が、より特殊化した運命を獲得する過程を言う。例えば、分化細胞は、特定の細胞タイプまたは組織に特徴的な表現型を有する。
【００４２】
好ましい一実施形態において、本明細書に用いられるＥＳ細胞およびＥＳ細胞系は、胚盤胞の内部細胞塊から誘導される。これらの胚盤胞は、回収されたインビボ受精の移植前胚から、またはインビトロ受精（ＩＶＦ）から、例えば、通例の授精、細胞質内精子注入、または卵細胞質移入により受精させた胚から単離できる。ヒト胚盤胞は、自発的に自分たちの余分な胚を提供する夫婦またはドナーから得られる。これらの胚は、これらの夫婦またはドナーから、自発的な同意文書を得た後に、研究目的で用いられる。あるいは、胚盤胞は、体細胞または体細胞核を、ヒトまたは非ヒト源の除核卵母細胞へ移入し、次いでそれを胚盤胞期まで発生させるように刺激することによって誘導できる。また、使用される胚盤胞は、凍結保存していてもよいし、または早期に凍結保存し、発生を続けさせて胚盤胞期の胚にした胚から生じるものでもよい。胚盤胞および内部細胞塊双方の発生は、種によって異なり、当業者に周知である。
【００４３】
マウスＥＳ細胞は、標準的な免疫手術法などの、当業者に周知の技法を用いて、胚盤胞などの移植前の胚からインビトロで誘導できる。（各々参照として本明細書に組み込まれているＥｖａｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１５４−１５９頁、１９８１年；Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：７６３４−７６３８頁、１９８１年）。マウスＥＧ細胞は、やはり当業者に周知の方法を用いて、胎児生殖細胞から誘導できる（参照として本明細書に組み込まれているＭａｔｓｕｉら、Ｃｅｌｌ  ７０：８４１−８４７頁、１９９２年）。マウスＥＳ細胞を未分化状態に維持するため、該細胞は線維芽細胞フィーダー層における白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下で培養することが好ましい（参照として本明細書に組み込まれているＷｉｌｌｉａｍｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：６８４−６８７頁、１９８８年）。
【００４４】
霊長類またはヒトのＥＳ細胞は、各々具体的には参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，８４３，７８０号および第６，２００，８０６号、Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５−１１４７頁、１９９８年）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：３９９−４０３頁、２０００年）に開示されている標準的な免疫手術法を用いて、胚盤胞から誘導できる。当業者に公知の任意の数の方法で誘導されたＥＳ細胞が、開示された本法において使用できるが、好ましい実施形態では、レーザーアブレーションによって誘導されたヒトＥＳ細胞が使用される（具体的には参照として本明細書に組み込まれている米国特許出願第１０／２２６，７１１号）。簡略に言うと、この方法は、内部細胞塊の細胞が吸引される胚盤胞の開口または孔を形成する胚盤胞の透明層部分および栄養外胚葉のレーザーアブレーションにより、胚盤胞の内部細胞塊から細胞を単離する。次いで、これらの細胞をさらに培養して、ＥＳ細胞系を確立することができる。この方法は、従来の厄介な免疫手術操作を受けることなく、内部細胞塊の細胞を単離できるため、有利である。さらに、この方法を用いて生成されたＥＳ細胞系、特にヒトＥＳ細胞系は、動物の生成抗体および血清の不在下で単離でき、動物病原菌がＥＳ細胞系に伝染する危険性が最小化される。他の実施形態において、ヒト胎児材料に存在する原始胚細胞から誘導されるヒトＥＧ細胞が用いられる。（各々具体的には参照として本明細書に組み込まれている米国特許第６，０９０，６２２号およびＳｈａｍｂｌｏｔｔら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９５：１３７２６−１３７３１頁）。
【００４５】
ＥＳ細胞系は、好ましくは長期間、例えば、１年以上、未分化状態で培養物中に維持でき、通常の正倍数性の核型を維持できる。ヒトＥＳ細胞は、核対細胞質の比率の高さ、顕著な核小体、および緻密なコロニー形成により形態学的に同定でき、明確な境界およびマウスＥＳ細胞よりしばしば平たいコロニーを有する。また、ヒトＥＳ細胞は、ヒト多能性ＥＳ細胞のマーカー、例えば、各々具体的には参照として本明細書に組み込まれているＴｈｏｍｓｏｎら（１９９８）、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（２０００）、ＢｕｅｈｒおよびＭｃｌａｒｅｎ（１９９３）により記載されているＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原、およびＴＲＡ  １−６０と免疫反応性であることが好ましい。また、ヒトＥＳ細胞は、アルカリホスファターゼ、ならびにＯＣＴ−４を発現することが好ましい。他の実施形態において、ＥＳ細胞は、非接着性の培養条件下で、胚葉体を形成することができる（各々参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，９１４，２６８号および６，６０２，７１１号）。これらの胚葉体は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉の分化誘導体、ならびに他の所望の細胞系を誘導するために使用できる。
【００４６】
多能性幹細胞、特に、ＥＳまたはＥＧ細胞は、該細胞を、実質的に未分化状態に維持する培養条件下で、連続的に増殖させることができる。ＥＳ細胞は、それらの分化を防ぐために培養培地を頻繁に交換しながら、適切な細胞濃度に保ち、繰り返し分離し、継代培養しなければならない。細胞培養およびＥＳ細胞の培養に関連する一般的な技法に関して、実践者は、標準的な教科書およびレビュー、例えば：各々が参照として本明細書に組み込まれている、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、「Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」編、ＩＲＬ  ＰｒｅｓｓＬｔｄ．、１９８７年；ＨｕおよびＡｕｎｉｎｓ、１９９７年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（２）：１４８−５３頁；Ｋｉｔａｎｏ、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７３−１０６頁；Ｓｐｉｅｒ、１９９１年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３７５−７９頁；ＢｉｒｃｈおよびＡｒａｔｈｏｏｎ、１９９０年、Ｂｉｏｐｒｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：２５１−７０頁；Ｘｕら、２００１年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９（１０）：９７１−４頁；およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．７  Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ８３−９３頁を参照できる。
【００４７】
伝統的に、ＥＳ細胞は、フィーダー細胞層において、ＥＳ培地中、培養される。フィーダー細胞層は、ＥＳ細胞と共培養され、ＥＳ細胞が、実質的な分化を受けずに増殖できる環境を提供する１つの組織タイプの細胞である。フィーダー層においてＥＳ細胞を培養する方法は、当業者に周知である（参照として、各々具体的には本明細書に組み込まれている米国特許第５，８４３，７８０号、および６，２００，８０６号、国際公開第９９／２０７４１、米国特許出願第０９／５３０，３４６号、および０９／８４９，０２２号、国際公開第０１／５１６１６号）。フィーダー層は、ＥＳ細胞の分化を減少、抑制、または防止することが好ましい。フィーダー層は、典型的には、ヒトまたはマウス源、例えばマウス胚線維芽細胞、ヒト胚線維芽細胞、ヒト線維芽細胞様細胞、またはヒト胚性幹細胞から誘導された間充織細胞、またはＳＴＯ細胞、の胚線維芽細胞フィーダー層である。
【００４８】
ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞の分化を減少、抑制、または防止するＥＳ培地の存在下で培養することが好ましい。ＥＳ細胞の培養に用いられるＥＳ培地は、栄養血清、例えば、ＥＳ細胞の増殖および生存を維持するために効果的な栄養素を供給する血清または血清ベースの溶液で補足されていることが好ましい。該栄養血清は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）または子ウシ胎児血清（ＦＣＳ）などの動物血清であってもよい（参照として本明細書に組み込まれている米国特許第５，４５３，３５７号、第５，６７０，３７２号、および第５，６９０，２９６号）。本明細書において用いられる場合、ＦＣＳの代わりにＦＢＳを用いてもよいし、また、その逆でもよい。ＥＳ培地は、無血清でもよい（具体的には参照として本明細書に組み込まれている国際公開第９８／３０６７９号、国際公開第０１／６６６９７号、米国特許出願第０９／５２２，０３０号）。ＥＳ細胞培養用の血清を有する好適なＥＳ培地の一例は、ピルビン酸ナトリウムを有さず、高含量のグルコース（７０〜９０％）（ＧＩＢＣＯ）を有し、ＦＢＳまたはＦＣＳ（１０〜３０％）、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１％）、およびＬ−グルタミン２ｍＭ，４ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、および５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補足したダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。該ＥＳ培地は、１０００Ｕ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含んでもよい。ＥＳ細胞培養用の好適な無血清培地の一例は、８０％の「ノックアウト」ダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＧＩＢＣＯ）、２０％のＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＳＲ（無血清代替品、ＧＩＢＣＯ）、β−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、非必須アミノ酸（１％）、およびＬ−グルタミン１ｍＭである。
【００４９】
ＥＳ細胞はまた、フィーダー無しの培養条件下で培養してもよい。フィーダー無しの培養物でＥＳ細胞を培養する方法は、当業者に周知である（参照として、各々具体的には本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００２／００２２２６８号、国際公開第０３／０２０９２０号、米国特許出願第１０／２３５，０９４号）。フィーダー無しの培養物中のＥＳ細胞は、好適な培養基質、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）またはラミニンなどの細胞外マトリックスにおいて増殖させることが好ましい。また、フィーダー無しの培養液では、ＥＳ細胞の増殖を支持するために、馴化培地を使用することが好ましい。馴化培地は、ある培地中で、マウス胚線維芽細胞またはヒト胚線維芽細胞の最初の集団を十分な期間培養して、実質的な分化無しに、ＥＳ細胞の培養を支持する「馴化」培地を作製することによって調製される。あるいは、フィーダー無しの培養物では、他の細胞タイプによって馴化せずに、細胞外マトリックスと、培養物に新鮮に添加される効果的な培地とを組み合わせることができる（具体的には参照として本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２００３／００１７５８９号）。
【００５０】
（神経前駆細胞の調製）
単離された多能性幹細胞を展開してから、それらを神経前駆細胞へと分化させる培養条件に供する。多能性幹細胞を神経分化経路に沿って進行させるために、本明細書に開示された分化プロトコルにしたがって、該細胞を培養する。可溶性因子および成長因子などの分化剤を含有する分化栄養培地中、好適な基質上で、多能性幹細胞を培養する。好適な基質としては、限定はしないが、陽電荷で覆った固体表面、例えば、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリオルニチン、細胞外マトリックス成分によってコーティングした基質、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ＰＤＧＦ，ＥＧＦ，コラーゲンＶ，ヒト羊膜、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい分化栄養培地は、所望の神経細胞タイプの増殖、分化、および生存を支持し、また、１種以上の好適な分化剤を含み得るものである。本明細書に用いられる用語の「成長因子」とは、細胞表面の受容体に結合して、細胞の増殖および分化の活性化を主にもたらす蛋白質を言う。好適な可溶性因子としては、限定はしないが、ニューロトロフィン類、マイトジェン類、幹細胞因子、成長因子、分化因子（例えば、ＴＧＦ−βスーパーファミリー）、ＴＧＦ−βスーパーファミリーアゴニスト、神経栄養因子、抗酸化剤、神経伝達物質および生存因子が挙げられる。多くの可溶性因子は、かなり可変性であり、種々の多数の細胞タイプにおける細胞分裂を刺激するが、他のものは、特定の細胞タイプに特異的である。
【００５１】
神経細胞タイプの分化を特異的に促進する好適な分化剤としては、限定はしないが、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、ニュールツリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ），音波ヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ），フォリスタチン（ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ），上皮成長因子（ＥＧＦ）、任意のタイプの線維芽細胞成長因子、シトシン−ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ）、成長および分化因子５（ＧＤＦ−５）、ニューロトロフィンファミリーのメンバー（神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン４（ＮＴ−４）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子β−３（ＴＧＦ−β−３）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）、骨形成蛋白質（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４）、グリア細胞誘導神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ミッドカイン、アスコルビン酸、ジブチリルｃＡＭＰ、ドーパミン、およびｇｐ１３０と錯体化する受容体に対するリガンド（例えば、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＳＣＦ、ＩＬ−１１、およびＩＬ−６）が挙げられる。本明細書に用いられている用語の「線維芽細胞成長因子」または「ＦＧＦ」とは、このような因子、およびそれらの機能的断片を発現する任意の生物から誘導した任意の好適な線維芽細胞成長因子を言う。種々のＦＧＦが当業者に知られており、限定はしないが、ＦＧＦ−１（酸性線維芽細胞成長因子）、ＦＧＦ−２（塩基性線維芽細胞成長因子）、ＦＧＦ−３（ｉｎｔ−２），ＦＧＦ−４（ｈｓｔ／Ｋ−ＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、およびＦＧＦ−９が挙げられる。分化栄養培地はまた、神経細胞の培養液の維持を助ける添加物、例えば、Ｎ２およびＢ２７補充物（Ｇｉｂｃｏ）を含有できる。分化剤の、レチノイン酸、１３−シスレチノイン酸、およびトランス−レチノイン酸は、本明細書に開示されたいずれの方法においても使用しないことが好ましい。
【００５２】
多能性幹細胞分化の第１の工程は、胚葉体を形成するように細胞を誘導することを含む。フィブロネクチンまたはラミニンなどの細胞外マトリックス成分を有する、または有さない好適な基質上に胚葉体を直接まき、ネスチン陽性神経前駆細胞などの神経前駆細胞への分化を促進させるように適合させた好適な分化培養培地中で培養する。ネスチンは、神経前駆体細胞に特徴的な細胞マーカーである。他の実施形態において、多能性幹細胞を、胚葉体を形成することにより、例えば、多能性幹細胞を、懸濁物中で培養することにより、先ず、異種細胞集団へと凝集させる。これらの細胞を、血清を有する、または有さない、また、上記の１種以上の分化剤を有する栄養培地中で培養し、胚葉体における細胞の分化を促進することができる。多能性幹細胞は、ＬＩＦを有さないＥＳ細胞培地で培養することが好ましい。
【００５３】
本明細書に用いられている用語の「胚葉体」とは、多能性幹細胞を、懸濁培養物中で増殖させる際に、または単層培養において過成長する際に生成する分化細胞の凝集物を言う。胚葉体はまた、細胞の凝集物中に、未分化細胞も有し得る。この細胞凝集物は、原始内胚葉によって包囲されていることが好ましい。胚葉体は、典型的に、３つの胚葉、内胚葉、中胚葉、外胚葉、の全てから誘導された細胞を含有する。ヒト成熟胚葉体において、神経細胞、造血細胞、肝細胞、および心筋細胞などの種々の細胞タイプのマーカーを有する細胞を識別することが可能である。成熟胚葉体におけるいくつかの細胞は、機能的に分化細胞のように挙動し得る。例えば、活性心筋細胞は、胚葉体を拍動させることができる。治療目的で特定の細胞タイプを得ることができるように、多能性幹細胞の分化を制御することが好ましい。
【００５４】
胚葉体は、十分な大きさ、または所望の分化に達するまで、例えば、３〜１０日間、好ましくは４〜８日間の培養後、基質にまく。該基質は、限定はしないが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリオルニチン、ラミニン、コラーゲン，フィブロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）などの細胞外マトリックス成分、またはそれらの組み合わせによりコーティングされていることが好ましい。胚葉体は、該細胞を分散させずに、直接、基質にまくことが好ましい。次いで、まかれた細胞をニューロン細胞またはＣＮＳ前駆体細胞へとさらに分化させることを促進する条件下で、胚葉体を培養する。例えば、ネスチン陽性細胞に関して選択されるＩＴＳＦｎ培地などの無血清合成培地中で胚葉体を培養できる。あるいは、展開させた多能性幹細胞を、基質に直接まき、ネスチン陽性細胞を選択するための無血清合成培地中で培養できる。ネスチンは、神経上皮に発現する中間径フィラメント蛋白質である。
【００５５】
胚葉体の展開に用いられる無血清合成培地は、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、フィブロネクチン、ＦＧＦ、ＳＨＨ，ＥＧＦ，およびＢＤＮＦからなる群より選択される１種以上の成長因子を追加したＤＭＥＭ：Ｆ−１２であることが好ましい。該無血清合成培地は、インスリン、セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、フィブロネクチンの栄養物を追加したＩＴＳＦｎ培地であることがより好ましい。一般的に、該細胞は、これらの条件下、５〜１６日の期間、より好ましくは、７日間増殖させる。好ましい実施形態において、上記の無血清合成培地を用いた選択により、生存ネスチン陽性細胞の集団は、約４０〜７０％へ、より好ましくは、約８０〜９０％へ、最も好ましくは、約９５〜９９％へ濃縮される。
【００５６】
次に、生成したニューロン細胞またはＣＮＳ前駆体細胞を、ＣＮＳ展開培地中で展開させる。本明細書に用いられている用語の「展開させる」または「展開」とは、細胞の増殖または分裂により、細胞の数または量を増加させる工程を言う。用語の「増殖させる」は、「展開させる」または「展開」と交換可能に使用できる。好ましくは、ＣＮＳ展開培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などの最少必須培地を含んでなり、神経細胞培養物の維持を助ける添加物、例えば、Ｎ２およびＢ２７補充物により補足される。ＣＮＳ展開培地はまた、ＣＮＳ前駆体細胞の増殖を促進し、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの生成効率を増加させる１種以上の神経誘導因子、例えば、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ならびに、インビボ胚形成時のＧＡＢＡ作動性ニューロンの運命を制御する他の因子を含むことが好ましい。ニューロン細胞またはＣＮＳ前駆体細胞は、ＣＮＳ展開培地中、４〜１０日間増殖させることが好ましい。また、該細胞は、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、コラーゲン，フィブロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、またはそれらの組み合わせによってコーティングした表面などの、ニューロン細胞またはＣＮＳ前駆体細胞の接着を可能にする表面にまかれることが好ましい。
【００５７】
一実施形態において、胚葉体は、マウスＥＳ細胞マウスＥＳ細胞から、該細胞を、適切な培地中、フィーダー細胞の不在下、細菌用プレート上で培養することによって生成させる。好ましくはマウスＥＳ細胞を先ず、例えば、トリプシンへの曝露により分離し、続いて該細胞をかき取り、小クラスターへ細分化する。次いで、これらの小クラスターを、細胞の付着を防ぎ、それによって、分化および胚葉体の形成を促進する非接着表面を好ましくは有する細菌用の皿へ、適切な密度でまく。該細胞を、適切な培地、例えば、好ましくは、高グルコースを有するＤＭＥＭ、または１０〜２０％のＦＣＳ、ＦＢＳで補足したノックアウトＤＭＥＭ、またはノックアウト血清代替物、ならびに、β−メルカプトエタノール、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、および抗生物質を含有するＥＳ培地中で培養する。培地は、少なくとも１日おきに交換し、胚葉体を好ましくは、約４〜８日間増殖させる。
【００５８】
他の実施形態において、胚葉体は、ヒトＥＳ細胞から、該細胞を、適切な培地中、フィーダー細胞の不在下、細菌用プレート上で培養することによって生成させる。好ましくはヒトＥＳ細胞を、クラスターへと分離してから、胚葉体の発生を促進する非接着性プレートにまく。適切な培地は、好ましくは、高グルコースを有するＤＭＥＭを含有し、１０〜２０％のＦＣＳで補足される。０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、および５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンなどの他の添加物を加えてもよい。
【００５９】
胚葉体を単離後、神経前駆細胞およびＣＮＳ前駆体細胞、好ましくは、ネスチン陽性細胞の選択のため、無血清培地中、０．１％から０．２％のゼラチンでコーティングされた培養プレートに胚葉体を再びまく。無血清培地は、成長因子類を追加したＤＭＥＭ：Ｆ−１２などの基本培地であることが好ましい。ネスチン陽性細胞に関して選択する培地であるＩＴＳＦｎ培地は、成長因子のインスリン、亜セレン酸ナトリウム、トランスフェリン、フィブロネクチンで補足された基本培地、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）またはＩＭＤＭ培地を含有する。
【００６０】
次に、好ましくは、これらの神経前駆細胞またはＣＮＳ前駆体細胞、好ましくは、ネスチン陽性細胞を、ニューロン前駆体、好ましくは、ＧＡＢＡ作動性ニューロン前駆体に関して選択する神経誘導成長因子を含有するＣＮＳ展開培地中で培養する。ＣＮＳ展開培地の一例は、Ｎ２，Ｂ２７，およびｂＦＧＦで補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を含有する。神経前駆細胞またはＣＮＳ前駆体細胞はまた、細胞外マトリックス、例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、ラミニン、コラーゲン，またはそれらの組み合わせによってプリコートされた他の培養皿にも再びまく。特定の機構に拘束されることは望まないが、ＣＮＳ展開培地に存在するこれらの種々の因子は、ニューロン細胞パーセンテージの全体的増加に寄与し、さらに、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表現型の分化を誘導すると考えられる。好ましい実施形態において、ネスチン陽性前駆体細胞をＣＮＳ展開培地中、５〜８日間、増殖させる。
【００６１】
（ＧＡＢＡ作動性ニューロンの分化）
本明細書に開示した方法によって調製された神経前駆細胞は、高比率の成熟ニューロン、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ならびにドーパミン作動性、セロトニン作動性、およびグルタミン酸作動性のニューロンへとさらに分化させることができる。また、神経前駆細胞は、希突起膠細胞または星状細胞などのグリア細胞へとさらに分化させることができる。神経前駆細胞またはＣＮＳ前駆体細胞の終末分化は、該細胞を、本明細書に開示された分化プロトコルにしたがって培養することによって達成される。
【００６２】
ネスチン陽性神経前駆細胞またはＣＮＳ細胞は、神経前駆細胞またはＣＮＳ細胞の、終末分化神経細胞または成熟ニューロンへの分化を促進する分化培地中、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、または２０日、展開させることが好ましい。また、神経前駆細胞またはＣＮＳ細胞の分化、増殖、または双方を促進させたβ−ＦＧＦなどの因子の一部または全てを取り除くことにより、分化を促進できる。例えば、展開した神経前駆細胞またはＣＮＳ細胞は、β−ＦＧＦを有するまたは有さない、ＦＣＳ、Ｎ２、Ｂ２７、またはそれらの組み合わせを追加したＤＭＥＭ：Ｆ−１２培地または神経基本Ａ培地を含有する分化培地中で、該細胞を培養することによって分化させることができる。分化培地はまた、終末分化またはＧＡＢＡ作動性ニューロンの収率を高めるために、多数の添加因子、例えば、Ａｒａ−Ｃも含有できる。好ましい一実施形態において、神経前駆細胞またはＣＮＳ細胞を、Ａｒａ−Ｃを含有する分化培地で１日以上培養してから、Ａｒａ−Ｃ無しの培地で、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、または２０日間培養する。他の好ましい実施形態において、神経前駆細胞またはＣＮＳ細胞を、Ｎ２およびＢ２７を追加したＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を含有する分化培地で１日間培養し；次いで、５％のＦＢＳ、Ｂ２７、およびＡｒａ−Ｃを追加したＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を含有する分化培地で２日間培養し；最後に、Ａｒａ−Ｃ無しの同じ培地で、２〜１６日間、好ましくは１２日間培養する。
【００６３】
好ましくは、高パーセンテージの神経前駆細胞、例えば、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の該細胞が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化する。好ましい一実施形態において、本明細書に開示された方法にしたがって展開させ、分化させた多能性幹細胞は、高パーセンテージ（少なくとも約６０％）のＧＡＢＡ作動性ニューロンを生じる。また、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、免疫標識、および蛍光選別、例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、などの当業者に周知の方法により、分化神経細胞集団からさらに精製できる。本明細書で誘導される他の分化神経細胞、例えば、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、およびグルタミン酸作動性のニューロン、ならびに、希突起膠細胞および星状細胞も同様な方法を用いて単離できる。
【００６４】
（神経前駆細胞および分化神経細胞の利用）
本明細書に記載された神経前駆細胞および分化神経細胞（例えば、ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンならびに希突起膠細胞および星状細胞）は、治療適用などの種々の適用のため、ならびにこれらの細胞に及ぼす作用に関する小型分子薬剤などの種々の化合物のインビトロおよびインビボ評価およびスクリーニングのために利用できる。これらの細胞はまた、当業者に周知である技法を用いて、これらの細胞の発現パターンを分析するｃＤＮＡ発現ライブラリを作成するために、ならびに用いられる特定の細胞に関するマーカーに特異的であるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を調製するために使用することができる。これらの細胞はまた、衰弱性の神経変性障害およびニューロン疾患を患っている個体のために治療的に使用することができる。
【００６５】
本開示は、中枢神経系（ＣＮＳ）または脊髄においてニューロンまたはグリア細胞が損傷しているか、または死滅している種々の神経変性障害およびニューロン疾患を治療または予防するために、本明細書に記載されている神経前駆細胞および分化神経細胞の使用を提供する。このような治療を必要とする対象は、このような細胞の治療的有効量により治療され、ＣＮＳまたは末梢神経系（ＰＮＳ）における機能を回復させるであろう。本明細書に用いられる細胞の「治療的有効量」とは、成熟ニューロン（ＧＡＢＡ作動性、ドーパミン作動性、およびセロトニン作動性ニューロン）、星状細胞、および希突起膠細胞などの神経細胞の欠損、損傷、または変性により引き起こされる対象における生理学的作用を阻止または寛解させるのに十分な量である。例えば、これらの細胞は、治療を受ける疾患または病態に依って、ＣＮＳの柔組織またはくも膜下部位に直接移植することにより治療的に利用できるであろう。
【００６６】
これらの細胞は、神経系に対する急性または慢性損傷、ならびにＣＮＳおよびＰＮｓなど神経系の障害または疾患を含む衰弱性の神経変性障害およびニューロン疾患を治療するのに使用できる。神経変性障害およびニューロン疾患としては、限定はしないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レービー体認知症、多発性硬化症、小脳性運動失調症、進行性核上麻痺、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、脳卒中、虚血、神経系に対する傷害または外傷が挙げられる。ある一定の神経学的障害、例えば、限定はしないが、不安障害、気分障害、耽溺、強迫症（ＯＣＤ）、人格障害、注意不足障害（ＡＤＤ）、注意不足機能亢進障害（ＡＤＨＤ）、および精神分裂症などの認知および心理状態に関連する障害もまた、多能性細胞から誘導される分化神経細胞により治療できる。
【００６７】
本開示の一実施形態は、多能性幹細胞、好ましくはマウスまたはヒト多能性幹細胞から誘導されるＧＡＢＡ作動性ニューロンの治療的有効量の投与によって、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの変性または破壊を特徴とする神経変性障害およびニューロン疾患を治療または予防する方法に関する。神経変性障害および神経疾患を患っているヒト患者は、本開示の神経前駆細胞および分化神経細胞の治療的有効量を患者に移植することによって治療を受けることが好ましい。患者が脳虚血または脳卒中を患っている場合、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの治療的有効量の投与により、記憶喪失、認知障害、または運動障害などの脳虚血または脳卒中と関連する症状の量または重症度の低減を生じることが好ましい。
【００６８】
使用される細胞の治療的有効量は、対象の必要性、対象の年齢、生理学的状態および健康、所望の治療効果、療法の目標となる組織領域のサイズ、埋め込み部位、病変の程度（例えば、ニューロン変性のレベル）、選択された送達経路、および治療方針に依るであろう。例えば、脳の広い領域に影響を及ぼす障害の治療は、より狭い目標領域と比較した場合、治療効果を達成するためにより大量の細胞を必要とするであろう。細胞はまた、低細胞用量の複数の小型移植片により、所与の目標組織における１箇所以上の部位に投与できる。本開示の細胞は、単独細胞の懸濁物を創製するために投与前に完全に分離してもよいし、また細胞の小さな凝集体を創製するために投与前にほぼ完全に分離してもよい。該細胞を、目的の組織部位に移植または移動させて、機能的欠失領域を再構築または再生させる様式で投与できる。該細胞を、自家療法用に使用し、それによって、移植後の免疫拒絶問題を最少にするか、または除外し、意図されたレシピエントと組織適合性となることが好ましい。あるいは、該細胞を同種異系療法に用いられる。
【００６９】
療法効果を達成するために投与できる細胞の好適な範囲は、約１００個から約１，０００，０００個のニューロン、好ましくは約５００個から約５００，０００個のニューロン、または約１０００個のニューロンから約１００，０００個のニューロンであり得る。投与される細胞数は、治療的投与を生き残る数に大いに依存するであろう。対象に投与される神経細胞の治療濃度は、製薬的に許容できる担体１マイクロリットル当たり約１０、１００、５００、１０００、５０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、２５０，０００、３００，０００、３５０，０００、４００，０００、４５０，０００から約５００，０００個の細胞の範囲であり得る。担体中の細胞濃度の範囲としては、例えば、１００〜５０，０００個の細胞／μｌ、１０００〜１０，０００個の細胞／μｌ、５０００〜２５，０００個の細胞／μｌ、１５，０００〜４５，０００個の細胞／μｌ、２０，０００〜５０，０００個の細胞／μｌ、５５，０００〜２００，０００個の細胞／μｌ、１００，０００〜４０，０００個の細胞／μｌ、１５０，０００〜５０，０００個の細胞／μｌなどが挙げられる。移植部位に移植された細胞数はまた、治療有効性にも影響を及ぼすであろう。
【００７０】
治療適用に関しては、前駆体の集団または分化神経細胞は、未分化多能性幹細胞の混じらない実質的に純粋なものであることがしばしば好ましい。治療製剤から多能性幹細胞を除去するための一方法は、未分化細胞において優先的に発現し、その発現が、多能性幹細胞に対し選択する遺伝子を有するベクターにより細胞に形質移入することである。未分化細胞において優先的に発現する好適なプロモーターは、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）およびＯＣＴ−４プロモーターである。ベクターにおいて発現された遺伝子は、例えば、毒素のように細胞に対して溶解性であり得るか、または外部薬剤の適用により、細胞に対して選択され得る。
【００７１】
本明細書に開示されている多能性幹細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンならびにドーパミン作動性およびセロトニン作動性ニューロンを生成する能力は、種々の神経変性障害およびニューロン疾患の治療的予防または治療に対する臨床的関連性が大きい。例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、高速抑制性シナプス伝達、ニューロン興奮性における異常性、および発作閾値、不安、パニック、およびストレスに対する反応（すなわち、「闘争または逃走」反応）などの気分の急速変化、ならびに記憶、気分、または痛覚機能の異常性を特徴とする神経変性障害およびニューロン疾患を治療または予防するために使用できる。例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、パーキンソン病、アルツハイマー病、てんかん、レービー体認知症、多発性硬化症、小脳性運動失調症、進行性核上麻痺、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、およびハンチントン病、ならびに脳卒中、虚血、脳虚血、神経系に対する傷害または外傷、神経毒傷害などを治療または予防するために使用できる。ＧＡＢＡ作動性ニューロンはまた、限定はしないが、不安障害、気分障害、耽溺、強迫症（ＯＣＤ）、人格障害、注意不足障害（ＡＤＤ）、注意不足機能亢進障害（ＡＤＨＤ）、および精神分裂症などの認知および心理状態に関連する障害などのある一定の神経学的障害を治療または予防するために使用できる。
【００７２】
パーキンソン病は、中脳の黒質におけるドーパミン作動性産生細胞の進行性変性により引き起こされる運動障害である。ドーパミン作動性ニューロンを、パーキンソン病患者の黒質に移植する細胞ベース療法は、治療的に有効であることが判っているが、症状の除去は不完全である（Ｌｉｎｄｖａｌｌ，Ｏ．、１９９７年、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．８（１４）：ｉｉｉ−ｘ）。したがって、ドーパミン作動性ニューロン移植は、パーキンソン病を治療するのに十分ではないと考えられ、最近の知見では、パーキンソン病の神経病理学に関係する他の脳領域、すなわち、視床下核（ＳＴＮ）があることを示唆している（Ｂｅｒｇｍａｎら、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２１：３２−３８頁；Ｌｕｏら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：４２５−２９頁）。脳の視床下部領域は、グルタメート作動性ニューロンおよびＧＡＢＡ作動性ニューロンの双方を含有する（Ｎｉｓｈｉｎｏら、１９８８年、Ｊａｐａｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４８：３３１−３３９頁）。パーキンソン病患者において、ＳＴＮに位置するニューロンは、黒質のニューロンと共に変性している（Ｄｕｒｉｎｇら、２００１年、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２（１２）：１５８９−９１頁）。このように、グルタメート作動性およびＧＡＢＡ作動性ニューロンもまた、パーキンソン病患者において変性し得る（Ｌｕｏら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８（１１）：４２５−４２９頁）。
【００７３】
最近の知見では、ＧＡＢＡの生合成に重要である酵素、ＧＡＤの、パーキンソン病モデルのＳＴＮへの導入は、パーキンソン病に伴う運動異常性を軽減することを示唆している（Ｌｕｏら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：４２５−４２９頁）。したがって、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンをＳＴＮに投与するか、または移植することにより、ＧＡＢＡ作動性ニューロンもまた、パーキンソン病を治療するために有用であり得る。ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、単独で、または黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの投与または移植と関連させてあるいは併用して投与または移植できる。ＧＡＢＡ作動性ニューロンはまた、植物、植物ベースのエキス、または抗パーキンソン活性、抗神経変性活性、または神経保護活性を有する合成源から由来する薬物と併用してパーキンソン病を治療するために使用できる。
【００７４】
アルツハイマー病は、脳の基底核における主としてコリン作動性細胞の欠損に関係している。コリン作動性細胞の細胞内投与または移植は、アルツハイマー病の有効な療法であるが、他のニューロン細胞タイプもまた、アルツハイマー患者の脳、特に海馬において喪失していることから、この疾患の治療に不十分であると考えられる。例えば、アルツハイマー患者は甚大な記憶機能喪失を患うが、それは、大部分がＧＡＢＡ作動性ニューロンである海馬ニューロンの喪失に一部依っていると考えられる、（Ｓｅｉｄｌら、２００１年、Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６３：１３９−１４５頁）。さらに、ＧＡＢＡ含量の有意な喪失だ、アルツハイマー患者の側頭部皮質、後頭部皮質、および小脳に見られた（Ｓｅｉｄｌら、２００１年）。一実施形態において、アルツハイマー患者を治療するために、本明細書に記載されている多能性幹細胞から誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンを、脳の海馬皮質領域に単独で、またはコリン作動性ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンなどの他のニューロンと併用して投与または移植する。
【００７５】
限定はしないが、パーキンソン病およびアルツハイマー病、ならびに脳虚血および脳卒中など、種々の神経変性障害およびニューロン疾患に対して、細胞生存能力を改善することが絶対必要である。種々の因子が、ニューロンの変性および死滅に影響を及ぼす。好ましい実施形態において、ニューロン変性および死滅を誘導する因子、例えば、細胞外カルシウム、過剰のグルタメート放出、または酸素ラジカルの放出は、本明細書に記載されている神経前駆細胞または分化神経細胞、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロンが患者の脳に投与または移植される前にブロックされる。細胞投与または細胞移植の部位におけるこれらの因子をブロックまたはアンタゴナイズすることによって、細胞がより高いパーセンテージで前記操作を生き残ることができる。
【００７６】
他の実施形態において、本開示は、神経変性障害またはニューロン疾患を治療するための、１つ以上の神経生存因子と本開示の神経前駆細胞および分化神経細胞との共投与に関する。神経細胞生存因子（１つまたは複数）を、所望の細胞の投与前、投与と併用して、または投与後に投与してもよい。本明細書に用いられる「神経細胞生存因子」は、該因子と接触するニューロンに該因子の存在しない場合に生じる生存期間よりも長期間生存させる（インビトロまたはインビボ）物質である。本治療実施形態に使用できるニューロン生存因子としては、限定はしないが、ＧＡＢＡアゴニスト類（例えば、ベノジアゼピン類、バルプロ酸塩、およびフェノバルビタール）、カルシウムアンタゴニスト類、グルタメートアンタゴニスト類、抗酸化剤、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳由来栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４（ＮＴ−４）、ＦＧＦ、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β１）、植物由来薬物、植物ベースエキス、または抗パーキンソン活性、抗脳卒中活性、抗脳虚血活性、抗神経変性活性、または神経保護活性を有する合成源が挙げられる。
【００７７】
好ましい一実施形態において、ニューロン生存因子は、ニューロン細胞、好ましくはＧＡＢＡ作動性ニューロンと同時投与して、脳虚血または脳卒中を患っている対象を治療する。現在、ＧＡＢＡアゴニスト類（例えば、ベノジアゼピン類、バルプロ酸塩、およびフェノバルビタール）、カルシウムアンタゴニスト類、グルタメートアンタゴニスト類、抗酸化剤、および他の神経保護剤または薬剤が、脳虚血または脳卒中を治療するために用いられる化学薬剤である。これらの薬物は、脳卒中または虚血患者の神経学的障害に関連する症状を軽減するのに役立ち得るが、それらは、これらの障害を治療することはできない。脳卒中または虚血患者におけるそれらの重要な役割を考慮して、これらの薬剤または薬物は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの治療的投与前、投与中、または投与後に多能性細胞から誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンと併用して、脳卒中または虚血と関連する神経学的障害および疾患を治療するために使用することができる。
【００７８】
他の好ましい実施形態において、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）は、脳虚血または脳卒中を患っている対象を治療するために、ニューロン細胞、好ましくはＧＡＢＡ作動性ニューロンの治療的投与前、投与中、または投与後に共投与される。ｔ−ＰＡの組換え形態は、患者の脳虚血または脳卒中と関連する血餅または血液妨害物を除去するために用いられており、脳虚血または脳卒中に関して唯一のＦＤＡ承認療法である。脳卒中または脳虚血を患っている患者の予後は、特に、脳の損傷部位（１つまたは複数）に任意のタイプのニューロン細胞を投与する前に、損傷部位（１つまたは複数）、好ましくは海馬領域、皮質領域、および視床領域に対して出来るだけ早く血液を供給することにより改善される。これは、患者にｔ−ＰＡを投与することにより達成できるが、これは、血管ブロックの解除により宿主環境における投与ニューロンの生存を改善し、それによってニューロンに十分な酸素と栄養を提供する。
【００７９】
本明細書に用いられる用語の「治療するために」、「治療」、または「療法」とは、治療処置および予防手段または保護手段を称す。治療処置としては、限定はしないが、特定の疾患また障害の症状を軽減または除去すること、または既存の疾患また障害の進行の遅速化、または減衰、あるいは治癒させることが挙げられる。したがって、治療を必要とする対象としては、神経変性障害またはニューロン疾患と既に診断された対象、ならびに神経変性障害またはニューロン疾患を予防すべき対象が挙げられる。本開示の方法は、限定はしないが、ヒト、霊長類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラット、マウスなどの家庭用動物、家畜、ペットまたはスポーツ用動物が挙げられる。「障害」は、神経始原細胞、分化神経細胞、または本開示の方法によって誘導される任意のタイプの細胞による治療から利益を得ると思われる病態である。本開示の細胞、特にＧＡＢＡ作動性ニューロンによる治療から利益を得ると思われる障害または疾患の例としては、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、レービー体認知症、多発性硬化症、小脳性運動失調症、進行性核上麻痺、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、脳卒中、虚血など、ならびに限定はしないが、不安障害、強迫症（ＯＣＤ）、人格障害、注意不足障害（ＡＤＤ）、注意不足機能亢進障害（ＡＤＨＤ）、および精神分裂症などの認知および心理状態に関連する障害である。
【００８０】
本開示の方法は、病巣領域に対して本開示の神経前駆細胞または分化神経細胞を直接投与することにより有利に実施できる。神経細胞移植および細胞培養の方法は当業者に周知であり、例えば、米国特許第５，５１４，５５２号；ＹｕｒｅｋおよびＳｌａｄｅｋ、１９９０年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：４１５−４４０頁；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ、１９９８年、Ｎｅｕｒｏｎ２０：１６９−１７２頁；Ｖｅｓｃｏｖｉら、１９９９年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ  １６（８）：６８９−９３頁；Ｖｅｓｃｏｖｉら、１９９９年、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏ．１５６（１）：７１−８３頁；Ｂｒｕｓｔｌｅら、１９９９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７５４−５６頁にあり；各々は、具体的には参照として本明細書に組み込まれている。該細胞は、単独または他の因子、例えば神経細胞生存因子と併用して送達してもよく、製薬的に許容できる媒体と共に送達してもよい。このような媒体は、該細胞の安定性および送達性を増強することが理想的である。
【００８１】
本開示はまた、リポソーム類、微粒子、またはマイクロカプセルなどの好適な媒体を用いて投与できる細胞を含有する製薬組成物を提供する。本開示の細胞はまた、等張性賦形剤を含んでなる製薬組成物の形態で供給でき、ヒト投与用に十分に滅菌された条件下で調製できる。細胞組成物の医薬品製剤の一般原則は、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ  ＆  Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ編集、ケンブリッジ大学プレス、１９９６年、およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃＳｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｅ．Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ  ＆  Ｐ．Ｌａｗ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２０００年、に見られ、具体的には、参照として本明細書に組み込まれている。さらに、ニューロン生存因子を含有する製薬組成物を、治療の必要な領域に局所的に投与することが望ましいと思われ、例えば、術中の局所注入、注射、カテーテル手段、または移植手段により達成でき、このような移植は、シラスチック膜または繊維などの膜を含む多孔性、非多孔性、またはゼラチン様材料であり得る。
【００８２】
本開示の神経前駆細胞および分化神経細胞は、実質的に均一な細胞集団、ほぼ均一な細胞集団、または不均一細胞集団として対象に投与できる。実質的に均一な細胞集団は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンなど、単独細胞タイプの７５％超、より好ましくは９０％超、最も好ましくは９５％〜９９％超を含んでなる。不均一細胞集団は、単独細胞集団に混合された２種以上の細胞タイプ、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、セロトニン作動性ニューロン、シュワン細胞、希突起膠細胞、星状細胞、およびグリア細胞からなる。該細胞はまた、脳、中枢神経系、末梢神経系、または他の組織の損傷領域において栄養因子、成長因子、ニューロン生存因子、または他の治療化合物を発現または放出させるために当業者に周知の方法により遺伝子変更させることができる。蛋白質発現のためのプロモーターおよび細胞タイプの組合せの使用は、一般に分子生物学の当業技術者に公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、を参照されたく、具体的には、参照として本明細書に組み込まれている。
【００８３】
本開示の神経前駆細胞および分化神経細胞において栄養因子、成長因子、ニューロン生存因子、または他の治療化合物の発現を達成するために、好適な調節要素は、種々の起源から誘導でき、通常の当業者により容易に選択できる。調節要素の例としては、転写プロモーター、エンハンサー、およびＲＮＡポリメラーゼ結合配列、ならびに翻訳開始シグナルを含むリボソーム結合配列が挙げられる。選択可能なマーカーなどの他の追加の遺伝子要素もまた、組換え分子に導入できる。組換え分子は、インビボ送達媒体またはインビボ技法を用いて、多能性幹細胞、あるいは多能性幹細胞から誘導された神経前駆細胞または分化神経細胞に導入できる。送達技法の例としては、レトロウィルスベクター類、アデノウィルスベクター類、ＤＮＡウィルスベクター類、リポソーム類、ミクロ注入などの物理的技法、および電気穿孔またはリン酸カルシウム沈殿によるトランスフェクション、あるいは組換え細胞を創製する転写に関して当業界に公知の他の方法が挙げられる。遺伝子変更細胞を、ミクロスフェアに封入でき、また疾患または損傷組織に、またはそれに近接して移植できる。使用されるプロトコルは、当業者に周知であり、例えば、参照として本明細書に組み込まれている、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、に見ることができる。
【００８４】
本開示の細胞移植療法もまた、移植術に使用のため神経前駆細胞および分化細胞の貯蔵および保存の幾つかの手段、例えば、凍結保存による長期保存、保存媒体中での短期保存を組み込まれていることが好ましい。凍結保存の胚中脳組織は、７０日間まで首尾よく保存されており、げっ歯類（Ｃｏｌｌｉｅｒら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、７８巻、ニューヨーク、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８８）、６３１−３６頁、具体的には参照として本明細書に組み込まれている）および霊長類（Ｃｏｌｌｉｅｒら、１９８７年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４３６：３６３−６６頁、具体的には参照として本明細書に組み込まれている）における同種移植片として移植されている。また、胚中脳細胞は、凍結保存後首尾よく培養できることが立証されている。中脳組織はまた、保存媒体中、４℃で短期間（２〜５日）貯蔵でき、引き続き新鮮組織のものと同様な生存移植片容積で移植できる（Ｓａｕｅｒら、１９８９年、Ｒｅｓｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．（Ｓｕｐｐｌ．：３．ｓｕｐ．ｒｄ  Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｐｌａｎ．）：５６、具体的には参照として本明細書に組み込まれている）。同様な技法は、本開示の神経前駆細胞と分化細胞を貯蔵し、保存するために使用することができ、このような技法は、当業者に周知である。
【００８５】
本明細書に記載されている神経前駆細胞および分化神経細胞に関する他の使用は、製薬用化合物、溶媒、小型分子、ペプチド類、またはポリヌクレオチド類などの因子に関して、ならびにこれらの細胞の表現型または特徴に影響を及ぼす培養条件または操作などの環境因子に関してスクリーンすることである。例えば、植物、植物ベースエキス、または動物、ヒト、または合成源に存在する生物活性分子を、これらの細胞を用いてスクリーンでき、評価できる。さらに、これらの細胞を、成長因子または分化因子の候補を評価するために使用できる。例えば、候補製薬用化合物は、単独または他の薬物と併用して神経前駆細胞または成熟ニューロンに添加でき、形態、表現型における何らかの変化、または細胞における機能的活性を査定し、評価できる。他の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンは、ＣＮＳ、ＰＮＳ、または特定の組織または臓器中のＧＡＢＡ作動性ニューロンの受容体（例えば、アゴニスト類またはアンタゴニスト類）に影響を及ぼす因子に関してスクリーンするために使用される。ＧＡＢＡ作動性ニューロンはまた、神経ペプチド類、神経伝達物質、神経ホルモン類、またはＧＡＢＡのアゴニスト類および／またはアンタゴニスト類に関してスクリーンするために使用できる。ＧＡＢＡ作動性ニューロンはまた、生物活性分子の神経毒を試験するために使用できる。
【００８６】
さらに、本明細書に記載されている神経前駆細胞および分化神経細胞は、分化のいずれかの時期にさらに修飾できる。例えば、これらの細胞を、一過性あるいは安定な単独遺伝子修飾または複数遺伝子修飾を有するように遺伝子修飾できる。これらの細胞の遺伝子変更は、遺伝子療法のための修飾細胞または移植または埋め込みのための組織置換など多くの理由で望ましいと思われる。本開示の細胞は、当業者に周知である神経特異的プロモーターの制御下で選択的マーカーを発現するベクター類の導入により遺伝子修飾できる。これらの細胞はまた、多能性幹細胞から誘導される分化細胞をさらに精製するために、あるいは分化を特定の細胞系列に誘導するために使用できる一定のマーカーまたは遺伝子を発現させるために任意の時期に修飾できる。これらの細胞は、移植後の免疫拒絶反応を軽減または防止するために、すなわち、意図されたレシピエントとの組織適合性のために修飾できる。
【００８７】
本開示を用いて生成させた細胞の複製能力を増加させるために、これらの細胞を、テロメラーゼ触媒成分（ＴＥＲＴ）を発現するように、好適なベクターによって遺伝子的にそれらを変更させることによりテロメル化してもよい。用いられるＴＥＲＴ配列は、ヒトまたはマウス（国際公開第９８／１４５９２号および国際公開第９９／２７１１３号、具体的には参照として本明細書に組み込まれている）ならびに他の哺乳動物から由来し得る。あるいは、内因性ＴＥＲＴ遺伝子の転写を増加させることができる。細胞を遺伝子修飾するために用いられる方法は、当業者に周知である。これらの方法では、種々の生物学技法が利用され、これらの多くは、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、に記載されており、具体的には、参照として本明細書に組み込まれている。
【００８８】
（成体脳細胞によるインビトロ移植）
ヒト脳細胞は、自己修復力が殆どなく、疾患または傷害により生じた脳損傷のための療法を開発することは、大きな臨床的チャレンジとして残されている。細胞移植術による脳損傷治療の可能性に大いに関心がもたれてきたが、このアプローチは、まだ早期の実験段階である。実験では、移植ニューロンの大部分が、移植術後に変性することを示すことから、神経細胞の移植術における１つの主要なハードルは、これらの細胞の生存性である。例えば、パーキンソン病の実験動物または対象に移植されたドーパミン作動性細胞の典型的な生存率は、約１０％に限られている（Ｂｒｕｎｄｉｎら、１９８７年、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．４９５：４７３−９６頁；Ｎａｋａｏら、１９９５年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１（３）：２２６−３１頁）。この低生存率の原因（１つまたは複数）は、未知であるが、レシピエントの脳細胞による神経毒作用のためか、または移植細胞に対する栄養および酸素の供給不十分のためであり得る。移植後の神経死が最少にすることができるように、神経死を引き起こす因子を、さらに明瞭に調査すべきである。
【００８９】
これらの因子を同定し、研究する一方法は、脳様の環境を創製してから、ニューロン細胞または神経細胞の有効性または生存性が、多能性幹細胞から誘導されるか、または他の起源から単離されるかを試験することである。本開示の一実施形態は、単離されたニューロン細胞または神経細胞の、成体神経細胞、好ましくは成体海馬から単離された細胞によるインビトロ移植の技法を用いることによる脳様環境を創製することである。本明細書に用いられる用語の「インビトロ移植」とは、同じ培養環境下で２つの異なるタイプの細胞を一緒に培養することを称す。インビトロ移植は、同様の環境下で２つのタイプの細胞適合性を決定し、移植細胞の生存性と機能性に影響を及ぼす因子を試験し、予測するために使用できる。このシステムは、単離ニューロン細胞または神経細胞、特に多能性細胞から誘導されたものの生存性および機能性を評価するために使用できる。次にこの評価は、限定はしないが、脳卒中、虚血、パーキンソン病、アルツハイマー病、癲癇、およびハンチントン病など、神経変性障害またはニューロン疾患を治療するために、これらの細胞能力を決定するのに役立つであろう。好ましい実施形態において、この技法は、宿主様環境において本明細書に開示されている多能性細胞から誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存性または有効性を評価するために用いられる。好ましい実施形態において、ニューロン細胞または神経細胞、好ましくは多能性細胞から誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存性は、インビトロ移植後の成体海馬細胞環境において少なくとも９０％である。他の実施形態において、ＧＡＢＡ作動性ニューロンの少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、または９９％が、この環境において生存する。
【００９０】
本明細書に開示された新規なインビトロ移植モデルはまた、以下のパラメータを試験するために使用できる：（１）移植細胞と宿主細胞との間でシナプス形成；（２）細胞移植後のニューロン死または神経死に関与している因子；および（３）ニューロン死または神経死の率。インビトロ移植モデルは、移植後の細胞生存性と機能性を改善するために必要な詳細な情報を提供するのに役立つばかりでなく、神経生物学者または外科医が、患者にニューロンを移植する前に方針を決定するのに役立つであろう。
【００９１】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を立証するために含まれる。以下の実施例に開示された技法は、本発明の実施に十分に機能するために本発明者により発見された技法を表し、したがって、その実施のために好ましいモデルを構成するために考慮され得ることが、当業者により認識すべきである。しかしながら、多くの変化が、開示される具体的な実施形態において成すことができ、さらに本発明の精神と範囲から逸脱することなく、類似の結果または同様の結果を得られることを、当業者は、本開示に鑑みて認識すべきである。
【実施例】
【００９２】
（実施例１）
以下の実施例は、マウス胚性幹細胞から機能性ＧＡＢＡ作動性ニューロンのインビトロ誘導を立証している。図１は、マウスＥＳ細胞からＧＡＢＡ作動性ニューロンの誘導を図示しており、一方、図２は、マウスＥＳ細胞を終末分化ニューロンに分化させるための種々の工程を図示している。
【００９３】
（１）マウス胚性幹細胞の培養と展開）
一連の本実験に利用されるマウスＥＳ細胞は、当業者に周知の技法を用いてマウス胚盤胞の内細胞塊から単離された。マウスＥＳ細胞は、Ｊ−１起源（米国メリーランド州バセスダ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｄｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した）のものであり、継代１４であった。該細胞は、ＥＳ細胞培地中で有糸分裂的に不活化されているマイトマイシンＣ処理マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞上に維持した。マウスＥＳ細胞を、ＥＳ細胞培地中で培養して、多数の未文化細胞を展開した。一般に、ＥＳ細胞は、多能性を消失することなく少なくとも約１０００倍に展開することができる。使用されるＥＳ培地には、炭素源、窒素源、および所望のｐＨを維持するために緩衝液を含ませた。ＥＳ細胞培地は、１０〜２０％ＥＳ細胞用胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清置換ノックアウト血清（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、２ｍＭのＬ−グルタミン、および０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノールが追加されたダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはノックアウトＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）の構成にした。ＥＳ培地にはまた、マウスＥＳ細胞の分化を阻止するために１０００単位／ｍｌの濃度で白血病抑制因子（ＬＩＦ）（ＥＳＧＲＯ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）が追加された。
【００９４】
当業者に周知の技法を用いて再度分化を阻止するためにＥＳ細胞培地中でＥＳ細胞を培養し、定期的に継代させることにより、マウスＥＳ細胞を展開した。ＥＳ細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、３７℃で少なくとも１〜２時間０．１％から０．２％ゼラチンで処理された組織培養プレート上で培養した。ＥＳ細胞を、１×１０５／ｍｌの濃度でマイトマイシン−Ｃで不活化されたマウスフィーダー細胞上で増殖させた。ＥＳ細胞を、約３５℃と４０℃との間の温度で、好ましくは、約３７℃で、約１％と１０％との間のＣＯ２雰囲気、より好ましくは、５％ＣＯ２雰囲気で４日間温置した。ＥＳ培地は、培養中のＥＳ細胞の増殖に依って毎日または１日おきに取り換えた。
【００９５】
（２）胚葉体の生成）
未分化マウスＥＳ細胞を増殖させ、展開した後、それらを、胚葉体を形成するために培養した。最初にＥＳ細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡへ短時間さらして解離させ、次いで細胞をかき取り小型クラスターに分けた。次いでこれらのクラスター類を、この適切な培地中、フィーダー細胞の不在下で６０ｍｍの細菌用の皿上に凡そ４×１０５細胞／ｍｌの密度でまいた。用いられた細菌用の皿は、付着を防ぐ非粘着性表面を有し、それによってＥＳ細胞の分化および胚葉体の形成を促す。これらの細胞を、ＥＳ培地中、懸濁培養として培養した。これらの細胞を培養するために用いられたＥＳ培地には、高グルコースを有するＤＭＥＭまたは１０〜２０％ＦＢＳまたはノックアウト血プレースメントが追加されたノックアウトＤＭＥＭを含ませ、このほかにβ−メルカプトエタノール（０．１ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および抗生物質でなどの他の添加物を加えた。ｂＦＧＦまたはＬＩＦについては、ＥＳ培地に添加しなかった。翌日に、細胞懸濁液を、新しい培養プレートに移した。前のプレートには幾らか細胞が付着していたが、そのままにした。ＥＳ細胞培地は、古い培地の細胞を遠心分離し、新鮮な培地に細胞を再懸濁し、非粘着性培養プレートに細胞を戻すことによって１日おきに交換した胚葉体を、４〜８日間増殖させた。４〜８日増殖させたあと、該胚葉体を採取し、低スピード（１０００ｒｐｍ、５分）で遠心沈殿させ、ＥＳ細胞培地に再懸濁させた。次に約３０〜４０の胚葉体を非コーティング組織培養プレートに移し、２４時間温置した。
【００９６】
（３）ネスチン陽性神経前駆細胞の選択および展開）
２４時間後、ＥＳ細胞培地をＩＴＳＦｎ（ネスチン選択）無血清合成培地で置換することによりネスチン陽性細胞（神経前駆細胞）を選択した。ＩＴＳＦｎ培地は、成長因子インスリン（５〜２５μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）、亜セレン酸ナトリウム（１〜５ｎＭ）（Ｓｉｇｍａ）、トランスフェリン（１〜１０μｇ／ｍｌ）（Ｇｉｂｃｏ）、およびフィブロネクチン（１〜５μｇ／ｍｌ）が追加されたＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）の構成にした。通常、該細胞は、１日おきに補充されているＩＴＳＦｎ培地により、約６〜１０日間、より好ましくは約７日間ＩＴＳＦｎ培地中に温置した。通常該細胞は、約３５℃と４０℃とで、好ましくは、約３７℃で、約１％と１０％との間のＣＯ２雰囲気、より好ましくは、約２％と６％との間のＣＯ２雰囲気で増殖させた。選択が完了した後、好ましくは７日間経過後、神経前駆細胞について、免疫蛍光法を用いてネスチン発現に関する特徴を調べると、凡そ９０％の細胞がネスチン発現に陽性であったことが判明した。引き続きネスチン陽性細胞を、下記のように展開した。
【００９７】
ネスチン陽性細胞を、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡを用いて解離し、ＣＮＳ展開媒体を含有するポリ−Ｌ−オルニチン／ラミニンコーティングプレート上にまいた。ＣＮＳ展開培地には、Ｎ２（１０ｕｇ／ｍｌ）およびＢ２７（２０ｕｇ／ｍｌ）と共にＤＭＥＭ：Ｆ１２培地を含ませた。神経成長因子もまた、ニューロン生産性を増強することが知られているＣＮＳ展開培地β−ＦＧＦ（１０〜２０ｎｇ／ｍｌ）に添加した。神経前駆細胞を、６日間展開して、大量のニューロン細胞を生成した。該細胞を、２日毎に補充されている培地と共に６日間ＣＮＳ展開培地中で増殖させた。
【００９８】
（４）ニューロン前駆細胞の分化）
展開されたニューロン前駆細胞は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ａ（Ｇｉｂｃｏ）、ＦＣＳ（１０〜２０％）（ＨＹＣＬＯＮＥ）、およびＢ２７補充物（２〜１０％）（Ｇｉｂｃｏ）を含有するが、β−ＦＧＦを含有しない分化用培地中で該細胞を培養することにより分化された。さらに、分化用培地には、ＧＡＢＡ作動性ニューロン収率を高める因子、好ましくはＡｒａ−Ｃ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、米国）を含ませた。Ａｒａ−Ｃ（２０ｕｇ／ｍｌ）を含有する分化用培地中、ニューロン前駆細胞を培養すると、マウスＥＳ細胞から誘導されたニューロン集団中のＧＡＢＡ作動性ニューロンのパーセンテージが増加した。Ａｒａ−Ｃを含有する分化用培地中で３日培養した後、該細胞をＡｒａ−Ｃ無しの同一培地中で８日間、１２日間、または１６日間培養させた。ニューロン前駆細胞をＡｒａ−Ｃを含有する分化用培地中３日間培養してから、該細胞を、Ａｒａ−Ｃ無しの分化用培地中で１６日間増殖させると、ニューロン前駆細胞の少なくとも６０％がＧＡＢＡ作動性ニューロンに分化した（図６）。
【００９９】
（５）分化ニューロンの特性）
上記方法を用いて生成されたニューロン細胞の全集団の分析により、分化細胞の９０％超がニューロン細胞であることが立証された。本開示によって生成された分化ニューロン細胞タイプは、細胞の全体的な形態によって評価され、免疫蛍光法により同定された表現型によっても評価された。免疫蛍光分析は、神経前駆体の展開段階で、ならびに上記プロトコルで開示された分化の４日後、８日後、１２日後、および１６日後に実施された。最初に、単離細胞を、２ウェルのチャンバスライド中で増殖させ、ＰＢＳでリンスし、４％パラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した。次に、該細胞を、１％の正常ヤギ血清を含有するＰＢＳ中の０．２％トリトンＸ−１００により浸透処理してから、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＰＢＳにより室温で１時間ブロックした。
【０１００】
次いで該細胞を一次抗体（抗体希釈液は、１％ＢＳＡ中で作製された）と共に４℃で一晩温置した。以下の一次抗体を、免疫蛍光検査に使用した：モノクローナルＧＡＢＡ、１：２００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；ＧＡＤ６７、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；ＧＡＴ−１、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；ＧＡＴ−２、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；グルタミン酸塩、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；ネスチン、１：５０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；希突起膠細胞、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；セロトニン、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；チロシンヒドロキラーゼ、１：８００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；ＭＡＰ−２、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）；およびＧＦＡＰ、１：５００（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社、米国）。一次抗体と共に一晩温置後、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣ標識二次抗体と共に暗所環境において１時間温置した。次に該細胞をＰＢＳで３回洗浄し、封入剤で覆った。チャンバスライドを、蛍光顕微鏡下で観察して分化の種々の段階で免疫陽性細胞を評価した。
【０１０１】
分化培養の免疫蛍光分析により、約９０％の分化ニューロン細胞が、ＧＡＤ−６５、ＧＡＤ６７、ＧＡＴ−１、ＧＡＴ−２、グルタミン酸塩、ＧＡＢＡ、ネスチンおよびＭＡＰ−２などのニューロン特異的マーカー類に免疫反応性であることが明らかになった（図３）。培養液の全ニューロン細胞の中で、約６０％のニューロン細胞が、ＧＡＢＡ作動性ニューロンのマーカーであるＧＡＢＡに対して染色され、一方、約１５％のニューロン細胞が、ドーパミン作動性ニューロンのマーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）に対して染色された。さらに、約１０％のニューロン細胞が、グルタミン酸塩に対して染色され、一方、約５％のニューロン細胞が、セロトニン作動性ニューロンのマーカーであるセロトニンに対して染色された。最後の約５〜１０％のニューロン細胞が、希突起膠細胞として染色された。細胞培養はまた、グリア細胞を、典型的には細胞集団の約５％から１０％の間で含んでいた。分析により、細胞培養液中の分化ニューロンの少なくとも幾つかは、シナプス的に活性であることが判った。典型的には、成熟ニューロンは、多数の微細棘状様構造を有する長い軸索突起の存在により確認される。軸索突起のミエリン会合蛋白質−２（ＭＡＰ−２）の存在もまた、ニューロンの成熟性を示す。
【０１０２】
分化細胞は、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７の発現が共存したかどうかを決定するために一次抗体により細胞を二重標識することによっても分析された（図４）。ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７は、ＧＡＢＡの合成に必要であるＧＡＢＡ作動性ニューロンに発現される２つの遺伝子である。分化ニューロンの細胞群が、上記のＧＡＤ６５／ＧＡＤ６７およびＧＡＢＡ抗体を用いる二重免疫標識法を使用することにより試験された。この二重免疫標識の結果は、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７蛋白質も発現するニューロン細胞が、ＧＡＢＡ神経伝達物質も発現することを示唆した（図４）。これらの結果は、開示された方法を用いて誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンが、ＧＡＢＡ産生細胞であることを支持する。グルタミン酸塩が、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７酵素の存在下、ＧＡＢＡ作動性ニューロンで変化したことから、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７蛋白質を発現したニューロン細胞は、早期発生時にＧＡＢＡを発現することも示された。
【０１０３】
分化の種々の段階で採取された細胞の遺伝子発現プロファイルもまた分析された。細胞は、開示された方法の以下の段階の各々から逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による分析のために採取された：（１）未分化；（２）胚葉体（ＥＢＳ）；（３）ネスチン展開；（４）２日間の分化；（５）４日間の分化；（６）８日間の分化；（７）１２日間の分化；および（８）１６日間の分化。細胞を採取した後、それらをペレット化し、全細胞ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｑｕｉａｇｅｎキットを用いて細胞ペレットから抽出した。単離されたＲＮＡを−２０℃で貯蔵した。全細胞ＲＮＡを、ＲＮアーゼ無しのＲＱ  ＤＮアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マジソン）で処理して微量のＤＮＡを全て除去した。ｃＤＮＡは、製造元の取扱い説明書に従ってモロニー白血病ウィルススーパースクリプトＩＩ逆転写酵素を用いて単離された全ＲＮＡから合成された。ランダムヘキサマープライマー類（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を、逆転写酵素（ＲＴ）反応を図るために用いた。
【０１０４】
この逆転写酵素反応により合成されたｃＤＮＡは、採取された細胞においてどの遺伝子が発現されるのか判断するために、種々のセットの特異的プライマー類によるＰＣＲ増幅に用いられた。該プライマー類は、ＧＡＢＡ作動性ニューロンにおいて発現されたｍＲＮＡ類、具体的には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ＧＡＤ１およびＧＡＤ２）、あるいはスプライスされたＧＡＤ１胚性ＲＮＡ、および小胞阻害アミノ酸トランスポーター（ＶＩＡＡＴ）転写物を同定するためにデザインされた。ＧＡＤ１は、発生中に選択的にスプライスされ、胚性転写物は、胎仔発生時に神経幹細胞／前駆細胞において主として発現される。偏在性発現遺伝子、β−アクチンの発現はまた、陽性対照としてモニターされた。これらのＰＣＲ反応は、当業者に周知である標準的なＰＣＲ条件下で、第１の鎖反応全体（ＲＴにより合成されたｃＤＮＡ）の１０％のみをテンプレートとして用い、白金Ｔａｑポリメラーゼを用いて実施された。ＤＮＡ産物を増幅するために用いられる一般的なサイクリングパラメータは、以下のとおりであった：
１．テンプレートｃＤＮＡを９４℃３０秒間で変性；
２．使用されるプライマー類に応じ、５５〜６５℃で１分間、プライマー類をアニーリング；
３．７２℃１分間で反応物を温置、２５回から４０回の間で工程１〜３を繰り返す（サイクル）。
【０１０５】
ＰＣＲ反応後、この産物を、ＤＮＡサイズラダーと共に電気泳動を用いて寒天ゲル中を移動させた。ＧＡＤ１、ＧＡＤ２、ＧＡＤ１胚性、ＶＩＡＡＴ、およびβ−アクチン全ての発現は、表１に記載されたプライマー類を用いてＲＴ−ＰＣＲにより分析された：
【０１０６】
【表１】
2007520207.tif 000002
ＲＴ−ＰＣＲによる上記の分析により、多くのＥＳ細胞誘導ニューロン細胞が、ＧＡＢＡ作動性表現型のマーカーを発現するニューロンに自発的に分化することが判った。分析された細胞培養の種々の段階でＧＡＤ１とＧＡＤ２との発現に差異が見られた。ＧＡＤ１遺伝子は、未分化段階を含みほぼ全ての段階（段階１から段階５）で発現された（図５）。これは、ＥＳ細胞におけるＧＡＤ１発現についての以前の報告と一致する（Ｂａｉｎら、１９９３年、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１７：２３−３０頁）。一方、ＧＡＤ２は、図５に示された分化段階でのみ発現された。この結果は、開示された方法を用いて生成されたＧＡＢＡ作動性ニューロンが、ＧＡＤ１とＧＡＤ２双方の遺伝子の不等な表現型発現を有していることを示唆している。ＧＡＤ１胚性スプライス変異体は、未分化段階を除いて全ての段階で発現されるが、ＧＡＢＡをトランスポートすることが知られている神経伝達物質遺伝子（ＶＩＡＡＴ）は、分化段階でのみ発現される（図５）。ハウスキーピング遺伝子βアクチンの発現は、陽性対照として用いられた（図５）。
【０１０７】
逆相高性能液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）もまた、開示された方法を用いて誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンによるＧＡＢＡ発現を分析するために使用された。ＧＡＢＡ作動性ニューロンの決定的な特徴は、ＧＡＢＡの産生であることから、ＧＡＢＡを産生するＥＳ細胞誘導ＧＡＢＡ作動性ニューロンの機能的能力は、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて細胞内ＧＡＢＡ濃度を直接測定することにより評価された。各サンプルで検出されたＧＡＢＡの濃度は、各実験の直前および直後にカラムに注入されたＧＡＢＡの標準溶液と比較することにより決定された。
【０１０８】
始めに、細胞を、開示された方法の種々の段階で採取した。すなわち、ネスチン展開段階および分化細胞を分化８日後、１２日後、および１６日後に単離した。培養物の上澄み液を種々の段階から採取し、測定のための神経伝達物質を安定化させるために、７．５％オルトリン酸とメタ重亜硫酸（０．２２ｍｇ／ｍｌ）とで直ちに処理し、ＲＰ−ＨＰＬＣによる分析まで−８０℃で貯蔵した。ＧＡＢＡの細胞内濃度は、ＯＰＡ／ｔ−ブチルチオールによるＧＡＢＡ誘導の電気化学的検出（ＫｅｈｒおよびＵｎｇｅｒｓｔｅｄｔ、１９８８年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５１（４）：１３０８−１０頁；Ｏｓｂｏｒｎｅら、１９９１年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄ３４：９９−１０６頁、双方とも具体的には参照として本明細書に組み込まれている）に基づいて、アイソクラチックＨＰＬＣ法を用いて検出された。ＨＰＬＣデータは、流速および感度を変えてＧＡＢＡ標品に対して正規化された（図７）。
【０１０９】
ネスチンまたはネスチン展開段階では、ＧＡＢＡが検出されなかったが、分化８日目のＧＡＢＡの測定濃度は２０．９５ｐｇ／ｍｌであり、分化１２日目および１６日目は、それぞれ２６．１８ｐｇ／ｍｌと１８．６０ｐｇ／ｍｌであった。この分析により、ＧＡＢＡの最高濃度は、分化１２日目以上で誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンにより産生されることが判った。培養細胞からＧＡＢＡの放出は全体で２１．５１ｐｇ／ｍｌであった。
【０１１０】
ＧＡＢＡの最高濃度が、分化１２日目に誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンにより産生されたので、この分化の同じ段階の細胞を、ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体の存在について評価した。機能性神経伝達物質受容体、例えば、ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体のニューロン、例えば、ＧＡＢＡ作動性ニューロン表面上の分布は、シナプス伝達およびシグナルプロセシングに大いに関連している（Ｅｄｅｒら、２００１年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１３：１０６５−６９頁）。成熟ＧＡＢＡ作動性ニューロン上のＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体の双方は、これらのニューロンの正常機能にとって重要であることが公知である。本明細書に記載されているマウスＥＳ細胞から誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンが、これらのＧＡＢＡ作動性受容体も発現するかどうか判断するために、前述の免疫蛍光プロトコルを用い、抗ＧＡＢＡ−Ａ受容体抗体、１：２５０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国）および抗ＧＡＢＡ−Ｂ受容体抗体、１：２５０（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、米国）を用いて細胞を免疫染色した。
【０１１１】
１２日目の分化培養液の免疫蛍光分析により、ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体の双方は、分化ＧＡＢＡ作動性受容体に局在化されていることが判った。興味深いことに、凡そ８０％の分化細胞は、ＧＡＢＡ−Ａ受容体を発現したが（図８）、凡そ２５％だけの分化細胞は、ＧＡＢＡ−Ｂ受容体を発現した（図９）。ＧＡＢＡ−Ａ受容体およびＧＡＢＡ−Ｂ受容体の双方の発現が、シナプス伝達および信号処理に大いに関連していることから、両受容体を発現するＧＡＢＡ作動性ニューロンの単離は、細胞移植後の細胞機能性をインプロージングするのに重要となり得るであろう。
【０１１２】
（実施例２）
以下の実施例において、本開示の出願者らは、インビトロ移植モデルを用いて、マウス胚性幹細胞から誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンの有効性、生存性、および機能性を試験する。図１は、インビトロ移植モデルを図示している。
【０１１３】
マウスＥＳ細胞から誘導されたＧＡＢＡ作動性ニューロンの生存性および機能性を、ＧＡＢＡ作動性ニューロンと成体マウス脳の海馬細胞とのインビトロ移植により試験した。海馬細胞は、成体マウス脳の海馬から細胞を単離することにより先ず単離し、これらの細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡにより解離させ、Ｂ２７（２０μｇ／ｍｌ）およびＮ２（１０μｇ／ｍｌ）により補足されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中で１週間細胞を培養した。成体海馬脳細胞を、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニンまたはゼラチンによりコーティングされた１００ｍｍの組織培養プレート上で増殖させた。１週間後、マウスＥＳ細胞から誘導され、分化１２日後に採取されたＧＡＢＡ作動性ニューロンを、成体海馬脳細胞上にまき、両細胞タイプを一緒に１週間培養した。凡そ９０％のＧＡＢＡ作動性ニューロンは、成体海馬脳細胞によるインビトロ移植後１週間生存した。この結果により、多能性幹細胞から誘導されたニューロンが、成体脳環境において機能的あり、成体脳細胞シナプス接続することを示唆しており、また、これらの細胞は、多様な神経変性障害またはニューロン疾患を治療するために治療的に使用できることを示唆している。
【０１１４】
本明細書に開示され、請求された全ての組成物および方法は、本開示に鑑みて過度の実験なしで成され、また実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態によって記載されているが、本発明の構想、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載された組成物および／または方法および方法の工程または工程の配列に応用できることが、当業者にとって明白であろう。より具体的には、化学的または生理的に関連するある一定の薬剤が、本明細書に記載された薬剤と置換されてもよく、同一または類似の結果が達成され得ることは明白であろう。当業者に明白な全てこのような類似の置換および修飾は、添付の請求項により定義された本発明の精神、範囲および構想内であると思われる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、マウスＥＳ細胞由来のＧＡＢＡ作動性ニューロンの誘導、ならびに、成体マウス脳から誘導した海馬ニューロンによるＧＡＢＡ作動性ニューロンのインビトロ移植の、図による説明である。
【図２】図２は、（１）未分化細胞の展開；（２）胚葉体の形成；（３）ネスチン陽性細胞の選択；（４）ネスチン陽性細胞の展開；および（５）神経前駆細胞の終末分化神経細胞への分化、を含む、マウスＥＳ細胞を終末分化神経細胞へと分化させる工程の、図による説明を示している。
【図３ａ】図３は、マウスＥＳ細胞から誘導した神経細胞集団における免疫反応性による以下のマーカー：（ａ）ＧＡＤ−６５およびＧＡＤ−６７；（ｂ）ＧＡＴ−１およびＧＡＴ−２；（ｃ）グルタミン酸およびＧＡＢＡ；および（ｄ）ネスチンおよびＭＡＰ−２、の局在化を示している。免疫反応性は、４つの異なった時期：ネスチン陽性細胞の展開、および分化後８日目、１２日目、および１６日目に試験された。
【図３ｂ】図３は、マウスＥＳ細胞から誘導した神経細胞集団における免疫反応性による以下のマーカー：（ａ）ＧＡＤ−６５およびＧＡＤ−６７；（ｂ）ＧＡＴ−１およびＧＡＴ−２；（ｃ）グルタミン酸およびＧＡＢＡ；および（ｄ）ネスチンおよびＭＡＰ−２、の局在化を示している。免疫反応性は、４つの異なった時期：ネスチン陽性細胞の展開、および分化後８日目、１２日目、および１６日目に試験された。
【図３ｃ】図３は、マウスＥＳ細胞から誘導した神経細胞集団における免疫反応性による以下のマーカー：（ａ）ＧＡＤ−６５およびＧＡＤ−６７；（ｂ）ＧＡＴ−１およびＧＡＴ−２；（ｃ）グルタミン酸およびＧＡＢＡ；および（ｄ）ネスチンおよびＭＡＰ−２、の局在化を示している。免疫反応性は、４つの異なった時期：ネスチン陽性細胞の展開、および分化後８日目、１２日目、および１６日目に試験された。
【図３ｄ】図３は、マウスＥＳ細胞から誘導した神経細胞集団における免疫反応性による以下のマーカー：（ａ）ＧＡＤ−６５およびＧＡＤ−６７；（ｂ）ＧＡＴ−１およびＧＡＴ−２；（ｃ）グルタミン酸およびＧＡＢＡ；および（ｄ）ネスチンおよびＭＡＰ−２、の局在化を示している。免疫反応性は、４つの異なった時期：ネスチン陽性細胞の展開、および分化後８日目、１２日目、および１６日目に試験された。
【図４】図４は、本明細書に開示された方法を用いてマウスＥＳ細胞から誘導したＧＡＢＡ作動性ニューロンにおけるＧＡＢＡおよびＧＡＤ−６５／ＧＡＤ−６７免疫反応性の共存を示している。ＧＡＤ−６５およびＧＡＤ−６７陽性細胞におけるＧＡＢＡ免疫蛍光の存在により、これらのＧＡＢＡ作動性ニューロンがＧＡＢＡを産生することが確認される。
【図５】図５は、マウスＥＳ細胞において、これらのＧＡＢＡ作動性ニューロンへ、これらの細胞がインビトロ分化する間の種々の時期における、ＧＡＢＡ作動性ニューロン特異的因子の遺伝子発現プロファイルを示している。これらの時期とは、未分化マウスＥＳ細胞（Ｕｎ）、胚葉体（ＥＢ）、ネスチン選択（Ｎ）、ネスチン展開（ＮＥ）、２日間の分化（Ｄ−２）、４日間の分化（Ｄ−４）、８日間の分化（Ｄ−８）、１２日間の分化（Ｄ−１２）、１６日間の分化（Ｄ−１６）である。以下のＧＡＢＡ作動性ニューロン特異的遺伝子：ＧＡＤ１、ＧＡＤ２、ＶＩＡＡＴ、およびＧＡＤ１の胚転写体が分析された。ＧＡＤ１発現は、未分化ＥＳ細胞を含み、全ての時期で見られた。ＧＡＤ２発現は、ネスチン選択、ネスチン展開、全ての分化期で見られたが、未分化の胚葉体段階では発現が無かった。ＶＩＡＡＴ発現は、分化期でのみ、特に、８日間および１２日間の分化で見られた。ＶＩＡＡＴが分化１６日後に発現されなかったことは興味深い。ＧＡＤ１胚遺伝子の発現は、未分化期を除いて、全ての時期で見られた。ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンは、陽性対照として、全ての時期で検出された。
【図６】図６は、マウスＥＳ細胞から誘導した神経細胞集団の比較分析である。誘導の種々の時期における細胞の総数を、形態計測学的分析を用い、計数を行った。分析した誘導の時期は、（ａ）ネスチン陽性細胞の展開（ＮＥ）；（ｂ）８日間の分化；（ｃ）１２日間の分化；および（ｄ）１６日間の分化である。該細胞は、（１）総ニューロン；（２）グルタミン酸発現；（３）ＧＡＢＡ発現；（４）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現；および（５）ＨＴ発現、によって定量化した。
【図７】図７は、以下の段階：ネスチン−展開（ＮＥ）；８日間の分化（Ｄ−８）；１２日間の分化（Ｄ−１２）；および１６日間の分化（Ｄ−１６）における逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により測定した細胞外ＧＡＢＡ濃度を示している。分化期ではＧＡＢＡのみが検出され、本明細書に開示された方法を用いてマウスＥＳ細胞から誘導されたニューロンが、ＧＡＢＡを産生することが確認された。
【図８】図８は、本明細書に開示された方法を用いて、抗ＧＡＢＡ−Ａ受容体抗体により１２日間の分化後、マウスＥＳ細胞から誘導された免疫反応性を示している。およそ８０％の細胞が、抗ＧＡＢＡ−Ａ受容体抗体による免疫蛍光に対して陽性であった。
【図９】図９は、本明細書に開示された方法を用いて、抗ＧＡＢＡ−Ｂ受容体抗体により１２日間の分化後、マウスＥＳ細胞から誘導された免疫反応性を示している。およそ２５％の細胞が、抗ＧＡＢＡ−Ｂ受容体抗体による免疫蛍光に対して陽性であった。
【図１】
2007520207.tif 000003
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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