(57)【要約】  開示されるのは、その動物に治療に有効な量のプニカ酸を経口的に又は非経口的に投与することによって、炎症性の腸の疾患のような免疫炎症性の疾患を予防する又は改良する、免疫系の発達を増加させる、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔのリンパ球の水準を維持する又は増加させる、免疫の機能を増加させる、ウィルスに対する免疫応答を増加させる、並びに、代謝の症候群、タイプ２の糖尿病、及び肥満症を予防する又は改良するための、ほ乳類及び人類を含む、動物の免疫応答を向上させる方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における免疫応答を向上させる方法であって、
当該方法は、プニカ酸、それのエステル、それの薬学的に適切な塩、それの代謝物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される治療的に有効な量の化合物を投与することを含むと共に、該化合物は、動物へ単一の用量又は多重の用量で投与される、方法。
【請求項２】
自由な形態のプニカ酸を前記動物へ投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬学的に適切な担体との組み合わせで前記化合物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ほ乳類へ前記化合物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記動物は、人間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
薬学的に適切な経口的な担体との組み合わせで経口的に前記化合物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非経口的に該化合物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
注射によって該化合物を投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
直腸に前記化合物を投与することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
薬学的に許容可能な賦形剤との組み合わせで直腸に前記化合物を投与することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
活性な処方成分との組み合わせで前記化合物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、一つ以上のビタミン類又は脂肪酸との組み合わせで投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
補足された栄養性の生産物における前記化合物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記栄養性の生産物は、繊維バー、エネルギーバー、穀物、パン、牛乳、チーズ、低炭水化物食品、幼児処方箋、子供製品、ヨーグルト、ケフィア、老人処方箋、体重管理処方箋、運動栄養学処方箋、果物飲料及び果物食品からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
動物の食品との組み合わせで前記化合物を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記動物の食品は、犬の食品、猫の食品、及び馬の食品である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記有効な量のプニカ酸は、約１０ｍｇ毎体重ｋｇ毎日と１０，０００ｍｇ毎体重ｋｇ毎日との間にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
投与された前記化合物の量は、前記動物におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の水準を増加させるために有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
投与された前記化合物の量は、前記動物におけるウイルス性の抗原に対する耐性を増加させるために有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ウィルス性の抗原は、インフルエンザウィルスの抗原である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
投与された前記化合物の量は、炎症性の腸の疾患を処置するために有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記炎症性の腸の疾患は、クローン病である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記炎症性の腸の疾患は、潰瘍性大腸炎である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
投与された前記化合物の量は、前記動物における免疫系の発達を向上させるために有効なものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫系は、一次的な及び二次的なリンパ系の器官及び免疫細胞を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記一次的な及び二次的なリンパ系の器官は、胸腺、脾臓、リンパ節、気管支に関連したリンパ系の組織、及び、消化管に関連したリンパ系の組織である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ほ乳類における免疫炎症性の障害を処置する方法であって、当該方法は、プニカ酸、それのエステル、それの薬学的に適切な塩、それの代謝物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される治療的に有効な量の化合物を投与することを含むと共に、該化合物は、ほ乳類へ単一の用量又は多重の用量で投与される、方法。
【請求項２８】
自由な形態のプニカ酸を前記ほ乳類へ投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
薬学的に適切な経口的な担体との組み合わせで経口的に前記化合物を投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
非経口的に該化合物を投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
活性な処方成分との組み合わせで前記化合物を投与することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物は、一つ以上のビタミン類又は脂肪酸との組み合わせで投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
投与された前記化合物の量は、炎症性の腸の疾患を処置するために有効なものである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記炎症性の腸の疾患は、クローン病である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記炎症性の腸の疾患は、潰瘍性大腸炎である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記有効な量のプニカ酸は、約１０ｍｇ毎体重ｋｇ毎日と１０，０００ｍｇ毎体重ｋｇ毎日との間にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記ほ乳類は、人間である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
炎症性の腸の障害を処置するための物質の組成物であって、当該組成物は、薬学的に許容可能な担体との組み合わせである量のプニカ酸を含むと共に、前記ある量のプニカ酸は、炎症性の腸の障害を処置するために有効なものである、物質の組成物。
【請求項３９】
前記プニカ酸は、それの遊離の酸の形態で存在する、請求項３８に記載の物質の組成物。
【請求項４０】
前記プニカ酸は、非毒性の塩、活性なエステル、プニカ酸を含有する構造的な脂質、メチル及びエチルエステル、活性な代謝物、並びに、それらの他の活性な化学物質の誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３８に記載の物質の組成物。
【請求項４１】
前記薬学的に許容可能な担体は、非経口的な投与に適切なものである、請求項３８に記載の物質の組成物。
【請求項４２】
前記薬学的に許容可能な担体は、経口的な投与に適切なものである、請求項３８に記載の物質の組成物。
【請求項４３】
前記薬学的に許容可能な担体は、カプセル、カシェ剤、錠剤、巨丸剤、又は、舐剤の形態で存在する、請求項４２に記載の物質の組成物。
【請求項４４】
前記有効な量は、約１０ｍｇ毎日と１０，０００ｍｇ毎日との間にある、請求項３８に記載の物質の組成物。
【請求項４５】
ほ乳類における代謝の症候群、タイプ２の糖尿病、及び肥満症を処置する又は予防する方法であって、当該方法は、プニカ酸、それのエステル、それの薬学的に適切な塩、それの代謝物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される治療的に有効な量の化合物を投与することを含むと共に、該化合物は、ほ乳類へ単一の用量又は多重の用量で投与される、方法。
【請求項４６】
前記ほ乳類へ遊離な形態のプニカ酸を投与することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
薬学的に適切な経口的な担体との組み合わせで経口的に前記化合物を投与することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
非経口的に前記化合物を投与することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
活性な処方成分との組み合わせで前記化合物を投与することを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物は、一つ以上のビタミン又は脂肪酸との組み合わせで投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
投与された前記化合物の量は、高インシュリン血症を処置する及び予防するために有効なものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
投与された前記化合物の量は、高血糖症を処置する及び予防するために有効なものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
投与された前記化合物の量は、腹部の脂肪の集積を処置する及び予防するために有効なものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
投与された前記化合物の量は、健康を害したブドウ糖の許容値を正常化するために有効なものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
前記有効な量のプニカ酸は、約１０ｍｇ毎体重ｋｇ毎日と１０，０００ｍｇ毎体重ｋｇ毎日との間にある、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
前記ほ乳類は、人間である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
動物におけるタイプ２の糖尿病及び腹部の肥満症を処置するための物質の組成物であって、薬学的に許容可能な担体との組み合わせで、タイプ２の糖尿病及び腹部の肥満症を処置するために有効なある量のプニカ酸を含む、物質の組成物。
【請求項５８】
前記プニカ酸は、それの遊離な酸の形態にある、請求項５７に記載の物質の組成物。
【請求項５９】
前記プニカ酸は、非毒性の塩、活性なエステル、プニカ酸を含有する構造的な脂質、メチル及びエチルエステル、活性な代謝物、並びに、それらの他の活性な化学物質の誘導体及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項５７に記載の物質の組成物。
【請求項６０】
前記薬学的に許容可能な担体は、非経口的な投与に適切なものである、請求項５７に記載の物質の組成物。
【請求項６１】
前記薬学的に許容可能な担体は、経口的な投与に適切なものである、請求項５７に記載の物質の組成物。
【請求項６２】
前記薬学的に許容可能な担体は、カプセル、カシェ剤、錠剤、巨丸剤、又は、舐剤の形態で存在する、請求項６１に記載の物質の組成物。
【請求項６３】
前記有効な量は、約１０ｍｇ毎日と１０，０００ｍｇ毎日との間にある、請求項５７に記載の物質の組成物。
【請求項６４】
ほ乳類におけるウィルス性の及び／又は細菌性の感染を予防する又は処置する方法であって、プニカ酸、それのエステル、それの薬学的に適切な塩、それの代謝物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される治療的に有効な量の化合物を投与することを含むと共に、該化合物は、ほ乳類へ単一の用量又は多重の用量で投与される、方法。
【請求項６５】
前記ウィルス性の及び／又は細菌性の感染を予防する又は処置することは、前記ほ乳類における免疫機能を増加させることを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ウィルス性の及び／又は細菌性の感染を予防する又は処置するための物質の組成物であって、当該組成物は、薬学的に許容可能な担体との組み合わせである量のプニカ酸を含むと共に、前記ある量のプニカ酸は、動物における前記ウィルス性の及び／又は細菌性の感染を処置するために有効なものである、物質の組成物。
【請求項６７】
腸管の免疫炎症性の障害を予防する又は改良するための物質の組成物であって、当該組成物は、薬学的に許容可能な担体との組み合わせである量のプニカ酸を含むと共に、前記ある量のプニカ酸は、腸管の免疫炎症性の障害を処置するために有効なものである、物質の組成物。
【請求項６８】
前記腸管の障害は、過敏な腸の症候群、クローン病、及び、潰瘍性大腸炎からなる群より選択される、請求項６７に記載の物質の組成物。
【請求項６９】
免疫系の発達を増加させるための物質の組成物であって、当該組成物は、薬学的に許容可能な担体との組み合わせである量のプニカ酸を含むと共に、前記ある量のプニカ酸は、免疫系の発達を増加させるために有効なものである、物質の組成物。
【請求項７０】
当該組成物は、食品の補足、薬学的な組成物、又は、食品の組成物の形態にある、請求項６９に記載の物質の組成物。
【請求項７１】
当該組成物は、錠剤、カプセル、溶液、又は、乳濁液の形態における薬学的な組成物である、請求項６９に記載の物質の組成物。
【請求項７２】
当該組成物は、マーガリン、脂肪に連続的な若しくは水に連続的な又は両方に連続的なスプレッド、脂肪が減少したスプレッド、チョコレート若しくはチョコレートコーティング若しくはチョコレートフィリング、又はベーカリーフィリングのような菓子の製品、アイスクリーム、アイスクリームコーティング、アイスクリームインクルージョン、ドレッシング、マヨネーズ、チーズ、クリームの代替品、乾燥したスープ、飲料、穀物のバー、ソース、スナックバー、乳製品、臨床の栄養製品、及び幼児調合物からなる群より選択される食料である、請求項６９に記載の物質の組成物。
【請求項７３】
当該組成物は、ゼラチン、デンプン、変成したデンプン、ブドウ糖、ショ糖、乳糖、及び果糖のようなデンプンの誘導体からなる群より選択されるカプセル化する材料を含む軟質のゲル又は硬質のカプセルの形態における食品の補足である、請求項６９に記載の物質の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ほ乳類及び人類を含む、動物における、免疫活性の有害な副作用を最小にすると共に免疫炎症性の又は代謝性の障害を予防する一方で、免疫応答を向上させるためのプニカ酸を使用する方法へ一般に向けられる。より具体的には、免疫応答を向上させる、免疫系の発達を増加させる、免疫炎症性の及び代謝性の障害（即ち、代謝性の症候群、肥満症及びタイプ２の糖尿病）を予防する又は改良する、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の水準を維持する又は増加させる、並びに、ウイルス性の疾患に対する耐性を改善するためにプニカ酸を使用する方法が、提供される。
【背景技術】
【０００２】
［引用文献］
この出願で引用された文献の十分な書誌の引用を、特許請求の範囲に先行する節に見出すことができる。
【０００３】
免疫応答は、感染及び／又は疾患を引き起こすために侵入する外来の物質に対する防御の体の機構である。免疫系の機能は、白血球を含む、数個のタイプの細胞の協調した努力を伴う複雑な過程である。免疫応答は、抗原が存在する細胞が、外来の抗原に遭遇するとき、開始する。抗原が存在する細胞は、それを劣化させると共にそれの表面に抗原決定基と呼ばれた抗原の断片（即ち、ウィルス、細菌、又は他の外来の本体）を表示する。
【０００４】
体におけるＴ細胞（白血球の分集団）の多くの異なるクローンのうち唯一なものとして、一つの特定のＴ細胞のクローンは、表示された抗原を認識すると共に抗原が存在する細胞に束縛する。この合併は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）及び腫瘍の壊死の因子（ＴＮＦ）のような、抗原が存在する細胞によってサイトカインと呼ばれたタンパク質の生産を変調する。これらのタンパク質は、抗原が存在する細胞とＴ細胞との間で伝達する。Ｔ細胞は、また、インターロイキン−２（ＩＬ−２）及びガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）のような他のタンパク質を生産する。連続する過程の一部として、ＩＬ−２は、他のＴ細胞及びキラーＴ細胞が、繁殖することを命令する。
【０００５】
増殖するヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞が繁殖する及び抗体を生産すること引き起こす物質を解放する。Ｂ細胞によって解放された抗体は、自由に浮遊するウィルス及び他の病原体の表面に抗原を束縛する。感染が、制御の下でもたらされると、活性化されたＴ及びＢ細胞は、サプレッサーＴ細胞によってオフにされる。しかしながら、少数の“記憶細胞”は、同じ病原体が、再度攻撃するとすれば、直ちに応答するために、後に残る。
【０００６】
体の免疫応答の複雑さのおかげで、さらなる研究は、免疫系が動物の免疫応答を向上させることを後援するための新規な方式を明かすために、必要とされる。理想的に、免疫系を向上させる新しい方法は、免疫の及び／又は炎症性の応答と関連した有害な副作用を予防する又は減弱させるために、作用することになる。
【０００７】
現今の調査は、また、炎症性の腸の疾患（ＩＢＤ）のような他の免疫の障害が、また、免疫系へのさらなる調査によって助けられることもあることを示唆する。ＩＢＤは、１，０００，０００人の米国人及び世界中で数百万人の人々を悩ます、未知の病因学の、慢性の、繰り返し発生する免疫炎症性の病気である。ＩＢＤは、患者の人口の大きなセグメントにおける流行性の原因の慢性の病気である。それは、それ自体を、二つの異なる形態：潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）で、明示することができる。二つの健康状態が、臨床的には非常に類似なものを現すとはいえ、ＵＣは、主として、上側の胃腸の消化管とは対照的に、結腸及び直腸の炎症を伴う。一方で、ＣＤは、上側の腸管の消化性の消化管のより大きいエリアを強い影響を与えると共に、このように、吸収不良並びに慢性のビタミン及び栄養の欠陥を誘発することが、よりありそうなものである。
【０００８】
ＩＢＤの経験の症状を患う個人は、慢性の腸管の炎症、下痢、出血、腹痛、発熱、関節痛、及び体重の喪失によって特徴付けられる。これらの症状は、軽度のものから重度のものまでの範囲にわたり得る。ＩＢＤは、初期の軽症の不快なことから徐々に且つ微妙に発達することもある、又は、鋭い強度と共に突然存在することもある。
【０００９】
ＩＢＤについての現今の処置は、６−メチルプレドニソロン及びブデソニドのようなコルチコステロイド、並びに、アザチオプリン、６−メルカプトプリン、シクロスポリン及びメトトレキサートのような免疫抑制薬を含む（非特許文献１１）。なお発展の下での新しい治療法は、食品及び薬物の投与が承認された抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）を含む（非特許文献６、非特許文献１１、非特許文献５）。ＩＢＤに対する既存の治療法が、改善されてきた一方で、それらは、適度に成功したままであるのみである。さらに、従来の治療法は、しばしば、使用者に対して顕著な副作用に帰着する。従って、ＩＢＤのような免疫炎症性の疾患を処置するための新規な予防的な及び／又は治療的な方法についての必要性が残るままである。
【００１０】
また、栄養性の製品を使用する、ほ乳類における免疫応答を向上させる新規な方法についての必要性が残るままである。免疫系へのさらなる調査は、免疫抑制を予防する栄養の介入を識別することもある。
【００１１】
また、赤子、幼児、及び、高齢者のような免疫抑制された個人における免疫応答を向上させる新規な方法についての必要性は、存在する。これらの個人は、ウィルス性の及び細菌性の感染に応答するための限定された能力を有すると共に、ウィルス性の及び細菌性の疾患に対する低減された耐性に帰着する。従って、栄養の方法を含む、これらの脆弱な個人の免疫応答を向上させる新規な方法を識別するための必要性が残るままである。
【００１２】
代謝性の症候群又は症候群Ｘ及びタイプ２の糖尿病のような代謝性の障害を処置する又は予防する新規な方法についての必要性は、また、存在する。西洋社会においては、肥満症の高い罹患率は、タイプ２の疾患、心臓血管の疾患、高血圧、及び、高脂血症、のような数個の代謝性の障害に帰着するが、それらは、全て症候群Ｘとして特徴付けられる。おおよそ千五百万人の米国人が、一万人の新しく診断された事例及び年当たりの医療費における千三百二十億ドルと共に、タイプ２の糖尿病によって悩まされる。（インシュリン耐性及び肥満症のような）代謝性の症候群のいくつかの構成要素は、免疫炎症性の異常性と関連したものであるように、現れる。免疫性、炎症、及び、代謝の間におけるこの接続は、腹部の脂肪性の組織において、特に強いものである。非特許文献１７は、皮下の脂肪性の組織と比較したとき、前炎症性のサイトカインの表現及びそれらの受容体（即ち、ＩＬ−６及びＩＬ−１Ｒ）を、人間の大網性の脂肪性の組織において増加させたことを立証した（非特許文献１７）。ゲムフィブロジル、ペルオキシソームの増殖因子で活性化された受容体アルファの作用薬は、心臓血管の疾患の処置に承認されると共に、血液の脂肪のプロファイルにおけるそれの効果によって十分に説明することができない心保護的な効果を顕在化させる（非特許文献１３、非特許文献１２）。よって、他の機構は、また、心臓血管の疾患を改善する際に、結果として影響を与えられるものである。ゲムフィブロジルによる免疫の機能及び炎症の変調は、それの効力のある健康の利益についての説明を提供する。加えて、ゲムフィブロジルは、代謝に、しかしまた、免疫の機能及び炎症に作用するアプローチを使用する、代謝性の障害に対する成功した介入の例である。
【００１３】
タイプ２の糖尿病についての新規な処置は、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）のようなペルオキシソームの増殖因子で活性化された受容体ガンマの作用薬を含む。しかしながら、有害な心臓血管（流体の保持及び鬱血性心臓不全）の及び肝臓（脂肪肝）の副作用のおかげで、これらの処置の安全性に関して、疑問が、挙げられてきた。従って、免疫、炎症、及び代謝の間の界面に位置させられた分子のネットワークに作用する栄養の方法を含む、代謝性の症候群、タイプ２の糖尿病、及び肥満症を予防する又は処置する新規な且つより安全な方法を識別するための必要性が残るままである。
【００１４】
一つのこのような新規な且つ安全な方法は、プニカ酸での処置であってもよい。プニカ酸は、人類に知られた且つ何世紀にもわたって人類に消費された、非毒性の、天然の、経口的に活性な食品の処方成分である。プニカ酸は、６０パーセントを超えるその油を表す、ザクロの種子、即ち、プニカザクロ皮に、天然に見出される。モモルジカバルサムニア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｂａｌｓａｍｎｉａ）は、類似の濃度のプニカ酸を備えたキュウリ科に属する別の医薬の植物である。ザクロの種子及び他の医薬の植物におけるプニカ酸の存在は、当分野において周知なものである。また、癌に対するザクロの利益は、当分野において周知なものである。例えば、ザクロの果実を使用する医療的な障害を処置する方法は、一般的なものである。しかしながら、プニカ酸を使用する、ほ乳類における免疫応答を向上させる方法はない。例えば、Ｍｕｒａｄへの特許文献１は、ザクロを含む、果実の抽出物で皮膚科学的な障害を処置する教示する。その方法は、皮膚におけるフリーラジカルを中和するための治療的に有効な量の少なくとも一つの果実の抽出物を投与することを含む。この方法は、皮膚における障害を標的にすると共に治すことにねらいを定められる。しかしながら、この方法は、免疫系及び胃腸の消化管における障害を処置する方法として免疫応答を向上させるための、ザクロの油又はプニカ酸の使用を教示しない。加えて、免疫系の発達及び機能又は代謝性の障害の予防を促進させるためのプニカ酸の使用は、また、教示されない。
【００１５】
Ｓｈｅｈａｄｅｈへの特許文献２は、サトイモ科アラム属の各種植物の抽出物、ザクロの抽出物、茶の抽出物、及び、フヨウ属の各種の植物の抽出物を含むハーブの抽出物の組成物を調製する方法を教示する。その抽出物を作り出すために使用されたザクロの構成成分は、果物の皮であるが、しかし、果物の皮は、（種子にのみ見出される）プニカ酸を含有しない。加えて、（水性の及びエタノール性の）利用される抽出の方法は、油又はプニカ酸ではなく、水溶性の構成成分を抽出するために設計される。
【００１６】
さらに、Ｌａｎｓｋｙへの特許文献３及び特許文献４は、水性の溶媒でザクロの種子を抽出すること、及び、シザンドラベリー（ｓｈｉｚａｎｄｒａ  ｂｅｒｒｙ）、中国のアスパラガスの根、及び、自由選択で、中国の甘草及び中国のアンゲリカの根を含有する、ハーブの抽出物とザクロの種子の抽出物を混和することによって、植物エストロゲンの経口的な補足及び軟膏剤を調製する方法を教示する。しかしながら、この方法は、ほ乳類における代謝性の障害を予防するための免疫応答を向上させるためのプニカ酸の使用を教示しない。
【００１７】
Ｍｕｒａｓｅ及びＩｍａｍｕｒａへの特許文献５は、カタルピック酸及びプニカ酸の合成に伴われた遺伝子を複製する方法を教示する。この技術が、プニカ酸の酵素的な生産に有用なものであることもある一方で、それは、ほ乳類の免疫応答を向上させるための、又は、代謝性の障害を予防するための、プニカ酸の使用を教示しない。
【００１８】
特許文献６及び特許文献７のような他の特許は、共役したトリエン系の脂肪酸又はエステルを重合させると共にプニカ酸を使用する合成樹脂を改善する方法を教示する。しかしながら、いずれの特許も、免疫系におけるプニカ酸の医療的な効果を教示しない。
【００１９】
さらに、ザクロの種子の油の使用を、人間の胸の腺癌の（ＭＣＦ−７）細胞の増殖及び生存に対して有用なものであることを示してきた一方で、局所的な投与を使用する試験管内の研究のみが、完了されてきた（特許文献１０）。他の研究は、ザクロの油の使用が、化学的に誘起した皮膚癌のマウスモデルにおける腫瘍の処置に有効なものであることを、示してきた（特許文献７）。
【特許文献１】米国特許第６，６３０，１６３号明細書
【特許文献２】米国特許第６，０３０，６２２号明細書
【特許文献３】米国特許第６，０６０，０６３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８９１，４４０号明細書
【特許文献５】特開２００２−２３８５６６号公報
【特許文献６】英国特許第１４６６４１８号明細書
【特許文献７】英国特許第７５８７２４号明細書  ［参考文献一覧］
【非特許文献１】Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｎｕｒｓｅｒｙ  ｐｉｇｓ  ｏｆ  ｄｉｒｔｙ  ａｎｄ  ｃｌｅａｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｇｒｏｗｔｈ，  ｅｍｐｔｙ  ｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ．”Ｊ  Ａｎｉｍ  Ｓｃｉ  ７９（３）：７１４−２１．
【非特許文献２】Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）．“Ｄｉｅｔａｒｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｃｄ８  （＋）  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．”  ＪＮｕｔｒ  １３１（９）：２３７０−７．
【非特許文献３】Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，Ｒ．Ｈｏｎｔｅｃｉｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．“Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８  （＋）  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｖｉｒａｌ  ｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．”Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０（９−１０）：１４３５−４４．
【非特許文献４】Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，Ｒ．Ｍ．Ｐｏｇｒａｎｉｃｈｎｉｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．“Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｌｉｎｏｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ｖｉｒａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ａ  Ｐｉｇ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｖｉｒａｌｌｙ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．”  ＪＮｕｔｒ  １３３：３２０４−３２１４．
【非特許文献５】Ｂａｓｓａｇａｎｙａ−Ｒｉｅｒａ，Ｊ．，Ｋ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＰＡＲ  ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｄｅｌｔａ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．”Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２７（３）：７７７−９１．
【非特許文献６】Ｃａｍｉｌｌｅｒｉ，Ｍ．（２００３）．“ＧＩ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２−２００３：Ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ｉｎ  ｒｅｖｉｅｗ．”  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １：４１５−４２０．
【非特許文献７】Ｈｏｒａ，Ｊ．Ｊ．，Ｅ．Ｒ．Ｍａｙｄｅｗ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．  “Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｓｅｅｄ  ｏｉｌ  ｏｎ  ｓｋｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ＣＤ１  ｍｉｃｅ．”Ｊ  Ｍｅｄ  Ｆｏｏｄ  ６（３）：１５７−６１．
【非特許文献８】Ｈｏｒｎｕｎｇ，Ｅ．，Ｃ．Ｐｅｒｎｓｔｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  Ｄｅ１ｔａ１１Ｄｅｌｔａｌ３−ｄｏｕｂｌｅ  ｂｏｎｄｓ  ｂｙ  Ｄｅｌｔａｌ２−ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  （１，４）−ａｃｙｌ−ｌｉｐｉｄ−ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  ｉｎ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  ｓｅｅｄｓ．”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９（１９）：４８５２−９．
【非特許文献９】Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｊ．Ｋｏｈｎｏ−Ｍｕｒａｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．“Ｄｅｌｔａ  １２−ｏｌｅａｔ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｔｒａｎｓ−ｄｅｌｔａ  １１，  ｃｉｓ−ｄｅｌｔａ  １３  ｄｏｕｂｌｅ  ｂｏｎｄｓ．”ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（７）：４６０３−１０．
【非特許文献１０】Ｋｉｍ，Ｎ．Ｄ．，Ｒ．Ｍｅｈｔａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．“Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｔｕｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｐｏｍｅｇｒａｎａｔｅ  （Ｐｕｎｉｃａ  ｇｒａｎａｔｕｍ）  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．”Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ７１：２０３−２０７．
【非特許文献１１】Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｒ．，Ｍ．Ａｂｒｅｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｃｏｌｉｔｉｓ，Ｔｈｅ  ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｈｅａｌｔｈ  ｃａｒｅ  ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，ＬＬＣ．
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【非特許文献１３】Ｒｕｂｉｎｓ，Ｈ．Ｂ．ａｎｄ  Ｓ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓ（２０００）．“Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＶＡ−ＨＩＴ  ｓｔｕｄｙ．”Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ８６（５）：５４３−４．
【非特許文献１４】ＳＡＳ（１９８８）．ＳＡＳ／ＳＴＡＴ  Ｕｓｅｒ’ｓ  ｇｕｉｄｅ（ｒｅｌｅａｓｅ  ６．０．３１．Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔ．Ｉｎｃ．
【非特許文献１５】Ｓａｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｌ．Ｊ．，Ｐ．Ｂｅｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）．“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｌｐｈａ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ  Ｉｄ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｃｏｌｉｔｉｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １１９（１）：１１９−２８．
【非特許文献１６】Ｓｔｒｏｂｅｒ，Ｗ．，Ｉ．Ｊ．Ｆｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）．“Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．”Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０：４９５−５４９．
【非特許文献１７】Ｖｏｈｌ，Ｍ．Ｃ．，Ｒ．Ｓｌａｄｅｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）．“Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎｄ  ｖｉｓｃｅｒａｌ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｍｅｎ．”Ｏｂｅｓ  Ｒｅｓ  １２（８）：１２１７−２２．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２０】
上述した必要性に応じて、本発明は、それの必要性における、ほ乳類及び人類を含む、動物の免疫応答を向上させる方法を提供する。その方法は、プニカ酸、それのエステル、それの薬学的に適切な塩、それの代謝物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される治療的に有効な量の化合物を投与することを含む。その化合物は、単一の用量又は多重の用量で動物へ投与されることもある。この方法は、ほ乳類及び人類を含む、動物の免疫応答を向上させるために、天然の量のプニカ酸を利用する。
【００２１】
ここに提供された方法は、プニカ酸が、免疫応答を向上させると共に免疫炎症性の（即ち、ＩＢＤ、アレルギー及び自己免疫性の疾患）及び代謝性の障害（即ち、肥満症及びタイプ２の糖尿病）を処置するための予防的な又は治療的な化合物として使用されることもあることを示す。プニカ酸は、また、ＩＢＤを予防する又は改良するために現今利用された他の薬理学的な処置の効力をさらに向上させることにねらいを定めた補助治療における見込みを示す。
【００２２】
従って、動物における免疫の障害を処置する方法が、提供されるが、ここで、免疫の障害を処置するために有効なある量のプニカ酸の化合物が、動物へ投与される。いずれの形態のプニカ酸も、使用されることがある一方で、好適な実施形態においては、遊離な酸の形態のプニカ酸が、使用される。
【００２３】
本発明の好適な実施形態においては、プニカ酸の化合物は、動物へ経口的に投与される。プニカ酸の化合物は、単独で又は薬学的に適切な担体との組み合わせで投与されることもある。
【００２４】
プニカ酸の化合物は、また、非経口的に、注射を介して又は直腸に、投与されることもある。プニカ酸の化合物は、単独で又は薬学的に適切な賦形剤との組み合わせで投与されることもある。
【００２５】
本発明の別の実施形態においては、治療的に有効な量のプニカ酸の化合物が、栄養の食品の補足との組み合わせで、動物へ投与される。このような補足は、幼児の処方箋、子供の製品、老人の処方箋、牛乳、チーズ、ケフィア、穀物のバー、体重管理の処方箋、エネルギーバー、他の人間の食品、機能性食品、及び動物の飼料を含むが、しかしそれらに限定されない。
【００２６】
プニカ酸は、また、ビタミン類又は他の脂肪酸のような他の活性な処方成分との組み合わせで投与されることもある。
【００２７】
プニカ酸の化合物の有効な量は、動物の必要性に依存する。例えば、一つの実施形態においては、動物における免疫応答を向上させるために有効な量が、提供される。
【００２８】
別の実施形態においては、ウイルス性の抗原、具体的にインフルエンザの抗原に対する免疫応答を向上させるために有効なある量のプニカ酸の化合物は、動物に投与される。
【００２９】
別の実施形態においては、動物の免疫系の発達を向上させるために有効なある量のプニカ酸の化合物が、投与される。プニカ酸の量は、好ましくは、胸腺、脾臓、リンパ節、腸管における消化管に関連したリンパ系の組織、及び、他の粘膜の表面を含むが、しかしそれらに限定されない、一次的な及び二次的なリンパ系の器官及び免疫の細胞の発達を向上させるために有効なものである。
【００３０】
別の実施形態においては、炎症性の腸の疾患（ＩＢＤ）を処置するために有効なある量のプニカ酸の化合物が、動物へ投与される。具体的には、ＩＢＤと関連した臨床的な兆候及び腸管の病変を予防する又は改良するために有効な量が、投与される。
【００３１】
別の実施形態においては、タイプ２の糖尿病及び肥満症を処置するために有効なある量のプニカ酸の化合物が、動物へ投与される。具体的には、健康を害したブドウ糖の許容値を正常化する、高血糖症を予防する、高インシュリン血症を予防する、及び、腹部の脂肪の集積を最小にするために有効な量が、投与される。
【００３２】
さらに別の実施形態においては、動物におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の水準を増加させるために有効なある量のプニカ酸の化合物が、投与される。プニカ酸の化合物の量は、好ましくは、悪化した免疫応答、アレルギー、過敏症の反応、又は、自己免疫反応を予防する一方で、Ｔ細胞の水準を増加させるために有効なものである。
【００３３】
別の実施形態においては、ほ乳類及び人類を含む、動物における免疫抑制を予防するために有効なある量のプニカ酸が、動物へ投与される。具体的には、幼児、子供、高齢者及び他の危険な状態にある人口における免疫抑制を予防するために有効な量が、投与される。
【００３４】
本発明は、また、経口的に又は非経口的に安全な及び有効な量のプニカ酸を投与するステップを含む、ほ乳類の主体におけるウィルス性の及び／又は細菌性の感染を予防する又は処置する方法を提供する。好ましくは、その方法は、免疫機能を増加させることを含むと共に、それによって、主体の免疫機能を増加させることによって、ウィルス性及び／又は細菌性の感染を処置する。
【００３５】
また、本発明によって提供されるのは、好ましくは主体における免疫機能を増加させることを含む、ウィルス性及び／又は細菌性の感染を予防する又は処置するために組成物の製造におけるプニカ酸の使用である。
【００３６】
本発明は、また、腸管の免疫の又は炎症性の障害を予防する又は改良するための組成物の製造におけるプニカ酸の使用を提供する。
【００３７】
本発明のさらなる態様は、免疫系の発達を増加させるための組成物の製造におけるプニカ酸の使用、免疫機能を増加させるための医薬の製造におけるプニカ酸の使用、及び、ウィルス性の及び／又は細菌性の感染を予防すること若しくは処置すること、腸管の免疫の又は炎症性の障害を予防すること若しくは改良すること、免疫系の発達を増加させること、又は免疫機能を増加させることにおける使用のためのプニカ酸である。
【００３８】
本発明は、また、処方箋の組成物において安全な且つ有効な用量のプニカ酸を添加するステップを含む、幼児の処方箋、老人の処方箋、牛乳、チーズ、ケフィア、穀物のバー、体重管理の処方箋、他の人間の食品、及び、動物の飼料の栄養の質を改善する方法を提供する。
【００３９】
本発明において開示されたプニカ酸の調合物は、単位服用量の形態で便利に与えられることもあると共に、製薬業又は栄養学の当技術において周知ないずれの方法によっても調製されることもある。可能な調合物は、カプセル、カシェ剤、錠剤、巨丸剤、又は、舐剤を含むが、しかしそれらに限定されないと共に、各々は、所定の量のプニカ酸を含有する。
【００４０】
好都合には、それの必要性において動物へ投与されることもあるプニカ酸の量に対する上限が無い。さらに、本発明の方法は、全ての年齢及び健康の、ほ乳類及び人類を含む、動物へ投与されることもある。例えば、高齢者の、肥満体の、糖尿病の、病気の、又は、非常に若いもののような脆弱な人口は、免疫抑制の経歴の無い健康的な個人であり得るように、本発明から利益を得ることができる。加えて、本発明の方法は、多種多様な方式で、投与されることもあると共に、それによって、免疫応答を向上させると共にほ乳類における代謝性の障害を予防する多角的な及び効率的な手段を提供する。
【００４１】
本発明の範囲は、付随する図面と関連して、後に続く発明の好適な実施形態の詳細な説明から、より十分に明らかになると思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
［定義］
以下に続く定義は、本出願のいたるところで使用される。
【００４３】
抗原：抗体の分子又はＴ細胞の受容体によって束縛されることもあるいずれの物質
ＡＮＯＶＡ：分散の分析。変動の源に基づいてデータの組みにおける全体的な分散を特異的な構成成分へと仕切るための算出的な仮定。処置の群の間における数の差異が、統計的に有意なものであるか否かを決定することが、使用されてきた。
【００４４】
脂肪生成：それによって新しい脂肪細胞又は脂肪蓄積細胞が発生させられる過程。
【００４５】
ＣＤ１９：クラスター分化１９。Ｂ細胞の表面に表現されたタンパク質。
【００４６】
ＣＤ４：クラスター文化４。ヘルパーＴ細胞の表面に見出された補助受容体。
【００４７】
ＣＤ３：クラスター文化３。全てのＴ細胞の表面に見出された補助受容体。
【００４８】
ＣＤ８：クラスター文化８。細胞毒性Ｔ細胞の表面に見出された補助受容体。
【００４９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞：ヘルパーＴ細胞。抗原に対する他の免疫細胞の活性を変調するタンパク質を分泌する細胞。
【００５０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞：細胞毒性Ｔ細胞。腫瘍細胞、ウィルス感染した細胞、及び細胞内のバクテリアで感染した細胞を含む、異常な細胞を機能不全にする又は破壊することが可能な細胞。
【００５１】
Ｃｏｎ  Ａ：コンカナバリンＡ。リンパ球の増殖を誘起する分裂促進因子。ＣｏｎＡでのリンパ球の刺激が、免疫機能における食物の介入の効果を検査するために広く利用されてきた。
【００５２】
ｃＲＰＭＩ：完全なＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの培地。長期間の細胞の生存に必要な全ての栄養を含有させるために処方された細胞培養培地。培地及び試薬の調整の下に示した詳細な組成。
【００５３】
ＤＳＳ：デキストラン硫酸ナトリウム。結腸の上皮細胞の死亡を引き起こすと共に結腸の炎症を誘起するために水（２．５％重量／容積）を飲むことによって投与された化学物質。ＤＳＳ結腸炎モデルは、実験的なＩＢＤの良く確立されたモデルである。
【００５４】
抗原決定基：特異的に抗体によってか又はＴ細胞の受容体によってかのいずれかで認識される主要な組織適合性の複合体１又は２に与えられた抗原の一部。
【００５５】
ＦＡＣＳ：蛍光で活性化した細胞の選別。細胞表面マーカーの内部移行を予防するためのフローサイトメトリーの用途に使用された特別な緩衝剤。培地及び試薬の調整の下に示した詳細な組成。
【００５６】
糖血症：血液におけるブドウ糖の濃縮。
【００５７】
高血糖症：正常な範囲を超えた血液におけるブドウ糖の増加した濃縮。
【００５８】
高インシュリン血症：正常な範囲を超えた血液におけるインシュリンの増加した濃縮。
【００５９】
ＩＢＤ：炎症性の腸の疾患。二つの臨床的な発現−クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）−によって特徴付けられた腸管の免疫炎症性の疾患。
【００６０】
インシュリン血症：血液におけるインシュリンの濃縮。
【００６１】
ｍＡｂ：単クローン性抗体。タンパク質の特異的な領域へ束縛する特異的な抗原性の刺激に応答してＢ細胞によって生産された抗体。
【００６２】
機能性食品：栄養的な利益のみならず特異的な医薬の利益を伴った化合物。
【００６３】
ＰＢＳ：リン酸塩で緩衝された生理食塩水。細胞の培養の用途に使用された緩衝剤。細胞を、より栄養価の高い緩衝剤への移行の前における時間の短い期間にＰＢＳ中で再懸濁することができる。培地及び試薬の調整の下に示した詳細な組成。
【００６４】
ＴＣＲ：Ｔ細胞の受容体。特異的な抗原を認識するＣＤ３の分子と常に共同で表現される、Ｔリンパ球の表面に表現されたタンパク質。抗原の認識の後に続けて、それは、リンパ球を活性化させると共に、抗原に対して免疫応答を開始する。
【００６５】
タイプ２の糖尿病又は非インシュリン依存性の真性糖尿病：インシュリンの作用に対する細胞の無応答性によって引き起こされたより一般的なタイプの糖尿病。細胞が、インシュリンに対して応答しないとすれば、それらは、血液からブドウ糖を取り上げることができないものであり、それは、ブドウ糖毒性に帰着する。付加的に、細胞は、ブドウ糖の酸化から誘導されたエネルギーから剥奪される。
【００６６】
［プニカ酸］
ここに使用されるような用語のプニカ酸は、Ｃ１８の炭素鎖におけるシス−９、トランス−１１、シス−１３の二重結合を含有する共役したリノレン酸の異性体、それの非毒性の塩、活性なエステル、活性な異性体、活性な代謝物、プニカ酸を含有する構造的な脂質、及び、それらの混合物を指す。プニカ酸は、また、トリコサン酸（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｉｃ  ａｃｉｄ）として知られると共にプニカザクロ皮（ザクロ科、ザクロ）及びへびうり（ウリ科、からすウリ）の種子の油に見出される。プニカ酸は、ザクロの種子の油のおおよそ８６％を構成する。非毒性の塩は、例えば、モノ−、ジ−、及びトリ−グリセリド並びにそれらの混合物のみならず、アルキル基に１個から６個までの炭素原子を有するアルキルエステルを含む。プニカ酸の活性な異性体は、エレオステアリン酸（シス−９、トランス−１１、トランス−１３のオクタデカトリエン酸）のような幾何異性体及びそれの非毒性の塩（例えば、ナトリウムの塩、カリウムの塩、カルシウムの塩、及びマグネシウムの塩）及びそれの活性なエステル（例えば、モノ−、ジ−、及びトリ−グリセリド並びにそれらの混合物のみならず、アルキル基に１個から６個までの炭素原子を有するアルキルエステル）を含む。
【００６７】
プニカ酸は、実質的に純粋な単一の化学的な化合物又は上に定義したような一つ以上のプニカ酸の化合物の混合物であってもよい。用語の“実質的に純粋な”は、少なくとも９０重量％、好ましくは少なくとも９８％のような少なくとも９５重量％、並びに、より好ましくは、なお約９９重量％及び１００重量％、の純度を有することを意味する。プニカ酸は、直接的に又は後に続く精製の一つ以上のステップのいずれかで、ザクロの種子の油から得ることが可能な又は得られた抽出物の形態にあってもよい。
【００６８】
プニカ酸は、酸素のフリーラジカルの酸化する、炎症、及び破壊の機能に抵抗するための極度に強い能力を有する。プニカ酸が、体における癌の進行を遅延させることのみならず強膜じゅく腫（ｓｃｌｅｒａｔｈｅｒｏｍａ）を予防することは、示されてきた。プニカ酸は、生理学的には、血漿のコレステロールを低下させるための抗酸化剤として作用する。さらに、プニカ酸は、人間の血小板における凝集及びアラキドン酸の代謝について試験管内で阻害の効果を有する。手短に言えば、プニカ酸は、ちょうど今少数の例を挙げると、医療及び健康の保護、食品、及び、化粧品産業における広範な用途の見込みを有する。
【００６９】
記載した方法で使用されたプニカ酸は、遊離な酸の形態にあってもよく、又はエステル結合を通じて化学的に束縛されてもよい。それの天然の形態においては、プニカ酸は、熱に安定なものである。プニカ酸は、それの天然の油の状態で、又は、乾燥した且つ粉末化された形態で、使用されることもある。さらに、プニカ酸の遊離な酸の形態は、塩基性のｐＨでのアルカリの水酸化物と化学的に等価な量の遊離な酸の形態を反応させることによって、ナトリウム、カリウム、又はカルシウムの塩のような非毒性の塩へと転換されることもある。
【００７０】
［投与］
本発明の方法の過程で、治療的に有効な量のプニカ酸の化合物が、ほ乳類及び人類を含む、動物へ投与される。好適な実施形態においては、プニカ酸の化合物が、経口的に又は非経口的に投与される一方で、医療の化合物又は煙霧剤を通じたもののような投与の他の形態は、また、予期される。
【００７１】
経口的な投与については、有効な量のプニカ酸が、例えば、固体、半固体、液体、又は気体の状態で、投与されることもある。具体的な例は、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、懸濁液、シロップ、及び、エリキシル剤を含む。しかしながら、プニカ酸の化合物は、これらの形態に限定されない。
【００７２】
本発明のプニカ酸を、錠剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液、又は懸濁液に調合するためには、プニカ酸の化合物は、好ましくは、結合剤、粉状化剤、及び／又、潤滑剤はと混合される。必要であれば、結果として生じる組成物は、知られた方法を使用して、希釈剤、緩衝剤、浸潤剤、防腐剤、及び／又は、調味料と混合されることもある。結合剤の例は、結晶性のセルロース、セルロース誘導体、トウモロコシデンプン、及びゼラチンを含む。粉状化剤の例は、トウモロコシデンプン、じゃがいもにデンプン、及び、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含む。潤滑剤の例は、滑石及びステアリン酸マグネシウムを含む。さらに、乳糖及びマンニトールのような添加剤が、また、使用されることもある。
【００７３】
非経口的な投与については、本発明のプニカ酸の化合物は、直腸に又は注射によって投与されることもある。直腸の投与については、座薬が、使用されることもある。座薬は、体の温度で溶融するがしかし室温で固体のままである薬学的に適切な賦形剤と本発明のプニカ酸を混合することによって、調製されることもある。例は、カカオ脂、炭素ワックス、又は、ポリエチレングリコールを含むが、それらに限定されない。結果として生じる組成物は、当分野に知られた方法を使用して、いずれの所望の形態にも成形されることもある。
【００７４】
注射による投与について、本発明のプニカ酸の化合物は、皮下的に、皮内的に、静脈内に、又は、筋肉内に、注入されることもある。このような注射のための医薬の薬物は、知られた方法によって水性の又は野菜の油、合成樹脂の酸のグリセリド、高級脂肪酸のエステル、若しくは、プロピレングリコールのような非水性の溶媒へと本発明のプニカ酸を溶解させること、懸濁させること、又は、乳化させることによって、調製されることもある。所望であれば、可溶化剤、浸透圧調整剤、乳化剤、安定化剤、又は、防腐剤のような添加剤が、また、添加されることもある。
【００７５】
本発明のプニカ酸を懸濁液、シロップ、又は、エリキシル剤へと調合するために、薬学的に適切な溶媒が、使用されることもある。
【００７６】
本発明のプニカ酸の化合物は、また、医薬の薬物を調製するための他の薬学的に適切な活性を有する付加的な化合物と一緒に、使用されることもある。
【００７７】
本発明のプニカ酸は、また、気体の又は液体の噴霧剤、必要であれば、膨張剤のような知られた補助剤と一緒に、液体又は微細な粉末の形態にプニカ酸を、煙霧剤の容器又は噴霧器のような非加圧の容器へと充填することによって調製された煙霧剤又は吸入剤の形態で投与されることもある。例えば、ジクロロフルオロメタン、プロパン、又は窒素の加圧された気体が、噴霧剤として使用されることもある。
【００７８】
プニカ酸は、錠剤、カプセル、溶液、又は乳濁液のような、薬学的な又は獣医学的な組成物として、それの必要性において、ほ乳類及び人類を含む、動物へ投与されることもある。本発明の好適な実施形態においては、プニカ酸の遊離な酸の形態が、投与される。しかしながら、単一の用量又は多重の用量で、それのエステル、それの薬学的に適切な塩、それの代謝物、及びそれらの組み合わせを含むが、しかしそれらに限定されない、プニカ酸の他の形態の投与は、また、本発明によって予期される。
【００７９】
プニカ酸は、また、食品又は機能性食品の補足としてのいずれかで、栄養の添加剤として、それの必要性において、動物へ投与されることもある。
【００８０】
用語の“予防すること又は処置すること”、“処置すること又は改良すること”、及びここに使用した類似の用語は、予防法及び全体的な又は部分的な処置を含む。それら用語は、また、症状を減少させること、症状を改良すること、症状の重症度を減少させること、疾患の発生率を減少させること、又は、治療的な成果を改善する患者の条件におけるいずれの他の変化をも含むこともある。
【００８１】
プニカ酸は、好ましくは、組成物の形態で、使用される及び／又は投与される。適切な組成物は、好ましくは、薬学的な組成物、食料、又は食品の補足である。これらの組成物は、その中にプニカ酸を搬送するための便利な形態を提供する。本発明の組成物は、酸化に関してプニカ酸の安定性を増加させるために有効な量で抗酸化剤を含むこともある。
【００８２】
投与されたプニカ酸の量は、好ましくは、日当たり約０．００１ｇから約２０ｇまで（より好ましくは、０．５ｇから５ｇまでのような、０．１ｇから１０ｇまで）のプニカ酸又はそれの誘導体である。適切な組成物を、それに応じて調合することができる。
【００８３】
本発明に従った好適な組成物は、食料である。食品の製品（その用語は、動物の飼料を含む）は、好ましくは、脂肪の相を含有するが、ここで脂肪の相は、プニカ酸を含有する。食料は、自由選択で、補完的な脂肪とのブレンドとして使用される。例えば、そのブレンドは、０．３〜９５重量％、好ましくは２〜８０重量％、最も好ましくは５〜４０重量％のプニカ酸、並びに、カカオ脂、カカオ脂の等価物、パーム油若しくはそれの留分、パームカーネル油若しくはそれの留分、前記の脂肪若しくはそれの留分のエステル交換された混合物、又は、ヒマワリ油、高オレイン酸のヒマワリ油、大豆油、菜種油、綿実油、魚油、ベニバナ油、高オレイン酸のベニバナ油、及び、トウモロコシ油のような液体の油のような、９９．７〜５重量％、好ましくは９８〜２０重量％、最も好ましくは９５〜６０重量％の補完的な脂肪を含むこともある。適切な食料の例は、マーガリン、脂肪に連続的な若しくは水に連続的な又は両方に連続的なスプレッド、脂肪が減少したスプレッド、チョコレート若しくはチョコレートコーティング若しくはチョコレートフィリング、又はベーカリーフィリングのような菓子の製品、アイスクリーム、アイスクリームコーティング、アイスクリームインクルージョン、ドレッシング、マヨネーズ、チーズ、クリームの代替品、乾燥したスープ、飲料、穀物のバー、ソース、スナックバー、乳製品、臨床の栄養製品、及び幼児の調合物からなる群より選択されるものを含む。
【００８４】
組成物の他の例は、錠剤、丸剤、カプセル、キャプレット；顆粒、ビーズ、ペレット、及びマイクロカプセル化された粒子を含む多数の微粒子；粉末、エリキシル剤、シロップ、懸濁液、及び溶液の形態におけるもののような、薬学的な組成物である。薬学的な組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤又は担体を含むこともあると共に、好ましくは非経口的な投与に（例えば、経口的に）適合させられる。経口的に投与可能な組成物は、固体又は液体の形態にあることもあると共に、錠剤、粉末、懸濁液、及びシロップの形態を取ることもある。自由選択で、組成物は、一つ以上の調味剤及び着色剤を含むこともある。
【００８５】
このような組成物における使用に適切な薬学的に許容可能な担体は、製薬業の技術において周知なものである。本発明の組成物は、０．１〜９９重量％のプニカ酸を含有することもある。本発明の組成物は、一般に、単位服用量の形態で調製される。好ましくは、プニカ酸の単位服用量は、１ｍｇから１０００ｍｇまで（より好ましくは、１００ｍｇから７５０ｍｇまで）である。これらの組成物の調製に使用された賦形剤は、当技術において知られた賦形剤である。
【００８６】
組成物についての製品の形態のさらなる例は、軟質のゲル、又は、ゼラチン、デンプン、変性したデンプン、ブドウ糖、ショ糖、乳糖及び果糖のようなデンプンの誘導体からなる群より選択されるカプセル化する材料を含む硬質のカプセルの形態におけるもののような食品の補足である。カプセル化する材料は、自由選択で、架橋又は重合剤、安定化剤、抗酸化剤、光に敏感な充填剤を保護するための光吸収剤、防腐剤、及び同様のものを含有することもある。好ましくは、食品の補足におけるプニカ酸の単位服用量は、１ｍｇから１０００ｍｇまで（より好ましくは、１００ｍｇから７５０ｍｇまで）である。
【００８７】
本発明の方法は、それの必要性において動物へ治療的に有効な量のプニカ酸の化合物を投与する。有効な量のプニカ酸は、投与されたプニカ酸の化合物の形態、投与の継続時間、投与の経路（例えば、経口的な又は非経口的な）、動物の年齢、及び、動物の健康状態に依存する。
【００８８】
例えば、動物における免疫応答を向上させるために有効なプニカ酸の量は、１０〜１０，０００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にわたる。プニカ酸の好適な有効な量は、１００から５，０００ｍｇ／ｋｇ／日までであると共に、より好適な用量は、１０から１００ｍｇ／ｋｇ／日までである。プニカ酸のおおよそ３５から４０ｍｇ／ｋｇ／日までの有効な量は、また、本発明の方法によって、想像されると共に、３８ｍｇ／ｋｇ／日は、好適な用量である。受給者の食物が、必要な必須の脂肪酸を含有する限り、プニカ酸が、相対的に非毒性のものであると、投与されるものである有効な量の上限は、臨床的なものではない。
【００８９】
ＵＣ及びＣＤを含む、ＩＢＤを処置する及び予防するために有効なプニカ酸の量は、１００から１５０ｍｇ／ｋｇ／日の好適な用量と共に、５０から５００ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にわたることができる。
【００９０】
プニカ酸の有効な量は、１５から５０日までの好適な期間及び３０から４２日までの最も好適な期間と共に約７から１００日までの範囲にわたる期間で投与されたとき、動物の免疫応答を向上させる際に、最も有効なものである。
【００９１】
１００から１５０ｍｇ／ｋｇ／日までの好適な用量と共に、４０から５００ｍｇ／ｋｇ／日までの範囲にわたることができる、ある量のプニカ酸は、タイプ２の糖尿病及び肥満症を予防する及び処置する際に、最も有効なものである。
【００９２】
本発明のプニカ酸の化合物の有効な量が、栄養の、医療の、獣医学の組成物で投与されるとき、好適な用量は、食品又は機能性食品の製品に対して約０．０１から２．０％重量／重量までの範囲にわたる。
【００９３】
本発明は、細菌性の若しくはウィルス性の感染、又は、細菌性の若しくはウィルス性の感染によって引き起こされた疾患若しくは障害、の処置を伴うこともある。細菌性の感染の例は、例えば、黄色ブドウ球菌、好水性アエロモナス、レジュネラ・ニューモフィラ菌、又は、バチルスラテロスポラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）を含むが、しかしそれらに限定されない、ブドウ球菌属、アエロモナス属、レジオネラ属、桿菌属、又は、球菌属から微生物によって引き起こされた感染を含む。ウィルス性の感染は、例えば、後に続く、ピコナウィルス、トガウィルス、パラミキソウィルス、オルトミキソウィルス、ラブドウィルス、レオウィルス、レトロウィルス、ブニヤウィルス、コロナウィルス、アレナウィルス、パルボウィルス、パポバウィルス、アデノウィルス、ヘルペウィルス、及び、ポックスウィルスの一つによって引き起こされたものを含む。
【００９４】
免疫系が不全なものである疾患又は障害の例は、例えば、（化学療法におけるもののような）薬物での処置から結果として生じる疾患又は障害、栄養失調、及び（例えば、ＨＩＶ及びＡＩＤＳのようなウィルスでの）感染を含む。
【００９５】
［プニカ酸の調製］
プニカ酸の豊富なザクロの油が、ザクロの種子から先に単離されてきたと共に抗癌原物質として記載されてきた（非特許文献１０、非特許文献７）。ザクロの種子は、それらのジュースサックから分離され、水で洗浄され、且つ、対流乾燥器において乾燥させられた。油の押し出しは、タイプ４０Ａの電気的スクリュープレス（Ｓｋｅｐｐｓｔａ  Ｍａｓｋｉｎ，Ｏｒｅｂｒｏ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、８０℃での“冷圧”によって行われた。結果として生じる油は、油のグラム当たり４８０ｍｇのプニカ酸を含有した。プニカ酸を、また、当分野で知られた方法を通じた酵素的な生合成によって得ることができる（非特許文献９、非特許文献８）。
【００９６】
しかしながら、プニカ酸の抽出の酵素的な合成及び冷圧の方法が、非効率的なもの（例えば、１０％の収率）であるために、溶媒抽出の方法が、推奨される。溶媒抽出の前に、種子は、酵素的な加水分解を減少させるために、蒸気で加熱されると共に過程を改善する。加熱した後、種子は、微細に粉砕されると共に溶媒抽出に使用される。ヘキサンのような正規な液体の溶媒は、攪拌すること、濾過すること、及び溶媒の蒸発と共に、１２から２０時間までの間に多数回、種子を浸すことを要求する。あるいは、プニカ酸が豊富なザクロの油は、当技術において知られたＣＯ２の超臨界の抽出方法によって発生させられることもある。
【００９７】
油が、種子から解放されたとき、酸化の過程に対してより感受性のものであるために、抽出は、好ましくは、空気との接触を予防するために、窒素ブランケットの下で行われる。加えて、油は、窒素で清掃されると共に、より長い期間の貯蔵の間に４℃で又は−２０℃で暗闇において一つ又は様々な抗酸化剤と共に貯蔵される。ザクロの種子からの油は、種子の重量の１８％の重量の量でこの過程の間に表現される。
【００９８】
本発明の実践は、後に続く実験によってさらに図説される。実験の節において参照された全ての刊行物、特許、及び特許出願は、ここでは参照によって組み込まれる。前述の明細書においてこの発明を、それのある一定の好適な実施形態に関係して記載してきたと共に多くの詳細を、図説の目的のために述べてきた一方で、本発明が、付加的な実施形態に対して許容できるものであること、及び、ここに記載したある一定の詳細を、本発明の基本的な原理から逸脱することなくかなり変動させてもよいことは、当業者には、明らかなことであると思われる。
【００９９】
後に続く限定しない例は、本発明を図説すると共にいずれの方式にもそれの範囲を限定しない。例において、及び、この明細書のいたるところで、全ての百分率、部、及び比は、別に示唆されない限り、重量によるものである。
【０１００】
｛実験｝
［実験１］
（目的）
ＩＢＤ及び結腸炎に関連した疾患におけるプニカ酸の効果を決定すること。
【０１０１】
（方法）
第一の実験においては、十一（１１）匹のＣ５７ＢＬ６マウスに、三十八（３８）日間に１００ｇの食品（１％のザクロ油）／ゼロ又は０．６ｇのプニカ酸を供給した。食物は、対照の食物においてリノレン酸でプニカ酸を置き換える（重量／重量の基準）ことによって、等カロリーに作られた。実験の日３２（マウスを犠牲にすることに先立つ七日）で、腸管の炎症を、マウスを、２．５％のＤＳＳ、飲料水における３６，０００から４０，０００モル／重量（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）で攻撃することによって誘発させた。ＤＳＳの結腸炎のモデルを含む、ＩＢＤの動物のモデルは、ＩＢＤの免疫学的な病因を探るための手段（非特許文献１６）及びプニカ酸のような新規な化合物の予防的な及び／又は治療的な効力を試験する安全な方法を表す。ＤＳＳ攻撃の鍵となる特徴の一つは、上皮細胞の障壁を妨害すると共に正常な管腔の及び粘膜の微生物相への増加した細胞の露出を促進するためのそれの能力である（非特許文献１６）。ＤＳＳ攻撃の後に続けて、マウスを、日々の基準で計量したと共に盲式の観察者によって結腸炎と関連した疾患の臨床的な兆候（即ち、肛門周囲の汚れ、直腸の出血、下痢、及び起毛）について検査した。疾患の活性の指標及び直腸の出血のスコアを、先に出版された配合した臨床的な得点を使用して計算した（非特許文献１５、非特許文献５）。
【０１０２】
マウスを犠牲にした後、結腸、脳、腎臓、肝臓、及び脾臓を、マウスから摘出した。結腸を、計量したと共に後に続く０から３までの尺度（例えば、０＝病変無し及び３＝重度の病変）に従って巨視的な病変の重症度に基づいて盲式の観察者によって得点を付けた。結腸の含有物を、５ｍＬのシリンジに接続されたマウスの胃管栄養法のニードルを使用して無菌の１×ＰＢＳで結腸を穏やかにすすぐことによって洗浄した。他の組織を、ホルマリンのビーカーへ直接的に添加した。全ての試験体には、概ね、後に続く情報：１）マウスの番号、２）収集したデータ、３）実験の番号、４）溶媒のタイプ、及び５）組織のタイプ、をラベルした。結腸、脳、腎臓、及び肝臓の切片を、１０％の緩衝させた中性のホルマリン（Ｆｉｓｈｅｒ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）に固定し、その後にパラフィンに埋め込み、且つそして、組織学的な検査のために、区分し（６−μｍ）且つヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ及びＥ）染色剤（ＡＭＬ  Ｌａｂｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）で染色した。組織のスライドを、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｌｌｅｓ，ＶＡ）で検査し、且つ、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ２．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で処理した。
【０１０３】
結腸を、１）陰窩の損傷、及び２）再生、３）化生／過生、４）固有層の血管の変化、５）粘膜下組織の変化、及び６）炎症性の浸潤物の存在、の程度を含む配合した組織学的な得点で等級付けした。切片を、先のカテゴリーの各々について０から４までの範囲で等級付けしたと共に、データを、規格化された配合された得点で与えた。陰窩の損傷については、０＝何も無し、１＝基底の１／３、２＝基底の２／３、３＝表面の上皮の無傷のみ、４＝全体的な陰窩及び上皮の喪失である。上皮の腐食については、０＝腐食無し、１＝穏やかな病巣の腐食、２＝穏やかな多病巣の腐食、３＝結腸のいたるところでの顕著な潰瘍、４＝結腸の体系の喪失である。粘膜の厚さについては、０＝正常な厚さ、１＝厚さにおける穏やかな増加、２＝厚さにおける穏やかから重度の増加、３＝厚さにおける重度の増加、４＝腸管の管腔を閉塞する粘膜である。再生については、４＝組織の修復無し、３＝無傷でない表面の上皮、２＝陰窩の欠乏を伴った再生、１＝ほとんど完全な再生、０＝完全な再生又は正常な組織である。化生／過生については、０＝何も無し、１＝穏やかな杯状細胞、２＝重度の杯状細胞の化生、３＝杯状細胞の化生及び基底における及び腺の２／３まで延びる未成熟な細胞の存在、４＝基底における及び腺の２／３を超えて延びる未熟な細胞の存在である。血管の変化については、０＝何も無し、１＝固有層における穏やかな毛管の拡張、２＝固有層及び粘膜下組織における穏やかな毛管の拡張、３＝重度の毛管の拡張、４＝固有層の大出血である。固有層の白血球の浸潤物について、０＝正常な浸潤物（いくつかの好中球を備えた形質細胞及びリンパ球の行列に等しい）、１＝固有層における好中球の穏やかな増加、２＝粘膜下組織に向かって延びる好中球における穏やかな増加、３＝固有層及び／又は粘膜下組織における重度の好中球の帰巣性、４＝固有層及び／又は粘膜下組織における重度の好中球の帰巣性及び固有層の形質細胞のシフトである。脳、腎臓、及び肝臓を、経口的なプニカ酸の投与の安全性を評価するために収集した。
【０１０４】
統計的な解析を、分散の解析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。ＡＮＯＶＡを、先に記載したもの（非特許文献４）のようなＳＡＳ（非特許文献１４）の概ね線形のモデルの手順を使用して行った。確率の値（Ｐ＜０．０５）を備えた差異を、統計的に有意なものと考慮した。
【０１０５】
［結果］
プニカ酸が供給されたマウスにおける死亡率が、０％であったのに対して、対照群における結腸の炎症と関連した死亡率は、２．５％ＤＳＳ攻撃の日６によって５０％であった。対照の食物が供給されたマウスにおいては、臨床的な疾患が、ＤＳＳ攻撃の後６日まで現れなかったのに対して、対照のマウスにおける臨床的な疾患の平均の発症は、ＤＳＳ攻撃を開始した後、１日であった。平均で、直腸の出血は、それが、プニカ酸が補足された食物が供給されたマウスにおけるＤＳＳ攻撃の日７まで開始しなかったのに対して、対照−供給されたマウスにおけるＤＳＳ攻撃の日４で開始した。ＤＳＳ攻撃は、体重の喪失、結腸炎に関連した臨床的な疾患及び直腸な出血を誘発させたが、それらは、プニカ酸が補足された食物が供給されたものにおけるよりも対照の食物が供給されたマウスにおいては、より早く現れたと共により重度のものであった。図１Ａは、実験的に誘発させられたＩＢＤの代表的なものである、７日のＤＳＳ攻撃（２．５％，重量／容積）の間における体重の喪失における食物のプニカ酸（０．６ｇ／１００ｇ）及び等カロリーの対照の食物の効果を図説する。図１Ｂは、７日のＤＳＳ攻撃（２．５％，重量／容積）の間の直腸の出血における食物のプニカ酸（０．６ｇ／１００ｇ）及び等カロリーの対照の食物の効果を図説する。図１Ｃは、７日のＤＳＳ攻撃（２．５％，重量／容積）の間の疾患の活性の指標における食物のプニカ酸（０．６ｇ／１００ｇ）及び等カロリーの対照の食物の効果を図説する。マウスには、ＤＳＳ攻撃に先立つ３２日の間にプニカ酸が補足された食物が供給された。結腸炎に関連した疾患が、改善された。結腸の炎症の臨床的な兆候の予防又は改良は、プニカ酸が供給されたマウスにおけるより低い結腸の重量及び病変の巨視的な解析におけるより少ない重度の得点と相関した。
【０１０６】
具体的には、ＤＳＳ攻撃の後に続けて、対照の食物が供給されたマウスの結腸における（０から３までの尺度における）平均の巨視的な得点は、プニカ酸が供給されたマウスにおける得点が１．４であったのに対して、３であった。対照−供給されたマウスにおける平均の結腸の重量は、平均したプニカ酸が供給されたマウスのものが０．１５３グラムであったのに対して、０．９５８グラムであった。これらのより低い結腸の重量及びより穏やかな病変を、結腸への低減された炎症性の細胞の移動によって、引き起こすことができる。顕微鏡下での結腸のＨ及びＥ染色されたスライドの組織病理学的な検査は、対照の食物が供給されたマウスが、結腸の粘膜の厚さの増大、上皮の腐食、及び、炎症性の細胞の浸潤を与えたのに対して、プニカ酸が供給されたマウスでは主要な病変を明かさなかった。２０倍で、図２Ａと比較したとき、上皮の表面の喪失が、図２Ｃにおいて観察された。４０倍の倍率で、図２Ｅ及び２Ｆは、炎症性の細胞の浸潤物、上皮細胞の平坦化、及び上皮の腐食を示した。図２Ｂは、腐食又は浸潤無しに結腸の粘膜の厚さの増大を示した。図２Ｄは、上皮細胞がそれらの正常な柱状の形状を維持したことを示した。
【０１０７】
病理学的な発見の得点記録は、対照−供給されたマウスにおける結腸の病変の重症度が、プニカ酸が供給されたマウスにおけるものよりも大きいものであることを明らかにする（図１）。
【０１０８】
表１．２．５％のＤＳＳでの７日の攻撃の期間の後に続く組織学的な得点
【０１０９】
【表１】
2007538002.tif 000002
値は、最小自乗の平均±平均の標準誤差
＊値が、統計的に異なるものであることを図説する。
【０１１０】
ＩＢＤの目標の予防的な又は治療的なアプローチが、実質的な臨床的な改善を誘発させることを含むことが、一般に受け入れられる（非特許文献１１）。プニカ酸の経口的な投与は、有意な臨床的な及び病理学的な改善に帰着した。加えて、代謝に伴った鍵となる器官（即ち、肝臓及び腎臓）及び脳の巨視的な及び組織学的な（データを示さない）解析は、異常性の無いことを明らかにしたが、それは、利用された用量が、有効な且つ安全なものであったことを提案する。副作用は、研究の継続時間のいたるところで、観察されなかった。
【０１１１】
［実験２］
（目的）
免疫系の発達、リンパ球の数、及びリンパ球の機能におけるプニカ酸の効果を検査すること。
【０１１２】
（方法）
投与、服用量、及びプニカ酸の調製は、実験１におけるのと同じものであった。
【０１１３】
（培地及び試剤の調製）
各々の培地又は緩衝剤の調製の後に、最終生産物を、後に続く１）生産物の名前、２）調製のデータ、３）呼気のデータ、４）貯蔵の推奨、５）技術者のイニシャル、及び６）無菌性の状態、でラベルした。
【０１１４】
調製した第一の培地は、ｃＲＰＭＩであった。調合物は、炭酸水素塩の緩衝系並びにアミノ酸及びビタミン類の量における変質を利用する、一連の細胞の培地に基づく。ｃＲＰＭＩ培地は、正常な人間の及び新生物性の白血球の培養に使用されてきた。適切に補足されたとき、ｃＲＰＭＩは、新鮮な人間のリンパ球を含む、多くのタイプの培養された細胞の成長を支持するための広範な適用範囲を有する。ｃＲＰＭＩは、後に続く様式で調製された。
【０１１５】
ｃＲＰＭＩ：
【０１１６】
【表２】
2007538002.tif 000003
ｃＲＰＭＩの組成物は、当技術において周知のものである（非特許文献１又は２）。全ての構成成分は、無菌の層流の流動のフード部の下で組み合わせられると共に６０ミクロンの前フィルター（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）を備えた０．２２ミクロンの膜のフィルターを使用する濾過によって滅菌される。調製された媒体は、ｅｔｏｘａｃｌｅａｎで清浄にした（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、加圧滅菌された、無菌の、ねじキャップの、ガラスの、５００ｍＬのボトルにおいて調製される（１５ＰＳＩでの１２１℃で３０分）と共に、ラベルされ、且つ、４℃で貯蔵される。
【０１１７】
ＦＡＣＳ及びＰＢＳの緩衝剤は、後に続く濃度に従って調製された。
【０１１８】
ＦＡＣＳの緩衝剤：
【０１１９】
【表３】
2007538002.tif 000004
処方成分を組み合わせた後で、ＦＡＣＳ緩衝剤は、ラベルされると共に４℃で貯蔵される。
【０１２０】
ＰＢＳ（１×）：
【０１２１】
【表４】
2007538002.tif 000005
ＰＢＳ（１０×）：
【０１２２】
【表５】
2007538002.tif 000006
＊脱イオン水を、Ｅ−純粋な水の精製系から得た（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ  Ｉｎｔ．，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）。
【０１２３】
処方成分を組み合わせたと共に３０分間の攪拌した後で、その溶液を、１５ＰＳＩでの１２１℃で３０分の間に加圧滅菌した（Ｂｒｉｎｋｍａｎ，Ｔｕｔｔｎａｕｅｒ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌ）。ｐＨを、いずれかの濃縮した塩酸又は炭酸水素ナトリウムを添加することによって、７．２まで調節した（ＡＲ１５  ＰＨ／ＭＶ／ＴＥＭＰメーター，Ａｃｃｕｍｅｔ，Ａｒｖａｄａ，ＣＯ）。
【０１２４】
合計で二十二匹のＣ５７ＢＬ６のマウスを、実験２で使用した。全てのマウスは、１１−２３−０３に誕生し、１１−１６−０３に離乳させ、及び、１２−１９−０３から１−１５−０４まで実験の食物を供給した。合計で１０匹のマウスには、対照の食物を供給したと共に１２匹のマウスには、プニカ酸で補足された食物を供給した（０．６ｇのプニカ酸／１００ｇの食品）。マウスを、毎週の基準で計量した。マウスを、安楽死させ、血液を、血清を発生させるための各々のマウスから収集したが、それを、−２０℃で貯蔵した。胸腺、脾臓、及び結腸のリンパ節を、摘出し、計量し、且つ、無菌の状態でｃＲＰＭＩに収集した。結腸及び肝臓の試験体を、後にＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に収集したと共に遺伝子の表現の解析のために−８０℃で凍結させた。脳、腎臓、肝臓、結腸、及び、回腸を、また、１０％の緩衝した中性のホルマリン溶液に収集したと共に、組織学的な評価のために実験１に記載したように処理した。死体の残留する部分を、５０ｍＬの円錐形の管に貯蔵させたと共に、体の組成物及び脂肪酸の解析のために−２０℃で凍結させた。全ての試験体を、概ね、後に続く情報：１）マウスの番号、２）収集したデータ、３）実験の番号、４）溶媒のタイプ、及び５）組織のタイプ、でラベルした。組織のスライドを、Ｏｌｙｍｐｕｓの顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｌｌｅｓ，ＶＡ）で検査した。画像を、Ｆｌａｓｈ  Ｂｕｓ  ＦＢＧソフトウェア（Ｉｎｔｅｇｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、取得したと共に、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ２．０（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で処理した。
【０１２５】
脾臓、胸腺、及び結腸のリンパ節を、氷上の完全なＰＲＰＭＩに収集した。単一の細胞の懸濁液を、３ｍＬのｃＲＰＭＩを含有するペトリ皿における二つのガラスのスライドの二つの凍らせた末端の間で、組織を穏やかに破壊することによって、各々の組織から得た。単一の細胞の懸濁液を、ペトリ皿から１５ｍＬのポリプロピレンの管（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）へ移行させたと共に４℃で５分の間に２００×ｇでのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離器（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）において遠心分離することによって洗浄した。上澄み液を、管のデカンテーションによって捨てた。細胞のペレットを、固体の表面に対して管を穏やかに軽くたたくことによって破壊した。各々のマウスにおける脾細胞、胸腺細胞、及び結腸のリンパ節のリンパ球の合計の数を、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）で数え上げた。手短に述べると、１０ｍＬのｉｓｏｔｏｎ  ＩＩの希釈剤の溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を、４０μＫの細胞の懸濁液が、４滴のＺａｐａｇｌｏｂｉｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ  ＦＬ）、及び、付加的な１０ｍＬのｉｓｏｔｏｎの溶液が後に続けて、計数バイアルに添加した。細胞を再懸濁させた容積を、５ｍＬの無菌のピペットを使用して、評価した。各々の管における細胞／ｍＬの濃度及び合計の容積を、各々の組織及びマウスにおける細胞の合計の量を決定するために、使用した。
【０１２６】
（流動細胞計測法）
流動細胞計測法は、リンパ球を含む、細胞の表現型を解析する効率的な、敏感な、及び定量的な方法を提供する。表面の膜における細胞の表現タンパク質を、特異的な集団又は分集団においてそれらを誘発させるために使用することができると共に増殖するための能力及び抗体などを生産するための能力のようなある一定の機能的な特性を暗示し得る。単クローン性の抗体（ｍＡｂｓ）は、種に特異的な様式で、これらのタンパク質（例えば、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ８、アルファベータ−ＴＣＲ、ガンマデルタ−ＴＣＲ、及びＣＤ１９）を束縛する。流動細胞計測法の適用については、ｍＡｂｓは、異なる蛍光の色素（例えば、フィコエリトリン、ＰＥ；フルオレセインイソチオシアナート、ＦＩＴＣ；ＣｙＣｈｒｏｍｅ、Ｃｙ）でラベルされる。流動細胞計測法は、現今では、調査（例えば、免疫表現すること、リンパ球の活性を測定すること、など）において、並びに、人間の免疫不全ウィルスに誘発されたリンパ球の消耗、白血病及びリンパ腫、移植の拒絶の監視の診断において、両方で利用されているものである。
【０１２７】
脾臓、胸腺、及び結腸のリンパ節におけるＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞の受容体（ＴＣＲ）アルファベータ＋、ＴＣＲガンマベータ＋、及びＣＤ１９＋のリンパ球におけるプニカ酸の効果を評価するために、プニカ酸が供給された及び対照の食物が供給されたマウスから回収された、脾細胞、胸腺細胞、及び結腸のリンパ節のリンパ球の表現型を、流動細胞計測法によって検査した。流動細胞計測法の使用の記載を、実験１に提供した。脾細胞の懸濁液は、浸透圧性の分解によって赤血球の遊離したものであった（１から２秒の間に４．５ｍＬの無菌の脱イオン水を添加すると共に、そして、１×ＰＢＳの溶液を作るために０．５ｍＬの１０×ＰＢＳを添加する）。細胞を、４℃で５分の間に２００×ｇでのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）において遠心分離することによって、再度洗浄した。上澄み液を、管のデカンテーションによって捨てた。細胞のペレットを、固体の表面に対して管を穏やかに軽くたたくことによって破壊した。ＦＡＣＳ緩衝剤（１ｍＬ）を、各々の管に添加した。脾細胞、胸腺細胞、及び、結腸のリンパ節から誘導された単核の細胞を、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）で数え上げたと共に、２×１０６個の細胞／ｍＬまで調節した。脾細胞、胸腺細胞、及び結腸のリンパ節を、先に記載したもの（非特許文献１又は２、非特許文献３、非特許文献４）のような流動細胞計測法によって、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、ＴＣＲアルファベータ、ＴＣＲガンマデルタ、及びＣＤ１９の分子の表現について解析した。手短に言えば、１００μｌの容積の脾細胞、胸腺細胞、及び、結腸のリンパ節のリンパ球の懸濁液を、丸底のマイクロタイターの板（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）へ添加したと共に、ＦＡＣＳ緩衝剤における５０μｌの一次的な抗体の溶液で染色した。抗マウスＣＤ８−ＰＥ（１：２００の希釈）、抗マウスＣＤ４−ＦＩＴＣ（１：５００の希釈）、抗マウスＣＤ３−ＣｙＣｈｒｏｍｅ（１：５００の希釈）、抗マウスアルファベータ−ＴＣＲ−ＰＥ（１：２００の希釈）、抗マウスガンマデルタ−ＴＣＲ−ＦＩＴＣ（１：５００の希釈）、及び、抗マウスＣＤ１９−ＰＥ（１：５００の希釈）。ＣＤ１９を、単色の解析で検査したのに対して、ＣＤ４及びＣＤ８の表現を、二色の解析で検査した。データの獲得を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣ  ＸＬ−ＭＣＬ流動細胞計測法（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を使用して、行った。データの解析を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔのソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、行った。
【０１２８】
（リンパ球の芽体形成の試験）
ｃＲＰＭＩ培地を、上に示したように調製した。９６個の井戸の平坦な底のマイクロタイターの板（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）の井戸には、井戸当たり２００μｌの合計の容積における２×１０５個の単核の細胞で接種した。井戸は、コンカナバリンＡ（５μｇ／ｍｌ，Ｃｏｎ−Ａ；Ｓｉｇｍａ）又は培地単独（刺激しなかった）のいずれかを含有した。板を、５％のＣＯ２の加湿された雰囲気において、３７℃で５日の間に温置した。５日の後に、１０μｌの培地における０．５μＣｉのメチル−［３Ｈ］チミジン（特異的な放射能６．７Ｃｉｍｍｏｌ−１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を、付加的な２０時間の間に温置された各々の井戸及び板へ添加した。井戸の含有物を、ＰＨＤ細胞収穫器（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を備えた繊維のフィルターへ摘出したと共に、組み込まれた放射能を、液体シンチレーション計数器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）によって測定した。試料を、三重に走らせたと共に、刺激の指標（ＳＩ）を、刺激した井戸の計数ｍｍ−１を、刺激してない井戸からの計数ｍｍ−１で割り算することによって、計算した。リンパ球の芽体形成の分析を、発明者によって先に記載されたもの（非特許文献１又は２、非特許文献３、非特許文献４）のように、行った。
【０１２９】
統計的な解析を、分散の解析（ＡＮＯＶＡ）によって行った。ＡＮＯＶＡを、先に記載したもの（非特許文献４）のようなＳＡＳ（非特許文献１４）の概ね線形のモデルの手順を使用して、行った。確率の値（Ｐ＜０．０５）を備えた差異を、統計的に有意なものと考慮した。
【０１３０】
（結果）
リンパ節は、二次的なリンパ系の器官であると共に、ウィルス及び細菌又は他の外来の抗原に対する免疫応答が、開始される。ガンマデルタＴ細胞の例外と共に、自生のリンパ球は、血液からリンパ節まで、及び、リンパ節から組織へと、再循環する。より密に占有されたリンパ節は、より強く開始すること及び外来の抗原に対してより有効な免疫応答に寄与することがありそうなものである。結果は、プニカ酸が供給されたマウスにおけるリンパ節におけるリンパ球の合計の数が、対照−供給されたマウスからのリンパ節のものよりも大きいものである（Ｐ＜０．００４３）ことを立証する。リンパ節の重量が、また、プニカ酸が供給されたマウスにおいて、数的に、より大きいものであった（２６１．６６ｍｇに対して２２３．３３）一方で、それは、統計的に有意なものではなかった。加えて、リンパ節のリンパ球の分集団の表現型の解析が、有意に膨張されたものであった、リンパ球の分集団が、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＴＣＲアルファベータ（αβ）＋Ｔ細胞を含んだことを明らかにする。プニカ酸が供給されたマウスにおけるＢ細胞の数は、有意に、対照の食物が供給されたマウスのものよりも大きいものではなかった。このデータは、人間を含む、プニカ酸が供給されたほ乳類が、プニカ酸が供給されてないものよりも有効なＴ細胞の応答を誘発させることができるものであることを提案する。この発見は、免疫系の発達、一般的な免疫の健康、及び、感染の疾患の耐性を変調することにおいて、ありそうな暗示を有する。表２は、プニカ酸又は対照の食物が供給されたマウスから回収されたリンパ節の間の差異を描く。
【０１３１】
表２：結腸のリンパ節の表現型の及び発達の解析
【０１３２】
【表６】
2007538002.tif 000007
値は、最小自乗の平均±平均の標準誤差である。
【０１３３】
＊値が、統計的に異なるものであることを図説する。
【０１３４】
脾臓は、免疫系の別の重大な器官である。脾臓で起こる出来事は、血液中で再循環するリンパ球に起こる変化の代表的なものである。プニカ酸が供給されたマウスにおける脾臓の重量は、有意に、対照が供給されたマウスのものよりも大きなものであった（Ｐ＜０．０１５１）。脾臓は、より大きい数のαβＴ細胞のおかげで、より大きいものであった（Ｐ＜０．０３５２）。リンパ球のこの集団は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞を含む（表３）。
【０１３５】
表３．脾臓の表現型の及び発達の解析
【０１３６】
【表７】
2007538002.tif 000008
値は、最小自乗の平均±平均の標準誤差である。
【０１３７】
＊値が、統計的に異なるものであることを図説する。
【０１３８】
胸腺は、免疫系の主要な器官であるが、ここで骨格の髄を起源としたＴ細胞の前駆体は、成熟すると共に成熟のＴ細胞へと分化するが、それらは、血流へと解放されると共に脾臓及びリンパ節のような二次的なリンパ球の器官を再度占有することができる。プニカ酸が供給されたマウスにおける胸腺の有意により大きい重量は、プニカ酸が、胸腺細胞の発達を好むことを示唆する。このより大きい胸腺の大きさ及び細胞充実度へ寄与した主要な占有は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋の二重の陽性の胸腺細胞であった。これらの胸腺細胞は、成熟のＣＤ４＋又はＣＤ８＋のＴ細胞の発生の前に、成熟のステップを表す。二重の陽性のリンパ球のいくつかは、ＣＤ４＋Ｔ細胞へと、及び、他のものは、ＣＤ８＋Ｔ細胞へと、分化することになる。これらのデータは、プニカ酸が、胸腺の発達に、及び、このように、免疫系の発達に、寄与することを立証する（表４）。
【０１３９】
表４：胸腺の表現型の及び発達の解析
【０１４０】
【表８】
2007538002.tif 000009
値は、最小自乗の平均±平均の標準誤差である。
【０１４１】
＊値が、統計的に異なるものであることを図説する。
【０１４２】
表１〜４は、プニカ酸が、免疫系（即ち、免疫器官の重量及び／又は細胞充実度）の発達を向上させると共にほ乳類におけるＴ細胞（即ち、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）の数を増加させることを示す。表５は、プニカ酸が、これらのリンパ球の機能的な能力を変調するか否かを検査する。具体的には、表５は、Ｔ細胞の分裂促進因子Ｃｏｎ  Ａでの刺激に対する応答におけるリンパ球の増殖の能力を図説する。結果は、プニカ酸が供給されたマウスから回収された脾細胞の増殖の能力が、対照の食物が供給されたマウスから回収されたものよりも有意に大きいものであることを示す。この発見の可能な用途は、ＰＵＡが供給されたマウスからのＴ細胞が、より急速に繁殖すると共に感染の間に病原体に対して応答することができることになることである。同じ数的な傾向を、リンパ節が誘導されたリンパ球の増殖の能力を比較するとき、観察することができる。しかしながら、リンパ節におけるこれらの数的な差異は、統計的に有意なものではなかった。
【０１４３】
表５．Ｃｏｎ  Ａでの刺激に対する応答におけるリンパ球の増殖
【０１４４】
【表９】
2007538002.tif 000010
値は、最小自乗の平均±平均の標準誤差である。
【０１４５】
＊値が、統計的に異なるものであることを図説する。
【０１４６】
［実験３］
（目的）
予防接種の後に続くインフルエンザウィルスの抗原に対する細胞の免疫応答におけるプニカ酸の効果を決定すること。
【０１４７】
（方法）
合計で二十五匹のＣ５７ＢＬ６のマウスを、実験３で使用した。１０匹のマウスには、対照の食物を供給したと共に１５匹のマウスには、プニカ酸で補足された食物を供給した（０．６ｇのプニカ酸／１００ｇの食品）。全てのマウスには、Ｆｒｅｕｎｄｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ免疫助成剤における１００μｇのＵＶで不活性化したインフルエンザウィルスの抗原からなるインフルエンザウィルス（ＶＲ−１４６９）のワクチンでの免疫処置に先立つ９週間に対照の又はプニカ酸で補足された食物のいずれかを供給した。マウスを、食物の補足の週１５で死亡させた。脾臓を、氷上の無菌のｃＲＰＭＩにおいて収集した。単一の細胞の懸濁液を、実験１に記載したような各々の組織から得た。単一の細胞の懸濁液を、ペトリ皿から１５ｍＬのポリプロピレンの管（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）へと移行したと共に、４℃で５分の間に２００×ｇでのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離器（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）において遠心分離することによって洗浄した。上澄み液を、管のデカンテーションによって捨てた。細胞のペレットを、固体の表面に対して管を穏やかに軽くたたくことによって破壊した。脾細胞を、Ｚ１  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）で数え上げた。手短に述べれば、１０ｍＬのｉｓｏｔｏｎ  ＩＩ希釈剤の溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を、４０μＬの細胞の懸濁液、４滴のＺａｐ−ｏｇｌｏｂｉｎ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）、及び付加的な１０ｍＬのｉｓｏｔｏｎの溶液が後に続けて、計数バイアルへと添加したと共に、機能的な分析に利用した。
【０１４８】
（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）増殖分析）
合計の２×１０７個の脾細胞を、ＣＦＳＥ増殖分析を行うために、分離した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。細胞を、５分間に遠心分離した（２００×ｇ）と共に上澄み液を吸引した。細胞が、遠心分離機にあった一方で、１ストックバイアルのＣＦＳＥを、９０μＬのジメチルスルホキシド（構成成分Ｂ）における１０ｍＭ（構成成分Ａ）まで希釈した。１０ｍＭのＣＦＳＥの溶液を、１μＭまで希釈した。合計で２×１０７個の脾細胞のペレットを、１ｍＬの５μＭのＣＦＳＥ溶液に再懸濁させたと共に、５％のＣＯ２の加湿された雰囲気において３７℃での暗闇で１０分の間に温置した。細胞を、再ペレット化したと共に１０％のウシ胎児血清を含有する３ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０において再懸濁させたと共に３７℃で予熱した。そして、細胞を、５％のＣＯ２の加湿された雰囲気において３７℃での暗闇で、付加的な１５分の間に温置した。１０％のウシ胎児血清を含有する３ｍＬの容積のＲＰＭＩ−１６４０を添加したと共に、細胞の懸濁液を、５分の間に遠心分離した（２００×ｇ）と共に上澄み液を、無菌のパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）ピペットを使用することによって吸引した。最後の二つのステップを、もう一度繰り返したと共に、そして、細胞を、ｃＲＰＭＩに再懸濁させた。ＣＦＳＥで染色した脾細胞を、数え上げたと共に、細胞の濃度を、ｃＲＰＭＩの２×１０６個の脾細胞／ｍＬまで調節した。細胞の懸濁液（１００μｌ）を、１００μｌの（刺激してない）培地又は培地プラス１０μｇ／ｍＬのＶＲ−１４６９のインフルエンザウィルスの抗原を含有する９６個の井戸の平坦な底のマイクロタイターの板へ添加した。試料を、各々の動物及び生体外の処置について六回の反復試験において走らせた。細胞を、５日間に５％のＣＯ２の加湿された雰囲気において３７℃で温置した。細胞が分割すると、ＣＦＳＥの膜の染色は、低減した平均の蛍光の強度に帰着することを縮小する。この特性は、平均の蛍光の色素に基づいた増殖するリンパ球と増殖しないリンパ球との間で区別するために、利用される。６日の周期の後に、同じ生体外の処置及びマウスの六個の井戸から培養した細胞を、貯めたと共に免疫表現するために調製した。１００μｌの容積のＣＦＳＥで染色した脾細胞を、丸底のマイクロタイターの板に添加した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）と共に、ＦＡＣＳ緩衝剤において５０μｌの一次的な抗体の溶液で染色した。抗マウスＣＤ８−ＰＥ（１：２００の希釈）、抗マウスＣＤ４−Ｂｉｏｔｉｎ（１：５００の希釈）、抗マウスＣＤ３−ＣｙＣｈｒｏｍｅ（１：５００の希釈）、抗マウスベータ−ＴＣＲ−ＰＥ（１：２００の希釈）、抗マウスガンマデルタ−ＴＣＲ−ＦＩＴＣ（１：５００の希釈）、及び、抗マウスＣＤ１９−ＰＥ（１：５００の希釈）。ＣＤ８に対するＣＤ４の染色は、ストレプトアビジン−Ｃｙｃｈｒｏｍｅを添加する余分なステップを要求したが、それは、ビオチンに束縛する。細胞の表面の表現型を、三色の解析において検査した。データの獲得を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＥＰＩＣ  ＸＬ−ＭＣＬ流動細胞計測法（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を使用して、行った。
【０１４９】
（結果）
実験２の結果が、食物のプニカ酸の補足が、一般の分裂促進的な刺激（増殖を誘発させる刺激）に対する応答において増殖する（繁殖する）ためのリンパ球の能力を向上させることを示唆する一方で、実験３の結果は、プニカ酸が、また、インフルエンザウィルス（フルウィルス）での予防接種の後に続くウィルスに対して応答するためのリンパ球の能力を向上させることを示す。実験３は、インフルエンザウィルスの抗原に対する免疫応答を規制するためのプニカ酸の能力を検査したと共に、プニカ酸の作用の細胞の標的（即ち、ＣＤ８＋のＴ細胞）の一つを特徴付けた。リンパ球の部分集合のインフルエンザウィルスに特異的な増殖を検査することによって、我々は、プニカ酸が、インフルエンザウィルスに対する応答におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の能力を向上させたことを見出した（表６）。この発見は、実験２で報告した先の結果と整合したものであると共にウィルス性の疾患の耐性及び予防接種された動物における一般的な冷たい及びフルの予防における暗示を有する。
【０１５０】
表６．インフルエンザウィルスの抗原での刺激に対する応答におけるリンパ球の部分集合に特異的な増殖
【０１５１】
【表１０】
2007538002.tif 000011
値は、最小自乗の平均±平均の標準誤差である。
【０１５２】
＊値が、統計的に異なるものであることを図説する。
【０１５３】
実験３は、また、長い期間の食物の補足の研究を表した（１０５日）。研究のいたるところで、マウスを、副作用又は臨床的な兆候について監視した。食物のプニカ酸の補足と関連した陰性の副作用は、研究のいたるところで観察されなかった。研究の終わりに、脳、腎臓、肝臓、心臓、及び肺臓は、収集されたと共に組織学的な解析のためにホルマリン中に固定された。Ｈ及びＥで染色したスライドは、これらの器官のいずれにも巨視的な病変の無いことを明らかにした。よって、プニカ酸は、有効に免疫機能を変調したが、しかし、また、１０５日の補足の周期の経過の間に安全なものであった。
【０１５４】
［実験４］
（目的）
高い死亡の食物によって誘発された肥満症の発達及びタイプ２の糖尿病におけるプニカ酸の効果を決定すること。具体的には、我々は、プニカ酸が、高い脂肪の食物が供給されたマウスにおいて、健康を害したブドウ糖の許容値を正常化させる、高血糖症及び高インシュリン血症を予防する、並びに、腹部の脂肪の集積を減弱させることができるものであったか否かを調査した。
【０１５５】
（方法）
西洋の国々では、代謝の症候群又は症候群Ｘ（即ち、糖尿病、肥満症、心臓血管の疾患、高血圧症、及び、高脂血症）は、定常的な上昇にある。経口的に活性な天然の化合物を使用する、栄養に基づいた治療的な又は予防的な介入の発達は、適時にあるだけでなく、また、緊急的に必要とされることもある。合計で五十匹のＣ５７ＢＬ６マウスを実験４で使用した。二十五匹のマウスには、対照の食物を供給したと共に、二十五匹のマウスには、プニカ酸が補足された食物が供給された（０．６ｇのプニカ酸／１００ｇの食品）。実験の最初の３２日間については、全ての食物は、７％の脂肪、０．０２の合計のコレステロールを含有したと共に、それらは、対照の食物においてリノレン酸（重量／重量の基準）でプニカ酸を置き換えることによって、脂肪から１４．５％のカロリーを得た（表７）。これらの食物は、正規の食物として定義されると共に処置の群の間で等カロリーなものであるように調合された。実験の日３２において、各々の群内の二十匹のマウスには、対照の高い脂肪の食物において豚脂でプニカ酸を置き換える（重量／重量の基準）ことによって脂肪から４０．１％のカロリーを得た、１９．６％の脂肪、０．２％の合計のコレステロールを含有する高い脂肪の食物が供給された（表８）。高い脂肪の食物を、また、処置の群の間で等カロリーのものであるように、調合した。各々の群（ｎ＝５）内における残留するマウスには、正規の食物を供給した。実験の日７８において、マウスを死亡させたと共に、血液を、収集したと共に、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用することによって、空腹時のブドウ糖の濃度について直ちに解析した、又は、血漿におけるインシュリンの濃度のその後の解析のために貯蔵した。ＲＮＡの解析のために、腹部の白色脂肪組織及び肩甲骨間の褐色脂肪組織を収集し、計量し、且つ、−８０℃で貯蔵した。肝臓、肺臓、腎臓、膵臓、及び心臓を、巨視的な異常性（肉眼的病変）について、検査し、リン酸塩で緩衝させたホルマリン（１０％）に固定し、且つ、組織学的な評価のために実験１に記載したように処理した。全ての試験体を、一般に、後に続く情報：１）マウスの番号、２）収集したデータ、３）実験の番号、４）溶媒のタイプ、及び５）組織のタイプ、でラベルした。
【０１５６】
表７．正規の食物１の組成物
【０１５７】
【表１１】
2007538002.tif 000012
１おおよそ７％の脂肪及び０．０２の合計のコレステロールを提供すると共にそれは、脂肪から１４．５％のカロリーを得る。
【０１５８】
２食物のｋｇ当たりの補足されたもの：３ｇのニコチン酸、１．６ｇのパントテン酸カルシウム、０．７ｇのピリドキシンＨＣｌ、０．６ｇのチアミンＨＣｌ、０．６ｇのリボフラビン、０．２ｇの葉酸、０．０２ｇのＤ−ビオチン、２．５ｇのビタミンＢ１２（マンニトール中で０．１％）、１５ｇのＤＬ−アルファ−トコフェリル＝アセタート（５００  ＩＵ／ｇ）、０．８ｇのビタミンＡ＝パルミタート（５００，０００  ＩＵ／ｇ）、０．２ｇのビタミンＤ３（コレカルシフェロール，５００，０００  ＩＵ／ｇ）、０．０７５ｇのビタミンＫ（フィロキノン）、及び、９７４．７０５ｇのショ糖。
【０１５９】
３食物のｋｇ当たりの補足されたもの：３５７ｇの炭酸カルシウム、１９６ｇの一塩基性のリン酸カリウム、７０．７８ｇのクエン酸カリウム、７４ｇの塩化ナトリウム、４６．６ｇの硫酸カリウム、２４．３ｇの酸化マグネシウム、６．０６ｇのクエン酸第二鉄、１．６５ｇの炭酸亜鉛、０．６３ｇの炭酸第一マンガン、０．３１ｇの炭酸第二銅、０．０１ｇのヨウ素酸カリウム、０．０１０２５ｇのセレン酸ナトリウム、０．００７９５ｇのパラモリブデン酸アンモニウム、１．４５ｇのメタケイ酸ナトリウム、０．２７５ｇの硫酸カリウムクロム、０．０１７４ｇの塩化リチウム、０．０８１５ｇのホウ酸、０．０６３５ｇのフッ化ナトリウム、０．０３１８ｇの炭酸ニッケル、水酸化物、四水和物、０．００６６ｇのバナジン酸アンモニウム、及び２２０．７１６ｇのショ糖。
【０１６０】
４抗酸化剤
表８．高い脂肪の食物１の組成物
【０１６１】
【表１２】
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１おおよそ１９．６％の脂肪及び０．２％の合計のコレステロールを提供すると共にそれは、脂肪から４０．１％のカロリーを得る。
【０１６２】
２食物のｋｇ当たりの補足されたもの：３ｇのニコチン酸、１．６ｇのパントテン酸カルシウム、０．７ｇのピリドキシンＨＣｌ、０．６ｇのチアミンＨＣｌ、０．６ｇのリボフラビン、０．２ｇの葉酸、０．０２ｇのＤ−ビオチン、２．５ｇのビタミンＢ１２（マンニトール中で０．１％）、１５ｇのＤＬ−アルファ−トコフェリル＝アセタート（５００  ＩＵ／ｇ）、０．８ｇのビタミンＡ＝パルミタート（５００，０００  ＩＵ／ｇ）、０．２ｇのビタミンＤ３（コレカルシフェロール，５００，０００  ＩＵ／ｇ）、０．０７５ｇのビタミンＫ（フィロキノン）、及び、９７４．７０５ｇのショ糖。
【０１６３】
３食物のｋｇ当たりの補足されたもの：３５７ｇの炭酸カルシウム、１９６ｇの一塩基性のリン酸カリウム、７０．７８ｇのクエン酸カリウム、７４ｇの塩化ナトリウム、４６．６ｇの硫酸カリウム、２４．３ｇの酸化マグネシウム、６．０６ｇのクエン酸第二鉄、１．６５ｇの炭酸亜鉛、０．６３ｇの炭酸第一マンガン、０．３１ｇの炭酸第二銅、０．０１ｇのヨウ素酸カリウム、０．０１０２５ｇのセレン酸ナトリウム、０．００７９５ｇのパラモリブデン酸アンモニウム、１．４５ｇのメタケイ酸ナトリウム、０．２７５ｇの硫酸カリウムクロム、０．０１７４ｇの塩化リチウム、０．０８１５ｇのホウ酸、０．０６３５ｇのフッ化ナトリウム、０．０３１８ｇの炭酸ニッケル、水酸化物、四水和物、０．００６６ｇのバナジン酸アンモニウム、及び２２０．７１６ｇのショ糖。
【０１６４】
４抗酸化剤
（ブドウ糖の許容値の試験）
ブドウ糖の許容値の試験を、実験の日７８に実行した。動物を、一晩中空腹にした（１４時間）。マウスを、Ｄ−ブドウ糖で腹膜内に注射した（１ｍｇ／体重ｋｇ）と共に、血液の試料を、注射（時間０）に先立ち、並びに、１５、３０、及び注射が後に続く６０分で尾静脈を介して収集した。
【０１６５】
（血漿のインシュリンの濃度の決定）
血漿のインシュリンの濃度を、商業的に入手可能な酵素に連結した免疫吸着の分析キット（Ｌｉｎｃｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ，ＭＯ）を使用することによって、決定した。
【０１６６】
（統計）
データを、分散の解析（ＡＮＯＶＡ）によって解析した。ＡＮＯＶＡを、先に記載したもの（非特許文献５）のようなＳＡＳの一般の線形のモデルの手順（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用することによって、行った。確率の値（Ｐ＜０．０５）を備えた差異を、有意なものと考慮した。
【０１６７】
（結果）
過剰な腹部の脂肪の集積及びインシュリン耐性は、代謝の症候群を類型化する鍵となる特性である。ブドウ糖の許容値の試験は、生体内におけるブドウ糖の恒常性を評価するための標準的な方法である。ブドウ糖の許容値の試験を使用することによって、我々は、ブドウ糖の許容値が、糖尿病の表現型を発達させなかった、正規の食物が供給された二つの群の間で異なるものではなかったことを発見した（図３Ａ）。しかしながら、健康を害したブドウ糖の許容値を正常化するための対照の高い脂肪の食物が供給されたマウスの能力は、プニカ酸が補足された高い脂肪の食物が供給されたものと比較したとき、有意に健康を害したものであった（図３Ｂ）。
【０１６８】
表９．腹部の白色脂肪組織及び肩甲骨間の褐色脂肪組織の重量、並びに、対照又はプニカ酸（ＰＵＡ）が補足された正規の及び高い脂肪の食物が供給されたマウスにおける血漿の空腹時のブドウ糖及びインシュリンの濃度１
【０１６９】
【表１３】
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１異なる上付き文字を備えた特定の組織についての行における最小自乗平均の値は、有意に異なるものである（Ｐ＜０．０５）。
【０１７０】
２最小自乗平均の蓄えられた標準誤差
さらに、対照の高い脂肪の食物が供給されたマウスは、際だって、プニカ酸が補足された高い脂肪の食品が供給されたマウス又は正規の食物が供給されたマウスよりも高血糖性の及び高インシュリン性のものであった（表９）。このように、プニカ酸の補足は、高い脂肪の食物が供給されたマウスにおいて、高血糖症の発達を予防する又は改良する、高インシュリン血症を減弱させる、及び、健康を害したブドウ糖の許容値を正常化する（表９）。これらの発見は、タイプ２の糖尿病、代謝の症候群、及びそれらの合併症（例えば、心臓血管の疾患、脳卒中、網膜症、腎臓病、及び、切断）の予防及び処置において臨床的に有意なものである。
【０１７１】
対照の高い脂肪の食物が供給されたマウスに観察された高血糖症及び高インシュリン血症は、増加した腹部の白色脂肪組織の堆積と相関した（表９）。しかしながら、褐色脂肪組織の重量における差異は、群の間で観察されなかった。プニカ酸が補足された高い脂肪の食物が供給されたマウスに観察された低減した腹部の脂肪は、対照の食物が供給されたマウスと比較したとき、抑制された脂肪生成又は増加した脂肪酸の消費のいずれかによって引き起こされ得るであろう。脂肪肝又は拡張した内臓が、プニカ酸で補足された食物が供給されたマウスに観察されなかったために、低減した腹部の肥満症は、低減した脂肪生成によって引き起こされるものではありそうにないと共に、それは、増加した脂肪酸の消費のおかげであることもある。それらの全ては、プニカ酸を、インシュリン耐性、腹部の肥満症、及び代謝の症候群の処置又は予防に利用することができるであろうことを提案する。
【０１７２】
本発明が、ここに図説した及び記載した部分の特定の構築及び配置に制限されないが、しかし、後に続く特許請求の範囲内で来るような、それのこのような変更した形態を包含することは、理解されると思われる。
【０１７３】
［関連出願の相互参照］
この出願は、２００５年１月７日に出願された一般的特許出願シリアル番号１１／ＸＸＸ，ＸＸＸ［代理人整理番号３４５４８．１２６］及び２００５年１月７日に出願された国際（ＰＣＴ）出願シリアル番号ＰＣＴ／ＵＳ２００５／ＸＸＸＸＸ［代理人整理番号３４５４８．１２８］の米国の３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０の下での一部継続であるが、それらの両方は、また、２００４年１月２０日に出願された米国仮特許出願番号６０／５３７，６１７に対する３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での優先権を主張すると共に、それら先願の全体は、ここでは参照によって組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１Ａ】図１Ａは、実験１の間における、体重の喪失における食物のプニカ酸及び等カロリーの対照の食物の効果を図説するグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、実験１の間における、直腸の出血における食物のプニカ酸及び等カロリーの対照の食物の効果を図説するグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、実験１の間における、疾患の活性の指標における食物のプニカ酸及び等カロリーの対照の食物の効果を図説するグラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、２０倍の倍率での、実験１の間における、プニカ酸が給餌されたマウスから回収された、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ及びＥ）で染色されたパラフィンが埋め込まれた結腸の組織の顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２０倍の倍率での、実験１の間における、プニカ酸の食物が給餌されたマウスから回収された、Ｈ及びＥで染色されたパラフィンが埋め込まれた結腸の組織の顕微鏡写真である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実験１の間における、対照の食物が給餌されたマウスから回収された、Ｈ及びＥで染色されたパラフィンが埋め込まれた結腸の組織の顕微鏡写真である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、実験１の間における、対照の食物が給餌されたマウスから回収された、Ｈ及びＥで染色されたパラフィンが埋め込まれた結腸の組織の顕微鏡写真である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、４０倍の倍率での、実験１の間における、プニカ酸の食物が給餌されたマウスから回収された、Ｈ及びＥで染色されたパラフィンが埋め込まれた結腸の組織の顕微鏡写真である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、４０倍の倍率での、実験１の間における、プニカ酸の食物が給餌されたマウスから回収された、Ｈ及びＥで染色されたパラフィンが埋め込まれた結腸の組織の顕微鏡写真である。
【図３Ａ】図３Ａは、実験４からの正規の食物が給餌されたマウスにおける血液のブドウ糖の濃度におけるプニカ酸の効果を図説するグラフである。
【図３Ｂ】図３Ｂは、実験４からの高い脂肪の食物が給餌されたマウスにおける血液のブドウ糖の濃度におけるプニカ酸の効果を図説するグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【国際調査報告】
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2007538002.tif 000022
2007538002.tif 000023
2007538002.tif 000024
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