(57)【要約】  ＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのレベルを増加させる化合物又はｓＦｌｔ−１レベルを減少させる化合物を用いた子癇前症又は子癇の治療方法が開示される。また、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのレベルを検出することによって子癇前症又は子癇の治療をモニターする方法が開示される。また、被験者のｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのレベルを検出することによって子癇前症及び子癇を診断する方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドレベルを測定することを含む、被験者の子癇前症又は子癇の治療をモニターする方法。
【請求項２】
レベルの測定が２回以上の機会に行われ、測定間のレベルの変化が子癇前症又は子癇の指標である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レベルを子癇前症基準と比較することを更に含み、子癇前症基準に対するｓＦｌｔ−１レベルの減少は、被験者の子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
レベルを子癇前症基準と比較することを更に含み、子癇前症基準に対するＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルの増加は、被験者の子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
モニタリングが化合物の治療用量を決定するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
化合物が、被験者のｓＦｌｔ−１レベルが２ｎｇ／ｍｌより低くなるような用量で投与される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
測定が免疫学的アッセイによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ｓＦｌｔ−１レベルが、遊離の、結合した、又は全量のｓＦｌｔ−１レベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ｓＦｌｔ−１レベルが、分解されているか又は酵素的に切断されている、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドのポリペプチド副産物のレベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
被験者の子癇前症又は子癇の治療をモニターする方法であって、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのポリペプチドのうち少なくとも２つのレベルを測定し、１つの測定基準を使用してレベル間の関係を計算することを含む、前記方法。
【請求項１１】
測定基準が、子癇前症抗血管形成指標（ＰＡＡＩ）：［ｓＦｌｔ−１／ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦ］である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
２０より小さいＰＡＡＩ値が子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
１０より小さいＰＡＡＩ値が子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＡＡＩが治療用化合物の用量を決定するために用いられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
治療用化合物が、治療用化合物を投与後のＰＡＡＩが２０より小さくなるような用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
治療用化合物が、治療用化合物を投与後のＰＡＡＩが１０より小さくなるような用量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
測定が免疫学的アッセイによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
ｓＦｌｔ−１レベルが、遊離の、結合した、又は全量のｓＦｌｔ−１レベルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
ｓＦｌｔ−１レベルが、分解されているか又は酵素的に切断されている、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドのポリペプチド副産物のレベルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルが、遊離のＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
子癇前症基準に対するｓＦＩｔ−１ポリペプチドレベルの減少が、子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項２２】
子癇前症基準に対する遊離のＶＥＧＦポリペプチドレベルの増加が、子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項２３】
子癇前症基準に対する遊離のＰｌＧＦポリペプチドレベルの増加が、子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項２４】
レベルの測定が２回以上の機会に行われ、測定間のレベルの変化が子癇前症又は子癇の診断指標である、請求項１０に記載の方法。
【請求項２５】
被験者の子癇前症又は子癇の治療をモニターする方法であって、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸分子のレベルを測定し、基準に対してレベルを比較することを含み、基準サンプルに対するレベルの変化により、被験者の子癇前症又は子癇を診断する。
【請求項２６】
ＶＥＧＦレベルを測定したときに、ｓＦｌｔ−１又はＰｌＧＦのレベルも測定する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
子癇前症基準に対するｓＦｌｔ−１核酸レベルの減少が、子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
子癇前症基準に対するＶＥＧＦ核酸レベルの増加が、子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
子癇前症基準に対するＰｌＧＦ核酸レベルの増加が、子癇前症又は子癇の改善を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
レベルの測定が２回以上の機会に行われ、測定間のレベルの変化が子癇前症又は子癇の診断指標である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向にあると診断する方法であって、被験者の尿サンプルの遊離のＰｌＧＦレベルを測定することを含む、前記方法。
【請求項３２】
妊娠中期又は妊娠後期に測定した４００ｐｇ／ｍｌ未満の尿サンプルの遊離のＰｌＧＦレベルが、子癇前症若しくは子癇の診断指標であるか又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
妊娠中期又は妊娠後期に測定した２００ｐｇ／ｍｇクレアチニン未満の尿サンプルの遊離のＰｌＧＦレベルが、子癇前症若しくは子癇の診断指標であるか又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
被験者の遊離のＰｌＧＦレベルを、基準サンプルのＰｌＧＦレベルと比較することを更に含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
基準サンプルが被験者から採取した前サンプルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
基準サンプルが、妊娠しているが子癇前症若しくは子癇ではないか又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向にない被験者から採取したサンプルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
基準サンプルと比較した被験者の遊離のＰｌＧＦの減少が、子癇前症若しくは子癇の診断指標であるか又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
減少が、基準サンプルと比較した被験者サンプルのＰｌＧＦレベルの少なくとも１０％の減少である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
（ａ）  尿、血液、羊水、血清、血漿、又は脳脊髄液から成る群より選択される体液である被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦのポリペプチドのうちの少なくとも１つのレベルを測定し；そして
（ｂ）  被験者のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦのレベルを、基準サンプルのｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦのポリペプチドのレベルと比較する、
ことを更に含み、
基準サンプルに対する被験者サンプルのｓＦｌｔ−１レベルの増加又はＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのポリペプチドレベルの減少が、子癇前症若しくは子癇の診断指標であるか又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
被験者の血清サンプルのｓＦｌｔ−１レベルを測定する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
被験者の血清サンプルのｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦのレベルを測定する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ａ）で得たｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのうちの少なくとも１つのレベル間の関係を測定基準を用いて計算することを更に含み、基準サンプルに対する被験者サンプルのレベル間の関係の変化により、被験者の子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
測定基準が、子癇前症抗血管形成指標（ＰＡＡＩ）：［ｓＦｌｔ−１／ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦ］である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
２０より大きいＰＡＡＩ値が子癇前症又は子癇の診断指標である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
測定が免疫学的アッセイによって行われる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
免疫学的アッセイがＥＬＩＳＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向にあると診断する方法であって、
（ａ）  被験者から尿サンプルを得；
（ｂ）  サンプルを、固定された第１のＰｌＧＦ結合物質を含む固体支持体に、第１のＰｌＧＦ結合物質をサンプル中に存在する遊離のＰｌＧＦに結合させるのに十分な時間接触させ；
（ｃ）  工程（ｂ）の後、固体支持体を、第２の標識ＰｌＧＦ結合物質の調製品に、第２の標識ＰｌＧＦ結合物質を、第１の固定されたＰｌＧＦ結合物質に結合した遊離のＰｌＧＦに結合させるのに十分な時間接触させ；
（ｄ）  第２の標識ＰｌＧＦ結合物質と、遊離のＰｌＧＦに結合した固定されたＰｌＧＦ結合物質との結合を、ＰｌＧＦ結合物質が固定された位置で観察し；そして
（ｅ）  工程（ｄ）で観察された結合を、基準サンプルを用いて観察された結合と比較する、
ことを含む、前記方法。
【請求項４８】
基準サンプルが４００〜８００ｐｇ／ｍｌの濃度の組換えＰｌＧＦであり、工程（ｅ）で基準サンプルを用いて観察された結合と比較した、工程（ｄ）で観察された結合の低下は、子癇前症若しくは子癇の診断指標であるか又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
標識が比色標識である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
ＰｌＧＦに結合する物質が、抗体、又はその精製断片、又はペプチドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
抗体又はその断片が遊離ＰｌＧＦに特異的に結合する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＰｌＧＦ結合物質に結合する物質が：抗免疫グロブリン抗体、プロテインＡ、及びプロテインＧから成る群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向にあると診断する方法であって：
（ａ）  被験者から尿サンプルを得；
（ｂ）  サンプルを、検出可能に標識されている固定されたＰｌＧＦ結合物質を含む固体支持体に、第１のＰｌＧＦ結合物質をサンプル中に存在する遊離のＰｌＧＦに結合させるのに十分な時間接触させ；そして
（ｃ）  遊離のＰｌＧＦに結合した標識ＰｌＧＦ結合物質を測定する、
ことを含み、
測定は、結合したＰｌＧＦ結合物質と未結合のＰｌＧＦ結合物質とを区別可能である、前記方法。
【請求項５４】
標識が蛍光標識である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
固体支持体がメンブランである、請求項４７又は５３に記載の方法。
【請求項５６】
被験者が妊娠していないヒトであり、子癇前症又は子癇を発症する傾向を診断する、請求項４７又は５３に記載の方法。
【請求項５７】
被験者が妊娠したヒトである、請求項４７又は５３に記載の方法。
【請求項５８】
被験者の体液サンプル中のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、若しくはＶＥＧＦの核酸又はポリペプチドのレベルを測定することを更に含む、請求項４７又は５３に記載の方法。
【請求項５９】
被験者の血清サンプル中のｓＦｌｔ−１ポリペプチドレベルを測定する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
レベルの測定が２回以上の機会に行われ、測定間のレベルの変化が子癇前症又は子癇の診断指標である、請求項４７又は５３に記載の方法。
【請求項６１】
被験者の子癇前症又は子癇を診断するキットであって、遊離のＰｌＧＦポリペプチドを検出するためのＰｌＧＦ結合物質及び使用説明書を含む、被験者の子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断するための前記キット。
【請求項６２】
免疫学的アッセイ、酵素的アッセイ、蛍光偏光アッセイ、又は比色分析アッセイのための成分を更に含む、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
ＰｌＧＦ結合物質がメンブランに固体されている、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
メンブランがディップスティック構造上に支持されており、ディップスティック構造をサンプル中に置くことによってサンプルがメンブラン上に置かれる、請求項６３に記載のキット。
【請求項６５】
メンブランが側方流動カセットに支持されており、カセットの開口によりサンプルがメンブラン上に置かれる、請求項６３に記載のキット。
【請求項６６】
療法のあいだ被験者をモニターするために用いられる、請求項６１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一般に、本発明は、子癇前症又は子癇を有する被験者の検出及び治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
子癇前症とは、妊娠の５〜１０％に影響し、母体及び胎児に相当な罹患率及び死亡率をもたらす、高血圧、浮腫、及びタンパク尿症の症候群である。子癇前症は、世界中で１年に少なくとも２００，０００人の母体死亡の原因である。子癇前症の症状は、典型的には妊娠２０週後に現れ、通常、女性の血圧及び尿の日常的モニタリングにより検出される。しかしながら、これらのモニタリング法は、初期段階での症候群の診断には効果がない。そのような初期の検出により、有効な治療が利用可能であれば、被験者又は発育中の胎児の危険性を減少させるであろう。
【０００３】
現在、子癇前症の治療法は知られていない。子癇前症は軽度から生命を脅かすまでの重篤度で変化し得る。軽度の子癇前症は、ベッドでの療養と頻繁なモニタリングにより治療することができる。中程度から重度の場合、入院が必要であり、発作を予防するために血圧の薬又は抗痙攣薬が投与される。病態が母親又は子供の生命を脅かすまでになった場合は、妊娠が終結され、子供は早産させられる。
【０００４】
胎児及び胎盤の適切な発育は、いくつかの成長因子によって介在される。これら成長因子の１つは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。ＶＥＧＦは、内皮細胞特異的分裂促進因子、血管形成誘発剤、及び血管透過性のメディエーターである。ＶＥＧＦは、糸球体係蹄修復に重要であるであることも示されている。ＶＥＧＦは、多くのさまざまな組織から得られる内皮細胞においてさまざまに発現する、２つの相同な膜貫通型チロシンキナーゼ受容体であるｆｍｓ様チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ−１）及びキナーゼドメイン受容体（ＫＤＲ）の１つにホモダイマーとして結合する。Ｆｌｔ−１は、胎盤形成に寄与する栄養膜細胞で高度に発現するが、ＫＤＲは発現しない。胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は、やはり胎盤発育に関与するＶＥＧＦファミリーのメンバーである。ＰｌＧＦは、細胞栄養芽層及びシンシチウム栄養芽層で発現し、内皮細胞の増殖、遊走、及び活性化を誘導可能である。ＰｌＧＦはホモダイマーとしてＦｌｔ−１受容体に結合するが、ＫＤＲ受容体には結合しない。ＰｌＧＦとＶＥＧＦはともに、胎盤の発育に重要な分裂促進活性及び血管形成に寄与している。
【０００５】
可溶型Ｆｌｔ−１受容体（ｓＦｌｔ−１）が、近年、ヒト臍帯静脈内皮細胞の培地において同定され、続いてｉｎ  ｖｉｖｏ発現が胎盤組織で立証された。ｓＦｌｔ−１は、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠失した、Ｆｌｔ−１受容体のスプライス変異体である。ｓＦｌｔ−１は高親和性でＶＥＧＦに結合するが、内皮細胞の有糸分裂誘発を刺激しない。ｓＦｌｔ−１は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路を下方制御するための「生理的シンク」として作用すると考えられている。したがって、ｓＦｌｔ−１レベルの調節は、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦシグナル伝達経路をモジュレートするように作用する。ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦのシグナル伝達経路の慎重な調節は、発育中の胎盤の栄養膜細胞による適切な増殖、遊走、及び血管形成を維持するのに重要である。子癇前症の危険性があるか又は子癇前症である被験者を、特に最も重篤な症状の発症前に、正確に診断する方法が必要とされている。治療も必要とされている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
発明者らは、子癇前症及び子癇を診断し、有効に治療するための手段を発見した。
発明者らは、遺伝子発現解析により、子癇前症を患う妊娠女性からの胎盤組織サンプルにおいてｓＦｌｔ−１レベルが顕著に上昇していることを発見した。ｓＦｌｔ−１は、「生理的シンク」として作用することにより、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦと拮抗することが知られており、子癇前症又は子癇の女性では、ｓＦｌｔ−１は、胎盤からこれら必須の血管新生因子及び分裂促進因子の必要量を奪っているかもしれない。また、過剰量のＦｌｔ−１は、血液脳関門を維持する内皮細胞及び／又は脳の脈絡叢を裏打ちする内皮細胞を崩壊させることにより子癇へと導くことができ、子癇において見られる脳浮腫及び発作をもたらす。本発明では、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦのレベルを増加させる化合物を被験者に投与し、上昇したｓＦｌｔ−１の効果に対抗することによって子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する。更に、ｓＦｌｔ−１に対する抗体は、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１への結合を競合的に阻害するために用いられ、それにより遊離のＶＥＧＦ及びＰＬＧＦのレベルを増加させる。ＲＮＡ干渉及びアンチセンス核酸塩基オリゴマーもｓＦｌｔ−１レベルを低下させるために用いられる。また、本発明は、子癇前症若しくは子癇又はその傾向、あるいは心血管病態若しくはその傾向の初期診断及び管理のための、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦの検出ツールとしての使用及びモニタリングを提供する。
【０００７】
また、本発明者らは、尿のＰｌＧＦレベルが、子癇前症若しくは子癇又はその傾向を検出するための診断ツールとして使用できることを発見した。遊離型ＰｌＧＦの平均分子量は約３０ｋＤａであり、非常に小さいため、腎臓によってろ過されて尿に放出される。ＰｌＧＦは、ｓＦｌｔ−１と複合体を形成すると、分子量が非常に大きくなり、したがって尿に放出されないであろう。ｓＦｌｔ−１レベルが増加すると、ｓＦｌｔ−１はＰｌＧＦと複合体を形成することができ、よって、尿に放出される遊離のＰｌＧＦレベルが低下する。その結果、遊離のＰｌＧＦレベルについての尿解析は、子癇前症若しくは子癇又はそれらを有する危険性のある患者を診断するために用いることができる。
【０００８】
したがって、１つの側面では、本発明は、被験者にｓＦｌｔ−１に結合可能な化合物を投与することによって、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する方法を提供し、投与は、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するのに十分な時間及び量である。好ましい態様では、化合物は、精製したｓＦｌｔ−１抗体又はその抗原結合断片である。
【０００９】
関連する側面では、本発明は、被験者にｓＦｌｔ−１に結合可能な成長因子のレベルを増加させる化合物（たとえばニコチン、テオフィリン、アデノシン、ニフェジピン、ミノキシジル、又は硫酸マグネシウム）を投与することによって、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する方法を提供し、投与は、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するのに十分な時間及び量である。
【００１０】
更に他の関連する側面では、本発明は、被験者にｓＦｌｔ−１核酸配列の少なくとも１部分に相補的なアンチセンス核酸塩基オリゴマーを投与することによって、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する方法を提供し、投与は、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するのに十分である。１つの態様では、アンチセンス核酸塩基オリゴマーの長さは８〜３０ヌクレオチドである。
【００１１】
他の関連する面では、本発明は、被験者にｓＦｌｔ−１核酸配列の少なくとも１部分を含有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を投与することによって、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する方法を提供し、投与は、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するのに十分である。１つの態様では、２本鎖ＲＮＡは、長さ１９〜２５ヌクレオチドの小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にプロセシングされる。
【００１２】
上記側面のさまざまな態様では、候補化合物は、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１２１、若しくはＶＥＧＦ１６５のような全てのアイソフォームを含めた血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；全てのアイソフォームを含めた胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）；などの成長因子、又はそれらの断片、及び改変型のＶＥＧＦ又はＰｌＧＦである。好ましい態様では、候補化合物はｓＦｌｔ−１に結合する抗体である。上記側面の他の態様では、本発明の方法は、被験者に抗高血圧化合物を投与することを更に含む。上記側面の更に他の態様では、被験者は、妊娠したヒト、産後のヒト、又はヒト以外（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、又はネコ）である。
【００１３】
他の側面では、本発明は、そのような治療を必要とする被験者に、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのポリペプチドを含む有効量の医薬組成物を投与することによって、子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する方法を提供する。１つの態様では、組成物はＶＥＧＦポリペプチドを含有する。他の態様では、組成物はＰｌＧＦポリペプチドを含有する。
【００１４】
関連する側面では、本発明は、そのような治療を必要とする被験者に、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦをコードする核酸分子を含む有効量の医薬組成物を投与することによって、子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する方法を提供する。１つの態様では、組成物はＶＥＧＦ核酸分子を含有する。他の態様では、組成物はＰｌＧＦ核酸分子を含有する。
【００１５】
他の関連する側面では、本発明は、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防する方法を提供する。本発明の方法は、被験者に、成長因子がｓＦｌｔ−１ポリペプチドに結合するのを阻害する化合物（例えば化学化合物、ポリペプチド、ペプチド、抗体、またはそれらの断片）を投与する工程を含み、投与は、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するのに十分である。１つの態様では、化合物はｓＦｌｔ−１に結合し、成長因子の結合をブロックする。
【００１６】
上記側面のさまざまな態様では、本発明の方法は、被験者に抗高血圧化合物（例えばアデノシン、ニフェジピン、ミノキシジル、及び硫酸マグネシウム）を投与する工程を更に含む。上記側面の他の態様では、被験者は、妊娠したヒト、産後のヒト、又はヒト以外（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、又はネコ）である。
【００１７】
他の側面では、本発明は、被験者の尿サンプルの遊離のＰｌＧＦレベルを測定することを含む、被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向があると診断する方法を特徴とする。この方法は、閾値レベルよりも低い遊離のＰｌＧＦの絶対レベルを決定するために用いることができ、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断法（diagnostic）である。妊娠中期の正常な尿ＰｌＧＦ濃度は、およそ４００〜８００ｐｇ／ｍｌである。好ましい態様では、４００ｐｇ／ｍｌより低い遊離のＰｌＧＦレベル、好ましくは３００、２００、１００、５０、又は１０ｐｇ／ｍｌより低い遊離のＰｌＧＦレベルは、子癇前症若しくは子癇又は又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断法法である。この方法は、基準サンプルと比較した、遊離のＰｌＧＦの相対レベルを決定するために用いることもでき、正常基準サンプルと比較した、遊離のＰｌＧＦレベルの低下（例えば１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、９０％、又はそれより高い）は、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断法である。この場合、正常基準サンプルは、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向のない、同一被験者から採取した前サンプルであるか、又は匹敵する被験者（例えば在胎週数が匹敵）から採取したサンプルであり得る）。更なる好ましい態様では、基準サンプルは、基準サンプルから派生した標準、レベル、又は数である。また、基準の標準又はレベルは、少なくとも１つの以下の判断基準によってサンプル被験者に匹敵する正常被験者に由来する値であり得る：胎児の在胎週数、母親の年齢、妊娠前の血圧、妊娠中の血圧、母親のＢＭＩ、胎児の体重、子癇前症又は子癇の前診断、及び子癇前症又は子癇の家族歴。好ましい態様では、測定は、ＥＬＩＳＡ、好ましくはサンドイッチＥＬＩＳＡ、又は蛍光イムノアッセイなどの免疫学的アッセイによって行われる。
【００１８】
好ましい態様では、本方法はまた、（ａ）尿、血液、羊水、血清、血漿、又は脳脊髄液からなる群より選択される体液である被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦのポリペプチドのうちの少なくとも１つのレベルを測定する工程、及び（ｂ）被験者のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦのうちの少なくとも１つのレベルを、基準サンプルの同一ポリペプチドレベルと比較する工程、を含み、基準サンプルと比較した、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１レベルの増加又はＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのポリペプチドレベルの低下は、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断指標である。好ましい態様では、ｓＦｌｔ−１、又はｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦは、尿ＰｌＧＦアッセイによって子癇前症又は子癇を発症する危険性があると同定された被験者の血清サンプル中で測定される。この方法は、上記工程（ａ）で得たｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのうちの少なくとも１つのレベル間の関係を測定基準を用いて計算する工程を更に含むことが望ましく、基準サンプルの測定基準に対する被験者サンプルの変化により、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断する。好ましくは、測定基準はＰＡＡＩ（上記のような）であり、２０より大きいＰＡＡＩ値は子癇前症又は子癇の診断指標である。好ましい態様では、ｓＦｌｔ−１は、遊離の、結合した、又は全量のｓＦｌｔ−１であり、ＰｌＧＦ及びＶＥＧＦは遊離のＰｌＧＦ及び遊離のＶＥＧＦである。
【００１９】
他の側面では、本発明は、被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向にあると診断する方法を特徴とし、以下の工程を含む：
（ａ）  被験者から尿サンプルを得；
（ｂ）  サンプルを固定された第１のＰｌＧＦ結合物質を含む固体支持体に、第１のＰｌＧＦ結合物質がサンプル中に存在する遊離のＰｌＧＦに結合するのに十分な時間接触させ；
（ｃ）  工程（ｂ）の後、固体支持体を第２の標識ＰｌＧＦ結合物質の調製品に、第２の標識ＰｌＧＦ結合物質が第１の固定されたＰｌＧＦ結合物質に結合した遊離のＰｌＧＦに結合するのに十分な時間接触させ；
（ｄ）  第２の標識ＰｌＧＦ結合物質の、遊離のＰｌＧＦに結合した固定されたＰｌＧＦ結合物質への結合を、ＰｌＧＦ結合物質が固定された位置で観察し；そして
（ｅ）  工程（ｄ）で観察された結合を、既知濃度のＰｌＧＦである基準サンプルを用いて観察された結合と比較する；更に、基準サンプルを用いて観察された結合と比較した、工程（ｄ）で観察された結合の低は、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断指標である。
【００２０】
他の関連する側面では、本発明は、被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向にあると診断する方法を特徴とすし、以下の工程を含む：
（ａ）  被験者から尿サンプルを得；
（ｂ）  乾燥標識ＰｌＧＦ結合物質とＰｌＧＦ結合物質に結合する固定された第２の物質とを含む固体支持体に、尿サンプルを、標識ＰｌＧＦ結合物質を再水和し、サンプルの遊離のＰｌＧＦを標識ＰｌＧＦ結合物質に結合させるのに十分な時間接触させ、ここで、標識ＰｌＧＦ結合物質に結合した遊離のＰｌＧＦは、固定された第２の物質に向かって移動することができ（例えば毛細管運動によって）；
（ｃ）  遊離のＰｌＧＦ−ＰｌＧＦ結合物質複合体の、固定された第２の物質への結合を、第２の物質が固定された位置で標識の存在を検出することにより観察し；そして
（ｄ）  工程（ｃ）で観察された結合を、１０ｐｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌの既知濃度のＰｌＧＦである基準サンプルを用いて観察された結合と比較する。
【００２１】
上記２つの側面の好ましい態様では、標識は比色標識である（例えば金コロイド）。更なる好ましい態様では、ＰｌＧＦに結合する物質は、抗体、若しくはその精製断片、又はペプチドである。抗体又はその精製断片は遊離のＰｌＧＦに特異的に結合することが望ましい。ＰｌＧＦに結合する物質は、抗免疫グロブリン抗体若しくはその断片、プロテインＡ、又はプロテインＧであることが望ましい。１つの態様では、基準サンプルは、既知の正常濃度のＰｌＧＦサンプルであ、基準サンプルと比較した被験者サンプルの遊離のＰｌＧＦの低下は、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断法である。
【００２２】
他の側面では、本発明は、被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向にあると診断する方法を特徴とし、以下の工程を含む：
（ａ）  被験者から尿サンプルを得；
（ｂ）  検出可能に標識された固定されたＰｌＧＦ結合物質を有する固体支持体に、サンプルを、標識がＰｌＧＦを遊離のＰｌＧＦに結合しているときと遊離のＰｌＧＦに結合していないときとで区別できるように接触させる。好ましい標識には蛍光標識が含まれる。メンブランは、被験者から得た尿サンプルに、ＰｌＧＦ結合物質をサンプル中に存在する遊離のＰｌＧＦに結合させるのに十分な時間曝される。次に、遊離のＰｌＧＦに結合した標識ＰｌＧＦ結合物質を測定する。そのようなアッセイは、ＰｌＧＦの相対レベルを決定するため（例えば基準サンプル又は標準又は段階からのレベルと比較した）又は上記のようにＰｌＧＦの絶対濃度を決定するために用いることができる。結合の測定に好ましいアッセイには蛍光イムノアッセイが含まれる。
【００２３】
他の側面では、本発明は、被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向にあると診断する方法を特徴とし、以下の工程を含む：
（ａ）  被験者から尿サンプルを得；
（ｂ）  固定された第１のＰｌＧＦ結合物質を含む固体支持体に、サンプルを、第１のＰｌＧＦ結合物質をサンプル中に存在する遊離のＰｌＧＦに結合させるのに十分な時間接触させ；
（ｃ）  工程（ｂ）の後、固体支持体を、酵素とカップリングした第２のＰｌＧＦ結合物質の調製品に、第２のＰｌＧＦ結合物質を第１の固定されたＰｌＧＦ結合物質に結合したＰｌＧＦに結合させるのに十分な時間接触させ；そして
（ｄ）  工程（ｃ）の酵素の基質の調製品を、酵素が基質を検出可能な基質に変換させるのに十分な時間及び量で加え；
（ｅ）  検出可能な基質のレベルを観察し；そして
（ｆ）  工程（ｅ）で観察されたレベルを、既知濃度のＰｌＧＦである基準サンプルを用いて観察された結合と比較する、
ここで、基準サンプルと比較した、工程（ｅ）で観察されたレベルの変化は、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断指標である。
【００２４】
１つの態様では、基準サンプルは既知の正常濃度のＰｌＧＦサンプルであり、基準サンプルと比較した、被験者サンプルの遊離のＰｌＧＦの低下は、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断法である。
【００２５】
上記方法の好ましい態様では、基質は分光分析又は化学発光によって視覚的に検出される。更なる好ましい態様では、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアルカリホスファターゼであり、基質はＴＭＢ（テトラメチルベンジジン）、Ｘｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、又は１，２−ジオキセタンである。更なる好ましい態様では、基準サンプルは、正常濃度の精製ＰｌＧＦを有するサンプルであり、被験者サンプルは、基準サンプルと比較して低下を示す（１０％、２５％、５０％、７５％、９０％又はそれよい大きい）。この方法の好ましい態様では、ＰｌＧＦ結合物質は、精製抗ＰｌＧＦ抗体、若しくはその断片、又はペプチドである。精製抗ＰｌＧＦ抗体、若しくはその断片は、遊離のＰｌＧＦに特異的に結合することが望ましい。
【００２６】
上記診断方法の好ましい態様では、固体支持体は、ディップスティック構造又は側方流動形式に支持されることができるメンブレンであり、それらの例はＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，６６０，５３４に記載されている。更なる好ましい態様では、被験者は、妊娠していないヒト、妊娠したヒト、又は産後のヒトである。上記側面の他の態様では、被験者はヒト以外である（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、又はネコ）。１つの態様では、被験者は妊娠していないヒトであり、本方法は、子癇前症又は子癇を発症する傾向を診断するために用いられる。他の態様では、被験者は子癇前症の病歴を有するヒトであり（妊娠しているか又は妊娠していない）、本方法は、その後の妊娠において子癇前症又は子癇を発症する傾向を診断するために用いられる。望ましくは、レベルの測定は２回以上の機会に行われ、測定間のレベルの変化は子癇前症又は子癇の診断指標である。
【００２７】
更なる好ましい態様では、被験者の尿サンプルのＰｌＧＦレベルを検出する方法は、ｓＦｌｔ−１、Ｐ、ＧＦ、又はＶＥＧＦの核酸又はポリペプチドのレベルを測定するために用いられる以下に記載の診断法と組み合わせることができる。
【００２８】
他の側面では、本発明は、被験者を、子癇前症若しくは子癇であるか、又は発症する傾向にあると診断する方法を提供し、この方法は、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドレベルを測定することを含む。
【００２９】
関連する側面では、本発明は、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドのうち少なくとも２つのレベルを決定し、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのレベル間の関係を、測定基準を用いて計算することによって、被験者を、子癇前症若しくは子癇であるか、又は発症する傾向にあると診断する方法を提供し、基準に対する被験者サンプルの変化により、被験者の癇前症又は子癇を診断する。好ましい態様では、本方法は、肥満度指数（ＢＭＩ）、胎児の在胎週数（ＧＡ）、又は両方を決定し、ＢＭＩ又はＧＡ又は両方を測定基準に含めることを更に含む。１つの態様では、測定基準は子癇前症抗血管新生指標（ＰＡＡＩ）：［ｓＦｌｔ−１／ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦ］であり、ＰＡＡＩは、抗血管新生活性の指標として用いられる。１つの態様では、１０より大きい、より好ましくは２０より大きいＰＡＡＩは、子癇前症又は子癇の指標である。他の態様では、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドレベルは、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的アッセイによって決定される。
【００３０】
上記側面のさまざまな態様では、サンプルは、血清又は尿などの体液である。１つの態様では、２ｎｇ／ｍｌより大きいｓＦｌｔ−１レベルは子癇前症又は子癇の指標である。上記側面の好ましい態様では、測定したｓＦｌｔ−１ポリペプチドのレベルは、遊離の、結合した、又は全量のｓＦｌｔ−１ポリペプチドレベルである。更なる態様では、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドは、ｓＦｌｔ−１断片、又はｓＦｌｔ−１の分解若しくは酵素的切断により生ずるポリペプチド副産物も含むことができる。上記側面の他の好ましい態様では、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルは、遊離のＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルである。
【００３１】
他の側面では、本発明は、被験者を、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸分子レベルを測定し、それを基準サンプルと比較することを含む、子癇前症若しくは子癇であるか、又は発症する傾向にあると診断する方法を提供し、レベルの変化により、被験者の子癇前症若しくは子癇を診断するか、又は，子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断する。
【００３２】
他の側面では、本発明は、被験者のｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの遺伝子の核酸配列を決定し、それを基準配列と比較することによって、被験者を、子癇前症若しくは子癇であるか、又は発症する傾向にあると診断する方法を提供し、被験者の遺伝子産物のレベル又は生物活性を変える被験者の核酸配列の変化により、子癇前症若しくは子癇、又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を有する被験者を診断する。１つの態様では、変化は核酸配列の多型である。
【００３３】
上記側面のさまざまな態様では、サンプルは、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦを正常に検出可能な被験者の体液である（例えば、尿、羊水、血清、血漿、又は脳脊髄液）。更なる態様では、サンプルは組織又は細胞である。非限定的な例には、胎盤組織又は胎盤細胞、内皮細胞、リンパ球、及び単球が含まれる。上記側面の他の態様では、被験者は、妊娠していないヒト、妊娠しているヒト、又は産後のヒトである。上記側面の他の態様では、被験者はヒト以外である（例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、イヌ、又はネコ）。１つの態様では、被験者はは妊娠していないヒトであり、本方法は、子癇前症又は子癇を発症する傾向を診断するために用いられる。上記側面の他の態様では、測定したレベルのうちの少なくとも１つは、（遊離の、結合した、又は全量の）ｓＦｌｔ−１のレベルである。更なる態様では、測定したｓＦｌｔ−１レベルには、ｓＦｌｔ−１の分解産物又は酵素的に切断された産物のレベルが含まれる。上記側面の他の態様では、ＶＥＧＦレベルが測定された場合、次にｓＦｌｔ−１又はＰｌＧＦのレベルも測定される。更なる態様では、ＢＭＩ又はＧＡ又は両方も測定される。上記側面のさまざまな態様では、基準に対するｓＦｌｔ−１の核酸又はポリペプチドのレベルの増加は、子癇前症又は子癇の診断指標である。上記側面の他の態様では、基準に対する遊離のＶＥＧＦポリペプチド又はＶＥＧＦ核酸のレベルの低下は、子癇前症又は子癇の診断指標である。上記側面の他の態様では、基準に対する遊離のＰｌＧＦポリペプチド又はＰｌＧＦ核酸のレベルの低下は子癇前症又は子癇の診断指標である。
【００３４】
上記側面の更なる態様では、レベルは２回以上の機会に測定され、測定間のレベルの変化は子癇前症又は子癇の診断指標である。１つの好ましい態様では、ｓＦｌｔ−１レベルは、１回目の測定から次の測定までに増加する。他の好ましい態様では、ＶＥＧＦ又はＰＬＧＦのレベルは、１回目の測定から次の測定までに低下する。
【００３５】
関連する側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、若しくはＰｌＧＦのポリペプチド、又はそれらの組み合わせの検出に有用な成分を含む、被験者の子癇前症又は子癇を診断するためのキットを提供する。１つの態様では、この成分は、免疫学的アッセイ、酵素的アッセイ、及び比色アッセイから成る群より選択されるアッセイである。上記側面の他の態様では、キットは、妊娠しているか又は妊娠していない被験者の、子癇前症又は子癇を発症する傾向を診断する。上記側面の好ましい態様では、キットは、ＶＥＧＦ、ｓＦｌｔ−１、又はＰｌＧＦを検出する。上記側面の他の好ましい態様では、キットがＶＥＧＦを検出する場合、次にｓＦｌｔ−１又はＰｌＧＦも検出される。更なる好ましい態様では、キットは、ＶＥＧＦ、ｓＦｌｔ−１、及びＰｌＧＦを検出し、サンプルのＰＡＡＩを決定するために使用される。
【００３６】
他の側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦの核酸分子、又はそれらに相補的な配列、又はそれらの組み合わせから成る群より選択される核酸配列又はその断片を含む、被験者の子癇前症又は子癇を診断するための診断キットを提供する。好ましい態様では、キットは、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸分子を検出するための少なくとも２つのプローブを含む。
【００３７】
また、本発明は、被験者の子癇前症若しくは子癇、又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断するための、尿サンプル中の遊離のＰｌＧＦを検出するためのＰｌＧＦ結合物質及び使用説明書を含む、被験者の子癇前症又は子癇を診断するためのキットを提供する。このキットは、以下から選択されるアッセイに有用な成分を含むこともできる：免疫学的アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）、酵素的アッセイ、又は比色アッセイ。望ましくは、キットは、上記診断方法の実施に必要な成分を含む。例えば、キットはメンブランを含むことが望ましく、ＰｌＧＦ結合物質又はＰｌＧＦ結合物質に結合する物質はメンブランに固定される。メンブランはディップスティック構造上に支持されることができ、この場合、ディップスティック構造をサンプル中に置くことによってサンプルがメンブラン上に置かれる。又はメンブランは側方流動カセット中に支持されることができ、この場合、サンプルはカセットの開口によってメンブラン上に置かれる。
【００３８】
上記診断キットの好ましい態様では、診断キットは、キット成分の意図する使用のためのラベル又は使用説明書、及び検量線を定めるために使用される基準サンプル又は精製タンパク質を含む。１つの態様では、診断キットは、被験者の子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断に使用するためにラベル表示されているか又は又は使用説明書を含む。他の態様では、診断キットは、心血管病態又は心血管病態を発症する傾向の診断に使用するためにラベル表示されているか又は使用説明書を含む。更に他の態様では、診断キットは、治療のモニタリング又は治療用量の決定に使用するためにラベルされているか又は使用説明書を含む。好ましい態様では、診断キットは、被験者サンプルのＰＡＡＩを決定し、このＰＡＡＩを基準サンプル値と比較するためにキットを使用するためにラベル又は使用説明書を含む。基準サンプル値はキットの意図する使用に依存することが理解されるであろう。例えば、サンプルは、正常なＰＡＡＩ基準値又は正常なＰｌＧＦ値と比較することができ、ＰＡＡＩの増加又はＰｌＧＦ値の低下は、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の指標である。他の例では、治療のモニタリングに用いられるキットは、子癇前症又は子癇の指標である基準のＰＡＡＩ値又はＰｌＧＦ値を有することができ、基準サンプルに対する被験者サンプルのＰＡＡＩ値の低下又はＰｌＧＦ値の増加は、治療用化合物の治療の有効性又は有効用量を示すために用いることができる。
【００３９】
本明細書に記載の方法及びキットは、以前に妊娠していた女性又は子癇前症の病歴を有する女性において、子癇前症又は子癇を診断するため又はその後の子癇前症を予測するために用いることができる。
【００４０】
本明細書に記載の診断法は、被験者の子癇前症又は子癇をモニターするために用いることもできる。好ましい態様では、診断法は、療法のあいだ被験者をモニターするため又は有効な治療用量を決定するためにも用いられる。１つの態様では、投与療法前の値に対する、療法のあいだ又は後に測定されたｓＦｌｔ−１のポリペプチド又は核酸のレベルの低下は、子癇前症又は子癇の改善を示す。好ましい態様では、２ｎｇ／ｍｌより小さいｓＦｌｔ−１ポリペプチドレベルは、子癇前症又は子癇の改善を示す。他の態様では、治療用化合物は、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドレベルが２ｎｇ／ｍｌより小さくなるような用量で投与される。他の態様では、投与療法前の値に対する、療法のあいだ又は後に測定されたＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのポリペプチド又は核酸のレベルの増加は、子癇前症又は子癇の改善を示す。更に他の態様では、被験者のＰＡＡＩ値の低下は、子癇前症又は子癇の改善を示す。好ましい態様では、ＰＡＡＩは２０より小さく、より好ましくは１０より小さい。ＰＡＡＩの低下は、治療用化合物の有効用量を示すこともできる。１つの例では、治療用化合物は、ＰＡＡＩが２０より小さくなるような用量で投与される。他の例では、治療用化合物は、ＰＡＡＩが１０より小さくなるような用量で投与される。好ましい態様では、ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦのレベルの測定は２回以上の機会に行われ、測定間のレベルの変化は、療法をモニターするため又は化合物の治療用量を決定するために用いられる。
【００４１】
尿サンプルの遊離のＰｌＧＦの測定を含む上記診断法は、療法のあいだ被験者をモニターするため又は有効な治療用量を決定するために用いることができる。例えば、上記のようなＰｌＧＦレベルについての尿検査は、療法のあいだ被験者をモニターするために定期的に行なうことができる（例えば、毎月、毎週、隔日、毎日、又は毎時）。１つの態様では、治療用化合物は、ＰｌＧＦ濃度が２００ｐｇ／ｍｌ、３００ｐｇ／ｍｌ、４００ｐｇ／ｍｌ、５００ｐｇ／ｍｌ、６００ｐｇ／ｍｌ、７００ｐｇ／ｍｌ、又は８００ｐｇ／ｍｌより大きくなるような用量で投与される。ＰｌＧＦを用いたアッセイをモニターするため、基準サンプルは子癇前を示すＰｌＧＦ濃度（４００ｐｇ／ｍｌより小さい）であり、基準サンプルと比較したＰｌＧＦ濃度の増加は、治療用化合物の有効用量を示すであろう。
【００４２】
関連する側面では、本発明は、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのポリペプチドのうちの少なくとも１つのレベルを基準サンプルと比較するための成分を含む、被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向があると診断するための装置を特徴とし、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのうちの少なくとも１つのレベルの変化により、被験者の子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断する。好ましい態様では、装置は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのポリペプチドのうちの少なくとも２つのレベルを比較するために測定基準を用いるための成分を含む。
【００４３】
関連する側面では、本発明は、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦの核酸分子のうちの少なくとも１つのレベルを基準サンプルと比較するための成分を含む、被験者を子癇前症若しくは子癇であるか又は発症する傾向があると診断するための装置を特徴とし、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦのうちの少なくとも１つのレベルの変化により、被験者の子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断する。好ましい態様では、装置は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦの核酸分子のうちの少なくとも２つのレベルを比較するために測定基準を用いるための成分を含む。
【００４４】
他の側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸分子を発現する細胞を、候補化合物と接触させ、候補化合物と接触させた細胞の核酸分子発現レベルを、候補化合物と接触させていない対照細胞の発現レベルと比較することによって、子癇前症又は子癇を改善させる化合物を同定する方法を提供し、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸分子の発現の変化は、候補化合物を子癇前症又は子癇を改善させる化合物として同定する。
【００４５】
１つの態様では、変化はｓＦｌｔ−１レベルの低下である。他の態様では、変化はＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルの増加である。他の態様では、変化は転写又は翻訳における変化である。他の態様では、本方法がＶＥＧＦの発現を増加させる候補化合物を同定する場合、候補化合物はまた、ＰｌＧＦの発現を増加させるか又はｓＦｌｔ−１の発現を低下させる。
【００４６】
他の側面では、本発明は、医薬的に許容可能な担体中に製剤化された、ＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのポリペプチド又はその部分を含む医薬組成物を提供する。
関連する側面では、本発明は、医薬的に許容可能な担体中に製剤化された、ＰｌＧＦ核酸分子又はその部分を含む医薬組成物を提供する。１つの態様では、本組成物は、ＶＥＧＦ核酸分子、又はその部分を更に含有する。
【００４７】
他の側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１に特異的に結合する精製抗体又はその抗原結合断片を含む組成物を提供する。１つの好ましい態様では、抗体は、成長因子によるｓＦｌｔ−１への結合を妨げる。他の態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の好ましい態様では、抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。他の態様では、抗体はＦｃ部分を欠失している。更に他の態様では、抗体は、Ｆ（ａｂ’）２構造、Ｆａｂ構造、又はＦｖ構造である。他の態様では、抗体又はその抗原結合断片は医薬的に許容可能な担体中に存在する。
【００４８】
他の側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させ、候補化合物を接触させた細胞のポリペプチド発現レベルを、候補化合物を接触させていない対照細胞のポリペプチド発現レベルと比較することを含む、子癇前症又は子癇を改善させる化合物を同定する方法を提供し、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドの発現の変化により、候補化合物を子癇前症又は子癇を改善させる化合物として同定する。１つの態様では、発現の変化は、免疫学的アッセイ、酵素的アッセイ、又はイムノアッセイを用いてアッセイされる。１つの態様では、発現の変化はｓＦｌｔ−１レベルの低下である。他の態様では、発現の変化は、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルの増加である。
【００４９】
他の側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドを発現する細胞を候補化合物と接触させ、候補化合物を接触させた細胞のポリペプチドの生物活性を、候補化合物を接触させていない対照細胞の生物活性レベルと比較することを含む、子癇前症又は子癇を改善させる化合物を同定する方法を提供し、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドの生物活性の増加により、候補化合物を子癇前症又は子癇を改善させる化合物として同定する。１つの態様では、生物活性の増加は、免疫学的アッセイ、酵素的アッセイ、又はイムノアッセイを用いてアッセイされる。１つの態様では、発現の変化はｓＦｌｔ−１活性の低下である。他の態様では、発現の変化は、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦの活性の増加である。
【００５０】
他の側面では、本発明は、候補化合物存在下でｓＦｌｔ−１ポリペプチドと成長因子との結合を検出することを含む、子癇前症又は子癇を改善させる化合物を同定する方法を提供し、候補化合物非存在下のｓＦｌｔ−１ポリペプチドと成長因子との結合に対する結合の低下により、候補化合物を子癇前症又は子癇を改善させる化合物として同定する。１つの態様では、成長因子はＶＥＧＦである。他の態様では、成長因子はＰｌＧＦである。
【００５１】
他の側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドと成長因子との結合を妨げるポリペプチド又はその断片を同定する方法を提供する。この方法は、候補ポリペプチド存在下でｓＦｌｔ−１ポリペプチドと成長因子との結合を検出することを含み、候補ポリペプチド非存在下のｓＦｌｔ−１ポリペプチドと成長因子との結合に対する結合の低下により、候補ポリペプチドをｓＦｌｔ−１ポリペプチドと成長因子との結合を妨げるポリペプチドとして同定する。１つの態様では、成長因子はＶＥＧＦである。他の態様では、成長因子はＰｌＧＦである。
【００５２】
他の側面では、本発明は、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドと候補化合物との結合を検出することを含む、子癇前症又は子癇を改善させる化合物を同定する方法を提供し、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドに結合する化合物は子癇前症又は子癇を改善させる。
【００５３】
関連する側面では、本発明は、先の側面にしたがい同定される化合物を提供し、化合物は、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドに特異的に結合し、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドがＶＥＧＦ又はＰｌＧＦに結合するのを妨げるポリペプチドである。１つの好ましい態様では、ポリペプチドは抗体である。他の好ましい態様では、ポリペプチドは、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの断片である。
【００５４】
上記側面の好ましい態様では、子癇前症又は子癇を改善させる化合物は、ｓＦｌｔ−１の発現レベル又は生物活性を低下させる。上記側面の好ましい態様では、子癇前症又は子癇を改善させる化合物は、ＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦの発現レベル又は生物活性を増加させる。
【００５５】
更に他の側面では、本発明は、被験者を心血管病態であるか又は発症する傾向があると診断する方法を特徴とする。この方法は、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１ポリペプチドレベルを測定し、それを基準サンプルと比較することを含み、被験者サンプルレベルの変化により、被験者の心血管病態又は心血管病態を発症する傾向を診断する。好ましい態様では、測定は、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的アッセイにより行われる。
【００５６】
関連する側面では、本発明は、被験者を心血管病態であるか又は発症する傾向にあると診断する方法を特徴とする。この方法は、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１核酸分子レベルを測定し、それを基準サンプルと比較することを含み、レベルの変化により、被験者の心血管病態又は心血管病態を発症する傾向を診断する。
【００５７】
上記側面の好ましい態様では、被験者は妊娠しているか又は妊娠していた女性（雌）である。更なる好ましい態様では、女性（雌）被験者は、子癇前症又は子癇の病歴がある。更なる好ましい態様では、基準サンプルは、子癇前症又は子癇の病歴のない女性（雌）から採取される。
【００５８】
関連する側面では、本発明は、被験者を心血管病態であるか又は発症する傾向にあると診断する方法を特徴とする。この方法は、被験者サンプルのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの遺伝子の核酸配列を決定し、それを基準配列と比較することを含み、被験者の遺伝子産物の発現レベル又は生物活性を変える変化である被験者の核酸配列の変化により、被験者の心血管病態又は心血管病態を発症する傾向を診断する。
【００５９】
上記側面の好ましい態様では、サンプルは、ｓＦｌｔ−１を正常に検出できる細胞、組織、又は体液である。好ましいサンプルには、尿、羊水、血清、血漿、脳脊髄液、及び胎盤の細胞又は組織が含まれる。上記側面の好ましい態様では、心血管病態は、粥状動脈硬化、一次性心筋梗塞、二次性心筋梗塞、狭心症、うっ血性心不全、突然心臓死、脳梗塞、再狭窄、失神、虚血、再灌流障害、血管閉塞、頸動脈閉塞性疾患、及び一過性脳虚血発作から成る群より選択される。
【００６０】
本発明の目的のために、以下の略語及び用語を定義する。
「変化」とは、上記のような標準技術の公知の方法で検出されるような遺伝子又はポリペプチドの発現レベルが変わることを意味する（増加又は低下）。本明細書において、変化には、発現レベルの１０％変化、好ましくは２５％変化、より好ましくは４０％変化、最も好ましくは５０％以上の変化が含まれる。「変化」は、本発明のポリペプチド（例えばｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦ）の生物活性の変化（増加又は低下）を表すこともできる。ＰｌＧＦ又はＶＥＧＦの生物活性の例としては、イムノアッセイ、リガンド結合アッセイ、又はスキャッチャードプロット解析によって測定されるような受容体に対する結合、及びＢｒｄＵ標識、細胞計数実験、又は３Ｈ−チミジン取り込みなどのＤＮＡ合成の定量によて測定されるような細胞増殖又は遊走の誘発が挙げられる。ｓＦｌｔ−１の生物活性の例としては、イムノアッセイ、リガンド結合アッセイ、又はスキャッチャードプロット解析によって測定されるようなＰｌＧＦ及びＶＥＧＦへの結合が挙げられる。それぞれのポリペプチドの生物活性に関するアッセイの更なる例が本明細書に記載される。本明細書において、変化には、生物活性の１０％変化、好ましくは２５％変化、より好ましくは４０％変化、最も好ましくは５０％以上の変化が含まれる。
【００６１】
「アンチセンス核酸塩基オリゴマー」とは、長さにかかわりなく、ｓＦｌｔ−１遺伝子のコード鎖又はｍＲＮＡに相補的な核酸塩基オリゴマーを意味する。「核酸塩基オリゴマー」とは、連結基によって連結された、少なくとも８核酸塩基、好ましくは少なくとも１２、最も好ましくは少なくとも１６塩の鎖を含む化合物を意味する。この定義に含まれるのは、修飾及び未修飾の、天然及び非天然オリゴヌクレオチド、並びにタンパク質核酸、ロックト核酸、及びアラビノ核酸などのオリゴヌクレオチド模倣体である。多数の核酸塩基及び連結基は、本明細書に援用される米国特許出願第２００３０１１４４１２号及び第２００３０１１４４０７号に記載のものを含めた本発明の核酸塩基オリゴマーに使用することができる。核酸塩基オリゴマーは、翻訳開始及び終止部位を標的とすることもできる。アンチセンス核酸塩基オリゴマーは約８〜３０ヌクレオチドを含むことが好ましい。アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、ｓＦｌｔ−１のｍＲＮＡ又はＤＮＡに相補的な、少なくとも４０、６０、８５、１２０、又はそれより長い連続したヌクレオチドを含有することもでき、全長のｍＲＮＡ又は遺伝子と同様であってもよい。
【００６２】
「肥満度指数」とは、身長と体重の測定値を用いて得られる数を意味し、体重が健常範囲内にあるかどうかの一般的指標を与える。肥満度指数を決定するために一般に用いられる式は、個人の身長（ｍ）の２乗で割った個人の体重（ｋｇ）、即ち体重（ｋｇ）／（身長（ｍ））２である。
【００６３】
「心血管病態」とは、心血管システムのイベント又は障害を意味する。心血管病態の非限定的な例には、粥状動脈硬化、一次性心筋梗塞、二次性心筋梗塞、狭心症（安定及び不安定狭心症を含む）、うっ血性心不全、突然心臓死、脳梗塞、再狭窄、失神、虚血、再灌流障害、血管閉塞、頸動脈閉塞性疾患、及び一過性脳虚血発作などが含まれる。
【００６４】
「化合物」とは、小分子化学化合物、抗体、核酸分子、若しくはポリペプチド、又はそれらの断片を意味する。
「キメラ抗体」とは、他のタンパク質の少なくとも一部（典型的には免疫グロブリン定常ドメイン）に連結した抗体分子の少なくとも抗原結合部分を含むポリペプチドを意味する。
【００６５】
「２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）」とは、センス鎖及びアンチセンス鎖で構成されるリボ核酸分子を意味する。ｄｓＲＮＡｓは典型的にはＲＮＡ干渉を介在するために用いられる。
【００６６】
「発現」とは、標準技術の公知の方法で遺伝子又はポリペプチドを検出することを意味する。例えば、ポリペプチド発現はウエスタンブロッティングで検出され、ＤＮＡ発現はサザンブロッティング又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で検出され、ＲＮＡ発現はノーザンブロッティング、ＰＣＲ、又はＲＮＡｓｅプロテクションアッセイで検出されることが多い。
【００６７】
「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の一部分を意味する。この部分は、基準核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％を含有することが好ましい。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ヌクレオチド又はアミノ酸を含有することができる。
【００６８】
「在胎週数」とは、胎児の年齢の言及を意味し、母親の最終月経期間の初日から計算され、通常週で表される。
「子癇前症又は子癇の病歴」とは、被験者自身又は親類の子癇前症若しくは子癇又は妊娠高血圧の以前の診断を意味する。
【００６９】
「相同な」とは、比較配列の長さにわたり、公知の遺伝子又はタンパク質の配列に対して少なくとも３０％の相同性、より好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、最も好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子又はタンパク質の配列を意味する。また、「相同な」タンパク質は、比較タンパク質の少なくとも１つの生物活性を有することができる。ポリペプチドでは、比較配列の長さは一般に少なくとも１６アミノ酸、好ましくは少なくとも２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも２５アミノ酸、最も好ましくは３５アミノ酸以上であろう。核酸では、比較配列の長さは一般に少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１１０ヌクレオチドであろう。「相同性」は、抗体を作製するために用いられるエピトープと、抗体が指向するタンパク質又はその断片とのあいだの実質的類似性を表すこともできる。この場合、相同性は、問題のタンパク質を特異的に認識できる抗体の産生を引き出すのに十分な類似性を表す。
【００７０】
「ヒト化抗体」とは、所定の抗原に結合可能な免疫グロブリンアミノ酸配列変異体又はその断片を意味する。通常、抗体は、軽鎖、及び少なくとも重鎖の可変ドメインを含有するであろう。抗体は、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、又はＣＨ４領域を含むこともできる。ヒト化抗体は、実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域（ＦＲ）と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）（「インポート」配列）とを含む。
【００７１】
一般に、ヒト化抗体は、ヒト以外の供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の全てを実質的に含むであろう。ここで、全て又は実質的に全てのＣＤＲ領域は非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、全ての又は実質的に全てのＦＲ領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部分を含むことが最適である。「相補正決定領域（ＣＤＲ）」とは、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のそれぞれの可変領域中の３つの超可変配列を意味する。「フレームワーク領域（ＦＲ）」とは、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の３つの超可変配列（ＣＤＲ）の両側に位置するアミノ酸配列を意味する。
【００７２】
ヒト化抗体のＦＲ及びＣＤＲ領域は、正確に親配列に相当する必要はない。例えば、インポートＣＤＲ又はコンセンサスＦＲは、その部位のＣＤＲ又はＦＲの残基がコンセンサス抗体にもインポート抗体にも相当しないように、少なくとも１残基の置換、挿入、又は欠失によって突然変異誘発させることができる。しかしながら、そのような突然変異は、広範囲に及ばないであろう。通常、ヒト化抗体の残基の少なくとも７５％、好ましくは９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、親のＦＲ及びＣＤＲ配列のものに相当するであろう。
【００７３】
「ハイブリダイズ」とは、さまざまなストリンジェンシーの条件下で、相補的なポリヌクレオチド配列間又はその部分間で２本鎖分子を形成するための対を意味する。（例えば、Ｗａｈｌ及びＢｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７、１９８７を参照されたい。）例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び７５ｍＭクエン酸三ナトリウムより低く、好ましくは約５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５０ｍＭクエン酸三ナトリウムより低く、最も好ましくは約２５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低いであろう。低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えばホルムアミドの非存在下で得ることができるが、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミド、最も好ましくは少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃、より好ましくは少なくとも約３７℃、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及びキャリアーＤＮＡの有無などのさまざまな更なるパラメータは、当該技術分野に熟練した者に周知である。さまざまなレベルのストリンジェンシーは、必要とされるこれらのさまざまな条件を組み合わせることによって達成される。好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び１％ＳＤＳ中で、３０℃で起こるであろう。より好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で起こるであろう。最も好ましい態様では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、及び２００μｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ中、４２℃で起こるであろう。これらの条件の有用な変形は、当該技術分野に熟練した者に容易に明らかになるであろう。
【００７４】
ほとんどの応用では、ハイブリダイゼーションに続く洗浄工程も、ストリンジェンシーがさまざまであろう。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度及び温度によって定義することができる。上記のように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を下げるか温度を上げることによって強めることができる。例えば、洗浄工程のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ  ＮａＣｌ及び３ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低く、最も好ましくは約１５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムよりも低いであろう。洗浄工程のストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃、より好ましくは少なくとも約４２℃、最も好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。好ましい態様では、洗浄工程は、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中、２５℃で起こるであろう。より好ましい態様では、洗浄工程は、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中、４２℃で起こるであろう。最も好ましい態様では、洗浄工程は、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム、及び０．１％ＳＤＳ中、６８℃で起こるであろう。これらの条件の更なる変形は、当該技術分野に熟練した者に容易に明らかになるであろう。ハイブリダイゼーション技術は当該技術分野に熟練した者には周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０、１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：３９６１、１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌら（分子生物学の最新プロトコール、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（分子クローニング技術の手引き、１９８７、アカデミック出版、ニューヨーク）；並びにＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所出版、ニューヨーク、に記載されている。
【００７５】
「子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）」とは、胎児の在胎週数から予測される胎児の体重の１０％よりも少ない出生体重を生ずる症候群を意味する。低出生体重に関する最近の世界保険機構の基準は、２，５００ｇ（５ポンド又は８オンス）よりも少ない体重、又は米国の人種、出産経歴、及び乳児の性別による在胎週数に対する出生体重表に照らして在胎週数の１０パーセンタイルよりも少ない体重である（Ｚｈａｎｇ及びＢｏｗｅｓ、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．８６：２００−２０８、１９９５）。これらの低出生体重児は、「在胎週数に比して小さい（ＳＧＡ）」ともいう。子癇前症は、ＩＵＧＲ又はＳＧＡに関連することが知られている病態である。
【００７６】
「測定基準」とは、尺度を意味する。測定基準は、例えば目的のポリペプチド又は核酸分子のレベルを比較するために用いることができる。例示的測定基準には、限定されるものではないが、比などの数式又はアルゴリズムが含まれる。使用すべき測定基準は、子癇前症又は子癇を有する被験者と正常対照被験者とのあいだのｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのレベルを最も区別するものである。使用する測定基準に応じて、子癇又は子癇前症の診断指標は、（例えば子癇前症でも子癇でもない対照被験者からの）基準値よりも顕著に高いか又は低いかもしれない。
【００７７】
ｓＦｌｔ−１レベルは、遊離の、結合した（即ち成長因子に結合した）、又は全量の（結合＋遊離）ｓＦｌｔ−１の量を測定することによって決定する。ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルは、遊離のＰｌＧＦ又は遊離のＶＥＧＦ（即ちｓＦｌｔ−１に結合していない）の量を測定することによって決定する。１つの例示的測定基準は、［ｓＦｌｔ−１／（ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦ）］であり、子癇前症抗血管新生指標（ＰＡＡＩ）ともいう。
【００７８】
「機能可能に連結された」とは、適切な分子（例えば転写アクチベータータンパク質）が調節配列に結合したとき遺伝子発現を可能にするような方法で遺伝子と調節配列が連結されることを意味する。
【００７９】
「医薬的に許容可能な担体」とは、ともに投与される化合物の治療特性を保持しながら、処置される哺乳動物にとって生理的に許容可能な担体を意味する。１つの例示的な医薬的に許容可能な担体物質は生理食塩水である。他の生理的に許容可能な担体及びその製剤は当該技術分野に熟練した者に公知であり、例えばレミントンの薬学（第２０版）、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州に記載されている。
【００８０】
「胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）」とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４９７６３によって定義されたタンパク質と相同性があり、ＰｌＧＦ生物活性を有する哺乳動物成長因子を意味する。ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦファミリーに属するグリコシル化ホモダイマーであり、選択的スプライシング機構を介して２つの異なるアイソフォームで見出される。ＰｌＧＦは胎盤の細胞栄養芽層及びシンシチウム栄養芽層によって発現され、ＰｌＧＦ生物活性には内皮細胞、特に栄養膜細胞の増殖、遊走、及び活性化の誘導が含まれる。
【００８１】
「多型」とは、病態を発症する傾向の指標である、ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦの核酸分子内の遺伝的変異、突然変異、、欠失又は付加を意味する。そのような多型は当業者に公知であり、Ｐａｒｒｙら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．２６：３２１−３、１９９９）に記載されている。多型は、ｓＦｌｔ−１遺伝子のプロモーター配列、オープンリーディングフレーム、イントロン配列、又は３’非翻訳領域に存在することができる。
【００８２】
「子癇前症」とは、タンパク尿若しくは浮腫、または両方を伴う高血圧、腎糸球体不全、脳浮腫、肝性浮腫、又は妊娠若しくは最近の妊娠の影響による血液凝固異常を特徴とする多臓器障害を意味する。子癇前症は通常妊娠２０週後に発症する。子癇前症は、通常、以下の症状のいくつかの組み合わせとして定義される：（１）妊娠２０週後の収縮期血圧（ＢＰ）＞１４０ｍｍＨｇ及び拡張期ＢＰ＞９０ｍｍＨｇ（通常４〜１６８時間あけて２回測定する）、（２）新たに発症したタンパク尿症（尿検査で１＋、２４時間畜尿中のタンパク質が＞３００ｍｇ、又はタンパク質／クレアチニン比＞０．３の無作為尿サンプルが１つ）、及び（３）産後１２週までの高血圧及びタンパク尿症の解消。重度子癇前症は、通常、（１）拡張期ＢＰ＞１１０ｍｍＨｇ（通常４〜１６８時間あけて２回測定する）、又は（２）２４時間畜尿中のタンパク質が３．５ｇ以上の測定値若しくは尿検査でタンパク質が少なくとも３＋の２つの無作為尿標本によって特徴付けられるタンパク尿症、として定義される。子癇前症では、高血圧及びタンパク尿症は、通常、互いに７日以内に発症する。重度子癇前症では、重度高血圧、重度タンパク尿症、及びＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝酵素の上昇、血小板低下）、又は子癇は、一度に同時に発症するか、たった１つの症状が起こり得る。時折、重度子癇前症は発作を発症させる得る。この重度型の症状を「子癇」という。子癇には、いくつかの臓器若しくは組織の機能不全又は損傷、例えば肝臓（例えば肝細胞障害、門脈周囲の壊死）及び中枢神経系（例えば脳浮腫及び脳出血）などを含めることもできる。発作の病因は、脳浮腫及び腎微小血管の局所痙攣の発症に対して２次性であると考えられる。
【００８３】
「子癇前症抗血管形成指標（ＰＡＡＩ）」とは、抗血管新生活性の指標として用いられるｓＦｌｔ−１／ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦの比を意味する。１０より大きいＰＡＡＩ、より好ましくは２０より大きいＰＡＡＩは、子癇前症の指標又は子癇前症の危険性とみなされる。
【００８４】
「タンパク質」又は「ポリペプチド」又は「ポリペプチド断片」とは、翻訳後修飾（例えばグリコシル化又はリン酸化）にかかわりなく、天然ポリペプチド若しくはペプチドの全部若しくは部分で構成されているか、又は非天然ポリペプチド若しくはペプチドで構成されている、２より多いアミノ酸の鎖を意味する。
【００８５】
「低下又は阻害する」とは、上記アッセイによって検出されたタンパク質又は核酸のレベル（「発現」を参照されたい）の、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。タンパク質又は核酸のレベルを低下又は阻害するためのアンチセンス核酸塩基オリゴマー又はＲＮＡ干渉の使用に関する態様の場合、％低下又は阻害は、アンチセンス核酸塩基オリゴマー又はｄｓＲＮＡで処置したサンプルのレベルを、処置していないサンプルのレベルと比較することによって決定される。
【００８６】
「基準サンプル」とは、試験サンプルの時間の前の被験者、子癇前症も子癇も有していない妊娠被験者、妊娠しているがサンプルは妊娠初期に採取した被験者（例えば妊娠第一期若しくは第二期又は又は子癇前症若しくは子癇の検出前）、妊娠しているが子癇前症も子癇も有しておらず子癇前症又は子癇の病歴もない被験者、あるいは妊娠している被験者から採取したサンプルを意味する。基準サンプルは、子癇前症又は子癇の診断法ではなく、正常濃度であることが知られている濃度の精製ポリペプチド（例えばＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ、又はｓＦｌｔ−１）であることもできる。例えば、正常妊娠中の尿ＰｌＧＦ濃度は４００〜８００ｐｇ／ｍｌの範囲であるが、妊娠中期に活性な子癇前症を有する場合は２００ｐｇ／ｍｌより低い範囲であり得る。４００ｐｇ／ｍｌ又は２００ｐｇ／ｍｌよりも低い尿ＰｌＧＦレベルは、子癇前症又は子癇前症を発症する傾向の指標である。「基準サンプル」は、基準標準又はレベルであることもできる。「基準標準又はレベル」とは、基準サンプルに由来する値又は数を意味する。基準標準又はレベルは、以下の基準のうちの少なくとも１つによってサンプル被験者に匹敵する正常被験者に由来する値又は数であることもできる：胎児の在胎週数、母体年齢、妊娠前の母体血圧、妊娠中の母体血圧、母親のＢＭＩ、胎児の体重、子癇前症又は子癇の前診断、及び子癇前症又は子癇の病歴。基準サンプル中の具体的ポリペプチドの値に基づいて決定される基準値を用いることもできる。
【００８７】
「小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）」とは、分解されるべき標的遺伝子又はｍＲＮＡを同定するために用いられる、好ましくは長さ１０ヌクレオチドより長い、より好ましくは長さ１５ヌクレオチドより長い、最も好ましくは長さ１９ヌクレオチドより長い単離ｄｓＲＮＡ分子を意味する。１９〜２５の範囲のヌクレオチドが最も好ましいサイズのｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡには、ｓｉＲＮＡ２本鎖の両方の鎖が１本のＲＮＡ分子内に含まれている短いヘアピンＲＮＡを含めることもできる。ｓｉＲＮＡには、あらゆる形態のｄｓＲＮＡ（より大きなｄｓＲＮＡがタンパク質分解により切断された産物、部分精製されたＲＮＡ、実質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換えにより産生されたＲＮＡ）、並びに１以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換、及び／又は改変によって天然ＲＮＡとは異なる改変ＲＮＡが含まれる。そのような改変には、例えば２１〜２３ヌクレオチドＲＮＡの末端又は内部への（ＲＮＡの１以上のヌクレオチドに）非ヌクレオチド物質の付加を含めることができる。好ましい態様では、ＲＮＡ分子は３’ヒドロキシル基を含有する。本発明のＲＮＡ分子のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含めた非標準的ヌクレオチドを含むこともできる。そのような改変ＲＮＡの全てを総称してＲＮＡアナログという。本発明のｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介在する能力を有する天然ＲＮＡに十分類似することのみが必要である。本明細書において、ＲＮＡｉとは、小さな干渉ＲＮＡ又はｄｓＲＮＡの細胞又は生物への導入を介した、特定ｍＲＮＡ分子のＡＴＰ依存性の標的切断及び分解を意味する。本明細書において、「ＲＮＡｉを介在する」とは、どのＲＮＡが分解されるか区別又は同定する能力を意味する。
【００８８】
「可溶性Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）」（ｓＶＥＧＦ−Ｒ１としても知られている）とは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１１３４によって定義されるタンパク質と相同であり、ｓＦｌｔ−１生物活性を有する可溶型Ｆｌｔ−１受容体を意味する。ｓＦｌｔ−１ポリペプチドの生物活性は、標準法を用いて、例えばＶＥＧＦへのｓＦｌｔ−１の結合をアッセイすることによって測定することができる。ｓＦｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１受容体の膜貫通ドメイン及び細胞内チロシンキナーゼドメインを欠失している。ｓＦｌｔ−１は、高親和性でＶＥＧＦ及びＰｌＧＦに結合することができるが、増殖又は血管新生を誘導することができず、したがって、Ｆｌｔ−１受容体及びＫＤＲ受容体とは機能的に異なっている。ｓＦｌｔ−１は初めにヒト臍帯内皮細胞から精製され、後に栄養膜細胞によって産生されることがｉｎ  ｖｉｖｏで示された。本明細書において、ｓＦｌｔ−１には、あらゆるｓＦｌｔ−１ファミリーメンバー又はアイソフォームが含まれる。更なる態様では、ｓＦｌｔ−１は、Ｆｌｔ−１受容体の酵素的な切断によって生じ、Ｆｌｔ−１生物活性を維持する分解産物又は断片を意味することもできる。１つの例では、胎盤から放出される特異的メタロプロテイナーゼはＦｌｔ−１受容体の細胞外ドメインを切断することができ、Ｆｌｔ−１のＮ端部分を循環中に放出する。
【００８９】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、サンプル、例えば天然に本発明のポリペプチドを含む生体サンプル中の他の分子は実質的に認識も結合もしない化合物又は抗体を意味する。１つの例では、ｓＦｌｔ−１に特異的に結合する抗体はＦｌｔ−ｌに結合しない。
【００９０】
「被験者」とは、限定されるものではないが、ヒト又はヒト以外の哺乳動物、例えばウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、又はネコなどを含めた哺乳動物を意味する。この定義に含まれるのは、妊娠した、産後の、及び妊娠していない哺乳動物である。
【００９１】
「実質的に同一」とは、保存的アミノ酸置換、例えば、１つのアミノ酸の同一クラスの他のアミノ酸への置換（例えばバリンをグリシンに、アルギニンをリジンに、など）、又はタンパク質の機能を破壊しないアミノ酸配列の位置における１以上の非保存的置換、欠失、若しくは挿入によってのみ異なっているアミノ酸配列を意味する。アミノ酸配列は、他のアミノ酸配列に対し、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％相同である。同一性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータプログラムを利用できる。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータプログラム法には、限定されるものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７、１９８４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）が含まれる。周知のスミス・ウォーターマンのアルゴリズムを用いて同一性を決定してもよい。ＢＬＡＳＴプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給源から公に入手可能である（ＢＬＡＳＴマニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、ベセズダ、メリーランド州２０８９４；ＢＬＡＳＴ  ２．０、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／）。これらのソフトウエアプログラムは、さまざまな置換、欠失、及び他の改変に相同性を割り当てることによって類似配列を適合させる。保存的置換には、典型的には以下の群の中での置換が含まれる:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン；グルタミン；セリン；トレオニン;リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン。
【００９２】
「子癇前症の症状」とは、以下のいずれかを意味する：（１）妊娠２０週後の収縮期血圧（ＢＰ）＞１４０ｍｍＨｇ及び拡張期ＢＰ＞９０ｍｍＨｇ、（２）新たに発症したタンパク尿症（尿検査で１＋、２４時間畜尿中のタンパク質が＞３００ｍｇ、又は無作為尿タンパク質／クレアチニン比が＞０．３）、並びに（３）産後１２週までの高血圧及びタンパク尿症の解消。子癇前症の症状には、腎機能不全及び糸球体内皮症又は肥大を含めることもできる。「子癇の症状」とは、妊娠又は最近の妊娠の影響による以下の症状のいずれかの発症を意味する：発作、昏睡、血小板減少症、肝浮腫、肺浮腫、及び脳浮腫。
【００９３】
「治療量」とは、子癇前症又は子癇の患者に投与した場合に、本明細書に記載の子癇前症又は子癇の症状に質的又は量的な軽減を引き起こすのに十分な量を意味する。「治療量」は、子癇前症又は子癇の患者に投与した場合に、本明細書に記載のアッセイによって測定して、ｓＦｌｔ−１発現レベルの低下又はＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦの発現レベルの増加を引き起こすのに十分な量を意味することもできる。
【００９４】
「処置する」とは、化合物又は医薬組成物を予防及び／又は治療目的で投与することを意味する。「疾患を処置する」又は「治療的処置」のための使用とは、既に疾患に罹患している被験者に、被験者の病態を改善するために処置を施すことを意味する。被験者は、以下に記載の特徴的な症状のいずれかの同定又は本明細書に記載の診断法の使用に基づいて、子癇前症又は子癇に罹患しているを診断されることが好ましい。「疾患を予防する」とは、まだ病気ではないが、具体的疾患を発症しやすいか、又は発症する危険性がある被験者の予防的処置を意味する。被験者は、本明細書に記載の診断法を用いて、子癇前症又は子癇を発症する危険性があると決定されることが好ましい。したがって、特許請求の範囲及び態様において、処置するとは治療又は予防目的での哺乳動物への施行である。
【００９５】
「栄養膜」とは、子宮内膜を侵食してそこから胎児が母親から栄養を摂取する胚盤胞を覆う中外胚葉細胞層を意味する；細胞は胎盤形成に寄与している。
「血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）」は、米国特許第５，３３２，６７１号；第５，２４０，８４８号；第５，１９４，５９６号；及びＣｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、４８：１１２０−１１２８、１９９３）に定義された成長因子と相同なＶＥＧＦ生物活性を有する哺乳動物成長因子を意味する。ＶＥＧＦはグリコシル化ホモダイマーとして存在し、少なくとも４つの選択的にスプライシングされた異なるアイソフォームを含む。天然ＶＥＧＦの生物活性には、血管内皮細胞又は臍帯静脈内皮細胞の選択的増殖の促進及び血管新生の誘発が含まれる。本明細書において、ＶＥＧＦには、あらゆるＶＥＧＦファミリーメンバー又はアイソフォーム（例えばＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ１６５、又はＶＥＧＦ１２１）が含まれる。ＶＥＧＦは、本明細書に援用される米国特許第６，４４７，７６８号；第５，２１９，７３９号；及び第５，１９４，５９６号に記載のＶＥＧＦ１２１又はＶＥＧＦ１６５アイソフォームであることが好ましい（Ｔｉｓｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、１１９４７−１１９５４、１９９１；Ｎｅｕｆｅｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １５：１５３−１５８、１９９６）。Ｇｉｌｌｅら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：３２２２−３２３０、２００１）に記載のＫＤＲ選択的ＶＥＧＦ及びＦｌｔ選択的ＶＥＧＦのようなＶＥＧＦの変異体型も含まれる。本明細書において、ＶＥＧＦには、ＬｅＣｏｕｔｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：８９０−８９３、２００３）に記載のもののような改変型ＶＥＧＦも含まれる。ヒトＶＥＧＦが好ましいが、本発明はヒト型に限定されるものではなく、他の動物型（例えばマウス、ラット、イヌ、又はニワトリ）のＶＥＧＦを含めることができる。
【００９６】
「ベクター」とは、通常、プラスミド又はバクテリオファージに由来するＤＮＡ分子を意味し、それにＤＮＡ断片を挿入又はクローン化することができる。組換えベクターは、１以上のユニーク制限部位を含有し、クローン化配列が再生できる規定の宿主又は媒体生物において自律複製可能である。ベクターは、遺伝子又はコード領域に、受容細胞に形質移入されるとＲＮＡが発現するように機能可能に連結したプロモーターを含有する。
【００９７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の好ましい態様の説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９８】
詳細な説明
発明者らは、ｓＦｌｔ−１レベルが、子癇前症の女性から採取した血清サンプルにおいて上昇していることを発見した。ｓＦｌｔ−１は高親和性でＶＥＧＦ及びＰｌＧＦに結合し、これら成長因子の分裂促進活性及び血管新生活性をブロックする。したがって、ｓＦｌｔ−１は子癇前症の優れた診断マーカーであり、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦは子癇前症の治療に用いることができる。発明者らは、尿中ＰｌＧＦレベルは、子癇前症若しくは子癇又はそれらになりやすい傾向を検出するための診断ツールとして使用できることも発見した。遊離型ＰｌＧＦの平均分子量は約３０ｋＤａであり、非常に小さいため、腎臓でろ過されて尿に放出される。ＰｌＧＦは、ｓＦｌｔ−１と複合体を形成すると、分子量が非常に大きくなり、したがって尿に放出されないであろう。ｓＦｌｔ−１レベルが上昇すると、ｓＦｌｔ−１はＰｌＧＦと複合体を形成することができ、尿に放出される遊離のＰｌＧＦレベルが低下する。その結果、遊離のＰｌＧＦレベルについての尿解析は、子癇前症若しくは子癇又はそれらを有する危険性のある患者を診断するために用いることができる。
【００９９】
更に、発明者らは、精製したＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦへのｓＦｌｔ−１の結合を妨げる治療用物質、又は生物学的に活性なＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのレベルを増加させる物質が、被験者の子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するために使用できることを発見した。そのような物質には、限定されるものではないが、ｓＦｌｔ−１に対する抗体、ｓＦｌｔ−１レベルを低下させるアンチセンス又はＲＮＡｉのためのオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルを増加させる化合物、及びｓＦｌｔ−１に結合し、成長因子結合部位をブロックする小分子が含まれる。また、本発明は、成長因子レベルを測定する方法を特徴とする；この方法は、子癇前症、又は子癇前症若しくは子癇を発症する危険性の増加を初期検出するための診断ツールとして用いることができる。
【０１００】
本明細書に提示した詳細な説明はｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦについて具体的に参照するが、当該技術分野に熟練した者には、詳細な説明が、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのファミリーメンバー、アイソフォーム、及び／又は変異体、並びにｓＦｌｔ−１に結合することが示された成長因子にも当てはめられることは明らかであろう。以下の実施例は本発明を具体的に説明するためのものであり、限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１０１】
子癇前症を有する妊娠女性におけるｓＦｌｔ−１のｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルの増加
子癇前症において病理学的役割を果たしている新規分泌因子を同定しようとして、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ９５Ａマイクロアレイチップを用いて、子癇前症女性及び子癇前症でない女性の胎盤組織の遺伝子発現プロファイリングを行った。遺伝子が子癇前症の女性において上方制御されていることが発見された。
【０１０２】
子癇前症におけるｓＦｌｔ−１の上方制御を確認するため、正常血圧の妊娠女性と比較して、子癇前症の妊娠女性においてノーザンブロットを行って胎盤ｓＦｌｔ−１  ｍＲＮＡレベルを解析し（図１Ａ）、ＥＬＩＳＡアッセイを行ってｓＦｌｔ−１の血清タンパク質レベルを測定した（図１Ｂ）。子癇前症は、(１)妊娠２０週の収縮期血圧（ＢＰ）＞１４０ｍｍＨｇ及び拡張期ＢＰ＞９０ｍｍＨｇ、（２）新たなタンパク尿症の発症（尿検査１＋、２４時間畜尿のタンパク質が＞３００ｍｇ、又は無作為に集めた尿のタンパク質／クレアチニン比＞０．３）、及び（３）産後１２週までの高血圧及びタンパク尿症の回復、として定義される。潜在的な高血圧、タンパク尿症、又は腎疾患の患者は排除した。腎臓の範囲のタンパク尿症（２４時間畜尿のタンパク質が＞３ｇ又は尿タンパク質／クレアチニン比が３．０より大きい）の有無に基づいて患者を軽度及び重度の子癇前症に分けた。軽度子癇前症群の平均尿タンパク質／クレアチニン比は０．９４±０．２であり、重度子癇前症群は７．８±２．１であった。さまざまな群の平均在胎週数は以下の通りであった：正常３８．８±０．２週、軽度子癇前症３４±１．２週、重度子癇前症３１．３±０．６週、及び早産２９．５±２．０週。出産後、直ちに胎盤サンプルを得た。それぞれの胎盤から４つの無作為サンプルをとり、ＲＮＡｌａｔｅｒ安定化溶液（Ａｍｂｉｏｎ、オースティン、テキサス州）に入れ、−７０℃で保存した。キアゲンＲＮＡｅａｓｙ  Ｍａｘｉキット（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）でＲＮＡを単離した。
【０１０３】
子癇前症の妊娠女性において、正常血圧の妊娠女性に対する胎盤ｓＦｌｔ−１  ｍＲＮＡ及び母体血清ｓＦｌｔ−１タンパク質の増加を検出した。重度子癇前症患者のｓＦｌｔ−１の平均血清レベルは、正常対照妊娠女性と比較してほぼ４倍高かった。この効果が子癇前症例の初期の在胎週数によるものである可能性を排除するため、他の理由で早産している妊娠期間が匹敵した正常血圧女性（在胎週数２３〜３６週）のｓＦｌｔ−１レベルも測定したところ、正常血圧満期妊娠と比較して、この群に顕著な相違は見られなかった。ノーザンブロットに用いたプローブはＰＣＲによって得たもので、ｐＵＣ１１８ヒトｆｌｔ−１ｃＤＮＡ由来コード領域の５００ｂｐ断片、及び標準化対照として用いたＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡを含んでいた。
【０１０４】
正常妊娠では、適切な胎盤発育に必要な、胎盤によって分泌される血管新生促進因子と抗血管新生因子とのあいだにはバランスがある。子癇前症では、ｓＦｌｔ−１の産生増加並びにＶＥＧＦ及びＰｌＧＦの産生低下は、抗血管新生に有利な方へバランスがシフトすると仮定された。正味の抗血管新生活性に取り組むため、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦの血清レベルを測定したところ、既に記載されているように（Ｔｉｄｗｅｌｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１８４：１２６７−１２７２、２００１）、ＰｌＧＦ及びＶＥＧＦの血清レベルは、正常対照患者と比較して、子癇前症患者において低いことがわかった（平均ＰｌＧＦ、２３５．３±４５．３ｐｇ／ｍｌ対４６４±１１６．６ｐｇ／ｍｌ）。ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦのレベルを正味の抗血管新生活性の指標としての抗血管新生指標、即ちＰＡＡＩに入れると、子癇前症患者を正常患者から明確に分離することができ、ＰＡＡＩは子癇前症の重篤度と相関するらしいことを発見した（図１Ｃ）。このＰＡＡＩは、妊娠女性の子癇前症を検出するための診断ツールとして有用であり得る。
【実施例２】
【０１０５】
子癇前症の女性の血清は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ内皮管腔形成アッセイにおいて血管新生を阻害する
子癇前症患者の過剰な循環ｓＦｌｔ−１は内皮機能不全を引き起こし、抗血管新生状態をもたらすと仮定された。これに取り組むため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生モデルとして内皮管腔形成アッセイを用いた。成長因子を減らしたマトリゲル（７ｍｇ／ｍＬ、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を予め冷却した４８ウェル細胞培養プレートのウェルに入れ（１００μｌ／ウェル）、３７℃で２５〜３０分間インキュベートして重合させた。継代数３〜５のヒト臍帯静脈内皮細胞（３００μｌの血清不含の内皮細胞基本培地中に３０，０００個、クローンテック、ウォーカーズビル、メリーランド州）を１０％患者血清で処理し、マトリゲルでコーティングしたウェルに捲き、３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。次に倒立位相差顕微鏡（ニコン、東京、日本）を用いて４倍で管形成を評価し、Ｓｉｍｐｌｅ  ＰＣＩ画像解析ソフトウェアで定量解析した（管腔面積及び全長）。
【０１０６】
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞がＶＥＧＦなどの外因性成長因子の存在下でのみ管腔を形成するように管腔形成アッセイの条件を調節した。これらの条件下では、正常血圧女性の血清は内皮細胞の標準の管腔様構造形成を誘発するが、子癇前症女性の血清は管腔形成を阻害することがわかった（図２）。特に、産後４８時間までに、この抗血管新生効果は消滅し、子癇前症患者の血清で注目された管腔の阻害はおそらく胎盤によって放出される循環因子によるものであることを示唆している。ｓＦｌｔ−１を正常血圧血清に子癇前症患者に見られるのと同様の用量で加えると、管腔形成は起こらず、子癇前症の女性の血清で見られた効果を模倣した。外因性ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦを子癇前症の血清を用いたアッセイに加えると、管腔形成が回復した（図２）。組換えヒトＶＥＧＦ、ヒトＰｌＧＦ、及びヒトＦｌｔ−１Ｆｃをこれらのアッセイに用いた。これらの結果は、子癇前症血清の抗血管新生特性は内因性ｓＦｌｔ−１によるＶＥＧＦ及びＰｌＧＦの拮抗作用によるものであることを示唆した。これらの結果は、精製ＶＥＧＦ及び／又はＰｌＧＦの添加は子癇前症病態を逆転又は緩和させることができ、治療的に用いることができることも示唆した。
【実施例３】
【０１０７】
ｓＦＩｔ−１はＶＥＧＦ及びＰｌＧＦによって誘発される腎微小血管の血管拡張を阻害する
血管収縮におけるｓＦｌｔ−１の病原的役割を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ微小血管反応性実験を用いて決定した。微小血管反応性実験は以前に記載されたようにラット腎微小血管を用いて行った（Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．、９０：１３８−１４３、２０００）。腎臓動脈微小血管（内径７０〜１７０μｍ）を、１０倍〜６０倍の解剖顕微鏡（オリンパス光学工業、東京、日本）を用いてラット腎から切り出した。微小血管を分離した微小血管チャンバーにおき、直径３０〜６０μｍを測定する２連ガラスマイクロピペットでカニューレを挿入し、１０−０ナイロンモノフィラメント糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、サマービル、ニュージャージー州）で固定した。３７℃に温めた酸素化（９５％酸素及び５％二酸化炭素）クレブスバッファー溶液を、血管チャンバーと全量１００ｍｌの溶液を含有するリザーバーとに連続的に循環させた。流れを止めた状態で血管にクレブスバッファー溶液を満たしたビュレット・マノメーターを用いて４０ｍｍＨｇまで加圧した。ビデオカメラに接続された倒立顕微鏡（４０倍〜２００倍；オリンパスＣＫ２、オリンパス光学工業）で、血管画像を白黒テレビモニターに写し出した。電子寸法分析器（Ｌｉｖｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、バーリントン、バーモント州）を用いて管腔の内径を測定した。ストリップ・チャート式記録計（Ｇｒａｐｈｔｅｃ、アービン、カリフォルニア州）で測定値を記録した。介入前、血管を微小血管チャンバーに少なくとも３０分間浸した。全ての実験群において、腎微小血管の弛緩反応を、４０ｍｍＨｇの膨張圧で基底径の４０〜６０％までＵ４６６１９（トロンボキサンアゴニスト）で微小血管を予備収縮させた後に試験した。いったん定常状態の調子に達してから、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、及びｓＦｌｔ−１などのさまざまな試薬に対する反応を試験した。組換えラットＶＥＧＦ、マウスＰｌＧＦ、及びマウスＦｌｔ−１Ｆｃをこれらのアッセイに用いた。全ての薬物は管腔外に適用した。反応が安定したときに測定した（通常薬物投与後２〜３分）。それぞれの血管について１〜４回の介入を行った。血管をクレブスバッファー溶液で洗浄し、介入のあいだ薬物不含クレブスバッファー溶液に２０〜３０分間平衡化させた。
【０１０８】
ｓＦｌｔ−１単独では顕著な血管収縮を引き起こさないが、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦによって誘発される血管拡張の用量依存的増加をブロックすることを発見した（図３Ａ）。更に、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦは、妊娠において見られる生理的レベルで、顕著な用量依存的細動脈弛緩を誘発し、この効果は重度子癇前症女性において観察される濃度である１０ｎｇ／ｍｌ  ｓＦｌｔ−１の添加によってブロックされることを発見した（図３Ｂ）。この結果は、子癇前症患者の循環ｓＦｌｔ−１が血管緊張低下に対抗し、高血圧に寄与し得ることを示唆した。これらの結果は、ｓＦｌｔ−１が高血圧を含めた子癇前症の多くの臨床症状及び生理的症状に関与するという結論を支持している。ｓＦｌｔ−１の阻害は、指向性抗体の使用を介して、例えば、子癇前症女性のタンパク質の効果を逆転し、そのようなｓＦｌｔ−１インヒビターは潜在的に治療剤として使用できるであろう。
【実施例４】
【０１０９】
子癇前症動物モデルにおけるｓＦｌｔ−１の効果
上記結果に基づいて、外因性ｓＦｌｔ−１の添加が動物モデルにおいて高血圧及びタンパク尿症を作り出すと仮定された。ｓＦｌｔ−１を発現するアデノウイルスは、顕著な抗腫瘍活性に関連する持続した全身ｓＦｌｔ−１レベルを作り出すことが示されている（Ｋｕｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：４６０５−４６１０、２００１）。マウスｓＦｌｔ−１をコードするこの組換えアデノウイルスを、妊娠８〜９日のスプラーグドーリーラット尾静脈に注入した。マウスＦｃ及びｓＦｌｋ１−Ｆｃ（マウスＶＥＧＦ受容体１  Ｆｌｋ１細胞外ドメインとＦｃタンパク質との融合タンパク質）を等量でコードするアデノウイルスを対照として用いた。Ｆｌｋ１はＶＥＧＦに結合することが示されているが、ＰｌＧＦには結合しない。したがって、ｓＦｌｋ−１Ｆｃを対照として選択し、ｓＦｌｔ１の抗ＶＥＧＦ活性と抗ＰｌＧＦ活性との区別に役立てた。
【０１１０】
妊娠及び非妊娠スプラーグドーリーラットに、１×１０９ｐｆｕのＡｄ  Ｆｃ、Ａｄ  ｓＦｌｔ−１、又はＡｄ  ｓＦｌｋ−１Ｆｃを尾静脈注射によって注入した。これらのアデノウイルスは依然に記載されており（Ｋｕｏら、上記）、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで作製された。妊娠ラットに、妊娠８〜９日（妊娠第二期初期）でアデノウイルスを注入し、妊娠１６〜１７日（妊娠第三期初期）に血圧を測定した。非妊娠動物では、アデノウイルス注入後８日にＢＰを測定した。ペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔後のラットのＢＰを測定した。頸動脈を単離し、圧力変換器に接続した３−Ｆｒ高性能マイクロチップカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ヒューストン、テキサス州）でカニューレを挿入した。Ｍｉｌｌａｒマイクロチップカテーテルを動脈内に進めて血圧を記録した。ストリップ・チャート式記録計で血圧及び心拍数を記録し（モデル５６−１Ｘ  ４０−００６１５８、Ｇｏｕｌｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、クリーブランド、オハイオ州）、10分間の平均をとった。次に、安楽死させる前に血液、組織、及び尿のサンプルを得た。標準の尿検査で尿アルブミンを測定し、他の場所に記載されているように（Ｃｏｈｅｎら、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｌ．、４５：１６７３−１６７９、１９９４）、競合的酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で定量した。ピクリン酸比色法キット（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）で尿クレアチニンを測定した。子癇前症の自然の病状を模倣するため、妊娠第三期初期に動脈内血圧を測定した。これらの実験は、非妊娠雌性スプラーグドーリーラットにおいても行い、ｓＦｌｔ−１の効果が胎盤の効果を介した直接的なものか又は間接的なものかを決定した。さまざまなｓＦｌｔ−１で処理した動物の血圧測定日の全身ｓＦｌｔ−１レベルは、ウエスタンブロット解析によって、２５〜３５０ｎｇ／ｍＬの範囲であることが確認された。さまざまな実験群の血圧及びタンパク尿症を表１に示す。
【０１１１】
【表１】
2007522457.tif 000002
【０１１２】
ｓＦｌｔ−１で処理した妊娠ラットは、Ｆｃ対照と比較して顕著な高血圧及び腎炎の範囲のタンパク尿症を有していた。ｓＦｌｔ１を投与された非妊娠ラットも高血圧及びタンパク尿症を発症した。特に、ｓＦｌｋ−Ｆｃで処理した非妊娠ラットは高血圧及びタンパク尿症を発症したが、ｓＦｌｋ−Ｆｃで処理した妊娠ラットは発症しなかった。したがって、妊娠ラットでは、おそらく高レベルＰｌＧＦの存在により、ＶＥＧＦの拮抗作用単独は子癇前症の作製には不十分である。非妊娠状態では、ＰｌＧＦが事実上存在しない場合は、ＶＥＧＦの拮抗作用単独で、血管新生促進／抗血管新生バランスのバランスを崩壊させ、子癇前症に関連したものに類似した腎臓の病状を作り出すのに十分である。さまざまな染色技術を用いてｓＦｌｔ−１で処理したラット全てで観察された腎病変を調べた（図４）。ラットから取り出した腎をブアン溶液で固定して切り出し、Ｈ＆Ｅ染色及びＰＡＳ染色を行った。電子顕微鏡の場合、腎組織をグルタールアルデヒドで固定し、アラルダイト−エポン混合物中に包埋し、超薄腎切片（１μｍ）を切り出し、トルエンブルーで染色し、そしてツァイスＥＭ１０を用いてさまざまな倍率で評価した。糸球体内のフィブリン沈着について、ポリクローナル抗フィブリン抗体（ＩＣＮ、スイス）を用いて免疫蛍光を行った。広範囲に拡散した糸球体内皮症は、ｓＦｌｔ−１で処理したラットにおいていたるところに観察される腎病変であった。血管内皮細胞の腫脹及び肥大によるループ状毛細血管の閉塞を伴う糸球体肥大を検出した。糸球体上皮細胞において多数の明らかなタンパク質吸収液滴が見られた。分節性糸球体硬化症は観察されなかった。糸球体内に孤立性「二重輪郭像」及び巣状フィブリン沈着が見られた。顕著なメサンギウム介入の非存在下でのこのフィブリン沈着の発見は、産前期のヒト疾患の典型的なものとして記載されているものに類似している（Ｋｉｎｃａｉｄ−Ｓｍｉｔｈ、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．、１７：１４４−１４８、１９９１）。フィブリンについての免疫蛍光は、ｓＦｌｔ−１で処理した動物の糸球体内にフィブリン沈着巣を示したが、Ｆｃで処理した動物には見られなかった。ｓＦｌｋ１で処理した非妊娠ラットは同一病変を発症した。実際、ｓＦｌｋ１をｓＦｌｔ−１と同一レベルで用いると、ｓＦｌｔ−１に対して拮抗する循環血管新生促進分子が少ないため、非妊娠ラットにおいて腎損傷はより重篤であった。これらの結果は、ｓＦｌｔ−１レベルの増加は、子癇前症と関連する糸球体内皮症に関与し得るが、糸球体変化が妊娠ラットに加えて非妊娠ラットにおいても検出されたため、この効果は胎盤と無関係であることを示唆していた。これらの結果は、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦの拮抗作用は、ｓＦｌｋ−１で処理した非妊娠マウスでは起こるが、ｓＦｌｋ−１で処理した妊娠マウスではＰｌＧＦレベルの高いと起こらない高血圧及びタンパク尿症のように、子癇前症の病理に重要であることも示唆していた。
【０１１３】
本明細書において作製した動物モデルは、新規治療用化合物を試験するための動物モデルとして用いることができる。この動物モデルを用いて潜在的治療用化合物の有効性並びに薬理及び毒性を試験することができる。
【実施例５】
【０１１４】
子癇動物モデルにおけるｓＦｌｔ−１の効果
妊娠第二期初期の妊娠ラットに外因性ｓＦｌｔ−１を注入する。次に、子癇の発症についてラットを妊娠第三期初期のあいだモニターし、試験する。子癇の検出に用いる試験には、浮腫の発症に関するラット脳のＭＲＩ、発作の発症に関するラット脳のＥＥＧ、並びに内皮損傷が血液脳関門及び脈絡叢に沿って起こっているかどうかを決定するための特異的内皮マーカーを用いたラット脳の組織像を含めることができる。
【０１１５】
本明細書において作製した動物モデルは、新規治療用化合物を試験するための動物モデルとして用いることができる。この動物モデルを用いて、潜在的治療用化合物の有効性並びに薬理及び毒性を試験することができる。
【実施例６】
【０１１６】
尿のＰｌＧＦ／クレアチニン比は子癇前症の診断法である
妊娠１６週の１０人の女性から尿サンプルを得た（正常５人、軽度子癇前症４人、及び重度子癇前症１人）。これらのサンプルは、マサチューセッツ総合病院のＲａｖｉ  Ｔｈａｄｈａｎｉ博士より提供された。正常妊娠女性では、尿の平均の遊離ＰｌＧＦ／クレアチニン比（クレアチニン１ｍｇあたりのＰｌＧＦ  ｐｇ）は７８±１０．７であり、４人の軽度子癇前症患者では３３±５．０であり、１人の重度子癇前症患者は１７であった。したがって、尿中のクレアチニンに対するＰｌＧＦの比の変化は、患者の子癇前症の診断指標として有用である。
【実施例７】
【０１１７】
尿ＰｌＧＦレベルは対照及び子癇前症妊娠女性を判定する
ＮＩＨのＲｉｃｈａｒｄ  Ｌｅｖｉｎｅ博士と共同して、ＣＰＥＰ試験に（実施例８を参照されたい）からの保管尿標本を用いて、対照妊娠女性及び子癇前症の女性の尿ＰｌＧＦを測定した（表２）。以下の表は、妊娠初期（＜２０週）ではなく、妊娠中期（２２〜３０週）及び妊娠後期（＞３０週）のあいだで、後に子癇前症を発症した患者において尿ＰｌＧＦの顕著な減少を示す。子癇前症の臨床症状の前に全ての尿標本を得た。
【０１１８】
【表２】
2007522457.tif 000003
【実施例８】
【０１１９】
女性における子癇前症及び子癇の診断指標としてのｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦのタンパク質レベル
この試験には、ＮＩＨのＲｉｃｈａｒｄ  Ｌｅｖｉｎｅ博士との共同で、正常血圧妊娠及び子癇前症妊娠における循環ｓＦｌｔ−１、遊離のＰｌＧＦ、及び遊離のＶＥＧＦの妊娠パターンを解析するために、子癇前症予防のためのカルシウム試験からの保管サンプルを用いた。子癇前症予防のためのカルシウム試験、即ちＣＰＥＰは、２ｇのカルシウム元素又はプラセボの毎日の補給による子癇前症の罹患率及び重篤度へお効果を評価するために１９９２〜１９９５年に実施された無作為化２重盲検臨床試験である（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：６９−７６、１９９７；Ｌｅｖｉｎｅら、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｌｉｎ．Ｔｒｉａｌｓ  １７：４４２−４６９、１９９６）。独身で妊娠している健常な未経産女性は、５つの関係米国医療センターで、共通プロトコール及び同一のデータ採取形式を用いて妊娠１３〜２１週に記録され、産後24時間まで追跡調査された。記載では、全てのCPEP参加者の血圧は＜１３５／８５ｍｍＨｇであり、誰も腎機能不全及びタンパク尿症でなかった。在胎週数は超音波検査で測定した。血清標本は、試験に参加前（１３〜２１週）、２６〜２９週、未だ妊娠している場合は３６週、及び高血圧又はタンパク尿症に気づいたときに参加者から得た。「終点標本」(活性PE)は、どこかに記載されているように、子癇前症の症状及び徴候の発症時又は発症後であるが、陣痛及び出産前に得た標本である（Ｌｅｖｉｎｅら、１９９６、上記）。ＣＰＥＰ試験からの保管血液サンプルは、ＮＩＨのＲｉｃｈａｒｄ  Ｌｅｖｉｎｅ博士と共同して得た。
【０１２０】
参加者
完全な結果情報、＜２２週に採取した血清サンプル、及び生産男児を有する被験者を選択した。４，５８９人のＣＰＥＰ参加者のうち、追跡調査できなかった２５３人、２０週より前に妊娠が終了した２１人、母体又は周産期の結果データのない１３人、喫煙歴のない４人、カルテ調査チームによって検証されていない高血圧を有する９人、及び死産だったその他の３２人を除外し、適切な情報と生産児を有する４，２５７人の女性を残した。このうち、２，１５６人は男児を有していた。染色体異常児を有する１人の女性、妊娠性高血圧のある３８１人、及び基本血清標本のない４３人を除外した後、１，７３１人の女性が残った。このうち、１７５人が子癇前症を発症し、１，５５６人が妊娠を通して正常血圧のままであった。
【０１２１】
カルシウム補充は子癇前症の危険性及び重篤度に効果がなく、血管新生促進因子及び抗血管新生分子の濃度に関連しなかったため、ＣＰＥＰ処置に関係なく症例及び対照を選択した。それぞれの子癇前症症例に対し、１人の正常血圧対照を選択し、記録部位、最初の血清標本採取時の在胎週数（１週間以内）、及び−７０℃での凍結保存期間（１２ヶ月以内）を一致させた。陣痛前に得た６５７の血清標本全てを解析するために、１２０の一致させたペア（「症例」と「対照」）を無作為に選択した（以下の表３）。最初の血清標本採取時の平均在胎齢は症例と対照でそれぞれ１１２．８日と１１３．６日であった；平均凍結保存期間は９．３５年と９．３９年であった。
【０１２２】
【表３】
2007522457.tif 000004
【０１２３】
この試験では、高血圧を、４〜１６８時間あけた２回の機会の拡張期血圧が少なくとも９０ｍｍＨｇと定義した。重度高血圧は、４〜１６８時間あけた２回の機会の拡張期血圧が、又は女性が抗高血圧療法を受けた場合は１回の機会の拡張期血圧が少なくとも１１０ｍｍＨｇと定義した。タンパク尿症は、２４時間畜尿中のタンパク質が３００ｍｇ以上、４〜１６８時間あけた２つの無作為尿標本のタンパク質が尿検査で少なくとも１＋、１つの尿サンプルのタンパク質／クレアチニン比が少なくとも０．３５、又は１つの無作為尿標本のタンパク質が尿検査で少なくとも２＋、と定義した。重度タンパク尿症は、２４時間畜尿サンプルのタンパク質が少なくとも３．５ｇ、又は２つの無作為尿標本のタンパク質が尿検査で少なくとも３＋で診断した。子癇前症は、高血圧及びタンパク尿症が互いに７日以内に発症と定義した；重度子癇前症は、重度高血圧、重度タンパク尿症、ＨＥＬＬＰシンドローム（溶血、肝酵素の上昇、血小板低下）を有する子癇前症、又は子癇と定義した。子癇前症の発症は、最初の血圧上昇又は尿サンプルのタンパク尿症の検出時であり、子癇前症の診断へと導く。
【０１２４】
在胎週数に比して小さい（ＳＧＡ）は、米国の人種、出産経歴、及び乳児の性別による在胎週数に関する出生体重表（Ｚｈａｎｇ及びＢｏｗｅｓ  １９９５、上記）による在胎週数の第１０パーセンタイルより小さい出生体重で定義される。
【０１２５】
手順
アッセイは、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センターで、患者の診断及び他の関連臨床情報について盲目の検査技師によって行われた。解析のため、標本を無作為に順序付けた。ヒトｓＦｌｔ−１、遊離のＰｌＧＦ、及び遊離のＶＥＧＦに関し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から購入したキットを用いて、製造者の指示にしたがい酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。−７０℃で保存していた血清サンプルのアリコートを室温まで融解し、ＢＳＡ／Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水で希釈し、ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦに対するキャプチャー抗体で予めコーティングした９６ウェルプレート中で２時間インキュベートした。次にウェルを３回洗浄し、過酸化水素とテトラメチルベンジジンとを含有する基質溶液で２０分間インキュベーションし、２Ｎ硫酸で反応を止めた。４５０ｎｍで光学密度を測定した（波長補正５５０ｎｍ）。全てのアッセイは２回行った。既知濃度のそれぞれの組換えタンパク質から得た検量線を用いてタンパク質濃度を計算した。２回の測定間の差が２５％を越える場合は、アッセイを繰り返し、最初の結果を破棄した。ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦのアッセイの感度はそれぞれ５、７、及び５ｐｇ／ｍｌであり、アッセイ間及びアッセイ内の変動係数はｓＦｌｔ−１で７．６％及び３．３％、ＰｌＧＦで１１．２％及び５．４％、ＶＥＧＦで７．３％及び５．４％であった。
【０１２６】
統計解析
母体又は乳児の特徴解析にχ２検定及びｔ検定を用いてそれぞれカテゴリ変数又は連続型変数を比較した。明細書及び図面には濃度の相加平均値を示しているが、統計的検定は特に記載のない限り対数変換後に行った。対数変換した濃度に対するロジスティック回帰を用いて修正を行った。
【０１２７】
結果
１２０人の症例のうち、ＨＥＬＬＰ症候群を伴う３人及び子癇を伴う３人を含め、８０人が軽度子癇前症を、４０人が重度子癇前症を発症した。症例患者は対照患者よりも背が低く、肥満度指数が高く、基準血圧が高かった（表２）。更に、症例患者のかなりの割合が、早産又は在胎週数に比して小さい（ＳＧＡ）乳児を伴う妊娠をしていた。症例患者は平均２．９の血清標本を試験に提供した；対照は２．６標本であった。
【０１２８】
最初に、妊娠期間が一致したこのＣＰＥＰ試験群からの対照と比較して、疾患の活動期、子癇前症患者でｓＦｌｔ−１、Ｐ１ＧＦ、及びＶＥＧＦが変化していることを確認した。臨床子癇前症が確立したとき（終点標本）に採取した標本では、以前に公開された報告書（Ｍａｙｎａｒｄら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：６４９−６５８、２００３）と類似の在胎週数を有する対照と比較して、ｓＦｌｔ−１レベルが劇的に増加し、ＰｌＧＦレベルは低下し、ＶＥＧＦレベルも低下していた（在胎週数２３週で一致させたペアにおける症例及び対照に関し、それぞれｓＦｌｔ１は４３８２対１６４３ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００１；ＰｌＧＦは１３７対６６９ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００１；及びＶＥＧＦは６．４１対１３．８６ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０６）。
【０１２９】
ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ及びＶＥＧＦのレベルの妊娠パターンを評価するために、さまざまな在胎週数期間の症例患者及び対照患者から得た血清標本のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦの循環濃度を測定した。１２０人の子癇前症と１２０人の対照女性のｓＦｌｔ−１タンパク質の妊娠パターンを図５Ａに示す。対照患者のｓＦｌｔ−１レベルは３３〜３６週まで一定のままであったが、陣痛及び出産まで１週間あたりおよそ１４５ｐｇ／ｍｌ増加した。臨床症状前の症例患者では、ｓＦｌｔ−１は２１〜２４週で増加し始めたように見え、より急勾配の増加と２９〜３２週の対照に対し統計的有意差を示した（図５Ａ）。全体的に、臨床症状発症前に測定した症例患者と対照患者との差は妊娠中期で１７％（ｐ＜０．０５）であった。終点標本は、疾患前に採取した標本と比較して顕著に増加していた。臨床疾患発症前のｓＦｌｔ−１上昇のメカニズムを評価するため、全ての子癇前症について、子癇前症発症前の週に関してｓＦｌｔ−１濃度をプロットした（図５Ｂ）。子癇前症発症前の完全な週に関し、症例患者標本の平均ｓＦｌｔ−１濃度をプロットした。子癇前症前５週に始まり、疾患発症前１週間までｓＦｌｔ−１濃度は実質的に増加し、終点標本で観察された濃度に達した。子癇前症前４、３、２、及び１週間のｓＦｌｔ−１の増加は平均在胎週数がほとんど変化することなく起こり、妊娠第三期後期の在胎週数の進行に伴う増加によって説明することができない。子癇前症前８〜６週から５週まで、ｓＦｌｔ−１は９６２ｐｇ／ｍｌに増加し、平均在胎週数は３１日に上昇した。このｓＦｌｔ−１の増加の約１／３は、妊娠期間の進行に起因し得ない。子癇前症発症前＜５週に得た標本を除去した後の対照及び症例においてｓＦｌｔ−１を在胎週数についてグラフにすると、実質的な差は観察されなかった（図５Ｃ）。これらのデータは、子癇前症発症前の症例患者のより高濃度のｓＦｌｔ−１は、臨床疾患発症前５週以内のｓＦｌｔ−１の急激な上昇によることが示唆される。
【０１３０】
次に、図６Ａに示すように、同一患者群におけるＰｌＧＦタンパク質の妊娠パターンをプロットした。対照ＰｌＧＦタンパク質濃度は妊娠第一期及び第二期に上昇し、２９〜３２週にピークに達し、妊娠後期に低下した。症例患者の中で、子癇前症前、ＰｌＧＦタンパク質濃度は類似の妊娠パターンを追うが、１３〜１６週の対照よりも顕著に低かった。全体的に、臨床症状発症前に測定した症例患者と対照とのＰｌＧＦの差は、妊娠中期で３５％であった（ｐ＜０．０００１）。子癇前症発症前の症例のＰｌＧＦレベルを子癇前症前の週について（図６Ｂ）、及び子癇前症前＜５週の標本を除去した後の在胎週数について（図６Ｃ）表す。子癇前症発症前１週までに、濃度は子癇前症発症後観察されたものに近づいた（図６Ｂ）。対照と比較すると、症例患者のＰｌＧＦレベルは、出産から離れた時期は穏やかに低下し、出産前５週及び３週ではより実質的に低下した。対象患者の濃度は、１７〜１５週から出産前３週まで高いままであり、その後劇的に低下した。子癇前症前≦５週に得た標本を除外したＰｌＧＦレベルを示すグラフは、妊娠２９〜３２週で症例において対照よりも小さな低下を示し、３３〜３６週に症例患者から得た標本では全く示さなかった（図６Ｃ）。これは、疾患前の週におけるＰｌＧＦ濃度の低下は、疾患発症時に注目される（又は図６Ａに示す終点標本）劇的に低いＰｌＧＦレベルに関与することを示唆している。
【０１３１】
妊娠を通したVEGF濃度は、非常に低く、37-41 週の症例患者における劇的な低下を除いて、子癇前症前の対照と症例で類似している。子癇前症前5 週に得た標本を除外した症例における２３〜３２週の平均ＶＥＧＦ濃度は、対照と有意に異ならなかった（１１．６対１２．８ｐｇ／ｍｌ）が、出産前≦５週の標本を含めた症例の濃度は有意に異なっていた（５．１対１２．８ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０１）。３３〜４１週に、子癇前症前＞５週、及び≦５週の症例ＶＥＧＦ濃度は、これらの差は有意ではないが、それぞれ対照よりも高く、及び低かった（１１．２ｐｇ／ｍｌ及び８．３対９．７ｐｇ／ｍｌ）。
【０１３２】
図７は、２３〜３２週（図７Ａ）及び３３〜４１週（図７Ｂ）の、子癇前症状態及び重篤度に関するｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦを表す。グラフは、子癇前症発症前のｓＦｌｔ−１の増加及びＰｌＧＦの低下は疾患の重篤度、発症時期、及びＳＧＡ児の存在に関連したことを示している。２３〜３２週に、子癇前症発症前のＳＧＡ児を有する症例患者のｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦは、ＳＧＡ児を有する対照患者の対応する濃度よりも、それぞれ有意に高く、及び低かった。更に、早産した対照患者と比較して、早産した症例患者はｓＦｌｔ−１が高く、ＰｌＧＦが有意に低かった。
【０１３３】
子癇前症の臨床徴候前のｓＦｌｔ−１又はＰｌＧＦの濃度がこの病態の危険性と関連するかどうかを決定するために、ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦの対照値のそれぞれの四分位数について子癇前症に関するオッズ比を、それぞれ最低又は最高四分位数と比較して計算した（表４）。他の全ての四分位数に関し、両極端の四分位数の子癇前症の危険性についても以下のように調べた。妊娠第二期及び妊娠第三期初期に得た標本の場合、最低四分位数のＰ１ＧＦは、出産前（妊娠＜３７週）子癇前症の危険性の増加に関連していた（１３〜２０週標本のＯＲ７．４、９５％ＣＩ  １．８〜３０．２；２１〜３２週標本のＯＲ７．９、９５％ＣＩ  ２．９〜２１．５）。しかしながら、最低四分位数のＰｌＧＦレベルは、満期（≧３７週）子癇前症の有意な予測材料ではなかった。ｓＦｌｔ−１の場合、子癇前症との関連性は、疾患発症近くでのみ観察された。妊娠２１〜３２週（しかし初期ではない）の最高四分位数のｓＦｌｔ−１レベルは出産前子癇前症を予測し（ＯＲ５．１、９５％ＣＩ  ２．０〜１３．０）、３３〜４１週（しかし初期ではない）の最高四分位数のレベルは満期子癇前症を予測した（ＯＲ６．０、９５％ＣＩ  ２．９〜１２．５）。これは、臨床疾患発症の５週以内にｓＦｌｔ−１が大きく上昇することを示す図５Ｂと一致する。最低四分位数のＶＥＧＦは子癇前症の予測材料ではなかった。
【０１３４】
【表４】
2007522457.tif 000005
【０１３５】
これらの結果は、ｓＦｌｔ−１レベルは、子癇前症症状発症前約５週に劇的に増加し始めることを示している。ｓＦｌｔ−１の増加と平行して、遊離のＰｌＧＦ及び遊離のＶＥＧＦのレベルは低下し、ＰｌＧＦ及びＶＥＧＦの低下は少なくとも部分的にｓＦｌｔ−１による拮抗作用によるものであり、ＰｌＧＦ及びＶＥＧＦの胎盤産生低下によるものではないことを示唆している。子癇前症の３つのサブグループ−重度子癇前症、初期に発症する疾患、及びＳＧＡ児−は、対照又は軽度子癇前症を有する女性よりも、２３〜３２週及び３３〜４１週で、ｓＦｌｔ−１濃度が高く、ＰｌＧＦ濃度が低かった。子癇前症を発症することが必至の女性における遊離のＰｌＧＦの妊娠第二期初期に始まる小さいが有意な低下も証明した。これらの結果は、ＰｌＧＦレベルの低下は、初期に発症する子癇前症の有用な予測材料であり得ることを証明している。
【０１３６】
妊娠期間を通して比較的安定なレベルの後、３３〜３６週に始まる安定な増加を観察する、正常妊娠のｓＦｌｔ−１の妊娠パターンについて本明細書に初めて記載する。この増加は、正常妊娠において他者が観察し（Ｔｏｒｒｙら、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０：１７８−１８８、１９９８；Ｔａｙｌｏｒら、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１８８：１７７−１８２、２００３）、そして本明細書に記載の結果に見られる妊娠後期のＰｌＧＦの低下に対応する。一時的な関連性は、ｓＦｌｔ−１がＰｌＧＦ  ＥＬＩＳＡ測定を妨げるという知識（Ｍａｙｎａｒｄら、上記）と共に、妊娠後期の遊離のＰｌＧＦレベルの低下はｓＦｌｔ−１レベルの増加によるものであり得ることを示唆している。妊娠第一期及び妊娠第二期のあいだ、胎児の要求の増加に伴い、胎盤成長が速度を維持する必要性がある場合、ＰｌＧＦ濃度は高く、ｓＦｌｔ−１濃度は低く、相対的に血管新生促進状態を作り上げる。妊娠期間後期、胎盤血管の増殖が和らげられ、抑制される必要があると、抗血管新生性のｓＦｌｔ−１が増加し、ＰｌＧＦが低下する。子癇前症の女性では、ｓＦｌｔ−１の増加は妊娠初期、症状発症前およそ５週、平均して妊娠約２９〜３２週に始まる。したがって、子癇前症では、抗血管新生の「ブレーキ」は、非常に迅速に、非常に強力に適用することができ、胎盤成長を拘束する正常な生理的過程を強調する。子癇前症を特徴とする病的な胎盤の変化は妊娠初期（１０〜１４週）、ｓＦｌｔ−１の劇的な増加よりもかなり前に起こるのは明らかなようである。その結果の胎盤虚血自体はｓＦｌｔ−１産生を高めることができ、最終的にｓＦｌｔ−１のバーストを引き起こす。
【０１３７】
臨床症状発症前５週に見られる大きな差に加えて、子癇前症を発症することが必至の女性では、妊娠１３〜１６週においても遊離のＰｌＧＦが、小さいが統計的に有意に低下した。このＰｌＧＦの低下は、通常、ｓＦｌｔ−１レベルの相反する増加を伴わなかった。しかしながら、妊娠第一期の症例において、統計的に有意ではないが、ｓＦｌｔ−１レベルがわずかに高い傾向があった（例えば１７〜２０週期間では、症例の平均ｓＦｌｔ−１レベルは８６５．７７ｐｇ／ｍｌであったのに対し、対照では７９５．２５ｐｇ／ｍｌであった）。妊娠初期のこのＰｌＧＦレベルの低下は、子癇前症やSGAのような病態の危険にさらされた妊娠において胎盤によるＰ１ＧＦ産生がより少ないことを反映しているであろう。重要なことには、ＳＧＡの危険にさらされた子癇前症患者において、疾患提示前のｓＦｌｔ−１上昇及びＰｌＧＦ低下に統計的に有意な増加を見出した。子癇前症における胎盤のＰ１ＧＦ産生に変化がなく、胎盤の局所ｓＦｌｔ−１レベルの増加が循環する遊離のＰｌＧＦの低下に寄与し得る可能性もある。これは、免疫組織化学的に測定された胎盤ＰｌＧＦは子癇前症において変化していないという発見によって支持されている（Ｚｈｏｕら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０：１４０５−１４２３，２００２）。
【０１３８】
要約すれば、ｓＦｌｔ−は子癇前症において少なくとも臨床疾患発症前５週に増加し始め、これは循環する遊離のＰｌＧＦ及び遊離のＶＥＧの低下を伴うことを示した。妊娠第一期に低下したＰｌＧＦは、子癇前症の予測材料として役立ち、増加したｓＦｌｔ−１は臨床疾患の近接性の予測材料として役立ち得る。このデータは、齧歯類においてｓＦｌｔ−１単独で子癇前症様症状を誘発することを示す上記動物実験と組み合わせて、子癇前症の発症機序におけるｓＦｌｔ−１の有望な病因的役割を示唆している。対照におけるＳＧＡ乳児及び早産に関する限られたデータは、症例患者と比較して、ＳＧＡ児を有する子癇前症妊娠におけるタンパク質レベルの増加した変化は、子癇前症のない子宮内増殖制限又は早産のみによる差よりも実質的であることを示唆している。
【実施例９】
【０１３９】
正常患者及び子癇前症患者の単球において検出されたｓＦｌｔ−１タンパク質及びタンパク質断片
単球に富んだ末梢血単核細胞を正常及び子癇前症患者から単離し、ｓＦｌｔ−１及びｓＦｌｔ−１断片のレベルの測定に用いた。タンパク質抽出物をＰＢＭＣから抽出し、Ｆｌｔ−１／ｓＦｌｔ−１レベルをウエスタンブロットで、Ｆｌｔ−１タンパク質のＮ端（両タンパク質に共通する領域）を認識する抗体を用いて解析した。この実験の結果は、子癇前症患者の単球におけるＦｌｔ−１及びｓＦｌｔ−１のレベル増加を示した（図８）。更に、全長ｓＦｌｔ−１よりも速い移動度を示すいくつかのバンドを検出した。これらの移動度の速いバンドは、分解産物、あるいはスプライシングアイソフォーム、酵素的に切断された産物、又は他の型のｓＦｌｔ−１であり得る。
【実施例１０】
【０１４０】
子癇前症の病歴を有する女性における心血管病態の診断指標としてのｓＦｌｔ−１タンパク質レベル
子癇前症の病歴を有する女性は、心血管病態を発症する傾向にあることが示されている（例えばＫｅｓｔｅｎｂａｕｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．４２：９８２−９８９、２００３を参照されたい）。子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断指標としてのｓ−Ｆｌｔ−１の使用の発見を前提として、ｓＦｌｔ−１が心血管病態を発症する傾向又は子癇前症の病歴を有する女性のイベントの診断指標としても使用できるかどうかを決定するために研究を行った。この研究の結果を表５に示す。
【０１４１】
マサチューセッツ総合病院のＲａｖｉ  Ｔｈａｄｈａｎｉ博士との共同研究で、マサチューセッツ工科大学の総合臨床研究センターにおいて、子癇前症の病歴を有する２９人の正常血圧女性と、産後１８．０±９．７ヶ月の先の正常妊娠を有する３２人の正常血圧女性について検査した。子癇前症はしばしば出産近くに現れ、他の障害は早産をもたらし得るため、妊娠結果の誤分類を避けるため、全ての正常血圧女性は満期出産した（＞３８週）。最近の妊娠、糖尿病又は妊娠性糖尿病の病歴、慢性高血圧、タンパク尿症又は血清クレアチニン＞１．０ｍｇ／ｄＬを有する女性を除外した。同意書を提出後、被験者は病歴の聴取及び身体検査並びに尿による妊娠検査を受けた。一晩の断食後の朝、遊離のＶＥＧＦ及びｓＦｌｔ−１を測定するために血液を採取した。サンプルを直ちに処理し、−８０℃で１８ヶ月以内保存し、現行の研究のためにのみ融解した。ｓＦｌｔ−１及び遊離のＶＥＧＦに市販のＥＬＩＳＡキットを用いた（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州、米国）。ｓＦｌｔ−１及びＶＥＧＦに関するアッセイ内とアッセイ間の変動係数（ＣＶ）はそれぞれ３．５と５．６、及び８．１と１０．９であった。妊娠結果について盲目の技術者によって全てのサンプルは２回試験した。
【０１４２】
妊娠結果群間の一変量比較を、必要に応じて２群ｔ検定、ウィルコクソンの順位和検定、又はフィッシャーの正確確立検定を用いて行った。ロジスティック回帰を用いて産後マーカーレベルを提示した先の子癇前症についてオッズ比を計算し、潜在的交絡を調整した。
【０１４３】
【表５】
2007522457.tif 000006
【０１４４】
これらの結果は、妊娠中子癇前症の病歴を有する女性は、妊娠後の長期間、ｓＦｌｔ−１レベルが上昇することを示した。統計解析が、子癇前症又は子癇の病歴を有する女性は心血管病態を発症する傾向があることを示していることを前提として、これらの結果は、心血管病態又は心血管病態を発症する傾向の診断指標としてのｓＦｌｔ−１産後レベルの使用を指示している。
【実施例１１】
【０１４５】
子癇前症の診断指標としての尿ＰｌＧＦレベル
ＶＥＧＦ、ｓＦｌｔ−１、及びＰｌＧＦの血清測定値を得ることが最前でない状況では、代替の、あまり侵襲性でないスクリーニング法はこれらのタンパク質を尿中で測定することであり得る。ｓＦｌｔ−１は非常に大きい分子である（１１０ｋＤａ）ため、タンパク尿症でなければ尿中にろ過されないが、ＰｌＧＦ及びＶＥＧＦはずっと小さなタンパク質である（それぞれ〜３０ｋＤａ及び４５ｋＤａ）ため、容易にろ過される。完全に循環血液に由来する尿ＰｌＧＦとは異なり、尿ＶＥＧＦの主な供給源は腎臓自体の細胞：糸球体足細胞及び尿細管細胞である。したがって、尿ＶＥＧＦは循環血管新生状態を反映しそうにない。保管尿サンプルを用いて、尿ＰｌＧＦは高血圧及びタンパク尿症の発症前にかなり低下し、子癇前症を予測するという仮説について試験した。
【０１４６】
参加者及び標本
ＣＰＥＰ臨床試験（実施例８を参照されたい）参加者から、試験参加前、妊娠２６〜２９週、依然として妊娠している場合は３６週、及び高血圧又はタンパク尿症が記録されたときに血清標本と尿標本を求めた。最初の朝の標本と２４時間畜尿標本とを求めた；いずれも入手できない場合は無作為の又は「スポット」尿標本を採取した。子癇前症と疑われる患者から２４時間畜尿を求めた。「終点標本」とは、子癇前症の徴候の発症（以下に定義）時又は発症後であるが、陣痛及び出産前に得たものを意味する。
【０１４７】
現行の研究のため、完全な結果情報、妊娠２２週より前に得た血清サンプル、及び生産男児を有する女性を選択した。この群は、胎児及び母体のＤＮＡがＹ染色体上の遺伝子の増幅によって区別された胎児ＤＮＡと子癇前症の研究のために先に選択されている。先の研究の解析は、乳児の性別によって母体の血清ｓＦｌｔ−１又はＰｌＧＦ濃度に有意差がないことを示した。
【０１４８】
カルシウム補充は、子癇前症の危険性若しくは重篤度（Ｌｅｖｉｎｅら、上記）、又は血管新生因子の血清（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：６７２−６８３、２００４）若しくは尿の濃度に効果がなかったため、カルシウム補充を受けたかプラセボを受けたかに関係なく女性を選択した。子癇前症を有するそれぞれの女性に関し、１人の正常血圧対照を選択し、記録部位、最初の血清標本採取時の在胎週数、及び−７０℃でのサンプル保存期間に関して一致させた。陣痛前に得た全ての血清及び尿の標本を解析するために合計１２０の一致させたペアを無作為に選択した。同日に得た尿標本が１より多くある女性の場合、無作為尿標本より最初の朝の標本を、２４時間畜尿より無作為を好んで１つの標本を選択した。１２０の子癇前症症例から３４８尿標本を、１１８の正常血圧対照から３１８の尿標本を特定した。血清試験からの２つの正常血圧対照には適格な尿標本がなく、更なる解析から除外した。
【０１４９】
妊娠２１〜３２週に対照及び出産前（＜３７週）に子癇前症を発症した症例から得た尿サンプルを別個に試験した。血清標本は同一女性から３日以内に採取している。出産前子癇前症症例の２０人と６９人の正常血圧対照から得た尿−血清標本ペアが合計８９あった。
【０１５０】
子癇前症は上記の通り定義した。子癇前症発症時（終点）は、血圧又は尿タンパク測定値が最初に上昇した時点と定義し、子癇前症の診断をもたらす。在胎週数に比して小さい乳児は、米国の人種、出産経歴、及び乳児の性別による在胎週数に対する出生体重表に照らして出生体重が第１０パーセンタイル以下の乳児と定義した。
【０１５１】
手順
出産結果について知らない人員がアッセイした。解析のため、標本を無作為に順位付けした。ｓＦｌｔ−１、遊離のＰｌＧＦ、及び遊離のＶＥＧＦに関する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を先に記載のように市販のキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州）を用いて２重で行った。ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦに関するアッセイの最小検出可能用量は、それぞれ５、７、及び５ｐｇ／ｍｌであり、アッセイ間及びアッセイ内変動係数はそれぞれｓＦｌｔ−１で７．６及び３．３％；ＰｌＧＦで１０．９及び５．６％；並びにＶＥＧＦで７．３及び５．４％であった。市販のピクリン酸比色アッセイ（Ｍｅｔｒａ  クレアチニンアッセイキット、Ｑｕｉｄｅｌ社、カリフォルニア州）を用いて尿クレアチニンを測定した。
【０１５２】
統計解析
χ２検定を用いてカテゴリ変数を比較し；ｔ検定で連続型変数を比較した。明細書及び図面には相加平均濃度を報告しているが、粗解析及びさまざまな標本数の被験者を計上する調整解析にＳＡＳ／ＰＲＯＣ  ＧＥＮＭＯＤ法（ＳＡＳ  ｖ８．０、カリー、ノースカロライナ州）を用いて対数変換後に統計的検定を行った。ロジスティック回帰分析を用いてオッズ比を補正した。
【０１５３】
結果
子癇前症を有する１２０人の女性のうち、８０人は軽度疾患を、４０人は重度疾患を有していた。対照と比較して、子癇前症を有する女性は、肥満度指数が大きく、ＣＰＥＰ試験参加時の血圧が高く、最近の妊娠が早産を伴うか又は在胎週数に比して小さい乳児を生ずる割合が大きい。患者と乳児の特徴は先に記載しており、表３に簡単にまとめる。
【０１５４】
子癇前症発症後の尿ＰｌＧＦの差
初めに、臨床子癇前症発症後の女性で尿ＰｌＧＦレベルが変化していることが判明した。子癇前症を有する女性と在胎週数が一致する対照との２２のペアの中で、終点標本は対照標本よりもＰｌＧＦレベルが低かった（平均ＰｌＧＦレベル、３２対２３４ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１；及び５０対２２７ｐｇ／ｍｇクレアチニン、ｐ＜０．００１）。
【０１５５】
尿ＰｌＧＦの妊娠性変化
妊娠パターンを評価するために、在胎週数期間４〜５週に得た尿と、濃度（図９Ａ）又はｐｇ／ｍｇクレアチニン（図９Ｂ）で表したＰｌＧＦレベルとの断面解析を行った。図９ＡのＰ値は、対数変換後、同一在胎週数期間に得た対照標本との比較したものであり、さまざまな標本数の被験者を計上している。臨床子癇前症を既に発症している女性から２９〜３６週に得た標本と、後に子癇前症を発症した女性から２９〜３６週に得た標本との対数変換後の差も有意であった（２９〜３２週の比較でｐ＜０．００１、３３〜３６週の比較でｐ＜０．００１、及び３７〜４２週の比較でｐ＝０．００３）。子癇前症発症前のＰｌＧＦ濃度に、高血圧又はタンパク尿症の出現後に得た終点標本は含まれないことに注意されたい。図９Ａは、その後子癇前症を発症した女性の、子癇前症発症前５週以内に得た標本を除外後のＰｌＧＦ平均血清濃度も示す（赤い破線）。図９Ｂのグラフは、既に臨床子癇前症を発症した女性から２９〜３６週に得た標本と、子癇前症を後に発症した女性から２９〜３６週に得た標本との対数変換後の差も有意であったことを示す（２９〜３２週の比較でｐ＝０．００４、３３〜３６週の比較でｐ＜０．００１、３７〜４２週の比較でｐ＝０．０２）。
【０１５６】
対照のＰｌＧＦレベルは、妊娠第一期及び第二期に増加し、２１〜２４週後により急速に増加し、２９〜３２週にピークに達し、その後低下した。その後子癇前症を発症した女性のレベルも同様のパターンを追ったが、２５〜２８、２９〜３２、及び３３〜３６週で有意に低かった。子癇前症発症前５週以内に得た標本を除外すると、先行する在胎週数期間における対照と後に子癇前症を発症した女性との差はあまり顕著でなかった。同一在胎週数期間に得た標本を有する女性の中で、既に臨床子癇前症を発症した女性は、その後子癇前症を発症した女性よりも、２９〜３２、３３〜３６、及び３７〜４２週における濃度が顕著に低かった。標本の解析を最初の朝（図９Ｃ）又は無作為（図９Ｄ）尿に限定すると、対照と臨床子癇前症発症前後の症例とのあいだで類似在胎週数パターンが観察された。
【０１５７】
尿ＰｌＧＦと子癇前症の重篤度との関係
子癇前症発症前、対照の尿ＰｌＧＦレベルと、その後３７週より前に子癇前症を発症した女性又は子癇前症及び在胎週数に比して小さい乳児を有する女性のレベルとのあいだに特に大きな差があった。図１０は、妊娠２１〜３２週のＰｌＧＦ濃度と、ｐｇ／ｍｇクレアチニンで表すＰｌＧＦを示す。
【０１５８】
尿ＰｌＧＦレベルの変化も、その後満期前に子癇前症を発症した女性（妊娠＜３７週）において、満期時に子癇前症を発症した女性（≧３７週）よりも顕著であった（２１〜３２週のＰｌＧＦ濃度は、満期前に子癇前症を有する女性の８７ｐｇ／ｍｌに対し満期時に子癇前症を有する女性で２２３ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１；３３〜４２週のＰｌＧＦ濃度は、満期前に子癇前症を有する女性の２２ｐｇ／ｍｌに対し満期時に子癇前症を有する女性で１１８ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）。ｐｇ／ｍｇクレアチニンで表したＰｌＧＦを用いた場合又はクレアチニン、標本採取時の在胎週数、保存期間、肥満度指数、及び母体年齢に対してＰｌＧＦ濃度を補正した後で、結果は類似していた。更に、後に子癇前症を発症し、在胎週数に比して小さい乳児を有する女性から子癇前症発症前に得た標本のＰｌＧＦレベルは、後に子癇前症を発症したが、乳児は在胎週数に比して小さくない女性のレベルよりも低かった（２１〜３２週のＰｌＧＦ濃度は６２対２０５ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００２；３３〜４２週のＰｌＧＦ濃度は４２対１２３ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０６）。
【０１５９】
尿ＰｌＧＦに関連した、子癇前症に関するオッズ比
臨床徴候発症前に得た標本の尿ＰｌＧＦに照らして子癇前症の危険性を決定するため、対照における分布に基づいてＰｌＧＦ値を四分位数に分け、最高四分位数と比較して（表６）又は他の全ての四分位数と比較して（以下に記載）、各四分位数について子癇前症に関する補正オッズ比を計算した。
【０１６０】
【表６】
2007522457.tif 000007
【０１６１】
妊娠２１〜３２週に得た標本の中で、最低四分位数のＰｌＧＦは、出産前子癇前症の危険性の大きな増加と満期時子癇前症の危険性の小さな増加に関連していた。出産前子癇前症の場合、標本採取時の在胎週数、保存期間、肥満度指数、及び年齢に関して補正後、ＰｌＧＦ濃度を用いた最低四分位数対他の全てに関するオッズ比は２２．５、９５％信頼区間は７．４〜６７．８であり；ｐｇ  ＰｌＧＦ／ｍｇクレアチニンを用いたオッズ比は１６．４、９５％信頼区間は５．９〜４５．５であった。標本を最初の朝の尿に限定すると、補正オッズ比は、ＰｌＧＦ濃度について３９．５、９５％信頼区間は６．５〜２４０．８であり；ＰｌＧＦ／ｍｇクレアチニンについて２０．４、９５％信頼区間は４．５〜９２．３であった。無作為尿標本を用いると、補正オッズ比はそれぞれ、１３．５、９５％信頼区間２．３〜７９．８；及び１１．１、９５％信頼区間２．０〜６１．３であった。満期時子癇前症の場合、上記因子に関して補正後、全ての尿標本を用いると、それぞれ、オッズ比２．２、９５％信頼区間１．２〜４．３；及び２．１、９５％信頼区間１．１〜４．１であった。妊娠１３〜２０週に得た標本の場合、最低四分位数のＰｌＧＦは、出産前子癇前症の危険性増加にも出産時子癇前症の危険性増加にも関連していなかった。しかしながら、最低四分位数のP1GFは、妊娠３３〜４２週に得た標本の他の全ての四分位数に対し、満期時子癇前症の危険性増加に関連していた：ｐｇ  ＰｌＧＦ／ｍｇクレアチニンで補正オッズ比２．３、９５％信頼区間１．２〜４．５。
【０１６２】
子癇前症を在胎週数に比して小さい乳児を伴って発症した女性の妊娠２１〜３２週に得た標本について同一解析を行なったところ、評価は不安定であることを発見した（ｐｇ  ＰｌＧＦ／ｍｇクレアチニンに関し補正ＯＲ４０５、９５％信頼区間２７〜５９８３）。これは、そのような女性はわずか２０人であり、その全てが最低（Ｎ＝１９）又は次に低い（Ｎ＝１）四分位数の尿ＰｌＧＦにあったためである。それにもかかわらず、データは、低尿ＰｌＧＦが、在胎週数に比して小さい乳児を伴う子癇前症の危険性の実質的増加に関連していることを示している。
【０１６３】
個々の女性における尿ＰｌＧＦの妊娠変化
図１１は、縦軸に出産前子癇前症（子癇前症＜３７週）を有する１３人の患者と在胎週数を一致させた標本を有する１３人の対照のＰｌＧＦ濃度変化を表す。少なくとも基本尿、 妊娠２１〜３２週以内に得た尿、及び２１〜３２週標本としても役立つかもしれない終点尿を有する、妊娠３７週より前に子癇前症を発症した１３人の女性全てが選択された。各症例は、同様の在胎週数に得た標本数が同一か又はそれより多い対照と一致させた。１人の対照は妊娠を通して尿ＰｌＧＦ／ｍｇクレアチニンが非常に低かった：妊娠１１６日、１７７日、及び２４８日でそれぞれ１７、５、及び０ｐｇ／ｍｌ。この女性は１つのエピソードが１＋タンパク尿症であり、妊娠２６６日の出産前２時間に記録した１つの拡張期血圧が９０ｍｍＨｇであった。出産前子癇前症を有する患者は通常妊娠を通してＰｌＧＦレベルが低かったが、対照はレベルが妊娠の進行とともに増加し、出産近くに低下する傾向を示した。
【０１６４】
尿ＰｌＧＦと子癇前症への近接性との関係
妊娠２１〜３２週に得た標本と子癇前症発症前５週以内の標本の尿ＰｌＧＦ濃度は（４３ｐｇ／ｍｌ）、臨床疾患前５週よりも以前に得た標本よりも（１９６ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．００１）低かった。妊娠３３〜４２週で得た標本では、濃度はそれぞれ１１０ｐｇ／ｍｌ対１８７ｐｇ／ｍｌであった（ｐ＝０．０５）。ＰｌＧＦをクレアチニンに関して標準化するとほとんど差はなかった。
【０１６５】
図１２Ａは、６９人の対照及びその後出産前に子癇前症を発症した（＜３７週）２０人の症例からの２１〜３２週の尿ＰｌＧＦ濃度の散布図である。出産前に子癇前症を発症した女性は、尿ＰｌＧＦ濃度が正常血圧対照よりも低かった。臨床疾患発症前５週以内に得た標本において濃度は最低であった（即ち１５０ｐｇ／ｍｌより低い）。しかしながら、多くの対照標本も尿ＰｌＧＦが低かった。これらの標本を子癇前症前５週以内に得た標本から区別するために、ＰｌＧＦに対するｓＦｌｔ−１の比の血清測定値を調べた。この比は、子癇前症発症前に観察されたｓＦｌｔ−１の増加とＰｌＧＦの低下を説明する。ペアにした血清中のＰｌＧＦ濃度に対するｓＦｌｔ−１濃度の比の散布図を図１２Ｂに示す。子癇前症発症前５週以内で得た全ての標本で比は増加し（＞５）、ほとんど全ての対照値を超えていた。
【０１６６】
子癇前症における尿ｓＦｌｔ−１と尿ＶＥＧＦ
臨床子癇前症発症前の妊娠２１〜３２週以内の尿ｓＦｌｔ−１とＶＥＧＦを解析するために、２２人の症例と２２人の対照を無作為に選択した。２２症例標本中１６（７３％）及び２２対照標本中１９（８６％）において、尿ｓＦｌｔ−１が検出できなかった。逆に、尿ＶＥＧＦは全ての標本で検出されたが、高血圧及びタンパク尿症の発症前又は後の症例で有意な変化はなかった（前：２２の無作為に選択された症例及び対照の群においてそれぞれ２７２対２４８ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．５６；後：２２の在胎週数を一致させた症例及び対照においてそれぞれ１６７対１０３ｐｇ／ｍｌ、ｐ＝０．６１）。
【０１６７】
結論
子癇前症を有する１２０人の女性及び１１８人の正常血圧対照のこの研究では、その後子癇前症を発症した女性の中で尿ＰｌＧＦ濃度は妊娠２５〜２８週に有意に低下し始めた。２９〜３６週に２群間の差はより顕著になった。血清の遊離のＰｌＧＦは妊娠１３〜１６週に症例において対照よりも低くなり始め、妊娠２５週にはかなり低くなっていることが先に示されている。血清測定値を用いたときのように、最近の研究では、３７週より前に子癇前症を発症したか又は在胎週数に比して小さい乳児を伴う症例及び臨床徴候発症前５週以内の症例において妊娠２１〜３２週の尿ＰｌＧＦが有意に低下していた。更に、妊娠21〜32週に最低四分位数の尿ＰｌＧＦ濃度（＜１１８ｐｇ／ｍｌ）にある女性の中で、妊娠37週より前に子癇前症を発症するか又は在胎週数に比して小さい乳児を伴う危険性は顕著に増加した。尿クレアチニン濃度の補正にかかわらず危険性は高かく、無作為尿においてさえも明らかであった。しかしながら、より濃縮されていると思われる最初の朝の標本に関して関連性はより強かった。したがって、尿ＰｌＧＦは、初期診断から大部分の恩恵を受けるであろう患者の同定に特に有用であった。選択された患者において尿ＰｌＧＦ測定の後、血清のｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦ測定を伴う戦略は、尿検査の偽陽性を最小にすることができることも立証した。
【０１６８】
最近、尿ＶＥＧＦ濃度が重度子癇前症を有する３７人の女性において、合併症を伴わない妊娠を有する３２人と比較して穏やかに上昇していることが報告された。子癇前症発症前後の尿ＶＥＧＦの有意でない上昇を発見し、尿ＶＥＧＦは初期の局所腎ＶＥＧＦ産生を反映するという仮説と一致した。尿ＶＥＧＦはほぼ全部が腎足細胞及び尿細管細胞に由来するため、非常に大きい分子であるため完全な糸球体を通して自由にろ過されない循環ｓＦｌｔ−１に曝されていない。したがって、子癇前症女性の尿ＰｌＧＦの低下は循環している遊離のＰｌＧＦの低下を反映すると思われるが、過剰な循環ｓＦｌｔ−１に対する結合の結果、尿ＶＥＧＦレベルは血中の血管新生の不均衡を反映していない。
【０１６９】
子癇前症の母体症候群を介在すると思われる血管新生タンパク質の同定は、適切な血管新生バランスを回復させる治療行為のための特定標的を提示することができる（Ｍａｙｎａｒｄら、上記）。予防及び治療は、在胎週数に比して小さい乳児を伴って、子癇前症又は子癇前症を初期に発症している女性にとって特に必要とされる。しかしながら、そのような女性は、まず臨床疾患発症前に同定されなければならない。これらのデータは、信頼性のある有効な尿検査を開発し、低尿ＰｌＧＦ濃度の女性全てをスクリーニングするために用いることができることを証明している。低尿ＰｌＧＦレベルと同定されたそのような女性の追跡調査として、次に血清ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦの連続的測定値を用いて危険性の高い個人がより正確に同定されるであろう。
【実施例１２】
【０１７０】
妊娠中期の尿ＰｌＧＦを示す補助試験は子癇前症を予測する特定判断材料である
補助試験を行い、妊娠２１〜３２週の尿ＰｌＧＦが男児を有する女性と女児を有する女性とのあいだで異なるかどうかを確かめ、妊娠性高血圧を有する女性及び妊娠を通して正常血圧のままであるが在胎週数に比して小さい（ＳＧＡ）乳児を出産した女性において尿ＰｌＧＦ濃度が正常より低いかどうかを決定した。適切なデータを有するＣＰＥＰ試験における、染色体異常があると知られていない生産児を出産した４２５６人の女性の中で、満期子癇前症（≧３７週）を有する２３９人を除外した。残った４０１７人の女性のうち、３３０３人には、陣痛又は出産前及び子癇前症又は妊娠性高血圧発症前の妊娠２１〜３２週に得た少なくとも１つの尿標本があった。これらの女性の中から、正常血圧妊娠でＳＧＡ児でなかった１２０人、正常血圧妊娠でＳＧＡ児を出産した６０人、妊娠性高血圧の６０人、及び出産前（＜３７週）子癇前症の５９人を無作為に選択した。それぞれの群において、男児を出産した女性の半分と女児を出産した女性の半分を選択し、出産前子癇前症を有する群を除いた。この群では、男児を有する３０人を選択したが、女児を有するわずか２９人を見出すであろう。妊娠２１〜３２週に得た全ての尿標本についてＰｌＧＦを解析した。
【０１７１】
子癇前症、妊娠性高血圧、在胎週数に比して小さい乳児、及び研究所の審査委員会
子癇前症は、それぞれ４〜１６８時間あけた２回の機会に、新たに上昇した拡張期血圧が少なくとも９０ｍｍＨｇ、及びタンパク尿が尿検査で少なくとも１＋（３０ｍｇ／ｄｌ）と定義した。重度子癇前症は、ＨＥＬＬＰ症候群（溶血、肝臓の酵素レベルの上昇、及び血小板数の低下）、子癇、又は重度高血圧（拡張期血圧≧１１０ｍｍＨｇ）若しくは重度タンパク尿症（尿タンパク質の排出が≧３．５ｇ／２４時間又は尿検査による検出で≧３＋［３００ｍｇ／ｄｌ］）を有する子癇前症として定義した。妊娠性高血圧は、上記のように定義されたタンパク尿症のない高血圧である。詳細な定義は公開されている（Ｌｅｖｉｎｅら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：６９−７６（１９９７）及びＬｅｖｉｎｅら、Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｌｉｎ．Ｔｒｉａｌｓ  １７：４４２−４６９（１９９６））。子癇前症発症時は、血圧又は尿タンパク質の測定値が最初に上昇したときとして定義され、子癇前症の診断をもたらす。同様に、妊娠性高血圧の発症は、血圧が最初に上昇したときと定義され、診断へと導く。在胎週数に比して小さい乳児とは、出生体重が、米国の人種、出産経歴、及び乳児の性別による在胎週数に対する出生体重表に照らして第１０パーセンタイルより少ない乳児である（Ｚｈａｎｇら、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．８６：２００−２０８（１９９５））。研究には特定可能な女性に結び付けられなかったデータ及び標本を用いるため、国立衛生研究所のヒト被験者研究オフィスは、研究所の審査委員会によって検討され、承認される必要性を免除を認めた。
【０１７２】
手順
妊娠結果についてしらない人員によってアッセイが行われた。解析のため、標本を無作為に順位付けした。ｓＦｌｔ−１、遊離のＰｌＧＦ、及び遊離のＶＥＧＦに関する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を、市販のキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州）を用いて先に記載のように２重で行った（Ｍａｙｎａｒｄら、上記）。ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦに関するアッセイの最小検出可能用量はそれぞれ５、７、及び５ｐｇ／ｍｌであり、アッセイ間及びアッセイ内変動係数はそれぞれｓＦｌｔ−１で７．６及び３．３％；ＰｌＧＦで１０．９及び５．６％；並びにＶＥＧＦで７．３及び５．４％であった。ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及びＰｌＧＦに関するＥＬＩＳＡキットは、尿標本の使用に有効であり、加えた尿サンプルからの回収はそれぞれ９６％、９８％、及び９９％であった。尿クレアチニンは市販のピクリン酸比色アッセイ（Ｍｅｔｒａ  クレアチニンアッセイキット、Ｑｕｉｄｅｌ社、カリフォルニア州）を用いて測定した。
【０１７３】
統計解析
χ２乗検定を用いてカテゴリ変数を比較し；ｔ検定を用いて連続型変数を比較した。明細書及び図面には相加平均濃度が報告されているが、統計的検定は、個別に対数変換した後、粗解析及びさまざまな標本数の被験者を計上する補正解析に一般化推定方程式（ＧＥＥ）法（ＳＡＳ／ＰＲＯＣ  ＧＥＮＭＯＤ法、ＳＡＳ  ｖ８．０、カリー、ノースカロライナ州）を用いてそれぞれの区間内で行った。ロジスティック回帰分析を用いてオッズ比を補正した。照合が完了したのは全試験集団中の最初の血清標本の解析についてのみであったため、統計解析において照合は説明しなかった。
【０１７４】
結果
尿ＰｌＧＦの低下は初期に発症した子癇前症に特異的であるという仮説を更に試験するために、類似の発症機序を共有するかもしれない他の産科病態を有する女性から２１〜３２週に得た尿標本を解析する第２の試験を行った。妊娠性高血圧を有する女性、及び妊娠を通して正常血圧のままであったがＳＧＡ児を出産した女性と、ＳＧＡ児でなかった正常血圧女性（対照）、及び３７週より前に子癇前症を有する女性とを比較した。この試験の女性及び新生児の臨床的特徴を表７にまとめる。子癇前症を有する女性及び乳児の特徴は、主要な研究においてそのような女性に関して報告されてものと類似していた。
【０１７５】
【表７】
2007522457.tif 000008
【０１７６】
ＳＧＡ児でなかった正常血圧女性と比較して、妊娠性高血圧の女性は、肥満度指数が高く、乳児の出生体重が大きい；そしてＳＧＡ児を有する正常血圧女性は、肥満度指数が小さく、乳児の出生体重が小さい。ＳＧＡ児を有する正常血圧女性は妊娠中喫煙していた可能性が非常に高く、妊娠性高血圧の女性は、妊娠中喫煙していた可能性が非常に低かった。
【０１７７】
図１３は、妊娠２１〜３２週の尿ＰｌＧＦを濃度（ｐｇ／ｍｌ）及びｐｇ／ｍｇクレアチニンで表す。妊娠を通して正常血圧のままであったがＳＧＡ乳児を出産した女性のＰｌＧＦレベルは、ＳＧＡ児でなかった正常血圧対照と異ならなかった。同様に、妊娠性高血圧を有する被験者のレベルは、正常血圧対照と異ならなかった。しかしながら、妊娠３７週より前に子癇前症を発症した患者の尿ＰｌＧＦレベルは−臨床疾患前、平均４２日間採取した−対照よりも非常に低かった（７７対２０６ｐｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００１）。それぞれの群の中で、男児を出産した女性と女児を出産した女性とのあいだでＰｌＧＦ濃度は顕著に異ならなかった。
【０１７８】
結論
３７週より前に子癇前症を発症した女性の尿ＰｌＧＦは、妊娠２１〜３２週で、子癇前症と類似する２つの産科病態である妊娠性高血圧を発症した女性又は在胎週数に比して小さい乳児を出産した女性よりも非常に低かった。したがって、この妊娠時期での低尿ＰｌＧＦ濃度は、子癇前症を妊娠性高血圧及び子宮内発育遅延と区別できそうである。
【実施例１３】
【０１７９】
子癇前症に対するＶＥＧＦ１２１療法の有効性を動物モデルにおいて決定するために、ＳｃｉｏｓのＳｔｅｖｅ  Ｐｏｌｌｉｔｔ博士及びＵｔｅ  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ博士と共に共同実験を行った。平均体重２５０ｇの雌性ラットを用いた。第０日に、全てのラットに２×１０９ｐｆｕのｓＦｌｔ−１発現アデノウイルスを注射した。療法の目的は、ヒト子癇前症に関連して見出した濃度を模倣するために、ｓＦｌｔ−１濃度およそ１０〜２０ｎｇ／ｍｌを達成することであった。動物を２群に分けた。動物５９〜６４にＰＢＳを注射して対照とした。動物６５〜７０にＶＥＧＦ１２１を２５μｇ／ラットの濃度（およそ１００μｇ／ｋｇ体重）で１日２回、第３〜第７日に皮下注射した。
【０１８０】
第７日の午後、ＶＥＧＦの最終投与からおよそ４〜５時間後に動物を屠殺した。血圧を測定した。結果を以下の表７にまとめる。血漿、尿、及び腎組織も得た。血漿ｓＦｌｔ−１レベル及び遊離のＶＥＧＦレベルをＥＬＩＳＡで測定した。これらのデータも表７にまとめる。
【０１８１】
循環ｓＦｌｔ−１レベルの変動にもかかわらず、平均して、ＶＥＧＦ１２１療法を受けた動物は血圧低下及びタンパク尿症を示した。これらの結果は、ｓＦｌｔ−１によって誘発される高血圧及びタンパク尿症の有効な処置としてのＶＥＧＦ１２１の可能性を示唆している。
【０１８２】
【表８】
2007522457.tif 000009
【０１８３】
診断法
本発明は、子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向を検出するための診断アッセイを特徴とする。ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又はｓＦｌｔ−１のレベル、遊離のレベルか全量のレベルを被験者サンプルについて測定し、子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向の指標として用いる。
【０１８４】
１つの態様では、測定基準を用いて、タンパク質の少なくとも２つのレベル間の関係が子癇前症又は子癇を表示しているかどうかを決定する。標準法を用いて、限定するものではないが尿、血清、血漿、唾液、羊水、又は脳脊髄液を含めた体液のＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又はｓＦｌｔ−１のポリペプチドレベルを測定することができる。そのような方法には、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又はｓＦｌｔ−１を指向する抗体を用いたイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチアッセイ」、ウエスタンブロッティング、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡ又はＧ  イムノアッセイ、並びにＯｎｇら（Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．９８：６０８−６１１、２００１）及びＳｕら（Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．９７：８９８−９０４、２００１）に記載のような免疫電気泳動アッセイ及び定量的酵素イムノアッセイ技術が含まれる。ＥＬＩＳＡアッセイはＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又はｓＦｌｔ−１のレベルの測定に好ましい方法である。検出の容易さと簡便さ、及び定量的性質に関して特に好ましいのは、多くの変形が存在するサンドイッチアッセイ又は２抗体アッセイであり、それらの全てが本発明によって意図される。例えば、典型的なサンドイッチアッセイでは、抗原（即ちｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦのポリペプチド）を認識する未標識抗体を固相、例えばマイクロタイタープレートに固定し、試験すべきサンプルを加える。抗体−抗原複合体を形成させる一定時間のインキュベーション後、検出可能シグナルを誘導可能なレポーター分子で標識した２次抗体を加え、異なる部位で抗原と結合させるのに十分な時間インキュベーションを継続し、抗体−抗原−標識抗体の複合体を形成する。抗原の存在は、既知量の抗原を含有する対照サンプルとの比較によって定量できるシグナルの観察によって決定される。
【０１８５】
血清ｓＦｌｔ−１レベルの上昇は、子癇前症の陽性指標であるとみなされる。このｓＦｌｔ−１値は、好ましくは２ｎｇ／ｍｌ以上であり得る。更に、レベルの正常レベルに対するｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの検出可能な変化は、子癇、子癇前症、又はそのような病態発症する傾向の指標である。ｓＦｌｔ−１を測定することが好ましく、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦの測定をこの測定と組み合わせることがより好ましく、３つ全てのタンパク質（又はタンパク質レベルの指標であるｍＲＮＡレベル）を測定することが最も好ましい。更なる好ましい態様では、肥満度指数（ＢＭＩ）及び胎児の在胎週数も測定し、診断測定基準に含める。
【０１８６】
他の態様では、ＰＡＡＩ（ｓＦｌｔ−１／ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦ）を、子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向の診断法である抗血管新生指標として用いる。ＰＡＡＩが１０より大きい場合、より好ましくは２０より大きい場合、被験者は、子癇前症、子癇を有するか、又はそれらを発症する切迫した危険性があるとみなされる。ＰＡＡＩ（ｓＦｌｔ−１／ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦ）比は、診断指標として用いることができる有用な測定基準の単なる１例である。本発明を限定することを意図するものではない。実際に、被験者のｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦのいずれかのレベルの正常対照に対する変化を検出する測定基準は診断指標として用いることができる。
【０１８７】
具体的な核酸又はポリペプチドの発現レベルは、具体的な病状（例えば子癇前症又は子癇）と相関するかもしれず、したがって診断に有用である。ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦの核酸配列に由来するオリゴヌクレオチド又はより長い断片は、発現をモニターするだけでなく、病態を発症する傾向の指標であるｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦの核酸分子に遺伝的変異、突然変異、又は多型を有する被験者を同定するためのプローブとして用いることができる。そのような多型は当業者に公知であり、例えばＰａｒｒｙら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．２６：３２１−３、１９９９）によって記載されている。ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）の調査は、Ｆｌｔ−ｌ／ｓＦｌｔ−１の遺伝子及びプロモーター領域に少なくとも３３０の公知の多型を示している。これらの多型はｓＦｌｔ−１の核酸若しくはポリペプチドの発現レベル又は生物活性に影響し得る。正常な基準サンプルに対する遺伝的変異、突然変異、又は多型の検出は、子癇前症、子癇、又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向の診断指標であり得る。
【０１８８】
そのような遺伝子変化は、ｓＦｌｔ−１遺伝子のプロモーター配列、オープンリーディングフレーム、イントロン配列、又は３’非翻訳領域中に存在し得る。遺伝子変化に関する情報は、被験者を子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向を有すると診断するために用いることができる。全体に記載しているように、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、及び／又はＰｌＧＦの生物活性レベルの特定の変化は、子癇前症若しくは子癇又はそれらを発症する傾向の可能性と相関し得る。その結果、当該技術分野に熟練した者は、突然変異を検出し、次にタンパク質の生物活性の１以上の測定基準をアッセイして、突然変異が子癇前症又は子癇の可能性を引き起こすか又は増加させるかどうかを決定することができる。
【０１８９】
１つの態様では、子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向を有する被験者は、ｓＦｌｔ−１をコードする核酸の発現増加又はＰｌＧＦ若しくはＶＥＧＦのレベルの変化を示すであろう。そのような変化を検出する方法は、当該技術分野において標準的なものであり、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、に記載されている。１つの例では、ノーザンブロッティング又はリアルタイムＰＣＲを用いてｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルを検出する。
【０１９０】
他の態様では、ゲノム配列又は密接に関連のある分子を含めたｓＦｌｔ−１核酸分子を検出可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションを、子癇前症若しくは子癇であるか又はそのような病態を発症する危険性がある被験者に由来する核酸配列をハイブリダイズさせるために用いることができる。プローブの特異性、高度に特異的な領域、例えば５’調節領域から作製されているか又は特異性の低い領域、例えば保存モチーフから作製されているか、及びハイブリダイゼーション又は増幅のストリンジェンシー（最高、高、中、又は低）は、プローブが天然配列、対立遺伝子多型、又は他の関連のある配列にハイブリダイズするかどうかを決定する。ハイブリダイゼーション技術を用いて、子癇前症若しくは子癇の指標であるｓＦｌｔ−１核酸分子の突然変異を同定することができ、又はｓＦｌｔ−１ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをモニターすることができる（例えばノーザン解析によって、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）。
【０１９１】
更に他の態様では、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸分子の配列を直接解析することによって、子癇前症又は子癇を発症する傾向についてヒトを診断することができる。
【０１９２】
子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向を有する被験者は、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドの発現増加を示すであろう。ｓＦｌｔ−１ポリペプチドには、全長ｓＦｌｔ−１、分解産物、ｓＦｌｔ−１の選択的スプライシングアイソフォーム、ｓＦｌｔ−１の酵素的切断産物などを含めることができる。ｓＦｌｔ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、子癇前症若しくは子癇を診断するため、又はそのような病態を発症する危険性がある被験者を同定するために用いることができる。そのようなポリペプチドの発現の変化を測定するためのさまざまなプロトコールが免疫学的方法（ＥＬＩＳＡ及びＲＩＡなど）を含めて知られており、子癇前症若しくは子癇又はそのような病態を発症する危険性を診断するための基準を提供する。やはり、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドレベル増加は、子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向を有する被験者の診断法である。
【０１９３】
１つの態様では、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、若しくはＰｌＧＦのポリペプチド又は核酸、あるいはそれらの組み合わせのレベルは、少なくとも２回の異なる時間に測定され、正常な基準レベルと比較した長期にわたるレベルの変化は、子癇前症、子癇、又はそのような病態発症する傾向の指標として用いられる。他の態様では、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、若しくはＰｌＧＦのポリペプチド又は核酸、あるいはそれらの組み合わせのレベルは、基準サンプルのレベルと比較される。
【０１９４】
ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドレベルは、検量線と比較して、ポリペプチドレベルの「正常範囲」内にあるかどうかを決定することもできる。この態様では、比較のための精製又は組換え型（例えば純度８０％、９０％、９５％、９９％より高いか又は１００％）のポリペプチドを用いて、それぞれのポリペプチドについて検量線を作成する。検量線を作成し、同一ポリペプチドについて作成した検量線と比較することによってポリペプチド濃度を決定する。例えば、ｓＦｌｔ−１について検量線を作成することができ、検量線と比較して２ｎｇ／ｍＬより多いｓＦｌｔ−１濃度を有する被験者サンプルは、子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向の指標とみなされる。
【０１９５】
子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向を有する被験者の体液中のｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのレベルは、正常対照のｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのレベルに対し、わずか１０％、２０％、３０％、又は４０％、あるいは５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％以上までも変化し得る（増加又は低下）。子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向を有する被験者の体液中に存在するｓＦｌｔ−１レベルは、正常対照被験者のレベルに対し、１．５倍、２倍、３倍、４倍まで、または１０倍以上でさえも増加し得る。
【０１９６】
１つの態様では、被験者の体液サンプル（例えば尿、血漿、血清、羊水、又は脳脊髄液）を子癇前症症状発症前の妊娠初期に採取する。他の例では、サンプルは、子癇前症症状発症前の妊娠初期に採取した組織又は細胞であり得る。非限定的な例には、胎盤組織、胎盤細胞、内皮細胞、及び単球のようなリンパ球が含まれる。ヒトでは、例えば、母体血清サンプルを妊娠女性の肘正中静脈から妊娠第一期、第二期、又は第三期に採取する。妊娠第一期のあいだ、例えば４、６、８、１０、若しくは１２週に、又は妊娠第二期のあいだ、例えば１４、１６、１８、２０、２２、若しくは２４週にアッセイを実施することが好ましい。そのようなアッセイは、妊娠第二期後期又は妊娠第三期、例えば２６、２８、３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、若しくは４０週に実施してもよい。この期間のあいだにｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのレベルを２回測定することが好ましい。産後の子癇前症又は子癇の診断には、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのアッセイを産後に実施してもよい。
【０１９７】
１つの具体的例では、妊娠のあいだ連続血液サンプルを採取することができ、可溶性ｓＦｌｔ−１レベルはＥＬＩＳＡによって決定される。この技術を用いた１つの研究では、ｓＦｌｔ−１をコードする選択的にスプライシングされたｍＲＮＡが栄養膜細胞によって非常に多く発現され、妊娠女性の血漿においてタンパク質を容易に検出可能であった。妊娠２０〜３６週におよそ３倍に増加したｓＦｌｔ−１レベルを観察した。その後子癇前症を発症した高危険率女性においてレベルが顕著に高いことが観察された（Ｃｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓら、Ｊ．Ｓｏｃ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．１０（２）：２３０、２００３）。
【０１９８】
１つの好ましい態様では、体液サンプル、好ましくは尿のＰｌＧＦポリペプチドレベルが測定され、子癇前症、子癇、又はそれらを発症する傾向の診断指標として用いられる。尿のＰｌＧＦポリペプチドレベルの測定は、子癇前症又は子癇の潜在的危険性の初期評価として用いることもでき、ＰｌＧＦ測定によって「危険性がある」と決定された女性は、その後、本明細書に記載のもの又は当該技術分野に公知のもののような更なる診断アッセイを受けることができる。１つの例では、尿サンプルのＰｌＧＦポリペプチド測定によって子癇前症又は子癇を発症する危険性があると診断された女性は、上記のようなＶＥＧＦ、ｓＦｌｔ−１、及び／又はＰｌＧＦのレベルの血清解析によって更にモニターされる。他の例では、これらのポリペプチドのそれぞれの血清値を用いてＰＡＡＩが決定される。ＰｌＧＦの尿解析によって子癇前症又は子癇を発症する危険性があると同定された女性は、妊娠前、妊娠中（例えば毎月、３週間ごと、２週間ごと、毎週、３日ごと、１日おき、又は毎日）、又は妊娠後に日常的にモニターされることができる。
【０１９９】
遊離型ＰｌＧＦの平均分子量は約３０ｋＤａであり、非常に小さいため、腎臓でろ過されて尿に放出される。ＰｌＧＦは、ｓＦｌｔ−１と複合体を形成すると、分子量が非常に大きくなり、したがって、尿に放出されないであろう。理論に拘束されるものではないが、発明者らは、子癇前症のあいだ、ｓＦｌｔ−１レベルが増加すると、ｓＦｌｔ−１はＰｌＧＦと複合体を形成することができ、尿に放出される遊離のＰｌＧＦレベルが低下することを発見した。その結果、遊離のＰｌＧＦレベルについての尿解析を用いて、子癇前症若しくは子癇、又はそれらを有する危険性のある患者を診断することができる。遊離のＰｌＧＦを検出するには、遊離のＰｌＧＦを特異的に認識する抗体をこれらのアッセイに用いることが好ましい。そのような抗体は、例えばＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合ドメインを認識することができる。そのような特異的抗体の例には、ヒトＰｌＧＦ  ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＤＧＧ００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）に用いるキャプチャー抗体、抗胎盤成長因子モノクローナル抗体（クローン３７２０３．１１１、シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）が含まれる。これらの抗体は、ヒトＰｌＧＦタンパク質のＮ端領域の特異配列を認識する。ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１結合領域はＰｌＧＦタンパク質の３９〜１０５アミノ酸にあり、ＰｌＧＦの全長はＰｌＧＦのアイソフォームに応じて１４９〜２２１アミノ酸で変化する。更なる好ましい抗体には、Ｎ端領域（ＰｌＧＦの３９〜１０５アミノ酸が好ましい）を認識し、遊離のＰｌＧＦに特異的に結合するが、ｓＦｌｔ−１に結合したＰｌＧＦには結合しない抗体が含まれる。Ｃ端に対して作製した抗体はこの特性を有さないであろう。
【０２００】
本発明の診断アッセイのいずれかを用いて、被験者サンプルのＰｌＧＦレベルを基準サンプルと比較し、相対レベルを決定することができる。基準サンプルは、診断アッセイの所望の使用に応じて、子癇前症を有する患者の尿サンプル（通常、遊離のＰｌＧＦレベルは４００ｐｇ／ｍｌより低く、好ましくは２００ｐｇ／ｍｌより低い）であるか、又は正常尿サンプル（ＰｌＧＦ濃度が２００ｐｇ／ｍｌ〜８００ｐｇ／ｍｌ）であることができる。ＰｌＧＦレベルは、基準値又は標準を比較して、絶対レベルを決定することもできる。基準値又は標準は、比較のためのＰｌＧＦの精製型又は組換え型（例えば純度が８０％、９０％、９５％、９９％より高いか又は１００％）に基づいて作成した検量線を用いて決定することができる。４００ｐｇ／ｍｌより低いＰｌＧＦ値、好ましくは２００ｐｇ／ｍｌより低い値、最も好ましくは１００ｐｇ／ｍｌより低い値か、又は２００ｐｇ／ｍｇクレアチニンより低いＰｌＧＦ／クレアチニン値、好ましくは１００ｐｇ／ｍｇクレアチニンより低い値は、子癇前症若しくは子癇、又はそれらを有する危険性のある患者の診断指標とみなされる。検量線には、１０ｐｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌの組換えＰｌＧＦを用いることができる。検量線の作成に使用できる組換えタンパク質の他の例には、ＰｌＧＦのアミノ末端を包含する特定ペプチド、好ましくはＰｌＧＦタンパク質の３９〜１０５アミノ酸（ｓＦｌｔ−１に結合するＰｌＧＦの領域）が含まれる。あるいは、組換えＰｌＧＦ／ＶＥＧＦヘテロダイマー（カタログ番号２９７−ＶＰとして市販されている、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州）を用いることもできる。後者は、このタンパク質は遊離のＶＥＧＦの測定におけるＶＥＧＦの検量線を作成するために用いることもできるという利点を有する。
【０２０１】
ＥＬＩＳＡアッセイは、遊離のＰｌＧＦレベルを測定する好ましい方法である。検出の容易さと簡便さ、及び定量的性質に関して特に好ましいのは、多くの変形が存在するサンドイッチアッセイ又は２抗体ＥＬＩＳＡアッセイであり、それらの全ては本発明に意図される。例えば、典型的なサンドイッチアッセイでは、ＰｌＧＦポリペプチドを認識する未標識抗体が固相、例えばマイクロタイタープレートに固定し、試験すべきサンプルを加える。抗体−抗原複合体を形成させるために一定期間インキュベーションした後、検出可能シグナルを誘発可能なレポーター分子で標識した２次抗体を加え、異なる部位で抗原と結合させるのに十分な時間インキュベーションを継続し、抗体−抗原−標識抗体の複合体を形成する。抗原の存在は、既知量の抗原を含有する対象サンプルとの比較によって定量できるシグナルの観察によって決定される。
【０２０２】
定量サンドイッチＥＬＩＳＡの例では、固体支持体（例えばマイクロタイタープレート又はメンブラン）は予め抗ＰｌＧＦ結合物質（例えば１次抗体）でコーティングされる。標準又はサンプルを基質に加えると、存在する場合はＰｌＧＦが抗体に結合するであろう。やはりＰｌＧＦを認識する酵素結合抗体の標準的調整品を次に加え、プレートに固定されたＰｌＧＦを「サンドイッチ」する。基質を加え、酵素と基質を短時間のインキュベーションで反応させる。酵素−基質反応を終了させ、公知の方法で変化を測定する（例えば目で、分光光度計を用いて、又は化学発光を測定して）。そのようなアッセイを用いてＰｌＧＦの相対レベル（例えば基準サンプル、標準、又はレベルのレベルと比較して）を決定することができ、又はＰｌＧＦ絶対濃度を決定することができる。非常に所望であれば、さまざまな濃度の精製ＰｌＧＦの較正基準セットを用いてＰｌＧＦ濃度を決定することができる。較正基準は同一時間にアッセイされ、サンプルとして例えば光学密度によって測定したＰｌＧＦ濃度に対する検量線を作成するために用いられる。次にサンプル中のＰｌＧＦ濃度を、例えばサンプルの光学密度を検量線と比較することによって決定する。正常妊娠の妊娠中期及び妊娠後期のＰｌＧＦ濃度は、母親の在胎週数に応じて２００〜８００ｐｇ／ｍｌであろう。４００ｐｇ／ｍｌより低い尿ＰｌＧＦ値、好ましくは２００ｐｇ／ｍｌより低い値、又は２００ｐｇ／ｍｇクレアチニンより低い尿ＰｌＧＦ値は、子癇前症の診断法であろう。一般に、ＥＬＩＳＡキットの検量線は、濃度範囲１０ｐｇ／ｍｌ〜１ｎｇ／ｍｌの組換え又は精製ＰｌＧＦを含むであろう。
【０２０３】
他の例では、尿サンプル中のＰｌＧＦを検出するアッセイには、遊離のＰｌＧＦに結合したときと遊離のＰｌＧＦに結合していないときのＰｌＧＦを区別できるような方法で検出可能に標識した固定されたＰｌＧＦ結合物質を有するメンブランが含まれる。好ましい標識には蛍光標識が含まれる。メンブランはＰｌＧＦ結合物質をサンプル中に存在する遊離のＰｌＧＦに結合させるのに十分な時間、サンプルに曝される。次に遊離のＰｌＧＦに結合した標識ＰｌＧＦ結合物質を測定する。そのようなアッセイを用いて、上記のように、ＰｌＧＦの相対レベルを決定することができ（例えば基準サンプル又は標準又はレベルからのレベルと比較して）、又はＰｌＧＦの絶対濃度を決定することができる。結合を測定するための好ましいアッセイには蛍光イムノアッセイが含まれる。
【０２０４】
他の例では、尿サンプル中のＰｌＧＦを検出するためのアッセイには、無水標識（例えば比色検出用）ＰｌＧＦ結合物質（１次物質）及び固定された抗ＰｌＧＦ結合物質（２次物質）を有するメンブランが含まれる。メンブランをサンプルに曝す。サンプルは標識ＰｌＧＦ結合物質を再水和し、ＰｌＧＦがサンプルに存在する場合はＰｌＧＦ結合物質に結合するであろう。ＰｌＧＦ−１次物質複合体は毛細管移動によってメンブランに落下移動し、固定された２次物質と相互作用するであろう。この相互作用は、２次物質が固定された位置で比色標識から可視線を生ずるであろう。
【０２０５】
他の例では、尿サンプル中のＰｌＧＦを検出するアッセイには、無水標識（例えば比色検出用）ＰｌＧＦ結合物質（１次物質）及び固定された抗ＰｌＧＦ結合物質（２次物質）を有するメンブランが含まれる。また、メンブランは、やはりメンブランに固定された精製ＰｌＧＦを閾値濃度で含む。この例では、メンブランは尿サンプルに曝される。サンプルは標識１次物質を再水和し、閾値濃度よりも高濃度でＰｌＧＦがサンプル中に存在する場合はＰｌＧＦ結合物質に結合するであろう。ＰｌＧＦ−標識１次物質複合体は毛細管移動によってメンブランに落下移動する。１次物質はサンプル由来のＰｌＧＦに既に結合しているので、固定された精製ＰｌＧＦには結合せず、この「試験」位置には可視線は現れないであろう。ＰｌＧＦ−１次物質複合体はメンブランに向かって落下し続け、固定された２次物質と相互作用するであろう。この相互作用は、抗ＰｌＧＦ結合物質が固定された「対照」位置で比色標識から可視線を生ずるであろう。この例では、たった１本の可視線が現れ、閾値濃度よりも高いＰｌＧＦ濃度を示すであろう。ＰｌＧＦ濃度が閾値濃度より低い場合は、標識１次物質は固定されたＰｌＧＦに結合し、「対照」位置に加えてこの「試験」位置にも可視線が現れるであろう。試験アッセイは、サンプル中のＰｌＧＦのいくつかの濃度を検出するために複数の試験ラインを含めることもできる。そのような段階的アッセイは米国特許第６，６６０，５３４号に記載されている。
【０２０６】
他の例では、類似のメンブランに基づいたアッセイを用いるが、標準サンドイッチＥＬＩＳＡ法に基づいている。この例では、メンブランは、酵素に結合した固定された１次ＰｌＧＦ結合物質を有する反応ゾーン；ＰｌＧＦのある領域に結合するが第１のＰｌＧＦ結合物質は結合しない他の固定されたＰｌＧＦ結合物質を有する試験ゾーン；及び１次Ｐ１ＧＦ結合物質を認識する固定された物質を有する対照ゾーンを含む。第１の固定されたＰｌＧＦ結合物質に結合した酵素に対する検出可能基質が試験ゾーンにも対照ゾーンにも含まれる。メンブランをサンプルに曝すと、サンプルは毛管作用によって反応ゾーンに移動する。ＰｌＧＦがサンプル中に存在する場合は酵素に結合した第１の固定されたＰｌＧＦ結合物質に結合し、複合体を形成し、そして毛管流動によって試験ゾーンへ運ばれるであろう。次に、ＰｌＧＦ−酵素に結合した固定されたＰｌＧＦ結合物質複合体は第２のＰｌＧＦ結合物質に結合し、固定された第２のＰｌＧＦ結合物質（「試験」ゾーン）の位置で可視線を形成する。残りの第１のＰｌＧＦ結合物質は、毛管流動によって運ばれ、第１の結合物質を認識するか又は結合する固定された物質に結合し、この位置（「対照」ゾーン）に可視線を生ずるであろう。ＰｌＧＦがサンプル中に存在しない場合は第２の線のみが対照ゾーンに現れるであろう。好ましい態様では、第１及び第２のＰｌＧＦ結合物質は抗体であり、第１の結合物質を認識するか又は結合する物質は、第１の抗体の免疫グロブリンを特異的に認識する２次抗免疫グロブリン抗体である。標準量の精製ＰｌＧＦタンパク質を用いて試験ゾーンの線の強度を比較してアッセイし、サンプルが閾値濃度より多いか又は少ないＰｌＧＦを含有するかどうかを決定することができる。
【０２０７】
本明細書に記載のアッセイでは、正常妊娠血清を更なる対照として用いることができ、ＰｌＧＦ活性を測定し、正常妊娠血清から測定されたＰｌＧＦ活性の割合として定量することができる。
【０２０８】
本明細書に記載のアッセイでは、サンプルは如何なる体液でもよい。ＰｌＧＦに基づいた診断アッセイには尿サンプルが好ましい。メンブランは標準のディップスティック型形式でも側方流動形式でもよい。ディップスティック型のアッセイは、妊娠検査（その場合はホルモンレベルを測定）、又は腎疾患の診断におけるクレアチニン若しくはアルブミンの尿検査による検出のようなアッセイに関して当該技術分野に公知である。ディップスティック型アッセイのさまざまな形式の例は、本明細書に援用される米国特許第６，６６０，５３４号に記載されている。
【０２０９】
上記ＰｌＧＦ検出アッセイは、単独で又は本明細書若しくは当該技術分野で記載されている更なる診断アッセイと組み合わせて使用することができる。好ましい態様では、ＰｌＧＦ診断アッセイを初期スクリーニングとして使用し、本明細書に記載のような血清ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ及び／又はＶＥＧＦのレベルの測定のためのアッセイが続く。このように、「危険性のある」患者を同定し、注意深くモニターし、又はより高精度の診断のために更にスクリーニングすることができる。
【０２１０】
上記のＰｌＧＦに基づいた診断アッセイの好ましい態様では、ＰｌＧＦ結合物質は、ＰｌＧＦ又はＰｌＧＦと相互作用するタンパク質若しくはペプチドを認識する１次抗体であることが好ましい。２次抗ＰｌＧＦ結合物質は、１次抗体又は１次抗体に結合するタンパク質（例えばプロテインＡ又はプロテインＧ）を認識する２次抗体、あるいはＰｌＧＦと相互作用するペプチドに特異的に結合する抗体であることが好ましい。ＰｌＧＦ結合物質が酵素で標識された態様では、用いる酵素は、目で検出及び／又は分光分析で測定できる比色反応を触媒することが好ましい。好ましい酵素／基質の組み合わせの非限定的な例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ＴＭＢ、β−ガラクトシダーゼ／ＸＧＡＬ、及びアルカリホスファターゼ／１，２−ジオキセタンである。標識ＰｌＧＦ結合物質を含む態様の場合、好ましい標識には比色（例えば金コロイド）、化学発光、又は蛍光標識が含まれる。
【０２１１】
獣医学診療では、妊娠中いつでもアッセイを行うことができるが、子癇前症症状発症前の妊娠初期に行うことが好ましい。妊娠期間が種間で広く変化することを考えると、アッセイのタイミングは獣医によって決定されが、一般にヒトの妊娠中のアッセイのタイミングに対応するであろう。
【０２１２】
本明細書に記載の診断法は、個別に用いても、又は子癇前症若しくは子癇の存在、重篤度又は発症の推定時期をより正確に診断するために本明細書に記載の他の診断法と組み合わせて用いてもよい。更に、本明細書に記載の診断法は、子癇前症若しくは子癇の存在、重篤度又は発症の推定時期の正確な診断に有用であると断定された他の診断法と組み合わせて用いることができる。
【０２１３】
本明細書に記載の診断法は、被験者の子癇前症又は子癇をモニターし、管理するために用いることもできる。１つの例では、被験者が、血清ｓＦｌｔ−タンパク質レベルが１０ｎｇ／ｍＬ、血清の遊離のＰｌＧＦレベルが１００ｐｇ／ｍＬであると断定された場合、血清ＰｌＧＦレベルがおよそ４００ｐｇ／ｍＬに上昇するまでＶＥＧＦを投与することができる。この態様では、疾患を診断するだけでなく子癇前症及び子癇の処置及び管理をモニターする方法として、ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、及びＶＥＧＦのレベル、又はこれらの全てを繰り返し測定する。上記のように、正常妊娠では、妊娠２０週後の尿ＰｌＧＦレベルは２００〜８００ｐｇ／ｍｌ又は２００〜８００ｐｇ／ｍｇクレアチニンの範囲である。４００ｐｇ／ｍｌより低いＰｌＧＦ値、好ましくは２００ｐｇ／ｍｌより低い値又は尿サンプルの２００ｐｇ／ｍｇクレアチニンよりも低い値は、子癇前症又は子癇前症を発症する傾向の診断法であるとみなされる。
【０２１４】
また、本発明は、心血管病態又は心血管病態を発症する傾向を検出するための診断アッセイを特徴とする。好ましい態様では、子癇前症又は子癇の病歴のある女性のｓＦｌｔ−１レベルを測定し、基準サンプルのｓＦｌｔ−１レベルと比較する。基準サンプルは、以前に妊娠していたか又は子癇前症若しくは子癇の病歴のない女性から採取したサンプルを含むことが好ましい。ｓＦｌｔ−１のポリペプチド又は核酸のレベルの基準サンプルに対する変化は、心血管病態を診断し、又は心血管病態を発症する傾向を予測するために用いることができる。ｓＦｌｔ−１、ＰｌＧＦ、又はＶＥＧＦの核酸配列の基準サンプルに対する変化も、心血管病態を診断し、又は心血管病態を発症する傾向を予測するために用いることができる。上記の診断法及び測定基準を用いて、子癇前症又は子癇の病歴のある女性を産後モニターし、又は心血管病態を診断し、又は心血管病態を発症する傾向を予測することができる。産後モニタリングは定期的に（例えば、１ヶ月に１回、６ヶ月に１回、毎年、１年おき、又はもっと少なく）実施し、診断、予測、又は将来の心血管イベント若しくは病態の予防を補助することができる。
【０２１５】
診断キット
また、本発明は、上記診断アッセイの実施に必要な成分、及び成分の使用説明書を含む、子癇前症若しくは子癇又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断するための診断試験キットを提供する。例えば、診断試験キットは、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦに対する抗体、並びに抗体とｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドとの結合を検出し及びより好ましくは評価するのに有用な成分を含めることができる。検出には、抗体か、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドのいずれかを標識し、抗体か、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドのいずれかを基質に結合させ、その結果、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチド−抗体相互作用が、抗体とｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドとの結合後、基質に結合した標識の量を測定することによって立証できる。１つの例では、キットは、ＰｌＧＦ結合物質とＰｌＧＦの存在を検出するための成分とを含む。慣用のＥＬＩＳＡ又はサンドイッチＥＬＳＩＡは抗体−基質相互作用を検出するための一般的で公知の方法であり、本発明のキットを提供できる。ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドは、限定されるものではないが尿、血清、血漿、唾液、羊水、又は脳脊髄液を含めた如何なる体液においても実際に検出できる。ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドレベルの、正常対照に存在するレベルのような基準に対する変化を測定するキットは、本発明の方法における診断キットとして有用である。キットは、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのレベルを検出するために用いるアッセイで標準として用いられる精製タンパク質を含むこともできる。キットはキットの使用説明書を含有することが望ましい。１つの例では、キットは、子癇前症、子癇、又は子癇前症若しくは子癇を発症する傾向を診断するためのキットの使用説明書を含有する。他の例では、キットは、心血管病態又は心血管病態を発症する傾向を診断するための説明書を含有する。更に他の例では、キットは、治療的処置又は用量をモニターするためのキットの使用説明書を含有する。
【０２１６】
本発明の１つの態様では、そのようなキットは、１次物質（例えば、抗原を認識する抗体又はタンパク質）でコーティングされた固体支持体（例えばメンブラン又はマイクロタイタープレート）、検量線を作成するための精製タンパク質の標準溶液、分析実行の品質検査のための体液（例えば血清又は尿）対照、西洋ワサビペルオキシダーゼ若しくは標識された他のもののような標識又は酵素に結合した２次物質（例えば、検出すべき抗原の第２のエピトープに反応する２次抗体又は１次抗体を認識する抗体若しくはタンパク質）、基質溶液、終止溶液、洗浄バッファー、及び指示マニュアルを含む。
【０２１７】
スクリーニングアッセイ
上で論じたように、sFlt-1の核酸又はポリペプチドの発現は、子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向のある被験者において増加する。こうした発見に基づき、本発明の組成物は、子癇前症又は子癇の被験者では変化しているｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチド又は核酸分子の発現を調節するものを同定するための候補化合物のハイスループット低コストスクリーニングに有用である。
【０２１８】
ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸分子の発現を変化させる新規候補化合物を同定するためのスクリーニングアッセイの実施に多くの方法が利用できる。１つの実施例では、候補化合物は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸配列を発現する培養細胞の培地にさまざまな濃度で加えられる。次に、例えばマイクロアレイ解析、ノーザンブロット解析（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）、又はＲＴ−ＰＣＲによって、ハイブリダイゼーションプローブとして核酸分子から調製した適当な断片を用いて遺伝子発現を測定する，。候補化合物存在下での遺伝子発現レベルを、候補化合物のない対照培地で測定したレベルと比較する。ＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦの遺伝子、核酸分子、又はポリペプチドの発現増加、あるいはｓＦｌｔ−１の遺伝子、核酸分子、又はポリペプチドの発現低下のような変化を促進する化合物、又はその機能的同等物は、本発明に有用であると思われる；そのような分子は、例えば被験者の子癇前症又は子癇を処置するための療法として用いることができる。
【０２１９】
他の実施例では、候補化合物の効果は、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドに特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング又は免疫沈降のような同様の一般的アプローチ及び標準免疫学的技術を用いてポリペプチド産生レベルで測定することができる。例えば、イムノアッセイは、生体における本発明のポリペプチドのうちの少なくとも１つの発現を検出し、モニターするために用いることができる。そのようなポリペプチドに結合可能なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体（上記のように製造）は、標準的イムノアッセイ形式（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、又はＲＩＡアッセイ）に用いて、ポリペプチドレベルを測定することができる。ある態様では、ＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのポリペプチドの発現又は生物活性の増加、あるいはｓＦｌｔ−１ポリペプチドの発現又は生物活性の低下のような変化を促進する化合物は特に有用であると思われる。やはり、そのような分子は、例えば被験者の子癇前症若しくは子癇、又は子癇前症若しくは子癇の症状を遅延させ、改善し、又は処置するための療法として用いることができる。
【０２２０】
更に他の実施例では、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドに特異的に結合するものに関し、候補化合物をスクリーニングすることができる。そのような候補化合物の有効性は、そのようなポリペプチド又はその機能的同等物と相互作用する能力に依存する。そのような相互作用は、多くの標準結合技術及び機能分析（例えばＡｕｓｕｂｅｌら、上記に記載のもの）を用いて容易にアッセイすることができる。１つの態様では、候補化合物を、本発明のポリペプチドに特異的に結合する能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。他の態様では、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドとＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのような成長因子との結合を低下させることによってｓＦｌｔ−１ポリペプチドの生物活性を低下させる能力について候補化合物を試験する。
【０２２１】
他の実施例では、ｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦの核酸は、検出可能レポーターとの転写融合体又は翻訳融合体として発現し、誘導性プロモーターのような異種プロモーターの制御下、単離細胞（例えば哺乳動物細胞又は昆虫細胞）中で発現する。次に融合タンパク質発現細胞を候補化合物と接触させ、その細胞内での検出可能レポーターの発現を、未処理対照細胞内での検出可能レポーターの発現と比較する。ｓＦｌｔ−１検出可能レポーターの発現を低下させる候補化合物、又はＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦの検出可能レポーターの発現を増加させる候補化合物は、子癇前症又は子癇の処置に有用な化合物である。好ましい態様では、候補化合物は、核酸に融合したレポーター遺伝子の発現を変化させる。
【０２２２】
１つの具体的な例では、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドに結合する候補化合物をクロマトグラフィに基づいた技術で同定することができる。例えば、本発明の組換えポリペプチドを、ポリペプチドを発現するように遺伝子操作した細胞（例えば上記のもの）から標準技術で精製し、カラムに固定することができる。次に候補化合物溶液をカラムに通し、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドに特異的な化合物を、ポリペプチドに結合し、カラムに固定される能力に基づいて同定する。化合物を単離するには、カラムを洗浄して非特異的に結合した分子を除去し、その後目的化合物をカラムから溶出させて回収する。類似の方法を用いてポリペプチドマイクロアレイに結合した化合物単離することができる。この方法（又は他の適切な方法）で単離した化合物は、所望により更に精製する（例えば高性能液体クロマトグラフィによって）。更に、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドの活性を低下させる能力又はＶＥＧＦシグナル伝達経路（例えば上記のような）の活性を増加させる能力に関して、これらの候補化合物を試験することができる。このアプローチで単離した化合物を、例えばヒト被験者の子癇前症又は子癇を処置するための療法として用いることもできる。１０ｍＭ以下の親和定数で本発明のポリペプチドに結合するとして同定された化合物は、本発明に特に有用であると考えられる。あるいは、いずれかのｉｎ  ｖｉｖｏタンパク質相互作用検出システム、例えば２ハイブリッドアッセイを利用して、本発明のポリペプチドに結合する化合物又はタンパク質を同定することができる。
【０２２３】
潜在的アンタゴニストには、有機分子、ペプチド、ペプチド模倣体、ポリペプチド、核酸、及びｓＦｌｔ−１核酸配列又はｓＦｌｔ−１ポリペプチドに結合する抗体が含まれる。
【０２２４】
ｓＦｌｔ−１  ＤＮＡ配列は、子癇前症又は子癇を処置するための治療用化合物の発見及び開発に用いることもできる。コードされたタンパク質は、発現すると、薬物スクリーニングの標的として用いることができる。更に、コードされたタンパク質のアミノ末端領域をコードするＤＮＡ配列、又はそれぞれのｍＲＮＡのシャイン−ダルガルノ配列若しくは他の翻訳促進配列を、ｓＦｌｔ−１コード配列の発現を低下させる配列を構築するために用いることができる。そのような配列は標準技術（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記）で単離することができる。
【０２２５】
場合により、上記アッセイで同定された化合物は、ｓＦｌｔ−１の生物活性を低下させる化合物又はＶＥＧＦシグナル伝達経路の活性を増加させる化合物のアッセイに有用であると確認することができる。
【０２２６】
本発明の小分子の分子量は２，０００ダルトン以下が好ましく、より好ましくは３００〜１，０００ダルトン、最も好ましくは４００〜７００ダルトンである。これらの小分子は有機分子であることが好ましい。
【０２２７】
ＶＥＧＦシグナル伝達経路を標的とする療法
ＶＥＧＦは、血管新生、血管透過性増大、及び血管拡張を刺激する、強力な内皮細胞特異的分裂促進因子である。ＶＥＧＦに対し、３つのチロシンキナーゼ型シグナル伝達受容体が同定されている。ＶＥＧＦ−受容体結合は、シグナル伝達カスケードを引き起こし、ホスホリパーゼＣγｌのチロシンリン酸化を生じ、イノシトール１，４，５−三リン酸の細胞内レベルを増加させ、一酸化窒素合成酵素を活性化する細胞内カルシウムを増加させ、一酸化窒素（ＮＯ）を産生する。ＮＯ形成は、血管平滑筋細胞及び内皮細胞でグアニル酸シクラーゼを活性化し、ＧＭＰ産生を引き起こす。このＮＯ／ｃＧＭＰカスケードはＶＥＧＦの血管作用効果を介在すると考えられる。ＶＥＧＦの血管作用効果の介在に関与すると思われる他の経路は、プロスタサイクリン放出経路である。ＶＥＧＦは、ＭＡＰＫカスケード開始の結果としてホスホリパーゼＡ２の活性化を介してＰＧＩ２産生を誘導する。
【０２２８】
ＶＥＧＦレベルの増加は、子癇前症及び子癇の処置に有用である。ＶＥＧＦシグナル伝達又はＶＥＧＦシグナル伝達の成分を標的とする治療用化合物、及びＶＥＧＦシグナル伝達の活性化を促進する治療用化合物も、子癇前症及び子癇の処置に有用である。そのような化合物には、シルデナフィル、プロスタサイクリンアナログ、例えばフローラン、Ｒｅｍｏｄｕｌｉｎ、及びトラクリアが含まれる。
【０２２９】
試験化合物及び抽出物
一般に、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドの活性を低下可能な化合物又はＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦの活性を増加可能な化合物は、当該技術分野に公知の方法にしたがい、天然産物又は合成（若しくは半合成）抽出物の大きなライブラリー、化学ライブラリー、又はポリペプチド若しくは核酸のライブラリーから同定される。薬物の発見及び開発の分野に熟練した者は、試験抽出物又は化合物の正確な供給源は本発明のスクリーニング法に重要ではないことを理解するであろう。スクリーニングに用いる化合物は、公知化合物（例えば他の疾患又は障害に用いる公知療法）を含むことができる。あるいは、実際に、本明細書に記載の方法を用いて多くの未知の化学抽出物又は化合物をスクリーニングすることができる。そのような抽出物又は化合物の例には、限定されるものではないが、植物、真菌、原核生物、又は動物に基づいた抽出物、発酵ブロス、及び合成化合物、並びに既存化合物の変形が含まれる。限定されるのものではないが、糖、脂質、ペプチド、及び核酸に基づいた化合物を含めた多くの化学化合物の無作為合成又は指令合成（例えば半合成又は全合成）に、数多くの方法も利用可能である。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（メリマク、ニューハンプシャー州）及びＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から市販されている。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物の抽出物の形態の天然化合物のライブラリーが、Ｂｉｏｔｉｃｓ（サセックス、英国）、Ｘｅｎｏｖａ（スラウ、英国）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ、フロリダ州）及びＰｈａｒｍａＭａｒ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を含めた多くの供給元から市販されている。その上、天然ライブラリー及び合成的に作製されたライブラリーが所望により当該技術分野に公知の方法、例えば標準的抽出及び分画法にしたがい作製される。更に、所望により、ライブラリー又は化合物は、標準の化学的、物理的、又は生化学的方法を用いて容易に改変される。
【０２３０】
その上、薬物の発見及び開発の分野に熟練した者は、脱複製（例えば分類学的脱複製、生物学的脱複製、及び化学的脱複製、又はそれらの組み合わせ）、又はｍｏｌｔ−破壊活性について既に知られている材料の複製物若しくは反復物の除去の方法を可能ならいつでも採用すべきであることを容易に理解する。
【０２３１】
粗抽出物がｓＦｌｔ−１ポリペプチドの活性を低下させるか又はｓＦｌｔ−１ポリペプチドに結合することがわかっているときは、観察された効果に関与する化学成分を単離するために陽性リード抽出物の更なる分画が必要である。したがって、抽出、分画、及び精製工程の目的は、ｓＦｌｔ−１ポリペプチドの活性を低下させる粗抽出物内の化学物質の慎重な特徴付け及び同定である。そのような異種抽出物の分画及び精製方法は当該技術分野に公知である。所望により、ヒトの子癇前症又は子癇を処置するための療法として有用であることが示された化合物は、当該技術分野に公知の方法にしたがい化学的に改変される。
【０２３２】
療法
本発明は、被験者の子癇前症又は子癇を治療又は予防する方法を特徴とする。療法は、子癇前症若しくは子癇の治療又は予防のため妊娠中に、あるいは産後子癇前症又は子癇を治療するために妊娠の後に投与することが好ましい。投与の技術及び用量は、化合物の種類（例えば化学化合物、抗体、アンチセンス、又は核酸ベクター）に応じて変化し、当該技術分野に熟練した者に周知であるか、又は容易に決定される。
【０２３３】
本発明の治療用化合物は、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤とともに単位剤形で投与することができる。非経口投与、経静脈投与、皮下投与、経口投与、又は羊水への直接注入により局所投与することができる。持続注入による経静脈送達は本発明の治療用化合物の投与に好ましい方法である。
【０２３４】
組成物は、経口投与用には丸剤、錠剤、カプセル、液体、若しくは徐放性錠剤の形態で；又は経静脈、皮下若しくは非経口投与には液体で；又は局所投与用にはポリマー若しくは他の徐放性ビヒクルであり得る。
【０２３５】
当該技術分野に周知の製剤作製方法は、例えば『レミントン：製剤の科学と実践』（第２０版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ．編、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、フィラデルフィア、ペンシルバニア州）にみられる。非経口投与用製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水、生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物性オイル、又は水素化ナフタレンを含有することができる。生体適合性、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、又はポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを用いて化合物の放出を制御することができる。ナノ粒子製剤（例えば生分解性ナノ粒子、固体脂質ナノ粒子、リポソーム）を用いて化合物の生体分布を制御することができる。他の潜在的に有用な非経口送達システムには、エチレン−酢酸ビニルコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、埋め込み型注入システム、及びリポソームが含まれる。製剤中の化合物濃度は、投与すべき薬物の用量、及び投与経路を含めた多くの因子に応じて変化する。
【０２３６】
化合物は、場合により、医薬産業で一般に用いられる非毒性の酸付加塩又は金属複合体のような医薬的に許容可能な塩として投与することができる。酸付加塩の例には、酢酸、乳酸、パモン酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、パルミチン酸、スベリン酸、サリチル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、又はトリフルオロ酢酸などの有機酸；タンニン酸、カルボキシメチルセルロースなどのポリマー酸；及び塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸が含まれる。金属複合体には、亜鉛、鉄などが含まれる。
【０２３７】
経口用製剤には、非毒性の医薬的に許容可能な賦形剤との混合物中に活性成分を含有する錠剤が含まれる。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤又は充填剤（例えばショ糖及びソルビトール）、潤滑剤、流動促進剤、及び粘着防止剤（例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油、又はタルク）であり得る。
【０２３８】
経口用製剤は、チュアブル錠として、又は活性成分が不活性固体賦形剤と混合されている硬ゼラチンカプセルとして、又は活性成分が水若しくは油性媒体と混合されている軟ゼラチンカプセルとして提供することもできる。
【０２３９】
用量及び化合物を投与するタイミングは、被験者の全般的な健康及び子癇前症症状の重篤度を含めたさまざまな臨床因子に依存する。一般に、いったん子癇前症又は子癇前症を発症する傾向が検出されると、精製タンパク質の持続注入により病態の更なる進行を治療又は予防する。治療は、１〜１００日間、より好ましくは１〜６０日間、最も好ましくは１〜２０日間、又は妊娠終了までの期間継続することができる。用量は、それぞれの化合物及び病態の重篤度に応じて変化し、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦ、又は両方の血清濃度範囲が１〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜５０ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは５〜１０ｎｇ／ｍＬの定常状態に達するまで漸増される。
【０２４０】
本明細書に記載の診断法用いて、療法中、子癇前症若しくは子癇をモニターし、又は治療用化合物の用量を決定することもできる。１つの例では、治療用化合物を投与し、療法のあいだＰＡＡＩを決定する。ＰＡＡＩが１０より小さい場合、好ましくは２０より小さい場合は、治療用量は有効用量であるとみなされる。
【０２４１】
ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのタンパク質発現を増加させる方法
本発明は、子癇前症又は子癇であると診断された被験者のＶＥＧＦ及びＰｌＧＦのレベルを増加させる方法を特徴とする。ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルの増加は、とりわけ以下に記載のいくつかの異なる方法で達成することができる。
【０２４２】
精製タンパク質
本発明の好ましい態様では、子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するために精製型のＶＥＧＦ又はＰｌＧＦ又は両方を被験者に投与する。
【０２４３】
精製ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ様タンパク質には、ＶＥＧＦのアミノ酸配列と相同な、より望ましくは実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは血管新生を誘発できるか、又は血管内皮細胞若しくは臍帯静脈内皮細胞の選択的増殖を促進可能なＶＥＧＦファミリーメンバーが含まれる。精製ＶＥＧＦ化合物の１つの例は、ジェネンテック社（サンフランシスコ、カリフォルニア州）製のヒト組換えＶＥＧＦ−１６５である。他の例は、Ｓｃｉｏｓ社（フレモント、カリフォルニア州）製のヒト組換えＶＥＧＦ−１２１である。
【０２４４】
精製ＰｌＧＦ又はＰｌＧＦ様タンパク質には、ＰｌＧＦアミノ酸配列と相同な、より望ましくは実質的に同一なアミノ酸配列を有するタンパク質、あるいは血管新生を誘発できるか、又は血管内皮細胞若しくは臍帯静脈内皮細胞の選択的増殖を促進可能なＰｌＧＦファミリーメンバーが含まれる。市販の精製ＰｌＧＦの例は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号２６４−ＰＧ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）製のヒト組換えＰｌＧＦである。ＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ社も虚血性脳卒中の治療用に精製型ＰｌＧＦを開発している；おそらくこの型のＰｌＧＦは本発明に記載の適用に有効であろう。
【０２４５】
ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦ活性を増加させる治療用化合物
本発明は、被験者の子癇前症の治療又は予防のための、ＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦの血清レベル、又はこれらのポリペプチドの生物活性を刺激又は増加することが知られている化合物の使用を提供する。これらの化合物は、単独で用いることも、あるいは上記精製タンパク質と、又は本明細書に記載のＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのタンパク質レベルを増加させるために用いる他の方法と組み合わせて用いることもできる。
【０２４６】
ＶＥＧＦ産生を刺激することが知られている化合物の１例はニコチンである。喫煙は妊娠女性及び発育中の胎児の全般的な健康に多くの危険をもたらすが、ニコチン自体はシガレットよりも安全であると考えられており、高危険率被験者に対する短期療法に用いることができる。例には、スミスクライン・ビーチャム製の市販のニコチンガム製品であるニコレット（ニコチン  ｐｏｌａｃｒｉｌｅｘ）、及びヘキスト・マリオン・ルセル社（以前はマリオン・メレル・ダウ）製の市販のニコチンパッチであるニコダームＣＱが含まれる。タバコを介して送達されるニコチンは、特に本発明の方法から除外されており、患者は本発明の方法で診断されてもいない。
【０２４７】
ニコチンは、子癇前症又は子癇の診断後にパッチ又はガムを用いて投与される。用量は、病態の重篤度及び被験者の全般的な健康に応じて変化する。一般に、製造者の指示は血清ニコチンレベルが５〜５００ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１００ｎｇ／ｍＬ、最も好ましくは５０〜１００ｎｇ／ｍＬに達するまで続いている。
【０２４８】
テオフィリンは、子癇前症若しくは子癇の治療又は予防に用いることができる追加の化合物の他の例である。テオフィリンは喘息の治療にしばしば用いられる気管支拡張薬であり、多くの商標名で（例えばＡｅｒｏｌａｔｅ  Ｓｒ、Ａｓｍａｌｉｘ、Ｅｌｘｏｐｈｙｌｌｉｎなど）、及びジェネリックで市販されている。投与方法及び用量はそれぞれの製造者で異なっており、被験者の全般的な健康及び病態の重篤度に基づいて選択される。一般に、日用量は１〜５００ｍｇ、より好ましくは１００〜４００ｍｇ、最も好ましくは２５０〜３５０ｍｇであり、１日２回、血清テオフィリンレベルが５〜５０μｇ／ｍＬに達するまで投与される。
【０２４９】
アデノシンは、子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するために用いることができる更なる化合物の他の例である。アデノシン（藤沢薬品工業）は一般に抗高血圧薬として用いられている。投与法及び用量はそれぞれの製造者で異なっており、被験者の全般的な健康及び病態の重篤度に基づいて選択される。一般に、日用量５０ｍｇ／ｋｇ、１日２回投与がアデノシンには典型的である。
【０２５０】
ニフェジピンは、子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するために用いることができる更なる化合物の他の例である。ニフェジピン（バイエル薬品）は一般に抗高血圧薬として使用される。投与法及び用量はそれぞれの製造者で異なっており、被験者の全般的な健康及び病態の重篤度に基づいて選択される。一般に、日用量１〜２ｍｇ／ｋｇ、１日２回、経口又は皮下投与がニフェジピンには典型的である。
【０２５１】
ミノキシジルは、子癇前症若しくは子癇を治療又は予防するために用いることができる更なる化合物の他の例である。ミノキシジルは一般に抗高血圧薬として用いられる。投与法及び用量はそれぞれの製造者で異なっており、被験者の全般的な健康及び病態の重篤度に基づいて選択される。一般に、日用量０．２５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、１日２回、経口又は皮下投与がミノキシジルには典型的である。
【０２５２】
硫酸マグネシウムは、子癇前症若しくは子癇の治療又は予防に使用できる追加の化合物の他の例である。硫酸マグネシウムは、典型的には抗高血圧薬として用いられるジェネリック薬品である。投与法及び用量はそれぞれの製造者で異なっており、被験者の全般的な健康及び病態の重篤度に基づいて選択される。一般に、日用量１〜２ｇ、４時間毎に経静脈投与が、硫酸マグネシウムの典型的用量である。
【０２５３】
ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦの血清レベルを増加させることができる化合物の使用に加えて、本発明は、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦ指向性の化合物と組み合わせて使用される慢性高血圧薬の使用を提供する。妊娠高血圧の治療に用いられる薬物には、メチルドーパ、塩酸ヒドララジン、又はラベタロールが含まれる。これら薬物のそれぞれに関し、投与様式及び用量は医師によって、及び製造者の指示によって決定される。
【０２５４】
治療用核酸
最近の研究は、ＶＥＧＦのような内皮細胞分裂促進因子を発現可能な核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の血管障害部位への送達は、障害血管の増殖及び再内皮化（reendothelialization）を誘発することを示している。本発明は血管障害に関するものではないが、これらの研究で用いられるＶＥＧＦ及びＰｌＧＦのような内皮細胞分裂促進因子をコードする核酸の送達技術は本発明にも利用できる。これらの技術は米国特許第５，８３０，８７９号及び第６，２５８，７８７号に記載されており、本明細書に援用される。
【０２５５】
本発明では、核酸は、ＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦ又はＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦのファミリーのメンバーをコードする、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びｍＲＮＡを含めて如何なる核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）でもよい。核酸には、ｓＦｌｔ−１受容体に結合することが示されているタンパク質をコードする核酸を含めることもできる。当該技術分野で日常的な手順、例えば組換えＤＮＡ、ＰＣＲ増幅を用いて所望のタンパク質をコードする核酸を得ることができる。
【０２５６】
ｓＦｌｔ−１発現を阻害する治療用核酸
また、本発明は、ｓＦｌｔ−１  ｍＲＮＡの発現を直接下方制御するためのアンチセンス核酸塩基オリゴマーの使用を特徴とする。相補的核酸配列（センス鎖又はコード鎖）に結合させることによって、アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、おそらくＲＮＡｓｅＨによるＲＮＡ鎖の酵素的切断を介してタンパク質発現を阻害することができる。アンチセンス核酸塩基オリゴマーは、過剰レベルのｓＦｌｔ−１を発現する細胞においてｓＦｌｔ−１タンパク質の発現を減少可能であることが好ましい。ｓＦｌｔ−１タンパク質発現の低下は、対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞に対して少なくも１０％、より好ましくは２５％、最も好ましくは５０％以上であることが好ましい。アンチセンス核酸塩基オリゴマーの選択及び調製方法は当該技術分野に周知である。ＶＥＧＦ発現を下方制御するためのアンチセンス核酸塩基オリゴマーの使用例として、本明細書に援用される米国特許第６，４１０，３２２号を参照されたい。タンパク質発現レベルのアッセイ法も当該技術分野に周知であり、それにはウエスタンブロッティング、免疫沈降、及びＥＬＩＳＡが含まれる。
【０２５７】
また、本発明は、ｓＦｌｔ−１の発現を阻害するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の使用を特徴とする。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、目的遺伝子又はｍＲＮＡに対応する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を生体に導入し、対応のｍＲＮＡを分解する、近年発見された転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）メカニズムである。ＲＮＡｉ反応では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖がともに長さ２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の２−ヌクレオチド３’尾部を有する小さなＲＮＡ断片又はセグメントにプロセシングされる。あるいは、長さ２１〜２３ｎｔで２−ヌクレオチド  ３’尾部を有する合成ｄｓＲＮＡを合成し、精製し、反応に用いることができる。これらの２１〜２３ｎｔ  ｄｓＲＮＡは、「ガイドＲＮＡ」又は「短い干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）としても知られている。
【０２５８】
次にｓｉＲＮＡ２本鎖は、複合体内でｓｉＲＮＡと相同性を有する内因性ｍＲＮＡを標的として破壊するタンパク質で構成されるヌクレアーゼ複合体に結合する。複合体内のタンパク質の正体は依然として未知であるが、複合体の機能は、ｓｉＲＮＡ鎖の１本と内因性ｍＲＮＡとの塩基対相互作用を介して相同なｍＲＮＡ分子を標的とすることである。次にｍＲＮＡはｓｉＲＮＡの３’端からおよそ１２ｎｔに切断され、分解される。この方法では、特定遺伝子を標的として分解することができ、それにより標的遺伝子からのタンパク質発現の喪失をもたらす。
【０２５９】
ｄｓＲＮＡの特定の必要性及び改変は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７５１６４号（本明細書に援用される）に記載されている。ｄｓＲＮＡ分子は長さがさまざまであり得るが、典型的には（２’−デオキシ）チミジン又はウラシルである２〜３ヌクレオチド３’突出末端を特徴とする２１〜２３ヌクレオチドｄｓＲＮＡのｓｉＲＮＡ分子を使用することが最も好ましい。ｓｉＲＮＡは典型的には３’ヒドロキシル基を含む。１本鎖ｓｉＲＮＡ及び平滑末端型ｄｓＲＮＡを用いることもできる。ＲＮＡの安定性を更に増大させるために、３’突出を分解に対して安定化させることができる。１つのそのような態様では、アデノシン又はグアノシンのようなプリンヌクレオチドを含めることによってＲＮＡを安定化させる。あるいは、改変アナログによるピリミジンヌクレオチドの置換、例えば（２’−デオキシ）thymideによるウリジン２−ヌクレオチド突出の置換は許容され、ＲＮＡｉ効率に影響しない。２’ヒドロキシル基が存在しなければ、組織培養培地において突出部分のヌクレアーゼ耐性を顕著に増大させる。
【０２６０】
あるいは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／７５１６４号（本明細書に援用される）に記載の方法を用いて、又はＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の標準的手法及びＥｌｂａｓｈｉｒらに記載のｄｓＲＮＡアニーリング法（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．、１５：１８８−２００、２００１）を用いてｓｉＲＮＡを調製することができる。また、ｓｉＲＮＡは、Ｅｌｂａｓｈｉｒらに記載のように、無細胞系ショウジョウバエ溶解物において標的遺伝子の配列に対応するｄｓＲＮＡをインキュベーションすることによって合胞体胚盤葉ショウジョウバエ胚から、ｄｓＲＮＡがプロセシングされて約２１〜約２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡを生じ、その後、当該技術分野に熟練した者に公知の技術を用いて単離される条件下で得られる。例えば、ゲル電気泳導を用いて２１〜２３ｎｔ  ＲＮＡを分離することができ、その後、ゲル切片からＲＮＡを溶出させることができる。その上、クロマトグラフィ（例えばサイズ排除クロマトグラフィ）、グリセロール勾配遠心、及び抗体を用いた親和性精製を用いて２１〜２３ｎｔ  ＲＮＡを単離することができる。
【０２６１】
本発明では、ｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、ｓＦｌｔ−１  ｍＲＮＡのｍＲＮＡ配列に相補的であり、ｓＦｌｔ−１の発現を低下又は阻害する。好ましくは、ｓＦｌｔ−１タンパク質発現の低下は、対照のｄｓＲＮＡ又はｓｉＲＮＡで処理された細胞に対して少なくとも１０％であり、より好ましくは２５％、最も好ましくは少なくとも５０％である。タンパク質発現レベルをアッセイする方法も、当該技術分野に周知であり、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、及びＥＬＩＳＡが含まれる。
【０２６２】
本発明では、用いる核酸は、何らかの方法で核酸の安定性又は機能を高める改変を含む。例には、リン酸骨格、ヌクレオチド間連結、又は糖鎖部分への改変が含まれる。
ｓＦｌｔ−１結合タンパク質をコードする核酸の操作及び取り扱いを簡便にするために、核酸は、プロモーターに機能可能に連結されたカセットに挿入されることが好ましい。プロモーターは、所望の標的宿主細胞においてｓＦｌｔ−１結合タンパク質の発現を駆動可能でなければならない。適切なプロモーターの選択は容易に達成することができる。好ましくは、高発現プロモーターを使用するであろう。好適なプロモーターの例は、７６３塩基対のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）（Ｄａｖｉｓら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１５１−１５９、１９９３）及びマウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）のプロモーターを用いることもできる。それらの天然プロモーターを用いて一定のタンパク質を発現させることができる。発現を促進させることができる他の配列も含めることができる（例えばエンハンサー、又は高発現レベルを生ずるシステム例えばｔａｔ遺伝子及びｔａｒ配列）。組換えベクターは、ｐＵＣ１１８、ｐＢＲ３２２、又は例えば大腸菌複製オリジンを含む他の公知のプラスミドベクターのようなプラスミドベクターであり得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所出版、１９８９を参照されたい）。プラスミドベクターは、アンピシリン耐性のためのβラクタマーゼ遺伝子のような選択可能マーカーを含むこともできる。但し、マーカーポリペプチドが、処理される生物の代謝に悪影響を及ぼさないことを条件とする。カセットは、ＰＣＴ公開番号Ｗ０９５／２２６１８号に開示されたシステムのような合成送達システムの核酸結合部分に結合させることもできる。
【０２６３】
核酸は、使用するベクターに適した手段で細胞に導入することができる。そのような方法の多くは当該技術分野に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；及びＷａｔｓｏｎら、「組換えＤＮＡ」、第１２章、第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、１９９２）。組換えベクターは、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション、リポソーム介在トランスフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、ウイルスキャプシド介在移送、ポリブレン介在移送、又は原形質融合のような方法で移送することができる。リポソーム調製、ターゲティング、及び内容物の送達の手順の概説として、Ｍａｎｎｉｎｏ及びＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６８２−６９０、１９８８）、Ｆｅｌｇｎｅｒ及びＨｏｌｍ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ、１１：２１、１９８９）、及びＭａｕｒｅｒ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｆｏｃｕｓ、１１：２５、１９８９）を参照されたい。
【０２６４】
組換えベクター（プラスミドベクター又はウイルスベクター）の移送は、羊水への直接注入又は経静脈送達によって達成することができる。
アデノウイルスベクター又はアデノ関連ベクター（ＡＡＶ）を用いた遺伝子送達を用いることもできる。アデノウイルスは非常に多くの動物種に存在し、あまり病原性ではないが、分裂細胞でも静止細胞でも同様に十分に複製できる。原則として、遺伝子送達に用いられるアデノウイルスは、ウイルス複製に必要な１以上の遺伝子を欠失している。ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ又はｓＦｌｔ−１結合タンパク質の送達に用いる複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、当該技術分野に公知の技術にしたがい作製できる（Ｑｕａｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：２５８１−２５８４、１９９２；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０：６２６−６３０、１９９２；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８：１４３−１５５、１９９２を参照されたい）。子宮内遺伝子療法の使用例として、米国特許第６，３９９，５８５号を参照されたい。
【０２６５】
ｄｓＲＮＡ若しくはオリゴヌクレオチドの哺乳動物細胞へのトランスフェクション又は導入に、さまざまな方法が利用できる。例えば、市販のトランスフェクション試薬は、限定されるものではないが：ＴｒａｎｓＩＴ−  ＴＫＯＴＭ（Ｍｉｒｕｓ、カタログ番号ＭＩＲ  ２１５０）、ＴｒａｎｓｍｅｓｓｅｎｇｅｒＴＭ（キアゲン、カタログ番号３０１５２５）、及びオリゴフェクタミンＴＭ（インビトロジェン、カタログ番号ＭＩＲ  １２２５２−０１１）を含めていくつかある。それぞれのトランスフェクション試薬のプロトコールは製造者より入手可能である。
【０２６６】
いったん移送されると、核酸は、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又は他のｓＦｌｔ−１結合タンパク質の血清レベルを増加させるのに十分な時間、障害部位で、細胞によって発現される。核酸を含有するベクターは、通常、細胞のゲノムに組み込まれないので、目的タンパク質の発現は限られた時間のみで起こる。典型的には、タンパク質は、約２日間〜数週間、好ましくは約１日〜２週間、治療レベルで発現される。ＤＮＡの再適用により、治療タンパク質の更なる発現期間を提供することができる。哺乳動物において血管疾患を治療するためにＶＥＧＦを用いた遺伝子療法の最近の例は、Ｄｅｏｄａｔｏら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：７７７−７８５、２００２）；Ｉｓｎｅｒら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１２：１５９３−１５９４、２００１）；Ｌａｉら（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：８０４−８１３、２００２）に見ることができ；ｒｅｖｉｅｗｅｄ  ｉｎ  Ｆｒｅｅｄｍａｎ及びＩｓｎｅｒ（Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３６：５４−７１、２００２）、並びにＩｓｎｅｒ  ＪＭ（Ｎａｔｕｒｅ、４１５：２３４−２３９、２００２）に概説されている。
【０２６７】
遺伝子及びタンパク質の発現アッセイ
以下の方法を用いてタンパク質又は遺伝子の発現を評価し、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又は他のｓＦｌｔ−１結合タンパク質のレベルを増加させるか、あるいはｓＦｌｔ−１タンパク質レベルを低下させる上記方法の有効性を決定することができる。
【０２６８】
ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又はｓＦｌｔ−１に結合することが知られているタンパク質リガンドのレベルについて被験者の血清を測定する。タンパク質の血清レベルを測定するために用いられる方法には、特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング、又はイムノアッセイが含まれる。更に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイを用いて生物活性を測定し、被験者の血液が抗血管新生状態から血管新生促進状態へ転換したかどうかを決定することができる。そのようなアッセイは、先の実施例２に記載されている。
【０２６９】
ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、又はｓＦｌｔ−１の核酸レベルについて被験者の血清サンプルを測定することもできる。遺伝子発現をアッセイする公知の方法がいくつかある。いくつかの例には、被験者の血液サンプルからのＲＮＡの調製、及びノーザンブロッティング、ＰＣＲに基づいた増幅、又はＲＮＡｓｅプロテクションアッセイのためのＲＮＡの使用が含まれる。
【０２７０】
治療的処置のための抗体の使用
子癇前症の妊娠女性から採取した血清サンプル中に見られるｓＦｌｔ−１レベルの増加は、ｓＦｌｔ−１が栄養膜細胞及び母体内皮細胞に結合し、機能性ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦを枯渇させる「生理的シンク」として作用することを示唆している。ｓＦｌｔ−１に結合し、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦの結合をブロックする抗体などの化合物の使用は、遊離のＶＥＧＦ又はＰｌＧＦを増加させることによって、子癇前症若しくは子癇の予防又は治療に役立つことができる。そのような増加は、胎盤発育及び胎児の栄養、並びに全身的な母体内皮細胞の健康に必要な栄養膜の増殖、遊走及び血管新生を増加させるであろう。
【０２７１】
本発明は、ｓＦｌｔ−１のリガンド結合ドメインに特異的に結合する抗体を提供する。ｓＦｌｔ−１を阻害するために抗体が用いられ、最も有効なメカニズムはＶＥＧＦ又はＰｌＧＦへの結合部位を直接ブロックすることによると考えられるが、他のメカニズムを無視することはできない。治療目的での抗体の調製及び使用方法は、本明細書に援用される米国特許第６，０５４，２９７号；第５，８２１，３３７号；第６，３６５，１５７号；及び第６，１６５，４６４号を含めたいくつかの特許に記載されている。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく；モノクローナル抗体が好ましい。
【０２７２】
モノクローナル抗体、特にマウスを含めた齧歯類に由来する抗体はさまざまな疾患の治療に用いられているが、治療の有効性の迅速な一掃及び軽減を引き起こすヒト抗マウス免疫グロブリン反応の誘導を含め、使用に限界がある。例えば、齧歯類モノクローナル抗体の臨床的使用の主な限界は、療法中の抗グロブリン反応である（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｌｏｏｄ、６２：９８８−９９５、１９８３；Ｓｃｈｒｏｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、４５：８７９−８８５、１９８５）。
【０２７３】
当該技術分野では動物の抗原結合可変ドメインをヒトの定常ドメインにカップリングさせた「キメラ」抗体を構築することによってこの問題を克服することを試みてきた（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５、１９８４；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２：６４３−６４６、１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：２６８−２７０、１９８５）。そのようなキメラ抗体の産生及び使用について以下に記載する。
【０２７４】
ｓＦｌｔ−１へのリガンド結合の競合的阻害は、子癇前症若しくは子癇の予防又は治療に有用である。ｓＦｌｔ−１に対する抗体は、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１への結合をブロックすることができ、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦのレベルの増加をもたらす。そのような増加は、内皮機能不全を救済し、血管新生促進因子／抗血管新生因子のバランスを血管新生の方向へシフトさせることができる。
【０２７５】
本発明のモノクローナル抗体の混合物を子癇前症又は子癇の有効処置として用いることができる。混合物には、わずか２、３、若しくは４種の異なる抗体、又は６、８、若しくは１０もの異なる抗体を含めることができる。その上、本発明の抗体は、抗高血圧薬（例えばメチルドーパ、塩酸ヒドララジン、又はラベタロール）、あるいは子癇前症、子癇、又は子癇前症若しくは子癇に関連した症状の処置に用いられる他の医薬と組み合わせることができる。
【０２７６】
抗体の調製
ｓＦｌｔ−１受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体は、当該技術分野に公知の方法で作製できる。これらの方法には、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７、１９７５）、及びＣａｍｐｂｅｌｌ（『モノクローナル抗体技術  齧歯類及びヒトのハイブリドーマの産生及び特徴付け』Ｂｕｒｄｏｎら編、生化学と分子生物学の実験室技術、第１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、アムステルダム、１９８５年）に記載の免疫学的方法、並びにＨｕｓｅら（ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、１２７５−１２８１、１９８９）に記載の組換えＤＮＡ法が含まれる。
【０２７７】
モノクローナル抗体は、培養ハイブリドーマ細胞の上清から、又はマウスへのハイブリドーマ細胞の腹腔内接種によって誘発された腹水から調製することができる。最初にＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、６、５１１−５１９、１９７６）によって記載されたハイブリドーマ技術は、多くの特異抗原に対するモノクローナル抗体を高レベルで分泌するハイブリッド細胞株の作製に広く応用されている。
【０２７８】
宿主動物又はそれに由来する培養抗体産生細胞の免疫経路やスケジュールは、通常、抗体の刺激及び産生に関する確立された慣用技術にしたがう。典型的には試験モデルとしてマウスを用いるが、ヒト被験者を含めた哺乳動物被験者、またはそれらに由来する抗体産生細胞を、本発明の方法にしたがい、ヒトを含めた哺乳動物のハイブリッド細胞株作製の基礎として役立つようにを操作することもできる。
【０２７９】
免疫後、免疫リンパ細胞をミエローマ細胞と融合し、永久に培養及びサブ培養できるハイブリッド細胞株を作製し、多量のモノクローナル抗体を産生する。本発明の目的には、融合のため選択された免疫リンパ細胞は、免疫動物のリンパ節組織又は脾臓組織から採取されるリンパ球及びそれらが正常に分化した子孫細胞である。マウス系に関し、より濃縮された便利な抗体産生細胞の供給源を提供するため、脾臓細胞の使用が好ましい。ミエローマ細胞は、融合されたハイブリッドの持続増殖の基礎を提供する。ミエローマ細胞は血漿細胞由来の腫瘍細胞である。マウスミエローマ細胞株は、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；マナッサス、ヴァージニア州）から得ることができる。ヒトミエローマ細胞株及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株についても記載されている（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１−３００５、１９８４；Ｂｒｏｄｅｕｒら、モノクローナル抗体の作製技術と応用、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、ｐｐ．５１−６３、１９８７）。
【０２８０】
ハイブリッド細胞株は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞培地中に維持することができる。いったんハイブリドーマ細胞株が確立されると、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの栄養的に適切なさまざまな培地に維持できる。更に、ハイブリッド細胞株は、液体窒素凍結保存を含めた多くの慣用の方法で保管及び貯蔵することができる。凍結細胞株は、よみがえらせ、永久に培養することができ、モノクローナル抗体の合成及び分泌が再開する。分泌抗体は、沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィなどの慣用の方法で組織培養上清から回収する。
【０２８１】
マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、及びヒトを含めた如何なる哺乳動物でも抗体を作製することができる。抗体は、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ、及びそれらのサブクラス、の１つのメンバーであり得、ＩｇＧ抗体が好ましい。
【０２８２】
モノクローナル抗体作製に好ましい動物はマウスであるが、本発明はあまり限定されない；実際、ヒト抗体を使用することができ、好ましいことが判明するかもしれない。そのような抗体はヒトハイブリドーマを用いることによって得ることができる（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体とがん治療」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．、ｐ．７７−９６、１９８５）。本発明では、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝をヒト抗体分子由来の遺伝子とともにスプライシングすることによりキメラ抗体を作製するために開発された技術を用いることができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１、６８５１−６８５５、１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２、６０４−６０８、１９８４；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４、４５２−４５４、１９８５）；そのような抗体は本発明の範囲内であり、以下に記載される。
【０２８３】
細胞融合の他の代替技術として，  エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で免役したＢ細胞を用いて本発明のモノクローナル抗体を作製する（Ｃｒａｗｆｏｒｄ  Ｄ．ら、Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６４：６９７−７００、１９８３；Ｋｏｚｂｏｒ及びＲｏｄｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１２７５−１２８０、１９８１；Ｋｏｚｂｏｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：１２０−１４０、１９８６）。一般に、手順は、好適な供給源、通常は感染細胞株からエプスタイン−バーウイルスを単離し、標的抗体分泌細胞を、ウイルスを含有する上清に曝すことから成る。細胞を洗浄し、適切な細胞培地中で培養する。その後、細胞培養物中に存在するウイルスで形質転換された細胞は、エプスタイン−バーウイルス核抗原の存在によって同定することができ、形質転換された抗体分泌細胞は、当該技術分野に公知の標準的方法を用いて同定することができる。組換えＤＮＡなどのモノクローナル抗体を産生するための他の方法も本発明の範囲内に含まれる。
【０２８４】
ｓＦｌｔ−１免疫源の調製
ｓＦｌｔ−１は、それ自体を免疫源として用いることができ、又は担体タンパク質若しくはセファロースビーズのような他の物質に結合させることができる。ｓＦｌｔ−１は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２２６：３２４−３２８、１９９６）などの内因性タンパク質を発現することが知られている細胞から精製することができる。更に、ｓＦｌｔ−１又はその部分をコードする核酸分子を、標準組換えＤＮＡ技術を用いて宿主細胞で発現させるための公知のベクターに挿入することができる。ｓＦｌｔ−１発現に好適な宿主細胞には、バキュロウイルス細胞（例えばＳｆ９細胞）、細菌細胞（例えば大腸菌）、哺乳動物細胞（例えばＮＩＨ３Ｔ３細胞）が含まれる。
【０２８５】
更に、ペプチドを合成し、免疫源として用いることができる。ペプチドに対する抗体の作製方法は当該技術分野に周知であり、通常、ペプチドを血清アルブミンなどの好適な担体分子へカップリングさせることが必要である。ペプチドには、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０１１３４に相当するｓＦｌｔ−１アミノ酸配列の部分に実質的に同一なアミノ酸配列が含まれる。ペプチドは如何なる長さでもよく、好ましくは１０アミノ酸以上、より好ましくは２５アミノ酸以上、最も好ましくは４０、５０、６０、７０、８０、又は１００アミノ酸以上である。好ましくは、アミノ酸配列は、Ｕ０１１３４の配列と少なくとも６０％同一であり、より好ましくは８５％、最も好ましくは９５％同一である。ペプチドは商業的に得ることができ、又は例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相法（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２：３４１−３４７、１９８５）のような当該技術分野に周知の技術を用いて作製することができる。手順には、Ｂｉｏｓｅａｒｔｈ  ９５００自動ペプチド作製機のような市販の合成機を用いることができ、ブロックされたアミノ酸の切断はフッ化水素で達成され、ペプチドはＷａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐ  ３０００機器を用いて分離用ＨＰＬＣで１５−２０μｍ  Ｖｙｄａｃ  Ｃ４  ＰｒｅｐＰＡＫカラムにかけて精製される。
【０２８６】
抗体の機能的同等物
本発明には、本明細書に記載の抗体の機能的同等物も含まれる。機能的同等物には、本発明の抗体の可変領域及び超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。機能的同等物は、抗体に匹敵する結合特性を有し、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、及び１本鎖抗体、並びにそれらの断片が含まれる。そのような機能的同等物の作製方法は、例えば、本明細書に援用されるＰＣＴ公開番号第ＷＯ９３／２１３１９号；欧州特許出願第２３９，４００号；ＰＣＴ公開公報ＷＯ８９／０９６２２号；欧州特許出願第３３８，７４５号；欧州特許出願第３３２４２４号；及び米国特許第４，８１６，５６７号に開示されている。
【０２８７】
キメラ抗体は、実質的に又は専らヒト抗体定常領域に由来する定常領域と、実質的に又は専らヒト以外の哺乳動物の可変領域の配列に由来する可変領域とを有することが好ましい。そのようなヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はそれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又は抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野に周知である（概説として、Ｖａｓｗａｎｉ及びＨａｍｉｌｔｏｎ、Ａｎｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８１：１０５−１１９、１９９８；及びＣａｒｔｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ、１：１１８−１２９、２００１を参照されたい）。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源から組み込まれた１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしばインポート残基と呼ばれ、典型的にはインポート可変ドメインから取られる。ヒト化は、実質的に当該技術分野に公知の方法にしたがい、ヒト抗体の対応配列を齧歯類ＣＤＲ又は他のＣＤＲ配列に置換することによって実施される（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５、１９８６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２９、１９８８；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６、１９８８）。したがって、そのようなヒト化抗体は、完全なヒト可変ドメインよりも実質的に小さい領域が非ヒト種由来の対応する配列に置換されたキメラ抗体である（例えば米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。実際に、ヒト化抗体は、典型的には、あるＣＤＲ残基とおそらくＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位に由来する残基によって置換されているヒト抗体である（Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６、１９９２）。
【０２８８】
ヒト化抗体を調製するための更なる方法は、本明細書に援用される米国特許第５，８２１，３３７号及び第６，０５４，２９７号、並びにＣａｒｔｅｒ（上記）に見出すことができる。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ、並びにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含めたアイソタイプを含めた免疫グロブリンのクラスから選択される。本発明のように細胞毒性が必要ではない場合は、定常ドメインはＩｇＧ２クラスが好ましい。ヒト化抗体は、１より多いクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、具体的な定常ドメインを選択して所望のエフェクター機能を最適にすることは当該技術分野において通常の技術である。
【０２８９】
ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーを含めた当該技術分野に公知のさまざまな技術を用いて作製することもできる（Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７、１９９１；及びＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３−４５５、１９９４）。Ｃｏｌｅら及びＢｏｅｒｎｅｒらの技術もヒトモノクローナル抗体の調製に有用である（Ｃｏｌｅら、上記；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６−９５、１９９１）。
【０２９０】
ヒト以外の好適な哺乳動物には、モノクローナル抗体を作製できるあらゆる哺乳動物が含まれる。ヒト以外の哺乳動物の例には、例えばウサギ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、又は霊長類が含まれ；マウスが好ましい。
【０２９１】
抗体の機能的同等物には、１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としても知られる１本鎖抗体断片も含まれる。１本鎖抗体断片は、典型的には抗原又は受容体に結合する組換えポリペプチドである；これらの断片は、１以上の相互接続リンカーを伴って又は伴わずに、抗体可変軽鎖配列（ＶＬ）の少なくとも１つの断片につながれた抗体可変重鎖アミノ酸配列（ＶＨ）の少なくとも１つの断片を含有する。そのようなリンカーは、１本鎖抗体断片が由来する完全な抗体の標的分子結合特異性を維持するようにいったん連結されると、ＶＬ及びＶＨドメインの適切な３次元フォールディングが確実に起こるように選択される短く屈曲性のペプチドであり得る。一般に、ＶＬ又はＶＨ配列のカルボキシル末端は、そのようなペプチドリンカーによって、相補的ＶＬ及びＶＨ配列のアミノ酸末端に共有結合的に連結されている。１本鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリー又は類似技術によって作製できる。これらのタンパク質は、真核細胞においても細菌を含めた原核細胞においても作製することができる。
【０２９２】
１本鎖抗体断片は、本明細書に記載の完全な抗体の少なくとも１つの可変領域又はＣＤＲを有するアミノ酸配列を含有するが、それらの抗体の定常ドメインのいくつか又は全てを欠失している。これらの定常ドメインは抗原結合に必要ではないが、完全な抗体の構造の主要部分を構成する。したがって、１本鎖抗体断片は、定常ドメインの部分又は全てを含有する抗体の使用に関連した問題のいくつかを克服することができる。例えば、１本鎖抗体断片は、生体分子と重鎖定常領域との望ましくない相互作用や他の無用の生物活性が取り除かれる傾向にある。更に、１本鎖抗体断片は、完全な抗体よりもかなり小さく、したがって、完全な抗体よりも毛細管透過性が高く、１本鎖抗体断片を標的抗原結合部位により効率的に局在させ、結合させることができる。また、抗体断片は、原核細胞において比較的大規模で製造でき、したがって、産生を容易にする。更に、比較的サイズの小さな１本鎖抗体断は、完全な抗体よりもレシピエントの免疫応答を誘発しそうにない。
【０２９３】
機能的同等物には、完全な抗体と同一か又は匹敵する結合特性を有する抗体断片が更に含まれる。そのような断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の１つ又は両方を含有することができる。抗体断片は、完全な抗体の６つのＣＤＲ全てを含有することが好ましいが、３つ、４つ又は５つのＣＤＲなど、そのような領域の全てよりも少ない領域を含有する断片も機能的である。
【０２９４】
更に、機能的同等物は、以下の免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥ、及びそれらのサブクラスのうちの１つのメンバーであるか、あるいはそれらと組み合わせることができる。
【０２９５】
抗体の機能的同等物の調製
抗体の同等物は、当該技術分野に公知の方法によって調製される。例えば、抗体の断片は完全な抗体から酵素的に調製することができる。抗体の同等物はそのような同等物をコードするＤＮＡから調製されることが好ましい。抗体の断片をコードするＤＮＡは、全長抗体をコードするＤＮＡの所望の部分を除く全てを欠失させるによって作製することができる。
【０２９６】
キメラ抗体をコードするＤＮＡは、実質的に又は専らヒト定常領域をコードするＤＮＡを、実質的に又は専らヒト以外の哺乳動物の可変領域の配列に由来する可変領域をコードするＤＮＡと組換えることによって作製することができる。ヒト化抗体をコードするＤＮＡは、定常領域と実質的に又は専ら対応するヒト抗体領域に由来するＣＤＲ以外の可変領域とをコードするＤＮＡと、実質的に又は専らヒト以外の哺乳動物に由来するＣＤＲをコードするＤＮＡとを組換えることによって作製することができる。
【０２９７】
抗体断片をコードするＤＮＡ分子の好適な供給源には、全長抗体を発現するハイブリドーマなどの細胞が含まれる。断片は、上記のように、それ自体を抗体同等物として用いることも、同等物と組換えることもできる。
【０２９８】
この節に記載のＤＮＡの欠失及び組換えは、上記公開特許出願に記載のもののような公知の方法で実施することができる。
抗体のスクリーニング及び選択
モノクローナル抗体は標準的な公知の方法で単離され、精製される。例えば、抗体は、ｓＦｌｔ−１ペプチド抗原に対するＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット解析などの標準的な公知の方法を用いてスクリーニングすることができる。そのような技術の非限定的な例は、本明細書に援用される米国特許第６，３６５，１５７号の実施例ＩＩ及びＩＩＩに記載されている。
【０２９９】
抗体の治療的使用
子癇前症若しくは子癇の治療又は予防にｉｎ  ｖｉｖｏで用いる場合、本発明の抗体は、治療的有効量で被験者に投与される。抗体は非経口投与又は持続注入によって経静脈投与されることが好ましい。用量及び用法は、疾患の重篤度、及び被験者の全般的健康に依存する。抗体投与量は、典型的には、被験者の体重１ｋｇあたり、約０．００１〜約１０ｍｇ、好ましくは０．０１〜約５ｍｇの範囲である。
【０３００】
非経口投与の場合、抗体は、医薬的に許容可能な非経口ビヒクルと組み合わせて、単位用量の注射剤型（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化される。そのようなビヒクルは、本質的に非毒性で、非治療的である。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及び５％ヒト血清アルブミンである。不揮発性油及びオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルを用いてもよい。リポソームを担体として用いることができる。ビヒクルは、等張性や化学的安定性を高める物質、例えばバッファー及び保存料のような微量の添加物を含有してもよい。抗体は典型的にはそのようなビヒクル中に約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。
【０３０１】
ｓＦｌｔ−１を阻害する治療用化合物
ｓＦｌｔ−１レベルが子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向のある被験者において増加しているならば、ｓＦｌｔ−１のポリペプチド又は核酸分子の発現を低下させる物質は本発明の方法に有用である。そのような物質には、ＶＥＧＦ又はＰｌＧＦへのｓＦｌｔ−１結合を崩壊させることができる小分子、アンチセンス核酸塩基オリゴマー、及びＲＮＡ干渉を介在するために用いるｄｓＲＮＡが含まれる。
【０３０２】
組み合わせ療法
場合により、子癇前症又は子癇の療法は、他の標準的な子癇前症又は子癇の療法と組み合わせて投与することができる；そのような方法は熟練した者に公知であり、本明細書に記載されている。本発明の子癇前症又は子癇の療法は、ＶＥＧＦ経路の活性を増加させる化合物と組み合わせて投与することができる。内因性ＶＥＧＦの産生も誘導する物質の非限定的な例には、ニコチン、ミノキシジル、ニフェジピン、アデノシン、硫酸マグネシウム、及びテオフィリンが含まれる。１つの態様では、ＰｌＧＦタンパク質は、上記内因性ＶＥＧＦ産生を誘導する物質と組み合わせて用いることができる。
【０３０３】
被験者のモニタリング
疾患状態、あるいは子癇前症、子癇、又はそのような病態を発症する傾向のある被験者の治療、本発明の方法及び組成物を用いてモニターすることができる。１つの態様では、尿、血漿、羊水、又はＣＳＦのような体液中に存在するｓＦｌｔ−１、ＶＥＧＦ、又はＰｌＧＦのポリペプチドの発現をモニターする。そのようなモニタリングは、例えば被験者における具体的薬物の有効性の評価、又は疾患の進行の評価に有用であり得る。ｓＦｌｔ−１の核酸分子若しくはポリペプチドの発現を低下させる、又はＶＥＧＦ若しくはＰｌＧＦの核酸分子若しくはポリペプチドの発現を増加させる療法は、特に本発明に有用であるとみなされる。
【０３０４】
他の態様
上記説明から、本明細書に記載の発明を変形及び改変して、さまざまな使用及び条件に適合させることができることは明らかである。そのような態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０３０５】
本明細書に記載の全ての出版物は、それぞれ個々の出版物又は特許出願が特に及び個別に援用されると示された場合と同一範囲で本明細書に援用される。加えて、米国特許出願公開番号第２００４−０１２６８２８号及びＰＣＴ公開番号ＷＯ２００４／００８９４６Ａ２は、本明細書にその全体が援用される。
【図面の簡単な説明】
【０３０６】
【図１】図１は、子癇前症におけるｓＦｌｔ−１のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現レベルを表すオートラジオグラムである。図１Ａは、ノーザンブロット解析によって決定した、３人の子癇前症患者（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）及び３人の正常血圧満期妊娠（Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３）の胎盤ｓＦｌｔ−１のｍＲＮＡ発現を示す。長いバンド（７．５ｋｂ）は全長ｆｌｔ−１  ｍＲＮＡであり、短く量の多いバンド（３．４ｋｂ）は選択的にスプライシングされたｓＦｌｔ−１  ｍＲＮＡである。ＧＡＰＤＨは対照として含まれており、矢尻は２８Ｓ  ＲＮＡを示す。患者Ｐ１及びＰ２は重度子癇前症であるが、患者Ｐ３は軽度子癇前症であった。図１Ｂは、軽度子癇前症（軽度ＰＥ）患者、重度子癇前症（重度ＰＥ）患者、及び正常血圧満期妊娠女性（正常）の血清ｓＦｌｔ−１レベルを示すグラフである。ｓＦｌｔ−１レベルは、市販のキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州）を用いてｓＦｌｔ−１について行ったＥＬＩＳＡで測定した。他の理由で早産した患者（早産）を、在胎週数特異的変化を除外するために更なる対照として含めた。試験患者数をＸ軸の括弧に示す。出産前（ｔ＝０）及び出産後４８時間（ｔ＝４８）にサンプルを採取した。図１Ｃは、図１Ｂに記載の患者全てについてＥＬＩＳＡによって決定した出産時（ｔ＝０）の抗血管形成指標比（ＰＡＡＩ＝ｓＦｌｔ−１／（ＶＥＧＦ＋ＰｌＧＦ））比を示すグラフである。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、子癇前症における過剰のｓＦｌｔ−１の抗血管新生作用を示す顕微鏡写真である。４人の正常妊娠対照と４人の子癇前症患者の血清を用いて内皮管腔形成アッセイを行った。１人の正常対照と１人の子癇前症患者の代表的な実験を示す。図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃは、正常患者の血清を用いて行ったアッセイを示し、図２Ｄ、２Ｅ、及び２Ｆは、子癇前症患者の血清を用いて行ったアッセイを示す。図２Ａはｔ＝０（正常満期妊娠女性の１０％血清）；図２Ｂはｔ＝４８（出産後４８時間の正常妊娠女性の１０％血清）；図２Ｃはｔ＝０＋外因性ｓＦｌｔ−１（１０ｎｇ／ｍｌ）；図２Ｄはｔ＝０（出産前の子癇前症女性の１０％血清）；図２Ｅはｔ＝４８（出産後４８時間の子癇前症女性の１０％血清）；及び図２Ｆはｔ＝０＋外因性ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ＰｌＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）。管腔形成アッセイを定量化し、各パネルの下のピクセルに平均管長±ＳＥＭを示す。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦによって誘発された腎微小血管の血管拡張のｓＦｌｔ−１による阻害を示すグラフである。図３Ａは、３つの異なる用量で測定したｓＦｌｔ−１（Ｓ）、ＶＥＧＦ（Ｖ）、ＰｌＧＦ（Ｐ）に対するラット腎細動脈の弛緩反応増加を示す。Ｖ＋及びＰ＋は、１００ｎｇ／ｍｌ  ｓＦｌｔ−１存在下における個々の試薬の血管拡張反応を表す。全ての実験は６つの異なる解離ラット腎微小血管で行なった。データを平均±ＳＥＭで示す。＊は、個々の試薬単独と比較した統計的有意差ｐ＜０．０１を表す。図３Ｂは、生理的用量における弛緩反応の増加を示す：ＶＥＧＦ  １００ｐｇ／ｍｌ（Ｖ）、ＰｌＧＦ  ５００ｐｇ／ｍｌ（Ｐ）、ｓＦｌｔ−１  １０ｎｇ／ｍｌ（Ｓ）、ＶＥＧＦ  １００ｐｇ／ｍｌ＋ＰｌＧＦ  ５００ｐｇ／ｍｌ（Ｖ＋Ｐ）又はＶＥＧＦ  １００ｐｇ／ｍｌ＋ＰｌＧＦ  ５００ｐｇ／ｍｌ＋ｓＦｌｔ−１  １０ｎｇ／ｍｌ（Ｖ＋Ｐ＋Ｓ）。全ての実験は６つの異なる解離ラット腎微小血管で行なった。データを平均±ＳＥＭで示す。＊は、Ｖ＋Ｐと比較した統計的有意差ｐ＜０．０５を表す。
【図４Ａ】図４Ａは、糸球体内皮症のｓＦｌｔ−１誘導を示す画像である。図４Ａは、肥大した糸球体及び腫脹した細胞質を有するｓＦｌｔ−１で処理した動物における毛細血管閉塞のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を、対照を比較して示す顕微鏡写真である。泡状細胞質を有する「糸球体内皮症」をｓＦｌｔ−１で処理した動物において過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色で示す。全ての光学顕微鏡写真はオリジナル倍率６０倍で撮影した。全ての図は同一倍率で再現した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、糸球体内皮症のｓＦｌｔ−１誘導を示す画像である。図４Ｂは、血管内皮細胞の細胞質腫脹を確認するｓＦｌｔ−１で処理した糸球体の電子顕微鏡写真である。フィブリンについての免疫蛍光（ＩＦ）写真はオリジナル倍率４０倍で撮影し、ＥＭ写真は２４００倍で撮影した。全ての図は同一倍率で再現した。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、在胎週数に関して子癇前症発症前後に測定したｓＦｌｔ−１レベルを示すグラフである。図５Ａは、正常血圧対照（細線に白三角）、子癇前症前症例（黒丸）、及び陣痛発生前の在胎週数４〜５週の時期内にある子癇前症後症例−「終点」標本−（黒四角）に関する平均血清濃度をｐｇ／ｍｌで示すグラフである。括弧は平均の標準誤差を示す。アスタリスクは、対数変換後の、同一在胎週数時期内にある対照標本に対する有意差を示す：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図５Ｂは、子癇前症前の週区間内にある子癇前症発症前後の症例についてｓＦｌｔｌの平均血清濃度をｐｇ／ｍｌで示すグラフである。ＰＥは４３の終点標本（子癇前症発症時又は発症後に得た）の相加平均を示す。平均在胎週数（日）を各時間間隔の下の括弧内に示す。横線は終点標本のレベルを示す。縦線は子癇前症前≦５週の期間を区別している。図５Ｃは、正常血圧対照及び子癇前症発症５週以内に得た標本を除外した後の子癇前症前症例について、在胎週数時期に関してｓＦｌｔ−１平均血清濃度をｐｇ／ｍｌで示すグラフである。有意差はない。
【図６】図６Ａ〜６Ｃは、在胎週数に関して子癇前症前後のＰｌＧＦレベルを示すグラフである。図６Ａは、陣痛及び出産前の全ての標本のＰｌＧＦレベルを示すグラフである。括弧は平均の標準誤差を示す。アスタリスクは、対数変換後の、同一区間内にある対照標本に対する有意差を示す：＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図６Ｂは、子癇前症前の週区間内にある子癇前症発症前後の症例についてＰｌＧＦ平均血清濃度をｐｇ／ｍｌで示すグラフである。ＰＥは、４３の終点標本（子癇前症発症時及び発症後に得た）の相加平均を示す。平均在胎週数（日）を各時間区間の下の括弧内に示す。横線は終点標本のレベルを示す。縦線は子癇前症前≦５週の期間を区別している。図６Ｃは、正常血圧対照及び子癇前症発症例について、在胎週数期間に関し、ＰｌＧＦ平均血清濃度をｐｇ／ｍｌで示すグラフである。
【図７】図７Ａ及び７Ｂは、子癇前症状態及び重篤度に関し、ｓＦｌｔ−１及びＰｌＧＦのレベルを示すグラフである。図７Ａは、対照、並びに軽度子癇前症、重度子癇前症、＜３７週に発症した子癇前症、在胎週数に比して小さい（ＳＧＡ）乳児を有する子癇前症、及び＜３４週に発症した子癇前症の症例（臨床疾患発症前）における妊娠２３〜３２週のｓＦｌｔ−１（黒棒）及びＰｌＧＦ（白棒）の相加平均血清濃度を示すグラフである。それぞれのカラム対の下に標本数が記録されている。在胎週数及び肥満度指数に対する調整によりわずかに変化を生じたが有意差のレベルに影響はなかった。図７Ｂは、対照、並びに軽度子癇前症、重度子癇前症、＜３７週に発症した子癇前症、及びＳＧＡ乳児を有する子癇前症の症例（臨床疾患発症前）における妊娠３３〜４１週のｓＦｌｔ−１（黒棒）及びＰｌＧＦ（白棒）の相加平均血清濃度を示すグラフである。それぞれのカラム対の下に標本数が記録されている。在胎週数及び肥満度指数に対する調整によりわずかに変化を生じた。
【図８】図８は、正常及び子癇前症患者から単離したＰＢＭＣ中のｆｌｔ、ｓＦｌｔ−１、及び関連変異体又は断片の発現を示すオートラジオグラムである。タンパク質溶解物をＦｌｔ−１タンパク質のＮ端を認識する抗体を用いたウエスタンブロットにより解析した。
【図９Ａ】図９は、在胎週数の区間に関して尿ＰｌＧＦ濃度を示すグラフである。図９Ａは、在胎週数に関し、臨床子癇前症発症前後の平均ＰｌＧＦ濃度を示すグラフである。Ｉ棒は標準誤差を表す。
【図９Ｂ】図９は、在胎週数の区間に関して尿ＰｌＧＦ濃度を示すグラフである。図９Ｂは、臨床子癇前症発症前後の平均ＰｌＧＦをｐｇ／ｍｇクレアチニンで示すグラフである。Ｉ棒は標準誤差を表す。
【図９Ｃ】図９は、在胎週数の区間に関して尿ＰｌＧＦ濃度を示すグラフである。図９Ｃは、最初のモニタリング尿標本のみを用いた臨床子癇前症発症前後の平均ＰｌＧＦ濃度を示すグラフである。Ｉ棒は標準誤差を表す。
【図９Ｄ】図９は、在胎週数の区間に関して尿ＰｌＧＦ濃度を示すグラフである。図９Ｄは、無作為尿標本のみを用いた臨床子癇前症発症前後の平均ＰｌＧＦ濃度を示すグラフである。Ｉ棒は標準誤差を表す。
【図１０】図１０は、子癇前症状態及び重篤度に関し、クレアチニンに対して標準化前後のＰｌＧＦ平均濃度を示すグラフである。対照、及び軽度子癇前症、重度子癇前症、妊娠３７週より前に発症した子癇前症、子癇前症と在胎週数に比して小さい（ＳＧＡ）乳児、又は妊娠３４週より前に発症した子癇前症を有するかどうかによって後に臨床子癇前症（ＰＥ）を発症した女性における妊娠２１〜３２週のＰｌＧＦ濃度及びｐｇ／ｍｇクレアチニンを示す。子癇前症を発症した女性の標本は臨床疾患発症前に得た。提示したＰ値は対照標本との比較によるものである。Ｉ棒はＳＥを表す。
【図１１】図１１は、個々の女性の胎盤成長因子濃度の経時プロットを在胎週数に関して示すグラフである。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、２１〜３２週における尿ＰｌＧＦ濃度及び血清中のＰｌＧＦに対するｓＦｌｔ−１の比の散布図を妊娠期間に関して示すグラフである。値は、妊娠３７週より前の子癇前症発症前の２０人の女性及び６９人の正常血圧対照からの尿及び血清の対標本から得た。図１２Ａは尿ＰｌＧＦ濃度を示す。図１２Ｂは血清のＰｌＧＦに対するｓＦｌｔ−ｌの比を示す。
【図１３】図１３は、在胎週数に比して小さい（ＳＧＡ）乳児でない乳児を有する正常血圧女性、ＳＧＡ乳児を有する正常血圧女性、妊娠性高血圧女性、及び妊娠３７週より前に子癇前症を発症した女性における胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）の平均尿濃度を示すグラフである。乳児が在胎週数に比して小さくない正常血圧女性（ＮＴ−ＳＧＡ）、ＳＧＡ乳児を有する正常血圧女性（ＮＴ＋ＳＧＡ）、その後に妊娠性高血圧（ＧＨ）を発症した女性、その後の妊娠３７週より前に子癇前症を発症した女性（ＰＥ＜３７週）における妊娠２１〜３２週の尿ＰｌＧＦ濃度をｐｇ／ｍｌ及びｐｇ／ｍｇクレアチニンで示す。妊娠性高血圧又は子癇前症を発症した女性の標本は臨床疾患発症前に得た。標本採取時の平均在胎週数は全ての群で同様である。Ｎは標本数を示す。提示したＰ値は対照（ＮＴ−ＳＧＡ）標本との比較によるものである。Ｉ棒はＳＥを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
2007522457.tif 000027
2007522457.tif 000028
2007522457.tif 000029