(57)【要約】本発明は、複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマー配列を増幅するための組成物および方法を提供する。本発明の特有の組成物は、DNA合成のための2種類のプライマーの混合物から構成されるプライマーセットを含む。片方の方向への伸長には、プライマーは全て、DNAポリメラーゼによってコピーされうるテンプレートとなる能力を破壊する修飾を含む。反対方向への伸長のために、このセットは、全長に渡ってDNAポリメラーゼによって複製される、テンプレートとなりうる少なくとも1つのプライマーを含む。本方法は、増幅反応混合物中で関心対象の核酸ポリマー配列をDNA合成プライマーのセットと混合することによって実施されうる。次いで、反応混合物をPCR反応の温度サイクリングと類似の温度サイクリングに供する。プライマーセットの少なくとも1つのプライマーが核酸ポリマーにハイブリダイズする。複製不能プライマーが核酸ポリマーにハイブリダイズして伸長し、複製可能プライマーが次にハイブリダイズする核酸ポリマー由来の配列を含む伸長産物を産生することが好ましい。もちろん、核酸ポリマーが二本鎖であれば、複製可能および複製不能プライマーの両方がハイブリダイズし、DNAポリメラーゼにより伸長される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーからヌクレオチド配列を増幅するための方法：
複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーを、
（i）核酸ポリマーにハイブリダイズする複製不能（non-replicable）プライマーであって、少なくとも4つの隣接2'-O-アルキルリボースを含む複製不能プライマー、および
（ii）複製不能プライマーからの核酸ポリマーの複製によって生じたプライマー伸長産物にハイブリダイズする複製可能プライマー、
を含むプライマーセットと接触させる工程であって、この工程は、核酸ポリマーをテンプレートとし、複製不能プライマーをプライマーとして用いて、複製可能プライマーにハイブリダイズすることができるプライマー伸長産物が生産される条件下で行われ、ここでプライマー伸長産物は、核酸ポリマーまたはその相補鎖のヌクレオチド配列の一部を含む、工程。
【請求項２】
プライマー伸長産物をその核酸ポリマーテンプレートから分離し、得られる混合物を、プライマー伸長産物が生産される条件下、プライマーセットで処理する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
プライマー伸長産物をその核酸ポリマーテンプレートから分離するステップを約20〜約60回繰り返す工程、および得られる混合物を、プライマー伸長産物が生産される条件下、プライマーセットで処理する工程をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
複製不能プライマーからの伸長産物が約10以上の増幅不能度数（sterilization number）を有する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
複製不能プライマーからの伸長産物が約100以上の増幅不能度数を有する、請求項2記載の方法。
【請求項６】
複製不能プライマーからの伸長産物が約1000以上の増幅不能度数を有する、請求項2記載の方法。
【請求項７】
複製不能プライマーからの伸長産物が約10,000以上の増幅不能度数を有する、請求項2記載の方法。
【請求項８】
プライマー伸長産物が複製不能プライマーおよび複製可能プライマーの両方によって生産されるように、核酸ポリマーが二本鎖領域を含む、請求項2記載の方法。
【請求項９】
核酸ポリマーが一本鎖領域を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
プライマーセットが、ポリマー核酸にハイブリダイズする第2の複製不能プライマーをさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
プライマーセットが、ポリマー核酸にハイブリダイズする第3の複製不能プライマーをさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
プライマーセットが、ポリマー核酸にハイブリダイズする1〜5個の複製不能プライマーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
約102コピー以上の産物が生産される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
約104コピー以上の産物が生産される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
約105コピー以上の産物が生産される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
約106コピー以上の産物が生産される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
約107コピー以上の産物が生産される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
2'-O-アルキルリボースが2'-O-メチルリボースである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
複製不能プライマーが少なくとも6個の隣接2'-O-アルキルリボースを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
2'-O-アルキルリボースが2'-O-メチルリボースである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
各プライマーが約0.6μM〜約5μMの濃度で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
プライマー濃度が約2μMである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
マグネシウムが約3mM〜約6mMの濃度で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
マグネシウムが約5mMの濃度で存在する、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
検出するために複製可能プライマーが標識される、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
複雑性の高い核酸サンプルがゲノムDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
以下の工程を含む、ゲノムDNAサンプル中のゲノム核酸ポリマーからヌクレオチド配列を増幅するための方法：
ゲノムDNAサンプル中のゲノム核酸ポリマーを、
（i）ゲノム核酸ポリマーにハイブリダイズする複製不能プライマーであって、6個の隣接2'-O-メチルリボースを含む複製不能プライマー、および
（ii）複製不能プライマーからの核酸ポリマーの複製によって生じたプライマー伸長産物にハイブリダイズする複製可能プライマー、
を含むプライマーセットと接触させる工程であって、プライマーセットの各プライマーが約2μMの濃度で存在し、マグネシウムが約5mMの濃度で存在し、この工程は、ゲノム核酸ポリマーをテンプレートとし、複製不能プライマーをプライマーとして用いて、複製可能プライマーにハイブリダイズすることができるプライマー伸長産物が生産される条件下で行われ、ここでプライマー伸長産物は、ゲノム核酸ポリマーまたはその相補鎖の配列の一部を含む、工程。
【請求項２８】
（i）ポリマー核酸にハイブリダイズする複製不能プライマーであって、少なくとも4個の隣接2'-O-アルキルリボースを含む複製不能プライマー、および
（ii）複製不能プライマーからの核酸の複製によって生じるプライマー伸長産物にハイブリダイズする複製可能プライマー
を含むプライマーセットを含む、複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーを増幅するためのキット。
【請求項２９】
1〜5個の複製不能プライマーを用いてゲノムDNAを増幅するための指示書をさらに含む、請求項28記載のキット。
【請求項３０】
約1,000以上の増幅不能度数を有する約106以上のアンプリコンを生産するための指示書をさらに含む、請求項28記載のキット。
【請求項３１】
指示書が約3mM〜約6mMのマグネシウムを増幅反応に含むようさらに示す、請求項30記載のキット。
【請求項３２】
指示書が各プライマーを約0.6μM〜約5μMの濃度で用いるようさらに示す、請求項30記載のキット。
【請求項３３】
複製可能プライマーが標識される、請求項28記載のキット。
【請求項３４】
2'-O-アルキルリボースが2'-O-メチルリボースである、請求項28記載のキット。
【請求項３５】
複製不能プライマーが少なくとも6個の隣接2'-O-アルキルリボースを含む、請求項28記載のキット。
【請求項３６】
2'-O-アルキルリボースが2'-O-メチルリボースである、請求項35記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸の複製および増幅の分野に関する。より具体的には、本発明は、熱安定性DNAポリメラーゼ、ならびに複製可能および複製不能（non-replicable）プライマーを含むプライマーセットを使用して、核酸を増幅するための方法および組成物に関する。
【０００２】
本願は、全体が参照により本明細書に組み入れられる2003年8月1提出の米国仮特許出願第60/492,120号に対する優先権を35 U.S.C. §119（e）の下に主張する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法は、特定の核酸ポリマー配列を増幅するために一般的に使用されている。その手順にはいくつかの連続的なステップが含まれ、DNAの一本鎖への変性、オリゴヌクレオチドプライマーのテンプレートDNA配列へのアニーリング、およびDNAポリメラーゼによるプライマーの伸長が含まれる（Mullis, K. B. et al., U.S. Pat. Nos. 4,683,202, 4,683,195; Mullis, K. B., EP201,184; Erlich, H., EP50,424, EP84,796, EP258,017, EP237,362; Erlich, H., U.S. Pat. No. 4,582,788; Saiki, R. et al., U.S. Pat. No. 4,683,202; Mullis, K. B. et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263 (1986); Saiki, R. et al. Science 230:1350 (1985); Saiki, R. et al. Science 231:487 (1988); Loh, E. Y. et al. Science 243:217 (1988)）。
【０００４】
オリジナルの鎖および前サイクルの伸長反応で生産された鎖を含む反応中の各合成DNA鎖が、アニーリングしたプライマーを複製の次のラウンドにおいて伸長させるテンプレートとして利用可能であることから、理論的には、プライマー結合部位の数はPCR複製の各ラウンドで二倍になる。本方法のこの局面は、十分豊富なオリゴヌクレオチドプライマー分子と組み合わせて、複製の連続的なラウンドで合成DNAを数理上指数関数的に蓄積させる。PCRにおけるこれらのステップを何回も繰り返し、オリゴヌクレオチドプライマーに挟まれた元の標的配列を大量に（増幅）提供することが可能である。たった1コピーのDNA配列でも、数百ナノグラム（ng）の産物へと増幅することができる（Li, H. et al. Nature 335:414 (1988)）。PCRは、非常に有力で確実であることから、また合成オリゴヌクレオチドプライマー、熱安定性DNAポリメラーゼ、および自動温度サイクリング機器が容易に利用可能であることから、分子生物学的研究において現在広く利用されているツールである。
【０００５】
PCRプロセスは、ある増幅反応混合物から後続の反応混合物へと、意図せずDNAが移されて起こるコンタミネーションに非常に影響を受けやすい。両PCRプライマー結合部位に渡るたった1つの全長核酸ポリマーが移ってしまっただけでも、後続の反応で偽陽性結果をもたらすのに十分となりうる。増幅産物の量が多い場合があるため、この問題を回避するためには非常に注意を払わなければならない（Kwok, S. and Higuchi, R. Nature 339:237 (1989)）。キャリーオーバーコンタミネーションを回避するための現在知られている手順では、PCRアッセイの実行が技術的に難しくなり、アッセイの費用が著しく増加する。
【０００６】
キャリーオーバーコンタミネーションのリスクを減らす技術が開発されている。結合直線的増幅（linked linear amplification）（「LLA」とも呼ばれる）として知られるこの技術は、複製欠陥、複製不能、またはブロックされている、あるいはそうなるように修飾された増幅プライマーを利用する。1,3-プロパンジオールなどの内部ブロッキング基を持つプライマーは、プライマー伸長を支えてアンプリコンを生じることができるが、これらのアンプリコンは後続の複製ラウンドにおいて、ブロッキング基の近傍で終結し、そのためプライマー結合に十分でないプライマー結合部位の一部のみを含むアンプリコンを生じる。例えば、米国特許第6,335,184号および第6,027,923号を参照されたい。また、Reyes et al. Clinical Chemistry 47:1 31-40 (2001); Wu et al. Genomics 4:560-569 (1989)も参照されたい。
【０００７】
LLAにおいてプライマー伸長産物から生じたアンプリコンは、後続のプライマー結合のテンプレートとなることができず伸長できないため、このDNAは後続のLLA増幅反応に干渉しない。LLAは理論的にはクロスコンタミネーションの問題を回避できるかもしれないが、適切なレベルの増幅産物を得るためには、尋常でない数の反応サイクルおよび/またはプライマーを必要とする。例えば、米国特許第6,335,184号には、500,500産物の収量を生じるためには1,000サイクルが必要であろうことが開示されている（対してPCRでは30サイクルである）。反応サイクルの数は、増幅反応に多数のLLAプライマーを含ませることによってある程度減らすことができる。しかしReyesらは、PCRに匹敵する増幅量を達成するためには14〜18種類のプライマーが必要であろうと示唆している（Clinical Chemistry 47:31-40 (2001)）。このような多数のプライマーを設計し合成するには時間も費用もかかるし、ほとんどの場合は利用可能なプライマー結合部位の数が不十分で、このような多数のプライマーの使用は増幅反応を害する可能性があり単純に不可能であるので、明らかにこれはキャリーオーバーコンタミネーション問題に対する現実的な解決策ではない。
【０００８】
長らく認識されているPCR産物のコンタミネーションの問題を回避するため、いくつか他のアプローチが開発されている。これらのアプローチには、化学的コンタミネーション除去、閉鎖システムの利用、紫外線照射したワークステーションの使用（Pao et al., Mol. Cell Probes 7:217-9 (1993)）、切断可能プライマー（Walder et al., Nucleic Acids Research 21:4, 229-43 (1993)）、または酵素的分解法（Longo et al., Gene 93:125-8 (1990)）が含まれる。これらの方法はいずれも完全に効果的なものではなく、さらなるプロセッシングステップを含み、増幅方法が複雑である。
【０００９】
このように、キャリーオーバーコンタミネーションに付随する問題を最小限に抑え、過剰な数の増幅プライマーを使用せずに適切なレベルの増幅を提供する、核酸を日常的に増幅するための新たな組成物および方法が必要である。このような組成物は理想的には、診断法に直接使用される一本鎖核酸産物を提供する方法に使用できる。
【００１０】
このような組成物および方法の例としては、それぞれ全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第10/377,168号（「Polynomial Amplification of Nucleic Acids」、2003年2月28日提出）および国際出願第PCT/US2003/006293号（WO03074724; 2003年9月12日公開）に記載されている。これら出願に記載の組成物および方法は、核酸増幅に付随する上記問題の多くを解決するが、これら組成物および方法は、ゲノムDNAなどの複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーからヌクレオチド配列を増幅するよう、本明細書に記載するさらなる研究によって改善される。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、核酸ポリマー配列を増幅するための組成物および方法を提供する。本発明の特有の組成物は、DNA合成のための2種類のプライマーの混合物から構成されるプライマーセットを含む。片方の方向への伸長には、プライマーは全て、DNAポリメラーゼによってコピーされうるテンプレートとなる能力を破壊する修飾を含む。反対方向への伸長のために、このセットは、全長に渡ってDNAポリメラーゼによって複製される、テンプレートとなりうる少なくとも1つのプライマーを含む。本方法は、増幅反応混合物中で関心対象の核酸ポリマー配列をDNA合成プライマーのセットと混合することによって実施できる。次いで、反応混合物をPCR反応の温度サイクリングと類似の温度サイクリングに供する。プライマーセットの少なくとも1つのプライマーが核酸ポリマーにハイブリダイズする。複製不能プライマーが核酸ポリマーにハイブリダイズして伸長し、複製可能プライマーが次にハイブリダイズする核酸ポリマー由来の配列を含む伸長産物を生じることが好ましい。もちろん、核酸ポリマーが二本鎖であれば、複製可能および複製不能プライマーの両方がハイブリダイズして、DNAポリメラーゼにより伸長される。
【００１２】
この方法の1つの利点は、後続の反応において同じプライマーセットで効率的に増幅できない伸長産物を効率的に生じることである。この方法の別の利点は、かなりの量の一本鎖DNAを生じることである。この一本鎖DNAは複製可能プライマーの伸長産物である。この方法は理想的には、ゲノムおよび他の複雑性の高いDNAサンプルに見られるDNAの増幅に適する。
【００１３】
本発明は、以下の工程を含む、複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーからヌクレオチド配列を増幅するための方法を提供する：複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーを、（i）核酸ポリマーにハイブリダイズする複製不能プライマーであって、少なくとも4つの隣接2'-O-アルキルリボースを含む複製不能プライマー、および（ii）複製不能プライマーからの核酸ポリマーの複製によって生じたプライマー伸長産物にハイブリダイズする複製可能プライマー、を含むプライマーセットと接触させる工程であって、この工程は、核酸ポリマーをテンプレートとし、複製不能プライマーをプライマーとして用いて、複製可能プライマーにハイブリダイズすることができるプライマー伸長産物が生産される条件下で行われ、ここでプライマー伸長産物は、核酸ポリマーまたはその相補鎖のヌクレオチド配列の一部を含む、工程。
【００１４】
本発明はまた、以下のものを含むプライマーセットを含む、複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーを増幅するためのキットを提供する：（i）ポリマー核酸にハイブリダイズする複製不能プライマーであって、少なくとも4つの隣接2'-O-アルキルリボースを含む複製不能プライマー、および（ii）複製不能プライマーからの核酸の複製によって生じたプライマー伸長産物にハイブリダイズする複製可能プライマー。
【００１５】
好ましい態様においては、プライマー伸長産物を核酸ポリマーテンプレートから分離し、得られる混合物を、プライマー伸長産物が生産される条件下でプライマーセットで処理する。さらなる態様において、プライマー伸長産物を核酸ポリマーテンプレートから分離するステップを約20〜約60回繰り返し、得られる混合物を、プライマー伸長産物が生産される条件下でプライマーセットで処理する。本発明の方法およびキットの複製不能プライマーからの伸長産物は、増幅不能度数約10以上、または好ましくは約100以上、またはより好ましくは約1000以上、およびさらにより好ましくは約10,000以上を有する。
【００１６】
本発明の方法およびキットにおいて使用される核酸ポリマーは、プライマー伸長産物が複製不能プライマーおよび複製可能プライマーの両方によって生産されるように二本鎖領域を含みうる。加えて、または代替的に、本発明の方法およびキットは、例えば、一本鎖領域を含む核酸ポリマーからヌクレオチド配列を増幅するために使用することができる。好ましい態様において、本発明の方法およびキットの複雑性の高い核酸サンプルはゲノムDNAである。
【００１７】
本発明の方法に使用され、本発明のキットに提供されるプライマーセットは、ポリマー核酸にハイブリダイズする第2の、第3の、または好ましくは1〜5個の複製不能プライマーをさらに含みうる。
【００１８】
本発明の方法およびキットは、約102コピー以上の産物、または好ましくは約104コピー以上の産物、またはより好ましくは約105コピー以上の産物、またはさらにより好ましくは約106コピー以上の産物、またはもっとも好ましくは約107コピー以上の産物を生産する。
【００１９】
本発明の1つの態様において、複製不能プライマーは、少なくとも6個の2'-O-アルキルリボースを有する。本発明の好ましい態様において、複製不能プライマーの2'-O-アルキルリボースは2'-O-メチルリボースであり、本発明の特に有利な態様においては、複製不能プライマーは少なくとも6個の隣接2'-O-メチルリボースを含む。本発明のさらなる態様においては、複製可能プライマーは検出するために標識されている。
【００２０】
本発明のさらなる態様において、各プライマーは濃度約0.6μM〜約5μMで存在し、好ましくは濃度は約2μMである。本発明のさらに別の態様では、増幅反応物中、マグネシウムが濃度約3mM〜約6mM、または好ましくは濃度約5mMで存在する。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明は、複雑性の高い核酸サンプル中のポリマーヌクレオチド配列を増幅するための新規な方法を提供する。この方法は、増幅反応混合物中で関心対象の核酸ポリマーをDNA合成プライマーの独特なセットと混合することによって実施できる。そして、増幅反応混合物をPCR反応の温度サイクリングと類似の温度サイクリングに供する。本方法は、片方の方向に伸長されるDNA合成プライマーが全て、複製のテンプレートとなるのを妨げる修飾を含むという点で独特である。そのため、これらプライマーから生じたアンプリコンが後続の伸長反応で複製される際、産物はオリジナルの鎖の複製を開始させるプライマーに対する結合部位を含まない。本発明の目的に関して、これらのプライマーを複製不能プライマーと呼ぶ。対向方向のDNA合成プライマーは、任意のPCRプライマーと同様に複製可能である。このような複製可能プライマーと複製不能プライマーの組み合わせを使用することにより、本増幅方法によってLLAよりも多くのアンプリコンが生産される。実際、記載の方法を使用して、多項式増幅（polynomial amplification）収量がPCRで得られる収量に近づきうる。
【００２２】
本増幅方法は、独特なプライマーセットを用いて実施される。上記のように、このプライマーセットは2種類のDNA合成プライマーを含む。一方のプライマーは複製可能であり、他方は複製不能である。複製可能プライマーには、反応混合物中の核酸ポリマーにハイブリダイズし、伸長反応においてDNAポリメラーゼによる核酸ポリマー鎖の伸長を開始し、その全長に渡って相補鎖伸長のテンプレートとなるオリゴヌクレオチドが含まれる。複製可能プライマーには化学的修飾を持たないオリゴヌクレオチドが含まれ、当技術分野で周知のPCRプライマーが含まれる。
【００２３】
複製不能プライマーには、反応混合物中の核酸ポリマーにハイブリダイズでき、伸長反応においてDNAポリメラーゼによる核酸ポリマー鎖の伸長を開始するが、その全長に渡ってテンプレートとなることができないオリゴヌクレオチドが含まれる。より具体的には、複製不能プライマーには、複製不能プライマーをテンプレートとして伸長反応を触媒するポリメラーゼによってコピーできないように修飾された構造を持つオリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。そのため、複製不能プライマーは、複製不能プライマーを含む鎖自身がテンプレートとなる際に、ポリメラーゼが同じ複製不能プライマーのための新たな結合部位を含む鎖を生じるのを妨げる傾向を持つ。
【００２４】
好ましくは、複製不能プライマーがDNA合成のテンプレートとなる場合、伸長している核酸ポリマーは修飾部位の近接部の決められた位置で正確に終結し、アンプリコン集団の3'末端は同じ3'末端ヌクレオチドを有する。場合によっては、修飾後さらに残基を付加することができ、元の複製不能プライマー結合部位が再生されない限り、本方法の有用性に干渉しない。さらに、様々な終結点を持つアンプリコンが合成された場合、アンプリコンの大部分が均一な位置で終結している限り、本方法の有用性ははっきり分かるほど影響されない。
【００２５】
複製不能プライマーが十分な増幅を提供する限り、任意の数の複製不能プライマーをプライマーセットに含めることができる。例えば、一部の方法では、1〜10個の複製不能プライマーをプライマーセットに含めることができる。本方法における収量を改善するためには、2個以上の複製不能プライマーが好ましい。少なくとも3個の複製不能プライマーを含むプライマーセットがより好ましく、4個の複製不能プライマーがさらにより好ましい。4個および5個の複製不能プライマーにより、多項式増幅反応において実質的な増幅が観察されている。例えば、プライマーセット中の複製不能プライマーは全て同じテンプレート鎖に結合し、同じ方向に伸長する。また、少なくとも1つの複製可能プライマーがプライマーセットに含まれる。この複製可能プライマーは、複製不能プライマーとは反対の鎖に結合する。
【００２６】
用語「ネステッド」は、プライマーを説明するために使用される場合、核酸ハイブリダイゼーション分野における通常の意味を持つ。具体的には、「ネステッドプライマー」は、最も離れたプライマー対の位置に挟まれた、関心対象のヌクレオチド配列に隣接する核酸上の位置にハイブリダイズすることができる（すなわち、複製不能プライマー、および最も離れた相補核酸鎖上の複製可能プライマーのハイブリダイゼーションの位置）。
【００２７】
数多くのオリゴヌクレオチド修飾が知られており、複製不能プライマーの作成に使用することができる。当業者は、例えば下記実施例4のように、1つ以上の修飾をプライマーに組み込んで増幅反応を実施し、アンプリコンの収量を評価することによって適切な修飾を同定することができる。これらの実験において、有用な修飾は、同じプライマー結合部位に結合する未修飾プライマーの場合よりもアンプリコンの収量を少なくする。または、プライマー伸長反応に使用する合成テンプレートおよびプライマーに直接修飾を組み込んで、修飾残基を越えた伸長が任意の測定可能な程度まで起こるかどうかを決定することができる。このアプローチはサイクリング反応フォーマットで実施できる。
【００２８】
これらのアプローチを用いて、いくつかの適切な修飾が同定されている。適切な修飾には、塩基部位、糖部位、およびリン酸の修飾が含まれる。これらの修飾は互いに排他的ではない。例えば、1,3-プロパンジオール（1,3-propandiol）は糖および塩基部位の両方を欠く。
【００２９】
塩基部位の適切な修飾としては、塩基の完全な不在（脱塩基残基）、イソシチジン、イソグアニジンなどの修飾塩基の組み込み、および通常は普通の塩基部位の、ニトロインドールなどの基による直接的修飾が挙げられる。
【００３０】
糖部位に対する適切な修飾としては、2'-ヒロキシル（hyroxyl）基のアルキル化、3炭素スペーサー基による置換、および2'-デオキシリボースの1,4-アンヒドロ-2-デオキシ-D-リビトールによる置換（d-spacer CE phosphoramidite; Glen Research, Sterling, VA）、2'-デオキシリボフラノシル（deoxyribofuranosyl）ナフタレン基の組み込みが挙げられる。適切な3炭素スペーサーとしては、プロパン、プロパノール、および1,3-プロパンジオールが挙げられる。これらのうち1,3-プロパンジオールが好ましく、特記されていない限り、本明細書の目的に関してC3スペーサーとして理解される。
【００３１】
適切なリン酸修飾としては、例えば、ホスホラミデート（phosphoramidate）、ホスホトリエステル（phosphotriester）、メチルホスホネートが挙げられる。
【００３２】
これらまたは他の修飾のいずれも本発明に用いることができるが、リボースの2-ヒドロキシ基のアルキル化がよりよい結果を与えることが見出されている。C1-C6直鎖または分枝鎖アルキル基を含む任意の適切なアルキル基によってアルキル化することができる。任意のアルキル化を用いることができるが、2'-O-メチル基が好ましいことがさらに見出されている。
【００３３】
適切なホスホラミダイト（phosphoramidite）前駆体を用い、当技術分野において公知の方法によって、化学的合成中に上記各オリゴヌクレオチド修飾をオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。例えば、1,3-プロパンジオールの残基を含むプライマーは、Seela et al., Nuc. Acids Res. 15, 3113-3129 (1987)に記載の方法に従って、例えばGlen Research（Sterling, VA）およびPierce（Milwaukee, WI）製の市販の出発材料から合成できる。1,4-アンヒドロ-2-デオキシ-D-リビトールの残基を含むプライマー（脱塩基部位のモデル）は、Eritja et al., Nucleosides & Nucleotides 6, 803-814 (1987)に記載の方法に従って合成できる。公開欧州特許出願第416,817A2号には、複製不能エレメントとして、プライマー配列とポリヌクレオチドテイルの間に1個以上の2'デオキシリボフラノシルナフタレン部位を含むプライマーの合成が記載されている。リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの誘導体などの、テンプレートのポリメラーゼ依存性増幅を停止させる他のエレメントを含むオリゴヌクレオチドプライマーの合成は、当業者には明らかであろう。
【００３４】
別の種類の複製不能プライマーは、プライマーがプライマー伸長産物に組み込まれた後に、およびその伸長産物がテンプレートとして用いられる際に完全にコピーされる前に、切断を提供する切断可能エレメントを組み込んでいる。適切な切断可能エレメントは、伸長産物の残りまたはそれがアニールするテンプレートを損傷しない条件下で切断可能である。このような切断事象は、元のプライマー結合部位を含まない短縮アンプリコンを生じる。1つの例示的な切断可能エレメントは、プライマーに、好ましくは3'末端に、組み込まれた1個以上のリボヌクレオチドである。このようなプライマーが標的DNAにアニールして伸長反応が開始されると、リボヌクレオチドを認識するリボヌクレアーゼがリボヌクレオチドの当該部位を切断し、アンプリコンの5'端に向かうアンプリコンの一部を除去することができる。
【００３５】
意図する位置にプライマーが選択的にハイブリダイズでき、伸長反応をブロックするのに十分な数である限り、任意の数の修飾をオリゴヌクレオチドプライマーに含めることができる。伸長がブロックされ、オリゴヌクレオチドが伸長反応を開始できる限り、2、3、4、5、および6個以上の修飾が存在してよい。オリゴヌクレオチドに複数の修飾が存在する場合、これらは同じであっても異なっていてもよい。相補鎖合成の際にプライマー結合部位の再生を妨げるのに十分である限り、修飾はオリゴヌクレオチド中の任意の位置であってもよい。好ましい修飾である2'-O-メチル-リボースである場合、少なくとも4個、および好ましくは6個または少なくとも6個の隣接修飾がオリゴヌクレオチドプライマーに存在していることが好ましい。
【００３６】
その修飾を通ってそれ以上認識可能な伸長をさせずに伸長反応をブロックする修飾の具体例としては、2個の隣接C3スペーサー、2個の隣接d-スペーサー、2個の隣接ニトロインドール修飾オリゴヌクレオチド、および6個の隣接2'-O-メチル修飾が挙げられる。1個のC3スペーサー、d-スペーサー、およびニトロインドール修飾を含むオリゴヌクレオチドは伸長反応を十分にブロックしなかった。
【００３７】
本発明のプライマーが結合できる核酸ポリマーはいずれも、本明細書に記載の方法による増幅のためのDNAポリメラーゼのテンプレートとなりうるが、記載の方法および組成物の利点は、複雑性の高い核酸サンプル中の核酸ポリマーに利用された場合に最もよく実現されることが見出されている。複雑性の高い核酸サンプルとは、サンプル中に異なる核酸ポリマーが多数存在するものである。複雑性の高い核酸サンプルの例としては、ゲノムDNA、および複雑性の高いRNAサンプルから作られたcDNAライブラリーが挙げられる。他の適切な核酸ポリマーとしては、そのような配列のコピーを含む増幅ポリマー配列；プラスミドDNAなどのクローニングされたDNA；クローニングされたDNAのセグメント；およびRNAの逆転写から得られたDNAが挙げられる。適切な核酸ポリマーには一本鎖および二本鎖ポリマーが含まれる。
【００３８】
本方法は、ゲノムDNA調製物などの複雑な混合物からの配列増幅に特によく適する。しかし、上記のように、DNAポリメラーゼの酵素活性および増幅を著しく干渉しない限り、核酸ポリマー配列が見いだされる任意の混合物を本方法に用いることができる。
【００３９】
増幅を最適化するために、場合によっては核酸ポリマー混合物を修飾することが必要となることがある。例えば、増幅反応を干渉する溶質を核酸ポリマー混合物が含む場合、脱塩またはイオン交換手順を通じてこれら溶質を除去または置換することが必要なことがある。また、反応を最適化するために、プロテアーゼインヒビター、キレーター、およびバッファーをポリマー混合物または増幅反応に加えることが必要なことがある。このような修飾の必要性を認識すること、および適切な修飾を実施することは、十分に当業者の技量の範囲内である。
【００４０】
本方法は、所望の核酸ポリマーをプライマーセットと接触させる工程を含む。プライマーを核酸ポリマーにアニールさせ、核酸ポリマーを1つ以上のプライマーの伸長のためのテンプレートとする、2つの成分を接触させる任意の方法が適している。このステップは、一方の成分を含む溶液を、他方を含む溶液に加えることによって簡単に達成できる。または、一方の成分を含む溶液を乾燥した状態の他方の成分に加えて、乾燥成分を溶液に溶解させてもよく、または成分は共に乾燥させて、第3の溶液に再溶解させることもできる。
【００４１】
相補部位を十分に含む場合に、本発明のプライマーセットは核酸ポリマーにハイブリダイズすることができる。プライマーは、適切な温度および溶液イオン強度条件下で核酸ポリマー分子にアニールする場合、その核酸ポリマー分子（cDNA、ゲノムDNA、またはRNAなど）にハイブリダイズすると言う。ハイブリダイゼーションには、適切な条件（ストリンジェンシー）下で互いに結合する相補配列を十分に含む2個の核酸（例えば、プライマーおよび核酸ポリマー）が必要である。温度、イオン強度、およびpH条件がハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野において周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。2つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、これら配列を有する核酸のハイブリッドの安定性は大きくなる。安定性の1つの目安は、オリゴヌクレオチドの融解温度（Tm）である。融解温度は一般的に、二重鎖核酸が一本鎖核酸に解離する温度として認識されている。短いプライマーは一般的に、低い融解温度でのみ結合部位にアニールする。本発明の目的には、プライマーは完全に相補的な配列を結合部位に含む必要はないが、ハイブリダイゼーションまたはアニーリングが起きる程度に十分に相補的でなくてはならない。
【００４２】
プライマーは、核酸ポリマーにハイブリダイズした後、本発明の多項式増幅法における重合触媒の基質として機能しうる。プライマーの3'端を、十分なヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下で伸長させ、テンプレート核酸ポリマー配列に相補的な鎖を生じることができる。こうして、複製不能プライマーは核酸ポリマーにハイブリダイズして伸長し、テンプレートに相補的なプライマー伸長産物を生じることができる。同様に、複製可能プライマーは核酸ポリマーにハイブリダイズして伸長し、テンプレートに相補的なプライマー伸長産物を生じることができる。同様に、プライマーセット中の複製可能プライマーは、複製不能プライマーからの核酸ポリマーの複製によって生じたプライマー伸長産物にハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズおよび伸長プロセスは、得られる二重鎖核酸を熱で変性し、プライマーを核酸ポリマー鎖にアニールさせ、再びプライマー伸長反応を行うことによって繰り返すことができる。
【００４３】
本発明のハイブリダイズしたプライマーからプライマー伸長産物を生産するために適切な条件を、多項式増幅に用いることができる。このような条件は当技術分野において周知であり、プライマーセットおよび核酸ポリマーを含む溶液中の4種類の一般的なヌクレオシド3リン酸、重合触媒、適切なバッファー、適切な塩の存在、ならびに適切な温度が含まれる。
【００４４】
一般的には4種類のヌクレオシド3リン酸全部が多項式増幅反応混合物に含まれる。効率的な増幅を提供する任意の適切な濃度を用いることができる。例えば、反応混合物中の各ヌクレオチド3リン酸の適切な濃度は、約10μM〜約400μMの範囲でありうる。好ましくは、各ヌクレオチドのヌクレオチド濃度は約100μM〜約300μMの範囲である。最も好ましいヌクレオチド3リン酸濃度は約200μMである。
【００４５】
効率的な増幅を提供する任意の適切なプライマー濃度を用いることができる。約0.2μM〜約10μMのプライマー濃度を本方法で用いることができるが、約0.6μM〜約5μMの範囲のプライマー濃度がよりよい結果を与えることが見出されており、さらに約2または約3μMの濃度がさらにより好ましい。
【００４６】
多項式増幅反応混合物中の重合触媒は、テンプレートである核酸ポリマーにアニールしたオリゴヌクレオチドプライマーの3'-ヒロキシル基を伸長させることができる任意の触媒でありうる。適切な触媒は、核酸ポリマーの塩基と水素結合を形成できるようにヌクレオチドを付加する。触媒としては、酵素、より具体的にはインビトロで核酸ポリマーを複製できるポリメラーゼが挙げられる。適切なポリメラーゼとしては、E. coli DNAポリメラーゼI、TAQポリメラーゼ、E. coli DNAポリメラーゼIのKlenowフラグメント、T4 DNAポリメラーゼ、逆転写酵素（テンプレートがRNAで、伸長産物がDNAである場合）、または熱安定性DNAポリメラーゼが挙げられる。5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有する熱安定性のDNAポリメラーゼが好ましい。Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼおよびImolase（商標）などの市販のポリメラーゼが好ましい。増幅核酸ポリマーの必要量を提供できるポリメラーゼの任意の適切な濃度を用いることができる。例えば、AmpliTaq GoldまたはImolase（商標）の使用濃度は、50μl反応当たり約0.1〜約5単位の範囲であってよく、2.5単位が最も好ましい。
【００４７】
伸長反応温度で触媒の至適pHから約1pH単位以内のpKを有する熱安定性のバッファーを、多項式増幅反応混合物に用いることができる。熱安定性バッファーは、温度サイクリング中に約0℃〜約100℃の範囲で変動する温度にさらされても化学的に安定である。例えば、ある熱安定性ポリメラーゼを用いると、至適pHは約7〜約8で、これらポリメラーゼを用いる反応中の適切なバッファーは伸長反応の温度で約6〜約9の範囲のpKを有する。好ましくは、Tris（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）バッファーをpH約8.3で塩素対イオンと共に用いる。Tris-Clを反応混合物に含ませる場合、好ましい濃度は約10mMであるが、約5mM〜100mMの濃度を用いることができる。
【００４８】
アンプリコンの収量を最適化するために、任意の適切な塩濃度が多項式増幅反応混合物に含まれうる。好ましい塩としては、一価および二価のイオン種が挙げられる。特に好ましい塩としてはKClおよびMgCl2が挙げられ、より好ましくはこれら2種類の塩の混合物である。効率的な多項式増幅を提供するこれらの種の任意の濃度を用いることができる。例えば、約5mM〜約150mM KClが多項式増幅反応に含まれうる。より好ましくは、約10mM〜約100mM KClを用い、さらにより好ましくは約25mM〜約75mM KClを用い、最も好ましくは約50mM KClが反応混合物に含まれる。MgCl2については、約1mM〜約10mM MgCl2を多項式増幅反応に用いることができる。より好ましくは、約2mM〜8mM MgCl2を用いる。約2mM〜約8mMの範囲のマグネシウム濃度を用いて増幅反応を行うことができるが、約3mM〜約6mMマグネシウムがよりよい結果を与え、5mMマグネシウムが特に好ましいことが見出されている。
【００４９】
増幅条件はまた、適切な温度計画を含む。プライマーの長さと配列により、約35℃〜約75℃のアニーリング温度が使用でき、約55℃〜約75℃の温度をプライマー伸長反応に使用できる。アニーリングおよび伸長に好ましい温度はプライマーの性質に依存し、最適化が必要な可能性がある。温度サイクリング中の各温度ステップの継続時間は数秒〜数分の範囲でありうる。温度サイクリング法におけるこれら温度とその継続時間を最適化することは、十分に当業者の技量の範囲内である。
【００５０】
多項式増幅に最適な反応条件は、複製不能プライマーを用いない増幅反応において典型的に用いられるものとは多少異なりうる。複製不能エレメントを生じる修飾は、プライマー未修飾対応物と比べて、プライマーアニーリング温度を上げるまたは下げることが必要となる場合がある。例えば、塩基アナログ1,3-プロパンジオールがオリゴヌクレオチドプライマーに含まれる場合、未修飾オリゴヌクレオチドプライマーよりも約5℃低いアニーリング温度が有利でありうる。
【００５１】
アニーリング温度および伸長温度での処理を含む連続的な温度ステップで反応混合物を処理した後、反応混合物を十分加熱することによりプライマー伸長産物を核酸ポリマーテンプレートから分離することができる。約90℃を超える温度、より好ましくは約95℃まで多項式増幅反応物を加熱することにより、アニールした鎖を解離させることができる。次いで、得られた混合物は、反応混合物を再びアニーリング温度でインキュベートしてから伸長温度でインキュベートして、反応混合物内に残った余剰プライマーで再び処理することができ、アニーリングと伸長のさらなるラウンドが起き、さらなるプライマー伸長産物を生じる。温度サイクリングは、必要量の増幅産物を生じるよう必要に応じて何回でも繰り返すことができる。例えば、温度サイクリングは約20〜約60回繰り返すことができる。
【００５２】
サイクリングが完了すると、多項式増幅反応の産物アンプリコンを、ある量の増幅不能度を有するものとして特徴付けることができる。本出願の目的に関して、用語「増幅不能」とは、産物が、同じプライマー（およびこれらプライマーの外側に結合する他のプライマー）でのさらなる増幅反応のためのテンプレートとならず、そのため後続の反応において夾雑物とならないことを意味する。本発明の多項式増幅反応において優先的に生産される分子種は、多項式増幅システムに用いるいずれのプライマーともハイブリダイゼーションできない核酸ポリマーである。例えば、複製サイクルの数に依存して、本発明の最もシンプルな形での操作により、プライマー伸長産物の80%以上がさらなる複製のテンプレートとなることが全くできない産物が生じる。さらなる複製サイクルの後には、夾雑核酸の相対量は、有意でないレベルまたはさらには検出不能なレベルまでさらに減る。増幅不能度数は、複雑性の高い核酸サンプル中の同数の標的を増幅する場合と比べて多項式増幅産物を標的とした際の、多項式増幅反応において生産された産物の減少量の定量的尺度である。つまり例えば、104個の標的を含むゲノムDNA混合物を特定の条件下で特定量増幅させ、多項式増幅反応からの104個の標的のサンプルを用い、同じ条件下で10倍少ない増幅産物が生産される場合、多項式増幅反応混合物からの産物についての増幅不能度数は10である。この決定を行う際、最初の多項式増幅反応に用いるプライマーを、ゲノムDNA標的および多項式増幅反応混合物からの標的にも用いる。
【００５３】
開示する多項式増幅法を利用すると、約10以上の増幅不能度数を有する産物を生産することができる。約100以上の増幅不能度数を有する産物も生産できる。好ましくは、約1,000、さらにより好ましくは約10,000以上の増幅不能度数を有する産物を、開示の方法により生産できる。増幅不能度数はサイクル数および複製不能プライマーの数が増加するにつれて増加し、100,000の増幅不能度数さえも得ることができると認められる。
【００５４】
これらの増幅不能度数は、同時にアンプリコンを効率的に生産しつつ達成される。例えば、上記増幅不能度数は、同時に約102倍の増幅を得る際に得ることができる。より好ましくは、増幅不能度数は、約103倍の増幅、より好ましくは104、さらにより好ましくは約105、またはさらにより好ましくは106倍の増幅を伴って得られる。さらにより好ましくは、前記のような増幅不能度を有する産物の107倍以上の増幅である。
【００５５】
場合によっては、まず直線的増幅反応を用いて標的配列の複数のコピーを作ることが望ましいことがある。直線的増幅反応においては、1個のプライマーを用いて、たった1つの鎖をコピーする。ビオチンなどのプライマーに結合した親和基を用いて、または所望の伸長産物の一部に相補的な固定化された核酸フラグメントへのハイブリダイゼーションによって、産物を固相支持体上で単離することができる。次に細胞残渣および他の不純物ならびにバックグラウンドDNAを洗浄除去する。支持体から標的配列を分離した後、多項式増幅を行うことができる。このような手順は、例えば、増幅すべき鎖のみ（その相補鎖ではない）が多項式増幅反応中に存在することが望ましい場合に実施されうる。
【００５６】
特定の態様および方法において、プライマー、好ましくは複製可能プライマーは、直接または間接的に検出可能シグナルを提供できる標識で修飾されうる。例示的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、ビオチンなどが挙げられる。フルオレセイン、リッサミン（lissamine）、フィコエリトリン、ローダミン（Perkin Elmer Cetus）、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX（Amersham）、およびその他（例えば、Kricka, Nonisotopic DNA Probe Techniques, 1992, Academic Press San Diego, Calif.を参照されたい）を含む多くの適切なフルオロフォアが知られており、使用することができる。このような標識をプライマーに組み込むことは分子生物学分野の当業者の技量の範囲内である。
【００５７】
特定の方法においては、複数のPCRサイクル、好ましくは10〜20サイクルを実施して、まず標的配列のコピーを複数作成してから、多項式増幅反応を行うことが好ましい。この方法は、サンプル中の増幅する配列のコピー数が非常に少ない場合に特に好ましいと考えられる。
【００５８】
本発明の1つの態様において、診断学的解析、法医学的解析、および遺伝子型解析において多項式増幅を実施するために必要な試薬をキット中に提供することができる。本発明は、特定の核酸配列を増幅する際に使用するためのこのような試薬キットを提供する。このようなキットは典型的には、上記のようなDNAポリメラーゼおよびプライマーセットを含む。このキットは任意に、プライマーとDNAポリメラーゼによって複製されうる対照核酸配列を含んでもよい。複製可能プライマーは標識されていてもよく、または標識するために必要な試薬を含んでもよい。このキットはまた、特定配列の増幅産物の存在または不在を示すことができる核酸プローブを含んでもよい。このキットはまた、例えば、増幅反応において使用するプライマーおよびマグネシウムの濃度を示す指示書を含んでもよい。キットは、切断可能エレメントを組み込んでいるプライマーを含む場合、プライマーを切断可能エレメントのところで切断するための試薬も含みうる。
【００５９】
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、いずれにせよ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００６０】
実施例1
本実施例および以降の実施例では、ヒトゲノムDNAからのヒト遺伝子座位NOD2遺伝子（SEQ ID NO:48）の増幅のための多項式増幅システムの使用を示す。
【００６１】
同程度の融解温度を持ち、二次構造が少なく、ヘテロダイマーを形成する傾向が低く、クロスハイブリダイゼーションのリスクが低い増幅プライマーを、GenBank Blast searchで決定して選択した。遺伝子座位およびプライマー結合部位の配列を以下の表1に示す。太字表記された配列はプライマー結合部位を示し、対応する矢印はプライマーの伸長する方向を示す。従って、「For」プライマーは配列において右に向かって伸長する。「Rev」と名付けられたプライマーは左に伸長し、示されている配列に相補的な配列を有する。
【００６２】
（表1）NOD2座位用のオリゴヌクレオチドプライマー結合部位
2007501005.tif 000002
【００６３】
実施例1における多項式増幅のための反応混合物の組成は、以下の表2に示す通りである。
【００６４】
（表2）Polyamp反応混合物
成分
10mM Tris pH8.3
50mM KCl
5.0mM MgCl2
400μM dNTP(各100μM）
10ng ヒトゲノムDNA
200nM（10pmol）各フォワード（修飾）プライマーオリゴヌクレオチド
200nM（10pmol）リバースプライマーオリゴヌクレオチド
2.5単位 Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ
μl 最終容量
【００６５】
表2の成分を加える順番は重要ではないが、通常、酵素を最後に加えた。多項式増幅反応の温度サイクルは、95℃で15分間加熱して開始し、続いて30、40、または50サイクルの3ステップサイクル（95℃30秒、55℃60秒、および72℃30秒）、そして反応物を72℃で3分間インキュベートした。サイクリング後、反応物を水で希釈して100μl容量とした。
【００６６】
多項式増幅反応に続いて、増幅反応の産物にリアルタイム定量的PCRアッセイを実施し、多項式増幅反応からの産物を定量した。PCRアッセイに加える前に多項式増幅反応産物混合物を希釈して100μLとし、1μLをPCR反応に加えた。リアルタイム定量的PCRアッセイには、上記表1に示した多項式増幅反応に用いたプライマーの内部にある以下の表3に示すオリゴヌクレオチドを使用した。
【００６７】
（表3）
2007501005.tif 000003
【００６８】
プライマー（SEQ ID NO:49およびSEQ ID NO:90）で生じたPCRフラグメントからInvitrogen（Carlsbad, CA）製のTOPO TAクローニングベクターpCR2.1-TOPOにクローニングされたNOD2座位全体を、PCRアッセイの定量標準とした。PCR反応混合物中の成分を以下の表4に示す。
【００６９】
（表4）PCR反応混合物
20mM Tris pH8.4
50mM KCl
3.0mM MgCl2
200μM 各dATP、dGTP、およびdCTP
400μM dUTP
0.5単位 ウラシル-DNA-N-デグリコシラーゼ
1.0単位 Taq DNAポリメラーゼ
50nM 基準色素
200nM プライマーFor-3
200nM プライマーRev-3
200nM プローブ
1μl 多項式増幅反応産物混合物
25μl 最終容量
【００７０】
PCRに採用した温度サイクルは以下の通り：50℃（または55℃）2分および95℃10分、続いて95℃15秒および60℃1分で40サイクル。既知量のNOD2ゲノムサブクローンを含むプラスミドDNAを用いて対照反応を行い、1x102、1x104、1x106、および1x108標的でのデータ点を用いて標準曲線を確立した。データ点は全て三つ組で実施した。
【００７１】
多項式増幅反応の陽性対照として、多項式増幅反応と同じであるが化学的修飾を欠くプライマーおよび反応混合物を用い、多項式増幅プライマーと同じNOD2座位中の結合部位に結合するプライマーでPCR反応を通常通り実施した。
【００７２】
増幅反応に続いて、1xTBEおよび7M尿素を含む8%アクリルアミドゲル中、増幅産物を電気泳動で分離した。GELSTAR（登録商標）染色でゲルを処理し、製造業者の指示に従って観察した。PCR後のゲルに見られたDNAバンドの強度を用い、標準曲線を参照して多項式増幅反応において産生された産物の量を決定した。
【００７３】
本実施例および以降の実施例で用いたプライマーを以下の表5に示す。修飾は以下の通り：xはオリゴヌクレオチドのその位置のヌクレオチドの代わりに置き換えられたC3炭素スペーサーを示し；塩基部位のニトロインドール修飾を「y」で示し；リボース環の2位に結合したメトキシ基を、通常の塩基名、すなわち、a、c、g、およびuに対応する太字の小文字で示す。
【００７４】
（表5）
2007501005.tif 000004
2007501005.tif 000005
2007501005.tif 000006
【００７５】
本実施例では、For-0〜For-4の各フォワードプライマーをリバースプライマーRev-2と共に用いてPCR反応を行った。それぞれ予測されたサイズおよび量の産物が得られた。以下の多項式増幅反応も実施した。
2007501005.tif 000007
【００７６】
上記の各修飾オリゴヌクレオチドをこれらの反応に用いた。複数の「For」プライマーを用いた場合、各「For」プライマー中の修飾は同じであった。例えば、For-3、For-4、Rev-2反応では、For-3およびFor-4オリゴヌクレオチドは両方とも2'-O-メチル修飾（SEQ ID NO:83および88）を1つの反応に含んだ。別の反応では、両方ともニトロインドール修飾（SEQ ID NO:82および87）を含んだ。
【００７７】
ゲノムDNAにおける多項式増幅反応の産物は、50増幅サイクル未満のゲル中には確認できるものはなかった。予測されたサイズの産物が50サイクルでかすかに確認可能であった。はっきりと認識できる産物は、1つのC3置換または2つのニトロインドール修飾プライマーを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いた反応でのみ見られた。対応するPCR反応によっては、いずれの場合にも豊富な産物が得られた。
【００７８】
本実施例によって、本実施例に記載の化学的修飾は全て増幅反応においてプライマーを複製不能とすることが示される。オリゴヌクレオチドプライマーの、2個の隣接3炭素スペーサーと複数の2'-O-メチル誘導修飾とからなる修飾は、複製のブロックにさらに効果的であった。しかし、本実施例に開示された条件下では、多項式増幅反応は非効率的であった。
【００７９】
実施例2
本実施例では多項式増幅反応の最適化を示す。
【００８０】
多項式増幅反応混合物は以下の組成であった。
Polyamp反応混合物
成分
10mM Tris-Cl, pH8.3
50mM KCl
5mM MgCl2
1x106コピー ラットCP遺伝子標的DNA
200μM dNTP（各50μM）
200nM（10pmol）フォワード（修飾）プライマーオリゴヌクレオチド
200nM（10pmol）第2の（ネステッド）フォワードプライマーオリゴヌクレオチド（任意）
200nM（10pmol）リバースプライマーオリゴヌクレオチド
2.5単位 Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ（Applied Biosystems Inc., Foster City, CA）
50μl 最終容量
【００８１】
PTC-200 Peltier Thermal Cycler（MJ Research, Waltham, MA）中で反応を行った。サイクリング条件は以下の通り：95℃15分、続いて10、20、30、40、または50サイクルの3ステップサイクル（95℃15秒、50℃30秒、および72℃30秒）、続いて72℃で3分間インキュベーション。増幅が完了した後、反応物を水で希釈して100μlとした。プライマーの安定性（Tm）に悪影響を及ぼす化学的修飾をオリゴヌクレオチドプライマーが含む場合、典型的には50℃のアニーリング温度を用いた。
【００８２】
3種類の反応を行った。これにはPCR増幅、2プライマー多項式増幅、および3プライマー「ネステッド」多項式増幅が含まれる。PCR反応には、以下の表1に示すFor-1結合部位のための未修飾プライマーを採用した。2プライマー多項式増幅では、For-1部位には修飾プライマーを、Rev-1部位には未修飾プライマーを使用した。3プライマーネステッド多項式増幅では、For-1およびFor-2部位には修飾プライマーを、Rev-1部位には未修飾プライマーを使用した。
【００８３】
これら反応で産生された産物の量を測定するため、希釈した増幅産物に直接、PCR反応を行った。PCRアッセイに用いたプライマーは内部未修飾プライマー（SEQ ID NO:26、29、および30）であった。SEQ ID NO:30に対応するオリゴヌクレオチドは二重標識蛍光-消光プローブである（Livak et al. PCR Methods Appl. 4:357-62.1995）。このプローブは6-カルボキシフルオレセイン（6-Fam）標識を5'端に、BlackHole（商標）Quencher-1（BH1）を3'端に有する。多項式増幅反応からのアンプリコンを測定できるように、PCRアッセイのプライマーはラットCP遺伝子標的中の中心位置を有するように選択した。試験システムを以下の表6に示す。
【００８４】
（表6）オリゴヌクレオチドプライマー結合部位
2007501005.tif 000008
【００８５】
各増幅反応の1μl分注物（反応の1%）をPCRアッセイにおける標的源として用いた。Invitrogen Platinum Supermix-UDG（Carlsbad, CA）を製造業者の指示に従って用い、PCR増幅を行った。反応混合物は以下の表7に示す成分から構成された。
【００８６】
（表7）PCR反応混合物
成分
20mM TrisCl pH8.4
50mM KCl
3mM MgCl2
200μM 各dATP、dGTP、およびdCTP
400μM dUTP
0.5単位 ウラシル-DNA-N-デグリコシラーゼ
1単位 Taq DNAポリメラーゼ
50nM 基準色素
200nM プライマーFor-3（SEQ ID NO:26）
200nM プライマーRev-3（SEQ ID NO:29）
200nM プローブ（SEQ ID NO:30）
1μL 標的DNA（増幅反応または標準から）
【００８７】
ABI-7700、ABI-7000、またはBioRad iCyclerのいずれかを用いてPCR定量アッセイを行った。予備実験により、多項式増幅からの反応産物の精製は不要であり、産物反応混合物はアンプリコン定量のPCR反応に直接加えられることが示された。
【００８８】
採用したサイクリング条件は以下の通り：50℃2分および95℃10分、続いて30サイクルの2ステップPCR（95℃15秒および60℃1分）。対照反応を各実験についてラットCP遺伝子標的プラスミドの既知の希釈物を用いて行い、1x102、1x104、1x106、および1x108個の標的分子を含む定量用の標準曲線を確立した。データ点は全て三つ組で行った。PolyAmp試験増幅反応は全てインプット標的DNA 1x106分子で開始した。そのため、1μl分注物（1/100、100μl容量に希釈後）をリアルタイムPCRアッセイに移し、移動基準 1x104標的分子とした。1x104分子を超える増加はいずれも、多項式増幅反応における増幅の結果とみなした。
【００８９】
増幅反応におけるマグネシウム濃度およびアニーリング温度を最適化するため、C3スペーサー（1,3-プロパンジオール、「x」で示す）、ニトロインドールスペーサー（「y」で示す）、およびd-スペーサー(1,4-アンヒドロ-2-デオキシ-D-リビトール、「d」で示す）ブロッキング基を1つまたは2つ挿入したFor-1部位のプライマーを調製して用いた。これらプライマーは1種類のリバースプライマーRev-1と共に用いた。1.5、2、3、および5mMマグネシウム濃度を用いて、反応のマグネシウム濃度依存性を試験した。約50、54、および58℃でアニーリング温度を試験した。
【００９０】
以下のオリゴヌクレオチド（表8に示す）をそれぞれRev-1プライマーと共に用いた。
【００９１】
（表8）
2007501005.tif 000009
【００９２】
実験結果を以下の表9に示す。
【００９３】
（表9）
2007501005.tif 000010
1温度サイクル10回に関するデータ
2アニーリング温度50℃を用いて得られたデータ
【００９４】
これら実験により、示したプライマーにつき、5mMマグネシウムで常に最大量の増幅産物が得られることがわかった。またこれは、54℃および58℃という高いアニーリング温度で反応を行った際の至適濃度であった。
【００９５】
実施例3
本実施例では、様々な修飾オリゴヌクレオチドプライマーを用いて多項式増幅反応法のアニーリング温度を評価する。
【００９６】
温度サイクリング法において、5mM MgCl2およびアニーリング温度を変化させて用い、実施例2に記載のように多項式増幅反応を行った。50℃、54℃、および58℃のアニーリング温度を比較した。以下のオリゴヌクレオチドプライマー（表10に示す）を調べた。
【００９７】
（表10）オリゴヌクレオチドプライマー配列
2007501005.tif 000011
【００９８】
プロセスに58〜60℃のアニーリング温度を利用した場合、増幅反応における未修飾プライマーが、定量（Taqman）および純度（ゲル）両方の局面から最適であることがわかった。至適アニーリング温度は、多項式増幅に用いたプライマーに採用した修飾によって異なった。C3およびd-スペーサーを含むオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:15、16、36、および37）は、アニーリング温度50℃を用いた場合に最も高い収量を与えた。この温度は54℃よりも優れており、54℃は58℃でのアニーリングを用いた増幅よりもかなり優れていた。ニトロインドール修飾オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:13および14）について、アニーリング温度50℃および54℃で得られた増幅は大体同じであり、両温度は58℃よりもかなり優れていた。2'-O-メチル基を含むオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:39）は、アニーリング温度50℃または58℃よりもアニーリング温度55℃でよく働いた。
【００９９】
dNTP、オリゴヌクレオチド、およびポリメラーゼ濃度を最適化するため、同様の実験を実施した。Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼの50μL反応当たり、約200μM各dNTPおよび約2.5単位ポリメラーゼの濃度が最適であることがわかった。
【０１００】
オリゴヌクレオチドプライマー濃度に関し、ネステッドプライマーセットにおける各プライマーの相対濃度を変化させ、どの1つのプライマーを増加させることが他のものより重要かを決定した。反応の収量は、どの個別のプライマーの濃度を増加させても有意には改善されなかった。しかし、全てのプライマーの濃度を10倍に約2μMまで増加させた場合に、約10倍の収量増加が得られた。試験におけるオリゴヌクレオチドプライマー濃度は0.2〜3μMの範囲であった。
【０１０１】
まとめると、最適な多項式増幅反応条件は以下の表11に示す通りである。
【０１０２】
（表11）最適化された多項式増幅反応混合物
10mM Tris pH8.3
50mM KCl
5.0mM MgCl2
800μM dNTP（各200μM）
標的DNA
2.0μM（100pmol）フォワード（修飾）プライマーオリゴヌクレオチド
2.0μM（100pmol）別の（ネステッド）フォワード（修飾）プライマーオリゴヌクレオチド
2.0μM（100pmol）リバースプライマーオリゴヌクレオチド
2.5単位 Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ
50μl 最終容量
【０１０３】
実施例4
本実施例では、広範な種類の修飾オリゴヌクレオチドで多項式増幅が起こることを示す。
【０１０４】
以下に示すオリゴヌクレオチド対を用いて多項式増幅反応を行った。各対から生じたアンプリコンのサイズも示す（表12）。
【０１０５】
（表12）
2007501005.tif 000012
【０１０６】
上記の各対に用いた修飾オリゴヌクレオチドを以下の表13に示す。
【０１０７】
（表13）
2007501005.tif 000013
【０１０８】
単一の修飾をオリゴヌクレオチドプライマーに組み込んだ場合、観察される増幅は、PCRにおいて約40よりも少ないサイクル数では低い。しかし、約50サイクルまで増幅を増加させた場合、1つの修飾を含む単一「For」プライマーで行った実験は全て、多項式増幅反応に関して理論的に可能であるよりも大きな増幅を生じた。結論としては、複製不能プライマーには複数の修飾が好ましい。10〜30回の増幅サイクルを用いた反応で達成された最大の増幅は約3000倍であった。
【０１０９】
2つの修飾を含むプライマーは全体的に収量が少なかったが、多項式増幅反応の特性をよりよく維持することができた。2つのC3修飾および／またはニトロインドール修飾に隣接するC3修飾が、本来の多項式増幅反応に関して予測された収量のたった1%という最も低い収量のアンプリコンを生じた。多項式増幅反応における2修飾プライマーからの収量は、1つの鎖に対して複数の修飾プライマーを用い、対向鎖に対して1つの未修飾プライマーを用いることによって増加した。用いたプライマーは以下の通り（表14）。
【０１１０】
（表14）
2007501005.tif 000014
【０１１１】
実施例5
本実施例では、多項式増幅反応においてアンプリコンの収量を増加させるためにさらなる複製不能プライマーを用いることができるかどうかを評価する。
【０１１２】
本実施例の反応において、化学的に修飾されたプライマーFor-00、For-000、およびFor-0000を含むさらなる複製不能プライマーを反応混合物に加えた。また、増幅反応混合物は実施例3に従って修飾した。増幅反応はさらに、ヌクレオチド3リン酸、プライマー、およびインプット標的DNAを含んだ。反応混合物は以下の通り（表15）。
【０１１３】
（表15）Polyamp反応混合物
成分
10mM Tris pH8.3
50mM KCl
5.0mM MgCl2
200μM 各dNTP
100ng ヒトゲノムDNA
2.0μM（100pmol）各フォワード（修飾）プライマーオリゴヌクレオチド
2.0μM（100pmol）リバースプライマー
2.5単位 Amplitaq Gold（登録商標）DNAポリメラーゼ
50μl 最終容量
【０１１４】
採用したサイクリング条件は以下の通り：95℃15分、続いて30、40、または50サイクルの3ステップサイクル（95℃30秒、55℃（または60℃）60秒、および72℃30秒）、続いて72℃で3分間インキュベーション。増幅が完了した後、反応混合物を水で希釈して100μl容量とした。反応産物をPAGEに供し、上記のように染色して可視化した。また、polyampアッセイにおいて生じた産物の量を決定するため、産物をリアルタイムPCRアッセイに供した。
【０１１５】
本実施例において試験したプライマーサンプルは、PCR反応物中に各未修飾「For」プライマーをRev-2プライマーと共に含む。多項式増幅反応について、試験したプライマーセットは以下の通りである。
試験したサンプル：
2007501005.tif 000015
【０１１６】
40サイクルで多項式増幅反応を行い、2回（Expt.1およびExpt.2）行ったこれら反応の結果を以下に示す（表16）。
【０１１７】
（表16）
2007501005.tif 000016
【０１１８】
反応6と反応7のアンプリコン収量の比較、および反応8と反応9のアンプリコン収量の比較により、複数のプライマー存在下では少なくとも、プライマーFor-00がアンプリコン収量を有意に減少させることが示された。このように、プライマーFor-00はさらなる増幅混合物（反応10など）に加えるべきでないことがわかった。
【０１１９】
本実施例では、本試験システムにおいて、約4または5個の複製不能プライマーが反応中に存在するまで、それぞれ添加されたオリゴヌクレオチドプライマーと共に増幅が増加することが示されている。それからシステムは複製不能プライマーについて飽和するようであり、約5個の複製不能プライマーを加えた後は、増幅の有意な増加は見られない。
【０１２０】
60℃のアニーリング温度を温度サイクリングプログラムに用いたことを除いて、実験を繰り返した。同様のプラトーに達したが、収量は各反応において約10倍高かった。
【０１２１】
実施例6
本実施例では、多項式増幅反応で生じた産物が、キャリーオーバーコンタミネーションによって後続の反応において偽陽性結果が得られるという問題を減少させる程度を評価する。
【０１２２】
実施例5の反応1〜5の反応産物を希釈し、第2ラウンドの多項式増幅反応において標的DNA源として使用した。そして第2ラウンドの増幅からの産物反応混合物を、第2の反応の増幅レベルを決定するために上記PCRアッセイに供した。対照として、オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:84および90）を用いて反応5の反応産物に40サイクルのPCRを行った。
【０１２３】
多項式増幅反応の産物を標的DNAとして使用すると、対応するゲノムDNA量よりも約10,000倍低い増幅を生じた。同じ産物は、PCR反応において標的DNAとして使用すると、効率的に増幅した。この増幅の減少を増幅不能度数（すなわち、増幅不能度数は10,000）と呼ぶ。
【０１２４】
実施例7
本実施例では、多項式増幅反応の産物が、キャリーオーバーコンタミネーションによる後続の反応における偽陽性結果を減少させる程度の別の評価を提供する。
【０１２５】
一連の多項式増幅を実施例5に示す条件下で行った。反応用のプライマーセット、および実施例5に記載のNOD2 PCRアッセイで決定した各反応で生じた産物の量を以下に示す（表17）。
【０１２６】
（表17）
2007501005.tif 000017
【０１２７】
多項式増幅反応産物が後続の増幅反応においてテンプレートとなりうる程度を決定するため、反応5からの産物反応混合物を希釈して100μlとし、標的DNAとして一連の試験多項式増幅反応および一連の試験PCR反応に加えた。約1x104コピーの標的DNAを各二次増幅反応に加えた。第2の多項式増幅反応完了後、定量的NOD2 PCRアッセイを用いて各反応混合物中の産物量を決定した。
【０１２８】
試験PCR反応はそれぞれ個別に、オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:90）、および一連の未修飾「For」プライマーからの可能な各「For」プライマーを含んだ。「For」プライマーは、SEQ ID NO:49、54、59、64、69、74、79、および84を含んだ。
【０１２９】
試験PCR反応は、各反応において豊富な量の産物を生じた。産物量は、SEQ ID NO:84の約1x1011から始まり、多項式増幅によって生じるアンプリコンの中心から最も離れているため全ての可能性が最も少ないプライマーであるSEQ ID NO:49の約7x109まで、徐々に減少した。
【０１３０】
対照的に、試験多項式増幅反応では反応6の標的DNAの増幅は限定され、多項式増幅産物はさらなるラウンドの多項式増幅の標的としては不十分であることが示された。試験PCR増幅および試験多項式増幅反応の結果を以下に示す（表18）。
【０１３１】
（表18）
2007501005.tif 000018
【０１３２】
多項式増幅反応産物は、さらなるラウンドの多項式増幅には不十分な基質である。多項式増幅（上記反応6）からの標的DNAを用いた上記多項式増幅反応で観察された収量をゲノム標的DNAと比較することにより、本発明の目的のために「有効増幅不能度」として同定される数を得ることができる。好ましい範囲である約4個の複製不能プライマーにおいては、有効増幅不能度は約1x103を超える。
【０１３３】
刊行物、特許出願、および特許を含む、本明細書に引用する全ての参考文献はこれにより、各文献が個別に具体的に参照により組み込まれたように示され、本明細書にその全体が示されたのと同じ程度に参照により組み込まれる。
【０１３４】
発明を説明する文脈における（特に請求の範囲の文脈における）用語「a」および「an」および「the」および同様の言及の使用は、本明細書に特に示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると見なされるものである。用語「含む、持つ、有する（comprising, having, including, containing）」は、特に記されていない限り、開かれた（open-ended）用語（すなわち、「含むがそれに限定されない」を意味する）と見なされるものである。本明細書における値の範囲の言及は、本明細書に特に示されない限り、その範囲内の各個別の値をそれぞれ指す略式の方法として用いることを意図するものに過ぎず、各個別の値は、本明細書に個別に言及されたのと同様に本明細書に組み込まれる。特定の値に言及する場合、用語「少なくとも」および「以上」は同一の意味を持つ。本明細書に述べる方法は全て、本明細書に特に示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順番で実施できる。本明細書に提供される任意のおよび全ての例または例示的表現（例えば「など」）の使用は、本発明をより明らかに示すことを意図するものに過ぎず、特に述べられていない限り、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中の表現はいずれも、請求されていない任意の要素が本発明の実施に不可欠であることを示すと見なすべきものではない。
【０１３５】
本発明を実施するために本発明者らが理解している最良の形態を含む、本発明の好ましい態様が本明細書に述べられている。これらの好ましい態様のバリエーションは、上述の記載を読めば、通常の技量を有する当業者には明らかとなるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのようなバリエーションを採用することを予測しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは異なるように実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法により許可される本明細書に添付の請求項に記載の対象物の全ての修飾および同等物を含む。さらに、特に本明細書に示されない限り、または特に文脈に明らかに矛盾しない限り、全ての可能なバリエーションにおける上記要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月16日(2006.5.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
（表3）
2007501005.tif 000019
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
プライマー（SEQ ID NO:29およびSEQ ID NO:70）で生じたPCRフラグメントからInvitrogen（Carlsbad, CA）製のTOPO TAクローニングベクターpCR2.1-TOPOにクローニングされたNOD2座位全体を、PCRアッセイの定量標準とした。PCR反応混合物中の成分を以下の表4に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
（表5）
2007501005.tif 000020
2007501005.tif 000021
2007501005.tif 000022
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
上記の各修飾オリゴヌクレオチドをこれらの反応に用いた。複数の「For」プライマーを用いた場合、各「For」プライマー中の修飾は同じであった。例えば、For-3、For-4、Rev-2反応では、For-3およびFor-4オリゴヌクレオチドは両方とも2'-O-メチル修飾（SEQ ID NO:63および68）を1つの反応に含んだ。別の反応では、両方ともニトロインドール修飾（SEQ ID NO:62および67）を含んだ。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
これら反応で産生された産物の量を測定するため、希釈した増幅産物に直接、PCR反応を行った。PCRアッセイに用いたプライマーは内部未修飾プライマー（SEQ ID NO:12、14、および15）であった。SEQ ID NO:15に対応するオリゴヌクレオチドは二重標識蛍光-消光プローブである（Livak et al. PCR Methods Appl. 4:357-62.1995）。このプローブは6-カルボキシフルオレセイン（6-Fam）標識を5'端に、BlackHole（商標）Quencher-1（BH1）を3'端に有する。多項式増幅反応からのアンプリコンを測定できるように、PCRアッセイのプライマーはラットCP遺伝子標的中の中心位置を有するように選択した。試験システムを以下の表6に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
（表6）オリゴヌクレオチドプライマー結合部位
2007501005.tif 000023
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８６】
（表7）PCR反応混合物
成分
20mM TrisCl pH8.4
50mM KCl
3mM MgCl2
200μM 各dATP、dGTP、およびdCTP
400μM dUTP
0.5単位 ウラシル-DNA-N-デグリコシラーゼ
1単位 Taq DNAポリメラーゼ
50nM 基準色素
200nM プライマーFor-3（SEQ ID NO:12）
200nM プライマーRev-3（SEQ ID NO:14）
200nM プローブ（SEQ ID NO:15）
1μL 標的DNA（増幅反応または標準から）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９１】
（表8）
2007501005.tif 000024
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
（表10）オリゴヌクレオチドプライマー配列
2007501005.tif 000025
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
プロセスに58〜60℃のアニーリング温度を利用した場合、増幅反応における未修飾プライマーが、定量（Taqman）および純度（ゲル）両方の局面から最適であることがわかった。至適アニーリング温度は、多項式増幅に用いたプライマーに採用した修飾によって異なった。C3およびd-スペーサーを含むオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:4、5、16、および17）は、アニーリング温度50℃を用いた場合に最も高い収量を与えた。この温度は54℃よりも優れており、54℃は58℃でのアニーリングを用いた増幅よりもかなり優れていた。ニトロインドール修飾オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:2および3）について、アニーリング温度50℃および54℃で得られた増幅は大体同じであり、両温度は58℃よりもかなり優れていた。2'-O-メチル基を含むオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:19）は、アニーリング温度50℃または58℃よりもアニーリング温度55℃でよく働いた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
（表13）
2007501005.tif 000026
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
（表14）
2007501005.tif 000027
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２２】
実施例5の反応1〜5の反応産物を希釈し、第2ラウンドの多項式増幅反応において標的DNA源として使用した。そして第2ラウンドの増幅からの産物反応混合物を、第2の反応の増幅レベルを決定するために上記PCRアッセイに供した。対照として、オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:64および70）を用いて反応5の反応産物に40サイクルのPCRを行った。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
（表17）
2007501005.tif 000028
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
試験PCR反応はそれぞれ個別に、オリゴヌクレオチド（SEQ ID NO:70）、および一連の未修飾「For」プライマーからの可能な各「For」プライマーを含んだ。「For」プライマーは、SEQ ID NO:29、34、39、44、49、54、59、および64を含んだ。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
試験PCR反応は、各反応において豊富な量の産物を生じた。産物量は、SEQ ID NO:64の約1x1011から始まり、多項式増幅によって生じるアンプリコンの中心から最も離れているため全ての可能性が最も少ないプライマーであるSEQ ID NO:29の約7x109まで、徐々に減少した。
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月15日(2006.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007501005000001.app
【国際調査報告】
2007501005.tif 000029
2007501005.tif 000030