(57)【要約】本発明は、血栓性疾患の処置における、減少したリシン結合能を有するプラスミノゲン活性化因子の使用に関する。特に有利な実施形態において、このプラスミノゲン活性化因子は、改変されたクリングルドメイン、好ましくは天然のｔ−ＰＡと比較すると改変されているクリングル２ドメインを示す。この後者のドメインは、リシン結合能を減少するように、全体的にか、または部分的に欠失され得る。このＫ２ドメイン、あるいはそれと機能的または構造的に、本質的に相同な領域は、リシン残基がこれ以上結合しないように、または低い親和性で結合するのみであるように、有利に改変され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓性疾患、特に脳卒中、を治療するための、リシン結合能を有するプラスミノゲン活性化因子の使用であって、該結合能は、天然のｔ−ＰＡの結合能と比較すると減少されている、使用。
【請求項２】
クリングル２、あるいはそれと機能的または構造的に相同なドメインでの、前記プラスミノゲン活性化因子の変異によって特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
クリングル２、あるいはそれと機能的または構造的に相同なドメインの欠失によって特徴付けられる、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
クリングル２リシン結合部位、あるいはそれと機能的または構造的に相同なドメインの変異によって特徴付けられる、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
Ｄ２３６Ｎの置換またはそれと相同なアミノ酸の置換によって特徴付けられる、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記プラスミノゲン活性化因子が、ｔ−ＰＡと、少なくとも７５％の相同性を示すことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ｔ−ＰＡ活性化部位が、タンパク分解性の開裂がおこらないような欠失または置換によって改変されることを特徴とする、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記アミノ酸位置Ｒ１５〜Ｉ１６の改変によって特徴付けられる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記活性化部位が、ＬＨＳＴ配列を示すことを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記クリングルとシステイン架橋との間の遷移領域において、前記プラスミノゲン活性化因子が、ＳＫＡＴを含むアミノ酸配列セグメントを示すことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
図３、図１１および図１３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含む、プラスミノゲン活性化因子。
【請求項１２】
請求項１０に記載のプラスミノゲン活性化因子と、少なくとも７０％の同一性、好ましくは８０％〜９０％の同一性、特に好ましくは９５％の同一性によって特徴付けられる、プラスミノゲン活性化因子。
【請求項１３】
天然のＤＳＰＡと比較して、増加した血栓崩壊活性によって特徴付けられる、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のプラスミノゲン活性化因子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プラスミノゲン活性化因子の有利な使用に関し、そして独国特許出願第１０３  ４２  ５１８．７号（その内容は参考として本明細書中に援用される）の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
種々の血栓塞栓性の疾患と関連する治療選択肢としての血栓崩壊の確立は、おおむね達成されてきたとみなされている。従って、血栓崩壊研究の主要な目的は、公知の血栓溶解剤のさらなる開発および改変ならびに／または併用治療の改良に関する。
【０００３】
新規の血栓溶解剤を開発するための出発点として重要な血栓溶解剤は、組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）であり、これは、ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼと比較して、より高いフィブリン選択性および優れた活性を有する。欠失変異体レテプラーゼ（ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）およびラノテプラーゼ（ｌａｎｏｔｅｐｌａｓｅ）、ならびにテネクテプラーゼ（ｔｅｎｅｃｔｅｐｌａｓｅ）は、このプラスミノゲン活性化因子のさらなる開発物である。
【０００４】
組織プラスミノゲン活性化因子（ｒｔ−ＰＡ）は、５２７アミノ酸からなる単鎖糖タンパク質である。最初は単鎖であるこの分子（ｓｃｔ−ＰＡ）は、タンパク分解によって二本鎖形態（ｔｃｔ−ＰＡ）に切断される。ｔ−ＰＡは、規定の構造および機能的なドメインを有する。従って、Ｎ末端構成鎖は、フィンガードメイン（Ｆ，  Ｓｅｒ１−Ｌｙｓ４９）、上皮増殖因子ドメイン（Ｅ，  Ｓｅｒ５０−Ａｓｐ８７）および２つのクリングルドメイン（Ｋ１，  Ｔｈｒ８８−Ｇｌｙ１７６；およびＫ２，  Ａｓｎ１７７−Ｃｙｓ２６１）を含む。セリンプロテイナーゼドメイン（Ｐ）を含むＣ末端鎖は、アミノ酸Ｓｅｒ２６２〜Ｐｒｏ５２７を含む。アミノ酸Ｈｉｓ３２２、Ａｓｐ３７１およびＳｅｒ４７８によって、Ｃ末端鎖は活性中心を形成する。
【０００５】
ｔ−ＰＡおよびその組換え改変体、ならびにそれらの調製物は、例えば、特許文献１および数多くの刊行物（例えば、非特許文献１）の主題である。ｔ−ＰＡの構造の図は、図１として添付される。
【０００６】
他の大部分のトリプシン様セリンプロテイナーゼ同様、ｓｃｔ−ＰＡは、切断によってｔｃｔ−ＰＡ形態に変換される。この切断は、Ａｒｇ２７５とＩｌｅ２７６との間の結合で起こる。その後、この２本の鎖は、次いで、セリン２６４とセリン３９５との間の一重ジスルフィド架橋によってのみ結合される。
【０００７】
ｔ−ＰＡ切断部位の番号付けは、非特許文献１（上記引用文）によって選択されたものに対応する。しかしながら、他の執筆者は、基準として異なる番号付けを使用して、この切断部位または活性化部位をＲ１５−Ｉ１６またはＲ３１０−Ｉ３１１と定義する。しかしながら、この方法によって定義される部位は、機能的または構造的に異ならない。
【０００８】
組織プラスミノゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ；アルテプラーゼ）は、プラスミノゲンを活性化することが可能であり、プラスミンに形質転換される。しかしながら、ｔ−ＰＡが循環プラスミノゲンをわずかに活性化することができるのみであるということは、速度定数から明らかである。この２つのｔ−ＰＡ形態（すなわち、単鎖分子および二本鎖分子の両方）は、何が原則として同一の薬理学的な特性であるかを示す。しかしながら、フィブリン結合プラスミノゲンは、遊離プラスミノゲンが活性されるよりも、１０３高い触媒効力で活性化される。従って、組織プラスミノゲン活性化因子の血栓溶解特性は、フィブリンの存在によって非常に大きく増強される。
【０００９】
５００〜１０００の因子が、ｔ−ＰＡの相対的なフィブリン選択性について報告されている。触媒効果はまた、βアミロイドまたはフィブリノゲンとのプラスミノゲン活性化因子の相互作用によって増大され得る。フィブリノゲンによって活性化されるｔ−ＰＡの能力は、βアミロイドによって活性化されるその能力と同等である。
【００１０】
プラスミノゲン活性化因子の効果は、インヒビターにより生理学的に制御され、プラスミノゲン活性化因子インヒビターＩ（ＰＡＩ−１）は、重要なアンタゴニストである。ＰＡＩ−１の、ｔ−ＰＡ分子の軽構成鎖への結合は、プラスミノゲンとの活性化反応がそれ以上起こらないように、触媒中心の構造を変更する（非特許文献２）。
【００１１】
組織プラスミノゲン活性化因子は、肝臓によって急速に代謝される。従って、患者における肝臓の機能不全は、この物質の血漿中半減期を引き延ばす（非特許文献３；非特許文献４）。
【００１２】
プラスミノゲン活性化因子は、心筋梗塞および脳卒中のような血栓性疾患を処置するために開発される。ｔ−ＰＡは、脳卒中を治療するためにアメリカ合衆国において食品医薬品局（ＦＤＡ）により認可されている現在唯一の血栓溶解剤である。
【００１３】
それにもかかわらず、ｔ−ＰＡが、一方で、脳卒中の処置に関連する予期される正の血栓溶解効果を示し、他方ではまた、組織の望ましくない破壊の原因でもあるという疑いがこれまでに高まってきた。従って、ｔ−ＰＡをｔ−ＰＡ欠損マウスに注入することは、より大きな梗塞を生じる（非特許文献５）。これらの拡大された損傷は、ＮＭＤＡ依存性グルタミン酸レセプターの刺激に起因するということが予想される（非特許文献６）。ｔ−ＰＡによるＮＭＤＡレセプターのタンパク分解性切断は、この効果の原因であり得る（非特許文献７）。
【特許文献１】米国特許第４，７６６，０７５号明細書
【非特許文献１】ＢｏｄｅおよびＲｅｎａｔｕｓ：  Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ：ｖａｒｉａｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｒｙｓｔａｌ／ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｄｅｍａｒｃａｔｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９７年、７：８６５−８７２
【非特許文献２】Ｂｅｎｎｅｔ  ＷＦ，Ｐａｏｎｉ  ＮＦ，Ｋｅｙｔ  ＢＡ，Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  Ｄ，Ｊｏｎｅｓ  ＡＪＳ，Ｐｒｅｓｔａ  Ｌ，Ｗｕｒｍ  ＦＭ，Ｚｏｌｌｅｒ  Ｍ：  Ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９１年；２６６：５１９１−５２０１
【非特許文献３】Ｅｍｅｉｓ  ＪＪ，ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎ  ＣＭ，Ｊｅｎｓｅ  Ｄ：  Ｈｅｐａｔｉｃ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  ｒａｔｓ，  Ｔｈｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓ  １９８５年；５４：６６１−６６４
【非特許文献４】Ｔｉｅｆｅｎｂｒｕｎｎ  ＡＪ，Ｒｏｂｉｓｏｎ  ＡＫ，Ｋｕｒｎｉｋ  ＰＢ，Ｌｕｄｂｒｏｏｋ  ＰＡ，Ｓｏｂｅｌ  ＢＥ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｖｏｌｖｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９８５年；７１：１１０−１１６
【非特許文献５】Ｗａｎｇ  ＹＦ，Ｔｓｉｒｋａ  ＳＥ，Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  Ｓ，Ｓｔｉｅｇ  ＰＥ，Ｓｏｒｉａｎｏ  ＳＧ，Ｌｉｐｔｏｎ  ＳＡ：  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔＰＡ）  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄａｍａｇｅ  ａｆｔｅｒ  ｆｏｃａｌ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｔＰＡ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９９８年；４（２）：２２８−２３１
【非特許文献６】Ｌｉｂｅｒａｔｏｒｅ  ＧＴ，Ｓａｍｓｏｎ  Ａ，Ｂｌａｄｉｎ  Ｃ，Ｓｃｈｌｅｕｎｉｎｇ  ＷＤ，Ｍｅｄｃａｌｆ  ＲＬ：Ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｄｅｓｍｏｔｅｐｌａｓｅ）：ａ  ｕｎｉｑｕｅ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈａｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｓｔｒｏｋｅ  ２００３年；３４（２）：５３７−５４３
【非特許文献７】Ｎｉｃｏｌｅ  Ｏ，Ｄｏｃａｇｎｅ  Ｆ，Ａｌｉ  Ｃ，Ｍａｒｇａｉｌｌ  Ｉ，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ，ＭａｃＫｅｎｚｉｅ  ＥＴら：Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＮＭＤＡ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００１年；７（１）：５９−６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、本発明の目的は、血栓性疾患、特に脳卒中の新規の治療上の処置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の目的は、天然のプラスミノゲン活性化因子と比較すると減少されているリシン結合能を示すプラスミノゲン活性化因子を使用することによって達成される。特に有利な実施形態において、このプラスミノゲン活性化因子は、改変されたクリングルドメイン、好ましくは天然のｔ−ＰＡと比較すると改変されているクリングル２ドメインを示す。この後者のドメインは、リシン結合能を減少するように、全体的にか、または部分的に欠失され得る。
【００１６】
このＫ２ドメイン、あるいはそれと機能的または構造的に、本質的に相同な領域は、リシン残基がこれ以上結合しないように、または低い親和性で結合するのみであるように、有利に改変され得る。
【００１７】
特に有利な実施形態において、本発明に従って使用され得るこのプラスミノゲン活性化因子は、改変ｔ−ＰＡである。
【００１８】
このＫ２ドメイン（ｔ−ＰＡ  Ｋ２欠失変異体の調製物を含む）の重要性は、Ｈｏｒｒｅｖｏｅｔｓ  ＡＪ、Ｓｍｉｌｄｅ  Ａ、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  Ｃ、Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ  Ｈ（Ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｆｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  ｋｒｉｎｇｌｅ  ２  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，１７，１２６３９−１２６４４，１９９４）において詳細に記載される。
【００１９】
それらのリシン結合能が、欠失しているか、または減少されているので、本発明に従って使用され得るプラスミノゲン活性化因子は、上昇したフィブリン選択性およびフィブリノゲンまたはβアミロイドによって活性化される減少した能力を示す。フィブリノゲンにより活性化されるこの減少した能力は、おそらくフィブリン選択性の原因である。高いフィブリン選択性のプラスミノゲン活性化因子による保有は、脳卒中の処置に関連してかなりの重要性を有する。特に、例えば、天然のｔ−ＰＡが、フィブリノゲンによって活性化され得、損傷した血液−脳障壁を克服し、次いで、引き続いてＮＭＤＡレセプターを活性化することによりグルタミン酸媒介性興奮毒性を刺激するためである。従って、本発明に従うフィブリノゲンにより活性化されるプラスミノゲン活性化因子の能力の減少はまた、神経毒性の減少を導く。
【００２０】
ｔ−ＰＡクリングル２上のリシン結合部位の重要性は、特に、ＤＳＰＡと比較したｔ−ＰＡの構造的ドメインおよび機能的ドメインの比較研究の結果として、明らかになった。ＤＳＰＡは、元々は、吸血コウモリの唾液から単離されたプラスミノゲン活性化因子である（この点に関しては、米国特許第６，０００，０１９号；欧州特許第０  ３８３  ４１７号を参照のこと）。ＤＳＰＡは、４つのアイソフォームに単離され得、そのうちのＤＳＰＡα１は、ＣＨＯ細胞を用いて組み替え的に調製され得る。
【００２１】
ｔ−ＰＡとは対照的に、ＤＳＰＡは、１つのクリングルドメインのみを有する。このドメインは、ｔ−ＰＡのＫ２ドメインよりもｔ−ＰＡのＫ１ドメインに、機能的および構造的により近く相当し、そして、いかなるリシン結合部位も有さない（Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ  Ｐ，Ｇｒｕｂｅｒ  Ｄ，Ｌｉｅｓｅ  Ａ，Ｔｏｓｃｈｉ  Ｌ，Ｋｒａｅｔｚｓｃｈｍａｒ  Ｊ，Ｓｃｈｌｅｕｎｉｎｇ  ＷＤ，Ｄｏｎｎｅｒ  Ｐ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ；  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９５；２７０（４３）：２５５９６−２５６０３）。このように、文献において、ＤＳＰＡがいかなるクリングル２ドメインも有さないという趣旨の、いくつかの記載が存在する。
【００２２】
さらに、ｔ−ＰＡの場合と同じように、プラスミン活性化部位が欠けているので、ＤＳＰＡは常に単鎖分子として存在する。ｔ−ＰＡと比較して、ＤＳＰＡの活性は、フィブリンの存在下で約４５０００倍刺激されるが、Ｇａｒｄｅｌｌ  ＳＪ，Ｄｕｏｎｇ  ＬＴ，Ｄｉｅｈｌ，Ｙｏｒｋ  ＪＤ，Ｈａｒｅ  ＴＲ，Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ＲＢ，Ｊａｃｏｂｓ  ＪＷ，Ｄｉｘｏｎ  ＲＡ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＰＡ（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃ−ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９８９；２６４（３０）：１７９４７−１７９５２）によると、この値は２０５である。
【００２３】
ＤＳＰＡの構造の図は、図２として添付される。図２ｂは、ｔ−ＰＡのアミノ酸配列とＤＳＰＡのアミノ酸配列との比較を示す（配列番号１および配列番号２）。
【００２４】
従来、ｔ−ＰＡのフィブリンに結合する能力は、機能的にフィンガードメインおよびクリングル２によるものであった（ｖａｎ  Ｚｏｎｎｅｎｆｅｌｄ  ＡＪ，Ｖｅｅｒｍａｎ  Ｈ，Ｐａｎｎｅｋｏｅｋ  Ｈ：（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８３：４６７０−４６７４）。しかしながら、より最近の刊行物はまた、プロテイナーゼドメインＰが、この点に関して特定の関連性を有し得るということを示唆する（Ｂｅｎｎｅｔｔ、上記引用文）。個々のドメインの機能はまた、Ｂａｋｋｅｒ  ＡＨＦ，Ｊａｃｏｌｉｎｅ  Ｅ．，Ｗｅｅｎｉｎｇ−Ｖｅｒｈｏｅｆｆｅｔ．Ｄ．，Ｖｅｒｈｅｉｊｅｎ  ＪＨ（Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌｙｓｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎ  ｃｌｏｄ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７０，２１，１２３５５−１２３６０，１９９５）によって研究されてきた。
【００２５】
Ｂａｋｋｅｒらは、ｔ−ＰＡの種々の改変（例えば、クリングル２、フィンガードメインまたは上皮増殖因子ドメインのいずれかを欠く２つの欠失変異体）を調製した。これらの変異体はまた、組み合わせられ、そしてそれらのうちのいくつかは、さらにクリングル２における点変異、すなわち置換Ｄ２３６Ｎを備える。この選択的アミノ酸置換は、位置２３６におけるＡｓｐのアスパラギンによる置換を生じ、それにより、リシン結合部位の欠失を生じる（Ｋ２ドメインにおけるＬＢＳ）。この変異体の調製について、Ｂａｋｋｅｒらの上述の刊行物、そこに引用される参考文献を参照のこと。
【００２６】
彼らの研究において、Ｂａｋｋｅｒらは、ＥＡＣＡ（ε−アミノカプロン酸）によるＫ２ドメインにおけるリシン結合部位の占有が、フィブリンに対する天然のｔ−ＰＡの結合を著しく減弱させるということを実証した。同じことが、減弱がより少ないということを除いて、Ｄ２３６Ｎ置換によるＬＢＳの改変に当てはまった。欠失変異体（Ｋ２ドメインおよびタンパク分解性Ｃ末端のみからなる）でさえ、わずかな程度ではあるが、やはりフィブリンに結合している。Ｋ２Ｐ変異体（ＬＢＳが欠失された）だけが、いかなるフィブリン結合も示さなかった。
【００２７】
これらの結果が、一方ではＦドメインおよびＫ２ドメイン、ならびにＫ２におけるＬＢＳの重要性を実証するが、それらはまた、フィブリンのｔ−ＰＡの相互作用が、ＦドメインおよびＫ２ドメインにより排他的に媒介されないということを実証する。むしろ、Ｋ２ドメインにおけるＬＢＳの機能がまた存在し、ＬＢＳはおそらくフィブリン結合について有利であるｔ−ＰＡの確立を安定化する原因である。
【００２８】
リシン結合部位を含むＫ２ドメインの重要性は、Ｓｔｅｗａｒｔ  ＲＪ，Ｆｒｅｄｅｎｂｕｒｇｈ  ＪＧおよびＷｉｔｚ  ＪＩ（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  ｖａｍｐｉｒｅ  ｂａｔ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ，  ｆｉｂｒｉｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  Ｄ−ｄｉｍｅｒ  ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｅ：  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３，２９，１８２９２−１８２９９，１９９８）によって行われた研究により明らかにされてきた。
【００２９】
結合研究において、Ｓｔｅｗａｒｔらは、特に、ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡのフィブリンおよびフィブリノゲンに対する親和性を調査した。これらの研究において、これらの親和性は、クリングル依存性相互作用の重要性を分析するために、リシンアナログであるＥＡＣＡの存在下で、または非存在下で調査された。彼らは、彼らの調査から、ＤＳＰＡはクリングルにおいてリシン結合部位を欠くのでフィブリノゲンに結合することができないと結論付けた。従って、彼らは、ｔ−ＰＡがフィブリンに結合する能力に不可欠である機能が、フィンガードメインと併せて、ｔ−ＰＡクリングル２におけるＬＢＳの特性であると推測する。
【００３０】
実施例１において報告される実験に基づく結果は、補因子βアミロイド（１−４２）、フィブリノゲンおよびフィブリンに対する、ＤＳＰＡα１および組換えヒトｔ−ＰＡの異なる親和性を確認する。これらのデータを得るために、動態パラメーターｋｃａｔおよびＫｍ、ならびにｋｃａｔ／Ｋｍ比が、各プラスミノゲン活性化因子／補因子の組み合わせについて決定された。補因子の非存在下において、プラスミノゲン活性化因子に対するＤＳＰＡα１の有効性は、この２つの化合物がフィブリンの存在下で等しく有効であるのに対して、ｔ−ＰＡの有効性よりも約１００倍低かった。ＤＳＰＡα１は、フィブリノゲンまたはβアミロイド補因子の存在下におけるｔ−ＰＡよりも約３０倍低い有効性であった。２μＭの生理学的なプラスミノゲン濃度において、これらのデータは、フィブリンの有効性についての比を、フィブリノゲンまたはβアミロイドの有効性についての補因子として、ＤＳＰＡα１の場合において４８０として、そしてヒトｔ−ＰＡの場合において１６として得る。
【００３１】
既に上で説明されてきたように、本発明に従って使用されるプラスミノゲン活性化因子は、そのクリングル２リシン結合部位が、存在しないか、または改変されているという事実によって特徴付けられる。１つの実施形態において、このクリングル２は欠失されている。しかしながら、別の実施形態において、クリングル２を保持し、そして位置２３６のアスパラギン酸をアスパラギンで置換することもまた、可能である。ゆえに、本発明に従ってクリングル構造を欠くように改変されたｔ−ＰＡは本発明に必須であるわけではなく、ｔ−ＰＡの活性を増大する補因子との相互作用が、もはや不可能であるように改変されたリシン結合部位のみが、本発明に必須である。
【００３２】
別の有利な実施形態において、使用されるプラスミノゲン活性化因子、特に改変されたｔ−ＰＡは、ｔ−ＰＡがレセプターにもはや結合できないように、クリングル１の欠失によって改変され得る。その結果、この組織プラスミノゲン活性化因子は、肝臓によって本来の様式ではもはや代謝されず、インビボでの延長された半減期を生じる（Ｒｉｊｋｅｎ  ＤＣ，Ｏｔｔｅｒ  Ｍ，Ｋｕｉｐｅｒ  Ｊ，ｖｏｎ  Ｂｅｒｋｅｌ  ＴＪＣ：  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｔ−ＰＡ）  ｂｙ  ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９９０；Ｓｕｐｅｌ．Ｘ：６３−７１）。クリングル１の欠失は、レテプラーゼ（ｒｅｔｅｐｌａｓｅ）から公知であり、例えば、
【００３３】
【数１】
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によって記載される。これに関して、用途はアミノ酸４〜１７６が欠失している変異体の作製である。半減期を延長することは、このプラスミノゲン活性化因子をボーラスとして投与することを可能にする。
【００３４】
好ましい実施形態において、本発明に従って使用され得るプラスミノゲン活性化因子は、図３、１１または１３において示されるアミノ酸配列の１つに基づく。これらのアミノ酸配列の各々は、改変されたｔ−ＰＡを構成し、ここで、クリングル２は欠失され、そして構造的な変化が、ｔ−ＰＡ活性化切断部位についての配列の領域において作製された。この変化は、活性化切断部位（例えば、ＨＳによる；配列番号３（図３）を参照のこと）におけるアミノ酸Ｒおよびアミノ酸Ｉの置換のみに存在するか、あるいは、隣接するアミノ酸（例えば、配列番号４（図１１）におけるＬＨＳＴでのＦＲＩＫの置換）にさらに影響を及ぼすかのいずれかである。後者の改変は、この点において天然のＤＳＰＡの構造に対応する。
【００３５】
本発明に従って、特に適切に、天然のｔ−ＰＡの利点（すなわち、特に、ヒト患者において使用された場合の低い免疫原性）とＤＳＰＡの利点（すなわち、神経毒性の欠如）を組み合わせるプラスミノゲン活性化因子を製造し、そして脳卒中処置のために使用することが好ましい。本発明の１つの実施形態において、ｔ−ＰＡクリングル２の欠失は、下流構造に対する遷移領域が作製され、この遷移領域が、ＤＳＰＡにおける類似の構造に対応するように選択される。この改変されたｔ−ＰＡの残存するクリングル１ドメインと下流システイン架橋との間の遷移領域は、従って、配列ＳＫＡＴによって有利に形成される。ＤＳＰＡにおいて、配列ＳＫＡＴは、クリングルとシステイン架橋との間に位置される。この有利な構造は、例えば、図１１に示される配列番号４において理解される。
【００３６】
図１２（多重配列アラインメント）は、ｔ−ＰＡと本発明に従う二つの記載される実施形態との間の比較を示す。
【００３７】
本発明に従う別の実施形態において、用途は、図１３（配列番号５）に示されるプラスミノゲン活性化因子の作製である。
【００３８】
本発明に従って、図３、１１および１３に示されるアミノ酸配列と相同であるか、あるいは部分的に同一である配列を有するタンパク質を使用することもまた当然に可能である。少なくとも７０％、好ましくは８０％と９５％との間の相同性または同一性が好ましい。これらの相同または同一のタンパク質は、プラスミノゲン活性因子（好ましくは、ｐＮＡの放出として示される）の活性を示し、インビトロでの血餅の溶解を引き起こす（実施例３を参照のこと）。
【００３９】
本発明に従って使用されるプラスミノゲン活性化因子は、フィンガードメインおよび上皮増殖因子ドメインの欠如によって特徴付けられ得る。この欠失は、肝臓レセプターへの結合を実質的に減少し、再度半減期を延長する
【００４０】
【数２】
2007505079.tif 000003
。
【００４１】
欠失変異体を除き、本発明に従って使用され得るプラスミノゲン活性化因子はまた、特定の部位の突然変異誘発によって点状にのみ改変され得る。従って、例えば、ｒｔ−ＰＡ−ＴＮＫ（テネクプテラーゼ（ｔｅｎｅｃｐｔｅｌａｓｅ））から、一方では、プラスミノゲン活性化因子インヒビターに対する結合部位での、そして他方では、ｔ−ＰＡが肝細胞に結合する結合部位での３つの変異が、触媒活性を増大させると同時に、ＰＡＩによって不活性化する能力を減少させる。このことにより、テネクテプラーゼは、１００倍に増大された触媒変換定数Ｋｃａｔ／Ｋｍを得た（このことに関して、
【００４２】
【数３】
2007505079.tif 000004
もまた参照のこと）。
【実施例】
【００４３】
（実施例１：）
１．βアミロイド（１〜４２）、フィブリノゲンおよびフィブリンの、ＤＳＰＡα１および組換えヒトｔ−ＰＡによるプラスミノゲン活性化に対する、補因子としての有効性の比較分析。
【００４４】
（材料および方法）
以下の物質を使用した。
【００４５】
−ＤＳＰＡα１（Ｐａｉｏｎ社製、ロット番号  ２ＤＳＡ０１、２００２年１２月１２日、サンプル１０）。１０ｍｇのこの物質を、１０ｍｌの滅菌水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００４６】
−組換えｔ−ＰＡ（Ａｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）、Ｐａｉｏｎ社製、ロット番号  １０２５７２）。１０ｍｇを、１０ｍｌの滅菌水に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００４７】
−ヒトＧｌｕプラスミノゲン、ヒト血漿（Ｐａｉｏｎ社製）から精製し、２５μＭの濃度でＰＣＬＡ緩衝液中に溶解させた。
【００４８】
−ヒトフィブリノゲン（本質的にプラスミノゲンを含まない）を、Ｓｉｇｍａから得た（カタログ番号  Ｆ４８８３、ロット  １２Ｋ７６２０）。２５ｍｇを、２５ｍｌのＰＣＬＡ緩衝液中に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００４９】
−ヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ；カタログ番号  Ｔ７００９．  ロット  ６１Ｋ７６０３）。１００Ｕを、１０ｍｌのＰＣＬＡ緩衝液に溶解させ、１０Ｕ／ｍｌの濃度を得た。
【００５０】
−Ｂｉｏｐｏｏｌ社製（カタログ番号  １０１３５３、ロット  １５１２０１６）のＦｌａｖｉｇｅｎ．ｐｌｉ呈色試薬（Ｄ−ｂｕｔ−ＣＨＴ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリン−ＤＨＣＬ）。１００μＭを、５０ｍｌのＰＣＬＡ緩衝液中に溶解させ、２ミリモル濃度の最終濃度を得た。
【００５１】
−Ｂａｃｈｅｍ社製（カタログ番号  Ｈ−１３６８、ロット  ０５３５１２０）のβアミロイドタンパク質（１〜４２）。４ｍｇを、４ｍｌの０．１％水酸化アンモニウム中に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【００５２】
すべての試薬を、アリコートに分け、２週間以内で−２０℃で保存した。
【００５３】
ＰＬＣ緩衝液（Ｊｏｎｅｓ  １９９０）：０．１Ｍ  ＮａＣｌ．２Ｈ２Ｏ（Ａｃｒｏｓ  カタログ番号  ２０７７９）；０．０３Ｍ  ＮａＨＣＯ３（Ａｃｒｏｓ  カタログ番号  ２１７１２）；４ｍＭ  ＫＣｌ（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号  ６０１３０）；１ｍＭ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（Ａｃｒｏｓ  カタログ番号  ２０７７８０）；１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号  ７１６３８）；０．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ（Ａｃｒｏｓ  カタログ番号  １９７５３０）；０．４ｍＭ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号  ６３１４０）；２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ  カタログ番号  Ａ１９６９）；０．０１％  ポリソルベート  ８０（Ｆｌｕｋａ、カタログ番号  ９３７８１）。
【００５４】
（プラスミノゲン活性化アッセイ：）
プラスミノゲン活性化についてのアッセイを、Ｂｒｉｎｇｍａｎｎら（上記引用文）に記載のように、マイクロタイタープレート上で、０．１５ｍｌの総体積で行った。以下の通り試薬を添加した：
５０μｌのプラスミノゲン（０〜２４μＭ）；１５μｌの補因子（１ｍｇ／ｍｌ）；１０μｇのプラスミノゲン活性化因子７．５ｎＭおよび７５μｌのＦｌａｖｉｇｅｎ（２ｍＭ）。
【００５５】
最終濃度を以下の通りにした：
プラスミノゲン活性化因子：（ｔ−ＰＡまたはＤＳＰＡα１）：０．５ｎＭ；Ｇｌｕ−プラスミノゲン；０．０６２５μＭ、０．１２５μＭ、０．２５μＭ、０．５μＭ、１μＭ、２μＭ、４μＭおよび８μＭ；ＦｌａｖｉｇｅｎＰｌｉ：１ｍＭおよび補因子：１００μｇ／ｍｌ。
【００５６】
補因子βアミロイド（１〜４２）、フィブリノゲンおよびフィブリンを、補因子を伴わないコントロールと比較した。コントロールについて、反応混合物に、さらなる０．１３ユニット／ｍｌのヒトトロンビンを含ませた。
【００５７】
添加の直後に、このマイクロタイタープレートを、２５℃で、ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ  ＴｈｅｒｍｏＭａｘ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ中に取り込んだ。
【００５８】
攪拌を、時間ｔ＝０から行った。
【００５９】
４０５ｎｍおよび４９０ｎｍでの光学濃度を、一定の間隔で測定した。４９０ｎｍでの光学濃度を、４０５ｎｍでの光学濃度から差し引き、液体の動きに起因する差異を除いた。全ての実験を、各プラスミノゲン濃度およびプラスミノゲン活性化因子濃度を用いて３回繰り返して行った。
【００６０】
Ｋｍおよびｋｃａｔ値を決定した（図４〜６）。
【００６１】
（図４）
ａ）ｐＮＡのモル濃度吸光度の決定。
【００６２】
ｂ）１０ｎＭプラスミンによるＦｌａｖｉｇｅｎ．ｐｌｉの、Ｆｌａｖｉｇｅｎ．ｐｌｉ濃度（μＭ単位）の関数としての変換。
【００６３】
ｃ）１０ｎＭプラスミンによるＦｌａｖｉｇｅｎの変換のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロット。図４ｂからの初速度を、ｐＮＡ／ｓに変換した。
【００６４】
（図５）
プラスミノゲン活性化因子および補因子の４つの異なる組み合わせについての、時間に対する光学濃度の曲線。８μＭ；４μＭ；２μＭ；１μＭ；０．５μＭ；０．２５μＭ；０．１２５μＭおよび０．０６２５μＭのプラスミノゲン濃度を、この目的のために使用した。
【００６５】
ａ）補因子を伴わないｔ−ＰＡ
ｂ）補因子としてβ−アミロイド（１〜４２）を伴うｔ−ＰＡ
ｃ）補因子としてフィブリノゲンを伴うｔ−ＰＡ
ｄ）補因子としてフィブリンを伴うｔ−ＰＡ
ｅ）補因子を伴わないＤＳＰＡα１
ｆ）補因子としてβ−アミロイド（１〜４２）を伴うＤＳＰＡα１
ｇ）補因子としてフィブリノゲンを伴うＤＳＰＡα１
ｈ）補因子としてフィブリンを伴うＤＳＰＡα１
（図６）
プラスミノゲン濃度に対する｛＝ｋｓ．ｋｃａｔ．ＰＡ．Ｅ．Ｐ．／（Ｋｍ＋Ｐ）｝のプロット。
【００６６】
ａ）補因子、あるいは補因子としてβ−アミロイド、フィブリノゲンまたはフィブリンを伴わないｔ−ＰＡについてのプロット
ｂ）補因子を伴わないＤＳＰＡα１１１．３８についてのプロット
（結果：）
【００６７】
【表１】
2007505079.tif 000005
表１：β−アミロイド（１〜４２）、フィブリノゲンまたはフィブリンを補因子として用いた、組換えヒトＴ−ＰＡまたはＤＳＰＡα１による、プラスミノゲンの活性化についてのｋｃａｔ／Ｋｍ値。
【００６８】
結果を、３回の独立した実験の平均値±標準偏差として得る。
【００６９】
Ｋｍ値が、使用可能な最大プラスミノゲン濃度（８μＭ）よりも高かったので、ｋｃａｔおよびＫｍについての正確な値を決定することは可能ではなかった。
【００７０】
Ｋｍ値に近いか、それ以下のプラスミノゲン濃度での反応速度がプラスミノゲン濃度に依存するので、速度定数の導出は、異なる補因子の有効性を比較するためには、そのままでは不十分でる。この理由のために、２μＭでの生理学的血漿プラスミノゲン濃度で、ミヒャエーリス−メンテン速度論を用いて、反応速度を計算する。ｔ−ＰＡおよびＤＳＰＡα１による、プラスミノゲン活性化についての異なる補因子の相対的な有効性（表２）を、この原理で決定する。
【００７１】
【表２】
2007505079.tif 000006
表１における動態パラメーターを用いて計算した、２μＭの生理学的プラスミノゲン濃度でのプラスミノゲン活性化の相対速度。ＤＳＰＡコントロールの組み合わせを１とする。
【００７２】
（実施例２：）
プリオン病、すなわち、海綿状脳障害は、アミロイド堆積物中の異常なアイソフォームのプリオンタンパク質（ＰｒＰＳＣ）の蓄積によって特徴付けられる、致命的な神経変性現象である。正常なプリオンタンパク質（ＰｒＰＣ）は、多くの組織（特に、脳）において発現され、シナプスにおいて濃縮される。ＰｒＰＳＣを生じるＰｒＰＣの構造における変化のメカニズムは、まだ十分には理解されておらず、ＰｒＰＳＣ形成による神経変性を導くメカニズムもまた、理解されていない。考え得るメカニズムが、ｔ−ＰＡによるプラスミノゲンの活性化に関連するＰｒＰＳＣへの影響に見出され得る。
【００７３】
本発明者らはすでに、組換えタンパク質を用いて、ＰｒＰがｔ−ＰＡによって触媒されたプラスミノゲン活性を３００倍に増大し得ることを示した
【００７４】
【数４】
2007505079.tif 000007
。
【００７５】
ＰｒＰがプラスミノゲン活性化を刺激する能力は、ＰｒＰの構造に依存しており、この構造は、Ｃｕ２＋の存在または非存在により影響された。後者の形態は、ＰｒＰＳＣアイソフォームに相当するβ構造を数多く包含し、そしてプラスミノゲン活性化を刺激する。これらのデータは、プラスミノゲンが、スクラピー感染マウスの脳から単離されたＰｒＰＳＣには結合したが、正常な脳細胞のＰｒＰＣには結合しなかったという初期の観察と一致する
【００７６】
【数５】
2007505079.tif 000008
。
【００７７】
さらに、本発明者らの実験は、ＰｒＰによって刺激されるプラスミノゲン活性化のメカニズムがまた、ａｐｏＰｒＰ（すなわち、Ｃｕ２＋を伴わないＰｒＰ）へのｔ−ＰＡの結合を包含するということを示した。この結合に必要とされる構造は、詳細にはまだ評価されていない。しかしながら、この結合は、ＤＦＰ不活性化ｔ−ＰＡによって妨げられたので、特異的である。
【００７８】
（他の方法：）
これらの研究において使用されたＰｒＰ群は、各々の場合においてＥ．ｃｏｌｉから単離された組換えマウスＰｒＰに由来した。Ｈｉｓ標識されたＰｒＰの精製に引き続き、塩化銅の非存在下または存在下において、ｈｏｌｏ−ＰｒＰまたはａｐｏ−ＰｒＰのいずれかを形成するために、このタンパク質を再度折りたたむ。これらのタンパク質の凝集した形態を、各々の場合において、水への急速な溶解により生成する。このタンパク質を遠心分離により回収した。この材料は、プロテイナーゼＫ消化に対し抵抗性である。Ｃｕ２＋結合部位を含まない変異体Δ５１−９０形態を、同様に調製した。ＤＳＰＡによるプラスミノゲン活性化に対する、これらの異なる形態のＰｒＰの効果を、ＰｒＰ（０〜１００μｇ／ｍ）を、Ｌｙｓ−プラスミノゲン（２５ｎｍ）およびＤＳＰＡ（０．２５ｎｍ）とインキュベートすることにより調査した。プラスミノゲン活性化を、３７℃で、ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｇｅｍｉｎｉ−ｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅマイクロプレートリーダーを用いて、プラスミノゲン特異的色素であるＨ−ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ―７−アミド−４−メチルクマリンの加水分解によって決定する。これらの実験のコントロールは、プラスミノゲン活性化に対するＰｒＰの効果についてのポジティブコントロールとしてはｓｃ−ｔ−ＰＡを含み、そしてｔ−ＰＡ活性およびＤＳＰＡ活性の刺激についてのポジティブコントロールとしてはフィブリンフラグメントを含む。
【００７９】
プラスミノゲン結合の特異性を、ＤＦＰ−不活性化ｔ−Ｐａとの競合によって決定した。リシンアナログであるＥＡＣＡもまた、競合的なインヒビターとして使用した。
【００８０】
（結果：）
実験の結果を、表３および図７〜１０において表す。
【００８１】
図７は、特に、有益な知見を提供する。この図は、ＰｒＰが特異的にｔ−ＰＡのみを活性化し、ＤＳＰＡを活性化しないことを明らかにする。これは、ＤＳＰＡとｔ−ＰＡとの間の本質的な違いとして、クリングル２のリシン結合部位が関連しているに違いないことを、さらに明らかにした。表３。
【００８２】
【表３】
2007505079.tif 000009
（実施例３：）
（ａ．ヒト化ＤＳＰＡ（ｈｕｍＤＳＰＡ）（アミノ酸配列を図１１に示す）の調製および精製）
組換えヒトＤＳＰＡバキュロウイルスＤＮＡを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて調製し、そして精製したウイルスＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞にトランスフェクとした。生成した組換えバキュロウイルスを、Ｓｆ９細胞を用いて増幅した。ＨｕｍＤＳＰＡを、懸濁培養液中の無血清培地において、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ昆虫細胞を用いて発現させた。この組換えタンパク質を含む細胞培養液上清を、さらなる使用時まで−２０℃で凍結した。
【００８３】
この細胞培養液上清を、振盪機上で、室温でゆっくりと解凍し、次いで４０００×ｇで１時間遠心分離した。このタンパク質溶液（１．５ｌ）を、５０ｍＭ  酢酸アンモニウムでｐＨ６．０まで平衡化し、ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）イオン交換カラム（総容積３５０ｍｌ）に充填し、５カラム容積の５０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液で洗浄した。この結合タンパク質を、１０カラム容積以上の、０％〜１００％  １Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６）勾配において溶出した。
【００８４】
ＨｕｍＤＳＰＡ含有画分を、ウェスタンブロッティングによって同定した；タンパク質定量の後、これらの画分を活性試験に供し、−８０℃で凍結し、引き続いて凍結乾燥した。
【００８５】
標準的な活性試験とは対照的に、５０μｌ溶離液（＝ｈｕｍＤＳＰＡ含有画分）、５０μｌの０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）およびＰＢＳ中の１００μｌの２ｍＭ  Ｓ−２２８８を、この実験に使用した。
【００８６】
（ｂ．ＤＳＰＡ活性のアッセイ）
使用した活性アッセイは、プラスミノゲン活性化因子が、無色の物質であるＳ−２２８８を呈色産物へと変換する速度の決定である。このアッセイは、プラスミノゲン活性化因子のタンパク分解活性を決定するための標準的な方法である。この活性は、試験物質による色素体（ｐ−ニトロアニリン、ｐＮＡ）の放出の定量により可視化される。Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ社は、この目的のために、この色素体Ｓ−２２８８を提供する。
【００８７】
このアッセイにおいて、反応の速度は、直接的（例えば、触媒（ｃａｔａｌ）単位で）には決定されず；その代わりに１００％活性と定義される標準との比較がなされる。
【００８８】
反応速度を、以下の組成を有する緩衝液中で測定した：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８  ／  ０．１％アルブミン  ／  １００ｍＭ  ＮａＣｌ  ／  １．１ｍＭ  グリシン  ／  １．２ｍＭマンニトール  ／  ２．５ｍＭ  Ｓ−２２８８。
【００８９】
測定を、ブランク値、標準および異なる濃度のタンパク質を含有するサンプルを用いて、９６ウェルプレートにおいて行った。
【００９０】
４０５ｎｍでの吸光度の経時的な増大を、光度計を用いて記録した。曲線の直線部分の傾きを、Ｅｘｃｅｌを用いて決定した。これにより、活性を得た。
【００９１】
図１４に、画分の活性を示す（Ｓ−２２８８活性で表される）。銀染色したゲルを、図１５ａおよび図１５ｂに示す。図１６ａおよび図１６ｂに、ウエスタンブロットを示す。ウエスタンブロットで検出したタンパク質は、銀染色したゲル中の矢印で示されるタンパク質に対応する。
【００９２】
［Ｌ＝充填；Ｔ＝流入；Ｗ＝洗浄；０〜４０％  Ｂ、Ａ２、Ａ３・・・画分］
（実施例４：）
血餅溶解（血栓溶解活性）
ｈｕｍＤＳＰＡ含有画分Ｂ６の残渣を、１５ｍｌのＰＢＳ中に溶解させ、この溶液を４０００×ｇで１５分間遠心分離した。この画分は、最も高い純度を示すのでこの画分を選択した。アリコートを除去し、そして活性定量のために使用した。このサンプルの触媒活性は、５μｇ／ｍｌのアクチベース（ａｃｔｉｖａｓｅ）の触媒活性とほぼ同等であった。
【００９３】
使用した血餅は、２４時間前に採取した正常な血液サンプルに由来し、各々の場合において、ポリプロピレンチューブに移した２ｍｌの血液から形成し、自然状態で凝固させた。溶解を、ＰＢＳ中で行った。
【００９４】
ｈｕｍＤＳＰＡ含有画分Ｂ６（ＳＰＸＬ−セファロース補足工程から）を、まず凍結乾燥した。この残渣を、１５ｍｌのＰＢＳ中に溶解させ、４０００ｇで１５分間遠心分離した。この溶液のサンプルを、血餅を加える前に、Ｓ−２２８８活性決定のために除去した。このサンプルの触媒活性は、５μｇ／ｍｌのアクチベースの触媒活性に本質的に相当する。
【００９５】
図１７ａ〜１７ｄに、ｈｕｍＤＳＰＡ添加後、０時間、３時間、４時間および２４時間での血餅溶解の経時的な経過の結果を示す。各々の場合における左側の実験的なアッセイに、コントロールを示す。上記期間におけるｈｕｍＤＳＰＡ含有ＰＢＳを、右側のアッセイに表す。
【００９６】
血球は、崩壊する血餅からゆっくりと沈降する。４時間後にすでに識別され得るメッシュの型は、２４時間後に残存する。このアッセイにおいて、剥離した血球をシリンジを用いて４時間後に吸引し、残存する血餅の構造を見た。
【００９７】
血餅がもはやそれ自身の溶解産物を垂れ下げない（ｈａｎｇｉｎｇ）場合に、フィブリン溶解が減速するという事実が考慮されるべきである。いかなる血餅も、２４時間後に多少なりともまだ存在するからである。
【００９８】
この反応を定量化することは不可能である。しかしながら、ｈｕｍＤＳＰＡは、天然のＤＳＰＡと比較すると活性の顕著な増加を示す。なぜなら、少なくとも４倍の量のＤＳＰＡが、同じサイズの血餅を溶解するために使用されなければならないからである。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】記載無し。
【図２Ａ】記載無し。
【図２Ｂ】記載無し。
【図３】記載無し。
【図４Ａ】記載無し。
【図４Ｂ】記載無し。
【図４Ｃ】記載無し。
【図５Ａ】記載無し。
【図５Ｂ】記載無し。
【図５Ｃ】記載無し。
【図５Ｄ】記載無し。
【図５Ｅ】記載無し。
【図５Ｆ】記載無し。
【図５Ｇ】記載無し。
【図５Ｈ】記載無し。
【図６Ａ】記載無し。
【図６Ｂ】記載無し。
【図７】記載無し。
【図８】記載無し。
【図９】記載無し。
【図１０】記載無し。
【図１１】記載無し。
【図１２】記載無し。
【図１３】記載無し。
【図１４】記載無し。
【図１５Ａ】記載無し。
【図１５Ｂ】記載無し。
【図１６Ａ】記載無し。
【図１６Ｂ】記載無し。
【図１７】記載無し。
【図１】
2007505079.tif 000010
【図２】
2007505079.tif 000011
【図２Ｂ】
2007505079.tif 000012
【図３】
2007505079.tif 000013
【図４Ａ】
2007505079.tif 000014
【図４Ｂ】
2007505079.tif 000015
【図４Ｃ】
2007505079.tif 000016
【図５Ａ】
2007505079.tif 000017
【図５Ｂ】
2007505079.tif 000018
【図５Ｃ】
2007505079.tif 000019
【図５Ｄ】
2007505079.tif 000020
【図５Ｅ】
2007505079.tif 000021
【図５Ｆ】
2007505079.tif 000022
【図５Ｇ】
2007505079.tif 000023
【図５Ｈ】
2007505079.tif 000024
【図６Ａ】
2007505079.tif 000025
【図６Ｂ】
2007505079.tif 000026
【図１１】
2007505079.tif 000027
【図１２】
2007505079.tif 000028
【図１３】
2007505079.tif 000029
【図１７ａ】
2007505079.tif 000030
【図１７ｂ】
2007505079.tif 000031
【図１７ｃ】
2007505079.tif 000032
【図１７ｄ】
2007505079.tif 000033
【図７】
2007505079.tif 000034
【図８】
2007505079.tif 000035
【図９】
2007505079.tif 000036
【図１０】
2007505079.tif 000037
【図１４】
2007505079.tif 000038
【図１５Ａ】
2007505079.tif 000039
【図１５Ｂ】
2007505079.tif 000040
【図１６Ａ】
2007505079.tif 000041
【図１６Ｂ】
2007505079.tif 000042
【配列表】
2007505079000001.app
【国際調査報告】
2007505079.tif 000043
2007505079.tif 000044
2007505079.tif 000045
2007505079.tif 000046
2007505079.tif 000047
2007505079.tif 000048
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