(57)【要約】  本発明は、ウイルスによって不死化された肝細胞系に関するものであり、この肝細胞系は、正常な初代ヒト肝細胞に由来し、無血清培地中で増殖することができ、非腫瘍形成性であり、且つタンパク質を産生する。こうした細胞系は、潜在的治療用薬物及び化学物質の毒性試験のために使用することができる。この細胞系はまた、治療用血漿タンパク質を産生するために使用することもできる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスによって不死化された肝細胞であって、
（ａ）正常肝臓細胞に由来し、
（ｂ）非腫瘍形成性であり、且つ
（ｃ）内因性治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）を自然に産生する
肝細胞。
【請求項２】
ヒト肝臓細胞に由来する、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項３】
凍結保存された初代ヒト肝細胞に由来する、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項４】
実質上純粋なシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のＤＮＡを含む、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項５】
前記ＤＮＡが野生型ＳＶ４０ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原（ＴＡｇ）をコードしている、請求項４に記載の肝細胞。
【請求項６】
前記ＳＶ４０  ＴＡｇが癌抑制因子と相互作用する、請求項５に記載の肝細胞。
【請求項７】
前記癌抑制因子がヒトＲｂを含む、請求項６に記載の肝細胞。
【請求項８】
前記癌抑制因子がヒトｐ５３を含む、請求項６に記載の肝細胞。
【請求項９】
無血清培地中で維持することができる、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項１０】
前記無血清培地が、ＭＣＴ社製無血清培地である、請求項９に記載の肝細胞。
【請求項１１】
前記ＭＣＴ社製無血清培地が、ＭＦＥ（Ｍｕｌｔｉ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ多機能増強）培地である、請求項１０に記載の肝細胞。
【請求項１２】
肝機能を保持する、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項１３】
前記肝機能が、肝酵素活性を発現し続ける能力である、請求項１２に記載の肝細胞。
【請求項１４】
前記肝酵素活性がチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性である、請求項１３に記載の肝細胞。
【請求項１５】
前記肝細胞の前記肝酵素活性を、肝臓に対する化合物の作用を評価するために使用することができる、請求項１３に記載の肝細胞。
【請求項１６】
前記肝細胞の前記肝酵素活性を、肝臓に対する薬物候補の作用を評価するために使用することができる、請求項１３に記載の肝細胞。
【請求項１７】
前記肝細胞の前記肝酵素活性を、酵素誘導を評価するために使用することができる、請求項１３に記載の肝細胞。
【請求項１８】
前記肝細胞の前記肝酵素活性を、細胞毒性を評価するために使用することができる、請求項１３に記載の肝細胞。
【請求項１９】
前記肝細胞の前記肝酵素活性を、化合物に対する肝臓の作用を評価するために使用することができる、請求項１３に記載の肝細胞。
【請求項２０】
前記肝細胞を、薬物代謝を評価するために使用することができる、請求項１９に記載の肝細胞。
【請求項２１】
前記肝細胞を、種間比較を評価するために使用することができる、請求項１９に記載の肝細胞。
【請求項２２】
前記肝機能が、アセトアミノフェン抱合物を形成する能力である、請求項１２に記載の肝細胞。
【請求項２３】
前記ＴＰＰが、アルブミン、α１アンチトリプシン、血液凝固因子、トランスフェリン、及びインターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩＰ）からなる群から選択される、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項２４】
前記ＴＰＰが、少なくとも有効な量のアルブミンからなる、請求項２３に記載の肝細胞。
【請求項２５】
前記ＴＰＰが、少なくとも有効な量のα１アンチトリプシンからなる、請求項２３に記載の肝細胞。
【請求項２６】
前記ＴＰＰが、少なくとも有効な量の血液凝固因子からなる、請求項２３に記載の肝細胞。
【請求項２７】
前記血液凝固因子が第ＶＩＩＩ因子又は第ＩＸ因子である、請求項２６に記載の肝細胞。
【請求項２８】
前記ＴＰＰが、有効な量のトランスフェリンからなる、請求項２３に記載の肝細胞。
【請求項２９】
前記ＴＰＰが、少なくとも有効な量のインターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩＰ）からなる、請求項２３に記載の肝細胞。
【請求項３０】
前記肝細胞が、
（１）足場非依存性増殖、又は無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成などの標準の試験を使用した、化学的、物理的、且つウイルス性の作用物質、並びに癌遺伝子、及び腫瘍からの高分子量ゲノムＤＮＡを含めた導入遺伝子による悪性転換の研究、
（２）潜在的な化学療法剤をスクリーニングするための、癌遺伝子の導入によって改変された細胞の使用、
（３）細胞増殖と外因性因子の作用と相互に関係付けた、細胞内のｐＨ及びカルシウムレベルの変化を含めた細胞生化学の研究、
（４）増殖因子に対する細胞応答及び増殖因子の産生の研究、
（５）細胞内情報伝達の研究、
（６）細胞表面抗原の特徴付け、
（７）癌抑制活性を同定するための細胞間雑種の研究、
（８）新規遺伝子の同定、
（９）複製する肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、非Ａ非Ｂ型、ＨＡＶ、及び他の肝臓親和性のウイルス、例えばＣＭＶ）の増殖、
（１０）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療するための新たな薬物の同定、
（１１）移植の、また体外の肝移植片及び肝機能補助装置のための細胞の増殖、
（１２）肝臓寄生虫の研究、
（１３）肝疾患の研究、
（１４）潜在的治療用薬物の同定、
（１５）新たな薬物標的の同定、
（１６）最終分化を誘導する生物学的薬剤及び化学的薬剤の同定、
（１７）発癌物質及び他の生体異物の代謝の研究、
（１８）ＤＮＡ変異誘発の研究、
（１９）染色体損傷作用物質の研究、
（２０）薬物、化合物、発癌物質、及び生体異物の細胞毒性の研究、
（２１）肝細胞由来のタンパク質の産生、並びに
（２２）対象のタンパク質を産生するための組換えＤＮＡ発現ベクターの使用
からなる群から選択される手順を実施するために使用することができる、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項３１】
Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号５５６６）である、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項３２】
Ｅａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号５５６５）である、請求項１に記載の肝細胞。
【請求項３３】
ウイルスによって不死化されたヒト初代肝細胞系Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号５５６６）。
【請求項３４】
ウイルスによって不死化されたヒト初代肝細胞系Ｅａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号５５６５）。
【請求項３５】
肝臓に対する化合物の作用を評価するために、請求項１に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
【請求項３６】
前記化合物が薬物候補である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記肝機能が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記肝酵素活性がチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記不死化肝細胞が、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６５）及びＦａ２Ｎ−４細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６６）からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
酵素誘導を評価するために、請求項１に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
【請求項４２】
前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記肝細胞が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記肝酵素活性がチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記不死化肝細胞が、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６５）及びＦａ２Ｎ−４細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６６）からなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
細胞毒性を評価するために、請求項１に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
【請求項４７】
前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記肝機能が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記肝酵素活性がチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記不死化肝細胞が、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６５）及びＦａ２Ｎ−４細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６６）からなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
化合物に対する肝臓の作用を評価するために、請求項１に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
【請求項５２】
前記肝細胞が肝機能を保持する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記肝機能が肝酵素活性を発現する能力を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記肝酵素活性がチトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記不死化肝細胞が、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６５）及びＦａ２Ｎ−４細胞系（ＡＴＣＣ受託番号５５６６）からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記化合物に対する肝臓の作用が薬物代謝を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬物代謝をアセトアミノフェン抱合物の形成によって測定する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
（１）足場非依存性増殖、又は無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成などの標準の試験を使用した、化学的、物理的、且つウイルス性の作用物質、並びに癌遺伝子、及び腫瘍からの高分子量ゲノムＤＮＡを含めた導入遺伝子による悪性転換の研究、
（２）潜在的な化学療法剤をスクリーニングするための、癌遺伝子の導入によって改変された細胞の使用、
（３）細胞増殖と外因性因子の作用と相互に関係付けた、細胞内のｐＨ及びカルシウムレベルの変化を含めた細胞生化学の研究、
（４）増殖因子に対する細胞応答及び増殖因子の産生の研究、
（５）細胞内情報伝達の研究、
（６）細胞表面抗原の特徴付け、
（７）癌抑制活性を同定するための細胞間雑種の研究、
（８）新規遺伝子の同定、
（９）複製する肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、非Ａ非Ｂ型、ＨＡＶ、及び他の肝臓親和性のウイルス、例えばＣＭＶ）の増殖、
（１０）Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療するための新たな薬物の同定、
（１１）移植の、また体外の肝移植片及び肝機能補助装置のための細胞の増殖、
（１２）肝臓寄生虫の研究、
（１３）肝疾患の研究、
（１４）潜在的治療用薬物の同定、
（１５）新たな薬物標的の同定、
（１６）最終分化を誘導する生物学的薬剤及び化学的薬剤の同定、
（１７）発癌物質及び他の生体異物の代謝の研究、
（１８）ＤＮＡ変異誘発の研究、
（１９）染色体損傷作用物質の研究、
（２０）薬物、化合物、発癌物質、及び生体異物の細胞毒性の研究、
（２１）肝細胞由来のタンパク質の産生、並びに
（２２）対象のタンパク質を産生するための組換えＤＮＡ発現ベクターの使用
からなる群から選択される手順を実施するために、請求項１に記載の不死化肝細胞を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年１０月１０日出願の米国特許仮出願第６０／５１０，５０９号の利益を主張するものであり、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本発明は、一部が、米国商務省の先端技術計画（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ）によって与えられた助成番号７０−ＮＡＮＢ７Ｈ３０７０として米国政府の支援によってなされた。米国政府は、本発明において何らかの権利を有する。
【０００３】
本発明は、ウイルスによって不死化された新規な非腫瘍形成性の正常ヒト肝細胞系、並びにこうした細胞系の、潜在的治療用薬物及び化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）の毒性試験及び代謝試験、ウイルスの複製、及び治療用血漿タンパク質の産生のための使用に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
潜在的治療用薬物及び化合物の毒性試験及び代謝試験
薬物によって誘導される肝毒性は臨床上重要な問題であり、数種の薬物が稀ではあるが重篤な（致死の場合さえある）肝毒性を引き起こす特性により市場から撤退した。トランスポーターを含む、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）及び関係する薬物代謝酵素（ＤＭＥ）の誘導は、臨床上重要な薬物間相互作用の原因として良く認識されており、また効力の喪失（薬物動態学的耐性）又は自己誘導（薬物がそれ自体の肝代謝を誘導する過程）の原因でもある。創薬の際に、誘導物質を回避し、肝臓による薬物クリアランスの増大に起因する薬物間相互作用の潜在的可能性を特徴付けるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験を使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ誘導研究では、従来から選択マーカー化合物と共に、肝細胞初代培養及び酵素活性が使用されている。
【０００５】
ＣＹＰは、主に肝臓での薬物代謝に関与している。例えば、ＣＹＰ３Ａ遺伝子発現の誘導は、リファンピン、フェノバルビタール、クロトリマゾール、及びデキサメタゾンを含む市販の様々な薬物によって引き起こされ、いくつかの一般的な薬物間相互作用の基礎となっている（Ｍｅｕｎｉｅｒら、「ヒト肝細胞の初代培養物におけるＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、及びＣＹＰ３Ａ４の発現及び誘導：１０年間の追跡調査（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＹＰ１Ａ１／１Ａ２，ＣＹＰ２Ａ６  ａｎｄ  ＣＹＰ３Ａ４  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：ａ  １０  ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ）」，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ３０（６）：５８９−６０７，２０００；Ｓａｈｉら、「ヒト及びラットの肝細胞におけるチトクロムＰ４５０酵素に対するトログリタゾンの作用（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ｏｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」，Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃａ  ３０（３）：２７３−２８４，２０００；Ｌｕｏら、「薬物によるＣＹＰ３Ａ４の誘導：ヒト肝細胞におけるプレグナンＸ受容体レポーター遺伝子アッセイとＣＹＰ３Ａ４発現との相関（ＣＹＰ３Ａ４  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｒｕｇｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ＣＹＰ３Ａ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０（７）：７９５−８０４，２００２；Ｍａｄａｎら、「ヒト培養肝細胞におけるシトクロムＰ４５０発現に対するミクロソーム酵素誘導物質プロトタイプの影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１（４）：４２１−４３１，２００３）。
【０００６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素誘導を評価するためのガイドラインは、Ｔｕｃｋｅｒら（「創薬の最適化：薬物代謝／トランスポーター相互作用の可能性を評価するための戦略−コンセンサスに向けて（Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｔｏ  ａｓｓｅｓｓ  ｄｒｕｇ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ／ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ−ｔｏｗａｒｄ  ａ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）」，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ．Ｒｅｓ．１８：１０７１−１０８０，２００１）及びＢｊｏｒｓｓｏｎら（「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物間相互作用の研究の実施：ＰｈＲＭＡによる展望（Ｔｈｅ  ｃｏｎｄｕｃｔ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｒｕｇ−ｄｒｕｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ：Ａ  ＰｈＲＭＡ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ）」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ：４３：４４３−４６９，２００３）に要約されている。これら２つの「コンセンサスレポート」では、化合物及び薬物候補の酵素誘導能を評価するための選択方法、すなわち至適基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）としてヒト肝細胞の初代培養物が同定されている。薬物は、種特異的な酵素誘導を引き起こすことが知られているので、ヒト由来の試験系に基づくこのｉｎ  ｖｉｔｒｏ手法は、実験動物での試験に基づくｉｎ  ｖｉｖｏ手法よりも優れている。例えば、２つのプロトタイプの誘導物質、すなわちオメプラゾール及びリファンピンは、ヒトＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の有効な誘導物質であるが、ラット及びマウスでは対応する酵素を誘導しない。
【０００７】
ヒト肝細胞は、前臨床の創薬においていくつかの重要な役割を果たしている。これらの細胞は、肝臓に対する薬物候補の作用（例えば、誘導及び細胞毒性）を臨床的に意義のある形で評価するために使用することができ、逆に、化合物に対する肝臓の作用（例えば、薬物代謝及び種間比較）を評価するために使用することもできる。ヒト肝細胞の初代培養物は、ＣＹＰアイソフォームの種特異的な誘導を示すという別の利点がある。しかし、凍結保存又は培養されるヒト初代肝細胞の有用性は、ヒトの肝臓の供給が限られており不安定であることによって、またＤＭＥの発現及び毒物に対する応答の有意な個体間差によって制限される。
【０００８】
ＨｅｐＧ２やＨ４ＩＩＥなどの腫瘍細胞由来の細胞系が、候補化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性を比較するために日常的に使用されている。このような細胞が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞特異的毒性を予見させる因子のうちの多く又はほとんどを保持している可能性は低い。例えば、大部分の腫瘍由来細胞は高度に分化しない。すなわち、これらの細胞は培養物中で急速に増殖し、それには莫大なエネルギー（ＡＴＰ消費）が必要であり、細胞傷害に対するこれら細胞の感受性が非増殖性細胞に比べて高くなる可能性がある。
【０００９】
したがって、正常ヒト肝細胞の特性、すなわち代謝機能及びトランスポーター機能を保持しながら、再現性があり無制限に利用できるという別の利点を提供する、非腫瘍形成性の不死化ヒト肝細胞系が求められている。
【００１０】
治療用血漿タンパク質
アルブミン、α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）、血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、インターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩＰ）などの治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）に対して非常に大きな需要が存在する。細胞ベースの系によりＴＰＰが産生されれば、ウイルス又は他の病原体による潜在的な汚染など、血液に由来する産物の有する危険が回避されるはずである。
【００１１】
現在、臨床用及び治療用に認可されているタンパク質の大多数は、組換えタンパク質技術によって大量生産されている。こうした製品は安全で有効であることが確認されているが、すべてが、それらの自然の対応物と同じ挙動を示すとは限らない。例えば、組換え第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子（ｒＦ）は、注入後その血漿由来の対応物よりも急速に排泄される。Ｓｈａｐｉｒｏ，Ａ．、Ｅ．Ｂｅｒｎｔｏｒｐ及びＭ．Ｍｏｒｆｉｎｉ、「組換え第ＩＸ因子を処置した未治療患者における増分回復評価、並びに体重及び年齢の影響（Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ａｇｅ  ｉｎ  ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ）」，Ｂｌｏｏｄ，２０００．９６（ｓｕｐｐｌ  １）：ｐ．２６５ａ。最近の知見において、これは不完全な、又は不適当な翻訳後修飾の結果であることが示唆されている。
【００１２】
血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子の欠乏）は、米国で男性５，０００〜１０，０００人に１人の割合で発生する。一方、血友病Ｂ（第ＩＸ因子の欠乏）の発生率は、男性１０，０００人に０．２５人である。現在、血友病の生涯治療に血漿由来及び組換えによる第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子濃縮物が使用されている。これらのＴＰＰは不足しているため、世界中の血友病人口の４分の３が治療をほとんど、又は全く受けられないと推定されている。したがって、組換え体の、又は血液由来のＴＰＰの欠点を克服した、完全に機能的で完全に自然の血液凝固因子が明らかに必要である。
【００１３】
α１アンチトリプシン（ＡＡＴ）はヒトの血液タンパク質である。欧州及び米国で約１５０，０００〜２００，０００の人が重篤なＡＡＴ欠乏症（遺伝性肺気腫）を罹っていると考えられている。ＡＡＴの先天的欠乏症、嚢胞性線維症、及び慢性閉塞性肺疾患を含む、多くの呼吸器疾患が肺でのＡＡＴとエラスターゼの不均衡を特徴としている。補充のＡＡＴの投与は、こうした疾患で生じる肺への有害な影響を軽減させる点で臨床上有効である。
【００１４】
現在、米国で認可されている、血漿由来のＡＡＴが１つだけあるが、供給が非常に限られている。したがって、組換え体の、又は血液由来のＴＰＰの欠点を克服することができる、完全に機能的で完全に自然のＡＡＴが明らかに必要である。
【００１５】
敗血症は、感染に対する激しい全身応答を特徴とする疾患であり、誰もが罹る恐れがあり、肺炎、外傷、外科手術、熱傷などの事象によって、或いは癌又はＡＩＤＳなどの疾患によって誘発される恐れがある。米国では、敗血症は、非心臓系の集中治療室での死因の第１位であり、死因全体の第１１位である。現在、感染により器官機能障害が生じた場合、敗血症の治療は、潜在する感染を管理する試み及び支持療法に限られている。集中的な治療にもかかわらず、いまだ患者の最大５０％がこの疾患で死亡している。
【００１６】
インターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩＰ）は、血漿中に比較的高濃度で存在する自然のセリンプロテアーゼインヒビターであり、炎症、創傷治癒、及び癌転移においていくつかの役割を果たしている。Ｂｏｓｔ，Ｆ．、Ｍ．Ｄｉａｒｒａ−Ｍｅｈｒｐｏｕｒ及びＪ．Ｐ．Ｍａｒｔｉｎ、「細胞外マトリックスに結合し、これを安定化させるインターαトリプシンインヒビタープロテオグリカンファミリーα群のタンパク質（Ｉｎｔｅｒ−αａｌｐｈａ−ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ｆａｍｉｌｙ−α  ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）」，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８．２５２：ｐ．３３９−３４６。ＩαＩＰは、敗血症患者の予測因子として有効であると考えられている。Ｌｉｍ，Ｙ．Ｐ．ら、「インタートリプシンインヒビター：敗血症患者における血漿レベルの低下及び実験的敗血症モデルにおけるその薬効（Ｉｎｔｅｒ−ｔｒｙｐｓｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｓｅｐｓｉｓ  ｍｏｄｅｌ）」，Ｓｈｏｃｋ，２０００．１３（Ｓｕｐｐｌ．）：ｐ．１６１。敗血症ラットモデルを使用したｉｎ−ｖｉｖｏでの動物研究で、ＩαＩＰを投与すると生存率が劇的に改善されることが示されている。Ｙａｎｇ  Ｓら、「敗血症の際にヒトインターαインヒビターを投与すると、血行動態の安定性が維持され、生存率が改善される（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒａｌｐｈａ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｅｐｓｉｓ）」，Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００２  Ｍａｒ；３０（３）：６１７−２２。この結果は、重篤な敗血症の管理においてＩαＩＰが治療の潜在能力をもつことを強く支持する。しかし、敗血症患者に投与するためのＩαＩＰの供給は準備が整っていない。したがって、組換え体の、又は血液由来のＴＰＰの欠点を克服した、完全に機能的で、完全に自然のＩαＩＰが明らかに必要である。
【００１７】
不死化細胞系について記載する特許及び刊行物がいくつかある。すなわち、米国特許第６１０７０４３号（Ｊａｕｒｅｇｕｉ）、米国特許第５６６５５８９号（Ｈａｒｒｉｓ）、米国特許出願公開第２００２／００４５２６２Ａ１号（Ｐｒａｃｈｕｍｓｒｉ）、及び国際公開ＷＯ９９／５５８５３号（Ｎａｍｂａ）である。しかし、今まで、とりわけ先行技術の細胞系は、機能的な治療用血漿タンパク質の産生において決定的に重要である、グリコシル化などのタンパク質の翻訳後修飾を安全、効果的、且つ費用効率良く実施するとともに、多数の治療用血漿タンパク質、特に第ＶＩＩＩ因子タンパク質又は第ＩＸ因子を同時に産生し、また活性なレベルのチトクロムＰ４５０酵素の無血清培地中での連続的な発現を維持する手段を提供していない。したがって、正常ヒト肝細胞の特性を保持しており、適切に処理された治療用血漿タンパク質を産生するのに使用することができる、非腫瘍形成性の不死化ヒト肝細胞系が求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、無血清培地中で維持することができ、アルブミン、α１アンチトリプシン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、インターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩＰ）などの内因性血漿タンパク質を産生する、ウイルスによって不死化された非腫瘍形成性のヒト肝細胞系に関する。好ましい一実施形態では、非腫瘍形成性の不死化細胞系は、Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号５５６６）及びＥａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号５５６５）細胞系を含む。この細胞系は、ブダペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ）に従って、２００３年１０月６日に米国１２３０１メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｐａｒｋｌａｗｎ  ＤｒｉｖｅのＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ米国基準菌株保存機構）に寄託されている。
【００１９】
本発明の好ましい一実施形態では、この細胞系はヒト肝細胞に由来する。好ましくは、この細胞系は正常ヒト肝細胞に由来する。より好ましくは、この細胞系は凍結保存された正常ヒト初代肝細胞に由来する。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は培地中で容易に増殖する。好ましくは、この細胞系は、無血清培地中で容易に増殖する。より好ましくは、この細胞系はＭＦＥ培地（ＭｕｌｔｉＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国ロードアイランド州Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ；ＸｅｎｏＴｅｃｈ，ＬＬＣ社製、米国カンザス州Ｌｅｎｅｘａ）中で増殖する。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は実質的に純粋なＳＶ４０ＤＮＡを含む。好ましくは、このＳＶ４０ＤＮＡは、野生型のＳＶ４０ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原（ＴＡｇ）をコードしている。より好ましくは、このＤＮＡは、野生型ＴＡｇをコードしており、他のＳＶ４０遺伝子産物をコードしていない。
【００２２】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は、無血清培地中でその肝機能を保持している。好ましくは、肝機能は、酵素活性を発現し、タンパク質を産生し続ける能力である。より好ましくは、肝機能は、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性を維持し、無血清培地中で完全に機能的な治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）を産生し続ける能力を含む。
【００２３】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は、肝臓に対する薬物候補の作用を評価するために使用することができる。好ましくは、この細胞系は、酵素誘導及び細胞毒性を評価するために使用される。
【００２４】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は、化合物に対する肝臓の作用を評価するために使用することができる。好ましくは、この細胞系は、薬物代謝及び種間比較を評価するために使用される。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系はタンパク質を産生し続ける。好ましくは、この細胞系は血漿タンパク質を自然に産生し続ける。より好ましくは、この細胞系は、アルブミン、α１アンチトリプシン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、トランスフェリン、並びにインターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩＰ）を含むＴＰＰを自然に産生し続ける。
【００２６】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系によるＴＰＰの産生が測定される。好ましくは、この細胞系によるＴＰＰの産生は、無血清培地中でその存在を検出することによって測定される。より好ましくは、この細胞系によるＴＰＰの産生は、ｍＲＮＡレベルではなくタンパク質レベルで測定される。
【００２７】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は無血清培地中でＴＰＰを産生する。好ましくは、この細胞系は、無血清培地中で複数のＴＰＰを同じ画分から同時に産生する。より好ましくは、この細胞系は、ウイルス汚染の危険なしに無血清培地中で複数のＴＰＰを同じ画分から同時に産生する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
略語及び用語
本発明に従い本明細書において使用する時、以下の用語及び略語は、特に明記しない限り以下の意味をもつと定義される。こうした説明は例示的なものにすぎない。これらの説明は、本明細書で記載又は参照される際用語を限定することを意図するものではない。そうではなく、こうした説明は、本明細書で記載し請求する際、任意の追加の態様及び／又は用語の例を含むことを意図する。
以下の略語を本明細書で使用する。
ＡＡＴ＝α１アンチトリプシン
ＤＭＥ＝薬物代謝酵素
ＩαＩｐ＝インターαタンパク質性インヒビター
ＭＣＴ＝ＭｕｌｔｉＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社
ＭＦＥ＝Ｍｕｌｔｉ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ（多機能増強）培地
ＲＴ−ＰＣＲ＝逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＶ４０＝シミアンウイルス４０
ＳＶ４０  ＴＡｇ＝シミアンウイルス４０Ｔ抗原及びｔ抗原
ＳＶ４０  ｔＡｇ＝シミアンウイルス４０ｔ抗原
ＴＰＰ＝治療用血漿タンパク質
【００２９】
用語「細胞系」とは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの何代かの継代培養の後に一緒に増殖する共通起源の細胞の集団又は混合物を指す。同じ培地及び培養条件で一緒に増殖することにより、細胞系の各細胞は、通常、類似する増殖速度、温度、気相、栄養要求、及び表面要求についての特徴を分かち合う。細胞系においてある種の物質、例えばアルブミンを発現する細胞の存在を、この系の細胞がすべてではないが十分な割合で、測定可能な量の物質を産生することを条件として確かめることができる。濃縮された細胞系とは、ある種の特徴を有する、例えばアルブミンを発現する細胞が、１代又は複数代の継代培養段階の後、元々の細胞系よりも大きな割合で存在する細胞系である。
【００３０】
用語「クローン細胞」とは、単細胞に由来する細胞である。現実の問題として、哺乳動物細胞の純粋なクローン化細胞培養物を得ることは困難である。代を重ねて細胞を繰り返し濃縮することにより高度の細胞純度を得ることができる。本明細書では、細胞群のうち少なくとも８０％が定義された１組の特徴を有する細胞培養物をクローン化細胞培養物と称する。好ましくは、細胞群のうち少なくとも９０％が定義された１組の特徴を有する細胞培養物をクローン化細胞培養物と称する。より好ましくは、細胞群のうち少なくとも９８％が定義された１組の特徴を有する細胞培養物をクローン化細胞培養物と称する。本発明で請求するＦａ２Ｎ−４細胞系及びＥａ１Ｃ−３５細胞系はクローン細胞系である。
【００３１】
用語「不死化」は、無限の増殖能の獲得と定義される。不死化は、初代培養細胞及び有限継代性の細胞系において、テロメラーゼ、癌遺伝子、又はＳＶ４０ラージＴ抗原のトランスフェクションにより、又はＳＶ４０による感染により誘導することができる。不死化は、必ずしも悪性転換ではないが、悪性転換の構成要素である可能性がある。
【００３２】
用語「不死化された」とは、適当な増殖培地中でｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養すると、老化せずに絶えず増殖する細胞系を指す。
【００３３】
用語「ウイルスによって不死化された」とは、野生型又は突然変異型のウイルスのゲノムのすべて若しくは一部をトランスフェクトし、又はそれに感染させた肝細胞を指す。好ましくは、このウイルスはＤＮＡウイルスである。より好ましくは、このウイルスは、ｐ５３及びＲｂ腫瘍抑制タンパク質に結合し、その腫瘍抑制経路の不活性化をもたらすＳＶ４０である。
【００３４】
用語「実質上純粋な」とは、自然に存在している状態では隣接する配列を除去して精製されたあるＤＮＡ、すなわちその断片に通常は隣接する配列、例えばその断片が自然に存在しているゲノム中でその断片に隣接する配列から切り出されたあるＤＮＡ断片、並びにＤＮＡに自然に付随する他の成分を除去して実質的に精製されたあるＤＮＡ、例えば、細胞内でＤＮＡに自然に付随するタンパク質を除去して精製されたＤＮＡを指す。
【００３５】
用語「肝細胞」とは、肝臓の塊（ｌｉｖｅｒ  ｍａｓｓ）の喪失（例えば、肝毒性の過程、疾患、又は外科手術によって）に応答してかなり再生することができ、肝臓の細胞集団の約８０％を占める肝臓細胞を指す。これらは、大きな多角細胞であり、大きさが２０〜３０μｍである。肝細胞は、細胞質での一般的な多くの代謝活性で産生される過酸化水素の分解に関与するペルオキシソームを各細胞あたり２００〜３００個有する。さらに、ペルオキシソームは、糖新生、並びにプリン、アルコール及び脂質の代謝における特異的な酸化機能を有する。肝細胞中の滑面小胞体（ｓＥＲ）は、毒素及び薬物の分解及び抱合に関与する酵素を含む。薬物、毒素又は代謝刺激物による肝細胞へのチャレンジの条件下では、このｓＥＲは、細胞の中で主役の細胞小器官となることがある。肝細胞は、ホメオスタシスに決定的に重要である多数の微調整された機能を果たしている。哺乳動物の体内における様々な細胞型のうち、肝細胞だけが、炭水化物、脂質、アミノ酸、タンパク質、核酸及び補酵素の合成経路と分解経路を同時に働かせて、独特の生物学的な役割を果している。
【００３６】
用語「単離された肝細胞」とは、その自然環境においてそれが付着している他の細胞から物理的に分離された肝細胞を指す。
【００３７】
用語「初代肝細胞」とは、無傷の肝組織から最近新たに単離された肝細胞を指す。
【００３８】
用語「正常ヒト初代肝細胞」とは、健常なヒト肝臓に由来し、適当な培地中で培養すると有限期間ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持される肝細胞を指す。
【００３９】
用語「凍結保存されたヒト肝細胞」とは、適当な培地中で培養する前に凍結保存された正常な初代ヒト肝細胞を指す。
【００４０】
用語「代謝活性」とは、異化（分解）及び同化（構築）を含めて、ある細胞内で進行する化学反応の総体を指す。肝細胞における代謝活性には、それだけには限らないが、潜在的に毒性の化合物、例えば薬物又は内在性代謝産物を処理して、毒性の少ない、又は無毒の化合物とする能力が含まれる。
【００４１】
用語「チトクロムＰ４５０酵素」又は「ＣＹＰ」とは、肝臓において主にみられる、ヘムベースの酸化酵素ファミリーを指す。これらの酵素は、毒素に対する防御の最前線をなしており、疎水性薬物、発癌物質、並びに他の、潜在的に毒性の化合物、及び血液中を循環している代謝産物の代謝に関与している。これらの酵素は、小胞体の表面に繋がれていることが分かっており、そこで化学ハンドル（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｈａｎｄｌｅ）を、炭素に富んだ毒素に付着させる。次いで、他の酵素がこの化合物をさらに修飾して、分子全体をより水溶性にすることができる。これにより毒素を泌尿器系及び消化器系によって除去することが可能となる。ＣＹＰファミリーは、サブファミリーに分けられ、それには、それだけには限らないが、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ２Ａ、ＣＹＰ２Ｃ、ＣＹＰ２Ｄ、ＣＹＰ２Ｅ、及びＣＹＰ３Ａが含まれる。こうしたサブファミリーの中には、「アイソザイム」又は「アイソフォーム」と称されることが多いヒトＣＹＰ酵素が多数ある。ヒトＣＹＰ３Ａ、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｃ、及びＣＹＰ１Ａアイソフォームは、薬物代謝において重要であることが知られている。例えば、Ｍｕｒｒａｙ，Ｍ．、２３  Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  １３２−４６（１９９２）を参照のこと。ＣＹＰ３Ａ４は、ヒトの肝臓及び小腸における極めて主要なアイソフォームであり、それらの組織中でそれぞれ、ＣＹＰ４５０総タンパク質のうちの３０％及び７０％を占める。主にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの研究に基づくと、ヒトで使用されるすべての薬物のうちの４０％〜５０％の代謝に、ＣＹＰ３Ａ４によって触媒される酸化が関与していると推定されている。Ｔｈｕｍｍｅｌ，Ｋ．Ｅ．及びＷｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｒ．、「ヒトＣＹＰ３Ａが関与しているｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物相互作用（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ＣＹＰ  ３Ａ）」，３８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，３８９−４３０（１９９８）を参照のこと。
【００４２】
用語「肝機能」とは、肝臓に特異的な生体機能を指し、その機能には、それだけには限らないが、（１）糖新生、（２）グリコーゲンの合成、貯蔵、及び分解、（３）それだけには限らないが、アルブミン、ヘモペキシン、セルロプラスミン、血液凝固因子（それだけには限らないが、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロトロンビン、及びフィブリノーゲンが含まれる）、α１アンチトリプシン、トランスフェリン、及び抗トロンビンＩＩＩを含めた血清タンパク質の合成、（４）胆汁酸の抱合、（５）ヘムの胆汁色素への変換、（６）リポタンパク質合成、（７）ビタミンの貯蔵及び代謝、（８）コレステロール合成、（９）尿素合成及びグルタミン合成を含めたアンモニア代謝、（１０）芳香族アミノ酸の代謝変換及び再利用を含めたアミノ酸代謝、並びに（１１）解毒及び薬物代謝が含まれる。
【００４３】
不死化ヒト肝細胞系
本発明は、ウイルスによって不死化された肝細胞系に関するものであり、この細胞系は、正常ヒト初代肝臓細胞に由来するものでよく、無血清培地中で増殖する能力を有し、非腫瘍形成性であり、アルブミン、α１アンチトリプシン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、トランスフェリン、インターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩｐ）などの内在性血漿タンパク質を産生することができるがタンパク質レベルで測定するとαフェトプロテインを発現していない。好ましい一実施形態では、非腫瘍形成性の不死化細胞系は、ブダペスト条約に従って、２００３年１０月６日に、米国１２３０１メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｐａｒｋｌａｗｎ  ＤｒｉｖｅのＡＴＣＣに寄託された、Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６６）及びＥａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６５）細胞系を含む。
【００４４】
本発明の好ましい一実施形態では、この細胞系は正常肝細胞に由来する。好ましくは、この細胞系は正常ヒト肝細胞に由来する。より好ましくは、この細胞系は凍結保存された正常ヒト初代肝細胞に由来する。
【００４５】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は培地中で容易に増殖する。好ましくは、この細胞系は無血清培地中で容易に増殖する。より好ましくは、この細胞系はＭＦＥ培地（ＭｕｌｔｉＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国ロードアイランド州Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ；ＸｅｎｏＴｅｃｈ，ＬＬＣ社製、米国カンザス州Ｌｅｎｅｘａ）中で容易に増殖する。
【００４６】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は実質上純粋なＳＶ４０ＤＮＡを含む。好ましくは、このＳＶ４０ＤＮＡは、野生型ＳＶ４０ラージＴ及びスモールｔ抗原（ＴＡｇ）をコードしている。より好ましくは、このＤＮＡは野生型のＴＡｇをコードし、他のＳＶ４０遺伝子産物をコードしていない。
【００４７】
本発明者らは、特許権のある多数の不死化されたヒト肝細胞系を開発してきた。こうした細胞系の大多数は、ＳＶ４０  ＴＡｇを不死化遺伝子として使用して作製された。ＳＶ４０  ＴＡｇをヒト細胞にトランスフェクトすると、この細胞がウイルス感染に対して半許容的であるため、細胞の寿命の延長、及び非腫瘍形成性の不死化をもたらすことができるので、この戦略が選択された。Ｃａｓｃｉｏ，Ｓ．、「ヒト肝細胞の不死化のための新規戦略（Ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇｓ，２００１．２５：ｐ．５２９−５３８。
【００４８】
ＳＶ４０  ＴＡｇ不死化細胞系は、初代の細胞型に伴う様々なレベルの分化型の特徴を保持していることが多く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの大規模な継代培養の前に腫瘍形成性を示さない。Ｋｕｒｏｋｉ，Ｔ．及びＮ．Ｈｕｈ、「なぜヒト細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで悪性細胞形質転換に抵抗性があるのか（Ｗｈｙ  ａｒｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ？）」，Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３．８４：ｐ．１０９１−１１００。
【００４９】
正常ヒト肝臓の初代細胞にＳＶ４０  ＴＡｇ遺伝子をトランスフェクトすることにより、この細胞を連続的に増殖させることができる。トランスフェクション又は感染は、ＳＶ４０  ＴＡｇ遺伝子を含むウイルス又はプラスミドを使用することによって達成することができ、細胞系の形質転換を導くことができる。また、パピローマウイルス又はエプスタインバーウィルスなど他の形質転換ベクターも有用であると思われる。連続的なヒト細胞系を作成するための技法は、以下の参考文献に記載されている：Ｇｒａｈｍ．Ｆ．Ｌ．、Ｓｍｉｌｅｙ  Ｊ．、Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．Ｃ．及びＮａｉｒｎ，Ｒ．、「ヒトアデノウイルス５型のＤＮＡによって形質転換されたヒト細胞系の特徴（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５）」，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９−７２（１９７７）；Ｚｕｒ  Ｈａｎｓｅｎ，Ｈ．、「発癌性のヘルペスウイルス（Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）」，Ｉｎ：Ｊ．Ｔｏｏｚｅ（ｅｄ．），ＤＮＡ  ｔｕｍｏｒ  ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｒｅｖ．Ｅｄ．２，ｐｐ  ７４７−７９８．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１）；Ｐｏｐｏｖｉｃ，Ｍ．、Ｌａｎｇｅ−Ｗａｎｔｅｉｎ，Ｇ．、Ｓａｒｉｎ，Ｐ．Ｓ．，Ｍａｎｎ，Ｄ．及びＧａｌｌｏ，Ｒ．Ｃ．、「ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ）によるヒト臍帯血Ｔ細胞の形質転換（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｎ  ｖｉｒｕｓ（ＨＴＬＶ））」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：５４０２−５４０６（１９８３）；ＤｉＰａｏｌｏ，Ｊ．Ａ．、Ｐｉｒｉｓｉ，Ｌ．、Ｐｏｐｅｓｅｕ，Ｎ．Ｃ．、Ｙａｓｕｍｏｔｏ，Ｓ．及びＰｏｎｉｇｅｒ，Ｊ．、「ヒトパピローマウイルス１６型ＤＮＡによりヒト及びマウスの細胞において誘導された進行性の変化（Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ−１６  ＤＮＡ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ５：２５３−２５７，（１９８７）。
【００５０】
カルシウムを含まない酸素飽和緩衝液の３７℃での前灌流により、ドナーであるヒトの肝臓の消化をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施した。肝臓が白くなるまで前灌流を継続し、次いで肝臓が完全に消化されるまで（およそ４５分）、コラゲナーゼ酸素飽和緩衝液を用いて灌流を行った。
【００５１】
細胞を回収するために、肝臓を細かく切って１ｃｍ２片にし、得られた懸濁液を＃１０ワイヤースクリーンでろ過し、次いで２５３μｍナイロンメッシュで再びろ過した。この懸濁液を２０×ｇ、４℃で５分間遠心分離して、無傷の実質細胞を沈殿させた。このペレットを４℃で再懸濁させ、洗浄緩衝液で洗浄して（３回）、コラゲナーゼをすべて除去した。この細胞ペレットを１５０ｍｌ組織培養液中で再懸濁させて、細胞３〜４×１０７個／ｍｌの密度の最終液量４００〜５００ｍｌを得た。この懸濁液のアリコートについてトリパンブルー及び乳酸脱水素酵素による生存率評価を実施した。
【００５２】
上記の通りドナーの肝臓から単離した新鮮分離ヒト肝細胞を、５０×ｇで５分間遠心分離することにより、洗浄緩衝液で３回洗浄した。この細胞ペレットを冷却した凍結用培地（無血清ＭＦＥ培地：ＦＢＳ：ＤＭＳＯ（８：１：１））中、５×１０６個／ｍｌの最終細胞密度で再懸濁させた。この細胞懸濁液のアリコートを、Ｎｕｎｃ社製クライオバイアル（Ｃｒｙｏｖｉａｌ）に移した（１．０ｍｌ／１．５ｍｌクライオバイアル、４．５ｍｌ／５ｍｌクライオバイアル）。クライオバイアル中のこの細胞を４℃で１５〜３０分間平衡化させ、次いでこのクライオバイアルを発泡スチロール容器中に−８０℃で少なくとも３時間置いた。次いでこのバイアルを保存のために液体窒素中に浸けた。
【００５３】
凍結保存されたヒト肝細胞を４２℃の水浴中で急速に解凍し、ＭＣＴ社製ＭＦＥ培地中で洗浄及び培養した。２日後、この細胞中に、リポフェクションによって媒介されるトランスフェクションにより不死化遺伝子を導入した。
【００５４】
Ｅａ１Ｃ−３５細胞系（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６５）を、ラージ−Ｔ抗原及びスモール−ｔ抗原を共に含み、その発現がＳＶ４０初期プロモーターによって駆動される、ＳＶ４０ゲノムの２．５ｋｂの初期領域を含む不死化ベクターを用いるトランスフェクションによって得た。この初期領域をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクターのバックボーン中に挿入し、ｐＢｌｕｅＴａｇと名付けた。ｎｅｏプラスミドの同時トランスフェクションにより、ネオマイシン耐性をトランスフェクトされる細胞に選択マーカーとして付与した。最初にＧ４１８含有培地中で増殖できるかどうかに基づいてクローンを選択した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系を樹立し、ＣＳＭ培地中で維持した。
【００５５】
Ｆａ２Ｎ−４細胞系（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６６）を、リポフェクションによって媒介される単一不死化ベクターのトランスフェクションによって不死化させた。ｐＢｌｕｅＴａｇベクター中に含まれるＳＶ４０ゲノムの初期領域をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製ｐＧＴ６０ｍｃｓプラスミドに基づくバックボーン中に挿入し、ｐＴａｇ−１と名付けた。ＳＶ４０  ＴＡｇコード領域は、ハイブリッドのｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターの影響下にある。また、このベクターは、薬剤選択マーカーとしてハイグロマイシン抵抗性遺伝子をコードしている。ハイグロマイシン含有培地中で増殖できるかどうかに基づいてクローンを選択した。Ｆａ２Ｎ−４細胞系を樹立し、ＭＦＥ培地中で維持した。
【００５６】
Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６６）及びＥａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６５）細胞系は、ブダペスト条約に従って、２００３年１０月６日にＡＴＣＣ、米国１２３０１メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅに寄託された。
【００５７】
Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６６）及びＥａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６５）細胞系はどちらも、１５０回の集団倍加によって最高１８カ月間培地中で維持された。こうした細胞系はどちらも、継代１５〜２０代の間に危機段階（ｃｒｉｓｉｓ  ｓｔａｇｅ）を経た。得られた不死化細胞系は、ＭＣＴ社製無血清ＭＦＥ培地中で維持すると増殖し機能し、損傷なしに無期限で凍結保存することができる。また、この細胞系は他の無血清培地中でも増殖し機能する。また、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系は血清培地中でも増殖し機能する。この細胞系は、倍加時間が７２〜９６時間である。ヌードマウスへの移植研究の結果から、Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６６）及びＥａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６５）細胞系はどちらも非腫瘍形成性であることが示されている。
【００５８】
潜在的治療用薬物及び化合物の毒性試験及び代謝試験
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は、無血清培地中で肝機能を保持している。好ましくは、肝機能は、酵素活性を発現し続ける能力である。より好ましくは、肝機能は、チトクロムＰ４５０（ＣＹＰ）酵素活性及び無血清培地中で他の薬物代謝酵素（ＤＭＥ）を維持し続ける能力が含まれる。
【００５９】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は、肝臓に対する薬物候補の作用を評価するために使用することができる。好ましくは、この細胞系は、酵素誘導及び細胞毒性を評価するために使用される。
【００６０】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系は、化合物に対する肝臓の作用を評価するために使用することができる。好ましくは、この細胞系は、薬物代謝及び種間比較を評価するために使用される。
【００６１】
Ｆａ２Ｎ−４（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６６）及びＥａ１Ｃ−３５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６５）細胞系を使用して、酵素誘導を研究し、また化合物が細胞毒性を引き起こすことができるかどうか検討することができる。ＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の活性は、Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５のどちらの細胞においても誘導可能であり、この活性によりこれらの細胞系が他の肝細胞系と区別される。ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４の活性はＦａ２Ｎ−４において誘導可能であり、この活性によりこの細胞系がＥａ１Ｃ−３５細胞系と区別される。本発明の不死化肝細胞系は、酵素活性、並びにｍＲＮＡレベルの測定に基づいて評価するのに十分な、酵素誘導のためのＣＹＰを発現する。さらに、本発明の細胞系は、アセトアミノフェンをグルクロン酸及び／又は硫酸塩で抱合させることが示されている。したがって、これら細胞系は、薬物候補の代謝安定性を評価するのに使用することができる。
【００６２】
培養によるＦａ２Ｎ−４細胞は、ヒト肝細胞の初代培養物と形態的にも機能的にも類似する。酵素誘導物質に対するこの細胞系の応答は、培養された初代ヒト肝細胞において観察されるものと酷似しており、薬物候補の酵素誘導能を評価するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択系、すなわち至適基準と考えられている。Ｆａ２Ｎ−４細胞は、初代ヒト肝細胞に勝る有利な点がいくつかあり、そのうちのいくつかにより、Ｆａ２Ｎ−４細胞が、化合物のよりハイスループットなスクリーニングのための有望なｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系となる。
【００６３】
供給が限られており不安定であるヒト肝臓とは対照的に、Ｆａ２Ｎ−４細胞は、供給に制限なく入手可能である。新鮮なヒト肝細胞を入手できるかどうかは、適当な肝組織ドナーを利用できるかどうかにかかっているので、ある化合物が誘導物質であることを確認するために３つの異なる肝臓から単離した肝細胞を使用して実験を行うには長い時間がかかる。さらに、新鮮な肝細胞のプレーティング効果は予測できないので、適当なドナーを有するが、プレーティング効果が低く、細胞の健全性が標準以下であるためその細胞を使用できないことが分かっていることは珍しいことではない。
【００６４】
Ｆａ２Ｎ−４細胞は、継代することができ、主要なＤＭＥの活性を保持しながら数代にわたって使用することができる。新鮮なヒト肝細胞では、細胞は１回しか使用することができず、したがって研究間でデータを比較することは難しくなる。凍結保存された培養可能な初代ヒト肝細胞は、理論的には１人のドナーについて様々な時点で多数の実験を行うこと、或いは潜在的に１度に多数のドナーを使用することが可能となる点での改善となる。しかし、凍結保存された培養可能な初代肝細胞は供給が限られている。新鮮な初代肝細胞、及び凍結保存された培養可能な肝細胞はどちらも、遺伝的特徴、環境、及び同時治療（ｃｏ−ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）の影響によってドナー間で変わりやすい。ドナーのＤＭＥプロファイルは非常に大きな違いが見られ、そのため、化学物質が潜在的に誘導可能かどうかの結論に達するまでに、３人のドナーからデータを得ることが現在推奨されている。
【００６５】
Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ酵素活性の誘導は、ヒト肝細胞よりも再現性が高い。さらに、Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ誘導は、９６ウェルプレートを含めて、様々な細胞培養フォーマットで測定することができるが、ヒト肝細胞に関してはそれがいつも可能であるとは限らない。したがって、本発明の不死化肝細胞、すなわちＦａ２Ｎ−４細胞は、誘導研究における新鮮なヒト肝細胞の適切な代用物であり、よりハイスループットな研究に適しているという属性をさらに提供することができる。Ｆａ２Ｎ−４細胞は、多様な遺伝子の誘導を示すので、以前から公開されている不死の細胞系よりも優れている。こうした細胞を使用して、ある薬物の誘導の潜在的可能性を判定することができ、その知見は初代ヒト肝細胞において酵素活性が増大するというモニター結果と一致する。ｍＲＮＡという指標によるよりハイスループットな細胞培養及び分析により、より多くの化合物を試験することが可能となり、化合物あたりのコストが下がるという創薬アッセイにとって好ましい２つの特徴が得られる。
【００６６】
本発明の細胞系は、それだけには限らないが以下のものを含めて、多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用途及び試験に比類なく適している。
【００６７】
（１）潜在的な化学療法薬物の同定：こうした細胞は、試験すべき化学物質を含有する培地中でそれらの細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖し、次いで適当な暴露期間の後、細胞毒性が生じたかどうか、或いはどの程度まで生じたかを判定することにより、例えば、すべて当技術分野で周知の標準の技法であるが、トリパンブルー排除試験又は関連する試験（Ｐａｔｅｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，５８：１４１（１９７９））により、或いはコロニー形成率などの増殖試験（ＭａｃＤｏｎａｌｄら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，５０：４１７（１９６８））により、癌及び関連する疾患を治療するのに適した化学物質をスクリーニングするのに有用である。
【００６８】
（２）新たな薬物標的の同定。生物学的薬剤及び化学的薬剤を、それらが遺伝子及び代謝経路を誘導又は阻害できるかどうかについてスクリーニングすることにより、新たな潜在的な薬物標的を同定することができる。化学物質及び生物学的物質をこうした肝臓細胞の増殖培地に添加し、次いで適当な期間の後、ＤＮＡ合成の停止、遺伝子発現の誘導又は阻害（ＲＴ−ＰＣＲ分析又はゲノムの発現プロファイリングによって測定する）、及び肝臓特異的タンパク質の産生（免疫化学的手法によって判定する）を含めて、複合的変化が起こるかどうかを判定することにより、それらが遺伝子発現又は代謝経路を誘導又は阻害できるかどうかについてスクリーニングする。遺伝子発現及び代謝経路の誘導又は阻害に対する化学物質及び生物学的物質の影響の同定は、癌などの疾患を治療するための新たな薬物標的を同定する１つの方法である。
【００６９】
（３）発癌物質及び他の生体異物の代謝研究：発癌物質及び他の生体異物をこうした細胞の増殖培地に添加し、薄層クロマトグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィーなどの技法により、こうした化合物の代謝産物の出現をモニターすることができ、化合物及び／又はそれらの代謝産物とＤＮＡとの相互作用が決定される。
【００７０】
（４）ＤＮＡ変異誘発の研究：変異誘発物質であることが既知の、又は疑わしい物質を、細胞の増殖培地に添加することができ、次いで、例えば薬剤耐性変異体の細胞コロニーの出現を検出することにより、変異を検査することができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，５８：３０８，１９７９）。
【００７１】
（５）染色体損傷作用物質の研究：ＤＮＡ又は染色体の損傷を引き起こすことが既知の、又は疑わしい物質を、こうした細胞系の培地に添加することができ、次いで、姉妹染色分体交換の頻度の測定など、当技術分野で周知の技法により染色体損傷の程度を測定することができる（Ｌａｔｔら、Ｉｎ：Ｔｉｃｅ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ，Ａ．，Ｓｉｓｔｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ，１１  ｆｆ．（１９８４））。姉妹染色分体を識別する方法は多数あるが、簡単な技法がほんのいくつかあればほとんどの研究に間に合う。代表的な技法である、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３２５８による蛍光（Ｓ．Ａ．Ｌａｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７０：３３９５（１９７３）；Ｓ．Ａ．Ｌａｔｔら、Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２５：９１３（１９７７））を使用する技法、或いはヘキスト３３２５８を使用し、続いて順次、照射、ＳＳＣでのインキュベート、及びギムザ染色（出典Ｐ．Ｐｅｒｒｙ及びＳ．Ｗｏｌｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ  ２６１：１５６（１９７４）；Ｓ．Ｗｏｌｆｆ（１９８１）、「哺乳動物における姉妹染色分体交換の測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉｓｔｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｉｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｉｎ  ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｖｏｌ．１，Ｐａｒｔ  Ｂ（Ｅ．Ｃ．Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ及びＰ．Ｃ．Ｈａｎａｗａｌｔ編），Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．）を行う技法は、使用することができるこのような技法のほんの２つの例である。
【００７２】
（６）薬物、化合物、発癌物質、及び生体異物の細胞毒性の研究：薬物、化合物、発癌物質、及び生体異物を細胞の増殖培地に添加することができ、遺伝子発現プロファイリング、色素排除法、酵素の漏出、コロニー形成率などの検査を使用して、暴露時間に応じた細胞の生存率を確認することができる。
【００７３】
（７）遺伝子発現の研究：薬物及び化合物を細胞の培地に添加することができ、ＲＮＡ及びタンパク質発現を生物学的指標として使用して、暴露に応じた遺伝子発現の変化をモニターすることができる。各変化は、特異的な遺伝子の誘導又は阻害のいずれかを反映している可能性がある。例えば、薬物及び化合物と共に細胞を培養して、それだけには限らないが、ＣＹＰ３Ａ４若しくはＣＹＰ１Ａ２と呼ばれるＣＹＰ、多剤耐性遺伝子、胆汁トランスポーター、グルクロニルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、スルファターゼなどを含めた薬物代謝酵素の発現を調節するこうした薬剤を同定することができる。
【００７４】
（８）不死化細胞を使用して、新たな薬物を同定し、それによりＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染を治療することができる。本発明者らは、ＥＡ１Ｃ−３５細胞系及びＦａ２Ｎ−４細胞系がどちらもＣＤ８１を発現していることを示した。ＣＤ８１は、ＨＣＶによって媒介されるウイルス感染に必要である（Ｃｏｒｍｉｅｒら、ＰＮＡＳ，１０１：７２７０−７２７４，２００４）。細胞をＨＣＶ陽性血清と共に培養することにより、細胞系に感染させることができる。ＨＣＶウイルスを増殖させる細胞系を使用して、この慢性感染を治療するための新たな薬物をスクリーニングすることができる。
【００７５】
治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系はタンパク質を産生し続ける。好ましくは、この細胞系は血漿タンパク質を自然に産生し続ける。より好ましくは、この細胞系は、アルブミン、α１アンチトリプシン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子、トランスフェリン、並びにインターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩＰ）を含む治療用血漿タンパク質を自然に産生し続ける。
【００７６】
本発明の別の好ましい実施形態では、この細胞系によるＴＰＰの産生が測定される。好ましくは、この細胞系によるＴＰＰの産生は、無血清培地中でその存在を検出することによって測定される。より好ましくは、この細胞系によるＴＰＰの産生は、ｍＲＮＡレベルではなくタンパク質レベルで測定される。
【００７７】
本発明の好ましい別の実施形態では、この細胞系は無血清倍地中でＴＰＰを産生する。好ましくは、この細胞系は、無血清培地中で複数のＴＰＰを同じ画分から同時に産生する。より好ましくは、この細胞系は、ウイルス汚染の危険なしに無血清培地中で複数のＴＰＰを同じ画分から同時に産生する。
【００７８】
肝細胞由来のタンパク質は、治療用のネイティブな血漿タンパク質を産生するためのより安全でより再現性の高い手法を提供する。この知見は本出願人のデータに基づいたものであり、このデータは、その特許権がある不死化ヒト肝細胞系が、インターαタンパク質性インヒビター、すなわち異なる４つの遺伝子から産生される異なる３つのポリペプチドによって形成される、血漿タンパク質の複合ファミリーを産生し続けることを実証している。Ｓａｌｉｅｒ，Ｊ．−Ｐ．ら、「インターαインヒビターファミリー：構造から調節まで（Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒ−α−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆａｍｉｌｙ：ｆｒｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ，１９９６．３５１：ｐ．１−９。
【００７９】
チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物細胞における遺伝的組換えによって産生された異種タンパク質とは対照的に、本発明の細胞系に由来するＴＰＰは、完全な機能に必要な第２の翻訳後修飾がネイティブな肝細胞による産生過程で行われるので、より正常に挙動する。本発明の細胞を使用してＴＰＰを産生することの重要な利点は、それを産生する細胞系が、ヒトに由来し、したがってより自然なタンパク質をもたらすことである。したがって、複数のＴＰＰがヒト肝細胞によって合成されるので、本発明の細胞系のヒト肝細胞ベースの発現系を使用して、ＴＰＰをその「ネイティブな」形で産生することができる。
【００８０】
ＴＰＰの翻訳後修飾は、生物活性、ｉｎ  ｖｉｖｏクリアランス率、免疫原性、及び／又は安定性に影響を与えることがある。本発明の不死化肝細胞系は、機能的なＴＰＰを産生する上で決定的に重要である、グリコシル化などのタンパク質修飾を自然に実施する。この細胞系は、培養により多数のＴＰＰを同時に産生し、したがってタンパク質の順次精製スキームにより、ウイルス汚染が再び起こる危険なしに血漿由来のタンパク質に類似する多数の産物が産生される。
【００８１】
本発明の肝細胞ベースの発現系によって分泌されるＴＰＰは、組換え体対応物よりも自然に挙動する。例えば、本発明者らは、その不死化ヒト肝細胞系が、生物活性のあるＩαＩＰを産生し、したがって現在組換え技術によって産生することができないこのタンパク質の強力な市販の供給源であることを実証した。したがって、本発明者らによる「ネイティブな」形のＩαＩＰの産生は、敗血症など、生命にかかわる疾患を治療するためのより効果的で、安全で、且つ費用効果の高い解決法をもたらす。
【００８２】
肝細胞由来の本発明のＴＰＰは、先行技術の欠点を克服したネイティブなＴＰＰを市販用に産生するための、安全で、効果的で、且つ費用効率の良い戦略を提供する。
【００８３】
本発明の細胞系を産生用プラットホームとして使用する例には、それだけには限らないが以下のものが含まれる。
【００８４】
（１）肝細胞由来のタンパク質の産生。適当な培地中で維持された細胞は、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子）、アルブミン、α１アンチトリプシン、トランスフェリン、インターαタンパク質、増殖因子などのタンパク質を自然に発現し、それを精製し使用することができる。
【００８５】
（２）対象のタンパク質を産生するための組換えＤＮＡ発現ベクターの使用。例えば、治療上価値のあるタンパク質をコードしている遺伝子を、制御用の（すなわち、エンハンサー配列を伴う、又は伴わないプロモーターを含む）ＤＮＡ断片で組み換え、細胞中に導入し、次いで、産生されたタンパク質を、当技術分野で周知の常用の手順により培養上清又は細胞抽出物から回収することができる。
【００８６】
これは、（１）発現されるタンパク質、発現されるタンパク質のサブユニット、又は発現されるタンパク質の前駆体をコードしている遺伝子、及び（２）遺伝子に作動可能に連結しており、遺伝子の転写に影響を与える少なくとも１種の制御エレメントを含む１種又は複数の組換えベクターを使用することによって実施することができる。この制御エレメントは通常、プロモーター、又はプロモーターとエンハンサーの組合せである。また、適当なベクターの特徴には、（１）複製起点、（２）所望の遺伝子をコードしているＤＮＡの挿入を可能にする制限エンドヌクレーゼ切断部位、（３）通常は抗生物質耐性を与えるものである選択マーカーが含まれる。特に好ましい一実施形態では、制御エレメントは、少なくとも１つのプロモーター及び少なくとも１つのエンハンサーを含む。
【００８７】
適当な組換えベクターには、それだけには限らないが、ＳＶ４０由来ベクター、マウスポリオーマウイルス由来ベクター、ＢＫウイルス由来ベクター、エプスタインバーウィルス由来ベクター、アデノウイルス由来ベクター、アデノ随伴ウイルス由来ベクター、バキュロウイルス由来ベクター、ヘルペスウイルス由来ベクター、レンチウイルス由来ベクター、レトロウイルス由来ベクター、アルファウイルス由来ベクター、ワクチニアウイルス由来ベクターなどが含まれる。このようなベクターは通常、強力で、構成的なプロモーター、発現されるべきＤＮＡ中にある少なくとも１つのイントロン、及び転写する配列の３’末端にあるポリアデニル化シグナルを含む。グリコシル化などの適切な翻訳後修飾を確実にするために、シグナルペプチドを追加することが望ましい可能性がある。こうしたベクター及びベクターの特徴は、すべてこの参照により本明細書に組み込む、Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅら、「遺伝子操作の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」（６ｔｈ  ｅｄ．，２００１，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ），ｐｐ．１７４−２０１；Ｇ．Ｌ．Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ、「レンチウイルスベクター（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ）」（１ｔｈ  ｅｄ，２００３，Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ，ＴＸ）；Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ、「遺伝子クローニング及びＤＮＡ解析：序論（Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」（４ｔｈ  ｅｄ．，２００１，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）に記載されている。
【００８８】
また、発現される血漿タンパク質をコードしているＤＮＡを単離し、このようなＤＮＡをこうしたベクターに挿入する方法も当技術分野で周知である。こうした方法は、例えば、参照により本明細書に組み込むＳ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、「遺伝子操作の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」（６ｔｈ  ｅｄ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００１）に記載されている。一般に、クローニング用の適当なＤＮＡは、特異的なｍＲＮＡの逆転写によって得ることができ、続いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用してそのＤＮＡを増幅することができる。このようなＤＮＡは一般に、ｃＤＮＡとして知られている。特異的な制限エンドヌクレアーゼでのベクターの切断、及び切断部位でのＤＮＡの挿入を通常含む技法により、ＤＮＡをベクター中に挿入することができる。
【００８９】
ウイルスによって不死化されたヒト肝細胞を形質転換、又はそれにトランスフェクトする方法は当技術分野で周知であり、本明細書でさらに詳細に記載する必要はない。一般に、このような方法には、それだけには限らないが、リポフェクション、リン酸カルシウムによって媒介されるトランスフェクション、ＤＥＡＥデキストランによって媒介されるトランスフェクション、電気穿孔法によるトランスフェクション、微粒子銃によるトランスフェクション、及びポリブレンを使用したトランスフェクションが含まれる。こうしたトランスフェクション法は、この参照により本明細書に組み込むＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」（３ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１），ｖｏｌ．３，ｃｈ．１６に記載されている。
【００９０】
多くの場合、１種又は複数のレポーター遺伝子をベクター中に組み込んで、トランスフェクション効率を評価することが望ましい。最適の遺伝子は、強力で遍在する、プロモーターとエンハンサーの組合せの制御下にある。こうした組合せには、ヒトサイトメガロウイルスの前初期遺伝子、ラウス肉腫ウイルスの末端反復配列、又はヒトβアクチン遺伝子由来のものが含まれる。適当なレポーター遺伝子の例は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）トランスポゾン中に存在するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子である。蛍光の検出、又は放射性生成物の検出など様々な技法により、レポーター遺伝子の発現の検出を実施することができる。レポーター遺伝子及びその試験は、この参照により本明細書に組み込むＭ．Ａ．Ａｉｔｋｅｎら、「高等真核生物の組織培養細胞における遺伝子の導入及び発現（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ）」  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ  ＆  Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９８），ｐｐ．２３５−２５０にさらに記載されている。
【００９１】
タンパク質が発現されると、その発現されたタンパク質を単離することが必要である。これは通常、標準のタンパク質精製方法によって実施される。こうした方法には、それだけには限らないが、硫酸アンモニアなどの塩での沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動、クロマトフォーカシング、及び／又はプロテアーゼ活性などの容易に確認される任意の特性を利用してタンパク質を検出するイムノアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。また、他の精製方法も当技術分野で知られている。タンパク質精製方法は、例えば、この参照により本明細書に組み込むＲ．Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ、「タンパク質精製：原理及び実施（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（３ｄ  ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４）に記載されている。
【００９２】
場合によっては、発現されるタンパク質を細胞から周辺の培地中に分泌させることができる。この方法の効率は、タンパク質が受ける、グリコシル化などの転写後修飾のパターンに依存する。このパターンは、小胞体及びゴルジ装置内のタンパク質のプロセシング、並びにその後の分泌に影響を与える。これは、この参照により本明細書に組み込むＡ．Ｊ．Ｄｏｒｎｅｒ及びＲ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ、「哺乳動物細胞で発現されるタンパク質の合成、プロセシング、及び分泌の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ）」ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９１），ｐｐ．５７７−５９８に記載されている。また、発現されるタンパク質が、タンパク質精製を容易にするために使用することができるタグと呼ばれる別のタンパク質と融合するように、クローニングベクターを選択することができる。タグの例には、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質ＭａｌＥ、及びポリヒスチジン配列が含まれる。次いで、得られた融合タンパク質を特異的なタンパク質分解によって切断してタグを除去し、精製されたタンパク質が得られる。
【００９３】
ウイルスによって不死化された非腫瘍形成性の肝細胞系の他の使用
本発明の細胞系を使用する他の例には、それだけには限らないが、以下のものが含まれる。
【００９４】
（１）足場非依存性増殖や、無胸腺ヌードマウスにおける腫瘍形成などの標準の試験を使用した、化学的、物理的、且つウイルス性の作用物質、並びに癌遺伝子、及び腫瘍からの高分子量ゲノムＤＮＡを含めた導入遺伝子による悪性形質転換の研究。例えば、リン酸ストロンチウムトランスフェクションを使用して、クローン化された、ウイルスの癌遺伝子ｋ−ｒａｓ（多くの肝細胞癌に存在する癌遺伝子）を肝細胞中に導入することができる。新たにトランスフェクトした細胞が、続いてマウスにおいて腫瘍を形成し、且つ足場非依存的に増殖することができるかどうか評価することができる。
【００９５】
（２）潜在的な化学療法剤、特に、特定の癌遺伝子又は癌遺伝子の組合せの活性化によって形質転換された細胞に特異的である可能性があるものをスクリーニングする（上記の節「潜在的治療用薬物及び化合物の毒性試験及び代謝試験」の段落（１）に記載の技法により）ための、この節の上記の段落（１）の場合と同様の、癌遺伝子の導入によって改変された細胞の使用。
【００９６】
（３）細胞増殖、並びにそれだけには限らないが、この節の上記の段落（１）と（２）及び上記の節「潜在的治療用薬物及び化合物の毒性試験及び代謝試験」の段落（１）から（５）に記載のものを含めた外因性因子の作用と相関する、細胞内のｐＨ及びカルシウムレベルの変化を含めた細胞生化学の研究。細胞内のｐＨ及びカルシウムレベルを研究するために、適当な培養容器中の細胞を蛍光指示色素に曝露し、次いで蛍光発光を蛍光分光光度計で検出する（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０：３４４０−３４５０（１９８５））。
【００９７】
（４）増殖因子に対する細胞応答及び増殖因子の産生の研究：ヒト肝臓の肝細胞の増殖及び分化に重要な増殖因子の同定及び精製。こうした細胞は、無血清培地中で増殖するので、このような用途に特に有用である。したがって、増殖因子に対する応答を、正確に定義された増殖培地において研究することができ、血清の存在で複雑化することなしに細胞によって産生された因子を同定及び精製することができる。
【００９８】
（５）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する細胞がギャップ結合を介して情報伝達することができるかどうか判定するための、例えば色素スクレープローディング試験（ｄｙｅ  ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）による、細胞内情報伝達の研究。増殖培地中蛍光色素の存在下で、例えば円刃刀で培養物に傷を付けることができる。この傷の端にある細胞は、機械的に破壊されており、したがって色素を取り込む。細胞内情報伝達が起こっているかどうかは、傷から離れたところにある細胞も色素を含有しているかどうか判定することによって確認することができる。
【００９９】
（６）細胞表面抗原の特徴付け：細胞を、対象の細胞表面抗原に対する抗体と共にインキュベートし、次いで蛍光色素と結合する二次抗体と反応させる。次いで、この細胞が蛍光を発し、したがって細胞表面抗原を有するかどうか判定するために、蛍光標示式細胞分取装置を使用してこの細胞を評価する。
【０１００】
（７）腫瘍抑制活性を同定するための細胞間雑種の研究（Ｓｔｒａｎｂｒｉｄｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５：２５２−２５９（１９８２））。こうした細胞系が癌抑制遺伝子を含んでいるかどうか判定するために、こうした細胞を悪性腫瘍細胞と融合させる。癌抑制遺伝子の存在は、例えば、無胸腺ヌードマウスにおいて腫瘍を形成できなくなることの検出による、雑種細胞における悪性度の喪失によって示される。
【０１０１】
（８）標準の分子生物学的技法（Ｄａｖｉｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６））、並びにｃＤＮＡサブトラクションクローニング及び類似の方法などの技法を使用した、この節の上記の段落（１）に記載の、自然に発生する癌における形質転換遺伝子、この節の上記の段落（４）に記載の増殖因子遺伝子、この節の上記の段落（７）に記載の癌抑制遺伝子を含めた新規遺伝子の同定。
【０１０２】
（９）複製する肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＣＶ、非Ａ非Ｂ型、ＨＡＶ、及び他の肝臓親和性の（ｌｉｖｅｒｔｒｏｐｉｃ）ウイルス、例えばＣＭＶ）の増殖。ヒト肝臓の癌細胞系のための確立されたトランスフェクション方法を使用した、複製する肝炎ウイルスを含むヒト肝臓肝細胞のクローン細胞系の樹立（Ｓｅｌｌｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：４４４−４４８）。ＨＢＶを含むヒト肝臓の肝細胞を使用して、ＨＢＶ単独の、またアフラトキシンＢなど、肝臓の化学発癌物質と併用した能力を、足場非依存性増殖試験、並びに無胸腺ヌードマウスにおける増殖を使用して、悪性形質転換について評価することができる。この節の上記の段落（７）のものと類似する細胞間雑種技術を使用して、悪性細胞との融合による癌抑制遺伝子の可能な不活性化をＨＢＶトランスフェクションの前後で評価することができる。このスクリーニングキットは、細胞系と、他の常用の構成要素及び試験を実施するための標識の使用説明書とを含む他のスクリーニングキットのように容易に組み立てられる。
【０１０３】
（１０）不死化細胞を使用して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を治療するための新たな薬物を同定することができる。本発明者らは、ＥＡ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞系はどちらも、ＣＤ８１を発現していることを示した。ＣＤ８１は、ＨＣＶによって媒介されるウイルス感染に必要である（Ｃｏｒｍｉｅｒら、ＰＮＡＳ，１０１：７２７０−７２７４，２００４）。細胞をＨＣＶ陽性血清と共に培養することにより、細胞系に感染させることができる。ＨＣＶウイルスを増殖させる細胞系を使用して、この慢性感染を治療するための新たな薬物をスクリーニングすることができる。
【０１０４】
（１１）不死化細胞は、どちらも移植され体外である肝移植片及び肝機能補助装置のために細胞を増殖する一方法として使用することができる。また、こうした細胞は、遺伝性代謝障害、特に肝臓の悪化（ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を伴うこうした疾患（すなわち、ある種の疾患は、特定の遺伝子の欠失又は異常に起因する）を治療するための器官移植のためにこれらの細胞中にトランスフェクトし／感染させた追加の遺伝子を有することができる。次いで、この遺伝子を細胞中にトランスフェクトし、次いでこの細胞を器官移植のために増殖させることができるはずである。
【０１０５】
（１２）肝臓寄生虫の研究：不死化肝細胞系が、それだけには限らないが、アメーバ症、マラリア、線虫、及び回虫を含めて、肝細胞に侵入する寄生虫の生活環を研究するのに有効であることを証明することができるはずである。
【０１０６】
（１３）肝疾患の研究：不死化肝細胞系を使用して、それだけには限らないが、感染性肝疾患（住血吸虫症、黄熱、包虫嚢胞（ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃａｌ  ｃｙｓｔ）、アメーバ症、ウイルス性肝炎など）；薬物によって誘導される肝疾患（トランキライザー（フェノチアジン）、抗生物質（イソニアジド）、及び麻酔薬（ハロタン）による疾患など）；脂肪肝（通常エタノールの形でのカロリー過剰摂取、肝臓毒（ＣＣｌ４及びＰＯ４）、及びコントロール不良の糖尿病、妊娠中毒症などの全身性代謝障害による疾患など）；肝硬変（食事要因（通常アルコール）による疾患、ウイルス性肝炎による大量壊死の後、色素沈着を伴うもの、胆管の疾患を伴うもの、その他の肝硬変など）；腫瘍；並びにヘモクロマトーシス（鉄代謝のまれな障害）を含めた、肝臓の疾患を研究することができるはずである。
【実施例】
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の範囲を何ら限定することなく本発明の特定の実施形態を説明するために提供するものである。
【０１０８】
（実施例１）
不死化ヒト肝細胞の特徴付け
ヒト肝細胞に、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下にある、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原の遺伝子をトランスフェクトすることにより、１００を越える数のヒト肝細胞クローン細胞系を樹立した。Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４と呼ばれる２つの細胞系についてを説明する。
【０１０９】
どちらの細胞系も、凍結保存された初代ヒト肝細胞へのＳＶ４０ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原を含むベクターの、リポフェクションによって媒介されるトランスフェクションによって作製した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系は、凍結保存されたヒト肝細胞への、Ｂｌｕｅ  Ｔａｇを含む不死化ベクター、すなわち野生型ＳＶ４０の初期領域を含む組換えプラスミドのトランスフェクションによって導き出した。Ｂｌｕｅ  Ｔａｇベクターを以下の通り構築した。ＰＢＲ／ＳＶ（ＡＴＣＣ）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ＳＶ４０初期プロモーター、並びにスモールｔ抗原及びラージＴ抗原のコード領域を含む２３３８ｂｐの断片（２３９〜２４６８ｂｐの断片を捨て、残りを置いておく。番号付けはＦｉｅｒｓ，Ｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７３：１１３−１２０に従う。）を放出させた。このＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ断片をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）中に挿入して、Ｂｌｕｅ  Ｔａｇ、すなわちＳＶ４０プロモーターを使用してＴ抗原の発現を駆動させるＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのベクターを産生させた。この初期領域をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫベクターのバックボーン中に挿入し、ｐＢｌｕｅＴａｇと名付けた。ｎｅｏプラスミドの同時トランスフェクションにより、トランスフェクトされる細胞に選択マーカーとしてネオマイシン耐性を与えた。最初にＧ４１８含有培地中で増殖できるかどうかに基づいてクローンを選択した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系をＭＣＴが特許権をもつ血清含有培地ＣＳＭ中で樹立した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系は、ＣＳＭ又はＭＦＥのいずれかで維持することができる。
【０１１０】
Ｆａ２Ｎ−４細胞系を、リポフェクションによって媒介される、単一の不死化ベクターのトランスフェクションによって不死化させた。ｐＢｌｕｅＴａｇベクター中に含まれるＳＶ４０ゲノムの初期領域をＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社製ｐＧＴ６０ｍｃｓプラスミドに基づくバックボーン中に挿入し、ｐＴａｇ−１と名付けた。Ｔ抗原コード領域は、ハイブリッドのｈＥＦ１−ＨＴＬＶプロモーターの影響下にある。このベクターはまた、薬剤選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子をコードしている。ハイグロマイシン含有培地中で増殖できるかどうかに基づいてクローンを選択した。Ｆａ２Ｎ−４細胞系を樹立し、ＭＦＥ培地中で維持した。
【０１１１】
（実施例２）
肝臓特異的転写因子の発現
肝臓特異的転写因子を保持することは肝機能の発現に必須であるので、最初にクローン細胞系を、ヒトのＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４α、ＨＮＦ４γ及びＣ／ＥＢＰ、並びにアルブミン用のプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによってスクリーニングした。簡単に言えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら（「ＭＡＰＰｉｎｇ（Ｍｅｓｓａｇｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇメッセージ増幅表現型分析）：少数の細胞からの多数のｍＲＮＡを同時に測定する技法（Ｍｅｓｓａｇｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ（ＭＡＰＰｉｎｇ）：ａ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｔｏ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍＲＮＡｓ  ｆｒｏｍ  ｓｍａｌｌ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７（１０）：１０９６−１１０３，１９８９）のマイクロアイソレーション法（ｍｉｃｒｏ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、各クローン細胞系の１０６個の細胞から全ＲＮＡを調製した。５０μｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ社製）をキャリアとして使用して、少数の細胞からのＲＮＡの単離を容易にした。Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ社製ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキットを使用して、ＲＴ−ＰＣＲ反応を実行した。供給元の使用説明書に従って、ランダムヘキサマー及び逆転写酵素Ｍ−ＭＬＶを使用して、１μｇの全ＲＮＡを逆転写した。各転写因子に独特のヌクレオチド断片を定義するオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＰＣＲ反応を実施した。このプライマーは、Ｃｒｕａｃｈｅｍ社（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）によって市販用に合成され精製されたものである。アニール温度５８℃、１分間のＰＣＲ反応を３０サイクル実施した。ＰＣＲ産物を臭化エチジウムで染色した後、１％アガロースゲル中で視覚化した。陽性対照の試料を、新鮮分離したヒト肝細胞の全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析に含めた（示さず）。下記の表１に示すように、どちらの細胞系でも５つの肝細胞関連転写因子がすべて発現された。肝細胞特異的遺伝子発現の指標としてアルブミンの産生を測定した。下記の表１に示すように、ヒトアルブミンを認識する抗体を使用したＥＬＩＳＡ試験による検出によれば、どちらの細胞系でも無血清条件の培地中にアルブミンが分泌される。
【表１】
2007518426.tif 000002
【０１１２】
（実施例３）
ｍＲＮＡ転写物の発現についての逆転写ポリメラーゼ連鎖反応分析
Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４と呼ばれる２つの不死化ヒト肝細胞系においてＲＴ−ＰＣＲ分析を実施した。細胞をＩ型コラーゲンコートディッシュ上に蒔き、ＭＦＥ培地中で維持した。培養細胞にリファンピン（１０μＭ）又は等しい容量のＤＭＳＯ（対照）を３日間処理した。
【０１１３】
以下のプライマー、すなわちアルブミン、アシアロ糖タンパク質ＩＩ受容体、ＨＮＦ−１α、ＨＮＦ−３、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ４γ、ｃ／ＥＢＰ、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ２Ｂ４、ＳＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＡＲ、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、チトクロムｃ、及びＮＡＤＰＨをＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した。
【０１１４】
２つの不死化ヒト肝細胞系Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４においてＲＴ−ＰＣＲ分析を実施して、肝細胞特異的転写因子（例えば、ＨＮＦ−１α、ＨＮＦ−３、ＨＮＦ−４α、ＨＮＦ４γ、Ｃ／ＥＢＰ）、肝臓特異的遺伝子（例えば、アルブミン及びアシアロ糖タンパク質受容体）、薬物代謝遺伝子を制御する転写因子（例えば、ＳＸＲ、ＲＸＲα、ＲＸＲβ、ＣＡＲ）、並びに第Ｉ相及び第ＩＩ相のＤＭＥ（例えば、それぞれＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｅ１、並びにＵＧＴ１Ａ１及びＵＧＴ２Ｂ４）の発現についてスクリーニングした。
【０１１５】
ＣＹＰ３Ａ４発現の既知の薬理学的誘導物質であるリファンピンに暴露し、又は暴露せずに分析を実施した。
【０１１６】
図１〜図８に示すように、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、検査されたすべての転写産物が、様々なレベルであるがどちらの細胞系によっても発現されることが分かった。リファンピン誘導によりＣＹＰ３Ａ４転写物の発現が増大した。図１〜図８のゲルローディングの順序の説明の概要を下記の表２及び表３に示す。
【表２】
2007518426.tif 000003
【０１１７】
（実施例４）
ＳＶ４０によって媒介される増殖活性
初代ヒト肝細胞は、培養すると増殖活性が限られてくる。この特徴を克服するために、ＳＶ４０ラージＴ抗原及びスモールｔ抗原をゲノム中に導入した。引き続いて、得られたクローン細胞系Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５を培養物中で最高１８カ月間維持した。どちらの不死化系統も、ＭＦＥ培地中で維持すると増殖及び機能しており、凍結保存し、貯蔵することができる。ラージＴ抗原及びアルブミンに対する多価抗体を使用した間接免疫蛍光染色により、これらの細胞系が、核に局在する不死化遺伝子を発現し（図９ａ）、且つ分化型の機能に特徴的な肝細胞特異的遺伝子を発現し（図９ｂ）続けることが実証された。Ｅａ１Ｃ−３５細胞系の形態を下記に示す（図９ｃ）。
【表３】
2007518426.tif 000004
【０１１８】
Ｆａ２Ｎ−４細胞の免疫染色をアルブミン発現について実施した。細胞をＩ型コラーゲン上に蒔き、無血清培地中で７２時間培養した。蛍光に結合する２次抗体を用いた間接免疫蛍光によりアルブミンを視覚化した。下記の図９ｂに示すように、すべての細胞で実質的にアルブミンが発現している。
【０１１９】
（実施例５）
薬物代謝データ
どちらの細胞系も、モデル物質の代謝に基づいて、単層培養物中で第Ｉ相（ＣＹＰ）及び第ＩＩ相の抱合反応を触媒し続ける。最も重要な第Ｉ相の酵素のうちの１つはＣＹＰ３Ａ４であり、これは全ての薬物のうちのおよそ５０％の代謝の原因である。ＣＹＰ３Ａ４の発現は、このＣＹＰの発現を全体にわたって誘導又は阻害することができる、多剤摂取を含めた多くの要素によって調節することができる。したがって、ある薬物の治療有効量は部分的に一部がＣＹＰ３Ａ４発現によって決まる。
【０１２０】
ＣＹＰ３Ａ４修飾物質は、その遺伝子の転写応答をモニターすることによって、またモデル物質（すなわちテストステロン）に対する酵素活性を測定することによって同定することができる。例えば、ＣＹＰ３Ａ４のｃＤＮＡを検出するための特異的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲにより、ＣＹＰ３Ａ４誘導物質の薬理学的プロトタイプ（すなわちリファンピン）に対する転写応答を試験することができる。また、リファンピンによって誘導されるＣＹＰ３Ａ４酵素活性は、細胞をテストステロンと共にインキュベートした場合の６β−ＯＨ−テストステロン代謝物の産生によって測定することができる。下記の表４に示すように、Ｆａ２Ｎ−４細胞系は、Ｅａ１Ｃ−３５細胞系よりもＣＹＰ誘導物質に対して感受性が高い。
【０１２１】
細胞系が第ＩＩ相の抱合酵素を発現し続けることを実証するために、細胞をアセトアミノフェンに２４時間曝露し、馴化条件培地を回収し、アセトアミノフェングルクロン酸抱合物又はアセトアミノフェン硫酸抱合物の産生について分析した。アセトアミノフェングルクロン酸抱合物及びアセトアミノフェン硫酸抱合物の産生をＨＰＬＣ分析によって測定した。その結果を表４に示した。継代数の影響を判定するために、１１代、１４代、２７代、３２代、４０代、及び４１代の継代の後のアセトアミノフェングルクロン酸及びアセトアミノフェン硫酸の産生をＦａ２Ｎ−４細胞について測定した。継代第４１代については、窒素代謝の指標としてアンモニアクリアランスも測定した。その結果を表５に示す。こうした結果から、どちらのＤＭＥ抱合経路も損なわれておらず、Ｆａ２Ｎ４細胞はアンモニアを除去できることが示される。
【表４】
2007518426.tif 000005
＊細胞をビヒクル又はリファンピンに７２時間曝露した。データを、ビヒクルを処理した対照と比べて表す。
＊＊細胞をビヒクル又はリファンピンに７２時間曝露し、次いでテストステロンと共に２４時間インキュベートした。６β−ＯＨ−テストステロン代謝物の産生をＨＰＬＣ分析によって定量し、データを全細胞タンパク質（ｍｇ）あたりで表す。
【表５】
2007518426.tif 000006
ＮＤ＝未測定
【０１２２】
（実施例６）
ＣＹＰ誘導物質を同定及びランク付け分類するための不死化肝細胞の使用
２つの系の証拠から、不死化ヒト肝細胞を使用してＣＹＰ３Ａ４誘導物質を「誘導能」に基づいて同定及びランク付け分類できることが示される。
【０１２３】
第１に、Ｆａ２Ｎ−４細胞をリファンピン（１０μＭ）に曝露した結果、下記の図１０に示すように、６−βテストステロン代謝物の産生が、デキサメタゾン（５０μＭ）又はフェノバルビタール（１ｍＭ）などのより弱いＣＹＰ３Ａ４誘導物質で処理した細胞よりも増大した。
【０１２４】
第２に、イムノブロット分析により、各細胞系をリファンピン又はフェノバルビタールに４８〜７２時間曝露すると、ビヒクル処理対照に比べてＣＹＰ３Ａ４タンパク質の発現が増大することが図１１で示された。ただし、リファンピンに曝露すると、ＣＹＰ３Ａ４タンパク質の発現がさらに増大する。イムノブロットでの上方のバンドは非特異的であり、したがって、ＣＹＰ１Ａ誘導物質であるＢＮＦはＣＹＰ３Ａ４タンパク質発現を誘導しない。
【０１２５】
全体として総合すれば、こうした結果から、不死化ヒト肝細胞系は、構成的で誘導可能なＣＹＰ３Ａ４発現を検出するための極めて貴重なモデルを提供することが明確に示される。
【０１２６】
（実施例７）
初代培養物との形態的且つ機能的類似性
培養Ｆａ２Ｎ−４細胞は、形態的にも機能的にも新鮮なヒト肝細胞の初代培養物と比類なく類似している。図１２は、ヒト肝細胞（上図）とＦａ２Ｎ−４細胞（下図）との間の密接なこの形態的類似を示す。ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４を含めて、多数のＣＹＰがＦａ２Ｎ−４細胞において誘導可能である。Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導を評価するための手順は、ヒト肝細胞の初代培養物のものに非常に類似している。
【０１２７】
Ｆａ２Ｎ−４細胞を、コラーゲン基質上、ＭＦＥ支持培地（ＭＦＥ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｍｅｄｉｕｍ）中で増殖させた。この細胞をトリプシン処理によって剥離し、遠心分離によって分離し、所望のフォーマット（例えば、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、又は９６ウェルのプレート）のコラーゲンに再び付着させた。２日の適応期間の後、この細胞を試験物質、又は適当な陰性及び陽性対照で３日間連続して１日１回処理した。最後の処理の後、酵素誘導を２４時間評価した。培養肝細胞から調製したミクロソーム中で測定されるＣＹＰ活性（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性）を、ヒト肝臓から直接調製したミクロソーム中で測定されるもの（ｅｘ  ｖｉｖｏでの活性）と比較した。
【０１２８】
細胞をフェナセチン（ＣＹＰ１Ａ２の測定用）、ブプロピオン（ＣＹＰ２Ｂ６の測定用）、ジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９の測定用）、又はミダゾラム（ＣＹＰ３Ａ４の測定用）と共にインキュベートすることにより、Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導を評価した。いずれの場合においても、物質の最終濃度は１００μＭであった。代謝産物の生成を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによりアリコートの細胞培地を様々な時点で（最高８時間）試験することによって判定した。様々な条件下での様々なＣＹＰ活性の比較を容易にするために、その結果を、８時間の時点で判定された対照の活性に比べて表した。
【０１２９】
Ｆａ２Ｎ−４細胞は酵素誘導物質に対して適切に応答する。ヒト肝細胞の場合と同様のように、ＣＹＰ１Ａ２は、Ａｈ受容体を活性化するこれらの作用物質によって高度に誘導可能であるが、ＰＸＲ及び／又はＣＡＲを活性化するこれらの作用物質は、ＣＹＰ３Ａ４の誘導を、また並びに程度はより低いがＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｃ９の誘導を引き起こす。図１３に示すように、Ｆａ２Ｎ−４細胞（６ウェルプレートで培養）を１００μＭのオメプラゾールで処理すると、著しいＣＹＰ１Ａ２活性の誘導が引き起こされるが、２０μＭのリファンピンで処理すると、ＣＹＰ３Ａ４の活性が、また並びに程度はより低いがＣＹＰ２Ｂ６及びＣＹＰ２Ｃ９の活性が誘導される。
【０１３０】
Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導は、実験毎に、また様々なサイズのマルチウェルプレートにわたり再現可能である。図１４は、リファンピンによるＣＹＰ２Ｂ６（ブプロピオンヒドロキシラーゼ）活性の誘導の再現性を３種の異なるプレートのフォーマットにわたって比較した結果を示す。複数の細胞継代にわたるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の誘導の再現性も評価し、こうした結果を図１５に示す。継代第３２〜４７代にわたる誘導の程度は、どちらのＣＹＰ酵素についても非常に再現性が高く、ヒト肝細胞の個々の調製物で通常見られる誘導よりも再現性に優れている。図１６に示すように、Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるリファンピンによるＣＹＰ２Ｂ６の誘導は、６ウェル、１２ウェル、及び２４ウェルのプレートで同じである。ＣＹＰ２Ｃ９についても同一の結果が得られた（結果は示さず）。こうした結果から、不死化肝細胞の分化型の特性が非常に安定していることが示される。再現性に関しては、本発明の不死化肝細胞系の方がヒト肝細胞の初代培養よりも優れているが、ＣＹＰ誘導の程度は調製毎に大幅に変化し得る。
【０１３１】
ヒト肝細胞の初代培養物における酵素誘導は、細胞培養フォーマットによって影響を受ける。したがって、ウェルサイズが小さくなるにつれて、ヒト肝細胞の初代培養物における酵素誘導の程度が低くなる。
【０１３２】
図１７は、オメプラゾールによるＣＹＰ１Ａ２の誘導、及びリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４の誘導に対する細胞培養フォーマットの影響を示す。誘導の程度が１２ウェル、２４ウェル、及び９６ウェルのフォーマットよりも６ウェル中の方が大きいという点から、細胞培養フォーマットは、ＣＹＰ１Ａ２誘導に対してわずかな影響を与えるように思われる。しかし、すべての場合において、オメプラゾールにより、対照の少なくとも９倍のＣＹＰ１Ａ２活性が誘導された。また、図１７は、ＣＹＰ３Ａ４の場合、リファンピンによる誘導は６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、及び９６ウェルのフォーマットで類似していることを示す。したがって、本発明の細胞系は、多くの細胞培養フォーマットにわたり、ヒト肝細胞の初代培養物よりも信頼性の高い酵素誘導を提供する。
【０１３３】
Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の誘導の経時変化は、ヒト肝細胞の初代培養物において観察されるものと類似する。図１８は、Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の誘導の経時変化を示す。
【０１３４】
Ｆａ２Ｎ−４細胞における酵素誘導は、適当な範囲の誘導物質濃度にわたって生じる。Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるオメプラゾールによるＣＹＰ１Ａ２誘導及びリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４誘導についての濃度応答曲線を図１９に示す。ヒト肝細胞においても類似の結果が得られる。
【０１３５】
Ｆａ２Ｎ−４細胞は、ヒト肝細胞においてＣＹＰ酵素を誘導し、又は誘導しないこうした化合物に対して適切に応答する。例えば、図２０に示すように、ヒト肝細胞においてＰＸＲを活性化し、ＣＹＰ３Ａ４を誘導することが以前に示されている化合物（Ｌｕｏら、「薬物によるＣＹＰ３Ａ４誘導：ヒト肝細胞におけるプレグナンＸ受容体レポーター遺伝子アッセイとＣＹＰ３Ａ４発現との相関（ＣＹＰ３Ａ４  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｒｕｇｓ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａ  ｐｒｅｇｎａｎｅ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ａｎｄ  ＣＹＰ３Ａ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３０：７９５−８０４，２００２）は、ヒト肝細胞の場合と同様のようにＦａ２Ｎ−４細胞においてＣＹＰ３Ａ４活性を誘導するが、Ａｈ受容体アゴニストはこれを誘導しない。クロトリマゾールはＣＹＰ３Ａ４の誘導物質でも阻害物質でもあり、したがってＣＹＰ３Ａ４誘導はその阻害作用によって遮断されることに留意されたい。また（図２０に示すように）、ヒト肝細胞の場合と同様のように、ＣＹＰ１Ａ２は、Ａｈ受容体を活性化するこうした作用物質によって高度に誘導可能である。
【０１３６】
表６は、Ｆａ２Ｎ−４細胞、及びヒト肝細胞の初代培養物におけるＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４の誘導の程度をまとめて示したものである。ＣＹＰ１Ａ２の場合、Ｆａ２Ｎ−４細胞における誘導の程度は、ヒト肝細胞における平均誘導倍率よりも大きかった。ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４の場合、Ｆａ２Ｎ−４細胞における誘導の程度は、ヒト肝細胞における誘導倍率中央値に匹敵するが、その平均誘導倍率よりも低い。ヒト肝細胞において誘導中央値が平均誘導値とかなり異なるのは、後者は、極めて高い値の誘導倍率を有する偶発的な試料によって著しく影響を受けるからである。このことは、０（１．５倍未満）〜１４５倍の範囲にわたるＣＹＰ３Ａ４誘導についての図２１に示される。ヒト肝細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の平均誘導倍率は１０倍であるが、より有意義なコンパレータである誘導中央値は約４倍である。
【表６】
2007518426.tif 000007
＊Ｍａｄｅｎら、「培養ヒト肝細胞におけるチトクロムＰ４５０発現に対するミクロソーム酵素誘導物質プロトタイプに対する影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）」，Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．３１：４２１−４３１，２００３からのデータ。
＊＊ＢＮＦ（β−ナフトフラボン）はヒト肝細胞のための誘導物質であったが、オメプラゾールはＦａ２Ｎ−４細胞のための誘導物質であった。
＊＊＊７−エトキシ−４−トリフルオロメチルクマリンＯ−脱アルキル（４倍）又はＳ−メフェニトインＮ−脱メチル（１３倍）に基づいたＣＹＰ２Ｂ６活性。
【０１３７】
（実施例８）
毒性研究における不死化肝細胞系の使用
Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞は、細胞ベースの毒性試験をｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施するための、ヒト肝細胞に由来する系を提供する。図２２は、毒性試験におけるＦａ２Ｎ−４細胞の使用を例示する。
【０１３８】
毒性のある濃度（最高１００μＭ）の数種の薬剤（すなわち、３−メチルコラントレン、メトトレキセート、メナジオン、ロテノン、及びトログリタゾン）で細胞を処理すると、膜の完全性が損なわれ、その結果、細胞内酵素、すなわちαグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（αＧＳＴ）が培地中に放出された。これをＢｉｏｔｒｉｎ  Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ａｌｐｈａ  ＧＳＴ  ＥＩＡ（Ｂｉｏｔｒｉｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、アイルランドＤｕｂｌｉｎ）を用いて測定した。それとは対照的に、毒性のない濃度のオメプラゾール、アセトアミノフェン、プロベネシド、フェルバメート、又はリファンピンで処理したＦａ２Ｎ−４細胞からは、αＧＳＴがほとんど、又は全く放出されなかった。
【０１３９】
アセトアミノフェン及びフェルバメートなど、こうした薬剤の一部は、高用量の場合だけではあるが（したがって、図２２で示す研究で使用するものよりもさらに高い濃度で）、臨床上重要な肝毒性を引き起こすことに留意されたい。例えば、アセトアミノフェン毒性は、４ｇ／日を超える用量、並びに他の併存する環境条件と関連している。不死化肝細胞を既知の毒物である、３−メチルコラントレン、メトトレキサート、メナジオン、ロテノン、及びトログリタゾンに曝露すると、細胞からのα−ＧＳＴの放出が著しく増大する。
【０１４０】
追加の研究を実施して、構造的に異なる２２種の化学物質での処理の後のＦａ２Ｎ−４細胞の応答を初代ヒト肝細胞のものと比較した。乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の培地中への放出、及びミトコンドリアの呼吸の途絶を（レサズリン還元の低下に基づいて）測定することにより毒性を評価した。下記の表７にまとめて示すように、大部分の化合物については、Ｆａ２Ｎ−４及び初代肝細胞の毒性プロファイルは類似していた。２つの細胞型の応答の違いがいくつか観察された。Ｆａ２Ｎ−４細胞は、初代肝細胞よりもトログリタゾン、ハイパーフォリン、及びベンゾ［ａ］ピレンに対して感受性が高かったが、メナジオンに対しては感受性が低かった。
【表７】
2007518426.tif 000008
＊ヒト肝細胞よりも感受性の高いＦａ２Ｎ−４細胞
＊＊ヒト肝細胞よりも感受性の低いＦａ２Ｎ−４細胞
したがって、こうした不死化肝細胞は、特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性スクリーニングに適している。さらに、不死化肝細胞は、再現性及び入手方法についての異なる利点を提供する。
【０１４１】
（実施例９）
Ｆａ２Ｎ−４細胞系を使用した薬物代謝酵素（ＤＭＥ）及び多剤耐性１（ＭＤＲ１）の誘導
プレーティングの４８時間後にＦａ２Ｎ−４細胞への薬物処理を開始した。ＲＮＡ定量のために、細胞を薬物に４８時間曝露した。ｍＲＮＡ転写物を定量するための強力であるが簡単なハイスループットシステムであるインベーダーアッセイ法（Ｉｎｖａｄｅｒ  ａｓｓａｙ）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）により、Ｆａ２Ｎ−４細胞における遺伝子発現をモニターした。既知の一群団の誘導物質で処理したＦａ２Ｎ−４細胞の全ＲＮＡ抽出物から、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｃ９、ＵＧＴ１Ａ、及びＭＤＲ１転写物を定量し、ビヒクル対照と比較した。
【０１４２】
また、酵素活性試験を使用して、ＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ｃ９、及びＣＹＰ３Ａ４の誘導をモニターした。酵素活性研究のために、細胞を薬物に７２時間曝露した。質量分析法によりテストステロンからの６β−ヒドロキシテストステロン形成の程度を測定することによりＣＹＰ３Ａ４活性を求めた。４’−ヒロドキシジクロフェナク生成の程度を測定することによりＣＹＰ２Ｃ９活性を求めた。７−エトキシレゾルフィンのＯ−脱アルキルの程度を測定することによりＣＹＰ１Ａ２活性を求めた。測定値を標準曲線と比較することにより代謝産物を定量した。
【０１４３】
Ｆａ２Ｎ−４細胞は、初代ヒト肝細胞と同じように応答した。１０μＭリファンピンで処理した結果、ＣＹＰ３Ａ４のｍＲＮＡ（１７倍）及び活性（６β−ヒドロキシテストステロン生成、９倍）、またＣＹＰ２Ｃ９のｍＲＮＡ（４倍）及び活性（４’−ヒロドキシジクロフェナク生成、２倍）が増大した。５０μＭのβ−ナフトフラボンで処理した結果、ＣＹＰ１Ａ２のｍＲＮＡ（１５倍）及び活性（７−エトキシレゾルフィン  Ｏ−脱アルキル、２７倍）が増大した。ＵＧＴ１ＡのｍＲＮＡはβ−ナフトフラボン（２倍）によって誘導され、ＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質）のｍＲＮＡはリファンピン（３倍）によって誘導された。表８は、初代肝細胞における公開されているデータに比べてのｍＲＮＡの増加倍率として表した、Ｆａ２Ｎ−４細胞における３つのＣＹＰの誘導データをまとめて示すものである。
【表８】
2007518426.tif 000009
【０１４４】
単一濃度の薬物の誘導効果を検査するのに加えて、Ｆａ２Ｎ−４細胞を使用して、用量と反応の関係を検討することもできる。例えば、１００ｎＭ〜５０μＭの範囲にわたる複数濃度のリファンピンを投与したＦａ２Ｎ−４細胞の応答に基づいてＥＣ５０値を計算した。図２３は、ＣＹＰ３Ａ４転写物の値の増加（図２３Ａ）、並びにＣＹＰ３Ａ４酵素活性の増大（図２３Ｂ）を使用した、Ｆａ２Ｎ−４細胞についてのＥＣ５０のグラフを含む。転写物及び酵素活性について計算したＥＣ５０は、それぞれ０．４３μＭ（ｒ２＝９２）及び０．７７μＭ（ｒ２＝９４）であった。さらに、計算した最大誘導（Ｉｍａｘ）値は、転写物指標では１３倍であり、酵素活性指標では９．７倍であった。
【０１４５】
複数の継代数のＦａ２Ｎ−４細胞をＣＹＰ３Ａ４誘導について試験した。図２４は、弱い応答を有するＣＹＰ３Ａ４誘導物質（５０μＭデキサメタゾン−網掛けの棒）及び強い応答を示すＣＹＰ３Ａ４誘導物質（１０μＭリファンピン−黒色の棒）に対する複数の継代数のＦａ２Ｎ−４細胞の応答を示すものである。空白の棒は、ＤＭＳＯビヒクルのみを処理した細胞の値を示す。デキサメタゾンで処理すると、ＣＹＰ３Ａ４転写物は、継代第２１代及び第３６代でそれぞれ１．６倍及び１．５倍増加した。１０μＭリファンピンで処理すると、ＣＹＰ３Ａ４転写物は、継代第２１代及び第３６代でそれぞれ１７倍及び１６倍増加した（図２４Ａ）。ＣＹＰ３Ａ４酵素活性は、継代第２８代及び第３６代でそれぞれ、デキサメタゾンについては２．１倍及び２．０倍、１０μＭリファンピンについては８．９倍及び４．９倍増大した（図２４Ｂ）。
【０１４６】
図２５は、様々なマルチウェルフォーマットを比較したものである。プレートのフォーマットにかかわらず、Ｆａ２Ｎ−４細胞は、リファンピンに対する相当なＣＹＰ３Ａ４誘導応答を示す。ＣＹＰ３Ａ４転写物の倍率変化は、２４ウェルプレートを使用した場合は１７．１倍、４８ウェルプレートを使用した場合は６．６倍、９６ウェルプレートを使用した場合は５．７倍であった。
【０１４７】
こうした結果は、本発明の不死化肝細胞系、特にＦａ２Ｎ−４細胞が、初代ヒト肝細胞の信頼性の高い代用物となることができ、またＤＭＥ及びトランスポーターの誘導の信頼性の高い評価をもたらすことができることを示している。
【０１４８】
（実施例１０）
Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系による血漿タンパク質の発現
こうした細胞系の十分に分化した性質は、それらの細胞系が成体肝細胞機能に特異的な血漿タンパク質を持続的に分泌することによってさらに裏付けられる（図２６）。６０ｍｍプレート又はローラーボトルのいずれかに蒔いたＦａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞から培地を回収し、ウエスタンブロット分析によって解析した。限外ろ過により培地を５０倍に濃縮し、アルブミン（全タンパク質１０μｇ／レーン）を除き４０μｇの全タンパク質を各レーンに添加した。ブロットを、アルブミン、α１アンチトリプシン、並びに第ＶＩＩＩ因子及び第ＩＸ因子に対する、モノクローナル抗体又はアフィニティー精製したポリクローナル抗体のいずれかと共にインキュベートし、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させた２次抗体を使用し、続いてそれをＤＡＢ基質と共にインキュベートして視覚化した。下記の図２６に示すように、どちらの細胞系も、プレートで維持する培養物のようにローラーボトル中で維持すると、プレートで維持する培養物のように、アルブミン、α１アンチトリプシン、及び第ＩＸ因子を１ｍｌあたり類似のレベルで発現し続ける。第ＶＩＩＩ因子の発現は様々で、細胞系及び培養条件に大きく依存している。第ＩＸ因子のプロセッシングは不均質であったが、これはヒト血漿由来タンパク質においても観察された。
【０１４９】
ＡＡＴ及びＩαＩｐはどちらも、トリプシンのタンパク質分解活性を阻害する血漿タンパク質である。下記の図２６に示すように、イムノブロット分析により、両方の細胞系の馴化条件培地中にＡＡＴが存在することが明確に実証された。
【０１５０】
全体として総合すれば、上記の実施例はすべて、本発明の不死化ヒト肝細胞系は、それだけには限らないがＦａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系を含めて、肝細胞に特徴的な多くの機能属性をｉｎ  ｖｉｖｏで維持しており、ＴＰＰを産生するための非常に重要なｉｎ  ｖｉｔｒｏ系であることを強く示唆している。
【０１５１】
（実施例１１）
アルブミンの産生
Ｆａ２Ｎ−４細胞をＴ−１５０フラスコの無血清培地中で増殖させてコンフルエントにし、ＥＬＩＳＡ試験によりアルブミン産生を測定した。この試験の結果は下記の表９でみられる。継代第１３代及び第１６代のＦａ２Ｎ−４細胞では、およそ３μｇ／ｍｌのアルブミンが産生された。継代第３３代のＦａ２Ｎ−４細胞では、およそ９μｇ／ｍｌのアルブミンが産生され、また継代第４１代のＦａ２Ｎ−４細胞では、およそ６μｇ／ｍｌのアルブミンが産生された。したがって、本発明の不死化肝細胞系、特にＦａ２Ｎ−４細胞は、ＴＰＰであるアルブミンを産生するための潜在的な供給源である。
【表９】
2007518426.tif 000010
【０１５２】
（実施例１２）
インターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩｐ）の発現
血漿中に比較的高濃度で存在する天然のセリンプロテアーゼインヒビターである、インターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩｐ）は、炎症、創傷治癒、及び癌転移において及びいくつかの役割を果たしている。ＩαＩｐは、肝細胞によって生成及び分泌される血漿タンパク質のファミリーである。ＩαＩｐの主要な形態は、インターαインヒビター（ＩαＩ、ビクニンと呼ばれる１本の軽鎖及び２本の重鎖を含有）及びプレαインヒビター（ＰαＩ、１本の軽鎖及び１本の重鎖を含有）である。最近、Ｐｒｏｔｈｅｒａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社（米国ロードアイランド州Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ）の科学者により、ヒトＩαＩｐの軽鎖を認識するモノクローナル抗体（ＭＡｂ６９．３１）が開発された。競合ＥＬＩＳＡにおいてＭＡｂ６９．３１を使用すると、重篤な敗血症患者の血漿ＩαＩｐレベルが、健常な対照に比べて有意に低下することがこうした研究者らによって実証された（Ｌｉｍ  ＹＰ、Ｂｅｎｄｅｌｊａ  Ｋ、Ｏｐａｌ  ＳＭ、Ｓｉｒｙａｐｏｒｎ  Ｅ、Ｈｉｘｓｏｎ  ＤＣ、Ｐａｌａｒｄｙ  ＩＦ、「重篤な敗血症患者の死亡率と、血漿中インターαインヒビターレベルとの相関（Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒ−ａｌｐｈａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒｅｌｙ  Ｓｅｐｔｉｃ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１８８：９１９−９２６，２００３）。
【０１５３】
ＭＡｂ６９．３１を使用したウエスタンブロット分析により、Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系はどちらも免疫反応性ＩαＩｐを合成し続けることが明らかに分かった（データは示さず）。その後、ＥＬＩＳＡ試験により、条件培地中に分泌されるＩαＩｐの量を定量した（下記の実施例１４参照）。したがって、Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞は、ＴＰＰであるＩαＩｐを産生するための潜在的な供給源である。
【０１５４】
（実施例１３）
不死化ヒト肝細胞によるトランスフェリンの産生
様々な継代数のＥａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞によってトランスフェリンが生成及び分泌されるかどうかを判定するために、この細胞をトランスフェリンを含まない無血清培地中で７日間培養した。７日後、馴化条件培地を回収し、市販の抗トランスフェリン抗体を使用してイムノブロット分析を実施した。ヒト血漿を陽性対照として使用した。図２７に示すように、抗トランスフェリン抗体を使用したイムノブロットにより、すべての継代の細胞でこの血漿タンパク質が発現し続けることが分かった。レーン２〜５は、様々な継代数のＥａｌＣ−３５細胞で、血漿由来のトランスフェリンとほぼ同一のトランスフェリンが産生されることを示す。レーン６〜９は、様々な継代数のＦａ２Ｎ−４細胞で、血漿由来のトランスフェリンとほぼ同じトランスフェリンが産生されることを示す。したがって、ここで特許請求する不死化肝細胞は、それだけには限らないがＥａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞系を含めて、トランスフェリンを産生するための潜在的な供給源である。
【０１５５】
（実施例１４）
馴化条件培地中に存在するインターαタンパク質性インヒビター（ＩαＩｐ）のトリプシン阻害試験及び定量
馴化条件培地の全トリプシン阻害活性には、主要なセリンプロテアーゼインヒビターであるα１アンチトリプシン及びＩαＩｐの活性が含まれる。色素のトリプシン基質Ｌ−ＢＡＰＡ（Ｎ（α）−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−４−ニトロアニリド塩酸塩、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製）を使用して、Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞から馴化条件培地中に分泌されるトリプシン阻害活性の量を測定した（表１０参照）。この試験は、セリンプロテアーゼインヒビターがＬ−ＢＡＰＡの加水分解を阻害することができるかどうかに基づくものである。４１０ｎｍでのδ吸光度／分という速度の低下により阻害をモニターすることができる。細胞内タンパク質１μｇあたりの生物活性に基づいて、特異的活性を計算した。Ｅａ１Ｃ−３５細胞では１１５ＴＩＵ／ｍｇのタンパク質が発現し、Ｆａ２Ｎ−４細胞では４５ＴＩＵ／ｍｇのタンパク質が発現した。
【表１０】
2007518426.tif 000011
【０１５６】
ＭＡｂ６９．３１（例えば、ヒトＩαＩｐに対して特異的なポリクローナル抗体）を使用した競合ＥＬＩＳＡにより、培地中のＩαＩｐの量を測定した。以下の通りＥＬＩＳＡを実施した。９６ウェルＩｍｍｕｎｏｌｏｎ−４プレート（Ｄｙｎｅｘ社製、米国）を５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．６中の精製されたＩαＩｐ（３００ｎｇ）でコーディングし、４℃で一晩インキュベートした。１％ラット血清を含有するＰＢＳ中の精製されたヒト血漿由来ＩαＩｐの段階希釈法を使用して、標準曲線を確定した。培地中のＩαＩｐレベルの定量分析のために、５０μＬの培地又は段階希釈したＩαＩｐを９６ウェルプレートの個々のウェルに添加した。５０μＬのＭＡｂ６９．３１を各ウェルに添加した後、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、続いて自動プレート洗浄器（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｌａｔｅ  ｗａｓｈｅｒ）（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して洗浄した。ＨＲＰに結合したヤギ抗マウスＩｇＧ（ヒト吸収）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ社製、米国カリフォルニア州Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）を３７℃、１時間で添加することにより、結合したＭＡｂ６９．３１を検出した。洗浄後、１００μＬの１−Ｓｔｅｐ  ＡＢＴＳ（Ｐｉｅｒｃｅ社製、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）（ＢｉｏＴｅｋ社製）を用いて４０５ｎｍでの吸光度を測定した。各試料につき３回繰り返して試験した。非馴化条件培地を基準対照として使用した。この結果を表１０にまとめて示す。Ｅａ１Ｃ−３５細胞では２０μｇ／ｍｌのＩαＩｐが発現し、Ｆａ２Ｎ−４細胞では４μｇ／ｍｌのＩαＩｐが発現した。
【０１５７】
こうした結果から、本発明の不死化肝細胞は、ＡＡＴ、ＩαＩｐなどのＴＰＰを産生するための潜在的な優れた供給源であることが実証される。
【０１５８】
（実施例１５）
二次元ゲル分析
２Ｄゲル電気泳動分析を使用して、Ｆａ２Ｎ４及びＥａ１Ｃ３５細胞系の分泌タンパク質を分離した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＺＯＯＭ  ＩＰＧＲｕｎｎｅｒシステムを使用して、固定化ｐＨ勾配ストリップ（ｐＨ３〜１０の範囲）を用いてタンパク質の第１のＩＥＦ分離を実施し、続いて４〜１２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて二次元目の分離を行った。どちらの細胞系においても、ＴＰＰの可能な候補としてタンパク質の多数のスポットを同定することができた（図２８Ａ：Ｆａ２Ｎ４、図２８Ｂ：Ｅａ１Ｃ３５）。２次元ゲル分離の後、Ｅａ１Ｃ３５細胞系の分泌タンパク質をニトロセルロース上に移し、抗第ＩＸ因子抗体を使用したウエスタンブロット分析を実施した。ＭＷが７０ＫＤで、ｐＩが６．５〜７．０の反応性のタンパク質を検出した（図２８Ｃ）。したがって、本発明で特許請求する不死化肝細胞系は、第ＩＸ因子などのＴＰＰの潜在的な供給源である。
【０１５９】
（実施例１６）
細胞系の増殖、及び血漿タンパク質分泌の定量
培養不死化ヒト肝細胞を産生細胞として使用した、ＴＰＰの経済的な産生は、この細胞が培養物の塊中で増殖する場合に、こうしたＴＰＰを生成及び分泌し続けない限り達成することができない。最初にこの問題を評価するために、Ｆａ２Ｎ−４細胞をＴ２５、Ｔ７５、及びＴ１５０培養フラスコ中で増殖させてコンフルエントにし、ＥＬＩＳＡ試験を、アルブミン、ＡＡＴ、又はＩαＩｐを認識する捕獲抗体と組み合わせて使用して、分泌される血漿タンパク質を定量した。最初に１ｃｍ２あたりそれぞれ５００万個、１５００万個、及び３０００万個となるように相当数の細胞を蒔いた。３日間馴化条件培地を回収し、貯蔵し、限外ろ過によって１０倍に濃縮し、試験した。下記の図２９に示すように、各血漿タンパク質の全発現は、ほぼ細胞数に比例していた。値は、同じ３組の平均＋／−ＳＤを表す。Ｔ１５０フラスコ中で３日間にわたり培養した細胞は、およそ２００μｇのアルブミン、５００ｎｇのＩαＩｐ、及び１５０ｎｇのＡＡＴを産生した。これは、本発明において特許請求する不死化肝細胞系がＴＰＰを産生するための潜在的な供給源であることを示す。
【０１６０】
（実施例１７）
アルブミン分泌に対する培養期間の影響
不死化ヒト肝細胞を、ＴＰＰを市販用に産生するためのバイオファクトリーとして使用する計画がある。したがって、ＴＰＰ分泌が長期間の培養で有意に減少してはならないことが必須である。この問題を評価するために、前記の実施例に記載の通りＦａ２Ｎ−４細胞をＴ２５、Ｔ７５、及びＴ１５０培養フラスコ中で増殖させ、アルブミン産生を全タンパク質分泌の指標として測定する研究を最近開始した。３日目に馴化条件培地を回収し、細胞に栄養を再補給し６日目にこれを試料として再回収した。ＥＬＩＳＡ試験によりアルブミン分泌を分析した。この結果から、アルブミン分泌がプレーティングのフォーマットとは無関係に６日間の回収期間にわたって増加し続けることが示される（図３０参照）。特に留意すべきことは、細胞をＴ７５及びＴ１５０フラスコ中で培養すると、アルブミンが劇的に増加することである。細胞内全タンパク質は培養の時間と共に有意に増加しないので（データは示さず）、こうした結果は、培養条件への適応の結果として産生が増強されたことが原因であり、フラスコあたりの細胞数が劇的に増加した結果ではない可能性が高いように思われる。
【０１６１】
（実施例１８）
血漿タンパク質分泌に対する腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の影響
一部の血漿タンパク質の産生は、ＴＮＦαなどの急性期タンパク質によってｉｎ  ｖｉｖｏで調節することができる。ＡＡＴの分泌に対するＴＮＦα処理の影響を研究した。Ｆａ２Ｎ４細胞を、特許権のある、ＴＮＦα（０、１、５、又は１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する無血清ＭＦＥ培地中で３日間維持した。下記の表１１に示すように、ＡＴＴの分泌は、無血清培地中に５ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαを含めることによって最も顕著に増大した。値は、２組の同じ試料の平均である。したがって、このサイトカインを使用するとＡＴＴ産生を増大させることができる可能性がある。したがって、本発明の不死化肝細胞系のＴＮＦαによる処理は、ＴＰＰの産生を増大させる有効な一方法である可能性がある。
【表１１】
2007518426.tif 000012
【０１６２】
（実施例１９）
不死化ヒト肝細胞による血漿タンパク質の発現に対するデキサメタゾンの影響
アルブミン発現は一部が、デキサメタゾン誘導可能プロモーターによって部分的に調節される（Ｎａｋｍｕｒａら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２６１：１６８８３−１６８８８，１９８６）。不死化ヒト肝細胞によるアルブミンの産生及び分泌に対するデキサメタゾンの影響を試験するために、Ｆａ２Ｎ−４細胞（継代第３２代）をＩ型コラーゲンディッシュ上、デキサメタゾンを含む、又は含まない培地中で４８時間培養し、ＥＬＩＳＡ試験によりアルブミン発現を測定した。値は２組の同じ試料の平均を表す。下記の表１２にまとめて示すように、アルブミンの分泌は、デキサメタゾンを含まない場合に有意に減少した。
【０１６３】
したがって、デキサメタゾンでの処理は、本発明で特許請求する不死化肝細胞系においてＴＰＰの産生を増大させる有効な一方法となる可能性がある。
【表１２】
2007518426.tif 000013
【０１６４】
（実施例２０）
治療用血漿タンパク質（ＴＰＰ）を産生及び発現できる能力
Ｆａ２Ｎ−４細胞系で免疫反応性ＴＰＰを適切に産生できるかどうかを、免疫反応性ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の産生によって示した。一時的トランスフェクションの前日に、Ｆａ２Ｎ−４細胞を、１０％ＮＢＣＳ−ＭＦＥ培地を使用したＮｕｎｃ社製６ウェルプレートの各ウェルに、Ｆａ２Ｎ−４細胞を０．５〜０．８×１０６個の細胞密度で蒔いた。トランスフェクションの日に、この細胞を１回洗浄して血清を除去し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ又はＱｉａｇｅｎ社製Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬キットのいずれかを使用して、ｈＧＨの完全ｃＤＮＡを含む、ＣＭＶベースのプラスミドを、Ｆａ２Ｎ−４細胞中に一時的にトランスフェクトした。製造元のプロトコール通りにトランスフェクションを実施した。
【０１６５】
２４時間後及び／又は４８時間後、馴化条件培地を各ウェルから回収し、続いてＥＬＩＳＡべースの免疫検出試験のために使用した。このＥＬＩＳＡ試験は、分泌されるｈＧＨを定量するための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の原理を利用した比色酵素免疫測定法である。ｈＧＨに対する抗体を事前に結合させたマイクロリットルプレートに、条件培地中に含まれる分泌ｈＧＨが結合する。その後、馴化条件培地中に含まれ、マイクロタイタープレート上に固定されたｈＧＨペプチドの第２エピトープに、ジゴキシゲニン標識ｈＧＨ抗体が結合する。次いで、ペルオキシダーゼに結合した抗ジゴキシゲニン抗体を添加し、続いてペルオキシダーゼ基質ＡＢＴＳを添加する。基質をペルオキシダーゼで触媒切断することにより、着色した反応産物が得られ、これはマイクロタイタープレートリーダーを使用して容易に検出することができる。
【０１６６】
こうした結果から、いずれかのトランスフェクションキットを使用し、トランスフェクションの２４時間後又は４８時間後に馴化条件培地を回収すると、Ｆａ２Ｎ−４細胞で、二重免疫検出されたｈＧＨが異常に大量に産生されるが、ＬａｃＺでのトランスフェクション又はプラスミドを含まない陰性対照では、ｈＧＨが検出可能なレベルで産生されないことが確認される。ＥＬＩＳＡプレート１及びプレート２の写真をそれぞれ図３１及び図３２に示す。図３１及び図３２の略語表を下記の表１３に示す。
【表１３】
2007518426.tif 000014
略語表
Ｂｌａｎｋ＝基質
Ｓｔｄ  Ｘ＝Ｘｎｇ／ｍｌのｈＧＨの標準
ＸＱＬａｃＺ  Ｙ＝Ｑｉａｇｅｎ社製キットを使用して、ＬａｃＺ対照プラスミドを０．５×１０（６）細胞中にトランスフェクトしたＸ日後に得られた試料Ｙ
ＸＱ（１：Ｙ）Ｚ＝Ｑｉａｇｅｎ社製キットを使用して、ＤＮＡとＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を１：Ｙの比で０．５×１０（６）細胞中にトランスフェクトしたＸ日後に得られた試料Ｚ
ＸＮｅｇ  Ｙ’＝Ｑｉａｇｅｎ社製キットを使用して、ＤＮＡを含まないものを０．８×１０（６）細胞中にトランスフェクトしたＸ日後に得られた試料Ｙ
ＸＱ（１：Ｙ）Ｚ’＝Ｑｉａｇｅｎ社製キットを使用して、ＤＮＡとＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を１：Ｙの比で０．８×１０（６）細胞中にトランスフェクトしたＸ日後に得られた試料Ｚ
ＩＬａｃＺ  Ｘ＝Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製キットを使用して、ＬａｃＺ対照プラスミドを０．７×１０（６）細胞中にトランスフェクトした翌日に得られた試料Ｘ
Ｉ（Ｘ）Ｙ＝Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製キットを使用して、ＸｕｇのＤＮＡを０．７×１０（６）細胞中にトランスフェクトした翌日に得られた試料Ｙ
Ｂｌａｎｋ’＝緩衝液
【０１６７】
（実施例２１）
ＥＡ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞系の免疫表現型の特徴付け
Ｅａ１Ｃ−３５（継代第２６代）及びＦａ２Ｎ−４（継代第３０代）細胞系の表現型を、様々な肝細胞又は胆管のマーカー、並びにＳＶ４０不死化遺伝子に対する一群団の抗体を使用した間接免疫蛍光分析によって分析した。その分析結果を下記の表１４にまとめて示す。
【表１４】
2007518426.tif 000015
【０１６８】
コネキシン３２の発現は密度に依存していた。細胞をコンフルエントな単層になるまで増殖させると、Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞の小集団で、成体肝組織中の肝細胞によってのみ発現されるギャップ結合タンパク質が発現する。
【０１６９】
すべての細胞で不死化遺伝子であるＳＶ４０  Ｔ抗原が発現した。免疫検出可能なＳＶ４０  Ｔ抗原の発現は、特に核に局在していた。不死化肝臓細胞の十分に分化した性質が、成体肝細胞に特異的な系統マーカーであるアルブミン及びコネキシン３２の強力な発現、並びに胎児の肝細胞マーカーであるαフェトプロテインの欠如によって示される。この細胞では胆管マーカーであるＣＤ４９ｆは発現しない。この細胞では、Ｃ型肝炎ウイルス糖タンパク質によって媒介されるウイルス感染の推定上の受容体であるＣＤ８１が発現する。ＣＤ８１を免疫染色したＦａ２Ｎ−４細胞の顕微鏡写真を図３３に示す。ＣＤ８１の発現は原形質膜に局在していることに留意されたい。
【０１７０】
他の実施形態
上記のすべての参考文献の全体をあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込む。本発明を好ましいその実施形態に関して具体的に示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、その形態及び詳細を様々な形で変更できることは当分野の技術者であれば理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図２】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図３】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図４】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図５】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図６】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図７】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図８】Ｅａ１Ｃ−３５及びＦａ２Ｎ−４細胞におけるいくつかのｍＲＮＡ転写物の発現分析のためのＲＴ−ＰＣＲ産物を示す図である。ゲルローディングの順序の説明の概要を上記の表１及び表２に示す。
【図９ａ】不死化細胞のゲノムＤＮＡ中へのＳＶ４０  ＤＮＡの組込みを確認するための、ラージＴ抗原についてのＥａ１Ｃ−３５不死化肝細胞系の免疫染色を示す図である。
【図９ｂ】増殖細胞でアルブミンが発現し続けることを実証するための、培養Ｆａ２Ｎ−４細胞の免疫染色を示す図である。
【図９ｃ】正常初代肝細胞の特性である、明確に定義される核小体及び顆粒状細胞質を有する不死化細胞の形態を示す図である。
【図１０】Ｆａ２Ｎ−４細胞を様々なＣＹＰ３Ａ４誘導物質で処理した後のテストステロン代謝の誘導能を示す図である。
【図１１】Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５をリファンピン（ＲＩＦ）、β−ナフトフラボン（ＢＮＦ）、及びフェノバルビタール（ＰＢ）で処理した結果として起こるＣＹＰ３Ａ４の誘導を実証するイムノブロットを示す図である。Ｃは未処理対照である。上方のバンドは非特異的であり、ＣＹＰ１Ａ誘導物質であるＢＮＦは、ＣＹＰ３Ａ４タンパク質発現を誘導しないことに留意されたい。
【図１２】ヒト肝細胞（上図）及びＦａ２Ｎ−４細胞（下図）の形態を光学顕微鏡レベルで示す図である。Ｆａ２Ｎ−４細胞はヒト肝細胞に非常に類似していることに留意されたい。
【図１３】６ウェルプレートで培養したＦａ２Ｎ−４細胞におけるオメプラゾール及びリファンピンによるＣＹＰ酵素の誘導を示す図である。
【図１４】リファンピンで処理したＦａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ２Ｂ６誘導の再現性を示す図である。
【図１５】数代の継代にわたるＦａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ酵素誘導の再現性を示す図である。点線は、新鮮なヒト肝細胞における誘導倍率中央値を表す。
【図１６】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ２Ｂ６の誘導に対する細胞培養フォーマットの影響を示す図である。
【図１７】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の誘導に対する細胞培養フォーマット（６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、又は９６ウェルプレート）の影響を示す図である。
【図１８】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の誘導の経時変化を示す図である。
【図１９】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４の誘導の濃度応答曲線を示す図である。
【図２０】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ１Ａ２及びＣＹＰ３Ａ４活性に対する様々な酵素誘導物質の影響を示す図である。
【図２１】ヒト肝細胞の初代培養物におけるＣＹＰ３Ａ４誘導の範囲を示す図である。誘導中央値と平均誘導値の差に留意されたい。
【図２２】化合物への曝露の７２時間後のα−ＧＳＴの培地中への放出を測定することにより毒物を非毒物と区別する上でのＦａ２Ｎ−４細胞の有用性を示す図である。
【図２３】Ｆａ２Ｎ−４細胞におけるリファンピンによるＣＹＰ３Ａ４誘導についての用量と反応の依存関係を示す図である。１００ｎＭ〜５０μＭのリファンピンで処理したＦａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の誘導の測定を実施した。３−パラメータＳ字状曲線（３−ｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｃｕｒｖｅ）を使用したＳｉｇｍａＰｌｏｔ（８版）を使用して、データを調整した。（Ａ）全ＲＮＡを分析してＣＹＰ３Ａ４転写物のレベルを求め、次いでビヒクル対照と比較して誘導倍率を求めた。データは、３組の同じ試料のデータの平均±ＳＤを表す。（Ｂ）ＣＹＰ３Ａ４活性を、テストステロン代謝産物である６β−ヒドロキシテストステロンの形成によって測定し、次いでビヒクル対照と比較して誘導倍率を求めた。データは、３組の同じ試料のデータの平均±ＳＤを表す。
【図２４】様々な継代数のＦａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４の誘導を示す図である。様々な継代数のＦａ２Ｎ−４細胞を２４ウェルプレートに蒔き、０．１％ＤＭＳＯビヒクル（空白の棒）、５０μＭデキサメタゾン（網掛けの棒）、及び１０μＭリファンピン（黒色の棒）に曝露した。（Ａ）単離した全ＲＮＡからＣＹＰ３Ａ４転写物のレベルを定量した。プロットは、４組の同じ試料のデータの平均±ＳＤを表す。（Ｂ）ＣＹＰ３Ａ４活性をテストステロン代謝産物である６β−ヒドロキシテストステロンの形成によって測定した。プロットは、２組の同じ試料の平均を表す。すべての化合物で、ビヒクル対照処理に比べて、転写物の統計的に有意な増加が示された（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図２５】様々なマルチウェルプレートフォーマットにおけるＣＹＰ３Ａ４誘導の比較を示す図である。１０μＭリファンピン（黒色の棒）への曝露の４８時間後の、ビヒクル（空白の棒）と比較したＦａ２Ｎ−４細胞におけるＣＹＰ３Ａ４転写物の誘導。データは、図に示すように各マルチウェルプレートフォーマットにおいて実施された研究からのものである。プロットは、４組の同じ試料のデータの平均±ＳＤを表す。すべての化合物で、ビヒクル対照処理に比べて、転写物の統計的に有意な増加が示された（スチューデントのｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【図２６】以下のレーン、すなわち１）ヒト血漿；２）プロテインマーカーライン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｌｉｎｅ）；３）培地（対照）；４）初代ヒト肝細胞（７２時間培養）；５）Ｅａ１Ｃ−３５単層、７２時間培養；６）Ｅａ１Ｃ−３５、ローラーボトル、７日間培養；７）Ｅａ１Ｃ−３５、ローラーボトル／１４日間培養；８）Ｆａ２Ｎ−４単層／７２時間培養；９）Ｆａ２Ｎ−４、ローラーボトル／７日間培養；１０）Ｆａ２Ｎ−４、ローラーボトル／１４日間培養を示す図である。
【図２７】以下のレーン、すなわち１）マーカー；２）Ｅａ１Ｃ−３５  ｐ１５；３）Ｅａ１Ｃ−３５  ｐ２４；４）Ｅａ１Ｃ−３５  ｐ２９；５）Ｅａ１Ｃ−３５  ｐ４３；６）Ｆａ２Ｎ−４  ｐ１０；７）Ｆａ２Ｎ−４  ｐ２３；８）Ｆａ２Ｎ−４  ｐ３１；９）Ｆａ２Ｎ−４  ｐ３９；１０）ヒト血漿により、抗トランスフェリン抗体を使用したイムノブロットを示す図である。
【図２８】Ｆａ２Ｎ−４及びＥａ１Ｃ−３５細胞系の分泌タンパク質の２次元ゲル分析、並びに抗第ＩＸ因子抗体を用いた、Ｅａ１Ｃ−３５ゲルのウエスタンブロット分析を示す図である。
【図２９】Ｔ２５、Ｔ７５、及びＴ１５０フラスコ中で増殖させたＦａ２Ｎ−４細胞における血漿タンパク質であるアルブミン、ＩαＩｐ、及びＡＡＴの発現を示す図である。
【図３０】Ｔ２５、Ｔ７５、及びＴ１５０フラスコ中での培養の３日後及び６日後のＦａ２Ｎ−４細胞による全アルブミン分泌を示す図である。
【図３１】分泌されるｈＧＨを定量するための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の原理を利用した比色酵素免疫測定法を含むＥＬＩＳＡプレート１の写真を示す図である。このプレートの略語表を上記の表１３に示す。
【図３２】分泌されるｈＧＨを定量するための、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の原理を利用した比色酵素免疫測定法を含むＥＬＩＳＡプレート２の写真を示す図である。このプレートの略語表を上記の表１３に示す。
【図３３】ＣＤ８１を免疫染色したＦａ２Ｎ−４細胞の顕微鏡写真を示す図である。ＣＤ８１の発現は原形質膜に局在していることに留意されたい。
【図１】
2007518426.tif 000016
【図２】
2007518426.tif 000017
【図３】
2007518426.tif 000018
【図４】
2007518426.tif 000019
【図５】
2007518426.tif 000020
【図６】
2007518426.tif 000021
【図７】
2007518426.tif 000022
【図８】
2007518426.tif 000023
【図９ａ】
2007518426.tif 000024
【図９ｂ】
2007518426.tif 000025
【図９ｃ】
2007518426.tif 000026
【図１２】
2007518426.tif 000027
【図１３】
2007518426.tif 000028
【図１４】
2007518426.tif 000029
【図１５】
2007518426.tif 000030
【図１６】
2007518426.tif 000031
【図１７】
2007518426.tif 000032
【図１８】
2007518426.tif 000033
【図１９】
2007518426.tif 000034
【図２０】
2007518426.tif 000035
【図２１】
2007518426.tif 000036
【図２２】
2007518426.tif 000037
【図２３】
2007518426.tif 000038
【図２４】
2007518426.tif 000039
【図２５】
2007518426.tif 000040
【図２８】
2007518426.tif 000041
【図２９】
2007518426.tif 000042
【図３０】
2007518426.tif 000043
【図３１】
2007518426.tif 000044
【図３２】
2007518426.tif 000045
【図３３】
2007518426.tif 000046
【図１０】
2007518426.tif 000047
【図１１】
2007518426.tif 000048
【図２６】
2007518426.tif 000049
【図２７】
2007518426.tif 000050
【国際調査報告】
2007518426.tif 000051
2007518426.tif 000052
2007518426.tif 000053
2007518426.tif 000054