(57)【要約】本発明は、ポリエチレングリコールと結合させたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含む、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストに関する。治療を目的とする、関連する製剤ならびにそれらの投与量および投与の方法も提供される。これらの改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト、組成物および方法は、IL-4およびIL-13により媒介される気道過敏性および好酸球増加症を阻害することにより、喘息などの呼吸器障害に罹患した個体に対する治療的選択肢を提供する。より詳細には、これらのアンタゴニストは、非改変IL-4RAと比較して血漿半減期が長いため、効果の持続時間が増大している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）SEQ ID NO：2、SEQ ID NO；3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7もしくはSEQ ID NO：8に示されたヌクレオチド配列；または
b）SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15もしくはSEQ ID NO：16に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項1記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項2記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを作製する方法であって、
a）請求項3記載の宿主細胞をアンタゴニストが発現される条件下で培養する段階；および
b）宿主細胞培養物からアンタゴニストを精製する段階
を含む方法。
【請求項５】
IL-4およびIL-13により媒介される活性を阻害する、請求項4記載の方法によって生産される改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項６】
ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーと結合している、請求項5記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項７】
約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのKdでIL-4受容体α鎖と結合する、請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項８】
IL-4に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項９】
IL-13に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１０】
IL-4に対するヒトB細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１１】
IL-4に対するヒトT細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１２】
血漿半減期が、非改変IL-4受容体アンタゴニストの少なくとも約2〜10倍の長さである、請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１３】
IL-4の28、36、37、38、104、105または106位にあるアミノ酸残基で非タンパク質性ポリマーと結合している、請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１４】
28、36、37、38、104、105または106位のアミノ酸残基がシステインである、請求項13記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１５】
IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療するための方法であって、
a）IL-4およびIL-13の活性が増加している病態を有するヒトを提供する段階；ならびに
b）請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの有効量を該ヒトに投与する段階
を含む方法。
【請求項１６】
障害が喘息、慢性閉塞性肺疾患または関連する肺病態である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
慢性閉塞性肺疾患が肺気腫または慢性気管支炎である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
a）請求項6記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト；および
b）薬学的に許容される担体、
を含む薬学的組成物。
【請求項１９】
IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療する方法であって、
a）IL-4およびIL-13の活性が増加している病態を有するヒトを提供する段階；ならびに
b）請求項18記載の薬学的組成物の有効量を該ヒトに投与する段階
を含む方法。
【請求項２０】
障害が喘息、慢性閉塞性肺疾患または関連する肺病態である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
慢性閉塞性肺疾患が肺気腫または慢性気管支炎である、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
IL-4の28、36、37、38、104、105または106位にあるアミノ酸残基で非タンパク質性ポリマーと結合している、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストであって、非タンパク質性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２３】
SEQ ID NO：10に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２４】
SEQ ID NO：11に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２５】
SEQ ID NO：12に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２６】
SEQ ID NO：13に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２７】
SEQ ID NO：14に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２８】
SEQ ID NO：15に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２９】
SEQ ID NO：16に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３０】
IL-4受容体α鎖と、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのKdで結合する、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３１】
IL-4に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３２】
IL-13に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３３】
IL-4に対するヒトB細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３４】
IL-4に対するヒトT細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３５】
血漿半減期が、非改変IL-4受容体アンタゴニストの少なくとも約2〜10倍の長さである、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３６】
28、36、37、38、104、105または106位のアミノ酸残基がシステインである、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項３７】
a）請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト；および
b）薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物。
【請求項３８】
IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療する方法であって、
a）IL-4およびIL-13の活性が増加している病態を有するヒトを提供する段階；ならびに
b）請求項37記載の薬学的組成物の有効量を該ヒトに投与する段階
を含む方法。
【請求項３９】
障害が喘息、慢性閉塞性肺疾患または関連する肺病態である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
慢性閉塞性肺疾患が肺気腫または慢性気管支炎である、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
活性型の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを作製する方法であって、
a）請求項3記載の宿主細胞をアンタゴニストが発現される条件下で培養する段階；
b）アンタゴニストをジチオトレイトールの存在下でリフォールディングさせる段階；および
c）宿主細胞培養物からアンタゴニストを精製する段階
を含む方法。
【請求項４２】
d）アンタゴニストを非タンパク質性ポリマーと結合させる段階；および
e）非タンパク質性ポリマーと結合させたアンタゴニストを精製する段階
をさらに含む、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
IL-4およびIL-13により媒介される活性を阻害する、請求項41または42記載の方法によって生産された改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項４４】
非タンパク質性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである、請求項43記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項４５】
IL-4受容体α鎖と、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのKdで結合する、請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項４６】
IL-4に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項４７】
IL-13に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項４８】
IL-4に対するヒトB細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項４９】
IL-4に対するヒトT細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項５０】
血漿半減期が、非改変IL-4受容体アンタゴニストの少なくとも約2〜10倍の長さである、請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項５１】
IL-4の28、36、37、38、104、105または106位にあるアミノ酸残基で非タンパク質性ポリマーと結合している、請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項５２】
28、36、37、38、104、105または106位のアミノ酸残基がシステインである、請求項51記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項５３】
IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療する方法であって、
a）IL-4およびIL-13の活性が増加している病態を有するヒトを提供する段階；ならびに
b）請求項44記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの有効量を該ヒトに投与する段階
を含む方法。
【請求項５４】
障害が喘息、慢性閉塞性肺疾患または関連する肺病態である、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
慢性閉塞性肺疾患が肺気腫または慢性気管支炎である、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
a）請求項43記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト；および
b）薬学的に許容される担体、
を含む、薬学的組成物。
【請求項５７】
IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療する方法であって、
a）IL-4およびIL-13の活性が増加している病態を有するヒトを提供する段階；ならびに
b）請求項56記載の薬学的組成物の有効量を該ヒトに投与する段階
を含む方法。
【請求項５８】
障害が喘息、慢性閉塞性肺疾患または関連する肺病態である、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
慢性閉塞性肺疾患が肺気腫または慢性気管支炎である、請求項58記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーと結合させたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストに関する。さらに、治療を目的とする、関連する製剤ならびにそれらの投与量および投与の方法も提供される。これらの改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト、ならびに関連する組成物および方法は、重症喘息、慢性閉塞性肺疾患および関連する肺病態に罹患した個体に対する治療的選択肢を提供するのに有用である。
【０００２】
相互参照
本出願は、2003年8月29日に提出された米国仮特許出願第60／498,906号；2003年12月9日に提出された第60／528,228号；および2003年12月17日に提出された60／530,182号の利益を請求し、これらの開示内容は本明細書に明示的に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
喘息は、さまざまな程度の可逆的な気流閉塞および気道過敏性（AHR）を特徴とし、これには気管支粘膜への活性化Tリンパ球（T細胞）および好酸球の浸潤が伴う。これらの細胞は、常在性気道マスト細胞とともに、この疾患の発生において根本的な役割を果たす種々のサイトカインおよびメディエーターを分泌する。CD4+ Th2細胞は、特定サイトカイン（IL-4、IL-5、IL-9およびIL-13）の放出を通じて、その疾患プロセスを組織化すると考えられている（1,2）。特に、Th2サイトカインであるIL-4およびIL-13は、気道炎症および気道過敏性の発生および維持にとって極めて重要であると考えられている。
【０００４】
数多くのインビボでの研究からも、IL-4およびIL-13が喘息の発生において極めて重要な役割を果たすことが裏づけられている。いずれかのサイトカインを欠損した動物、またはIL-4もしくはIL-13のいずれかの機能を無効化する試薬を用いて、これらのサイトカインが、気道炎症および気道過敏性を招く一次および二次免疫応答の調節に重要な役割を果たすことが観察されている（3,4）。以上を総合すると、これらのデータは、IL-4およびIL-13がアレルギー性気道応答において重複した役割および独立した役割の両方を果たすこと、ならびにこの両方のサイトカインを標的とすることが、いずれかのサイトカインのみを標的とするよりも著しい利益を付け加える可能性があることを示唆している。
【０００５】
IL-4のアンタゴニストは文献に報告されている。アンタゴニストとして機能するIL-4の変異体には、IL-4アンタゴニストであるムテインIL-4／Y124D（Kruse, N., Tony, H. P., Sebald, W., 「Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement」, Embo J. 11: 3237-44, 1992）および二重ムテインIL-4[R121D/Y124D]（Tony, H., et al., 「Design of Human Interleukin-4 Antagonist in Inhibiting Interleukin-4 dependent and Interleukin-13-dependent responses in T-cells and B-cells with high efficiency」, Eur. J. Biochem. 225：659-664 (1994)）。この単一ムテインは、D-ヘリックス中にある124位のチロシンのアスパラギン酸による置換物である。二重ムテインは、D-ヘリックス中にある121位のアルギニンがアスパラギン酸により、124位のチロシンがアスパラギン酸により置換されたものである。Dヘリックスのこの区域における差異は、第2の結合領域での相互作用の変化と正に相関する。
【０００６】
野生型IL-4に対する作動性または拮抗性を示すIL-4の変異体は、IL-4の多面的な作用と関連性のある病態の治療において有用な可能性がある。例えば、IL-4のアンタゴニストは、喘息、アレルギーまたは炎症反応が関係するその他の病態といった、IL-4産生によって悪化する疾患の治療に有用と考えられる。IL-4のアゴニストは、IL-4の存在が疾患の改善または減弱と関連する病態、例えば関節リウマチ、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病などの自己免疫疾患を治療するために有用な可能性がある。これらの自己免疫疾患は、1型および2型（Th1、Th2）というTヘルパー細胞集団の生成における偏りを特徴とする。ナイーブCD4+ T細胞は、刺激時に存在するサイトカインに応じて、Th1またはTh2サブセットへと分化する。IL-4アゴニストは理想的には、所望のTヘルパー細胞、すなわちTh2の方に生成を推移させ、それによって治療効果を及ぼすと考えられる。
【０００７】
PCT／US93／03613号は、αヘリックスドメイン内にPhe-Leu配列またはTyr-Leu配列を有し、このPhe-Leu配列またはTyr-Leu配列のすぐ上流または下流の2つのアミノ酸の内部に負に荷電した1つのアミノ酸を有するIL-4変異体であって、中性アミノ酸が負に荷電したアミノ酸に置換されたためにIL-4受容体に対する親和性が高まった変異体を開示している。これはまた、IL-4のαヘリックス内部におけるTrp-LeuまたはPhe-Leuの、負に荷電した残基の2残基以内の特定的な置換が親和性の向上をもたらすことも開示している。この変異体は（ジフテリア毒素との）IL-4融合タンパク質である。
【０００８】
そのアミノ酸配列の2つの位置が変異した、ヒトIL-4に由来する組換えムテインタンパク質（IL-4RA）は、以前に米国特許第6,028,176号および第6,313,272号で報告されている。IL-4RAは、IL-4受容体複合体およびIL-13受容体複合体の両方の重要な機能性シグナル伝達成分であるヒトIL-4受容体α鎖と、高い親和性で結合する。このムテインはインビトロではアゴニスト活性を有さず、強力な競合性IL-4およびIL-13受容体アンタゴニストとして作用する（米国特許第6,028,176号および第6,313,272号を参照）。IL-4RAを用いることの大きな欠点は、そのインビボでの半減期が比較的短い（約3〜6時間）ことにある。霊長類喘息モデルにおけるIL-4RAの薬物動態学的／薬力学的モデル化により、最適な治療効果のための有効平均定常濃度は約60ng／mlであることが示されている。
【０００９】
短い半減期を克服するためのアプローチの一つは、患者に対するIL-4RAムテインの頻回の投与であるが、頻回の投与（通常は注射または気管内挿管による）は、診療所における治療法および治療的投与に対する患者の許容性に極めて大きな障壁をもたらす。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、以前に報告されたムテインよりも半減期の長いIL-4RAムテインを提供する。本発明はまた、IL-4およびIL-13により媒介される免疫応答を抑制する試薬および方法も提供する。本発明の上記およびその他の面は、以下に挙げる態様の1つまたは複数によって提供される。
【００１１】
1つの態様において、本発明は、IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーと結合させたものを含む、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの精製調製物を提供する。この態様の1つの面において、精製調製物は、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO；3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7またはSEQ ID NO：8に示されたヌクレオチド配列によってコードされる、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストポリペプチドを含む。もう1つの面において、本ポリペプチドは、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15またはSEQ ID NO：16に示されたアミノ酸配列を含む。
【００１２】
1つの態様において、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのポリペプチドは、IL-4の28、36、37、38、104、105または106位にあるアミノ酸残基で、非タンパク質性ポリマーと結合されうる。このような位置は、野生型IL-4（すなわち、ヒトインターロイキン-4）のアミノ酸配列に従って番号付けされる。この態様の1つの面において、28、36、37、38、104、105または106位にあるアミノ酸残基はシステインである。
【００１３】
1つの態様において、本発明の改変型ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4受容体α鎖と、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのKdで結合する。
【００１４】
もう1つの態様において、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する。
【００１５】
さらにもう1つの態様において、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-13に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMより選択されるIC50で阻害する。
【００１６】
さらにもう1つの態様において、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4に対するヒトB細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMより選択されるIC50で阻害する。
【００１７】
もう1つの態様において、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4に対するヒトT細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μM、約1.0nM〜約100nMからなる群より選択されるIC50で阻害する。
【００１８】
さらにもう1つの態様において、本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの血漿半減期は、非改変IL-4受容体アンタゴニストのそれの少なくとも約2〜10倍の長さである。
【００１９】
本発明はまた、（a）ヒトIL-4受容体と結合する改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト；および（b）薬学的に許容される担体、を含む薬学的組成物も提供する。
【００２０】
本発明はまた、（a）SEQ ID NO：2、SEQ ID NO；3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7もしくはSEQ ID NO：8に示されたヌクレオチド配列；または（b）SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15もしくはSEQ ID NO：16に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、を含む、精製されたポリヌクレオチドも提供する。
【００２１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および本発明の発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００２２】
加えて、本発明は、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを作製する方法であって、（a）上記の宿主細胞をアンタゴニストが発現される条件下で培養する段階；および（b）宿主細胞培養物からアンタゴニストを精製する段階を含む方法も提供する。1つの特定の局面において、本発明の方法によって産生されるアンタゴニストは、IL-4およびIL-13により媒介される活性を阻害することができ、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーと結合している。
【００２３】
本発明はまた、IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療するための方法であって、（a）IL-4およびIL-13の活性が増加している病態を有するヒトを提供する段階；ならびに（b）本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストまたは本発明の薬学的組成物の有効量を前記ヒトに投与する段階を含む方法も提供する。1つの面において、障害は、喘息、慢性閉塞性肺疾患（肺気腫または慢性気管支炎など）、または関連する肺病態である。
【００２４】
本発明はまた、活性型の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを作製する方法、この方法によって作製されたアンタゴニスト、このようなアンタゴニストを含む組成物、ならびにこのようなアンタゴニストおよびこのようなアンタゴニストを含む薬学的組成物を投与することを含むヒト疾患の治療方法も提供する。本方法は、（a）上記の宿主細胞をアンタゴニストが発現される条件下で培養する段階；（b）アンタゴニストをジチオトレイトールの存在下でリフォールディングさせる段階；および（c）宿主細胞培養物からアンタゴニストを精製する段階を含む。1つの態様において、本方法はさらに、（d）アンタゴニストを非タンパク質性ポリマーと結合させる段階；および（e）非タンパク質性ポリマーと結合させたアンタゴニストを精製する段階を含む。
【００２５】
本発明の具体的な好ましい態様は、特定の好ましい態様に関する以下のさらに詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、非タンパク質性ポリマーと、好ましくはポリエチレングリコール分子と結合させたIL-4ムテイン受容体を含む、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストに関する。
【００２７】
文脈によって別に要求される場合を除き、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００２８】
本明細書で用いる節の見出しは構成のみを目的としており、記載された対象物を限定するものとみなされるべきではない。本出願に引用されたすべての参考文献は、本明細書に参照として明示的に組み入れられる。
【００２９】
定義
「ポリヌクレオチド」または「核酸配列」または「核酸分子」という用語は、DNA配列またはRNA配列のことを指す。この用語は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニル-シトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシ-メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソ-ペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノ-メチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキューオシン、5'-メトキシカルボニル-メチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン（oxybutoxosine）、プソイドウラシル、キューオシン（queosine）、2-チオシトシン、5-メチル2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシンおよび2,6-ジアミノプリンといった（ただしこれらには限定されない）、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体の任意のものから形成された分子を含む。
【００３０】
「精製された」または「単離された」ポリヌクレオチドという用語は、（1）源となる細胞から全核酸を単離した場合に自然下でそれに伴って認められるタンパク質、脂質、糖質もしくは他の材料の少なくとも約50パーセントから分離されている、（2）「単離された核酸分子」が自然下で結合しているポリヌクレオチドの全体もしくは一部分と結合していない、（3）自然下では結合していないポリヌクレオチドと機能的に結合している、または（4）より大きなポリヌクレオチド配列の一部としては自然下で存在しない、本発明の核酸分子のことを指す。本発明の単離された核酸分子は、他のいかなる混入性の核酸分子も、ポリペプチド生産におけるその使用またはその治療、診断、予防もしくは研究用の用途の妨げになると考えられる、その自然環境で認められる他の混入物も、実質的に含まないことが好ましい。
【００３１】
「野生型IL-4に従って番号付けされた」により、本発明者らは、選択したアミノ酸を、そのアミノ酸が野生型IL-4において通常存在する位置に関して特定することを意味している。
【００３２】
「ベクター」という用語は、コードする情報を宿主細胞に移行させるために用いられる任意の分子（例えば、核酸、プラスミドまたはウイルス）のことを指して用いられる。
【００３３】
「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換のために適したベクターのことを指し、これは挿入された異種核酸配列の発現を指令および／または制御する核酸配列を含む。発現には、転写、翻訳およびRNAスプライシング（イントロンが存在する場合）などのプロセスが含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
「宿主細胞」という用語は、本明細書において、核酸配列によって形質転換された、または形質転換された後に関心対象の選択された遺伝子を発現することが可能な、細胞のことを指して用いられる。この用語には親細胞の子孫も含まれ、これは、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態または遺伝的構成の点で元の親細胞と同一であるか否かとは関係ない。
【００３５】
「形質導入」という用語は、通常はファージによる、1つの細菌から別のものへの遺伝子の移行のことを指して用いられる。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得および移行のことも指す。
【００３６】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来性または外因性DNAの取り込みのことを指して用いられ、外因性DNAが細胞膜の内側に導入された場合には、細胞は「トランスフェクト」されている。さまざまなトランスフェクション法が当技術分野では周知であり、本明細書に開示されている。例えば、Graham et al., 1973、Virology 52：456；Sambrook et al., 「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」（Cold Spring Harbor Laboratories, 1989）；Davis et al., 「Basic Methods in Molecular Biology」（Elsevier, 1986）；および、Chu et al., 1981, Gene 13: 197を参照されたい。このような技法は、1つまたは複数の外因性DNA成分を適した宿主細胞に導入するために用いることができる。
【００３７】
本明細書で用いる「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変化のことを指し、細胞は、それが新たなDNAを含むように改変された場合には形質転換されている。例えば、細胞は、それがその天然の状態から遺伝的に改変されている場合には形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、形質転換用のDNAを、細胞の染色体中に物理的に組み込むことによって細胞のそれと組み換えさせること、複製されないエピソーム性エレメントとして一過性に維持すること、またはプラスミドとして独立に複製させることができる。細胞は、DNAが細胞の分裂に伴って複製される場合には、安定的に形質転換されたとみなされる。
【００３８】
「同一性」という用語は、当技術分野で公知であるように、2つもしくはそれ以上のポリペプチド分子または2つもしくはそれ以上の核酸分子の配列間の、配列を比較することによって決定されるような、関係のことを指す。当技術分野において、「同一性」とは、核酸分子またはポリペプチド間の配列関連性の程度のことも意味し、これは場合に応じて、2つもしくはそれ以上のヌクレオチド配列または2つもしくはそれ以上のアミノ酸配列の連鎖間の一致によって決定される。「同一性」は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって扱われる、ギャップ付きアラインメント（あれば）下での2つまたはそれ以上の配列のうち短い方の間での完全一致のパーセンテージを表す。
【００３９】
「類似性」という用語は「同一性」と関係のある概念であるが、それとは対照的に、「類似性」は、完全一致および保存的置換性一致の両方を含む、関連性の指標のことを指す。2つのポリペプチド配列の、例えば、20個中10個のアミノ酸が同一であり、残りがすべて非保存的な置換であるならば、同一度（percent identity）および類似度はいずれも50％であると考えられる。同じ例において、保存的置換である位置が5つ多く存在する場合には、同一度は50％のままであるが、類似度は75％（15個／20個中）になると考えられる。したがって、保存的置換が存在する場合には、2つのポリペプチド間の類似度は、その2つのポリペプチド間の同一度よりも高いと考えられる。
【００４０】
関連のある核酸およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に算出することができる。このような方法には、「COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY」(Lesk, A.M., ed.), 1988, Oxford University Press, New York；「BIOCOMPUT1NG: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS」(Smith, D.W., ed.), 1993, Academic Press, New York；「COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, Part 1」(Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds.), 1994, Humana Press, New Jersey；von Heinje, G.,「SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY」, 1987, Academic Press；SEQUENCE ANALYSIS PRIMER」(Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, M. Stockton Press, New York；Carillo et al., 1988, SIAM J Applied Math., 48: 1073；およびDurbin et al., 1998, 「BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS」, Cambridge University Pressに記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
同一性を決定するための好ましい方法は、検討する配列間で最大の合致が得られるように設計される。同一性を決定するための方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、GCGプログラムパッケージが含まれるが、これに限定されず、これはGAP（Devereux et al., 1984, Nucl. Acid. Res., 387；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI）、BLASTP、BLASTNおよびFASTA (Altschul et al., 1990, J Mol. Biol., 215: 403-410)を含む。BLASTXプログラムは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）（NCBI）および他の入手元（BLAST Manual, Altschul et al. NCB／NLM／NTH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990, 前記）に公開されている。よく知られたSmith Watermanアルゴリズムを同一性の決定に用いることもできる。
【００４２】
2つのアミノ酸配列のアラインメントを行う、ある種のアラインメント手法は、2つの配列の短い領域のみをマッチングさせることができ、アラインメントがなされたこの短い領域は、2つの完全長配列の間には有意な関連がなくても、極めて高い配列同一性を有する可能性がある。したがって、ある特定の態様において、選択されたアラインメント方法（GAPプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも50個の連続したアミノ酸の範囲にわたるアラインメントを行うと考えられる。
【００４３】
例えば、コンピュータアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI）を用いて、配列同一度を決定しようとする2つのポリペプチドのアラインメントを、それぞれのアミノ酸に関して最適なマッチングが得られるように行う（アルゴリズムによって決定される「マッチング範囲（matched span）」）。ある特定の態様において、ギャップオープニングペナルティー（gap opening penalty）（これは平均ダイアゴナルの3倍として計算される；ここで「平均ダイアゴナル」とは、用いる比較マトリックスのダイアゴナルの平均のことである；「ダイアゴナル」とは、特定の比較マトリックスにより、各々の完全アミノ酸一致に対して割り当てられるスコアまたは数のことである）およびギャップ伸長ペナルティ（gap extension penalty）（これは通常、ギャップオープニングペナルティの10分の1である）、さらにはPAM250またはBLOSUM 62などの比較マトリックスが、このアルゴリズムとともに用いられる。ある特定の態様においては、標準的な比較マトリックス（PAM 250比較マトリックスに関しては、Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:345-352；BLOSUM 62比較マトリックスに関しては、Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919を参照されたい）も、アルゴリズムによって用いられる。
【００４４】
ある特定の態様において、ポリペプチド配列の比較のためのパラメーターには以下のものが含まれる：
アルゴリズム：Needleman et al, 1970, J. Mol. Biol, 48: 443-453；
比較マトリックス：BLOSUM 62（Henikoff et al., 1992, 前記）；
ギャップペナルティー：12
ギャップ長ペナルティ：4
類似性の閾値：0
【００４５】
GAPプログラムは、以上のパラメーターを用いると有用であると考えられる。ある特定の態様において、前述のパラメーターは、GAPアルゴリズムを用いる、ポリペプチド比較のためのデフォールトのパラメーターである（このほか、末端ギャップに関してはペナルティーなしとする）。
【００４６】
本明細書で用いる場合、20種の通常のアミノ酸およびそれらの略号は従来の使用法に従う。IMMUNOLOGY--A SYNTHESIS, 2nd Edition（E. S. Golub and D. R. Gren, Eds.）, Sinauer Associates：Sunderland, MA, 1991, を参照されたい（これは任意の目的で参照として本明細書に組み入れられる）。20種の通常のアミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）；非天然アミノ酸、例えばα,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸および他の通常でないアミノ酸も、本発明のポリペプチドの適した成分となる可能性がある。通常でないアミノ酸の例には、以下のものが含まれる：4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニン、ならびにその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリン）。本明細書で用いるポリペプチドの表記法では、標準的な用法および慣例に合わせて、左方向がアミノ末端の方向であり、右方向がカルボキシル末端の方向である。
【００４７】
天然に存在する残基は、側鎖の共通の特徴に基づいて複数のクラスに分類することができる：
1）疎水性：ノルロイシン（Nor）、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、GIn；
3）酸性：Asp、Glu；
4）塩基性：His、Lys、Arg；
5）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；および
6）芳香族性：Trp、Tyr、Phe。
【００４８】
保存的アミノ酸置換物は、これらのクラスの構成要素と、同じクラスの別の構成要素との交換を含みうる。保存的アミノ酸置換物は、天然には存在しないアミノ酸残基を含んでもよく、これらは通常、生体システムにおける合成ではなく、ペプチド化学合成によって組み入れられる。これらには、ペプチド模倣物、およびその他の逆転型または逆方向型のアミノ酸部分が含まれる。
【００４９】
非保存的置換物は、これらのクラスのうち1つの構成要素と、別のクラスの構成要素との交換を含みうる。このような置換残基は、非ヒトタンパク質と相同なヒトタンパク質の領域に導入されても、または分子の非相同領域に導入されていてもよい。
【００５０】
このような変化を作り出す際に、ある特定の態様によれば、アミノ酸のハイドロパシーインデックス（hydropathic index）を考慮してもよい。それぞれのアミノ酸には、その疎水性および荷電特性に基づいて、ハイドロパシーインデックスが指定されている。それらは以下の通りである：イソロイシン（+4.5）；バリン（+4.2）；ロイシン（+3.8）；フェニルアラニン（+2.8）；システイン／シスチン（+2.5）；メチオニン（+1.9）；アラニン（+1.8）；グリシン（-0.4）；トレオニン（-0.7）；セリン（-0.8）；トリプトファン（-0.9）；チロシン（-1.3）；プロリン（-1.6）；ヒスチジン（-3.2）；グルタミン酸（-3.5）；グルタミン（-3.5）；アスパラギン酸（-3.5）；アスパラギン（-3.5）；リジン（-3.9）；およびアルギニン（-4.5）。
【００５１】
タンパク質に相互作用性の生物機能を付与する際のアミノ酸のハイドロパシーインデックスの重要性は、当技術分野では理解されている（例えば、Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131を参照されたい）。ある種のアミノ酸を、類似したハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに用いても、類似した生物活性が保たれることが知られている。ハイドロパシーインデックスに基づく変化の作出には、ある特定の態様において、ハイドロパシーインデックスが±2以内であるアミノ酸同士の置換が含まれる。ある特定の態様においては、±1以内であるものが含まれ、ある特定の態様においては、±0.5以内であるものが含まれる。
【００５２】
また、同じようなアミノ酸同士の置換を親水性に基づいて有効に行うことができること、特に、それによって作り出される生物機能性のタンパク質またはペプチドを本明細書で開示するような免疫学的態様に用いることを意図している場合にはそうであることも、当技術分野では理解されている。ある特定の態様において、それに隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるような、タンパク質の最大の局所的平均親水性は、その免疫原性および抗原性と、すなわちタンパク質の生物学的性質と相関する。
【００５３】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に対して指定されている：アルギニン（+3.0）；リジン（+3.0）；アスパラギン酸（+3.0±1）；グルタミン酸（+3.0±1）；セリン（+0.3）；アスパラギン（+0.2）；グルタミン（+0.2）；グリシン（0）；トレオニン（-0.4）；プロリン（-0.5±1）；アラニン（-0.5）；ヒスチジン（-0.5）；システイン（-1.0）；メチオニン（-1.3）；バリン（-1.5）；ロイシン（-1.8）；イソロイシン（-1.8）；チロシン（-2.3）；フェニルアラニン（-2.5）およびトリプトファン（-3.4）。類似した親水性の値に基づく変化の作出には、ある特定の態様において、親水性の値が±2以内であるアミノ酸同士の置換が含まれる。ある特定の態様においては、±1以内であるものが含まれ、ある特定の態様においては、±0.5以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は「エピトープ性コア領域」とも呼ばれる。
【００５４】
アミノ酸置換の例を表1に示す。
【００５５】
（表１）アミノ酸置換
2007526757.tif 000002
【００５６】
当業者は、本明細書に示したような、ポリペプチドの適した変異体を、よく知られた技法を用いて特定しうると考えられる。ある特定の態様において、当業者は、活性にとって重要ではないと考えられている領域を標的とすることにより、分子の適した領域を、活性を破壊することなく変化させることができる。また別の態様において、当業者は、類似性のあるポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を同定することができる。さらに別の態様においては、生物活性または構造のために重要と思われる領域に対してさえも、生物活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換を行うこともできる。
【００５７】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要な、類似したポリペプチドにおける残基を特定する構造機能解析を詳しく検討することができる。このような比較に鑑みて、当業者は、類似したタンパク質における活性または構造に重要なアミノ酸残基に対応する、タンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、このような予測された重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似したアミノ酸置換を選択することもできる。
【００５８】
当業者はまた、三次元構造およびアミノ酸配列を、類似したポリペプチドにおけるその構造と関連づけて分析することもできる。このような情報に鑑みて、当業者が、ポリペプチドのアミノ酸残基の並び方を、その三次元構造との関係から予測してもよい。ある特定の態様において、当業者は、タンパク質の表面にあると予想されるアミノ酸残基には大きな変化を加えないように選択してもよく、これはこのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与している可能性があるためである。さらに、当業者は、それぞれの所望のアミノ酸残基に一つずつアミノ酸置換を含む、複数の被験変異体を作製することもできる。これらの変異体を、続いて、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングする。このような変異体を用いて、適した変異体に関する情報を集めることができる。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、活性の破壊、望ましくない低下、または不適切な活性を引き起こすことが見いだされたならば、そのような変化を有する変異体を避けることができる。言い換えれば、このようなルーチン的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独、または他の変異と組み合わせた、さらなる置換を回避すべきアミノ酸を容易に特定することができる。
【００５９】
数多くの科学刊行物が二次構造の予測に向けられている。Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7: 422-427；Chou et al., 1974, Biochemistry 13: 222-245；Chou et al., 1974, Biochemistry 113: 211-222；Chou et al., 1978, Adv. Enzymnol. Relat. Areas Mol. Biol. 47: 45-148；Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276；およびChou et al., 1979, Biophys. J. 26: 367-384を参照されたい。さらに、二次構造の予測を支援するためのコンピュータプログラムが現在利用可能である。二次構造を予測するある方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、30％を上回る配列同一性または40％を上回る類似性を有する、2つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（PDB）の最近の拡大により、ポリペプチドまたはタンパク質の構造内の潜在的な折りたたみ回数を含む、二次構造の予測性の向上がもたらされた。Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27: 244-247を参照されたい。任意のポリペプチドまたはタンパク質に存在する折り畳みの数は限定されており、ひとたび決定的な数の構造が解明されると、構造予測は劇的に正確になると考えられることが示唆されている（Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7: 369-376）。
【００６０】
二次構造を予測するそのほかの方法には、「スレッディング（threading）」が含まれる（Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 377-87；Sippl et al., 1996, Structure 4: 15-19）、「プロファイル解析」（Bowie et al., 1991, Science 253: 164-170；Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183: 146-159；Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 4355-4358）および「進化的連鎖（evolutionary linkage）」（Holm, 1999, 前記；およびBrenner, 1997, 前記を参照されたい）。
【００６１】
ある特定の態様において、タンパク質変異体には、グリコシル化部位の数および／またはタイプが親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して変化しているグリコシル化変異体が含まれる。ある特定の態様において、タンパク質変異体は、天然のタンパク質よりもN結合型グリコシル化部位の数が多いか、または少ない。N結合型グリコシル化部位は配列：Asn-X-SerまたはAsn-X-Thrを特徴とし、式中、Xと表記されたアミノ酸残基は、プロリンを除く任意のアミノ酸残基であってよい。この配列を作り出すためのアミノ酸残基の置換により、N結合型糖鎖の付加のための新たな部位の候補が得られる。または、この配列を取り除く置換は、既存のN結合型糖鎖を除去させると考えられる。1つまたは複数のN結合型グリコシル化部位（一般的には天然のもの）が取り除かれて1つまたは複数の新たなN結合型部位が作り出される、N結合型糖鎖の再編成も提供される。そのほかの好ましい変異体には、親アミノ酸配列と比較して、1つまたは複数のシステイン残基が欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）に置換されている、システイン変異体が含まれる。システイン変異体は、タンパク質が、不溶性封入体の分離後などに生物活性のあるコンフォメーションへとリフォールディングされなければならない場合には有用である可能性がある。システイン変異体は一般に、天然のタンパク質よりも少数のシステイン残基を有し、典型的には、非対合システインに起因する相互作用を最小限に抑えるために偶数で有する。
【００６２】
さらに別の態様において、タンパク質変異体は、置換、付加、欠失またはそれらの任意の組み合わせなどの突然変異を含むことができ、これらは典型的には、本明細書に記載した方法に従った、さらには当技術分野で公知の方法（例えば、Sambrook et al.,「MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL」, 3rd Ed., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y.、およびBerger and Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA.を参照されたい。これらは参照として本明細書に組み入れられる）に従った、1つまたは複数の変異誘発性オリゴヌクレオチドを用いる位置指定突然変異誘発法によって作製される。
【００６３】
ある特定の態様によれば、アミノ酸置換は（1）タンパク質分解に対する感受性を低下させ、（2）酸化に対する感受性を低下させ、（3）タンパク質複合体の形成に関する結合親和性を変化させ、（4）結合親和性を変化させ、および／または（5）このようなポリペプチドに対して他の物理化学的または機能的な特性を付与する、もしくはそれを改変するものである。ある特定の態様によれば、単一または複数のアミノ酸置換（ある特定の態様においては、保存的なアミノ酸置換）を、天然に存在する配列（ある特定の態様においては、分子間の接触を形成するドメイン外のポリペプチドの部分）に施すことができる。好ましい態様において、保存的アミノ酸置換は典型的には、親配列の構造的特徴を実質的には変化させない（例えば、置換アミノ酸には、親配列に存在するαヘリックスを破壊したり、または親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を乱したりする傾向があるべきではない）。当技術分野で認知されているポリペプチド二次構造および三次構造の例は、「PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES」（Creighton, Ed.）, 1984, W. H. Freeman and Company, New York；「INTRODUCTION TO PROTEIN STRUCTURE」（C. Branden and J. Tooze, eds.）, 1991, Garland Publishing, New York, N.Y.；およびThornton et al., 1991, Nature 354：105に記載されており、これらはそれぞれ参照として本明細書に組み入れられる。
【００６４】
ペプチド類似体は、テンプレートペプチドのものと類似した特性を備えた非ペプチド薬として製薬産業でよく用いられている。この種の非ペプチド化合物は「ペプチドの模倣物（peptide mimetic）」または「ペプチド模倣物（peptidemimetic）」と呼ばれる。Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15: 29；Veber & Freidinger, 1985, TINS p.392；およびEvans et al,. 1987, J. Med. Chem. 30: 1229を参照されたい（これらは任意の目的で参照として本明細書に組み入れられる）。治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物は、同程度の治療効果または予防効果を得るために用いることができる。一般に、ペプチド模倣物は模範ポリペプチド（すなわち、生物活性または薬理活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体などと構造的に類似しているが、当技術分野で周知の方法により、1つまたは複数のペプチド結合が、-CH２NH-、-CH２S-、-CH２-CH２-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH２-、-CH(OH)CH２-および-CH２SO-からなる群より選択される結合によって置き換えられている。ある特定の態様においては、コンセンサス配列の1つまたは複数のアミノ酸の、同じタイプのD-アミノ酸（例えば、L-リジンの代わりにD-リジン）による体系的な置換を用いて、より安定性の高いペプチドを作製することができる。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列変形物を含む拘束性ペプチドを、当技術分野で公知の方法により（Rizo & Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 387、これは任意の目的で参照として本明細書に組み入れられる）；例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成しうる内部システイン残基を付加することにより、作製することもできる。
【００６５】
（a）改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの特徴
本明細書で用いる「改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト」には、米国特許第6,028,176号および第6,313,272号（それらの全体が参照として組み入れられる）に記載されたIL-4RAムテインにアミノ酸置換が加えられたものであって、前記置換が、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコール（PEG）分子などの少なくとも1つの非タンパク質性ポリマーとムテインとの位置特異的結合を可能にするものが含まれる。PEGの位置特異的結合により、例えば、ポリエチレン-グリコシル化（PEG化）分子の利点、すなわち血漿半減期の延長および免疫原性の低下を有する一方で、N末端およびリジン側鎖のPEG化といった非特異的なPEG化戦略を上回る効力を保った、改変ムテインの作製が可能となる。また、発現後の分子の適切なフォールディングを可能にする具体的なアミノ酸置換の部位の選択も、本発明には本来備わっている。改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4およびIL-13と、IL-4RAのそれに比して10分の1を下回ることのない親和性で結合する。改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、IL-4およびIL-13により媒介される活性を、IL-4RAのそれに比して10分の1を下回ることのない効力で阻害する。加えて、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの血漿半減期は、非改変IL-4RAのそれの少なくとも2〜10倍の長さである。
【００６６】
また、本発明のIL-4ムテインは、天然のIL-4ポリペプチド鎖における1つまたは複数の部位での、またはそれの他の残基での、アミノ酸の挿入、欠失、置換および修飾によっても特徴づけられる。本発明によれば、あらゆるそのような挿入、欠失、置換および修飾は、そのIL-4関連活性を保ったIL-4ムテインを生じさせるはずである。
【００６７】
本発明のさらにもう1つの面は、実施例2に示したようにタンパク質を発現させてリフォールディングさせる方法において提供される。IL-4ムテインは、効率的なPEG化が可能になるように適切に精製されなければならない。精製に関しては、例えば以下の実施例2に記載されている。ムテインを、β-メルカプトエタノール、グルタチオンまたはシステインなどのスルフヒドリル保護剤の存在下でリフォールディングさせる場合には、IL-4に導入されたシステインにおける活性スルフヒドリルが酸化型保護剤によって失活するため、精製ムテインをPEG化することはできない。ジスルフィド共有結合がIL-4ムテインの遊離システインと保護剤との間に形成される。これとは対照的に、酸化して安定なジスルフィド結合を形成するスルフヒドリル保護剤ジチオトレイトール（DTT）は、IL-4ムテインの遊離システインとは共有結合を形成せず、このため、そのスルフヒドリル基はPEGマレイミド試薬と自由に反応することができる。β-メルカプトエタノール、グルタチオンまたはシステインの存在下でのリフォールディング後に精製されたIL-4ムテインは、DTTで処理した場合にはPEG試薬と反応しうるが、モノPEG化産物と多PEG化産物との混合物が生じることから、既存のIL-4システインもPEG化されることが示唆される。既存のシステインのPEG化は、活性のない、誤って折り畳まれた産物をもたらすと考えられる。
【００６８】
IL-4受容体に対する、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのKdは、実施例4に概要を述べたリアルタイム二分子相互作用分析（BIA）などの技術を含む、当技術分野で公知の任意の方法を用いてアッセイすることができる。BIAは、相互作用物のいずれをも標識することなく、生物学的特異的相互作用をリアルタイムで検討するための技術である（例えば、BIAcore（商標））。光学現象である表面プラズモン共鳴（SPR）の変化は、生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いることができる。
【００６９】
改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストが免疫細胞の増殖応答を阻害する能力は、実施例5に概要を述べた増殖アッセイを用いて評価することができ、この能力は増殖阻害濃度50％（IC50）として表すことができる。
【００７０】
BIAcore（商標）アッセイにおいて、本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、約1.0nM〜約100nMの範囲にある好ましいKdでヒトIL-4受容体と特異的に結合する。本発明のより好ましい態様は、ヒトIL-4受容体と約0.5nM〜約1.0μMのKdで結合する。本発明のさらにより好ましい態様は、ヒトIL-4受容体と約0.1nM〜約10μMのKdで結合する。さらに、本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、想定される通り、約1.0nM〜約100nMの範囲にある好ましいIC50で、ヒトIL-4受容体と結合し、免疫細胞の増殖を促進するその能力を中和すると考えられる。より好ましいヒトアンタゴニストは、約0.5nM〜1μMの範囲にあるIC50で、IL-4受容体と結合し、その免疫細胞増殖能力を中和すると考えられ、本発明の最も好ましいアンタゴニストは、約0.1nM〜約10μMのIC50で、IL-4受容体と結合して阻害する。
【００７１】
本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのこの態様はまた、非改変IL-4RAのそれの好ましくは少なくとも2〜10倍の長さである血漿半減期も示し、本発明の最も好ましい態様は、非改変IL-4RAのそれの10〜100倍の長さである血漿半減期を示す（実施例7参照）。
【００７２】
上記の特徴を備えた、数多くの改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストが、以上のアッセイを用いて候補をスクリーニングすることによって同定されている。本発明の態様は、表2に示されたポリペプチド配列を有する（SEQ ID NO：10〜16）。
【００７３】
（表２）ポリペプチド配列
2007526757.tif 000003
【００７４】
（b）改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチド
本発明はまた、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドも提供する。これらのポリヌクレオチドは、例えば、治療用途のためにアンタゴニストを多量に生産するために用いることができる。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、cDNAライブラリーもしくはゲノムライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリーのスクリーニング、および／またはcDNAのPCR増幅を非制限的に含むさまざまなやり方で容易に入手しうる。
【００７６】
本明細書に記載した組換えDNA手法は概ね、Sambrook et al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）および／または「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc.およびWiley and Sons 1994）に示されたものである。本発明は、本明細書に記載したような核酸分子、および、このような分子を入手するための方法を提供する。
【００７７】
適した核酸配列を入手するための一つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。この方法では、逆転写酵素という酵素を用いて、cDNAをポリ(A)+RNAまたは全RNAから調製する。続いて、2つのプライマー（これは通常は、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのcDNAの2つの別々の領域に対して相補的である）を、TaqポリメラーゼなどのポリメラーゼとともにcDNAに添加すると、ポリメラーゼが2つのプライマー間のcDNA領域を増幅する。
【００７８】
本発明の核酸分子を調製するためのもう1つの手段は、Engels et al., 1989, Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-34によって記載されたものなどの、当業者に周知の方法を用いる化学合成である。これらの方法には、特に、核酸合成のためのホスホトリエステル法、ホスホルアミダイト法およびH-ホスホネート法が含まれる。このような化学合成のための1つの好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いるポリマー支持合成である。通常は、DNAは数百ヌクレオチド長であると考えられる。これらの方法を用いて、約100ヌクレオチドよりも長い核酸を、複数の断片として合成することができる。続いて断片を互いに連結することができる。当業者に公知である他の方法を用いてもよい。
【００７９】
改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストをコードさせるために用いうる本発明のポリヌクレオチドは、表3に示されている（SEQ ID NO：2〜8）。
【００８０】
（表３）ポリヌクレオチド配列
2007526757.tif 000004
2007526757.tif 000005
2007526757.tif 000006
【００８１】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクター、および本発明の発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。
【００８２】
本発明のポリヌクレオチドは、標準的な連結手法を用いて、適切な発現ベクターに挿入することができる。ベクターは通常、用いる特定の宿主細胞において機能を有するように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現などが起こりうるように、宿主細胞の機構と適合性がある）。本発明のポリヌクレオチドは、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核生物性の宿主細胞において発現させることができる。宿主細胞の選択は、所望の発現レベルなどのさまざまな要因に依存すると考えられる。発現ベクターに関する総説については、Meth. Enz., vol. 185（D.V. Goeddel, ed., Academic Press 1990）を参照されたい。
【００８３】
一般に、宿主細胞内で用いられる発現ベクターは、プラスミドの維持ならびに外因性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含むと考えられる。ある特定の態様において、「隣接配列」と総称されるこのような配列は、一般に、以下のヌクレオチド配列のうち1つまたは複数を含むと考えられる：プロモーター、1つまたは複数のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、スプライスドナー部位およびアクセプター部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現させようとするポリペプチドを核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれについて、以下に述べる。
【００８４】
隣接配列は、同種性（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来）、異種性（すなわち、宿主細胞の種または株以外の種に由来）、雑種性（すなわち、複数の源からの隣接配列の組み合わせ）または合成性のいずれであってもよく、または隣接配列が、TL-4ムテイン受容体アンタゴニストの発現を調節するように通常機能する天然の配列であってもよい。このため、隣接配列の源は、隣接配列が宿主細胞の機構において機能性であって、それによって活性化されうる限り、任意の原核生物もしくは真核生物、任意の脊椎動物もしくは無脊椎動物、または任意の植物であってよい。
【００８５】
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当技術分野で周知のいくつかの方法のうち任意のものによって入手しうる。典型的には、本明細書において有用な隣接配列――IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト遺伝子の隣接配列以外のもの――は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに同定されており、このため、適した組織源から適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて単離することができる。場合によっては、隣接配列の完全なヌクレオチド配列が公知のこともある。この場合、隣接配列を、核酸合成またはクローニングのための本明細書に記載した方法を用いて合成することができる。
【００８６】
隣接配列の全体または一部分が判明している場合には、PCRを用いて、および／または、同じ種もしくは別の種に由来する適したオリゴヌクレオチドおよび／もしくは隣接配列断片によるゲノムライブラリーのスクリーニングにより、それを入手することができる。隣接配列が未知である場合には、例えばコード配列またはさらには別の1つもしくは複数の遺伝子も含む可能性のある、より大きなDNA片から、隣接配列を含むDNAの断片を単離するとよい。単離は、適したDNA断片を作製するための制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、アガロースゲル精製、Qiagen（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Chatsworth, CA）または当業者に公知の他の方法を用いる単離によって行うことができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は当業者には直ちに明らかであると考えられる。
【００８７】
複製起点は一般に、市販の原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製起点部位を含まない場合には、既知の配列を用いてそれを化学合成し、ベクター中に連結することができる。例えば、プラスミドpBR322（New England Biolabs, Beverly, MA）由来の複製起点は大部分のグラム陰性菌に適しており、種々の起点（例えば、SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（VSV）、またはHPVもしくはBPVなどのパピローマウイルス）が、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングのために有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターに対しては必要でない（例えば、SV40起点はしばしば、それが初期プロモーターを含むという理由で用いられる）。
【００８８】
転写終結配列は一般に、ポリペプチドコード領域の3'側の末端に位置し、転写を終結させる役割を果たす。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、G-Cリッチ断片の後にポリ-T配列が続くというものである。その配列はライブラリーから容易にクローニングでき、ベクターの一部として販売されてもいるが、これを本明細書に記載したような核酸合成の方法を用いて容易に合成することもできる。
【００８９】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培地中で増殖させる宿主細胞の生存および増殖のために必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、以下のことを行うタンパク質をコードする：（a）原核生物宿主細胞に対して、アンピシリン、ネオマイシンまたはカナマイシンなどの抗生物質または他の有害物質に対する耐性を付与する；（b）細胞の栄養要求性に伴う欠乏状態を補完する；または（c）複合培地からは得られない必須栄養素を供給する。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子は、原核生物および真核生物性の宿主細胞における選択のために用いることもできる。
【００９０】
その他の選択遺伝子を、発現されると考えられる遺伝子を増幅するために用いてもよい。増幅とは、増殖にとって重要なタンパク質の産生のために高度に求められる遺伝子を、組換え細胞の後続世代の染色体内部に縦列的に反復させるプロセスのことである。哺乳動物細胞に適した選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミジンキナーゼが含まれる。哺乳動物細胞の形質転換体を、形質転換体のみがベクター中に存在する選択遺伝子の効力によって生存するように唯一順応化するような選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択薬剤の濃度が継続的に変化しており、そのために、選択遺伝子および改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストをコードするDNAの両方の増幅がもたらされるような条件下で、形質転換細胞を培養することによって与えられる。その結果として、増幅されたDNAから、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストがより大量に合成される。
【００９１】
リボソーム結合部位は通常、mRNAの翻訳開始のために必要であり、これはシャイン-ダルガーノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴づけられる。このエレメントは一般に、プロモーターの3'側かつ改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのコード配列の5'側に位置する。シャイン-ダルガーノ配列はさまざまであるが、多くの場合はポリプリンである（すなわち、A-G含有量が多い）。数多くのシャイン-ダルガーノ配列が同定されており、それらのそれぞれは本明細書に示した方法を用いて容易に合成して、原核生物ベクター中に用いることができる。
【００９２】
リーダー配列またはシグナル配列は、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを宿主細胞の外に導くために用いうる。通常、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト核酸分子のコード領域の内部に、または改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのコード領域の5'末端にすぐ続いて配置される。数多くのシグナル配列が同定されており、選択した宿主細胞において機能性である任意のものを、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト核酸分子とともに用いることができる。このため、シグナル配列は、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト核酸分子に対して同種性（天然に存在する）でも異種性でもよい。さらに、本明細書に記載する方法を用いて、シグナル配列を化学合成してもよい。ほとんどの場合には、シグナルペプチドの存在を介した、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの宿主細胞からの分泌により、分泌された改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストからのシグナルペプチドの除去が起こると考えられる。シグナル配列はベクターの成分でもよく、またはそれはベクター中に挿入された改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト核酸分子の一部でもよい。
【００９３】
多くの場合には、核酸分子の転写は、ベクター中に1つまたは複数のイントロンが存在することによって強まる；これはポリペプチドが真核生物宿主細胞、特に哺乳動物宿主細胞である場合には特にそうである。用いるイントロンは、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト遺伝子の内部に天然に存在するものでよく、これは特に、用いる遺伝子が完全長ゲノム配列またはその断片である場合にそうである。イントロンがその遺伝子の内部に天然には存在しない場合には、イントロンを別の源から入手することができる。イントロンが効果を現すためには転写されなければならないため、隣接配列および改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト遺伝子に対するイントロンの位置は一般に重要である。したがって、本発明の核酸分子を転写させる場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の3'側かつポリ-A転写終結配列の5'側である。1つまたは複数のイントロンを、それがコード配列を中断しないようにcDNAの一方または両方の側（すなわち、5'側または3'側）に配置することが好ましい。ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む任意の源からの任意のイントロンを、それが内部に挿入される宿主細胞と適合性がある限り、本発明の実施に用いることができる。合成イントロンも本明細書に含まれる。任意には、複数のイントロンをベクター中に用いることができる。
【００９４】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは通常、宿主生物によって認識され、本発明の核酸分子と機能的に結合しているプロモーターを含むと考えられる。プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち、5'側）に位置し、その構造遺伝子の転写を制御する、非転写性の配列 （一般的には約100〜1000bp以内）である。プロモーターは慣例的に以下の2つのクラスのいずれかに分類されている：誘導性プロモーターおよび構成性プロモーター。誘導性プロモーターは、栄養素の有無または温度の変化といった培養条件の何らかの変化に反応して、その制御下にあるDNAからの転写レベルの上昇を惹起する。これに対して、構成性プロモーターは、連続的な遺伝子産物産生を惹起する；すなわち、遺伝子発現の制御はほとんどまたは全く行われない。種々の宿主細胞候補によって認識される、多数のプロモーターがよく知られている。源となるDNAから制限酵素消化によってプロモーターを除去して、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより、適したプロモーターを本発明の核酸分子と連結させることができる。天然型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのプロモーター配列を、本発明の核酸分子の増幅および／または発現を導くために用いてもよい。しかし、天然のプロモーターと比較して、より高度の転写および発現タンパク質のより多くの収量を可能とし、しかも用いるために選択した宿主細胞系との適合性があるならば、異種プロモーターが好ましい。
【００９５】
原核生物宿主とともに用いるのに適したプロモーターには、β-ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（trp）プロモーター系；ならびにtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーターが含まれる。他の公知の細菌プロモーターも適している。それらの配列は公開されており、そのため、当業者は、有用な制限部位を付与するためにリンカーまたはアダプターを必要に応じて用いて、それらを所望のDNA配列と連結することが可能である。
【００９６】
酵母宿主とともに用いるのに適したプロモーターも当技術分野で周知である。酵母エンハンサーは酵母プロモーターとともに用いるのが好都合である。哺乳動物宿主細胞とともに用いるのに適したプロモーターは周知であり、これには、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス2など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス40（SV40）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれるが、これらに限定されない。その他の適した哺乳動物プロモーターには、異種性の哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
【００９７】
遺伝子発現を制御するのに興味が持たれるそのほかのプロモーターには、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：SV40初期プロモーター領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-10）；CMVプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列に含まれるプロモーター（Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-97）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296：39-42）；β-ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 3727-31）；またはtacプロモーター（DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-25）。同じく興味が持たれるものには、組織特異性を示し、トランスジェニック動物に用いられている、以下の動物性転写制御領域がある：脾臓腺房細胞において活性を有するエラスターゼI遺伝子制御領域（Swift et al., 1984, Cell 38: 639-46；Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409 (1986)；MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515）；膵臓β細胞において活性を有するインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22）；リンパ球様細胞において活性を有する免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-58；Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38；Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol., 7: 1436-44）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ球様細胞およびマスト細胞において活性を有するマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95）；肝臓において活性を有するアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76）；肝臓において活性を有するα-フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5: 1639-48；Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58）；肝臓において活性を有するα1-アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1：161-71）；骨髄系細胞において活性を有するβ-グロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40；Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94）；脳内のオリゴデンドロサイト細胞において活性を有するミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-12）；骨格筋において活性を有するミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域（Sani, 1985, Nature 314: 283-86）；および視床下部において活性を有するゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78）。
【００９８】
エンハンサー配列は、高等真核生物による本発明の核酸分子の転写を増大させるためにベクター中に挿入することができる。エンハンサーはDNAのシス作用性エレメントで通常は約10〜300bp長であり、プロモーターに対して作用して転写を増大させる。エンハンサーは向きおよび位置に対して比較的非依存的である。これらは転写単位に対して5'側にも3'側にも認められる。哺乳動物遺伝子から入手しうるエンハンサー配列がいくつか知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインスリン）。しかし、ウイルス由来のエンハンサーを用いることも考えられる。SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサー性エレメントの例である。エンハンサーは、ベクター中において本発明の核酸分子の5'側または3'側の位置に接合させてもよいが、プロモーターの5'側の部位に配置されることが一般的である。
【００９９】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築することができる。このようなベクターは、所望の隣接配列のすべてを含んでいることも、そうではないこともある。本明細書に記載した隣接配列の1つまたは複数がベクター中にすでに存在している場合には、それらを個別に入手してベクター中に連結することができる。隣接配列のそれぞれを入手するために用いられる方法は当業者に周知である。
【０１００】
本発明を実施するために好ましいベクターは、細菌性、昆虫性および哺乳動物性の宿主細胞と適合性のあるものである。このようなベクターには、特に、pCRII、pCR3およびpcDNA3.1（Invitrogen, San Diego, CA）、pBSII（Stratagene, La Jolla, CA）、pET15（Novagen, Madison, WI）、pGEX（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）、pEGFP-N2（Clontech, Palo Alto, CA）、pETL（BlueBacII, Invitrogen）、pDSR-α（PCT公開公報第90／14363号）およびpFastBacDual（Gibco-BRL, Grand Island, NY）が含まれる。
【０１０１】
そのほかの適したベクターには、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルスが含まれるがこれらに限定されず、しかし当業者は、ベクター系に選択した宿主細胞との適合性がなければならないことを認識していると考えられる。このようなベクターには、Bluescript（登録商標）プラスミド誘導体（ColE1を基にした高コピー数のファージミド、Stratagene Cloning Systems, La Jolla CA）、Taqにより増幅されたPCR産物のクローニング用に設計されたPCRクローニングプラスミド（例えば、TOPO（商標）TA Cloning Kit、PCR2.1（登録商標）プラスミド誘導体、Invitrogen, Carlsbad, CA）、および哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター、例えばバキュロウイルス発現系（pBacPAKプラスミド誘導体、Clontech, Palo Alto, CA）などのプラスミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
ベクターを構築して、本発明の核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後に、完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチドの発現のために、適した宿主細胞に挿入することができる。選択した宿主細胞への本発明の発現ベクターの形質転換導入は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、電気穿孔法、微量注入法、リポフェクション法、DEAE-デキストラン法またはその他の公知の技法などの方法を含む周知の方法によって行いうる。選択される方法は、一部には、用いようとする宿主細胞のタイプと関係する。これらの方法およびその他の適した方法は当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al., 前記に記載されている。
【０１０３】
宿主細胞は原核生物宿主細胞（大腸菌など）でもよく、真核生物宿主細胞（酵母、昆虫または脊椎動物細胞）でもよい。宿主細胞は適切な条件下で培養されると、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを合成し、それを後に培地から採取すること（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接採取すること（それが分泌されない場合）ができる。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために要望または要求されるポリペプチドの修飾（グリコシル化またはリン酸化など）および生物活性分子へのフォールディングの容易性といった、さまざまな要因に依存すると考えられる。
【０１０４】
さまざまな適した宿主細胞が当技術分野では公知であり、その多くをAmerican Type Culture Collection（ATCC）, Manassas, VAから入手することができる。その例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO）、CHO DHFR(-)細胞（Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 4216-20）、ヒト胎児腎臓（HEK）293細胞もしくは293T細胞、または3T3細胞などの哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。適した哺乳動物宿主細胞、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物の生産および精製のための方法は当技術分野で公知である。その他の適した哺乳動物細胞株には、サルCOS-1細胞株およびCOS-7細胞株ならびにCV-1細胞株がある。哺乳動物宿主細胞のさらにほかの例には、形質転換細胞株を含む、霊長動物細胞株および齧歯動物細胞株が含まれる。正常二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物に由来する株化細胞、さらには初代エクスプラントも適している。候補細胞は遺伝子型的に選択遺伝子を欠損していてもよく、または優性作用性の選択遺伝子を含んでもよい。その他の適した哺乳動物細胞株には、マウス神経芽腫N2A細胞、HeLa細胞、マウスL-929細胞、Swiss、Balb-cまたはNIHマウスに由来する3T3細胞株、BHKまたはHaKハムスター細胞株が含まれるが、これらに限定されない。これらの細胞株はそれぞれタンパク質発現の分野の当業者には公知であって入手可能である。
【０１０５】
本発明に適した宿主細胞として同様に有用なものに細菌細胞がある。例えば、バイオテクノロジーの分野では、種々の大腸菌株（例えば、HB101、DH5□、DH10およびMC1061）が宿主細胞として周知である。枯草菌（B. subtilis）、シュードモナス属（Pseudomonas）、他のバシラス属（Bacillus）、ストレプトミセス属（Streptomyces）などの種々の株を、本方法に用いることもできる。
【０１０６】
当業者に公知である酵母細胞の多くの株を、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用することもできる。好ましい酵母細胞には、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピキア・パストリス（Pichia-pastoris）が含まれる。
【０１０７】
さらに、必要に応じて、昆虫細胞系を本発明の方法に利用することもできる。このような系は、例えば、Kitts et al., 1993, Biotechniques, 14: 810-17；Lucklow, 1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4: 564-72；およびLucklow et al., 1993, J. Virol., 67: 4566-79に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Sf-9およびHi5（Invitrogen）である。
【０１０８】
宿主細胞内に存在する本発明のポリヌクレオチドは、膜成分、タンパク質および脂質などのその他の細胞成分を含まないように単離することができる。ポリヌクレオチドは、標準的な核酸精製法を用いて細胞から単離すること、または連鎖反応（PCR）などの増幅法を用いて、もしくは自動合成装置を用いることによって合成することができる。ポリヌクレオチドを単離するための方法はルーチン的であり、当技術分野で公知である。ポリヌクレオチドを入手するためのあらゆるそのような技法を、本発明のアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを単離するために用いることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いて、アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを単離することができる。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、他の分子を含まない、または少なくとも70、80もしくは90％が他の分子でない調製物である。
【０１０９】
本明細書に記載の核酸分子およびポリペプチド分子を、組換えおよび他の手段によって作製しうることは、当業者には理解されると考えられる。例えば、本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのcDNA分子は、mRNAをテンプレートとして用いて標準的な分子生物学の技法によって作製することができる。その後に、cDNA分子を、当技術分野で公知であって実施例1に記載されている分子生物学の技法を用いて複製する。実施例2は、本発明の改変ムテインアンタゴニストの作製に用いた具体的な組換え発現および精製の手法を述べている。
【０１１０】
（c）ヒトアンタゴニストの治療的有用性の評価
アレルギー性喘息の治療における特定のアンタゴニストの有効性を評価するためには、アンタゴニストを、実施例5および6に詳述した細胞増殖アッセイにてインビトロで試験することが可能である。さらに、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの血漿半減期を、実施例6に従った薬物動態試験によってインビボで測定することができる。
【０１１１】
（d）薬学的組成物
上記の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストの任意のものを、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物として提供することができる。薬学的に許容される担体は、非発熱性であることが好ましい。組成物は単独で、または安定化化合物などの少なくとも1つの他の作用因子と組み合わせて投与することができ、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水を非制限的に含む、任意の無菌性で生体適合性のある薬学的担体中にある状態で投与することができる。例えば0.4％食塩水、0.3％グリシンといった、さまざまな水性担体を用いることもできる。これらの溶液は無菌性であり、粒子状物質を一般に含まない。これらの溶液は、従来のよく知られた滅菌手法（例えば、濾過）によって無菌化しうる。
【０１１２】
組成物は、薬学的に許容される補助物質を、必要に応じて含んでもよい。許容される補助物質は、用いる投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、浸透圧、粘度、清澄度、色調、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸収または浸透を、改変、維持または保持するための補助物質を含みうる。適した配合材料には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）、抗菌薬、抗酸化物質（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸、重炭酸、Tris-HCl、クエン酸、リン酸または他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-βシクロデキストリンなど）、賦形剤、単糖類、二糖類および他の糖質（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）、着色・香味・希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（ナトリウムなど）、保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック；PEG；ソルビタンエステル；ポリソルベート類、例えばポリソルベート20もしくはポリソルベート80など；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポールなど）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）、張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物――好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム――またはマンニトール ソルビトールなど）、送達媒体、希釈剤、添加剤および／または薬学的補助薬。Remington's Pharmaceutical Sciences（18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990）を参照のこと。
【０１１３】
このような薬学製剤における本発明のアンタゴニストの濃度は、広範囲、すなわち、重量比にして約0.5％未満、通常は少なくとも約1％から、15％または20％までの範囲にわたってよく、これは選択される具体的な投与様式に従い、主として液体の容積、粘度などに基づいて選択されると考えられる。必要に応じて、複数の種類のアンタゴニスト、例えばIL-4受容体結合に関するKdが異なるものを、1つの薬学的組成物に含めることができる。
【０１１４】
組成物は患者に対して、単独で、または他の作用因子、薬剤またはホルモンとともに投与することができる。これらの薬学的組成物は、有効成分に加えて、有効化合物の薬学的に用いうる製剤への加工処理を容易にする添加剤および補助物質を含む、適した薬学的に許容される担体を含むことができる。
【０１１５】
許容される配合材料は、用いる投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であることが好ましい。
【０１１６】
薬学的組成物は、例えば、組成物のpH、浸透圧、粘度、清澄度、色調、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸収または浸透を、改変、維持または保持するための補助物質を含みうる。適した配合材料には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）、抗菌薬、抗酸化物質（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸、重炭酸、Tris-HCl、クエン酸、リン酸または他の有機酸など）、増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（EDTA）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなど）、賦形剤、単糖類、二糖類および他の糖質（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど）、着色・香味・希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成性対イオン（ナトリウムなど）、保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁化剤、界面活性剤または湿潤剤（プルロニック；PEG；ソルビタンエステル；ポリソルベート類、例えばポリソルベート20もしくはポリソルベート80など；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポールなど）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）、張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物―好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム―またはマンニトール ソルビトールなど）、送達媒体、希釈剤、添加剤および／または薬学的補助薬。Remington's Pharmaceutical Sciences（18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990）を参照のこと。
【０１１７】
最適な薬学的組成物は、例えば、意図する投与経路、送達形式および所望の投与量に応じて、当業者によって決定されうる。例えば、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、前記を参照されたい。このような組成物は、本発明の核酸分子または骨密度調節薬の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボ排出速度に影響を及ぼす可能性がある。
【０１１８】
薬学的組成物における主要な媒体または担体は、水性でも非水性でもよい。例えば、注射のために適した媒体または担体としては、水、生理的食塩水または人工的脳脊髄液が可能であり、場合によっては非経口投与用の組成物において一般的な他の材料が加えられる。中性緩衝食塩水、または血清アルブミンと混合した食塩水は、媒体のさらに別の例である。薬学的組成物の別の例は、pHが約7.0〜8.5のTris緩衝液、またはpHが約4.0〜5.5の酢酸緩衝液を含み、これはさらにソルビトールまたは適した代替物も含みうる。本発明の1つの態様において、本発明の薬学的組成物は、所望の程度の純度を有する選択した組成物を任意的な配合物質と混合することにより、凍結乾燥した固形物または水溶液の形態として、貯蔵用に調製することができる（Remington's Pharmaceutical Sciences、前記）。さらに、組成物を、スクロースなどの適切な添加剤を用いて凍結乾燥物として製剤化することもできる。
【０１１９】
薬学的組成物を、非経口的送達用に選択することができる。または、組成物を吸入用、または消化管を通した送達用（経口的など）に選択することもできる。このような薬学的に許容される組成物の調製は当技術分野の技術の範囲内にある。
【０１２０】
製剤の成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液は、組成物を生理的pHまたはそれよりも幾分低いpHに、典型的にはpH約5〜約8の範囲に維持するために用いられる。
【０１２１】
非経口的投与を想定している場合には、本発明に用いるための治療用組成物は、薬学的に許容される媒体中に本発明の所望の分子を含む、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態であってよい。非経口的注入のために特に適した媒体は、適切に保存された無菌性等張液として分子が配合されている滅菌蒸留水である。さらにもう1つの製剤には、生成物の制御的または持続的な放出をもたらし、続いてそれが蓄積注射物を介して送達されるような、所望の分子と注射用マイクロスフェア、生崩壊性粒子、重合化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームなどの物質との配合物を含みうる。ヒアルロン酸を用いることもでき、これは血行中での持続期間を向上させる効果を有しうる。所望の分子の導入のためのその他の適した手段には、植え込み型の薬物送達デバイスが含まれる。
【０１２２】
1つの態様においては、薬学的組成物を吸入用に製剤化することができる。例えば、本発明の核酸分子または骨密度調節薬を、吸入用の乾燥粉末として製剤化することができる。吸入用溶液を、エアロゾル送達のための噴霧剤とともに製剤化することもできる。さらにもう1つの態様において、溶液を霧状にすることもできる。肺への投与に関しては、化学修飾タンパク質の肺送達を記載しているPCT公開公報第94／20069号にさらに記載されている。
【０１２３】
また別の態様において、ある種の製剤は経口的に投与することができる。本発明の1つの態様において、この様式で投与される本発明の核酸分子または骨密度調節薬は、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の調合に慣例的に用いられている担体とともに製剤化することも、それを伴わずに製剤化することもできる。例えば、カプセルを、生物学的利用能が最大となり、全身移行前の分解が最小限に抑えられるような消化管内の箇所で、製剤の活性部分を放出するように設計することができる。本発明の分子または調節役の吸収を促進させるために別の物質を含めることもできる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤を用いることもできる。
【０１２４】
もう1つの薬学的組成物は、本発明の核酸分子または骨密度調節薬の有効量を、錠剤の製造に適した非毒性添加剤との混合物として含みうる。錠剤を滅菌水または別の適切な媒体中に溶解させることにより、溶液を単位用量剤形として調製することができる。適した添加剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトースもしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチンもしくはアラビアゴムなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクなどの潤滑剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
そのほかの薬学的組成物は、持続的または制御的な送達用の製剤として本発明の核酸分子または骨密度調節薬を含む製剤を含め、当業者には明らかであると考えられる。リポソーム担体、生崩壊性微粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射といった、さまざまなその他の持続的または制御的な送達手段の製剤化のための手法も当業者には公知である。例えば、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を記載しているPCT／US93／00829号を参照されたい。
【０１２６】
徐放性製剤のそのほかの例には、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態にある半透過性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号および欧州特許第058481号）、L-グルタミン酸とγエチル-L-グルタミン酸との共重合体（Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56）、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277およびLanger, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105）、エチレンビニル酢酸（Langer et al.,前記）またはポリ-D(-)-3-ヒドロキシ酪酸（欧州特許第133988号）が含まれうる。徐放性組成物にはまた、当技術分野で公知のいくつかの方法のうち任意のものによって調製しうるリポソームも含まれうる。例えば、Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-92；ならびに欧州特許第036676号、第088046号および第143949号を参照されたい。
【０１２７】
インビボ投与のために用いようとする薬学的組成物は通常、無菌性でなければならない。これは、無菌濾過膜を通す濾過によって得ることができる。組成物を凍結乾燥させる場合には、この方法を用いる滅菌を、凍結乾燥および再構成の前に行っても後に行ってもよい。非経口的投与のための組成物は、凍結乾燥形態として、または溶液として保存することができる。加えて、非経口的組成物は一般に、無菌性アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射用針によって貫通しうる栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物は、経口的、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口的、局所適用、舌下または直腸内手段を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載のさまざまな経路の任意のものによって投与することができる。
【０１２９】
薬学的組成物を調製した後に、それらを適切な容器に入れて、適応となる病態の治療に関して標示することができる。このような標示は、投与の量、頻度および方法を含むと考えられる。
【０１３０】
（d）治療方法
本発明は、IL-4受容体α鎖を結合させて、IL-4およびIL-13により媒介される活性を阻害することにより、障害の症状を改善する方法を提供する。これらの障害には、喘息および他の免疫疾患またはアレルギー性疾患に伴うマスト細胞、好酸球およびリンパ球の動員および活性化を含む、気道過敏性および気道炎症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
本発明の1つの態様においては、本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストおよび／または本発明の薬学的組成物の治療的有効量を、以上の障害のようなIL-4およびIL-13の活性の増加を特徴とする障害を有する患者に対して投与する。
【０１３２】
（e）治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は当業者の能力の十分な範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の非存在下で認められる有効性と比較して喘息を有効に治療するために用いられるアンタゴニストの量のことを指す。
【０１３３】
治療的有効量は最初に動物モデルで、通常はラット、マウス、ウサギ、イヌ、ブタまたは非ヒト霊長動物で推測することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するためにも用いうる。続いて、このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。
【０１３４】
ヒトアンタゴニストの治療効果および毒性、例えば、ED50（集団の50％に治療効果のある用量）およびLD50（集団の50％にとって致死的である用量）は、細胞培養物または実験動物において標準的薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これはLD50／ED50として表すことができる。
【０１３５】
大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。動物試験によって得られたデータが、ヒトに用いるための投与量の範囲の設定に用いられる。このような組成物に含まれる用量は、ED50を含むが毒性はほとんどまたは全くない流血中濃度の範囲にあることが好ましい。投与量は、用いる剤形、患者の感受性および投与経路に応じて、この範囲内で異なる。
【０１３６】
厳密な投与量は、治療を必要とする患者に関係する諸要因に鑑みて、臨床医によって決定されると考えられる。投与量および投与は、十分なレベルのアンタゴニストが得られるように、または所望の効果が維持されるように調整される。考慮に入れうる要因には、病状の重症度、被験体の全般的健康状態、被験体の年齢、体重および性別、食事内容、投与の時期および頻度、併用薬剤、反応感受性、ならびに治療に対する耐容性／応答性が含まれる。長時間作用型の薬学的組成物は、個々の製剤の半減期および排出速度に応じて、3〜4日毎、週1回または2週間に1回投与することができる。
【０１３７】
本発明の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを構築し、トランスフェリン-ポリカチオンを介したDNA移入、裸状または封入性の核酸によるトランスフェクション、リポソームを介した細胞融合、DNAをコーティングしたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔法、「遺伝子銃」およびDEABまたはリン酸カルシウムを介したトランスフェクションを非制限的に含む、十分に確立された技法を用いて、エクスビボまたはインビボのいずれかにおいて細胞に導入することができる。
【０１３８】
アンタゴニストの有効インビボ投与量は、約5μg〜約50μg／kg、約50μg〜約5mg／kg、約100μg〜約500μg／kg（患者体重）および約200〜約250μg／kg（患者体重）の範囲にある。アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドの投与に関する、有効インビボ投与量は、DNAにして約100ng〜約200ng、500ng〜約50mg、約1μg〜約2mg、約5μg〜約500μgおよび約20μg〜約100μgの範囲にある。
【０１３９】
改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含む本発明の薬学的組成物の投与様式は、アンタゴニストが宿主に送達される任意の適した経路であってよい。本発明の薬学的組成物は、非経口的投与、すなわち、皮下、筋肉内、静脈内、髄腔内、または鼻腔内および肺への他の投与様式のために特に有用である。
【０１４０】
本開示において引用したすべての特許および特許出願は、参照として本明細書に明示的に組み入れられる。以上の開示は本発明を全般的に説明したものである。以下の具体的な実施例を参照することにより、より完全な理解を得ることができるが、これらは例示のみを目的として提供されており、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【０１４１】
実施例
実施例1
IL-4-RAおよびIL-4-REシステインムテインの組換え生産
pET Directional TOPO（登録商標）発現システム（Invitrogen）をIL-4の組換え発現のために選択した。このシステムは、関心対象の遺伝子の大腸菌における高レベルおよびIPTG誘導性発現を目的として平滑末端PCR産物およびT7lacプロモーターの定方向クローニングを行うために、高効率一段階「TOPO（登録商標）Cloning」戦略を用いる。そのほかの特徴には、基礎的な転写を低下させるためのlacI遺伝子、プラスミドの複製および維持のためのpBR322起点、ならびに選択用のアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。
【０１４２】
組換えIL-4タンパク質の生産のためにIL-4をpET101／D-TOPOベクター中にクローニングした。オリゴヌクレオチドプライマーは表4に示されている。フォワードPCRプライマーは、定方向クローニングを容易にするための5'CACC突出部の後にサブクローニング用の固有のNdeI制限酵素部位および最初のATG開始コドンが続くものを用いて設計した。リバースPCRプライマーは、c-末端タグが確実に組み入れられないようにするための2つの終止コドンおよびサブクローニング用の固有のBamHI制限酵素部位を含む。平滑末端IL-4PCR産物は、以前にクローニングされたヒトIL-4をテンプレートとして用いて作製した。その産物をゲル精製し、塩溶液およびTOPO（登録商標）ベクターとともに室温で5分間インキュベートして、pET101／D-TOPOベクター中への定方向クローニングを行わせた。この組換えベクターを、化学的コンピテント（chemically competent）One Shot TOP 10大腸菌に形質転換導入した。組換えプラスミドDNAを、正しい配列を確かめるためのDNAシークエンシングに供した。
【０１４３】
（表４）IL-4 REシステインムテインを作製するためのオリゴヌクレオチドプライマー
2007526757.tif 000007
【０１４４】
IL-4／pET101／D-TOPOを、Strategene社製のQuikChange（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kitを用いてIL-4REシステインムテインを作製するためのテンプレートとして用いた。各々のシステインムテインは、ベクターの対向鎖に対してそれぞれ相補的であって、所望のシステイン変異を組み入れるためにコドンTGCまたはGCAを含む、2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて作製した。表4に、IL-4REムテインを作製するために用いたプライマーの一覧を示している。互い違いに位置するニック（staggered nick）を含む変異プラスミドを、製造元のプロトコールに定められたサイクルパラメーターおよび条件を用いて作製した。この産物をDpnIエンドヌクレアーゼにより37℃で1時間処理し、メチル化された非変異型の親DNAテンプレートを消化した。DpnIで処理したDNAをXL-1Blueスーパーコンピテント細胞に形質転換導入し、そこで変異プラスミド中のニックを修復させた。配列の正しさを確かめるために、この変異誘発性プラスミドを標準的なシークエンシング手法によって解析した。
【０１４５】
実施例2
組換え発現および精製
プラスミドを含むタンパク質による形質転換を受けたBL21 Star（DE3）One Shot細胞（Invitrogen）を至適発現の特徴に関して調べた上で、0D600が約0.4に達するまで37℃で増殖させ、1mM IPTG（Invitrogen）による誘導処理を37℃で3時間行った。1リットル分の細胞を13,000rpmで10分間遠心してペレット化し、秤量した上で-80℃で保存した。凍結細胞ペレットを、細胞1グラム当たり8mlの細胞破壊用バッファー（0.1Mリン酸緩衝液 pH7.3、0.1％ Triton X100、1mM EDTA）中に再懸濁させ、1分間ずつの間をおいて1分間×4回の超音波処理を行った。細胞溶解物を35000g、10分間の遠心処理によって除去した。続いて細胞ペレットを、30mlの細胞破壊用バッファー中に再懸濁させ、1分間の超音波処理の後に遠心処理を行うことを2〜3回繰り返して洗浄した。最終的な細胞ペレットである封入体を-20℃で保存した。封入体を、細胞1グラム当たり5mlの可溶化バッファー（0.2M Tris pH9、7M塩酸グアニジン）中に再懸濁させた。スルホトライシス（Sulphotolysis）試薬（細胞1グラム当たり亜硫酸ナトリウム0.16グラム、テトラチオン酸カリウム0.08グラム）を添加し、封入体を室温で2時間攪拌した。続いて、溶解しなかった成分を35000gでの20分間の遠心によって除去し、可溶化した封入体のみを残した。続いて、タンパク質を単離するために封入体をSuperdex200サイズ排除カラム（Akta）にかけた。カラムをカラム容量（CV）の2倍の6M塩酸グアニジン／PBS pH7により流速1ml／分で平衡化し、タンパク質を1.5 CVに溶出させた。ピーク画分（各1.5ml）を採取し、12％または4〜20％のBis-Tris-SDSゲル電気泳動によりスクリーニングした。タンパク質を含む画分をプールし、タンパク質分子を還元するために最終濃度7.5mMのDTTを添加した。室温での2時間のインキュベーションの後に、この混合物を水で5倍に希釈し、4.5Lの3mM NaH２PO４、7mM Na２HPO４、2mM KCl、120mM NaClに対する透析に供した。透析は、新たな緩衝液に少なくとも3回交換しながら3〜4日間続けた。続いて透析材料を0.2μmフィルターに通して濾過し、酢酸を用いてpHを5に調整した。カラムを10 CVのバッファー1（25mM酢酸アンモニウム pH5）で平衡化し、続いて注入後に20分間の勾配で100％バッファーB（25mM酢酸アンモニウム pH5／1M NaCl）にした。ピーク画分（各0.5ml）を採取し、12％または4〜20％のBis-Tris-SDSゲル電気泳動によりスクリーニングした。産物を含む画分をプールし、バッファーA（0.1％ TFA／水）で2倍に希釈した。続いてタンパク質を、C4逆相-HPLC（Beckman system Gold）により、5mlループおよび流速1ml／分を用い、以下のプログラムを用いてクロマトグラフィー処理した：注入期間は10％バッファーA、10分間の勾配で40％バッファーB（0.1％ TFA／ACN）に、30分間の勾配で50％バッファーBに、5分間の勾配で100％バッファーBに。ピーク画分（各0.5ml）を採取し、12％または4〜20％のBis-Tris-SDSゲル電気泳動によりスクリーニングした。タンパク質を含む画分を吸引乾燥させ、分析およびアッセイのために0.1M MES pH6.1中に再懸濁させた。
【０１４６】
実施例3
位置特異的システインPEG化および精製
タンパク質のスルフヒドリルと、直鎖状22kDメトキシ-ポリエチレングリコール-マレイミド誘導体（Nektar Therapeutics）のマレイミド基との間の安定的なチオエステル結合を介して、システインを含むIL4 RAムテインをPEG化するためのプロトコールを確立した。2倍モル過剰量のmPEG-MAL 22kD試薬を、反応バッファー（0.1M MES、pH6）中に溶解したタンパク質60□Mに添加した。室温に0.5時間おいた後に、mPEG-MAL 22kDに対して2倍モル過剰量のシステインによって反応を停止させた（図1）。PEG化タンパク質を、反応しなかったmPEG-MAL 22kD（システインにより反応停止させた）および反応しなかったIL4 RAシステインムテインから、陽イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。粗反応混合物を、0.4mLの0.1M MES、pH6で平衡化したVivapure Mini S陽イオン交換カラム（Vivascience）にかけた。カラムを0.4mLの0.1M MES、pH6で2回洗浄し、各洗浄後に2,000×gで遠心した。0.4mLの0.6M NaCl／0.1M MES、pH6を用いたカラムからの遠心処理によって試料を溶出させた。0.4mLの溶出液を、Beckman HPLC system Goldを用いるTSK-GEL G2000SWXL HPLCサイジングカラム（Tosoh Biosep）にかけた。リン酸緩衝食塩水（Dulbecco's PBS）の移動相を流速1ml／分で30分間用いて試料を分離した。ピーク画分（0.5ml）を採取し、4〜12％のBis-Tris-SDSゲル電気泳動によってPEG化タンパク質に関して評価した。産物を含む画分をプールした上で、分析およびインビトロアッセイのために、Ultrafree Biomax-5装置（Millipore）を製造元のプロトコールに従って用いて濃縮し、約60μM（またはほぼ1mg／ml）とした。PEG化タンパク質の最終濃度はアミノ酸分析によって決定した。最終的な収量は表5に示されている。
【０１４７】
（表５）PEG化IL-4RAシステインムテインの精製収量
2007526757.tif 000008
【０１４８】
実施例4
BiaCore IL-4受容体結合アッセイ
IL-4受容体を、BIAcore CM5研究用グレードセンサーチップ上にアミン結合によって固定化した。センサー表面をEDC／NHSパルスにより活性化させた。IL-4受容体を10mM酢酸緩衝液（pH 5.0）中に溶解させてフローセル2に注入し、その後に表面を失活させるために1.0Mエタノールアミン-HCLのパルスを与えた。受容体の固定化レベルはほぼ300RUであった。フローセル1はリガンドを用いずに活性化させ、ブランクとして用いた。動態分析の実施にはBiacore Wizardを用いた。IL-4REアンタゴニストの候補をHBS-EP（泳動バッファー）中に希釈し、30μl／分の流速で3分間注入し、解離時間は15分間とした。チップの再生処理は、一連の濃度における次の注入の前にベースラインに対する10mMグリシン pH2.5（流速100μl／分）の30秒間の2回の注入によって行った。解離定数（KD）値を、直接結合による反応速度論に基づいて各候補について算出した（表5）。その結果、構築物IL4-RE-A104C、IL4-RE-N105CおよびIL4-RE-Q106Cのすべてで0.6nM未満の解離定数が得られたことが示された。
【０１４９】
実施例5
TF-1細胞増殖アッセイ
IL-4（0.5ng／ml、0.033nM）またはIL-13（5ng／ml、0.416nM）に対するTF-1細胞の増殖応答を用いて、IL-4RE分子の機能的拮抗活性を評価した。このアッセイでは、96ウェルプレート（1×104個／ウェル、容積100μl）において、10％血清を加えたRPMI中で、IL-4またはIL-13およびIL-4RE分子の存在下または非存在下でTF-1細胞を2〜4日間培養した。GM-CSF処理を陽性対照として用いた。最終的な読み取りの24時間前に、10μlのAlamarBlue（容積比10％）を各ウェルに添加した。530／590nmでの蛍光を、WALLAC Victor 2を用いて測定した。増殖阻害濃度50％（IC50）はIL-4RE分子候補の用量漸増法によって決定した。IL-4およびIL-13の阻害に関するTF-1バイオアッセイの結果の要約が表6に示されている。これらの結果は、構築物IL4-RE-K37C、IL4-RE-N38CおよびIL4-RE-Al04Cが、IL-4またはIL-13の存在下でIL-4-RAのそれと同程度のIC50値を示したことを示している。
【０１５０】
（表６）PEG-IL-4RE BIAcore結合アッセイ、ならびにTF-1細胞増殖アッセイにおけるIL-4RAに対するPEG化ムテインの生物活性評価
2007526757.tif 000009
【０１５１】
実施例6
初代細胞増殖アッセイ
IL-4に対するヒト初代細胞（T細胞およびB細胞）の増殖応答もIL-4RE分子の前処理後に評価した。末梢血単核細胞（PBMC）を末梢血から単離し、T細胞芽球化を誘導するためにその一部をPHAで4日間処理した。B細胞活性を活性化するためにPBMCを抗CD40でも処理し、直ちに用いた。細胞を96ウェルプレート（1ウェル当たり細胞105個）に播いた。PHA T細胞芽球およびB細胞調製物を、種々の濃度のIL-4RE分子の存在下で、IL-4（10ng／ml、0.667nM）により3日間刺激した。インキュベーションの最後の20時間におけるトリチウム標識チミジンの取り込みを増殖の指標として用いた。これらのアッセイの結果は表7に示されている。これらの結果は、どちらの初代細胞アッセイに関しても、すべてのPEG化構築物がIL-4RAの5倍未満のIC50を示したことを示している。
【０１５２】
（表７）B細胞およびT細胞芽球の増殖アッセイにおけるPEG-IL4RE生物活性の評価
2007526757.tif 000010
【０１５３】
実施例7
ラット薬物動態試験
体重250〜300グラムの成体雄性Sprague-Dawleyラットを用いた。血液試料の採取のために、ラットに頸静脈カテーテルを挿管した。さらに、静脈内（IV）投与群のラットには、薬剤投与のために大腿静脈カテーテルも挿管した。
【０１５４】
ラットに対して、IL-4RAまたは改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのいずれかを、それぞれ1mg／kgおよび0.5mg／kgの用量で投与した。IV経路およびSC（皮下）経路の両方を用いた。IV投与は、留置した大腿静脈カテーテルからの直接注入によって行った。SC投与は胸背領域への注射によって行った。各投与群には3匹ずつのラットを用いた。
【０１５５】
単回ボーラス注入（IVまたはSC）の後に、血液試料を、投薬前および投薬後の所定の時点（168時間後まで）で採取した。試料に対する遠心処理は採取1時間以内に開始した。血漿を収集し、ドライアイス上に置いた後に約-70℃で保存した。
【０１５６】
IL-4RAおよび改変ムテインの血漿中濃度は、固相酵素免疫アッセイを用いて定量した。抗IL-4抗体をコーティング用および検出用の試薬として用いた。このアッセイの定量域の下限は0.2ng／mlであった。薬物動態パラメーターは、WinNonlin（Pharsight, Mountain view, CA）を用いるノンコンパートメント解析によって得た。特に注目したのは、吸収および排出の動態、分布容積ならびに吸収された量の評価である。
【０１５７】
参考文献
2007526757.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】PEG化反応の化学の概略図を示す。
【図１】
2007526757.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成18年6月7日(2006.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a）SEQ ID NO：2、SEQ ID NO；3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7もしくはSEQ ID NO：8に示されたヌクレオチド配列；または
b）SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15もしくはSEQ ID NO：16に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含む、精製されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項1記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項2記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを作製する方法であって、
a）請求項3記載の宿主細胞をアンタゴニストが発現される条件下で培養する段階；および
b）宿主細胞培養物からアンタゴニストを精製する段階
を含む方法。
【請求項５】
活性型の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストを作製する方法であって、
a）請求項3記載の宿主細胞をアンタゴニストが発現される条件下で培養する段階；
b）アンタゴニストをジチオトレイトールの存在下でリフォールディングさせる段階；および
c）宿主細胞培養物からアンタゴニストを精製する段階
を含む方法。
【請求項６】
d）アンタゴニストを非タンパク質性ポリマーと結合させる段階；および
e）非タンパク質性ポリマーと結合させたアンタゴニストを精製する段階
をさらに含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
IL-4およびIL-13により媒介される活性を阻害する、請求項4から6のいずれか一項記載の方法によって生産される改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項８】
IL-4の28、36、37、38、104、105または106位にあるアミノ酸残基で非タンパク質性ポリマーと結合している、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストであって、非タンパク質性ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンである、改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項９】
ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールおよびポリオキシアルキレンからなる群より選択される非タンパク質性ポリマーと結合している、請求項7記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１０】
約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのKdでIL-4受容体α鎖と結合する、請求項8または9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１１】
IL-4に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項8または9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１２】
IL-13に対するTF-1細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項8または9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１３】
IL-4に対するヒトB細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項8または9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１４】
IL-4に対するヒトT細胞の増殖応答を、約0.1nM〜約10μM、約0.5nM〜約1μMまたは約1.0nM〜約100nMのIC50で阻害する、請求項8または9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１５】
血漿半減期が、非改変IL-4受容体アンタゴニストの少なくとも約2〜10倍の長さである、請求項8または9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１６】
IL-4の28、36、37、38、104、105または106位にあるアミノ酸残基で非タンパク質性ポリマーと結合している、請求項9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１７】
28、36、37、38、104、105または106位のアミノ酸残基がシステインである、請求項8または16記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１８】
SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、またはSEQ ID NO：16に示されたアミノ酸配列を含む、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項１９】
a）請求項7から9のいずれか一項記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト；および
b）薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物。
【請求項２０】
IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療するための、請求項9記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニスト。
【請求項２１】
IL-4およびIL-13の活性の増加に関連するヒト障害を治療するための、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
障害が喘息、慢性閉塞性肺疾患または関連する肺病態である、請求項20記載の記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストまたは請求項21記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
慢性閉塞性肺疾患が肺気腫または慢性気管支炎である、請求項22記載の改変型IL-4ムテイン受容体アンタゴニストまたは薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007526757000001.app
【国際調査報告】
2007526757.tif 000013
2007526757.tif 000014
2007526757.tif 000015
2007526757.tif 000016
2007526757.tif 000017
2007526757.tif 000018