(57)【要約】本発明は、トランスジェニック哺乳動物が、哺乳動物トランスジェニック動物の乳汁内に膜貫通型レセプタータンパク質を製造することを実証するデータを提供し、これらのタンパク質およびそのドミナントネガティブなバージョンを治療用分子として使用するための製造方法を提供する。本発明の方法は、望ましいレセプター膜貫通型タンパク質についてトランスジェニックである非ヒト哺乳動物を、核移植プロセスを介してクローニングする工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核移植プロセスによって非ヒト哺乳動物をクローニングするための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）ドナー核の供給源として使用される、所望の分化した哺乳動物細胞を得る工程；
（ｉｉ）該ドナー核の供給源である細胞と、同じ種の哺乳動物から少なくとも１つの卵母細胞を得る工程；
（ｉｉｉ）該少なくとも１つの卵母細胞を、除核する工程；
（ｉｖ）該所望の分化した細胞または細胞核を、該除核した卵母細胞中に移植する工程；
（ｖ）該細胞対を同時に融合および活性化して、トランスジェニック胚を形成させる工程；
（ｖｉｉ）２細胞発生段階を越えるまで、該トランスジェニック胚（ＥＳ）を培養する工程；および
（ｖｉｉｉ）該胚が胎仔へと発育するように、該トランスジェニック胚をホスト哺乳動物に移植する工程
を包含し、
該所望の分化した細胞または細胞核は、組換え導入遺伝子を含み、かつ、該組換え導入遺伝子は、目的の組換え膜貫通型レセプタータンパク質をコードする、方法。
【請求項２】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、中胚葉由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、内胚葉由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、外胚葉由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、胎仔の体細胞組織由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、胎仔の体細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、線維芽細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、有蹄動物由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ドナー細胞またはドナー細胞核が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギおよび水牛からなる群より選択される有蹄動物由来である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、成体の非ヒト哺乳動物体細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、線維芽細胞および筋肉細胞からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓および尿道からなる群より選択される器官に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの卵母細胞が、除核前に、インビボで成熟させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの卵母細胞が、除核前に、インビトロで成熟させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト哺乳動物がげっ歯類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、非静止状態の体細胞であるか、または、該非静止状態の体細胞から単離された核である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記胎仔が、子孫へと発育する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの卵母細胞が、インビトロ成熟開始の、約１０〜６０時間後に除核される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記分化した哺乳動物細胞または細胞核を、前記除核した卵母細胞へ挿入する前に、所望の遺伝子が、該分化した哺乳動物細胞または細胞核中に挿入されるか、該分化した哺乳動物細胞または細胞核から取り出されるか、または該分化した哺乳動物細胞または細胞核において改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１９に記載の方法で得られた、子孫。
【請求項２１】
前記核移植手順の結果として作製された子孫がキメラ体である、請求項１９に記載の得られた子孫。
【請求項２２】
サイトカラシン−Ｂが前記クローニングプロトコルにおいて使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
サイトカラシン−Ｂが前記クローニングプロトコルにおいて使用されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
培養された内部細胞塊細胞を生成するための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）ドナー核の供給源として使用される、所望の分化した哺乳動物細胞を得る工程；
（ｉｉ）該ドナー核の供給源である細胞と同じ種の哺乳動物から、少なくとも１つの卵母細胞を得る工程；
（ｉｉｉ）該少なくとも１つの卵母細胞を除核する工程；
（ｉｖ）該除核した卵母細胞中に、該所望の分化した細胞または細胞核を移植する工程；
（ｖ）該細胞対を同時に融合および活性化して、第１のトランスジェニック胚を形成する工程；
（ｖｉ）融合せずに第１のトランスジェニック胚を作製することはないが、さらなる電気ショックを含む少なくとも１つのさらなる活性化プロトコルを提供することによって最初の電気ショック後に活性化される細胞対を活性化して、第２のトランスジェニック胚を形成する、工程；および
（ｖｉ）該培養した活性化された胚から得られた細胞を培養して、培養された内部細胞塊細胞を得る工程
を包含し、
該トランスジェニック胚は、目的の組換え膜貫通型レセプタータンパク質をコードする、方法。
【請求項２５】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、中胚葉由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、内胚葉由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、外胚葉由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、胎仔の体細胞組織由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、胎仔の体細胞由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、線維芽細胞由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、有蹄動物由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記ドナー細胞またはドナー細胞核が、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギおよび水牛からなる群より選択される有蹄動物由来である、請求項２４または３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、成体の非ヒト哺乳動物体細胞由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラニン細胞、軟骨細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、赤血球、マクロファージ、単球、線維芽細胞および筋肉細胞からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
ドナー核の供給源またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器官、膀胱、腎臓および尿道からなる群より選択される器官に由来する、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの卵母細胞が、除核前に、インビボで成熟させられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つの卵母細胞が、除核前に、インビトロで成熟させられる、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記非ヒト哺乳動物がげっ歯類由来である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３９】
ドナー核またはドナー細胞核の供給源として使用される前記ドナーの分化した哺乳動物細胞が、非静止状態の体細胞であるか、または、該非静止状態の体細胞から単離された核である、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記培養された内部細胞塊細胞の胎仔が、非ヒト子孫へと発育する、請求項２４または３１のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの卵母細胞が、インビトロ成熟開始の、約１０〜６０時間後に除核される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４２】
前記分化した哺乳動物細胞または細胞核を、前記除核した卵母細胞へ挿入する前に、所望の遺伝子が、該分化した哺乳動物細胞または細胞核に挿入されるか、該分化した哺乳動物細胞または細胞核から取り出されるか、または該分化した哺乳動物細胞または細胞核において改変される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４３】
請求項２４または４２に記載の方法で得られた、子孫。
【請求項４４】
前記核移植手順の結果として作製されたどの非ヒト子孫もキメラ体である、請求項４２に記載の得られた子孫。
【請求項４５】
サイトカラシン−Ｂが前記プロトコルにおいて使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４６】
サイトカラシン−Ｂが前記プロトコルにおいて使用されない、請求項２４に記載の方法。
【請求項４７】
サイトカラシン−Ｂが前記プロトコルにおいて使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項４８】
ＤＮＡの連続コード配列の産物である、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項４９】
少なくとも１ｇ／ｌのレベルで前記ホストトランスジェニック哺乳動物の乳汁中において発現される、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５０】
乳汁分泌を誘導した際に乳房上皮細胞において発現される、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５１】
発現の際に、その生物学的活性を保持する、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５２】
ネイティブな膜貫通型タンパク質のドミナントネガティブなバージョンとして機能するように遺伝子操作された、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５３】
あらゆる生物学的機能性を欠如している、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５４】
ＩＬ−１３レセプター、オレキシンレセプター、メラニン濃縮ホルモンレセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター、ＣＦＴＲレセプター、ＣＤ４レセプターおよびカドヘリンを含むリストから選択される、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５５】
ＩＬ−１３レセプター、オレキシンレセプター、メラニン濃縮ホルモンレセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター、ＣＦＴＲレセプター、ＣＤ４レセプターおよびカドヘリンを含むリストから選択される生物学的タンパク質のドミナントネガティブなバージョンである、請求項１に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５６】
チャネルタンパク質、薬物耐性調節因子タンパク質、およびイオン孔タンパク質を含むリストから選択される、請求項１に記載の組換え膜貫通型タンパク質。
【請求項５７】
ＤＮＡの連続コード配列の産物である、請求項２４に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項５８】
少なくとも１ｇ／ｌのレベルで、前記ホストトランスジェニック哺乳動物の乳汁中において発現される、請求項２４に記載の組換え膜貫通型タンパク質。
【請求項５９】
乳汁分泌を誘導した際に乳房上皮細胞において発現される、請求項２４に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項６０】
発現の際に、その生物学的活性を保持している、請求項２４に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項６１】
ネイティブな膜貫通型タンパク質のドミナントネガティブなバージョンとして機能するように遺伝子操作された、請求項２４に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項６２】
あらゆる生物学的機能性を欠如している、請求項２４に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項６３】
ＩＬ−１３レセプター、オレキシンレセプター、メラニン濃縮ホルモンレセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター、ＣＦＴＲレセプター、ＣＤ４レセプターおよびカドヘリンを含むリストから選択される、請求項２４に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項６４】
ＩＬ−１３レセプター、オレキシンレセプター、メラニン濃縮ホルモンレセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター、ＣＦＴＲレセプター、ＣＤ４レセプターおよびカドヘリンを含むリストから選択される生物学的タンパク質のドミナントネガティブなバージョンである、請求項２４に記載の組換え膜貫通型レセプタータンパク質。
【請求項６５】
チャネルタンパク質、薬物耐性調節因子タンパク質、およびイオン孔タンパク質を含むリストから選択される、請求項２４に記載の組換え膜貫通型タンパク質。
【請求項６６】
核移植プロセスにより非ヒト哺乳動物をクローニングするための方法であって、該方法は、以下：
（ｉ）ドナー核の供給源として使用される、所望の分化した哺乳動物細胞を得る工程；
（ｉｉ）該ドナー核の供給源である細胞と同じ種の哺乳動物から、少なくとも１つの卵母細胞を得る工程；
（ｉｉｉ）該卵母細胞を徐核する工程；
（ｉｖ）該除核した卵母細胞中に、該所望の分化した細胞または細胞核を移植する工程；
細胞対に対して少なくとも２回の電気ショックを使用して、活性化し、かつ融合した胚への、該細胞対の融合および活性化を開始させる工程；
（ｖｉｉ）２細胞発生段階を越えるまで、該活性化し、かつ融合した胚を培養する工程；および
（ｖｉｉｉ）該胚が胎仔へと発育するように、該融合した胚をホスト哺乳動物中に移植する工程
を包含し、
該少なくとも２回の電気ショックのうちの２回目が、最初の電気ショックの少なくとも１５分後に与えられ；
該分化した哺乳動物細胞または細胞核を、該除核した卵母細胞へ挿入する前に、該所望の遺伝子が、該分化した哺乳動物細胞または細胞核中に挿入されるか、該分化した哺乳動物細胞または細胞核から取り出されるか、または該分化した哺乳動物細胞または細胞核において改変され；そして
該所望の遺伝子が乳汁分泌を誘導した際に乳房の上皮細胞において発現され得る目的の組換え膜貫通型レセプタータンパク質をコードする、
方法。
【請求項６７】
疾患を処置する方法であって、該方法は、遺伝子組み換えで生成された膜貫通型レセプタータンパク質またはそのドミナントネガティブなバージョンの有効量を投与して、疾患状態であるか、または疾患状態に曝露される細胞または細胞群と該化合物が接触するようにする工程を包含し、該化合物は、該疾患の連続性の進行を妨害するようにはたらく、方法。
【請求項６８】
前記疾患が喘息である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾患がアレルギーである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記疾患が乾癬である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾患が、ＦＧＲＦの過剰生成により引き起こされた癌である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記疾患が炎症である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
肥満を処置する方法であって、該方法は、遺伝子組み換えで生成された膜貫通型レセプタータンパク質またはそのドミナントネガティブなバージョンの有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項７４】
前記膜貫通型レセプタータンパク質が、オレキシンレセプター、メラニン濃縮ホルモンレセプターおよびグレリンレセプターからなる群より選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
前記化合物の投与が、錠剤などの薬学的処方物の経口投与によって達成される、請求項６７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、トランスジェニック哺乳動物の乳汁において望ましい膜貫通型レセプター構築物を発現することが可能なトランスジェニック動物の作製のための改良方法に関する。より具体的には、本発明は、治療用分子として有用な膜貫通型レセプタータンパク質および／またはドミナントネガティブ膜貫通型レセプタータンパク質の発現についてトランスジェニックである動物の作製を改良するための方法を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般的には、核移植の分野および望ましいトランスジェニック動物の作製の分野に関する。より具体的には、本発明は、トランスジェニック動物において膜貫通型レセプタータンパク質を生成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
トランスジェニック動物を作製することが可能な技術の発達によって、特定の形質を保有するように遺伝子操作されたトランスジェニック動物、あるいは特定のタンパク質または他の分子化合物を発現するように設計されたトランスジェニック動物の作製において、桁外れの精度のための手段が提供される。すなわち、トランスジェニック動物は、発生初期段階において体細胞および／または生殖細胞中に意図的に導入された遺伝子を保有する動物である。その動物が発達して成長すると、その動物中に遺伝子操作されたタンパク質産物または特定の発生変化が、明らかになる。
【０００４】
新規治療標的についてのリード化学物質を発見する能力が、ほとんどの製薬会社にとって薬物開発プログラムの最初の重要な段階である。細胞生物学、ゲノム配列決定、および遺伝子導入における最近の進歩によって、シグナル伝達経路の精査、ならびに新規な生化学的制御点の精査が可能になり、それによって、その産業において前例のない速度で低分子薬物介入についての潜在的に新規な機会の同定が促進される。
【０００５】
この方向に沿って、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）は、製薬産業にとっての主要な種類の標的である。ＧＰＣＲは、多数のオートクラインシグナル伝達系、パラクラインシグナル伝達系、およびエンドクラインシグナル伝達系において重要な機能を有する、７回膜貫通型レセプタータンパク質のスーパーファミリーである。これらのタンパク質は、細胞外リガンドおよびホルモンの結合を、グアニンヌクレオチド結合調節タンパク質（Ｇタンパク質）の調節を介して細胞内シグナル伝達事象へと伝達する。ＧＰＣＲを標的とする従来の薬物開発プログラムは、出発点として天然供給源由来の動物体全体または組織調製物を使用して、生物学的アッセイまたは薬理学的アッセイにおいて合成ライブラリー／医薬ライブラリーまたは天然産物ライブラリーのスクリーニングを実施することに依存していた。膜貫通型タンパク質のその性質に関連する発現の問題に起因して、膜貫通型レセプタータンパク質は、使用可能な量で発現または精製することが極めて困難であった（Ｌｏｉｓｅｌら、１９９７）。
【０００６】
この分野の当業者は、単独型の治療分子として、感知可能な量の可溶性膜貫通型レセプターまたはそのドミナントネガティブバージョンを生成することは、全く成功しなかった。例えば、１６６残基の造血成長ホルモンエリスロポエチン（ＥＰＯ）についての代理低分子リガンドおよびそのサイトカインレセプターを発見することに関して、かなりの努力がなされた。天然のＥＰＩリガンドとは配列が無関係である２０残基の環状ペプチドが、同定され、広範に研究された（Ｌｉｖｎａｈら、１９９６）が、このサイズが減少したペプチドは、薬物自体へと翻訳されることもなく、治療分子の開発のために利用可能なレセプタータンパク質を生成する助けにもならなかった。
【０００７】
本発明の前に、膜貫通型レセプタータンパク質を生成することが可能なトランスジェニック家畜動物の作製のために利用可能な技術は、商業的に実行可能な規模近くで望ましい組換えタンパク質を生成するためには非効率的であり、かつ／またはそれを生成することはできなかった。目的とするレセプター膜貫通型ＤＮＡ配列を保有するトランスジェニック創始系統を開発する間には、種々の問題が存在する。代表的には、その導入遺伝子は、全く組み込まれないか、または組み込まれるが発現されないかの、いずれかであり得る。さらなる問題は、位置効果に起因する不正確な調節の可能性である。これは、同じトランスジェニック構築物を用いて作製された異なるファウンダー動物間における、遺伝子発現レベルおよび遺伝子調節の精度の変動を指す。従って、多数のファウンダー動物を作製し、しばしば、そのトランスジェニック系統の維持を保証する様式では５％未満しかその導入遺伝子を発現しないことを確認することは、珍しいことではない。
【０００８】
さらに、トランスジェニック家畜動物を作製する効率は、低く、作製された１００匹の子孫のうちの１匹がトランスジェニックである効率は、珍しくない（Ｗａｌｌら、１９９７）。結果として、トランスジェニック動物を作製することに関するコストは、発現動物１匹当たり２５０，０００〜５００，０００ドル程度であり得る（Ｗａｌｌら、１９９７）。
【０００９】
先行技術の方法は、代表的には、クローニング手順において胚細胞型を使用している。これには、Ｃａｍｐｂｅｌｌらによる業績（Ｎａｔｕｒｅ  １９９６）およびＳｔｉｃｅらによる業績（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．１９９６）が挙げられる。これらの研究の両方において、胚細胞株が、１０日間未満の妊娠期間の胚から誘導された。両方の研究において、これらの細胞は、フィーダー層において維持されて、そのクローニング手順において使用されるドナー細胞の明白な分化が防がれた。本発明は、分化した細胞を使用する。胚細胞型はまた、分化したドナー核で始まるクローニング胚とともに、本発明の方法において使用され得ることが、考えられる。
【００１０】
従って、トランスジェニック動物は、いくつかの異なる種において種々の方法によって作製されているが、望ましい膜貫通型タンパク質を大量に発現可能であるかまたは導入遺伝子の挿入によって生じる遺伝子変化を示すことが可能なトランスジェニック動物を、手頃なコストで容易にかつ再現可能に作製するための方法が、なお欠けている。発現することに関する以前の試みとしては、膜貫通ドメインが欠失した膜結合型タンパク質を遺伝子操作し、それによってリガンドに結合し得る細胞外部分を残すことが挙げられる（Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、米国特許出願公開第２００３／００１７１５７号明細書）。そのような可溶性形態の膜貫通型レセプタータンパク質は、リガンドへの結合について天然形態と競合するために使用され得る。そのような可溶性フラグメントは、インヒビターとして作用し得ることが可能であるが、それらのフラグメントが、その膜貫通配列を保持する天然の膜貫通型レセプターと本当に競合する能力を本当に提供するか否かは、不明確である。
【００１１】
喘息および関連する呼吸疾患に関して、疫学的研究は、アレルギー性疾患の有病率が増加していること、およびその高い診断率は、単に診断様式の変化にも検出の改良にも起因するわけではないことを、明らかに示す。さらに、アレルギー性鼻炎およびアレルギー性喘息が頻繁に共存するという認識が増加していることは、これらの外見上別個の障害が、上気道または下気道のいずれかにおいて発現される同じ疾患の症状発現であるという考えをもたらした。
【００１２】
多くの喘息処置は、今日、その疾患自体の進行の基礎となる機構（ある場合には、有意な副作用と関連し、長期使用後の効力減少と関連する）を標的としない。過去２５年間にわたってなされたこの治療の進歩にも関わらず、喘息の有病率および重篤度は、かなり増加している。新規な治療標的に対する新規な薬物を開発する必要性が、存在する。新規かつ有効な喘息薬剤についての商業的可能性は、非常に重要であり、喘息薬物についての現在の市場規模は、５０億ＵＳドルを超えると推定される。
【００１３】
喘息病理の種々の局面を標的とする一定範囲の新規な治療が、現在臨床開発中であるが、かなりのデータが、ＩＬ−１３とそのレセプターとの相互作用を主要な相互作用として指摘している。この相互作用は、他のサイトカインベースの標的および非サイトカインベースの標的の上流で生じる。しかし、喘息の処置のための可能性がある治療経路として、ＩＬ−１３に対する機能不全状態の膜貫通型レセプターを生成することは、追及も示唆もされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、膜貫通型レセプタータンパク質の組換え発現のための改良された方法についての必要性が、存在する。この方法は、特に、喘息または関連するアレルギー状態の処置のためのさらなる治療選択肢を提供し得る分子の生成に関して、トランスジェニック動物の発生における生成効率の増加を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（発明の要旨）
簡単に述べると、本発明は、トランスジェニック組換え系において膜貫通型タンパク質を発現するための方法を提供する。本発明の方法は、望ましいレセプター膜貫通型タンパク質についてトランスジェニックである非ヒト哺乳動物を、核移植プロセスを介してクローニングする工程を含む。この核移植プロセスは、ドナー核の供給源として使用される、所望の分化した哺乳動物細胞を得る工程；上記ドナー核の供給源である細胞と同じ種の哺乳動物から少なくとも１つの卵母細胞を得る工程；上記少なくとも１つの卵母細胞を除核する工程；上記所望の分化した細胞または細胞核を、上記除核した卵母細胞中に移植する工程；上記細胞対（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｐｌｅｔ）を同時に融合および活性化して、トランスジェニック胚を形成させる工程；２細胞発生段階を越えるまで、上記活性化したトランスジェニック胚を培養する工程；および最後に、上記トランスジェニック胚をホスト哺乳動物（ｈｏｓｔ  ｍａｍｍａｌ）に移植して上記胚が胎仔へと発育するようにする工程；を包含する。代表的には、上記の方法は、目的の膜貫通型レセプタータンパク質をコードする所望の遺伝子が、上記分化した哺乳動物細胞または哺乳動物細胞核を上記除核した卵母細胞中へ挿入する前に、上記分化した哺乳動物細胞または哺乳動物細胞核中に挿入されるか、上記分化した哺乳動物細胞または哺乳動物細胞核から取り出されるか、または上記分化した哺乳動物細胞または哺乳動物細胞核において改変される。また、使用される卵母細胞は、好ましくは、除核の前にインビトロで成熟されるという事実にも、留意すべきである。
【００１６】
さらに、本発明は、膜貫通型レセプターのトランスジェニック生成を提供する。この膜貫通型レセプターとしては、ＩＬ−１３レセプター、線維芽細胞増殖因子レセプター１〜４、ＣＦＴＲレセプター、オレキシンレセプター、メラニン凝集ホルモンレセプター、ＣＤ−４レセプター、ならびに上記すべてのドミナントネガティブバージョンが挙げられる。本発明は、多くの種々の膜貫通型タンパク質が、トランスジェニック乳汁において生成され得ることを示す。この能力は、上記組換え哺乳動物トランスジェニック発現系に独特である。本発明はまた、レセプター機能を阻害する能力があるドミナントネガティブ膜貫通型タンパク質の発現および成熟を提供する。この発現は、膜貫通型レセプターに依存してシグナル伝達経路に干渉することによって疾患病理の新規な治療アプローチ標的化の基礎を形成するように、この発現される分子を使用することを可能にする。
【００１７】
好ましい実施形態に従って、上記ドミナントネガティブな膜貫通型レセプタータンパク質は、目的のタンパク質中の１つ以上のチロシンキナーゼ部位の機能を排除することを介して、なされる。生理的機能を排除するように変化され得る他の部位としては、目的の膜貫通型レセプタータンパク質の機能において重要な、活性セリンキナーゼ部位が挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明の方法はまた、ヤギ卵母細胞の使用を介して、トランスジェニック動物の生成を最適化することを提供する。このヤギ卵母細胞は、除核され、ドナー体細胞と融合され、同時に活性化されており、第ＩＩ中期で静止している。上記のトランスジェニッククローン動物のうちの１匹の乳汁を分析すると、所望されるヒト標的トランスジェニックタンパク質生成物の高レベル生成が示された。
【００１９】
細胞、組織、および器官は、クローニングした子孫からも単離され得ることを指摘することもまた、重要である。このプロセスは、多くの医学的治療および獣医学的治療（細胞治療および遺伝子治療を含む）にとっての「材料」供給源を提供し得る。上記細胞が、その細胞が由来した動物中へ移入して戻された場合、免疫学的拒絶が、回避される。また、多くの細胞型がこれらのクローンから単離され得るので、他の方法論（例えば、造血キメラ化）が、同じ種の動物間ならびに種間での免疫学的拒絶を回避するために使用され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（好ましい実施形態の説明）
以下の略語は、本明細書中で指定された意味を有する。
【００２１】
（略号）
体細胞核移植（ＳＣＮＴ）
培養された内細胞塊（ＣＩＣＭ）
核移植（ＮＴ）
合成卵管液（ＳＯＦ）
ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）。
【００２２】
（用語の説明）
「ヤギの（ｃａｐｒｉｎｅ）」−種々の種類のヤギの、またはそのヤギに関連する
「再構成された胚」−再構成された胚は、除核手順を介してその遺伝物質が除去された卵母細胞である。この胚は、融合事象の後にその卵母細胞中に成体体細胞の遺伝物質または胎児体細胞の遺伝物質を配置することを介して、「再構成」された。
【００２３】
「融合スライド」−固定された距離だけ離して配置されている、平行電極についてのスライドガラス。細胞対が、これらの電極の間に配置されて、融合および活性化のための電流を受容する。
【００２４】
「細胞対（ｃｅｌｌ  ｃｏｕｐｌｅｔ）」−融合および／または活性化する前の、除核された卵母細胞と体細胞核質（または胎児核質）
「サイトカラシン（ｃｙｔｏｃｈｏｌａｓｉｎ）Ｂ」−細胞質分裂を選択的かつ可逆的にブロックするが核分裂には影響しない、特定の真菌の代謝産物
「細胞質体」−真核生物細胞の細胞質物質
「ドミナントネガティブ効果」−変異体レセプターまたは変化したアミノ酸配列が、その野生型レセプター／リガンドと二量体形成し得るが、細胞内シグナル伝達は、主要ドメイン領域が存在しないことまたはその領域における変化に起因して活性化され得ない（例えば、チロシンキナーゼドメインは、上記変異体レセプターから欠失している）。従って、この変異を有する細胞は、リガンドの存在下で応答することができない
「核質」−除核によって細胞から得られる細胞核であって、細胞質および形質膜からなる狭い縁に囲まれている、細胞核
「体細胞」−生物本体にある、生殖細胞以外の任意の細胞
「単為生殖の（ｐａｒｔｈｅｎｏｇｅｎｉｃ）」−精子が侵入することなく卵母細胞から胚へと発生すること
「トランスジェニック生物」−別の生物由来の遺伝物質が実験的に移入されて、そのホストが、その染色体組成中に移入した遺伝子の遺伝形質を獲得している、生物
「体細胞核移植」−治療的クローニングとも呼ばれる。これは、除核された卵母細胞と体細胞が融合されるプロセスである。その体細胞の核は、遺伝情報を提供し、一方、その卵母細胞は、胚の発生のために必要な栄養および他のエネルギー生成物質を提供する。一旦融合が生じると、その細胞は、全能性であり、最終的には、胚盤胞へと発生し、この時点で、内細胞塊が単離される。
【００２５】
核移植における有意な進歩が、体細胞を利用してヒツジにおいて成功したという最初の報告（Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７）以降に生じた。他の多くの種が、種々の成功の程度で、体細胞からクローニングされた（Ｂａｇｕｉｓｉら、１９９９およびＣｉｂｅｌｌｉら、１９９８）。他の多数の胎仔体細胞組織型および成体体細胞組織型（Ｚｏｕら、２００１、およびＷｅｌｌｓら、１９９９）、ならびに胚（Ｙａｎｇら、１９９２；Ｂｏｎｄｉｏｌｉら、１９９０；およびＭｅｎｇら、１９９７）もまた、報告されている。再構成時に核質が存在する細胞周期もまた、種々の実験方法論において重要であることが示されている（Ｋａｓｉｎａｔｈａｎら、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２００１；Ｌａｉら、２００１；Ｙｏｎｇら、１９９８；およびＫａｓｉｎａｔｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００１）。しかし、融合および活性化のために使用される、配列、タイミング、および方法において、極めて大きな変動性が存在する。
【００２６】
先行技術は、核移植手順のために初期胚の割球を使用することに依存する。このアプローチは、利用可能な胚割球の数が少ないことによって、そして外来遺伝物質をそのような細胞中に導入することができないことによって、制限される。対照的に、分化した胚細胞、胎仔体細胞、または成体体細胞は、核移植のための核質ドナーとして機能し得るという発見は、生殖細胞系を改変するための広範な可能性を提供した。本発明に従って、核移植のために組換え体細胞系を使用すること、および「再構成された」胚の使用を介して利用可能な細胞の数を増加することによってこの手順の効率を改善することによって、従来のトランスフェクション方法により導入遺伝子をより多くのトランスジェニック動物中へ導入するのが可能になるだけでなく、トランスジェニック動物の生成効率が実質的に増加されつつ、ファウンダー動物のモザイク化という問題が克服される。
【００２７】
本発明者らは、同時に電気的に融合および活性化することによって、ヤギ種および他の動物において生きている子孫を成功裡に作製し得ることを以前に示した。ドナー核質は、トランスジェニック雄由来の精液を用いて陰性の成体雌を人工授精することによって生産した４０日齢トランスジェニック雌胎仔に由来する初代雌体細胞系から得た。生きている子孫は、２つの核移植手順を用いて作製した。一つ目のプロトコルにおいて、静止第二中期にあるヤギ卵母細胞を、除核し、ドナー体細胞と電気融合すると同時に活性化した。第二のプロトコルにおいて、活性化したインビボのヤギ卵母細胞を、第二終期において除核し、ドナー核質と電気融合すると同時活性化し、再びゲノムの再活性化を誘導した。３匹の健常な同一の雌子孫が、生まれた。遺伝子型分析によって、クローニング子孫すべてが、上記のドナー細胞系に由来することが確認された。そのトランスジェニッククローニング動物のうちの一匹の乳汁の分析によって、ヒト膜貫通型レセプタータンパク質の高レベル生成が示された。従って、本発明において使用される方法論および系を介して、トランスジェニック動物（ヤギ）が、体細胞核移植により作製され、そのトランスジェニック動物（ヤギ）は、クローン動物の乳汁において標的治療レセプタータンパク質を生成することが可能であることが示された。
【００２８】
上記の発明は、理解するための説明および例示としていくらか詳細に記載されているが、特定の変化および改変が行われ得ることが、当業者にとって明らかである。従って、本記載および実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示される。
【００２９】
（ＧＰＣＲ）
代表的には、ＧＰＣＲは、放射標識結合アッセイにおいてアゴニストの親和性とアンタゴニストの親和性とにおける薬理学的差異についての知見を介して同定された、レセプターサブタイプに分類されている。現代ゲノム学の進歩によって、特化した細胞系において発現される既知のサブタイプの組換えヒトレセプターのスクリーニングは、リード発見プログラムの標準となっている。
【００３０】
現在の技術の代表的な発見シナリオは、放射性リガンド膜置換アッセイを使用し、その後、細胞レポーター二次アッセイを含み得る。使用されるアッセイに関わらず、目的のレセプターを高レベル発現する一連の単細胞クローンが、同定されて分子スクリーニングのために利用可能にされなければならない。これは、しばしば、レポーター遺伝子の読出しを使用することによって最も容易に達成される（Ｓｔａｂｌｅｓら、１９９９）。代替的アプローチは、全細胞放射リガンド結合アッセイを介してクローンを選択することを含む。後者のアプローチは、特許の制約から自由であるが、より労働集約的である。このプロセスは、通常、目的のレセプターのｃＤＮＡを、レポーター遺伝子をそのレセプターに依存性であるシグナル伝達経路により調節されるプロモーターの制御下で共発現する安定な細胞株中にトランスフェクションすることから始まる。目的のレセプターを、そのリガンドまたはアゴニストによって活性化すると、最終的には、その活性が容易に測定されるレポーター遺伝子の転写をもたらす。この活性は、レセプターを発現する安定なクローン細胞株を同定するために使用される、なぜなら、通常は、そのレポーターシグナルの大きさは、レセプターの発現レベルと相関するからである。一旦、陽性クローンが同定されると、そのクローンは増殖され、アッセイ形態が選択される。置換アッセイは、２つの一般型（濾過ベースの放射リガンド結合、およびＳＰＡ）がある。置換による活性化合物の検出は、単純な充分に規定された系を示し、従って、詳細な親和性研究および構造活性相関（ＳＡＲ）研究を実施することを可能にする（Ｒｏｓａｔｉら、１９９８）。しかし、先行技術に従うと、潜在的治療分子として使用するために、膜貫通型レセプター自体を調製して発現させることも、そのドミナントネガティブバージョンを調製して発現させることも、可能ではなかった。
【００３１】
歴史的な低い成功率が源信で、標的化タンパク質−レセプターの相互作用は、バイオテクノロジー産業が大きく回避する領域である。タンパク質／タンパク質相互作用の例は、レセプター標的と係合する、サイトカインまたは増殖因子である。生物学的には、これらは、シグナル伝達、細胞輸送、および接着における重要な事象を制御する重要な役割を果たし、従って、自己免疫疾患、癌、喘息、アレルギーなどにおける介入点として潜在的に魅力的である。
【００３２】
（膜貫通型レセプタータンパク質の発現）
乳汁分泌乳房上皮細胞の独特な生理的特徴の１つは、その細胞が乳汁中に脂質を分泌することである。この脂質は、乳脂肪球（リン脂質の膜およびタンパク質によって囲まれた脂肪小滴）として大々的に分泌される。多数の細胞膜タンパク質が、この乳脂肪球の膜画分において見出される。本発明者らは、本発明において、トランスジェニック動物の乳汁から組換え膜貫通型タンパク質を生成するための道具としてこの分泌経路を使用する方法を提供する。１つ以上の膜貫通ドメインを有するタンパク質が乳腺において導入遺伝子から発現される場合、その乳房上皮細胞は、乳脂肪球中にそのタンパク質を「分泌」することが可能であり得、従って、その組換えタンパク質が、乳汁から取得され得る。このことは、このトランスジェニック乳汁生成を、膜貫通型タンパク質を分泌することが可能である唯一の系にし、本発明の実施者に対して、他のタンパク質発現系が生成する機会を提供できない多くの種類の膜貫通型タンパク質（例えば、チャネルタンパク質、細胞表面レセプター、薬物耐性調節因子）を潜在的に生成する機会を提供する。本発明は、膜貫通型タンパク質（例えば、ＩＬ−１３レセプター）およびそのドミナントネガティブバージョンを、トランスジェニック動物の乳汁において発現することを提供する。
【００３３】
（喘息およびアレルギーの処置のためのトランスジェニックドミナントネガティブＩＬ−１３レセプター）
現在の喘息マネージメントガイドラインは、第一線の抗炎症治療としての吸入コルチコステロイドによる初期介入の重要性を強調している。いくつかの研究により、特定の第２世代の抗ヒスタミン剤が、抗炎症活性を有することが実証された。アレルギー性鼻炎および喘息の両方における鼻腔内コルチコステロイドおよび／または吸入コルチコステロイドに対して、ロイコトリエンレセプターアンタゴニストと組み合わせてそれらの効果を調査する研究もまた、行われた。新規な抗サイトカイン治療の中でも、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−１３、抗ＴＮＦ−α、および可溶性ＩＬ−４レセプターアンタゴニストでの処置は、喘息用に現在研究されている最中である。
【００３４】
最近刊行されたマウスでの研究では、アレルギー性喘息の発症におけるＩＬ−１３の役割が強調された。喘息様症状を発症させるように刺激されたマウスは、短縮形態のＩＬ−１３で処置された場合に、このような症状の軽減または除去を示した。未処置マウスの気道に対する組換えＩＬ−１３の反復投与は、類似の症状を誘導し、これらの病理におけるＩＬ−１３の役割を確認した。
【００３５】
これらの報告および種々の他の研究により、マウスアレルギー性気道疾患の発症、拡げると、ヒト喘息の発症におけるＩＬ−１３の中心的役割が同定されている。ヒトでの近年の共同研究において、種々の細胞におけるＩＬ−１３レセプター発現が、ヒト喘息肺の生検において見出されることが実証された。そのデータは、ＩＬ−１３が、気道の疾患の重大な特徴の発生において重要な役割を果たすことを示す。このことに基づくと、ネイティブＩＬ−１３レセプターのリガンドと競合するか、またはＩＬ−１３シグナル伝達経路の成分を他の方法で妨害するために利用可能なドミナントネガティブＩＬ−１３レセプターの有効性は、喘息またはアレルギー性鼻炎の治療的処置のための新規な治療経路を表す。
【００３６】
（ＩＬ−１３  レセプター導入遺伝子の構築）
ＩＬ−１３は、動物モデルにおいてアレルギー性喘息を媒介するために必要かつ十分であることが最近見出された２型サイトカインである。ＩＬ−１３レセプターでのＩＬ−１３リガンドの中和は、気道の過敏症、ＩｇＥ生成および粘膜過敏症を含む喘息表現型を完全にブロックすることが示された（ＳＣＩＥＮＣＥ，Ｄｅｃ  １９９８）。本発明に従って、本発明者らは、ＩＬ−１３レセプターのドミナントネガティブ変異体を提供し、この変異体は、本発明のトランスジェニック発現系によって作製され得、その後、気道細胞に送達され得る。送達の際に、ＩＬ−１３の正常なシグナル伝達経路がブロックされると、レセプターの阻害がもたらされる。その治療的な結果は、喘息表現型の処置である。従って、本発明者らは、乳汁中で膜タンパク質を生成する例としてＩＬ−１３レセプターを発現すること、および治療用分子として生成するためにドミナントネガティブ膜レセプターを利用可能にする方法におけるこの膜レセプターの発現を選択する。
【００３７】
導入遺伝子を構築するために、ＩＬ−１３レセプターのｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）を、クローニングベクターｐｕｃ１９−２Ｘにサブクローニングして、２つのＸｈｏ  Ｉ部位、すなわち、開始コドンの５’側に１つ、および終止コドンの３’側にもう１つを導入した。次いで、このＩＬ−１３レセプターｃＤＮＡのＸｈｏ  Ｉフラグメントを、ＢＣ３５０にクローニングして、ＢＣ９４８を得た。このＢＣ９４８導入遺伝子は、ＩＬ−１３レセプターコード領域全体、その後ろに、Ｖ５タグおよびＣ末端にＨｉｓＣタグを含んでいた。このＢＣ９４８のＳａｌ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉフラグメントを、マイクロインジェクションのために精製した。トランスジェニック創始マウスを、ＩＬ−１３レセプター導入遺伝子特異的オリゴ対を使用するＰＣＲにより同定した。
【００３８】
乳汁中でのＩＬ−１３レセプターの発現を、ＨＲＰ結合抗Ｖ５タグ抗体を使用してウェスタンブロッティングにより決定した。分析した７匹の雌トランスジェニック創始マウスのうち、５匹は、ＩＬ−３を彼らの乳汁中に発現した。ＩＬ−１３レセプター発現のレベルは、０．１〜０．２５ｍｇ／ｍｌの範囲であった（図３）。
【００３９】
ヒトＩＬ−１３レセプターの配列は公知であり、当該分野で数名の異なる著者らによって示された。以下は、ヒトＩＬ−１３レセプターのアミノ酸配列である：
配列番号１．Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号ＮＰ＿０００６３１，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−ヒトＩＬ−１３レセプター（３８０アミノ酸残基）；（Ｗｕら，（２００３）；およびＤａｖｉｄら，（２００２））
【００４０】
【化１】
2007505604.tif 000002
。
【００４１】
（カドヘリン）
カドヘリンは、細胞表面膜貫通レセプタータンパク質のファミリーを構成し、このタンパク質は、８つのグループに系統立てられる。カドヘリンの最もよく知られたグループは、「伝統的カドヘリン」とよばれており、細胞−細胞接着複合体（接着性結合（ａｄｈｅｒｅｎｓ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ））を確立および維持するにあたって役割を果たす。伝統的なカドヘリンは、二量体のクラスターとして機能し、その接着の強度は、細胞表面に発現される二量体の数およびクラスター化の程度の両方を変動させることによって調節される。伝統的なカドヘリンは、カテニンといわれる細胞質アダプタータンパク質に結合し、カテニンは、カドヘリンをアクチン細胞骨格に連結する。カドヘリンクラスターは、シグナル伝達タンパク質およびその基質を三次元複合体に組織化する細胞骨格足場を形成することによって、細胞内シグナル伝達を調節する。伝統的なカドヘリンは、主に、細胞−細胞接着の特異性ならびに細胞形状および細胞運動の変化を制御することによって、組織形態形成に必須である。このカドヘリンスーパーファミリーは、７０より多い構造的に関連したタンパク質からなり、これらのタンパク質は全て、２つの特性を共有している：これらのタンパク質の細胞外領域がカルシウムイオン（以降、カルシウムに関しては、Ｃａ）を結合して、適切に折りたたまれることおよびこれらのタンパク質が、他のタンパク質（以降、「接着因子（ａｄｈｅｒｉｎ）」）に接着すること。このカドヘリンは、細胞−細胞接着、細胞移動、およびシグナル伝達に必要とされる。発見されたカドヘリンの第１のグループは、上皮細胞の間で形成された接着帯接合部において見出されたカドヘリンを含む。これらのカドヘリンは、ここでより関連性が遠いファミリーメンバーから区別するために、「伝統的なカドヘリン」とよばれる。全ての伝統的なカドヘリンは、１つの膜貫通ドメイン、このタンパク質のアミノ末端に５つの細胞外ドメイン、および保存された細胞質Ｃ末端テールを有する膜貫通レセプターである。
【００４２】
脊椎動物において、５つの伝統的なカドヘリンは、それらが初めて発見された部位：上皮、胎盤、神経、網膜、および血管内皮に基づいて、それぞれ、Ｅ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、Ｒ−カドヘリン、およびＶＥ−カドヘリンとよばれる。伝統的なカドヘリンは、細胞表面上で二量体のクラスターとして機能する。これらの二量体は、隣り合う細胞上の同一な二量体に結合する。このＮ−カドヘリンとＲ−カドヘリンの対はまた、互いに結合する（異好性結合（ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ））。細胞は、結合力調節によって細胞の接着の強度を制御し得る。結合力調節には、細胞表面上のレセプターの総数および原形質膜内でのレセプターの側方への拡散の両方を変動させることが必要である。クラスター化しないカドヘリンは、隣り合う細胞と強力な接着を形成しない。細胞−細胞接着におけるカドヘリンクラスター化の重要性についての直接的な証拠が存在する。この証拠を提供した実験は、カドヘリン細胞質テールが、二量体化にとって重要であるという事実に基づく（Ｙａｐら，１９９７）。
【００４３】
伝統的なカドヘリンは、細胞−細胞接着の強度を制御することによって、および特異的な細胞−細胞認識についての機構を提供することによって、発生の間に重大な役割を果たす。例えば、発生の過程でＥ−カドヘリンは、胚盤胞が形成するときに発現され、密着結合（ｔｉｇｈｔ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を形成し、続いて、上皮細胞が発生中の胚において分極するときに、細胞−細胞接着を増大させると考えられる。驚くべきことではないものの、Ｅ−カドヘリン遺伝子の遺伝子ノックアウトは、発生早期において致死的である（Ｌａｒｕｅら，１９９４）。他のカドヘリンファミリーメンバーの機能的変異またはノックアウトは、広範な種々の器官（脳、脊髄、肺および腎臓が挙げられる）の発生に影響を及ぼす。これらの発生事象の全てに共通するある重要なテーマは、陥入として公知の細胞移動というプロセスである。例えば、最初の神経組織は、外胚葉を含む細胞が胚の外側表面に沿って稜を形成するときに、脊椎動物において現れる。この稜は、裂口へと深まり、次いで、細くなって、神経管を形成する。この管を形成するために、上皮細胞は、それらの先端ドメインの成長を止め（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔ）、内側に屈曲させ、溝を形成しなければならず、その後、分離して、新たな位置に移動し、管を閉じなければならない。類似の移動が、多くの外胚葉に由来する組織の形成において起こり、全て、細胞−細胞接触の型における変形例を要する。カドヘリン遺伝子の欠失は、広範な種々の発生異常（例えば、誤って分化したニューロン（ｍｉｓｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｎ）（これはまた、上皮陥入における間違いから生じる（Ｆｅｓｅｎｋｏ，２００１））に起因する不十分な運動能力）を生じる。
【００４４】
（目的の他の分子）
オレキシンレセプター
配列番号２  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号ＮＰ＿００１５１６、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−ヒトオレキシンレセプター１，（Ｓａｋｕｒａｉ，Ｔ．ら，（１９９８））（４２５アミノ酸）。
【００４５】
【化２】
2007505604.tif 000003
配列番号３  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号ＮＰ＿００１５１７、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−ヒトオレキシンレセプター２，（ｄｅ  Ｌｅｃｅａ，Ｌ．ら，（１９９８））（４４４アミノ酸）。
【００４６】
【化３】
2007505604.tif 000004
（メラニン凝集ホルモンレセプター）
配列番号４  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号ＮＰ＿００５２８８、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−メラニン凝集ホルモンレセプター−１（Ｐｉｓｓｉｏｓ，Ｐ．ら，（２００３））（４２２アミノ酸）。
【００４７】
【化４】
2007505604.tif 000005
配列番号５  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号ＮＰ＿１１５８９２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−メラニン凝集ホルモンレセプター−２（Ｈｉｌｌ  Ｊ．ら，（２００１））（３４０アミノ酸）。
【００４８】
【化５】
2007505604.tif 000006
（線維芽細胞増殖因子レセプター−ファミリー）
配列番号６  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号Ｐ２２４５５、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−線維芽細胞増殖因子レセプター−４（Ｐａｒｔａｎｅｎ  Ｊ．ら，（１９９１））（８０２アミノ酸）。
【００４９】
【化６】
2007505604.tif 000007
配列番号７  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号Ｐ２２６０７、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−線維芽細胞増殖因子レセプター−３（Ｍｕｒｇｕｅ，Ｂ．ら，（１９９１））（８０６アミノ酸）。
【００５０】
【化７】
2007505604.tif 000008
配列番号８  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号Ｐ２１８０２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−線維芽細胞増殖因子レセプター−２（Ｄｉｏｎｎｅ  Ｃ．Ａ．ら，（１９９０））（８２１アミノ酸）。
【００５１】
【化８】
2007505604.tif 000009
配列番号９  Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ  登録番号Ｐ１１３６２、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから−線維芽細胞増殖因子レセプター−１（Ｉｓｓａｃｃｈｉ  Ａ．ら，（１９９０））（８２２アミノ酸）。
【００５２】
【化９】
2007505604.tif 000010
。
【００５３】
（材料および方法）
ドナーの発情同期化および過排卵を、卵母細胞ドナーとして使用し、そして顕微操作を、Ｇａｖｉｎ  Ｗ．Ｇ．，１９９６（本明細書に具体的に参考として援用される）に記載されるように行った。初代体細胞の単離および樹立、ならびに核質ドナーとして使用される体細胞のトランスフェクションおよび調製もまた、上記に記載されるように行った。初代体細胞は、非生殖細胞に分化され、この非生殖細胞は、標準的な脂質ベースのトランスフェクションプロトコルを使用して、目的の遺伝子でトランスフェクトされた動物組織から得られた。このトランスフェクトした細胞を試験すると、導入遺伝子陽性細胞であった。この陽性細胞を培養し、核移入のドナー細胞として使用するために、Ｂａｇｕｉｓｉら，１９９９に記載されるように調製した。除核および再構成の手順は、核酸を視覚化するために、ＤＮＡ染色色素であるＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２または他の蛍光感受性組成物での卵母細胞の染色ありまたはなしで、行われ得ることもまた、思い起こされるべきである。しかし、好ましくは、このＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２は、中期板（ｍｅｔａｐｈａｓｅ  ｐｌａｔｅ）において遺伝物質の照射のために、約０．１〜５．０μｇ／ｍｌで使用される。
【００５４】
（ヤギ）
この研究のために使用した、スクレイピーがない、純血種および交雑種（ｍｉｘｅｄ−ｂｒｅｅｄ）のＡｌｐｉｎｅ乳用ヤギ、Ｓａａｎｅｎ乳用ヤギおよびＴｏｇｇｅｎｂｕｒｇ乳用ヤギの群を、Ｇｏｏｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＡＰ）ガイドラインの下に維持した。
【００５５】
（ヤギ胎仔体細胞株の単離）
核質ドナーとして使用される初代ヤギ胎仔線維芽細胞株は、２匹の非トランスジェニック雌動物に、トランスジェニック雄動物から新しく集めた精子を人工授精することによって生産した、３５日齢および４０日齢の胎仔から得た。胎仔を、外科手術により取り出し、平衡化リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有）中に置いた。単一の細胞懸濁物を、３８℃で１０分間、０．０２５％  トリプシン、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡに曝した胎仔組織を細かく切り刻むことにより調製した。細胞を、胎仔細胞培地［１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する平衡化培地−１９９（Ｍ１９９，Ｇｉｂｃｏ）（ヌクレオシド、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（各１０，０００  Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）を補充した）］で洗浄し、２５ｃｍ２  フラスコ中で培養した。初代胎仔細胞のコンフルエントな単層を、インキュベーションして４日間後のトリプシン処理により回収し、次いで、培養により維持するかまたは低温保存した。
【００５６】
（ドナー細胞株の性別鑑別および遺伝子型決定）
ゲノムＤＮＡを胎仔組織から単離し、標的シグナル配列の存在について、および性別鑑別に有用な配列について、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により分析した。この標的トランスジェニック配列を、３６７−ｂｐ配列の増幅によって検出した。性別鑑別を、ｚｆＸ／ｚｆＹプライマー対および増幅したフラグメントのＳａｃ  Ｉ制限酵素消化を用いて行った。
【００５７】
（胚再構成のためのドナー細胞の調製）
トランスジェニック雌系統（ＣＦＦ６）を、全ての核移入手順について使用した。胎仔体細胞を、胎仔細胞培地を含む４ウェルプレート中に播種し、培養して維持した（５％ＣＯ２、３９℃）。４８時間後、その培地を新しい低血清（０．５％  ＦＢＳ）胎仔細胞培地と交換した。この培養培地を、次の７日間にわたって、４８〜７２時間毎に低血清胎仔細胞培地と交換した。低血清培地を最初に添加してから７日目に、体細胞（核質ドナーとして使用される）を、トリプシン処理により回収した。この細胞を、除核した卵母細胞に融合する１〜３時間前に、１０％  ＦＢＳを含有する平衡化Ｍ１９９（２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（各１０，０００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）を補充）中に再懸濁した。
【００５８】
（卵母細胞収集）
卵母細胞ドナーを、以前に記載されるように同期化し、過排卵させ（Ｇａｖｉｎ  Ｗ．Ｇ．，１９９６）、４８時間間隔で精管切除した雄と交配させた。卵母細胞を収集した後、この卵母細胞を、１０％  ＦＢＳを含有する平衡化Ｍ１９９（２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１％  ペニシリン／ストレプトマイシン（各１０，０００  Ｉ．Ｕ．／ｍｌ）を補充）中で培養した。
【００５９】
（細胞質体調製および除核）
丘細胞（ｃｕｍｕｌｕｓ  ｃｅｌｌ）が付着した卵母細胞を、廃棄した。丘がない卵母細胞を、２つの群に分けた：停止した中期−ＩＩプロトコル（１つの極体）および終期−ＩＩプロトコル（明らかに見える極体がなく、部分的に突出している第２極体の存在もない）。この停止した中期−ＩＩプロトコルにおける卵母細胞を、最初に除核した。活性化終期−ＩＩプロトコルに割り当てた卵母細胞を、Ｍ１９９／１０％  ＦＢＳ中で２〜４時間培養することによって調製した。この期間の後、全ての活性化卵母細胞（部分的に突出した第２極体が存在する）を、培養誘導したカルシウム活性化終期−ＩＩ卵母細胞（終期−ＩＩ−Ｃａ）および除核として群分けした。培養期間の間に活性化されなかった卵母細胞を、その後、７％  エタノールを含有するＭ１９９、１０％  ＦＢＳ中で５分間インキュベートして、活性化を誘導し、次いで、１０％  ＦＢＳを含有するＭ１９９中でさらに３時間培養して、終期−ＩＩに到達させた（終期−ＩＩ−ＥｔＯＨプロトコル）。
【００６０】
全ての卵母細胞を、除核の前に、サイトカラシン−Ｂ（Ｓｉｇｍａ、１０％  ＦＢＳを含有するＭ１９９中で５μｇ／ｍｌ）で１５〜３０分間処理した。中期−ＩＩ段階卵母細胞を、２５〜３０μｍのガラスピペットで、第１極体およびその極体を取り囲む、隣接する細胞質体（細胞質体の約３０％）を吸引して、中期板を除去することによって、除核した。第１極体および部分的に突出している第２極体を含む取り囲んでいる細胞質体（細胞質の１０〜３０％）を取り出すことによって、終期−ＩＩ−Ｃａ卵母細胞および終期−ＩＩ−ＥｔＯＨ卵母細胞を除核した。除核後、全ての卵母細胞を、直ぐに再構成した。
【００６１】
（核移入および再構成）
ドナー細胞注射を、卵母細胞除核のために使用したのと同じ培地中で行った。あるドナー細胞を、ガラスピペットを用いて透明体と卵質膜との間に配置した。この細胞−卵母細胞対を、電気融合手順および活性化手順の前に、Ｍ１９９中で３０〜６０分間インキュベートした。再構成した卵母細胞を、融合緩衝液（３００ｍＭ  マンニトール、０．０５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．１ｍＭ  ＭｇＳO４、１ｍＭ  Ｋ２ＨＰO４、０．１ｍＭ  グルタチオン、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）中で２分間平衡化した。電気融合および活性化を、融合培地で満たし、「融合スライド」（５００μｍ間隙；ＢＴＸ−Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に合わせた２つのステンレス鋼電極を備える融合チャンバ中で、室温で行った。
【００６２】
融合を、融合スライドを用いて行った。この融合スライドを、融合ディッシュ内部に置き、このディッシュに十分量の融合緩衝液を注ぎ入れて、融合スライドの電極を覆った。その対を、培養インキュベーターから取り出し、融合緩衝液で洗浄した。立体顕微鏡を用いて、その対を電極の間に等距離に置き、核質／細胞質接合点を、その電極に対して平行にした。活性化および融合を促進するためにその対に印加された電圧範囲は、１．０ｋＶ／ｃｍ〜１０．０ｋＶ／ｃｍであり得ることに注意すべきである。しかし、好ましくは、その初期の単一の同時に起こる、融合および活性化電気パルスは、２．０〜３．０ｋＶ／ｃｍの電圧範囲を有し、最も好ましくは、２．５ｋＶ／ｃｍの電圧範囲を有し、好ましくは、少なくとも２０μ秒の持続時間である。これは、ＢＴＸ  ＥＣＭ  ２００１  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒを用いてその細胞対に印加される。マイクロパルスの持続時間は、１０〜８０μ秒まで変動し得る。このプロセスの後に、その処理された対を、代表的には、新たな融合緩衝液の液滴に移す。融合処理対は、平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳで洗浄し、サイトカラシン−Ｂありまたはなしの平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳに移した。サイトカラシン−Ｂが使用される場合、その濃度は、１〜１５μｇ／ｍｌまで変動し得、最も好ましくは、５μｇ／ｍｌである。その対を、空気中に約５％  ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバ中、３７〜３９℃でインキュベートした。本開示において提供されるいずれのプロトコル全体を通して、マンニトールが、サイトカラシン−Ｂの代わりに使用され得る（Ｃａ＋２およびＢＳＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝化マンニトール（０．３ｍｍ）ベースの培地）ことに注意すべきである。
【００６３】
融合してから１０〜９０分間の後に、最も好ましくは、融合して後３０分間で開始して、実際の核質／細胞質体融合物が存在することを決定する。本発明の目的に関して、融合された対は、さらなる活性化処理（二重パルス）を受け得る。このさらなるパルスは、１０〜８０μ秒の時間範囲にわたって、０．１〜５．０ｋＶ／ｃｍの電圧強度で変動し得る。しかし、好ましくは、この融合された対は、２０μ秒間にわたって０．４ｋＶ／ｃｍまたは２．０ｋＶ／ｃｍのさらなる単一の電気パルス（二重パルス）を受ける。さらなるパルスの送達は、最初のパルスから少なくとも１５分後に開始され得るが、最も好ましくは、このさらなるパルスを、最初の融合および活性化の処理から３０分間後〜２時間後に開始して、さらなる活性化を促進する。他の実験において、融合されていない対を、単一の電気パルスで再度融合した。このさらなるパルスについての電圧および時間の範囲は、少なくとも１０μ秒の間に１．０ｋＶ／ｃｍ〜５．０ｋＶ／ｃｍまで変動し得、これは、最初の融合パルスから少なくとも１５分間後に生じる。しかし、より好ましくは、このさらなる電気パルスは、最初の融合および活性化処理から３０分間後〜１時間後に開始して、２０μ秒の間に、２．２〜３．２ｋＶ／ｃｍまで変動させて、融合を促進した。全ての融合した対および融合処理した対を、ＳＯＦ／ＦＢＳ＋５μｇ／ｍｌ  サイトカラシン−Ｂに戻した。この対を、空気中に約５％  ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバ中で、少なくとも２０分間、好ましくは、３０分間、３７〜３９℃でインキュベートした。
【００６４】
本発明のこの方法のさらなる変形例は、細胞対に、最初の融合および活性化処理から少なくとも１５分間後、好ましくは、３０分間後〜１時間後に開始して、好ましくは、２．０ｋＶ／ｃｍのさらなる単一の電気パルス（二重パルス）を、少なくとも２０μ秒にわたって提供して、さらなる活性化を促進する。このさらなる活性化パルスの電圧範囲は、１．０〜６．０ｋＶ／ｃｍまでで変動し得る。
【００６５】
あるいは、その後の努力において、残りの融合された対は、最初の融合および活性化処理から少なくとも３０分間後に始まって、最も好ましくは、２．０ｋＶ／ｃｍで、１５〜３０分間間隔で２０μ秒にわたって、少なくとも３回のさらなる単一の電気パルス（四重パルス）を受けて、さらなる活性化を促進した。しかし、このさらなるプロトコルにおいて、このさらなる活性化パルスについての電圧範囲は、１．０〜６．０ｋＶ／ｃｍまでで変動し得、持続時間は、１０μ秒〜６０μ秒までの範囲で変動し得、開始は、最初の融合処理から１５分後程度の時間の短さであってもよいし、４時間程度の時間の長さであってもよいことに注意すべきである。その後の実験において、融合されていない対を、最初の融合および活性化処理して１時間後に開始して、２．６〜３．２ｋＶ／ｃｍの単一の電気パルスで２０μ秒間にわたって再度融合して、融合を促進した。全ての融合した対および融合処理した対を、サイトカラシン−Ｂありまたはなしの平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳに戻した。サイトカラシン−Ｂが使用される場合、その濃度は、１〜１５μｇ／ｍｌまで変動し得、最も好ましくは、５μｇ／ｍｌである。その対を、空気中に約５％  ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバ中、少なくとも３０分間、３７〜３９℃でインキュベートした。マンニトールが、サイトカラシン−Ｂに代わって使用され得る。
【００６６】
再融合して３０分後に開始して、核質／細胞質体再融合の結果を決定した。融合処理された対を、平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳで洗浄し、次いで、平衡化ＳＯＦ／ＦＢＳ＋５μｇ／ｍｌ  シクロヘキシミドに移した。この対を、空気中に約５％  ＣＯ２を含む加湿ガスチャンバ中、４時間まで３７〜３９℃でインキュベートした。
【００６７】
シクロヘキシミド処理の後に、対を、平衡化ＳＯＦ培地（少なくとも０．１％、好ましくは、少なくとも０．７％、好ましくは、０．８％のウシ血清アルブミンと、１００Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補充（ＳＯＦ／ＢＳＡ））で徹底的に洗浄した。対を、平衡化ＳＯＦ／ＢＳＡに移し、２４〜４８時間にわたって、約６％Ｏ２、５％ＣＯ２、平衡窒素を含む加湿モジュラーインキュベーションチャンバ中で、３７〜３９℃で静置して培養した。適切な発生齢を有する核移入胚（２４〜４８時間で１細胞〜８細胞）を、代理同期化レシピエントに移入した。
【００６８】
（核移入胚培養およびレシピエントへの移入）
全ての核移入胚を、１０％  ＦＢＳを含有するＭ１９９の５０μｌの液滴に鉱油を重層した中にある初代ヤギ卵管上皮細胞の単層上で同時に培養した。胚の培養を、レシピエントに胚を移入する前に、４８時間にわたって５％ＣＯ２を含む加湿した３９℃のインキュベーター中で維持した。レシピエント胚移入を、以前に記載のように行った２２。
【００６９】
（妊娠および周産期の配慮）
ヤギに関しては、妊娠を、発情期（ｓｔａｎｄｉｎｇ  ｅｓｔｒｕｓ）の初日から２５日目に開始する超音波検査によって決定した。妊娠の７５日目までに１週間に１度、雌を評価し、その後１ヶ月に１回胎仔の生存を評価した。１５２日を超えて継続した妊娠については、分娩を、５ｍｇのＰＧＦ２α（Ｌｕｔａｌｙｓｅ，Ｕｐｊｏｈｎ）で誘導した。分娩は、処置後２４時間以内に起こった。仔ヤギを、誕生後直ぐに母親から離し、誕生して１時間後以内に、熱処理した初乳を与えた。
【００７０】
（クローニングした動物の遺伝子型決定）
誕生の直後、血液サンプルおよび耳の皮膚生検を、ゲノムＤＮＡ単離のために、クローニングした雌動物（例えば、ヤギ）および代理母から得た。各サンプルを、特定のトランスジェニック標的タンパク質に対するプライマーを使用するＰＣＲによって最初に分析し、次いで、その特定の標的タンパク質に対するｃＤＮＡを用いるサザンブロット分析に供した。各サンプルに関して、当該分野で公知の標準的手順に従って、５μｇのゲノムＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化し、０．７％  アガロースゲル（ＳｅａＫｅｍ（登録商標），ＭＥ）中で電気泳動し、毛細管現象で移すことによって、ナイロン膜（ＭａｇｎａＧｒａｐｈ，ＭＳＩ，Ｗｅｓｔｂｏｒｏ，ＭＡ）上に固定した。膜を、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ（登録商標）キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、α−３２Ｐ  ｄＣＴＰで標識した１．５ｋｂのＸｈｏ  ＩからＳａｌ  ＩのｈＡＴ  ｃＤＮＡフラグメントでプローブした。ハイブリダイゼーションを、６５℃で一晩行った。このブロットを、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳで洗浄し、Ｘ−ＯＭＡＴＴＭ  ＡＲフィルムに４８時間露出した。
【００７１】
（乳汁のタンパク質分析）
若年の雌性トランスジェニック動物に対する乳汁分泌のホルモン誘導を、２月齢で行った。それらの動物を、１日１回手絞りで搾乳して、ｈＡＴ発現分析用の乳汁サンプルを収集した。ウエスタンブロット分析およびｒｈＡＴ活性分析を、記載されるように（Ｅｄｍｕｎｄｓ，Ｔ．ら、１９９８）行った。
【００７２】
本発明の開発の間に行った実験では、除核および再構成の後、核質／細胞質体の対を、１％〜１５％のウシ胎仔血清（好ましくは、１０％  ＦＢＳ）＋１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した（ＳＯＦ／ＦＢＳ）、平衡化合成卵管液培地中でインキュベートした。その対を、空気中に約５％のＣＯ２を含む加湿ガスチャンバ中で、３７〜３９℃にて少なくとも３０分間インキュベートした後、融合させた。
【００７３】
本発明は、活性化し、そして融合されたトランスジェニック胚のさらなる世代を提供することによってトランスジェニック手順の有効性の増加を可能にする。これらの胚は、代理動物に移植され得るか、またはクローン増殖され保存されるかもしくは利用され得る。また、核移植と、インビボでこれらの細胞を改変および選択するための能力とを組み合わせることによって、この手順は、以前のトランスジェニック胚技術よりも効率的になる。本発明により、これらのトランスジェニッククローン胚が、ＣＩＣＭ細胞株または他の真核細胞株を産生するために使用され得る。従って、本発明は、インビトロで未分化細胞株を誘導および維持する必要性を排除し、これは、遺伝子操作技術の助けとなる。
【００７４】
従って、１つの局面において、本発明は、哺乳動物をクローニングするための方法を提供する。概して、哺乳動物は、以下の工程を包含する核移植プロセスによって産生され得る：
（ｉ）ドナー核の供給源として使用される、所望の分化した哺乳動物細胞を得る工程；
（ｉｉ）ドナー核の供給源である細胞と、同じ種の哺乳動物から卵母細胞を得る工程；
（ｉｉｉ）卵母細胞を除核する工程；
（ｉｖ）所望の分化した細胞または細胞核を、除核した卵母細胞中に移植する工程；
（ｖ）細胞対を同時に融合および活性化して、トランスジェニック胚を形成させる工程；
（ｖｉ）２細胞発生段階を越えるまで、トランスジェニック胚を培養する工程；および
（ｖｉｉ）胚が胎仔へと発育するように、トランスジェニック胚をホスト哺乳動物に移植する工程；
ここで、上記トランスジェニック胚は、目的の膜貫通型レセプタータンパク質のＤＮＡ配列を含む。
【００７５】
本発明はまた、遺伝子操作された哺乳動物またはトランスジェニック哺乳動物をクローニングする方法を包含し、この方法によって、分化された哺乳動物細胞または細胞核において、所望の遺伝子が挿入されるか、除去されるかまたは改変され、その後、その分化された哺乳動物細胞または細胞核が除核された卵母細胞に挿入される。
【００７６】
また、本発明によって、上記の方法により得られる哺乳動物およびそれらの子孫が提供される。本発明は、好ましくは、ヤギをクローニングするために使用される。本発明はさらに、細胞移植、組織移植および器官移植の分野において、核移植胎仔ならびに核移植子孫およびキメラ子孫の使用を提供する。
【００７７】
別の局面において、本発明は、ＣＩＣＭ細胞を産生するための方法を提供する。この方法は、以下：
（ｉ）ドナー核の供給源として使用される、所望の分化した哺乳動物細胞を得る工程；
（ｉｉ）ドナー核の供給源である細胞と同じ種の哺乳動物から、卵母細胞を得る工程；
（ｉｉｉ）卵母細胞を徐核する工程；
（ｉｖ）除核した卵母細胞に、所望の分化した細胞または細胞核を移植する工程；
（ｖ）細胞対を同時に融合および活性化させて、トランスジェニック胚を形成する工程；
（ｖｉｉ）２細胞発生段階を越えるまで、トランスジェニック胚を培養する工程；
（ｖｉｉｉ）培養された活性化した胚から得た細胞を培養して、ＣＩＣＭ細胞を得る工程
を包含し、
上記トランスジェニック胚は、目的の膜貫通レセプタータンパク質のＤＮＡ配列を含む。
【００７８】
また、本明細書中に記載される方法に由来するＣＩＣＭ細胞は、細胞移植、組織移植および器官移植の分野、あるいは胎仔または子孫（トランスジェニック胎仔またはトランスジェニック子孫を含む）の産生において有利に使用される。分化した哺乳動物細胞は、初期胚形成期を過ぎた細胞である。分化した細胞は、外胚葉、中胚葉または内胚葉組織あるいは細胞層に由来し得る。
【００７９】
代替的な方法もまた使用され得、ある方法では、融合および活性化を促進するために、細胞対が複数回の電気ショックに曝露され得る。一般的に、哺乳動物は、核移植プロセスによって産生され、この核移植プロセスは、以下の工程：
（ｉ）ドナー核の供給源として使用される、所望の分化した哺乳動物細胞を得る工程；
（ｉｉ）そのドナー核の供給源である細胞と同じ種の哺乳動物から、少なくとも１つの卵母細胞を得る工程；
（ｉｉｉ）卵母細胞を徐核する工程；
（ｉｖ）除核した卵母細胞に、所望の分化した細胞または細胞核を移植する工程；
細胞対に対して少なくとも２回の電気ショックを使用して、活性化し、かつ融合した胚への、細胞対の融合および活性化を開始させる工程；
（ｖｉｉ）２細胞発生段階を越えるまで、活性化し、かつ融合した胚を培養する工程；および
（ｖｉｉｉ）胚が胎仔へと発育するように、第１のトランスジェニック胚および／または第２のトランスジェニック胚をホスト哺乳動物に移植する工程
を包含し、
上記少なくとも２回の電気ショックのうちの２回目は、最初の電気ショックの少なくとも１５分後に行われる。
【００８０】
哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）は、周知の方法によって得られ得る。本発明で有用な哺乳動物細胞としては、例えば、上皮細胞、神経細胞、表皮細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Ｂリンパ球およびＴリンパ球）、赤血球、マクロファージ、単球、単核細胞、線維芽細胞、心筋細胞および他の筋細胞などが挙げられる。さらに、核移植に使用される哺乳動物細胞は、異なる器官（例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器など）から得られ得る。これらは、適切なドナー細胞の単なる例である。適切なドナー細胞（すなわち、本発明で有用な細胞）は、身体の任意の細胞または器官から得られ得る。これは、すべての体細胞または生殖細胞を含む。
【００８１】
線維芽細胞は、理想的な細胞型である。なぜなら、線維芽細胞は、発育中の胎仔および成体動物から大量に得られ得るからである。線維芽細胞は、いくらか分化しており、それゆえ以前は、クローニング手順で使用するには不十分な細胞型であると考えられていた。重要なことには、これらの細胞は、インビトロで迅速な倍加時間で容易に増殖され得、遺伝子標的化手順で使用するためにクローン増殖され得る。この場合もまた、分化した細胞型が使用されるので、本発明は新規なものである。本発明は、細胞が容易に増殖され得、遺伝子改変され得、そしてインビトロで選択され得るので、有利である。
【００８２】
卵母細胞に適切な哺乳動物供給源としては、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、モルモット、マウス、ハムスター、ラット、霊長類などが挙げられる。好ましくは、卵母細胞は、ヤギおよび有蹄動物から得られ、最も好ましくは飼育ヤギ（ｇｏａｔ）である。卵母細胞の単離方法は、当該分野で公知である。本質的に、その方法は、卵母細胞を哺乳動物（例えば、飼育ヤギ）の卵巣または生殖管から単離する工程を包含する。容易に利用可能な飼育ヤギ卵母細胞の供給源は、ホルモン誘導した雌性動物に由来する。
【００８３】
遺伝子操作、核移植およびクローニングのような技術の使用に成功するために、卵母細胞は、好ましくは、インビボで成熟され得、その後これらの細胞がレシピエント細胞として使用され得、そしてその後、それらが精子細胞によって受精されて核移植のための胚へと発育し得る。インビボで成熟された中期ＩＩ段階の卵母細胞は、核移植技術において首尾よく使用される。本質的に、成熟した中期ＩＩ卵母細胞は、過排卵でない動物または過排卵の動物のいずれかから、発情の開始数時間後またはヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）もしくは同様のホルモンの注射の数時間後に、外科的に収集される。
【００８４】
さらに、トランスジェニック技術を通して動物のゲノムを改変する能力は、組換えタンパク質の製造の新しい代替法を提供することに留意すべきである。トランスジェニック飼育動物の乳汁中でのヒト組換え医薬品の産生は、微生物バイオリアクターに関連する多くの問題（例えば、翻訳後修飾の欠失、不適切なタンパク質のフォールディング、高い精製コスト）または動物細胞バイオリアクターに関連する多くの問題（例えば、高い資本コスト、高価な培養培地、低収率）を解決する。
【００８５】
除核および核移植における卵母細胞の成熟の段階は、核移植法の成功のために重要であることが報告されている（ＦｉｒｓｔおよびＰｒａｔｈｅｒ  １９９１）。一般に、成功する哺乳動物の胚クローニングの実行では、レシピエント卵母細胞として中期ＩＩ段階の卵母細胞を使用する。なぜなら、この段階では、卵母細胞が、それが受精する精子のように、誘導された核を処理するために十分に「活性化」され得るかまたは「活性化」されると考えられているからである。家畜（特に、飼育ヤギ）では、卵母細胞の活性化期間は、一般的に、精子の接触時に生じ、卵母細胞の原形質膜へと浸透する。
【００８６】
約１０〜４０時間、好ましくは約１６〜１８時間の範囲の一定成熟期間の後、卵母細胞は、除核される。除核前に、卵母細胞は、好ましくは、取り出され、１ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼを含むＥＭＣＡＲＥ培地中に置かれた後、卵丘細胞が除去される。これは、非常に細い口径のピペッターを通して繰り返しピペッティングするか、または短時間ボルテックスすることによって行われ得る。次いで、裸の卵母細胞は、極体についてスクリーニングされ、次いで、極体の存在によって決定された、選択された中期ＩＩ卵母細胞が、核移植のために使用される。次に除核を行う。
【００８７】
除核は、米国特許第４，９９４，３８４号（本明細書中に参考として援用される）に記載されるような公知の方法によって行われ得る。例えば、中期ＩＩ卵母細胞は、迅速な除核のためにＥＭＣＡＲＥ培地（好ましくは、７．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含む）中に置かれるか、または適切な培地（例えば、１０％ＦＢＳを加えた胚培養培地（例えば、ＣＲ１ａａ））中に置かれ、次いで、その後（好ましくは、２４時間以内、より好ましくは、１６〜１８時間以内に）除核される。
【００８８】
除核は、極体および隣接する細胞質を除去するようにマイクロピペットを使用して、顕微手術で達成され得る。次いで、卵母細胞がスクリーニングされて、首尾よく除核された卵母細胞が同定される。このスクリーニングは、卵母細胞をＥＭＣＡＲＥまたはＳＯＦ中の１μｇ／ｍｌの３３３４２  Ｈｏｅｃｈｓｔ色素で染色すること、次いで、その卵母細胞を１０秒未満の間紫外線照射下で観察することによって行われ得る。次いで、首尾よく除核された卵母細胞が、適切な培養培地中に置かれ得る。
【００８９】
本発明において、レシピエント卵母細胞は、好ましくは、インビトロもしくはインビボでの成熟の開始から約１０時間後〜約４０時間後、より好ましくは、インビトロもしくはインビボでの成熟の開始から約１６時間後〜約２４時間後、最も好ましくは、インビトロもしくはインビボでの成熟の開始から約１６時間後〜１８時間後の範囲の時間で除核される。
【００９０】
次いで、除核卵母細胞と同じ種の単一の哺乳動物細胞が、活性化された胚を産生するために使用される除核卵母細胞の卵黄周囲腔に移される。哺乳動物細胞および除核卵母細胞は、当該分野で公知の方法に従って、活性化された胚を産生するために使用される。例えば、細胞は、電気融合によって融合され得る。電気融合は、原形質膜の一過性崩壊を生じるのに十分な電気パルスを提供することによって達成される。原形質膜は、迅速に再編成されるので、この膜の崩壊は、非常に短い。従って、２つの隣接する膜が崩壊するように誘導され、再編成の際に脂質二重層が混ざり合う場合、２つの細胞間で小さいチャネルが開く。そのような小さな開口部の熱力学的不安定性に起因して、その開口部は、２つの細胞が１つになるまで拡大する。Ｐｒａｔｈｅｒらによる米国特許第４，９９７，３８４号（本明細書中にその全体が参考として援用される）に対して、このプロセスに関するさらなる議論のために参照がなされる。種々の電気融合培地が使用され得、例えば、スクロース緩衝溶液、マンニトール緩衝溶液、ソルビトール緩衝溶液およびリン酸緩衝溶液が挙げられる。融合はまた、融合誘導因子としてＳｅｎｄａｉウイルスを用いても達成され得る（Ｐｏｎｉｍａｓｋｉｎら、２０００）。
【００９１】
また、いくつかの場合（例えば、小さなドナー核を用いる場合）では、エレクトロポレーション融合を用いてではなく、核を卵母細胞に直接注入することが好ましくあり得る。このような技術は、ＣｏｌｌａｓおよびＢａｒｎｅｓ、ＭＯＬ．ＲＥＰＲＯＤ．ＤＥＶ．、３８：２６４−２６７（１９９４）に開示されており、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【００９２】
活性化された胚は、公知の方法によって活性化され得る。このような方法は、例えば、活性化された胚を生理温度以下で（本質的には、活性化された胚に低温もしくは実質的に低温のショックを適用することによって）培養する工程を包含する。これは、活性化された胚を室温（胚が通常曝露される生理温度条件と比較して低い温度）で培養することによって最も都合よく行われ得る。
【００９３】
あるいは、活性化は、公知の活性化因子の適用によって達成され得る。例えば、受精中の精子による卵母細胞への侵入は、灌流卵母細胞を活性化して、核移植後に多数の生存可能な妊娠および複数の遺伝的に同一の仔ウシを得ることが示されている。また、電気的ショックおよび化学的ショックのような処置は、融合後にＮＴ胚を活性化するために使用され得る。適切な卵母細胞活性化法は、Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈらに対する米国特許第５，４９６，７２０号（本明細書中にその全体が参考として援用される）の主題である。
【００９４】
さらに、経時的な活性化のためのプロトコルが存在するが、活性化は同時にされることにより最も良好に行われ得る。活性化の点では、以下の細胞事象が起こる：
（ｉ）卵母細胞における二価カチオンレベルの上昇、および
（ｉｉ）卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化の減少。
【００９５】
上記の事象は、二価カチオン（例えば、マグネシウム、ストロンチウム、バリウムまたはカルシウム）を（例えば、イオノフォアの形態で）卵母細胞の細胞質に導入することによって、外因的に刺激されて起こり得る。二価カチオンレベルを上昇させる他の方法としては、電気ショックの使用、エタノールによる処理およびケージ型のキレート剤による処理が挙げられる。リン酸化は、公知の方法によって（例えば、キナーゼインヒビター（例えば、６−ジメチル−アミノプリン、スタウロスポリン、２−アミノプリンおよびスフィンゴシンのようなセリン−スレオニンキナーゼインヒビター）の添加によって）減少され得る。あるいは、細胞タンパク質のリン酸化は、卵母細胞にホスファターゼ（例えば、ホスファターゼ２Ａおよびホスファターゼ２Ｂ）を導入することによって阻害され得る。
【００９６】
（治療用組成物）
本発明のタンパク質は、公知の方法に従って、薬学的に有用な組成物を調製するために配合され、それによって、本発明の分子またはその機能的な誘導体が、薬学的に受容可能なキャリアビヒクルと共に混合物中に混ぜ合わせられる。適切なビヒクルおよびそれらの配合物（他のヒトタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）を含む）は、例えば、有効な投与に適切な薬学的に受容可能な組成物を形成するために記載され、そのような組成物は、有効量の１以上の本発明のタンパク質を、適切な量のキャリアビヒクルと一緒に含む。
【００９７】
本発明による使用のための薬学的組成物は、１以上の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を用いて、従来の様式で処方され得る。従って、組換え膜貫通レセプタータンパク質ならびにそれらの生理学的に受容可能な塩および溶媒和物が、吸入またはガス注入による投与（口もしくは鼻のいずれかを通して）あるいは経口投与、口腔投与、非経口投与または直腸投与のために処方され得る。
【００９８】
経口投与のために、薬学的組成物は、例えば、錠剤またはカプセルの形態を取り得、その錠剤またはカプセルは、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶性セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、滑石またはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸デンプンナトリウム）；あるいは湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような薬学的に受容可能な賦形剤と共に従来の手段により調製される。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。経口投与のための液状調製物は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態を取り得るか、あるいは液状調製物は、使用前に水または他の適切なビヒクルと構成されるための乾燥製品として与えられ得る。このような液状調製物は、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えば、レシチンおよびアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコールまたは分画した植物油）；ならびに防腐剤（例えば、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）のような薬学的に受容可能な添加剤と共に、従来の手段によって調製され得る。調製物はまた、必要に応じて、緩衝塩、香料、着色料および甘味料を含み得る。
【００９９】
経口投与のための調製物は、活性化合物の放出制御を与えるように適切に配合され得る。口腔投与のために、組成物は、従来の様式で処方される錠剤またはロゼンジの形態を取り得る。
【０１００】
吸入による投与のために、本発明による使用のための、本発明の組換え膜貫通レセプタータンパク質は、適切な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切な気体）の使用を伴う、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧プレゼンテーション（ａｅｒｏｓｏｌ  ｓｐｒａｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の形態で簡便に送達される。加圧エアロゾルの場合では、投薬単位は、定量を送達するように弁を提供することによって決定され得る。吸入器または噴霧器で使用するための（例えば、ゼラチンの）カプセルまたはカートリッジが、化合物と適切な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプン）との粉末混合物を含んで配合され得る。
【０１０１】
本発明の組換え膜貫通レセプタータンパク質は、注射（例えば、ボーラス注射または連続注入）による非経口投与のために配合され得る。注射用の処方物は、防腐剤が添加された単位投薬形態（例えば、アンプルまたは複数用量容器）で提供され得る。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液のような形態を取り得、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤のような処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）と構成されるために散剤形態であり得る。
【０１０２】
化合物はまた、例えば、従来の坐剤基剤（例えば、ココアバターまたは他のグリセリド）を含む直腸組成物（例えば、坐剤または保持浣腸）中に配合され得る。
【０１０３】
上記の処方物に加えて、本発明の組換え膜貫通レセプタータンパク質はまた、持続性調製物として配合され得る。そのように長時間作用する処方物は、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与され得る。従って、例えば、化合物は、適切なポリマー物質または疎水性物質（例えば、受容可能なオイル中の乳濁液として）か、またはイオン交換樹脂と共に配合されても、やや可溶性の誘導体（例えば、やや可溶性の塩）として配合されてもよい。
【０１０４】
組成物は、所望の場合、パックまたはディスペンサー装置内で提供され、そのパックまたはディスペンサー装置は、活性成分を含む１以上の単位投薬形態を含み得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔（例えば、ブリスター包装）を含み得る。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための指示書が添付され得る。
【０１０５】
本発明のいくつかの組換え膜貫通レセプタータンパク質は、癌治療において治療的に有効であり得る（ＦＧＦＲ１〜４）。従って、それらは、目的の化合物の送達を標的するのに有用な従来の化学療法剤または他の因子と併用して配合され得る。従来の化学療法剤としては、アルキル化剤、代謝拮抗剤、種々の天然製品（例えば、ビンカアルカロイド、エピポドフィロトキシン、抗生物質およびアミノ酸枯渇酵素）、ホルモンおよびホルモンアンタゴニストが挙げられる。特定のクラスの因子としては、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素、トリアジン（ｔｒｉａｚｅｎｅ）、葉酸アナログ、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、白金錯体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲンおよびアンドロゲンが挙げられる。いくつかの例示的な化合物としては、シクロフォスファミド、クロラムブシル、メトトレキセート、フルオロウラシル、シタラビン、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、プレドニソン、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲステロール、ジエチルスチルベストロール、エチニルエストラジオール、タモキシフェン、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンが挙げられる。乳癌の処置においては、例えば、タモキシフェンが好ましい。
【０１０６】
従って、本明細書中で膜貫通レセプタータンパク質のトランスジェニック生成を提供する本発明の実施形態が、本発明の原理の適用の単なる例示であることが理解されるべきである。先の説明から、特許請求されたトランスジェニック生物製剤の治療的用途のための形態の変更、使用方法および開示された方法の要素の適用が新規なものであり、そして本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく改変および／または用いられ得ることが明らかである。
【０１０７】
（引用され、参考として援用される文献）
【０１０８】
【化１０】
2007505604.tif 000011
【０１０９】
【化１１】
2007505604.tif 000012
【０１１０】
【化１２】
2007505604.tif 000013
（特許出願）
Ｓｔ．Ｃｒｏｉｘら、米国特許出願公開第２００３／００１７１５７号、「ＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬ  ＣＥＬＬ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＡＴＴＥＲＮＳ」（２００３年１月２３日出願）
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】図１は、核移植を介してクローニング動物を作製するプロセスの概略図を示す。
【図２】図２は、ＩＬ−１３レセプター導入遺伝子の構築を示す。
【図３】図３は、トランスジェニックマウスの乳汁におけるＩＬ−１３レセプターの発現を示す。レーン１〜８は、それぞれ、８匹のファウンダーマウスであるＢＣ８９４−４、ＢＣ８９４−７９、ＢＣ８９４−８１、ＢＣ８９４−９６、ＢＣ８９４−１０４、ＢＣ８９４−１１４Ａ、ＢＣ８９４−１１４Ｂ、およびＢＣ８９４−１１６に由来する全乳である。レーン９および１０はそれぞれ、マウス１およびマウス２の脂質画分である。Ｍは、分子量マーカーである。Ｎは、ネガティブコントロールの乳汁である。
【図１】
2007505604.tif 000014
【図２】
2007505604.tif 000015
【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年4月3日(2006.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007505604000001.app
【国際調査報告】
2007505604.tif 000040
2007505604.tif 000041
2007505604.tif 000042
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