(57)【要約】  本発明は、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞内で標的遺伝子、特に脳由来神経栄養因子（BDNF）又は関連遺伝子の発現に影響を与える方法に関する。本方法は、siRNA組成物を製剤化し前記哺乳動物の標的部位にデリバーし、前記神経細胞内で標的遺伝子の発現に影響を与えて前記標的遺伝子をダウンレギュレートする工程を含み、ここで前記標的部位は脳脊髄腔又は神経細胞によって支配される筋肉組織である。さらにまた開示されるものは、siRNAの標的細胞へのin vivoデリバリー及び遺伝子調節に関する新規な本方法の実施に使用されるキットである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞内で標的遺伝子の翻訳活性を調節する方法：
a）前記標的遺伝子の一部分と相補的な鎖を有するように構築された小さな干渉RNA（siRNA）を提供する工程；及び
b）前記siRNA組成物を哺乳動物の標的部位にデリバーし、前記神経細胞内で標的遺伝子のダウンレギュレーションを惹起する工程、ここで前記標的部位は神経細胞によって支配される筋肉組織又は脳脊髄腔である。
【請求項２】
前記標的遺伝子が脳由来神経栄養因子（BDNF）である、請求項１の方法。
【請求項３】
前記標的遺伝子が、BDNF関連分子又はBDNF調節分子と協調的に作用する、レセプター又はBDNFの下流のシグナリング分子を含む、請求項1の方法。
【請求項４】
前記標的遺伝子がタンパク質ホスファターゼ、好ましくはPP2Aである、請求項3の方法。
【請求項５】
前記筋肉組織が舌又は横隔膜筋肉である、請求項1の方法。
【請求項６】
前記筋肉組織が、呼吸、移動、姿勢制御、話す、伸ばす、掴む及びそれらの組合せからなる群から選択される運動行動に必要とされる、請求項1の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項1の方法。
【請求項８】
前記siRNA組成物が、デリバリー試薬の存在下で標的部位にデリバーされる、請求項1の方法。
【請求項９】
前記デリバリー試薬が、脂質、陽イオン脂質、リン脂質及びリポソームから成る群から選択される、請求項8の方法。
【請求項１０】
前記デリバリー試薬がオリゴフェクタミン(商標)である、請求項8の方法。
【請求項１１】
前記神経細胞が、髄質又は脊髄内の細胞体から標的筋肉へ突起を射出する運動ニューロン、又は、筋肉若しくは皮膚へ突起を射出する感覚ニューロンである、請求項1の方法。
【請求項１２】
翻訳活性を調節する前記能力が、閉塞性睡眠時無呼吸、脊髄損傷後の呼吸不全、神経変性運動ニューロン疾患により惹起される呼吸不全、ポリオによる呼吸不全及び幼児突然死症候群から成る群から選択される呼吸制御疾患の治療を可能にする、請求項1の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞内で標的遺伝子をダウンレギュレートする方法：
a）前記標的遺伝子の一部分と相補的な鎖を有するように構築された小さな干渉RNA（siRNA）を提供する工程；及び
b）前記siRNA組成物を哺乳動物の標的部位にデリバーし、前記神経細胞内で標的遺伝子のダウンレギュレーションを惹起する工程、ここで前記標的部位は神経細胞によって支配される筋肉組織又は脳脊髄腔である。
【請求項１４】
前記標的遺伝子が脳由来神経栄養因子（BDNF）である、請求項13の方法。
【請求項１５】
前記標的遺伝子が、BDNF関連分子又はBDNF調節分子と協調的に作用する、レセプター又はBDNFの下流のシグナリング分子を含む、請求項13の方法。
【請求項１６】
前記標的遺伝子がタンパク質ホスファターゼ、好ましくはPP2Aである、請求項15の方法。
【請求項１７】
前記筋肉組織が舌又は横隔膜筋肉である、請求項13の方法。
【請求項１８】
前記筋肉組織が、呼吸、移動、姿勢制御、話す、伸ばす、掴む及びそれらの組合せから成る群から選択される運動行動に必要とされる、請求項13の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がヒトである、請求項13の方法。
【請求項２０】
前記siRNA組成物が、デリバリー試薬の存在下で標的部位にデリバーされる、請求項13の方法。
【請求項２１】
前記デリバリー試薬がオリゴフェクタミン(商標)である、請求項20の方法。
【請求項２２】
前記神経細胞が、髄質又は脊髄内の細胞体から標的筋肉へ突起を射出する運動ニューロン、又は、筋肉若しくは皮膚へ突起を射出する感覚ニューロンである、請求項13の方法。
【請求項２３】
神経細胞内で標的遺伝子をダウンレギュレートする前記能力が、閉塞性睡眠時無呼吸、脊髄損傷後の呼吸不全、神経変性運動ニューロン疾患時の呼吸不全、ポリオ後の呼吸不全及び幼児突然死症候群から成る群から選択される呼吸制御疾患の治療を可能にする、請求項13の方法。
【請求項２４】
以下を含む、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞内で標的遺伝子をダウンレギュレートするためのキット：
a）標的遺伝子の一部分と相補的な鎖を有するように構築されたsiRNA組成物；及び
b）前記神経細胞内の標的遺伝子をダウンレギュレートすることができるように、前記siRNA組成物を前記哺乳動物の標的部位にデリバーするための指示。
【請求項２５】
前記標的遺伝子がBDNFであるか、又はPP1、PP2A、PP2B及びPP2Cから成る群から選択されるタンパク質ホスファターゼである、請求項24のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願60/529,326号（2004年12月12日出願）の権利を主張する。前記出願は参照により本明細書に含まれる。
連邦政府援助研究開発に関する記載
本発明は、NIHのグラントHL65383及びHL07654の補助金によりアメリカ合衆国政府の援助を受けて達成された。合衆国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
背景技術
小型の干渉RNA（siRNA）は、特定の遺伝子のノックダウン又は新しいタンパク質への遺伝子の翻訳に関する干渉（一般的にはRNA干渉（RNAi）として知られる）を誘発することができる。RNAiを用いて、C.エレガンス（elegans）（Fire et al. 1998, Nature 391:806-811）、ショウジョウバエ（Drosophila）（J.R. Kennerdell and R.W. Carthew, 1998, Cell 95:1017-1026）、ゼブラダニオ（Wargelius et al. 1999, Biochem Biophys Res Commun 263:156-161）及びマウス（McCaffrey et al. 2002, Nature 418:38-39）の特定の遺伝子の生理学的機能が判定された。RNAiの作用メカニズムは一般的には、RNA誘発サイレンシング複合体（RISC）と称されるタンパク質複合体のsiRNA誘発、それによる配列特異的mRNA切断又は翻訳阻害を含むと考えられる。RNAiは、種々の哺乳動物のin vitro系で遺伝子発現の配列特異的低下を生じる。最近、RNAiは、成獣マウスでルシフェラーゼトランスジーンの発現及び活性を抑制することが示され（Mccaffrey et al. 2002）、RNAiは重要な分子ツール、おそらくin vivoで使用される臨床的ツールになりえることが示唆された。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる同様なプロトコルを凌駕するRNAiの主要な利点は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して長期的な効果を生じるためには、輸送及び適切な構造での維持が困難な大型分子の定常的及び反復デリバリーを必要とし、高価であり、数日以上は一般的には現実的ではないということである。
【０００３】
対照的に、siRNAはサブモル比で触媒的に作用し、細胞内の95%もの標的mRNAを切断する。RNA干渉作用は長期間持続することができ、何回もの細胞分割後に検出可能である。これらの特性によって、siRNAは、いったん細胞内に導入されれば標的遺伝子発現の阻害において極めて有効なものになる。しかしながら、siRNAの研究で躊躇を感じさせる主要な事柄は、多様な器官へのsiRNAの実際的なin vivoデリバリーであった。
遺伝子治療の主要な関心点は、生細胞に遺伝物質（通常はDNA）をデリバリーする方法の発見に向けられていた。過去には、研究者らは、遺伝物質（例えばsiRNA）のデリバリーに関する問題を克服するために、ウイルスベクターを用いて細胞をin vivoで効率的にトランスフェクトしてきた。しかしながら、哺乳動物細胞株でウイルスベクターを用いてRNA干渉を誘発する試みは、部分的にはインターフェロン応答の誘発によるタンパク質の全体的な阻害を生じたために成功には限界があった。
さらに最近では、in vivoでの遺伝子発現を低下させようとする潜在的な有害な免疫作用を回避するために、非ウイルス性遺伝子デリバリーが用いられた。そのような非ウイルス的方法は、siRNA又は他の遺伝物質の肝臓への効率的なデリバリーを可能にする血管内デリバリー方法の開発を含んでいた（Herwejer et al. 2001, J. Gene Med. 3(3):280-91；Wolff et al. 1997, Hum. Gene Ther. 8:1763-72 ）。しかしながら、今日までほぼ全ての事例で、非ウイルスDNA/ポリマー或いはDNA/脂質ポリプレックスは、in vivoではin vitroほど効率的に細胞に遺伝子をデリバーすることはできなかった。なぜならば、非ウイルス粒子は生理学的溶液中では凝集し、大きなサイズの凝集物は血管内に残留し標的細胞に接近するその能力が損なわれるからである。さらにまた、以前に開発された非ウイルス粒子は、パッケージされたDNAが完全に保護されるために正味の陽性荷電を必要とし、標的細胞とin vivoでそれらが接触するのを妨げた。
【０００４】
Wolffらはまた、カテーテル仲介静脈内遺伝子デリバリーを用いる、肝細胞への静脈内siRNAデリバリーは、ポリマー系遺伝子デリバリー系を用いたとき、標的遺伝子発現のノックダウンに有効であることを開示した（米国特許6,265,387号参照）。
さらにMakimuraらは、プラスミドによる系を用いてラットの視床下部でsiRNAをデリバーしたとき、代謝機能に影響を与えることができることを開示した。プラスミドによる方法は、in vivoではヘアピンループをもつ短い二本鎖RNA生成物を生じ、標的遺伝子のmRNAレベルを低下させると考えられている。彼らの発見は、RNAiプロトコルを用いて、代謝速度を高め、さらに体重の減少をもたらす中枢神経系の特定の内因性視床下部タンパク質レベルを低下させることができることを示唆している（Makimura et al. 2002, BMC Neurosci. 3:18）。
しかしながら、哺乳動物の神経系の他の領域における機能の改変を目的とするRNAiの応用はまだ明瞭には示されていない。1つの理由は、（視床下部と異なり）他の神経構造物は脳血管障壁の存在のために血液に接近することができないので、有効なデリバリーには、中枢神経系関連器官に関しては特に不確実さがあるということである。血中では、siRNA及びmiRNA（小さな調節性RNA分子、ミクロRNAと称される）は迅速に分解され、したがって内因性mRNAの翻訳防止又はノックダウンを目的とする治療ツールとして小RNAの血液デリバリーには限界がある。
【０００５】
実際、効率的にsiRNAを利用して神経系で遺伝子発現を調節することができないことがIsacsonらによって最近報告された。彼らは、ドーパミンD1レセプターmRNAを標的とするsiRNAの線条体内輸液は、完全なラットでドーパミンD1レセプターmRNAレベル又はタンパク質レベルを低下させなかったことを記載している。これらの結果は、ドーパミンD1レセプターリガンド結合で76%の低下が得られたというin vitroの観察とは対照的であった。したがって、Isacsonらは、ラットの脳に直接輸液によって投与された合成siRNAはRNA干渉を誘発する能力をもたないと結論した（Isacoson et al. 2003, Acta Physiol Scand 179:173-177）。
したがって、これまでのところ主要な制約条件は、中枢神経系の標的細胞にsiRNA又はmiRNAを効率的にデリバーすることの困難さであったので、RNA干渉を利用してin vivoでタンパク質機能を標的としこれを阻害する新規で有効な方法を開発することが希求されよう。
【０００６】
発明の開示
本発明の要旨は、哺乳動物の中枢神経系の特定のタイプの神経細胞内で特定の標的遺伝子の遺伝子発現に影響を与える方法である。前記方法は、標的遺伝子の一部分に相補的な鎖を有するように構築したsiRNA組成物を製剤化し；さらに前記siRNA組成物を前記哺乳動物の標的部位にデリバーし、前記神経細胞内で標的遺伝子の発現に影響を与えることを含む。標的注入部位は、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートできるように、運動神経細胞によって支配された筋肉組織であるか、又は脳脊髄液内への集中注射による。
本発明のある特徴では、標的遺伝子は脳由来神経栄養因子（BDNF）である。
また別の特徴では、標的遺伝子はレセプター又はシグナリング分子、例えばMAPキナーゼ又はBDNFの発現を調節するホスファターゼである。この特徴では、前記神経細胞は、髄質若しくは脊髄内の細胞体（cell body）から標的筋肉へ突起（process）を射出（send）する運動ニューロン、又は筋肉若しくは皮膚に突起を射出する感覚ニューロンである。
また別の特徴では、前記筋肉組織は舌又は横隔膜筋肉である。
また別の特徴では、siRNA組成物は、デリバリー試薬、好ましくはオリゴフェクタミン（oligofectamine）(商標)の存在下で標的部位にデリバーされる。
また別の特徴では、本発明はまた、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞で標的遺伝子の遺伝子発現に影響を与えるために使用されるキットを提供する。前記キットはsiRNA組成物及び遺伝子発現に影響を与える方法の実施のための指示を含む。
【０００７】
また別の特徴では、本発明は、断続的低酸素症に対するニューロン応答（及びおそらくは呼吸制御における神経適応性の一形態、呼吸長期促通（respiratory long-term facilitation）又はLTFとしても知られている）におけるBDNF、MAPキナーゼ及びタンパク質ホスファターゼの調節メカニズムに対する識見を提供する。さらにまた提供されるものは、髄質及び脊髄内でin vivoで遺伝子機能を調節するためにBDNF又はタンパク質ホスファターゼに対してsiRNA技術を使用することの有用性である。さらにまた、本発明は他の分子にも拡大され、多様な医学的症状の治療に有用であろう。したがって、また別の実施態様では、運動ニューロン機能、例えばBDNFの下流のレセプター及びシグナリング分子に影響を与えることができるか、又はBDNFと平行して作用するか、又はBDNFを調節することができる遺伝子がBDNFと組み合わされて、又は単独で標的とされる。
さらにまた別の実施態様では、siRNA組成物をデリバーする多様な態様が、運動ニューロン関連症状、例えば閉塞性睡眠時無呼吸、脊髄損傷、変性性運動ニューロン疾患（ALS）、ポリオの治療に極めて有用であることを立証することができる。siRNAの皮膚又は神経への投与による同様なアプローチは慢性疼痛の治療に有用でありえる。本発明の方法が有用でありえる他の応用は以下で詳細に記載されるであろう。
別に規定されないかぎり、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本発明が属する分野の業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は検査に適した方法及び材料は下記に記載されるが、本明細書に記載されたものと類似するか又は等価である他の方法及び材料（それらは当業者に周知である）もまた用いることができる。
本発明の他の目的及び特徴は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明から明白となろう。
【０００８】
発明の詳細な説明
本発明は一般的に、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞内で標的遺伝子の遺伝子発現に影響を与える方法に関する。本方法は、標的遺伝子の一部と相補的な鎖を有するように構築したsiRNA組成物を製剤化する工程；及び前記siRNA組成物を前記哺乳動物の標的部位にデリバーし、神経細胞内で前記標的遺伝子の遺伝子発現に影響を与える工程を含む。前記標的部位は、前記標的遺伝子又は前記遺伝子の新規なタンパク質の産生能力を前記神経細胞内でダウンレギュレートすることができるように、前記神経細胞と連結された筋肉組織又は脳脊髄腔であろう。
本発明にしたがえば、ある実施態様では、哺乳動物のクモ膜下腔内へのsiRNA組成物の直接的デリバリーがBDNF mRNAに効果的に干渉し、断続的低酸素症と称される酸素流入の低下によって誘引される頸部脊髄におけるBDNFの増加が阻止される。断続的低酸素症は、横隔神経長期促通（phrenic long-term facilitation, pLTF）として知られている、セロトニン依存脊髄シナプスの適応性の一形態を惹起する。
この実施態様では、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞内で標的遺伝子（好ましくはBDNF）がダウンレギュレートされた。ただし、BDNFの下流のレセプター若しくはシグナリング分子、又はBDNFと協調して作用する分子、又はBDNFを調節する分子も同様に標的とすることができる。本方法は、BDNF mRNAの一部と相補的な鎖を有するように構築したsiRNA組成物を製剤化する工程；及び前記siRNA組成物を前記哺乳動物の標的部位にデリバーし、運動神経細胞内でBDNFのダウンレギュレーションを惹起する工程を含む。標的ニューロンは髄質又は脊髄内の運動ニューロンである。siRNAのデリバリー部位は運動ニューロンに連結された筋肉又は脳脊髄腔である。出願人らは、例示的デリバリー試薬は、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬、例えば標的部位にsiRNA組成物をデリバーするために用いられるオリゴフェクタミン(商標)であることを記しておく。さらにまた、中枢神経系の神経細胞は、通常の呼吸機能のために重要であり、呼吸の引き金となる、適切な運動アウトプット（motor output）を提供する必要があることも記しておく。
【０００９】
さらにまた、別の実施態様では、siRNA組成物を運動ニューロンが支配する筋肉内に間接的にデリバーすることによって、血液中に循環するRNA分解酵素からsiRNAを保護し、その結果、無傷のsiRNA分子を神経細胞に輸送させる態様が提供される。この間接的な筋肉から神経細胞へのsiRNA分子の輸送の結果、siRNAが舌の筋肉に注射されたときは、舌下神経（下の運動神経）における断続的低酸素症に続くLTFは阻止されるが、横隔神経（横隔膜と連携している）の運動アウトプットは阻止されない。舌に付く運動ニューロンに対する作用によって、髄質内に局在する標的運動ニューロンへの個別のデリバリーが示される。siRNAが舌の代わりに横隔膜に注射されたとき、LTFは横隔神経の運動アウトプットでは阻止されたが、舌下神経の運動アウトプットでは阻止されなかった。横隔膜に付着する運動ニューロンに対する作用によって、脊髄内に局在する標的運動ニューロンへの個別のデリバリーが明らかにされる。したがって、本発明の方法は、siRNA分子を標的部位に直接的に又は間接的にデリバーすることによって、標的遺伝子の発現に影響を与え、生理学的影響を生じることができる。
特にこの実施態様は、哺乳動物の中枢神経系の神経細胞内で標的遺伝子をダウンレギュレートする方法を開示する。繰り返せば、例示的な標的遺伝子は脳由来の神経栄養因子（BDNF）であるが、しかしながら、BDNFの下流のレセプター若しくはシグナリング分子、又はBDNFと協調して作用する分子、又はBDNFを調節する分子もまた本発明のに包含される。本方法は、BDNFの一部と相補的な鎖を有するように構築したsiRNA組成物を製剤化する工程；及び前記siRNA組成物を前記哺乳動物の標的部位にデリバーし、神経細胞内でBDNFのダウンレギュレーションを惹起する工程を含む。この場合、標的部位は前記神経細胞と連結された筋肉組織である。好ましくは、前記筋肉組織は舌又は横隔膜筋肉である。呼吸以外の他の運動機能に必要な他の筋肉及び他の運動ニューロンも本発明に包含される。さらにまた、例示的デリバリー試薬は、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬、例えば標的部位にsiRNA組成物をデリバーするために用いられるオリゴフェクタミン(商標)である。
【００１０】
さらに本発明の範囲内に包含されるものは、本発明の方法を補填するために、遺伝子発現に影響を与え医学的症状を治療するために適した条件下で、他のタイプの治療法を使用することである。意図される他の治療法には当業界で公知のもの、例えばモノクローナル抗体療法、化学療法、放射線療法、栄養因子補充、及び鎮痛療法又はそれらの組合せが含まれる。
本発明はまた、標的細胞、例えば哺乳動物の中枢神経系の神経細胞にin vivoでsiRNA分子をデリバーし、遺伝子発現に影響を与える方法の実施で用いられる成分を含むキットを提供する。本キットは一般的には、本明細書に記載したsiRNA分子を単独で含むか、又は標的細胞にデリバーするためにデリバリー試薬と複合体を形成されてある（siRNA組成物）。本キットはさらに、水性のデリバリー担体、例えば緩衝食塩水溶液などを含むことができる。さらにまた、本キットは、標的遺伝子と競合させるために競合RNAを含むことができる。本キットでは、上記の成分は、宿主にデリバーするために単一の水性組成物として結合されてあっても、又は別個の若しくは分離させた組成物として、例えば別個の容器に分離されてあってもよい。場合によって前記キットはさらに、宿主に水性組成物をデリバーするためにクモ膜下腔又は筋肉内デリバリー手段、例えば注射筒を含むことができる。この場合、前記デリバリー手段には予め前記水性組成物が充填されてあってもされてなくてもよい。
上記組成物の他に、本キットはさらに本方法を実施する指示を含むであろう。これらの指示は多様な形態で本キットに含まれ、その1つ又は2つ以上はキット内に存在するであろう。これらの指示が存在しえる1つの形態は、適切な媒体又は物質上に（例えば情報が印刷された紙片）、キットのパーケージとして、パッケージ挿入物として存在する。さらに別の手段はコンピュータ読出し可能媒体、例えばディスク、CDなどで、前記に情報が記録されている。存在しえるさらに別の手段は、ウェッブサイトのアドレスであり、前記を用いインターネットを介して遠隔地で情報にアクセスすることができる。都合のよいいずれの手段も前記キットに存在し得る。
【００１１】
定義
本明細書で用いられる“低酸素症”という用語は、機能障害を惹起するために十分な体内の酸素欠乏状態を指す。一般的に、低酸素症は、不適切な酸素輸送、例えば無呼吸時、または大気中の（例えば高所での）酸素量の低下によって生じる血中の酸素分圧の低下である。
本発明によって記載されるように、２つのタイプの低酸素症、断続的低酸素症及び持続的低酸素症が存在する。断続的低酸素症は、正常酸素状態が点在する低酸素症の反復挿入と大雑把に定義される。断続的低酸素症は、肺疾患及び睡眠障害呼吸によって実証されるように頻繁な発生によって生じる。断続的低酸素症は、O2枯渇によって惹起され、順応と生存又はニューロンの傷害に至る可能性がある生理学的及び生物学的なニューロン内事象の連鎖反応の引き金となる。特に、断続的低酸素症は、呼吸長期促通として知られているセロトニン依存脊髄シナプスの適応性の一形態を生じる。持続的低酸素症は高所での長期滞在及び慢性肺疾患によって惹起される。
LTFに関して断続的及び持続的低酸素症を区別する細胞性メカニズムは未だ理解されてはいないが、出願人らは、本詳細な説明に提示した結果から、断続的及び持続的刺激（低酸素症/セロトニン）はタンパク質ホスファターゼに対して弁別的作用を示し、このような相違が前記パターン感受性LTF発現の原因となると考えている。
【００１２】
本明細書で用いられる“長期促通”又は“LTF”という用語は、広く研究されている呼吸適応性のモデルを指す。LTFは、最初Millhornとその共同研究者らによって20年以上も前に記載された。彼らは、積算された横隔神経活性は、麻酔して麻痺させ通気を施されているネコの頚動脈洞神経内の化学求心性（chemoafferent）ニューロンの挿入刺激後少なくとも90分間は刺激前レベルよりも高い状態が維持されることを観察した。
LTFの概念がいつか判明するとしても、研究者らは、神経適応性のこの形態をやっと理解し始めたところである。本発明の方法にしたがって、出願人らは麻酔して麻痺させ通気を施したラットをin vivoでの呼吸LTFのメカニズムの研究モデルとして利用した。LTFは、いくつかの呼吸関連神経、例えば横隔神経（横隔膜の神経支配）及び舌下神経（舌の神経支配）で観察され、低酸素症エピソードの15−30分後に発生し、1時間以上持続する神経のバーストアンプリチュード（burst amplitude）の強化として出現する。
より具体的には、“横隔神経LTF”又は“pLTF”という用語は、ほとんど横隔神経運動ニューロン内又はその近傍で中枢神経メカニズムから生じる。ここ何年間の間に、出願人らは、pLTFは、一般的には中枢メカニズムによるものであり（なぜならば、pLTFは低酸素症の非存在下で頚動脈神経の化学求心性ニューロンの電気刺激によって誘引することができ、断続的低酸素症後の頚動脈神経の化学求心性活性では観察されないからである）、横隔神経運動アウトプットに際して短い潜伏性をもつ脊髄により惹起される応答で観察され、さらにセレトニンレセプターアンタゴニスト、タンパク質合成阻害剤の脊髄適用及びBDNF mRNAに対して誘導した小さな干渉RNA（siRNA）によって阻止されることを見出した。
【００１３】
さらにまた、出願人らは、pLTFは脊髄セロトニン5-HT2Aレセプターの活性化をその開始のために必要とするが、その維持のためには必要とされないことを見出した。なぜならば、pLTFは断続的低酸素症の早くも15分後には脊髄のセロトニン依存タンパク質合成を必要とするからである。横隔神経運動ニューロンの樹状突起における断続的5-HT2Aレセプター活性化は、現状で存在する樹状突起のmRNAの翻訳による新規なタンパク質の合成を開始させると考えられる（すなわちBDNF合成の増加及びpLTFは翻訳依存であるが、転写依存ではない）。
pLTFに必須のタンパク質は脳由来神経栄養因子（BDNF）である。断続的低酸素症は、横隔神経運動核を含む腹側脊髄分節でのBDNF合成のセロトニン依存増加を誘引する。本明細書で述べたように、出願人らは、断続的低酸素症に続く脊髄BDNF合成を阻止するために小さな干渉RNA（siRNA）によるRNA干渉を用いた。siRNAはpLTFを停止させ、新規なBDNF合成はその根幹的メカニズムに必要であることを示した。さらにまた、高親和性のBDNFレセプター（TrkB）の阻害はpLTFを停止させ、一方、脊髄BDNF適用は、pLTFと同様に横隔神経バーストアンプリチュードを促進する。
【００１４】
本明細書で用いられる、“siRNA”、“siRNAデュープレックス”又は“siRNA分子”という用語は、RNA干渉“RNAi”の能力を有する（デュープレックス）二本鎖核酸分子を指す（例えば以下を参照されたい：Elbashir et al. 2001, Nature 411:494-498）。本明細書で用いられる、siRNA分子は、必ずしも天然又は内因性のRNAヌクレオチドを含む分子にのみ限定されるわけではなく、化学的に改変されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含される。適切な改変例はsiSTABL(商標)siRNA（Dharmacon Research Inc.から入手できる）である。siSTABL(商標)siRNAはsiRNAの特許形態であり、前記では、相補鎖が化学的に改変されて、細胞への毒性が増加することなく、デュープレックスの安定性、サイレンシング寿命および能力が強化されている。siSTABLE(商標)siRNAはまた、デュープレックスのセンス鎖を不活化し、オフターゲットサイレンシングにおけるセンス鎖の参画を排除する改変も含んでいる。
下記に詳細に記載される本発明のsiRNAデュープレックスは、Dharmaconによってデザインされ合成された。しかしながら、設計及び製造が可能な具体的なsiRNAは、とりわけOligo Engine（Seattle, WA）、Ambion（Austin, TX）又はsiRNA Technolohiesから入手できる。
本明細書で用いられる“siRNA組成物”又は“siRNAデュープレックスプール”という用語は、トランスフェクション試薬、デリバリー試薬と結合した裸のsiRNAを指す。siRNA組成物は標的部位にデリバーされ、標的遺伝子の発現をダウンレギュレートするか、又は新規なタンパク質を翻訳するその能力をRNA干渉により障害する。
【００１５】
本明細書で用いられる“デリバリー試薬”とは、ポリヌクレオチド（好ましくはsiRNA）と結合するか、又は前記と複合体を形成し、前記ポリヌクレオチドの細胞内侵入を仲介する、従来技術で用いられている化合物である。デリバリー試薬はまたsiRNAの細胞との結合及び細胞への内在化も仲介する。
本発明のsiRNA分子は、直接添加するか、陽イオン脂質と複合体を形成するか、デリバリー試薬内にパッケージするか、又は投与に適した条件下で別の方法で標的細胞又は組織へデリバーすることができる。デリバー試薬の例には、陽イオンリポソーム及び脂質、リン酸カルシウム沈殿物、再チャージ可能な粒子並びにポリリジン複合体が含まれる。典型的にはデリバリー試薬は、siRNAの陰性荷電と結合する正味の陽性荷電を有する。トランスフェクション試薬は、その陽性荷電（細胞膜の陰性荷電と結合する）を介して、又は細胞のレセプターと結合するリガンドを介してsiRNAと細胞の結合を仲介する。例えば陽性リポソーム又はポリリジン複合体は、DNAとの結合を可能にする正味の陽性荷電を有する。当業界で周知の、遺伝子を細胞内に移すために用いられる他のデリバリー試薬もまた本発明の範囲内に包含される。これらには、細胞内侵入又はエレクトロポレーションを促進する粒子上でポリヌクレオチドの複合体を形成することが含まれる。荷電は細胞の透過性を高める。
本発明の好ましいトランスフェクション試薬はオリゴフェクタミン(商標)（Invitrogen, Carlsbad, CA）である。他の適切な市販のトランスフェクション試薬には、例えばリポフェクチン（Lipofectin(商標)2000；Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）又はTransIT-TKO(商標)トランスフェクション試薬（Mirus, Madison, WI）が含まれる。さらに本発明の範囲内に包含されるものはまた、バイオポリマーに取り込ませて、又は取り込ませない状態での注射又は輸液ポンプによる、関連組織へのex vivo又はin vivoでのsiRNA複合体の局所投与である。
さらにまた、siRNA組成物のデリバリーを多様な種々の態様で達成することも意図される。本発明のsiRNA組成物の例示的なデリバリー方法には、クモ膜下腔内又は筋肉内注射が含まれる。
【００１６】
本明細書で用いられる“神経細胞”は中枢神経系の細胞を指し、前記中枢神経系は好ましくは脳及び脊髄を含むが、末梢神経及び神経節もまた含むことができる。本開示では多数の細胞タイプを含むことが可能で、前記にはニューロン、星状膠細胞、グリア細胞、ミクログリア細胞、稀突起神経膠細胞、シュワン細胞及び脈絡叢の上皮細胞が含まれる。
本明細書で用いられる“標的遺伝子”という用語は、ポリヌクレオチド、好ましくはその一部分が本発明のsiRNA分子と相補的なmRNAを指す。細胞質及び核内標的遺伝子の両方が本発明に包含される。好ましい標的遺伝子には、BDNF及び、BDNF下流の又はBDNFを調節する、又はBDNFと協調して作用する任意のレセプター又はシグナリング分子を含むことができる。
出願人らは、BDNF遺伝子を標的とするsiRNA組成物は、運動ニューロン機能に影響を及ぼすことができる他のmRNA標的にも応用することができると考えている。例えば、BDNF遺伝子発現は、BDNFの下流のレセプター及びシグナリング分子、又はBDNFの発現を調節する分子、例えば転写因子（すなわち、特にカルシウム応答エレメント（CRE）、活性化T細胞アイソフォーム4の核因子（NFATc4））又はタンパク質フォスファターゼ（下記で述べる）を標的とすることによって調節することができる。BDNFの下流の主要な標的には、マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼERK-1及びERK-2、ERK活性化を調節するキナーゼ（MEKK）、BDNFのための高親和性チロシンキナーゼレセプター（TrkB）、タンパク質キナーゼC、タンパク質キナーゼA及びCAMKIIが含まれる。これらの分子の多くがその都度キナーゼによって制御される分子であるので、出願人らは、前記を不活化するホスファターゼを標的とすることによって、正味の系活性化の方向へ平衡をシフトさせることができると考えている。したがって、siRNAの他の細胞標的にはタンパク質ホスファターゼを含むことができる。
【００１７】
ホスファターゼの中では、タンパク質ホスファターゼ1、2Aおよび2Bが、pLTFでの突出した役割及び呼吸運動ニューロン機能の強化の可能性についてのもっとも強力な候補物質である。これらのうちで、タンパク質ホスファターゼ2A（PP2）が、下記実施例で述べるように好ましい（下記実施例では、持続的低酸素症はもっぱらPP2を活性化することが見出された）。PP2は、内因性“ブレーキ”として作用し、pLTFの発現をキナーゼ活性化のレベルでその基礎的なメカニズムを停止させることによって阻害する。
PP2A基質の主要クラスの1つは、セリン-スレオニンタンパク質キナーゼであり、PP2Aは時にはキナーゼホスファターゼとみなされる。例えば、PP2Aはタンパク質キナーゼC（PKC）活性化を阻害し、哺乳動物細胞ではPP2AとPKC間に直接的な物理的結合が存在する。実際、PP2Aの影響下では、PKCの長時間の活性化はそれ自体の脱リン酸化、及びその後のそれ自身の活性のダウンレギュレーションを生じる。PP2AはまたERK1/2 MAPキナーゼを不活化する。
他の潜在的な細胞標的には、NOGO（成人のCNSの軸索成長阻害物質）、ミエリン塩基性タンパク質、セロトニン作動性レセプター、GABAレセプター、グルタメートレセプター（及びそれらのサブユニット）及び/又は特殊なカリウム及び塩化物チャネルが含まれる。個々の標的は、運動ニューロンの適応性及び/又は生存を促進するために選択することができる。上記に記載したように、siRNA組成物でシグナリング分子を標的とすることによって、本発明によって開示されるデリバリーアプローチは多様な症状のための治療として高度に有用であることを立証することができる。
【００１８】
本明細書で用いられる“BDNF”という用語は、脳由来神経栄養因子（Genbank Accession No.：BDNF, NM_012513を参照されたい）を指す。ニューロトロフィン、例えばBDNF及びニューロトロフィン-3（NT-3）は、神経適応性の多くの形態で重要な役割を果たす（8−12）。出願人らは、BDNFは以下のような関連するシグナリング連鎖反応で産生されると考えている：5-HT2AレセプターはGタンパク質（Gαq）、ホスホリパーゼ、続いてタンパク質キナーゼC（PKC）を活性化する。続いてPKCは、関連する翻訳開始因子、例えば真核細胞開始因子4E（eIF-4E）の（直接的又は間接的）リン酸化を介して新規なBDNF合成をもたらす。その後、BDNFは横隔神経運動ニューロンの樹状突起から放出され、高親和性レセプターチロシンキナーゼ（TrkB）を活性化することによってシナプス前及び/又はシナプス後で作用することができる。BDNFが横隔神経運動ニューロンでTrkBレセプターのオートクリン的活性化を誘引した後、シグナルトランスダクションの連鎖反応が活性化され、前記は少なくとも最初にpLTFを確立させる。BDNFの下流の細胞メカニズムは未だ判明していないが、同様な寄与因子は細胞外の被調節キナーゼ1/2（ERK1/2）（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼファミリー（MAPキナーゼ）の一員）である。例えば、外因性BDNFは、脊髄運動ニューロンを含む多数のタイプのニューロンで、ERK1/2 MAPキナーゼを活性化すると考えられている。ERK1/2の活性化は、シナプス適応性の多くの形態（海馬のLTP及びアメフラシの長期シナプス促通を含む）で要求される。
したがって、本発明にしたがえば、小さな干渉RNA（siRNA）を用いるBDNF mRNA翻訳の干渉がpLTFを停止させることができるので、BDNF合成はpLTFのために必要である。レセプターチロシンキナーゼの阻害によってpLTFは停止したので、BDNFはおそらく高親和性TrkBレセプターを介してpLTFを誘発すると考えられる。本明細書に提示した結果はまた、BDNFは断続的低酸素症後のpLTFに必要にして十分であることを例証している。
【００１９】
“ダウンレギュレート”、“阻害”又は“ノックダウン”は、遺伝子の発現、又は1つ若しくは2つ以上のタンパク質をコードするRNA若しくは等価のRNAのレベル、又は1つ若しくは2つ以上のタンパク質の活性が、siRNA組成物の非存在下で観察されるものより減少することを意味する。本発明にしたがえば、BDNF mRNAは、断続的低酸素症後のBDNF合成の阻止を目的とする、siRNAによるダウンレギュレーションの標的である（機能の低下）。また別には、タンパク質ホスファターゼ2Aは、持続的低酸素症後のBDNF合成を促進するためにダウンレギュレートされる適切な標的である（機能の獲得）。
本発明にしたがえば、機能低下（痙性又は慢性疼痛を最小限にする）または機能獲得（閉塞性睡眠時無呼吸又は脊髄損傷治療又はALS）に基づく治療アプローチが達成されえると考えられる。機能低下的アプローチでは、BDNF又は下流の分子（例えばERK又は、ERK及びMEKKのアクチベーター）は適切な遺伝子標的である。機能獲得的アプローチでは、BDNFを調節するか、又はBDNFと協調して作用して機能を付加する他の分子が適切な遺伝子標的である。そのような分子の例はタンパク質ホスファターゼであろう。さらにまた、プリン作動性レセプターのような分子は適切な標的と考えられる。なぜならば、断続的低酸素症は、重要なATPレセプター（例えばP2X7レセプター）をアップレギュレートするからである。
【００２０】
本明細書で用いられる、“適応性（plasticity）”という用語は、経験に基づく系の反応態様における変化を指す。そのような適応性は、呼吸制御をもたらす神経ネットワークの特性として適切に示される。適応性は、呼吸制御系の発達の誘導及び加齢において多くの潜在的な役割を有する。実際に、呼吸を制御する神経エレメントは、生涯にわたって広範囲の生理学的及び/又は環境的変化（例えば、誕生、妊娠、肥満、呼吸器感染、高所への暴露、神経損傷、並びに、場合によっては加齢による肺機構及びガス交換の正常な劣化）に適応しなければならない。（特に疾患時の）呼吸適応性の決定的な重要性にもかかわらず、適応性を生じる詳細なメカニズムはよく理解されていない。したがって、本発明にしたがえば、断続的及び持続的低酸素症後のpLTFは、ニューロトロフィン、それらの調節及び神経適応性におけるそれらの役割の理解を進めるために大きな可能性をもつ、脊髄のセロトニン依存性適応性のモデルである。セロトニン依存性呼吸適応性のそのような理解は、幼児突然死症候群（SIDS）、閉塞性睡眠時無呼吸、脊髄損傷後の呼吸機能不全、神経変性運動ニューロン疾患（例えばALS）に付随する呼吸不全、感染性運動ニューロン疾患（例えばポリオ）及び呼吸制御に影響を与える他の疾患（例えばレット症候群）を含む呼吸疾患に対する治療方法の開発に重要な示唆を与える可能性がある。
【００２１】
本発明の応用性
本発明の方法は、多様な症状を治療するために標的遺伝子の遺伝子発現に影響を与えるときに用いることができると考える。例えば、本発明の方法を利用し、標的分子、例えばBDNF及びPP2Aに対して作製したsiRNA組成物を用いて、遺伝子発現をダウンレギュレートし、さらに運動ニューロン関連症状、例えば閉塞性睡眠時無呼吸、脊髄損傷、変性性運動ニューロン疾患（例えばALS及びポリオ）の治療を促進することができる。同様なアプローチを用いて、siRNAを組織（例えば筋肉）に適用し、例えばBDNF及び関連分子の発現を低下させて慢性疼痛を最小限にすることができる。慢性疼痛を最小限にするこのアプローチは、運動ニューロンに対する影響を介するのではなく、感覚神経細胞に対する作用によるものであろう。慢性疼痛に関しては、脊髄後角におけるBDNFの増加が示された。したがって、特異的にこの部位にデリバーされた、BDNFに対して作製したsiRNAは疼痛治療として有望でありえよう。しかしながら、他のタイプの疼痛、例えば手根管症候群の疼痛、背中の痛み、首の痛み、坐骨神経痛、肋間神経痛、オピオイド耐性痛、三叉神経痛、関節炎、変形性関節炎、及び癌関連疼痛も本発明に包含される。
さらにまた、本発明の方法を用いて、例えば睡眠時無呼吸、中枢性低換気症候群及び未成熟無呼吸によって惹起される断続的低酸素症エピソードに続く遺伝子発現に影響を与えることが可能であろう。断続的な全身性又は局所性低酸素症エピソードは代謝経路に影響を及ぼし、神経適応性を開始させ、脈管形成を誘発し、炎症性応答に影響を与える。細胞が酸素の変化を検出し、これに迅速に適用する能力を持たないことが、種々の血管、肺、冠状動脈、脳及び睡眠の障害の根幹にあるかもしれない。
低酸素症はまた、遺伝子調節因子、成長因子及び、酸素レベルの変化に対する細胞応答における中継シグナルとして機能する反応性酸素種の活性を調整することが示された。さらにまた、上気道開存性の低下に付随する睡眠時無呼吸（前記は高血圧、心筋梗塞、脳血管障害及び神経系認識不全のリスクを高める）中の血中酸素飽和の周期的減少を間接的に治療及び予防するために、本発明の方法を用いることも意図される。
以下の実施例で、本発明の遺伝子発現効果を達成し、これを分析するために用いられる材料と方法が提供される。これらの実施例は本発明の例示的説明を意図し、本発明を制限しようとするものではない。
【００２２】
材料と方法
実験動物：
実験は、成獣雄のスプラーグドーリー（Sprague Dawley, Sasco colonies K62及びP04；Charles River Laboratories, Wilmington, MA）及びフィッシャー（Fisher rat, F344,コロニー217；Harlan, Indianapolis, IN）ラット（体重225−495g）で実施した。全ての実験方法は、ウィスコンシン-マジソン大学（University of Wisconsin-Madison）の学内動物取り扱い委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）で承認された。
in vivoラットの調製：
外科手術の方法は別の場所に記載されている（７）。ラットをイソフルラン（50%O2中に2.5%）で麻酔し、迷走神経を切断し、ポンプ換気（Harvard Apparatus, South Natick, MA）を実施した。横隔神経を切開して遠位部を切断し鞘を除去した。C2でラミネクトミーを実施し、シリコーンカテーテル（2フレンチ、Access Technologies；Skokie, IL）を50μLのガラスの筒（Hamilton；Reno NV）に連結し、前記をカテーテルの先端がC4−C5上に静置されるようにC2の硬膜の小孔に沿って前進させた。手術後、ラットをウレタン麻酔（1.6g/kg、i.v.）に変え、臭化パンクロニウム（2.5mg/kg）で麻痺させた。ウレタンの追加投与を必要に応じて実施した。手術開始後1時間で、重炭酸ナトリウム溶液（8.4%）及び乳酸リンゲル液（1：4）の静脈内輸液を開始し、酸-塩基バランスを維持した（5mL/kg/時間）。呼吸終期のPCO2をフロースルーカプノグラフ（Novametrix, Wallingford, CT）を用いてモニターした。プロトコル全体を通して周期的に、動脈血をヘパリン添加注射筒に採集し（0.3mL）、値が一定であることを確認した（PaO2＜45mmHg（低酸素状態）、PaO2＞120mmHg（高酸素状態）、PaCO2±基準値より1mmHg）。換気装置の頻度を必要に応じて調節することにより、動脈のPCO2を標的範囲に修正した。
１つのラットグループでは、頚動脈洞神経を舌咽神経との結合部で左右対称に切開した（CSNX）（16）。別の擬似グループでは、頚動脈洞神経を特定したが、切開は実施されなかった。CSNXラットは薬剤処置を与えられなかったので、これらの動物ではラミネクトミーは実施されなかった。
呼吸関連活動は、二極性銀電極を用いて横隔神経で記録した。神経活動を増幅し（A-N Systems, Everett, WA）、バンドパス-フィルターを使用し（100Hzから10kHz）、さらに積算した（CWE821フィルター；Paynter, Ardmore, PA）。横隔神経活動はデジタル化して記録し、WINDAQデータアクィジションシステム（DATAQ Instruments, Akron, OH）を用いて分析した。
術後90分で、安定な積算横隔神経ディスチャージ（discharge）が高酸素状態で確立され（基準値；50%O2、PaO2＞120mmHg）、CO2を吸入ガスに添加してPaCO2をCO2無呼吸閾値（〜45mmHg）より2−3mmHgより高くなるようにした。担体又は薬剤溶液のクモ膜下腔内注射ラットでは、10−15μLのボーラス注射を投与し、プロトコルの開始前に30−35分間薬剤を脊髄に浸透させた。血液ガスは、断続的低酸素症又は高炭酸ガス症の前、間、並びに15分後、30分後及び60分後に、又はコントロールラット（低酸素症又は高炭酸ガス症をもたない）では対応する時間に測定した。
【００２３】
腹側脊髄BDNF濃度の測定：
吸入酸素を操作して、断続的低酸素症（LTFプロトコル、前記は反復無呼吸を模倣する）又は同等期間におけるコントロール酸素レベルを作り出した。薬剤注射を用いる、その後の実験と比較するために、コントロールグループ及び断続的低酸素暴露ラットグループに、断続的低酸素症の30分前（又はコントロールラットでは同等の時間）に賦形剤（人工CSF）のクモ膜下腔内注射を実施した。人工CSFは以下から成っていた：120mMのNaCl、3mMのKCl、2mMのCaCl2、2mMのMgCl2、23mMのNaHCO3、10mMグルコース、適切なpH（7.4）を得るために95%O2/5%CO2を通気した。コントロールラットには2時間にわたって等炭酸ガス高酸素症（50%O2；n=9）を施し、基準値BDNF測定を得た。断続的低酸素症の処理を受けるラットには3回、5分の等炭酸ガス低酸素症エピソードを実施し、5分間の回復時間（50% O2）で間隔をあけた。断続的低酸素症の後、前低酸素症（基準値）状態に60分間戻した（50％O2；PaCO2±基準値より1mg）。C3−C5脊髄分節をプロトコル終了時に採取し、その後のBDNF及びNT-3タンパク質測定のために凍結した。断続的低酸素症後の腹側C3−C5 BDNFレベルにおける観察された増加を確認するために、クモ膜下腔内注射を実施しなかった別のラットグループでBDNFをアッセイした（コントロール、n=4；断続的低酸素症、n=6）。
BDNFタンパク質濃度は、エメチン（タンパク質合成阻害剤；Sigma, St. Louis, MO）又はマレイン酸メチセルジド（セロトニンレセプターアンタゴニスト；Sandoz, Hanover, NJ）を断続的低酸素症又は等炭酸ガス高酸素症の30分前にクモ膜下腔内に注射したラットグループで測定した。C3−C5脊髄分節を、断続的低酸素症後60分（エメチン、n=6；メチセルジド、n=8）、又は等炭酸ガス高酸素症2時間（エメチンコントロール、n=3；メチセルジドコントロール、n=9）で採取した。エメチン又はメチルセルジドは人工CSFに溶解し、それぞれ濃度1μg/kg（70μM）又は250μg/kg（20mM）でクモ膜下腔内からデリバーした（注射容積10−15μL）。
【００２４】
腹側C3−C5 BDNFタンパク質濃度は、CSNX（n=11）又は擬似手術（n=10）を施されたラットにおいて断続的低酸素症後60分で決定した。基準値（コントロール）BDNF測定は、2時間の等炭酸ガス高酸素に暴露した対応するグループで実施した（CSNX、n=10；擬似手術、n=10）。
断続的高炭酸ガス症の影響を調べるために、安定な横隔神経ディスチャージ（上記参照、50%O2；動脈PCO2〜45mmHg）を確立させ、吸入CO2を操作して、3回、5分の高炭酸ガス症エピソードを作り出し（動脈PCO2〜85mmHg）、間に5分の回復期間を置いた（n=6）。断続的高炭酸ガス症の後、ラットを基準値状態に戻した（動脈PCO2±基準値より1mg）。プロトコルの全体を通して、吸入酸素は50％O2で維持した。腹側C3−C5 BDNFレベルは、断続的高炭酸ガス症後60分、又は血液正常炭酸ガス状態の75分後に採取した（コントロール；n=3）。
ひとまとめにした脊髄分節C3−C5を凍結ミクロトーム上に置き、後角の50μmの連続切片を取り出し、中心管の腹側の外観が出現するまで廃棄した。BDNF及び/又はNT-3分析は残りの腹側脊髄で実施した。組織サンプルの重量を測定し、冷却した抽出緩衝液中で均質化した（抽出緩衝液：1%のNP-40、10%のグリセロール、5mMのメタバナジウム酸ナトリウム、10mMのPMSF、100μg/mLアプロチニン及び10μg/mLロイペプチンを含むトリス-緩衝食塩水（pH8.0））。均質化物を1NのHCl（pH約3.0）で酸性化し、室温で15分インキュベートし、1NのNaOH（pH約7.6）で中和した。続いて均質化物を7000g10分で微量遠心し、上清を抗体サンドイッチELISAでアッセイした（BDNF ELISA, R&A Systems, Mineapolis, MN；NT-3 ELISA, Promega Corporation, Madison, WI）。ニュートロフィン濃度は、組織湿潤重量1グラム及びBCA（ビシンコニン酸）法（Pierce, Rockford, IL）で決定した総タンパク質1グラムにつき標準化した。両方の標準化方法によって定性的に同様な結果が得られたので、ニュートロフィンの濃度は組織湿潤重量1グラム当たりについてのみ提示される。
【００２５】
クモ膜下腔内BDNF注射後の横隔神経の活動：
クモ膜下腔内カテーテルを設置し、BDNF溶液（0.1μg；n=5）又は賦形剤（人工CSF+0.1%BSA；n=5）の10−13μLを注入した。クモ膜下腔内BDNF注入が意図せずして脊髄を超えて頭蓋運動プールに拡散したか否かを確認するために、舌下神経もまた切開し、脱鞘し記録をとった。舌下神経及び横隔神経の活動を注入後90分観察した。別のラットの群では、2本のクモ膜下腔内カテーテルをC4に設置し、チロシンキナーゼ阻害物質K252aのボーラス注入をBDNF注入の10分前に実施した（BDNF＋K252a；BDNF＝0.1μg；K252a＝0.15μg、n=3）。組換えヒトBDNF（Promega Corporation, Madison, WI）を人工CSF＋0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）に溶解した。K252a（Calbiochem, San Diego, CA）を最初ジメチルスルホキシド（DMSO；1.5mLのDMSOに100μgのK252a）に溶解し、200μLアリコットで凍結した。実験の前に、0.8mLの人工CSFを添加して200μLのK252a/DMSO溶液とし、その10−15μLをクモ膜下腔内にデリバーした（K252aの最終濃度＝0.13−0.2μg；28μM）。賦形剤のデリバリーは、K252aを添加しなかったことを除いて上記に記載したとおりであった（DMSO＋人工CSF）。注入後30分、60分及び90分に、動脈血中ガスを分析して、PaO2及びPaCO2レベルは注射前の値と同様であることを確認した。
【００２６】
siRNAの設計と合成：
本明細書に記載したように、低酸素症誘発BDNF合成をin vivoでダウンレギュレートするために、BDNF mRNAに対して作製した小さい干渉RNA（siRNA）又はスクランブル配列を設計してDharmacon社（Lafayette, CO）が合成した。BDNF siRNAは、4種のプールされた、対称性の3'オーバーハングをもつ21ヌクレオチドのデュープレックスから成っていた（SMARTプール）。4種のデュープレックスの配列は以下のとおりであった：1）TCGAAGAGCTGCTGGATGA（配列番号:1）；2）TATGTACACTGACCATTAA（配列番号:2）；3）GAGCGTGTGTGACAGTATT（配列番号:3）；及び4）GAACTACCCAATCGTATGT（配列番号:4）。BDNF siRNA及びスクランブルsiRNAをsiRNAユニバーサル緩衝液（Dharmacon, Layfayette, CO）に懸濁して、50μMの濃度を得た。siRNAストックをアリコットに分けて、20℃で保存した。BDNF誘発低酸素症を調節するまた別のアプローチとして、in vivo又はin vitroで適用するために本明細書に記載したように個々のタンパク質ホスファターゼ（PP1、PP2A、PP2B及びPP2C）、又はキナーゼ（例えばERK1/2、CAMKII、PKC、PKA、MEKK）、又は翻訳因子のmRNAに対抗するsiRNAを作製することも意図される。
さらにまた、WO99/32619及びWO01/68836に記載したように、本発明のsiRNAを化学的又は酵素的に合成することも意図される。siRNAの酵素合成は、細胞のRNAポリメラーゼ又はバクテリオファージのRNAポリメラーゼ（例えばT3、T7、SP6）を用い、例えば米国特許5,795,715号に記載されているように当業界で公知の発現構築物によって促進することができる。意図された構築物は、標的遺伝子の一部分と同一又は相補的な、それぞれセンス鎖及びアンチセンス鎖を表すヌクレオチド配列を含むRNAを生成する鋳型を提供する。これらの参考文献によって提供される同一の配列の長さは、少なくとも25塩基対の長さである。この方法では、より長いdsRNAが、長いdsRNAをin vivoでsiRNAに変換する内在性ヌクレアーゼ複合体により19−25量体の長さに消化されることが意図される。化学的又は酵素的に合成されたdsRNA間で、RNA干渉での使用について予想される特性に違いはない。
出願人らは、RNAが手動及び/又は自動化された工程を用いてin vitro又はin vivoで合成できることを条件に、siRNAが合成される態様に何らの制限も設けない。上記に引用した参考文献はまた、例えばクローン化RNAポリメラーゼ（例えばT3、T7、SP6）を内在性DNA（又はcDNA）鋳型又は両者の混合物の転写のために用いる化学的又は酵素的なin vitro合成を提供している。繰り返せば、化学的又は酵素的に合成されたsiRNA間で、RNA干渉での使用で所望される特性に違いはない。
【００２７】
in vitroでのsiRNA：
ネズミのHT-22海馬細胞株（Salk Institute, San Diego, CA）を〜80%コンフルエンシーに増殖させ、10%ウシ胎児血清及び100単位/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを補充したダルベッコー改変イーグル培養液（Dulbecco's modified Eagle's medium）で継代した。細胞を2ｘ105細胞/ウェルの密度でファルコンの6ウェルプレートで一晩培養した。細胞を200nMのスクランブルsiRNA又はBDNFsiRNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの20分前に、siRNA（BDNF又はスクランブル）又はsiRNAユニバーサル緩衝液をオリゴフェクタミン(商標)（ストックから0.6μL、Invitrogen, Carlsbad, CA）と混合し、適切なウェルに添加した。BDNF mRNAに対する個々のBDNF siRNAデュープレックスの作用を同様な態様で調べた。各処置（緩衝液、スクランブルsiRNA及びBDNF siRNA）はデュープリケートで実施した。出願人らはまた、これらのin vitro実験は、siSTABLE(商標)改変を有するBDNF siRNA（Dharmacon（Lafayette, Colorado）から入手できる）を用いて実施できることを意図する。siSTABLE(商標)は、有効性を損なうことなく、さらに細胞毒性を増加させることなく、安定性及びサイレンシングの寿命を高める化学的に改変された鎖を含むsiRNAの特許形態である。
処置の24時間後に、全RNAをHT-22細胞から抽出した。M-MLV逆転写酵素（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いてcDNAを合成した。18s rRNAを用いてBDNF mRNA値を標準化した。遺伝子配列はユニジーン（Unigene）検索エンジン（国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）によって維持されている）を用いてGenbankから得た。プライマー配列は、プライマー発現ソフトヴァージョン2.0（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）を用いて設計し、インテグレイテッドDNAテクノロジーズ（Integrated DNA Technologies, Coralville, IA）社が合成した。BDNFフォワードプライマー：5'-CTGACACTTTTGAGCACGTGATC-3'（配列番号:5）；リバースプライマー：5'-AGGCTCCAAAGGCACTTGACT-3'（配列番号:6）；18Sリボソームサブユニットフォワードプライマー：5'-AACGAGACTCTCGGCATGCTAA-3'（配列番号:7）；リバースプライマー：5'-CCGGACATCTAAGGGCATCA-3'（配列番号:8）。対応するGenbankアクセッション番号は以下のとおりである：BDNF、NM_012513；及び18sリボソームサブユニット、X01117K01593。
定量的RT-PCRはアプライドバイオシステムズ（Applied Biosystems）モデルABI7000プリズム配列検出系（Prism Sequence Detection System, Applied Biosystems, Inc.）を用いて実施した。RT-PCR反応容積は25μLを用いた。全てのサンプルは、60℃のアニーリング温度を用いデュープリケートで実施した。データを収集し、コンパラティブCT法を用いて分析した。プライマーの特異性は、解離（融解）曲線解析及びアガロースゲル電気泳動によって確認した。
【００２８】
in vivoでのsiRNA：
上記に記載したように、コントロールラット又はスクランブル配列若しくはBDNF siRNAで処置したラットを外科手術により準備した。siRNA（17μL）をオリゴフェクタミン(商標)（2.5μL）と混合し、siRNA組成物を作製した。siRNA組成物を室温（22−24℃）で15分インキュベートした。ラットをイソフルランで麻酔し、横隔膜を小さな腹部正中線切開で露出させた。ラットに、siSTABLE(商標)（BDNF又はスクランブル）又は賦形剤の10、4μLの左右対称横隔膜注射を実施した。siRNA組成物は、脊髄露出後直ちにC4に注射した（2から10マイクロリットルを1分間隔で注射）。（上記に記載したように）プロトコルの開始前に2時間おき、組織は最後の低酸素症エピソードの後で採集した（コントロール、n=3；スクランブルsiRNA、n=3；BDNF siRNA、n=4）。基準値BDNF測定の場合、低酸素症に暴露することなくsiRNA注射後3.5時間で組織を採集した（コントロール、n=3；スクランブルsiRNA、n=3；BDNF siRNA、n=4）。凍結ミクロトームを用い脊髄後角を取り出し、小さな切開ナイフで腹側灰白質を単離することによって、C4−C5分節の腹側灰白質を単離した。腹側C4−C5灰白質のBDNFタンパク質濃度はELISAにより決定した。pLTFに対するsiRNAの作用は、断続的低酸素症の2時間前にスクランブルsiRNA（n=3）又はBDNFsiRNAプール（n＝5）を与えられた別のラットグループで決定した。さらに別の4匹のラットで、個々のsiRNAデュープレックスを上記のように投与し（デュープレックス1及び4、各々n=2）、pLTFを測定した。
【００２９】
断続的低酸素症及び持続的低酸素症：
空気、O2及び/又はN2を混合して、所望の吸入酸素濃度パターンを得た。麻酔ラットで、断続的低酸素症は、5分間隔で3回5分の11%O2エピソードから成っていた。これは、前記パターンがLTFを誘発し、低酸素症60分後のBDNFタンパク質レベルの増加をもたらすことが示されたためである。持続的低酸素症は25分の11%O2から成り、このプロトコルはLTFを誘引しない（Baker and Mitchell, 2000）。同様な外科手術又は処置を施されたが、低酸素症に暴露されていないコントロール群は、対応するラットが低酸素症に暴露された。
覚醒ラットは施設内に設計された環境チャンバーで低酸素症に暴露された。チャンバーは容積がほぼ４Lであった。コンピュータ混合ガスをチャンバーにつき4L/分の流速で通過させ、CO2蓄積レベルを0.5%未満に担保し、低酸素症エピソード時のON及びOFF移行における迅速な動的変化（下降及び上昇移行のためにそれぞれ50及び70秒）を可能にした。断続的低酸素症は、5分間隔で５回5分の9−10％O2エピソードから成り、前記パターンは覚醒ラットでLTFを誘引することが示されていたためである。持続的低酸素症は25分の9−10%O2から成っていた。
【００３０】
クモ膜下腔内K252aに続くpLTF：
K252aのクモ膜下腔内注射は断続的低酸素症前に実施した。K252aは上記に記載したように調製した。K252a（n=6）又は賦形剤（DMSO＋人工CSF；n=5）は断続的低酸素症の30分前にクモ膜下腔内にデリバーし、横隔神経ディスチャージを断続的低酸素症後60分間継続的にモニターした。横隔神経活動は基準（低酸素症前）値の百分率として表した（図5参照）。
積算ピーク横隔神経アンプリチュードは、低酸素症前（基準値）及び低酸素症後60分又は高炭酸ガス症の30秒分（bin）を平均し、pLTFの規模を基準値のパーセント変化として低酸素症60分後又は高炭酸ガス症で算出した。回帰分析は、pLTFの規模とBDNFのコントロールに対するパーセント変化との間の関係を決定するために実施した。この分析のために、pLTFを平均し、各実験条件内のコントロールに対するBDNFの変化を本明細書に提示した。
一サンプルｔ-検定を用いて、DMSO、K252a、スクランブルsiRNA又はBDNFsiRNAで前処置したラットは有意なpLTFを有するか否かを決定した。スチューデントｔ-検定を用いて、処置群のpLTFをコントロール（DMSO対K252a、スクランブルsiRNA対BDNFsiRNA）と比較した。反復測定デザインをもつ2方向ANOVAを用いて、BDNF、賦形剤及びBDNF＋K252a注射の前後の横隔神経応答を比較し、個々の比較はスチューデント-ノイマン-クーエルポストホック検定により実施した。P＜0.05ならば相違は有意であると考えた。全ての値は平均±標準誤差として表わされている。
【００３１】
siRNA分子の舌の筋肉へのデリバリー：
本発明のこの実施態様では、上記で述べたようにBDNF標的遺伝子に対して作製したsiRNA組成物をラットの舌に注射した。ラット（フィッシャー（F344））はハーランスプラーグ-ドーリー（Harlan Sprague-Dawley, Indianpolis, IN）から入手した。siRNA分子はDharmaconから入手し、本明細書に記載したように4種の21-ヌクレオチドデュープレックスから成っていた。siRNAのストック（50μL）を7.5μLのオリゴフェクタミン(商標)（Invitrogen, Carlsbad, CA）と混合し、siRNA組成物を作製した。前記siRNA組成物をラットの舌に注射する前に室温で15分維持した。麻酔誘発時にカルプロフェン（5mg/kg）を皮下に投与し、痛みを軽減させた。8回7μLのBDNF siRNA組成物の一連の注射を舌に実施し、舌の上部、下部及び基部を左右対称に被覆した。ラットを分析前に2日間回復させた。続いてラットを上記のようにLTFプロトコルに付した。LTFは2日後に阻止されたことが示された。
分析の結果は図6に提供されている。図6は、BDNF siRNA分子の舌への注射後の機能的な結果のグラフを示している。前記の結果は、BDNF依存適応性（LTF）の形態は、標的とされる運動ニューロンプール、XII核で阻止されたが、関連する（ただし分離されている）横隔神経運動アウトプットでは阻止されなかったことを示唆している。このことは、おそらくsiRNAは、舌のXII核を支配する運動ニューロンプールに止められ、他の関連する標的に到達しなかったことを示している。
この実験は、BDNF siRNAは、舌の筋肉から運動ニューロンの細胞体に輸送され、BDNF機能を阻止することができることを示している。このアプローチによって、接近しやすい末梢部位（筋肉）へのsiRNAのデリバリーによって血液脳関門の背後の神経系に存在する神経細胞（運動ニューロン）に影響を与えることができる。このアプローチをsiRNAの種々の分子標的に応用し、十分に範囲が限定された細胞、適切には運動ニューロン（前記は神経-筋疾患、例えば睡眠時無呼吸、脊髄損傷、ALS及びポリオで役割を果たす）での遺伝子発現を改変することが意図される。
【００３２】
siRNAの横隔膜筋肉へのデリバリー：
意図されることはまた、上記の舌への注射と同様に、siRNA組成物を哺乳動物の横隔膜筋肉に注射することができるとともに、実質的に身体のいずれの筋肉にも注射することができる。本発明のこの実施態様では、BDNF標的遺伝子に対して作製されたsiRNA組成物が、横隔神経運動ニューロンに到達するように横隔膜筋肉に注射される。横隔膜注射の前に、siRNAストック（50μL）を7.5μLのオリゴフェクタミン(商標)（RNaseを含まない状態）と混合し、室温で15分維持することによってsiRNA組成物を調製した。麻酔誘発時に直ちにカプロフェン（5mg/kg）を皮下に投与した。正中線切開を実施して横隔膜を露出させた。続いて、12回ほぼ5μLのsiRNA組成物（すなわちBDNF siRNA、スクランブルsiRNA又は食塩水）の一連の注射を横隔膜で実施し、二等分した横隔膜の両方を被覆した。ラットをLTFプロトコル前に2−5日間回復させた。横隔膜に注射されたBDNF siRNAは、横隔神経運動ニューロンに3日以内に到達し、断続的低酸素症後の脊髄の呼吸適応性に影響を与えた。
ホスファターゼ活性を測定するために、組織サンプルを1mLのホスファターゼ保存緩衝液（50mMトリス-HCl（pH7.5）、1mMのEDTA、0.1%β-メルカプトエタノール、100mMロイペプチン、75mMペプスタチン）中で均質化し、100,000ｘgで1時間4℃遠心した。ホスファターゼ活性は、以下に記載するように直ちに上清で定量した。
mRNA分析のためには、XII核及び腹側灰白質を、製造元の指示にしたがって250mLのRNA抽出試薬（Trizol Reagent, Invitrogen）中でそれぞれ均質化した。簡単に記せば、クロロホルム（トリゾール（Trizol）容積の1/5）をサンプルに添加し、タンパク質を変性させる。室温で3分インキュベートした後、サンプルを遠心し（12,000g、4℃、15分）、有機層と無機層を分離させた。有機層を採集し、イソプロパノール（トリゾール容積の1/2）を添加して、RNAを沈殿させる（室温で10分間のインキュベーション）。RNAを遠心してペレットにし（12,000g、4℃、10分）、500mLの氷冷80%エタノールで洗浄し、2回遠心して（12,000g、4℃、10分）、過剰のエタノールを除去する。ペレットを10分間風乾し、30−50mLのDEPC処理水に再懸濁する。RNAサンプルは以後の分析のために-80℃で保存する。
【００３３】
ELISA：
BDNF ELISA（R&D Systems）を用いて、処置後のBDNFの変化を定量した。簡単に記せば、組織サンプル及び標準サンプルは、BDNFモノクローナル抗体でプレコーティングした96ウェルのポリスチレンプレートに添加される。続いてプレートを2時間室温でインキュベートし、実験サンプル及び標準サンプル中のBDNFを固定抗体と結合させる。酵素結合（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）BDNFモノクローナル抗体を添加し、室温で1時間インキュベートし、その間に結合した抗体は、固定抗体-BDNFタンパク質複合体とともに“サンドイッチ”を形成する。続いて、プレートを緩衝液で洗浄し、さらに基質溶液（過酸化水素＋発色源）を添加する。30分発色させ、続いて、酸性溶液（2N硫酸）を添加してペルオキシダーゼ反応を停止させる。色の濃さをマイクロプレート読取装置（MRXI Absorbance Reader with MRX Revelation software；Dynex Technologies）（570nmの波長修正で450nmに設定）を用いて測定する。吸収は、結合BDNFの量に正比例する。サンプル中のBDNFタンパク質レベルを総タンパク質レベル及び湿潤組織の1グラム当たりの両方について標準化する。総タンパク質はBCAアッセイキット（Pierce Biotechnology）を用いて決定する。
【００３４】
イムノブロット分析：
サンプルを2ｘのサンプル緩衝液で1：2に希釈し（サンプル緩衝液：20mMトリス、2mMのEDTA、1mMのNa3VO4、2mMのジチオスレイトール、2%のSDS、20%のグリセロール）、5分間煮沸する（105℃）。各サンプルから等量のタンパク質（〜30mg）を各レーンにロードし、10%SDS-PAGEゲルで分離させた。ゲル中のタンパク質をインモビリン（Immobilin）ポリビニリデンジフルオリド（PVDF）メンブレン（Millipore Corp.）に移した。メンブレンは5%脱脂乳/TBST（10mMトリス-HCl（pH8）、150mMのNaCl、0.05%トゥイーン20）で30分37℃で封鎖した。抗リン酸化ERK1/2キナーゼ抗体（Cell Signaling Technology）（前記は酵素的に活性なERK1/2を認識する）を、1：2500の希釈で一晩37℃で用いた。セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させた二次抗体（ヤギ抗ウサギIgG-HRP、Santa Cruz Biotechnology）を1：8000の希釈で用いて免疫反応バンドを可視化し、化学発光はスーパーシグナルウェストピコ化学発光基質（SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate；Pierce Biotechnology）で検出した。バンドの濃度はAC1オートケミシステム（AutoChemi System；UVP）を用いて決定し、ラブワークイメージアクィジションアンドアナリシスソフト（LabWorks Image Acquisition and Analysis Software；UVP）を用いて定量する。全てのサンプルはデュープリケートで泳動させた。リン酸化ERK1/2 MAPキナーゼの免疫反応バンドの画像化の後で、再生ウェスタンブロットストリッピングバッファー（Restore Western Blot Stripping Buffer）を用いてメンブレンの乳剤を剥がし（37℃で30分；Pierce Biotechnology）、5%ミルク/TBST中で再封鎖し、ERK1/2のリン酸化及び非リン酸化形の両方を認識する抗ERK1/2 MAPキナーゼ抗体（1：2500希釈；Santa Cruz Biotechnology）を用いてプローブする。リン酸ERK1/2 MAPキナーゼの濃度は、同じレーン内の総ERK1/2 MAPキナーゼに対して標準化した。続いて、同じゲル上で泳動させた処置ラット対コントロールラットにおける標準化したリン酸化ERK1/2 MAPキナーゼのパーセント変化を計算した。
【００３５】
タンパク質ホスファターゼ活性：
タンパク質ホスファターゼ活性は、セリン/スレオニンホスファターゼアッセイシステム（Promega Corporation）を製造元の指示にしたがって用いアッセイした。簡単に記せば、サンプル中の遊離ホスファターゼをセファデックスG-25樹脂カラムを用いて除去し、600gで5分4℃で遠心する。タンパク質ホスファターゼ2Aをもっぱら標的とする反応緩衝液及び1mMのホスホペプチド（5mL）を96ウェルプレートに添加し、30℃3分インキュベートする（PPTase-2A 5xの反応緩衝液：10mL；250mMイミダゾール（pH7.2）、1mMのEGTA、0.1%β-メルカプトエタノール、0.5mg/mLのBSA）。ホスファターゼ保存緩衝液（30mL；組織調製の項を参照されたい）で希釈したサンプル溶解物（5mL）をウェルに添加し、30℃30分インキュベートした。サンプル溶解物中のタンパク質ホスファターゼの酵素活性はモリブデン酸色素/添加物混合物（50mL）で停止させ、プレートを室温で15分インキュベートした。サンプルの光学濃度をマイクロプレート読取装置（MRXI Absorbance Reader with MRX Revelation software；Dynex Technologies）を用いて630nmで読み取った。各サンプルのセリン/スレオニンホスファターゼ活性のレベルを、ホスフェート標準物を希釈して作製した標準曲線を用いて計算した。サンプル間で比較するために、サンプル溶解物中の総タンパク質（BCAタンパク質アッセイキット（Pierce）を）用いて決定）でホスファターゼ活性を割った。
【００３６】
統計的比較及び分析：
BDNF測定のために、各処置群で、同様な外科手術及び薬剤処置を施したが断続的低酸素症または高炭酸ガス症には暴露されていない日齢適合コントロールラットの対を形成した。BDNFにおける変化を解析するために、スチューデントのｔ-検定を用いて、断続的低酸素症又は高炭酸ガス症に暴露された対応するコントロール群と実験群の間の有意な相違を検出した。群間で比較するために、断続的低酸素症又は高炭酸ガス症後のBDNFレベルを適切なコントロールのパーセント変化として標準化し、同じ日に解析した（バッチの相違を管理するため）。例えば、メチセリジドで前処置したラットの低酸素症後のBDNF濃度は、同じ溶解緩衝液で均質化したメチセリジドコントロールの平均BDNF濃度のパーセント変化として表し、同じELISAプレートで解析した。二方向ANOVAを用いて、コントロール（薬剤無し＋スクランブルsiRNA）及びBDNF siRNA処置ラットにおける基準BDNF濃度に対する統計的推定を実施した。
【００３７】
実施例1：断続的低酸素症は腹側頸部BDNFを調節する
本発明にしたがって、断続的低酸素症はpLTFを誘引し、横隔神経運動核と結合する腹側脊髄分節でBDNF合成を増加させると決定された。このことは最初、麻酔ラットの断続的低酸素症の60分後に、積算ピーク横隔神経活動は低酸素症前（基準値）より増加するという観察から認識され、pLTF（3、4、6）が示された（図1a）。BDNF又はNT-3タンパク質濃度における変化がpLTFと密接に関係するのか否かを決定するために、BDNF及びNT-3レベルを、横隔神経運動核（C3−C5）を包含する腹側頸部分節で分析した。クモ膜下腔内に人工CSFを投与したラットでは、腹側C3−C5のBDNFタンパク質濃度は、コントロールラットの2476±321pg/g組織から低酸素症60分後の3940±308pg/g組織に増加した（P＜0.05；図1b）。したがって、断続的低酸素症は、横隔神経運動核近傍のBDNFタンパク質濃度を56±12%増加させた（バッチ管理；P＜0.05）。この観察は、断続的低酸素症暴露ラット（クモ膜下腔内CSF投与無し）で確認され、BDNF濃度は断続的低酸素症の60分後に49±9%増加した（P＜0.05；データは示されていない）。対照的に、腹側頸部NT-3濃度は断続的低酸素症で影響を受けなかった（コントロール：2397±457；低酸素症後60分：2291±389pg/g組織；P＞0.05）。断続的低酸素症はまた他の呼吸神経運動核（例えば舌下神経）においても、他の機能（例えば歩行、姿勢、伸ばす（reaching）及び握る、又は話す）に必要とされる非運動核と同様にBDNF合成を増加させると考えられる。
【００３８】
断続的低酸素症後のBDNFの増加はpLTFと同様なメカニズム（7）によって調節されているのか否かを決定するために、断続的低酸素症前に、セロトニンレセプターアンタゴニスト（メチセルジド）又はタンパク質合成阻害剤（エメチン）のクモ膜下腔内注射を頸部脊髄で実施した。クモ膜下腔内メチセルジド（250μg/kg）は、腹側頸部BDNF濃度に対する断続的低酸素症の影響を阻止した（メチセルジドコントロールに対する変化、-10±8%、P＞0.05；図2a）。断続的低酸素症後のBDNFの増加もまた新規なタンパク質の合成を必要とする。なぜならば、エメチンによる前処置（1μg/kg）は低酸素症後60分のBDNF増加を低下させた（エメチンコントロールに対する変化、19±11%、P＞0.05；図2a）。同様なメカニズムが他の呼吸神経及び非呼吸神経運動核のBDNFを調節する可能性があると考えられる。
図2に示すように、クモ膜下腔内に人工CSFを注射したラットは、断続的低酸素症60分後の腹側C3−C5のBDNF濃度に有意な増加を示した。クモ膜下腔内メチセルジド又はエメチンは断続的低酸素症60分後のBDNF増加を阻止し、BDNF合成におけるセロトニン依存増加を示唆した。したがって、断続的低酸素症は、BDNF合成のセロトニン依存増加によって腹側頸部BDNF濃度を調節する。
成熟哺乳動物の主要な酸素感受性化学受容器は頸動脈小体に存在する。頸動脈神経除去ラット（CSNX）では、断続的低酸素症は、腹側C3−C5 BDNF濃度の非有意な増加、19±11%を誘引した。（P＞0.05；図2b）。擬似CSNXラットは断続的低酸素症後に腹側頸部BDNFが38±12%増加したが（P＜0.05；図2b）、この値はCSNXラットの変化に対しては有意な相違ではなかった（P＞0.05）。それにもかかわらず、無傷の化学受容器が、腹側頸部BDNFに対する断続的低酸素症の完全な影響のために必要であるように見える。
【００３９】
腹側C3−C5のBDNF濃度を断続的高炭酸ガス症後に測定し、BDNF濃度の増加が呼吸（シナプス）活動の増加に対する非特異的応答であるか否かを決定した。高炭酸ガス症は強力な刺激であるが、pLTFは誘引しない（3、13）。BDNF濃度は高炭酸ガス症の60分後に変化がなかった（コントロールとの差は-10±13%、P＞0.05；図2b）。図2bを参照して、断続的低酸素症後の腹側C3−C5のBDNFの増加は頸動脈化学受容器を少なくとも部分的に必要とする。なぜならば、断続的低酸素症はCSNX後にBDNFを有意に増加させることができないからである。BDNFの増加は高炭酸ガス症の60分後に観察されず、BDNF増加の作用は呼吸系駆動増加に対する一般的な応答ではないことが示唆された。したがって、断続的低酸素症は腹側脊髄BDNF合成に対して固有の影響を示すことが判明した。
本明細書に記載した実験から得られた平均的データにおける回帰分析によって（コントロールに対する）BDNFのパーセント変化とpLTFの規模との間の強力な相関性（R2＝0.67、P＝0.01；図2c）が明らかにされた。
【００４０】
実施例2：クモ膜下腔内BDNFは長期持続横隔神経促通を誘引する
出願人らは、クモ膜下腔内BDNFが横隔神経運動アウトプットを促進しpLTFを誘引するために十分であると決定した。この決定を得るために、ラットのクモ膜下腔内の横隔神経運動核の上にBDNF（0.1μg）を注射した。賦形剤（人工CSF＋0.1%BSA）の注射は横隔神経活動の時間依存変化を誘発しなかったが（注射後90分：基準値から36±24％、P＞0.05；図3b）、クモ膜下腔内BDNFは積算横隔神経ディスチャージを有意に増加させた（注射後90分：125±25%、P＜0.05；図3a、b）。クモ膜下腔内BDNFは横隔神経バーストアンプリチュードを注射後60分及び90分に有意に増加させ、この作用はK255aによって阻止された。BDNF誘発促進はK252a（Trkレセプター阻害物質）のクモ膜下腔内前処置によって阻止された（注射後90分：9±10%、P＞0.05；図3b）。舌下神経活動（脳幹呼吸運動アウトプットの反映）における時間依存変化がなかった（注射後90分：30±7%、P＞0.05；図3c）ので、クモ膜下腔内BDNFの作用は脊髄に限定された。したがって、脊髄BDNFは、おそらくTrkBレセプター活性化を介して横隔神経運動アウトプットを促進する。
【００４１】
実施例3：BDNF siRNAはpLTFを阻止する
さらにまた、出願人らは、上記の実施例で述べたように、BDNF siRNAは、in vitroでBDNF mRNAを減少させ、さらにin vivoで低酸素症誘発BDNF合成を低下させることを見出した。前記を決定する際に、pLTFにおける内因性BDNFの役割をRNA干渉（RNAi）を用いてテストした。RNA干渉は、内因性経路を介して相同なmRNAの配列特異的阻害又は分解を誘引する二本鎖RNAセグメントを用いて達成される（14、15）。BDNF mRNAに対して作製した二本鎖RNAの小さな合成セグメント（小さな干渉RNA；siRNA）を用いて、断続的低酸素症によって誘発されるBDNF mRNAを減少させた。BDNF mRNAそれ自体を分解するのではなくて、目的は、断続的低酸素症後の新規なBDNF合成を最小限にするために、BDNF mRNAの翻訳を障害することであった。用いられるsiRNA配列の有効性を確認するために、BDNF mRNAをノックダウンするこれらsiRNAの能力をin vitroで決定した。海馬細胞株（HT-22）で、BDNF siRNA（200nM）は、トランスフェクション後24時間でBDNF mRNAを75%に減少させ、この作用はスクランブルデュープレックスでは認められなかった（図4a）。プールしたデュープレックスもまた個々に検査し、BDNF siRNAプールの個々のデュープレックスはそれぞれ、トランスフェクション後24時間でHT-22細胞のBDNF mRNAを減少させた。検査した4種のデュープレックスのうち3種がBDNF mRNAを50%以上ノックダウンさせた。
【００４２】
続いて、断続的低酸素症後のBDNF合成のBDNF siRNAによる阻害の影響を麻酔ラットで調べた。注射しなかったラットと基準条件でスクランブルsiRNAを注射したラットのC4−C5腹側灰白質におけるBDNFタンパク質濃度に有意な相違は存在しなかった（それぞれ8293±479対8588±783pg/g組織湿潤重量）。同様に、注射しなかったラットと断続的低酸素症の60分後にスクランブルsiRNAを注射したラットとの間に有意な相違は存在しなかった（それぞれ10307±490対10282±592pg/g組織湿潤重量、P＞0.8）。両グループを分析のために一緒にし、コントロールラットと称した。コントロールラット対BDNF siRNA投与ラットで、基準値（低酸素症無し）BDNFタンパク質濃度において有意な相違は存在せず（それぞれ8440±416対7818±761pg/g組織湿潤重量、P＝0.4；図4b）、BDNF siRNAは、この短い時間枠内では基準レベルのBDNFタンパク質をノックダウンしないことを示唆した。対照的に、断続的低酸素症後60分でコントロールラットは、C4−C5腹側灰白質におけるBDNFタンパク質濃度を有意に増加させ（基準値：8440±416pg/g組織湿潤重量；低酸素症後60分：10295±344 pg/g組織湿潤重量、P＜0.05）一方、BDNF siRNA処理で処置したラットは増加させなかった（基準値：7818±761pg/g組織湿潤重量；低酸素症後60分：7529±318 pg/g組織湿潤重量、P＞0.05；図4b）
図4bに示されているように、BDNF siRNAは、この短い時間枠では基準BDNFタンパク質レベルをノックダウンさせなかった（灰色棒線）。しかしながら、BDNF siRNAは、BDNFタンパク質濃度の低酸素症誘発増加を妨げた（黒色棒線）。
【００４３】
断続的低酸素症後のpLTFに対するBDNF siRNAの影響（及びBDNF合成増加の欠如）を決定するために、ラットにスクランブルsiRNA配列又はBDNF シルプール（10mg）のクモ膜下腔内注射を施し、その間横隔神経活動を記録した。スクランブルsiRNA注射を受けたラットは断続的低酸素症の60分後に有意なpLTFを発現した（基準値から71±30%、P＜0.05；図5b）。対照的に、BDNF siRNAプールを投与されたラットはpLTFを発現しなかった（-7±9%、P＜0.05；図5a、b）。
図5aを参照すれば、典型的なラットは、断続的低酸素症後少なくとも1時間、横隔神経アンプリチュード（pLTF）の漸進的増加を示した（上図）。対照的に、クモ膜下腔内BDNF siRNA又はK252aで前処理したラットはpLTFを示さなかった（下部の2図）。
これら同じラットでは、断続的低酸素症60分後の腹側C3−C5のBDNFタンパク質濃度に検出可能な増加はなかった（BDNF siRNAを投与されたが低酸素症に暴露されていないラットとの相違10±7%、P＞0.05）。in vivoにおけるBDNF siRNAの特異性を確認するために、2種の個々のBDNF siRNAデュープレックスをpLTFに対するそれらの影響について調べた。断続的低酸素症の1時間後、デュープレックス1及び4についてpLTFの平均はそれぞれ23%及び27%であった（デュープレックス配列については方法の項参照）。両値は、コントロールラットのpLTFに対する95%信頼区間の下方限界より低い（67%から125%）。総合すれば、これらのデータは、断続的低酸素症後のpLTFには内因性BDNF合成が必要であるという強力な証拠を提供しつつ、BDNF siRNAは、低酸素症誘発BDNF mRNAの翻訳及びpLTFを阻害することを示している。BDNFは、他の運動核においても同様にLTF又は運動適応性に必要であると考えられる。
【００４４】
実施例4：pLTFはTrkレセプターの活性化を必要とする
さらにまた、K252aによるBDNF siRNA及びTrkレセプター阻害はpLTFを阻止することが見出された。この発見は、pLTFは高親和性Trkレセプターの活性化を必要とするという仮説を調べることによって見出された。ラットをクモ膜下腔内K252a（非特異的Trkレセプター阻害物質）（0.13−0.2μg）で前処置した。クモ膜下腔内DMSO（賦形剤）投与ラットでは、積算横隔神経バーストアンプリチュードは、断続的低酸素症60分後の基準値から有意に増加し（基準値より109±19%、P＜0.05；図5a、c）、pLTFを示した。対照的にK252aで前処置したラットは断続的低酸素症の60分後の横隔神経バーストアンプリチュードで有意な増加を示さなかった（25±6%、P＞0.05；図5a、c）。前記反応は、DMSO単独注射を受けたラットの反応よりも有意に低かった（P＜0.05）。したがって、Trkレセプター活性化は、断続的低酸素症後の完全なpLTFの発現に必要であり、前記の結果は、BDNFはTrkレセプターを介して作用してpLTFを誘引するという仮説と一致する。
【００４５】
実施例5：BDNF siRNAの横隔膜注射は横隔神経LTFを阻止する
本発明にしたがって、横隔運動ニューロン内のBDNF合成はpLTFに必要であるという仮説を確認し、標的筋肉から前記筋肉を支配する運動ニューロンへのsiRNAの逆方向輸送の蓋然性を示すために実験を実施した。この実験のために、siRNAを横隔膜に注射することによって横隔運動ニューロンをBDNF siRNAの標的とし、横隔運動ニューロンそのものの中で低酸素症誘発BDNF合成を阻止した。予備実験では、出願人らは、軸索取り込み及び逆方向輸送のためにBDNF siRNAを横隔膜にデリバーした。図10は、BDNF siRNAの横隔膜注射を受けた1匹のラットの極めて興味深い予備的データを示している（10回の4mL注射；2種のsiRNAデュープレックスの50mM溶液、50mLを8mLのオリゴフェクタミン(商標)に添加）。注射3日後に、pLTFは大きく減弱したが、LTFはなお遠位の呼吸運動プール（XII）で観察された。平行した実験では、BDNF siRNAを舌に注射し、逆の結果が観察された（すなわち、XII LTFは停止したが、pLTFは停止しなかった；図6）。総合すれば、これらのデータは、筋肉内注射後にBDNF siRNAは標的運動ニューロンに輸送され、そこでBDNF siRNAはBDNF mRNAを分解/阻害しLTFを阻止することを強く示唆している。siRNAのデリバリーの成功は、正常なタンパク質の代謝のためにBDNFタンパク質レベルを低下させ、BDNF mRNAの低酸素症誘発翻訳を低下させるはずである。出願人らは、この技術は、BDNF siRNAの横隔膜注射後のBDNF mRNA及びタンパク質変化の特徴を知るとともに、LTFにおける機能的な帰結に関する更なる実験によってさらに発展させることができると考える。出願人らはまた、この技術は、他の関連分子、例えばセロトニンレセプター、キナーゼ及びホスファターゼのためのmRNAを標的とするsiRNAの作用の特徴を知ることによってさらに発展させることができると考える。
【００４６】
実施例6：断続的（持続的ではなく）低酸素症は腹側頸部灰白質のBDNFを増加させる
一連の実験を通して、出願人らは、断続的（持続的ではない）低酸素症は麻酔ラットの腹側頸部脊髄（C4−C5）のBDNFタンパク質濃度を増加させ、その作用はpLTFの規模に相関することを示すことができた。覚醒ラットの換気LTFが同様なBDNF依存メカニズムによって生じるか否か、又は持続的低酸素症は脊髄のBDNF合成に影響を与えるか否かは不明である。
したがって、以下の種々の酸素環境（それぞれn=4）に暴露した3つの無麻酔ラット群から組織を採集した：1）コントロール（正常酸素状態のみ）、2）断続的低酸素症（5回の5分間低酸素エピソード；10.5% O2；間で5分間の正常酸素状態）、及び3）持続的低酸素症（25分の持続的低酸素症；10.5% O2）。低酸素暴露後に、ラットを正常酸素状態に60分間戻した。処置に続いて、C4−C5腹側灰白質を採集し、BDNFタンパク質濃度をについてアッセイした（ELISA；R&D Systems）。麻酔ラットと同様に、断続的低酸素症は、覚醒ラットの頸部脊髄の腹側灰白質におけるBDNFタンパク質濃度を増加させた。比較すると、等しい持続時間の持続的低酸素症では、BDNFタンパク質濃度に変化は生じなかった（図8参照）。したがって、pLTFと同様に、覚醒ラットで換気神経のLTFを誘引することが知られているプロトコルは、腹側頸部BDNF濃度の増加をもたらした。BDNF合成に対するこの作用は横隔神経LTFと換気神経LTFに対して同様なパターン感受性を示す。
【００４７】
実施例7：断続的（持続的ではなく）低酸素症はERK1/2 MAPキナーゼの継続的活性化を誘引する
上記に示したように、ERK1/2 MAPキナーゼは、pLTFで突出した役割を果たすために多くの必須の特徴を有する。例えば、ERK1/2 MAPキナーゼはシナプスの適応性の重要なモデルに決定的に必要とされる。特にpLTFに関しては、ERK1/2は5-HT2Aレセプターの活性化（いくつかの細胞タイプにおける反応性酸素種と密接な関係をもつ作用）によって活性化される。同様に、BDNF及びTrkBレセプター活性化は迅速にERK1/2 MAPキナーゼを活性化する。ERK1/2 MAPキナーゼはグルタミン酸レセプタートラフィッキングに必要とされるので、出願人らは、前記キナーゼはBDNFシグナリングをシナプス強化にむけて翻訳し、それによってpLTFを樹立するための論理的な候補物質であると考えている。ERK1/2と他の可能なMAPキナーゼ（例えばp38）を弁別的に標的とする薬剤を用いて、この考え方の蓋然性を示した。
断続的（持続的ではなく）低酸素症がERK1/2 MAPキナーゼの継続的な活性化を誘引するか否かを解明するために、腹側頸部（C4−C5）脊髄分節を以下の3つの覚醒ラット群から単離した：1）正常酸素コントロール、2）断続的低酸素症（5回の5分間エピソード、10.5%）、及び3）持続的低酸素症（25分、10.5%）。低酸素症の60分後に組織を採集し、ホスホ-ERK1/2（Cell Signaling）又は全ERK1/2（Santa Cruz）に対する抗体によるイムノブロット（上段パネル）のために保存した。リン酸化（活性化）ERK1/2対全ERK1/2の比は、断続的（持続的ではない）低酸素症後60分で有意に増加した（図10B参照）。同様な変化は、MAPキナーゼファミリーのまた別のメンバーであるp38の免疫反応性では見られなかった（データは示されていない）。したがって、ERK1/2はpLTFにおける主要な役割と一致した態様で活性化される。
【００４８】
実施例8：ERK1/2 MAPキナーゼ活性化はBDNF依存性である
ERK1/2 MAPキナーゼ活性化はBDNF依存性である（BDNFシグナリングから下流にある）か否かを決定するために、BDNF siRNAを2匹の麻酔ラットのC4に注射した：1匹は酸素正常状態（コントロール）に置き、他方には断続的低酸素症を施した。この方法は、横隔神経運動ニューロン近傍の低酸素症誘発BDNF合成を効果的に妨げる。組織を採集し、イムノブロットによりERK1/2の活性化を評価した。これらの予備的データは、新規なBDNF合成のBDNF siRNAによる阻害はまた低酸素症誘発ERK1/2 MAPキナーゼの活性化を阻止することを示し、新規なBDNF合成の阻害がERK1/2 MAPキナーゼ活性化を引き起こすことを示唆している（図12参照）。
【００４９】
実施例9：ERK1/2 MAPキナーゼの活性化（CaMKIIの活性化ではなく）はpLTFに必要である
ERK1/2 MAPキナーゼの活性化だけがpLTFに必要であるのか否を決定するために、1匹の麻酔ラットを、断続的低酸素症の30分前にクモ膜下腔内でUO126（MAPキナーゼ阻害物質）（0.4mg；100mM）により前処置した。ERK1/2 MAPキナーゼの活性化の阻害はpLTFを阻止した。対照的に、無関係のキナーゼ、CaMKII（KN62及びKN93、それぞれn=1；2mg；250mM）はpLTFを阻止しなかった。これらの結果は、ERK1/2を標的として脊髄におけるシナプス機能を改変することの妥当性を明示している。
【００５０】
実施例10：MAPキナーゼ活性化は横隔神経バーストアンプリチュードを促進する
MAPキナーゼ活性化は横隔神経バーストアンプリチュードの促進に十分であるか否かを決定するために、タンパク質合成阻害剤であって、非特異的にMAPキナーゼもまた活性化するアニソマイシン（100mg；20mM）を、1匹の麻酔ラットのクモ膜下腔内に注射した。注射の30後に、横隔神経バーストアンプリチュードは注射前のレベルより60%増加した。アニソマイシンに続く横隔神経アンプリチュードの増加はMAPキナーゼの活性化のためであるようである。なぜならば、選択的なMAPキナーゼ阻害剤による前処理（UO126；0.4mg；100mM）はその作用を阻止したからである（n=1）。アニソマイシンは多数のMAPキナーゼ（特にp38）を活性化するので（データは示されていない）、出願人らは、これらの予備的データは、ERK1/2 MAPキナーゼの活性化はpLTFと同様に横隔神経活動を促進するために十分であるという仮説を支持していると考える。したがって、ERK1/2の活性化を調節する分子を標的とすることによって、脊髄のシナプス機能を改変することができる。
【００５１】
実施例11：持続的（断続的ではない）低酸素症はタンパク質ホスファターゼ（PP）活性を高める
3匹の覚醒ラットに正常酸素状態、断続的低酸素症（5回5分間のエピソード；10.5%）又は持続的低酸素症（25分；10.5%）を与えた。腹側C4−C5を低酸素症の15分後に採集し、市販のキット（Promega, Madison, WI）を用いてセリン/スレオニンタンパク質ホスファターゼ活性についてアッセイした。緩衝液の条件はタンパク質ホスファターゼ2A（PP2A）をもっぱら標的として最適化したが、タンパク質ホスファターゼ2B又は2Cの作用も又このアッセイの説明に必要である。持続的低酸素症に暴露したラットは、正常酸素状態又は断続的低酸素症に暴露したラットと比較してPP2活性が上昇し、断続的低酸素症はPP2活性に影響を与えなかった。したがって、PP2活性化は、持続的低酸素症と断続的低酸素症をそれらのpLTF誘引能力について識別する潜在的能力を有する（図12参照）。
【００５２】
実施例12：持続的低酸素症はタンパク質ホスファターゼ阻害後に横隔神経LTFを誘引する
予備的データは、持続的低酸素症はホスファターゼ活性を特別に増加させることを示唆したので、出願人らは、タンパク質ホスファターゼ阻害は前記阻害性拘束を取り除き、持続的低酸素症後にpLTFを示すと考えた。したがって、1匹の麻酔ラットで、タンパク質ホスファターゼ1/2A（PP1及びPP2A）の阻害剤である10mLのオカダ酸（okadaic acid）（0.15mg；20mM）を、持続的低酸素症（25分）の30分前にC4のクモ膜下腔内にデリバーした。持続的低酸素症の60分後に、軽度のpLTFが出現した（図13参照）。この発見はさらに別の3匹のラットでも繰り返すことができた。総合すれば、これらのデータは、持続的低酸素症によるタンパク質ホスファターゼの優先的な活性化は、シグナリング連鎖反応の決定的な工程で脱リン酸化によってpLTFへ至るメカニズムを停止させる（すなわち、前記“ブレーキ”の排除は持続的低酸素症後のpLTF発現を可能にする）という仮設を支持する（例えばPKC；図8）。
【００５３】
考察
本発明にしたがい、上記実施例は総合的に、断続的低酸素症に対するニューロン応答（及びおそらくはpLTF）におけるBDNF、MAPキナーゼ及びタンパク質ホスファターゼのそれぞれの役割を示している。出願人らはまた、断続的低酸素症と持続的低酸素症の、脊髄運動ニューロンにおける長期持続性機能的改変を誘引する弁別的能力を明らかにし、さらに重大な呼吸系制御障害、例えば閉塞性睡眠時呼吸障害、幼児突然死症候群、脊髄損傷後又は神経変性疾患時の呼吸不全の治療のための新規な治療方法の開発に論理的根拠を提供することができる。
特に、直接的（クモ膜下腔内）又は間接的（筋肉内）in vivoデリバリーを介して、例えばBDNF及びPP2Aのような遺伝子をsiRNA分子の標的にして、遺伝子発現に影響を与え、生理学的変化を生じることができる。上記で具体的に示したように、本発明は、siRNA組成物を哺乳動物のクモ膜下腔に直接にデリバーしてBDNF mRNAとの効果的な干渉を提供する。BDNF mRNAとの干渉は、断続的低酸素症と称される酸素流低下によって誘引される頸部脊髄におけるBDNFの増加を阻止した（断続的低酸素症は、横隔神経長期促通（pLTF）として知られるセロトニン依存脊髄シナプス適応性の一形態を惹起する）。
さらにまた、本発明では、BDNF siRNA組成物の筋肉内への（神経細胞によって支配される筋肉への）間接的デリバリーによって血中の循環RNA分解酵素からsiRNA分子が保護され、無傷のsiRNA分子の神経細胞への輸送がもたらされる。siRNA分子の筋肉から神経細胞へのこの間接的な輸送は、断続的低酸素症後の舌下神経（舌の運動神経）におけるLTFの阻止をもたらしたが、横隔神経（横隔膜と結合）運動アウトプットの阻止は生じず、又siRNAがどこに注射されるかに応じて逆もまた真なりであった。これらの発見は、BDNFの新規な役割及び調節メカニズムを明示し、さらに、脳及び脊髄の遺伝子機能をin vivoで解明し操作するためにsiRNA技術を用いることの有用性を明らかにする。
上述の発明は明快な理解のために例示及び実施例により詳細に記載してきたが、本発明の教示にしたがってある種の変更及び改変を添付の請求の範囲を外れることなく実施できることは当業者には明白であろう。
【００５４】
参考文献
1. Mitchell, G.S. & Johnson, S.M. Neuroplasticity in respiratory motor control. J. Appl. Physiol. 94, 358-374 (2003). 
2. Feldman, J.L., Mitchell, G.S. & Nattie, E.E. Breathing: Rhythmicity, plasticity and chemosensitivity. Annu. Rev. Neurosci. 26, 239-266 (2003).
3. Baker, T.L., Fuller, D.D., Zabka, A.G. & Mitchell, G.S. Respiratory plasticity: differential actions of continuous and episodic hypoxia and hypercapnia. Respir. Physiol. 129, 25-35 (2001).
4. Mitchell, G.S. et al. Intermittent hypoxia and respiratory plasticity. J. Appl. Physiol. 90, 2466-2475 (2001).
5. Prabhakar, N.R. Oxygen sensing during intermittent hypoxia: cellular and molecular mechanisms. J. Appl. Physiol. 90, 1986-1994 (2001).
6. Fuller, D.D., Zabka, A.G., Baker, T.L. & Mitchell, G.S. Selected Contribution: Phrenic long-term facilitation requires 5-HT receptor activation during but not following episodic hypoxia. J. Appl. Physiol. 90, 2001-2006 (2001). 
7. Baker-Herman, T.L. & Mitchell, G.S. Phrenic long-term facilitation requires spinal serotonin receptor activation and protein synthesis. J. Neurosci. 22, 6239-6246 (2002).
8. Thoenen, H. Neurotrophins and neuronal plasticity. Science 270, 593-598 (1995).
9. Thoenen, H. Neurotrophins and activity-dependent plasticity. Prog. Brain Res. 128, 183-191 (2000).
10. Black, I.B. Trophic regulation of synaptic plasticity. J. Neurobiol. 41, 108-118 (1999).
【００５５】
11. Schinder, A.F. & Poo, M-m. The neurotrophin hypothesis for synaptic plasticity. Trends Neurosci. 23, 639-645 (2000).
12. Poo, M-m. Neurotrophins as synaptic modulators. Nature Rev. 2, 1-9 (2001).
13. Bach, K.B. & Mitchell, G.S. Hypercapnia-induced long-term depression of respiratory activity requires a2-adrenergic receptors. J. Appl. Physiol. 84, 2099-2105 (1998).
14. Fire, A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-811 (1998).
15. Hammond, S.M., Bernstein, E., Beach, D. & Hannon, G.J. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature 404, 293-296 (2000).
16. Bavis, R.W. & Mitchell, G.S. Selected Contribution: Intermittent hypoxia induces phrenic long-term facilitation in carotid-denervated rats. J. Appl. Physiol. 94, 399-409 (2003). 
17. Solomon, I.C. Excitation of phrenic and sympathetic output during acute hypoxia: contribution of medullary oxygen detectors. Respir. Physiol. 121, 101-117 (2000).
18. Bodineau, L. & Larnicol, N. Brainstem and hypothalamic areas activated by tissue hypoxia: Fos-like immunoreactivity induced by carbon monoxide inhalation in the rat. Neuroscience 108, 643-653 (2001).
19. Kokaia, Z. et al. Regional brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein levels following transient forebrain ischemia in the rat. Brain Res. Mol. Brain Res. 38, 139-144 (1996).
20. Blitz, D.M. & Rameriz, J.M. Long-term modulation of respiratory network activity following anoxia in vitro. J. Neurophysiol. 87, 2964-2971 (2002).
【００５６】
21. Patterson, S.L., Grover, L.M., Schwartzkroin, P.A. & Bothwell, M. Neurotrophin expression in rat hippocampal slices: a stimulus paradigm inducing LTP in CA1 evokes increases in BDNF and NT-3 mRNAs. Neuron 9, 1081-1088 (1992).
22. Richerson, G.B., Wang, W., Tiwari, J. & Bradley, S.R. Chemosensitivity of serotonergic neurons in the rostral ventral medulla. Respir. Physiol. 129, 175-190 (2001).
23. Veasey, S.C., Fornal, C.A., Metzler, C.W. & Jacobs, B.L. Response of serotonergic caudal raphe neurons in relation to specific motor activities in freely moving cats. J. Neurosci. 15, 5346-5359 (1995).
24. Uchino, H., Lindvall, O., Siesjo, B.K. & Kokaia, Z. Hyperglycemia and hypercapnia suppress BDNF gene expression in vulnerable regions after transient forebrain ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 1303-1308 (1997).
25. Caplen, N.J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A. & Morgan, R.A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9742-9747 (2001).
26. Elbashir, S.M. et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 411, 494-498 (2001).
27. Basura, G.J., Zhou, S.Y., Walker, P.D. & Goshgarian, H.G. Distribution of serotonin 2A and 2C receptor mRNA expression in the cervical ventral horn and phrenic motoneurons following spinal cord hemisection. Exp. Neurol. 169, 255-263 (2001).
28. Balkowiec A. & Katz, D.M.. Activity-dependent release of endogenous brain-derived neurotrophic factor from primary sensory neurons detected by ELISA in situ. J. Neurosci. 20, 7417-7423 (2000).
29. Tongiorgi, E., Righi, M. & Cattaneo, A. Activity-dependent dendritic targeting of BDNF and TrkB mRNAs in hippocampal neurons. J. Neurosci. 17, 9492-9505 (1997).
30. Li, Y.X., Zhang, Y., Lester, H.A., Schuman, E.M. & Davidson, N. Enhancement of neurotransmitter release induced by brain-derived neurotrophic factor in cultured hippocampal neurons. J. Neurosci. 18, 10231-10240 (1998).
【００５７】
31. Schinder, A.F., Berninger, B. & Poo, M. Postsynaptic target specificity of neurotrophin-induced presynaptic potentiation. Neuron 25, 151-163 (2000).
32. Levine, E.S., Crozier, R.A., Black, I.B. & Plummer, M.R. Brain-derived neurotrophic factor modulates hippocampal synaptic transmission by increasing N-methyl-D-aspartic acid receptor activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 10235-10239 (1998).
33. Grosshans, D.R., Clayton, D.A., Coultrap, S.J. & Browning, M.D. LTP leads to rapid surface expression of NMDA but not AMPA receptors in adult rat CA1. Nat. Neurosci. 5, 27-33 (2002).
34. Malinow, R. & Malenka, R.C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annu. Rev. Neurosci. 25, 103-126 (2002).
35. Tanaka, T., Saito, H. & Matsuki, N. Inhibition of GABAA synaptic responses by brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in rat hippocampus. J. Neurosci. 17, 2959-2966 (1997).
36. Kafitz, K.W., Rose, C.R., Thoenen, H. & Konnerth, A. Neurotrophin-evoked rapid excitation through TrkB receptors. Nature 401, 918-921 (1999).
37. Ling, L. et al. Chronic intermittent hypoxia elicits serotonin-dependent plasticity in the central neural control of breathing. J. Neurosci. 21, 5381-5388(2001).
38. Kinkead, R. et al. Cervical dorsal rhizotomy enhances serotonergic innervation of phrenic motoneurons and serotonin-dependent long-term facilitation of phrenic motor output in rats. J. Neurosci. 18, 8436-8443 (1998).
39. Johnson, R.A., Okragly, A.J., Haak-Frendscho, M. & Mitchell, G.S. Cervical dorsal rhizotomy increases brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 expression in the ventral spinal cord. J. Neurosci. 20, RC77 1-5 (2000).
40. Kinney, H.C., Filiano, J.J. & White, W.F. Medullary serotonergic network deficiency in the sudden infant death syndrome: review of a 15-year study of a single dataset. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 60, 228-247 (2001).
【００５８】
41. Strollo, P.J. & Rogers, R.M. Obstructive sleep apnea. N. Engl. J. Med. 334, 99-104 (1996).
42. Bixler, E.O. et al. Prevalence of sleep-disordered breathing in women: effects of gender. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 608-613 (2001).
43. Young, T., Peppard, P.E. & Gottlieb, D.J. Epidemiology of obstructive sleep apnea: a population health perspective. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165, 1217-1239 (2002).
44. Veasey, S.C., Panckeri, K.A., Hoffman, E.A., Pack, A.I. & Hendricks, J.C. The effects of serotonin antagonists in an animal model of sleep-disordered breathing. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153, 776-786 (1996).
45. Zabka, A.G., Behan, M., Mitchell, G.S. Long term facilitation of respiratory motor output decreases with age in male rats. J. Physiol. 531, 509-514 (2001).
46. Jackson, A.B. & Groomes, T.E. Incidence of respiratory complication following spinal cord injury. Arch. Phys. Med. Rehabil. 75, 270-275 (1994).
47. Mansel, J.K. & Norman, J.R. Respiratory complications and management of spinal cord injuries. Chest 97, 1446-1452 (1990).
48. Fuller, D.D., Johnson, S.M., Olson, E.B. Jr. & Mitchell, G.S. Synaptic pathways to phrenic motoneurons are enhanced by chronic intermittent hypoxia following cervical spinal cord injury. J. Neurosci. 23, 2993-3000. (2003).
49. Thoenen, H. & Sendtner, M. Neurotrophins: from enthusiastic expectations through sobering experiences to rational therapeutic approaches. Nat. Neurosci. 5, 1046-1050  (2002).
50. Millhorn DE, Eldridge FL, Waldrop TG (1980a). Prolonged stimulation of respiration by a new central neural mechanism. Respir Physiol 41:87-103.
51. Millhorn DE, Eldridge FL, Waldrop TG (1980b). Prolonged stimulation of respiration by endogenous central serotonin. Respir Physiol 42:171-88.
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図1a−bは、断続的な低酸素症は、pLTFとして知られる横隔運動ニューロン適応性の一形態、及び横隔運動核と結合した腹側脊髄分節でBDNF合成の増加を誘引することを示す。（a）：3回、5分の低酸素症エピソード（11%O2）の前および60分後に得られる典型的な未加工及び積算した横隔神経ニューログラムを示す。この例では、横隔神経アンプリチュードは低酸素症の60分後には基準値レベルより80%増加し、pLTFを示している。（b）：3回、5分の低酸素症エピソードの60分後に、BDNF濃度は、低酸素症を施されなかったコントロールと比較したとき腹側脊髄分節C3−C5で増加した。*有意な増加（P＜0.05）；データは平均±SEMである。
【図２】図2a−cは、断続的低酸素症後の腹側頸部BDNFの調節を示すグラフである。（a）：低酸素症前にクモ膜下腔内に人工CSF、メチセルジド又はエメチンで前処理したラットにおける、対応コントロールに対し％増加で表したBDNF濃度を示す。クモ膜下腔内に人工CSF注射を受けたラットは、断続的低酸素症の60分後の腹側C3−C5BDNF濃度で有意な増加を示した。クモ膜下腔内メチセルジド又はエメチンは、断続的低酸素症の60分後のBDNF増加を阻止し、BDNF合成のセロトニン依存増加を示唆した。（b）：断続的低酸素症（CSNX-擬似）、断続的低酸素症＋頚動脈神経切断（CSNX）又は断続的高炭酸ガス症に暴露したラットにおける、対応コントロールに対し％増加で表したBDNF濃度を示す。（c）：断続的低酸素症又は高炭酸ガス症の60分後の腹側頸部脊髄分節中のBDNFにおける平均的変化（％コントロール）と平均的pLTF（％基準値）との間の相関性を示す。グループは以下のとおりである：人口 CSF及び断続的低酸素症（黒丸）；クモ膜下腔内注射無しの断続的低酸素症（黒丸）；クモ膜下腔内メチセルジド及び断続的低酸素症（黒四角）；クモ膜下腔内エメチン及び断続的低酸素症（下向き黒三角）；CSNX-擬似処理及び断続的低酸素症（上向き黒三角）；CSNX処理及び断続的低酸素症（上向き黒三角）；断続的高炭酸ガス症（黒ダイヤ）；及びsiRNA及び断続的低酸素症（黒四角）。低酸素症後60分の平均pLTFはBDNFのパーセント増加と強い相関性を示す（R2＝0.67、P＝0.01）。*有意の増加、（P＜0.05）；データは平均±SEMである。
【図３】図3a−cは、クモ膜下腔内BDNFは横隔運動アウトプットを促進することを示す。（a）：クモ膜下腔内BDNF（100ng）注射前、注射時、及び注射後90分の積算横隔膜ディスチャージの代表的なトレースを示す。（b）：クモ膜下腔内BDNF（黒丸）の30分後、60分後及び90分後の横隔神経バーストアンプリチュードのパーセント変化を示す平均的データである。賦形剤（人工CSF＋0.1%BSA；黒四角）又はBDNF＋K252a（黒三角）。（c）：クモ膜下腔内BDNFはXII活性に影響は与えず、脊髄の作用部位を示唆した。*基準値より有意に増加及び他の群から有意に相違することを示す（P＜0.05）；データは平均±SEMである。
【図４】図4a−bは、BDNF siRNAは、in vitroでBDNF mRNAを、さらにin vivoで低酸素症誘発BDNF合成を減少させることを示している。（a）：BDNF mRNAは、HT-22細胞でトランスフェクション後24時間でコントロールより75%減少する。（b）：成獣ラットへのBDNF siRNAのクモ膜下腔内注射3時間後に腹側灰白質（C4−C5）のBDNFタンパク質基準値レベルに有意な変化はないことを示す。しかしながら、断続的低酸素症で通常観察されるBDNF濃度の増加は、BDNF siRNAの先行投与によって阻止される。*基準値より有意な相違、#有意に相違するグループ（P＜0.05）；データは平均±SEMである。
【図５】図5a−cは、BDNF siRNA 及びK252aによるTrkレセプター阻害はpLTFを阻止することを示す。（a）：3回5分間の低酸素症エピソード中及びその後のpLTFの発生を示す代表的な積算横隔神経ニューログラムを示す。（b）クモ膜下腔内BDNF（非スクランブル）siRNA前処理は、断続的低酸素症60分後のpLTFを阻止する（基準活性に対する%変化）ことを示す平均的データである。（c）：クモ膜下腔内K252a前処理は、賦形剤注射を投与されたラットと比較したとき、断続的低酸素症60分後のpLTFを減弱させることを示す平均的データである。*基準値より有意な増加及び他の処理群とは有意な相違（P＜0.05）；データは平均±SEMである。
【図６】図6は、BDNF siRNA組成物の舌の筋肉への注射は、舌下神経活性でLTFを阻害し、一方、横隔神経のLTFを無傷で残すことができることを示すグラフである。この実験は、筋肉内注射によって、筋肉内siRNA注射の3日後に、限局した運動ニューロン集団の機能に影響を与えることができることを示している（ここでは舌下LTFの阻害（横隔膜LTFの阻害ではない）として表される）。
【図７】図7は、BDNF siRNAの横隔膜注射は、横隔神経LTF（XII LTFではない）を停止させることを示している。黒い棒線は、断続的低酸素症60分後の麻酔ラットにおける平均的横隔LTF及びXII LTFを示す。灰色の棒線は、低酸素症暴露の3日前にBDNF siRNAの横隔膜注射を与えたラットにおける、断続的低酸素症の60分後での横隔神経及びXII神経活性（％基準値）を示す。したがって、横隔神経運動ニューロン内のBDNFは横隔LTFのために必要であろう。*有意なpLTFを示す（ｐ＜0.05）。この実験は図6を補完し、横隔神経運動ニューロンは、舌下神経（舌の）運動ニューロンとは独立して、siRNAの横隔膜注射により標的とすることができることを示している。さらにまた、この実験は、siRNAの筋肉内注射は特定の神経細胞集団の活動に効果的に影響を与えることができ、したがってRNA干渉の使用によって遺伝子を標的とする治療に用いることができるという議論を支持する。
【図８】図8a−bは本発明の基本的概念を示し、この場合、キナーゼ及びホスファターゼ活性化の弁別的バランスは、それらのpLTF誘引能力における断続的低酸素症（a）と持続的低酸素症（b）との間の相違の原因となる。持続的低酸素症では、ホスファターゼ活性化はpLTFにいたるメカニズムを停止させる。相補的配列をもつsiRNAによるキナーゼ又はホスファターゼmRNAを標的とすることによって、BDNFの発現及びBDNFによって誘発される神経適応性（neuroplasticity）を調節することができる。
【図９】図9は、断続的（持続的ではない）低酸素症は腹側頸部灰白質におけるBDNFを増加させることを示す。特に、BDNFタンパク質濃度は、腹側C4−C5で断続的（持続的ではない）低酸素症の60分後に無麻酔ラット（n=4/群）で増加する。*はコントロールより有意に高いことを示す（ｐ＜0.05）。
【図１０】図10A−Bは、断続的（持続的ではない）低酸素症が継続的なERK1/2 MAPキナーゼの活性化を誘引することを示す。（A）：酸素正常状態（コントロール）、断続的低酸素症（IH）又は持続的低酸素症（SH）下のラットの腹側C4−C5灰白質におけるリン酸化（活性化）ERK1/2 MAPキナーゼのイムノブロット。組織を低酸素症の60分後に採集した。さらにまた、断続的（持続的ではない）低酸素症は、横隔神経運動核と結合する脊髄領域で継続的なERK1/2 MAPキナーゼの活性化を誘引することが示されている（B）。覚醒ラットにおける断続的又は持続的低酸素症の60分後（各々n=4）の腹側C4−C5灰白質におけるリン酸化ERK1/2 MAPキナーゼの平均濃度が、総ERK1/2 MAPキナーゼに対して標準化され、酸素正常状態下のラットに対するパーセント変化として表されている。*持続的低酸素症に対し有意な増加及び相違を示す（ｐ＜0.05）。
【図１１】図11は、ERK1/2 MAPキナーゼ活性化はBDNF依存であることを示す。特に、BDNF合成が、横隔神経運動ニューロン近傍での断続的低酸素症（IH）誘発ERK1/2の活性化に必要であることを示す、酵素により活性化された（リン酸化された）ERK1/2 MAPキナーゼのイムノブロットが示されている。BDNF siRNAは、断続的低酸素症の1.5時間前にC4上に注射された。腹側灰白質C4−C5を低酸素症の60分後に採集した。コントロールラットは同等な時間BDNF siRNAを投与されたが、低酸素症には暴露されなかった。この実験は、BDNF siRNAの投与は下流のシグナリング分子の活性化を調節できることを示している。
【図１２】図12は、持続的（断続的ではない）低酸素症はタンパク質ホスファターゼ2（PP2）活性を高めることを示している。覚醒ラットを酸素正常状態、断続的低酸素症（IH）又は持続的低酸素症（SH）に暴露した（各処置につきn=1）。低酸素症の15分後に、腹側C4−C5を採集し、タンパク質ホスファターゼ2活性についてアッセイした。持続的低酸素症に暴露されたラットは、酸素正常状態又は断続的低酸素症下のラットと比較してPP2活性が増加した。各サンプルはトリプリケートでアッセイした。誤差表示線はトリプリケートの標準偏差を示す。
【図１３】図13は、持続的低酸素症は、タンパク質ホスファターゼ阻害後に横隔LTFを誘引することを示す。オカダ酸（okadaic acid）によるタンパク質ホスファターゼの脊髄内阻害によって、持続的低酸素症に暴露されたラット（SH+オカダ酸）でpLTFが示された。他のラットでは、断続的（持続的ではない）低酸素症（IH）は低酸素症の60分後にpLTFを誘引する。*はIHよりも有意に低い応答を示す（ｐ＜0.05）。この実験は、siRNAによりタンパク質ホスファターゼを標的にすることによって、BDNF及び他の下流の分子の発現を調節する分子に影響を与えることができることを示している。したがって、タンパク質ホスファターゼを標的とし、これを分解することによって、BDNF機能を強化することができる。
【図１】
2007513968.tif 000002
【図２】
2007513968.tif 000003
【図３】
2007513968.tif 000004
【図４】
2007513968.tif 000005
【図５】
2007513968.tif 000006
【図６】
2007513968.tif 000007
【図７】
2007513968.tif 000008
【図８】
2007513968.tif 000009
【図９】
2007513968.tif 000010
【図１０】
2007513968.tif 000011
【図１１】
2007513968.tif 000012
【図１２】
2007513968.tif 000013
【図１３】
2007513968.tif 000014
【配列表】
2007513968000001.app
【国際調査報告】
2007513968.tif 000015
2007513968.tif 000016
2007513968.tif 000017