(57)【要約】プロテオソームをベースとするアジュバントとともに麻疹ウイルス抗原を含む組成物、ならびに、プロテオソームをベースとするアジュバントを含む麻疹ウイルス抗原の治療用組成物を作製し、使用するための方法が提供される。麻疹ウイルス抗原は、種々の供給原に由来し、例えば、組み換え産生によるか、または分割抗原調製物に由来し得る。麻疹ワクチン処方物は、例えば、麻疹ウイルスによる感染を処置または予防するための方法において、および防御免疫応答を誘発するための方法において使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アジュバントと、１つ以上の麻疹ウイルス抗原とを含む免疫原性組成物であって、該アジュバントは、プロテオソームとリポ糖とを含み、少なくとも１つの麻疹抗原がＨタンパク質である、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記アジュバントと、Ｆタンパク質およびＨタンパク質を含む２つ以上の麻疹ウイルス抗原とを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
１つ以上の麻疹ウイルス抗原が組換え麻疹抗原である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
１つ以上の麻疹抗原が麻疹分割抗原である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記麻疹分割抗原が、Ｍｏｒａｔｅｎ株、Ｓｃｈｗａｒｚ株、Ｚａｇｒｅｂ株、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株に由来する、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
プロテオソームタンパク質の重量パーセントとしてのリポ糖の最終含有量が約１０％から５００％までの範囲である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記プロテオソームと前記リポ糖とが同じ細菌から得られる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記プロテオソームと前記リポ糖とが異なる細菌から得られる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記プロテオソームがナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の種から得られる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記リポ糖が、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プレシオモナス属（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種から得られるものである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記免疫原性組成物が、１つ以上のさらなる微生物抗原をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記１つ以上のさらなる微生物抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、またはそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
麻疹ウイルス抗原に対するプロテオソームの割合が、少なくとも４：１である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
麻疹ウイルス抗原に対するプロテオソームの割合が、少なくとも２：１である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
アジュバントと、１つ以上の麻疹ウイルス抗原とを含む免疫原性組成物であって、該アジュバントはプロテオソームを含み、該少なくとも１つの麻疹ウイルス抗原がＨタンパク質である、免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントと、Ｆタンパク質およびＨタンパク質を含む２つ以上の麻疹ウイルス抗原とを含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
１つ以上の麻疹ウイルス抗原が組換え麻疹抗原である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
１つ以上の麻疹ウイルス抗原が麻疹分割抗原である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
前記麻疹分割抗原が、Ｍｏｒａｔｅｎ株、Ｓｃｈｗａｒｚ株、Ｚａｇｒｅｂ株、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株に由来する、請求項１８に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
前記プロテオソームが髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２１】
麻疹ウイルス抗原に対するプロテオソームの割合が、少なくとも４：１である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２２】
麻疹ウイルス抗原に対するプロテオソームの割合が、少なくとも２：１である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物が、少なくとも１つのさらなる微生物抗原をさらに含む、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのさらなる微生物抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、またはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の免疫原性組成物。
【請求項２５】
前記プロテオソームが髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から得られる、請求項２１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２６】
前記プロテオソームが髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から得られ、そして前記リポ糖がフレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）から得られる、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
請求項１から４、１３から１８、２１、および２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を、それが必要である被験体に投与する工程を包含する、麻疹感染を処置または予防する方法。
【請求項２９】
前記免疫原性組成物が、粘膜、腸内、非経口、経皮、経粘膜、鼻腔内、および吸入からなる群より選択される経路によって投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫原性組成物が鼻腔内に投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１から４、１３から１８、２１、および２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を、それが必要である被験体に投与する工程を包含する、免疫応答を誘発する方法。
【請求項３２】
前記免疫原性組成物が非経口的にまたは鼻腔内に投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫応答が粘膜免疫応答を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記粘膜免疫応答が、ＩｇＡ免疫グロブリンの産生を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫応答が、細胞性応答を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫応答が、全身性体液性応答を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
免疫応答を誘発するための方法であって、（ａ）少なくとも１つの麻疹ウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドに対して動作可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組み換え発現ベクターを、それが必要である被験体に投与する工程、該工程に続く（ｂ）請求項１から４、１３から１８、２１、および２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を少なくとも１回投与する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
工程（ｂ）において、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物が投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記免疫原性組成物が非経口的にまたは鼻腔内に投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記免疫応答が、粘膜免疫応答を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記粘膜免疫応答が、ＩｇＡ免疫グロブリンの産生を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記免疫応答が、細胞性応答を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫応答が、全身性体液性応答を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
麻疹感染を処置または予防するための方法であって、（ａ）少なくとも１つの麻疹ウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドに対して動作可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組み換え発現ベクターを、それが必要である被験体に投与する工程、該工程に続く（ｂ）請求項１から４、１３から１８、２１、および２２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を少なくとも１回投与する工程を包含する、方法。
【請求項４５】
工程（ｂ）において、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物が投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記組成物が、粘膜、腸内、非経口、経皮、経粘膜、鼻腔内、および吸入からなる群より選択される経路によって投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記免疫原性組成物が鼻腔内に投与される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、ワクチンと、感染性疾患の処置または予防に関する。より具体的には、本発明は、プロテオソームアジュバント、または麻疹ウイルス抗原とともに処方されるプロテオソーム：リポ糖アジュバントを含む組成物、ならびにそれらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連分野の説明）
麻疹は、伝染性の強い疾患であり、毎年およそ４０００万人がこれに感染し、これによって９０万人を超える人が死亡している（ＷＨＯ／ＵＮＩＣＥＦ，Ｊｏｉｎｔ  ＷＨＯ／ＵＮＩＣＥＦ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｏｎ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｌｅｓ，Ｗｅｅｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｃｏｒｄ  １９：１３３，１９８７）。２００１年には、世界保健機構（ＷＨＯ）とＵＮＩＣＥＦによって、開発途上国向けのワクチン接種キャンペーンを通じて、麻疹による死亡数を２００５年までに少なくとも５０％減少させるためのプログラムが発表された。これは、世界中の８０％以上において８０％以上が確保されることによって達成される（すなわち；非特許文献１）。現在使用されている生の弱毒化ワクチンは有効ではあるが、深刻な限界がある。具体的には、中和母体抗体の存在が原因で、しばしば、９ヶ月未満の月齢の子供の防御ができないことがある（非特許文献２；非特許文献３）。麻疹ウイルス（ＭＶ）に伴う死亡の３０％から５０％が、この受攻期に生じる。母体抗麻疹抗体力価は非常に幅広く変化し、受動的に獲得した抗体は、通常、３から４週間の半減期を有する。結果として、乳児は、誕生から１歳までの間のほぼいずれかの時点で、麻疹にかかりやすくなる（非特許文献４）。
【０００３】
現在利用されている生の弱毒化ワクチンを使用して母体抗体による妨害をバイパスするいくつかの試みが行われてきた。高力価の生（感染性）の麻疹ウイルスワクチン（標準的なワクチン接種のついての１０３．４プラーク形成単位（ＰＦＵ）と比較してワクチン株ウイルスの１０６．３ＰＦＵまでを有している）が試みられ（非特許文献３）、エアゾール投与が試みられた（非特許文献５）。前者のアプローチによっては、３ヶ月程度の月齢の乳児はうまく防御することができたが、これには、あまり理解されていない理由による幼児死亡率の増大が伴った。このような致死率は、生の麻疹ウイルスまたは弱毒化麻疹ウイルスを含むワクチンの投与に関係している可能性がある。生ワクチンＭＶ株のエアゾール投与を用いた早い段階での結果もまた、期待された。しかし、極めて高度な送達システムが必要とされる投与は、非常に面倒である。認められてはいないが、これらの試みにより、２〜３ヶ月の月齢の乳児にはＭＶ抗原に反応する能力が生まれつき備わっていること、および粘膜免疫は母体抗体の妨害に左右されないことが明らかにされている。
【０００４】
宿主中で防御免疫応答を誘導する抗原の能力は、抗原を、免疫賦活剤および／またはアジュバントと混合することによって高めることができる。ミョウバンをベースとするアジュバントは、認可の注射可能なヒト用ワクチンについてほぼ例外なく使用されている。しかし、ミョウバンは特定のタイプの血清抗体反応（２型）を高めるが、他のタイプの抗体反応（１型）を高めることはほとんどなく、例えば、細胞内病原体に対する防御について重要である細胞性の免疫応答の十分ではない活性化因子である。
【非特許文献１】Ｏｒｅｎｓｔｅｉｎら，「Ａｍ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ（２０００）第９０巻：ｐ．１５２１
【非特許文献２】Ａｌｂｒｅｃｈｔら、「Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．」（１９７７）、第９１巻：ｐ．７１５
【非特許文献３】Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、「Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．」（１９９０）、第３２２巻：ｐ．５８０
【非特許文献４】Ｃｒｏｗｅ、「Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．」（２００１）、第３３巻：ｐ．１７２０
【非特許文献５】Ｂｅｎｎｅｔｔら、「Ｂｕｌｌ．Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．」（２００２）、第８０巻：ｐ．８０６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、麻疹感染に対して治療的に有効である組成物、具体的には、ワクチンとして機能し、防御免疫を誘発することができるそのような組成物を同定し、開発する必要がある。さらに、ヒトに対して安全であり、防御性の全身的、および粘膜、体液性、および細胞性の免疫応答の誘導を増強することができる強力なアジュバントを含むワクチン処方物、具体的には、サブユニットワクチン処方物が必要とされている。本発明は、このような必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明により、プロテオソーム処方麻疹ワクチン組成物とその治療的使用が提供される。これらのワクチンは、麻疹感染を処置または予防するための防御免疫応答を簡単に生じ、そのような防御免疫反応を誘発することができる。麻疹抗原には、１つ以上の組み換えまたは合成によって生産された麻疹ポリペプチドが含まれる場合があり、また、麻疹ウイルス粒子または感染した宿主細胞から単離された１つ以上の麻疹ポリペプチドが含まれる場合もある。麻疹抗原には、少なくとも１つの麻疹ウイルスポリペプチド、例えば、麻疹ウイルスＨタンパク質またはＦタンパク質が含まれ、また、中和抗体反応もしくは細胞性免疫を誘発することができる、２つ以上の麻疹ウイルス抗原が含まれる場合もある。プロテオソーム処方アジュバントには、グラム陰性細菌（プロジュバント）から得られた外膜タンパク質、または外膜タンパク質とリポ糖の組み合わせ（ＯＭＰ−ＬＰＳ）が含まれる場合もある。
【０００７】
１つの態様においては、本発明により、アジュバントと、１つ以上の麻疹ウイルス抗原を含む免疫原性組成物が提供される。ここでは、アジュバントには、プロテオソームとリポ糖が含まれ、少なくとも１つの麻疹抗原がＨタンパク質である。特定の実施形態においては、免疫原性組成物には、Ｆタンパク質とＨタンパク質を含む少なくとも２つの麻疹ウイルス抗原が含まれる。他の実施形態においては、１つ以上の麻疹ウイルス抗原は組換え体である麻疹抗原であるか、または麻疹分割抗原（ｓｐｌｉｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）である。関連する実施形態においては、麻疹分割抗原は、麻疹ウイルスのＭｏｒａｔｅｎ株、Ｓｈｗａｒｚ株、Ｚａｇｒｅｂ株、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株に由来する抗原である。さらに他の実施形態においては、免疫原性組成物のプロテオソームタンパク質の重量パーセントとしてのリポ糖の最終含有量は、約１０％から５００％までの範囲である。さらに別の実施形態においては、プロテオソームとリポ糖は、同じ細菌から得られるものであるか、または、別の細菌から得られるものである。他の実施形態においては、プロテオソームは、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種に由来する。さらに他の実施形態においては、リポ糖は、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プレシオモナス属（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種に由来する。特定の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物にはさらに、１つ以上の別の微生物抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、またはそれらの組み合わせが含まれる。特定の実施形態においては、上記免疫原性組成物のいずれかには、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤が含まれる。
【０００８】
別の実施形態においては、本発明により、アジュバントと１つ以上の麻疹ウイルス抗原を含む免疫原性組成物が提供される。ここでは、アジュバントにはプロテオソームが含まれ、少なくとも１つの麻疹抗原がＨタンパク質である。特定の実施形態においては、組成物には、Ｆタンパク質とＨタンパク質を含む少なくとも２つの麻疹ウイルス抗原が含まれる。他の実施形態においては、１つ以上の麻疹ウイルス抗原は組換え体である麻疹抗原であるか、または麻疹分割抗原である。関連する実施形態においては、麻疹分割抗原は、Ｍｏｒａｔｅｎ株、Ｓｈｗａｒｚ株、Ｚａｇｒｅｂ株、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株に由来する抗原である。他の実施形態においては、プロテオソームは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する。さらに他の実施形態においては、麻疹ウイルス抗原に対するプロテオソームの割合は、少なくとも２：１、３：１、または４：１である。特定の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物には、さらに、１つ以上の別の微生物抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、またはそれらの組み合わせが含まれる。他の実施形態においては、上記免疫原性組成物のいずれかには、さらに、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤が含まれる。
【０００９】
さらに別の実施形態においては、本発明により、上記の免疫原性組成物のいずれかをそれが必要である被験体に投与することを含む、麻疹感染を処置または予防する方法が提供される。関連する態様においては、本発明は、上記の免疫原性組成物のいずれかをそれが必要である被験体に投与することを含む、免疫応答を誘発する方法に関する。特定の実施形態においては、免疫応答には、粘膜免疫応答が含まれる。他の実施形態においては、免疫応答には、細胞性応答が含まれる。特定の実施形態においては、上記の免疫原性組成物は、粘膜、腸内、非経口、経皮、経粘膜的、鼻腔内、または吸入から選択される経路によって投与され得る。
【００１０】
１つの実施形態においては、本発明により、少なくとも１つの麻疹ウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドに対して動作可能であるように連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組み換え発現ベクターをそれが必要である被験体に投与すること、その後、少なくとも１回、上記の免疫原性組成物のいずれか１つの組成物を投与することを含む、免疫応答を誘発するための方法が提供される。特定の実施形態においては、少なくとも１つの麻疹ウイルス抗原がＨタンパク質である；別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、Ｈタンパク質とＦタンパク質である少なくとも２つの麻疹ウイルス抗原をコードする。別の実施形態においては、この方法には、組成物を鼻腔内に投与することが含まれる。特定の実施形態においては、免疫応答は全身性体液性応答；粘膜免疫応答（ここでは、粘膜応答には、ＩｇＡ免疫グロブリンの生産が含まれる）；および／または細胞性免疫応答である。
【００１１】
１つの実施形態においては、少なくとも１つの麻疹ウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドに対して動作可能であるように連結された少なくとも１つのプロモーターを含む組み換え発現ベクターを投与すること、その後、少なくとも１回、上記の免疫原性組成物のいずれか１つを投与することを含む、麻疹感染を処置または予防するための方法が提供される。特定の実施形態においては、少なくとも１つの麻疹ウイルス抗原がＨタンパク質である；別の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、Ｈタンパク質とＦタンパク質である少なくとも２つの麻疹ウイルス抗原をコードする。別の実施形態においては、この方法には、組成物を鼻腔内に投与することが含まれる。特定の実施形態においては、免疫応答は粘膜免疫応答であり、別の実施形態においては、粘膜応答は細胞性免疫応答である。
【００１２】
別の実施形態においては、アジュバントと本明細書中に記載される１つ以上の麻疹ウイルス抗原を含む免疫原性組成物は、被験体の麻疹感染を処置または予防するための医薬品の製造に使用することができる。別の実施形態においては、このような免疫原性組成物を、免疫応答を誘発するための医薬品の製造に使用することができる。特定の実施形態においては、免疫応答は全身性体液性応答；粘膜応答（ここでは、粘膜応答には、ＩｇＡ免疫グロブリンの生産が含まれる）；および／または細胞性免疫応答である。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の詳細な説明と添付の図面を参照して明らかになるであろう。さらに、公開されている文献についての様々な参照は、それらが本発明のさらに詳細な特定の態様において記載され、したがって、それらの全体が参照により組み入れられることを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に記載される発明は、プロテオソームをベースとするＭＶワクチン（プロテオソーム：リポ糖（ＬＰＳ−ＭＶワクチン）の鼻腔内投与が、気道と全身的な抗体応答の両方において粘膜応答を刺激することができるという驚くべき発見に関係する。さらに、本明細書中に記載されるワクチン組成物の動物（マウスおよび幼若アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）を含む）への投与により、組成物は宿主または被験体に安全に投与することができ、観察できる毒性作用または有害な作用を何ら伴わないことが示される。プロテオソームと１つ以上の麻疹ウイルス抗原を含む免疫原性組成物が、本明細書中でさらに詳細に議論される。これらは、麻疹感染を処置または予防するというような治療的な使用、ならびにそれらを調製するための方法に適している。
【００１５】
本発明により、プロテオソームをベースとするアジュバントとともに処方された１つ以上の麻疹抗原を含む治療用組成物が提供される。この組成物は、防御免疫応答を誘発するためのワクチンとして使用することができる。背景としては、生の弱毒化麻疹ワクチンが広く使用されており、推奨されている免疫化の月齢は６ヶ月から１５ヶ月までの範囲であるが、これはなおも議論中である（Ｖｏｌｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．９：３１１，１９９３）。呼吸経路からの免疫化は、より月齢の低い乳児について推奨されているが、このような試みは、中和母体抗体による妨害が原因で（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，前出）、うまくいかないかまたは実用的ではないかのいずれかであることが証明されている（Ｋｈａｎｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  １：１５０，１９８７）。さらに、現在の生の麻疹ワクチンの使用に関する欠点としては、ウイルスが最初に入り複製する粘膜表面の保護ができないこと、ワクチンの熱安定性が低いこと、注射の前に再構成が必要であること、および注射器具の汚染の危険があること、ならびに、免疫化後に生じる望ましくない副作用または合併症が挙げられる。
【００１６】
本明細書中では、任意の濃度範囲、パーセントの範囲、または整数の範囲は、別段の指定のない限りは、記載される範囲内の任意の整数の値を含み、そして適切である場合には、その端数（例えば、整数の１０分の１、および１００分の１）をも含むように理解される。本明細書中で使用される場合は、「約」または「本質的に〜を含む」は、±１５％を意味する。別の表現（例えば、「または」）の使用は、１つ、両方、または別の表現のそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されるべきである。本明細書中で使用される場合は、不定冠詞の使用、例えば、「ａ」または「ａｎ」は、名詞または名詞句の単数と複数を言うと理解されるべきである。さらに、本明細書中に記載される個々の組成物、処方物、もしくは化合物、または組成物の種々の成分もしくは組み合わせに由来する組成物、処方物、または化合物のグループ、あるいは、配列、構造、および置換は、組成物または化合物のそれぞれ、または組成物もしくは化合物のグループが個々に示されているかのように、同じ程度で本明細書によって開示されると理解されるべきである。したがって、特定の配列、構造、または置換の選択は、本発明の範囲内である。
【００１７】
（麻疹ウイルスポリペプチド免疫原）
本発明は、概して、Ｈタンパク質、Ｆタンパク質、Ｍタンパク質、Ｎタンパク質、Ｌタンパク質、Ｐタンパク質、またはそれらの断片を含む、麻疹ウイルス（ＭＶ）ポリペプチド免疫原に関する。これらには、他のポリペプチド（例えば、疎水性アミノ酸配列）への融合体もしくは他の修飾体（例えば、脂質の付加またはグリコシル化）が含まれる。免疫原性ＭＶポリペプチドには、ＭＶ感染に対して防御免疫応答（細胞性または体液性）を誘発することができる少なくとも１つのエピトープを有しているそのようなポリペプチドの任意の部分が含まれ得る。本発明の免疫原性ポリペプチドはまた、直線的な形態に並べることも、また、そのような形態で組み合わせることもでき、それぞれの免疫原が繰り返される場合も、また、繰り返されない場合もある。反復は、一回である場合も、また複数回である場合もある。さらに、複数の異なるＭＶ免疫原性ポリペプチド（例えば、種々のＨタンパク質、Ｆタンパク質、またはＮタンパク質変異体、あるいはそれらの断片）を選択することができ、防御免疫応答を誘発することにおいて使用される多価ワクチンを提供するように、混合組成物になるように混合または組み合わせることができる。ＭＶ感染を処置または予防するため、あるいは、ＭＶポリペプチド免疫原もしくはその断片、またはポリペプチドの組み合わせ（融合タンパク質を含む）を使用して免疫応答を誘発するための方法もまた意図される。
【００１８】
ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片は、感染した被験体の組織、または培養細胞株のような、種々の生物学的供給源から調製することができる。ＭＶの初代単離物は、例えば、末梢血細胞に由来するものである場合があり、また、気道の分泌物に由来するものである場合もある。好ましくは、単離されたＭＶは初代細胞培養物（例えば、ヒトの血液、肺、結膜、腎臓、小腸、羊膜、皮膚、筋肉、胸腺間質、包皮、または子宮の細胞、あるいは、サルの腎臓または精巣細胞）上で、あるいは、確立されている細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ、ＫＢ、ＣＶ−１、ＢＳＣ−１、Ｂ９５−８、ＷＩ−３８、ＭＲＣ−５、Ｈｅｐ−２、ＨｅＬａ、またはＡ５４９）上で増幅させられる。さらに好ましくは、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片は、当該分野で公知であるかまたは当該分野で後に確立される、確立されたＭＶワクチン株から調製される。１つの好ましい実施形態においては、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片は、Ｍｏｒａｔｅｎ株、Ｓｈｗａｒｚ株、Ｚａｇｒｅｂ株、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株から調製される。
【００１９】
特定の実施形態においては、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片は、完全なウイルス粒子から単離される。本明細書中で使用される場合は、用語「単離された」は、物質がそのもとの環境または自然界における環境から取り出されていることを意味する。例えば、生存している動物または細胞、またはウイルスの中に存在の天然に存在する核酸分子またはポリペプチドは単離されていないが、自然体系において一緒に存在している物質の一部または全てから離されると、これらの核酸分子またはポリペプチドは単離されている。核酸分子は、例えば、ベクターの一部であることもでき、そして／または、そのような核酸もしくはポリペプチドは組成物の一部であることもでき、そしてさらにそのようなベクター中に単離することもでき、また、組成物は、その自然界での環境の一部ではない。他の実施形態においては、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片は、部分的に精製されたもの、または均質になるように精製されたもののいずれかである場合もある。
【００２０】
本明細書中に記載され、当該分野で公知であるように、種々の方法を、本発明のＭＶポリペプチド免疫原またはその断片を単離または精製するために使用することができる。ＭＶは、選択された細胞株、例えば、Ｖｅｒｏ細胞（アフリカミドリザルの腎臓細胞）またはＣＶ−１上で増殖させることができ、ウイルス粒子は、哺乳動物細胞から部分的または実質的に分離することができる。例えば、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片の粗抽出物を、少なくとも１回の凍結−融解サイクルを行った感染細胞から調製し、遠心分離して細胞の破片を除去し、濾過することができ、そして、ウイルスを、限外濾過によって単離し、超音波処理し、薬学的に許容される希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水、ＰＢＳ）中に再懸濁することができる（実施例４を参照のこと）。あるいは、またはこれに加えて、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片を、界面活性剤抽出、またはショ糖密度勾配遠心分離法を使用して単離または精製して、定量化可能なＭＶ免疫原の量を得ることができる。本明細書中で使用される場合は、「麻疹分割抗原」の調製とは、完全な麻疹ウイルス粒子からのＭＶポリペプチドの分離、単離、または精製をいう。１つの好ましい実施形態においては、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片には、麻疹分割抗原が含まれる。これは、例えば、界面活性剤での可溶化によって調製することができる。
【００２１】
本発明はさらに、１つ以上のウイルス抗原を含む特定の処方物に関する。ここでは、ウイルス抗原は、組成物の一部、または脂質ラフトとして知られている成分であり得る。本明細書中で記載されており、当該分野で公知であるように、このような脂質ラフトは、特異的なウイルス抗原を多く含む生物学的に関係している膜（宿主細胞またはウイルス）を提示する場合がある。このような脂質ラフトは、特定の界面活性剤、例えば、オクチルグルコシドまたはメチルβシクロデキストリンでの処理によって解離させて、さらにワクチン処方物を修飾することができる。したがって、脂質ラフトの単離は、特異的な所望される抗原を多く含ませるために使用される場合があり、また、ワクチンの処方を助けるために使用される場合もある。脂質ラフトの存在またはそれが存在しないことは、例えば、免疫原の安定性または免疫学的結果に影響を与える場合がある。
【００２２】
本発明により、さらに、融合タンパク質を含む合成のＭＶポリペプチド免疫原を生産するための方法が提供される。免疫原性ポリペプチド成分は、自動化された手順による合成を含む標準的な化学的方法によって合成することができる。一般的には、免疫原性ポリペプチドまたはペプチドは、標準的な固相Ｆｍｏｃ保護ストラテジーに基づいて、カップリング剤としてＨＡＴＵを用いて合成される。免疫原性ペプチドは、適切なスカベンジャーを含むトリフルオロ酢酸を用いて、固相樹脂から切り離すことができる。これについてはまた、側鎖官能基の脱保護が行われる。粗免疫原性ペプチドはさらに、分取逆相クロマトグラフィーを使用して精製することができる。他の精製方法、例えば、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、または他の当業者によって行われる方法が使用される場合もある。ｔＢｏｃ保護ストラテジー、種々のカップリング試薬の使用などのような当該分野で公知である他の合成技術を使用して、同様の免疫原性ペプチドが生産される場合もある。さらに、Ｄ−またはＬ−アミノ酸およびそれらの組み合わせを含む任意の天然に存在するアミノ酸またはその誘導体が使用される場合もある。
【００２３】
本明細書中で記載される場合は、ＭＶポリペプチド免疫原またはその断片が、組換え体である場合もある。ここでは、所望されるＭＶ免疫原は、組み換え核酸発現構築物中の発現制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）に対して動作可能であるように連結されたポリヌクレオチドから発現される。例えば、ＨまたはＦまたはＮタンパク質免疫原をコードする核酸発現構築物を含む宿主細胞（例えば、バキュロウイルスおよび哺乳動物細胞株）を培養して、組み換えＨまたはＦまたはＮタンパク質免疫原、あるいはそれらの断片を生産することができる（例えば、Ｐｕｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．３３：５２５（２００３）およびその中で引用されている参考文献を参照のこと；一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）前出を参照のこと）。
【００２４】
（ワクチンアジュバント−プロテオソーム（「プロジュバント」およびＯＭＰ−ＬＰＳ））
本発明はまた、１つ以上のＭＶ抗原と、免疫応答を誘発することを助けるかまたは別の方法で協力する別の成分（例えば、アジュバント）を含む、免疫原性組成物に関する。上記のように、現在の生の弱毒化麻疹ワクチンは、中和母体抗体と未熟な乳児免疫系を維持していることが原因で、９ヶ月の月齢より低い乳児においては免疫原性が低い。生の弱毒化麻疹ワクチンの使用に関係する欠点としては、特に、第三世界諸国においては、保存の際の熱安定性が低いことが挙げられる。これは、電力供給が不安定である国において問題となり得る。投与経路は、現在は注射による投与であり、これは、危険な方法で注射が行われると他の疾患の伝染を導く恐れがある。良好なＭＶワクチンを処方するための多数の努力が行われているにもかかわらず、その必要がある個体を免疫化する、特に、麻疹による感染に対して免疫化するために有効な組成物が依然として必要とされている。
【００２５】
生の弱毒化麻疹ウイルスに代わるものは、本発明によって提供されるＭＶサブユニットワクチン、例えば、本明細書中に記載されているような、分割麻疹抗原調製物とプロテオソームをベースとするアジュバントを含む処方物である。サブユニットＭＶワクチンの有効性を最大にするために、ＭＶ抗原が、強力な免疫賦活剤またはアジュバントと混合される場合がある。例示的なアジュバントとしては、ミョウバン（水酸化アルミニウム、ＲＥＨＹＤＲＡＧＥＬ（登録商標））、リン酸アルミニウム、プロテオソームアジュバント（例えば、米国特許第５，７２６，２９２号および同第５，９８５，２８４号、ならびに米国特許出願公開番号２００１／００５３３６８を参照のこと）、ビロソーム、Ｌｉｐｉｄ  Ａを含むかまたは含まないリポソーム、Ｄｅｔｏｘ（Ｒｉｂｉ／Ｃｏｒｉｘａ）、ＭＦ５９、あるいは他の油および水エマルジョン型アジュバント（例えば、ナノエマルジョン（例えば、米国特許第５，７１６，６３７号を参照のこと）およびサブミクロンエマルジョン（例えば、米国特許第５，９６１，９７０号を参照のこと）、ならびにフロイトの完全および不完全アジュバント）が挙げられる。特に好ましいアジュバントはプロテオソームである。
【００２６】
プロテオソームは、通常はナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種に由来するが、他のグラム陰性細菌から導くこともできる外膜タンパク質（ＯＭＰ）からなる（例えば、Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第４，７０７，５４３号を参照のこと）。プロテオソームは、２０〜８００ｎｍの小胞または小胞様ＯＭＰクラスターへと自律的に組み立て、そして、タンパク質抗原（Ａｇ）、具体的には、疎水性部分を有している抗原を非共有的に取り込む、配位する、会合する、または別の方法で協働する能力を有している。プロテオソームは疎水性であり、ヒトへの使用について安全であり、大きさに関して特定のウイルスと同程度である。背景として、理論に拘泥するものではないが、プロテオソームのタンパク質（例えば、抗原）との混合により、抗原とプロテオソームとの間での非共有的な会合または配位を含む組成物が提供される。ここでは、会合または配位は、安定化させるための界面活性剤が、例えば、透析によって選択的に除去されるかまたは減少させられると形成する。本明細書中で使用される場合は、「プロテオソーム」は、グラム陰性細菌、例えば、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種に由来する外膜タンパク質（ＯＭＰ）の調製物をいう（例えば、Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：６５８，１９８８；Ｌｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：８００，１９８８；Ｌｙｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．４５：１０４，１９８４；Ｌｏｗｅｌｌ，「Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」第２版、Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｂａｓｉｌ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，頁１９３，１９９７；米国特許第５，７２６，２９２号；米国特許第５，９８５，２８４号；米国特許第４，７０７，５４３号を参照のこと）。これは、ＭＶ抗原のような免疫原についての担体またはアジュバントとして有用である。プロテオソームは、当該分野で記載されているように、または本明細書中に記載されるように調製することができる（図１Ａおよび１Ｂのフローチャートを参照のこと）。
【００２７】
１つ以上のＯＭＰの溶けた球形のようなＯＭＰ組成物を含む小胞または小胞様形態の外膜タンパク質成分を生じる任意の調製方法が、「プロテオソーム」の定義に含まれる。１つの実施形態においては、プロテオソームは、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の種、より好ましくは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に由来する。特定の実施形態においては、プロテオソームは担体ではなくアジュバントである。本明細書中で使用される場合は、アジュバントであるプロテオソームは、「プロジュバント」と呼ばれる場合がある。特定の他の実施形態においては、プロテオソームはアジュバントであり、抗原送達組成物である場合がある。好ましい実施形態においては、本発明のＭＶ免疫原性組成物には、本明細書中に記載される１つ以上のＭＶ抗原（すなわち、ＭＶ免疫原またはその断片）とアジュバントが含まれる。ここでは、アジュバントにはプロジュバント（すなわち、プロテオソーム）が含まれる。少なくとも１つの麻疹抗原はＨタンパク質である。別の実施形態においては、この処方物には、Ｆタンパク質とＨタンパク質を含む１つ以上の麻疹ウイルス抗原が含まれる。本明細書中に記載されるように、ＭＶ抗原は、組換え体である供給源に由来するものであってもよく、また、麻疹分割抗原を含むこともできる。好ましくは、麻疹分割抗原は、ワクチン株、例えば、Ｍｏｒａｔｅｎ株、Ｓｈｗａｒｚ株、Ｚａｇｒｅｂ株、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株から得られる。
【００２８】
特定の実施形態においては、本発明により、リポ糖のような免疫賦活剤をさらに含む免疫原性組成物が提供される。すなわち、アジュバントが別の免疫賦活剤を含むように調製される場合もある。例えば、プロジュバントを、本明細書中に記載されるようにリポ糖と混合して、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントを提供することができる。したがって、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントは２つの塩基性成分から構成され得る。第１の成分は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のようなグラム陰性細菌から調製されたプロテオソームの外膜タンパク質調製物（すなわち、プロジュバント）である。第２の成分はリポ糖の調製物である。本明細書中で使用される場合は、「リポ糖」は、グラム陰性細菌、例えば、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、プレジオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）、または他のグラム陰性細菌（アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エドワードシエラ属（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）、Ｅｈｒｌｉｃｈａ、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、）フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ガルドネレラ属（Ｇａｒｄｎｅｒｅｌｌａ）、ヘモフィラス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）（レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）を含む）、モラクセラ属（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、他のプレシオモナス属（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）（ポルフィロモナス・ギンギバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）を含む）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、他のシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スピリルム属（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、ベイヨネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、またはエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）の種を含む）に由来する、天然に存在しているかまたは修飾されている、リポ多糖またはリポオリゴ糖をいう（まとめて、ＬＰＳとも呼ぶ）。リポ糖は、無毒化された形態（すなわち、Ｌｉｐｉｄ  Ａコアが除去されている）である場合も、また、無毒化されていない形態である場合もある。リポ糖は、図２のフローチャートに記載されているように調製することができる（例えば、米国特許出願公開番号２００３／００４４４２もまた参照のこと）。第２の成分に、脂質、糖脂質、糖タンパク質、低分子などが含まれる場合があることもまた意図される。
【００２９】
プロテオソーム：ＬＰＳまたはプロトリン（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ）またはＩＶＸまたはＩＶＸ−９０８は、本明細書中で使用される場合は、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物（これは、免疫賦活組成物としての役割を果たすことができる）を提供するために、本明細書中で記載されるように少なくとも１種のリポ糖と混合されたプロジュバントの調製物をいう。したがって、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントは、例えば、ＩＶＸ−９０８の２つの塩基性成分（これには、（１）グラム陰性細菌、例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から調製されたプロテオソーム（すなわち、プロジュバント）である外膜タンパク質調製物と、（２）１つ以上のリポ糖の調製物が含まれる）から構成され得る。
【００３０】
本明細書中で記載される場合は、ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントの２つの成分は、これらの成分の間での相互作用を最適にするために、特異的な初期比で処方することができ（図３のフローチャートを参照のこと）、これによって、本明細書中に記載されるＭＶ免疫原性組成物の調製において使用される成分の安定な会合および処方物が得られる。このプロセスには通常、選択された界面活性剤の溶液（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、またはＭｅｇａ−１０）中で複数の成分を混合すること、その後、予め決定された好ましい濃度になるように、透析によって、または好ましくは、透析濾過／限外濾過方法によって、界面活性剤の量を減少させながらＯＭＰとＬＰＳ成分の錯体形成を行うことが含まれる。２つの成分の混合、共沈、または凍結乾燥もまた、適切であり安定な会合または処方を行うために使用される場合がある。好ましい実施形態においては、本発明のＭＶ免疫原性組成物には、本明細書中に記載される１つ以上のＭＶ抗原（すなわち、ＭＶ免疫原またはその断片）とアジュバントが含まれる。ここでは、アジュバントには、プロジュバント（すなわち、プロテオソーム）およびリポ糖が含まれる。少なくとも１つの麻疹抗原がＨタンパク質である。別の実施形態においては、この処方物には、Ｆタンパク質とＨタンパク質を含む１つ以上の麻疹ウイルス抗原が含まれる。本明細書中に記載されるように、ＭＶ抗原は、組換え体である供給源に由来するものである場合があり、また、麻疹分割抗原を含む場合もある。好ましくは、麻疹分割抗原は、Ｍｏｒａｔｅｎ株、Ｓｈｗａｒｚ株、Ｚａｇｒｅｂ株、またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株から得られる。
【００３１】
好ましい実施形態においては、全プロテオソームタンパク質の重量パーセントとしての最終的なリポ糖の含有量は、約１０％から約５００％までの範囲であり得、約２０％から約２００％までの範囲、あるいは、約３０％から約１５０％までの範囲であり得る。１つの好ましい実施形態においては、プロテオソームを含むアジュバント組成物は、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）から調製され、リポ糖は、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）またはプレジオモナス・シゲロイデス（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）から調製される。最終的なリポ糖の含有量は、全プロテオソームタンパク質に対して重量で５０％から１５０％の間である。別の実施形態においては、プロテオソームは、全ＯＭＰの約０．５％から約５％までの範囲の内因性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）含有量を有するように調製される。本発明の別の実施形態により、全ＯＭＰの約１２％から約２５％までの範囲、好ましい実施形態においては、全ＯＭＰの約１５％から約２０％の間の内因性リポ糖を含むプロテオソームが提供される。本発明により、また、任意のグラム陰性細菌種に由来するリポ糖を含む組成物が提供される。これは、プロテオソームの供給源と同じグラム陰性細菌種に由来する場合も、また、別の細菌種に由来する場合もある。
【００３２】
（免疫原性組成物およびその使用）
１つ以上のＭＶ免疫原を含む本明細書中に記載される免疫原性組成物は、免疫応答、例えば、防御免疫応答を誘発するために使用することができる。本発明により、本明細書中に記載されるように、１つ以上のＭＶ免疫原またはその断片、融合タンパク質、多価免疫原、あるいは、そのような免疫原の混合物を、ＭＶに特異的な免疫応答（細胞性および／または体液性）（これは、防御免疫応答である場合もある）を誘発するために十分な用量で、被験体に投与することによって、ＭＶによる感染を処置または予防するための方法が提供される。ＭＶポリペプチド免疫原およびその変異体、またはそのような免疫原の混合物は、本発明の方法において使用される場合には、アジュバント、例えば、プロジュバントまたはＯＭＰ−ＬＰＳを含む組成物の一部であることが好ましい。１つの実施形態においては、本発明の免疫原性組成物にはさらに、１つ以上の別の微生物抗原、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。例えば、ＭＶ免疫原性組成物には、風疹抗原およびおたふく風邪抗原もまた含まれる場合がある。
【００３３】
免疫原性組成物には、さらに、１つ以上のＭＶ免疫原またはその断片に加えて、薬学的に許容されるビヒクル、担体、希釈剤、または賦形剤が、そして状況に応じて他の成分が含まれる場合がある。例えば、本発明の免疫原性組成物との使用に適している薬学的に許容される担体または他の成分としては、増粘剤、緩衝化剤、溶媒、保湿剤、保存剤、キレート化剤、別のアジュバントなど、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３４】
さらに、本発明の薬学的組成物には、さらに、水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）のような希釈剤が含まれ得る。好ましくは、希釈剤は、約０．１ｍＭから約１Ｍまで、より好ましくは、約０．５ｍＭから約５００ｍＭまで、さらにより好ましくは、約１ｍＭから約５０ｍＭまで、最も好ましくは、約２．５ｍＭから約１０ｍＭまでの最終リン酸濃度範囲；および約１００ｍＭから約２００ｍＭまで、最も好ましくは、約１２５ｍＭから約１７５ｍＭまでの最終塩濃度範囲のＰＢＳである。好ましくは、最終的なＰＢＳ濃度は、約５ｍＭのリン酸と約１５０ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）である。特定の実施形態においては、ＭＶ免疫原またはＭＶ分割抗原と本発明のアジュバント（例えば、プロジュバントまたはＯＭＰ−ＬＰＳ）の混合物を含む上記の免疫原性組成物の任意のものは、滅菌であることが好ましい。
【００３５】
組成物は、無菌環境下でそれらを調製すること、またはそれらを当該分野で利用されている方法を使用して最後に滅菌することのいずれかによって滅菌することができる。多くの医薬品は滅菌のものとして製造され、この基準はＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞によって規定されている。この実施形態での滅菌は、当業界で承認されており、ＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞に列挙されている多数の手段によって行うことができる。これには、ガス殺菌、電離放射線、または濾過が含まれる。滅菌状態は、これもまたＵＳＰ  ＸＸＩＩ＜１２１１＞で規定されている無菌処理と呼ばれる方法で維持することができる。ガス殺菌に使用することができる気体として、エチレンオキシドガスが挙げられる。電離放射線法に使用することができる放射線のタイプとしては、ガンマ線、例えば、コバルト６０源からのガンマ線、および電子線が挙げられる。ガンマ放射線の一般的な線量は、２．５ＭＲａｄである。適切である場合は、適切な孔の大きさ（例えば、０．２２μｍ）であり適切な材質（例えば、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標））のフィルターを使用して濾過を行うことができる。用語「ＵＳＰ」は、米国薬局方（ｗｗｗ．ｕｓｐ．ｏｒｇ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をいう。プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳが小さい粒子を生じるという事実から、本発明の免疫原性組成物を、０．８μのフィルター、０．４５μのフィルター、または０．２μのフィルターを通じて濾過することが十分である。したがって、好ましい実施態様においては、本発明のＭＶ免疫原性組成物は濾過によって滅菌される。そのような混入物の存在によるあらゆる厄介な問題を排除することが望ましいので、これは非常に有効である。
【００３６】
本発明はまた、アジュバントと１つ以上の麻疹ウイルス抗原を含む免疫原性組成物を、それが必要である被験体に投与することを含む、麻疹感染を処置または予防するための方法に関する。ここでは、アジュバントには、プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳのいずれかが含まれ、少なくとも１つの麻疹抗原がＨタンパク質である。別の実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、免疫応答（細胞性または体液性、あるいは両方、これは、１型または２型の細胞性応答であることが好ましい場合もある）を誘発するために使用することができる。ＭＶ免疫原処方物を用いる処置または免疫応答の誘発に適している被験体は、疾患を発症するリスクについての十分に確立された指標、または既存の疾患についての十分に確立された指標によって同定することができる。本明細書中に開示されるＭＶ免疫原で処置することができる感染としては、ＭＶによって、またはＭＶが原因で引き起こされる感染が挙げられ、感染が一次感染である、二次感染である、日和見感染であるなどは問わない。ＭＶの例としては、これらのウイルスの任意の抗原性変異体が挙げられる。
【００３７】
本発明の免疫原性組成物を調製するための方法は、本明細書中に記載され、当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公開番号２００１／００５３３６８、および同２００３／００４４４２５を参照のこと）。抗原（単数または複数）およびアジュバントは、これらの成分の間での相互作用（または協働）を最適にするような特異的な初期比で処方され、これによって、２つの成分の有意な部分が互いに非共有的に会合する（または非特異的に並ぶ）。例えば、少なくとも１つのＭＶポリペプチド抗原のプロテオソーム（プロジュバント）またはＯＭＰ−ＬＰＳとの混合物は、界面活性剤の存在下で調製され、透析濾過／限外濾過による混合物からの界面活性剤の減少または除去によって、アジュバントとの抗原の会合（または配位）が導かれる（図３を参照のこと）。好ましい実施形態においては、混合物中のウイルス抗原に対するプロテオソームの割合は、１：１以上、好ましくは、２：１以上、より好ましくは、３：１以上、そしてさらに好ましくは４：１である。この割合は、８：１またはそれ以上であることもできる。あるいは、混合物中のウイルス抗原に対するプロテオソームの割合は、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：８である。２つの成分の界面活性剤をベースとする溶液には、同じ界面活性剤が含まれる場合も、また、異なる界面活性剤が含まれる場合もあり、１つ以上の界面活性剤が、限外濾過／透析濾過が行われる混合物中に存在する場合もある。適切な界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ、およびＭｅｇａ−１０が挙げられる。他の界面活性剤もまた使用することができる。界面活性剤は、組成物を調製するために使用される成分を可溶化させるように作用する。界面活性剤の混合物の使用が特に有効である場合もある。この混合物は、もちろん、最終的な処方の前に透析濾過／限外濾過によって、除去されるか、または濃度が低下させられる。
【００３８】
本明細書中に記載される１つ以上のＭＶ抗原とプロテオソームをベースとするアジュバントを含む免疫原性組成物は、その組成物を被験体、例えば、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、ヒト以外の霊長類、または齧歯類、例えば、マウスまたはラット）に投与できる任意の形態であり得る。例えば、そのような免疫原性組成物は、液体溶液として調製し、投与することができ、また、固体形態（例えば、凍結乾燥させた）として調製することもできる。これは、固体形態として投与することができ、また、投与と同時に溶液中に再懸濁することもできる。ＭＶ免疫原性ポリペプチド組成物は、その中に含まれる有効成分を、被験体（または患者）に組成物が投与されると生体利用可能になるか、または徐放により生体利用可能になるように処方される。被験体または患者に投与される組成物は、１つ以上の投与量単位の形態をとる。例えば、ドロップは、単回投与量単位であり得、エアゾール形態の本発明の１つ以上の化合物の容器には、複数の投与量単位を含めることができる。特定の好ましい実施形態においては、本発明のＭＶ免疫原または免疫原の混合液を含む上記の薬学的組成物のいずれかは、容器中に、好ましくは、滅菌の容器中に存在する。用量レベル、投与のタイミング、投与回数、投与間隔を含む特定の投与プロトコールの設計は、当業者に周知である常法を使用してそのような手順を最適化することによって決定される。
【００３９】
１つの実施形態においては、免疫原性組成物は、鼻腔に投与される。他の一般的な投与経路としては、腸内、全身的、経皮／経粘膜、鼻腔、および吸入が挙げられる。用語「腸内」は、本明細書中で使用される場合は、免疫原性組成物が、消化管または口腔粘膜を通じて吸収される投与経路であり、これには、経口、直腸内、舌下が含まれる。用語「全身的」は、本明細書中で使用される場合は、消化管をバイパスする投与経路を記載し、これには、動脈内、皮内、筋肉内、鼻腔内、眼内、腹腔内、静脈内、皮下、粘膜下、および膣内での注射または注入技術が含まれる。用語「経皮／経粘膜」は、本明細書中で使用される場合は、免疫原性組成物が皮膚を介してかまたは皮膚から投与される投与経路であり、これには、局所投与が含まれる。用語「鼻腔内」および「吸入」には、免疫原性組成物が呼吸樹に導入される投与技術が含まれ、肺内または経肺動脈投与が含まれる。組成物は、当該分野で公知の装置、例えば、機械的装置（例えば、ネブライザー）によってエアゾールとして投与され得る。ここでは、エアゾール組成物は、呼吸菅上部および下部に投与される。好ましくは、本明細書中に記載される免疫原性組成物は、鼻腔内に投与される（鼻腔内投与）。
【００４０】
さらに、本明細書中で開示される免疫原性組成物は、生の弱毒化麻疹ワクチンのような別のワクチンとともに投与する場合には、免疫性を増強するために、または追加免疫として使用することができる。例えば、１つ以上のＭＶポリペプチド免疫原をプロジュバントまたはＯＭＰ−ＬＰＳとともに含む組成物は、生の弱毒化麻疹ワクチンの投与前またはその投与後に、感作免疫として、または追加免疫として使用される（粘膜または全身的経路によって）場合もある。
【００４１】
別の実施形態においては、麻疹感染を処置または予防するため、および／あるいは、免疫応答を誘発するために、被験体には、少なくとも１回、２回、または３回のＤＮＡワクチンでの感作免疫が投与され、その後、１つ以上のＭＶポリペプチド免疫原をプロジュバントまたはＯＭＰ−ＬＰＳとともに含む本明細書中に開示される組成物での追加免疫が投与される。ＤＮＡワクチンには、プロモーター配列に動作可能であるように連結された麻疹ウイルスポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む１つ以上の組み換え発現構築物が含まれる（例えば、Ｆｅｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：１６０３−１０（１９９９）；Ｐａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５２０９−１７（２００３）を参照のこと）。ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの麻疹ウイルスポリペプチド、例えば、Ｈタンパク質をコードすることができ、少なくとも２つの麻疹ウイルスポリペプチド（すなわち、２シストロン性ポリヌクレオチド）、例えば、Ｈタンパク質とＦタンパク質をコードする場合があり、また、３個、４個、もしくは５個、またはそれ以上の麻疹ウイルスポリペプチド（すなわち、多シストロン性ポリヌクレオチド）をコードする場合もある。ＤＮＡワクチンには、２つ以上の組み換え発現構築物が含まれる場合がある。例えば、それぞれの構築物には、少なくとも１つの麻疹ウイルスポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチド配列に対して動作可能であるように連結させられたプロモーターを含むポリヌクレオチドを含まれる。
【００４２】
組み換えポリヌクレオチド発現構築物は、分子生物学の分野の当業者に公知の方法にしたがって調製することができる。原核生物宿主および真核生物宿主とともに使用されるクローニングおよび発現ベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００１）に記載されており、プラスミド、コスミド、シャトルベクター、ウイルスベクター、および本明細書中で開示される染色体複製起点を含むベクターを挙げることができる。組み換え発現構築物にはまた、宿主細胞中での目的のポリペプチドの発現を可能にする発現制御配列（調節配列）も含まれる。これには、１つ以上のプロモーター配列（例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ａｒａ、ｔｒｐ、λファージ、Ｔ７ファージ、Ｔ５ファージプロモーター、ＣＭＶ、前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、およびマウスメタロチオネイン−Ｉ）、エンハンサー配列、オペレーター配列（例えば、ｌａｃＯ）などが含まれる。
【００４３】
一般的には、組み換え発現ベクターには、複製起点と宿主細胞の形質転換を可能にする選択マーカー、および下流の構造配列の転写を指示する高度に発現される遺伝子に由来するプロモーターが含まれる。異種構造配列は、翻訳開始配列および翻訳終結配列とともに適切な段階で組み立てられる。好ましい実施形態においては、構築物は、インビボで投与される組成物中に含まれる。このようなベクターおよび構築物としては、染色体配列；非染色体配列；および合成のＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体）；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドの組み合わせに由来するベクター；およびファージＤＮＡ；ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、および仮性狂犬病ウイルス）；あるいは、以下に記載されるような複製欠損レトロウイルスが挙げられる。しかし、任意の他のベクターが、組み換え発現構築物の調製に使用される場合もあり、好ましい実施形態においては、そのようなベクターは複製可能であり、宿主（被験体）中で生存可能である。
【００４４】
１つの実施形態においては、ＤＮＡワクチンは、細菌に組み換え発現ベクターを導入することによって調製される。細菌は、その後被験体に投与される。例えば、１つ以上の麻疹ウイルスポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドを含む組み換え発現ベクターが、赤痢菌の株（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（例えば、Ｆｅｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｐａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，前出）に導入され得る（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換によって）。細菌は、その後、そのようなＤＮＡワクチンの送達のために当業者によって行われる方法にしたがって被験体に投与するために調製され得る。ＤＮＡワクチンは、鼻腔内、筋肉内、皮内、全身的、吸入によって、あるいは、コードされるＭＶポリペプチドが発現される様式で被験体にワクチンを提供する任意の他の経路および方法によって送達され得る。
【００４５】
好ましくは、本明細書中に記載されるＭＶ免疫原性組成物は、１つ以上の全身性体液性応答、粘膜免疫応答、および細胞性免疫（ＣＭＩ）を含む、特異的な抗ＭＶ免疫応答を誘導する。全身性体液性免疫応答は、特異的な抗麻疹抗原ＩｇＧ抗体または他のクラスの免疫グロブリンが血清中に存在することにより示される。その防御効果または治療効果は、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）アッセイを含む機能的アッセイにおいて決定することができる。ＨＩによって測定される応答の誘導は、ヘマグルチニンを阻害する免疫化された被験体に由来する生物学的試料中の免疫グロブリンの存在が、ヒトにおいてはＭＶに対する防御と相関していると考えられているので、有用である。粘膜免疫応答には、鼻咽頭および肺を含む呼吸菅から回収される分泌物のような粘膜分泌物中のＩｇＡを含む粘膜抗体の生産が含まれる。理論に拘泥するものではないが、粘膜免疫応答システムによって、おそらく、ＭＶ感染に対する最初の免疫学的バリアが提供され、粘膜の体液性応答において優性であるＩｇＡによって防御機能が媒介される。抗ＭＶ  ＩｇＡ抗体のインビトロでの分析は、抗ＭＶ免疫応答によりウイルスの侵入が妨げられ、ウイルスの複製が邪魔され、そして／または、ウイルスの上皮を通過する輸送が妨害されることを示唆している（例えば、Ｌａｍｍ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：３１１−４０（１９９７）；Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４３０−３５（２００２）を参照のこと）。
【００４６】
粘膜バリアを含む細胞集団は、体内で局所に、または異なる部位に到達することができるシグナルに応答する（Ｓｖａｎｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２：９９−１０５（１９９９））。限定されない理論にしたがうと、トル様受容体（ＴＬＲ）は、生得的な免疫系の鍵となる成分であり、おそらく、ＩＶＸ９０８−ＭＶは、ＴＬＲシステムを通じて作用するであろう。なぜなら、ＩＶＸ９０８中の主要な髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｏｍｐタンパク質であるＰｏｒＢは、ＴＬＲ−２に結合するからである（Ｍａｓｓａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８：１５３３−３７（２００２））。ＬＰＳはＴＬＲ−４を活性化し（Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３３５−７６（２００３））、そして麻疹のＨタンパク質もまた、ＴＬＲ−２に結合することができる（Ｂｉｅｂａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８７２９−３６））。ＴＬＲの関与により、プロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１２）の生産と、抗原提示細胞上の副刺激分子のアップレギュレーションが生じる。活性化された生得的反応は、効果的な適応的免疫応答を指示する。
【００４７】
細胞性免疫（ＣＭＩ）により、より高いかまたは優勢なＴＨ２応答からの、混合された平衡状態の高いかまたは優勢なＴＨ１応答（例えば、ＴＦＮ−γのようなサイトカインの発現の誘導によって決定される）へのスイッチまたは減少が、それに見合う特定のＴＨ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−５）の誘導の増加を伴うことなく（そのレベルは、例えば、維持される、減少する、または存在しない場合もある）誘導される。このようなＴＨ１応答は、他のＣＭＩ関連反応、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の発生の誘導の素因であり、これは、ＴＨ１免疫の指標である。
【００４８】
血清、鼻洗浄液、および／または肺洗浄液を含む被験体に由来する生物学的試料中に麻疹特異的抗原が存在することは、当該分野で行われる多数の免疫学的アッセイのいずれか１つによって決定することができる。このような免疫学的アッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、放射免疫検定、およびオクタローニ（Ｏｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）が挙げられるが、これらに限定されない。麻疹特異的抗体の機能的活性の決定もまた、本明細書中に記載される当該分野で公知の方法、例えば、プラーク減少中和検定、ヘマグルチニン阻害アッセイ、およびオプソニン化抗体の存在を決定するアッセイにしたがって決定することができる。
【００４９】
本明細書中に記載されているプロテオソーム：ＭＶおよび／またはＩＶＸ９０８−ＭＶ組成物のようなＭＶワクチン組成物の、ＭＶに対する特異的免疫応答を誘発する、および／または麻疹ウイルス感染を予防する、または被験体の麻疹ウイルス感染を処置する能力は、本明細書中に記載される当該分野で公知の動物モデルにおいて決定することができる。例えば、マウスモデルまたはヒト以外の霊長類モデル、例えば、アカゲザルモデルを使用することができる。弱毒化麻疹ワクチンまたは麻疹ＤＮＡワクチンのような、１用量、２用量、３用量、またはそれ以上の用量のＭＶワクチン組成物を、初回免疫および追加免疫として、あるいは、別のワクチンでの初回または感作免疫後の１回以上の追加免疫として、動物に投与することができる。好ましくは、ＭＶワクチンは、ヒトにワクチンを投与する、例えば、鼻腔内に投与するために使用することができる送達方法と同様の様式で動物に送達され得る。動物の免疫応答は、応答が治療的または防御的であることを示す機能に特異的に結合するかまたはそのような機能を示す免疫グロブリンの存在を決定することによって評価することができる。例えば、免疫グロブリン、特に、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体は、特異的な免疫応答が生じた場合に、または特異的な免疫応答が生じたかどうかを決定するためにサンプリングすることができる。本明細書中に記載される当該分野で公知の例示的なアッセイとしては、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよび免疫ブロッティング）；麻疹ウイルス特異的サイトカインの生産（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ４、ＩＬ５）の決定；ならびにプラーク減少中和（ＰＲＮ）アッセイが挙げられる。ＰＲＮ値は、免疫応答を特徴づけ、そして麻疹ウイルスでチャレンジした場合に、麻疹感染および疾患に関係する続発症の発症から動物を保護するかどうかを評価するために特に有効である。ヒトにおける血清防御（ｓｅｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）はＰＲＮ値１２０超として定義されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１０３６−４２（１９９０））。
【００５０】
本明細書中で記載される場合は、プロテオソーム組成物およびＯＭＰ−ＬＰＳ組成物を含むアジュバント組成物はまた、麻疹ウイルス以外の、または麻疹ウイルスに加えて、１つ以上の微生物（ウイルス、細菌、寄生虫、真菌）に由来する１つ以上の抗原と混合することができ、他の感染性疾患の処置または予防のために使用することができる。例えば、本明細書中に記載されるように調製されたプロテオソーム：抗原またはＩＶＸ９０８：抗原組成物は、風疹ウイルスまたはおたふく風邪ウイルスによる感染によって生じる疾患を処置または予防するために使用することができる。このような免疫原性組成物はまた、風疹ウイルスまたはおたふく風邪ウイルスのようなウイルスに特異的な免疫応答を誘発するためにも使用することができる。このような組成物に使用されるウイルス抗原は、ウイルス粒子から単離または部分的に単離することができ、また、ウイルスに感染した細胞から導くこともでき、また、標準的な分子生物学的方法にしたがって組み換えによって発現させ、その後で単離することもできる。１つ以上のウイルス抗原を、本明細書中に記載される方法にしたがって、プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントと組み合わせることができる。
【００５１】
プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントと組み合わせられたウイルス抗原は、１つのタイプのウイルスに由来するものである場合も、また、混合物として使用される、すなわち、１つのウイルスに由来する１つ以上の抗原が１つ以上の他のウイルスの１つ以上の抗原と組み合わせられる場合もある。任意の多数の混合物または組み合わせを調製することができる。例えば、１つの組成物に、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、およびおたふく風邪ウイルスに由来する抗原が含まれる場合、あるいは、麻疹ウイルスと風疹ウイルスに由来する抗原が含まれる場合、または麻疹ウイルスとおたふく風邪ウイルスに由来する抗原が含まれる場合、また、おたふく風邪ウイルスと風疹ウイルスに由来する抗原が含まれる場合もある。１つ以上のウイルスに由来する任意の１つ以上の抗原を、その後、プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントと組み合わせることができる。あるいは、プロテオソーム：風疹抗原（単数または複数）および／またはＯＭＰ−ＬＰＳ：おたふく風邪抗原（単数または複数）を、本明細書中に記載されるプロテオソーム：ＭＶまたはＩＶＸ９０８−ＭＶ組成物と組み合わせて、それが必要である被験体に対して任意の組み合わせで投与することができる。個々の免疫原性組成物は、種々の回数（および経路）で別の免疫原性組成物と別々に投与することができる。これらの免疫原性組成物の任意のものを、初期（初回または感作）免疫および追加免疫として使用することができ、また、追加免疫として使用することもできる。別の感作（または初回）免疫原には、その後に追加免疫が行われるウイルスの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のウイルスポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチンが含まれ得る。これらのＤＮＡワクチンは、本明細書中に記載されている当該分野で公知の方法によって調製することができる。
【００５２】
本明細書中に記載される全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物、および／または出願データシート（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ｓｈｅｅｔ）は、それらの全体が参照によって本明細書中に組み入れられる。以下の実施例は、本明細書中に記載される本発明を説明するために意図され、限定されるようには意図されない。
【実施例】
【００５３】
（実施例１）
（プロテオソームの調製）
免疫原（例えば、麻疹ウイルス抗原）は、ヒトまたは動物被験体の防御免疫応答を誘発することができる本発明のワクチン組成物を形成するように、プロテオソームとともに処方され得る。プロテオソームはアジュバントとして有用であり、グラム陰性細菌から精製される外膜タンパク質から構成される。プロテオソームを調製するための方法は、例えば、Ｍａｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：２３８２，１９９５；米国特許第６，４７６，２０１  Ｂ１号；米国特許出願公開番号２００１／００５３３６８；ならびに米国特許出願公開番号２００３／００４４４２５に記載されている。簡単に説明すると、フェノールで死滅させたグループＢ  ２型髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のペーストを、１Ｍの塩化カルシウム中の６％のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）（ＥＢＢ）（Ａｌｂｒｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｗｈｉｔｈａｖｅｎ，Ｃｕｍｂｒｉａ，ＵＫ）の溶液で抽出した。抽出物をエタノールで沈殿させ、１％ＥＢＢ−Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ−生理食塩水中に溶解させ、その後、硫酸アンモニウムで沈殿させた。沈殿したプロテオソームを１％のＥＢＢ緩衝液中に再度溶解させ、透析濾過し、０．１％のＥＢＢ緩衝液中で−７０℃で保存した。
【００５４】
約０．５％から約５％の間のリポ糖含有量を有しているプロテオソームが得られたこのプロセスのフローチャートを、フローチャート１Ａ（図１Ａ）に示す。プロテオソームはまた、得られるプロテオソームが約１２％から約２５％の間のリポ糖含有量を有していることが所望される場合には、硫酸アンモニウム沈殿工程を省略してプロセスを短縮することもでき、材料によっては、フローチャート１Ｂ（図１Ｂ）に示されるように、約１５％から約２０％の間のリポ糖含有量である場合もある。当業者であれば、本発明のプロジュバントまたはＯＭＰ−ＬＰＳ組成物を含む処方物を調製するための方法を、ワクチン成分の特定の特性に合うように調整することができることを理解するはずである。
【００５５】
（実施例２）
（リポ糖の調製）
フローチャート２（図２）の例は、フレクスナー赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）またはプレジオモナス・シゲロイデス（Ｐ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ）からのＬＰＳの単離および精製のためのプロセスを示す。このプロセスは、他のグラム陰性細菌（赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プレシオモナス属（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種を含む）からＬＰＳを調製するために同様に使用することができる。細菌を醗酵によって３００Ｌ中で増殖させた後、細菌を堆積させ、細胞ペーストを、細菌ペースト１グラムあたり３ｍＬの０．９ＭのＮａＣｌ、０．００５ＭのＥＤＴＡ、および１０ｍｇのリゾチームで再度水和した。リゾチームでの消化を、室温で１時間進行させた。その後、０．０２５ＭのＭｇＣｌ２中の５０Ｕ／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ＤＮａｓｅ）を添加し、ＤＮａｓｅ消化を室温で３０分間進行させた。その後、懸濁液を１４，０００から１９，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーを通過させることによって砕いた。新しいＤＮａｓｅ（５０Ｕ／ｍＬ）を添加し、懸濁物の消化を、さらに３０分間室温で進行させた。消化した細胞懸濁物を水浴中で６８℃に加熱し、等量の９０％のフェノール（これもまた６８℃に加熱した）を添加し、その後、混合液を震盪させながら６８℃で３０分間インキュベートした。混合液を４℃で遠心分離して、水相と有機相を分離させた。水相を回収し、有機相をＷＦＩ（注射用蒸留水）で６８℃で３０分間再度抽出した。混合液を４℃で遠心分離し、第２の水相を回収し、２つの回収した水相を合わせた。核酸を沈殿させるために、１０ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０％のエタノールをプールした水相に添加した。混合液を４℃で一晩攪拌し、次いで、沈殿した核酸を、１０，０００×ｇで３０分間の遠心分離によって堆積させた。上清を回収し、濃縮し、３０，０００ＭＷ中空線維カートリッジを使用して、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５ＭのＴｒｉｓ、０．０１ＭのＥＤＴＡ、および０．１％のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢ、ｐＨ８．０の中に透析濾過した。最後に、ＬＰＳを、０．２２μＭのＭｉｌｌｐａｋ（登録商標）６０フィルターユニットを使用して滅菌濾過し、滅菌の保存容器に等分し、−８０℃で保存した。
【００５６】
（実施例３）
（プロテオソーム：リポ糖アジュバントの調製および特徴づけ）
本発明のプロテオソームアジュバント処方物を、おそらくは非共有的である会合を可能にするためにプロテオソームとＬＰＳを混合することによって製造した。ＬＰＳは、多数のグラム陰性細菌、例えば、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、プレシオモナス属（Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、またはサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の種のいずれかから導くことができる（実施例２を参照のこと）。これを、フローチャート３（図３）に記載したように、実施例１のプロテオソームと混合する。簡単に説明すると、プロテオソームとＬＰＳを４℃で一晩融解させ、ＴＥＥＮ緩衝液中で１％のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）ＢＢになるように調節した。２つの成分を、約１０：１から約１：３の間のプロテオソーム：ＬＰＳの最終ｗｔ／ｗｔ比を生じる量で、室温で１５分間混合した。プロテオソーム：ＬＰＳ混合物を適切な大きさ（例えば、Ｓｉｚｅ９）の１０，０００  ＭＷＣＯ中空線維カートリッジ上でＴＮＳ緩衝液（０．０５ＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中に透析濾過した。浸透液中のＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）含有量が＜５０ｐｐｍ（Ｅｍｐｉｇｅｎ（登録商標）Ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ  Ａｓｓａｙによるか、またはＢｒａｄｆｏｒｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａｓｓａｙによる）になった時点で、透析濾過を停止した。バルクのアジュバント（本明細書中ではＯＭＰ−ＬＰＳと呼ぶ）を濃縮し、５ｍｇ／ｍＬのタンパク質となるように（Ｌｏｗｒｙアッセイによる）調製した。最後に、アジュバントを、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ  ２０フィルターユニットを使用して滅菌濾過した。バルクのアジュバントを、滅菌の保存容器に等分し、凍結させた。
【００５７】
ＯＭＰ−ＬＰＳアジュバントを、（１）逆相ＨＰＬＣを使用してＥｍｐｉｇｅｎ（登録商標）（４００ｐｐｍ）について；（２）Ｌｏｗｒｙアッセイによってタンパク質含有量について；（３）２−ケト−３−デオキシオクトネート（ＫＤＯ）アッセイの測定によってＬＰＳ含有量について試験した。ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物をさらに、粒子サイズ測定装置（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅｒ）（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓモデル９０プラス、または同様の機器）（１０〜１００ｎｍ）を使用した定数加重分析によって決定される粒子の大きさの分布について、さらに特徴付けた。しかし、複合体の粒子の大きさは、ＬＰＳに対するプロテオソームの比の変化（例えば、高い）に応じて増大または変化する場合がある。アジュバント処方物中のＯＭＰ−ＬＰＳ組成物の安定性は、赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ＬＰＳワクチンについて以前に実証された安定性（米国特許出願公開番号２００３／００４４４２５を参照のこと）と一致するはずである。これらのデータは、ＯＭＰ−ＬＰＳ組成物が、冷蔵温度とそれよりも高い温度（２５℃および３７℃）のいずれにおいても安定であったことを示す。これらの条件下では、組成物のＬＰＳ成分、またはその任意の統計学的に有意な部分を、ワクチン処方物のプロテオソーム成分と錯体形成させることができる。
【００５８】
（実施例４）
（麻疹ウイルス抗原の調製）
米国でワクチンの目的に使用されている麻疹ウイルス（ＭＶ）の弱毒化株であるＭｏｒａｔｅｎ株の増殖を、０．０１〜０．００１の感染多重度（ＭＯＩ）でＶｅｒｏミドリザル腎臓細胞を感染させることによって行った。ここでは、感染させた細胞を、１０レベルの工業用チャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）で培養した。ＭＯＩは、不完全な妨害を生じる粒子の発生を最少にするために低くした。感染細胞の培養を、有意な細胞病理学が検出されるまで（例えば、約３〜５日）モニターし、その時点で、感染細胞の培養物を、１回の凍結−融解サイクルに供して細胞を破壊させた。細胞の破片を２１００×ｇで２０分間、４℃での遠心分離によって除去した。細胞を含まないＭＶを含む上清を回収し、０．４５μｍのフィルターと、その後に０．２２μｍのフィルターを連続して通過させて濾過した。その後、濾過した上清を４℃で２時間、１４，０００ｒｐｍで限外濾過した。堆積した麻疹ウイルス粒子をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再度懸濁させ、次いで超音波処理を行った。タンパク質濃度を、２シストロン性酸性タンパク質アッセイを使用して決定し（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、標準曲線を、ウシ血清アルブミン画分Ｖ（ＢＳＡ）とウシγグロブリン画分ＩＩ（ＢＧＧ）の混合物を使用して作製した。
【００５９】
（実施例５）
（麻疹ウイルス抗原調製物の分析）
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を、ウイルス調製物中のＭＶヘマグルチニン（Ｈ）タンパク質と融合（Ｆ）タンパク質の存在を評価するために行った（図４を参照のこと）。ウイルス試料の段階希釈物を、１０％のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離し、タンパク質のバンドを、クマシーブリリアントブルーＧ−２５０（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）での染色によって視覚化した。クマシーブリリアントブルーでの染色によって検出された個々のＭＶ抗原の相対的な量と、試料の全タンパク質含有量の割合として決定したＨタンパク質とＦタンパク質の量を、Ｓｃｉｏｎ  ｉｍａｇｅソフトウェアを使用する定量的デンシトメトリーによって決定した。タンパク質調製物中のＨタンパク質とＦタンパク質の量は４４．４％であった。
【００６０】
平行して、別のゲルから分離したＭＶ試料を、ＭＶ  Ｈタンパク質とＦタンパク質の免疫ブロット分析による評価のためにＰＶＤＦ膜に移した。移した後、膜を０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の５％の脱脂粉乳でブロックし、その後、ＭＶ  Ｈタンパク質またはＦタンパク質を検出することができるモノクローナル抗体とともに、室温で６０分間インキュベートした。その後、免疫ブロットをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、次いで、ヤギ−抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の存在下で室温で６０分間インキュベートした。その後、膜を、ＨＲＰ基質、ＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共にインキュベートした。シグナルを、免疫ブロットをＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露光させることによって視覚化した。
【００６１】
ＭＶ  Ｈタンパク質とＦタンパク質に相当するバンドを、クマシーブリリアントブルーと免疫ブロット分析の両方を使用して検出した。例えば、８０ｋＤａのＭＶ  Ｈタンパク質のバンドを、重ね焼きした免疫ブロットとクマシー染色したゲル上で検出した。免疫ブロットによって検出したＭＶ  Ｆタンパク質は、Ｆ０一次翻訳産物がタンパク質分解によってＦ１とＦ２サブユニットへと処理されるとの理由から予想される、存在する種々のウイルスＦタンパク質の大きさを示した。５０〜６０ｋＤａの２つの形態のＦ０を同定することができた。この原因は、おそらく、翻訳後のグリコシル化の差である。Ｆ１バンドは、４１ｋＤａのタンパク質バンドとして同定した。これらの実験で使用したＶｅｒｏ細胞タンパク質とＦタンパク質抗体との間にはいくつかの交差反応性が検出された（例えば、図４ＡのＶｅｒｏ細胞抽出物の対照のレーンを参照のこと）。
【００６２】
（実施例６）
（プロテオソーム：ＬＰＳと麻疹ウイルス抗原を含む処方物の調製）
本発明の処方物を、実施例３によるプロテオソーム：ＬＰＳアジュバント（本明細書中ではＯＭＰ−ＬＰＳとも呼ぶ）を実施例４によるＭＶ抗原と、最適な安定性と免疫学的結果を促進する割合で混合することによって調製した。いくつかの場合には、プロテオソーム：ＬＰＳアジュバントとの処方の前に、ウイルス抗原調製物を、１％の界面活性剤（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢまたはＭｅｇａ−１０）を含むように調製し、続いて、透析し、その後、プロテオソーム：ＬＰＳアジュバントと混合した。
【００６３】
（実施例７）
（プロテオソームと麻疹ウイルス抗原を含む処方物の調製）
本発明の処方物を、実施例１によるプロテオソームを、実施例４によるＭＶ抗原と、安定性と免疫学的結果について最適な処方物となる割合で混合することによって調製した。プロテオソームとの処方の前に、ウイルス抗原調製物を、実施例６に開示したように１％の界面活性剤（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢまたはＭｅｇａ−１０）を含むように調製した。
【００６４】
（実施例８）
（麻疹ウイルス抗原ワクチン処方物の分析）
ワクチン処方物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシーブリリアントブルー染色と免疫ブロット分析）によって、そして免疫金顕微鏡法によって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の前に、ワクチン処方物を１０，０００で１５秒間遠心分離した。ワクチン処方物の可溶性の画分（上清）と不溶性の画分（ペレット）を回収した。不溶性の画分をＰＢＳ中に再度懸濁させ、その後、β−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液を添加した。プロテオソーム処方ＭＶワクチン組成物の場合は、ワクチン処方物の可溶性画分中のプロテオソームＯＭＰの存在をモニターし、これらの実験において、良好な処方プロセスの指標として確保した。クマシーブリリアントブルー染色を使用して、可溶性画分と不溶性画分中にタンパク質が存在することを検出し、免疫ブロット分析を使用して、透析した調製物の中にＭＶ  Ｈタンパク質とＦタンパク質が存在することを確認した。ＭＶ抗原を含むプロテオソームのワクチン処方物、およびＭＶ抗原を含むＯＭＰ：ＬＰＳが、検出することができる量のＭＶ  Ｈタンパク質とＦタンパク質を含むことを見出した（図５Ａ）。
【００６５】
電子顕微鏡による分析（図５Ｂ）のために、ワクチン処方物試料を５分間、ニッケルグリッド上でエアーフュージした（ａｉｒｆｕｇｅ）。グリッドを１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むブロッキング溶液中に５分間浸し、洗浄し、その後、ＭＶ  Ｈタンパク質に対するモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）とともに室温で６０分間インキュベートした。その後、グリッドを１％のＢＳＡで５分間ブロックし、続いて抗マウスＩｇＧ−Ｇｏｌｄ−１０ｎｍとともに１時間インキュベートし、ＰＢＳ、再蒸留水で洗浄し、風乾させ、ＰＴＡ  ３％、ｐＨ６．０で染色し、東芝の電子顕微鏡を使用して観察した。これらの実験では、ＭＶ抗原ワクチン処方物と、対照のプロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳのみは、約１００ｎｍから約３００ｎｍまでの大きさの範囲にある、種々の大きさの丸い膜構造を呈した（図５Ｂ）。免疫金で標識されたシグナルは、プロテオソームを含むＭＶ抗原の共局在を明確に示す。
【００６６】
（実施例９）
（麻疹ウイルス抗原ワクチン処方物でのマウスの免疫化）
免疫化を、グループあたり５匹のマウスを含む２１のグループの１０週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに対して行った。それぞれの実験について、全てのマウスを２日おきに、体重と、毒性の兆候（例えば、毛の状態、猫背の姿勢、脂性肌、眼の分泌物、および脱水状態）について、実験手順が終わるまで評価した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを粘膜内（ＩＭ）および／または鼻腔内（ＩＮ）より、プロテオソーム：ＭＶ抗原処方物、またはプロテオソーム：ＬＰＳ：ＭＶ抗原処方物で１日目および１４日目に免疫化した。全てのワクチン処方物には、実施例４で調製した０．４μｇのＭＶ抗原を含めた。ＩＮ免疫化については、マウスを最初にイソフランの吸入によって軽く麻酔し、その後、鼻腔内に２５μｌ（１つの鼻腔について１２．５μｌ）を送達する自動導入チャンバーを使用して、ワクチンまたは対照処方物を投与した。ＩＭ免疫化については、２５μｌのワクチン処方物を、後肢に注射することによって投与した。全ての場合において、対照マウスを、緩衝液（ＰＢＳ）のみ、ＭＶ抗原のみ、プロテオソームのみ、またはプロテオソーム：ＬＰＳ（例えば、ＯＭＰ：ＬＰＳ）のみでＩＮまたはＩＭによって免疫化した。
【００６７】
分析のために、試料を１日目、１４日目に側部伏在静脈から採取し、ワクチン処方物を３用量投与したマウスについては、２８日目にもまた採取した。最後の免疫化の８日後（２用量および３用量の実験グループについて、それぞれ、２２日目及び３６日目）に、マウスをＣＯ２での窒息によって安楽死させ、心臓の穿刺によって放血させた。鼻の洗浄と肺の洗浄もまた、気管の切開を行い、そしてカテーテル（Ｃｌｅａｒ−Ｃａｔｈ，Ａｂｏｔｔ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を、最初に、主気道に、その後に鼻咽頭に挿入することによって行った。それぞれの位置について、カテーテルを縫合によって固定し、０．１％のＢＳＡとプロテアーゼ阻害因子（ＡＥＢＳＦ、ＥＤＴＡ、ベスタチン、Ｅ−６４、ロイペプチン、およびアプロチニン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含む１ｍｌのＰＢＳを用いてサンプリングした。全ての試料を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。脾臓もまた、それぞれのマウスから回収し、脾細胞を、７０μｍのＮｙｌｏｎ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を使用して調製した。単細胞懸濁液を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して２８０×ｇで２０分間遠心分離した。血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面に存在する細胞を回収し、２回洗浄し、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むウシ胎児血清中で凍結させた。
【００６８】
（実施例１０）
（ＥＬＩＳＡによる麻疹ウイルスに特異的な抗体の分析）
血清と粘膜ＭＶ特異的抗体応答を、定量的ＥＬＩＳＡによって測定した。血清試料について、全ＩｇＧ、ＩｇＧイソ型（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）およびＩｇＡを測定した。鼻洗浄液および肺洗浄液については、ＩｇＡのみを評価した。Ｕ底の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に希釈した１μｇ／ｍｌのＭＶ抗原で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、ＰＢＳ  ０．１％のＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）中の２％の脱脂粉乳でブロックし、その後、試料の希釈物を２連で添加し、３７℃で２時間インキュベートした。二次抗体には、ヤギ抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＢＤ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ１ＨＲＰ，ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ、またはヤギ抗−マウスＩｇＧ２ｂ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を含めた。ラット抗マウスＩｇＡ−ビオチン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＢＤ）を、ＩｇＡの検出のための二次抗体として使用し、続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。アッセイを、ＴＭ  Ｂｌｕｅ基質（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の添加によって完了させた。反応を、０．２Ｍの硫酸（Ｓｉｇｍａ）を使用して停止させた。４５０ｎｍで記録した光学密度の値の平均と標準偏差（ＳＤ）を、自動マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から計算した。試験試料中の抗体濃度を、精製したマウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または精製したマウスＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）を使用してそれぞれのプレート上でインキュベートした標準曲線から計算した。値は、血清または洗浄液１ミリリットルあたりの特異的抗体のナノグラム数を示す（図６を参照のこと）。
【００６９】
（実施例１１）
（プラーク減少中和アッセイによる麻疹ウイルスに特異的な抗体の分析）
試料（血清および／または洗浄液）中に含まれるＭＶ特異的抗体の、ＭＶの増殖を中和する能力を、以前に記載された（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３３：１４７，１９９９）プラーク減少中和（ＰＲＮ）アッセイによって評価した。簡単に説明すると、Ｖｅｒｏ細胞を、９０〜９５％の細胞集密度が得られるように２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）にプレートした。試料をＰＲＮ中で使用する前に、５６℃で４０分間熱不活化させた。試料を希釈し、３７℃で９０分間、ＭＶとともにインキュベートし、その後、７０％の細胞集密度のＶｅｒｏ細胞の２連のウェルを、１００μｌの１０倍の段階希釈物に感染させた。ＬｅｂｏｖｉｔｚのＬ１５培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中の１６％のメチルセルロースの重層を、感染させた細胞に適用し、その後、プレートを５％のＣＯ２中で３７℃で４日間インキュベートした。４％のニュートラルレッドの溶液を添加して単層を染色し、その後、さらに２４時間置いた。最後に、細胞の単層を、３．７％のホルマリンで１０分間固定させ、目で見ることができるプラークを数えて、プラーク形成単位の数を決定した（図７を参照のこと）。それぞれの試料を２連で評価した。ＰＲＮ指数を、Ｋａｂｅｒ法を使用して決定して、中和の５０％終点を計算した。以下の式を使用してＰＲＮ値を計算した：最高希釈の逆数のｌｏｇ１０−［（平均プラーク数／ウイルス対照による平均プラーク数の和−０．５）×希釈係数のｌｏｇ１０］。
【００７０】
（実施例１２）
（麻疹ウイルス抗原ワクチン処方物の安全性）
ＭＶ抗原ワクチン処方物を、マウスにおいて安全性（すなわち、毒性）について評価した（実施例９もまた参照のこと）。マウスを、プロテオソームまたはＯＭＰ−ＬＰＳとともに処方したＭＶ抗原の２または３用量のいずれかで、鼻腔内に（ＩＮ）免疫化した。さらに、プロテオソームとともに処方したＭＶ抗原を使用して、粘膜内経路（ＩＭ）を通じてマウスを免疫化した。毒性がないことを、本明細書中に開示したワクチン処方物のいずれかを使用して検出した。マウスを毎日観察し、体重を測定した。ＩＮまたはＩＭのいずれかで投与したワクチン処方物については、全てのマウスにおいて行動の変化は記録されず、体重においても統計学的に有意な変動（例えば、＋／−１．０グラムより大きい）は検出されなかった。これらのデータは、本発明のワクチン処方物が、おそらく、ヒトである被験体に用いる場合にも安全であることを示唆している。
【００７１】
（実施例１３）
（麻疹ウイルス抗原ワクチン処方物での免疫化後の血清ＩｇＧ抗体応答）
ＭＶ抗原ワクチン処方物の全身性免疫を誘発する能力を、ＭＶ特異的抗体についての定量的ＥＬＩＳＡによる血清試料の分析によって評価した。これらの実験では、マウスを図６に示した（矢印）ように、１日目、１４日目、および／または２８日目に免疫化した。これらの実験では、２用量または３用量のＩＮで投与したプロテオソームＭＶ抗原ワクチン処方物によって、測定可能な量のＩｇＧの統計学的に有意な増加が誘導された（図６）。ＩＭで投与した場合には、プロテオソーム−ＭＶワクチン処方物によって、２用量のワクチンを投与した後、全てのマウスにおいて血清ＩｇＧの測定可能な増加が誘発され、これは、３用量の投与後には有意に増加した（図６）。血清ＩｇＧの検出可能なレベルはまた、ＩＭで投与した３用量のＭＶのみを投与したマウスにおいても観察された。ＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ抗原ワクチン処方物でＩＮで免疫化したマウスは、３用量のワクチンの後に有意なレベルのＩｇＧを生じた。２用量のＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ抗原処方ワクチンの投与によっては、検出可能な血清ＩｇＧ応答は誘発されなかった。血清ＩｇＧは、全ての動物において免疫化の前には検出されず、ＰＢＳ対照を投与したグループ、ＭＶ抗原のみをＩＮで投与したグループ（２または３用量）、ならびにＯＭＰ−ＬＰＳのみを投与したグループ（２または３用量）を含む対照グループにおいては全ての時点で検出できないままであった（図６）。
【００７２】
（実施例１４）
（麻疹ウイルス抗原ワクチン処方物での免疫化後の粘膜抗体応答）
鼻洗浄液および肺洗浄液中のＩｇＡの検出のためのＥＬＩＳＡを使用して、鼻および気道の粘膜免疫を誘発するＭＶワクチン処方物の能力を決定した。鼻洗浄および肺洗浄を、最後の免疫化の８日後に行った。有意なレベルのＭＶ特異的ＩｇＡが、３用量のプロテオソーム：ＭＶワクチン処方物をＩＮで投与したマウスにおいて検出されたが、そのようなレベルは２用量のワクチンを投与したマウスにおいては検出されなかった（図６）。対照的に、ＩＭで投与した２用量または３用量のプロテオソーム：ＭＶ処方ワクチンによっては、検出可能なＩｇＡ応答は誘発されなかった（図６）。ＩＮで投与した３用量のＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ抗原処方ワクチンで免疫化したマウスは、有意なレベルのＭＶ特異的ＩｇＡを誘発し、力価は肺洗浄液試料において６０００ｎｇ／ｍｌに達した。ＩｇＡレベルは、鼻洗浄液よりも肺洗浄液中でより高かった（図６）。このことは、ＩＮで投与されたＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ抗原ワクチン処方物によって、気道において粘膜免疫応答が誘発されたことを示唆している。ＩＭで投与されたＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ抗原処方ワクチン（２用量）は、検出可能なＩｇＡ応答を誘発しなかった。ＩｇＡのレベルは、ＭＶ抗原のみをＩＮで投与したグループ、ＭＶ抗原のみをＩＭで投与したグループ（２用量または３用量）、ＰＢＳ対象、およびＯＭＰ−ＬＰＳのみをＩＮで投与したグループ（２用量または３用量）を含む対照グループから得られた鼻洗浄液および肺洗浄液の両方において低いままであったか、または検出できなかった。
【００７３】
（実施例１５）
（麻疹ウイルス抗原ワクチン処方物で免疫化したマウスに由来する血清および洗浄液試料の免疫中和活性）
プラーク減少中和アッセイを使用して、血清試料、さらには、鼻洗浄液および肺洗浄液試料を、最後の免疫化の８日後に採取した際の免疫中和活性について分析した。これらの実験では、ＩＮで投与したプロテオソーム−ＭＶ抗原処方ワクチンは、低いが有意なＭＶ中和を示した（図７）。ＩＭで投与したプロテオソーム−ＭＶワクチン処方物は、粘膜ＩｇＡ応答を誘発せず（図６）、結果として、ウイルスの中和は、ＭＶを鼻または肺洗浄液試料に接触させた場合にも観察されなかった。ＩＭで投与したプロテオソーム−ＭＶワクチン処方物（３用量）によって得られた血清試料は、ＭＶの増殖を中和することが示された（図７）。ＩＭで投与したプロテオソーム−ＭＶ抗原ワクチン（３用量）と比較して、有意に低い中和レベルが、プロテオソーム−ＭＶ抗原処方物（２用量）をＩＭで投与したマウスと、ＭＶ抗原のみをＩＭで投与（３用量）したマウスに由来する血清試料を用いて観察された（図４）。これは、ＥＬＩＳＡによって測定したＩｇＧレベル（図６）と一致した。さらに、ＩＮで投与した３用量のＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ抗原ワクチン処方物により、中和血清抗体の生産が誘発された。同様の結果が、ＩＮで投与されたプロテオソーム−ＭＶ処方物についても観察された。免疫中和活性の検出可能なレベルはまた、肺洗浄液試料においても観察された（図７）。ＭＶ抗原のみをＩＮで投与したグループ（２または３用量）、ＰＢＳのみを投与したグループ、およびＯＭＰ−ＬＰＳのみを投与したグループ（２または３用量）のような対照グループから得られた試料は、ＭＶ中和活性を有していなかった。これらのデータは、ＭＶ抗原ワクチン処方物が、ＭＶ感染とその合併症からワクチンを接種した被験体を防御できる免疫応答を誘発することを示唆している。
【００７４】
（実施例１６）
（麻疹ウイルス抗原ワクチン処方物で免疫化したマウスにおける免疫応答）
種々のＩｇＧ抗体イソ型の優位は、特異的なタイプの免疫応答に関係している。血清ＩｇＧ１は体液性免疫に関与しているＴＨ２型応答に関係しており、一方、血清ＩｇＧ２ａは細胞性免疫に関与しているＴＨ１型応答に関係している。イソ型特異的ＩｇＧ１またはＩｇＧ２ａ抗体の濃度を、最後の免疫化の８日後に回収した血清においてＥＬＩＳＡによって測定した。図８は、各実験群について、血清試料中のＩｇＧ１とＩｇＧ２ａレベルと、それぞれのＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比を示す。血清ＩｇＧ応答が対照よりも有意に高いグループについては、プロテオソームまたはＯＭＰ：ＬＰＳを含むＭＶの処方物により、ＭＶのみをＩＮまたはＩＭで投与したグループと比較して低いＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ比が得られ、これは、プロテオソームおよびＯＭＰ：ＬＰＳがＭＶ特異的免疫応答を１型の表現形へと再度向けることに有効であることを示している。
【００７５】
（実施例１７）
（麻疹ウイルス抗原に対する血清抗体の特異性の分析）
血清抗体の抗原特異性を、免疫ブロット分析によって決定した。ＭＶ  Ｈ、Ｆ、およびＭタンパク質を検出するために、比較用免疫ブロットを設計した（図９）。ＭＶ中和抗体を有している血清（ＩＮで投与したＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ抗原ワクチン処方物（３用量）で免疫したマウスから得た）を、非中和抗体を有している血清（ＩＭで投与したプロテオソーム−ＭＶ抗原ワクチン処方物（２用量）で免疫化したマウスから得た）と比較した。高い中和活性を有している抗体を含む血清は、ＭＶタンパク質に特異的に結合することができた。対照的に、低い中和活性を有している血清試料は、ＭＶ  Ｈタンパク質を検出することができず、ＭＶ  Ｍタンパク質を弱く認識した。ＭＶ  Ｆタンパク質の認識は、同様の分子の大きさの交差反応性であるＶｅｒｏ細胞タンパク質の存在が原因で、非特異的なバックグラウンドの結合を上回って検出することは困難であった。それにもかかわらず、Ｆ０／Ｆ１バンドの強さは、免疫ブロットを中和抗体と接触させた場合には、非中和抗体と比較して高かった。まとめると、これらの結果は、中和活性のレベルが、ＭＶ抗原の認識、例えば、ＭＶ  Ｈタンパク質の認識のレベルと相関関係にあることを示している。
【００７６】
（実施例１８）
（種々の用量の麻疹ウイルス抗原−プロテオソーム：ＬＰＳ処方物を投与した動物の免疫応答）
この実施例では、種々の鼻腔内用量のプロテオソーム：ＬＰＳ（ＩＶＸ９０８）とともに処方された麻疹ウイルスワクチンを投与したマウスにおける、粘膜および全身性中和抗体免疫応答について記載する。
【００７７】
（麻疹抗原の調製）
麻疹ウイルス分割抗原を以下のように調製した。Ｍｏｒａｔｅｎワクチン株ＭＶ（Ｒ．Ｗｉｔｔｅｓ，Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮから譲り受けた）を、１０レベルの細胞工業用チャンバー（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を使用して、０．０１〜０．００１の感染多重度（ＭＯＩ）でＶｅｒｏミドリザル腎臓細胞中で増殖させた。細胞変性効果がピークの時に、フラスコを１回凍結−融解させた。細胞の破片を遠心分離（２１００×ｇ、４℃で２０分間）によって除去し；プールした上清を最初に０．４５μｍのフィルター、その後、０．２２μｍのフィルターを通して濾過した。濾液を超遠心分離し（１０，０００×ｇ、４℃で２時間）、ペレットを再度懸濁し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で超音波処理した。タンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン画分Ｖとウシγグロブリン画分ＩＩ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）の混合物を用いた標準曲線に基づいて測定した。ＩＶＸ９０８との処方の前に、１％の界面活性剤（Ｍｅｇａ−１０、Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ）をＭＶ抗原調製物に添加し、その後、これを、ＰＢＳに対して、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中で７日間かけて透析した。
【００７８】
（麻疹ウイルス抗原の特徴付け）
ＭＶ分割抗原の段階希釈物を、１０％のポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によって分離し、タンパク質のバンドを、クマシーブルーＧ−２５０（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）で視覚化した（図１０Ａ）。ＭＶ  Ｈタンパク質に相当する８０ｋＤａのバンドが観察された。予想されたように、種々のＦタンパク質のバンドが得られた。Ｆ０は６０ｋＤａのタンパク質として同定され、タンパク質分解によって処理されたＦ１サブユニットは４１ｋＤａのタンパク質バンドとして見られた。クマシー染色によって同定された他のＭＶ抗原には、Ｎタンパク質（５０〜６０ｋＤａ）とＭタンパク質（３８ｋＤａ）が含まれていた。ＭＶ抗原調製物中の残りのＶｅｒｏタンパク質の存在（例えば、Ｖｅｒｏ細胞溶解物中でのみ検出された約７０ｋＤａの濃いバンド）もまた、クマシー染色によって観察された。
【００７９】
図１０Ｂに示すように、抗原調製物中に存在する個々のＭＶタンパク質の相対量および絶対量を、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅソフトウェアを使用したクマシー染色したゲルの定量的デンシトメトリー分析によって見積もった。それぞれのバンドの全タンパク質に対する分率を評価し、Ｈ抗原とＦ抗原に起因する割合を決定した。Ｈタンパク質とＦタンパク質は、ＭＶ調製物中の全タンパク質の約３０％を占めた。
【００８０】
平行なゲル上で泳動したＭＶ抗原を、免疫ブロット分析のためにＰＶＤＦ膜に移した。膜を、５％の脱脂粉乳−０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でブロックし、その後、室温（ＲＴ）で１時間、モノクローナル抗Ｆまたは抗Ｈ抗体（Ｆａｂｉａｎ  Ｗｉｌｄ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ｄｅ  Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅより提供された）とともにインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、ＰＶＤＦ膜をヤギ抗マウスＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）に、室温で１時間接触させた。膜をＨＲＰ基質中に浸し、ＰＶＤＦ膜へのヤギ抗マウスＨＲＰ結合体の結合を、製造業者の説明書（ＥＣＬキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にしたがって行ったＥＣＬアッセイを使用して視覚化した。結果を図１０Ａに示す。
【００８１】
（プロテオソームをベースとする麻疹ウイルス（ＩＶＸ９０８−ＭＶ）の調製）
ＩＶＸ９０８（Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ（商標）としてもまた公知である）を、ｃＧＭＰガイドラインにしたがって製造した。これは、以前に記載されたように（Ｒｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１：６５−８３（１９９５））透析濾過によって調製された期待される赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）ワクチンのプロテオソーム−赤痢菌（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ  ＬＰＳロットと同じであった。ＬＰＳに対するプロテオソームポーリンの比は、およそ１：１ｗｔ／ｗｔであった。髄膜炎菌（Ｎ．Ｍｅｎｉｎｇｔｉｄｉｓ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）Ａ、ポーリンＢ、およびクラスＩＶタンパク質は、それぞれ、全プロテオソームタンパク質含有量の約２０％、７５％、および５％を占めた。ＩＶＸ９０８を、動物への投与の直前に、１：１の比でＭＶ抗原調製物と混合した。
【００８２】
（電子顕微鏡によるＩＶＸ９０８−ＭＶの特徴付け）
ワクチン処方物を、ニッケルグリッドの上のａｉｒｆｕｇｅ上で５分間遠心分離した。次いで、グリッドを１％のＢＳＡのブロッキング溶液中に５分間浸した。モノクローナル抗Ｈ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を、一次抗体として使用した。室温で１時間のインキュベーションの後、グリッドをさらに、１％のＢＳＡで５分間ブロックし、その後、抗マウスＩｇＧ−Ｇｏｌｄ−１０ｎｍ（Ａｕｒｉｏｎ，Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）に対して室温で１時間接触させた。グリッドをＰＢＳと再蒸留水で洗浄し、その後、風乾させた。最後に、グリッドをＰＴＡ  ３％（ｐＨ６．０）（ホスホタングジック酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｉｃ  ａｃｉｄ）で着色し、日立７１００電子顕微鏡を使用して観察した。代表的な電子顕微鏡写真を図１０Ｃに示す。ＩＶＸ９０８は、種々の大きさ（１００ｎｍから３００ｎｍ）の丸型の膜構造を示した（図１Ｃ）。ＩＶＸ９０８構造の表面との金粒子の接近した会合は、ワクチン処方物中でＭＶ抗原がＩＶＸ９０８と会合していることを示した。ＩＶＸ９０８と会合していないＨ抗原もまた観察された。
【００８３】
（動物実験の手順および試料の採取）
全ての動物の処理は、マギル大学（ＭｃＧｉｌｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（プロトコール＃４４８１）によって承認された。１０週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの２１個のグループを使用した（１つのグループあたり５匹の動物）。体重と毒性の兆候（すなわち、毛の状態、猫背の姿勢、脂性肌、眼の分泌物、脱水状態）を、２日ごとに、実験手順が終わるまでモニターした。表１は、研究した種々の実験グループを記載する。ワクチン処方物には、１用量あたり１μｇ、３μｇ、および６μｇの濃度でＭＶ抗原を含めたが、ＩＶＸ９０８の濃度は、全ての処方物について３μｇ／用量の定量に維持した。ＰＢＳを、全てのワクチン処方物について希釈剤として使用した。対照のグループには、ＩＶＸ９０８のみ（３μｇ／用量）、ＭＶ抗原のみ（１、３、または６μｇ／用量）、Ｖｅｒｏ細胞タンパク質のみ（６μｇ／用量）、ＩＶＸ９０８−Ｖｅｒｏ細胞タンパク質（６μｇ／用量）、およびビヒクルＰＢＳを投与した。
【００８４】
全てのワクチンを鼻腔内に投与した。免疫化を、自動導入チャンバーを使用したイソフルラン麻酔下で行い、２５μｌのワクチンを、ピペットゴムと滅菌チップを使用して、鼻腔内に（１つの鼻腔について１２．５μｌ）注入した。マウスを、２週間おきに、１日目と１４日目に、３用量を投与するグループについては、２８日目にも免疫化した。マウスを、各免疫化の前と、最後の免疫化の１０日後（２用量のグループおよび３用量のグループについて、それぞれ、２４日目および３８日目）に、側部伏在静脈から採血した。ＩＶＸ９０８−ＭＶの全ての用量は、初回免疫および追加免疫の両方について十分に寛容であった。行動の変化は記録されず、体重においてもごくわずかな変動しか（例えば、＋／−１．０グラム）検出されなかった。ＩＶＸ９０８のみ、またはＩＶＸ９０８−ＭＶで鼻腔内に免疫化した動物のうちの少数（＜１０％）は、油性被毛を有しており、免疫化の５日後までに猫背の姿勢となった。しかし、体重の減少はそれらのマウスにおいては観察されなかった。
【００８５】
最終日に、マウスをＣＯ２での窒息によって屠殺し、その後、マウスを心臓の穿刺によって放血させた。鼻と肺の洗浄を、気管の切開を行い、そして１２Ｇ−カテーテル（Ｃｌｅａｒ−Ｃａｔｈ，Ａｂｂｏｔｔ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を、最初に、主気道に、その後に鼻咽頭に挿入することによって行った。それぞれの位置について、カテーテルを縫合と、０．１％のＢＳＡとプロテアーゼ阻害因子混合物（ＡＥＢＳＦ、ＥＤＴＡ、ベスタチン、Ｅ−６４、ロイペプチン、およびアプロチニン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ）の混合物を含む）を含む１ｍｌのＰＢＳによって固定した。洗浄液を、肺洗浄液の吸引、または鼻孔から垂れる液を集めることによって回収した。全ての液体を、使用するまで−２０℃で保存した。最終日には、脾臓を無菌操作によって取り出し、単細胞懸濁液を、７０μｍのＮｙｌｏｎ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を使用して調製した。脾細胞を、１０％のウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）と１μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｗｉｓｅｎｔ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｗｉｓｅｎｔ）中に再度懸濁した。
【００８６】
（表１  実験グループの詳細）
【００８７】
【表１】
2007505836.tif 000002
（ＥＬＩＳＡによるＭＶ特異的抗体の定量）
血清および粘膜のＭＶ特異的抗体応答を、定量的ＥＬＩＳＡによって測定した。血清中の全ＩｇＧおよび特異的ＩｇＧイソ型（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）を測定した。鼻洗浄液および肺洗浄液中のＭＶ特異的ＩｇＡレベルを決定した。丸底の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ，ＭＪＳ  Ｂｉｏｌｙｎｘ，Ｂｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）を、炭酸−重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に希釈した１μｇ／ｍｌの超音波処理した全ＭＶ抗原で、４℃で一晩コーティングした。プレートを、２％の脱脂粉乳−ＰＢＳ−Ｔでブロックし、その後、試料の希釈物を２連で添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでの洗浄後、二次標識抗体を、３７℃で１時間かけて添加した。二次抗体には、ヤギ抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  ＢＤ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ、およびヤギ抗−マウスＩｇＧ２ｂ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を含めた。ＩｇＡの検出のためには、ラット抗マウスＩｇＡ−ビオチン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＢＤ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を二次抗体として使用し、続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用した。アッセイを、ＴＭ  Ｂｌｕｅ基質（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）の添加によって完了させた。反応を、０．２Ｍの硫酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して停止させた。各試料の段階希釈物を測定し、標準曲線の２５％〜７５％の範囲に入るデータ点の光学密度の値を選択して、最終的な推定濃度を得た。４５０ｎｍでの光学密度の値の平均と標準偏差（Ｓ．Ｄ．）の値を、自動マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から計算した。試験試料中の抗体濃度を、精製したマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃａｎａｄａ，Ｏａｋｖｉｌｌｅ，Ｏｎｔａｒｉｏ）または精製したマウスＩｇＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）を使用してそれぞれのプレートについて作製した標準曲線から計算した。値は、血清または肺／鼻洗浄液１ｍｌ中の特異的抗体のｎｇを示す。プロテオソームをベースとするワクチンで免疫化した後のセロコンバーションを、ワクチン前のレベルからの少なくとも４倍の抗体力価の上昇と定義した。
【００８８】
免疫化した日（１日目、１４日目、２８日目）、および最終日（２４日目または３８日目）にＥＬＩＳＡによって測定したＢａｌｂ／ｃマウスの血清中に存在する全ＭＶ特異的ＩｇＧを示すデータを、図１１に提供する。値は、平均ＩｇＧ濃度＋／−ＳＥＭとして示す。血清抗体は、第１回目のワクチン用量の後では、全ての研究グループにおいてほとんどの動物において検出できなかった。ＩＶＸ９０８−ＭＶで免疫化した動物は、２回目の免疫化の後にセロコンバーションし（図１１Ａ）、これは、少なくとも１回の追加用量が免疫応答を誘発するために効果的であることを示唆している。有意に高いレベルのＭＶ特異的血清ＩｇＧが、３回目の免疫を投与した動物において得られた。血清ＩｇＧレベルの上昇は、ワクチン処方物に使用されるＭＶ分割抗原の濃度に応じて変化した。ＭＶ抗原の用量と血清ＩｇＧとの間の相関係数（Ｒ２）は、２用量の後では０．９３８であり、３用量の後では０．９３４であった。ＭＶのみ（図１１Ａに示した６μｇのＭＶ対照）、ＩＶＸ９０８のみ、６μｇのＶｅｒｏタンパク質、ＩＶＸ−Ｖｅｒｏ、およびＰＢＳは、検出できなかったか、または非常に低いレベルのＩｇＧを有していた（１〜５００ｎｇ／ｍｌの範囲の値）（一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニ多重比較試験によってｐ＜０．０５）。
【００８９】
特異的イソ型抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を、３用量のＩＶＸ−９０８−ＭＶを投与した動物の最後の採血の血清試料について行った（図１１Ｂ）。図１１Ｂの左側のパネルの値は、５匹の動物の平均濃度＋／−ＳＤを示す。ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａの平均レベルの比を計算し、値を示し、図１１Ｂの右側のパネルにおいてグラフにプロットした。
【００９０】
図１２は、最後の免疫化の１０日後（２用量または３用量での免疫化についてそれぞれ、２４日目または３８日目）に動物から得られた鼻洗浄液および肺洗浄液中のＩｇＡのレベルを示すＥＬＩＳＡデータを示す。２用量の後、ＭＶ特異的ＩｇＡのセロコンバーションは、６μｇのＭＶ分割抗原を含むＩＶＸ９０８−ＭＶで免疫化した動物においてのみ観察された。このことは、ＭＶ特異的粘膜応答の誘導が抗原用量依存的であることを示唆している。用量依存性はまた、３用量を投与した動物においても観察された。３用量を投与した動物についての、鼻洗浄液および肺洗浄液中のＭＶ用量とＩｇＡレベルとの間の相関係数は、それぞれ、０．９７７および０．８２６であった。ＭＶ特異的ＩｇＡレベルは、肺洗浄液と鼻洗浄液において同様であり、このことは、Ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ−ＭＶによって、下部および上部気道の両方において粘膜応答が誘発されたことを示唆している。ＩｇＡのレベルは、全ての対照グループの呼吸粘膜分泌物中では低いままであったか、または検出不可能であった。
【００９１】
（プラーク減少中和（ＰＲＮ）アッセイ）
ＭＶ中和抗体を、以前に記載された（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｇｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．３３：１４７−５２（１９９９））プラーク減少中和（ＰＲＮ）アッセイによって評価した。簡単に説明すると、Ｖｅｒｏ細胞を、９０〜９５％の細胞集密度が得られるように２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）に播種した。血清試料を、各実験グループの５匹の動物からプールし、使用前に、５６℃で４０分間熱不活化させた。血清の段階希釈物を混合し、３７℃で９０分間、継代数の低いＥｄｍｏｎｓｔｏｎ  ＭＶ（２５〜３５プラーク形成単位）とともにインキュベートした。その後、細胞集密状態のＶｅｒｏ細胞の２連のウェルを、１００μｌの血清の２倍の段階希釈物＋ＭＶ混合物に感染させた。ＬｉｅｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中の１６％のメチルセルロースの重層を、感染させた細胞に適用し、その後、細胞を５％のＣＯ２中で３７℃で４日間インキュベートした。４％のニュートラルレッドの溶液を添加して、単層を染色し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。その後、細胞の単層を、３．７％のホルマリンで１０分間固定した。目で見ることができるプラークを数えて、プラーク形成単位（ＰＦＵ）の数を決定した。ウイルスのみを陰性対照とし、そして麻疹ウイルスワクチンをワクチン接種した個体に由来するヒトの血清を陽性対照とした。ＰＲＮ値をＫａｂｅｒ法を使用して得、中和の５０％終点を決定した。ＰＲＮ値は、プラークの数が≧５０％減少した血清希釈の逆数のｌｏｇ２として表される。比較のために、ヒトの血清防御は、ＰＲＮ値＞１２０として定義されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１０３６−４２（１９９０））。ＰＲＮ値を抗体濃度に対して標準化した。２用量および３用量のＩＶＸ９０８：ＭＶ抗原ワクチンを投与した後に動物から得られた血清試料の中和活性のグラフによる表示を、それぞれ、図１３Ａおよび図１３Ｂに示す。全てのＭＶ分割抗原濃度で、２用量のＩＶＸ９０８−ＭＶが、有意な血清中和活性を誘発するために十分であった。さらなる用量のＩＶＸ９０８−ＭＶによって、血清中和応答が増強された。鼻洗浄液および肺洗浄液中に存在する抗体による有意な中和はまた、最も高いＭＶ分割抗原濃度（６μｇ）を投与したグループにおいて、および３μｇ／用量の肺洗浄液中でも観察された。対照グループに由来する血清および粘膜試料は、いずれの時点においても中和活性を有していなかった。
【００９２】
（血清中の抗Ｈタンパク質抗体の検出）
血清を、３用量の高い中和活性を有している、１用量あたり６μｇのＩＶＸ９０８−ＭＶを投与した動物から回収し、ＭＶ抗原に特異的な抗体を検出するための免疫ブロットによって分析した。ＨおよびＦ  ＭＶ抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を使用したＭＶ分割抗原の免疫ブロット分析（上記の調製方法を参照のこと）もまた行った。ＭＶ分割抗原、Ｖｅｒｏタンパク質、およびＯＭＰプロテオソームの調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、分離した抗原の免疫ブロットを上記のように行った。図１４に示すように、ＩＶＸ９０８−ＭＶで免疫化したマウスから回収した血清は、麻疹ウイルスＨタンパク質（８０ｋＤａ）；麻疹ウイルスＦ０タンパク質（５０〜６０ｋＤａ）；麻疹ウイルスＦ１タンパク質（４１ｋＤａ）；髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＭＰ  Ｐｏｒ  Ａ（４５ｋＤａ）；および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＭＰ  Ｐｏｒ  Ｂ（３３ｋＤａ）を認識した。
【００９３】
（ＥＬＩＳＰＯＴによるサイトカインの検出）
マウスにおいては、血清ＩｇＧ１はＴＨ２型応答に関係しており、一方、血清ＩｇＧ２ａはＴＨ１型応答に関係している（Ｍａａｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：２７５１−５７（２００３））。最後のワクチン用量の１０日後に、脾臓を全てのマウスから得た。単核細胞を、７０μｍのＮｙｌｏｎ細胞ストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通して処理することによって脾臓から単離し、単細胞懸濁液を得た。１つの実験グループあたり５匹の動物（表１を参照のこと）に由来する脾細胞をプールした。脾細胞によるＩＦＮγ分泌のＭＶ特異的刺激を、ＥＬＩＰＳＯＴによって定量した（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳＰＯＴ）（ＭＡＢＴＥＣＨ，Ｎａｃｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。脾細胞を、炭酸／重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に希釈した抗ＩＦＮγモノクローナル抗体クローンＡＮ−１８の５μｇ／ｍｌでコーティングしたＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（商標）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｌｏｎ−Ｐベース９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）中に１００，０００細胞／ウェルの密度で播種した。脾細胞を、種々の濃度のＭＶ分割抗原（０．１から１０μｇ）で７２時間刺激した。ＰＨＡ（５μｇ／ｍＬ）を陽性対照として使用した。Ｖｅｒｏタンパク質調製物（１０μｇ／ｍＬ）と培養培地を陰性対照として使用した。結果を、陰性対照の値を引き算した後、スポット形成細胞（ＳＦＣ）／１００万個の脾細胞として表す。陰性対照は、ほとんどの実験において１つのウェルあたり５未満のスポットを生じた（平均＝１．３±１．２）。実験用のウェルは、５より多いスポット／ウェルが存在する（平均よりも＞３  ＳＤ）場合に、ポジティブとみなした。Ｖｅｒｏタンパク質調製物のみによって誘導されたスポットの平均数（陰性対照値）を、種々の濃度のＭＶ分割抗原によって誘導されたスポットの平均数から引き算し、これを、１００，０００個の細胞あたりのサイトカインスポット形成Ｔ細胞サブセットの数に対して較正した（図１５）。ＭＶ分割抗原の、対照グループ（ＩＶＸのみ、ＭＶのみ、ＰＢＳ）に由来する脾細胞とのインキュベーションによっては、スポット形成は生じなかった。これらのデータは、鼻腔内に投与されたＩＶＸ９０８−ＭＶがＭＶ特異的ＩＦＮγ応答を誘導する能力を有していることを示している。値は、３連の実験の平均を表す（＊ｐ＜０．０５  不等分散の片側ｔ検定）。
【００９４】
この実施例の実験についての統計学的分析を、Ｉｎｓｔａｔ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して行った。種々の試験グループについて得られた平均を、ボンフェローニ多重比較ＡＮＯＶＡを使用して比較した。全ての試験において、＜０．０５のｐ値を統計学的に有意とみなした。
【００９５】
（実施例１９）
（ＤＮＡワクチンで感作し、ＩＶＸ９０８で追加免疫したサルにおける免疫応答）
この実施例では、麻疹ＤＮＡワクチンで免疫し、その後、ＩＶＸ９０８を鼻腔内に追加免疫した幼若アカゲザルにおける免疫応答を記載する。この研究の全ての動物を、実験用動物の適切な世話についての手順およびプロトコールにしたがって世話し、処置した。
【００９６】
幼若アカゲザル（麻疹血清反応陰性）のグループに、ＤＮＡワクチン構築物での２回の感作免疫を投与し、その後、弱毒化麻疹ワクチンまたはＩＶＸ９０８−ＭＶのいずれかで追加免疫した。ＤＮＡワクチン構築物には、ＭＶ  Ｈタンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミド（ｐＭＳＩＮＨ）と、ＭＶ  Ｈタンパク質およびＦタンパク質をコードするＤＮＡを含む２シストロン性プラスミド（ｐＭＳＩＮＨ−ＦｄＵ）を含めた。プラスミドを、当該分野で公知の方法にしたがって調製した。第３のＤＮＡワクチン、ＣＶＤ  １２０８（ｐＭＳＩＮ／ＨＦ）を、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ株ＣＶＤ  １２０８を、Ｈタンパク質とＦタンパク質をコードするプラスミドで、Ｐａｓｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：５２０９−１７（２００３））に記載されている方法と同様の手順にしたがってトランスフェクトすることによって調製した。動物に、０日目と２８日目に、ＤＮＡワクチンで２回の感作免疫を受けさせた。ｐＭＳＩＮＨおよびｐＭＳＩＮＨ−ＦｄＵのそれぞれの感作用量は、全部で１ｍｇであり、２本の異なる脚にＢｉｏｊｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｂｉｏｊｅｃｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｍｉｎｓｔｅｒ，ＮＪ）を使用して５００μｇのアリコートを皮内に（ｉ．ｄ．）投与した。ＣＶＤ  １２０８（ｐＭＳＩＮ／ＨＦ）細菌を、鼻腔内に（ｉ．ｎ．）投与した。５９日目に、動物に弱毒化麻疹ワクチン（例えば、標準的なプロトコールにしたがって弱毒化したＳｃｈｗａｒｚ株またはＥｄｍｏｎｓｔｏｎ株（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｎ，ＶＡ））のいずれかを、当該分野で公知の方法にしたがってエアゾールによって追加免疫を投与したか、あるいは、鼻腔内（ｉ．ｎ．）に投与したＩＶＸ９０８−ＭＶ（全部で５０μｇ、片側の鼻孔に２５μｇ）で追加免疫した。追加免疫を、５９日目に投与した。対照には、（１）ＰＢＳでの２回の感作免疫、その後の弱毒化麻疹ワクチンのエアゾール投与による追加免疫；（２）ＰＢＳでの２回の感作免疫、その後のＩＶＸ９０８での追加免疫を含めた。免疫化プロトコールの概要を表２に示す。
【００９７】
（表２  動物のグループと免疫化スケジュール）
【００９８】
【表２】
2007505836.tif 000003
血清試料を、感作免疫の前に、−７日目および０日目（採決前）にサルから得た。その後、動物に最初の感作免疫を投与した後に、数日おき、１週間おき、または２週間に１回、血清を回収した。
【００９９】
血清中のＭＶ抗原特異的ＩｇＧ抗体の存在を、ＥＬＩＳＡによって決定した。ＥＬＩＳＡは、当業者に公知の標準的な手順にしたがって行った。ＭＶ溶解物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｍｂｉａ，ＭＤ）。表３は、０日目から７３日目まで、および０日目から９１日目までの抗ＭＶ抗原力価の倍加を示す。
【０１００】
（表３  麻疹抗原特異的ＩｇＧ応答）
【０１０１】
【表３】
2007505836.tif 000004
麻疹ウイルス抗原特異的ＩＦＮγを、血液を分画するための当該分野で公知の方法にしたがって動物から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して決定した。ＰＢＭＣをＭＶ溶解物（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｍｂｉａ，ＭＤ）（５μｇ／ｍｌ）で、予めＩＦＮγ抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ）でコーティングしておいたニトロセルロースプレート中で刺激した。１０６個のＰＢＭＣあたりのスポット形成細胞の平均数として表した結果を、表４に示す。
【０１０２】
（表４  幼若アカゲザルにおける麻疹ウイルス特異的ＩＦＮγ応答）
【０１０３】
【表４】
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動物から回収した血清を、当該分野で公知であり実施例１８に記載する方法にしたがって行ったＰＲＮアッセイにおいて中和活性について分析した。個々のサルについての結果を、表５に示す。比較のために、ヒトの血清防御は、ＰＲＮ値＞１２０として定義されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６２：１０３６−４２（１９９０））。
【０１０４】
７匹の動物にＩＶＸ９０８−ＭＶを投与し、全ての動物が全く症状を示さなかった。このことは、ＩＶＸ９０８−ＭＶ処方物には全く毒性がなく、動物に有害な反応を全く生じないことを示している。したがって、ＩＶＸ９０８−ＭＶ麻疹ワクチンは、動物に安全に投与され、特異的なウイルス中和免疫応答を誘導する。
【０１０５】
ＩＶＸ９０８−ＭＶ麻疹ワクチンの、動物が麻疹感染の臨床的な症状を発現することを防ぐ能力を、追加免疫のおよそ１年後に、麻疹ウイルス株で、表２に示したグループにおいてサルをチャレンジすることによって決定した。動物を、麻疹感染を示す兆候についてモニターし、ウイルス負荷を決定した。体液性免疫応答（全身性および粘膜の両方）を、血清と、鼻洗浄液および肺洗浄液中の免疫グロブリンレベルを測定するための本明細書中に記載した方法によって決定した。動物において誘導される細胞性応答は、当該分野で公知であり、本明細書中に記載される方法によって決定した。
【０１０６】
（表５  免疫化マカク由来血清中のＭＶ中和抗体）
【０１０７】
【表５−１】
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【０１０８】
【表５−２】
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上記から、本発明の特異的な実施形態が、説明の目的のために本明細書中に記載されているが、種々の変更を、本発明の精神および範囲を逸脱することなく行うことができることが明らかである。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて、限定されない。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１Ａ】図１ＡおよびＢは、プロテオソームのバルク材料の製造についての２つの実施形態を示す（それぞれ、フローチャート１Ａおよびフローチャート１Ｂ）
【図１Ｂ】図１ＡおよびＢは、プロテオソームのバルク材料の製造についての２つの実施形態を示す（それぞれ、フローチャート１Ａおよびフローチャート１Ｂ）
【図２】図２は、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）２ａ  ＬＰＳの製造のためのスキームを示す（フローチャート２）。
【図３】図３は、ＩＶＸ−９０８プロテオソーム−ＬＰＳアジュバントの製造のためのスキームを示す（フローチャート３）。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、麻疹ウイルスＦタンパク質とＨタンパク質が、免疫ブロット分析において麻疹ウイルス分割抗原調製物中で検出可能であることを示す。麻疹ウイルス分割抗原調製物の免疫ブロットを、Ｈタンパク質に特異的に結合する抗体で（図４Ａ、「Ｈ」で示したレーン）、そしてＦタンパク質に特異的に結合する抗体（図４Ａ、「Ｆ」で示したレーン）でプローブした。抗Ｆタンパク質抗体もまた、Ｖｅｒｏ細胞抽出物の免疫ブロットをプローブするためにも使用した。麻疹ウイルス分割抗原調製物のクマシーブルーで染色したゲルは、図４Ａの一番右寄りのレーンに示されている。図４Ｂは、クマシーブルーで染色したゲルの定量的デンシトメトリー分析を示す。
【図５Ａ】図５は、プロジュバントまたはＯＭＰ−ＬＰＳを用いた、およびそれらを用いない、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電子顕微鏡によるＭＶ抗原調製物の分析を示す。図５Ａでは、左側のパネルは、以下に列挙された試料のクマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、中央のパネルは抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体でプローブした免疫ブロットを示し、右側のパネルは、抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体でプローブした免疫ブロットを示す。レーン１：ＭＶ；レーン２：ＭＶの可溶性画分；レーン３：ＭＶの不溶性画分；レーン４：ＭＶ＋ＯＭＰ；レーン５：ＭＶ＋ＯＭＰの可溶性画分；レーン６：ＭＶ＋ＯＭＰの不溶性画分；レーン７：ＯＭＰのみ。図５Ｂは、プロテオソーム：ＭＶ調製物（Ｐｒｏ−ＭＶ）中、およびＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ調製物中のＨタンパク質の存在を示す。
【図５Ｂ】図５は、プロジュバントまたはＯＭＰ−ＬＰＳを用いた、およびそれらを用いない、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび電子顕微鏡によるＭＶ抗原調製物の分析を示す。図５Ａでは、左側のパネルは、以下に列挙された試料のクマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、中央のパネルは抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体でプローブした免疫ブロットを示し、右側のパネルは、抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体でプローブした免疫ブロットを示す。レーン１：ＭＶ；レーン２：ＭＶの可溶性画分；レーン３：ＭＶの不溶性画分；レーン４：ＭＶ＋ＯＭＰ；レーン５：ＭＶ＋ＯＭＰの可溶性画分；レーン６：ＭＶ＋ＯＭＰの不溶性画分；レーン７：ＯＭＰのみ。図５Ｂは、プロテオソーム：ＭＶ調製物（Ｐｒｏ−ＭＶ）中、およびＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶ調製物中のＨタンパク質の存在を示す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、ＭＶ分割抗原ワクチンを投与した動物中での血清ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡのレベルのグラフ表示を示す。図６Ａは、プロテオソーム：ＭＶを鼻腔内に（ＩＮ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。図６Ｂは、プロテオソーム：ＭＶを筋肉内に（ＩＭ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。図６Ｃは、ＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶを鼻腔内に（ＩＮ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、ＭＶ分割抗原ワクチンを投与した動物中での血清ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡのレベルのグラフ表示を示す。図６Ａは、プロテオソーム：ＭＶを鼻腔内に（ＩＮ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。図６Ｂは、プロテオソーム：ＭＶを筋肉内に（ＩＭ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。図６Ｃは、ＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶを鼻腔内に（ＩＮ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、ＭＶ分割抗原ワクチンを投与した動物中での血清ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡのレベルのグラフ表示を示す。図６Ａは、プロテオソーム：ＭＶを鼻腔内に（ＩＮ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。図６Ｂは、プロテオソーム：ＭＶを筋肉内に（ＩＭ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。図６Ｃは、ＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶを鼻腔内に（ＩＮ）投与したマウスにおける免疫グロブリンレベルを示す。
【図７】図７は、プロテオソーム：ＭＶで鼻腔内に（Ｐｒｏ−ＭＶ  ＩＮ）（上段のパネル）；プロテオソーム：ＭＶで筋肉内に（Ｐｒｏ−ＭＶ  ＩＭ）（中段のパネル）；およびＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶで鼻腔内に（ＩＮ）（下段のパネル）免疫化した動物の、血清中の抗体と、鼻および肺の洗浄液中の粘膜抗体のプラーク減少中和（ＰＲＮ）活性のグラフ表示を示す。
【図８】図８は、ＴＨ応答のタイプの指標としての特異的ＩｇＧイソ型のレベルのグラフ表示を示す。動物は、プロテオソーム：ＭＶで鼻腔内に（Ｐｒｏ−ＭＶ  ＩＮ）（上段のパネル）；プロテオソーム：ＭＶで筋肉内に（Ｐｒｏ−ＭＶ  ＩＭ）（中段のパネル）；およびＯＭＰ−ＬＰＳ−ＭＶで鼻腔内に（ＩＮ）（下段のパネル）免疫化した。
【図９】図９は、Ｈタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（１番目のレーン）；Ｆタンパク質に特異的なモノクローナル抗体（２番目のレーン）；Ｍタンパク質に特異的なモノクローナル抗体でプローブしたＭＶ抗原の免疫ブロットを示す。ＰＲＮアッセイにおいて高い中和活性を有していた血清試料を、ＭＶタンパク質（４番目のレーン）およびＶｅｒｏタンパク質（５番目のレーン）の免疫ブロットに使用し、低い中和抗体または低い中和活性を有している血清試料を、ＭＶタンパク質（６番目のレーン）およびＶｅｒｏタンパク質（７番目のレーン）に使用した。
【図１０Ａ】図１０は、麻疹ウイルス分割抗原調製物の免疫ブロット分析と電子顕微鏡分析を示す。図１０Ａは、麻疹ウイルス分割抗原調製物を抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体で（レーン「Ｈ」）または抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体で（レーン「Ｆ」）でプローブした免疫ブロットを示す。麻疹ウイルス抗原調製物はまた、クマシーブルーでも染色した（レーン「クマシー」）。図１０Ｂには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出したタンパク質バンドのデンシトメトリー分析を示す。図１０Ｃは、ＩＶＸ９０８のみ（左側のパネル）と、麻疹ウイルス抗原調製物と組み合わせ、抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体で検出したＩＶＸ９０８の電子顕微鏡分析を示す。
【図１０Ｂ】図１０は、麻疹ウイルス分割抗原調製物の免疫ブロット分析と電子顕微鏡分析を示す。図１０Ａは、麻疹ウイルス分割抗原調製物を抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体で（レーン「Ｈ」）または抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体で（レーン「Ｆ」）でプローブした免疫ブロットを示す。麻疹ウイルス抗原調製物はまた、クマシーブルーでも染色した（レーン「クマシー」）。図１０Ｂには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出したタンパク質バンドのデンシトメトリー分析を示す。図１０Ｃは、ＩＶＸ９０８のみ（左側のパネル）と、麻疹ウイルス抗原調製物と組み合わせ、抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体で検出したＩＶＸ９０８の電子顕微鏡分析を示す。
【図１０Ｃ】図１０は、麻疹ウイルス分割抗原調製物の免疫ブロット分析と電子顕微鏡分析を示す。図１０Ａは、麻疹ウイルス分割抗原調製物を抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体で（レーン「Ｈ」）または抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体で（レーン「Ｆ」）でプローブした免疫ブロットを示す。麻疹ウイルス抗原調製物はまた、クマシーブルーでも染色した（レーン「クマシー」）。図１０Ｂには、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出したタンパク質バンドのデンシトメトリー分析を示す。図１０Ｃは、ＩＶＸ９０８のみ（左側のパネル）と、麻疹ウイルス抗原調製物と組み合わせ、抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体で検出したＩＶＸ９０８の電子顕微鏡分析を示す。
【図１１】図１１は、種々の用量のＩＶＸ９０８−ＭＶで免疫化したマウスの血清中のＩｇＧのＥＬＩＳＡによる定量を示す。図１１Ａ：免疫化後１４日、２８日、および３８日目に動物から得た血清中のＭＶ特異的ＩｇＧ（ｎｇ／ｍｌ）。図１１Ｂ、左側のパネル：血清中のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの検出；図１１Ｂ、右側のパネル：マウスにおけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａの割合。
【図１２】図１２は、２用量を投与した動物については２４日目（図１２Ａ）、また、３用量を投与した動物については３８日目（図１２Ｂ）である、ＩＶＸ９０８−ＭＶでの最後の免疫化の１０日後に動物から得た鼻および肺の洗浄液中のＩｇＡのレベルを示すＥＬＩＳＡデータを示す。＊によって示す統計学的優位性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニ多重比較試験によるｐ＜０．０５を示す。
【図１３】図１３は、２用量（図１３Ａ）および３用量（図１３Ｂ）のＩＶＸ９０８−ＭＶを投与した後に動物から得た血清試料のプラーク減少中和活性のグラフ表示を示す。＊によって示す統計学的優位性は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびボンフェローニ多重比較試験によるｐ＜０．０５を示す。
【図１４】図１４は、ＩＶＸ９０８−ＭＶで免疫化したマウスから採取した血清中の麻疹ウイルス抗原に特異的に結合する抗体の存在を決定するための免疫ブロット分析を示す。１番目のレーン：抗Ｈタンパク質モノクローナル抗体でブロットした分割ＭＶ抗原調製物；２番目のレーン：抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体でブロットした分割ＭＶ抗原調製物；３番目のレーン：マウスの血清でブロットした分割ＭＶ抗原調製物；４番目のレーン：マウスの血清でブロットしたＶｅｒｏ細胞調製物；５番目のレーン：マウスの血清でブロットしたプロテオソーム。検出したタンパク質の分子量は以下のとおりである：麻疹ウイルスＨタンパク質（８０ｋＤａ）；麻疹ウイルスＦ０タンパク質（５０〜６０ｋＤａ）；麻疹ウイルスＦ１タンパク質（４１ｋＤａ）；髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＭＰ  Ｐｏｒ  Ａ（４５ｋＤａ）；および髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＯＭＰ  Ｐｏｒ  Ｂ（３３ｋＤａ）。
【図１５】図１５は、２用量（図１５Ａ）および３用量（図１５Ｂ）のＩＶＸ９０８−ＭＶを投与したマウスから単離し、その後、ＭＶ分割抗原で刺激した脾細胞中でのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の生産を示す。＊によって示す統計学的優位性は、不等分散の片側ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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