(57)【要約】  本発明は、血栓形成または血液凝固疾患の予防または治療用の薬剤の製造用のＧＰＩＩｂへの結合および／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化もしくは阻害用のＬＩＭＫ−１、ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンド、ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングするスクリーニング方法、ならびに血栓形成または血液凝固疾患の治療用の薬剤を製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＩＩｂへの結合のためのＬＩＭＫ−１またはＬＩＭＫ−１類似体の使用。
【請求項２】
ＬＩＭＫ−１類似体がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化物質または阻害物質、好ましくはその阻害物質である請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化または阻害、好ましくはその阻害のための請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化または阻害、好ましくはその阻害のためのＬＩＭＫ−１リガンドの使用。
【請求項５】
ＬＩＭＫ−１リガンドがＬＩＭＫ−１アゴニストまたはＬＩＭＫ−１アンタゴニスト、好ましくはＬＩＭＫ−１アンタゴニストである請求項４に記載の使用。
【請求項６】
血栓形成または血液凝固疾患の予防または治療用薬剤の製造のためのＬＩＭＫ−１、ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドの使用。
【請求項７】
ＬＩＭＫ−１類似体がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の阻害物質であるか、あるいはＬＩＭＫ−１リガンドがＬＩＭＫ−１アンタゴニストである請求項６に記載の使用。
【請求項８】
疾患が血栓形成または血液凝固の増加に関連する疾患である請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
疾患がアテローム血栓性疾患である請求項６〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
疾患が、心筋梗塞、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、冠動脈疾患、冠動脈血栓溶解後の再閉塞、血栓形成術中の閉塞および冠動脈再狭窄、卒中、一過性虚血性発作、肺塞栓症、左室機能不全、心血管および脳血管疾患を有する患者における臨床的血管性合併症の二次的予防、アテローム性動脈硬化症、血管インターベンショナル戦略に対する同時投薬からなる群から選択される請求項６〜９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
（ａ）ＧＰＩＩｂタンパク質および場合によりその下流シグナル伝達の少なくとも１つの要素を供給する工程、
（ｂ）試験化合物を供給する工程、および
（ｃ）ＧＰＩＩｂタンパク質への試験化合物の結合を検出する工程
を含み、試験化合物がＬＩＭＫ−１由来である、ＬＩＭＫ−１類似体をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）の代わりに
（ｃ’）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよび／またはその下流シグナル伝達の活性化または阻害を検出する工程
を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）ＬＩＭＫ−１タンパク質を供給する工程、
（ｂ）試験化合物を供給する工程、および
（ｃ）ＬＩＭＫ−１タンパク質への試験化合物の結合を検出する工程
を含む、ＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングする方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）の代わりに、
（ｃ’）ＬＩＭＫ−１またはＧＰＩＩ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化または阻害、好ましくは、その活性化を検出する工程
をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）ＬＩＭＫ−１タンパク質を供給する工程、
（ｂ）ＧＰＩＩｂおよび／またはその下流シグナル伝達の少なくとも１つの要素を供給する工程、
（ｃ）試験化合物を供給する工程、および
（ｄ）試験化合物とＬＩＭＫ−１タンパク質との相互作用を検出する工程
を含む、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよび／またはその下流シグナル伝達カスケードと相互作用する試験化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
試験化合物を化合物ライブラリーの形で供給する請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ＧＰＩＩｂタンパク質もしくはＬＩＭＫ−１タンパク質への試験化合物の結合またはＧＰＩＩｂおよび／もしくはその下流シグナル伝達に対するその影響を不均一または均一検定法で検出する請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
不均一検定法がＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光免疫検定法）またはＳＰＡ（シンチレーション近接検定法）である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
均一検定法がＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）検定法、ＦＰ（蛍光偏光）検定法、ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネセンス近接均一検定法）、ＥＦＣ（酵素断片相補性）検定法である請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
アレイで実施する請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
全細胞を用いて実施する請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ロボット工学システムで実施する請求項１１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
マイクロフルイディクスを用いて実施する請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドの高処理スクリーニングの方法である請求項１１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項１１〜２４のいずれか１項に記載の方法を実施する工程、
（ｂ）検出された化合物の適切な量を供給する工程、および
（ｃ）検出された試験化合物を１つまたはそれ以上の製薬上許容できる担体または補助物質を用いて製剤化する工程
を含む血栓形成または血液凝固疾患の予防または治療用の薬剤を製造する方法。
【請求項２６】
疾患がアテローム血栓性疾患である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アテローム血栓性疾患が心筋梗塞、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、冠動脈疾患、冠動脈血栓溶解後の再閉塞、血栓形成術中の閉塞および冠動脈再狭窄、卒中、一過性虚血性発作、肺塞栓症、左室機能不全、心血管および脳血管疾患を有する患者における臨床的血管性合併症の二次的予防、アテローム性動脈硬化症、血管インターベンショナル戦略に対する同時投薬からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血栓形成または血液凝固疾患の予防または治療用の薬剤の製造用のＧＰＩＩｂへの結合および／またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化もしくは阻害用のＬＩＭＫ−１、ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンド、ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングするスクリーニング方法の方法、ならびに血栓形成または血液凝固疾患の治療用の薬剤を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は、最小の血液細胞であり、巨核球細胞質の断片にすぎないが、正常な止血に重要な役割を有し、血栓性疾患への重要な寄与因子である。血小板付着、活性化および凝集は、止血の開始のための欠くことができない反応であり、様々な冠動脈、脳および末梢血管疾患の病理に重要な役割を果たす（Ｂｈａｔｔら、２００３年、Ｇｅｏｒｇｅ、２０００年、Ｍｏｒｏｉら、１９９８年、Ｒａｏら、２０００年、Ｒｕｇｇｅｒｉ、２０００年）。
【０００３】
血小板膜は、細胞外マトリックス成分への血小板付着に関与する高濃度のインテグリンおよび他の糖タンパク質を含む（Ｌｏｐｅｚら、１９８８年、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９８８年、Ｓｈａｔｔｉｌ、１９９９年）。コラーゲン線維およびヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）は、曝露された内皮下層への血小板の付着のための重要な部位を与え、血管損傷の部位にそれらを捕捉し、損傷した範囲にわたる細胞の単層の形成を可能にする（Ｒｕｇｇｅｒｉ、２００２年、Ｗａｔｓｏｎ、１９９９年）。コラーゲン線維およびｖＷＦは、Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲｓ）を介して作用するシグナルとともに、インテグリン糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（□ＩＩｂ□３としても知られている）の「裏返し(ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ）」調節、高密度およびα顆粒からの分泌、トロンボキサンの生成および前凝固活性の発現につながる血小板の活性化も刺激する（Ｐａｒｉｓｅ、１９９９年、Ｒｕｇｇｅｒｉ、２００２年、Ｓｈａｔｔｉｌ、１９９９年）。また、血小板は、活性化により、通常の円盤状から付着を促進する長い樹状延長部分を有する緻密な球体に変化する。これらのすべての事象が止血過程を支えている。膜タンパク質ＧＰＩＩｂ（ＣＤ４１）およびＧＰＩＩＩａ（ＣＤ６１）は、フィブリノーゲン、ヴォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）およびフィブロネクチンに結合する血小板の表面上の最も豊富なヘテロ二量体複合体を形成する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、可溶性フィブリノーゲンに対する低い親和力を有する不活性構造の休止血小板の表面上に発現する。コラーゲン、ＡＤＰまたはトロンビンのような多数の重要なアゴニストによる血小板の活性化の後に、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、可溶性フィブリノーゲンに対するその結合親和力を増加させる構造の変化を受け、血小板凝集をもたらす（Ｐａｒｉｓｅ、１９９９年、Ｒｕｇｇｅｒｉ、２００２年、Ｓｈａｔｔｉｌ、１９９９年）。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａによるシグナル伝達は、細胞質側末端のいくつかの領域に関係する。エンドネキシン、カルシウムおよびインテグリン結合タンパク質（ＣＩＢ）、ＳｈｃおよびＧｒｂ２などの数種のシグナル伝達タンパク質がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリンの細胞質ドメインに結合する。さらに、αサブユニットの細胞質側末端における配列ＫＶＧＦＦＫＲがシグナル伝達に関与しており、この領域に対応する脂質修飾ペプチドが血小板を完全に活性化する（Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、１９９８年）。しかし、血小板活性化からフィブリノーゲン受容体曝露までの正確な一連のシグナル伝達は、知られていない。
【０００４】
アスピリンが血小板に対して、また心筋梗塞の一次予防に有効であることが実証されて以来、血栓性障害に対するアスピリンの予防的使用は著しく増加した。したがって、数十年間にわたって、抗血小板療法は、トロンボキサン経路およびアスピリンによるその阻害に重点が置かれている。
【０００５】
その関連性を考えると、付着は抗血栓薬の開発の魅力的な標的であると予想される。しかし、血小板凝集を妨げるように設計された最初の一連の化合物であるαＩＩｂβ３アンタゴニストは、経口長期治療薬として成功しなかった。これは、天然リガンドの場合と同様に、αＩＩｂβ３アンタゴニスト（多くがフィブリノーゲンの受容体認識配列に基づく）が「細胞内への（ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ）」シグナル伝達を実際に誘発することに起因すると想定される（Ｃｏｘら、２０００年）。したがって、血小板を活性化せずに、リガンドと受容体との相互作用を直接妨害することは不可能かもしれない。
【０００６】
近年、いくつかの抗血小板療法が導入され、血栓塞栓性障害におけるアスピリンから、チクロピジンおよびクロピドロゲルにおよぶ抗血小板療法の有用性が実証されている（Ｋｏｎｓｔａｎｔｏｐｏｕｌｏｓら、２００１年、Ｍｏｕｓａら、２００２年、Ｗｅｋｓｌｅｒ、２０００年）。しかし、これらの各種療法はすべて血栓塞栓性障害の治療に付加的な利点を加えるものであるが、種々の薬剤を用いた併用療法の有効性が十分でないことが判明する多くの症例は依然として存在する。さらに、多くの場合にこれらの抗血小板療法による治療は、望ましくない副作用を伴う。したがって、血栓塞栓性障害の治療のための新規なアプローチが緊急に求められている。
【非特許文献１】Ｍｉｚｕｎｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、１６０５〜１６１２頁、１９９４年
【非特許文献２】Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第５版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、１９９２年
【非特許文献３】Ｍｕｊｕｍｄａｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ  Ｃｈｅｍ．、第４巻、１０５頁、１９９２年
【非特許文献４】Ｐｏｎｃｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６２巻、８４７６〜８４８２頁、１９８７年
【非特許文献５】Ｓｃｈｏｂｅｌ  Ｕ．ら、（１９９９年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、第１０巻、１１０７〜１１１４頁
【特許文献１】米国特許第５７４４３０５号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、血栓形成または血液凝固疾患の予防および治療改善のための新規のアプローチならびに例えば、抗血栓療法に対する新規の標的を特定する方法を提供することであった。
【０００８】
驚くべきことに、ＬＩＭＫ−１タンパク質がＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに結合することが今回発見された。ＬＩＭＫ−１は、７２.６ｋＤａのタンパク質（ヒト：６４７アミノ酸）であり、ＬＩＭモチーフ含有タンパク質キナーゼファミリーのメンバーである。その遺伝子は、７ｑ１１.２３における第７染色体上に位置する。該タンパク質は、２つのＮ末端システインリッチＬＩＭ／二重ジンクフィンガーモチーフ、いくつかの推定上のカゼインキナーゼおよびＭＡＰキナーゼ認識部位を含むプロリンセリンリッチ領域、ＰＤＺドメイン（ＰＳＤ９５／ｄｉｓｃ  ｌａｒｇｅ／ＺＯ−１）およびＣ末端セリン／トレオニンキナーゼドメインを含む。ジンクフィンガー様ＬＩＭドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用を仲介すると推定されており、核および細胞骨格タンパク質内に存在すると記載された。ＬＩＭＫ−１のＣ末端キナーゼ断片は、ＬＩＭドメインに結合し、ＬＩＭ断片は、ＬＩＭＫ−１のキナーゼコア断片のキナーゼ触媒活性を用量依存的に阻害することが示された。したがって、Ｎ末端ＬＩＭドメインは、Ｃ末端キナーゼドメインとの直接的相互作用によって、ＬＩＭＫ−１のキナーゼ活性を負に調節する（Ｎａｇａｔａら、１９９９年）。ＬＩＭドメインキナーゼ１（ＬＩＭＫ−１）は、コフィリンのリン酸化によってアクチン細胞骨格の再組織化を調節する。活性なフィリンは、アクチンの解重合をもたらす。結果としてＬＩＭＫ−１によるコフィリンのリン酸化は、コフィリンのアクチン解重合活性の失活につながる（Ｂｉｅｒｎｅら、２００１年、Ｇｏｈｌａら、２００２年、Ｙａｎｇら、１９９８年）。しかし、これまでに血小板におけるＬＩＭＫ−１（またはＬＩＭＫ−２）の潜在的役割に関する報告はなかった。ＬＩＭＫ−１は血小板インテグリンＧＰＩＩｂに結合するので、ＬＩＭＫ−１は、血小板の活性化のために誘発され、また必要な血小板の形状の変化を誘発する。したがって、ＬＩＭＫ−１の阻害は、催血栓刺激による血小板の活性化の阻害につながる。したがって、ＬＩＭＫ−１の阻害は、血小板の活性化と凝集、およびしたがって血栓形成を妨げる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本発明の第一の態様は、特に、インテグリンＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａのシグナル伝達下流を調節、好ましくは阻害するための、ＧＰＩＩｂへの結合のためのＬＩＭＫ−１またはＬＩＭＫ−１類似体のインビトロおよびインビボでの使用を対象とする。
【００１０】
本発明によるＬＩＭＫ−１は、天然のあらゆるＬＩＭＫ−１タンパク質である。これは、ＬＩＭＫ−１タンパク質および種々の動物種、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類のその変異型ならびにスプライス変異型を含む。好ましいＬＩＭＫ−１タンパク質は、ヒトＬＩＭＫ−１タンパク質である。ヒトＬＩＭＫ−１タンパク質のアミノ酸配列は、Ｍｉｚｕｎｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第９巻、１６０５〜１６１２頁、１９９４年に開示されている。
【００１１】
本発明による「ＬＩＭＫ−１類似体」という用語は、ＧＰＩＩｂに結合するが、ＬＩＭＫ−１ではないＬＩＭＫ−１由来のタンパク質を指す。より詳細には、ＬＩＭＫ−１類似体は、天然のＬＩＭＫ−１配列（すなわち、野生型ポリペプチド）と１つまたはそれ以上のアミノ酸が異なっているアミノ酸配列を指す。そのような類似体は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失の点で野生型ポリペプチドと異なっている。好ましいものは半保存的置換であり、より好ましいものは保存的アミノ酸置換であり、それにより、残基が同様な特性を有する他のものによって置換されている。一般的な置換は、脂肪族アミノ酸の間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の間、酸性残基を有するアミノ酸の間、アミド誘導体の間、塩基性残基を有するアミノ酸の間または芳香族残基を有するアミノ酸の間の置換である。一般的な半保存的および保存的置換は、以下のとおりである。
【００１２】
【表１】
2007520456.tif 000002
【００１３】
Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの変化は、新たなシステインが遊離のチオールとして留まる場合、半保存的である。さらに、当業者は、立体的に必要な位置におけるグリシンは置換すべきでなく、Ｐはαらせんまたはβシート構造を有するタンパク質の部分に導入すべきでないことを認識するであろう。
【００１４】
変異型ポリペプチドは、野生型と比べて、一次構造（アミノ酸配列）が異なっているが、二次もしくは三次構造または機能はさほど異なっていてもまたはいなくてもよい。いずれにせよ、類似体は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の野生型ＬＩＭＫ−１との同一性（相同）を示す。
【００１５】
類似体は、ＧＰＩＩｂに結合するために十分なＬＩＭＫ−１の部分であってもよい。この部分は、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは少なくとも１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも３００アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも４５０アミノ酸、最も好ましくは少なくとも６００アミノ酸を含む。類似体のこの部分は、上で詳述したように１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失において野生型ポリペプチドの部分と異なっていてよい。１つの実施形態において、ＬＩＭＫ−１またはＬＩＭＫ−１類似体は、他の分子、例えば、タンパク質および／またはマーカー（例えば、上で詳述したような）に融合されていてよい。
【００１６】
「ＧＰＩＩｂへの結合」または「ＧＰＩＩｂに結合する」という用語は、ＧＰＩＩｂタンパク質への優勢な化合物（ＬＩＭＫ−１またはＬＩＭＫ−１類似体）の特異的結合を指す。本発明によるＧＰＩＩｂタンパク質への特異的結合は、限定なしに、１０-4ｍｏｌ／ｌを超えない、好ましくは１０-5ｍｏｌ／ｌを超えない、より好ましくは１０-6ｍｏｌ／ｌを超えない解離定数ＫDでの結合を含む。解離定数ＫDは、例えば、実施例（例えば、図１を参照）に示すように免疫沈降を用いて、種々の濃度の供試化合物、例えば、ＬＩＭＫ−１またはＬＩＭＫ−１類似体ならびに一定の濃度のＧＰＩＩｂを用いることにより測定することができる。ＧＰＩＩｂに結合している供試化合物の濃度は、例えば、ＬＩＭＫ−１またはＬＩＭＫ−１類似体に対する特異抗体を用いることにより測定される。ＫDは、次の式により求められる。
Ｂ［Ｌ］＝［Ｌ］／（［Ｌ］＋ＫD）
ここで、［Ｌ］は化合物の濃度を表す。ＫDは供試化合物の解離定数であり、Ｂ［Ｌ］は供試化合物の特定の濃度における結合（％）である。
【００１７】
検出のために、抗体は標識することができ、これは適宜、フルオロフォア、発色団、放射性標識、金属コロイド、酵素、または化学発光もしくは生物発光分子であってよい。適切なフルオロフォアおよび発色団は、Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｕｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第５版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．、１９９２年に開示されている。好ましいフルオロフォアの例としては、フルオレセイン、ローダミンおよびスルホインドシアニン色素Ｃｙ５などがある（Ｍｕｊｕｍｄａｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ  Ｃｈｅｍ．、第４巻、１０５頁、１９９２年）。好ましい放射性標識としては、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、99mＴｃまたは125Ｉなどがある。好ましい酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アリカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼおよびウレアーゼなどがある。
【００１８】
本発明によるＧＰＩＩｂは、任意の天然に存在するＰＩＩｂタンパク質である。これは、種々の動物種、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類のＧＰＩＩｂタンパク質およびその変異型ならびにスプライス変異型を含む。好ましいＧＰＩＩｂタンパク質は、ヒトＧＰＩＩｂタンパク質であり、そのアミノ酸配列は、Ｐｏｎｃｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６２巻、８４７６〜８４８２頁、１９８７年に開示されている。
【００１９】
本発明の１つの好ましい実施形態において、ＬＩＭＫ−１類似体は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化物質または阻害物質、好ましくはその阻害物質である。
【００２０】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化物質は、検出可能なシグナルをもたらす各シグナル伝達経路を活性化する。阻害物質は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達を少なくとも部分的に遮断する。活性化および不活性化は、以下で定義する。活性化物質および不活性化物質は、下記のように特定される。
【００２１】
本発明の他の好ましい実施形態において、ＬＩＭＫ−１またはＬＩＭＫ−１類似体は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化または阻害、より好ましくはその阻害のために用いる。
【００２２】
上で詳述したように、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化は、とりわけ通常の円盤状から長い樹状延長部分を有する小型の球体への血小板の外観における構造変化を特徴とする血小板の活性化につながる。本発明によるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化は、ＬＩＭＫ−１またはアゴニスト性ＬＩＭＫ−１類似体で刺激したとき、血小板の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも８０％の活性化に対応する。したがって、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の阻害は、血小板の活性化の阻害につながる。本発明によるＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の阻害は、場合によりＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ活性化物質の存在下で、阻害性ＬＩＭＫ−１類似体で阻害したとき、血小板の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも８０％の阻害に対応する。
【００２３】
本発明の他の対象は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化または阻害、好ましくはその阻害のためのＬＩＭＫ−１リガンドの使用である。
【００２４】
ＬＩＭＫ−１リガンドは、ＬＩＭＫ−１に特異的に結合するあらゆる化合物分子である。本発明によるＬＩＭＫ−１への特異的結合は、限定なしに、１０-4ｍｏｌ／ｌを超えない、好ましくは１０-5ｍｏｌ／ｌを超えない解離定数ＫDでの結合を含む。解離定数ＫDは、ＧＰＩＩｂを用いて詳述したように、またはＬＩＭＫ−１タンパク質および適切な標識ＬＩＭＫ−１リガンドを用いることにより測定することができる。適切なマーカーは、上で詳述した。さらに、ＬＩＭＫ−１アゴニスト性またはアンタゴニスト性ＬＩＭＫ−１リガンドの結合は、それぞれＬＩＭＫ−１のキナーゼ機能の活性化または不活性化により検出することができる。キナーゼ機能は、当業者に知られている方法により容易に検出することができる。それらのうちの一部は以下で詳述する。アンタゴニスト性ＬＩＭＫ−１リガンドの検出のためには、例えば、ＰＡＫ（ｐ２１活性化キナーゼ）またはＲＯＣＫ（Ｒｈｏキナーゼ）でＬＩＭＫ−１を活性化することが必要である場合がある。あるいは、ＬＩＭＫ−１リガンドの結合は、シグナル伝達経路のより下流のシグナル、例えば、血小板の活性化もしくは不活性化またはそれらの構造変化の誘導を測定することによって検出することができる。本発明によるＬＩＭＫ−１への特異的結合は、限定なしに、アゴニスト性およびアンタゴニスト性ＬＩＭＫ−１リガンドについてそれぞれ、１０-4ｍｏｌ／ｌを超えない、好ましくは１０-5ｍｏｌ／ｌを超えないＥＣ50値およびＩＣ50値での結合を含む。ＥＣ50およびＩＣ50値の測定および計算は、当業者に知られている。
【００２５】
ＬＩＭＫ−１は、非重合有機化合物、脂質、炭水化物、ペプチド、好ましくは約１０〜約３００アミノ酸、特に１０〜５０アミノ酸を有するペプチドであってよい。特に好ましいものは、約２００ｇ／ｍｏｌ〜約１５００ｇ／ｍｏｌ、特に４００ｇ／ｍｏｌ〜１０００ｇ／ｍｏｌの好ましい分子量を有する実験室で合成されるかまたは天然に発見される小化合物分子、特に非重合有機化合物である。
【００２６】
あるいは、本発明のＬＩＭＫ−１リガンドは、粗製または精製形態の天然産物抽出物であってよい。抽出物は、ヘビ毒、葉または微生物発酵ブロスのような動物、植物、真菌または細菌源からの水および／またはアルコールおよび／または有機溶媒抽出および／またはカラムクロマトグラフィーおよび／または沈降などの標準的な方法により製造することができる。
【００２７】
好ましい実施形態において、ＬＩＭＫ−１リガンドは、ＬＩＭＫ−１アゴニストまたはＬＩＭＫ−１アンタゴニスト、より好ましくはＬＩＭＫ−１アンタゴニストである。
【００２８】
アゴニストは、ＬＩＭＫ−１に結合し、ＬＩＭＫ−１の変化、例えば、構造変化を誘発し、各シグナル伝達を活性化、例えば、検出可能なシグナルをもたらす、ＬＩＭＫ−１のキナーゼ機能を活性化する。アンタゴニストまたはブロッカーもＬＩＭＫ−１に結合するが、一般的にシグナル伝達を誘導しない。アゴニストの存在下では、アンタゴニストは、アゴニストにより誘導されるシグナル伝達を用量依存的に阻害する。
【００２９】
本発明の他の対象は、血栓形成または血液凝固疾患の予防または治療用の薬剤の製造のための本発明によるＬＩＭＫ−１、ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドの使用である。血栓形成または血液凝固疾患は、血栓形成または血液凝固の変化を伴う疾患である。健常者と比較して、血栓形成または血液凝固（の素因）が増加または減少し得る。
【００３０】
薬剤の生産のために、ＬＩＭＫ−１、ＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドまたはその製薬上許容できる塩は、一般的に所望の特性を得るために混合された製薬上許容できる担体または補助物質のような成分の混合物からなる薬剤剤形中に混入しなければならない。
【００３１】
製剤は、少なくとも１つの適切な製薬上許容できる担体または補助物質を含む。そのような物質の例は、脱塩水、等張食塩水、リンゲル液、緩衝液、有機または無機酸および塩基ならびにそれらの塩、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、プロピレングリコールなどのグリコール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、グルコース、スクロースおよびラクトースなどの糖、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミドなどの可溶化剤および乳化剤、落花生油、綿実油、トウモロコシ油、大豆油、ひまし油などの油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピルなどの合成脂肪酸エステル、ゼラチン、デキストラン、セルロースおよびその誘導体などのポリマーアジュバント、アルブミン、有機溶媒、クエン酸塩および尿素などの錯化剤、プロテアーゼまたはヌクレアーゼ阻害剤、好ましくはアプロチニン、ε−アミノカプロン酸またはペプスタチンＡなどの安定化剤、ベンジルアルコールなどの保存剤、亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤、ワックスおよびＥＤＴＡなどの安定化剤である。着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、着香および芳香剤、保存剤および抗酸化剤も組成物中に存在していてよい。生理緩衝液は、好ましくは、約６.０〜８.０のｐＨ、特に約６.８〜７.８のｐＨ、特に約７.４のｐＨおよび／または約２００〜４００ミリオスモル／リットル、好ましくは約２９０〜３１０ミリオスモル／リットルのオスモル濃度を有する。薬剤のｐＨは、一般的に適切な有機または無機緩衝液、例えば、好ましくはリン酸緩衝液、トリス緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジノ］エタンスルホン酸）またはＭＯＰＳ緩衝液（３−モルホリノ−１−プロパンスルホン酸）などを用いて調整する。各緩衝液の選択は、一般的に所望の緩衝液のモル濃度に依存する。例えば、注射および注入液剤には、リン酸緩衝液が適切である。薬剤ならびに適切な製剤上許容できる担体および補助物質を調合する方法は、当業者によく知られている。製剤上許容できる担体および補助物質は、とりわけ、広く用いられている剤形および特定された化合物に応じて選択する。
【００３２】
経口、鼻内、直腸、非経口、膣、局所または膣投与用の薬剤組成物を製造することができる。非経口投与は、皮下、皮内、筋肉内、静脈内または腹腔内投与などである。
【００３３】
薬剤は、カプセル剤、錠剤、丸薬、散剤および顆粒剤などの経口投与用の固形剤形、製薬上許容できる乳剤、マイクロエマルジョン剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤などの経口投与用の液体剤形、注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性または油性懸濁剤、直腸または膣投与用組成物、好ましくは坐剤、ならびに軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、噴霧剤、吸入剤またはパッチ剤などの局所または経皮投与用の剤形を含む様々な剤形として調合することができる。
【００３４】
個々の患者における特定の治療的に有効な用量レベルは、特定された化合物の活性、剤形、患者の年齢、体重および性別、治療期間ならびに医療技術分野でよく知られている同様な因子を含む様々な因子に依存する。
【００３５】
１回または分割量でヒトまたは他の哺乳類に投与する本発明の化合物の総１日量は、例えば、約０.０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重またはより好ましくは約０.１〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の量であってよい。１回量組成物は、そのような量または１日量を構成するその分量を含んでいてよい。一般的に、本発明による治療法は、１日当たり本発明の化合物の約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇを１回または複数回そのような治療を必要とする患者に投与することを含む。
【００３６】
好ましい実施形態において、ＬＩＭＫ−１類似体は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の阻害物質である。他の好ましい実施形態において、ＬＩＭＫ−１リガンドは、ＬＩＭＫ−１アンタゴニストである。
【００３７】
血栓形成または血液凝固疾患を有する患者のほとんどが血栓形成または血液凝固（の素因）の亢進を伴う疾患に罹患している。したがって、それらの患者は、血栓形成または血液凝固を抑制する薬剤を特に必要とする。したがって、阻害性ＬＩＭＫ−１類似体およびアンタゴニスト性ＬＩＭＫ−１リガンドのような血栓形成または血液凝固を抑制する薬物が、薬剤の製造のための使用に好ましい。
【００３８】
他の好ましい実施形態において、血栓形成または血液凝固疾患は、血栓形成または血液凝固の亢進を伴う疾患である。
【００３９】
血栓形成または血液凝固の亢進を伴う疾患は、当業者に知られており、例えば、アテローム血栓性疾患を含む。
【００４０】
より好ましい実施形態において、疾患は、アテローム血栓性疾患であり、より好ましくは、心筋梗塞、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、冠動脈疾患、冠動脈血栓溶解後の再閉塞、血栓形成術中の閉塞および冠動脈再狭窄、卒中、一過性虚血性発作、肺塞栓症、左室機能不全、心血管および脳血管疾患を有する患者における臨床的血管性合併症の二次的予防、アテローム性動脈硬化症、血管インターベンショナル戦略に対する同時投薬（comedication to vascular interventional strategy）からなる群から選択される疾患である。
【００４１】
さらに、本発明の他の実施形態は、
（ａ）ＧＰＩＩｂタンパク質および場合によりその下流シグナル伝達の少なくとも１つの要素を供給する工程、
（ｂ）試験化合物を供給する工程、および
（ｃ）ＧＰＩＩｂタンパク質への試験化合物の結合を検出する工程
を含み、試験化合物がＬＩＭＫ−１由来であるＬＩＭＫ−１類似体をスクリーニングする方法である。
【００４２】
一般的に、ＧＰＩＩｂおよび場合によりその下流シグナル伝達の少なくとも１つの要素を、例えば、検定システムに供給し、ＬＩＭＫ−１由来の試験化合物と直接または間接的に接触させる。「ＬＩＭＫ−１由来の試験化合物」という表現は、上記で定義したようにＬＩＭＫ−１類似体を指す。次いで、ＬＩＭＫ−１タンパク質への試験化合物の結合を検出する。この場合、結合は、ＧＰＩＩｂと試験化合物との相互作用を測定するか、または下流シグナル伝達に対するその影響を測定することによって検出することができる。
【００４３】
「ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａまたはＧＰＩＩｂの下流シグナル伝達の要素」という用語は、ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａまたはＧＰＩＩｂの下流のシグナル伝達の一部である各分子またはイオンを指す。これは、シグナル伝達カスケードにおけるいずれかの段階のいずれかの要素であってよい。好ましくは、要素それ自体が測定可能なシグナルであるか、またはそれが測定可能なシグナルを発生させる。要素は、例えば、二次メッセンジャーまたは酵素であってよい。シグナルは、例えば、物質の濃度の変化または構造変化であってよい。
【００４４】
結合は、直接的に、すなわち、例えばシグナル伝達経路における下流シグナルであり得る構築複合体を検出、または間接的に、すなわち、複合体の構築の影響を検出することにより、検出することができる。その後、適切なリガンドを分析し、かつ／または分離することができる。ＧＰＩＩｂへのＬＩＭＫ−１類似体の結合を直接測定する方法は、上に詳述した。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、本発明によるＬＩＭＫ−１類似体をスクリーニングする方法は、工程（ｃ）の代わりに次の工程を含む。
（ｃ’）ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよび／またはその下流シグナル伝達の活性化または阻害を検出する。
【００４６】
ＬＩＭＫ−１の活性化または阻害を検出するための適切な機能検定法は、例えば、ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａの下流シグナル伝達を含むものであってよい。活性化または阻害は、例えば、下流シグナル、例えば、血小板の活性化またはそれらの構造変化を解析することによって上記で詳述したように検出することができる。シグナルを阻害性ＬＩＭＫ−１類似体により阻害させ、ＧＰＩＩｂおよび／またはＬＩＭＫ−１刺激物質の存在下でＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａシグナル伝達の阻害を検出することが必要であろう。
【００４７】
本発明の他の実施形態は、
（ａ）ＬＩＭＫ−１タンパク質を供給する工程、
（ｂ）試験化合物を供給する工程、および
（ｃ）ＬＩＭＫ−１タンパク質への試験化合物の結合を検出する工程
を含むＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングする方法である。
【００４８】
一般的に、ＬＩＭＫ−１を例えば検定システムに供給し、試験化合物、特に生化学または化学試験化合物、例えば、化合物ライブラリーの形で直接または間接的に接触させる。次いで、ＬＩＭＫ−１タンパク質への試験化合物の結合を検出する。結合は、直接的に、すなわち、例えばシグナル伝達経路における下流シグナルであり得る構築複合体を検出、または間接的に、すなわち、複合体の構築の影響を検出することにより、検出することができる。ＬＩＭＫ−１へのＬＩＭＫ−１リガンドの結合を直接測定する方法は、上記で詳述した。その後、適切なリガンドを分析し、かつ／または分離することができる。
【００４９】
本発明の他の実施形態において、本発明によるＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングする方法は、工程（ｃ）の代わりに次の工程を含む。
（ｃ’）ＬＩＭＫ−１またはＧＰＩＩ／ＩＩＩａ下流シグナル伝達の活性化または阻害、好ましくはその活性化を検出する工程。
【００５０】
ＬＩＭＫ−１の活性化または不活性化を検出するための適切な機能検定は、例えば、ＬＩＭＫ−１のキナーゼ機能に関するものである。キナーゼ活性を検出する方法は、当業者に知られている（以下を参照）。一般的に、これらの方法は、リン酸基、例えば、32Ｐまたは33Ｐ標識リン酸基のような標識リン酸基の受容体への移動に関するものである。したがって、ＬＩＭＫ−１の活性化はリン酸の移動の増加を伴い、不活性化はリン酸の移動の減少を伴う。シグナルをアンタゴニスト性ＬＩＭＫ−１リガンドにより阻害させ、ＬＩＭＫ−１刺激物質の存在下でＬＩＭＫ−１の不活性化を検出することが必要であろう。活性化または不活性化は、下流シグナル、例えば、血小板の活性化またはそれらの構造変化を測定することによっても検出することができる。
【００５１】
本発明の他の対象は、
（ａ）ＬＩＭＫ−１タンパク質を供給する工程、
（ｂ）ＧＰＩＩｂおよび／またはその下流シグナル伝達の少なくとも１つの要素を供給する工程、
（ｃ）試験化合物を供給する工程、および
（ｄ）ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａ下流シグナル伝達に対する試験化合物の影響を検出する工程
を含むＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよび／またはその下流シグナル伝達と相互作用する試験化合物をスクリーニングする方法である。
【００５２】
一般的に、ＬＩＭＫ−１およびＧＰＩＩｂおよび／またはその下流シグナル伝達の少なくとも１つの要素を例えば検定システムに供給し、試験化合物、特に生化学または化学試験化合物、例えば、化合物ライブラリーの形で直接または間接的に接触させる。次いで、ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａシグナル伝達への試験化合物の影響を上記のように検出する。その後、適切なリガンドを分析し、かつ／または分離することができる。
【００５３】
１つの好ましい実施形態において、全細胞、例えば、血小板を本発明のスクリーニング方法に用い、それにより、ＧＰＩＩｂ／ＧＰＩＩＩａおよびその下流シグナル伝達のさらなる要素を提供する。この場合、検出されるシグナルは、血小板の形状の変化であり得る。
【００５４】
試験化合物の存在下でのＬＩＭＫ−１またはその類似体のＧＰＩＩｂへの結合が試験化合物の非存在下での結合と異なる場合、試験化合物はＧＰＩＩｂおよび／またはその下流シグナル伝達と相互作用している。シグナル伝達は、増加または減少、好ましくは減少し得る。下流シグナル伝達の検出される差は、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも８０％であり、試験化合物の存在下および非存在下でのシグナルの比として計算される。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法の他の実施形態において、試験化合物を化合物ライブラリーの形で供給する。化合物ライブラリーは、複数の化合物を含み、化学的に合成された分子および天然産物を含む複数の源のいずれかから集められ、あるいはコンビナトリアルケミストリー技術により得られたものであった。それらは、高処理スクリーニングに特に適している。それらは、特定の構造の化合物または植物のような特定の生物の化合物から構成されていてよい。本発明の状況において、化合物ライブラリーは、好ましくは、タンパク質およびポリペプチドまたは小分子を含むライブラリーである。
【００５６】
本発明によるＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングするためのスクリーニング方法の他の実施形態において、前記ＧＰＩＩｂタンパク質または前記ＬＩＭＫ−１タンパク質への試験化合物の結合あるいはＧＰＩＩｂおよび／またはその下流シグナル伝達に対するその影響を不均一または均一検定法により検出する。本明細書で用いているように、不均一検定法は、１つまたはそれ以上の洗浄工程を含む検定法であるが、均一検定法では、そのような洗浄工程は必要ではない。試薬および化合物を混合し、測定するのみである。
【００５７】
好ましい実施形態において、不均一検定法は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光免疫検定法）、ＳＰＡ（シンチレーション近接検定法）またはフラッシュプレート検定法である。
【００５８】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）は、種々の会社によって供給されている。該検定法は、ＬＩＭＫ−１のようなキナーゼによりリン酸化することができるランダムペプチドを用いる。キナーゼを含む試料を通常、例えばＡＴＰおよび必須の陽イオンを含む反応緩衝液で希釈し、次いで、プレートウエルに加える。単に混合物を除去して、反応を停止させる。その後、プレートを洗浄する。例えば、ビオチン化基質をキナーゼに加えて、反応を開始させる。反応後、特異的抗体を加える。通常、試料をあらかじめブロックしたプロテインＧプレートに移し、洗浄した後、例えば、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加える。その後、非結合ストレプトアビジン−ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を除去し、ペルオキシダーゼ基質を加えて、ペルオキシダーゼ呈色反応を開始させ、適切なデンシトメーターで光学濃度を測定する。
【００５９】
ＤＥＬＦＩＡ（解離増強ランタニド蛍光免疫検定法）を用いる検定法は、固相検定法である。通常、抗体をユウロピウムまたは他のランタニドで標識し、非結合ユウロピウム標識抗体を洗い流した後、ユウロピウム蛍光を検出する。
【００６０】
ＳＰＡ（シンチレーション近接検定法）およびフラッシュプレート検定法は、通常、放射性標識基質を捕捉するためにビオチン／アビジン相互作用を利用する。一般的に、反応混合物は、キナーゼ、ビオチン化ペプチド基質およびγ−［Ｐ33］ＡＴＰを含む。反応後、ビオチン化ペプチドをストレプトアビジンにより捕捉する。ＳＰＡ検出においては、ストレプトアビジンはシンチラントを含むビーズに結合し、一方、フラッシュプレート検出においては、ストレプトアビジンはシンチラントを含むマイクロプレートのウエルの内側に結合する。免疫化されたならば、放射性標識基質は、発光を刺激するのに十分にシンチラントに近い。
【００６１】
他の好ましい実施形態において、均一検定法は、ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）検定法、ＦＰ（蛍光偏光）検定法、ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネセンス近接均一検定法）、ＥＦＣ（酵素断片相補性）検定法または遺伝子検定法である。
【００６２】
ＴＲ−ＦＲＥＴ（時間分解蛍光共鳴エネルギー移動）に基づく検定法は、通常、Ｃｙ３／Ｃｙ５またはＣｙ５／Ｃｙ７のような重複スペクトルを伴うユウロピウムとＡＰＣ、修飾アロフィコシアニンまたは他の色素との間の蛍光共鳴エネルギー移動を利用する検定法である（Ｓｃｈｏｂｅｌ  Ｕ．ら、（１９９９年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、第１０巻、１１０７〜１１１４頁）。例えば、３３７ｎｍの光によるユウロピウムの励起後に、分子は６２０ｎｍの蛍光を発する。しかし、この蛍光がＡＰＣに十分に近い場合、ユウロピウムはその励起エネルギーをＡＰＣに移動させ、ＡＰＣは６６５ｎｍの蛍光を発する。キナーゼ基質は、通常ビオチン標識基質である。キナーゼ反応の後に、ユウロピウム標識（Ｐ）特異抗体をストレプトアビジン−ＡＰＣとともに加える。リン酸化ペプチドがユウロピウム標識抗体とストレプトアビジン−ＡＰＣとを密接に接触させる。ユウロピウムフルオロフォアへのＡＰＣの密接な近接により、ＡＰＣ蛍光のためにユウロピウム蛍光の消光がもたらされる（ＦＲＥＴ）。
【００６３】
蛍光偏光（ＦＰ）を用いる検定法は、溶液中の蛍光性基質ペプチドを励起するために偏光を用いる検定法である。これらの蛍光性ペプチドは、溶液中で遊離であり、回転して、放射光を偏光解消させる。しかし、基質ペプチドが（Ｐ）−Ｔｙｒのようなより大きい分子に結合しているときには、その回転率は著しく減少し、放射光は高度に偏光したままである。キナーゼの検定のために、一般的に以下の２つの選択肢がある。
（ａ）蛍光性ホスホペプチドトレーサーを（Ｐ）特異抗体に結合させる。リン酸化生成物が抗体における蛍光性ホスホペプチドと競合して、高から低への偏光の変化をもたらす。
（ｂ）リン酸化基質ペプチドがリン特異的抗体に結合して、低から高への偏光の変化をもたらす。
【００６４】
ＡＬＰＨＡ（増幅ルミネセンス近接均一）に基づく検定法は、リン酸化ペプチドにより近接させたドナービーズとアクセプタービーズとの間の一重項酸素の移動に依拠する検定法である。６８０ｎｍでの励起により、ドナービーズにおける光増感剤が周囲の酸素を一重項状態酸素に変換し、一重項状態酸素が２００ｎｍまでの距離に拡散する。アクセプタービーズにおけるケミルミネセンス基がビーズ内の蛍光性受容体にエネルギーを移動させ、次いで、蛍光性受容体が約６００ｎｍの光を放射する。
【００６５】
ＥＦＣ（酵素断片相補性）に基づく検定法または同等の検定法は、特に、化合物の高処理スクリーニングに用いることができる。ＥＦＣ検定法は、酵素アクセプター（ＥＡ）と酵素ドナー（ＥＤ）の２つの断片からなる工学処理β−ガラクトシダーゼ酵素に基づいている。断片を分離すると、β−ガラクトシダーゼ活性はないが、断片が共存すると、結合（相補）して活性な酵素を形成する。ＥＦＣ検定法は、分析物が抗体または受容体のような特異的結合性タンパク質によって認識され得る、ＥＤ−分析物複合体を用いるものである。特異的結合性タンパク質が存在しない場合、ＥＤ−分析物複合体は、ＥＡを相補結合して活性なβ−ガラクトシダーゼを形成し、正のルミネセンスシグナルを発生することができる。ＥＤ−分析物複合体が特異的結合性タンパク質によって結合されている場合、ＥＡとの相補結合が妨げられて、シグナルは存在しない。遊離分析物が供給される（試料中に）場合、遊離分析物は、特異的結合性タンパク質への結合についてＥＤ−分析物複合体と競合する。遊離分析物は、ＥＡとの相補結合のためにＥＤ−分析物複合体を遊離させ、試料中に存在する遊離分析物の量に依存するシグナルを発生させる。
【００６６】
また、他の実施形態において、本発明によるＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングするためのスクリーニング方法は、アレイにＧＰＩＩｂまたはＬＩＭＫ−１を結合させることによりアレイについて実施する。固相化学および光不安定性保護基を用いてそのようなアレイを調製する方法は、例えば、米国特許第５７４４３０５号明細書に開示されている。これらのアレイは、試験化合物または化合物ライブラリーと接触させ、相互作用、例えば、結合や構造変化について試験することもできる。
【００６７】
なお、他の実施形態において、本発明によるＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングするためのスクリーニング方法は、全細胞を用いて実施する。血小板は血液ドナーから容易に入手することができるため、血小板をそのような試験に用いることが好ましい。あるいは、細胞株、場合によりトランスフェクト細胞株を用いることができる。そのような細胞株は、巨核球細胞株（例えば、ＤＡＭＩまたはＭＥＧ−１）、ＨＥＫ２９３細胞（初代ヒト胚腎）、３Ｔ３細胞（マウス胚線維芽細胞）、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣）、ＣＯＳ−７細胞（アフリカミドリザル細胞株）、ＨｅＬａ細胞（ヒト類上皮子宮頸癌）、ＪＵＲＫＡＴ細胞（ヒトＴ細胞白血病）、ＢＨＫ２１細胞（ハムスター正常腎、線維芽細胞）およびＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌）を含むが、これらに限定されない。全細胞を用いることは、細胞内物質、酵素等を試験系に加える必要がないため、膜と比べて有利である。さらに、マルチウエルプレートに加えた全細胞は、高処理スクリーニング試験および自動化試験系に特に適している。
【００６８】
他の実施形態において、本発明によるＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングするためのスクリーニング方法は、ロボット工学システムにおいて実施する。本発明の方法を、例えば、マイクロフルイディクス、すなわち、チャンネル構造を用いた、ロボットによる平板培養およびロボットによる液体輸送を含むロボット工学システムで実施することが有利である。
【００６９】
他の実施形態において、本発明によるＬＩＭＫ−１類似体またはＬＩＭＫ−１リガンドをスクリーニングするためのスクリーニング方法は、高処理スクリーニングシステムの形で実施する。そのようなシステムでは、スクリーニング方法は、自動化かつ小型化されていることが有利である。特に、システムは、ロボットにより制御される小型化ウエルおよびマイクロフルイディクスを用いている。
【００７０】
本発明の他の対象は、
（ａ）本発明によるスクリーニングする方法を実施する工程、
（ｂ）検出された試験化合物の適切な量を供給する工程、および
（ｃ）検出された試験化合物を上記で詳述したような１つまたはそれ以上の製薬上許容できる担体または補助物質を用いて製剤化する工程
を含む血栓形成または血液凝固疾患の予防または治療用の薬剤を製造する方法である。
【００７１】
血栓形成または血液凝固疾患は、血栓形成または血液凝固の変化を伴う疾患である。健常者と比較して、血栓形成または血液凝固（の素因）が増加または減少し得る。血栓形成または血液凝固の亢進を伴う疾患は、当業者に知られており、例えば、アテローム血栓性疾患を含む。
【００７２】
好ましい実施形態において、疾患はアテローム血栓性疾患である。
【００７３】
本発明のより好ましい実施形態において、アテローム血栓性疾患は、心筋梗塞、不安定狭心症、急性冠動脈症候群、冠動脈疾患、冠動脈血栓溶解後の再閉塞、血栓形成術中の閉塞および冠動脈再狭窄、卒中、一過性虚血性発作、肺塞栓症、左室機能不全、心血管および脳血管疾患を有する患者における臨床的血管性合併症の二次的予防、アテローム性動脈硬化症、血管インターベンショナル戦略に対する同時投薬からなる群から選択される。
【００７４】
以下の図および表は、本発明の範囲を限定することなく、本発明をより詳細に説明するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７５】
図１にＧＰＩＩｂ免疫沈降物の２Ｄ電気泳動によるＬＩＭＫ１の検出を示す。対照ＩｇＧ（図１Ａ）またはＧＰＩＩｂに対する特異抗体（図１Ｂ）によるヒト休止血小板抽出物（３.９ｍｇ）の免疫沈降物を、ｐＨ３〜１０勾配で最初の段階においてＩＥＦ（等電点電気泳動）により分離した。その後、タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で二次元で分離した。ゲルをコロイダルクマシー染色し、分析した。特異ＧＰＩＩｂ抗体のみを含むゲル上の可視タンパク質スポットを切除し、トリプシンで消化し（ゲル中消化）、抽出し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳにより分析した。
【００７６】
図２にＬＩＭＫ−１に対する抗体による免疫沈降後のインテグリンＧＰＩＩｂの検出を示す。ＬＩＭＫ−１に対する特異抗体によるヒト血小板抽出物（２ｍｇ）ならびにヒト巨核球細胞株ＤＡＭＩおよびＭＥＧ−０１の免疫沈降物を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をエレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。インテグリンＧＰＩＩｂを特異抗体を用いて検出した。
【００７７】
図３にＬＩＭＫ−１およびＧＰＩＩｂに対する抗体による免疫沈降後のＬＩＭＫ−１の検出を示す。ＬＩＭＫ−１およびＧＰＩＩｂに対する特異抗体によるヒト血小板抽出物の免疫沈降物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をエレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。ＬＩＭＫ−１を特異抗体を用いて検出した。
【００７８】
図４に血小板ならびにＤＡＭＩおよびＭｅｇ−０１細胞の抽出物中のＬＩＭＫ−１の検出を示す。ヒト血小板の抽出物からの等量のタンパク質（５０μｇ）を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をエレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。ＬＩＭＫ−１を特異抗体を用いて検出した。
【００７９】
図５に種々のヒト組織の抽出物中のＬＩＭＫ−１の検出を示す。ヒトの結腸、精巣、腎臓、心臓、血小板、肝臓、筋肉、皮膚、膵臓、脳および胸腺組織の抽出物からの等量のタンパク質を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質をエレクトロトランスファーによりニトロセルロース膜に移した。ＬＩＭＫ−１を特異抗体を用いて検出した。
【００８０】
図６に種々のヒト組織における定量的Ｔａｑｍａｎ分析によるＬＩＭＫ−１転写物の検出を示す。ヒト骨髄、結腸、精巣、腎臓、心臓、血小板、肝臓、胎児肝臓、肺、乳腺、胎盤、前立腺、唾液腺、腸、脊髄、脾臓、胃、気管、子宮、筋肉、膵臓、脳、胎児脳および胸腺組織のｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ分析により分析した。
【実施例】
【００８１】
１．材料および方法
１．１  血小板の準備
血小板は、血液銀行からの（４人のドナー）血小板濃縮製剤から準備した。すべての操作段階を室温で実施した。血小板濃縮製剤をタイロード緩衝液（ｐＨ７.４；１３７ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、２.７ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ、１２ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＨＣＯ3、０.３６ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＨ2ＰＯ4、１ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＣｌ2、１０ｍｍｏｌ／ｌ  ＨＥＰＥＳ、５.６ｍｍｏｌ／ｌデキストロース）で希釈し、得られた懸濁液を制動せずに１２０×ｇで１５分間遠心分離した。次いで、プロスタグランジンＥ1（ＰＧＥ1  ０.５μｇ／ｍｌ）を上清に加え、混合物を室温で５分間インキュベートし、制動せずに６５０×ｇで１５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットをタイロード緩衝液（０.１％ＢＳＡを含む）に再懸濁し、ＰＧＥ1（０.５μｇ／ｍｌ）を加えた。混合物を室温で５分間インキュベートし、その後、制動せずに６５０×ｇで５分間遠心分離した。上清を捨て、ペレットをタイロード緩衝液（ＢＳＡを含まない）に再懸濁し、ＰＧＥ1（０.２５μｇ／ｍｌ）を加え、混合物をインキュベートし（室温で５分間）、遠心分離した（制動せずに６５０×ｇで１５分間）。再び上清を捨て、ペレットをタイロード緩衝液（ＢＳＡを含まない）に再懸濁し、細胞を液体窒素で凍結し、次いで、使用時まで−８０℃で保存した。
【００８２】
１．２  細胞培養
ヒトＤＡＭＩおよびＭｅｇ−０１巨核細胞株の培養物を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（３７℃、５％ＣＯ2）中で増殖させた。細胞を洗浄し、収集し、細胞のペレットを、抽出物の調製の前に−８０℃で保存した。
【００８３】
１．３  免疫沈降のための血小板の処理
凍結血小板ペレットを１〜２ｍｌの溶解緩衝液（下を参照）中で解凍し、次いで、ピペッティングにより上下にかき混ぜた後、音波処理（１０パルス、３０％）により再懸濁した。血小板を遠心分離して（５分、３０００×ｇ）、上清中の可溶性たんぱく質の濃縮のために前分画を行った。
【００８４】
図１で用いた溶解および洗浄緩衝液：
溶解緩衝液（ｐＨ８）：１０ｍｍｏｌ／ｌトリス、１４０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、１％トリトン、０.０５％ＳＤＳ、１ｔａｂ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、２００μｍｏｌ／ｌペファブロック（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩））
洗浄緩衝液（ｐＨ８）：１０ｍｍｏｌ／ｌトリス、１４０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、１％トリトン
図２で用いた溶解および洗浄緩衝液：
溶解緩衝液（ｐＨ７.５）：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、０.５％トリトン、０.０５％ＳＤＳ、１ｍｍｏｌ／ｌＮａ3ＶＯ4、１ｔａｂ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、５ｍｍｏｌ／ｌＮａＦ
洗浄緩衝液（ｐＨ７.５）：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、０.１％トリトン
図３で用いた溶解および洗浄緩衝液：
溶解緩衝液（ｐＨ７.５）：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、１５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、１％トリトン、１ｍｍｏｌ／ｌＮａ3ＶＯ4、１ｔａｂ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、１μｇ／ｍｌペプスタチン、５ｍｍｏｌ／ｌＮａＦ
洗浄緩衝液（ｐＨ７.５）：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス、１５０ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ、０.１％トリトン
【００８５】
１．４  免疫沈降
プロテインＡ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）ならびにプロテインＧ−アガロース（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、抗体の種類によって免疫沈降に用いた。すべての操作段階を４℃で行った。
【００８６】
ビーズを使用前に洗浄緩衝液（上を参照）で３回洗浄した。血小板溶解物をビーズ材料とともに１時間インキュベートしてあらかじめ清澄にし（図１および２、図３ではなし）、その後、遠心分離した（３分、５００×ｇ）。血小板溶解物を抗体とともに１時間インキュベートし、免疫沈降のためにビーズを一夜加えた。その後、ビーズを洗浄緩衝液（上記参照）で３回洗浄し、ＩＥＦ再水和緩衝液（２Ｄゲル分析用）または溶解緩衝液（１Ｄゲル分析用）とともにインキュベートして溶出を行った。
【００８７】
１．５  抗体の仕様
ＧＰＩＩｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｒｏｎｉａ、ＵＳＡ、カタログ番号ｓｃ−７３１０）、免疫沈降用（プロテインＡ）
ＧＰＩＩｂ（Ｂｉｏｔｒｅｎｄ  Ｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号６０６５）、ウエスタンブロット（１：１０００）用  ＬＩＭＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｒｏｎｉａ、ＵＳＡ、カタログ番号ｓｃ−５５７６）、免疫沈降用（プロテインＧ）およびウエスタンブロット（１：２５０）用
【００８８】
１．６  ２Ｄゲル電気泳動
１次元ゲル電気泳動は、Ｂｉｏｒａｄ  Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＥＦ  Ｃｅｌｌ（ＩＰＧストリップ：１１ｃｍ、ｐＨ３〜１０）（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）および次のＩＥＦ再水和緩衝液（８ｍｏｌ／ｌ尿素、０.５％ＣＨＡＰＳ、１０ｍｍｏｌ／ｌＤＴＴ、０.２％Ｂｉｏｌｙｔｅ、０.００１％ブロモフェノールブルー）を用いて行った。能動的再水和のために、１８５μｌの容積の試料を用いてＩＰＧストリップを５０Ｖで一夜放置した。ＩＥＦ（等電点電気泳動）は、直線ランプ、最終電圧８０００Ｖおよび合計少なくとも４００００Ｖｈｒｓで行った。２次元ゲル電気泳動の前に還元／アルキル化を各平衡緩衝液（ｐＨ８.８、６ｍｏｌ／ｌ尿素、２％ＳＤＳ、０.３７５ｍｏｌ／ｌトリス、２０％グリセロール、１３０ｍｍｏｌ／ｌＤＴＴまたは１３５ｍｍｏｌ／ｌヨードアセタミド）中で１０分間行った。
２次元ゲル電気泳動は、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ４〜２０％ゲルを用い、ランニング緩衝液として２５ｍｍｏｌ／ｌトリス、１９２ｍｍｏｌ／ｌグリシン、０.１％ＳＤＳを用いて１５０Ｖで行った。
【００８９】
１．７  １Ｄゲル電気泳動
１Ｄゲル電気泳動は、Ｘ−Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｅ  Ｌｏｃｋ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖｅｘ−ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ならびにランニング緩衝液としてのＭＯＰＳ−ＳＤＳおよび１５０Ｖの電圧を用いて行った。
【００９０】
１．８  エレクトロトランスファー／ウエスタンブロット（Ｓｅｍｉｄｒｙ）
エレクトロトランスファーのために、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（不連続緩衝液システム）（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｉｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた。陽極緩衝液１は０.３ｏｉｌ／ｌトリス、２０％メタノール、陽極緩衝液２は２５ｍｍｏｌ／ｌトリス、２０％メタノール、陰極緩衝液は４０ｍｍｏｌ／ｌアミノカプロン酸、０.０１％ＳＤＳ、２０％メタノールであった。
タンパク質を０.８ｍＡ／ｃｍ2を用いてニトロセルロースシート（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、Ｄａｓｓｅｌ／Ｒｅｌｌｉｅｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、Ｐｒｏｔｒａｎ  ＢＡ８５  ０.４５μｍ）上にブロットした。
【００９１】
１．９  染色技術
ゲルはコロイダルクマシー（Ｎｅｕｈｏｆｆら、１９８８年）または銀（Ｂｌｕｍら、１９８７年の後に修正）で染色した。修正された銀染色は、ゲルを４０％エタノール／１０％酢酸で１時間固定し、３０％エタノールで２回、水で１回各２０分間洗浄し、０.０２％Ｎａ2Ｓ2Ｏ3で１分間増感し、水（３×２０秒）で洗浄し、冷０.１％ＡｇＮＯ3中で４℃で２０分間インキュベートし、水（１×１分よりも３×２０秒）で洗浄し、３％ＮａＣＯ3／０.０５％ホルマリンで現像し、水中でもう１回２０秒間洗浄した。最後に５％酢酸で染色を完了した。
【００９２】
１．１０  画像化
抗体は、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ、カタログ番号ＲＰＮ２１３２）への５分間の曝露後にケミルミネセンス（ＥＣＬ  ｐｌｕｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ、カタログ番号ＲＰＮ２１３２）により検出し、Ａｄｅｆｏ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ（００００９）およびＡｄｅｆｏ−Ｆｉｘａｔｏｒ（０００６２）（ＡＤＥＦＯ−ＣＨＥＭＩＥ  ＧｍｂＨ、Ｎｕｅｒｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により現像した。
【００９３】
１．１１  ゲル中消化
ゲル中消化は、Ｐａｎｄｅｙら、２０００年に従って行った。簡単に述べると、ゲルスポットを手作業により切り取り、分解のためにトリプシン（ブタ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ、カタログ番号Ｖ５１１Ａ）を用いた。
【００９４】
１．１２  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＳＴＲ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦワークステーション（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。試料を乾燥小滴法により調製し、□−シアノヒドロキシケイ皮酸（アセトニトリル／トリフルオロ酢酸中３ｍｇ／ｍｌ）をマトリックスとして用いて２×９６ウエルテフロン被覆試料プレート上にスポットした。７００〜４０００Ｄａの検出範囲で行った。
【００９５】
１．１３  タンパク質の定量
試料のタンパク質含量は、製造業者の指示（５６２ｎｍでの検出）に従ってＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００９６】
１．１４  組織分布パターン
レーンにつき５０μｇのタンパク質をゲル上にのせた。種々のヒト組織をＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。血小板および巨核球からのＬＩＭＫの検出は、上清中であらかじめ濃縮して促進した（図４および図５についてそれぞれ１５０００×ｇ、１５分間または３０００×ｇ、５分間遠心分離）。
【００９７】
１．１５  Ｔａｑｍａｎ分析
増幅のために、以下のＰＣＲプロトコールを用いた。増幅のための次の試薬のすべてがＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）により供給された。２０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１単位のＴａｑＧｏｌｄポリメラーゼ、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液、５００μＭのｄＮＴＰ、２.５ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、２００ｎｍｏｌ／ｌの各増幅プライマー対、Ｈ2Ｏ  ａｄ５μｌ
ＰＣＲの増幅プログラム
９５℃×１０分  ×１サイクル
９５℃×３０秒
７０℃×３０秒  ×２サイクル
９５℃×３０秒
６５℃×３０秒  ×２サイクル
９５℃×３０秒
６０℃×３０秒  ×２サイクル
９５℃×３０秒
５６℃×３０秒
７２℃×３０秒  ×４０サイクル
７２℃×１０分
４℃×３０秒  ×１サイクル
【００９８】
１．１６  装置
実験は、ＣＭ５チップおよびＮｉ−ＮＴＡチップを装着したＢｉａｃｏｒｅ  ３０００最高性能研究システム（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＳＡ、７９１１１  Ｆｒｅｉｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。
【００９９】
結果
２．１  ＬＩＭＫ−１とインテグリンＧＰＩＩｂとの相互作用
本発明者らは、ＧＰＩＩｂに対する市販の特異抗体との共同免疫沈降を用いて、ＧＰＩＩｂとのタンパク質複合体を濃縮した。これらの複合体は、２次元ゲル電気泳動により分離した（図１）。この実験で得られた結果は、ＬＩＭＫ−１はヒト血小板抽出物中のインテグリンＧＰＩＩｂと共同沈降することを示している。
【０１００】
これらの結果を検証するために、本発明者らは、ウエスタン分析によるＧＰＩＩｂのその後の検出のため、ＬＩＭＫ−１に対する市販の特異抗体による血小板抽出物ならびにヒト巨核球細胞株ＤＡＭＩおよびＭＥＧ−０１の免疫沈降を用いた（図２）。これらの結果は、インテグリンＧＰＩＩｂがヒト血小板中のＬＩＭＫ−１と会合するという知見を確認するものであった。ヒト巨核球細胞株ＤＡＭＩおよびＭＥＧ−０１においてはＧＰＩＩｂとＬＩＭＫ−１との相互作用は示されなかった。これらの巨核球細胞株は、分化後に血小板を生産する前駆細胞株である（Ｆｕｇｍａｎら、１９９０年、Ｇｅｏｒｇｅ、２０００年、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９８８年、Ｏｇｕｒａら、１９８８年、Ｓｃｈｉｃｋら、１９９８年、Ｔａｋｅｕｃｈｉら、１９９８年、Ｖｉｔｔｅｔら、１９９２年）。しかし、本発明者らの実験のために本発明者らはこれらの細胞株を未分化形として用いた。これらの未分化巨核球細胞株におけるＧＰＩＩｂインテグリンの発現レベルを分析したとき、本発明者らはＧＰＩＩｂの発現はこれらの細胞株においては血小板における発現と比較してはるかに低いことを見いだした。これは、本発明者らがこれらの細胞株におけるインテグリンとＬＩＭＫ−１との相互作用を検出しなかった理由の説明となっている。
【０１０１】
本発明者らの結果をさらに検証するために、本発明者らは、後続のウエスタン分析によるＬＩＭＫ−１の検出のためにＬＩＭＫ−１およびＧＰＩＩｂに対する市販の特異抗体による血小板抽出物の免疫沈降を用いた（図３）。再び、これらの結果は、インテグリンＧＰＩＩｂがヒト血小板中のＬＩＭＫ−１と会合しているという本発明者らの以前の知見を確認するものであった。
【０１０２】
２．２  ＬＩＭＫ−１の組織分布
本発明者らは、ＬＩＭＫ−１に対する特異抗体を用いて血小板ならびに巨核球細胞株ＤＡＭＩおよびＭＥＧ−０１におけるＬＩＭＫ−１の発現を分析した（図４）。このように、本発明者らはＬＩＭＫ−１に対する特異抗体を用いて、血小板ならびに巨核球細胞株ＤＡＭＩおよびＭＥＧ−０１におけるＬＩＭＫ−１の発現を確認した。
【０１０３】
さらに、種々のヒト組織におけるＬＩＭＫ−１の発現を分析するために、本発明者らは後続のウエスタン分析のためにヒト組織抽出物をゲル電気泳動により分離した（図５）。これらの結果は、ＬＩＭＫ−１が精巣、心臓、血小板、筋肉および脳組織において発現することを示している。発現は血小板に対して絶対的に特異的でないが、ＬＩＭＫ−１はすべての組織に普遍的には発現しない。この知見は、脳、胎児脳および精巣におけるＬＩＭＫ−１の発現を示しているＴａｑｍａｎ分析（図６）により確認されている。血小板は、このＴａｑｍａｎパネルには示さない。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ＧＰＩＩｂ免疫沈降物の２Ｄ電気泳動によるＬＩＭＫ１の検出を示す。
【図２】ＬＩＭＫ−１に対する抗体による免疫沈降後のインテグリンＧＰＩＩｂの検出を示す。
【図３】ＬＩＭＫ−１およびＧＰＩＩｂに対する抗体による免疫沈降後のＬＩＭＫ−１の検出を示す。
【図４】血小板ならびにＤＡＭＩおよびＭｅｇ−０１細胞の抽出物中のＬＩＭＫ−１の検出を示す。
【図５】種々のヒト組織の抽出物中のＬＩＭＫ−１の検出を示す。
【図６】種々のヒト組織における定量的Ｔａｑｍａｎ分析によるＬＩＭＫ−１転写物の検出を示す。
【図１】
2007520456.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007520456.tif 000007
【図６】
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【国際調査報告】
2007520456.tif 000009
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