(57)【要約】  ボツリヌストキシン（ボツリヌストキシン誘導体を含む）を局所適用するための組成物は、ボツリヌストキシン、及び正に帯電した分枝基若しくは「効果」基が結合している長鎖ポリペプチド又は非ペプチジルのポリマーを含むポリマーの主鎖を含む担体を含んでいる。本発明は、筋肉の麻痺、及びボツリヌストキシンで処置することができる他の状態、詳しくは、皮下の麻痺、最も詳しくは、顔面の筋肉を、有効な量のボツリヌストキシン及び担体を組み合わせて、対象の皮膚又は上皮に局所的に適用することにより緩和するための方法にも関する。投与するためのキットも記載する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌストキシンと、正に帯電した分枝基が結合しているポリマー主鎖を含む担体とを含む組成物であって、担体とボツリヌストキシンとの結合が非共有結合性である組成物。
【請求項２】
ボツリヌストキシンがボツリヌストキシン誘導体である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
ボツリヌストキシンが組換えボツリヌストキシンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ボツリヌストキシンが修飾されたボツリヌストキシンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
ボツリヌストキシンが、血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ型のボツリヌストキシンから選択される、請求項１記載の組成物。
【請求項６】
ボツリヌストキシンがＡ型ボツリヌストキシンである、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
ボツリヌストキシンがＢ型ボツリヌストキシンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
ボツリヌストキシンがＣ１型ボツリヌストキシンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ボツリヌストキシンがＤ型ボツリヌストキシンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
ボツリヌストキシンがＥ型ボツリヌストキシンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ、アンテナペディアＰＴＤ及びＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはアンテナペディアＰＴＤの断片（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から選択される、正に帯電した分枝基が結合しているポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２から選択される正に帯電した分枝基を有するポリペプチドを含み、式中、下付文字ｎ１は約０から約２０までの整数であり、下付文字ｎ２は独立に約５から約２５までの奇数である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
下付き文字ｎ１が、０〜約８の整数である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
下付き文字ｎ１が、約２〜約５の整数である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
下付き文字ｎ２が、約７〜約１７の奇数である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
下付き文字ｎ２が、約７〜約１３の奇数である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
担体が、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片から選択される、正に帯電した分枝基が結合しているポリペプチドを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
分枝基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有する正に帯電したＨＩＶ−ＴＡＴ断片である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
正に帯電した分枝基が、担体全体の重量の少なくとも約０．０５重量％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
正に帯電した分枝基が、担体全体の重量の約０．５重量％〜約４５重量％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
正に帯電した分枝基が、担体全体の重量の約０．１重量％〜３０重量％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
主鎖が、正に帯電したポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
主鎖が、正に帯電したポリリジンを含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ポリリジンが、約１０，０００〜１，５００，０００の分子量を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
ポリリジンが、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
ポリリジンが、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
主鎖が、正に帯電した非ペプチジル担体を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
主鎖が、正に帯電したポリアルキレンイミンを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
ポリアルキレンイミンが、ポリエチレンイミンである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
ポリエチレンイミンが、約１０，０００〜約２，５００，０００の分子量を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
ポリエチレンイミンが、約１００，０００〜約１，８００，０００の分子量を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
ポリエチレンイミンが、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３３】
ｐＨが約４．５〜約６．３である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３４】
室温で、又は冷蔵条件下で貯蔵した場合に安定である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３５】
請求項１に記載の制御放出組成物。
【請求項３６】
請求項１に記載の液体組成物。
【請求項３７】
請求項１に記載のゲル組成物。
【請求項３８】
クリーム剤、ローション剤、又は軟膏剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３９】
食塩水をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４０】
食塩水及びｐＨ緩衝系をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４１】
ボツリヌストキシン、及びその経皮送達に有効な量の正に帯電した分枝基が結合している、ポリマーの主鎖を含む担体を含み、担体とボツリヌストキシンの間の結合が非共有結合である、ボツリヌストキシンを対象に投与するためのキット。
【請求項４２】
特別仕様でつくられたアプリケーターをさらに含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
特別仕様でつくられたアプリケーターが、医療専門家が使用するために設計されている、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
特別仕様でつくられたアプリケーターが、対象が自己投与するために設計されている、請求項４２に記載のキット。
【請求項４５】
ボツリヌストキシン及び担体を含む予め配合された組成物を含む、請求項４１に記載のキット。
【請求項４６】
ボツリヌストキシン及び担体が、投与の前に混合するために別々に配合されている、請求項４１に記載のキット。
【請求項４７】
ボツリヌストキシンが、ボツリヌストキシンを対象に皮膚から投与するための装置に含まれている、請求項４１に記載のキット。
【請求項４８】
装置が皮膚パッチである、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
ボツリヌストキシンを皮膚に送達するための器具と、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片、並びにアンテナペディアＰＴＤ（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から選択される、正に帯電した分枝基が結合しているポリマー主鎖を含む担体を含む組成物とを含む、ボツリヌストキシンを対象に投与するためのキット。
【請求項５０】
器具が皮膚パッチである、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
正に帯電した分枝基が結合しているポリマー主鎖を含む有効量の担体と共に、ボツリヌストキシンを対象の皮膚又は上皮に局所的に適用することを含む、ボツリヌストキシンを対象に投与する方法であって、担体とボツリヌストキシンとの結合は非共有結合性である方法。  
【請求項５２】
有効量の請求項１に記載の組成物を、対象の皮膚又は上皮に局所的に適用することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
対象の皮膚又は上皮にボツリヌストキシン及び担体を別々に適用することを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
望ましい生物学的効果を達成するためにボツリヌストキシンを投与する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
審美上の又は美容上の利点を達成するために、ボツリヌストキシンを投与する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
免疫応答を低下させ又は防止するためにボツリヌストキシンを適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
後の組成物の繰返し再投与の際に、低下し、又は防止された免疫応答が治療効果を増強する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
自覚的な又は臨床上の多汗症に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを投与する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
自覚的な又は臨床上のジストニー収縮（dystonic contractions）又はジストニア(dystonia)を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
筋痙攣に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
ボツリヌストキシンを対象の背下部に局所的に適用する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ボツリヌストキシンを対象の頚部に局所的に適用する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
ボツリヌストキシンを対象の少なくとも１本の脚に局所的に適用する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
ボツリヌストキシンを対象の顔面に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
ボツリヌストキシンを対象の腋窩に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
ボツリヌストキシンを対象の掌に、若しくは足に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
ボツリヌストキシンを対象の背部若しくは頚部に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６８】
ボツリヌストキシンを対象の鼠径部に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項６９】
組成物を対象の手若しくは足に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７０】
ボツリヌストキシンを対象の肘、上腕、膝、若しくは上脚に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７１】
ボツリヌストキシンを対象の臀部に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７２】
ボツリヌストキシンを対象の胴に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７３】
ボツリヌストキシンを対象の骨盤に、又はその一部分に局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７４】
ボツリヌストキシンを、免疫応答を生じさせる、又は増強するために適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７５】
ボツリヌストキシンを偏頭痛に関連する症状を予防し、又は緩和するために局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７６】
ボツリヌストキシンを、座瘡を予防し、又は緩和するために局所的に適用する、請求項５１に記載の方法。
【請求項７７】
ボツリヌストキシンがボツリヌストキシン誘導体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項７８】
ボツリヌストキシンが組換えボツリヌストキシンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項７９】
ボツリヌストキシンが修飾されたボツリヌストキシンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８０】
ボツリヌストキシンが血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧ型のボツリヌストキシンから選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項８１】
ボツリヌストキシンがＡ型ボツリヌストキシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項８２】
ボツリヌストキシンがＢ型ボツリヌストキシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項８３】
ボツリヌストキシンがＣ型ボツリヌストキシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項８４】
ボツリヌストキシンがＤ型ボツリヌストキシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項８５】
ボツリヌストキシンがＥ型ボツリヌストキシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項８６】
担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ、アンテナペディアＰＴＤ、及びＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはアンテナペディアＰＴＤの断片（式中、下付き文字ｎ１は、０〜約２０の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５の奇数である）から選択される、正に帯電した分枝基が結合しているポリマー主鎖を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項８７】
担体が、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２から選択される正に帯電した分枝基を有するポリペプチドを含む（式中、下付文字ｎ１は約０〜約２０の整数であり、下付文字ｎ２は独立に約５〜約２５の奇数である）請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
下付き文字ｎ１が、０〜約８の整数である、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
下付き文字ｎ１が、約２〜約５の整数である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９０】
下付き文字ｎ２が、約７〜約１７の奇数である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９１】
下付き文字ｎ２が、約７〜約１３の奇数である、請求項８７に記載の方法。
【請求項９２】
担体が、ＨＩＶ−ＴＡＴ及びその断片から選択される正に帯電した分枝基が結合しているポリペプチドを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
分枝基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有する正に帯電したＨＩＶ−ＴＡＴ断片である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
正に帯電した分枝基が、担体全体の重量の少なくとも約０．０５重量％を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項９５】
正に帯電した分枝基が、担体全体の重量の約０．５重量％〜約４５重量％を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項９６】
正に帯電した分枝基が、担体全体の重量の約０．１重量％〜約３０重量％を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項９７】
主鎖が、正に帯電したポリペプチドを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項９８】
主鎖が、正に帯電したポリリジンを含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ポリリジンが、約１０，０００〜１，５００，０００の分子量を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
ポリリジンが、約２５，０００〜約１，２００，０００の分子量を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
ポリリジンが、約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
主鎖が、正に帯電した非ペプチジル担体を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項１０３】
正に帯電した非ペプチジルポリマーが、ポリアルキレンイミンである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
ポリエチレンイミンが、約１０，０００〜約２，５００，０００の分子量を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
ポリエチレンイミンが、約１００，０００〜約１，８００，０００の分子量を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
ポリエチレンイミンが、約５００，０００〜約１，４００，０００の分子量を有する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
ボツリヌストキシンが組換えボツリヌストキシンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項１０９】
ボツリヌストキシンが約４．５〜約６．３のｐＨを有する組成物に適用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１０】
ボツリヌストキシンが制御放出組成物に適用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１１】
ボツリヌストキシンが液体組成物に含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１２】
ボツリヌストキシンがゲル組成物に含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１３】
ボツリヌストキシンが、クリーム剤、ローション剤、又は軟膏剤である組成物に含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１４】
ボツリヌストキシンが、食塩水をさらに含む組成物に含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１５】
ボツリヌストキシンが、食塩水及びｐＨ緩衝系をさらに含む組成物に含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１６】
ボツリヌストキシンがボツリヌストキシンを投薬するための装置に含まれており、装置を対象の皮膚又は上皮に局所的に適用する請求項５１に記載の方法。
【請求項１１７】
装置が皮膚パッチである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
装置が細胞封入装置である、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
粘液分泌に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２０】
肥満又はその症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２１】
炎症又はその症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２２】
乾癬に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
組成物を他の治療形態と組み合わせて適用する、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
いびきを予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２５】
糖尿病に関連する皮膚の症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２６】
創傷治癒を改善するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２７】
自律神経障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２８】
脳性麻痺に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１２９】
橋本甲状腺炎に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３０】
乳腺の障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３１】
発毛を変調するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３２】
副甲状腺疾患に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３３】
運動障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３４】
パーキンソン病に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
振戦に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３６】
てんかんに関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３７】
内耳の障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３８】
泌尿器の障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１３９】
他のコリン作動性に制御される分泌を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１４０】
神経精神障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１４１】
負傷した筋肉に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１４２】
耳の障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１４３】
癌に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１４４】
神経絞扼障害に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１４５】
高カルシウム血症に関連する症状を予防し、又は緩和するために、ボツリヌストキシンを局所的に適用する、請求項５４に記載の方法。
【請求項１４６】
ボツリヌストキシンが融合タンパク質を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項１４７】
ボツリヌストキシンがＦ型ボツリヌストキシンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４８】
ボツリヌストキシンがＧ型ボツリヌストキシンである、請求項５に記載の組成物。
【請求項１４９】
ボツリヌストキシンがＦ型ボツリヌストキシンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項１５０】
ボツリヌストキシンがＧ型ボツリヌストキシンである、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年３月３日に出願された米国仮特許出願第６０／５５００１５号の優先権の利益を主張するものである。米国特許仮出願第６０／５５００１５号の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、外部環境の脅威から身体の器官を保護し、身体の温度を維持するためのサーモスタットの役割を果たす。皮膚は、いくつかの異なる層からなり、それぞれは特殊な機能を有する。主要な層には、表皮、真皮、及び下皮が含まれる。表皮は、結合組織からなる、真皮の上に横たわる上皮細胞の層状の層である。表皮と真皮の双方とも、皮下組織、即ち脂肪組織の内層によってさらに支持されている。
【０００３】
表皮、即ち皮膚の最上層は、０．１〜１．５ミリメートルの厚さしかない（Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。表皮は、ケラチノサイトからなり、分化状態に基づいていくつかの層に分けられる。表皮は、角質層、並びに、顆粒メルピギー（melphigian）及び基底細胞からなる分裂可能な表皮にさらに分類することができる。角質層は吸湿性であり、その屈曲性及び柔軟性を維持するために少なくとも１０％重量の水分を必要とする。吸湿性は、ある程度は、ケラチンの保水力に起因し得る。角質層は、その柔軟性及び屈曲性を失うと、粗く且つ脆くなり、乾燥した皮膚を生じる。
【０００４】
表皮の真下に横たわる真皮は、１．５〜４ミリメートルの厚さである。これは、皮膚の３種の層のうちで最も厚い。さらに、真皮は、汗腺及び皮脂腺（孔（pore）と呼ばれる皮膚中の開口部、又は面ぽうを通して物質を分泌する）、毛穴、神経終末、並びに血管及びリンパ管を含めて、皮膚構造体の大部分が存在する場所でもある（Inlander, Skin, New York, NY:People's Medical Society, 1-7 (1998)）。しかし、真皮の主成分は、コラーゲン及びエラスチンである。
【０００５】
皮下組織は、皮膚の最下層である。皮下組織は、体温維持のための絶縁体としての役割と器官保護のための衝撃吸収材としての役割の両方を果たす（Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998)）。さらに、皮下組織はまた、エネルギー備蓄のために脂肪を蓄える。皮膚のｐＨは、一般に５〜６である。この酸性度は、皮脂腺の分泌物に由来する両性のアミノ酸、乳酸、及び脂肪酸の存在に起因する。「酸外套（acid mantle）」という用語は、皮膚の大部分の領域に水溶性物質が存在することに関係する。皮膚の緩衝能は、一部には、皮膚の角質層で蓄積されているこれらの分泌物によるものである。
【０００６】
しわは、加齢の証拠となる徴候の１つであり、環境的損傷から蓄積する生化学的、組織学的、及び生理的変化によって引き起こされ得る（Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)）。さらに、顔のしわの特徴的なひだ、溝、及び折り目を引き起こし得る他の２次因子もある（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。これらの２次因子としては、重力の恒常的な引張り、皮膚に対する高頻度且つ恒常的な位置的圧力（即ち、就寝中）、及び顔筋の収縮によって生じる反復性の顔面運動が挙げられる（Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)）。加齢の徴候のうちのいくつかを潜在的に軽減するために、様々な技術が利用されている。これらの技術は、αヒドロキシ酸及びレチノールを含有する顔用保湿剤から、外科的処置及び神経毒素の注射にまで及ぶ。
【０００７】
皮膚の主要機能のうちの１つは、水及び正常な恒常性に対して潜在的に有害な物質の輸送に対する障壁を提供することである。丈夫な半透性の皮膚が無ければ、身体は急速に水分を失うはずである。皮膚は、有害物質の身体への進入を防止するのに寄与する。大半の物質は、この障壁を透過することができないが、皮膚の透過性を選択的に高めるためにいくつかの戦略が開発され、いくらか成功を収めている。
【０００８】
ボツリヌストキシン（ボツリヌス（botulin）トキシン又はボツリヌス神経毒素としても公知である）は、グラム陽性細菌のボツリヌス菌（Clostridium botulinum）によって産生される神経毒素である。これらは、神経筋接合部を通過するアセチルコリンのシナプス伝達又は放出を防止することによって、筋肉の麻痺を生じさせる作用を果たし、同様に他の方法でも作用すると考えられている。それらの作用は、本質的には、普通なら筋肉の痙攣又は収縮を引き起こして麻痺をもたらすはずであるシグナルを遮断する。
【０００９】
ボツリヌストキシンは、血清学的に関連しているが異なる、８種の神経毒素に分類されている。これらのうち、７種、即ち、ボツリヌス神経毒素の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧは、麻痺を引き起こすことができる。これらのそれぞれは、型特異的抗体による中和によって区別される。それでもなお、ボツリヌストキシンタンパク質分子の分子量は、これらの活性なボツリヌストキシン血清型の７種すべてにおいて、約１５０ｋＤである。細菌によって放出されるとき、ボツリヌストキシンは、結合した無毒性タンパク質と共に当該の１５０ｋＤボツリヌストキシンタンパク質分子を含む複合体である。Ａ型ボツリヌストキシン複合体は、９００ｋＤ、５００ｋＤ及び３００ｋＤ型として、クロストリジウム（Clostridia）属細菌によって産生され得る。Ｂ型及びＣ型ボツリヌストキシンは、７００ｋＤ又は５００ｋＤの複合体としてのみ産生されるようである。Ｄ型ボツリヌストキシンは、３００ｋＤ及び５００ｋＤの双方の複合体として産生される。Ｅ型及びＦ型ボツリヌストキシンは、約３００ｋＤの複合体としてのみ産生される。これらの複合体（即ち分子量が約１５０ｋＤより大きいもの）は、無毒素のヘマグルチニンタンパク質及び無毒素且つ無毒性の非ヘマグルチニン（nonhemaglutinin）タンパク質を含有すると考えられている。これら２種の無毒性タンパク質（ボツリヌストキシン分子と共に、当該の神経毒素複合体を含む）は、ボツリヌストキシン分子に対する変性に対抗する安定性、及びトキシンが経口摂取された場合の、消化酸からの保護を実現する役割を果たすことができる。さらに、より大型の（分子量が約１５０ｋＤより大きい）ボツリヌストキシン複合体は、ボツリヌストキシン複合体の筋肉内注射部位から離れた場所に、より遅い速度でボツリヌストキシンを拡散させることができる。
【００１０】
様々な血清型のボツリヌストキシンは、作用する動物種、並びに誘発する麻痺の重症度及び持続期間において異なる。例えば、ラットで生じる麻痺の速度で評価すると、Ａ型ボツリヌストキシンは、Ｂ型ボツリヌストキシンより５００倍強力であることが測定されている。さらに、Ｂ型ボツリヌストキシンは、Ａ型に対する霊長類のＬＤ５０の約１２倍である４８０Ｕ／ｋｇの用量では、霊長類において無毒性であることが確認されている。ボツリヌストキシンの分子サイズ及び分子構造が原因となって、ボツリヌストキシンは、角質層及びその下にある皮膚構造の複数の層を通過することができない。
【００１１】
ボツリヌス中毒、即ち、全身性のボツリヌストキシン暴露に起因する特徴的な症状群は、古代からヨーロッパで存在していた。１８９５年に、Emile P. van Ermengemは、ベルギーでボツリヌス中毒が原因で死んだ犠牲動物の死後組織から得た生の塩漬け豚肉から、嫌気性の胞子形成桿菌を初めて単離した。Van Ermengemは、彼がバチルスボツリヌス（Bacillus botulinus）と呼んだものによって産生される細胞外毒素によって疾患が引き起こされることを発見した（Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26:1-56; Rev Infect (1897)）。この名称は、１９２２年にクロストリジウムボツリヌス（Clostridium botulinum）に変更された。クロストリジウムという名称は、その微生物の嫌気性の性質、また、その形態学的特徴を反映するために使用された（Carruthers and Carruthers, Can J Ophthalmol, 31:389-400 (1996)）。１９２０年代には、食中毒のさらなる集団発生後に、Ａ型ボツリヌストキシンの粗製の型が単離された。サンフランシスコ州カリフォルニア大学のHerman Sommer博士は、神経毒素を精製しようと初めて試みた（Borodic et al., Ophthalmic Plast Recostr Surg, 7:54-60 (1991)）。１９４６年に、Edward J. Schantz博士及び彼の同僚は、結晶型の神経毒素を単離した（Schantz et al., In: Jankovi J, Hallet M (Eds) Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY: Marcel Dekker, 41-49 (1994)）。１９４９年までに、Burgen及び彼の共同研究者は、 ボツリヌストキシンが、神経筋接合部を通過するインパルスを遮断することを実証することに成功した（Burgen et al., J Physiol, 109:10-24 (1949)）。Allan B. Scottは、１９７３年に、サルでＡ型ボツリヌストキシン（ＢＴＸ−Ａ）を初めて使用した。Scottは、可逆性の眼筋麻痺が３カ月持続することを実証した（Lamanna, Science, 130:763-772 (1959)）。その後すぐに、ＢＴＸ−Ａは、ヒトの斜視、眼瞼痙攣、及び痙性斜頚の上出来の治療薬であることが報告された（Baron et al., In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM (Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO: Mosby Year Book, 504-523 (1994); Carruthers and Carruthers, Adv Dermatol, 12:325-348 (1997); Markowitz, In: Strickland GT (Eds) Hunters Tropical Medicine, 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 441-444 (1991)）。１９８６年に、Jean及びAlastair Carruthers、即ち、眼科形成外科医及び皮膚科医からなる夫妻のチームは、眉間領域における動作に関連したしわを治療するためのＢＴＸ−Ａの美容用途を開発し始めた（Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York:Academic Press, 143-150 (1981)）。CarruthersはＢＴＸ−Ａをしわの治療用に使用し、１９９２年に彼らはこの手法に関する影響力の大きい論文を発表した。（Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981)）。１９９４年までに、同チームは、動作に関連した顔面の他のしわを用いた経験を報告した（Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)）。これは、結果として、美容用のＢＴＸ−Ａ治療の時代の誕生をもたらした。
【００１２】
Ａ型ボツリヌストキシンは、人類に知られている最も致死的な天然の生物学的作用物質であると言われている。ボツリヌス菌（C.botulinum）の胞子は土壌中に存在し、また、不適切に滅菌され、密封された食品容器中で増殖することができる。この細菌を経口摂取すると、致死的になることがあるボツリヌス中毒を引き起こし得る。同時に、ボツリヌストキシンの筋肉麻痺効果は、治療効果のためにも使用されている。ボツリヌストキシンの制御投与は、病態、例えば、機能亢進性の骨格筋を特徴とする神経筋障害を治療するために筋肉麻痺を与えるのに使用されている。ボツリヌストキシンで治療されている病態としては、片側顔面痙攣、成人発症型痙性斜頚、裂肛、眼瞼痙攣、脳性麻痺、頚部ジストニア、片頭痛、斜視、顎（temperomandibular）関節障害、並びに様々なタイプの筋痙攣及び痙攣が挙げられる。より最近では、ボツリヌストキシンの筋肉麻痺効果は、しわ、眉間のしわ、及び顔面筋肉の痙攣又は収縮による他の結果の治療など治療的及び美容的な顔への用途に利用されている。
【００１３】
ボツリヌストキシンの局所適用は、適用が無痛性であること、包含され得る治療表面積がより大きいこと、より高い特異的活性を有する純粋な毒素を調製できること、ボツリヌス治療薬を使用するための訓練の必要性が軽減されること、所望の効果を発揮するのに必要な用量がより少ないこと、及び治療的な臨床結果に達するための大量の毒素の溜まり場がないことによって、より安全でより望ましい治療の代替手段となる。注射を必要としない数々の病状を処置し、又は予防するための、ボツリヌストキシンを経皮送達するための効果的な手段、及びボツリヌストキシンを投与するための効果的な手段は、このように非常に望ましい。
【特許文献１】米国仮特許出願第６０／５５００１５号
【非特許文献１】Inlander, Skin, New York, NY:People's Medical Society, 1-7 (1998)
【非特許文献２】Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999)
【非特許文献３】Stegman et al., The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 2nded., St. Louis, MO: Mosby Year Book: 5-15 (1990)
【非特許文献４】Van Ermengem, Z Hyyg Infektionskr, 26:1-56; Rev Infect (1897)
【非特許文献５】Carruthers and Carruthers, Can J Ophthalmol, 31:389-400 (1996)
【非特許文献６】Borodic et al., Ophthalmic Plast Recostr Surg, 7:54-60 (1991)
【非特許文献７】Schantz et al., In: Jankovi J, Hallet M (Eds) Therapy with Botulinum Toxin, New York, NY: Marcel Dekker, 41-49 (1994)
【非特許文献８】Burgen et al., J Physiol, 109:10-24 (1949)
【非特許文献９】Lamanna, Science, 130:763-772 (1959)
【非特許文献１０】Baron et al., In: Baron EJ, Peterson LR, Finegold SM (Eds), Bailey & Scotts Diagnostic Microbiology, St. Louis, MO: Mosby Year Book, 504-523 (1994)
【非特許文献１１】Carruthers and Carruthers, Adv Dermatol, 12:325-348 (1997)
【非特許文献１２】Markowitz, In: Strickland GT (Eds) Hunters Tropical Medicine, 7th ed. Philadelphia: W.B. Saunders, 441-444 (1991)
【非特許文献１３】Schantz and Scott, In Lewis GE (Ed) Biomedical Aspects of Botulinum, New York:Academic Press, 143-150 (1981)
【非特許文献１４】Scott, Ophthalmol, 87:1044-1049 (1980)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ボツリヌストキシンを含む新規な組成物に関し、より詳しくはボツリヌストキシンの皮膚又は上皮による輸送又は送達（「経皮送達」とも呼ばれる）を可能にし、したがって本明細書に記載するように様々な治療上の、審美上の、及び／又は美容上の目的で対象にボツリヌストキシンを提供するための局所適用として用いることのできる組成物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様は、ボツリヌストキシン及び担体を含む組成物を提供することである。担体は、正の電荷を持つ分枝基が結合しているポリマーの主鎖を有する。担体とボツリヌストキシンの間の結合は、非共有結合性である。
【００１６】
本発明の別の態様は、ボツリヌストキシンを対象に投与するためのキットを提供することである。キットは、その経皮送達に有効な量で存在するボツリヌストキシン、及び正に帯電した分枝基が結合しているポリマーの主鎖を有する担体を含む。担体とボツリヌストキシンの間の結合は、非共有結合性である。
【００１７】
本発明のさらに別の態様は、ボツリヌストキシンを対象に投与するためのキットを提供することである。このキットは、ボツリヌストキシンを皮膚に送達するための装置、並びに−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴとその断片、及びアンテナペディアＰＴＤから選択される正に帯電した分枝基が結合しているポリマーの主鎖を有する担体を含む組成物を含み、式中、下付文字ｎ１は０から約２０までの整数であり、下付文字ｎ２は独立に約５から約２５までの奇数の整数である。
【００１８】
本発明は、ボツリヌストキシンを有効な量の担体と組み合わせて対象の皮膚又は上皮に局所的に適用することに関する、ボツリヌストキシンを対象に投与する方法も提供する。担体は、正に帯電した分枝基が結合しているポリマーの主鎖を有し、ボツリヌストキシンと非共有結合で結合している。
【００１９】
一態様では、本発明は、（本明細書で定義する）ボツリヌストキシンと、本明細書ですべて説明するような、正に帯電した分枝又は「効率」基を持つ正に帯電した「主鎖」を含む担体とを含む組成物に関する。最も好ましくは、正に帯電した担体は、長鎖の正に帯電したポリペプチド、又は正に帯電した非ペプチジルポリマー、例えばポリアルキレンイミンである。本発明はさらに、好ましくは、このような治療を必要とする対象又は患者の皮膚に、有効量のこのような組成物を局所的に適用することによって、筋肉麻痺、過分泌若しくは発汗の低減、神経性の疼痛若しくは片頭痛の治療、筋肉痙攣の低減、座瘡の予防若しくは軽減、又は、免疫応答の低減若しくは増進などの生物学的効果を生み出すための方法に関する。本発明はまた、例えば、顔筋に注射する方法の代わりに、顔にボツリヌストキシンを局所適用することによって、審美効果又は美容効果を生み出すための方法にも関する。
【００２０】
本発明はまた、担体及びボツリヌストキシンを含む組成物を調製又は配合するためのキット、並びに、使用可能な調製物を作製するのに必要な追加品目、又はそのような調製物を作製するのに次いで使用することができるプレミックスも提供する。或いは、キットは、ボツリヌストキシン及び担体を、別々であるが組み合わせて対象に投与するための手段を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、ボツリヌストキシンを適切な製剤の局所適用により送達するための、特に経皮送達するための組成物、及び方法を提供する。
【００２２】
本発明によると、本明細書に記載する、効果基を有する正に帯電した担体分子が、ボツリヌストキシンの輸送システムとして適切であることが見出されており、この毒素を筋肉及び／又は他の皮膚に関連する構造に経皮的に適用するのが可能となっている。輸送は、ボツリヌストキシンの共有結合性の修飾なしで起こる。
【００２３】
「正に帯電した」とは、その担体が、少なくともいくつかの液相条件下で、より好ましくは少なくとも、いくつかの生理学的に適合する条件下で正電荷を有することを意味する。より詳細には、本明細書で使用する「正に帯電した」とは、問題の基が、例えば第４級アミンなど、すべてのｐＨ条件下で帯電している官能基を含むこと、又は、第１級アミンの場合のｐＨ変化など特定の液相条件下で正電荷を獲得することができる官能基を含むことを意味する。より好ましくは、本明細書で使用する「正に帯電した」とは、生理学的に適合する条件の間に、陰イオンと結合する挙動を起こすグループを意味する。当業者には明らかであるように、正に帯電した部分を多数有するポリマーが、ホモポリマーである必要はない。当業者には明らかであるように、正に帯電した部分の他の例は従来技術で周知であり、容易に使用することができる。
【００２４】
一般に、正に帯電した担体（「正に帯電した主鎖」とも呼ぶ）は、典型的には、原子の直鎖であり、生理的ｐＨで正電荷を有する基を鎖中に含み、又は、主鎖から伸びた側鎖に結合された、正電荷を有する基を含む。好ましくは、正に帯電した主鎖それ自体は、所定の酵素活性又は治療的生物活性を有していないと考えられる。直鎖状の主鎖は、炭化水素主鎖であり、いくつかの実施形態では、窒素、酸素、硫黄、ケイ素、及びリンから選択されるヘテロ原子が割り込んでいる。主鎖の原子の大半は、通常は、炭素である。さらに、主鎖は、しばしば、繰り返し単位（例えば、アミノ酸、ポリ（エチレンオキシ)、ポリ（プロピレンアミン）、ポリアルキレンイミンなど）のポリマーであるだけでなく、ヘテロポリマーであってもよい。実施形態の１つの群では、正に帯電した主鎖は、いくつかのアミン窒素原子が、正電荷を有するアンモニウム基（４置換型）として存在するポリプロピレンアミンである。別の実施形態では、正に帯電した主鎖は、ポリアルキレンイミン、例えばポリエチレンイミン又はポリプロピレンイミンなど、約１０，０００〜約２，５００，０００、好ましくは約１００，０００〜約１，８００，０００、最も好ましくは約５００，０００〜１，４００，０００の分子量を有する、ヘテロポリマーでもホモポリマーでもよい非ペプチジルポリマーである。実施形態の別の群では、主鎖は、正に帯電した基（例えば、アンモニウム基、ピリジニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム基、グアニジウム基、アミジニウム基）を含む複数の側鎖部分を結合している。実施形態のこの群における側鎖部分は、主鎖に沿って、距離が一定又は様々である間隔で配置されていてよい。さらに、側鎖の長さは類似していても異なっていてもよい。例えば、実施形態の１つの群では、側鎖は、１〜２０個の炭素原子を有し、前述の正に帯電した基のうちの１つの（主鎖から離れた）末端で終わっている、直鎖状又は分枝状の炭化水素鎖でよい。本発明のすべての態様において、担体と生物学的に活性な作用物質との結合は、非共有結合性の相互作用によるものであり、その非限定的な例としては、イオン性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、又はそれらの組合せを挙げることができる。
【００２５】
実施形態の１つの群では、正に帯電した主鎖は、正に帯電した複数の側鎖基（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニンなど）を有するポリペプチドである。好ましくは、このポリペプチドは、約１０，０００〜約１，５００，０００、より好ましくは約２５，０００〜約１，２００，０００、最も好ましくは約１００，０００〜約１，０００，０００の分子量を有する。本発明のこの部分でアミノ酸が使用される場合、側鎖は、結合の中心においてＤ又はＬ型（立体配置Ｒ又はＳ）を形成してよいことが当業者には理解されよう。或いは、主鎖は、ペプトイドなどポリペプチドの類似体でもよい。例えば、Kessler, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32:543 (1993); Zuckermann et al. Chemtracts-Macromol. Chem. 4:80 (1992);及びSimon et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:9367 (1992)を参照されたい。手短に言えば、ペプトイドは、α炭素原子ではなく主鎖の窒素原子に側鎖が結合されているポリグリシンである。前述したように、側鎖の一部分は、通常、正に帯電した基で終結し、正に帯電した主鎖成分を構成すると考えられる。ペプトイドの合成は、例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５８７７２７８号で記述されている。この用語を本明細書で使用する場合、ペプトイド主鎖構造を有する正に帯電した主鎖は、α炭素位置に天然に存在する側鎖を持つアミノ酸から構成されていないため、「非ペプチド」とみなされる。
【００２６】
例えば、ペプチドのアミド結合が、チオアミド（−ＣＳＮＨ−）、逆向きのチオアミド（−ＮＨＣＳ−）、アミノメチレン（−ＮＨＣＨ２−）若しくは逆向きのメチレンアミノ（−ＣＨ２ＮＨ−）基、ケト−メチレン（−ＣＯＣＨ２−）基、ホスフィナート（−ＰＯ２ＲＣＨ２−）、ホスホンアミダート及びホスホンアミド酸エステル（−ＰＯ２ＲＮＨ−）、逆向きのペプチド（−ＮＨＣＯ−）、トランス−アルケン（−ＣＲ＝ＣＨ−）、フルオロアルケン（−ＣＦ＝ＣＨ−）、ジメチレン（−ＣＨ２ＣＨ２−）、チオエーテル（−ＣＨ２Ｓ−）、ヒドロキシエチレン（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）、メチレンオキシ（−ＣＨ２Ｏ−）、テトラゾール（ＣＮ４）、スルホンアミド（−ＳＯ２ＮＨ−）、メチレンスルホンアミド（−ＣＨＲＳＯ２ＮＨ−）、逆向きのスルホンアミド（−ＮＨＳＯ２−）などの代用物によって置換されている、ポリペプチドの立体的又は電気的模倣物、並びに、例えば、Fletcher他（(1998) Chem. Rev. 98:763）に総説があり、また、その中で引用されている参考文献によって詳述されている、マロン酸及び／又はｇｅｍ−ジアミノ−アルキルサブユニットを有する主鎖を用いる、他の様々な主鎖を使用することができる。前述した置換の多くは、αアミノ酸から形成された主鎖に対してほぼ等配電子のポリマー主鎖を生じる。
【００２７】
上記に提供した各主鎖に、正に帯電した基を有する側鎖基を結合させることができる。例えば、スルホンアミド結合の主鎖（−ＳＯ２ＮＨ−及び−ＮＨＳＯ２−）は、窒素原子に結合された側鎖基を有することができる。同様に、ヒドロキシエチレン（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）結合は、ヒドロキシ置換基に結合された側鎖基を有することができる。当業者なら、標準の合成法によって、正に帯電した側鎖基を与えるように、他の結合化学反応を容易に適合させることができる。
【００２８】
一実施形態では、正に帯電した主鎖は、分枝基（効率基とも呼ぶ）を有するポリペプチドである。本明細書で用いる効果基又は分枝基は、正の電荷を持つ主鎖の、組織又は細胞膜による移動を促進する効果を有するあらゆる物質である。分枝基又は効果基の非限定的な例に、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはこの断片、又はアンテナペディアのタンパク質導入ドメイン若しくはその断片が含まれ、式中、下付文字ｎ１は０から２０までの、より好ましくは０から８までの、さらにより好ましくは２から５までの整数であり、下付文字ｎ２は独立に約５から約２５までの、より好ましくは約７から約１７までの、最も好ましくは約７から約１３までの奇数の整数である。ＨＩＶ−ＴＡＴ断片が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有し、この断片が、その断片のＣ末端又はＮ末端を介して主鎖に結合しているような実施形態が、さらにより好ましい。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立に、０〜８、より好ましくは２〜５の整数であるものである。別の好ましい実施形態では、正に帯電した側鎖又は分枝基は、アンテナペディア（Ａｎｔｐ）タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、又は活性を保持しているその断片である。好ましくは、正に帯電した担体は、側鎖の正に帯電した分枝基を、担体の全重量に対するパーセンテージとして、少なくとも約０．０５％、好ましくは約０．０５〜４５重量％、最も好ましくは約０．１〜約３０重量％の量で含む。式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する正に帯電した分枝基の場合、最も好ましい量は、約０．１〜約２５％である。
【００２９】
別の実施形態では、主鎖部分はポリリジンであり、正に帯電した分枝基は、リジン側鎖のアミノ基に結合している。このポリリジンは、約１０，０００〜約１，５００，０００、好ましくは約２５，０００〜約１，２００，０００、最も好ましくは約１００，０００〜１，０００，０００の分子量を有してもよい。これは、例えば、分子量が７０，０００より大きいポリリジン、分子量７０，０００〜１５０，０００のポリリジン、分子量１５０，０００〜３００，０００のポリリジン、及び分子量が３００，０００より大きいポリリジンなど、市販されている（Sigma Chemical Company社製、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ州、米国）ポリリジンのうちの任意のものでよい。適切なポリリジンの選択は、組成物の残りの成分に応じて変わると考えられ、組成物に全体として正味の正電荷を与え、負に帯電した成分を合わせた長さの好ましくは１〜４倍の長さを与えるのに十分と考えられる。好ましい正に帯電した分枝基又は効率基としては、例えば、−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ（−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７）又はＨＩＶ−ＴＡＴが挙げられる。別の好ましい実施形態では、正に帯電した主鎖は、ポリエチレンイミン、例えば分子量が約１，０００，０００のものなどの長鎖ポリアルキレンイミンである。
【００３０】
前述の分枝基を有するポリペプチド又はポリアルキレンイミンを含む、正に帯電した主鎖又は担体分子は、新規な化合物であり、本発明の一態様を構成する。
【００３１】
本発明の一実施形態では、正に帯電した分枝基を有する正に帯電した担体のみが、ボツリヌストキシンを経皮送達するのに必要である。ある一実施形態では、正に帯電した担体は、前述したように、正に帯電した複数の側鎖基を有するポリペプチド（例えば、リジン、アルギニン、オルニチン、ホモアルギニンなど）である。好ましくは、ポリペプチドの分子量は、少なくとも約１０，０００である。別の実施形態では、正に帯電した担体は、少なくとも約１００，０００の分子量を有する正に帯電した複数の側鎖基を有する、ポリアルキレンイミンなどの非ペプチジルポリマーである。このようなポリアルキレンイミンとしては、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミンが挙げられる。いずれの場合も、経皮送達のために唯一必要な作用物質として使用するために、正に帯電した担体分子は、−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２（式中、下付き文字ｎ１は、０〜２０、より好ましくは０〜８、さらにより好ましくは２〜５の整数であり、下付き文字ｎ２は、独立に、約５〜約２５、より好ましくは約７〜約１７、最も好ましくは約７〜約１３の奇数である）、ＨＩＶ−ＴＡＴ若しくはその断片、又はアンテナペディアＰＴＤ若しくはその断片を含む、正に帯電した分枝基又は効率基を含む。好ましくは、側鎖又は分枝基は、前述した一般式−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２を有する。他の好ましい実施形態は、分枝基又は効率基が、式（ｇｌｙ）ｐ−ＲＧＲＤＤＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ、（ｇｌｙ）ｐ−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ｇｌｙ）ｑ、又は（ｇｌｙ）ｐ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ−（ｇｌｙ）ｑ（下付き文字ｐ及びｑは、それぞれ独立に、０〜２０の整数である）を有するＨＩＶ−ＴＡＴ断片であり、この断片が、その断片のＣ末端又はＮ末端を介して担体分子に結合しているような実施形態である。側鎖分枝基は、結合の中心においてＤ又はＬ型（立体配置Ｒ又はＳ）を形成してよい。好ましいＨＩＶ−ＴＡＴ断片は、下付き文字ｐ及びｑがそれぞれ独立に、０〜８、より好ましくは２〜５の整数であるものである。他の好ましい実施形態は、分枝基がアンテナペディアＰＴＤ基、又はその基の活性を保持しているその断片であるものである。これらは、例えば、Console et al., J.Biol. Chem. 278:35109 (2003)により、当技術分野では公知である。好ましくは、正の電荷を持つ担体は、側鎖の正の電荷を持つ分枝基を、全部の担体の重量のパーセント値として少なくとも約０．０５％の、好ましくは約０．０５から約４５重量％までの、最も好ましくは約０．１から約３０重量％までの量で含む。−（ｇｌｙ）ｎ１−（ａｒｇ）ｎ２の式を有する正の電荷を持つ分枝基では、最も好ましい量は約０．１から約２５％までである。
【００３２】
別の実施形態では、担体はポリリジンであり、正に帯電した分枝基は、リジン側鎖のアミノ基に結合している。この特定の実施形態で使用されるポリリジンは、例えば、分子量が７０，０００より大きいポリリジン、分子量７０，０００〜１５０，０００のポリリジン、分子量１５０，０００〜３００，０００のポリリジン、及び分子量が３００，０００より大きいポリリジンなど、市販されている（例えば、Sigma Chemical Company社製、セントルイス、ミズーリ州、米国）ポリリジンのうちの任意のものでよい。しかし、好ましくは、ポリリジンの分子量は、少なくとも約１０，０００である。好ましい正に帯電した分枝基又は効率基としては、例えば、−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ−ａｒｇ（−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７）、ＨＩＶ−ＴＡＴ又はその断片、及びアンテナペディアＰＴＤ又はその断片が挙げられる。
【００３３】
本発明の他の実施形態では、担体は、比較的短いポリリジン又はポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の主鎖（直線状でも分枝していてもよい）であり、正の電荷を持つ分枝基を有する。このような担体は、治療用の組成物において、輸送の効率が劇的に減少することをもたらす、主鎖及びボツリヌストキシンの非制御の凝集を最小にするのに有用である。担体が比較的短い直線状ポリリジン又はＰＥＩ主鎖である場合、主鎖の分子量は、７５，０００未満であり、より好ましくは３０，０００未満であり、最も好ましくは２５，０００未満である。しかし、担体が比較的短い分枝ポリリジン又はＰＥＩ主鎖である場合は、主鎖の分子量は６０，０００未満であり、より好ましくは５５，０００未満であり、最も好ましくは５０，０００未満である。しかし、本明細書に記載するような分割剤が組成物に含まれる場合には、分枝ポリリジン及びＰＥＩ主鎖の分子量は７５，０００までであってよく、直線状のポリリジン及びＰＥＩ主鎖の分子量は１５０，０００までであってよい。
【００３４】
本明細書では、「ボツリヌストキシン」という用語は、細菌によって産生されたものであれ組換え技術によって作製されたものであれ、公知の型のボツリヌストキシンのうちの任意のもの、並びに、人工的に作り出された変異体又は融合タンパク質を含めて、続いて発見される可能性のあるような任意の型を指すことを意図されている。前述したように、現在のところ、７種の免疫学的に異なるボツリヌス神経毒素、即ち、ボツリヌス神経毒素の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＧが明らかにされており、これらのそれぞれは、型特異的抗体による中和によって区別される。これらのボツリヌストキシン血清型は、Sigma-Aldrich社及びMetabiologics社（マディソン、ウィスコンシン州）、並びに他の供給元から入手可能である。異なる血清型のボツリヌストキシンの、それらが影響を及ぼす動物種、並びにそれらが誘発する麻痺の重症度及び持続期間は様々である。少なくとも２種の型のボツリヌストキシン、即ちＡ型及びＢ型が、いくつかの病態の治療用の製剤に入れられて市販されている。例えば、Ａ型は、商標「BOTOX（登録商標）」を有するAllergan社製の薬剤及び商標「DYSPORT（登録商標）」を有するIpsen社製の薬剤中に含まれ、また、Ｂ型は、商標「MYOBLOC（登録商標）」を有するElan社製の薬剤中に含まれる。
【００３５】
代替として、本発明の組成物中で使用されるボツリヌストキシンは、ボツリヌストキシン誘導体、即ち、ボツリヌストキシン活性を有するが、天然又は組換え天然ボツリヌストキシンに比べて、任意の部分又は任意の鎖上に１つ又は複数の化学的又は機能的改変を含む化合物でもよい。例えば、ボツリヌストキシンは、改変された神経毒素（例えば、天然のものと比較すると、そのアミノ酸のうちの少なくとも１つが欠失、改変、又は置換されている神経毒素、或いは組換えにより作製された神経毒素又はその誘導体若しくは断片）でもよい。例えば、ボツリヌストキシンは、例えば、その諸特性を増強し、又は、望ましくない副作用を低減するように改変されているが、所望のボツリヌストキシン活性をなお保持しているものでよい。ボツリヌストキシンは、前述のように、細菌によって産生されるボツリヌストキシン複合体のうちの任意のものでよい。或いは、ボツリヌストキシンは、組換え技術又は合成化学技術によって調製される毒素（例えば、組換えペプチド、融合タンパク質、又は）異なるボツリヌストキシン血清型のサブユニット若しくはドメインから調製されるハイブリッド神経毒素でもよい（例えば、米国特許第６４４４２０９号を参照されたい））。ボツリヌストキシンは、必要なボツリヌストキシン活性を有することが示されている分子全体の一部分でもよく、また、このような場合、それ自体で、又は組合せ若しくは共役分子、例えば融合タンパク質の一部として使用することができる。また、ボツリヌストキシンは、それ自体は無毒性でもよいボツリヌストキシン前駆体、例えば、タンパク質分解で切断されると毒性になる無毒性の亜鉛プロテアーゼの形態でもよい。
【００３６】
本発明はまた、ボツリヌストキシンの組合せ及び混合物の一般的使用も企図するが、ボツリヌストキシン血清型の混合物は、それらの性質及び諸特性が様々であるため、医療業界又は化粧品業界では通常、現時点では投与されない。
【００３７】
本発明の組成物は、好ましくは、対象又は患者、即ち、特定の治療を必要とするヒト又は他の哺乳動物の皮膚又は上皮に適用される製品の形態である。「必要である」は、薬剤上の又は健康に関する必要性、例えば望ましくない顔面の筋肉の攣縮を含む状態を処置すること、並びに化粧上及び自覚的な必要性、例えば顔面の組織の外観を変更し又は改善することの両者を含むことを意味する。一般に、ボツリヌストキシンを、通常は、１種又は複数の付加的な製薬上許容される担体又は賦形剤と共に、担体と混合することによって、組成物を調製する。最も単純な形態では、それらは、緩衝化された生理食塩水など、製薬上許容される単純な水性の担体又は希釈剤を含有してよい。しかし、これらの組成物は、皮膚科学的に又は製薬上許容される担体、ビヒクル、又は媒体（即ち、それらが適用される組織に適合性のある担体、ビヒクル、又は媒体）を含む、局所用の薬剤組成物又は薬用化粧組成物において一般的な他の成分を含有してよい。本明細書では、「皮膚科学的に又は製薬上許容される」という用語は、そのように説明された組成物又はその成分が、これらの組織と接触して使用するのに、又は、通常は、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを起こさずに、患者に使用するのに適していることを意味する。必要に応じて、本発明の組成物は、考察中の分野、特に化粧品及び皮膚科学の分野で従来使用されている任意の成分を含んでよい。組成物は、ある量の小型のアニオン、好ましくは多価アニオン、例えば、リン酸塩、アスパラギン酸塩、又はクエン酸塩も含むことができる。
【００３８】
その形態の点で、本発明の組成物としては、液剤、乳剤（マイクロエマルジョンを含む）、懸濁剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、或いは、皮膚及び組成物を使用し得る他の組織に適用するために使用される他の一般的な固体又は液体組成物を挙げることができる。このような組成物は、ボツリヌストキシン、及び担体に加えて、場合によっては麻酔薬、かゆみ止め剤、植物エキス、コンディショニング剤、濃色化剤若しくは淡色化剤、光輝顔料、湿潤剤、マイカ、鉱物、ポリフェノール、シリコン若しくはその誘導体、日焼け止め、ビタミン、及び植物薬（phytomedicinal）を含めて、抗菌薬、保湿剤及び水和剤、浸透剤、保存剤、乳化剤、天然油又は合成油、溶剤、界面活性剤、洗浄剤、皮膚軟化剤、抗酸化剤、芳香剤、増量剤、増粘剤、ワックス、臭気吸収剤、染料、着色剤、散剤など、このような製品において一般に使用される他の成分を含有してもよい。
【００３９】
特に好ましい実施形態では、組成物はゲル化剤、及び／又は粘度調整剤を含む。これらの物質は、一般的に、組成物の適用がより容易且つより的確になるように、組成物の粘度を増大するために加えられる。さらに、これらの物質は、ボツリヌストキシンの活性の低下をもたらす傾向がある、ボツリヌストキシン／担体の水溶液の乾燥を防止する助けとなる。特に好ましい物質は、電荷を持たず、ボツリヌストキシンの活性、又は毒素−担体複合体が皮膚を通過する効率を妨げない物質である。ゲル化剤は、例えばヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）などの、ある種のセルロースベースのゲル化剤であってよい。いくつかの実施形態では、ボツリヌストキシン／担体の複合体を、ＨＰＣ２〜４％を有する組成物に配合する。或いは、ボツリヌストキシン／担体の複合体を含む溶液の粘度を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加することにより変更することができる。他の実施形態では、ボツリヌストキシン／担体の溶液をCetaphil（登録商標）モイスチャライザーなどの予め混合した粘稠剤と組み合わせる。
【００４０】
本発明の組成物は、任意選択で分割剤を含むことができる。本明細書で用いる「分割剤」は、ボツリヌストキシンの本発明の担体との、不必要な、又は非制御の凝集を防止し、又は最小にする特徴を有するあらゆる物質又は添加物である。分割剤は、例えば、体積の制約により濃縮ボツリヌストキシン溶液を使用しなければならない場合に有用なことがある。このような場合に、分割剤はボツリヌストキシンの分散を保持し、それによって分割剤がなかったら生じるであろう毒素の凝集を防止する。一般的に分割剤は、（１）非刺激性で、（２）ボツリヌストキシンを破壊せず、（３）透過性のいかなる増大も与えず、（４）信頼性及び安定性のある粒子サイズを提供し、（５）電荷を持たず、（６）毒素と経皮の担体との複合体を妨害しない。適切な分割剤の一例は、エタノール（ＥｔＯＨ）である。好ましい実施形態では、ＥｔＯＨは組成物の２０％未満であり、最も好ましくは、組成物の５％未満である。
【００４１】
例として、体積の制約が１００Ｕのボツリヌストキシンの、２．５ｍｌではなく０．５ｍｌの溶液に再構成することを必要とする場合、ボツリヌストキシンが望ましくない凝集を示し、したがって活性を低下させることが、典型的に観察される。しかし、１％ＥｔＯＨを分割剤として加えることにより、２４時間後でもこの濃度で完全な活性が維持される。別の例として、０．９％ＮａＣｌ  １．０ｍｌで再構成したBotox（登録商標）は完全な活性を有し、１％及び５％のＥｔＯＨプラス０．９％ＮａＣｌの０．５ｍｌに再構成すると完全な活性を有する溶液が生じる。
【００４２】
本発明のある実施形態では、オリゴアニオン又はポリアニオンの架橋をボツリヌストキシン組成物に加えて、毒素と正電荷を持つ主鎖の担体との複合体形成を改善する。当技術分野ではよく知られているように、ボツリヌストキシンは実際、正の電荷を持つものも負の電荷を持つものもある様々なタンパク質の複合体である。毒素の構成成分の正確な分布は毒素の供給源に応じて変化するが、ある種の供給源からのボツリヌストキシンは、本明細書に記載する正の電荷を持つ主鎖と複合体を形成する傾向がより低いことがある。しかし、本発明の一態様は、このようなボツリヌストキシンにオリゴアニオン又はポリアニオンの架橋を加えることにより、局所適用の有効性及び効力が劇的に増大するという発見である。このようなオリゴアニオン／ポリアニオン架橋の適切な例には、リン酸ナトリウム（５％）、ＰＢＳ、又は５％ポリ−Ｌ−アスパラギン酸（例えば、分子量３０００を有するもの）が含まれる。
【００４３】
本発明による組成物は、ボツリヌストキシンと担体とが、それらが制御された方式で時間をかけて皮膚上に放出されるように、ある物質内にカプセル化又は別の方法で含有されている、制御放出組成物又は持続放出組成物の形態でよい。ボツリヌストキシンと担体は、マトリックス、リポソーム、小胞、マイクロカプセル、マイクロスフェアなどの内部に、又は、固体粒子物質内部に含有されてよく、これらはすべて、ボツリヌストキシンを時間をかけて放出するように選択及び／又は構築される。ボツリヌストキシン及び担体は、一緒に（例えば、同じカプセル内に）、又は別々に（別々のカプセル内に）カプセル化されてよい。
【００４４】
本明細書に記載した組成物を用いて、ボツリヌストキシンを皮膚の下にある筋肉、又は皮膚の中にある腺構造に、麻痺を生じ、弛緩を生じ、収縮を軽減し、痙攣を予防若しくは軽減し、腺の排出量を減少させ、又は他の望ましい効果を表すのに効果的な量で送達することができる。この方法でボツリヌストキシンを局所送達すると、投与量を減少させ、毒性を減少させ、注射可能な又は埋め込み可能な材料に対する望ましい効果に対してより正確な投与量の最適化ができるようになる。
【００４５】
本発明の組成物は、有効量のボツリヌストキシンを投与するために適用される。本明細書では、「有効量」という用語は、所望の筋肉麻痺又は他の生物学的又は美的効果を生じるのに十分であるが、暗黙のうちに安全な量、即ち、重大な副作用を回避するのに十分な少なさの量である、上記に定義したボツリヌストキシンの量を意味する。所望の効果としては、例えば、特に顔の細い線及び／又はしわの出現を低減させること、又は、目の拡大、口角の持ち上げ、若しくは上唇から扇形に広がる線の平滑化など他の方法で顔の外観を調整することを目的として特定の筋肉を弛緩させること、或いは、筋肉の緊張の全般的な軽減が挙げられる。最後に述べた効果、即ち筋肉の緊張の全般的な軽減は、顔又は別の場所において達成することができる。本発明の組成物は、一回投与量処置として適用するために適切な有効な量のボツリヌストキシンを含んでいてもよく、或いは、投与する場所での希釈、又は複数の適用における使用のいずれかのために、より濃縮していてもよい。本発明の正に帯電した担体の使用によって、顔筋若しくは他の筋肉の望ましくない痙攣などの病態、多汗症、座瘡、又は、筋肉の疼痛若しくは痙攣の軽減が望まれる、身体の別の場所の病態を治療するために、対象に経皮的にボツリヌストキシンを投与することができる。ボツリヌストキシンは、筋肉、又は皮膚に結合した他の構造体への経皮送達のために局所的に投与される。例えば、下肢、肩、下背部を含む背中、腋か、手掌、足、頚部、鼠径部、手又は足の甲、肘、上腕、膝、上脚、臀部、胴、骨盤、又はボツリヌストキシンの投与が望まれる身体の他の任意の部分に投与してよい。
【００４６】
神経性の疼痛の治療、片頭痛若しくは他の頭痛の疼痛の予防若しくは低減、座瘡の予防若しくは低減、自覚的若しくは臨床的に関わらずジストニア（dystonia）若しくはジストニー収縮(dystonic contractions)の予防若しくは低減、自覚的若しくは臨床的な多汗症に関連している症状の予防若しくは低減、過分泌若しくは発汗の低減、免疫応答の低減若しくは増進、又は、注射によるボツリヌストキシンの投与が提案若しくは実施されている他の状態の治療を含めて、他の状態を治療するために、ボツリヌストキシンの投与を実施してもよい。
【００４７】
ボツリヌストキシン又は、本明細書で説明する他の治療用タンパク質の投与は、免疫化に関連した目的のために実施してもよい。驚くべきことに、本明細書に記載したボツリヌストキシンの投与は、免疫応答を低下させるために行うことができる。より詳しくは、本発明により、ボツリヌストキシンを改変された投与経路により送達することができ、それによりその物質の複合抗原の提示を変更する。このように、本発明は、ボツリヌストキシンに対する抗原に対する免疫応答を低下させ、免疫に関連した活性を低下させないで繰返し投与を容易にするのに有用であることができる。或いは、免疫応答を増強するために、例えば、例えば注射を用いない幼児期の免疫化のために、様々なタンパク質に対する免疫化を実現するために、複合体を調製し局所適用することもできる。免疫に関連した活性に関しての使用に対する、「有効な量」は、ボツリヌストキシンの適用又はその一連の適用の後、対象がボツリヌストキシンに対する免疫応答を増大することができるのに十分な量のボツリヌストキシンを意味する。
【００４８】
最も好ましくは、医師又は他の医療従事者によって、又はその指示のもとで組成物を投与する。１回の治療で、又は、長期にわたる一連の定期的治療においてそれらを投与してよい。前述の目的のためにボツリヌストキシンを経皮送達するために、効果が望まれる皮膚の１つ又は複数の位置に前述の組成物を局所的に適用する。ボツリヌストキシン／担体の水溶液を皮膚に直接適用する実施形態では、毒素の活性の低下をもたらす溶液の乾燥を防ぐために、処置した領域を覆い（例えば、Cetaphil（登録商標）モイスチャライザーで）、又は処置した領域をバリア（例えば、Telfa）で塞ぐことが好ましい。その性質が原因となって、最も好ましくは、適用するボツリヌストキシンの量は、いかなる有害又は望ましくない結果ももたらさずに所望の結果を生み出すと考えられる適用速度及び適用頻度で、注意して使用すべきである。したがって、例えば、本発明の局所用の組成物は、皮膚表面のｃｍ２当たりのボツリヌストキシンが約１Ｕから約２００００Ｕまでの、好ましくは約１Ｕから約１００００Ｕまでの割合で適用するべきである。これらの範囲内のより多い投与量は、好ましくは、例えば、制御放出物質と組み合わせて使用し、又は、除去する前の、皮膚上での存在時間をより短くさせる。
【００４９】
ボツリヌストキシン／担体の組成物を適用する前に皮膚表面を適切に準備することは、溶液の効力を維持するために重要である。例えば、界面活性剤はボツリヌストキシンの活性を破壊する様子であるので、適用前に皮膚の表面の油を拭き取る目的で皮膚の表面に界面活性剤を採用することは、驚くべきことに逆効果である。これは、ボツリヌストキシン／担体の溶液を適用する前に、数回引き続き水で皮膚を洗浄した場合でさえも起こる。乳児用ウェッティーに見られるものなどの特に穏和な界面活性剤でさえも、この現象を引き起こす様子である。したがって、本発明の組成物を投与する好ましい方法では、水だけを用いて皮膚を前洗浄する。水だけで洗浄すると、ボツリヌストキシンの経皮輸送を適度に向上させる様子でもある。
【００５０】
さらに、ボツリヌストキシン／担体の複合体を適用する前に、角質層を減少させるために皮膚を剥離してもよい。原則として、皮膚を剥離する過程により、ボツリヌストキシンの経皮輸送の有効性の増大がもたらされなければならない。しかし、皮膚を剥離するのに用いる方法が重要である。例えば、ヒト又は動物で、アセトンを介して角質層を減少させると、引き続き適用するボツリヌストキシンの活性を低下させる様子である。それとは対照的に、テープ剥離（即ち、テープを皮膚の表面上に適用し、次いでテープを取り除く）は、マウスのモデルでもヒトでも、ボツリヌストキシンをより深く浸透させ、投与量を減少させる様子である。皮膚表面の擦過（例えば、剥離パッドの使用による）は、テープ剥離と同様の効果をもたらすであろうと予想される。
【００５１】
本発明は、ボツリヌストキシン、及び本明細書に定義した分枝基が結合している正の電荷を持つ主鎖を有する担体を含む組成物の経皮の伝達のための装置も含む。このような装置は、皮膚パッチのように単純な構成でもよく、又は、組成物を分配し組成物の分配をモニターする手段、及び任意選択で、対象の状態をモニターする（例えば、分配されている物質に対する対象の反応をモニターする）手段を含めた、より複雑な装置でもよい。
【００５２】
装置の構成のための材料を選択することが重要であることを注意されたい。送達の装置の構成に好ましい材料は、分解又はボツリヌストキシンの装置の表面上への不必要な吸着のいずれかにより、ボツリヌストキシン／担体の溶液の活性の損失をもたらさない材料である。このような望ましくない振る舞いは、例えば、ボツリヌストキシン／担体の水溶液がポリプロピレンの表面に接触した場合に観察されているが、ボツリヌストキシン／担体の溶液が塩化ポリビニル（ＰＶＣ）の表面に接触した場合には観察されていない。
【００５３】
一般的に、組成物を予め配合し、且つ／又は装置中に予め設置することができ、或いは、例えば、２つの成分（ボツリヌストキシン及び担体）を別々に収容するが適用時に又は適用前にこれらを組み合わせる手段を提供するキットを用いて、後で調製することができる。ボツリヌストキシンに対する担体分子の量又は比率は、問題となる組成物に用いるように選択された担体に依存する。所与の場合における担体分子の適切な量又は比率は、例えば、以下に記載するもののような１つ又は複数の実験を行うことにより、容易に決定することができる。
【００５４】
一般的に、本発明は、ボツリヌストキシンを必要とする対象又は患者に投与するための方法も含む。この方法は、有効な量のボツリヌストキシンを、本明細書に記載した正の電荷を持つ分枝基が結合した正の電荷を持つ主鎖を有する担体と組み合わせて局所的に投与することを含む。「組み合わせて」は、２つの構成成分（ボツリヌストキシン及び担体）を組合せの手順で投与することを意味し、この手順は、これらを、引き続き対象に投与し、又は別々であるが一緒に作用して有効な量の治療用のタンパク質の必要な送達を提供する方法で投与する組成物に組み合わせることを伴うことができる。例えば、担体を含む組成物を最初に対象の皮膚に適用し、その後ボツリヌストキシンを含む皮膚パッチ又は他の装置を適用してもよい。ボツリヌストキシンは、皮膚パッチ又は他の分配用装置に乾燥形態で組み込むことができ、正の電荷を持つ担体は、この２つが一緒に作用し望ましい経皮送達をもたらすように、パッチを適用する前に皮膚表面に適用してもよい。したがって、この２つの物質（担体及びボツリヌストキシン）は、組み合わさって作用し、又はおそらく相互作用してその部位で組成物又は組合せを形成する。したがって、本発明は、皮膚によりボツリヌストキシンを分配するための装置、及び担体又は主鎖を含み、対象の皮膚又は上皮に適用するのに適する液体、ゲル、クリームなどの両方を含むキットも含む。医療従事者の指示のもとで、又は患者若しくは対象によって、本発明の組成物を投与するためのキットは、この目的に適する特別仕様でつくられた（custom）アプリケーターも含んでよい。
【００５５】
本発明の組成物、キット、及び方法により、より純粋なボツリヌストキシンを、より高い比活性で、且つ潜在的に改善された薬物動態で送達するのが可能となっている。さらに、担体は安定化剤として働き、外来の付属タンパク質（例えば、４００〜６００ｍｇの範囲のヒト血清アルブミン、若しくは２５０〜５００ｍｇの範囲の組換え血清アルブミン）、及び／又は多糖類の安定化剤の必要性を減少させ、ボツリヌストキシンに対する免疫応答を有益に低下させることができる。さらに、組成物は、約４．５から約６．３までの範囲のｐＨの生理学的環境で使用するのに適しており、したがってこのようなｐＨを有することができる。本発明の組成物は、室温で、又は冷蔵条件下のいずれかで貯蔵することができる。
【００５６】
以下は、本発明の代表的な実施例である。これらは、送達される神経毒の共有結合性の修飾を必要としないで、機能上のボツリヌス神経毒複合体を皮膚を通して送達することを説明するものである。
【実施例１】
【００５７】
ペプチジル担体を用いたｉｎ  ｖｉｖｏでのボツリヌストキシンの輸送
本実験は、１回の投与後に、標識した完全なタンパク質ボツリヌストキシンを含有する大型複合体を無傷の皮膚を通して輸送するためのペプチジル担体の使用を対照と比べて実証する。
【００５８】
主鎖の選択
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７にコンジュゲートしている）、分子量１１２，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７をコンジュゲートさせることによって、正に帯電した主鎖を構築した。修飾した主鎖を「ＫＮＲ」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。
【００５９】
治療薬
ボツリヌストキシンＡの「Botox（登録商標）」ブランド（Allergan社製）を本実験のために選択した。その分子量は、約１５０，０００である。
【００６０】
試料の調製
製造業者の取扱い説明書に従って、ボツリヌストキシンに水を加えて元に戻した。計算上１２倍モル過剰のスルホＮＨＳ−ＬＣビオチン（Pierce Chemical社製）を用いて、一定分量のタンパク質をビオチン標識した。標識した生成物を「Btox-b」と呼んだ。
【００６１】
各事例において、陰性度の高い大型ヌクレオチド複合体の送達の際のように、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築した。正味の中性又は正電荷は、陰性度の高い細胞表面プロテオグリカン及び細胞外基質からタンパク質複合体が反発するのを防止する。局所適用される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、Btox-bの用量を全グループにわたって標準化した。以下のように試料を調製した。
【００６２】
「ＪＭＷ−７」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのBtox-b（即ち、合計２０Ｕ）及びペプチジル担体ＫＮＲを計算上の分子量比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を１．８ｍｌのCetaphil（登録商標）ローションと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
【００６３】
「ＪＭＷ−８」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのBtox-b（即ち、合計２０Ｕ）及びＫを電荷比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で２００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を１．８ｍｌのCetaphilと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
【００６４】
ペプチジル担体及び標識したBtoxを用いた１回の処置後の経皮送達効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝４）は、背部皮膚の頭側部分（マウスの口や肢がこの領域に届かないために選択された）に適用される、計量した用量２００マイクロリットルの適切な処置の局所適用を受けた。動物は、脱毛処理は受けなかった。初回の処置の３０分後に、マウスをＣＯ２吸入によって安楽死させ、盲検化された観察者が、処置した皮膚部分の全層を採取した。処置部分を３つの部分に等分し、頭側部分を１０％中性緩衝ホルマリン中で１２〜１６時間固定し、次いで、パラフィン包埋するまで７０％エタノール中で保存した。中央部分は急速凍結し、以下に要約するような、盲検化された観察者によるビオチン可視化に直接使用した。尾側の処置部分は、可溶化調査のために急速凍結した。
【００６５】
以下のようにしてビオチン可視化を行った。手短に言えば、各切片を「NeutrAvidin（登録商標）」緩衝溶液に１時間浸した。アルカリホスファターゼ活性を可視化するために、断面を生理食塩水中で４回洗浄し、次いで、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Pierce Scientific社製）に１時間浸した。次いで、切片を生理食塩水中ですすぎ、平面アポクロマートレンズの付いたNikon E600顕微鏡で全体を撮影した。
【００６６】
データ処理及び統計分析
盲検化された観察者は、Image Pro Plusソフトウェア（Media Cybernetics社製、シルバースプリング、メリーランド州）を用いて、バッチ式画像解析によって陽性染色の総量を測定し、それぞれについて陽性染色のパーセントを決定するために、横断面領域全体にそれを標準化した。続いて、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を測定した。
【００６７】
結果
ビオチン標識したボツリヌストキシンに対して陽性な断面領域の平均を、ＫＮＲ（「EB-Btox」）又はＫ（「ｎｌ」）のいずれかと共にBtox-bを１回局所投与した後の全領域に対するパーセントとして報告した。これらの結果を以下の表１に示し、図１に例示する。図１では、標識に対して陽性の領域を、Btox-b及びペプチジル担体ＫＮＲを含む「EB-Btox」、並びに対照としてのポリカチオンＫと共にBtox-bを含む「ｎｌ」による１日１回の処置を３日間行った後の全領域に対するパーセントとして決定した。各群について平均及び標準誤差を示す。
表１．ＫＮＲ（ＪＭＷ−７）又はＫ（ＪＭＷ−８）と共にBtox-bを３０分間、１回局所投与した後の、全断面に対するパーセントとしての、標識されたボツリヌストキシン領域の平均値及び標準誤差
【００６８】
【表１】
2007526340.tif 000003
【実施例２】
【００６９】
ボツリヌストキシンのペプチジル担体との局所用の調製物の治療上の効力
実施例１は、ペプチジル経皮担体が、無傷の皮膚のマウスモデルにおける局所適用後の効率的なボツリヌストキシン輸送を可能にすることを実証した。しかし、本実験は、皮膚を通過して移動した後に、タンパク質ボツリヌストキシン複合体が機能的な形態で放出されるかどうかは示さなかった。したがって、このペプチジル担体を用いて（さらに、タンパク質を共有結合で修飾せずに）、無傷の皮膚を通って、ボツリヌストキシンを局所薬として治療的に送達させることができるかどうかを評価するために、以下の実験を構成した。
【００７０】
リジン側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、１８％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に１８個が−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７にコンジュゲートしている）、分子量１１２，０００のポリリジンに−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７をコンジュゲートさせることによって、正に帯電した主鎖を再び構築した。修飾された主鎖を「ＫＮＲ」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のポリリジン（「Ｋ」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。実施例１の場合と同じボツリヌストキシン治療物質を使用し、同じ方法で調製した。以下のように試料を調製した。
【００７１】
「ＪＭＷ−９」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及びペプチジル担体ＫＮＲを計算上の分子量比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのCetaphilと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
【００７２】
「ＪＭＷ−１０」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及びＫをＭＷ比４：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのCetaphilと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
【００７３】
「ＪＭＷ−１１」と名づけた群：ポリカチオン無しの、アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）をリン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのCetaphilと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
【００７４】
ペプチジル担体及びボツリヌストキシンを用いた１回の処置後の治療効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝４）は、つま先から大腿中央まで均一に適用される適切な処置の計量した用量４００マイクロリットルの局所適用を受けた。両方の肢に処置し、両側に無作為に処置を施した。動物は、脱毛処理は受けなかった。初回の処置の３０分後に、公表されているボツリヌストキシン投与後の足の可動性に関する指外転スコア[Aoki, KR.. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec; 39(12): 1815-20]に従って、マウスの指の外転能力を評価した。マウスの可動性も主観的に評価した。
【００７５】
データ処理及び統計分析
２名の盲検化された観察者が、それぞれ独立に、指外転スコアを表にした。続いて、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を測定した。
【００７６】
結果
ＫＮＲ（「ＪＭＷ−９」）、Ｋ（「ＪＭＷ−１０」）、又はポリカチオン無しの希釈剤（「ＪＭＷ−１１」）と共にボツリヌストキシンを１回局所投与した後の平均指外転スコアを以下の表２に示し、以下の図２の代表的な顕微鏡写真において例示する。ペプチジル担体ＫＮＲは、互いに同等である両方の対照と比べて、統計学的に有意な、皮膚を通過してのボツリヌストキシンの機能的送達をもたらした。本実験をさらに独立して反復することにより（合計３回の独立した実験のすべてで、ＫＮＲを伴う局所的ボツリヌストキシンから統計学的に有意な麻痺が起こり対照では起こらないという同一の結論が得られた）、本発明の研究結果が確認され、Ｋのある場合又は無い場合（即ち、双方の対照）に局所的ボツリヌストキシンの間で有意な差は明らかにされなかった。興味深いことに、マウスは、一貫して、麻痺した肢の方へ移動した（処置された動物の１００％、並びに両対照群の対照の０％で起こった）。図２で示すように、対照のポリカチオンを加えたボツリヌストキシン、又はポリカチオン無しのボツリヌストキシン（「Botox単独」）で処置された肢は、（持ち上げられたときの防衛機構として）指を動かすことができるが、ペプチジル担体ＫＮＲを加えたボツリヌストキシン（「Essentia Botoxローション剤」）で処置された肢は動かすことができなかった。
表２．ペプチジル担体ＫＮＲ（「ＪＭＷ−９」）と共に、対照のポリカチオンＫ（「ＪＭＷ−１０」）と共に、又は単独（「ＪＭＷ−１１」）でボツリヌストキシンを１回局所適用した３０分後の指外転スコア
【００７７】
【表２】
2007526340.tif 000004
【００７８】
結論
本実験は、ペプチジル経皮担体が、治療薬を共有結合で修飾せずに、治療有効量のボツリヌス治療薬を皮膚を通過して輸送できることを実証するのに役立つ。本実験はまた、対照において局所適用された場合はボツリヌストキシンが機能しないことも裏付ける。
【実施例３】
【００７９】
ボツリヌストキシンの非ペプチジル担体との局所用の調製物の治療上の効力
本実験は、本発明の非ペプチジル担体の能力を実証する。
【００８０】
方法
主鎖の選択
ＰＥＩ側鎖の遊離アミンに対する末端グリシンのカルボキシルを介して、３０％の飽和度で（即ち、１００個のリジン残基毎に３０個が−ＧＩｙ３Ａｒｇ７にコンジュゲートしている）、分子量１，０００，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に−Ｇｌｙ３Ａｒｇ７をコンジュゲートさせることによって、正に帯電した主鎖を構築した。修飾された主鎖は、大型の非ペプチジル担体を示すために「ＰＥＩＲ」と呼んだ。対照のポリカチオンは、同じサイズ及び同じロットの未修飾のＰＥＩ（「ＰＥＩ」と呼ぶ、Sigma Chemical社製、セントルイス、ミズーリ州）であった。実施例１と同じボツリヌストキシン治療物質を使用した。
【００８１】
製造業者の取扱い説明書に従って、Botox製品からボツリヌストキシンを元に戻した。各事例において、陰性度の高い大型ヌクレオチド複合体の送達の際のように、過剰なポリカチオンを使用して、過剰な正電荷を有する最終複合体を構築した。正味の中性又は正電荷は、陰性度の高い細胞表面プロテオグリカン及び細胞外基質からタンパク質複合体が反発するのを防止する。局所適用される組成物の合計体積及び最終ｐＨと同様に、ボツリヌストキシンの用量を全グループにわたって標準化した。以下のように試料を調製した。
【００８２】
「ＡＺ」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及び超高純度型の非ペプチジル担体ＰＥＩＲを計算上の分子量比５：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのCetaphilと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
【００８３】
「ＢＡ」と名づけた群：アリコート当たり２．０ユニットのボツリヌストキシン（即ち、合計６０Ｕ）及びＰＥＩを電荷比５：１で混合して均質にし、リン酸緩衝化生理食塩水で６００マイクロリットルに希釈した。得られた組成物を５．４ｍｌのCetaphilと混合して均質にし、２００マイクロリットルずつ分取した。
【００８４】
１回処置後の治療効率を測定するための動物実験
処置を施す間、イソフルランの吸入によって動物を麻酔した。麻酔をかけた後、C57 black6マウス（１群当たりｎ＝３）は、つま先から大腿中央まで均一に適用される適切な処置の計量した用量４００マイクロリットルの局所適用を受けた。両方の肢に処置し、両側に無作為に処置を施した。動物は、脱毛処理は受けなかった。初回の処置の３０分後に、公表されているボツリヌストキシン投与後の足の可動性に関する指外転スコア[Aoki, KR.. A comparison of the safety margins of botulinum neurotoxin serotypes A, B, and F in mice. Toxicon. 2001 Dec; 39(12): 1815-20]に従って、マウスの指の外転能力を評価した。マウスの可動性も主観的に評価した。
【００８５】
データ処理及び統計分析
２名の盲検化された観察者が、それぞれ独立に、指外転スコアを表にした。続いて、Statviewソフトウェア（Abacus社製、バークリー、カリフォルニア州）を用いた、反復測定による１元配置分散分析における９５％信頼度の有意性分析により、各群の平均値及び標準誤差を測定した。
【００８６】
結果
ボツリヌストキシンと、ウルトラピュアＰＥＩＲ（「ＡＺ」）、又は対照のポリカチオンＰＥＩ（「ＢＡ」）の１回局所投与後の平均指外転スコアを表３に示し、繰り返したもの（この実験に対する１回の独立した繰返し）を表４に示した。非ペプチジル担体ＰＥＩＲは、対照と比べて、統計学的に有意な、皮膚を通過してのボツリヌストキシンの機能的送達をもたらした。先と同様に、動物は、麻痺した肢の方向へ同じ所をめぐりながら歩くのが観察された。
【００８７】
表３．超高純度ＰＥＩＲ（「ＡＺ」）、又は対照のポリカチオンＰＥＩ（「ＢＡ」）と共にBotoxを１回局所投与した３０分後の指外転スコア。平均値及び標準誤差を示す。
【表３】
2007526340.tif 000005
【００８８】
表４．超高純度ＰＥＩＲ（「ＡＺ１」）、又は対照のポリカチオンＰＥＩ（「ＢＡ１」）と共にBotoxを１回局所投与した３０分後の指外転スコア。平均値及び標準誤差を示す。
【表４】
2007526340.tif 000006
【００８９】
結論
本実験は、非ペプチジル経皮担体が、ボツリヌストキシンを事前に共有結合で修飾せずに、治療量のボツリヌストキシンを皮膚を通過して輸送できることを実証した。これらの研究結果は、ペプチジル輸送物質によるものを補完する。治療効果を得るために非ペプチジル又はペプチジル担体の使用を選択できることにより、個々の状況、環境、及び適用方法に合わせることが可能になり、本発明の経皮送達の場の幅が広げられる。
【実施例４】
【００９０】
ボツリヌストキシンのペプチジル担体との局所用の調製物の前額部多汗症及びしわに対する治療上の効力
この実験は、ヒト対象における前額部多汗症及びしわを処置するための、このペプチジル担体を用いた局所用薬剤として、ボツリヌストキシンが無傷の皮膚を通して治療的に送達できることを説明するものである。
【００９１】
前額部多汗症及びしわの研究の実験手順
Nikon社製TTL Macro-speedlight SB29sフラッシュ付きのNikon社製D70カメラ（Nikon社製、米国）を用い、青色背景で対象の前額部のベースライン時及び処置後の写真を撮影した。
【００９２】
Sony社製Digital Hadycamカメラ一体型ＶＴＲを用いて、青色背景で対象の前額部のベースライン時及び処置後のビデオを撮影した。
【００９３】
１０％の局所用ポビドンヨード溶液（Deerfield、Walgreen社製、イリノイ州）及びKingsfordの１００％コーンスターチ（Memphis、ACH Food Companies社製、テネシー州）を用いてMinorのヨウ素／デンプン試験を行って、汗の生成を視覚化した。滅菌綿球（Johnson & Johnson Consumer Product Company社製、ニュージャージー州、Skillman）を用いてヨウ素溶液を対象の前額部に塗り、次いで完全に乾燥させた。この領域に、滅菌綿球を用いてデンプン粉を軽く散布した。周囲の室温で、身体を動かして発汗を誘発した。汗がヨウ素を溶解しデンプン粉と反応すると、暗い青黒色の斑点が現れた。ヨウ素−デンプン試験のベースライン時及び処置後の写真を、Nikon社製TTL Macro-speedlight SB29sフラッシュ付きのNikon社製D70カメラを用いて青色背景で撮影した。対象の前額部を、７０％ＥｔＯＨで、次いで脱イオン水で清浄にした。
【００９４】
処置を適用する前に、対象の前額部上の予め決められた処置領域を、角質層に対する非侵襲性のテープ剥離法により準備した。予めカットしたテープを処置領域に適用し、数秒間しっかりと押圧した。テープの一角を引っ張って、テープを速やかに取り除いた。第１のテープを取り除いた後、直ちに第２のテープを同じ領域に注意深く適用した。テープ剥離を３〜５回繰り返した。
【００９５】
処置準備
滅菌０．９％塩化ナトリウム（Abbott Laboratories社製、イリノイ州、North Chicago）プラス５％ＥｔＯＨプラス５％のＡ−３Ｃとラベルしてある短鎖ポリアスパラギン酸溶液（Donlar BioPolymer社製、イリノイ州、Bedford Park）のBotoxの再構成溶液を調製した（即ち、溶液１．０ミリリットルにつき、滅菌０．９％塩化ナトリウム９００マイクロリットルプラス１００％ＥｔＯＨ５０マイクロリットルプラス短鎖ポリアスパラギン酸溶液５０マイクロリットル）。Ｋｎ２１Ｔは、０．９％塩化ナトリウムプラス５％ＥｔＯＨで１ミリグラム／ミリリットルの濃度に調製した（即ち、Ｋｎ２１Ｔ５００マイクロリットルを等分し、１００％ＥｔＯＨ２５マイクロリットルを加えた）。本明細書で用いるＫｎ２１Ｔは、分子量２１０００でＴＡＴ分枝基を有する正の電荷を持つポリリジンの主鎖を意味する。１８Ｇ１１／２付の滅菌した３ｍｌのラテックスフリーのシリンジ（Becton Dickinson & Co.社製、ニュージャージー州、Franklin Lakes）を用いて、１．０ミリリットルの再構成溶液で、１００単位のBotox（カリフォルニア州、Irvine、Allergan社製）を再構成した。再構成したBotoxを、注意深く８回転倒混和した。各対象にBotox２００単位を用いた。「Essentia Botox溶液」は、２００単位のBotox、及びＫｎ２１Ｔプラス５％ＥｔＯＨで調製し（即ち、Ｋｎ２１Ｔ５００マイクロリットルプラス１００％ＥｔＯＨ２５マイクロリットルにBotox２．０ミリリットルを加え）、室温で５分間静置して複合体を形成させた。
【００９６】
再構成溶液、及びＫｎ２１Ｔプラス５％ＥｔＯＨで対照の溶液を調製し（即ち、Ｋｎ２１Ｔ５００マイクロリットルプラス１００％ＥｔＯＨ２５マイクロリットルに再構成溶液２．０ｍｌを加え）、室温で保持した。
【００９７】
処置の適用
対象は、目、顔面、及び上半身の周りを保護被覆してテーブル上に横になった。ピペットを用いて対象の前額部に処置を均等に施し、パウダーフリーのニトリル手袋を着用して、指で円を描いて皮膚中にマッサージした。処置領域をCetaphil（登録商標）モイスチャライジングクリーム（Galderma社製、テキサス州、Fort Worth）の薄層で覆い、６０分間インキュベートした。６０分間インキュベート後、滅菌ガーゼパッドで処置を除去した。ガーゼパッドと手袋は、バイオハザートバックに捨てた。
【００９８】
結果
図３は、Peptidyl担体及びボツリヌスの組合せで局所的に処置した後、しわの長さ、深さ、及び幅が大幅に減少したことを表している。この実験により、ボツリヌストキシンを経皮の担体と組み合わせて局所的に適用した場合に、著しい筋肉の麻痺をもたらして化粧上の効果をもたらすことができることが確認された。図４は、処置した皮膚（Ａ）対、非処置の皮膚（Ｂ）のMikrosilキャストである。非処置の皮膚のキャスト上に、しわが見える。
【００９９】
図５及び図６はMinorのヨウ素／デンプン試験の結果を示す。図５は、適用２分後に撮影した写真を示し、パネル（Ａ）はEssentia Botoxローションで処置した側に対応し、パネル（Ｂ）はＫｎ２１Ｔ担体を単独で含む対照のローションで処置した側に対応する。図６は、４分後に撮影したことの他は、図５と同じである。対照のローションの側では、着色がより明らかであり、そちら側の皮膚が汗をより多く分泌していることを指摘していることに注意されたい。非処置の側では、発汗がより早く始まったことも注意されたい。
【０１００】
結果
この実施例は、局所的に適用したボツリヌストキシンの複合体は、細かいしわ、及び粗いしわを減少させる上で著しい美容上の利点をもたらすことができることを実証している。この経上皮の効果により、本明細書に開示したもののようなボツリヌストキシン複合体を局所的に適用した後、適切な担体で筋肉の麻痺を成し遂げることができることが、さらに確立されている。したがって、この実施例は、ボツリヌストキシンを局所的に適用することにより、眼瞼痙攣、又は斜頚などの筋肉の痙攣の緩和、及び背下部痛などの筋肉の痙攣に関連する疼痛の緩和をもたらすことができることを示している。
【実施例５】
【０１０１】
ボツリヌストキシンのペプチジル担体との局所用の調製物の腋窩多汗症に対する治療上の効果
この実施例は、ヒト対象で腋窩多汗症を処置するために、このペプチジル担体を用いた局所用薬剤として、ボツリヌストキシンが無傷の皮膚を通して治療的に送達されるか否かを実証するものである（無作為化した２重盲検法で１グループ当たりｎ＝１０の腋窩で、患者１人当たり１つの腋窩を処置し１つを対照とする）。
【０１０２】
腋窩多汗症の試験の組み入れ基準
年齢：１８歳以上
健康な志願者である
志願者はインフォームドコンセントに署名、提出する
対象は快く指示に従い、フォローアップに来訪する
対象には先在する自覚的な多汗症がある
対象は妊娠しておらず、又はこの先３カ月以内に妊娠する予定が無い
対象はサンフランシスコ、又は近郊の研究地区に居住し、及び／又は勤務している
対象は過去６カ月以内に脇の下の発汗の処置を受けていない
対象はこの先３カ月以内に脇の下の発汗の処置を受ける予定が無い
【０１０３】
重量測定法の手順
重量測定法の手順の一部として、対象は最初に試験領域に順化させられた。詳しく述べると、各対象は、７２〜７７°Ｆ（２２．２〜２５℃）の室温で、安静位で１５分間腰をかけた。
【０１０４】
腋窩の準備：（以下の手順では、パウダーフリーのニトリル手袋を着用した）
対象は、両腋窩を完全に曝すように、使い捨てのケープ及びブラジャーに着替え（女性の場合）、又は上半身の着衣をすべて脱いだ（男性の場合）。投与領域は、毛髪が生えている皮膚が覆っている領域プラス各腋窩の毛髪が生えている皮膚から１ｃｍ拡張している領域と予め決定した。５０ｍｌのコニカルチューブからの予め湿らせた滅菌ガーゼパッドで、ガーゼの片側を用いて上から下に同じ方向で５回の長めの動作で拭って投与領域を清浄にした。この手順を、さらなる３回、各回とも清浄な予め湿らせたガーゼパッドで、皮膚を刺激又は擦過しないように気をつけて繰り返した。ガーゼパッドはゴミ箱に捨てた。他方の腋窩に同じ洗浄の手順を繰り返した。腋窩を乾燥した滅菌ガーゼで、皮膚を刺激又は擦過しないように気をつけて腋窩の上から下までしっかりとパディングする動きを用いて乾燥させた。次いで、腋窩のしわの下にろ紙を配置して腋窩をさらに乾燥させ、ろ紙を５分間試験部位に留まらせ、重量分析の評価の手順を続けた。患者は、安静位で腕を彼の／彼女の身体にもたせかけて腰をかけていた。ろ紙はゴミ箱に捨てた。対象は、最初の重量分析の評価の前は、腋窩の操作なしで１分間安静にさせられていた。
【０１０５】
汗の生成の測定（重量測定法）：（これらの測定の前に、新しい１双のパウダーフリーのニトリル手袋を着用した）
対象は、彼又は彼女の手を頭の後ろでつないで腋窩を完全に曝し、半ばリクライニングした（約４５°）。予め重量を測定したろ紙を、貯蔵用コニカルチューブから取り出し、ろ紙の先端を腋窩のしわの線の中央に合わせて、対象の腋窩下に配置した。ろ紙は指を使って所定の位置に保持し、対象は腕を体の側面にだらりとさせた。対象は、５分間、彼の／彼女の胴体に両腕をもたせかけてしっかりと保持し腰をかけていた。ろ紙が確実に両腋窩の下に配置されたときに、時間の測定を開始した。両腋窩を同時に測定した。５分後にろ紙を腋窩から取り除き、それぞれ同じコニカルチューブ中に戻した。最初に配置したろ紙を最初に取り除いた。コニカルチューブのキャップを固く閉めてチューブから汗が蒸発するのを防いだ。汗の生成は、１分間の間隔で、さらなる２回繰り返した。
【０１０６】
Minorのヨウ素／デンプン試験
対象は、彼の／彼女の手を頭の後ろでつないで腋窩を完全に曝した。予め決定した腋窩の領域に、先のように滅菌ガーゼパッドでヨウ素溶液を塗り、空気乾燥させた。ヨウ素が完全に乾燥したら、ヨウ素で覆った領域上にデンプンの薄層を綿球でパディングした。擬陽性及びバックグラウンドを低減させるために、ヨウ素を空気乾燥させた後にデンプンを適用した。次いで、対象は彼の／彼女の胴体に両腕をもたせかけてしっかりと保持し腰をかけていた。５分後、対象は彼の／彼女の腕を上げ、頭の後で手をつないで腋窩を完全に曝した。左右の腋窩及び日付をはっきりとラベルした各腋窩の写真を撮影した。腋窩を７０％ＥｔＯＨで、次いで滅菌脱イオン水で清浄にした。
【０１０７】
処置の準備
Ｋｎ２１ｐｒを、食塩水プラス５％ＥｔＯＨで１ミリグラム／ミリリットルの濃度に調製した（即ち、Ｋｎ２１ｐｒ５００マイクロリットルを等量にし、１００％ＥｔＯＨ２５マイクロリットルを加えた）。本明細書で用いるＫｎ２１ｐｒは、分子量２１０００の、正の電荷を持つポリリジン主鎖、及び保護されたオリゴアルギニンを含む分枝基を意味する。Botox（登録商標）（Allergan社製、カリフォルニア州、Irvine）１００単位を、０．９％塩化ナトリウム（Abbott Laboratories社製、イリノイ州、North Chicago）０．７５ミリリットルで、１８Ｇ１１／２付きの滅菌３ｍｌのラテックスフリーのシリンジ（Beckton Dickinson and Company社製、ニュージャージー州、Franklin Lakes）を用いて再構成した。再構成したBotox（登録商標）を、注意深く８回転倒混和した。各対象に、Botox（登録商標）２００単位を用いた。処置溶液は、Botox（登録商標）２００単位及びＫｎ２１ｐｒプラス５％ＥｔＯＨで調製し（即ち、Botox（登録商標）１．５ミリリットルを、Ｋｎ２１ｐｒ５００マイクロリットルプラス１００％ＥｔＯＨ２５マイクロリットルに加え）、室温に５分間保って複合体を形成させた。５分間のインキュベーション時間の後、約１．０ミリリットルの４％ＨＰＣ（ヒドロキシプロピルセルロース）（１％ＥｔＯＨを含む）を加え、金属の小型ヘラで穏やかに且つ完全に混和した。均一の処置用液を、シリンジ先端キャップつき３ｍｌシリンジ（Beckton Dickinson and Company社製、ニュージャージー州、Franklin Lakes）中に移した。
【０１０８】
対照の溶液を、０．９％塩化ナトリウム、及びＫｎ２１ｐｒプラス５％ＥｔＯＨで調製し（即ち、０．９％塩化ナトリウム１．５ミリリットルに、Ｋｎ２１ｐｒ５００マイクロリットルプラス１００％ＥｔＯＨ２５マイクロリットルを加え）、室温に５分間放置した。インキュベーション後、４％ＨＰＣ（１％ＥｔＯＨを含む）を約１．０ミリリットル加え、金属の小型ヘラで穏やかに且つ完全に混和した。均一の対照溶液を、シリンジ先端キャップ付３ｍｌシリンジ中に移した。
【０１０９】
処置の適用（パウダーフリーのニトリル手袋を着用のこと）：
対象は、彼の／彼女の手を指を組んでつなぎ、頭の後ろに置いて、対象の腋窩を完全に曝した。次いで、対象は約４５度の角度に椅子でリクライニングした。図７に示すように、適用するために投与領域を視覚的に精密に記した（即ち、毛髪の生えている皮膚を１ｃｍ超えたところ）。投与領域が乾燥していることを確かめた。左には「Ｌ」、右には「Ｒ」としるしたラベルのあるシリンジからシリンジ先端のキャップを取り除き、対象の腋窩上に適用する準備をした。処置用液を投与領域周辺にシリンジで均等に広げ、１分間指で皮膚中にマッサージした。次いで、対象は、彼の／彼女の腕を体の側面に沿って降ろし、６０分間インキュベートした。６０分間インキュベート後、滅菌ガーゼパッドで処置を清浄にした。ガーゼパッド及び手袋は、バイオハザートバックに捨てた。対象を開放した。
【０１１０】
結果
Essentia局所用ＢＴは発汗を６５％減少させ、図８ａに示した。Ｋｎ２１ｐｒ主鎖単独（対照）又はＫｎ２１ｐｒ主鎖プラスBotox２００Ｕ（ベースライン時に対する比率）で処置４週間後（左右各々無作為化）の汗の生成。前述したＰでＮＰＳＳを用いてWilcoxonの符号付順位検定による統計学的分析を行い、Ｐ＜０．０５で有意差があった［対象ｎ＝１０］。
【０１１１】
第２の比較：ベースライン時対４週間後（図８ｂを参照されたい）
Ｋｎ２１ｐｒ主鎖単独（対照）、又はＫｎ２１ｐｒ主鎖プラスBotox２００Ｕ（対照に対する処置の比率）で腋窩処置４週間後（左右各々無作為化）の汗生成（５分間当たりのｍｇ）を表６に示した。前述したＰでＮＰＳＳを用いてWilcoxonの符号付順位検定による統計学的分析を行い、Ｐ＜０．０５で有意差があった（ＰｒＴｐ＝０．０２１７）［ｎ＝１０］。
【０１１２】
図９は、腋窩多汗症を処置するための、「Essentia Botoxローション」で局所的に処置する前、及び後の、Minorのヨウ素／デンプン試験を表す写真を示している。対象＃１２に対し、右腋窩は「Essentia Botoxローション」で処置し（ａ及びｃ）、左腋窩は対照を適用した（ｂ及びｄ）場合の、ベースライン時対２週間後のヨウ素／デンプン試験を示す。これらの写真は、ヨウ素デンプンにおける、担体＋Botoxで処置した後に観察される典型的な利点を示している。対照側では、ある程度のクロスオーバーが観察されたが（重量分析データにおける２５％の減少に一致し）、処置で大幅な減少がもたらされている（処置側に対する重量分析データにおける６５％の減少に一致した）。
【０１１３】
結果
本明細書に開示された本発明により形成されたボツリヌス複合体を局所適用すると、自覚的又は量的に、多汗症の患者の同齢集団における発汗を減少させる治療上の利点が容易にもたらされることが、この実施例により確認された。発汗を減少させるこの効果は、先に示した前額部の場合、及び滞留時間中に製剤の広がりを制限するための手袋と組み合わせた場合の掌／足裏への適用においてももたらされている。治療のためのボツリヌストキシン複合体のこの経上皮の送達は、この取組みが、膀胱の機能不全若しくは痙攣、消化管への適用、又は臭いを減少させ若しくはざ瘡を予防／処置するための皮脂腺分泌など、ＳＮＡＰ機能又はアセチルコリンのシグナルが決定的である他の症例に拡張できることをさらに確かにしている。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１】ペプチドの主鎖を含む本発明の組成物を用いて、ボツリヌストキシンの経皮送達の効果を実証する実験の結果を表す図である。
【図２】一方の肢の領域を本発明の組成物で処置し、他方の領域を本発明の担体を含まない、別のボツリヌストキシン含有組成物で処置したマウスの後肢の状態を示す写真である。
【図３】「Essentia Botoxローション」で局所的に処置する前、及び後の対象の前額部のしわを示す写真である。
【図４】「Essentia Botoxローション」でしわを局所的に処置した後（Ａ）の、及び処置する前（ｂ）の前額部のMikrosilキャストを示す図である。これらのMikrosilキャストは、実際の対象の写真撮影に起因することがあるアーチファクトを最小にするため有用であり、非処置の側に深いしわがあることをはっきりと示している。
【図５】「Essentia Botoxローション」（Ａ）及び対照のローション（Ｂ）を、対象の前額部に適用して５日後に行った、Minorのヨウ素／デンプン試験を示す写真である。対照のローションには、分子量約２１０００を有しＴＡＴ分枝基を有する正の電荷を持つポリリジンの主鎖が含まれていた。これらの写真は、適用２分後に撮影した。
【図６】図５と同じであるが、４分経過後に撮影した写真である。
【図７】腋窩多汗症の試験で用いた投与領域を示す図である。投与領域は、腋毛で覆われている皮膚の領域を１センチメートル拡張していることに注意されたい。
【図８ａ】ヒト対象で腋窩多汗症を処置するために、短いペプチジルの担体を用いた局所用薬剤として無傷の皮膚を通して治療的に送達されたボツリヌストキシンの効果を実証する実験の結果を表す図である。グラフは、Botoxプラス短いペプチジルの担体、又は担体のみで処置し、４週間後に重量測定法で測定した汗の量（５分当たりのｍｇ）に有意な減少があったことを示している。結果は、同じグループで、ベースライン値に対する比率で表した４週間後の値であり、Ｎ＝１０の患者でWilcoxonの分析で決定してＰ＜０．０５で有意差があった。
【図８ｂ】ヒト対象で腋窩多汗症を処置するために、短いペプチジルの担体を用いた局所用薬剤として無傷の皮膚を通して治療的に送達されたボツリヌストキシンの効果を実証する実験の結果を表す図である。グラフは、Botoxプラス短いペプチジルの担体、又は担体のみで処置し、４週間後に重量測定法で測定した汗の量（５分当たりのｍｇ）に有意な減少があったことを示している。結果は、両時間点で、対照値に対する比率で表した処置の値であり、Ｎ＝１０の患者でWilcoxonの分析で決定してＰ＜０．０５で有意差があった。
【図９】腋窩多汗症を処置するために「Essentia Botoxローション」で局所的に処置する前、及び後の、Minorのヨウ素／デンプン試験を示す写真である。対象＃１２の、右腋窩を「Essentia Botoxローション」で処置し（ａ及びｃ）、左腋窩に対照を適用した（ｂ及びｄ）場合の、ベースライン時対２週間後のヨウ素／デンプン試験を示してある。これらの写真は、担体＋Botoxで処置した後にヨウ素デンプンで観察された、典型的な利点を示している。対照側にいくらかの交差が観察されるが（重量分析のデータにおける２５％の減少に一致する）、処置で大幅な減少がもたらされている（処置側に重量分析のデータにおける６５％の減少に一致する）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【国際調査報告】
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