(57)【要約】【課題】本発明は、ＰｒＰを含む可能性を有するヒトあるいは動物の生体サンプルにおけるＰｒＰの検出方法に関する。【解決手段】本発明の方法は、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を含有する分子、並びに、大環状リガンド及びグリコサミノグリカンから選択されるタンパク質リガンド以外のリガンドを使用することを特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子、並びに、大環状リガンド及びグリコサミノグリカンリガンドから選択される、タンパク質リガンド以外のリガンドを使用することを特徴とする、ＰｒＰを含む可能性を有するヒトあるいは動物起源の生体サンプルにおけるＰｒＰの検出方法。
【請求項２】
少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子は、ＰｒＰを沈殿させるために、タンパク質リガンド以外のリガンド添加よりも前に生体サンプルに添加されることを特徴とする請求項１に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項３】
プロテイナーゼＫをサンプルに添加する付加的な段階を含むことを特徴とする請求項１又は２に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項４】
以下の段階：
ａ）プロテイナーゼＫをサンプルに添加し、ＰｒＰｃを分解する、
ｂ）そのようにして得られた混合物に、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子を添加し、ＰｒＰ凝集体を得る、
ｃ）タンパク質リガンド以外のリガンドを添加し、さらに、
ｄ）ＰｒＰｒｅｓの存在を検知する、
を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項５】
以下の付加的な段階ｉ）及びｉｉ）の少なくとも一つの段階：
ｉ）反応混合物からのＰｒＰ凝集体の分離、及び、
ｉｉ）ＰｒＰ凝集体の変性、
ここで、これらの段階は、適切な場合には、段階ｂ）とｃ）の間に含まれることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項６】
ＰｒＰ−特定結合パートナーとＰｒＰ間での免疫反応用のＰｒＰ−特定結合パートナーは、適切な場合には、段階ｄ）において添加されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項７】
タンパク質リガンド以外のリガンドは固体支持体に結合されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項８】
少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子は、少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子、好ましくはストレプトマイシン、特に好ましくはその塩であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項９】
タンパク質リガンド以外のリガンドは大環状リガンドであることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項１０】
大環状リガンドは、メタシクロファン、好ましくはカリックスアレーンから選択されることを特徴とする請求項９に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項１１】
大環状リガンドは下記一般式（Ｉ）：
【化１】
2007520704.tif 000013
式中、Ｒ１は水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基であり、Ｒは下記に示すものであり、Ｒ２は水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ又はＣＨ２Ｐｏｌ基であり、この中でＰｏｌはホスフェート、スルフェート、アミン、アンモニウム又はカルボン酸基を示し、Ｒは下記に示すものであり、Ｒ３は水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基であり、Ｒは下記に示すものであり、Ｒ４は水素原子、水酸基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基であり、Ｒは下記に示すものであり、Ｙは炭素、窒素又は硫黄原子であり、Ｒ５とＲ６は各々独立して、存在又は非存在の水素原子、ＣＨ２基又は下記に示すＲ基であるか、あるいは、共に酸素又は硫黄原子であり、ＸはＣＨ２基、酸素又は硫黄原子であり、ｍは０又は１の整数であり、Ｒは水素原子、又は、ハロゲン基で置換若しくは非置換であってもよく、極性又は非極性官能基を運搬する、飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状の炭化水素鎖であり、ｎは３−１５の整数であり、置換基Ｒ１−Ｒ５、Ｒ、Ｘ及びＹ、並びに、整数ｍは、ユニットにより本質的に異なっても良いものであることを特徴とする請求項１０に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項１２】
大環状リガンドは下記一般式（Ｉａ）：
【化２】
2007520704.tif 000014
式中、ｎは４−８の整数であり、各々Ｒ２は、独立して、スルフェート基又はホスフェート基であり、Ｒ７は（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基であり、ここで、ｔは０−６の整数であり、ｓは０−６の整数であることを特徴とする請求項１１に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項１３】
リガンドは一般式（Ｉａ）のカリックスアレーンであり、式中、２つのＲ２基が各々スルフェート基であり、ｎは４、６又は８であり、Ｒ７は水素原子、−ＣＨ２ＣＯＯＨ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
大環状リガンドは、一般式（Ｉａ）中、ｎ＝６、Ｘ＝Ｙ＝スルフェート、Ｒ７は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２のものであることを特徴とする請求項１０に記載のＰｒＰの検出方法。
【請求項１５】
動物あるいはヒト生物体から由来、又は、得られる生体サンプルを、抗生物質を除いた少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子と接触させる段階を含むことを特徴とするＰｒＰ、特にＰｒＰｓｃの検出方法。
【請求項１６】
大環状リガンド及びグリコサミノグリカンから選択される、タンパク質リガンド以外のリガンド、及び、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子を含むことを特徴とするＰｒＰ検出のための診断キット。
【請求項１７】
タンパク質リガンド以外のリガンドは固体支持体に結合されていることを特徴とする請求項１６に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プリオン病の分野に関する。特に本発明は、これらの病気に関与するプリオン種の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然又は正常なプリオンタンパク質（プリオンタンパク質細胞をＰｒＰｃと表す。）は、哺乳類のリンパ細胞及び神経細胞に広く発現する糖タンパク質である。ＰｒＰｃの構造変化が、プロテイナーゼＫ抵抗性異常型タンパク質ＰｒＰｓｃの出現及び伝播に繋がる。この異常型タンパク質を、本出願においては区別することなく、以降、ＰｒＰｓｃ又はＰｒＰｒｅｓと表す。本出願において「ＰｒＰ」という語は、正常あるいは正常でないものでもよく、あるいは、抵抗性あるいは抵抗性でないものでもよいプリオンタンパク質のいずれかの種を表す。
【０００３】
哺乳類の器官にＰｒＰｓｃが蓄積すると、数多くの病気、いわゆるプリオン病又は伝達性海綿状脳症（ＴＳＥｓ）、特に小さな反芻動物に見られる羊海綿状脳症（スクレーピー）、ヘラジカ及びレイヨウの慢性消耗病（ＣＷＤ）、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）及びヒトのクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）の原因となる。感染主における病気の進行は、脳内での異常型タンパク質ＰｒＰｓｃの蓄積によってもたらされ、これにより脳細胞が修復不可能な損傷を負う。ＢＳＥに感染したウシに関しては、発症が遅いこと（２〜６年の潜伏期間経過後）及び症状の進行がゆるやかであることが、疫学モデルの発展を著しく遅らせている。ＢＳＥは摂取によりヒトに感染し、ヒトにおける新種のクロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）の出現に繋がっている。
【０００４】
症状が現れていない感染動物中、特に病気に感染した動物の血液や尿のような生理液中において、病気の進行前に異常型タンパク質ＰｒＰｓｃを検出することは困難である。ヒトの食用動物に含まれるＰｒＰｓｃは、感染した組織が摂取された場合にヒトに感染することが現在では判明している。従って、公衆衛生上、主要目的とされるのは、
−食物連鎖から排除する目的で、ヒトの食用動物中の、
−ヒトの献血及び輸血用血液誘導体中の、
ＰｒＰｓｃの存在を検出することにより、感染を防ぐことである。実際には、脳に影響が及ぶよりもかなり前に、従って臨床的に明白なプリオン病を連想させる神経の兆候を検出する可能性よりもかなり前に、血液中及びリンパ細胞中に異常型タンパク質ＰｒＰｓｃの存在により示されるものではあるが、ヒトの生理病理学は知られていない。ヒツジにおける試験的感染の実施は不可能であるので、血液中又は他の生体液中において、検出するための試験の欠如により研究が不可能となり、それ故に献血を経由したヒト間の感染の防止が不可能となり、動物の群れにおいて脳疾患段階前、ひいては、感染した動物を早期に、食肉処理場に到達する前に排除すること可能とするために、脳の病変が始まる前に感染主を処置するという発想を実現不可能なものとしている。
【０００５】
従って、ヒトあるいは動物の生体サンプル中において、ＰｒＰｓｃの存在を検出することは極めて重要であり、いくつかの研究グループが免疫検出方法を開発している（特許文献１）。さらに、ｖＣＪＤ処置を目的とした、ペプチド、低分子化合物あるいは抑制剤をＰｒＰｓｃと共に錯化する方法が盛んに研究されている。しかし、生体サンプル中のＰｒＰｓｃが少量である場合、先行技術の方法ではＰｒＰｓｃを確実に特定することの困難さに常に直面する。
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０２／０８６５１１号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、予期に反して、プリオンタンパク質を含む可能性を有する生体サンプル中のＰｒＰを診断するための試験における、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子の使用、及び、タンパク質リガンド以外のリガンドを使用することにより、希釈状態且つ現在使用される方法では検出不可能な条件下で、このタンパク質の検出が可能であること、該診断試験において使用されるＰｒＰ−特定結合パートナーへのＰｒＰの結合能を変更することなく、これら２つの成分を組み合わせて使用することを論証した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明の主題は、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子、及び、タンパク質リガンド以外のリガンドを使用することを特徴とする、ＰｒＰを含む可能性を有するヒトあるいは動物起源の生体サンプルにおけるＰｒＰ、特にＰｒＰｓｃの検出方法である。
【０００９】
本発明の主題はまた、タンパク質リガンド以外のリガンド、及び、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子を含む、ＰｒＰ検出のための診断キットに関する。
【００１０】
「タンパク質リガンド以外のリガンド」という表現は、ＰｒＰと結合可能な化合物であり、且つ、本質的に非タンパク質である化合物を意味する。このリガンドの定義より除かれるタンパク質リガンドとして、抗ＰｒＰ抗体が挙げられる。
【００１１】
「少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子」という表現は、少なくとも一つの正電荷を有する分子若しくはグリコシド結合が関係する官能基を有する分子、又は、その両方を有する分子を意味する。
【００１２】
従って、本発明の方法は、前記のように定義された、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子の使用、及び、タンパク質リガンド以外のリガンドの使用を組み合わせることにより、生体サンプル中に少量存在するＰｒＰの検出を可能とする利点を有する。
【００１３】
本発明の検出方法が実施される生体サンプルは、ＰｒＰを含有する可能性を有する動物又はヒト起源の任意のサンプルである。そのようなサンプルの例として、脳、中枢神経系組織、脾臓や腸のような器官、及び、セファロスピナル液（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、尿や血液といった生体液が挙げられる。
【００１４】
本発明の方法を適用可能な動物は、プリオン病に感染する動物である。例として、ヒツジ種やウシが挙げられるが、これらに限定されるものではない。少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子に含まれる正電荷としては、グアニジウム又はアンモニウム官能基のような塩基性官能基により付与される正電荷が好ましい。少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子に含まれるグリコシド結合としては、マクロライドやアミノグルコシドに見られる結合のようなヘテロシドタイプの結合が好ましい。本発明の目的のために好ましい、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子は、少なくとも一つの正電荷及び少なくとも一つのグリコシド結合の両方を有する分子、及び、少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子、好ましくは非ポリマーである親水性分子系である。
【００１５】
本発明の特別な実施態様によれば、少なくとも一つの正電荷及び少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子は、グアニジウム環を有するアミノグルコシドから選択され、ストレプトマイシンが特に好ましい。
【００１６】
本発明の他の特別な実施態様によれば、少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子は、ポリアリルアミン、トリエチレンテトラアミン（ＴＥＴ）、ビス−３−アミノプロピルアミン、スペルミンテトラヒドロクロリド、ジヒドロストレプトマイシンセスキスルフェート及びストレプトマイシンから選択され、後者の２つの化合物は、少なくとも一つの正電荷及び少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子の一群にも属する。
【００１７】
少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子、特に少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子、好ましくはストレプトマイシン、特に好ましくはその塩の使用により、試験生体サンプル中に存在するＰｒＰの沈殿が与えられる。この沈殿特性は、ＰｒＰｓｃの存在下、特にプロテイナーゼＫ処理後に増大する。この沈殿は、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子と共に処理した後に得られるＰｒＰ凝集体（あるいは、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子により架橋したＰｒＰとも呼ばれる）の形成の結果によるものである。
【００１８】
従って、この定義に対応する抗生物質を除き、ストレプトマイシンのような、少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子と、動物あるいはヒト生物体から由来、又は、得られる生体サンプルを接触させることを特徴とする方法によって、ＰｒＰ、特にＰｒＰｓｃの検出が可能である。
【００１９】
本方法は、
ａ）抗生物質を除く、少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子を、動物あるいはヒトの器官から由来、又は、得られる生体サンプルに添加する、
ｂ）溶液を加熱（例えば３７℃−１５０℃）、その後、遠心分離を行い、上清からペレットを分離する、
ｃ）電気泳動ゲル上を移行、移動及び免疫検出後にＰｒＰｓｃを検出、又は、固体支持体上で捕集、続いてＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ免疫検出後にＰｒＰｓｃの検出を行う、
からなる段階を経て実施される。
【００２０】
本方法はまた、付加的な段階として、後で示す条件下での変性段階を含む。本方法はまた、付加的な段階として、好ましくは段階ａ）の前に、後で示す条件下でのプロテイナーゼＫの添加段階を含む。同様に、ＰｒＰｓｃ検出段階は、後で示す条件下で実施可能である。
【００２１】
そのＰｒＰｓｃへの結合能のために、抗生物質を除く、少なくとも２つのグアニジウム及び／又はアンモニウム官能基を有する分子は、免疫組織化学による検出の間であっても、ＰｒＰｓｃの沈殿、検出及び／又は診断、さらに、組織又は生体液からＰｒＰｓｃを除去するのに特に有益である。
【００２２】
タンパク質リガンド以外のリガンドの添加、特に、大環状リガンド又はグリコサミノグリカンの添加により、タンパク質リガンドと異なり、ＰｒＰタンパク質の検出感度を増大し、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子により架橋したＰｒＰをより効果的に捕集することを可能とする。その結果、生体サンプル中に少量のみ存在するＰｒＰが検出可能である。
【００２３】
少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子、及び、タンパク質リガンド以外のリガンドの量は、サンプルの特異性に応じて、当業者により容易に決定することができる。例えば、ストレプトマイシンのような少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子の量は、５０−５００ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは１００−３００ｍｇ／ｍｌである。
【００２４】
予期に反して、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子のＰｒＰへの作用、及び、その後の、このようにして形成したＰｒＰ凝集体とのタンパク質リガンド以外のリガンドの錯化、並びに、その逆においても、例えば抗ＰｒＰ検出抗体を使用するＰｒＰの検出を決して損なわない。
【００２５】
本発明の特別な実施態様によれば、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する前記分子は、ＰｒＰを沈殿させるために、タンパク質リガンド以外のリガンド添加よりも前に生体サンプルに添加される。
【００２６】
好ましくは、ＰｒＰの沈殿を促進するために、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子の添加後、反応媒体は２５℃−４５℃の範囲で適度に、好ましくは３７℃で加熱される。
【００２７】
被試験生体サンプルを少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子と接触させる前に、細胞状ＰｒＰのタンパク分解を可能とするため、サンプルをプロテイナーゼＫで前処理することができる。そのように処理されたサンプルは、プリオンタンパク質として、抵抗性ＰｒＰｓｃタンパク質（ＰｒＰｒｅｓ）のみを含む。プロテイナーゼＫ処理段階は、ＰｒＰｓｃ又はＰｒＰｒｅｓに特異的な抗体又はリガンドの非存在下、プリオン病又はＰｒＰｓｃと共に試験されるサンプルの汚染を決定するための特徴的な段階である。本発明の方法において使用されるプロテイナーゼＫの量は、当業者により容易に決定することが可能であり、例えば、８０μｇ／ｍｌ−１６０μｇ／ｍｌの範囲内である。
【００２８】
従って、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明におけるＰｒＰの検出方法は、プロテイナーゼＫをサンプルに添加する付加的な段階を含む。このプロテイナーゼＫ分解段階は、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する前記分子でのＰｒＰの架橋の前後どちらにおいても実施可能である。
【００２９】
更なる実施態様によれば、本発明の方法は以下の段階を含む。
ａ）プロテイナーゼＫを前記サンプルに添加し、ＰｒＰｃを分解する、
ｂ）そのようにして得られた混合物に、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する前記分子を添加し、ＰｒＰ凝集体を得る、
ｃ）タンパク質リガンド以外のリガンドを添加し、さらに、
ｄ）ＰｒＰｒｅｓの存在を検知する。
プロテイナーゼＫによる前処理の有無に関わらず、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子の存在下で形成した、ＰｒＰを含むＰｒＰ凝集体は、タンパク質リガンド以外のリガンドとの反応前に反応媒体から分離可能である。分離方法は、当業者に公知のどのような沈殿の分離方法によっても実施可能である。例としては、遠心分離、続いて、上清を除去することによりＰｒＰ凝集体を反応媒体から分離することが挙げられる。この分離段階により、プロテイナーゼＫのような、その後のＰｒＰ検出のための反応に必要のない全ての生成物の除去が可能であり、適切な場合には、分解されたタンパク質、並びに、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子が溶液中に存在しない。
【００３０】
本発明の検出方法の感度をさらに向上させるため、ＰｒＰ凝集体とタンパク質リガンド以外のリガンドとの反応前において、被試験生体サンプル中に存在する前記凝集体の変性を実施することが可能である。この変性段階は、当業者に公知のどのようなタンパク質凝集体の変性方法によっても実施可能である。好ましくは、グアニジンＨＣｌの添加により、変性は実施される。
【００３１】
従って、本発明のＰｒＰ検出方法は、好ましくは、少なくとも以下の付加的な段階ｉ）及びｉｉ）の一つを含む。
ｉ）反応混合物からのＰｒＰ凝集体の分離、及び、
ｉｉ）ＰｒＰ凝集体の変性。
これらの段階は、適切な場合には、段階ｂ）とｃ）の間に含まれる。好ましい実施態様によれば、本発明の検出方法は、段階ｉ）とｉｉ）を連続して、好ましくは段階ｂ）とｃ）の間に行う。
【００３２】
本発明の方法によれば、生体サンプル中におけるＰｒＰの存在の検知は、サンプル中の検体検出のための従来方法により実施可能である。例えば、免疫検出又は非免疫検出により実施可能である。「免疫検出」という語は、ＰｒＰとの免疫反応を証明することを意味し、この免疫反応は、検出するＰｒＰとＰｒＰ−特定結合パートナー間での結合からなる。あるいは、被試験サンプル中に含まれる可能性を有するＰｒＰとラベル化ＰｒＰ間での競争反応からなる。「非免疫検出」として、例えば、当業者に公知の電気泳働ゲル染色法が挙げられる。免疫反応によるＰｒＰの検出は、例えば、ＰｒＰ−特定結合パートナーの添加後に実施可能である。「ＰｒＰ−特定結合パートナー」という語は、ＰｒＰと結合可能な、どのようなパートナーをも意味する。免疫反応の可視化は、ＰｒＰ−特定結合パートナー／ＰｒＰ錯体の可視化からなる。
【００３３】
好ましい実施態様によれば、本発明の方法では、ＰｒＰ−特定結合パートナーとＰｒＰ間での免疫反応用のＰｒＰ−特定結合パートナーは、適切な場合には、段階ｄ）において添加される。
【００３４】
ＰｒＰ−特定結合パートナーとして、例えば、抗体、抗体断片、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ハプテン及びアプタマーが挙げられる。「抗体」には、多クローン性又は単クローン性抗体、遺伝子組み換えにより得られる抗体及び抗体断片が含まれる。多クローン性抗体は、少なくとも一つの所望のターゲット抗原との動物の免疫処置により得ることが可能であり、ＰｒＰの場合、続いて所望の抗原を精製した状態で回復し、前記動物の漿液をサンプリングし、とりわけ、アフィニティークロマトグラフィーにより、抗体、特にＰｒＰにより特異的に認識される抗原が付着したカラム上で、他の漿液構成成分から前記抗体を分離することにより得られる。単クローン性抗体は、ハイブリドーマ法により得ることが可能である。その一般的原理については後述する。
【００３５】
まず、動物、一般にはマウス（又は、生体内免疫処置の場合は、培養物中の細胞）を所望のターゲット抗原で免疫化する。ＰｒＰの場合、ＰｒＰのＢリンパ球がその後、前記抗原に対し抗体を産生可能となる。これらの抗体産生性リンパ球はその後、「不死化」骨髄腫細胞（例としてマウス細胞）と融合されて、ハイブリドーマのもととなる。このようにして得られる細胞の異種混合物を用いることでその後、特定の抗体の産生及び無制限に増殖が可能な細胞の選択が実施される。各々のハイブリドーマはクローンとして増殖され、各々が単クローン性抗体の産生をもたらし、所望の抗原に関する単クローン性抗体の認識特性を、例えば、ＥＬＩＳＡ、１次元若しくは２次元免疫ブロット、免疫蛍光、又は、バイオセンサーを用いることにより試験できる。そのように選択された単クローン性抗体は、続いて、特に前述のアフィニティークロマトグラフィー法により精製される。
【００３６】
本発明における適当な抗体として、例えば、抗体８Ｇ８、１２Ｆ１０（ＳｐｉＢｉｏ社製、フランス）及び３Ｆ４（Ｉｍｍｕｎｏｋ社製）が挙げられる。抗体断片は、ＰｒＰ結合機能を保存する。
【００３７】
「ポリペプチド」という語は、少なくとも２つのアミノ酸鎖を意味する。「アミノ酸」という語は、タンパク質をコードする第一級アミノ酸、トランス−４−ヒドロキシ−プロリンのような酵素作用後の誘導アミノ酸、ノルバリン、Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシン又はスタリン（ｓｔａｌｉｎｅ）（Ｈｕｎｔ  Ｓ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ，Ｂａｒｅｔｔ  ＧＣ，ｅｄ．，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８５）のような天然のものではあるが、タンパク質中には存在しないアミノ酸、固体支持又は液相合成において使用可能な化学官能基で保護されたアミノ酸、及び、非天然のアミノ酸を意味する。
【００３８】
「タンパク質」という語は、繊維質あるいは球状の核タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質及び糖タンパク質のようなホロタンパク質及びヘテロタンパク質を含む。「核酸」という語は、オリゴヌクレオチド、デオキシリボ核酸、リボ核酸及びその誘導体を意味する。「オリゴヌクレオチド」という語は、少なくとも２つの、天然あるいは修飾したのものであっても良いヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又は、その両方）を示す。「修飾ヌクレオチド」という語は、例えば、修飾塩基を含む、及び／又は、ヌクレオチド間結合レベル及び／又は主鎖レベルでの修飾を含むヌクレオチドを意味する。修飾塩基の例として、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン及びブロモ−５−デオキシウリジンが挙げられる。修飾ヌクレオチド間結合としては、例えば、ホスホロチオエート、Ｎ−アルキルホスホロアミデート、アルキルホスホネート及びアルキルホスホジエステル結合が挙げられる。仏国特許出願公開第２６０７５０７号明細書において開示されているアルファ−オリゴヌクレオチド、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８，Ｉｓｓｕｅ  １６，８  Ａｕｇｕｓｔ  １９９８，ｐａｇｅｓ  ２２１９−２２２２に記載のホスホロチオエート−ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡのようなＬＮＡ、Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．による論文、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９２），１１４，１８９５−１８９７の主題であるＰＮＡｓが、主鎖が修飾されたヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドの例である。
【００３９】
「ハプテン」という語は、非免疫原性化合物、すなわち、それら自身では抗体の産生により免疫反応を促進できないが、公知の条件下での動物の免疫処置、特にハプテン−タンパク質結合体での免疫処置によって得られる抗体により認識されることが可能な化合物である。これらの化合物の分子量は、通常３０００Ｄａ未満であり、最も一般的には２０００Ｄａ未満であり、例えば、グリコシル化ペプチド、代謝産物、ビタミン、ホルモン、プロスタグランジン、トキシン又は様々な医療品、ヌクレオシド及びヌクレオチドであっても良い。
【００４０】
アプタマーは、本質的にタンパク質あるいは核酸である捕集パートナーであり、その官能基は抗体として作用し、タンパク質リガンドと結合する（Ｔｏｕｌｍｅ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｉｅｇｅ，Ｒ．，１９９８，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４（２），１５５−１６６）。  
【００４１】
これら全てのポリペプチド、タンパク質、ハプテン及びアプタマーは、ＰｒＰ及びＰｒＰ凝集体との結合能を有する。
【００４２】
特に段階ｂ）において実施されるＰｒＰ−特定結合パートナーとＰｒＰ間の免疫反応の可視化は、当業者に公知であるどのような直接的又は非直接的手法な手法によっても実施可能である。直接検出、すなわち、ラベル化を使用しない場合、免疫反応は、例えば、プラズモン共鳴又は電極に導電性ポリマーを使用したサイクリックボルタメトリーにより観測可能である。非直接検出、すなわち、ラベル化を使用する場合、ＰｒＰ−特定結合パートナーを用いてラベル化を実施することが可能であり、それから予めラベル化される。
【００４３】
本発明の方法によれば、生体サンプル中に存在するＰｒＰの可視化は、「競争」法に従っても実施可能である。予めラベル化したＰｒＰをその後、特に段階ｄ）において、ＰｒＰ−特定結合パートナーの代わりに添加する。この場合、検出シグナルはＰｒＰ非存在下で最大となり、ラベル化していない、調べているＰｒＰの濃度が競争反応により上昇するに伴い、その後徐々に低下する。
【００４４】
「ラベル化」という語は、直接的又は非直接的に検出シグナルを発生することが可能なラベルを付与することを意味する。これらのラベルは、限定されるものではないが、以下のものからなる。
・ホースラディシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、α−ガラクトシダーゼ又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼのような、例えば、比色計、蛍光計又は発光計により検出可能なシグナルを発生する酵素、
・発光性化合物又は染料のような発色団、
・３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉのような放射性分子、
・フルオレセイン、ローダミン、アレクサ又はフィコシアニンのような蛍光分子、及び、
・金粒子、磁性ラテックス粒子又はリポソームのような粒子。
【００４５】
例えば他のリガンド／アンチリガンド対により、非直接的な系も使用可能である。リガンド／アンチリガンド対は当業者に公知のものであり、例えば、ビオチン／ストレプトアビジン、ハプテン／抗体、抗原／抗体、ペプチド／抗体、糖／レクチン又はポリヌクレオチド／相捕的ポリヌクレオチドが挙げられる。この場合、結合剤を運搬するのはリガンドである。アンチリガンドは、前段で記載したラベルにより直接検出可能であり、あるいは、それ自身がリガンド／アンチリガンドにより検出可能である。
【００４６】
一定の条件下におけるこれら非直接的な検出系は、シグナルの結果として生ずる。このシグナルの増幅方法は当業者に公知であり、文献Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．４５：４８１−４９１，１９９７を参照することが可能である。
【００４７】
タンパク質のラベル化は当業者に広く公知であり、例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．ＨｅｒｍａｎｓｏｎによりＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ，５２５Ｂ  Ｓｔｒｅｔ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ９２１０１  ＵＳＡに記載されている。
【００４８】
使用されるラベル化の種類に応じて、例えば酵素を使用する場合、当業者はラベル化を可視化するために試薬を追加できる。そのような試薬は当業者に公知であり、特にＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｅｓｓａｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｃ．Ｐｒｉｎｃｅ，Ｄ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７，３４５  Ｐａｒｋ  Ａｖｅｎｕｅ  Ｓｏｕｔｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００４９】
ＰｒＰ検出としては、固相検出、すなわち、被検出タンパク質を捕集することを意図した結合パートナーが固定された固相を使用した固相検出が可能である。本発明の場合、固相に予め固定された捕集パートナーとして働くのは、タンパク質リガンド以外のリガンドである。当業者に公知の固相検出の例は、ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ検出のようなサンドイッチ−タイプ検出である。
【００５０】
従って、本発明の好ましい実施態様によれば、タンパク質リガンド以外のリガンドは固体支持体に結合されている。固体支持体としては、例えば、磁性ビーズのようなビーズ、及び、ミトロ滴定（ｍｉｔｒｏｔｉｔｒａｔｉｏｎ）板が挙げられる。タンパク質リガンド以外のリガンドは当業者に公知の手法、例えば、吸着又は共有結合により固体支持体に結合することが可能であるが、共有結合によるものが好ましい。
【００５１】
従って、固体支持体は、リガンドにより運搬される官能基と結合を形成可能な官能基を用いて官能基化することが可能である。好ましい実施態様によれば、固体支持体はＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）結合又はＮＨ２官能基で官能基化される。この官能基はリガンドにより運搬される官能基と反応し得る。この実施態様においては、固体支持体の官能基結合と結合を形成するために反応可能な官能基を運搬するリガンド、特にＮＨ２又はＣＯＯＨ結合を運搬するリガンドが特に好ましい。タンパク質リガンド以外のリガンドの例として、例えば、大環状リガンド、グリコサミノグリカンが含まれる。これらリガンドは全て、タンパク質リガンドと異なり、ＰｒＰタンパク質検出の感度を増幅する特殊性を有する。
【００５２】
本発明の一実施態様によれば、タンパク質リガンド以外のリガンドは、大環状リガンド及びグリコサミノグリカンから選択される。グリコサミノグリカンは当業者に広く公知であり、例えば、Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｍ．Ｙａｌｐａｎｉ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８８に記載されている。本発明の目的に適したグリコサミノグリカンとして、例えば、ヘパリン、コンドロイチンスルフェート、デルマタンスルフェート、ヒアルロン酸又はケラチンスルフェートが挙げられる。
【００５３】
「大環状リガンド」という語は、大環状を形成する環の連続からなる化合物を意味する。大環状リガンドは当業者に公知である。非限定的な例として、シクロファン、メタシクロファン、シクロデキストリン、シクロ（テトラ−クロモトロプ酸）、スプヘランド（ｓｐｈｅｒａｎｄｓ）あるいはシクロ（ｎ）ベラトリレン（ｃｙｃｌｏ［ｎ］ｖｅｒａｔｒｙｌｅｎｅｓ）が挙げられる。大環状リガンドは、被試験タンパク質を、かご効果により遊離状態又は凝集状態で捕捉することができるという特別の利点を有する。大環状リガンドは当業者に公知の手法に従って調整可能であり、例えば、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９６に記載されている。本発明の方法に好ましい大環状リガンドは、メタシクロファン、特に好ましいカリックスアレーンから選択される。そのようなカリックスアレーン化合物は、Ａｒｄｕｉｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ，Ｌ．Ｍ．＆  Ｍｏｄｄｙ，Ｃ．Ｊ．Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ及びＤａ  Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｓｕｐｒａｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１：１３５−１３８に記載の方法論に従って得ることが可能である。
【００５４】
好ましい実施態様によれば、大環状リガンドは下記一般式（Ｉ）である。
【００５５】
【化１】
2007520704.tif 000002
【００５６】
式中、Ｒ１は水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基であり、Ｒは下記に示すものである。Ｒ２は水素原子、Ｒ、ＣＯＲ、Ｐｏｌ又はＣＨ２Ｐｏｌ基であり、この中でＰｏｌはホスフェート、スルフェート、アミン、アンモニウム又はカルボン酸基を示し、Ｒは下記に示すものである。Ｒ３は水素原子、水酸基、ＯＲ基又はＯＣＯＲ基であり、Ｒは下記に示すものである。Ｒ４は水素原子、水酸基、ＯＲ基、ＯＣＨ２Ｒ基又はＯＣＯＲ基であり、Ｒは下記に示すものである。Ｙは炭素、窒素又は硫黄原子である。Ｒ５とＲ６は各々独立して、存在又は非存在の水素原子、ＣＨ２基又は下記に示すＲ基であるか、あるいは、共に酸素又は硫黄原子である。ＸはＣＨ２基、酸素又は硫黄原子である。ｍは０又は１の整数である。Ｒは水素原子、又は、ハロゲン基で置換若しくは非置換であってもよく、極性又は非極性官能基を運搬する、飽和若しくは非飽和、分岐若しくは非分岐、環状若しくは非環状の炭化水素鎖である。ｎは３−１５の整数である。置換基Ｒ１−Ｒ５、Ｒ、Ｘ及びＹ、並びに、整数ｍは、ユニットにより本質的に異なっても良い。
【００５７】
従って、式（Ｉ）の化合物は、ｎ個のベンゼン環が存在することを特徴とするユニットが連続したものであり、環上の置換基は、前記の定義の範囲内であれば各々のユニットにおいて異なっても良い。ハロゲン基で置換又は非置換であってもよく、極性又は非極性官能基を運搬する、飽和又は非飽和、分岐又は非分岐、環状又は非環状の炭化水素鎖は、当業者に広く公知のものである。例としては、アルキル、アルケン、アリール及びシクロヘキサンのような飽和した環が挙げられる。非極性基の例はＣＦ３であり、極性基の例は上記で定義した置換基Ｐｏｌである。
【００５８】
特に好ましい式（Ｉ）の化合物は、下記式（Ｉａ）である。
【００５９】
【化２】
2007520704.tif 000003
【００６０】
式中、ｎは４−８の整数である。各々Ｒ２は、独立して、スルフェート基又はホスフェート基である。Ｒ７は（ＣＨ２）ｔ−（ＣＯ）ｓ−（ＮＨ２）基又は（ＣＨ２）ｔ−ＣＯＯＨ基であり、ここで、ｔは０−６の整数であり、ｓは０−６の整数である。特に好ましい式（Ｉａ）の化合物は、２つのＲ２基が各々スルフェート基であり、ｎは４、６又は８であり、Ｒ７は水素原子、−ＣＨ２ＣＯＯＨ基、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２基又は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２基であり、本発明の一実施態様である。
【００６１】
好ましい実施態様によれば、大環状リガンドは、一般式（Ｉａ）中、ｎ＝６、Ｘ＝Ｙ＝スルフェート、Ｒ７は−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２のものである。
【００６２】
本発明の病原性ＰｒＰを免疫検出する方法を実行するために、タンパク質リガンド以外のリガンド、好ましくは大環状リガンド、及び、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子を含む診断キットを使用しても良い。
【００６３】
好ましい実施態様によれば、キット中の前記タンパク質リガンド以外のリガンドは、固相検出方法に従って病原性ＰｒＰの検出を実施するため、固体支持体に結合している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６４】
本発明は以下の実施例及び図１−１０により、さらに詳細に理解されるが、これらに限定されるものではない。
【実施例】
【００６５】
実施例１：サンプルの前処理
１．ストレプトマイシンで処理していない、脳抽出物のような固体器官サンプル
最初に、５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液中で器官（脳等）を均質化し、１０％懸濁液を得る。５μｌの２ｍｇ／ｌプロテイナーゼＫ（ＰＫ）溶液、１μｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）溶液及び６μｌの２．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グリコピラノシド水溶液を１００μｌの前記均質化溶液に添加する。混合物を渦状に混ぜて、その後３７℃で６０分間培養する。５００μｌのクロロホルム：メタノール（１：２）混合物をその後添加し、混合物を渦状に混ぜる。続いて１５，０００ｒｐｍで１０分間、室温にて遠心分離段階を経る。上清をその後除去し、ペレットを２５μｌの６Ｍグアニジン塩酸塩溶液中で再懸濁する。懸濁液を３７℃で３０分間培養する。最後に４００μｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）溶液及びツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（０．０５％ｗ／ｖ）を添加する。
【００６６】
２．ストレプトマイシンで処理した、脳抽出物のような固体器官サンプル
最初に、５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液中で器官（脳、脾臓等）を均質化し、１０％懸濁液を得る。５μｌの２ｍｇ／ｌプロテイナーゼＫ（ＰＫ）溶液、２０μｌの２．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−オクチル−β−Ｄ−グリコピラノシド水溶液を１００μｌの前記均質化溶液に添加する。混合物を渦状に混ぜて、その後３７℃で３０分間培養する。１ｇ／ｍｌのストレプトマイシンスルフェート溶液２０μｌを添加し、混合物を攪拌し、３７℃で１時間再培養する。５００μｌのクロロホルム：メタノール（１：２）混合物をその後添加し、混合物を渦状に混ぜる。続いて１０，０００ｒｐｍで１０分間、室温にて遠心分離段階を経る。上清をその後除去し、ペレットを２５μｌの６Ｍグアニジン塩酸塩溶液中で再懸濁する。懸濁液を３７℃で３０分間培養する。最後に４００μｌのＰＢＳ溶液及びツイーン２０（０．０５％ｗ／ｖ）を添加する。        
【００６７】
３．ストレプトマイシンで処理した、漿液や血漿のような生体液サンプル
プロテイナーゼＫ溶液を１００μｌの漿液又は血漿に添加し、酵素の最終濃度を８０μｇ／ｍｌとする。溶液をその後渦状に混ぜて、３７℃で３０分間培養する。１ｇ／ｍｌのストレプトマイシンスルフェート溶液２０μｌを添加し、混合物を攪拌し、３７℃で１時間再培養する。１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後に上清を廃棄する。残留ペレットを２５μｌの６Ｍグアニジン塩酸塩溶液中で渦状に混ぜることにより再懸濁する。その後懸濁液を３７℃で３０分間培養する。その後４００μｌのＰＢＳ溶液及びツイーン２０緩衝液（０．０５％ｗ／ｖ）を添加し、混合物を渦状に混ぜる。
【００６８】
４．神経系から調整した、精製した分解（ＰｒＰｒｅｓ）ＰｒＰｓｃ原繊維サンプル
最初に、５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液中で器官（脳等）を均質化し、１０％懸濁液を得、濾過する。１００ｍｇ組織当たり２５μｇの割合でＰＫを使用する。渦状に混ぜて均質化後、試験管を培養器に入れ、３７℃で１時間放置する。１０ｍＭのＰｅｆａｂｌｏｃ（Ｒ）と均質化することによりＰＫの活動を停止する。超遠心分離用の調整は、６００μｌの３０％サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）と共に、１０００μｌの分解した、すり合わせた材料の均質化を含む。超遠心分離用試験管（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｑｕｉｓｋ  Ｓｅａｌ，２．２ｍｌ）中の蔗糖クッション（４００μｌの１０％蔗糖）上に移す前に、混合物を室温で少なくとも１５分間放置する。試験管を超純水で満たし、その後溶封し、超遠心分離ローター中に設置する。超遠心分離は１００，０００ｒｐｍ、２０℃で２時間続く。脂質画分を含む２／３の上清をその後吸引除去する。吸収紙の上でひっくり返すことにより、ペレットを乾燥する。その後、ペレットを、１００又は２００μｌのＰＢＳ（即座の使用のため）又は変性緩衝液（凍結用）に溶解する。後者の場合、ペレットを１００℃で１０分間加熱する。冷却後、試験管を１２，０００ｒｐｍ、２０℃で５分間遠心分離を行う。上清を−８０℃で凍結する。これらのサンプルは、「陽性」の精製ＰｒＰｒｅｓ標準としての役目を果たす。
【００６９】
実施例２：カリックスアレーンリガンド、ｐ−スルフォナト−３，７−（２−アミノエチロキシ）カリックス−［６］−アレーン（以後Ｃ６Ｓ）の調整
１．合成
このＣ６Ｓ大環状免疫リガンドは、以下の一般式を有する：
【００７０】
【化３】
2007520704.tif 000004
【００７１】
上記リガンドは、Ｅｒｉｃ  Ｄａ  Ｓｉｌｖａ  ａｎｄ  Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｗ．Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｐ−ｓｕｌｐｈｏｎａｔｏ−ｃａｌｉｘ−［ｎ］−ａｒｅｎｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５９（２００３）７３５７−７３６４に記載の方法に従って調整される。このリガンドはその後、後で示す活性表面を有する固体支持体（ビーズ又はプレート）とカップリングすることが可能である。
【００７２】
２．プレート上へのＣ６Ｓのグラフト化
９６−ウェル（ｗｅｌｌ）「ＮＨＳ活性化プレート」は、Ｃｏｖａｌａｂ社（リヨン、フランス）製である。１００μｌのリガンド溶液は、５０ｍＭのｐＨ８．２ホスフェート緩衝液中に種々の濃度で溶解する。３７℃で２時間培養後、ウェルを３回（３×２００μｌ）、ＭｉｌｌｉＱ水で洗浄する。使用前にプレートは室温で乾燥する。グラフト化の図式：
【００７３】
【化４】
2007520704.tif 000005
【００７４】
３．ビーズ上へのグラフト化
４ｍｌのＮＨＳ活性化ビーズ溶液（２×１０９ビーズ／ｍｌ；Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｒ）Ｍ２７０Ａｍｉｎｅ、Ｄｙｎａｌｓ社、ノルウェー）を１ｍｌ試験管に等分する。ビーズの遠心分離を行い、磁化により沈殿させる。上清を除去し、ビーズを１ｍｌの水で３回洗浄する。ビーズペレットを、５０ｍＭホスフェート緩衝液中のカリックスアレーン溶液の種々量に溶解し、ｐＨ８．２−６００μｌ、１２０μｌ、６０μｌあるいは１２μｌのリガンド溶液を５０ｍｇ／ｍｌ（５０ｍＭホスフェート緩衝液、ｐＨ８．２）で添加する。ビーズを室温で２４時間攪拌する。ビーズをＭｉｌｌｉＱ１８Ω水で３回洗浄し、未反応のリガンドを除去する。ビーズを１ｍｌの水中で保存し、初期濃度（２×１０９ビーズ／ｍｌ）に戻す。ビーズ溶液を使用する準備が整う。これらのビーズを本文中、「Ｃ６Ｓビーズ」と定義する。Ｃ６Ｓをビーズ上へグラフト化する図式：
【００７５】
【化５】
2007520704.tif 000006
【００７６】
実施例３：ＰｒＰｒｅｓの検出 
１．使用サンプル
陽性のウシの脳、漿液及び血漿サンプルは、Ｍａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，２８：３５３−３６２に記載された、ウェスタンブロットによる脳組織中のＰｒＰｒｅｓの研究を含む従来の参照方法により、ＴＳＥ（伝達性海綿状脳症）に感染していることが確認された動物由来のものである。陰性のコントロールは、同じ方法によりプリオン病に感染している可能性が排除された動物の脳、漿液及び血漿サンプルである。血漿サンプル用に使用される抗凝血剤はＥＤＴＡである。これらのサンプルは、ＡＦＳＳＡ（Ａｇｅｎｃｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｓｅｃｕｒｉｔｅ  Ｓａｎｉｔａｉｒｅ  ｄｅｓ  Ａｌｉｍｅｎｔｓ）［Ｆｒｅｎｃｈ  ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓａｆｅｔｙ］、リヨン、フランスより供給される。
【００７７】
２．ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ法によるＰｒＰｒｅｓの検出
使用前に、前記実施例２の２．で得られるプレートのウェルを、脱脂乳（５％）とＰＢＳ／ツイーン２０（０．０５％ｗ／ｖ）の混合物で、３７℃、６０分間処理することにより予め飽和する。その後、ウェル毎に８００μｌのＰＢＳ／ツイーン２０（０．０５％ｗ／ｖ）で、ウェルを３回洗浄する。プレートをひっくり返すことにより残留緩衝液除去する。前記実施例１の３．に従って調整した１００μｌの各々の生体液サンプルをウェルに分配し、プレートを機械的に４００ｒｐｍで攪拌しながら３７℃で１００分間培養する。この最初の培養に続けて、各々のウェルを８００μｌのＰＢＳ／ツイーン２０（０．０５％ｗ／ｖ）混合物で３回洗浄し、その後プレートを乾燥する。ペルオキシダーゼでラベル化し、ＰＢＳ／ツイーン２０（０．０５％ｗ／ｖ）混合物中で０．０５μｇ／ｍｌに希釈した抗ＰｒＰ検知抗体を１００μｌ／ウェルの割合で添加し、プレートを再度３７℃で６０分間培養する。使用抗体は、ヒトＰｒＰのアミノ酸１４５−１５４により定められる領域及び動物プリオンの相同領域を認識する（抗体ＡＣ２３）。プレートをその後、８００μｌのＰＢＳ／ツイーン２０（０．０５％ｗ／ｖ）溶液（ＰＷ４１、Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）で３回すすぎ、プレートをひっくり返すことにより残留緩衝液を除去する。検知は製造者の推奨（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘキット）に従って調整した１００μｌの検知溶液を、ウェル毎に添加することにより実施した。プレートを暗所中、室温で１０分間培養する。５０μｌの硫酸溶液（１．８Ｎ）を添加することにより、反応を停止する。得られるシグナルを分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  ＰＲ２１００，Ｂｉｏｒａｄ）を用いて４９０ｎｍで読み取る。
【００７８】
３．ウェスタンブロット法による脳内のＰｒＰｒｅｓの検出
使用プロトコルは、動物中でのプリオン病の確実性の診断に使用され、さらに、Ｍａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，２８：３５３−３６２に記載の参照プロトコルである。
【００７９】
４．結果
結果を表１に示す：
表１：ウシの脳を使用して実施するウェスタンブロットタイプの参照プロトコルと比較した、前記ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ法による、同一の動物の漿液及び血漿中のＰｒＰｒｅｓ検出の特定を表す。
【００８０】
【表１】
2007520704.tif 000007
【００８１】
２つの試験（本発明の方法と参照ウェスタンブロット）が一致することから、これらの結果は、本発明の方法により、生体液中のＰｒＰの検出が可能であることを明確に示している。その上、本発明の方法は、漿液や血漿のような生理的な液体にも適用可能である。
【００８２】
実施例４：様々な種への本発明の応用
１．サンプル
上記実施例３で使用されるサンプルに加えて、ウェスタンブロットによる脳の組織中のＰｒＰｒｅｓ研究により、プリオン病スクレーピーに感染していることが確認された動物由来の、陽性ヒツジの脳、漿液及び血漿サンプル、及び、（陽性のウシと見なされた）ウシの脳起源のＢＳＥ種に感染したヒツジ種の身体の一部からの血漿も使用した。ネズミの漿液サンプルは、マウス適合Ｃ５０６Ｍ３スクレーピー種に感染したヒツジ由来の脳の懸濁液１００μｌを、予め腹膜内注射により接種されたＣ５７ＢＬ６マウスから、５％グルコース溶液中１０％で採取し、１／２００に希釈した。血液は、眼窩の洞様血管（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｉｎｕｓ）から接種１５日後に採取した。また、これらのサンプルは、ＡＦＳＳＡ（Ａｇｅｎｃｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｓｅｃｕｒｉｔｅ  Ｓａｎｉｔａｉｒｅ  ｄｅｓ  Ａｌｉｍｅｎｔｓ）［Ｆｒｅｎｃｈ  ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓａｆｅｔｙ］、リヨン、フランスより供給された。
【００８３】
２．ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ法による生体液中のＰｒＰｒｅｓの検出
実施例３の２．に記載のプロトコルを再現した。
【００８４】
３．結果
陽性あるいは陰性（＋あるいは−）マウスの漿液、ヒツジの漿液及びウシの血漿サンプル中で得られたＯＤ値の結果を図１に示す。この図は驚くべきことに、どのような種を考察しても、プリオン病に感染した動物由来のサンプルの光学濃度値は、コントロールの動物由来のサンプルと比較して著しくプラスであることを証明している。従って、本発明の方法は様々な種に適用可能である。
【００８５】
実施例５：本発明の方法における様々な抗体の使用
１．サンプル
前記実施例３に記載のウシのサンプルを使用した。
【００８６】
２．ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ法による生体液中のＰｒＰｒｅｓの検出
前記実施例３の２．に記載のプロトコルを、検知抗体として、前記抗体ＡＣ２３、又は、抗体８Ｄ１１Ｇ１２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，フランス）のいずれかを使用して再現した。
【００８７】
３．結果
陽性あるいは陰性（＋あるいは−）ウシの血漿サンプル中で得られたＯＤ値の結果を図２に示す。この図は、本発明の方法が様々な抗ＰｒＰ抗体と共に実施可能であることを証明している。
【００８８】
実施例６：固体器官中のＰｒＰｒｅｓの検出
１．サンプル
使用サンプルは、
ｉ）ウェスタンブロット法による脳組織中のＰｒＰｒｅｓの研究を含む従来の参照方法により、プリオン病に感染あるいは非感染であることが確認された、陽性あるいは陰性のウシ由来の脳サンプル、及び、
ｉｉ）既にスクレーピーのマウス適合種を接種（Ｉ／Ｃ）し、病気に特徴的な兆候を示しているマウスから採取した脳及び脾臓サンプル、
である。これらのサンプルは、ＡＦＳＳＡ（Ａｇｅｎｃｅ  Ｆｒａｎｃａｉｓｅ  ｄｅ  Ｓｅｃｕｒｉｔｅ  Ｓａｎｉｔａｉｒｅ  ｄｅｓ  Ａｌｉｍｅｎｔｓ）［Ｆｒｅｎｃｈ  ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｓａｆｅｔｙ］、リヨン、フランスより供給された。これらを実施例１の２．に示したように処置した。
【００８９】
２．ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ法による固体器官中のＰｒＰｒｅｓの検出
実施例３の２．に記載のプロトコルを再現した。
【００９０】
３．結果
固体器官の同一サンプルでの、参照ウェスタンブロット法により得た結果と、本発明の方法により得た結果を比較した。ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ法による、脳調整時のストレプトマイシンの使用、及び、カリックスアレーンの使用の両方を組み合わせた本発明の方法を使用することにより、全ての陽性サンプル中でのＰｒＰｒｅｓの検出が可能であることを結果は証明している。本発明の方法を使用することにより、スクレーピーのマウス適合種を接種したマウスから採取した脳及び脾臓中のＰｒＰｒｅｓの検出も可能である。
【００９１】
実施例７：ヒトの漿液及び血漿中のＰｒＰｒｅｓの検出
１．サンプル
使用サンプルは、従来の参照方法により、クロイツフェルト・ヤコブ病に感染あるいは非感染であることが確認された、陽性あるいは陰性患者から採取した漿液及び血漿である。
【００９２】
２．ＥＬＩＳＡ−ｔｙｐｅ法による漿液及び血漿中のＰｒＰｒｅｓの検出
前記実施例３の２．に記載のプロトコルを、検知抗体として、前記抗体ＡＣ２３、又は、抗体８Ｄ１１Ｇ１２（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，フランス）のいずれかを使用して再現した。
【００９３】
３．結果
結果を図３に示す。図３は、本発明の方法によって、２つの異なる検知抗体を使用した、クロイツフェルト・ヤコブ病に関して陽性（ＣＪＤ＋）、あるいは、陰性（ＣＪＤ−）のヒトの漿液及び血漿サンプル中のＰｒＰｒｅｓ検出後に得られたＯＤ値のグラフである。驚くべきことに、本発明の方法により、ＣＪＤに感染した患者の漿液及び血漿中のＰｒＰｒｅｓを特異的に検出することが可能であることを図３は証明している。従って、本発明の方法はヒトにも適用可能である。
【００９４】
実施例８：少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する様々な分子の使用
１．サンプルの調整
試験サンプルは、以下に示すようにＢＳＥ陽性ウシの脳ホモジェネートから調整した。
・１μｇのプロテイナーゼＫを、５％グルコース溶液中で懸濁したＢＳＥ陽性ウシの脳の１０％ホモジェネート１００μｌに添加し、その後３７℃で１時間培養した。
・１００μｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をその後添加し、混合物を渦状に混ぜ、１００℃で５分間加熱し、１２，０００回転で５分間遠心分離を行い、上清を回収した。この懸濁液５，６，８，１０あるいは５０μｌ（２５０，３００，４００，５００あるいは２５００μｇのウシの組織に対応）を、少なくとも一つの正電荷及び／又は少なくとも一つのグリコシド結合を有する分子を添加又は非添加の状態で、以下に示す実験用として使用した。
【００９５】
２．ウェスタンブロット法
Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（１９７０），６８０−６８５に記載のように、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）存在下、１次元の１５％ポリアクリルアミド電気泳働ゲル上を移行後、タンパク質を電気泳働によりニトロセルロース膜上に移し、室温で６０分間、アミノ酸１４６−１６０からなるプリオンタンパク質に特異的なエピトープを認識する単クローン性抗体（ＳｐｉＢｉｏ社製、フランス）と共に免疫ブロットする。補助検出抗体（１／５０００）は、ホースラディシュ  ペルオキシダーゼ（ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ）に結合したマウス免疫グロブリンＨ及びＬ鎖に対して割り当てられたヤギ抗体である。ブロットをその後洗浄し、シグナルをフィルム（Ｂｉｏｍｅｘ、Ｋｏｄａｋ社製）上でＥＣＬキット（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）バイオサイエンス社製）と共に、あるいは、ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｕｌｔｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）及びＦｌｕｏｒ  Ｓ．Ｍｕｌｔｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）上での可視化のいずれかと共に化学ルミネセンスにより検出する。
【００９６】
３．ジヒドロストレプトマイシンセスキスルフェートを使用したＰｒＰｓｃの検出
この分子は、２つのグアニジウム官能基と１つのアンモニウム官能基を有する分子である。ジヒドロストレプトマイシンセスキスルフェートの濃縮物（０，２．５，５あるいは１０ｍｇ）、又は、比較としてストレプトマイシンの濃縮物を、前記１．で調整したサンプル中の一定量のＰｒＰｓｃ（５０μｌ）に添加した。３７℃で１時間培養後、１２，０００回転で５分間、遠心分離を実施し、上清（出発上清）を回収した。ペレットも回収し、５０μｌの８Ｍウレア溶液（ｖ／ｖ）及び５０μｌのＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をペレットに添加する。渦状に激しく攪拌後、それらを１００℃で５分間加熱し、１２，０００回転で５分間遠心分離を行う。最後に上清（ペレット上清）を回収した。出発上清及びペレット上清を、前記２．に示したＳＤＳ  ＰＡＧＥ上で移行した。この試験結果を図４に示す。図４は、移行後得られた電気泳働ゲルの図表示であり、その中で１−１５レーンは、ストレプトマイシン系分子の存在下又は非存在下、下記表２で示す処置条件に対応する。
【００９７】
【表２】
2007520704.tif 000008
【００９８】
図４に示すように、試験分子の非存在下では、上清中にある全てのＰｒＰｓｃバンドは特定され、ストレプトマイシン又はジヒドロストレプトマイシンセスキスルフェート存在下では、ＰｒＰｓｃ物質はペレット中で検出される。ストレプトマイシンのように、媒体に添加されるジヒドロストレプトマイシンセスキスルフェートは、ＰｒＰの架橋を引き起し、簡単な遠心分離（超遠心分離の必要が無い）で完全なＰｒＰの沈殿を与えることが、結果から示されている。そのようにして得られた凝集体は、適切な場合には、本発明の方法によるタンパク質リガンド以外のリガンドとの反応後にＰｒＰの検出を可能とする。
【００９９】
４．トリエチレンテトラアミン（ＴＥＴ）を使用したＰｒＰｓｃの検出
この分子は、４つのアンモニウム官能基を有する分子である。この実験のために、ＴＥＴの濃縮物（１０５，２１０，４２０，６３０あるいは８４０μｇ）を前記１．により調整したＢＳＥに感染したウシ科動物の脳２５０μｇから得た一定量（５μｌ）のＰｒＰｓｃに添加した。混合物を即座に１２，０００回転で５分間遠心分離を行い、上清をウェスタンブロットによる免疫検出に使用した。この試験結果を図５に示す。図５は、移行後得られた電気泳働ゲルの図表示であり、その中で１−７レーンは、ＴＥＴ存在あるいは非存在下での、下記表３で示す処置条件に対応する。
【０１００】
【表３】
2007520704.tif 000009
【０１０１】
図５の結果が示すように、１０５，２１０，４２０，６３０あるいは８４０μｇの添加によって、媒体中のトリエチレンテトラアミンの量が増加すると、分子無しのコントロールと比較して、自発的にプリオンタンパク質の分子量の増加が引き起こされる。従って、プリオンタンパク質の検出は、トリエチレンテトラアミンの添加量に比例する。試験の条件下において、ＴＥＴはストレプトマイシンのＰｒＰへの効果と同様の効果をもたらす、すなわち、ＰｒＰの架橋がＴＥＴ添加量に比例することが、アクリルアミドゲル中で移行したバンドの見掛け分子量の増加により具体化される、ということがこれらの結果により実証される。
【０１０２】
５．ビス−３−アミノプロピルアミンを使用したＰｒＰｓｃの検出
この分子は、３つのアンモニウム官能基を有する分子である。ビス−３−アミノプロピルアミン（１３０，２６０，５２０，７８０あるいは１０４０μｇ）を、前記１．で調整したサンプル中の一定量（５μｌ）のＰｒＰｓｃに添加し、混合物を室温で３０分間培養した以外は、前記３．と同様の手順を再現した。この結果を図６に示す。図６は、ペレット上清の移行後得られた電気泳働ゲルの図表示であり、その中でいくつかのレーン１−７は、ビス−３−アミノプロピルアミン存在下あるいは非存在下での、下記表４で示す処置条件に対応する。
【０１０３】
【表４】
2007520704.tif 000010
【０１０４】
図６の結果が示すように、１３０，２６０，５２０，７８０あるいは１０４０μｇの添加によって、媒体中のビス−３−アミノプロピルアミンの量が増加すると、分子無しのコントロールと比較して、３つのプリオンタンパク質バンドの、見かけ上の分子量の増加が引き起こされる。これらの条件下、前記４．で言及した遠心分離条件においてプリオンタンパク質は沈殿する。これは、ストレプトマイシンによりもたらされる効果と類似の効果についても確証するものである。
【０１０５】
６．結論
媒体に添加される試験分子により、ＰｒＰの架橋が引き起こされ、これにより簡単な遠心分離で完全なるＰｒＰの沈殿が可能となることを結果が示している。そのようにして得られた凝集体は、適切な場合には、本発明の方法によるタンパク質リガンド以外のリガンドとの反応後、ＰｒＰの検出を可能とする。
【０１０６】
実施例９：カリックスアレーンＣ６Ｓ及びストレプトマイシンでサンプルを処理することによるウェスタンブロット法を用いたウシの脳内におけるＰｒＰｒｅｓの検出
使用サンプルは、ウェスタンブロットによる脳組織中のＰｒＰｒｅｓの研究を含む従来の参照方法により、プリオン病に感染していることが確認された、陽性のウシ科動物由来の脳サンプルである。最初に、５％（ｗ／ｖ）グルコース溶液中で器官を均質化し、１０％懸濁液を得る。１μｌの０．１ＭカリックスアレーンＣ６Ｓ溶液を、１００μｌの前記均質化溶液に添加し、その後混合物を渦状に混ぜて、３７℃で１時間培養する。７μｌの２ｍｇ／ｌプロテイナーゼＫ（ＰＫ）溶液を添加し、混合物を渦状に混ぜて、３７℃で３０分間培養する。濃度の異なる（５％，１０％あるいは２０％）ストレプトマイシンスルフェートを含む２０μｌの溶液を添加し、混合物を攪拌し、その後３７℃で１時間再培養する。１００μｌの変性Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を添加後、混合物を１００℃で５分間加熱し、１２，０００ｒｐｍで５分間、遠心分離を行う。上清を廃棄し、ペレットを回収する。５０μｌの８Ｍウレア溶液（５０％ｖ／ｖ）及びＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をペレットに添加する。渦状に激しく攪拌後、混合物を１００℃で５分間加熱し、１２，０００回転で５分間遠心分離を行い、その後上清を回収し、Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ２２７（１９７０），６８０−６８５に記載されたように、それらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に移行する。移行後、タンパク質を電気泳働によりニトロセルロース膜上に移し、周囲の温度で６０分間、アミノ酸１２６−１６０からなる特定のエピトープを認識する単クローン性抗体（ＳｐｉＢｉｏ社製、フランス）と共に免疫ブロットする。補助抗体（１／５０００）は、ホースラディシュ  ペルオキシダーゼ（ＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ）に結合したマウス免疫グロブリンＨ及びＬ鎖に対して割り当てられたヤギ抗体である。ブロットをその後洗浄し、シグナルをフィルム（Ｂｉｏｍｅｘ、Ｋｏｄａｋ社製）上でＥＣＬキット（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）バイオサイエンス社製）と共に、あるいは、ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｕｌｔｒａ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）及びＦｌｕｏｒ  Ｓ．Ｍｕｌｔｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社製）上での可視化のいずれかと共に化学ルミネセンスにより検出する。
【０１０７】
結果を図７に示す。ここで、レーン１−３は、カリックスアレーン及びストレプトマイシンで処理していないコントロールサンプルに対応し、レーン４−６はカリックスアレーン単独で処理（前記手順による処理であるが、ストレプトマイシンでの処理段階は含まない）したサンプルに対応し、レーン７−１５はカリックスアレーンで処理し、その後５％（レーン７−９）、１０％（レーン１０−１２）あるいは２０％（レーン１３−１５）の比率においてストレプトマイシンで処理したサンプルに対応する。結果が証明するように、カリックスアレーンとストレプトマイシンを共に使用すると、ＰｒＰｒｅｓの検出が改善し、この方法の感度は使用するストレプトマイシンの量とともに増大する。
【０１０８】
実施例１０：ヘパリン及びストレプトマイシンでサンプルを処理することによるウェスタンブロット法を用いた生体液中におけるＰｒＰｒｅｓの検出
１．サンプル
１．１：陽性あるいは陰性標準生成のための脾臓抽出物の調整
新変異型クロイツフェルト・ヤコブ病で死亡した患者の脾臓の剖検サンプル、あるいは、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）に感染していない患者の脾臓の剖検サンプルから、脾臓抽出物を調整した。まず、リーシス緩衝液（０．５％  ＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０）＋０．５％  ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム））中で脾臓サンプルを均質化し、１０％懸濁液を得た。そのようにして得たホモジェネートを、その後５００ｇで５分間遠心分離を行い、細胞残骸を除去した。上清は、血液サンプルをオーバーロードするために保存した。
１．２：血液サンプルの処置
クロイツフェルト・ヤコブ病に感染していない患者（正常ドナー）から採取し、グリコサミノグリカン、この場合はヘパリン（そのリチウム塩の状態）と接触させた、いくつかの血液のプールを調整する。
１．３：陽性あるいは陰性標準でオーバーロードしたサンプルの生成及び処置
１．３．１：オーバーローディング
ヘパリンで予め処置した血液のプールをいくつかのアリコットに分配し、下記表５で示す量に従って、ＣＪＤ陽性あるいは陰性の脾臓ホモジェネート（１％，５％あるいは１０％）で、各々のアリコットをオーバーロードした。
【０１０９】
【表５】
2007520704.tif 000011
【０１１０】
１．３．２：プロテイナーゼＫでの分解
オーバーロード後、０−３００μｇ／ｍｌの最終濃度（２５０μｌのサンプル中、０−５０−１００−２００あるいは３００μｇ／ｍｌ）であるプロテイナーゼＫ（ＰＫ）でサンプルを分解した。渦状に混ぜた後、培養器中、３７℃で３０分間サンプルを培養した。
１．３．３：ストレプトマイシンとの培養
２５μｌの１ｇ／ｍｌ（蒸留水中）のストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ社製）を、その後混合物に添加し（最終濃度２００ｍｇ／ｍｌ）、それから渦状に混ぜて均質化した後、培養器中、３７℃で６０分間、サンプルを培養した。
１．３．４：ウェスタンブロット法のための調整
培養後、サンプルを１５，０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離を行い、上清を除去した。ペレットを５０μｌのＳＤＳ変性緩衝液中で再溶解し、１００℃で１０分間加熱後、サンプルを１２，０００ｒｐｍで５分間、再度遠心分離を行った。上清をウェスタンブロット法による分析用に採取した。
【０１１１】
２．ウェスタンブロット法によるオーバーロードした血液中のＰｒＰｒｅｓの検出
２．１：電気泳働及び移行
１５μｌの各々の上清を１２％のビストリスアクリルアミドゲル（ＮｕＰａｇｅ、インビトロジェン社製）にロードした。２００ボルトで４５分間、移行を実施し、その後、２１ボルト、１１０ミリアンペア、２ワットで１時間、半乾燥システム（グラファイト電極）を使用して、タンパク質を再水和したＰＶＤＦ膜上に移す。
２．２：免疫可視化
その後、膜を以下の段階に沿って処置した。
・ＰＢＳ−０．０５％ツイーン（ＰＢＳＴ）＋５％ミルク中での膜の飽和、
・＋（２−８）℃での一晩培養、
・ＰＢＳＴ中での膜のすすぎ、
・０．２μｇ／ｍｌ、ＰＢＳＴ中で使用される主抗体：３Ｆ４（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ，９６２０．１０３）の添加、
・周囲の温度（ＡＴ）での１時間の培養、
・ＰＢＳＴ中での洗浄、
・ＰＢＳＴ中１／２０，０００に希釈状態で使用される第２抗体：ペルオキシダーゼ−連結  抗マウス（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ）（Ｊａｃｋｓｏｎ社製、１１５−０３５−０６２）の添加、
・周囲の温度での３０分間の培養、
・ＰＢＳＴ中での洗浄、
・ＰＢＳ中、ｐＨ７．２での洗浄、
・オートラジオグラフィック物質（ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ社製）の含浸、
・写真現像。
【０１１２】
３．結果
結果を図８−１０に示す。図８は、１％のＣＪＤ＋あるいはＣＪＤ−脾臓ホモジェネートでオーバーロードした正常サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図８Ｂ）の図表示（図８Ａ）であり、図９は、５％のＣＪＤ＋あるいはＣＪＤ−脾臓ホモジェネートでオーバーロードした正常サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図９Ｂ）の図表示（図９Ａ）であり、図１０は、１０％のＣＪＤ＋あるいはＣＪＤ−脾臓ホモジェネートでオーバーロードした正常サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図１０Ｂ）の図表示（図１０Ａ）である。これらのゲルにおいて、レーン１−５及び８−１２のサンプルは下記表６に示す特性を有する。６レーンは分子量マーカーレーンに対応し、７レーンは、クロイツフェルト・ヤコブ病で死亡した患者の脳抽出物から採取し、ＣＪＤの確実な分解のために決まって使用される参照方法（Ｍａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，２８：３５３−３６２）に従って調整した陽性コントロールサンプルに対応する。
【０１１３】
【表６】
2007520704.tif 000012
【０１１４】
結果が実証するように、ＣＪＤ陽性脾臓ホモジェネートでオーバーロードした血液サンプル中で、オーバーロード後の密度がどのようなものであっても、プロテイナーゼＫ抵抗バンドを示す。実際、（ＣＪＤ（−）脾臓でオーバーロードした）陰性サンプルに対するプロテイナーゼＫの濃度が１００μｇ／ｍｌ以上では、このバンドは消失する一方で、陽性サンプルでは、それに対するプロテイナーゼＫの濃度がどのようなものであっても、このバンドは残存する。従って、ヘパリン及びストレプトマイシンの使用を組み合わせた試験の実現により、血液サンプル中のリンパ起源（脾臓）のＰｒＰｒｅｓ検出の感度及び特定が確証される。これは、神経侵害段階及び／又は最初の病気の臨床兆候前に採取した、病原性プリオン（ＰｒＰｓｃ）で汚染された個体血液中のＰｒＰｒｅｓの検出用に試験が実施される、生理病理学的状況に良く対応する。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
正常なキャリアー及び／又は無症状段階にある、汚染された個体からの献血のスクリーニングを公衆衛生の観点から使用できる。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】本発明の方法によって、陽性（＋）あるいは陰性（−）であるマウスの漿液、ヒツジの漿液及びウシの血漿サンプル中におけるＰｒＰｒｅｓ検出後に得られたＯＤ値のグラフ。
【図２】本発明の方法によって、２つの異なる検知抗体を使用した、陽性（血漿＋）あるいは陰性（血漿−）であるウシの血漿サンプル中におけるＰｒＰｒｅｓ検出後に得られたＯＤ値のグラフ。
【図３】本発明の方法によって、２つの異なる検知抗体を使用した、クロイツフェルト・ヤコブ病に関して陽性（ＣＪＤ＋）、あるいは、陰性（ＣＪＤ−）のヒトの漿液及び血漿サンプル中のＰｒＰｒｅｓ検出後に得られたＯＤ値のグラフ。
【図４】ストレプトマイシンセスキスルフェート（５−７レーン及び１３−１５レーン）、あるいは、ストレプトマイシン（２−４レーン及び１０−１２レーン）のどちらかで処理したＢＳＥ感染したウシの脳サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図４Ｂ）の図表（図４Ａ）、１及び９レーンは未処置のコントロールに対応し、８レーンは分子量マーカーレーンに対応する。
【図５】トリエチレンテトラアミンの増加量（２−６レーン）で処理した、ＢＳＥ感染したウシの脳サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図５Ｂ）の図表示（図５Ａ）、１レーンは未処置のコントロールに対応し、８レーンは分子量マーカーレーンに対応する。
【図６】ビス−３−アミノプロピルアミンの増加量（３−７レーン）で処理した、ＢＳＥ感染したウシの脳サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図６Ｂ）の図表示（図６Ａ）、２レーンは未処置のコントロールに対応し、１レーンは分子量マーカーレーンに対応する。
【図７】ストレプトマイシン及びカリックスアレーン  ｐ−スルフォナト−３，７−（２−アミノ−エチロキシ）カリックス−［６］−アレーン（７−１５レーン）で処理した、ＢＳＥ感染したウシの脳サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図７Ｂ）の図表示（図７Ａ）、１−３レーンはストレプトマイシン又はカリックスアレーン未添加のコントロールサンプルに対応し、４−６レーンはカリックスアレーンのみ添加したサンプルに対応する。
【図８】クロイツフェルト・ヤコブ病に対し陽性あるいは陰性（それぞれ、ＣＪＤ＋、あるいは、ＣＪＤ−）の１％脾臓ホモジェネートでオーバーロードし、ストレプトマイシン及びヘパリン（１−５レーン：ＣＪＤ＋、８−１２レーン：ＣＪＤ−）で処置した、正常なヒトの血液（あるいはクロイツフェルト・ヤコブ病に対し陰性）サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図８Ｂ）の図表示（図８Ａ）、６レーンは分子量マーカーレーンに対応し、７レーンは陽性コントロールサンプルに対応する。
【図９】クロイツフェルト・ヤコブ病に対し陽性あるいは陰性（それぞれ、ＣＪＤ＋、あるいは、ＣＪＤ−）の５％脾臓ホモジェネートでオーバーロードし、ストレプトマイシン及びヘパリン（１−５レーン：ＣＪＤ＋、８−１２レーン：ＣＪＤ−）で処置した、正常なヒトの血液サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット法後の電気泳働ゲル（図９Ｂ）の図表示（図９Ａ）、６レーンは分子量マーカーレーンに対応し、７レーンは陽性コントロールサンプルに対応する。
【図１０】クロイツフェルト・ヤコブ病に対し陽性あるいは陰性（それぞれ、ＣＪＤ＋、あるいは、ＣＪＤ−）の１０％脾臓ホモジェネートでオーバーロードし、ストレプトマイシン及びヘパリン（１−５レーン：ＣＪＤ＋、８−１２レーン：ＣＪＤ−）で処置した、正常なヒトの血液サンプルの移行後に得られたウェスタンブロット後の電気泳働ゲル（図１０Ｂ）の図表示（図１０Ａ）、６レーンは分子量マーカーレーンに対応し、７レーンは陽性コントロールサンプルに対応する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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