(57)【要約】  本発明は、Ａｎｇ−２に結合する特異的ペプチドに関する。また、本発明は、前記ペプチドを含むペプチボディー、そのようなペプチド及びペプチボディーを作製する方法、及び前記ペプチド及びペプチボディーを使用した治療方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、およびこの生理学的に許容可能な塩を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、アミノ酸配列：
【化１】
2007524610.tif 000094
を含み、前記ペプチドが、長さにして、約５から約５０アミノ酸である、方法。
【請求項２】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、アミノ酸配列：
【化２】
2007524610.tif 000095
およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、アミノ酸配列：
【化３】
2007524610.tif 000096
（式中ｚ２が、酸性または中性極性アミノ酸残基である。）、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、アミノ酸配列：
【化４】
2007524610.tif 000097
（式中ｚ２が、酸性または中性極性アミノ酸残基である。）、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、アミノ酸配列：
【化５】
2007524610.tif 000098
（式中ａ１、ａ２およびａ３が、それぞれ独立してアミノ酸残基であり、
ａ５がアミノ酸残基であり、
ａ１２が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ａ１３が存在しないか、中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基であり、
ａ１４が、中性疎水性または中性極性アミノ酸残基である。）、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ａ１がＶ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり、
ａ２がＶ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり、
ａ３がＡ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、ＫまたはＨであり、
ａ５がＡ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、ＤまたはＥであり、
ａ１２がＳ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、ＫまたはＲであり、
ａ１３がＬ、ＴまたはＨであり、
ａ１４がＶ、Ｌ、Ｉ、ＷまたはＭであり、
であり、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ａ１がＱであり、
ａ２はＥであり、
ａ３がＥであり、
ａ５はＤまたがＥであり、
ａ１２はＤまたがＥであり、
ａ１３はＨであり；および
ａ１４がＭであり、
であり、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号４および配列番号７６から配列番号１１８（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、およびこの生理学的に許容可能な塩を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、以下の式のアミノ酸配列：
【化６】
2007524610.tif 000099
を含み、式中、
ｃ２が、中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ４がＡ、ＤまたはＥであり、
ｃ６が、酸性アミノ酸残基であり、
ｃ７が、アミノ酸残基であり、
ｃ８が中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基である、前記方法。
【請求項１０】
式中ｃ２がＬまたはＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
式中ｃ６が、ＤまたはＥである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、以下の式のアミノ酸配列、およびこの生理学的に許容可能な塩を含み、
【化７】
2007524610.tif 000100
式中、
ｄ１が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ｄ２が存在しないか、中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ３が存在しないか、または中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｄ４が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ｄ６が、中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｄ８がＡ、ＤまたはＥであり、
ｄ１０が、酸性アミノ酸残基であり、
ｄ１１がアミノ酸残基であり、
ｄ１２が中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ１５が、存在しないか、中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ１６が存在しないか、または中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ１７が存在しないか、中性疎水性、または中性極性アミノ酸残基であり、
ｄ１８が存在しないか、または中性疎水性、または中性極性アミノ酸残基であり、
ｄ１９が存在しないか、または中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ２０が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ｄ２１が存在しないか、または中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ２２が存在しないか、または中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基である、
請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ｄ１がＴ、Ｓ、Ｑ、ＲまたはＨであり、
ｄ２がＴ、Ｑ、ＮまたはＫであり、
ｄ３がＦであり、
ｄ４がＭ、Ｑ、ＥまたはＫであり、
ｄ６がＬまたはＭであり、
ｄ８がＤまたはＥであり、
ｄ１０がＥであり、
ｄ１１がＱまたはＥであり、
ｄ１２がＴまたはＲであり、
ｄ１５Ｙ、Ｄ、ＥまたはＫであり、
ｄ１６がＱであり、
ｄ１７がＷまたはＦであり、
ｄ１８がＬ、Ｉ、ＭまたはＴであり、
ｄ１９がＬ、ＦまたはＹであり、
ｄ２０がＱ、ＤまたはＥであり、
ｄ２１が存在しないか、ＱまたはＨであり、
ｄ２２が存在しないか、Ａ、Ｌ、Ｇ、ＳまたはＲであり、
であり、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号６および配列番号１１９から配列番号１４２（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、以下の式のアミノ酸配列：
【化８】
2007524610.tif 000101
を含み、式中、ｅ３が中性極性アミノ酸残基であり、
ｅ４が酸性アミノ酸残基であり、
ｅ５が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｅ６が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｅ７が中性疎水性アミノ酸残基であり、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項１６】
式中ｅ３がＹまたはＣである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
式中ｅ４がＤまたはＥである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
式中ｅ６がＩまたはＭである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、以下の式
【化９】
2007524610.tif 000102
のアミノ酸配列を含み、
式中、
ｆ１が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ２が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ３が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｆ４が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ７が中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ８が酸性アミノ酸残基であり、
ｆ９が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｆ１０が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｆ１１が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｆ１３が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１４が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１５が中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１６が中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１７が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｆ１８が中性疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｆ１９が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、および
ｆ２０が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基である、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
ｆ１がＳ、ＡまたはＧであり、
ｆ２がＧ、ＱまたはＰであり、
ｆ３がＱ、ＧまたはＤであり、
ｆ４がＬ、ＭまたはＱであり、
ｆ７がＣまたはＹであり、
ｆ８がＥまたはＤであり、
ｆ９がＥ、ＧまたはＤであり、
ｆ１０がＩまたはＭであり、
ｆ１１がＦまたはＬであり、
ｆ１３がＣまたはＷであり、
ｆ１４がＧまたはＰであり、
ｆ１５ＴまたはＮであり、
ｆ１６がＱ、ＹまたはＫであり、
ｆ１７がＮ、ＤまたはＱであり、
ｆ１８がＬ、Ｖ、ＷまたはＲであり、
ｆ１９がＡ、Ｑ、ＹまたはＩであり；および
ｆ２０がＬ、Ａ、ＧまたはＶであり、
であり、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号３および配列番号１４３から配列番号１４８（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、以下の式のアミノ酸配列：
【化１０】
2007524610.tif 000103
を含み、式中、
ｇ２が酸性アミノ酸残基であり、
ｇ４が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｇ５がＥ、ＤまたはＱであり、
ｇ１０が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｇ１３が酸性残基である、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む方法。
【請求項２３】
ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、以下の式
【化１１】
2007524610.tif 000104
のアミノ酸配列を含み、
式中、
ｈ１が存在しないか、中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｈ２が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｈ３が酸性アミノ酸残基であり、
ｈ４が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｈ６が酸性アミノ酸残基であり、
ｈ８が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ９がＥ、ＤまたはＱであり、
ｈ１４が、中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｈ１７が酸性アミノ酸残基であり、
ｈ１８が中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸残基であり、
ｈ１９が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、および
ｈ２０が存在しないか、またはアミノ酸残基である、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｈ１は存在しないか、またはＡ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、ＫまたはＨであり、
ｈ２はＬ、ＦまたはＱであり、
ｈ３はＤまたはＥであり、
ｈ４はＷまたはＹであり、
ｈ６はＤまたはＥであり、
ｈ８はＶまたはＭであり、
ｈ１４はＦまたはＱであり、
ｈ１７はＤまたはＥであり、
ｈ１８はＭ、Ｙ、ＮまたはＫであり、
ｈ１９はＬまたはＱであり；および
ｈ２０は存在しないか、またはＭ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、ＫまたはＲであり、
であり、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号５および配列番号１４９から配列番号１５７（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含み、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物、およびこの多量体を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、少なくとも１つのａおよびｂが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して、０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つまたはそれ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９のアミノ酸配列を有するペプチド、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、方法。
【請求項２７】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、式
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物、およびこの多量体を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、少なくとも１つのａおよびｂが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して、０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つまたはそれ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して、配列番号７１および７２のアミノ酸配列を有するペプチド、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、前記方法。
【請求項２８】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物、およびこの多量体を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、少なくとも１つのａおよびｂが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して、０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つまたはそれ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して、配列番号７３および配列番号７４のアミノ酸配列を有するペプチド、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、方法。
【請求項２９】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物、およびこの多量体を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、少なくとも１つのａおよびｂが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して、０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つまたはそれ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して、配列番号７５および配列番号１５８のアミノ酸配列を有するペプチド、およびこの生理学的に許容可能な塩を含む、方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの抗炎症性薬剤を投与することをさらに含む、請求項１から８、請求項９から１４、請求項１５から２１、請求項２２から２５または請求項２６から２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗炎症性薬剤が、少なくとも１つのＤＭＡＲＤ、ＳＡＡＲＤおよびＮＳＡＩＤを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗炎症性薬剤が、少なくとも１つのメトトレキサート、ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤およびＰ−３８阻害剤を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＴＮＦ阻害剤が、少なくとも１つのエタネルセプト、アダリムマブ、ペグスネルセプトｓＴＮＦ−Ｒ１、オネルセプトおよびインフリキシマブを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＩＬ−１阻害剤が、少なくとも１つのアナキヌラ、ＩＬ−１  ＴＲＡＰ、ＩＬ−１抗体および可溶性ＩＬ−１レセプターである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記投与が、同時投与である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与が、非同時投与である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号４および配列番号２５で列記されたアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３８】
処置を必要とする患者に、治療的に効果的な量の、Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号１２４、１２６または１３７で列記されたアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３９】
さらに、少なくとも１つの抗炎症性薬剤を投与することを含む、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記投与が、同時投与である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記投与が、非同時投与である、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００２年９月２７日出願の米国特許仮出願第６０／４１４，１５５号及び２００１年１０月１１日出願の米国特許仮出願第６０／３２８，６２４号に対する優先権を主張する、２００２年１０月１０日出願の米国特許仮出願第１０／２６９，６９５号に対する優先権を主張するものである（これらは全てその全体が参照により、本明細書に組み込まれる。）。
【０００２】
本発明は、アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）を認識し結合する特異的な結合物質に関連する。より具体的には、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する、前記特異的結合物質及びその断片の産生、診断での使用及び治療での使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
既存の血管からの新しい血管の形成である血管新生は、多くの生理的及び病的過程にとって不可欠である。通常、血管新生はプロ血管新生因子及び抗血管新生因子によって厳密に調節されているが、癌、眼血管新生疾患、関節炎及び乾癬等の疾患の場合には、その過程が逸脱してしまうことがある。Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１：２７−３１（１９９５）。
【０００４】
血管新生は、関節リウマチにおける炎症組織の拡大（パンヌス）を維持するのに重要な役割を果たすと考えられている（Ｗａｌｓｈら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．，３：１４７−１５３（２００１））。実際、制御不能又は望ましくない血管新生を伴うことが知られる疾患は多い。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２４９−２５７（２０００）参照。
【０００５】
そのような疾患には、これらに限定されないが、網膜症（糖尿病性網膜症を含む。）加齢性黄斑変性等の眼血管新生疾患、乾癬、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、リウマチ様又はリウマチ性炎症性疾患等の炎症性疾患、特に関節炎（関節リウマチを含む）又は慢性喘息、動脈又は移植後アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症等の他の慢性炎症性疾患及び新生物性疾患、例えばいわゆる固形腫瘍及び液性（又は造血系）腫瘍（白血病及びリンパ腫等）が含まれる。望ましくない血管新生に関連する他の疾患は、当業者にとって明白である。
【０００６】
多くのシグナル伝達系が血管新生の調節に関連するが、最も広く特徴が分かっており且つ最も内皮細胞選択的な系には、Ｔｉｅ−２受容体チロシンキナーゼ（「Ｔｉｅ−２」又は「Ｔｉｅ−２Ｒ」（「ＯＲＫ」とも呼ばれる。）と呼ばれる；マウスＴｉｅ−２は「ｔｅｋ」とも呼ばれる。）及びそのリガンドであるアンジオポエチンが含まれる（Ｇａｌｅｓ，Ｎ．Ｗ．及びＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ，Ｇ．Ｄ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１０５５−１０６６［１９９９］）。アンジオポエチン−１（「Ａｎｇ−１」）からアンジオポエチン−４（「Ａｎｇ−４」）まで、４種類の既知のアンジオポエチンが存在する。これらのアンジオポエチンは「Ｔｉｅ−２リガンド」とも呼ばれる。（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−１１６９［１９９６］；Ｇｒｏｓｉｏｓ，Ｋ．ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，８４：１１８−１２０［１９９９］；Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［１９９９］；Ｋｏｂｌｉｚｅｋ，Ｔ．Ｉ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，８：５２９−５３２［１９９８］；Ｌｉｎ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：５５−６０［１９９７］；Ｐａｐａｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．ら、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ，７９：２１３−２２３［１９９９］；Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３７５：７０−７４［１９９８］；Ｓｈｙｕ，Ｋ．Ｇ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２０８１−２０８７［１９９８］；Ｓｕｒｉ，Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ，８７：１１７１―１１８０［１９９６］；Ｓｕｒｉ，Ｃ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２：４６８―４７１［１９９８］；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＵＳＡ，９６：１９０４−１９０９［１９９９］；Ｗｉｔｚｅｒｎｂｉｃｈｌｅｒ，Ｂ．ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２７３：１８５１４−１８５２１［１９９８］）。Ａｎｇ−１のＴｉｅ−２への結合は培養内皮細胞における受容体リン酸化を刺激するが、Ａｎｇ−２は、Ｔｉｅ−２受容体リン酸化の活性化及び拮抗の両方が認められている（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．ら、［１９９６］、前出；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、［１９９７］、前出；Ｋｉｍ，Ｉ．，Ｊ．Ｈ．Ｋｉｍら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９（３９）：４５４９−４５５２（２０００）；Ｔｅｉｃｈｅｒｔ−Ｋｕｌｉｓｚｅｗｓｋａ，Ｋ．，Ｐ．Ｃ．Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４９（３）：６５９−７０（２００１））。
【０００７】
Ｔｉｅ−２ノックアウトマウス及びＡｎｇ−１ノックアウトマウスの表現型は類似しており、このことから、Ａｎｇ−１が刺激するＴｉｅ−２リン酸化が、内皮細胞−支持細胞接着を維持することにより、胎内おける発生中の脈管の再構築と安定化に介在することが示唆される（Ｄｕｍｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１８９７−１９０９［１９９４］；Ｓａｔｏ，Ｔ．Ｎ．ら、Ｎａｔｕｒｅ，３７６：７０−７４［１９９５］；Ｓｕｒｉ，Ｃ．ら、［１９９６］、前出）。脈管安定化におけるＡｎｇ−１の役割は成体において保たれていると思われ、成体においてＡｎｇ−１は広く且つ構成的に発現されている（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：４８−５０［１９９７］；Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．ら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１５９：３９１−４００［１９９９］）。これに対し、Ａｎｇ−２の発現は主として血管再構築の部位に限定され、そこでＡｎｇ−２はＡｎｇ−１の機能をブロックし、それによって血管新生を助ける血管可塑性の状態を誘導すると思われる（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．、［１９９７］、前出；Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：１９９４−１９９８［１９９９］；Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、［１９９７］、前出）。
【０００８】
血管新生に関連した疾患状態における血管選択的Ａｎｇ−２発現を明らかにしたという主旨の数多くの研究が公表されている。これらの病的状態には、例えば乾癬、黄斑変性及び癌が含まれる（Ｂｕｎｏｎｅ，Ｇ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５５：１９６７−１９７６［１９９９］；Ｅｔｏｈ，Ｔ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１：２１４５−２１５３［２００１］；Ｈａｎｇａｉ，Ｍ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４２：１６１７−１６２５［２００１］；Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ら、［１９９９］、前出；Ｋｕｒｏｄａ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１１６：７１３−７２０［２００１］；Ｏｔａｎｉ，Ａ．ら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ＆Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０：１９１２−１９２０［１９９９］；Ｓｔｒａｔｍａｎｎ，Ａ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１５３：１４５９−１４６６［１９９８］；Ｔａｎａｋａ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，１０３：３４−３４５［１９９９］；Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｙ．ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：１２２１−１２２５［１９９９］；Ｙｕａｎ，Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：１６５−１７１［２０００］；Ｚａｇｚａｇ，Ｄ．ら、［１９９９］、前出。）。これらの試験の大半が癌に焦点を合わせており、多くのタイプの腫瘍が血管Ａｎｇ−２発現を示すと思われる。病的血管新生におけるその発現と異なり、正常組織でのＡｎｇ−２発現は極めて限られている（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ，Ｐ．Ｃ．ら、［１９９７］、前出；Ｍｅｚｑｕｉｔａ，Ｊ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６０：４９２−４９８［１９９１］）。健常成人では、血管新生の３つの主要部位は卵巣、胎盤及び子宮である；これらは、Ａｎｇ−２ｍＲＮＡが検出される正常（すなわち非癌性）組織の中の主要組織である。
【０００９】
一部の機能研究により、Ａｎｇ−２が腫瘍血管新生に関与することが示唆されている。Ａｈｍａｄら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１：１２５５−１２５９［２００１］）はＡｎｇ−２の過剰発現について述べており、その報告では、それがマウス異種移植モデルにおける腫瘍増殖の上昇に結びつくことを示している。Ａｎｇ−２の過剰発現と腫瘍の血管分布過多とを結びつけることを主旨とするデータを示す、Ｅｔｏｈら、前出及びＴａｎａｋａら、前出も参照のこと。しかし、一方で、Ｙｕら（Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈ．，１５８：５６３−５７０［２００１］）は、ルイス肺癌腫及びＴＡ３乳癌細胞におけるＡｎｇ−２の過剰発現により、対応する形質転換体を注入したマウスの生存が延長されたことを示すデータを報告している。
【００１０】
この数年間に、様々な公表文献が抗癌治療のための可能性のある標的としてＡｎｇ−１、Ａｎｇ−２及び／又はＴｉｅ−２を示唆してきた。例えば、米国特許第６，１６６，１８５号、５，６５０，４９０号及び５，８１４，４６４号はそれぞれ、抗Ｔｉｅ−２リガンド抗体及び受容体の概念を開示している。Ｌｉｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：８８２９−８８３４［１９９８］）は、可溶性Ｔｉｅ−２を発現するアデノウイルスをマウスに注入した；可溶性Ｔｉｅ−２は、報告によればマウスによって発現される腫瘍の数と大きさを低下させた。関連する試験では、Ｌｉｎら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：２０７２−２０７８［１９９７］は可溶性形態のＴｉｅ−２をラットに注入した；この化合物は、報告によればラットにおいて腫瘍の大きさを低下させた。Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５９：３１８５−３１８９［１９９９］）は、Ｔｉｅ−２の細胞外ドメインを発現するヒト黒色腫細胞株を作製し、これらの細胞株をヌードマウスに注入して、可溶性Ｔｉｅ−２により腫瘍増殖及び腫瘍血管新生が「顕著に阻害」されると結論した。この情報を考慮し、且つＡｎｇ−１とＡｎｇ−２の両方がＴｉｅ−２に結合すると仮定して、Ａｎｇ−１、Ａｎｇ−２又はＴｉｅ−２が抗癌治療のための魅力的な標的であるかどうかはこれらの試験から明らかになっていない。
【００１１】
その分子の半減期を改善するために、Ｉｇ定常領域等の安定な血漿タンパク質へある種のペプチドを融合させることについて、例えば、２０００年５月４日公開のＰＣＴ特許公開公報ＷＯ００／２４７８２号に記載されている。
【００１２】
その分子の半減期を向上させるために、Ｉｇ定常領域等の安定な血漿タンパク質へタンパク質又はその断片を融合させることについて、様々な文献に記述されている（例えば、米国特許第５，４８０，９８１号；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４：５５９０−５６００（１９９５）；Ｆｉｓｈｅｒら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）；Ｖａｎ  Ｚｅｅ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６：２２２１−２２３０（１９９６）；１９９８年９月１５日発行の米国特許第５，８０８，０２９号；Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｈａｒｖｉｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ．，１：９５−１０５（１９９５）；１９９７年７月３日公開のＷＯ９７／２３６１４号；１９９７年１２月１１日出願のＰＣＴ／ＵＳ９７／２３１８３号；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：５６１−５６９（１９９１）；１９９５年８月１０日公開のＷＯ９５／２１２５８号参照）。
【００１３】
大部分の固形腫瘍は直径１ｍｍから２ｍｍを超えて増殖するために血管新生を必要とするので、有効な抗Ａｎｇ−２治療は膨大な癌患者群に恩恵をもたらすことになろう。そのような治療は、網膜症、関節炎及び乾癬等の他の血管新生関連疾患においても、広く適用されると考えられる。
【００１４】
Ａｎｇ−２を特異的に認識し結合する新規薬剤を同定することが必要とされているが、十分に進んでいない。そのような薬剤は、Ａｎｇ−２活性に関連した疾患状態における診断スクリーニング及び治療処置のために有用である。
【００１５】
従って、Ａｎｇ−２活性を調節する、Ａｎｇ−２の特異的結合物質を提供することが本発明の目的である。本発明のそのような物質は、ペプチボディー、すなわち、そのペプチド部分がＡｎｇ−２に特異的に結合している、抗体のＦｃドメイン等の他の分子に融合したペプチドの形態をとる。
【００１６】
本明細書中で引用される全ての特許、特許明細書及び他の文書の開示は、本明細書により明確にそれらの全てが参考として援用される。
【００１７】
本発明の要約
本発明は、ある実施形態において、Ａｎｇ−２に結合するペプチド（本明細書中においてポリペプチドとも称する）を対象とする。また、そのようなペプチドの変異体及び誘導体も本発明に包含される。
【００１８】
別の実施形態において、本発明のペプチド及びその変異体及び誘導体はビヒクルに結合している。
【００１９】
別の実施形態において、該ペプチドはＦｃドメインに融合し得、それによってペプチボディーが得られ得る。場合によっては、該ペプチボディーは、例えば配列番号３から配列番号６、又は配列番号７６から配列番号１５７、ならびにそれらの変異体及び誘導体の少なくとも１個のペプチドを含む。さらに、該ペプチドは、配列番号６５から配列番号７５、及び配列番号１５８に示されている式に従った少なくとも１個のペプチドを含み得る。
【００２０】
さらに別の実施形態において、本発明は、前記特異的結合物質、及びその変異体及び誘導体をコードする核酸分子を提供する。
【００２１】
さらに別の実施形態において、本発明は、該ペプチボディー、ならびにその変異体及び誘導体をコードする核酸分子を提供する。場合によっては、そのような核酸分子は配列番号３３から配列番号５３を含む。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の特異的結合物質の有効量を、それを必要とする対象に投与することにより、腫瘍を低減する方法を提供する。本発明はまた、本発明の特異的結合物質の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において血管新生を阻止する方法を提供する。本発明はさらに、本発明の特異的結合物質の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において癌を治療する方法を提供する。
【００２３】
本発明はまた、アミノ酸配列ＷＤＰＷＴ（配列番号６５）を含み、約５から約５０アミノ酸の長さである、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、ならびにその生理的に許容される塩に関する。前記ポリペプチドはまた、アミノ酸配列：
【００２４】
【化１２】
2007524610.tif 000002
及びその生理的に許容される塩を含み得る。加えて、前記ポリペプチドは、アミノ酸配列：
【００２５】
【化１３】
2007524610.tif 000003
（式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である。）及びその生理的に許容される塩を含み得る。前記ポリペプチドはさらに、アミノ酸配列：
【００２６】
【化１４】
2007524610.tif 000004
（式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である。）及びその生理的に許容される塩を含み得る。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、式：
【００２８】
【化１５】
2007524610.tif 000005
【００２９】
（式中、
ａ１、ａ２及びａ３は、各々独立してアミノ酸残基であり；
ａ５は、アミノ酸残基であり；
ａ１２は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ａ１３は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ａ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。好ましい実施形態において：
ａ１は、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ａ２は、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ａ３は、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨであり；
ａ５は、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥであり；
ａ１２は、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ａ１３は、Ｌ、Ｔ又はＨであり；
ａ１４は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＭである。
【００３０】
より好ましい実施形態において、ａ１はＱであり；ａ２はＥであり；ａ３はＥであり；ａ５はＤ又はＥであり；ａ１２はＤ又はＥであり；ａ１３はＨであり；及びａ１４はＭである。
【００３１】
本明細書中での小文字とその上付き数字（ａ１及びｂ１等）の使用はアミノ酸の位置を特定することを意図しており、所与のアミノ酸についての１文字略語を示すことを意図しないことを理解されたい。１文字アミノ酸略語は本明細書中において大文字で表す。
【００３２】
本発明はさらに、式：
【００３３】
【化１６】
2007524610.tif 000006
【００３４】
（式中、
ｂ１は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ２は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｂ３、ｂ４、ｂ５及びｂ６は、各々独立して存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ８は、アミノ酸残基であり；
ｂ１５は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｂ１６は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｂ１７は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｂ１８、ｂ１９及びｂ２０は、各々独立して存在しないか又はアミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態において：
ｂ１は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ２は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｎ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ３は、存在しないか又はＡ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｒ又はＨであり；
ｂ４は、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ５は、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；
ｂ６は、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨであり；
ｂ８は、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥであり；
ｂ１５は、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；
ｂ１６は、Ｌ、Ｔ又はＨであり；
ｂ１７は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＭであり；
ｂ１８は、存在しないか又はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｙ、Ｑ、Ｄ、Ｅ又はＲであり；
ｂ１９は、存在しないか又はＶ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ又はＲであり；及び、
ｂ２０は、存在しないか又はＶ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｙ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｋ又はＲである。
【００３５】
より好ましい実施形態において、ｂ１は存在しないか又はＰ又はＴであり；ｂ２は存在しないか又はＩ又はＮであり；ｂ３は存在しないか又はＲ又はＩであり；ｂ４はＱであり；ｂ５はＥであり；ｂ６はＥであり；ｂ８はＤ又はＥであり；ｂ１５はＤ又はＥであり；ｂ１６はＨであり；ｂ１７はＭであり；ｂ１８は存在しないか又はＷ又はＰであり；ｂ１９は存在しないか又はＧ又はＥであり；及びｂ２０は存在しないか、Ｖ又はＫである。
【００３６】
本発明が、好ましくは、配列番号４、及び配列番号７６から配列番号１１８（両端を含む。）からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド、ならびに生理的に許容されるその塩に関することも明白である。それらのペプチド配列を下記に示す。
【００３７】
【表１】
2007524610.tif 000007
2007524610.tif 000008
【００３８】
一部のペプチド及び／又はペプチボディーは接頭辞「ＴＮ」、「ＴＮ８」又は「ＴＮ１２」をを含み得ること、及びこの接頭辞は所与のペプチボディーに対して存在してもよく又は存在しなくてもよいことは明白である。従って、例えば「ＴＮ８−Ｃｏｎ４」及び「Ｃｏｎ４」という用語は本明細書中において交換可能に使用される。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又は複数は、各々独立して本明細書中に記載のポリペプチドを含む。）から選択される。）
を有する物質の組成物及びその多量体に関する。例えば、好ましい実施形態において、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立して、配列番号３から配列番号６、及び／又は配列番号７６から配列番号１５７のポリペプチドを含み得る。
【００４０】
別の実施形態において、前記物質の組成物は、式：
Ｘ１−Ｆ１
又は、
Ｆ１−Ｘ２
の組成物及びその生理的に許容される塩であり、式中、Ｘ１、Ｆ１及びＸ２は本明細書中で定義するとおりである。別の実施形態において、前記物質の組成物は、式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１
の組成物及びその生理的に許容される塩であり、式中、Ｌ１、Ｆ１及びＰ１は本明細書中で定義するとおりである。さらに別の実施形態において、前記物質の組成物は、式：
Ｆ１−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の組成物及びその生理的に許容される塩であり、式中、Ｌ１、Ｆ１、Ｐ１、Ｐ２、及びｃ及びｄは本明細書中で定義するとおりである。さらに別の実施形態において、前記物質の組成物は、式：
Ｐ１−（Ｌ１）ｃ−Ｆ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２
の組成物及びその生理的に許容される塩である。好ましい実施形態において、Ｆ１はＦｃドメイン又はその断片である。
【００４１】
本発明はさらに、式：
【００４２】
【化１７】
2007524610.tif 000009
【００４３】
（式中、
ｃ２は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｃ４は、Ａ、Ｄ又はＥであり；
ｃ６は、酸性アミノ酸残基であり；
ｃ７は、アミノ酸残基であり；及び
ｃ８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及び生理的に許容されるその塩に関する。好ましい実施形態において、ｃ２はＬ又はＭである。別の好ましい実施形態において、ｃ６はＤ又はＥである。
【００４４】
本発明はさらに、式：
【００４５】
【化１８】
2007524610.tif 000010
【００４６】
（式中、
ｄ１は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ２は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ３は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ４は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｄ８は、Ａ、Ｄ又はＥであり；
ｄ１０は、酸性アミノ酸残基であり；
ｄ１１は、アミノ酸残基であり；
ｄ１２は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１５は、存在しないか又は中性疎水性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１６は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ１７は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ１８は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；
ｄ１９は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ｄ２１は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｄ２２は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。好ましい実施形態において：
ｄ１は、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｒ又はＨであり；
ｄ２は、Ｔ、Ｑ、Ｎ又はＫであり；
ｄ３は、Ｆであり；
ｄ４は、Ｍ、Ｑ、Ｅ又はＫであり；
ｄ６は、Ｌ又はＭであり；
ｄ８は、Ｄ又はＥであり；
ｄ１０は、Ｅであり；
ｄ１１は、Ｑ又はＥであり；
ｄ１２は、Ｔ又はＲであり；
ｄ１５は、Ｙ、Ｄ、Ｅ又はＫであり；
ｄ１６は、Ｑであり；
ｄ１７は、Ｗ又はＦであり；
ｄ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＴであり；
ｄ１９は、Ｌ、Ｆ又はＹであり；
ｄ２０は、Ｑ、Ｄ又はＥであり；
ｄ２１は、存在しないか、Ｑ又はＨであり；
ｄ２２は、存在しないか、Ａ、Ｌ、Ｇ、Ｓ又はＲである。
【００４７】
好ましい実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号６、及び配列番号１１９から配列番号１４２（両端を含む）からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができる。配列番号６、及び配列番号１１９から配列番号１４２を下記に示す：
【００４８】
【表２】
2007524610.tif 000011
【００４９】
本発明はまた、式：
【００５０】
【化１９】
2007524610.tif 000012
【００５１】
（式中、
ｅ３は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｅ４は、酸性アミノ酸残基であり；
ｅ５は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｅ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｅ７は、中性疎水性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。好ましい実施形態において、ｅ３はＹ又はＣである。別の好ましい実施形態において、ｅ４はＤ又はＥである。さらに別の好ましい実施形態において、ｅ６はＩ又はＭである。
【００５２】
本発明はさらに、式：
【００５３】
【化２０】
2007524610.tif 000013
【００５４】
（式中、
ｆ１は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ３は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ７は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ８は、酸性アミノ酸残基であり；
ｆ９は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ１０は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｆ１１は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｆ１３は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１５は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１６は、中性極性アミノ酸残基であり；
ｆ１７は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；
ｆ１８は、中性疎水性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｆ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及び
ｆ２０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。
【００５５】
好ましい実施形態において、
ｆ１は、Ｓ、Ａ又はＧであり；
ｆ２は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；
ｆ３は、Ｑ、Ｇ又はＤであり；
ｆ４は、Ｌ、Ｍ又はＱであり；
ｆ７は、Ｃ又はＹであり；
ｆ８は、Ｅ又はＤであり；
ｆ９は、Ｅ、Ｇ又はＤであり；
ｆ１０は、Ｉ又はＭであり；
ｆ１１は、Ｆ又はＬであり；
ｆ１３は、Ｃ又はＷであり；
ｆ１４は、Ｇ又はＰであり；
ｆ１５は、Ｔ又はＮであり；
ｆ１６は、Ｑ、Ｙ又はＫであり；
ｆ１７は、Ｎ、Ｄ又はＱであり；
ｆ１８は、Ｌ、Ｖ、Ｗ又はＲであり；
ｆ１９は、Ａ、Ｑ、Ｙ又はＩであり；及び、
ｆ２０は、Ｌ、Ａ、Ｇ又はＶである。
【００５６】
より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号３及び配列番号１４３から配列番号１４８（両端を含む。）からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。配列番号３、及び配列番号１４３から配列番号１４８は下記の通りである。
【００５７】
【表３】
2007524610.tif 000014
【００５８】
さらに別の局面において、本発明は、式：
【００５９】
【化２１】
2007524610.tif 000015
【００６０】
（式中、
ｇ２は、酸性アミノ酸残基であり；
ｇ４は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｇ５は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；
ｇ１０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｇ１３は、酸性残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。好ましい実施形態において、ｇ２はＥ又はＤである。別の好ましい実施形態において、ｇ４はＶ又はＭである。さらに別の実施形態において、ｇ１０はＦ又はＱである。さらに別の実施形態において、ｇ１３はＤ又はＥである。
【００６１】
本発明はさらに、式：
【００６２】
【化２２】
2007524610.tif 000016
【００６３】
（式中、
ｈ１は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ｈ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ３は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ６は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ８は、中性疎水性アミノ酸残基であり；
ｈ９は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；
ｈ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；
ｈ１７は、酸性アミノ酸残基であり；
ｈ１８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；
ｈ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及び
ｈ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。
【００６４】
好ましい実施形態において、
ｈ１は、存在しないか又はＡ，Ｌ，Ｍ，Ｇ，Ｋ又はＨであり；
ｈ２は、Ｌ、Ｆ又はＱであり；
ｈ３は、Ｄ又はＥであり；
ｈ４は、Ｗ又はＹであり；
ｈ６は、Ｄ又はＥであり；
ｈ８は、Ｖ又はＭであり；
ｈ１４は、Ｆ又はＱであり；
ｈ１７は、Ｄ又はＥであり；
ｈ１８は、Ｍ、Ｙ、Ｎ又はＫであり；
ｈ１９は、Ｌ又はＱであり；及び、
ｈ２０は、Ｍ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｋ又はＲである。
【００６５】
より好ましい実施形態において、本発明は、配列番号５、及び配列番号１４９から配列番号１５７（両端を含む。）からなる群より選択される少なくとも１個のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関する。配列番号５、及び配列番号１４９から配列番号１５７を下記に示す。
【００６６】
【表４】
2007524610.tif 000017
【００６７】
極めて好ましい実施形態において、本発明は、式：
（Ｘ１）ｑ−Ｆ１−（Ｘ２）ｒ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２−（Ｌ３）ｕ−Ｐ３；及び、
−（Ｌ１）ｓ−Ｐ１−（Ｌ２）ｔ−Ｐ２−（Ｌ３）ｕ−Ｐ３−（Ｌ４）ｖ−Ｐ４；
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又は複数は、各々独立して、
（ａ）該ポリペプチドが５−５０アミノ酸の長さである、アミノ酸配列ＷＤＰＷＴ（配列番号６５）；
（ｂ）アミノ酸配列ＷＤＰＷＴＣ（配列番号６６）；
（ｃ）式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である、アミノ酸配列Ｃｚ２ＷＤＰＷＴ（配列番号６７）；
（ｄ）式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である、アミノ酸配列
【００６８】
【化２３】
2007524610.tif 000018
であり；
（ｅ）式中、ｃ２は中性疎水性アミノ酸残基であり；ｃ４はＡ、Ｄ又はＥであり；ｃ６は酸性アミノ酸残基であり；ｃ７はアミノ酸残基であり；及びｃ８は中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基である、アミノ酸配列
【００６９】
【化２４】
2007524610.tif 000019
であり；
（ｆ）式中、ｅ３は中性極性アミノ酸残基であり；ｅ４は酸性アミノ酸残基であり；ｅ５は中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｅ６は中性疎水性アミノ酸残基であり；及びｅ７は中性疎水性アミノ酸残基である、アミノ酸配列
【００７０】
【化２５】
2007524610.tif 000020
（ｇ）式中、ｇ２は酸性アミノ酸残基であり；ｇ４は中性疎水性アミノ酸残基であり；ｇ５は中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｇ１０は中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及びｇ１３は酸性残基である、アミノ酸配列
【００７１】
【化２６】
2007524610.tif 000021
であり；
（ｈ）配列番号１のポリペプチド；
（ｉ）配列番号２のポリペプチド；及び
（ｊ）配列番号７のポリペプチド；
からなる群より選択されるポリペプチドを含み；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである。）
から選択され、
ｑ、ｒ、ｓ、ｔ、ｕ及びｖは、ｑ及びｒの少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である。）
を有する物質の組成物及びその多量体及びその生理的に許容される塩に関する。
【００７２】
本発明がさらに、本明細書中で述べるような少なくとも１個のペプチド及びビヒクルを含み、Ａｎｇ−２に結合することができる融合ポリペプチド及びその生理的に許容される塩に関することを理解されたい。前記融合ポリペプチドにおいて、そのビヒクルは、好ましくはＦｃドメイン、ポリエチレングリコール、脂質、コレステロール群、糖質及びオリゴ糖のうち少なくとも１つである。アルブミン等の他の適切なビヒクルは当業者に認識され、本発明の範囲内に包含される。
【００７３】
当業者は、様々な分子を特異的結合物質構造に挿入できることを認識する。つまり、所与の分子を、特異的結合物質の所望する活性を保持しながら、例えば特異的結合物質のペプチドとビヒクル部分の間に、又はペプチド部分自体の中に挿入することができる。例えば、Ｆｃドメイン又はその断片、ポリエチレングリコール又はデキストラン等の他の関連分子、脂肪酸、脂質、コレステロール群、低分子量糖質、ペプチド、細胞傷害性物質、化学療法剤、本明細書中で述べるような検出可能成分（蛍光物質、放射性同位体等の放射性標識を含む。）、オリゴ糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、干渉（又は他の）ＲＮＡ、酵素、ホルモン等のような分子を容易に挿入することができる。このような挿入に適する他の分子は当業者によって認識され、本発明の範囲内に包含される。これには、例えば、場合によっては適切なリンカーにより連結された、２個の連続アミノ酸の間に所望する分子を挿入することが含まれる。例として、Ｃｏｎ４（Ｃ）ペプチボディー配列：
【００７４】
【化２７】
2007524610.tif 000022
において、当業者は、ペプチドのＡｎｇ−２に対する結合能を保持しながら、所望する構造及び／又は機能を達成するために、例えば２個の隣接するグルタミン（「ＱＱ」）残基の間に所望する分子を容易に挿入することができる。従って、この配列は次のように修飾され得る：
【００７５】
【化２８】
2007524610.tif 000023
必要であれば、適切なリンカー分子を付加することができる。前記分子が、次のようなビヒクルとペプチドの間の、適切な側鎖上を含むその分子上の多くの位置に：
【００７６】
【化２９】
2007524610.tif 000024
のように、又は当業者が所望する他の何らかの位置に挿入できることをさらに理解されたい。他の適切な実施形態は当業者にとって明白である。
【００７７】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書中で述べるような、本発明の特異的結合物質（ペプチド及び／又はペプチボディーを含むが、これらに限定されない。）をコードするポリヌクレオチドに関する。当業者は、アミノ酸配列が既知である場合、その対応するヌクレオチド配列を既知の手法を用いて容易に決定できることを認識する。例えば、Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄ．，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．（１９８６）参照。本発明のペプチドをコードする具体例としてのヌクレオチド配列を下記に示す。当業者は、２個以上のコドンが所与の１個のアミノ酸をコードし得、従って、本発明は、本発明のペプチド及び／又はペプチボディーをコードするあらゆるヌクレオチド配列に関することを理解されたい。
【００７８】
【表５】
2007524610.tif 000025
2007524610.tif 000026
2007524610.tif 000027
2007524610.tif 000028
2007524610.tif 000029
2007524610.tif 000030
2007524610.tif 000031
2007524610.tif 000032
2007524610.tif 000033
【００７９】
さらに別の実施形態において、本発明は、本発明の少なくとも１個のポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。別の実施形態において、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、好ましくは原核細胞（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞等）又は真核細胞であることを理解されたい。
【００８０】
本発明はまた、医薬適合性のその担体と混合した、本明細書中で述べる組成物の有効量を含有する医薬組成物にも関する。
【００８１】
本発明はまた、本明細書中で述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において望ましくない血管新生を抑制する方法にも関する。本発明はまた、本明細書中で述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において血管新生を調節する方法にも関する。本発明はさらに、本明細書中で述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において望ましくない血管新生を特徴とする腫瘍増殖を抑制する方法に関する。加えて、本発明は、本明細書中で述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量及び化学療法剤を投与することを含む、哺乳類において癌を治療する方法に関する。好ましい実施形態において、前記化学療法剤は、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１及びタキソテール（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）の少なくとも１つである。しかしながら、他の適切な化学療法剤及び他の癌治療が使用できることを理解されたい。
【００８２】
本発明はまた、本明細書中で述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において血管透過性又は血漿漏出の少なくとも１つを調節する方法にも関する。本発明はさらに、本明細書中で述べるポリペプチド又は組成物の治療上有効な量を投与することを含む、哺乳類において、眼血管新生疾患、肥満、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、炎症性疾患、炎症性障害、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、新生物性疾患、骨関連疾患又は乾癬の少なくとも１つを治療する方法に関する。
【００８３】
本発明の特異的結合物質が、無秩序な、又は望ましくない血管新生に関連する多くの疾患を治療するために使用できることを理解されたい。そのような疾患には、これらに限定されないが、網膜症（糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性を含む）等の眼新生血管新生、乾癬、血管芽細胞腫、血管腫、動脈硬化症、リウマチ様又はリウマチ性炎症性疾患等の炎症性疾患、特に関節炎（関節リウマチを含む）又は慢性喘息、動脈又は移植後アテローム硬化症、子宮内膜症等の他の慢性炎症性疾患及び新生物性疾患、例えばいわゆる固形腫瘍及び液性腫瘍（白血病等）が含まれる。特異的結合物質の投与によって治療できるさらなる疾患は、当業者にとって明白である。そのようなさらなる疾患には、これらに限定されないが、肥満、血管透過性、血漿漏出、及び骨粗しょう症を含む骨関連疾患が含まれる。従って、本発明はさらに、無秩序な、又は望ましくない血管新生に関連するこれらの疾患を治療する方法に関する。
【００８４】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、Ａｎｇ−２との結合が可能であり、アミノ酸配列：
【００８５】
【化３０】
2007524610.tif 000034
又はその生理的に許容される塩を含有するペプチド又はぺプチボディー（ここで、前記ペプチド又はぺプチボディーは、約５アミノ酸から約５０アミノ酸の長さである。）の治療上有効な量を投与することを含む、方法に関する。
【００８６】
別の実施形態において、前記ペプチド又はぺプチボディーは、アミノ酸配列：
【００８７】
【化３１】
2007524610.tif 000035
及びその生理的に許容される塩を含み得る。
【００８８】
別の実施形態において、前記ペプチド又はぺプチボディーは、アミノ酸配列：
【００８９】
【化３２】
2007524610.tif 000036
（式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である。）及びその生理的に許容される塩を含む。
【００９０】
さらに別の実施形態において、前記ペプチド又はぺプチボディーは、アミノ酸配列：
【００９１】
【化３３】
2007524610.tif 000037
（式中、ｚ２は酸性又は中性の極性アミノ酸残基である。）及びその生理的に許容される塩を含み得る。
【００９２】
さらに別の実施形態において、前記ペプチド又はぺプチボディーは、アミノ酸配列：
【００９３】
【化３４】
2007524610.tif 000038
【００９４】
（式中、
ａ１、ａ２及びａ３は、各々独立してアミノ酸残基であり；
ａ５は、アミノ酸残基であり；
ａ１２は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；
ａ１３は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；
ａ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である。）
及びその生理的に許容される塩を含む。好ましい実施形態において：
ａ１は、Ｖ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；ａ２は、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり；ａ３は、Ａ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＨであり；ａ８は、Ａ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、Ｄ又はＥであり；ａ１２は、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、Ｋ又はＲであり；ａ１３は、Ｌ、Ｔ又はＨであり；ａ１４は、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｗ又はＭである。より好ましい実施形態において、ａ１はＱであり；ａ２はＥであり；ａ３はＥであり；ａ５はＤ又はＥであり；ａ１２はＤ又はＥであり；ａ１３はＨであり；及びａ１４はＭである。その生理的に許容される塩もまた適切である。
【００９５】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、それを必要とする患者に対して、配列番号４及び配列番号７６から配列番号１１８（両端を含む。）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び生理的に許容されるその塩を含有する、Ａｎｇ−２に結合できるペプチド又はぺプチボディーの治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。
【００９６】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、式：
【００９７】
【化３５】
2007524610.tif 000039
【００９８】
（式中、
ｃ２は、中性疎水性アミノ酸残基であり；ｃ４は、Ａ、Ｄ又はＥであり；ｃ６は、酸性アミノ酸残基であり；ｃ７は、アミノ酸残基であり；及びｃ８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列及びその生理的に許容される塩を含み、Ａｎｇ−２に結合できるポリペプチド又はぺプチボディーの治療上有効な量を投与することを含む、方法に関する。好ましい実施形態において、ｃ２はＬ又はＭである。別の好ましい実施形態において、ｃ６はＤ又はＥである。その生理的に許容される塩もまた適切である。
【００９９】
別の実施形態において、そのペプチド又はぺプチボディーは、式：
【０１００】
【化３６】
2007524610.tif 000040
【０１０１】
（式中、
ｄ１は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；ｄ２は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；ｄ３は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；ｄ４は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；ｄ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；ｄ８は、Ａ、Ｄ又はＥであり；ｄ１０は、酸性アミノ酸残基であり；ｄ１１は、アミノ酸残基であり；ｄ１２は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；ｄ１５は、存在しないか又は中性疎水性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；ｄ１６は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；ｄ１７は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；ｄ１８は、存在しないか又は中性疎水性若しくは中性極性アミノ酸残基であり；ｄ１９は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；ｄ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基であり；ｄ２１は、存在しないか又は中性極性、酸性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；ｄ２２は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含有する。生理的に許容されるその塩もまた適切である。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において：
ｄ１は、Ｔ、Ｓ、Ｑ、Ｒ又はＨであり；ｄ２は、Ｔ、Ｑ、Ｎ又はＫであり；ｄ３は、Ｆであり；ｄ４は、Ｍ、Ｑ、Ｅ又はＫであり；ｄ６は、Ｌ又はＭであり；ｄ８は、Ｄ又はＥであり；ｄ１０は、Ｅであり；ｄ１１は、Ｑ又はＥであり；ｄ１２は、Ｔ又はＲであり；ｄ１５は、Ｙ、Ｄ、Ｅ又はＫであり；ｄ１６は、Ｑであり；ｄ１７は、Ｗ又はＦであり；ｄ１８は、Ｌ、Ｉ、Ｍ又はＴであり；ｄ１９は、Ｌ、Ｆ又はＹであり；ｄ２０は、Ｑ、Ｄ又はＥであり；ｄ２１は、存在しないか、Ｑ又はＨであり；ｄ２２は、存在しないか、Ａ、Ｌ、Ｇ、Ｓ又はＲである。生理的に許容されるその塩もまた適切である。
【０１０３】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、配列番号６及び配列番号１１９から配列番号１４２（両端を含む。）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及び生理的に許容されるその塩を含有し、Ａｎｇ−２に結合することができるペプチド又はぺプチボディーの治療上有効な量を投与することを含む、方法に関する。
【０１０４】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、式：
【０１０５】
【化３７】
2007524610.tif 000041
【０１０６】
（式中、
ｅ３は、中性極性アミノ酸残基であり；ｅ４は、酸性アミノ酸残基であり；ｅ５は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｅ６は、中性疎水性アミノ酸残基であり；ｅ７は、中性疎水性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列及び生理的に許容されるその塩を含み、Ａｎｇ−２に結合することができるペプチド又はぺプチボディーを投与することを含む、方法に関する。好ましい実施形態において、ｅ３はＹ又はＣである。別の好ましい実施形態において、ｅ４はＤ又はＥである。別の好ましい実施形態において、ｅ６はＩ又はＭである。生理的に許容されるその塩もまた適切である。
【０１０７】
別の実施形態において、このペプチド又はぺプチボディーは、式：
【０１０８】
【化３８】
2007524610.tif 000042
【０１０９】
（式中、
ｆ１は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｆ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｆ３は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｆ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｆ７は、中性極性アミノ酸残基であり；ｆ８は、酸性アミノ酸残基であり；ｆ９は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｆ１０は、中性疎水性アミノ酸残基であり；ｆ１１は、中性疎水性アミノ酸残基であり；ｆ１３は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｆ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｆ１５は、中性極性アミノ酸残基であり；ｆ１６は、中性極性アミノ酸残基であり；ｆ１７は、中性極性又は酸性アミノ酸残基であり；ｆ１８は、中性疎水性又は塩基性アミノ酸残基であり；ｆ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；及びｆ２０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列及びその生理的に許容される塩を含む。好ましい実施形態において、ｆ１は、Ｓ、Ａ又はＧであり；ｆ２は、Ｇ、Ｑ又はＰであり；ｆ３は、Ｑ、Ｇ又はＤであり；ｆ４は、Ｌ、Ｍ又はＱであり；ｆ７は、Ｃ又はＹであり；ｆ８は、Ｅ又はＤであり；ｆ９は、Ｅ、Ｇ又はＤであり；ｆ１０は、Ｉ又はＭであり；ｆ１１は、Ｆ又はＬであり；ｆ１３は、Ｃ又はＷであり；ｆ１４は、Ｇ又はＰであり；ｆ１５は、Ｔ又はＮであり；ｆ１６は、Ｑ、Ｙ又はＫであり；ｆ１７は、Ｎ、Ｄ又はＱであり；ｆ１８は、Ｌ、Ｖ、Ｗ又はＲであり；ｆ１９は、Ａ、Ｑ、Ｙ又はＩであり；ｆ２０は、Ｌ、Ａ、Ｇ又はＶである。その生理的に許容される塩もまた適切である。
【０１１０】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、配列番号３及び配列番号１４３から配列番号１４８（両端を含む。）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及びその生理的に許容される塩を含み、Ａｎｇ−２に結合できるペプチド又はぺプチボディーの治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。
【０１１１】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、式：
【０１１２】
【化３９】
2007524610.tif 000043
【０１１３】
（式中、ｇ２は、酸性アミノ酸残基であり；ｇ４は、中性疎水性アミノ酸残基であり；ｇ５は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；ｇ１０は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｇ１３は、酸性残基である。）
のアミノ酸配列及びその生理的に許容される塩を含み、Ａｎｇ−２に結合できるペプチド又はぺプチボディーの治療上有効な量を投与することを含む、方法に関する。
【０１１４】
別の実施形態において、そのペプチド又はぺプチボディーは、式：
【０１１５】
【化４０】
2007524610.tif 000044
【０１１６】
（式中、ｈ１は、存在しないか又は中性疎水性、中性極性若しくは塩基性アミノ酸残基であり；ｈ２は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｈ３は、酸性アミノ酸残基であり；ｈ４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｈ６は、酸性アミノ酸残基であり；ｈ８は、中性疎水性アミノ酸残基であり；ｈ９は、Ｅ、Ｄ又はＱであり；ｈ１４は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｈ１７は、酸性アミノ酸残基であり；ｈ１８は、中性疎水性、中性極性又は塩基性アミノ酸残基であり；ｈ１９は、中性疎水性又は中性極性アミノ酸残基であり；ｈ２０は、存在しないか又はアミノ酸残基である。）
のアミノ酸配列を含む。その生理的に許容される塩もまた適切である。別の好ましい実施形態において、ｈ１は、存在しないか又はＡ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、Ｋ又はＨであり；ｈ２は、Ｌ、Ｆ又はＱであり；ｈ３は、Ｄ又はＥであり；ｈ４は、Ｗ又はＹであり；ｈ６は、Ｄ又はＥであり；ｈ８は、Ｖ又はＭであり；ｈ１４は、Ｆ又はＱであり；ｈ１７は、Ｄ又はＥであり；ｈ１８は、Ｍ、Ｙ、Ｎ又はＫであり；ｈ１９は、Ｌ又はＱであり；ｈ２０は、存在しないか又はＭ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｋ又はＲである。その生理的に許容される塩もまた適切である。
【０１１７】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、配列番号５及び配列番号１４９から配列番号１５７（両端を含む。）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列及びその生理的に許容される塩を含み、Ａｎｇ−２に結合できるペプチド又はぺプチボディーの治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。
【０１１８】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、それを必要とする患者に対して、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；（式中、
ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件に、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して０又は１であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーであり；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又は複数は、各々独立して、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８及び配列番号６９のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する。）から選択される。）
の物質の組成物及びその多量体及びその生理的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む、方法に関する。
【０１１９】
本発明はさらに、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；（式中、
ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件に、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して０又は１であり；Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーであり；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又は複数は、各々独立して、配列番号７１及び配列番号７２のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する。）から選択される。）
の物質の組成物及びその多量体及びその生理的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。
【０１２０】
本発明はまた、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；（式中、
ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件に、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して０又は１であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーであり；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又は複数は、各々独立して、配列番号７３及び配列番号７４のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する。）から選択される。）
の物質の組成物及びその多量体及びその生理的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む、方法にも関する。
【０１２１】
本発明はまた、炎症性疾患を治療するための、処置を必要とする患者に対して、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
（式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；及び、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；（式中、
ａ及びｂの少なくとも１つが１であることを条件に、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆは、それぞれ独立して０又は１であり、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーであり；Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４の１個又は複数は、各々独立して、配列番号７５及び配列番号１５８のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する。）から選択される。）
の物質の組成物及びその多量体及びその生理的に許容される塩の治療上有効な量を投与することを含む方法にも関する。
【０１２２】
本発明がまた、本明細書中に記載する特異的な結合物質（ペプチド、ぺプチボディー又は物質の組成物等）を用いた、さらに少なくとも１つの抗炎症剤を投与することを含む、炎症性疾患を治療するための方法にも関することを理解されたい。ある好ましい実施形態において、この抗炎症剤は、ＤＭＡＲＤ、ＳＡＡＲＤ及びＮＳＡＩＤのうち少なくとも１つを含有し得る。別の好ましい実施形態において、この抗炎症剤は、メトトレキセート、ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤及びＰ−３８阻害剤のうち少なくとも１つを含有し得る。さらに別の好ましい実施形態において、このＴＮＦ阻害剤は、エタネルセプト、アダリムマブ、ペグスネルセプト（ｐｅｇｓｕｎｅｒｃｅｐｔ）  ｓＴＮＦ−Ｒ１、オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）及びインフリキシマブのうち少なくとも１つを含有する。さらに別の好ましい実施形態において、そのＩＬ−１阻害剤は、アナキンラ、ＩＬ−１  ＴＲＡＰ、ＩＬ−１抗体及び可溶性ＩＬ−１受容体のうち少なくとも１つであり得る。
【０１２３】
本明細書で述べられる場合、この投与が同時投与又は非同時投与であり得ることを理解されたい。
【０１２４】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、炎症性疾患を治療するための、それを必要とする患者に対して、配列番号４又は配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合できるペプチド又はぺプチボディーの治療上有効な量を投与することを含む方法に関する。さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、炎症性疾患を治療するための、それを必要とする患者に対して、配列番号１２４、１２６又は１３７に記載のアミノ酸配列を含み、Ａｎｇ−２に結合できるペプチド又はぺプチボディーの治療上有効量を投与することを含む方法に関する。これらの方法はまた、さらに、少なくとも１つの抗炎症剤を投与することも含み得る。この投与は、同時投与又は非同時投与であり得る。
【０１２５】
本発明の他の実施形態は、本明細書によって提供される開示から容易に明らかとなろう。
【０１２６】
本発明の詳細な説明
章の見出しは、本明細書中において構成のためにのみ使用するものであり、いかなる意味においても記述する対象を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１２７】
組換えＤＮＡ分子、タンパク質及び抗体生産、ならびに組織培養及び細胞形質転換のために、標準的な手法を使用し得る。酵素反応及び精製手法は、一般的には製造者の使用説明書に従って、又はＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ［１９８９］）に述べられているような従来の手順を用いてこの技術分野において一般的に実施されるように、又は本明細書中で述べるように実施する。特定の定義が与えられない限り、本明細書で述べる分析化学、合成有機化学、及び医薬及び製薬化学に関して使用する術語及び実験手順及び手法は、公知のものであり且つこの技術分野で一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、製薬調製、製剤及び送達、及び患者の処置のために、標準的な手法を使用し得る。
【０１２８】
定義
この明細書を通じて使用する用語は、特定の場合に限られた別段の記載がない限り、下記のように定義される。
【０１２９】
「Ａｎｇ−２」という用語は、米国特許第６，１６６，１８５号の図６に記載のポリペプチド（「Ｔｉｅ−２リガンド−２」）又はその断片ならびに、対立遺伝子変異体、スプライシング変異体、誘導体、置換、欠失及び／又は挿入変異体、融合ペプチド及びポリペプチド、及び種間相同体を含む関連ポリペプチドを意味する。Ａｎｇ−２ポリペプチドは、調製される方法に依存して、付加的な末端残基、例えばリーダー配列、標的配列、アミノ末端メチオニン、アミノ末端メチオニン及びリシン残基、及び／又はタグ又は融合タンパク質配列を含んでいてもよく又は含んでいなくてもよい。
【０１３０】
Ａｎｇ−２又はＡｎｇ−２特異的結合物質に関連して使用される場合、「生物学的に活性」という用語は、Ａｎｇ−２又はＡｎｇ−２特異的結合物質の特徴である少なくとも１つの活性を有するペプチド又はポリペプチドを意味する。Ａｎｇ−２の特異的な結合物質は、少なくとも１つのＡｎｇ−２の生物活性に関して、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性又は中和活性又はブロッキング活性を有し得る。
【０１３１】
「特異的結合物質」という用語は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する分子、好ましくはタンパク質様分子、及び本明細書において定義するようなその変異体及び誘導体を意味する。特異的結合物質は、Ａｎｇ−２に選択的に結合するタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質又は低分子量化合物であり得る。好ましい実施形態において、本発明による特異的結合物質は、単独で、又は既知の手法と組み合わせて提供される他のアミノ酸配列との組み合わせでのいずれかのペプチド又はペプチボディー、ならびにその断片、変異体又は誘導体である。そのような手法には、これらに限定されないが、酵素的切断、化学的切断、ペプチド合成又は組換え手法が含まれる。本発明の抗Ａｎｇ−２特異的結合物質は、Ａｎｇ−２の生物活性及び／又は他のＡｎｇ−２に関連する活性を調節する、例えば阻害する又は促進するＡｎｇ−２の部分に結合することができる。
【０１３２】
本明細書中で使用される場合、「変異体」という用語は、アミノ酸残基が、該結合物質に対する天然に生じる（又は少なくとも既知の）アミノ酸配列に挿入されている、アミノ酸配列から欠失している、及び／又は置換されている、ペプチド及びポリペプチドを含む。本発明の変異体は下記で述べるような融合タンパク質を含む。
【０１３３】
「誘導体」は、挿入、欠失又は置換変異体とは異なる方法で化学修飾されている結合物質を含む。
【０１３４】
「Ａｎｇ−２に特異的に結合する」とは、その親和性（例えば本明細書中で述べるようなアフィニティーＥＬＩＳＡ又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイによって測定される。）又はその中和能力（例えば本明細書中で述べる中和ＥＬＩＳＡアッセイ又は同様のアッセイによって測定される。）が、他の何らかのアンジオポエチン又は他のペプチド又はポリペプチドに対する親和性又は中和能力よりも少なくとも１０倍高いが、場合によっては５０倍、１００倍、２５０倍又は５００倍又は、少なくとも１０００倍高いというように、成熟、全長又は部分長ヒトＡｎｇ−２ポリペプチド又はその相同分子種を認識し、それに結合する、本発明の特異的結合物質（ペプチボディー、又はそのペプチド部分等）の能力を意味し、但し、そのペプチボディーのペプチド部分は、最初に、そのようなアッセイにおける評価のためにヒトＦｃ部分に融合させる。
【０１３５】
「エピトープ」という用語は、特異的結合物質、例えばペプチボディーによって、その結合物質の抗原結合領域の１つ又は複数において、認識され得る又は結合され得るあらゆる分子の部分を意味する。エピトープは通常、例えばアミノ酸又は糖質側鎖等の、分子の化学的に活性な表面配置からなり、特異的三次元構造特性ならびに特異的電荷特性を有する。本明細書中で使用される場合のエピトープは、隣接又は非隣接であり得る。
【０１３６】
「阻害及び／又は中和エピトープ」という用語は、ペプチボディー等の特異的結合物質によって結合された場合、その結果としてインビボ、インビトロ又はインシトゥで、そのようなエピトープを含む分子、細胞又は生物の生物活性の喪失（又は少なくとも生物活性の低下）をもたらすエピトープである。本発明に関して、中和エピトープは、Ａｎｇ−２の生物活性領域に位置するか、又は生物活性領域に結合している。あるいは、「活性化エピトープ」という用語は、抗体等の本発明の特異的結合物質によって結合されたとき、Ａｎｇ−２が活性化される、又は少なくともＡｎｇ−２の生物学的に活性のある立体配座が維持されるようになるエピトープである。
【０１３７】
「ペプチボディー断片」という用語は、完全なインタクトのペプチボディーではないものを含むペプチド又はポリペプチドを意味する。
【０１３８】
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞等のような生物学的物質に関して使用される場合、「天然に生じる」という用語は、天然において見出され、人間によって修飾されていないものを意味する。
【０１３９】
Ａｎｇ−２又はＡｎｇ−２の特異的結合物質に関して使用される場合、「単離された」という用語は、その自然環境において見いだされる少なくとも１つの夾雑ポリペプチド又は化合物を含まない、好ましくはその治療的又は診断的使用を妨害するいかなる他の夾雑哺乳類ポリペプチドも実質的に含まない化合物を意味する。
【０１４０】
Ａｎｇ−２ペプチボディー又はその断片、又はＡｎｇ−２のあらゆる他のタンパク質様特異的結合物質に関して使用される場合、「成熟」という用語は、リーダー又はシグナル配列を欠くペプチド又はポリペプチドを意味する。本発明の結合物質が、例えば原核宿主細胞において発現される場合、「成熟」ペプチド又はポリペプチドは、アミノ末端メチオニン、又は１個又は複数のメチオニン及びリシン残基等の付加的なアミノ酸残基も含み得る（しかし、やはりリーダー配列を欠く。）。このようにして産生されるペプチド又はポリペプチドは、これらの付加的なアミノ酸残基を除去して、又は除去せずに使用することができる。
【０１４１】
Ａｎｇ−２の特異的結合物質に関して使用される場合、「有効量」又は「治療上有効な量」という用語は、Ａｎｇ−２の１つ又は複数の生物活性のレベルの観察可能な変化を支持するために有用な又は必要な、特異的結合物質の量を意味する。その変化は、Ａｎｇ−２活性のレベルの上昇又は低下のいずれかであり得る。好ましくは、その変化はＡｎｇ−２活性の低下である。
【０１４２】
「ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、少なくとも１個のペプチドに結合した抗体Ｆｃドメインを含む分子を意味する。ペプチボディーの産生は、２０００年５月４日公開のＰＣＴ特許公開広報ＷＯ００／２４７８２号に概説されている。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合、「変異体」という用語は、アミノ酸残基が、その分子についてのアミノ酸配列に挿入されている、アミノ酸配列から欠失している、及び／又は置換されている、本発明のペプチボディーのようなペプチド又はペプチド−ビヒクルの組合せ等の分子を含む。１個又は複数のアミノ酸が挿入されている変異体は、下記で述べるような融合タンパク質を含む。
【０１４４】
「誘導体」は、挿入、欠失又は置換変異体とは異なる方法で化学修飾されている、ペプチボディーのようなペプチド及び／又はペプチド−ビヒクルの組合せを含む。
【０１４５】
「断片」という用語は、該ペプチド及び／又はペプチド−ビヒクルの組合せの全長アミノ酸配列ではないものを含むペプチド又はペプチド−ビヒクルの組合せを意味する。そのような断片は、例えば、アミノ末端の短縮、カルボキシ末端の短縮及び／又は該ペプチド又はペプチド−ビヒクルの組合せのアミノ酸配列からの残基の内部欠失から生じ得る。断片は、選択的ＲＮＡスプライシングから、又はインビボ若しくはインビトロでのプロテアーゼ活性から生じ得る。そのような断片はまた、化学的ペプチド合成法によって、又はペプチド、ペプチド−ビヒクルの組合せ又はＦｃ部分及び／又はペプチボディーのペプチド部分をコードするポリヌクレオチドを修飾することによっても構築され得る。
【０１４６】
「Ｆｃ」という用語は、本発明のビヒクルの１つのタイプを意味し、単量体又は多量体の、完全な抗体をタンパク質分解性に消化することにより生じる抗体の非抗原結合断片の配列を含む。本発明におけるＦｃのソースは、好ましくは全面的にヒトＦｃであり、免疫グロブリンのいずれかであり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。しかし、本明細書中では、部分的にヒトであるＦｃ分子又はヒト以外の種から得られるＦｃ分子も包含される。Ｆｃは、共有結合（すなわちジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体又は多量体形態へと連結され得る単量体ポリペプチドで作られる。ネイティブのＦｃ分子の単量体サブユニットの間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に依存して１−４の範囲をとる。ネイティブＦｃの一例は、ＩｇＧをパパイン消化することにより生じるジスルフィド結合二量体である［Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９を参照。］。本明細書中で使用される場合、「ネイティブＦｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量体形態の総称である。
【０１４７】
「Ｆｃドメイン」という用語は、ネイティブＦｃ及びＦｃ変異体分子及び上記で定義した配列を包含する。Ｆｃ変異体及びネイティブＦｃに関して、「Ｆｃドメイン」という用語は、完全な抗体から消化されたか又は他の手段によって生成されたかに関わらず、単量体又は多量体形態の分子を含む。
【０１４８】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用するとき「多量体」という用語は、共有結合によって、非共有結合によって、又は共有結合と非共有結合の両方の相互作用によって結合された２つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を意味する。ＩｇＧ分子は通常、二量体を形成し；ＩｇＭは五量体；ＩｇＤは二量体；及びＩｇＡは単量体、二量体、三量体又は四量体を形成する。多量体は、ＦｃのネイティブのＩｇソースの配列及びその結果生じる活性を利用することによって、又はそのようなネイティブのＦｃを誘導体化する（下記で定義する。）ことによって形成され得る。
【０１４９】
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む分子に適用する場合、「二量体」という用語は、共有結合によって又は非共有結合によって結合された２つのポリペプチド鎖を有する分子を意味する。
【０１５０】
「ビヒクル」という用語は、治療タンパク質の分解を防ぐ、及び／又は半減期を延長させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、又は生物活性を上昇させる分子を意味する。具体例としてのビヒクルには、Ｆｃドメインならびに線状重合体（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デキストラン等）；分枝鎖重合体（例えば１９８１年９月１５日発行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらへの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日発行のＴａｍへの米国特許第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔらによるＷＯ９３／２１２５９号を参照。）；脂質；コレステロール群（ステロイド等）；糖質又はオリゴ糖；又はサルベージ受容体に結合するあらゆる天然又は合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチドが含まれる。ビヒクルについては下記でさらに説明する。
【０１５１】
「誘導体化する」及び「誘導体」又は「誘導体化された」という用語は、それぞれ、（１）化合物が環状部分、例えば化合物内のシステイニル残基間の架橋を有する；（２）化合物が架橋する、又は架橋部位を有する、例えば化合物がシステイニル残基を有しており、それ故培養中又はインビボで架橋二量体を形成する；（３）１つ又は複数のペプチジル結合が非ペプチジル結合によって置換される；（４）Ｎ末端が−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシニミド基、又は置換若しくは非置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−［式中、Ｒ及びＲ１及び環置換基は下記で定義するとおりである。］によって置換される；（５）Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２又は−ＮＲ３Ｒ４［式中、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は下記で定義するとおりである。］によって置換される；及び（６）化合物の個々のアミノ酸部分が、選択側鎖又は末端残基と反応することができる物質を用いて処理することにより修飾される、工程及びそれにより得られる化合物を含む。誘導体については下記でさらに説明する。
【０１５２】
「ペプチド」という用語は、約３−約７５アミノ酸の分子を意味し、約５−５０アミノ酸の分子が好ましく、８−４０アミノ酸分子がより好ましく、約１０−２５アミノ酸の分子が最も好ましい。ペプチドは、天然に生じる、又は人工の（すなわち非天然に生じる）アミノ酸配列であり得る。具体例としてのペプチドは、ペプチドライブラリー（例えばファージディスプレイライブラリー）において実施されるような、本明細書中で述べる方法のいずれかによって生成されるか、化学合成によって生成されるか、タンパク質の消化によって誘導されるか、又は組換えＤＮＡ手法を用いて生成され得る。
【０１５３】
「薬理学的に活性」という用語は、そのように記述される物質が、医学的パラメータ（例えば血圧、血球算定、コレステロールレベル）又は疾患状態（例えば癌、自己免疫疾患等）に影響を及ぼす活性を有すると判定されることを意味する。
【０１５４】
「アンタゴニストペプチド」又は「阻害因子ペプチド」という用語は、対象とする関連タンパク質の生物活性をブロックする、又は何らかの方法で生物活性を妨害する、又は対象とする関連タンパク質の既知のアンタゴニスト又は阻害因子と同等の生物活性を有するペプチドを意味する。従って、「Ａｎｇ−２アンタゴニストペプチド」という用語は、Ａｎｇ−２拮抗作用特性を有すると特定できる、又は推定できるペプチドを含む。
【０１５５】
さらに、本発明の化合物の生理的に許容される塩も本明細書に包含される。「生理的に許容される塩」とは、医薬適合性であることが知られている、又は後ほど発見されるあらゆる塩を意味する。一部の具体例は、酢酸塩；トリフルオロ酢酸塩；塩酸塩及び臭化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；硫酸塩；クエン酸塩；酒石酸塩；グリコール酸塩；及びシュウ酸塩、メシレート及びリン酸塩である。
【０１５６】
ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）
本発明の１つの局面は、Ａｎｇ−２ペプチボディーの開発に関する。タンパク質リガンドとその受容体の相互作用は比較的大きな界面で起こることが多い。しかし、ヒト成長ホルモンとその受容体に関して明らかにされたように、結合エネルギーの大部分に寄与するのは、界面にあるキーとなるごく少数の残基のみである。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：３８３−６（１９９５）。タンパク質リガンドの大部分は単に、正しいトポロジーで結合エピトープを表示するか、又は結合に無関係な機能を果たす。それ故、「ペプチド」の長さ（一般に２から４０アミノ酸）のみの分子が、ある一定の大きなタンパク質リガンドの受容体タンパク質に結合することができる。そのようなペプチドは、大型タンパク質リガンドの生物活性を模倣し得るか（「ペプチドアゴニスト」）、又は競合結合により、大型タンパク質リガンドの生物活性を阻害し得る（「ペプチドアンタゴニスト」）。
【０１５７】
ファージディスプレイ技術はそのようなペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを同定する上での強力な方法として出現した。例えば、Ｓｃｏｔｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４（１９９０）；１９９３年６月２９日発行の米国特許第５，２２３，４０９号；１９９８年３月３１日発行の米国特許第５，７３３，７３１号；１９９６年３月１２日発行の米国特許第５，４９８，５３０号；１９９５年７月１１日発行の米国特許第５，４３２，０１８号；１９９４年８月１６日発行の米国特許第５，３３８，６６５号；１９９９年７月１３日発行の米国特許第５，９２２，５４５号；１９９６年１２月１９日公開のＷＯ９６／４０９８７号；及び１９９８年４月１６日公開のＷＯ９８／１５８３３号（そのそれぞれを本明細書中で参考として援用する。）参照。ペプチドファージディスプレイライブラリーでは、線状ファージの外殻タンパク質との融合によってランダムなペプチド配列を表示することができる。表示されたペプチドは、必要であれば、受容体の抗体固定化細胞外ドメインに対してアフィニティー溶出することができる。一連のアフィニティー精製及び再増殖を反復することにより、保持されたファージを濃縮し得る。最良の結合ペプチドの配列決定を行い、１つ又は複数の構造的に関連するペプチドのファミリー中で鍵となる残基を同定することができる。例えば、２つの異なるファミリーが特定された、Ｃｗｉｒｌａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１６９６−９（１９９７）参照。そのペプチド配列はまた、どの残基がアラニンスキャニングによって、又はＤＮＡレベルでの突然変異誘発によって安全に置換し得るかも示唆すると考えられる。最適の結合因子をさらに最適化するために、突然変異誘発ライブラリーを作製して、スクリーニングし得る。Ｌｏｗｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１−２４（１９９７）。
【０１５８】
タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析も、大型タンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆するために使用し得る。そのような分析においては、結晶構造から大型タンパク質リガンドの非常に重要な残基の同一性と相対的方向が示唆され得、そこらからペプチドを設計し得る。例えば、Ｔａｋａｓａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １５：１２６６−７０（１９９７）参照。これらの分析方法はまた、受容体タンパク質とファージディスプレイにより選択されたペプチドとの間の相互作用を調べるためにも使用でき、それにより、結合親和性を高めるためのペプチドのさらなる修飾が示唆され得る。
【０１５９】
他の方法も、ペプチド研究においてファージディスプレイに匹敵する。ペプチドライブラリーをｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端に融合させて、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）において発現させることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）を利用した別の方法を用いて、ペプチドグリカン関連リポタンパク質（ＰＡＬ）との融合により細胞の外膜上に表示できるようになる。以下、これら及び関連する方法を集合的に「Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ディスプレイ」と呼ぶ。別の方法では、ランダムなＲＮＡの翻訳をリボソーム放出の前で停止させて、それらの関連ＲＮＡがまだ結合しているポリペプチドのライブラリーを生じさせる。以下、この方法及び関連する方法をまとめて「リボソームディスプレイ」と呼ぶ。他の方法は、ＲＮＡへのペプチドの化学結合を使用する。例えば、ＲｏｂｅｒｔｓとＳｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  ｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４：１２２９７−３０３（１９９７）参照。以下、この方法及び関連する方法をまとめて「ＲＮＡペプチドスクリーニング」と呼ぶ。ペプチドがポリエチレンロッド又は溶媒透過性樹脂等の安定な非生物学的物質上に固定されている、化学的に誘導されるペプチドライブラリーが開発された。化学的に誘導される別のペプチドライブラリーは、スライドガラス上に固定されたペプチドを走査するためにフォトリソグラフィー（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）を用いる。以下、これらの方法及び関連する方法をまとめて「化学的ペプチドスクリーニング」と呼ぶ。化学的ペプチドスクリーニングは、Ｄ−アミノ酸及び他の非天然類似体、ならびに非ペプチドエレメントの使用を可能にするという点で有利である。生物学的方法及び化学的方法の両方がＷｅｌｌｓとＬｏｗｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：３５５−６２（１９９２）において総説されている。
【０１６０】
概念的には、ファージディスプレイ及び上述した他の方法を用いてあらゆるタンパク質のペプチドミメティックを発見し得る。これらの方法は、エピトープマッピングのため、タンパク質−タンパク質相互作用における重要なアミノ酸の同定のため、及び新規治療物質の発見のための手がかりとして使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｔｅｓｅら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７：６１６−２１（１９９６）参照。ペプチドライブラリーは現在、エピトープマッピング等の免疫学の研究において最も頻繁に使用されている。Ｋｒｅｅｇｅｒ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  １０（１３）：１９−２０（１９９６）参照。
【０１６１】
ファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって同定されたペプチドは、治療薬そのものとしてよりはむしろ治療薬の開発における「手がかり」とみなされてきた。他のタンパク質及びペプチドと同様に、それらは腎濾過、細網内皮系における細胞クリアランス機序又はタンパク質分解のいずれかによって、インビボで速やかに除去されると考えられる［Ｆｒａｎｃｉｓ、前出］。その結果、この技術分野では現在、薬剤標的の有効性を確認するため、又は化学的ライブラリースクリーニングを通してはそれほど容易に、又はそれほど速やかに同定されないであろう有機化合物設計のための骨格として、ペプチドが使用されている［Ｌｏｗｍａｎ、前出；Ｋａｙら、前出］。そのようなペプチドにより血管新生に対する治療薬がより容易に生み出され得るプロセスから、この技術分野に利益がもたらされる。
【０１６２】
ペプチボディーの構造
本発明に従って調製される組成物では、ペプチドは、そのペプチドのＮ末端又はＣ末端を介してビヒクルに結合され得る。従って、本発明のビヒクル−ペプチド分子は下記の５つの式及びその多量体によって表し得る：
【０１６３】
【表６】
2007524610.tif 000045
【０１６４】
式中、Ｆ１は、ビヒクル（好ましくはＦｃドメイン）であり；
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して：−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２、−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３及び−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４
（式中、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３及びＰ４は、各々独立して本明細書中で述べる薬理的に活性のあるペプチドの配列であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３及びＬ４は、各々独立してリンカーである。）
から選択され；
「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」、「ｅ」及び「ｆ」は、「ａ」及び「ｂ」の少なくとも１つが１であることを条件として、各々独立して０又は１である。
【０１６５】
ペプチド
本発明は、Ａｎｇ−２に選択的に、又は特異的に結合するペプチドを考慮する。いかなる数のそのようなペプチドも本発明に関連して使用し得る。ファージディスプレイは、とりわけ、ランダムペプチドのライブラリーからのアフィニティー選択を使用していかなる遺伝子産物のいかなる部位についてのペプチドリガンドも特定できることが示されたように、本発明において使用するためのペプチドを生成する上で有用である。Ｄｅｄｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０２５−３０（１９９３）。
【０１６６】
本発明におけるペプチドは、この技術分野において開示されている方法のいずれかによって調製され得る。１文字アミノ酸略語を使用する。何らかの配列中の「Ｘ」（及び特定の場合における別段の規定がない限り、本明細書全体を通じて）は、２０種類の天然に生じるアミノ酸残基のいずれか又は何らかの非天然に生じるアミノ酸（下記の「変異体」の章で述べる。）が存在し得ることを意味する。これらのペプチドのいずれかは、リンカーと共に、又はリンカーなしで、縦列に（すなわち連続的に）連結され得、縦列連結の例は表に示されている。リンカーは「Ｌ」として列挙されており、本明細書中で述べるリンカーのいずれであってもよい。明確にするために縦列反復配列とリンカーはダッシュで分けて示している。システイニル残基を含むいずれのペプチドも、別のＣｙｓ含有ペプチドと架橋され得、そのいずれか又は両方がビヒクルに連結し得る。２個以上のＣｙｓ残基を有するペプチドは、ペプチド内ジスルフィド結合も形成し得る。これらのペプチドのいずれもが本明細書中で述べるように誘導体化され得る。カルボキシル末端がアミノ基でキャップされ得る誘導体については、そのキャップアミノ酸は−ＮＨ２である。アミノ酸残基がアミノ酸残基以外の成分で置換される誘導体については、その置換基はＳで表わされ、Ｂｈａｔｎａｇａｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４−９（１９９６）、及びＣｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０：２８７６−８２（１９９７）（参考として本明細書中に援用する。）に述べられている成分のいずれかを意味する。ペプチドは全て、特に別段の記載がない限り、ペプチド結合を介して連結される。
【０１６７】
ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅｓ）
１つの実施形態において、本発明は、そのペプチドのＮ末端、Ｃ末端又はそのペプチドのアミノ酸残基の１個の側鎖を介して少なくとも１つのビヒクル（Ｆ１、Ｆ２）に結合される少なくとも１個のペプチドを提供する。複数のビヒクルも使用し得る；例えば各々の末端のＦｃ、又は１つの末端のＦｃと他方の末端又は側鎖のＰＥＧ基である。
【０１６８】
Ｆｃドメインは、１つの好ましいビヒクルである。Ｆｃドメインは、ペプチドのＮ又はＣ末端に、又はＮ末端とＣ末端の両方に融合され得る。
【０１６９】
上述したように、Ｆｃ変異体は本発明の範囲内の適切なビヒクルである。ネイティブＦｃは、サルベージ受容体への結合が維持されることを条件として、本発明によるＦｃ変異体を形成するために広汎に修飾され得る。例えばＷＯ９７／３４６３１号及びＷＯ９６／３２４７８号参照。そのようなＦｃ変異体においては、本発明の融合分子には必要でない構造的特徴又は機能的活性を与えるネイティブＦｃの１つ又は複数の部位が除去され得る。これらの部位は、例えば残基を置換するか又は欠失させる、残基をその部位に挿入する、又はその部位を含む部分を切り取ることによって除去し得る。挿入又は置換残基はまた、ペプチドミメティック又はＤ−アミノ酸等の変化したアミノ酸でもあり得る。Ｆｃ変異体は、多くの理由から望ましいと考えられるが、そのいくつかを下記で述べる。代表的なＦｃ変異体には次のような分子及び配列が含まれる：
１．ジスルフィド結合の形成に関与する部位が除去されている。そのように除去を行うことにより、本発明分子を産生させるために使用する宿主細胞中に存在する、他のシステイン含有タンパク質との反応が回避され得る。このために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントを切り取るか、又はシステイン残基を欠失させる、又は他のアミノ酸（例えばアラニル、セリル）で置換し得る。システイン残基が除去されている場合でも、一本鎖Ｆｃドメインはなお、非共有結合的に結合保持される二量体Ｆｃドメインを形成できる。
【０１７０】
２．ネイティブＦｃが、選択した宿主細胞とより適合するように修飾されている。例えば、プロリンイミノペプチダーゼ等のＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）内の消化酵素によって認識され得る、典型的なネイティブＦｃのＮ末端近くのＰＡ配列を除去し得る。また、特にその分子がＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）等の細菌細胞において組換え発現されるときは、Ｎ末端メチオニル残基を付加することもできる。
【０１７１】
３．選択した宿主細胞において発現された場合にＮ末端が不均一になることを防ぐためにネイティブＦｃのＮ末端の一部が除去されている。このために、Ｎ末端の最初の２０アミノ酸残基のいずれか、特に１、２、３、４及び５番の位置のものを欠失させ得る。
【０１７２】
４．１又は複数のグリコシル化部位が除去されている。通常、グリコシル化される残基（例えばアスパラギン）は細胞溶解応答を付与し得る。そのような残基を欠失させるか、又は非グリコシル化残基（例えばアラニン）で置換し得る。
【０１７３】
５．Ｃ１ｑ結合部位等の、相補物との相互作用に関与する部位が除去されている。例えば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を欠失させるか、又は置換し得る。相補物の動員は本発明の分子にとって有益ではないと考えられ、それ故そのようなＦｃ変異体で回避し得る。
【０１７４】
６．サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合に影響を及ぼす部位が除去されている。ネイティブＦｃは、本発明の融合分子には必要でないある種の白血球との相互作用のための部位を有すると考えられ、そのため除去し得る。
【０１７５】
７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位はこの技術分野において既知である。例えば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関してはＭｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３−９（１９９２）参照。これらの部位もやはり、本発明の融合分子には必要でないため、除去し得る。
【０１７６】
８．ネイティブＦｃが非ヒト抗体由来である場合、ネイティブＦｃをヒト化し得る。通常、ネイティブＦｃをヒト化するために、非ヒトネイティブＦｃ中の選択された残基を、ヒトネイティブＦｃにおいて通常認められる残基で置換する。抗体のヒト化のための手法はこの技術分野において公知である。
【０１７７】
選択的ビヒクルは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片又はサルベージ受容体に結合することができる小分子（例えばペプチドミメティック化合物）となろう。例えば、Ｐｒｅｓｔａらへの１９９８年４月１４日発行の米国特許第５，７３９，２７７号に述べられているポリペプチドをビヒクルとして使用することができる。ペプチドはまた、ＦｃＲｎサルベージ受容体への結合に関するファージディスプレイにより選択することもできる。そのようなサルベージ受容体結合化合物も「ビヒクル」の意味に含まれ、本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、半減期が長いこと（例えばプロテアーゼによって認識される配列を避けることによって）及び免疫原性が低いこと（例えば抗体ヒト化において見られるような、非免疫原性配列を優先することによって）により選択すべきである。
【０１７８】
上述したように、重合体ビヒクルもＦ１及びＦ２に対して使用され得る。ビヒクルとして有用な化学的成分を結合するための様々な手段が現在使用可能であり、例えば、その全体を参考として本明細書に援用する、「Ｎ末端化学修飾タンパク質組成物及び方法（Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）」と題された特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開広報ＷＯ９６／１１９５３号参照。このＰＣＴ出願は、中でも特に、タンパク質のＮ末端への水溶性重合体の選択的結合を開示している。
【０１７９】
好ましい重合体ビヒクルはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ群はいかなる好都合な分子量でもあり得、線状又は分枝のいずれでもあり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤａ」）から約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ−約５０ｋＤａ、最も好ましくは約５ｋＤａ−約１０ｋＤａの範囲である。ＰＥＧ群は一般に、ＰＥＧ成分上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ、チオール又はエステル基）を介した、本発明の化合物上の反応基（例えばアルデヒド、アミノ又はエステル基）へのアシル化又は還元的アルキル化によって本発明の化合物に結合する。
【０１８０】
合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略は、溶液中で共役結合を形成することを介して、各々他方に対して相互に反応性である特別な官能性を担う、ペプチドとＰＥＧ成分を結合することからなる。前記ペプチドは、この技術分野で公知の従来の固相合成によって容易に調製できる。そのペプチドを特定部位で適切な官能基によって「事前に活性化（ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ）」する。その前駆物質を精製し、ＰＥＧ成分と反応させる前に十分に特性を明らかにする。ペプチドとＰＥＧの連結は通常水相で起こり、逆相分析的ＨＰＬＣによって容易にモニターできる。ＰＥＧ化したペプチドは分取ＨＰＬＣによって容易に精製でき、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析及びレーザー脱離質量分析によって特性を明らかにすることができる。
【０１８１】
多糖類重合体は、タンパク質修飾のために使用し得る別のタイプの水溶性重合体である。デキストランは、主としてａ１−６結合によって連結されたグルコースの個々のサブユニットからなる多糖類重合体である。デキストラン自体は多くの分子量範囲内で入手可能であり、約１ｋＤａから約７０ｋＤａの分子量で容易に入手できる。デキストランは、それだけで、又は別のビヒクル（例えばＦｃ）と組み合わせて、ビヒクルとして本発明において使用するのに適した水溶性重合体である。例えば、ＷＯ９６／１１９５３号及びＷＯ９６／０５３０９号参照。治療用又は診断用免疫グロブリンに共役させられたデキストランの使用が報告されている；例えば、参照により、本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第０３１５４５６号を参照。デキストランを本発明に従ってビヒクルとして使用する場合は、約１ｋＤａから約２０ｋＤａのデキストランが好ましい。
【０１８２】
リンカー
いかなる「リンカー」基も任意である。存在する場合は、主としてスペーサーとして働くので、その化学構造は非常に重要というわけではない。リンカーは、好ましくはペプチド結合によって共に連結されたアミノ酸で構成される。従って、好ましい実施形態において、リンカーはペプチド結合によって連結された１個から２０個のアミノ酸で構成され、それらのアミノ酸は２０種類の天然に生じるアミノ酸から選択される。当業者には十分に理解されるように、これらのアミノ酸の１個又は複数がグリコシル化され得る。より好ましい実施形態において、１個から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン及びリシンから選択される。さらに一層好ましくは、リンカーは、グリシン及びアラニン等の立体障害されないアミノ酸が大部分を占めるように構成される。それ故、好ましいリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）及びポリアラニンである。ＧｌｙとＡｌａの組合せもまた、本明細書においてＫ１と呼ぶ、本明細書中の実施例において示すアミノ酸配列を有するリンカーと同様に好ましい。
【０１８３】
非ペプチドリンカーも可能である。例えば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−［式中、ｓ＝２−２０］等のアルキルリンカーが使用できる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル（例えばＣ１−Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニル等のあらゆる非立体障害基によってさらに置換され得る。一般的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカーであり、１００−５０００ｋＤａ、好ましくは１００−５００ｋＤａの分子量を有する。ペプチドリンカーは、上述と同様に誘導体を形成するように変化させ得る。
【０１８４】
変異体及び誘導体
特異的結合物質の変異体及び誘導体は本発明の範囲内に含まれる。挿入、欠失及び置換変異体が変異体に包含される。本発明の特定の特異的結合物質が１、２又は３種類全ての変異体を含み得ることは明白である。挿入及び置換変異体は、天然アミノ酸、特殊なアミノ酸（下記で述べるような）又はその両方を含み得る。
【０１８５】
一例では、天然に生じる、又は特殊なアミノ酸のいずれかの１個又は複数のアミノ酸残基がペプチド又はペプチボディーのアミノ酸配列を補足する、挿入変異体が提供される。挿入は、タンパク質のいずれか一方又は両方の末端に位置するか、又はペプチボディーアミノ酸配列の内部領域内に位置し得る。いずれか一方又は両方の末端に付加残基を有する挿入変異体には、例えば、融合タンパク質及びアミノ酸タグ又は標識を含むタンパク質が含まれ得る。挿入変異体には、１個又は複数のアミノ酸残基がペプチド又はペプチボディーアミノ酸配列に付加されているペプチド及びペプチボディー又はその断片が含まれる。
【０１８６】
本発明の変異体産物にはまた、リーダー又はシグナル配列が除去されており、その結果得られるタンパク質が付加的なアミノ末端残基を有し、そのアミノ酸が天然又は非天然であり得る、成熟ペプチド及びペプチボディーが含まれる。−２及び−１の位置に付加的なメチオニン及びリシン残基を有する特異的結合物質（Ｍｅｔ−２−Ｌｙｓ−１−）と同様に、−１のアミノ酸位置に付加的なメチオニル残基を有する特異的結合物質（ペプチボディー等）（Ｍｅｔ−１−ペプチボディー）が考慮される。付加的なＭｅｔ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ残基（又は一般に１個又は複数の塩基性残基）を有する変異体は、細菌宿主細胞における組換えタンパク質産生を促進するために特に有用である。
【０１８７】
本発明はまた、特定発現系を使用することにより生じる付加的なアミノ酸残基を有する特異的結合物質変異体を包含する。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合産物の一部として所望するポリペプチドを発現する市販のベクターを使用することにより、所望するポリペプチドからＧＳＴ成分を切断した後、−１アミノ酸位置に付加的なグリシン残基を有する所望のポリペプチドが得られる。ポリ−ヒスチジンタグが通常アミノ酸配列のカルボキシ及び／又はアミノ末端でアミノ酸配列に組み込まれているものを含む、他のベクター系における発現から生じる変異体も考慮される。
【０１８８】
挿入変異体にはまた、ペプチド又はペプチボディーのアミノ及び／又はカルボキシ末端が別のポリペプチド、その断片又は一般に何らかの特定タンパク質配列の一部であるとは認識されないアミノ酸に融合している融合タンパク質も含まれる。そのような融合タンパク質の例は、免疫原性ポリペプチド、免疫グロブリン定常領域等の長い循環半減期を有するタンパク質、マーカータンパク質、所望するペプチド又はペプチボディーの精製を容易にするタンパク質又はポリペプチド、及び多量体タンパク質の形成を促進するポリペプチド配列（二量体の形成／安定性において有用なロイシンジッパーモチーフ等）である。
【０１８９】
この種の挿入変異体は一般に、Ｎ又はＣ末端で第二のポリペプチドの全部又は一部に連結されたネイティブ分子の全部又は実質的な部分を有する。例えば、融合タンパク質は通常、異種宿主におけるタンパク質の組換え発現を可能にする他の種由来のリーダー配列を使用する。別の有用な融合タンパク質には、その融合タンパク質の精製を容易にするための、抗体エピトープ等の免疫学的に活性等メインの付加を含む。融合の接合点又はその近くに切断部位を含むことにより、精製後の外来性ポリペプチドの除去が容易になる。他の有用な融合には、酵素からの活性部位等の機能的ドメイン、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル又は膜貫通領域の連結が含まれる。
【０１９０】
本発明において使用し得る様々な市販の融合タンパク質発現系が存在する。特に有用な系には、これらに限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、マルトース結合タンパク質系（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、ＦＬＡＧ系（ＩＢＩ，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）、及び６ｘＨｉｓ系（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）が含まれる。これらの系は、そのペプチド又はペプチボディーの活性に著しい影響を及ぼさないと考えられる、少数の付加的なアミノ酸のみを担う組換えペプチド及び／又はペプチボディーを産生することができる。例えば、ＦＬＡＧ系及び６ｘＨｉｓ系は、その両方が抗原性が低いことが知られており、ポリペプチドのそのネイティブの立体配座への折りたたみに有害な作用を及ぼさない短い配列のみを付加する。有用と考えられる別のＮ末端融合は、タンパク質又はペプチドのＮ末端領域におけるＭｅｔ−Ｌｙｓジペプチドの融合である。そのような融合により、タンパク質の発現又は活性が有利に上昇し得る。
【０１９１】
他の融合系は、所望するペプチド又はペプチボディーから融合パートナーを切り出すことが望ましいポリペプチドハイブリッドを産生する。ある実施形態において、融合パートナーは、プロテアーゼについての特異的認識配列を含むペプチド配列によって組換えペプチボディーに連結される。適切な配列の例は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）又は第Ｘａ因子（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｒｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によって認識されるものである。
【０１９２】
本発明はまた、短縮型組織因子（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ、ｔＴＦ）と組み合わせて、本発明のペプチボディー又はペプチドの全部又は一部を含む融合ポリペプチドを提供する。ｔＴＦは、米国特許第５，８７７，２８９号；同第６，００４，５５５号；同第６，１３２，７２９号；同第６，１３２，７３０号；同第６，１５６，３２１号；及び欧州特許第ＥＰ０９８８０５６号に述べられているように、腫瘍血管凝固物質として働くヒト凝固誘導タンパク質の短縮型からなる、腫瘍血管標的化合物である。抗Ａｎｇ−２ペプチボディー若しくはペプチド又はその断片へのｔＴＦの融合により、標的細胞への抗Ａｎｇ−２の送達が促進される。
【０１９３】
別の局面において、本発明は、ペプチド又はペプチボディー内の１個又は複数のアミノ酸残基が除去されている欠失変異体を提供する。欠失は、ペプチボディーの一方又は両方の末端において、又はペプチボディーアミノ酸配列内の１個又は複数の残基を除去することにより実施できる。欠失変異体には必然的にペプチド又はペプチボディーの全ての断片が含まれる。
【０１９４】
さらに別の局面において、本発明は、本発明のペプチド及びペプチボディーの置換変異体を提供する。置換変異体には、１個又は複数のアミノ酸残基が除去されて、天然又は非天然に生じるものであり得る、１個又は複数の代替アミノ酸で置換されているペプチド及びペプチボディーが含まれる。置換変異体は、その２個の分子がある程度の割合の同一アミノ酸を有するという点で、元のペプチド又はペプチボディーに「類似」するペプチド又はペプチボディーを生じる。置換変異体は、ペプチド又はペプチボディー内に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個のアミノ酸の置換を含み、置換の数は該ペプチド又はペプチボディーのアミノ酸の１０％以上までであり得る。ある局面において、置換は本来保存的であるが、本発明は非保存的である置換も包含し、また特殊なアミノ酸も含む。
【０１９５】
関連ペプチド及びペプチボディーの同一性及び類似性は既知の方法によって容易に算定できる。そのような方法は、これらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に述べられているものが含まれる。
【０１９６】
２個のペプチド又はペプチボディー、又はポリペプチドとペプチドの関連性又は同一性の割合を決定するための好ましい方法は、検討する配列の間で最大の対合を与えるように設計される。同一性を決定するための方法は、公に使用可能なコンピュータプログラムの中に述べられている。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法には、これらに限定されないが、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出（１９９０））より公に入手可能である。公知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
【０１９７】
２個のアミノ酸配列を整合させるためのアラインメントスキームは、この２つの配列の短い領域のみの一致を生じることがあり、その２つの完全長配列の間に重要な関係がない場合でも、この小さな整合領域が非常に高い配列同一性を有し得る。従って、ある一部の実施形態において、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、比較する標的ポリペプチドの完全長の少なくとも１０％に及ぶアラインメント、すなわち少なくとも４００アミノ酸の配列を比較する場合は少なくとも４０個の隣接アミノ酸、少なくとも３００から約４００アミノ酸の配列を比較する場合は３０個の隣接アミノ酸、２００から約３００アミノ酸の配列を比較する場合は少なくとも２０個の隣接アミノ酸、約１００から２００アミノ酸の配列を比較する場合は少なくとも１０個の隣接アミノ酸、のアラインメントを生じる。
【０１９８】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、パーセント配列同一性を決定しようとする２個のポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸の一致が最大になるように（アルゴリズムによって決定される「一致範囲（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」）整合させる。ある一部の実施形態において、ギャップ開始ペナルティー（通常、３Ｘ平均対角線として計算される；「平均対角線」は、使用する比較マトリックスの対角線の平均値である；「対角線」は、個々の比較マトリックスによって各々完全なアミノ酸照合に割り当てられるスコア又は数値である。）及びギャップ伸長ペナルティー（通常ギャップ開始ペナルティーの１／１０である。）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２等の比較マトリックスをこのアルゴリズムと共に使用する。ある一部の実施形態において、標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスに関しては、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５（３）（１９７８）；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照のこと。）もこのアルゴリズムによって使用される。
【０１９９】
ある実施形態において、ポリペプチド配列比較のためのパラメータには次のものが含まれる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関して有用であり得る。ある一部実施形態において、上記のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用したポリペプチド比較のための初期設定パラメータ（末端ギャップについてのペナルティーなし。）である。
【０２００】
ある実施形態において、ポリヌクレオチド分子配列（アミノ酸配列に対して）比較に関するパラメータには次のものが含まれる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、前出（１９７０）；
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関しても有用であり得る。上記のパラメータは、ポリヌクレオチド分子比較のための初期設定パラメータである。
【０２０１】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，バージョン９、１９９７年９月に述べられているものを含む、他の具体例としてのアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較マトリックス、類似性の閾値等も使用し得る。行うべき個々の選択は当業者には明白であり、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ等の実施する特定の比較及びそれに加えて、比較を所与の配列の対の間で行うか（この場合は一般にＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが好ましい。）又は１個の配列と大きな配列データベースの間で行うか（この場合はＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい。）に依存する。
【０２０２】
本明細書中で使用される場合、２０種類の通常のアミノ酸及びそれらの略語は慣例的用法に従う。あらゆる目的のために参照により、本明細書に組み込まれる、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ―Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ及びＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編集、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照。
【０２０３】
アミノ酸はＬ型又はＤ型の立体配置のいずれかを有しており（Ｇｌｙを除く、ＧｌｙはＬでもＤでもない。）、本発明のポリペプチド及び組成物は立体配置の組合せを含み得る。しかし、Ｌ立体配置が好ましい。本発明はまた、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端への配列が逆転している逆の分子（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を提供する。例えば、正常配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３を有する分子の逆は、Ｘ３−Ｘ２−Ｘ１である。本発明はまた、上記のように、アミノ酸のアミノ末端からカルボキシ末端への配列が逆転しており、且つ通常「Ｌ」鏡像異性体である残基が「Ｄ」立体異性体に変化しているレトロ逆分子を提供する。
【０２０４】
２０種類の通常アミノ酸、α−，α−２置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の特殊なアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。特殊なアミノ酸の例には、これらに限定されないが、アミノアジピン酸、β−アラニン、β−アミノプロピオン酸、アミノ酪酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸、アミノへプタン酸、アミノイソ酪酸、アミノピメリン酸、ジアミノ酪酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリシン、アロヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ−メチルグリシン、サルコシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン及び他の類似アミノ酸及びアミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。
【０２０５】
同様に、特に別段の規定がない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’方向と呼ぶ。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向を転写方向と呼ぶ；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写産物の５’側から５’末端にあるＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列」と呼ぶ；ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写産物の３’側から３’末端にあるＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と呼ぶ。
【０２０６】
アミノ酸残基がそれらの共通の側鎖特性に基づくクラスに分類できることを理解されたい：
１．中性疎水性：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）及びメチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）。
【０２０７】
２．中性極性：グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｕ；Ｑ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）及びノルロイシン。
【０２０８】
３．酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）。
【０２０９】
４．塩基性：リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）。
【０２１０】
Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．，Ｇｅｎｅｓ Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４），ｐ．１１参照。
【０２１１】
保存的アミノ酸置換は、通常、生物系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、特殊なアミノ酸残基を包含し得る。これらには、以下のものに限定されないが、ペプチドミメティック及び他の逆又は逆転形態のアミノ酸成分が含まれる。非保存的置換は、これらのクラスの１つの成員が別のクラスの成員に交換されることを含み得る。
【０２１２】
そのような変更を行う場合、ある一部の実施形態によれば、アミノ酸のハイドロパシー指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｄｅｘ）を考慮し得る。各アミノ酸には、その疎水性及び電荷特性に基づいてハイドロパシー指標が割り当てられている。それらは：イソロイン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【０２１３】
タンパク質に相互作用性生物学的機能を付与する上でのアミノ酸のハイドロパシー指標の重要性はこの技術分野において理解されている。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。ある一定のアミノ酸は、類似したハイドロパシー指標又はスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、置換後もなお同様の生物活性が保持され得ることが知られている。ハイドロパシー指標に基づいて変更を行う場合、ある一部の実施形態において、そのハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。ある一部の実施形態において、±１以内であるものが含まれ、またある一部の実施形態において、±０．５以内であるものが含まれる。
【０２１４】
また、類似アミノ酸の置換は、特に、本発明の場合のように、それによって生成される生物学的機能を有するペプチボディー又はペプチドが免疫学的実施形態における使用を意図されるものである場合は、親水性に基づいて有効に実施し得ることも、この技術分野において理解されている。ある一部の実施形態において、その隣接アミノ酸の親水性に支配される、タンパク質の最大局所的平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【０２１５】
次のような親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；及びトリプトファン（−３．４）。類似する親水性値に基づいて変更を行う場合、ある一部の実施形態において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある一部の実施形態において、±１以内であるものが含まれ、またある一部の実施形態において、±０．５以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定し得る。これらの領域は「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【０２１６】
具体例としてのアミノ酸置換を下記の表２に示す。
【０２１７】
【表７】
2007524610.tif 000046
【０２１８】
当業者は、公知の手法を使用して本明細書中で述べるようなポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。ある一部の実施形態において、当業者は、活性にとって重要ではないと考えられる領域を標的することにより、活性を破壊することなく変更され得る分子の適切な領域を同定し得る。ある一部の実施形態において、類似ペプチド又はポリペプチド間で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。ある一部の実施形態において、生物活性にとって、又は構造にとって重要と考えられる領域でさえも、生物活性を破壊することなく、又はポリペプチド構造に有害な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【０２１９】
加えて、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似ポリペプチド内の残基を同定する構造−機能試験を検討することができる。そのような比較に鑑みて、類似タンパク質における活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、あるタンパク質におけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測上の重要アミノ酸残基に関して化学的に類似するアミノ酸置換を選択し得る。
【０２２０】
当業者はまた、類似ポリペプチドにおける構造に関連付けて三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。そのような情報に鑑みて、当業者は、その三次元構造に関する抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。ある一部の実施形態において、当業者は、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基に根本的な変化を加えないことを選択し得る。そのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与すると考えられるからである。さらに、当業者は、各所望アミノ酸残基における１個のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成し得る。次に、その変異体を、当業者にとって公知の活性アッセイを使用してスクリーニングすることができる。そのような変異体を、適切な変異体についての情報を収集するために使用し得る。例えば、特定のアミノ酸残基へと変更することにより活性が破壊される、不適切に活性が低下する、又は不適切な活性がもたらされることを発見した場合は、そのような変更を有する変異体を回避し得る。つまり、そのような通常行われる実験から収集した情報に基づいて、当業者は、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、さらなる置換を避けるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【０２２１】
二次構造の予測に関する学術公表文献が数多くある。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｃｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。さらに、二次構造の予測を促進するために、現在、コンピュータプログラムを利用することができる。二次構造を予測するある方法は、ホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、類似した構造トポロジーを有することが多い。近年のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発展により、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の潜在的な折りたたみ数をはじめとして、二次構造の予測能力が高まった。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）参照。あるポリペプチド又はタンパク質内の折りたたみ数は限られた数であること、及びひとたび重要な数の構造が解明されれば、構造予測が劇的に正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング法」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，前出（１９９９）、及びＢｒｅｎｎｅｒ，前出（１９９７））が含まれる。
【０２２２】
ある実施形態において、ペプチボディー変異体には、Ｎ−結合グリコシル化部位等の１つ又は複数のグリコシル化部位がそのペプチボディーに付加されたグリコシル化変異体が含まれる。Ｎ−結合グリコシル化部位の特徴は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ（式中、Ｘで表されるアミノ酸残基はプロリン以外のいかなるアミノ酸残基でもよい。）である。この配列を生成させるためのアミノ酸残基の置換又は付加により、Ｎ−結合型糖鎖の付加のための新しい候補部位が得られる。あるいは、この配列を排除する置換により、既存のＮ−結合糖質鎖が除去される。また、１つ又は複数のＮ−結合グリコシル化部位（通常、天然に生じるもの）を排除し、１つ又は複数の新しいＮ−結合部位が生成されるような、Ｎ−結合糖鎖の再配列ももたらされる。
【０２２３】
本発明はまた、アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換以外の又はそれらに加えて、修飾が施されたペプチボディーを含む「誘導体」を提供する。好ましくは、その修飾は本来共有結合であり、例えば、重合体、脂質、他の有機及び無機成分との化学結合が含まれる。本発明の誘導体は、ペプチボディーの循環半減期を延ばすように調製され得るか、又は所望する細胞、組織又は器官に対するペプチボディーのターゲティング能力を向上させるように設計され得る。
【０２２４】
具体例としての誘導体には、次の修飾の１つ又は複数が為されている成分が含まれる：
・ペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合の１つ又は複数が、−ＣＨ２−カルバメート結合［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］；ホスホネート結合；−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］結合；尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］結合；−ＣＨ２−二級アミン結合；又はアルキル化ペプチジル結合［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−（式中、Ｒ６は低級アルキルである。）］等の非ペプチジル結合によって置換されている。
【０２２５】
・Ｎ末端が、−ＮＲＲ１基；−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ基；−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ基；−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ基；−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ基（式中、Ｒ及びＲ１は、ＲとＲ１の両方同時に水素ではないことを条件として、水素又は低級アルキルである。）；スクシニミド基；ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）基；又はフェニル環上に低級アルキル、低級アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群より選択される１個から３個の置換基を有するベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−基に誘導体化されているペプチド；及び
・遊離Ｃ末端が−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（式中、Ｒ２は、低級アルコキシ及び−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３及びＲ４は水素及び低級アルキルからなる群より独立して選択される。）からなる群より選択される。）に誘導体化されているペプチド。「低級」とは、１個から６個の炭素原子を有する基を意味する。
【０２２６】
さらに、個々のアミノ酸の修飾は、選択した側鎖又は末端残基と反応することができる有機誘導体化試薬とペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることによって、本発明のポリペプチド又は組成物に導入され得る。下記はその具体例である：
リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応し得る。これらの物質による誘導体化はリシニル残基の電荷を逆転させる作用を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデート等のイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロ水素化ホウ素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０２２７】
アルギニル残基は、１個又は複数の従来の試薬、中でも特にフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応によって修飾され得る。アルギニン残基の誘導体化では、グアニジン官能基のｐＫａが高いので、アルカリ性条件下で反応を実施することが必要とされる。さらに、これらの試薬はリシンの基ならびにアルギニングアニジノ基と反応し得る。
【０２２８】
チロシン残基の特異的修飾はそれ自体広く研究されており、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心が寄せられている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成し得る。
【０２２９】
カルボニル側鎖（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等のカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾し得る。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換され得る。
【０２３０】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、しばしば対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基を弱酸性条件下で脱アミド化し得る。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
【０２３１】
二官能性物質による誘導体化は、ペプチド又はそれらの機能性誘導体を水不溶性支持マトリックス又は他の高分子担体に架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤には、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタールアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）等のジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化糖質等の反応性水不溶性マトリックス及び米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に述べられている反応性基質がタンパク質の固定化のために使用され得る。
【０２３２】
他の可能な修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ末端アミンのアセチル化及び、一部の例では、Ｃ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。
【０２３３】
そのような誘導体化成分により、好ましくは、その化合物の抗血管新生作用、溶解度、吸収、生物学的半減期等を含む１つ又は複数の特性が向上する。あるいは、誘導体化成分は、誘導体化されない化合物と同じか又は基本的に同じ特徴及び／又は特性を有する化合物を生じ得る。それらの成分は、あるいは、その化合物の望ましくない副作用等を排除し得るか、又は減じ得る。
【０２３４】
本発明の化合物はＤＮＡレベルでも変化させ得る。該化合物のいずれかの部分のＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞とより適合するコドンに変更し得る。好ましい宿主細胞であるＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）については、最適化コドンはこの技術分野において既知である。制限部位を排除するように、又は、サイレント制限部位（ｓｉｌｅｎｔ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ）を含むようにコドンを置換することができるが、これは選択宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングに役立つ。前記の配列変化のいずれかを含むようにビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列を修飾し得る。従って、本明細書中で論じる全ての修飾、置換、誘導体化等は、これらに限定されないが、ペプチド、ペプチド二量体及び多量体、リンカー及びビヒクルを含む、本発明の全ての局面に等しく適用される。
【０２３５】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要である類似ポリペプチド内の残基を同定する構造−機能研究を検討することができる。そのような比較に鑑みて、あるタンパク質内の、類似タンパク質内の活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応するペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、ペプチドにおけるそのような予測上の重要アミノ酸残基に関して化学的に類似するアミノ酸置換を選択し得る。
【０２３６】
当業者はまた、類似ポリペプチドにおける構造に関連付けて三次元構造及びアミノ酸配列を分析することもできる。そのような情報に鑑みて、当業者は、その三次元構造に関するペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予測し得る。当業者は、タンパク質の表面上に存在すると予測されるアミノ酸残基に根本的な変化を加えないよう選択し得る。そのような残基は他の分子との重要な相互作用に関与すると考えられるからである。さらに、当業者は、所望する各アミノ酸残基における１個のアミノ酸置換を含む試験変異体を生成させ得る。次にその変異体を、当業者にとって公知の活性アッセイを使用してスクリーニングすることができる。そのようなデータは、適切な変異体についての情報を収集するために使用できる。例えば、特定アミノ酸残基への変更により、活性が破壊される、不適切に活性が低下する、又は不適切な活性がもたらされることが発見された場合は、そのような変更を有する変異体は回避される。つまり、そのような通常の実験から収集した情報に基づいて、当業者は、単独で又は他の突然変異と組み合わせて、さらなる置換を避けるべきアミノ酸を容易に決定することができる。
【０２３７】
二次構造の予測に関する多くの学術公表文献がある。Ｍｏｕｌｔ  Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｃｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。さらに、二次構造の予測を促進するために、現在、コンピュータプログラムを利用することができる。二次構造を予測するある方法は、ホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％を超える配列同一性又は４０％を超える類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、類似した構造トポロジーを有することが多い。近年のタンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の発展により、ポリペプチド又はタンパク質の構造内の潜在的な折りたたみ数をはじめとして、二次構造の予測能力が高まった。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）参照。あるポリペプチド又はタンパク質内の折りたたみ数は限られた数であること、及びひとたび重要な数の構造が解明されれば、構造予測が劇的に正確になることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３６９−３７６（１９９７））
二次構造を予測するさらなる方法には、「スレッディング法」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ，前出（１９９９）、及びＢｒｅｎｎｅｒ，前出（１９９７））が含まれる。
【０２３８】
本発明はさらに、誘導特異的結合物質、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号；及び同第４，１７９，３３７号に述べられているような、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコール等の１個又は複数の水溶性重合体結合物を含むように共有結合修飾されたペプチボディーを包含する。この技術分野で既知のさらなる他の有用な重合体には、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース又は他の糖質ベースの重合体、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモ重合体、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）及びポリビニルアルコール、ならびにこれらの重合体の混合物が含まれる。特に好ましいのは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）サブユニットで共有結合修飾されたペプチボディーである。水溶性重合体は、特定位置で、例えばペプチボディーのアミノ末端で結合し得るか、又はポリペプチドの１つ又は複数の側鎖にランダムに結合し得る。特異的結合物質、例えばペプチボディー、及び特にヒト化抗体の治療能力を向上させるためのＰＥＧの使用は、２０００年１０月１７日発行のＧｏｎｚａｌｅｓらへの米国特許第６，１３３，４２６号に述べられている。
【０２３９】
本発明はまた、化合物のペプチド及び／又はビヒクル部分を誘導体化することを考慮する。そのような誘導体は、化合物の溶解度、吸収、生物学的半減期等を向上させ得る。それらの成分は、あるいは、該化合物の望ましくない副作用等を排除し得るか、又は減じ得る。具体例としての誘導体には、次のような化合物が含まれる：
１．化合物又はその何らかの部分が環状である。例えば、ペプチド部分を、ジスルフィド結合の形成によって環化できる、２個以上のＣｙｓ残基を含むように（例えばリンカー内に）修飾し得る。
【０２４０】
２．化合物が架橋されている、又は分子間で架橋できるようになっている。例えば、１個のＣｙｓ残基を含み、それによって同様の分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができるように、ペプチド部分を修飾し得る。その化合物はまた、そのＣ末端を介して架橋され得る。
【０２４１】
３．１個又は複数のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合が非ペプチジル結合によって置換されている。具体例としての非ペプチジル結合は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−二級アミン及びアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−（式中、Ｒ６は低級アルキルである。）］である。
【０２４２】
４．Ｎ末端が誘導体化されている。通常は、Ｎ末端はアシル化されるか、又は置換アミンに修飾され得る。具体例としてのＮ末端誘導体基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシニミド又はベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）、（式中Ｒ及びＲ１は、各々独立して水素又は低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、クロロ及びブロモからなる群より選択される１個から３個の置換基で置換され得る。）が含まれる。
【０２４３】
５．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。通常は、Ｃ末端はエステル化されるか、又はアミド化される。例えば、この技術分野で記述されている方法を使用して、Ｃ末端で本発明の化合物に（ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ２）２を付加し得る。同様に、この技術分野で記述されている方法を使用して、Ｃ末端で本発明の化合物に−ＮＨ２を付加し得る。具体例としてのＣ末端誘導体基には、例えば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２（式中、Ｒ２は、低級アルコキシ又は−ＮＲ３Ｒ４（式中、Ｒ３及びＲ４は、独立して水素又はＣ１−Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１−Ｃ４アルキル）である。）である。）が含まれる。
【０２４４】
６．ジスルフィド結合が別の、好ましくはより安定な、架橋成分（例えばアルキレン）で置換されている。例えばＢｈａｔｎａｇａｒ（前出）；Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，３５７−９（１９９３）参照。
【０２４５】
７．１個又は複数の個々のアミノ酸残基が修飾されている。下記で詳述するように、様々な誘導体化剤が選択した側鎖又は末端残基と特異的に反応することが知られている。
【０２４６】
リシニル残基及びアミノ末端残基は、リシニル残基の電荷を逆転させる、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応し得る。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬には、メチルピコリンイミデート等のイミドエステル；ピリドキサルリン酸；ピリドキサル；クロロ水素化ホウ素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が含まれる。
【０２４７】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンを含む、１個又はいくつかの従来の試薬の組合せとの反応によって修飾され得る。アルギニン残基の誘導体化では、グアニジン官能基のｐＫａが高いので、アルカリ性条件下で反応を実施することが必要とされる。さらに、これらの試薬はリシンの基ならびにアルギニンε−アミノ基と反応し得る。
【０２４８】
チロシン残基の特異的修飾はそれ自体広く研究されており、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに特に関心が寄せられている。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成し得る。
【０２４９】
カルボニル側鎖基（アスパルチル又はグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド等のカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され得る。さらに、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基に変換され得る。
【０２５０】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、対応するグルタミル及びアスパルチル残基に脱アミド化され得る。あるいは、これらの残基を弱酸性条件下で脱アミド化し得る。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
【０２５１】
システイニル残基は、アミノ酸残基又はジスルフィド結合を除去するための、又は逆に、架橋を安定化するための他の成分によって置換され得る。例えばＢｈａｔｎａｇａｒ（前出）参照。
【０２５２】
二官能性物質による誘導体化は、ペプチド又はそれらの機能性誘導体を水不溶性支持マトリックス又は他の高分子ビヒクルに架橋するために有用である。一般的に使用される架橋剤には、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタールアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）等のジスクシニミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミドが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化糖質等の反応性水不溶性マトリックス及び米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；及び同第４，３３０，４４０号に述べられている反応性基質がタンパク質の固定化のために使用され得る。
【０２５３】
糖質（オリゴ糖）基は、タンパク質内のグリコシル化部位であることが知られている部位に好都合に結合させられ得る。一般に、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘはプロリン以外のあらゆるアミノ酸残基であり得る。）の一部である場合、Ｏ−結合型オリゴ糖はセリン（Ｓｅｒ）又はスレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合し、Ｎ−結合型オリゴ糖はアスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合する。Ｘは、好ましくはプロリン以外の１９種類の天然に生じるアミノ酸の１つである。Ｎ結合型及びＯ結合型オリゴ糖の構造及び各々の種類で認められる糖残基は異なる。両方で一般的に認められる糖のうちあるタイプは、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸と呼ばれる）である。シアル酸は通常Ｎ結合型及びＯ結合型オリゴ糖の両方の末端残基であり、その負電荷により、グリコシル化化合物に酸性特性を付与し得る。そのような部位は本発明の化合物のリンカー内に組み込むことができ、好ましくはポリペプチド化合物の組換え産生の間に（例えばＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳ等の哺乳類細胞において）細胞によってグリコシル化される。しかし、そのような部位は、この技術分野で既知の合成又は半合成手順によってさらにグリコシル化され得る。
【０２５４】
他の可能な修飾には、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓ中の硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ），ｐ．７９−８６（１９８３）］が含まれる。
【０２５５】
本発明の化合物はＤＮＡレベルでも変化され得る。化合物のいずれかの部分のＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞に対してより適合するコドンに変更し得る。好ましい宿主細胞であるＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）については、最適化コドンはこの技術分野において既知である。制限部位を排除するように、又は、沈黙化制限部位を含むようにコドンを置換することができるが、これは選択宿主細胞におけるＤＮＡのプロセシングに役立つ。前記の配列変化のいずれかを含むようにビヒクル、リンカー及びペプチドＤＮＡ配列を修飾し得る。
【０２５６】
親和性成熟
本発明のある実施形態は、「親和性成熟した」ペプチド及びペプチボディーを含む。この手順は、ファージディスプレイ又は他の選択技術を使用して本発明のペプチド及びペプチボディーの親和性又は生物活性を高めることを意図する。コンセンサス配列（関連ペプチドの収集のために生成される。）に基づいて、「コア」アミノ酸（コンセンサス配列から決定される。）が一定に保持されているか、又はその発生頻度に偏りがある、特異的な二次ファージディスプレイライブラリーを作製することができる。あるいは、個々のペプチド配列は、偏りのある特異的ファージディスプレイライブラリーを作製するために使用できる。そのようなライブラリーから掬い出すことにより、Ａｎｇ−２への高い結合性又は高い生物活性を有するペプチド（ペプチボディーに変換することができる）を得ることができる。
【０２５７】
非ペプチド類似体／タンパク質ミメティック
さらに、安定な構造又は低い生分解性をもたらすペプチドの非ペプチド類似体も考慮される。ペプチドミメティック類似体は、選択した阻害性ペプチドに基づいて１個又は複数の残基を非ペプチド成分で置換することによって調製できる。好ましくは、その非ペプチド成分は、ペプチドがその天然の立体配座を保持する、又はＡｎｇ−２を認識し、結合する能力を保持する、好ましい、例えば生物活性のある、立体配座を安定化することを可能にする。ある局面において、得られる類似体／ミメティックはＡｎｇ−２に対する高い結合親和性を示す。ペプチドから非ペプチドミメティック類似体を作製するための方法の一例が、Ｎａｃｈｍａｎら、Ｒｅｇｕｌ．Ｐｅｐｔ．５７：３５９−３７０（１９９５）に述べられている。必要であれば、本発明のペプチドを、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン酸化によって、又は本発明のペプチドの酸付加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステル及びＮ−アシル誘導体の生成によって修飾することができる。ペプチボディーも、他の成分との共有結合又は非共有結合複合体を形成することによってペプチド誘導体を生成するように修飾することができる。共有結合複合体は、ペプチボディーを含むアミノ酸の側鎖上の官能基、若しくはＮ又はＣ末端に化学的成分を結合することにより調製できる。
【０２５８】
特に、ペプチドは、放射能標識、蛍光標識、酵素（例えば比色定量又は蛍光分析反応を触媒する。）、基質、固体マトリックス又は担体（例えばビオチン又はアビジン）を含むが、これらに限定されないレポーター基に共役できることが予想される。従って、本発明は、ペプチボディー分子を含み、好ましくは放射能標識、蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックス及び担体からなる群より選択されるレポーター基をさらに含む分子を提供する。そのような標識は当業者にとって公知であり、例えばビオチン標識が特に考慮される。そのような標識の使用は当業者とって公知であり、例えば米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９９６，３４５号；及び同第４，２７７，４３７号に述べられている。有用となる他の標識には、これらに限定されないが、放射能標識、蛍光標識及び化学発光標識が含まれる。そのような標識の使用に関する米国特許には、例えば米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；及び同第３，９９６，３４５号が含まれる。本発明のペプチドのいずれも、これらの標識のいずれか１個、２個又はそれ以上を含み得る。
【０２５９】
ペプチド作製方法
本発明のペプチドは、この技術分野で既知の様々な手法を使用して作製することができる。例えば、そのようなペプチドは、従来の手法に従って溶液中又は支持体上で合成され得る。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコールに従って使用できる。例えば、各々参考として本明細書中に援用される、Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ（前出）；Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６）；ＢａｒａｎｙとＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１−２８４；Ｂａｒａｎｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，３０：７０５−７３９（１９８７）；及び米国特許第５，４２４，３９８号参照。
【０２６０】
固相ペプチド合成法は、０．１−１．０ｍＭアミン／ｇ重合体を含むコポリ（スチレンジビニルベンゼン）を使用する。ペプチド合成のためのこれらの方法は、α−アミノ基のブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）保護を用いる。どちらの方法も、ペプチドのＣ末端から出発して各々の段階で１個のアミノ酸を付加する段階的合成を含む（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，Ｕｎｉｔ９参照）。化学合成の終了時に、合成ペプチドを脱保護してｔ−ＢＯＣ又はＦＭＯＣアミノ酸保護基を除去し、低温にて酸を用いて処理することにより（例えば０℃で約１５分間から約１時間、液体ＨＦ−１０％アニソール）重合体から切断することができる。試薬を蒸発させた後、ペプチドを１％酢酸溶液で重合体から抽出し、次にそれを凍結乾燥して未精製物質を得る。通常、５％酢酸を溶媒として使用するＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−１５でのゲル濾過等の手法によってこれを精製することができる。カラムの適切な分画を凍結乾燥することにより、均質なペプチド又はペプチド誘導体を得て、次にそれを、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、溶解度等の標準的手法によって特徴を調べ、固相エドマン分解法によって定量することができる。
【０２６１】
ファージディスプレイライブラリーからペプチドを選択すること等の他の方法も使用可能である。ライブラリーは、ここで述べるようなアミノ酸のセットから調製することができる。ファージディスプレイは、本発明に従った有用なペプチドを同定する上で特に有用であり得る。簡単に述べると、４個から約８０個のアミノ酸残基からインサートを表示するファージライブラリーを調製する（例えばｍｌ  １３，ｆｄ又はλファージを使用して）。それらのインサートは、例えば完全な変性又はバイアスアレイであり得る。次に、所望する抗原に結合するファージ担持インサートを選択することができる。所望する抗原に結合するファージを再び選択する数回のサイクルを通してこの過程を反復することができる。反復することにより、特定配列を担うファージが濃縮される。発現されたペプチドの配列を特定するためにＤＮＡ配列分析を実施することができる。所望する抗原に結合する配列の最小の直線状部分を決定することができる。最小の直線状部分の一部又は全部＋その上流又は下流の１個又は複数の付加変性残基を含むインサートを含むバイアスライブラリーを使用してこの手順を反復することができる。これらの手法により、Ａｎｇ−２に対して本明細書中で既に同定した物質よりも高い結合親和性を有する本発明のペプチドが同定され得る。
【０２６２】
ペプチドを作製する方法に関係なく、そのような各ペプチド及びペプチボディーをコードする核酸分子を、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて生成させることができる。そのようなＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は、核酸コードの縮退を明らかにするため、ならびに特定の宿主細胞におけるコドンの優先性を明らかにするために、それらがコードするアミノ酸配列を変化させることなく必要に応じて操作することができる。
【０２６３】
組換えＤＮＡ技術は、本発明の完全長ペプチボディー及び他の大きなタンパク質様特異的結合物質又はそれらの断片を調製するための好都合な方法である。ペプチボディー又は断片をコードするＤＮＡ分子を発現ベクターに挿入し、次に今度はそれを抗体又は断片を産生させるために宿主細胞に挿入することができる。
【０２６４】
一般に、ペプチド又はペプチボディーをコードするＤＮＡ分子は、本明細書中で実施例において述べる手順を用いて得ることができる。プローブ及び一般的なハイブリダイゼーション条件は、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｐｒｅｓｓ［１９８４］）の中で述べられているようなものである。ハイブリダイゼーション後、試験するブロットを、プローブの大きさ、クローンに対するプローブの予想されるホモロジー、スクリーニングするライブラリーの種類及びスクリーニングするクローンの数等の因子に依存して、適切なストリンジェンシーで洗浄することができる。高ストリンジェンシースクリーニングの例は、５０℃から６５℃の温度、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳである。
【０２６５】
酵母ツーハイブリッドスクリーニング法も、Ａｎｇ−２に結合する本発明のペプチドを同定するために使用し得る。つまり、抗原又はその断片を使用して、Ａｎｇ−２結合物質、例えば本発明のペプチボディーを特定し、選択するために、ファージディスプレイライブラリーを含むペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる。
【０２６６】
あるいは、本発明のペプチドを含有し、発現するために様々な発現ベクター／宿主系を使用し得る。このような系には、以下のものに限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌等の微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）で形質転換した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクションした、又は細菌発現ベクター（例えばＴｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は動物細胞系が含まれる。組換えタンパク質産生において有用である哺乳類細胞には、これらに限定されないが、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７等）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２及び２９３細胞が含まれる。ペプチドの組換え発現のための具体例としてのプロトコールを下記で述べる。
【０２６７】
「発現ベクター」という用語は、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からのポリペプチドを発現するためのプラスミド、ファージ、ウイルス又はベクターを意味する。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝子エレメント（１個又は複数）、例えばプロモーター又はエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される結合物質をコードする構造又は配列、及び（３）適切な転写開始及び終結配列、の構築物を含む転写ユニットを含み得る。酵母又は真核生物発現系における使用を意図した構造ユニットは、好ましくは、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、組換えタンパク質がリーダー又は輸送配列なしで発現される場合、そのタンパク質はアミノ末端メチオニル残基を含み得る。この残基はその後、最終ペプチド産物を提供するように発現組換えタンパク質から切断されてもよく、又は切断されなくてもよい。
【０２６８】
例えば、ペプチドは、市販の発現系、例えばＰｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、製造者の使用説明書に従って酵母において組換え発現され得る。この系はまた、分泌を指令するプレ−プロ−α配列に基づくが、インサートの転写は、メタノールによる誘導時にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって推進される。
【０２６９】
分泌されたペプチドは、例えば細菌及び哺乳類細胞上清からペプチドを精製するために使用される方法によって、酵母増殖培地から精製される。
【０２７０】
あるいは、そのペプチドをコードするｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にクローニングし得る。このベクターを製造者の使用説明書（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用し、ｓＦ９タンパク質フリー培地中でＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞に感染させて、組換えタンパク質を産生させることができる。この組換えタンパク質を、ヘパリン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて培地から精製して濃縮することができる。
【０２７１】
あるいは、そのペプチドを昆虫系において発現し得る。タンパク質発現のための昆虫系は当業者にとって公知である。そのような系のうちあるものでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用し、スポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫において外来遺伝子を発現させることができる。そのペプチドコード配列を、ポリヘドリン遺伝子等のウイルスの非必須領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置くことができる。ペプチドを首尾よく挿入することにより、ポリヘドリン遺伝子は不活性となり、外殻タンパク質のコートを欠く組換えウイルスが産生される。その組換えウイルスを使用して、ペプチドが発現されるＳ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫に感染させることができる。Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９１：３２２４−７（１９９４）。
【０２７２】
別の例において、そのペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲによって増幅して、適切なベクター、例えばｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にクローニングすることができる。ｐＧＥＸベクターは、そのベクターによってコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びベクターのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片によってコードされるタンパク質を含む融合タンパク質を産生するように設計される。ＰＣＲのためのプライマーは、例えば適切な切断部位を含むように作製することができる。融合成分が発現を促進するためだけに使用される場合、又は対象ペプチドへの結合物として望ましくない場合は、その組換え融合タンパク質を融合タンパク質のＧＳＴ部分から切断し得る。ｐＧＥＸ−３Ｘ／特異的結合物質ペプチド構築物をＥ．コリ（大腸菌）ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に形質転換し、個々の形質転換体を単離して増殖させる。個々の形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、所望の特異的結合物質をコードする核酸インサートが適切な方向で存在することを確認するために自動シーケンサーを使用して部分的に配列決定することができる。
【０２７３】
本発明のペプチド組成物は、ペプチボディーが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の何らかの抗腫瘍ペプチドに共役しているものである。特に好ましい方法において、ＴＮＦ特異的結合物質ペプチドのキメラを、ＴＮＦ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）コード配列にフレーム内融合させたペプチドコード配列との組換え融合体として生成させる。ペプチド−ＴＮＦ  ｃＤＮＡをｐＥＴ−１１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、ｐＥＴ１１ｂの製造者の指示に従ってＢＬ２１  Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）におけるＴＮＦ−ペプチドの発現を誘導することができる。可溶性ＴＮＦ−ペプチドを、硫酸アンモニウム調合物、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでの疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗでのイオン交換クロマトグラフィー及びＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ−３００  ＨＲでのゲル濾過クロマトグラフィーによって細菌溶解産物から精製することができる。
【０２７４】
細菌中の不溶性封入体として産生し得る融合タンパク質は次のようにして精製できる。宿主細胞を遠心分離によって破壊し；０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で洗浄し；室温で１５分間、０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で処理することができる。その溶解産物を超音波破砕によって清澄化し、１２，０００×ｇで１０分間遠心分離して細胞デブリをペレット化することができる。その融合タンパク質含有ペレットを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁し、５０％グリセロール上に層状に重ね、６０００×ｇで３０分間遠心分離することができる。そのペレットを、Ｍｇ＋＋及びＣａ＋＋を含まない標準リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に再懸濁することができる。再懸濁したペレットを変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）中で分画化することによって、その融合タンパク質をさらに精製することができる。ゲルを０．４Ｍ  ＫＣｌに浸してタンパク質を目で見えるようにして、それを切り出し、ＳＤＳ非含有ゲル泳動緩衝液中で電気溶出することができる。ＧＳＴ／融合タンパク質が細菌中で可溶性タンパク質として生産される場合は、ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて精製することができる。
【０２７５】
その融合タンパク質を消化に供して、本発明のペプチドからＧＳＴを切断することができる。０．５ｍｌ  ＰＢＳ中のその消化反応物（２０ｍｇから４０ｍｇ融合タンパク質、２０単位から３０単位のヒトトロンビン（４０００Ｕ／ｍｇ、Ｓｉｇｍａ））を室温で１６時間から４８時間インキュベートし、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加して反応産物を分画化することができる。ゲルを０．４Ｍ  ＫＣｌに浸してタンパク質のバンドを目で見えるようにすることができる。そのペプチドの予想分子量に対応するタンパク質バンドの同一性は、自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４７３Ａ型、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたアミノ酸配列分析によって確認できる。あるいは、ペプチドのＨＰＬＣ及び／又は質量分析を実施することによって同一性を確認することができる。
【０２７６】
あるいは、そのペプチドをコードするＤＮＡ配列は、所望するプロモーター及び、場合によっては、リーダー配列を含むプラスミドにクローニングすることができる［Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３（１９８８）］。この構築物の配列を自動配列決定によって確認することができる。次にそのプラスミドを、細菌のＣａＣｌ２インキュベーション及び熱ショック処理を用いる標準手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）を使用して、Ｅ．コリ（大腸菌）株ＭＣ１０６１に形質転換することができる。形質転換した細菌をカルベニシリン補足ＬＢ培地で増殖させ、適切な培地中での増殖によって発現タンパク質の産生を誘導することができる。存在する場合は、リーダー配列はペプチドの分泌を生じさせることができ、分泌の間に切断され得る。
【０２７７】
分泌された組換えタンパク質は、下記の述べる方法によって細菌培地から精製することができる。
【０２７８】
組換えタンパク質の発現のための哺乳類宿主系は当業者にとって公知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質をプロセシングする、又はタンパク質活性を与える上で有用である一定の翻訳後修飾を生じさせる特定の能力によって選択できる。そのようなタンパク質修飾には、これらに限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が含まれる。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８等のような種々の宿主細胞は、そのような翻訳後活性に対する特異的細胞機構及び特徴的機序を有しており、導入される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセシングが確実に行われるように選択され得る。
【０２７９】
形質転換細胞を長期的な高収率のタンパク質産生のために使用することは好ましく、そのためには安定な発現が望ましい。そのような細胞が所望する発現カセットと共に選択マーカーを含むベクターで形質転換した時点で、それらの細胞を富栄養培地中で１日から２日間増殖させ、その後培地を選択培地に切り換えることができる。選択マーカーは選択に対する耐性を与えるように設計され、それが存在することにより、導入した配列を首尾よく発現する細胞を増殖させ回収することが可能となる。安定に形質転換された細胞の耐性集塊を、細胞に適切な組織培養手法を使用して増殖させることができる。
【０２８０】
組換えタンパク質産生を目的として形質転換された細胞を回収するために、いくつもの選択系を使用することができる。そのような選択系には、これらに限定されないが、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−又はａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。また、代謝拮抗物質耐性は、メトトレキセートに対する耐性を与えるＤＨＦＲ；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ；アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与え、且つクロルスルフロンに対する耐性を与えるｎｅｏ；及びヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏについての選択の基盤として使用できる。有用と考えられるさらなる選択可能遺伝子には、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にするｔｒｐＢ、又は細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にするｈｉｓＤが含まれる。形質転換体を特定するための視覚的指標を与えるマーカーには、アントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質であるＧＵＳ、及びルシフェラーゼとその基質であるルシフェリンが含まれる。
【０２８１】
特異的結合物質の精製及び再折りたたみ
一部の場合において、本発明のペプチド及び／又はペプチボディーのような特異的結合物質は、生物活性を有するために、適切な三次構造へと「再び折りたたまれ」て酸化され、ジスルフィド結合を生成することを必要とすることがある。再折りたたみはこの技術分野で公知のいくつかの手順を用いて実施され得る。そのような方法には、例えば、可溶化されたポリペプチド物質をカオトロピック試薬の存在下で通常７を超えるｐＨに曝露することが含まれる。カオトロピック試薬の選択は封入体の可溶化のために用いられる選択と同様であるが、カオトロピック試薬は一般に、低濃度で使用される。具体例としてのカオトロピック試薬はグアニジンである。ほとんどの場合、再折りたたみ／酸化溶液はまた、システイン架橋形成のためのジスルフィドシャフリングの惹起を可能にする特定の酸化還元電位を生じさせる特定比率での、還元剤＋その酸化形態を含有する。一部の一般的に使用される酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオスレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、及び２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれる。多くの場合、再折りたたみの効率を高めるためにコソルベントを使用し得る。一般的に使用されるコソルベントには、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール及びアルギニンが含まれる。
【０２８２】
本発明のペプチド及びペプチボディーを精製することは望ましいと考えられる。タンパク質精製手法は当業者にとって公知である。これらの手法は、あるレベルにおいて、タンパク質様及び非タンパク質様画分の粗分別を含む。ペプチド及び／又はペプチボディーを他のタンパク質から分離した後、部分的又は完全な精製（又は均一にするための精製）を達成するためのクロマトグラフィー及び電気泳動手法を用いて対象ペプチド又はポリペプチドをさらに精製することができる。本発明のペプチボディー及びペプチドの調製に特に適する分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に効率的な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー又はＨＰＬＣである。
【０２８３】
本発明のある局面は、本発明のペプチボディー又はペプチドの精製に関し、特定の実施形態において、本発明のペプチボディー又はペプチドの実質的な精製に関する。本明細書中で使用される場合、「精製ペプチボディー又はペプチド」という用語は、ペプチボディー又はペプチドがその天然で得られる状態に比べてある程度まで精製されている、他の成分から単離可能な組成物を表すことが意図されている。従って、精製ペプチド又はペプチボディーはまた、それが天然に生じ得る環境から分離しているペプチボディー又はペプチドも意味する。
【０２８４】
一般に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するための分別に供されており、その組成物が実質的にその発現される生物活性を保持しているペプチド又はペプチボディー組成物を意味する。「実質的に精製された」という用語を使用する場合、この表現は、ペプチボディー又はペプチドが、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％又はそれ以上を構成するような、組成物の主要成分を形成するペプチド又はペプチボディー組成物を意味する。
【０２８５】
ペプチド又はペプチボディーの精製度合を定量するための様々な方法は、本発明の開示に照らして当業者にとって公知である。これらは、例えば、活性分画の特異的結合活性を測定すること、又はＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって分画中のペプチド又はペプチボディーの量を評価することを含む。ペプチド又はペプチボディー分画の純度を評価するための好ましい方法は、その分画の結合活性を算定し、それを初期抽出物の結合活性と比較して、その後、本明細書中では「−倍数の精製度」として評価する、精製度合を算定することである。結合活性の量を表すために使用する実際の単位は、言うまでもなく、精製を追跡するために選択される個々のアッセイ手法、及びそのペプチボディー又はペプチドが検出可能な結合活性を示すかどうかに依存する。
【０２８６】
精製における使用に適する様々な手法が当業者に公知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降法）等による沈降反応、又は熱変性とそれに続く遠心分離；アフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト及びアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；及びそれらやその他の手法の組合せが含まれる。この技術分野において一般的に知られるように、様々な精製段階を実施する順序は変更し得る、又は一部の段階を省いて、それでもなお実質的に精製された特異的結合物質の調製のために適切な方法をもたらし得ると考えられる。
【０２８７】
本発明のペプチド又はペプチボディーが常にその最も精製された状態で必ずしも提供される必要はない。実際に、実質的に特異性のより低い結合物質は一部の実施形態で有用性を有し得ると想定される。部分的精製は、より少ない精製段階を組み合わせて使用することによって、又は同じ一般的精製スキームの異なる形態を利用することによって達成し得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて実施される陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ手法よりも高い「−倍数」精製を生じることが認識されている。相対的精製度が低い方法は、ペプチド又はペプチボディーの全体的回収において、又はペプチド又はペプチボディーの結合活性を維持する上で有利であり得る。
【０２８８】
ペプチド又はポリペプチドの移動は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥの種々の条件によって、時として顕著に変化し得ることが知られている［Ｃａｐａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，７６：４２５（１９７７）］。そのため、異なる電気泳動条件下では、精製又は部分精製特異的結合物質発現産物の見かけ分子量が変化し得ることを理解されたい。
【０２８９】
結合アッセイ
免疫学的結合アッセイは、一般に、分析物標的抗原に特異的に結合し、それをしばしば固定するための捕獲試薬を利用する。捕獲試薬は分析物に特異的に結合する成分である。本発明のある実施形態において、捕獲試薬は、Ａｎｇ−２に特異的に結合するペプチド又はペプチボディー又はその断片である。これらの免疫学的結合アッセイはこの技術分野において公知である［Ａｓａｉ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３７巻，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）］。
【０２９０】
免疫学的結合アッセイは、捕獲試薬と抗原とによって形成される結合複合体の存在をシグナル表示する標識試薬を利用することが多い。標識試薬は結合複合体を含む分子の１つであり得る；すなわち、標識特異的結合物質又は標識抗特異的結合物質抗体であり得る。あるいは、標識試薬は、結合複合体に結合する第三の分子、一般的には別の抗体であり得る。標識試薬は、例えば、標識を担う抗特異的結合物質抗体であり得る。結合複合体に特異的な第二抗体は、標識を有していなくてもよいが、第二抗体がその成員である抗体の種に特異的な第四の分子によって結合可能である。例えば、第二抗体を、その後酵素標識ストレプトアビジン等の第四の分子によって結合され得る、ビオチン等の検出可能な成分で修飾することができる。プロテインＡ又はプロテインＧ等の、免疫グロブリン定常領域に特異的に結合することができる他のタンパク質も、標識試薬として使用し得る。これらの結合タンパク質は、連鎖球菌属細菌の細胞壁の通常成分であり、様々な種由来の免疫グロブリン定常領域に強い非免疫原性反応を示す。Ａｋｅｒｓｔｒｏｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２（１９８５）；Ｃｈａｕｂｅｒｔ，Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ．，１０：５８５−５９１（１９９７）。
【０２９１】
アッセイ全体を通じて、試薬の各々の組合せ後に、インキュベーション及び／又は洗浄段階が必要な場合がある。インキュベーション段階は、約５秒間から数時間、好ましくは約５分間から約２４時間まで様々であり得る。しかし、インキュベーション時間は、アッセイ様式、分析物、溶液の体積、濃度等に依存する。通常、アッセイは室温で実施されるが、一連の温度範囲で実施することができる。
【０２９２】
Ａ．非競合結合アッセイ：
免疫学的結合測定法は非競合型であり得る。これらのアッセイは、直接測定される捕獲分析物の量を含む。例えば、ある好ましい「サンドイッチ」アッセイでは、捕獲試薬（抗体又はペプチボディー）を直接固体基質に結合させてそれに固定することができる。これらの固定化捕獲試薬は、その後、被験試料中に存在する抗原を捕獲（結合）する。次に、そのようにして固定されたタンパク質は、標識を有する第二抗体等の標識試薬に結合する。別の好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいて、第二抗体は標識を持たないが、その第二抗体が由来する種の抗体に特異的な標識抗体によって結合され得る。第二抗体はまた、ストレプトアビジン等の第三の標識分子が特異的に結合する、ビオチン等の検出可能成分で修飾することもできる。参考として本明細書中に援用される、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈ  １４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（１９８８）参照。
【０２９３】
Ｂ．競合結合アッセイ：
免疫学的結合アッセイは競合型であり得る。試料中に存在する分析物の量を、置き換えられた、又は試料中に存在する分析物によって捕獲試薬（抗体又はペプチボディー）から競合排除された添加分析物の量を測定することによって間接的に測定する。ある好ましい競合結合アッセイにおいて、通常は標識された既知量の分析物を試料に加え、次に試料を捕獲試薬と接触させる。抗体に結合した標識分析物の量は、試料中に存在する分析物の濃度に逆比例する（Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｈ  １４，ｐ．５７９−５８３、前出）。
【０２９４】
別の好ましい競合結合アッセイにおいて、捕獲試薬を固体基質に固定する。捕獲試薬に結合するタンパク質の量は、タンパク質／抗体複合体中に存在するタンパク質の量を測定することによって、又は、あるいは、残存する非複合タンパク質の量を測定することによって決定し得る。タンパク質の量は、標識タンパク質を与えることによって検出し得る。Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（前出）。
【０２９５】
さらに別の好ましい競合結合アッセイにおいて、ハプテンの阻害が利用される。ここでは、既知の分析物を固体基質に固定する。既知量の抗体を試料に加え、固定された分析物に試料を接触させる。固定分析物に結合する抗体の量は、試料中に存在する分析物の量に逆比例する。固定抗体の量は、抗体の固定された分画又は溶液中に残存する分画のいずれかを検出することによって検出し得る。検出は、抗体が標識されている場合は直接的であり得、又は上述したようにその後抗体に特異的に結合する標識成分を添加することによって間接的であり得る。
【０２９６】
Ｃ．競合結合アッセイの利用：
競合結合アッセイは、当業者が、本発明のペプチボディーによって認識されるタンパク質又は酵素複合体が所望するタンパク質であり、交差反応分子ではないかどうかを判定すること、又は前記ペプチボディーが該抗原に特異的であり、非関連抗原に結合しないかどうかを判定することを可能にする、交差反応性の判定のために使用できる。この種のアッセイでは、抗原を固相支持体に固定することができ、未知のタンパク質混合物をアッセイ系に加えて、それを固定タンパク質へのペプチボディーの結合と競合させる。競合分子は、該抗原に関連のない１つ又は複数の抗原にも結合する。前記タンパク質混合物の交差反応性を判定するために、固定抗原へのペプチボディーの結合と競合する該タンパク質の能力を、固相支持体に固定した同じタンパク質による結合と比較する。
【０２９７】
Ｄ．他の結合アッセイ：
本発明はまた、試料中のＡｎｇ−２の存在を検出又は定量するためのウエスタンブロット法も提供する。その手法は一般に、試料タンパク質を分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離することと、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター又は誘導体化ナイロンフィルター等の適切な保持体にそのタンパク質を移すこととを含む。Ａｎｇ−２に特異的に結合するペプチボディー又はその断片と共に試料をインキュベーションし、生じた複合体を検出する。これらのペプチボディーは直接標識し得るか、又は、あるいは、その後該ペプチボディーに特異的に結合する標識抗体を使用して検出し得る。
【０２９８】
診断アッセイ
本発明のペプチド及びペプチボディー又はその断片等の誘導体結合物質は、Ａｎｇ−２又はサブユニットの発現を特徴とする状態又は疾患の診断のための、又はＡｎｇ−２の誘導物質、その断片、Ａｎｇ−２活性のアゴニスト又は阻害因子で治療される患者を監視するためのアッセイにおいて有用である。Ａｎｇ−２についての診断アッセイには、ヒト体液又は細胞若しくは組織の抽出物においてＡｎｇ−２を検出するためにペプチボディー及び標識を利用する方法が含まれる。本発明のペプチボディーは、修飾を加えて、又は修飾なしで使用することができる。好ましい診断アッセイにおいて、例えば標識又はレポーター分子を結合させることによってペプチボディーを標識する。様々な標識及びレポーター分子が既知であり、その内の一部については既に本明細書中で述べている。特に、本発明はヒト疾患の診断のために有用である。
【０２９９】
それぞれのタンパク質に特異的なペプチボディーを使用してＡｎｇ−２タンパク質を測定するための様々なプロトコールがこの技術分野において知られている。その例には、酵素結合免疫反応吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）が含まれる。Ａｎｇ−２上の２つの非干渉エピトープに対して反応性のあるモノクローナル抗体を使用する２部位のモノクローナルに基づく免疫測定法が好ましいが、競合結合測定法も使用できる。これらのアッセイは、例えばＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１５８：１２１１（１９８３）に述べられている。
【０３００】
診断の基礎となるものを提供するために、通常、ヒトＡｎｇ−２発現の正常値又は標準値を確立する。これは、正常被験対象、対象物由来、好ましくはヒト由来の体液又は細胞抽出物を、この技術分野で公知の複合体形成に適した条件下で、Ａｎｇ−２に対するペプチボディーと組み合わせることによって決定することができる。標準的な複合体形成の量は、既知量のＡｎｇ−２タンパク質へのペプチボディーの結合を対照及び疾患試料の両方と比較することによって定量できる。その後、正常試料から得た標準値を、疾患に罹患している可能性のある被験対象由来の試料から得た値と比較することができる。標準値と被験対照値の間の差は、疾患状態におけるＡｎｇ−２の役割を示唆する。
【０３０１】
診断適用のために、ある一部の実施形態において、本発明のペプチボディー又はペプチドを、典型的には検出可能成分で標識する。その検出可能成分は、直接又は間接的に検出可能なシグナルを生じることができるあらゆるものであり得る。例えば、検出可能成分は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、又はアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素であり得る。Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−１６３（１９９０）。
【０３０２】
疾患
本発明は、ヒト疾患及び病的状態の治療のために有用な、Ａｎｇ−２に結合するペプチド、ペプチボディー又はその断片、変異体若しくは誘導体等の結合物質を提供する。Ａｎｇ−２の結合活性又は他の細胞活性を調節する物質は、それらの治療効果を増強する、又は起こり得る副作用を低下させる他の治療剤と組み合わせて使用し得る。
【０３０３】
ある局面において、本発明は、細胞における有害な、又は異常なレベルのＡｎｇ−２活性を特徴とする疾患及び状態を治療するために有用な試薬及び方法を提供する。これらの疾患には、癌及び過形成、乾癬、接触皮膚炎、免疫学的疾患及び不妊症等の過増殖状態が含まれる。
【０３０４】
本発明はまた、Ａｎｇ−２活性を阻害又は低下させる、ペプチボディー等の特異的結合物質の有効量を動物に投与することを含む、ヒトを含む動物において癌を治療する方法を提供する。本発明はさらに、生体系における細胞増殖、侵襲及び転移の過程を含む、癌細胞増殖を抑制する方法を対象とする。それらの方法は、癌細胞増殖の阻害剤としての本発明の化合物の使用を含む。好ましくは、前記方法を、哺乳類等の生存動物において癌細胞増殖、侵襲、転移又は腫瘍発生を阻害又は低下させるために使用する。本発明の方法はまた、アッセイ系における使用、例えば癌細胞増殖及びその特徴を検定する、ならびに癌細胞増殖に影響を及ぼす化合物を同定するアッセイ系での使用に容易に適合させ得る。
【０３０５】
本発明の方法によって治療できる癌は、好ましくは哺乳類において発生する。哺乳類には、例えばヒト及び他の霊長類、ならびにイヌ及びネコ等のペット又はコンパニオン動物、ラット、マウス及びウサギ等の実験動物、及びウマ、ブタ、ヒツジ及びウシ等の家畜が含まれる。
【０３０６】
腫瘍又は新生物は、細胞の増殖が制御不能且つ進行性である組織細胞の増殖を含む。そのような増殖の一部は良性であるが、その他は悪性と呼ばれ、生物にとって致死性である。悪性新生物又は癌は、激しい細胞増殖を示すことに加えて、周辺組織を侵襲し、転移し得るという点で良性増殖とは区別される。さらに、悪性新生物は、著しい低分化性（著しい脱分化）、及び相互に、及びそれらの周辺組織と比べて、著しく秩序が失われていることを特徴とする。この特徴は「退形成」とも呼ばれる。
【０３０７】
本発明によって治療し得る新生物にはまた、固形腫瘍、すなわち癌腫及び肉腫も含まれる。癌腫には、周辺組織を浸潤（侵襲）し、転移を生じさせる上皮細胞に由来する悪性新生物が含まれる。腺癌は、腺組織に由来する、又は認識し得る腺構造を形成する癌腫である。別の広いカテゴリー又は癌には、細胞が胚性結合組織のような繊維状物質又は均質物質中に埋まっている腫瘍である、肉腫が含まれる。本発明はまた、白血病、リンパ腫及び一般に腫瘍塊を示さないが血管又はリンパ細網系に分布する他の癌を含む、骨髄系又はリンパ系の癌の治療も可能にする。
【０３０８】
本発明による治療を受け入れやすい癌又は腫瘍細胞のタイプには、例えば、ＡＣＴＨ産生腫瘍、急性リンパ性白血病、急性非リンパ性白血病、副腎皮質の癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、胆嚢癌、有毛細胞白血病、頭部及び頸部癌、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、腎臓癌、肝臓癌、肺癌（小細胞及び非小細胞）、悪性腹水、悪性胸水、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣（生殖細胞）癌、膵臓癌、陰茎癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、皮膚癌、軟組織肉腫、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、栄養膜腫瘍、子宮癌、膣癌、外陰部の癌、及びウィルムス腫瘍が含まれる。
【０３０９】
本発明を、特にある種の実験的に定義されている癌の治療を参照しながらここで説明する。これらの例示的治療において、標準的技術水準のインビトロ及びインビボモデルを使用した。これらの方法は、インビボ治療計画において有効であると期待できる物質を同定するために使用できる。しかし、本発明の方法はこれらの腫瘍型の治療に限定されず、あらゆる器官系に由来するあらゆる固形腫瘍に及ぶことを理解されたい。その侵襲又は転移がＡｎｇ−２の発現又は活性に関連する癌は、特に本発明によって阻止されやすいか、又はさらには消退へと誘導されやすい。
【０３１０】
本発明はまた、ペプチボディー等の本発明の化合物を、従来の何らかの化学療法剤のような別の抗癌化学療法剤と組み合わせて含むことによって実施され得る。そのような他の薬剤と特異的結合物質の組合せは化学療法プロトコールを増強し得る。熟達した医師にとって、数多くの化学療法プロトコールが本発明の方法に組み込むことができるものとして考えつく。アルキル化剤、代謝拮抗物質、ホルモン及びアンタゴニスト、放射性同位体、ならびに天然物質を含む、あらゆる化学療法剤を使用することができる。例えば、本発明の化合物は、ドキソルビシン及び他のアントラサイクリン類似体等の抗生物質、シクロホスファミド等のナイトロジェンマスタード、５−フルオロウラシル、シスプラチン、ヒドロキシ尿素、タキソール及びその天然及び合成誘導体等のピリミジン類似体等と共に投与することができる。別の例として、腫瘍がゴナドトロピン依存性及びゴナドトロピン非依存性細胞を含む、乳房の腺癌等の混合腫瘍の場合は、本発明の化合物をロイプロリド又はゴセレリン（ＬＨ−ＲＨの合成ペプチド類似体）と共に投与することができる。他の抗腫瘍プロトコールには、本明細書中で「補助抗腫瘍治療様式」とも呼ぶ、別の治療様式、例えば手術、放射線等を伴うテトラサイクリン系化合物の使用が含まれる。従って、本発明の方法は、副作用を低減し、効果を増強するという利点を有するそのような従来の処方計画で使用することができる。
【０３１１】
従って、本発明は、固形腫瘍及び白血病を含む極めて多様な癌の治療のために有用な組成物及び方法を提供する。治療し得る癌の種類には、これらに限定されないが：乳房、前立腺及び結腸の腺癌；すべての形態の肺の気管支原性癌；骨髄腫；黒色腫；肝癌、神経芽細胞腫；乳頭腫；アプドーマ；分離腫；鰓腫；悪性カルチノイド症候群；カルチノイド心疾患；癌腫（例えばウォーカー癌、基底細胞癌、基底有棘細胞癌、ブラウン−ピアース癌、腺管癌、エールリッヒ腫瘍、クレブス２、メルケル細胞腫、粘液性癌腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬性癌、細気管支癌、気管支原性癌、扁平上皮癌及び移行上皮癌）；組織球性疾患；白血病；悪性組織球増殖症；ホジキン病；免疫増殖性小細胞肺癌；非ホジキンリンパ腫；形質細胞腫；細網内皮症；黒色腫；軟骨芽細胞腫；軟骨腫；軟骨肉腫；線維腫；線維肉腫；巨細胞腫；組織球腫；脂肪腫；脂肪肉腫；中皮腫；粘液腫；粘液肉腫；骨腫；骨肉腫；脊索腫；頭蓋咽頭腫；未分化胚細胞腫；過誤腫；間葉腫；中腎腫；筋肉腫；エナメル上皮腫；セメント質腫；歯牙腫；奇形腫；胸腺腫；絨毛癌が含まれる。さらに、次の種類の癌も治療し得る：腺腫；胆管細胞癌；コレステリン腫；円柱腫；嚢胞腺癌；嚢胞腺腫；顆粒膜細胞腫；男女性胚細胞腫；肝癌；汗腺腫；膵島細胞腫；ライディッヒ細胞腫；乳頭腫；セルトリ細胞腫；莢膜細胞腫；平滑筋腫；平滑筋肉腫；筋原細胞腫；筋腫；筋肉腫；横紋筋腫；横紋筋肉腫；上衣細胞腫；神経節細胞腫；神経膠腫；髄芽細胞腫；髄膜腫；神経鞘腫；神経芽細胞腫；神経上皮腫；神経線維腫；神経腫；傍神経節腫；非クロム親和性傍神経節腫；被角血管腫；好酸球増加症を伴う血管リンパ過形成；血管腫硬化；血管腫症；グロムス血管腫；血管内皮腫；血管腫；血管周囲細胞腫；血管肉腫；リンパ管腫；リンパ管筋腫；リンパ管肉腫；松果体腫；癌肉腫；軟骨肉腫；葉状嚢胞肉腫；線維肉腫；血管肉腫；平滑筋肉腫；白血肉腫症；脂肪肉腫；リンパ管肉腫；筋肉腫；粘液肉腫；卵巣癌；横紋筋肉腫；肉腫；新生物；神経線維腫症；及び子宮頸部形成異常。
【０３１２】
本発明の別の局面は、乾癬及び接触皮膚炎を含む皮膚の過剰増殖状態又は他の過増殖性疾患を予防及び／又は治療するために本発明の物質及び方法を使用することである。乾癬及び接触皮膚炎の患者はこれらの病巣において高いＡｎｇ−２活性を有することが明らかにされた［Ｏｇｏｓｈｉら、Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，１１０：８１８−２３（１９９８）］。好ましくは、Ａｎｇ−２に特異的な特異的結合物質を、これらの臨床症状を発現するヒトを治療するために他の薬剤と組み合わせて使用する。特異的結合物質は、本明細書中で述べる投与経路及び当業者に公知の他の経路を介して、様々な担体のいずれかを用いて送達することができる。
【０３１３】
本発明の他の局面は、血管新生が関与する様々な網膜症（糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性を含む。）、ならびに子宮内膜症、子宮筋腫等の女性生殖器官の障害／疾患、及び女性生殖周期中の不正血管増殖（子宮内膜微小血管増殖を含む。）に関連する他のそのような状態を治療することを含む。
【０３１４】
本発明のさらに別の局面は、脳動静脈奇形（ＡＶＭ）、胃腸粘膜損傷及び修復、発作から生じる虚血を含む、消化性潰瘍疾患の病歴を有する患者における胃十二指腸粘膜の潰瘍、肝疾患における広範囲の肺血管障害及び非肝門脈圧亢進を有する患者における門脈圧亢進症を含む、血管増殖異常を治療することに関する。
【０３１５】
本発明の別の局面は、本発明によって提供される組成物及び方法を利用した癌の予防である。そのような試薬には、Ａｎｇ−２に対するペプチボディー等の特異的結合物質が含まれる。
【０３１６】
医薬組成物
ペプチボディー等のＡｎｇ−２特異的結合物質の医薬組成物は本発明の範囲内である。抗体を含む医薬組成物は、例えば２００１年１月９日発行の、Ｌａｍらへの米国特許第６，１７１，５８６号に詳述されている。そのような組成物は、本明細書中で述べるような、抗体又はその断片、変異体、誘導体又は融合物等の特異的結合物質の治療上又は予防上有効な量を、医薬適合性の物質と混合して含有する。好ましい実施形態において、医薬組成物は、医薬適合性の物質と混合して、Ａｎｇ−２の少なくとも１つの生物活性を部分的に又は完全に変化させるアンタゴニスト特異的結合物質を含む。一般的に、その特異的結合物質は、動物への投与のために十分に精製されている。
【０３１７】
該医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は浸透を変化、維持又は保存するための製剤物質を含有し得る。適切な製剤物質には、これらに限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸等）；充填剤（マンニトール又はグリシン等）、キレート化剤［エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等］；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等）；増量剤；単糖類；二糖類及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリン等）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等）；着色料；着香料及び希釈剤；乳化剤；親水性重合体（ポリビニルピロリドン等）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウム等）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコール等）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトール等）；沈殿防止剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパール等）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトール）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物等）（好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール、ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は製薬補助剤が含まれる。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）。
【０３１８】
最適化医薬組成物は、例えば意図する投与経路、送達形式及び所望する用量に依存して、当業者により決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出参照。そのような組成物は、特異的結合物質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼし得る。
【０３１９】
医薬組成物中の主要ビヒクル又は担体は、水性又は非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクル又は担体は、できれば非経口投与用組成物に共通する他の物質を補足した、注射用蒸留水、生理食塩水又は人工脳脊髄液であり得る。中性緩衝塩類溶液又は血清アルブミンと混合した塩類溶液はさらなる具体例としてのビヒクルである。他の具体例としての医薬組成物には、ソルビトール又はその適切な代用物をさらに含み得る、約ｐＨ７．０から８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液が含まれる。本発明のある実施形態において、結合物質組成物は、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で、所望する精製度の選択した組成物を任意の製剤物質（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と混合することにより保存用に調製され得る。さらに、結合物質生成物は、スクロース等の適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤し得る。
【０３２０】
医薬組成物は非経口的送達のために選択することができる。あるいは、その組成物は、吸入用又は経口、耳、眼、直腸又は膣経路等の経腸的送達用に選択し得る。そのような医薬適合性の組成物の調製は当分野の技術範囲内である。
【０３２１】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝剤は、組成物を生理的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、通常は約５−約８の範囲内のｐＨに維持するために使用される。
【０３２２】
非経口投与を考慮する場合、本発明において使用するための治療組成物は、医薬適合性のビヒクル中に所望の特異的結合物質を含む、発熱物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。非経口注射用の特に適切なビヒクルは、結合物質が、適切に保存された無菌等張溶液として処方される無菌蒸留水である。さらに別の調製物は、蓄積注射によって送達され得る生成物の放出又は持続放出を制御する、注射用ミクロスフェア、生体受食性粒子、重合体化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ又はリポソーム等の物質と所望する分子の製剤を含み得る。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中の保持時間を延長する効果を有し得る。所望する分子の導入のための他の適切な手段には、埋め込み可能な薬剤送達装置が含まれる。
【０３２３】
別の局面において、非経口投与に適する医薬組成物は、水溶液中、好ましくはハンクス液、リンガー液又は生理緩衝食塩水等の生理的に適合性の緩衝液中で処方され得る。水性注射懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン等の、懸濁液の粘度を上昇させる物質を含み得る。さらに、活性化合物の懸濁液は適切な油性注射懸濁液中で調製され得る。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ゴマ油等の脂肪油、又はオレイン酸エチル、トリグリセリド等の合成脂肪酸エステル又はリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオンアミノ重合体も送達のために使用し得る。場合によっては、懸濁液はまた、化合物の溶解度を向上させ、高度濃縮溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は作用物質も含み得る。
【０３２４】
別の実施形態において、医薬組成物を吸入用に処方し得る。例えば、結合物質は吸入用の乾燥粉末として処方し得る。ポリペプチド又は核酸分子吸入溶液はまた、エアロゾル送達のために推進薬と共に処方し得る。さらに別の実施形態において、溶液を噴霧し得る。肺投与はさらにＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に記述されており、この特許願は化学修飾したタンパク質の肺送達について述べている。
【０３２５】
ある処方物は経口的に投与し得ると想定される。本発明のある実施形態において、このようにして投与される結合物質分子は、錠剤及びカプセル等の固形の剤型の調合において慣例的に使用される担体と共に又は担体なしで処方することができる。例えば、カプセルは、生体利用効率が最大となり、全身循環前の分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小となる胃腸管の一定部位で製剤の活性成分を放出するように設計され得る。結合物質分子の吸収を促進するために付加的な物質を含むことができる。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、沈殿防止剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用し得る。
【０３２６】
経口投与用の医薬組成物はまた、経口投与に適した用量でこの技術分野において公知の医薬適合性の担体を用いて処方することができる。そのような担体により、患者による摂取のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等に医薬組成物を処方することが可能となる。
【０３２７】
経口使用のための医薬製剤は、錠剤又は糖衣錠コアを得るために、活性化合物を固体賦形剤と混合し、得られた顆粒の混合物を加工する（場合によっては摩砕した後）ことにより得られる。必要であれば、適切な補助剤を加えることができる。適切な賦形剤には、ラクトース、スクロース、マンニトール及びソルビトールを含む糖類等の糖質又はタンパク質充填剤；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース；アラビアゴム及びトラガカントを含むゴム；及びゼラチン及びコラーゲン等のタンパク質が含まれる。必要であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天及びアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムのようなその塩等の、崩壊剤又は可溶化剤を添加し得る。
【０３２８】
糖衣錠コアは、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタンを同時に含み得る濃縮糖溶液、ラッカー溶液、及び適切な有機溶媒又は溶媒混合物等の適切なコーティングと共に使用し得る。製品の特定のために、又は活性化合物の量、すなわち用量を示すために、染料又は顔料を錠剤又は糖衣錠コ―ティングに添加し得る。
【０３２９】
経口的に使用できる医薬製剤にはまた、ゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン及びグリセロール又はソルビトール等のコーティングで作られる密封軟カプセルも含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトース又はデンプン等の充填剤又は結合剤、タルク又はステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤及び、場合によっては、安定剤と混合した有効成分を含み得る。軟カプセルの場合は、活性化合物を、安定剤と共に、又は安定剤なしで、脂肪油、液体、又は液状ポリエチレングリコール等の適切な液体に溶解し得るか、又は懸濁し得る。
【０３３０】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に適する非毒性賦形剤と混合して結合物質の有効量を含み得る。錠剤を無菌水又は適切なビヒクルに溶解することにより、溶液を単位用量形態で調製することができる。適切な賦形剤には、これらに限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸又は重炭酸ナトリウム、ラクトース又はリン酸カルシウム等の不活性希釈剤；又はデンプン、ゼラチン又はアカシア等の結合剤；又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルク等の潤滑剤が含まれる。
【０３３１】
さらなる医薬組成物は、持続又は制御送達製剤中に結合物質分子を含有する製剤を含めて、当業者にとって明らかである。リポソーム担体、生体受食性微粒子又は多孔性ビーズ及び蓄積注射等の様々な他の持続又は制御送達手段を処方するための手法も、当業者にとって公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性重合体微粒子の制御放出を述べている、ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号参照。持続放出製剤のさらなる例には、成形製品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態の半透性重合体マトリックスが含まれる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許ＥＰ第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとの共重合体［Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３）］、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）［Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）］及び［Ｌａｎｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）］、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８号）が含まれ得る。持続放出性組成物にはまた、この技術分野で公知のいくつか方法のいずれかによって調製できる、リポソームが含まれ得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８２：３６８８−３６９２（１９８５）；欧州特許ＥＰ第３６，６７６号；欧州特許ＥＰ第８８，０４６号；欧州特許ＥＰ第１４３，９４９号参照。
【０３３２】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、一般に無菌でなければならない。これは無菌濾過膜を通して濾過することによって達成し得る。組成物を凍結乾燥する場合、この方法による滅菌は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に実施され得る。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態又は溶液として保存され得る。さらに、非経口組成物は一般に、無菌アクセス口を有する容器、例えば皮下注射針を刺し通すことができる栓を備える静脈内溶液バッグ又はバイアル内に納められる。
【０３３３】
医薬組成物が製剤された時点で、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体又は脱水若しくは凍結乾燥粉末として無菌バイアル中で保存し得る。そのような製剤は、即時使用形態又は投与前に再構成を必要とする形態（例えば凍結乾燥）で保存され得る。
【０３３４】
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を調製するためのキットを対象とする。そのキットは各々、乾燥タンパク質を含む第一の容器及び水性系を含む第二の容器の両方を含み得る。単一及び多区画プレフィルドシリンジ（例えば液体シリンジ及びｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ）を含むキットも本発明の範囲内に含まれる。
【０３３５】
治療に使用される医薬組成物の有効量は、例えば治療背景及び目的に依存する。それ故に、当業者は、治療のための適切な用量レベルが、一部には、送達される分子、結合物質分子が使用される適応症、投与経路及び患者の体の大きさ（体重、体表面積又は器官の大きさ）及び状態（年齢及び一般的健康状態）に依存して変化することを認識する。適宜に、臨床医は、最適の治療効果を得るために、用量を調節し、投与経路を変更し得る。一般的な用量は、上述した因子に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲を取り得る。他の実施形態において、用量は、０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ；又は５ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲を取り得る。
【０３３６】
いかなる化合物についても、治療上有効な用量は、細胞培養アッセイにおいて、又はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ又はサル等の動物モデルにおいて最初に評価することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用し得る。次にそのような情報を使用して、ヒトにおける投与のための有用な用量及び経路を決定することができる。
【０３３７】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして決定される。用量及び投与は、活性化合物の十分なレベルを提供するように、又は所望する効果を維持するように調整される。考慮し得る因子には、疾患状態の重症度、対象の全般的健康状態、対象の年齢、体重及び性別、投与の時間及び頻度、薬剤の組合せ、反応感受性及び治療に対する応答が含まれる。長時間作用型医薬組成物は、個々の製剤の半減期及びクリアランス速度に依存して３日から４日ごと、週に１回又は２週間に１回投与し得る。
【０３３８】
投与頻度は、使用する製剤中の結合物質分子の薬物動態パラメータに依存する。通常は、所望効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回投与として、又は所与の期間にわたる複数回投与として（同じであるか又は異なる濃度／用量で）、又は持続注入として投与し得る。適切な用量をさらに改善することは常套的に行われる。適切な用量−反応データを使用して適切な用量を確認し得る。
【０３３９】
医薬組成物の投与経路は、既知の方法によって、例えば経口的、静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路による注射を介して、髄内、クモ膜下腔、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸的、局所、舌下、尿道、膣又は直腸的手段によって、持続放出システムによって、又は埋め込み装置によって投与される。必要であれば、組成物は、ボーラス注射によって、又は注入によって持続的に、又は埋め込み装置によって投与され得る。
【０３４０】
あるいは、又はさらに、組成物は、膜、海綿又は所望分子が吸収されている又は封入されている別の適切な材料の埋め込みにより、局所的に投与され得る。埋め込み装置を使用する場合は、装置を適切な組織又は器官に埋め込み、拡散、持続放出型（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）ボーラス又は持続投与によって所望分子を送達し得る。
【０３４１】
一部の場合において、エクスビボで医薬組成物を使用することが望ましいと考えられる。そのような場合は、患者から切除した細胞、組織又は器官を医薬組成物に曝露し、その後それらの細胞、組織及び／又は器官を患者の体内に移植し戻す。
【０３４２】
他の場合において、本明細書中で述べるような方法を使用して、そのポリペプチドを発現し、分泌するように遺伝子操作したある種の細胞を移植することによって、ペプチボディー等の本発明の結合物質を送達することができる。そのような細胞は、動物又はヒト細胞であり得、自己由来、異種又は組織移植片に関して異種であり得る。場合によっては、前記細胞は不朽化し得る。免疫学的応答の可能性を低下させるため、周辺組織の浸潤を回避するようにその細胞を被包し得る。被包材料は、一般に、タンパク質産物の放出は許容するが、患者の免疫系又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性重合体エンクロージャー又は膜である。
組み合わせ治療
（ペプチボディーのような）本発明の特異的結合剤は、Ａｎｇ−２発現に関連する疾患の処置において、他の治療との組み合わせで使用可能である。これらの他の治療には、たとえば放射線治療、化学治療、およびハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（商標）、リティキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（商標）、グリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）（商標）のような標的化治療などが含まれる。本明細書で特に列記してはいないさらなる組み合わせ治療もまた、本発明の目的の範囲内である。
【０３４３】
したがって、本発明は、１つまたはそれ以上の追加的好適な薬剤（群）との組み合わせで、同一の患者に投与した、本発明の１つまたはそれ以上の特異的結合剤の投与を含み、それぞれは、これらの薬剤に好適なレジメにしたがって投与される。これには、本発明の特異的結合剤と、１つまたはそれ以上の好適な薬剤の同時投与が含まれる。本明細書で使用するところの、用語「同時に投与した（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」および「同時投与（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」には、本発明にしたがった（ペプチドまたはペプチボディーのような）１つまたはそれ以上の特異的結合剤、および１つまたはそれ以上のさらなる好適な薬剤（群）の本質的に同時の投与が含まれる。
【０３４４】
本明細書で使用するところの用語「非同時（ｎｏｎ−ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）」投与は、異なる時間時点で、任意の順番で、重なりあうか、または重なりあわずに、本発明にしたがった（ペプチドまたはペプチボディーのような）１つまたはそれ以上の選択的結合薬剤、および１つまたはそれ以上のさらなる好適な薬剤（群）を投与することを意味する。これには、限定はしないが、（前処置、後処置または重なり処置のような）組み合わせの成分の連続処置、ならびに、薬剤を変更するレジメ、または１つの成分を長期間投与し、他を断続的に投与すること、が含まれる。成分は、同時または分割成分中で投与して良く、また同一または異なる投与経路によって投与して良い。
【０３４５】
化学治療処置を、たとえば、メクロロエタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファランおよびクロラムブシルのような窒素マスタード類、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、およびセムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）のような窒素供給源、スリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、トリエチレン、チオホスホラミド（チオテパ）、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ、アルトレタミイン）のようなエチレンイミン類／メチルメラミン、ブスルファンのようなアルキルスルホネート類、デカルバジン（ＤＴＩＣ）のようなトリアジン類、メトトレキサートおよびトリメトレキサートのようなギ酸類似体類、５−フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ゲムシタビン、シトシンアラビノシド（ＡｒａＣ、シタラビン）、５−アザシチジン、２，２’−ジフルオロデオキシシチジンにようなピリジン類似体、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アザチオプリン、２’−デオキシコホルミシン（ペントスタチン）、エリスロヒドロキシノニルアデニン（ＥＨＮＡ）、フルダラビンホスフェートおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン、２−ＣｄＡ）のようなプリン類似体を含む代謝拮抗物質、パクリタキセル、ビンブラスチン（ＶＬＢ）、ビンクリスチンおよびビノレルビンを含むビンカアルカロイド類、タキソテール、エストラムスチンおよびエストラムスチンホスフェートのような抗有糸分裂剤、エトポシドおよびテニポシドのようなピポドフィロトキシン類、アクチモマイシンＤ、ダウノマイシン（ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ミトキサントロン、イダルビシン、ブレオマイシン類、プリカマイシン（ミスラマイシン）、マイトマイシンＣおよびアクチノマイシンのような抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼのような酵素、インターフェロン−α、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのような生物学的応答改変物、シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金配向錯体類、マイトキサトロンのようなアンスラセンジオン類、ヒドロキシウレアのような置換尿素、Ｎ−メチルヒドラジン（ＭＩＨ）およびプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、ミトタン（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）およびアミノグルテスイミドのようなアドレノコルチコール抑制剤を含む種々の薬剤、プレドニゾンおよび同等物、デキサメタゾンおよびアミノグルテスイミドのようなアドレノコルチコステロイドアンタゴニスト類、ヒドロキシプロゲステロン、カルプロアーテ、酢酸メドロキシプロゲステロンおよび酢酸メゲステロールのようなプロゲスチン、ジエチルシルベストロールおよびエチルエストラジオール同等物のようなエストロゲン、タモキシフェンのような抗エストロゲン、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン／同等物を含むアンドロゲン類、フルタミド、ゴナドトロピン−放出ホルモン類似体およびリュープロリドのような抗アンドロゲン剤、およびフルタミドのような非ステロイド性抗アンドロゲン類を含むホルモンおよびアンタゴニスト類を含む、抗腫瘍薬剤を使用可能である。
【０３４６】
増殖因子との組み合わせ治療には、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＦＮ、ＴＮＦ０、ＴＮＦ１、ＴＮＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポイエチン、幹細胞因子またはエリストポイエチンのような、サイトカイン類、リンホカイン類、増殖因子類および他の造血因子類が含まれうる。他の組成物には、アンジオポイエチン、たとえば、Ａｎｇ−１、−２、−４、−Ｙおよび／またはヒトＡｎｇ−様ポリペプチド、および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）が含まれうる。増殖因子には、アンジオジェニン、骨形態発生タンパク質−１、骨形態発生タンパク質−２、骨形態発生タンパク質−３、骨形態発生タンパク質−４、骨形態発生タンパク質−５、骨形態発生タンパク質−６、骨形態発生タンパク質−７、骨形態発生タンパク質−８、骨形態発生タンパク質−９、骨形態発生タンパク質−１０、骨形態発生タンパク質−１１、骨形態発生タンパク質−１２、骨形態発生タンパク質−１３、骨形態発生タンパク質−１４、骨形態発生タンパク質−１５、骨形態発生タンパク質レセプターＩＡ、骨形態発生タンパク質レセプターＩＢ、脳由来神経栄養因子、繊毛神経栄養因子、繊毛神経栄養因子レセプター、サイトカイン−誘導好中球遊走性因子１、サイトカイン−誘導好中球、遊走性因子２、サイトカイン−誘導好中球遊走性因子２、内皮細胞増殖因子、エンドセリン１、上皮増殖因子、上皮−由来好中球誘因物、繊維芽細胞増殖因子４、繊維芽細胞増殖因子５、繊維芽細胞増殖因子６、繊維芽細胞増殖因子７、繊維芽細胞増殖因子８、繊維芽細胞増殖因子８ｂ、繊維芽細胞増殖因子８ｃ、繊維芽細胞増殖因子９、繊維芽細胞増殖因子１０、酸性繊維芽細胞増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、グリア細胞株−誘導神経栄養因子レセプター−１、グリア細胞株−誘導神経栄養因子レセプター−２、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質−１、増殖関連タンパク質−２−、増殖関連タンパク質−３、ヘパリン結合表皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子レセプター、インスリン−様増殖因子Ｉ、インスリン−様増殖因子レセプター、インスリン−様増殖因子ＩＩ、インスリン−様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病阻害因子、白血病阻害因子レセプター−１、神経増殖因子神経増殖因子レセプター、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子２、血小板−由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子Ａ鎖、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子Ｂ鎖、血小板由来増殖因子ＢＢ、血小板由来増殖因子レセプター−１、血小板由来増殖因子レセプター−２、プレ−Ｂ細胞増殖刺激因子、幹細胞因子、幹細胞因子レセプター、形質転換増殖因子−１、形質転換増殖因子−２、形質転換増殖因子−１、形質転換増殖因子−１．２、形質転換増殖因子−２、形質転換増殖因子−３、形質転換増殖因子−５、潜在的形質転換増殖因子−１、形質転換増殖因子−１結合タンパク質Ｉ、形質転換増殖因子−１結合タンパク質ＩＩ、形質転換増殖因子−１結合タンパク質ＩＩＩ、Ｉ型主要壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ１）、ＩＩ型主要壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ２）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化レセプター、血管内皮増殖因子、およびこれらのキメラタンパク質、生物学的または免疫学的活性断片が含まれる。
【０３４７】
（ペプチドまたはペプチボディーのような）本発明の特異的結合薬剤は、１つまたはそれ以上の抗炎症性薬剤と投与して良い。本明細書で使用するところの用語「抗炎症性薬剤（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）」は、一般的に、患者内の炎症または腫脹を減少させる任意の薬剤を意味する。多数の典型的な抗炎症性薬剤を本明細書で引用しているが、本明細書で特に引用していないさらなる好適な抗炎症性薬剤が存在しうることが理解され、本発明に含まれる。
【０３４８】
抗炎症性薬剤は、たとえば、炎症性サイトカインの、これらのレセプターへの相互作用を阻害する化合物でありうる。本発明の特異的結合薬剤との組み合わせで有用なサイトカイン阻害剤の例には、たとえば、ＴＧＦ−βの（抗体のような）アンタゴニスト、ならびに、炎症に関与するサイトカインに対する（抗体のような）アンタゴニストが含まれる。このようなインターロイキンが本明細書に記述されており、好ましくは、限定はしないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８が含まれる。Ｆｅｇｈａｌｉら，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉ．，２：１２−２６（１９９７）を参照のこと。
【０３４９】
本発明の特異的結合薬剤はまた、抗レトロウイルス治療を受けているＨＩＶ−感染患者において、Ｔ細胞増殖を促進するために、Ｉ型タンパク質キナーゼＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ  Ａ  Ｔｙｐｅ  １）の阻害剤と組み合わせて投与しうる。
【０３５０】
神経増殖因子（ＮＧＦｓ）もまた、特定の条件を処置するために、本発明の特異的結合薬剤と組み合わせることが可能である。このような条件には、神経変性疾患、脊髄損傷および多発性硬化症が含まれる。本組み合わせで処置可能な他の状態は、緑内障および糖尿病である。
【０３５１】
好ましい組み合わせ治療は、１つまたはそれ以上の好適なＩＬ−１阻害剤を組み合わせで患者に投与した、本発明の特異的結合薬剤に関連する。ＩＬ−１の阻害剤には、限定はしないが、ＩＬ−１のレセプター−結合ペプチド断片、ＩＬ−１またはＩＬ−１ベータまたはＩ型ＩＬ−１レセプター、または、遺伝的に改変した変異体、これらの改変変異体、多量体形態および徐放性処方が含まれる。特異的アンタゴニストには、ＩＬ−１ｒａポリペプチド類、ＩＬ−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、アンタゴニストＩ型ＩＬ−１レセプター抗体、Ｉ型ＩＬ−１レセプターおよびＩＩ型ＩＬ−１レセプターのＩＬ−１結合形態、ＩＬ−１アルファおよびＩＬ−１ベータおよび他のＩＬ−１ファミリーメンバーを含む、ＩＬ−１への抗体、およびＩＬ−１  Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）として公知の治療剤が含まれる。ＩＬ−１ｒａポリペプチドには、米国特許第５，０７５，２２２号で記述されたＩＬ−１ｒａの形態、および米国特許第５，９２２，５７３号、国際特許第ＷＯ９１／１７１８４号、第ＷＯ９２  １６２２１号および第ＷＯ９６  ０９３２３号で記述されたものを含む改変形態および変異体が含まれる。ＩＬ−１ベータ変換酵素（ＩＣＥ）阻害剤には、ＰＣＴ特許明細書第ＷＯ９１／１５５７７号、第ＷＯ９３／０５０７１号、第ＷＯ９３／０９１３５号、第ＷＯ９３／１４７７７号および第ＷＯ９３／１６７１０号、欧州特許明細書第０  ５４７  ６９９号に記述されたものを含む、ペプチジルおよび小分子ＩＣＥ阻害剤が含まれる。非ペプチジル化合物には、ＰＣＴ特許明細書第ＷＯ９５／２６９５８号、米国特許第５，５５２，４００号、米国特許第６，１２１，２６６号、およびＤｏｌｌｅら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９，ｐｐ．２４３８−２４４０（１９９６）に記述されたものが含まれる。さらなるＩＣＥ阻害剤が、米国特許第６，１６２，７９０号、同第６，２０４，２６１号、同第６，１３６，７８７号、同第６，１０３，７１１号、同第６，０２５，１４７号、同第６，００８，２１７号、同第５，９７３，１１１号、同第５，８７４，４２４号、同第５，８４７，１３５号、同第５，８４３，９０４号、同第５，７５６，４６６号、同第５，６５６，６２７号、同第５，７１６，９２９号に記述されている。Ｉ型ＩＬ−１レセプターおよびＩＩ型ＩＬ−１レセプターのＩＬ−１結合形態が、米国特許第４，９６８，６０７号、同第４，９６８，６０７号、同第５，０８１，２２８号、第Ｒｅ３５，４５０号、同第５，３１９，０７１号および同第５，３５０，６８３号で記述されている。他の好適なＩＬ−１アンタゴニストには、限定はしないが、ＩＬ−１シグナル伝達レセプターに競合的に結合可能なＩＬ−１から由来したペプチド、Ｉ型ＩＬ−１Ｒが含まれる。特定のＩＬ−１（および他のサイトカイン）アンタゴニストに関するさらなるガイダンスは、米国特許第６，４７２，１７９号で見ることができる。
【０３５２】
さらに、ＴＮＦ阻害剤が好適であり、限定はしないが、ＴＮＦαのレセプター−結合ペプチド断片、ＴＮＦα産出を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド類またはリボザイム類、ＴＮＦαに対する抗体、およびＴＮＦαに対するレセプターの全てまたは一部分、または遺伝的に改変した変異体、多量体形態および徐放性処方を含む、この改変変異体を含む組換え体タンパク質が含まれる。ＴＡＰＩ（イムネックス社（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．））およびＧＷ−３３３３Ｘ（グラクソ  ウェルカム社（Ｇｌａｘｏ  Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｉｎｃ．））のような、ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子−α変換酵素（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α  Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ））阻害剤も好適である。欧州特許第ＥＰ  ０  ６１４  ４６４Ｂ号に開示されたペプチドのようなＩｇＡ−α，ＡＴ複合体の形成、またはこの複合体に対する抗体を阻害する分子も好適である。さらに好適な分子には、限定はしないが、ＴＮＦα−阻害ジサッカライド、グルコサミンの硫酸化誘導体、または米国特許第６，０２０，３２３号に記述された他の同様の糖類が含まれる。さらに好適な分子には、米国特許第５，６４１，７５１号および同第５，５１９，０００号にて開示されたペプチドＴＮＦα阻害剤、および米国特許第５，７５３，６２８号にて記述されたＤ−アミノ酸含有ペプチドが含まれる。さらに、ＴＮＦα変換酵素の阻害剤もまた好適である。第ＷＯ０１／０３７１９号は、さらに、本発明にしたがって、組み合わせで使用可能な追加薬剤を記述している。
【０３５３】
またさらに好適な化合物には、限定はしないが、サリドマイドまたはサリドマイド類似体類、ペントキシフィリンのような小分子またはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤または他の小分子が含まれる。本目的のために好適なＭＭＰ阻害剤には、たとえば、米国特許第５，８８３，１３１号、同第５，８６３，９４９号および同第５，８６１，５１０号に記述されたもの、ならびに米国特許第５，８７２，１４６号にて記述されたようなメルカプトアルキルペプチジル化合物が含まれる。ＴＮＦα産出を減少可能な他の小分子には、たとえば、米国特許第５，５０８，３００号、同第５，５９６，０１３号および同第５，５６３，１４３号に記述された分子が含まれる。さらに好適な小分子には、限定はしないが、米国特許第５，７４７，５１４号および同第５，６９１，３８２号で記述されたようなＭＭＰ阻害剤、ならびに、米国特許第５，８２１，２６２号で記述されたもののようなヒドロキサム酸誘導体が含まれる。さらに好適な分子には、たとえば、置換オキシム誘導体（第ＷＯ９６／００２１５号）、キノリンスルホンアミド（米国特許第５，８３４，４８５号）、アリールフラン誘導体（第ＷＯ９９／１８０９５号）、およびヘテロ二環状誘導体（第ＷＯ９６／０１８２５号、英国特許第２  ２９１  ４２２Ａ号）のような、ホスホジエステラーゼＩＶおよびＴＦＮα産出を阻害する小分子が含まれる。ＴＮＦαおよびＩＮＦγ（第ＷＯ９９／１５５２４号）を抑制するチアゾール誘導体、ならびにＴＮＦαおよび他の炎症性サイトカインを抑制するキサンチン誘導体（たとえば米国特許第５，１１８，５００号、第５，０９６，９０６号および第５，１９６，４３０号を参照のこと）もまた有用である。本明細書で記述した状態を処置するために有用なさらなる小分子は、米国特許第５，５４７，９７９号で記述されたものが含まれる。
【０３５４】
組み合わせ治療によって投与されうる薬物および薬物型のさらなる例には、限定はしないが、抗ウイルス、抗生物質、鎮痛剤（たとえばアセタミノフェン、コデイン、プロポキシフェン  ナプシレート、オキシコドン塩酸塩、酸性酒石酸ヒドロコドン、トラマドール）、コルチコステロイド類、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、疾患修飾性抗リウマチ薬（Ｄｉｓｅａｓｅ−Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ａｎｔｉ−Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｒｕｇｓ（ＤＭＡＲＤｓ））、非ステロイド性抗炎症薬（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ（ＮＳＡＩＤｓ））、および遅効性抗リウマチ薬（Ｓｌｏｗ−Ａｃｔｉｎｇ  Ａｎｔｉ−Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｒｕｇｓ（ＳＡＡＲＤｓ））が含まれる。
【０３５５】
例示的な疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤｓ）には、限定はしないが、リューマトレックス（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ）（商標）（メトトレキサート）、エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ）（登録商標）（エタネルセプト）、レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）（登録商標）（インフリキシマブ）、ヒューミラ（Ｈｕｍｉｒａ）（商標）（アダリムマブ）、セガード（Ｓｅｇａｒｄ）（登録商標）（アフェリモマブ）、アラバ（Ａｒａｖａ）（商標）（レフルノミド）、キネレット（Ｋｉｎｅｒｅｔ）（商標）（アナキンラ）、アラバ（Ａｒａｖａ）（商標）（レフルノミド）、Ｄ−ペニシラミン、ミオクリシン（Ｍｙｏｃｈｒｙｓｉｎｅ）、プラクエニル（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）、リダウラ（Ｒｉｄａｕｒａ）（商標）（アウラノフィン）、ソルガナル（Ｓｏｌｇａｎａｌ）、レネルセプト（ホフマン−ラ  ロッシュ（Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ））、ＣＤＰ８７０（セルテック（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ））、ＣＤＰ５７１（セルテック）、ならびに欧州特許第０  ５１６  ７８５Ｂ１号、米国特許第５，６５６，２７２号、欧州特許第０  ４９２  ４４８Ａ１号に記述された抗体、オネルセプト（セローノ（Ｓｅｒｏｎｏ）、ＣＡＳ  ｒｅｇ．ｎｏ．１９９６８５−５７−９）、ＭＲＡ（中外（Ｃｈｕｇａｉ））、イムラン（Ｉｍｕｒａｎ）（商標）（アザチオピリン）、ＮＦＫＢ阻害剤、シトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）（商標）（シクロホスファミド）、シクロスポリン、ヒドロキシクロロクインサルフェート、ミノシクリン、スルファサラジン、および経口金、チオマレイン酸ナトリウム金およびオウロチオグルコースのような金化合物が含まれる。
【０３５６】
さらに好適な分子には、たとえば、第ＷＯ９９／０４００１号にて記述されたＴＮＦＲのような、このＴＮＦＲから由来するＴＮＦＲ−Ｉｇを含む、ｐ５５およびｐ７５  ＴＮＦＲｓ以外の、ＴＮＦαレセプター分子の細胞外領域から由来した可溶性ＴＮＦＲｓが含まれる。さらなる好適なＴＮＦα阻害剤が、本明細書で記述したような使用に好適である。これらには、本明細書で使用したようなＴＮＦαまたはＴＮＦＲに対する抗体のみではなく、（米国特許第５，７９５，８５９号、または米国特許第６，１０７，２７３号で記述されたもののような）ＴＮＦαの競合的阻害剤、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ融合タンパク質、ｐ５５  ＴＮＦαレセプターの細胞外部分を含むもののようなもの、ＩｇＧ融合タンパク質以外の可溶性ＴＮＦＲ、またはＴＮＦα変換酵素の阻害剤のような（たとえば米国特許第５，５９４，１０６号を参照のこと）内因性ＴＮＦαレベルを減少する他の分子、または小分子またはＴＮＦα阻害剤の使用が含まれ、これらの多くは本明細書に記述されている。
【０３５７】
考慮の患者の特異的な必要性にしたがって、経験のあるヘルスケア提供者によって、最適に用量が決定されるけれども、ＴＮＦに対する抗体に関して、ＴＮＦαに対する抗体に関する１つの例示的な好ましい用量範囲は、０．１から２０ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは１から１０ｍｇ／ｋｇである。抗−ＴＮＦα抗体に関する他の好ましい用量範囲は、０．７５から７．５ｍｇ／体重ｋｇである。
【０３５８】
本発明はまた、特異的結合薬剤と、１つまたはそれ以上の非ステロイド性抗炎症薬物（Ｎｏｎ−Ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｄｒｕｇｓ（ＮＳＡＩＤｓ））の任意を使用可能である。ＮＳＡＩＤｓは、少なくとも部分的に、プロスタグランジン合成の阻害まで、これらの抗炎症活性を所有する。ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ「治療の薬理学的基礎（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  第７編（１９８５）。ＮＳＡＩＤｓは、９つの群に特性化可能である。（１）サリチル酸誘導体類、（２）プロピオン酸誘導体類、（３）酢酸誘導体類、（４）フェナミン酸誘導体類、（５）カルボン酸誘導体類、（６）ブチル酸誘導体類、（７）オキシカム類、（８）ピラゾール類および（９）プラゾロン類である。ＮＳＡＩＤｓの例には、限定はしないが、アナプロックス（Ａｎａｐｒｏｘ）（商標）、アナプロックス  ＤＳ（商標）（ナプロキセン  ナトリウム）、アンサイド（Ａｎｓａｉｄ）（商標）（フルルビプロフェン）、アルスロテック（Ａｒｔｈｒｏｔｅｃ）（商標）（ジクロフェナク  ナトリウム＋ミソプロスチル）、カタフラム（Ｃａｔａｆｌａｍ）（商標）／ボルタレン（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）（商標）（ジクロフェナク  カリウム）、クリノリル（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）（商標）（サリンダック）、ダイプロ（Ｄａｙｐｒｏ）（商標）（オキサプロジン）、ジサルシド（Ｄｉｓａｌｃｉｄ）（商標）（サルサレート）、ドロビッド（Ｄｏｌｏｂｉｄ）（商標）（ジフルニサール）、ＥＣ  ナプロシン（ＥＣ  Ｎａｐｒｏｓｙｎ）（商標）（ナプロキセン  ナトリウム）、フェルデン（Ｆｅｌｄｅｎｅ）（商標）（ピロキシカム）、インドシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）（商標）、インドシンＳＲ（商標）（インドメタシン）、ロジン（Ｌｏｄｉｎｅ）（商標）、ロジンＸＬ（商標）（エトドラック）、モトリン（Ｍｏｔｒｉｎ）（商標）（イブプロフェン）、ナプレラン（Ｎａｐｒｅｌａｎ）（商標）（ナプロキセン）、ナプロシン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ）（商標）（ナプロキセン）、オルジス（Ｏｒｕｄｉｓ）（商標）（ケトプロフェン）、オルバイル（Ｏｒｕｖａｉｌ）（商標）（ケトプロフェン）、レラフェン（Ｒｅｌａｆｅｎ）（商標）（ナブメトン）、トレクチン（Ｔｏｌｅｃｔｉｎ）（商標）（トルメチン  ナトリウム）、トリリサート（Ｔｒｉｌｉｓａｔｅ）（商標）（コリンマグネシウムトリサリチル酸）、ビオックス（Ｖｉｏｘｘ）（商標）（ロフェコキシブ）、アルコキシア（Ａｒｃｏｘｉａ）（商標）（エトリコキシブ）、セレブレックス（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）（商標）（セレコキシブ）のような、Ｃｏｘ−１阻害剤、Ｃｏｘ−２阻害剤、モビック（Ｍｏｂｉｃ）（商標）（メロキシカム）、ベキシトラ（Ｂｅｘｔｒａ）（商標）（バルデコキシブ）、ダイナスタット（Ｄｙｎａｓｔａｔ）（商標）パラコシキブ  ナトリウム、プレキシジ（Ｐｒｅｘｉｇｅ）（商標）（ルミラコキシブ）、およびナンブメトンが含まれる。さらなる好適なＮＳＡＩＤｓには、限定はしないが、以下の、ε−アセタミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル酸、アミキセトリン、��ニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザック、ベンダザックリシネート、ベンジダミン、ベンプロジン、ブロペラモール、ブコローム、ブフェゾラック、シプロクアゾン、クロキシメート、ダジダミン、デボキサメット、デトミジン、ジフェンピラミド、ジフェンピラミド、ジフィサラミン、ジタゾール、エモルファゾン、ファネチゾールメシラート、フェンフルミゾール、フルオクタフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロクアゾン、ホピルトリン、ホスフォサル、グアイメサール、グアイアゾレン、イソニキシム、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リシンクロニキシナート、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロルム、オキサパドール、パラニリン、ペリソキサル、クエン酸ペリソキサル、ピホキシム、ピプロキセン、ピラゾラック、ピルフェニドン、プロクアゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプタミド、および、４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ１２７、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１およびＷＹ４１７７０のような企業コード番号によって指定されるものが含まれる。ＮＳＡＩＤｓと同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連ＮＳＡＩＤｓもまたこの群に含まれる。
【０３５９】
好適なＳＡＡＲＤｓまたはＤＭＡＲＤＳには、限定はしないが、アロクプレイド  ナトリウム、アウラノフィン、アウロチオグルコース、アウロチオグリカニド、アザチオプリン、ブレクイナル  ナトリウム、ブシラミン、カルシウム  ３−アウロチオ−２−プロパノール−１−スルホネート、クロラムブシル、クロロクイロ、クロブザリット、クプロキソイン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダプソン、１５−デオキシスペルグアリン、ジアセレイン、グルコサミン、金塩（たとえば、シクロクイン金塩、金ナトリウムチオマレイン酸、チオ硫酸金ナトリウム）、ヒドロキシクロロクイン、ヒドロキシウレア、ケブゾン、レバミソール、ロベンザリット、メソチン、６−メルカプトプリン、メトトレキサート、ミゾリビン、ミコフェノレート、モフェチン、ミオラル、窒素マスタード、Ｄ−ペニシラミン、ＳＫＮＦ８６００２およびＳＢ２０３５８０のようなピリジノールイミダゾール類、ラパマイシン、チオール類、チモポイエチンおよびビンクリスチンが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連ＳＡＡＲＤｓまたはＤＭＡＲＤｓもまたこの群に含まれる。
【０３６０】
シグナル伝達カスケードにおけるキナーゼの阻害剤もまた、本発明の特異的結合薬剤との組み合わせのための好適な薬剤である。これらには、限定はしないが、Ｐ−３８（ａ．ｋ．ａ．、「ＲＫ」または「ＳＡＰＫ−２」、Ｌｅｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３７２：７３９（１９９４））を阻害可能な薬剤が含まれる。Ｐ−３８は、セリン／スレオニンキナーゼ（Ｈａｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２６５：２２４−２２７（１９９５）を参照のこと）として記述されている。Ｐ−３８の阻害剤は、細胞外刺激と、ＩＬ−１の分泌間を干渉し、細胞からのＴＮＦαは、シグナル伝達経路に位置するキナーゼの阻害を介した、シグナル伝達の阻害に関与する。
【０３６１】
ＭＫ２阻害剤、およびｔｐｌ−２阻害剤がさらに好適である。さらに、Ｔ−細胞阻害剤もまた好適であり、たとえば、ｃｔｌａ−４、ＣｓＡ、Ｆｋ−５０６、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｒ−Ｆｃ、ＯＸ４０抗体、ＯＸ４０リガンド、ＯＸ４０リガンド抗体、ｌｃｋおよびＺＡＰ７０が含まれる。また、経口レチノイド類を含むレチノイド類、ならびにＴＧＦ−βのアンタゴニストも好適である。
【０３６２】
本発明の特異的結合薬剤との組み合わせに好適なさらなる薬剤には、たとえば、任意の１つまたはそれ以上のサリチル酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類が含まれる。このようなサリチル酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類には、アセタミノサロール、アロキシプリン、アスピリン、ベノリレート、ブロモサリゲニニン、カルシウムアセチルサリチル酸、コリンマグネシウムトリサリチル酸ジフルシナール、エーテルサレート、フェンドサル、ゲンチシン酸、グリコールサリチル酸、イミダゾールサリチル酸、リシンアセチルサリチル酸、メサラミン、サリチル酸モルホリン、１−ナフチルサリチル酸、オルサラジン、パラサルミド、フェニルアセチルサリチル酸、フェニルサリチル酸、サルアセタミド、サリチルアミドＯ−酢酸、サルサレートおよびスルファサラジンが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連サリチル酸誘導体類も、この群に含まれることが意図される。さらに好適な薬剤には、たとえば、プロピオン酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類が含まれる。プロピオン酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類には、アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシ酸、カルプロフェン、デキシインドプロフェン、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルビプロフェン、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェン  アルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、ピリドキシプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェンが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連プロピオン酸誘導体類も、この群に含まれることが意図される。酢酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類もまた、使用に好適である。酢酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類には、アセメタシン、アルクロフェナク、アムフェナク、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラック、デルメタシン、ジクロフェナク  ナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、グルカメタシン、イブフェナク、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパク、ロナゾラク、メチアジン酸、オキサメタシン、オキシピナク、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダク、タルメタシン、チアラミド、チオピナク、トルメチン、ジドメタシンおよびゾメピラクが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連酢酸誘導体類も、この群に含まれることが意図される。さらに、フェナミン酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類が、本明細書で記述したような使用に好適である。フェナミン酸誘導体類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩類には、エンフェナミン酸ナトリウム、エトフェナメート、フルフェナミン酸、イソニキシン、メクロフ��ナミン酸、メクロフェナメートナトリウム、メドフェナミン酸、メファナミン酸、ニフルミン酸、タルニフルメート、テロフェナメート、トルフェナミン酸およびウフェナメートが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連フェナミン酸誘導体類も、この群に含まれることが意図される。
【０３６３】
使用可能なカルボン酸誘導体、このプロドラッグエステルおよび医薬適合性の塩も好適であり、シダナック、ジフルニサール、フルフェニサール、イノリジン、ケトロラックおよびチノリジンが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連カルボン酸誘導体類も、この群に含まれることが意図される。酪酸誘導体、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩もさらに好適である。酪酸誘導体、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩には、ブマジゾン、ブチブフェン、フェンブフェンおよびキセンブシンが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連酪酸誘導体類も、この群に含まれることが意図される。オキシカム類、このプロドラッグエステル類、または医薬適合性の塩もまた好適である。オキシカム類、このプロドラッグエステル類、または医薬適合性の塩には、ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカムおよび４−ヒドロキシル−１，２−ベンゾチアジン１，１−ジオキシド−４−（Ｎ−フェニル）−カルボキサミドが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連オキシカム類も、この群に含まれることが意図される。ピラゾール類、このプロドラッグ類および医薬適合性の塩もまた好適である。使用しうるピラゾール類、このプロドラッグ類および医薬適合性の塩には、ジフェナミゾールおよびエピリゾールが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連ピラゾール類も、この群に含まれることが意図される。さらに、ピラゾロン類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩も好適である。使用しうるピラゾロン類、このプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩には、アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾンおよびチアゾリノブタゾンが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連ピラゾロン類も、この群に含まれることが意図される。
【０３６４】
ＴＮＦ−仲介疾患の処置のために、このプロドラッグ類または医薬適合性の塩も好適である。コルチコステロイド類、このプロドラッグおよび薬学的に許容可能な塩には、ヒドロコルチゾンおよびヒドロコルチゾンから由来した化合物、たとえば２１−アセトキシ−プレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムノニド、ベクロメタゾン、ベータ−メタゾン、吉草酸ベータメタゾン、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、プロピオン酸クロベタゾール、クロベタゾン、ブチル酸クロベタゾン、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デフラザコン、デソニド、デソキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドネート、エノキソロン、フルアザコルト、フルコロニド、フルメタゾン、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、フルシノロンアセトニド、フルシノニド、フルロシノロンアセトニド、ブチルフルオロコルチン、フルコルトロン、ヘキサン酸フルオロコルトロン、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、酢酸フルペロロン、酢酸フルプレドニデン、フルプレドニゾロン、フルランデノリド、ホルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ハロプレドン、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾン  テブテート、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニコロン、モメタゾン  フロエート、パラメタゾン、プレドニカルバート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドリアミノ酢酸、リン酸プレドニゾロンナトリウム、コハク酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンナトリウム２１−ｍ−スフホベンゾエート、プレドニゾロンナトリウム２１−ステアログリコレート、プレドニゾロン  テブテート、プレドニゾロン  ２１−トリメチル酢酸、プレドニゾン、プレドニバール、プレドニリデン、プレドニリデン  ２１−ジエチルアミノ酢酸、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロン  アセトニド、トリアムシノロン  ベネトニドおよびトリアムシノロン  ヘキサアセトニドが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連コルチコステロイド類も、この群に含まれることが意図される。
【０３６５】
抗細菌剤（およびこのプロドラッグエステル類または医薬適合性の塩）もまた、本明細書で記述したような組み合わせ使用に好適である。好適な抗細菌剤には、たとえば、アンピシリン、アモキシシリン、アウレオマイシン、バシトラシン、セフタジジム、セフトリアキソン、セホタキシム、セファクロル、セファレキシン、セフラジン、シプロフロキサシン、クラブラン酸、クロキサシリン、ジクロキサシラン、エリスロマイシン、フルクロキサシラン、ゲンタマイシン、グラミシジン、メチシラン、ネオマイシン、オキサシラン、ペニシリンおよびバンコマイシンが含まれる。同様の鎮痛および抗炎症特性を有する、構造関連抗細菌剤類も、この群に含まれることが意図される。
【０３６６】
さらに好適な化合物には、限定はしないが、ＢＮ５０７３０、テニダップ、Ｅ５５３１、チアパファントＰＣＡ４２４８、ニメスリド、パナビル、ロリプラム、ＲＰ７３４０１、ペプチドＴ、ＭＤＬ２０１，４４９Ａ、塩酸（１Ｒ，３Ｓ）−Ｃｉｓ−１−［９−（２，６−ジアミノプリニル）］−３−ヒドロキシ−４−シクロペンテン、（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［９−（２，６−ジアミノ）プリン］−３−アセトキシシクロペンタン、塩酸（１Ｒ，３Ｒ）−トランス−１−［９−アデニル）−３−アジドシクロペンタンおよび（１Ｒ、３Ｒ）−トランス−１−［６−ヒドロキシ−プリン−９−イル）−３−アジドシクロペンタンが含まれる。
【０３６７】
肺でのＩＬ−４の過剰発現が、上皮細胞肥大およびリンパ球、好酸球および好中球の蓄積を引き起こす、喘息でのような、いくつかの場合で、ＩＬ−４が、炎症効果を減少可能であることがわかった。この応答は、他のＴｈ２サイトカインによって誘導される炎症性応答の主な特徴の典型である。したがって上記のように、ＩＬ−４の阻害剤も、本発明にしたがって有用である。さらに、限定はしないがｉＮＯＳ阻害剤および５−リポオキシゲナーゼ阻害剤を含む、特定の免疫抑制薬剤がまた、喘息の治療で使用可能であることが理解されるであろう。
【０３６８】
Ｇｉｎｇｅｒは、特定の抗炎症特性を有し、したがって、コンドロイチンであるように、本発明にしたがった、抗炎症薬剤としての使用に好適であることが示される。
【０３６９】
上記列挙は、例示の方法によってのみであり、当業者に公知の、または本明細書で列記したガイドラインを用いて、当業者が知ることが出来る本明細書で記述した化合物と共に使用可能である、他の化合物または処置の使用を排除はしない。
免疫治療
免疫治療は、一般的に、癌細胞を標的として、破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子を使用することに依存する。免疫エフェクターは、たとえば、標的細胞の表面上の、いくつかのマーカーを認識する、本発明のペプチボディーでありうる。ペプチボディー単独が、治療のエフェクターとして働くか、これが、実際に細胞を殺すことに影響を与えるために、他の細胞を呼び寄せるかでありうる。ペプチボディーはまた、薬物または毒素（化学治療、放射性同位体、レシチンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に共役してもよく、したがって、単に標的化薬剤として働きうる。
【０３７０】
本発明にしたがって、Ａｎｇ−２の変異体形態が、本発明のペプチボディーまたはペプチボディー共役物いずれかでの免疫治療によって標的化されうる。本発明のペプチボディー組成物が、Ａｎｇ−２標的化治療との組み合わせでの、混合治療アプローチで使用されうることが、とりわけ考慮される。
【０３７１】
受動的免疫治療が、多数の癌に対して、とりわけ効果的であることが証明されてきている。たとえば、第ＷＯ９８／３９０２７号を参照のこと。
【０３７２】
以下の実施例は、例示の目的のみを意図しており、本発明の目的を制限するとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０３７３】
病的および正常組織におけるＡｎｇ−２発現
Ａｎｇ−２発現を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成を使用して、正常および病的組織中で試験した。ヒト（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ００４３２７、ヌクレオチド１２７４−１７２６）および齧歯類（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：ＡＦ００４３２６、ヌクレオチド１１３５−１５８８）Ａｎｇ−２配列の断片を、ヒトまたは齧歯類胎児肺ｃＤＮＡから、逆転写酵素−ＰＣＲによって増幅し、ｐＧＥＭ−Ｔプラスミド中にクローン化し、配列決定によって確認した。３３Ｐ−標識アンチセンスＲＮＡプローブを、３３Ｐ−ＵＴＰおよびＲＮＡポリメラーゼを用いて、直線化プラスミド鋳型から転写した。ホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋組織のブロックを、５μｍで分け、チャージスライド上に回収した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成に先立って、組織は０．２Ｍ  ＨＣｌで透過性であり、続いてＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋによって消化し、トリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化した。切片を、放射標識プローブで、５５℃にて一晩ハイブリッド形成し、続いて、ＲＮａｓｅ消化、および約０．１Ｘ  ＳＳＣ中、５５℃での高いストリンジェンシー洗浄にかけた。スライドを、コダック（Ｋｏｄａｋ）ＮＴＢ２エマルション中に浸し、２から３週間４℃にて暴露し、現像し、対比染色した。切片を、暗視野および標準発酵によって試験して、組織形態およびハイブリッド形成シグナルの同時評価を可能とした。
【０３７４】
結果によって、正常生後ヒトにおいて、Ａｎｇ−２発現が、卵巣、胎盤および子宮のような、血管新生脈管系を含むいくつかの組織に制限されていることが示唆された。正常の成人ヒト心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、筋肉、扁桃腺、甲状腺、虫垂、リンパ管、胆嚢、前立腺または睾丸では、Ａｎｇ−２発現は検出されなかった。５週齢マウスにおいては、腎臓が、直細血管にて、顕著なＡｎｇ−２発現を示した（ただし成体サルまたはヒトでは示されなかった）。この発現が、胚発生の残存であったかどうかを決定するために、この実験を、齧歯類Ａｎｇ−２プローブおよび上述した条件を用いて、１年齢までの範囲のマウスから由来した腎臓で繰り返した。Ａｎｇ−２発現が、新生児発育の間に減少することが観察されたが、１年齢マウスの腎臓において、まだ痕跡があった。
【０３７５】
Ａｎｇ−２発現はまた、大腸癌（５例）、乳癌（１０例）、肺癌（８例）、膠芽細胞腫（１例）のような初代ヒト腫瘍、脳へ転移した乳癌（２例）、肺癌（２例）および卵巣癌（２例）のような転移ヒト腫瘍、およびＣ６（ラットグリオーマ）、ＨＴ２９（ヒト大腸癌）、Ｃｏｌｏ−２０５（ヒト大腸癌）、ＨＴＣ１１６（ヒト大腸癌）、Ａ４３１（ヒト類表皮癌）、Ａ６７３（ヒト胎児型性横紋筋肉腫）、ＨＴ１０８０（ヒト線維肉腫）、ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）、Ｂ１６Ｆ１０（齧歯類ミエローマ）、ＭｅｔｈＡ（齧歯類肉腫）、およびルイス（Ｌｅｗｉｓ）肺癌メッツを含む、試験した実質的にすべての腫瘍型でも検出された。さらに、Ａｎｇ−２発現は、ＶＥＧＦに対する応答で、マトリジェル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）プラグ内に増殖した新生血管中、および未熟児の網膜症のマウス低酸素状態モデル中でも検出された。
【実施例２】
【０３７６】
Ａｎｇ−２ペプチボディーを評価するための分子アッセイ
分子アッセイ（アフィニティーＥＬＩＳＡ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＥＬＩＳＡ）、ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡ（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ）およびビアコア（ＢＩＡｃｏｒｅ））を、Ａｎｇ−２および関連ファミリーメンバーに対する直接ペプチボディー結合、およびＡｎｇ−２：Ｔｉｅ−２相互作用におけるペプチボディーの効果を査定するために開発した。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは以下のように記述される。
【０３７７】
アフィニティーＥＬＩＳＡ
候補抗−Ａｎｇ−２ペプチボディーの初期スクリーニングのために、精製したヒトＡｎｇ−２（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、カタログ番号６２３−ＡＮ、Ａｎｇ−２は、２つの短化バージョンの混合物として提供される）、または齧歯類Ａｎｇ−２ポリペプチド（以上で記述したように調製した）を使用した。確認結合アッセイのために、ヒトＡｎｇ−２を、全長ヒトＡｎｇ−２  ＤＮＡをトランスフェクトした、ヒト２９３Ｔ細胞の条件培地から得、約５０マイクログラム／牛血清アルブミン（ＢＳＡ）ｍｌを含む血清を含まないダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ））中で培養した。
【０３７８】
マイクロタイタープレートを用いて、Ａｎｇ−２のウェルあたりおよそ１００マイクロタイターを、各ウェルに加えて、プレートを、約２時間インキュベートして、この後、このプレートを、約０．１パーセント  トゥイーン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で４回洗浄した。次いでウェルを、ＰＢＳ中約５パーセントＢＳＡの、約２５０マイクロタイター／ウェルを用いてブロックし、プレートを、室温にて約２時間インキュベートした。インキュベーション後、過剰なブロッキング溶液を捨て、約１００マイクロタイターの、各候補抗−Ａｎｇ−２ペプチボディーを、約４０ナノモルの濃度で開始した、希釈系列にてウェルに加え、次いで約１パーセントＢＳＡを含むＰＢＳ中４倍に連続希釈した。次いでプレートを室温にて一晩インキュベートした。インキュベーションの後、プレートを、約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。洗浄を、さらに２回繰り返し、この後約１００マイクロタイター／ウェルの、先に１パーセントＢＳＡを含むＰＢＳ中で１：５０００希釈した、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）−ＨＲＰ（ピアス  ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、カタログ＃３１４１６）を加えた。プレートを、室温にておよそ１時間インキュベートした。次いでプレートを、約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で５回洗浄し、この後、約１００マイクロタイター／ウェルのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン  リキッド  サブストレート  システム（Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）、シグマ  ケミカル  カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ、カタログ番号Ｔ８６６５）基質を加えて、プレートを、青い色が発色するまで、約５から１５分間インキュベートした。次いで吸収を、約３７０ｎｍにて、分光光度計で読んだ。
【０３７９】
ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡ
ヒトＡｎｇ−２ポリペプチドが結合したマイクロタイタープレートを、アフィニティＥＬＩＳＡに関して記述したように調製した。候補抗Ａｎｇ−２ペプチボディーを、約１％  ＢＳＡおよび約１ｎＭ  Ｔｉｅ−２（Ｔｉｅ−２部分が、分子の可溶性細胞外部分のみを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される。Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号３１３−ＴＩ）を含むＰＢＳの溶液中で、１０００ｎＭから０．２ｐＭまで４倍希釈で滴定した。約１００マイクロタイターの抗体／Ｔｉｅ−２溶液を、各ウェルに加えた後、プレートを、室温にて一晩インキュベートし、次いで約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で、５回洗浄した。洗浄後、約１００マイクロタイター／ウェルの抗Ｔｉｅ−２抗体（ファルミンゲン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、カタログ＃５５７０３９）を、約１マイクログラム／ｍｌの最終濃度まで加え、プレートを、約１時間、室温にてインキュベートした。次に、約１００マイクロタイター／ウェルのヤギ−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ（ピアス  ケミカルＣＯ．（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、カタログ＃３１４３２）を、約１パーセントＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１０，０００の希釈にて加えた。プレートを、室温にて約１時間インキュベートし、この後、約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。次いで約１００マイクロタイター／ウェルの（上記）ＴＭＢ基質を加えて、発色させた。次いで吸収を、３７０ｎｍにて、分光高度計で読んだ。
【０３８０】
アフィニティービアコア
各候補Ａｎｇ−２ペプチボディーのアフィニティー解析を、ランニング緩衝液として、ＰＢＳおよび０．００５パーセントＰ２０界面活性剤（ビアコア社（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）で、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００（ビアコア社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上で実施した。組換え体Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（レプリゲン（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）、Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を、製造業者が示したプロトコールにしたがって、Ａｍｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ビアコア社）を用いて、第一級アミン基を介して、研究グレードＣＭ５センサーチップ（ビアコア社）に固定化した。
【０３８１】
結合アッセイを、固定化Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇへの、約１００Ｒｕの各候補抗Ａｎｇ−２ペプチボディーの第一の捕獲、この後、種々の濃度（０から１００ｎＭ）のｈｕＡｎｇ−２またはｍＡｎｇ−２を、３分間、５０μｌ／分間の流速で、結合抗体表面上に注入することによって実施した。ｋａ（結合速度定数）、ｋｄ（解離速度定数）、およびＫＤ（解離平衡定数）を含むペプチボディー結合速度論パラメータを、ＢＩＡ評価３．１コンピュータプログラム（ビアコア社）を用いて決定した。より低い解離平衡定数が、Ａｎｇ−２に対するより大きなペプチボディーのアフィニティーを示唆した。
【実施例３】
【０３８２】
Ａｎｇ−２結合ペプチドの同定
１．Ａｎｇ−２−コート磁気ビーズ調製
Ａ．磁気ビーズ上のＡｎｇ−２固定化
非特異的溶出のために、ビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質（ビオチン化組換え体ヒトアンジオポイエチン−２（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２）、Ｒ＆Ｄシステムズ社、カタログ番号ＢＴ６２３）を、選別の３回のラウンドすべてに関して、製造業者からの１００μｌのビーズストックあたり、約４μｇのビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質の濃度で、ストレプトアビジン  ダイナビーズ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（ダイナール（Ｄｙｎａｌ），Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）上に固定化した。抗原（Ａｎｇ−２）およびレセプター（Ｔｉｅ−２）溶出のために、２μｇのビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質を、選別の第二ラウンドのために５０μｇのストレプトアビジン  ダイナビーズ上に固定化した。コーティング濃度を、選別の第三ラウンドのために、５０μｇのビーズストックあたり、約１μｇのビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質まで減少させた。磁石を用いて、ビーズをチューブの１つの側に引き寄せ、液体をピペットで吸い取ることによって、ビーズをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で５回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させた。ビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質を、以上の濃度で、洗浄したビーズに加え、室温にて１時間、回転させてインキュベーションし、４℃にて一晩のインキュベートまで、数時間回転させた。次いでＡｎｇ−２コートビーズを、約１％の最終濃度まで、ＢＳＡに加え、回転させながら４℃にて一晩インキュベートすることによってブロックした。得られたＡｎｇ−２コートビーズを、次いでＰＢＳにて５回洗浄して、選別手順にかけた。
【０３８３】
Ｂ．ネガティブ選別ビーズ調製
さらなるビーズをまた、ネガティブ選別のために調製した。各パニング条件に関して、製造業者からの５００μｌのビーズストックを、ビオチン化Ａｎｇ−２でのインキュベーション段階を削除したこと以外、上記手順（項目１Ａ）にかけた。最後の洗浄段階において、ビーズを５つの１００μｌ分液に分けた。
【０３８４】
２．Ａｎｇ−２結合ファージの選別
Ａ．全般的戦略
「ＴＮ８−ＩＸ」（５×１０９  独立トランスフォーマント）、「ＴＮ１２−Ｉ」（１．４×１０９  独立トランスフォーマント）、および「Ｌｉｎｅａｒ」（２．３×１０９  独立トランスフォーマント）（すべてダイアックス社（Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．）より）として命名された、３つのフィラメンタスファージライブラリーを用いて、Ａｎｇ−２結合ファージに関して選別した。次いで各ライブラリーを、非特異的溶出、Ａｎｇ−２溶出、およびレセプター溶出（Ｔｉｅ−２）のいずれかにかけた。９つの異なるパニング条件を、Ａｎｇ−２に対して実施した（非特異的溶出法を用いるＴＮ８−ＩＸ、Ａｎｇ−２溶出法を用いるＴＮ８−ＩＸ、Ｔｉｅ−２溶出法を用いるＴＮ８−ＩＸ、非特異的溶出法を用いるＴＮ１２−Ｉ、Ａｎｇ−２溶出法を用いるＴＮ１２−ＩおよびＴｉｅ−２溶出法を用いるＴＮ１２−Ｉ、非特異的溶出法を用いるＬｉｎｅａｒ、Ａｎｇ−２溶出法を用いるＬｉｎｅａｒおよびＴｉｅ−２溶出法を用いるＬｉｎｅａｒ）。３つのすべてのライブラリーに関して、第一ラウンドの選別からのファージを、さらなるラウンドの選別のために、非特異的様式のみにて溶出した。Ａｎｇ−２およびＴｉｅ−２溶出を第二および第三ラウンド選別のために使用した。Ｌｉｎｅａｒライブラリーに関して、選別は、Ａｎｇ−２およびＴｉｅ−２溶出に関して、第二ラウンドのみ実施した。
【０３８５】
Ｂ．ネガティブ選別
各パニング条件に関して、ＴＮ８−ＩＸおよびＴＮ１２−Ｉライブラリー（ＴＮ８−ＩＸに関して、約５×１０１１ｐｆｕ、ＴＮ１２−Ｉに関して、約１．４×１０１１ｐｆｕ）に対する約１００の無作為ライブラリー等価物、および直線ライブラリー（約１×１０１１ｐｆｕ）に関して、約１０の無作為ライブラリー等価物を、ライブラリーストックより分液し、ＰＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０入りＰＢＳ）で約４００μｌまで希釈した。最後の洗浄の後、液体を、ネガティブ選別のために調製したビーズの最初の１００μｌ分液より吸引し（項目１Ｂ）、およそ４００μｌの希釈ライブラリーストックをビーズに加えた。得られた混合液を、回転させて、室温にて約１０分間インキュベートした。ファージ上清を、磁石を用いて引き出し、他のネガティブ選別段階のために、第二の１００μｌ分液に加えた。この方法において、５回のネガティブ選別段階を実施した。
【０３８６】
Ｃ．Ａｎｇ−２タンパク質コートビーズを用いる選別
最後のネガティブ選別段階（項目１Ｂ）後のファージ上清を、Ａｎｇ−２コートビーズ（項目１Ａ）に加えた。この混合液を、１から２時間、室温にて回転させてインキュベートし、ファージを、標的タンパク質に結合させた。上清を捨てた後、ビーズを約１０回、ＰＢＳＴで洗浄し、続いてＰＢＳで２回洗浄した。
【０３８７】
Ｄ．非特異的溶出
最終洗浄の後、液体を取り除き（項目２Ｃ）、約１ｍｌのＭｉｎＡ塩溶液（６０ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、３３ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７．６ｍＭ  （ＮＨ４）ＳＯ４、および１．７ｍＭ  クエン酸ナトリウム）をビーズに加えた。このビーズ混合液を、感染のために、濃縮細菌試料に直接加えた（以下の項目３Ａおよび３Ｂを参照のこと）。
【０３８８】
Ｅ．結合ファージの抗原（Ａｎｇ−２）溶出
ラウンド２のために、最後の洗浄段階（項目２Ｃ）の後、１００μｌの１ｐＭ、０．１ｎＭおよび１０ｍＭ組換え体Ａｎｇ−２タンパク質（リコンビナント  ヒト  アンジオポイエチン−２（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２）、Ｒ＆Ｄシステムズ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を加え、続いて、各条件に関して、３０分間インキュベーションすることによって、結合ファージを、磁気ビーズより溶出した。残ったファージを、非特異的に溶出した（項目２Ｄ）。１０ｎＭおよび非特異的溶出より溶出されたファージを合わせ、これらを、第三ラウンドの選別にかけた（以下の項目４を参照のこと）。
【０３８９】
ラウンド３のために、最後の洗浄段階後（項目２Ｃ）、結合したファージを、約１ｎＭの組換え体Ａｎｇ−２タンパク質、および１０ｎＭの組換え体Ａｎｇ−２タンパク質を加え、引き続いて各条件に関して、３０分間インキュベーションすることによって、磁気ビーズより溶出した。さらに、ファージを、１ｍｌの１００ｍＭ  トリエチルアミン溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で、ローター上にて約１０分間溶出した。ファージ含有トリエチルアミン溶液のｐＨを、０．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和した。１００ｍＭトリエチルアミン溶液での最後の溶出の後、残っているファージを、細菌に対してビーズを加えることによって溶出した（項目２Ｄ）。
【０３９０】
Ｆ．結合ファージのレセプター（Ｔｉｅ−２）溶出
ラウンド２のために、最後の洗浄段階（項目２Ｃ）の後、１００μｌの１ｐＭ、０．１ｎＭおよび１０ｎＭ組換え体Ｔｉｅ−２タンパク質（リコンビナント  ヒト  Ｔｉｅ−２−Ｆｃキメラ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｅ−２−Ｆｃ  Ｃｈｉｍｅｒａ）、Ｒ＆Ｄシステムズ社、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を加え、続いて、各条件に関して、３０分間インキュベーションすることによって、結合ファージを、磁気ビーズより溶出した。残ったファージを、非特異的に溶出した（項目２Ｄ）。１０ｎＭおよび非特異的溶出より溶出されたファージを合わせ、これらを、第三ラウンドの選別にかけた（以下の項目４を参照のこと）。
【０３９１】
ラウンド３のために、最後の洗浄段階後（項目２Ｃ）、結合したファージを、約１ｎＭの組換え体Ａｎｇ−２タンパク質、および１０ｎＭの組換え体Ｔｉｅ−２タンパク質を加え、引き続いて各条件に関して、３０分間インキュベーションすることによって、磁気ビーズより溶出した。さらに、ファージを、１ｍｌの１００ｍＭ  トリエチルアミン溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で、ローター上にて１０分間溶出した。ファージ含有トリエチルアミン溶液のｐＨを、０．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で中和した。１００ｍＭトリエチルアミン溶液での最後の溶出の後、残っているファージを、細菌に対してビーズを加えることによって溶出した（項目２Ｄ）。
【０３９２】
３．増幅
Ａ．プレーティング細胞の調製
新鮮な大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ．）（ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’）培養液を、約１２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンを含むＬＢ培地中、約０．５のＯＤ６００まで増殖させた。各パニング条件のために、約２０ｍｌのこの培養液を、氷上で冷却し、遠心した。細菌ペレットを、約１ｍｌのＭｉｎ  Ａ  Ｓａｌｔｓ溶液中に再懸濁させた。
【０３９３】
Ｂ．形質導入
上述した（項目２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ）各異なる溶出方法からの各混合液を、濃縮細菌試料（項目３Ａ）に加え、約３７℃にて約１５分間、インキュベートした。およそ２ｍｌのＮＺＣＹＭ培地（２ＸＮＺＣＹＭ、５０μｇ／ｍｌ  アンピシリン）を、各混合液に加えて、約３７℃にて１５分間インキュベートした。得られた４ｍｌの溶液を、約５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む、大ＮＺＣＹＭ寒天プレート上でプレートし、３７℃にて一晩インキュベートした。
【０３９４】
Ｃ．ファージ回収
各細菌／ファージ混合液を、大ＮＺＣＹＭ寒天プレート上で一晩増殖させ（項目３Ｂ）、この後、約３５ｍｌのＬＢ培地内にこすり落とした。寒天プレートをさらに、さらなる３５ｍｌのＬＢ培地で濯いだ。ＬＢ培地中の得られた細菌／ファージ混合液をペレットまで遠心して、細菌を除去した。次いでおよそ５０ｍｌのファージ上清を、新鮮なチューブに写し、約１２．５ｍｌのＰＥＧ溶液（２０％  ＰＥＧ８０００、３．５Ｍ  酢酸アンモニウム）を加え、２時間氷上でインキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを、遠心し、６ｍｌのファージ再懸濁緩衝液（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁させた。このファージ溶液をさらに、遠心によって精製し、残っている細菌を除去し、約１．５ｍｌのＰＥＧ溶液を加えることによって、二回ファージを沈殿させた。遠心段階の後、ファージペレットを、約４００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させた。この溶液を、最終遠心にかけて、残余細菌残骸の溶液を取り除いた。得られたファージ調製物を、標準のプラーク形成アッセイを用いて滴定した。
【０３９５】
４．追加選別および増幅
第二ラウンドにおいて、第一ラウンド（項目３Ｃ）から増幅したファージ調製物（約１０１０ｐｆｕ）を、インプットファージとして使用して、選別および増幅段階を実施した（項目２および３）。Ａｎｇ−２およびＴｉｅ−２溶出のために、１０ｎＭおよび非特異的溶出からのファージを合わせ、第三ラウンドの選別のために増幅した。第二ラウンドから増幅したファージ調製物（約１０９ｐｆｕ）を、続いて第三ラウンドの選別および増幅を実施するためのインプットファージとして使用した（項目２および３）。第三ラウンドの溶出段階（項目２Ｄ、２Ｅおよび２Ｆ）の後、溶出したファージの小画分を、プラーク形成アッセイとして、プレートした（項目３Ｃ）。個々のプラークをつまみ、各ウェル中に１００μｌのＴＥ緩衝液を含む、９６ウェルマイクロタイタープレート内にまいた。これらのマスタープレートを、４℃にて一晩インキュベートして、ＴＥ緩衝液内にファージを溶出した。
【０３９６】
５．クローン解析
ファージクローンを、ファージＥＬＩＳＡおよびＤＮＡシークエンシングによって解析した。配列を、これらの２つのアッセイからの組み合わせ結果に基づいてランク付けした。
【０３９７】
Ａ．ファージＥＬＩＳＡ
ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’培養液を、ＯＤ６００が約０．５に達するまで増殖させた。約３０μｌのこの培養液を、９６−ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに分液した。約１０μｌの溶出ファージ（項目４）を各ウェルに加え、室温にて約１５分間、細菌に感染させた。およそ１２．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよびおよそ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む、約１００μｌのＬＢ培地を各ウェルに加えた。次いでマイクロタイタープレートを、撹拌しながら、約３７℃にて一晩インキュベートした。組換え体Ａｎｇ−２タンパク質（ＰＢＳ中約１μｇ／ｍｌ）を、約４℃にて一晩、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）に結合させた。対照として、純粋なストレプトアビジンを、別のＭａｘｉｓｏｒｐプレート上に、ＰＢＳ中約２μｇ／ｍｌでコートした。
【０３９８】
翌日に、タンパク質コートＭａｘｉｓｏｒｐプレート中の液体を捨て、各ウェルを、約４℃にて一晩（あるいは室温にて１時間）、約３００μｌの５％ミルク溶液でブロックした。次いでミルク溶液を除去し、ウェルを、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。最後の洗浄段階の後、約５０μｌのＰＢＳＴ−４％ミルクを、タンパク質コートＭａｘｉｓｏｒｐプレートの各ウェルに加えた。９６ウェルマイクロタイタープレート中の各ウェルからの約５０μｌの一晩培養液を、Ａｎｇ−２コートプレートならびに対照ストレプトアビジンコートプレートの相当するウェルに移した。各型のプレート中の１００μｌの混合液を、約１時間、室温にてインキュベートした。液体を、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートより捨て、ウェルをＰＢＳＴにて約３回洗浄した。ＨＲＰ−共役抗−Ｍ１３抗体（アマシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、約１：７，５００まで希釈し、約１００μｌの希釈溶液を、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートの各ウェルに加え、室温にておよそ１時間インキュベートした。液体を再び捨て、ウェルをＰＢＳＴにて約５回洗浄した。次いで約１００μｌのＴＭＢ基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を各ウェルに加えて、反応を、約５０μｌの５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４溶液で停止させた。ＯＤ４５０を、分光光度計（モレキュラー  デバイシス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ））上で読んだ。
【０３９９】
Ｂ．ファージクローンのシークエンシング
各ファージクローンに関して、シークエンシング鋳型を、ＰＣＲを用いて調製した。以下のオリゴヌクレオチド対を使用して、およそ５００ヌクレオチド断片を増幅した。
【０４００】
【化４１】
2007524610.tif 000047
【０４０１】
以下の混合液を各クローンのために調製した。
【０４０２】
【表８】
2007524610.tif 000048
【０４０３】
ＰＣＲのために、サーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いて、以下のプログラムを走らせた。９４℃で５分間、（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間）×３０サイクル、７２℃で７分間。４℃まで冷却。各反応からのＰＣＲ産物を、製造業者のプロトコールにしたがって、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて精製した。次いで精製したＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル上で、約１μｌの色素（１０×ＢＢＸＳアガロースゲルローディング色素）との、１０μｌの各ＰＣＲ反応混合物を走らせることによって査定した。次いで残った産物を、製造業者の推奨プロトコールにしたがって、ＡＢＩ３７７  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（パーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて配列決定した。
【０４０４】
６．配列ランキングおよびコンセンサス配列決定
Ａ．配列ランキングおよび解析
可変ヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列（項目５Ｂ）を、ＥＬＩＳＡデータと関連づけた。Ａｎｇ−２コートウェル中で高いＯＤ４５０を示し、ストレプトアビジンコートウェル中で低いＯＤ４５０を示したクローンに、より高い優先ランクを与えた。複数回現れた配列も高い優先ランクを与えた。候補配列を、ペプチドまたはペプチボディーとして、さらなる解析のために、これらの基準に基づいて選択した。
【０４０５】
Ｂ．コンセンサス配列決定
３つの異なる種類のコンセンサスモチーフが、以下のようにＴＮ８−ＩＸライブラリーより産出された。
【０４０６】
【化４２】
2007524610.tif 000049
【０４０７】
１つのコンセンサスモチーフが、ＴＮ１２−Ｉライブラリーより産出された。
【０４０８】
【化４３】
2007524610.tif 000050
【０４０９】
すべてのコンセンサスモチーフ配列に関して、各コンセンサス配列からの下線「コアアミノ酸配列（ｃｏｒｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」を、各位置でもっとも頻繁に現れるアミノ酸を決定することによって得た。「Ｘ」は、天然に存在するアミノ酸を指す。コア配列に連結する２つのシステインが、ＴＮ８−ＩＸおよびＴＮ１２−Ｉライブラリーにおける固定アミノ酸である。
【０４１０】
Ａｎｇ−２に結合するとして同定されたペプチドを、以下の表３で列記している。
【０４１１】
【表９】
2007524610.tif 000051
【実施例４】
【０４１２】
ＤＮＡコードペプチボディーの構造
Ａｎｇ−２：Ｔｉｅ−２結合に対する潜在的な阻害として選択された改変ペプチド（表３を参照のこと）を使用して、各ペプチドのモノマー、または各ペプチド（モノマーユニットのリンカーを有する）のタンデムダイマーいずれかが、リンカーをコードしているＤＮＡ、続いてヒトＩｇＧ１のＦｃ領域にイン−フレームで融合した、融合タンパク質を構築した。各改変ペプチドは、オリゴヌクレオチド類（「オリゴ類（ｏｌｉｇｏｓ）」）のアニーリング対によって構築され、ペプチドに依存して、５つのグリシン残基、８つのグリシン残基または１つのリシン残基からなるリンカーと共に、ペプチドをコードしているポリヌクレオチド二本鎖を産出し、これらの構造は、ＮｄｅＩからＸｈｏＩ断片として産出された。これらの二本鎖ポリヌクレオチド分子を、先にＮｄｅＩおよびＸｈｏＩによって消化した、ヒトＦｃ遺伝子を含むベクター（ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ  Ｎ−末端、さらに以下で記述する）内にライゲートした。得られたライゲーション混合物を、標準の手順を用いて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株２５９６細胞（ＧＭ２２１、以下でさらに記述する）内に、エレクトロポレーションによって形質導入した。クローンを、組換え体タンパク質産物を産出する、正確なヌクレオチド配列を有する遺伝子融合物を有する能力に関して選別した。このようなクローンの単独を、改変ペプチドのそれぞれに関して選別した（すなわち、Ｆｃ−ペプチド融合産物）。
【０４１３】
ｐＡＭＧ２１−Ｆｃ  Ｎ−末端ベクターの構築
ｐＡＭＧ２１
発現プラスミドｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）は、開示されている国際特許出願第ＷＯ００／２４７８２号にて記述された手順（１００から１０３ページにわたる実施例２の部分、ならびに図１７Ａおよび１７Ｂを参照のこと）にしたがうことで、発現ベクターｐＣＦＭ１６５６（ＡＴＣＣ番号６９５７６）および米国特許第４，７１０，４７３号にて記述された発現ベクター系より由来する。
【０４１４】
Ｆｃ  Ｎ−末端ベクター
Ｆｃ  Ｎ−末端ベクターを、鋳型として、大腸菌株３７８８、ｐＡＭＧ２１  Ｔｐｏ＿Ｇｌｙ５＿Ｆｃモノマーを用いて作製した。この株のクローニングに関する情報は、第ＷＯ００／２４７８２号（実施例２および図１０を参照のこと）において見ることが出来る。（以下でさらに記述する）５’ＰＣＲプライマーを、ｐＡＭＧ  Ｔｐｏ  Ｇｌｙ５中のＴｐｏペプチド配列を除去し、ＡｐａＬＩおよびＸｈｏＩ部位を含むポリリンカーで置換するように設計した。鋳型として株３７８８を使用して、５’プライマーとして、以下の配列番号８のオリゴヌクレオチド、およびユニバーサル３’プライマー、以下配列番号９を用いて、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで実施した。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｓｒＧＩで消化した。このリンカーと一緒に、プラスミドおよび、対照の各ペプチドをコードしているポリヌクレオチド両方を、キアゲン（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）ゲル精製スピンカラムを用いてゲル精製した。次いでプラスミドおよび挿入物を、標準のライゲーション手順を用いてライゲートし、得られたライゲーション混合物を、大腸菌細胞（株２５９６）内に形質転換した。単独クローンを選別し、ＤＮＡシークエンシングを実施した。正確なクローンを同定し、これを、本明細書で記述した改変ペプチドに対する、ベクター供給源として使用した。
【０４１５】
【化４４】
2007524610.tif 000052
【０４１６】
これらの改変ペプチドを、Ｆｃに対するＮ−末端融合物として作製することに加えて（Ｎ−末端ペプチボディー）、これらのいくつかをまた、Ｃ−末端融合産物（Ｃ−末端ペプチボディー）として作製した。Ｃ−末端融合物を作製するために使用したベクターを以下に記述する。
【０４１７】
Ｆｃ  Ｃ−末端ベクターの構築
改変ペプチドに対するＦｃ  Ｃ−末端ベクターを、大腸菌株３７２８、鋳型としてｐＡＭＧ２１  Ｆｃ＿Ｇｌｙ５＿Ｔｐｏモノマーを使用して作製した。この株のクローニングに関する情報は、第ＷＯ００／２４７８２号（実施例２および図７を参照のこと）において見ることが出来る。３’ＰＣＲプライマー（配列番号１０）を、Ｔｐｏペプチド配列を除去し、ＡｐａＬＩおよびＸｈｏＩ部位を含むポリリンカーで置換するように設計した。鋳型として株３７２８を使用して、ユニバーサル５’プライマー（配列番号１１）および上記３’プライマーを用いて、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅで実施した。得られたＰＣＴ産物をゲル精製し、制限酵素ＢｓｒＧＩおよびＢａｍＨＩで消化した。このリンカーと一緒に、プラスミドおよび、対照の各ペプチドをコードしているポリヌクレオチド両方を、キアゲンゲル精製スピンカラムを用いてゲル精製した。次いでプラスミドおよび挿入物を、標準のライゲーション手順を用いてライゲートし、得られたライゲーション混合物を、大腸菌細胞（株２５９６）内に形質転換した。単独クローンを選別し、ＤＮＡシークエンシングを実施した。正確なクローンを同定し、これを、本明細書で記述した改変ペプチドに対する、ベクター供給源として使用した。
【０４１８】
【化４５】
2007524610.tif 000053
【０４１９】
ＧＭ２２１（＃２５９６）  Ｆｃ−ペプチド融合タンパク質を発現するために使用した宿主株＃２５９６は、ｌｕｘプロモーター、および早期ｅｂｇ領域中に温度感受性ランバダレプレッサーｃＩ８５７ｓ７、および後期ｅｂｇ領域中にｌａｃＩＱレプレッサー両方を含むように改変した大腸菌Ｋ−１２株である。これらの２つのレプレッサー遺伝子の存在によって、この宿主を、様々な発現系で使用可能になる。この株のＡＴＣＣ指定は２０２１７４である。
【実施例５】
【０４２０】
ペプチボディーの産出
大腸菌内での発現  大腸菌ＧＭ２２１のｐＡＭＧ２１−Ｆｃ融合構造物それぞれの培養液を、３７℃にてＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地中で増殖させた（Ｔａｒｔｏｆ  ａｎｄ  Ｈｏｂｂｓ、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋら、参考文献中に引用された「プラスミドおよびコスミドクローンを増殖させるための改善培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｄｉａ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｉｎｇ  ｐｌａｓｍｉｄ  ａｎｄ  ｃｏｓｍｉｄ  ｃｌｏｎｅｓ）」、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ  Ｆｏｃｕｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ９，ページ１２、１９８７を参照のこと）。ｌｕｘＰＲプロモーターからの遺伝子産物発現の誘導を、合成オートインデューサー、Ｎ−（３−オキソへキサノイル）−ＤＬ−ホモセリンラクトンを、最終濃度２０ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ）まで、培養培地中に加えることに続いて実施した。培養液を、さらに６時間、３７℃にてインキュベートした。次いで細菌培養液を、封入体の存在に関して、顕微鏡によって試験し、遠心によって回収した。屈折封入体が、誘導培養液で観察され、このことは、Ｆｃ−融合物が、大腸菌内の不溶性画分中で、産出される可能性がもっとも高いことを示唆している。細胞ペレットを、１０％  β−メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で再懸濁することによって直接溶解し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。ほとんどの場合、適切な分子量の、強力なクーマシー染色バンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で観察された。
【０４２１】
精製  細胞を、高圧均質化（１４，０００ＰＳＩで２回通過させる）を用いて、水中（１／１０）で破壊し、封入体を遠心（Ｊ−６Ｂ遠心器中４０００ＲＰＭ、１時間）によって回収した。封入体を、６Ｍ  グアニジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．５中に、１／１０比で１時間可溶化した。Ｆｃに融合した直線ペプチドに関して、可溶化混合液を、２Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ  アルギニン、２ｍＭ  システイン、ｐＨ８．５中に、２５倍希釈した。酸化を、４℃にて２日間進行させ、ジスルフィド−結合化合物の形成を可能にした（すなわちＦｃ−ペプチドホモダイマー）。Ｆｃに融合した環状ペプチドに関して、この同様のプロトコールを、以下の３つの維持条件とともに実施した。（１）２Ｍ尿素、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ  アルギニン、４ｍＭ  システイン、１ｍＭ  シスタミン、ｐＨ８．５、（２）４Ｍ尿素、２０％グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭアルギニン、２ｍＭ  システイン、ｐＨ８．５、および（３）４Ｍ尿素、２０％  グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１６０ｍＭ  アルギニン、４ｍＭ  システイン、１ｍＭ  シスタミン、ｐＨ８．５。再折りたたみタンパク質を、１．５Ｍ尿素、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０に対して透析した。この混合液のｐＨを、酢酸によってｐＨ５に下げた。沈殿物を遠心によって除去し、各融合産物の等電点に依存して、上清をｐＨ５から５．６に合わせた。タンパク質を濾過し、各構造に関して決定したｐＨで、２０ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム上に、４℃にてのせた。タンパク質を、５０ｍＭ  ＮａＣｌから５００ｍＭ  ＮａＣｌの範囲の同一の緩衝液中の、２０カラム容量直線勾配を用いて溶出した。ピークを貯めて濾過した。
【０４２２】
上記手順を用いて産出されたペプチボディーを、以下表４に列記する。
【０４２３】
【表１０】
2007524610.tif 000054
2007524610.tif 000055
2007524610.tif 000056
【０４２４】
表４において、「Ｆｃ」は、ヒトＦｃ  ＩｇＧ１配列を意味する。カラム２は、ペプチボディーのアミノ酸配列を列記している。このＦｃ部位を「Ｆｃ」と表記し、以下配列番号６０中に列記している。たとえば「Ｃｏｎ４」または「Ｃｏｎ−４」のようなラベルを用いる場合、これは、Ｃｏｎ−４ペプチドを意味し、一方、添え字「Ｃ」、「（Ｃ）」または「−Ｃ」、または「Ｎ」、「（Ｎ）」、または「−Ｎ」の使用は、分子が、本明細書で記述したようなペプチボディーであることを示している。ペプチボディー名中の添え字「Ｎ」、「（Ｎ）」、または「−Ｎ」は、Ａｎｇ−２−結合ペプチド（またはペプチド類）が、Ｆｃドメインに対するＮ−末端であることを示し、添え字「Ｃ」、「（Ｃ）」または「−Ｃ」は、Ａｎｇ−２−結合ペプチド（またはペプチド類）が、Ｆｃドメインに対するＣ−末端であることを示す。さらに、配列番号２５で定義したような、２×Ｃｏｎ４（Ｃ）１Ｋもまた、本明細書で「１Ｋ」添え字なしで意味しうる。
【０４２５】
各ペプチボディーのＦｃ部分のアミノ酸配列は以下のようである（アミノ末端からカルボキシル末端）
【０４２６】
【化４６】
2007524610.tif 000057
【０４２７】
表４にてそれぞれペプチボディー配列番号１２から３２に相当するペプチボディーをコードしているＤＮＡ配列（配列番号３３から５３）を以下に列記する。
【０４２８】
【化４７】
2007524610.tif 000058
2007524610.tif 000059
2007524610.tif 000060
2007524610.tif 000061
2007524610.tif 000062
2007524610.tif 000063
2007524610.tif 000064
2007524610.tif 000065
2007524610.tif 000066
2007524610.tif 000067
【実施例６】
【０４２９】
ペプチボディーアッセイ
１４のペプチボディーを、ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡで試験し、３つのペプチボディーをアフィニティーＥＬＩＳＡを用いて試験した。結果を表５に列記している。
【０４３０】
【表１１】
2007524610.tif 000068
【０４３１】
陰性対照ペプチボディー４８８３のアミノ酸配列は以下のようである（Ｆｃ部位は下線部であり、リンカーは「ＧＧＧＧＧ」であり、ペプチド部分は、太字で示している）。
【０４３２】
【化４８】
2007524610.tif 000069
【０４３３】
本明細書での用語「阻害なし（Ｎｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」の使用が、化合物が阻害性質をもたないことを示すことを意味するものではないと理解されるであろう。むしろ、本明細書で使用するところの「阻害なし」は、本明細書で記述された条件下での、ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡアッセイを用いて試験したときに、これらの化合物を選別したときにもっとも高い濃度であった、１０００ｎＭ以上のＩＣ５０値を示した化合物を意味する。有意な阻害性質が、「阻害なし」を示していると標識した分子に関しては観察されない一方で、これらの分子が、実際に、異なるアッセイ条件下、または異なるアッセイにおいて、阻害性質を示しうることが理解されるであろう。好ましい実施態様において、本発明が、本明細書で記述したアッセイを用いて、阻害性質を有するペプチボディーに関することが理解されるであろう。
【０４３４】
２つのペプチボディーを、（実施例２で記述したように）アフィニティーＢＩＡｃｏｒｅアッセイを用いて試験した。結果を以下の表６で列記する。
【０４３５】
【表１２】
2007524610.tif 000070
【実施例７】
【０４３６】
全身投与Ａｎｇ−２ペプチボディーでの治療効果研究
Ａｎｇ−２ペプチボディー、ＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃを、腫瘍チャレンジ後７２時間、１日１回スケジュールにて、Ａ４３１腫瘍移植マウスに、皮下で投与した。使用したペプチボディーの用量は、１０００、２００、４０および８ｕｇ／マウス／日であった。合計２０用量をすべての動物に与えた。腫瘍用量および体重を３回／週記録した。試験の最後に、動物を犠牲死させ、この血清を、ＥＬＩＳＡによってペプチボディーレベルを測定するために回収した。腫瘍および正常組織のパネルをすべての群より回収した。
【０４３７】
結果を図１で示す。見ることができるように、腫瘍増殖における有意な差が、Ａｎｇ−２ペプチボディー処置群とビヒクル対照間で観察された。Ａｎｇ−２ペプチボディーの４用量すべてが、ビヒクル対照と比較して、腫瘍増殖を阻害した（繰り返し測定ＡＮＯＶＡを用いて、ｐ＜０．０００１対ビヒクル）。対照的に、対照群中の腫瘍は、非常に速い速度で増殖を続けた。このペプチボディーでの処置は、上記用量で処置した動物の最終的体重、器官体重、または血液学的パラメータにおいて、有意な効果を持たなかった。
【実施例８】
【０４３８】
１．Ａｎｇ−２第二ペプチドライブラリーの構築
Ａ．エレクトロコンピテント大腸菌細胞
Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ（登録商標）  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’エレクトロポレーションコンピテント細胞（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）＃２００１５８）を、ストラタジーン（ストラタジーン  クローニング  システムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）より購入した。
【０４３９】
Ｂ．ｐＣＥＳ１ベクターの改変
ＰＣＲを、１μｇのｐＣＥＳ１ベクター（ターゲットクエスト社（ＴａｒｇｅｔＱｕｅｓｔ  Ｉｎｃ．）を鋳型として、Ｅｘｔｅｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ロッシュ  ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．）、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて実施した。ＰＣＲ混合液用量は、１×ＰＣＲ緩衝液、２００ｎＭの各２つのプライマー：
【０４４０】
【化４９】
2007524610.tif 000071
【０４４１】
２００ｎＭ  ｄＮＴＰおよび３ユニット（Ｕ）のＴａｇ  ＤＮＡポリメラーゼを含む１００μｌであった。ＴＲＩＯ−Ｔｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ（バイオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ））ＰＣＲシステムを以下のように走らせた。９４℃で５分間；９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で４５秒間の３０サイクル；および７２℃で１０分間；４℃まで冷却。
【０４４２】
次いでＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で走らせ、製造業者のプロトコールにしたがって、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（キアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．）、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。第二ＰＣＲ反応を、上記と同一のＰＣＲ条件下で、５μｌのＰＣＲ産物、および２００ｎＭの各２つのプライマー
【０４４３】
【化５０】
2007524610.tif 000072
で実施した。
【０４４４】
次いでＰＣＲ産物およびオリジナルのｐＣＥＳ１ベクターを、１×ＮＥＢ２緩衝液、６０ＵのＡｐａＬＩ（ニューイングランド  バイオラボズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ），Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、６０ＵのＢａｍＨＩ（ニューイングランド  バイオラボズ）を含む１００μｌ反応中で、３７℃にて１時間、別々に消化した。次いで消化したＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを用いて精製し、室温にて一晩、１×ライゲーション緩衝液および４０ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランド  バイオラボズ）を含む４０μｌ反応中で一緒にライゲーションした。
【０４４５】
ベクターを大腸菌内にトランスフェクトし、３７℃にて一晩インキュベートした。単離した単独コロニーを選別し、次いでプラスミドを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを用いて精製した。正確な挿入を、ＤＮＡシークエンシングによって確認した。
【０４４６】
Ｃ．ベクターＤＮＡの調製
１マイクログラムの（上記項目１Ｂからの）改変ｐＣＥＳ１ベクターＤＮＡを、２５００Ｖ、２５μＦおよび２００オームで設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（バイオ−ラド（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて、４０μｌの（上記項目１Ａからの）エレクトロコンピテントＸＬ１−ｂｌｕｅ  大腸菌内に形質導入した。次いで形質導入細菌試料を、９６０μｌのＳＯＣ（２％  トリプトン、０．５％  酵母抽出物、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  グルコース、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を含むチューブ内に素早く移し、培養液を、１時間撹拌して、３７℃にて増殖させた。
【０４４７】
次いで細胞を、２×ＹＴＡＧＴ（１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン、１２．５ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび２％グルコースを含む２×ＹＴ）寒天プレート上に撒き、３７℃にて一晩インキュベートした。単独コロニーを、シークエンシングによって確認し、一晩撹拌して、３７℃にて、２リットルの２×ＹＴＡＧＴ培地を植菌するために使用した。プラスミドベクターＤＮＡを、製造業者のプロトコールにしたがって、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔで精製した。
【０４４８】
Ｄ．ベクターＤＮＡの消化
（上記項目１Ｃからの）合計約２０００マイクログラムのベクターＤＮＡを、１×ＮＥＢ緩衝液２、３００ＵのＡｐａＬＩおよび３００ＵのＸｈｏＩを含む５０００μｌの反応液中、３７℃にて一晩、消化した。制限消化反応液を、３７℃にて一晩インキュベートし、先に作製した０．８％アガロースゲル（エンビ  テック（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）中で解析した。次いで直線化ベクターＤＮＡを、ゲルより切り取り、製造業者の指示にしたがって、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社）で抽出した。
【０４４９】
Ｅ．ライブラリーオリゴヌクレオチドの調製
６つのライブラリーオリゴヌクレオチド（１つは固定、５つはドープ）を、上述した結果から由来した配列に基づいて設計した。１つの固定ライブラリーオリゴヌクレオチドは、
【０４５０】
【化５１】
2007524610.tif 000073
であり、２つの７０％ドープライブラリーオリゴヌクレオチドは以下のようであった。
【０４５１】
【化５２】
2007524610.tif 000074
2007524610.tif 000075
【０４５２】
下の場合の文字は、７０％の示した塩基と、１０％の他の３つのヌクレオチドのそれぞれの混合物を表している。９１％のドープライブラリーオリゴヌクレオチドの他の３つは、以下のようであった。
【０４５３】
【化５３】
2007524610.tif 000076
【０４５４】
上記のオリゴに関して、「Ｎ」は、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）のそれぞれが、オリゴ合成の間に、等しく示されることを示唆しており、「Ｋ」は、ヌクレオチドＧおよびＴが、オリゴ合成の間に、等しく示されたことを示唆することが、当業者によって理解されるであろう。下の場合の文字は、９１％の示した塩基と、３％の各他の３つのヌクレオチドの混合物を示している。これらのオリゴヌクレオチドのそれぞれを、ＰＣＲにて、鋳型として使用した。
【０４５５】
Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍキット（ロッシュ  ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．））を、ＰＣＲ反応のために使用した。各ライブラリーオリゴを、１ｎＭのライブラリーオリゴヌクレオチド、１×ＰＣＲ緩衝液、３００ｎＭの各プライマー
【０４５６】
【化５４】
2007524610.tif 000077
【０４５７】
２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および３５０ＵのＥｘｐａｎｄポリマーを含む、９６ウェル５０μｌ  ＰＣＲ反応液中で増幅させた。サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００、アプライド  バイオシステムズ）を使用して、以下のプログラムを走らせた。９４℃で５分間、（９４℃で３０秒間、５２．５℃で６０秒間、７２℃で３０秒間）の２５サイクル、７２℃で１０分間、４℃まで冷却。次いで遊離ヌクレオチドを、製造業者のプロトコールにしたがって、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン社、カタログ＃２８１０４）を用いて除去した。
【０４５８】
Ｆ．ライブラリーオリゴヌクレオチド類の消化
各ライブラリーに関して、ＰＣＲ産物（項目１Ｅ）を、３７℃にて一晩、１×ＮＥＢ緩衝液２、７５０ＵのＡｐａＬＩおよび７５０ＵのＸｈｏＩを含む、１２００μｌ反応液中で消化した。この消化したＤＮＡを、先に作製した３％アガロースゲル（Ｅｍｂｉ  Ｔｅｃ）上で分離した。各反応からの対照のＤＮＡバンドを、ゲルより切断し、ＣＯＳＴＡＲ  Ｓｐｉｎ−Ｘ遠心チューブフィルター、０．２２μｍ酢酸セルロース（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、カタログ＃８１６０）で抽出した。
【０４５９】
Ｇ．ライブラリーオリゴヌクレオチドとのベクターのライゲーション
１６℃にて一晩の、４５０μｌのライゲーション反応は、直線化ベクター（項目１Ｄ）と、各消化ライブラリーＰＣＲ産物（項目１Ｆ）、１：５モル比、１×ＮＥＢライゲーション緩衝液、および２０，０００ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含んだ。ライゲーションした産物を、６５℃にて２０分間インキュベートして、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを不活性化し、さらに、３７℃にて２時間、１００Ｕ  ＮｏｔＩとともにインキュベートして、ベクターの自己−ライゲーションを最小化した。次いでライゲーションした産物を、標準のフェノール／クロロホルム抽出（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｍａｎｉａｔｉｓら，第３編，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）によって精製して、１２０μｌのＨ２Ｏ中に再懸濁させた。
【０４６０】
Ｈ．エレクトロポレーション形質転換
各ライブラリーのために、１２のエレクトロポレーション反応を実施した。各形質転換のために、１０μｌのライゲーションしたベクターＤＮＡ（項目１Ｇ）と、３００μｌのＸＬ１−ＢＬＵＥ  ＭＲＦ’細胞（項目１Ａ）を、０．２−ｃｍキュベット（バイオ−ラド（ＢＩＯ−ＲＡＤ））中で混合した。得られた混合液を、２５００Ｖ、２５ｕＦおよび２００オームで設定した、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩによってパルスした。次いで１２のエレクトロポレーション反応からの形質転換した細菌を合わせ、３７℃にて１時間のインキュベーションのために、２６ｍｌのＳＯＣを含むフラスコ内に移した。細胞を、４５０ｍｌの２×ＹＴＡＧに加え、３７℃にて５時間撹拌しながら、増殖させた。細胞を、４０００ｒｐｍにて１５分間、４℃にて遠心した。次いで細胞ペレットを、１２ｍｌの１５％グリセロール／２×ＹＴ中で再懸濁して、−８０℃にて保存した。これが、ライブラリーの初期ストックであった。タイターが、５．０×１０９（ライブラリー番号２０）、３．３×１０１０（ライブラリー番号９４）、４．７×１０９（ライブラリー番号２５）、５．０×１０９（ライブラリー番号２６）、３．０×１０９（ライブラリー番号２７）、および４．２×１０９（ライブラリー番号９９）の独立したトランスフォーマントのライブラリーサイズを示した。
【０４６１】
２．ライブラリーの増幅
Ａ．ライブラリーの二次ストックの作製
（上記項目１Ｈからの）初期ライブラリー細胞ストックから、１０×過剰の各ライブラリーサイズをカバーするのに十分な細胞を使用して、２×ＹＴＡＧＴ（１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン、１２．５ｕｇ／ｍｌテトラサイクリンおよび２％グルコースを含む２ＹＴ）培地を植菌し、開始ＯＤ６００は、０．１であった。この培養液を、ＯＤ６００＝０．５まで、数時間、撹拌して、３７℃にて増殖させた。各ライブラリーから１０分の１分液をとり、３７℃にてさらに２時間、別のフラスコ中で増殖させた。次いでこれらのサブ培養液を、ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＪＡ−１４ローターを用いて、４０００ｒｐｍにて、１０分間４℃で遠心し、細菌ペレットを、７．０ｍｌ（各ライブラリーに関して）の１５％  グリセロール／２×ＹＴ中で再懸濁させ、−８０℃にて保存した。
【０４６２】
Ｂ．ファージ誘導
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージアリコート（アマシャム  ファルマシア  バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ））を、３×１０９ｐｆｕ／ｍｌの最終濃度まで、（上記項目２Ａからの）ＯＤ６００＝０．５にて、残っている細菌培養液に加えた。ヘルパーファージを、振とうせずに３０分間、およびゆっくりと振とうして３０分間、３７℃にて、細菌に感染させた。感染細胞を、５０００ｒｐｍにて１５分間、４℃にて遠心した。細胞ペレットを、２×ＹＴＡＫ培地（１００ｕｇ／ｍｌアンピシリンおよび４０ｕｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＹＴ）での同容量中に再懸濁させた。ファージミド産出を、撹拌しながら、３０℃にて一晩実施させた。
【０４６３】
Ｃ．ファージの回収
上記項目２Ｂからの細菌培養液を、４℃にて１５分間、５０００ｒｐｍにて遠心した。次いで上清を、新しいボトル中に移し、０．２容量の２０％  ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加え、氷上で１時間インキュベートして、ファージミドを沈殿させた。沈殿したファージミドを、１０，０００ｒｐｍにて４℃で３０分間遠心し、注意深く、１００ｍｌの冷ＰＢＳで再懸濁した。ファージミド溶液をさらに、４０００ｒｐｍにて１０分間、４℃で残っている細胞を遠心によって取り除き、０．２容量の２０％ＰＥＧ／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加えることによって、ファージミドを沈殿させることによって精製した。ファージミドを、４℃にて３０分間、１０，０００ｒｐｍで遠心し、ファージミドペレットを、１８ｍｌの冷ＰＢＳで再懸濁した。６ｍｌの６０％グリセロール溶液を、ファージミド溶液に加えて、−８０℃にて保存した。ファージミドタイターを、標準の手順によって決定した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｍａｎｉａｔｉｓら  第３編）。
【０４６４】
３．Ａｎｇ−２結合ファージの選別
Ａ．磁石ビーズ上でのＡｎｇ−２の固定化
（上記項目３Ａからの）ビオチン化Ａｎｇ−２を、２０００ｎｇ  Ａｎｇ−２タンパク質／製造業者からのビーズストック１００μｌの濃度で、Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＤＹＮＡＬ、Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）上に固定化した。ビーズを、磁石を用いて、チューブの片側に引き寄せ、液体をピペッティングで取り除いた後、ビーズを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）によって二回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。ビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質を、上記濃度で洗浄したビーズに加え、室温にて一時間、回転させてインキュベートした。次いでＡｎｇ−２コートビーズを、ＢＳＡを、２％最終濃度まで加え、回転させてながら４℃にて一晩インキュベートすることによってブロックした。次いで得られたＡｎｇ−２コートビーズを、選別手順にかける前に、ＰＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）で２回洗浄した。
【０４６５】
Ｂ．Ａｎｇ−２コートビーズを用いる選別
（上記項目２Ｃからの）約１０００倍のライブラリー等価ファージミドを、１ｍｌの、２％ＢＳＡを含むＰＢＳで１時間ブロックした。ブロックしたファージミド試料を、ブランクビーズ（項目３Ａのものと同一のビーズであるが、Ａｎｇ−２タンパク質をコートしていない）に加えることによって、３回ネガティブ選別段階にかけ、この混合液を、室温にて１５分間、回転させてインキュベートした。ファージミド含有上清を、磁気を用いて引き出し、ブランクビーズ（上記項目３Ａのものと同一のビーズであるが、Ａｎｇ−２タンパク質をコートしていない）を含む第二チューブに移し、この混合物を、回転させて、１５分間、室温にてインキュベートした。
【０４６６】
この手順を繰り返した。次いでファージミド含有上清を、磁石を用いて引き出し、（項目３Ａからの）Ａｎｇ−２タンパク質コートビーズを含む新しいチューブに移し、この混合液を、室温にて１時間、回転させてインキュベートした。上清を捨てた後、ファージミド−結合−ビーズを、２％  ミルク−ＰＢＳで１０回、２％  ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回、ＰＢＳＴで１０回、およびＰＢＳで２回洗浄した。次いでファージミドを、１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中に、ローター上で１０分間、溶出した。ファージミド含有溶液のｐＨを、０．５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を加えることによって、中和した。得られたファージミドを使用して、振とうなしで３０分間、ゆっくり振とうしながら３０分間、３７℃にて、１０ｍｌの新鮮に増殖させたＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細菌（ＯＤ６００約０．５）に感染させた。次いで感染したＸＬ１−ＢＬＵＥ  ＭＲＦ’細胞の全てを、１５×１５ｃｍ  ２×ＹＴＡＧプレート上にプレートし、３０℃にて一晩インキュベートした。
【０４６７】
Ｃ．ファージの誘導および回収
２×ＹＴＡＧＴ培地の１０ｍｌアリコートを、（項目３Ｂからの）プレートに加え、ＸＬ１−ＢＬＵＲ  ＭＲＦ’細胞を再懸濁した。全てのＸＬ１−ＢＬＵＥ  ＭＲＦ’細胞をチューブに回収し、２５０μｌのこれらの細胞のアリコートを、２５ｍｌの２×ＹＴＡＧＴに加え、ＯＤ６００＝０．５まで、３７℃にて増殖させた。Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを、最終濃度３×１０９ｃｆｕ／ｍｌまで加え、振とうなしで３０分間、振とうしながら３０分間、３７℃にてインキュベートした。細胞を、５０００ｒｐｍにて１０分間、４℃にて遠心し、２５ｍｌの２×ＹＴＡＫにて再懸濁させた。これらの細菌を、振とうしながら、３０℃にて一晩増殖させた。誘導したファージミドを回収し、項目２Ｃでのように精製した。
【０４６８】
Ｄ．第二ラウンド選別
以下を除いて、上記項目３Ｂから３Ｃで概略したように、第二ラウンド選別を実施した。項目３Ｃから得られた約１００倍のライブラリー等価ファージミドを、インプットファージミドとして使用した。Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ上にコートしたビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質（項目３Ａ）の量は、２０ｎｇまで減少した。次いでファージ−結合−ビーズを、２％  ミルク−ＰＢＳで１０回、２％  ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回、ＰＢＳＴで１０回洗浄し、最終洗浄には、ＰＢＳＴ中、室温にて６０分間のインキュベーションが含まれる。ビーズをＰＢＳにて２回洗浄した。溶出条件は、最初のラウンド（項目３Ｂ）と同様であった。
【０４６９】
Ｅ．第三ラウンド選別
第三ラウンド選別を、以下を除いて、項目３Ｂから３Ｃで概略したように実施した。項目３Ｄから得られた約１０倍のライブラリー等価ファージミドを、インプットファージミドとして使用した。約２ｎｇのビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質（項目３Ａより）を、Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ上にコートするために使用した。ファージ−結合−ビーズを、２％  ミルク−ＰＢＳで１０回、２％  ＢＳＡ−ＰＢＳで１０回、ＰＢＳＴで１０回洗浄し、最終洗浄には、ＰＢＳＴ中、室温にて６０分間のインキュベーションが含まれる。ビーズをＰＢＳにて２回洗浄した。溶出条件は、最初のラウンド（項目３Ｂ）と同様であった。
【０４７０】
Ｆ．第四ラウンド選別
第四ラウンド選別を、以下を除いて、上記項目３Ｂから３Ｃで概略したように実施した。項目３Ｅから得られたライブラリー等価ファージミドを、インプットファージミドとして使用した。Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ上にコートしたビオチン化Ａｎｇ−２タンパク質（項目３Ａ）の量を、ライブラリー２５、２６および２７に関して、０．４ｎｇまで減少させた。ライブラリー２０および９４に関しては、コーティング量は、第三ラウンドと同様、２ｎｇで維持した。ライブラリー９９は、第四ラウンド選別段階を実施しなかった。溶出条件は、最初のラウンド（項目３Ｂ）と同様であった。
【０４７１】
４．クローン解析
Ａ．マスタープレートの調製
第二ラウンド選別からの単一コロニーをピックアップし、ウェルあたり１２０μｌの２×ＹＴＡＧＴを含む９６ウェルプレートに植菌した。この９６ウェルプレートを、３０℃シェーカー内で、一晩インキュベートした。６０％グリセロールの４０マイクロリットルをウェルあたりに加えて、−８０℃にて保存した。
【０４７２】
Ｂ．ファージミドＥＬＩＳＡ
（上記項目４Ａからの）マスタープレートからの約２μｌアリコートの細胞を、ウェルあたり１００μｌの２×ＹＴＡＧＴを含んだ、新鮮なコースター（Ｃｏｓｔａｒ）（登録商標）９６ウェルプレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，カタログ＃９７９４）内に、植菌し、この新規の細胞プレートを、およそＯＤ６００＝０．５まで、３７℃にて増殖させた。
【０４７３】
Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（１．５×１０１３ｃｆｕ／ｍｌ）を含む４０μｌの２×ＹＴＡＧＴを、各ウェルに加え、この９６ウェルプレートを、振とうせずに３０分間、およびゆっくりと振とうしてさらに３０分間、３７℃にてインキュベートした。このプレートを、４℃にて１０分間、２０００ｒｐｍにて遠心した（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣＳ−６Ｒテーブルトップ遠心）。上清をウェルから除去し、各細胞ペレットを、ウェルあたり１５０μｌの２×ＹＴＡＫを用いて再懸濁した。プレートを、ファージミド発現のために、３０℃にて一晩インキュベートした。
【０４７４】
ヒトＡｎｇ−２タンパク質を、１×ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌにて、４℃で一晩、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ）上にコートした。対照として、２％  ＢＳＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を、別のＭａｘｉｓｏｒｐプレート上にコートした。翌日、一晩細胞培養液を、２０００ｒｐｍにて１０分間、４℃にて遠心した。各ウェルからの１０μｌの上清を、ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を含む新しい９６ウェルプレートに移し、上清を１：１０で希釈した。得られた混合液を、振とうしながら室温にて１時間インキュベートして、ファージミドをブロックした。同時に、Ａｎｇ−２タンパク質コートプレートを、ウェルあたり２％  ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液、４００μｌで、振とうしながら室温にて１時間ブロックした。ＢＳＡ溶液を捨て、各ウェルをＰＢＳ溶液で３回洗浄した。最後の洗浄段階の後、１００μｌのブロックファージミド溶液を、Ａｎｇ−２タンパク質コートプレート、ならびに対照プレートの各ウェルに加え、振とうしながら室温にて１時間インキュベートした。液体を捨て、各ウェルを、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。１００μｌの、１５，０００希釈での、ＨＲＰ−共役抗−Ｍ１３  ｍＡｂ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、Ａｎｇ−２タンパク質コートおよび対照プレートの各ウェルに加え、これらのプレートを、振とうしながら室温にて１時間インキュベートした。液体を再び捨て、各ウェルを、ＰＢＳＴ溶液で３回洗浄した。１００μｌのＬｕｍｉＧＬＯ化学蛍光基質（キルケガード＆ペリー  ラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）をウェルに加え、各ウェルを、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＤＬＲｅａｒｌｙ器具（ラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）によって読んだ。
【０４７５】
Ｃ．ファージクローンのシークエンシング
ＰＣＲ反応を、鋳型として、マスタープレート（項目４Ａ）の各ウェルからの１μｌの細菌を用いて実施した。各ＰＣＲ混合液の容量は、５０μｌであり、１×ＰＣＲ緩衝液、３００ｎＭの各２つのプライマー：
【０４７６】
【化５５】
2007524610.tif 000078
【０４７７】
２００μＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および２．５Ｕ  ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））を含んだ。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９７００（アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を使用して以下のプログラムを走らせた。９４℃で５分間、（９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で９０秒間）の４０サイクル、７２℃１０分間、４℃まで冷却。ＰＣＲ産物を、製造業者の指示にしたがって、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）によって精製した。全ての精製したＰＣＲ産物を、製造業者の指示にしたがって、ＡＢＩ３７７０  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（パーキン  エルマー）を用いてプライマー
【０４７８】
【化５６】
2007524610.tif 000079
で配列決定した。
【０４７９】
５．配列ランク付け
（上記項目４Ｃからの）ヌクレオチド配列から翻訳したペプチド配列を、ＥＬＩＳＡデータと比較した。Ａｎｇ−２コートウェルで高いＯＤ値を示し、ＢＳＡコートウェルで低いＯＤ値を示したクローンが、より重要であると考慮した。多数回発生した配列もまた、重要であると関連付けた。ライブラリー２０からの２４ペプチド配列、ライブラリー９４からの２６ペプチド配列、ライブラリー２５からの７ペプチド配列、ライブラリー２６からの１８ペプチド配列、ライブラリー２７からの６ペプチド配列、およびライブラリー９９からの４ペプチド配列をさらなる解析およびペプチド産出のために選択した。さらに、ライブラリー２０および９４からの１１のコンセンサス配列、ライブラリー２６および９９からの３つのコンセンサス配列、およびライブラリー２５からの２つを推定し、ペプチボディーを産出するために使用した。表７中のペプチボディーを、本明細書実施例１０で記述したニュートラリゼーションＥＬＩＳＡプロトコールを用いて評価した。結果を以下の表７で列記する。
【０４８０】
【表１３】
2007524610.tif 000080
2007524610.tif 000081
2007524610.tif 000082
2007524610.tif 000083
2007524610.tif 000084
2007524610.tif 000085
2007524610.tif 000086
2007524610.tif 000087
【実施例９】
【０４８１】
抗−Ａｎｇ２ペプチボディーの６つの試料を、ＢＩＡｃｏｒｅ上で、ｈｕＡｎｇ２（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＢＮＯ１２１０３Ａ）に対するこれらの結合活性に関して試験した。Ｇタンパク質を、標準のアミン−結合プロトコール（ＢＩＡｃｏｒｅ社）にしたがって、ＣＭ５チップに固定し、次いでペプチボディーを、捕獲のためにＧタンパク質表面上に注入した（ＲＬから１００Ｒｕ）。ｈＡｎｇ２と捕獲ペプチボディー間の結合を試験するために、０．３ｎＭから４０ｎＭのｈｕＡｎｇ２を、捕獲されたペプチボディー表面上に注入し、結合センサーグラムを、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．０（ＢＩＡｃｏｒｅ社）を用いて解析した。表８は、この実験の結果を要約している。
【０４８２】
【表１４】
2007524610.tif 000088
【実施例１０】
【０４８３】
ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡ
ヒト、齧歯類、イヌおよびラットＡｎｇ−２、およびヒトおよび齧歯類Ａｎｇ−１条件化培地を、以下のように、ＤＭＥＭ／５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ中に希釈した。ｈＡｎｇ−２−１：６４希釈、ｍＡｎｇ−２−１：６４希釈、ラットＡｎｇ−２−希釈しない、イヌＡｎｇ−２−１：３２希釈、ｈＡｎｇ−１−１：４希釈、およびｍＡｎｇ−１−１：４希釈。
【０４８４】
これらの条件化培地のそれぞれを希釈する程度は、最大達成可能結合（すなわちプラトー）の５０％での、（Ｔｉｅ−２部分が、分子の可溶性細胞外部分のみを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される。Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号３１３−ＴＩ）１ｎＭ  ｈＴｉｅ２−Ｆｃに結合する能力によって決定した。マイクロタイタープレートを、１００μｌの希釈条件化培地でコートした。Ａｎｇ−２ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡのために、候補抗−Ａｎｇ−２ペプチボディーを、約１％  ＢＳＡおよび約１ｎＭの（Ｔｉｅ−２部分が、分子の可溶性細胞外部分のみを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される。Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号３１３−ＴＩ）Ｔｉｅ−２を含むＰＢＳの溶液中、４倍希釈で、６２．５ｎＭから０．０１５ｐＭまで滴定した。Ａｎｇ−２ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡのために、候補抗Ａｎｇ−２ペプチボディーを、約１％  ＢＳＡおよび約１ｎＭの（Ｔｉｅ−２部分が、分子の可溶性細胞外部分のみを含むＴｉｅ−２−Ｆｃ分子として提供される。Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号３１３−ＴＩ）Ｔｉｅ−２を含むＰＢＳの溶液中、４倍希釈で、１０００ｎＭから０．２ｐＭまで滴定した。
【０４８５】
約１００マイクロタイターのペプチボディー／Ｔｉｅ−２溶液を各ウェルに加えた後、プレートを一晩室温でインキュベートし、次いで約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で５回洗浄した。洗浄後、約１００マイクロタイター／ウェルの抗−Ｔｉｅ−２抗体（ファルミンゲン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、カタログ＃５５７０３９）を、最終濃度約１マイクログラム／ｍｌまで加え、プレートを、約１時間、室温にてインキュベートした。次に、約１００マイクロリットル／ウェルの、ヤギ抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ（ピアス  ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）カタログ＃３１４３２）を、約１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ中、１：１０，０００の希釈で加えた。
【０４８６】
プレートを、約１時間室温にてインキュベートし、この後、約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。次いで約１００マイクロリットル／ウェルのＴＭＢ基質（シグマ（ＳＩＧＭＡ）、カタログ＃Ｔ８６６５）を加え、青色を発色させた。次いで吸収を、分光光度計にて、３７０ｎｍで読んだ。結果を以下の表９で列記する。
【０４８７】
【表１５】
2007524610.tif 000089
【実施例１１】
【０４８８】
ＰＫ試験
試験設計
オスＣＤ−１マウス、体重２０から３０ｇを、各ペプチボディー処置群（２×Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−ＮおよびＬ１−２１−Ｎ）に無作為に分けた。動物には、５０μｇのペプチボディーの単独ＩＶボーラス（ｎ＝３８／群）または単独ＳＣ投与（ｎ＝３４／群）を行った。注射は、それぞれＩＶおよびＳＣ投与のために、尾静脈を介して、または肩の皮膚下で行った。
【０４８９】
血液サンプリングおよび解析方法
血液試料を、各抗Ａｎｇ−２ペプチボディー濃度測定投与前、およびＳＣおよびＩＶ群に関して用量投与後１、２、４、８、１６、２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８、２１６、２６４、３１２および３３６時間の時点で、回収した。さらなる試料を、ＩＶ群に関して、投与後５および３０分の時点で回収した。２匹の動物を、時間点あたり出血させ、サンプリングの後に動物を犠牲死させた。血液（およそ０．５０ｍＬ）を、ポリプロピレンマイクロテイナー（登録商標）血清分離チューブ内に、心臓穿刺から回収した。試料を、およそ２０分間、または凝血塊が発生するまで、氷上で維持した。血清を、２から８℃にておよそ１０分間、遠心によって血液試料から分離し、アッセイまで、およそ−７０℃で保存した。試料を、１００ｎｇ／ｍＬの低い定量化制限（ＬＬＯＱ）での検証時間分離蛍光（ＴＲＦ）アッセイを用いて測定した。ＮＵＮＣ  ｆｌｕｏｒｏＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを、組換え体マウスＡｎｇ−２タンパク質でコートした。次いでプレートを、タンパク質溶液でブロックして、非特異的結合を減少させた。標準、精度対照および未知の試料を、１０％マウス血清アッセイ緩衝液中に調製し、マイクロタイタープレートのウェル中にピペッティングした。ペプチボディーは、固定化Ａｎｇ−２に特異的に結合した。未結合基質の洗浄除去後（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、ビオチン化ヤギ抗−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）モノクローナル抗体（ジャクソン  イムノリサーチ  ラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）をウェルに加えた。未結合ビオチン化モノクローナル抗体の除去のための洗浄段階に続いて、エウロピウム標識ストレプトアビジンをウェルに加えた。未結合ストレプトアビジンエウロピウムの洗浄除去後、結合したエウロピウムを、各ウェル中にピペッティングした酸性溶液で、ストレプトアビジンから放出させた。蛍光シグナルが発生し、Ｗａｌｌａｃの蛍光分析計にて読んだ。マウス血清中の抗−Ａｎｇ−２ペプチボディーの解析に関するアッセイ範囲は、０．０７８から５μｇ／ｍＬである。
【０４９０】
薬物動態学的解析
各群に関する、混成平均濃度−時間データを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．３、ファーサイト社（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．）、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて非コンパートメント解析にかけた。名目サンプリング時間を、名目時間の１０％以内に試料を回収したので、ＰＫ解析のために使用した。ＬＬＯＱ以下のすべての濃度値を、ＰＫ解析の前に０に設定した。以下のＰＫパラメータを推定した。
【０４９１】
・末端半減期（ｔ１／２）を、ｔ１／２＝Ｉｎ（２）／ｋｅｌとして計算し、式中ｋｅｌは、末端ｌｏｇ−直線減衰相の直線回帰を介して推定した、第一序列速度定数であった。
【０４９２】
・血清濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ（０−ｌａｓｔ））を、０から最後までの直線／ｌｏｇ台形法、最後の定量化可能濃度（Ｃｌａｓｔ）の時間を用いて推定した。
【０４９３】
・０から無限までの曲線下面積（ＡＵＣ（０−∞））を、相当するＡＵＣ（０−ｌａｓｔ）の合計と、推定Ｃｌａｓｔ／ｋｅｌ値として推定した。
【０４９４】
ＡＵＣ（０−∞）＝ＡＵＣ（０−ｌａｓｔ）＋推定Ｃｌａｓｔ／ｋｅｌ
・ＳＣ投与後の絶対バイオアベイラビリティ（Ｆ）を、
Ｆ＝ＡＵＣ（０−∞）ＳＣ／ＡＵＣ（０−∞）ＩＶ  ×１００
のように計算した。
【０４９５】
結果を図２に列記する。
【実施例１２】
【０４９６】
メスヌードマウスに、試験０日目に、１×１０７Ａ４３１細胞を皮下に注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４−Ｃを、２００μｇ／マウス／日の用量で、皮下に投与した。腫瘍容量および体重を、図で示したように、標準間隔で記録した。腫瘍増殖における有意な差が、Ａｎｇ−２ペプチボディー−処置群対ビヒクル対照および対照ペプチボディー（繰り返し測定ＡＮＯＶＡを用いる各対照に対して、ｐ＜０．０００１、シェフェのポストホック検定）間で観察された。このペプチボディーでの処置によっては、体重における有意な効果はなかった。結果を図３に列記する。
【実施例１３】
【０４９７】
Ａ４３１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖曲線
Ａ４３１細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、２００μｌのＤＭＥＭ中、ウェルあたり２０００細胞にて、９６−ウェル組織培養プレート中に撒いた。次いで撒いた後、培地を１６時間吸引した。次いで以下をウェル内に加え戻し、三重で設定した。ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳのウェルあたり１００μｌ、１ｍｇ／ｍｌ陰性対照ペプチボディー４８８３またはペプチボディーＴＮ８−Ｃｏｎ４。同様の設定を、５つのプレート上で繰り返した。１つのプレートからの培地を、処置後、２４、４８、７２、９６および１２０時間で吸引した。次いでウェルあたり１００μｌの１０％  トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、次いでプレートを４℃にて保存した。全てのプレートを、最後のプレートを最低４時間、１０％  ＴＣＡ中においた時に回収した。１０％ＴＣＡを振って乾かし、ウェルを水道水で５回濯いだ。次いで細胞を、１％酢酸（シグマＡ−６２８３）中の１００μｌの０．４％  スルホローダミンＢ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｓ−９０１２）で、室温にて１０分間染色し、次いで１％酢酸で５回洗浄した。次いでプレートを風乾かした。色素を、回転攪拌機上で２時間、３００μｌの２０ｍＭ未緩衝Ｔｒｉｓ（ｐＨ＞１０）で可溶化した。次いで光学密度（ＯＤ）を、マイクロタイタープレート読み取り機上で、５４０ｎｍにて読んだ。結果を図４に列記する。
【実施例１４】
【０４９８】
メスヌードマウスに、試験０日目に、２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下に注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチボディーＬ１−７−Ｎ、Ｌ１−２１−Ｎ、Ｃｏｎ４−Ｃおよび２×Ｃｏｎ４−Ｃを、１４μｇ／マウスの用量で、１週間に２回、皮下に投与した。抗−Ａｎｇ−２抗体Ａｂ５３６を、４７μｇ／マウス、１週間に３回、陽性対照として投与した。腫瘍容量および体重を、標準間隔で記録した。
【０４９９】
腫瘍増殖における有意な差が、各Ａｎｇ−２ペプチボディー１つの処置群対賦形剤対照および対照ペプチボディー（繰り返し測定ＡＮＯＶＡを用いる各対照に対して、ｐ＜０．０００１、シェフェのポストホック検定）間で観察された。これらのペプチボディーでの処置によっては、体重における有意な効果はなかった（結果は示していない）。結果を図５に列記する。
【実施例１５】
【０５００】
メスヌードマウスに、試験０日目に、２×１０６Ｃｏｌｏ−２０５細胞＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下に注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４−Ｃを、１４、２．８および０．５６μｇ／マウスの用量で、１週間に２回、皮下に投与した。腫瘍容量および体重を、示したように、標準間隔で記録した。腫瘍増殖における有意な差が、各Ａｎｇ−２ペプチボディーの２つの高用量での処置群対賦形剤対照および対照ペプチボディー（繰り返し測定ＡＮＯＶＡを用いて、中間用量に関して、ｐ＝０．００３、高用量に対してｐ＜０．０００１、シェフェのポストホック検定）間で観察された。これらのペプチボディーで処置によっては、体重における有意な効果はなかった。点線は、未知の理由での１匹のマウスの死による、１０匹から９匹までのマウスの、合計ｎの群の減少を示している。結果を図６に列記する。
【実施例１６】
【０５０１】
抗−Ａｎｇ−２−ペプチボディー対Ｃｏｌｏ−２０５  ゼノグラフト腫瘍
メスヌードマウスに、試験０日目に、２×１０６  Ｃｏｌｏ−２０５細胞＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下に注射した。３日目に、Ａｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４−Ｃまたは対照ペプチボディーを、３５０μｇ／日の用量で、皮下に投与した。（表５で示したような）対照ペプチボディーで処置した群からの腫瘍を、１４日目（大きさ−適合対照）または１８日目（時間−適合対照）いずれかで回収した。次いで２×Ｃｏｎ４（Ｃ）からの腫瘍を、１８日目に回収した。腫瘍容量を、示したように、標準間隔で記録した。腫瘍増殖における有意な差が、時間−適合対照群と２×Ｃｏｎ４−Ｃ処置群（繰り返し測定ＡＮＯＶＡによって、ｐ＝０．０１５４、シェフェのポストホック検定）間で観察された。これらのペプチボディーで処置によっては、体重における有意な効果はなかった。
【０５０２】
イメージ解析のために調製した腫瘍を、冠状に分岐させ、半分をＯＣＴ（サクラ  フィネテック  ＵＳＡ社（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．）、Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中で瞬間冷凍した。Ｃｒｙｏ−切片を、クロモジェンとしてＤＡＢで、２μｇ／ｍｌにて、抗−マウスＣＤ３１（カタログ＃５５３３７０、ＢＤファーマミンゲン（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて免疫組織化学染色した。腫瘍切片を、２０×対物倍率で、デジタル写真を撮った。腫瘍あたり４つの「コンパス−点」視野を、処置群あたり１０腫瘍で、捕獲した。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ（ユニバーサル  イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ）イメージ解析計を、イメージ内での、ＣＤ３１染色血管の閾値に関して使用した。ＣＤ３１陽性染色の面積を、各視野内の、総腫瘍組織の比として示した。結果を図７に列記する。
【実施例１７】
【０５０３】
メスヌードマウスに、試験０日目に、２×１０６  Ｃｏｌｏ−２０５細胞＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下に注射した。Ａｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４−Ｃ、または同等対照ペプチボディー、３５０μｇ／マウス、ｓ．ｃ．、１週間に２回での処置を、試験３、１０または１５日目いずれかに開始した。腫瘍容量および体重を、標準間隔で記録した。腫瘍増殖における有意な差が、Ａｎｇ−２ペプチボディーでの処置群対ビヒクル対照間で観察された（繰り返し測定ＡＮＯＶＡを用いて、１５日群に関してｐ＝０．０８９、３日および１０日群に関してｐ＜０．０００１、シェフェのポストホック検定）。これらのペプチボディーでの処置によっては、体重における有意な効果はなかった。結果を図８に列記する（体重は示していない）。
【実施例１８】
【０５０４】
完全応答（ＣＲ）率のまとめを、１週間に３回、腹腔内に投与した、４７μｇ／メスヌードマウスでの、抗体Ａｂ５３６を用いて、またはＡ４３１およびＣｏｌｏ−２０５ゼノグラフトモデル両方で、異なる長期間試験（≧１０週間の投与）での、多用量スケジュールで皮下に与えた、ペプチボディー２×Ｃｏｎ４（Ｃ）で、得た。本明細書で使用するところのＣＲは、処置に続いて、測定可能な腫瘍が残っていない結果を意味する。結果を、図９に列記する。
【実施例１９】
【０５０５】
ａ）Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍モデルにおける、Ｐｂのタキソテールとの組み合わせ
メスヌードマウスに、試験０日目に、２×１０６  Ｃｏｌｏ−２０５細胞＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下に注射した。１４日目に、ａ）３５０μｇ／マウス、ｓ．ｃ．、１週間２回のＡｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４−Ｃ、ｂ）２０ｍｇ／ｋｇ  ｑｗ×３ｉ．ｐ．のタキソテール、ｃ）両方の組み合わせで処置を開始した。腫瘍容量および体重を、標準間隔で記録した。腫瘍増殖における有意な差が、すべての処置群対ビヒクル対照（繰り返し測定ＡＮＯＶＡを用いて、ｐ＜０．０００１、シェフェのポストホック検定）間で観察された。さらに、組み合わせ治療群は、単一処置薬剤のいずれか１つと、有意に異なった（ｐ＜０．０００１対２×Ｃｏｎ−４−Ｃ、およびｐ＝０．０１２２対タキソテール）。点線は、未知の理由での１匹のマウスの死による、１０匹から９匹までのマウスの、合計ｎの群の減少を示している。これらのペプチボディーは、体重において、有意な効果を持たなかった。結果を図１０ａに列記する。
【０５０６】
ｂ）Ｃｏｌｏ−２０５腫瘍モデルにおける、Ｐｂの５−ＦＵとの組み合わせ
メスヌードマウスに、試験０日目に、２×１０６  Ｃｏｌｏ−２０５細胞＋Ｍａｔｒｉｇｅｌ（２：１）を皮下に注射した。１４日目に、ａ）３５０μｇ／マウス、ｓ．ｃ．、１週間２回のＡｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４−Ｃ、ｂ）５０ｍｇ／ｋｇ  ｑｄｘ×５  ｉ．ｐ．の５−ＦＵ、または、ｃ）両方の組み合わせで処置を開始した。腫瘍容量および体重を、示したように、標準間隔で記録した。
【０５０７】
腫瘍増殖における有意な差が、すべての処置群対ビヒクル対照（繰り返し測定ＡＮＯＶＡを用いて、ｐ＜０．０００１、シェフェのポストホック検定）間で観察された。さらに、組み合わせ治療群は、単一処置薬剤のいずれか１つよりも、有意に異なった（ｐ＝０．０３７５、対２×Ｃｏｎ−４−Ｃ、およびｐ＝０．０４５３、対５−ＦＵ）。体重の一過性の減少象が、５−ＦＵ処置群（１８％、試験日２０）、ならびに組み合わせ治療群（１６％、試験日２０）にて観察され、続いて、完全に体重は回復した。結果を図１０ｂに列記する。
【実施例２０】
【０５０８】
アジュバント関節炎モデル
オスＬｅｗｉｓラット（１２０から１３０ｇ、チャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ）を、１２−時間明／暗サイクルにて、環境制御室（温度２３±２℃、相対湿度５０±２０％）内に、２匹／フィルター−キャップケージで飼育した。動物には、市販齧歯類餌（Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ８６４０、テック  ラボ（Ｔｅｋ  Ｌａｂ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を給餌し、自由に濾過精製水道水を与えた。餌カルシウムおよびリン含量は、それぞれ、１．２％および１．０％であった。
【０５０９】
アジュバント関節炎を、尾の根本で経皮的に、０．０５ｍＬパラフィン油（クレセント  ケミカル社（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）を含む、熱殺傷マイコバクテリウム  チューブロクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ（ディフコ  ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）単独０．５ｍｇ注射によって誘導した。関節炎の臨床発症は、後足の腫れおよび歩行困難によって示されるように、第９日目であった。２×Ｃｏｎ４（ｃ）処置群（免疫化の後第１日目より処置した）を除いて、処置は、（関節炎の発症前）免疫後第９日目に、毎日皮下注入を開始し、１８日目まで続けることで行った。
【０５１０】
アジュバント関節炎の臨床モニタリング
炎症の進行を、Ｆｅｉｇｅら，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｏｌｅｃ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５７：１４５７−１４７０（２０００）によって記述された方法にしたがって、水プレチスモグラフィーを用いて、後足容量の断続的測定によって、臨床的に査定した。足炎症の阻害は、以下の式
［１−｛（処置ＡｄＡ）−正常）／（未処理ＡｄＡ−正常）｝］×１００
にしたがった、台形ルールを用いて、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて計算した。
【０５１１】
さらに、体重欠損が、この関節炎モデルにおける関節炎症の進行と平行することが示されてきているので、総体重を、予備エンドポイントとして、９−日処置レジメを通して、毎日測定した。動物を１８日目に、ＣＯ２下で犠牲死させた。
【０５１２】
骨ミネラル濃度（ＢＭＤ）の欠損を、検視（免疫後１８日目）で試験した。後足を、毛皮線にて除去し（足関節（ひざ）に非常に近い）、７０％エタノールに浸し、次いでファンビームＸ−線デンシトメーター（Ｍｏｄｅｌ  ＱＤＲ−４５００Ａ，ホロジック（Ｈｏｌｏｇｉｃ）、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて、水平方向でスキャンした。上記Ｆｅｉｇｅら，を参照のこと。スキャンの後、踵骨を中心とした長方形ボックス（２９×２５ｍｍ）を、解析すべき部位を描写するために配置し、工業所有権を有するアルゴリズム（Ｈｏｌｏｇｉｃソフトウェア）で、骨面積、骨ミネラル含量、および骨ミネラル密度を計算した。
【０５１３】
全ての結果を、平均値±標準偏差として表した。０．０５のｐ値を使用して、群間の有意な差を表した。市販されている統計学的ソフトウェア（Ｓｔａｔｓｏｆｔ  ｖ３．０、スタットソフト（Ｓｔａｔｓｏｆｔ）、Ｔｕｌｓａ、ＯＫ）を用いて、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡおよびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を、臨床試験（連続変数）にて実施した。
【０５１４】
結果を、それぞれ図１１ａ、１１ｂおよび１１ｃで列記する。
【実施例２１】
【０５１５】
角膜血管新生モデル
ラットでのＶＥＧＦ−誘導血管新生におけるＣＯＮ４（Ｃ）の効果
Ａｎｇ−２ペプチボディーＣＯＮ４（Ｃ）を、ラットにおける血管新生の角膜モデルで評価した。血管新生を、角膜基質内へＶＥＧＦ−（またはＢＳＡ対照）を浸したナイロンディスクを移植することによって誘導した（ｎ＝８／群）。ペプチボディーＴＮ８ＣＯＮ４−Ｃを、７日間、１．０または０．１ｍｇ／ラット／日にて、皮下注射によって投与した。２つの他の群の動物を、陰性対照ペプチボディー４８８３の同一用量で処置した。全ての群を、１．０または０．１ｍｇの維持用量の三倍である、３．０または０．３ｍｇの単一負荷用量で前処理した（図を参照のこと）。７日間の処置の後、２つの血管エンドポイント、ディスクと角膜輪部間の中間点に交差している血管の数、血管面積を、ラット角膜の各デジタルイメージから決定した。ＴＮ８ＣＯＮ４−Ｃの処理によって、用量依存様式で、ＶＥＧＦ−誘導血管新生が有意に阻害され（ｐ＜０．０４）、一方で、対照ペプチボディーでの処置は、いずれのエンド−ポイントにおいても有意な効果を持たなかった。処置動物の体重に基づく明白な毒性の証拠は存在しなかった。結果を図１２に列記する。
【実施例２２】
【０５１６】
エピトープマッピング
全長（アミノ酸１から４９５）、Ｎ−末端（アミノ酸１から２５４）、およびＣ−末端（アミノ酸２５５から４９５）ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）タンパク質を、Ｃ−末端６×Ｈｉｓタグを含む、ＣＭＶ−駆動哺乳動物発現ベクター内にクローン化した。３つの得られた構造＋ベクター対照を、２９３Ｔ細胞に一過性に発現させた。次いで条件化培地を、トランスフェクト細胞から回収し、培地中でのＡｎｇ−２の発現レベルを、抗６×ｈｉｓ  ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングによって推定した。
【０５１７】
抗−Ａｎｇ−２抗体およびペプチボディーの結合エピトープを、以下のプロトコールにしたがったＥＬＩＳＡによって、ヒトｈＡｎｇ−２の３つのバージョンへ結合するこの能力によって決定した。高結合９６−ウェルアッセイプレートを、ウェルあたり２００μｌの条件化培地でコートし、３７℃にて１時間インキュベートした。条件化培地を吸引し、プレートを、室温にて１位時間、ＰＢＳ中の５％ＢＳＡ、ウェルあたり１００μｌでブロックした。次いでブロッキング溶液を吸引した。ウェルあたり１００μｌの抗体、ペプチボディー、またはＴｉｅ２−Ｆｃを、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌで加え、室温にて１時間インキュベートした。ウェルを、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ、２００μｌで４回洗浄した。ウェルあたり１００μｌのＨＲＰ−共役ヤギ抗−ヒトＩｇＧまたはヤギ抗−マウスＩｇＧを加え、室温にて４５分間インキュベートした。次いでウェルを、２００μｌのＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎで４回洗浄した。次いでウェルあたり１００μｌのＴＭＢ基質を加えた。Ｏ．Ｄ．を、３７０ｎｍで読んだ。
【０５１８】
結果を、図１３ａ、図１３ｂ、および図１３ｃに列記する。
【実施例２３】
【０５１９】
ＢｉａＣｏｒｅアッセイでの特定の感度制限特性のために、結合アフィニティーをまた、Ｓｅｐｉｄｙｎｅ  ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いて評価した。
【０５２０】
２×ＣＯＮ４−Ｃ（Ｐｂ５７１４）の、ｈｕＡｎｇ−２への結合を、ＫｉｎＥｘＡ（サピダイン（Ｓｐｉｄｙｎｅ）、Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ）上で試験した。Ｒｅａｃｔｉ−Ｇｅｌ  ６×ビーズ（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、ｈｕＡｎｇ−２でコートし、ＢＳＡでブロックした。１０ｐＭおよび３０ｐＭの２×ＣＯＮ４−Ｃ試料を、種々の濃度（０．３ｐＭから３ｎＭ）のｈｕＡｎｇ−２と共に、ｈｕＡｎｇ−２コートビーズを介して走らせる前に、室温にて８時間インキュベートした。ビーズ結合ペプチボディーの量を、蛍光（Ｃｙ５）標識ヤギ抗−ヒト−Ｆｃ抗体（ジャクソン  イムノ  リサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）によって定量した。結合シグナルは、平衡で、遊離ペプチドの濃度と比例する。
【０５２１】
解離平衡定数（ＫＤ）を、二重曲線単一部位均質結合モデル（ＫｉｎＥｘ（商標）ソフトウェア）を用いて、競合曲線の非直線回帰より得た。次いでＫＤを、ｈｕＡｎｇ−２との２×ＣＯＮ４−Ｃ結合に関して、およそ２ｐＭであると測定した。
【０５２２】
図１４で見られるように、ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いて、ペプチボディー２×Ｃｏｎ４は、ｈＡｎｇ−２に関して、〜２ｐＭ親和性を有することが示された。
【実施例２４】
【０５２３】
ペグ化ペプチド
Ｌ１−７ペプチドを、標準の結合プロトコール、および残基１４（ｍｅｔ）から、Ｎ−末端残基１（Ｃｙｓ）への二重結合を用いて、４３１ＡＢＩ合成機で合成した。番号はＮ−末端からＣ−末端である。
【０５２４】
Ｌ１−７ペプチドの、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）−マレイミドとの共役物、ＭＷ：５ＫＤａ、用語「ｍＰＥＧ５Ｋ−（Ｌ１−７  ペプチド）」
４００μＬの緩衝液１（２０ｍＭリン酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）中の０．８ｍｇのＬ１−７ペプチドの溶液を、１３．５ｍｇのメトキシ−ポリ（エチレンン  グリコール）−マレイミド（ＭＷ＝５ＫＤａ、シェアウォーター社（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．））、緩衝液１中の０．２７ｍｌの５０．０ｍｇ／ｍＬ溶液で処理した。反応混合液を、４℃にて一晩インキュベートし、次いで１．６ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  塩酸Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２）で希釈し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（３５００ＭＷＣＯ、ピアス）中で、同一の緩衝液に対して透析した。透析した反応混合液を、１．０ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャム  バイオサイエンセス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．））上の、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。産物ピークを、４０カラム容量にわたり、１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）の勾配までの、２つの１．０ｍＬ区画に溶出した。合わせた産物画分を、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  １Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（パル  ライフ  サイエンセス（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））で、０．２３ｍｇタンパク質／ｍＬを含む２５０μＬまで濃縮した。
【０５２５】
Ｌ１−７ペプチドの１，１１−ｂｉｓ−マレイミドテトラエチレンングリコールとの共役物、用語「ＰＥＯ４（Ｌ１−７  ペプチド）２」
５００μＬの緩衝液１（２０ｍＭリン酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）中のＬ１−７ペプチド１．０ｍｇの溶液を、０．０３７５ｍｇの１，１１−ビス−マレイミドテトラエチレンングリコール（ピアス）（緩衝液１中の０．３７５ｍＬの０．１ｍｇ／ｍＬ溶液）で処理した。反応混合液を、４℃にて３．３３時間インキュベートし、次いでＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（３５００ＭＷＣＯ、ピアス）中で、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  塩酸Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２）に対して透析した。透析反応混合液を、１．０ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャム  バイオサイエンセス社）上の、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。二量体産物ピークを、４０カラム容量にわたり、１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）の勾配までの、３つの１．０ｍＬ区画に溶出した。合わせた産物画分を、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  １Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（パル  ライフ  サイエンセス）で、０．１２ｍｇタンパク質／ｍＬを含む５５０μＬまで濃縮した。
【０５２６】
Ｌ１−７ペプチドのポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミドとの共役物、ＭＷ  ３．４ＫＤａ、用語「ＰＥＧ３．４Ｋ（Ｌ１−７  ペプチド）２」
１．５ｍＬの緩衝液１（２０ｍＭリン酸、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５）中のＬ１−７ペプチド３．０ｍｇの溶液を、１．１２５ｍｇのポリ（エチレングリコール）−ビス−マレイミド（ＭＷ＝３．４ＫＤａ、シェアウォーター社）、緩衝液１中の０．５６３ｍｌの２．０ｍｇ／ｍＬ溶液で処理した。反応混合液を、４℃にて一晩インキュベートし、次いでＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット（３５００ＭＷＣＯ、ピアス）中で、緩衝液Ａ（２０ｍＭ  塩酸Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．２）に対して透析した。透析した反応混合液を、５．０ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラム（アマシャム  バイオサイエンセス社）上の、イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。産物ピークを、４０カラム容量にわたり、１００％緩衝液Ａから１００％緩衝液Ｂ（緩衝液Ａ＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ）の勾配までの、３つの３．０ｍＬ区画に溶出した。合わせた産物画分を、Ｍｉｃｒｏｓｅｐ  １Ｋ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅ（パル  ライフ  サイエンセス）で、０．２４ｍｇタンパク質／ｍＬを含む８５０μＬまで濃縮した。
【０５２７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果は、以下のようであった。
【０５２８】
【表１６】
2007524610.tif 000090
【０５２９】
ＰＥＧ３．４Ｋ（Ｌ１−７ペプチド）およびＰＥＯ４（Ｌ１−７ペプチド）に関する下付き文字「２」が、ポリマー鎖あたり２つのペプチドが存在し、１つがポリマーの各末端に局在することを示すことが理解されるであろう。
【０５３０】
ＩＣ５０決定
Ｌ１−７遊離およびＰＥＧ化ペプチドに関する、ｈＡｎｇ２：ｈＴｉｅ２−Ｆｃ相互作用の阻害に対するＩＣ５０を、実施例２にて記述したように、ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡによって決定した。ニュートラリゼーションＥＬＩＳＡのために、ヒトＡｎｇ−２ポリペプチドを結合させたマイクロタイタープレートを、アフィニティＥＬＩＳＡのために実施例２で記述したように調製した。候補抗−Ａｎｇ−２  Ｌ１−７  ＰＥＧ化および遊離ペプチドを、約１％  ＢＳＡおよび約１ｎＭ  Ｔｉｅ−２（Ｔｉｅ−２部分が、分子の可溶性細胞外部分のみを含むＴｉｅ−２Ｆｃ分子として提供される。Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カタログ番号３１３−ＴＩ）を含むＰＢＳの溶液中で、１０００ｎＭから０．２ｐＭまで４倍希釈で滴定した。約１００マイクロタイターの抗体／Ｔｉｅ−２溶液を、各ウェルに加えた後、プレートを、室温にて一晩インキュベートし、次いで約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中で、５回洗浄した。洗浄後、約１００マイクロタイター／ウェルの抗Ｔｉｅ−２抗体（ファルミンゲン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、カタログ＃５５７０３９）を、約１マイクログラム／ｍｌの最終濃度まで加え、プレートを、約１時間、室温にてインキュベートした。次に、約１００マイクロタイター／ウェルのヤギ抗−マウス−ＩｇＧ−ＨＲＰ（ピアス  ケミカルＣＯ．（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、カタログ＃３１４３２）を、約１パーセントＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１０，０００の希釈にて加えた。プレートを、室温にて約１時間インキュベートし、この後、約０．１パーセントＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄した。次いで約１００マイクロタイター／ウェルの（上記）ＴＭＢ基質を加えて、発色させた。次いで吸収を、３７０ｎｍにて、分光光度計で読んだ。
【０５３１】
Ｌ１−７ペプチド
【０５３２】
【化５７】
2007524610.tif 000091
には、ＰＥＧへの結合のための、Ｎ−末端システイン、および５Ｇｌｙリンカーが含まれた。ＡＱおよびＬＥ隣接配列が、オリジナルのファージクローン中、およびペプチボディー中両方で存在した。ｈＡｎｇ−２：Ｔｉｅ２阻害ＩＣ５０結果は以下のようであった。
【０５３３】
【表１７】
2007524610.tif 000092
【実施例２５】
【０５３４】
ラットアジュバント関節炎における、Ａｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４（Ｃ）の効果を、免疫化の時点（０日）、または関節炎の臨床症状が開始する直前）（８日）いずれかで開始して投与して、研究した。Ａｎｇ−２ペプチボディー２×Ｃｏｎ４（Ｃ）をまた、ＰＥＧ化ＴＮＦ阻害剤、ペグスネルセプト（ＰＥＧｓＴＮＦ−Ｒ１）との組み合わせで研究した。
【０５３５】
オスＬｅｗｉｓラット（２００から２５０ｇ）を、チャールズ  リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）より得た。関節炎を、０日に、尾の根本で経皮的に、０．０５ｍＬパラフィン油（クレセント  ケミカル社（Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ）に懸濁した、「ＭＴｂ」と呼ぶ、熱殺傷マイコバクテリウム  チューブロクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７Ｒａ（ディフコ  ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）単独０．５ｍｇ注射によって誘導した。ＰＥＧｓＴＮＦ−Ｒ１（３０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｋｇにて与えた）、ペプチボディー２×Ｃｏｎ４（Ｃ）（３０．８ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ラットで与えた）、または賦形剤（ＰＢＳ）を、以下の表で概略したように、皮下で投与した。
【０５３６】
【表１８】
2007524610.tif 000093
【０５３７】
１ｍｇ／ｋｇのＰＥＧｓＴＮＦ−Ｒ１の、最大効果用量未満を、ペプチボディー２×Ｃｏｎｃ４（Ｃ）との効果的な相加的治療効果の査定を可能にするように、選択した。水プレチスモグラフィー（Ｆｅｉｇｅら，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５７：１４５７−１４７０（２０００））を用いて、後足容量の毎日測定によって、臨床的に査定した。足炎症の阻害は、以下の式
［（ＡＵＣ関節炎ＡｄＡ−ＡＵＣ処置ＡｄＡ）／ＡＵＣ関節炎ＡｄＡ］×１００
にしたがって、曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて計算した。
【０５３８】
体重欠損が、この関節炎モデルにおける関節炎症の進行と平行することが示されてきているので、総体重を、予備エンドポイントとして、９日から１８日までの毎日決定した。
【０５３９】
図１６にて、結果を、平均値±標準偏差として表した。０．０５のｐ値を使用して、群間の有意な差を表した。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡおよびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を、多数の試験のための調整をせずに、臨床試験（連続変数）にて実施した。
【０５４０】
体重：任意の時間期間の間、ペプチボディー２×Ｃｏｎ４（Ｃ）またはＰＥＧｓＴＮＦ−Ｒ１のみいずれかを与えた群は、実験の間、体重を失ったか、または得なかった。８から１７日、ペプチド２×Ｃｏｎｃ４（Ｃ）およびＰＥＧｓＴＮＦ−Ｒ１での組み合わせ治療を行った動物は、体重を維持したが、体重増加はなかった。しかしながら、いずれかの過程（０から１７日または８から１７日）で与えたＰＥＧｓＴＮＦ−Ｒ１と共に、０から１７日に、２×Ｃｏｎｃ４（Ｃ）を与えた関節炎動物は、実験の間にわたり、体重が増加した。
【０５４１】
結果を、図１５、１６および１７で列記する。
【図面の簡単な説明】
【０５４２】
【図１】本発明のペプチボディーＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で処置した、Ａ−４３１担癌マウスにおける腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図２】２ｘＣｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ又はＬ１−２１−Ｎペプチボディーのいずれかの５０μｇ用量で処置した野生型マウスにおけるペプチボディー濃度（ｙ軸）対投与後の時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図３】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は対照ペプチボディーで処置した、Ａ−４３１担癌マウスにおける腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図４】本発明によるペプチボディーＣｏｎ４−Ｃ又は対照ペプチボディーで処置した、又は未処置の、培養Ａ−４３１細胞のインビトロ増殖を示すグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図５】本発明によるペプチボディーＣｏｎ４−Ｃ、ペプチボディーＬ１−７−Ｎ、ペプチボディーＬ１−２１−Ｎ又はペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、抗Ａｎｇ−２抗体（Ａｂ５３６）又はＦｃで処置したＣｏｌｏ２０５腫瘍細胞における腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図６】種々の用量の本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃの様々な用量又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はＦｃで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植片担癌マウスにおける腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図７】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ又は対照ペプチボディーで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植片担癌マウスにおける腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。図７はまた、これらのペプチボディーについてのＣＤ３１染色面積／総腫瘍面積のグラフも示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図８】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は対照ペプチボディーで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植片担癌マウスにおける腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。このグラフは、抗Ａｎｇ−２ペプチボディーが、投与がいつ開始されたかに関わりなく、Ｃｏｌｏ２０５腫瘍増殖を阻止し得ることを示している。
【図９】Ａ４３１及びＣｏｌｏ−２０５異種移植モデルの両方において、抗体Ａｂ５３６又はペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃを使用して雌性ヌードマウスにおいて得られた完全応答（ＣＲ）率の要約である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１０Ａ】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又は２ｘＣｏｎ４−Ｃとタキソテールの組合せ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＰＢＳ＋タキソテールで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植片担癌マウスにおける腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１０Ｂ】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又は２ｘＣｏｎ４−Ｃと５−ＦＵの組合せ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＰＢＳ＋５−ＦＵで処置した、Ｃｏｌｏ２０５異種移植片担癌マウスにおける腫瘍体積（ｙ軸）対時間（ｘ軸）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１１Ａ】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は対照ペプチボディーで処置したラットにおけるアジュバント誘発性関節炎モデル、又は正常又は関節炎対照での、肢腫脹レベル（ＡＵＣ±ＳＥ）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１１Ｂ】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は対照ペプチボディーで処置したラットにおけるアジュバント誘発性関節炎モデル、又は正常又は関節炎対照での、肢骨塩密度（ＢＭＤ）のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１１Ｃ】本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃ、又はリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又は対照ペプチボディーで処置したラットにおけるアジュバント誘発性関節炎モデル又は正常若しくは関節炎対照での、体重変化のグラフである。詳細は実施例の中で述べる。
【図１２】ラットにおけるＶＥＧＦ誘導性角膜血管新生の阻止を示す２つのグラフである。最初のグラフは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＶＥＧＦ＋リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＶＥＧＦ＋本発明のペプチボディーＣｏｎ４−Ｃで処置したラットにおいて測定された血管数を示す。２番目のグラフは、ＢＳＡ、ＶＥＧＦ＋リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、又はＶＥＧＦ＋本発明のペプチボディーＣｏｎ４−Ｃで処置したラットにおける血管面積（ｍｍ２）を示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図１３Ａ】本発明によるペプチボディーＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ、ならびに対照ペプチボディー、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８又は５Ｂ１２それぞれについての、全長ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）、ｈＡｎｇ−２のＮ末端及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に対する、エピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１３Ｂ】本発明によるペプチボディーＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ、ならびに対照ペプチボディー、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８又は５Ｂ１２それぞれについての、全長ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）、ｈＡｎｇ−２のＮ末端及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に対する、エピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１３Ｃ】本発明によるペプチボディーＴＮ８−Ｃｏｎ４−Ｃ、Ｌ１−７−Ｎ及び１２−９−３−Ｃ、ならびに対照ペプチボディー、Ｔｉｅ２−Ｆｃ、Ｃ２Ｂ８又は５Ｂ１２それぞれについての、全長ヒトＡｎｇ−２（ｈＡｎｇ−２）、ｈＡｎｇ−２のＮ末端及びｈＡｎｇ−２のＣ末端に対する、エピトープマッピングデータ（Ｏ．Ｄ．３７０）である。詳細は実施例の中で述べる。
【図１４】Ｓａｐｉｄｙｎｅ  ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いた、本発明によるペプチボディー２ｘＣｏｎ４−Ｃの結合親和性（ＫＤ）を示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図１５】図１５は、ラットアジュバント関節炎における肢腫脹に対する、ぺプチボディー  ２ｘＣｏｎ４（Ｃ）及び抗炎症剤、ＰＥＧ  ｓＴＮＦ−Ｒ１の効果を示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図１６】図１６も、ラットアジュバント関節炎におけるＡＵＣ肢腫脹に対する、ぺプチボディー  ２ｘＣｏｎ４（Ｃ）及び抗炎症剤、ＰＥＧ  ｓＴＮＦ−Ｒ１の効果を示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図１７】図１７は、ラットアジュバント関節炎での体重における、ぺプチボディー  ２ｘＣｏｎ４（Ｃ）及び抗炎症剤、ＰＥＧ  ｓＴＮＦ−Ｒ１の効果を示す。詳細は実施例の中で述べる。
【図１】
2007524610.tif 000105
【図２】
2007524610.tif 000106
【図３】
2007524610.tif 000107
【図４】
2007524610.tif 000108
【図５】
2007524610.tif 000109
【図６】
2007524610.tif 000110
【図７】
2007524610.tif 000111
【図８】
2007524610.tif 000112
【図９】
2007524610.tif 000113
2007524610.tif 000114
2007524610.tif 000115
2007524610.tif 000116
2007524610.tif 000117
2007524610.tif 000118
【図１２】
2007524610.tif 000119
2007524610.tif 000120
2007524610.tif 000121
2007524610.tif 000122
【図１４】
2007524610.tif 000123
【図１５】
2007524610.tif 000124
【図１６】
2007524610.tif 000125
【図１７】
2007524610.tif 000126
【配列表】
2007524610000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月7日(2007.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、または生理学的に許容可能なその塩の治療的有効量を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記ペプチドまたはペプチボディーが、アミノ酸配列：
【化１】
2007524610.tif 000240
を含み、前記ペプチドが約５〜約５０アミノ酸の長さである、前記医薬組成物。
【請求項２】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、下記のアミノ酸配列を含むものであり：
【化２】
2007524610.tif 000241
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、下記のアミノ酸配列を含むものであり：
【化３】
2007524610.tif 000242
（式中、ｚ２が、酸性または中性極性アミノ酸残基である）、または生理学的に許容可能なその塩である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、下記のアミノ酸配列を含むものであり：
【化４】
2007524610.tif 000243
（式中、ｚ２が、酸性または中性極性アミノ酸残基である）、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、下記のアミノ酸配列を含むものであり：
【化５】
2007524610.tif 000244
（式中、ａ１、ａ２およびａ３が、それぞれ独立してアミノ酸残基であり、
ａ５がアミノ酸残基であり、
ａ１２が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ａ１３が存在しないか、中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基であり、
ａ１４が、中性疎水性または中性極性アミノ酸残基である）、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ａ１がＶ、Ｉ、Ｐ、Ｗ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり、
ａ２がＶ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｓ、Ｑ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、ＲまたはＨであり、
ａ３がＡ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｔ、Ｇ、Ｄ、Ｅ、ＫまたはＨであり、
ａ５がＡ、Ｖ、Ｇ、Ｑ、Ｎ、ＤまたはＥであり、
ａ１２がＳ、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｅ、ＫまたはＲであり、
ａ１３がＬ、ＴまたはＨであり、
ａ１４がＶ、Ｌ、Ｉ、ＷまたはＭである、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ａ１がＱであり、
ａ２はＥであり、
ａ３がＥであり、
ａ５はＤまたはＥであり、
ａ１２はＤまたはＥであり、
ａ１３はＨであり；および
ａ１４がＭである、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号４および配列番号７６〜配列番号１１８（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものであり、または生理学的に許容可能なその塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、または生理学的に許容可能なその塩の治療的有効量を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記ペプチドまたはペプチボディーが、下記の式のアミノ酸配列を含むものであり：
【化６】
2007524610.tif 000245
式中、
ｃ２が、中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｃ４がＡ、ＤまたはＥであり、
ｃ６が、酸性アミノ酸残基であり、
ｃ７が、アミノ酸残基であり、
ｃ８が中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基である、前記医薬組成物。
【請求項１０】
ｃ２がＬまたはＭである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ｃ６が、ＤまたはＥである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、下記の式のアミノ酸配列を含むものであり：
【化７】
2007524610.tif 000246
式中、
ｄ１が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ｄ２が存在しないか、中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ３が存在しないか、または中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｄ４が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ｄ６が、中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｄ８がＡ、ＤまたはＥであり、
ｄ１０が、酸性アミノ酸残基であり、
ｄ１１がアミノ酸残基であり、
ｄ１２が中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ１５が、存在しないか、中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ１６が存在しないか、または中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ１７が存在しないか、中性疎水性、または中性極性アミノ酸残基であり、
ｄ１８が存在しないか、または中性疎水性、または中性極性アミノ酸残基であり、
ｄ１９が存在しないか、または中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ２０が存在しないか、またはアミノ酸残基であり、
ｄ２１が存在しないか、または中性極性、酸性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｄ２２が存在しないか、または中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基である、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ｄ１がＴ、Ｓ、Ｑ、ＲまたはＨであり、
ｄ２がＴ、Ｑ、ＮまたはＫであり、
ｄ３がＦであり、
ｄ４がＭ、Ｑ、ＥまたはＫであり、
ｄ６がＬまたはＭであり、
ｄ８がＤまたはＥであり、
ｄ１０がＥであり、
ｄ１１がＱまたはＥであり、
ｄ１２がＴまたはＲであり、
ｄ１５Ｙ、Ｄ、ＥまたはＫであり、
ｄ１６がＱであり、
ｄ１７がＷまたはＦであり、
ｄ１８がＬ、Ｉ、ＭまたはＴであり、
ｄ１９がＬ、ＦまたはＹであり、
ｄ２０がＱ、ＤまたはＥであり、
ｄ２１が存在しないか、ＱまたはＨであり、
ｄ２２が存在しないか、Ａ、Ｌ、Ｇ、ＳまたはＲである、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号６および配列番号１１９〜配列番号１４２（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものであり、または生理学的に許容可能なその塩である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、または生理学的に許容可能なその塩の治療的有効量を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記ペプチドまたはペプチボディーが、下記の式のアミノ酸配列を含むものであり：
【化８】
2007524610.tif 000247
式中、
ｅ３が中性極性アミノ酸残基であり、
ｅ４が酸性アミノ酸残基であり、
ｅ５が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｅ６が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｅ７が中性疎水性アミノ酸残基である、
前記医薬組成物。
【請求項１６】
ｅ３がＹまたはＣである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ｅ４がＤまたはＥである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ｅ６がＩまたはＭである、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、下記の式のアミノ酸配列を含むものであり：
【化９】
2007524610.tif 000248
式中、
ｆ１が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ２が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ３が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｆ４が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ７が中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ８が酸性アミノ酸残基であり、
ｆ９が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｆ１０が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｆ１１が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｆ１３が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１４が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１５が中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１６が中性極性アミノ酸残基であり、
ｆ１７が中性極性または酸性アミノ酸残基であり、
ｆ１８が中性疎水性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｆ１９が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、および
ｆ２０が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基である、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ｆ１がＳ、ＡまたはＧであり、
ｆ２がＧ、ＱまたはＰであり、
ｆ３がＱ、ＧまたはＤであり、
ｆ４がＬ、ＭまたはＱであり、
ｆ７がＣまたはＹであり、
ｆ８がＥまたはＤであり、
ｆ９がＥ、ＧまたはＤであり、
ｆ１０がＩまたはＭであり、
ｆ１１がＦまたはＬであり、
ｆ１３がＣまたはＷであり、
ｆ１４がＧまたはＰであり、
ｆ１５ＴまたはＮであり、
ｆ１６がＱ、ＹまたはＫであり、
ｆ１７がＮ、ＤまたはＱであり、
ｆ１８がＬ、Ｖ、ＷまたはＲであり、
ｆ１９がＡ、Ｑ、ＹまたはＩであり；および
ｆ２０がＬ、Ａ、ＧまたはＶである、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号３および配列番号１４３〜配列番号１４８（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものであり、または生理学的に許容可能なその塩である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、または生理学的に許容可能なその塩の治療敵有効量を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記ペプチドまたはペプチボディーが、下記の式のアミノ酸配列を含むものであり：
【化１０】
2007524610.tif 000249
式中、
ｇ２が酸性アミノ酸残基であり、
ｇ４が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｇ５がＥ、ＤまたはＱであり、
ｇ１０が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｇ１３が酸性残基である、
前記医薬組成物。
【請求項２３】
ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、下記の式のアミノ酸配列を含むものであり：
【化１１】
2007524610.tif 000250
式中、
ｈ１が存在しないか、中性疎水性、中性極性または塩基性アミノ酸残基であり、
ｈ２が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｈ３が酸性アミノ酸残基であり、
ｈ４が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｈ６が酸性アミノ酸残基であり、
ｈ８が中性疎水性アミノ酸残基であり、
ｈ９がＥ、ＤまたはＱであり、
ｈ１４が、中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、
ｈ１７が酸性アミノ酸残基であり、
ｈ１８が中性疎水性、中性極性、または塩基性アミノ酸残基であり、
ｈ１９が中性疎水性または中性極性アミノ酸残基であり、および
ｈ２０が存在しないか、またはアミノ酸残基である、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ｈ１は存在しないか、またはＡ、Ｌ、Ｍ、Ｇ、ＫまたはＨであり、
ｈ２はＬ、ＦまたはＱであり、
ｈ３はＤまたはＥであり、
ｈ４はＷまたはＹであり、
ｈ６はＤまたはＥであり、
ｈ８はＶまたはＭであり、
ｈ１４はＦまたはＱであり、
ｈ１７はＤまたはＥであり、
ｈ１８はＭ、Ｙ、ＮまたはＫであり、
ｈ１９はＬまたはＱであり；および
ｈ２０は存在しないか、またはＭ、Ｔ、Ｇ、Ｓ、Ｄ、ＫまたはＲである、
または生理学的に許容可能なその塩である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号５および配列番号１４９〜配列番号１５７（両側含む）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含むものであり、または生理学的に許容可能なその塩である、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
治療的に効果的な量の、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物またはこの多量体、或いは生理学的に許容可能なその塩を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、ａおよびｂの少なくとも１つが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８および配列番号６９のアミノ酸配列を有するペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項２７】
治療的に効果的な量の、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物またはこの多量体、或いは生理学的に許容可能なその塩を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、ａおよびｂの少なくとも１つが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して配列番号７１および配列番号７２のアミノ酸配列を有するペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項２８】
治療的に効果的な量の、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物またはこの多量体、或いは生理学的に許容可能なその塩を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、ａおよびｂの少なくとも１つが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して配列番号７３および配列番号７４のアミノ酸配列を有するペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項２９】
治療的に効果的な量の、式：
（Ｘ１）ａ−Ｆ１−（Ｘ２）ｂ
の物質の組成物またはこの多量体、或いは生理学的に許容可能なその塩を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、式中、
Ｆ１がビヒクルであり、
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２；
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３；および
−（Ｌ１）ｃ−Ｐ１−（Ｌ２）ｄ−Ｐ２−（Ｌ３）ｅ−Ｐ３−（Ｌ４）ｆ−Ｐ４；
から選択され、式中、ａおよびｂの少なくとも１つが１であるという条件で、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅおよびｆがそれぞれ独立して０または１であり、式中Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４がそれぞれ独立してリンカーであり、ここで１つ以上のＰ１、Ｐ２、Ｐ３およびＰ４がそれぞれ独立して配列番号７５および配列番号１５８のアミノ酸配列を有するペプチドである、前記医薬組成物。
【請求項３０】
更に少なくとも１つの抗炎症性薬剤を含む、請求項１〜８、請求項９〜１４、請求項１５〜２１、請求項２２〜２５または請求項２６〜２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記抗炎症性薬剤が、ＤＭＡＲＤ、ＳＡＡＲＤおよびＮＳＡＩＤの少なくとも１種を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
前記抗炎症性薬剤が、メトトレキサート、ＴＮＦ阻害剤、ＩＬ−１阻害剤、ＴＡＣＥ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤およびＰ−３８阻害剤の少なくとも１種を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記ＴＮＦ阻害剤が、エタネルセプト、アダリムマブ、ペグスネルセプトｓＴＮＦ−Ｒ１、オネルセプトおよびインフリキシマブの少なくとも１種を含む、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記ＩＬ−１阻害剤が、アナキヌラ、ＩＬ−１  ＴＲＡＰ、ＩＬ−１抗体および可溶性ＩＬ−１レセプターの少なくとも１種である、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
同時投与されるよう製剤化されている、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
非同時投与されるよう製剤化されている、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）の治療的有効量を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号４および配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むものである、前記医薬組成物。
【請求項３８】
Ａｎｇ−２に結合可能なペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）の治療的有効量を含む、炎症性疾患を治療するための医薬組成物であって、前記ペプチドまたはペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）が、配列番号１２４、配列番号１２６または配列番号１３７で示されるアミノ酸配列を含むものである、前記医薬組成物。
【請求項３９】
更に少なくとも１つの抗炎症性薬剤含む、請求項３７または請求項３８に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
同時投与されるよう製剤化されている、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
非同時投与されるよう製剤化されている、請求項３９に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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