(57)【要約】【解決手段】  本発明は、遺伝子調節のＲＮＡ干渉経路において使用するための修飾オリゴマー化合物及びオリゴマー化合物の組成物を提供するものである。前記修飾オリゴマー化合物は、少なくとも１つの親和性修飾を有するｓｉＲＮＡ及びａｓＲＮＡを含むものである。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式（Ｉ）の化合物であって、
【化１】
2007514643.tif 000078
ここにおいて、
Ｔ１は、Ｈ、保護基、活性化リン基、或いは−Ｌｓ−ＳＳであり、Ｌｓは結合部位であり、ＳＳは固体支持媒体であり；
Ｔ２は、Ｈ、保護基、活性化リン基、或いは−Ｌｓ−ＳＳであり、Ｌｓは結合部位であり、ＳＳは固体支持媒体であり；
Ｂｘは、水素或いは核酸塩基であり；
Ｘは、ハロゲン、アミノ、アジド、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換或いは非置換アルコキシ、置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、或いは置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルキニルである、化合物。
【請求項２】
請求項１の化合物において、
Ｘは、化学式Ｉａ或いはＩｂの基であり：
【化２】
2007514643.tif 000079
Ｒｂは、Ｏ、Ｓ、或いはＮＨであり；
Ｒｄは、単結合、Ｏ、Ｓ或いはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｒｅは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）、或いは化学式Ｉｃを有し；
【化３】
2007514643.tif 000080
Ｒｐ及びＲｑはそれぞれ独立して、水素、或いはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒｒは、−Ｒｘ−Ｒｙであり；
それぞれのＲｓ、Ｒｔ、Ｒｕ及びＲｖは独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルフルホニル、アリールスルホニル、化学機能基、或いは共役基であり、ここにおいて前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択されるものであり；
或いは任意で、Ｒｕ及びＲｖは、それらが連結された窒素原子でフタルイミド部位を一緒に形成するものであり、
それぞれのＲｗは独立して、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル、或いはアリールであり；
Ｒｋは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｐは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｘは、単結合、或いは結合部位であり；
Ｒｙは、化学機能基、共役基、あるいは固体支持媒体であり、；
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、ここにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル；ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ、及びアシル（前記アシルは酸アミド或いはエステルである）から選択されるものであり、；
或いはＲｍ及びＲｎは、共にアミノ保護基である、Ｎ及びＯから選択された付加的ヘテロ原子を任意に含む環構造に連結している、若しくは化学機能基であり；
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、或いはＮ（Ｒｚ）２であり；
それぞれのＲｚは独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、或いはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり；
Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈは、約４〜約７炭素原子を有する、若しくは約３〜約６炭素原子と１或いは２ヘテロ原子を有する環システムを有し、ここにおいて、前記へテロ原子は、酸素、窒素、及び硫黄から選択されるものであり、前記環システムは、脂肪族、非飽和脂肪族、芳香族、或いは飽和或いは非飽和複素環であり；
Ｒｊは、１〜約１０炭素原子を有するアルキル或いはハロアルキル、２〜約１０炭素原子を有するアルケニル、６〜約１４炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋ或いはＣＮであり；
ｍａは、１〜約１０であり；
それぞれのｍｂは独立して、０或いは１であり；
ｍｃは、０或いは１〜１０の整数であり；
ｍｄは、１〜１０の整数であり；
ｍｅは、０、１、或いは２であり；及び、
ｍｃが０である場合、ｍｄは１以上である。
【請求項３】
請求項１の化合物において、
Ｔ１或いはＴ２の１つは、活性化リン基である。
【請求項４】
請求項１の化合物において、
Ｔ１或いはＴ２の１つは、−Ｌｓ−ＳＳである。
【請求項５】
請求項１の化合物において、
前記Ｘは、フルオロ、置換或いは非置換アルコキシ、置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、或いは置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２アルキニルから選択されるものである。
【請求項６】
請求項１の化合物において、
前記Ｘは、フルオロ、−Ｏ−ＣＨ３、或いは−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３から選択されるものである。
【請求項７】
請求項１の化合物において、
前記Ｘは、アリール、アミノ、アジド、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−アリル、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｍａ−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、或いはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、
ここにおいて、
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、
ｍａは、１〜約１０である。
【請求項８】
化学式ＩＩの化合物の少なくとも１つのヌクレオシドを有するオリゴマーであって、
【化４】
2007514643.tif 000081
ここにおいて、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して、内部ヌクレオシド結合であり；
Ｂｘは、水素或いは核酸塩基であり；
Ｘは、ハロゲン、アミノ、アジド、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１２、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換或いは非置換アルコキシ、置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、或いは置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルキニルである、オリゴマー。
【請求項９】
請求項８のオリゴマー化合物において、
前記Ｘは、化学式Ｉａ或いはＩｂの基であり：
【化５】
2007514643.tif 000082
ここにおいて、
Ｒｂは、Ｏ、Ｓ、或いはＮＨであり；
Ｒｄは、単結合、Ｏ、Ｓ、或いはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｒｅは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）、或いは化学式Ｉｃを有するものであり；
【化６】
2007514643.tif 000083
Ｒｐ及びＲｑはそれぞれ独立して、水素、或いはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒｒは、−Ｒｘ−Ｒｙであり；
それぞれのＲｓ、Ｒｔ、Ｒｕ及びＲｖは独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルフルホニル、アリールスルホニル、化学機能基、或いは共役基であり、ここにおいて、前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択されるものであり；
或いは任意で、Ｒｕ及びＲｖは、それらが連結された窒素原子でフタルイミド部位を一緒に形成するものであり、
それぞれのＲｗは独立して、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル、或いはアリールであり；
Ｒｋは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｐは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｘは、単結合、或いは結合部位であり；
Ｒｙは、化学機能基、共役基、あるいは固体支持媒体であり、；
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、ここにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル；ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ、及びアシル（前記アシルは酸アミド或いはエステルである）から選択されるものであり、；
或いはＲｍ及びＲｎは、共にアミノ保護基であり、Ｎ及びＯから選択された付加的ヘテロ原子を任意に含む環構造に連結している、若しくは化学機能基であり；
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、或いはＮ（Ｒｚ）２であり；
それぞれのＲｚは独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、或いはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり；
Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈは、約４〜約７炭素原子を有する、若しくは約３〜約６炭素原子と１或いは２ヘテロ原子を有する環システムを有し、ここにおいて前記へテロ原子は、酸素、窒素、及び硫黄から選択されるものであり、前記環システムは、脂肪族、非飽和脂肪族、芳香族、或いは飽和或いは非飽和複素環であり；
Ｒｊは、１〜約１０炭素原子を有するアルキル或いはハロアルキル、２〜約１０炭素原子を有するアルケニル、６〜約１４炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋ或いはＣＮであり；
ｍａは１〜約１０であり；
それぞれのｍｂは独立して、０或いは１であり；
ｍｃは、０或いは１〜１０の整数であり；
ｍｄは、１〜１０の整数であり；
ｍｅは、０、１、或いは２であり；及び、
ｍｃが０である場合、ｍｄは１以上である。
【請求項１０】
請求項８のオリゴマー化合物において、
前記Ｌ１或いはＬ２の少なくとも１つは、ホスホジエステル内部ヌクレオシド結合である。
【請求項１１】
請求項８のオリゴマー化合物において、
前記Ｌ１或いはＬ２の少なくとも１つは、ホスホロチオエート内部ヌクレオシド結合である。
【請求項１２】
請求項８のオリゴマー化合物において、
前記Ｘは、フルオロ、置換或いは非置換アルコキシ、置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、或いは置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２アルキニルから選択されるものである。
【請求項１３】
請求項８のオリゴマー化合物において、
前記Ｘは、フルオロ、−Ｏ−ＣＨ３、或いは−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３から選択されるものである。
【請求項１４】
請求項８のオリゴマー化合物において、
前記Ｘは、アリール、アミノ、アジド、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−アリル、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｍａ−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、或いはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、
ここにおいて、
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、
ｍａは、１〜約１０である。
【請求項１５】
８から８０ヌクレオチドを有する、請求項８のオリゴマー化合物。
【請求項１６】
８から５０ヌクレオチドを有する、請求項８のオリゴマー化合物。
【請求項１７】
８から３０ヌクレオチドを有する、請求項８のオリゴマー化合物。
【請求項１８】
１０から３０ヌクレオチドを有する、請求項８のオリゴマー化合物。
【請求項１９】
１５から３０ヌクレオチドを有する、請求項８のオリゴマー化合物。
【請求項２０】
１５から２５ヌクレオチドを有する、請求項８のオリゴマー化合物。
【請求項２１】
第１のオリゴヌクレオチド及び第２のオリゴヌクレオチドを有する組成物であって、
前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、前記第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、
前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、選択された標的核酸に対して相補的であり、ハイブリダイズすることができ、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、以下の化学式の４’−チオヌクレオシドを有する修飾も持つ少なくとも１つのヌクレオシドを含み：
【化７】
2007514643.tif 000084
ここにおいて、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して、内部ヌクレオシド結合であり；
Ｂｘは、水素或いは核酸塩基であり；
Ｘは、ハロゲン、アミノ、アジド、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１２、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換或いは非置換アルコキシ、置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、或いは置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルキニルである、組成物。
【請求項２２】
請求項２１の組成物であって、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにおいて、化学式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシドに対して、そこに含有されたＸは、化学式Ｉａ或いはＩｂの基であり：
【化８】
2007514643.tif 000085
ここにおいて、
Ｒｂは、Ｏ、Ｓ、或いはＮＨであり；
Ｒｄは、単結合、Ｏ、Ｓ或いはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｒｅは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）、或いは化学式Ｉｃを有し；
【化９】
2007514643.tif 000086
Ｒｐ及びＲｑはそれぞれ独立して、水素、或いはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒｒは、−Ｒｘ−Ｒｙであり；
それぞれのＲｓ、Ｒｔ、Ｒｕ及びＲｖは独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルフルホニル、アリールスルホニル、化学機能基、或いは共役基であり、ここにおいて、前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択されるものであり；
或いは任意で、Ｒｕ及びＲｖは、それらが連結された窒素原子でフタルイミド部位を一緒に形成するものであり、
それぞれのＲｗは独立して、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル、或いはアリールであり；
Ｒｋは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｐは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｘは、単結合、或いは結合部位であり；
Ｒｙは、化学機能基、共役基、あるいは固体支持媒体であり、；
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、ここにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル；ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ、及びアシル（前記アシルは酸アミド或いはエステルである）から選択されるものであり、；
或いはＲｍ及びＲｎは、共にアミノ保護基であり、Ｎ及びＯから選択された付加的ヘテロ原子を任意に含む環構造に連結している、若しくは化学機能基であり；
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、或いはＮ（Ｒｚ）２であり；
それぞれのＲｚは独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、或いはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり；
Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈは、約４〜約７炭素原子を有する、若しくは約３〜約６炭素原子と１或いは２ヘテロ原子を有する環システムを有し、ここにおいて、前記へテロ原子は、酸素、窒素、及び硫黄から選択されるものであり、前記環システムは、脂肪族、非飽和脂肪族、芳香族、或いは飽和或いは非飽和複素環であり；
Ｒｊは、１〜約１０炭素原子を有するアルキル或いはハロアルキル、２〜約１０炭素原子を有するアルケニル、６〜約１４炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋ或いはＣＮであり；
ｍａは１〜約１０であり；
それぞれのｍｂは独立して、０或いは１であり；
ｍｃは、０或いは１〜１０の整数であり；
ｍｄは、１〜１０の整数であり；
ｍｅは、０、１、或いは２であり；及び、
ｍｃが０である場合、ｍｄは１以上である、組成物。
【請求項２３】
請求項２１の組成物において、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにおいて、化学式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシドに対して、そこに含有されたＬ１或いはＬ２の少なくとも１つは、ホスホジエステル内部ヌクレオシド結合である。
【請求項２４】
請求項２１の組成物において、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにおいて、化学式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシドに対して、そこに含有されたＬ１或いはＬ２の少なくとも１つは、ホスホロチオエート内部ヌクレオシド結合である。
【請求項２５】
請求項２１の組成物において、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにおいて、化学式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシドに対して、そこに含有されたＬ１或いはＬ２の少なくとも１つは、ホスホジエステル内部ヌクレオシドであり、もう一方は、ホスホロチオエート内部ヌクレオシド結合である。
【請求項２６】
請求項２１の組成物において、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにおいて、化学式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシドに対して、そこに含有されたＸは、フルオロ、置換或いは非置換アルコキシ、置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２アルケニル、或いは置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２アルキニルから選択されるものである。
【請求項２７】
請求項２１の組成物において、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにおいて、化学式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシドに対して、そこに含有されたＸは、フルオロ、−Ｏ−ＣＨ３、或いは−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３から選択されるものである。
【請求項２８】
請求項２１の組成物において、
前記第１或いは第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つにおいて、化学式ＩＩの少なくとも１つのヌクレオシドに対して、そこに含有されたＸは、アリール、アミノ、アジド、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−アリル、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｍａ−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、或いはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、
ここにおいて、
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、
ｍａは、１〜約１０である。
【請求項２９】
請求項２１の組成物において、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの相補性対である。
【請求項３０】
請求項２１の組成物において、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのアンチセンス／センス対である。
【請求項３１】
請求項２１の組成物において、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、１０〜４０ヌクレオチドを有しているものである。
【請求項３２】
請求項２１の組成物において、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、１８〜３０ヌクレオチドを有しているものである。
【請求項３３】
請求項２１の組成物において、
前記第１及び第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、１８〜２４ヌクレオチドを有しているものである。
【請求項３４】
請求項２１の組成物において、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【請求項３５】
請求項３４の組成物において、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドである。
【請求項３６】
請求項３４の組成物において、
前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のリボースヌクレオチドユニットを有しているものである。
【請求項３７】
請求項２１の組成物において、
前記第１のオリゴヌクレオチドは、化学式ＩＩの少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むものである。
【請求項３８】
１，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピル  ジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトールを調合する方法であって、
以下の適切な溶媒におけるＴｉ（ＩＶ）イソプロポキドの溶液へジエチル−Ｌ−酒石酸を添加し、その後、前記適切な溶媒において適切なペルオキシドを添加ことによって酸化混合物を調合する工程と、
１，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピル  ジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトールを形成するために、１，４−アンヒドロ−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−Ｄ−リビトールを、前記酸化混合物で処理する工程と
を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００３年９月１８日に出願された米国仮出願出願番号第６０／５０３，９９７号に優先権を主張するものであり、その全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、４’−チオヌクレオシドから成る単量体及びオリゴマー化合物を提供する。より詳しくは、本発明は、オリゴマー化合物、及び少なくとも１つの本発明の４’−チオヌクレオシドを有する組成物を提供する。若干の実施例において、本発明のオリゴマー化合物および組成物は、ターゲットＲＮＡの正常機能の欠損を生じる一部のターゲットＲＮＡにハイブリッド形成する。
【背景技術】
【０００３】
病気の原因となる遺伝子配列を標的化することは、最初は３０年前以上前に提案されており（Ｂｅｌｉｋｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，１９６７，３７，３５５７〜３５６２）、アンチセンス活性は、１０年以上後で細胞培養において示された（Ｚａｍｅｃｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９７８、７５、２８０〜２８４）。病気の原因となる遺伝子から生じる疾患或いは病状の治療におけるアンチセンス技術の１つの利点は、特異的な病気の原因となる遺伝子の発現を調節する（増加させる或いは減少させる）能力を有する直接的な遺伝子アプローチであることである。別の利点は、アンチセンス化合物を用いた治療用ターゲットの確証によって、前記アンチセンス化合物は潜在的な治療薬であるという、薬剤候補物質の直接的で即時的な発見に繋がることである。
【０００４】
通常、アンチセンス技術の背景にある原理は、アンチセンス化合物がターゲット核酸にハイブリッド形成して、遺伝子発現活性または機能（例えば、転写または翻訳）を調節するということである。たとえば、遺伝子発現の調節は、ターゲット分解または占有に基づく阻害によって達成されることができる。分解によるＲＮＡターゲット機能の調節の例は、ＤＮＡ様アンチセンス化合物とのハイブリダイゼーションによるターゲットＲＮＡのＲＮａｓｅ−Ｈに基づく分解である。ターゲット分解による遺伝子発現の調節の他の例は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。ＲＮＡｉとは一般に、ターゲット化された内因性のｍＲＮＡレベルの配列−特異的減少を導く、ｄｓＲＮＡの導入に関連するアンチセンス仲介性遺伝子サイレンシングを意味している。特異的メカニズムに関係なく、この配列特異性は、アンチセンス化合物を、ターゲット確証及び遺伝子機能付与のための道具として、さらに悪性腫瘍および他の疾患の病原性に関係している遺伝子の発現を選択的に調節する治療として、極めて魅力的なものにする。
【０００５】
アンチセンス化合物は、動物（ヒトを含む）における病状の治療における治療薬として使用された。アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、様々な治験において、安全で効果的に多数のヒトに投与されている。１９９８年において、アンチセンス化合物、Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ（登録商標）（ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ；Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡによって開発された）は、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）から、マーケティング・クリアランスを達成した最初のアンチセンス薬剤であり、ＡＩＤＳ患者におけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）誘導性網膜炎の治療において現在使用されている。多くの癌において過剰発現されたＢｃｌ−２つのｍＲＮＡを標的としたアンチセンス化合物である、Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（商標）（ｏｂｌｉｍｅｒｓｅｎ  ｓｏｄｉｕｍ、Ｇｅｎｔａ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪ）によって開発）の新しい薬剤適用は、ＦＤＡによって承認された。少し例を挙げれば、ｃ−ｍｙｃ（ＮｅｕＧｅｎｅ（登録商標）ＡＶＩ−４１２６、ＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ｒｉｄｇｅｆｉｅｌｄ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）、ＴＮＦ−アルファ（ＩＳＩＳ  １０４８３８（Ｉｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．によって開発された））、ＶＬＡ４（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．，Ｔｏｏｒａｋ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）および、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧ９８，ＭＧＩ  Ｐｈａｒｍａ，（Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）によって開発された）を含む多くの他のアンチセンス化合物は、治験中である。
【０００６】
新規な化学修飾は、アンチセンス化合物の作用強度および効力を改良し、経口送達の可能性を明らかにし、さらには皮下投与の増強、副作用の可能性の減少、及び患者の便宜における改善を提供することになった。アンチセンス化合物の作用強度を増強する化学修飾は、毒性の可能性を軽減し、さらには治療に係る全体的なコストを軽減する、低用量での投与を可能とする。分解に対する耐性を増強する修飾は、体からのより遅いクリアランスに起因し、より少ない頻度の投薬を可能にする。異なる種類の化学修飾は、更に化合物の効力を最適化するための１つの化合物との組み合わせでありえる。
【０００７】
アンチセンス技術は、１若しくはそれ以上の特異的遺伝子産物の発現を減少するために有効な手段であり、従って、多くの治療、診断及び研究適用においてユニークな有用性を提供できる。
【０００８】
従って、アンチセンス・メカニズムを介して特異的に遺伝子発現を調節する薬剤に対する長い間切実であった必要性が残されている。例えば、ＲＮａｓｅＨ、ＲＮＡｉおよびｄｓＲＮＡ酵素などの、作用メカニズム、さらにはターゲット分解またはターゲット占有に基づいた他のアンチセンスメカニズムに依存しているものを含む、遺伝子発現経路を調節することに役立つアンチセンス化合物は、本願明細書において開示される。この開示技術を一度取得した当業者は、過度の実験なしで、これらの使用のためのアンチセンス化合物を同定し、調合して、開発することが可能である。
【０００９】
多くの種において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入は、強力および特異的な遺伝子サイレンシングを誘発する。この現象は、植物および動物において起こり、ウイルス性防御およびトランスポゾン・サイレンシング・メカニズムの役割を有する。この現象は、そもそも、ペチュニア草花を研究している研究者によって十年以上前に記載されていた。これらの花の紫色を濃くしようと、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎらは強力なプロモータの制御中で、色素−産生性遺伝子を導入した。期待される深い紫色の代わりに、花の多くは、雑色であるか白が現れた。導入遺伝子および相同内因性遺伝子の両方の発現が抑制されたため、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎは、観察されたこの現象を「共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」と名付けた（Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９０，２，２７９〜２８９、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３１，９５７〜９７３）。
【００１０】
共抑制は、植物、菌の多くの種で起こっていることが見出され、、アカパンカビにおいては特に「抑制（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）」として知られており、よく特徴付けられている（Ｃｏｇｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２０００，１０，６３８〜６４３、及びＧｕｒｕ，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０４，８０４〜８０８）。
【００１１】
ｄｓＲＮＡが動物の遺伝子サイレンシングを導くことができるという最初の証拠は、線虫（シノラブディス・エレガンス）における研究によって明らかになった。１９９５年において、研究者ＧｕｏおよびＫｅｍｐｈｕｅｓは、その機能を評価するために、ｐａｒ−１遺伝子の発現を停止するためにアンチセンスＲＮＡを使用しようとした。予想されたように、アンチセンスＲＮＡの注入はｐａｒ−１の発現を阻止したが、センス鎖コントロールの注入でも発現が阻止された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１，６１１〜６２０）。この結果は、Ｆｉｒｅらが線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）にｄｓＲＮＡ（センスおよびアンチセンス鎖の混合物）を注射するまで、難問であった。この射出は、単独でセンスかアンチセンス鎖のいづれかの注入に比べ、非常に効率的なサイレンシングを生じた。細胞につきｄｓＲＮＡの数分子の注入は、相同遺伝子の発現を完全に停止させるのに十分であった。さらに、虫の腸へのｄｓＲＮＡの注入によって、その虫だけでなく最初の世代子孫において遺伝子サイレンシングが生じた（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６〜８１１）。
【００１２】
ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅは、この現象の作用強度から、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ  ｕｎｃ−２２に対するｄｓＲＮＡ相同体を発現するように設計された、線虫バクテリアを供給することによって、ｄｓＲＮＡ効果の限界を探検した。驚くべきことに、これらの虫は、ｕｎｃ−２２ヌル様表現型を発生した（Ｔｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９５，８５４；及び、Ｔｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００１，２６３，１０３〜１１２）。更なる研究では、虫をｄｓＲＮＡに浸すことによって、サイレンシングを誘発することが可能であることが示された（Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，４３０〜４３１）。ＰＣＴ公報番号第ＷＯ０１／４８１８３号では、線虫によって或いは二本鎖ＲＮＡを生産することができるＤＮＡを導入することによって、食品有機体の経口摂取に続いて、ターゲット遺伝子の一部と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ構造を生産することができる食品有機体を虫に供給する工程を含む、線虫におけるターゲット遺伝子の発現を阻害する方法が開示されている（Ｂｏｇａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００１３】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）にさらすことに起因する、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて定義された転写後遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として指定された。この用語は、トランスジェニック（遺伝子導入）ＤＮＡが導入遺伝子および内因性遺伝子の両方のサイレンシングを導く共抑制とは異なる、内因性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的減少を導くｄｓＲＮＡを含む、遺伝子サイレンシングの全ての形を総称するようになった。Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓへの外因性二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入は、相同配列を含んでいる遺伝子の活性を特異的で強力に破壊させることを示した。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙらは、ｄｓＲＮＡの初期干渉効果が転写後のことであると示唆し、この結論は、ｄｓＲＮＡ仲介性干渉の後、初期ＤＮＡ配列の実験（変化の証拠がなかった発見）から生じ、その後、その下流遺伝子の活性に対して影響がない上流オペロンの変化を含む研究が続いた。これらの結果は、転写の開始或いは延長への影響に対して相反するものである。最後に、彼らは、ｄｓＲＮＡ仲介性干渉が実質的に、完全ではないが、転写産物の細胞質蓄積は実質的に除去された一方、に核における新生転写産物の蓄積が減少したことをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成によって観察した。これらの結果によって、内因性ｍＲＮＡは、干渉のための初期ターゲットであることが示され、翻訳の前に標的とされたｍＲＮＡを分解するメカニズムを示唆された。また、このメカニズムは、ＳＭＧシステム（標的化及び破壊異常メッセージに関与している、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおけるｍＲＮＡサーベイランスシステム）に依存しないことが発見された。この著者は更に、ｄｓＲＮＡが、分解のために相同的ｍＲＮＡを標的とし触媒メカニズムとしてどのように機能するかというモデルを提案した。（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２〜１５５０７）。
【００１４】
最近、ＲＮＡｉの多くの特徴を再利用するシンシチウム胞胚葉ショウジョウバエ胚からの無細胞システムの開発が、報告された。この反応において観察される干渉は、配列特性であって、一本鎖ＲＮＡではなくｄｓＲＮＡによって促進され、特異的ｍＲＮＡ分解によって機能して、最小限の長さのｄｓＲＮＡを必要とする。さらに、ｄｓＲＮＡのプレインキュベーションは、ＲＮＡｉが可溶反応の配列特異性プロセスによって仲介されることができることを証明している、その活性を増強  する（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９９，１３，３１９１〜３１９７）。
【００１５】
次の実験においてＴｕｓｃｈｌらは、ショウジョウバエのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用し、２１−および２２−ｎｔ  ＲＮＡ断片がＲＮＡｉの配列−特異性介在物質であることを証明した。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｓ）と名付けられたこれらの断片は、長いｄｓＲＮＡからＲＮａｓｅ  ＩＩＩ−様プロセシング反応によって産生されることが示された。彼らはさらに、オーバーハング３’末端を有する化学的に合成されたｓｉＲＮＡ二本鎖は、ショウジョウバエ可溶化液における効率的なターゲットＲＮＡ開裂を仲介し、前記切断部位は誘導ｓｉＲＮＡに延びた領域の中央の近くに位置することを示した。加えて、彼らは、ｄｓＲＮＡプロセシングの方向は、センス或いはアンチセンス標的ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ−タンパク複合体によって切断されることができるかどうか決定することを示唆した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００１，１５，１８８〜２００）。さらに、２１〜２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡｓによって引き起こされる内因性及び異種性遺伝子の発現の抑制は、ヒト胚性腎臓（２９３）及びＨｅＬａ（ヒーラー）細胞を含むいくつかの哺乳類細胞株において調査された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４〜４９８）。
【００１６】
つい最近、Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎらは、実際、アンチセンス方向性の一本鎖ＲＮＡオリゴマーが、遺伝子サイレンシングの強力誘導因子でありえることを明らかにした。共抑制の場合のように、彼らは、アンチセンスＲＮＡがＲＮＡｉ遺伝子ｒｄｅ−１およびｒｄｅ−４とは独立して作用するが、突然変異誘発体／ＲＮＡｉ遺伝子ｍｕｔ−７および推定ＤＥＡＤボックスＲＮＡヘリカーゼであるｍｕｔ−１４を必要とすると示した。著者によれば、彼らのデータから、遺伝子サイレンシングは、鋳型としてｍＲＮＡを使用してＲＮＡプライマー伸長によって達成され、これは、一本鎖ＲＮＡオリゴマーが最終的にＲＮＡｉ現象の原因となることを示唆する、その後分解されるｄｓＲＮＡを導く、という仮説を支持するものであった。
【００１７】
最近のいくつかの刊行物は、ＲＮＡｉ活性のために必要なｄｓＲＮＡトリガーに対する構造上要求を記載していた。最近の報告によって、理想的なｄｓＲＮＡ配列は、２ｎｔの３’末端オーバーハングを含む、長さ２１ｎｔのものであることが示された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ，２００１，２０，６８７７〜６８８７；及びＳａｂｉｎｅ  Ｂｒａｎｔｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，２００２，１５７５，１５〜２５）。このシステムにおいて、３’末端からの４ヌクレオシドの２’−デオキシヌクレオシドでの置換は、活性に影響を与えないということが示された。一方、配列（センスまたはアンチセンス）の全体にわたる２’デオキシヌクレオシド或いは２’−ＯＭｅ−ヌクレオシドでの置換は、ＲＮＡｉ活性に有害なことが示された。
【００１８】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓのＲＮＡサイレンシングのための構造上の必要性の調査によって、活性を阻害しない内部ヌクレオチド連結（ホスホロチオエート）の修飾が示された（Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２０００，６，１０７７〜１０８７）。また、２’−アミノ或いは５’−イオドウリジンのような化学的修飾はセンス鎖においてかなり許容性を示したが、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖はそうではなく、これはＲＮＡｉの２つの鎖は役割が異なっていることを提案するものであるとＰａｒｒｉｓｈらによって明らかにされた。グアニンからイノシン（１つの水素結合が消失する）へなどの塩基修飾は、その修飾の位置（センスまたはアンチセンス）に独立して、それぞれにＲＮＡｉ活性を減少させることが示された。同じ「位置に依存しない」活性の消失は、ｄｓＲＮＡトリガーにミスマッチを導入することに続くことが見出された。例えば、５−イオドＵ立体的に要求されている塩基の導入などのいくつかの修飾は、アンチセンス鎖内に置かれた場合、ＲＮＡｉ活性に有害である一方、センス鎖内に置かれた修飾は、ＲＮＡｉ活性に対してあまり有害でないことが示された。２１ｎｔ  ｄｓＲＮＡ配列の場合のように、ＲＮＡ−ＤＮＡ  異種性二本鎖は、ＲＮＡｉのためのトリガーとして働かなかった。しかし、２’−Ｆ−２’−デオキシヌクレオシドを含むｄｓＲＮＡは、２’−Ｆ−２’−デオキシヌクレオシドの位置（センスまたはアンチセンス）とは独立して、ＲＮＡｉ反応の引き金を引くのに効率的であるように見られた。
【００１９】
１つの実験において、遺伝子発現の減少は、着床後マウス胚における電気穿孔されたｄｓＲＮＡおよび２５ｍｅｒモルフォリノを使用して研究された（Ｍｅｌｌｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１１８，５７〜６３）。モルフォリノオリゴマーは、活性を示したが、ｄｓＲＮＡほど効果的でなかった。
【００２０】
ＲＮＡｉ現象に関する多くのＰＣＴ出願が、最近公開された。これらは、ＰＣＴ公開第ＷＯ  ００／４４８９５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４９０３５号；ＰＣＴ公開第ＷＯ００／６３３６４号；ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／３６６４１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／３６６４６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／３２６１９号；ＰＣＴ公開第ＷＯ００／４４９１４号；ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／２９０５８号；そして、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１／７５１６４号を含む。
【００２１】
米国特許第５，８９８，０３１号および第６，１０７，０９４号（それぞれは本願出願と同一出願人であり、この参照によって本願明細書に組み込まれる）では、ＲＮＡ様特性を有する特定のオリゴヌクレオチドが記載されている。ＲＮＡとハイブリッド形成されるときに、これらのオリゴヌクレオチドは、酵素によるＲＮＡの切断を導くｄｓＲＮａｓｅ酵素の基質として役立つ。
【００２２】
最近出版された他の雑誌（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００２，１１０，５６３〜５７４）において、一本鎖ｓｉＲＮＡと同様に二本鎖ｓｉＲＮＡは、ｅｌＦ２Ｃ１およびｅｌｆ２Ｃ２（ヒトＧＥＲｐ９５０  Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク）と共にＲＮＡ−誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に属することが示された。５’−リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡの活性は、システム研究において二本鎖ｓｉＲＮＡに対して比較可能であった。関連した研究において、５’−リン酸部位の含有物は、ショウジョウバエ胚におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡｓの活性を強化することが示された（Ｂｏｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２００１，１１，１７７６〜１７８０）。他の研究において、５’−リン酸塩がヒトＨｅｌａ細胞においてｓｉＲＮＡ機能のために必要であると報告された（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２００２，１０，５３７〜５４８）。
【００２３】
また、最近出願された他の雑誌（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２００２，１０，５４９〜５６１）において、ｓｉＲＮＡの５’−水酸基は、活性化するためにリン酸化されることが重要である一方、３’−水酸基は重要ではなく、ビオチンなどの置換基を許容することが示された。１若しくは両方のセンスまたはアンチセンス鎖のバルジ（隆起）構造は、未修飾ｓｉＲＮＡ二本鎖と関連した活性を破壊する、或いは低下させることが示された。また、ソラレンがｓｉＲＮＡ二本鎖のクロスリンクさせるために用いられたとき、活動の著しい低下が示された。
【００２４】
ＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル２−チオエチル）リン酸塩）のようなリン保護基は、個々のヌクレオチドのリン酸部位、及びオリゴヌクレオチドの部位を連結している内部ヌクレオチドリン酸塩を遮断するために用いられた。これらの基はさらに、細胞間エステラーゼの作用によって、細胞内で脱保護されたオリゴヌクレオチドを産出するために、生物システムにおいて使われていた。このような基は、ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９６／０７３９２号、第ＷＯ９３／２４５１０号、第ＷＯ９４／２６７６４号および米国特許第５，７７０，７１３号において開示されている。
【００２５】
１グループの研究者らは、４’−チオ−含有化合物の合成及び特性を研究しており、彼らの結果は公開されている（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  &  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９９，１８（６  &  ７），１４２３〜１４２４；ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，１９９４，５８０（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），６８〜７９、ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  &  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４（３−５），１０２７〜３０）。
【００２６】
別の雑誌では、デオキシ４’−チオヌクレオチドを含むオリゴデオキシヌクレオチドの特性を開示している（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９６，２４（２１），４１１７〜４１２２）。
【００２７】
パメラー（Ｐｕｍｍｅｒｅｒ）反応を利用した４’−チオリボヌクレオシドの立体合成は、他のグループの研究者によって記載されていた（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ，１９９８，３９，２１〜２２、及び、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２０００，１２２（３０），７２３３〜７２４３）。
【００２８】
ＲＮＡｓｅ  Ｈ経路のような、遺伝子発現のアンチセンス調節のＲＮＡ干渉経路は、特異的な遺伝子産物のレベルを調節するための効果的手段であって、従って、遺伝子サイレンシングに関する多数の治療、診断、及び研究適用において独自な有用性を提供するであろう。従って、本発明は更に、遺伝子発現経路を調節することに役立つオリゴマー化合物を提供し、これは、ＲＮＡ干渉およびｄｓＲＮＡ酵素、さらには非アンチセンスメカニズムなどのアンチセンスの作用機構に依存するものを含む。ここで開示されたことを取得した当業者は、過度の実験なしで、これら或いは他の使用に対して付加的なオイゴマー化合物を同定することができるものである。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、化学式（Ｉ）の化合物を提供するものであり、
【００３０】
【化１０】
2007514643.tif 000002
【００３１】
ここにおいて、
Ｔ１は、Ｈ、保護基、活性化リン基、或いは−Ｌｓ−ＳＳであり、Ｌｓは結合部位であり、ＳＳは固体支持媒体であり；
Ｔ２は、Ｈ、保護基、活性化リン基、或いは−Ｌｓ−ＳＳであり、Ｌｓは結合部位であり、ＳＳは固体支持媒体であり；
Ｂｘは、水素或いは核酸塩基であり；
Ｘは、ハロゲン、アミノ、アジド、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換或いは非置換アルコキシ、置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、或いは置換或いは非置換−Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、若しくは、
Ｘは、化学式Ｉａ或いはＩｂの基であり：
【００３２】
【化１１】
2007514643.tif 000003
【００３３】
Ｒｂは、Ｏ、Ｓ、或いはＮＨであり；
Ｒｄは、単結合、Ｏ、Ｓ或いはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｒｅは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）、或いは化学式Ｉｃを有し；
【００３４】
【化１２】
2007514643.tif 000004
【００３５】
Ｒｐ及びＲｑはそれぞれ独立して、水素、或いはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒｒは、−Ｒｘ−Ｒｙであり；
それぞれのＲｓ、Ｒｔ、Ｒｕ及びＲｖは独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルフルホニル、アリールスルホニル、化学機能基、或いは共役基であり、ここにおいて前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択されるものであり；
或いは任意で、Ｒｕ及びＲｖは、それらが連結された窒素原子でフタルイミド部位を一緒に形成するものであり、
それぞれのＲｗは独立して、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル、或いはアリールであり；
Ｒｋは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｐは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｘは、単結合、或いは結合部位であり；
Ｒｙは、化学機能基、共役基、あるいは固体支持媒体であり、；
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、ここにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル；ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ、及びアシル（前記アシルは酸アミド或いはエステルである）から選択されるものであり、；
或いはＲｍ及びＲｎは、共にアミノ保護基である、Ｎ及びＯから選択された付加的ヘテロ原子を任意に含む環構造に連結している、若しくは化学機能基であり；
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、或いはＮ（Ｒｚ）２であり；
それぞれのＲｚは独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、或いはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり；
Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈは、約４〜約７炭素原子を有する、若しくは約３〜約６炭素原子と１或いは２ヘテロ原子を有する環システムを有し、ここにおいて、前記へテロ原子は、酸素、窒素、及び硫黄から選択されるものであり、前記環システムは、脂肪族、非飽和脂肪族、芳香族、或いは飽和或いは非飽和複素環であり；
Ｒｊは、１〜約１０炭素原子を有するアルキル或いはハロアルキル、２〜約１０炭素原子を有するアルケニル、６〜約１４炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋ或いはＣＮであり；
ｍａは、１〜約１０であり；
それぞれのｍｂは独立して、０或いは１であり；
ｍｃは、０或いは１〜１０の整数であり；
ｍｄは、１〜１０の整数であり；
ｍｅは、０、１、或いは２であり；及び、
ｍｃが０である場合、ｍｄは１以上である。
【００３６】
本発明の他の実施形態において、オリゴマー化合物は、化学式（ＩＩ）の少なくとも１つの部位を有するものとして開示され：
【００３７】
【化１３】
2007514643.tif 000005
【００３８】
ここにおいて、ＢｘおよびＸは、本明細書で定義され、Ｌ１およびＬ２は、本明細書で定義されるように内部ヌクレオシド連結である。本発明のオリゴマーに好ましい内部ヌクレオシド連結は、これに限定されるものではないが、ホスホジエステル結合、ホスホチオエート結合、およびそれらの混合物を含む。本発明の好適なオリゴマーは、これに限定されるものではないが、オリゴマー８〜８０ヌクレオチド、８〜５０ヌクレオチド、８〜３０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、１５〜２５ヌクレオチド、などを含む。
【００３９】
好適なＸ２’−置換基は、これに限定されるものではないが：ＯＨ、Ｆ、Ｏ−アルキル（例えばＯ−メチル）、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、Ｏ−アルキニル、Ｓ−アルキニル、Ｎ−アルキニル；Ｏ−アルキル−Ｏアルキルを含み、ここにおいてアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、それぞれ、飽和或いは不飽和のＣ１〜Ｃ１０アルキル若しくはＣ２〜Ｃ１０アルケニルまたはアルキニルであってもよい。特に好ましくは、Ｏ［（ＣＨ２）ｇＯ］ｈＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｇＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｇＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｇＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｇＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｇＯＮ［（ＣＨ２）ｇＨ］２であり、ここにおいてｇおよびｈは、１〜約１０までである。他の好適なオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のうちの１つ：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル或いはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、複素環式芳香族化合物、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレータ（干渉物質）、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基を有するものである。他の実施形態において、Ｘは、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３（２’−Ｏ−（２−メトキシエチルまたは２’−ＭＯＥとして公知）を含むことができる（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６〜５０４）。本発明の別の実施例において、Ｘは、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（以下の実施例に記載されたように、２’−ＤＭＡＯＥ、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当業者には、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして公知である）として知られている）を含むことができ、本明細書において詳細に記載された実施例にも記載されている。
【００４０】
他の好適な修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。２’−修飾は、アラビノ（上）位置またはリボ（下）位置である。好適な２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様な修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上或いは２’−５’連結したオリゴヌクレオチドにおける糖の３’ヌクレオチド、若しくは５’末端ヌクレオチドの５’位でなされ得る。
【００４１】
特に有用な糖置換基基は、Ｏ［（ＣＨ２）ｇＯ］ｈＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｇＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｇＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｇＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｇＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｇＯＮ［（ＣＨ２）ｇＨ）］２を含み、ｇおよびｈは１〜約１０まである。
【００４２】
本発明の１実施形態において、Ｒ２は、Ｈまたはヒドロキシルであり、Ｒ１は、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｍａ−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、或いはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり；
そこにおいて：
各々のＲｍおよびＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノおよびアシルから選択されるものであり、前記アシルは酸アミドまたはエステルであり；そして、ｍａは１〜約１０まである。
【００４３】
本発明の更なる実施形態は、化学式Ｉによって記載されたヌクレオシドのホスホラミダイトを含み、Ｔ１またはＴ２の１つは、活性化リン酸基である。
【００４４】
本発明の他の実施形態において、固形支持体に結合したヌクレオシドであり、化学式Ｉにおいて、Ｔ１またはＴ２のうちの１つは−Ｌｓ−ＳＳであり、Ｌｓは連結部位であり、ＳＳは支持媒体である。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを有する組成物が開示されており：
前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、前記第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部とハイブリッド形成することができ、
前記第１のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部は、選択された標的核酸に対して相補的でありハイブリッド形成することができ、
前記第１或いは前記第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、化学式ＩＩの４’−チオヌクレオシドから成る修飾を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含み：
【００４６】
【化１４】
2007514643.tif 000006
【００４７】
そこにおいて、Ｂｘ、Ｌ１およびＬ２は、本明細書において定義されている。
【００４８】
１実施形態において、前記組成物は、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの相補性ペアーである第１および第２のオリゴヌクレオチドを有する。もう一つの実施形態では、前記組成物は、オリゴヌクレオチドのアンチセンス／センス対である第１および第２のオリゴヌクレオチドから成る。
【００４９】
本発明の１実施形態において、前記組成物から成る第１および第２のオリゴヌクレオチドの各々は、長さ１０〜約４０ヌクレオシドを有する。本発明の他の実施形態において、前記組成物から成る第１および第２のオリゴヌクレオチドの各々は、長さ１８〜約３０ヌクレオシドを有する。本発明の更なる実施形態において、前記組成物から成る第１および第２のオリゴヌクレオチドの各々は、長さ１８〜約２４ヌクレオシドを有する。
【００５０】
本発明の１実施形態において、前記第１のオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明の他の実施形態において、前記第２のオリゴヌクレオチドは、センスオリゴヌクレオチドである。本発明の更なる実施形態において、前記第２のオリゴヌクレオチドは、複数のリボースヌクレオチド単位を有する。
【００５１】
本発明の１実施形態において、前記第１のオリゴヌクレオチドは、修飾を有するヌクレオシドを含む。
【００５２】
本発明の１実施形態において、１，４−無水−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトールを調合するための工程が開示されており、この工程は：
適切な溶剤のＴｉ（ＩＶ）イソプロポキシドの溶液へジエチル−Ｌ酒石酸塩を添加し、その後前記適切な溶剤に適切な過酸化物を添加することによって酸化混合物を調合する工程と；
適切な溶液の１，４−無水−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロポルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトールを、前記酸化混合物で処理し、１，４−無水−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロポルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトールを生成する工程とを有する。
【００５３】
本発明の他の実施形態は、本明細書において詳細に記載された本発明の化合物のいずれかを製造する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明は、新規４’−チオヌクレオシド、それらから調合された一本鎖および二本鎖オリゴマー化合物を提供する。本発明の４’−チオヌクレオシドは、それらが取り込まれる、特にオリゴリボヌクレオチドにおいて、オリゴマー化合物を化学的及び酵素的に安定させることに有用である。本発明の４’−チオヌクレオシドは、ｓｉＲＮＡ二本鎖、ミクロＲＮＡ及びａｓＲＮＡ一本鎖化合物を利用する作用機構に対する基質特異性を強化するために、所望立体配座を有すると更に考えられる。本発明のオリゴマーはまた、診断適用のプライマーおよびプローブとして有用である。
【００５５】
本発明の４’−チオヌクレオシドは、これに限定されるものではないが、ヘミマー、ギャップマー、均一体、他の化学物質での改変体を含む、様々なモチーフに有用である。これらのモチーフと関連して、多様な連結はまた、これに限定されるものではないが、均一に使用されるリン酸ジエステルおよびホスホロチオネート結合を含むように使用される、または組み合わせにおいて使用されることができる。４’−チオヌクレオシドの位置決め、および結合戦略の使用は、特定の標的のための最高な活動を容易に最適化され得る。
【００５６】
ほとんどの部分に対して、本発明の４’−チオヌクレオシドは、対応するリボヌクレオシドに同様な立体配座を有する天延リボヌクレオシドで見出される機能基の化学反応性および立体的位置決めを保持している。それゆえに、オリゴヌクレオチドに組み込まれるときに、結果として生じる４’−チオＲＮＡは、安定性の期待された増加を有する天然ＲＮＡに類似した立体配座を有する。
【００５７】
ＮＭＲ実験は、未修飾リボヌクレオシドに見られるような核酸塩基の優性抗立体配座を示していた。重要なことに、４’−チオヌクレオシドの核酸塩基のｐＫａ値は変化しない。これは、未変性ＲＮＡで見つけられる期待されるハイブリダイゼーション特性の保持に起因する。従って、４’−チオヌクレオシドは、ＲＮＡに連結した未変性リン酸ジエステルと比較して、拡張ヌクレアーゼを有する比較可能な雑種形成およびＴｍと安定性がＲＮＡを連結した効果があると思われる。本発明のリン酸ジエステル４’−チオヌクレオシド修飾オリゴマー化合物は、タンパク質結合、改変組織−分布、およびｐＫ特性の強化が予想される。
【００５８】
本発明の４’−チオヌクレオシドは、化学式Ｉの化合物であり、ここにおいて、Ｘは、ハロガリル（ｈａｌｏｇａｌｌｙｌ）、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、−ＣＨ３、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、或いはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され、各々のＲｍおよびＲｎは、独立して、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。
【００５９】
２つの鎖を有するオリゴマー化合物および組成物は、少なくとも一つの修飾ヌクレオシドを有し、ここにおいて、Ｘは、ハロゲン（特にフルオロ）、アルキル（特にメチル）、アルケニル（特にアリル）、アミノ、置換アミノ、アジド、アルコキシ（特に−Ｏ−メチル）、またはアルコキシ（特に−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３などの置換アルコキシ）から選択されるものである。
【００６０】
他の適切なＸ置換基は、アミノオキシ、置換アミノオキシ、−Ｏ−アセトアミド、置換Ｏ−アセトアミド（−Ｏ−ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｍＲｎ）、アミノエチロキシエトキシ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｏｘｙｅｔｈｏｘｙ）（−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＲｍＲｎ）、置換アミノエチロキシエトキシ（−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＮＲｍＲｎ）である。
【００６１】
他の適切なＸ置換基は、フルオロ、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）ｍａ−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、或いはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され：
各々のＲｍおよびＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルであり、そこにおいて、前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニール、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ、および酸アミドまたはエステルであるアシルから選択されるものであり；そして、ｍａは１から約１０まである。
【００６２】
本発明は、１，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトールの調合のための新しい方法も開示し、この方法は、
ジエチル−Ｌ−酒石酸塩を適切な溶解剤のＴｉ（ＩＶ）イソプロポキシドの水溶液に添加し、その後適切な溶解剤の適切なパーオキシドを添加することによって、酸化混合物を調合する工程と；
１，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトールを形成するために、前記酸化している混合物を適切な溶媒の１，４−アンヒドロ−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−Ｄ−リビトールと処理する工程とを有する。
【００６３】
リボヌクレオチド、および取り入れられる少なくとも一つのリボヌクレオシドとこれらの２つの極度間に属する全ての可能な構造とを有するオリゴマー化合物の調合は、本発明に取り込まれている。対応するオリゴマー化合物は、二本鎖（重複）オリゴマー化合物を形成するために相補的な部位を有するオリゴリボヌクレオチドを含む更なるオリゴマー化合物とハイブリッド形成することができる。そのような二本鎖オリゴヌクレオチド部位は、従来技術において、標的発現を調節し、翻訳、さらにはアンチセンス・メカニズムを経たＲＮＡプロセシングを調節することが示された。さらに、前記二本鎖部位は、化学修飾さらされてもよい（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６〜８１１；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９５，８５４、Ｔｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００１，２６３，１０３〜１１２、Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，４３０〜４３１、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２〜１５５０７、Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９９，１３，３１９１〜３１９７、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４〜４９８、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００１，１５，１８８〜２００）。例えば、そのような二本鎖部位は、標的への二本鎖のアンチセンス鎖の古典的なハイブリダイゼーションによって、標的を抑制し、それによって標的の酵素的分解のトリガーを引くことが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４〜６９７）。
【００６４】
本発明のオリゴマー化合物を調合する方法は、創薬および標的確証の領域でも適用されることができる。本発明は、タンパク質および病状、表現型、或いは状態の間に存在する関係を解明する創薬活動において、本明細書で同定されるオリゴマー化合物および標的の使用を含む。これらの方法は、サンプル、組織、細胞または生物を本発明のオリゴマー化合物と接触させる工程と、処理後一定時間で標的および／または関連した表現型或いは化学終末点の核酸またはタンパク質レベルを測定する工程と、任意に非処理されたサンプル或いは本発明のオリゴマー化合物で処理されたサンプルとの計測値を比較する工程とを有する、標的ペプチドを検出する或いは調節する工程を含む。これらの方法はまた、標的確証の過程での未知の遺伝子の機能を決定する、または特定の病気、状態、或いは表現型の治療或いは予防のための標的として特定の遺伝子産物の妥当性を決定するための他の実験と平行して、または組合わせて実行され得る。
【００６５】
ＲＮＡｉ活性に対するヌクレオシド修飾の効果は、既存の文献に従って評価される（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００１），４１１，４９４〜４９８、Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００１），１０７，４１５〜４１６、及びＢａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０００），１０１，２３５〜２３８）。
【００６６】
定義
一般化学
本発明を記載するために用いられる様々な用語の定義は、以下に説明されている。それらが個別にあるいはより大きい群の一部として特定な例において制限されていない限り、この明細書および請求項の全体にわたって使われるように、これらの定義は用語に適用される。特に定義されていない、記載されている全ての用語は、関連分野の当業者が前記用語に付けた意味と一致するものとする。
【００６７】
本願明細書において使われたように、「Ｃ１−Ｃ１２アルキル」という用語は、１〜３、１〜１２、または１〜６の炭素原子をそれぞれ含む、飽和、直鎖−または分枝鎖炭化水素ラジカルを意味する。Ｃ１−Ｃ１２アルキルラジカルの例は、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシルラジカルを含むが、これに限定されるものではない。
【００６８】
「脂肪族基」は、炭素原子、水素原子、ハロゲン原子、酸素、窒素、イオウまたは他の原子のいかなる組み合わせも含むことができ、任意に不飽和（例えば、二重および／または三重結合）の１若しくはそれ以上の単位を含む、非環式非芳香部位である。脂肪族基は、直鎖状または分岐状であり、好ましくは、約１〜約２４の炭素原子、より好ましくは約１〜約１２の炭素原子を含む。脂肪族炭化水素基に加えて、脂肪族基は、例えばポリアルキレングリコール、ポリアミンおよびポリイミンなどのポリアルコキシアルキルを含む。そのような脂肪族基は、更に置換されることができる。
【００６９】
本発明の適切な置換基は、これに限定されるものではないが、?Ｆ、?Ｃｌ、?Ｂｒ、?Ｉ、?ＯＨ、保護ヒドロキシル、脂肪族エーテル、芳香族エーテル、オキソ、アジド、??Ｃ１−Ｃ１２−、?ＣＮ、任意にハロゲンで置換された?Ｃ１−Ｃ１２−アルキル（例えば、ペルハロアルキル）、ハロゲンで任意に置換されたＣ２−Ｃ１２−アルケニル、ハロゲンで任意に置換された?Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨ２、保護アミド、?ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨ−アリル、?ＮＨ−ヘテロアリル、?ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、?ジアルキルアミノ、?ジアリルアミノ、?ジヘテロアリルアミノ、?Ｏ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?Ｏ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?Ｏ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?Ｏ−アリル、?Ｏ−ヘテロアリル、?Ｏ−ヘテロシクロアルキル、?Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?Ｃ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?Ｃ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?Ｃ（Ｏ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?Ｃ（Ｏ）−アリル、?Ｃ（Ｏ）−ヘテロアリル、?Ｃ（Ｏ）−ヘテロシクロアルキル、?ＣＯＮＨ２、?ＣＯＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＣＯＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＣＯＮＨ−アリル、?ＣＯＮＨ−ヘテロアリル、?ＣＯＮＨ−ヘテロシクロアルキル、?ＣＯ２−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＣＯ２−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＣＯ２−アリル、?ＣＯ２−ヘテロアリル、?ＣＯ２−ヘテロシクロアルキル、???ＣＯ２−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＯＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＯＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＯＣＯ２−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＯＣＯ２−アリル、?ＯＣＯ２−ヘテロアリル、?ＯＣＯ２−ヘテロシクロアルキル、?ＯＣＯＮＨ２、−ＯＣＯＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＯＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＯＣＯＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＯＣＯＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＯＣＯＮＨ−アリル、?ＯＣＯＮＨ−ヘテロアリル、?ＯＣＯＮＨ−ヘテロシクロアルキル、?ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨＣ（Ｏ）−アリル、?ＮＨＣ（Ｏ）−ヘテロアリル、?ＮＨＣ（Ｏ）−ヘテロシクロアルキル、?ＮＨＣＯ２−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨＣＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨＣＯ２−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨＣＯ２−アリル、?ＮＨＣＯ２−ヘテロアリル、?ＮＨＣＯ２−ヘテロシクロアルキル、?ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−アリル、?ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−ヘテロアリル、?ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ２、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−アリル、?ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−ヘテロアリル、?ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、?ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−アリル、?ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロアリル、?ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨＣ（ＮＨ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨＣ（ＮＨ）−アリル、?ＮＨＣ（ＮＨ）−ヘテロアリル、?ＮＨＣ（ＮＨ）−ヘテロシクロアルキル、?Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−アリル、?Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロアリル、?Ｃ（ＮＨ）ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、?Ｓ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?Ｓ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?Ｓ（Ｏ）−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?Ｓ（Ｏ）−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?Ｓ（Ｏ）−アリル、?Ｓ（Ｏ）−ヘテロアリル、?Ｓ（Ｏ）−ヘテロシクロアルキル?ＳＯ２ＮＨ２、?ＳＯ２ＮＨ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＳＯ２ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＳＯ２ＮＨ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＳＯ２ＮＨ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＳＯ２ＮＨ−アリル、?ＳＯ２ＮＨ−ヘテロアリル、?ＳＯ２ＮＨ−ヘテロシクロアルキル、?ＮＨＳＯ２−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?ＮＨＳＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?ＮＨＳＯ２−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?ＮＨＳＯ２−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?ＮＨＳＯ２−アリル、?ＮＨＳＯ２−ヘテロアリル、?ＮＨＳＯ２−ヘテロシクロアルキル、?ＣＨ２ＮＨ２、?ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３、?アリル、?アリルアルキル、?ヘテロアリル、?ヘテロアリルアルキル、?ヘテロシクロアルキル、  ?Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、ポリアルコキシアルキル、ポリアルコキシ、?メトキシメトキシ、?メトキシエトキシ、?ＳＨ、?Ｓ−Ｃ１−Ｃ１２−アルキル、?Ｓ−Ｃ２−Ｃ１２−アルケニル、?Ｓ−Ｃ２−Ｃ１２−アルキニル、?Ｓ−Ｃ３−Ｃ１２−シクロアルキル、?Ｓ−アリル、?Ｓ−ヘテロアリル、?Ｓ−ヘテロシクロアルキル、或いはメチルチオメチルを含む。アリル、ヘテロアリル、アルキル、及びそれらの同等物はさらに置換され得ることは理解されるであろう。
【００７０】
本明細書において使われたように、「Ｃ２−Ｃ１２アルケニル」または「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」という用語は、単一の水素原子の除去による少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を有する６つの２〜１２、或いは２〜６の炭素原子を含む炭化水素部位から誘導された一価基を示す。アルケニル基は、例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、アルカジエンなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００７１】
本明細書において使われたように、「置換アルケニル」という用語は、以前に定義されたような「Ｃ２−Ｃ１２アルケニル」または「Ｃ２−Ｃ６アルケニル」基が、１、２、３若しくはそれ以上の置換基によって置換されたことを言及している。
【００７２】
本明細書において使われたように、「Ｃ２−Ｃ１２アルキニル」または「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」という用語は、単一の水素原子の除去による少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を有する２〜１２、或いは２〜６の炭素原子を含む炭化水素部位から誘導された一価基を示す。代表的なアルキニル基は、例えばエチニル、１−プロピニル、１−ブチニルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００７３】
本明細書において使われたように、「置換アルキニル」という用語は、以前に定義されたような「Ｃ２−Ｃ１２アルキニル」または「Ｃ２−Ｃ６アルキニル」が、１、２、３若しくはそれ以上の置換基によって置換されたことを意味している。
【００７４】
本明細書において使われたように、「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して親分子部位へ結合された、以前に定義されたような脂肪族基に関連する。アルコキシの例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシおよびｎ−へコキシ（ｈｅｘｏｘｙ）を含むが、これに限定されるものではない。
【００７５】
本明細書において使われたように、「置換アルコキシ」という用語は、１、２、３若しくはそれ以上の置換基で置換された、以前に定義されたアルコキシ基である。
【００７６】
本明細書において使われたように、「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択された原子を意味する。
【００７７】
本明細書において用いられたように、「アリール」または「芳香族」という用語は、これに限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈｙｌ）、インダニル、イデニル（ｉｄｅｎｙｌ）などを含む１或いは２の芳香環を有する単−または二環式環状炭素系を意味する。
【００７８】
本明細書において用いられたように、「置換アリール」または「置換芳香族」という用語は、１、２、３若しくはそれ以上の置換基によって置換されたアリール若しくは芳香族基を意味する。
【００７９】
本明細書において用いられたように、「アリールアルキル」という用語は、Ｃ１−Ｃ３アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルキル残基を介して親化合物に結合されたアリール基を意味する。例としては、ベンジル、フェネチルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００８０】
本明細書において用いられたように、「置換アリールアルキル」という用語は、１、２、３若しくはそれ以上の置換基によって置換された、以前に定義されたようなアリールアルキル基を意味する。
【００８１】
本明細書において用いられたように、「ヘテロアリール」または「芳香族複素」という用語は、少なくとも１つの環原子がＳ、ＯおよびＮから選択され、０、１、若しくは２環原子は、Ｓ、ＯおよびＮから独立して選択される付加ヘテロ原子であるものであり、残りの環は炭素であって、環の範囲内で含まれるいかなるＮまたはＳは任意に酸化されるものである、５〜１０の環原子を有する単環、二環、または三環芳香族ラジカル或いは環を意味している。そして、残留する環原子は炭素である。そこにおいて、ことができる。ヘテロアリールは、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル（ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）、ベンジミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノキサリニルなどを含むが、これに限定されるものではない。芳香族複素環は、炭素またはヘテロ原子を介して化学構造に結合されてもよい。
【００８２】
本明細書において用いられたように、「置換ヘテロアリール」または「置換複素環式芳香族」という用語は、１、２、３またはそれ以上の置換基によって置換されるた、ヘテロアリールまたは複素環式芳香族を意味する。
【００８３】
本明細書において用いられたように、「脂環式」という用語は、単一の水素原子の去による、単環或いは二環式飽和環状炭素化合物に由来する一価基を示す。例としては、これに限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチル、およびビシクロ［２．２．２］オクチルを含む。
【００８４】
本明細書において用いられたように、「置換脂環式」という用語は、１、２、３若しくはそれ以上の置換基によって置換された脂環式基を意味する。
【００８５】
本明細書において用いられたように、「複素環式」という用語は、３或いはそれ以上の環原子、若しくは二環或いは三環基融合系を有する非芳香族環を意味し、ここにおいて（ｉ）各環は、酸素、硫黄、及び窒素から独立して選択された１〜３複素原子を含み、（ｉｉ）各５員環は、０〜１の二重結合を有し、各６員環は、０〜２の二重結合を有し、（ｉｉｉ）前記窒素及び硫黄複素原子は、任意に酸化されており、（ｉｖ）前記窒素複素原子は、任意にベンゼン環と融合されており、（ｖ）残りの環原子は、オキソ置換されてもよい炭素原子である。代表的な複素環式アルキル基は、これに限定されるものではないが、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、およびテトラヒドロフリルを含む。
【００８６】
本明細書において用いられたように、「置換複素環式」という用語は、１、２、３若しくはそれ以上の置換基によって置換された、以前に定義されたような複素環基を意味する。
【００８７】
本明細書において用いられたように、「ヘテロアリールアルキル」という用語は、Ｃ１−Ｃ３アルキルまたはＣ１−Ｃ６アルキル残基を介して親化合物に結合したヘテロアリール基を意味している。例としては、ピリジニルメチル、ピリジニルメチルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００８８】
本明細書において用いられたように、「置換へテルアリールアルキル」という用語は、１、２、３若しくはそれ以上の置換基の独立置換によって置換された、以前に定義されたようなヘテロアリールアルキル基を意味する。
【００８９】
「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）という構造を有する基を意味する。
【００９０】
「ジアルキルアミノ」という用語は、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、及び環状アミンの構造を有する基を意味する。ジアルキルアミノの例としては、これに限定されるものではないが、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ、ピペリジノ、モルフォリノなどである。
【００９１】
「アルコキシカルボニル」という用語は、例えばカルボメトキシル、エトキシカルボニルなどのカルボニル基を介して親分子部位に結合される、エステル基（すなわち、アルコキシ基）を表す。
【００９２】
本明細書において用いられたように、「カルボキサルデヒド（ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）」という用語は、化学式−ＣＨＯの基を意味する。
【００９３】
本明細書において用いられたように、「カルボキシ」という用語は、化学式−ＣＯＯＨの基を意味する。
【００９４】
本明細書において用いられたように、「カルボキサミド」という用語は、化学式−Ｃ（Ｏ）ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、または、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、Ｎ（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１２アルキル）などを意味している。    
本明細書において用いられたように、「保護基」という用語は、合成手順の間、望んでいない反応に対してヒドロキシル或いはアミノ基を保護するための、従来技術において周知である不安定な化学部位を意味する。前記合成の手順の後、本願明細書において記載されたブロッキング基は、選択的に除去されることができる。当業者には既知であるブロッキング基は、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されている。ヒドロキシルブロッキング基の例としては、これに限定されるものではないが、ベンジルオキシカルボニル、４−ニトロベンジロキシカルボニル、４−ブロモベンジロキシカルボニル、４−メトキシベンジロキシカルボニル、カルボメトキシル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２−フリロキシカルボニル（ｆｕｒｆｕｒｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、アリルオキシカルボニル、アセチル、ホルミル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル、メチル、ｔ−ブチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、３−メチル−３−ブテニル、アリル、ベンジル、パラ−メトキシベンジルジフェニルメチル、トリフェニルメチル（トリチル）、４，４’−ジメトキシトリゲニルメチル（ＤＭＴ）、置換或いは非置換ピキシル、テトラヒドロフリル、メトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、メタンスルフォニル、パラ−トルエンスルホニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリルなどを含む。本発明のための好適なヒドロキシルブロッキング基は、ＤＭＴおよび置換或いは非置換ピキシルである。
【００９５】
本分野で既知であるアミノブロッキング基は、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に一般的に記載されている。アミノブロッキング基の例としては、ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００９６】
本明細書において用いられたように、「保護水酸基」という用語は、上で定義されたように、保護基によって保護されている水酸基を意味する。
【００９７】
「アシル」という用語は、これに限定されるものではないが、カルボン酸、カルバミン酸、炭酸、スルホン酸、および亜リン酸を含む、置換或いは非置換酸から誘導される残基を含む。例としては、脂肪族化合物カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族化合物スルホニル、芳香薬スルフィニル、脂肪族化合物スルフィニル、芳香薬リン酸塩および脂肪族化合物リン酸塩を含む。
【００９８】
本明細書において用いられたように、「非プロトン溶媒」という用語は、陽子（プロトン）活性に比較的非活性である、すなわち、プロトン供与体として作用しない溶媒を意味している。例としては、これに限定されるものではないが、炭化水素（例えば、ヘキサンおよびトルエン）、ハロゲン化炭化水素（例えば、塩化メチレン、塩化エチレン、クロロホルムなど）、複素環化合物（例えば、テトラヒドロフランおよびＮ−メチルピロリジノン）、及びエーテル（例えば、ジエチルエーテル、ビス−メトキシメチルエーテル）を含む。そのような化合物は、当業者にとって周知であり、例えば、試薬の溶解度、試薬の反応性、および好適な温度領域のような因子に依存して、個々の溶剤またはそれの混合物は特異的化合物および反応条件のために好ましいということは当業者にとって明らかである。たとえば、非プロトン溶媒の更なる説明は、有機化学教科書において、または例えば、以下の専門モノグラフなどにおいて見つけられることができる：  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、４ｔｈ  ｅｄ．、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ａ．  Ｒｉｄｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ、Ｖｏｌ．  ＩＩ、ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９８６。本発明の工程において有用な非プロトン溶媒は、これに限定されるものではないが、トルエン、アセトニトリル、ＤＭＦ、ＴＨＦ、ジオキサン、ＭＴＢＥ、ジエチルエーテル、ＮＭＰ、アセトン、炭化水素およびハロ脂肪族を含む。
【００９９】
本明細書において用いられたように、「プロトン性溶媒」という用語は、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔ−ブタノールなど）のような、陽子を提供する傾向がある溶媒を意味する。この種の溶剤は当業者にとって周知である、そして、試薬、試薬の反応性および、たとえば、好適な温度領域の溶解度のような因子によって、個体溶剤またはそれの混合物が特性化合物および反応条件のために好まれることができることは当業者にとって明らかである。たとえば、プロトン供与溶媒の更なる議論は、有機化学教科書においてまたは専門モノグラフにおいて見つけられることができる：Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｏｌｖｅｎｔｓ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、４ｔｈ  ｅｄ．、ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ａ．  Ｒｉｄｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｖｏｌ．  ＩＩ、ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９８６。
【０１００】
本明細書で記載されている化合物は、１若しくはそれ以上の不斉中心を含んでおり、鏡像異性体、ジアステレオマー、およびアミノ酸の（Ｒ）−或いは（Ｓ）−として、若しくは（Ｄ）−或いは（Ｌ）−としての絶体立体化学の観点から定義することができる他の立体異性体を生じる。本発明は、全てのそのような可能な異性体、さらにはそれらのラセミ体および光学上純粋な形態を含むものある。光学異性体は、上記した手順によって、またはラセミ混合物を分割することによって、それらのそれぞれの光学活性前駆体から調合されることができる。前記分割は、分割剤の存在下で、クロマトグラフィによってまたは繰り返し結晶化によって、若しくは当業者にとって既知であるこれらの技術の組み合わせによって実行されることができる。分割に関する更なる詳細は、Ｊａｃｑｕｅｓ、ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，１９８１）に記載されている。本明細書に記載されている化合物がオレフィン二重結合、他の不飽和または他の幾何非対称の中心を含むときに、特に指定されていなければ、前記化合物は、ＥおよびＺ幾何異性体、若しくはシス−およびトランス−異性体を含むことを意図している。同様に、全ての互変異性型も含まれることを意図している。ここに記載されているいかなる炭素−炭素二重結合の構造は、便宜だけのために選択されたものであり、文章でそう記載しない限り、特定の構造を示すことを意図するものではなく；従って、任意に本明細書ではトランスとして記載されている炭素−炭素二重結合または炭素−ヘテロ原子二重結合は、シス、トランス、またはいかなる比率の２つの混合物であってもよい。
【０１０１】
遺伝子調節
本明細書において用いられたように、「標的核酸」または「核酸標的という用語は、これに限定するものではないが、ＤＮＡ、ＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ、またはそれらの一部分を含む）、及びそのようなＲＮＡから派生されたｃＤＮＡを含む、標的とされることができるいかなる核酸も含むように、便宜のために使われる。本発明の１実施形態において、前記標的核酸は、メッセンジャーＲＮＡである。もう一つの実施形態では、前記標的メッセンジャーＲＮＡの分解は、本発明のオリゴマー化合物で形成されたＲＩＳＣ複合体によって促進される。もう一つの実施形態では、前記標的メッセンジャーＲＮＡの分解は、ＲＮａｓｅＨのようなヌクレアーゼによって促進される。
【０１０２】
本発明のオリゴマー化合物とその標的核酸とのハイブリダイズ形成は、「アンチセンス」と一般に呼ばれる。従って、本発明のいくつかの実施形態の実行における１つのメカニズムは、本願明細書において「アンチセンス阻害」と言及される。そのようなアンチセンス阻害は、少なくとも１つの鎖または断片が切断される、分解される、または手術不能になるように、オリゴヌクレオチド鎖或いは断片の水素結合の水素結合に基づいたハイブリダイゼーションに一般的には基づく。この点では、そのようなアンチセンス阻害にとって、特異的核酸分子およびそれらの機能を標的とすることは、現在適切である。
【０１０３】
阻害されるＤＮＡの機能は、複製および転写を含むことができる。複製および転写は、例えば、内因性の細胞性鋳型、ベクター、プラスミドコンストラクトまたは別から行われえる。阻害されるＲＮＡの機能は、例えば、タンパク質翻訳の部位に対するＲＮＡの転座、ＲＮＡ合成の部位から遠く離れている細胞内の部位に対するＲＮＡの転座、前記ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１若しくはそれ以上のＲＮＡ種を生じるＲＮＡスプライシング、およびＲＮＡに関連する或いは促進される、ＲＮＡを含む触媒活性または複合体形成を含むことができる。
【０１０４】
本発明の文脈において、「調節」及び「発現の調節」とは、遺伝子（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）をコード化している核酸分子の量またはレベルの増加（刺激）或いは減少（阻害）を意味する。阻害はしばしば、発現の調節の所望の形態であり、ｍＲＮＡはしばしば、所望の標的核酸である。
【０１０５】
本発明の化合物および方法は、研究、特徴決定、確証および低分子非翻訳ＲＮＡの調節にも役立つ。これらは、これに限定されるものではないが、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子  ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子一時性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、および小非翻訳ＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）、またはそれらの前駆体、或いはプロセシング後転写物、若しくは他の細胞性成分との会合物を含む。
【０１０６】
低分子非翻訳ＲＮＡは、植物、線虫および哺乳類を含む広範囲の生物におけるさまざまな発生的および調節的経路において機能することを示した。ミクロＲＮＡは、酵素切断によってより大きい前駆体からプロセシングされて、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する低分子非翻訳ＲＮＡである。一方、ｍｉＲＮＡｓに類似した前駆体からプロセシングされるｓｔＲＮＡｓは、発生上のタイミング調節に関与していると示された。他の非翻訳低分子ＲＮＡは、転写産物、翻訳、輸送および染色体組織化の細胞性スプライシング、さらには多様性などの現象に関係している。
【０１０７】
低分子非翻訳ＲＮＡ機能の修飾因子（モジュレーター）として、本発明の化合物は、細胞性機能、若しくはスプライシング、染色体パッケージング或いはメチル化の制御、発生上のタイミング現象の調節、特異的生物経路への運搬のタイミングに依存した標的ＲＮＡ発現レベルの増加或いは減少、及び翻訳或いは転写制御などのプロセスの制御及び操作における有用性を見出される。加えて、本発明の化合物は、特定の細胞性区画（例えば、細胞質、核、核小体、またはミトコンドリア）におけるそれらの効果を最適化するために修飾されることができる。
【０１０８】
本発明の化合物は更に、スクリーニングアッセイまたは装置において、さらにはＲＮＡプロセシングまたは代謝の調節性経路の構成成分を同定するために用いられ得る。
【０１０９】
オリゴマー化合物
本発明の文脈において、「オリゴマー化合物」という用語は、核酸分子の領域とハイブリダイズすることができるポリマー構造を意味する。この用語は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド擬態、及びこれらの組み合わせを含む。オリゴマー化合物は、日常的に直線状には調合されるが連結状には調合されない、若しくは環状に調合され分岐も含むものである。オリゴマー化合物は、例えば、二本鎖化合物を形成するようにハイブリダイズされた二本鎖などの二本鎖コンストラクトを含むことができる。前記二本鎖化合物は、結合或いは分離され得、末端上にオーバーハングを含むことができる。一般的に、オリゴマー化合物は、連結した単量体サブユニットのバックボーンを有し、この各連結した単量体サブユニットは、直接的に或いは間接的に複素環塩基部位に連結しているものである。オリゴマー化合物はさらに、複素環塩基部位に連結しておらず、その結果脱塩基部位を提供する単量体サブユニットも含む。単量体サブユニット、糖部位或いは代理部位に連結している結合、及び複素環塩基部位は、ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒｓ）、ギャップマー及びキメラを含む結果として生じるオリゴマー化合物独立して修飾され得る。
【０１１０】
本分野において既知であるように、ヌクレオシドは、塩基−糖鎖組合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常複素環塩基部位である。そのような複素環塩基の２つの最も共通したクラスは、プリンとピリミジンである。ヌクレオチドは、さらに、ヌクレオシドの糖部分に共有結合的に連結したリン酸基を含むヌクレオシドである。ペンタフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の２’、３’、或いは５’ヒドロキシル基と連結され得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、共有結合で隣接するヌクレオシドと別のヌクレオシドを連結し、直線ポリマー化合物を形成する。この直線ポリマー構造のそれぞれの末端は、ハイブリダイゼーションによって、或いは共有結合の形成によって、環状構造を形成するように連結され得るが、開環構造は一般的に望ましい。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基は、オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオシド結合を形成するものとして一般的に言及される。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常内部ヌクレオシド連結は、３’〜５’リン酸ジエステル結合である。
【０１１１】
本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、リボ核酸（ＲＮＡ）或いはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマー或いはポリマーを意味する。この用語は、天然由来の核酸塩基、糖、及び共有結合内部ヌクレオシド結合から成るオリゴヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド類似体」という用語は、オリゴヌクレオチドと同じ方法で機能する１若しくはそれ以上の非天然由来部分を有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのような非天然由来オリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞性取り込み、核酸標的への増強された親和性、及びヌクレアーゼの存在下における増加した安定性などの望ましい特性のため、しばしば天然由来形態よりも望ましい。
【０１１２】
本発明の文脈において、「オリゴヌクレオシド」という用語は、リン原子を持たない内部ヌクレオシド結合によって連結されたヌクレオシドの配列を意味する。このタイプの内部ヌクレオシド結合は、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合へテロ原子アルキル、混合へテロ原子シクロアルキル、１若しくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子、及び１若しくはそれ以上の短鎖複素環を含む。これらの内部ヌクレオシド結合は、これに限定されるものではないが、シロキサン、スルフィド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファミン酸、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホン酸、スルホンアミド、アミド、及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成成分部分を有する他のものを含む。
【０１１３】
上記のオリゴヌクレオシドの調合を教示している代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号及び第５，６７７，４３９号を含み、いくつかは本明細書と同一出願人によってなされたものであり、それぞれは、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
さらに本明細書において含まれるものは、アンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、及び標的核酸の少なくとも一部分にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物などのオリゴマー化合物である。そのようなものとして、これらのオリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、環状、或いはヘアピンオリゴマー化合物の形態で導入され、内部或いは末端バルジ或いはループなどの構造ヨウ素を含む。一度システムに導入されたら、本発明のオリゴマー化合物は、１若しくはそれ以上の酵素、或いは構造タンパク質の作用を誘発し、標的核酸の修飾に影響を及ぼす。
【０１１５】
そのような酵素の１つの限定されない例は、ＲＮＡｓｅ  Ｈであり、これはＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。「ＤＮＡ様」である
一本鎖アンチセンスオリゴマー化合物が、ＲＮＡｓｅ  Ｈを誘発することは、本分野においては既知である。従って、ＲＮＡｓｅ  Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の切断に起因し、それによって遺伝子発現のオリゴヌクレオチド仲介性阻害の効率を著しく増強する、同様な役割は、酵素のＲＮＡｓｅＩＩＩ及びリボヌクレアーゼＬファミリーなどの他のリボヌクレアーゼも想定される。
【０１１６】
アンチセンスオリゴマー化合物の１つの形態が一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、多くの種における二本鎖構造（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子）の導入は、遺伝子若しくはそれに関連する遺伝子産物の機能の強力で特異的なアンチセンス仲介性減少を誘導するように見られた。この現象は、植物及び動物の両方において生じ、ウイルス性防御及びトランスポゾンサイレンシングに進化的な関係を有していると考えられている。
【０１１７】
上述した修飾に加え、本発明のオリゴマー化合物のヌクレオシドは、これらの他の修飾単独或いは他のヌクレオシドとの組合わせで、上述した望ましい特性の１若しくはそれ以上を増強する限り、多くの他の修飾を有することができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドへ取り込まれたヌクレオチドに対して、これらのヌクレオチドは、天然由来糖或いは修飾糖に対応する糖部分を有することができる。代表的な修飾糖は、炭素環或いは非環式糖、それらの２’、３’、或いは４’位の１若しくはそれ以上において置換基を有する糖、及び糖の１若しくはそれ以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖を含む。置換された塩基部位及び／若しくは置換糖部位を有する本発明に適している付加的なヌクレオシドは、米国特許第３，６８７，８０８号及びＰＣＴ出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２３２３号に開示されている。
【０１１８】
ここで用いられたように、「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）」という用語は、「核酸塩基（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｂａｓｅ）或いはそれらの擬態」と同義で使用される。一般的に、核酸塩基は、オリゴヌクレオチドの塩基と水素結合できる１若しくはそれ以上の原子或いは原子の基を含む基礎構造である。
【０１１９】
ここで用いられたように、「非修飾」或いは「天然」核酸塩基は、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、及びピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、例えば、ここに定義されたように、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル及びアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピル、及びアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル、及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン、及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチル、及び他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、３−デアザグアニン及び３−デアザアデニン、普遍的塩基、疎水性塩基、乱交雑塩基、サイズ拡張塩基、及びフッ化塩基などの他の合成及び天然核酸塩基などの他の合成及び天然核酸塩基を含む。更なる修飾核酸塩基は、例えば、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロール［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オンなど）のＧ−クランプなどの三環系ピリミジンを含む。更なる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ８５８〜８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  &  Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されたもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ２８９〜３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に記載されたものを含む。
【０１２０】
修飾核酸塩基
修飾核酸塩基は、これに限定されるものではないが、ここに定義されたような、普遍的塩基、疎水性塩基、乱交雑塩基、サイズ拡張塩基、及びフッ化塩基を含む。これらの核酸塩基は好ましくは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加するのに有用なものである。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、及びＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンを含む）を含む。５−メチルシトシン置換基は、核酸二本鎖安定性を０．６〜１．２℃ほど増加するように示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６〜２７８）、現在好ましい塩基置換基であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、さらに好ましい。
【０１２１】
上述した修飾核酸塩基、さらには他の修飾核酸塩基の調合を教示している代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号、更には米国特許第４，８４５，２０５号；第５，１３０，３０２号；第５，１３４，０６６号；第５，１７５，２７３号；第５，３６７，０６６号；第５，４３２，２７２号；第５，４５７，１８７号；第５，４５９，２５５号；第５，４８４，９０８号；第５，５０２，１７７号；第５，５２５，７１１号；第５，５５２，５４０号；第５，５８７，４６９号；第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１；第５，６１４，６１７号；第５，６４５，９８５号；第５，８３０，６５３号；第５，７６３，５８８号；第６，００５，０９６号；及び第５，６８１，９４１号を含み、いくつかは本明細書と同一出願人によるものであり、それぞれはこの参照によって本明細書に組み込まれる。米国特許第５，７５０，６９２号は本明細書と同一出願人によるものであり、この参照によって本明細書に組み込まれるものである。
【０１２２】
ここで用いられたように、「普遍的塩基」という用語は、二本鎖の第２配列における対応位置で天然由来塩基、すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、或いはＵと対になることができる第１配列におけるモノマーを意味しており、その二本鎖では以下の：（１）２つの間では重要な対はない、或いは（２）それらの間の対は、前記二本鎖の有意な不安定化なしで、各天然由来塩基によって非判別性を生じる、という１若しくはそれ以上は真実である。
【０１２３】
普遍的塩基の例としては、Ｓｕｒｖｅｙ  ａｎｄ  ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｓ．Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，２９，１２，２４３７〜２４４７を参照のこと。
【０１２４】
【化１５】
2007514643.tif 000007
【０１２５】
ここで用いられたように、「疎水性塩基」という用語は、二本鎖の第２配列における対応位置で天然由来塩基、すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、或いはＵと対になることができる第１配列におけるモノマーを意味しており、その二本鎖では以下の：（１）疎水性塩基は、天然由来ヌクレオシドの１つの非極性近接サイズ及び形態模倣（同配体）として作用する、或いは（２）疎水性塩基は、ワトソン−クリック対端部上の全ての水素結合機能性を欠損している、という１若しくはそれ以上は真実である。
【０１２６】
アデニン同配体の例としては、Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｆｐｇ  ａｎｄ  ＭｕｔＹ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｐｏｌａｒ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ．（Ｆｒａｎｃｉｓ，ＡＷ，Ｈｅｌｑｕｉｓｔ，ＳＡ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ｄａｖｉｄ，ＳＳ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００３，１２５，１６２３５〜１６２４２）若しくはＳｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ  ｎｏｎｐｏｌａｒ  ｉｓｏｓｔｅｒｅ  ｆｏｒ  ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ．（Ｇｕｃｋｉａｎ，ＫＭ，Ｍｏｒａｌｅｓ，ＪＣ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，９６５２〜９６５６５．）を参照のこと。
【０１２７】
【化１６】
2007514643.tif 000008
【０１２８】
シトシン同配体の例としては、Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ／ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｎｏｎｐｏｌａｒ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｉｓｏｓｔｒｅｒｅｓ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ＨＩＶ  ｔｙｐｅ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．（Ｒａｕｓｃｈ，ＪＷ，Ｑｕ，Ｊ，Ｙｉ−Ｂｒｕｎｏｚｚｉ  ＨＹ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ，ＬｅＧｒｉｃｅ，ＳＦＪ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００３，１００，１１２７９〜１１２８４．）を参照のこと。
【０１２９】
【化１７】
2007514643.tif 000009
【０１３０】
グアノシン同配体の例としては、Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｎｏｎｐｏｌａｒ  ｉｓｏｓｔｅｒｅ  ｏｆ  ｄｏｅｏｘｇｕａｎｏｓｉｎｅ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｓｔａｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒｉｎｇ．（Ｏ’Ｎｅｉｌ，ＢＭ，Ｒａｔｔｏ，ＪＥ，Ｇｏｏｄ，ＫＬ，Ｔａｈｍａｓｓｅｂｉ，ＤＣ，Ｈｅｌｑｕｉｓｔ，ＳＡ，Ｍｏｒａｌｅｓ，ＪＣ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００２，６７，５８６９〜５８７５．）を参照のこと。
【０１３１】
【化１８】
2007514643.tif 000010
【０１３２】
チミジン同配体の例としては、Ａ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｓｈａｐｅ  ａｎａｌｏｇ  ｌａｃｋｉｎｇ  Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ｐａｉｒｉｎｇ  ａｂｉｌｉｔｙ  ｉｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ．（Ｍｏｒａｎ，Ｓ，Ｒｅｎ，ＲＸ−Ｆ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９７，９４，１０５０６〜１０５１１）或いはＤｉｆｌｕｏｒｏｔｏｌｕｅｎｅ，ａ  ｎｏｎｐｏｌａｒ  ｉｓｏｓｔｅｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ，ｃｏｄｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，２０５６〜２０５７．）を参照のこと。
【０１３３】
【化１９】
2007514643.tif 000011
【０１３４】
ここで用いられたように、「乱交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基」という用語は、二本鎖の第２配列における対応位置で天然由来塩基、すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、或いはＵと対になることができる第１配列におけるモノマーを意味しており、そこにおいて前記乱交雑塩基は、天然由来塩基、すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、或いはＵの１以上と非判別的に対をなすことができる、例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｎｅ  ｂａｓｅｓ．（Ｈｉｌｌ，Ｆ．；Ｌｏａｋｅｓ，Ｄ．；Ｂｒｏｗｎ，Ｄ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９８，９５，４２５８〜４２６３．）を参照のこと。
【０１３５】
【化２０】
2007514643.tif 000012
【０１３６】
ここで用いられたように、「サイズ拡張塩基」という用語は、サイズとしてより大きく、それらのワトソン−クリック対形成能力は維持している、天然由来核酸塩基の類似体を意味している。例えば、Ａ  ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  ｐａｉｒｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｈｅｌｉｘ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｓｉｚｅ．（Ｌｉｕ，Ｂ，Ｇａｏ，Ｊ，Ｌｙｎｃｈ，ＳＲ，Ｓａｉｔｏ，Ｄ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｌ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，３０２，８６８〜８７１）及びＴｏｗａｒｄ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ：ｓｉｚｅ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｏｆ  ｄｅｏｘｙａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ．（Ｌｉｕ，Ｈ，Ｇｏａ，Ｊ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｙ，Ｓａｉｔｏ，Ｄ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１１０２〜１１０９．）を参照のこと。
【０１３７】
【化２１】
2007514643.tif 000013
【０１３８】
ここで用いられたように、「フッ素化核酸塩基」という用語は、核酸塩基或いは核酸塩基類似体を意味し、そこにおいて芳香環置換基の１若しくはそれ以上がフッ素原子であるものである。前記環置換基の全てがフッ素原子であることも可能である。フッ素化核酸塩基の例としては、ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｂａｓｅｓ  ａｓ  ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ｓｔａｃｋｉｎｇ．（Ｌａｉ，ＪＳ，ＱＵ，Ｊ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，２００３，４２，５９７３〜５９７７）、及びＳｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐａｉｒｎｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｂａｓｅｓ，（Ｌａｉ，ＪＳ，Ｋｏｏｌ，ＥＴ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００４，１２６，３０４０〜３０４１）、及びＴｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ，（Ｋｌｏｐｐｆｅｒ，ＡＥ，Ｅｎｇｅｌｓ，ＪＷ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  &  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００３，２２，１３４７〜１３５０）、及びＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２’ａｍｉｎｏアルキル−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｆｌｕｏｒｉｎａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ，（Ｋｌｏｐｆｆｅｒ，ＡＥ，Ｅｎｇｅｌｓ，ＪＷ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．，２００３，５，７０７〜７１６）を参照のこと。
【０１３９】
【化２２】
2007514643.tif 000014
【０１４０】
本発明のいくつかの実施形態において、オリゴマー化合物、例えばオリゴヌクレオチドは、１若しくはそれ以上の複素環塩基部位の代わりに多環式複素環化合物を有するように調合される。多くの三環系複素環化合物は、以前報告されていた。これらの化合物は、標的鎖に対する修飾鎖の結合特性を増強するために、アンチセンス適用において日常的に使用される。最も研究された修飾は、グアノシンを標的化することであり、それ故それらはＧ−クランプ或いはシチジン類似体と呼ばれる。多くのこれらの多環式複素環化合物は、以下の化学式を有する。
【０１４１】
【化２３】
2007514643.tif 000015
【０１４２】
第２のオリゴヌクレオチドにおいてグアノシンと３つの水素結合を作る代表的なシトシン類似体は、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）［Ｋｕｒｃｈａｖｏｖ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，１８３７〜１８４６］、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｓ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）［Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，３８７３〜３８７４］及び６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｆ）［Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．，Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８，３９，８３８５〜８３８８］を含む。
【０１４３】
オリゴヌクレオチドに取り込まれたこれらの塩基修飾は、相補的グアニンとハイブリダイズするようであり、後者はさらにアデニンともハイブリダイズし、拡張スタッキング相互作用によってヘリカル温度安定性を増強するようである（さらに、２００２年５月２４日に出願された、題名「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ」の米国特許出願（出願番号第１０／１５５，９２０号）、及び２００２年５月２４日に出願された、題名「Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」の米国特許出願（出願番号第１０／０１３，２９５号）を参照のこと。これらは本出願と同一出願人であり、それらの全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１４４】
更なる経リックス−安定特性は、強固な１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン足場へ結合したシトシン類似体／置換基がアミノエトキシ部位を有する場合に観察された（（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１＝−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｒ１２−１４＝Ｈ）［Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８５３１〜８５３２］）。結合研究は、単一取り込みは、単一修飾に対して最も高い既知親和性増強である５−メチルシトシン（ｄＣ５ｍｅ）と相対的に、１８゜までのΔＴｍを有する相補的標的ＤＮＡ或いはＲＮＡに対するモデルオリゴヌクレオチドの結合親和性を増強することができる、一方、ヘリカル安定性が増すことは、オリゴヌクレオチドの特異性を妥協するものではない。Ｔｍデータは、ｄＣ５ｍｅと比較して、完璧なマッチとミスマッチ配列との間のより優れた判別を示していた。テザーアミノ基は付加的水素結合ドナーとして働き、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎフェース、すなわち、相補的グアニン４つのＯ６と相互作用し、それによって水素結合を形成すると示唆された。これは、Ｇ−クランプの増加された親和性は、拡張塩基スタッキング及び付加的な特異的水素結合の組み合わせによって仲介される。
【０１４５】
本発明に適した更なる三環系複素環化合物及びそれらを使用する方法は、２０００年５月２２日に出願された米国特許番号第６，０２８，１８３号、及び１９９９年１２月２８日に出願された米国特許番号第６，００７，９９２号において開示されており、その両方の内容は、本出願と同一出願人によるものであり、それらの全体はこの参照によって本明細書に組み込まれている。そのような化合物は、以下の化学式を有するものを含む。
【０１４６】
【化２４】
2007514643.tif 000016
【０１４７】
ここにおいて、Ｒ１１は、（ＣＨ３）２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−；Ｐｈ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−；Ｈ２Ｎ−；フルオレニル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−；フタルイミジル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−；Ｐｈ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｏ−；Ｐｈ−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−Ｏ−；（ＣＨ３）２Ｎ−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｏ−；フルオレニル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）２−Ｏ−；フルオレニル−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｈ）−（ＣＨ２）３−Ｏ−；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−；Ｎ３−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−；Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）２−Ｏ−、及びＮＨ２Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ−を含む。
【０１４８】
さらに、以下の化学式の三環系複素環化合物も開示される。
【０１４９】
【化２５】
2007514643.tif 000017
【０１５０】
ここにおいて、Ｒ１０ａは、Ｏ、Ｓ、或いはＮ−ＣＨ３であり、Ｒ１１ａは、Ａ（Ｚ）ｘ１であり、ここにおいてＡはスペーサーであり、Ｚは独立して、検出可能な標識と任意に結合される標識結合基であるが、Ｒ１１ａはアミンで、保護アミン、窒素、或いはシアノではなく、Ｒｂは独立して、−ＣＨ＝、−Ｎ＝、−Ｃ（Ｃ１−８アルキル）＝、或いは−Ｃ（ハロゲン）＝であるが、隣接するＲｂは両方とも−Ｎ＝ではない、若しくは２つの隣接するＲｂは、以下の構造を有するように環を形成するように一緒に取られるものであり：
【０１５１】
【化２６】
2007514643.tif 000018
【０１５２】
ここにおいて、Ｒｃは独立して、−ＣＨ＝、−Ｎ＝、−Ｃ（Ｃ１−８のアルキル）＝或いは−Ｃ（ハロゲン）＝であるが、隣接するＲｂは両方とも−Ｎ＝ではないものである。
【０１５３】
それらの配列特異性を共に有するフェノキサジン誘導体の増強された結合親和性は、それらを、より協力なアンチセンスベース薬剤を開発するために価値のある核酸塩基類似体にした。実は、有望なデータは、フェノキサジン置換基を含むヘプタヌクレオチドはＲＮＡａｓｅＨを活性化し、細胞性取り込みを増強し、増加したアンチセンス活性を示すことができると示したｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から導かれた［Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，８５３１〜８５３２］。活性化増強はさらに、Ｇ−クランプの場合でも発見され、一回の置換は、２０ｍｅｒの２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作用強度の有意な改善を示された［Ｆｌａｎａｇａｎ，Ｗ．Ｍ．；Ｗｏｌｆ，Ｊ．Ｊ．；Ｏｌｓｏｎ，Ｐ．；Ｇｒａｎｔ，Ｄ．；Ｌｉｎ，Ｋ．−Ｙ．；Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．Ｗ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９９，９６，３５１３〜３５１８］。それにも関わらず、オリゴヌクレオチド設計を最適化するために、及びこれらの複素環修飾の生物学的活性に対する影響をより良く知るために、オリゴマーのヌクレアーゼ安定化に対するそれらの影響を評価することは重要である。
【０１５４】
本発明に適している更なる三環系及び四環系化合物は、以下の化学式を有するものを含む：
【０１５５】
【化２７】
2007514643.tif 000019
【０１５６】
ここにおいて、Ｒ１４は、ＮＯ２、或いはＲ１４及びＲ１２の両方は独立して−ＣＨ３である。これらの化合物の合成は、１９９５年７月１８日に出願された米国特許番号第５，４３４，２５７号、１９９６年３月２６日に出願された米国特許番号第５，５０２，１７７号、及び１９９７年７月８日に出願された米国特許番号第５，６４６，２６９号に開示されており、これらの内容は、本出願と同一出願人によるものであり、それらの全体は本明細書に組み込まれる（以降本明細書では「’２５７、‘１１７、及び‘２６９特許」として言及している）。
【０１５７】
本発明に適し、’２５７、‘１１７、及び‘２６９特許にも開示されている更なる三環系複素環化合物は、以下の化学式を有するものを含む：
【０１５８】
【化２８】
2007514643.tif 000020
【０１５９】
ここにおいて、ａ及びｂは独立して０或いは１であり、ａとｂの合計が０或いは１になるものであり、Ａは、Ｎ、Ｃ、或いはＣＨであり、Ｙは、Ｓ、Ｏ、Ｃ＝Ｏ、ＮＨ或いはＮＣＨ２であり、Ｒ６；ＺはＣ＝Ｏであり、ＢはＡと共に取られて、５或いは６環原子を有するアリール或いはヘテロアリール環構造を形成し、ここにおいて前記へテロアリール環は、単一Ｏ環へテロ原子、単一Ｎ環へテロ原子、単一Ｓ環へテロ原子、炭素原子によって分離された単一Ｏ及び単一Ｎ環へテロ原子、Ｃ原子によって分離された単一Ｓ及び単一Ｎ環へテロ原子、炭素原子によって分離された２Ｎ環へテロ原子、或いは炭素原子によって分離された少なくとも２つの３Ｎ環へテロ原子を有し、前記アリール或いはヘテロアリール環炭素原子は、Ｈ以外のもので不飽和される、若しくは少なくとも１つの非架橋環炭素原子は、Ｒ２０或いは＝Ｏで置換されている、若しくはＺはＡと共に取られて、６環原子を有するアリール環構造を形成し、ここにおいて、前記アリール環炭素原子は、Ｈ以外のもので不飽和される、若しくは少なくとも１つの非架橋環炭素原子は、Ｒ６或いは＝Ｏで置換されており、Ｒ６は独立して、Ｈ、Ｃ１−５アルキル、Ｃ２−６アルキニル、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ３）２、ＣＮ或いはハロである、或いはＲ６は隣接するＢ基Ｒ６と共に取られ、フェニル環を完成させ、Ｒ２０は独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、ＮＯ２、Ｎ（Ｒ２１）２、ＣＮ或いはハロである、或いはＲ２０は隣接するＲ２０と共に取られ、５或いは６環原子を含む環を完成させるものである化合物、及び互変異性体、溶媒和化合物、及びそれらの塩類、さらに、Ｒ２１は独立して、Ｈ或いは保護基であり、Ｒ３は保護基或いはＨである化合物、及び互変異性体、溶媒和化合物、及びそれらの塩類である。
【０１６０】
’２５７、‘１１７、及び‘２６９特許に含まれる塩基のより特異的な例は、以下の化学式の化合物である：
【０１６１】
【化２９】
2007514643.tif 000021
【０１６２】
ここにおいて、各Ｒ１６は独立して、水素及び様々な置換基から選択されるものである。以下の化学式を有する更なる多環式塩基部位：
【０１６３】
【化３０】
2007514643.tif 000022
【０１６４】
ここにおいて、Ａ６はＯ或いはＳであり、Ａ７はＣＨ２、Ｎ−ＣＨ３、Ｏ或いはＳであり、Ａ８及びＡ９のそれぞれは水素である、或いはＡ８及びＡ９の１つは水素で、Ａ８及びＡ９のもう１つは以下の化学式からなる群から選択されるものであり、
【０１６５】
【化３１】
2007514643.tif 000023
【０１６６】
ここにおいて、Ｇは−ＣＮ、−ＯＡ１０、−ＳＡ１０、−Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−ＯＮ（Ｈ）Ａ１０、或いは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；Ｑ１はＨ、−ＮＨＡ１０、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０、−Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０、或いは−Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ａ１０であり；各Ｑ２は独立して、Ｈ或いはＰｇであり；Ａ１０はＨ、Ｐｇ、置換或いは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、アセチル、ベンジル、−（ＣＨ２）ｐ３ＮＨ２、−（ＣＨ２）ｐ３Ｎ（Ｈ）Ｐｇ、Ｄ或いはＬ  (−アミノ酸、或いはＤ、Ｌ或いはラセミα−アミノから誘導されたペプチドであり、Ｐｇは窒素、酸素、或いはチオール保護基であり、各ｐ１は独立して２〜約６であり、ｐ２は１〜約３であり、ｐ３は１〜約４である、は、２００１年１１月２８日に出願された米国特許番号第０９／９９６，２９２号に開示されており、これは本出願と同一出願人によるものであり、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６７】
いくつかの特に有用な本発明のオリゴマー化合物は、１、２、３、或いはそれ以上の脂肪族置換基、ＲＮＡ切断基、リポーター基、干渉物質、オリゴマー化合物の薬物動態的な特性を改善する基、或いはオリゴマー化合物の薬力学的な特性を改善する気、及び同様な特性を有する他の置換基を有する少なくとも１つのヌクレオシドを含む。好ましい修飾は、２’−メトキシエトキシ［２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）或いは２’−ＭＯＥとしても知られている］（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。さらに好ましい修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基であり、これは２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている。代表的なアミノオキシ置換基は、同一出願人によって１９９９年６月２５日に出願された米国特許番号第０９／３４４，２６０号（題名「Ａｍｉｎｏｏｘｙ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」）、及び１９９９年８月９日に出願された米国特許番号第０９／３７０，５４１号（題名「Ａｍｉｎｏｏｘｙ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｋｉｎｇ  Ｓａｍｅ」）に開示されており、それらの全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６８】
他の特に有益な２’−修飾は、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様な修飾は、ヌクレオシド及びオリゴマーの他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上の糖の３’部位、或いは２’−５’連結オリゴマーなどの２’位からの結合を有するヌクレオシドの３’−位置、及び５’末端ヌクレオシドの５’位置でもなされる。オリゴマーは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位などの糖擬態も有する。そのような修飾糖構造の調合を教示している代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；及び第５，７００，９２０号を含み、これらのいくつかは１９９５年６月５日に出願された米国特許出願番号第０８／４６８，０３７号と同一出願によるものであり、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
化学式において示された代表的なグアニジン置換基は、同一出願人によって１９９９年７月７日に出願された（２００２年１０月２３日に特許発行費用が支払われた）、米国特許第０９／３４９，０４０号（題名「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」）に開示されている。
【０１７０】
代表的になアセトアミド置換基は、米国特許第６，１４７，２００号に開示されており、その全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、１９９９年８月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５号（題名「２’−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」）に開示されており、その全体はこの参照により本明細書に組み込まれる。ペントフラノシル糖を含むそれらのヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の２’、３’、或いは５’ヒドロキシ部位に連結され得る。オリゴヌクレオチドを形成する場合、リン酸基は隣接するヌクレオシドを他の１つと共有結合的に連結させ、直線ポリマー化合物を形成する。この直線ポリマー構造のそれぞれの末端は、ハイブリダイゼーションによって、或いは共有結合を形成することによって、環状構造を形成するように連結され得るが、開環直線構造が一般的に好ましい。オリゴヌクレオチド構造内で、一般的にリン酸基は、オリゴヌクレオチドの内部ヌクレオシド結合を形成するものとして言及される。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常な内部ヌクレオシド結合は、３’から５’ホスホジエステル結合である。
【０１７１】
本発明に従ったオリゴマー化合物は、約８〜約８０核酸塩基（すなわち、約８〜約８０連結ヌクレオシド）を有することができる。本発明は、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、或いは８０の核酸塩基、若しくはそのあらゆる範囲内でのオリゴマー化合物を具象化するものであることを当業者は理解するであろう。
【０１７２】
別の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さが１２〜５０の核酸塩基である。これは、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、或いは５０の核酸塩基、或いはそのあらゆる範囲内でのオリゴマー化合物を具象化するものであることを当業者は理解するであろう。
【０１７３】
別の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は、長さが１５〜３０の核酸塩基である。これは、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、或いは３０の核酸塩基、或いはそのあらゆる範囲内でのオリゴマー化合物を具象化するものであることを当業者は理解するであろう。
【０１７４】
適切なオリゴマー化合物は、約１２〜約５０核酸塩基、或いは約１５〜３０核酸塩基のオリゴヌクレオチドである。
【０１７５】
オリゴマー及びモノマー修飾
本分野では既知であるように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部位は通常、複素環塩基である。そのような複素環塩基の２つの最も共通したクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部位に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらヌクレオシドに対して、リン酸基は、糖の２’、３’、或いは５’ヒドロキシル部位に結合され得る。オリゴヌクレオチドを形成する場合、リン酸基は、隣接するヌクレオシドを別のものと共有結合させ、直線ポリマー化合物を形成する。言い換えると、この直線ポリマー化合物のそれぞれの末端はさらに、環状化合物を形成するように結合され得るが、直線化合物が一般的に好ましい。加えて、直線化合物は、内部核酸塩基相補性を有し、従って、完全な或いは部分的な二本鎖化合物を産生するような方法で折り畳まれる。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は一般的に、内部ヌクレオシド結合を形成するものとして、或いは糖鎖環と連結してオリゴヌクレオチドのバックボーンを形成するものとして言及される。
【０１７６】
キメラオリゴマー化合物
オリゴマー化合物の全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実は前述した修飾の１以上は、単一オリゴマー化合物、或いはオリゴマー化合物内のヌクレオシドなどの単一モノマーサブユニットに取り込まれている。本発明は、キメラオリゴマー化合物であるオリゴマー化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラ」オリゴマー化合物、或いは「キメラ」とは、２若しくはそれ以上の化学的に異なった領域を含むオリゴマー化合物であり、そのそれぞれの領域は少なくとも１つのモノマーユニット、すなわち、核酸ベースオリゴマーの場合におけるヌクレオチドで構成されている。
【０１７７】
キメラオリゴマー化合物は一般的に、ヌクレアーゼ分解に対する抵抗の増加、増加した細胞性取り込み、及び／若しくは標的核酸への増加した結合親和性を与えるように修飾された少なくとも１つの領域を含む。オリゴマー化合物の付加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ或いはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質として働く。例として、ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。従って、ＲＮａｓｅＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それによって、遺伝子発現の阻害の有効性が優位に増強される。その結果として、キメラを用いた場合、例えば、同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドと比較して、より短いオリゴマー化合物と類似な結果をしばしば得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、及び必要であれば、本分野では既知である関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって日常的に検出され得る。
【０１７８】
本発明のキメラオリゴマー化合物は、上述されたような、２若しくはそれ以上のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド、及び／若しくはオリゴヌクレオチド擬態の複合体構造として形成される。そのようなオリゴマー化合物は、本分野において、ハイブリッドヘミマー、ギャップマー、或いは逆位ギャップマーとしても言及される。そのようなハイブリッド構造の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許第５，０１３，８３０号；第５，１４９，７９７号；第５，２２０，００７号；第５，２５６，７７５号；第５，３６６，８７８号；第５，４０３，７１１号；第５，４９１，１３３号；第５，５６５，３５０号；第５，６２３，０６５号；第５，６５２，３５５号；第５，６５２，３５６号；及び第５，７００，９２２号を含み、これらのいくつかは本出願と同一出願人によってなされており、それらの全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７９】
オリゴマー擬態
本発明に適しているオリゴマー化合物の他のグループは、オリゴヌクレオチド擬態を含む。オリゴヌクレオチドに適用された場合の擬態という用語は、フラノース環或いはフラノース環及び内部ヌクレオチド結合の両方のみが新規基で置換されるものであるオリゴマー化合物を含むことを意図しており、フラノース環のみの置換は、本分野において糖代用になるものとしても言及されている。複素環塩基部位、或いは修飾複素環塩基部位は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションに対しても維持されるものである。
【０１８０】
別の修飾は、ロックト核酸（ＬＮＡｓ）を含み、ここにおいて２’−ヒドロキシ基は糖環の４’炭素原子に連結しており、２’−Ｃ，４’−オキシメチレン結合を形成し、二環性糖部位を形成するものである。前記結合は、好ましくはメチレン、エチレンＥＮＡとして本分野では言及されている）、或いは２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋している（−ＣＨ２−）ｎ基（ｎは１〜１０）であり得る（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５〜４５６）。ＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二本鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０Ｃ）、３’−エキソ核酸分解に対する安定性、及び優れた可溶特性を示す。二環性環状系を示すＬＮＡの基礎構造は、以下に示されている：
【０１８１】
【化３２】
2007514643.tif 000024
【０１８２】
２Ｄ  ＮＭＲ分光法によって検出されたＬＮＡの立体配座は、ＬＮＡヌクレオチドのロックト（固定）配向、一本鎖ＬＮＡ及び二本鎖においての両方が、Ｎ−型立体配座のより高い集団を導入するような方法においてリン酸バックボーンを拘束することを示していた（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，２０００，１３，４４〜５３）。これらの立体配座は、核酸塩基の改善されたスタッキングに関与している（Ｗｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９９，１８，１３６５〜１３７０）。
【０１８３】
ＬＮＡは、非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖を形成すると示された（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１３２５２〜１３２５３）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、熱的に最も安定な核酸型二本鎖システムであると示され、ＬＮＡのＲＮＡ−様（擬態）特徴は二本鎖レベルで立証された。３ＬＮＡモノマー（Ｔ或いはＡ）の導入は、ＤＮＡ相補性に対する融点（Ｔｍ＝＋１５／＋１１）を有意に増加した。ＬＮＡ仲介性ハイブリダイゼーションの普遍性は、非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二本鎖の形成によって強調された。ＬＮＡのＲＮＡ−様（擬態）は、前記モノマーのＮ−型立体配座制限、及びＬＮＡ：ＲＮＡ二本鎖の二次構造に関して反映された。
【０１８４】
ＬＮＡは、相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ、或いはＬＮＡとも熱的に高い親和性を有した二本鎖を形成する。円偏光二色性（ＣＤ）分光によって、完全に修飾されたＬＮＡ（特にＬＮＡ：ＲＮＡ）に関わる二本鎖は、Ａ−形態ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖と構造的に類似していることが示された。ＬＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）実験によって、ＬＮＡモノマーの３’−エンド立体配座が確認された。二本鎖ＤＮＡの認識は、ＬＮＡによる鎖侵入の徴候も示した。ミスマッチ配列の研究によって、ＬＮＡは、対応する非修飾参照鎖と比較して一般的に改善された選択性を有し、ワトソン−クリック塩基対形成ルールに従うことが示された。
【０１８５】
ＬＮＡと同様に、ＬＮＡ−オリゴマー化合物の新規タイプは、広範囲の診断及び治療適用において有用である。これらは、アンチセンス適用、ＰＣＲ適用、鎖置換オリゴマー、核酸ポリメラーゼに対する基質、及び一般的にヌクレオチドベースの薬剤としてで使用される。
【０１８６】
ＬＮＡを含む強力で無毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３〜５６３８に記載されていた。著者は、ＬＮＡはいくつかの望ましい特性をアンチセンス因子に与えると示唆した。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、血液血漿及び細胞抽出物において容易に分解されなかった。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、生きたラット脳におけるＧ−タンパク質共役受容体シグナル伝達や、大腸菌における受容体遺伝子の検出法とは異なるアッセイシステムにおいて、強力なアンチセンス活性を示した。生きたヒト乳癌細胞へのＬＮＡのリポフェクチン仲介性の効率的な運搬も達成された。
【０１８７】
オリゴマー化及び核酸認識特性に沿ったＬＮＡモノマー、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調合が記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７〜３６３０）。ＬＮＡ及びそれらの調合は、国際公開第９８／３９３５２号及び第９９／１４２２６号にも記載されている。
【０１８８】
ＬＮＡ、ホスホロチオエート−ＬＮＡ、及び２’−チオ−ＬＮＡの第１の類似体も調合された（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９〜２２２２）。核酸ポリメラーゼに対する基質としてのオリゴデオキシリボヌクレオチド二本鎖を含むロックトヌクレオシド類似体の調合も報告されていた（Ｗｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＣＴ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ９８−ＤＫ３９３    １９９８０９１４）。さらに、ハンドルを有する新規の立体配座的に制限された高親和性オリゴヌクレオチド類似体２’−アミノ−ＬＮＡの合成は、本分野において記載されていた（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５〜１００３９）。さらに、２’−アミノ、及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡは調合され、相補性ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖を有するそれらの二本鎖の熱安定性は、以前に報告された。
【０１８９】
さらに、オリゴヌクレオチド擬態は、以下の化学式（アミド化モノマーを示した）を有する、二環式及び三環式ヌクレオシドつい時代を含むように調合された：
【０１９０】
【化３３】
2007514643.tif 000025
【０１９１】
（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９７，８０，２４２６〜２４３９；Ｓｔｅｆｆｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９９，１２１，３２４９〜３２５５；及びＲｅｎｎｅｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４，５９９３〜６００２を参照のこと）。これらの修飾ヌクレオシド類似体は、ホスホラミダイトアプローチを用いてオリゴマー化され、その結果生じた三環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれ自身をハイブリダイズした場合、熱安定性（Ｔｍ’ｓ）の増加を示した。二環式ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ二本鎖に近い熱安定性を示した。
【０１９２】
別のクラスのオリゴヌクレオチド擬態は、バックボーンにリン酸基を取り込んだリン酸一エステル核酸として言及される。このクラスのオリゴヌクレオチド擬態は、核酸の検出用のプローブとして、及び分子生物学における補助として、遺伝子発現阻害の領域における物理的、生物学的、及び薬学的に有用な特性（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、及び三重形成オリゴヌクレオチド）を有すると報告されている。
【０１９３】
一般化学式（マルクーシュ構造の定義、米国特許第５，８７４，５５３号及び第６，１２７，３４６号を参照し、その全体はこの参照によって組み込まれる）は、以下に示してある。
【０１９４】
【化３４】
2007514643.tif 000026
【０１９５】
別のオリゴヌクレオチド擬態は報告されており、そこにおいてフラノシル環はシクロブチル部位によって置換されている。
【０１９６】
修飾内部ヌクレオシド結合
本発明において有用なアンチセンスオリゴマー化号物の特定の例としては、修飾された、例えば非天然由来内部ヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドを含む。本明細書において定義されたように、修飾内部ヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持する内部ヌクレオシド結合、及びリン原子を持たない内部ヌクレオシド結合を含む。本明細書の目的として、さらにしばしば本分野で言及されるように、それらの内部ヌクレオシドバックボーンにおいてリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであると考えられている。
【０１９７】
線虫システムにおいて、内部ヌクレオチド結合（ホスホロチオエート）の修飾は、ＲＮＡｉ活性を有意に干渉しなかった。この観察に基づいて、本発明の特定のオリゴマー化合物は、１若しくはそれ以上の修飾内部ヌクレオシド結合も有し得ると示唆される。修飾内部ヌクレオシド結合を含む１つのリンは、ホスホロチオエート内部ヌクレオシド結合である。
【０１９８】
リン原子をその中に含む修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホラミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）及びアミノアルキルホスホラミデート、チオノホスホラミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェート（正常な３’−５’結合、これらの２’−５’結合した類似体を有する）、及び１若しくはそれ以上の内部ヌクレオチド結合が３’〜３’、５’〜５’、或いは２’〜２’結合である転化極性を有するものを含む。転化極性を有するオリゴヌクレオチドは、３’−モスト内部ヌクレオチド結合に１つの３’〜３’結合、すなわち、脱塩基である１つの転化ヌクレオシド残基（その核酸塩基は欠損、或いはそれの代わりにヒドロキシル基を有している）を有することができる。様々な塩類、混合塩類、及び遊離酸形態も含まれる。
【０１９９】
上述したリン含有結合の調合を教示している代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号；第４，４６９，８６３号；第４，４７６，３０１号；第５，０２３，２４３号；第５，１７７，１９６号；第５，１８８，８９７号；第５，２６４，４２３号；第５，２７６，０１９号；第５，２７８，３０２号；第５，２８６，７１７号；第５，３２１，１３１号；第５，３９９，６７６号；第５，４０５，９３９号；第５，４５３，４９６号；第５，４５５，２３３号；第５，４６６，６７７号；第５，４７６，９２５号；第５，５１９，１２６号；第５，５３６，８２１号；第５，５４１，３０６号；第５，５５０，１１１号；第５，５６３，２５３号；第５，５７１，７９９号；第５，５８７，３６１号；第５，１９４，５９９号；第５，５６５，５５５号；第５，５２７，８９９号；第５，７２１，２１８号；第５，６７２，６９７号、及び第５，６２５，０５０号を含み、いくつかは本出願と同一出願人によるものであり、それぞれはこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０２００】
本発明のいくつかの実施形態において、オリゴマー化合物は、１若しくはそれ以上のホスホロチオエート及び／若しくはヘテロ原子内部ヌクレオシド結合、特に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）或いはＭＭＩバックボーンとして知られている）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここにおいて未変性ホスホジエステル内部ヌクレオチド結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として表されている）を有するものである。ＭＭＩ型内部ヌクレオシド結合は、上で参照した米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。適切なアミド内部ヌクレオシド結合は、上で参照した米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
【０２０１】
その中にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキル或いはシクロアルキル内部ヌクレオシド、混合ヘテロ原子及びアルキル或いはシクロアルキル内部ヌクレオシド結合、或いは、１若しくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子或いは複素環内部ヌクレオシド結合によって形成される。これらは、モルフォリノ結合（ヌクレオシドの糖部分からの一部で形成される）を有するもの、シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシド及びスルホンバックボーン；ホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルバックボーン；リボアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファミン酸バックボーン；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノバックボーン；スルホネート及びスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーン；及び混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２構成成分を有する他のものを含む。
【０２０２】
上述したオリゴヌクレオシドの調合を教示する代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号；第５，１６６，３１５号；第５，１８５，４４４号；第５，２１４，１３４号；第５，２１６，１４１号；第５，２３５，０３３号；第５，２６４，５６２号；第５，２６４，５６４号；第５，４０５，９３８号；第５，４３４，２５７号；第５，４６６，６７７号；第５，４７０，９６７号；第５，４８９，６７７号；第５，５４１，３０７号；第５，５６１，２２５号；第５，５９６，０８６号；第５，６０２，２４０号；第５，６１０，２８９号；第５，６０２，２４０号；第５，６０８，０４６号；第５，６１０，２８９号；第５，６１８，７０４号；第５，６２３，０７０号；第５，６６３，３１２号；第５，６３３，３６０号；第５，６７７，４３７号；第５，７９２，６０８号；第５，６４６，２６９号、及び第５，６７７，４３９号を含み、いくつかは本出願と同一出願人によるものであり、それぞれはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
修飾糖
本発明のオリゴマー化合物は、１若しくはそれ以上の置換糖部位も含む。適切なオリゴマー化合物は、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−或いはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、或いはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、或いはＮ−アルキニル；或いはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を有し、ここにおいて、アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル或いはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルである。特に適切なのは、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２であり、ここにおいてｎ及びｍは１〜約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル或いはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、干渉物質、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基、或いはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、及び同様な特性を有する他の置換基から選択された糖置換基を有する。１つの修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）或いは２’−ＭＯＥとしても知られている）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６〜５０４）。別の修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）（以下の実施例に記載されている）、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（本分野では２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシエチル、或いは２’−ＤＭＡＥＯＥ）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０２０４】
他の適切な糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及びフルオロ（Ｆ）を含む。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位、或いはリボ（下）位の形態である。同様な修飾は、オリゴマー化合物上の他の位置、特に３’末端ヌクレオシド上の或いは２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける３’位糖、及び５’末端ヌクレオチドの５’位でもなされる。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の代わりのシクロブチル部位などの糖擬態も有する。そのような修飾糖構造の調合を教示する代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号；第５，１１８，８００号；第５，３１９，０８０号；第５，３５９，０４４号；第５，３９３，８７８号；第５，４４６，１３７号；第５，４６６，７８６号；第５，５１４，７８５号；第５，５１９，１３４号；第５，５６７，８１１号；第５，５７６，４２７号；第５，５９１，７２２号；第５，５９７，９０９号；第５，６１０，３００号；第５，６２７，０５３号；第５，６３９，８７３号；第５，６４６，２６５号；第５，６５８，８７３号；第５，６７０，６３３号；第５，７９２，７４７号；及び第５，７００，９２０号を含み、いくつかは本出願と同一出願人によるもので、それぞれの全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。さらなる代表的な糖置換基は、化学式Ｉａ、或いはＩｂの基を含む：
【０２０５】
【化３５】
2007514643.tif 000027
【０２０６】
ここにおいて、
Ｒｂは、Ｏ、Ｓ、或いはＮＨであり；
Ｒｄは、単結合、Ｏ、Ｓ或いはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｒｅは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）、或いは化学式Ｉｃを有し；
【０２０７】
【化３６】
2007514643.tif 000028
【０２０８】
Ｒｐ及びＲｑはそれぞれ独立して、水素、或いはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒｒは、−Ｒｘ−Ｒｙであり；
それぞれのＲｓ、Ｒｔ、Ｒｕ及びＲｖは独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルフルホニル、アリールスルホニル、化学機能基、或いは共役基であり、ここにおいて、前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニルから選択されるものであり；
或いは任意で、Ｒｕ及びＲｖは、それらが連結された窒素原子でフタルイミド部位を一緒に形成するものであり、
それぞれのＲｗは独立して、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル、或いはアリールであり；
Ｒｋは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｐは、水素、アミノ保護基、或いは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｘは、単結合、或いは結合部位であり；
Ｒｙは、化学機能基、共役基、あるいは固体支持媒体であり、；
それぞれのＲｍ及びＲｎは独立して、Ｈ、アミノ保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、ここにおいて、置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル；ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ、及びアシル（前記アシルは酸アミド或いはエステルである）から選択されるものであり、；
或いはＲｍ及びＲｎは、共にアミノ保護基であり、Ｎ及びＯから選択された付加的ヘテロ原子を任意に含む環構造に連結している、若しくは化学機能基であり；
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、或いはＮ（Ｒｚ）２であり；
それぞれのＲｚは独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、或いはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり；
Ｒｆ、Ｒｇ、及びＲｈは、約４〜約７炭素原子を有する、若しくは約３〜約６炭素原子と１或いは２ヘテロ原子を有する環システムを有し、ここにおいて、前記へテロ原子は、酸素、窒素、及び硫黄から選択されるものであり、前記環システムは、脂肪族、非飽和脂肪族、芳香族、或いは飽和或いは非飽和複素環であり；
Ｒｊは、１〜約１０炭素原子を有するアルキル或いはハロアルキル、２〜約１０炭素原子を有するアルケニル、６〜約１４炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋ或いはＣＮであり；
ｍａは１〜約１０であり；
それぞれのｍｂは独立して、０或いは１であり；
ｍｃは、０或いは１〜１０の整数であり；
ｍｄは、１〜１０の整数であり；
ｍｅは、０、１、或いは２であり；及び、
ｍｃが０である場合、ｍｄは１以上である。
【０２０９】
化学式Ｉａの代表的な置換基は、１９９８年８月７日に出願された米国特許出願番号第０９／１３０，９７３号（題名「Ｃａｐｐｅｄ  ２’-Ｏｘｙｅｔｈｏｘｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」）に開示されており、この全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
化学式Ｉｂの代表的な環状置換基は、１９９８年７月２７日に出願された米国特許出願番号第０９／１２３，１０８号（題名「ＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ２’−Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｄ」）に開示されており、この全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１１】
糖置換基は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＨ）］２も含み、ここにおいて、ｎ及びｍは１〜約１０である。
【０２１２】
代表的なアセトアミド置換基は、米国特許第６，１４７，２００号に開示されており、この全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１３】
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、１９９９年８月６日に出願された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５号（題名「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」）に開示されており、この全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１４】
複合体
本発明のオリゴマー化合物に付け加えられる別の置換としては、結果として生じるオリゴマー化合物の活性、細胞分布あるいは細胞への取り込みを強化する、１若しくはそれ以上の部分または複合体との結合が含まれる。そのような修飾されたオリゴマー化合物の実施形態の１つにおいて、オリゴマー化合物は、ヒドロキシル基やアミノ基のような官能基に複合体を共有結合させることで調製される。本発明の複合基には、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリエチレングリコール、ポリエーテルのようなオリゴマーの薬物動態の特性を強化したり、薬力学的な特性を強化する基が含まれる。典型的な複合基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリンおよび染料が含まれる。本発明に関して、薬物動態の特性を強化する基には、オリゴマーの取り込みを改善したり、オリゴマーが分解されにくくしたり、そして／またはＲＮＡとの配列特異的なハイブリッド形成を強めるような基が含まれる。本発明に関して、薬物力学的な特性を強化する基には、オリゴマーの取り込み、分布や排泄を改善するような基が含まれる。代表的な複合基については、１９９２年１０月２３日に出願された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号に開示されてあり、その全体はこの参照によって、本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
複合分子部分には、これに制限されるわけではないが、コレステロール（Ｌｅｓｔｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３〜６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３〜１０６０）、例えば、ヘキシル‐Ｓ‐トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６〜３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５〜２７７０）のようなチオエーテル、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３〜５３８）、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｌｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１〜１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７〜３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９〜５４）のような脂肪族鎖、ジ‐ヘキサデシル‐ｒａｃ‐グリセロール、または、１，２−ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−リン酸トリエチルアンモニウム（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１〜３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７〜３７８３）のようなリン脂質、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  &  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９〜９７３）、あるいは酢酸アダマンタン（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１〜３６５４）、パルミチル分子（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９〜２３７）またはオクタデシルアミンあるいはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール分子部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍｅｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３〜９３７）が含まれる。
【０２１６】
本発明のオリゴマー化合物はまた、活性のある薬物分子、例えば、アスピリン、ワファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナミン酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメチシン、バルビツール酸、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗微生物薬、抗生物質などと複合体形成されていてもよい。オリゴヌクレオチド−薬物の複合体とその調製については、米国特許出願公開第０９／３３４，１３０号（１９９９年６月１５日に出願）に記載されており、その全体はこの参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１７】
そのようなオリゴヌクレオチド複合体の調製について教示した代表的な米国特許としては、これらに限定されるものではないが、米国特許出願公開第４，８２８，９７９号；第４，９４８，８８２号；第５，５２５，４６５号；第５，５４１，３１３号；第５，５４５，７３０号；第５，５５２，５３８号；第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号；第５，５８０，７３１号；第５，５９１，５８４号；第５，１０９，１２４号；第５，１１８，８０２号；第５，１３８，０４５号；第５，４１４，０７７号；第５，４８６，６０３号；第５，５１２，４３９号；第５，５７８，７１８号；第５，６０８，０４６号；第４，５８７，０４４号；第４，６０５，７３５号；第４，６６７，０２５号；第４，７６２，７７９号；第４，７８９，７３７号；第４，８２４，９４２号；第４，８３５，２６４号；第４，８７６，３３５号；第４，９０４，５８２号；第４，９５８，０１３号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，０８２，８３０号；第５，１１２，９６３号；第５，２１４，１３６号；第５，２４５，０２２号；第５，２５４，４６９号；第５，２５８，５０６号；第５，２６２，５３６号；第５，２７２，２５０号；第５，２９２，８７３号；第５，３１７，０９８号；第５，３７１，２４１号、第５，５９１，７２３号；第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号；第５，５１２，６６７号；第５，５１４，７８５号；第５，５６５，５５２号；第５，５６７，８１０号；第５，５７４，１４２号；第５，５８５，４８１号；第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号；第５，５９７，６９６号；第５，５９９，９２３号；第５，５９９，９２８号、そして第５，６８８，９４１号があり、このうちのいくつかのものは同一出願人によるものであり、これらはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
３’−エンドの修飾
本発明の１観点において、オリゴマー化合物は、３’−エンドの糖立体配座を誘導するべく合成的に修飾したヌクレオシドを含むことである。ヌクレオシドはヘテロ環塩基、糖部分あるいはその両方に合成による修飾を加えて、望ましい３’−エンドの糖立体配座をとることができる。このような修飾ヌクレオシドは、ＲＮＡを模したヌクレオシドを持つことで、オリゴマー化合物の望ましい３’−エンドの幾何配置を保ちながら、特定の特性を強化することができる。ＲＮＡ干渉に必要とされる（例えば、トリガー）こととして、ＲＮＡ二本鎖型（主として３’−エンドのＡ型へリックス）には明白な選択性があり、このことは、２’−デオキシ−２’−Ｆ−ヌクレオシドが高い効率で、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）の系でＲＮＡｉの反応を惹き起こすという事実によってある程度支持される。より安定な３’−エンドのヌクレオシドによって強化される特性には、これらに限定されるわけではないが、タンパク質の結合速度、タンパク質の解離速度、吸収およびクリアランスの修飾、化学的安定性のみならずヌクレアーゼ分解に対する安定性の修飾、オリゴマーの結合親和性や特異性の（相補的配列に対するばかりなく酵素に対する親和性や特異性）修飾、そしてＲＮＡの切断効率を高めることなどによる薬力学的な特性がある。本発明は、３’−エンドの立体配座を好ましいものにするように修飾されたヌクレオシドの１若しくはそれ以上をもったＲＮＡｉのオリゴマーのトリガーを提供する。
【０２１９】
【化３７】
2007514643.tif 000029
【０２２０】
ヌクレオシドの立体配座は、ペントフラノシル糖の２’、３’、または４’位における置換を含めた多様な因子によって影響を受ける。電気陰性の置換は、一般的に軸上の位置を好み、立体的に強要的な置換は、一般的に赤道上の位置が好ましい（「核酸構造の原則」、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｓａｎｇｅｒ，１９８４年，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。下記に示すスキーム（計画案）１ａ（Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｒｏｎ（２００１），５７，５７０７〜５７１３），Ｈａｒｒｙ−Ｏ’ｋｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９７），６２（６），１７５４〜１７５９およびＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９９），６４，７４７〜７５４）に示すように、認識部分としての２’−ＯＨを残しながら２’位を３’−エンド立体配座に向けた修飾が可能である。或いは、３’−エンドの立体配座への選択は、電気陰性的なフッ素原子を軸位に配置した３’−エンドの立体配座をとる、２’デオキシ−２’Ｆ−ヌクレオシド（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９３），３６、８３１〜８４１）に例証されるように、２’−ＯＨを削除することにより可能である。例えば、４’位での置換により４’−Ｆ修飾ヌクレオシド（Ｇｉｌｌｅｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５），５，１４５５〜１４６０およびＯｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ，Ｃｈｅｍ．（１９７６），４１，３０１０〜３０１７）とする置換や、例えば、メタノカルバヌクレオシド類似体（Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２０００），４３，２１９６〜２２０３、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００１），１１，１３３３〜１３３７）に変換するような、リボース環のその他の修飾もまた、３’−エンド立体配座を好ましいとする修飾をもたらす。同様に、ＲＮＡｉ反応の引き金となるオリゴマーは、Ｃ３’−エンド型の立体配座にロックされるような、すなわちロックト核酸（ＬＮＡ，Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８），４，４５５〜４５６）やエチレン架橋核酸（ＥＮＡ，Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  &  Ｍｅｄｉｃｉｎａ；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２），１２，７３〜７６）の立体配座をとるように修飾されたヌクレオシドの１若しくはそれ以上からなる。本発明に含まれる修飾ヌクレオシドの例を下記のスキーム（計画案）Ｉａに示した。これらの例は代表的なものであって、これらが全てであるという意味ではない。
【０２２１】
【化３８】
2007514643.tif 000030
【０２２２】
修飾ヌクレオシドとそのオリゴマーの好ましい立体配座は、分子動力学的計算、核磁気共鳴スペクトル法、ＣＤ計測法などの多様な方法によって、推測することができる。それ故に、オリゴマーに関するＡ型二本鎖の幾何配置であるＲＮＡ類似の立体配座をもたらすと予想される修飾のタイプが、本発明の修飾ヌクレオシドに用いられるべく選択された。本発明に含まれる修飾ヌクレオシドの多くについての合成は、技術分野ではよく知られている（例えば、「ヌクレオシドとヌクレオチドの化学」Ｖｏｌ  １〜３，ｅｄ．Ｌｅｒｏｙ  Ｂ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，１９８８，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，や以下の実施例の項を参照）。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤／基質として知られているヌクレオシド（例えば、ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ）。
【０２２３】
ある観点において、本発明は核酸の標的に対する特性が、天然のＲＮＡに比較して強化された特性を有するべく調製されたオリゴヌクレオチドを目指すものである。標的が同定され、標的配列の一部を相補的な配列と効果的な長さによってオリゴヌクレオチドが選択される。選ばれた配列の、各ヌクレオシドが、可能な強化のための修飾について吟味される。好ましい修飾とは、一つあるいはそれ以上のＲＮＡヌクレオシドを、同じ３’−エンド立体幾何配置をもったヌクレオシドで置き換えたものである。そのような修飾は、天然のＲＮＡに比較して、化学的およびヌクレアーゼに対する安定性を強めると同時に、ずっと安価であり、合成したり／またはヌクレオチドに組み込むことをより容易にするものである。選択された配列は、更に領域と、キメラ立体配座の結果でありうる強化のための修飾について評価された各領域のヌクレオシドに分けられる。しばしば、有利な修飾がエンドのヌクレオシドの一つまたはそれ以上に可能であるので、５’−と３’−エンドについてもまた考慮される。本発明のオリゴマー化合物は少なくとも一つの５’−修飾リン酸基を一本鎖に、あるいは二本鎖の配列の少なくとも一つの５’位に有しているオリゴマー化合物である。更なる修飾については、ヌクレオシド間の結合、複合基、置換糖や置換塩基、一つあるいはそれ以上のヌクレオシドのヌクレオシド擬似化合物による置換そして目的とする標的に対する選択された配列をより効果的にするためのその他の修飾などについてもまた考慮される。
【０２２４】
ホモ二本鎖核酸の立体幾何学的配置を説明するために用いられる用語はＲＮＡについては「Ａ型」、ＤＮＡについては"Ｂ型"とする。ＲＮＡとＤＮＡの二本鎖のそれぞれの立体幾何学的配置は、核酸線維のＸ線回折分析（Ａｒｎｏｔｔ  ａｎｄ  Ｈｕｋｉｎｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９７０，４７，１５０４）によって決定された。一般的に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖は、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖に比較して、より安定であり、より高い融点（Ｔｍ’ｓ）を有する（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，「核酸構造の原則」，１９８４，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｌｅｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，１０８０７〜１０８１５；Ｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，２６２７〜２６３４）。ＲＮＡの高い安定性の原因については幾つかの構造的な特色によるものとされ、最も顕著なものとしては、Ａ型幾何学的配置の結果としての塩基の積み重ねの相互作用があげられる（Ｓｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，２０５１〜２０５６）。ＲＮＡ上の２’位のヒドロキシル基の存在は、糖をＣ３’エンドの歪み（パッカー）のほうへ傾かせる、すなわちその歪みはノーザンパッカーとも呼ばれるが、それが二本鎖をＡ−型の幾何学配置をとらせる。さらに、ＲＮＡ上の２’位のヒドロキシル基は水分子を介した水素結合のネットワークを形成しそれがＲＮＡ二本鎖の安定を助ける（Ｅｇｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５，８４８９〜８４９４）。他方、デオキシ核酸は、サザンパッカーとして知られるＣ２’−エンド糖の歪み（パッカー）を好み、それがより不安定なＢ型の幾何学配置をとらせる理由の一つと考えられている（Ｓａｎｇｅｒ，Ｗ．（１９８４）「核酸構造の原則」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。ここで使われるように、Ｂ型幾何学配置はＣ２’−エンドパッカーとＯ４’−エンドパッカーの両方を含む。このことは、Ｂ型二本鎖を惹き起こすフラノース立体配置を考えるにあたって、Ｏ４’−エンドパッカーの寄与もまた考えられるべきであると指摘したＢｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８、２６、２４７３−２４８０の意見に一致する。
【０２２５】
しかしながら、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖は、通常、単なるＲＮＡ：ＲＮＡの二本鎖よりも不安定であり、その配列によって、ＤＮＡ：ＤＮＡ二本鎖よりも安定であったり、不安定であったりする（Ｓｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２１，２０５１〜２０５６）。ハイブリッド二本鎖の構造は、Ａ型とＢ型の幾何学配置の中間をとり、そのために積み重ねの相互作用が弱い結果となる可能性がある（Ｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９３，２１５，２９７〜３０６；Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９３，２３３，５０９〜５２３；Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，３４，４９６９〜４９８２；Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，２６４，５２１〜５３３）。これらに限定されるものではないが、アンチセンスやＲＮＡ干渉による治療にとって、それらのメカニズムは、合成オリゴヌクレオチド鎖と標的ＲＮＡ鎖との結合を必要とするので、標的ＲＮＡと合成配列の間に形成される二本鎖の安定性は、特に重要である。アンチセンスの場合、ｍＲＮＡの効果的な阻害には、アンチセンスＤＮＡがそのｍＲＮＡに対して非常に高い結合親和性をもっていることが必要である。そうでなければ、合成ヌクレオチド鎖と標的のＲＮＡ鎖間の希望する相互作用は、まれにしか起こらず、薬効の低いものとなる。
【０２２６】
糖の歪みを修飾するために決まって使われる方法の一つは、糖の幾何学的配置に影響する置換基で糖の２’−位に置換を行うことである。環の立体配座への影響は２’−位の置換基の性質による。数多くの置換基について、それらの糖の歪みへの影響が調べられた。例えば、２’−ハロゲンについて調べた結果では、２’−フルオロ誘導体が、Ｃ３’−エンド型のうち、最大の割合を占め（６５％）、２’−ヨード化合物の割合は最小であった（７％）。アデノシン（２’−ＯＨ）とデオキシアデノシン（２’−Ｈ）の割合はそれぞれ、３６％と１９％であった。更にアデノシン二量体（２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン−２’−デオキシ−２’−フルオロ−アデノシン）の２’−フルオロ基の影響はさらに積み重ねの立体配座の安定化に関連する。
【０２２７】
予期されるように、二本鎖の比較的な安定性は、２’−ＯＨ基を２’−Ｆ基で置き換えることによって、Ｃ３’−エンドの割合をたかめることで、強化することができる。２’−Ｆ結合の高い極性と、極端にＣ３’−エンドの歪みを好む特性が、Ａ型の二本鎖の積み重ね立体配座を安定化することが想定される。ＵＶ減色効果、円偏光二色性、そして１Ｈ  ＮＭＲのデータはまた、ハロ置換基の電気陰性が減少するにつれて、積み重ねの程度が減少することを示している。さらに、糖部分の２’−位の立体容積は、Ｂ型二本鎖よりもＡ型二本鎖により良く収まる。従って、ジヌクレオシドの一リン酸塩の３’−エンドの２’−位の置換基は積み重ねの立体配座に、複数の影響を示す：それらは、立体的反発、フラノースのパッカリングへの選択性、静電気的反発、疎水性引力そして水素結合能力などである。これらの置換基による影響は、置換基の分子量、電気陰性度や疎水性によって決定されると考えられる。相補的鎖の融点はまた、２’−位の置換されたアデノシン二リン酸によって増大する。結合能の増加が、立体配座の３’−エンド志向によるものか、置換基の存在によるものかについては明確でない。しかしながら、隣接する（積み重ねの）塩基の重複を強めることは３’−エンドの立体配座によって可能となる。
【０２２８】
ヌクレアーゼに対する抵抗性を増し、ヌクレオチドへの非常に高い結合親和性をもたらす２’−位の合成的修飾の一つは、２−メトキシエトキシ（２’ＭＯＥ、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）の側鎖である（Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，２７２，１１９４４〜１２０００）。２’−ＭＯＥ置換が即座に有利である点は、結合親和性の改善であり、それはＯ−メチル、Ｏ−プロピルやＯ−アミノプロピルのような多くの同様な２’位の修飾に比較して、非常に顕著である。２’−Ｏ−メトキシエチル置換基をもったオリゴヌクレオチドもまた、生体内への使用についての有望な特色を持ち、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤として実証された（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６〜５０４；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍｉａ，１９９６，５０，１６８〜１７６；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，１９９６，２４，６３０〜６３７；そしてＡｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｎｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，９１７〜９２６）。ＤＮＡに関しては、２’−ＭＯＥ修飾を受けたオリゴヌクレオチドはＲＮＡに対する親和性の改善とより高いヌクレアーゼに対する抵抗性を示した。分子翼上および、デオキシ−チオリン酸エステルヌクレオチド（また間隙オリゴヌクレオチドあるいはギャップマーと呼ばれる）の内部のヌクレオシドに２’−ＭＯＥ置換基をもったキメラオリゴヌクレオチドが低量で動物モデルの腫瘍の成長を効果的に抑制することが示された。２’−ＭＯＥ置換型オリゴヌクレオチドはまた、幾つかの疾患においてアンチセンス薬剤として顕著な有望性を示した。そのようなＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドの一つは、ＣＭＶによる網膜炎の治療についての臨床治験で現在、試験中である。
【０２２９】
前述の化学式全てにおいて、波線マーク（〜）は５’−リン酸の酸素または硫黄原子への結合を意味する。リン酸保護基には、米国特許出願公開第ＵＳ５，７６０，２０９号、第ＵＳ５，６１４，６２１号、第ＵＳ６，０５１，６９９号、第ＵＳ６，０２０，４７４号、第ＵＳ６，３２６，４７８号、第ＵＳ６，１６９，１７７号、第ＵＳ６，１２１，４３７号、第ＵＳ６，４６５，６２８号に記載されたものが含まれ、これらの全体はこの参照によって本発明に組み込まれた。
【０２３０】
オリゴマー合成
修飾または未修飾のヌクレオシドのオリゴマー化は、適切なＤＮＡ（「オリゴヌクレオチドとその類似体のためのプロトコール」、Ｅｄ．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３）、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ）そして／またはＲＮＡ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３，２０６〜２１７，Ｇａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，「化学合成されたＮＲＡのＮＲＡ：タンパク質相互作用への応用，Ｅｄ．  Ｓｍｉｔｈ，（１９９８），１〜３６，Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），５７，５７０７〜５７１３）合成についての文献上の方法に従って行った。さらに、本発明のオリゴマー化合物合成に特異的なプロトコールについては、以下の実施例に示した。
【０２３１】
オリゴヌクレオチドは、一般的に、溶液中で、あるいは例えば、固体の支持媒体上で調製される。一般に、最初のシントン（例えば、一つのヌクレオシドのようなモノマー）を支持媒体に付け、次々に支持体に結合したシントンにモノマーを結合させてヌクレオチドを合成する。この繰り返しの伸長過程によって、最終的なオリゴマー化合物やポリペプチドのようなその他のポリマーができる。適切な支持媒体は、可溶性であったり、不溶性であったり、または、希望によって溶液内あるいは溶液外に、支持体に結合したポリマーが長く伸びるように、異なる溶媒にたいして多様な溶解度をもっていてもよい。固体の伝統的な支持媒体は、ほとんどの場合、不溶性であり、決まって反応管に入れ、オリゴマーがめざす長さに達するまで、試薬と溶媒が反応しそして／あるいは洗浄し、次に支持体から切断し、必要であれば、さらに反応を加えて、最終的なポリマー化合物を得る。より最近のやり方としては、可溶性のポリマー支持体を含めて、可溶性の支持体が導入され、合成過程の希望する時点で反復合成生成物を沈殿させた後に溶解させる（Ｇｒａｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９７，９７，４８９〜５１０）。
【０２３２】
支持媒体という用語には、オリゴマー化合物やペプチドのような関連した化合物の合成についての技術分野の当業者には知られている全ての型の支持体が含まれることを意図している。本発明の方法に含まれる代表的な支持体には、これらに限定されるわけではないが、以下のものが含まれる：微細孔性ガラス（ＣＰＧ）、オキサリル微細孔性ガラス（例えば、Ａｌｕｌ，Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１，１９，１５２７を参照）、細孔性ガラスビーズやシリカゲルのように、トリクロロ−［３−（４−クロロメチル）フェニル］プロピルシランと細孔性ガラスビーズ（Ｐａｒｒ  ａｎｄ  Ｇｒｏｍａｎｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｅｒｎａｌ．Ｅｄ．１９７２，１１，３１４を参照、"ポラシル  Ｅ"（商標）としてＷａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．，米国から販売されている）との反応によって形成されるシリカ含有粒子、１，４−ジヒドロキシメチルベンゼンとシリカのモノエステル（Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９７０，４５０３を参照、"バイオパック（ＢＩＯＰＡＫ）"（商標）でＷａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから販売）、テンタゲル（ＴＥＮＴＡＧＥＬ）（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９３，３４，３３７３を参照）、スチレン／ジビニルベンゼンの架橋された共重合体のビーズ基体または、ポリスチレン／ジビニルベンゼンの共重合体（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）であるポロス、可溶性の支持媒体である多様なポリエチレングリコール  ＰＥＧ（Ｂｏｎｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  &  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，４，２２５〜２３１を参照）。
【０２３３】
本発明に含まれる支持媒体についてさらに挙げると、これらに限定されることなく、ペンダント長鎖ポリスチレン（ＰＳ）とのグラフト（分子量が１０６のオーダーである（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８９，１１１，８０２４と国際出願番号第ＷＯ９０／０２７４９号）を参照）共重合体によるポリスチレン（ＰＥ）フィルムであるＰＥＰＳが含まれる。フィルムの負荷許容量は、ビーズマトリックスと同程度に高く、加えて、複数の合成が同時に可能である柔軟性がある。ＰＥＰＳフィルムは、それぞれが個別の反応区画となる不連続なラベルされた薄板の形式で作られてもよい。合成サイクルの全て同一のステップの間、これらの薄板は、従来の方法により単一のペプチドを調整した場合に近い速度で複数のペプチドを同時に調製することができるように、一つの反応管に一緒に保たれる。また、例えば、織りのないフェルト、編んだネットあるいはマイクロウェルプレートのようなその他の幾何学配置をとったＰＥＰＳの実験では、合成効果の制限はないことを示した。
【０２３４】
本発明に含まれる支持媒体をさらに挙げると、これらに限定されることなく、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−ベータ−アラニル−Ｎ’−アクリロイルヘキサメチレンジアミンの既知量を含め、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンと架橋されたジメチルアクリルアミドの共重合体に基づく粒子がある。典型的には、幾つかのスペーサー分子がベータアラニル基を介して付加され、続いて、アミノ酸残基のサブユニットが加えられる。また、ベータアラニル基を含むモノマーは、樹脂ビーズを形成する重合の過程でアクリロイルサフコシンのモノマーで置き換えても良い。重合化に続いて、ビーズとエチレンジアミンを反応させ、共有結合された官能基としての第一級アミンを含む樹脂粒子を形成させる。ポリアクリルアミドに基づく支持体は、ポリスチレンに基づく支持体に比較してより親水性が高く、通常、ジメチルフォルムアミド、ジメチルアセタミド、Ｎ−メチルピロリドンやその類似体を含む極性で非プロトン性の溶媒と用いられる（Ａｔｈｅｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９７５，９７，６５８４，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９７９，８、そしてＪ．Ｃ．Ｓ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ５３８（１９８１）を参照）。
【０２３５】
本発明に含まれる支持媒体をさらに挙げると、これらに限定されることなく、樹脂と、用いられる有機合成反応にかなり不活性な別の物質との合成物がある。典型的な合成物の一つは（Ｓｃｏｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｓｃｉ．，１９７１，９，５７７を参照）反応性のクロロメチル基を含む、疎水性で架橋されたスチレンポリマーでコートされたガラス粒子を用いたもので、Ｎｏｒｔｈｇａｔｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ｏｆ  Ｈａｍｄｅｎ（Ｃｏｎｎ．米国）が供給元である。別の典型的な合成物としては、ポリスチレンをグラフト共重合させたフッ素化エチレンポリマーを核にもつ化合物（Ｋｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｉｓｒａｅｌ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．，１９７８，１７，２４３、及びｖａｎ  ｒｉｅｔｓｃｈｏｔｅｎ，「ペプチド」，１９７４，Ｙ．Ｗｏｌｍａｎ，Ｅｄ．，Ｗｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５，ｐｐ．１１３〜１１６を参照）、木綿薄板（Ｌｅｂｌ  ａｎｄ  Ｅｉｃｈｌｅｒ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．，１９８９，２，２３２）やヒドロキシプロピルアクル酸エステルでコートされたポリプロピレン膜（Ｄａｎｉｅｌｓ、ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９８９，４３４５）のようなＰＥＰＳ以外の接触性の固体支持媒体。アクリル酸でグラフト重合したポリエチレン棒や、伸長するペプチド鎖を固定化し、隔室化された合成をするための９６−マイクロタイターウェル（Ｇｅｙｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１，３９９８）がある。従来から使われているポリマービーズを入れた"ティーバッグ"（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，５１３１）。異なる密度の二つの異なる支持体の同時使用（Ｔｒｅｇｅａｒ，「ペプチドの化学と生物学」、Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｓｃｉ，Ｐｕｂｌ．，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，１９７２，ｐｐ．１７５〜１７８）。マニフォールドを介した反応管の併合（Ｇｏｒｍａｎ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４，１３６，３９７）。多カラムによる個相合成（例えば、Ｋｒｃｋｎａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，１９８９，３３，２０９やＨｏｌｍ  ａｎｄ  Ｍｅｌｄａｌ，「第２０回ヨーロッパペプチドシンポジウム議事録」、Ｇ．Ｊｕｎｇ  ａｎｄ  Ｅ．Ｂａｙｅｒ，ｅｄｓ．，Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  &  Ｃｏ．，Ｂｅｒｌｉｎ，１９８９、ｐｐ．２０８〜２１０）。セルロース紙（Ｅｉｃｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８９，５４，１７４６）。ペプチドの支持媒体を用いた合成もまた報告されている（「合成ペプチド、使用者ガイド」、Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．Ｇｒａｎｔ，Ｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２；米国特許出願公開第ＵＳ−Ａ−４，４１５，７３２号；第４，４５８，０６６号；第４，５００，７０７号；第４，６６８，７７７号；第４，９７３，６７９号；第５，１３２，４１８号；第４，７２５，６７７号と第Ｒｅ−３４，０６９号）。
【０２３６】
支持体結合によるオリゴヌクレオチドの合成は、伸長する鎖の一方の末端でのヌクレオチドの連続的な付加に頼る。典型的には、最初のヌクレオシド（環外にあるアミンの官能性基に保護基を持った）が適当なガラスビーズの支持体に貼り付けられ、適切に活性化された亜リン酸エステル部分をもった、すなわち"活性化リン基"（典型的には、ヌクレオチドホスホアミダイトであってこれもまた適切な保護基をもつ）が段階的に加えられ、オリゴヌクレオチドの鎖を伸長する。固相合成の方法の追加分はＣａｒｕｔｈｅｒｓの米国特許出願公開第４，４１５，７３２号；第４，４５８，０６６号；第４，５００，７０７号；第４，６６８，７７７号；第４，９７３，６７９号；そしてＫｏｓｔｅｒの米国特許出願公開第４，７２５、６７７号と第Ｒｅ．３４，０６９号に見られる。
【０２３７】
オリゴマー化合物とそれに関連した化合物の支持体に基づく合成に、日常的に使われる、市販の装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を含む数社の業者によって販売されている。技術分野で知られている、このような合成のための、その他のどんな方法をも付け加えたり、あるいは代用してもよい。自動化された合成技術を含め、適切な固相技術については、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  （ｅｄ．）「オリゴヌクレオチドと類似体、実践方法」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載がある。
【０２３８】
ここで用いられる「結合部分」という用語は一般的に、二官能性の基を指し、エンドの３’ヌクレオシド（従ってオリゴヌクレオチドの発端）を合成中、固体の支持媒体に共有結合させるが、５’−保護基あるいは、適応するなら、いかなる２’−保護基が除去される条件に直交するような条件下では切断される。適切な結合部分には、それらに限定されるものではないが、アルキレン、シクロアルキレン、アリレン、ヘテロシクリル、ヘテロアリレンのような二価の基や上述したようなその他の可変部が含まれる。典型的なアルキレン結合部分には、それらに限定されるものではないが、Ｃ１−Ｃ１２アルキレン（例えば好ましくは、メチレン、エチレン（例えば、エチル−１，２−エン））、プロピレン（例えば、プロピル−１，２−エン、プロピル−１，３−エン）、ブチレン（例えば、ブチル−１，４−エン、２−メチルプロピル−１，３−エン）、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、デシレン、ドデシレン）等である。典型的なシクロアルキレン基には、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンタニル−１，３−エン、シクロヘキシル−１，４−エンなどのようなＣ３−Ｃ１２シクロアルキレン基が含まれる。典型的なアリレン結合部分には、それらに限定されるわけではないが、例えば、フェニル−１，２−エン、ナフチル−１，６−エン、ナフチル−２，７−エンやアントラセニルのような６個から１２個の炭素原子をもった一環系または二環系アリレン基が含まれる。本発明の範囲に含まれる典型的なヘテロ環基には、約４から１２個の炭素原子を持ち、またそこで環部分が部分的に脱水素化されるが、約１から４個の、Ｎ，ＯそしてＳのようなヘテロ原子を有する一環系または二環系のアリル基が含まれる。本発明の範囲内であるとされるある種のヘテロアリル基には、ピロリジニル、ピペリジニル（例えば、２，５−ピペリジニル、３，５−ピペリジニル）、ピペラジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキナゾリニル、テトラヒドロキノキサリニル等が含まれる。典型的なヘテロアリレン基には、約４から約１２個の炭素原子と、Ｎ，ＯやＳのようなヘテロ原子を持った一環系または二環系のアリル基が含まれる。本発明の範囲に含まれるとされるある種のヘテロアリル基には、ピリジレン（例えば、ピリジル−２，５−エン、ピリジル−３，５−エン）、ピリミジニル、チオフェニル、フラニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル等が含まれる。
【０２３９】
ＨＯＣＯ−Ｑ−ＣＯ基を導入する適切な試薬には、ジアシド（二酸）（ＨＯ２Ｃ−Ｑ−ＣＯ２Ｈ）が含まれる。とくに適切なジアシドには、マロン酸（Ｑはメチレン）、コハク酸（Ｑは１，２−エチレン）、グルタール酸、アジピン酸、ピメリン酸、フタール酸が含まれる。上記のＨＯＣＯ−Ｑ−ＣＯ基を導入するその他の適切な試薬にはジアシドの無水物が含まれる。特に適切なジアシドの無水物には、無水マロン酸、無水コハク酸、無水グルタール酸、無水アジピン酸、無水ピメリン酸、無水フタール酸が含まれる。ＨＯＣＯ−Ｑ−ＣＯ基を導入するその他の適切な試薬には、ジアシドエステル、ジアシドハロゲン化物等が含まれる。特に好ましいＨＯＣＯ−Ｑ−ＣＯ基を導入する試薬の一つは、無水コハク酸である。
【０２４０】
化学式に示される化合物は、ＨＯＣＯ−Ｑ−ＣＯ基のエンドのカルボキシル基を介して、支持媒体の反応基に結合されてもよい。実施形態のあるものでは、エンドのカルボキシル基は、支持体表面のアミンとアミド結合を形成する。別の実施形態では、エンドのカルボン酸は、支持媒体のＯＨ基とエステルを形成する。ある実施形態においては、エンドのカルボン酸は、エンドの酸のハロゲン化物、酸のエステル、酸の無水物等で置き換えられても良い。特異的な酸のハロゲン化物には、カルボン酸の塩化物、臭化物やヨウ化物が含まれる。特異的なエステルには、フォルミル、アセチル、プロパノイルや他のＣ１−Ｃ１０アルカノイルエステルが含まれる。
【０２４１】
本発明はまた、少なくとも一つの２’−Ｏ−保護のヌクレオシドをここで記述されるオリゴマー化合物に組み込む調製法も含む。組み込みと適切な脱保護の後に、２’−保護のヌクレオシドは組み込まれた位置で、リボヌクレオシドに変換される。最終的なオリゴマー化合物においての２−リボヌクレオシド単位の数と配置は、どの位置においても一つからそれ以上であり得るし、または、完全に２’−ＯＨで修飾されたオリゴマー化合物を調製するような対策をとることもできる。オリゴマー化合物の合成に従う全ての２’−保護基は本発明に含まれる。一般的に、保護されたヌクレオシドは、例えば、コハク酸エステル結合によって、固体支持相に付加される。続いて、５’−エンドのヒドロキシル基に脱保護と更に続くヌクレオシド単位のカップリング、キャッピングと酸化（あるいは硫黄化）の繰り返しのサイクルでオリゴヌクレオチドが伸長される。さらにより頻回に使われる方法では、完成したオリゴヌクレオチドは、アンモニア溶液で処理されることにより、リン酸保護基と環外アミノ保護基を除去して、固体支持相から切断される。２’−ヒドロキシル基の保護に使われた、より特殊な保護基には、さらに続く脱保護のステップが必要とされ、それによって、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドが得られる。
【０２４２】
オリゴリボヌクレオチドの合成に多数の２’−Ｏ−保護基が使われてきたが、長年のうちに、より効果的な基が判明されてきた。効果的な２’−Ｏ−保護基としての鍵は、選択的に２’−Ｏ−位に導入されうることと、合成後に、不必要な副生成物を生成すること無しに、用意に除去されうることである。保護基はまた、オリゴリボヌクレオチド合成に必要とされる通常の脱保護、カップリングやキャッピングのステップに対して不活性である必要がある。オリゴリボヌクレオチド合成に最初に使用された脱保護基の幾つかには、テトロヒドロピラン−１−イルそして４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イルが含まれる。これら二つの基は、全ての５’−Ｏ−保護基には適合しないので、その修飾された基が１−（２−フルオロ−フェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）のような５’−ＤＭＴと用いられた。Ｒｅｅｓｅは、１−［（クロロ−４−メチル）フェニル−４’−メトキシピペリジン−４−イル（Ｒｅｅｓｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９８６，（２７），２２９１）を含めた、オリゴリボヌクレオチドの合成に有用なピペリジン誘導体（Ｆｐｍｐのような）を多数同定した。別のやり方は、標準的な５’−ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）基を、レブリニルや９−フルオレニルメトキシカルボニルのような非酸性条件下で除去された保護基で置き換えるやり方である。このような基は、オリゴリボヌクレオチド合成に、酸に不安定な２’−保護基の使用を可能にする。最初にオリゴリボヌクレオチドの合成に使われ、より広く用いられたもう一つの保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基（Ｏｇｉｌｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９７４、２８６１；Ｈａｋｉｍｅｌａｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９８１，（２２），２５４３、そしてＪｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ，２７６２）であった。２’−Ｏ−保護基は、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル基が、切断／脱保護の全てのステップの後で、オリゴマー化合物をテトラブチルアンモニウムのフッ化物（ＴＢＡＦ）で処理することにより除去されるように、その除去に特殊な試薬を必要とし得る。
【０２４３】
研究者のあるグループは、２’−保護基の数を調べた（Ｐｉｔｓｃｈ，Ｓ．，Ｃｈｉｍｉａ，２００１，（５５），３２０〜３２４）。そのグループは、中程度の条件下で除去されるフッ化物に不安定な基、光に不安定な基について調べた。調べられた光に不安定な基のグループは、［２−（ニトロベンジル）オキシ］メチル（ｎｂｍ）保護基であった（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９２，（２），１０１９）。調べられた他のグループにはホルムアルデヒドアセタール誘導体に構造的に関連した２’−保護基が含まれた。また調製されたのは、２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）３，ＴＯＭ）を含めた２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシドのリン酸アミドエステルの調製に関連した多数の保護基であった。ＴＯＭ基に直交的に用いるために調製された２’−Ｏ−保護基の一つは、２’−Ｏ−［（Ｒ）−１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシメチル］（（Ｒ）−ｍｎｂｍ）であった。
【０２４４】
フッ化物に不安定な５’−Ｏ−保護基（酸安定性）と酸に不安定な２’−Ｏ−保護基を使用するための別の方策が報告されている（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，（２３），２０６〜２１７）。５’−Ｏ−保護のために可能性のある多数のシリルエーテルが、２’−Ｏ−保護のために多数のアセタールとオルトエステルが調べられた。最も結果がよかった保護策は、５’−シリルエーテル−２’ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシル）シクロドデシルオキシシリル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−Ｏ−アセトキシエトキシ）メチルエーテル（ＡＣＥ）であった。このやり方は、ＲＮＡ／ＤＮＡの合成に日常的には使用されない異種の試薬を必要とするホスホアミダイトの修飾合成法を用いることによる。
【０２４５】
多くの研究がオリゴリボヌクレオチドの合成にあてられてきたにも関わらず、商業的に現在使われている主要なＲＮＡ合成法には、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］（ＦＰＭＰ）、２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−ＯＳｉ（ｉＰｒ）３（ＴＯＭ）、そして２’−ＡＣＥ  ５’−シリル  エーテル（（ＤＯＣ）−２’−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシロキシシリルエーテル（ＡＣＥ）が含まれる。現在ＲＮＡ製品を販売している主要な会社のリストには、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、及びＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃが含まれる。そのような会社の一つであるＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓは、ＲＮＡ合成活性剤を、特にＴＯＭとＴＢＤＭＳの化学においてカップリング時間を短縮するとして、販売している。そのような活性剤もまた、本発明に含まれるであろう。
【０２４６】
商業的なＲＮＡ合成に使われている主要な基は、
ＴＢＤＭＳ＝５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル；
ＴＯＭ＝２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル；
ＤＯＤ／ＡＣＥ＝（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシルオキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル；
ＦＰＭＰ＝５‘−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］である。
【０２４７】
前述のＲＮＡ合成法の全ては本発明に入れられる。例えば、一つの方法から５’−保護基を用い、別の方法から２’−Ｏ−保護基を用いるような、上記の方法の組み合わせからなる方法もまた本発明に入れられる。
【０２４８】
本発明の標的
本発明に関して、アンチセンスオリゴマー化合物が、特定の核酸分子を標的とするには複数の過程によるであろう。その過程は、通常、その機能を調節するべき標的の核酸の同定から始まる。この核酸標的は、例えば、その発現が特定の疾患や病状を伴う細胞の遺伝子（または遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、あるいは、感染作因の核酸分子である。
【０２４９】
標的を定める過程には、通常、アンチセンスの作用によって、例えば、発現の調節のような望ましい効果を引き起こしたい標的核酸内の少なくとも一つの領域、断片や部位を決定することが含まれる。本発明に関しては、「領域」という用語は、少なくとも１つの同定されうる構造、機能または特徴をもった標的核酸の一部と定義する。「断片」は、標的核酸内で、領域よりも小さい、またはその部分であると定義する。本発明に用いられる「部位」とは、標的核酸内の位置として定義される。領域、断片や部位の用語は、また、例えば、３つの別々の断片をもつギャップのあるオリゴマー化合物というように本発明のオリゴマー化合物を説明するためにも用いられる。技術分野で知られているように、翻訳開始コドンは、典型的には、５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡにおいて；５’−ＡＴＧは相当するＤＮＡ分子において）であるので、翻訳開始コドンはまた「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」あるいは「ＡＵＧ開始コドン」という。翻訳開始コドンを持つ遺伝子の少数のものは、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ，５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧや５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧや５’−ＣＵＧを開始コドンとして持ち、生体内でそれが機能性のあることが示された。従って、開始アミノ酸はそれぞれの場合に典型的には、メチオニン（真核生物において）あるいはフォルミルメチオニン（原核生物において）であるにもかかわらず、「翻訳開始コドン」や「開始コドン」という用語は多くのコドン配列を含み得る。また、真核生物や原核生物の遺伝子が、二つ以上の代替できる開始コドンを持ち、特定の細胞のタイプや組織において、あるいは、特定の条件下において、そのいずれかが優先的に翻訳開始のために用いられることが技術分野では知られている。本発明に関しては、"開始コドン"や「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列には関係なく、標的核酸の遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で開始するための一つのあるいは複数のコドンをいう。また、ある遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は、三つの配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧそして５’−ＵＧＡ（相当するＤＮＡの配列はそれぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧそして５’−ＴＧＡである）の内の一つをもっているであろうことが技術分野では知られている。
【０２５０】
「開始コドン領域」と「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンからいずれかの方向に（すなわち、５’または３’）続く約２５から約５０のヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。同様に、「終止コドン領域」や「翻訳終止コドン領域」と言う用語は、翻訳終止コドンからいずれかの方向に（すなわち、５’または３’）続く約２５から約５０のヌクレオチドを含むそのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部をいう。従って、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）と「終止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は全て、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物で効果的に標的とされる領域である。
【０２５１】
技術分野では翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間の領域として知られる、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」はまた、効果的に標的とされうる領域である。本発明に関しては、一つの領域とは、ある遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを含む遺伝子内の領域をいう。
【０２５２】
その他の標的となりうる領域には、技術分野では、翻訳開始コドンから５’の方向にあるｍＲＮＡの一部として言及される、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、従って、ｍＲＮＡ（または遺伝子上の相当するヌクレオチド）の５’キャップ部位と翻訳開始コドンの間のヌクレオチドを含み、そして技術分野では、翻訳終止コドンから３’の方向にあるｍＲＮＡの一部として言及される、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、従って、ｍＲＮＡ（または遺伝子上の相当するヌクレオチド）の翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３’エンドの間のヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡのキャップ部位は、ｍＲＮＡの５’のほとんどの残基に、５’−５’三リン酸結合を介して、つながったＮ７−メチル化グアノシン残基からなる。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体に加えて、キャップ部位に隣接する最初の５０のヌクレオチドを同様に含む。５’キャップ領域を標的とすることもまた適切である。
【０２５３】
真核生物のｍＲＮＡの転写生成物のあるものは、直接翻訳されるが、多くは、翻訳の前に転写生成物から削除される「イントロン」として知られる１若しくはそれ以上の領域を有する。残りの（従って翻訳される）領域は「エキソン」として知られる領域で、連続したｍＲＮＡの配列を形成するために一緒にスプライスされる。スプライス部位、すなわちイントロン−エキソンの接合部やエキソン−イントロンの接合部、を標的とすることもまた、異常なスプライシングが疾患と関連していたり、特定のスプライス生成物の過剰産生が疾患に関連していたりするような場合には特に、有益であるかもしれない。再構成や欠失のための異常な融合による接合もまた、適切な標的部位である。異なる遺伝子に由来する二つの（またはそれ以上の）ｍＲＮＡのスプライシングの過程で作られたｍＲＮＡ転写生成物は、「融合転写生成物」として知られる。また、例えば、ＤＮＡやｍＲＮＡの前駆体を標的としたアンチセンスオリゴマー化合物で、効果的にイントロンを標的とすることができることも知られている。
【０２５４】
また、ＤＮＡの同じゲノム領域から、選択的ＲＮＡ転写生成物が生成されることも技術分野では知られている。これらの選択的転写生成物は一般的に、「変異株」として知られる。更に特異的には、"ｍＲＮＡ前駆体変異株"は同じゲノムＤＮＡから生じ、同じゲノムＤＮＡから作られた他の転写生成物とは、開始あるいは終止部位において、異なり、イントロンとエキソンの両方の配列を持つ。
【０２５５】
スプライシングの過程で、一つあるいはそれ以上のエキソンまたはイントロン、あるいはそれらの一部の切除に際して、ｍＲＮＡ前駆体変異株はより小さい「ｍＲＮＡ変異株」を生じる。従って、スプライシングの結果として、ｍＲＮＡ変異株は常にユニークな、ｍＲＮＡ変異株を生成しなくてはならない。これらのｍＲＮＡ変異株は、また"選択的スプライス変異株"としても知られる。もしもｍＲＮＡ前駆体変異株のスプライシングが起こらなければ、ｍＲＮＡ前駆体変異株はｍＲＮＡ変異株と同一である。
【０２５６】
また、変異株は、転写の開始と終止の選択的なシグナルを通じても生成され、ｍＲＮＡ前駆体やｍＲＮＡが一つ以上の開始あるいは終止コドンを持つことが技術分野では知られている。選択的な開始コドンを使って、ｍＲＮＡ前駆体またはｍＲＮＡに由来する変異株は、そのｍＲＮＡ前駆体あるいはｍＲＮＡの「選択的開始変異株」として知られる。選択的終止コドンを使う転写生成物は、そのｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的終止変異株」として知られる。選択的終止変異株の特異的なタイプの一つは、"ポリＡ変異株"で、転写機構による「ポリＡ終止シグナル」の一つを選択的に選んだためにユニークなポリＡ部位で終止する転写生成物を生じる結果として複数の転写生成物が生成される。本発明に関して、ここで説明した変異株の型はまた標的核酸として適切である。
【０２５７】
アンチセンスオリゴマー化合物がハイブリッドを形成する標的核酸上の場所は"適切な標的断片"と云う。ここで用いられる「適切な標的断片」という用語は、活性なアンチセンスオリゴマー化合物が標的とする標的領域の少なくとも８核塩基の部分として定義される。理論に縛られたくはないが、現在のところ、これらの標的断片は、ハイブリッド形成のために、近接できる、標的核酸の部分を代表すると考えられている。
【０２５８】
典型的なアンチセンスオリゴマー化合物には、例えば、細胞の遺伝子または遺伝子から転写されたｍＲＮＡのような標的核酸の５’−エンドから少なくとも連続した８核酸塩基からなるオリゴマー化合物からなる（残りの核酸塩基は、特異的に標的核酸にハイブリッド形成のできるアンチセンス化合物の５’−エンドのすぐ上流から始まり、オリゴヌクレオチドが約８から約８０の核酸塩基を含むまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続的な伸びた核酸鎖である）。同様に、アンチセンスオリゴマー化合物は、説明されたアンチセンス化合物の３’エンドから少なくとも連続的な８核酸塩基からなるオリゴヌクレオチドの配列として代表される（残りの核酸塩基は、特異的に標的核酸にハイブリッド形成のできるアンチセンス化合物の３’−エンドのすぐ下流から始まり、オリゴヌクレオチドが約８から約８０の核酸塩基を含むまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続的な伸びた核酸鎖である）。ここで述べたアンチセンス化合物の技術を持つその分野に当業者には、多くの実験なしに、アンチセンス化合物をさらに同定することが可能である。
【０２５９】
一度、１若しくはそれ以上の標的領域、断片または部位が同定されたなら、希望する効果が得られるように、標的に十分に相補的であり、すなわち、特異的で十分なハイブリッド形成が行われるようなアンチセンスオリゴマー化合物が選択される。
【０２６０】
本発明の１実施形態に従って、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物からなる一連の核酸二本鎖とその相補体が、特異的な一つあるいは複数の標的に対してデザインされる。核酸鎖のエンドは１若しくはそれ以上の天然型のあるいは修飾型の核酸塩基を付加することでさらに突出部を着けても良い。次に、二本鎖のセンス鎖がアンチセンス鎖の相補鎖としてデザインされ、合成され、それにもどちらかのエンドに修飾や付加がなされてもよい。例えば、実施形態の一つにおいては、二本鎖の両鎖は、それぞれが一方のあるいは両方のエンドに突出部をもち、中央の核酸塩基で相補的であってもよい。
【０２６１】
例えば、ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列ＩＤ番号：１）の配列をもち、デオキシチミジン（ｄＴ）の突出部をもったアンチセンスオリゴマー化合物からなる二本鎖は以下のような構造になる。
【０２６２】
【化３９】
2007514643.tif 000031
【０２６３】
ＲＮＡの二本鎖はここに開示された方法によって合成したり、例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、コロラド州）のような多数のＲＮＡ合成の会社から購入できる。ひとたび、合成されれば、相補鎖はアニールされる。一本鎖は分注され、５０μＭの濃度に希釈される。ひとたび、希釈されれば、３０μＬの各鎖と１５μＬの５ｘアニーリング緩衝液を混ぜる。緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭ  酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨｐＨ７．４で２ｍＭ  酢酸マグネシウムである。最終容量は７５μＬである。この溶液を９０°Ｃで一時間インキュベートし、１５秒間遠心分離する。遠心管を、実験的にｄｓＲＮＡ二本鎖を得る時間である一時間３７°Ｃで放置する。ｄｓＲＮＡの最終濃度は２０μＭである。この溶液は凍結保存（−２０°Ｃ）可能で、５回まで凍結融解できる。
【０２６４】
一度、調製されると、希望する合成二本鎖が標的の発現を調節できるかについての評価を行う。細胞が８０％の集密度に達したら、本発明のオリゴマー化合物の少なくとも一つをからなる合成二本鎖で細胞を処理する。９６ウェルプレートに培養された細胞については、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１低血清培養液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一度洗い、次に１３０μＬの、１２μｇ／ｍＬのリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１培養液と、希望するｄｓＲＮＡ化合物の最終濃度２００ｎＭで処理する。５時間処理した後に、培養液は新鮮な培養液で置き換える。処理１６時間後に細胞を採取し、標的の発現の減少をＲＴ−ＰＣＲで測定する。
【０２６５】
さらなる実施形態においては、ここで同定された「適切な標的断片」も、標的の発現を調節するさらに余分のオリゴマー化合物の選抜に用いられてもよい。「活性調節因子」とは、標的遺伝子をコードする核酸分子の発現を減少させたり、増加させたりする、それらのオリゴマー化合物で、適切な標的断片に相補的な少なくとも８核酸塩基からなる。選抜のためのスクリーニング法は、標的をコードする核酸の適切な標的断片に接触し、標的をコードする核酸の発現を増減する１若しくはそれ以上の活性調節因子候補を選ぶステップからなる。ひとたび、一つあるいは複数の活性調節因子が標的をコードする核酸分子の発現を調節（減少させるか、増加させるかのいずれか）できることが示されれば、その調節因子はさらに、本発明にしたがって、標的の機能についての、あるいは研究、診断または治療薬としての使用について調べられる。
【０２６６】
本発明の適切な標的断片は、本発明のそれぞれの相補的アンチセンスオリゴマー化合物とあわせて、安定な二本鎖のオリゴヌクレオチドを形成させても良い。
【０２６７】
ハイブリッド形成
本発明に関して、「ハイブリッド形成」とは、オリゴマー化合物の相補的核酸鎖との対の形成を意味する。本発明においては、対を成すメカニズムの一つは、オリゴマー化合物の核酸鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチドの塩基（核酸塩基）間の、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたはフーグスティーン逆向き水素結合とされる水素結合を含む。例えば、アデニンとチミンは水素結合の形成によって、対をつくる相補的なヌクレオチド塩基（核酸塩基）である。ハイブリッド形成は多様な状況下で起こりうる。標的の核酸に結合し、特異的な結合が希望される条件下、すなわち標的核酸の正常な機能を妨げ、活性の欠失を起こし、生体を使った（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイや疾患の治療のような生理学的条件下で、あるいは、アッセイが試験管内で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）行われるような条件下で、標的でない核酸配列に対するアンチセンス化合物の非特異的な結合をさけるために十分な相補性があれば、アンチセンスオリゴマー化合物は特異的なハイブリッド形成を行うことが出来る。本発明においては、「ストリンジェントな（厳密な）ハイブリッド形成条件」または「ストリンジェントな（厳密な）条件」とは、本発明のオリゴマー化合物が、その標的配列に対してハイブリッド形成をするが、他の配列には最小限にしかハイブリッド形成をしないような条件を云う。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、ことなる状況下では変化し、本発明に関しては、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリッド形成する「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の特性と組成および調査試験に使われるアッセイによって決定される。
【０２６８】
ここで用いられる「相補的」とは、二者の存在位置には関わり無く二つの核酸塩基の精確な対の構成能を云う。例えば、もしもオリゴマー化合物のある位置の核酸塩基が、ＤＮＡ，ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド分子のような標的核酸分子上の、ある位置の核酸塩基と水素結合を形成することができるなら、オリゴヌクレオチドと標的核酸間の水素結合の位置は相補的位置であると考えられる。オリゴマー化合物とＤＮＡ、ＲＮＡまたはヌクレオチド分子は、それぞれの分子上の十分な数の相補的位置が、互いに水素結合で結合できる核酸塩基によって占められていれば、さらに相互に相補的となる。従って、"特異的にハイブリッド形成の出来る"および「相補的」という用語は、オリゴヌクレオチドと標的核酸間に安定で特異的な結合がおこるように、精確な対の形成あるいは相補性の程度が十分であることを意味するために用いられる。
【０２６９】
アンチセンスオリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリッド形成を行いうるために、標的核酸の配列に１００％相補的である必要はないことが技術分野では知られている。さらに、オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド形成を妨害したり、隣接する断片は含まれない、一つあるいはそれ以上の断片にハイブリッド形成をすることがある（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）。本発明のアンチセンスオリゴマー化合物は少なくとも、約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％あるいは少なくとも約９９％の配列相補性を、標的とする標的核酸内の標的領域に対して持つものである。例えば、アンチセンスオリゴマー化合物の２０の核酸塩基農地１８が標的領域に相補的であり、従って特異的にハイブリッド形成するアンチセンスオリゴマー化合物は、９０％の相補性を持つと表示される。この例において、残りの非相補的な核酸塩基はクラスターをなしていたり、相補的核酸塩基とともに散在していたりしてもよく、互いにあるいは相補的な核酸塩基に隣接していなくてもよい。そのような、長さが１８核酸塩基であり、標的核酸と完全な相補性をもつ二つの領域に隣接された４つの非相補的核酸塩基をもったアンチセンスオリゴマー化合物は、標的核酸と７７．８％の全体的な相補性を持つとされ、本発明の範囲に含まれる。アンチセンスオリゴマー化合物の標的核酸領域との％相補性は、技術分野では知られているブラスト（ＢＬＡＳＴ）（基本的な局所的アラインメントの探索ソフトウェア）やパワーブラスト（ＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴ）のようなソフトウェアで日常的に決定できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３〜４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．，１９９７，７，６４９〜６５６）。
【０２７０】
スクリーニングと標的の評価
いくつかの実施形態において、「適切な標的断片」が選択されたタンパク質の発現を調節するさらに付加されるオリゴマー化合物のスクリーニングのために用いられてもよい。「活性調節因子」はタンパク質をコードする核酸分子の発現を増減させるオリゴマー化合物であり、適切な標的断片に相補的な、少なくとも８核酸塩基からなる。選抜のためのスクリーニング法は、標的をコードする核酸の適切な標的断片に接触し、タンパク質をコードする核酸の発現を増減する１若しくはそれ以上の活性調節因子候補を選ぶステップからなる。一度、一つあるいは複数の活性調節因子がペプチドをコードする核酸分子の発現を調節（減少させるか、増加させるかのいずれか）できることが示されれば、その調節因子はさらに、本発明にしたがって、そのペプチドの機能についての、あるいは研究、診断または治療薬としての使用について調べられる。
【０２７１】
本発明の適切な標的断片は、本発明のそれぞれの相補的アンチセンスオリゴマー化合物とあわせて、安定な二本鎖のオリゴヌクレオチドを形成させても良い。そのような二本鎖のオリゴヌクレオチド部分は、標的の発現を調節し、アンチセンスのメカニズムによって、ＲＮＡの処理過程と同様に翻訳を規制することが技術分野では示された。さらに、二本鎖の部分は化学修飾の対象ともなる（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６〜８１１；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ、２００１、２６３、１０３〜１１２；Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９８、２８２、４３０〜４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２〜１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９９，１３，３１９１〜３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４〜４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００１，１５，１８８〜２００）。例えば、そのような二本鎖部分は標的への二本鎖のアンチセンス鎖によるクラシックなハイブリッド形成によって標的を阻害し、それによって標的の酵素分解を惹き起こしたことが示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４〜６９７）。
【０２７２】
本発明のオリゴマー化合物はまた、薬の発見や薬の標的の評価の分野にも応用されうる。本発明はオリゴマー化合物と個々に同定された標的の、タンパク質と病状、表現型または条件との間の関係を解明するような薬物の発見のための使用を含む。これらの方法には、サンプル、組織、細胞、または生物と本発明のオリゴマー化合物を接触させ、標的の核酸あるいはタンパク質のレベル、そして／または関連した表現型の、あるいは化学的評価事項を処理後のある時間において測定したり、任意に、測定値を未処理のサンプルや本発明のそれ以上のオリゴマー化合物で処理したサンプルと比較することからなる標的ペプチドの検出や調節が含まれる。これらの方法はまた、標的の妥当性評価の過程のための未知の遺伝子の機能を決定したり、特定の遺伝子生成物の、特定の疾患、病状あるいは表現型の治療や予防のための標的としての妥当性を決定する他の実験と並行してあるいは、合わせて、実施されることも出来る。
【０２７３】
ヌクレオシドの修飾のＲＮＡｉ活性への影響は既存の文献に従って評価された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００１），４１１，４９４〜４９８；Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｃｅｌｌ（２００２），１０７，４１５〜４１６；そしてＢａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０００），１０１，２３５〜２３８）。
【０２７４】
キット、研究用試薬、診断薬と治療薬
本発明のオリゴマー化合物は、診断薬、治療薬、予防薬そして研究用試薬やキットとして利用可能である。さらに、極めて精巧な特異性で遺伝子発現を阻害できる、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、当業者によって、特定の遺伝子の機能を解明したり、生物学的経路の多様な因子間の機能を区別するために、用いられる。
【０２７５】
キットや診断薬としての使用については、本発明のオリゴマー化合物は、単独であるいは他のオリゴマー化合物や治療薬と組み合わせて、細胞内および組織内に発現される遺伝子の一部または全体の発現パターンを解明する、相違による、そして／または組み合わせによる分析手段として使用することが出来る。
【０２７６】
限定されない例の１つとして、１若しくはそれ以上のアンチセンスオリゴマー化合物で処理された細胞や組織での発現パターンをアンチセンスオリゴマー化合物で処理されていない対照の細胞や組織のそれと比較し、得られたパターンを、例えば、疾患とのつながり、シグナル経路、細胞局在、発現レベル、調べている遺伝子の構造または機能に関連させて、遺伝子発現のレベルの相違によって分析する。これらの分析は、刺激を加えた細胞や加えない細胞において、そして発現パターンに影響する他の化合物そして／または他のオリゴマー化合物の存在下あるいは非存在下に実施できる。
【０２７７】
技術分野で知られる遺伝子発現の分析法の例には、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（Ｂｒａｚｍａ  ａｎｄ  Ｖｉｌｏ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，１７〜２４；Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２〜１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続的分析）（Ｍａｄｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５〜４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化されたＤＮＡの制限酵素による増幅）（Ｐｒａｓｈａｒ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９９９、３０３，２５８〜７２）、ＴＯＧＡ（全体的な遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７〜８１）タンパク質アレイとプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２〜１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｈｐｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００〜１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定（Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２〜１６；Ｌａｒｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、Ｆｕｃｈｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１〜９８；Ｌａｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００、４１，２０３〜２０８）、消去式クローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（Ｊｕｒｅｃｉｃ  ａｎｄ  Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６〜２１）、比較ゲノムハイブリッド形成（Ｃａｒｕｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６〜９６）、ＦＩＳＨ（蛍光原位置ハイブリッド形成）技術（Ｇｏｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５〜９０４）、そして質量分析法（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５〜４１）が含まれる。
【０２７８】
本発明のオリゴマー化合物は、タンパク質をコードする核酸にハイブリッド形成をするので、研究や診断に有用である。例えば、タンパク質の効果的な阻害剤としてここに開示されるような条件下で、そのような効率をもってハイブリッド形成することが示されたこれらのオリゴマー化合物はまた、遺伝子の増幅や検出のそれぞれの条件下で効率の良いプライマーやプローブとなる。これらのプライマーやプローブは、タンパク質をコードする核酸分子の特異的検出に必要な方法や核酸分子の検出のための増幅、或いはさらに進んだ研究での使用のために有用である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、特にプライマーやプローブの核酸とのハイブリッド形成は技術分野では知られている方法で検出できる。そのような方法には、オリゴヌクレオチドの酵素への複合体形成、オリゴヌクレオチドの放射性標識またはその他適切な検出方法が含まれてもよい。サンプルにおいての選択的なタンパク質のレベルを検出する、そのような検出手段を用いるキットもまた調製されてもよい。
【０２７９】
アンチセンスの特異性と感度は、その分野の当業者における治療上の手段としても使用される。アンチセンスオリゴマー化合物は、ヒトを含む動物の病状の治療におけるその一部として使われてきた。リボザイムを含めて、アンチセンスオリゴヌクレオチド薬は、安全に効果的にヒトに投与されてきたし、多くの臨床試験が現在、進行中である。従って、アンチセンスオリゴマー化合物が有用な治療形態であり、細胞、組織、動物、特にヒトの治療のための治療法として有益であるような形状を整えることが可能である。
【０２８０】
治療薬としては、選択的なタンパク質の発現を調節することで治療できる疾患や異常の疑いのある、ヒトを含めた動物は、本発明に従って、アンチセンスオリゴマー化合物の投与によって治療される。例えば、限定されない実施形態の例においては、その方法は、治療の必要のある動物に治療上の有効量のタンパク質阻害剤を投与するステップからなる。本発明のタンパク質阻害剤は、タンパク質の活性を、あるいはタンパク質の発現を有効に阻害する。実施形態のある例では、動物や細胞において、タンパク質の活性または発現が少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、あるいは１００％阻害される。
【０２８１】
例えば、タンパク質の発現の減少は、動物の血清、脂肪組織、肝臓やその他のいずれかの体液、組織あるいは器官においても測定できる。分析される体液、組織または器官にある細胞はタンパク質をコードする核酸分子または、そのタンパク質自体を含んでいる。
【０２８２】
本発明のオリゴマー化合物は、有効量のオリゴマー化合物を適切な医薬品として許容可能な希釈剤や担体に加えて、医薬品組成として利用できる。オリゴマー化合物の使用と本発明の方法はまた予防のためにも有用であろう。
【０２８３】
また別の実施形態の一例では、本発明は、本発明の化合物を、ここに開示したいずれかのあるいは全ての疾患と病状の治療のための医薬品の製造に使用することを提供する。
【０２８４】
製剤処方
本発明のオリゴマー化合物は全ての医薬品として許容可能な塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含めた動物への投与に際して、生物学的に活性な代謝生成物やその残基を提供できる（直接的に、または間接的に）そのほかの全ての化合物を含む。従って、例えば、本開示は、本発明のオリゴマー化合物のプロドラッグや医薬品として許容可能な塩、そのようなプロドラッグの医薬品として許容可能な塩やそしてその他の生物学的同等物にもまた及ぶものである。
【０２８５】
「プロドラッグ」という用語は、不活性な型で調製され、生体内あるいは細胞内で、内因性の酵素やその他の化学物質の作用、そして／または条件によって、活性体（すなわち薬物）に変換される医薬品を意味する。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ版は、１９９３年１２月９日に公開されたＧｏｓｓｅｌｉｎらによる国際出願番号第ＷＯ９３／２４５１０号あるいはＩｍｂａｃｈらの国際出願番号第ＷＯ９４／２６７６４号と米国特許出願公開第５，７７０，７１３号に開示された方法によるＳＡＴＥ［（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）リン酸エステル］誘導体である。
【０２８６】
「薬学的に許容可能な塩」という用語は、生理学的に、そして薬理学的に許容できる本発明のオリゴマー化合物の塩をいい、すなわち、所望する生物学的活性を保持して、望ましくない副作用をもたらさない塩である。オリゴヌクレオチドに関して、医薬品として許容可能な塩とそれらの使用については米国特許出願公開第６，２８７、８６０号にさらに記載があり、その全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
本発明について、その実施形態の幾つかにより、特異性について説明したが、以下の実施例は本発明をさらに説明するためのものであって、本発明の範囲を限定する意図はない。
【０２８８】
合成スキーム
本発明の化合物と過程は、本発明の化合物がそれによって調製されてよい方法を図解する以下の合成方法案との関連において、さらに良く理解されるであろう。
【０２８９】
スキーム２：チオ糖の合成。
【０２９０】
【化４０】
2007514643.tif 000032
【０２９１】
ａ）０．５％ＨＣｌのメタノール溶液；ｂ）ＢｎＢｒ、ＮａＨ、ＤＭＦ；ｃ）２Ｎ  ＨＣｌ、還流；ｄ）ＮａＢＨ４；ｅ）ＴＢＤＰＳ−Ｃｌ、ピリジン；ｆ）ｐ−ニトロ安息香酸、ＰＰｈ３、ジイソプロピルアゾイジカルボン酸エステル、ＴＨＦ；ｇ）ＮａＯＭｅ，次にＴＲＥＡＴ．ＨＦ；ｈ）ＭｓＣｌ，ピリジン、次にＮａ２Ｓ．９Ｈ２Ｏ、ＤＭＦ、１００°Ｃ；ｉ）ＢＣｌ３、ジクロロメタン、−９８°Ｃ。Ｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２，７２３３−７２４３を参照。
【０２９２】
スキーム３：４’−チオ−Ｕアミドリン酸エステルの合成。
【０２９３】
【化４１】
2007514643.tif 000033
【０２９４】
ｊ）ＴＩＰＤＳ（Ｃｌ）２、ピリジン；ｋ）２，４−ジメトキシベンゾイルクロライド、ピリジン；ｌ）ｍＣＰＢＡ、ＣＨ２Ｃｌ２（Ｒ：Ｓ＝３：１、で回収率８０％）またはオゾン分解、−７８°Ｃ（Ｒ：Ｓ＝１６：１、で回収率７５％）またはＴｉ（ＩＶ）イソピロポキサイド、ｔ−ＢｕＯＯＨ、Ｌ−ジエチル酒石酸エステル、−２０°Ｃ（選択的にＲを得る；回収率９０％）；ｍ）ウラシル、ＴＭＳ−トリフラート、ｎ）ＴＲＥＡＴ．ＨＦ、ＴＥＡ；ｏ）ＮａＯＭｅ；ｐ）ＤＭＴ−Ｃｌ、ＤＭＡＰ；ｑ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、硝酸銀、ピリジン、ＴＨＦ；ｒ）β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイト、ＤＭＦ。
【０２９５】
スキーム４：４’−チオ−Ｃホススホアミダイトの合成。
【０２９６】
【化４２】
2007514643.tif 000034
【０２９７】
ａ）プンメラーの条件；ｂ）ＴＲＥＡＴ．ＨＦ；ｃ）ＤＭＴ−Ｃｌ、ピリジン；ｄ）ジオキサン−アンモニア；ｅ）ＴＭＳ−Ｃｌ、ピリジン、Ｂｚ２Ｏ、ＴＲＥＡＴ．ＨＦ；ｆ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、硝酸銀、ピリジン、ＴＨＦ；ｇ）β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ．Ｎ’Ｎ’−テトライソプロピルリン酸アミド、ＤＭＦ。
【０２９８】
スキーム５：４’−チオ−Ｇアミドリン酸エステルの合成。
【０２９９】
【化４３】
2007514643.tif 000035
【０３００】
ａ）プンメラーの条件；ｂ）ＴＲＥＡＴ．ＨＦ；ｃ）ＤＭＴ−Ｃｌ、ピリジン；ｄ）ジオキサン−アンモニア；ｅ）ＴＥＳ−Ｃｌ、ピリジン、塩化イソ酪酸、ＴＲＥＡＴ．ＨＦ；ｆ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、硝酸銀、ピリジン、ＴＨＦ；ｇ）β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイト、ＤＭＦ。
【０３０１】
スキーム６：２’−ＯＭｅ−４’−チオ−Ｕの合成。
【０３０２】
【化４４】
2007514643.tif 000036
【０３０３】
ａ）ＴＩＰＤＳＣｌ２、ピリジン；ｂ）テトラブチルアンモニウムブロマイド、ＣＨ２Ｃｌ２、Ｎａ２ＣＯ３溶液、ジクロロエタン、ベンゾイルクロライド；ｃ）酸化銀、ヨードメタン；ｄ）ＴＲＥＡＴ．ＨＦ、ＴＥＡ，メタノール性アンモニア；ｅ）ＤＭＴ−Ｃｌ、ピリジン。
【０３０４】
スキーム７：２’−ＯＭｅ−４’−チオ−Ｃの合成。
【０３０５】
【化４５】
2007514643.tif 000037
【０３０６】
ａ）ＴＩＰＤＳＣｌ２、ピリジン；ｂ）ＰＯＣｌ３、ＴＥＡ、ＣＨ３ＣＮ、次にＮＨ４ＯＨ、ジオキサンｃ）ベンゾイルテトラゾールＣＨ３ＣＮ、６０°Ｃｄ）ＴＲＥＡＴ．ＨＦ、ＴＥＡ；ｅ）ＤＭＴ−Ｃｌ、ピリジン。
【０３０７】
スキーム８：２’−フルオロ−４’−チオ−ウラシルの合成。
【０３０８】
【化４６】
2007514643.tif 000038
【０３０９】
ａ）ジフェニル炭酸エステル、重炭酸ナトリウム、ＤＭＡ、加熱；ｂ）テトラブチルアンモニウムフルオライド、ＴＨＦ、加熱；ｃ）ベンジリデンジメチルアセタール、カンファースルホン酸、ＤＭＦ；ｄ）１Ｎ  ＮａＯＨ、水／ジオキサン、還流；ｅ）ノナフルオロブタンスルフォニルフルオライド、ＤＢＵ、トルエン、加熱；ｅ）ＴＣＡ、メタノール。
【０３１０】
実施例
本発明の化合物と過程は実施例を用いて、特に好ましい実施形態についてさらにその詳細が説明されるが、これらは説明のためにのみ示されるものであって、本発明の範囲を限定する意図ではないことは了解の上である。開示された実施形態に対する多様な変更や修飾ができることは技術分野の専門家には明らかであり、制限なしに、本発明の化学構造、置換基、誘導体、製剤処方、そして／または方法を含むそれらの変更や修飾は、本発明の真意や添付の請求項の範囲から外れることはない。
【実施例１】
【０３１１】
１−Ｏ−メチル−Ｄ−リボース（２）
【０３１２】
【化４７】
2007514643.tif 000039
【０３１３】
Ｄ−リボース（５００ｇ、３．３３ｍｏｌｅｓ）を１．５Ｌの、０．５％の塩酸を含む乾燥させたメタノールに溶解させ、炭酸カルシウム乾燥管をとりつけたフラスコ内で４８時間攪拌した。反応混合物をダウエックス（ＯＨ型）樹脂でｐＨ７に中和した。反応混合物をろ過し、減圧下に濃縮して、真空下に一夜乾燥させ、９８％の収率で化合物２（５５０ｇ）を得た。
【実施例２】
【０３１４】
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−１−Ｏ−メチル−Ｄ−リボース（３）
【０３１５】
【化４８】
2007514643.tif 000040
【０３１６】
化合物２（１５０ｇ、０．９１４ｍｏｌｅ）を乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ、１．５Ｌ）に、機械的攪拌棒と余分の漏斗を装備した三つ首フラスコ中で、窒素気流下に溶解させた。溶液を氷槽中で０°Ｃに冷却した。ＮａＨ（２２０ｇ、ミネラルオイルに６０％となるように分散させた液、５．４８ｍｏｌｅ、６ｅｑ．）を、反応を制御し、過剰過熱をさけるようにすこしづつ加えた。ＮａＨをすべて加えた後に、ベンジルブロマイド（６５０ｍＬ、５．４８ｍｏｌｅ、６ｅｑ．）を余分の漏斗から滴下した。全てのベンジルブロマイドが加えられた時点で、反応を室温まで戻し、５時間攪拌した。次に反応を６０°Ｃまで加熱して、その温度で一夜攪拌した。反応をメタノールで止め、真空下に乾燥させ、エーテルと水の間に分配した。エーテル層を１０％クエン酸溶液で一度洗い、飽和重炭酸ナトリウム溶液で一度洗い食塩水で一度洗った。そのエーテル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮して、淡黄色のシロップを得た。このシロップを５％酢酸エチルを含むヘキサンに溶解させ、２Ｌの半融ガラス漏斗に詰めたシリカゲルにかけた。５％酢酸エチルを含むヘキサンを使い希望する生成物を２Ｌの分画に溶出した。めざす分画を減圧下に濃縮し化合物３（３００ｇ）を収率７５％で得た。
【実施例３】
【０３１７】
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｄ−リビトール（４）
【０３１８】
【化４９】
2007514643.tif 000041
【０３１９】
化合物３（３００ｇ、０．６８８ｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、化合物４（２００ｇ）を収率７０％で得た。
【実施例４】
【０３２０】
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｄ−リビトール（５）
【０３２１】
【化５０】
2007514643.tif 000042
【０３２２】
氷冷した化合物４（２００ｇ、０．４７ｍｏｌｅ）の乾燥ピリジン（１Ｌ）溶液を、窒素気流下に、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロライド（１３０ｍＬ、０．５０ｍｏｌｅ、１．０５ｅｑ．）に激しく攪拌しながら、ゆっくりと加えた。反応混合物を室温まで冷まして、一夜攪拌した。反応をメタノールで止め、溶媒を減圧下に除去した。残渣を酢酸エチルにとり、水（二度）、１０％クエン酸溶液、飽和重炭酸ナトリウム溶液そして食塩水で次々に洗った。酢酸エチルの層を分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮して、化合物５（４００ｇ）を収率９８％で得た。この物質は十分な純度を持っており、さらに精製することなく使用した。
【実施例５】
【０３２３】
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−１−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−４−Ｏ−ｐ−ニトロベンゾイル−Ｌ−リキシトール（６）
【０３２４】
【化５１】
2007514643.tif 000043
【０３２５】
化合物５（１５０ｇ、２３２．５ｍｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、化合物６（１３０ｇ）を収率７０％で得た。
【実施例６】
【０３２６】
２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−Ｌ−リキシトール（７）
【０３２７】
【化５２】
2007514643.tif 000044
【０３２８】
化合物６（１１０ｇ、１３８．５４ｍｍｏｌｅ）をメタノール（５００ｍＬ）に溶解させ、メトキシドナトリウム（１１ｇ、２０４．０ｍｍｏｌｅ、１．５ｅｑ．）を加え、その溶液を室温で２時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、残渣をエーテルと水の間に分配した。分離した有機相を食塩水で洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。残渣を真空下に３時間乾燥させ、窒素気流下に乾燥ＴＨＦに溶解させた。トリエチルアミン（ＴＥＡ）（１００ｍＬ、０．７５２ｍｏｌｅ、５ｅｑ．）を加え、続いて、トリエチルアミントリヒドロフルオライド（ＴＲＥＡＴ．ＨＦ）（２００ｍＬ、０．７５２ｍｏｌｅ，１０ｅｑ．）を加え、混合物を室温で一夜攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をエーテルと水の間に分配した。エーテル相を食塩水で洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで（４０％酢酸エチルを含むヘキサン）精製し、５１ｇの化合物７を収率９０％で得た（文献には、収率８１％と報告されている）。
【実施例７】
【０３２９】
１，４−アンヒドロ−２，３，５−トリ−Ｏ−ベンジル−４−チオ−Ｄ−リビトール（８）
【０３３０】
【化５３】
2007514643.tif 000045
【０３３１】
化合物７（５１ｇ、１２１．０ｍｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、４７ｇの化合物８を収率８５％で得た。
【実施例８】
【０３３２】
１，４−アンヒドロ−４−チオ−Ｄ−リビトール（９）
【０３３３】
【化５４】
2007514643.tif 000046
【０３３４】
化合物８（４７ｇ、１１２ｍｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、化合物９（１３ｇ）を収率８０％で得た。
【実施例９】
【０３３５】
１，４−アンヒドロ−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−Ｄ−リビトール（１０）
【０３３６】
【化５５】
2007514643.tif 000047
【０３３７】
化合物９（１５ｇ、１００．０ｍｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、化合物１０（２４ｇ）を収率８０％で得た。
【実施例１０】
【０３３８】
１，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−Ｄ−リビトール（１１）
【０３３９】
【化５６】
2007514643.tif 000048
【０３４０】
化合物１０（２４ｇ、６１ｍｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、化合物１１（３０ｇ）を収率９０％で得た。
【実施例１１】
【０３４１】
１，４−アンヒドロ−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−スルフィニル−Ｄ−リビトール（１１ａ）
【０３４２】
【化５７】
2007514643.tif 000049
【０３４３】
本化合物は、新しい経路で（同様な先行技術で、不斉１，３−ジチオレインヌクレオシド類似体を合成するＲｏｍｕａｌｏ  Ｃａｐｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００３、３４６〜３５０の方法に従った）調製された。Ｔｉ（ＩＶ）イソプロポキシド（０．３ｍＬ、１．１０ｍｍｏｌｅ、０．４５ｅｑ．）の乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）溶液に窒素気流下にＬ−酒石酸ジエチルエステル（０．６ｍＬ、１．１５ｍｍｏｌｅ、１．５ｅｑ．）を激しく攪拌しながら、加えた。攪拌は、室温で、澄明な麦藁色のような黄色の溶液が得られるまで２０分間続けた。この溶液を同じ温度で５分間攪拌し、化合物１０（１．３ｇ、２．３ｍｍｏｌｅ）の乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を、同じ温度で、ＴＬＣによって出発物質が完全になくなるまで２４時間攪拌した。反応を水を加えて止め、室温になるまで放置した。反応混合物を分離漏斗に移し、食塩水とジクロロメタンの間で分配した。食塩水の層をジクロロメタンで数回抽出し、その抽出液を合わせて無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。濁った溶液をセライトを通してろ過し、減圧下に濃縮してシロップとした。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで、ジクロロメタン中の５から１５％の勾配の酢酸エチル溶液を用いて溶出し、化合物１１（１．２ｇ）を収率９０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲは、生成物が希望する（Ｒ）異性体のみを含み、文献値に相当することを示した。生成物は、残存するＬ−酒石酸ジエチルエステルを含んでいたが、この不純物は次のステップを妨げないので、さらに精製することなしに使用した。
【実施例１２】
【０３４４】
１−［２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（１２）
【０３４５】
【化５８】
2007514643.tif 000050
【０３４６】
化合物１１（１．２ｇ、２．１ｍｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、化合物１２（１．３ｇ）を収率９０％で得た。
【実施例１３】
【０３４７】
１−（４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（１３）
【０３４８】
【化５９】
2007514643.tif 000051
【０３４９】
化合物１２（１．２ｇ、１．９０ｍｍｏｌｅ）を窒素気流下で乾燥ＴＨＦに溶解させた。ＴＥＡ（１．３ｍＬ、９．５ｍｍｏｌｅ、５ｅｑ．）とＴＲＥＡＴ．ＨＦ（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌｅ、１０ｅｑ．）を加え、混合物を室温で４−５時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をトルエンと３回共蒸発させた。メタノール性アンモニア（２０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で一夜攪拌した。溶媒は減圧下に除去し、残渣はフラッシュクロマトグラフィーで（１０％メタノールのジクロロメタン溶液）精製し、化合物１３（４２０ｍｇ）を収率９０％で得た。
【０３５０】
化合物１３はまた、文献上の方法（Ｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、）をほとんど修飾しないで用いて合成し、収率が有意に増加する結果が得られた。
【実施例１４】
【０３５１】
１−［５−（４，４‘−ジメトキシトリチル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（１４）
【０３５２】
【化６０】
2007514643.tif 000052
【０３５３】
化合物１３（２ｇ、７．７５４ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２０ｍＬ）に溶解させ、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（２．９ｇ、８．５３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で一夜攪拌した。反応をメタノールで止め、酢酸エチル（２００ｍＬ）にとった。酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で二度洗い、水で一度、食塩水で一度洗って無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（７％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製した。希望する分画を集めて濃縮し、化合物１４（３．０ｇ）を８０％の収率で得た。化合物１４の構造は、１Ｈ  ＮＭＲとＥＳＭＳで確認した。
【実施例１５】
【０３５４】
１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（１５ａ−ｃ）
【０３５５】
【化６１】
2007514643.tif 000053
【０３５６】
化合物１４（４．３ｇ、７．６６ｍｍｏｌ）、硝酸銀（３．１ｇ、１８．５ｍｍｏｌ），無水ピリジン（４．５ｍＬ、５６．０ｍｍｏｌ）とＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（２．８ｇ、１８．５７ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（７５ｍＬ）に溶解させ、室温で一夜攪拌した。沈殿した塩化銀をセライトで濾過して除き、ＴＨＦで数回洗った。洗液を合わせて濃縮し、発泡体を得、それをフラッシュクロマトグラフィー（４０％酢酸エチルのヘキサン溶液）で精製して、化合物１５ａ（３．２ｇ、６３％）、１５ｂ（１．２ｇ、２３％）と１５ｃ（０．４３ｇ、８．３％）を得た。それらの構造を１Ｈ  ＮＭＲ  で確認した。
【実施例１６】
【０３５７】
１−（３−Ｏ−（２−シアノエトキシ（ジホスホリルアミノ）ホスフィノ）−５−（４，４‘−ジメトキシトリチル）−２−ｔｅｒｔ．ブチルジメチルシリル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（１６）
【０３５８】
【化６２】
2007514643.tif 000054
【０３５９】
化合物１５ａ（２．５ｇ、３．７ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１３ｍＬ）溶液に，乾燥１Ｈ−テトラゾール（０．２ｇ、２．８ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．０７７ｇ、０．９ｍｍｏｌ）と２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイト（１．６ｇ、５．３０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で８時間攪拌した。それをＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）にとり、食塩水で洗った（５ｘ５０ｍＬ）。有機層を濃縮し、その結果のオイルをカラムクロマトグラフィーにかけ、１０％アセトンのジクロロメタン溶液で溶出して精製した。適切な分画を集めて、濃縮して泡を形成させ、それを高真空下で二日間乾燥させて、純粋なアミダイトを２．９６ｇ、収率９１．６％で得た。１Ｈ  および３１Ｐ  ＮＭＲは化合物１６の正しい構造であることを示した。
【実施例１７】
【０３６０】
Ｎ４−アセチル−１−［２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン（１７）
【０３６１】
【化６３】
2007514643.tif 000055
【０３６２】
化合物１１（１．２ｇ、２．１ｍｍｏｌｅ）をＮａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理して、化合物１７を得た。
【実施例１８】
【０３６３】
１−（４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）シトシン（１８）
【０３６４】
【化６４】
2007514643.tif 000056
【０３６５】
化合物１７（１ｅｑ．）を窒素気流下に乾燥ＴＨＦに溶解させた。ＴＥＡ（１．３ｍＬ、９．５ｍｍｏｌｅ、５ｅｑ．）とＴＲＥＡＴ．ＨＦ（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌｅ、１０ｅｑ．）を加え、混合物を室温で４から５時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をトルエンと三回共蒸発させた。メタノール性アンモニア（２ｍＬ）を加え、反応混合物を室温で一夜、攪拌した。溶媒を除去して、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで（１０％メタノールの、０．１％ＴＥＡ  を含むＣＨ２Ｃｌ２溶液）精製し、化合物１８を得た。
【実施例１９】
【０３６６】
１−［２，３−ジ−Ｏ−５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（１９）
【０３６７】
【化６５】
2007514643.tif 000057
【０３６８】
化合物１４（３．０ｇ、５．３６ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン（２５ｍＬ）に溶解させた。無水酢酸（５ｍＬ、５３．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で１６時間攪拌した。反応をメタノールで止め、酢酸エチルにとった（１００ｍＬ）。酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で二度洗い、水で一度、食塩水で一度洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製した。希望する分画を集めて、濃縮し、化合物１９（２．５ｇ）を収率７５％で得た。
【実施例２０】
【０３６９】
１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン（２０）
【０３７０】
【化６６】
2007514643.tif 000058
【０３７１】
１，２，４−トリアゾール（３．７３ｇ、５４ｍｍｏｌ）を乾燥アセトニトリル（４２ｍＬ）に懸濁させ、氷槽中で０°Ｃに冷やした。ＰＯＣｌ３（１．４４ｍＬ，１５．４ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら滴下して加えた。ＴＥＡ（１０．７３ｍＬ、７７ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながらゆっくりと加え、混合物を室温でさらに３０分間攪拌した。化合物１９の（２．４３ｇ、３．８５ｍｍｏｌ）の乾燥アセトニトリル（１４ｍＬ）溶液を加え、混合物を０°Ｃで２時間室温で攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチルにとった。酢酸エチル溶液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で二度洗い、食塩水で一度洗って、無水炭酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下に除去し、残渣をジオキサン（４０ｍＬ）にとって、３０％水酸化アンモニウム溶液（２０ｍＬ）を加えた。混合物を、封をしたフラスコ内で一夜、室温で攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製して、化合物２０（２．０ｇ）を収率７５％で得た。
【実施例２１】
【０３７２】
Ｎ−ベンゾイル−１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン（２１）
【０３７３】
【化６７】
2007514643.tif 000059
【０３７４】
化合物２０（２．０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解させ、無水安息香酸（１．６３ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一夜攪拌した。反応を、氷冷した飽和重炭酸ナトリウム溶液に注いで止め、３０分間攪拌した。混合物を分離漏斗に移し、ジクロロメタンで三回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物２１（２．０ｇ）を収率８５％で得た。
【実施例２２】
【０３７５】
Ｎ−ベンゾイル−１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン（２３）
【０３７６】
【化６８】
2007514643.tif 000060
【０３７７】
化合物２１（２００ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、硝酸銀（１００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）とＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（７０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦに溶解させ、室温で一夜攪拌した。反応物を酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、水と食塩水で洗った。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３０％酢酸エチルのヘキサン溶液）で精製し、化合物２３（１００ｍｇ）を収率４５％で得た。３−位を保護された類似体（Ｎ−ベンゾイル−１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３−（ｔ−ブチルジメチルシリル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン）もまた微量の生成物として分離された。
【実施例２３】
【０３７８】
Ｎ４−Ｂｚ−１−（３−Ｏ−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）フォスフォリノ）−５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−ｔｅｒｔ．ブチルジメチルシリル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］シトシン（２４）
【０３７９】
【化６９】
2007514643.tif 000061
【０３８０】
化合物２３（０．４９ｇ、０．６２８ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３ｍＬ）に溶解させ、乾燥させた１Ｈ−テトラゾール（０．０４ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．０１３ｇ）と２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイト（０．２８ｇ、０．９４８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で８時間攪拌し、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）にとり、食塩水（５ｘ１０ｍＬ）で洗った。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮した。結果として得られたオイルをカラムクロマトグラフィーで、１０％アセトンのジクロロメタン溶液を溶出液に用いて、精製した。適切な分画を集めて、濃縮し泡を形成させ、それを高真空下で二日間乾燥させて、純粋なアミダイトを０．５５２ｍｇ、収率８９％で得た。１Ｈと３１Ｐ  ＮＭＲによって化合物２４の正しい構造が示された。
【実施例２４】
【０３８１】
４’−チオアデノシンの合成
この化合物の合成は、Ｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００、に記載された手順に従って処理した。
【実施例２５】
【０３８２】
Ｎ６−ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎジイソプロピル−ホスホアミダイト）−４−チオ−アデノシン
この表題の化合物は、４’−チオアデノシンから、標準的な方法によって調製された（Ｃｌａｕｄｉｎｅ  Ｌｅｙｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、「アンチセンス研究と開発５」、１９９５、１６７、とそれに掲載される文献およびＣｌａｕｄｉｎｅ  Ｌｅｙｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「ヌクレオシドとヌクレオチド」、１３、１９９４、２０３５とそれに掲載される文献）。
【実施例２６】
【０３８３】
４’−チオグアノシンの合成（３３）
【０３８４】
【化７０】
2007514643.tif 000062
【０３８５】
この化合物は、化合物１１からスタートする文献上の方法によって調製された（Ｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１２２，Ｎｏ．３０，２０００）。
【実施例２７】
【０３８６】
Ｎ２−イソブチリル−５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−（シアノエトキシ−Ｎ，Ｎジイソプロピル−ホスホアミダイト）−４−チオ−グアノシン（３４）
【０３８７】
【化７１】
2007514643.tif 000063
【０３８８】
この化合物は、４’−チオグアノシンから、多数の文献上の方法の一つを使って調製された（Ｍａｓａｄ  Ｊ．Ｄａｈｍａ  &  Ｋｅｌｖｉｎ  Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅによる「分子生物学の手法」２０巻、８１頁、（とそこに掲載された文献）；「オリゴヌクレオチドとその類似体」、Ｅｄ．Ｓ．Ａｇａｗａｌ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；「オリゴヌクレオチド合成の実際的手法」（１９８４）、Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．；Ｆｒａｎｋｌｙｎ，Ｃｈｒｉｓｏｐｈｅｒ；Ｕｓｍａｎ，Ｎａｓｓｉｍ，「ｂ−シアノエチル保護リボヌクレオシドホスホアミダイトを用いた生物学的に活性なオリゴリボヌクレオチドの化学合成」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９０），１８（１８），５４３３−４１）。
【実施例２８】
【０３８９】
２’−ＯＭｅ−４’−チオ−Ｕホスホアミダイト
【０３９０】
【化７２】
2007514643.tif 000064
【０３９１】
ａ）ＴＩＰＤＳＣｌ２、ピリジン；ｂ）塩化安息香酸、テトラブチルアンモニウムブロマイド、ＣＨ２Ｃｌ２、飽和Ｎａ２ＣＯ３溶液、ジクロロメタン；ｃ）酸化銀、ヨードメタン；ｄ）ＴＲＥＡＴ．ＨＦ、ＴＥＡ、ＴＨＦ、メタノール性アンモニア；ｅ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｆ）標準的方法。
【０３９２】
１−［３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（３５）：
化合物１３（１．１ｇ、４．２３ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１０ｍＬ）に窒素気流中で溶解させ、氷槽中で冷やした。ＴＩＰＤＳＣｌ２（１．４ｍＬ、４．４４ｍｍｏｌ）を激しく攪拌しながら滴下した。同じ温度でさらに２から４時間攪拌を続けた。化合物１３の全てが使いきられた時点で、氷上に注ぐことで反応を止めた。混合物を酢酸エチルと水の間に分離し、酢酸エチル層を冷やした飽和重炭酸ナトリウム溶液で三回、食塩水で一回洗った。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（５％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物３５（１．７ｇ、収率８０％）を得た。
【０３９３】
３−Ｎ−ベンゾイル−１−［３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（３６）：
化合物３５（２５０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌｅ），Ｎａ２ＣＯ３（４２４ｍｇ，４  ｍｍｏｌｅ）とテトラブチルアンモニウムブロマイド（７ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌｅ）を二相性のＣＨ２Ｃｌ２−Ｈ２Ｏの混合液に溶解させた。塩化安息香酸（８７μＬ、０．７５ｍｍｏｌｅ）を加え、混合物を室温で化合物３５が使いきられるまで攪拌した。その混合物を分離漏斗に移した。有機相を集め、水相をＣＨ２Ｃｌ２で二回抽出した。有機抽出相を合わせて、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。残渣を１，２−ジクロロエタンにとり、６０°Ｃで１５分間加熱した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％アセトンのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物３６（２２５ｍｇ、収率７５％）を得た。
【０３９４】
３−Ｎ−ベンゾイル−１−［２−Ｏ−メチル−３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（３７）：
化合物３６（１００ｍｇ、０．１６５ｍｍｏｌｅ）を乾燥ＤＭＦに、不活性気体中で溶解させた。酸化銀（３８３ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌｅ）とヨードメタン（２００μＬ、３．３ｍｍｏｌｅ）を加え、その混合物を室温で一夜攪拌した。メタノールを加えて、反応を止め、反応混合物を酢酸エチルと水の間に分配した。酢酸エチル層を水で二回、食塩水で一回洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中の酢酸エチルの勾配）で精製し、化合物３７（６７ｍｇ、収率６５％）を得た。
【０３９５】
１−（２−Ｏ−メチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（３８）：
化合物３７（２６０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌｅ）を乾燥ＴＨＦ（１．５ｍＬ）に溶解させた。ＴＲＥＡＴ．ＨＦ（１．５ｍＬ）とＴＥＡ（０．７５ｍＬ）を加え、混合物を４時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、続いて乾燥トルエンで二回共蒸発させた。残渣をメタノール性アンモニアに（５ｍＬ）にとり、封をした試験管内で一夜攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物３８（１００ｍｇ、収率８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）、８．０（ｄ、１Ｈ）、５．９７（ｄ、１Ｈ）、５．６４（ｄ、１Ｈ）、５．２（ｂｒｓ、２Ｈ）、４．２（ｄ、１Ｈ）、３．９（ｄ、１Ｈ）、３．５８（ｄｄ、２Ｈ）、３．２６（ｓ、３Ｈ）、１．１８（ｍ、１Ｈ）。
【０３９６】
１−（５−（４，４’−ジメトキシ−トリチル）−２−Ｏ−メチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（３９）：
化合物３８（４００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌｅ）を冷やした乾燥ピリジンに溶解させた。ジメトキシトリチルクロライド（６００ｍｇ、１．７５２ｍｍｏｌｅ）を加え、その混合物を室温で２４時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し残渣をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル：ジクロロメタン＝１：１）で精製し、化合物３９（６００ｍｇ、収率７５％）を得た。
【０３９７】
２’−Ｏ−メチル−４−チオ−Ｕホスホアミダイト（４０）：
化合物３９を、標準的な方法に従って、相当するホスホアミダイト化合物１０７に変換させた（「オリゴヌクレオチド合成：実際的方法」Ｇａｉｔ、Ｍ．Ｊ．（Ｅｄ．），ＵＫ（１９８４），ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）。
【実施例２９】
【０３９８】
１−［２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４１）
【０３９９】
【化７３】
2007514643.tif 000065
【０４００】
化合物１２（１ｅｑ．）を乾燥ＴＨＦに溶解させた。ＴＥＡ（５ｅｑ．）とＴＲＥＡＴ．ＨＦ（１０ｅｑ．）を加え、その混合物を室温で６時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を真空下でトルエンと共蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４１を得た。
【実施例３０】
【０４０１】
１−［３，５−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン−２−Ｏ−（２，４−ジメトキシベンゾイル）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４２）
【０４０２】
【化７４】
2007514643.tif 000066
【０４０３】
化合物４１（１ｅｑ．）を乾燥ＤＭＦに溶解させた。ショウノウスルホン酸（０．２ｅｑ．）とｐ−メトキシアルデヒド−ジメチルアセタール（４ｅｑ．）を加え、反応液を室温で全ての出発物質がなくなるまで攪拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和重炭酸ナトリウムの溶液（２ｘ）、水（１ｘ）と食塩水（１ｘ）で洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。続いて減圧下に濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４２を得た。
【実施例３１】
【０４０４】
１−［３，５−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４３）
化合物４２をメタノール性アンモニアに溶解させ、室温で１３時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４３を得た。
【実施例３２】
【０４０５】
３’，５’−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン−４’−チオ−Ｏ２，２’  −無水ウリジン（４４）
化合物４３（１ｅｑ．）を乾燥ＤＭＦ中で、ジフェニル炭酸エステル（２１．２ｅｑ．）で処理し、９０°Ｃに加熱し、重炭酸ナトリウム（化合物４３の１ｇあたり１０ｇ）を加えた。反応を１１０°Ｃに２．５時間保ち、冷やしてろ過した。残渣を酢酸エチルで数回洗って、洗液を最初のろ液と合わせた。あわせたろ液を水（２ｘ）、食塩水（１ｘ）で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４４を得た。
【実施例３３】
【０４０６】
１−［３，５−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４５）
化合物４４（１ｅｑ．）を乾燥ＴＨＦに溶解させた。ＴＢＡＦ（１０ｅｑ．）を加え、反応混合物を、出発物質がなくなるまで還流した。溶媒を減圧下に除去し残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４５を得た。
【０４０７】
あるいは、化合物４５は化合物４４を乾燥ＤＭＦに、１８−クラウン−６（５ｅｑ．）とＫＦ（２０ｅｑ．）の存在下に、１１０°Ｃで加え、続いて上記の作業とフラッシュクロマトグラフィーを行うことによっても得られる。
【実施例３４】
【０４０８】
１［２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４６）
化合物４５を８０％のＡｃＯＨに溶解させ、室温で１０時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、トルエンとの共蒸発を二回行った。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４６を得た。
【実施例３５】
【０４０９】
１−［３，５−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル］ウラシル（４７）
化合物４４（０．３ｍｍｏｌ）をジオキサン（２ｍＬ）に溶解させ、２Ｎ  ＮａＯＨ溶液（２ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で出発物質が完全になくなるまで攪拌した。反応混合物を酢酸で中和し、減圧下で濃縮し乾燥させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物４７を得た。
【実施例３６】
【０４１０】
１−［３，５−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン−２−メタンスルフォニル−４−チオ−β−Ｄ−アラビノフラノシル］ウラシル（４８）
化合物４７（１ｅｑ．）を乾燥ピリジンに溶解させ、０°Ｃに冷却した。メタンスルホニルクロライド（１．５ｅｑ．）を加え、室温で一夜攪拌して反応させた。反応を氷上に注いで止め、水相をジクロロメタンで三回抽出した。ジクロロメタンの溶液を減圧下で濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４８を得た。
【実施例３７】
【０４１１】
１−［３，５−Ｏ−ｐ−メトキシベンジリデン−２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４５）
化合物４８（１ｅｑ．）を乾燥ＤＭＦに溶解させた。ＴＢＡＦ（１０ｅｑ．）を反応混合物に加え、出発物質がなくなるまで、１００°Ｃで加熱して反応させた。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して、化合物４５を得た。
あるいは、化合物４５は化合物４８を乾燥ＤＭＦに、１８−クラウン−６（５ｅｑ．）とＫＦ（２０ｅｑ．）の存在下に、１１０°Ｃで加え、続いて上記の作業とフラッシュクロマトグラフィーを行うことによっても得られる。
【実施例３８】
【０４１２】
１−［２−フルオロ−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（４６）
化合物４５を８０％のＡｃＯＨに溶解させ、室温で１０時間攪拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、トルエンとの共蒸発を二回行った。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４６を得た。
【実施例３９】
【０４１３】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−フルオロ−２’−デオキシ−４’−チオ−ウリジン
表題の化合物を、化合物１４のための、上記の方法を使って調製した。
【実施例４０】
【０４１４】
１−（３−Ｏ−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−５−Ｏ−（４，４‘−ジメトキシトリチル）−２−フルオロ−２−デオキシ）−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）ウラシル（４９）
【０４１５】
【化７５】
2007514643.tif 000067
【０４１６】
表題の化合物を、化合物１６のための上記の方法を使って、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’  −フルオロ−２’−デオキシ−４’−チオ−ウリジンから調製した。
【実施例４１】
【０４１７】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−［２−（メトキシ）エチル］−４’−チオウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホアミダイト（５３）
【０４１８】
【化７６】
2007514643.tif 000068
【０４１９】
（Ａ）（ＰｈＯ）２ＣＯ、ＮａＨＣＯ３、ＤＭＡ、１００°Ｃ；（Ｂ）Ａｌ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅ）３、還流、４８時間；（Ｃ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、ピリジン、ＲＴ：（Ｄ）テトラゾール、ＮＭＩ、ホスフィチル化試薬、ＤＭＦ、ＲＴ。
【０４２０】
化合物１３をジフェニル炭酸エステルおよび重炭酸ナトリウムとジメチルアセトアミド中で１００°Ｃに加熱して化合物５０を得る。化合物５０を無水２−メトキシエタノールおよびアルミニウム２−メトキシトキシドと還流すると化合物５１が得られる。化合物５１の、触媒量のＤＭＰＡの存在下にピリジン中で、５’位での選択的トリチル化することによって化合物５２を得、それを３’位でホスフィチル化することで化合物５３を得る。
【実施例４２】
【０４２１】
Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−［２−（メトキシ）エチル］−４’−チオウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホアミダイト（５６）
【０４２２】
【化７７】
2007514643.tif 000069
【０４２３】
（Ａ）ＴＭＳＣｌ、ピリジン、１，２，４−トリアゾール、ＰＯＣｌ３、Ｅｔ３Ｎ、ＣＨ３ＣＮ、ＮＨ４ＯＨ／ジオキサン；（Ｂ）ＤＭＦ、無水安息香酸、ＲＴ；（Ｃ）１−Ｈテトラゾール、ＮＭＩ、ホスフィチル化試薬、ＤＭＦ。
【０４２４】
化合物５２の３’−ヒドロキシル基を、ピリジン中でＴＭＳＣｌで処理して、トリメチルシリル基で一時的に保護する。この一時的に保護された化合物をさらに、アセトニトリル中で１，２，４−トリアゾールとＰＯＣｌ３で処理して塩基の４−位のトリアゾール化合物を得る。トリアゾールエステルをジオキサン中で水酸化アンモニウムで処理して、化合物５４を得、それを室温でＤＭＦ中で無水安息香酸で処理して化合物５５に変換させる。化合物５５のホスフィチル化で化合物５６を得る。
【実施例４３】
【０４２５】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−［２−（メトキシ）エチル］−Ｎ２−イソブチリル−４’−チオグアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホアミダイト（６６）
【０４２６】
【化７８】
2007514643.tif 000070
【０４２７】
（Ａ）Ｃｓ２ＣＯ３、トルエン−スルフォン酸−２−エチルエステル、ＤＭＦ；（Ｂ）アデノシンデアミナーゼ、リン酸緩衝液、ｐＨ７．５、ＲＴ；（Ｃ）ＴＭＳＣｌ、ピリジン、塩化イソブチリルに続いてＮＨ４ＯＨ；（Ｄ）ＤＭＴＣｌ、ピリジン、ＤＭＡＰ；（Ｅ）１−Ｈテトラゾール、ＮＭＩ、ＤＭＦ、２−シアノエチル−テライソプロピルホスホアミダイト、ＲＴ。
【０４２８】
化合物６６は、合成方法案１３に説明した。化合物６１は、ＤＭＦ中でＣｓ２ＣＯ３およびトルエン−４−スルフォン酸−２−メトキシエチルエステルで処理することにより化合物６２を生じる。化合物６２をｐＨ７．５のリン酸緩衝液中でアデノシンデアミナーゼで処理することで化合物６３を得る。化合物６３の環外アミノ基はイソブチリル基の処理で、一時的な保護を受け化合物６４を生じる。化合物６４は室温で、触媒量のＤＭＡＰの存在下にピリジン中でＤＭＴＣｌで処理すると化合物６５を得る。化合物６５のホスファチル化は化合物６６を生じる。
【実施例４４】
【０４２９】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−Ｏ−スクシニル−４’−チオウリジン（６７）
化合物１５ｂ（０．２６ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を無水コハク酸（０．０６ｇ、０．５７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．０２ｇ、０．２ｍｍｏｌ）に混合し、減圧下、４０°Ｃで一夜乾燥させた。混合物を無水ＣｌＣＨ２−ＣＨ２Ｃｌ（１ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（０．１１ｍＬ、０．８ｍｍｏｌ）を加えた。その溶液を室温でアルゴン気流下に７時間攪拌した。次にＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）で希釈し、氷冷したクエン酸水溶液（１０ｗｔ％、２０ｍＬ）と食塩水（２０ｍＬ）で洗った。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮してさらに乾燥させた。こうして得られた残渣をシリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて精製した。カラムを１０％ＭｅＯＨのＣＨ２Ｃｌ２溶液で溶出し、標題の化合物を収率８３％で単離した（０．２４ｇ）：Ｒｆ０．１（５０％酢酸エチルのヘキサン溶液）。
【０４３０】
１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ２）δ０．０６（ｓ、３Ｈ）、０．０７（ｓ、９Ｈ）、２．４５−２．６７（ｍ、４Ｈ）、３．３５−３．５０（ｍ、２Ｈ）、３．７９（ｓ、６Ｈ）、４．３２（ｄ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１９（ｄｄ、Ｊ＝３．２と５．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．５５（ｄ、Ｊ＝８．２０Ｈｚ、１Ｈ）、６．４５（ｄ、Ｊ＝８．８０Ｈｚ、４Ｈ）、６．８４（ｄ、Ｊ＝８．８Ｈｚ、１Ｈ）、７．２３−７．４５（ｍ、９Ｈ）、７．５９（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、１０．１２（ｂｒ  ｓ、１Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（５０ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ−４．３、−４．８、２５．５、２８．５、２９．０、５５．１、６０．６、６０．３、６４．９、７３．６、７７．４、８７．２、１０３．２、１１３．２、１２７．０、１２７．９、１２８．１、１３０．１，１３５．０、１３５．３、１４０．８、１４４．２、１５１．３、１５８．６、１６３．８、１７１．３，１７５．７；ＭＳ（ＦＡＢ）ｍ／ｚ７９９．２０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【実施例４５】
【０４３１】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−４’−チオウリジン−２’−Ｏ−スクシニルＣＰＧ（６８）
化合物６７を、標準的な合成法（ＴＢＴＵによる官能化ＣＰＧの合成：Ｂａｙｅｒ，Ｅ；Ｂｌｅｉｃｈｅｒ，Ｋ；Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．；Ｚ．Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．，１９９５，５０ｂ，１０９６〜１１００）に従って、アミノアルキル規制細孔ガラス（ＣＰＧ）にかけて官能化された固体支持相６８（４９μｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０４３２】
【化７９】
2007514643.tif 000071
【実施例４６】
【０４３３】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−［２−（メトキシ）エチル］−Ｎ６−ベンゾイル−４’−チオアデノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル］ホスホアミダイト（６９）
【０４３４】
【化８０】
2007514643.tif 000072
【０４３５】
化合物６９は、まず４’−チオアデノシン（実施例２４）をＣｓ２ＣＯ３とトルエン−４−スルフォン酸２−メトキシ−エチルエステルをＤＭＦ中で処理して、２’−Ｏ−メトキシエチル中間体を提供することで調製した。この物質はさらにピリジン中でＴＭＳＣｌで一時的に保護を行い、塩化ベンゾイルでさらに処理してＮ６−Ｂｚ保護の中間体を得る。そのＮ６−Ｂｚ中間体の５’−ヒドロキシル基はジメトキシトリチルクロライドを使って選択的に保護される。ＤＭＴ保護の化合物は、実施例１６に前述したように、２−シアノエトキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホアミダイトを使って標準的な条件下でホスフィチル化されて、標題の化合物が得られる。
【実施例４７】
【０４３６】
４’−チオ修飾ＲＮＡ合成
４’−チオ修飾を行ったオリゴヌクレオチドが合成された。無水アセトニトリル中の０．１Ｍのアミダイトが修飾ヌクレオチドの合成に使われた。ホスホアミダイトは二回に分けて加え、一回毎にカップリングのための待ち時間を５分かけた。標準的な２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳホスホアミダイトと市販の固体支持相（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）をＡ，Ｃ，ＧとＴの組み込みに用いた。ヌクレオチド間の亜リン酸エステルトリエステルをリン酸トリエステルに変える酸化はｔｅｒｔ−ブチルヒドロ過酸化物／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用い待ち時間を１０分かけた。他の全てのステップについては、ミリポアのプロトコールを修飾しないで用いた。カップリングの効率は９７％以上であった。合成を終えた後で、ＣＰＧを水酸化アンモニウムの水溶液（３０ｗｔ．％）：エタノール（２：１）に懸濁し、室温で２時間放置した。ＣＰＧをろ過し、ろ液を５５°Ｃで６時間加熱して、２’位のＴＢＤＭＳ基以外の保護基を全て除去した。残渣を無水ＴＥＡ．ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１ｍＬの１．５ｍＬＮ−メチルピロリドン、７５０μｌＴＥＡ，１ｍｌＴＥＡ．３ＨＦを混ぜて１．４ＭＨＦ溶液としたもの）中で６５°Ｃで１．５時間加熱して２’位のＴＢＤＭＳを除去した。反応を１．５Ｍ重炭酸アンモニウム（１ｍＬ）で止め、混合物をセファデックスＧ−２５のカラム（ＮＡＰ  カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）にかけた。オリゴヌクレオチドを水で溶出し、オリゴヌクレオチドを含む分画を集めて、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、ウォータース、Ｃ−１８、７．８ｘ３００ｍｍ、Ａ＝１００  ｍＭトリエチルアンモニウムアセテート、ｐＨ＝７、Ｂ＝アセトニトリル、４０分間に５から１０％、続いて６０％Ｂを６０分間、流速２．５ｍＬｍｉｎ−１，λ＝２６０ｎｍ）で精製した。完全鎖のオリゴヌクレオチドを含む分画を集めて（ＣＧＥ分析で評価して>９０％）蒸着させた。残渣を滅菌１０Ｍ酢酸アンモニウム溶液に（０．３ｍＬ）溶解させた。エタノール（１ｍＬ）を加えて、冷却して−７８°Ｃで一時間放置して、沈殿を形成させ、その沈渣をマイクロヒュージ（ＮＹＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１５Ｃ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ニューヨーク州）を使って３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で１５分間、遠心分離した。上清を傾けて捨て、その沈渣を集めた。沈殿したオリゴヌクレオチドを滅菌水（０．３ｍＬ）に溶解させ、エタノール（１ｍＬ）を加え、その混合物を−７８°Ｃで１時間冷却して沈殿させた。分離された修飾オリゴヌクレオチドの収率は３０−３５％であった。オリゴヌクレオチドはＥＳ  ＭＳで性格付けし、純度は毛細管ゲル電気泳動とＨＰＬＣ（ウォータース、Ｃ−１８、３．９ｘ３００ｍｍ、Ａ＝１００ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ＝７、Ｂ＝アセトニトリル、４０分間に５から６０％Ｂ、流速１．５ｍＬｍｉｎ−１、λ＝２６０ｎｍ）で評価した。
【実施例４８】
【０４３７】
２’−ＯＭｅ−４’−チオ−Ｕホスホアミダイトの合成（４０）
【０４３８】
【化８１】
2007514643.tif 000073
【０４３９】
（ａ）ジフェニル炭酸エステル、重炭酸ナトリウム、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、加熱；（ｂ）トリメチルホウ酸エステル、トリメチルオルトホウ酸エステル、重炭酸ナトリウム、メタノール、加熱；（ｃ）塩化４，４’−ジメトキシトリチル、ピリジン、ＤＭＡＰ、；（ｄ）２−シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン、塩化メチレン
２、２’−無水−４’−チオ−ウリジン（５０）：
４’−チオ−ウリジン（１３）（１ｇ、３．８ｍｍｏｌｅ），重炭酸ナトリウム（５ｍｇ）、ジフェニル炭酸エステル（９００ｍｇ、４．０ｍｍｏｌｅ）を１０ｍＬの乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解させ、１００°Ｃで２時間加熱した。反応混合物を室温まで冷まして、急速に攪拌しながらエーテルに注いだ。その結果の沈殿を遠心分離で除き（８００ｍｇ、収率７６％）そのままつぎのステップに使った。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．８（ｄ、１Ｈ）、６．２（ｄ、１Ｈ）、５．８２（ｍ、２Ｈ）、５．４（ｄ、１Ｈ）、５．２（ｍ、１Ｈ）、４．６（ｍ、１Ｈ）、３．２−３．４（ｍ、３Ｈ）。ＥＳＭＳ＝２４３（ＭＨ＋），計算値はＣ９Ｈ１０Ｎ２Ｏ４Ｓ＝２４２．０３。
【０４４０】
２’−Ｏ−メチル−４’−チオ−ウリジン（３８）：
化合物５０（１ｇ、４．０ｍｍｏｌｅ）、トリメチルホウ酸エステル（２ｍＬ）、トリメチルオルトホウ酸エステル（１ｍＬ）、重炭酸ナトリウム（５ｍｇ）そしてメタノール（３ｍＬ）を鋼鉄製のボンベに入れ、１５０°Ｃで２日間加熱した。ボンベを室温まで冷まして、残渣を減圧下に濃縮しメタノールと数回共蒸発を行った。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物３８（８００ｍｇ、収率７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．０（ｄ、１Ｈ）、５．９５（ｄ、１Ｈ）、５．６（ｍ、２Ｈ）、５．１５−５．２５（ｂｒ、２Ｈ）、４．２（ｍ、１Ｈ）、３．８２（ｍ、１Ｈ）、３．６２（ｍ、２Ｈ）、３．５（ｓ、３Ｈ）、３．３８（ｍ、１Ｈ）。ＥＳＭＳ＝２７５（ＭＨ＋），計算値はＣ１０Ｈ１４Ｎ２Ｏ５Ｓ＝２７４．０６。
【０４４１】
５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−４’−チオ−ウリジン（３９）：
化合物３８（４００ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌｅ）を冷却した乾燥ピリジンに溶解させた。ジメトキシトリチルクロライド（６００ｍｇ、１．７５２ｍｍｏｌｅ）を加え、混合物を室温で２４時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１：１酢酸エチル：ジクロロメタン）で精製し、化合物３９を得た（６００ｍｇ、収率７５％）。１Ｈ  ＮＭＲ  ＣＤＣｌ３：δ８．０５（ｄ、１Ｈ）７．１５−７．４５（ｍ、９Ｈ）、６．８５（ｍ、４Ｈ）、６．０５（ｄ、１Ｈ）、５．４５（ｄ、１Ｈ）、４．２（ｂｒ、１Ｈ）、３．８（ｓ、７Ｈ）、３．６２（ｍ、２Ｈ）３．５５（ｓ、３Ｈ）、３．４（ｂｒ、１Ｈ）。ＦＡＢＭＳ＝５７７．２（ＭＨ＋），計算値はＣ３１Ｈ３２Ｎ２Ｏ７Ｓ＝５７６．１９。
【０４４２】
３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］−５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−４’−チオ−ウリジン（４０）：
化合物３９（４００ｍｇ、０．７ｍｍｏｌｅ）を２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイト（１２５μｌ）とジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）中で０°Ｃで２時間処理した。反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）と飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）間に分配した。酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で二回洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％アセトンのメチレンクロライド溶液）で精製し、化合物４０（４００ｍｇ、収率６０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ８．１（ｄ、０．５Ｈ）７．９（ｄ、０．５Ｈ）、７．２−７．５（ｍ、１０Ｈ）、６．８５（ｍ、４Ｈ）、６．０５（ｄｄ、１Ｈ）、５．５５（ｄｄ、１Ｈ）、４．３（ｍ、１Ｈ）、３．８（ｍ、７Ｈ）３．５５（ｍ、５Ｈ）、２．６（ｍ、１。２Ｈ）、２．４（ｍ、０．８Ｈ）、１．０−１．２（ｍ、１２Ｈ）。ＦＡＢＭＳ＝７７７．３００（ＭＨ＋），計算値はＣ４０Ｈ４９Ｎ４Ｏ８ＰＳ＝７７６．３００９。
【実施例４９】
【０４４３】
２’−ＯＭｅ−４’−チオＣホスホアミダイト
【０４４４】
【化８２】
2007514643.tif 000074
【０４４５】
ａ）ＴＩＰＤＳＣｌ２、ピリジン；ｂ）ＰＯＣｌ３，ＴＥＡ，ＣＨ３ＣＮ，続いて、１，４−ジオキサン、ＮＨ４ＯＨ；ｃ）無水安息香酸、ＤＭＡＰ、ピリジン；ｄ）ＴＲＥＡＴ．ＨＦ、ＴＥＡ、ＴＨＦ；ｅ）ＤＭＴｒ−Ｃｌ，ＤＭＡＰ，ピリジン；ｆ）２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン、メチレンクロライド
１−［３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２−Ｏ−メチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］ウラシル（１０８）：
化合物３８（７０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌｅ）を無水ピリジン（３ｍＬ）に窒素気流下に氷槽中で溶解させた。ＴＩＰＤＳ−Ｃｌ２（１６６μＬ、０．５２ｍｍｏｌｅ）を、激しく攪拌しながら、滴下して加えた。攪拌を同じ温度でさらに２から４時間続けた。化合物３８が全て使いきられた時点で氷上に注いで、反応を止めた。その混合物を酢酸エチルと水の間に分離させ、酢酸エチル層を冷えた飽和重炭酸ナトリウム溶液で３回洗って、食塩水で１回洗った。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで（５％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物１０８を得た（１２０ｍｇ、収率９０％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ８．０２（ｄ、１Ｈ）６．０２（ｄ、１Ｈ）、７．２−７．５（ｍ、１０Ｈ）、６．８５（ｍ、４Ｈ）、６．０５（ｄｄ、１Ｈ）、５．６（ｄ、１Ｈ）、４．２（ｂｒ、１Ｈ）、３．６２（ｍ、３Ｈ）３．５５（ｓ、３Ｈ）、３．４（ｂｒ、１Ｈ）、１．１−０．９（ｍ、２８Ｈ）。ＥＳＭＳ＝５１７（ＭＨ＋），計算値はＣ２２Ｈ４０Ｎ２Ｏ６ＳＳｉ２＝５１６．０２。
【０４４６】
１−［３，５−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２−Ｏ−メチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ−ベンゾイル−シトシン（１０９）：
化合物１０８（４７５ｍｇ、０．９２ｍｏｌｅ）乾燥アセトニトリル（４ｍＬ）に溶解させた。別のフラスコに１，２，４−トリアゾール（０．８９ｇ、１２．８８ｍｍｏｌｅ）を、窒素気流下に、氷槽中で０°Ｃに冷やして、乾燥アセトニトリル（１２ｍＬ）に懸濁させた。ＰＯＣｌ３（０．３３ｍＬ、３．６８ｍｍｏｌｅ）を、激しく攪拌しながら滴下して加え、続いてＴＥＡ（２．６ｍＬ、１８．４ｍｍｏｌｅ）のアセトニトリル（５ｍＬ）溶液を滴下して加えた。ＴＥＡ  を加え終わった時点から、反応混合物をさらに同じ温度でさらに３０分間攪拌した。化合物１０８の溶液を加え、０°Ｃで１時間、室温で１２時間攪拌して反応させた。反応が終わった時点で、粗生成物を酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウムに分配した。酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で二回洗い、食塩水で一回洗った。無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後に、溶媒を減圧下に除去した。その結果のオイル状の残渣を１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）にとり、アンモニア水（５ｍｌ）を加えた。封をしたフラスコで１２時間攪拌して反応させた。反応混合物を酢酸エチルと水に分配させた。酢酸エチル層を水で二回、食塩水で一回洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。その結果の粗な残渣を乾燥アセトニトリル（２２０ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌｅ）に溶解させた。ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（５５ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌｅ）と無水安息香酸（１５０ｍｇ、０．８５３ｍｍｏｌｅ）を加え、６５°Ｃで２０分間攪拌して反応させた。反応物を酢酸エチルと水に分配し、酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で三回洗い、食塩水で一回洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を減圧下に除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（５０％酢酸エチルのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物１０９（４８０ｍｇ、収率８５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ８．９（ｄ、１Ｈ）８．７（ｂｒｓ、１Ｈ）、７．９（ｄ、２Ｈ）、７．５（ｍ、３Ｈ）、５．９６（ｓ、１Ｈ）、４．１５（ｍ、３Ｈ）、３．８５（ｍ、５Ｈ）、１．１５−０．８（ｍ、２８Ｈ）。ＥＳＭＳ＝６２０（ＭＨ＋），計算値はＣ２９Ｈ４５Ｎ３Ｏ６ＳＳｉ２＝６１９．２。
【０４４７】
１−［５−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｏ−メチル−４−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル］−Ｎ−ベンゾイル−シトシン（１１０）：
化合物１０９（２００ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌｅ）を乾燥ＴＨＦに溶解させた。ＴＲＥＡＴ．ＨＦ（１．５ｍＬ）とＴＥＡ（０．７５ｍＬ）を加え、混合物を４時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、続いて、乾燥トルエンと共蒸着を二回行った。残渣をさらに二回無水ピリジン（１０ｍＬ）と共蒸着させ、五酸化リン上で一夜乾燥させた。残渣を冷やした乾燥ピリジン（５ｍＬ）に溶解させた。ＤＭＡＰ（８ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌｅ）とジメトキシトリチルクロライド（２００ｍｇ、０．６ｍｍｏｌｅ）を加えて、混合物を室温で２４時間攪拌した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１０％メタノールのジクロロメタン溶液）で精製し、化合物１１０（１８０ｍｇ、収率８０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ８．８（ｄ、１Ｈ）８．６（ｄ、１Ｈ）、７．９（ｄ、２Ｈ）、７．６−７．２（ｍ、１３Ｈ）、６．９（ｄ、４Ｈ）、６．１５（ｓ、１Ｈ）、４．２（ｂｒ、１Ｈ）、３．８（ｓ、６Ｈ）、３．７６（ｍ、１Ｈ）、３．７３（ｓ、３Ｈ）、３．６６（ｍ、３Ｈ）。ＦＡＢＭＳ＝６８０．２（ＭＨ＋），計算値はＣ３８Ｈ３７Ｎ３Ｏ７Ｓ＝６７９．２３５。
【０４４８】
３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］−５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−４’−チオ−Ｎ−ベンゾイル−シチジン（１１１）：
化合物１１０（１９０ｍｇ）を２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホアミダイト（１２５μＬ）とジイソプロピルエチルアミン（２００μＬ）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）中で０°Ｃで２時間処理した。反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）と飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）間に分配した。酢酸エチル層を飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍＬ）で二回洗って、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（３０％酢酸エチルのヘキサン溶液）で精製し、化合物１１３（１５０ｍｇ、収率７５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ８．８（ｄ、０．５Ｈ）８．６（ｄ、０．５Ｈ）、７．９（ｄ、２Ｈ）、６．９ｄ（４Ｈ）、７．６−７．２（１５Ｈ）、６．１（ｄ、１Ｈ）、４．４（ｍ、０．５Ｈ）、４．２（ｍ、０．５Ｈ）、３．９（ｍ、１Ｈ）、３．８（ｄ、６Ｈ）、３．７−３．３（ｍ、７Ｈ）２．５５（ｍ、０．５Ｈ）２．４（ｍ、０．５Ｈ）、１．３−１．０（ｍ、１２Ｈ）。ＦＡＢＭＳ＝８８０．３（ＭＨ＋），計算値はＣ４７Ｈ５４Ｎ５Ｏ８ＰＳ＝８７９．３４３１。
【実施例５０】
【０４４９】
２’−Ｏ−メチル−４’−チオ−修飾型ｓｉＲＮＡ
Ａ、Ｕ、ＧとＣ残基の組み込みには、標準的なホスホアミダイトと固体の支持相が使われた。０．１Ｍ  アミダイトの無水アセトニトリル溶液を合成に用いた。米国、ヴァージニア州のＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．から入手した、化学的リン酸化試薬を用いて、修飾オリゴヌクレオチドの５’エンドをリン酸化した。修飾オリゴヌクレオチドは、自動的固相ＤＮＡ合成装置で、官能基を持った規制細孔ガラス（ＣＰＧ上に合成された。一般的な固相支持体を用いて、エンドの２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾部分をもったオリゴヌクレオチドの合成を行った。４３アミドリン酸エステルの１２当量を二回に分け、一回ごとに６分間のカップリングの待ち時間をとって、加えた。他の全てのステップは、製造業者からのプロトコールに、修飾を加えないで従った。ｔｅｒｔ−ブチルヒドロ過酸化物／アセトニトリル／水（１０：８７：３）を用いて、ヌクレオシド間の亜リン酸をリン酸に酸化した。カップリングの効率は９７％以上であった。合成の完了後、固体支持相を水酸化アンモニウムの水溶液（３０ｗｔ．％）：エタノール（３：１）に懸濁し、５５°Ｃで６時間加熱して、２’位のＴＢＤＭＳ基以外の保護基を全て除去した。固体の支持相を濾過してろ液を集め濃縮して乾燥させた。残渣を無水トリエチルアミントリヒドロフルオライド／トリエチルアミン／１−メチル−２−ピロリジノン溶液（１ｍＬ  トリエチルアミン  トリヒドロフルオライド、７５０μｌトリエチルアミンと１．５ｍＬ  １−メチル−２−ピロリドン、を混ぜて、１．４Ｍ  ＨＦ溶液としたものの０．７５ｍＬ）中で６５°Ｃで１．５時間加熱して２’位のＴＢＤＭＳを除去した３７。反応を１．５Ｍ重炭酸アンモニウム（０．７５ｍＬ）で止め、混合物をセファデックスＧ−２５のカラム（ＮＡＰ  カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）にかけた。オリゴヌクレオチドを水で溶出し、オリゴヌクレオチドを含む分画を集めて、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で強陰イオン交換カラム（モノＱ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、１６／１０、２０ｍＬ、１０μｍ、イオン許容量０．２７〜０．３７ｍｍｏｌ／ｍＬ，Ａ＝１００ｍＭ酢酸アンモニウム、３０％アセトニトリル水溶液、Ｂ＝１．５Ｍ  ＮａＢｒのＡ溶液、４０分間に０〜６０％のＢの勾配、流速１．５ｍＬ／ｍｉｎ−１、λ＝２６０ｎｍ）を使って精製した。完全鎖のオリゴヌクレオチドを含む分画を集めて（ＣＧＥ分析で評価して>９０％）蒸着させた。残渣を滅菌水に（０．３ｍＬ）溶解させた。無水エタノール（１ｍＬ）を加えて、冷却して−７８°Ｃで一時間放置して、沈殿を形成させ、その沈渣をマイクロヒュージ（ＮＹＣｅｎｔｒｉｆｕｇｅ５４１５Ｃ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、ニューヨーク州）を使って３０００ｒｐｍ（７３５ｇ）で遠心分離した。上清を傾けて捨て、その沈渣を集めた。沈殿したオリゴヌクレオチドを滅菌水（０．３ｍＬ）に溶解させ、エタノール（１ｍＬ）を加え、その混合物を−７８°Ｃで１時間冷却して沈殿させた。上記の要領で、沈殿を遠心して集めた。オリゴヌクレオチドはＥＳ  ＭＳで性格付けし、純度は毛細管ゲル電気泳動とＨＰＬＣ（ウォータース、Ｃ−１８、３．９���３００ｍｍ、Ａ＝１００ｍＭ  酢酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ＝７、Ｂ＝アセトニトリル、４０分間に５から６０％のＢの勾配、流速１．５ｍＬｍｉｎ−１、λ＝２６０ｎｍ）で評価した。
【０４５０】
【表１】
2007514643.tif 000075
【実施例５１】
【０４５１】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−４’−チオ−ウリジンの合成。
【０４５２】
【化８３】
2007514643.tif 000076
【０４５３】
（ｉ）ＴＢＤＰＳＣｌ、Ｐｙ、ｒｔ、９１％（ｉｉ）（ＰｈＯ）２ＣＯ、ＮａＨＣＯ３、ＤＭＡ、１００°Ｃ、８０％；（ｉｉｉ）Ｂ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅ）３、ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅ、還流、２１ｈ、６３％、（ｉｖ）１Ｍ  ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液、ＴＨＦ、酢酸、（ｉＶ）ＤＭＴＣｌ、ＤＭＡＰ、Ｐｙ、ｒｔ、６０％、２−シアノエチル  ジイソプロピルクロロホスホアミダイト、ジイソプロピルエチルアミン、メチレンクロライド。
【０４５４】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−４−チオウリジン（１１２）：
４’−チオ−ウリジン（２．９５ｇ、１１．４３ｍｍｏｌｅ）をＤＭＡＰ  （０．０２ｇ、０．１５ｍｍｏｌｅ）に混ぜ、減圧下にＰ２Ｏ５上で乾燥させた。反応混合物を無水ピリジン（１５ｍＬ）に溶解させ、塩化ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（３．２７ｍＬ、１３ｍｍｏｌｅ）を加えた。反応混合物を室温で、アルゴン気流下に１２時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させた。有機相をＮａＨＣＯ３（５％、５０ｍＬ）水溶液で洗った。有機層を分離し無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下に濃縮した。得られた残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、メタノール量を増加させた（５−１０％）ジクロロメタンで溶出し、化合物１１２（５．１２ｇ、収率９１％）を泡として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．３３（ｓ、１Ｈ）、７．８４（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、７．６６−７．３３（ｍ、１０Ｈ）、５．８６（ｄ、Ｊ＝６．４  Ｈｚ、１Ｈ）、５．５８（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．４７（ｄ、Ｊ＝８．２Ｈｚ、１Ｈ）、５．３４（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．０９（ｍ、２Ｈ）、３．９７（ｍ、１Ｈ）、３．７７（ｍ、１Ｈ）、３．３５（ｍ、１Ｈ）、１．０１（ｓ、９Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）ｍ／ｚ４９９．１［ＭＨ＋］。
【０４５５】
２，２’−無水−５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−４’−チオ−ウリジン（１１３）：
乾燥させた化合物１１２（１．１ｇ、２．２０ｍｍｏｌｅ），ジフェニルカーボネイト（０．５５ｇ、２．４２ｍｍｏｌ），無水ＮａＨＣＯ３（７３．７ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌｅ）  の混合物にジメチルアセトアミド（５．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を１００°Ｃで５時間加熱した。溶媒を減圧下に蒸留して除去し、オイルを得、そのオイルをフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、５から１０％のメタノールの勾配のジクロロメタン溶液で溶出し、化合物１１３（０．８７ｇ、８２％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：７．８１（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、７．５７−７．３４（ｍ、１０Ｈ）、６．１９（ｄ、Ｊ＝６．４  Ｈｚ、１Ｈ）、５．５８（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、１Ｈ）、５．４７（ｄ、Ｊ＝７．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．９８（ｄ、Ｊ＝４．４Ｈｚ、１Ｈ）、５．３９（ｄ、１Ｈ）、５．５８（ｄ、Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．７６（ｂｒｓ、１Ｈ）、３．４０−３．７（ｍ、３Ｈ）、１．００（ｓ、９Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）ｍ／ｚ４８１．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０４５６】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−４’−チオ−ウリジン（１１４）：
化合物１１３（０．７ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）をトリス（２−メトキシエチル）ホウ酸（０．６３ｇ、２．９３ｍｍｏｌ）、ＮａＨＣＯ３（０．０２ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）と２−メトキシエタノール（７ｍＬ）に混合した。混合物を１４０°Ｃで２１時間加熱した。溶媒を減圧下に除去し、残渣と水にして、水槽の温度を５０−６０°Ｃに保って溶媒をロータリーエヴァポレーターで濃縮した。この操作を二回繰り返して、得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、ＣＨ２Ｃｌ２の５％メタノール溶液で溶出し、化合物１１４（０．５１ｇ、６６％）を発泡体として得た。１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．３８（ｓ、１Ｈ）、７．８９（ｄ、１Ｈ）、７．６７−７．４４（ｍ、１０Ｈ）、５．９２（ｄ、１Ｈ）、５．６９（ｄ、１Ｈ）、５．４６（ｄ、１Ｈ）、５．３０（ｄ、１Ｈ）、４．１７（ｍ、１Ｈ）、４．０１−３．９４（ｍ、２Ｈ）、３．８２（ｍ、１Ｈ）、３．５８（ｍ、１Ｈ）、３．５２−３．３８（ｍ、４Ｈ）、３．２０（ｓ、３Ｈ）、１．０１（ｓ、９Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）ｍ／ｚ５７９．１［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０４５７】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−４’−チオ−ウリジン（５１）：
化合物１１４（０．４９ｇ、０．８８ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（３７ｍＬ）溶液に１ＭテトラブチルアンモニウムフルオライドのＴＨＦ（１．８ｍＬ）溶液を加えた。酢酸（０．１２ｍＬ、２．０３ｍｍｏｌ）をこの混合物に加え、その結果の反応混合物を室温で３０分間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、アセトンで溶出して、化合物５１（０．２３ｇ、８３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．２（ｓ、１Ｈ）、８．０４（ｄ、１Ｈ）、５．９４（ｄ、１Ｈ）、５．６９（ｄ、１Ｈ）、５．２０（ｄ、１Ｈ）、４．１５（ｔ、１Ｈ）、４．０４（ｍ、１Ｈ）、３．６７−３．５３（ｍ、６Ｈ）、３．４７−３．３６（ｍ、２Ｈ）、３．３１（ｓ、３Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）ｍ／ｚ３４１．０［Ｍ＋Ｎａ］＋。
【０４５８】
２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−４’−チオ−ウリジン（５１）：
化合物５１（０．２７ｇ、０．８５ｍｍｏｌ）をＤＭＡＰ（０．０５ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を混ぜて、減圧下に乾燥させた。その混合物を無水ピリジンに溶解させ、４，４’−ジメトキシトリチルクロライド（０．３６ｇ、１．０６ｍｍｏｌ）を加えて、その結果の溶液を不活性ガス気流下に室温で２０時間攪拌した。溶媒を減圧下に除去し、得られた残渣をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解させ、ＮａＨＣＯ３（５ｗｔ％、４０ｍＬ）の水溶液と食塩水で洗った。。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下に蒸発させた。得られた残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、０−５％メタノールのＣＨ２Ｃｌ２溶液で溶出して化合物５２（０．３２ｇ、６１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：１１．３９（ｓ、１Ｈ）、７．７６（ｄ、１Ｈ）、７．７４−７．１５（ｍ、９Ｈ）、６．９０（ｄ、４Ｈ）、５．８９（ｄ、１Ｈ）、５．５０（ｄｄ、１Ｈ）、５．２５（ｄ、１Ｈ）、４．０５（ｍ、１Ｈ）、３．８８（ｍ、１Ｈ）、３．７３（ｓ、６Ｈ）、３．５３（ｍ、１Ｈ）、３．４８−３．５３（ｍ、５Ｈ）、３．１８（ｓ、３Ｈ）；ＭＳ（ＡＰＩ−ＥＳ）ｍ／ｚ６４３．２［Ｍ＝Ｎａ］＋。
【実施例５２】
【０４５９】
ヌクレオシドホスホアミダイトの合成
アミダイトおよびそれらの中間体を含めて、以下の化合物は米国特許出願公開番号第６，４２６，２２０号および国際出願番号第ＰＣＴ／ＷＯ／０２／２６７４３号に記載された方法に従って調製された；５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−チミジン中間体、５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシシチジン中間体、５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジンの最後から二番目の中間体、［５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト（５−メチルｄＣアミダイト）、２’−フルオロデオキシアデノシン、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、２’−フルオロデオキシシチジン、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾型アミダイト、２’Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン中間体、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン、最後から二番目の中間体、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト（ＭＯＥ  Ｔアミダイト）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン最後から二番目の中間体、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト（ＭＯＥ  ５−Ｍｅ−Ｃアミダイト）、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−  Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト（ＭＯＥ  Ａ  アミダイト）、［５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−イル］−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト（ＭＯＥ  Ｇ  アミダイト）、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−［（２−フタールイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルマドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒ���−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホアミダイト］、２’−ジメチルアミノ−エトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル］−５−メチルウリジンおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−［２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル］−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホアミダイト。
【実施例５３】
【０４６０】
オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオシドの合成
本発明に従って用いられるアンチセンスオリゴマー化合物は、固相合成のよく知られた技術で簡便に、日常的に合成されうる。そのような合成のための装置は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（フォスターシティ、カリフォルニア州）を含め数社の販売元から市販されている。そのような合成のための技術分野で知られるその他の全ての方法もさらに加えられたり、代わりとして使われても良い。ホスホロチオエートやアルキル化された誘導体のようなヌクレオチドの調製に同様な技術が使われることはよく知られている。
【０４６１】
オリゴヌクレオチド：非置換型、および置換型ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドは、標準的なホスホアミダイトとヨウ素による酸化を用いて、自動ＤＮＡ合成機（アプライド  バイオシステムズ  モデル３９４）で合成される。
【０４６２】
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｏ）は以下の例外事項以外は、ホスホジエステル  オリゴヌクレオチドと同様に合成される：チエート化は、亜リン酸エステル結合の酸化のための、１０％ｗ／ｖの３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドのアセトニトリル溶液を用いることで影響を受ける。チエート化の反応ステップの時間を、１８０秒に増やし、通常のキャッピングステップにすすめた。ＣＰＧカラムからの切断および濃縮水酸化アンモニウム中、５５°Ｃ（１２−１６時間）での脱ブロックの後でオリゴヌクレオチドは１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ溶液から>３容量のエタノールで沈殿させて回収する。オリゴヌクレオチドのホスフィン酸塩は米国特許出願公開第５，５０８，２７０号に記載された要領で調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４６３】
オリゴヌクレオチドのアルキルホスホン酸塩は、米国特許出願公開第４，４６９、８６３号の記載に従って、調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
オリゴヌクレオチドの３’−デオキシ−３’−メチレンホスホン酸塩は、米国特許出願公開第５，６１０、２８９または５，６２５、０５０号の記載に従って調製し、それはこの参照によって本明細書にくみこまれる。オリゴヌクレオチドのホスホアミダイトは米国特許出願公開第５，２５６、７７５号または米国特許出願公開第５，３６６，８７８号の記載に従って調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４６４】
オリゴヌクレオチドのアルキルホスホノチオエートは公開された、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号および第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ  ９４／１７０９３およびＷＯ  ９４／０２４９９として公開）の記載に従って調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４６５】
オリゴヌクレオチドの３’−デオキシ−３’−アミノホスホアミダイトは米国特許出願公開第５，４７６，９２５号の記載に従って、調製し、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４６６】
オリゴヌクレオチドのホスホトリエステルは、米国特許出願公開第５，０２３、２４３号に記載の方法で調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４６７】
ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許出願公開第５，１３０、３０２号および第５，１７７，１９８号の記載に従って調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４６８】
オリゴヌクレオシド：ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとも同定されるメチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド、ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとも同定されるメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド、そしてアミド−３−結合オリゴヌクレオシドとも同定されるメチレンカルボニルアミノオリゴヌクレオシド、そしてアミド−４−結合オリゴヌクレオシドとも同定されるメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオチドも、混ざったバックボーンの、例えば、ＭＭＩそしてＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓの結合を交互に持ったオリゴマー化合物と同様に米国特許出願公開第５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，６０２，２４０、および５，６１０，２８９号の記載に従って調製され、それは全てこの参照によって本明細書に組み込まれる。ホルムアセタルとチオホルムアセタル結合のオリゴヌクレオシドは米国特許出願公開第５，２６４，５６２号と第５，２６４，５６４号の記載に従って調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
エチレンオキシド結合オリゴヌクレシドは米国特許出願公開第５，２２３，６１８号の記載に従って調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【実施例５４】
【０４６９】
ＲＮＡ合成
一般的に、ＲＮＡ合成の化学は、策戦的な中間反応においての多様な保護基の選択的な組み込みに基づくものである。その分野の当業者は、有機合成における保護基の使用について理解するけれども、有用な部類の保護基にはシリルエーテルが含まれる。特に、かさばったシリルエーテルは、２’−ヒドロキシルの酸に不安定なオルトエステル保護基との組み合わせで、５’−ヒドロキシルを保護するために使われる。そこで、この組み合わせの保護基は標準的な固相合成技術に使われる。他の全ての合成ステップの後で、酸に不安定なオルトエステルを最後に除去することは重要である。さらに、合成中の初期にシリル保護基を使うことは、望ましくない２’ハイドロキシルの脱保護なしに、希望に応じて、容易な除去を確実にする。
【０４７０】
除去についても、化学的不安定性についてもそれぞれに異なる保護基による２’−ヒドロキシルと５’−ヒドロキシルの連続的な保護の方法に従って、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは合成された。
【０４７１】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは段階的に合成される。各ヌクレオチドは、固相支持体結合オリゴヌクレオチドに連続的に（３’から５’への方向で）加えられる。分子鎖の最初のヌクレオシドは固相支持体に、３’−エンドで共有結合されている。ヌクレオチド前駆物質であるリボヌクレオシドホスホアミダイトと活性化剤が加えられ、最初のヌクレオシドの５’−エンドに二番めの塩基がカップリングされる。支持体を洗って、未反応の５’−ヒドロキシル基は全て無水酢酸で覆われ、５’−アセチル部分となる。その結合は、さらに安定となるように酸化され、最終的には望ましいＰ（Ｖ）結合となる。ヌクレオチド付加サイクルの終わりに、５’−シリル基はフッ化物で切断される。サイクルはヌクレオチド毎に順次繰り返される。
【０４７２】
合成に続いて、リン酸エステルのメチル保護基は、１Ｍ  ２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１ジチオレート二ナトリウム三水和物（Ｓ２Ｎａ２）のＤＭＦ溶液を用いて、３０分間で切断される。脱保護溶液は、水を使って、固相支持体結合のオリゴヌクレオチドから洗い流される。次に支持体は４０％メチルアミンの水溶液で５５°Ｃで１０分間処理される。これによって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを溶液中に遊離し、環外アミンを脱保護し、２’−基を修飾する。この段階で、オリゴヌクレオチドは陰イオン交換ＨＰＬＣで分析できる。
【０４７３】
２’−オルトエステル基は、最後に除去される保護基である。ダーマコンリサーチ  インク（ラファイエット、コロラド州）によって開発されたエチレングリコールモノアセテートオルトエステルは、次のような重要な特性を持った有用なオルトエステル保護基の一例である。それは、ヌクレオシドホスホアミダイト合成やオリゴヌクレオチド合成の条件下で安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成の後で、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切断するばかりで無くまたオルトエステルからアセチル基を除去するメチルアミンで処理される。その結果として生じるオルトエステル上の２−エチル−ヒドロキシ置換基は、アセチル化された前駆体よりも電子引力が低い。その結果、修飾されたオルトエステルは、酸触媒の加水分解により不安定となる。特に、切断の速度は、アセチル基が除去された後は、ほぼ１０倍も速くなる。従って、オルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合し、なお続いて修飾された時に、最終的なＲＮＡオリゴヌクレオチド生成物に適合する比較的穏やかな水溶性の条件下で脱保護を可能とするのに十分な安定性を持っている。
【０４７４】
さらに、ＲＮＡ合成の方法は技術分野では、よく知られている（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ，１９９６；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１１８２０〜１１８２１；Ｍａｔｔｅｒｕｃｃｉ，Ｍ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９８１，１０３，３１８５〜３１９１；Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｔｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９〜１８６２；Ｄａｈｌ，Ｂ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．，１９９０，４４，６３９〜６４１；Ｒｅｄｄｙ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９４，２５，４３１１〜４３１４；Ｗｉｎｃｏｔｔ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９５，２３，２６７７〜２６８４；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，２３０１〜２３１３；Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｂ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９６７，２３，２３１５〜２３３１）。
【０４７５】
本発明のＲＮＡアンチセンスオリゴマー化合物（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）はここに掲載された方法で合成されても良いし、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．（ラファイエット、コロラド州）から購入されてもよい。一度、合成されれば、相補的アンチセンスオリゴマー化合物は技術分野で知られる方法でアニールされ、二本鎖の（二本鎖の）アンチセンスオリゴマー化合物を形成する。例えば、二本鎖はそれぞれ３０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチド（５０μＭ  ＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）と１５μｌの５Ｘ  アニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）を合わせて、９０°Ｃで１分間、次に３７°Ｃで１時間加熱することで二本鎖が形成される。その結果としての二本鎖のアンチセンスオリゴマー化合物は標的核酸の役割を調べるためのキット、アッセイ、スクリーニングやその他の方法に用いられることが出来る。
【実施例５５】
【０４７６】
キメラオリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラ型のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドやオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドの混合型には、異なった数種類のタイプがある。これらには、結合ヌクレオシドの「ギャップ」断片が結合ヌクレオシドの５’と３’の「ウィング」断片の間に位置されている最初のタイプと、"ギャップ"断片がオリゴマー化合物の３’または５’エンドのいづれかに位置する"開放エンド"の二番目のタイプが含まれる。最初のタイプのオリゴヌクレオチドは、また技術分野では、「ギャップマー‘あるいはギャップのあるオリゴヌクレオチドとしても知られる。二番目のタイプのオリゴヌクレオチドは、技術分野ではまた、「ヘミマー」あるいは「ウィングマー」として知られる。
【０４７７】
［２’−Ｏ−Ｍｅ］−［２’−デオキシ］−［２’?Ｏ−Ｍｅ］キメリックホスホロチオエートオリゴヌクレオチド：
２’−Ｏ−アルキルホスホチオエートと２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの断片をもったキメラオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの自動ＤＮＡ合成機  モデル３９４で合成される。オリゴヌクレオチドは、自動合成機で、ＤＮＡ部分に２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホアミダイトそして５’と３’のウィングに５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホアミダイトを使って合成される。標準的な合成サイクルは、カップリングステップに、５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホアミダイトの反応時間を長くすることを組み入れて修飾される。完全に保護されたオリゴヌクレオチドは支持体から切断され、濃アンモニア水（ＮＨ４ＯＨ）で５５°Ｃで１２−１６時間脱保護される。脱保護されたオリゴは次に、適切な方法で（沈殿、カラムクロマトグラフィー、真空下での減量とキャピラリー電気泳動と質量分析による収量と純度の光学的分析）によって回収される。
【０４７８】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメリックホスホロチオエートオリゴヌクレオチド：
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）］−−［２’−デオキシ］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）］キメリックホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、上記の２’−Ｏ−メチルキメリックオリゴヌクレオチドの方法によって、２’−Ｏ−メチル−アミダイトを２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アミダイトで置換して調整された。
【０４７９】
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシ  ホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメリックオリゴヌクレオチド：
［２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル］−−［２’−デオキシ  ホスホロチオエート］−−［２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル］キメリックオリゴヌクレオチドは、上記の２’−Ｏ−メチルキメリックオリゴヌクレオチドの方法によって、２’−Ｏ−メチル−アミダイトを２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アミダイトで置換し、キメラ型の構造のウィング部分にヌクレオチド間のホスホジエステル結合を形成するためにヨウ素で酸化し、３，Ｈ−１，２ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（ボーケイジ試薬）で中央のギャップにヌクレオチド間のホスホロチオエートを形成するためのスルフル化を行って調製された。
【０４８０】
その他のオリゴヌクレオチド、キメラ型オリゴヌクレオシドやオリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドの混合型は米国特許出願公開番号第５，６２３，０６５号に記載の方法によって調製され、それはこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【実施例５６】
【０４８１】
選択的標的に対する二本鎖のアンチセンスオリゴマー化合物のデザインとスクリーニング
本発明に従って、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物からなる一連の核酸二本鎖およびそれらの補足化合物は、標的に対してのデザインが可能である。二本鎖のエンドは１若しくはそれ以上の天然のあるいは修飾された核酸塩基によって、オーバーハングを形成するための付加を行って修飾されてもよい。続いて、ｄｓＲＮＡのセンス鎖が、アンチセンス鎖の補足体としてデザインされ、それもまたいずれか一方のエンドに修飾や付加を含んでいてもよい。例えば、実施形態のある例では、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両鎖は中央の核酸塩基で相補的であり、それぞれが一方のあるいは両方のエンドにオーバーハングを有する。
【０４８２】
例えば、ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧの配列をもち、デオキシチミジン（ｄＴ）の二核酸塩基オーバーハングをもったアンチセンス鎖からなる二本鎖は以下のような構造をとる。
【０４８３】
【化８４】
2007514643.tif 000077
【０４８４】
二本鎖のＲＮＡはここに開示された方法によって合成されたり、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（ラファイエット、コロラド州）から購入されたりできる。一度、合成されれば、相補鎖がアニールされる。一本鎖は、分注され、５０μＭの濃度に希釈される。希釈した後に、それぞれ３０μＬの核酸鎖を１５μＬの５ｘアニール緩衝液と混ぜる。その緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、そして２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終容量は７５μＬである。この溶液を１分間９０°Ｃでインキュベートし１５秒間遠心する。試験管を３７°Ｃで一時間放置した後に、ｄｓＲＮＡを実験に用いることが出来る。ｄｓＲＮＡの最終濃度は２０μＭである。この溶液は、凍結保存し（−２０°Ｃ）、５回まで凍結融解が可能である。
【０４８５】
一度、調製されれば、二本鎖のアンチセンスオリゴマー化合物は、標的核酸の発現調節能について評価される。
【０４８６】
細胞が８０％の集密度に達したら、本発明の二本鎖のアンチセンスオリゴマー化合物で処理される。９６ウェルプレートに増殖した細胞について、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１低血清培養液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で一回洗い、１２μｇ／ｍＬのリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と最終濃度が２００ｎＭの希望の二本鎖アンチセンスオリゴマー化合物を含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理する。処理５時間後に、培養液を新鮮な培養液に代える。細胞を処理後１６時間で採取して、ＲＮＡを単離し、標的発現の減少をＲＴ−ＰＣＲで測定する。
【実施例５７】
【０４８７】
オリゴヌクレオチド単離
微細孔ガラス支持体からの切断と、濃水酸化アンモニウム中で５５°Ｃで１２−１６時間の脱保護を行った後で、オリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオシドは、１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃから>３容量のエタノールを用いて沈殿させて回収する。合成ヌクレオチドは、エレクトロスプレイ質量分析（分子量決定）とキャピラリー電気泳動によって分析され、少なくとも全長の７０％の長さをもっているかを評価された。合成で得られたホスホロチオエートとホスホジエステル結合の量比は正しい分子量の−１６ａｍｕ生成物の比によって決定された（＋／−３２、＋／−４８）。ある例においては、オリゴヌクレオチドは、Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９１，２６６，１８１６２〜１８１７１の記載によって、ＨＰＬＣで精製された。ＨＰＬＣ精製物質で得られた結果は、ＨＰＬＣによらない精製物のそれと同様であった。
【実施例５８】
【０４８８】
オリゴヌクレオチド合成―９６ウェルプレートフォーマット
オリゴヌクレオチドが、９６ウェルフォーマットで９６配列を同時に組み立てることの出来る自動合成機で、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホアミダイトの化学によって合成された。ヌクレオチド間のホスホジエステル結合は、ヨウ素水溶液で酸化することで可能であった。ヌクレオチド間のホスホチオエート結合は、３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１ジオキシド（ボーケイジ試薬）の無水アセトニトリル溶液を用いて生成した。標準的な塩基保護ベータ−シアノエチル−ジイソ−プロピルホスホアミダイトは、販売元（例えば、ＰＥ−アプライドシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、あるいはファーマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージィ州）から購入した。標準的でないヌクレオシドは、標準的なあるいは特許上の方法で合成された。それらは、塩基保護ベータ−シアノエチル−ジイソ−プロピル  ホスホアミダイトとして使用された。オリゴヌクレオチドは支持体から切断され、温度を高めて（５５−６０°Ｃ）１２−１６時間、濃ＮＨ４ＯＨで脱保護され真空下で乾燥された。乾燥生成物は、続いて、滅菌水に再懸濁され、そこから全ての分析用あるいは試験用のサンプルがロボット製のピぺッターで希釈されるべく、マスタープレートとした。
【実施例５９】
【０４８９】
オリゴヌクレオチド分析−９６ウェルプレートフォーマット
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度はサンプルの希釈度とＵＶ分光光度法で査定された。各生成物の完全長鎖の度合いは、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）で、９６ウェルフォーマット（ベックマンＰ／ＡＣＥ（商標）ＭＤＱ）または個別に調製されたサンプルについて市販のＣＥ装置で測定した（例えば、ベックマン  Ｐ／ＡＣＥ（商標）５０００、ＡＢＩ２７０）。塩基と骨格組成はオリゴマー化合物のエレクトロスプレイ質量分析を使って質量分析で確認した。全てのアッセイテストプレートは、シングルあるいはマルチチャンネルロボット製ピペッターでマスタープレートから希釈された。プレートは、プレート上のオリゴマー化合物の少なくとも８５％が、少なくとも完全鎖の８５％のものである場合に許容できると判断された。
【実施例６０】
【０４９０】
細胞培養とオリゴヌクレオチド処理
標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の影響は、標的核酸が測定可能なレベルで発現されている提供された多様な細胞種でテストすることができる。これは例えば、ＰＣＲ  やノーザンブロット分析で日常的に決定できる。その他の細胞種も選んだ細胞種に標的核酸が発現されていることが示されれば、日常的に使用できるが、以下の細胞種が説明のために提供される。これは、例えば、ノーザンブロット、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ、あるいはＲＴ−ＰＣＲのような技術分野では決まった方法で、容易に決定できる。
【０４９１】
ヒトの移行性膀胱癌細胞株Ｔ−２４はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア州）から入手された。Ｔ−２４は、１０％牛胎児血清（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）、ペニシリン  １００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ，ストレプトマイシン  １００μｇ／ｍＬ（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）を含む完全マッコイ基礎培養液（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）で日常的に培養された。細胞は９０％の集密度に達した時点でトリプシン処理と希釈によって決まって継代された。ＲＴ−ＰＣＲ分析のためには、細胞は９６ウェルプレートに（ファルコン−プリマリア  ＃３５３８７２）に７０００ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種した。
【０４９２】
ノーザンブロット分析のためには、細胞は適当量の培養液とオリゴヌクレオチドを用いて、１００ｍｍあるいはその他の標準的な培養プレートに播種してもよい。
【０４９３】
Ａ５４９細胞：ヒトの肺癌細胞株であるＡ５４９はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（マナッサス、バージニア州）から入手した。Ａ５４９細胞は１０％牛胎児血清（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）、ペニシリン  １００  ｕｎｉｔｓ／ｍＬ，ストレプトマイシン  １００μｇ／ｍＬ（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）を含むＤＭＥＭ基礎培養液（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）で日常的に培養された。細胞は９０％の集密度に達した時点でトリプシン処理と希釈によって決まって継代された。
【０４９４】
ヒトの新生児皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）はクロネティックス  コーポレーション（ウォーカースビル、マリーランド州）から入手された。ＮＨＤＦは、供給元によって推薦された補給物質を加えた、線維芽細胞増殖培養液（クロネティックス  コーポレーションウォーカースビル、マリーランド州）で日常的に維持された。供給元から推薦されたように、細胞は１０継代まで維持した。
【０４９５】
ＨＥＫ細胞：ヒトの胎児ケラチノサイト（ＨＥＫ）はクロネティックス  コーポレーション（ウォーカースビル、マリーランド州）から入手された。ＨＥＫは供給元によって推薦された補給物質を加えたケラチノサイト増殖培養液（クロネティックス  コーポレーションウォーカースビル、マリーランド州）で日常的に維持された。供給元から推薦されたように、細胞は１０継代まで維持した。
【０４９６】
アンチセンスオリゴマー化合物による処理：細胞が６５−７５％の集密度に達した時点で、細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。９６ウェルプレートに増殖した細胞について、ウェルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１低血清培養液（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）で一回洗い、３．７５μｇ／ｍＬのリポフェクチン（インビトロジェン  コーポレーション、カールスバッド、カリフォルニア州）と希望の濃度のオリゴヌクレオチドを含む１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理した。３７°Ｃで処理４−７時間後に、培養液を新鮮な培養液に代えた。細胞をオリゴヌクレオチドで処理後１６−２４時間で採取した。
【０４９７】
用いるオリゴヌクレオチドの濃度は細胞株によって異なる。特定の細胞株についてのオリゴヌクレオチド最適濃度を決めるために、細胞は、一定の範囲の濃度の陽性コントロールであるオリゴヌクレオチドで処理される。ヒトの細胞については、陽性コントロールのオリゴヌクレオチドは、ヒトのＨ−ｒａｓを標的とするＩＳＩＳ１３９２０、（ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ、配列ＩＤ番号：５）あるいはヒトのジュン−Ｎ−エンド  キナーゼ−２（ＪＮＫ２）を標的とするＩＳＩＳ  １８０７８、（ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＴＣ、配列ＩＤ番号：６）のどちらかが選ばれる。両方のコントロールはホスホロチオエートの骨格をもつ、２’−Ｏ−メトキシエチル  ギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字で示されている）である。マウスまたはラットの細胞についての陽性コントロールはＩＳＩＳ  １５７７０、ＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡ、配列ＩＤ番号：７で、マウスとラットの両方のｃ−ｒａｆを標的とする、ホスホチオエートの骨格を持つ２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルは太字で示されている）である。ｃ−Ｈ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ  １３９２０について）、ＪＮＫ２（ＩＳＩＳ  １８０７８について）またはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ  １５７７０について）ｍＲＮＡの発現を８０％阻害した陽性コントロールの濃度を、その細胞株の次の実験の新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニングの濃度とする。もしも８０％の阻害が得られなければ、ｃ−Ｈ−ｒａｓ、ＪＮＫ２、またはｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡを６０％阻害した陽性コントロールオリゴヌクレオチドの最低濃度をその細胞株の次の実験のスクリーニング濃度とする。もしも、６０％の阻害が得られなければ、その特定の細胞株は、オリゴヌクレオチドのトランスフェクションの実験には不適であると考えられる。ここで用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は５０ｎＭから３００ｎＭである。
【実施例６１】
【０４９８】
標的核酸発現のオリゴヌクレオチドによる阻害の分析
標的核酸発現のアンチセンスによる調節は、技術分野で知られる多様な方法でアッセイ可能である。例えば、標的ｍＲＮＡのレベルは、例えば、ノーザンブロット分析、競合的ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）、あるいはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）で測定できる。リアルタイム定量的ＰＣＲが現在では望ましい。ＲＮＡ分析は全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを用いてできる。本発明のＲＮＡ分析の一方法は、ここに含めた他の実施例に記載されたように全細胞ＲＮＡを用いる方法である。ＲＮＡの単離方法は技術分野ではよく知られている。ノーザンブロット分析もまた技術分野では決まって使われる方法である。リアルタイム定量的（ＰＣＲ）方法は、ＰＥ−アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、から入手できる市販のＡＢＩプリズム（ＡＢＩＰＲＩＺＭ（商標））７６００、７７００または７９００配列検出システムを用いて、製造業者の取り扱い説明書に従って、簡便に達成できる。
【０４９９】
標的核酸のタンパク質レベルは、免疫沈降法、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）あるいは蛍光細胞分析分離法（ＦＡＣＳ）のような技術分野ではよく知られる多様な方法で定量できる。同定された標的タンパク質に対する抗体は、ＭＳＲＳの抗体カタログ（エーリー  コーポレーション、バーミングハム、ミシガン州）のような多様な入手源から入手できるし、あるいは、技術分野でよく知られたモノクローナルまたはポリクローナル抗体を作成する通常の方法で調製できる。
【実施例６２】
【０５００】
表現型アッセイのデザインと標的発現阻害剤を使用する生体実験
表現型アッセイ：一度、標的阻害剤がここに開示された方法で同定されれば、オリゴマー化合物は、特定の疾患や病状の治療において予想される薬効となる測定可能なエンドポイントをそれぞれ持った１若しくはそれ以上の表現型アッセイでさらに検討される。使用される表現型アッセイ、キットそして試薬は当業者にはよく知られていて、ここで健康と疾病状態での標的核酸の役割とそして／または関わりについて検討するために使われる数社の販売元から購入できる代表的な表現型アッセイには、細胞生存度、細胞障害性、増殖または細胞生存を決定する方法（モレキュラー  プローブ、ユージーン、オレゴン州；パーキンエルマー、ボストン、マサッチューセッツ州）、タンパク質に基づくアッセイとしては、酵素的アッセイ（パンベラ、ＬＬＣ、マジソン、ウィスコンシン州；ＢＤバイオサイエンシズ、フランクリン  レイクス、ニュージャージィ州；オンコジーン  リサーチ  プロダクツ、サンディエゴ、カリフォルニア州）、細胞調整、シグナル伝達、炎症、酸化過程、そしてアポプトーシス（アッセイ  デザインズ  インク、アン  アーバー、ミシガン州）、トリグリセライド蓄積（シグマ−アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州）、血管新生アッセイ、血管形成アッセイ、サイトカインやホルモンアッセイそして代謝アッセイ（ケミコン  インターナショナル  インク、テムキュラ、カリフォルニア州；アメルシャム  バイオサイエンシズ、ピスカタウェイ、ニュージャージィ州）などがある。
【０５０１】
限定されない実施例の一例としては、特定のアッセイに適切であると決められた細胞は（すなわち、ＭＣＦ−７細胞は乳癌の研究に選択され、脂肪細胞は糖尿病の研究に選択される）上記の方法で決定された最適濃度のコントロール化合物と生体の実験から同定された標的阻害剤で処理される。処理時間の後に、処理または無処理の細胞を、表現型の発現とエンドポイントを決定するためのアッセイに特異的な１若しくはそれ以上の方法で分析される。表現型のエンドポイントには、時間経過あるいは処理用量にわたる細胞の形態学的変化やタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖や金属類の細胞レベルの変化が含まれる。ｐＨ，細胞サイクルのステージ、細胞による生物学的インディケーターの取り込みや排泄を含む細胞の状態の測定も興味のあるエンドポイントである。
【０５０２】
細胞の遺伝子型（細胞の一つあるいはそれ以上の遺伝子の発現の測定）の処理後の変化も標的阻害剤の薬効や強度の指標となる。特徴となる遺伝子や特定の病状や条件あるいは表現型に関わることが疑われる遺伝子が処理された、あるいは処理されていない細胞の両方において測定される。
【０５０３】
生体内試験
ここで記載される生体内試験の個々の対象は、ヒトを含む温血の脊椎動物である。
【０５０４】
臨床試験は、個々の患者が不必要に危険にさらされないこと、また患者は試験においての役割について十分な情報をあたえられることを保証するために厳重な支配化に置かれる。
【０５０５】
治療を受けることの心理学的な影響を考慮して、志願者は無作為にプラシーボーまたは標的阻害剤を投与される。さらに医師が治療への先入観をもつことを防ぐために、投与薬剤が標的阻害剤であるか、プラシーボーであるかについての情報は与えられない。このような無作為化の方法を用いて、各志願者が、新しい治療を受けるかプラシーボーを受けるかについてのチャンスは同じである。
【０５０６】
標的阻害剤またはプラシーボーをうける志願者は治療の対象とする病状や条件に関連する生物学的指標をもち、それらは始め（治療前のベースライン測定）、終わり（最後の治療の後）と試験期間内の決まった時間間隔で測定される。それらの測定には、体液、組織あるいは器官における標的をコードする核酸分子と標的タンパク質のレベルの治療前のレベルとの比較が含まれる。それらに限定されるものではないが、その他の測定にはＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝と排泄）の測定と同様に、治療しようとする病状や条件の徴候、体重、血圧、疾患や毒性の薬理学的指標の血清中力価が含まれる。各患者について記録される情報は、年齢（才）、性別、身長（ｃｍ）、疾患や条件の家族歴（はい／いいえ）、動機づけの程度（ある程度／中程度の／非常に高い）や治療する病状や条件の過去の治療法が含まれる。
【０５０７】
この試験に参加する志願者は、健康な成人で（年齢１８から６５歳）ほぼ同数の男性と女性が参加する。ある種類の特徴をもった志願者は、プラシーボー群と標的阻害剤治療の群に均等に分布される。一般的に、プラシーボーの治療を受けた志願者は治療に対して、ほとんどあるいは全然反応を示さないが、標的阻害剤で治療された志願者は、試験終了時に、病状や条件が改善する傾向を示す。
【実施例６３】
【０５０８】
ＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡはＭｉｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２９９６，４２，１７５８−１７６４）の方法に従って単離された。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離の他の方法は、技術分野では日常的に使われる。簡単に言えば、９６ウェルプレートに増殖した細胞は、増殖用培養液を除去して、各ウェルを２００μｌの冷たいＰＢＳで洗った。６０μＬの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ，０．５％ＮＰ−４０、２０ｍＭ  バナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに加え、プレートを静かにゆすり、室温で５分間インキュベートした。５５μＬの溶解液をオリゴｄ（Ｔ）でコートした９６ウェルプレートに移した（ＡＧＣＴ  インク、アービン、カリフォルニア州）。プレートを室温で６０分間インキュベートし、２００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗った。最後の洗浄の後で、プレートから紙タオルで余分な洗浄緩衝液を除き、５分間空気乾燥させた。７０°Ｃに予め加熱してあった６０μＬの溶出緩衝液を（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６）を各ウェルに加えて、プレートを９０°Ｃのホットプレート上で５分間インキュベートし、溶出液を次に新しい９６ウェルプレートに移した。
【０５０９】
１００ｍｍまたはその他の標準的なプレートに増殖した細胞は、全ての溶液の適当量を使って同様に処理できる。
【０５１０】
全ＲＮＡ単離
全ＲＮＡは、キアジェン  インク（バレンシア、カリフォルニア州）から購入したアールネヌイージィ（ＲＮＥＡＳＹ９６（商標））キットを使って、製造会社の推薦する方法に従って、単離された。簡単に言えば、９６ウェルプレートに増殖した細胞については、増殖用培養液を細胞から除去し、２００μＬの冷やしたＰＢＳで各ウェルを洗った。１５０μＬのＲＬＴ緩衝液を各ウェルに加えて、プレートを激しく２０秒間ゆすった。続いて１５０μＬの７０％エタノールを各ウェルに加えて、内容物を上下に３回パイペット操作を加えた。次にサンプルを、廃液採取トレイと真空源に繋いだキアバック（ＱＩＡＶＡＣ（商標））マニホールドに接続したアールエヌイージイ（ＲＮＥＡＳＹ（商標））９６ウェルプレートに移した。真空を１分間適用した。５００μＬのＲＷ１緩衝液をＲＮＥＡＳＹ（商標）９６ウェルプレートの各ウェルに加え、１５分間インキュベートし、真空を再び１分間適用した。ＲＮＥＡＳＹ（商標）９６ウェルプレートの各ウェルにさらに５００μＬのＲＷ１緩衝液を加え、真空を分間適用した。ＲＮＥＡＳＹ（商標）９６ウェルプレートの各ウェルに１ｍＬのＲＰＥ緩衝液を加え、真空を９０秒間適用した。次にＲＰＥ緩衝液による洗浄を繰り返し、さらに分間真空を適用した。プレートを次にＱＩＡＶＡＣ（商標）マニホールドから外して、紙タオルで水気を取った。プレートを次に、１．２ｍＬの採取管を入れた採取管ラックにすえつけたキアバック（ＱＩＡＶＡＣ（商標））マニホールドに再び接続させた。続いて、１４０μＬのＲＮＡ分解酵素を含まない水を各ウェルにピペットで加えて、１分間インキュベートしてＲＮＡを溶出し、続いて真空を３分間適用した。繰り返しのピペット操作と溶出ステップは、キアジェン（ＱＩＡＧＥＮ）バイオ−ロボット９６０４（ＱＩＡＧＥＮ  ＩＮＣ．バレンシア、カリフォルニア州）を使って自動化してもよい。基本的には、細胞を培養プレート上で溶解し、プレートをロボットデッキに移して、そこでピペット操作、ＤＮＡ分解酵素処理および溶出ステップを行う。
【実施例６４】
【０５１１】
標的ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
標的ｍＲＮＡレベルの定量は、エイビーアイプリズム（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標））７６００、７７００、または７９００の配列検出システム（ＰＥ−アプライド  バイオシステムズ、フォスター  シティ、カリフォルニア州）を使って製造会社の取り扱い説明書に従って、リアルタイム定量的ＰＣＲによって達成された。これは、閉じられた系で、ゲルを用いない、蛍光検出システムで、実時間でのポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）の生成物を高処理定量することを可能としたものである。増幅生成物の定量をＰＣＲの終了時に定量する標準的なＰＣＲに反して、リアルタイムＰＣＲの生成物は蓄積しながら定量される。これは、順方向プライマーと逆方向プライマーの間で特異的にアニールし、二つの蛍光剤を含むオリゴヌクレオチドプローブをＰＣＲ反応に含めることで達成できる。レポーター蛍光剤は（例えば、ＦＡＭ  またはＪＯＥで、これらはＰＥ−アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、オペロン  テクノロジーズ  インク、アラメダ、カリフォルニア州、またはインテグレイテッド  ＤＮＡ  テクノロジーズ  インク、コラルビル、アイオワ州、のいずれかから入手した）はプローブの５’−エンドに付けられ、クエンチャー蛍光剤は（例えば、ＴＡＭＰＡで、これはＰＥ−アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州、オペロン  テクノロジーズ  インク、アラメダ、カリフォルニア州、またはインテグレイテッド  ＤＮＡ  テクノロジーズ  インク、コラルビル、アイオワ州、のいずれかから入手した）プローブの３’エンドに付けられる。プローブと蛍光剤が完全なときには、リポーター蛍光剤の発光は、３’エンドのクエンチャー蛍光剤の接近によって消光される。増幅の間に、プローブの標的配列へのアニーリングは、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性によって切断される基質を生成する。ＰＣＲ増幅の拡張期の間に、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断は、残りのプローブ（すなわちクエンチャー部分）からリポーター蛍光剤を遊離し、配列特異的な蛍光シグナルが生成される。各サイクル毎に、さらにリポーター蛍光剤分子が対応するプローブから切断され、蛍光強度が、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）配列検出システムに装備されたレーザー光学機によって規則的な間隔でモニターされる。各アッセイにおいて、未処理のコントロールサンプルからのｍＲＮＡの連続的希釈を含む一連の並行する反応が標準曲線を生じ、それがテストサンプルのアンチセンス処理後の定量的なパーセント阻害を定量するのに使われる。
【０５１２】
定量的ＰＣＲ分析に先立ち、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブのセットは、ＧＡＰＤＨ増幅反応で"多発性"でありうるかどうかを評価される。多発性であれば、標的遺伝子と内部標準遺伝子であるＧＡＰＤＨは単一のサンプル中で同時に増幅されうる。この分析においては、処理されていない細胞から単離されたｍＲＮＡは連続的に希釈される。各希釈を、ＧＡＰＤＨに特異的なプライマー−プローブのセットのみ、標的遺伝子のセットのみ（「単発性の」）、または両方のセット（多発性の）の存在下で増幅される。ＰＣＲの増幅に続いて、ＧＡＰＤＨの標準曲線と希釈関数としての標的ｍＲＮＡシグナルが、単発性の、および多発性のサンプルの両方からもたらされる。もしも多発性のサンプルからもたらされたＧＡＰＤＨと標的シグナルのスロープと相関係数が、単発性のサンプルからもたらされた相当値の１０％以内に収まれば、その標的に対するプライマー−プローブのセットは多発性であると考えられる。ＰＣＲのその他の方法も技術分野では知られている。
【０５１３】
ＰＣＲ試薬は、インビトロジェンコーポレーション（カールスバッド、カリフォルニア州）から入手した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、２０μＬのＰＣＲカクテル（２．５ｘＰＣＲ緩衝液からＭｇＣｌ２を除いたもの、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ３７５μＭのｄＡＴＰ．ｄＣＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ、それぞれ３７５ｎＭの順方向プライマーと逆方向プライマー、１２５ｎＭのプローブ、４ユニットのＲＮＡ分解酵素阻害剤、１．２５ユニットのＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５ユニットのＭｕＬＶ逆トランスクリプターゼそして２．５ｘＲＯＸ染色剤）を３０μＬの全ＲＮＡ溶液（２０−２００ｎｇ）を含む９６ウェルプレートに加えて行った。ＲＴ反応は、４８°Ｃで３０分間インキュベートすることで行われた。プラチナム（ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標））Ｔａｑを活性化するための９５°Ｃで１０分間のインキュベーションに続いて、４０サイクルの２ステップＰＣＲプロトコールを進行させた：９５°Ｃで１５秒間（変性）に続いて６０°Ｃで１．５分間（アニーリング／伸展）。
【０５１４】
リアルタイムＰＣＲで得られた遺伝子標的の定量値は、その発現が一定であるＧＡＰＤＨの発現に対して、あるいはリボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標））（モレキュラー  プローブ  インク、ユージーン、オレゴン州）を用いた合計ＲＮＡのを定量化することで規準化される。ＧＡＰＤＨの発現はリアルタイムＰＣＲによって、標的と同時に、多発性に定量されるかまたは別々に定量される。合計ＲＮＡはリボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標））定量試薬（モレキュラー  プローブ  インク、ユージーン、オレゴン州）を使って定量できる。リボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標））によるＲＮＡの定量法はＪｏｎｅｓ、Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８−３７４）の文献に示される。
このアッセイにおいては、１７０μＬのリボグリーン（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標））作業試薬（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）試薬を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．５で１：３５０に希釈）を３０μＬの精製された細胞ＲＮＡを含む９６ウェルプレートにピペットでとる、プレートをサイトフルオル（ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ）４０００（ＰＥ−アプライドバイオシステムズ）を使って、励起波長４８５ｎｍ，発光波長５３０ｎｍで読み取る。
【０５１５】
プローブは発表された配列情報を使って、ヒトの標的配列にハイブリッド形成をするようにデザインされる。
【実施例６５】
【０５１６】
標的ｍＲＮＡのノーザンブロット分析
アンチセンス処理後１８時間で、細胞の単層を二度冷たいＰＢＳで洗い、１ｍＬのアールエヌエイゾル（ＲＮＡＺＯＬ（商標））（テルテスト"Ｂ"インク、フレンズウッド、テキサス州）で溶解させた。製造会社の推薦するプロトコールに従って、全ＲＮＡを調製した。２０μｇの全ＲＮＡを、１．１％のホルムアルデヒドを含む１．２％のアガロースゲルの電気泳動で、ＭＯＰＳ緩衝液（アムレスコ  インク、ソロン、オハイオ州）を使って分画した。ＲＮＡはゲルからハイボンド（ＨＹＢＯＮＤ（商標））-Ｎ＋ナイロン膜（アメルシャム  ファーマシア  バイオテク、ピスカタウェイ、ニュージャージィ州）を使って一夜、ノーザン／サザン  トランスファー緩衝液システム（テルテスト"Ｂ"インク、フレンズウッド、テキサス州）を用いてキャピラリートランスファーでトランスファーした。ＲＮＡのトランスファーはＵＶ可視化で確認した。膜はストラタリンカー（ＳＴＲＡＴＥＬＩＮＫＥＲ（商標））ＵＶクロスリンカー２４００（ストラタジーン、ラホラ、カリフォルニア州）で架橋し、クイックハイブ（ＱＵＩＣＫＨＹＢ（商標））ハイブリッド形成溶液（ストラタジーン、ラホラ、カリフォルニア州）を使って製造会社の推薦に従って、厳密な条件下でプローブを用いた。
【０５１７】
ヒトの標的を検出するには、ヒトの標的特異的プライマー−プローブセットがＰＣＲによって調製される。負荷とトランスファーの効率の変動を規準化するために、膜を洗い剥がし、ヒトのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のＲＮＡ（クロンテック、パロアルト、カリフォルニア州）に対してのプローブを使った。
ハイブリッド形成させた膜は、ホスホイメジャー（ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（商標））とイメージカント（ＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（商標））ソフトウェアＶ３．３（モレキュラー  ダイナミックス、サニィベイル、カリフォルニア州）を使って可視化され、定量化された。データは、処理されないコントロールのＧＡＰＤＨレベルに対して規準化された。
【実施例６６】
【０５１８】
オリゴヌクレオチドによるヒトの標的発現のアンチセンス阻害
本発明に従って、一連のオリゴマー化合物が、ヒトの標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするようにデザインされる。ここで別の実施例に記載した定量的リアルタイムＰＣＲによって、オリゴマー化合物はそのヒトの標的ＲＮＡレベルへの影響を分析される。データは３実験からの平均である。これらの配列が相補的である標的領域は、ここでは"適切な標的断片"といわれ、そのために本発明のオリゴマー化合物によって標的とされるのに適切である。その配列は、適切なアンチセンスオリゴマー化合物の逆相補を示す。
【０５１９】
これらの「適切な標的断片」は本発明のアンチセンスオリゴマー化合物とのハイブリッド形成ができ、それが可能であることが実験によって示されたので、技術分野の専門家は、それ以上の決まりきった実験をしなくても、これらの適切な標的断片に特異的にハイブリッド形成し、標的の発現を結果として阻害する他のオリゴマー化合物を含める本発明の実施形態について認識するかまたは確認することが出来るであろう。
【０５２０】
本発明によると、アンチセンスオリゴマー化合物はアンチセンスオリゴマー化合物、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外導出配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、代替スプライサー、プライマー、プローブそしてその他の、標的核酸の少なくとも一部にハイブリッド形成する短いオリゴマー化合物を含む。
【実施例６７】
【０５２１】
標的タンパク質のウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析（免疫ブロット分析）は標準法を使って行った。細胞を、オリゴヌクレオチドで処理後１６−２０時間で採取し、ＰＢＳで一度洗って、ラムリ（Ｌａｅｍｕｌｉ）緩衝液（１００μＬ／ｗｅｌｌ）に懸濁させ、５分間煮沸して、１６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。ゲルは１５０Ｖで１．５時間泳動させ、ウェスタンブロットのために膜にトランスファーした。放射性原子により、あるいは蛍光的に標識された、第一次抗体種に対する第二次抗体と適切な標的に対する第一次抗体が使われる。バンドはホスホイメジャー（ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（商標））（モレキュラー  ダイナミックス、サニィベル、カリフォルニア州）を使って可視化される。
【０５２２】
本発明は、多様な好ましい実施形態に関して詳細に説明されたが、それに限定する意図ではなく、むしろ、技術分野の専門家は、本発明の趣旨と添付された請求項の範囲内で、変化や修飾が可能であることを認識するであろう。
【０５２３】
ここで言及された全ての発表論文、特許、特許出願公開そしてその他の文献は、その全容をこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０５２４】
【図１】図１は、本発明の代表的なＰＴＥＮ  ｓｉＲＮＡコンストラクトを表したものである。
【図２】図２は、本発明の選択ｓｉＲＮＡｓによって達成されたＨｅＬａ細胞におけるヒトＰＴＥＮ  ｍＲＮＡの減少を示したものである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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