(57)【要約】１、２、またはそれ以上の流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）を有し、これらの全てが、全ての流路に共通の多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を含み、多孔質ベッドがベッドを通過する溶質Ｓと作用することができる固定された反応物Ｒを有する、マイクロチャネル構造を含むマイクロ流体装置。流路の少なくとも１つ（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）が、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上流に配置され、溶質Ｓに対する作用ではダミーとなるが、溶質Ｓを伴う液体アリコート中に存在し、溶質Ｓと固定された反応物Ｒとの間の作用の結果を妨害できる物質ＤＳとは作用しうる第２の多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を含む。固定されたＲが、包括親和力リガンドＬＩ、および／またはＬＩとは異なった包括リガンドＬＩＩを示す多孔質ベッドＩＩで置き換えられる装置および装置の変形を用いる方法も記載されている。
2007520707.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１、２、またはそれ以上の流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）を有し、これらの全てが、全ての流路に共通の多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を含み、多孔質ベッドがベッドを通過する溶質Ｓと作用することができる固定された反応物Ｒを有する、マイクロチャネル構造を含むマイクロ流体装置であって、
流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）の少なくとも１つ（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）が、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上流に配置され、溶質Ｓに対する作用ではダミーとなるが、溶質Ｓを伴う液体アリコート中に存在し、溶質Ｓと固定化された反応物Ｒとの間の作用の結果を妨害しうる物質ＤＳとは作用しうる第２の多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を含むことを特徴とするマイクロ流体装置。
【請求項２】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）と多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）が、物理的に互いに分離されたことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項３】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上流端部が、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の下流端部と接続されたことを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体装置。
【請求項４】
上流端部と下流端部との間に、多孔質膜（１０６）を有することを特徴とする請求項３に記載のマイクロ流体装置。
【請求項５】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）および多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の少なくとも１つが、粒子を押し固めたベッドであり、残りのベッドが、もしあるのなら、多孔質の一体物のプラグであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項６】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）および多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の少なくとも１つが、サイズ排除材料からなる固相材料を含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項７】
上記妨害物質が溶質Ｓより小さく、上記少なくとも１つの流路の少なくとも１つの中の、少なくとも多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）が、溶液に関連して、妨害物質が多孔質ベッドＩＩを通るのを遅らせる排除限界を有するサイズ排除材料である固相材料を含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項８】
上記１、２、またはそれ以上の流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）の残りの、少なくとも１、２、またはそれ以上（２０１ｂ；３０１ｂ）が、多孔質ベッドＩＩを有さないことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項９】
上記少なくとも１、２、またはそれ以上の流路中の多孔質ベッドＩＩが、溶質とともに存在する妨害物質と作用することができる固定された試薬ＲＤＳを含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項１０】
上記少なくとも１つの流路が、２またはそれ以上の流路であり、上記２またはそれ以上の少なくとも１つの中のＲＤＳが、上記２つの流路の残りの、少なくとも１つの中のＲＤＳとは異なることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項１１】
マイクロ流体装置のマイクロチャネル構造の流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’）中で行われ、上記流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）中に配置され、移動中に溶質Ｓと作用することができる固定された反応物Ｒを有する多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を通って、溶質Ｓを含む液体アリコートを移動させる工程を含むマイクロ流体プロセスであって、
ｉ）多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上流にあり、溶質Ｓとの作用に関してはダミーであるが、妨害物質ＤＳとは作用することができる多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を含む形態の上記流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）を提供する工程と、
ｉｉ）多孔質ベッドＩＩの上流にある上記流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）中に、上記溶質Ｓと上記妨害物質とを含む液体アリコートを提供する工程と、
ｉｉｉ）多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を通ってアリコートを移動させる工程と、そして、
ｉｖ）その後に、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を通って溶質Ｓを移動させ、反応物Ｒとの作用を行わせる工程とを含むマイクロ流体プロセス
【請求項１２】
それらのそれぞれが上記流路の全てに共通な多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を含み、それらの少なくとも１つ（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）が多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上流にある多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を含む、１、２、又はそれ以上の流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）を含むマイクロチャネル構造を有するマイクロ流体装置であって、
上記少なくとも１つの流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）中の、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）および多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の一方または双方が、包括リガンドを含む固相材料を含むことを特徴とするマイクロ流体装置。
【請求項１３】
上記少なくとも１つの流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）の１またはそれ以上の中の、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）中の包括リガンドが、多孔質ベッドＩ中と同じであることを特徴とする請求項１２のマイクロ流体装置。
【請求項１４】
上記少なくとも１つの流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）の１またはそれ以上の中の、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）中の包括リガンドが、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）中のリガンドに対して親和対（アンチリガンド）であることを特徴とする請求項１２に記載のマイクロ流体装置。
【請求項１５】
上記リガンドが、ビオチンおよびアンチビオチンから選択されることを特徴とする請求項１２〜１３のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項１６】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）および多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の双方を含むたった１つの流路（１０１）を有することを特徴とする請求項１２〜１５のいずれかに記載のマイクロ流体装置。
【請求項１７】
多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の下流端部が、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上流端部に接続され、可能であればその端部の間に多孔質膜を有することを特徴とする請求項１６に記載のマイクロ流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体装置、および当該装置のマイクロチャネル構造の特別な種類の流路（１０１；１０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）中で行われる工程を含むマイクロ流体プロセスに関する。プロセスの一部は、溶質Ｓが、固相材料に固定された反応物Ｒと作用することを含む。関連する特別な流路は、流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）中の多孔質ベッドＩ（２０４，２０４，３０４）の形態の固相材料を含む。
【０００２】
プロセスは、例えば、
ａ）例えば多孔質ベッドＩ上のグループへの親和力による、溶質Ｓが固相によって保持または解体されるような、液体から溶質Ｓの分離を含む除去、および／または、
ｂ）固定された反応物Ｒとなるように用いられる触媒システムの１つの構成要素を備えた、例えば酵素反応のような触媒反応、および／または、
ｃ）固相合成、
を含む。
【０００３】
変形（ａ）および（ｂ）では、本発明のプロセスは、一般に分析評価またはプロトコルの一部であり、反応物（アナライト）の未同定の形態は、例えば、同一性、構造的特徴、濃度のような絶対的または相対的用語の量等で、特徴づけられ、規定される。「反応物」の用語は、アナライトおよび試薬を含む。
【０００４】
「溶質」の用語は、真に溶解された形態、又はコロイド状を含む懸濁した状態の物質をいう。この用語はこのように、バクテリア、糸状菌、ウイルス、バクテリオフォージ等のマイクロ生物体を含み懸濁形態で使用された場合、それらの残像物も含む。
【０００５】
ここで引用された全ての特許および特許出願は、参照されることによりその全体がここに組み込まれる。
【背景刊行物】
【０００６】
WO 02075312(Gyros AB)は、液体アリコートから特別の材料を除去するための分離ユニットをそれぞれが含む、マイクロチャネル構造を備えたマイクロ流体装置が記載されている。液体アリコートは、次の工程における、親和力に基づく評価の反応物である溶質を含む。
【０００７】
PCT/SE2004/001424、WO 0147638(Gyros AB)、WO 03098302(Gyros AB)、WO 02075775(Gyros AB)、WO 02075775(Gyros AB)には、上流処理の結果物の、同定処理を含む場合もある下流処理、に続く液体サンプルの上流処理がそれのために提案された、様々な構造が記載されている。
【０００８】
US 6,632,655(Caliper)、Piyasera et al (Anal. Chem. 76 (2004) 6266-6273)およびBuranda et al (Anal. Chem. 74 (2004) 1149-1156)には、区分を含む多孔質ベッドが記載されている。ベッドは、マルチアナライト分析で使用される。
【発明が解決しようとする問題】
【０００９】
生物学上の液体試料のような多くの試料が、多くの場合、溶質と、多孔質ベッドに固定された反応物との間の反応の、否定的な良くない結果となりうる妨害物質を含む。これは、WO 02075312(Gyros AB)、およびWO 04083108(Gyros AB)に概略が記載されたサンドイッチ分析中で、即ちアナライトが上述の溶質Ｓと同じ場合、問題を発生させる。妨害物質は、分解された合成物、集合体、および／または、多くの種類の機能しない試薬（下記参照）を含む特別な材料であってもよい。生物学的に得られた粒状材料は、細胞有機堆積物等や脂質であってもよい。遭遇する問題は、例えばアナライトのような反応物のタイプに関連する。膜関連の生物学的アナライトは、評価を妨害する比較的大量の粒状材料に伴う。細胞、組織、および体液からの試料は、マイクロ流体装置中で扱うのが難しい。免疫性の評価で、望まない方法で免疫試薬と影響しあう、異種親和性の免疫があるかも知れない。試薬の組成は、評価の結果を妨害する形態を含むかもしれない。例えば、通常の背景応答と同等、まあはこれより高い信号応答を形成することによる。区別された反応物は、異常な密度の区別されたグループを有する形態を含み、これにより、通常の区別された形態から、大きさおよび／または化学的に分けられる。
【発明の目的】
【００１０】
本発明の目的は、他の問題と同様に、上述の問題に関連するマイクロ流体装置に適用できる改良を提供するものである。これは、アナライトの特徴が特定される分析的評価の、改良された検出限界、アナライト特異性、診断感度および特異性、精度、ダイナミックレンジ、回復等を可能とする方法およびマイクロ流体装置を意味する。本発明は、このように、ａ）１０−９Ｍ以下、又は１０−１２Ｍ以下、又は１０−１３Ｍ以下、又は１０−１４Ｍ以下、又は１０−１５Ｍ以下、又は１０−１６Ｍ以下のような、１０−６Ｍ以下のアナライトの検出限界、ｂ）２、３、４、５、またはそれ以上のオーダーのマグニチュード（Ｍ）のダイナミックレンジ、ｃ）±１０％以内、又は±５％以内、又は±３％以内のような、±２０％以内の精度（ＣＶ）、ｄ）８０％以上、又は９０％以上、又は９５％以上、又は１００％以上、又はそれ以上のような、７０％以上の回復を目的とする。「技術分野」の表題の下部に示したタイプのような、他のプロセスプロトコルに対して、この目的は、他の関連する変形、例えば、単位時間に受け入れられる実験／ランの数、精度、再生産性等に関連する、改良された処理に関する。
【発明】
【００１１】
３つの目的の達成が、以下により実現される。
ａ）多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上流の位置に、マイクロチャネル構造の流路（１０１，２０１ａ，３０１ａ，ａ’）中の多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を有する形態の固相材料を提供し、
ｂ）溶質と付随する液体とが、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）をとって移動する前に、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を通って、１又はそれ以上の妨害物質を含む液体アリコート中に溶けた溶質Ｓを移動させる。
多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）は、溶媒Ｓに関連したダミーであり、即ち、溶質Ｓは、影響されずにベッドを通過でき、一方、妨害物質は、固相材料と反応してベッド中で中和される。中和は、退化、捕獲、又は溶質Ｓと同時又は前に、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を通過するのを防止する他の方法を意味する。溶質Ｓは、このように、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）中で中和された妨害物質の存在下で、固相材料の多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）と影響しあうことができる。
【００１２】
本発明の第１の形態は、１、２、又はそれ以上のマイクロチャネル構造を含むマイクロ流体装置である。各マイクロチャネル構造は、共通の多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の形状の固相材料を保有する共通反応マイクロキャビティＩ（１０２，２０２，３０２）を含む、１又はそれ以上の流路（１０１，２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）を含む。このベッドは、ベッドを通過する溶質Ｓと影響しあうことができる固定した反応物Ｒをさらし、又はさらそうとする。この文脈で、共通は、この反応マイクロキャビティＩ／多孔質ベッド（１０２，２０２，３０２／１０４，２０４，３０４）を通る全ての流路を意味する。
【００１３】
この装置の主な特徴は、マイクロチャネル構造が、第１の多孔質ベッドＩの上流に配置された、第２の多孔質ベッド（１０５，２０５，３０５）を含むことである。多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）は、反応マイクロキャビティＩ（１０２，２０２，３０２）から物理的に分離され、又は長い反応マイクロキャビティＩ＋ＩＩを形成するように反応マイクロキャビティＩＩ（１０３，２０３，３０３）と接続されて、反応マイクロキャビティＩＩ（１０３，２０３，３０３）中には配置される。もし、２つの多孔質ベッドＩおよびＩＩが、そのような反応マイクロキャビティ中に配置された場合、これらは、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）に対応する上流セグメントと、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）に対応する下流セグメントとを含むジョイント多孔質ベッドを形成する。還元すれば、上流セグメントの下流端部が、下流セグメントの上流端部と接する。これは、多孔質膜（１０６）がセグメント中に配置され、この境界面で２つの固相材料は混合しないことを確実にすることを含む。多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）は、溶質Ｓとの関係ではダミーであるが、妨害物質に対してはダミーでは無い。
【００１４】
マイクロキャビティ、マイクロ導管、又は他の機能的ユニットが、他にマイクロキャビティ、マイクロ導管、又は他の機能的ユニットと流体接続され、前者から後者に移動する。
【００１５】
妨害物質
妨害物質は、得られる結果に負の影響を与える程度に、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の中又は下流で起きる１又はそれ以上の所望の相互作用の結果を妨害する。一般のプロセスでは、反対方向に影響する多くの品質のパラメータ（結果）が存在する。例えば、同一プロセス／方法の、１回の実験またはランを行うのに必要な時間の量（増加）、単位時間あたりのラン数として測定された生産性（減少）、使用される１又はそれ以上の個々の反応物の回復又は損失（それぞれ減少または増加）、１又はそれ以上の得られる生産物の量（減少）、生産量、純度等のような製造パラメータについての精度（増加）である。分析評価のプロトコルでは、１又はそれ以上の、以下に示す品質パラメータが、反対に影響する。精度（低下）、検出限界（増加）、ダイナミックレンジ（狭くなる）、アナライト感度（低下）、診断感度および特異性（低下）、回復（低下）、アナライト等の使用する反応物の望まない損失（低下）である。
【００１６】
妨害物質は、溶解した状態、および／または粒子の状態であっても良い。粒子の状態は、溶解していない如何なる状態も含む。粒子の状態では、妨害物質は、多孔質ベッドＩや、多孔質ベッドＩの下流にある他の多孔質ベッドを詰まらすことにより、有害な影響を発揮する。プロセス中にベッドの上流又は中で容易に粒子の状態にならない限り、溶解した状態の妨害物質は、ベッドを詰まらせる危険性は低い。溶解した状態の妨害物質は、妨害の影響を次のように発揮する。
ａ）所望の物質の測定に使用する特徴と同じか、またはそうでなければこの特徴を妨害する測定上の特徴を本来的に含むことにより、またはプロセス中に、そのような測定される特徴を含む存在になる反応にあずかることによる。
ｂ）プロセスの所望の反応と抵触することによる。例えば、加えられた反応物（例えば、アナライトおよび／または１またはそれ以上の加えられた試薬）の中和またはそうでなければ消費による。
ｃ）粒子の状態に変わることにより、マイクロチャネル構造（例えば、多孔質ベッド、測定ゾーン、および／または他の場所）中での堆積および／または沈殿を含む沈殿を起こすことによる。
【００１７】
本発明の文脈では、妨害物質は、主として、例えばアナライトまたは試薬のような、溶質Ｓが反応物である液体中で考えられる。この部脈での液体は、処理されないマイクロ流体装置に投与されることを意図する液体を意味する。
【００１８】
試薬含有液
この種類の液体は、一般に合成物である。溶媒や緩衝成分から分配された妨害物質は、このように、比較的容易に避けることができる。試薬部分は、より複雑かも知れない。例えば生物学的有機試薬のような有機試薬は、一般により複雑な材料から形成され、しばしば除去が困難な妨害物質（汚染物）を含む。このように、これらの物質が、使用される液体中に残っている危険性がある。例えば、発言するペプチド／アミノ酸、炭水化物、および／または液体構造（ステロイド構造を含む）、のような生物学的成分により得られた試薬は、このように、出発材料、複生産物等により汚染されるかも知れない。分極するために使用される試薬に加えて、分極される試薬は、活性、および／または分極の数、および／またはそれぞれの分極が取り付けられる位置について異なっている分子状の存在のスペクトラムを含んでも良い。２つの物質ＡおよびＢの結合は、活性、Ａおよび／またはＢの量、Ａの数とＢの数との比、および／またはＡがＢに取り付けられる位置およびＢがＡに取り付けられる位置、に関連して変化する分子状の存在のスペクトラムを含んでも良い。分極により得られた分極された試薬は、活性度が変化する断辺のスペクトラムを含んでも良い。分極されていない形態の試薬は、分極汚染物を含む。例えば、それらは、生物学的材料から分極され、および／またはペプチドまたはアミノ酸、ヌクレオチド、炭化水素、および／またはステロイド構造を含む液体構造から選択される、少なくとも１つの構造を示す。分極した試薬、および分極していない形態の試薬の双方は、例えば分子量のスペクトラムを有する集塊試薬を含んでも良い。このように、試薬合成物中の分子のいくつかは、検出、および／または処理される感度の限界を、例えば、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）やマイクロチャネル構造の内部表面への不特定な固定のような、複製産物中で関係する他のものより高くする傾向にある。
【００１９】
アナライト含有液
この種類の液体は、アナライトの濃度および他の成分に関連した、重要な中間試料変化を有する試料により、一般に代表される。アナライト含有液は、一般に、複雑な混合物から形成され、本発明により実行される評価を妨害する物質を多数含む。アナライト含有試料は、このように、工業的または研究的プロセスや方法のプロセスから分配されても良い。プロセスは、非生物学的プロセス、または化学的または生物学的方法により得られる少なくともいくつかの生物学的に得られた材料を用いるという意味において生物学的プロセスであっても良い。例えば、ペプチドまたはアミノ酸、ヌクレオチド、炭化水素、および／またはホルモン構造を含む液体構造から選択される少なくとも１つの構造を示す生物学的有機物を含む。試料の重要な供給源は、血液や血漿および血清のようなその一部、リンパ液、尿、髄液（ＣＳＦ）、涙、唾液、腸液、胃液、吐き出し液、汗、細胞ホモジェネート、組織上清、人口生物学的流体等のような生物学的流体（即ち、液体）である。「生物学的流体」の用語は、１又はそれ以上のそれらの液体に起因する、この明細書で示される生物学的構造を一般に示す生物学的有機合成物を含む部分も意図する。人口的な生物学的流体は、ここで記載された種類の、１又はそれ以上の生物学的有機分子が加えられた液体を意図する。
【００２０】
上述のアナライト含有流体中に存在する３つの主な妨害物質がある（内生的物質）。
Ａ）上述のような粒子材料。血液に起因する試料にとって、粒子材料の用語は、血小板のような血球、赤血球やリンパ細胞のような血液細胞、それらの血球の断片、フィブリンのような凝固生産物、凝血およびその断片、他の血液沈殿物質を含む。一般に生物学的流体では、粒子材料が、細胞関連であり、細胞とその断片、組織断片、分極されていない形態の中性および／またはイオン性の液体等であっても良い。
Ｂ）上述のような沈殿、堆積物、またはデポジットを形成する物質。
Ｃ）プロセスで使用される試薬と望まない方法で反応し、測定される特徴から分けることができない測定上の特徴を含む物が形成される物質。試薬は、固定化した試薬Ｒ、又は分類されたおよび／または結合した形態の試薬のような溶解した形態の試薬でも良い。異好抗体は、この文脈で重要であり、即ち、内生的な抗体は、抗体決定要因を示す抗体試薬と反応し、抗体決定要因は、試料の内生的な抗体を固定することができる。アナライトのための内生的キャリアタンパクは重要であり、特に、もしアナライトが低分子量（例えば、５０００ダルトン以下のような１００００ダルトン以下）の場合、および／またはもしその自由形態が限定される場合に重要である。他の例は、使用される分類と同じ測定上の特徴を有する内生的な構成である。例えば、もし、試薬で使用される分類が、内生的な酵素と同じ部室を使用すれば、内生的な酵素は測定を妨害する。
Ｄ）アルブミン、特にＩｇＧおよびＩｇＡを含むガンマ−グロブリン、アンチトリプシン、およびハプトグロブリンを含むバルクタンパクは妨害し、Ｃ）によってキャリアタンパクとして働かない場合でさえも、除去するべきである。
【００２１】
多孔質ベッドＩおよびＩＩ中の固相材料
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）および多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の固相材料は、同様または異なる種類でも良い。このように、下流のベッド（１０４，２０４，３０４）は、多孔質の一体的なプラグであり、上流のベッド（１０５，２０５，３０５）は、粒子又は他の周囲の方法で密集させたベッドである。両方のベッドは、多孔質の一体物または粒子を密集させた多孔質ベッドでも良い。２つのベッドの固相材料は、基本材料、粒子サイズ（および粒子サイズの分布）、極性、被覆性、親水性／疎水性、膨潤性、弾力性、剛性等の１又はそれ以上について異なってもよい。
【００２２】
適当な粒子は、球状又は楕円状（玉状）又は非球状である。固相材料として使用される粒子の適当な平均直径は、一般に１〜１００μｍの範囲内であり、好適な平均直径は１０μｍ以上、または１５μｍ以上のような５μｍ以上、および／または５０μｍ以下である。また、例えば平均直径が０．１μｍのような、より小さな粒子も使用できる。反応マイクロキャビティの出口と使用される粒子は、互いにマッチして、粒子が反応マイクロキャビティ中に保持される。直径は、「流体力学」の直径に属する。粒子の準備は、単分散（単一サイズ）または多分散（複サイズ）である。粒子は、多孔質での非多孔質でも良い。単一サイズ／複サイズ、および多孔質／非多孔質の用語は、WO 02075312(Gyros AB)と同じ意味を有する。
【００２３】
固相の基本材料は、無機、および／または有機材料から形成される。一般的な無機材料はガラスを含み、一般的な有機材料は有機ポリマを含む。ポリマ材料は、例えばガラスのような無機ポリマや、人工的なまたは生物学的な起源から形成される有機ポリマ（生物ポリマ）でも良い。生物ポリマの用語は、天然生物ポリマから形成されるポリマバックボーンを有する半人工的ポリマを含む。一般の人工的有機ポリマは架橋されており、しばしば、重合可能な炭素と炭素の２重結合を含むモノマの重合により得られる。適当なモノマの例は、水酸基のアルキルアクリレートと対応するメタクリレート、アクリルアミドとメタクリルアミド、ビニルとスチリルエーテル、アルケン置換ポリハイドロキシポリマ、スチレン等である。一般的な生物ポリマは、架橋であってもなくても良い。多くの場合、それらは、例えば、アガローズ、デキシトラン、デンプン等の炭水化物構造を示す。多孔質ベッドの文脈における「親水性」の用語は、水と接触した場合に、水を吸着する能力を意図する。この表現は、また、吸着中に液体と接触するベッドの内面が、例えば、酸素や窒素から選択されるヘテロ原子を有する複数の多孔質機能グループを示す。適当な機能グループは、水酸化グループ、エチレンオキサイドグループ（-X-[-CH2CH2O-]n、ここでｎは１より大きい整数で、Ｘは窒素または酸素）、アミノグループ、アミドグループ、エステルグループ、するフォングループ等から選択され、好ましくは、それらのグループは、本質的に電荷のない独立のｐＨを有し、例えば２〜１２の範囲である。特別な形態での固相材料では、これは、少なくとも粒子の外部表面が、多孔質機能グループを示すことを意味する。
【００２４】
もし、固相材料の基質材料が疎水性又は十分な親水性で無い場合、例えば、スチレンやポリオレフィンポリマ（コポリマ）に基づく場合、水性液と接触する表面は親水化されなければならない。一般的なプロトコルは、固相材料が、上述と同じような多孔機能グループを示す化合物または化合物の混合物で被覆された固相材料を含む。
【００２５】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）、および多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）中の固相材料は、原則的に、WO 04083108(Gyros AB)のＡＣｓのための材料と同じ固相材料から選択される。選択基準またはベッド保持作用の存在に基づく特徴は、適用されてもされなくても良い。多孔質ベッドＩＩ（１０４，２０４，３０４）の材料のための追加の基準は、所定の変形でのサイズ排除材料（size exclusion material）は有益であることである。
【００２６】
多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）は、妨害物質および溶質Ｓの双方を含む液体のフィルタと考えられる。妨害物質が粒子材料の場合、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の上端で機械的に集められる。もし妨害物質が溶解した形態の場合、溶質Ｓの前又は同時に、反応物が多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）に達するのを防止するのに２つの主な選択がある。ａ）この明細書の他の箇所で示したように、固相材料が、妨害物質を中和できる固定化した反応物ＲＤＳを備える、および／またはｂ）固相材料が、妨害材料を遅らし溶質Ｓを遅らさないサイズ排除材料の形態を備える。
【００２７】
適当に選択されたサイズ排除固相材料は、多くの利点を有する。なぜならば、適当に固定されたＲＤＳを備えた場合、ａ）粒子材料、ｂ）ＲＤＳと反応する化合物、およびｃ）溶質Ｓより小さなサイズを有する溶解した化合物の形態の妨害物質の中和に有効だからである。好ましいサイズ排除材料または媒体は、ゲル濾過材料を含む液体クロマトグラフィサイズ排除材料である。この文脈で、「より小さいサイズ」は、一般に、より低い分子量、および／または、より小さな流体力学サイズをいう。低い分子量の溶解された妨害物質は、例えば５００００ダルトン以下、または１００００ダルトン以下、または７０００ダルトン以下のような１０００００ダルトン以下の分子量を有する物質から選択される。「より小さな」と「分子量」の用語は、上述のクロマトグラフサイズ排除材料で行われる測定で与えられる。
【００２８】
多孔質サイズ排除媒体は、多孔質ベッドＩＩを通過する反応物（溶質Ｓ）に対して、例えば０．４より小さい、または０．１より小さいような、０．５より小さいＫａｖ値を有する固相材料から選択されると信じられている。もし、溶質Ｓより前または同意に多孔質ベッドＩに到達することができる小さいまたは低い分子量の妨害物質または合成物を送らせることが目的であれば、好適なサイズ排除媒体は、０．１〜０．９５の範囲無い、典型的には０．４０〜０．９５の範囲内のＫａｖ値を有する。例えば、Ｋａｖの定義については、L.Hagerの「タンパクの純化原理、高分解、および応用」、J-C Janson and L Ryden (Eds), VCH Publishers Inc. New York, 1989, 99頁参照。
【００２９】
固定化した試薬ＲＤＳの選択は、公知の原理により行われ、妨害物質の種類に依存する。ＲＤＳはこのように、ａ）多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）への電子対により、またはそうでなければプロセスに無害な物質を作ることにより妨害物質を細くする化学反応物、ｂ）物質を無害な生産物に換える触媒システムを有する化合物、ｃ）妨害物質への親和力対（ＡＣＤＳ）である。アナライト含有試料の異好抗体は、例えば、（ｃ）ＡＣＤＳが、不適切な抗体活性（cold Ig）の免疫グロブリンの準備であり、異好抗体の抗体活性部分と反応する抗原性のデタミナントをさらす場合に、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）に捕獲される。多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の固相材料は、ＨＩＣ媒体、即ち、疎水性のグループ（ＡＣＤＳ）を含む親水性分離媒体でも良い。かかる媒体は、リポイド系物質および／または反応物断片より疎水性の反応物断片のような疎水性グループをさらす妨害物質と、潜在的に関係し、中和する。
【００３０】
固定化したＲＤＳは、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）中の溶質（ＡＣＳ）と親和性のある一方のような、固定化した試薬Ｒで議論したように、この分野で公知な技術的により行われる。ステプタビジンとビボチンのそれぞれのような、包括的な固定化した親和性のあるペア（バインダＢＤＳとリガンドＬＤＳ）は、特に有用であると予想される。
【００３１】
ＡＣＤＳのような、固定化したＲＤＳの部分についての更なる情報は、WO 04083108 (Gyros AB)に見られる固定技術や、以下のＡＣＳでの議論に記載されている。
【００３２】
一般には、水中でミセル（micelles）を形成する、固定化した両親媒性の高分子材料は、分極した試薬分子を除去するための固定化したＲＤＳとして特に有用である。適当な高分子材料としては、ベータカセインを備えたカセインのような、乳タンパクのようなペプチド構造を示す高分子材料から選択される。適当なそのような物質は、例えば、ポリプロピレン酸化物チェインのような疎水性のポリマチェインのセントラルブロックや、例えばポリスチレン酸化物のような親水性ポリマチェインのエンドブロックを含む、トリブロックポリマのような合成された両親媒性の高分子材料から選択される。ＳＥ出願 05001318、および２００５年１月２０日出願の対応ＵＳ仮出願「保護物質（Protecting agent）」を参照。最も重要なこの種類のＲＤＳ／ＡＣＤＳの改良された効果は、ダイナミックレンジと検出限界の下方への拡張、ダイナミックレンジの低い部分での感度の増加として表れると思われる。この変形は、特に、疎水分類のような、疎水グループが導入される、分極した試薬に対して有用であると考えられている。
【００３３】
多孔質ベッドＩの固相材料は、有機的、無機的、生物化学的な作用等の関連できる、固定化した試薬Ｒを含む。環境や反応物の種類や溶質Ｓに依存して、この作用は、ａ）分離、ｂ）触媒反応、ｃ）親和反応、ｄ）固相合成、およびｅ）その他、の一部からなる。固定化された試薬Ｒは、ａ）〜ｅ）の中で、溶質Ｓの対する親和の一方ＡＣＳである。即ち、溶質Ｓと、親和複合体ＡＣＳ−Ｓを形成することができる。親和対は、一般に、（ａ）静電気作用、（ｂ）疎水性作用、（ｃ）電子供給需要作用、および／または（ｄ）生物親和固定、に基づく。
【００３４】
親和対ＡＣＳと溶質Ｓは、このように、生物的親和反応物／生物的親和対の部材である。一般に、生物的親和対は、ａ）抗原／ハフテンと抗体、ｂ）相補性核酸、ｃ）免疫グロブリン結合タンパクと免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、またはそのＦｃ部分とタンパクＡまたはＧ）、ｄ）レクチンおよび対応する炭水化物、ｅ）ビオチンおよびアビジン（ストレプトアビジン）、ｅ）酵素系合成物（酵素物質、酵素余因子、酵素抑制剤等）、ｆ）ヒスチジルおよび／またはシステイニル、リン酸化残渣（即ち、ＩＭＡＣモチーフ）等を含むＩＭＡＣグループおよびアミノ酸シーケンス、である。抗体は、抗原固定フラグメント、および抗体の擬態を含む。「生物親和対」の用語は、一方または双方の部材が合成物である親和対、例えば、天然生物親和対の部材の一方または双方の擬態、を含む。ＩＭＡＣの用語は、固定化された金属キレートを表す。
【００３５】
「親和反応物」の用語は、また、例えば二硫化形態より、可逆共有結合できる反応物を含む。この種類の反応物は、一般に、ＨＳ−または−Ｓ−ＳＯｎ−グループ（ｎは０、１、又は２、炭素への自由電子価結合）である。米国特許 5,887,997 (Batista)、4,175,173 (Axen et al.)、および4, 563,304 (Axen et al.)参照。
【００３６】
固定化反応物Ｒは、触媒システムまたは触媒システムの化合物でも良い。触媒システムの化合物は、触媒、共触媒、共同因子、基質（物質）または補基質、制限物質、促進剤等である。酵素システムについて、対応合成物は、酵素、共触媒、共同因子、補酵素、基質、補基質等である。「触媒システム」の用語は、例えば第１のシステムの製造物が、第２の触媒システム等の基質や、すべての生物学的細胞またはそのような細胞の一部である、結合触媒システムを含む。
【００３７】
固定化された親和反応物（ＡＣＳ等のＲ）は、適当な感度と、意図する応用に関連する溶質Ｓとの作用を特定するように選択されるべきである。一般的な方法や、反応物Ｒの適当な選択の基準は、この分野では公知である。
【００３８】
固相材料への結合は、共有結合、親和結合（例えば、生物学的親和結合）、物理吸着等により行われる。固定化のための技術は、この分野において、一般に知られている。
【００３９】
親和結合による固定には、例えば、電子対の共有のように、部材（固定化されたリガンド又はＬ）の１つが固相材料に固く取り付けられた、固定化された親和対を用いる。対の他の部材（固定化されたバインダ、Ｂ）は、バインダＢと反応物（Ｒ、例えばＡＣＳ）とを含む結合（固定化結合）として使用される。固定化された親和対の例は、ａ）ストレプトアビジン／アビジン／ニュートラアビジンと、ビオチニル化された反応物（または、逆に）、ｂ）抗体とハプテニル化された反応物（または、逆に）、ｃ）ＩＭＡＣグループと反応物／溶質Ｓと接合されたヒスチジルおよび／またはシスチジルおよび／またはホスホニル化された残渣（即ち、ＩＭＡＣモチーフ）を含むアミノ酸シークエント、等である。本発明で使用される固定化された結合対は、一般的な意味で、使用された親和結合は、その後の親和反応に無関係である。
【００４０】
「結合（conjugate）」の用語は、第１に、化学結合や組み換え製造結合（半分のそれぞれがペプチド構造）のような電子対共有結合をいう、この用語は、また、いわゆる自然結合、即ち、親和は２つの異なった分子物質に向かっや、互いに間隔をおいた２つの結合サイトを有する親和反応物である。例えば、分子の一の側の種（species）とクラス特性（class-specific）と、他の側の抗原／ハプテン結合とを含む。
【００４１】
好ましい固定化親和対（ＬとＢ）は、一般には、多くとも１０倍以下、または１０２倍、または１０３倍、ストレプトタビジンとビオチンの対応する親和定数より大きい、親和定数（ＫＬ−Ｂ＝[Ｌ][Ｂ]／[Ｌ−Ｂ]）を有する。これは、親和定数が、おおよそ１０−１３ｍｏｌ／ｌ以下、１０−１２ｍｏｌ／ｌ以下、１０−１１ｍｏｌ／ｌ以下、１０−１０ｍｏｌ／ｌ以下のそれぞれであることを意味する。好ましくは、ＬとＢは、それぞれビオチン結合化合物、ストレプトアビジン結合化合物から選択され、または逆に、ビオチン結合化合物として、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、およびアビジン、ストレプトアビジン、およびニュートラアビジン、アンチビオジン抗体の他の置き換え化学的変形形態のようなアンチビオチンを含む。
【００４２】
上述の親和定数は、バイアコア（Uppsala、スエーデン）製のバイオセンサ（表面プラズモン共鳴）、即ち、デキストラン被覆の金表面に固定された親和反応物（ＡＣＳおよびＬ）によりその値が得られる。
【００４３】
本発明で使用される親和対の少なくとも１つの部材は、特に、生物親和対では、ａ）ポリおよびオリゴペプチド構造のようなペプチド構造を含むアミノ酸構造、ｂ）炭水化物構造、ｃ）ヌクレイン酸構造を含むヌクレオチド構造、ｄ）ステロイド構造、トリグリサリド構造等のような脂質構造、から選択される構造を示す。この文脈において親和対の用語は、固定化親和対（ＬとＢ）、親和反応物および溶質（ＡＣＳおよびＳ）、および例えばＲＤＳの固定化に使用される他の親和対をいう。
【００４４】
流路および反応マイクロ流路／多孔質ベッド
本発明にかかる一般的なマイクロチャネル構造は、１、２、３、またはそれ以上の流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）を含み、かかる流路のそれぞれは、流路の全てに対して共通の部分を有する。この共通部分（１０８，２０８）において、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を含む反応マイクロキャビティＩ（１０２，２０２，３０２）があり、この多孔質ベッドＩは、流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）の全てに共通である。それぞれの流路は、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を通って液体を移動させるために使用される。図１〜３参照。共通部分の上流では、少なくとの１つの流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）中に多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を含む上流の反応マイクロキャビティ（１０２，２０２，３０２）を有する。
【００４５】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）は、ベッド（１０４，２０４，３０４）中を通る液体中に存在する溶質Ｓと作用する反応物Ｒを示す。多孔質ベッドＩＩ（１０５）は、例えば、溶質Ｓを含む液体のような、ベッド中を通る液体中に存在する妨害物質ＤＳと作用する反応物（ＲＤＳ）を示しても示さなくても良い。多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）と妨害物質との間の相互作用は、もし、妨害物質が溶質Ｓより小さなサイズを有し、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の固相材料が適当に選択された場合に、サイズ排除により起きる。
【００４６】
多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）および／または多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）は、代わりに、包括的な固定化親和対の包括的なリガンドを示しても良い。この変形で、包括的リガントは、マイクロチャネル構造の少なくとも２つの多孔質ベッド中と同じ結合特異性を有する。例えば同じ流路の多孔質ベッドＩおよびＩＩ（１０４，２０４，３０４および１０５，２０５，３０５）は、本質的に同じ包括的リガント（同じリガント）を有する。このように、同じ流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）にある多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）と多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）は、包括リガンド（または抗ビオチン）としてビオチンを有する。代わりに、包括リガンドは、同じ流路中の多孔質ベッＩおよびＩＩ（１０４，２０４，３０４および１０５，２０５，３０５）で、異なった結合特異性を有する。このように、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）は、ビオチンを有し、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）は、同じ流路（１０１；２０１ａ；３０１ａ，ａ’）中に、抗ビオチン又は逆に包括リガンドＬを有する。
【００４７】
多孔質ベッドＩまたはＩＩ（それぞれ１０４，２０４，３０４と１０５，２０５，３０５）を含む反応マイクロキャビティは、ベッドにより占められる体積により定義される。反応マイクロキャビティは、全体として直線または湾曲したマイクロ導管のようで、連続して広くおよび／または狭くなっても、ならなくても良い。同じ位置に配置され、および／または１のマイクロチャネル構造中で機能するマイクロキャビティは、一般に、他のマイクロチャネル構造中の対応マイクロキャビティと、実質的の同じ形状および／または大きさを有する。一般の、反応マイクロキャビティとして、多孔質ベッドＩまたはＩＩ（１０４，２０４，３０４および１０５，２０５，３０５）を含むマイクロキャビティは、少なくとも１つの断面直径（深さおよび／または幅）において、５００μｍ以下、または２００μｍ以下のような１０００μｍ以下となる。最も小さい断面直径は、一般には２５μｍ以上、または５０μｍ以上のような５μｍ以上である。反応マイクロキャビティの全体積は、一般には、１０００ｎｌ以下、または５００ｎｌ以下、または１００ｎｌ以下、または５０ｎｌ以下、または２５ｎｌ以下のような、５０００ｎｌ以下である。
【００４８】
図１ａは、変形例であり、多孔質ベッドＩ（１０４）および多孔質ベッドＩＩ（１０５）の双方のための、１の単体の反応マイクロキャビティ（１０２＋１０３）を備えた少なくとも１つの流路（１０１）を有する。上流ベッド（１０５）の下流端部は、下流ベッド（１０４）の上流端部に接し、可能ならば、ベッド（１０４，１０５）の間に多孔質膜（１０６）を含む。
【００４９】
図１ｂは、変形例であり、２つの分離されたマイクロキャビティＩおよびＩＩ（それぞれ１０２および１０３）を備えた少なくとも１つの流路（１０１）を有する。１つは多孔質ベッドＩ（１０４）用であり、他方は多孔質ベッドＩＩ（１０５）用である。図２のために、より詳細の述べると、２つの反応マイクロキャビティ（１０２および１０３）の間に、液体ルータ機能（１０７）を有する。このルータ（１０７）は、液体を、多孔質ベッドＩ（１０４）に接続されたマイクロ導管（１０９）、または流路（１０１）から液体を排出できるマイクロ導管（１１０）のいずれかに接続される。
【００５０】
図２は、変形例であり、少なくとも２種類の流路（２０１ａおよび２０１ｂ）を有する。それらの１つは、上述のように多孔質ベッドＩおよびＩＩ（２０４および２０５）の双方がその中にある流路（２０１ａ）を含む。他の１つは、多孔質ベッドＩＩの無い流路（２０１ｂ）を含む。反応マイクロキャビティ／ベッド（２０２／２０４；２０３／２０５）の間には、液体ルータ機能（２０７）を有する。この機能は、２つのマイクロ導管ＡおよびＢ（それぞれ２０９および２１０）のいずれかに液体を切り替え、多孔質ベッドＩＩ（２０５）のみと作用することを意図する液体が、多孔質ベッドＩ（２０４）を通過するのを防止することができる。液体ルータ機能（２０７）は、機械的又は表面張力に基づくバルブ機能を有する。もし遠心力が使用された場合、ルート機能は、PCT/SE2004/001424 (Gyros AB)に記載されたようになる。この液体ルータ機能は、多孔質ベッドＩＩ（２０５）が、包括的リガンドに対する包括的な親和の一方（バインダ）を含む結合形態の反応物をそれに固定化する包括的リガンドＲＤＳを最初から含む場合に有用である。多孔質ベッドＩ（２０４）が包括的リガンドを示した場合、固定化された反応物Ｒは、多孔質ベッドＩ（２０４）を通る流路（２０１ｂ）、即ち、多孔質ベッドＩＩ（２０５）の無い流路を介して、このリガンド（包括的バインダ）に対する包括的な一方（counterpart）を備えた結合（共役）の形で反応物Ｒを通すことにより、導入される。実際の方法が行われた場合、妨害物質を伴う反応物を含む液体がベッドＩＩ（２０５）を通り、マイクロ導管Ａ（２０９）を介して多孔質ベッドＩ（２０４）を通る。他の液体は、好ましくは、多孔質ベッドＩＩの無い流路（２０１ｂ）を介して導入される。
【００５１】
図３は、他の変形例であり、少なくとも２種類の流路（３０１ａ，３０１ａ’および３０１ｂ）を有する。それらの１つは、多孔質ベッドＩおよびＩＩ（３０４および３０５）の双方を有する流路（３０１ａ，３０１ａ’）を含む。他の１つは、全ての流路（３０１ａ，３０１ａ’および３０１ｂ）に共通の多孔質ベッドＩ（３０４）のみを含む流路を含む。各流路（３０１ａ，３０１ａ’）は、多孔質ベッドＩＩ（３０５，３０５’）と多孔質ベッドＩに続くマイクロ導管（３０９）を備えた多孔質ベッドＩ（３０４，３０４’）との間の液体ルータ（３０７，３０７’）と、マイクロ導管Ｂ（３１０）への出口を有する。多孔質ベッドＩＩを含む１又はそれ以上の流路（３０１ａ）中の多孔質ベッドＩＩ（３０５）は、多孔質ベッドＩＩを含む流路（３０１ａ’）の１又はそれ以上の残りの流路中の多孔質ベッドＩＩ（３０５）とは異なり、または本質的に同一である。違いは、マトリックスの種類、妨害物質と作用する固定化された反応物（ＲＤＳ）、包括的なリガンド等に関する。この変形例は、１の溶液が第１の妨害物質を含み、他の溶液が、同じ固相材料を使用して中和できない第２の妨害物質、例えば同じ固定化反応物ＲＤＳを含む場合に結うようである。
【００５２】
本発明で使用されるマイクロチャネル構造の一般的な概略は、更に、WO 02074438 (Gyros AB)中の図４ｃ、WO 04083108 (Gyros AB)中の図１、PCT/SE2004/001424 (Gyros AB)中の図２により示される。明細書の実験１および２で使用される構造は、WO 04083108 (Gyros AB)の図１による。
【００５３】
上述の流路は、単にマイクロチャネル構造の一部を表すだけである。加えて、以下の中から選択される、１、２、３、又はそれ以上の機能的ユニットを有しても良い。ａ）例えば、可能であれば体積測定ユニットを備えた導入ポート／導入開口部を含む導入アレンジ、ｂ）液体移動用の更なるマイクロ導管、ｃ）例えば、均一系反応を行う、１またはそれ以上の他の反応マイクロキャビティ、ｄ）混合マイクロキャビティ、ｅ）粒子を液体から分離するためのユニット（導入アレンジ内にあるのが好ましい）、ｆ）例えば、毛細管電気泳動、クロマトグラフィ等により、試料中に溶けたまたは懸濁した成分を、互いに分離するためのユニット、ｇ）検出マイクロキャビティ、ｈ）排水導管／マイクロキャビティ、ｉ）バルブ、ｊ）周囲環境への通気孔、等。例えば、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を含む反応マイクロキャビティと、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を含む検出マイクロキャビティとを兼ねるように、機能的ユニット部分は１以上の機能を有しても良い。マイクロ流体装置中の多くの種類の機能的ユニットは、Gyros AB/Amersham Pharmacia Biotech AB によるWO 9955827、WO 9958245、WO 02074438、WO 0275312、WO 03024598、WO 03018198、およびTecan/Gamera BiosciencesによるWO 0187587、WO 0187486、WO 0079285、WO 0078455、WO 0069560、WO 9807019、WO 9853311に開示されている。
【００５４】
それらの機能的ユニットは、本発明で使用されるマイクロチャネル構造に有しても良い。例えば、多孔質ベッドＩおよびＩＩの間の上流多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）、および／または流路／マイクロチャネル構造中を移動する液体アリコートを更に処理するための上流多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）である。マイクロチャネル構造は、本発明の主な特徴により使用される、多孔質ベッドの上流または下流に追加された多孔質ベッドを含んでも良い。マイクロチャネル構造中も追加された１対の多孔質ベッドＩおよびＩＩは、流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’，ｂ）から分離された流路の組みを規定しても良い。
【００５５】
上述のように、多孔質ベッド用を意図する反応マイクロキャビティは、１またはそれ以上の導入アレンジメント（上流方向）に接続されても良い。導入アレンジメントのそれぞれは、導入ポートと少なくとも１つの体積測定ユニットを含む。１の有用な変形例では、１つのマイクロチャネル構造につき１つの分離された導入アレンジメントを有し、反応マイクロキャビティは、固相材料を含むことを意図する。他の有用な変形例では、導入アレンジメントは、すべてまたは一部のマイクロチャネル構造にとって（また、反応マイクロキャビティの一部にとっても）共通である。この種類の共通導入アレンジメントは、一般に、共通の導入ポートと、一部である各マイクロチャネル構造／反応マイクロキャビティについて１の体積測定ユニットを備えた分配マニフォールドを含む。双方の変形例で、体積測定ユニットは、続いて、マイクロチャネル構造の下流部分、および／または下流の反応マイクロキャビティと接続される。共通導入アレンジメント、および／または共通分配マニフォールドにより接続されたマイクロチャネル構造は、装置のマイクロチャネル構造のグループを規定する。
【００５６】
一般的な導入アレンジメントは、WO 0274438、(Gyros AB)、WO 0275312 (Gyros AB)、WO 0275775 (Gyros AB)、およびWO 0275776 (Gyros AB)に記載されている。
【００５７】
マイクロ流体装置は、異なるマイクロチャネル構造に接続された、他の共通のマイクロチャネル／マイクロ導管を含んでも良い。導入ポート、排出ポート、通気孔等のような様々な部分を含む共通チャネルは、それらが接続された、それぞれのマイクロチャネル構造の一部と考えられる。
【００５８】
マイクロ流体装置の他の特徴
マイクロ流体装置は、１又はそれ以上の、マイクロリットル（μｌ）範囲の液体アリコート、一般にはナノリットル（ｎｌ）範囲で、例えば、アナライトおよび試薬、製造物、試料、バッファ、および／またはその他のような多くの種類の反応物がその中で処理されるマイクロチャネル構造を含む。マイクロリットル（μｌ）範囲の液体アリコートは、例えば１００μｌ以下、または１０μｌ以下のような、１０００μｌ以下の体積を有し、多くの場合は、例えば５００ｎｌ以下または１００ｎｌ以下のような、１０００ｎｌ以下の体積である、上限が５０００ｎｌであるナノリットル（ｎｌ）範囲を含む。ナノリットル（ｎｌ）範囲は、ピコリットル（ｐｌ）の範囲を含む。マイクロチャネル構造は、１０３以下、好ましくは１０２以下のような５×１０２以下の断面直径を有する、１またはそれ以上のキャビティおよび／または導管を含む。
【００５９】
マイクロ流体装置は、好ましくは、本発明により固相を含むことを意図する複数のマイクロチャネル構造／装置を含む。この文脈において、複数は、２またはそれ以上のマイクロチャネル構造を意味し、一般には、例えば２５以上または９０以上または１８０以上または２７０以上または３６０以上であり、１０以上となる。上述のように、装置のマイクロチャネル構造はグループに分割され、各グループは、反応マイクロキャビティのサイズおよび／または形状や、共通の導入アレンジメントやマニフォールド等のような、共通マイクロチャネルにより特定される。そのような各グループは、一般に、３〜１５、または３〜５０のマイクロチャネル構造を含む。
【００６０】
異なった原理が、上述の１またはそれ以上機能部分の間のマイクロ流体装置／マイクロチャネル構造中の液体のアリコートを移動させるのに使用される。例えば、以下で検討するようなディスクの回転による、慣性力が使用されても良い。他の好適な力は、毛管力、動電気的力、毛管力や静水力等のような非動電気的力である。
【００６１】
マイクロ流体装置は、一般にはディスク状である。好ましい形態は、ディスク面に垂直な対称軸（Ｃｎを含む）。ここで、ｎは、２、３、４、５、またはそれ以上の整数であり、好ましくは∞（Ｃ∞）である。還元すれば、ディスクは、例えば正方形のような矩形や他の多角形形状でも良いが、好ましくは円形である。一旦好ましいディスク形状が決定された場合、回転軸に装置が回転されることにより、遠心力が液流を移動させるのに使用される。回転軸は、ディスク面に垂直または平行である。好ましい変形では、回転軸は、対称軸と同一である。
【００６２】
好ましい遠心力に基づく変形では、各マイクロチャネル構造が、回転軸に対して、下流部分より小さい半径の上流部分を含む。多孔質ベッドＩおよび／またはＩＩを含む反応マイクロキャビティは、２つの部分の半径位置の中間の半径位置にある。
【００６３】
好ましい装置は、従来のＣＤ形状と類似したサイズおよび形状を備えたディスク形状であり、例えば、従来のＣＤ形状の、１０％増から３００％増の範囲にある。
【００６４】
マイクロ流体装置のマイクロチャネル／マイクロキャビティは、他の本質的に平坦な基板（蓋）を用いて表面を覆う、カバーされていないチャネル／キャビティを示す本質的に平坦な基板から形成される。WO 9116966 (Pharmacia Biotech AB)およびWO 0154810 (Gyros AB)参照。双方の基板は、好ましくは、プラスチックポリマ材料等のプラスチック材料から形成されることが好ましい。
【００６５】
内部表面の汚染活性や親水性は、装置中で行われる処理に適用されるべきである。例えば、WO 0147637 (Gyros AB)参照。
【００６６】
「濡れ性」（親水性）および「非濡れ性」（疎水性）の用語は、表面が、それぞれ９０°以下または９０°以上の水接触角を有することを意図する。異なった機能部分の間の液体の効率的な移動を確実にするために、マイクロチャネル構造の個々の部分の内面は、最初は濡れ性を有し、好ましくは例えば、５０°以下、または４０°以下、または３０°以下、または２０°以下のような６０°以下の接触角を有する。これらの濡れ性の値は、少なくとも１、２、３または４つのマイクロ導管の内壁に適用される。１またはそれ以上の内壁がより高い水との接触角を有する場合、残りの内壁のより低い接触角により補正される。特に導入アレンジメントでは、一旦液体がキャビティに入りだすと、毛管現象（自己吸入）もより意図するマイクロキャビティが満たされるように水の流体が満たされるように、濡れ性が適用されるべきである。マイクロチャネル構造の内壁の濡れ性のある表面は、例えば、能動バルブ、反ウイッキング手段、周囲環境に通気する通気孔単独機能等の導入のように、親水性の内部側壁中への、部分的な疎水性表面の割り込みを含んでも良い。例えば、WO 9958245(Gyros AB)およびWO 0274438(Gyros AB)参照。
【００６７】
一般には＋２５℃である使用温度のおける値に対する接触角は一定で、WO 0056808 (Gyros AB)およびWO 0147637 (Gyros AB)に記載された方法で測定できる。
【００６８】
マイクロ流体装置を使用する方法
本発明の第２の形態は、本発明の第１の形態で定義したようなマイクロチャネル構造の流路中で、マイクロ流体処理を行う方法である。このマイクロ流体処理は、一般に、例えば、本発明の方法に必要とされる型の多孔質ベッドを含みまた含まない追加の流路のような、マイクロチャネル構造中に追加の機能／部分が有ることを必要とする。装置の、少なくとも１、２、又はそれ以上のマイクロチャネル構造のそれぞれに対して、方法は以下の工程を含む。
（ｉ）多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）と多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）とを含む流路（１０１；２０１ａ，ａ’..；３０１ａ，ａ’..）の多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の上流である位置に、溶質Ｓを含む第１の液体アリコートを提供する工程、
（ｉｉ）多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を通ってアリコートを移動させる工程、および
（ｉｉｉ）その後に、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）を通って溶質Ｓを移動させる工程。
【００６９】
工程（ｉ）は、アリコートおよび／または溶質Ｓが、装置／マイクロチャネル構造の中で形成され、またはマイクロチャネル構造に投入されることを含む。アリコートおよび／または溶質Ｓの形成は、一般に、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の上流位置で行われる。アリコートの投入は、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の上流位置であり、本発明で使用される各マイクロチャネル構造の導入ポートを介して行われる。この導入ポートは、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の上流の位置で流路と液体接続されている。その中で形成が行われる機能や、またはアリコートが投入される導入ポートが、多くのマイクロチャネル構造に対して共通である。
【００７０】
（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の工程は、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）中の固定化された反応物が中和されることを意味し、例えば、以下ように得られるグループ又は合成物に変形される。
ａ）例えば、（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の工程の連続したランのように、処理の連続した工程で、反応物として使用される固定化された製造物として、または
ｂ）多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）から放出され、処理の他の工程で使用される製造物として。
【００７１】
触媒非基質合成物である固定化された反応物（ＲおよびＲＤＳ）を含む多孔質ベッドＩおよびＩＩ（１０４，２０４，３０４；１０５，２０５，３０５）は、（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の繰り返しランで、再使用することができる。上述のように形成された分析的に検出できる製造物／反応物は、例えば、アナライトである溶質Ｓの、反射特性のように、処理の特性の検出器として使用される。もし、特徴づけられるアナライトがある場合、アナライトは、このように、この種類の製造物／反応物を測定することで、得られた値から特定される。測定は、反応マイクロキャビティＩ（１０２，２０２，３０２）／多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の中、および／またはこのマイクロキャビティ／多孔質ベッドの下流で行われる。
【００７２】
（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の工程は、行われる処理により必要とされるように、１度、２度、またはそれ以上繰り返される。これは、処理と方法が、第２の液体アリコートが使用される、（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の工程の第２のランを含むことを意味する。この第２のアリコートは、溶質Ｓ、可能であれば第１のアリコートの妨害物質とは異なる１またはそれ以上の妨害物質、他のバッファ又はバッファ濃度、および／または異なった溶液成分等を含む。第２のアリコートは、第１のアリコートと同一の流路、または多孔質ベッドＩおよびＩＩを含む他の流路（３０１ａ’）で供給される。この他の流路（３０１ａ’）の中の多孔質ベッドＩＩの、妨害物質に対する能力は、第１の使用された流路（３０１ａ）の中の多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）の対応能力とは一般に異なる。更に、溶質Ｓと妨害物質とを含む更なるアリコート（第３、第４等）は、（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の工程の繰り返しランで、連続して提供される。追加のアリコート／ラン（第２、第３、第４...）のそれぞれに対して、多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）と流路が、移動されるアリコートの溶質Ｓと同時または前に、妨害物質が多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）に到達するのを妨げるように選択される。
【００７３】
第１のランの前に、ランの間、および／または（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の工程の最後のランに続いて、１またはそれ以上の追加の液体アリコートのそれぞれが、以下のように与えられても良い。
ａ）多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を含む流路（１０１；２０１ａ，ｂ；３０１ａ，ａ’）中の上流の多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）、または
ｂ）多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）を含む流路（２０１ｂ、３０１ｂ）中の上流の多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）。
【００７４】
追加のアリコートは、一般に、多くの理由から処理にとって受け入れられると考えられる妨害物質を含む、妨害物質が無い。これらは、一般に、溶質Ｓの欠けた洗浄または調整液であり、バッファ基質、水、水混和性溶媒、および、例えば、中和剤やテンサイドのような表面活性材を含んでもよい。それらの１またはそれ以上は、溶質Ｓを含む。
【００７５】
本発明にかかる方法および処理は、またアリコートが多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）およびＩＩ（１０５，２０５，３０５）を通り抜けることを必要としない液体アリコートの処理を含む。一般に、そのような工程は、下流の多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）および上流の多孔質ベッドＩＩ（１０５，２０５，３０５）で処理される。
【００７６】
第１のランおよび／または繰り返しランの、工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間の移動は、安定したまたは以下の間の作用のための条件を提供するように選択される。
ａ）親和力対ＡＣＤＳのような安定化反応物ＲＤＳ、および妨害物質、および／または、
ｂ）親和力対ＡＣＳのような安定化反応物Ｒ、および溶質Ｓ。
【００７７】
多孔質ベッドを通過する一般的な流量の条件は、例えば、０．０５０秒以上、または０．１秒以上のような０．０１０秒以上で、一般には、例えば１時間以下のような２時間の上限時間である滞在時間を与える。実例となる流量は、例えば０．０１〜１００ｎｌ／秒、より一般には０．１〜１０ｎｌ／秒のような、０．０１〜１０００ｎｌ／秒の範囲内である。それらの流量間隔は、例えば１〜５０ｎｌ又は１〜２５ｎｌのような、１〜２００ｎｌの範囲のベッド体積に有用である。時間に対する滞在時間は、反応マイクロキャビティ中で液体アリコートが固相と接触するように時間である。流量は、言及した相互作用が、拡散限定条件、または非拡散限定条件の下で起きるように適用される。流量条件を伴う更なる詳細や特徴は、WO 0275312 (Gyros AB)で与えられる。
【００７８】
（ｉ）から（ｉｉｉ）の一連の工程は、（ａ）分離方法、（ｂ）触媒反応の方法、（ｃ）固相合成等の一部であっても良い。
【００７９】
分離は、以下に示す他のものを含む。
ａ）捕獲、即ち、多孔質ベッドＩが、溶質Ｓのための固定能力を有する親和構造（親和リガンド、親和反応物）を示す。これにより、溶質Ｓを含む液体がベッドを通過した場合、溶質Ｓの無い液体、または溶質Ｓが低減された液体が、溶出液に出て、および／または、
ｂ）固相材料の後での使用のための、固相材料上への溶質の固定であり、捕獲、触媒反応、固相触媒等の中で修正される。
【００８０】
代わりに、（ａ）（捕獲）溶質は、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）に向かい、親和構造や溶質を含む固定化された親和複合体を形成する。
【００８１】
固定化（ｂの代わり）において、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）は接続Ｂ’−ＡＣ’Ｓ（＝Ｓ’）に対する親和対である一般的な親和構造Ｌ’（包括的リガンド）（ＡＣＳ）を示す。この接続Ｂ’−ＡＣ’Ｓは、２種類の接続サイトを有する。第１のサイトＢ’は、包括的で、多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４）の上の包括的親和構造Ｌ’の方向を向き、第２のサイトＡＣ’Ｓは、溶質Ｓ、Ｌ’、Ｂ’、Ｓ’およびＡＣ’Ｓの方向を向き、Ｌ、Ｂ、Ｓ、おおよびＡＣＳに対応し、本発明の第１の形態の文脈で、親和常数を含むＬ、Ｂ、Ｓ、およびＡＣＳについて言われたように、ここでも適用する。
【００８２】
分離は、溶質Ｓの純化または濃縮プロトコルの一部である。溶質Ｓは、汚染物、または純化や濃縮等がなされる物質でも良い。分離は、また、合成プロトコル、準備プロトコル、細胞に基づく分析、核酸分析、免疫分析、酵素分析、および他のレセプタとリガンドとの間の親和力に基づくリガンド−レセプタ分析を含む多くの種類の親和力分析の一部でもある。
【００８３】
固相材料（多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４））上に固定化された反応物Ｒに溶質Ｓを固定するための捕獲工程を用いる親和力分析は、一般に、分析で使用される反応物（アナライト）の特徴づけられない長所や変化の特徴づけを目的とする。一般的な特徴／変化は、以下の２種類からなる。ａ）存在および／または不存在、濃度、相対量、固定、結合活性や酵素活性のような活性を含む量、およびｂ）例えば、親和定数、特異性等のような親和力を含む親和反応の特性、である。ｐＨ、温度、イオン強度等のような反応変数、問題となる実験／反応の結果への影響も、特徴づけられる／決定される（収量、精度、回復等）。WO 02705312 (Gyros AB)参照。
【００８４】
本発明が適用される親和力分析の主なグループは、ａ）阻害試験や置き換え試験を含む競争親和力分析、またはｂ）サンドイッチ分析を含む非競争親和力分析、である。親和力試験の条件は、親和複合体の量が、試料中のアナライトの不存在、存在、および／または量（濃度を含む）と関連するように選択される。親和力分析は、少なくとも一工程が、親和力複合体を作製するように、固定化された反応物と親和力対との間の親和反応を利用するという意味で、異種（homogeneous）である。親和力複合体、試料中のアナライトの存在、不存在、および／または量に関連する量、を測定するために、親和力分析は、分析的に検出可能な反応物を使用する。親和力反応物で使用される分析的な検出可能な反応物は、親和力反応物と分類された化合物との間で、検出可能なまたは人工の結合を、本質的に検出できる。２つの主な種類の分類が存在する。
ａ）酵素分類（酵素、コエンザイム、基質、補基質、補因子等）、放射性のあるイソプトペス、発色団、色原体、および／または蛍光団、バイオルミノファ、および／またはバイオルミノゲン、金属原子、およびイオン等のような信号放射分類、および、
ｂ）親和力分類に固定される１の部分と、分析的に検出可能な他の部分とを含む第二の検出反応を必要とする親和力分類、である。
【００８５】
本発明に適用される触媒反応は、使用される触媒システムの１又はそれ以上の固定化された化合物を示す固相材料（多孔質ベッドＩ（１０４，２０４，３０４））を含み、また同じシステムの他の化合物は溶質Ｓである。触媒反応は、固定化された部材（親和構造、親和リガンド、親和反応物）と溶質Ｓ、可能であれば溶媒システムの他の部材を含む、との間で、親和力複合体が形成されることを含む。
【００８６】
「触媒システム」の用語は、単体酵素システムと、一連の接続された酵素システム、他の反応システムと接続された単体触媒システム、細部全体、酵素活性を示す細胞部分等を含むより複雑な形態を含む。ベッドは、酵素リアクタとして触媒リアクタとして機能しても良い。酵素免疫学的検定のような酵素レセプタ−リガンド分析（酵素親和力分析）が、接続された触媒システムを使用する処理、他のレセプタ−リガンド反応と接続する、の一例である。
【００８７】
固定化された反応物Ｒと溶質Ｓとの間の作用がその間に起きる工程は、酵素分析のような触媒分析の一部であり、１またはそれ以上の触媒システムの部材または他の反応変数（例えば、反応条件）を特徴づける。分析は、液体試料中の粒子状触媒、基質、補基質、補因子、補触媒等の活性を特定する。触媒分析の用語は、いわゆる酵素目根記分析を意図する。特定される活性に対応した分子物質は、アナライトと呼ばれる。WO 03093802 (Gyros AB) 参照。
【００８８】
固相合成は、オリゴペプタイド合成やオリゴヌクレオチド剛性、固相材料上での他の低分子の剛性のような、例えば、ポリマ合成を含む。ポリマ合成中で使用される固定化反応物は、例えば、核酸、炭水化物、アミノ酸構造、およびそれらの構造の模倣のような、対応するモノマの構造を示す。組み合わせライブラリの固定化部材のライブラリの合成も含まれる。そのような部材は比較的低い分子量（例えば、重合バックボーンへのスペーサを含む、１００００ドルトン以下）である。
【００８９】
包括的リガンドを含むマイクロ流体装置
本発明の第３の形態は、１、２、またはそれ以上のマイクロチャネル構造を有するマイクロ流体装置を含む。それらのマイクロ流体装置の少なくとも１つは、１、２、またはそれ以上の流路（１０１；２０１ａ，ａ’；３０１ａ，ａ’，ｂ）と、第１の形態で記載されたような直列接続された２つの多孔質ベッド（１０４，２０４，３０４；１０５，２０５，３０５）を含む少なくとも１、２、またはそれ以上の流路（１０１；２０１ａ，ａ’；３０１ａ，ａ’）のそれぞれとを含む。第１の形態のように、上流の多孔質ベッド（１０５，２０５，３０５）の上流、多孔質ベッド（１０４，２０４，３０４；１０５，２０５，３０５）の間、および下流の多孔質ベッド（１０４，２０４，３０４）の下流に、追加の機能ユニットを有しても良い。
【００９０】
特徴づけられる長所は、上流の多孔質ベッドと下流の多孔質ベッドとを含む流路のそれぞれにおいて、少なくとも１つ、好ましくは双方のベッドが、２つのベッドで同じかまたは異なる包括的リガンドＬを含むことである。このリガンドは、それぞれのベッドで、ベッドの固相材料に固定される。流路中の２つのリガンドは、下流のベッド（１０４，２０４，３０４）にためのＬＩと、上流のベッド（１０５，２０５，３０５）に対するＬＩＩで表される。２つの多孔質ベッドを含む２又はそれ以上の流路を有する場合、包括的なリガンドの組み合わせは、少なくとも２つの流路の間で異なるが、好ましくは、組み合わせは、多孔質ベッドＩおよび多孔質ベッドＩＩを含む全ての流路において同じである。
【００９１】
ベッドＩおよびベッドＩＩを含む流路中の、一般的なリガンドの組み合わせは、１）ＬＩ＝ＬＩＩ、２）ＬＩＩ＝非（anti）ＬＩ、および３）ＬＩ＝非ＬＩＩ、である。包括的な固定親和対のようなビオチン化合物およびビオチン接続化合物（非ビオチン）に対して、これは、１）ビオチンＩ；ビオチンＩＩ、または非ビオチンＩ；非ビオチンＩＩ、２）ビオチンＩ；非ビオチンＩＩ、および３）非ビオチンＩ；ビオチンＩＩ、を意味する。
【００９２】
包括的リダンドＬに対する多孔質ベッドＩまたはＩＩ（１０４，２０４，３０４；１０５，２０５，３０５）の固定能力は、体積あたりのモルとしてのリガンドの量、無視したブロッキング、および固定に起因する接続サイトの破壊として測定される。この測定において、適当な接続能力は、一般に、液体で飽和したベッド形態中の固相でｎｌあたり、例えば０．０１〜３００ｐｍｏｌのような０．００１〜３０００ｐｍｏｌの範囲となる。もし、ｎｌあたり０．１ｐｍｏｌのストレプトビジンが固定されれば、これは、０．４ｐｍｏｌ／ｎｌのビオチン接続サイトに対応する。変換因子４は、ストレプトビジンが、ストレプトビジン分子と接続するために４つの接続サイトを有するためである。接続能力は、また、バインダＢの実際の接続能力として測定できる。即ち、液体で飽和したベッド形態中の固定された親和リガンドを含む固相の単位体積あたりの、活性接続サイトのｍｏｌとして測定される。接続能力は、固定化技術、固相の孔のサイズ、固定される物質のサイズ、固相の材料および形状等に依存するであろう。理想的には、同じ範囲が、接続サイトの総量として、（上述のように）実際の接続能力に適用されるであろう。実際の接続能力が、第１に、例えば、接続されず、および／または分配されない、基本形態のバインダＢの固定／捕獲となる。WO 04083109 (Gyros AB) 参照。
【００９３】
多様な流路、マイクロキャビティ、機能ユニット等を含むマイクロチャネル構造／マイクロ流体装置に関する本発明の第３の形態の、他の特徴的な長所では、固相材料等が上述のように、本発明の第３の形態となるであろう。
【実験１】
【００９４】
非アナライト抗体を示す単体多孔質ベッドと非アナライト抗体を示す多孔質ベッドダミーを備えた多孔質ベッドとの比較
この例は、ＰＤＧＦβレセプタに向かい、＋／−リガンドＰＤＧＦ−ＢＢで刺激される膜を安定して示す、汚染された大動脈皮内（ＰＡＥ）からの、細胞溶解物中のＰＤＧＦβレセプタのためのサンドイッチ免疫学的検定を記載する。捕獲抗体は、ターゲットタンパクに向かって生じ、検出抗体は、調整されたリン酸化アミノ酸サイトに向かう。固定、分類（Alexa 647）およびマイクロチャネル構造／マイクロ流体装置／器機を含む分析は、WO 04083108 (Gyros)のマイオグロビン分析と同じである。使用されるマイクロチャネル構造は、WO 04083108の図１に記載されている。多孔質ベッドは、反応マイクロキャビティ（１０４）中に配置される。
【００９５】
細胞培養
ＰＡＥ細胞は、ＰＤＧＦβレセプタとともに移動され、細胞培養の１つが、選択されたＧ−４１８である[Claesson-Welsh, L. et al. ＰＤＧＦ分子を含むＢチェインを特定する人間の血小板由来増殖因子レセプタのｃＤＮＡクローニングおよび発現、Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 3476-3486]。細胞は、Ｈａｍの、１０％ウシ胎仔血清、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、およびグルタミンが補われたハムの媒体Ｆ−１２中で成長する。ほぼ細胞の融合性の単層は、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補い、攪拌板上で６０分間、１００ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢ１００μｍを用いて＋／−刺激した、ＨａｍのＦ−１２中で、夜通し飢えさせる。刺激しない細胞は、制御として使用される。この細胞のみがリン酸化されていないＰＤＦＧβレセプタを有するからである。レセプタは活性化され、内在化を禁じる高濃度のリガンドで飽和され、刺激中のデグラデーションに続く。刺激の後に、細胞は、氷冷されたＰＢＳバッファ中で２回洗浄され、１ｍｌＰＢＳ中で「ラバーポリスメン（rubber police men）」を用いて解体される。細胞懸濁液は、蓄えられ、２００μｌの氷冷されたリーシスバッファ（２０ｍＭ  ３重ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．５％  トリトンＸ−１００，０．５％，Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．５ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４  および１％  Ｔｒａｓｙｌｏｌ（バイエルン））に、１５分間、氷上で溶解される。溶解物は１３０００ｒｐｍで１５分間、４℃で遠心分離され、上清がアリコート中に蓄えられ、−２０℃で保存される。より濃縮された溶解液を作製するために、細胞は、第１成長は７５ｃｍ２の培養皿の上で、第２のランは１７５ｃｍ２の培養フラスコ中で行われる。全タンパクは、PIERCE Biotechnology (Boule Nordic AB, Huddinge S.)からの、ＢＣＡタンパク分析きっとマイクロプレート手続き（BCA Protein Assay Kit Microplate procedure）に従って定量される。
【００９６】
ＰＤＧＦβレセプタ抗体
人間のＰＤＧＦβレセプタのカルボキシ末端のアミノ酸９５８−１１０６に対応した組み換えタンパクに向かうラビットポリクローナル抗体９５８、人間のＰＤＧＦβレセプタのカルボキシ末端のペプチドに向かう羊ポリクローナル抗体Ｐ−２０、およびマウスモノクローナエウＰＹ９９は、Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA)から得られる。ＰＤＧＦβレセプタ抗体Ｐ−２０および６５８は、人間のＰＤＧＦレセプタタイプβの検出、および少ない程度において、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降、および免疫組織化学により、マウスおよびラビットオリジン（origen）の検出に薦める。それらは、ＰＤＧＦレセプタタイプαとは交差反応性を有すべきではない。この抗体は、同じ細胞培養を伴う、免疫沈降やウエスタンブロッティングの実験において、広範囲に使用される。[Pietras K., et al.ＰＤＧＦレセプタ信号伝達の禁止による腫瘍間質中の化学療法の抗腫瘍効果の拡張，Cancer Research 62 (2002) 5476-5480]。
【００９７】
サンドイッチに基づく免疫学的検定法
分析において、洗浄バッファおよび抗体は、共通の分配チャネルを通って分配され、細胞溶解プレパレーションは、それぞれの導入口を通って分配される。それぞれのバッチランは、３重のおよび空の試料蛛に標準を含む。分析は、小さな希釈続き（＋／−ＰＤＧＦ−ＢＢ）および、リーシスバッファを有する多くのブランクを含む。分析中の全ての工程は、Gyrolab Workstation (Gyros AB) 中で自動的に行われる。
【００９８】
分析中の異なった抗体の組み合わせは、高度の特異結合、９５８／ＹＰ９９、９５８／Ｐ−２０、Ｐ−２０／Ｐ−２０、Ｐ−２０／９５８、およびＰ−２０／ＰＹ９９（捕獲／検出）を与える組み合わせを見つけるために試験される。
【００９９】
滴化は、検出抗体の濃度は４００ｎＭであるべきことを示した。
【０１００】
＋／−ＰＤＧＦ−ＢＢ刺激を伴うβ−ＰＡＥ細胞溶解物は、リサートバッファ（２倍、４倍、８倍）中で希釈された。希釈されない細胞溶解物は、標準点として含まれた。
【０１０１】
捕獲抗体の固定化
多孔質ベッドは、ＰＢＳ−Ｔ（０．０１５Ｍ  Ｎａ−ＰＯ４  ｐＨ７．４，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％  ＮａＮ３，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄され、ストレプトアビジンが固定されたフェニルデキシトランで被覆されたポリスチレンベッドを再生するために、短時間回転する。回転に続いて、洗浄バッファ中で希釈された、ビオチニル化捕獲酵素が、６６７ｎＭの濃度で加えられた。再生と同じ方法で、洗浄は２回繰り返された。
【０１０２】
基本分析プロトコル
細胞溶解物が個々の導入口に加えられ、体積（２００ｎｌ）が規定され、ＰＤＧＦβレセプタ（アナライト）が捕獲される多孔質ベッドに運ばれる。２つの洗浄工程の後、短い回転を行い、蛍光検出中にベッドが液体で満たされるのを確実にする。背景蛍光検出は、ＬＩＦ検出器で設定される、１％、５％、および２５％の異なった３つの感度を有する。回転工程中にアナライトに接合することができる検出抗体を加える前に、超過のバッファは、短い回転により洗い流された。６つの洗浄工程は、最終的に、２つの洗浄工程が通常の洗浄バッファを用い、４つがイソプロパノール２０％を含む洗浄バッファを用い、過剰の検出抗体を除去する。
【０１０３】
最初に、細胞溶解物ランは、捕獲抗体が多孔質ベッドの全体に分配される基本的な分析プロトコルに基づいて行われた。ＰＤＧＦβレセプタと抗体との間に特有の作用を確立するのが困難であるため、修正が検討された。まず、最初に、アナライトと検出抗体回転プログラムが拡張され、ベッド上の直線的な流れが、細胞溶解液中のＰＤＧＦβレセプタが、捕獲抗体に付着するのを低減する。アナライトを加えた後、３つの追加の洗浄工程が、Ｔｗｅｅｎ−２０のないＰＢＳバッファを用いて含まれ、第２および第４の洗浄工程に続いてパルス回転プログラムが行われ、簡単な拡散により、ベッドを通って溶液が除去できるようにした。イソプロパノールが洗浄バッファに含まれる場合を除いて、検出抗体の後の最後の洗浄工程は、先のパラグラフと同じである。
【０１０４】
細胞溶解液分析中の制御されない特別で無い作用により、捕獲非アナライト抗体の無い第２の多孔質ベッド（ＩＩ）が、非アナライト抗体を示す多孔質ベッド（Ｉ）の上に導入される。多孔質ベッド（ＩＩ）は、ゲル状の濾過媒体Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）のペプチド（Asmersham Bioscience, Uppsala, Sweden）からなる。溶媒は、５倍に希釈されたスラリ（それに対してストレプトアビジンが固定されるフェニルデキシトロンで覆われたポリスチレンビーズ）として多孔質ベッドＩの上に導入される。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）ペプチドは、ペプチドと分子量で１００〜７０００ダルトンの他の小さな有機分子の高解像度のゲル状濾過として使用される。
【０１０５】
結果
予備実験から、Ｐ−２０／９５８、Ｐ−２０／ＰＹ９９、および９５８／ＰＹ９９の、３つの抗体の組みが選択された。
【０１０６】
多孔質ベッド（Ｉ）スラリ
細胞溶解物実験は、ベッド中の信号分布（３倍）により、高いＣＶ値が得られた。いくつかの実験では、細胞溶解物とブランク信号との間で信号の若干の違いが見られたが、殆ど重要な信号は背景信号から区別できなかった。ベッド中の濃化は殆ど不規則であり、通常のベッドパターンは見られなかった。いく地下の場合、信号が多孔質ベッドの下で進む傾向にあった。
【０１０７】
多孔質ベッド（Ｉ）の上流の多孔質ベッド（ＩＩ）
以下の２つの組み合わせが試験された。
ａ）ストレプトアビジンが固定されたフェニルデキシトロンで覆われたポリスチレン粒子のベッド上の、フェニルデキシトロンで覆われたポリスチレンビーズのベッド（本質的に多孔質でない）、および
ｂ）ストレプトアビジンが固定されたフェニルデキシトロンで覆われたポリスチレンビーズのベッド上の、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）ペプチド。
【０１０８】
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）ペプチドの組み合わせは、単体のベッドの形態に比較して、３つの抗体ペアに対して、改良を示した。細胞溶解液の応答とブランクの応答との違いが識別できた。
【実験２】
【０１０９】
天然試料中の親水性抗体の影響の中和
基本分析
ＴＮＦαのためのマイクロ流体サンドイッチ蛍光免疫測定が、WO 04083108 (Gyros AB)の実験の一部において、マイオグロビンが概説されている。固相および固定化技術および蛍光分類技術は、WO 04083108 (Gyros AB)に概説されている。分析は、ＩｇＧベッド、または対応する固定化されたＩｇＧの無い対応するベッドを、捕獲アンチＴＮＦαマウス抗体を示すベッドの上流に隣接して配置することにより、修正された。
【０１１０】
道具およびマイクロ流体装置
双方とも、WO 04083108(Gyros AB)で使用されたものと同じである。
【０１１１】
試料
親水性抗体に富んだ３つの人間血清試料と、１つの通常の試料が、Ａにおいて使用された。４つの全ての試料は、人間ＴＮＦα（２００ｐｇ／ｍｌ）が加えられ、Ｂで使用された。
【０１１２】
固相−免疫グロブリン
WO 04083108 (Gyros AB) で使用されたものと同種のストレプトアビジン粒子が、バッチモードで、ボビンＩｇＧとマウスＩｇＧとの４つの組み合わせ−ボビンＩｇＧ：マウスＩｇＧが１０：１、ボビンＩｇＧ：マウスＩｇＧが１：１、ボビンＩｇＧ、マウスＩｇＧで被覆された。続いて粒子が、捕獲アンチＴＮＦαマウス抗体を示すベッドの上に導入された。双方のベッドに対する導入技術は、WO 04083108 (Gyros AB) のアンチマイオグロビン抗体ベッドと同じである。実験中の流路方向は、ＩｇＧベッドからアンチＴＮＦαマウス抗体ベッドに向かう方向である。
【０１１３】
実験
アンチＴＮＦαマウス抗体ベッドの前のＩｇＧベッドの、Ａ）上述の４つの人間血清試料の疎水性抗体の検出、Ｂ）上述のＴＮＦαが加えられた人間血清試料のＴＮＦα分析のためのＴＮＦαの回復、およびＣ）標準カーブ、に対する影響。
【０１１４】
（Ａ）の結果
図４参照。各グループのステープル（staple）は、個々の試料を示す。１０：１のボビン：マウスＩｇＧに基づくＩｇＧベッドが、捕獲疎水性抗体中で最も有効であった。疎水性抗体は、普通の血清試料では検出されなかった。アンチＴＮＦαマウス抗体ベッドの前のＩｇＧベッドを使うことなく、後者のベッドは、アンチＴＮＦαマウス抗体ベッドに基づくＴＮＦα分析を妨害する、多量の親水性抗体を捕獲した。
【０１１５】
（Ｂ）の結果
図５ａ参照。各グループのステープルは、個々の試料を示し、ステープルの無いものは、普通の血清試料を示す。ＩｇＧベッドをアンチＴＮＦαマウス抗体ベッドの前に配置した場合、ＴＮＦαの回復の変化が得られた。
【０１１６】
（Ｃ）の結果
図５ｂ参照。ＩｇＧベッドの無い場合と比較して、異なったＩｇＧベッドをアンチＴＮＦαマウス抗体ベッドの前に配置した場合、標準カーブの変化が重要であった。
【０１１７】
本発明の所定の革新的な形態は、添付された請求項により詳細に規定される。本発明およびその利点は詳細に記載したが、多様な変化、代用、および代用は、添付された請求項により規定される発明の精神や範囲から離れることなく、ここに行われる。更に、本発明の範囲は、明細書で記載されたプロセス、機械、製造、内容の構成、手段、方法、および工程の特別な具体例に限定することを意図するものではない。ここに存在しまたは後に展開された、ここに記載された対応する具体例と本質的に同様の機能が得られ又は本質的に同様の結果が得られる、プロセス、機械、製造、内容の構成、手段、方法、または工程を、当業者は、本発明の記載から認識することができるであろう。このように、添付された請求項は、そのようなプロセス、機械、製造、内容の構成、手段、方法、または工程の範囲内に含まれることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１ａ】共通の流路中に、直列に接続された２つの異なった多孔質ベッドを有する２つの変形を示す。
【図１ｂ】共通の流路中に、直列に接続された２つの異なった多孔質ベッドを有する２つの変形を示す。
【図２】共通の多孔質ベッドを有する２つの流路を備えた変形を示す。流路の１つは、共通の多孔質ベッドの上流に、第２の多孔質ベッドを有する。
【図３】共通の多孔質ベッドと、３つの流路の外の２つにある１の追加の多孔質ベッドとを有する３つの流路を備えた変形を示す。
【図４】実験１Ａの結果を示す。
【図５ａ】実験２Ｂの結果を示す。
【図５ｂ】実験２Ｂの結果を示す。
【符号の説明】
【０１１９】
１０１  流路、１０２、１０４  多孔質ベッドＩ、１０３、１０５  多孔質ベッドＩＩ、１０６  多孔質膜、１０７  液体ルータ機能、１０８  共通部分、１０９  マイクロ導管。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【国際調査報告】
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