(57)【要約】  本発明は細菌種の同定及び細菌感染の診断に有用である核酸プローブ及び広域プライマー、ならびに細菌感染の診断に関する。特に、本発明は感染原因となる細菌種のＲＮＡポリメラーゼベータサブユニット、ｒｐｏＢ（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＢ）にかかわる遺伝子の保存領域の近辺に位置する高頻度可変領域に由来する特異的核酸プローブに関する。本発明はまた、ｒｐｏＢ遺伝子の保存領域に由来する広域プライマーに関する。さらに、本発明は、これらの核酸プローブ及び広域プライマーの細菌感染診断における使用及びこれらの核酸プローブ及び広域プライマーを用いる診断方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染原因となる細菌種を臨床試料から検出及び同定するための診断方法であって、
ａ）感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域に由来する配列とハイブリッド形成する配列を包含するＤＮＡプライマーの混合物を使用し、上記臨床試料から単離されたＤＮＡを増幅させ、ここで上記配列は配列番号：２０及び２１により同定される配列及び／又はその相補的配列及び／又はその機能性フラグメントを包含しており；
ｂ）増幅されたＤＮＡを、上記感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の近辺に位置する高頻度可変領域とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブ配列の所望の組合せと正常ハイブリッド形成条件下に接触させ、ここで上記配列は上記ハイブリッド形成条件下に細菌種−特異性であり；次いで
ｃ）可能なハイブリッド形成複合体の形成を検出する；
ことを特徴とする、上記診断方法。
【請求項２】
上記感染原因となる細菌種がヒト疾病、特に呼吸器官感染及び／又は耳、鼻及び喉疾病を発症させる細菌種であることを特徴とする、請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
上記高頻度可変領域が、ハエモフィラス  インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス  プニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス  パイオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、プシュードモナス  アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ  プニューモフィラ（Ｌｅｇｉｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、コリネバクテリウム  ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、マイコプラズマ  プニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エスケリッチャ  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、モラキセラ  カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）及びナイセリア  ゴノルホエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）から選択される細菌種のｒｐｏＢタンパク質をコードする遺伝子の高頻度可変領域であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の診断方法。
【請求項４】
工程ｂ）で使用されるオリゴヌクレオチドプローブ配列の長さが、１５〜３０、さらに好ましくは１９〜３０、最も好ましくは１９〜２６個の核酸であり、及び場合により標識付けされていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の診断方法。
【請求項５】
上記オリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せが、配列番号：１〜１９によって同定される配列の全部又は一部、及び／又はその反転的配列及び／又は相補的配列、あるいはその機能性フラグメントを包含し、好ましくは配列番号：１〜１９によって同定される配列の全部を包含することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の診断方法。
【請求項６】
上記オリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せを固体支持体上に、好ましくは処理ガラス上に結合させることを特徴とする、請求項５又は６のいずれかに記載の診断方法。
【請求項７】
工程ａ）において、臨床試料から単離されたＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させ、及び工程ｂ）において、増幅されたＤＮＡを固体支持体上に結合されている細菌種−特異性オリコゴヌクレオチドプローブと接触させることを特徴とする、請求項１に記載の診断方法。
【請求項８】
工程ａ）において、適当に標識付けしたヌクレオチドを臨床試料から単離されたＤＮＡの増幅に使用し、検出可能な標的鎖を発現させ、及び工程ｂ）において、増幅され、場合により標識付けされた標的ＤＮＡを、その上に配列番号：１〜１９によって同定される、及び／又はその反転的配列及び／又は相補的配列の細菌種−特異性オリゴヌクレオチドプローブの全部が結合されている固体支持体と接触させることを特徴とする、請求項７に記載の診断方法。
【請求項９】
工程ｂ）において、増幅され、場合により標識付けされた標的ＤＮＡを、その上に感染原因となる１種の特定の細菌種又は数種の特定の細菌種を検出する特異性オリゴヌクレオチドプローブ配列が結合されている固体支持体、好ましくは処理ガラスと接触させ、ここで上記配列は表３に示されている配列及び／又はその相補的配列から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の診断方法。
【請求項１０】
工程ｃ）において、マイクロアレイ技法を使用することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の診断方法。
【請求項１１】
ＤＮＡプライマー混合物であって、感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の配列とハイブリッド形成する配列を包含し、当該混合物は配列番号：２０及び２１により同定される配列及び／又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントを包含することを特徴とするＤＮＡプライマー混合物。
【請求項１２】
感染原因となる細菌種の診断に有用なオリゴヌクレオチド配列であって、細菌種特異性であり、かつ当該感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の近辺に存在する高頻度可変領域の配列と、正常ハイブリッド形成条件下にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド配列であり、ここでこのオリゴヌクレオチド配列は、配列番号：１〜１９によって同定される配列の１種、及び／又はその反転的配列及び／又は相補的配列あるいはその機能性フラグメントを包含することを特徴とするオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１３】
感染原因となる細菌種の診断に有用なオリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せであって、配列番号：１〜１９によって同定される配列、及び／又はその反転的配列又は相補的配列、あるいはその機能性フラグメントのいずれかの組合せを包含することを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せ。
【請求項１４】
配列番号：１〜１９によって同定される配列の全部を包含することを特徴とする、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプローブの組合せ。
【請求項１５】
発病原因となる細菌種の検出、同定、又は分類における請求項１３又は１４に記載のオリゴヌクレオチドプローブの組合せの使用。
【請求項１６】
感染原因となる細菌、特に呼吸器官感染原因となる細菌の診断に用いる診断用キットであって、
ａ）感染原因となる細菌種、特に呼吸器官感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の配列とハイブリッド形成する配列を包含するＤＮＡプライマーの混合物であって、配列番号：２０及び２１により同定される配列及び／又はその反転的配列又は相補的配列、あるいはその機能性フラグメントを包含するＤＮＡプライマー混合物；
ｂ）固体支持体上に結合されていてもよく、配列番号：１〜１９によって同定される配列、及び／又はその反転的配列又は相補的配列、あるいはその機能性フラグメントのいずれかの組合せを包含する細菌種特異性オリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せ；
ｃ）陽性及び場合により陰性でもよい対照プローブ配列；及び場合により、
ｄ）増幅、ハイブリッド形成、精製、洗浄、及び／又は検出工程で要求される試薬；
を含むことを特徴とする診断用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細菌種の同定及び細菌感染の診断に有用である核酸プローブ及び広域プライマーに関する。特に、本発明は感染原因となる細菌種のＲＮＡポリメラーゼベータサブユニット、ｒｐｏＢ（ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットＢ）をコードする遺伝子領域の保存配列の近辺に位置する高頻度可変領域に由来する特異的核酸プローブに関する。本発明はまた、ｒｐｏＢ遺伝子の保存領域に由来する広域プライマーに関する。さらに、本発明は、これらの核酸プローブ及び広域プライマーの細菌感染の診断における使用及びこれらの核酸プローブ及び広域プライマーを用いる診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
呼吸器官感染は、フィンランド及び全世界において、診療所を訪れる人々に一般的に発生する。ウィルスに加えて、呼吸器官感染は種々の細菌種によって引き起こされる。ストレプトコッカス  パイオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、（グループＡストレプトコッカス）は扁桃炎の重要な原因病原体である。扁桃周辺の腫瘍などの重篤な合併症の危険性は未処置扁桃炎に関連している。さらにまた、Ｓ．パイオゲネスにより発症される扁桃炎の後遺症は重篤であって、致死的でさえある病気である糸球体腎炎及びリウマチ熱を包含する。ウィルス以外で、外来患者の肺炎の最も重要な原因病原体には、ストレプトコッカス  プニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（プニューモコッカス（ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ））、マイコプラズマ  プニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びクラミジア  プニューモニアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）があり、プニューモコッカスは最も一般的であって、重篤な肺炎発症病原体である。頻度は少ないが、肺炎を発病させる細菌種には、レジオネラ  プニューモフィラ（Ｌｅｇｉｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）がある。他方マイコバクテリウム  ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は肺結核を発症させる。プニューモコッカスに加えて、副鼻腔炎及び中耳の炎症（中耳炎）の原因病原体は、ハエモフィラス  インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）及びモラキセラ  カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）を包含する。
【０００３】
現時点において、細菌呼吸器官感染の診断は細菌培養試験に主として基づいている。しかしながら、細菌培養試験は比較的緩慢であり、培養に基づく診断方法は通常、試料採取後の数日のみの、時には数週間までの結果をもたらす。さらにまた、細菌の培養は実験室条件下では常時成功するものではない。これは、使用される培養方法が問題の細菌種に適用できないという事実、又は患者が試料採取以前に抗生物質治療を受けているという事実のどちらかの結果である。咽頭炎の診断において、抗原検出に基づく迅速方法は細菌培養試験の良好な補助方法であるが、この方法は限定数の細菌（グループＡストレプトコッカス）に対してのみ動作する。或る種の細菌感染（例えば、Ｃ．プニューモニアエ及びＭ．プニューモニアエ）の診断において、血清学的方法をまた使用することができるが、これらの方法は感染発現から数日後又は数週間後にのみ結果をもたらす。従って、これらの方法は患者の緊急処置の助けには必ずしもならない。
【０００４】
核酸の増幅及びハイブリッド形成に基づく分子法が細菌培養試験の上記問題点の解決に試みられている。これらの方法で補助すると、病原体は同時的に検出及び同定され、さらに迅速な診断が得られ、また時間を消費する追加の培養試験の必要性が排除される。また、抗生物質は培養試験と同じ程度には分子的方法を干渉しない。
【０００５】
細菌診断に使用される分子法の一つは、広域ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ））と称される方法であり、この方法は広域プライマー（ｂｒｏａｄ−ｒａｎｇｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ）の使用に基づいている。現時点で、最も一般的な広域ＰＣＲ法はリボソームＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ／ｒＲＮＡ又は２３Ｓ  ｒＤＮＡ／ｒＲＮＡ）をコードする細菌染色体遺伝子の保存ＤＮＡ配列を認識するプライマーの使用に基づいている。広域ＰＣＲに基づく細菌同定において、実際の同定工程は増幅されたＰＣＲ生成物の配列決定によって行われる（例えば、ＥＰ−Ｂ１  ６１３５０２、米国特許第６，００１，５６４号及び米国特許出願Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．００２００５５１０１参照）。複数種の細菌感染の直接的同定はクローン化により生成される形質転換株ライブラリイの配列決定を要する。
【０００６】
広域細菌ＰＣＲ法は臨床的細菌診断に或る程度までは適用することができ、この方法は培養単離物からの細菌種及びカビ種の同定に最も適しており、この目的用の商業的試験、例えばＭｉｃｒｏＳｅｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が開発されている。しかしながら、これらの試験は広く使用されていない。この理由は、ＰＣＲ生成物の配列決定は時間を消費し、また多量の労力を要し、及び分析それ自体及び必要な装置、例えば配列決定装置は高価であり、さらにこの試験の実施には特別に訓練された熟練者を要する。
【０００７】
細菌診断に或る程度まで用いられているもう一つの方法は、古典的な特異的オリゴヌクレオチドを基材とするＰＣＲ又はその応用方法、複合ＰＣＲ法（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ）である。この方法では、細菌種−特異性プライマーの混合物を使用する。Ｈｅｎｄｏｌｉｎ等は中耳炎を発病させる病原体を同定する場合に、複合ＰＣＲ法を使用した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，３５：１１，２８５４−２８５８，１９９７）。この方法では、１６Ｓ  ｒＲＮＡの保存遺伝子領域に由来する広域プライマーが１種のＰＣＲプライマーとして使用され、及び４種の相違する細菌種特異性プライマーからなるプライマー混合物がもう一種のＰＣＲプライマーとして使用されている。種特異性プライマーは、増幅されたＰＣＲ生成物が発現時点の細胞種に依存して相違する長さを有するようにデザインされている。従って、病原体の同定は増幅されたＰＣＲ−フラグメントの長さに基づく。
【０００８】
複合ＰＣＲ法は比較的敏感であり、また迅速であるが、いくつかの欠点を有する。短い方のＤＮＡフラグメントは長い方のＤＮＡフラグメントよりも効果的に増幅されることが知られている。従って、同一試料が２種の相違する細菌種を含有する場合、短い方のフラグメントの細菌ＤＮＡはさらに効果的に増幅され易く、当該方法の感度に影響を与える。さらにまた、複合ＰＣＲの場合、数少ない細菌種を同時的に同定することができるのみである。この理由は、同一ＰＣＲ条件下で機能するような特異性プライマーペアー（ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒｓ）を１ダース以上もデザインすることが不可能であることにある。従って、複合ＰＣＲは、例えば１０種よりも多くの臨床的に重要な病原体を同時に測定することが要求される呼吸器官感染の診断に適用することはできない。
【０００９】
正常細菌叢と称される細菌はまた、複合ＰＣＲに基づく微生物診断において問題を起こすことがある。数ダースの細菌種のみのゲノムは全体的にマップ形成されており、これらの細菌種の大部分は病気の原因となる病原体として知られている。従って、正常細菌叢の細菌及びそれらのＤＮＡ配列にかかわる情報は非常に少ない。このことは、種−特異性ＰＣＲプライマーのデザイン及びＰＣＲ増幅にのみ基づく細菌診断が何故にほとんど不可能であるかの理由である。
【００１０】
リボソームＲＮＡの使用はまた、いくつかの欠点を包含する。ｒＲＮＡ分子の助けにより関連細菌種を相互に区別することは困難である。何故ならば、これらの分子の配列は、これらを相互に比較した場合、充分に可変性の領域を含有していないからである。さらに、種々の細菌種間の相違点を見出すことができたとしても、これらの可変性部位は一般に、ｒＲＮＡ分子全体（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡの長さは約１５００ヌクレオチドである）を横切って分割されており、診断における当該方法の使用を制限する。従って、原則的に、関連細菌種はｒＲＮＡコード遺伝子全体の配列決定によって相互に区別することができるのみである。しかしながら、この方法でさえも、細菌種を相互に区別するには、常時充分な方法ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（発明の簡単な説明）
本発明の課題は、感染疾病の細菌診断、特に呼吸器官感染、ならびに耳、鼻及び喉疾病の原因となる細菌種の診断に有用であるが、前記細菌診断法の欠点に欠けている用具及び手段を提供することにある。特に、本発明の課題は、分子法に基づく細菌診断で有用である新規手段及び方法を提供することにあり、この手段及び方法は敏感であり、有効であり、また種特異性であり、さらに所望の細菌種のみを特異的に同定することができる。本発明のもう一つの課題は、従来可能であった方法に比較して実質的に迅速に感染性細菌を診断することができる方法を提供することにあり、これによって正しく、効果的な抗生物質治療を感染の初期段階で患者に指示することが可能にされ、感染の持続時間が短縮され、潜在的有害の危険性が致死的合併症でさえも減少される
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、それらの高頻度可変領域が種々の細菌種の中で塩基配列の点で有意に相違しているＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢ、ｒｐｏＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の近辺に位置する高頻度可変領域に由来する細菌種特異性オリゴヌクレオチドプローブを提供する。これらの細菌種特異性プローブを用いると、感染原因となる細菌のゲノムを同時的に検出及び同定することができる。
【００１３】
本発明はまた、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域に由来し、多数の異種（非細菌）ＤＮＡを含有する臨床的試料からさえも、感染原因となる細菌のＤＮＡを効果的に増幅させる広域プライマーを提供する。
【００１４】
さらにまた、本発明は従来技術の欠点を克服する簡単、迅速、敏感、及び特異的である方法を提供する。これらの方法を用いることによって、臨床的に重要な細菌種を臨床的試料又は細菌培養物から確実性を持って同定し、診断することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明は、感染原因となる細菌、特に呼吸器官ならびに耳、鼻及び喉疾病の感染原因となる細菌のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の近辺に位置する高頻度可変領域の配列と、正常ハイブリッド形成条件下にハイブリッド形成し、配列番号（ＳＥＱ．ＩＤ，ＮＲ）：１〜１９によって同定される配列、及び／又はその反転的配列（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）及び／又は相補的配列（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、あるいはその機能性フラグメントのいずれか１種を含有するオリゴヌクレオチドプローブに関する。
【００１６】
感染原因となる細菌、特に呼吸器官ならびに耳、鼻及び喉の疾病の感染原因となる細菌種の例には、ハエモフィラス  インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス  プニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス  パイオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、プシュードモナス  アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ  プニューモフィラ（Ｌｅｇｉｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、コリネバクテリウム  ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、マイコプラズマ  ブニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エスケリッチャ  コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ）、モラキセラ  カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）及びナイセリア  ゴノルホエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）が包含される。特定の例には、ストレプトコッカス  プニューモニアエ、ハエモフィラス  インフルエンザエ、スタフィロコッカス  アウレウス、及びコリネバクテリウム  ジフテリアエが包含される。
【００１７】
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ配列の長さは、１５〜３０個の核酸、さらに好ましくは１９〜３０個の核酸、最も好ましくは１９〜２６個の核酸である。
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドプローブ配列を細菌種の検出、同定又は分別に使用することに関する。
【００１８】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドプローブの混合物に関し、この混合物は配列番号：１〜１９によって同定される配列、及び／又はその反転的配列及び／又は相補的配列、あるいは上記配列の機能性フラグメントのいずれかの組合わせ、好ましくは配列番号：１〜１９によって同定される配列の全部を含有する。好適態様の一つにおいて、当該プローブの望ましい混合物は固体支持体に結合されている。好ましくは、配列番号：１〜１９によって同定される配列の全部及び／又はその反転的配列及び／又は相補的配列を含有する混合物は固体支持体上に結合されている。
【００１９】
本発明はさらに、感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の配列とハイブリッド形成する配列を包含する混合物であって、配列番号：２０及び２１により同定される配列及び／又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントを包含するＤＮＡプライマーの新規混合物に関する。
本発明はまた、上記プライマー混合物をｒｐｏＢの増幅に使用することに関する。
【００２０】
さらにまた、本発明は臨床試料中の感染原因となる細菌を検出及び同定するための診断方法に関し、この方法は、
ａ）感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の配列とハイブリッド形成する配列を包含する配列であって、配列番号：２０及び２１により同定される配列及び／又はそれらの相補的配列及び／又はその機能性フラグメントを包含するプライマー混合物を使用し、上記臨床試料から単離されたＤＮＡを増幅させ；
ｂ）この増幅されたＤＮＡを、感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の近辺に位置する高頻度可変領域の配列とハイブリッド形成し、細菌種特異性であるオリゴヌクレオチドプローブ配列の所望の組合せと正常ハイブリッド形成条件下に接触させ；次いで
ｃ）可能なハイブリッド形成複合体（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）を検出する；
ことを包含する。
【００２１】
本発明の方法の好適態様の一つは、臨床試料から単離されたＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅させ、次いでこの増幅されたＤＮＡを固体支持体上に結合されている細菌種−特異性オリゴヌクレオチドプローブと接触させることを包含する。
本発明の方法の好適態様の一つにおいて、臨床試料から単離されたＤＮＡの増幅に適当に標識付けしたヌクレオチドを使用し、検出可能な標的鎖を発現させる。
【００２２】
本発明の方法のもう一つの好適態様において、増幅され、標識付けされていてもよい標的ＤＮＡは、その上に配列番号：１〜１９によって同定される配列、及び／又はその反転的配列及び／又は相補的配列を有する本発明による種特異性オリゴヌクレオチドプローブの全部が結合されている固体支持体と接触させる。
【００２３】
本発明の方法のさらにもう一つの好適態様において、増幅され、標識付けされていてもよい標的ＤＮＡは、その上に呼吸器感染原因となる１種の特定の細菌種又は数種の特定の細菌を検出する特異性オリゴヌクレオチドプローブが結合されている固体支持体、好ましくは処理ガラスと接触させる。ここで上記特異性オリゴヌクレオチドプローブは、表３からの配列番号：１及び２、３及び４、５及び６、７及び８、９及び１０、１１及び１２、１３及び１４、１５及び１６、１７及び１８又は１９によって同定されている相当する配列、及び／又はそれらの反転的配列及び／又はその相補的配列を含有する。
【００２４】
本発明はさらに、感染原因となる細菌、特に呼吸器官感染原因となる細菌の診断に用いるための診断用キットに関し、このキットは、
ａ）上記定義のとおりの本発明によるＤＮＡプライマー混合物、
ｂ）固体支持体上に結合されていてもよい、上記定義のとおりの本発明による細菌種特異性オリゴヌクレオチドプローブ配列混合物、
ｃ）陽性及び場合により陰性でもよい対照プローブ配列、及び場合により、
ｄ）増幅、ハイブリッド形成、精製、洗浄及び／又は検出工程で要求される試薬、
を包含する。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、感染原因となる細菌の診断にリボソームＲＮＡを使用する代わりのさらに特異的な別法を見出そうとする研究に基づいている。この研究は細菌の生存に必須である別の遺伝子に焦点を当てるものであった。ｒｐｏＢ遺伝子領域は、これらのサブユニットα、β及びβ´（それぞれ、ｒｐｏＡ、ｒｐｏＢ及びｒｐｏＣ）からなるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］のサブユニットβをコードする。細菌におけるＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの機能は、ＤＮＡの転写を触媒することにある。
【００２６】
タンパク質、及び対応する、遺伝子中の或る領域は、進化過程でほとんど未変化のまま残される、すなわち保存される。この点について、「保存領域」（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）又は「複数の保存領域」（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ）の用語は、その塩基配列又は同等アミノ酸配列が種々の感染原因となる相違する細菌種間でほとんど未変化のまま残されているｒｐｏＢ遺伝子又はタンパク質の領域又は複数の領域を表わす。通常、これらの保存領域は当該タンパク質の機能にとって最も重要な領域である。しかしながら、ｒｐｏＢ−分子は、リボソームＲＮＡ分子と同様には保存されない。問題の分子がタンパク質であることから、これらのタンパク質をコードする遺伝子はそれらの遺伝暗号の性質に応じて構造ＲＮＡ分子（例えば、１６Ｓ  ｒＲＮＡ分子）をコードする遺伝子とは核酸レベルの点でさらなる相違点を含んでいる。さらに、ｒｐｏＢ分子は全体として、進化過程中、構造ＲＮＡ分子と同様に未変化のままでは残されない：短いＤＮＡフラグメントをｒｐｏＢ分子中に見出すことができ、その各種細菌種（密接に関連した細菌種を包含する）間の差異は、これらのＤＮＡ配列が種特異性であると考えることができるほど大きい。これらの配列は高頻度可変配列であり、この点について、高頻度可変配列の用語は相違する細菌間におけるヌクレオチド塩基配列が細菌種特異性に影響を与える程度まで相違しており、またｒｐｏＢ遺伝子の保存配列の近辺に位置しており、場合により、保存配列によって制限又は限定されているｒｐｏＢ遺伝子のＤＮＡ配列を表わす。
【００２７】
上記特徴は、細菌株にかかわる種特異的オリゴヌクレオチドのデザインに利用されている。種特異性プローブ（オリゴヌクレオチド）のデザイン（表３）において、配列に基づく計画戦略が使用される。標的細菌種のｒｐｏＢ遺伝子を対照細菌の対応する遺伝子と並列させる。これらの配列はＥＭＢＬ公表配列データベースから得ることができ、又はこのような配列が公表データベースから入手できない場合、これらは細菌種からのｒｐｏＢ遺伝子配列フラグメントをクローン化することによって得られる。これらの配列は細菌培養単離物からの所望のｒｐｏＢＤＮＡ配列を増幅させることによって形成される。所望のＤＮＡ配列フラグメントを次いで、クローン化し、次いで配列決定する。細菌種マイコプラズマ  プニューモニアエの高頻度可変性ｒｐｏＢ遺伝子領域の例は図１に示されている。保存領域は太文字で書かれ、下線が引かれている。そこに種特異性プローブがデザインされている高頻度可変領域は、これらの保存配列の間に存在する（小さい方の大文字）。
【００２８】
配列の並列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）はＢｉｏＥｄｉｔプログラム及びＣｌｕｓｔａｌＷ並列アルゴリズムを用いて行われた。これらの並列の共通配列を計算し、適当な保存領域を手動式で同定した。これらの領域は標的細菌種の遺伝子に保存されているが、対照細菌種の遺伝子中には少なくとも全体的には見出されない配列フラグメントを表わす。比較分析用に、これらの領域から適当な長さ（例えば、１９〜２６ヌクレオチド）を有するオリゴヌクレオチド配列を選択した。選択されたオリゴヌクレオチド配列はＦａｓｔＡアリゴリズムプログラムを用いてＥＭＢＬ公表配列データベースに対し比較した。非標的細菌種のｒｐｏＢ配列と比較した場合、少なくとも２個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチド配列を引き続く分析用に選択した。オリゴヌクレオチドの融点（Ｔｍ）を計算し、また二次構造（ヘアピン構造）の形成を検査した。強力な二次構造を有しておらず、４５℃よりも高いＴｍを有するオリゴヌクレオチドを特異性試験用に選択した。当該オリゴヌクレオチドプローブの特異性は、種々の細菌種から単離された純粋ＤＮＡ試料（表２）及び臨床患者試料（表４）の両方を用いて実験室条件下に試験した。
【００２９】
本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは配列番号：１〜１９により同定される配列、及び／又はそれらの反転的配列及び／又は相補的配列を包含する。これらは、長さの点で相違することができ、所望の種特異性及びハイブリッド形成反応におけるこれらのオリゴヌクレオチドプローブの機能性はそれらの適当な長さを決定する。これらのオリゴヌクレオチドプローブの長さは一般に、１５〜３０、好ましくは１９〜３０、最も好ましくは１９〜２６ヌクレオチドである。さらにまた、これらのプローブは相違する方法で修飾することができる（例えば、修飾ヌクレオチド、例えばイノシンを含有することができる）。また、種々の化学化合物又は基（例えば、アミノ基）又は別の分子、例えば検出に必要な標識などをプローブに結合させることができ、あるいはこれらのプローブは全く未修飾であることもできる。好適細菌種特異性プローブ及びそれらの詳細は表３に示されており、これらは配列番号：１〜１９により同定される配列を有する。当然のこととして、当業者にとって明白であるように、これらのオリゴヌクレオチド配列の反転的配列及び相補的配列は同等に有用であり、また好適である。同様に、前記オリゴヌクレオチド配列の機能性フラグメントはまた、種特異性が未変化のまま残されている限り、プローブとして有用である。
【００３０】
ＰＣＲプライマーをデザインするために、クラミジア  プニューモニアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ  プニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ハエモフィラス  インフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス  プニューモニアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及びストレプトコッカス  パイオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のｒｐｏＢタンパク質のアミノ酸配列は、ＣｌｕｓｔａｌＷ並列アリゴリズムによるＢｉｏＥｄｉｔプログラムを用いて並列させた。並列研究において、かなりの保存領域が見出され、広域プライマーデザイン用の出発点として採用された。これらの保存アミノ酸配列は、対応する核酸配列に逆−翻訳（ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）された。遺伝子コードの性質に依存し、プライマー配列には数種の縮重部位が存在していた。保存配列に基づき、数種のプライマーペアーをデザインし、実験室で試験した（特異性及び感度試験）。
【００３１】
本試験の目的は、一方で臨床試料からのＤＮＡを増幅し、他方で全部の呼吸器官感染原因となる細菌のｒｐｏＢタンパク質を増幅することができるように高度の特異性を保有するプライマーペアーを見出すことにあつた。プライマーペアーの機能は、表１に示されている。このプライマーペアーの場合、大量のヒトＤＮＡの存在下においてさえも、系統発生学的に相互に相違する細菌のｒｐｏＢ遺伝子の全部（表２）を増幅させることができる。
【００３２】
表１．ｒｐｏＢ広域プライマー
【表１】
2007514432.tif 000002
【００３３】
上記プライマー配列において、
Ｄは塩基Ａ又はＧ又はＴを表わす、
Ｙは塩基Ｃ又はＴを表わす、
Ｎは塩基Ａ又はＧ又はＣ又はＴを表わす、
Ｈは塩基Ａ又はＣ又はＴを表わす、
Ｗは塩基Ａ又はＴを表わす、
Ｒは塩基Ａ又はＧを表わす、
Ｓは塩基Ｃ又はＧを表わす、及び
Ｖは塩基Ａ又はＣ又はＧを表わす。
【００３４】
従って、別様の数種の相違するプライマーからなるプライマー混合物が考えられる。一例として、プライマーｒｐｏＢ２−ｆｏｒの場合、混合物はＷがＡ（アデニン）を表わすプライマー及びＷがＴ（チミン）を表わすプライマーを包含する。
【００３５】
本発明に従い、ハイブリッド形成を証明することができるいずれか適当な方法によって、感染原因となる病原体、特に呼吸器官感染、ならびに耳、鼻及び喉の疾病を発病させる細菌の同定に、特異性プローブを使用することができる。これらの方法は当業者の中で周知であり、これらの方法は溶液中、及びＤＮＡが結合する支持体上、例えばニトロセルロース上、又はナイロン膜上、又はガラス上の両方で行うことができる。
【００３６】
本発明の方法の好適態様の一つにおいて、細菌同定はＤＮＡマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）技法を使用して行われる。この点に関し、ＤＮＡマイクロアレイ又はＤＮＡチップ（ｃｈｉｐ）の用語は、既知核酸配列がその上に予め定められた順序で結合されている小型基板を意味する。マイクロアレイに結合されている核酸フラグメントが１００塩基対よりも短い場合（一般に、ほぼ２０〜３０塩基対）、このマイクロアレイはオリゴヌクレオチドアレイと称される。
【００３７】
本発明の方法において、分析される試料は細菌培養物、組織フラグメント、分泌物試料、例えば唾液又はブラシふき取り試料（ｂｒｕｓｈ  ｓａｍｐｌｅ）、血液試料、又は感染性疾病を患っている患者から得られるその他適当な試料であることができる。特に、分析される試料は臨床診断用途に適する分泌物試料である。
【００３８】
ＤＮＡはいずれか慣用の方法、例えば市販ＤＮＡ単離キット（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（例えば、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ；ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；又はＱ１Ａａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ−ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、又はフェノール−クロロホルム又は同等の有機溶剤を手動式で使用し、又はＤＮＡ単離の実施に適する特別の装置による常習的抽出を使用し、被分析試料から単離する。市販キットは、それらの一般的利用可能性，迅速性及び反復可能性から好ましく使用される。
【００３９】
本発明の方法において、ＤＮＡ増幅に使用される試薬は、ＤＮＡの増幅に慣用であって、当業者に周知であるいずれかの試薬であることができる。市販されており、適当で価格的に効果的な試薬は種々のタイプのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ及び当該ポリメラーゼ用の緩衝剤（例えば、ＡｍｐｌｉＴａｑＧＯＬＤ、ＡｍｐｌｉＴａｑＬＤ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ、ＴａｑＰｌｕｓ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、及びＨｏｔＳｔａｒｔＴａｑ）、ヌクレオチド又はヌクレオチドの予備混合物（例えば、Ｓｉｇｍａ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭｇＣｌ２（この場合、Ｔａｑポリメラーゼの製造業者からの製品が一般に使用される）、及びＣｙ５−ｄＣＴＰ（例えば、ＮＥＮ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が包含される。
【００４０】
本発明による方法において、クローン化はいずれか慣用の公知方法のいずれかを用い、例えば市販クローン化キット（例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ又はＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いることによって行うことができる。クローン化生成物の配列決定はこの目的に適するいずれかのシークエンサー（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、モデル３７３Ａ、３７７又は３１００、あるいはＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｓｅｑｕｉ−Ｇｅｎ  ＧＴ）を用いて行うことができ、あるいはこの生成物は手動式で配列決定することもできる。これらの配列は手動式で分析することができ、あるいはこの目的にデザインされた配列分析プログラム（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ又はＶｅｃｔｏｒ  ＮＴ１  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７、ＩｎｆｏｒＭａｘ）を用いて分析することができる。
【００４１】
増幅に用いられる装置はまた、いずれか適当な装置であることができる（例えば、Ｔ１  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏｍｅｔｒａ又はＧｅｎＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ２７００、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。実用に際し、ＤＮＡ増幅に適する全部の装置及び用具を使用することができ、増幅はまた、反応管を一つの温度から別の温度に移すことによって手動式で行うこともできる。さらに、増幅はＤＮＡマイクロアレイ上で直接に行うこともできる。
【００４２】
ＰＣＲ生成物の精製は、いずれかの商業的方法（例えば、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ：ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ  Ｓ−４００又はＳ−３００  ＨＲ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；又はＱ１Ａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ−精製キット、Ｑｉａｇｅｎ）により、あるいは有機溶剤による抽出を用いて行うことができる。増幅生成物はまた、いずれか追加の精製又は抽出工程を使用せずに、ハイブリッド形成反応に使用することもできる。
【００４３】
一本鎖標的鎖（ｔａｒｇｅｔ  ｓｔｒａｎｄ）を形成するためには、いずれか公知のデザイン方法を使用することができる。これらの方法は、例えば非対称ＰＣＲ、エキソヌクレアーゼ処理、又はマイクロアレイ（例えば、ｍａｔｒｉＸａｒｒａｙ、Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｌｅｎｃｅ）表面上における直接的一本鎖標的鎖の合成を包含する。本発明はまた、二本鎖ＰＣＲ生成物をハイブリッド形成反応に使用することができる応用方法を包含する。この本発明の態様において、非対称ＰＣＲは一本鎖標的鎖の発現に好適な方法である。
【００４４】
本発明の方法において、いずれか適当な標識を使用し、標識付けした標的鎖を生成することができる。適当な標識は、蛍光標識（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ２、ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＦＩＴＣ、Ａｌｅｘａ４８８、ＴＭＲ、ＦｌｕｏｒＸ、ＲＯＸ、ＴＥＴ、ＨＥＸ）、放射性標識（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３３Ｓ）、及び化学発光標識（例えば、ＨｉＬｉｇｈｔ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｏｌｏｒ  Ｋｉｔ）を包含する。本発明において、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ化学発光標識（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は好適である。本発明はまた、標識を必要としない応用方法を包含する。このような方法では、核酸の検出は電気的インパルス（例えば、ＭｏｔｏｒｏｌａｅＳｅｎｓｏｒ）に基づいている。
【００４５】
ハイブリッド形成を固体支持体上で行う場合、ハイブリッド形成に用いられるプローブは、共有結合又は非共有結合により固体支持体の表面上に結合させることができる。別法として、他の化学的、電気化学的又は同等の結合方法を使用することもできる。その上にプローブを結合させる基板又は支持体は、ガラス、プラスティック、金属、ナイロン、ニトロセルロース、ポリアクリルアミド、シリコン、又はこれらの材料の組合せから製造することができ、基板の大きさは２〜３ミリメーターから数センチメーターまで変えることができる。使用される基板の表面はアミノシランにより、あるいはいずれか別の適当な表面処理により、例えばエポキシシランにより処理することができ、又は別法として、いずれかの別段の表面処理を必要としない基板を使用することもできる。オリゴヌクレオチドプローブ用に好適な基板は、アミノシランにより処理された顕微鏡用ガラススライドである（例えば、Ｇｅｎｏｒａｍｓ、Ａｓｐｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．エストニア）。
【００４６】
プローブは、この目的に適する市販されているアレイ形成装置（ａｒｒａｙｅｒ）（例えば、Ｑａｒｒａｙ−Ｍｉｎｉアレイ形成装置、Ｌｕｃｉｄｅａ  Ａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ、ＯｍｎｉＧｒｉｄ又はＧｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓアレイ形成装置）を用い、マイクロアレイ支持体の表面上に印刷することができ、あるいはプローブは基板上にピペットにより手動式に形成することもできる。別法として、プローブは写真を用いることによって表面上に直接合成することができる。
【００４７】
ハイブリッド形成に用いられるハイブリッド形成混合物は、後続で実施例に示されているものとは組成の点で相違することができ、例えば塩組成及び／又は濃度を変えることができ（例えば、２〜４ｘＳＳＣ又はＳＳＰＥ）、あるいは市販ハイブリッド形成溶液（例えば、ＡｒｒａｙＨｙｂ、Ｓｉｇｍａ）を使用することができる。さらに、非特異的結合を減少させる物質（例えば、ＢＳＡ、すなわちウシ血清アルブミン、又はｓｓＤＮＡ、すなわちサケ血清ＤＮＡ）、あるいは変性又は安定化添加剤（例えば、ホルムアミド、ＤＭＳＯ、すなわちジメチルスルホキシド）をハイブリッド形成混合物に使用することができる。ハイブリッド形成は種々のハイブリッド形成温度で行うことができ（一般に、４０〜７０℃）、またハイブリッド形成の実施に必要な時間は用途に応じ、数分から１日まで変えることができる。
【００４８】
水浴の代わりに、ハイブリッド形成は、例えばインキュベーター又は特別のハイブリッド形成装置（例えば、ＧｅｎｅＴＡＣ  ＨｙｂＳｔａｔｉｏｎ又はＬｕｃｉｄｅａ  Ｓｌｉｄｅｐｒｏ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｒ）で行うことができる。ハイブリッド形成後の洗浄工程は、それらの持続時間、容量、温度、及び洗浄溶液の組成に応じて変えることができ、従って例示方法毎に変えることができる。マイクロアレイスライドの洗浄工程はまた、分離した装置で行うことができる。いくつかの場合では、マイクロアレイスライドはハイブリッド形成後に直ちに分析することができることから、洗浄工程は不必要である。好適方法において、＋５７℃の水浴は適当なハイブリッド形成条件である。ガラススライドはこれらの条件で１４〜１６時間、ハイブリッド形成させた。
【００４９】
マイクロアレイ又はチップは、この目的に利用できるいずれかの装置又は読取り機（ｒｅａｄｅｒ）（例えば、ＧｅｎｅＴＡＣ  ＵＣ４、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  ４１００Ａ、又はＡｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ）を用いて分析することができる。標的鎖が蛍光標識で標識されている場合、分析は、例えば蛍光顕微鏡を用いて行うこともできる。放射性標識が使用されている場合、チップ又は膜はオートラジオグラフイにより分析することができる。ハイブリッド形成が電子式マイクロアレイの表面で行われている場合、分析は電子検出（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）に基づいており、このようなマイクロアレイはこの目的用にデザインされた特別の装置を用いて分析することができる。
【００５０】
本発明の方法は従来技術の問題に遭遇しない。本発明による方法の増幅工程は、非常に敏感であり、また系統発生学的に相違する細菌種からの或る遺伝子領域ｒｐｏＢは、細菌種がグラム陰性菌であるか、又はグラム陽性菌であるかに無関係に、本発明による広域プライマーによって効果的に増幅された（表２）。さらに、ＰＣＲ生成物は短く（約１１４塩基対）、このことは増幅反応の効率を改善する。
【００５１】
細菌種特異性プローブは、例えば１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子領域（この領域は従来、細菌診断に用いられていた）よりも格別にさらに多様であるｒｐｏＢ遺伝子領域に対しデザインされている。正常細菌叢の細菌種はまた、本方法で用いられる広域プライマーによって効果的に増幅されるが、本発明によるプローブは非常に細菌種特異性であり、これらがデザインされた対象細菌種のみを同定することから、誤った陽性反応は生じない。ガラススライド上でストレプトコッカス  プニューモニアエの培養単離物から増幅された標的鎖をハイブリッド形成する場合、この標的鎖はストレプトコッカス  プニューモニアエに特異的なプローブ及び陽性対照とのみハイブリッド形成するものと見做される。他方、正常細菌叢の細菌、例えばストレプトコッカス  オラリスから増幅された標的鎖をハイブリッド形成させる場合、生成物はいずれの病原体プローブにも結合しない；この場合、陽性対照プローブのみがシグナルを発生する（図３）。本発明による全部の特異性オリゴヌクレオチドプローブを種々の細菌種（正常細菌叢に属するかなりの細菌種を包含する）と交差試験したが、交差反応の発生は見出されなかった。すなわち、本発明の方法は、類似タイプの従来開示された方法に比較し、格別にさらに敏感であり、また特異的である。
【００５２】
本発明の追加の利点は、感染原因となる細菌の診断が達成される限り、多様である。方法及び試験キットは多数の細菌病原体を同定する臨床試料の分析、すなわち病気を発症させる細菌にかかわる臨床試料のスクリーニングに対し所望に応じて設計することができる。別法として、方法及び試験キットはいずれかの細菌病原体（１種又は２種以上）がそれぞれ特異的に同定されるようにデザインすることもできる。一例として、その迅速な検出が正しい処置にとって極度に重要であるジフテリア発症病原体（Ｃ．ジフテリアエ）の検出用に特別の方法及び試験キットをデザインすることができる。Ｃ．ジフテリアエの培養診断は常習的臨床診断実験室では通常入手できない特殊な培養培地の使用を必要とする。
【００５３】
下記に、本発明を例によりさらに詳細に説明する。方法を説明する場合、この用途に使用される相違する装置、材料、温度、化学物質、又は同等物を参考にした。これらは当然のこととして、本発明の相違する用途に適する様相で変えることができる。従って、本発明及びその態様はまた、下記例に制限されるものではない。
【実施例】
【００５４】
例１．本発明によるＰＣＲプライマーのデザイン
ＰＣＲプライマーをデザインするに際し、クラミジア  プニューモニアエ、マイコプラズマ  プニューモニアエ、ハエモフィラス  インフルエンザエ、ストレプトコッカス  プニューモニアエ及びストレプトコッカス  パイオゲネスのｒｐｏＢタンパク質のアミノ酸配列を、ＣｌｕｓｔｌＷ  並列アルゴリズムを用い、ＢｉｏＥｄｉｔプログラムにより並列した。この並列中に数種の保存遺伝子領域が見出された。
【００５５】
これらの保存アミノ酸配列を広域プライマーのデザインにおける出発点として使用した。最初に、これらを対応する核酸配列に逆−翻訳した。遺伝子コードの種類から、これらのアミノ酸配列中に数種の縮重部位が見出された。この後、保存配列に基づき、種々のプライマーペアーを合成し（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、英国からの注文、ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏ．ｕｋ）、次いで特異性及び感度について試験した。特異性は、下記例４に記載の方法を使用し、表２に示されている細菌種から単離されたＤＮＡを増幅させることによって試験した。被験細菌種全部のｒｐｏＢ遺伝子を増幅したプライマー、すなわち配列ＧＣＹＧＧＮＣＧＨＣＡＹＧＧＷＡＡＹＡＡＲＧＧ（配列番号：２０）を含有するプライマーｒｐｏＢ２−ｆｏｒ及び配列がＧＧＹＡＣＳＣＣＶＡＧＤＧＧＧＴＴＹＡ（配列番号：２１）であるＲＰＯｂ２−ｒｅｗを広域ＰＣＲプライマーとして選択した；ここで、Ｄは塩基Ａ又はＧ又はＴを表わし、Ｙは塩基Ｃ又はＴを表わし、Ｎは塩基Ａ又はＧ又はＣ又はＴを表わし、Ｈは塩基Ａ又はＣ又はＴを表わし、Ｗは塩基Ａ又はＴを表わし、Ｒは塩基Ａ又はＧを表わし、Ｓは塩基Ｃ又はＧを表わし、及びＶは塩基Ａ又はＣ又はＧを表わす（表１参照）。
【００５６】
表２示されている細菌種全部のｒｐｏＢ遺伝子の保存配列を、このプライマー混合物によって同定し、次いで臨床試料からのＤＮＡを増幅させた（例６参照）。特に、このプライマー混合物を使用し、試料が多量のヒトＤＮＡを含有する場合でさえも、系統発生学的に相互に離れている細菌（表２）のｒｐｏＢ遺伝子を増幅することができる。
【００５７】
表２．ｒｐｏＢ  ＰＣＲプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの試験に使用された細菌種
【表２】
2007514432.tif 000003
ＡＴＣＣ＝Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｉｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ＤＳＭ＝Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｔ  Ｚｅｌｉｋｕｌｔｕｒｅｎ
【００５８】
例２．本発明により定義されているとおりのオリゴヌクレオチドプローブのデザインに要求される新規配列のクローン化による生成
細菌種モレキセリア  カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｉａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、モレキセリアクニクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｉａ  ｃｕｎｉｃｕｌｉ）、モレキセリア  カビアエ（Ｍｏｒａｘｅｌｉａ  ｃａｖｉａｅ）、ナイセリア  ゴノルホエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ハエモフィラス  ダクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、ハエモフィラス  パラインフルエンザエ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ストレプトコッカス  オラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｒａｌｉｓ）、ストレプトコッカス  ミチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ）、コリネバクテリウム  ジフテリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）、レジオネラ  プニューモフィラ（Ｌｅｇｉｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、及びパスツーレラ  プニューモトロピカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）のｒｐｏＢ配列を下記の一般的方法に従い配列決定し、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブをデザインした。
【００５９】
最初に、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）を使用し、ＤＮＡを細菌培養単離物から単離する。ＤＮＡが単離された場合、クローン化に用いられた所望の標的鎖を、対称（慣用）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させる。増幅の第一段階で、試料から単離されたＤＮＡ、広域細菌プライマー（例１）及び増幅工程に必要なその他の成分を混合することによって反応混合物を調製する。
【００６０】
ここで、ＰＣＲクローン化に用いられた反応混合物（２５μｌ）は、ブライマー混合物ｒｐｏＢ２−ｆｏｒ  ２０ｐｍｏｌ、プライマー混合物  ＲＰＯＢ２−ｒｅｗ  ２０ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ（Ｓｉｇｍａ、米国）それぞれ２００μＭ、１ｘＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）（これはまた、０．２８ｍＭの最終濃度を達成するためにＭｇＣｌ２を含有する）、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  １．２５Ｕ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）、及び単離ＤＮＡ２．５μｌを含有する。
【００６１】
クローン化用ＰＣＲは、下記プログラムを使用し、ＧｅｎＡｍｐ  ＰＣＲ装置２７００熱サイクラー（ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行う：９５℃において１５分間の変性工程、９４℃で３５秒間、５４℃で４０秒間、７２℃で３５秒間の３８サイクル、最後に７２℃における７分間の抽出工程。ＰＣＲが行われた後、増幅の成功はエチジウムブロマイド含有２％アガロースゲルを用いる電気泳動によって確認する。
【００６２】
クローン化は、ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を用いてＰＣＲ後に直ちに行う。このクローン化用反応混合物は、ＰＣＲ生成物４μｌ、塩溶液１μｌ（１．２Ｍ  ＮａＣｌ、０．０６Ｍ  ＭｇＣｌ２）及びＴＯＰＯベクター  １μｌ（ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ）を含有し、これらはエッペンドルフ管で一緒に混合する。この混合物を室温で１５分間インキュベートし，その後、この溶液を氷上に移す。この化学形質転換が行われた後、ここで冷却されたクローン化混合物２μｌを受容性ＴＯＰＯ１０Ｅ．コリ細胞５０μｌへ形質転換させる。形質転換された細胞を氷上で１０分間にわたりインキュベートする。次の工程において、熱衝撃処理を行う。細胞を含有する管を４２℃の水浴に３０秒間で移す。この後、この管を直ちに、氷上に移し、次いでＳＯＣ媒質２５０μｌを室温で添加する（トリプトン２％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ  １０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ）。この管を３７℃において１時間にわたり水平方向に振り混ぜる（２００ｒｐｍ）。この後、クローン化混合物２０μｌを予備加温されている選択的ＬＢ板上に展開させる（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ、トリプトン１０％、イーストエキス０．５％、ＮａＣｌ  １．０％、水で稀釈されているＬ−アガール１．５％）、これはまた、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）５０ｇ／ｍｌを含有する。この板を３７℃で一夜かけてインキュベートする。翌日、この板から１０個のコロニイを選択し、次いで配列決定ＰＣＲを行う。
【００６３】
配列決定ＰＣＲ用の反応混合物（５０μｌ）はＭ１３反転プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）（５´−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ−３´）及びＭ１３正方向プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）（キットにより提供される）０．４ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ（Ｓｉｇｍａ、米国）それぞれ１５０μＭ、１ｘＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ  １Ｕ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）を含有する。増幅反応用に、細菌コロニイの小部分を試料棒の助けを用いてＰＣＲ反応管に移す。
【００６４】
配列決定ＰＣＲは、下記プログラムを使用し、ＧｅｎＡｍｐ  ＰＣＲシステム２７００熱サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行う：９５℃において１５分間の変性工程、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間の３０サイクル、及び最後に７２℃における１０分間の抽出工程。ＰＣＲが行われた後、増幅の成功はエチジウムブロマイド含有２％アガロースゲルを用いるゲル電気泳動によって確認する。この後、このＰＣＲ生成物を追加のプライマー、ヌクレオチド、緩衝液及びポリメラーゼ酵素のＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）による除去によって精製する。
【００６５】
精製工程後、ベクター中に挿入されたフラグメントを配列決定する。配列決定工程用反応混合物１２μｌは、ＰＣＲ生成物１００ｎｇ及びＭ１３反転プライマー又はＭ１３正方向プライマーのどちらか５ｐｍｏｌを含有する。配列決定はＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０Ｋｉｔ及びＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ３１００  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）で行う。配列は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７プログラム（ＩｎｆｏｒＭａｘ、米国）により分析する。
【００６６】
上記一般的方法によりｒｐｏＢ配列が下記細菌種用に生成された：モレキセリア  カタルハリス、モレキセリア  クニクリ、モレキセリア  カビアエ、ナイセリア  ゴノルホエアエ、ハエモフィラス  ダクレイ、ハエモフィラス  パラインフルエンザエ、ストレプトコッカス  オラリス、ストレプトコッカス  ミチス、コリネバクテリウム  ジフテリアエ、レジオネラ  プニューモフィラ及びパスツーレラ  プニューモトロピカ（配列番号：２２〜３２）。
【００６７】
例３．種特異性プローブのデザイン
細菌種特異性オリゴヌクレオチド、すなわちプローブをデザインするために、並列に基づく設計戦略を使用した。標的細菌種のｒｐｏＢ遺伝子を、数種の対照細菌（密接に関連する細菌種）の対応する遺伝子と並列させた。一例として、ストレプトコッカス  プニューモニアエのｒｐｏＢ遺伝子をストレプトコッカス  パイオゲネス、ストレプトコッカス  ミチス、ストレプトコッカス  オラリス、スタフィロコッカス  アウレウス、及びフソバクテリウム  ネクロホラム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｅｃｒｏｐｈｏｒｕｍ）のｒｐｏＢ遺伝子と並列させた。Ｓ．オラリス及びＳ．ミチスは、Ｓ．プニューモニアエと密接に関連している。従って、Ｓ．プニューモニアエ用にデザインされたオリゴヌクレオチドは、これらの正常細菌叢細菌と反応すべきではない。配列はＥＭＢＬ公表配列データベースから入手したか、又は例２に記載されているようなクローン化により生成させた。
【００６８】
配列の並列は、ＣｌｕｓｔａｌＷ並列アルゴリズムを用いＢｉｏＥｄｉｔプログラムにより行った。これらの並列の共通配列を計算し、適当な保存領域を手動式で同定した。これらの領域は標的細菌種の遺伝子中に保存されており、また対照細菌の遺伝子から少なくとも全体的に見出されない配列フラグメントを表わす。比較分析用に、これらの領域から適当な長さ（１９〜２６ヌクレオチド）を有するオリゴヌクレオチド配列を選択した。選択されたオリゴヌクレオチド配列を、ＦａｓｔＡアリゴリズムプログラムを用いてＥＭＢＬ原核配列データベース（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）と比較した。非標的細菌のｒｐｏＢ配列に比較し、少なくとも２個のミスマッチを有するオリゴヌクレオチド配列を後続の分析用に選択した。オリゴヌクレオチドについて理論的融点（Ｔｍ）を測定し、二次構造の形成を検討した。Ｔｍ（℃）は下記方程式により計算した：
８１．５＋１６．６ｌｏｇ［Ｎａ］＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％ｆｏｒ）５００／Ｎ
【００６９】
式中、Ｎａは一価カチオンの濃度であり（５０Ｍを計算に使用した）、％ＧＣはグアニン及びチトシンの割合であり、％ｆｏｒはホルムアルデヒドの濃度であり（０％を計算に使用した）、及びＮはオリゴヌクレオチドの長さである。二次構造の形成はＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓにより提供されているプログラムを用いて検討した。このプログラムはインターネットアドレス  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａ−ｇｅｎｏｓｙｓ．ｃｏ．ｕｋ／ｏｌｉｇｏｓ／ｆｒａｍｅｓｅｔ．ｈｔｍｌ（計算機オペレーター／基本計算機オペレーター）でウエブブラウザの助けの下に使用した。強力な二次構造を形成せず、及びそのＴｍ温度が少なくとも４５℃であったオリゴヌクレオチドを実験的特異性試験用に選択した。
【００７０】
オリゴヌクレオチドプローブを合成し、同時的に５´末端から修飾した（ＮＨ２−修飾オリゴス）（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ、英国）。これらのプローブの特異性は、例４及び５及び６に記載のとおりに、相違する細菌種から（表２）及び患者試料から（表４）単離したＤＮＡ試料を用いて実験室で試験した。被験プローブの中から、最良に機能し、また最高の特異性を有するものを選択した。これらの細菌種特異性プローブの配列及び特異性を表３に示す。
【００７１】
表３．ｒｐｏＢオリゴヌクレオチド配列
【表３】
2007514432.tif 000004
【００７２】
例４．患者試料から単離されたＤＮＡの増幅
下記常習的方法を使用し、細菌培養単離物又は臨床患者試料から単離されたＤＮＡを増幅させ、次いで標識付けした。
ＤＮＡは分析する試料（細菌培養物又は臨床患者試料）から、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）を用いて単離した。ＤＮＡが単離された時点で、所望の標的鎖を非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅させた。この増幅の第一段階において、試料から単離されたＤＮＡ、広域ｒｐｏＢ２−ｆｏｒ及びＲＰＯｂ２−ｒｅｗプライマー混合物（例１）及び増幅に要するその他の成分を一緒に混合することによって反応溶液を調製した。
【００７３】
このＰＣＲ反応混合物は、総量２５μｌ中にＲＰＯｂ２−ｒｅｗプライマー混合物３２ｐｍｏｌ、ｒｐｏＢ２−ｆｏｒプライマー混合物８ｐｍｏｌ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれ、２００μＭ、ならびにｄＣＴＰ１４０μＭ（Ｓｉｇｍａ、米国）、１ｘＨｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＰＣＲ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）（ここには、最終濃度が２．８ｍＭであるようにＭｇＣｌ２が添加されている）、Ｃｙ５−ＡＰ３−ｄＣＴＰ２．５ｎｍｏｌ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国）、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１．２５Ｕ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）、及び単離ＤＮＡ２．５μｌを含有する。
【００７４】
ＰＣＲはＧｅｎＡｍｐ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ  ２７００熱サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）を使用して行なう。下記ＰＣＲプログラムを使用した：９５℃において１５分間の変性工程、９４℃で３５秒間、５４℃で４０秒間、７２℃で３５秒間の３８サイクル、及び最後に７２℃における７分間の抽出工程。ＰＣＲが行われた後、増幅の成功はエチジウムブロマイド含有２％アガロースゲルによるゲル電気泳動によって確認する。この後、このＣｙ５−標識したＰＣＲ生成物は、追加のプライマー、ヌクレオチド、緩衝液及びポリメラーゼ酵素のＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ国）による除去によって精製する。
【００７５】
例５．試料マイクロアレイのデザイン及び官能性化
５´末端でアミノ化されているオリゴヌクレオチドプローブ（例３に従うデザイン）を５０μＭの最終濃度まで炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）４００ｍＭ中に溶解した。プローブはアミノシラン塗布顕微鏡用スライド（Ｇｅｎｏｒａｍａ、Ａｓｐｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．エストニア）上に共有結合させた。このガラススライド上へのプローブの移動はこの目的用に開発されたロボット（ＯｍｎｉＧｒｉｄ、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ、米国）及びピン（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  ＳＭＰ３、米国）を用いて行った。印刷されたプローブの面積の平均値は１２０μｍであった。さらに、５´末端がアミノ化されている陽性対照プライマーをガラススライド上に印刷した。印刷後、これらのマイクロアレイスライドはアンモニア蒸気中に１時間にわたり保持し、プローブをスライドに結合させた。アンモニア処理後、これらを無菌水により３回洗浄し、次いで乾燥させた。
【００７６】
次いで、そこにプローブが結合されている顕微鏡用スライドにＣｙ５−標識した標的鎖（例４に従い製造）をハイブリッド形成させた。このハイブリッド形成反応混合物は、標的鎖約２００〜３００ｎｇ、２０ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣ  １μｌは、ＮａＣｌ  １７５．３ｇ及びクエン酸ナトリウム８８．２ｇを含有し、ｐＨはＨＣｌにより７．０に調整されている；最終濃度は３．４ｘである）、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）２μｌ（最終濃度０．３％）、及び反応混合物の容積が３７μｌである量の無菌水を含有した。最初に、この混合物を９５℃において３０分かけて変性させた。この後、これらの管を氷上に直ちに移した。混合物を冷却させた後、その上にプローブが結合されているガラススライドの反対側に位置するカバースライド上にピペットにより添加する。このマイクロアレイスライドをハイブリッド形成室（Ａｒｒｙｌｔ、ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、米国）内に入れ、この室を厳しく閉鎖する。最後に、このハイブリッド形成室を水浴中に浸す。マイクロアレイスライドは５７℃で１４〜１６時間かけてハイブリッド形成させた。
【００７７】
ハイブリッド形成後、これらのマイクロアレイスライドを３種の相違する洗浄溶液により洗浄し、未ハイブリッド形成ＤＮＡを除去した。洗浄工程は次のとおりに行った：０．１％ＳＤＳ溶液中で５７℃において５分間、０．１％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ洗浄溶液中で室温において５分間、次いで０．０６ｘＳＳＣ中で室温において５分間。
【００７８】
ガラススライドを乾燥させた後、これらをマイクロアレイスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）により分析した。Ｃｙ５−標識した標的鎖が１個又は数個のプローブに結合している場合、これらのスポットは蛍光シグナルを発光した。さらにまた、陽性対照プローブはまた、蛍光シグナルを与えた。
【００７９】
ハイブリッド形成結果の例は図３に示されている。同一種に属するストレプトコッカス  プニューモニアエ（病原性）及びストレプトコッカス  オラリス（正常細菌叢）の培養単離物から単離されたｒｐｏＢ  ＤＮＡフラグメント（非対称Ｃｙ５−標識されたＰＣＲ生成物）を標的鎖として使用した。この例のスライドにおいて、矢印はＳ．プニューモニアエの標識付けされた標的鎖と結合するオリゴヌクレオチドスポットを指摘している。このスライド上のオリゴヌクレオチド配列は表３に示されているＳ．プニューモニアエ  オリゴヌクレオチドプローブ５及び６である。また、陽性対照オリゴヌクレオチド（広域ＰＣＲプライマー、配列番号：２１）を含有するオリゴヌクレオチドスポットは両方のスライド上にシグナルを与えた。この陽性対照スポットはハイブリッド形成の成功を示すマーカーであるが、細菌特異性結合は検出されない。Ｓ．オラリス特異性オリゴヌクレオチドスポットはガラススライド上に検出されない。これら２種の像間の比較は、Ｓ．オラリス（正常細菌叢）がＳ．プニューモニアエ（病原性）オリゴヌクレオチドスポットと交差反応しないことを証明している。これは、Ｓ．オラリスの増幅されたｒｐｏＢ  ＤＮＡフラグメントとハイブリッド形成した別のマイクロアレイスライドにおいて、細菌特異性ハイブリッド形成が生じなかったからである。Ｓ．プニューモニアエ標的鎖はスライド上のいずれか他のオリゴヌクレオチドスポットに対しハイブリッド形成しなかった。
【００８０】
例６．患者試料の分析
呼吸器官感染を受けている患者から得られた臨床試料からＤＮＡを単離し、例４に記載の方法を用いて増幅させた。これらの試料は、その上にプローブ及び陽性対照オリゴヌクレオチド（表３に列挙）が結合されているマイクロアレイスライド（例５に記載）を用いて試験した。同一試料をまた、培養試験によって分析した。結果の要旨を表４に示す。本発明による方法によって得られた結果は、従来技術の培養試験に比較し、完全に同一である。本発明による方法は、培養試験よりも実質的に迅速に行われる。すなわち、培養試験を行う場合、結果はほぼ１日で得られる。
【００８１】
表４．本発明による方法と培養試験との比較
【表４】
2007514432.tif 000005
【００８２】
表に用いられている略語：Ｓｐ−ストレプトコッカス  プニューモニアエ、Ｈｉ−ハエモフィラス  インフルエンザエ、Ｓａ−スタフィロコッカス  アウレウス、及びＣｄ−コリネバクテリウム  ジフテリアエ。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、保存配列により制限されている高頻度可変性ｒｐｏＢ遺伝子領域の例（マイコプラズマ  ブニューモニアエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））を示している。保存領域は太字で示され、下線が引かれており、これらはｒｐｏＢプライマーのアニーリング部位として動作する。高頻度可変領域はこれらの保存配列の間に存在し、小文字で記されている。
【図２】図２は、培養単離細菌の標識付け−ＰＣＲ結果のアガロースゲル電気泳動分析を示している。この図において、レーン１はＭ．タルハリス（ｔａｒｒｈａｌｉｓ）であり、レーン２はＭ．クニクリ（ｃｕｎｉｃｕｌｉ）であり、レーン３はＭ．カビアエ（ｃａｖｉａｅ）であり、レーン４はＮ．ゴノルホエアエ（ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）であり、レーン５はＨ．インフルエンザエ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）であり、レーン６はＨ．ダクレイー（ｄｕｃｒｅｙｉ）であり、レーン７はＨ．パラインフルエンザエ（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）であり、レーン８はＳ．パイオゲネス（ｐｙｏｇｅｎｅｓ）であり、レーン９はＳ．プニューモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、レーン１０はＳ．オラリス（ｏｒａｌｉｓ）であり、レーン１１はＳ．ミチス（ｍｉｔｉｓ）であり、レーン１２はＰ．アエルギノーサ（ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）であり、レーン１３はＣ．ジフテリアエ（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）であり、レーン１４はＬ．プニューモフィラ（ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）であり、レーン１５はＥ．コリ（ｃｏｌｉ）であり、レーン１６はＰ．プニューモトロピカ（ｐｎｅｕｍｏｔｒｏｐｉｃａ）であり、レーン１７はＳ．アウレウス（ａｕｒｅｕｓ）であり、レーン１８はＭ．プニューモニアエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であり、及びＭは１００塩基対マーカーである。
【図３】図３は、マイクロアレイスライド上におけるハイブリッド形成の結果の例を示している。ストレプトコッカス  プニューモニアエ（病原体）及びストレプトコッカス  オラリス（正常細菌叢）（これらは同一属に属する）の培養単離物から単離されたｒｐｏＢ遺伝子の増幅されたＤＮＡをハイブリッド形成させる標的鎖として使用した（非対称Ｃｙ−５−ｄＣＴＰ標識されたＰＣＲ生成物）。例示スライドにおいて、矢印（→）はオリゴヌクレオチドスポットを指摘しており、これはＳ．プニューモニアエの標識されている標的鎖に結合する。これらのスポットにおけるオリゴヌクレオチド配列は、表３に示されているＳ．プニューモニアエオリゴヌクレオチドプローブ５及び６である。また、陽性対照オリゴヌクレオチド（広域ＰＣＲプライマー、配列番号：２１）はシグナルを生じた。Ｓ．オラリス特異的オリゴヌクレオチドスポットは、このガラススライド上に検出されない。
【図１】
2007514432.tif 000006
【図２】
2007514432.tif 000007
【図３】
2007514432.tif 000008
【配列表】
2007514432000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月3日(2006.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
感染原因となる細菌種を臨床試料から検出及び同定するための診断方法であって、
ａ）感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域に由来する配列とハイブリッド形成する配列を包含するＤＮＡプライマーの混合物を使用し、上記臨床試料から単離されたＤＮＡを増幅させ、ここで上記配列は配列番号：２０及び２１及び／又はその相補的配列及び／又はその機能性フラグメントを包含しており；
ｂ）増幅されたＤＮＡを、上記感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の近辺に位置する高頻度可変領域と正常ハイブリッド形成条件下にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプローブ配列の所望の組合せと接触させ、ここで上記配列は上記ハイブリッド形成条件下に細菌種−特異性であり；次いで
ｃ）可能なハイブリッド形成複合体の形成を検出する；
ことを特徴とする、上記診断方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
上記オリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せが、配列番号：１〜１９の全部又は一部、及び／又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントを包含し、好ましくは配列番号：１〜１９の全部を包含することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の診断方法。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
上記オリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せを固体支持体上に、好ましくは処理ガラス上に結合させることを特徴とする、請求項５に記載の診断方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
工程ａ）において、適当に標識付けしたヌクレオチドを臨床試料から単離されたＤＮＡの増幅に使用し、検出可能な標的鎖を発現させ、及び工程ｂ）において、増幅され、場合により標識付けされた標的ＤＮＡを、その上に配列番号：１〜１９及び／又はその相補的配列の細菌種−特異性オリゴヌクレオチドプローブの全部が結合されている固体支持体と接触させることを特徴とする、請求項７に記載の診断方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
ＤＮＡプライマー混合物であって、感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の配列とハイブリッド形成する配列を包含し、当該混合物は配列番号：２０及び２１及び／又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントを包含することを特徴とするＤＮＡプライマー混合物。
【手続補正６】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
感染原因となる細菌種の診断に有用なオリゴヌクレオチド配列であって、細菌種特異性であり、かつ当該感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の近辺に存在する高頻度可変領域の配列と、正常ハイブリッド形成条件下にハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド配列であり、ここでこのオリゴヌクレオチド配列は、配列番号：１〜１９の１種、又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントの包含することを特徴とするオリゴヌクレオチド配列。
【手続補正７】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
感染原因となる細菌種の診断に有用なオリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せであって、配列番号：１〜１９又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントのいずれかの組合せを包含することを特徴とするオリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せ。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１４】
配列番号：１〜１９の全部を包含することを特徴とする、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドプローブの組合せ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１６】
感染原因となる細菌、特に呼吸器官感染原因となる細菌の診断に用いる診断用キットであって、
ａ）感染原因となる細菌種、特に呼吸器官感染原因となる細菌種のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ［ＥＣ：２．７．７．６］サブユニットＢをコードするｒｐｏＢ遺伝子の保存領域の配列とハイブリッド形成する配列を包含するＤＮＡプライマーの混合物であって、配列番号：２０及び２１又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントを包含するＤＮＡプライマー混合物；
ｂ）固体支持体上に結合されていてもよく、配列番号：１〜１９又はその相補的配列、あるいはその機能性フラグメントのいずれかの組合せを包含する細菌種特異性オリゴヌクレオチドプローブ配列の組合せ；
ｃ）陽性及び場合により陰性でもよい対照プローブ配列；及び場合により、
ｄ）増幅、ハイブリッド形成、精製、洗浄、及び／又は検出工程で要求される試薬；
を含むことを特徴とする診断用キット。
【国際調査報告】
2007514432.tif 000009
2007514432.tif 000010
2007514432.tif 000011
2007514432.tif 000012
2007514432.tif 000013
2007514432.tif 000014
2007514432.tif 000015
2007514432.tif 000016