(57)【要約】任意のポリペプチドあるいは大分子複合体の同定と定量に有用な、コアプタマー構築物セットを利用した組成物と方法が開示される。大分子構築物のポリペプチドの固有のエピトープに結合するアプタマー構築物が作製される。これらアプタマー構築物は、エピトープ結合部位、コアプタマー結合部位、および検出可能な標識を含む。同族ポリペプチド、被分析物−ポリペプチド複合体、あるいはその他の大分子複合体の存在下で、コアプタマーは互いに結合して検出可能なシグナルを生み出す。コアプタマー構築物はリンカーで連結されて二価アプタマー構築物を産生してもよい。
2007525661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のポリペプチドを検出する方法であって、該方法は
（ａ）第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物にサンプルを接触させるステップと、
（ｂ）第１のアプタマー構築物、第２のアプタマー構築物、およびポリペプチドの結合を検出方法により検出するステップと、
を含み、
（ｃ）第１のアプタマー構築物は前記ポリペプチドの第の１エピトープに結合でき、第２のアプタマー構築物はポリペプチドの第２のエピトープに結合でき、
（ｄ）第１アプタマー構築物は
（ｉ）第１のエピトープと結合できる第１のアプタマーと、
（ｉｉ）第１のシグナリングオリゴと、
（ｉｉｉ）第１の標識と
を含み、
（ｅ）第２のアプタマー構築物は
（ｉｖ）第２のエピトープと結合できる第２のアプタマーと、
（ｖ）第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、
（ｖｉ）第２の標識と
を含む、前記方法。
【請求項２】
第１と第２のシグナリングオリゴが、それぞれ５ヌクレオチド〜７ヌクレオチドからなる、請求項１の方法。
【請求項３】
第１のアプタマーは天然の同族結合エレメント配列を含み、第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される、請求項１の方法。
【請求項４】
第１の標識は蛍光ドナーであり、第２の標識は蛍光アクセプターである、請求項１の方法。
【請求項５】
第１の標識は蛍光アクセプターであり、第２の標識は蛍光ドナーである、請求項１の方法。
【請求項６】
検出方法が蛍光の変化を検出する請求項１の方法。
【請求項７】
検出方法がＦＲＥＴである請求項２１の方法。
【請求項８】
第１のアプタマーと第２のアプタマーがインビトロの進化によって選択される請求項１の方法。
【請求項９】
ポリペプチドは元来は天然同族結合エレメント配列に結合しない請求項１の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドがトロンビンである請求項９の方法。
【請求項１１】
第１のアプタマーがトロンビンフィブリノゲンエクソサイトに結合し、第２のアプタマーがトロンビンのフィブリノゲンエクソサイトに結合する請求項１０の方法。
【請求項１２】
第１の標識がフルオレセインである請求項１１の方法。
【請求項１３】
検出方法が蛍光偏光である請求項１２の方法。
【請求項１４】
第２の標識がダブシルで、検出方法がフルオレセインの蛍光強度の変化を検出することである請求項１２の方法。
【請求項１５】
第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物がリンカーで連結されている請求項１の方法。
【請求項１６】
リンカーが柔軟なスペーサー１８リンカーである、請求項１の方法。
【請求項１７】
サンプル中の被分析物を検出する方法であって、該方法は
（ａ）第１のアプタマー構築物、第２のアプタマー構築物、およびポリペプチドにサンプルを接触させるステップと、
（ｂ）第１のアプタマー構築物、第２のアプタマー構築物、ポリペプチド、および被分析物の結合を検出方法により検出するステップと、
を含み、
（ｃ）被分析物の存在下で、第１のアプタマー構築物はポリペプチドの第１のエピトープに結合でき、第２のアプタマー構築物はポリペプチドの第２のエピトープに結合でき、
（ｄ）第１のアプタマー構築物は、第１のエピトープと結合できる第１のアプタマーと、第１のシグナリングオリゴと、第１の標識とを含み、
（ｅ）第２のアプタマー構築物は、第２のエピトープと結合できる第２のアプタマーと、第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、第２の標識とを含む、
前記方法。
【請求項１８】
第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴは、それぞれ５ヌクレオチド乃至７ヌクレオチドからなる請求項１７の方法。
【請求項１９】
第１のアプタマーは天然同族結合エレメントの配列を含み、第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される請求項１７の方法。
【請求項２０】
第１の標識は蛍光ドナーであり、第２の標識は蛍光アクセプターである請求項１７の方法。
【請求項２１】
第１の標識は蛍光アクセプターであり、第２の標識は蛍光ドナーである、請求項１７の方法。
【請求項２２】
検出方法が蛍光の変化を検出する請求項１７の方法。
【請求項２３】
検出方法がＦＲＥＴである請求項２２の方法。
【請求項２４】
第１のアプタマーと第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される請求項１７の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが元々は天然同族結合エレメント配列に結合しない請求項１７の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが被分析物との結合の際に構造上の変化を起こす請求項１７の方法。
【請求項２７】
被分析物が薬物であり、前記ポリペプチドは該薬物に結合できる請求項２６の方法。
【請求項２８】
被分析物がスタチン薬物であり、前記ポリペプチドがＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼである請求項２７の方法。
【請求項２９】
被分析物が環境中に見出される毒素である請求項１７の方法。
【請求項３０】
第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物がリンカーで連結されている請求項１７の方法。
【請求項３１】
リンカーが柔軟なスペーサー１８リンカーである請求項３０の方法。
【請求項３２】
第１と第２のアプタマー構築物を含むアプタマー構築物セットを作製する方法であって、該方法は
（ａ）第１のエピトープを含む第１の基質に対する第１のアプタマーを選択し、第２のエピトープを含む第２の基質に対する第２のアプタマーを選択することとを含むステップであって、第１のアプタマーは第１のエピトープに結合でき、第２のアプタマーは第２のエピトープに結合できるステップと、
（ｂ）第１の標識を第１のアプタマーに結合させ、第２の標識を第２のアプタマーにさせるステップと、
（ｃ）第１のシグナリングオリゴを第１のアプタマーに結合させ、第２のシグナリングオリゴが第２のアプタマーに結合させるステップであって、第２のシグナリングオリゴが第１のシグナリングオリゴに相補的であるステップと、
（ｄ）その結果（ｉ）第１のアプタマー構築物が第１のアプタマー、第１の標識、および第１のシグナリングオリゴを含み、（ｉｉ）第２のアプタマー構築物が第２のアプタマー、第２の標識、および第２のシグナリングオリゴを含むステップと
を含む前記方法。
【請求項３３】
第１の基質がポリペプチドであり、第２の基質が第１のアプタマーと結合したポリペプチドであり、第１のアプタマーが第１のエピトープをマスクする請求項３２の方法。
【請求項３４】
第１の基質がポリペプチドあるいは大分子複合体であり、第２の基質が第１のアプタマーと結合したポリペプチドあるいは大分子複合体であり、第１のアプタマーが（ａ）第１のシグナリングオリゴあるいは第１の標識上に結合され、（ｂ）第１のエピトープをマスクしている、請求項３２の方法。
【請求項３５】
第１の基質が本質的に第１のエピトープからなるポリペプチドの断片であり、第２の基質が本質的に第２のエピトープからなるポリペプチドの断片である請求項３２の方法。
【請求項３６】
第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが、各々５ヌクレオチド乃至７ヌクレオチドからなる請求項３２の方法。
【請求項３７】
第１のアプタマーが天然同族結合エレメント配列を含み、第２のアプタマーはインビトロ進化を用いて選択される、請求項３２の方法。
【請求項３８】
第１の標識が蛍光ドナーであり、第２の標識が蛍光アクセプターである請求項３２の方法。
【請求項３９】
第１の標識が蛍光アクセプターであり、第２の標識が蛍光ドナーである請求項３２の方法。
【請求項４０】
第１のアプタマーと第２のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択される請求項３２の方法。
【請求項４１】
柔軟なリンカーで第１のアプタマー構築物を第２のアプタマー構築物に連結するステップを含む請求項３２の方法。
【請求項４２】
第１のアプタマー、第１の標識、第１のシグナリングオリゴ、第２のアプタマー、第２の標識、第２のシグナリングオリゴおよびリンカを包む二価アプタマー構築物であって、第１のアプタマーが第１のエピトープに結合でき、第２のアプタマーが第２のエピトープに結合できる二価アプタマー構築物。
【請求項４３】
第１のエピトープと第２のエピトープが同一のポリペプチドの重複しない異なるエピトープである請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項４４】
リンカーが柔軟なリンカーである請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項４５】
リンカーがスペーサー１８リンカーである請求項４４の二価アプタマー構築物。
【請求項４６】
リンカーがデオキシチミジンポリマーである請求項４４の二価アプタマー構築物。
【請求項４７】
第１の標識が蛍光ドナーである請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項４８】
第２の標識が蛍光受容体である請求項４７の二価アプタマー構築物。
【請求項４９】
第１と第２のシグナリングオリゴは、５ヌクレオチド長乃至７ヌクレオチド長である請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５０】
第１のアプタマーが天然同族結合エレメント配列を含む請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５１】
第２のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択された、請求項５０の二価アプタマー構築物。
【請求項５２】
第１のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択された請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５３】
ポリペプチドがトロンビンであり、第１の標識がフルオレセインであり、第２の標識がダブシルであり、第１のエピトープがヘパリンエクソサイトであり、第２のエピトープがフィブリノゲンエクソサイトであり、リンカーがスペーサー１８である、請求項４２の二価アプタマー構築物。
【請求項５４】
ポリペプチドがトロンビンであり、第１の標識がフルオレセインであり、第２の標識がダブシルであり、第１のエピトープがヘパリンエクソサイトであり、第２のエピトープがフィブリノゲンエクソサイトであり、リンカー分子がスペーサー１８である請求項４３の二価アプタマー構築物。
【請求項５５】
第１の標識が結合された第１のエピトープおよび第２の標識が結合された第２のエピトープを含むキットであって、
（ａ）第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープ結合剤標識が、それぞれポリペプチドの第１のエピトープとポリペプチドの第２のエピトープに結合した時（ｂ）第１の標識と第２の標識が相互作用して観測可能なシグナルを生み出す、キット。
【請求項５６】
第１のエピトープ結合剤が抗体である請求項５５のキット。
【請求項５７】
第１のエピトープの結合剤は第１のアプタマー構築物であり、第１のアプタマー構築物は第１のアプタマー、第１の標識、および第１のシグナリングオリゴが含む請求項５５のキット。
【請求項５８】
第２のエピトープ結合剤が第２のアプタマー構築物であり、第２のアプタマー構築物は第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴを含む、請求項５７のキット。
【請求項５９】
第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが５個ヌクレオチド乃至７個ヌクレオチドの長さである請求項５８のキット。
【請求項６０】
第１のアプタマーが天然同族結合エレメント配列を含む、請求項５８のキット。
【請求項６１】
第２のアプタマーがインビトロ進化を用いて選択される、請求項５８のキット。
【請求項６２】
第１の標識は蛍光ドナーであり、第２の標識は蛍光受容体である請求項５５のキット。
【請求項６３】
第１の標識がフルオレセインで第２の標識がダブシルである請求項６２のキット。
【請求項６４】
被分析物と結合できるポリペプチドをさらに含む請求項５５のキット。
【請求項６５】
キットを使用するためのプリントされた指示のセットをさらに含む請求項５５のキット。
【請求項６６】
疾病を診断する方法であって、該方法は
（ａ）患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープ結合剤に該サンプルを接触させるステップと、
（ｃ）該サンプル中のポリヌクレオチドの存在を検出方法を用いて検出するステップと、
を含み、該サンプル中の前記ポリペプチドの存在は患者に疾病があるかどうかを示す、疾病を診断する方法。
【請求項６７】
（ａ）第１のエピトープ結合剤は第１の標識と第１のシグナリングオリゴが結合された第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤は第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴが結合した第２のアプタマーであり、（ｃ）検出方法は蛍光検出法であり、
（ｄ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合し第２のアプタマーもポリペプチドに結合した時、（ｅ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｆ）第１の標識が第２の標識に接近して蛍光の変化が起こる、請求項６６の方法。
【請求項６８】
サンプルが、血液、尿、腹水、および組織サンプルからなる群から選択される請求項６６の方法。
【請求項６９】
患者がヒトである請求項６６の方法。
【請求項７０】
疾病を診断する方法であって、該方法は
（ａ）患者からサンプルを得るステップと、
（ｂ）第１のエピトープ結合剤、第２のエピトープ結合剤、および第１のエピトープと第２のエピトープを含むポリペプチドにサンプルを接触させるステップと、
（ｃ）サンプル中の、前記ポリペプチドに結合できる被分析物の存在を検出方法を用いて検出するステップと、
を含み、前記分析物の存在は疾病が患者にあるかを示す、疾病を診断する方法。
【請求項７１】
（ａ）第１のエピトープ結合剤は第１の標識と第１のシグナリングオリゴが結合した第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤は第２の標識と、第１のシグナリングオリゴに相補的な第２シグナリングオリゴとが結合した第２のアプタマーであり、（ｃ）検出方法は蛍光検出法であり、
（ｄ）被分析物がポリペプチドに結合した時、（ｅ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合し、第２のアプタマーもポリペプチドに結合し、（ｆ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｇ）第１の標識が第２の標識に接近して蛍光の変化が起こる、請求項７０の方法。
【請求項７２】
サンプルが、血液、尿、腹水、および組織サンプルからなる群より選択される請求項７０の方法。
【請求項７３】
患者がヒトである請求項７０の方法。
【請求項７４】
有用な試薬についてサンプルをスクリーニングする方法であって、
（ａ）第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープ結合剤にサンプルを接触させるステップと、
（ｂ）検出方法を用いてサンプル中の有用な試薬の存在を検出するステップと、
を含む方法。
【請求項７５】
有用な試薬が第１のエピトープと第２のエピトープを含むポリペプチドである請求項７４の方法。
【請求項７６】
被分析物と結合できるポリペプチドにサンプルを接触させるステップをさらに含み、前記有用な試薬が被分析物である、請求項７４の方法。
【請求項７７】
前記有用な試薬が潜在的な治療組成物である、請求項７４の方法。
【請求項７８】
（ａ）第１のエピトープ結合剤が、第１の標識と第１シグナリングオリゴが結合した第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤が、第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２シグナリングオリゴが結合した第２のアプタマーであり、（ｃ）検出方法が蛍光検出法であり、（ｄ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合するとき、また第２のアプタマーとポリペプチドが結合した時、（ｅ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｆ）第１の標識が第２の標識に接近して蛍光の変化が起こる、請求項７４の方法。
【請求項７９】
有用な試薬が第１のエピトープと第２のエピトープとを含むポリペプチドである、請求項７８の方法。
【請求項８０】
被分析物に結合できるポリペプチドにサンプルを接触させるステップをさらに含み、有用な試薬が被分析物である、請求項７８の方法。
【請求項８１】
有用な試剤は潜在的な治療組成物である、請求項７８の方法。
【請求項８２】
請求項４２乃至５４のいずれか一項の二価アプタマー構築物を含む薬理学的組成物。
【請求項８３】
サンプル中の分子間相互作用を促進する方法であって、請求項４２乃至５４のいずれか一項の二価アプタマーをサンプルに投与するステップを含み、第１のエピトープと第２のエピトープは異なる分子上にあり、第１のエピトープと第２のエピトープは接近して分子間相互作用を行う、サンプル中の分子間相互作用を促進する方法。
【請求項８４】
サンプルが細胞、組織、脳脊髄液、血液、インビトロ反応混合液、および環境システムからなる群から選択される請求項８３の方法。
【請求項８５】
サンプル中のポリペプチドを検出する方法であって、該方法は
（ａ）第１の分子認識構築物と第２の分子認識構築物にサンプルを接触させるステップと、（ｂ）検出方法を用いて第１の分子認識構築物、第２の分子認識構築物、およびポリペプチドの結合を検出するステップと
を含み、
（ｃ）第１の分子認識構築物はポリペプチの第１のエピトープと結合でき、第２の分子認識構築物はポリペプチドの第２のエピトープと結合でき、
（ｄ）第１の分子認識構築物は（ｉ）第１のエピトープに結合できる第１のエピトープ結合剤と、（ｉｉ）第１のシグナリングオリゴと、（ｉｉｉ）第１の標識とを含み、
（ｅ）第２の分子認識構築物は（ｉｖ）第２のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合剤と、（ｖ）第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、（ｖｉ）第２の標識とを含む、
サンプル中のポリペプチドを検出する方法。
【請求項８６】
第１のエピトープ結合剤がアプタマーである請求項８５の方法。
【請求項８７】
第２のエピトープ結合剤がアプタマーである請求項８６の方法。
【請求項８８】
第２のエピトープ結合剤が抗体である請求項８６の方法。
【請求項８９】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである請求項８６の方法。
【請求項９０】
第１のエピトープ結合剤が抗体である請求項８５の方法。
【請求項９１】
第２のエピトープ結合剤が第２の抗体である請求項９０の方法。
【請求項９２】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項９０の方法。
【請求項９３】
第１のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第１の結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項８５の方法。
【請求項９４】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第２の結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項９３の方法。
【請求項９５】
検出方法が、プラズモン共鳴、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光相互相関分光（ＦＣＣＳ）、蛍光消光、蛍光偏光、着色物産生、化学発光、シンチレーション、生物発光、および発光共鳴エネルギー移動からなる群から選択される、請求項８５乃至９４のいずれか一項の方法。
【請求項９６】
検出方法が発光共鳴エネルギー移動である請求項９５の方法。
【請求項９７】
ポリペプチドがトロンビンあるいはｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（ＣＰＲ）である、請求項８５乃至９６のいずれか一項の方法。
【請求項９８】
サンプルが、血液、尿、腹水、細胞サンプル、および組織サンプルからなる群より選択される、請求項８５乃至９７のいずれか一項の方法。
【請求項９９】
第１の分子認識構築物と第２の分子認識構築物とを含む分子ビーコンであって、
（ａ）第１の分子認識構築物はポリペプチドの第１のエピトープと結合でき、また第２の分子認識構築物はポリペプチドの第２のエピトープと結合することができ、
（ｂ）第１の分子認識構築物は（ｉ）第１のエピトープに結合できる第１のエピトープ結合剤と、（ｉｉ）第１のシグナリングオリゴと（ｉｉｉ）第１の標識とを含み、
（ｃ）第２の分子認識構築物は（ｉｖ）第２のエピトープに結合できる第２のエピトープ結合剤と、（ｖ）第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴと、（ｖｉ）第２の標識とを含む、
分子ビーコン。
【請求項１００】
第１のエピトープ結合剤がアプタマーである、請求項９９の分子ビーコン。
【請求項１０１】
第２のエピトープ結合剤がアプタマーである、請求項１００の方法。
【請求項１０２】
第２のエピトープ結合剤が抗体である請求項１００の方法。
【請求項１０３】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの結合部位を包む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１００の方法。
【請求項１０４】
第１のエピトープ結合剤が抗体である、請求項９９の方法。
【請求項１０５】
第２のエピトープ結合剤が第２の抗体である、請求項１０４の方法。
【請求項１０６】
第２のエピトープの結合剤がポリペプチドへの結合部位を包む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１０４の方法。
【請求項１０７】
第１のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第１の結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項９９の方法。
【請求項１０８】
第２のエピトープ結合剤がポリペプチドへの第２の結合部位を包む二本鎖ポリヌクレオチドである、請求項１０７の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
親出願に関する記載
この特許出願は２００３年１２月１２日に出願された米国仮出願（Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）番号６０／５２９、０７６からの優先権を主張する。
【０００２】
政府援助
この研究業務は保健福祉省／国立衛生研究所に支援されており（補助番号ＣＡ９４３５６）、アメリカ政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
配列リスト
紙にコピーした配列リストと、同じ配列のコンピューターで読み取り可能な形式とは下に添付され、本明細書に参照により取り込まれる。３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２１  （ｆ）に従い、コンピューターで読み取り可能な形式で記録された情報は記載された配列リストと同一のものである。
バックグラウンド技術
【０００４】
発明の分野
本発明は、キット  （ｋｉｔ）、分子ビーコン  （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）、および任意のポリペプチド、被分析物  （ａｎａｌｙｔｅ）、大分子複合体  （ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）  あるいはその組み合わせ方法を検出する方法に関係するものである。本発明はバイオメディカル研究ツールと診断キットに関係している。
【０００５】
バックグラウンド技術
我々の環境、食物、水、生物サンプル（血液、脳脊髄液、尿など）の中の特定分子の検出、同定、および定量は、非常に複雑、高価、かつ時間もかかるものでありえる。これらの方法にはガスクロマトグラフィー、質量分析、ＤＮＡ配列決定、免疫分析、細胞を基礎とする分析、生物分子ブロットおよびゲル、および無数の多段化学および物理分析法が含まれる。
【０００６】
生物あるいは環境サンプル中の特定タンパク質のレベルを検出および測定する簡便な方法が強く求められ続けている。、タンパク質を検出しそのレベルを測定することは生物医学研究における最も基礎的でかつよく行われる方法の一つである。抗体ベースのタンパク質検出方法は研究および医学的診断において非常に有用であるが、迅速かつハイ・スループット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）な並列蛋白質検出（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）によく適合するものではない。
【０００７】
以前に、本発明者は、タンパク質の特定のサブクラス（つまり配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質）を検出するための蛍光センサー法を開発した（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２、  ２０、  １７１−１７６；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００３、  ３１６、  １−１０；  米国特許番号６、５４４、７４６  および係属中の特許出願番号  １０／０６２、０６４、  ＰＣＴ／ＵＳ０２／２４８２２  と  ＰＣＴ／ＵＳ０３／０２１５７、  これらは参照により本明細書に取り込まれる）。この方法はタンパク質のＤＮＡ結合部位を２つのＤＮＡ半部位（ｈａｌｆ−ｓｉｔｅｓ）に分けることに基づいている。生じる半部位の各々は、２つのＤＮＡ半部位が完全に機能的なタンパク結合部位を再構成するように結合するいくらかの傾向を導入するように設計された長さの、短い相補的一本鎖部位を含んでいる。この傾向は、タンパク質が存在しない時はＤＮＡ半部位のほんの一部のみが結合するように、低く設計されている。タンパク質が反応混合液の中に存在する時、それは完全に機能的な結合部位にのみ結合する。この選択的結合は、ＤＮＡ半部位の結合を促進し、このタンパク質依存的な結合は、目標タンパク質の存在を知らせる分光的シグナルを生み出すのに用いられる。単語「分子ビーコン」当業界で前記検出を述べるのに用いられ、選択的認識と、認識を知らせるシグナルの発生が検出の際に同時に起こることを強調している。いくつかのタンパク質について、ＤＮＡ結合タンパク質用分子ビーコンが開発されており、その一般的適用可能性について示している  （Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２、  ２０、  １７１−１７６、参照により本明細書に取り込まれる）。その物理的作用機構は確立されており、ＤＮＡ結合タンパク質に結合するリガンドの存在を検出するアッセイ用のプラットフォームとしても用いられている  （Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ、；  Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００３、  ３１６、  １−１０；  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．；  Ｈｅｔｄｕｋ、  Ｔ．  Ａｎａｌｙｔ．  Ｃｈｅｍ．  ２００４、  ７６、  １１５６−１１６４；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｆｅｉ、  Ｙ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２００３、  ６、  １８３−１９４、  参照により本明細書に取り込まれる）。  このアッセイはすでにかなり有用だが、このアッセイは天然のＤＮＡ結合活性を示すタンパク質に限定されている。
【０００８】
分子ビーコンとしてのアプタマー
タンパク質検出のための簡便で、特異的で高感度のハイ・スループット（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）アッセイの開発は、依然として非常に重要な目標である。このようなアッセイは研究、創薬および医学診断に応用できる。これまでのところ、目標のタンパク質を認識する抗体が、大部分のタンパク質検出アッセイの最重要物である。インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で、一群のランダムな配列の核酸の中から目標タンパク質を認識するアプタマーを選択する方法は、最初の本当の抗体の替代物を提供した。アプタマーの潜在的な利点の一つは、オリゴヌクレオチドを増やし合成するのが容易であるということである。さらに、例えば蛍光プローブなどのレポーター基を含むアプタマーを設計するのに標準的な核酸化学操作を用いうる。このため、様々なフォーマットのタンパク質の検出アッセイにおいてアプタマーを使用することについてかなりの関心があることには疑いがない。最も有望な路線は、目標タンパクの認識と該タンパクの存在を知らせる光学的シグナルの産生を組み合わせるアプタマーを基礎としたセンサーの開発である。
【０００９】
いくつかの発行された報告では、特定のタンパク質と結合した際に蛍光シグナルを発するアプタマーを基礎とした「分子ビーコン」の巧妙な設計について述べられている。これらの設計は全て、蛍光シグナルの変化を生み出す、目標タンパク質によって誘導されるアプタマー中の構造遷移に依存している。ＹａｍｏｍｏｔｏとＫｕｍｅｒ  （Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２０００、  ５、  ３８９−３９６）  は、ＨＩＶのＴａｔタンパク質認識の際に蛍光シグナルが増強した分子ビーコンアプタマーを記載している。蛍光シグナルは、Ｔａｔタンパク質に誘導されるアプタマーのヘアピン構造と二重らせん構造の間の遷移に起因する、蛍光団−消光剤間の近さの変化によって生み出される。Ｈａｍａｇｕｃｈｉ  らは  （Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００１、  ２９４、  １２６−１３１）  トロンビン認識の際に蛍光を増強させた分子ビーコンアプタマーを記載している。目標タンパク質が存在しない時、このビーコンは蛍光団と消光団を近接させるようにステム−ループ構造を形成するように設計されている。該タンパク質が存在する時、ビーコンはリガンド結合構造  をとらされ、その結果蛍光団と消光剤の間の距離が開き、蛍光シグナルは増強される。Ｌｉ  ．らは（Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２００２、  ２９２、  ３１−４０）は、目標タンパク質の存在時に緩いらせんから稠密な単分子四重らせんへの遷移を行う分子ビーコンアプタマーを記載している。このタンパク質に誘導されるアプタマー構造の変化は、アプタマーの末端に結合した蛍光プローブの間の近さの変化を生じ、蛍光シグナルの変化を生み出す。類似の手法がＰＤＧＦを認識する分子ビーコンアプタマーを設計するためにＦａｎｇら  （ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．  ２００３、  ４、  ８２９−８３４）に用いられた。これらの例は、タンパク質の存在を光学的シグナルに変換できるセンサーを設計するためのアプタマーの大きな可能性を示している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者は、先のセンサーの設計を成功裏に押し広め、これらセンサーをタンパク質および天然の核酸結合活性を持たないその他の被分析物への配列特異的ヌクレオチド結合の検出に先に適用されたセンサーの設計を一般化することに成功し、これらセンサーの応用範囲を拡大した。簡単に言えば、配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質を認識する天然のＤＮＡ配列を、ランダム配列のプールからインビトロ選択によって得られた、特定の目標タンパク質に結合する核酸によって置き換えた。インビトロＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの体系的進化）の手法を使用して天然のＤＮＡ結合活性を欠くタンパク質に特異的に結合できる核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）アプタマーを生み出せることが良く確立された  （Ｔｕｅｒｋ、  Ｃ．；  Ｇｏｌｄ、  Ｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０、  ２４９、  ５０５−５１０；  Ｇｏｌｄ、  Ｌ．；  Ｐｏｌｉｓｋｙ、  Ｂ．；  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、  Ｏ．；  Ｙａｒｕｓ、  Ｍ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９５、  ６４、  ７６３−７９７；  Ｗｉｌｓｏｎ、  Ｄ．Ｓ．；  Ｓｚｏｓｔａｋ、  Ｊ．Ｗ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９９、  ６８、  ６１１−６４７）。ＳＥＬＥＸは、結合、非結合配列の洗い落とし、および目標結合配列のＰＣＲ増幅のサイクルによってランダムＤＮＡ（またはＲＮＡ）配列プールから特定の目標に結合する核酸配列を選択することを伴う。様々なタンパク質およびその他の目標分子に特異的に結合するアプタマーを成功裏に選択した多数の例  （Ｔｕｒｅｋ  １９９０、  Ｐｏｌｉｓｋｙ  １９９５  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ  １９９９）は、数多くの天然タンパク質に対するアプタマーを作り出すことが可能であることを強く示している。
【００１１】
発明者は係属中の特許出願１０／０６２、０６４  （参照により本明細書に取り込まれる）に記載された近接性を基礎としたアッセイの応用を、核酸結合因子、そのリガンドおよび共調節因子を超えて、任意のポリペプチド（プリオンその他の誤って折り畳まれたタンパク質を含む）被分析物、小分子リガンドあるいは大分子複合体をも含むようにすることをさらに可能とする組成物と方法を開発した。本発明は、各アプタマーの末端に短い（好ましくは約５〜７ヌクレオチドの）相補的一本鎖ポリヌクレオチド配列（シグナリングオリゴと呼ばれる）を含む一群の標識アプタマーの使用に関する。アプタマー群中の各アプタマーは、ポリペプチドあるいは大分子複合体の特異的かつ異なるエピトープに結合する；つまりアプタマー群のうち第１のアプタマーはポリペプチドあるいは大分子複合体の第１のエピトープに結合し、アプタマー群のうち第２のアプタマーはこのポリペプチドあるいは大分子複合体の第２のエピトープと結合する。ポリペプチドあるいは大分子複合体が存在する時、各アプタマーの末端の短い相補的な一本鎖ポリヌクレオチド配列が互いに安定に結合するように、第１のアプタマーは第１のエピトープと結合し、第２のアプタマーは第２のエピトープと結合する、第１のアプタマー末端の短い一本鎖ポリヌクレオチド配列が、第２のアプタマー末端の短い一本鎖ポリヌクレオチド配列に安定に結合する時、第１のアプタマー上の標識は第２のアプタマー上の標識に接近し、測定可能なシグナルを生み出す。言い換えれば、任意のポリペプチドあるいは大分子複合体に結合する２つ以上の新規な核酸半部位を作製し、任意のポリペプチドあるいは大分子複合体を検出するための近接性を基礎とするアッセイに用いることができる。アプタマー群は柔軟なリンカーによって結合されて二価アプタマー構築物を形成してもよい。
【００１２】
本発明の一つの実施形態は、ポリペプチドあるいは生体大分子複合体の第１のエピトープと第２のエピトープにそれぞれ結合する第１のアプタマーと第２のアプタマーを製造することを含む方法である。アプタマーは、指数的濃縮によるリガンドの体系的進化（ａ．ｋ．ａ．  ＳＥＬＥＸ；  Ｋｌｕｇ、  Ｓ．；  Ｆａｍｕｌｏｋ、  Ｍ．、Ａｌｌ  ｙｏｕ  ｗａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｋｎｏｗ  ａｂｏｕｔ  ＳＥＬＥＸ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９９４、  ２０、  ９７−１０７、参照により本明細書に取り込まれる）などのインビトロ選択を使ってアプタマーを作ることができる。あるいは、一つ以上の既存のアプタマーあるいは天然の同族核酸を、末端に標識と短い一本鎖ポリヌクレオチド配列を含むように変化して、ポリペプチド、被分析物、あるいは大分子複合体を検出するのに用いることができる。
【００１３】
本発明の別の実施形態では本願は、ポリペプチドあるいは大分子複合体の第１のエピトープを認識し第１のシグナリングオリゴを含む第１のアプタマー構築物と、ポリペプチドあるいは大分子複合体の第１のエピトープを認識し第１のシグナリングオリゴを含む第２のアプタマー構築物とを含む二価アプタマーに関係し、ここで第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物は柔軟なリンカーによって互いに結合されている。好ましい実施形態では、第１のアプタマー構築物は第１の標識を含み、第２のアプタマー構築物は検出のための第２の標識を含む。
【００１４】
この二価アプタマー構築物は、分子と大分子複合体の検出にとどまらず非常に多くの応用範囲で有用であると想定される。この二価アプタマーは抗体と同様にして用いることができる。例えば、分子と複合体の検出、分子と複合体の精製、エピトープと抗原のブロッキング、生物内の免疫反応（先天性および特異的の両者）の促進、疾病の治療および対象への受動免疫の付与である。好ましい対象は人、家畜、あるいはペットである。
【００１５】
二価アプタマーは細胞あるいは組織中の分子の相互作用の阻害、あるいは細胞や組織中分子の相互作用を促進することで患者に所望の治療結果をもたらす治療組成物として用いることができることがさらに想定される。好ましい対象は人、家畜、あるいはペットである。
【００１６】
アプタマー構築物あるいは二価アプタマー構築物は、医学あるいは獣医学の診断、あるいは安全で有效な有力な薬物製品を同定するのを助ける薬学的スクリーニングにも使用できることが想定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
別途定義されない限り、本明細書中の技術的および科学的用語は全て、本発明の属する分野の当業者が共通して理解するのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと同様あるいは等価な任意の方法あるいは材料が本発明の実施あるいは試験において用いられうるが、好ましい方法と材料を記載する。本発明のために、以下の用語を下記のように定義する。
「アプタマー」の語は生化学的活性、分子認識または結合属性に関して有用な生物学的活性を有する任意のポリヌクレオチド、一般にＲＮＡまたはＤＮＡを指している。通常、アプタマーはポリペプチドの特定のエピトープ（領域）においてポリペプチドに結合する、あるいは酵素活性を有するなどの分子活性を有する。任意のポリペプチドに結合する際に特異的であるアプタマーがインビトロ進化で合成および／または同定できることが一般に受け入れられている。
「天然の同族結合エレメント配列」の語は核酸結合因子の結合部位として働くヌクレオチドの配列を指している。好ましくは天然の同族結合エレメント配列は天然のヌクレオチド結合因子によって認識される天然の配列である。
「分子認識構築物」の語は「エピトープ結合剤」を含み、また「分子ビーコン」として働くことができる構築物を指す。好ましくは分子認識構築物は「シグナリングオリゴ」と「標識」をも含む。第一の分子認識構築物と第二の分子認識構築物は「リンカー」で連結されて「二価分子認識構築物」を形成してもよい。「分子ビーコン」は検出方法として測定可能な読み出しシステムを用いる、被分析物、ポリペプチドその他の生体分子、生体分子を含む大分子複合体、あるいは生物学的共調節因子（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｅｇｕｌａｔｏｒ）を検出し定量化するための任意の化学を基礎としたシステムを指す。分子認識構築物あるいは二価分子認識構築物は、よりよい特異性および感度を有する特定のタイプの分子ビーコンである。
「アプタマー構築物」の語は、アプタマーあるいは天然の同族結合エレメント配列を含み、「分子ビーコン」として働くことができる構築物を指す。好ましくはアプタマー構築物は「シグナリングオリゴ」と「標識」も含む。第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物は「リンカー」で連結され、「二価アプタマー構築物」を形成してもよい。アプタマー構築物は、分子認識構築物の部分集合である。アプタマー構築物あるいは二価アプタマー構築物もよりよい特異性および感度を有する特定の形式の分子ビーコンである。
「抗体」の語は一般に、抗原のエピトープを認識し、結合できるポリペプチドあるいはタンパク質を意味する。ここで抗体は当業界で理解されるような完全な抗体（つまり２つの重鎖と２つの軽鎖からなる）でもよいし、あるいは抗体は、Ｆａｂ断片や超可変領域を含むペプチドのような完全抗体の断片でもよい。
「エピトープ結合剤」の語は、抗原、ポリペプチド、タンパク質、あるいは大分子複合体の特定のエピトープに結合できる任意の物質を指す。エピトープ結合剤の非限定的な例はリガンドとリガンドの断片、レセプターとレセプターの断片、抗体と抗体の断片、アプタマーその他のポリヌクレオチド、補酵素その他の共同調節因子、およびアロステリック分子とイオンを含む。好ましいエピトープ結合剤は、アプタマー、天然同族結合エレメント配列、抗体およびその断片が含まれる。
「エピトープ」の語は一般に、抗原、ハプテン、分子、ポリマー、プリオン、ビリオン、細胞、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、あるいは大分子複合体の特定の領域を指す。エピトープはより大きなポリペプチドに由来する小ペプチドからなっていてもよい。エピトープは、ポリペプチド、タンパク質、あるいはいくつかの不連続なペプチド領域あるいはアミノ酸基を含む大分子複合体の二次元あるいは三次元表面、あるいは表面特徴でありうる。
「シグナリングオリゴ」の語は、短い（一般に２から１５ヌクレオチド長、好ましくは５から７ヌクレオチド長）一本鎖ポリヌクレオチドを指す。好ましくは第１のシグナリングオリゴは第２のシグナリングオリゴに相補的である。好ましくは、第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴは、第３の薬剤の媒介によって第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが接近しない限りは水素結合による安定な結合を形成できない。
本明細書において「リンカー」あるいは「リンカー分子」の語はアプタマーあるいはアプタマー構築物に結合された任意のポリマーを指す。結合は共有結合であるかあるいは非共有結合である。リンカーはアミノ酸あるいはヌクレオチドのポリマーでもよいことが想定される。好ましいリンカー分子は柔軟で、核酸結合因子が核酸成分セットに結合することを妨害しない。好ましいリンカーは、１２個の（スペーサー１８−フォスフォルアミデート）（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）部分からなる。別の好ましいリンカーは、ポリーｄＴである。
「インビトロ進化」の語は一般に、生体分子、特にペプチドあるいはポリペプチド、に結合するアプタマーを選択する任意の方法を意味する。インビトロ進化はまた「インビトロ選択」、”ＳＥＬＥＸ”あるいは”指数的濃縮によるリガンドの体系的進化”としても知られている。簡単に言えば、インビトロ進化は一群のランダムポリペプチドを、生体分子と結合する、あるいは選択可能な特定の活性を有する特定のポリペプチドについてスクリーニングすることを伴う。一般的に、前記特定のポリペプチド（つまりアプタマー）はランダムポリヌクレオチドのプールのごくわずかな割合でしかなく、そのためアプタマー増幅過程（通常はポリメラーゼ連鎖反応）が潜在的に有用なアプタマーの割合を増やすために用いられる。選択と増幅を連続して繰り返すことにより、特定の有用なアプタマーの量が指数的に増加する。インビトロ進化は、Ｆａｍｕｌｏｋ、  Ｍ．；  Ｓｚｏｓｔａｋ、  Ｊ．  Ｗ．、  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ、  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  １９９２、  １０４、  １００１．  （Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  １９９２、  ３１、  ９７９−９８８．）；  Ｆａｍｕｌｏｋ、  Ｍ．；  Ｓｚｏｓｔａｋ、  Ｊ．  Ｗ．、  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ、  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、  Ｖｏｌ  ７、  Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、  Ｄ．  Ｍ．  Ｊ．  Ｌｉｌｌｅｙ、  Ｅｄｓ．、  １４  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、  Ｂｅｒｌｉｎ、  １９９３、  ｐｐ．  ２７１；  Ｋｌｕｇ、  Ｓ．；  Ｆａｍｕｌｏｋ、  Ｍ．、  Ａｌｌ  ｙｏｕ  ｗａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｋｎｏｗ  ａｂｏｕｔ  ＳＥＬＥＸ；  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １９９４、  ２０、  ９７−１０７；  ａｎｄ  Ｂｕｒｇｓｔａｌｌｅｒ、  Ｐ．；  Ｆａｍｕｌｏｋ、  Ｍ．、  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅ；  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  １９９５、  １０７、  １３０３−１３０６  （Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  １９９５、  ３４、  １１８９−１１９２）、（これらは参照により本明細書に取り込まれる）に記載されている。
本発明を実施する際に、インビトロ進化は任意の与えられたポリペプチドあるいは大分子複合体上の異なるエピトープと結合する複数のアプタマーを作製するために用いられる。アプタマーは興味のあるエピトープを含む「基質」に対して選択される。ここで「基質」は、アプタマーが結合できるエピトープを含みアプタマーの選択の上で有用な任意の分子的実体である。
本明細書中で「標識」の語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、アプタマー、核酸成分、その他の基質材料に結合でき、検出法によって検出できる物質を指す。本発明に適用可能な標識の非限定的な例は、これに限定されないが、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光消光剤、有色分子、放射性同位元素、シンチラント、質量標識（質量変化から検出）、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、Ａタンパク、Ｇタンパク、抗体あるいは抗体断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ2+、フラッグタグ（Ｆｌａｇ  ｔａｇ）、ｍｙｃタグ、重金属、酵素、アルカリンホスファターゼ、ペロキシダーゼ、ルシフェラーゼ、電子ドナー／アクセプター、アクリジニウム・エステル類、および発色基質を含む。当業者は上には挙げられていないが本発明の操作で用いることの出来る他の有用な標識を容易に認識するであろう。
本明細書中で「検出方法」は、分子相互作用を検出する、当業界で知られている任意の方法を意味する。本明細書中で「検出可能なシグナル」は本質的には「検出方法」と同様である。検出方法は、質量変化の検出（例：プラスミン共振）、蛍光変化（例：ＦＲＥＴ、ＦＣＣＳ、蛍光の消滅あるいは増強、蛍光偏光）、酵素活性（例：基質の枯渇あるいは生成物の形成（例えば検出可能な色素（アルカリ性ポスファターゼのＮＢＴ−ＢＣＩＰシステムは一例である））、化学発光あるいはシンチレーションの変化（例：シンチレーション近接アッセイ、発光共鳴エネルギー移動、生物発光共鳴エネルギー移動など）を含む。
【００１８】
本明細書中で「被分析物」は一般に、リガンド、化学構造部分、化合物、イオン、塩類、金属、酵素、細胞内シグナル伝達経路のセカンド・メッセンジャー、薬物、ナノ粒子、環境的汚染物質、毒素、脂肪酸、ステロイド、ホルモン、炭水化物、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質その他アミノ酸ポリマー、微生物、ウイルス、あるいはアプタマーへの結合のためにエピトープを形成するかエピトープの利用可能性を変化させるようにポリペプチド、タンパク質、あるいは大分子複合体に結合できる任意の他の薬剤、を指す。
【００１９】
本明細書中で「大分子複合体」の語は、大分子を含む任意の組成物を指す。好ましくは、これらは互いに会合した一つ以上の大分子（ポリペプチド、脂質、炭水化物、核酸、天然あるいは人工ポリマーなど）の複合体である。会合は大分子複合体の成分間での共有的あるいは非共有的な相互作用を伴っていても良い。大分子複合体は比較的単純（ポリペプチドに結合したリガンドなど）であってもよいし、比較的複雑（脂質ラフト）でもよく、非常に複雑（細胞表面、ウイルス、細菌、胞子など）でもよい。大分子複合体は本質的に生物性でも非生物性でもよい。
【００２０】
一つの実施形態では、本発明は、サンプルを第１の分子認識構築物と第２の分子認識構築物とに接触させるステップと、検出方法によって第１と第２の分子認識構築物の間の安定な相互作用を検出するステップとを含む、サンプル中のポリペプチドを検出する方法に関する。いくつかの有用な分子認識構築物の組み合わせ（センサー）のバリエーションが本発明者によって想定され、図２６中に図示されている。パネルＡは、タンパク質の２つの異なるエピトープを認識する２つのアプタマーを含むセンサーのバリエーションを示している。パネルＢは、ＤＮＡ結合タンパクへの結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドとタンパクの異なるエピトープを認識するアプタマーを含むセンサーのバリエーションを示す。パネルＣは、タンパク質の異なるエピトープを認識する抗体およびアプタマーを含むセンサーのバリエーションを示している。パネルＤは、ＤＮＡ結合タンパクへの結合部位を含む二本鎖ポリヌクレオチドとタンパク質の異なるエピトープを認識する抗体とを含むセンサーのバリエーションを示している。パネルＥは、タンパク質の異なる２つのエピトープを認識する２つの抗体を含むセンサーのバリエーションを示している。パネルＦは、タンパク質の異なる２つのエピトープを認識する２つの二本鎖ポリヌクレオチド断片を含むセンサーのバリエーションを示している。パネルＧは、別の一本鎖ポリヌクレオチドの２つの異なる配列エレメントを認識する２つの一本鎖ポリヌクレオチドエレメントを含むセンサーのバリエーションを示している。パネルＨは、第１のシグナリングオリゴヌクレオチドで標識された二本鎖ポリヌクレオチド断片（タンパク質の結合部位を含む）と第２のシグナリングオリゴヌクレオチドで標識されたタンパク質を用いる、タンパク質−ポリヌクレオチド複合体の形成の直接検出を可能にするセンサーのバリエーションを示している。に接続したもの。パネルＩは、それぞれシグナリングオリゴヌクレオチドで標識された２つの対応するタンパク質を用いる、タンパク質−タンパク質複合体の形成の直接検出を可能にするセンサーのバリエーションを示している。
【００２１】
好ましい実施形態では、第１と第２の分子認識構築物はアプタマー構築物であり、第１アプタマー構築物はポリペプチド上のエピトープ（つまり第１のエピトープ）を認識するアプタマーあるいは天然の核酸配列を含み、第２のアプタマー構築物は同じポリペプチド上の別のエピトープ（つまり第２のエピトープ）を認識するアプタマーあるいは天然の核酸配列を含む（図２６、ＡとＢの部分）。好ましくは第１と第２のアプタマー構築物はそれぞれ短い一本鎖オリゴヌクレオチド配列（シグナリングオリゴ）を含んでおり、第１のアプタマー構築物の短い一本鎖オリゴヌクレオチド（つまり第一シグナリングオリゴ）は  第２のアプタマー構築物の短い一本鎖オリゴヌクレオチド（つまり第二シグナリングオリゴ）に相補的である。理論に拘束されることを意図するものではないが、２つのアプタマー構築物を一緒にすることができるポリペプチドが存在しない時に互いに安定な相互作用を形成出来ないように、２つのシグナリングオリゴの長さは短くすべきである。好ましくはシグナリングオリゴは、少なくとも５ヌクレオチド長であり、７ヌクレオチド長を超えない。
【００２２】
好ましくは、第１のアプタマー構築物は第１の標識を含み、第２のアプタマー構築物は第２の標識を含み、第１と第２のエピトープを含むポリペプチドの存在下で、第１と第２の標識は相互作用してサンプル中のポリペプチドの存在や量のシグナルとなる検出可能なシグナルを生み出す。好ましくは第１の標識は蛍光ドナーで、第２の標識は蛍光受容体で、検出方法は蛍光シグナル出力の変化を検出である。
【００２３】
所望により、第１のアプタマー構築物を表面に固定してもよく、第２のアプタマー構築物を表面に固定してもよく、あるいは両者を表面に固定してもよい〔表面はマイクロタイタープレート、試験管、ビーズ、樹脂、その他のポリマーなどでもよい〕。好ましい実施形態では、第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物を柔軟なリンカーで連結して二価アプタマーを形成してもよい。好ましい柔軟なリンカーには、スペーサー１８ポリマーおよびデオキシチミジン（ｄＴ）ポリマーが含まれる。
【００２４】
別の実施形態では、第１と第２のアプタマーはサンプル中の大分子複合体の検出に使用されうる。この実施形態では、前記のように、第１のエピトープは１つのポリペプチド上にあり、第２のエピトープは別のポリペプチド上にあり、大分子複合体が形成される時、前記２つのポリペプチドは接近し、その結果第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物が安定した相互作用を形成して検出可能なシグナルを生み出す。また、前記のように、第１と第２のアプタマー構築物は表面に固定されてもよく、互いに柔軟なリンカーで固定されていもよい。
【００２５】
別の実施形態では、第１と第２のアプタマーはサンプル中の被分析物の検出に使用されうる。この実施形態では、分析物がポリペプチドあるいは大分子複合体に結合する時、第１あるいは第２のエピトープが作られあるいは利用可能になり、第１あるいは第２アプタマー構築物と結合する。このため、被分析物が、その同族ポリペプチドあるいは大分子複合体結合パートナーを含むサンプル中にある時、第１のアプタマー構築物と第２のアプタマー構築物は安定な接近状態となり、前記のように検出可能なシグナルを生み出す。また、前記のように第１と第２のアプタマーは表面上に固定されていてもよく、柔軟なリンカーによって互いに固定されていてもよい。
【００２６】
本発明の別の実施形態では、本発明は第１と第２のアプタマー構築物を含む１セットのアプタマー構築物を作製する方法に関し、この方法は（ａ）（第１のエピトープを含む）第１の基質に対して（第１のエピトープに結合できる）第１のアプタマーを選択し、（第２のエピトープを含む）第２の基質に対して（第２のエピトープに結合できる）第２のアプタマーを選択するステップと、（ｂ）第１の標識を第１のアプタマーに付し、第２の標識を第２のアプタマーに付すステップと、（ｃ）第１のシグナリングオリゴを第１のアプタマーに付し、第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴを第２のアプタマーに付すステップと、（ｄ）その結果（ｉ）第１のアプタマー構築物は第１のアプタマー、第１の標識、および第１のシグナリングオリゴを含み、および（ｉｉ）第２のアプタマー構築物は第２のアプタマー、第２の標識、および第２のシグナリングオリゴを含むステップ、を含む。好ましくは、アプタマーはインビトロ進化法（上掲）を用いて選択される。しかし本願の実施においては天然のＤＮＡ結合エレメントも使用できる。
【００２７】
好ましい実施形態では、第１の基質はポリペプチドで、第２の基質は第１のアプタマーに結合した前記ポリペプチドである。ここで、第２のアプタマーが第１のエピトープに結合できないように第１のアプタマーは第１のエピトープをマスクする。あるいは、（ｉ）第１のアプタマーおよび第１のシグナリングオリゴを含む、あるいは（ｉｉ）第１のアプタマー、シグナリングオリゴおよび標識を含む、第１のアプタマー構築物で第１のアプタマーを置き換えてもよく、それによりシグナル検出のために最適な第２のアプタマーあるいはアプタマー構築物を選択することを可能にする第２の基質を生み出す。さらなるステップとして、前述の通り、それから第１と第２のアプタマー構築物を柔軟なリンカーで互いに連結してもよい。
【００２８】
別の実施形態では、第１の基質は本質的に第１のエピトープからなるペプチドであり、第２の基質は本質的に第２のエピトープからなるペプチドである。よって、別の実施形態では、アプタマーの製造あるいは選択において、エピトープをマスクする必要はない。同様に、前述の通り、この方法を用いて製作される第１と第２のアプタマー構築物は柔軟なリンカーで互いに連結されてもよい。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は（第１のエピトープに結合できる）第１のアプタマー、第１の標識、第１のシグナリングオリゴ、（第２のエピトープに結合できる）第２のアプタマー、第２の標識、第２のシグナリングオリゴ、およびリンカーを含む二価のアプタマー構築物に関するものである。第１と第２のエピトープは同じポリペプチド上にあってもよく、大分子複合体の異なるポリペプチド上にあってもよく、被分析物に結合したポリペプチド上にあってもよい。柔軟なリンカーは好ましくはアプタマーの働きを妨害しないポリマーである。好ましい柔軟なリンカーには、デオキシチミジンポリマー（ポリーｄＴ）およびスペーサー１８ポリマーが含まれる。しかし、本願を実施する際に当業者は任意の数のリンカーを置換できるであろう。
【００３０】
あるいは、二価アプタマー構築物は検出用の標識を有していなくてもよい。これら別の二価アプタマー構築物は抗体と同じようにして分子を検出する、分子を結合する、（カラムあるいはプルダウン形式の操作のように）分子を精製する、分子の相互作用を阻害する、分子の相互作用を促進あるいは安定させる、あるいは生物に受動免疫を付与することに用いうることが想定される。二価アプタマー構築物が治療の目的にも使用できることがさらに想定される。本発明は、本発明により当業者が任意の数の分子から２つ以上の異なるエピトープを認識するアプタマーの任意の組み合わせを、二価、三価、あるいはその他の多価アプタマー構築物に構築し、それら異なる複数の分子を引っ張り合わせて効果をテストしたり所望の治療結果を生み出すことができるという点で本当に強力である。例えば、リガンドのレセプターに対する天然の結合速度論が好ましくない場合（例えば糖尿病患者中でのインスリンのインスリンレセプターへの結合）、リガンドのレセプターへの結合を促進するため二価アプタマー構築物を作ることができる
別の実施形態では、本発明は第１の標識が付与された第１のエピトープ結合剤、および第２の標識が付与された第２のエピトープ結合剤を含むキットに関するものである。ここで（ａ）第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープの結合剤標識がそれぞれポリペプチドの第１のエピトープとポリペプチドの第２のエピトープに結合する時、（ｂ）第１の標識と第２の標識が相互作用して、検出可能なシグナルを生み出す。好ましい実施形態では、エピトープ結合剤はアプタマー、標識、およびシグナリングオリゴを含むアプタマー構築物である。しかし、エピトープ結合剤は抗体あるいは抗体断片でもよい。このキットはポリペプチド、被分析物、あるいは大分子複合体の検出に有用であり、そのため研究あるいは医学的／獣医学的診断の用途で使用可能であろう。
【００３１】
さらに別の実施形態では本発明は、（ａ）患者からサンプルを取得するステップ、（ｂ）サンプルを第１のエピトープ結合剤および第２のエピトープ結合剤と接触させるステップ、および（ｃ）検出方法を用いてサンプル中のポリペプチド、被分析物あるいは大分子複合体の存在を検出するステップを含む疾病を診断する方法に関する。ここでサンプル中のポリペプチド、被分析物あるいは大分子複合体の存在は患者に疾病が存在するかどうかを示す。好ましい実施形態では、（ａ）第１のエピトープ結合剤は、第１の標識と第１のシグナリングオリゴが付着した第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤は、第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２シグナリングオリゴが付着した第２のアプタマーであり、（ｃ）検出方法は蛍光検出方法で、（ｄ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合し第２のアプタマーがポリペプチドに結合すると、（ｅ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｆ）第１の標識が第２の標識に接近して蛍光の変化が起こる。好ましいサンプルには血液、尿、腹水、細胞と組織サンプル／生検が含まれる。好ましい患者には人、家畜、およびペットが含まれる。
【００３２】
さらに別の実施形態では、本発明はサンプルから有用な試薬をスクリーニングする方法に関し、該方法は（ａ）サンプルを第１のエピトープ結合剤と第２のエピトープ結合剤に接触させるステップと、（ｂ）検出方法を用いて該サンプル中の有用な試薬の存在を検出するステップとを含む。好ましい試薬には、第１のエピトープと第２のエピトープを含むポリペプチド、ポリペプチドに結合する被分析物（この場合は、前記方法はさらにポリペプチドをスクリーニング混合液に加えるステップを含む）、および潜在的な治療組成物が含まれる。好ましい実施形態では、（ａ）第１のエピトープ結合剤は第１の標識と第１のシグナリングオリゴが付与された第１のアプタマーであり、（ｂ）第２のエピトープ結合剤は、第２の標識と第１のシグナリングオリゴに相補的な第２のシグナリングオリゴが付与された第２アプタマーにであり、（ｃ）検出方法は蛍光検出法であり、（ｄ）第１のアプタマーがポリペプチドに結合し第２のアプタマーがポリペプチドに結合する時、（ｅ）第１のシグナリングオリゴと第２のシグナリングオリゴが互いに結合し、（ｆ）第１の標識が第２の標識に接近して、蛍光の変化が生じる。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態が以下の実施例で記載される。請求の範囲の範囲内にある他の実施形態は、本明細書の考察および本明細書に開示された発明の実施から当業者には明らかになるであろう。本明細書および実施例は単に例示であると考えられることが意図されており、本発明の範囲と精神は実施例の後にある請求の範囲に示されている。
【実施例１】
【００３４】
特定のアプタマー構築物を製造する一般的方法
序説
開示されるのはサンプル中のタンパク質、タンパク質複合体、あるいはタンパク質と結合する被分析物を速やかにかつ高感度で検出する方法である。この方法の基礎はタンパク質によって誘発される、タンパク質の２つの異なるエピトープを認識する２つの核酸構築物の結合に基づいている（通称”アプタマー構築物”）（図１Ａ）。この２つのアプタマー構築物は、柔軟なリンカーによってアプタマーに結合された短く相補的なシグナリングオリゴを含んでいる。、２つのアプタマーが同時に目標タンパク質に結合した時、前記相補的なヌクレオチド（通称「シグナリングオリゴ」）の相対的位置は近接し、シグナリングオリゴ間の結合が促進されて安定した二本鎖を形成する。蛍光プローブをシグナリングオリゴの末端に付与することで、タンパク質が誘発する２つのアプタマー構築物の間の結合を検出する手段が与えられる（図１Ａ）。天然の核酸結合活性を有するタンパク質の場合、アプタマーの一方は天然のタンパク質結合部位を含む核酸配列で置き換えてもよい（図１Ｂ）。
【００３５】
所与のタンパク質の２つの異なるエピトープについてのアプタマーの開発あるいは選択は、図１に示されたアプタマー構築物の開発の必須のステップである。アプタマーに関する利用可能な文献を検討すると、この目標を達成する少なくとも２つの可能な手法が明らかとなる。第１の手法は、タンパク質と結合した核酸アプタマーとタンパク質と結合していない核酸アプタマーの分離に異なる方法を用いる、核酸アプタマーのインビトロ選択（通称インビトロ進化）を行うことである。その原理は、これら異なる区分法では、タンパク質の異なる領域が選択的に示され、その結果タンパク質表面の異なる領域に対するアプタマーが得られる。トロンビンについて選択されたアプタマー（後述）は、そのような手法の一例である。
【００３６】
アガロースビーズ上に固定されたトロンビンを基質として用いた、第１のアプタマーのインビトロ選択の結果、ヘパリンエクソサイト（ｅｘｏｃｉｔｅ）上でトロンビンに結合するアプタマーが得られた。区分法としてのニトロセルロースに結合されたトロンビン−第１のアプタマー複合体を基質として用いたさらなるインビトロ選択の結果、フィブリノゲンエクソサイトでトロンビンに結合する第２のアプタマーが得られた。
【００３７】
有用ではあるものの、この区分手法は理知的な設計というよりは、異なるエピトープの偶然による選択に依存するものである。第２の手法は目標タンパク質分子の選択された領域に対応するペプチドを基質として用いて、アプタマーを育てあるいは選択するものである。このような戦略がアプタマー開発のために基質として用いられるペプチドが由来する完全なタンパク質を認識できるアプタマーを開発するのに使用可能であることを示す証拠が当業界には存在する。さらに、この手法はすでに完全なタンパク質を認識する抗体を作製するのに広く用いられている。
【００３８】
第１のアプタマーの結合部位とは異なるタンパク質のエピトープについてのアプタマーセットを作製する前記の一般的手法は、天然のＤＮＡ結合活性を有するタンパク質にも用いることができる。つまり、天然ＤＮＡ結合部位とは異なる部位で基質に結合するコアプタマー（ｃｏ−ａｐｔａｍｅｒｓ）を作製できる。この方法で作製されたコアプタマーは、図１に示された分子検出法で働くのに最適化されている。
結果と考察
図２は上記方法の全体的設計を表す。コアプタマーの選択は、第１のアプタマーにあらかじめ結合された基質タンパク質を用いて行われる（図２Ａ）。あるいは、コアプタマーの選択は、その天然の核酸結合部位にあらかじめ結合したタンパク質を用いて行われる（図２Ｂ）。短い（５−７ヌクレオチド長）一本鎖オリゴヌクレオチド、つまりシグナリングオリゴ（図２）、を柔軟なリンカーによって第１のアプタマーに連結させる。コアプタマーの選択に用いられるランダムＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）の両端に、ＰＣＲ増幅のため均一な配列を配置する。これらの均一な隣接配列のうちの１つは末端に第１のアプタマーのシグナリングオリゴに相補的な配列、つまりもう一つのシグナリングオリゴ（図２）を含む。このため、このようなランダムＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）構築物を利用したコアプタマーの作製あるいは選択は、第１のアプタマーのエピトープとは異なる部位で基質タンパク質に結合できるアプタマーへとバイアスがかかり、第１のアプタマーのシグナリングオリゴとの間で二重鎖を形成できる。選択におけるバイアスの程度は、第１のアプタマーのシグナリングオリゴおよび第２のアプタマーの相補的シグナリングオリゴの長さを変えることで調節できる。
【実施例２】
【００３９】
トロンビンを検出する方法とアプタマー
序説
本発明の発明者は、以下の文献に記載されているようにＤＮＡ結合タンパク質の検出方法を開発した：Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  ａｎｄ  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、  ２０、  １７１−１７６、  ２００２、  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．、  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．、  ａｎｄ  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ、  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３１６、  １−１０、  ２００３、  および同時係属した特許出願番号０９／９２８、３８５（米国特許番号６、５４４、７４６）、  １０／０６２、０６４、ＰＣＴ／ＵＳ０２／２４８２２およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０２１５７（これらは参照により本明細書に取り込まれる）。この方法の基礎は、ＤＮＡのタンパク質結合部位を２つの「半部位」に分けることにある。生じた「半部位」は、２つの「半部位」同士が結合して完全に機能的な同族タンパク質結合部位を含む二本鎖を再構成する蛍光を与えるように設計された長さの短い相補的な一本鎖領域を含んでいる。この傾向は、タンパク質の非存在下ではＤＮＡ半部位のほんの一部しか結合しないように、低く設計されている。タンパク質が反応混合液の中に存在する時、タンパク質は完全で機能的な結合部位を含む二本鎖にのみ結合する。この選択的な結合は、ＤＮＡ半部位同士の結合を促し、またこのタンパク質依存的な相互結合は、目標タンパク質の存在を示す分光学的その他のシグナルを生み出すのに用いることができる。
【００４０】
科学文献中では、「分子ビーコン」の語は、選択的な認識と報告シグナルの発生が同時に起こることを強調するために、このアッセイを記述するために用いられる。いくつかのタンパク質について、ＤＮＡ結合タンパク質の分子ビーコンが開発されており、その一般的適用可能性を示している（Ｈｅｙｄｕｋ  と  Ｈｅｙｄｕｋ、  ２００２）。その物理的な作用原理は確立されており（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｋｎｏｌｌ、  Ｈｅｙｄｕｋ、  ２００３）、ＤＮＡ結合タンパク質に結合するリガンドの存在を検出するアッセイのプラットホームとしても用いられている（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｆｅｉ、  Ｙ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２００３、  ６、  １８３−１９４）。すでに非常に有用ではあるものの、このアッセイは天然のＤＮＡ結合活性を示すタンパク質に限定されている。
【００４１】
インビトロ選択法によって、天然のＤＮＡ結合活性を持たないタンパク質に特異的に結合できる核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）アプタマーを作製できることは十分に確立されている（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、  Ａ．Ｄ．、  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ、  Ｊ．Ｗ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３４６、  ８１８−８２２、  １９９０；  Ｔｕｅｒｋ、  Ｃ．、  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ、  Ｌ．  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：  ＲＮＡ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｏ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、  ５０５−５１０、  １９９０；  Ｇｏｌｄ、  Ｌ．、  Ｐｏｌｉｓｋｙ、  Ｂ．、  Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、  Ｏ．  ＆  Ｙａｒｕｓ、  Ｍ．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６４、  ７６３−７９７、  １９９５；  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ、  Ｄ．Ｓ．  ＆  Ｓｚｏｓｔａｋ、  Ｊ．Ｗ．  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６８、  ６１１−６４７、  １９９９；これらの文献は全て参照により本明細書に取り込まれる）。インビトロ選択は、結合、非結合配列の洗い出し、目標に結合した配列のＰＣＲ増幅のサイクルによって、ランダムＤＮＡ配列のプールから特定の基質目標に結合する核酸配列を選択することを伴う。種々のタンパク質その他の目標分子に特異的に結合するアプタマーを成功裏に選択できた数多くの例（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ、  １９９０；  Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ、  １９９０；  Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌｉａ、  １９９５；  Ｗｉｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ、  １９９９）は任意のおよび全てのタンパク質に対するアプタマーを作製することが可能であることを強く示唆している。
【００４２】
本実施例に記載されるのは、天然のＤＮＡ結合活性を有するタンパク質に限定されない、タンパク質検出用の核酸を基礎とする分子ビーコンの新規な概念である。トロンビンの例（上掲）は本発明の実験的妥当性を示す。
結果と考察
図３Ｂは任意の目標タンパク質を認識する分子ビーコンの総体的概念を示す。この設計は、先述のおよび上掲のＤＮＡ結合タンパク質用分子ビーコン（図３Ａ）との一般的類似性を有する。タンパク質への天然の結合部位を含むＤＮＡ二本鎖を２つの「半部位」に分割する代わりに、半部位の機能上の等価物としてタンパク質の２つの異なるエピトープを認識する２つのアプタマーを用いる。蛍光団（第１の標識）を含んだ短いオリゴヌクレオチド（シグナリングオリゴ）と消光剤（第２の標識）を含んだ短い前記オリゴヌクレオチドに相補的なオリゴヌクレオチド（シグナリングオリゴ）は、柔軟なリンカーで２つのアプタマーに連結される（図３Ｂ）。目標タンパク質が存在しない時、相補的なシグナルオリゴが結合を促進するには短かすぎるため、２つのアプタマー構築物は結合しない。目標タンパク質が存在する時、２つのアプタマーへのタンパク質の結合は２つのアプタマー構築物の間の結合を促し、第１と第２の標識が接近するために蛍光シグナルの変化が起こる。
【００４３】
図３Ｂの概念の実験的検証を与えるため、トロンビンをモデル的非ＤＮＡ結合タンパク質システムとして選択する。先に２つの実験室のがこのタンパク質の２つの異なるエピトープを背宅的に認識するＤＮＡアプタマーを同定している（Ｂｏｃｋ、  Ｌ．Ｃ．、  Ｇｒｉｆｆｉｎ、  Ｌ．Ｃ．、  Ｌａｔｈａｍ、  Ｊ．Ａ．、  Ｖｅｒｍａｓｓ、  Ｅ．Ｈ．、  ａｎｄ  Ｔｏｏｌｅ、  Ｊ．Ｊ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｉｎ、  Ｎａｔｕｒｅ  ３５５、  ５６４−５６６、  １９９２；  ａｎｄ  Ｔａｓｓｅｔ、  Ｄ．Ｍ．、  Ｋｕｂｉｋ、  Ｍ．Ｆ．、  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｅｒ、  Ｗ．  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｉｎｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７２、  ６８８−９８、  １９９７、参照により本明細書に取り込まれる）。そのうちの一つのアプタマー（Ｇ１５Ｄ；図４中のＴＨＲ４）  はヘパリンエクソサイト（ｈｅｐａｒｉｎ  ｅｘｏｓｉｔｅ）で結合することが示され、もう一つのアプタマー（６０−１８［２９］；図４中のＴＨＲ３）はフィブリノゲンエクソサイトで結合することが示された。トロンビンを認識するのに有用なアプタマー構築物セットを開発するための最初のステップとして、前記アプタマーが柔軟なリンカーにより共有結合した種々のアプタマー構築物を作製した（図４）。これら実験の主要な目的は、柔軟なリンカーで２つのアプタマー構築物を連結すると、本当に個々のアプタマー構築物のセットに比べてより高い親和性でトロンビンに結合することが出来る二価アプタマー構築物を作製できるかどうかを決定することである。これら実験の第２の目的は、リンカーの適切な長さの確立し、２つのアプタマーのリンカーに対する５’端と３’端の適切な向きを確立することである。
【００４４】
個々のアプタマーをフルオレセインで標識し（図４中のＴＨＲ１とＴＨＲ２）、トロンビン用の様々な構築物の親和性の決定を容易にした。トロンビンとフルオレセイン標識６０−１８［２９］アプタマー（ＴＨＲ１）との間の複合体の形成は、蛍光偏光により簡便に追跡でき（図５Ａ）、フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）の結合は蛍光強度の変化により追跡することが出来た（図５Ｂ）。どちらのアプタマーもナノモル濃度範囲でトロンビンに結合した（図５Ａと図５Ｂ）。ＴＨＲ２の場合の結合の定量分析（図５Ｃ）の結果、Ｋd値として６．３ｎＭの値が得られた。この値は以前に示唆された値（Ｂｏｃｋ  １９９２、  Ｔａｓｓｅｔ  １９９７）よりも幾分高い親和性であるが、それは我々が真平衡結合アッセイを用いたのに対し、以前の報告では非平衡法が用いられたことで説明ができる。ＴＨＲ２の結合が十倍過剰量の未標識６０−１８［２９］アプタマー（ＴＨＲ３）の存在下で行われた場合（図５Ｄ）、僅かな、有意義ではない親和性の低下が見られたのみであった。このことからＧ１５Ｄアプタマーと６０−１８［２９］アプタマーが実際にトロンビンの２つの異なるエピトープに独立に結合することが示された。
【００４５】
つぎのステップにおいて、図４に示された各種のアプタマー構築物がトロンビンへの結合についてＴＨＲ２と競合する能力が評価された。図６はこれらの実験を行うやり方を説明したものである。トロンビンがある時とない時のＴＨＲ２の蛍光スペクトルを記録した（図６Ａ）。トロンビンはＴＨＲ２の蛍光を約５０％増強した。続いて、未標識競合アプタマー構築物が加えられた（図６Ｂ−Ｄ）。競合物の存在下でトロンビンがＴＨＲ２の蛍光に与える影響が小さければ、有効な競合物の証明となるであろう。ＴＨＲ３は競合物ではなく（図６Ｂ）、これは図５Ｃと５Ｄの結果と調和する。ＴＨＲ４（未標識のＴＨＲ２のバリエーション）は予測されたとおり競合できる（図６Ｃ）。しかし、ＴＨＲ７（二価アプタマー構築物の一つ）はＴＨＲ４よりもずっと優れた競合物であった（図６Ｄ）。溶液中にＴＨＲ７が存在するときは、トロンビンの存在するときでもＴＨＲ２の蛍光変化を検出できなかった。図７は、図４に示された構築物の全てを用いた競合実験のまとめである。
【００４６】
すべての二価アプタマー構築物は、個々のアプタマーに比べてより緊密にトロンビンに結合することが示され（ＫdはｐＭ範囲）、タンパク質上の２つの異なるエピトープを認識する２つのアプタマーを柔軟なリンカーで連結すれば高い親和性を有するトロンビンリガンドを作製できるという予想を実証した。さらに、これらのデータは、２つのアプタマーを１０個のスペーサー１８単位を含むより長いリンカーで連結した場合に、トロンビンに対する親和性が若干向上したことも示した。これらデータは、アプタマーのリンカーに対する向きがＴＨＲ７のようであると親和性が向上することも示した（ＴＨＲ６とＴＨＲ７の親和性の比較）。このため、以降の全ての実験において、ＴＨＲ７同様の向きのアプタマーを有する構築物が用いられた。
【００４７】
図８の実験の目的は、トロンビンの２つのエピトープはどちらも、二価アプタマーが高い親和性で結合するのに重要であることを証明することである。ＴＨＲ２と二価アプタマー構築物の間の結合の直接競合から、ＴＨＲ２により認識されるエピトープ（ヘパリンエクソサイト）は二価アプタマー結合のために必要であることが示された。第２のエピトープも重要であることを証明するため、我々は過剰量の未標識ＴＨＲ３の非存在下および存在下でのトロンビンに対する結合について、二価アプタマー構築物（ＴＨＲ５）がＴＨＲ２と競合する能力を比較した。我々は、もしＴＨＲ５が高い親和性の結合のために両方のトロンビンエピトープを必要とするのであれば、ＴＲＨ３の存在下ではＴＨＲ５がＴＨＲ２と競合する能力が低下するであろうと予測した。この予測は図８に示された実験でまさに観察されたものであった。ＴＨＲ５は単独でＴＨＲ２に対する非常に強力な競合物であった（図８Ｄと８Ａを比較）。ＴＨＲ３は単独ではＴＨＲ２の競合物ではなかった（図８Ａと８Ｃを比較）。ＴＨＲ５単独の場合に比べ、ＴＨＲ３が存在する時にはＴＨＲ５はより劣った競合物となった（図８Ｂと８Ｃを比較）。我々はそれゆえ、二価のアプタマー構築物のトロンビンへの高い親和性での結合には第１と第２のアプタマーのエピトープが関与すると結論付けた。
【００４８】
二価アプタマー構築物−トロンビン複合体は未変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に耐えるのに十分なほど安定している（図９Ａ）。我々はこの属性を利用して、ゲルシフト法（ＥＭＳＡ）を用いてＴＨＲ７−トロンビン複合体の形成を追跡し、複合体の化学量論を決定した。我々はトロンビンによるＴＨＲ７の滴定を行った（どちらの分子も高濃度であった）。この条件の下で、結合は化学量論的であるはずである。実際には、形成された複合体を、トロンビンのＴＨＲ７に対する比に対してプロットすると、複合体の１：１の化学量論は示さなかった（図９Ｂ）。
【００４９】
図１０と図１１に示された実験は、二価アプタマー構築物の別の設計がこれらの構築物を作製するのに用いることが出来るかどうかをテストするために行われた。我々は図１０に示された二価アプタマー構築物を設計し、それが完全にＤＮＡからなり、非ＤＮＡリンカーの使用は避けた（この場合はポリｄＴをリンカーとして用いた）（図１０）。これによりこのような構築物の設計に更なる柔軟性が潜在的にもたらされ、アプタマー構築物を作製するコストも低減できるであろう。２つのアプタマーはＤＮＡ二本鎖により柔軟なリンカーの末端で互いに連結されている（図１０）。本発明のこの側面はシグナル「ビーコン」（図３Ｂ）の設計を模倣することを意図しており、シグナル機能はアプタマーと二本鎖を連結するリンカーの末端での二本鎖ＤＮＡの形成を伴う。３種の異なる長さのポリｄＴリンカー（７、１７、および２７ヌクレオチド長）をテストして高親和性結合のための最小必要リンカー長を決定した。図１１は、図１０に示された構築物をトロンビンで動じて規定した結果を示す。アプタマー構築物−トロンビン複合体の生成をＥＭＳＡで追跡した。構築物はそれぞれトロンビンに高い親和性で結合した。しかし７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーを有する構築物は、１７ヌクレオチド長あるいは２７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーを有する構築物よりもトロンビンに対する親和性が有意に低かったことが明らかである。これは星印でマークされたレーンを調べると最もよく分かり、この特定のトロンビン濃度では、１７および２７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカー構築物のほとんど全てがトロンビンに結合したのに対し、７ヌクレオチド長のポリｄＴ構築物のかなりの割合（約５０％）は結合してないままだった。要約すると、図１０と図１１に述べられた結果は、図１０に示された別の二価アプタマー構築物設計も実行可能であり、またアプタマーとＤＮＡ二本鎖を連結する少なくとも１７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーは、構築物をトロンビンに結合するのにより適していることを示している。
【００５０】
図３から図１１に提示された実験データは、トロンビンおよびそれぞれトロンビンの２つの異なる領域に結合する２つのアプタマーの場合は、図３Ｂに示されたシグナリングビーコンに必要な条件は全て満たされていることの証明を与えた。図３から図１１に示された実験により与えられた情報に基づいて、我々はトロンビンシグナリングビーコンを設計し、テストした。図１２Ａと図１２Ｂに示されたビーコンはＴＨＲ１６／ＴＨＲ１７二価アプタマー構築物の誘導体である。複数のアプタマーは１７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーで、５’端をフルオレセインで標識された７ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド（シグナリングオリゴ）と３’端をダブシルで標識された７ヌクレオチド長の前記オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド（シグナリングオリゴ）にそれぞれ連結された。トロンビンをＴＨＲ８とＴＨＲ９の混合液中に加えると、タンパク質依存的な蛍光強度の消光が見られた。ダブシル標識されたパートナー（ＴＨＲ８）が存在しないと、トロンビンをＴＨＲ９に加えても蛍光の変化は観察されない。明らかに、これらのデータは予測されたトロンビンに誘発されるＴＨＲ８とＴＨＲ９の間の結合（図１２Ｂに示されるとおり）が実際に観察され、機能的なトロンビンシグナリングビーコンを得ることができたことを示している。
【００５１】
トロンビンに誘導される蛍光変化の程度は非常に再現性がよく特異的ではあるが、最初はそれほど大きくはなかった（約２０％）。このため、我々はトロンビンのシグナリングビーコンのこの性質を、より柔軟なスペーサー１８リンカーでポリｄＴリンカーを置き換えることにより改善することを試みた（図１３ＡおよびＢ）。我々は、ポリｄＴリンカーは柔軟ではあるものの、若干の残留合成を示し（Ｍｉｌｌｓ、  Ｊ．Ｂ．、  Ｖａｃａｎｏ、  Ｅ．、  ａｎｄ  Ｈａｇｅｒｍａｎ、  Ｐ．Ｊ．  Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ：  ｕｓｅ  ｏｆ    ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ｈｅｌｉｃｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ  ｌｅｎｇｔｈｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｄＴ）  ａｎｄ  ｐｏｌｙ（ｄＡ）、  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８５、  ２４５−５７、  １９９９、本明細書に参照により取り込まれる）２つのアプタマーがトロンビンに結合する時にシグナリング二本鎖の結合を阻害すると考えた。図１３に示されたビーコンは図１２に示されたビーコンとリンカーの性質のみが異なる。それ以外の点では、残りの配列は同一である。図１３Ｃは、トロンビンをＴＨＲ２０とＴＨＲ２１の混合液に加えた時、タンパク質濃度依存的な蛍光消光が観察され、トロンビンがＴＨＲ２１単独に加えられた場合は蛍光の変化は検出されないことを示す。この特定のビーコンの場合、ビーコンのトロンビンに対する反応はずっと大きかった（蛍光における約二倍の減少）。この場合の蛍光シグナル変化の度合いは、ＤＮＡ結合タンパク質検出用分子ビーコン（前掲）について我々が先に観察したものと同程度であった。よって、我々は機能的なトロンビンビーコンが得られ、より柔軟なスペーサー１８リンカーを用いた設計によりポリｄＴリンカーを用いた場合に比べてトロンビン結合の際により良いシグナル変化が得られたと結論づけた。続いて、我々はこのトロンビンビーコンの挙動をさらに特徴づけるための一連の実験を行った。
【００５２】
図１４に示された実験は、ＴＨＲ２０とトロンビンの存在下でフルオレセイン標識アプタマー構築物（ＴＨＲ２１）が実際に安定な複合体の中に組み込まれることを確認するために行われた。図１５に結果は示され、トロンビン検出の感度（図１５Ａ）と特異性（図１５Ｂ）を示している。トロンビンの二価のアプタマー構築物への結合性は非常に緊密であり（ｐＭ  Ｋｄ’ｓ）、アッセイはフルオレセインシグナルの検出感度のみに制限されているようであるため、アプタマー構築物の濃度を変化させることでトロンビン検出感度を調整できる。このことは図１５Ａに示され、５０ｎＭのＴＨＲ２１と７５ｎＭのＴＨＲ２０を使用した時、おおよそ１０ｎＭのトロンビンを検出でき、１０倍低い濃度のアプタマー構築物を使った時（５ｎＭのＴＨＲ２１と７．５ｎＭのＴＨＲ２０）、１０倍低い濃度（およそ１ｎＭ）のトロンビンが検出できたことを描いている。さらに低い濃度のアプタマー構築物を使用すると（５００ｐＭのＴＨＲ２１と７５０ｐＭのＴＨＲ２２）、おおよそ１００ｐＭ程度のトロンビンを検出できた（図示なし）が、フルオレセイン標識アプタマー構築物のこの低い濃度は我々の機器の測定機器の感度の限界に近く、データの質もこれに伴って落ちてゆく。トロンビン検出の特異性を証明するために、我々はこのアプタマー構築物のトロンビンに対する反応とトリプシン（トロンビンと同じファミリーに属しトロンビンと構造上の相同性を有するプロテアーゼ）に対する反応を比較した。トリプシン添加の場合、シグナル（図１５Ｂ）は検出されず、アプタマー構築物のトロンビンに対する高い特異性を示している。
【００５３】
図１６は比較実験の結果を示し、様々なアプタマー構築物の有する、あらかじめ形成されたトロンビンアプタマー構築物の複合体を分離させる能力が試験された。得られたデータは、全ての二価のアプタマー構築物は個々のエピトープ特異的のアプタマーのどれよりもはるかに効果的な競合物であることを示したが、これはフルオレセイン標識された個々のアプタマーを用いて行った同様の実験と一致する（上掲、ＴＨＲ２；図６）。これら二価のアプタマー構築物の中で、ＴＨＲ１８／ＴＨＲ１９（２７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーを有する構築物）およびＴＨＲ１６／ＴＨＲ１７（１７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーを有する構築物）は最も効果的な競合物で、その次はＴＨＲ１４／ＴＨＲ１５（７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーを有する構築物）とＴＨＲ７（スペーサー１８リンカーを有する）。よって、スペーサー１８リンカーの有するさらなる柔軟性はアプタマー構築物シグナル変化による蛍光シグナル変化の強度の面では有益だが、より硬いポリｄＴリンカーを含む構築物と比較した場合トロンビンに結合する親和性の若干の低下にもつながっているようである。
結論
我々は、トロンビンの二つの異なるエピトープを認識する２つのアプタマーを含む二価のアプタマー構築物の基本的な物理化学的の特徴を明らかにするデータを得た。この二価のアプタマー構築物のトロンビンに対する親和性は、二価構築物中の個々のアプタマー成分に比べて高い。これは、トロンビンをアプタマー「半部位」の混合液に加えることで２つの半部位の結合を誘導し、蛍光団と消光剤は接近させることで蛍光シグナルを生み出すことを示唆する。ビーコン構築物を用いた実験はこの仮説を完全に証明した。我々は多くの目標タンパクに対して同様のビーコンを開発することが可能であると予想する。我々はまた、ここに記載されたビーコンの設計は天然のＤＮＡ結合活性を有するタンパク質を検出するためのビーコン（図１Ａ）を改善するためにも採用できることを注記する。この場合、アプタマー「半部位」のうち一つは柔軟なリンカーで相補的なシグナリングオリゴに連結された（タンパク質結合部位の配列を含む）二本鎖ＤＮＡで置き換えることができる。
【実施例３】
【００５４】
サンプル中の被分析物の検出
材料
精製トロンビンはＲａｙ  Ｒｅｚａｉｅ博士（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ大学）から贈られたものであった。Ｘａ因子、プロトロンビン、オボアルブミン、牛血清アルブミン、ＳＳＢ、トリプシン、および血漿はシグマ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＨｅＬａ細胞抽出物はプロテイン・ワン（Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ、  ＭＤ）から購入した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−ＮＨＳとＳｙｂｒ  ＧｒｅｅｎはＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、  ＯＲ）から購入し、Ｃｙ５−ＮＨＳとＣｙ３−ＮＨＳはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、  ＮＪ）から購入、ＡＭＣＡ−ｓｕｌｆｏＮＨＳはＰｉｅｒｃｅ  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、  ＩＬ）から購入した。そのほかのすべての試薬は、商業的に入手可能な分析グレードのものであった。
【００５５】
この研究を通じて用いられたオリゴヌクレオチドは表１に列記されている。オリゴヌクレオチドはエール大学のＫｅｃｋ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入、あるいはＩＤＴ  （Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、  ＩＡ）から購入したものである。５端’のフルオレセインと３’端のダブシルは適当なホスホラミデートを使用して、オリゴヌクレオチド合成の間に取り込まれた。他のすべての蛍光団は、５’アミノあるいはＣ６アミノ−ｄＴを適切な位置に有するオリゴヌクレオチドを色素のＮＨＳエステルを用いて合成後修飾することで、オリゴヌクレオチド中に取り入れられた。蛍光プローブで標識されたオリゴヌクレオチドは、先に述べたとおり逆相ＨＰＬＣにより精製された（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９７、  ２４８、  １６−２２７）。Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．；  Ｃｌａｕｓ、  Ｐ．；Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉ、  Ｊ．Ｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９７、  ２７２、  １９７６３−１９７７０に記載された２段階法により、ユーロピウムキレート（（Ｅｕ3+）ＤＴＰＡ−ＡＭＣＡ）によるオリゴヌクレオチドの修飾が行われた。すべてのオリゴヌクレオチドの濃度は、２６０ｎｍにおける蛍光団吸光の寄与についての補正後の２６０ｎｍのＵＶ吸光値から計算された、。
【００５６】
表１
2007525661.tif 000003
2007525661.tif 000004
2007525661.tif 000005
蛍光の測定
すべての蛍光測定は５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ2中で行った。蛍光スペクトルはＡｍｉｎｃｏ  Ｂｏｗｍａｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、  ＮＹ）に記録した。バッファーおよび測定機器の反応についてスペクトルを校正した。マイクロプレート中の蛍光はＴｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ＦｌｕｏｒＰｌｕｓマイクロプレートリーダー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、  ＮＣ）で読んだ。あるいは、マイクロプレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（ＢｉｏＲａｄ、  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、  ＣＡ）で画像化し、ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて個々のウェルに対応する画像面積について積分して蛍光強度を決定した。９６−ウェルプレートと３８４−ウェルプレート中での実験は、それぞれ１００μｌと２０μｌの体積で行われた。測定機器に依存して、僅かに異なるビーコンシグナル変化が記録されたが、これは異なる測定機器を用いた場合のことなるバッファーバックグラウンドの読み取り値（測定機器の感度による）、および各測定機器で利用可能な励起波長と発光波長についての差異に起因する。
【００５７】
ユーロピウムキレートＣｙ５標識ビーコンの場合の時間分解蛍光は、励起源としてパルス窒素レーザーを用いた、実験室で製作された機器（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１、  ２８９、  ６０−６７）で記録された。レーザーパルス後３０マイクロ秒後に、１００マイクロ秒分発光を積分した。
トロンビンアプタマー解離定数を決定するための競合アッセイ
競合物の存在下および非存在下でのＴＨＲ２の蛍光強度を決定した。トロンビン、ＴＨＲ２、および（もし存在すれば）競合物の濃度はそれぞれ１５０ｎＭ、２００ｎＭ、および２００ｎＭであった。これらの条件の下、アプタマーのトロンビンへの結合は本質的に化学量論的であった。先に記載した方法（Ｍａｔｌｏｃｋ、  Ｄ．Ｌ．；Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０００、  ３９、  １２２７４−１２２８３）を用いて、これらの条件下で、ＴＨＲ２の競合物に対する解離定数の比を計算した。
ゲルシフト分析（ＥＭＳＡ）によるトロンビンアプタマー結合
４１７ｎＭのＴＨＲ２のサンプル５マイクロリットルを、種々の量のトロンビン（０〜８３３ｎＭ）と共にインキュベートした。１５分間インキュベートした後、１(ｌの３０％Ｆｉｃｏｌｌを加え、サンプルはＴＢＥバッファー中１０％のポリアクリルアミドゲルで泳動された。泳動後、ゲルはＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎで３０分間染色され、ゲル上のイメージがＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて得られた。ゲル中のバンド強度はＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ）を用いて個々のバンドに対応するイメージの面積について積分することで求められた。
アプタマーを基礎とする分子ビーコンの設計
図１７Ｂは天然の配列特異的ＤＮＡ結合活性を有さないタンパク質用の分子ビーコンの全体的概念を示す。この設計は発明者が先に記載したＤＮＡ結合タンパク質用分子ビーコンにある程度の一般的類似性を有する（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２、  ２０、  １７１−１７６；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００３、  ３１６、  １−１０；  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ａｎａｌｙｔ．  Ｃｈｅｍ．  ２００４、  ７６、  １１５６−１１６４；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｆｅｉ、  Ｙ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ２００３、  ６、  １８３−１９４）（図１７Ａ）。タンパク質への天然の結合部位を含むＤＮＡ二本鎖を２つの半部位に分割する代わりに、「半部位の」機能的等価物として、タンパク質の２つの重複しないエピトープを認識する２つのアプタマーが用いられる。蛍光団と消光剤を含む複数の短く相補的な“シグナリング”オリゴヌクレオチドは柔軟なリンカーによって２つのアプタマーに連結されている（図１７Ｂ）。目標タンパク質が存在しない時、相補的なオリゴヌクレオチドは効率的なアニーリングを促進するには短かずぎるからである。アプタマー「半部位」が目標タンパク質に結合すると、２つの「シグナリング」オリゴヌクレオチドが相対的に接近して、それらの局所的濃度を高める。これによって「シグナリング」オリゴヌクレオチドはアニーリングし、蛍光団と消光剤は接近し、蛍光シグナルが変化する。
二価トロンビンアプタマーの特性
我々は図１７Ｂの概念の「理論の証明」を示すためのモデル系としてトロンビンを用いた。トロンビンは凝血カスケードに関与し天然にはＤＮＡやＲＮＡに結合しないタンパク質分解酵素である。タンパク質の２つの異なるエピトープを選択的に認識するＤＮＡアプタマーが、すでに２つの実験室によって開発された（Ｂｏｃｋ、  Ｌ．Ｃ．；  Ｇｒｉｆｆｉｎ、  Ｌ．Ｃ．；  Ｌａｔｈａｍ、  Ｊ．Ａ．；  Ｖｅｒｍａｓｓ、  Ｅ．Ｈ．；  Ｔｏｏｌｅ、  Ｊ．Ｊ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９２、  ３５５、  ５６４−５６６、  Ｔａｓｓｅｔ、  Ｄ．Ｍ．；  Ｋｕｂｉｋ、  Ｍ．Ｆ．；  Ｓｔｅｉｎｅｒ、  Ｗ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９７、  ２７２、  ６８８−６９８）。一つのアプタマー（Ｇ１５Ｄ；ＴＨＲ４、表１）はヘパリン結合エクソサイト（ｅｘｏｓｉｔｅ）（Ｂｏｃｋ、  １９９２）に結合することが示され、またもう一つのアプタマー（６０−１８［２９］；ＴＨＲ３、表１）はフィブリノゲン結合エクソサイト（Ｔａｓｓｅｔ  １９９７）に結合することが示されている。トロンビンを認識するビーコンを開発する最初のステップとして、我々は前記アプタマーが柔軟なリンカーで共有結合された種々のアプタマー構築物を作製した。これらの実験の主要な目的は、柔軟なリンカーでタンパク質表面上の２つの異なるエピトープを認識する２つのアプタマーを連結すれば、個々のアプタマーよりも高い親和性でタンパク質に結合できる二価アプタマーが得られるかどうかを決定することであった。そのような二価のアプタマー構築物のこの性質は、図１７Ｂのアッセイが機能するために必要不可欠な条件である。これらの二価構築物の親和性に対する長い柔軟なリンカーが与える影響を予測することは不可能なため、この問題に実験的に対処することが必要であった。これらの実験の第二の目的はリンカーの適切な長さ、および２つのアプタマーの５’端と３’端のリンカーに対する適切な向きを確立することであった。
【００５８】
様々な構築物の有するトロンビンへの親和性の決定を容易にするため、個々のアプタマーはフルオレセインで標識された〔ＴＨＲ１（表１）はフィブリノゲンのエクソサイトに特異的であり、ＴＨＲ２（表１）はヘパリンのエクソサイトに特異的である〕。トロンビンとフルオレセイン標識６０−１８［２９］アプタマー（ＴＨＲ１）との間の複合体の形成は蛍光偏光によて簡便に追跡でき（図示はしない）、フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）の結合は蛍光強度によって追跡できた（図１８Ａ）。どちらのアプタマーもナノモル程度の濃度範囲でトロンビンに結合した（ＴＨＲ１および図１８Ａにはデータを示していない）。ＴＨＲ２の場合の結合の定量的分析（図１８Ａ）はＫd値として６．３ｎＭの値を返した。これは以前に示唆されていたもの（Ｂｏｃｋ  １９９２、  Ｔａｓｓｅｔ  １９９７）より若干高い親和性であり、これはおそらく我々が真平衡結合アッセイを用いたのに対して以前は非平衡結合法が用いられたためである。ＴＨＲ２の結合が十倍過剰量の未標識６０−１８［２９］アプタマー（ＴＨＲ３）中で行われた場合（図１８Ｂ）、僅かな有意義ではない親和性の減少が観察されただけであった（Ｋdは１７．７ｎＭ）。これにより、以前報告されたとおり、Ｇ１５Ｄアプタマーと６０−１８［２９］アプタマーは独立にトロンビンの２つの異なるエピトープに結合したことが証明された。
【００５９】
次のステップでは、各種アプタマー構築物の有する、トロンビンへの結合についてＴＨＲ２と競合する能力が評価された。トロンビンを加えた場合のＴＨＲ２の蛍光強度の変化を競合物の存在下および非存在下で測定し、競合物の存在下でのトロンビンに結合したＴＨＲ２の量を材料と方法（Materials and Methods）に記載したとおりに計算した。これら実験で用いたアプタマーの濃度では、アプタマー−アプタマー相互作用は蛍光偏光アッセイで検出できず（未陳列）、競合データはＴＨＲ２およびトロンビンへの結合についての競合物の相対的親和性について正しく報告したことを示している。ＴＨＲ３は競合物ではなく（図１８Ｃ）、これは図１８ＡおよびＢに示されたデータと一致する。ＴＨＲ４（ＴＨＲ２の未標識変種）は予測どおり競合能力を備えていた（図１８Ｃ）。この場合の競合の定量的分析により、ＴＨＲ４はＴＨＲ２より１．７倍よくトロンビンに結合したことが示され、このアプタマーのフルオレセインによる標識が、トロンビンへのアプタマー結合に対して僅かな（有意義ではない）負の作用しか与えなかったことを示した。明らかに、すべての二価アプタマー構築物はＴＨＲ４よりもはるかに優れた競合物であった（図１８Ｃ）。ＴＨＲ７が最高の競合物のようで、１：１の比においてＴＨＲ２の結合を本質的に完全に阻害した。この場合の競合の定量分析によって、ＴＨＲ７はＴＨＲ２より少なくとも６５倍（ＴＨＲ７の推定Ｋd(９７ｐＭ）強くトロンビンに結合したことが明らかになった。図１８Ｃに示されたデータは、タンパク質の２つの異なるエピトープを認識する２つのアプタマーを柔軟なリンカーで連結すると、高親和性トロンビンリガンドが作り出されるという予想を確認した。さらに、これら２つのアプタマーをより長いリンカー（１０個スペーサー１８単位を含む（５個のスペーサー１８単位との比較））で連結した場合、トロンビンに対してやや良好な親和性（ＴＨＲ５とＴＨＲ６の結合の比較）が得られることをこれらのデータは示した。これらのデータはまた、アプタマーのリンカーに対する向きがＴＨＲ７のような場合は、親和性がより良い（ＴＨＲ６とＴＨＲ７の親和性の比較）ことを示した。このため、以下のすべて構築物中、ＴＨＲ７のようなアプタマーの向きが用いられた。
【００６０】
二価のアプタマー構築物（ＴＨＲ７）とトロンビンの間の複合体は、非変性ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に耐えるのに十分なほど安定している（図１８Ｄ）。我々はこの観察を利用して、ゲルシフト分析法（ＥＭＳＡ）（Ｆｒｉｅｄ、  Ｍ．  Ｇ．；  Ｃｒｏｔｈｅｒｓ、  Ｄ．  Ｍ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９８１、  ９、  ６５０５−６５２５）を用いて複合体の化学量論を決定し、ＴＨＲ７−トロンビン複合体形成を追跡した。我々はトロンビンでＴＨＲ７滴定した（どちらの分子も高濃度であった）。これらの条件の下では、結合は化学量論的であるはずである。形成された複合体対トロンビンのＴＨＲ７に対する比のプロットは、複合体の１：１の化学量論を示し（図１８Ｄ）、これは両アプタマー（ＴＨＲ７の成分）がＴＨＲ７−トロンビンの複合体中でその各々のエピトープに結合するという観念と整合している。
トロンビンを検出するアプタマーを基礎とした分子ビーコン
以上に記載の実験データは、図１７Ｂに示されたシグナリングビーコン設計を成功裏に実施するために必要な全ての条件が満たされたことの証明を与えた。これらのデータに基づき、我々は図１９Ａに示されたトロンビンビーコンを設計した。５個のスペーサー１８リンカーを用いてトロンビンアプタマー（複数）を、それぞれ５’端と３’端がフルオレセインおよびダブシルで標識された７ヌクレオチド長の相補的なオリゴヌクレオチドに連結された。、これら２つの構築物の混合物は個々のアプタマーに比べ、より緊密に（約３６倍）トロンビンに結合した（図１８Ｃ）が、これは２つのアプタマーを柔軟なリンカーで永続的に連接した二価アプタマー構築物について観察された高いトロンビン親和性と整合する。トロンビンをそれぞれ蛍光団および消光剤で標識されたＴＨＲ２０とＴＨＲ２１の混合液に加えると、タンパク質濃度に依存した蛍光強度の消光が起こった（図１９Ｃ）。観測された最大の消光は約４０％であった。ダブシル標識されたパートナー（ＴＨＲ２０）の非存在下ではトロンビンをＴＨＲ２１に加えても蛍光変化は観察されず（図１９Ｃ）、蛍光の消光は、図１９Ｂに示されるようにアニーリングにつながるタンパク質に誘導されるシグナリングオリゴヌクレオチドのさらなる接近に起因することを示している。ビーコン成分とトロンビンがナノモル濃度であるとき、約１５分間のインキュベーションはビーコンの最大の反応を生み出すのに十分である。我々は類似した図１９に示されたビーコンと同様であるが、１７ヌクレオチド長のポリｄＴリンカーがスペーサー１８リンカーの代わりに用いられている種々のトロンビンビーコンについてもテストした。トロンビン依存的な蛍光消光は観察されたが、消光はスペーサー１８リンカーを含む構築物を用いた場合よりも約２倍小さかった。ポリｄＴリンカーは柔軟ではあるもののいくらかの残留硬さを示した可能性が強い（Ｍｉｌｌｓ、  Ｊ．Ｂ．；  Ｖａｃａｎｏ、  Ｅ．；  Ｈａｇｅｒｍａｎ、  Ｐ．Ｊ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９９、  ２８５、  ２４５−２５７）、そのためおそらく２つのアプタマーがトロンビンに結合した際のシグナリング二本鎖の結合を阻害したのであろう。トロンビンと構造的に類似するタンパク質分解酵素であるトリプシンで図１９に示されたビーコンを滴定すると、蛍光強度の変化は観測されなかった。我々は、図１７Ｂに示された設計による機能的なトロンビンビーコンが得られたと結論付けた。
ビーコン性能の改善
次の一群の実験において、我々は別のドナー−アクセプター標識ペアを利用してビーコンの性能を改善することを追求した。前述の通り、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を読取に用いたアッセイでは、アクセプター発光を増強すると潜在的によりよいシグナル対バックグラウンド比、より高いダイナミックレンジ、およびよりよい感度が得られることが先に示されている（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．；  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．；  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．  Ａｎａｌｙｔ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００３、  ３１６、  １−１０）。我々は図１７Ｂに示されたものと同様だが、フルオレセイン−ダブシルのペアに代えて蛍光ドナーと蛍光アクセプターの様々な組み合わせがシグナリンゴオリゴヌクレオチドに導入された一連のトロンビンビーコン構築物を作製した。適切な染料のＮＨＳエステルで標識されたＴＨＲ２１（あるいは適当な染料のＮＨＳエステルで標識されたＴＨＲ２８）とＴＨＲ２７をこれらのビーコンの作製に用いた。図２０は、フルオレセイン−テキサスレッド（図２０Ｂ）、フルオレセイン−Ｃｙ５（図２０Ｃ）、およびＣｙ３−Ｃｙ５（図２０Ｄ）で標識されたビーコンの蛍光スペクトル（トロンビン添加有りおよび無し）を示す。全てのケースで機能性ビーコンが得られた。蛍光ドナーと蛍光アクセプターを有するビーコンの各ケースにおいて、トロンビン濃度依存的な感作アクセプター発光の大きな増加が観察された（図２０の挿入図、および図２１Ａ−Ｄ）。比較のため、図２０Ａは蛍光団−消光剤（フルオレセイン−ダブシル）のペアの場合にトロンビン存在下で観察された蛍光消光を示している。図２１Ｅは時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）を検出方法として用いることを可能にするユーロピウムキレート−Ｃｙ５ドナー−アクセプターペアを用いて得られる結果を示している（Ｓｅｌｖｉｎ、  Ｐ．Ｒ．；  Ｒａｎａ、  Ｔ．Ｍ．；  Ｈｅａｒｓｔ、  Ｊ．Ｅ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９４、  １１６、  ６０２９−６０３０；Ｓｅｌｖｉｎ、  Ｐ．Ｒ．；  Ｈｅａｒｓｔ、  Ｊ．Ｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９４、  ９１、  １００２４−１００２８；  Ｍａｔｔｈｉｓ、  Ｇ．Ｃｌｉｎｉｃ．  Ｃｈｅｍ．  １９９５、  ４１、  １３９１−１３９７）。ＴＲ−ＦＲＥＴを用いることで、光散乱および直接励起されたアクセプターからの即時蛍光を除き、ビーコンのシグナル対バックグラウンド比をさらに改善することが可能になる。図２１Ｆはドナーおよびアクセプタープローブの様々な組合せを用いたビーコンバリエーションの性能をまとめている。数値は、トロンビン非存在下で観測されるビーコンのバックグラウンドシグナルと比較した、飽和濃度のトロンビンの存在下におけるシグナル変化の倍率を示している。その比は、フルオレセイン−ダブシルペアの場合の約２倍から、ユーロピウムキレート−Ｃｙ５ペアの場合の約２２倍にまでばらついている。このため、最良のドナー−アクセプターペアを選択し、シグナル検出のやり方として感作アクセプター発光を用いることによりビーコン性能の実質的改善をなしうる。蛍光ドナーと蛍光アクセプターのビーコンバリエーションのさらなる利点は、その反応をアクセプター対ドナーのシグナル比の二色決定により測定できることである。このようなレシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）な測定により、より安定したシグナルが得られ、これはサンプル中に存在する添加剤による光吸收、光散乱、蛍光消光などの非特異的影響により抵抗性である。最良のドナー−アクセプターペアを用いて得られる上昇したシグナル対バックグラウンド比により、ビーコン感度も上昇する。このことは図２２に示され、低濃度のトロンビンに対する三つの選ばれたビーコンバリエーションの反応を示している。フルオレセイン−ダブシル標識ビーコン（飽和濃度のトロンビンの存在下で最低（約２倍）のシグナル変化を示す）の場合、統計的に有意なシグナル変化は最高のトロンビン濃度（１ｎＭ）においてのみ検出された。フルオレセイン−テキサスレッド標識ビーコン（飽和トロンビン濃度で約５倍のシグナル変化を示す）の場合、統計的に有意なシグナル変化はより低いトロンビン濃度（２００ｐＭ）において検出された。フルオレセイン−Ｃｙ５標識ビーコン（飽和トロンビン濃度で約１５倍のシグナル変化を示す）の場合、統計的に有意なシグナル変化は最低のトロンビン濃度（５０ｐＭ）で既に検出できた。
【００６１】
図２３はトロンビンビーコンシグナルの優れた再現性と安定性を示す。ビーコンシグナルは５回の独立したテストにおいて４つのトロンビン濃度で測定された。テストされた各タンパク質濃度において変動係数は小さかった（図２３Ａ）。ビーコンシグナルは少なくとも２４時間にわたり安定であった（図２３Ｂ）。
【００６２】
図１７Ｂに示されたビーコンを用いてシグナルを発生するためには、三つの分子接触が同時に起こることが必要である：アプタマーの各々とタンパク質との間の２つの接触と、２つの相補的なシグナリングオリゴヌクレオチド間の接触である。３つの接触は各々、ビーコン−タンパク質複合体の全体的安定性に対して自由エネルギー上の寄与を与える。複合体の自由エネルギーと平衡解離定数との間の指数的関係のため、上述の三個の分子接触のいずれがかけても複合体の全体的安定性が大きく減少する。よって、単一分子接触に基づいたアッセイ（例えば、単一アプタマーを基礎としたアッセイ）に比べて、ここに記載された分子ビーコンはタンパク質検出におけるより高い特異性を示すことが予想される。この観点を説明するため、我々は単一のトロンビンアプタマーとトロンビンビーコンのＳＳＢ（大腸菌の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、一本鎖ＤＮＡへの結合について非特異的な高い親和性を示すタンパク質である）に対する反応を比較した（データは示さない）。ＳＳＢはナノモル濃度で単一のフルオレセイン標識アプタマー（ＴＨＲ１、表１）と共に大きなシグナル（蛍光偏光アッセイで測定）を生み出した。ＳＳＢは、トロンビンがこのアプタマーに結合するのに必要な濃度と同様の濃度範囲で反応を示した。よって、単一のトロンビンアプタマーはＳＳＢとトロンビンを非常に弱くしか区別しないことが分かった。対照的に、トロンビンビーコンをナノモルのＳＳＢ濃度にさらした場合、有意なビーコン反応は生まれず、トロンビンは同じ濃度範囲で大きなビーコン反応を生み出した。このため、トロンビンビーコンはＳＳＢとトロンビンを非常によく区別し、ビーコンの向上した特異性が示された。
【００６３】
ここに記載したアッセイ設計の主な応用は、均一で高スループットのタンパク検出であろう。Ｚｈａｎｇらは（Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １９９９、  ４、  ６７−７３）高スループットでの使用用のアッセイを評価するのに用いれる簡単な統計的パラメーターを開発した。Ｚ’−因子はタンパク質の存在下および非存在下における、多回数の測定の繰り返しから計算される。Ｚ’値が１であることは理想的なアッセイであることを示しており、Ｚ’値が０．５から１であると優れたアッセイであることを示している。Ｚ’値が０．５より小さいことは高スループットへの応用にはあまり適していないことを示している。トロンビンビーコンのＺ’値は０．９４（図２４）であり、これが非常に優れた高スループットアッセイであることを示している。
複合体混合液中のトロンビンの検出
次の一連の実験は、トロンビンビーコンの特異性、およびそれが細胞抽出液と血漿中のトロンビンを検出する能力についてのものである。１ｎＭのトロンビンに対するビーコンの反応は、１００および１０００倍過剰量の関係ないタンパク質（オブアルブミン、図２５Ａ）では影響されなかった。また、１００倍過剰量のＸａ因子（トロンビンに類似する別の凝血プロテアーゼ）は１ｎＭのトロンビンに対するビーコンの反応に影響を与えなかった（図２５Ａ）。１０００倍過剰量のＸａ因子はビーコンの反応を僅かに弱めたが、これらの条件の下でも１ｎＭのトロンビンは依然として容易に検出可能であった（図２５Ａ）。トロンビンが存在しない場合は、１μＭまでの濃度のオボアルブミンとＸａ因子はビーコンシグナルに影響しなかった（図２５Ａ）。我々はビーコンはトロンビンに対して高度に選択的であると結論した。
【００６４】
ビーコンが複合体混合液中でトロンビンを検出できるかをテストするため、我々はＨｅＬａ細胞抽出液を様々な量のトロンビンでスパイクし、該混合液に対するビーコン反応を決定した（図２５Ｂ）。低ナノモル濃度のトロンビンは容易に検出された。２０μｌの分析液の中に総量８μｇのタンパク質を加えるが、この量は細胞抽出液を使用した実験において使用される典型的な範囲に属するものである。細胞抽出液を加えた時に観察されたシグナルは、特定の競合物（未標識トロンビンアプタマー）を加えることで完全に消去された、細胞抽出液中で観察されたシグナルはトロンビンによるものであることが確認された。細胞抽出液を使用した実験において遭遇した一つの問題はアッセイの成分であるオリゴヌクレオチドの、細胞抽出物中のヌクレアーゼによる分解であった。我々は様々なバッファー添加剤を試して、細胞抽出液の存在下でトロンビンビーコンが十分に長い時間安定性でいられる条件を見出した。我々は高濃度のランダムな配列の３０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ（１０μＭ）、高濃度の２０ヌクレオチド長のランダム配列一本鎖ＤＮＡ（０．１μＭ）、および２．５ｍＭのＥＤＴＡの添加により、細胞抽出液の存在下においてビーコンのトロンビンに対する反応に有意な影響を与えることなくトロンビンビーコンは分解から保護されることを見出した。図２５Ｂに示されたデータは、上述の添加物の存在下で得られた。
【００６５】
トロンビンは血漿タンパク質であるので、我々はビーコンが血漿中のタンパク質を検出するのに使用できるかを確かめた。血漿中にあるトロンビンは全てその前駆体であるプロトロンビンの形で存在しており、プロトロンビンはＸａ因子によるタンパク質分解的な処理によってトロンビンに変換される。プロトロンビンはトロンビンビーコンに認識されるものの、トロンビンに比べはるかに低い感度である（約２０倍低い、データは示さない）。このことは図２５Ｃの実験によってよく表され、そこではプロトロンビンの存在下でのビーコンの感作アクセプター発光が時間の関数として観察された。矢印でマークされた点において、Ｘａ因子が混合液に加えられ、プロトロンビンのトロンビンへの変換を開始した。この変換により、ビーコンシグナルは時間とともに増加したが、これはビーコンのトロンビンに対するはるかに高い感度と整合する。このため、血漿中のトロンビンを検出するためには、Ｘａ因子はアッセイ混合液中に含まれる（図２５Ｄ）。血漿の添加量を増加させるとビーコンシグナルはそれに比例して増加した（図２５Ｄ）。Ｘａ因子がアッセイ中に存在する場合のみ血漿の添加によりビーコンの反応が生み出された。血漿を加えた時に生まれたシグナルは、特定の競合物（未標識トロンビンアプタマー）の添加により完全に消去され、細胞抽出液中の観察されたシグナルがトロンビンによるものであることが確認された。２０μｌの反応容量中、５ｎＬの血漿サンプルはビーコンの測定可能な反応を生み出した。まとめると、図２５に示された実験は、複雑な生物的混合液中のタンパク質を検出するトロンビンビーコンの機能性を証明した。
考察
ここで説明したアプタマーを基礎とした分子ビーコンの設計は、我々によって先に開発された配列特異的なＤＮＡ結合タンパク質を検出する分子ビーコンを一般化したものである（図１７）。トロンビンをモデルタンパク質として用いたここに記載された実験によりこの設計の実施可能性についての原理の証明が得られた。我々はこの設計がいくつかの重要な利点を有するであろうと信じる。ここに記載された分子ビーコンの設計はいかなる特定のタンパク質に限定されるものではないため、多くのタンパク質に一般的に適用可能である。目標タンパク質の存在下での我々のビーコンによるシグナリングには、２つの異なるアプタマーによるタンパク質の２つの別々のエピトープの協働的認識が必要である。これによってビーコンの特異性が向上し、親和性（つまり検出感度）も向上する。この２つのアプタマーによる協働的作用により、ほどほどの親和性を有するアプタマーを用いて高親和性と高特異性で目標タンパク質に結合する分子ビーコンを作製できる。ビーコンのアプタマー成分は、タンパク質の存在下で異なる状態間のスイッチングを可能にするために構造の分布を調製するためのいかなる構造の加工も必要としない。この種の加工はアプタマーの特定の配列（構造）に依存的でありえ、核酸の代替的構造のエネルギー論のそのようなバランスは些少なものであるとは限らない。本ビーコン設計中のシグナリング要素（“シグナリング”オリゴヌクレオチド）はそのアプタマー成分と分離しているため、任意のアプタマー配列（および構造）が我々のビーコンの設計に適用可能である。“シグナリング”オリゴヌクレオチドの添加が、ビーコンの成分であるアプタマーのの親和性や特異性に有害な影響を及ぼすことはありそうにない。このため、タンパク質の２つの異なるエピトープを認識する２つのアプタマーを得ることのできる任意のタンパク質は、図１７の設計による分子ビーコンの開発の良いターゲットとなるはずである。
【００６６】
タンパク質の異なるエピトープを認識する抗体（複数）を得ることは比較的容易である。同樣に、多くの目標タンパク質について異なるエピトープを認識するアプタマー（複数）を開発できない理由は無く、すでにいくつかの例が得られている（Ｊａｙａｓｅｎａ、  Ｓ．Ｄ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９、  ４５、  １６２８−１６５０）。この目標を達成するためにはいくつかのやり方が可能である。第一のやり方はタンパク質に結合したオリゴヌクレオチドとタンパク質に結合していないオリゴヌクレオチドを分離するために異なる方法を用いながらインビトロ選択（ＳＥＬＥＸ）を行うことであろう。その原理はこれらの異なる区分法において、タンパク質の異なる領域を選択的に提示でき、タンパク質表面上の異なる領域に対するアプタマーが得られる。トロンビンについて選択されたアプタマーはそのようなやり方の一例でなる（Ｂｏｃｋ、１９９２；Ｔａｓｓｅｔ、１９９７）。第２のやり方は、目標タンパク質分子の異なる領域に相当するペプチドに対するアプタマーを生成させることであろう。アプタマー開発の目標として用いられたペプチドが由来する完全タンパク質を認識できるアプタマーを開発するためにそのような戦略を用いることが出来ることについては、実験的証拠が存在する。（Ｗｅｉ、  Ｘ．；  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、  Ａ．Ｄ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １９９６、  ９３、  ７４７５−７４８０）。このやり方はタンパク質を認識する抗体を作製するために広く用いられている。タンパク質の異なるエピトープを認識する２つのアプタマーは、第１の段階で選択されたアプタマーが飽和濃度存在する中でアプタマーを選択することを第２の段階が伴う２段階連続ＳＥＬＥＸによっても作製可能である。我々のトロンビンをモデルシステムとして用いてこの手順を検証した（Ｈｅｙｄｕｋ、Ｅ．とＨｅｙｄｕｋ、Ｋ．未発表）。最後に我々は、我々の分子ビーコン設計中で機能するように特に設計された一対のアプタマーを作製するための新規なインビトロ選択戦略を開発した（Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｅ．、  Ｋａｌｕｃｋａ、  Ｊ．、  Ｋｉｎｎｅａｒ、  Ｂ．、  Ｋｎｏｌｌ、  Ｅ．、  ａｎｄ  Ｈｅｙｄｕｋ、  Ｔ．、未発表）。このため、タンパク質の重複しないエピトープ（複数）を認識するアプタマー対を得る多くの手法が利用可能である。
【実施例４】
【００６７】
センサー設計のバリエーション
本発明を実施する際には、本分子ビーコンのいくつかのバリエーションが利用可能である。分子ビーコンのそれらバリエーションは図２６に示され、本明細書中でまとめられている（前記）。図２６Ｆに示されたセンサー設計は、ＤＮＡ結合タンパク質を効果的に検出できることが示されている。ＤＮＡ結合タンパク質の一例であるｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（“ＣＲＰ”）をドナーおよびアクセプター標識センサー成分（複数）の混合液に滴定した場合、感作アクセプター蛍光強度もそれに合わせて増加する（図２７）。
【００６８】
図２６Ｇに示されたセンサーの設計は図２８で証明されている。パネルＡはセンサー機能の原理を示している。センサーの要素（複数）に相補的な２つの異なる配列エレメントを含む一本鎖ＤＮＡを、それぞれドナーおよびアクセプター標識された２つのセンサー成分の混合液に加えた場合、感作アクセプター蛍光強度もそれに合わせて上昇する（図２８Ｂ、”＋”記号がある線）。この特定の場合におけるセンサーはテキサスレッド標識されたＴＨＲ２９およびＴＨＲ３２を含んでいた。
【００６９】
本分子ビーコンセンサーの設計を、単一の目標大分子認識要素に基づいたアッセイと比べた場合の増加した特異性は実験的に証明されている（図２９）。センサーによる目標分子の認識は、それぞれ複合体全体の安定性に寄与する自由エネルギー（ΔＧ）を与える３つの分子接触が同時に起こることを伴う。自由エネルギーと複合体の平衡解離定数の間の指数的関係のため、複合体全体の安定性は上述の三つの分子接触のいずれが欠けても大きく減少するため、目標分子認識の特異性が高くなる。ナノモル濃度の非特異的一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）は単一のフルオレセイン標識アプタマー（ＴＨＲ１、表１）と共に大きなシグナルを生み出した（蛍光偏光アッセイによって測定した）。トロンビンがこのアプタマーを結合するのに必要な濃度に非常に近い濃度範囲で、ＳＳＢは反応を生み出した。このため、単一トロンビンアプタマーはＳＳＢとトロンビンを非常に弱くしか区別しないことが分かった（パネルＢ）。ナノモル濃度のＳＳＢにトロンビンセンサー〔ＴＨＲ２１（フルオレセイン標識標識）とＴＨＲ２７（テキサスレッド標識）の混合液〕をさらした場合、有意なビーコン反応は起こらなかった（虚線）のに対し、同濃度範囲でトロンビンは大きなビーコン反応を生み出す（パネルＣ）。このため、トロンビンビーコンはＳＳＢとトロンビンを非常によく区別することが分かり、ビーコンの向上した特異性を示している。
各種センサー用アプタマーを作製する方法
図３０は本発明の実施に有用なアプタマーを選択する方法をまとめている。パネルＡは第１のアプタマーに結合したタンパク質の存在下での第２のアプタマーの選択を示す。シグナリングオリゴはランダム配列含有構築物の５’端に位置しており、相補的なシグナリングオリゴは長く柔軟なリンカーで第１のアプタマーに連結されている。この種のランダムＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）構築物を用いたコアプタマーの選択は、第１のアプタマーのエピトープと箱となる部位でタンパク質に結合でき、図２６Ａに示されたセンサー内で機能するアプタマーへとバイアスがかかる。
【００７０】
パネルＢには別のシナリオが示されており、そこではタンパク質の２つの異なるエピトープに結合する２つのアプタマーの同時選択が記載されている。（プライマー１およびプライマー４の末端の）棒は、アプタマー構築物を含むランダム配列の５’端と３’端にある短い相補的配列を示している。この種のランダムＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）構築物を用いたアプタマー選択は、同時にタンパク質の２つの異なるエピトープに結合でき、図２６Ａが示すセンサーで機能するアプタマー（複数）へとバイアスがかかる。
【００７１】
さらに別の実施形態では、二本鎖ＤＮＡが結合したタンパク質の存在下で第２のアプタマーが選択される（図３０、パネルＣ）。棒は（ランダム配列含有構築物の５’端の）短い配列を示し、二本鎖ＤＮＡに長い柔軟なリンカーで連結されたシグナリングオリゴヌクレオチドに相補的である。このようなランダムＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）構築物を用いたコアプタマー選択は、タンパク質の二本鎖ＤＮＡ結合部位とは異なる部位でタンパク質に結合でき、図１７Ｂに示されたセンサーで機能するアプタマーへとバイアスがかかるであろう。
【００７２】
さらに別の実施形態では、タンパク質の別のエピトープに抗体が結合した該タンパク質の存在下で、第２のアプタマーが選択される（図３０、パネルＤ）。棒は（ランダム配列含有構築物の５’端の）短い配列を表し、長い柔軟なリンカーで抗体に連結されたシグナリングオリゴヌクレオチドに相補的である。このようなランダムＤＮＡ（あるいはＲＮＡ）構築物を用いたコアプタマーの選択は、タンパク質に抗体のエピトープとは異なる部位で結合でき、図１７Ｃに示されたセンサーで機能するアプタマーへとバイアスがかかるであろう。
【００７３】
Ｇ１５Ｄアプタマーの結合部位と異なるエピトープでトロンビンに結合するアプタマーの選択を、過剰量のＧ１５Ｄアプタマー含有構築物（ＴＨＲ２２）の存在下で３３ヌクレオチド長のランダム配列を含む構築物（ＴＨＲ１１）から始まるＳＥＬＥＸ手順を用いて行った（図３１、パネルＡ）。パネルＢは、表示された各選択回数後に得られた一本鎖ＤＮＡのトロンビン結合活性を示す。測定可能なトロンビン結合活性は４回目の選択後に現れ、１２回目の選択後に最大値に達した。過剰量のＴＨＲ２２の存在下で結合を測定した。１２回目の選択後に得られたＤＮＡをクローニングし、各クローンから得られたＤＮＡを配列決定した。パネルＣは、それぞれのクローンの配列アラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＸを使用）を示す。４回の独立した選択実験により得られたクローンが示されている。これらの選択は、以下にあげたアプタマー構築物とランダム配列含有構築物のペアを用いて行った：ＴＨＲ２２とＴＨＲ１１；ＴＨＲ２５とＴＨＲ１１；ＴＨＲ４２とＴＨＲ１１；ＴＨＲ４３とＴＨＲ１１。いくつかの、高度に保存された配列のファミリーがパネルＣ中で容易に見られる。
【００７４】
テキサスレッド標識されたＴＨＲ２７と、図３１Ｃのクローン２０〜２６に対応する配列を含むフルオレセイン標識されたＴＨＲ３５あるいはＴＨＲ３６とを含む機能的なトロンビンセンサーが図３２に示されている。ＴＨＲ３５とＴＨＲ３６は、クローン２０〜２６の配列に隣接するＤＮＡ配列の長さの点で異なる。２０ｎＭ（パネルＡ）あるいは１００ｎＭ（パネルＢ）の標示されたトロンビンセンサーと表示された濃度のトロンビンとを含むマイクロプレートのウェルの蛍光像（感作アクセプター発光）が示される。比較のため、ＴＨＲ２１とＴＨＲ２７を含むセンサーも示される。
【００７５】
図３３は、２つの異なるエピトープでトロンビンに結合する２つのアプタマーの同時選択をまとめている。アプタマーの選択は、３０ヌクレオチド長のランダム配列を含む２つの構築物（ＴＨＲ４９とＴＨＲ５０）から始まるＳＥＬＥＸ手順を用いて行った（パネルＡ）。表示された各回の選択後に得られる一本鎖ＤＮＡの混合物のトロンビン結合活性がパネルＢに示されている。測定可能なトロンビン結合活性は、６回目の選択後に現れ、１４回目の選択の後に最大値に達した。１４回目の選択後に得られたＤＮＡをクローニング氏、個々のクローンから得られたＤＮＡを配列決定した。パネルＣはクローンの配列アラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＸを使用）を示す。いくつかの高度に保存された配列のファミリーが容易に見い出せる。
【００７６】
アプタマーを基礎とした分子ビーコンをｃＡＭＰ反応エレメント結合タンパク質（“ＣＲＰ”）について開発した。タンパク質のＤＮＡ結合部位とは異なる部位に結合するアプタマーを選択した。ＣＲＰ結合部位を含む構築物〔ＭＩＳ１１とハイブリダイズしたＭＩＳ１０Ｘ３〕の過剰量の存在下で、３３ヌクレオチド長のランダム配列を含む構築物（ＭＩＳ１２）から始めてＳＥＬＥＸ手順を用いてアプタマーが選択された（図３４、パネルＡ）。各会の選択後に得られた一本鎖ＤＮＡのＣＲＰ結合活性が図３４、パネルＢに示されている。測定可能なＣＲＰ結合活性は６回目の選択後に現れ、１２回目の選択後に最大値に達した。ＭＩＳ１１とハイブリダイズしたＭＩＳ１０Ｘ３の過剰量の存在下で結合を測定した。１２回目の選択後に得られたＤＮＡをクローニングし、各クローンから得られたＤＮＡを配列決定した。クローンの配列アラインメント（ＣｌｕｓｔａｌＸを使用）はパネルＣに示されている。約１６ヌクレオチド長の保存されたコア配列が同定できた。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】タンパク質検出用の分子ビーコンの全体設計。（Ａ）天然のＤＮＡ結合活性を有さないタンパク質用の設計のバリエーション。この場合のビーコンはタンパク質の２つの異なるエピトープを認識するように開発された２つのアプタマーからなるであろう。（Ｂ）天然のＤＮＡ結合活性を有するタンパク質用の設計バリエーション。この場合のビーコンはタンパク質結合部位に対応するＤＮＡ配列を含む短いＤＮＡ二本鎖と、タンパク質の異なるエピトープを認識するように開発されたＤＮＡ（ＲＮＡ）アプタマーとからなるであろう。
【図２】第１のアプタマー（Ａ）の結合部位とは異なるエピトープ、あるいはタンパク質（Ｂ）の天然の結合部位を含む核酸の結合部位とは異なるエピトープ、についてのコアプタマーを作製する方法。
【図３】ＤＮＡ結合タンパク質（Ａ）用分子ビーコンの設計と、タンパク質（Ｂ）の２つの異なるエピトープに対するアプタマーに基づいてタンパク質を検出する分子ビーコンの比較。
【図４】トロンビンにフィブリノゲンエクソサイト（６０−１８［２９］）およびヘパリン  エクソサイト（Ｇ１５Ｄ）で結合するアプタマーを含むアプタマー構築物。
【図５】フルオレセイン標識アプタマーのトロンビンへの結合。（Ａ）蛍光偏光で検出された６０−１８［２９］アプタマー（ＴＨＲ１）（５０ｎＭ）の結合；（Ｂ）蛍光強度の変化により検出されたＧ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）（５０ｎＭ）の結合；（Ｃ）フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）（２０ｎＭ）のトロンビンによる定量的平衡滴定。実線はアプタマーとトロンビンの間の１：１複合体形成を記述した方程式への実験データの非線形適合；（Ｄ）十倍過剰量の非標識６０−１８［２９］のアプタマー（ＴＨＲ３）の存在かにおける、フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）（２０ｎＭ）のトロンビンによる定量的平衡滴定。実線はアプタマーとトロンビンの間の１：１複合体形成を記述した方程式への実験データの非線形適合。
【図６】トロンビンへの結合についての、トロンビンアプタマー構築物とフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）の間の競合。競合物がない時（Ａ）、１５０ｎＭのＴＨＲ３の存在下（Ｂ）、１５０ｎＭのＴＨＲ４の存在下（Ｃ）、および１５０ｎＭのＴＨＲ７の存在下（Ｄ）におけるトロンビンあり、および無しでの、５０ｎＭのフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ（ＴＨＲ２）の蛍光スペクトル。
【図７】トロンビンへの結合に関する、トロンビンアプタマー構築物とフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）の間の競合を検出する実験の概要。競合物（２５０ｎＭ）の非存在下および存在下におけるフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）（５０ｎＭ）の蛍光強度を、競合物の存在下における結合ＴＨＲ２の％を決定するのに用いた。トロンビンの濃度は７５ｎＭであった。図中に示された解離定数の値は、２００ｎＭのフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）、２００ｎＭの競合物および１５０ｎＭのトロンビンを用いた別個の実験から計算された。
【図８】６０−１８［２９］アプタマー（ＴＨＲ３）が、フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）とＴＨＲ５構築物の間のトロンビンへの結合についての競合について与える影響。トロンビン（１５０ｎＭ）の存在下および非存在下における、（Ａ）競合物の非存在下、（Ｂ）１０００ｎＭのＴＨＲ３と２００ｎＭのＴＨＲ５の存在下、（Ｃ）１０００ｎＭのＴＨＲ３の存在下、および（Ｄ）２００ｎＭのＴＨＲ５の存在下での２００ｎＭのフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ（ＴＨＲ２）の蛍光スペクトル。
【図９】ゲル電気泳動移動率シフトアッセイにより検出されたＴＨＲ７アプタマー構築物のトロンビンへの結合。４１７ｎＭのＴＨＲ７のサンプルを様々な量の（０〜８３３ｎＭ）のトロンビンと共にインキュベートし、１５分のインキュベーション後に１０％の天然プロピレンゲル上にロードした。（Ａ）Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎで染色されたゲルのイメージ。（Ｂ）トロンビン濃度の関数としての、ＴＨＲ７−トロンビン複合体に相当するバンドの強度。
【図１０】二価トロンビンアプタマー構築物のファミリーで、Ｇ１５Ｄと６０−１８［２９］アプタマーが、９−２７個のヌクレオチド長のｐｏｌｙＴリンカーによって２０ｂｐ二本鎖ＤＮＡに連結されたもの。
【図１１】ゲルシフト法（ＥＭＳＡ）によって検出された、トロンビンの図８中に示された二価アプタマー構築物（各３３ｎＭ）への結合。星印は、トロンビンが９ヌクレオチド長のポリＴリンカーを有する構築物と比較して２７ヌクレオチド長および１７ヌクレオチド長のｐｏｌｙＴリンカーに選択的に結合することを最もよく示しているレーンを示す。トロンビンの濃度は０から４００ｎＭの間で変化された。
【図１２】１７ヌクレオチド長のｐｏｌｙＴリンカーで９ｂｐの蛍光団（あるいは消光剤）標識“シグナル”二本鎖に連結されたＧ１５Ｄと６０−１８［２９］アプタマーを用いたトロンビンビーコンの設計。（Ａ）フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ構築物（ＴＨＲ９）とダブシル標識６０−１８［２９］構築物（ＴＨＲ８）のヌクレオチド配列。（Ｂ）トロンビンビーコンによるシグナル機構。（Ｃ）トロンビンをトロンビンビーコンに加えた際に検出される蛍光シグナル変化。比較のため、ダブシル標識６０−１８［２９］構築物（ＴＨＲ８）の非存在下でのフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ構築物（ＴＨＲ９）トロンビンによる滴定も示される（ドナーのみの曲線）。
【図１３】５個のスペーサー１８単位を含むリンカーを介して９ｂｐの蛍光団（あるいは消光剤）標識“シグナル”二本鎖に連結されたＧ１５Ｄと６０−１８  ［２９］のアプタマーを用いたトロンビンビーコンの設計。（Ａ）フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ構築物（ＴＨＲ２１）とダブシル標識６０−１８［２９］構築物（ＴＨＲ２０）のヌクレオチドの配列。（Ｂ）トロンビンビーコンによるシグナル機構。（Ｃ）トロンビンをトロンビンビーコンに加えた際に検出される蛍光シグナルの変化。比較のため、ダブシル標識６０−１８［２９］構築物（ＴＨＲ２０）が存在しない場合のフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ構築物（ＴＨＲ２１）のトロンビンによる滴定も示す（ドナーのみの曲線）。挿入図は、主グラフの各データ点に対応する様々なトロンビン濃度において記録される蛍光発光スペクトルを示す。
【図１４】ゲルシフト法によって検出された、トロンビンの図１３中に示されたビーコン（ＴＨＲ２０／ＴＨＲ２１）への結合。ゲルはフルオレセイン発光で画像化された（つまり、ビーコンのＴＨＲ２１成分のみが見える）。
【図１５】（Ａ）２つの異なるビーコン濃度でのトロンビン検出の感度。赤丸：５０ｎＭのＴＨＲ２１と９５ｎＭのＴＨＲ２０。青丸：５ｎＭのＴＨＲ２１と９．５ｎＭのＴＨＲ２０。（Ｂ）ビーコンのトロンビンに対する特異性。５０ｎＭのＴＨＲ２１と９５ｎＭのＴＨＲ２０がトロンビン（赤丸）およびトリプシン（青丸）で滴定された。
【図１６】競合的アプタマー構築物によるトロンビンビーコンシグナルの反転。競合物ＤＮＡの濃度を増加させながら、５０ｎＭのＴＨＲ２１、９５ｎＭのＴＨＲ２０および１００ｎＭのトロンビンの蛍光強度を測定した。実験数値は、初期のビーコンとトロンビンの混合物のシグナル（Ｆo）に対する相対的蛍光増加量としてプロットされている。塗りつぶされていない青の四角：ＴＨＲ７；塗りつぶされた黒丸：ＴＨＲ１４／ＴＨＲ１５；塗りつぶされた赤の四角：ＴＨＲ１６／ＴＨＲ１７；塗りつぶされた青の三角：ＴＨＲ１８／ＴＨＲ１９；塗りつぶされていない赤の三角：ＴＨＲ３；塗りつぶされた緑の逆三角：ＴＨＲ４；塗りつぶされていない黒の三角：非特異的一本鎖ＤＮＡ。
【図１７】タンパク質検出用分子ビーコンを示す。ＤＮＡ結合タンパク質用分子ビーコン（Ａ）と、タンパク質の２つの異なるエピトープに対するアプタマーを基礎としたタンパク質検出用分子ビーコン（Ｂ）の設計の比較。
【図１８】アプタマー構築物のトロンビンへの結合を示す。（Ａ）５’フルオレセイン部位の蛍光強度の変化によって検出されたＧ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）（５０ｎＭ）の結合；実線は実験データの単純な１：１結合等温線への最適適合を示す。（Ｂ）１０倍過剰量の未修飾６０−１８［２９］アプタマーの存在下でのＧ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）の結合；実線は実験データの単純な１：１結合等温線への最適適合を示す。（Ｃ）トロンビンアプタマー構築物とフルオレセイン標識Ｇ１５Ｄアプタマー（ＴＨＲ２）の間の競合を検出する実験の概要。ＴＨＲ２（２００ｎＭ）の蛍光の強度が、競合物（２００ｎＭ）の存在下における結合ＴＨＲ２の％を決定するために用いられた。トロンビンは１５０  ｎＭであった。各棒の上の表示は、ＴＨＲ２アプタマーの親和性と比較した場合の競合物の相対的親和性（親和性定数の増加倍率で表示）を示す。（Ｄ）ゲルシフトアッセイによって検出されたＴＨＲ７アプタマー構築物のトロンビンへの結合。ＴＨＲ７−アプタマー複合体に対応するバンドの強度をトロンビン濃度の関数としてプロットした。挿入図：ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎによって染色されたゲルの画像。蛍光の変化（％）は１００×（Ｉ−Ｉ0）／Ｉ0として計算された。ここでＩおよびＩ0はそれぞれ所定濃度のトロンビンの存在および非存在下で観察される、希釈補正蛍光発光強度に対応する。
【図１９】トロンビンビーコンの設計を示す。Ｇ１５Ｄと６０−１８［２９］のアプタマーが５個のスペーサー１８単位を含むリンカーにより７ｂｐの蛍光団（あるいは消光剤）標識シグナル二本鎖に連結された。（Ａ）フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ構築物（ＴＨＲ２１）とダブシル標識６０−１８［２９］構築物（ＴＨＲ２０）のヌクレオチド配列。Ｘはスペーサー１８部位に対応する。（Ｂ）トロンビンビーコンによるシグナル機構。（Ｃ）トロンビンビーコンにトロンビンを加えた際に検出される蛍光シグナル変化。比較のため、ダブシル標識６０−１８［２９］構築物（ＴＨＲ２０）の非存在下での、フルオレセイン標識Ｇ１５Ｄ構築物（ＴＨＲ２１）のトロンビンによる滴定も示す（ドナーのみの曲線）。シグナル変化（％）は１００×（Ｉ−Ｉo）／Ｉ0として計算される。ここでＩおよびＩoはそれぞれ所定濃度のトロンビンの存在および非存在下で観察される、希釈補正蛍光発光強度に対応する。挿入図は主グラフの各データ点に対応する種々のトロンビン濃度において記録された蛍光発光スペクトルを示す。
【図２０】種々の組み合わせのドナー−アクセプター蛍光団を備えたトロンビンビーコンのバリエーションを示す。（Ａ）フルオレセイン−ダブシル；（Ｂ）フルオレセイン−テキサスレッド；（Ｃ）フルオレセイン−Ｃｙ５；（Ｄ）Ｃｙ３−Ｃｙ５。トロンビンの非存在下（黒線）および存在下（赤線）でのビーコンの発光スペクトルが示される。挿入図は対応するビーコンと表示された濃度のトロンビンを含むマイクロプレートのウェルの偽カラー画像を示す。画像はＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  ＦＸで得られたもので、以下の励起−発光設定を用いた：（Ａ）４８８ｎｍレーザー−５３０ｎｍバンドパスフィルター；（Ｂ）４８８ｎｍレーザー−６４０ｎｍバンドパスフィルター；（Ｃ）４８８ｎｍレーザー−６９５ｎｍバンドパスフィルター；（Ｄ）５３２ｎｍレーザー−６９５ｎｍバンドパスフィルター。蛍光値は恣意的単位（測定機器反応について補正）で表され、線形スケールにプロットされている。
【図２１】様々な組み合わせのドナー−アクセプターペアを有するビーコンの反応曲線。（Ａ）フルオレセイン−ダブシル；（Ｂ）フルオレセイン−テキサスレッド；（Ｃ）Ｃｙ３−Ｃｙ５；（Ｄ）フルオレセイン−Ｃｙ５；（Ｅ）ユーロピウムキレート−Ｃｙ５；（Ｆ）飽和トロンビン濃度において法事されたドナー−アクセプターペアについて観察されるシグナル変化の倍率。挿入図は低トロンビン濃度におけるデータ点の拡大図を示す。全ての実験において５ｎＭのドナーで標識され、５．５ｎＭのアクセプターで標識されたアプタマー構築物が用いられた。シグナル変化（倍率）は１００×（Ｉ−Ｉo）／Ｉ0として計算される。ここでＩおよびＩoはそれぞれ所定濃度のトロンビンの存在および非存在下で観察される、希釈補正蛍光発光強度に対応する。シグナル変化を計算する前に、ＩおよびＩoから緩衝液のバックグラウンドを差し引いた。
【図２２】トロンビンビーコンの感度のドナー−アクセプターペアへの依存を示す。低トロンビン濃度で、フルオレセイン−ダブシルペア（三角形）、フルオレセイン−テキサスレッドペア（逆三角形）、およびフルオレセイン−Ｃｙ５ペア（丸）で標識されたビーコンを使用して、１０ｎＭのドナーで標識され１１ｎＭのアクセプターで標識されたビーコンの反応が決定された。四つの独立した実験の平均と標準偏差が示されている。シグナル変化（倍率）図５と同様に計算された。
【図２３】トロンビンビーコンの再現性と安定性を示す。（Ａ）四つの異なるトロンビン濃度における、５つの独立したビーコンシグナルの決定が行われた。示されたデータは平均値＋／−標準偏差を示す。（Ｂ）四つのトロンビン濃度におけるトロンビンビーコンシグナルを最大２４時間にわたり測定した。示された数値は５回の独立した測定の平均値＋／−標準偏差を示す。本実験中では、５ｎＭのフルオレセイン標識アプタマー（ＴＨＲ２１）と５．５ｎＭのテキサスレッド標識アプタマー（ＴＨＲ２７）を含むビーコンを用いた。シグナル変化（倍率）の計算は、緩衝液バックグラウンドを差し引かなかった点を除けば図５と同様に行った。
【図２４】トロンビンビーコンのＺ’因子（Ｚ’−ｆａｃｔｏｒ）の決定を示す。プロットの中央のパネルは、グラフに示された実験（上半部のウェルは＋トロンビン、下半部のウェルは−トロンビン）に対応するマイクロプレートウェルの偽カラー画像を示す。実験では、５ｎＭのフルオレセイン標識アプタマー（ＴＨＲ２１）と５．５ｎＭのテキサスレッド標識アプタマー（ＴＨＲ２７）を用いた。シグナルは、ドナー励起によって測定されたアクセプターの対ドナー発光強度比（恣意的単位で表示）に対応する。
【図２５】複合体混合液中でのトロンビンの検出を表す。（Ａ）過剰量の無関係なタンパク質の存在下における１ｎＭのトロンビン濃度での、トロンビンビーコンの反応。示されたデータは４つの独立な実験の平均値と標準偏差である。（Ｂ）種々の量のトロンビンでスパイクされたＨｅＬａ細胞抽出物中でのトロンビンの検出。示されたデータは三つの独立な実験の平均値と標準偏差である。細胞抽出物中のトロンビン濃度は：１．８８ｎＭ（淡灰色の棒）；  ３．７５  ｎＭ（濃灰色の棒）；  ７．５  ｎＭ（黒棒）。ビーコン混合液単体のシグナルは、細胞抽出物（トロンビン未添加）がある時（図には示されていない）より約２５％低く、細胞抽出物および特異的競合物の存在下で観察されたシグナルとほぼ同じであった。（Ｃ）トロンビンビーコンで観察された、Ｘａ因子によって触媒されるプロトロンビンからトロンビンへの変換の時間的経過。（Ｄ）血漿中でのトロンビンの検出。示されたデータは四つの独立な実験の平均値と標準偏差である。用いられた血漿の体積（アッセイ混合液２０μｌあたり）は：０．００５μｌ（淡灰色棒）；０．０１５μｌ（濃灰色棒）；０．０４５μｌ（黒棒）。「特異的」は未標識トロンビンアプタマー競合物を指し（ＴＨＲ７）、「非特異的」は３０ヌクレオチド長のランダム配列のＤＮＡを指す。パネルＡ、Ｂ、およびＤ中のシグナルは、ドナー励起によって測定されたアクセプターの対ドナー発光強度比（恣意的単位で表示）を示す。ビーコン混合液単体（ＡとＤ）および細胞抽出物が存在する時のビーコン混合液（Ｂ）、の値が１となるようにシグナルを規格化した。パネルＣは生のアクセプター蛍光強度（アクセプター励起下）を示す。
【図２６】センサーのバリエーションを示す。
【図２７】図２６のＦに示されたセンサー設計の実験的証明を示す。（Ａ）センサー機能の原理。（Ｂ）ＤＮＡ結合タンパク質の濃度を増加させた場合の、ドナーとアクセプターの標識センサー成分の混合物に対する滴定の際の、感作アクセプターの蛍光の増加。
【図２８】図２６のＧに示されたセンサー設計の機能の実験的証明を示す。（Ａ）センサー機能の原理。（Ｂ）２つのドナーおよびアクセプター標識センサー成分の混合物（−で示されるスペクトル）にセンサー要素に相補的な２つの異なる配列エレメントを含む一本鎖ＤＮＡを加えた場合の感作アクセプター蛍光の増加（＋で表される発光スペクトル）。
【図２９】目標大分子を認識する単一の要素に基づいたアッセイと比べた場合の、我々のセンサー設計の有する増加した特異的の実験的証明を示す。
【図３０】図２６に示されたセンサー用アプタマーを作る方法を示す。
【図３１】Ｇ１５Ｄアプタマーの結合部位とは異なるエピトープにおいてトロンビンに結合するアプタマーの選択の概要を示す。
【図３２】図３１パネルＣのクローン２０−２６中の配列に対応する配列を含む、テキサスレッド標識ＴＨＲ２７およびフルオレセイン標識ＴＨＲ３５あるいはＴＨＲ３６を含む機能的トロンビンセンサーの証明を示す。
【図３３】２つの異なるエピトープにおいてトロンビンと結合する２つのアプタマーの同時選択の概要を示す。
【図３４】ＣＲＰタンパク質と、該タンパク質のＤＮＡ結合部位でない部位で結合するアプタマーの選択の概要を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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