(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスの３’非翻訳領域の部分に対応する、選択されたオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、これらのオリゴヌクレオチドを用いて、試料中のＨＣＶ核酸を検出する方法、および定量化する方法も含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号２４、配列番号４１、配列番号４３、および配列番号４２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項２】
配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号２４、配列番号４１、配列番号４３、および配列番号４２からなる群から選択されたヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸。
【請求項３】
配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号２４、配列番号４１、配列番号４３、および配列番号４２からなる群から選択されたヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸であって、前記ヌクレオチド配列が、１つから４つまでのミスマッチをさらに有し、ＮＡＳＢＡハイブリダイゼーション条件下で、ＨＣＶの３’ＮＴＲにハイブリッド形成する単離された核酸。
【請求項４】
配列番号３７に記載のヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項５】
配列番号３７に記載のヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸。
【請求項６】
（ａ）５’末端および３’末端を有するタグオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む、単離された核酸であって、タグオリゴヌクレオチドが、無作為に選択された、ＨＣＶとは異種の約１８から約２３ヌクレオチドからなり、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている単離された核酸。
【請求項７】
タグオリゴヌクレオチドが、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項８】
（ａ）二本鎖形態である場合にＴ７プロモーターとして機能できるプロモーターオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む、単離された核酸であって、プロモーターオリゴヌクレオチドが、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている単離された核酸。
【請求項９】
プロモーターオリゴヌクレオチドが、配列番号３８に記載の核酸配列を有する、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
プロモーターオリゴヌクレオチドが、配列番号２３に記載の核酸配列を有する、請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法であって、
ａ．配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４；配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を増幅のプライマーとして利用し、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成させるステップと、
ｂ．増幅された産物の存在を検出するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
増幅が、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含む第一のプライマーと、配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む第二のプライマーとを利用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
二本鎖形態である場合にＴ７プロモーターとして機能できるプロモーターオリゴヌクレオチドを、第一のプライマーがその５’末端にさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔ７プロモーターが配列番号３８である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
増幅が、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む第一のプライマーと、配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む第二のプライマーとを利用する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
二本鎖形態である場合にＴ７プロモーターとして機能できるプロモーターオリゴヌクレオチドを、第一のプライマーがその５’末端にさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
増幅が、第一のプライマーおよび第二のプライマーを利用し、前記第二のプライマーが、（ａ）５’末端および３’末端を有するタグオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含み、タグオリゴヌクレオチドが、無作為に選択された、ＨＣＶとは異種の約１０から約２５ヌクレオチドからなり、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
増幅が、第一のプライマーおよび第二のプライマーを利用し、前記第一のプライマーが、（ａ）二本鎖形態である場合にＴ７プロモーターとして機能できるプロモーターオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含み、プロモーターオリゴヌクレオチドが、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
検出可能なプローブを増幅産物にハイブリッド形成させることによって、検出が行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
検出可能なプローブが、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号４１、配列番号４３、および配列番号４４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
固定された捕捉プローブ上に増幅産物を捕捉することによって検出が行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
捕捉プローブが、配列番号１９からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
増幅が、等温増幅または温度サイクリング増幅によって行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法であって、
ａ．ＨＣＶの３’ＮＴＲにおける選択された部分を含む標的核酸を増幅するステップと、
ｂ．配列番号２１、配列番号２２；配列番号１９、配列番号２４、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプローブを利用して、増幅された産物の存在を検出するステップと
を含む方法。
【請求項２５】
試料中のＨＣＶ核酸の存在を検出する方法であって、配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を、選択的なハイブリダイゼーション条件下で試料とハイブリッド形成させるステップを含む方法。
【請求項２６】
試料中のＨＣＶ核酸の量を定量化する方法であって、
ａ．配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４；配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を増幅のプライマーとして利用し、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成させるステップと、
ｂ．増幅された産物の量を定量化するステップと
を含む方法。
【請求項２７】
増幅が、配列番号１１および配列番号１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む第一のプライマーと、配列番号８に記載のヌクレオチド配列を含む第二のプライマーとを利用する、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年１月２３日出願の米国特許仮出願第６０／５３８，８１５号、２００４年１月２３日出願の米国特許仮出願第６０／５３８，８１４号、および２００４年１月２３日出願の米国特許仮出願第６０／５３８，８１６号に基づく権利を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の検出および／または定量化に有用な、ＨＣＶの３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）に結合するオリゴヌクレオチドに関する。３’ＮＴＲを標的領域として利用する、ＨＣＶの検出、捕捉、および増幅に有用な核酸アッセイの方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
１９７０年代における、Ａ型肝炎ウイルスおよびＢ型肝炎ウイルスの診断検査の開発の後、輸血に伴う非Ａ型、非Ｂ型肝炎の症例の大部分の原因となっていた非経口的に伝搬される別の病原体が認識された。この病原体の同定は、極めて困難なものであった（ＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒおよびＬｏｈｍａｎｎ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１６３１−１６４８（２０００年））。組換えＤＮＡの到来によって、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と名付けられたウイルスのゲノムがクローニングされた（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：３５９−３６２（１９８９年））。生物物質がごくわずかであり、かつＲＮＡ複製が低効率なので、そのＲＮＡを研究するのは困難であった（ＳｈｉおよびＬａｉ、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５８：１２７６−１２９５（２００１年））。
【０００４】
核酸を研究するための一般的な技法が数多く知られている。必要な場合には、核酸配列を酵素で増幅することによって、所望の核酸配列を検出する能力が強化されるであろう。一般に、現在知られている増幅スキームは、その酵素増幅反応が、変性温度と、プライマーアニーリング温度と、アンプリコン（核酸の酵素増幅産物）合成温度との間の連続的な温度のサイクルによって駆動されているか、あるいは、酵素増幅過程を通して温度が一定に保たれている（等温増幅）かに基づいて、大きく分けて２つのクラスに分類することができる。典型的なサイクル核酸増幅技法（温度サイクリング）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）である。そのような反応の詳細なプロトコールは、例えば、分子生物学の簡潔プロトコール(Short Protocols in Molecular Biology)第二版、分子生物学の現在のプロトコール由来の方法概論(A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology)（Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社、ニューヨーク、１９９２年）第１５章に論じられている。等温性である反応には、転写介在増幅（transcription-mediated amplification，ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence-based amplification，ＮＡＳＢＡ）、および鎖置換増幅（strand displacement amplification，ＳＤＡ）が含まれる。
【０００５】
米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ）；第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓ）；および第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、ＤＮＡポリメラーゼ、相補的プライマー分子および熱反応の反復サイクルを利用し、標的核酸分子を指数関数的に複製することについて記載している。等温性の標的増幅方法には、転写ベースの増幅方法が含まれ、この場合、増幅の初期段階でＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列がプライマー伸長産物中に組み込まれ（ＷＯ８９／０１０５０）、さらに、標的配列、または標的相補配列は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド中間体産物におけるＲＮＡ鎖の転写ステップおよび消化によって増幅される。例えば、米国特許第５，１６９，７６６号および第４，７８６，６００号を参照されたい。これらの方法には、転写介在増幅（ＴＭＡ）、自己保持配列複製（self-sustained sequence replication，３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、およびそれらの変形形態が含まれる。例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１８７４−１８７８（１９９０年）；米国特許第５，７６６，８４９号、第５，３９９，４９１号；第５，４８０，７８４号；第５，７６６，８４９号；第５，４６６，５８６号（ＮＡＳＢＡ）；第５，４０９，８１８号（ＮＡＳＢＡ）；第５，５５４，５１７号（ＮＡＳＢＡ）；第６，０６３，６０３号（ＮＡＳＢＡ）；第５，１３０，２３８号（ＮＡＳＢＡ）；およびおよび第５，６５４，１４２号（ＴＭＡ）；ならびに第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）；第５，４０９，８１８号（Ｄａｖｅｙら）；第５，６５４，１４２号（Ｋｉｅｖｉｔｓ）；および第６，３１２，９２８号（Ｖａｎ  Ｇｅｍｅｎら）（核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）技法）を参照されたい。米国特許第５，７９２，６０７号（Ｂａｃｋｍａｎ）は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）と呼ばれる増幅方法について記載している。米国特許第５，７４４，３１１号（Ｆｒａｉｓｅｒ）；第５，６４８，２１１号（Ｆｒａｉｓｅｒ）および第５，６３１，１４７号（Ｌｏｈｍａｎ）は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）をベースとした等温増幅系について記載している。他のアプローチには、Ｑβレプリカーゼ、鎖置換アッセイ（ＳＤＡ）、転写介在増幅，転写介在増幅ｉｓｏＣＲサイクリングプローブ技術、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）およびカスケードローリングサークル増幅（ＣＲＣＡ）が含まれる。核酸増幅について記載しているさらなる米国特許文書には、米国特許第４，８７６，１８７号；第５，０３０，５５７号；第５，３９９，４９１号；第５，４８５，１８４号；第５，５５４，５１７号；第５，４３７，９９０号；第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号が含まれる。
【０００６】
核酸ハイブリダイゼーション技術は、多数の出版物の中でも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング実験マニュアル(Molecular Cloning A Laboratory Manual)」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年１２月；米国特許第４，５６３，４１９号（Ｒａｎｋｉ）および第４，８５１，３３０号（Ｋｏｈｎｅ）、ならびに、Ｄｕｎｎら、Ｃｅｌｌ  １２、２３〜２６頁（１９７８年）に記載されている。
【０００７】
核酸を利用した検出方法も知られている。核酸は、様々な検出目的でしばしば標識される。例えば、米国特許第４，４８６，５３９号（Ｋｏｕｒｌｉｓｋｙ）；第４，４１１，９５５号（Ｗａｒｄ）；第４，８８２，２６９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）および第４，２１３，８９３号（Ｃａｒｒｉｃｏ）に記載の方法は、特定の核酸配列を検出するための標識された検出プローブの調製を例示する。さらに、抽出された核酸をプローブに曝露する前または後に、磁性ビーズなどの基質に結合した「捕捉プローブ」を用いて、標的捕捉手段によって直接的または間接的に標的核酸を固定することができる。標的捕捉方法の例は、Ｒａｎｋｉら、米国特許第４，４８６，５３９号、およびＳｔａｂｉｎｓｋｙ、米国特許第４，７５１，１７７号に記載されている。プローブのさらに別の使用は、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号；第５，４８７，９７２号；第５，８０４，３７５号；第５，９９４，０７６号に記載されている。
【０００８】
ＨＣＶは、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）において他から明確に識別されるヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）と呼ばれる属の唯一のメンバーとして分類されている。ＨＣＶは、長さ約９６００ヌクレオチドのプラス鎖ＲＮＡを有する、エンベロープに覆われた粒子である。ゲノムは、タンパク質分解によって１セットの異なる産物に切断されるポリプロテインをコードする単一の長いオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。長さ約３４０ヌクレオチドの５’非翻訳領域（ＮＴＲ）は、ＨＣＶ  ＯＲＦの翻訳のための内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）として機能する（Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１４７６−１４８３（１９９２年）；Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３３３８−３３４４（１９９３年））。３’ＮＴＲは、さらに最近になってから研究された（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３６３−３３７１（１９９６年）；Ｔａｎａｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２１５：７４４−７４９（１９９５年）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３０７−３３１２（１９９６年）；Ｙａｍａｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２３：２５５−２６１（１９９６年））。ＨＣＶの３’非翻訳領域は、４つのエレメント（プラス鎖センス、５’から３’への方向）、すなわち、（ｉ）遺伝子型相互でかなりの可変性を有する短い配列、（ｉｉ）ホモ重合体ポリ（Ｕ）領域、（ｉｉｉ）分散したＣ残基を伴った、主としてＵからなるポリピリミジンストレッチ、（ｉｖ）９８塩基の新規の配列（Ｘ−領域）を含むことが判明した。この後者のヌクレオチド配列は、ヒトゲノムＤＮＡの中には存在せず、ＨＣＶ遺伝子型の間で高度に保存されている（Ｋｏｌｙｋｈａｌｏｖら（１９９６年）；ＰａｖｉｏおよびＬａｉ、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．２８（３）：２８７−３０４（２００３年））。ほとんどのＨＣＶ感染が持続的であり、全症例の約５０％が慢性肝炎となり、これから、慢性活動性肝炎、肝硬変、および原発性肝細胞癌へ進行することがある。さらに、ＨＣＶは世界中に広がっており、感染個体の数は約１億７０００万人にのぼると推算されている（ＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒおよびＬｏｈｍａｎｎ（２０００年））。したがって、感染個体を特定する決定的な診断試験が必要とされている。さらに、患者のＨＣＶ遺伝子型決定が、診断および疫学の研究、ならびにＨＣＶの自然史および治療の研究に必須である。
【０００９】
ＨＣＶ  ＲＮＡの検出は、急性および慢性のＨＣＶ感染に利用される診断試験である。しかし、Ｃ型肝炎患者におけるＨＣＶ複製が低レベルであったり、感染細胞の数が少なかったりすることによって、容易でないことが多い（ＳｈｉおよびＬａｉ（２０００年））。最も定性的で定量的な診断検査は、ＨＣＶゲノムの最も保存されている領域である５’−ＵＴＲを標的としたＲＴＰＣＲである。しかし、この方法の感度には、おそらくＲＮＡ２次構造の領域における、誤ったプライミングの問題が伴うと報告されている（ＳｈｉおよびＬａｉ（２０００年））。この問題は、タグ付きプライマーの使用、または耐熱性逆転写酵素の使用によって部分的に対処されている（Ｌａｎｆｏｒｄ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０２：６０６−６１４（１９９４年））。コア遺伝子およびＮＳ５Ｂ遺伝子は、比較的保存されており、かつ、顕著な２次構造を含有していないので、これらも様々な検出法で利用されている。
【００１０】
３’−ＵＴＲのＸ領域は、ＨＣＶゲノム中で高度に保存されているもう１つの領域であるが、この領域は顕著な高次構造を有する。３’ＨＣＶ  ＮＴＲは、少なくとも２つの理由、すなわち、それが安定性の高い２次構造を形成すること、そして、このＮＴＲが極めて小さいことから、増幅が困難な標的であると考えられている。この領域がＨＣＶ  ＲＮＡの検出に用いられなかったのは、少なくとも一部は、確かに確立されている、５’−ＵＴＲ配列ベースの試験にまさる実用的な利点がなかったことによる（ＳｈｉおよびＬａｉ（２０００年））。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、ＨＣＶの存在の検出に、より有用かつ信頼性の高い結果を提供するプライマーおよびプローブの設計が明らかに必要である。詳細には、３’ＮＴＲの２次構造、型特異性、およびハイブリダイゼーションの過程に影響を与えうるであろうパリンドローム配列の問題の解消を目的としたプライマーおよびプローブ、ならびに、ＨＣＶ核酸の検出、捕捉、および／または増幅の改善された手段が必要である。本発明は、そのような問題の解決を補助することに対するこれらの必要性に対処するオリゴヌクレオチドを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、ＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応する特定の核酸配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、Ｃ型肝炎ウイルス由来の単離された核酸を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、ＨＣＶ核酸の存在を検出するのに有用である。詳細には、本発明は配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４；配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。
【００１３】
本発明は、（ａ）５’末端および３’末端を有するタグオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、ＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応するヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む単離された核酸をさらに提供し、その際、タグオリゴヌクレオチドは、無作為に選択された、ＨＣＶとは異種の約１８から約２３ヌクレオチドからなり、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている。より詳細には、本発明は、（ａ）５’末端および３’末端を有するタグオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む単離された核酸をさらに提供し、その際、タグオリゴヌクレオチドは、無作為に選択された、ＨＣＶとは異種の約１８から約２３ヌクレオチドからなり、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている。
【００１４】
本発明は、（ａ）ＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応する特定の核酸配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を増幅のプライマーとして利用し、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成させるステップと、（ｂ）増幅された産物の存在を検出するステップとを含む、核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法をさらに提供する。詳細には、本発明は、（ａ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４；配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を、増幅のプライマーとして利用して、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成させるステップと、（ｂ）増幅された産物の存在を検出するステップとを含む、核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法をさらに提供する。本発明は、（ａ）ＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応する特定の核酸配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を増幅のプライマーとして利用し、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成させるステップと、（ｂ）増幅された産物の量を定量化するステップとを含む、試料中のＨＣＶ核酸の量を定量化する方法をさらに提供する。本発明は、（ａ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４；配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号４１、配列番号４２、および配列番号４３からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を、増幅のプライマーとして利用して、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成させるステップと、（ｂ）増幅された産物の量を定量化するステップとを含む、試料中のＨＣＶ核酸の量を定量化する方法を明確にさらに提供する。
【００１５】
さらに、（ａ）ＨＣＶの３’ＮＴＲの選択された部分を含む標的核酸を増幅するステップと、（ｂ）配列番号２１、配列番号２２；配列番号１９、配列番号２４、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプローブを利用して、増幅された産物の存在を検出するステップとを含む、核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法も提供する。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
３’ＨＣＶ  ＮＴＲは、少なくとも２つの理由から、増幅が困難な標的と考えられている。第一に、それは、安定性の高い２次構造を形成する。分子内対合（潜在的な二本鎖（ステム）領域およびパリンドローム領域を含める）は、プライマー結合、プライマー伸長、およびプローブ結合に困難を引き起こすと予測される。第二に、このＮＴＲは極めて小さく（９８ｎｔ）、その結果、プライマーおよびプローブの選択が著しく制限され、かつ、アンプリコンの長さが最適以下となる（理想的にはアンプリコンは＞１００ｎｔ）。温度を上昇させることによって２次構造を低減させる（ＰＣＲのように）ことができないことによって、これが、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡなどの等温増幅法には特に問題となっている。本発明は、これらの難問の克服を補助するプライマーおよびプローブを提供する。Ｃ型肝炎ウイルスの３’ＮＴＲは、以下の配列を有する：
遺伝子型１：
ＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＣＵＵＡＧＣＣＣＵＡＧＵＣＡＣＧＧＣＵＡＧＣＵＧＵＧＡＡＡＧＧＵＣＣＧＵＧＡＧＣＣＧＣＡＵＧＡＣＵＧＣＡＧＡＧＡＧＵＧＣＵＧＡＵＡＣＵＧＧＣＣＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＣＡＵＧＵ（配列番号２５）
遺伝子型２：
ＧＧＵＧＧＣＵＣＣＡＵＣＵＵＡＧＣＣＣＵＡＧＵＣＡＣＧＧＣＵＡＧＣＵＧＵＧＡＡＡＧＧＵＣＣＧＵＧＡＧＣＣＧＣＡＵＧＡＣＵＧＣＡＧＡＧＡＧＵＧＣＣＧＵＡＡＣＵＧＧＵＣＵＣＵＣＵＧＣＡＧＡＵＣＡＵＧＵ（配列番号２６）
【００１７】
遺伝子型１と遺伝子型２との間の配列相違で最も一般的なものが下線によって示されている。この領域は高度に保存されているが、個々の単離株には、他のヌクレオチドの相違が存在することもある。
【００１８】
上述の通り、本発明は、選択された試料中のＨＣＶ核酸の存在を検出するか、あるいは量を定量化するアッセイで特に有用であることが判明している、Ｃ型肝炎ウイルスの３’ＮＴＲに由来するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１９】
本出願を通して、核酸配列は、「ｎｔ」範囲の数を含む記述子を有することがある。そのような記述子は、９８ヌクレオチドの３’ＨＣＶ  ＮＴＲの中でその配列が対応する箇所を示し、ウイルスゲノムに沿って５’−３’方向に読んで、９８ヌクレオチドの最初のものは、数「１」を有する。例えば、次のオリゴヌクレオチド、すなわち「１２０６（ｎｔ５〜２４）」は、１２０６と名付けられたオリゴヌクレオチド配列が、３’ＮＴＲのヌクレオチド５〜２４に対応する核酸配列を有することを示す。さらに、チミジンを含む配列に関する言及は、特定のアッセイに有用である場合に、チミジンの代わりにウリジンを利用するように、容易に適合させられることに留意されたい。さらに、ヌクレオチドを化学基の添加、あるいは、類似体（例えば、２’−Ｏ−メトキシ型）による個々の残基の置換によって修飾してもよい。他のそのような修飾ヌクレオチドは、当技術分野で知られており、一部の例には、ヒドロキシメチルヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、フッ化ヌクレオチド、アルファチオリン酸ヌクレオチド、アミン修飾ヌクレオチド、メトキシヌクレオチド、カルボキシメチルヌクレオチド、チオヌクレオチド、イノシン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、ワイブトシン、ケウオシン、Ｃ７ｄＧＴＰが含まれる。他の修飾ヌクレオチドは、米国特許第５，４０５，９５０号および第５，６３３，３６４号（共に、ＭｏｃｋおよびＬｏｖｅｒｎ）に見出される。
【００２０】
本発明は、特に、ＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応する特定の核酸配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、Ｃ型肝炎ウイルス由来の単離された核酸を提供する。詳細には、本発明は、配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。本発明は、配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されたヌクレオチド配列から本質的になる単離された核酸も提供する。プライマーおよびプローブがＨＣＶ３’ＮＴＲにハイブリッド形成するのに有用な標的領域の局在性を考慮すると、提供された配列からのわずかな改変、一次配列のミスマッチは、それらが依然として、適切なハイブリダイゼーション条件下で、ＨＣＶの標的領域にハイブリッド形成するという条件で、有用であると企図される。したがって、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、列挙したヌクレオチド配列からの１つから４つまでのミスマッチをさらに有する場合があり、その場合、このオリゴヌクレオチドは、ＮＡＳＢＡハイブリダイゼーション条件下でＨＣＶの３’ＮＴＲにハイブリッド形成するものである。ＮＡＳＢＡ条件は、当技術分野で知られており、これには、例えば、約４１℃および約７０ｍＭ  ＫＣｌによって得られるストリンジェンシーを生み出すパラメーターが含まれる場合がある（例えば、米国特許第５，４６６，５８６号；第５，４０９，８１８号；第５，５５４，５１７号；第６，０６３，６０３号；および第５，１３０，２３８号；Ｄｅｉｍａｎ  Ｂ，ｖａｎ  Ａａｒｌｅ  Ｐ，Ｓｉｌｌｅｋｅｎｓ  Ｐ「核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）の特性と応用(Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA))」Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００２年２月；２０（２）：１６３−７９）。さらに、そのような配列は、ＨＣＶ３”ＮＴＲゲノム配列からの１つから４つまでのミスマッチを有する場合があり、その場合、このオリゴヌクレオチ
ドは、ＮＡＳＢＡハイブリダイゼーション条件下でＨＣＶの３’ＮＴＲにハイブリッド形成するものである。ミスマッチの例は本明細書に例示されている。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、試料中のＨＣＶ核酸を検出するためのプライマーおよび／またはプローブとして利用することができる。本出願を通して、特定のオリゴヌクレオチドを、特定のタイプ（例えば、Ｐ１タイプ（二本鎖形態である場合にプロモーター領域を提供する配列に連結される）または、Ｐ２タイプ（単独で使用されるか、あるいはタグオリゴヌクレオチドに連結される））のプライマーとして、あるいはプローブとしての使用で例示する場合があるが、そのような使用によって、そのオリゴヌクレオチドが有用でありうる使用を制限するべきでない。例えば、Ｐ１プライマーとして例示されたプライマーが、Ｐ２タイプのプライマーとして有用である場合もある。さらに、プローブとしての使用に例示されたオリゴヌクレオチドが、他のスタイルのプローブ（例えば、異なった標識、または捕捉オリゴヌクレオチドもしくはそのプローブタイプが機能するための他の構造を有する）のためのベースＨＣＶハイブリッド形成配列として有用である場合もある。
【００２２】
本発明は、プライマーの５’末端に無関係の配列を付加することを介した、アンプリコンの長さの変調を提供する。そのような無関係の配列は、本明細書におけるＰ２プライマーなど、非プロモーター連結プライマーに特に有用である。本発明者らの結果は、本明細書の教示に基づき、本発明を用いて、効率の高いプローブベースの検出用に、アンプリコンの長さを変調し、さらに、その２次構造を変調することができることを実証する。
【００２３】
したがって本発明は、（ａ）５’末端および３’末端を有するタグオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、かつＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応するヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む、単離された核酸をさらに提供し、その際、タグオリゴヌクレオチドは、無作為に選択された、ＨＣＶとは異種の約１８から約２３ヌクレオチドからなり、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている。より詳細には、本発明は、（ａ）５’末端および３’末端を有するタグオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む、単離された核酸をさらに提供し、その際、タグオリゴヌクレオチドは、無作為に選択された、ＨＣＶとは異種の約１８から約２３ヌクレオチドからなり、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている。
【００２４】
好ましい実施形態では、タグオリゴヌクレオチド（または「テール」）は標的核酸とは異種の配列であり、より好ましくは、ＨＣＶのいかなる領域に対しても異種の配列である。タグオリゴヌクレオチドは、約１８〜２３ヌクレオチドの任意に選択された異種配列を含むことができる。当業者ならば、（プロモーターを保持しない）プライマーを用いて、増幅反応からの検出可能なアンプリコンを増加させるのに有用な追加の検出テールを生成させるために、これらの教示に基づいて、約２０量体のオリゴヌクレオチド「テール」を容易に設計することができる。テールは、標的核酸とは異種の配列からなることが好ましい。オリゴヌクレオチドテールは、長さが約１８から約２３ヌクレオチドまでのものでよく、好ましくは長さが約１９〜２２ヌクレオチド、より好ましくは長さが約２０〜２１ヌクレオチド、そして最も好ましくは長さが２０ヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドテールの一例は、配列番号９に記載の「ＥＣＬ（電気化学ルミネセンス）テール」である。
【００２５】
特に好ましい実施形態では、タグオリゴヌクレオチドがＥＣＬタグ、より詳細には、配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは配列番号８に記載の核酸配列を有するプライマーの５’末端にその３’末端で連結したタグオリゴヌクレオチドを含む。したがって、本発明は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列を含む、好ましい単離された核酸を提供し、このヌクレオチド配列は、配列番号８に記載のヌクレオチド配列を有するプライマー（本明細書では「１２５９」と呼ばれる）の５’末端にその３’末端で連結したＥＣＬタグからなる。
【００２６】
本発明は、（ａ）二本鎖形態である場合にＴ７プロモーターとして機能できるプロモーターオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、ＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応するヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む、単離された核酸をさらに提供する。より詳細には、本発明は、（ａ）二本鎖形態である場合にＴ７プロモーターとして機能できるプロモーターオリゴヌクレオチドと、（ｂ）５’末端および３’末端を有し、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプライマー核酸とを含む、単離された核酸を提供し、その際、プロモーターオリゴヌクレオチドは、その３’末端でプライマー核酸の５’末端に連結されている。
【００２７】
Ｔ７プロモーターの核酸配列は当業者に周知であり、本明細書では特定の配列が例示されているが、軽微の差異を有する機能的な等価物を設計することもできる。好ましい実施形態では、配列番号３８に記載の配列がＴ７プロモーター配列である。さらに別の例を、配列番号２３によって提供する。Ｔ７プロモーター配列を有するオリゴヌクレオチドは、プライマーとして有用であり、そのように利用される場合、本明細書ではこれを「Ｐ１プライマー」、「Ｐ１タイププライマー」、「プロモーターオリゴヌクレオチド」、または、単に「Ｐ１」と呼ぶ。転写ベースの増幅反応（例えば、ＮＡＳＢＡ、ＴＭＡ）では、これらのＴ７プロモーター配列は、当技術分野で知られている通り、増幅反応で、標的の鋳型、この場合はＨＣＶからのＲＮＡ転写のプライミングを行う機能を有する。本明細書で「Ｐ１」タイプのものとして例示するプライマーのヌクレオチド配列は、通常、Ｔ７プロモーター配列なしで示すが、実験ではそのようなＴ７プロモーター配列が存在する。
【００２８】
核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法であって、（ａ）ＨＣＶの３’ＮＴＲにおける選択された部分を含む標的核酸を増幅するステップと、（ｂ）配列番号２１、配列番号２２；配列番号１９、配列番号２４、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むプローブを利用して、増幅された産物の存在を検出するステップとを含む方法も提供する。そのような方法では、いかなる有用なＨＣＶプライマーを利用してもよく、それらの例は本明細書に提示されている。アッセイ条件は、当業者に知られており、本明細書に例示されている。
【００２９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、広範な用途を持ちうる。それらは、例えば、捕捉反応および検出反応におけるプローブとして、そして、様々な増幅反応におけるプライマーおよび／またはプローブとして利用することができる。本明細書では、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡに例示される３’ＨＣＶ増幅で用いられるプライマーおよびプローブを提示する。これらの方法は両方とも、ＲＮＡアンプリコンを生成するのに等温増幅を用い、逆転写酵素およびＴ７ポリメラーゼを併用してこれを行う。これらの類似性のため、これら２つのシステムのプライマーおよびプローブは、何らかの機能の類似性を共有すると予測され、実験（実施例を参照）もこれを支持する。
【００３０】
本発明は、（ａ）ＨＣＶの３’ＮＴＲの一部に対応する特定の核酸配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を増幅のプライマーとして利用し、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成するステップと、（ｂ）増幅された産物の存在を検出するステップとを含む、核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法をさらに提供する。詳細には、本発明は、（ａ）配列番号８、配列番号１１、配列番号１５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、および配列番号３２からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸を、増幅のプライマーとして利用して、選択されたＨＣＶ核酸を増幅して、ＨＣＶ増幅産物を形成するステップと、（ｂ）増幅された産物の存在を検出するステップとを含む、核酸試料中のＨＣＶの存在をアッセイする方法を提供する。
【００３１】
核酸ハイブリダイゼーション技法および条件は、当業者に知られており、例えば、他の多くの出版物の中でも、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング実験マニュアル」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年１２月；米国特許第４，５６３，４１９号（Ｒａｎｋｉ）および第４，８５１，３３０号（Ｋｏｈｎｅ）、ならびに、Ｄｕｎｎら、Ｃｅｌｌ  １２、２３〜２６頁（１９７８年）に記載されている。ハイブリダイゼーション反応の様々な改変が、当技術分野で知られており、それらには、１つまたは複数の反応ステップで固体支持体上にプローブを捕捉する溶液中ハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションが含まれる。
【００３２】
核酸を利用する検出法も知られている。検出に用いるために核酸を標識することができる。例えば、１つまたは複数の特定のオリゴヌクレオチドの塩基、糖、またはリン酸部分に、直接的に、あるいはリンカーアームを介して間接的に、検出可能な標識を結合させる（例えば、米国特許第４，４８６，５３９号（Ｋｏｕｒｌｉｓｋｙ）；第４，４１１，９５５号（Ｗａｒｄ）；第４，８８２，２６９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、および第４，２１３，８９３号（Ｃａｒｒｉｃｏ）を参照のこと）。当技術分野で知られている標識には、蛍光色素、放射性同位元素、色素、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、およびルミネッセンスまたは化学発光分子が含まれる。例えば、検出可能な標識プローブは、増幅反応中またはその後に、増幅された核酸反応生成物すなわちアンプリコンに結合させるのに使用できる。特に有用なプローブは、利用されるアッセイおよびプローブタイプに好ましい条件下で標的を検出できるものであり、典型的なハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって教示されたものなど、緊縮性のハイブリダイゼーション条件でありうる。
【００３３】
本発明は、ＨＣＶ３’末端の９８塩基非翻訳領域を効率的に捕捉、増幅、および検出するためのプライマーおよびプローブ設計に関する。このプライマー設計は、ＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ、ＳＤＡ、ＰＣＲ、および他の増幅法に適用できる。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の検出および定量化アッセイに有用である。増幅は、温度サイクリング法によって行うことも、等温法によって行うこともできる。本発明のオリゴヌクレオチドは、転写ベースの増幅法、例えばＮＡＳＢＡおよびＴＭＡで特に有用であり、かつ、それらで使用されることが好ましい。転写ベースの増幅法は、入力物質として、一本鎖ＤＮＡも、二本鎖ＤＮＡも同様に用いることができるが、一本鎖ＲＮＡを入力物質として利用することが多い。標的配列の３’末端および５’末端の両方に追加の配列を備えた一本鎖ＲＮＡ（「プラス」センス）を含む試料で転写ベースの増幅法を行う場合、この方法で使用するのが好都合な１対のオリゴヌクレオチドは、（１）標的配列の３末端にハイブリッド形成できる第一のオリゴヌクレオチド（しばしば、「プロモーターオリゴヌクレオチド」または「Ｐ１」プライマーと呼ばれる）であって、プロモーター（好ましくはＴ７プロモーター）の配列がその５’末端に付加されているオリゴヌクレオチド（このオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部分は、入力物質として用いられるプラスＲＮＡの反対の極性を有する）と；（２）標的配列の３’末端を含む第二のオリゴヌクレオチド（「プライマー」）（このオリゴヌクレオチドは、プラスＲＮＡと同じ極性を有する）とを含むものでありうる。
【００３４】
適切な活性を有するすべての酵素と共に、そのような１対のオリゴヌクレオチドと、必要なリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの十分な供給とを１つの反応混合物中に入れ、適当な条件下（すなわち、適切な緩衝条件および適切な温度）（そのような条件は当技術分野で知られている）に十分な時間維持した際に、連続的な等温増幅反応が開始するであろう。
【００３５】
非転写ベースの方法で使用する場合、第一のプライマーは、ここに提示したオリゴヌクレオチドでよく、また、Ｔ７プロモーター配列をもたないものでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、いかなる増幅法にも、アンプリコンを検出するためのプローブを提供できる。本明細書に提示したプローブ設計は、標的捕捉（試料調製）用、アンプリコン捕捉用、およびアンプリコン検出用のものであり、これらの方法は当技術分野で知られている。様々な検出法、すなわち、ＨＰＡ、ＴＡＱｍａｎ、分子ビーコン、およびサンドウィッチハイブリダイゼーションのためのプローブ設計も発見されている。これらの設計は、アンプリコンへのハイブリダイゼーションによる、効率的な捕捉および検出を実証する。
【実施例】
【００３６】
本出願中、中でも実施例の中で、利用するプライマーをＰ１プライマーまたはＰ２プライマーと呼ぶことがある。この用語法が示すのは、単純に、これらの実施例におけるＮＡＳＢＡまたはＴＭＡ反応の中で、Ｐ１プライマーは、その５’末端に付加されたＴ７プロモーター配列を有するプライマー（プロモータープライマー）であり、Ｐ２プライマーは、それをもたないプライマーであるということである。この用語法は限定的なものではない。
【００３７】
（３’ＨＣＶのＴＭＡ増幅および検出）
ＨＣＶ増幅における、様々なプライマーの有用性を評価するために、次の通りに、標準的なＶＩＤＡＳ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄ２  ｑＨＣＶアッセイ条件を用いた。溶解させるために、０．５ｍｌの試料（ＥＤＴＡ血漿、または、ベースマトリックス中に希釈されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＮＡ転写物など）を、尿素ベースの溶解緩衝液０．４ｍｌと混合し、６７．５℃（２０分）でインキュベートし、室温（２０分）まで冷却した。これらのインキュベーション中に、遊離した核酸をｃａｐＢプローブ（配列番号１９）によって捕捉した。ｃａｐＢプローブは、ポリＡテールによって磁性ビーズに連結されていた。複合体を洗浄し、ＲＡＲ緩衝液（表１参照）中に再懸濁した。次に、６５℃でＲＮＡ標的を変性させ、その後、プライマー１２５９（配列番号８）および１２３６（配列番号１１）を用いた４２℃のＴＭＡによって増幅した（標準条件；ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら、核酸増幅技術(Nucleic acid amplification technologies)、１９９８年、１１３〜１２３頁、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｂｏｏｋｓ，マサチューセッツ州Ｎａｔｉｃｋ，Ｌｅｅ  Ｈ，Ｍｏｒｓｅ  Ｓ，Ｏｌｓｖｉｋ  ０編）。詳細には、ＲＡＲ中に再懸濁され、精製された標的を、次に、ＶＩＤＡＳプローブストリップ（酵素、プローブ、洗浄溶液、検出基質など、増幅および検出に必要なすべての追加試薬を含有する）に添加した。ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製ＡｍｐＳｔａｔｉｏｎｓで増幅を行い、その後、これをＶＩＤＡＳ測定器に移し、この測定器が、アンプリコンの配列特異的な捕捉、洗浄、および、３’末端に特異的な蛍光結合プローブを用いた検出を行った。ＳＰＲプローブ１２４７（配列番号２２）は、ＶＩＤＡＳ  ＳＰＲ表面にアンプリコンを捕捉する。ＡＫＰプローブ（１２４６）（配列番号２１）は、アルカリ性ホスファターゼに結合しており、精製されたアンプリコンに結合して、蛍光ＡＫＰ基質を介した検出を提供する。
【表１】
2007518425.tif 000003
【００３８】
（ＴＭＡ増幅に使用される追加プライマーの配列）
Ｐ１（Ｔ７プロモーター）（配列番号：１０〜１８）プライマーおよびＰ２（逆方向）（配列番号：１〜８）プライマー（表３）のいくつかを、上述の通り、ＶＩＤＡＳ  Ｐｒｏｂｅアッセイで、３’ＨＣＶ増幅に関して評価した。これらのうち、１２３６（配列番号１１）／１２５９（配列番号８）プライマー対が最適であり、これらの派生物（例えば、１２３６由来の配列番号２７、１２５９由来の配列番号３７）も、ＮＡＳＢＡによって試験した（下記に記述する）。プライマー１２７９（配列番号１５）も、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡで良好な結果を与えた。
【００３９】
表２：プライマー配列
Ｐ２プライマー
１２０６（配列番号１）ＧＣＴＣＣＡＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣ
１２４２（配列番号２）ＴＣＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡ
１２４３（配列番号３）ＴＴＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧ
１２４４（配列番号４）ＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣ
１２４５（配列番号５）ＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡ
１２５７（配列番号６）ＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧ
１２５８（配列番号７）ＡＧＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧＣ
１２５９（配列番号８）ＣＣＣＴＡＧＴＣＡＣＧＧＣＴＡＧＣ
Ｐ１プライマー
１２１１（配列番号１０）ＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＣＡＧＣＡＣＴＣＴＣ
１２３６（配列番号１１）ＡＧＧＣＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣ
１２３７（配列番号１２）ＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧ
１２３８（配列番号１３）ＡＧＧＣＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＣＴＣＵＣＴＧＣ
１２７８（配列番号１４）ＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴ
１２７９（配列番号１５）ＣＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
１２８０（配列番号１６）ＡＧＧＣＣＡＧＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣ
１２８１（配列番号１７）ＡＧＴＡＴＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴ
１２８２（配列番号１８）ＣＡＧＴＡＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴ
【００４０】
（３’ＨＣＶのＮＡＳＢＡ増幅）
１２３６／１２５９（Ｐ１／Ｐ２）プライマー対をＮＡＳＢＡ増幅での使用について分析した。このプライマー対は、ＴＭＡアッセイで最適に機能したものである。さらに大きなアンプリコンを生成することが予測された他のプライマー、例えば、プライマーＰ１：１２１１（ｎｔ８３〜６４）（配列番号１０）、およびプライマーＰ２：ＶＰ１２０６（ｎｔ５〜２４）（配列番号１）も試験した。
【００４１】
ＮＡＳＢＡによって生成されたアンプリコンを検出するために、上記の実施例におけるＶＩＤＡＳ  Ｐｒｏｂｅアンプリコン捕捉プローブ部位と、アンプリコン検出プローブ部位とを併せたものに対応する領域に結合するようにプローブを設計した。プローブは、ＴＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣ（ｎｔ３６〜５４）（配列番号４３）またはＴＧＴＧＡＡＡＧＧＴＣＣＧＴＧＡＧＣＣＧＣ（ｎｔ３４〜５４）（配列番号４４）のいずれかのＨＣＶ塩基配列に基づいたものであった。これらのプローブを、ＥＣＬアッセイ（下記参照）における捕捉プローブ（ＥＧ６、ＥＧ７）として、あるいは、分子ビーコンのアンプリコン結合（「ループ」）部分（ＭＢ１４０（ＥＧ１８）（配列番号２４）；ＭＢ１０２（Ｑ１）（配列番号４１））として試験した。
【００４２】
ＥＣＬ（電気化学ルミネセンス）は、配列特異的な捕捉の後にアンプリコンを検出するＮＡＳＢＡ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ  Ｉｎｃ．社、Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）エンドポイント検出システムである。ＥＣＬシステムは、Ｐ２プライマーの５’末端に連結されたＥＣＬ検出タグ（「ＥＣＬテール」）を利用する。上述のプライマーおよび捕捉プローブＥＧ７と共にＥＣＬ検出タグ（配列番号９）を利用したところ、相当量の増幅があり、それは、１２０６／１２１１対より、１２５９／１２３６対を用いた場合の方が良かった。（表３）。
【表３】
2007518425.tif 000004
【００４３】
同様に、ＥＣＬタグの非存在下でも、１２３６プライマーおよび１２５９プライマーは、１２０６および１２１１より良い結果をＮＡＳＢＡ反応で与えた。表４に示す通り、１２３６／１２５９対は良い結果を与えた。
【表４】
2007518425.tif 000005
【００４４】
ＥＣＬ検出は、２次構造の影響を比較的受けにくいと考えられており、これは、感度の相違が、検出の増強ではなく、増幅の増大による可能性が高いことを示唆する。
【００４５】
（Ｐ２プライマー設計の改変）
上記のアッセイでは、２０ヌクレオチドの汎用ＥＣＬタグをＰ２プライマーに付加することによって、１２５９の成績が向上することも見出された。１２５９Ｐ２プライマーにＥＣＬテールを用いた場合、ＥＣＬテールのないＰ２プライマーと比較して、約１０倍の感度の増大が観測された（表５に示す通り、１０×希釈試料のタグ付き検出は、１×試料のタグなし検出とほぼ同程度であった）。
【表５】
2007518425.tif 000006
【００４６】
ＨＣＶ特異的プローブ（すなわちＥＣＬタグを認識しない）を用いたＥＣＬアッセイも、タグの存在による成績の向上を実証した。これは、この成績の向上が、増幅の増大による可能性が高いことを示唆する（表６）。
【表６】
2007518425.tif 000007
【００４７】
タグの効果に関するもっともと思われる説明の１つは、ＨＣＶアンプリコンが非常に小さく（タグのなしで７０ｎｔが、タグ付きでは９０まで伸長する）、かつ、ＮＡＳＢＡでは、小さなアンプリコンは比較的効率が悪いというものである。ＥＣＬタグをさらに伸長（さらに１０または２０ヌクレオチド）させること（標的に相同のもの、または異種のもの）によって、増幅が改善されるかどうか試験するために、６つのＰ２プライマーを設計した。異種配列を追加したものには、いずれにも成績の向上がなく、また、相同の配列を追加したものでは、成績が低下した。
【００４８】
（他のＮＡＳＢＡ用Ｐ１プライマー）
ＮＡＳＢＡにおける機能に関して、表７に記載するもう１セットのＰ１（プロモーター）プライマーを試験した。このセットのプライマーは、プライマー１２３６の位置から、１ヌクレオチド増分で３’方向に移行して、（最終プライマーＰ１．８９の３’末端で）プローブ結合部位から３塩基の位置までの範囲にわたる。このセットのプライマーの中で、検出可能なシグナルを生成することに最も良く機能した（プライマー１２３６に匹敵する）のは、Ｐ１．６３、Ｐ１．８２、Ｐ１．８３、Ｐ１．８４、およびＰ１．８５であった。これらの試験で使用されたＰ２はＥＧ４、プローブはＥＧ１８であった（蛍光値は正規化した）。
【００４９】
表７
Ｐ１．６３（配列番号２７）ＡＧＡＣＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣ
Ｐ１．８１（配列番号２８）ＧＡＣＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡ
Ｐ１．８２（配列番号２９）ＡＣＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧ
Ｐ１．８３（配列番号３０）ＣＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴ
Ｐ１．８４（配列番号３１）ＣＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣ
Ｐ１．８５（配列番号３２）ＡＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡ
Ｐ１．８６（配列番号３３）ＧＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴ
Ｐ１．８７（配列番号３４）ＴＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧ
Ｐ１．８８（配列番号３５）ＴＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣ
Ｐ１．８９（配列番号３６）ＡＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＣＧ
【表８】
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【００５０】
本出願を通して、様々な出版物を参照した。本発明が属する技術分野の現況をより完全に記述する目的で、これにより、これら各出版物の開示をそれらの全体において参照により本出願に援用する。
【００５１】
したがって、本発明の好ましい実施形態であると現在考えられるものについて記述したが、当業者ならば、本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに、他の実施形態およびさらなる実施形態を作製できることを認識するであろう。そして、そのような、さらなる変更および改変の全てが、本発明の真の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】Ｐ１プライマー、Ｐ２プライマー、および検出プローブのハイブリダイゼーションの一般領域を示すＨＣＶの３’ＮＴＲ（９８配列）の模式図である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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