(57)【要約】  本発明は、原虫オーシストを精製するための方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、オーシストがアイメリアのオーシストである。本方法は、糞便材料および原虫オーシストを含む組成物を、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、多糖分解酵素に接触させることを含む。
2007531531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糞便材料を含む組成物からオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を多糖分解酵素に接触させるステップを含む方法。
【請求項２】
多糖分解酵素をオーシストとの接触から引き離すステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
多糖分解酵素との接触後にオーシストを収集するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
多糖分解酵素が、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ヘミセルラーゼ、ベータ−グルカナーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、アミログルコシダーゼ、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される酵素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
多糖分解酵素がセルラーゼを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
多糖分解酵素がセルラーゼおよびペクチナーゼを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
セルラーゼが２×１０4〜５０×１０4単位／リットルの範囲内の量で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
セルラーゼが４×１０4〜２５×１０4単位／リットルの範囲内の量で存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
組成物を、セルラーゼおよびペクチナーゼを含む多糖分解酵素に接触させるステップと、
次に、組成物を、アミラーゼを含む多糖分解酵素と接触させるステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
オーシストが胞子形成オーシストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
オーシストがアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
アイメリアオーシストが、アイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）オーシスト、アイメリア・ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）オーシスト、アイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）オーシスト、アイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）オーシスト、アイメリア・ブルネッチ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）オーシスト、アイメリア・ネカトリックス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）オーシスト、アイメリア・プレコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）オーシスト、アイメリア・ミバチ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アイメリアオーシストが、アイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）オーシスト、アイメリア・アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ）オーシスト、アイメリア・ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）オーシスト、アイメリア・ディスパーサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）オーシスト、アイメリア・イノキュア（Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａ）オーシスト、およびアイメリア・サブロタンダ（Ｅ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａ）オーシスト、ならびにそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
アイメリアオーシストが、アイメリア・ツェルニィ（Ｅ．ｚｕｅｒｎｉｉ）オーシスト、アイメリア・ボビス（Ｅ．ｂｏｖｉｓ）オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
アイメリアオーシストが、アイメリア・アーサーター（Ｅ．ａｈｓａｔａ）オーシスト、アイメリア・バクエンシス（Ｅ．ｂａｋｕｅｎｓｉｓ）オーシスト、アイメリア・クランダリス（Ｅ．ｃｒａｎｄａｌｌｉｓ）オーシスト、アイメリア・ファウレイ（Ｅ．ｆａｕｒｅｉ）オーシスト、アイメリア・グラニュローサ（Ｅ．ｇｒａｎｕｌｏｓａ）オーシスト、アイメリア・イントリカータ（Ｅ．ｉｎｔｒｉｃａｔａ）オーシスト、アイメリア・マルシカ（Ｅ．ｍａｒｓｉｃａ）オーシスト、アイメリア・オビノイダリス（Ｅ．ｏｖｉｎｏｉｄａｌｉｓ）オーシスト、アイメリア・パリダ（Ｅ．ｐａｌｌｉｄａ）オーシスト、アイメリア・パルバ（Ｅ．ｐａｒｖａ）オーシスト、アイメリア・ウェイブリジェンシス（Ｅ．ｗｅｙｂｒｉｄｇｅｎｓｉｓ）オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
アイメリアオーシストが、アイメリア・インテスチナリス（Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）オーシスト、アイメリア・ベイドフスキイ（Ｅ．ｖｅｊｄｏｖｓｋｙｉ）オーシスト、アイメリア・ピリフォルミス（Ｅ．ｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓ）オーシスト、アイメリア・コエシコラ（ｃｏｅｃｉｃｏｌａ）オーシスト、アイメリア・イレシドゥア（Ｅ．ｉｒｒｅｓｉｄｕａ）オーシスト、アイメリア・フラベセンス（Ｅ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）オーシスト、アイメリア・エキシグア（Ｅ．ｅｘｉｇｕａ）オーシスト、アイメリア・マグナ（Ｅ．ｍａｇｎａ）オーシスト、アイメリア・パーフォランス（Ｅ．ｐｅｒｆｏｒａｎｓ）オーシスト、アイメリア・メディア（Ｅ．ｍｅｄｉａ）オーシスト、アイメリア・スティダイ（Ｅ．ｓｔｉｅｄａｉ）オーシスト、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
組成物を多糖分解酵素に３０分〜２４時間接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
組成物を多糖分解酵素に２時間〜１０時間接触させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
組成物を多糖分解酵素に１５℃〜３０℃の範囲内の温度で接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
組成物を多糖分解酵素に２１℃〜２７℃の範囲内の温度で接触させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物を多糖分解酵素にｐＨ１〜ｐＨ７．５の範囲内のｐＨで接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
組成物を多糖分解酵素にｐＨ４〜ｐＨ６の範囲内のｐＨで接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
異なるｐＨで行なわれる２つの酵素消化ステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
組成物を、セルラーゼおよびアミラーゼを含む多糖分解酵素に、ｐＨ４〜ｐＨ５．５の範囲内のｐＨで接触させるステップと、
次に  組成物を、アミラーゼを含む多糖分解酵素に、ｐＨ４〜ｐＨ７．５の範囲内のｐＨで接触させるステップと
を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
密度浮上分離工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
密度浮上分離工程が、組成物を多糖分解酵素に接触させた後に行なわれる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
密度浮上分離溶液が塩溶液である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
塩溶液が硫酸マグネシウム溶液である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
密度浮上分離溶液がグリセロール溶液である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
グリセロール溶液がグリセロール−ポリアルギニン溶液である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
糞便材料が、収集期間前に大きな平均粒径を持つ飼料が与えられていた動物から収集されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
大きな粒径を持つ飼料がオオムギを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
大きな粒径を持つ飼料がオオムギ−ダイズを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
糞便材料を含む組成物からアイメリアオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を、セルラーゼを含む多糖分解酵素に接触させることを含む方法。
【請求項３５】
多糖分解酵素をオーシストとの接触から引き離すことをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
多糖分解酵素との接触後にオーシストを収集するステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
多糖分解酵素がペクチナーゼをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
糞便材料を含む組成物からアイメリアオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を、セルラーゼおよびペクチナーゼからなる多糖分解酵素と接触させるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願情報
本願は、２００４年３月３１日に出願された米国仮出願第６０／５５８，３４８号の利益を主張し、前記仮出願は参照することによりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、原虫オーシストを精製するための方法および組成物を提供する。特に本発明は、ワクチンの製造に使用することができるアイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストを精製するための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
家禽のコクシジウム症は、アイメリア属の寄生原虫類が引き起こす疾患である。アイメリア属の種のオーシストは環境中に遍在し、家禽敷料中で何ヶ月も存続する。オーシストの摂取は、種特異的に、腸管のさまざまな領域の感染をもたらす。この生物は腸内で数日間にわたって増殖し、その結果、糞便中に次世代のオーシストを排泄する。複数サイクルの感染は免疫をもたらし、ある群れに対して感染が初期にかつ群内に均一な量で提示されると、数サイクルの曝露を経て発達した免疫は、極めて頑強になり得る。
【０００４】
対照的に、感染が鳥に均一な形で提示されない場合は、未感作の鳥が突然の大量感染を起こして、飼料要求率および体重増加の点で成績が低下し、二次感染の危険が高まるという状況が生じ得る。現在、家禽産業においてコクシジウム症の防除に用いられている最も一般的な方法はワクチン接種ではなく、飼料への抗コクシジウム薬の投与である。ワクチン接種率が低いのは、多くの場合、伝統的な投与経路および投与回数である育成施設における飼料もしくは水を介した投薬、または孵化場における噴霧室内ワクチン接種（ｓｐｒａｙ  ｃａｂｉｎｅｔ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）による投薬の均一性が、不確かであることに原因があると考えられる。孵化場における投与時の送達の均一性を改善することに対する関心が高まっている。
【０００５】
最近、生オーシストに基づくコクシジウム症ワクチンの投与に卵内（インオボ；ｉｎ  ｏｖｏ）ワクチン接種技術を応用できることが見い出された（例えば、いずれもＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．に付与された、米国特許第６，５００，４３８号、米国特許第６，４９５，１４６号、および米国特許第６，６２７，２０５号を参照されたい）。卵内投与経路は、個々の胚に対して、胚がまだ卵の中にある間に均一な用量のワクチンを送達する便利な方法になる。鳥類ワクチンの卵内への送達は、現在、米国内で毎年生産されるブロイラー鳥９０億羽の約８５％で実施されており、米国外で毎年生産されるブロイラー鳥２１０億羽でもその割合が増えつつある（例えば米国政府に付与された米国特許第４，４５８，６３０号を参照されたい）。したがって、卵内送達型コクシジウム症生ワクチンの潜在的市場は、現在の孵化後送達型コクシジウム症ワクチンの市場よりもかなり大きい。
【０００６】
コクシジウム症生ワクチンに使用されるオーシストは糞便から得られるが、この糞便には最初は大量の汚染微生物が含まれている。通例、規制行政機関は卵内送達型ワクチンが汚染微生物を本質的に含まないことを示すように要求する。汚染微生物数レベルが最終製品において完全に最少化されることを保証するために、オーシスト生産工程の各段階で汚染微生物のレベルを効果的に管理する組成物および方法論を使用することは有益である。不要固形物の減少は汚染微生物数減少方法論の効率を向上させ得る。
【０００７】
したがって当分野においては、特にワクチン製造に用いられる、原虫オーシストを精製する改良された方法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、例えばワクチンの製造などに用いられる原虫オーシスト（例えばアイメリアオーシスト）を精製するための改良された方法および組成物に関する。特に家禽ワクチンに関して、本発明は、孵化後用ワクチンまたは卵内用ワクチンの生産に適している。また、本ワクチンは、ブロイラー鳥、産卵鳥、種鳥、シチメンチョウ、愛玩鳥および／または飼い鳥産業でも使用することができる。
【０００９】
本発明は、一つには、オーシストを含有する糞便材料を、オーシストの生存能および／または回収率に甚だしい影響を与えずに、多糖分解酵素で酵素消化することができるという発見に基づいている。したがって本発明は、オーシストを含む組成物中の糞便材料を減少させるための改良された方法であって、糞便材料を多糖分解酵素で消化することによる方法を提供する。本発明は、組成物中の糞便材料を多糖分解酵素で消化することを含む工程によって、糞便材料を含む組成物からオーシストを精製する方法も提供する。多糖分解酵素は、固形不溶性植物残渣を切断して、除去可能な可溶性小成分にするように働く。例えば、酵素消化の可溶性産物は、遠心分離またはタンジェンシャルフロー濾過などの技術を使ってオーシストを分離および濃縮することによって、除去することができる。
【００１０】
本発明の方法および組成物は、糞便負荷量を減少させ、より小さな工程規模の使用を容易にすることにより、商業的オーシスト生産工程（例えばワクチン用）にとって有利である。組成物中の不要糞便残渣の最少化は、汚染微生物の管理および所望であれば滅菌最終製品の生産にとって有益である。さらに、酵素消化は組成物中の固形物の量を実質的に減少させ、その結果、全ての下流工程について、それに見合った作業規模の減少をもたらすことができる。工程規模の減少により、その工程の効率および経済性を高めることができる。
【００１１】
酵素消化は、より大きな精製スキームに組み込むことができ、オーシストを精製するための現在の技術（例えば篩分、浮上分離、遠心分離など）と一緒に使用するか、それらの代替法として使用することができる。浮上分離工程を酵素消化により置き換える場合、その利点には、（１）装置に対して腐食性を持つ塩類が精製工程から除去されるか、減少すること、および／または（２）工程の頑強性が改善されることが含まれる。酵素消化を浮上分離に先だって使用する場合、その利益には、一般に糞便物の出発体積に直接比例する浮上分離溶液の体積の減少が含まれ得る。
【００１２】
したがって、第１の態様として、本発明は、糞便材料を含む組成物からオーシスト（例えば生存可能なオーシスト）を精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を多糖分解酵素に接触させることを含む方法を提供する。特定の実施形態では、多糖分解酵素がセルラーゼを含むか、本質的にセルラーゼからなるか、またはセルラーゼからなる。別の実施形態では、多糖分解酵素がセルラーゼおよびペクチナーゼを含むか、本質的にセルラーゼおよびペクチナーゼからなるか、またはセルラーゼおよびペクチナーゼからなる。さらなる代表的実施形態では、多糖分解酵素がセルラーゼ、ペクチナーゼおよびアミラーゼを含むか、本質的にセルラーゼ、ペクチナーゼおよびアミラーゼからなるか、またはセルラーゼ、ペクチナーゼおよびアミラーゼからなる。
【００１３】
さらにもう一つの態様として、本発明は、糞便材料を含む組成物からアイメリアオーシスト（例えば生存可能なアイメリアオーシスト）を精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を、セルラーゼを含む多糖分解酵素に接触させることを含む方法を提供する。
【００１４】
本発明は、ワクチンの生産に用いられるアイメリアオーシスト（例えば生存可能なアイメリアオーシスト）を精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させるのに十分な条件下で、組成物を、セルラーゼを含む多糖分解酵素に接触させることを含む方法も提供する。
【００１５】
さらにもう一つの態様として、本発明は、本発明の方法を使って（例えばワクチンを製造するために）原虫オーシストを精製する際に用いられる、多糖分解酵素を含む組成物を提供する。
【００１６】
以下の発明の説明では、本発明のこれらの態様および他の態様を、さらに詳しく説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下に、発明の好ましい実施形態に関して、本発明を説明する。ただし本発明は、異なる形態で体現することもでき、本明細書に記載する実施形態に限定されるとみなしてはならならい。むしろこれらの実施形態は、この開示が綿密かつ完全になるように、そしてこの開示によって本発明の範囲が当業者に完全に伝わるように、記載するものである。
【００１８】
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解している意味と同じ意味を持つ。本明細書において発明の説明に用いられる術語は、特定の実施形態を説明するために過ぎず、本発明の限定を意図するものではない。
【００１９】
本明細書において言及する刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献はいずれも、参照することによりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる。
【００２０】
本明細書において発明の説明に用いられる術語は、特定の実施形態を説明するために過ぎず、本発明の限定を意図するものではない。発明の説明および本願請求項において使用される単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明白である場合を除き、複数形も包含するものとする。
【００２１】
本発明は、医学用および獣医学用のオーシストを精製するのに適している。用語「動物」および「動物対象」は、哺乳動物対象および／または鳥類対象を包含するが、それらに限定されるわけではない。
【００２２】
適切な哺乳動物対象には、ヒト対象および非ヒト霊長類対象、例えばサル、ブタ、ウシ（例えば畜牛）、ヤギ、ウマ、ネコ、ヒツジ、イヌ、ネズミ（例えばマウス、ラット）およびウサギ対象が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００２３】
本明細書において使用する用語「鳥類」および「鳥類対象」（すなわち「鳥」および「鳥対象」）は、任意の鳥類種の雄および雌を包含するものとするが、主として、卵もしくは肉を得るために、またはペットとして、商業的に飼育される家禽を包含するものとする。したがって、用語「鳥類」および「鳥類対象」は、特に、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタンインコ、オカメインコ、ダチョウ、エミューなどを包含するものとするが、それらに限定されるわけではない。特定の実施形態では、鳥類対象がニワトリ対象またはシチメンチョウ対象である。別の実施形態では、鳥類対象がニワトリである。本明細書において使用する「鳥類」または「鳥類対象」は、卵内の鳥類胚、または孵化後の鳥類を指すことができる。
【００２４】
本発明は、概して、原虫オーシストを精製するための方法および組成物に関する。そのような方法および組成物は、例えばワクチンを製造する方法に役立つ。さらに本方法は、例えば組換えタンパク質生産のために遺伝子改変されたオーシストを精製するためにも使用することができる。多くの原虫は「オーシスト」と呼ばれる生活段階を形成する。本発明は、任意の原虫種（アイメリア、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、プラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉａ）およびイソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）を含むが、それらに限定されるわけではない）からオーシストを精製するために実施することができる。本発明の実施形態では、本発明の方法および組成物がアイメリアオーシストを精製するために使用される。
【００２５】
用語「原虫」「オーシスト」「スポロシスト」「スポロゾイト」および「メロゾイト」は、当分野において一般に容認されているそれぞれの意味を持つ。別段の表示がある場合を除き、これらの用語は、弱毒型を含む生きた（すなわち生存可能な）原虫、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイトおよびメロゾイトを指すものとする。ただし、死滅した原虫、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイトおよびメロゾイトを使ってワクチンを製剤化できることは当業者には理解されるだろう。死滅ワクチンが通常はまず生きた微生物を精製することによって調製されることは、当業者には理解されている。遺伝子改変された原虫、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイトおよびメロゾイトも包含される。オーシストは胞子形成オーシストまたは非胞子形成オーシストであることができる。
【００２６】
用語「アイメリア」はアイメリア属の一つまたは複数の種を示す。用語「アイメリア」は、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ）または哺乳動物（例えば畜牛、ヒツジまたはウサギ）種に感染するアイメリアの株または種を包含するが、それらに限定されるわけではない。そのようなアイメリアの種には、ニワトリに見いだされるもの、例えばアイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、アイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、アイメリア・マキシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、アイメリア・ネカトリックス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、アイメリア・ミチス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、アイメリア・プレコックス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）、アイメリア・ミバチ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）およびアイメリア・ブルネッチ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）；シチメンチョウに見いだされるもの、例えばアイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）、アイメリア・アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ）、アイメリア・ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）、アイメリア・ディスパーサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）、アイメリア・イノキュア（Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａ）、およびアイメリア・サブロタンダ（Ｅ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａ）；畜牛に感染するもの、例えばアイメリア・ボビス（Ｅ．ｂｏｖｉｓ）およびアイメリア・ツェルニィ（Ｅ．ｚｕｅｒｎｉｉ）；ヒツジに感染するアイメリアの種、例えばアイメリア・アーサーター（Ｅ．ａｈｓａｔａ）、アイメリア・バクエンシス（Ｅ．ｂａｋｕｅｎｓｉｓ）、アイメリア・クランダリス（Ｅ．ｃｒａｎｄａｌｌｉｓ）、アイメリア・ファウレイ（Ｅ．ｆａｕｒｅｉ）、アイメリア・グラニュローサ（Ｅ．ｇｒａｎｕｌｏｓａ）、アイメリア・イントリカータ（Ｅ．ｉｎｔｒｉｃａｔａ）、アイメリア・マルシカ（Ｅ．ｍａｒｓｉｃａ）、アイメリア・オビノイダリス（Ｅ．ｏｖｉｎｏｉｄａｌｉｓ）、アイメリア・パリダ（Ｅ．ｐａｌｌｉｄａ）、アイメリア・パルバ（Ｅ．ｐａｒｖａ）、アイメリア・ウェイブリジェンシス（Ｅ．ｗｅｙｂｒｉｄｇｅｎｓｉｓ）；ならびにウサギに感染するアイメリアの種、例えばアイメリア・インテスチナリス（Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、アイメリア・ベイドフスキイ（Ｅ．ｖｅｊｄｏｖｓｋｙｉ）、アイメリア・ピリフォルミス（Ｅ．ｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓ）、アイメリア・コエシコラ（ｃｏｅｃｉｃｏｌａ）、アイメリア・イレシドゥア（Ｅ．ｉｒｒｅｓｉｄｕａ）、アイメリア・フラベセンス（Ｅ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、アイメリア・エキシグア（Ｅ．ｅｘｉｇｕａ）、アイメリア・マグナ（Ｅ．ｍａｇｎａ）、アイメリア・パーフォランス（Ｅ．ｐｅｒｆｏｒａｎｓ）、アイメリア・メディア（Ｅ．ｍｅｄｉａ）、およびアイメリア・スティダイ（Ｅ．ｓｔｉｅｄａｉ）などがある。さらに用語「アイメリア」は、上述したアイメリアの種の全ての株（例えば野性株、早熟株または他の選択株、弱毒株、および例えば放射線照射、化学的処理などによって弱毒化されたオーシストを含むが、それらに限定されるわけではない）を包含する。さらにまた、用語「アイメリア」はアイメリアの任意の新発見株または新発見種も包含する。最後に、用語「アイメリア」は、生きたアイメリアおよび死滅したアイメリアを包含する。ただし、別段の表示がある場合を除き、生きたアイメリアを意味する。
【００２７】
生存能は、例えば、宿主におけるオーシストの感染性を決定することなどによって評価することができる。特定の実施形態では、本発明の方法に従って精製された「生存可能な」オーシストが、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％の本発明の酵素処理に付していないオーシストの感染性を持つ。
【００２８】
アイメリアオーシストを含む組成物は、鳥をコクシジウム症に対して免疫する方法に役立つ。鳥をコクシジウム症に対してワクチン接種する方法は当分野において公知であり、卵内ワクチン接種法（例えばＰｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．に付与された米国特許第６，５００，４３８号、米国特許第６，４９５，１４６号、および米国特許第６，６２７，２０５号）ならびに孵化後ワクチン接種法（例えばＡｕｂｕｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに付与された米国特許第３，１４７，１８６号；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに付与された米国特許第５，０５５，２９２号および米国特許第４，４３８，０９７号）が含まれる。
【００２９】
最終ワクチン組成物に使用される他の生活段階（例えばスポロゾイトまたはスポロシスト）を放出するように、またはワクチン接種用の抽出物もしくはタンパク質を生産するために、オーシストをさらに加工できることは、当業者には理解されるだろう。
【００３０】
用語「原虫」は、野生型株、早熟株または他の選択株、弱毒株、および例えば放射線照射、化学的処理などによって弱毒化されたオーシストを包含する。さらに用語「原虫」は、原虫の任意の新発見株または新発見種も包含する。最後に、用語「原虫」は生きた原虫と死滅した原虫の両方に適用される。ただし、別段の表示がある場合の除き、生きた原虫を意味する。
【００３１】
オーシストの「生産」、「生成」又は「製造」（「ｐｒｏｄｕｃｅ」「ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ」または「ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」）などの用語は、一般に、動物からオーシストを採取し、糞便材料からオーシストを精製する工程を指す。
【００３２】
別段の表示がある場合を除き、オーシストの調製物に関して本明細書において使用する用語「精製」（「ｐｕｒｉｆｙ（ｉｅｓ）」「ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」「ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ」および「ｐｕｒｉｆｉｅｄ」）は、オーシストを含有する調製物からの糞便残渣および他の不必要な材料の分離または除去を指す。これらの用語は、糞便中に存在する他の材料からのオーシストの単離度または分離度が強化されることを示すものであって、不要材料の全てがオーシスト調製物から完全に除去されることを示すわけではない（不要材料の大部分が除去されることを示すわけでさえない）ものとする。さらにオーシスト調製物は、最終調製物が意図する用途にとって（例えば孵化後ワクチンとして）適切である限り、ある程度の微生物汚染を含有していてもよい。特定の実施形態において、卵内投与用のワクチンは、不必要な微生物（すなわち関心対象の原虫オーシスト以外の微生物）、特に胚に対して病原性である（すなわち有意な病気または死亡を引き起こす）汚染微生物による検出可能な汚染を、本質的に含まない。
【００３３】
文脈によっては、「精製」工程が、ワクチン接種目的に適した調製物を生産するために糞便からオーシストを精製する工程全体を指す場合もある。あるいは、「精製」工程とは、精製スキーム全体の中で、ステップの任意のサブセットを指す場合もあり、単一ステップを指す場合すらある。
【００３４】
本発明は、オーシスト（例えばアイメリアオーシスト）を精製するための方法および組成物を提供する。本発明の消化方法は、精製スキームの一部として、一つまたは複数の他の精製ステップと組み合わせることができる。例えば本発明の方法は当分野において公知の他の方法と一緒に使用することができる。
【００３５】
アイメリアオーシストなどのオーシストを生産する方法は、当分野において公知である（例えばＡｕｂｕｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに付与された米国特許第３，１４７，１８６号；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｏｃｔｒｏｏｉ  Ｍａａｔｓｃｈａｐｐｉｊ「Ｏｃｔｒｏｐａ」Ｂ．Ｖ．の米国特許第４，５４４，５４８号；Ｕｎｉｌｅｖｅｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓの米国特許第４，８６３，７３１号；国際特許公報ＷＯ  ００／５００７２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）；ＷＯ  ０３／０２０９１７（Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．）；およびＷＯ  ０２／３７９６１（Ｎｏｖｕｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９４４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５：７０；Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６１）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ．４７：３５７；Ｊａｃｋｓｏｎ，（１９６４）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ５４：８７；Ｌｏｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６１）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ．４７：５８８；Ｓｃｈｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３１：１８１；Ｗｈｉｔｌｏｃｋ，（１９５９）Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．３５：３１０を参照されたい）。
【００３６】
本明細書において、あるステップまたは工程が別のステップまたは工程の「前に行なわれる」または「後に行なわれる」などの表現をする場合、それは精製スキームにおいて第１のステップまたは工程が第２のステップのそれぞれ前または後に行なわれることを意味し、中間ステップが存在する可能性を排除しない。
【００３７】
「微生物汚染」、「微生物による汚染」などの用語は、細菌、カビ、真菌、酵母およびウイルスを含む（ただしそれらに限定されるわけではない）検出可能かつ不必要で生存可能な微生物（すなわち関心対象の原虫オーシスト以外の微生物）の存在を示すものとする。特定の実施形態では、オーシスト調製物が検出可能な微生物汚染を本質的に含まない（有意なレベルの微生物汚染が調製物中に検出されないことをいう）か、検出可能な微生物汚染を全く含まない。微生物を検出する方法は当分野において公知であり、検出される微生物の種類に依存する。
【００３８】
「衛生化」（「ｓａｎｉｔｉｚｉｎｇ」または「ｓａｎｉｔｉｚａｔｉｏｎ」または「ｓａｎｉｔｉｚｅｄ」などの用語）は、オーシスト調製物において微生物汚染（すなわち上で定義した生存可能な汚染微生物）の減少が起こることを意味する。最終調製物が意図する用途にとって（例えばワクチンとして）適切である限り、オーシスト調製物が微生物汚染を全く含有しないことは必要でない。鳥への卵内投与用の組成物について言えば、一般に調製物は検出可能な微生物汚染を本質的に含まない（すなわち有意なレベルの汚染微生物が検出されない）か、検出可能な微生物汚染を全く含まない（すなわち純培養である）だろう。
【００３９】
略号「ｖ／ｖ」は「体積／体積」を指す。略号「ｗ／ｖ」は「重量／体積」を指す。
【００４０】
本発明の個々の態様を以下に詳述する。
【００４１】
糞便残渣の酵素消化による原虫オーシストの精製
本発明者らは、多糖分解酵素による酵素消化を使って、オーシストの生存能および／または回収率を甚だしく減少させずに、糞便残渣を減少させることができるという発見をした。多糖分解酵素は、不溶性植物材料を、オーシストから容易に除去することができる可溶（例えば水溶液に可溶）な形態に分解するように働く。したがって本発明は、糞便材料を含む組成物からオーシストを精製する方法であって、組成物中の糞便材料の量を減少させる（すなわち固形糞便材料の一部または全てを可溶化することによって、容易に除去できるようにする）のに十分な条件下で、組成物を多糖分解酵素に接触させることを含む方法を提供する。特定の実施形態では、オーシストは、生存可能なオーシストである。
【００４２】
本発明の方法は、糞便材料およびオーシストを含む任意の組成物で実施することができる。例えばオーシストは感染動物の糞便、盲腸コア、腸壁または他の組織などから収集することができる。商業的目的の場合、オーシストは通例、感染動物の糞便から収集される。
【００４３】
本発明における多糖分解酵素は、一つまたは複数の多糖類分解性酵素を含むことができる。２以上の多糖類分解性酵素を本発明の方法で使用する場合は、それらの酵素を同時に使用するか、任意の順序で逐次的に使用することができる。多糖分解酵素は当分野において公知であり、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、アラビナーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、およびアミログルコシダーゼを含むが、それらに限定されるわけではない。
【００４４】
本発明の代表的一実施形態では、多糖分解酵素がセルラーゼを含むか、本質的にセルラーゼからなるか、またはセルラーゼからなる。「本質的にセルラーゼからなる」とは、その多糖分解酵素がセルラーゼ以外の多糖分解酵素を取るに足らないレベルしか含有していないことを意味する。
【００４５】
別の代表的実施形態では、組成物をセルラーゼおよびペクチナーゼと接触させる。別の例示的実施形態では、組成物をセルラーゼ、ペクチナーゼおよびアミラーゼによる消化に付す。そのような実施形態の一つでは、組成物をまずセルラーゼおよびペクチナーゼで消化し、次に（例えばセルラーゼおよびペクチナーゼによる酵素消化が完了した後に、または実質的に完了した後に、例えば少なくとも７０％、８０％もしくは９０％完了した後に）アミラーゼによる消化に付す。
【００４６】
酵素消化の具体的反応条件は、所望する任意の終点、例えば純度、オーシストの回収率、オーシストの生存能、工程規模、時間効率、費用効率、その工程内の他のステップとの適合性、装置との適合性などが達成されるように、選択し、最適化することができる。
【００４７】
組成物に加える酵素の量は、オーシストの回収率および／または生存能に有害な影響を与えずに所望の精製レベルが達成されるように選択される。酵素消化の完了に要する期間が温度および酵素濃度ならびに使用する特定酵素に依存することは、当業者には理解されるだろう。したがって、同程度の消化を達成するには、通例、酵素濃度が低いほど長い反応時間および／または高い反応温度が用いられる。
【００４８】
特定の実施形態では、各酵素が、少なくとも約０．２５×１０3単位／リットル、約０．５×１０3単位／リットル、約１×１０3単位／リットル、約２×１０3単位／リットル、約５×１０3単位／リットル、約１×１０4単位／リットル、約２×１０4単位／リットル、約４×１０4単位／リットル、約５×１０4単位／リットル、約１×１０5単位／リットル、約２×１０5単位／リットルまたは約３×１０5単位／リットルであり、かつ約２×１０4単位／リットル、約３×１０4単位／リットル、約５×１０4単位／リットル、約８×１０4単位／リットル、約１０×１０4単位／リットル、約１２×１０4単位／リットル、約１５×１０4単位／リットル、約２０×１０4単位／リットル、約２５×１０4単位／リットル、約３０×１０4単位／リットル、約４０×１０4単位／リットル、約５０×１０4単位／リットル、約１０×１０5単位／リットル、約１５×１０5単位／リットル、約２０×１０5単位／リットル、約３５×１０5単位／リットル、約５０×１０5単位／リットル、約１０×１０6単位／リットル、約２０×１０6単位／リットル、約２５×１０6単位／リットル、または約３０×１０6以上より少ない濃度（上限と下限の組合せは任意）で存在する。
【００４９】
セルラーゼの場合、実例となる実施形態では、セルラーゼが、１リットルあたり約０．５×１０4〜３５×１０5単位、約１×１０4〜１５×１０5単位／リットル、約２×１０4〜５０×１０4単位／リットル、約３×１０4〜３０×１０4単位／リットル、約４×１０4〜２５×１０4単位／リットル、または約８×１０4〜２０×１０4単位／リットル以上の量で存在する。
【００５０】
ペクチナーゼの場合、代表的な実施形態では、ペクチナーゼが、約５×１０4〜２０×１０6単位／リットル、約１×１０5〜１０×１０6単位／リットル、約２×１０5〜５×１０6単位／リットル、または約３×１０5〜２．５×１０6単位／リットル以上の量で存在する。
【００５１】
アミラーゼの場合、代表的な実施形態では、アミラーゼが、約０．２５×１０3〜１５×１０4単位／リットル、約０．５×１０3〜８×１０4単位／リットル、約１×１０3〜５×１０4単位／リットル、または約２×１０3〜３×１０4単位／リットル以上の量で存在する。
【００５２】
酵素消化の継続時間は、オーシストの回収率および／または生存能に有害な影響を与えずに、所望する糞便残渣の減少が達成されるように選択される。上述のように、酵素反応の速度は一般に反応温度、酵素濃度および使用する特定の多糖分解酵素に依存する。特定の実施形態では、消化反応が少なくとも約３０分、４５分、１時間、２時間または３時間から、長くて約３、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２４、３０または３６時間以上（上限と下限の組合せは任意）にわたって行なわれる。酵素消化を行なう時間範囲の実例は、約３０分〜２４時間、約１〜２０時間、約１〜１５時間、約２〜１０時間、約２〜８時間、および約２〜５時間である。場合によっては、酵素消化は、消化反応を完了するのに必要な期間より長く行なわれる。例えば、たとえ反応がもっと短期間で完了するとしても、消化を終夜行なうことが好都合な場合もあり得る。
【００５３】
酵素消化工程は、通例、所望の反応速度（すなわち工程時間）が達成されるが、オーシストの回収率および／または生存能に有害な影響を与えないような温度で行なわれる。一般に、温度は通常は約３１℃または３２℃未満である。本発明の実施形態では、温度が少なくとも約１２、１５、１８、２０、２１、２２または２４℃であり、かつ約２６、２７、２８、２９または３０℃未満（上限と下限の組合せは任意）である。酵素消化の実例となる温度は、約１５℃〜３０℃、約１８℃〜２９℃、および約２１℃〜２７℃の範囲内にある。
【００５４】
同様に、反応のｐＨも、所望の酵素活性レベルおよび所望のオーシスト精製レベルが達成されるように、常法により選択することができる。例示的な実施形態では、セルラーゼおよび／またはペクチナーゼによる消化が、約ｐＨ１〜ｐＨ７．５、約ｐＨ２〜ｐＨ６．５、約ｐＨ３〜ｐＨ６、または約ｐＨ４〜ｐＨ５．５もしくは６の範囲内のｐＨで行なわれる。アミラーゼの場合は、一つにはアミラーゼの供給源（例えば細菌由来または真菌由来）に依存して、一般に約ｐＨ４〜ｐＨ７．５で反応が行なわれる。特定の実施形態では、約ｐＨ４．５〜ｐＨ７、約ｐＨ６〜ｐＨ８または約ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５の範囲内で反応が行なわれる。
【００５５】
消化に使用する酵素が一つより多い場合は、各酵素反応に合わせて溶液のｐＨを調節することができる。例示的な方法では、組成物をまず、約ｐＨ３〜ｐＨ６または約ｐＨ４〜ｐＨ５．５もしくは６の範囲内のｐＨで、セルラーゼおよび／またはペクチナーゼによって消化する。次に、アミラーゼ消化のために、溶液のｐＨを、例えば塩基の添加または所望のｐＨ範囲内にある溶液との交換（例えば遠心分離によるペレット化および新しい溶液への再懸濁）などによって、約ｐＨ４〜ｐＨ７．５または約ｐＨ６．５〜ｐＨ７．５に調節する。
【００５６】
ある温度またはｐＨ「範囲」内で反応を行なうとは、それぞれ表示した温度またはｐＨ範囲内の一つのまたは一つより多い温度またはｐＨで、反応を行ない得ることを意味する。
【００５７】
所望のレベルの酵素消化が達成された後に、要すれば、酵素（または複数の酵素）を（例えば遠心分離またはタンジェンシャルフロー濾過などの標準的技術によって液体材料からオーシストを分離することによって）除去するか、酵素を（例えば温度および／またはｐＨを変化させることによって、および／または化学的不活化によって）不活化することができる。したがって特定の実施形態では、本方法は、精製スキーム中の次のステップのため、衛生化のため、またはワクチン製造などの最終用途のために、酵素をオーシストとの接触から引き離すこと、および要すれば、オーシストを（例えば遠心分離、浮上分離またはタンジェンシャルフロー濾過などによって）収集することを、さらに含む。
【００５８】
本発明による例示的な酵素消化方法を以下に説明する。この実施形態によれば組成物はアイメリアオーシストを含む。組成物を、セルラーゼおよび要すればペクチナーゼにより、約２１℃〜２７℃の範囲内の温度および約ｐＨ４〜ｐＨ６の範囲内のｐＨで、約２〜１８時間にわたって消化する。セルラーゼの濃度は約８×１０4〜２０×１０4単位／リットルの範囲内にあり、ペクチナーゼが存在する場合、ペクチナーゼの濃度は約１×１０5〜１０×１０6単位／リットルの範囲内にある。
【００５９】
本発明の酵素消化方法は単独で使用するか、より大きなオーシスト精製スキームに組み込むことができる。オーシストを生産する方法は当分野において公知であり、Ａｕｂｕｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎに付与された米国特許第３，１４７，１８６号；Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  Ｏｃｔｒｏｏｉ  Ｍａａｔｓｃｈａｐｐｉｊ「Ｏｃｔｒｏｐａ」Ｂ．Ｖ．に付与された米国特許第４，５４４，５４８号；Ｕｎｉｌｅｖｅｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｈｏｌｄｉｎｇｓに付与された米国特許第４，８６３，７３１号；国際特許公報ＷＯ  ００／５００７２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）；ＷＯ  ０３／０２０９１７（Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．）；およびＷＯ  ０２／３７９６１（Ｎｏｖｕｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｍｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９４４）Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｖｅｔ．Ｒｅｓ．５：７０；Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６１）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ．４７：３５７；Ｊａｃｋｓｏｎ，（１９６４）Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ  ５４：８７；Ｌｏｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９６１）Ｊ．Ｐａｒａｓｉｔ．４７：５８８；Ｓｃｈｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．３１：１８１；Ｗｈｉｔｌｏｃｋ，（１９５９）Ａｕｓｔ．Ｖｅｔ．Ｊ．３５：３１０（これらの開示は参照することによりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる）に記載のアイメリアオーシスト生産方法が含まれる。
【００６０】
一般に、これらの方法は、動物を関心対象の原虫に感染させ、感染動物からオーシストを含有する糞便を収集し、篩分、遠心分離、濾過および／または密度浮上分離などの一連の分離手順によって糞便材料からオーシストを精製し、オーシストを胞子形成させることを含み、任意選択的な追加分離ステップ、および所望であれば、汚染微生物を不活化するために胞子形成オーシストを衛生化することを含む。次に、異なるオーシスト調製物（例えば異なる種または株に由来するもの）を組み合わせて、最終製品、例えば複数の原虫（例えばアイメリア）種に対するワクチンなどを形成させることができる。
【００６１】
酵素消化は、オーシスト精製工程内の任意の時点で行なうことができる。酵素消化は糞便の収集中または糞便収集の完了時に、篩分などの上流精製工程に先だって行なうことができる。別の代表的実施形態では、酵素消化工程を、篩分または遠心分離などの上流精製ステップ後に行なう。一般に、酵素消化工程は、工程規模を減少させるために、浮上分離などの下流精製ステップの前に使用することが有利であり得る。別の実施形態では、浮上分離などの下流精製ステップの前に、またはそのような下流精製ステップの代わりに、酵素消化が行なわれる。さらに、オーシストの胞子形成は、酵素消化前に、または酵素消化と同時に、または酵素消化後に行なうことができる。一部の実施形態では、胞子形成前または胞子形成後に、遠心分離でペレット化することによって、またはタンジェンシャルフロー濾過などの技術で液体を除去することによって、オーシストが濃縮される。酵素消化工程はそのような濃縮ステップの前または後に組み込むことができる。本発明の例示的な一実施形態では、糞便組成物中のオーシストが、上流精製ステップ（例えば遠心分離および／または篩分）に付された後、胞子形成に付される。この実施形態によれば、酵素消化は、胞子形成ステップ後に、密度浮上分離などの下流精製ステップ前の時点で（またはそのような下流精製ステップの代わりに）行なわれる。
【００６２】
特定の実施形態では、精製工程が、密度浮上分離ステップ、例えば塩（例えば硫酸マグネシウム）溶液またはグリセロール（例えばグリセロール−アルギニン）溶液における浮上分離を、さらに含む。塩および非イオン性密度浮上分離溶液、ならびに塩および非イオン性溶液を使った密度浮上分離方法は、国際特許公報ＷＯ  ００／５００７２（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．）およびＷＯ  ０３／０２０９１７（Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．）に記載されており、これらは参照によりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる。代表的実施形態では、酵素消化工程後に密度浮上分離工程が行なわれる。
【００６３】
オーシストの密度浮上分離を行なう方法は当分野において公知である。特定の実施形態では、密度浮上分離が、オーシストを含有する調製物を、高密度の液体を含む組成物に懸濁して、オーシストの浮上をもたらすのに十分な条件下で懸濁液を形成させる段階、および懸濁液からオーシストを回収することを含む。一般に、オーシストを含有する材料を浮上分離溶液と混合し、溶液を分離させると、オーシストは上清画分に残り、糞便残渣はペレットを形成する。遠心分離を使って分離を促進または改善することができる。
【００６４】
浮上分離媒質は、遠心分離／洗浄ステップ、透析および濾過（例えばタンジェンシャルフロー濾過）を含む、当分野において公知である任意の適切な方法によって、オーシストから除去することができる。
【００６５】
所望であれば、精製オーシストを衛生化して、滅菌溶液を生産することができる。衛生化ステップは、卵内鳥類ワクチン用のオーシストを生産する方法で通例使用される任意選択的なステップであり、時には、孵化後鳥類ワクチンにも使用される。当分野では公知であるように、ワクチン調製物に使用されるオーシストは、慣例的に、次亜塩素酸ナトリウム溶液を使って衛生化される。オーシストを衛生化する他の方法はＷＯ  ０３／０２０９１７（Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．）に記載されており、その開示は参照することによりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる。
【００６６】
本発明の実施形態では、酵素消化（および任意選択的に他の精製ステップ）が抗微生物溶液中で行なわれる。単純糖質を遊離させる多糖分解酵素の作用は、汚染微生物の迅速な成長を潜在的に促進することができる。適切な抗微生物溶液の例は国際特許公報ＷＯ  ０３／０２０９１７（Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．）に開示されており、その開示は参照することによりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる。
【００６７】
特定の実施形態では、糞便材料およびオーシストを含む組成物を、多糖分解酵素だけでなくリパーゼおよび／またはプロテアーゼなどの他の酵素とも（同時にまたは任意の順序で逐次的に）接触させる。
【００６８】
本発明者らはさらに、糞便残渣の酵素消化の効率が、糞便材料を収集する動物に与えられた飼料による影響を受け得ることも見い出した。特定の実施形態では、オーシスト収集期間中および／またはオーシスト収集期間前に、動物に大きな平均粒径を持つ飼料を与える。例示的な大粒子飼料は、オオムギ、トウモロコシ（例えば挽き割りトウモロコシ）、コムギ、エンバク、雑穀および／またはモロコシなどの全粒を含有する。例えばオオムギを含有する飼料を鳥に与えると、より効率よく消化される組成物が生じるようである。オオムギは家禽飼料における使用に適した任意の形態、例えば蒸煮圧扁オオムギなどの形態をとることができる。したがって本発明の方法は、オオムギを含有する飼料、例えばオオムギ−ダイズ飼料を与えた鳥から収集したオーシストを含有する糞便材料を使って行なうことができる。実例となる飼料は、少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％以上のオオムギ（ｗ／ｗ）を含有する。他の例示的な飼料は約１５％〜７０％（ｗ／ｗ）、約２０％〜６０％（ｗ／ｗ）、約２０％〜５０％（ｗ／ｗ）、約２５％〜４５％（ｗ／ｗ）、または約２５％〜４０％（ｗ／ｗ）のオオムギを含有する。代表的飼料の一つは、約３５％（ｗ／ｗ）の蒸煮圧扁オオムギ、約３５％（ｗ／ｗ）の高タンパク質大豆ミール、約１０％（ｗ／ｗ）のクリンプ処理した（ｃｒｉｍｐｅｄ）エンバク、約６％（ｗ／ｗ）の米ぬか、ならびに鳥の健康を支えるための他の脂肪、ミネラル、ビタミンおよび補助添加物を含有する。
【００６９】
大きな平均粒径を持つ動物飼料はＷＯ  ０３／０２０９１７（Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．）に開示されており、これは参照することによりそのまま完全な形で本明細書に組み入れられる。
【００７０】
多糖含有飼料の消化可能性を改善するため（例えば米国再発行特許第３８，０４７号参照；ヘミセルラーゼ）、成長速度を高めるため（例えば米国特許第６，３３３，０６２号参照；アルファ−ガラクトシダーゼ）、吸収不良（例えばＵ．Ｓ．ＷＯ  ９１／０４６７３参照；セルラーゼまたはキシラナーゼ）および／またはペイスティ・ベント（ｐａｓｔｙ  ｖｅｎｔ）症候群を処置するために鳥に酵素を与える方法は、当分野において公知である。したがって、そこから糞便材料を収集し、オーシストを採取する動物（例えば鳥）には、多糖分解酵素を与えることができる。例えばＮａｔｕｇｒａｉｎ（登録商標）、Ｓｅｌｆｅｅｄ（登録商標）、およびＨｅｍｉｃｅｌｌ（登録商標）などの多酵素調製物が市販されている。
【００７１】
本発明の酵素消化方法を行なうことによって、糞便材料の望ましい減少、例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％（ｖ／ｖ）、（ｗ／ｗ）または（ｗ／ｖ）以上の減少を達成することができる。
【００７２】
さらに特定の実施形態では、酵素消化工程からのオーシスト（任意選択的に、生存可能なオーシスト）の回収率は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％（ｖ／ｖ）、（ｗ／ｗ）または（ｗ／ｖ）以上である。例えばオーシストの感染性を評価することなどによってオーシストの生存能を決定する方法は当分野において公知である（例えば実施例７参照）。
【００７３】
免疫原組成物
本発明の方法を使って生産される免疫原組成物は、原虫疾患に対するワクチン接種を行なうために、動物対象に投与することができる。本発明の方法を使って生産されたオーシストを含有する免疫原組成物（例えばワクチン）は、免疫応答を誘発するために投与することができる。通例、免疫原組成物は、本明細書に開示する免疫原量のオーシストを、薬学的に許容される担体と一緒に含む。「免疫原量」とは、免疫原組成物を投与する対象において免疫応答を開始または惹起するのに十分であるようなオーシストの量である。当業者には理解されるとおり、免疫原組成物は、生きた生物、弱毒化された生物および／または死滅した生物を使って製剤化することができる。このアプローチは、スポロゾイトまたはスポロシストなどの他の寄生生活段階にも適用可能である。
【００７４】
「薬学的に許容される」とは、生物学的にまたはその他の点で望ましくないことのない材料、すなわち望ましくない生物学影響を引き起こさずにその材料を対象に投与し得ることを意味する。したがってそのような薬学的組成物は、例えば、免疫処置用組成物の調製に使用することができる。薬学的に許容される担体は、当分野において公知であるように、他の化合物、例えば安定剤、塩類、緩衝剤、アジュバントおよび／または保存剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤）など（ただしそれらに限定されるわけではない）を含有してもよい。薬学的に許容される担体は滅菌状態である必要はないが、鳥類胚に卵内投与する場合には一般に滅菌状態であるだろう。
【００７５】
当分野において公知の免疫原組成物投与経路は、原虫に対する能動免疫応答（好ましくは防御免疫応答）が誘発される限り、どれでも使用することができる。対象が鳥である場合、免疫原組成物は卵内または孵化後に投与することができる。例示的な投与経路は孵化後経口投与または卵内注射（例えば羊膜への注射）である。本発明の特定の実施形態では、自動注射装置を用いる卵内投与が使用される。
【００７６】
用語「ワクチン接種」または「免疫処置」は当分野においてよく理解されている。例えば、ワクチン接種または免疫処置という用語は、抗原に対する対象の免疫反応を（したがって感染に抵抗するまたは感染を克服する対象の能力を）もたらすおよび／または増加させる工程であると理解することができる。アイメリアに対して鳥をワクチン接種する卵内法は当分野において公知である（例えば米国特許第６，５００，４３８号、米国特許第６，４９５，１４６号、および米国特許第６，６２７，２０５号（Ｐｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．））。
【００７７】
本明細書において使用する用語「防御免疫」または「防御免疫応答」とは、その後の曝露時またはチャレンジ時にその動物が感染と戦うことができるように、宿主動物がワクチンに対して能動免疫応答を開始することを意味するものとする。したがって防御免疫応答は、処置された動物の間で、その病原体に対するその後の曝露による罹病および死亡の発生率を低下させるだろう。商業的畜産業において、群れ（ｆｌｏｃｋまたはｈｅｒｄ）全体に対するワクチン接種の影響を評価することによって、防御免疫応答の生成を評価できることは、当業者には理解されるだろう。例えばワクチン接種した動物の少数には病気または罹病および脂肪の徴候がまだ存在し得る。
【００７８】
「能動免疫応答」とは、その原虫または原虫抗原に対するその後の曝露からの任意のレベルの保護であって、対象の集団において、死亡率の低下であるか、障害の低下であるか、飼料要求率の改善であるか、またはその疾患の他の任意の有害作用の減少などであるかを問わず、防御が不完全であるか完全であるかとは無関係に、何らかの利益をもたらすものを意味する。「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および宿主細胞の関与」を特徴とし、「これは、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖を伴い、それが抗体の合成もしくは細胞媒介性反応性の発達またはその両方につながる」（Ｈｅｒｂｅｒｔ  Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ「Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ  ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ  １１７（Ｊｏｓｅｐｈ  Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ  ｅｄ．，１９８５））。別の言い方をすると、能動免疫応答は、感染による免疫原への曝露後に、または本件の場合のようにワクチン接種による免疫原への曝露後に、宿主によって開始される。能動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への既製物質（抗体、伝達因子、胸腺移植片、インターロイキン２）の移入」によって獲得される受動免疫と対比させることができる（同上書）。
【００７９】
以下の実施例は本発明を例示するために記載するものであり、本発明の限定であるとみなすべきではない。
【実施例１】
【００８０】
酵素試験
消化酵素を使ったアイメリアオーシスト精製の実現可能性を調べるために、初期実験を行なった。アイメリア・マキシマのオーシストをブロイラーで生産させた。オーシストを含有する糞便を接種の５〜８日後に、１０％クエン酸、０．７５〜３％過酸化水素、および０．２５％プロオピン酸からなる抗微生物溶液中に収集した。材料を篩い分けして大きな残渣を除去し、１０％クエン酸、０．７５〜３％過酸化水素、および０．２５％プロピオン酸中で撹拌および曝気しながら少なくとも４８時間にわたって胞子形成させた。胞子形成後に材料の試料を採取し、さまざまな酵素処理に付した（表１参照）。この実験に使用するために二つの供給業者（ＮｏｖｏｚｙｍｅｓおよびＧｅｎｅｎｃｏｒ）から酵素（セルラーゼおよびアミラーゼ）を入手した。酵素は各調製物に２０％（ｖ／ｖ）の濃度で加えた。セルラーゼ処理またはセルラーゼ＋アミラーゼ処理の場合は試料のｐＨを約４．５に調節し、アミラーゼ処理だけの場合はｐＨ７．０に調節した。材料を穏やかに撹拌しながら最高３日間インキュベートし、オーシスト数および残渣決定を行なった。オーシストはＭｃＭａｓｔｅｒｓの方法で数えた（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．，（１９７０）「Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ：ｏｏｃｙｓｔｓ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｔ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」Ｅｘｐｅｒ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：９９−１０２）。残渣値は、代表的副次試料を１８００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレット化した固形物の体積を測定し、試料の単位体積あたりのペレット化可能な固形物の体積を計算することによって決定した。次に、試料１ｍＬあたりのペレット化可能な固形物に関する値に総試料体積を掛けることによって、総固形物を決定した。結果を下記の表１に記載する。
【００８１】
この実施例および以下の実施例において、製造業者から受け取った酵素調製物の比活性は、以下のとおりだった：セルラーゼ（８．４×１０5単位／リットル）；ペクチナーゼ（２．６×１０7単位／リットル）；およびアミラーゼ（３×１０5単位／リットル）。材料は、各実験について表示するとおりに、ｖ／ｖベースで希釈した。
【００８２】
【表１】
2007531531.tif 000003
【００８３】
結果
対照試料は正常であるように見えた。最善の結果は１日インキュベーション時のＮｏｖｏｚｙｍｅｓセルラーゼで観察された。本質的に定量的なオーシストの回収が得られ、オーシストは正常な外観を持っていた。残渣の約７３％は１日間のインキュベーション後に可溶性になった。残渣の減少はさらにインキュベーションを行なってもあまり変化しなかった。これらの結果に基づき、セルラーゼおよび／またはアミラーゼ処理に焦点を合わせて、さらなる研究を行なった。
【実施例２】
【００８４】
多酵素実験Ｉ：オーシストが除去された後の糞便固形物を用いる研究
ブロイラー鳥にアイメリア・マキシマのオーシストを感染させ、オーシスト含有糞便を感染の５〜８日後に収集した。糞便は１０％クエン酸、０．７５〜３％過酸化水素および０．２５％プロピオン酸中に収集した。その懸濁液を篩い分けして、大きな粒子を除去し、１０％クエン酸、０．７５〜３％過酸化水素、および０．２５％プロピオン酸中で撹拌および曝気しながら少なくとも４８時間にわたってオーシストを胞子形成させた。胞子形成後に、懸濁液を遠心分離してオーシストおよび糞便残渣をペレット化し、上清を捨てた。密度１．２ｇ／ｍＬに調節した硫酸マグネシウム浮上分離溶液にペレットを再懸濁し、１８００×ｇで約１０分間遠心分離した。上清に含有されるオーシストを水で希釈し、他の実験で使用するためにさらに加工した。生産鳥からの未消化糞便材料に相当する残りのペレット化した材料を、１０％クエン酸および０．２５％プロピオン酸に再懸濁した。これらの固形物は、酵素消化によって可溶化されるべき糞便由来の標的不溶性植物残渣に相当する。これらの固形物を一連の実験で使用することにより、さまざまな酵素消化条件を評価した。残渣の減少は実施例１に記載したように評価した。
【００８５】
セルラーゼおよびセルラーゼ＋キシラナーゼを用いる処理
上述した固形物の一部を遠心分離することによって９個のレプリケート１５ｍＬペレットを調製した。ペレットをＰＢＳで１回洗浄した。次にその懸濁液を遠心分離し、ペレットを適切な処理溶液に再懸濁した。
【００８６】
【表２】
2007531531.tif 000004
【００８７】
全てのレプリケートを穏やかに撹拌しながら室温で終夜インキュベートした。次にその懸濁液を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレット化した固体の体積を測定した。
【００８８】
【表３】
2007531531.tif 000005
【００８９】
結果
セルラーゼ処理により残渣が６７％減少した。セルラーゼ＋キシラナーゼ処理には、セルラーゼ処理だけの場合と比較して、何も利点はないようだった。
【００９０】
実験Ｉの処理２−セルラーゼで得た３本のレプリケート試験管を使って追加実験を行なった。ペクチナーゼ、アミログルコシダーゼまたはベータ−グルコシダーゼを、セルラーゼ処理物に直接加え、穏やかに撹拌しながら終夜インキュベートした。
【００９１】
【表４】
2007531531.tif 000006
【００９２】
結果
セルラーゼ＋ペクチナーゼ処理は、重い残渣ペレットの上に清澄な上清を与えた。アミログルコシダーゼ処理およびベータ−グルコシダーゼ処理には、セルラーゼ処理だけの場合と比較して、どちらも目に見える利点がなかった。
【実施例３】
【００９３】
多酵素実験ＩＩ：アイメリアオーシストを含有する糞便材料を用いる研究
ブロイラーニワトリにアイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマまたはアイメリア・テネラのいずれかのオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便はそれぞれの種のピークオーシスト排出期間中に収集した。１０％クエン酸、約０．７５〜３％過酸化水素、および０．２５％プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に、糞便を収集した。試料を篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。
【００９４】
ＰＢＳ（ｐＨ５．０）に懸濁した５ｍＬのペレット化固形物をそれぞれが含む３個のレプリケート試料を各処理の対照とした。各酵素処理につき３個のレプリケート試料を調製した。試料を、ＰＢＳ（ｐＨ５．０）中の２０％セルラーゼ溶液または２０％セルラーゼ＋４％ペクチナーゼに再懸濁し、穏やかに撹拌しながら室温で少なくとも４時間インキュベートした。対照試料および処理試料中のオーシストをＭｃＭａｓｔｅｒｓの方法を使って数え、実施例１に記載した方法によって固形物を決定した。対照試料との比較で残渣減少率およびオーシスト回収率を計算した。
【００９５】
固形物の調製
各試料から約５ｍＬのレプリケートペレットを９個調製した。ＰＢＳを使ってペレットを１回洗浄した。下記表５に示す処理１〜３用の適切な酵素溶液に、洗浄したペレットを再懸濁した。
【００９６】
【表５】
2007531531.tif 000007
【００９７】
手順
処理１〜３を調製したら、処理１緩衝液対照についてオーシスト数の計数および残渣決定を行なった。処理２および処理３は穏やかに撹拌しながら終夜インキュベートした。インキュベーション後に、処理２および処理３について、オーシスト数を数え、残渣決定を行なった。
【００９８】
次に、処理２および処理３で生じた残存材料を使って、表６に示すとおり、処理２−アミラーゼおよび処理３−アミラーゼを調製した。
【００９９】
【表６】
2007531531.tif 000008
【０１００】
処理２および処理３で生じた残存材料を含有する試験管を遠心分離し、ペレットをＰＢＳで１回洗浄した。洗浄したペレットをアミラーゼ溶液に再懸濁した。穏やかに撹拌しながら室温で終夜インキュベートした後、処理番号２および処理番号３について、オーシスト数を数え（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．，（１９７０）「Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ：ｏｏｃｙｓｔｓ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｆｏｒ  ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｔａｔ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ」Ｅｘｐｅｒ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．２８：９９−１０２）、残渣決定を行なった。
【０１０１】
【表７】
2007531531.tif 000009
【０１０２】
結果
セルラーゼ＋ペクチナーゼ処理では、セルラーゼ処理だけの場合よりも高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ＋ペクチナーゼで処理すると、より良い残渣減少を与えた。セルラーゼ＋ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約７９％が除去された。これらの処理では総オーシスト回収率が５７〜６８％の間で変動した。酵素処理では、標準的な浮上分離技術によって通例達成される５０〜９０％の回収率に匹敵するかそれを上回るという、許容できるオーシスト回収率が得られた。
【０１０３】
【表８】
2007531531.tif 000010
【０１０４】
結果
セルラーゼ＋ペクチナーゼでは、セルラーゼ処理だけの場合の約２倍という、はるかに高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ＋ペクチナーゼで処理すると、より良い残渣減少を与えた。セルラーゼ＋ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約７３％が除去された。この実験セットでは、総オーシスト回収率は本質的に定量的だった。
【０１０５】
【表９】
2007531531.tif 000011
【０１０６】
結果
セルラーゼ＋ペクチナーゼでは、セルラーゼ処理だけの場合よりも高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ＋ペクチナーゼで処理すると、はるかに良好な減少（約４倍高い減少率）を与えた。セルラーゼ＋ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約８１％が除去された。この実験セットでは、総オーシスト回収率は約７０％だった。
【０１０７】
総合的結論
セルラーゼ＋ペクチナーゼでは、セルラーゼ処理だけの場合よりも高い残渣減少率が得られた。アミラーゼ処理は、試料をまずセルラーゼ＋ペクチナーゼで処理すると、はるかに良好な減少（約５倍高い減少率）を与えた。セルラーゼ＋ペクチナーゼ処理後のアミラーゼ処理により、残渣の約８０％が除去された。この実験セットでは、総オーシスト回収率は約７５〜９５％だった。
【０１０８】
要約
ｐＨ５でセルラーゼとペクチナーゼの組合せを使った酵素消化では、胞子形成後の残渣レベルが、全てのワクチン株について約６０％減少し、オーシスト回収率は平均約８２％だった。
【０１０９】
セルラーゼ＋ペクチナーゼ処理後にｐＨ７でアミラーゼによる消化を行なうと、胞子形成後の残渣減少率が合計８０％になり、アミラーゼ処理後のオーシスト回収率は、このステップについて９４．４％だった。この一連の酵素処理を使っての総オーシスト回収率は平均７６％だった。
【実施例４】
【０１１０】
３種のアイメリアに関するセルラーゼおよびペクチナーゼを使った残渣消化
ブロイラーニワトリに、アイメリア・アセルブリナ、アイメリア・マキシマまたはアイメリア・テネラのオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便はそれぞれの種のピークオーシスト排出期間中に収集した。１０％クエン酸、約０．７５〜３％過酸化水素、および０．２５％プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に、糞便を収集した。試料を篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。
【０１１１】
ＰＢＳ（ｐＨ５．０）に懸濁した５ｍＬのペレット化固形物をそれぞれが含む３個のレプリケート試料を各処理の対照とした。各酵素処理につき３個のレプリケート試料を調製した。試料を、ＰＢＳ（ｐＨ５．０）中の２０％セルラーゼ溶液または２０％セルラーゼ＋４％ペクチナーゼに再懸濁し、穏やかに撹拌しながら室温で少なくとも４時間インキュベートした。対照試料および処理試料中のオーシストを標準的顕微鏡技術を使って数え、試料の遠心分離およびペレット体積の測定によって固形物を決定した。対照試料との比較で残渣減少率およびオーシスト回収率を計算した。結果を以下の表１０に示す。
【０１１２】
【表１０】
2007531531.tif 000012
【０１１３】
結果は、セルラーゼをペクチナーゼと組合せると、セルラーゼ処理だけの場合よりも残渣減少率が高くなることを示している。どちらの処理でも、標準的な浮上分離技術によって通例達成される５０〜９０％の回収率に匹敵するかそれを上回るという、許容できるオーシスト回収率が得られた。
【実施例５】
【０１１４】
２０％セルラーゼおよび４％ペクチナーゼを用いる糞便残渣消化の時間経過
ブロイラーニワトリにアイメリア・マキシマのオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便を接種の５〜８日後に収集した。糞便は、１０％クエン酸、約０．７５〜３％過酸化水素、および０．２５％プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に収集した。試料を篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。
【０１１５】
ペレット化した固形物のレプリケート５ｍＬ試料を２０個調製した。試料のｐＨを約ｐＨ５．０に調節した。試料を遠心分離して固形物をペレット化した。ｐＨ５．０に調節したＰＢＳ中に２個の対照試料を再懸濁した。これら２個の試料を遠心分離して固形物をペレット化し、ペレットの体積を測定した。残り１８個の試料は、ｐＨ５．０に調節したＰＢＳ中の２０％セルラーゼ＋４％ペクチナーゼに再懸濁した。試料を穏やかに撹拌しながら室温でインキュベートした。約半時間おきに１個のレプリケートを遠心分離し、ペレットの体積を測定した。２個の対照試料の平均ペレット体積との比較で残渣減少率を計算した。結果を図１に示す。
【０１１６】
結果は、セルラーゼとペクチナーゼの組合せを使った残渣の酵素消化が約１時間で約９０％完了し、３〜５時間で約９９％完了したことを示している。全体として、セルラーゼおよびペクチナーゼは、試料中の残渣の約５７％を可溶化した。
【実施例６】
【０１１７】
飼料への酵素の使用
ニワトリ飼料への酵素の使用は、飼料の総合的消化性に寄与することが知られている。試料中の酵素がオーシスト収集時の糞便固形物レベルも低下させる可能性を評価した。製剤中に酵素を添加して、および製剤中に酵素を添加せずに、トウモロコシ／ダイズ飼料を試験した。酵素含有飼料には３種類の市販酵素調製物（Ｎａｔｕｇｒａｉｎ（登録商標）、Ｓｅｌｆｅｅｄ（登録商標）、およびＨｅｍｉｃｅｌｌ（登録商標））の組合せを含めた。２つの飼料処置のそれぞれについて、５つのレプリケートペンを使用し、ブロイラーを１つのペンにつき９羽ずつ配置した。鳥にアイメリア・マキシマオーシストを接種した。オーシストを含有する糞便を、接種の５〜８日後に収集した。１０％クエン酸、約０．７５〜３％過酸化水素、および０．２５％プロピオン酸からなる抗微生物溶液中に糞便を収集した。各レプリケート飼料を総体積８ｍＬに調節し、よく撹拌し、副次試料を採取した。各試料から約５０ｍＬの副次試料を２個採取し、４℃で保存した。試料を残渣含量およびオーシスト濃度について分析した。２個のレプリケート８Ｌ試料をプールし、篩い分けして大きな残渣粒子を除去し、遠心分離して残渣をペレット化した。この研究で評価した変量には、１羽あたりの初期残渣レベルおよびオーシスト排出量を含めた。
【０１１８】
接種の５〜８日後に収集した糞便中の１羽あたりの平均ペレット材料および１羽あたりの平均オーシスト数を、表１１に示す。死亡が起こったペンでは、鳥の平均数を死亡日に基づいて計算した。酵素を飼料に加えると１羽あたりのペレットは数字上低下したものの、独立試料ｔ検定を使って処置を比較したところ、１羽あたりのペレットまたは１羽あたりのオーシスト排出量に有意な処置差は見られなかった。
【０１１９】
酵素を含む実験飼料と酵素を含まない実験飼料の間で、１羽あたりのペレット体積または１羽あたりのオーシスト排出量に有意差は見られなかった。
【０１２０】
【表１１】
2007531531.tif 000013
【０１２１】
酵素を含むトウモロコシ／ダイズ飼料および酵素を含まないトウモロコシ／ダイズ飼料から得た糞便材料の試料を篩い分けして、結果を比較した。各処理について、合計１８羽に相当する２つのレプリケート試料をプールし、順次、１８メッシュ、６０メッシュおよび２３０メッシュの篩いを使って篩い分けした。各篩分段階で体積を記録し、代表的副次試料を採取した。試料を残渣含有量およびオーシスト濃度について分析した。篩分工程によるオーシスト回収率および残渣減少率を計算した。
【０１２２】
【表１２】
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【０１２３】
【表１３】
2007531531.tif 000015
【０１２４】
結果は、どちらの飼料でもオーシストの回収率および最終ペレットレベルが似ていたことを示している。篩分工程中に、トウモロコシ／ダイズ＋酵素飼料から得た試料は、非酵素処理試料よりも粘度が低く、篩いを通過しやすいことが、定性的に認められた。
【０１２５】
全体的に見て、飼料への酵素の使用は、収集時または篩分後の固形物の体積を有意に減少させなかった。しかし、酵素含有飼料を消費する鳥では、ペイスティ・ベント問題の軽減が観察された。これはおそらく酵素の粘度低下効果に起因すると考えられる。飼料中の酵素は出発固形物の量を減らすことには成功しなかったが、オーシスト生産時の飼料に酵素を含めることにより、鳥の全体的健康の改善および篩分特性の改善などといった付随的利益を得ることができる。
【０１２６】
酵素処理後に、または酵素処理を行なわずに、２つの異なる浮上分離溶液を使って浮上分離を行なう下流工程により、酵素を含むトウモロコシ／ダイズ飼料または酵素を含まないトウモロコシ／ダイズ飼料を使って生産される材料、ならびに酵素を含むオオムギ／ダイズ飼料を使って生産される材料を、さらに試験した。
【０１２７】
浮上分離のみ
篩い分けした材料の試料３Ｌを３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化した。上清を捨て、ペレット体積を見積った。３体積の浮上分離溶液（硫酸マグネシウムまたはグリセロール−アルギニン）を使ってペレットを再懸濁した。試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、オーシストを浮上させた。浮上させたオーシストを含む上清全体をもう一つの容器にデカントし、４体積の水で希釈した。試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してオーシストをペレット化した。上清をデカントして捨てた。オーシストペレットを５％クエン酸２００ｍＬに再懸濁した。
【０１２８】
酵素処理後の浮上分離
篩い分けした材料の試料３Ｌを３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によってペレット化した。上清をデカントし、ペレット体積を見積った。２体積の水を使ってペレットを再懸濁した。リン酸二カリウムを加えてｐＨを５．０に調節した。セルラーゼを２０％になるように加え、ペクチナーゼを４％になるように加えた。試料を室温でインキュベートし、約４時間撹拌した。試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレット体積を見積った。３体積の浮上分離溶液（硫酸マグネシウムまたはグリセロール−アルギニン）を使ってペレットを再懸濁した。試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離してオーシストを浮上させた。浮上させたオーシストを含む上清全体をもう一つの容器に移し、４体積の水で希釈した。希釈した試料を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより、オーシストをペレット化した。上清を捨て、オーシストペレットを５％クエン酸２００ｍＬに再懸濁した。
【０１２９】
【表１４】
2007531531.tif 000016
【０１３０】
酵素による工程内処理を行なった後、グリセロール−アルギニンを使って浮上分離を行なうと、他の処理より良い残渣除去結果が得られた。一般に、オオムギ系飼料を使用すると、オーシスト回収率が改善された。
【実施例７】
【０１３１】
酵素を使って生産したオーシストの生存能
飼料または加工に酵素を使用することがアイメリア・マキシマオーシストの生存能に及ぼす影響を調べた。アイメリア・マキシマオーシストを、飼料中に酵素を使用して、または飼料中に酵素を使用せずに、ブロイラーで生産した。次に、どちらかの飼料を使って生産されたオーシストを、精製工程に酵素を使用して、または酵素を使用せずに、精製した。
【０１３２】
上述のように生産された精製オーシストの生存能を調べるために、バタリーケージで各処置につき５つのペンを使用し、１つのペンにつき５羽のブロイラーを配置した。鳥には試験中常に通常のブロイラースターター飼料を与えた。鳥に、適切な処理の胞子形成アイメリア・マキシマオーシスト１０００個を、経口胃管によって投与した。オーシストは投与の時点で２ヶ月未満の古さだった。紙を引き、チャレンジ後５日目に、各パンに２Ｌの収集液（１０％クエン酸および０．２５％プロピオン酸）を加えた。チャレンジ後８日目に、鳥を安楽死させ、糞便を各パンから個別に収集した。各試料を水で総体積４Ｌに調節し、市販の混合機中、中速で手短に混合し、副次試料を採取した。ＭｃＭａｓｔｅｒｓの方法を使ってオーシスト濃度を決定した。結果は以下の表に示すとおりだった。
【０１３３】
【表１５】
2007531531.tif 000017
【０１３４】
結論
飼料中もしくは加工時またはその両者に酵素を使用しても、オーシスト排出量によって決定されるオーシストの生存能には影響がない。
【実施例８】
【０１３５】
オーシスト精製法への酵素の生産規模使用
ニワトリをアイメリアに感染させ、その結果得られるオーシストに富む糞便を、各種のピーク排出期間中に、１０％クエン酸、０．７５％過酸化水素、および０．２５％プロピオン酸の溶液に収集した。糞便を篩い分けして大きな粒子を除去し、オーシストを胞子形成させた。その懸濁液を遠心分離してオーシストをペレット化し、オーシストを含まない上清を捨てた。ペレット化したオーシスト含有材料をｐＨ約５のリン酸緩衝液に再懸濁した。セルラーゼおよびペクチナーゼ酵素を、体積ベースでそれぞれ約５〜１０％の濃度で加え、その懸濁液を室温で終夜撹拌した。総オーシスト数および総固形物を酵素処理の前後に決定した。
【０１３６】
結果
結果を以下の表１６に示す。
【０１３７】
【表１６】
2007531531.tif 000018
【０１３８】
酵素消化は固形物の体積を平均で５９％減少させることに成功した。オーシスト回収率はいずれの場合も本質的に定量的だった。
【０１３９】
加工すべき固形物の量の減少は、１）下流の加工に必要な試薬の量の減少、２）下流の加工に必要な装置の規模の減少、および３）以降の精製ステップの効率の改善を含むいくつかの良い影響を、工程に与える。
【０１４０】
以上、明快に理解されるように、具体例および実施例を挙げて、本発明をいくらか詳しく説明したが、本願請求項およびその等価物の範囲内で、一定の変更および修正を実施できることは、明白だろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】２０％（ｖ／ｖ）セルラーゼおよび４％（ｖ／ｖ）ペクチナーゼを用いる糞便残渣消化の時間経過を表す。
【図１】
2007531531.tif 000019
【国際調査報告】
2007531531.tif 000020
2007531531.tif 000021
2007531531.tif 000022