(57)【要約】【課題】  信号を記録する技法を提供することにある。【解決手段】  本発明の一態様では、信号を記録する方法は以下のステップを有する。信号に応答してポリマーの合成中に１つまたは複数の誤りが選択的に導入される。合成ポリマー内の１つまたは複数の誤りの１回または複数の発生が記録される。ポリマーの合成は、信号に応答して１つまたは複数の誤りを選択的に導入できるポリマー・シンセターゼを有することができる。信号を分析する方法も提供される。【選択図】  図１
2007501624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
信号に応答してポリマーの合成中に１つまたは複数の誤りを選択的に導入するステップと、
前記合成ポリマー内の前記１つまたは複数の誤りの１回または複数の発生を記録するステップと
を有する、信号を記録する方法。
【請求項２】
複数の供給源からの複数の信号に応答してポリマーの合成中に１つまたは複数の誤りを選択的に導入するステップと、
前記合成ポリマー内の前記１つまたは複数の誤りの１回または複数の発生を記録するステップと、
前記複数の供給源について前記１つまたは複数の誤りの前記１回または複数の記録された発生を比較するステップとによって前記複数の供給源からの前記複数の信号を同時に記録するステップを有する、信号を分析する方法。
【請求項３】
前記または各信号が細胞信号である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記または各ポリマーがバイオポリマーを有する、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
前記信号が、カルシウム濃度、サイクリックＡＭＰ濃度、サイクリックＧＭＰ濃度、電圧、ｐＨ、およびこれらの信号の少なくとも１つを有する組み合わせからなるグループから選択される、請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ポリマーの前記合成が、前記信号に応答して前記１つまたは複数の誤りを選択的に導入できるポリマー・シンセターゼまたはポリメラーゼを有する、請求項１ないし５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記または各ポリマーの前記合成が、前記信号に応答して前記１つまたは複数の誤りを選択的に導入できるデオキシリボ核酸ポリメラーゼを有する、請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記または各信号が細胞活性または神経衝撃と相関関係にある、請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記または各ポリマーが、デオキシリボ核酸、リボ核酸、デオキシリボ核酸誘導体、リボ核酸誘導体、タンパク質、炭水化物、および前記のポリマーの少なくとも１つを有する組み合わせからなるグループから選択される、請求項１ないし８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーの合成中の固有誤り率が、サブユニットあたり約１×１０-5個未満またはそれに等しい誤りである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、信号に関し、詳細には、信号を記録し分析するための技法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞内信号を記録することは、ゲノム解析、細胞生物学、および神経科学の分野では重要なデータ供給源である。たとえば、ゲノム解析および細胞生物学では、細胞内の重要分子の濃度をモニターすることにより、遺伝子発現およびタンパク質相互作用のパターンが測定される。神経科学では、細胞膜を越える電圧差または自由イオンの濃度を記録することにより、研究者は、それにより脳内のほぼすべての計算が実行される細胞内活動電位（１ミリ秒、１００ミリボルト（ｍＶ）のパルス）の時間パターンを入手することができる。
【０００３】
生物学的有機体は様々な構造からなり、その構造は多種多様な型の多数の細胞からなる。たとえば、神経系は、解剖学的に指定された接続を越えて中継される活動電位のパターンを使用して通信する何十億個もの細胞、すなわち、ニューロンからなる。ニューロンから記録するための伝統的な方法は、ガラス微小電極により、直径が約１０〜約２５マイクロメートル程度になる点でニューロンの細胞内空間にアクセスし、細胞の内側と外側との電圧差を増幅し、記録装置を使用して増幅した信号を記録することを伴う。ニューロンの細胞内空間にアクセスすることを伴う方法の説明については、１９５２年にＪ．  ＰＨＹＳＩＯＬ．より発行されたＡ．  Ｌ．  Ｈｏｄｇｋｉｎ他による「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ−Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｉａｎｔ  Ａｘｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｌｉｇｏ」の１１６、４４２−４４８を参照されたい（非特許文献１）。複数のニューロンにアクセスするには、それぞれが個別の増幅器および記録装置に接続された複数の電極を使用することが必要である。このような小さい生物学的構造からの記録に関する機械的制約は、同時に行える記録の近接性および回数を制限していた。進歩により多数のニューロンの記録を可能にする能力が拡張されても、制約は依然として存在する。現在の技法は、わずか１００個までのニューロンを同時に記録することに制限されている。２００１年に２５  ＭＥＴＨＯＤＳより発行されたＪ．  Ｄ．  Ｋｒａｌｉｋ他による「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｅｈａｖｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌｓ」の１２１−５１を参照されたい（非特許文献２）。
【０００４】
生物学的構造を完全に特徴付けるためには、多数の細胞からの記録が必要である。その構造によって実現される時間的相関、原因と結果の相互作用、潜在的通信および情報処理戦略を決定するために、これらの記録をオフラインで分析する必要がある。現在可能な同時記録の回数に制限があるので、これらのオフライン分析を実行するために、種々の時間に種々の検体について行われた種々の実験からの記録が結合される。種々の実験からの結果を結合すると、往々にして、調査した実験標本のいずれか１つの基礎をなす力学を曖昧にし、したがって、たとえば、構造の全体的な機能に関して間違った結論に至る可能性がある。
【０００５】
細胞内記録に関する代替手法は、人工的に導入された細胞内蛍光体を介して細胞内信号が蛍光信号に変換される光学方法の使用を伴う。１８  ＭＥＴＨＯＤＳより発行されたＤ．  Ｓｍｅｔｔｅｒｓ他による「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ」の２１５−２２１を参照されたい（非特許文献３）。蛍光照明下の細胞から放出された光が顕微鏡ビデオ記録を使用して記録されるので、これらの光学方法は複数の細胞の細胞内空間に同時に機械的にアクセスするという問題を解決する。しかし、ほとんどの生物学的組織は光散乱性が高く、したがって、放出された光を集めるために最も進歩した顕微鏡技法を使用しても、焦点面が構造の内側わずか１ミリメートル（ｍｍ）まで進んだときに単細胞の解像は不可能になる。さらに、集光装置の視界および開口数は、結像可能な構造のサイズを制限し、したがって、これらの方法を使用して同時に記録可能な細胞の数を制限する。細胞信号をモニターするキメラ蛍光タンパク質（Chimeric fluorescentprotein）は、すでに合成されている。しかし、これらは、上記で強調された短所を克服するものではない。
【０００６】
細胞からの信号を記録するための他の代替手法は、機能性磁気共鳴映像法（ｆＭＲＩ：functional magnetic resonance imaging）または陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ：positronemission tomography）の使用を伴う。どちらの方法も、脳組織の非常に大きい領域から記録することができる。これらの方法の空間分解能はミリメートル規模に制限される、時間分解能は数百ミリ秒に制限される。したがって、単一ニューロンのサイズが非常に小さくなり、たとえば、０．０５ｍｍ未満になり、活動電位の時間尺度がより短時間になり、たとえば、約１つの隣接ニューロンであると仮定すれば、これらの方法のいずれかを使用する活動電位の細胞内記録は理論的に不可能である。同時に、これらの記録は高度に報知的なミリ秒になりうる。その代わりに、ｆＭＲＩおよびＰＥＴ撮影法が提供するものは、何十万もの脳機能からの平均信号へのアクセスであり、それらは脳構造を単一ニューロンのレベルまで分解することができず、したがって、これらの構造内のニューロ・コンピューティングを分析することができない。
【特許文献１】米国特許第６４６９１５４号
【特許文献２】米国特許第６４０３３７４号
【特許文献３】米国特許第６３４９１６０号
【特許文献４】米国特許第６３４２３７９号
【特許文献５】米国特許第６３１９６６９号
【特許文献６】米国特許第６２４８５５０号
【特許文献７】米国特許第６１９７９２８号
【特許文献８】米国特許第６１８０４１１号
【特許文献９】米国特許第６１５０１７６号
【特許文献１０】米国特許第６１４０１３２号
【特許文献１１】米国特許第６１２４１２８号
【特許文献１２】米国特許第６１０７０６６号
【特許文献１３】米国特許第６０７７７０７号
【特許文献１４】米国特許第６０６６４７６号
【特許文献１５】米国特許第６０５４３２１号
【特許文献１６】米国特許第６０５４２７１号
【特許文献１７】米国特許第６０４６９２５号
【特許文献１８】米国特許第６００８３７８号
【特許文献１９】米国特許第５９９８２０４号
【特許文献２０】米国特許第５９８１２００号
【特許文献２１】米国特許第５９４８９０６号
【特許文献２２】米国特許第５９２５５５８号
【特許文献２３】米国特許第５９１２１３７号
【非特許文献１】１９５２年にＪ．  ＰＨＹＳＩＯＬ．から発行されたＡ．  Ｌ．  Ｈｏｄｇｋｉｎ他による「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｕｒｒｅｎｔ−Ｖｏｌｔａｇｅ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｉａｎｔ  Ａｘｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｌｉｇｏ」の１１６、４２４−４４８
【非特許文献２】２００１年に２５  ＭＥＴＨＯＤＳより発行されたＪ．  Ｄ．  Ｋｒａｌｉｋ他による「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｍｕｌｔｉｓｉｔｅ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ  Ｒｅｃｏｒｄｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｅｈａｖｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌｓ」の１２１−５１
【非特許文献３】１８  ＭＥＴＨＯＤＳより発行されたＤ．  Ｓｍｅｔｔｅｒｓ他による「Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ａｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ」の２１５−２２１
【非特許文献４】１９９６年に２７４  ＳＣＩＥＮＣＥ  ５２８９より発行されたＭＲ．．  Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ他による「Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ」の９９８−１００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
生物学的構造およびプロセスの包括的研究を実現できるように、上記その他の制限を受けない細胞分析のための技法を有することが望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、第１の態様において、信号を記録する方法を提供し、この方法は、信号に応答してポリマーの合成中に１つまたは複数の誤りを選択的に導入するステップと、合成ポリマー内の１つまたは複数の誤りの１回または複数の発生を記録するステップとを有する。
【０００９】
好ましくは、信号は細胞信号である。
【００１０】
好ましくは、ポリマーはバイオポリマーを有する。
【００１１】
好ましくは、信号は、カルシウム濃度、サイクリックＡＭＰ濃度、サイクリックＧＭＰ濃度、電圧、ｐＨ、および前記の信号の少なくとも１つを有する組み合わせからなるグループから選択される。
【００１２】
好ましくは、ポリマーの合成は、信号に応答して１つまたは複数の誤りを選択的に導入できるポリマー・シンセターゼを有する。
【００１３】
好ましくは、ポリマーの合成は、信号に応答して１つまたは複数の誤りを選択的に導入できるポリメラーゼを有する。
【００１４】
好ましくは、ポリマーの合成は、信号に応答して１つまたは複数の誤りを選択的に導入できるデオキシリボ核酸ポリメラーゼを有する。
【００１５】
好ましくは、信号は細胞活性と相関関係にある。
【００１６】
好ましくは、信号は神経衝撃と相関関係にある。
【００１７】
好ましくは、ポリマーは、デオキシリボ核酸、リボ核酸、デオキシリボ核酸誘導体、リボ核酸誘導体、タンパク質、炭水化物、および前記のポリマーの少なくとも１つを有する組み合わせからなるグループから選択される。
【００１８】
好ましくは、ポリマーの合成中の固有誤り率は、サブユニットあたり約１×１０-5個未満またはそれに等しい誤りである。
【００１９】
好ましくは、ポリマーの合成は既知の比率で進行する。
【００２０】
好ましくは、信号記録は生体外で実行される。
【００２１】
好ましくは、信号記録は生体内で実行される。
【００２２】
好ましくは、ポリマー・シンセターゼは、信号によって誘発されたコンフォメーション（conformation）の変化により１つまたは複数の誤りを選択的に導入することができる。
【００２３】
好ましくは、記録ステップは、合成されたポリマーの実際の組成とそのポリマーについて予測された組成を比較するステップをさらに有する。
【００２４】
好ましくは、予測された組成は、相補的バイオポリマー（complementarybiopolymer）から誘導される。
【００２５】
好ましくは、信号を誘発するために刺激を提供するステップを有する。
【００２６】
第２の態様において、本発明は、信号を分析する方法を提供し、この方法は、複数の供給源からの複数の信号に応答してポリマーの合成中に１つまたは複数の誤りを選択的に導入するステップと、合成ポリマー内の１つまたは複数の誤りの１回または複数の発生を記録するステップと、複数の供給源について１つまたは複数の誤りの１回または複数の記録された発生を比較するステップとによって複数の供給源からの複数の信号を同時に記録するステップを有する。
【００２７】
好ましくは、複数の供給源は１つまたは複数の細胞を有する。
【００２８】
好ましくは、複数の信号は、カルシウム濃度、サイクリックＡＭＰ濃度、サイクリックＧＭＰ濃度、電圧、ｐＨ、および前記の信号の少なくとも１つを有する組み合わせからなるグループから選択される。
【００２９】
好ましくは、ポリマーの合成は、複数の信号に応答して１つまたは複数の誤りを選択的に導入できる少なくとも１つのポリマー・シンセターゼを有する。
【００３０】
好ましくは、複数の信号は１つまたは複数の細胞活性と相関関係にある。
【００３１】
好ましくは、複数の信号は神経衝撃と相関関係にある。
【００３２】
好ましくは、ポリマーは、デオキシリボ核酸、リボ核酸、デオキシリボ核酸誘導体、リボ核酸誘導体、タンパク質、炭水化物、および前記のポリマーの少なくとも１つを有する組み合わせからなるグループから選択される。
【００３３】
好ましくは、ポリマーの合成中の固有誤り率は、サブユニットあたり約１×１０-5個未満またはそれに等しい誤りである。
【００３４】
好ましくは、ポリマーの合成は既知の比率で進行する。
【００３５】
好ましくは、少なくとも１つのポリマー・シンセターゼは、複数の信号によって誘発されたコンフォメーションの変化により１つまたは複数の誤りを選択的に導入することができる。
【００３６】
好ましくは、記録ステップは、
合成されたポリマーの組成とそのポリマーについて予測された組成を比較するステップと、
合成されたポリマー内の１つまたは複数の誤りを識別するステップと、
１つまたは複数の誤りを分析するステップと、
をさらに有する。
【００３７】
好ましくは、予測された組成は、相補的バイオポリマーから誘導される。
【００３８】
したがって、本発明は、好ましくは、信号を記録する技法を提供する。本発明の一態様では、信号を記録する方法は以下のステップを有する。信号に応答してポリマーの合成中に１つまたは複数の誤りが選択的に導入される。合成ポリマー内の１つまたは複数の誤りの１回または複数の発生が記録される。ポリマーの合成は、信号に応答して１つまたは複数の誤りを選択的に導入できるポリマー・シンセターゼを有することができる。
【００３９】
本発明の他の態様では、信号を分析する方法は以下のステップを有する。複数の供給源からの複数の信号が同時に記録される。複数の信号に応答してポリマーの合成中に１つまたは複数の誤りを選択的に導入し、合成ポリマー内の１つまたは複数の誤りの１回または複数の発生を記録することによって、複数の信号が記録される。複数の供給源について１つまたは複数の誤りの１回または複数の記録された発生が比較される。
【００４０】
次に、添付図面に関連して、一例としてのみ、本発明の好ましい一実施形態について説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
細胞信号を記録し分析するための例示的な技法に関連して、本発明について以下に説明する。しかし、本発明の教示は細胞に関連する信号に制限されず、他の供給源、たとえば、非生物学的供給源から誘導された信号も含む予定であることを理解されたい。
【００４２】
図１は、細胞信号を記録する例示的な技法を示す図である。図１に示されている通り、細胞信号に応答して、ポリマー、この例示的な実施形態ではバイオポリマーの合成中に誤りを選択的に導入することができる。具体的には、図１には細胞信号１０２が存在する。細胞信号１０２は、カルシウム濃度、サイクリック・アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）濃度、サイクリック・グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）濃度、電圧、ｐＨ、および前記の細胞信号の少なくとも１つを有する任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない特定の細胞活性を示す任意の発生を有することができる。したがって、本明細書で使用する細胞信号という用語は、細胞活性の任意のインジケータに広く関連するものである。このため、細胞信号１０２は、細胞活性と相関関係にある可能性がある。たとえば、細胞信号１０２がカルシウム濃度を有する場合、相関関係のある細胞活性は神経衝撃である可能性がある。神経衝撃中に電位開口型カルシウム・チャネルが開くと高いカルシウム濃度が発生し、その結果、あるニューロンから他のニューロンに神経衝撃を伝達する神経伝達物質のリリースに至る可能性がある。
【００４３】
本明細書で記録される細胞信号は、細胞内信号、細胞外信号、またはその両方を含む可能性がある。すなわち、本明細書で提供される技法は、たとえば、以下に詳細に説明する通り、細胞信号およびバイオポリマー合成前駆体が人工的に提供される生体外媒体を介して独立してまたは細胞外に存在する信号に関して相関関係のある細胞内活動を示す細胞内信号の記録に等しく適用可能である。
【００４４】
合成されたバイオポリマー、たとえば、バイオポリマー１０４は、サブユニットの連鎖を有する任意の生物学的物質を有することができ、その組成は配列技術などの従来の方法によって入手することができ、その合成は制御しモニターすることができる。適切なバイオポリマーとしては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ誘導体、タンパク質、炭水化物、および前記のバイオポリマーの少なくとも１つを有する組み合わせを含むがこれらに限定されない生物学的物質を含む。例示的な一実施形態では、バイオポリマー１０４はＤＮＡを有する。
【００４５】
図１に示されている例示的な実施形態では、バイオポリマー１０４は、ＤＮＡ複製の既知のプロセスにより、鋳型鎖、すなわち、バイオポリマー１０６を使用して合成される。その場合、バイオポリマー１０６は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ誘導体、ＲＮＡ誘導体、タンパク質、炭水化物、および前記のバイオポリマーの少なくとも１つを有する組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の生物学的物質も有することができる。このため、バイオポリマー１０４とバイオポリマー１０６は相補的物質になる。しかし、図１に示されているように、バイオポリマー合成、たとえば、複製または転写に相補的物質を使用することは、例示的な方法の１つに過ぎない。バイオポリマーは、バイオポリマー内の組成、すなわち、サブユニットの配列がどうあるべきかを指図する他の既知の生化学的メカニズムによって合成することができ、その結果、予測可能なエレメントの配列が得られる。本明細書の教示によれば、以下に詳細に説明する通り、使用するバイオポリマー合成方法の結果として、導入される誤りの決定を可能にするために予測可能なサブユニットの配列が得られるはずである。これらの生化学的メカニズムは、バイオポリマーの合成を調整するために特定の前駆体および代謝経路の使用を伴う可能性がある。
【００４６】
次に、バイオポリマー１０４の合成中に選択的に導入された誤りが識別される。本明細書で使用する「誤り」という用語は、バイオポリマー内で発生する任意の予期せぬサブユニットを指す。バイオポリマー内の予期されたサブユニットの配列は、既知の生化学的プロセスに基づいて予測することができる。これらのプロセスは、あるバイオポリマーから他のバイオポリマーへの複製または転写を含むことができ、その場合、予期されたサブユニットの配列は鋳型または相補的バイオポリマーによって表される。他の既知の生化学的プロセスは、上述の通り、鋳型が必ずしも存在せずに予測された配列に基づいて、予期された配列を発生することができる。
【００４７】
予期されたサブユニットの配列が相補的バイオポリマー、たとえば、バイオポリマー１０６によって表される事例では、相補的バイオポリマーの組成は既知のものであるかまたは決定可能なものでなければならない。次に、合成されたバイオポリマー１０４の組成は、以下に詳細に説明する通り、バイオポリマー１０６の既知の組成または決定された組成と比較することができる。
【００４８】
例示的な一実施形態では、細胞信号１０２に応答する改変バイオポリマー・シンセターゼ、たとえば、バイオポリマー・シンセターゼ１０８の使用により、バイオポリマー１０４の合成中に誤りが選択的に導入される。バイオポリマー・シンセターゼ１０８は、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼを含むがこれらに限定されない任意のバイオポリマー合成触媒を有することができる。しかし、本明細書で使用する「シンセターゼ」という用語は、少なくとも２つの分子の連鎖に触媒作用を及ぼす任意の分子に広く適用可能である。
【００４９】
細胞信号１０２の存在の結果として、バイオポリマー・シンセターゼ１０８の誤り率が増加する。たとえば、カルシウム濃度が増加すると、複製誤り率が増加する。細胞信号１０２が飽和に到達すると、誤り率は理論的に言えばサブユニットあたり１つの誤りに近づかなければならない。以下に説明する通り、固有誤り率が低い場合、合成された配列内の誤りは、相対的な確信を持って、細胞信号１０２に帰する可能性がある。
【００５０】
バイオポリマー・シンセターゼは、遺伝物質の複製を含む、多くの身体プロセスにおいて重要な役割を果たす。たとえば、ＤＮＡのコピーは、あるタイプのバイオポリマー・シンセターゼ・タンパク質、すなわち、特定の鋳型配列から相補的ＤＮＡ鎖を構築するＤＮＡポリメラーゼによって生成される。例示的な一実施形態では、合成されたバイオポリマーはＤＮＡであり、バイオポリマー・シンセターゼはＤＮＡポリメラーゼである。しかし、本明細書の教示によれば、バイオポリマーはＲＮＡなどの任意の適切な遺伝物質を有することができ、バイオポリマー・シンセターゼはＲＮＡポリメラーゼなどの任意の適切なバイオポリマー・シンセターゼを有することができる。
【００５１】
ＤＮＡおよびＲＮＡなどのバイオポリマーの合成は、毎秒１０００個の塩基対（ｂｐ／秒）に近い比率で行われる。自然複製プロセス中に固有の誤りが発生する。しかし、このような固有の誤りの発生率（固有誤り率）は概して非常に低い。固有誤り率は一般にサブユニットあたり１×１０-5個未満の誤りである。たとえば、Ｔ７ウイルスのＤＮＡ複製の場合、誤り率はサブユニットあたり約１×１０-7個の誤りであり、大腸菌およびキイロショウジョウバエの誤り率はサブユニットあたり約１×１０-10個の誤りである。しかし、前述の通り、改変バイオポリマー・シンセターゼ、たとえば、バイオポリマー・シンセターゼ１０８の場合、誤り率は細胞信号１０２の存在中にサブユニットあたり１個の誤りに近づく可能性がある。したがって、本明細書の教示によれば、細胞信号１０２が存在しない場合、改変バイオポリマー・シンセターゼは、天然タンパク質の固有誤り率、たとえば、サブユニットあたり１×１０-5個未満の誤りに近い誤り率を示さなければならない。
【００５２】
バイオポリマー・シンセターゼ１０８の誤り率は、細胞信号１０２の量が低減されるかまたはそれが存在しないときに固有誤り率への逆戻りを可能にする任意の適切なメカニズムにより細胞信号１０２に応答して増加する可能性がある。例示的な一実施形態では、細胞信号１０２の存在は、バイオポリマー・シンセターゼ１０８においてコンフォメーションの変化を誘発する。このコンフォメーションの変化により、バイオポリマー・シンセターゼ１０８はますます、バイオポリマー鎖内の突き止め可能な位置において合成されたバイオポリマー１０４内に間違ったサブユニットを入れることになる。
【００５３】
バイオポリマー・シンセターゼ１０８がＤＮＡポリメラーゼを有し、バイオポリマー１０４がＤＮＡを有する例示的な実施形態では、間違ったサブユニットは、相補的鎖、すなわち、バイオポリマー１０６上の同じ位置でヌクレオチド塩基に対して非相補的であるヌクレオチド塩基を示す。たとえば、図１に示されている通り、鎖の５¢端からのバイオポリマー１０６は、最初の３つのヌクレオチド塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、アデニン、およびチミン（Ｔ）を有する。鎖の５¢端からのバイオポリマー１０４は、最初の３つのヌクレオチド塩基、すなわち、チミン、チミン、およびシトシン（Ｃ）を有する。アデニンとチミンは相補的ヌクレオチド塩基対であるが、チミンとシトシンはそうではない。したがって、バイオポリマー１０４内のシトシンの間違ったヌクレオチド塩基対が細胞信号１０２に応答するものと推定される。
【００５４】
したがって、たとえば、細胞信号１０２がカルシウム濃度を有する場合、神経衝撃中にカルシウム・レベルは上昇し、バイオポリマー・シンセターゼ１０８は一時的なコンフォメーションの変化を受け、複製中の誤り率は増加することになる。このコンフォメーションの変化は、典型的なタンパク質工学技法を使用してＤＮＡポリメラーゼ・タンパク質内に人工的に導入されたカルシウムとカルシウム結合ドメインとの結合によって生成される。カルシウムを結合すると、この変性タンパク質は、ＤＮＡポリメラーゼのイプシロン・サブユニットを不活性状態にするコンフォメーションの変化を受けるが、これは通常、複製されたＤＮＡを「プルーフリーディング（proofread）」するためのＤＮＡポリメラーゼの通常の能力ならびに３¢〜５¢エキソヌクレアーゼ活性に対する責任がある。ＤＮＡポリメラーゼの第２の重合サブユニットは依然としてコンフォメーションの変化の影響を受けないので、複製は通常の比率で進行することになる。カルシウム誘発のコンフォメーションの変化がイプシロン・サブユニットを不活性状態にしているので、重合サブユニットによって導入される誤りはもはやイプシロン・サブユニットによって削除または訂正されることはない。
【００５５】
したがって、時期および場所にかかわらず、増加したカルシウム濃度の存在下で複製が行われると、変性ＤＮＡポリメラーゼ、たとえば、バイオポリマー・シンセターゼ１０８に関する有効誤り率、したがって、新たに合成されたＤＮＡの鎖内で観察される誤り率は、必ずより高いものになる。カルシウム・レベルが低下すると、カルシウム結合ドメインはもはやカルシウムを結合せず、変性ＤＮＡポリメラーゼはその以前のコンフォメーションに戻り、ＤＮＡポリメラーゼのイプシロン・サブユニットのプルーフリーディング機能は回復され、固有誤り率が検出される。
【００５６】
コンフォメーションを変更し、細胞内信号を蛍光信号などの記録可能な信号に変換することが可能な改変タンパク質の例は、たとえば、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６４６９１５４号「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ」（特許文献１）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６４０３３７４号「Ｌｏｎｇ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（特許文献２）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６３４９１６０号「Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ」（特許文献３）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６３４２３７９号「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（特許文献４）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６３１９６６９号「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（特許文献５）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６２４８５５０号「Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」（特許文献６）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６１９７９２８号「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ」（特許文献７）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６１８０４１１号「Ｌｉｇｈｔ−Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  Ｔｈａｔ  Ｍｅｍｏｒｉｚｅ  Ａｎａｌｙｔｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ」（特許文献８）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６１５０１７６号「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐＨ  ｏｆ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ」（特許文献９）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６１４０１３２号「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐＨ  ｏｆ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ」（特許文献１０）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６１２４１２８号「Ｌｏｎｇ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（特許文献１１）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６１０７０６６号「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ  ｂｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」（特許文献１２）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６０７７７０７号「Ｌｏｎｇ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（特許文献１３）、Ｔｓｉｅｎ他による米国特許第６０６６４７６号「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（特許文献１４）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第６０５４３２１号「Ｌｏｎｇ  Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（特許文献１５）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第６０５４２７１号「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（特許文献１６）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第６０４６９２５号「Ｐｈｏｔｏ  ｃｈｒｏｍｉｃ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｓｔｏｒａｇｅ，  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」（特許文献１７）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第６００８３７８号「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｔｈａｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  Ｒｅａｃｔ  Ｗｉｔｈ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」（特許文献１８）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第５９９８２０４号「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｅｓ」（特許文献１９）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第５９８１２００号「Ｔａｎｄｅｍ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」（特許文献２０）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第５９４８９０６号「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ  Ｄｙｅｓ  ｆｏｒ  Ａｌｋａｌｉ  Ｍｅｔａｌ  Ａｃｔｉｏｎｓ」（特許文献２１）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第５９２５５５８号「Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕｉｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」（特許文献２２）、Ｔｉｓａｎｅ他による米国特許第５９１２１３７号「Ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕｉｎｃｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ」（特許文献２３）に記載されている。上記文献に示されている改変タンパク質は、蛍光ベースの分析を提供するものである。
【００５７】
例示的な一実施形態では、本明細書で提供される技法は、生体内で、たとえば、マウス、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼを有するバイオポリマー・シンセターゼ１０８およびＤＮＡを有するバイオポリマー１０４を備えたマウス・モデル内で実行される。バイオポリマー１０６およびバイオポリマー・シンセターゼ１０８はマウス宿主（以下「宿主」）に導入される。バイオポリマー１０６およびバイオポリマー・シンセターゼ１０８は、ウイルス感染、細胞による直接噴射、バイオポリマー１０６とバイオポリマー・シンセターゼ１０８を既に有する遺伝子導入宿主の使用、および前記の導入技法の少なくとも１つを有する組み合わせを含むがこれらに限定されない任意の適切な既知の技法によって宿主に導入することができる。
【００５８】
複数の細胞からの複数の細胞信号は同時に記録することができる。細胞信号１０２とバイオポリマー１０４に導入された誤りを相関させる正確な時間判断を達成するために、バイオポリマー１０４の合成を制御することは有利なことである。具体的には、バイオポリマー１０４の合成が開始し終了する時期を制御できることにより、その間に細胞信号１０２発生し、誤りが導入される期間の正確なスナップショットが得られることになる。例示的な一実施形態では、バイオポリマー・シンセターゼ１０８は不活性状態の形で宿主に導入される。所望であれば、バイオポリマー・シンセターゼ１０８は、バイオポリマー１０６の複製を開始するように活性化することができる。具体的には、バイオポリマー・シンセターゼ１０８は、宿主に導入される薬物、熱ショックまたは前記の活性化技法の少なくとも１つを有する任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない何らかの適切な外的影響を使用して、選択的に活性化することができる。
【００５９】
さらに、細胞信号１０２または相関関係のある細胞活性あるいはその両方は何らかの刺激によって呼び出すことができる。例示的な刺激としては、可視刺激、可聴刺激、および前記の刺激の少なくとも１つを有する組み合わせを含むがこれらに限定されない、宿主が曝される外部刺激を含む。これらの刺激は、細胞信号１０２が神経衝撃を有する細胞活性と相関関係にあるときに最も適用可能である。また、宿主有機体は、特定の薬物によって刺激することもできる。この薬物導入方法は、特定の薬物療法の全身作用を検査するために適している。
【００６０】
バイオポリマー１０４の合成における誤りの発生は、図１にさらに示されているように記録される。図１では、誤り率１１０は、細胞信号１０２、バイオポリマー１０６、およびバイオポリマー１０４に関して示されている。誤り率１１０から分かるように、細胞信号１０２のそれぞれが検出され、その後の間違ったサブユニット、たとえば、ヌクレオチド塩基が合成されたバイオポリマー１０４内に現れると、誤り率は増加する。その特定の細胞信号がもはや存在しなくなると、他の細胞信号１０２が検出されるまで、誤り率１１０は低下して元に戻る。
【００６１】
図１に示されている通り、バイオポリマー１０４の合成および相関関係のある誤り率１１０は時間の関数として提示される。上記で強調されている通り、ＤＮＡ複製は約１０００ｂｐ／秒の比率で行われる。このため、本明細書の技法は、たとえば、複製されるゲノムのサイズによって指図された持続時間を有することができる。たとえば、バイオポリマー１０６が４００００塩基対のＴ７ウイルス・ゲノムである場合、実験フェーズは４０秒を超えてはならない。しかし、使用するゲノムのサイズが増加するにつれて、実験フェーズの持続時間も増加する可能性がある。
【００６２】
実験フェーズの所定の持続時間に達した後にバイオポリマー１０４の合成において発生した誤りを記録するために、宿主は犠牲にされ、組織は迅速に固定される。宿主を犠牲にすることにより、バイオポリマー１０６のそれ以上の複製が中止される。固定ステップは、合成されたバイオポリマー１０４をこのフェーズで決定された安定状態に保持するために必要である。次に、宿主の細胞組織が解剖され、カタログに登録される。この技法の空間分解能は、適切な解剖および検索方法、たとえば、レーザ捕獲顕微解剖の場合に、単細胞分解まで容易に低減することができ、１９９６年に２７４  ＳＣＩＥＮＣＥ  ５２８９より発行されたＭＲ．．  Ｅｍｍｅｒｔ−Ｂｕｃｋ他による「Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ」の９９８−１００１を参照されたい。
【００６３】
次に、各細胞が取られた場所を示す物理的座標に基づいて、各細胞をカタログに登録することができる。細胞型を含むその他の情報は、細胞をカタログに登録する際に有用である可能性がある。
【００６４】
合成されたバイオポリマー１０４のそれぞれは、細胞から抽出され、独立して配列される。次に、各バイオポリマー１０４の組成は、上述の通りに決定された、予測された組成と比較される。たとえば、図１のように、各バイオポリマー１０４の組成は、相補的バイオポリマー１０６のそれぞれの配列と比較することができる。バイオポリマー１０４の合成中に導入された誤りは識別され、その後、分析することができる。バイオポリマー１０４内の誤りを分析すると、それぞれの誤りと、おそらくその誤りを誘発した細胞信号１０２とを相関させることができる。制御された実験持続時間、たとえば、固定された開始点および停止点と、バイオポリマー合成の既知の比率を有することにより、この相関を正確に行うことができる。図１は、細胞信号１０２と細胞活性をさらに相関させるために、この相関をどのように使用できるかを示している。細胞信号１０２と細胞活性を相関させることにより、相互に関してならびにこのような細胞の系全体に関して細胞の活性を分析することができる。この例示的な実施形態では、細胞活性は神経衝撃である。神経衝撃は一般に、ニューロンまたは神経細胞の膜を越える電圧変動によって特徴付けられる。前述の通り、カルシウム濃度は神経衝撃を知らせることができる。図１で提供される情報、すなわち、細胞信号１０２の各事例が発生する時期、およびバイオポリマー１０４の合成中の誤り率１１０を使用すると、元の細胞活性、たとえば、神経衝撃１１２を再現することができる。
【００６５】
本明細書の教示によれば、バイオポリマー１０４の合成中に導入された誤りは、任意の従来の技法を使用して識別し分析することができる。例示的な一実施形態では、観察されたサブユニットの配列に作用し、それを予測されたサブユニットの配列と比較するコンピュータ・アルゴリズムを使用して、誤りが検出される。観察された配列内の予測されたサブユニットはアルゴリズムによって０として記録され、予期せぬサブユニットは１として記録される。次に、記録された１と０の配列がアルゴリズムによってさらに処理されるが、これは、元の細胞信号を再構築する目的でその配列にフィルタを適用する可能性がある。このフィルタは、１組の共通フィルタ（たとえば、ガウス・フィルタ）から選択するか、または細胞信号の最適再構築のために計算し、そのアルゴリズムに提供することができる。複数の再構築された細胞信号は次に、原因と結果の相互作用または複数の記録された細胞間に存在するネットワーク特性あるいはその両方を分析するために相関分析を実行する第２のコンピュータ・アルゴリズムによって比較される。相関関係、原因と結果の相互作用、またはネットワーク特性、あるいはこれらの組み合わせは、細胞信号が記録された細胞のカタログ登録された位置に関して第２のコンピュータ・アルゴリズムによって表示される。このように、時空間相関マップを構築することができる。
【００６６】
上記で強調されている通り、本明細書で提供される技法は、生体内モデルによる実験手順を対象とするが、この技法は生体外実験にも等しく適用可能であることを理解されたい。例示的な一実施形態では、バイオポリマー１０６およびバイオポリマー・シンセターゼ１０８はバイオポリマー１０４の合成のために必要な前駆体を含む適切な媒体に導入される。細胞信号１０２は選択的に導入または除去あるいはその両方が行われ、バイオポリマー１０４の合成における誤り率１１０が記録される。
【００６７】
上述の通り、信号という用語は、非生物学的供給源から誘導された信号も含むことができる。例示的な一実施形態では、記録された信号は、たとえば、化学反応からの化学信号である可能性がある。化学反応を伴う生産プロセスは概して化学排水を生み出す。この化学排水の存在は、ポリマーの合成中に誤りを選択的に導入する働きをする可能性がある。このため、この化学排水は、本明細書で提供される技法により、記録可能かつ分析可能な信号である可能性がある。
【００６８】
本発明の例示的な諸実施形態について本明細書で説明してきたが、本発明はこれらの諸実施形態そのものに限定されず、本発明の範囲または精神を逸脱せずに当業者により様々な他の変更および修正が可能であることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】本発明の一実施形態により細胞信号を記録する例示的な技法を示す図である。
【図１】
2007501624.tif 000003
【国際調査報告】
2007501624.tif 000004
2007501624.tif 000005
2007501624.tif 000006