(57)【要約】  光学トラップの静的アレイは微視的な対象物をサイズに対して指数関数的な感度で仕分けするために使用することができる。斯かる光学分別は外力と移動する対象物の光学傾斜トラップに対する異なる親和性との間の競合に基づくものである。逆分別法では、トラップの影響をより強く受ける対象物はアレイに動力学的に固定されやすくなり、意図的に入力フローに曲げ戻される。サーマル・ラチェット法では、パタンは粒子が拡散できるよう間隔が置かれ、それらのパタンの中を前方または後方に移動する機会が与えられる。他の仕分け技術と異なり、光学分別は連続的に機能することができ、連続的に最適化可能である。また指数関数的感度は、事実上、一般的にポテンシャルウェルの見掛け幅の粒子サイズ依存性から生じる。
2007516095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１チャネルおよび第２チャネルと、
前記チャネルの中を進むよう微小対象物の集団を駆動するための駆動力源と、
前記第１および第２のチャネルが合流する位置にあり、複数の光学トラップを形成するためのレーザ光線により生成される複数のマニホルドと
を備えてなり、
前記光学トラップは、ある１つのパタンのマニホルドが残りのパタンのマニホルドによって分離されるように複数のパタンに組織されると共に、
前記光学トラップは、駆動力方向に対してある角度で傾斜し、各パタンの光学トラップがその他残りのパタンのトラップによって分離されるように配置され、
微小対象物の集団は少なくとも１つの所望する部分と所望しない部分とに分別されるものである、微小対象物の集団を分別するための光学分別装置。
【請求項２】
微小対象物の集団は前記第１チャネルを流れる流体媒質内に分散し、緩衝流体は前記第２チャネルを流れるものである請求項１に記載の光学分別装置。
【請求項３】
前記チャネルはＨ接合を構成するものである請求項１に記載の光学分別装置。
【請求項４】
前記光学トラップは、ホログラフィックな光学的手段によって生成されるものである請求項１に記載の光学分別装置。
【請求項５】
前記所望しない部分は前記所望する部分よりも拡散性または運動性が高いものである請求項１に記載の光学分別装置。
【請求項６】
前記所望する部分は前記所望しない部分よりも拡散性または運動性が高いものである請求項１に記載の光学分別装置。
【請求項７】
前記駆動力の方向における前記マニホルドの間隔は個々のトラップの幅よりも十分大きいものである請求項１に記載の光学分別装置。
【請求項８】
前記光学トラップは、前記パタンが順次励起される間に微小粒子の集団の一部のみを前進させるように構成されている請求項７に記載の光学分別装置。
【請求項９】
前記パタンは、１つのパタンにトラップされた微小粒子の集団が別のパタンが励起されているときに拡散することができるように構成されている請求項７に記載の光学分別装置。
【請求項１０】
微小粒子の集団を少なくとも１つの所望する部分と所望しない部分とに連続的に分別する方法であって、
微小粒子の集団を駆動するための外力を提供する段階と、
複数の光学トラップを形成するためのレーザ光線を提供する段階と、
前記所望する部分を保持しながら前記所望しない部分をトラップから逃すことができるように前記光学トラップを組織する段階と
を含んでなる光学分別方法。
【請求項１１】
微小対象物の集団を前記第１チャネルに流れる流体内へと分散させる段階を更に含み、緩衝流体は前記第２チャネルへと流れるものである請求項１０に記載の光学分別方法。
【請求項１２】
前記チャネルはＨ接合を構成するものである請求項１０に記載の光学分別方法。
【請求項１３】
前記光学トラップをホログラフィック光ピンセット技術により生成する段階を更に含む請求項１０に記載の光学分別方法。
【請求項１４】
前記駆動力の方向における前記マニホルドの間隔は個々のトラップの幅よりも十分大きいものである請求項１０に記載の光学分別方法。
【請求項１５】
前記パタンが順次励起される間に微小粒子の集団の一部のみが前記光学トラップを前進するものである請求項１０に記載の光学分別方法。
【請求項１６】
１つのパタンにトラップされた微小粒子の集団は、別のパタンが励起されたときに自由に拡散することができる状態に置かれるものである請求項１０に記載の光学分別方法。
【請求項１７】
一部の微小粒子は前記光学トラップのアレイを前進し、一部の微小粒子は前記光学トラップのアレイを後進するものである請求項１０に記載の光学分別方法。
【請求項１８】
微小粒子の集団を駆動するための外力を提供する段階と、
複数の光学トラップを形成するためにレーザ光線を集束させる段階と、
各マニホルドは少なくとも１つのトラップを含んでおり、各パタンが少なくとも１つのマニホルドを含む複数のパタンを提供する段階と、
先に熱的に励起されたパタンにトラップされた粒子が別のパタンが熱的に励起されたときに自由に拡散するように各パタンを適切な時間間隔で熱的に励起させる段階と
を含んでなり、
微小対象物の集団は、少なくとも１つの所望する部分と所望しない部分とに分別されるものである、微小粒子の集団を連続的に分別する光学分別方法。
【請求項１９】
ホログラフィック光ピンセット技術により前記光学トラップを生成する段階を更に含む請求項１８に記載の光学分別方法。
【請求項２０】
前記駆動力の方向における前記マニホルドの間隔は個々のトラップの幅よりも十分大きいものである請求項１８に記載の光学分別方法。
【請求項２１】
前記パタンが順次励起される間に微小粒子の集団の一部分のみが前記光学トラップを前進するものである請求項１８に記載の光学分別方法。
【請求項２２】
１つのパタンにトラップされた微小粒子の集団は別のパタンが励起されたときに自由に拡散することができる状態に置かれるものである請求項１８に記載の光学分別方法。
【請求項２３】
一部の微小粒子は前記光学トラップのアレイを前進し、一部の微小粒子は前記光学トラップのアレイを後進するものである請求項１８に記載の光学分別方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は米国政府の支援により米国立科学財団から受けた研究補助金DMR-0304960およびDBI-0233971をもとに、また研究補助金DMR-0213745を受けた米国立科学財団のＭＲＳＥＣプログラムを通じて実施された。米国政府は本研究を実施するにあたって結ばれた契約および補助金に基づいて本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、一般に微小粒子を仕分けするための方法および装置の実現に関する。より具体的には、本発明は、例えば高分子、生体分子、ナノクラスタ、コロイド粒子および生体細胞などの微小対象物を仕分けするホログラフィック光ピンセット（holographic optical tweezers）技術の利用を対象にする。
【背景技術】
【０００３】
光ピンセットは、光勾配力を利用して２次元および３次元の両方における微小な通常はマイクロクラスタ程度の容積を有する物質をトラップする。ホログラフィック形態の光ピンセットは、コンピュータ処理の回折光学素子を利用して単一のレーザ光線から多数の光ピンセットを作り出す。これらの光ピンセットはその場の必要に応じて任意の望ましい配置に設定できる。
【発明の開示】
【０００４】
粒子を正確に比較的高い信頼度で移動させるシステムが知られているが、従来のシステムでは粒子の運動の各個別の段階毎に個別のホログラムが投影される必要がある。複数のホログラムの計算は時間を消費し、かなりの計算の手間を要する。さらに、斯かるコンピュータ処理の光ピンセットまたは他の動的な光ピンセットシステムを実現するために必要とされるコンピュータ・アドレス可能な投影システムは極めて高価なものになりがちである。
【０００５】
多くの技術的にも商業的にも重要なシステムの挙動は、変調されたポテンシャルエネルギーのランドスケープを通る古典的な輸送の結果、生じる。これらの挙動を利用する１つの方法は光学分別（optical fractionation）である。光学分別は微小対象物の集団を、光学トラップのアレイの中を移動する異なる能力に基づいて、別々の部分に（与えられた時間区分の中で）連続的に仕分けすることができる。特に、例えば流れている流体の中の粘性抵抗などの外力によって駆動される対象物は、その対称軸が駆動力の方向とは一定の角度だけ傾いたトラップのアレイに遭遇する。一般的に、これらのトラップはホログラフィック光ピンセット技術により作り出される。トラップによって生み出されたポテンシャルエネルギーウェルの影響をより強く受けた対象物はトラップからトラップへと飛び移る傾向があり、そのため駆動力の方向から離れるように偏向される。駆動力の影響をより強く受けたあるいは光学トラップの影響をより小さく受けた他の対象物は偏向されることなくトラップを通過する。トラップの配置に基づいて異なる部分を異なる量だけ偏向させるために本発明を利用することができる。一部の環境では、上記二成分態様の完全な分離（clean separation）が好ましい。しかしながら、収集のため複数の部分を選択することは本発明の範囲内にある。例えば、１つの形態として、不均一なサンプルは、光“クロマトグラフィー”法において連続的な範囲の方向に扇形に展開される場合がある。偏向された部分と偏向されない部分は別々に収集可能である。
【０００６】
一般的に、不均一な入力サンプルと出力部分は、チャネルを流れる流体内に分散している。１つの好ましい形態として、チャネルは、いわゆるＨ接合（H-junction）の形態を採り、このＨ接合は、一方が入力混合サンプルを含みもう一方がただ背景（バックグランド）流体を含む２本のチャネルが合流して設定された距離を並行して流れた後に２本の出力チャネルに分かれている。チャネルが十分小さければ、流れている流体のレイノズル数（Reynolds number）は、２本の流れが混ざらないが層流となって並行して流れるのに十分なほど小さい。その結果、入力流内の対象物は、通常、おそらくは拡散によるものを除いては、流れの間の区分線（separatrix）を緩衝（バッファ）チャネルへ横切らないようになっている。
【０００７】
本発明の一態様は、離散的な光学トラップのアレイを使用して光学トラップと競合する外力（外部から加えられた力）との相対的な親和性（affinities）に基づいて微小対象物を連続的に仕分けする光学分別に関係している。所望しない部分（undesired fraction）は所望する部分（desired fraction）よりも拡散性または運動性が高い。しかしながら、本発明の別の態様は、“逆（reverse）”光学分別に関係している。逆光学分別においては、所望する部分は所望しない部分よりも拡散性または運動性が高い。
【０００８】
本発明の別の態様は、微小対象物が投影された一連の光学トラッピングパタンによって確定的に輸送される光学蠕動（optical peristalsis）として知られる技術の変更を含む。光学蠕動と開示される光学サーマル・ラチェット技術（optical thermal ratchet technique）との相違は、フラックス反転（flux reversal）として知られる効果による双方向ポンピングを制限することなく含む質的に新しい能力をシステムおよび方法に授けると共に、不均一なサンプルを仕分けるための新たな可能性も体現することにある。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明は光学分別のための方法および装置に関する。本発明の一態様は、離散的な光学トラップのアレイを使用して微小な対象物を光学トラップおよび競合する外力（外部から加わる力）に対する相対的な親和性（あるいは親和性）に基づいて連続的に仕分けする光学分別技術に関する。本発明の別の態様は、“逆（reverse）”光学分別技術に関する。本発明の第３の態様は“ラチェット（ratcheting）”光学分別技術の利用に関する。
【００１０】
モデルシステムは、個々のコロイド球が離散的な光ピンセットで生成されたポテンシャルウェルの規則的なアレイを進むよう駆動されると同時にそれらの動きがデジタルビデオ顕微鏡法によって解析される変調輸送を調べるために開発されてきている。このシステムの実験では、アレイが駆動力に関して回転されると駆動粒子は動力学的閉じこめ状態の悪魔の階段階層（Devil's staircase hierarchy of kinetically locked-in states）をたどることが実証されている。これらの状態の各状態の中では、粒子の軌跡はアレイの方向性とは無関係にトラップ格子を対称性で選ばれた方向に進み、それ故に駆動力からは横方向に逸れるように偏向される。斯かる偏向は、選ばれた集団がトラップのアレイによって偏向される一方で残りのサンプルは進路を妨害されずに通過する連続的分別技術の基礎を与えるものと期待されている。この方法論は、光学分別の実例を提示するものであり、さらに光学分別の分解能は粒子サイズに指数関数的に依存し得ることを実証する。それ故にこの方法論は、すでに報告したどの仕分け技術よりも優れた感度を実現する。
【００１１】
離散的な光学トラップを使用して微小な対象物を光学トラップおよび競合する外力（外部から加わる力）に対する相対的な親和性に基づいて連続的に仕分けする光学分別技術の概念の１つの具体的な形を示すことができる。このアプローチは、水流に対してある角度だけ傾いた光ピンセットの線形アレイを通過して流れる水の中に分散した２つの異なるサイズのコロイド状シリカ球の軌跡を利用する。流れているコロイド分散は、カバースリップの端を顕微鏡スライドに固着させることによって形成された４ｍｍ×０．７ｍｍ×４０μｍのガラスチャネル（ガラス導水路）に閉じこめられている。このチャネルの両端に掛けられた圧力の差は、数分にわたって約６０μｍ／秒でほぼ一定のポアズイユ流（Poisseuille flow）を引き起こす。サンプルは、半径ａ＝０．７９μｍの球（Duke Scientific Duke Scientific Corporation, 2463 Faber Place Palo Alto, California 94303, Lot No. 24169）と半径ａ＝０．５μｍの球（Duke Scientific Lot No. 19057）との混合物である。ここで、両方の球は、従来の明視野顕微鏡とデジタルビデオ解析を使用して１／６０秒間隔で平面内を３０ｎｍ以内で追跡記録することが可能である。さらに、これらの球はそれらの外観に基づいて確実に区別することができ、光学分別に対するその微視的な応答をリアルタイムでモニタすることができる理想的なモデルシステムを提供する。大小の球の一般的な軌跡は、それぞれ図４Ａおよび図４Ｂに表れている。
【００１２】
シリカ球は水の密度のほぼ２倍の密度を有しているので、チャネルの下部ガラス壁の真上に単層になって落ち着くが、より小粒の球はより軽いために若干より上の方を浮遊する。チャネル内におけるポアズイユ流の分布を仮定すると、より小粒の球は平均速度ｕs＝１７±９μｍ／秒でより大きな球の平均速度ｕs＝１３±２μｍ／秒と比べると幾分より速く移動する。定常球に対する粘性抵抗Ｆ1＝γｕは球の半径ａと束縛面からの近さにも依存する抵抗係数γによって特徴付けられる。集団の抵抗係数は、拡散率Ｄからアインシュタイン・スモルコフスキ（Einstein-Smoluchowsky）関係Ｄ＝ＫBＴ／γを使用して概算できる。ＫBＴは温度Ｔにおける熱エネルギースケールである。拡散率はこのとき図４Ａおよび図４Ｂに示された軌跡の横方向速度の揺らぎから測ることができる。より一般に、印加力Ｆ1は、電気泳動（electrophoresis）、電気浸透（electroosmosis）、磁気泳動（magnetophoresis）、または重力沈降（gravitational sedimentation）などのプロセスを通じて与えることができる。
【００１３】
本実施形態の光学トラップは、動的ホモグラフィック光ピンセット技術により作り出されている。５３２ｎｍのレーザ光で１．７±０．８ｍＷの電力がそれぞれに供給される１２個の離散的な光ピンセットが、チャネル軸に対してθ＝１２．０°±０．５°傾いた直線上にピンセットの中心から中心までｂ＝３．６±０．１μｍの間隔をあけた状態で配置されている。各トラップは、共に球の半径ａに依存する深さＶ0であり幅σのほぼガウス型ポテンシャルウェルとしてモデル化されることがある。
【００１４】
光学トラップがないとしたならば、印加力Ｆ1によって粘性流体の中を駆動される粒子は平均速度ｕ＝Ｆ1／γで移動することになる。印加力Ｆ1が十分大きい条件の下では、光学トラップは粒子をその軌道から逸らせるのみである。偏向が小さい場合には、粒子は、トラップのラインから下流に移動し続け、トラップラインから逃れたといってよい。他方、各トラップが粒子を隣のトラップの影響領域に逸らせるのに十分に強い場合があり得る。この場合、粒子は、トラップからトラップへ通過し、アレイによって効率的に捕捉される。これは、動力学的閉じ込め輸送（kinetically locked-in transport）のメカニズムである。偏向角θは、この閉じ込め輸送の最大偏向角近くに選ばれている。捕捉された粒子の軌道の逃れた粒子の軌道に対する相対的偏向は光学分別による仕分けの基礎となる。偏向された部分と偏向されない部分は別々に集めることができ、そのプロセスは図１に概略的に示されている。
【００１５】
トラップの幾何学的配置を所与として、レーザパワーは大小の球が逃れるための実験的に決まる閾値の間に設定された。図４Ａおよび図４Ｂに示された軌跡は、これらの条件の下でトラップのアレイによって、小さい方の球は曲げられずに、大きい方の球が意図的に曲げられることを実証している。その結果、小さい球は進路を妨害されることなく大きな球の分布における結果的に生じる陰に流れ込み、そこでそれらを集めることが可能である。逆に、偏向した大きな球は光学トラップアレイの端にある小さな領域に集中し、そこでそれらは単独に集められる。小さな球の浄化と大きな球の集中は大きな方の部分の横方向の偏向の結果生じるので、この光学分別プロセスは継続的に進行することが可能で、従って例えばゲル電気泳動法（gel electrophoresis）などのバッチモード（batch-mode）技術を超えた利点を提供するものである。
【００１６】
ほんの２、３の軌跡のこの定性的な解釈は、図４Ｃおよび図４Ｄに集められた何万もの軌跡を統計的に議論することによってより説得力のあるものとなり得る。ここで我々は、各集団ごとに、
【数１】
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を中心とする面積
【数２】
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の領域における球の時間平均されたエリアル密度
【数３】
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を時間平均された平均エリアル密度ｎ0で規格化したものをプロットした。球のトラップに対する相対的親和性を測ることが可能であり、大きな球は大半の流れ（bulk flow）の中よりもトラップの中でほぼ１８倍も見つかる可能性が高くなるのに対して、小さな球は大半の流れ（bulk flow）の中よりもトラップの中でほぼ３倍足らずしか見つかる可能性は高くならない。球の相対速度を考えると、これらの比は、小さい方の球はただ速度が遅くなるだけなのに対して大きい方の球は一時的に局所的なポテンシャルの極小点に止まることと矛盾しない。
【００１７】
相対的な集団濃度を流れの中での位置の関数として測定することによって、結果として生じる分離の度合を測ることができる。
【数４】
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【００１８】
図５Ａおよび図５Ｂに示したこの性能指数は、大きな球だけを含む領域においては最大値＋１に達し、小さな球だけを含む領域においては最小値−１に達する。図５Ａにおいてトラップアレイよりも前で流れを横断するラインＡに沿った断面は、図５Ｂに小さな円で示されるように完璧に混ざり合ったサンプルＱ（ｙ）＝０を示す。図５Ａにおいてトラップアレイよりも後で流れを横断するラインＢに沿った断面は、図５Ｂに大きな円でプロットされているように大きな球と小さな球両方のほぼ４０％の純度を示す。大きな球が逃れるのを許した背景の大半は、トラップアレイにおける衝突が原因だと考えられる。衝突によって誘起されるトラップからの脱出は図４Ｃにおけるトラップアレイの下流の大きな球の濃度分布では明白であり、衝突と脱出は大きな球がトラップアレイの下流側の端で飽和するにつれてますます起こり得るようになる。斯かる衝突は、何本かの平行なトラップラインを投影することによって最も効率的に避けられる。本実験条件の下ではほんの三本程度で基本的に完全な分別が実現するが、より濃度の高い懸濁液ではもっと本数が必要となる。
【００１９】
図４Ａおよび図４Ｂ並びに図５Ａおよび図５Ｂのデータは、離散的な光学トラップのアレイが球をそれらのサイズに基づいて連続的に分離することができることを実証している。１つのタイプの粒子がトラップアレイに捕捉される一方で別のタイプの粒子がそのトラップアレイから逃れる状況を作り出す物理的条件を議論することによって、光学分別を最適化するための基礎が提供される。
【００２０】
簡単のため、ｘ＝±ｂ／２に中心があるほんの２つの離散的な光学トラップの、それらの中間点ｘ＝０近くにある粒子への影響が解析された。粒子の全ポテンシャルエネルギーは、
【数５】
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である。
【００２１】
粒子は、全体の力のｙ成分が消えることを表す式、
【数６】
2007516095.tif 000008
を満たすポインを通過することで脱出する。粒子は捕捉力が最も弱いｘ＝０、しかも最大力からの隔たりｙ＝σの近くで最も容易に逃れるはずである。この場合、捕捉される軌道を許す最大の達成可能な偏位（deflection）は、
【数７】
2007516095.tif 000009
で与えられる。この式において相対トラップ強度ｆ（ａ）＝（２／√ｅ）Ｖ0／Ｖ1はサイズを含む粒子の物質特性に依存するが、トラップの配置には依存しない。ここで、Ｖ1＝Ｆ1σは駆動力を特徴付ける。同様に、光学トラップの見掛けの広がりσ（ａ）は集束したレーザ光の幅σ0だけでなく粒子のサイズにも依存する。
【数８】
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【００２２】
大きな方の粒子は小さな方の粒子よりも広い範囲で光学トラップの影響を受ける。σのａに対する定性的依存性は指数関数的に感じる分離の条件を設定した。例示目的のため式（５）を使い続けることにする。
【００２３】
本データに対して、光学トラップの深さを特徴付ける熱的揺らぎ解析を利用して、大きな球と小さな球でそれぞれＶ0／Ｖ1＝１．３および０．７３が得られた。トラップの見掛け幅について同じ解析をするとσ＝０．９４±０．０７μｍおよび０．７４±０．０７μｍが示される。これらの結果は、大きな球に対しては臨界角θ＝１４°±１°、小さな球に対しては臨界角θ＝３°±２°を提示し、このことは小さな球が脱出する一方で大きな球が意図的に捕捉される観測と矛盾しない。Ｎトラップアレイに対する辛うじて捕捉される粒子の全横方向偏位は（Ｎ−１）ｂ・ｓｉｎθである。従って、
【数９】
2007516095.tif 000011
は１トラップ当たりの横方向偏位を設定し、故にアレイの効率を特徴付ける。トラップ間隔としてｂ＝２σ（ａ）を選ぶとこの効率はΔ＝４／ｅＶ0／Ｆ1で最適化される。この結果は実際の光学分別システムを設計するのに有用であるが、粒子サイズに対する感度を必ずしも最適化しない。
【００２４】
この感度は次のように公式化される。
【数１０】
2007516095.tif 000012
これは次の関係を設定することによって最適化される。
【数１１】
2007516095.tif 000013
【００２５】
これにより以下の結果が得られる。
【数１２】
2007516095.tif 000014
ここで、
【数１３】
2007516095.tif 000015
【００２６】
式（９）は、捕捉される“大きな”粒子と脱出する“小さな”粒子とを最も敏感に区別するであろう角度θの光学トラップアレイに対するトラップ間隔ｂを設定する。
【００２７】
実例として、これらの結果は粘性流における光学分別の最適化に適用することができる。サイズが光の波長と同程度またはそれより小さな粒子に対しては、ポテンシャルウェルの深さは粒子体積Ｖ0＝Ａａ3で測るものとするところ、粘性抵抗力はそれらの半径に比例するのでｆ（ａ）はａ2に比例する。最適化された間隔ｂを式（４）の流れベースの分離の判定基準に代入すると次式が得られる。
【数１４】
2007516095.tif 000016
【００２８】
式（４）および式（５）が、光学分別がポテンシャルウェルの深さに線形依存することを更に実証する。従って、光学ボルテックスの実際のアレイではポテンシャルウェルの深さが変化しても、分離の分解能を線形的にのみ低下させるだけで、一般に粒子サイズに対する実質上より大きな依存性によって代償することができる。
【００２９】
まとめると、上記実例は、コロイド状シリカ球のモデルシステムに対して実際に光学分別を実例で示し、その技術はサイズベースの分離の指数関数的な感度を約束することを具体的に示した。上記議論は、光学分別システムの幾何学的性質がサイズに基づく分離を最適化するよう選べること、また指数関数的な感度が標準的なものになるべきことを示すものである。他の特性に基づく分離は指数関数的な感度は一般の場合には期待できないが同様な論法によって最適化することが可能である。
【００３０】
式（１１）は、その寸法ａが数十ナノメータで測られるタンパク質およびナノクラスタなどの対象物に光学分別を適用する可能性に関する識見を更に提供する。特に、式（１１）は、固定角度θで１マイクロメータスケールから１０マイクロメータスケールまでの対象物を移動させるには比Ａ／Ｂの大きさを数桁上げる必要があることを示している。これは原理的には、光の強度を増大させ、光の波長を小さくし、そして粒子との相互作用が共振的に強まる波長を選択することによって達成することができる。
【００３１】
斯かるシステムにおいて光学分別を実施することには、粒子の所望する部分が区分線を越えて緩衝流（buffer flow）内に偏向されるように、入力される混合流全体に掛かるトラップアレイを作り出すことを含む。一態様として、作業が成功するには、サンプルは所望しない部分が自発的に区分線を受入可能な低い割合で横切るのに十分なほど低い拡散性または運動性を持つことが要求される。
【００３２】
しかしながら、本発明の別の態様は、所望する部分が所望しない部分よりも拡散性または運動性が高い正反対のケースを対象とする。さらに、それは所望する部分がその他の部分よりも弱く相互作用して従来の光学分別によっては選ばれないようなケースを対象とすることができる。本発明からの最も大きな利益はいずれか一方の条件でも十分であるが両方の条件が該当するシステムにおいて実現される。図１に２つの流体が流れるマイクロ流体のＨ接合１００を示す。１つの流れは混合入力流１１０であって、分別されるべき不均一サンプルを含む。その他の流れは緩衝流（buffer flow）１２０であって、背景（バックグラウンド）流体または緩衝流体からなる。入力流１１０内の対象物はその流れに対して角度θをなす光ピンセットのアレイ１３０に遭遇し、そのアレイによってサンプルの選ばれた部分は収集のための緩衝出力流１４０内に偏向される。サンプルの偏向されなかった部分はオリジナルストリームまたは出力流１５０内に残り続け、そこに集められる。
【００３３】
対象物を混合入力流１１０から取り出し緩衝流１２０内に導くよう光学トラップアレイを構成するのではなく、図２に示すように、本発明は光学トラップを使用して対象物をそれらが拡散または活発な泳動によって区分線を横切ろうとする際に入力混合流に戻すよう導くこともできる。図１に示した従来の方法のように、マイクロ流体のＨ接合２００は、分別されるべき不均一サンプルを含む一方の流れ２１０と緩衝溶液だけを含む他方の流れ２２０からなる２つの流れている流体ストリームを含む。これら２つの流れの間の区分線を横切ろうとする混合入力流２１０内の対象物のみが、対象物を混合入力流２１０に戻すよう導くよう生成された光学トラップのアレイ２３０に遭遇する。トラップアレイ２３０を通って区分線を横切る対象物は緩衝出力流２４０内に集められる。拡散性が低かったりあるいはトラップアレイ２３０によって偏向されたりしたためにオリジナルの入力流に残るものは出力流２５０内に単独に集められる。この場合、拡散性または運動性に劣る対象物は混合入力流内に戻るよう導かれることになるが、拡散性または運動性のより高い部分はトラップを逃れて区分線を横切って集められることになる。同様に、光学トラップの影響をあまり強く受けない対象物は区分線を横切って集められる可能性がより高くなる。
【００３４】
光学分別は全混合入力流を満たすのに十分に多数の光学トラップを必要とするが、この逆プロセスは流れの間の区分線周辺の領域をちょうどカバーするのに十分なトラップのみを必要とする。その結果、逆光学分別は従来の光学分別に必要とされるよりもはるかに少ない光学トラップで済み、結果的にトラップを生成するのに必要なレーザ光をより効率的に利用することができる。
【００３５】
光学分別が他の仕分け技術を超える十分裏付けられた利点を有する範囲内において、逆光学分別は同じ利点を提供する。これらはバッチモード作業ではなく連続的な作業と、レーザパワー、レーザ波長、光ピンセットの幾何学的構成、駆動力、およびサイズに対する指数関数的な感度の調整を通じた連続的な最適化とを含む。逆光学分別は、従来の光学分別が適用不可能または実用不可能なシステムにこれらの利点を拡張する。従来の光学分別と同様に、逆光学分別は、捕捉光の偏極または捕捉ビームのモード構造をうまく利用して、サイズ、光散乱断面積、光吸収率、面電荷、および形状などの特性の他にそれらの複屈折、光活性、弾力性に基づいて対象物を仕分けする。
【００３６】
マイクロ流体Ｈ接合は対象物を拡散性に基づいて仕分けするのに有用であることが知られている。逆光学分別用に構成された光ピンセットアレイを加えることによってプロセスの選択性が大きく向上し、対象物をそれによって仕分けするためのありとあらゆる新たな物理的基盤が提供される。
【００３７】
本発明の別の態様として、サーマル・ラチェット法（thermal ratcheting）が利用される。図６（Ａ乃至Ｄ）は光学蠕動（optical peristalsis）が働く原理を示すもので、光学サーマル・ラチェットの特徴を説明するのに役立つ。図６Ａには、離散的光学トラップのパタンが単一の対象物を局在させる様子が示されている。本パタンは、それぞれ幅σを有し中心が距離Ｌだけ隔てられた２つの離散的なポテンシャルエネルギーウェルとして意図的に描かれている。現実には、実際のパタンはマニホルド（manifolds）に組織化されるかなり多くの光学トラップを含むものである。光学蠕動とここに開示された同じく光学サーマル・ラチェット法の両方の目標は、トラップの１つのマニホルドから別のマニホルドまで対象物を移動させることにある。これら２つのアプローチはそれらがこれを達成する仕方が異なる。
【００３８】
光学蠕動では、トラップの初期パタンはマニホルドがσ程度の距離だけシフトした別のパタンにより置き換えられる（図６Ｂを参照）。新たなポテンシャルウェルは古いものと重なるために、粒子はこの新たなパタン上の最も近いマニホルドに確定的に受け渡される。このプロセスは図６Ｃにおいてトラップの別の更にシフトしたパタンで繰り返される。オリジナルのパタンが投影されたときに１サイクルの光学蠕動は完了する（図６Ｄを参照）。このサイクルの正味の効果は、捕捉粒子を最初のパタンのトラップの１つのマニホルドから同じく最初のパタンの次のマニホルドに輸送することにある。実際には、かなり多くの粒子がかなり多くの光学トラップに捕捉されることが可能であり、その全ての粒子は各光学蠕動サイクル毎に１セットのマニホルド分だけ前方に輸送されることになる。移動の方向は曖昧さ無くパタンシーケンスの順序で決まり、その順序を逆にすることによってのみ逆転が可能である。
【００３９】
光学サーマル・ラチェットは移動方向におけるマニホルドの間隔が個々のトラップの幅よりも十分大きい点で光学蠕動とは異なる。結果、最初のパタン（第１パタン）に捕捉された粒子は第２パタンが励起されたときには自由に拡散できる状態に置かれる。第２パタンにおける最も近いマニホルドに到達するのに十分なほど遠くに拡散するそれらの粒子はすぐに局在した状態になる。続いてこの局在した部分は、第３パタンが投影されるとすぐに（この場合も同様に拡散により）前方に送られることが可能で、サイクルが最初のパタンに戻ると再び送られる。確定的な輸送が各サイクル毎に全ての捕捉粒子が前方に移動することを約束する光学蠕動とは異なり、このバイアスが掛かった拡散はサンプルの一部のみを前方に輸送する。
【００４０】
しかし、本形態のサーマル・ラチェットは新たな機会をもたらす。前方に進む波をキャッチするには遅すぎる粒子は、図６Ｃの第３パタンが照射されているときにそれらの出発点に向かって逆行してウェルをキャッチするのに十分に遠くまで拡散する場合がある。これらの粒子は、各サイクル毎にマニホルド間隔の１／３だけ後方に送られることになる。集団が一連のトラッピングパタンを通じて前方に移動するかまたは後方に移動するかは粒子の拡散速度と一連のトラッピングパタンが循環する速度とのバランスによって決まる。循環速度（cycling rate）は故に平均運動の方向を変えることができ、この現象はフラックス反転（flux reversal）として知られている。
【００４１】
循環する光ピンセットパタンの影響下における粒子の期待されるフラックスが計算できる。位置ｘjにある光ピンセットは、次のガウス型ポテンシャルウェルとしてモデル化できる。
【数１５】
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【００４２】
このウェルは深さＶ0および幅σを有する。このガウス型ポテンシャルウェルは明らかに空間的に対称的である。ウェルのパタンは、ラチェット動作に必要とされる３状態サイクルの１つの状態を設定する。一例として、ウェルは、あるパタンにおいて間隔Ｌで等間隔に並んでいると考えることができ、この場合、状態ｋにおける全体のポテンシャルは、
【数１６】
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で与えられる。ただし、ｋ＝０、１、または２である。再び一例として、ポテンシャルエネルギーのランドスケープ（地形）はこれら３つの状態を等時間間隔Ｔで繰り返し循環すると考えることができる。この時間Ｔは拡散率Ｄの粒子がシステム全体に拡散するのに必要とされる時間τと比較される。
【数１７】
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Ｔとτとのバランスは粒子が一連のポテンシャルエネルギー状態によってシステムを駆動される方向を決定することになる。
【００４３】
光学トラップおよびランダムな熱的力（thermal force）が複合した影響のもとに時間ｔにおいて位置ｘのｄｘに１つのブラウン粒子を見出す確率ｐ（ｘ、ｔ）ｄｘは、次のマスタ方程式（master equation）によって支配される。
【数１８】
2007516095.tif 000020
【００４４】
上式において各状態ｋの伝搬関数は、
【数１９】
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で与えられる。
【００４５】
時間ｔ＜Ｔに対して、
【数２０】
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【００４６】
ここでβ-1は熱エネルギースケールである。１つの完全な３状態サイクルに対するマスタ方程式は次のようになる。
【数２１】
2007516095.tif 000023
【００４７】
対称的な光ピンセットポテンシャルについて、我々は、このマスタ方程式は次のような周期条件を満たす定常状態解を有すると考えている。
【数２２】
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【００４８】
このとき、この定常状態の平均速度は、
【数２３】
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で与えられる。
【００４９】
図７に、βＶ0＝１０およびσ／Ｌの２つの代表値に対するこの方程式系の数値解を示す。循環時間Ｔの非常に小さな値に対して、粒子は速く時間発展するポテンシャルエネルギーのランドスケープに遅れずについていくことは不可能なのでランダムに拡散する。従って平均速度はこの極限では消える。連続したパタンにおけるトラップが重なる場合（図７に示されたσ＝０．１５Ｌ）、粒子はトラップからトラップへ確定的に移り、一様に正のドリフト速度をもたらす。この移動は適度の循環時間Ｔの間に最大効率に達し、より長い滞留時間の間に改善はしない。その結果、ドリフト速度は長時間極限では１／Ｔで低下する。
【００５０】
より広い間隔で分離したトラップ（図７におけるσ＝０．１０Ｌ）は別の挙動を与える。ここでは、粒子は十分大きな値のＴの間に前方に進む波に遅れずについていくことが可能である。しかしより高速な循環は負の値のｖによって特徴付けられるフラックス反転をもたらす。この数値結果は、光ピンセットのアレイがそれに基づいて十分対称的なサーマル・ラチェットをフラックス反転で実施するために使用できる原理を実証する。
【００５１】
図７に示すように、βＶ0＝１０におけるガウス型ウェルポテンシャルの３状態サイクルについて、σ＝０．１５Ｌにおける確定的な光学蠕動からσ＝０．１０Ｌにおけるフラックス反転のサーマル・ラチェット動作まで重なり部分が生じる。
【００５２】
ここまでのところ、フラックス反転は循環時間Ｔの変化の結果としてもたらされるものとして説明されてきた。同じ効果はその異なる拡散係数が異なる値のτを与える不均一サンプル内の異なる集団に生じ得る。これらの異なる集団は、１つの集団を前方に進めその他の集団を後方に進めるようＴが選ばれているという条件で、正反対の方向に同時に移動するようになっている場合がある。このように、上述した光学サーマル・ラチェットは流体によって運ばれる小さな対象物を分離して精製するのに有用である。
【００５３】
反転可能なサーマル・ラチェットを実施する好ましい光学的アプローチは、他のラチェットベースの分離スキームを超える利点を有する。例えば、相互に嵌合した電極アレイに基づくサーマル・ラチェットは、ＤＮＡフラグメントを仕分けすることに適用されている。しかしこれらは洗練された微細加工を必要とするが、光学ラチェットは費用を掛けずに実施でき、ラブ・オン・チップ（Lab on Chip）用途のためのマイクロ流体装置に容易に一体化できる。単一の時間分割走査式光ピンセットに基づく光学ラチェットはすでにフラックス反転を誘導することが実証されている。このアプローチは時間平均された意味において空間的に非対称なポテンシャルエネルギーのランドスケープを作り出すことに基づいており、システムはすでに述べたプロセスとは異なる原理で動作する。ここで説明した好ましいシステムでは、各パタンにおける各光学トラップは空間的に対称的なポテンシャルエネルギーウェルを提供する。パタンそれ自体は空間的に対称的である。一方向輸送は、各サイクルにおいて一連の少なくとも３パタンを通じて時間空間的な対称性を破ることによって駆動される。
【００５４】
すでに提案されている対称的なサーマル・ラチェットの１つの例も一連の３つの状態を含む。このアプローチは、粒子は１つの状態でのみ拡散することが許されるが他の２つの状態は確定的ラチェットとしての機能を果たすことに基づいており、それにより拡散にバイアスをかける。この文書で説明したプロセスは３つの状態において拡散および局在化の両方を含み、それ故に不均一なサンプルのより高い選択性とより迅速な仕分けを実現する。
【００５５】
好ましい実施形態について図示および説明が行われてきたが、当業者であればより広い態様において本発明から逸脱することなく様々な変更および修正が可能なことは理解されたい。本発明の様々な特徴は本願特許請求の範囲の請求項に定義される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】マイクロ流体Ｈ接合が分別されるべき不均一サンプルを含む第１のフローと背景（バックグラウンド）流体もしくは緩衝（バッファ）流体から成る第２のフローとから成る光学分別を示した図である。
【図２】マイクロ流体Ｈ接合が一方は分別されるべき不均一サンプルを含み、もう一方は緩衝液だけを含む２本の流れている流体を含む逆光学分別を示した図である。
【図３】（Ａ）は光学分別の概略側面図であり、（Ｂ）は図３（Ａ）の光学分別の平面図である。
【図４】微小シリカ球から大きなシリカ球を光学分離する様子を示しており、（Ａ）は１／６０秒間隔で測定された半径０．７９マイクロメータの球の代表的な軌跡を示した図であり、（Ｂ）は同時に得られた半径０．５マイクロメータの球の軌跡を示した図であり、（Ｃ）は半径０．７９マイクロメータの球の時間平均されたエリアル密度（areal density）をそれらの平均エリアル密度との対比で示した図であり、（Ｄ）は半径０．５０マイクロメータの球の時間平均されたエリアル密度をそれらの平均エリアル密度との対比で示した図である。
【図５】一直線に並んだ光学トラップで得られた分離の空間的分解度を示した図である。
【図６】（Ａ）はあるパタンの光学トラップが対象物を局在させる従来の光学蠕動法を示した図であり、（Ｂ）は光学トラップパタンをある距離だけずらしたもので置き換えた図であり、（Ｃ）は光学トラップパタンを更に別の距離だけずらした図であり、（Ｄ）は光学蠕動の１サイクルが完了した図である。
【図７】フラックス反転を実証する光学サーマル・ラチェット法の運動方程式の数値解を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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