(57)【要約】  本発明は、ポリエチレングリコールのブチルアルデヒド部分をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＮ末端のフェニルアラニンに結合させることにより調製された、化学的に修飾された該タンパク質を提供する。本発明に従って化学的に修飾されたタンパク質は、未修飾ｈＧＨの値よりずっと長く持続するｈＧＨ活性を有すると思われ、低減した用量および治療計画による治療回数を可能にする。本発明はまた、成長ホルモンの使用が有益である疾患または障害の治療および/または予防のための使用法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉまたは式ＩＩの構造を有する、ポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨ：
【化１】
2007520544.tif 000011
[式中
ｎは１および１０の間の整数である；
ｍは１および１０の間の整数である；
Ｒはヒト成長ホルモン、またはメチオニル成長ホルモンである]
の治療有効量を、単独でまたは別の治療薬と併用して、それを必要とする患者に投与することを包含する、成長ホルモンの使用が有益である疾患または障害の予防および/または治療のための方法であって、ここで成長ホルモンの使用が有益である前記疾患または障害が、勃起機能不全、ＨＩＶ脂肪異栄養症、線維筋痛症、骨粗しょう症、記憶障害、鬱、クローン病、骨格の形成異常、外傷性脳傷害、クモ膜下出血、Noonan症候群、ダウン症候群、特発性低身長症（ＩＳＳ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、超低出生体重児（ＶＬＢＷ）、骨髄幹細胞の救済、メタボリック症候群、グルココルチコイドミオパチー、小児のグルココルチコイド治療に起因する低身長、および未熟児の低身長のキャッチアップ成長不全、から成る群より選択される前記方法。
【請求項２】
ＧＨの使用が有益である前記疾患または障害が、特発性低身長症、超低出生体重児、外傷性脳傷害、メタボリック症候群、Noonan症候群から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｎが４に等しく、ｍが３に等しい、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨが、ｎが４に等しく、ｍが３に等しい式Ｉの構造を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト成長ホルモンが配列番号１のアミノ酸配列を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールの９０％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンにコンジュゲート化する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールの９５％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンにコンジュゲート化する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
各ｍＰＥＧが約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
別の治療薬、および少なくとも１つの医薬的に受容可能な担体と組み合わせての、式Ｉまたは式ＩＩのヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲート：
【化２】
2007520544.tif 000012
[式中
ｎは１および１０の間の整数である；
ｍは１および１０の間の整数である；
Ｒはヒト成長ホルモン、またはメチオニル成長ホルモンである]
を包含する組成物。
【請求項１０】
前記のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨが、ｎが４に等しく、ｍが３に等しい式Ｉの構造を有する、請求項９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年２月４日に提出された米国特許出願第１０/７７１８９５号に対する優先権を主張し、同文献を本明細書に記載されているかのようにその全内容において参照として援用する。
【０００２】
発明の技術分野
[001]本発明は、ｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体のペグ化（PEGylation）を含む化学的修飾に関し、それによりヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の化学的および/または生理学的特性を変えることができる。ペグ化ｈＧＨは、増加した血漿滞留時間、減少したクリアランス速度、改善された安定性、減少した抗原性、減少したペグ化の不均一性、またはそれらの組み合わせを有しうる。本発明はまたｈＧＨの修飾のための方法に関する。加えて本発明は、修飾されたｈＧＨを含有する医薬組成物に関する。さらなる態様は、成長および発達の障害の治療のための修飾されたｈＧＨの使用である。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
[002]ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、２つのジスルフィドの架橋で架橋された１本鎖の１９１アミノ酸を包含するタンパク質であり、そのモノマーの形は分子量２２ｋＤａを有する。ヒトＧＨは下垂体により分泌され、これはまた組み換え遺伝子工学により製造することもできる。ｈＧＨは成長することのできるすべての体組織において成長を引き起こす。ｈＧＨは人の成長期における成長を促進するだけでなく、正常な体組成、同化作用、および脂質代謝を維持する上で重要な役割を担っている（K. Barneis. And U. Keller, Baillieres Clin. Endocrinlo. Metab. 10:337 (1996)）。
【０００４】
[003]組み換えｈＧＨは、数年間に市販により入手できるようになった。２つのタイプの治療上有用な組み換えｈＧＨ調製剤が市場に出ている：天然のタイプ、例えばGenotropin（登録商標）またはNuropin（登録商標）、およびＮ末端に付加的なメチオニン残基を伴う類似体、例えばSomatonorm（登録商標）が挙げられる。ｈＧＨは、成長ホルモン分泌不全症（ＧＨＤ）ともいう下垂体機能低下性小人症、またはターナー症候群の患者における身長増加（軸方向の成長）を刺激するために使用されるが、在胎期間に対して低身長で生まれた小児（ＳＧＡ）における成長不全の長期治療、プラダーウィリー症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、ＡＩＤＳによる消耗、及び加齢の患者の治療のためを含む、それ以外の適用もまた示唆された。成人成長ホルモン分泌不全症（ａＧＨＤ）の患者は様々な問題、例えば脂肪量の増加、除脂肪体重および細胞外液の減少、および骨密度の低下、脂質代謝異常、ならびに心血管の機能不全を含む、体組成の特徴的な変化を有する。これらの問題の多くは、ｈＧＨ補充療法により改善される（J. Verhelst J and R. Abs. Drugs.;62:2399 (2002)）。
【０００５】
[004]成長ホルモン（ＧＨ）の主な生物学的効果は、若い哺乳動物における成長の促進、およびより年齢の高い哺乳動物の組織の維持である。影響を受ける器官系は、骨格、結合組織、筋肉、および内臓、例えば肝臓、腸、および腎臓を含む。成長ホルモンは、標的細胞の膜上の特異的な受容体との相互作用と通してそれらの効果を及ぼす。ｈＧＨは、胎盤性ラクトゲン、プロラクチン、および成長ホルモンのその他の遺伝子および種による変異体を含む相同のホルモンのファミリーの一員である(Nicoll, C. S., et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 169)。ｈＧＨはこれらの中で、それが広範囲の種に対して特異性を呈し、クローン化した成長ホルモン受容体(somatogenic receptor)(Leung, D. W., et al. [1987] Nature 330; 537)、またはプロラクチン受容体(Boutin, J. M., et al. [1988] Cell; 53: 69)のいずれかと結合するという点で、変わっている。ｈＧＨに関するクローン化遺伝子は、大腸菌において分泌型にて発現され(Chang, C. N., et al. [1987] Gene 55:189)、そのＤＮＡおよびアミノ酸配列が報告されている(Goeddel, et al. [1979) Nature 281: 544; Gray, et al. [1985] Gene 39:247)。
【０００６】
[005]ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、正常なヒトの成長および発達の調節の多くに関与する。この下垂体性ホルモンは、身長増加（成長促進作用(somatogenesis)）、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様効果および特に糖尿病誘発性効果を含む、多数の生物学的効果を呈する(Chawla, R, K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, C. K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M. 0., et al. (1988) J. Clin. Invest. 81:745)。小児における成長ホルモン分泌不全は小人症をもたらすが、この疾患はｈＧＨの体外からの投与により１０年以上の間治療が成功してきた。
【０００７】
[006]成人においても小児と同様に、ｈＧＨは窒素保持の増加および骨格筋の成長の刺激により、そして体脂肪の動員により正常な体組成を維持している。内臓脂肪組織は特にｈＧＨに応答する。増加する脂肪分解に加えて、ｈＧＨは体脂肪貯蔵へのトリグリセリドの取り込みを低下させる。ＩＧＦ−Ｉ（インスリン様成長因子−Ｉ）およびＩＧＦＢＰ３（インスリン様成長因子結合タンパク質３）の血清濃度は、ｈＧＨにより増加する。
【０００８】
[007]ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、１９１アミノ酸から成る単鎖ポリペプチド（分子量  ２１，５００）である。ジスルフィド結合は、５３および１６５の位置、ならびに１８３および１８９の位置を架橋する。Niall, Nature, New Biology, 230:90 (1971)。ｈＧＨは、特に窒素、リン、カリウムおよびカルシウムの保持による、効力のある同化作用物質である。下垂体切除したラットのＧＨによる処置は、ラットの成長速度の少なくとも一部を回復することができる。Moore et al., Endocrinology 122:2920-2926 (1988)。その中で下垂体機能低下症（ＧＨ欠損）の被験者における最も著しい効果は、骨端軟骨の加速された軸方向の成長、その結果としての身長増加である。Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964)。
【０００９】
[008]ｈＧＨは、軸方向の骨の成長、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様効果および糖尿病誘発性効果、等を含む、様々な動物モデルにおける種々の生理学的および代謝的効果を引き起こす。(R. K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34:519 (1983); 0. G. P. Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C. K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M. 0. Thomer and M. L. Vance, J. Clin. Invest. 82:745 (1988); J. P. Hughes and H. G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47:469 (1985))。特に閉経後の女性において、ＧＨ分泌は年齢と共に下降することが報告された。Millard et al., Neurobiol. Aging, 11:229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinology M, L6- 137-142 (1987)。Rudman et al., J. Clin. Invest., 67:1361-1369 (1981) およびBlackman, Endocrinology and Aging, 16:981 (1987)もまた参照のこと。さらに、減少した徐脂肪体重、脂肪組織量の拡大、および皮膚の菲薄化を含む、加齢を明示するもののいくつかは、週３回のＧＨ治療により低減させることができるという報告がある。例えばRudman et al., N. Eng. J. Med., 323:1-6 (1990)、および同じ雑誌の発行物におけるDr. Vanceによる付随する論文 (pp. 52-54)を参照のこと。これらの生物学的効果は、ｈＧＨおよび特異的な細胞の受容体との間の相互作用に由来する。２つの異なるヒト受容体である、ｈＧＨ肝臓受容体(D. W. Leung et al., Nature 330:537(1987))、およびヒトプロラクチン受容体(J. M. Boutin et al., Mol. Endocrinology. 3:1455 (1989))がクローン化された。しかしヒト胎盤性ラクトゲン受容体を含むこれ以外のものもあるようである(M. Freemark, M. Comer, G. Komer, and S. Handwerger, Endocrinol. 120:1865 (1987))。これらの相同な受容体は、配列およびサイズのかなり異なる、糖鎖結合した細胞外のホルモン結合ドメイン、１回膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインを含有する。１つまたはそれより多くの受容体が、ｈＧＨへの生理学的応答において決定的な役割を担うと考えられている。
【００１０】
[009]体内に投与された生理学的に活性なタンパク質は、体内におけるそれらの速いクリアランス速度のために、それらの薬理学的活性を短時間の間しか示すことができないことが、一般に観察されている。さらにこれらのタンパク質の相対的な疎水性が、これらの安定性および/または溶解度を限定すると思われる。
【００１１】
[0010] 治療用タンパク質のクリアランス速度を低下させ、安定性を改善し、または抗原性を排除する目的のため、タンパク質を水溶性のポリマーを用いて化学的に修飾するといういくつかの方法が提案された。このタイプの化学的修飾は、タンパク質分解酵素を、タンパク質の基幹そのものとの物理的な接触から効果的に遮断し、それにより変性を防ぐと思われる。ある種の水溶性ポリマーを化学的に結合させることは、その分子の増加した流体力学的容積のために、腎クリアランスを効果的に低減すると思われる。付加的な利点として、ある種の環境下での、治療用タンパク質の安定性および循環時間の増加、溶解度の増加、ならびに免疫原性の低下を含む。ポリ（アルケン酸化物）、特にポリ(エチレングリコール)（ＰＥＧ）は、治療用タンパク質生成物の調製に使用されてきた、１つのそのような化学的部分である（“ペグ化する”という動詞は、少なくとも１つのＰＥＧ分子を結合させることを意味する）。ポリ(エチレングリコール)の結合は、タンパク質分解を防ぐことが示されており、Sada, et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991)、ある種のポリ(エチレングリコール)部分を結合させるための方法を利用することができる。１９７９年１２月１８日に発行された米国特許第４，１７９，３３７号、 Davis et al., "Non-Immunogenic Polypeptides,"；および１９７７年１月１１日に発行された米国特許第４，００２，５３１号、 Royer, "Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby,"を参照のこと。まとめとしては、Abuchowski et al.のEnzymes as Drugs (J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981))を参照のこと。
【００１２】
[0011]他の水溶性ポリマーも使用されており、例えばエチレングリコール/ポリエチレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ(−１，３-ジオキソラン)、ポリ (−１，３，６−トリオキサン)、エチレン/マレイン酸無水物コポリマー、ポリ−アミノ酸（ホモポリマーまたはランダムなコポリマーのいずれか）が挙げられる。
【００１３】
[0012]ペグ化された治療用タンパク質の数多くの例が記載されてきた。ＡＤＡＭＧＥＮ（登録商標）、すなわちアデノシンデアミナーゼのペグ化製剤は、重症の複合型免疫不全性疾患の治療用として認可されている。ＯＮＣＡＳＰＡＲ（登録商標）、すなわちペグ化Ｌ−アスパラギナーゼは、過敏症のすべての患者の治療用として認可されている。ペグ化スーパーオキシドジスムターゼは、頭部外傷の治療に関する臨床的試みが行われた。ペグ化α−インターフェロン（米国特許５，７３８，８４６、５，３８２，６５７）は、肝炎の治療用に認可された；ペグ化グルコセレブロシダーゼおよびペグ化ヘモグロビンは、前臨床検査が行われたことが報告されている。もう１つの例は、ＩＬ−６に付加したポリ(エチレングリコール)分子を開示する、“Modified hIL-6（修飾ｈＩＬ−６）”という表題のＥＦ  ０  ４４２  ７２４のペグ化ＩＬ−６である。
【００１４】
[0013]化学的に修飾されたもう１つの具体的な治療用タンパク質は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。Ｇ−ＣＳＦは好中性顆粒球の急速な増殖および血流への放出を誘導し、それにより感染と戦う上での治療効果を提供する。１９９０年１２月１２日に公開された"Chemically Modified Granulocyte Colony Stimulating Factor"という表題の欧州特許出願ＥＰ ０ ４０１ ３８４は、ポリ(エチレングリコール)分子を結合させるＧ−ＣＳＦを調製するための材料および方法について記載している。修飾されたＧ−ＣＳＦおよびその類似体はまた、水溶性のパーティクルポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)との共有結合によりコンジュゲート化した様々なＧ−ＣＳＦおよび誘導体の使用について述べている、"Continuous Release Pharmaceutical Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated To A Water Soluble Polymer"という表題の、１９９２年３月４日に公開されたＥＰ  ０  ４７３  ２６８においても報告されている。ヒト顆粒球コロニー刺激因子活性を有する修飾ポリペプチドが、１９８９年１０月４日に公開されたＥＰ  ０  ３３５４２３に報告されている。米国特許５，８２４，７８４に提供されているのは、タンパク質またはその類似体をＮ末端で修飾するための方法、および新規のＮ末端で化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦ組成物を含む、結果として得られる組成物である。米国特許５，８２４，７７８は化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦを開示している。
【００１５】
[0014]ポリ(エチレングリコール)に関して、ポリ(エチレングリコール)分子をタンパク質に結合させるために様々な手段が使用されてきた。一般にポリ(エチレングリコール)分子はタンパク質上に見出される反応基を介してタンパク質に接続される。
【００１６】
[0015]アミノ基、例えばリジン残基上またはＮ末端のアミノ基は、そのような結合に都合がよい。例えばRoyer (米国特許第４，００２，５３１号、上に記載)は、ポリ(エチレングリコール)分子の酵素への結合のために還元的アルキル化を使用したと述べている。Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994)は、還元的アルキル化を介してモノメトキシポリ(エチレングリコール)アルデヒドを用いてのＣＤ４イムノアドヘシンの修飾を報告している。同著者らは、ペグ化の程度をコントロールできる条件下で、５０％のＣＤ４―ＩｇがＭｅＰＥＧ修飾されたと報告している。同文献１３７ページ。同著者らはまた同文献において、修飾ＣＤ４−Ｉｇ（タンパク質ｇｐ  １２０に対して）のin vitro の結合能力は、ＭｅＰＥＧ化の程度に相関した比率で減少したと報告している。１９９０年２月２７日に発行された米国特許第４，９０４，５８４号、Shawは、反応性のアミノ基を介してのポリ(エチレングリコール)分子の結合に関する、タンパク質中の一定数のリジン残基の修飾に関する。
【００１７】
[0016]ＷＯ  ９３/００１０９は、３日またはそれより多くの日数の間、継続的な有効な血漿ＧＨ濃度を維持することを包含する、哺乳動物または鳥類のＧＨ応答性組織を刺激するための方法に関する。そのような血漿濃度を達成する１つの方法は、マクロ分子の物質、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）とカップルさせたＧＨの使用によるものであると述べられている。マクロ分子の物質とのカップリングは、改善された半減期をもたらすと述べられている。ペグ化ヒト成長ホルモンは、ＷＯ  ９３/００１０９において、ｍＰＥＧアルデヒド−５０００およびｍＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００）を使用して報告された。ｍＰＥＧ−ＮＨＳの使用は、ｈＧＨの多重にペグ化された形での不均一な混合物を得ることになった。ＷＯ  ９３/００１０９はまた、システインｈＧＨ変異体をペグ化するためのｍＰＥＧ−マレイミドの使用を開示している。
【００１８】
[0017]ＷＯ  ９９/０３８８７は、ペグ化されたシステイン変異体成長ホルモンを開示している。ＢＴ−００５と呼ばれるこのコンジュゲートは、成長不ホルモン分泌不全ラットにおける体重増加を刺激する上でより有効であり、そしてｈＧＨより長い半減期を有することを意図する。
【００１９】
[0018]ペグ化ヒト成長ホルモンはまた、カルボキシメチル化したＰＥＧのスクシンイミジルエステルを用いて、Clark et al.(Journal of Biological Chemistry  271:21969-21977, 1996)にて報告された。Clarkらは、第１級アミンに対して選択的にコンジュゲート化するｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００を用いての、増大したサイズのｈＧＨの誘導体について記載している。ＰＥＧ修飾のレベルの増加は、その受容体へのアフィニティーを低下させ、細胞に基づいたアッセイにおけるＥＣ５０を１５００倍まで上昇させた。Olson et al., Polymer Preprints38:568-569, 1997は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）ＰＥＧおよびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）ＰＥＧの使用は、多重にペグ化されたｈＧＨ種を得ることになると開示している。
【００２０】
[0019]ＷＯ  ９４/２００６９は、経肺送達のための製剤の一部分としてペグ化ｈＧＨを開示している。
[0020]米国特許４，１７９，３３７は、生理学的に活性な非免疫原性の水溶性ポリペプチドコンジュゲートを得るための、酵素およびホルモンをペグ化する方法を開示している。ＧＨはペグ化するホルモンの一例として述べられている。
【００２１】
[0021]ＥＰ  ４５８０６４  Ａ２は、ソマトトロピン中に導入されたまたは天然に存在するシステイン残基のペグ化を開示している。ＥＰ ４５８０６４ Ａ２はさらに、野生型ウシソマトトロピンの１０２−１１２残基に位置すると言われるオメガループと呼ばれるループ中に２つのシステイン残基を組み込むことについて述べている。より具体的にはＥＰ ４５８０６４ Ａ２は、ウシソマトトロピンの１０２番から１１２番の残基の各々ＳｅｒからＣｙｓへ、およびＴｙｒからＣｙｓへの置換を開示している。
【００２２】
[0022]ＷＯ  ９５/１１９８７は、親分子に存在する、または部位特異的変異誘発により導入されたいずれかのシステイン残基のチオ基へのＰＥＧの結合を提案している。ＷＯ  ９５/１１９８７は、プロテアーゼであるネキシン−１のペグ化に関するが、ｈＧＨおよびその他のタンパク質の一般的なペグ化も同様に提案している。
【００２３】
[0023]ＷＯ  ９９/０３８８７は、例えば、２５番セリン残基への付加的なｃｙｓの挿入、および導入されたシステイン残基にＰＥＧを結合させることにより修飾された成長ホルモンを開示している。
【００２４】
[0024]ＷＯ  ００/４２１７５は、ＰＥＧの結合のためのフリーのシステイン残基を含有するタンパク質を作成するための方法に関する。ＷＯ  ００/４２１７５は、ｈＧＨの以下の変異タンパク質：Ｔ３Ｃ、Ｓ１４４ＣおよびＴ１４８Ｃ、ならびにそのシステインのペグ化について開示している。
【００２５】
[0025]ＷＯ  ９７/１１１７８（ならびにＵＳ  ５８４９５３５、ＵＳ  ６００４９３１、およびＵＳ  ６０２２７１１）は、ｈＧＨのアゴニストまたはアンタゴニストとしてのＧＨ変異体の使用に関する。ＷＯ  ９７/１１１７８はまた、リジンのペグ化、およびリジンの導入または置換（例えばＫ１６８ＡおよびＫ１７２Ｒ）を含むｈＧＨのペグ化を開示している。ＷＯ  ９７/１１１７８はまた、置換  Ｇ１２０Ｋを開示している。
【００２６】
[0026]ＷＯ  ０３/０４４０５６は、分枝鎖４０Ｋ  ＰＥＧアルデヒドｈＧＨコンジュゲートを含む、様々なペグ化ｈＧＨ種を開示している。
[0027]ペグ化ｈＧＨのこれまでの報告は複数のＰＥＧの結合を必要としており、これは望ましくない不均一な生成物を得ることになるが、記載されている腎臓濾過のカットオフ値である７０Ｋ分子量より大きな流体力学的体積を得るためである(Knauf, M.J. et al, J. Biol. Chem. 263: 15064-15070, 1988)。
【００２７】
[0028]ｒｈＧＨの現行の投与は毎日、長期間の間行われ、そのためより低頻度の投与が大いに望まれることになる。より長い循環半減期を有するｈＧＨ分子は、必要な投与回数を減らすことになり、付随する治療効果の向上を伴う、より至適な治療上のｈＧＨレベルを提供する可能性もあるだろう。
【発明の開示】
【００２８】
[0029]ｈＧＨをペグ化するいくつかの試みにもかかわらず、実現可能な商業製品であるための適当な特性を備えたペグ化ｈＧＨ分子に対する、満たされていない必要性が今なお存在している。本発明は、他のＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲートを上回る利点を提供する、大部分がｈＧＨのＮ末端のフェニルアラニンに結合した単一のＰＥＧを有するＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲートを提供する。ｍＰＥＧアルデヒド−５０００またはｍＰＥＧ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ｍＰＥＧ−ＮＨＳ−５０００）を用いて、α−またはε−のアミノ部位（Ｎ末端およびｈＧＨ中の９つのリジン）に複数の低分子量（５Ｋｄ）のＰＥＧを結合させることについて、ＷＯ  ９３/００１０９、Clark et al. (Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996、および Olson et al. (Polymer Preprints 38:568-569, 1997)に記載された。この方法は不均一な集団を得ることになる。例えば、９つのリジンを有するｈＧＨは、１０個の結合したＰＥＧを有する一部の分子、９個を有する一部の分子、８個を有する一部の分子、７個を有する一部の分子、６個を有する一部の分子、５個を有する一部の分子、４個を有する一部の分子、３個を有する一部の分子、２個を有する一部の分子、１個を有する一部の分子、０個を有する一部の分子、を有すると思われる。そしていくつかのＰＥＧを有する分子の内でも、別々の分子ではＰＥＧは同じ位置に結合していないと思われる。この結果としての不均一性は、治療用生成物の開発の際に、コンジュゲートの作成、精製、および特徴づけを困難にし、費用がかかる、非常に再現性が悪いという不利な点となる。もう１つのアプローチ（ＷＯ  ００/４２１７５）は、ＰＥＧの結合のためにフリーのシステイン残基を含有するｈＧＨ変異体を使用するものであった。しかしこのアプローチは、正しくないペアのジスルフィド結合を有する、正しく折りたたまれていないタンパク質を生じ、そしてシステインの一部またはすべてに結合したＰＥＧを有する、不均一なペグ化生成物を得ることになり得る。複数の部位に結合した多重のＰＥＧを有することは、ＰＥＧおよび多様な部位との間により不安定な結合を有する分子をもたらすと思われ、この分子は異なる比率で解離するようになる可能性がある。このことは、生成物の薬物動態を正確に予測することを困難にし、不正確な投与を行う結果となる。不均一な生成物はまた、治療生成物に関する規定の認可を得る上で、望ましくない問題を抱えることにもなる。
【００２９】
[0030]したがって、単一の部位に結合した単一のＰＥＧを有するペグ化ｈＧＨ分子を有することは望ましいことであろう。本発明はいくつかの方法においてこの必要性に取り組むものである。
【００３０】
発明の概要
[0031]本発明は、化学的に修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体に関し、これらは、減少したクリアランス速度、増加した血漿滞留時間、増加した安定性、改善された溶解度、および減少した抗原性より選択されるがこれに限定されない、少なくとも１つの改善された化学的または生理学的特性を有する。したがってより詳細に以下に記載するように、本発明は、ｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を含むがこれに限定されないポリペプチドを化学的に修飾すること、ならびにポリ(エチレングリコール)のブチルアルデヒド部分を用いての具体的な修飾に関するいくつかの側面を有する。
【００３１】
[0032]本発明はまた、化学的に修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を生成する方法に関する。特に本発明は、Ｎ末端への結合より高い選択性を結果的に得られる、ブチルアルデヒドを用いて化学的に修飾されたｈＧＨを生成する方法に関する。
【００３２】
[0033]本発明はまた、化学的に修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を、単独でまたは別の治療薬と組み合わせて包含する組成物に関する。
[0034]本発明はまた、本発明の化学的に修飾されたｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体を、単独でまたは別の治療薬と併用して、ＧＨ治療が有用である障害および/または疾患の予防および/または治療において使用することに関する。
【００３３】
詳細な説明
[0041]ｈＧＨおよびそのアゴニスト変異体は、米国特許４，６５８，０２１(メチオニルヒト成長ホルモン  −Ｍｅｔ−１−１９１  ｈＧＨ)および米国特許５，６３３，３５２に記載されている、組み換えタンパク質のファミリーの一員である。これらの組み換え産生物および使用法は、米国特許４，３４２，８３２、４，６０１，９８０；米国特許 ４，８９８，８３０；米国特許５，４２４，１９９；および米国特許５，７９５，７４５に詳述されている。
【００３４】
[0042]ホスト細胞、例えば組み換え遺伝子技術を用いることにより形質転換またはトランスフェクションした大腸菌および動物の細胞により産生される、あらゆる精製、単離されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を、本発明において使用してよい。さらなるｈＧＨ変異体については、米国特許６，１４３，５２３、および１９９２年１月１１日に公開されたＷＯ  ９２/０９６９０に記載されている。それらの中で、形質転換した大腸菌により産生されるｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体が特に好ましい。そのようなｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、高い純度および均一性を有する多量の製造にて得てよい。例えば上記のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、米国特許４，３４２，８３２、４，６０１，９８０；米国特許４，８９８，８３０；米国特許５，４２４，１９９；および米国特許５，７９５，７４５に開示された方法に従って調製してよい。“以下のアミノ酸配列を実質的に有する”という用語は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の機能において何の不利な非類似性の原因ともならない限り、上記のアミノ酸配列が、１つまたはそれより多くのアミノ酸の変化（欠失、付加、挿入または置換）を含んでもよいことを意味する。少なくとも１つのリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ペアでないシステイン残基、フリーのＮ末端のα−アミノ基、またはフリーのＣ末端のカルボキシル基が含まれるアミノ酸配列を実質的に有する、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を使用することが、より好ましい。
【００３５】
[0043]“ｈＧＨポリペプチドまたはｈＧＨタンパク質”という用語は、本明細書において使用する場合、成長期において、そして正常な体組成、同化作用および脂質代謝を維持する上で成長を促進することを特徴とするすべてのｈＧＨポリペプチド、好ましくは哺乳類の種由来のもの、より好ましくはヒトおよびネズミ科の種由来のもの、同様にそれらの変異体、類似体、オーソログ、相同体、および誘導体、ならびにそれらのフラグメントを包含する。好ましくは“ｈＧＨポリペプチドまたはｈＧＨタンパク質”という用語は、配列番号１のｈＧＨポリペプチド、ならびに本質的に同じ生物学的活性（成長期において、そして正常な体組成、同化作用および脂質代謝を維持する上で成長を促進する）を本質的に呈する、その変異体、相同体および誘導体をいう。より好ましくは“ｈＧＨポリペプチドまたはｈＧＨタンパク質”という用語は、配列番号１のポリペプチドをいう。
【００３６】
[0044]“ｈＧＨポリペプチド変異体”という用語は本明細書で使用する場合、同一種由来であるが、基準ｈＧＨポリペプチドとは異なるポリペプチドをいう。一般に、基準のものと変異体のアミノ酸配列は全体としてほとんど類似し、多くの領域において同一であるように差異は限定される。好ましくはｈＧＨポリペプチドは、基準ｈＧＨポリペプチド、好ましくは配列番号１のｈＧＨポリペプチドと、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。照会(query)アミノ酸配列と少なくとも例えば９５％“同一の”アミノ酸配列を有するポリペプチドにより、対象ポリペプチド配列が、照会アミノ酸配列の１００個の各アミノ酸当たり５個までのアミノ酸の変更を含んでよいこと以外は、対象ポリペプチドのアミノ酸配列が照会配列と同一であることを意図する。基準配列からのこれらの変更は、基準アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシル末端の位置で、またはこれら両末端の位置の間のあらゆるところ、すなわち基準配列中の残基の間に個別に、または基準配列内の１つまたはそれより多くの連続する基においてのいずれかに散在して起こってもよい。照会配列は、基準配列の全アミノ酸配列でもよいし、または上に記載したように特定されたあらゆるフラグメントでもよい。
【００３７】
[0045]そのようなｈＧＨポリペプチド変異体は、天然に起こる変異体、例えばある器官の染色体上の所定の遺伝子座を占有するｈＧＨのいくつか異なる形の１つによりコードされる天然に起こる対立遺伝子の変異体、または１つの最初の転写物を起源とする天然に起こるスプライシングの変異体によりコードされるアイソフォームでもよい。あるいは、ｈＧＨポリペプチド変異体は天然に起こることは知られていない、そして当該技術分野に公知の突然変異技術を用いて作成することのできる変異体でもよい。
【００３８】
[0046]１つまたはそれより多くのアミノ酸を、生物学的機能を実質的に失うことなく、生態活性なペプチドまたはタンパク質のＮ末端またはＣ末端から欠失してよいことは、当該技術分野において公知である（例えばRon et al., (1993), Biol Chem., 268 2984-2988を参照のこと；同開示を本明細書によりその全内容において参照として援用する）。
【００３９】
[0047]ｈＧＨポリペプチドの一部のアミノ酸配列を、タンパク質の構造または機能への有意な影響を伴わずに変えることができることもまた、当業者に容認されるだろう。そのような突然変異は、活性にほとんど影響を及ぼさないように当該技術分野において公知の一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、反転、繰り返し、および置換を含む。例えば表現型的にサイレントなアミノ酸の置換を行う方法に関する手引書が、Bowie et al. (1990), Science 247:1306-1310（本明細書によりその全内容において参照として援用する）にて提供されており、同文献において同著者らは、変化に対するアミノ酸配列の抵抗性を研究するための２つの主要なアプローチがあることを示している。
【００４０】
[0048]第１の方法は、突然変異が天然の選択により受容、または拒絶のいずれかとされる、進化の過程に依存する。第２のアプローチは、クローン化ｈＧＨにより具体的な位置にアミノ酸の変化を導入するための遺伝子工学、および機能性を維持している配列を同定するための選択またはスクリーニングを使用する。これらの研究は、タンパク質がアミノ酸の置換に驚くほど抵抗性があることを明らかにした。同著者らはさらに、どのアミノ酸の変化がタンパク質のある種の位置で受け入れられそうであるかについて示した。例えば、（構造上）最も埋もれているアミノ酸残基は非極性の側鎖を必要とするが、一方では表面の側鎖のわずかな特徴しか一般に保存されていない。その他のそのような表現型的にサイレントな置換は、Bowie et al. (1990)  上記文献、および同文献に引用された参考文献に記載されている。
【００４１】
[0049]保存的な置換として典型的に認められるのは、脂肪族アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＰｈｅの間である残基の別な残基への置換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基であるＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒｇ間の交換、ならびに芳香族残基であるＰｈｅ、Ｔｙｒ間の置き換えである。加えてアミノ酸の以下のグループは一般に均等な変化を示す：(１) Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；(２)Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；(３)Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；(４)Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；(５) Ｐｈｅ，Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓが挙げられる。
【００４２】
[0050]ｈＧＨポリペプチドという用語はまた、ｈＧＨの類似体、オーソログ、および/または種の相同体によりコードされるすべてのｈＧＨポリペプチドを包括的に含む。本明細書で使用する場合、“ｈＧＨ類似体”という用語は、各有機体において同じ機能を行うが、有機体の起源が共通して有していた起源の構造を基点としなかった、異なるそして関連のない有機体のｈＧＨをいう。というよりｈＧＨ類似体は別々に発生し、その後進化して同じ機能（または類似の機能）を行うようになった。換言すれば、ｈＧＨ類似体ポリペプチドは、まったく異なるアミノ酸配列を有するが、同じ生物学的活性、すなわち成長期において、そして正常な体組成、同化作用および脂質代謝を維持する上で成長の促進を行うポリペプチドである。本明細書で使用する場合“ｈＧＨオーソログ”という用語は、それらの配列が、ある起源の種における共通の相同なｈＧＨを介して互いに関連するが、進化して互いに異なるようになった、２つの異なる種のｈＧＨをいう。本明細書で使用する場合“ｈＧＨ相同体”という用語は、各有機体において同じ機能を行い、有機体の起源が共通して有していた起源の構造を基点とする、異なる有機体のｈＧＨをいう。換言すればｈＧＨ相同体ポリペプチドは、同じ生物学的活性、すなわち成長期において、そして正常な体組成、同化作用および脂質代謝を維持する上で成長の促進を行う、きわめて類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。好ましくは、ｈＧＨポリペプチド相同体は、基準ｈＧＨポリペプチド、好ましくは配列番号１のｈＧＨポリペプチドに対して、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を呈するポリペプチドとして定義してよい。
【００４３】
[0051]このように本発明に従ってのｈＧＨポリペプチドは以下のものでよい。例えば：（ｉ）１つもしくはそれより多くのアミノ酸残基が保存的または非保存的なアミノ酸残基（好ましくは保存的なアミノ酸残基）で置換されており、そしてそのような置換されたアミノ酸残基は、遺伝子コードによりコードされていてもそうでなくてもよいもの：あるいは（ｉｉ）１つまたはそれより多くのアミノ酸残基が置換基を含むもの：あるいは（ｉｉｉ）ｈＧＨポリペプチドが別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加する化合物（例えばポリエチレングリコール）と融合しているもの：あるいは（ｉｖ）付加的なアミノ酸、例えばＩｇ  Ｆｃ融合領域のペプチド、またはリーダー配列もしくは分泌配列、またはポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の上術の形態への精製のために使用される配列、がポリペプチドの上術の形態と融合しているもの、が挙げられる。
【００４４】
[0052]ｈＧＨポリペプチドはモノマーまたは多量体でよい。多量体はダイマー、トリマー、テトラマー、または少なくとも５つのモノマーポリペプチドユニットを包含する多量体でよい。多量体はまたホモダイマーまたはヘテロダイマーでもよい。本発明の多量体は、疎水性、親水性、イオン性のおよび/または共有的な会合（または結合）により得られるものでよいし、ならびに/または、例えばリポソームの形成により間接的に連結されていてもよい。一例において共有結合は、ｈＧＨポリペプチドまたはそのフラグメントを含有する融合タンパク質中に含有された不均一な配列間に存在する（例えば米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと。同開示を本明細書によりその全内容において参照として援用する。）もう１つの例において、ｈＧＨポリペプチドまたはそのフラグメントは、ｈＧＨポリペプチド、または不均一なポリペプチドのいずれかでよい１つまたはそれより多くのポリペプチドと、ペプチドリンカー  例えば米国特許第５，０７３，６２７号（本明細書により参照として援用する）に記載されているものを通して結合する。多量体ｈＧＨポリペプチドを調製するためのもう１つの方法は、ＷＯ  ９４/１０３０８の技術を含む当業者に公知の技術を用いて得られる、タンパク質の多量体化を促進することが知られているロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーのポリペプチド配列と融合したｈＧＨポリペプチドの使用を含む。もう１つの例においてｈＧＨポリペプチドは、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列を含有する融合ｈＧＨポリペプチド中に含有されるＦｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列との間の相互作用により会合させてもよい。ｈＧＨ多量体はまた、当該技術分野に公知の化学的技術、例えば当該技術分野において公知のリンカー分子およびリンカー分子の長さの至適化技術（例えば米国特許５，４７８，９２５を参照のこと）、多量体に含有されることが所望されるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に１つもしくはそれより多くの分子間の架橋を形成する当該技術分野における公知の技術（例えば米国特許５，４７８，９２５を参照のこと）、ｈＧＨポリペプチドのＣ末端もしくはＮ末端へのシステインもしくはビオチンの付加、そして１つもしくはそれより多くのこれらの修飾ポリペプチドを含有する多量体を生成するための技術（例えば米国特許５，４７８，９２５を参照のこと）、またはｈＧＨ多量体を含有するリポソームを製造する３０の技術のいずれか（例えば米国特許第５，４７８，９２５号を参照のこと）、を用いて製造してよい。以上の開示をそれらの全内容において参照として援用する。
【００４５】
[0053]本明細書で使用する場合“ｈＧＨポリペプチドフラグメント”という用語は、ｈＧＨポリペプチド、好ましくは配列番号１のポリペプチドのアミノ酸配列の一部の連続する区間を包含する、あらゆるペプチドまたはポリペプチドをいう。
【００４６】
[0054]より具体的には、ｈＧＨポリペプチドフラグメントは、本発明に従ってｈＧＨポリペプチドの少なくとも６、少なくとも８から１０、より好ましくは１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、１９１の連続するアミノ酸を包含する。ｈＧＨポリペプチドフラグメントは付加的に、少なくとも６のアミノ酸を包含するｈＧＨポリペプチドの亜属(sub-genuses)として記載してよく、ここで“少なくとも６”は、６、および配列番号１のポリペプチドを含むｈＧＨポリペプチドのＣ末端アミノ酸を表す整数との間のあらゆる整数として定義する。さらに含まれるものとして、それらのＮ末端およびＣ末端の位置の用語でさらに特定される、上に記載したような少なくとも６のアミノ酸の長さのｈＧＨポリペプチドフラグメントの種である。個々の種として“ｈＧＨポリペプチドフラグメント”という用語により包含されるのはまた、Ｎ末端およびＣ末端の位置により特に特定してよい、上に記載したような少なくとも６アミノ酸の長さのすべてのｈＧＨポリペプチドフラグメントである。すなわち、配列リストまたは本発明のあらゆる所定のアミノ酸配列上の、少なくとも６の連続するアミノ酸残基の長さのフラグメントが占有することのできるＮ末端およびＣ末端の位置の各々の組み合わせが、本発明に含まれる。
【００４７】
[0055] あるいは、本発明のポリペプチドフラグメントの上記の種は、式“ａからｂ”により記載してもよいことに特に言及しておく；この場合“ａ”はポリヌクレオチドの最もＮ末端よりのアミノ酸の位置に等しく、“ｂ”は最もＣ末端よりのアミノ酸の位置に等しい；そしてさらにここで“ａ”は１、およびｈＧＨポリヌクレオチド配列のアミノ酸の数から６を引いた数の間の整数に等しく、“ｂ”は７、およびｈＧＨポリヌクレオチド配列のアミノ酸の数の間の整数に等しい；そしてここで“ａ”は“ｂ”より少なくとも６小さい整数である。
【００４８】
[0056]上記のｈＧＨポリペプチドフラグメントは、上記の記載を用いて直ちに認識することができるため、単に本明細書を不必要に長くしない目的のため、個々には列記しない。さらに上記のフラグメントは必ずしもｈＧＨの生物学的活性を有する必要はない、しかしこれらの活性を有するポリペプチドは、例えばイムノアッセイにおいて、エピトープのマッピング、エピトープのタギングにおいて、ワクチンとして、および分子量のマーカーとして有用となるであろう故、そのような活性を有するペプチドは本発明の好ましい態様である。上記のフラグメントはまた、ポリペプチドの特定の部分に対する抗体を生成するために使用してもよい。
【００４９】
[0057]“ｈＧＨポリペプチドフラグメント”という用語によりまた包括的に含まれるものとして、ｈＧＨポリペプチドのドメインがある。そのようなドメインは、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックスモチーフ、翻訳後修飾部位、例えばグリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファへリックス、およびベータシート、コードされたタンパク質の分泌を方向付けるシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写の調節に関与する配列、例えばホメオボックス、酸性のストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、および酵素による開裂部位を含むがこれらに限定されない直鎖状または構造的なモチーフおよびサイン(signature)を、結果的に包含してよい。そのようなドメインは、特定の生物学的活性、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの結合、タンパク質の分泌、転写の調節、酵素活性、基質結合活性、等．．．を表してよい。
【００５０】
[0058]一つのドメインは一般に３および１９１の間のアミノ酸を包含する。より好ましい態様において、ドメインは６および１９１の間のあらゆる整数であるアミノ酸の数を包含する。ドメインは、抗ｈＧＨ抗体を生成するためのｈＧＨポリペプチドの調製について本明細書に開示されたものを含めて、当業者に公知のあらゆる方法を用いて合成してよい。特定の生物学的活性を伴うドメインを構成するアミノ酸を決定する方法は、変異誘発試験、および検査する生物学的活性を決定するためのアッセイを含む。
【００５１】
[0059]本発明の内容において特に好ましいフラグメントは、実質的な生物学的活性を保持している、すなわち成長期において、そして正常な体組成、同化作用および脂質代謝を維持する上で成長を促進するｈＧＨポリペプチドである。
【００５２】
[0060]あるいは本発明のポリペプチドは、データベース中のモチーフ、ドメイン、および/またはサインについて、当業者に公知のあらゆるコンピューターによる方法を用いてスキャンしてもよい。探索可能なデータベースは、Prosite (Hofmann et al., (1999) Nucl. Acids Res. 27:215-219; Bucher and Bairoch (1994) Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman et al, Eds., pp53-61, AAAIPress, Menlo Park), Pfam (Sonnhammer et al., (1997) Proteins28(3):405-20; Henikoff et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):228-30; Bateman et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):263-6), Blocks (Henikoff et al., (2000) Electrophoresis 21(9):1700-6), Print (Attwood et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24(1):182-8), Prodom (Sonnhammer and Kahn (1994) Protein Sci. 3(3):482-92; Corpet et al. (2000) Nucleic Acids Res.28(1):267-9), Sbase (Pongor et al. (1993) Protein Eng. 6(4):391-5; Murvai et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):260-2), Smart (Schultz et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 95, 5857-5864), Dali/FSSP (Holm and Sander (1996) Nucleic Acids Res. 24(1):206-9 ; Holm and Sander (1997) Nucleic Acids Res. 25(1):231-4 ; Holm and Sander (1999) Nucleic Acids Res. 27(1):244-7), HSSP (Sander and Schneider (1991) Proteins 9(1):56-68.), CATH (Orengo et al., (1997) Structure5(8):1093-108; Pearl et al., (2000) Biochem. Soc. Trans. 28(2):269-75), SCOP (Murzin et al., (1995) J. Mol. Biol. 247(4):536-40; Lo Conte et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):257-9), COG (Tatusov et al., (1997) Science 278, 631 :637 ; Tatusov et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):33-6), specific family databases and derivatives thereof (Nevill-Manning et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95, 5865-5871; Yona et al., (1999) Proteins 37(3):360-78; Attwood et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28(1):225-7)を含み、これらの開示の各々を本明細書によりそれらの全内容において参照として援用する。利用可能なデータベースに関するまとめとして、Nucleic Acid Research (2000)の第２８巻の１号を参照のこと、同開示を本明細書によりその全内容において参照として援用する。
【００５３】
[0061]“ｈＧＨポリペプチドフラグメント”という用語はまた、エピトープを保有するフラグメントを包括的に含む。これらのエピトープは、抗原エピトープでも、または抗原エピトープおよび免疫原性エピトープの双方でもよい。免疫原性エピトープは、ポリペプチドが免疫原である場合にin vivoにおいて抗体応答を生ずるタンパク質の一部として定義する。他方、抗体が結合するポリペプチドの領域を抗原エピトープとして定義する。エピトープは空間的なコンフォメーションにおけるわずか３アミノ酸程度しか包含しないことも可能であり、これはエピトープに独特のものである。一般にはエピトープは少なくとも６アミノ酸、およびより頻繁には少なくとも８−１０のそのようなアミノ酸から成る。
【００５４】
[0062]本発明に従ってのｈＧＨエピトープを保有するフラグメントは、その長さが６アミノ酸およびｈＧＨポリペプチドの全長の間であるあらゆるフラグメント、好ましくは６および５０アミノ酸の間のフラグメントであってよい。エピトープを保有するフラグメントは、（サブグループとしての）連続するアミノ酸残基の数、または上に記載したような（種としての）具体的なＮ末端およびＣ末端の位置、のいずれかにより特定してよい。
【００５５】
[0063]エピトープとして機能するフラグメントは、あらゆる従来の手段により生成してよい（例えばHoughten (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5131-5135 および米国特許４，６３１,２１を参照のこと。これらの開示を本明細書によりそれらの全内容において参照として援用する）。エピトープを構成するアミノ酸を決定するための方法は、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴、およびエピトープマッピング、例えばGeysen et al., (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:3998-4002；ＰＣＴ出願  ＷＯ  ８４/０３５６４およびＷＯ  ８４/０３５０６（これらの開示を本明細書によりそれらの全内容において参照として援用する）により記載されているPepscan法を含む。もう１つの例は、Jameson and Wolf, (1988), Comp. Appl. Biosci. 4:181-186（前記参考文献をその全内容において参照として援用する）のアルゴリズムである。このJameson - Wolf 抗原分析は、例えば初期設定パラメータを用いるコンピュータプログラムＰＲＯＴＥＡＮ（Version 4.0 Windows, DNASTAR, Inc.）を用いて行ってよい。
【００５６】
[0064]本発明はまた、上に記載したようなＮ末端およびＣ末端の位置により特定されるあらゆるｈＧＨフラグメントの種、またはアミノ酸残基のサイズにより特定されるサブグループのあらゆるフラグメントを除外するものとして提供する。上に記載したようなＮ末端およびＣ末端の位置により、またはアミノ酸残基のサイズにより特定されるあらゆる数のフラグメントは、個々の種として除外してよい。本発明はまた同様の様式において、あらゆるｈＧＨドメインまたはエピトープ保有フラグメントを除外するものとして提供する。
【００５７】
[0065]本発明のｈＧＨポリペプチドは、あらゆる適切な方法で調製することができる。そのようなｈＧＨポリペプチドおよびそれらのフラグメントは、当業者に公知の技術を用いて、天然の材料から精製する、化学的に合成する、in vitro 翻訳技術もしくはｈＧＨ  ｃＤＮＡを発現することのできる組み換え細胞における発現を含む組み換え技術により生成する、またはこれらの方法を組み合わせてもよい。（例えばタンパク質を精製するための様々な方法に関する“Methods in Enzymology, Academic Press, 1993”；タンパク質の化学的合成に関するCreighton, (1983) Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co. 2nd Ed., T.  E., New York；および Hunkapiller et al., (1984) Nature. 310(5973): 105-11 、ならびに組み換え技術に関するDavis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NY を参照のこと。これらの開示をそれらの全内容において参照として援用する）。本発明のポリペプチドは好ましくは単離された形で提供し、部分的にまたは好ましくは実質的に精製してよい。
【００５８】
[0066]“基準のポリヌクレオチドと少なくともｘ％の同一性を有するポリヌクレオチド”、および“基準のポリペプチドとの少なくともｘ％の同一性を有するポリペプチド” という用語は、その残基（各々ヌクレオチドまたはアミノ酸）の配列が、以下に定義するように各々前記の基準のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、ｘに等しいまたはｘより高い同一性の比率（パーセント）を呈する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包括的に含む。
【００５９】
[0067]この同一性の比率は、比較ウィンドウ全体の２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の最適なアライメントの後に決定し、この場合比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、配列のアライメントを最適化するために、１つまたはそれより多くの残基の付加または欠失を包含してよい。比較ウィンドウは、あるいくつかの位置（残基、または残基の挿入/欠失に対応するギャップのいずれか）を含有してよく、この位置の数がウィンドウのサイズに対応する。各ウィンドウの位置は、以下の状態の１つを表してよい。
【００６０】
１°/アライメントした第１の配列上のこの位置に、ある残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）があり、アライメントした第２の配列上の同じ位置に異なる残基がある、換言すれば第２の配列は、第１の配列と比較してこの位置に置換された残基を有する。
【００６１】
２°/アライメントした第１の配列上のこの位置に、ある残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）があり、アライメントした第２の配列上の同じ位置に同じ残基がある。
３°/アライメントした第１の配列上のこの位置に、ある残基（ヌクレオチドまたはアミノ酸）があり、アライメントした第２の配列上の同じ位置には残基がない、換言すれば第２の配列は、第１の配列と比較してこの位置の欠失を表す。
【００６２】
上に定義した第１の分類に属する比較ウィンドウ内の位置の数をＲ１と呼ぶ。
上に定義した第２の分類に属する比較ウィンドウ内の位置の数をＲ２と呼ぶ。
上に定義した第３の分類に属する比較ウィンドウ内の位置の数をＲ３と呼ぶ。
【００６３】
[0068]同一性の比率（％ｉｄ）は、以下の式：
【００６４】
【化１】
2007520544.tif 000002
【００６５】
のいずれかにより計算してよい。
[0069]比較するための配列のアライメントは、当該技術分野に公知の様々な配列比較のアルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて行ってよい。そのようなアルゴリズムおよびプログラムは、以下；ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、ＦＡＳＴＤＢ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ−ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ (Pearson and Lipman, (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448; Altschul et al., (1990), J.  Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., (1993), Nature hGHtics 3:266-272; Altschul et al., (1997), Nuc. Acids Res. 25:3389-3402;  Thompson et al., (1994), Nuc. Acids Res.. 22:4673-4680;  Higgins et al., (1996), Meth. Enzymol. 266:383-402; Brutlag et al. (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245; Jones and Swindells, (2002) Trends Biochem Sci 27:161-4; Olsen et al. (1999) Pac Symp Biocomput; 302-13、を含むが決してこれらに限定されることはない。これらの開示をそれらの全内容において参照として援用する。
【００６６】
[0070]特定の態様においてSmith-Waterman 法は、スコアリングマトリックス、例えばＰＡＭ、ＰＡＭ２５０を用いて、または好ましくはＢＬＯＳＵＭマトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭ６０またはＢＬＯＳＵＭ６２を用いて、そして初期設定パラメータ(Gap Opening Penalty=10 およびGap Extension Penalty=1)を用いて、または初期設定パラメータより好ましくは優れたユーザーの特定のパラメータを用いて使用する。
【００６７】
[0071]もう１つの特定の態様においてタンパク質および核酸の配列は、初期設定パラメータを用いて、またはユーザーにより提供された修飾されたパラメータを用いて、the Basic Local Alignment Search Tool (“ＢＬＡＳＴ”)プログラムを使用してアライメントする。好ましくは使用するスコアリングマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス(Gonnet et al., (1992), Science 256:1443-1445; Henikoff and Henikoff, (1993), Proteins 17:49-61、これらの開示を本明細書によりそれらの全内容において参照として援用する）。これより好ましいものではないが、ＰＡＭマトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスもまた使用してよい（例えばSchwartz and Dayhoff, (1978), eds., Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequence and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundationを参照のこと、この開示を本明細書によりその全内容において参照として援用する）。
【００６８】
[0072]なおもう１つの特定の態様において、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列は、Brutlag et al. (1990)（上に記載）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを使用してアライメントする。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢアライメントにおいて使用する好ましいパラメータは以下のとおりである：Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch Penalty= 1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score= 1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty 0.05, Window Size=500または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらか短いほう）。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アライメントに使用する好ましいパラメータは以下のとおりである：Matrix=PAM 0, k-tuple=2, Mismatch Penalty= 1, Joining Penalty=20, Randomization Group25Length=0, Cutoff Score= 1, Window Size=sequence length, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, Window Size=500 または対象ヌクレオチド配列の長さ（どちらか短いほう）。
【００６９】
[0073]本発明に従ってポリ(エチレングリコール)を、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のアミノ酸残基を通して共有結合する。いくつかの異なる官能基、リンカー、立体配置および分子量を有する様々な活性化ポリ(エチレングリコール)は当業者に公知であり、それらを使用してＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲートまたはＰＥＧ−ｈＧＨアゴニスト変異体コンジュゲートを作製してよい（総説としてRoberts M.J. et al., Adv. Drug Del. Rev.54:459-476, 2002、 Harris J.M. et al., Drug Delivery Sytems 40:538-551, 2001を参照のこと）。本発明は、アルデヒド化学を使用し、ブチリルアルデヒドリンカー部分を使用して、Ｎ末端へのＰＥＧ部分の選択性を方向付ける方法に関する。ブチリルアルデヒドリンカーはアセトアルデヒドリンカーと比較して、増加したＮ末端特異性を結果的に得られる（表１および図１）。
【００７０】
[0074]本発明の１つの態様は、式Ｉまたは式ＩＩの構造： 
【００７１】
【化２】
2007520544.tif 000003
【００７２】
[式中
ｎは１および１０の間の整数である；
ｍは１および１０の間の整数である；
Ｒはヒト成長ホルモン、メチオニル成長ホルモン、またはヒト成長ホルモン変異体である]。
を有するヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲートである。
【００７３】
[0075]特定の態様において、ｎは１および５の間であり、ｍは１および５の間である。
[0076]式Ｉの特定の態様において：ｎは１であり、ｍは１である；ｎは１であり、ｍは２である；ｎは１であり、ｍは３である；ｎは１であり、ｍは４である；ｎは１であり、ｍは５である；ｎは１であり、ｍは６である；ｎは１であり、ｍは７である；ｎは１であり、ｍは８である；ｎは１であり、ｍは９である；ｎは１であり、ｍは１０である；ｎは２であり、ｍは１である；ｎは２であり、ｍは２である；ｎは２であり、ｍは３である；ｎは２であり、ｍは４である；ｎは２であり、ｍは５である；ｎは２であり、ｍは６である；ｎは２であり、ｍは７である；ｎは２であり、ｍは８である；ｎは２であり、ｍは９である；ｎは２であり、ｍは１０である；ｎは３であり、ｍは１である；ｎは３であり、ｍは２である；ｎは３であり、ｍは３である；ｎは３であり、ｍは４である；ｎは３であり、ｍは５である；ｎは３であり、ｍは６である；ｎは３であり、ｍは７である；ｎは３であり、ｍは８である；ｎは３であり、ｍは９である；ｎは３であり、ｍは１０である；ｎは４であり、ｍは１である；ｎは４であり、ｍは２である；ｎは４であり、ｍは３である；ｎは４であり、ｍは４である；ｎは４であり、ｍは５である；ｎは４であり、ｍは６である；ｎは４であり、ｍは７である；ｎは４であり、ｍは８である；ｎは４であり、ｍは９である；ｎは４であり、ｍは１０である；ｎは５であり、ｍは１である；ｎは５であり、ｍは２である；ｎは５であり、ｍは３である；ｎは５であり、ｍは４である；ｎは５であり、ｍは５である；ｎは５であり、ｍは６である；ｎは５であり、ｍは７である；ｎは５であり、ｍは８である；ｎは５であり、ｍは９である；ｎは５であり、ｍは１０である；ｎは６であり、ｍは１である；ｎは６であり、ｍは２である；ｎは６であり、ｍは３である；ｎは６であり、ｍは４である；ｎは６であり、ｍは５である；ｎは６であり、ｍは６である；ｎは６であり、ｍは７である；ｎは６であり、ｍは８である；ｎは６であり、ｍは９である；ｎは６であり、ｍは１０である；ｎは７であり、ｍは１である；ｎは７であり、ｍは２である；ｎは７であり、ｍは３である；ｎは７であり、ｍは４である；ｎは７であり、ｍは５である；ｎは７であり、ｍは６である；ｎは７であり、ｍは７である；ｎは７であり、ｍは８である；ｎは７であり、ｍは９である；ｎは７であり、ｍは１０である；ｎは８であり、ｍは１である；ｎは８であり、ｍは２である；ｎは８であり、ｍは３である；ｎは８であり、ｍは４である；ｎは８であり、ｍは５である；ｎは８であり、ｍは６である；ｎは８であり、ｍは７である；ｎは８であり、ｍは８である；ｎは８であり、ｍは９である；ｎは８であり、ｍは１０である；ｎは９であり、ｍは１である；ｎは９であり、ｍは２である；ｎは９であり、ｍは３である；ｎは９であり、ｍは４である；ｎは９であり、ｍは５である；ｎは９であり、ｍは６である；ｎは９であり、ｍは７である；ｎは９であり、ｍは８である；ｎは９であり、ｍは９である；ｎは９であり、ｍは１０である；ｎは１０であり、ｍは１である；ｎは１０であり、ｍは２である；ｎは１０であり、ｍは３である；ｎは１０であり、ｍは４である；ｎは１０であり、ｍは５である；ｎは１０であり、ｍは６である；ｎは１０であり、ｍは７である；ｎは１０であり、ｍは８である；ｎは１０であり、ｍは９である；ｎは１０であり、ｍは１０である。
【００７４】
[0077]特定の態様は、以下の構造：
【００７５】
【化３】
2007520544.tif 000004
【００７６】
[式中Ｒはヒト成長ホルモン、メチオニルヒト成長ホルモン、またはヒト成長ホルモン変異体である]
を有するヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲートである。
【００７７】
[0078]本発明のもう１つの特定の態様は、ヒト成長ホルモンが配列番号１のアミノ酸を包含する、または該アミノ酸から成るヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲートである。
[0079]本発明の具体的な態様は、ポリエチレングリコールの８０％、より好ましくは８１％、より好ましくは８２％、より好ましくは８３％、より好ましくは８４％、より好ましくは８５％、より好ましくは８６％、より好ましくは８７％、より好ましくは８８％、より好ましくは８９％、より好ましくは９０％、より好ましくは９１％、より好ましくは９２％、より好ましくは９３％、より好ましくは９４％、より好ましくは９５％、より好ましくは９６％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンとコンジュゲート化されたヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲートである。
【００７８】
[0080]本発明のもう１つの具体的な態様は、ポリエチレングリコールの９０％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンとコンジュゲート化されたヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲートである。
【００７９】
[0081]本発明のもう１つの具体的な態様は、ポリエチレングリコールの９５％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンとコンジュゲート化されたヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲートである。
【００８０】
[0082]本発明のもう１つの具体的な態様は、ポリエチレングリコールの９８％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンとコンジュゲート化されたヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲートである。
【００８１】
[0083]本発明において使用するポリ(エチレングリコール)は、いかなる特定の形または分子量の範囲にも制限されない。ポリ(エチレングリコール)の分子量は、約５００および約１００，０００ダルトンの間でよい。“約”という用語は、ポリエチレングリコールの調製物において、一部の分子は記述された分子量より大きく、一部はより小さい、そして記述された分子量は平均の分子量をいうことを示している。ポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)に伴うある程度の多分散が存在することは理解される。多分散性の低いＰＥＧを使用することが好ましい。通例、分子量約５００から約６０，０００のＰＥＧを使用する。本発明の具体的なＰＥＧ分子量の範囲は、約１，０００から約４０，０００である。もう１つの具体的な態様において、ＰＥＧ分子量は約５，０００より大きく約４０，０００までである。もう１つの具体的な態様において、ＰＥＧ分子量は約２０，０００から約４０，０００である。所望の治療上の側面（例えば所望の徐放性の期間、もしあるなら生物学的活性における効果、治療タンパク質に対するポリエチレンの抗原性およびその他の公知の影響の程度または欠損）に依存して、これ以外のサイズを使用してもよい。例えばポリエチレングリコールは、平均分子量  約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ダルトンを有してよい。
【００８２】
[0084]もう１つの態様においてポリ(エチレングリコール)は、結合するＰＥＧ部分を１つまたはそれより多く有する分枝鎖ＰＥＧである（米国特許５，９３２，４６２；米国特許５，３４２，９４０；米国特許５，６４３，５７５；米国特許５，９１９，４５５；米国特許６，１１３，９０６；米国特許５，１８３，６６０； Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5:283-288 (1994);およびＷＯ  ０２/０９７６６を参照のこと）。好ましい態様において、分枝鎖ＰＥＧの各ポリ(エチレングリコール)の分子量は、約５，０００−２０，０００である。具体的な態様において、分枝鎖ＰＥＧの各ポリ(エチレングリコール)の分子量は約２０，０００である。
【００８３】
[0085]ポリ(アルキレン酸化物)、特にポリ(エチレングリコール)は、末端の反応基を介してｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に結合し、この反応基は、ＰＥＧおよびタンパク質間に連結部分（スペーサー）を残していても残していなくてもよい。本発明のｈＧＨコンジュゲートまたはそのアゴニスト変異体のコンジュゲートを形成するため、ポリマー  例えばポリ(アルキレン酸化物)は、そのような用語が当業者に公知であるような、活性型に変換する。この反応基は例えば末端の反応基であり、これがタンパク質およびポリ(エチレングリコール)の化学的部分の間の結合を仲介する。典型的には１つまたは双方の末端のポリマーのヒドロキシル末端の基（すなわちアルファ末端およびオメガ末端のヒドロキシル基）を、共有結合のコンジュゲートを可能にする反応性の官能基に変換する。この方法をしばしば“活性化”といい、反応基を有するポリ(エチレングリコール)生成物を本明細書において以下、“活性化ポリ(エチレングリコール)”という。具体的な態様において、ポリマーの末端のヒドロキシル末端の基の１つは、非反応性の基を用いて変換またはキャップ(cap)する。具体的な態様において、ポリマーの末端のヒドロキシル末端の基は、メチル基で変換またはキャップする。本明細書において使用する場合、“ｍＰＥＧ”という用語は、１つの末端をメチル基でキャップされたＰＥＧをいう。ｍＰＥＧは構造的には
CH3O-(CH2CH2O)n-H
と表すことができる。
【００８４】
[0086]αおよびε双方の連結基を含有するポリマーを、“ビス−活性化ポリ(アルキレン酸化物)”といい、“二官能基の”という。α末端およびε末端のヒドロキシルに同じ反応基を含有するポリマーを、時に“ホモ二官能基の”または“ホモビス−活性化”という。α末端およびε末端のヒドロキシルに異なる反応基を含有するポリマーを、時に“ヘテロ二官能基の”（例えばＷＯ  ０１/２６６９２を参照のこと）または“ヘテロビス−活性化”という。１つの反応基を含有するポリマーを、“モノ−活性化”ポリアルキレン酸化物、または“一官能基の”ポリアルキレン酸化物という。その他の実質的に非抗原性のポリマーも、同様に“活性化”または“官能基化”する。
【００８５】
[0087]このように活性化ポリマーは、タンパク質の化学的部分、例えばα−またはβ−のアミノ基、カルボキシル基、またはチオール基と、ポリ(エチレングリコール)との間の結合を仲介するのに適する。ビス−活性化ポリマーはこの様式で、２つのタンパク質分子または１つのタンパク質分子と反応して、そしてもう１つの態様における反応性の小分子も反応して、架橋を通してタンパク質ポリマーコンジュゲートまたはタンパク質−小分子コンジュゲートを効果的に形成することができる。
【００８６】
[0088]本発明の１つの好ましい態様において、第二級アミンまたはアミドの連結は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のＮ末端のリジンのα−アミノ基またはε−アミノ基、および活性化ＰＥＧを用いて形成する。本発明のもう１つの好ましい側面において、第二級アミンの連結は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のＮ末端の第一級α−アミノ基または第一級ε−アミノ基、および単鎖または分枝鎖のＰＥＧのアルデヒドとの間に、適切な還元剤、例えばChamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994)、米国特許第４，００２，５３１号、ＷＯ  ９０/０５５３４、および米国特許第５，８２４，７８４号に記載されているような、ＮａＣＮＢＨ３、ＮａＢＨ３、ピリジンボラン等を用いての還元的アルキル化により形成する。
【００８７】
[0089]好ましい態様において、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、好ましくは少なくとも８２％、好ましくは少なくとも８３％、好ましくは少なくとも８４％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも８６％、好ましくは少なくとも８７％、好ましくは少なくとも８８％、好ましくは少なくとも８９％、好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、好ましくは少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９３％、好ましくは少なくとも９４％、好ましくは少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９６％、好ましくは少なくとも９７％、そして最も好ましくは少なくとも９８％のポリ(エチレングリコール)が、アミノ末端のαアミノ基に存在する。
【００８８】
[0090]ペグ化反応ともいうコンジュゲート化反応は、歴史的には過剰モルのポリマーを用いて溶液中で、ポリマーがタンパク質のどこに結合するのかには構わずに行われた。しかしそのような一般的な技術は、十分な生体活性を保持しながら生体活性なタンパク質を非抗原性ポリマーとコンジュゲート化させるためには典型的には不適当であることが証明された。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の生体活性を維持するための１つの方法は、ポリマーとのカップリングの方法において、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の受容体結合部位（１つまたは複数）に関与する反応基でのコンジュゲート化を実質的に避けることである。本発明のもう１つの側面は、保持された活性の高レベルを維持しながら、ポリ(エチレングリコール)をｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体とコンジュゲート化させる方法を提供することである。
【００８９】
[0091]共有結合を通しての化学的修飾は、生物学的に活性な物質と活性化ポリ(エチレングリコール)との反応において、一般に受け入れられる適切な条件下で行ってよい。コンジュゲート化反応は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を不活性化してしまうことを避けるため、比較的マイルドな条件下で行う。マイルドな条件には、反応溶液のｐＨを３から１０の範囲に、そして反応温度を約０°−３７℃の範囲内に維持することを含む。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体中の反応性のアミノ酸残基がフリーのアミノ基を有する場合、上術の修飾は好ましくは、リン酸、ＭＥＳ、クエン酸、酢酸、コハク酸、またはＨＥＰＥＳの各バッファーを含む適切なバッファー（ｐＨ３から１０）の非限定的リストにおいて、１−４８時間、４°−３７℃で行う。ＰＥＧアルデヒドのような試薬でＮ末端アミノ基を標的とする場合、ｐＨ４−７に好ましくは維持する。活性化ポリ(エチレングリコール)は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のフリーのアミノ基の数のモル量の、約０．０１−１００倍、好ましくは約０．０１−２．５倍にて使用してよい。これとは反対に、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体中の反応性のアミノ酸残基がフリーのカルボキシル基を有する場合、上術の修飾は好ましくは約３．５から約５．５のｐＨで行い、例えばポリ(オキシエチレンジアミン)による修飾は、カルボジイミド（ｐＨ４−５）の存在下、１−２４時間、４°−３７℃で行う。活性化ポリ(エチレングリコール)は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のフリーのカルボキシル基の数のモル量の、０．０１−３００倍にて使用してよい。
【００９０】
[0092]独立した態様において、コンジュゲート化反応に含まれるポリマーの量の上限は、高分子量の種の実質的な量を形成することなく、すなわちｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の１分子当たり約１本より多くのポリマー鎖を含有するコンジュゲートが約２０％より多くなることなく、活性化ポリマーと、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を反応させることのできる程度に、約１：１を上回る。例えば、本発明のこの側面において、あらゆる高分子量の種から後に単離することのできる所望のコンジュゲートの有意な量を形成するために、約６：１までの比率を使用することができると考えられる。
【００９１】
[0093]本発明のもう１つの側面において、二官能基の活性化ＰＥＧ誘導体を使用して、複数のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の分子がＰＥＧを介して架橋される、ポリマーのｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体−ＰＥＧ分子を製造してもよい。本明細書に記載する反応条件は、有意な量の未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を結果的に得ることになるが、未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、さらなるコンジュゲート化反応のため今後のバッチ中に、容易に再利用することができる。本発明の方法は、高分子量の種、およびｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の１分子当たり１本より多くのポリマー鎖を含有する種（単数または複数）を、驚くほどわずかしか、すなわち約３０％未満、そしてより好ましくは約１０％未満しか製造しない。これらの反応条件は、活性化ポリマーが標的に対して数倍モル過剰にて存在する、ポリマーのコンジュゲート化反応として典型的に使用する条件とは対照的である。本発明の他の側面においてポリマーは、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の１当量当たり約０．１から約５０等量の量で存在する。本発明の他の側面においてポリマーは、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の１当量当たり約１から約１０等量の量で存在する。
【００９２】
[0094]本発明のコンジュゲート化反応は、モノ−ＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲートおよびジ−ＰＥＧ−ｈＧＨコンジュゲート、未反応のｈＧＨ、未反応のポリマー、および通常約２０％未満の高分子量の種を含有する反応混合液またはプールを、初めに提供する。高分子量の種は、１つまたはそれより多くのポリマー鎖を含有するコンジュゲート、および/またはポリマー化したＰＥＧ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の種を含有するコンジュゲートを含む。未反応の種および高分子量の種を除去した後、モノ−ポリマーおよびジ−ポリマー−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のコンジュゲートを主として含有する組成物を回収する。ほとんどの部分としてのコンジュゲートが１本のポリマー鎖を含むという事実を考慮すれば、このコンジュゲートは実質的に均一である。これらの修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、標準的なＦＤＣ−Ｐ１細胞増殖アッセイ(Clark et al. Journal of Biological Chemistry  271:21969-21977, 1996)、受容体結合アッセイ (米国特許５，０５７，４１７)、または下垂体切除したラットの成長 (Clark et al. Journal of Biological Chemistry  271:21969-21977, 1996)を用いて測定した場合、天然または未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体に伴うin vitro の生物学的活性の、少なくとも約０．１％を有する。しかし本発明の好ましい側面において、修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はin vitro の生物学的活性の約２５％を有する、より好ましくは修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、in vitro の生物学的活性の約５０％を有する、より好ましくは修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体はin vitro の生物学的活性の約７５％を有する、そして最も好ましくは修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は均等のまたは改善されたin vitro の生物学的活性を有する。
【００９３】
[0095]本発明の方法は好ましくは、ポリマー  対  ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のむしろ限定された比率を含む。このようにｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のコンジュゲートは、１本のポリマー鎖のみを含有する種に主に限定されることが発見された。さらにｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の反応基へのポリマーの結合は、より高い過剰モルのポリマーリンカーを使用する場合に比して、実質的によりランダム性が低い。反応プール中に存在する未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、コンジュゲート化反応を停止させた後、イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーまたは類似の分離技術を用いて、今後の反応に再利用することができる。
【００９４】
[0096]ポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体、すなわち本発明に従って化学的に修飾されたタンパク質は、タンパク質の生成に使用する従来の方法、例えば透析、塩析、限界濾過、イオン交換クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、ゲルクロマトグラフィー、および電気泳動により、反応混合液から精製してよい。イオン交換クロマトグラフィーは、未反応のポリ(エチレングリコール)およびｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を除去する上で特に有効である。本発明のさらなる態様において、モノ−ポリマーおよびジ−ポリマー−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の種を反応混合液から単離して、高分子量の種、および未修飾のｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を除去する。分離は、約０．５−１０ｍｇ/ｍＬのｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体−ポリマーコンジュゲートを含有するバッファー中の混合した種を、カラムにかけることにより達成することができる。適切な溶液はｐＨ  約４から約１０を有する。この溶液は好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、ＣＨ３ＣＯ２Ｈ、およびＮａＯＨより選択される１つまたはそれより多くのバッファー用の塩を含有する。
【００９５】
[0097]反応バッファーに依存して、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体とポリマーとのコンジュゲートの溶液は、あらゆる未反応のポリマーを除去するために、最初にバッファー交換/限界濾過を行わなければならない。例えば、ＰＥＧ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のコンジュゲート溶液は、低分子量カットオフ（１０，０００から３０，０００ダルトン）膜を通して限界濾過を行い、ほとんどの望ましくない材料、例えば未反応のポリマー、もし含まれていれば界面活性剤、等を除去することができる。
【００９６】
[0098]所望の種を含有するプールにコンジュゲートを分画するには、好ましくはイオン交換クロマトグラフィーの媒体を用いて行う。そのような媒体は、ある程度予測できる形で変化する電荷の差異により、ＰＥＧ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のコンジュゲートを選択的に結合することができる。例えば、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の表面電荷は、タンパク質の表面上の利用可能な荷電した基の数により決定される。これらの荷電した基は典型的には、ポリ(アルキレン酸化物)ポリマーが結合することのできるポイントとなる。したがってｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のコンジュゲートは、選択的な単離を可能とする他の種とは異なる電荷を有することになる。
【００９７】
[0099]強い極性の陰イオンまたは陽イオン交換樹脂、例えば各々第四級アミン樹脂またはスルホプロピル樹脂を、本発明の方法のために使用する。イオン交換樹脂は特に好ましい。本発明の使用に適する、市販により入手可能な陽イオン交換樹脂を含む非限定的リストは、SP-hitrap（登録商標）、SP Sepharose HP（登録商標）、およびSP Sepharose（登録商標）のfast flow（高流速）である。他の適切な陽イオン交換樹脂、例えばＳおよびＣＭ樹脂もまた使用することができる。本発明の使用に適する、市販により入手可な陰イオン交換樹脂を含む陰イオン交換樹脂の非限定的リストは、Q-hitrap（登録商標）、Q Sepharose HP（登録商標）、および Q sepharos（登録商標）のfast flowである。他の適切な陰イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ樹脂もまた使用することができる。
【００９８】
[00100]例えば、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂は、好ましくは従来の手段によりカラムに詰め、平衡化する。ポリマーとコンジュゲート化したｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の溶液と等しいｐＨおよび重量モル浸透圧濃度を有するバッファーを使用する。溶出バッファーは好ましくは、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、ＮａＢＯ４、および(ＮＨ４)２ＣＯ３より選択される１つまたはそれより多くの塩を含有する。次にコンジュゲートを含有する溶液を、カラムに保持されない未反応のポリマーおよび一部の高分子量の種と共に、カラムに吸着させる。サンプルをカラムにのせ終わったら、塩濃度を増加させながらの溶出バッファーの濃度勾配を行い、ポリアルキレン酸化物とコンジュゲート化したｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の所望の分画を溶出させる。溶出させ、プールした分画は、陽イオンまたは陰イオン交換樹脂のステップ後、好ましくは一様なポリマーコンジュゲートに限定される。次にコンジュゲート化されなかったあらゆるｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を、従来技術によりカラムから逆洗させることができる。所望であればモノおよび多重にペグ化されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の種を、さらなるイオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィーにより互いからさらに分離することができる。
【００９９】
[00101]塩濃度またはｐＨを増加させながらの複数回の均一濃度の(isocratic)ステップを利用する技術を使用することもできる。濃度を増加させながらの複数回の均一濃度の溶出ステップでは、ジ−、次にモノ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体−ポリマーコンジュゲートの連続的な溶出が得られることになる。
【０１００】
[00102]溶出のための温度範囲は、約４℃および約２５℃の間である。好ましくは溶出は、約４℃から約２２℃までの温度で行う。例えばＰＥＧ−ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の分画の溶出は、２８０ｎｍのＵＶ吸光度により検出する。分画の採集は、シンプルな時間溶出プロフィールにより達成してよい。
【０１０１】
[00103]ポリ(エチレングリコール)ポリマーを、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の部分とコンジュゲート化する方法において、界面活性剤を使用することができる。適切な界面活性剤は、イオン性タイプの物質、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む。他のイオン性界面活性剤  例えばドデシル硫酸リチウム、第四級アンモニウム化合物、タウロコール酸、カプリル酸、デカンスルホン酸、等もまた使用することができる。非イオン性界面活性剤もまた使用することができる。例えばポリ(オキシエチレン)ソルビタン(Tweens)、ポリ(オキシエチレン)エーテル(Tritons)のような材料を使用することができる。Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp.をまた参照のこと。本発明の方法において使用する界面活性剤の唯一の制限は、ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の実質的に不可逆的な変性の原因とならない、そしてポリマーのコンジュゲート化を完全に阻害することのない条件下および濃度でそれらを使用することである。界面活性剤は、反応混合液中に約０．０１−０．５％；好ましくは０．０５−０．５％、そして最も好ましくは約０．０７５−０．２５％の量で存在するものとする。界面活性剤の混合したものもまた考慮してよい。
【０１０２】
[00104]界面活性剤は、ポリマーのコンジュゲート化の方法の間に、一時的、可逆的な保護システムを提供すると考えられている。界面活性剤は、リジンに基づいたまたはアミノ末端に基づいたコンジュゲート化の促進を可能とする一方で、選択的にポリマーのコンジュゲート化を妨げる上で有効であることが示された。
【０１０３】
[00105]本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、より持続的な薬理学的効果を有するが、この効果はin vivoの延長された半減期に起因すると思われる。
【０１０４】
[00106]本発明のもう１つの態様は、本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の治療有効量を、単独でまたは別の治療薬と併用して、それを必要とする患者に投与することを包含する、ＧＨ、好ましくはｈＧＨの使用が有益である疾患または障害の予防および/または治療のための方法に関する。本発明はまた、ＧＨ、好ましくはｈＧＨの使用が有益である疾患または障害の予防および/または治療のための医薬剤の製造における、本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体の使用に関する。加えて本発明はまた、ＧＨ、好ましくはｈＧＨの使用が有益である疾患または障害の予防および/または治療のための、本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を包含する医薬的組成物に関する。
【０１０５】
[00107]ＧＨの使用が有益である疾患または障害は、成長ホルモン分泌不全症（ＧＨＤ）、成人成長ホルモン分泌不全症（ａＧＨＤ）、ターナー症候群、在胎期間に対して低身長で生まれた小児（ＳＧＡ）における成長不全、プラダーウィリー症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、ＡＩＤＳによる消耗、加齢、末期の腎不全、嚢胞性線維症、勃起機能不全、ＨＩＶ脂肪異栄養症、線維筋痛症、骨粗しょう症、記憶障害、鬱、クローン病、骨格の形成異常、外傷性脳傷害、クモ膜下出血、Noonan症候群、ダウン症候群、特発性低身長症（ＩＳＳ）、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）、超低出生体重児（ＶＬＢＷ）、骨髄幹細胞の救済、メタボリック症候群、グルココルチコイドミオパチー、小児のグルココルチコイド治療に起因する低身長、および未熟児の低身長のキャッチアップ成長不全、を含むがこれに限定されない。
【０１０６】
[00108]本発明のより具体的な態様において、本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を、ＧＨＤ、ａＧＨＤ、ＳＧＡ、ＰＷＳ、ターナー症候群およびＣＲＩから成る群より選択される障害または疾患の予防および/または治療において使用する。
【０１０７】
[00109]本発明のもう１つのより具体的な態様において、本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を、特発性低身長症、超低出生体重児、外傷性脳傷害、メタボリック症候群、およびNoonan症候群から成る群より選択される障害または疾患の予防および/または治療において使用する。
【０１０８】
[00110]本発明のもう１つの態様は、本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体を、単独で、または別の治療薬および少なくとも１つの医薬的に受容可能な賦形剤もしくは担体と組み合わせて包含する医薬組成物に関する。本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は次に、患者にそれらを投与するために、医薬的に受容可能な希釈剤、等張溶液を調製するための物質、ｐＨ調整剤、等を含有する医療用薬剤中に製剤化してよい。
【０１０９】
[00111]上記の薬剤は治療の目的に依存して、皮下、筋肉内、静脈内、経肺、皮膚内、または経口により投与してよい。用量はまた、治療する患者の障害の種類および状態に基づいてよいが、標準的には成人に対して注射により０．１ｍおよび５ｍｇの間、経口投与では０．１ｍｇおよび５０ｍｇの間である。
【０１１０】
[00112]本明細書で使用する場合、本発明のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体は、別の治療薬と併用して使用してよい。本明細書において使用する場合、化合物Ａおよび１つまたはそれより多くのその他の治療薬についていう “併用”、“併用した”および“〜と併用して”という用語は、以下を意味し、そしてまさに言及し、含むことを意図する：
−治療を必要とする患者へのＡおよび治療薬（単数または複数）のそのような併用の同時投与、この場合そのような成分は１つの剤形中に合剤化され、その剤形から前記成分が実質的に同じ時間に前記患者に放出される。
【０１１１】
−治療を必要とする患者へのＡおよび治療薬（単数または複数）のそのような併用の実質的同時投与、この場合そのような成分は、実質的に同じ時間に前記患者により摂取される別個の剤形中に互いに分けて製剤化され、その場合前記成分は実質的に同じ時間に前記患者に放出される
−治療を必要とする患者へのＡおよび治療薬（単数または複数）のそのような併用の連続投与、この場合そのような成分は、各投与間に有意な時間間隔をおいて前記患者により連続した時間に摂取される別個の剤形中に互いに分けて製剤化され、その場合前記成分は実質的に異なる時間に前記患者に放出される；そして
−治療を必要とする患者へのＡおよび治療薬（単数または複数）のそのような併用の連続投与、この場合そのような成分は、コントロールされた様式で前記成分を放出する１つの剤形中に合剤化され、その場合これらの成分は、前記患者により同じおよび/または異なる時間に、同時に、連続して、および/または重複して投与される。
【０１１２】
[00113]Ａと併用して使用してよいその他の治療薬、それらの医薬的に受容可能な塩および/またはそれらの誘導体の形の適切な例は、以下を含むが決してこれらに限定されることはない：アロマターゼ阻害薬  例えばエキセメスタン、フォルメスタン、アタメスタン、ファドロゾール、レトロゾール、ボロゾール、およびアナストロゾール；フィブリン酸誘導体（例えばフェノフィブレート、クロフィブレート、ゲミフィブロジル、ベザシブレートおよびシプロフィブレート）およびニコチン酸誘導体  例えばアシピモックスを含む脂肪酸の調節薬；ビグアニド剤  例えばメトホルミンを含むがこれに限定されないインスリン抵抗性改善薬、ＰＰＡＲガンマインスリン抵抗性改善薬、およびチアゾロデニオン剤(thiazolodeniones)  例えばトログリタゾンおよびロシグリタゾン、トログリタゾン、５−[[４−[３,４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２,５,７,８−テトラメチル−２Ｈ−]−ベンゾピラン−２−イル)メトキシ]フェニル]メチル３−２,４−チアゾリジネジオン Ｖ４１１(ＤＩＡＢＩＩ, Glaucanin)、ピグオリタゾン(ＡＣＴＯＳ、ＡＤ  ４８３３、Ｕ  ７２１０７、Ｕ  ７２１０７Ａ、Ｕ  ７２１０７Ｅ、ＺＡＣＴＯＳ)化学名：２,４−チアゾリジネジオン、５−[[４−[２−(５−エチル−２−ピリジル)エトキシ]フェニル]メチル]−、一塩酸塩、(ａ/−)；ロシグリタゾン(Avandia,ＢＲＬ  ４９６５３, ＢＲＬ  ４９６５３Ｃ) 化学名：２,４チアゾリジネジオン、５−[[４−[２−(メチル−２−ピリジニルアミノ)エトキシ]フェニル]メチル];２５ベキサロテン−経口(ＬＧＤ  １０６９  経口、ターグレチン(Targretin)  経口、ターグレチン、ターグレチン(Targretyn)  経口、ターグレキシン(Targrexin)  経口)化学名： ４−[１−(３,５,５,８,８−ペンタメチル−５,６,７,８−テトラヒドロ−２−ナフチル)エチル]安息香酸； ＺＤ  ２０７９、(ＩＣＩ  Ｄ  ２０７９)  (化学名: Ｒ)−Ｎ−[２−４−(カルボキシメチル)３０フェノキシ]エチル)−Ｎ−(２−ヒドロキシ−２−フェネチル)塩化アンモニウム：ネトグリタゾン、(イサグリタゾン(Isaglitazone)、ＭＣＣ  ５５５、ＲＷＪ  ２４１９４７) (化学名：５−[６(２−フルオロベンジルオキシ)ナフタレン−２−イルメチル]チアゾリジン−２,４−ジオン)；ＩＮＳ(Ｄ−キロ-イノシトール) (化学名：Ｄ−１,２,３,４,５,６−ヘキササヒドロキシシクロヘキサン)、ＯＮ  ２３４４(ＤＲＦ  ２５９３)；デキスリポタム(Dexlipotam)、化学名：５(Ｒ)−(１,２−ジチオラン−３−イル) pentaloic ３５ acid; ＨＱＬ  ９７５、化学名：３−[４− [２−(５−メチル−２−フェニルオキサゾル−４−イル)エトキシ]フェニル]−２(Ｓ)−(プロピオルアミノ)プロピオン酸；ＹＭ  ２６８、化学名：５,５’−メチレン−ビス(１,４−フェニレン)ビスメチレンビス(チアゾリジン−２,４−ジオン)。開発中のＩ  ＰＰＡＲアゴニストは以下を含む：レグリタザル(ＪＴＴ  ５０１、ＰＮＵ  １８２７１６、ＰＮＵ  ７１６) (化学名：イソキサゾリジエン−３,５−ジオン、ｉ ４−[[４−(２−フェニル−５−メチル)−１,３−オキサゾリル]エトキシフェニル−４]メチル−、 (４ＲＳ)); Ｉ(ＲＰ ２９７、化学名：１０  ５−(２,４−ジオキソチアゾリジン−５−イルメチル)−２−メトキシ−Ｎ−[４−(トリフルオロメチル)ベンジルベンズアミド；Ｒ  １１９７０２(ＣＩ  １０３７、���Ｓ  ０１１)  化学名：(/−)−５−[４−(５−メトキシ−１Ｈベンゾイミダゾル−２−イルメトキシ)ベンジル]チアゾリン−２,４−ジオン；塩酸塩； １５  ＤＲＦ  ２１８９、化学名：５−[[４−[２−(１−インドリル)エトキシ]フェニル]メチル]チアゾリジン−２,４−ジオン；コルチゾル合成阻害薬、例えばケトコナゾール、エコナゾールまたはミコナゾール；成長ホルモン、例えばソマトロピンまたはソマトノルム、およびそれらの誘導体、例えばヒト成長ホルモン融合タンパク質  例えばＡＬＢＵＴＲＯＰＩＮ；ポリエチレングリコール成長ホルモン  例えばシステイン−ペグ化成長ホルモン、ＢＴ  ００５(Bolder BioTechnology Inc.)；成長ホルモン分泌促進薬、例えばＳＭ  １３０６８６(Sumitomo)、カプロモレリン(capromorelin)(Pfizer)、メカセルミン (Fujisawa)、セルモレリン(Salk Institute, Bio-Technology General)、ソマトレム、ソマトメジン(C Llorente; Pharmacia Corporation)、エキサモレリン(examorelin)、タビモレリン(tabimorelin)；ＣＰ  ４６４７０９(Pfizer)、ＬＹ ４２６４１０および ＬＹ ４４４７１１(Lilly)；ＷＯ２００２０５７２４１に開示されているような 8-(アミノアルコキシイミノ)−８Ｈ−ジベンゾ[ａ,ｅ]トリアゾロ [４,５−ｃ]シクロヘプテン類、ＷＯ２００２０５６８７３に開示されているような２−置換ジベンゾ[ａ,ｅ]１,２,３−トリアゾロ[４,５−ｃ][７]アヌレン−８−オン類、米国特許第４，４１１，８９０号および公開広報  ＷＯ  ８９／０７１１０、ＷＯ  ８９／０７１１１に記載されているような成長ホルモン放出ペプチド  ＧＨＲＰ−６およびＧＨＲＰ−１、ＷＯ  ９３／０４０８１に記載されているようなＢ−ＨＴ９２０、ヘキサレリンおよびＧＨＲＰ−２、または成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ、またはＧＲＦともいう）およびその類似体、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２を含むソマトメジン、およびそれらの誘導体  例えばソマトカイン−すなわちインスリン様成長因子−１およびその結合タンパク質であるＢＰ−３の組み換え融合体、アルファ−２−アドレナリン作用性アゴニスト  例えばクロニジン、キシラジン、デトミジンおよびメデトミジン、またはセレトニン５ＨＴＩＤアゴニスト  例えばスルニトリプタン(surnitriptan)、またはソマトスタチンまたはその放出を阻害する物質  例えばフィソスチグミンおよびピリドスチグミン、ＴｈＧＲＦ  １−４４(Theratechnologies)；Ｌ １６５１６６ (Merck & Company)；ＷＯ９８５８９４７に記載されているようなジペプチド誘導体、ジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害薬  例えばＵＳ６５２１６４４、ＷＯ９５/１５３０９およびＷＯ９８/１９９９８に記載されているようなアミノ−アシルピロリジンニトリル；ベータ−アミノ複素環式ジペプチジルペプチダーゼ阻害薬  例えばＵＳ２００３０１００５６３およびＷＯ２００３０８２８１７に記載されているもの； ＵＳ２００３００５５２６１、ＵＳ２００３００４０４８３、ＥＰ １８ ０７２、ＥＰ ８３ ８６４、ＷＯ  ８９/０７１１０、ＷＯ  ８９/０１７１１、ＷＯ  ８９/１０９３３、ＷＯ  ８８/９７８０、ＷＯ  ８３/０２２７２、ＷＯ  ９１/１８０１６、ＷＯ  ９２/０１７１１、ＷＯ  ９３/０４０８１、ＷＯ  ９５１４６６６、ＥＰ０９２３５３９、米国特許第５，２０６，２３５号、５，２８３，２４１号、５，２８４，８４１号、５��３１０，７３７号、５，３１７，０１７号、５，３７４，７２１号、５，４３０，１４４号、５，４３４，２６１号、５，４３８，１３６号、５，４９４，９１９号、５，４９４,９２０号、５，４９２，９１６号、５，５３６，７１６号、および５，５７８，５９３号、ＷＯ  ９４/１３６９６、ＷＯ  ９４/１９３６７、ＷＯ  ９５/０３２８９、ＷＯ  ９５/０３２９０、ＷＯ  ９５/０９６３３、ＷＯ  ９５/１１０２９、ＷＯ  ９５/１２５９８、ＷＯ  ９５/１３０６９、ＷＯ  ９５/１４６６６、ＷＯ  ９５/１６６７５、ＷＯ  ９５/１６６９２、ＷＯ  ９５/１７４２２、ＷＯ  ９５/１７４２３、ＷＯ  ９５/３４３１１、およびＷＯ  ９６/０２５３０に記載されているような成長ホルモン放出化合物、ＵＳ５８０４５７８、ＵＳ５７８３５８２、ＷＯ２００４００７４６８に記載されているようなピペリジン、ピロリジンおよびヘキサヒドロ−１Ｈ−アジピン、アミドスピロピペリジン、例えばＷＯ０１０４１１９に記載されているもの、ＵＳ６３２９３８３に記載されているような２−[(５,６-ジメチル−２−ベンゾイミダゾリル)アミノ]−４−ヒドロキシ−６−メチル−５−ピリミジン酢酸(２)および２−[(５,６−ジメチル−２−ベンゾイミダゾリル)アミノ]−４−ヒドロキシ−６−メチル−５−ピリミジン酢酸、エチルエステルを含む２−アミノ−５−ピリミジン酢酸化合物、ＥＰ１１５５０１４に記載されているようなベンゾイミダゾール、米国特許４，４１１，８９０のＧＲＦに関するペプチジル化合物類似体およびペプチド、ゴナドトロピン放出ホルモンのアンタゴニスト  例えばＷＯ０１７０２２８、ＷＯ０１７０２２７、ＷＯ０１７０２２８、ＷＯ００６９４３３、ＷＯ０００４０１３、Ｗ０９９５１５６、ＷＯ９９５１５９５、ＷＯ９９５１２３１−４、ＷＯ９９４１２５１−２、ＷＯ９９２１５５７、ＷＯ９９２１５５３に記載されているのもの、およびＷＯ００５３６０２、ＷＯ００５３１８５、ＷＯ００５３１８１、ＷＯ００５３１８０、ＷＯ００５３１７９、ＷＯ００５３１７８、ＵＳ６２８８０７８に記載されているような６−アザインドール化合物；ＩＧＦ−１分泌促進薬；インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２またはソマトメジンＡ）およびＩＧＦ−２分泌促進薬；ミオスタチンアンタゴニストおよび繊維芽細胞成長因子受容体−３（ＦＧＦＲ−３）チロシンキナーゼを阻害する化合物、が挙げられる。
【０１１３】
[00114]含まれるポリマー物質はまた、好ましくは室温で水溶性である。そのようなポリマーの非限定的リストは、ポリ(アルキレン酸化物)ホモポリマー、例えばポリ(エチレングリコール)またはポリ(プロピレングリコール)、ポリ(オキシエチル化ポリオール)、それらのコポリマーおよびそれらのブロックコポリマーを含む、ただしブロックコポリマーの水溶性は維持されるものとする。
【０１１４】
[00115]ＰＥＧを基本とするポリマーに代わるものとして、実際上非抗原性の材料  例えばデキストラン、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(アクリルアミド)、ポリ(ビニルアルコール)、炭化水素を基本とするポリマー、等を使用することができる。実際にこれらのポリマー物質のα末端およびε末端の基の活性化は、ポリ(アルキレン酸化物)を変換するために使用したものと同様の様式で達成することができ、したがって当業者には明らかであろう。当業者は、前述のリストが単に説明のためであり、本明細書に記載した特質を有するすべてのポリマー材が考慮されることを了解するだろう。本発明の目的のため、“実際上非抗原性の”は、哺乳動物において非毒性であり、感知可能な免疫原性応答を起さないものとして当該技術分野において理解されている、すべての材料を意味する。
【０１１５】
（定義）
[00116]以下に略語のリスト、および本明細書において互変姓を持って使用される際の対応する意味を挙げる：
ｇ              グラム（単数または複数）
ｍｇ            ミリグラム（単数または複数）
ｍｌまたはｍＬ  ミリリットル（単数または複数）
ＲＴ            室温
ＰＥＧ          ポリ(エチレングリコール)
[00117]本開示において引用したすべての公開広報、特許、特許出願の全内容を、各々個々の公開広報、特許、特許出願が参照として援用するために具体的に個別に示されているかのように、本明細書において参照として援用する。
【０１１６】
[00118]前述の発明は、理解を明確にする目的で説明および実施例という方法で幾分詳細に記載したが、本発明の精神および範囲から離れずに変更および修飾を行うことができることは、本発明の意図を考慮して、当業者には容易に理解できるだろう。以下の実施例は例示の目的のためのみに提供しており、上術の広範囲の用語にて記載した本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１１７】
[00119]以下の実施例において、ｈＧＨは配列番号１のものである。ｈＧＨまたはそのアゴニスト変異体のポリペプチドのファミリーの他のメンバーもまた、以下の実施例の例示するのと同様の様式でペグ化することができるものと理解される。
【実施例】
【０１１８】
（実施例１）
（分枝鎖の４０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチルアルデヒドｈＧＨ）
【０１１９】
【化４】
2007520544.tif 000005
【０１２０】
[00120]本実施例は、還元的アルキル化によりＮ末端でモノペグ化されたｈＧＨの実質的に均一な調製物の製造のための方法を実証する。およそ４０，０００ＭＷのメトキシ−分枝鎖ＰＥＧ−ブチルアルデヒド試薬(Shearwater Corp.)は、Ｎ末端の第一級アミンのｐＫａ値  対  リジン残基のε−アミノの位置の第一級アミンのｐＫａ値の相対的な差異を利用することにより、ｈＧＨのＮ末端の還元的アミノ化を経て選択的にカップルした。２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)ｐＨ７．０、（所望により２５ｍＭ  ＭＥＳ(Sigma Chemical, St. Louis, MO)ｐＨ６．０、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム(Sigma Chemical, St. Louis, MO)ｐＨ４．５）中に１０ｍｇ/ｍＬで溶かしたｈＧＨタンパク質をメトキシ−ＰＥＧ−ブチルアルデヒドと反応させ、またＭ−ＰＥＧ−ＡＬＤ(Shearwater Corp., Huntsville, AL)を添加することにより、Ｍ−ＰＥＧ−ＡＬＤと反応させ、相対的ＰＥＧ：ｈＧＨモル比  ２：１を得た。反応は、Ｈ２Ｏ中に溶かしたストック１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ４(Sigma Chemical, St. Louis, MO)を最終濃度１０−５０ｍＭまで添加することにより触媒とした。反応は、暗所、室温で１８−２４時間行った。１Ｍ  Ｔｒｉｓ(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 〜ｐＨ７．６を、５０ｍＭの最終Ｔｒｉｓ濃度となるように添加することにより、または直後の精製用の適当なバッファー中に希釈することにより、反応を停止させた。
【０１２１】
[00121]表１は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定された、４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−アルデヒドおよび４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ブチルアルデヒドに関する、多重にペグ化された種、モノペグ化コンジュゲート、未反応のＰＥＧの比率（パーセント）、および最終生成物の収率を示す。ＰＥＧ−ブチルアルデヒドはＰＥＧ−アルデヒドに比して、増加したモノペグ化コンジュゲート、減少したレベルの未反応のＰＥＧ、および増加した最終収率という結果を得られる。
【０１２２】
【表１】
2007520544.tif 000006
【０１２３】
（実施例２）
（直鎖状３０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチリルアルデヒドｈＧＨ）
[00122]メトキシ−直鎖状３０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチリルアルデヒド試薬を、実施例１に記載した方法を用いてｈＧＨのＮ末端にカップルさせる。
【０１２４】
（実施例３）
（直鎖状２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチリルアルデヒドｈＧＨ）
[00123]メトキシ−直鎖状２０，０００ＭＷ  ＰＥＧ−ブチリルアルデヒド試薬を、実施例１に記載した方法を用いてｈＧＨのＮ末端にカップルさせる。
【０１２５】
（実施例４）
（ペグ化ｈＧＨの精製）
[00124]ペグ化ｈＧＨ種を、１回のイオン交換クロマトグラフィーのステップを用いて、反応混合液から＞９５％（ＳＥＣ分析）に精製した。
【０１２６】
（陰イオン交換クロマトグラフィー）
[00125]ペグ化ｈＧＨ種を、１回の陰イオン交換クロマトグラフィーのステップを用いて、反応混合液から＞９５％（ＳＥＣ分析）に精製した。モノペグ化ｈＧＨを、未修飾のｈＧＨ、および多重にペグ化されたｈＧＨ種から、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。典型的な２０ＫブチリルアルデヒドｈＧＨ反応混合液（５−１００ｍｇタンパク質）を、上に記載したように、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ  ７．３(バッファーＡ)にて平衡化したQ-Sepharose Hitrap カラム(１もしくは５ｍＬ)(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)、または Q-Sepharose fast flow カラム(２６/２０、７０ｍＬベッド容積)(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上で精製した。反応混合液はバッファーＡで５−１０倍に希釈し、２．５ｍＬ/分の流速でカラムにかけた。カラムは、カラム容積の８倍量のバッファーＡで洗浄した。その後様々なｈＧＨ種を、カラム容積の８０−１００倍量のバッファーＡ、および０−１００ｍＭ  直線的ＮａＣｌの濃度勾配にて、溶出させた。溶出液は２８０ｎｍ（Ａ２８０）の吸光度によりモニターし、５ｍＬの分画にて集めた。分画を、（実施例１５で評価するように）ペグ化の程度、例えばモノ、ジ、トリ、等としてプールした。次にプール溶液をCentriprep YM10 濃縮装置(Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA)にて０．５−５ｍｇ/ｍＬに濃縮した。プール溶液のタンパク質濃度をＡ２８０により吸光係数  ０．７８を用いて決定した。
【０１２７】
（陽イオン交換クロマトグラフィー）
[00126]陽イオン交換クロマトグラフィーは、１０  ｍＭ  酢酸ナトリウム  ｐＨ ４．０(バッファーＢ)にて平衡化した、ＳＰ Sepharose高速(high performance)カラム(Pharmacia XK 26/20, ７０ｍｌ  ベッド容積)で行った。反応混合液はバッファーＢで１０倍に希釈し、５ｍＬ/分の流速でカラムにかけた。次にカラム容積の５倍量のバッファーＢで、続いてカラム容積の５倍量の１２％バッファーＣ（１０ｍＭ  酢酸バッファー  ｐＨ４．５、１Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。その後、ＰＥＧ−ｈＧＨ種をカラム容積の２０倍量の１２から２７％  バッファーＣの直線的濃度勾配にてカラムより溶出させた。溶出液は２８０ｎｍでモニターし、１０ｍＬの分画にて集めた。分画を、ペグ化の程度（モノ、ジ、トリ、等）に従ってプールし、１０ｍＭ  酢酸塩  ｐＨ４．５バッファーに交換し、Amicon YM10膜をセットした攪拌セル中で１−５ｍｇ/ｍＬに濃縮した。プール溶液のタンパク質濃度はＡ２８０により吸光係数  ０．７８を用いて決定する。
【０１２８】
（実施例５）
（生化学的特徴づけ）
[00127]精製したペグ化ｈＧＨのプール溶液を、非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、非変性サイズ排除クロマトグラフィー、およびペプチドマッピングにより特徴づけを行った。
【０１２９】
（サイズ排除高速液体クロマトグラフィー）（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
（非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
[00128]様々な結合化学、サイズ、リンカーおよび幾何学的構造のメトキシ−ＰＥＧと、ｈＧＨとの反応、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製プール溶液、ならびに最終精製物を、非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて評価した。分析的な非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、カラム、Superdex  ２００  ７．８ｍｍ×３０ｃｍ (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ)のカラムを用いて、２０ｍＭ  リン酸バッファー  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で、流速０．５ｍＬ/分（所望によりTosohaas G4000PWXL Amersham Bioscience, Piscataway, NJ）にて行った。ペグ化は、より早い保持時間へのシフトに至るタンパク質の流体力学的容積を大きく増加させる。新しい種は、未修飾ｈＧＨと共にＰＥＧアルデヒドｈＧＨ反応混合物中に観察された。これらのペグ化された種およびペグ化されていない種を、Ｑ−Sepharoseクロマトグラフィー上で分離し、その結果得られた精製モノＰＥＧ−アルデヒドｈＧＨ種は、その後非変性ＳＥＣで1本のピークとして溶出されることが示された（＞９５％  純度）。Ｑ−Sepharoseクロマトグラフィーのステップは、フリーのＰＥＧ、ｈＧＨ、および多重にペグ化されたｈＧＨ種を、モノペグ化ｈＧＨから効果的に除去した。
【０１３０】
（変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
[00129]ブチリルアルデヒドポリエチレングリコールのｈＧＨとの反応、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製、および最終精製物を、変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて評価する。分析的な変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、Tosohaas 3000SWXL カラム  ７．８ｍｍ×３０ｃｍ (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)を用いて、１００ｍＭ  リン酸バッファー  ｐＨ６．８、０．１％  ＳＤＳ中で、流速  ０．８ｍＬ/分にて行った。ペグ化はタンパク質の流体力学的容積を大きく増加させ、より早い保持時間へと変化させる。ペグ化された種およびペグ化されていない種を、Ｑ−Sepharoseクロマトグラフィー上で分離する。
【０１３１】
（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ/ＰＶＤＦ転写）
[00130]ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ＰＥＧブチリルアルデヒドのｈＧＨとの反応、および精製最終生成物を評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１ｍｍ厚の１０−２０％  Trisトリシンゲル(Invitrogen, Carlsbad, CA)上で、還元的条件および非還元的条件下で行い、Novex Colloidal Coomassie（登録商標） G-250 染色キット(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて染色した。バンドは、その後のＮ末端配列の同定のためＰＶＤＦ膜上にブロットする。
【０１３２】
（分析的な陰イオン交換ＨＰＬＣ）
[00131]ＰＥＧブチリルアルデヒド/ｈＧＨ反応混合液、陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製分画、および最終精製物を、分析的な陰イオン交換ＨＰＬＣを用いて評価した。分析的な陰イオン交換ＨＰＬＣは、Tosohaas Ｑ５ＰＷまたはＤＥＡＥ−ＰＷ  陰イオン交換カラム、７．５ｍｍ×７５ｍｍ (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) を用いて、５０ ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐｈ ８．６中で、流速  １ｍＬ/分にて行った。サンプルは５−２００ｍＭ  ＮａＣｌの直線勾配にて溶出させた。
【０１３３】
（Ｎ末端の配列およびペプチドマッピング）
[00132]自動化エドマン分解化学を用いて、ＮＨ２−末端のタンパク質配列を決定した。Applied Biosystems Model 494 Procise シーケンサ(Perkin Elmer, Wellesley, MA)を分解に使用した。各ＲＴＨ−ＡＡ誘導体は、Perkin Elmer/Brownlee 2.1 mm 内径  ＰＴＨ−Ｃ１８カラムに接続したApplied Biosystems Model 140C PTH アナライザを使用するオンライン様式のＲＰ−ＨＰＬＣ分析により同定した。
【０１３４】
[00133] トリプシン消化は１ｍｇ/ｍＬの材料の濃度で行い、典型的には５０μｇの材料を１回の消化に使用した。トリプシンは、トリプシン  対  ＰＥＧ−ｈＧＨ比が１：３０（ｗ/ｗ）となるように加えた。Ｔｒｉｓバッファーは３０ｍＭ、ｐＨ７．５とする。サンプルを室温で１６±０．５時間インキュベーションした。反応は、消化溶液１ｍＬ当たり１Ｎ  ＨＣｌ  ５０μＬを加えて停止させた。自動サンプル測定器にサンプルを設置する前に、６．２５％  アセトニトリル中に最終濃度  ０．２５ｍｇ/ｍｌとなるようにサンプルを希釈した。アセトニトリルを最初に（１９．８％  アセトニトリルとなるように）加え、緩やかに混合した後、水を最終容積（出発容積の４倍量）になるように加えた。余分の消化溶液を取り出し、１週間まで−２０℃で保存してもよい。
【０１３５】
[00134]分析にはWaters Alliance 2695 ＨＰＬＣシステムを使用したが、他のシステムでも同様の結果が得られるはずである。使用したカラムは、５μｍ粒度のAstec C-4 ポリマーの２５ｃｍ×４．６ｍｍカラムであった。実験は周囲温度で、１回のサンプル当たり典型的には５０μｇのタンパク質をカラムにかけた。バッファーＡは水中の０．１％  トリフルオロ酢酸であり；バッファーＢはアセトニトリル中の０．０８５％トリフルオロ酢酸である。勾配は以下のとおりとした：
【０１３６】
【表２】
2007520544.tif 000007
【０１３７】
[00135]カラムを、ヒートジャケットを使用して４０℃に加熱する。ピークはWaters 996 PDA検出器を使用して検出し、２１０および３００ｎｍ間のデータを集積した。得られた２１４ｎｍのクロマトグラムをサンプルの分析用に使用した。
【０１３８】
[00136]トリプシンによるマッピングを、ｈＧＨ、４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−アルデヒド、および４０Ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ブチリルアルデヒドについて行った（図１）。Ｎ末端のトリプシンによるフラグメントをＴ−１とした。非ペグ化ｈＧＨと比較してのＴ−１の存在の比率（パーセント）を、表２に示す。このデータは、ＰＥＧ−ブチリルアルデヒドの使用によるＮ末端での９８％より多くのＰＥＧ修飾と比較して、ＰＥＧ−アルデヒドを使用すると、ＰＥＧ修飾の９０％がＮ末端にあり、残りは明らかにいくつかの可能なリジン残基の１つと連結していることを示唆する。
【０１３９】
【表３】
2007520544.tif 000008
【０１４０】
（実施例６）
（薬物動態学的試験）
（ラットの体重増量）
[00137]Taconic Labsにて下垂体切除した雌Sprague Dawleyラットを、７から１１日間成長速度についてプレスクリーニングした。ラットは８群に分けた。１群は、毎日、または第０日および第６日のいずれかにビヒクルの皮下投与を行ったラットから成る。２群は、毎日ＧＨ（３０μｇ/ラット/用量）の皮下投与を行った。３群は、第０日および第６日にＧＨ（１８０μｇ/ラット/用量）の皮下投与を行った。４群は、第０日および第６日に４０ｋ分枝鎖ＰＥＧ−ブチリルアルデヒドｈＧＨ（１８０μｇ/ラット/用量）の皮下投与を行った。下垂体切除したラットは、試験中、少なくとも隔日に体重測定により体重の増量をモニターした。図３および図４。
【０１４１】
（ラットの頸骨の長さ）
[00138]１１日間体重増量試験の動物を第１１日に屠殺し、左側頸骨を切除し、Ｘ線照射し、ノギスを用いて骨長を測定した。図５。
【０１４２】
（ＩＧＦ−１試験）
[00139]６日間体重増量試験の動物を使用した。血液サンプルは試験中の様々な時間に採血し、血清ＩＧＦ−１レベルをＥＬＩＳＡにより決定した。図６。
【０１４３】
（血清生化学試験）
[00140]１１日間体重増量試験の動物を使用して、表３に示すように、第０日および第６日の１．８ｍｇ/ｋｇの累積的投与後、第７日に血清生化学値を評価した。
【０１４４】
【表４】
2007520544.tif 000009
【０１４５】
[00141]第１１日の血液尿素窒素濃度は、ｈＧＨ処置およびＰＨＡ−７９４４２８処置した動物において、ビヒクル群と比較して同程度まで有意に（ｐ＜０．１０）減少した。このことは、高められた成長の間の新たなタンパク質合成の結果としての増加した窒素の利用を示す。
【０１４６】
（薬物動態学的試験）
[00142]薬物動態学的試験を、正常な、カテーテル挿入した雄Sprague Dawleyラットで行った。注入は、１群当たり６頭のラットを用いて、１００μｇ/ｋｇ/ラットのＧＨまたはＰＥＧ−ＧＨの単回皮下ボーラス投与として行った。血液サンプルは、関連するＰＫパラメータの評価に適当なように１日から５日間にわたり採取した。ＧＨおよびＰＥＧ−ＧＨの血液レベルを、各サンプリングについてイムノアッセイによりモニターした。
【０１４７】
（ｈＧＨイムノアッセイ）
[00143]マウスおよびカニクイザル(cynomolgus monkey)の血漿中のｈＧＨおよびペグ化ｈＧＨのタンパク質濃度レベルを、ｈＧＨ  AutoDELFIAキット蛍光イムノアッセイ(PerkinElmer)を用いて決定した。ラットおよびヒトのＩＧＦ−１レベルを、イムノアッセイキット(Diagnostic System Laboratories)によりモニターした。
【０１４８】
（ヒト以外の霊長類における実施例１のｈＧＨ−ＰＥＧコンジュゲートに関する非コンパートメント薬物動態学的特性）
[00144]実施例１のｈＧＨ−ＰＥＧコンジュゲートをカニクイザルに、０．１８ｍｇ/ｋｇ  静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）のボーラス注射として投与した（表４）。ＰＫパラメータはｎ＝３の動物のデータの平均値を用いて決定した。血漿濃度は、AutoDELFIAキット蛍光イムノアッセイ(PerkinElmer)、およびＰＥＧ−ＧＨコンジュゲートについて予め決定しておいた標準曲線を用いて測定した。
【０１４９】
【表５】
2007520544.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】[0035]図１は、ｈＧＨおよび４０Ｋ分枝鎖ブチリルアルデヒドｈＧＨまたは４０Ｋ分枝鎖アルデヒドｈＧＨの反応の、トリプシンマップ分析のＨＰＬＣ曲線である。上のパネルは、４０Ｋ分枝鎖ブチリルアルデヒドｈＧＨのトリプシンによるマッピングである。真ん中のパネルは、４０Ｋ分枝鎖アルデヒドｈＧＨのトリプシンによるマッピングである。下のパネルは非ペグ化ｈＧＨのトリプシンによるマッピングである。Ｔ１はＮ末端のトリプシンによるフラグメントである。
【図２】[0036]図２は、ヒト成長ホルモンのアミノ酸配列を示す（配列番号１）。
【図３】[0037]図３は、ラットの体重増量アッセイにおける４０Ｋ分枝鎖ブチルアルデヒドｈＧＨの効能を示す。下垂体切除した雌Sprague-Dawleyラットを４−５週齢（１００−１２５ｇ）でHarlan Labsより購入した。動物用ケージに入れて、動物を８０°Ｆの一定の室温に維持し、ラットのベースラインの成長を確立するため、４−１０日間毎日体重測定した。第０日に開始し、その後コントロール群のラット（〜１００ｇ）に毎日〜０．３ｍｇ/ｋｇ  ｈＧＨ（黒丸）、またはＰＢＳ（白丸）の皮下注射を、１１日間連続して行った。４０Ｋ分枝鎖ブチルアルデヒドｈＧＨ検査群（黒四角）には第０日および６日に、１．８ｍｇ/ｋｇのＰＨＡ−７９４４２８を各々単回投与した。各群８−１０頭の動物とした。平均の成長＋/−ＳＥＭをプロットした。
【図４】[0038]図４は、ラットにおける４０Ｋ分枝鎖ブチルアルデヒドｈＧＨの用量に応答した成長促進効果を示す。この効能試験は、４０Ｋ分枝鎖ブチルアルデヒドｈＧＨの様々な単回用量を投与したこと（第０日のみ）、および試験を６日間追跡したことを除いて、図３に記載したものと同様の様式で行った。コントロール群は、０．３ｍｇ/ｋｇ  ｈＧＨ（黒丸）、またはＰＢＳ（白丸）のいずれかの１日１回の注射を、６日間連続投与した。４０Ｋ分枝鎖ブチリルアルデヒドｈＧＨは、１．８ｍｇ/ｋｇ（黒四角）、０．６ｍｇ/ｋｇ（白四角）、０．２ｍｇ/ｋｇ（黒三角）、または０．０６７ｍｇ/ｋｇ（白三角）にて投与した。各群８頭の動物とした
【図５】[0039]図５は、４０Ｋ分枝鎖ブチルアルデヒドｈＧＨに応答した頚骨の成長を示す。下垂体切除したラットを図３に記載したように処置した。第１１日に動物を屠殺し、左側頸骨を切除し、Ｘ線照射し、ノギスを用いて骨長を測定した。平均の長さ＋/−ＳＥＭをプロットする。星印はコントロール群との有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図６】[0040]図６は、６日間効能試験に関する血漿ＩＧＦ−１レベルを示す。動物は図４に記載したように処置した。血液サンプルを様々な時間に採取し、ＥＬＩＳＡにより血清ＩＧＦ−１レベルを決定した。プロットは平均＋/−ＳＥＭである。
【図１】
2007520544.tif 000013
【図２】
2007520544.tif 000014
【図３】
2007520544.tif 000015
【図４】
2007520544.tif 000016
【図５】
2007520544.tif 000017
【図６】
2007520544.tif 000018
【配列表】
2007520544000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月28日(2006.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉまたは式ＩＩの構造を有する、ポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨ：
【化１】
2007520544.tif 000021
[式中
ｎは１および１０の間の整数である；
ｍは１および１０の間の整数である；
Ｒはヒト成長ホルモン、またはメチオニル成長ホルモンである]
を含む、医薬。
【請求項２】
式Ｉまたは式ＩＩの構造を有する、ポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨ：
【化２】
2007520544.tif 000022
[式中
ｎは１および１０の間の整数である；
ｍは１および１０の間の整数である；
Ｒはヒト成長ホルモン、またはメチオニル成長ホルモンである]
を、単独でまたは別の治療薬と組合わせて含む、成長ホルモンの使用が有益である疾患または障害の予防および/または治療のための医薬であって、ここで前記疾患または障害が、成長ホルモン分泌不全症（ＧＨＤ）、成人成長ホルモン分泌不全症（ａＧＨＤ）、ターナー症候群、在胎期間に対して低身長で生まれた小児における成長不全（ＳＧＡ）、プラダーウィリー症候群（ＰＷＳ）、慢性腎不全（ＣＲＩ）、外傷性脳傷害、クモ膜下出血、Noonan症候群、特発性低身長症（ＩＳＳ）、超低出生体重児（ＶＬＢＷ）、小児のグルココルチコイド治療に起因する低身長、および未熟児の低身長のキャッチアップ成長不全、から成る群より選択される、前記医薬。
【請求項３】
ＧＨの使用が有益である前記疾患または障害が、ＧＨＤ、ａＧＨＤ、ターナー症候群、ＳＧＡ、ＰＷＳ、ＣＲＩ、およびＩＳＳから成る群より選択される、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
ｎが４に等しく、ｍが３に等しい、請求項１から３のいずれかに記載の医薬。
【請求項５】
前記のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨが、ｎが４に等しく、ｍが３に等しい式Ｉの構造を有する、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
前記ヒト成長ホルモンが配列番号１のアミノ酸配列を包含する、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項７】
前記ポリエチレングリコールの９０％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンにコンジュゲート化する、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
前記ポリエチレングリコールの９５％より多くが、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ末端のフェニルアラニンにコンジュゲート化する、請求項７に記載の医薬。
【請求項９】
各ｍＰＥＧが約２０ｋＤａの分子量を有する、請求項１または２に記載の医薬。
【請求項１０】
別の治療薬、および少なくとも１つの医薬的に受容可能な担体と組み合わせての、式Ｉまたは式ＩＩのヒト成長ホルモン−ＰＥＧコンジュゲート：
【化３】
2007520544.tif 000023
[式中
ｎは１および１０の間の整数である；
ｍは１および１０の間の整数である；
Ｒはヒト成長ホルモン、またはメチオニル成長ホルモンである]
を包含する組成物。
【請求項１１】
前記のポリ(エチレングリコール)修飾されたｈＧＨが、ｎが４に等しく、ｍが３に等しい式Ｉの構造を有する、請求項１０に記載の組成物。
【国際調査報告】
2007520544.tif 000024
2007520544.tif 000025