(57)【要約】  P. cariniiによる感染は、状況に応じて抗生物質のような追加の治療薬と併用して、メチオニナーゼを投与することによって治療することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてPneumocystis carinii（P. carinii）感染を治療する方法であって、
そうした治療を必要とする被験体に、当該被験体の血中メチオニンレベルを低下させ、当該感染を治療するのに有効な量のメチオニナーゼ（METアーゼ）を投与することを含んでなる前記方法。
【請求項２】
メチオニナーゼが組換えによって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
メチオニナーゼがポリマーと結合している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
メチオニナーゼが、Pseudomonas putidaのゲノムによってコードされるメチオニナーゼである、請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
前記被験体に有効量の追加の治療薬を投与することをさらに包含する、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記治療薬が抗生物質である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗生物質が、ペンタミジンである、またはトリメトプリムおよびスルファメトキサゾールの組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記メチオニナーゼおよび治療薬が実質的に同時に投与される、請求項５〜７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
被験体においてP. carinii感染を治療する医薬組成物であって、前記感染の治療に有効な投薬量のメチオニナーゼを、少なくとも１つの製薬上許容される賦形剤と組み合わせて含んでなる、前記医薬組成物。
【請求項１０】
メチオニナーゼが組換えによって作製される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
メチオニナーゼがポリマーと結合している、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
メチオニナーゼが、Pseudomonas putidaのゲノムによってコードされるメチオニナーゼである、請求項９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの治療薬をさらに包含する、請求項９〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１４】
治療薬が抗生物質である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗生物質が、ペンタミジンである、またはトリメトプリムおよびスルファメトキサゾールの組み合わせである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
被験体においてP. carinii感染を治療するキットであって、メチオニナーゼを含んでなる組成物、および少なくとも１つの治療薬を含んでなる組成物を、含んでなる前記キット。
【請求項１７】
メチオニナーゼが組換えによって作製される、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
メチオニナーゼがポリマーと結合している、請求項１６または１７に記載のキット。
【請求項１９】
メチオニナーゼが、Pseudomonas putidaのゲノムによってコードされるメチオニナーゼである、請求項１６〜１８のいずれか１つに記載のキット。
【請求項２０】
治療薬が抗生物質である、請求項１６に記載のキット。
【請求項２１】
前記抗生物質が、ペンタミジンである、またはトリメトプリムおよびスルファメトキサゾールの組み合わせである、請求項１６に記載のキット。
【請求項２２】
被験体においてP. carinii感染を治療する薬物を調製するための、メチオニナーゼの使用。
【請求項２３】
メチオニナーゼが組換えによって作製される、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
メチオニナーゼがポリマーと結合している、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
メチオニナーゼが、Pseudomonas putidaのゲノムによってコードされるメチオニナーゼである、請求項２２〜２４のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２６】
前記治療が少なくとも１つの治療薬の投与をさらに包含する、請求項２２〜２５のいずれか１つに記載の使用。
【請求項２７】
治療薬が抗生物質である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
抗生物質が、ペンタミジンである、またはトリメトプリムおよびスルファメトキサゾールの組み合わせである、請求項２７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染、詳細にはPneumocystis cariniiによる感染の治療に関する分野に属する。さらに具体的には、本発明はこのような治療をもたらすさまざまなリアーゼの利用に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許仮出願番号第60/482,047号、2003年6月23日出願、に対して米国特許法第119条(e)項に基づく利益を主張する。この出願の内容は参考として本明細書に含めるものとする。
【背景技術】
【０００３】
P. cariniiは、エイズ患者、化学療法を受けている患者、もしくは免疫抑制剤による治療を受けている移植患者のような、免疫系の低下した人々にカリニ肺炎（PCP）を引き起こす真菌である。最も有効であると思われる、現在使用されている薬物は、ペンタミジン、ならびにトリメトプリムおよびスルファメトキサゾールの併用である。これらの治療は副作用が重く、死亡率は依然として高い。したがって、この病気のための、既存のものに代わるより良い治療法が必要とされている。
【０００４】
P. cariniiの既知の性質は、S-アデノシルメチオニン（AdoMet）を絶対的に要求し、この化合物を合成できないことである。P. cariniiは感染した宿主の血液からこの物質を利用するために取り去ると思われる。Merali, S., et al., J. Biol. Chem. (2000)275: 14958-14963を参照されたい。血液中のメチオニン濃度を激減させることで、血中AdoMetの利用もできなくなり、したがってこの病原体は抑制される。
【０００５】
P. cariniiによるAdoMetの取り込みは、感染のレベル、および感染した被験体におけるAdoMetの血漿レベルの逆相関によって検証される。Skelly, M., et al., Lancet (2003) 361: 1267-1277を参照されたい。このように、血漿中のAdoMetレベルを、この感染の診断法として使用することができる。
【０００６】
メチオニン依存性の腫瘍を治療するためにL-メチオニン-α-脱アミノ-γ-メルカプトメタン リアーゼ（メチオニナーゼ、METアーゼ）を使用すること、組換えMETアーゼを製造すること、ならびに、ポリエチレングリコールのようなポリマーと結合することによって、抗原性を減らし半減期を増すようにMETアーゼを修飾することは、すでに米国特許第6,231,854号; 第6,461,851号; 第5,888,506号; 第5,690,292号; 第5,891,704号; および第5,715,835号に記載されており、これらはいずれも参考として本明細書に含めるものとする。さらに、腫瘍治療のためにメチオニナーゼをコードする遺伝子の発現を利用することが、米国特許第6,524,571号に記載されており、これも参考として本明細書に含めるものとする。本発明により、メチオニナーゼは、状況に応じて追加の抗生物質と併用して、P. carinii感染の抑制に用いられる。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、メチオニナーゼが血中メチオニンレベルを激減させ、それによって感染性寄生体P. cariniiから必須の代謝物であるS-アデノシルメチオニン（AdoMet）を奪うことができる能力を利用する。したがって、ある態様において、本発明は、P. cariniiに感染した、もしくは感染の可能性の高い（曝露された）被験体を治療することを目的とし、その方法は、前記被験体の血中メチオニンレベルの低下、およびそれによるP. carinii感染症の治療もしくは予防に有効な量のメチオニナーゼを、前記被験体に投与することを含んでなる。好ましい実施形態において、メチオニナーゼは、その生物学的半減期が長くなり、抗原性が低下するように、メチオニナーゼをポリマー、もっとも好都合にはポリエチレングリコールと結合することによって修飾される。
【０００８】
別の態様において、本発明は、活性成分として、P. carinii感染の治療に効果のある単位用量のメチオニナーゼを含んでなる医薬組成物に関する。
【０００９】
メチオニナーゼは、この真菌に対して有効であることが知られている他の抗生物質および他の薬物と併用して使用することができる。たとえこうした有効な薬物の多くが重い副作用を有していても、治療過程でメチオニナーゼを使用することによって、前記補助薬の投与量の十分な減少が可能となり、そうした副作用を低減し、または除去することができる。したがって、もう一つの態様において、本発明は、P. cariniiに感染した被験体に、メチオニナーゼおよび少なくとも1つのこの病気の治療に有効な追加の治療薬を同時に、または順次、投与することによって、当該被験体を治療する方法に関する。別の態様において本発明は、メチオニナーゼと追加の薬物、好ましくは抗生物質との組み合わせである組成物またはキットに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の基礎をなすのは、血液および／または細胞におけるメチオニンの枯渇である。メチオニンはP. cariniiが要求するAdoMetの前駆体である。P. cariniiは2つのAdoMetトランスポーターを有し、一方は高親和性（Km, 54.5mM）であり、他方は低親和性（Km, 5,333mM）である。高親和性トランスポーターは、至適pHが7.5であり、関連する天然化合物は取り込みにおいて競合しない。
【００１１】
本発明は、その態様のすべてにおいて、製薬上許容される形態のメチオニナーゼを使用する。ある実施形態において、メチオニナーゼは、上記米国特許に記載の組換え技法によって調製される。ある実施形態において、メチオニナーゼはPseudomonas putidaに由来し、これは172kDのホモテトラマー酵素である。METアーゼは一般に活性のためにピリドキサール5’リン酸（PRP）をコファクターとして要求し、メチオニンの加水分解を触媒してαケト酪酸、メチルメルカプタンおよびアンモニアを生成する。
【００１２】
上記特許に記載の技法を用いて、組換えによって作製されたメチオニナーゼを、高度に精製された実質的にエンドトキシンフリーの状態で提供することができる。記載のように、メチオニナーゼをポリマーと結合させて抗原性を低下させ、血中の半減期を増加させることも有利である。ポリエチレングリコール（PEG）をこの酵素に結合することによって特に好都合な製剤が得られる。
【００１３】
本発明の治療法で使用されるメチオニナーゼは、標準処方Remington’s Pharmaceutical Science、最新版、Mack Publishing Co., Easton, PAに記載のような酵素活性のあるタンパク質に適した剤形で投与され、前記は参考として本明細書に含めるものとする。典型的には、この酵素は、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内などを含めた注射によって投与される。あるいはまた、酵素は経粘膜もしくは経皮的方法によって投与してもよい。適当な剤形が消化管内での分解から酵素を保護することができるならば、経口投与も可能である。
【００１４】
本発明は、メチオニナーゼ組成物、および状況に応じて、抗生物質のような少なくとも1つの追加の治療薬を含有する組成物を含むキットも包含する。典型的には、2つ以上の活性成分が関与する場合には、その成分は別の組成物として別々に包装される。キットにおいて、活性成分組成物は、好ましくは、たとえばすでに薬物の投与を行うのに適したシリンジもしくは他の容器に入れられて、単位投与剤形で包装される。
【００１５】
一般に、製剤の性質は投与方法によって決まる。適当な投与量レベルは、感染症の重篤度、被験体の性質、追加の抗生物質を治療に含めるかどうか、そして最終的には医師の判断によって決まる。メチオニナーゼ投与に適した投与量範囲は、単独で投与する場合、1日当たり典型的な70kgの被験体について0.01mg-500mgの範囲にあり、通例0.1mg-100mgの範囲にある。しかしながら、上記の要因に応じて、この範囲外レベルの投与を行ってもよい。個別の被験体に対する具体的な投与量は、感染のレベル、および／または血中に循環するAdoMetのレベルによって測定される反応を考慮して、通常の最適化によって決定される。治療に適した被験体は、ヒト、霊長類全般、ならびに哺乳類および鳥類被験体を包含する。
【００１６】
治療の成功は、METアーゼによる治療をクリアした時点で、血中のAdoMetレベルを評価することによってモニターすることができる。上記のように、AdoMetの血漿濃度は一般に、肺におけるP. cariniiの数と逆相関の関係にあるので、これによって治療の成功を評価する方法が与えられる（Merali, S., et al., J. Biol. Chem. (2000) 275: 14958-14963, 上記）。しかしながら、治療中はもちろん、血漿中のAdoMetレベルは低下している。
【００１７】
「治療すること」は、感染症の症状を改善すること、被験体における感染性生物の力価を低下させること、または力価レベルの増加を防止すること、もしくは症状が強まることを防止することを意味する。したがって。「治療」は、感染症の進行（もしくは進行しないこと）と関連した、被験体の病気の状態の全般的な改善を包含する。
【００１８】
「有効な量」は、所定のプロトコルにしたがって治療の成功を達成することができる量を意味する。したがって追加の治療薬と共に投与される場合には、有効なメチオニナーゼの量は、メチオニナーゼ単独で投与される場合に有効である量よりも少ないと考えられる。同様に、追加治療薬の有効な量は、メチオニナーゼとともに投与される場合、単独で投与される場合より低い下限値を有すると考えられる。
【００１９】
上記のように、追加の治療薬、一般的には抗生物質と併用してメチオニナーゼを与えることは有利であると思われる。現在知られている有効な薬物には、ペンタミジン、ならびにトリメトプリムおよびスルファメトキサゾールの併用が挙げられる。これらの薬物は明らかに、単独の治療法として用いる場合には問題のある副作用を有するが、しかしながら、メチオニナーゼと併用すれば、必要とされる投与レベルを、許容できる副作用発生率を示すレベルにまで下げることができる。
【００２０】
調製A:
PEG付加メチオニナーゼの調製
メチオニナーゼは、Pseudomonas putidaから単離された、メチオニナーゼをコードするヌクレオチド配列から組換えによって調製し、上記の米国特許第5,891,704号に記載のように精製した。組換えメチオニナーゼに対してさまざまの割合のPEG付加試薬で、精製したメチオニナーゼをメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルグルタレート-500と結合した。Amicon 30K Sentry Prep濃縮装置を用いて、またはSephacryl（商標名）S-300 HRゲル濾過クロマトグラフィーによって、未反応PEGを除去した；未反応METアーゼは、DEAE Sepharose（登録商標）FF陰イオン交換クロマトグラフィーによって除去した。その結果得られたPEG付加組成物を、MALDI-TOF質量分析により分析し、酵素と結合したPEG分子の数を測定した。PEG付加メチオニナーゼをマウスに注射して、半減期および消失期間を測定し、さらに、PEG付加のない組換えMETアーゼと比較して、PEG付加型によって生じるIgGおよびIgM値によって、抗原性を測定した。これらの測定の結果を表1に示す。
【表１】
2007516178.tif 000002
【００２１】
表に示すように、METアーゼ分子当たり8-10分子のPEGを含有するPEG付加産物は、PEGと結合していないMETアーゼと比較して、半減期が20倍増加し、消失期間が10倍増加し、抗原性の低下を示した。30/1の比率で得られた誘導体化産物は、未修飾METアーゼの約70%の酵素活性を有していた。PEG付加によってラットにおける血清半減期が約160分に増加したが、これに対して未修飾METアーゼは80分であり、また、PEG付加型は血清メチオニンレベルを約8時間、<0.1μMに減少させたが、これに対してMETアーゼ自体では2時間であった。マウスに静脈注射したPEG-METアーゼは、腫瘍／血液保持比が、非修飾酵素で1/10であるのに対して約1/6であった。Tan, Y.,et aL, Protein Expression and Purification (1998)12 : 45-52を参照されたい。
【００２２】
ヌードマウスに静脈内投与した後、PEG-METアーゼの分布は、多い方から順に血液：腎臓：肝臓：脾臓：肺：腫瘍：腸：筋肉であった。しかしながら、腫瘍組織中に相当なレベルが蓄積し、60ユニットを注射した1時間後に、ヌードマウスの皮下で増殖させたヒト大腸腫瘍においてレベルは、PEGなしのMETアーゼが0.017ユニット／mgであるのに対して、約0.026ユニット／mgタンパク質であった。Tan, et al., 上記、を参照されたい。さらに、METアーゼのPEG付加は、PRPコファクターの損失を防ぐと思われる。METアーゼおよびPEG付加METアーゼはいずれも、ヌードマウスにおいて、メチオニンの血漿レベルを5μM未満に低下させる。
【００２３】
加えて、マカクザルにおいて、組換えMETアーゼを1,000-4,000 U/kgまでの投与量範囲で単回静脈内投与することによる研究で、血漿メチオニンレベルは30分までには検出不能レベルまで激減し、4時間検出不能な状態であった。4,000 U/kgの投与量で、8時間で血漿メチオニンレベルが1μM未満に激減することが達成された。しかしながら、PEG付加されない組換えMETアーゼは、2.49時間の半減期で急速に排除され、一部の被験体は、反復される高用量レベルに対する免疫応答によって生じるアレルギー反応を示した。METアーゼをポリマーに結合する利点は、こうした結果から明白である。
【００２４】
調製B:
P. cariniiの培養
この細胞を上記のMerali, S. , et al., J. Biol. Chem. (2000) 275: 14958-14963の方法にしたがって培養した。P. carinii細胞は、20%ウマ血清および下記を添加したEarle平衡塩を含む最小必須培地で維持される：プトレシン、ピロリン酸第二鉄、L-システイン、およびグルタミン。3x106個の細胞を、6ウェルプレート中の24-mmコラーゲンコート、膜孔径0.4-mmのTranswellインサート上に載せる。培地2.5mlをインサートより下のウェルに加える。Transwellシステムによって、インサート内の細胞を損なうことなく培地を交換することが可能となる。培地は１日２回交換し、交換ごとに、AdoMet保存液を最終濃度500mMとなるように添加する。培養物を室温で31℃にてインキュベートする。
【００２５】
下記の実施例は、説明のために提供されるのであって、本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００２６】
PCPのラットモデルを、Merali, S., et al.,Antimicrob. Agents Chemother. (1995) 39: 1442-1444の方法にしたがって調製する。無菌Sprague-Dawleyラットはバリアコロニーに入れられ、他の日和見感染を避けるために複数の抗生物質が与えられる。飲料水にデキサメタゾンを添加することによって（1.5mg/l）、ラットは免疫抑制される。
【００２７】
次に、ラットを調製Bで培養したP. cariniiに感染させる。
【００２８】
対照群のラットには、賦形剤のみを与える。テスト群のラットには、さまざまな量のポリエチレングリコールと結合した、さまざまな投与量の組換えMETアーゼを与える。テスト群のラットは、P. carinii感染の症状の軽減を示す。
【国際調査報告】
2007516178.tif 000003
2007516178.tif 000004
2007516178.tif 000005