(57)【要約】【課題】幹細胞からナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）への分化調節用遺伝子を有効成分として含む分化調節剤の提供【解決手段】本発明は、幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節用遺伝子を有効成分として含む細胞分化調節剤に関するものである。より詳細には、幹細胞から前駆ナチュラルキラー細胞への分化調節用遺伝子を有効成分として含む細胞分化調節剤及びＳＡＧＥ分析方法を通じて前記分化調節遺伝子をスクリーニングする方法に関するものである。本発明の遺伝子は、幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化を調節すると知られていない新規遺伝子で、前記遺伝子はＳＡＧＥ分析方法を通じて手軽にスクリーニングすることができ、前記遺伝子を有効成分として含むナチュラルキラー細胞分化調節剤は抗癌剤として有用に使用することができる。【選択図】図４
2007526246.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホメオボックスタンパク質ＭＩＸ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＦ１５４５７，以下ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ）、プレプロ−プロテイナーゼ３（Ｕ９７０７３）、骨髄芽球症（Ｍｙｂ）腫瘍遺伝子（Ｍ１６４９９）、ケラチンコンプレックス１、酸性、遺伝子１３（ＮＭ＿０１０６６２）、ＰＡ−フォスファターゼ関連ホスホエステラーゼ（ＡＫ００２９６６）、γパルビン（ＢＣ０１１２００）、フォークヘッド関連転写因子１Ｃ（ＡＦ３３０１０５）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ５７３０５０１Ｎ２０遺伝子（ＡＫ０１７７４４）、ｃ−ｍｙｃタンパク質（Ｘ０１０２２３）、リボソームタンパク質  Ｌ１０Ａ（ＡＫ００２６１３）、Ｏｃｔ  ２ｂ遺伝子（Ｘ５３６５４）、雄睾丸遺伝子（ＡＫ０１５６０１）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＢＣ００３３６８）、トラクル（Ｕ８１０３０）、ライソザイム（ＢＣ００２０６９）、フェリチンＨ鎖（ＢＣ０１２３１４）、ブレビカン（Ｘ８７０９６）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＢＣ０１９１３５）、ＥＩＡ刺激性遺伝子の細胞抑制剤（ＡＦ０８４５２４）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（ＢＣ０２７６３５）、ＭＰＳ１タンパク質（Ｌ２０３１５）、トランスグルタミナーゼ２（ＢＣ０１６４９２）、血清及びグルココチコイド調節性タンパク質キナーゼ（ＡＦ１３９６３９）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ５８３０４１３Ｌ１９（ＢＣ０２７４９６）、インターフェロン誘導性タンパク質（ＢＣ００３８０４）、乳脂肪球皮膜タンパク質ＥＧＦ因子８（ＢＣ０１８５７７）、細胞表面糖蛋白質ｐ９１（Ｕ８３１７２）、アルギナーゼ  １（ＢＣ０５０００５）、腫瘍壊死因子受容体１（Ｍ５９３７８）、レチノイド誘導性セリンカルボキシペプチダーゼ（ＡＦ３３００５２）、ＦＬＪ１１０００相同体（ＢＣ０２３８０２）、インターロイキン−１８結合タンパク質ｄ前駆体（ＡＦ１１０８０３）、クロライドチャネル７（ＡＫ００９４３５）、ＣＤ３６抗原（ＢＣ０１０２６２）、亜鉛フィンガータンパク質相同体（ＢＣ０３０１８６）、カルボハイドレイト結合タンパク質３５（Ｊ０３７２３）、Ｃ型カルシウム依存性カルボハイドレイト（ＢＣ００３２１８）、リポタンパク質リパーゼ（ＮＭ＿００８５０９）、ｖ−ｍａｆ腱膜線維肉腫腫瘍遺伝子（ＢＣ０３８２５６）、インターロイキン７受容体（ＮＭ＿００８３７２）、キモカイン（Ｃ−Ｃ）受容体１（ＢＣ０１１０９２）、ニューロピリン（ＭＧＤ｜ＭＧＩ：１０６２０６）（ＡＫ００２６７３）、ＳＥＲＰＩＮＡ３Ｇ（ＸＭ＿１２７１３７）、ＧＡＢＡ−Ａ受容体サブユニット６（Ｘ５１９８６）、ＬＡＰＴｍ５（Ｕ５１２３９）、Ｇ−タンパク質シグナル調節剤（ＢＣ０４９９６８）、崩壊促進因子ＧＰＩ固定ｍＲＮＡ（Ｌ４１３６６）、Ｙボックスタンパク質３（ＡＫ０１９４６５）、オステオポンチン前駆体（Ｊ０４８０６）、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質結合ファミリー（ＡＫ０２１３３１）、Ｔ細胞受容体ベータサブユニット類似体（Ｕ６３５４７）、免疫関連ヌクレオチド１（ＢＣ００５５７７）、上流転写因子１（ＮＭ＿００９４８０）、嗅覚受容体ＭＯＲ２６７−７（ＮＭ＿１４６７１４）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｍ１２０５６）、破骨細���腫抑制因子（ＡＢ０１３８９８）、血小板活性受容体相同体（ＢＣ０２４０５４）、ナチュラルキラー細胞タンパク質群２−Ａ１（ＡＦ０１６００８）、未同定のタンパク質ＭＧＣ３６６６２（ＢＣ０２３８５１）、セマフォリン６Ａ前駆体相同体（ＡＫ００４３９０）、ニューロフィラメント相同ポリペプチド（ＢＣ０２５８７２）、コロニン相同アクチン結合タンパク質２Ａ（ＢＣ０２６６３４）、ソルート伝達ファミリー６（ＢＣ０１５２４５）、暫定的プリン受容体Ｐ２Ｙ１０相同体（ＡＫ０２０００１）、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖（Ｘ０３８０２）、ポリＡポリメラーゼアルファ（ＮＭ＿０１１１１２）、ＯＰＡ関連タンパク質ＯＩＰ５類似体（ＡＫ０１７８２５）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１類似体（ＢＣ００６７０８）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を有効成分として含む幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節剤。
【請求項２】
ホメオボックスタンパク質ＭＩＸ（ＡＦ１５４５７）、プレプロ−プロテイナーゼ３（Ｕ９７０７３）、骨髄芽球症（Ｍｙｂ）腫瘍遺伝子（Ｍ１６４９９）、ケラチンコンプレックス  １、酸性、遺伝子１３（ＮＭ＿０１０６６２）、ＰＡ−フォスファターゼ関連ホスホエステラーゼ（ＡＫ００２９６６）、γパルビン（ＢＣ０１１２００）、フォークヘッド関連転写因子１Ｃ（ＡＦ３３０１０５）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ５７３０５０１Ｎ２０遺伝子（ＡＫ０１７７４４）、ｃ−ｍｙｃタンパク質（Ｘ０１０２２３）、リボソームタンパク質  Ｌ１０Ａ（ＡＫ００２６１３）、Ｏｃｔ  ２ｂ遺伝子（Ｘ５３６５４）、雄睾丸遺伝子（ＡＫ０１５６０１）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＢＣ００３３６８）、トラクル（Ｕ８１０３０）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を含む幹細胞から前駆ナチュラルキラー細胞への分化調節剤。
【請求項３】
ライソザイム（ＢＣ００２０６９）、フェリチンＨ鎖（ＢＣ０１２３１４）、ブレビカン（Ｘ８７０９６）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＢＣ０１９１３５）、ＥＩＡ刺激性遺伝子の細胞抑制剤（ＡＦ０８４５２４）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（ＢＣ０２７６３５）、ＭＰＳ１タンパク質（Ｌ２０３１５）、トランスグルタミナーゼ２（ＢＣ０１６４９２）、血清及びグルココチコイド調節性タンパク質キナーゼ（ＡＦ１３９６３９）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ５８３０４１３Ｌ１９（ＢＣ０２７４９６）、インターフェロン誘導性タンパク質（ＢＣ００３８０４）、乳脂肪球皮膜タンパク質ＥＧＦ因子８（ＢＣ０１８５７７）、細胞表面糖蛋白質ｐ９１（Ｕ８３１７２）、アルギナーゼ  １（ＢＣ０５０００５）、腫瘍壊死因子受容体１（Ｍ５９３７８）、レチノイド誘導性セリンカルボキシペプチダーゼ（ＡＦ３３００５２）、ＦＬＪ１１０００相同体（ＢＣ０２３８０２）、インターロイキン−１８結合タンパク質ｄ前駆体（ＡＦ１１０８０３）、クロライドチャネル７（ＡＫ００９４３５）、ＣＤ３６抗原（ＢＣ０１０２６２）、亜鉛フィンガータンパク質相同体（ＢＣ０３０１８６）、カルボハイドレイト結合タンパク質３５（Ｊ０３７２３）、Ｃ型カルシウム依存性カルボハイドレイト（ＢＣ００３２１８）、リポタンパク質リパーゼ（ＮＭ＿００８５０９）、ｖ−ｍａｆ腱膜線維肉腫腫瘍遺伝子（ＢＣ０３８２５６）、インターロイキン７受容体（ＮＭ＿００８３７２）、キモカイン（Ｃ−Ｃ）受容体１（ＢＣ０１１０９２）、ニューロピリン（ＭＧＤ｜ＭＧＩ：１０６２０６）（ＡＫ００２６７３）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を有効成分として含む前駆ナチュラルキラー細胞から成熟ナチュラルキラー細胞への分化調節剤。
【請求項４】
ＳＥＲＰＩＮＡ３Ｇ（ＸＭ＿１２７１３７）、ＧＡＢＡ−Ａ受容体サブユニット６（Ｘ５１９８６）、ＬＡＰＴｍ５（Ｕ５１２３９）、Ｇ−タンパク質シグナル調節剤（ＢＣ０４９９６８）、崩壊促進因子ＧＰＩ固定ｍＲＮＡ（Ｌ４１３６６）、Ｙボックスタンパク質３（ＡＫ０１９４６５）、オステオポンチン前駆体（Ｊ０４８０６）、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質結合ファミリー（ＡＫ０２１３３１）、Ｔ細胞受容体ベータサブユニット類似体（Ｕ６３５４７）、免疫関連ヌクレオチド１（ＢＣ００５５７７）、上流転写因子１（ＮＭ＿００９４８０）、嗅覚受容体ＭＯＲ２６７−７（ＮＭ＿１４６７１４）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｍ１２０５６）、破骨細胞腫抑制因子（ＡＢ０１３８９８）、血小板活性受容体相同体（ＢＣ０２４０５４）、ナチュラルキラー細胞タンパク質群２−Ａ１（ＡＦ０１６００８）、未同定のタンパク質ＭＧＣ３６６６２（ＢＣ０２３８５１）、セマフォリン６Ａ前駆体相同体（ＡＫ００４３９０）、ニューロフィラメント相同ポリペプチド（ＢＣ０２５８７２）、コロニン相同アクチン結合タンパク質２Ａ（ＢＣ０２６６３４）、ソルート伝達ファミリー６（ＢＣ０１５２４５）、暫定的プリン受容体Ｐ２Ｙ１０相同体（ＡＫ０２０００１）、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖（Ｘ０３８０２）、ポリＡポリメラーゼアルファ（ＮＭ＿０１１１１２）、ＯＰＡ関連タンパク質ＯＩＰ５類似体（ＡＫ０１７８２５）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１類似体（ＢＣ００６７０８）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を有効成分として含む成熟ナチュラルキラー細胞の分化調節剤。
【請求項５】
前記分化調節剤を、坑癌用に使用することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載の細胞分化調節剤。
【請求項６】
前記癌が、乳癌、黒色腫癌及び肺癌からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の細胞分化調節剤。
【請求項７】
１）細胞から全ＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成する工程；
２）工程１のｃＤＮＡを切断してタグを分離する工程；
３）工程２で分離したタグ各々を連結した後、塩基配列を分析する工程；及び
４）工程３で分析した塩基配列をＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）分析プログラムを使用して発現量を測定する工程を含む幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節用遺伝子をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節用遺伝子を有効成分として含む細胞分化調節剤及び前記遺伝子をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、多くの機関での分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）と自己再生能（ｓｅｌｆ  ｒｅｎｅｗａｌ）を持った細胞で、胚芽でだけではなく成体でも発見される。幹細胞は一つの細胞から特異な細胞または器官への分化が可能で、これを使用した器官移植（ｏｒｇａｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）または細胞代替療法（ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）の治療に非常に大きな関心を集めている。
【０００３】
成体幹細胞中のひとつの造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）は、血液を構成するすべての細胞すなわち、赤血球、白血球、血小板及びリンパ球に分化することができる細胞で、主に骨髄にある造血幹細胞から生体の免疫体系を構成する細胞が持続的に自己再生される。現在、造血幹細胞は骨髄移植を通じて癌や様々な血液疾患の治療にだけ使用されているが、最近では動物モデルで造血幹細胞が筋肉、神経、骨のような他の形の細胞にも分化が可能であることが報告され、これを人間細胞に適用すれば造血幹細胞が多様な細胞と組織を代替することができるようになり、糖尿病、パーキンソン氏病、脊髄損傷を含む多くの疾患の治療ができるようになると期待されている。
【０００４】
特に、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ，以下「ＮＫ細胞」と略称する）は、非特異的な癌の殺傷能力がある。このようなＮＫ細胞の殺害能力を使用して、ＬＡＫ（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ）とＴＩＬ（ｔｕｍｏｒ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を使用して固形癌（ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ）治療に使用したり、供与者リンパ球注入（ｄｏｎｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）を通じた免疫治療法（非特許文献１及び２）を遂行することにより、骨髄移植や臓器移植時に発生する拒絶反応を防止するための新しい細胞治療療法に応用されている。また、ＮＫ細胞の分化と活性の欠陥は乳癌（非特許文献３）、黒色腫癌（非特許文献４）、肺癌（非特許文献５）など多様な疾病と関連していることが報告され、このような疾病を治療するためにＮＫ細胞治療法が台頭してきている。
【０００５】
以上のことに鑑みて、本発明ではＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を使用して幹細胞からＮＫ細胞への分化調節に関与する新規な遺伝子を見出した。このような細胞分化調節遺伝子を使用することによりＮＫ細胞の分化を調節してさらには癌を治療することができる可能性を確認することにより本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８６年，第３６（１０）巻，３９１０−３９１５頁
【非特許文献２】Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉａ，１９９９年，第８４巻，１１１０−１１４９頁
【非特許文献３】Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．，２００３年，第６６（３）巻，２５５−２６３頁
【非特許文献４】Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．，２００３年，第１３（４）巻，３４９−３５６頁
【非特許文献５】Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２年，第３５（１）巻，第２３−１８頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節用遺伝子を有効成分として含むＮＫ細胞分化調節剤及びＳＡＧＥ分析方法を使用して前記遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記目的を果たすために本発明は、幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節剤を提供する。
【０００８】
また、本発明は幹細胞から前駆ナチュラルキラー細胞への分化調節剤を提供する。
【０００９】
また、本発明は前駆ナチュラルキラー細胞から成熟ナチュラルキラー細胞への分化調節剤を提供する。
【００１０】
また、本発明は前記分化調節剤を使用した抗癌剤を提供する。
【００１１】
また、本発明はＳＡＧＥ分析方法を使用して幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節用遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【００１２】
本発明において、「分化調節遺伝子」と言うのは、幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化工程を調節する遺伝子で、分化を促進または抑制する機能をするすべての遺伝子を意味する。すなわち、本発明の分化調節遺伝子によって分化を促進させて次の工程に進行することができるようにすることもできるし、各工程を維持するのに必須的な機能をすることもでき、次の分化工程に進行することができないようにする機能を果たすこともできる。
【００１３】
本発明において、「ＳＡＧＥ」と言うのは、「遺伝子発現の順次的な分析（Ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」を意味するもので、本発明で分析したＳＡＧＥ分析方法は、通常のＳＡＧＥ分析方法を使用しても無難であり、製造社の方針（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）にしたがって遂行することもできる。
【００１４】
本発明の遺伝子名の後ろにある括弧中の表示は、各遺伝子の配列が示されている遺伝子銀行寄託番号（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ）で、前記遺伝子銀行寄託番号は当業者なら誰でも容易に検索して、使用することができる。
【００１５】
本発明でＩＩ型制限酵素は、遺伝工学で広く使用される酵素で活性発現にマグネシウムイオンを必要として、ＤＮＡ分子の特定の塩基配列を認識してその部位または認識塩基配列から一定塩基離れた隣接部位を正確に切断する酵素を言い、本発明で使用した「ＩＩＳ型制限酵素」は、ＮｌａＩＩＩ（約２５０塩基対ごとにＣＡＴＧ部位を認識して切る）を言う。
【００１６】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００１７】
本発明は、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸ（ＡＦ１５４５７）、プレプロ−プロテイナーゼ  ３（Ｕ９７０７３）、骨髄芽球症（Ｍｙｂ）腫瘍遺伝子（Ｍ１６４９９）、ケラチンコンプレックス  １、酸性、遺伝子１３（ＮＭ＿０１０６６２）、ＰＡ−フォスファターゼ関連ホスホエステラーゼ（ＡＫ００２９６６）、γパルビン（ＢＣ０１１２００）、フォークヘッド関連転写因子１Ｃ（ＡＦ３３０１０５）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ    ５７３０５０１Ｎ２０遺伝子（ＡＫ０１７７４４）、ｃ−ｍｙｃタンパク質（Ｘ０１０２２３）、リボソームタンパク質  Ｌ１０Ａ（ＡＫ００２６１３）、Ｏｃｔ  ２ｂ遺伝子（Ｘ５３６５４）、雄睾丸遺伝子（ＡＫ０１５６０１）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＢＣ００３３６８）、トラクル（Ｕ８１０３０）、ライソザイム（ＢＣ００２０６９）、フェリチンＨ鎖（ＢＣ０１２３１４）、ブレビカン（Ｘ８７０９６）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＢＣ０１９１３５）、ＥＩＡ刺激性遺伝子の細胞抑制剤（ＡＦ０８４５２４）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（ＢＣ０２７６３５）、ＭＰＳ１タンパク質（Ｌ２０３１５）、トランスグルタミナーゼ２（ＢＣ０１６４９２）、血清及びグルココチコイド調節性タンパク質キナーゼ（ＡＦ１３９６３９）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ  ５８３０４１３Ｌ１９（ＢＣ０２７４９６）、インターフェロン誘導性タンパク質（ＢＣ００３８０４）、乳脂肪球皮膜タンパク質ＥＧＦ因子８（ＢＣ０１８５７７）、細胞表面糖蛋白質ｐ９１（Ｕ８３１７２）、アルギナーゼ  １（ＢＣ０５０００５）、腫瘍壊死因子受容体１（Ｍ５９３７８）、レチノイド誘導性セリンカルボキシペプチダーゼ（ＡＦ３３００５２）、ＦＬＪ１１０００相同体（ＢＣ０２３８０２）、インターロイキン−１８結合タンパク質ｄ前駆体（ＡＦ１１０８０３）、クロライドチャネル７（ＡＫ００９４３５）、ＣＤ３６抗原（ＢＣ０１０２６２）、亜鉛フィンガータンパク質相同体（ＢＣ０３０１８６）、カルボハイドレイト結合タンパク質３５（Ｊ０３７２３）、Ｃ型カルシウム依存性カルボハイドレイト（ＢＣ００３２１８）、リポタンパク質リパーゼ（ＮＭ＿００８５０９）、ｖ−ｍａｆ腱膜線維肉腫腫瘍遺伝子（ＢＣ０３８２５６）、インターロイキン７受容体（ＮＭ＿００８３７２）、キモカイン（Ｃ−Ｃ）受容体１（ＢＣ０１１０９２）、ニューロピリン（ＭＧＤ｜ＭＧＩ：１０６２０６）（ＡＫ００２６７３）、ＳＥＲＰＩＮＡ３Ｇ（ＸＭ＿１２７１３７）、ＧＡＢＡ−Ａ受容体サブユニット６（Ｘ５１９８６）、ＬＡＰＴｍ５（Ｕ５１２３９）、Ｇ−タンパク質シグナル調節剤（ＢＣ０４９９６８）、崩壊促進因子ＧＰＩ固定ｍＲＮＡ（Ｌ４１３６６）、Ｙボックスタンパク質３（ＡＫ０１９４６５）、オステオポンチン前駆体（Ｊ０４８０６）、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質結合ファミリー（ＡＫ０２１３３１）、Ｔ細胞受容体ベータサブユニット類似体（Ｕ６３５４７）、免疫関連ヌクレオチド１（ＢＣ００５５７７）、上流転写因子１（ＮＭ＿００９４８０）、嗅覚受容体ＭＯＲ２６７−７（ＮＭ＿１４６７１４）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｍ１２０５６）、破骨細胞腫抑制因子（ＡＢ０１３８��８）、血小板活性受容体相同体（ＢＣ０２４０５４）、ナチュラルキラー細胞タンパク質群２−Ａ１（ＡＦ０１６００８）、未同定のタンパク質ＭＧＣ３６６６２（ＢＣ０２３８５１）、セマフォリン６Ａ前駆体相同体（ＡＫ００４３９０）、ニューロフィラメント相同ポリペプチド（ＢＣ０２５８７２）、コロニン相同アクチン結合タンパク質２Ａ（ＢＣ０２６６３４）、ソルート伝達ファミリー６（ＢＣ０１５２４５）、暫定的プリン受容体Ｐ２Ｙ１０相同体（ＡＫ０２０００１）、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖（Ｘ０３８０２）、ポリＡポリメラーゼアルファ（ＮＭ＿０１１１１２）、ＯＰＡ関連タンパク質ＯＩＰ５類似体（ＡＫ０１７８２５）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１類似体（ＢＣ００６７０８）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を有効成分として含むことを特徴とするナチュラルキラー細胞の分化調節剤を提供する。
【００１８】
また、本発明は、ホメオボックスタンパク質ＭＩＸ（ＡＦ１５４５７）、フリープロプロテイナーゼ  ３（Ｕ９７０７３）、骨髄芽球症（Ｍｙｂ）腫瘍遺伝子（Ｍ１６４９９）、ケラチンコンプレックス１、酸性、遺伝子１３（ＮＭ＿０１０６６２）、ＰＡ−フォスファターゼ関連ホスホエステラーゼ（ＡＫ００２９６６）、γパルビン（ＢＣ０１１２００）、フォークヘッド関連転写因子１Ｃ（ＡＦ３３０１０５）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ    ５７３０５０１Ｎ２０遺伝子（ＡＫ０１７７４４）、ｃ−ｍｙｃタンパク質（Ｘ０１０２２３）、リボソームタンパク質Ｌ１０Ａ（ＡＫ００２６１３）、Ｏｃｔ  ２ｂ遺伝子（Ｘ５３６５４）、雄逍丸遺伝子（ＡＫ０１５６０１）、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ（ＢＣ００３３６８）、トラクル（Ｕ８１０３０）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を有効成分として含むことを特徴とする幹細胞から前駆ナチュラルキラー細胞への分化調節剤を提供する。
【００１９】
また、本発明は、ライソザイム（ＢＣ００２０６９）、フェリチンＨ鎖（ＢＣ０１２３１４）、ブレビカン（Ｘ８７０９６）、マトリックスメタロプロテイナーゼ１２（ＢＣ０１９１３５）、ＥＩＡ刺激性遺伝子の細胞抑制剤（ＡＦ０８４５２４）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ９（ＢＣ０２７６３５）、ＭＰＳ１タンパク質（Ｌ２０３１５）、トランスグルタミナーゼ２（ＢＣ０１６４９２）、血清及びグルココチコイド調節性タンパク質キナーゼ（ＡＦ１３９６３９）、ＲＩＫＥＮ  ｃＤＮＡ５８３０４１３Ｌ１９（ＢＣ０２７４９６）、インターフェロン誘導性タンパク質（ＢＣ００３８０４）、乳脂肪球皮膜タンパク質ＥＧＦ因子８（ＢＣ０１８５７７）、細胞表面糖蛋白質ｐ９１（Ｕ８３１７２）、アルギナーゼ１（ＢＣ０５０００５）、腫瘍壊死因子受容体１（Ｍ５９３７８）、レチノイド誘導性セリンカルボキシペプチダーゼ（ＡＦ３３００５２）、ＦＬＪ１１０００相同体（ＢＣ０２３８０２）、インターロイキン−１８結合タンパク質ｄ前駆体（ＡＦ１１０８０３）、クロライドチャネル  ７（ＡＫ００９４３５）、ＣＤ３６抗原（ＢＣ０１０２６２）、亜鉛フィンガータンパク質相同体（ＢＣ０３０１８６）、カルボハイドレイト結合タンパク質３５（Ｊ０３７２３）、Ｃ型カルシウム依存性カルボハイドレイト（ＢＣ００３２１８）、リポタンパク質リパーゼ（ＮＭ＿００８５０９）、ｖ−ｍａｆ腱膜線維肉腫腫瘍遺伝子（ＢＣ０３８２５６）、インターロイキン７受容体（ＮＭ＿００８３７２）、キモカイン（Ｃ−Ｃ）受容体１（ＢＣ０１１０９２）、ニューロピリン（ＭＧＤ｜ＭＧＩ：１０６２０６）（ＡＫ００２６７３）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を有効成分として含むことを特徴とする前駆ナチュラルキラー細胞から成熟ナチュラルキラー細胞への分化調節剤を提供する。
【００２０】
また、本発明は、ＳＥＲＰＩＮＡ３Ｇ（ＸＭ＿１２７１３７）、ＧＡＢＡ−Ａ受容体サブユニット６（Ｘ５１９８６）、ＬＡＰＴｍ５（Ｕ５１２３９）、Ｇ−タンパク質シグナル調節剤（ＢＣ０４９９６８）、崩壊促進因子ＧＰＩ固定ｍＲＮＡ（Ｌ４１３６６）、Ｙボックスタンパク質３（ＡＫ０１９４６５）、オステオポンチン前駆体（Ｊ０４８０６）、アミロイドベータ（Ａ４）前駆体タンパク質結合ファミリー（ＡＫ０２１３３１）、Ｔ細胞受容体ベータサブユニット類似体（Ｕ６３５４７）、免疫関連ヌクレオチド１（ＢＣ００５５７７）、上流転写因子１（ＮＭ＿００９４８０）、嗅覚受容体  ＭＯＲ２６７−７（ＮＭ＿１４６７１４）、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｍ１２０５６）、破骨細胞腫抑制因子（ＡＢ０１３８９８）、血小板活性受容体相同体（ＢＣ０２４０５４）、ナチュラルキラー細胞タンパク質群２−Ａ１（ＡＦ０１６００８）、未同定のタンパク質  ＭＧＣ３６６６２（ＢＣ０２３８５１）、セマフォリン６Ａ前駆体相同体（ＡＫ００４３９０）、ニューロフィラメント相同ポリペプチド（ＢＣ０２５８７２）、コロニン相同アクチン結合タンパク質２Ａ（ＢＣ０２６６３４）、ソルート伝達ファミリー６（ＢＣ０１５２４５）、暫定的プリン受容体Ｐ２Ｙ１０相同体（ＡＫ０２０００１）、Ｔ細胞受容体ガンマ鎖（Ｘ０３８０２）、ポリＡポリメラーゼアルファ（ＮＭ＿０１１１１２）、ＯＰＡ関連タンパク質ＯＩＰ５類似体（ＡＫ０１７８２５）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１類似体（ＢＣ００６７０８）からなる群から選択される一つ以上の遺伝子を有効成分として含むことを特徴とする成熟ナチュラルキラー細胞の分化調節剤を提供する。
【００２１】
本発明の分化調節剤の有効成分である遺伝子は、１）幹細胞から前駆ＮＫ細胞への分化調節、２）前駆ＮＫ細胞から成熟ＮＫ細胞への分化調節及び、３）成熟ＮＫ細胞の分化調節機能をする遺伝子で、前記各工程の分化調節遺伝子は皆、幹細胞からＮＫ細胞への分化調節剤として使用することができる。本発明の実施例では、造血幹細胞であるＨＳＣ細胞にサイトカインを処理して培養することにより前駆ＮＫ細胞、成熟ＮＫ細胞で分化誘導をさせることができた（図１のＡ乃至図１のＣ）。前記各工程の細胞から全ＲＮＡを分離して、図２に示した模式図のようにＳＡＧＥ分析を遂行した。ＳＡＧＥ分析を通じて各分化工程別に発現が特異的に増加する遺伝子を探索することができた（図３のＡ乃至図３のＦ）。前記探索した遺伝子を使用して既存の遺伝子銀行に寄託された公知の遺伝子と比較分析した結果、幹細胞からｐＮＫ細胞への分化（表３参照）、ｐＮＫ細胞からｍＮＫ細胞への分化（表４参照）、ｍＮＫ細胞の分化（表５参照）を調節する機能をすると従来報告されていない遺伝子群を探索することができた。
【００２２】
したがって、ＳＡＧＥを通じて本発明で分析した遺伝子は、幹細胞からＮＫ細胞への分化を調節するとは従来は知られていない新規な機能をする遺伝子であることが分かり、このような遺伝子を一つ以上有効成分として含む製剤は、細胞分化を調節するのに使用することができる。すなわち、表３に記載した遺伝子の中から一つ以上の遺伝子を使用して幹細胞から前駆ＮＫ細胞への分化調節剤を製造することができ、表４に記載した遺伝子の中から一つ以上の遺伝子を使用して前駆ＮＫ細胞から成熟ＮＫ細胞への分化調節剤を製造することができ、表５に記載した遺伝子の中から一つ以上の遺伝子を使用して成熟ＮＫ細胞の分化調節剤を製造することができる。また、前記表３、表４及び表５に記載した遺伝子はすべて、幹細胞からＮＫ細胞への分化を調節する機能をするのでこれらの中の一つ以上の遺伝子を使用してナチュラルキラー細胞の分化調節剤を製造することができる。
【００２３】
本発明の細胞分化調節剤は、癌の治療用途に使用することができる。本発明の分化調節剤を使用して治療することができる癌としては、乳癌、黒色腫癌及び肺癌からなる群から選択される癌であることが好ましい。ＮＫ細胞の分化と活性に欠陥が生じるようになれば多様な癌が発生するようになる。例えば、乳癌（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ．，２００３年，第６６（３）巻，２５５−２６３頁）、黒色腫癌（Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．，２００３年，第１３（４）巻，３４９−３５６頁）、肺癌（Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ，２００２年，第３５（１）巻，２３−１８頁）が発生すると報告されている。よって、本発明のＮＫ細胞分化調節剤を使用すれば、ＮＫ細胞分化を調節することにより癌、特に前記記載した癌を治療することができるということが明らかである。
【００２４】
本発明の細胞分化調節剤は、臨床投与の時に経口または非経口で投与が可能で一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。すなわち、本発明の細胞分化調節剤は、実際の臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与することができる。製剤化する場合には普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希薄剤または賦形剤を使用して調剤する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は一つ以上の本発明の遺伝子に少なくとも一つ以上の賦形剤例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤する。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤等も使用する。経口投与のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤等が該当するが、よく使用する単純希薄剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存剤などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレイン酸のような注射可能なエステル等が使用できる。座薬の基材にでは、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トゥイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチン等を使用することができる。
【００２５】
本発明の治療剤の有効用量は、０．１〜０．２ｍｇ／ｋｇで、好ましくは０．１５ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜３回投与することができる。
【００２６】
また、本発明は、
１）細胞から全ＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成する工程；
２）工程１のｃＤＮＡを切断してタグを分離する工程；
３）工程２で分離したタグ各々を連結した後、その塩基配列を分析する工程；及び
４）工程３で分析した塩基配列をＳＡＧＥ分析プログラムを使用して発現量を測定する工程を含むことを特徴とする幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節用遺伝子をスクリーニングする方法を提供する。
【００２７】
前記工程１において、細胞は幹細胞からナチュラルキラー細胞までの各分化工程別細胞であることが好ましい。本発明の好ましい実施例では幹細胞に造血幹細胞（ＨＳＣ）を使用して、ナチュラルキラー細胞に前駆ナチュラルキラー細胞、成熟ナチュラルキラー細胞を使用した。また、全ＲＮＡはサンプルからＲＮａｓｅ汚染を防止しながら高収率で全ＲＮＡを分離することができる方法ならいずれの方法を使用して分離してもかまわない（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，１９８９年，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）。通常は、ＲＮＡ分離試薬を使用して製造社の方針に従って分離するのが簡便である。また、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することは、全ＲＮＡにオリゴｄＴプライマーを結合させてｃＤＮＡを合成することで、必ず前記方法で合成しなくても良く、ｃＤＮＡを合成することができる方法ならどんな方法を使用しても構わない。本発明の好ましい実施例では全ＲＮＡにオリゴｄＴプライマーを結合させてｃＤＮＡを合成した。ここで、オリゴｄＴプライマーは、ｍＲＮＡを合成するためにポリＡ配列を挿入するために使用したものである。オリゴｄＴプライマーは、２０乃至３０個のＴ配列が反復されることが好ましい。また、前記オリゴｄＴプライマーには  一方末端に磁石ビードを追加して結合させることもでき、磁石ビードを使用すれば手軽に他の物質の汚染なしにタグを分離することができる長所がある。
【００２８】
また、前記工程２において、ｃＤＮＡを切断してタグを分離する工程は、
ａ）ｃＤＮＡをＩＩＳ型制限酵素１で切断してタグを製造する工程；
ｂ）ＩＩＳ型制限酵素１認識部位を一方末端に含む２種のアダプターを前記工程ａで製造したタグの切断部位に各々連結させる工程；
ｃ）アダプター連結された前記工程ｂのタグをＩＩＳ型制限酵素２で切断して前記タグからオリゴｄＴ磁石ビードを切断してタグを分離する工程；
ｄ）工程ｃで製造されたタグ各々を連結して二重タグを製造する工程；
ｅ）工程ｄで製造された二重タグをＩＩＳ型制限酵素１で切断してアダプターを切断することにより二重タグのみを製造する工程を含んで製造することが好ましい。
【００２９】
前記工程ａにおいて、合成されたｃＤＮＡをＩＩＳ型制限酵素１で切断することは、前記制限酵素で切断した部位が追後のタグを連結するための部位に使用することができ、切断した部位が５’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇｓ）を形成することでタグ連結が容易であるという長所のため、前記制限酵素で切断するものである。ＩＩＳ型制限酵素１は、さまざまな酵素の中からいずれの一つを選択して使用しても無難であるが、ＮｌａＩＩＩ制限酵素を使用することがより好ましい。なぜなら、ｃＤＮＡにおいて２５０ｂｐごとに前記ＮｌａＩＩＩ制限酵素認識部位が存在していると知られているので、前記制限酵素を使えば一定の大きさを有するタグを手軽に切断することができる。
【００３０】
前記工程ｂにおいて、タグの切断部位に各々連結させる２種のアダプターは、約４０ｂｐ内外の長さを有する配列が相補的に結合されたもので、タグと結合する部位にあるＮｌａＩＩＩ制限酵素認識部位（ＣＡＴＧ）を一方の末端に含んでいてオーバーハングを形成し、この部位がタグと結合しやすくする。
【００３１】
前記工程ｃにおいて、アダプター連結された前記タグをＩＩＳ型制限酵素２で切断することは、ＩＩＳ型制限酵素２がアダプターにある制限酵素部位に結合して制限酵素切断部位から１０乃至１４ｂｐ下流にある部位を切断して最終的には５’末端に４ｂｐのオーバーハング末端を含む約５０ｂｐサイズのタグを分離できるようにする。前記ＩＩＳ型制限酵素２は、ＢｓｍＦＩを使用するのが好ましい。
【００３２】
前記工程ｄにおいて、タグ各々を連結して二重タグを形成することは、タグ各々の  ５’末端がオーバーハング末端を形成しているので、この部位をお互いに連結することにより二重タグを形成するものである。このように形成された二重タグは、約１００ｂｐ程度の大きさを形成する。
【００３３】
前記工程ｅにおいて、二重タグをＩＩＳ型制限酵素１で切断してアダプターを切断することによって二重タグのみを製造することは、タグの末端とアダプターの連結される部位がＩＩＳ型制限酵素１認識部位を含むので前記酵素を使用すれば、アダプターが切断されて約２６ｂｐ大の二重タグのみを分離することができる。
【００３４】
また、前記工程３において、工程２で分離したタグ切片を１０乃至２０個連結した後、塩基配列を分析する工程は、下記に記載した工程で遂行することが好ましい。
【００３５】
ａ）工程２で製造した二重タグを各々連結してコンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）形態で製造した後、クローニング用ベクターにクローニングする工程；及び
ｂ）工程ａでクローニングしたベクターのタグ塩基配列を分析する工程。
【００３６】
前記工程ａにおいて、二重タグを連結してコンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）形態で製造することは、二重タグの両末端がすべてＩＩＳ型制限酵素１認識部位を含んでオーバーハングを形成するので、このように製造された二重タグ各々はすべて連結することができて、このようにして約２０乃至５０個のタグが連結されたコンカテマーを形成することができる。また、前記製造したコンカテマー形態のタグをクローニング用ベクターにクローニングすることは、塩基配列分析を容易にするために通常使用するクローニングベクターに挿入することが好ましく、本発明の好ましい実施例では、ｐＺｅｒＯ−１ベクターを使用した。前記発現ベクターは、ＳＡＧＥ分析方法を遂行するために提供される分析キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に含まれているベクターで、容易に使用することができる。
【００３７】
また、前記工程４において、分析した塩基配列をＳＡＧＥ分析プログラムを使用して発現量を測定することは、塩基配列分析した結果を遺伝子銀行に寄託された遺伝子塩基配列と比べてどのような遺伝子なのか確認した後、ＳＡＧＥ分析プログラムを使用して発現様相が高いものから始めて低いものまでをクラスタリングして赤色、黄色、緑、青色で区分して表示することにより遺伝子の発現様相を容易に確認することができるようにする。また、このような発現量は数値化しても構わない。ＳＡＧＥ分析プログラムは、製造社が提供するプログラムを使用したりインターネット上で提供されているソフトウェアを使用することができる。本発明では、ＳＡＧＥ結果をクラスタリングするために一般的に使用するプログラム（ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｔｒｅｅｖｉｅｗ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ，  ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．１ｂ１．ｇｏｖ）を使用した。
【００３８】
本発明の遺伝子スクリーニング方法は、ＳＡＧＥ分析方法を通じてスクリーニングするもので、前記各工程は一般的なＳＡＧＥ分析方法を使用して遂行しても無難で、製造社の方針に従って適正に調整して遂行することが好ましい。本発明の方法を簡単に模式図で示すと図２のようになる。
【００３９】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
但し、下記の実施例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
＜実施例１＞骨髄からの造血細胞の分離
６乃至９週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（供給源：大韓実験動物）の脛骨と大腿骨を含むすべての骨を粉砕して粉砕物を７０ミクロン細胞ストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒ）を通過させた後、溶解溶液（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓｅ，ＭＯ）で処理して赤血球を除去することにより骨髄細胞を得た。骨髄細胞を系統マーカー（ＣＤ１１ｂ：大食細胞マーカー、Ｇｒ−１：顆粒球マーカー、Ｂ２２０：Ｂ細胞マーカー、ＮＫ１．１：ＮＫ細胞マーカー、ＣＤ２：Ｔ細胞マーカー、ＴＥＲ−１１９：赤血球マーカー）に対してビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）標識された抗体と反応させた後、洗浄して、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）が標識された磁石ビード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）と反応させた。磁石が標識されたＬｉｎ＋細胞は、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の磁場中でＣＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に通過させて除去した。カラムを通過した残りのＬｉｎ−細胞をｃ−ｋｉｔと結合した磁石ビードと反応させてＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を通過させた後、カラムに残留するｃ−ｋｉｔ＋細胞を得た。このようにして得たＬｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋である造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，以下「ＨＳＣ細胞」と略称する）の純度は、蛍光流細胞計数器（ＦＡＣＳ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ，ＣＡ）で確認した結果、９６％以上の純度を有することを確認した。
【００４１】
＜実施例２＞造血細胞からＮＫ細胞への分化誘導
前記実施例１で骨髄から分離したＨＳＣ細胞を２×１０６細胞数／ウェルの濃度でマウス  ＳＣＦ（３０ｎｇ／ｍｌ，ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、マウスＦｌｔ３Ｌ（５０ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、マウスＩＬ−７（０．５ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）、インドメタシン（２μｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）、ゲンタマイシン（２０μｇ／ｍｌ）及び１０％ウテア血清を含むＲＰＭＩ完全培地を使用して、６−ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）に接種した。前記細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６日間培養し、培養３日後培養上澄み液の半分を捨てて前記接種の時と同じ組成のサイトカインが含有された新しい培地に交換した。培養６日後、ＦＩＴＣ標識されたＣＤ１２２抗体と磁石ビード（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓ）が付いた抗ＦＩＴＣ抗体を使用してＭＡＣＳでＣＤ１２２＋であるＮＫ前駆体細胞（ｐｒｅｍａｔｕｒｅＮＫｃｅｌｌ，以下「ｐＮＫ細胞」と略称する）を分離した。ＮＫ前駆体細胞の純度は、蛍光流細胞計数器（ＦＡＣＳ）で分析した結果、９２％以上だった。
【００４２】
成熟したＮＫ細胞（ｍａｔｕｒｅＮＫｃｅｌｌ，以下「ｍＮＫ細胞」と略称する）へ分化させるため、６日後にＨＳＣ細胞を回収してＯＰ９間質細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４年，第２６５（５１７５）巻，１０９８−１１０１頁；Ｎａｋａｎｏ  Ｔ，Ｋｏｄａｍａ  Ｈ，  Ｈｏｎｊｏ  Ｔ．：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）と共にまたは単独でマウスＩＬ−１５（２０ｎｇ／ｍｌ，ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）の存在下で培養した。培養３日後、培養培地の半分を同じ組成の新しい培地に交換し、培養１２日目、ＦＩＴＣで標識された抗ＮＫ１．１抗体と磁石ビード（ＭＡＣＳ）が付いた抗ＦＩＴＣ抗体を使用してＮＫ１．１＋細胞を分離した。成熟したＮＫ細胞は、抗ＣＤ１２２、ＮＫ１．１、ＤＸ５、ＮＫ細胞受容体抗体を使用して流細胞計数器（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）で分析した。
【００４３】
＜実施例３＞分離精製したＮＫ細胞の分化工程別特異的表現型の確認
ＮＫ細胞の分化工程別特異的細胞を得るため、マウスの骨髄から分離したＬｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋  ＨＳＣ（＞９５％）をＳＣＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＬ−７存在下で６日間培養した後、ＣＤ１２２＋であるｐＮＫ細胞（９５％）を分離して、流細胞計数器で分析した。そして、ｍＮＫ細胞（−ＯＰ９または＋ＯＰ９）は、ＩＬ−１５単独またはＩＬ−１５とＯＰ９間質細胞を一緒に６日間さらに培養した後、細胞を回収して流細胞計数器で分析した（図１ａ）。間質細胞と共に培養した時、さらに多いｍＮＫ細胞（−ＯＰ９；９４％及び＋ＯＰ９；＞９５％）を得ることができた。ｍＮＫ細胞表面のＬｙ４９受容体は、ｍＮＫ細胞の機能に重要な役目をし、それらの発現は他の免疫細胞等との相互連関（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）によるシグナル伝達によって調節される。骨髄から由来したＨＳＣと間質細胞との同時培養が、ｍＮＫ細胞のＬｙ４９受容体発現に必須なのかどうかを調べるためにＩＬ−１５の存在下で単独またはＯＰ９細胞と共にｍＮＫ細胞を培養してＬｙ４９発現を調査した（図１ｂ）。ＯＰ９と一緒に培養した時（＋ＯＰ９）ｍＮＫ細胞でＬｙ４９Ｃ／Ｉ及びＬｙ４９Ｇ２の発現が誘導された一方、ＯＰ９と一緒に培養しない場合には（−ＯＰ９）  Ｌｙ４９Ｃ／Ｉ及びＬｙ４９Ｇ２の発現が誘導されなかった。これは、ＯＰ９間質細胞との同時培養がＮＫ細胞のその後の成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）に必須であることを暗示するものである。ＮＫ細胞分化工程別ＣＤ１２２とパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）遺伝子発現様相を通じて、分化する間、ＮＫ細胞に成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）することを確認することができた（図１ｃ）。
【００４４】
＜実施例４＞ＳＡＧＥ（Ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記実施例２で製造したＨＳＣ細胞を含むＮＫ分化工程特異的な細胞（ｐＮＫ及びｍＮＫ）から全ＲＮＡを分離した後、５μｇの全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）２５磁石ビード（Ｄｙｎａｌ  Ａ．Ｓ．，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用してｍＲＮＡを分離精製した。前記オリゴｄＴビードで分離精製したｍＲＮＡを５’−ビオチン化され３’−連結されたオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用してｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で合成した。製造社の方針（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にしたがって図２の模式図に例示した方法でｃＤＮＡからＳＡＧＥ分析用タグを製作した。前記ｃＤＮＡを制限酵素であるＮＩａＩＩＩで切った後、３’−部分をストレプトアビジンコーティングされた磁石ビード（Ｄｙｎａｌ）で結合させた。タグは２個の分画に分けて、ＮＩａＩＩＩ認識部位がある２個のリンカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で各々連結した。リンカーを連結したタグをＢｓｍＦＩで切断した後、切断によって遊離したタグとリンカーにＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを処理してブラント末端にし、ブラント末端を連結して二重タグ（ｄｉｔａｇ）が形成されるようにした。ビオチン標識されたＳＡＧＥプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して前記二重タグをＰＣＲ増幅した後、二重タグをＮＩａＩＩＩで切断してリンカーから分離して、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを処理してコンカテマー（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）形態にした。前記製造したコンカテマーをＳｐｈ  Ｉ−切断したｐＺｅｒｏ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした（図２）。配列番号１で記載されるＭ１３正方向プライマーと配列番号２で記載されるＭ１３逆方向プライマーを使用して前記クローニング産物をＰＣＲ増幅した後、増幅された陽性コロニーを選択してＰＣＲ産物を塩基配列分析キット（Ｂｉｇ−Ｄｙｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）と塩基配列分析器機（ＡＢＩ３７７  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）で配列分析した。タグ配列は、ＳＡＧＥ３００ソフトウェアで抽出した。
【００４５】
＜実施例５＞ＳＡＧＥデータ分析
＜５−１＞生物情報学的分析
参照ＳＡＧＥタグデータベースは、遺伝子銀行（ＧｅｎＢａｎｋ）で大部分知られているマウス発現配列を示すユニジンマウスデータベース（ＵｎｉＧｅｎｅ  ｍｏｕｓｅ  ｄａｔａｂａｓｅ）から製作した。配列でＳＡＧＥタグを決定する条件は、（ｉ）各々転写体の方向性、（ｉｉ）ポリ（Ａ）シグナル（ＡＡＴＡＡＡまたはＡＴＴＡＡＡ）の存在、（ｉｉｉ）ポリＡ尾の存在、（ｉｖ）配列で最後のＣＡＴＧ切断部位の存在とした。参照配列から抽出されたすべてのＳＡＧＥタグは、参照ＳＡＧＥデータベースを駆逐するのに使用した。参照ＳＡＧＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｐｃ１．ｃｓ．ｕｃｈｉｃａｇｏ．ｅｄｕ／ｇｉｓｔ）に対して実験的なＳＡＧＥタグをマッチして、各々のＳＡＧＥタグに対応可能な遺伝子を同定するためにコンピュータープログラム、ＳＡＧＥｍａｐ（Ｌａｓｈ  Ａ．Ｅ等，２０００）を使用した。
【００４６】
＜５−２＞ＳＡＧＥプロファイルの定量的な分布によるクラスタリング分析
前記実施例＜４−１＞で遂行して得たＳＡＧＥデータを、ＮＫ細胞分化過程の間、それらの他の発現と機能的パターンに基づいてクラスタリング（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）するためにクラスターコンピュータープログラム（ｃｌｕｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｔｒｅｅｖｉｅｗ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍ，  ｈｔｔｐ：／／ｒａｎａ．１ｂ１．ｇｏｖ）を使用して分析した。簡単に、各々の測定工程にそれらの頻度によって（ＰＥＲＬ  ｓｃｒｉｐｔ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｕｐｏｎ  ｒｅｑｕｅｓｔ）青、緑、黄色、赤の色を割り当てた。中間値は相応するＲＧＢ値に挿入した。このような色相化された可視的な検査によって高くて明確な発現様相を示すいくつかのタグを採択し、それらをパネルでお互いに離れるように配置した。他のタグは、隣合う列が類似の発現様相を見せて全体が漸次的な色相変化を示すようにする方法で再配列した。
【００４７】
ＨＳＣ、ｐＮＫ、ｍＮＫ（−ＯＰ）及びｍＮＫ（＋ＯＰ９）細胞のＳＡＧＥプロファイルを使用してＮＫ細胞に分化する過程中に遺伝子発現様相が増加または減少するのかどうか分析した。その結果、図３のＡ乃至図３のＦに見られるように採択された遺伝子を４個の異なる群でクラスタリングした。例えば、図３のＡはＨＳＣで発現が高くてＮＫ細胞が分化されるにつれて減少する遺伝子群を示し、図３のＢ及び図３のＣは、各々ｐＮＫ細胞とｍＮＫ（−ＯＰ９）細胞で発現が高い遺伝子群を示し、図３のＤは発現が漸次的に増加してｍＮＫ（＋ＯＰ９）細胞で最大の発現を見せる遺伝子群を示した。特に、ｐＮＫ細胞群で最大発現を示す遺伝子群（図３のＢ）は、リンパ球分化抗体、Ｃ−Ｃケモカイン受容体、腫瘍壊死因子及びインターロイキン−１８結合タンパク質のような多くの免疫調節遺伝子を含んでいる。これは、ｐＮＫ細胞の分化に免疫調節遺伝子が重要であることを示唆する。次に、公開されたデータベースを基に、遺伝子をＮＫ細胞活性を調節する機能によって分類した。図３のＥ及び図３のＦは、各々ＮＫ細胞活性を阻害及び促進する遺伝子を示した。多くの場合、これら遺伝子は分化過程中の遅い工程で発現される。活性化遺伝子には、ミトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ）活性化したタンパク質キナーゼ（ｍｉｔｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）、ホスホリパーゼＡ２（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ２）、ＩＬ−２受容体（ＩＬ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ケモカイン受容体（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）のような多くのシグナル分子が含まれている。
【００４８】
＜実施例６＞ＮＫ細胞分化工程別分化工程調節遺伝子分析
＜６−１＞ＮＫ細胞分化工程別ＳＡＧＥライブラリ製造
前記実施例４を通じてＳＡＧＥ分析した結果を使用して各分化工程（ＨＳＣ，ｐＮＫ，ｍＮＫ（−ＯＰ９），ｍＮＫ（＋ＯＰ９））にあるＮＫ細胞から４群の独立的なＳＡＧＥライブラリを作った。ＨＳＣのＳＡＧＥライブラリでは、全体４４，９９８個のタグから１９，８３０個の特異（ｕｎｉｑｕｅ）転写体が同定され、その中で１２，８９９個の特異遺伝子が同定された。ｐＮＫ細胞のＳＡＧＥライブラリでは、全体４０，７７１個のタグから１７，７４５個の特異転写体が同定され、その中で１１，６８４個の特異遺伝子が同定された。同様に、ｍＮＫ細胞のＳＡＧＥライブラリでは、全体４２，１６０個のタグ（ｍＮＫ（−ＯＰ９））と４２，５３５個のタグ（ｍＮＫ（＋ＯＰ９））から各々２０，８０３個及び２０，７９１個の特異転写体が同定され、その中で各々３，６５０個及び１４，３３５個の特異遺伝子が同定された。全体的に、４個のＳＡＧＥライブラリから総１７０，４６４個のタグが同定され、それから５９，６５７個の特異転写体及びそれから３５，３８５個の特異遺伝子が同定された。５９，６５７個の特異転写体の中で７７．９％は単一コピー、１６．８％は２乃至４コピー、３．２％は５乃至９コピー、１．９％は１０乃至９９コピーを示し、わずか０．２％だけが１００コピー以上を示した（表１）。
【００４９】
表１：ＮＫ細胞への分化工程別ＳＡＧＥの結果
【００５０】
【表１】
2007526246.tif 000003
【００５１】
また、前記分析されたＳＡＧＥ結果からＮＫ細胞分化に影響を及ぼすと知られている遺伝子の発現様相がそのまま反映されるかどうか確認した。その結果、公知されているようにグランザイム（Ｇｒａｎｚｙｍｅ）（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＮＭ＿０１３５４２）とＮＫＧ２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＦ１０６００８）、２Ｂ４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  Ｌ１９０５７）、Ｌｙ４９Ｑ（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＢ０３３７６９）、ＣＤ９４（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＡＦ０５７７１４）のようなｍＮＫ細胞受容体等は、ｍＮＫ細胞では高く計数されたがＨＳＣとｐＮＫ細胞では計数されなかった。ＩＬ−１５（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  Ｕ１４３３２）は、ＨＳＣとｐＮＫ細胞から検出され、ＩＤ−２（ＧｅｎＢａｎｋ  ＩＤ  ＢＣ００６９５１）はｐＮＫ細胞工程から検出されることを確認した（表２）。
【００５２】
表２：分化工程関連公知遺伝子のＳＡＧＥ結果の確認
【００５３】
【表２】
2007526246.tif 000004
【００５４】
＜６−２＞ＮＫ細胞分化過程中で分化工程特異的に発現する遺伝子の分析
ＮＫ分化の各々の工程にはお互いに区別される遺伝子の発現様相が現われることが知られているので、分化工程特異的に誘導される遺伝子を同定した。統計的に有意差を調査するために特定工程で少なくとも４倍以上計数される遺伝子群を表にした。
【００５５】
その結果、１５個の遺伝子がＨＳＣで著しく発現した（表３）。その中でインターロイキン−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）は、ＮＫ細胞活性化とシグナル伝達に関与して、ＩＲＡＫ−欠乏マウスは、ＩＬ−１８に誘導されたＮＫ細胞毒性の誘導能と活性化したＮＫ細胞によるＩＦＮ−ガンマの生成が深刻に損傷されていることがわかり、本発明の分析が正確に行なわれたことが分かった。
【００５６】
【表３】
2007526246.tif 000005
【００５７】
また、ｐＮＫ細胞では３０個の遺伝子がほとんど例外的にこの工程で発現した（表４）。その中で、ｃ−ｋｉｔリガンドは、正常な数の完全分化したｍＮＫ細胞の生成に必須なシグナルで、前駆体からＮＫ細胞の生成がｃ−ｋｉｔシグナル伝達不在下では減少することが知られている。また、２−マイクログロブリン（ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）は、Ｌｙ４９受容体発現の開始とＮＫ細胞分化の核心調節者であるＮＫ細胞受容体多様性の形成に関与すると知られていて、変異したＦｃ受容体の発現はＮＫ細胞の発生と機能に影響を及ぼして循環上のＣＤ５６＋ＣＤ３−ＮＫ細胞の数を減少させて、ＮＫ細胞血球減少症（ｃｙｔｏｐｅｎｉａ）と臨床的に重要な免疫欠乏症を起こすと知られている。よって、ＮＫ細胞分化を調節すると公知された遺伝子の発現様相が正確に示されたものと見られ、本発明で測定した結果が正確であることが分かった。
【００５８】
【表４】
2007526246.tif 000006
【００５９】
一方、ｍＮＫ細胞からは２７個の遺伝子が選択された（表５）。そのうちＳｒｃファミリチロシンキナーゼＦｙｎは、ＮＫ細胞活性化と関連があると知られている。
【００６０】
【表５】
2007526246.tif 000007
【００６１】
＜実施例７＞ＲＴ−ＰＣＲ遂行を通じた遺伝子発現様相分析
ＳＡＧＥデータから他の遺伝子の発現様相を確認するために半正量的（ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＲＴ−ＰＣＲを遂行した。発現を確認しようとする遺伝子によって下記のようなプライマーを作成してＲＴ−ＰＣＲを遂行した。すべてのＰＣＲ混合物は、９５℃から１分間加熱して、ＨＳＣとｍＮＫ細胞に対しては９５℃１分、５５℃で１分、７２℃で２分の条件で、ＮＫ前駆体細胞に対しては９５℃１分、６０℃で１分、７２℃で２分で２８回または３２回で  ＰＣＲを行って、７２℃でさらに１０分伸張反応させた後、増幅されたＰＣＲ産物を電気泳動してエチジウムブロマイド染色で確認した。
【００６２】
γパルビン（ｐａｒｖｉｎ）：配列番号３及び配列番号４、
フォークヘッド関連転写因子１ｃ（Ｆｏｒｋｈｅａｄ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  １ｃ，Ｆｏｘｐ１ｃ）：配列番号５及び配列番号６、
ｃ−ｍｙｃタンパク質：配列番号７及び配列番号８、
ケラチンコンプレックス（ｋｅｒａｔｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ＫＣ）１：配列番号９及び配列番号１０、
ＰＡ−フォスファターゼ関連ホスホエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｅｓｔｅｒａｓｅ，ＰＡ−ＰＲＰ）：配列番号１１及び配列番号１２、
インターロイキン１受容体関連キナーゼ（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ，ＩＲＡＫ）：配列番号１３及び配列番号１４、
リボソームタンパク質（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）Ｌ１０Ａ：配列番号１５及び配列番号１６、
プレプロプロテイナーゼ（ｐｒｅ−ｐｒｏ−ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）３：配列番号１７及び配列番号１８、
マイエロブラストシスオンコゲン（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ）：配列番号１９及び配列番号２０、
カルボハイドレイト結合タンパク質（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＢＰ）３５：配列番号２１及び配列番号２２、
ＩＬ−７  受容体：配列番号２３及び配列番号２４、
リポタンパク質リパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｐａｓｅ，ＬＰＬ）：配列番号２５及び配列番号２６、
フェリチンＨ鎖：配列番号２７及び配列番号２８、
マトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ，ＭＭＰ）１２：配列番号２９及び配列番号３０、
Ｇ−タンパク質シグナル調節剤（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ＲＧＳ）：配列番号３１及び配列番号３２、
セルピナ３Ｇ（Ｓｅｒｐｉｎａ３Ｇ）：配列番号３３及び配列番号３４、
ピュリノジック受容体（ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）Ｐ２Ｙ：配列番号３５及び配列番号３６、
リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）：配列番号３７及び配列番号３８、  
セマフォリン６Ａ前駆体（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ６Ａ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）：配列番号３９及び配列番号４０、
ＣＤ１２２：配列番号４１及び配列番号４２、
パーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）：配列番号４３及び配列番号４４、
βアクチン（ａｃｔｉｎ）：配列番号４５及び配列番号４６。
【００６３】
その結果、ＨＳＣでは、γパルビン、フォークヘッド関連転写因子１Ｃ（Ｆｏｘｐ１Ｃ）、ｃ−ｍｙｃ及びプレプロプロテイナーゼ３等９個の遺伝子が選択的に発現した（図４のＡ）。ｐＮＫ細胞では、例外的にＩＬ−７Ｒとマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１２）が発現した（図４のＢ）。ｍＮＫ細胞では、ピュリノジック受容体Ｐ２Ｙ１０とリンパ球特異的ＰＴＫが例外的に発現することを確認した（図４のＣ）。
【００６４】
＜実施例８＞ＬＰＬがＮＫ細胞分化過程に及ぼす影響の確認
前記実施例４の結果を通じて、ＮＫ細胞分化過程の中で分化工程特異的に発現する遺伝子の中に配列番号４７で記載されるリポタンパク質リパーゼ（以下「ＬＰＬ」と略称する）がＮＫ細胞分化過程中にｐＮＫ細胞で過量発現することを確認した。ＬＰＬは、ＮＫ細胞の増殖を促進させて、自発的な細胞毒性（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）とリンフォカイン活性化したキラー（ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ，ＬＡＫ）活性を阻害すると知られている。それで、ＬＰＬのｐＮＫ−特異的な発現がｍＮＫ細胞への分化に要求されるかどうかを調べるため、ＨＳＣを６日間初期培養した後、ＯＰ９間質細胞の不在下でＩＬ−１５と共にＬＰＬを処理してＮＫ細胞の割合を測定した。
【００６５】
その結果、ＩＬ−１５を単独で処理して培養したものと比べてＬＰＬと一緒に処理した時、ＮＫ細胞の割合が漸次的に増加した（ＮＫ１．１＋ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅ＋細胞；ＩＬ−１５単独処理では５０％存在、これに対し、ＩＬ−１５とＬＰＬ２５０ｎｇ／ｍｌ及びＩＬ−１５とＬＰＬ５００ｎｇ／ｍｌ処理では各々７１％及び８６％存在）（図４のＤ）。よって、前記結果からｐＮＫ細胞でｍＮＫ細胞への分化にＬＰＬが重要な役目を果たすことが分かった。これを通じて本発明でＮＫ細胞分化調節遺伝子を探索した結果が正確な結果であることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【００６６】
前記で詳しく見たように、幹細胞からナチュラルキラー細胞への分化調節に関連機能をする遺伝子を探索して、ＳＡＧＥ分析方法を使用すれば前記のように既存に知られていない機能をする遺伝子を探索するのに有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】ＯＰ９間質細胞存在下（＋ＯＰ９）またはＯＰ９不在下（−ＯＰ９）でマウスの造血幹細胞（ＨＳＣ）から前駆ＮＫ細胞（ｐＮＫ）を経て成熟ＮＫ細胞（ｍＮＫ）への分化工程別表面分子の発現を比較した図である。図１のＡ：ＮＫ細胞分化各工程にある細胞の純度を二色の流細胞分析器によって決定したもので、各々の四分面（ｑｕａｄｒａｎｔ）にある数字は該当の細胞の百分率を示す。図面で、Ｌｉｎ−  ｃ−ｋｉｔ＋：（９６％）、ＣＤ１２２＋  ＮＫ１．１−：（９５％）、ＣＤ１２２＋  ＮＫ１．１＋：（各々９４％、９６％）図１のＢ：前駆ＮＫ細胞をＯＰ９間質細胞を添加して培養し、成熟ＮＫ細胞に分化させた時、ＮＫ細胞関連表面マーカー（ＮＫ１．１，ＤＸ５，ＣＤ９４，ＮＫＧ２Ａ）が発現誘導されることを示したグラフである。図１のＣ：ＮＫ細胞分化過程中の各工程の細胞で全体細胞質ＲＮＡを分離して代表的なＮＫ細胞関連遺伝子であるＣＤ１２２及びパーフォリン（ｐｅｒｆｏｒｉｎ）が発現されるかどうかを確認したＲＴ−ＰＣＲ分析結果である。
【図２】本発明の分化調節遺伝子を探索するためのＳＡＧＥ分析方法を示した模式図である。
【図３−１】ＮＫ細胞分化過程うちの遺伝子発現プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）をＳＡＧＥ分析してクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）したものである。図３のＡ：ＨＳＣ細胞で発現が一番高い遺伝子群を示す。図３のＢ：ｐＮＫ細胞で発現が一番高い遺伝子群を示す。前記図３のＡ及びＢでＳＡＧＥ分析してクラスターした結果でクラスターの頻度が８０以上のものは赤、５０乃至７９のものは黄色、３０乃至４９のものは緑、２９以下は青で表示した。
【図３−２】ＮＫ細胞分化過程うちの遺伝子発現プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）をＳＡＧＥ分析してクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）したものである。図３のＣ：ｍＮＫ（−ＯＰ９）細胞で発現が一番高い遺伝子群を示す。図３のＤ：ｍＮＫ（＋ＯＰ９）細胞で発現が一番高い遺伝子群を示す。前記図３のＣ及びＤでＳＡＧＥ分析してクラスターした結果でクラスターの頻度が８０以上のものは赤、５０乃至７９のものは黄色、３０乃至４９のものは緑、２９以下は青で表示した。
【図３−３】ＮＫ細胞分化過程うちの遺伝子発現プロファイル（ｐｒｏｆｉｌｅ）をＳＡＧＥ分析してクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）したものである。図３のＥ：ＮＫ細胞の活性を阻害する遺伝子を示す。図３のＦ：ＮＫ細胞の活性を促進させる遺伝子を示す。前記図３のＥ及びＦでＳＡＧＥ分析してクラスターした結果でクラスターの頻度が８０以上のものは赤、５０乃至７９のものは黄色、３０乃至４９のものは緑、２９以下は青で表示した。
【図４】本発明でＳＡＧＥ分析を通じてＮＫ細胞分化調節をすると分析された遺伝子が実際に発現するかどうかをＲＴ−ＰＣＲで分析したもので、各々はβアクチン遺伝子を比較群にして定量化した。図４のＡ：ＮＫ細胞分化過程中、ＨＳＣ細胞に特異的に発現する遺伝子を分析したものである。図４のＢ：ｐＮＫ細胞に特異的に発現する遺伝子を分析したものである。図４のＣ：ｍＮＫ細胞に特異的に発現する遺伝子を分析したものである。図４のＤ：ＮＫ細胞分化にリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）が及ぼす影響を調査するためにＬＰＬを２５０ｎｇ／ｍｌ及び５００ｎｇ／ｍｌ処理した時、ｍＮＫ細胞で分化が増加することを確認したものである。
【００６８】
配列目録フリーテキスト
配列番号１と配列番号２の塩基配列は、実施例３のＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号３と配列番号４の塩基配列は、実施例６のγパルビンのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号５と配列番号６の塩基配列は、実施例６のフォークヘッド関連転写因子１ｃのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号７と配列番号８の塩基配列は、実施例６のｃ−ｍｙｃタンパク質のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号９と配列番号１０の塩基配列は、実施例６のケラチンコンプレックス１のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号１１と配列番号１２の塩基配列は、実施例６のＰＡ−フォスファターゼ関連ホスホエステラーゼのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号１３と配列番号１４の塩基配列は、実施例６のインターロイキン１受容体関連キナーゼのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号１５と配列番号１６の塩基配列は、実施例６のリボソームタンパク質Ｌ１０ＡのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号１７と配列番号１８の塩基配列は、実施例６のプレプロプロテイナーゼ３のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号１９と配列番号２０の塩基配列は、施例６のマイエロブラストシスオンコジンのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号２１と配列番号２２の塩基配列は、実施例６のカルボハイドレイト結合タンパク質３５のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号２３と配列番号２４の塩基配列は、実施例６のＩＬ−７受容体のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号２５と配列番号２６の塩基配列は、実施例６のリポタンパク質リパーゼのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号２７と配列番号２８の塩基配列は、実施例６のフェリチンＨ鎖のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号２９と配列番号３０の塩基配列は、実施例６のマトリックスメタロプロテイナーゼ１２のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号３１と配列番号３２の塩基配列は、実施例６のＧ−タンパク質シグナル調節剤のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号３３と配列番号３４の塩基配列は、実施例６のセルピナ３ＧのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号３５と配列番号３６の塩基配列は、実施例６のピュリノジック受容体Ｐ２ＹのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号３７と配列番号３８の塩基配列は実施例６のリンパ球−特異的タンパク質チロシンキナーゼのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号３９と配列番号４０の塩基配列は、実施例６のセマフォリン６Ａ前駆体のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号４１と配列番号４２の塩基配列は、実施例６のＣＤ１２２のＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号４３と配列番号４４の塩基配列は、実施例６のパーフォリンのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号４５と配列番号４６の塩基配列は、実施例６のβアクチンのＲＴ−ＰＣＲ反応に使用したプライマー配列である。
配列番号４７の塩基配列は、リポタンパク質リパーゼの塩基配列である。
配列番号４８のアミノ酸配列は、マウスタンパク質のアミノ酸配列である。
【図３−１】
2007526246.tif 000008
【図３−２】
2007526246.tif 000009
【図３−３】
2007526246.tif 000010
【図１】
2007526246.tif 000011
【図２】
2007526246.tif 000012
【図４】
2007526246.tif 000013
【配列表】
2007526246000001.app
【国際調査報告】
2007526246.tif 000014
2007526246.tif 000015