(57)【要約】本発明は、コリン作動性ムスカリン受容体遺伝子の発現を、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を用いて調節するのに有用な化合物、組成物、及び方法に関する。また、本発明は、コリン作動性ムスカリン受容体遺伝子の発現経路及び／又は低分子核酸分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関与する他の遺伝子の発現及び活性を調節するのに有用な化合物、組成物、及び方法に関する。特に本発明は、Ｍ３ムスカリン性アセチルコリン受容体又はコリン作動性ムスカリン３受容体（ＣＨＲＭ３）等のコリン作動性ムスカリン受容体遺伝子の発現の調節に用いられる、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の低分子核酸分子並びに方法を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介してコリン作動性ムスカリン３受容体（ＣＨＲＭ３）ＲＮＡの開裂を導く、化学的に合成された短二本鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子であって、
ａ）前記ｓｉＮＡ分子の各々の鎖は、約１８から約２３のヌクレオチド長であり、
ｂ）前記ｓｉＮＡ分子の一つの鎖は、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介したＣＨＲＭ３ＲＮＡの開裂を導くために、前記ＣＨＲＭ３ＲＮＡに対する充分な相補性を有するヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子。
【請求項２】
前記ｓｉＮＡ分子はリボ核酸を含まない請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項３】
前記ｓｉＮＡ分子は一つ以上のリボ核酸を含む請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項４】
前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の第１の鎖は、ＣＨＲＭ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部と相補的であるヌクレオチド配列を含み、
前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の鎖は、前記ＣＨＲＭ３ＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と実質的に類似したヌクレオチド配列を含む請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項５】
ｓｉＮＡ分子の各々の鎖は、約１８から約２３のヌクレオチドを含み、
各々の鎖は、他方の鎖のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１９のヌクレオチドを含む請求項４記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項６】
前記ｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部と相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、
前記ｓｉＮＡは、センス領域を更に含み、
前記センス領域は、前記ＣＨＲＭ３遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似したヌクレオチド配列を含む請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項７】
前記アンチセンス領域および前記センス領域は、約１８から約２３のヌクレオチドを含み、
前記アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドに相補的である少なくとも約１８のヌクレオチドを含む請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項８】
前記ｓｉＮＡ分子は、センス領域およびアンチセンス領域を含み、
前記アンチセンス領域は、ＣＨＲＭ３遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と相補的であるヌクレオチド配列を含み、
前記センス領域は、前記アンチセンス領域と相補的であるヌクレオチド配列を含む請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項９】
前記ｓｉＮＡ分子は、２つの別々のオリゴヌクレオチド断片から構成され、
第１の断片は、前記ｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み、
第２に断片は、前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１０】
前記センス領域は、リンカー分子を介してアンチセンス領域に接続されている請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１１】
前記リンカー分子は、ポリヌクレオチドリンカーである請求項１０記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１２】
前記リンカー分子は、非ヌクレオチドリンカーである請求項１０記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１３】
センス領域におけるピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１４】
センス領域におけるプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１５】
センス領域に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１６】
前記センス領域を含む断片は、前記センス領域を含む断片の５’末端、３’末端、または、５’末端及び３’末端の両方に、末端キャップ部分を含む請求項９記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１７】
前記末端キャップ部分は、逆位デオキシ脱塩基の部分である請求項１６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１８】
前記アンチセンス領域におけるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項１９】
前記アンチセンス領域におけるプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２０】
前記アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを含む請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２１】
前記アンチセンス領域は、前記アンチセンス領域の３’末端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む請求項１８記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２２】
前記アンチセンス領域は、前記アンチセンス領域の３’末端にグリセリル修飾を含む請求項６記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２３】
前記ｓｉＮＡ分子の２つの断片の各々は、約２１ヌクレオチドを含む請求項９記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２４】
ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドにと塩基対形成し、
ｓｉＮＡ分子の各断片の３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他方の断片のヌクレオチドと塩基対形成しない請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２５】
ｓｉＮＡ分子の各断片の３’末端ヌクレオチドは、２’−デオキシピリミジンである請求項２４記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２６】
前記２’−デオキシピリミジンは、２’−デオキシチミジンである請求項２５記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２７】
ｓｉＮＡ分子の各断片の約２１ヌクレオチドの全てが、ｓｉＮＡ分子の他方の断片の相補ヌクレオチドと塩基対形成する請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２８】
アンチセンス領域の約１９ヌクレオチドが、ＣＨＲＭ３遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成する請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項２９】
アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドが、ＣＨＲＭ３遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部と塩基対形成する請求項２３記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項３０】
前記アンチセンス領域を含む断片の５’末端は、任意にリン酸基を含む請求項９記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項３１】
請求項１記載のｓｉＮＡ分子を、薬理学的に許容できる担体または希釈液中に含む組成物。
【請求項３２】
ＣＨＲＭ３ＲＮＡは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７４０．１を含む請求項１記載のｓｉＮＡ分子。
【請求項３３】
前記ｓｉＮＡは、配列番号１から３２０のいずれかを含む請求項１記載のｓｉＮＡ。
【請求項３４】
薬理学的に許容できる担体または希釈液と共に、請求項３２記載のｓｉＮＡを含む組成物。
【請求項３５】
薬理学的に許容できる担体または希釈液と共に、請求項３３記載のｓｉＮＡを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コリン作動性ムスカリン受容体遺伝子発現及び／又は活性の調節に対応する形質、疾患及び症状の研究、診断及び治療に用いられる化合物、組成物及び方法に関する。本発明はまた、コリン作動性ムスカリン受容体遺伝子の発現経路又はそれらの形質、疾患若しくは症状の維持及び進展を媒介する細胞過程に関与する遺伝子の発現及び／又は活性に対応する形質、疾患及び病状に関連する化合物、組成物及び方法を目的とする。具体的には、本発明は、コリン作動性ムスカリン受容体、特にＭ３ムスカリン性アセチルコリン受容体（ＣＨＲＭ３）の遺伝子発現に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する能力を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）等の小さな核酸分子に関する。それらの小さな核酸分子は、たとえば、対象となるコリン作動性ムスカリン受容体発現の調節に反応する、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、及び／又は呼吸器又は肺の疾患、異常及び／又は尿失禁等の症状を含む、形質、疾患及び症状の治療のための組成物を提供する点において有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉに関連する従来技術についての議論を以下に示す。これらの議論は、後に示す本発明の理解に供することのみを目的とする。要約は、ここで述べる研究の全てが本出願に係る発明の先行技術であることを認めるものではない。
【０００３】
ＲＮＡ干渉とは、動物における短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介した配列特異的な転写後遺伝子抑制（サイレンシング、ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）の過程をいう（Ｚａｍｏｒｅ他，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３；Ｆｉｒｅ他，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６；Ｈａｍｉｌｔｏｎ他，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１；Ｌｉｎ他，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９；Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３：１３９−１４１；及びＳｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６）。植物における対応する過程（Ｈｅｉｆｅｔｚ他，ＷＯ９９／６１６３１号国際公開公報）は、一般に転写後遺伝子抑制又はＲＮＡ抑制と呼ばれており、菌類においてはクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれている。転写後遺伝子抑制の過程は、外来遺伝子の発現を阻止するための進化的に保存された細胞の防御機構であると考えられており、多様な植物及び種族の間で広く共有されている（Ｆｉｒｅ他，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。このような外来遺伝子からの防御は、ウィルスの感染又はトランスポゾンエレメントの宿主ゲノム内へのランダムインテグレーションにより誘発された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に対応して、相同な一本鎖ＲＮＡ又はウィルスのゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して進化したものであるかもしれない。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、未だ完全に解明されていないメカニズムによってＲＮＡｉ応答が引き起こされる。このメカニズムは、ｄｓＲＮＡに媒介されたプロテインキナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素の活性化により、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的分解を引き起こす、インターフェロン応答等の既知のメカニズムとは異なっているようである。（例えば、米国特許第６，１０７，０９４号及び第５，８９８，０３１号明細書、Ｃｌｅｍｅｎｓ他，１９９７，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＆  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１７，５０３−５２４、Ａｄａｈ他，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８，１１８９を参照）。
【０００４】
長鎖のｄｓＲＮＡが細胞内に存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される（Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５、Ｚａｍｏｒｅ他，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｈａｍｍｏｎｄ他，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片に切断するプロセシングに関与している（Ｚａｍｏｒｅ他，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５、Ｂｅｒｓｔｅｉｎ他，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサーの活性により生じた短鎖干渉ＲＮＡは、通常約２１〜２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を有する（Ｚａｍｏｒｅ他，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３、Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。ダイサーは、翻訳制御に関与している保存構造の前駆体ＲＮＡからの、２１及び２２ヌクレオチドの短鎖一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除にも関与している。（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答は、通常ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれ、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体によっても特徴づけられる。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こる。（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。
【０００５】
ＲＮＡｉは、多くの系について研究されている。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は、線虫（Ｃ．  Ｅｌｅｇａｎｓ）において最初にＲＮＡｉを観測した。ＢａｈｒａｍｉａｎとＺａｒｂｌ（１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３）及びＷｉａｎｎｙとＧｏｅｔｚ（１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０）は、哺乳類系においてｄｓＲＮＡに媒介されたＲＮＡｉについて記述している。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡを導入されたショウジョウバエの細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）及びＴｕｓｃｈｌら（ＷＯ０１／７５１６４号国際公開公報）は、ヒト胎児腎臓細胞及びＨｅＬａ細胞を含む培養された哺乳類細胞へ合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖を導入することにより誘起されるＲＮＡｉについて記述している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ，２０，６８７７）は、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成、及び配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖は、３’末端ジヌクレオチド突出を含む場合に最も活性であることを示した。さらに、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが、３’末端ｓｉＲＮＡ突出ヌクレオチドを２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）で置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心における単一のミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに、これらの研究はまた、標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ｓｉＲＮＡの５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示した（Ｎｙｋａｎｅｎ他，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）。
【０００６】
２ヌクレオチドの３’−突出を有する２１量体ｓｉＲＮＡ二本鎖中の、３’−末端ヌクレオチドが突出したセグメントをデオキシリボヌクレオチドで置換しても、ＲＮＡｉ活性に有害な影響を与えないことが研究によって明らかにされた。ｓｉＲＮＡの各末端のヌクレオチドを４つまでデオキシヌクレオチドに置換することは十分許容されることが報告されているが、完全にデオキシヌクレオチドに置換するとＲＮＡｉ活性は失われる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７、及びＴｕｓｃｈｌ他，ＷＯ０１／７５１６４号国際公開公報）。さらに、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（上掲）は、ｓｉＲＮＡを２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換すると、ＲＮＡｉ活性が完全に破壊されたことについても報告している。Ｌｉら（ＷＯ００／４４９１４号国際公開公報）、及びＢｅａｃｈら（ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報）は、ｓｉＲＮＡが、リン酸エステル−糖骨格又はヌクレオチドのいずれかについて少なくとも１つの窒素又は硫黄へテロ原子を含める修飾を行いうることを予備的に示唆している。しかし、いずれの出願も、ｓｉＲＮＡ分子においてどの程度そのような修飾が許容されるかについて仮定しておらず、そのような修飾ｓｉＲＮＡについてそれ以上の指針又は例も示されていない。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（カナダ特許出願第２，３５９，１８０号）もまた、ｄｓＲＮＡコンストラクトにおいて二本鎖ＲＮＡ依存性蛋白質キナーゼＰＫＲの活性化を妨げる目的で用いるための化学的修飾、特に２’−アミノ又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、及び２’−Ｏ又は４’−Ｃメチレン架橋を含むヌクレオチドについて記述している。しかし、Ｋｒｅｕｔｚｅｒらも同様に、ｓｉＲＮＡ分子においてこれらの修飾がどの程度許容されるかについての例又は指針を提供していない。
【０００７】
Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７）は、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的として、長鎖の（＞２５ｎｔ）ｓｉＲＮＡ転写産物を用いたある種の化学修飾を試みた。著者は、Ｔ７及びＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いてチオリン酸ヌクレオチドアナログを取り込ませることにより、これらのｓｉＲＮＡ転写産物にチオリン酸エステル残基を導入し、２つのホスホロチオエートで修飾した塩基を有するＲＮＡも、ＲＮＡｉとしての有効性を大幅に低下させることを観測したことについて記述している。さらに、Ｐａｒｒｉｓｈらは、２残基よりも多くホスホロチオエートで修飾すると、インビトロでＲＮＡが大幅に不安定化され、干渉活性がアッセイできなくなることを報告した（同上、１０８１ページ）。著者は、長鎖ｓｉＲＮＡ転写物中のヌクレオチドの糖の２’位における化学修飾を試み、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに置換すると、特にウリジンをチミジンに、かつ／又はシチジンをデオキシシチジンに置換した場合に、干渉活性が大幅に減少することを見出した（同上）。さらに、著者は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖における、ウラシルの４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、及び３−（アミノアリル）ウラシルへの置換、並びにグアノシンのイノシンへの置換を含む、置換等の塩基の修飾を試みた。４−チオウラシル及び５−ブロモウラシルへの置換は許容されるようであるが、Ｐａｒｒｉｓｈは、イノシンがどちらのＲＮＡに取り込まれた場合にも干渉活性を大幅に低下させることを報告した。Ｐａｒｒｉｓｈは、５−ヨードウラシル及び３−（アミノアリル）ウラシルがアンチセンス鎖に取り込まれた場合にも、ＲＮＡｉ活性が大幅に低下することについても報告した。
【０００８】
長鎖のｄｓＲＮＡの使用についても記述されている。例えば、Ｂｅａｃｈら（ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報）は、内部由来のｄｓＲＮＡを用いて遺伝子の発現を減少させる特異的な方法について記述している。Ｔｕｓｃｈｌら（ＷＯ０１／７５１６４号国際公開公報）は、ショウジョウバエのインビトロのＲＮＡｉ系及びある種の機能的ゲノム用途並びにある種の治療用途に特定のｓｉＲＮＡ分子を用いることを記述している。しかし、Ｔｕｓｃｈｌ（２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５）は、インターフェロン応答の活性化の危険性のため、遺伝的疾患又はウィルス感染の治療のためにＲＮＡｉを用いることができるか否かは疑わしいと述べている。Ｌｉら（ＷＯ００／４４９１４号国際公開公報）は、ある種の標的遺伝子の発現を弱めるために特定のｄｓＲＮＡを用いることを記述している。Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら（ＷＯ０１／３６６４６号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡ分子を用いて、哺乳動物細胞において特別の遺伝子の発現を阻害する方法を記述している。Ｆｉｒｅら（ＷＯ９９／３２６１９号国際公開公報）は、遺伝子発現の阻害に用いるためにある種のｄｓＲＮＡ分子を細胞内に導入するための特別の方法を記述している。Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら（ＷＯ００／０１８４６号国際公開公報）は、特定のｄｓＲＮＡ分子を用いて細胞において特別の表現型を与える原因である特定の遺伝子を同定するある種の方法を記述している。Ｍｅｌｌｏら（ＷＯ０１／２９０５８号国際公開公報）は、ｄｓＲＮＡが媒介するＲＮＡｉに関与する特定の遺伝子の同定を記述している。Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ  Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅら（ＷＯ９９／０７４０９号国際公開公報）は、ある種の抗ウィルス剤と組み合わせた特別のｄｓＲＮＡ分子からなる特定の組成物を記述している。Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（ＷＯ９９／５３０５０号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて、植物細胞における核酸の表現型の発現を減少させるある種の方法を記述している。Ｄｒｉｓｃｏｌｌら（ＷＯ０１／４９８４４号国際公開公報）は、標的生物において遺伝子サイレンシングを促進するのに用いるための特定のＤＮＡコンストラクトについて記述している。
【０００９】
ＲＮＡｉ及び遺伝子抑制系については、他にも多くの報告がなされている。例えば、Ｐａｒｒｉｓｈら（２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．，６，１０７７−１０８７）は、線虫のｕｎｃ−２２遺伝子を標的にした特定の化学修飾ｄｓＲＮＡコンストラクトについて記述している。Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ（ＷＯ０１／３８５５１号国際公開公報）は、植物におけるある種のｄｓＲＮＡを用いたポリコーム遺伝子の発現を制御するある種の方法について記述している。Ｃｈｕｒｉｋｏｖら（ＷＯ０１／４２４４３号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡを用いて生物の遺伝的特性を改変するある種の方法について記述している。Ｃｏｇｏｎｉら（ＷＯ０１／５３４７５号国際公開公報）は、アカパンカビの抑制遺伝子を単離するある種の方法及びその使用について記述している。Ｒｅｅｄら（ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報）は、植物における遺伝子を抑制するある種の方法について記述している。Ｈｏｎｅｒら（ＷＯ０１／７０９４４号国際公開公報）は、パーキンソン病のモデルとしてトランスジェニックな線虫を用い、ある種のｄｓＲＮＡを用いたある種の薬剤のスクリーニング方法について記述している。Ｄｅａｋら（ＷＯ０１／７２７７４号国際公開公報）は、ショウジョウバエにおけるＲＮＡｉに関連するかもしれないある種のショウジョウバエ由来遺伝子産物について記述している。Ａｒｎｄｔら（ＷＯ０１／９２５１３号国際公開公報）は、ＲＮＡｉを増強する因子を用いて遺伝子抑制を媒介するある種の方法について記述している。Ｔｕｓｃｈｌら（ＷＯ０２／４４３２１号国際公開公報）は、ある種の合成ｓｉＲＮＡコンストラクトについて記述している。Ｐａｃｈｕｋら（ＷＯ００／６３３６４号国際公開公報）及びＳａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎら（ＷＯ０１／０４３１３号国際公開公報）は、ある種のｄｓＲＮＡを用いてある種のポリヌクレオチド配列の機能を阻害するためのある種の方法及び組成物について記述している。Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉら（ＷＯ０２／３８８０５号国際公開公報）は、ＲＮＡｉにより同定されたある種の線虫遺伝子について記述している。Ｋｒｅｕｔｚｅｒら（ＷＯ０２／０５５６９２号国際公開公報、ＷＯ０２／０５５６９３号国際公開公報、及び欧州特許第１１４４６２３号公報）は、ＲＮＡｉを用いて遺伝子発現を阻害するある種の方法について記述している。Ｇｒａｈａｍら（ＷＯ９９／４９０２９号国際公開公報及びＷＯ０１／７０９４９号国際公開公報、及びオーストラリア特許第４０３７５０１号明細書）は、ベクターから発現されるある種のｓｉＲＮＡ分子について記述している。Ｆｉｒｅら（米国特許第６，５０６，５５９号明細書）は、ＲＮＡｉを媒介するある種の長い（２５ヌクレオチドより長い）ｄｓＲＮＡコンストラクトを用いてインビトロで遺伝子発現を阻害するためのある種の方法について記述している。Ｍａｒｔｉｎｅｚら（２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４）は、Ｈｅｌａ細胞中でＲＮＡ干渉を媒介する、５’位がリン酸化されたある種の一本鎖ｓｉＲＮＡを含むある種の一本鎖ｓｉＲＮＡコンストラクトについて記述している。Ｈａｒｂｏｒｔｈら（２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａ���ｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，８５−１０５）は、ある種の化学的に又は構造的に修飾されたｓｉＲＮＡについて記述している。Ｃｈｉｕ及びＲａｎａ（２００３，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８）は、ある種の化学的に又は構造的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子について記述している。Ｗｏｏｌｆら（ＷＯ０３／０６４６２６号及びＷＯ０３／０６４６２５号国際公開公報）は、ある種の化学的に修飾されたｄｓＲＮＡコンストラクトについて記述している。
【００１０】
【特許文献１】ＷＯ９９／６１６３１号国際公開公報
【特許文献２】米国特許第６，１０７，０９４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８９８，０３１号明細書
【特許文献４】ＷＯ０１／７５１６４号国際公開公報
【特許文献５】ＷＯ００／４４９１４号国際公開公報
【特許文献６】ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報
【特許文献７】カナダ特許出願第２，３５９，１８０号
【特許文献８】ＷＯ０１／３６６４６号国際公開公報
【特許文献９】ＷＯ９９／３２６１９号国際公開公報
【特許文献１０】ＷＯ００／０１８４６号国際公開公報
【特許文献１１】ＷＯ０１／２９０５８号国際公開公報
【特許文献１２】ＷＯ００／６３３６４号国際公開公報
【特許文献１３】ＷＯ９９／０７４０９号国際公開公報
【特許文献１４】ＷＯ９９／５３０５０号国際公開公報
【特許文献１５】ＷＯ０１／４９８４４号国際公開公報
【特許文献１６】ＷＯ０１／３８５５１号国際公開公報
【特許文献１７】ＷＯ０１／４２４４３号国際公開公報
【特許文献１８】ＷＯ０１／５３４７５号国際公開公報
【特許文献１９】ＷＯ０１／６８８３６号国際公開公報
【特許文献２０】ＷＯ０１／７０９４４号国際公開公報
【特許文献２１】ＷＯ０１／７２７７４号国際公開公報
【特許文献２２】ＷＯ０１／９２５１３号国際公開公報
【特許文献２３】ＷＯ０２／４４３２１号国際公開公報
【特許文献２４】ＷＯ００／６３３６４号国際公開公報
【特許文献２５】ＷＯ０１／０４３１３号国際公開公報
【特許文献２６】ＷＯ０２／３８８０５号国際公開公報
【特許文献２７】ＷＯ０２／０５５６９２号国際公開公報
【特許文献２８】ＷＯ０２／０５５６９３号国際公開公報
【特許文献２９】欧州特許第１１４４６２３号公報
【特許文献３０】ＷＯ９９／４９０２９号国際公開公報
【特許文献３１】ＷＯ０１／７０９４９号国際公開公報
【特許文献３２】オーストラリア特許第４０３７５０１号明細書
【特許文献３３】Ｆｉｒｅ他，米国特許第６，５０６，５５９号明細書
【特許文献３４】ＷＯ０３／０６４６２６号国際公開公報
【特許文献３５】ＷＯ０３／０６４６２５号国際公開公報
【非特許文献１】Ｚａｍｏｒｅ他，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３
【非特許文献２】Ｆｉｒｅ他，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６
【非特許文献３】Ｈａｍｉｌｔｏｎ他，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，９５０−９５１
【非特許文献４】Ｌｉｎ他，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４０２，１２８−１２９
【非特許文献５】Ｓｈａｒｐ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３：１３９−１４１
【非特許文献６】Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，８８６
【非特許文献７】Ｆｉｒｅ他，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８
【非特許文献８】Ｃｌｅｍｅｎｓ他，１９９７，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ＆  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．，１７，５０３−５２４
【非特許文献９】Ａｄａｈ他，２００１，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８，１１８９
【非特許文献１０】Ｂａｓｓ，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２３５
【非特許文献１１】Ｈａｍｍｏｎｄ他，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３
【非特許文献１２】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４
【非特許文献１３】Ｂｅｒｓｔｅｉｎ他，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３
【非特許文献１４】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８
【非特許文献１５】Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４
【非特許文献１６】Ｂａｈｒａｍｉａｎ，Ｚａｒｂｌ，１９９９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９，２７４−２８３
【非特許文献１７】Ｗｉａｎｎｙ，Ｇｏｅｔｚ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，２，７０
【非特許文献１８】Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７
【非特許文献１９】Ｎｙｋａｎｅｎ他，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９
【非特許文献２０】Ｐａｒｒｉｓｈ他，２０００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，６，１０７７−１０８７
【非特許文献２１】Ｔｕｓｃｈｌ，２００１，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５
【非特許文献２２】Ｍａｒｔｉｎｅｚ他，２００２，Ｃｅｌｌ，１１０，５６３−５７４
【非特許文献２３】Ｈａｒｂｏｒｔｈ他，２００３，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，８５−１０５
【非特許文献２４】Ｃｈｉｕ及びＲａｎａ，２００３，ＲＮＡ，９，１０３４−１０４８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を用いてコリン作動性ムスカリン受容体遺伝子発現を調節するために有用な化合物、組成物、及び方法に関する。また、本発明は、短鎖核酸分子を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、コリン作動性ムスカリン受容体の遺伝子の発現及び／又は活性経路に関与する他の遺伝子の発現及び活性を調節するために有用な化合物、組成物、及び方法に関する。特に、本発明は、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、及び短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の短鎖核酸分子、及びコリン作動性ムスカリン受容体（ＣＨＲＭ３等）遺伝子の発現を調節するために用いられる方法を特徴とする。
【００１２】
本発明のｓｉＮＡは、非修飾又は化学修飾されていてもよい。本発明のｓｉＮＡは、化学合成され、ベクターから発現され、又は酵素的に合成されていてもよい。本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による、細胞におけるコリン作動性ムスカリン受容体遺伝子の発現又は活性を調節することが可能な、種々の化学的修飾された合成の短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子をも特徴とする。化学修飾ｓｉＮＡの使用は、インビボでのヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大及び／又は細胞摂取の増大によって天然のｓｉＮＡ分子の種々の特性を改善する。さらに、以前の公表された研究に反して、複数の化学修飾を有するｓｉＮＡは、そのＲＮＡｉ活性を保持する。本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の治療、診断、標的の確認、ゲノム発見、遺伝子操作、及びファーマコゲノミクスへの応用に有用な試薬及び方法を提供する。
【００１３】
１つの実施形態において、本発明は、呼吸器及び／又は肺疾患、異常又は症状の維持及び／又は発展に関与するコリン作動性ムスカリン受容体を含むタンパク質等のタンパク質をコードしている、表１に示したＧｅｎＢａｎｋ受入番号で表され、本明細書において「コリン作動性ムスカリン受容体」と呼ばれる配列を含む配列をコードしている、コリン作動性ムスカリン受容体遺伝子の発現を、独立して、又は組み合わさって調節する、１種又は複数種類のｓｉＮＡ分子及び方法を特徴とする。本発明の態様や実施形態に関する以下の説明は、本明細書においてＣＨＲＭ３と呼ばれる例示的なＭ３ムスカリン性アセチルコリン受容体遺伝子に関連してなされる。しかし、様々な態様及び実施形態は、ホモログ遺伝子及びＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ４、又はＣＨＲＭ５、及びある種のＣＨＲＭ３遺伝子に関連する多型（一塩基多型（ＳＮＰｓ）等）を含む転写変異体等の他のムスカリン性アセチルコリン受容体遺伝子をも対象とするものである。同様に、様々な態様及び実施形態は、例えば、本明細書に述べたような形質、疾患若しくは症状の維持及び進展に関与している、ＣＨＲＭ３に媒介される信号変換又は遺伝子発現に関与している他の遺伝子をも対象とするものである。これらの標的遺伝子は、本明細書中でＣＨＲＭ３遺伝子について述べた方法を用いて、標的部位について解析することができる。したがって、他の遺伝子の調節及びそのような調節の効果については、本明細書の記載に基づき実施、決定及び測定することができる。
【００１４】
１つの実施形態において、本発明はＣＨＲＭ３遺伝子の発現を減少させる、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とするが、前記ｓｉＮＡは、約１５〜約２８塩基対を有する。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導く、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、前記二本鎖は第１及び第２の分子鎖を有し、ｓｉＮＡのそれぞれの分子鎖は約１８〜約２８ヌクレオチドの長さを有し、ｓｉＮＡの第１の分子鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導くのに適したＣＨＲＭ３  ＲＮＡに対する相補性を有するヌクレオチド配列を有しており、前記ｓｉＮＡ分子の第２の分子鎖は、第１の分子鎖に相補的なヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
１つの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導く、二本鎖は第１及び第２の分子鎖を有し、ｓｉＮＡのそれぞれの分子鎖は約１８〜約２３ヌクレオチドの長さを有し、ｓｉＮＡの第１の分子鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導くのに適したＣＨＲＭ３  ＲＮＡに対する相補性を有するヌクレオチド配列を有しており、前記ｓｉＮＡ分子の第２の分子鎖は、第１の分子鎖に相補的なヌクレオチド配列を有する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００１７】
１つの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導く、二本鎖は第１及び第２の分子鎖を有し、ｓｉＮＡのそれぞれの分子鎖は約１８〜約２８ヌクレオチドの長さを有し、ｓｉＮＡの第１の分子鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導くのに適したＣＨＲＭ３  ＲＮＡに対する相補性を有するヌクレオチド配列を有しており、前記ｓｉＮＡ分子の第２の分子鎖は、第１の分子鎖に相補的なヌクレオチド配列を有する、化学的に合成された二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００１８】
１つの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導く、二本鎖は第１及び第２の分子鎖を有し、ｓｉＮＡのそれぞれの分子鎖は約１８〜約２３ヌクレオチドの長さを有し、ｓｉＮＡの第１の分子鎖は、該ｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉によるＣＨＲＭ３  ＲＮＡを破壊に導くのに適したＣＨＲＭ３  ＲＮＡに対する相補性を有するヌクレオチド配列を有しており、前記ｓｉＮＡ分子の第２の分子鎖は、第１の分子鎖に相補的なヌクレオチド配列を有する、化学的に合成された二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００１９】
１つの実施形態において、本発明は、例えばＣＨＲＭ３をコードする配列を有するＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御するｓｉＮＡ分子を特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、例えばＣＨＲＭ３の遺伝子間領域又は調節要素をコードする配列を有するＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御するｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００２０】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、配列の相同性を共有するＣＨＲＭ３遺伝子又はＣＨＲＭ３遺伝子ファミリーの発現を阻害するのに用いられる。そのような配列の相同性は、例えば配列アラインメント等の公知の方法により同定することができる。ｓｉＮＡ分子は、例えば完全に相補的な配列、又は、ミスマッチ及び／又は他の配列をも標的とすることが可能なゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）塩基対等の非正準塩基対を用いて、そのような相同な配列を標的とするようにデザインすることができる。ミスマッチが同定された場合においては、複数の遺伝子配列を標的とするｓｉＮＡ分子を生成するために非正準塩基対（例えば、ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対）を用いることができる。限定されない例においては、ＵＵ及びＣＣ塩基対等の非正準塩基対を用いて、配列の相同性を共有するＣＨＲＭ３標的とは異なる配列（ＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ４、又はＣＨＲＭ５等）を標的とすることのできるｓｉＮＡ分子を生成している。そのように、本発明のｓｉＮＡ分子を用いることの利点は、相同な遺伝子の間で保存されているヌクレオチド配列に相補的な配列を包含する単一のｓｉＮＡをデザインすることが可能であることである。このようなアプローチによると、異なる遺伝子を標的とするために複数のｓｉＮＡ分子を用いる代わりに、１つのｓｉＮＡを用いて複数の遺伝子の発現を阻害することが可能である。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３をコードする、表１に示すＧｅｎｂａｎｋ受入番号を有する配列等の配列を有する任意のＲＮＡに対して相補的な配列を有する、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡに対しＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。他の実施形態において、本発明は、  例えば、表１には示されていないが、呼吸器及び肺疾患、病変、及び／又は症状の維持及び／又は進展に関与していることが知られている他の変異型ＣＨＲＭ３遺伝子等の、ＣＨＲＭ３をコードする異なる配列を有するＲＮＡに対して相補的な配列を有する、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡに対しＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。表３及び表４又は本明細書において別途示すような化学修飾を、任意の本発明に係るｓｉＮＡコンストラクトに対して適用することができる。他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３遺伝子の配列と相互作用することができ、それによって、例えば、該ｓｉＮＡ分子がＣＨＲＭ３遺伝子のクロマチン構造又はメチル化パターンを調節する細胞過程を介してＣＨＲＭ３遺伝子発現の制御に介在し、ＣＨＲＭ３遺伝子の転写を阻害することにより、ＣＨＲＭ３の遺伝子発現の抑制を媒介するヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３ハプロタイプ多型に由来し、疾患や症状（呼吸器及び肺疾患、病変及び／又は症状）に関連するＣＨＲＭ３タンパク質の発現を下方制御又は阻害するために用いられる。ＣＨＲＭ３遺伝子、ＣＨＲＭ３タンパク質又はＲＮＡレベルの解析は、そのような多型を有する被験者又は本明細書で述べた形質、症状又は疾患の進展のリスクを有する被験者の特定に用いることができる。これらの被験者は、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子及び他の任意のＣＨＲＭ３遺伝子の発現に関連する疾患の治療に有用な組成物を用いた治療等の治療の影響を受けやすい。このように、ＣＨＲＭ３タンパク質又はＲＮＡレベルの解析を、被験者の治療における治療法の種類及び治療方針の決定に用いることができる。ＣＨＲＭ３タンパク質やＲＮＡのレベルをモニターすることを、治療効果の予測及び体調、症状、又は疾患に関連するある種のＣＨＲＭ３タンパク質のレベル及び／又は活性を調節する化合物及び組成物の有効性を決定するために用いることができる。
【００２３】
１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子はＣＨＲＭ３タンパク質をコードするヌクレオチド配列又はその一部に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖を有する。ｓｉＮＡは、さらにセンス鎖を有しており、前記センス鎖は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域を有する。前記ｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列を有するセンス領域をさらに有する。
【００２５】
他の実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域にＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するｓｉＮＡを特徴とする。他の実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３遺伝子配列又はその一部を有する配列に相補的な、例えばｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域等の領域を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００２６】
１つの実施形態において、ＣＨＲＭ３に対するｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域は、配列番号１〜９９、１９９〜２１４、２２３〜２３０、２３９〜２４６、２５５〜２６２、２７１〜２７８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、又は３１９のいずれかを有する配列と相補的な配列を有する。１つの実施形態において、ＣＨＲＭ３コンストラクトのアンチセンス領域は、配列番号１００〜１９８、２１５〜２２２、２３１〜２３８、２４７〜２５４、２６３〜２７０、２７９〜３０２、３０４、３０６、３０８、３１１、３１３、３１５、３１７、又は３２０のいずれかを有する配列と相補的な配列を有する。他の実施形態において、ＣＨＲＭ３コンストラクトのセンス領域は、配列番号１〜９９、１９９〜２１４、２２３〜２３０、２３９〜２４６、２５５〜２６２、２７１〜２７８、３０３、３０５、３０７、３０９、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、又は３１９のいずれかを有する配列と相補的な配列を有する。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、配列番号１〜３２０のいずれかを有する配列を有する。配列番号１〜３２０で表される配列は、これに制限されるものではない。本発明のｓｉＮＡ分子任意の連続的ＣＨＲＭ３配列（例えば、約１５〜約２５個、又は約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個の連続的ＣＨＲＭ３ヌクレオチド）を含んでいてもよい。
【００２８】
さらに異なる実施形態において、本発明は、配列、例えば、表１に示されているＧｅｎｂａｎｋ受入番号によって表される配列を含む配列又は配列の一部と相補的なｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。表３及び４並びに本明細書中に記載された化学修飾を、本発明の任意のｓｉＲＮＡコンストラクトに適用することができる。
【００２９】
本発明の１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖は、ＣＨＲＭ３タンパク質をコードするＲＮＡ配列に相補的であり、前記ｓｉＮＡは、さらに約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有するセンス鎖を含み、前記センス鎖及び前記アンチセンス鎖は、少なくとも約１５の相補的ヌクレオチドを有する別々のヌクレオチド配列である。
【００３０】
本発明の別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有するアンチセンス領域を含み、ここで、アンチセンス領域はＣＨＲＭ３タンパク質をコードするＲＮＡ配列に相補的であり、前記ｓｉＮＡはさらに約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）個のヌクレオチドを有するセンス領域を含み、ここで、前記センス領域及び前記アンチセンス領域は、少なくとも約１５の相補的ヌクレオチドを有する直鎖状分子を含む。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３遺伝子にコードされたＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。ＣＨＲＭ３遺伝子は互いにある程度の配列ホモロジーを共有することができるため、異なるＣＨＲＭ３標的の間で共有されているか、又は特定のＣＨＲＭ３標的にユニークである配列を選択することにより、一群のＣＨＲＭ３遺伝子（及び関連するレセプター又はリガンド遺伝子）又は特定のＣＨＲＭ３遺伝子を標的とするようｓｉＮＡ分子を設計することができる。したがって、１つの実施形態においては、ｓｉＮＡ分子は、１つのｓｉＮＡ分子でいくつかのＣＨＲＭ３遺伝子（例えば、異なるＣＨＲＭ３アイソフォーム、スプライシング変種、変異体遺伝子等）を標的とするように、いくつかのＣＨＲＭ３遺伝子の間でホモロジーを有するＣＨＲＭ３  ＲＮＡ配列の保存領域を標的とするよう設計することができる。したがって、１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、被験者においてＣＨＲＭ３対立遺伝子の一方又は両方の発現を媒介する。他の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を媒介するためには高度の特異性を必要とするため、ｓｉＮＡ分子は特定のＣＨＲＭ３  ＲＮＡ配列にユニークである配列を標的とするよう設計することができる。
【００３２】
１つの実施形態において、ＲＮＡ干渉遺伝子抑制応答のメディエータとして作用する本発明の核酸分子は、二本鎖核酸分子である。別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間に約１９塩基対を含む二本鎖から構成される。さらに他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は約１〜約３（例えば、約１、２、又は３）ヌクレオチドの突出末端を有するデュープレックス、例えば、約１９塩基対及び３’末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、又はトリヌクレオチド突出を有する約２１のヌクレオチドの二本鎖を含む。さらに別の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、両末端が平滑である、あるいは一方の末端が平滑である、平滑末端を有する二本鎖核酸分子を有する。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３をコードするＲＮＡ等の、ＣＨＲＭ３を発現する核酸分子に特異性を有する、１又は複数の化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを特徴とする。１つの実施形態において、本発明は、本明細書に述べたような１又は複数の化学修飾を含む、ＣＨＲＭ３を発現する核酸に対する特異性を有する、ＲＮＡをベースとするｓｉＮＡ分子（２’−ＯＨヌクレオチドを有するｓｉＮＡ等）を特徴とする。そのような化学的修飾の非限定的な例には、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「万能塩基」ヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、及び末端グリセリル及び／又は逆位デオキシ無塩基残基を取り込むことが含まれるが、これらに限定されない。これらの化学的修飾は、種々のｓｉＮＡコンストラクト中で用いた場合、細胞においてＲＮＡｉ活性を保ち、同時に、これらの化合物の血清安定性を劇的に増加させることが示されている。さらに、Ｐａｒｒｉｓｈら（上掲）により公表されたデータに反して、本発明においては、多数（２以上）のホスホロチオエートへの置換が充分に許容され、修飾ｓｉＮＡコンストラクトの血清安定性を実質的に増加させることが示される。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを用いて、インビトロ又はインビボでの特性、例えば安定性、活性、及び／又は生物利用性を改良することができる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数のパーセンテージとして修飾ヌクレオチドを含むことができる。すなわち、本発明のｓｉＮＡ分子は、一般に、約５％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％修飾を受けたヌクレオチド）を含んでいてもよい。所定のｓｉＮＡ分子中に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、ｓｉＮＡ中に存在するヌクレオチドの総数によって異なるであろう。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合、修飾率は一本鎖ｓｉＮＡ分子中に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合、修飾率は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことができる。
【００３５】
本発明の１つの実施形態は、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する二本鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。１つの実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、１又は複数の化学修飾を有し、二本鎖ｓｉＮＡのそれぞれの分子鎖は、約２１ヌクレオチドの長さを有する。１つの実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含まない。他の実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子は、１又は複数のリボヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各々の分子鎖は、それぞれ独立して約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有し、それぞれの分子鎖は、他の分子鎖のヌクレオチドに相補的な約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の分子鎖は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有し、前記二本鎖ｓｉＮＡ分子の第２の分子鎖は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列とほぼ同一なヌクレオチド配列を有する。
【００３６】
他の実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御し、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有しているアンチセンス領域、及びＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列とほぼ同一なヌクレオチド配列を有しているセンス領域とを有する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、アンチセンス領域及びセンス領域は、それぞれ独立して約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有しており、アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドと相補的な、約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有する。
【００３７】
他の実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する、センス領域及びアンチセンス領域を有し、前記アンチセンス領域は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部によりコードされたヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有し、前記センス領域は、前記アンチセンス領域と相補的なヌクレオチド配列を有する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００３８】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端（突出ヌクレオチドを含まない末端）を有する。例えば、本明細書に記載した修飾（式Ｉ〜ＶＩＩで表される構造を有するヌクレオチド若しくは「Ｓｔａｂ００」〜「Ｓｔａｂ３２」（表４）ｓｉＮＡコンストラクト又はこれらの任意の組み合わせ（表４参照）等）及び／又は本明細書に記載された任意の長さを有するｓｉＮＡ分子は、平滑末端、すなわち突出ヌクレオチドを有しない末端を有していてもよい。
【００３９】
１つの実施形態において、任意の本発明のｓｉＮＡ分子は、１又は複数の平滑末端（突出ヌクレオチドを有しない末端）を含んでいてもよい。１つの実施形態において、平滑末端を有するｓｉＮＡ分子は、前記ｓｉＮＡ分子の各分子鎖に存在するヌクレオチドの数と同数の塩基対を有する。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、例えばアンチセンス鎖の５’−末端及びセンス鎖の３’−末端に突出ヌクレオチドを有しておらず、一方の末端のみに平滑末端を有する。他の例においては、ｓｉＮＡ分子は、例えばアンチセンス鎖の３’−末端及びセンス鎖の５’−末端に突出ヌクレオチドを有しておらず、一方の末端のみに平滑末端を有する。他の例においては、ｓｉＮＡ分子は、アンチセンス鎖の３’−末端及びセンス鎖の５’−末端にもアンチセンス鎖の５’−末端及びセンス鎖の３’−末端にも突出ヌクレオチドを有しておらず、両方の末端に平滑末端を有する。平滑末端を有するｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）を有していてもよい。平滑末端を有するｓｉＮＡ分子に存在する他のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の活性を調節することによりＲＮＡ干渉を媒介するために、例えば、ミスマッチ、バルジ、ループ、又はゆらぎ塩基対を有していてもよい。
【００４０】
「平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ（ｓ））」とは、対称的な末端又は突出ヌクレオチドを有しない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。二本鎖ｓｉＮＡ分子中の２本の分子鎖は、末端に突出ヌクレオチドを生じないように互いに配置されている。例えば、平滑末端を有するｓｉＮＡコンストラクトは、前記ｓｉＮＡ分子のセンス及びアンチセンス領域の間で相補的な末端ヌクレオチドを有している。
【００４１】
１つの実施形態において、本発明は、第１の断片がｓｉＮＡ分子のセンス領域を構成し、第２の断片がｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を構成する２つの別個のヌクレオチド断片から構成される、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。センス領域は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス領域に結合されていてもよい。
【００４２】
１つの実施形態において、本発明は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）塩基対を有し、ｓｉＮＡ分子の個々の分子鎖が１又は複数の化学修飾を有する、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。他の実施形態において、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の１つの分子鎖は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有しており、前記ｓｉＮＡ分子の第２の分子鎖は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列とほぼ同一なヌクレオチド配列を有している。他の実施形態において、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の分子鎖の一方は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有しており、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の第２の分子鎖は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列とほぼ同一なヌクレオチド配列を有している。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの分子鎖は、少なくとも約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有し、それぞれの分子鎖は、他の分子鎖と相補的な少なくとも約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有する。ＣＨＲＭ３遺伝子は、例えば表１に示したような配列を有していてもよい。
【００４３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。
【００４４】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含む。
【００４５】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス領域を有しており、前記ｓｉＮＡ分子は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部のヌクレオチド配列とほぼ同一なヌクレオチド配列を有するセンス領域をさらに有している。他の実施形態において、アンチセンス領域及びセンス領域は、それぞれ約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有しており、アンチセンス領域は、センス領域のヌクレオチドと相補的な少なくとも約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有している。ＣＨＲＭ３遺伝子は、例えば表１に示したような配列を有していてもよい。他の実施形態において、ｓｉＮＡは、二本鎖を有する核酸分子であり、前記ｓｉＮＡ分子の２本の分子鎖は、それぞれ独立して約１５〜約４０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個）のヌクレオチドを有しており、前記ｓｉＮＡ分子の１本の分子鎖は、少なくとも約１５個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個、又はそれ以上）の、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部の核酸配列と相補的なヌクレオチドを有する。
【００４６】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有しており、アンチセンス領域は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部によってコードされているＲＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有しており、センス領域は、アンチセンス領域と相補的なヌクレオチド配列を有している。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、第１の断片がｓｉＮＡ分子のセンス領域を構成し、第２の断片がｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を構成する２つの別個のヌクレオチド断片から構成されている。他の実施形態において、センス領域は、リンカー分子を介してアンチセンス領域に結合されている。他の実施形態において、センス領域は、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス領域に結合されている。ＣＨＲＭ３遺伝子は、例えば表１に示したような配列を有していてもよい。
【００４７】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を有し、アンチセンス領域は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列を有しており、センス領域は、アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有しており、前記ｓｉＮＡ分子は、１又は複数の修飾されたピリミジン及び／又はプリンヌクレオチドを有している、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。他の実施形態において、センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。他の実施形態において、センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。１つの実施形態において、アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシプリンヌクレオチドである。上述した任意のｓｉＮＡ分子の他の実施形態においては、センス鎖の非相補的領域（突出領域）に存在する任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
【００４８】
１つの実施形態において、本発明は、第１の断片がｓｉＮＡ分子のセンス領域を構成し、第２の断片がｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を構成する２つの別個のヌクレオチド断片から構成され、前記断片は、５’−末端、３’−末端、又は前記末端の５’及び３’末端の両者に末端キャップ残基を有する、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。１つの実施形態において、末端キャップ残基は、逆位デオキシ脱塩基残基又はグリセリル残基である。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の２つの断片は、それぞれ独立して約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを有している。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の２つの断片は、それぞれ独立して約１５〜約４０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個）のヌクレオチドを有している。非限定的な例において、ｓｉＮＡ分子の２つの断片は、それぞれ約２１個のヌクレオチドを有する。
【００４９】
１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを有し、前記修飾されたヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドであるｓｉＮＡ分子を特徴とする。ｓｉＮＡは、例えば、約１５〜約４０ヌクレオチドの長さを有していてもよい。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中の修飾されたヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ｓｉＮＡ中の修飾されたヌクレオチド少なくとも１つの２’−フルオロシチジン及び少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのシチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのアデノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのグアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは、少なくとも１つの、ホスホロチオエートリンカー基等の修飾されたヌクレオチド間結合基をさらに有していてもよい。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを有する部位等の、リボヌクレアーゼによる切断を受けやすい、ｓｉＮＡ中の特に選択された部位に存在する。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子に少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを導入することを含み、前記修飾されたヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである、リボヌクレアーゼによる分解に対するｓｉＮＡ分子の安定性を向上させる方法を特徴とする。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中の収縮されたヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシチジン又は２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。他の実施形態において、ｓｉＮＡ中の修飾されたヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−フルオロシチジン及び２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのウリジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのシチジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのアデノシンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ中に存在する全てのグアノシンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡは、少なくとも１つの、ホスホロチオエートリンカー基等の修飾されたヌクレオチド間結合基をさらに有していてもよい。１つの実施形態において、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを有する部位等の、リボヌクレアーゼによる切断を受けやすい、ｓｉＮＡ中の特に選択された部位に存在する。
【００５１】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域及びアンチセンス領域を有し、アンチセンス領域は、ＣＨＲＭ３遺伝子又はその一部にコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有し、センス領域は、アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有し、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを有する、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。異なる実施形態において、アンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを有する。上記の実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合基を前記アンチセンス領域の３’末端に有していてもよい。あるいは、上記のいの実施形態のいずれにおいても、アンチセンス領域は、グリセリル基による修飾を前記アンチセンス領域の３’末端に有していてもよい。上述のｓｉＮＡ分子のいずれとも異なる他の実施形態において、アンチセンス鎖の非相補的領域（突出領域）に存在する任意のヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
【００５２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患に特異的な対立遺伝子に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を有する配列等の、特定の疾患に関連するＣＨＲＭ３の対立遺伝子に特有な配列を有する、ＣＨＲＭ３転写産物の一部と相補的な配列を有する。そのように、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患、症状、又は形質に関連する対立遺伝子に対する選択的なＲＮＡｉを媒介する上で特異性を付与するために、特定の対立遺伝子に特有な配列に相補的な配列を有していてもよい。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、第１の断片がｓｉＮＡ分子のセンス領域を構成し、第２の断片がｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を構成する２つの別個のヌクレオチド断片から構成される、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、二本鎖を有する核酸分子であって、それぞれの分子鎖は、約２１ヌクレオチドの長さであり、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの断片の約１９個のヌクレオチドは、前記ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補的なヌクレオチドと塩基対を形成しており、前記ｓｉＮＡ分子のそれぞれの断片の少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片のヌクレオチドと塩基対を形成していない。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、二本鎖を有する核酸分子であって、，それぞれの分子鎖は約１９ヌクレオチドの長さであり、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの断片のヌクレオチドは、前記ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補的なヌクレオチドと、少なくとも約１５（例えば、約１５、１６、１７、１８、又は１９）対の塩基対を形成しており、前記ｓｉＮＡ分子の片方又は両方の末端は、平滑末端である。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子のそれぞれの断片のヌクレオチドにおける、２つの３’末端のそれぞれは、２’−デオキシ−チミジン等の２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。他の実施形態において、ｓｉＮＡのそれぞれの断片における全てのヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片の相補的なヌクレオチドと塩基対を形成している。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、約１９〜約２５塩基対を有し、センス領域及びアンチセンス領域を有する、二本鎖を有する核酸分子であって、アンチセンス領域の約１９個のヌクレオチドは、ＣＨＲＭ３遺伝子にコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成している。他の実施形態において、アンチセンス領域の約２１ヌクレオチドは、ＣＨＲＭ３遺伝子にコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成している。上述の全ての実施形態において、前記アンチセンス領域を構成する断片の５’−末端は、必要に応じてリン酸基を含んでいてもよい。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡの配列（例えば、前記標的ＲＮＡ配列は、ＣＨＲＭ３経路に関与しているＣＨＲＭ３遺伝子によりコードされている）の発現を阻害し、リボヌクレオチドを含まず、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子のそれぞれの分子鎖は約１５〜約３０個のヌクレオチドを有する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、２１ヌクレオチドの長さを有する。非リボヌクレオチドを含むｓｉＮＡコンストラクトの例は、表４に示した安定な組み合わせを必要に応じて組み合わせた、Ｓｔａｂ７／８、Ｓｔａｂ７／１１、Ｓｔａｂ８／８、Ｓｔａｂ１８／８、Ｓｔａｂ１８／１１、Ｓｔａｂ１２／１３、Ｓｔａｂ７／１３、Ｓｔａｂ１８／１３、Ｓｔａｂ７／１９、Ｓｔａｂ８／１９、Ｓｔａｂ１８／１９、Ｓｔａｂ７／２０、Ｓｔａｂ８／２０、Ｓｔａｂ１８／２０、Ｓｔａｂ７／３２、Ｓｔａｂ８／３２、又はＳｔａｂ１８／３２（例えば、Ｓｔａｂ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、又は３２のセンス若しくはアンチセンス鎖又はそれらの任意の組み合わせを有する任意のｓｉＮＡ）等、必要に応じて組み合わせたセンス／アンチセンスの組み合わせ等の、任意の組み合わせである。
【００５５】
１つの実施形態において、本発明は、ＲＮＡ干渉によりＣＨＲＭ３  ＲＮＡを切断に導く、化学合成された、二本鎖を有するＲＮＡ分子で、前記ＲＮＡ分子の分子鎖は、それぞれ約１５〜約３０ヌクレオチドの長さを有し、前記ＲＮＡ分子の一方の分子鎖は、前記ＲＮＡ分子がＲＮＡ干渉によりＣＨＲＭ３  ＲＮＡを切断に導くために十分なＣＨＲＭ３  ＲＮＡに対する相補性を有するヌクレオチド配列を有し、前記ＲＮＡ分子の少なくとも１つの分子鎖は、必要に応じて、デオキシヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオチド等が挙げられるがこれらに限定されない１又は複数の本明細書に記載の化学修飾されたヌクレオチドを有するＲＮＡ分子を特徴とする。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む薬剤を特徴とする。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む有効成分を特徴とする。
【００５８】
１つの実施形態において、本発明は、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子で、前記ｓｉＮＡ分子は、１又は複数の化学修飾を有し、前記二本鎖を有するｓｉＮＡの分子鎖は、それぞれ独立して、約１５〜約３０又はそれ以上（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０、又はそれ以上）ヌクレオチドの長さを有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現阻害、下方制御、又は減少させるために使用することを特徴とする。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、１又は複数の化学修飾を有する二本鎖を有する核酸分子で、前記ｓｉＮＡ分子中の２つの断片は、それぞれ独立して約１５〜約４０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０個）のヌクレオチドを有し、分子鎖のうち１つは、ＣＨＲＭ３をコードするＲＮＡ又はその一部と相補的な、少なくとも１５個のヌクレオチドを有する。非限定的な例において、ｓｉＮＡ分子の２つの断片はそれぞれ約２１個のヌクレオチドを有する。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、１又は複数の化学修飾を有し、それぞれの分子鎖は約２１ヌクレオチドの長さであり、前記ｓｉＮＡ分子の各断片のうち約１９個のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片にある相補的なヌクレオチドと塩基対を形成しており、ｓｉＮＡ分子の各断片における両３’末端にある少なくとも２つのヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片にあるヌクレオチドと塩基対を形成していない、二本鎖を有する核酸分子である。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、１又は複数の化学修飾を有し、それぞれの分子鎖は、約１９ヌクレオチドの長さであり、ｓｉＮＡ分子の個々の断片にあるヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片にある相補的なヌクレオチドと塩基対を形成し、少なくとも約１５（例えば、約１５、１６、１７、１８、又は１９）の塩基対を形成しており、ｓｉＮＡ分子の両方又は片方の末端が平滑末端である、二本鎖を有する核酸分子である。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の個々の断片における２つの３’末端ヌクレオチドは、２’−デオキシ−チミジン等の２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の個々の断片における全てのヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の断片にある相補的なヌクレオチドと塩基対を形成している。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有し、１又は複数の化学修飾を有しており、アンチセンス領域の約１９個のヌクレオチドは、ＣＨＲＭ３遺伝子にコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成している、約１９〜約２５塩基対の、二本鎖を有する核酸分子である。他の実施形態において、アンチセンス領域の約２１個のヌクレオチドは、ＣＨＲＭ３遺伝子にコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列又はその一部と塩基対を形成している。上述の全ての実施形態において、前記アンチセンス領域を構成する断片の５’−末端は、必要に応じてリン酸基を含んでいてもよい。
【００５９】
１つの実施形態において、本発明は、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の分子鎖のうち１つは、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり、他方の分子鎖は、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり、前記二本鎖を有するｓｉＮＡに存在する大多数のピリミジンヌクレオチドが糖の化学修飾を有する、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を阻害、下方制御し、又は減少させる、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とする。
【００６０】
１つの実施形態において、本発明は、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の分子鎖の一方は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり、他方の分子鎖は、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するセンスであり、前記二本鎖を有するｓｉＮＡに存在する大多数のピリミジンヌクレオチドが糖の化学修飾を有する、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を阻害、下方制御し、又は減少させる、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００６１】
１つの実施形態において、本発明は、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の分子鎖の一方は、タンパク質又はその一部をコードするＣＨＲＭ３  ＲＮＡのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり、他の分子鎖は、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子中に存在する大多数のピリミジンヌクレオチド糖の化学修飾を有する、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を阻害、下方制御し、又は減少させる、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の個々の分子鎖は、約１５〜約３０又はそれ以上（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０、又はそれ以上）のヌクレオチドを有し、個々の分子鎖は、他の分子鎖のヌクレオチドと相補的な少なくとも約１５のヌクレオチドを有する。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子は、第１の断片がｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域のヌクレオチド配列を有し、第２の断片がｓｉＮＡ分子のセンス領域のヌクレオチド配列を有する、２つのヌクレオチド断片から構成される。１つの実施形態において、センス鎖は、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス鎖に接続されている。さらなる実施形態において、センス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。他の実施形態において、センス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、アンチセンス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖内に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、１又は複数の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド及び１又は複数の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖内に存在するピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖内に存在する任意のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。さらなる実施形態において、センス鎖は、末端のキャップ基（例えば、逆位デオキシ脱塩基残基又は逆位チミジン等の逆位デオキシヌクレオチド残基）を、センス鎖の５’−末端、３’−末端、又は５’及び３’−末端の両者に有する、３’−末端及び５’−末端を有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を、アンチセンス鎖の３’末端に有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、グリセリル修飾基を３’末端に有する。他の実施形態において、アンチセンス鎖の５’−末端は、必要に応じてリ���酸基を有する。
【００６２】
ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を阻害する二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の上述の任意の実施形態において、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子中に存在する大多数のピリミジンヌクレオチドは、糖の化学修飾を有しており、ｓｉＮＡ分子の２本の分子鎖はそれぞれ、約１５〜約３０個又はそれ以上（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個、又はそれ以上）のヌクレオチドを有していてもよい。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の個々の分子鎖中の約１５〜約３０個又はそれ以上（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個、又はそれ以上）のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の分子鎖にある相補的なヌクレオチドと塩基対を形成している。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の個々の分子鎖の約１５〜約３０個又はそれ以上（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個、又はそれ以上）のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の分子鎖にある相補的なヌクレオチドと塩基対を形成しており、ｓｉＮＡ分子の個々の分子鎖の少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子の他の分子鎖にあるヌクレオチドと塩基対を形成していない。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子の各断片の２つの３’末端ヌクレオチドは、それぞれ、２’−デオキシ−チミジン等の２’−デオキシ−ピリミジンである。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の個々の分子鎖は、ｓｉＮＡ分子の他の分子鎖の相補的なヌクレオチドと塩基対を形成している。１つの実施形態において、アンチセンス鎖の約１５〜約３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドは、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と塩基対を形成している。１つの実施形態において、アンチセンス鎖の約１８〜約２５個（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個）のヌクレオチドは、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と塩基対を形成している。
【００６３】
１つの実施形態において、本発明は、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の分子鎖の一方は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なアンチセンス鎖であり、他の分子鎖は、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子中に存在する大多数のピリミジンヌクレオチドは、糖の化学修飾を有し、アンチセンス領域を構成する断片の５’−末端は、必要に応じてリン酸基を含んでいる、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を阻害する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明は、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の分子鎖の一方は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり、他の分子鎖は、前記アンチセンス鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子中に存在する大多数のピリミジンヌクレオチドは、糖の化学修飾を有し、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列又はその一部は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡの非翻訳領域又はその一部のヌクレオチド配列と相補的である、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を阻害する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明は、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子の分子鎖の一方は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖であり、他の分子鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するセンス鎖であり、二本鎖を有するｓｉＮＡ分子中に存在する大多数のピリミジンヌクレオチドは、糖の化学修飾を有し、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ中に存在するＣＨＲＭ３  ＲＮＡ又はその一部のヌクレオチド配列と相補的である、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を阻害する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容される担体又は希釈剤中に含む組成物を特徴とする。
【００６７】
非限定的な例において、化学修飾されたヌクレオチドを核酸分子中に導入すると、体外から投与された天然のＲＮＡ分子に固有の、インビボでの安定性及び生体利用性に関する潜在的な制限を克服した強力なツールがもたらされる。例えば、化学修飾された核酸分子は、血清中でより長い半減期を有する傾向にあるため、化学修飾された核酸分子の使用により、所定の治療効果のために必要な特定の核酸分子の投与量を減少させることが可能になる。さらに、ある種の化学修飾により、特定の細胞又を標的とし、かつ／又は核酸分子の細胞への取り込みを増大させることにより、核酸分子の生体利用性を増大させることができる。したがって、化学修飾された核酸分子の活性が、天然の核酸分子と比較して、例えば、全長ＲＮＡ分子と比較して低い場合であっても、修飾された核酸分子の全体としての活性は、改善された安定性及び／又は分子の取り込み量のために、天然の分子のそれよりも高くなることもありうる。天然の非修飾ｓｉＮＡと異なり、化学修飾されたｓｉＮＡにおいては、ヒトにおけるインターフェロン活性を賦活する可能性を最低限にとどめることもできる。
【００６８】
本明細書に記載の任意のｓｉＮＡ分子の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の３’−末端に含んでいてもよい。本明細書に記載の任意のｓｉＮＡ分子の実施形態において、アンチセンス領域は、約１〜約５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の５’−末端に含んでいてもよい。本明細書に記載の任意のｓｉＮＡ分子の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の３’−末端ヌクレオチド突出は、糖、塩基、又は骨格が化学修飾されたリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書に記載の任意のｓｉＮＡ分子の実施形態において、３’−末端ヌクレオチド突出は、１又は複数の万能塩基リボヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書に記載の任意のｓｉＮＡ分子の実施形態において、３’−末端ヌクレオチド突出は１又は複数の非環状ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００６９】
本発明の１つの実施形態は、少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子を、核酸分子が発現可能な態様でコードする核酸配列を有する発現ベクターを提供する。本発明の他の実施形態は、そのような発現ベクターを有する哺乳類細胞を提供する。前記哺乳類細胞はヒト細胞であってもよい。発現ベクターのｓｉＮＡ分子は、センス領域及びアンチセンス領域を有していてもよい。アンチセンス領域は、ＣＨＲＭ３をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ配列と相補的な配列を有していてもよく、センス領域は、アンチセンス領域に相補的な配列を有していてもよい。ｓｉＮＡ分子は、相補的なセンス及びアンチセンス領域を有する２つの個別の分子鎖を有していてもよい。ｓｉＮＡ分子は、相補的なセンス及びアンチセンス領域を有する単一の分子鎖を有していてもよい。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明は、細胞内又は再構成されたインビトロ系において、ＣＨＲＭ３に対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することが可能で、前記化学修飾は、１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の）、式Ｉで表される骨格修飾ヌクレオチド間結合を有するヌクレオチドを有する、化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【化１】
2007525206.tif 000002
式中、Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、天然起源であっても化学修飾されたものであってもよい任意のヌクレオチド、非ヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを表し、Ｘ及びＹは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、又は置換アルキルを表し、Ｚ及びＷは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、又はアセチルを表し、必要に応じて、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺの全てがＯであることはない。他の実施形態において、本発明の骨格の修飾は、ホスホノアセテート及び／又はチオホスホノアセテートヌクレオチド間結合を含む（例えば、Ｓｈｅｅｈａｎ他，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１，４１０９−４１１８を参照）。
【００７１】
例えば、Ｚ、Ｗ、Ｘ、及び／又はＹのいずれかが独立して硫黄原子を含む、式Ｉで表される、化学修飾されたヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド分子鎖、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の分子鎖に存在してよい。本発明のｓｉＮＡ分子は、１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の）式Ｉで表される化学修飾されたヌクレオチド間結合を、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の分子鎖の３’−末端、５’−末端、又は３’及び５’−末端の両方に有していてもよい。例えば、例示的な本発明のｓｉＮＡ分子、約１〜約５（例えば、約１、２、３、４、５、又はそれ以上）の、式Ｉで表される化学修飾されたヌクレオチド間結合を、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の分子鎖の５’−末端に有していてもよい。他の非限定的な例においては、例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は、１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の）式Ｉで表されるヌクレオチド間結合を有するピリミジンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の分子鎖に有していてもよい。さらに異なる非限定的な例において、例示的な本発明のｓｉＮＡ分子は、１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）式Ｉで表されるヌクレオチド間結合を有するプリンヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の分子鎖に有していてもよい。他の実施形態において、式Ｉで表されるヌクレオチド間結合を有する本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかで表される化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを有していてもよい。
【００７２】
１つの実施形態において、本発明は、細胞内又は再構成されたインビトロ系において、ＣＨＲＭ３に対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することが可能で、前記化学修飾は、１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の）、式ＩＩで表されるヌクレオチド又は非ヌクレオチドを有するヌクレオチドを有する、化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【化２】
2007525206.tif 000003
式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ2、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキニルアミノ、置換シリル、又は式Ｉ又はＩＩで表される基を表し、Ｒ9は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ2を表し、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の非天然塩基等のヌクレオチド塩基又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の万能塩基等の非ヌクレオチド塩基を表す。
【００７３】
式ＩＩで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、１又は複数の式ＩＩで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、約１〜約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式ＩＩで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に有することができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、約１〜約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式ＩＩで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に含んでいてもよい。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明は、細胞内又は再構成されたインビトロ系において、ＣＨＲＭ３に対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することが可能で、前記化学修飾は、１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の）、式ＩＩＩで表されるヌクレオチド又は非ヌクレオチドを有する、化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【化３】
2007525206.tif 000004
式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ2、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキニルアミノ、置換シリル、又は式Ｉ又はＩＩで表される基を表し、Ｒ9は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ2を表し、Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の非天然塩基等のヌクレオチド塩基又はフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、若しくは標的ＲＮＡに相補的であっても相補的でなくてもよい任意の他の万能塩基等の非ヌクレオチド塩基を表す。
【００７５】
式ＩＩＩで表される化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方のオリゴヌクレオチド鎖に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に、１又は複数の式ＩＩＩで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に、約１−約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式ＩＩＩで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含むことができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に、約１−約５個又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の式ＩＩＩで表される化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【００７６】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、式ＩＩ又はＩＩＩで表されるヌクレオチドを含み、ここで、式ＩＩ又はＩＩＩで表されるヌクレオチドは逆位のコンフィギュレーションである。例えば、式ＩＩ又はＩＩＩを有するヌクレオチドは、ｓｉＮＡコンストラクトに３’−３’、３’−２’、２’−３’、又は５’−５’コンフィギュレーションで、例えば、ｓｉＮＡ鎖の一方又は両方の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に結合させることができる。
【００７７】
１つの実施形態において、本発明は、細胞内又は再構成されたインビトロ系において、ＣＨＲＭ３に対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することが可能で、前記化学修飾は、１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の）、式ＩＶで表される５’−末端リン酸基を有する、化学修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【化４】
2007525206.tif 000005
式中、Ｘ及びＹは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、又はアルキルハロを表し、Ｚ及びＷは、それぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、アルキルハロ、又はアセチルを表し、Ｗ、Ｘ、Ｙ、及びＺの全てがＯであることはない。
【００７８】
１つの実施形態において、本発明は、標的−相補的鎖、例えば、標的ＲＮＡに相補的な鎖に式ＩＶを有する５’末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで、ｓｉＮＡ分子は、全ＲＮＡｓｉＮＡ分子を含む。他の実施形態においては、本発明は、標的−相補的鎖に式ＩＶで表される５’末端リン酸基を有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで、ｓｉＮＡ分子はまた、一方又は両方の鎖の３’末端に約１〜約４個（例えば、約１、２、３、又は４個）のデオキシリボヌクレオチドを有する、約１〜約３個（例えば、約１、２、又は３個）ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド突出を含む。別の実施形態においては、式ＩＶで表される５’末端リン酸基は、本発明のｓｉＮＡ分子、例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する化学的修飾を有するｓｉＮＡ分子の標的−相補的鎖に存在する。
【００７９】
１つの実施形態において、本発明は、化学的修飾は１又は複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、細胞の内部で又は再構成されたインビトロ系においてＣＨＲＭ３に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる、化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。例えば、非限定的な例においては、本発明は、一方のｓｉＮＡ鎖に約１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。さらに他の実施形態においては、本発明は、両方のｓｉＮＡ鎖に独立して約１、２、３、４、５、６、７、８個又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ二本鎖のオリゴヌクレオチド鎖の一方又は両方に、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に存在することができる。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に１又は複数のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。例えば、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に、約１〜約５又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５、又はそれ以上）の連続するホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。別の非限定的な例においては、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。さらに別の非限定的な例においては、本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖に、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。
【００８０】
１つの実施形態において、本発明は、センス鎖が１又は複数、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は約１又は複数の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含み、かつ、アンチセンス鎖が約１〜約１０又はそれ以上、特に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１又は複数の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており、同一又は異なる分子鎖に存在する、１又は複数の、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を有していても有していなくてもよい。
【００８１】
他の実施形態において、本発明は、センス鎖が約１〜約５、特に約１、２、３、４、又は５のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５個又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含み、かつ、アンチセンス鎖が約１〜約５又はそれ以上、特に約１、２、３、４、５又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。他の実施形態においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１又は複数、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており、同じ又は異なる鎖に存在する、約１〜約５又はそれ以上、例えば、約１、２、３、４、５又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を有していても有してなくてもよい。
【００８２】
１つの実施形態において、本発明は、アンチセンス鎖が１又は複数、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は約１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含み、かつ、アンチセンス鎖が約１〜約１０又はそれ以上、特に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の実施形態様においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１又は複数、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており、同じ又は異なる鎖に存在する１又は複数、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を有していても有していなくてもよい。
【００８３】
他の実施形態において、他の実施形態においては、本発明は、アンチセンス鎖が約１〜約５又はそれ以上、特に約１、２、３、４、５又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含み；かつ、アンチセンス鎖が約１〜約５又はそれ以上、特に約１、２、３、４、５又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ−２’−フルオロ、及び／又は１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の万能塩基修飾ヌクレオチドを含み、必要に応じてアンチセンス鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を含む、ｓｉＮＡ分子を特徴とする。他の実施形態においては、センス及び／又はアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１又は複数、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ、２’−Ｏ−メチル及び／又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドで化学的に修飾されており、同じ鎖又は異なる鎖に存在する約１〜約５、例えば、約１、２、３、４、５又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び／又は、３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に末端キャップ残基を有していても有していなくてもよい。
【００８４】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子の各鎖に約１〜約５、特に約１、２、３、４、５又はそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する、化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００８５】
他の実施形態において、本発明は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２’−５’ヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ配列鎖の一方又は両方の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に存在することができる。さらに、２’−５’ヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ配列鎖の一方又は両方の種々の他の位置に存在することができ、例えば、ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖のピリミジンヌクレオチドの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上、例えば全てのヌクレオチド間結合は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含むことができ、又はｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖のプリンヌクレオチドの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上、例えば全てのヌクレオチド間結合は、２’−５’ヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。
【００８６】
他の実施形態において、本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子は、２つの鎖を有する二本鎖を含み、この一方又は両方を化学的に修飾することができ、各鎖は約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）ヌクレオチドの長さであり、二本鎖は約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）塩基対を有し、化学的修飾は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有する構造を含む。例えば、本発明の化学的に修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は２つの鎖を有する二本鎖を含み、この一方又は両方は式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する化学的修飾で化学的に修飾されていてもよく、各鎖は約２１ヌクレオチドからなり、それぞれは２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド突出を有し、二本鎖は約１９塩基対を有する。他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖ヘアピン構造を有し、ここで、ｓｉＮＡは約３６〜約７０（例えば、約３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）ヌクレオチドの長さであり、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）塩基対を有し、ｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む化学的修飾を含むことができる。例えば、本発明の化学的に修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する化学的修飾で化学的に修飾された、約４２〜約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチドを有する直鎖状オリゴヌクレオチドを含み、ここで、直鎖状オリゴヌクレオチドは約１９〜約２１（例えば、１９、２０、又は２１）塩基対及び２−ヌクレオチドの３’末端ヌクレオチド突出を有するヘアピン構造を形成する。他の実施形態においては、本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを含み、ここで、ｓｉＮＡ分子のループ部分は生物分解性である。例えば、本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解により３’末端突出、例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド突出を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成されうるように設計される。
【００８７】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、ヘアピン構造を有し、ｓｉＮＡは、約２５〜約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチドの長さを有し、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）塩基対を有し、ｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む化学的修飾を含んでいてもよい。例えば、例示的な本発明の化学修飾を有するｓｉＮＡ分子は、約２５〜約３５個（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５個）のヌクレオチドを有する直鎖状オリゴヌクレオチドで、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１又は複数の化学的修飾を有しており、直鎖状のオリゴヌクレオチドは、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）塩基対を有するヘアピン構造を形成しており、５’−末端リン酸基は、本明細書に記載されたような化学修飾（例えば、式ＩＶで表される５’−末端リン酸基）を有する。他の実施形態において、本発明の直鎖状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループ構造を有し、ｓｉＮＡ分子のループの一部は生分解性である。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の直鎖状ヘアピンは、一部に非ヌクレオチドリンカーを有するループを有する。
【００８８】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、非対称なヘアピン構造を有し，ｓｉＮＡは、約２５〜約５０（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチドの長さを有し、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）塩基対を有し、ｓｉＮＡは式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む化学的修飾を含んでいてもよい。例えば，例示的な本発明の化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、約２５〜約３５個（例えば、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５個）のヌクレオチドを有する直鎖状オリゴヌクレオチドで、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１又は複数の化学的修飾を有しており、直鎖状のオリゴヌクレオチドは、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）塩基対を有する非対称なヘアピン構造を形成しており、５’−末端リン酸基は、本明細書に記載されたような化学修飾（例えば、式ＩＶで表される５’−末端リン酸基）を有する。１つの実施形態において、本発明の非対称なヘアピンｓｉＮＡ分子は、ステムループ構造を有し、ｓｉＮＡ分子のループの一部は生分解性である。他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の非対称なヘアピンは、一部に非ヌクレオチドリンカーを有するループを有する。
【００８９】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス及びアンチセンス領域を有する個別のポリヌクレオチド鎖を有する非対称な二本鎖を有する構造を有しており、アンチセンス領域は、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）ヌクレオチドの長さであり、センス領域は、約３〜約２５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）ヌクレオチドの長さであり、センス領域及びアンチセンス領域は、少なくとも３つの相補的なヌクレオチドを有し、ｓｉＮＡは、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１又は複数の化学的修飾を有していてもよい。例えば，例示的な本発明の化学修飾されたｓｉＮＡ分子は、センス及びアンチセンス領域を有する個別のポリヌクレオチド鎖を有する非対称な二本鎖を有する構造を有しており、アンチセンス領域は、約１８〜約２３（例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、又は２３）ヌクレオチドの長さであり、センス領域は、約３〜約１５（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）ヌクレオチドの長さであり、センス領域及びアンチセンス領域は、少なくとも３つの相補的なヌクレオチドを有し、ｓｉＮＡは、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む１又は複数の化学的修飾を有していてもよい。他の実施形態において、非対称な二本鎖を有するｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載されたような化学修飾（例えば、式ＩＶで表される５’−末端リン酸基）を有する５’−末端リン酸基をも有していてもよい。
【００９０】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は環状核酸分子を含み、ここで、ｓｉＮＡは約３８〜約７０（例えば、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７０）ヌクレオチドの長さであり、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）塩基対を有し、ｓｉＮＡは化学的修飾を含むことができ、これは式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する構造を含む。例えば、本発明の化学的に修飾された例示的なｓｉＮＡ分子は、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する化学的修飾で化学的に修飾された約４２〜約５０（例えば、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチドを有する環状オリゴヌクレオチドを含み、環状オリゴヌクレオチドは約１９塩基対及び２個のループを有するダンベル形状の構造を形成する。
【００９１】
他の実施形態において、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、２つのループモチーフを含み、ここで、ｓｉＮＡ分子のループ部分の一方又は両方は生物分解性である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子のループ部分のインビボでの分解により、３’末端突出、例えば約２ヌクレオチドを含む３’末端ヌクレオチド突出を有する二本鎖ｓｉＮＡ分子が生成することができるように設計される。
【００９２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の脱塩基成分、例えば、式Ｖで表される化合物を含む。
【化５】
2007525206.tif 000006
式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ11及びＲ12は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ2、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキニルアミノ、置換シリル、又は式Ｉ又はＩＩで表される基を表し、Ｒ9は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ2を表す。
【００９３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の逆位脱塩基成分、例えば、式ＶＩで表される化合物を含む。
【化６】
2007525206.tif 000007
式中、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12、及びＲ13は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ2、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は式Ｉで表される基であり、Ｒ9は、Ｏ、Ｓ、ＣＨ2、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、又はＣＦ2であり、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ8又はＲ13のいずれかは、本発明のｓｉＮＡ分子への結合の点として作用する。
【００９４】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、少なくとも１つ（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上）の置換ポリアルキル成分、例えば、式ＶＩＩで表される化合物を有する。
【化７】
2007525206.tif 000008
式中、ｎは、それぞれ独立して、１〜１２の整数であり、Ｒ1、Ｒ2及びＲ3は、それぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ3、ＯＣＦ3、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ2、ＮＯ2、Ｎ3、ＮＨ2、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ2、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、又は式Ｉで表される基であり、Ｒ1、Ｒ2又はＲ3は、本発明のｓｉＮＡ分子への結合の点として作用する。
【００９５】
他の実施形態において、本発明は、Ｒ1及びＲ2はヒドロキシル（ＯＨ）基であり、ｎは１であり、Ｒ3はＯを含み、かつ本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方又は両方の鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方への、又は本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子への結合の点である、式ＶＩＩで表される化合物を特徴とする。この修飾は、本明細書において「グリセリル」と称される（例えば、図１０の修飾６を参照）。
【００９６】
他の実施形態において、本発明の化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかを有する残基）は、本発明のｓｉＮＡ分子の３’−末端、５’−末端、又は３’及び５’−末端の両方に存在する。例えば、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかを有する残基）は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方の３’−末端、５’−末端、又は３’及び５’−末端の両方に存在していてもよい。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかを有する残基）は、本発明の二本鎖を有するｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端並びにアンチセンス鎖の３’−末端に存在する。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかを有する残基）は、本発明の二本鎖を有するｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端並びにアンチセンス鎖の３’−末端の末端部に存在する。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかを有する残基）は、本発明の二本鎖を有するｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端並びにアンチセンス鎖の３’−末端の両末端部に存在する。１つの実施形態において、化学修飾されたヌクレオシド又は非ヌクレオシド（例えば、式Ｖ、ＶＩ又はＶＩＩのいずれかを有する残基）は、本発明の二本鎖を有するｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５’−末端及び３’−末端並びにアンチセンス鎖の３’−末端の末端から２番目の位置に存在する。さらに、式ＶＩＩで表される残基は、本明細書に記載したようなｓｉＮＡ分子のヘアピン部の３’−末端又は５’−末端に存在していてもよい。
【００９７】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、式Ｖ又はＶＩを有する脱塩基残基を含み、ここで、式ＶＩ又はＶＩを有する脱塩基残基は、３’−３’、３’−２’、２’−３’、又は５’−５’コンフィギュレーションで、例えば、一方又は両方のｓｉＮＡ鎖の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方でｓｉＮＡコンストラクトに結合している。
【００９８】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’末端及び３’末端の両方、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）のロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
【００９９】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、ｓｉＮＡ分子の５’末端、３’末端、５’末端及び３’末端の両方、又はそれらの任意の組み合わせにおいて、１又は複数（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）の非環状ヌクレオチドを含む。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、センス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、センス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
【０１０１】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、センス領域中に存在する任意の（例えば１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２'−デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２'−デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが−デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、センス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２'−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２'−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２'−デオキシプリンヌクレオチドである）、ここで、前記センス領域中に存在する３'−末端ヌクレオチド突出を含む任意のヌクレオチドは、２'−デオキシヌクレオチドである。
【０１０２】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、センス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、センス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
【０１０３】
１つの実施形態において、本発明は、センス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、センス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、センス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）、ここで、前記センス領域中に存在する３’末端ヌクレオチド突出を含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１０４】
１つの実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
【０１０５】
１つの実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）、ここで、前記アンチセンス領域中に存在する３’末端ヌクレオチド突出を含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１０６】
１つの実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
【０１０７】
１つの実施形態において、本発明は、アンチセンス領域を含む、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、かつ、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
【０１０８】
１つの実施形態において、本発明は、細胞の内部又は再構成されたインビトロ系においてＣＨＲＭ３に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる、本発明の化学的に修飾された短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、化学的に修飾されたｓｉＮＡはセンス領域を含み、ここで、センス領域中に存在する１又は複数のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、センス領域中に存在する１又は複数のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）、及び、センス領域の３’末端、５’末端、又は３’末端、及び５’末端の両方に存在していてもよい逆位デオキシ脱塩基修飾を含み、センス領域はさらに約１〜約４（例えば、約１、２、３、又は４）の２’−デオキシリボヌクレオチドを有する３’末端突出を含んでいてもよく、かつ、化学的に修飾された短鎖干渉核酸分子はアンチセンス領域を含み、ここで、アンチセンス領域中に存在する１又は複数のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域中に存在する１又は複数のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）、及び末端キャップ修飾、例えば、本明細書に記載されるか又は図１０に示されるいずれかの修飾を含み、これは必要に応じて、アンチセンス配列の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に存在してもよく、アンチセンス領域はさらに必要に応じて、約１−約４個（例えば、約１、２、３、又は４個）の２’−デオキシヌクレオチドを有する３’末端ヌクレオチド突出を含んでいてもよく、ここで突出ヌクレオチドはさらに１又はそれ以上（例えば、１、２、３、又は４個）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。これらの化学的に修飾されたｓｉＮＡの非限定的な例は図４及び５及び本明細書の表３及び６に示される。あるいは、これらの記載された任意の実施形態において、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）であり、アンチセンス領域に存在する１又は複数のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。また、これらの記載された任意の実施形態において、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは、プリンリボヌクレオチド（例えば、全てのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである）であり、アンチセンス領域に存在する１又は複数のプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。さらに、これらの実施形態の任意のものについて、あるいは、センス領域に存在する、及び／又はアンチセンス領域に存在する１又は複数のプリンヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択され（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択されるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシヌクレオチド、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される）。
【０１０９】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子中に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、好ましくは、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが、また必要に応じて、センス及び／又はアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に存在していてもよく、これは、天然に生ずるリボヌクレオチドと類似する特性又は特徴を有する修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明は、ノーザンコンフォメーション（例えば、ノーザン偽回転サイクル、例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編，１９８４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。このように、本発明のｓｉＮＡ分子中に存在する化学的に修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖に存在するが、また必要に応じてセンス及び／又はアンチセンス鎖及びセンス鎖の両方に存在してもよく、これはヌクレアーゼ分解に対して耐性であると同時にＲＮＡｉを媒介する能力を維持する。ノーザンコンフィギュレーションを有するヌクレオチドの非限定的な例としては、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル）ヌクレオチド）；２’−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド；２’−メチル−チオ−エチル、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−クロロヌクレオチド、２’−アジドヌクレオチド、及び２’−Ｏ−メチルヌクレオチドが挙げられる。
【０１１０】
１つの実施形態において、本発明の二本鎖を有するｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、逆位デオキシ脱塩基残基等の末端キャップ残基（例えば図１０を参照）を、センス鎖の３’−末端、５’−末端、又は３’及び５’−末端の両方に有している。
【０１１１】
１つの実施形態において、本発明は、化学修飾が、該化学修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合したコンジュゲートを有する、細胞の内部で又は再構成されたインビトロ系においてＣＨＲＭ３に対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介しうる、化学修飾された短鎖干渉核酸分子（ｓｉＮＡ）を特徴とする。本発明で予定されているコンジュゲートの非限定的な例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅらによる、米国特許出願第１０／４２７，１６０号、２００３年４月３０日出願（図面を含む全体が、参照として本明細書に組み込まれる）に記載されたコンジュゲート及びリガンドを含む。他の実施形態において、コンジュゲートは生物分解性リンカーを介して化学修飾されたｓｉＮＡ分子に共有結合している。１つの実施形態においては、コンジュゲート分子は、化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端に結合している。他の実施形態においては、コンジュゲート分子は、化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の５’末端に結合している。さらに他の実施形態においては、コンジュゲート分子は、化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両方の鎖の３’末端及び５’末端の両方、又はそれらの任意の組み合わせに結合している。１つの実施形態においては、本発明のコンジュゲート分子は、化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子の生物学的システム（例えば細胞）へのデリバリーを促進する分子を含む。他の実施形態においては、化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に結合したコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、又は細胞取り込みを媒介することができる細胞レセプターのリガンドである。化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に結合させることができる、本発明により企図される特定のコンジュゲート分子の例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅら（米国特許出願第１０／２０１，３９４号、２００２年７月２２日出願、参照として本明細書に組み込まれる）に記載される。用いられるコンジュゲートのタイプ及び本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲーションの程度は、同時にｓｉＮＡがＲＮＡｉ活性を媒介する能力を維持しながら、ｓｉＮＡコンストラクトの改良された薬物動態学プロファイル、生物利用性、及び／又は安定性について評価することができる。このように、当業者は、例えば、当該技術分野において一般的に知られる動物モデルにおいて、種々のコンジュゲートで修飾されたｓｉＮＡコンストラクトをスクリーニングして、ｓｉＮＡコンジュゲート複合体がＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら改良された特性を有するかを判定することができる。
【０１１２】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡがさらにｓｉＮＡのセンス領域とｓｉＮＡのアンチセンス領域とを連結させるヌクレオチド、非ヌクレオチド、又は混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーを含む本発明の短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態においては、本発明のヌクレオチドリンカーは、２ヌクレオチド以上の長さ、例えば、３、４、５、６、７、８、９、又は１０ヌクレオチドの長さのリンカーでありうる。別の実施形態においては、ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであってもよい。本明細書において用いる場合、「アプタマー」又は「核酸アプタマー」とは、標的分子に特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで、核酸分子は、その天然の設定において標的分子により認識される配列を含む配列を有する。あるいは、アプタマーは天然には核酸に結合しない標的分子に結合する核酸分子であってもよい。標的分子は目的とする任意の分子でありうる。例えば、アプタマーを用いてタンパク質のリガンド結合ドメインに結合させ、このことにより、天然に生ずるリガンドとタンパク質との相互作用を妨害することができる。これは非限定的な例であり、当業者は当該技術分野において一般に知られる手法を用いて他の態様を容易に生成しうることを認識するであろう（例えば、Ｇｏｌｄ他，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３、Ｂｒｏｄｙ及びＧｏｌｄ，２０００，Ｊ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，５、Ｓｕｎ，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２，１００、Ｋｕｓｓｅｒ，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７；Ｈｅｒｍａｎｎ及びＰａｔｅｌ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７，８２０、及びＪａｙａｓｅｎａ，１９９９，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４５，１６２８を参照）。
【０１１３】
さらに別の実施形態においては、本発明の非ヌクレオチドリンカーには、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、又は他のポリマー性化合物（例えば、ポリエチレングリコール、例えば２〜１００個のエチレングリコール単位を有するもの）が含まれる。特定の例としては、Ｓｅｅｌａ及びＫａｉｓｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，７５，６３５３及びＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７，７５，３１１３、Ｃｌｏａｄ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１７３，６３２４、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＳｃｈｅｐａｒｔｚ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，７７３，５１０９、Ｍａ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９３，２７，２５８５及びＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３、３２：１７５１；Ｄｕｒａｎｄ他，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，７５，６３５３、ＭｃＣｕｒｄｙ他．、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １９９１，１０，２８７、Ｊｓｃｈｋｅ他，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，３０１、Ｏｎｏ他．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，３０，９９１４、Ａｒｎｏｌｄ他、ＷＯ８９／０２４３９号国際公開公報、Ｕｓｍａｎ他，ＷＯ９５／０６７３１号国際公開公報、Ｄｕｄｙｃｚ他．、ＷＯ９５／１１９１０号国際公開公報、及びＦｅｒｅｎｔｚ及びＶｅｒｄｉｎｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９１，７７３，４０００（すべて参照として本明細書に組み込まれる）に記載されたものが挙げられる。「非ヌクレオチド」はさらに、１又は複数のヌクレオチドユニットの代わりに糖及び／又はリン酸置換のいずれかにより核酸鎖中に取り込むことができ、残りの塩基がその酵素活性を発揮することを可能とする任意の基又は化合物を意味する。基又は化合物は、一般に認識されているヌクレオチド塩基、例えばアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンを、例えば糖のＣ１位に含まない場合、脱塩基であってもよい。
【０１１４】
１つの実施形態において、本発明は、細胞内又は再構成されたインビトロ系でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介する能力がある短鎖干渉核酸を特徴とするが、ここで２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てられるｓｉＮＡ分子の１つ又は両方の鎖はリボヌクレオチドを含まない。例えば、ｓｉＮＡ分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられてもよく、ここで、ｓｉＮＡのセンス領域及びアンチセンス領域は、オリゴヌクレオチドに存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有さない別々のオリゴヌクレオチドを含む。別の例においては、ｓｉＮＡ分子は単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられてもよく、ここで、ｓｉＮＡのセンス領域及びアンチセンス領域は、本明細書中に記載されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドによって連結されるか、又は環化されており、オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドに存在するリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を有さない。出願人は、ｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチド（例えば、２’−ヒドロキシル基を有するヌクレオチド）の存在は、ＲＮＡｉ活性を支持するために必要ではないか、又は重要ではないことを意外にも見出した。したがって、１つの実施形態において、ｓｉＮＡ内の全ての位置は、細胞内のＲＮＡｉ活性を支持するｓｉＮＡ分子の能力が維持される程度まで、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、又はＶＩＩ、あるいはその組合せを有するヌクレオチド又は非ヌクレオチドなどの化学修飾ヌクレオチド及び／又は非ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【０１１５】
１つの実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞又は再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列に対して相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、５’末端リン酸基を含む。他の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は５’末端リン酸基及び３’末端リン酸基（例えば、２’、３’−環状リン酸）を含む。他の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、約１９−約２９ヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載される１又は複数の化学的に修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含む。例えば、細胞中においてｓｉＮＡ分子がＲＮＡｉ活性を支持する能力が維持される程度に、ｓｉＮＡ分子中の全ての位置で、化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド又はそれらの任意の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１１６】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞又は再構成されたインビトロ系においてＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり、ここで、ｓｉＮＡ分子は、標的核酸配列に対する相補性を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み、ｓｉＮＡ中に存在する１又は複数のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例えば、全てのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、あるいは複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、及びアンチセンス領域中に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであり（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである）、及び末端キャップ修飾、例えば、本明細書に記載されるか又は図１０に示される任意の修飾を含み、これは必要に応じてアンチセンス配列の３’末端、５’末端、又は３’末端及び５’末端の両方に存在していてもよく、ｓｉＮＡはさらに必要に応じて、ｓｉＮＡ分子の３’末端に約１〜約４個（例えば、約１、２、３、又は４個）の末端２’−デオキシヌクレオチドを含んでいてもよく、ここで末端ヌクレオチドはさらに１又はそれ以上（例えば、１、２、３、又は４）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができ、ｓｉＮＡはさらに必要に応じて、末端リン酸基、例えば５’末端リン酸基を含んでいてもよい。あるいは、これらの任意の実施形態において、アンチセンス領域中に存在する任意の（例えば、１又は複数、又は全ての）プリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、あるいは複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。また、これらの任意の実施形態において、ｓｉＮＡに存在する任意のプリンヌクレオチド（センス及び／又はアンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド）は、あるいは、ロック核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、全てのプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである、あるいは、複数のプリンヌクレオチドがＬＮＡである）であってもよい。また、これらの任意の実施形態において、あるいは、ｓｉＮＡに存在する任意のプリンヌクレオチドは、あるいは、２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである（例えば、全てのプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである、あるいは、複数のプリンヌクレオチドが２’−メトキシエチルプリンヌクレオチドである）。他の実施形態において、本発明の一本鎖を有するｓｉＮＡ分子に存在する任意の修飾されたヌクレオチドは、天然に存在するリボヌクレオチドと同様の性質又は特徴を有する修飾されたヌクレオチドを有する。例えば、本発明は、ノーザンコンフォメーション（例えば、ノーザン偽回転サイクル、例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ編，１９���４を参照）を有する修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。このように、本発明の一本鎖を有するｓｉＮＡ分子に存在する化学修飾されたヌクレオチドは、好ましくは、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持していると同時に、ヌクレアーゼによる分解に対する抵抗性を有している。
【０１１７】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等の、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかで表される）化学修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチドを、ｓｉＮＡの１又は複数の分子鎖又は領域内の交代点に有している。例えば、そのような化学修飾を、ＲＮＡをベースとするｓｉＮＡの、３’−末端又は５’−末端の１番目又は２番目のヌクレオチドから始まるｓｉＮＡ分子の他の任意の位置に導入してもよい。非限定的な例において、個々の分子鎖の１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９及び２１位が（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等の、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかで表される）化学修飾された、ｓｉＮＡの個々の分子鎖が２１ヌクレオチドの長さを有する、本発明の二本鎖を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。他の非限定的な例において、個々の分子鎖の２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、及び２０位が（例えば、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等の、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかで表される）化学修飾された、ｓｉＮＡの個々の分子鎖が２１ヌクレオチドの長さを有する、本発明の二本鎖を有するｓｉＮＡ分子を特徴とする。そのようなｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載されたような末端キャップ残基及び／又は骨格の修飾をさらに有していてもよい。
【０１１８】
１つの実施形態において、本発明は、細胞中においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有すること、（ｂ）細胞中におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
【０１１９】
１つの実施形態において、本発明は、細胞中においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は標的ＲＮＡの配列と同一又はほぼ同一の配列を有すること、（ｂ）細胞中におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
【０１２０】
他の実施形態において、本発明は、細胞中において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有すること、（ｂ）細胞におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
【０１２１】
他の実施形態において、本発明は、細胞中において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一又はほぼ同一の配列を有すること、（ｂ）細胞におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
【０１２２】
他の実施形態において、本発明は、細胞中において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は、標的ＲＮＡの配列と同一又はほぼ同一の配列を有すること、（ｂ）細胞におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
【０１２３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、エクスビボ用途における試薬として用いられる。例えば、ｓｉＮＡ試薬は、治療効果のために被験者の中に移植される組織又は細胞に導入される。細胞及び／又は組織は、その後に外植片を受ける生物又は被験者由来、又は移植前の別の生物又は被験者由来であってもよい。ｓｉＮＡ分子を用いて、インビボ移植された場合に細胞又は組織が所望の表現型を獲得し、又は機能を実行しうるように、細胞又は組織における１つ以上の遺伝子の発現を調節することができる。１つの実施形態においては、ある種の標的細胞が患者から抽出される。これらの抽出細胞は、これらの細胞によるｓｉＮＡの取込みに適した条件下に（例えば、陽イオン脂質、リポソーム等などのデリバリー試薬を用い、又はエレクトロポレーションなどの方法を用いて、細胞へのｓｉＮＡのデリバリーを促進することにより）細胞内の特定のヌクレオチド配列をターゲティングするｓｉＮＡと接触させる。次いで、細胞は同じ患者又は他の患者に再導入されて戻される。１つの実施形態においては、本発明は、組織外植片におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有すること、及び（ｂ）組織外植片におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入することを含む。他の実施形態においては、この方法はさらに、その生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、組織外植片をその組織が由来する生物に戻すか又は別の生物に導入することを含む。
【０１２４】
１つの実施形態において、本発明は、組織外植片においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列は標的ＲＮＡの配列と同一の配列を含み；そして（ｂ）組織外植片におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入することを含む。他の実施形態においては、この方法はさらに、その生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、組織外植片をその組織が由来する生物に戻すか又は別の生物に導入することを含む。
【０１２５】
他の実施形態において、本発明は、組織外植片において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）組織外植片におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入することを含む。他の実施形態においては、この方法はさらに、その生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、組織外植片をその組織が由来する生物に戻すか又は別の生物に導入することを含む。
【０１２６】
１つの実施形態において、本発明は、生物においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）被験者又は生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を被験者又は生物に導入することを含む。ＣＨＲＭ３タンパク質又はＲＮＡのレベルは、当業者に周知の種々の方法により決定することができる。
【０１２７】
他の実施形態において、本発明は、被験者又は生物において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み；そして（ｂ）生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を被験者又は生物に導入することを含む。ＣＨＲＭ３タンパク質又はＲＮＡのレベルは、当業者に周知の種々の方法により決定することができる。
【０１２８】
１つの実施形態においては、本発明は、細胞内においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡはＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）細胞におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む。
【０１２９】
他の実施形態において、本発明は、細胞内において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡはＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）細胞におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子をインビトロ又はインビボで細胞と接触させることを含む。
【０１３０】
１つの実施形態において、本発明は、組織外植片においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡはＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）組織外植片におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞と接触させることを含む。他の実施形態においては、この方法はさらに、その生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、組織外植片をその組織が由来する被験者又は生物に戻すか又は別の被験者又は生物に導入することを含む。
【０１３１】
他の実施形態において、本発明は、組織外植片において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡはＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）組織外植片におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物に由来する組織外植片の細胞に導入することを含む。他の実施形態においては、この方法はさらに、その生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、組織外植片をその組織が由来する被験者若しくは生物に戻すか又は別の被験者若しくは生物に導入することを含む。
【０１３２】
１つの実施形態において、本発明は、生物においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡはＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を被験者又は生物に導入することを含む。
【０１３３】
他の実施形態において、本発明は、生物において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡはＣＨＲＭ３遺伝子のＲＮＡに対する相補性を有する一本鎖配列を含み；そして（ｂ）生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下でｓｉＮＡ分子を被験者又は生物に導入することを含む。
【０１３４】
１つの実施形態において、本発明は、生物においてＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
【０１３５】
１つの実施形態において、本発明は、被験者又は生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、被験者又は生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、被験者又は生物の、呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、及び／又は尿失禁）を治療又は予防する方法を特徴とする。
【０１３６】
１つの実施形態において、本発明は、被験者又は生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、被験者又は生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、被験者又は生物の、呼吸器肺疾患、異常、及び／又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。
【０１３７】
１つの実施形態において、本発明は、被験者又は生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、被験者又は生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、被験者又は生物の、肺疾患、異常、及び／又は症状を治療又は予防する方法を特徴とする。
【０１３８】
１つの実施形態において、本発明は、被験者又は生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、被験者又は生物を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、被験者又は生物のＣＯＰＤを治療又は予防する方法を特徴とする。
【０１３９】
他の実施形態において、本発明は、被験者又は生物において２以上のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節する方法を特徴とし、該方法は、生物におけるＣＨＲＭ３遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、被験者又は生物を１又は複数の本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む。
【０１４０】
本発明のｓｉＮＡ分子は、種々のＲＮＡ分子を標的とするＲＮＡｉにより標的（ＣＨＲＭ３）遺伝子の発現が阻害されるよう設計することができる。１つの実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子に対応する種々のＲＮＡを標的とするよう用いられる。そのようなＲＮＡの非限定的な例には、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、標的遺伝子の選択的ＲＮＡスプライシング変種、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子のプレ−ｍＲＮＡ、及び／又はＲＮＡテンプレートが含まれる。選択的スプライシングにより、適当なエクソンの使用により区別される転写産物のファミリーが生ずる場合には、本発明は、適当なエクソンにより遺伝子発現を阻害して、遺伝子ファミリーメンバーの機能を特異的に阻害するか又はその間を区別するために用いることができる。例えば、選択的スプライシングされた貫膜ドメインを含むタンパク質を、膜結合型及び分泌型の両方の形で発現させることができる。本発明を用いて貫膜ドメインを含むエクソンを標的とすることにより、分泌型のタンパク質に対して、膜結合型の薬学的ターゲティングの機能的重要性を判定することができる。これらのＲＮＡ分子を標的とすることに関連する本発明の用途の非限定的な例には、治療的医薬用途、医薬の発見用途、分子診断及び遺伝子機能用途、及び遺伝子マッピング、例えば本発明のｓｉＮＡ分子を用いる単一ヌクレオチド多型のマッピングが含まれる。そのような用途は、既知の遺伝子配列を用いて、又は発現配列タグ（ＥＳＴ）から入手可能な部分配列から実行することができる。
【０１４１】
他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、遺伝子ファミリー、例えばＣＨＲＭ３ファミリー遺伝子に対応する保存配列を標的とするために用いられる。そのように、多くのＣＨＲＭ３標的を標的とするｓｉＮＡ分子は、増加した治療効果を提供することができる。さらに、ｓｉＮＡは、種々の応用法において遺伝子機能の経路を特性決定するために用いることができる。例えば、本発明を用いて、経路における標的遺伝子の活性を阻害して、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析、又は翻訳分析において、特性決定されていない遺伝子の機能を決定することができる。本発明は、医薬開発に向けて、種々の疾患及び健康状態に関与する可能性のある標的遺伝子経路を決定するために用いることができる。本発明は、例えば、呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、及び／又は尿失禁）に関与する遺伝子発現の経路を理解するために用いることができる。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子及び／又は方法は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号で表されるＲＮＡをコードする遺伝子、例えば、本明細書においてＧｅｎｂａｎｋ受入番号（例えば表１に示されるＧｅｎｂａｎｋ受入番号）で表されるＲＮＡ配列をコードするＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御するために用いられる。
【０１４３】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）予め決定された複雑性を有するｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生成し、そして（ｂ）標的ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適した条件下で、上述の（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする、ことを含む方法を特徴とする。他の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は、固定された長さ、例えば、約２３ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに他の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は、異なる長さのものであり、例えば、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。１つの実施形態においては、アッセイは、本明細書に記載されるような再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。他の実施形態においては、アッセイは、標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。他の実施形態においては、標的ＲＮＡのフラグメントを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析、又はＲＮＡｓｅ保護アッセイにより検出可能なレベルの切断について分析して、標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られるように、例えば、クローニング及び／又はインビトロ系については転写、インビボ系においては細胞発現により、得ることができる。
【０１４４】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）予め決定された複雑性、例えば４N（Ｎは、ｓｉＮＡコンストラクトの鎖のそれぞれにおいて塩基対形成したヌクレオチドの数を示し、例えば、１９塩基対を有する２１個のヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を有するｓｉＮＡコンストラクトについては、複雑性は４19となる）を有するランダム化されたｓｉＮＡコンストラクトのライブラリを生成する工程及び（ｂ）標的ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的部位を決定するのに適した条件下で、上述の（ａ）のｓｉＮＡコンストラクトをアッセイする工程を含む方法を特徴とする。他の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は、固定された長さ、例えば約２３ヌクレオチドの長さの鎖を含む。さらに他の実施形態においては、（ａ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さのものであり、例えば、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。１つの実施形態においては、アッセイは、本明細書の実施例７に記載されるような、再構成されたインビトロ  ｓｉＮＡアッセイを含むことができる。他の実施形態においては、アッセイは、標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。他の実施形態においては、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡのフラグメントを、例えば、ゲル電気泳動、ノーザンブロット分析、又はＲＮＡｓｅ保護アッセイにより検出可能なレベルの切断について分析して、標的ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的ＣＨＲＭ３ＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られるように、例えば、クローニング及び／又はインビトロ系については転写により、インビボ系においては細胞発現により、得ることができる。
【０１４５】
他の実施形態において、本発明は、：（ａ）標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ標的の配列を分析する工程、（ｂ）（ａ）のＲＮＡの１又は複数の領域に相補的な配列を有する１又は複数のｓｉＮＡ分子の組を合成する工程及び（ｃ）標的ＲＮＡ配列中のＲＮＡｉ標的を決定するのに適した条件下で（ｂ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする工程を含む方法を特徴とする。１つの実施形態においては、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は、固定された長さ、例えば約２３ヌクレオチドの長さの鎖を有する。他の実施形態においては、（ｂ）のｓｉＮＡ分子は、異なる長さ、例えば、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０）ヌクレオチドの長さの鎖を有する。１つの実施形態においては、アッセイは、本明細書に記載されるような再構成されたインビトロｓｉＮＡアッセイを含んでいてもよい。他の実施形態においては、アッセイは、標的ＲＮＡが発現されている細胞培養系を含むことができる。標的ＲＮＡのフラグメントを、検出可能なレベルの切断について、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット分析、又はＲＮＡｓｅ保護アッセイにより分析して、標的ＲＮＡ配列中の最も適当な標的部位を決定する。標的ＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られるようにして、例えば、クローニング及び／又はインビトロ系については転写により、インビボ系においては発現により、得ることができる。
【０１４６】
「標的部位」とは、アンチセンス領域中に標的配列に相補的な配列を含むｓｉＮＡコンストラクトにより媒介される切断の「標的とされる」、標的ＲＮＡ中の配列を意味する。
【０１４７】
「検出可能なレベルの切断」とは、標的ＲＮＡのランダム分解から生成するＲＮＡのバックグラウンドから切断産物を識別するのに十分な程度の標的ＲＮＡの切断（及び切断産物ＲＮＡの形成）を意味する。ほとんどの検出方法について、標的ＲＮＡの１〜５％から切断産物が生成すれば、バックグラウンドから検出するのに充分である。
【０１４８】
１つの実施形態において、本発明は、化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容できる担体又は希釈剤中に含む組成物を特徴とする。他の実施形態においては、本発明は、１又は複数の遺伝子を標的とし、化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を薬学的に許容できる担体又は希釈剤中に含む医薬組成物を特徴とする。他の実施形態において、本発明は、被験者において疾患又は健康状態を診断する方法を特徴とし、該方法は、被験者に本発明の組成物を、被験者における疾病又は健康状態の診断に適した条件下で投与することを含む。他の実施形態においては、本発明は、被験者又は生物において疾患又は健康状態を治療又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の治療又は予防に適した条件下で、被験者又は生物に本発明の組成物を単独で又は１又は複数の他の治療用化合物と併用して投与することを含む。さらに他の実施形態においては、本発明は、被験者において組織拒絶を低減又は予防する方法を特徴とし、該方法は、被験者又は生物における組織拒絶の低減又は予防に適した条件下で被験者又は生物に本発明の組成物を投与することを含む。
【０１４９】
他の実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３遺伝子標的を評価する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾してもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有すること、（ｂ）細胞、組織、又は生物においてＣＨＲＭ３標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を細胞、組織、又は生物に導入すること及び（ｃ）細胞、組織、被験者、又は生物における表現型変化をアッセイすることにより、遺伝子の機能を決定することを含む。
【０１５０】
他の実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３標的を評価する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）本発明のｓｉＮＡ分子を合成し、これは化学的に修飾されていてもよく、ｓｉＮＡ鎖の一方はＣＨＲＭ３標的遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を有すること、（ｂ）生物学的システムにおけるＣＨＲＭ３標的遺伝子の発現を調節するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を生物学的システムに導入すること及び（ｃ）生物学的システムにおける表現型の変化をアッセイすることにより、遺伝子の機能を決定することを含む。
【０１５１】
「生物学的システム」とは、生物起源、例えば、限定されないが、ヒト、動物、植物、昆虫、細菌、ウィルス又は他の起源からの、精製された又は精製されていない形の物質を意味し、ここで、システムはＲＮＡｉ活性に必要な成分を含む。「生物学的システム」との用語には、例えば、細胞、組織、又は生物、又はそれらの抽出物が含まれる。生物学的システムとの用語にはまた、インビトロの設定で用いることができる再構成されたＲＮＡｉ系が含まれる。
【０１５２】
「表現型変化」とは、本発明の核酸分子（例えばｓｉＮＡ）との接触又は処理に応答して生ずる任意の検出可能な細胞の変化を意味する。そのような検出可能な変化には、限定されないが、形状、サイズ、増殖、運動性、タンパク質発現又はＲＮＡ発現、又は当該技術分野において知られる方法によりアッセイすることができる他の物理学的又は化学的変化が含まれる。検出可能な変化にはまた、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポーター遺伝子／分子、又は発現されたタンパク質を同定するために用いられる種々のタグ、又はアッセイすることができる任意の他の細胞成分の発現が含まれる。
【０１５３】
１つの実施形態において、本発明は、化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とし、これは細胞、組織、又は生物におけるＣＨＲＭ３標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。他の実施形態においては、本発明は、化学的に修飾されていてもよい２以上の本発明のｓｉＮＡ分子を含有するキットを特徴とし、これは細胞、組織、被験者、又は生物において２以上のＣＨＲＭ３標的遺伝子の発現を調節するために用いることができる。
【０１５４】
１つの実施形態において、本発明は、化学的に修飾されていてもよい本発明の１又は複数のｓｉＮＡ分子を含有する細胞を特徴とする。他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含有する細胞は哺乳動物細胞である。さらに他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含有する細胞はヒト細胞である。
【０１５５】
１つの実施形態において、化学的に修飾されていてもよい本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の２つの相補的鎖を合成し、（ｂ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を得るのに適した条件下で２つの相補的鎖を一緒にアニーリングさせることを含む。他の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２つの相補的鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成により行う。さらに他の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子の２つの相補的鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成により行う。
【０１５６】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ二本鎖分子を合成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の第１のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し、ここで、第１のオリゴヌクレオチド配列鎖はｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の合成の足場として用いることができる切断可能なリンカー分子を有すること、（ｂ）第１のオリゴヌクレオチド配列鎖の足場上でｓｉＮＡの第２のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し、ここで、第２のオリゴヌクレオチド配列鎖はさらに、ｓｉＮＡ二本鎖を精製するために用いることができる化学成分を有すること、（ｃ）２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに適した条件下で（ａ）のリンカー分子を切断する工程及び（ｄ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学成分を利用してｓｉＮＡ二本鎖を精製する工程を含む。１つの実施形態においては、上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、オリゴヌクレオチドの脱保護の間に、例えば、メチルアミン等のアルキルアミン塩基を用いて加水分解条件下で行う。１つの実施形態においては、合成の方法は、調整多孔ガラス（ＣＰＧ）又はポリスチレン等の固体支持体上での固相合成を含み、ここで、（ａ）の第１の配列は、固体支持体を足場として用いてスクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。（ａ）において第２の鎖を合成するための足場として用いられる切断可能なリンカーは、固体支持体誘導化リンカーと（ａ）の切断可能なリンカーの切断が同時に行われるように、固体支持体誘導化リンカーと同様の反応性を有することができる。他の実施形態においては、結合したオリゴヌクレオチド配列の単離に用いることができる（ｂ）の化学成分は、ジメトキシトリチル基等のトリチル基を含み、これは本明細書に記載されるトリチルオン合成戦略において利用することができる。さらに他の実施形態においては、ジメトキシトリチル基等の化学成分は、精製の間に、例えば酸性条件を用いて除去する。
【０１５７】
さらに他の実施形態においては、ｓｉＮＡ合成の方法は溶液相合成又はハイブリッド相合成であり、ここでは、第１の配列に結合され、第２の配列の合成の足場として作用する切断可能なリンカーを用いて、ｓｉＮＡ二本鎖の両方の鎖をタンデムで合成する。別々のｓｉＮＡ配列鎖がハイブリダイズするのに適した条件下でリンカーを切断することにより、二本鎖ｓｉＮＡ分子が形成される。
【０１５８】
他の実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ二本鎖分子を合成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の一方のオリゴヌクレオチド配列鎖を合成し、ここで、配列は他方のオリゴヌクレオチド配列の合成の足場として用いることができる切断可能なリンカー分子を含み；（ｂ）第１の配列鎖に対して相補性を有する第２のオリゴヌクレオチド配列を（ａ）の足場上で合成し、ここで、第２の配列は二本鎖ｓｉＮＡ分子の他方の鎖を含み、かつ、第２の配列はさらに、結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために用いることができる化学成分を含み；（ｃ）第２のオリゴヌクレオチド配列鎖の化学成分を利用して、切断可能なリンカーにより接続された両方のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖を含む全長配列を単離するのに適した条件下で、かつ、２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖がハイブリダイズして安定な二本鎖を形成するのに適した条件下で、（ｂ）の生成物を精製する、の各工程を含む。１つの実施形態においては、上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、オリゴヌクレオチドの脱保護の間に、例えば加水分解条件下で行う。他の実施形態においては、上述の（ｃ）におけるリンカー分子の切断は、オリゴヌクレオチドの脱保護の後に行う。他の実施形態においては、合成の方法は、調整多孔ガラス（ＣＰＧ）又はポリスチレン等の固体支持体上での固相合成を含み、ここで、（ａ）の第１の配列は、スクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で、固体支持体を足場として用いて合成する。（ａ）において第２の鎖を合成するための足場として用いられる切断可能なリンカーは、固体支持体誘導化リンカー及び（ａ）の切断可能なリンカーが同時に又は別々に切断されるように、固体支持体誘導化リンカーと同様の反応性又は異なる反応性を有することができる。１つの実施形態においては、結合したオリゴヌクレオチド配列を単離するために用いることができる（ｂ）の化学成分は、トリチル基、例えばジメトキシトリチル基を含む。
【０１５９】
他の実施形態において、本発明は、１回の合成プロセスで二本鎖ｓｉＮＡ分子を作製する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）第１の配列及び第２の配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、ここで、第１の配列は第２の配列に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチド配列は切断可能なリンカーを介して第２の配列に連結されており、かつ、第２の配列を有するオリゴヌクレオチドには末端５’−保護基、例えば、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル基（５’−Ｏ−ＤＭＴ）が残存しており、（ｂ）オリゴヌクレオチドを脱保護し、このことにより脱保護によって２つのオリゴヌクレオチド配列を結合しているリンカーが切断され；そして（ｃ）二本鎖ｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、例えば本明細書に記載されるトリチル−オン合成戦略を用いて、（ｂ）の生成物を精製する工程を含む。
【０１６０】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の合成の方法は、Ｓｃａｒｉｎｇｅらの米国特許第５，８８９，１３６号、第６，００８，４００号、及び第６，１１１，０８６号（その全体を参照として本明細書に組み込まれる）の教示を含む。
【０１６１】
１つの実施形態において、本発明はＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのヌクレアーゼ耐性を増加させる１又は複数の化学的修飾、例えば、式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有する１又は複数の化学的修飾を含む。
【０１６２】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子中に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大したｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でアッセイすることを含む、ヌクレアーゼに対する抵抗性が増大したｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１６３】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有する（例えば、表４に示されたｓｉＮＡモチーフ）ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子中に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、改善された毒性プロフィールを有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でアッセイすることを含む、改善された毒性プロフィールを有する（例えば、免疫促進性が弱められた、あるいは有しない）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１６４】
他の実施形態において、本発明は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はこれらの任意の組み合わせを有する（例えば、表４に示されたｓｉＮＡモチーフ）ヌクレオチドをｓｉＮＡ分子中に導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、インターフェロン応答を刺激しないｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でアッセイすることを含む、細胞、被験者、又は生物内でインターフェロン応答を刺激しない（例えばインターフェロン応答を生じない、あるいはインターフェロン応答が弱められた）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１６５】
「改善された毒性プロフィール」とは、化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトが、細胞、被験者、又は生物内において、修飾されていないｓｉＮＡ分子又は修飾がより少ない、あるいは毒性を増大させる効果がより低い修飾を有するｓｉＮＡ分子に比べて毒性が低下していることを意味する。
【０１６６】
非限定的な例において、改善された毒性プロフィールを有するｓｉＮＡ分子は、細胞、被験者又は生物中において、修飾されていないｓｉＮＡ分子又は修飾がより少ない、あるいは毒性を増大させる効果がより低い修飾を有するｓｉＮＡ分子に比べて、免疫刺激性が減少したか弱められたことと関連する。１つの実施形態において、改善された毒性プロフィールを有するｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを有しない。１つの実施形態において、改善された毒性プロフィールを有するｓｉＮＡ分子は、５未満のリボヌクレオチド（例えば、１、２、３、又は４のリボヌクレオチド）を有する。
【０１６７】
１つの実施形態において、改善された毒性プロフィールを有するｓｉＮＡ分子は、Ｓｔａｂ７、Ｓｔａｂ８、Ｓｔａｂ１１、Ｓｔａｂ１２、Ｓｔａｂ１３、Ｓｔａｂ１６、Ｓｔａｂ１７、Ｓｔａｂ１８、Ｓｔａｂ１９、Ｓｔａｂ２０、Ｓｔａｂ２３、Ｓｔａｂ２４、Ｓｔａｂ２５、Ｓｔａｂ２６、Ｓｔａｂ２７、Ｓｔａｂ２８、Ｓｔａｂ２９、Ｓｔａｂ３０、Ｓｔａｂ３１、Ｓｔａｂ３２又はこれらの任意の組み合わせ（表４参照）を含む。１つの実施形態において、所定のｓｉＮＡ分子に関連する免疫刺激性のレベルは、知られているように、例えば、ＰＫＲ／インターフェロン応答、増殖、Ｂ−細胞の活性化、及び／又はサイトカイン産生等のレベルをアッセイにおいて決定し、特定のｓｉＮＡ分子の免疫刺激応答を定量することにより測定することができる（例えば、Ｌｅｉｆｅｒ他，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，２６，３１３−９、及び米国特許第５，９６８，９０９号明細書、全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１６８】
１つの実施形態においては、本発明はＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和性を調節する、１又は複数の本明細書に記載される化学的修飾を含む。
【０１６９】
他の実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。
【０１７０】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と細胞中の相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性を調節する本明細書に記載される１又は複数の化学的修飾を含む。
【０１７１】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス鎖と細胞中の相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性を調節する本明細書に記載される１又は複数の化学的修飾を含む。
【０１７２】
他の実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＲＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を同定するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１７３】
他の実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖と相補的標的ＤＮＡ配列との間の結合親和性が増加しているｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１７４】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ｓｉＮＡコンストラクトは、化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトに対する配列ホモロジーを有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成しうる細胞性ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する、本明細書に記載される１又は複数の化学的修飾を含む。
【０１７５】
他の実施形態において、本発明は、化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に対して配列ホモロジーを有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成しうる細胞性ポリメラーゼのポリメラーゼ活性の増加を媒介することができるｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子に対して配列ホモロジーを有する追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成しうる細胞性ポリメラーゼのポリメラーゼ活性の増加を媒介することができるｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１７６】
１つの実施形態において、本発明は、細胞においてＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介する化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここで、化学的修飾は、そのようなｓｉＮＡコンストラクトにより媒介されるＲＮＡｉの効率を低下させるような様式で、ｓｉＮＡと標的ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子及び／又はタンパク質又はＲＮＡｉに必須の他の因子との相互作用に有意に影響を与えない。
【０１７７】
他の実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３に対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。
【０１７８】
さらに他の実施形態においては、本発明は、ＣＨＲＭ３標的ＲＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）標的ＲＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。
【０１７９】
さらに他の実施形態においては、本発明は、ＣＨＲＭ３標的ＤＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）標的ＤＮＡに対する改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイすることを含む。
【０１８０】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、ｓｉＮＡコンストラクトの細胞取り込みを調節する本明細書に記載される１又は複数の化学的修飾を含む。
【０１８１】
他の実施形態において、本発明は、改良された細胞取り込みを有する、ＣＨＲＭ３に対するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良された細胞取り込みを有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１８２】
１つの実施形態において、本発明は、ＣＨＲＭ３に対するＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡコンストラクトを特徴とし、ここで、ｓｉＮＡコンストラクトは、例えば、ｓｉＮＡコンストラクトの薬物動態学を改良するポリエチレングリコール又は同等のコンジュゲート等のポリマー性コンジュゲートを結合させることにより、又はインビボで特定の組織のタイプ又は細胞のタイプにターゲティングするコンジュゲートを結合させることにより、ｓｉＮＡコンストラクトの生物利用性を増加させる、本明細書に記載される１又は複数の化学的修飾を含む。そのようなコンジュゲートの非限定的な例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他，米国特許出願１０／２０１，３９４号（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１８３】
１つの実施形態において、本発明は、改良された生物利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）コンジュゲートをｓｉＮＡ分子の構造中に導入すること、及び（ｂ）改良された生物利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。そのようなコンジュゲートには、細胞レセプターのリガンド、例えば、天然に生ずるタンパク質リガンドに由来するペプチド、タンパク質局在化配列、例えば細胞ＺＩＰコード配列；抗体；核酸アプタマー、ビタミン及び他の補因子、例えば葉酸及びＮ−アセチルガラクトースアミン；ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン脂質、ポリアミン、例えばスペルミン又はスペルミジン、及び他のものが含まれる。
【０１８４】
１つの実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部と相補的な第１のヌクレオチド配列及び前記第１の配列と相補的な第２の配列とを有し、前記第２の配列は、ＲＮＡ干渉を効率的に媒介するガイド配列としては機能せず、かつ／又はＲＮＡｉを促進する細胞内タンパク質に認識されないような態様で化学修飾された二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１８５】
１つの実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部と相補的な第１のヌクレオチド配列及び前記第１の配列と相補的な第２の配列とを有し、第２の配列は、ガイド配列として、又は標的核酸（例えばＲＮＡ）配列に相補的な配列としてＲＮＡｉ経路に導入されることを防止するような態様でデザインされ又は修飾された、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。そのようなデザイン又は修飾により、ｓｉＮＡの活性が増大し、かつ／又は本発明のｓｉＮＡ分子の特異性が改善されることが期待される。これらの修飾により、オフターゲット効果及び／又はそれに関連する毒性を最小化することも期待される。
【０１８６】
１つの実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部と相補的な第１のヌクレオチド配列及び前記第１の配列と相補的な第２の配列とを有し、前記第２の配列は、ＲＮＡ干渉を効率的に媒介するガイド配列としては機能することができない、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１８７】
１つの実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部と相補的な第１のヌクレオチド配列及び前記第１の配列と相補的な第２の配列とを有し、前記第２の配列は末端５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）又は５’−リン酸基を有しない、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【０１８８】
１つの実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部と相補的な第１のヌクレオチド配列及び前記第１の配列と相補的な第２の配列とを有し、前記第２の配列は、前記第２の配列の５’−末端に末端キャップ残基を有する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、末端キャップ残基は、逆位脱塩基、逆位ヌクレオチド残基、図１０に示す基、アルキル又はシクロアルキル基、ヘテロ環、又はＲＮＡｉ活性を阻害し、第２の配列はＲＮＡｉに対するガイド配列又はテンプレートとして作用する、任意の他の基を有する。
【０１８９】
１つの実施形態において、本発明は、標的ＲＮＡ配列又はその一部と相補的な第１のヌクレオチド配列及び前記第１の配列と相補的な第２の配列とを有し、前記第２の配列は、前記第２の配列の５’−末端及び３’−末端に末端キャップ残基を有する、二本鎖を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。１つの実施形態において、末端キャップ残基は、それぞれ、逆位脱塩基、逆位ヌクレオチド残基、図１０に示す基、アルキル又はシクロアルキル基、ヘテロ環、又はＲＮＡｉ活性を阻害し、第２の配列はＲＮＡｉに対するガイド配列又はテンプレートとして作用する、任意の他の基を有する。
【０１９０】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の構造に１又は複数の化学修飾を導入すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、特異性が改善されたｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でアッセイすることを含む、標的核酸（例えば、遺伝子又は対応するＲＮＡ等のＤＮＡ又はＲＮＡ）発現の下方制御又は阻害の特異性が改善された本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。他の実施形態において、特性を改善するのに用いられる化学修飾は、ｓｉＮＡ分子の５’−末端、３’−末端、又は５’及び３’−末端の両方に存在する末端キャップによる修飾を含む。末端キャップによる修飾は、例えば、図１０に示した構造（例えば、逆位デオキシ脱塩基残基）又はｓｉＮＡ分子の一部（例えばセンス鎖）がオフターゲット核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介することができないようにする任意の他の化学修飾を有していてもよい。非限定的な例において、ｓｉＮＡ分子は、前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のみが、対応する標的ＲＮＡ配列のＲＩＳＣに媒介された分解のガイド配列として作用することができるようにデザインされている。これは、ＲＮＡｉ機構によってセンス鎖がガイド配列として認識されなくなるような化学修飾をセンス鎖に導入することにより、ｓｉＮＡのセンス配列を不活性にすることによって達成することができる。１つの実施形態において、このような化学修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖の５’−末端に任意の化学基、又はセンス鎖を、ＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列として不活性にさせる任意の他の基を有している。例えば、これらの修飾によりセンス鎖の５’−末端が遊離の５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）基又は遊離の５’−リン酸基（例えば、リン酸エステル、二リン酸エステル、三リン酸エステル、環状リン酸エステル等）を有しない分子を生じてもよい。このようなｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例は、「Ｓｔａｂ９／１０」、「Ｓｔａｂ７／８」、「Ｓｔａｂ７／１９」、「Ｓｔａｂ１７／２２」、「Ｓｔａｂ２３／２４」、「Ｓｔａｂ２４／２５」、及び「Ｓｔａｂ２４／２６」（例えば、Ｓｔａｂ７、９、１７、２３、又は２４センス鎖を有する任意のｓｉＮＡ）の組み合わせ及びそれらの変種（表４を参照）等の、本明細書に記載の、ｓｉＮＡセンス鎖の５’−末端及び３’−末端に遊離のヒドロキシル基又はリン酸基を有しないものである。
【０１９１】
１つの実施形態において、本発明は、ｓｉＮＡ分子の構造に、ｓｉＮＡの分子鎖またはその一部がＲＮＡｉ活性に対するテンプレート又はガイド配列として作用するのを防止する１又は複数の化学修飾を導入することを含む、標的核酸（例えば、遺伝子又は対応するＲＮＡ等のＤＮＡ又はＲＮＡ）発現の下方制御又は阻害の特異性が改善された本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子の不活性な分子鎖又はセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖又はセンス領域、すなわち、標的核酸配列に対する相補性を有しないｓｉＮＡの分子鎖又は領域である。１つの実施形態において、そのような化学修飾は、ｓｉＮＡのセンス鎖又は領域の５’−末端に、５’−ヒドロキシル（５’−ＯＨ）又は５’−リン酸基を含まない任意の化学基、又はセンス鎖又はセンス領域を、ＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としては不活性化させる任意の他の基を有する。このようなｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例は、「Ｓｔａｂ９／１０」、「Ｓｔａｂ７／８」、「Ｓｔａｂ７／１９」、「Ｓｔａｂ１７／２２」、「Ｓｔａｂ２３／２４」、「Ｓｔａｂ２４／２５」、及び「Ｓｔａｂ２４／２６」（例えば、Ｓｔａｂ７、９、１７、２３、又は２４センス鎖を有する任意のｓｉＮＡ）の組み合わせ及びそれらの変種（表４を参照）等の、本明細書に記載の、ｓｉＮＡセンス鎖の５’−末端及び３’−末端にヒドロキシル基又はリン酸基を有しないものである。
【０１９２】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）複数の非修飾ｓｉＮＡ分子を生成すること、（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介する活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でスクリーニングすること、及び（ｃ）化学修飾（例えば、本明細書に記載の又は他の公知の化学修飾）を、工程（ｂ）の活性なｓｉＮＡ分子に導入することを含む、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介する活性を有するｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とする。１つの実施形態において、前記方法は、工程（ｃ）の化学修飾されたｓｉＮＡ分子を、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介する活性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で再スクリーニングすることをさらに含む。
【０１９３】
１つの実施形態において、本発明は、（ａ）複数の化学修飾されたｓｉＮＡ分子（例えば、本明細書に記載の、又は他の公知のｓｉＮＡ分子）を生成すること、及び（ｂ）工程（ａ）のｓｉＮＡ分子を、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介する活性を有する化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下でスクリーニングすることを含む、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介する活性を有する化学的に修飾されたｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とする。
【０１９４】
「リガンド」という用語は、受容体等の他の化合物と直接的、又は間接的に相互作用することができる、薬剤、ペプチド、ホルモン、又は神経伝達物質等の任意の化合物を意味する。リガンドと相互作用する受容体は、細胞表面に存在していてもよく、あるいは、細胞間受容体であってもよい。リガンドと受容体との相互作用は、生化学反応を引き起こすものであってもよく、単純に物理的相互作用又は会合を引き起こすものであってもよい。
【０１９５】
他の実施形態においては、本発明は、改良された生物利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）賦形剤処方をｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良された生物利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で、工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。そのような賦形剤には、ポリマー、例えばシクロデキストリン、脂質、カチオン性脂質、ポリアミン、リン脂質、ナノ粒子、受容体、リガンド、及びその他のものが含まれる。
【０１９６】
他の実施形態においては、本発明は、改良された生物利用性を有する本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とし、該方法は、（ａ）式Ｉ〜ＶＩＩのいずれか又はそれらの任意の組み合わせを有するヌクレオチドをｓｉＮＡ分子に導入すること、及び（ｂ）改良された生物利用性を有するｓｉＮＡ分子を単離するのに適した条件下で工程（ａ）のｓｉＮＡ分子をアッセイする、ことを含む。
【０１９７】
他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ化合物にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を共有結合的に結合させることができる。結合したＰＥＧは、任意の分子量のものであってよく、好ましくは約２、０００〜約５０、０００ダルトン（Ｄａ）である。
【０１９８】
本発明は、単独で、又はインビトロ又はインビボでＲＮＡを試験サンプル及び／又は被験者に導入するのに必要な試薬の少なくとも１つを有するキットの成分として、用いることができる。例えば、キットの好ましい成分には、本発明のｓｉＮＡ分子及びｓｉＮＡを目的とする細胞内に導入することを促進する本明細書に記載されるビヒクルが含まれる（例えば、脂質及び当該技術分野において知られるトランスフェクションの他の方法、例えば、Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他，米国特許第６，３９５，７１３号明細書を参照）。キットは、標的評価、例えば、遺伝子機能及び／又は活性の判定において、又は薬剤最適化において、及び薬剤の発見において用いることができる（例えば、Ｕｓｍａｎ他，米国特許出願６０／４０２，９９６号を参照）。そのようなキットはまた、キットのユーザが本発明を実施できるようにするための指針を含むことができる。
【０１９９】
本明細書において用いる場合、「短鎖干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「短鎖干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「短鎖干渉核酸分子」、「短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、又は「化学的に修飾された短鎖干渉核酸分子」という用語は、例えば、配列特異的様式でＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」又は遺伝子サイレンシングを媒介することにより遺伝子発現を阻害又はダウンレギュレートしうる任意の核酸分子を表す（例えば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８；及びＫｒｅｕｔｚｅｒ他，ＷＯ００／４４８９５号国際公開公報；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ他，ＷＯ０１／３６６４６号国際公開公報；Ｆｉｒｅ，ＷＯ９９／３２６１９号国際公開公報；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ他，ＷＯ００／０１８４６号国際公開公報；Ｍｅｌｌｏ及びＦｉｒｅ，ＷＯ０１／２９０５８号国際公開公報；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，ＷＯ９９／０７４０９号国際公開公報；及びＬｉ他，ＷＯ００／４４９１４号国際公開公報；Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ他，２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ他，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ及びＺａｍｏｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２０５６−６０；ＭｃＭａｎｕｓ他，２００２，ＲＮＡ，８，８４２−８５０；Ｒｅｉｎｈａｒｔ他，２００２，Ｇｅｎｅ  ＆  Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６；及びＲｅｉｎｈａｒｔ及びＢａｒｔｅｌ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３１を参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例は、図４〜６及び本明細書の表２、３及び６に示される。例えば、ｓｉＮＡは、自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であってもよく、ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２つの別々のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、ここで一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖及びセンス鎖は自己相補的であり（すなわち、各鎖は、他方の鎖中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、例えば、アンチセンス鎖とセンス鎖とが二本鎖又は二本鎖構造を形成し、例えば、二本鎖領域は約１９塩基対である）、アンチセンス鎖は標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス鎖は標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは、ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく、ここで、ｓｉＮＡの自己相補的センス領域及びアンチセンス領域は、核酸系又は非核酸系のリンカーにより連結されている。ｓｉＮＡは、自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は別��標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは２又はそれ以上のループ構造及び自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を含むステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、ここで、アンチセンス領域は標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、環状ポリヌクレオチドは、インビボ又はインビトロでプロセシングされて、ＲＮＡｉを媒介しうる活性なｓｉＮＡ分子を生ずることができる。ｓｉＮＡはまた、標的核酸分子又はその一部中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば、そのようなｓｉＮＡ分子がｓｉＮＡ分子中に標的核酸配列又はその一部に対応するヌクレオチド配列の存在を必要としない場合）、ここで、一本鎖ポリヌクレオチドはさらに末端リン酸基、例えば５’−リン酸（例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚ他，２００２，Ｃｅｌｌ．，１１０，５６３−５７４及びＳｃｈｗａｒｚ他，２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ．，１０，５３７−５６８を参照）、又は５’、３’−二リン酸を含んでいてもよい。ある実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々のセンス及びアンチセンス配列又は領域を含んでいてもよく、センス及びアンチセンス領域は、当該技術分野において知られるヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合により結合しているか、あるいは、イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、及び／又はスタッキング相互作用により非共有結合的に結合している。ある態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、標的遺伝子の発現の阻害が引き起こされるように、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書において用いる場合、ｓｉＮＡ分子はＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、化学的に修飾されたヌクレオチド及び非ヌクレオチドも包含する。ある態様においては、本発明の短鎖干渉核酸分子は２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）含有ヌクレオチドを欠失している。本出願人は、ある態様において、ＲＮＡｉを媒介するために２’−ヒドロキシ基を有するヌクレオチドの存在を必要としない短鎖干渉核酸について記述している。すなわち、本発明の短鎖干渉核酸分子は、必要に応じてリボヌクレオチド（例えば、２’−ＯＨ基を有するヌクレオチド）を含まなくてもよい。しかし、ＲＮＡｉを支持するためにｓｉＮＡ分子中にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１又は複数のヌクレオチドを含む、結合したリンカー又は他の結合又は会合している基、成分、又は分子鎖を有することができる。必要に応じて、ｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位置の約５、１０、２０、３０、４０、又は５０％にリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾短鎖干渉核酸分子はまた、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」と称される。本明細書において用いる場合、ｓｉＮＡとの用語は、配列特異的ＲＮＡｉを媒介しうる核酸分子を記述するために用いられる他の用語、例えば、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、及び他のものと同等であることを意味する。さらに、本明細書において用いる場合、ＲＮＡｉとの用語は、配列特異的ＲＮＡ干渉を記述する他の用語、例えば転写後遺伝子サイレンシング、又は後成遺伝学（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）と同等であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を用いて、転写後レベル又は転写前レベルの両方で後成的に遺伝子をサイレンシングさせることができる。非限定的な例においては、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的制御は、クロマチン構造のｓｉＮＡ媒介性修飾により生じて遺伝子発現を変化させることができる（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ他，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ他，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。
【０２００】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド「ＤＦ０」である（例えば、図１４〜１５及びＶａｉｓｈ他、米国特許出願第１０／７２７，７８０号、２００３年１２月３日出願、及び国際特許出願ＵＳ０４／１６３９０号、２００４年５月２４日出願、を参照）。
【０２０１】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、多機能性のｓｉＮＡである（例えば、図１６〜２１、及びＪａｄｈａｖ他、米国特許出願第６０／５４３，４８０号、２００４年２月１０日出願及びＰＣＴ国際特許出願ＵＳ０４／１６３９０号、２００４年５月２４日出願を参照）。本発明の多機能性ｓｉＮＡは、例えば、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡの２つの領域を標的とする配列を有していてもよい（例えば、表２及び３の標的配列を参照）。
【０２０２】
「非対称ヘアピン」という用語は、本明細書中で使用される場合において、アンチセンス領域、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドを含んでいてもよいループ部分、及び、アンチセンス領域よりもヌクレオチド数が少数ではあるが、アンチセンス領域との塩基対形成によりループを有する二本鎖を形成するには十分な相補的ヌクレオチドを有する程度であるセンス領域を有する、直鎖状のｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、細胞内又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域及び約４〜約１２（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２）ヌクレオチドを有するループ領域、及び約３〜約２５（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５）ヌクレオチドを有する、アンチセンス領域と相補的なセンス領域を有していてもよい。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学修飾されていてもよい５’−末端リン酸基を有していてもよい。非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、又は本明細に記載のコンジュゲート分子を有していてもよい。
【０２０３】
「非対称二本鎖」という用語は、本明細書中で使用されている場合において、センス領域及びアンチセンス領域を有し、センス領域は、アンチセンス領域よりも少数ではあるが、アンチセンス領域との塩基対形成により二本鎖を形成するには十分な相補的ヌクレオチドを有する程度の数のヌクレオチドを有する、２つの個別の分子鎖を意味する。例えば、本発明の非対称二本差ｓｉＮＡ分子は、細胞内又はインビトロ系においてＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド）を有するアンチセンス領域、及び約３〜約２５（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５）ヌクレオチドを有する、アンチセンス領域と相補的なセンス領域を有していてもよい。
【０２０４】
「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」という用語は、遺伝子の発現又はＲＮＡ分子のレベル又は１又は複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子、又は１又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が、モジュレータが存在しない場合に観測される発現量、レベル、又は活性よりも大きく又は小さくなるように、上方制御又は下方制御されることを意味し、例えば、「調節する」という用語は「阻害する」ことを意味してもよいが、「調節する」という用語の用法は、本定義によって制限されるものではない。
【０２０５】
「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「下方制御する（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅ）」、又は「減少させる（ｒｅｄｕｃｅ）」という用語は、遺伝子の発現又はＲＮＡ分子のレベル又は１又は複数のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードする等価なＲＮＡ分子、又は１又は複数のタンパク質若しくはタンパク質サブユニットの活性が本発明のｓｉＮＡ分子が存在しない場合の観測値よりも低下することを意味する。１つの実施形態において、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は、不活性な又は活性の弱められた分子の存在下で観測されるレベルを下回る。他の実施形態において、ｓｉＮＡ分子による阻害、下方制御又は減少は例えば、スクランブル配列又はミスマッチを有するｓｉＮＡ分子の存在下で観測されるレベルを下回る。他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の阻害、下方制御又は減少は、核酸分子の存在する場合の方が存在しない場合よりも大きい。１つの実施形態において、遺伝子発現の阻害、下方制御、又は減少は、ＲＮＡｉに媒介された標的核酸分子（例えばＲＮＡ）の分解又は翻訳の阻害等の転写抑制に関連している。１つの実施形態において、遺伝子発現の阻害、下方制御、又は減少は転写前抑制に関連している。
【０２０６】
「遺伝子」、又は「標的遺伝子」という用語は、例えば、ＲＮＡをコードする核酸を意味し、核酸配列は、例えば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むがこれに限定されない。遺伝子又は標的遺伝子は、低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びそれらの前駆体ＲＮＡ等の、機能性ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）又は非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）をコードしていてもよい。そのような非コーディングＲＮＡは、ｆＲＮＡ又は細胞過程の機能又は制御に関与するｎｃＲＮＡの活性を調節する場合における、ｓｉＮＡ分子に媒介されたＲＮＡ干渉に対する標的核酸分子として作用することができる。したがって、疾患を招く異常なｆＲＮＡ又はｎｃＲＮＡの活性を、本発明のｓｉＮＡ分子により調節することができる。ｆＲＮＡ及びｎｃＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子は、被験者、生物、又は細胞の遺伝子型又は表現型を、遺伝子のインプリンティング、転写、翻訳、又は核酸のプロセシング（例えば、トランスアミノ化、メチル化等）等の細胞過程に介入することにより操作又は改変するために用いることができる。標的遺伝子は、細胞から誘導された遺伝子、内因性遺伝子、トランス遺伝子、又は、感染後に細胞内に存在するウィルス等の病原体の遺伝子等の外因性遺伝子であってもよい。標的遺伝子を含む細胞は、例えば、植物、動物、原生動物、ウィルス、バクテリア、又は真菌類等の任意の生物から誘導したものであっても含まれるものであってもよい。植物の非限定的な例としては、単子葉植物、双子葉植物、又は裸子植物が挙げられる。動物の非限定的な例としては、脊椎動物及び非脊椎動物が挙げられる。真菌類の非限定的な例としては、カビ及び酵母が挙げられる。総説としては、例えば、Ｓｎｙｄｅｒ及びＧｅｒｓｔｅｉｎ，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３００，２５８−２６０を参照。
【０２０７】
「非正準塩基対」とは、逆位ミスマッチ、単一水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、三塩基相互作用、及び四塩基相互作用を含む、ミスマッチ及び／又はゆらぎ塩基対等の、任意の非ワトソン・クリック塩基対を意味する。このような非正準塩基対の非限定的な例には、ＡＣ逆位フーグスティーン、ＡＣゆらぎ、ＡＵ逆位フーグスティーン、ＧＵゆらぎ、ＡＡ  Ｎ７アミノ、ＣＣ  ２−カルボニル−アミノ（Ｈ１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡ共有、ＵＣ  ４−カルボニル−アミノ、ＵＵ  イミノ−カルボニル、ＡＣ逆位ゆらぎ、ＡＵフーグスティーン、ＡＵ逆位ワトソン・クリック、ＣＧ逆位ワトソン・クリック、ＧＣ  Ｎ３−アミノ−アミノ  Ｎ３、ＡＡ  Ｎ１−アミノ対称、ＡＡ  Ｎ７−アミノ対称、ＧＡ  Ｎ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋  カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１、ＧＧ  Ｎ１−カルボニル対称、ＧＧ  Ｎ３−アミノ対称、ＣＣカルボニル−アミノ対称、ＣＣ  Ｎ３−アミノ対称、ＵＵ  ２−カルボニル−イミノ  対称、ＵＵ  ４−カルボニル−イミノ  対称、ＡＡ  アミノ−Ｎ３、ＡＡ  Ｎ１−アミノ、ＡＣアミノ２−カルボニル、ＡＣ  Ｎ３−アミノ、ＡＣ  Ｎ７−アミノ、ＡＵアミノ−４−カルボニル、ＡＵ  Ｎ１−イミノ、ＡＵ  Ｎ３−イミノ、ＡＵ  Ｎ７−イミノ、ＣＣカルボニル−アミノ、ＧＡアミノ−Ｎ１、ＧＡアミノ−Ｎ７、ＧＡカルボニル−アミノ、ＧＡ  Ｎ３−アミノ、ＧＣアミノ−Ｎ３、ＧＣカルボニル−アミノ、ＧＣ  Ｎ３−アミノ、ＧＣ  Ｎ７−アミノ、ＧＧ  アミノ−Ｎ７、ＧＧカルボニル−イミノ、ＧＧ  Ｎ７−アミノ、ＧＵアミノ−２−カルボニル、ＧＵカルボニル−イミノ、ＧＵイミノ−２−カルボニル、ＧＵ  Ｎ７−イミノ、ψＵイミノ−２−カルボニル、ＵＣ  ４−カルボニル−アミノ、ＵＣイミノ−カルボニル、ＵＵイミノ−４−カルボニル、ＡＣ  Ｃ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡ  カルボニル−Ｃ２−Ｈ、ＵＵイミノ−４−カルボニル  ２  カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣ  アミノ（Ａ）  Ｎ３（Ｃ）−カルボニル、ＧＣ  イミノ  アミノ−カルボニル、Ｇψ  イミノ−２−カルボニル  アミノ−２−カルボニル、及びＧＵイミノ  アミノ−２−カルボニル塩基対が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
「ＣＨＲＭ３」又は「コリン作動性ムスカリン受容体」という用語は、本明細書で使用されている場合において、任意のムスカリン性アセチルコリン受容体タンパク質、ペプチド、又は、表１に示したＧｅｎｂａｎｋ受入番号を有するＣＨＲＭ３にコードされたもの等のＭ３ムスカリン性アセチルコリン受容体活性を有するポリペプチドを意味する。「ＣＨＲＭ３」という用語は、任意のムスカリン性アセチルコリン受容体タンパク質、ペプチド、又はＭ３ムスカリン性アセチルコリン受容体活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列をも意味する。「ＣＨＲＭ３」という用語には、ＣＨＲＭ３アイソフォーム（例えば、ＣＨＲＭ１、ＣＨＲＭ２等）、ＣＨＲＭ３変異体遺伝子、ＣＨＲＭ３のスプライス変異体、及びＣＨＲＭ３の遺伝子多型等の、ＣＨＲＭ３をコードする他の配列も含まれる。
【０２０９】
「相同な配列」という用語は、遺伝子、遺伝子転写産物及び／又は非コーディングポリヌクレオチド等の、１又は複数のポリヌクレオチド配列に共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同な配列は、遺伝子ファミリーの異なる構成タンパク質、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、又はサイトカインとそれに対応する受容体のような全く相違する遺伝子等の、関連するが異なるタンパク質をコードする２種類以上の遺伝子に共有されるヌクレオチド配列であってもよい。相同な配列は、非コーディングＤＮＡ又はＲＮＡ、制御配列、イントロン、及び転写制御又は調節領域等の、２種類以上の非コーディングポリヌクレオチドに共有されるヌクレオチド配列であってもよい。また、相同な配列は、２種類以上のポリヌクレオチドに共有されている保存配列を含んでいてもよい。部分的に相同な（例えば、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％等）配列も本発明に含まれるため、相同性は、完全な相同性（例えば１００％）である必要はない。
【０２１０】
「保存されている配列領域」という用語は、ポリヌクレオチドの１又は複数の領域のヌクレオチド配列が、世代間で、又は１つの生体系、被験者若しくは生物と他の生体系、被験者若しくは生物との間で顕著に変化しないことを意味する。ポリヌクレオチドは、コーディング及び非コーディングＤＮＡ及びＲＮＡの双方を含んでいてもよい。
【０２１１】
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対する相補性を有する、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のセンス領域は、標的核酸配列とホモロジーを有する核酸配列を含むことができる。
【０２１２】
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対する相補性を有する、ｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対する相補性を有する核酸配列を必要に応じて含むことができる。
【０２１３】
「標的核酸」とは、その発現又は活性が調節されるべき任意の核酸配列を意味する。標的核酸はＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。
【０２１４】
「相補性」とは、核酸が、伝統的なワトソン−クリック又は他の非伝統的なタイプのいずれかにより、別の核酸配列と水素結合を形成しうることを意味する。本発明の核酸分子に関して、核酸分子とその相補的配列との結合自由エネルギーは、核酸の適切な機能、例えば、ＲＮＡｉ活性を進行させるのに十分なものである。核酸分子についての結合自由エネルギーの決定は当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｔｕｒｎｅｒ他，１９８７，ＣＳＨ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩｐｐ．１２３−１３３；Ｆｒｉｅｒ他，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，９３７３−９３７７；Ｔｕｒｎｅｒ他，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９，３７８３−３７８５を参照）。相補性のパーセンテージは、核酸分子中の、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成しうる連続する残基のパーセンテージを示す（例えば、１０塩基中の５、６、７．８、９、１０塩基は、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％の相補性である）。「完全な相補性」とは、核酸配列の連続する残基がすべて第２の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合するであろうことを意味する。１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、約１５〜約３０個又はそれ以上（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個、又はそれ以上）の、１又は複数の標的核酸分子又はその一部と相補的なヌクレオチドを含む。
【０２１５】
１つの実施形態において、本発明のＣＨＲＭ３遺伝子の発現を下方制御又は減少させるｓｉＮＡ分子は、被験者又は生物の呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状の予防又は治療に用いられる。
【０２１６】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、被験者又は生物の呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、及び／又は尿失禁）を治療するのに用いられる。
【０２１７】
「呼吸器疾患」という用語は、ぜんそく、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、及び、細胞又は組織中で、単独で又は他の治療と組み合わせての疾患に関連する遺伝子発現の調節に応答を示す、任意の他の呼吸器疾患、症状、形質、遺伝子型又は表現型等の、気道に影響を及ぼす任意の疾患又は症状を意味する。
【０２１８】
本発明の１つの実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は、独立して、約１５〜約３０ヌクレオチドの長さであり、特定の態様においては、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチドの長さである。他の実施形態においては、本発明のｓｉＮＡ二本鎖は、独立して、約１５〜約３０（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）塩基対を含む。他の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子の１又は複数の分子鎖は、それぞれ独立して、標的核酸分子に対し相補的な約１５〜３０個（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個）のヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態においては、ヘアピン又は環状構造を含む本発明のｓｉＮＡ分子は、約３５〜約５５（例えば、約３５、４０、４５、５０又は５５）ヌクレオチドの長さであるか、又は約３８〜約４４（例えば、３８、３９、４０、４１、４２、４３又は４４）ヌクレオチドの長さであり、約１５〜約２５（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）塩基対を含む。本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、表２に示される。本発明の例示的合成ｓｉＮＡ分子は、表３及び６、及び／又は図４〜５に示される。
【０２１９】
本明細書において用いる場合、「細胞」は、その通常の生物学的意味で用いられ、多細胞生物全体を指さず、特にヒトを指さない。細胞は生物中で、例えば、鳥類、植物及び哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヤギ、無尾サル、有尾サル、ブタ、イヌ及びネコ中で存在することができる。細胞は、原核生物（例えば細菌細胞）又は真核生物（例えば哺乳動物又は植物細胞）であってもよい。細胞は体細胞起源でも生殖細胞系起源でもよく、全能細胞でも多能性細胞でもよく、分裂していても分裂していなくてもよい。細胞はまた、配偶子又は胚、幹細胞、又は完全に分化した細胞に由来するか、又はこれらを含むものであってもよい。
【０２２０】
本発明のｓｉＮＡ分子は、直接加えてもよく、又はカチオン性脂質と複合体化して、リポソーム中に封入して、又は他の方法により、標的細胞又は組織にデリバリーすることができる。核酸又は核酸複合体は、関連する組織にエクスビボで、又は注射、注入ポンプ又はステントを用いてインビボで、バイオポリマー中に取り込ませて又は取り込ませずに、局所的に投与することができる。特定の態様においては、本発明の核酸分子は表２〜３及び／又は図４〜５に示される配列を含む。そのような核酸分子の例は、これらの表及び図面において規定される配列から本質的になる。さらに、表４に記載される化学的に修飾されたコンストラクトを本発明の任意のｓｉＮＡ配列に適用することができる。
【０２２１】
他の態様において、本発明は本発明の１又は複数のｓｉＮＡ分子を含む哺乳動物細胞を提供する。１又は複数のｓｉＮＡ分子は、独立して、同じ又は異なる部位を標的とすることができる。
【０２２２】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β−Ｄ−リボフラノース成分の２’位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、単離されたＲＮＡ、例えば部分的に生成されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え的に製造されたＲＮＡ、並びに１又は複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換及び／又は変更により天然に生ずるＲＮＡと異なるように変更されたＲＮＡを含む。そのような変更は、非ヌクレオチド物質の付加、例えば、ｓｉＮＡの末端又は内部（例えばＲＮＡの少なくとも１又は複数のヌクレオチド）への付加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、標準的ではないヌクレオチド、例えば、天然に生じないヌクレオチド又は化学的に合成されたヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドを含むことができる。これらの変更されたＲＮＡは、類似体又は天然に生ずるＲＮＡの類似体と称することができる。
【０２２３】
「被験者」とは、外植された細胞のドナー又はレシピエントである生物又は細胞それ自体を意味する。「被験者」とはまた、本発明の核酸分子を投与することができる生物を表す。一般的に被験者とは哺乳動物又は哺乳動物細胞であり、ヒト又はヒト細胞を含む。
【０２２４】
本明細書において用いる場合、「ホスホロチオエート」という用語は、式Ｉ（式中、Ｚ及び／又はＷは硫黄原子を含む）を有するヌクレオチド間結合を表す。したがって、ホスホロチオエートとの用語は、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートヌクレオチド間結合の両方を表す。
【０２２５】
本明細書において用いる場合、「ホスホノアセテート」という用語は、Ｚ及び／又はＷはアセチル又は保護されたアセチル基を有する、式Ｉで表されるヌクレオチド間結合を意味する。
【０２２６】
本明細書において用いる場合、「チオホスホノアセテート」という用語は、Ｚはアセチル又は保護されたアセチル基を有し、Ｗは硫黄原子を有する、あるいは、Ｗはアセチル又は保護されたアセチル基を有し、Ｚは硫黄原子を有する、式Ｉで表されるヌクレオチド間結合を意味する。
【０２２７】
本明細書において用いる場合、「万能塩基」という用語は、天然のＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれと、これらをほとんど区別せずに塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を表す。万能塩基の非限定的な例としては、当該技術分野において知られるように（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，２４３７−２４４７を参照）、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、及びニトロアゾール誘導体、例えば、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドールが挙げられる。
【０２２８】
本明細書において用いる場合、「非環状ヌクレオチド」という用語は、非環状リボース糖を有する任意のヌクレオチド、例えば、リボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、又はＣ５）のいずれかが、独立して又は組み合わせてヌクレオチド中に存在しないヌクレオチドを表す。
【０２２９】
本発明の核酸分子は、個別に、又は他の薬剤と組み合わせて又は一緒に、被験者又は生物の、呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、及び／又は尿失禁）の予防又は治療に用いることができる。
【０２３０】
例えば、特定の疾患又は健康状態を治療するために、治療に適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を個別に又は１又は複数の薬剤と組み合わせて被験者に投与することができ、又は当業者には明らかな他の適当な細胞に投与することができる。
【０２３１】
さらに他の実施形態においては、ｓｉＮＡ分子を他の既知の治療法と組み合わせて用いて、被験者又は生物の呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状を治療することができる。例えば、本明細書に記載される分子を１又は複数の既知の化合物、治療法、又は手順と組み合わせて用いて、被験者又は生物の呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状を予防又は治療することができる。
【０２３２】
１つの実施形態において、本発明は、本発明の少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を、そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とするように含む発現ベクターを特徴とする。例えば、ベクターは、二本鎖を含むｓｉＮＡ分子の両方の鎖をコードする配列を含むことができる。ベクターはまた、自己相補的でありしたがってｓｉＮＡ分子を形成する１つの核酸分子をコードする配列を含むことができる。そのような発現ベクターの非限定的な例は、Ｐａｕｌ他，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ及びＴａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ他，２００２，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９、５００；及びＮｏｖｉｎａ他，２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎ  ｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５に記載されている。
【０２３３】
他の実施形態において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む、ヒト細胞等の哺乳類細胞を特徴とする。
【０２３４】
さらに他の実施形態においては、本発明の発現ベクターは、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号、例えば表１に示されるＧｅｎｂａｎｋ受入番号で表されるＲＮＡ分子に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子の配列を含む。
【０２３５】
１つの実施形態においては、本発明の発現ベクターは、２又はそれ以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み、これらは同じであっても異なっていてもよい。
【０２３６】
本発明の別の態様においては、標的ＲＮＡ分子と相互作用して、標的ＲＮＡ分子（例えば、本明細書においてＧｅｎｂａｎｋ受入番号で表される標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子をダウンレギュレートするｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターであってもよい。ｓｉＮＡを発現するウィルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、又はアルファウィルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは、本明細書に記載されるようにデリバリーされ、標的細胞中に残留する。あるいは、ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウィルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば、ｓｉＮＡ分子は結合してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子機能又は発現を下方制御する。ｓｉＮＡを発現するベクターのデリバリーは、全身的（例えば、静脈内又は筋肉内投与により）、被験者から外植された標的細胞に投与した後、被験者に再導入することにより、又は所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により行うことができる。
【０２３７】
「ベクター」とは、所望の核酸をデリバリーするために用いられる、任意の核酸及び／又はウィルスに基づく手法を意味する。
【０２３８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の本発明の好ましい態様の説明及び特許請求の範囲から明らかであろう。
【０２３９】
図面の簡単な説明
図１は、ｓｉＮＡ分子を合成するスキームの非限定的な例を示す。相補的ｓｉＮＡ配列鎖である鎖１及び鎖２をタンデムで合成し、切断可能な結合、例えばヌクレオチドスクシネート又は脱塩基スクシネートで結合させる。これは、固体支持体上の固相合成において用いられる切断可能なリンカーと同じであっても異なっていていてもよい。合成は固相でも液相でもよく、示される例においては，合成は固相合成である。合成は、タンデムオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチド上にジメトキシトリチル基等の保護基が残るように実施する。オリゴヌクレオチドを切断及び脱保護すると、２つのｓｉＮＡ鎖は自発的にハイブリダイズしてｓｉＮＡ二本鎖を形成するため、末端保護基の性質を利用して二本鎖を精製することができる。これは、例えば、末端保護基を有する二本鎖／オリゴヌクレオチドのみが単離されるトリチルオン精製法を適用することにより行うことができる。
【０２４０】
図２は、本発明の方法により合成された精製ｓｉＮＡ二本鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す。示される２つのピークは、別々のｓｉＮＡ配列鎖の推定質量に対応する。この結果は、タンデム合成から生成されたｓｉＮＡ二本鎖を、単純なトリチルオン精製方法論を用いて単一物質として精製しうることを示す。
【０２４１】
図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提唱されるメカニズムの非限定的な例を示す図である。外来一本鎖ＲＮＡ、例えばウィルス、トランスポゾン、又は他の外因性ＲＮＡからＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、ダイサー（ＤＩＣＥＲ）酵素を活性化し、次にこれはｓｉＮＡ二本鎖を生成する。あるいは、合成された又は発現されたｓｉＮＡを適当な手段により細胞内に直接導入することができる。活性なｓｉＮＡ複合体が形成され、これは標的ＲＮＡを認識し、その結果、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ複合体により標的ＲＮＡが分解されるか、又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により追加のＲＮＡが合成され、これはダイサーを活性化して追加のｓｉＮＡ分子が生じ、このことによりＲＮＡｉ応答が増幅される。
【０２４２】
図４Ａ−Ｆは、本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。図中、Ｎは任意のヌクレオチド（アデノシン、グアニン、シトシン、ウリジン、又は必要に応じてチミジン）を表し、例えば、括弧（ＮＮ）により表される突出領域においてチミジンで置換されていてもよい。ｓｉＮＡコンストラクトのセンス鎖及びアンチセンス鎖について種々の修飾が示されている。
【０２４３】
図４Ａ：センス鎖は、４個のホスホロチオエート５’−及び３’末端ヌクレオチド間結合を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで、２つの末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて塩基対形成してもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、必要に応じて３’末端グリセリル成分を有していてもよく、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく、１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合及び４個の５’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。ホスホロオチオエート、ホスホロジチオエート、又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間結合等の修飾されたヌクレオチド間結合は、「ｓ」で示され、必要に応じてアンチセンス鎖に（ＮＮ）ヌクレオチドを結合している。
【０２４４】
図４Ｂ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは、必要に応じて塩基対形成してもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、必要に応じて３’末端グリセリル成分を有していてもよく、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは、必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在しうる全てのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチルであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。ホスホロオチオエート、ホスホロジチオエート、又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間結合等の修飾されたヌクレオチド間結合は、「ｓ」で示され、必要に応じてセンス及びアンチセンス鎖に（ＮＮ）ヌクレオチドを結合している。
【０２４５】
図４Ｃ：センス鎖は５’末端キャップ成分及び３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて塩基対形成していてもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチル又は２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は、２１ヌクレオチドを含み、必要に応じて３’末端グリセリル成分を有していてもよく、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく、１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。ホスホロオチオエート、ホスホロジチオエート、又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間結合等の修飾されたヌクレオチド間結合は、「ｓ」で示され、必要に応じてアンチセンス鎖に（ＮＮ）ヌクレオチドを結合している。
【０２４６】
図４Ｄ：センス鎖は５’末端キャップ成分及び３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて塩基対形成してもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができ、存在しうる全てのプリンヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、これは必要に応じて３’末端グリセリル成分を有していてもよく、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく、１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在しうる全てのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。ホスホロオチオエート、ホスホロジチオエート、又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間結合等の修飾されたヌクレオチド間結合は、「ｓ」で示され、必要に応じてアンチセンス鎖に（ＮＮ）ヌクレオチドを結合している。
【０２４７】
図４Ｅ：センス鎖は５’末端キャップ成分及び３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて塩基対形成してもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、必要に応じて３’末端グリセリル成分を有していてもよく、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在しうる全てのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドであり、これは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。ホスホロオチオエート、ホスホロジチオエート、又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間結合等の修飾されたヌクレオチド間結合は、「ｓ」で示され、必要に応じてアンチセンス鎖に（ＮＮ）ヌクレオチドを結合している。
【０２４８】
図４Ｆ：センス鎖は５’末端キャップ成分及び３’末端キャップ成分を有する２１ヌクレオチドを含み、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて塩基対形成してもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は２１ヌクレオチドを含み、必要に応じて３’末端グリセリル成分を有していてもよく、ここで、２個の末端３’−ヌクレオチドは必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的であってもよく、１個の３’末端ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有していてもよく、存在しうる全てのピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、存在しうる全てのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレオチドを除き２’−デオキシヌクレオチドであり、これはリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、万能塩基、又は本明細書に記載される他の化学的修飾を含むことができる。ホスホロオチオエート、ホスホロジチオエート、又は本明細書に記載の他の修飾されたヌクレオチド間結合等の修飾されたヌクレオチド間結合は、「ｓ」で示され、必要に応じてアンチセンス鎖に（ＮＮ）ヌクレオチドを結合している。コンストラクトＡ−Ｆのアンチセンス鎖は、本発明のいずれかの標的核酸配列に相補的な配列を含む。さらに、図４Ａ〜Ｆの任意のコンストラクトにおいて、グリセリル残基（Ｌ）がアンチセンス鎖の３’−末端に存在する場合、ヌクレオチド間結合は任意である。
【０２４９】
図５Ａ−Ｆは、本発明の化学修飾された特定のｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示す。Ａ−Ｆは、図４Ａ−Ｆに示される化学的修飾をＣＨＲＭ３配列に適用したものである。そのような化学的修飾は、本明細書に記載される任意のＣＨＲＭ３配列及び／又はＣＨＲＭ３多型配列に適用することができる。
【０２５０】
図６は、本発明の種々のｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す。示される例（コンストラクト１、２、及び３）は典型的な約１９塩基対を有するが、本発明の異なる態様には本明細書に記載される任意の数の塩基対が含まれる。括弧内の領域は、例えば約１、２、３、又は４ヌクレオチドの長さ、好ましくは約２ヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を表す。コンストラクト１及び２は、ＲＮＡｉ活性用に独立して用いることができる。コンストラクト２は、ポリヌクレオチド又は非ヌクレオチドリンカーを含むことができ、これは、必要に応じて、生物分解性リンカーとして設計することができる。１つの実施形態においては、コンストラクト２に示されるループ構造は生物分解性リンカーを含むことができ、このことにより、インビボ及び／又はインビトロでコンストラクト１が形成される。別の例においては、同じ原理でコンストラクト２を生成するためにコンストラクト３を用いることができ、ここで、リンカーはインビボ及び／又はインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト２を生成するために用いられ、これは必要に応じて別の生物分解性リンカーを用いてインビボ及び／又はインビトロで活性なｓｉＮＡコンストラクト１を生成することができる。そのように、ｓｉＮＡコンストラクトの安定性及び／又は活性は、インビボ又はインビトロで、及び／又はインビトロにおいて用いるためのｓｉＮＡコンストラクトの設計に基づいて調節することができる。
【０２５１】
図７Ａ−Ｃは、ｓｉＮＡヘアピンコンストラクトを生成するための発現カセットを作製するために用いられるスキームの概略図である。
【０２５２】
図７Ａ：５’−制限部位（Ｒｌ）配列、次に予め決定されたＣＨＲＭ３標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）を含むようにＤＮＡオリゴマーを合成する。ここで、センス領域は、例えば、約１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド（Ｎ）の長さを有し、その後に例えば約３−約１０ヌクレオチドを含む規定された配列（Ｘ）のループ配列を有する。
【０２５３】
図７Ｂ：次に、合成コンストラクトをＤＮＡポリメラーゼにより伸長して、自己相補的配列を有するヘアピン構造を生成し、このことにより、ＣＨＲＭ３標的配列に対する特異性を有し、自己相補的センス領域及びアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ転写産物が得られる。
【０２５４】
図７Ｃ：コンストラクトを加熱（例えば約９５℃に）して、配列を直鎖状とすることにより、第１の鎖の３’−制限配列に対するプライマーを用いて相補的な第２のＤＮＡ鎖を伸長することができる。次に、二本鎖ＤＮＡを細胞における発現用の適当なベクター中に挿入する。コンストラクトは、例えば、制限部位を設計することにより、及び／又はＰａｕｌら（２００２、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｌｌｏｌｏｇｙ、２９、５０５−５０８）に記載されるようにポリＵ末端領域を利用することにより、転写により３’末端ヌクレオチド突出が生ずるように設計することができる。
【０２５５】
図８Ａ−Ｃは、発現カセットを作製して二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトを生成するために用いられるスキームの概略図である。
【０２５６】
図８Ａ：５’−制限（Ｒ１）部位配列、次に予め決定されたＣＨＲＭ３標的配列と同一の配列を有する領域（ｓｉＮＡのセンス領域）を有するように、ＤＮＡオリゴマーを合成する。ここで、センス領域は、例えば、約１９、２０、２１、又は２２ヌクレオチド（Ｎ）の長さを含み、その後に規定された配列（Ｘ）のループ配列に隣接する３’−制限部位（Ｒ２）を有する。
【０２５７】
図８Ｂ：次に、合成コンストラクトをＤＮＡポリメラーゼで伸長させて、自己相補的配列を有するヘアピン構造を生成する。
【０２５８】
図８Ｃ：コンストラクトをＲ１及びＲ２に特異的な制限酵素で処理して二本鎖ＤＮＡを生成し、次にこれを細胞における発現用の適当なベクター中に挿入する。Ｕ６プロモーター領域がｄｓＤＮＡの両側を挟むように転写カセットを設計し、このことによりｓｉＮＡの別々のセンス鎖及びアンチセンス鎖が生ずる。ポリＴ末端配列をコンストラクトに付加して、得られる転写産物中にＵ突出を生成することができる。
【０２５９】
図９Ａ−Ｅは、特定の標的核酸配列、例えばメッセンジャーＲＮＡ中のｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉの標的部位を決定するために用いられる方法の概略図である。
【０２６０】
図９Ａ：ｓｉＮＡコンストラクトのアンチセンス領域が標的核酸配列の全域で標的部位に対する相補性を有し、センス領域がｓｉＮＡのアンチセンス領域に相補的な配列を含むよう、ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールを合成する。
【０２６１】
図９Ｂ及びＣ：配列をプールし、ベクターの細胞中へのトランスフェクションによりｓｉＮＡが発現するように（図９Ｃ）、ベクター中に挿入する（図９Ｂ）。
【０２６２】
図９Ｄ：標的核酸配列の調節に伴う表現型の変化に基づいて細胞を分類する。
【０２６３】
図９Ｅ：分類された細胞からｓｉＮＡを単離し、シークエンスして、標的核酸配列中の有効な標的部位を同定する。
【０２６４】
図１０は、例えば、本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる、種々の安定化化学（１−１０）の非限定的な例を示す：（１）［３−３’］−逆位デオキシリボース；（２）デオキシリボヌクレオチド；（３）［５’−３’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（４）［５’−３’］−リボヌクレオチド；（５）［５’−３’］−３’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３’−グリセリル；（７）［３’−５’］−３’−デオキシリボヌクレオチド；（８）［３’−３’］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５’−２’］−デオキシリボヌクレオチド；及び（１０）［５−３’］−ジデオキシリボヌクレオチド。図面に示されている修飾及び非修飾の骨格化学に加えて、これらの化学を本明細書に記載されるような別の骨格修飾、例えば、式Ｉを有する骨格修飾と組み合わせることができる。さらに、示される末端修飾の５’側に示される２’−デオキシヌクレオチドは、本明細書に記載される別の修飾又は非修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド、例えば、式Ｉ〜ＶＩＩ又はそれらの任意の組み合わせを有する修飾であってもよい。
【０２６５】
図１１は、ヌクレアーゼに耐性であるがＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持している本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを同定するために用いられる戦略の非限定的な例を示す。経験に基づく設計パラメータ（例えば、２’−修飾、塩基修飾、骨格修飾、末端キャップ修飾等の導入）に基づいてｓｉＮＡコンストラクトに化学修飾を導入する。修飾されたコンストラクトを適当な系（例えば、示されるようにヌクレアーゼ耐性についてはヒト血清、又はＰＫ／デリバリーパラメータについては動物モデル）で試験する。平行して、例えば、細胞培養系において、例えばルシフェラーゼレポーターアッセイにより、ＲＮＡｉ活性についてｓｉＮＡコンストラクトを試験する。次に、特定の特徴を有するがＲＮＡｉ活性を保持しているリードｓｉＮＡコンストラクトを同定し、これをさらに修飾し、再びアッセイする。この同じ方法を用いて、改良された薬物動態学的プロファイル、デリバリー、及びＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ−コンジュゲート分子を同定することができる。
【０２６６】
図１２は、直鎖及び二本鎖コンストラクト並びにこれらの非対称誘導体を含む、リン酸化された本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。
【０２６７】
図１３は、本発明の化学修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す。
【０２６８】
図１４は、標的核酸配列内で同定された回文配列及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的なＤＦ０コンストラクトをデザインするために用いられる方法論の非限定的な例を示す。（ｉ）回文配列又は反復配列を標的核酸配列内で同定する。（ｉｉ）配列を、標的核酸配列及び回文配列に相補的になるようにデザインする。（ｉｉｉ）相補的な配列の非回文／反復部分の逆方向反復配列を、相補的な配列の３’−末端に結合させ、標的核酸配列に相補的な配列を有する自己相補的ＤＦ０分子を生成する。（ｉｖ）ＤＦ０分子は自己会合し、二本鎖を有するオリゴヌクレオチドを形成する。図１４Ｂは、二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドの非限定的な代表例を示す。図１４Ｃは、代表的な二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド配列の自己会合の概略の非限定的な例を示す。図１４Ｄは、代表的な二本鎖を形成するオリゴヌクレオチド配列の自己会合後に、標的核酸配列と相互作用し遺伝子発現の調節をもたらす概略の非限定的な例を示す。
【０２６９】
図１５は、対象となる標的核酸配列に相補的な配列を有するＤＦ０コンストラクトに導入された回文配列及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的なＤＦ０コンストラクトをデザインの非限定的な例を示す。これらの回文／反復配列を導入することにより、それぞれの分子鎖が標的遺伝子の発現の調節を、例えばＲＮＡｉにより媒介することが可能な二本鎖を形成するＤＦ０コンストラクトのデザインが可能になる。まず、標的配列を同定する。その後、ヌクレオチド又は非ヌクレオチドによる修飾（Ｘ又はＹと示す）を相補的な配列に導入し、人工的な回文配列（図中にＸＹＸＹＸＹと示す）を生成する相補的な配列を生成する。回文／反復ではない相補的な配列の逆方向反復配列を相補的な配列の３’−末端に結合させ、核酸標的に相補的な配列を有する自己相補的なＤＦ０を生成する。ＤＦ０は、自己会合し二本鎖を有するオリゴヌクレオチドを形成することができる。
【０２７０】
図１６は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有する、多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１６Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１６Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。
【０２７１】
図１７は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有する、単一のポリヌクレオチド配列を有する多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。
【０２７２】
図１７Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１７Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置する多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。１つの実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロにおいてプロセスされ、図１６に示したような多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを生成する。
【０２７３】
図１８は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有し、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１８Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１８Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第１及び第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。
【０２７４】
図１９は、それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有し、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、単一のポリヌクレオチド配列を有する多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。図１９Ａは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の３’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。図１９Ｂは、第１の核酸配列に相補的な第１の領域（相補的領域１）と第２の核酸配列に相補的な第２の領域（相補的領域２）とを有し、第２の相補的領域は前記多機能性ｓｉＮＡのそれぞれのポリヌクレオチド配列の５’−末端に位置し、第１及び第２の相補的領域はさらに自己相補的、回文又は反復領域を有する、多機能性ｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々のポリヌクレオチド配列の破線を付した領域は、ｓｉＮＡ二本鎖の対応する部分に対する相補性を有するが、標的核酸配列に対する相補性を有していない。１つの実施形態において、これらの多機能性ｓｉＮＡコンストラクトは、インビボ又はインビトロにおいてプロセスされ、図１８に示したような多機能性ｓｉＮＡコンストラクトを生成する。
【０２７５】
図２０は、多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子が、どのようにして、異なるタンパク質、例えばサイトカイン及び対応する受容体、異なるウィルス菌株、ウィルス及びウィルスの感染又は複製に関与する細胞タンパク質、又は疾患の維持または進行に関与する共通の又は多様な生物学的経路に関与する異なるタンパク質をコードする個別のＲＮＡ分子等の２つの個別の標的核酸分子を標的にするかの非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々の分子鎖は、個別の標的核酸分子に対して相補性を有する領域を有する。多機能性ｓｉＮＡ分子は、前記ｓｉＮＡの個々の分子鎖がＲＩＳＣ複合体に利用され、対応する標的のＲＮＡ干渉に媒介される分解を開始することことができるようにデザインされる。これらのデザイン要素には、ｓｉＮＡコンストラクトのそれぞれの末端の安定化（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ他，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照）が含まれていてもよい。このような安定化は、例えば、グアノシン−シチジン塩基対、代わりの塩基対（例えば、ゆらぎ塩基対）、又は末端ヌクレオチドの位置における不安定化されるような公知の化学修飾を受けたヌクレオチド等によって達成されてもよい。
【０２７６】
図２１は、多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子が、どのようにして、ＲＮＡの交互コード領域、ＲＮＡのコーディング及び非コーディング領域、又はＲＮＡの交互スプライス変異領域等の、同一標的核酸分子内の２つの個別の標的核酸配列を標的にするかの非限定的な例を示す。多機能性ｓｉＮＡコンストラクトの個々の分子鎖は、標的核酸分子の個別の領域に対して相補性を有する領域を有する。多機能性ｓｉＮＡ分子は、前記ｓｉＮＡの個々の分子鎖がＲＩＳＣ複合体に利用され、対応する標的領域のＲＮＡ干渉に媒介される分解を開始することことができるようにデザインされる。これらのデザイン要素には、ｓｉＮＡコンストラクトのそれぞれの末端の安定化（例えば、Ｓｃｈｗａｒｚ他，２００３，Ｃｅｌｌ，１１５，１９９−２０８を参照）が含まれていてもよい。このような安定化は、例えば、グアノシン−シチジン塩基対、代わりの塩基対（例えば、ゆらぎ塩基対）、又は末端ヌクレオチドの位置における不安定化されるような公知の化学修飾を受けたヌクレオチド等によって達成されてもよい。
【０２７７】
図２２は、ＰＣ３細胞中で、ＣＨＲＭ３  ｍＲＮＡを標的とする化学修飾されたｓｉＮＡに媒介されたＣＨＲＭ３  ｍＲＮＡの減少の非限定的な例を示す。ＰＣ３細胞に、２５ｎＭのｓｉＮＡと複合化された０．２５μｇ／ウェルの脂質を用いて遺伝子をトランスフェクションした。数種類の安定化成分（表３及び４を参照）を有する活性なｓｉＮＡコンストラクト（実線）を、未処理の細胞と比較し、無関係なｓｉＮＡコントロールコンストラクト（３２０７２／３２０７５）と適合させた組み合わせ、及び脂質のみをトランスフェクションした細胞（トランスフェクションコントロール）と比較した。図から明らかなように、ｓｉＮＡコンストラクトは、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡの発現を優位に減少させた。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２７８】
本発明の核酸分子の作用機構
以下の議論は、現在知られている短鎖干渉ＲＮＡにより媒介されるＲＮＡ干渉の提唱されるメカニズムについて記述しているが、限定を意味するものではなく、先行技術であると認めるものではない。本出願人は、本明細書において、化学的に修飾された短鎖干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子と類似の又は改良されたＲＮＡｉ媒介能力を有し、インビボで改良された安定性及び活性を有すると予測されることを示す。したがって、この議論は、ｓｉＲＮＡのみに限定されることを意味するものではなく、ｓｉＮＡ全体に適用することができる。「ＲＮＡｉを媒介する改良された能力」又は「改良されたＲＮＡｉ活性」とは、インビトロ及び／又はインビボで測定されたＲＮＡｉ活性を含むことを意味し、ここで、ＲＮＡｉ活性はｓｉＮＡがＲＮＡｉを媒介する能力と本発明のｓｉＮＡの安定性との両方を反映する。本発明においては、これらの活性の積を、全ＲＮＡｓｉＲＮＡ又は複数のリボヌクレオチドを含むｓｉＮＡと比較して、インビトロ及び／又はインビボで増加させることができる。場合によっては、ｓｉＮＡ分子の活性又は安定性は低下するかもしれないが（すなわち、１０分の１以下）、ｓｉＮＡ分子の全体的活性はインビトロ及び／又はインビボで増強される。
【０２７９】
ＲＮＡ干渉とは、動物において短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）により媒介される配列特異的な転写後遺伝子抑制の過程をいう（Ｆｉｒｅ他，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）。植物における対応する過程（Ｈｅｉｆｅｔｚ他，ＷＯ９９／６１６３１号国際公開公報）は、一般に転写後遺伝子抑制又はＲＮＡ抑制と呼ばれており、菌類においてはクエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）とも呼ばれている。転写後遺伝子抑制の過程は、外来遺伝子の発現を阻止するための進化的に保存された細胞の防御機構であると考えられており、多様な植物及び種族の間で広く共有されている（Ｆｉｒｅ他，１９９９，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。このような外来遺伝子からの防御は、ウィルスの感染又はトランスポゾンエレメントの宿主ゲノム内へのランダムインテグレーションにより誘発された二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に対応して、相同な一本鎖ＲＮＡ又はウィルスのゲノムＲＮＡを特異的に破壊する細胞応答を介して進化したものであるかもしれない。細胞中にｄｓＲＮＡが存在すると、未だ完全に解明されていないメカニズムによってＲＮＡｉ応答が引き起こされる。このメカニズムは、ｄｓＲＮＡに媒介されたプロテインキナーゼＰＫＲ及び２’，５’−オリゴアデニレート合成酵素の活性化により、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特異的分解を引き起こす、インターフェロン応答等の既知のメカニズムとは異なっているようである。
【０２８０】
長鎖のｄｓＲＮＡが細胞内に存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が刺激される。ダイサーは、ｄｓＲＮＡを短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡの短い断片に切断するプロセシングに関与している（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ他，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４０９，３６３）。ダイサーの活性により生じた短鎖干渉ＲＮＡは、通常約２１〜２３ヌクレオチド長であり、約１９塩基対の二本鎖を有する。ダイサーは、翻訳制御に関与している保存構造の前駆体ＲＮＡからの、２１及び２２ヌクレオチドの短鎖一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）の切除にも関与している。（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ他，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答は、通常ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれ、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖と相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するエンドヌクレアーゼ複合体によっても特徴づけられる。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖と相補的な領域の中央で起こる。（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１５，１８８）。さらに、ＲＮＡ干渉には、小さいＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）に媒介される遺伝子サイレンシングが関与する場合もある。これはおそらくは、クロマチン構造を制御する細胞性メカニズムによるものであり、このことにより標的遺伝子配列の転写が妨害される（例えば、Ａｌｌｓｈｉｒｅ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８１８−１８１９；Ｖｏｌｐｅ他，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１８３３−１８３７；Ｊｅｎｕｗｅｉｎ，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２１５−２２１８；及びＨａｌｌ他，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，２２３２−２２３７を参照）。このように、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ転写産物との相互作用を介して、あるいは特定の遺伝子配列との相互作用により、遺伝子サイレンシングを媒介するために用いることができ、そのような相互作用により転写レベル又は転写後レベルのいずれかで遺伝子サイレンシングが生ずる。
【０２８１】
ＲＮＡｉは、多くの系について研究されている。Ｆｉｒｅら（１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，８０６）は、線虫（Ｃ．  Ｅｌｅｇａｎｓ）において最初にＲＮＡｉを観測した。Ｈａｍｍｏｎｄら（２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡを導入されたショウジョウバエの細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４）は、ヒト胎児腎臓細胞及びＨｅＬａ細胞を含む培養された哺乳類細胞へ合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二本鎖を導入することにより誘起されるＲＮＡｉについて記述している。ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究は、効率的なＲＮＡｉ活性を媒介するために必須であるｓｉＲＮＡの長さ、構造、化学組成、及び配列についてのある種の要件を明らかにした。これらの研究は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二本鎖は、３’末端ジヌクレオチド突出を含む場合に最も活性であることを示した。さらに、一方又は両方のｓｉＲＮＡ鎖を２’−デオキシ（２’−Ｈ）又は２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで置換するとＲＮＡｉ活性が破壊されるが、３’末端ｓｉＲＮＡ突出ヌクレオチドを２’−デオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）で置換することは許容されることが示された。ｓｉＲＮＡ二本鎖の中心における単一のミスマッチ配列もまたＲＮＡｉ活性を破壊することが示された。さらに、これらの研究はまた、標的ＲＮＡにおける切断部位の位置はｓｉＲＮＡガイド配列の３’末端ではなくガイド配列の５’末端により規定されることを示した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ他，２００１，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究は、ｓｉＲＮＡ二本鎖の標的相補鎖の５’−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ｓｉＲＮＡの５’−リン酸成分を維持するためにＡＴＰが用いられることを示したが（Ｎｙｋａｎｅｎ他，２００１，Ｃｅｌｌ，１０７，３０９）、５’−リン酸を欠失したｓｉＲＮＡは外的に導入したときに活性であり、このことは、インビボでｓｉＲＮＡコンストラクトの５’−リン酸化が生じているかもしれないことを示唆する。
【０２８２】
核酸分子の合成
１００ヌクレオチドを越える長さの核酸の合成は、自動化方法を用いては困難であり、そのような分子の治療コストは非常に高くなる。本発明においては、好ましくは、小さい核酸モチーフ（「小さい」とは、１００ヌクレオチド以下の長さ、好ましくは８０ヌクレオチド以下の長さ、最も好ましくは５０ヌクレオチド以下の長さの核酸モチーフ、例えば、別々のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列又はタンデムで合成されたｓｉＮＡ配列を表す）が外的デリバリーに用いられる。これらの分子は構造が簡単であるため、核酸がタンパク質及び／又はＲＮＡ構造の標的領域に進入する能力が高い。本発明の例示的分子は化学的に合成するが、他の分子も同様に合成することができる。
【０２８３】
オリゴヌクレオチド（例えば、ある種の修飾オリゴヌクレオチド又はリボヌクレオチドを欠失しているオリゴヌクレオチドの一部）は、例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１１，３−１９，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，ＷＯ９９／５４４５９号国際公開公報，Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４，Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９，Ｂｒｅｎｎａｎ他，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，６１，３３−４５，及びＢｒｅｎｎａｎ，米国特許第６，００１，３１１号明細書に記載されるような、当該技術分野において知られるプロトコルを用いて合成する。これらの文献はすべて参照として本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの合成は、一般の核酸保護基及びカップリング基、例えば５’末端にジメトキシトリチル、及び３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的な例においては、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルで、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程、及び２’−デオキシヌクレオチド又は２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドについては４５秒間のカップリング工程で、小スケールの合成を行う。表５は、合成サイクルで用いる試薬の量及び接触時間の概要を示す。あるいは、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、９６ウエルプレート合成機、例えば、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ社（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）により製造される装置で、サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。デオキシ残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して２２倍過剰（４０μＬの０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホルアミダイト及び７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬの０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）を用いることができる。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機における平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量により決定して、典型的には９７．５〜９９％である。３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成器で用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは、ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）及びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２、６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は、ＴＨＦ中１６．９ｍＭＩ２、４９ｍＭピリジン、９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは、ホスホロチオエート結合の導入のためには、ボーケージ試薬（３Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン−１、１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０２８４】
ＤＮＡ系オリゴヌクレオチドの脱保護は以下のように行う：ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し、４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中、６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後、上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して、白色粉末を得る。
【０２８５】
本発明のある種のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡについて用いられる合成方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５）、Ｓｃａｒｉｎｇｅら（１９９０，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３）及びＷｉｎｃｏｔｔら（１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）、Ｗｉｎｃｏｔｔら（１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，７４，５９）に記載の方法にしたがい、慣用の核酸保護基及びカップリング基、例えば、５’末端にジメトキシトリチル、及び３’末端にホスホルアミダイトを用いて行う。非限定的な例においては、小スケールの合成は、３９４  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．合成機で、改変した０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いて、アルキルシリル保護ヌクレオチドについては７．５分間のカップリング工程を、２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドについては２．５分間のカップリング工程を行う。表５は、合成サイクルにおいて用いる試薬の量及び接触時間の概要を示す。あるいは、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、９６ウエルプレート合成機、例えば、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）により製造される装置で、サイクルに最少の改変を加えて行うことができる。２’−Ｏ−メチル残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して３３倍過剰（６０μＬの０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイト及び７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬの０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）を用いることができる。リボ残基の各カップリングサイクルにおいては、ポリマー結合５’−ヒドロキシルに対して６６倍過剰（１２０μＬの０．１１Ｍ＝１３．２μｕｍｏｌ）のアルキルシリル（リボ）保護ホスホルアミダイト及び１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬの０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ）を用いることができる。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３９４型ＤＮＡシンセサイザーにおける平均カップリング収率は、トリチル画分の比色定量により決定して、典型的には９７．５〜９９％である。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製３９４型ＤＮＡシンセサイザーで用いる他のオリゴヌクレオチド合成試薬は以下のとおりである：脱トリチル化溶液は塩化メチレン中３％ＴＣＡ（ＡＢＩ）であり；キャッピングは、ＴＨＦ中１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）及びＴＨＦ中１０％無水酢酸／１０％２、６−ルチジン（ＡＢＩ）中で行い；酸化溶液は、ＴＨＦ中１６．９ｍＭＩ２、４９ｍＭピリジン、９％水（ＰＥＲＳＥＰＴＩＶＥ（登録商標））である。Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ合成等級アセトニトリルは試薬瓶から直接用いる。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中０．２５Ｍ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｉｎｃ．から入手した固体から作成する。あるいは、ホスホロチオエート結合の導入のためには、ボーケージ試薬（３Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン−１、１−ジオキシド、アセトニトリル中０．０５Ｍ）を用いる。
【０２８６】
ＲＮＡの脱保護は、２ポットプロトコル又は１ポットプロトコルのいずれかを用いて行う。２ポットプロトコルについては、ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し、４０％水性メチルアミン（１ｍＬ）の溶液中で６５℃で１０分間懸濁する。−２０℃に冷却した後、上清をポリマー支持体から取り出す。支持体を１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ2Ｏ／３：１：１で３回洗浄し、ボルテックスし、次に上清を最初の上清に加える。オリゴリボヌクレオチドを含む合わせた上清を乾燥して、白色粉末を得る。塩基脱保護オリゴリボヌクレオチドを無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（１．５ｍＬＮ−メチルピロリジノン、７５０μＬＴＥＡ及び１．０ｍＬＴＥＡ・３ＨＦの溶液３００μＬ、ＨＦ濃度１．４Ｍ）に再懸濁し、６５℃に加熱する。１．５時間後、オリゴマーを１．５Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3で反応を停止させる。
【０２８７】
あるいは、１ポットプロトコルのためには、ポリマー結合トリチルオンオリゴリボヌクレオチドを４ｍＬのガラスねじ蓋バイアルに移し、３３％エタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ）の溶液中で、６５℃で１５分間懸濁する。バイアルを室温にする。ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）を加え、バイアルを６５℃で１５分間加熱する。試料を−２０℃に冷却し、次に１．５Ｍ  ＮＨ4ＨＣＯ3で反応を停止させる。
【０２８８】
トリチルオンオリゴマーの精製のためには、停止したＮＨ4ＨＣＯ3溶液を、アセトニトリル、続いて５０ｍＭＴＥＡＡで予備洗浄したＣ−１８含有カートリッジに負荷する。負荷したカートリッジを水で洗浄した後、ＲＮＡを０．５％ＴＦＡで１３分間脱トリチル化する。次にカートリッジを水で再び洗浄し、１ＭＮａＣｌで塩交換し、再び水で洗浄する。次に、３０％アセトニトリルでオリゴヌクレオチドを溶出する。
【０２８９】
平均段階カップリング収率は、典型的には＞９８％である（Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７−２６８４）。当業者は、合成のスケールは、上述の例より大きく又は小さく、例えば、限定されないが、９６ウェルのフォーマットに適合させることができることを認識するであろう。
【０２９０】
あるいは、本発明の核酸分子は、別々に合成して、合成後に例えばライゲーションにより（Ｍｏｏｒｅ他，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６，９９２３；Ｄｒａｐｅｒ他，ＷＯ９３／２３５６９号国際公開公報；Ｓｈａｂａｒｏｖａ他，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９，４２４７；Ｂｅｌｌｏｎ他，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１６，９５１；Ｂｅｌｌｏｎ他，１９９７，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｌｏｎ他，１９９７，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．８，２０４）、又は合成及び／又は脱保護の後にハイブリダイゼーションにより、一緒につなげてもよい。
【０２９１】
本発明のｓｉＮＡ分子はまた、本明細書の実施例１に記載されるようにタンデム合成法により合成することができる。この方法では、両方のｓｉＮＡ鎖を、切断可能なリンカーにより分離された単一の連続するオリゴヌクレオチドフラグメント又は鎖として合成し、次にこれを切断して別々のｓｉＮＡフラグメント又は鎖を生成し、これはハイブリダイズしてｓｉＮＡ二本鎖の精製を可能とする。リンカーはポリヌクレオチドリンカーであっても非ヌクレオチドリンカーであってもよい。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成は、マルチウエル／マルチプレート合成プラットフォーム、例えば９６ウェル又は同様のより大きなマルチウエルプラットフォームのいずれにも容易に適合させることができる。本明細書に記載されるｓｉＮＡのタンデム合成はまた、バッチリアクター、合成カラムなどを用いる大規模合成プラットフォームにも容易に適合させることができる。
【０２９２】
ｓｉＮＡ分子はまた、一方のフラグメントがＲＮＡ分子のセンス領域を含み、第２のフラグメントがアンチセンス領域を含む２つの別々の核酸鎖又はフラグメントから組み立ててもよい。
【０２９３】
本発明の核酸分子は、広範囲に修飾して、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈによる修飾により安定性を高めることができる（概説として、Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２，ＴＩＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ他，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３を参照）。ｓｉＮＡコンストラクトは、一般的な方法を用いてゲル電気泳動により精製するか、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｗｉｎｃｏｔｔ他，（上掲）を参照、その全体を参照として本明細書に組み込まれる）により精製し、水に再懸濁する。
【０２９４】
本発明の別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現される。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミド又はウィルスベクターでありうる。ｓｉＮＡを発現するウィルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス又はアルファウィルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターを本明細書に記載されるようにデリバリーし、標的細胞中に残留させることができる。あるいは、ｓｉＮＡ分子の過渡的発現を与えるウィルスベクターを用いてもよい。
【０２９５】
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基、糖及び／又はリン酸）を有する化学的に合成した核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによる分解を防止することができ、このことによりその抗力を高めることができる（例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他，ＷＯ９２／０７０６５号国際公開公報；Ｐｅｒｒａｕｌｔ他，１９９０  Ｎａｔｕｒｅ  ３４４，５６５；Ｐｉｅｋｅｎ他，１９９１  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，３１４；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７，３３４；Ｕｓｍａｎ他，ＷＯ９３／１５１８７号国際公開公報；Ｒｏｓｓｉ他，ＷＯ９１／０３１６２号国際公開公報；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号明細書；Ｇｏｌｄ他，米国特許第６，３００，０７４号明細書及びＢｕｒｇｉｎ他，（上掲）を参照（これらはすべて参照として本明細書に組み込まれる）。上述の参考文献はすべて、本明細書に記載される核酸分子の塩基、リン酸及び／又は糖成分になしうる種々の化学修飾について記述している。細胞中におけるその抗力を増強するよう修飾し、及びオリゴヌクレオチドの合成時間を短縮し化学物質の必要性を減少するために核酸分子から塩基を除去することが望ましい。
【０２９６】
当該技術分野には、そのヌクレアーゼ安定性及び効力を有意に増強することができる、核酸分子中に導入することができる糖、塩基及びリン酸修飾を記述するいくつかの例がある。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ等のヌクレオチド塩基修飾で修飾することにより、安定性を高め、及び／又は生物学的活性を増強するために修飾される（総説については，Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，１９９２  ＴＩＴＢＳ  １７，３４；Ｕｓｍａｎ他，１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１，１６３；Ｂｕｒｇｉｎ他，１９９６  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｙ  ３５，１４０９０を参照）。核酸分子の糖修飾は、当該技術分野において広く記載されている（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他，ＷＯ９２／０７０６５号国際公開公報；Ｐｅｒｒａｕｌｔ他，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０，３４４，５６５−５６８；Ｐｉｅｋｅｎ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５３，３１４−３１７；Ｕｓｍａｎ及びＣｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９９２，１７，３３４−３３９；Ｕｓｍａｎ他，ＷＯ９３／１５１８７号国際公開公報；Ｓｐｒｏａｔ，米国特許第５，３３４，７１１号明細書，Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他，１９９５  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２５７０２；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他，ＷＯ９７／２６２７０号国際公開公報；Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他，米国特許第５，７１６，８２４号明細書；Ｕｓｍａｎ他，米国特許第５，６２７，０５３号明細書；Ｗｏｏｌｆ他，ＷＯ９８／１３５２６号国際公開公報；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，米国特許出願第６０／０８２，４０４号（１９９８年４月２０日出願）；Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ他，１９９８，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３９，１１３１；Ｅａｒｎｓｈａｗ及びＧａｉｔ，１９９８，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ），４８，３９−５５；Ｖｅｒｍａ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，１９９８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７，９９−１３４；及びＢｕｒｌｉｎａ他，１９９７，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５，１９９９−２０１０を参照、これらの参考文献はすべて、その全体を参照として本明細書に組み込まれる）。これらの刊行物は、触媒活性を変更することなく、糖、塩基及び／又はリン酸修飾等を核酸分子中に組み込む位置を決定する一般的方法及び戦略を記載しており、参照として本明細書に組み込まれる。このような教示の態様から、ｓｉＮＡが細胞においてＲＮＡｉを促進する能力が有意に阻害されない限り、本明細書に記載されるように、同様の修飾を用いて本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾することができる。
【０２９７】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、及び／又は５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を改良するが、過剰な修飾はある種の毒性又は活性の低下を引き起こしうる。したがって、核酸分子を設計する場合、これらのヌクレオチド間結合の量は最小にすべきである。これらの結合の濃度を減少させると、毒性が低下し、これらの分子の効力が増加し特異性が高くなるはずである。
【０２９８】
活性を維持又は増強する化学的修飾を有する短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子が提供される。そのような核酸はまた、一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対する耐性が高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボで活性は顕著に低下しないはずである。調節が目的である場合には、外的にデリバリーされる治療用核酸分子は、最適には、望ましくないタンパク質のレベルが低下するのに充分長い時間標的ＲＮＡの翻訳が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。この時間は、疾患の状態により数時間から数日まで様々である。ＲＮＡ及びＤＮＡの化学合成における進歩（Ｗｉｎｃｏｔｔ他，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２６７７；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ他，１９９２，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１，３−１９（参照として本明細書に組み込まれる））により、上述のようにヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を高めることにより、核酸分子を改変する可能性が拡大した。
【０２９９】
１つの実施形態においては、本発明の核酸分子は、１又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）のＧクランプヌクレオチドを含む。Ｇクランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体であり、ここで、修飾は、二本鎖中の相補的グアニンのワトソン・クリック及びフーグスティーン面の両方の水素結合の能力を与える。例えば、Ｌｉｎ及びＭａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０，８５３１−８５３２を参照。オリゴヌクレオチド中の単一のＧクランプ類似体置換により、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズしたときのらせん熱安定性及びミスマッチ識別性を実質的に増強することができる。そのようなヌクレオチドを本発明の核酸分子中に取り込ませることにより、核酸標的の相補的配列又はテンプレート鎖に対する親和性及び特異性の両方が増強される。他の実施形態においては、本発明の核酸分子は１又はそれ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上）のＬＮＡ「ロック核酸」ヌクレオチド、例えば、２’、４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドを含む（例えば、Ｗｅｎｇｅｌ他，ＷＯ００／６６６０４号国際公開公報及びＷＯ９９／１４２２６号国際公開公報を参照）。
【０３００】
他の実施形態においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲート及び／又は複合体を特徴とする。そのようなコンジュゲート及び／又は複合体は、生物学的システム、例えば細胞へのｓｉＮＡ分子のデリバリーを容易にするために用いることができる。本発明により提供されるコンジュゲート及び複合体は、治療用化合物を、細胞膜を超えて輸送し、薬物動態学を変更し、及び／又は本発明の核酸分子の局在化を調節することにより、治療的活性を付与することができる。本発明は、分子、例えば、限定されないが、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、トキシン、負に荷電したポリマー及び他のポリマー、例えば、タンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、又はポリアミンを、細胞膜を横切ってデリバリーするための、新規コンジュゲート及び複合体の設計及び合成を包含する。一般に、記載されるトランスポーターは、個々に又は多成分系の一部として、分解性リンカー付きで又はなしで用いるよう設計される。これらの化合物は、血清の存在下又は非存在下で、本発明の核酸分子を異なる組織に由来する多数の細胞タイプにデリバリー及び／又は局在化することを改良すると予測される（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ，米国特許第５，８５４，０３８号明細書を参照）。本明細書に記載される分子のコンジュゲートは、生物分解性のリンカー、例えば生物分解性核酸リンカー分子を介して、生物学的に活性な分子に結合させることができる。
【０３０１】
本明細書において用いる場合、「生物分解性リンカー」という用語は、１つの分子を別の分子に、例えば、生物学的に活性な分子を本発明のｓｉＮＡ分子に、又は本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖とアンチセンス鎖とを接続するための生物分解性リンカーとして設計される核酸又は非核酸リンカー分子を表す。生物分解性リンカーは、特定の目的、例えば特定の組織又は細胞タイプへのデリバリーのためにその安定性を調節することができるように設計する。核酸に基づく生物分解性リンカー分子の安定性は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−Ｏ−アリル、及び他の２’−修飾又は塩基修飾ヌクレオチドの種々の組み合わせを用いることにより調節することができる。生物分解性核酸リンカー分子は、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はより長い核酸分子、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであることができ、又はリン酸に基づく結合、例えば、ホスホルアミデート又はホスホジエステル結合を有する単一のヌクレオチドを含むことができる。生物分解性核酸リンカー分子はまた、核酸骨格、核酸糖、又は核酸塩基修飾を含むことができる。
【０３０２】
本明細書において用いる場合、「生物分解性」との用語は、生物学的システムにおける分解、例えば酵素的分解又は化学的分解を表す。
【０３０３】
本明細書において用いる場合、「生物学的に活性な分子」という用語は、システムにおいて生物学的応答を導き出すか又は調節することができる化合物又は分子を表す。本発明により単独又は他の分子との組み合わせで企図される生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の非限定的な例としては、治療上活性な分子、例えば、抗体、ホルモン、抗ウィルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、小分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、トリプレックス形成オリゴヌクレオチド、２、５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ及びこれらの類似体が含まれる。本発明の生物学的に活性な分子には、他の生物学的に活性な分子の薬物動態学及び／又は薬力学を調節することができる分子、例えば、脂質及びポリマー、例えば、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール及び他のポリエーテルも含まれる。
【０３０４】
本明細書において用いる場合、「リン脂質」との用語は、少なくとも１つのリン酸基を含む疎水性分子を表す。例えば、リン脂質は、リン酸含有基及び飽和又は不飽和アルキル基を含むことができ、これは、ＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、又は置換若しくは未置換アリール基で必要に応じて置換されていてもよい。
【０３０５】
外的にデリバリーされた治療用核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、最適には、ＲＮＡ転写産物のレベルが低下するのに充分長い時間ＲＮＡの逆転写が調節されるまで細胞内で安定であるべきである。核酸分子は、有効な細胞内治療用薬剤として機能するためには、ヌクレアーゼに耐性である。本明細書に及び当該技術分野において記載される核酸分子の化学合成の改良により、上述したように、ヌクレオチド修飾を導入してそのヌクレアーゼ安定性を増強させることにより、核酸分子を修飾する可能性が拡大した。
【０３０６】
さらに他の実施形態においては、ＲＮＡｉに関与するタンパク質の酵素活性を維持するか又は増強させる化学的修飾を有するｓｉＮＡ分子が提供される。そのような核酸はまた、一般に非修飾核酸よりヌクレアーゼに対してより耐性が高い。したがって、インビトロ及び／又はインビボで、活性は顕著に低下しないであろう。
【０３０７】
本発明の核酸系分子の使用は、組み合わせ療法の可能性を提供することにより、疾患の進行のよりよい治療につながるであろう（例えば、異なる遺伝子を標的とする多数のｓｉＮＡ分子、既知の小分子阻害剤とカップリングさせた核酸分子、又は分子（異なる酵素的核酸分子モチーフを含む）及び／又は他の化学的又は生物学的分子の組み合わせによる間欠的治療）。ｓｉＮＡ分子を用いる被験者の治療にはまた、異なる種類の核酸分子、例えば、酵素的核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２、５−Ａオリゴアデニレート、デコイ、及びアプタマーの組み合わせが含まれる。
【０３０８】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１又は複数の５’及び／又は３’−キャップ構造を、例えばセンスｓｉＮＡ鎖のみに、アンチセンスｓｉＮＡ鎖のみに、又は両方のｓｉＮＡ鎖に含む。
【０３０９】
「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学的修飾を意味する（例えば、Ａｄａｍｉｃ他，米国特許第５、９９８、２０３号明細書（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、デリバリー及び／又は細胞中の局在化を助けるであろう。キャップは５’末端（５’−キャップ）に存在してもよく、又は３’末端（３’−キャップ）に存在してもよく、両方の末端に存在してもよい。非限定的な例においては、５’−キャップは、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（成分）；４’、５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド；炭素環式ヌクレオチド；１、５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’、４’−セコヌクレオチド；非環状３、４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環状３、５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド成分；３’−３’−逆位脱塩基成分；３’−２’−逆位ヌクレオチド成分；３’−２’−逆位脱塩基成分；１、４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホルアミデート；ヘキシルリン酸；アミノヘキシルリン酸；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；又は架橋又は非架橋メチルホスホネート成分からなる群より選択される。キャップ残基の非限定的な例を図１０に示す。
【０３１０】
非限定的な例においては、３’−キャップは、例えば、グリセリル、逆位デオキシ脱塩基残基（成分）、４’、５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸；１、３−ジアミノ−２−プロピルリン酸；３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１、２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１、５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；スレオペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’、４’セコヌクレオチド；３、４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３、５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド成分；５’−５’−逆位脱塩基成分；５’−ホスホルアミデート；５’−ホスホロチオエート；１、４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋及び／又は非架橋５’−ホスホルアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋メチルホスホネート及び５’−メルカプト成分からなる群より選択される（より詳細には、Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＩｙｅｒ、１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５（参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。
【０３１１】
「非ヌクレオチド」との用語は、１又は複数のヌクレオチドユニットの代わりに核酸鎖中に導入することができ、糖及び／又はリン酸置換のいずれかを含み、残りの塩基がその酵素的活性を発揮することを可能とする任意の基又は化合物を意味する。基又は化合物は、一般に認識されているヌクレオチド塩基、例えば、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル又はチミンを含まず、したがって１’位に塩基を欠失している場合、脱塩基である。
【０３１２】
「アルキル」基とは、飽和脂肪族炭化水素を表し、直鎖、分枝鎖、及び環状アルキル基が含まれる。好ましくは、アルキル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは、これは１〜７個の炭素、より好ましくは１〜４個の炭素を有する低級アルキルである。アルキルは置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ2又はＮ（ＣＨ3）2、アミノ、又はＳＨである。この用語は、また、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む不飽和炭化水素基であるアルケニル基を含み、直鎖、分枝鎖、及び環状基を含む。好ましくは、アルケニル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは、これは１〜７個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子の低級アルケニルである。アルケニル基は置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ2、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ3）2、アミノ、又はＳＨから選択される。「アルキル」との用語はまた、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む不飽和の炭化水素基を有するアルキニル基を含み、直鎖、分枝鎖、及び環状基を含む。好ましくは、アルキニル基は１〜１２個の炭素を有する。より好ましくは、これは１〜７個の炭素、より好ましくは１〜４個の炭素を有する低級アルキニルである。アルキニル基は、置換されていてもされていなくてもよい。置換されている場合、置換基は、好ましくは、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ2又はＮ（ＣＨ3）2、アミノ又はＳＨである。
【０３１３】
そのようなアルキル基はまた、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、複素環アリール、アミド及びエステル基を含むことができる。「アリール」基とは、共役したパイ電子系を有する少なくとも１つの環を有する芳香族基を表し、炭素環式アリール、複素環アリール及び二アリール基が含まれる。これらはすべて必要に応じて置換されていてもよい。アリール基の好ましい置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、及びアミノ基である。「アルキルアリール」基は、アリール基（上述）に共有結合したアルキル基（上述）を表す。炭素環式アリール基は、芳香族環の環原子がすべて炭素原子である基である。炭素原子は必要に応じて置換されていてもよい。複素環アリール基は、芳香族環中の環原子として１−３個の複素原子を有し、環原子の残りが炭素原子である基である。適当な複素原子には、酸素、硫黄、及び窒素が含まれ、例えば、フラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低級アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル等が挙げられる。これらはすべて必要に応じて置換されていてもよい。「アミド」とは、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｒ（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素のいずれかである）を表す。「エステル」とは、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’（式中、Ｒはアルキル、アリール、アルキルアリール又は水素のいずれかである）を表す。
【０３１４】
本明細書において用いる場合、「ヌクレオチド」は、当該技術分野においては、天然塩基（標準的）、及び当該技術分野においてよく知られる修飾塩基を含むと認識されている。そのような塩基は、一般にヌクレオチド糖成分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に、塩基、糖及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、糖、リン酸及び／又は塩基成分において修飾されていてもされていなくてもよい（互換的に、ヌクレオチド類似体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準的ヌクレオチド等とも称される。例えば、Ｕｓｍａｎ及びＭｃＳｗｉｇｇｅｎ（上掲）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他，ＷＯ９２／０７０６５号国際公開公報；Ｕｓｍａｎ他，ＷＯ９３／１５１８７号国際公開公報；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ、（上掲）（すべて参照として本明細書に組み込まれる）を参照）。当該技術分野において知られる修飾核酸塩基のいくつかの例があり、Ｌｉｍｂａｃｈ他，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３にまとめられている。核酸中に導入することができる塩基修飾のいくつかの非限定的な例としては、例えば、イノシン、プリン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２、４、６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えばリボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば５−ブロモウリジン）又は６−アザピリミジン又は６−アルキルピリミジン（例えば６−メチルウリジン）、プロピン及びその他のものが挙げられる（Ｂｕｒｇｉｎ他，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，１４０９０；Ｕｈｌｍａｎ及びＰｅｙｍａｎ、上掲）。この態様において、「修飾塩基」とは、１’位におけるアデニン、グアニン、シトシン及びウラシル以外のヌクレオチド塩基又はそれらの同等物を意味する。
【０３１５】
１つの実施形態においては、本発明はリン酸骨格修飾を有する修飾されたｓｉＮＡ分子を特徴とし、これは１又は複数のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、及び／又はアルキルシリル置換を含む。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説については、Ｈｕｎｚｉｋｅｒ及びＬｅｕｍａｎｎ，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｍｏｄｅｒｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１−４１７，及びＭｅｓｍａｅｋｅｒ他，１９９４，Ｎｏｖｅｌ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４−３９を参照されたい。
【０３１６】
「脱塩基」とは、１’位において塩基を欠失しているか、又は塩基の代わりに他の化学基を有する糖成分を意味する（例えば、Ａｄａｍｉｃ他，米国特許第５、９９８、２０３号明細書を参照）。
【０３１７】
「非修飾ヌクレオシド」とは、β−Ｄ−リボ−フラノースの１’炭素に結合した塩基、アデニン、シトシン、グアニン、チミン又はウラシルのいずれかの塩基を意味する。
【０３１８】
「修飾ヌクレオシド」とは、非修飾ヌクレオチドの塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造中に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を意味する。修飾ヌクレオチドの非限定的な例は式Ｉ〜ＶＩＩに示されるか、及び／又は本明細書に記載される他の修飾である。
【０３１９】
本発明において記載される２’−修飾ヌクレオチドに関して、「アミノ」とは、２’−ＮＨ2又は２’−Ｏ−ＮＨ2を意味し、これは修飾されていてもされていなくてもよい。そのような修飾基は、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ他，米国特許第５、６７２、６９５号明細書及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ他，米国特許第６、２４８、８７８号明細書（いずれもその全体を参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０３２０】
核酸ｓｉＮＡ構造に対する種々の修飾を作成して、これらの分子の有用性を高めることができる。例えば、このような修飾は、製品寿命、インビトロの半減期、安定性、及びそのようなオリゴヌクレオチドを標的部位に導入する容易さを高め、例えば、細胞膜の透過性を高め、標的とする細胞を認識し結合する能力を付与するであろう。
【０３２１】
核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は、呼吸器及び／又は肺疾患、異常、及び／又は症状（例えば、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、尿失禁、及び／又は、細胞又は組織内のＣＨＲＭ３のレベルに関連又は応答する、他の任意の形質、疾患又は症状を予防又は治療するために、単独で又は他の治療と組み合わせて使用することに適合させることができる。例えば、ｓｉＮＡ分子は、被験者に投与するためのリポソーム等のデリバリービヒクル、担体及び希釈剤、及びそれらの塩を含むことができ、及び／又は薬学的に許容できる処方中に存在することができる。核酸分子のデリバリーの方法は、Ａｋｈｔａｒ他．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，２，１３９；Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｅｄ．Ａｋｈｔａｒ，１９９５；Ｍａｕｒｅｒ他．，１９９９，Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１６，１２９−１４０；Ｈｏｆｌａｎｄ及びＨｕａｎｇ，１９９９，Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３７，１６５−１９２；及びＬｅｅ他．．２０００，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，７５２，１８４−１９２（いずれも参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ他．，米国特許第６，３９５，７１３号明細書及びＳｕｌｌｉｖａｎ他．，ＷＯ９４／０２５９５号国際公開公報は、さらに、核酸分子をデリバリーするための一般的な方法について記述している。これらのプロトコルを用いて、事実上いかなる核酸分子もデリバリーすることができる。核酸分子は当業者に知られる種々の方法によって細胞に投与することができ、これには、限定されないが、リポソームへの封入、イオントホレシス、又は他のビヒクル、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ他，１９９９、ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．，１０，１０６８−１０７４を参照、Ｗａｎｇ他，ＷＯ０３／４７５１８号及びＷＯ０３／４６１８５号国際公開公報）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）及びＰＬＣＡミクロスフェア（例えば米国特許第６，４４７，７９６号明細書及び米国特許出願公開公報第２００２１３０４３０号を参照）、生分解性ナノカプセル、及び生体接着性小球体への組み込み、又はタンパク質性ベクター（Ｏ’Ｈａｒｅ及びＮｏｒｍａｎｄ、国際公開ＷＯ００／５３７２２）によるものが含まれる。他の実施形態において、本発明の核酸分子を、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）又はポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体等のポリエチレンイミン又はその誘導体と製剤又は錯形成することもできる。１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、米国特許出願公開公報第２００３００７７８２９号（全体を参照として本明細書に組み込まれる）に記載されたように製剤される。
【０３２２】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、膜破壊剤、例えば米国特許出願公報第２００１０００７６６６号（図面を含む全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載のもの等と組み合わされる。他の実施形態において、膜破壊剤（１又は複数）及びｓｉＮＡは、カチオン性脂質又はヘルパー脂質分子、例えば米国特許第６，２３５，３１０号明細書（図面を含む全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載のもの等と組み合わされる。
【０３２３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、米国特許出願公開公報第２００３０７７８２９号及びＷＯ００／０３６８３号及びＷＯ０２／０８７５４１号国際公開公報（これらは、図面を含む全体が参照として本明細書に組み込まれる）に記載のデリバリーシステムと組み合わされる。
【０３２４】
１つの実施形態において、本発明の核酸分子は、肺に関連する組織への核酸分子の迅速な局所投与を可能にする、エアロゾルの吸引又は吸入器若しくはネブライザーによって投与されるスプレードライ製剤等による、肺へのデリバリーを介して投与される。微小化された核酸組成物の吸入可能な乾燥粒子を含む固体粒子状の組成物は、乾燥又は凍結乾燥した核酸組成物を粉砕後、微小化した組成物を、例えば４００メッシュのスクリーンを通して、大きな凝集物を破砕又は分離することにより調製することができる。本発明の核酸組成物を含む固体粒子組成物は、エアロゾルや他の治療用化合物の生成を助ける分散剤を、必要に応じて含んでいてもよい。好適な分散剤は、重量比１：１等の任意の好適な比率で核酸と混合可能なラクトースである。
【０３２５】
本発明の核酸組成物を含む液体粒子のエアロゾルは、ネブライザー（例えば米国特許第４，５０１，７２９号明細書を参照）等の任意の適当な手段により生成することができる。ネブライザーは市販の装置であり、有効成分の溶液又は懸濁液を、通常は空気、酸素等の圧縮ガスを、狭いヴェンチュリオリフィスを通して加速したり、又は超音波で撹拌することにより治療用のエアロゾルミストを形成する。ネブライザーで用いられる好適な調剤は、調剤の４０重量％未満、好ましくは２０重量％未満の有効成分を液体担体中に含む。担体は、通常水又は低濃度のアルコール水溶液で、好ましくは塩化ナトリウム又は他の適当な塩を添加することにより体液と等張にされている。任意の添加剤としては、調剤が無菌条件で調整されていない場合にはヒドロキシ安息香酸メチル等の保存料、酸化防止剤、香料、揮発性油、緩衝剤及び乳化剤及び他の調剤用界面活性剤等が挙げられる。活性な組成物及び界面活性剤を含む固体粒子のエアロゾルは、任意の固体粒子エアロゾル生成器によって同様に生成することができる。被験者に固体粒子の治療剤を投与するためのエアロゾル生成器は、上述したような吸入可能な粒子を生成し、ヒトへの投与に適当な量の、所定量の治療用の組成物を含む所定体積のエアロゾルを生成する。固体粒子アエロゾル生成器の一例としては、吸入器が挙げられる。吸入による投与に適した製剤としては、吸入器により投与可能な微粉砕された粉末が挙げられる。吸入器内では、例えば本明細書に記載の治療を行うのに有効な投与量の粉末は、通常ゼラチン又はプラスチック製のカプセル又はカートリッジに搭載されており、装置内部で穿孔又は開封され、粉末は、吸入時に、又は手動ポンプにより装置に導入される空気によって投与される。吸入器に使用される粉末は、有効成分のみからなるものでもよく、又は有効成分及びラクトース、必要に応じて界面活性剤等の適当な粉末希釈剤を含む混合粉末よりなるものであってもよい。有効成分は、通常製剤中に重量比０．１〜１００の割合で含まれる。エアロゾル生成器の二番目の例としては、定量噴霧器が挙げられる。定量噴霧器は、加圧式のエアロゾル供給器であり、通常、有効成分の液化高圧ガス中への溶液又は懸濁液を含んでいる。使用中には、これらの装置は、一定体積を取り出すために設けられたバルブを介して調剤を放出し、有効成分を含む微粒子のスプレーを生成する。好適な高圧ガスは、例えばクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロメタン及びそれらの混合物等のある種のクロロフルオロカーボン化合物を含む。製剤は、必要に応じて、エタノール等の１又は複数の共溶媒、乳化剤、オレイル酸、トリオレイル酸ソルビタン等の他の製剤用界面活性剤、酸化防止剤、及び適当な香料を含んでいてもよい。肺への他の投与法については、例えば、米国特許出願公開公報第２００４００３７７８０号、及び米国特許第６，５９２，９０４号、第６，５８２，７２８号、第６，５６５，８８５号明細書に記載されている。
【０３２６】
１つの実施形態において、本発明のデリバリーシステムは、例えば水性及び非水性ゲル、クリーム、多成分乳液、メイクロエマルション、リポソーム、軟膏、水性及び非水性溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基材及び粉末を含み、可溶化剤等の賦型剤、分散補助剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪族アルコール及びアミノ酸）、及び親水性ポリマー（例えば、ポリカルボフィル及びポリビニルピロリドン）を含んでいてもよい。１つの実施形態において、薬学的に許容される担体は、リポソーム及び経皮吸収促進剤である。本発明に用いることのできるリポソームは、下記の成分を含む：（１）セルフェクチン（ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ）、Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミト−イル−スペルミン及びジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）体積比１：１．５混合物よりなるカチオン性脂質のリポソーム製剤；（２）サイトフェクチン（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）ＧＳＶ、カチオン性脂質リポソーム組成物及びＤＯＰＥ（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の体積比２：１混合物；（３）ＤＯＴＡＰ（メチル硫酸Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリ−メチル−アンモニウム］）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ）；及び（４）リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、カチオン性脂質リポソーム組成物及びＤＯＰＥ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）の体積比３：１混合物。
【０３２７】
１つの実施形態において、本発明のデリバリーシステムは、パッチ、錠剤、座薬、ペッサリー、ゲル、及びクリームを含み、可溶化剤等の賦型剤、促進剤（例えば、ポリエチレングリコール、胆汁塩及びアミノ酸）、及び他のビヒクル（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステル及び誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒアルロン酸等の親水性ポリマー）を含んでいてもよい。
【０３２８】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体により誘導体化したＰＥＩ、及びそれらのポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体（例えば、Ｏｇｒｉｓ他，２００１，ＡＡＰＡ  ＰｈａｒｍＳｃｉ，３，１−１１；Ｆｕｒｇｅｓｏｎ他，２００３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１４，８４０−８４７；Ｋｕｎａｔｈ他，２００２，Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，８１０−８１７；Ｃｈｏｉ他，２００１，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２２，４６−５２；Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ他，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０，５５８−５６１；Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１３，８４５−８５４；Ｅｒｂａｃｈｅｒ他，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐｒｉｎｔ，１，１−１８；Ｇｏｄｂｅｙ他，１９９９．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６，５１７７−５１８１；Ｇｏｄｂｅｙ他，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，６０，１４９−１６０；Ｄｉｅｂｏｌｄ他，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７４，１９０８７−１９０９４；Ｔｈｏｍａｓ  及び  Ｋｌｉｂａｎｏｖ，２００２，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９９，１４６４０−１４６４５；及びＳａｇａｒａ，米国特許第６，５８６，５２４号明細書、参照として本明細書に組み込まれる）等を含む、ポリエチレンイミン（例えば、直鎖状又は分岐を有するＰＥＩ）及び／又はポリエチレンイミン誘導体と共に製剤され又は複合体を形成している。
【０３２９】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他，米国特許第１０／４２７，１６０号（２００３年４月３０日出願）、米国特許第６，５２８，６３１号、第６，３３５，４３４号、第６，２３５，８８６号、第６，１５３，７３７、第５，２１４，１３６号、第５，１３８，０４５号明細書（全て参照として本明細書に組み込まれる）に記載の核酸コンジュゲート等のバイオコンジュゲートを含んでいる。
【０３３０】
すなわち、本発明は、本発明の１又は複数の核酸を、許容しうる担体、例えば安定剤、緩衝液等に含む医薬組成物を特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、安定剤、緩衝液等を用いて又は用いずに医薬組成物を形成することにより、任意の標準的な手段により、投与（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はタンパク質）し、被験者に導入することができる。リポソームデリバリーメカニズムを利用することが望ましい場合には、リポソームを形成する標準的なプロトコルにしたがうことができる。本発明の組成物は、クリーム、ゲル、スプレー、オイル、及び全身又は経皮投与に適した公知の他の組成物として処方及び使用することができる。
【０３３１】
本発明はまた、記載される化合物の薬学的に許容できる処方を含む。これらの処方には、上述の化合物の塩、例えば、酸付加塩（例えば、塩酸、シュウ酸、酢酸及びベンゼンスルホン酸の塩）が含まれる。
【０３３２】
医薬組成物又は処方は、細胞又は被験者（例えばヒト）への投与（例えば全身投与）に適当な形態の組成物又は処方を表す。適当な形態は、部分的には、使用する投与経路（例えば経口、経皮、又は注射）に依存する。そのような形態は、組成物又は処方が標的細胞（すなわち、負に荷電した核酸がデリバリーされることが望まれる細胞）に到達することを妨害してはならない。例えば、血流中に注入される医薬組成物は可溶性でなければならない。他の因子は当該技術分野において知られており、例えば、毒性、及び組成物又は処方がその効果を発揮することを妨害する形態等を考慮することが含まれる。
【０３３３】
１つの実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、薬学的に許容される組成物又は製剤として被験者に全身投与される。「全身投与」とは、インビボでの全身吸収、又は血流中における薬剤の蓄積の後に全身に分配されることを意味する。全身的吸収をもたらす投与経路には、限定されないが、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内及び筋肉内が含まれる。これらの投与経路のそれぞれは、本発明のｓｉＮＡ分子をアクセス可能な疾患組織に暴露する。薬剤が循環中に入る速度は、分子量又はサイズの関数であることが示されている。本発明の化合物を含むリポソーム又は他の薬剤担体を使用することにより、薬剤を、例えば、あるタイプの組織（例えば網状内皮系（ＲＥＳ）の組織）に局在化させることが可能である。薬剤と細胞（例えば白血球及びマクロファージ）の表面との会合を容易にすることができるリポソーム処方もまた有用である。この方法は、マクロファージ及び白血球による異常な細胞の免疫認識の特異性を利用することにより、薬剤の標的細胞への輸送を増強するであろう。
【０３３４】
「薬学的に許容できる処方」又は「薬学的に許容される組成物」とは、本発明の核酸分子をその所望の活性に最も適した物理学的位置に有効に分布させることができる組成物又は処方を意味する。本発明の核酸分子とともに処方するのに適した薬剤の非限定的な例には以下のものが含まれる：ＣＮＳ中への薬剤の侵入を促進することができるＰ−糖タンパク質阻害剤（ＰｌｕｒｏｎｉｃＰ８５等）（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ及びＴｉｌｌｅｍｅｎｔ，１９９９，Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１３，１６−２６）；大脳内移植後の徐放輸送用の生分解性ポリマー、例えばポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）微小球（Ｅｍｅｒｉｃｈ，ＤＦ他，１９９９，Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、及び薬剤を脳血管関門を越えて輸送することができ、神経の取り込みメカニズムを変更しうる、例えばポリブチルシアノアクリレート製の充填されたナノ粒子（Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２３，９４１−９４９，１９９９）。本発明の核酸分子のデリバリー戦略の他の非限定的な例には、Ｂｏａｄｏ他，１９９８，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８７，１３０８−１３１５、Ｔｙｌｅｒ他，１９９９，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２１，２８０−２８４、Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ他，１９９５，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９２，５５９２−５５９６；Ｂｏａｄｏ，１９９５，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１５，７３−１０７、Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ他，１９９８，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２６，４９１０−４９１６；及びＴｙｌｅｒ他，１９９９，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．，９６，７０５３−７０５８に記載される物質が含まれる。
【０３３５】
本発明はまた、ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ−修飾、又は長期間循環リポソーム又はステルスリポソーム）を含む表面修飾リポソームを含む組成物の使用を特徴とする。これらの処方は、標的組織における薬剤の蓄積を増加させる方法を提供する。この種類の薬剤担体は、単核食細胞システム（ＭＰＳ又はＲＥＳ）によるオプソニン作用及び排除に抵抗性であり、したがって、封入された薬剤の血流循環時間を長くし、組織への暴露を増強する（Ｌａｓｉｃ他，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９５，９５，２６０１−２６２７；Ｉｓｈｉｗａｔａ他，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９９５，４３，１００５−１０１１）。そのようなリポソームは、おそらくは脈管新生標的組織における溢出及び捕獲のため、腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（Ｌａｓｉｃ他，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９５，２６７，１２７５−１２７６；Ｏｋｕ他，１９９５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２３８，８６−９０）。長期間循環リポソームは、特に、ＭＰＳの組織で蓄積することが知られている慣用のカチオン性リポソームと比べて、ＤＮＡ及びＲＮＡの薬物動態学及び薬力学を増強する（Ｌｉｕ他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９５，４２，２４８６４−２４８７０；Ｃｈｏｉ他，ＷＯ９６／１０３９１号国際公開公報；Ａｎｓｅｌｌ他，ＷＯ９６／１０３９０号国際公開公報；Ｈｏｌｌａｎｄ他，ＷＯ９６／１０３９２号国際公開公報）。長期間循環リポソームはまた、代謝的に攻撃的なＭＰＳ組織、例えば肝臓及び脾臓における蓄積を回避するその能力に基づいて、カチオン性リポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解からより強く保護するようである。
【０３３６】
本発明はまた、薬学的に有効量の所望の化合物を薬学的に許容できる担体又は希釈剤中に含む、保存又は投与用に調製される組成物を含む。治療用途に用いるための許容しうる担体又は希釈剤は、医薬の技術分野においてよく知られており、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編．１９８５）（参照として本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、染料、及び風味剤を用いることができる。これらには、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いてもよい。
【０３３７】
薬学的に有効な用量とは、疾患状態の予防、発症の阻害、又は治療（症状をある程度緩和し、好ましくは全ての症状を緩和する）に必要な用量である。薬学的に有効な用量は、疾患の種類、用いる組成物、投与の経路、治療する哺乳動物の種類、考慮中の特定の哺乳動物の物理学的特性、同時に投与される薬剤、及び医薬の分野の当業者が認識するであろう他の因子によって異なる。一般に、負に荷電したポリマーの効力に依存して、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の活性成分を投与する。
【０３３８】
本発明の核酸分子及びその処方は、慣用的な無毒性の薬学的に許容できる担体、アジュバント及びビヒクルを含む用量単位処方中で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入又はスプレーにより、又は直腸に投与することができる。本明細書において用いる場合、非経口的との用語には、経皮、皮下、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、又は髄腔内注射又は注入の手法等が含まれる。さらに、本発明の核酸分子及び薬学的に許容できる担体を含む医薬処方が提供される。１又は複数の本発明の核酸分子は、１又は複数の無毒性の薬学的に許容できる担体及び／又は希釈剤、及び／又はアジュバント、及び所望の場合には他の活性成分とともに存在することができる。本発明の核酸分子を含有する医薬組成物は、経口使用に適した形、例えば、錠剤、トローチ剤、菱形剤、水性又は油性懸濁液、分散可能な粉体又は顆粒、乳剤、硬カプセル又は軟カプセル、又はシロップ又はエリキシル剤の形であることができる。
【０３３９】
経口で使用することが意図される組成物は、医薬組成物の製造について当該技術分野において知られる任意の方法にしたがって製造することができ、そのような組成物は、薬学的に洗練された口に合う製品を提供するために、１又は複数のそのような甘味剤、芳香剤、着色剤又は保存剤を含んでいてもよい。錠剤は、錠剤の製造に適した無毒性の薬学的に許容できる賦形剤との混合物として活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム又はリン酸ナトリウム；顆粒化剤及び崩壊剤、例えば、コーンスターチ、又はアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン又はアラビアゴム、及び潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルクでありうる。錠剤は被覆しなくてもよく、既知の手法により被覆してもよい。場合によっては、既知の手法によりそのような被覆を調製して、胃腸管における崩壊及び吸収を遅延させ、このことによりより長い期間の持続的な作用を与えることができる。例えば、遅延用材料、例えばグリセリルモノステアレート又はグリセリルジステアレートを用いることができる。
【０３４０】
経口使用のための処方は、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル、又は活性成分が水又は油状媒体、例えば、ピーナッツ油、液体パラフィン又はオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルであってもよい。
【０３４１】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含む。そのような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トララガントガム及びアラビアゴムである。分散剤又は湿潤剤は、天然に生ずるホフファチド、例えば、レシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。水性懸濁液はまた、１又は複数の保存剤、例えば、エチル−、又はｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、１又は複数の着色剤、１又は複数の芳香剤、及び１又は複数の甘味剤、例えばショ糖又はサッカリンを含んでいてもよい。
【０３４２】
油性懸濁液は、活性成分を植物油、例えば、アラキス油、オリーブ油、ゴマ油又はココナッツ油、又は無機油、例えば液体パラフィン中に懸濁させることにより処方することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば、密ロウ、硬パラフィン又はセチルアルコールを含むことができる。甘味剤及び芳香剤を加えて、口に合う経口製品を得ることができる。これらの組成物は、抗酸化剤、例えばアスコルビン酸を加えることにより保存することができる。
【０３４３】
水を加えることにより水性懸濁液を製造するのに適した分散可能な粉体及び顆粒は、活性成分を、分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び１又は複数の保存剤との混合物中で与える。適当な分散剤又は湿潤剤又は懸濁剤は、上で例示したとおりである。さらに別の賦形剤、例えば、甘味剤、芳香剤及び着色剤が存在していてもよい。
【０３４４】
本発明の医薬組成物はまた、水中油エマルジョンの形であってもよい。油相は、植物油又はミネラルオイル又はこれらの混合物であってもよい。適当な乳化剤としては、天然に生ずるガム、例えば、アラビアゴム又はトラガガントゴム、天然に生ずるホスファチド類、例えば、大豆、レクチン、及び脂肪酸とヘキシトールから誘導されるエステル又は部分エステル、無水物、例えば、ソルビタンモノオレエート、及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。エマルジョンは、甘味料及び芳香剤を含んでいてもよい。
【０３４５】
シロップ及びエリキシル剤は、甘味剤、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース又はショ糖を用いて処方することができる。このような処方はまた、粘滑剤、保存剤及び甘味料及び着色料を含んでいてもよい。医薬組成物は、滅菌した注射可能な水性又は油性の懸濁液の形であってもよい。この懸濁液は、上述した適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を用いて、当該技術分野において知られるように処方することができる。滅菌した注射可能な製品はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の滅菌した注射可能な溶液又は懸濁液、例えば、１、３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。用いることのできる許容可能なビヒクル及び溶媒の例は、水、リンゲル溶液及び等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌し固定した油を溶媒又は懸濁媒体として便利に用いることができる。この目的のためには、任意の非刺激性の固定した油、例えば、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを用いることができる。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸を注射可能な薬剤の製造において用いることができる。
【０３４６】
本発明の核酸分子はまた、例えば、薬剤の直腸投与用に、座剤の形で投与することができる。これらの組成物は、薬剤を、通常の温度では固体であるが直腸温度では液体であり、したがって直腸中で溶融して薬剤を放出する適当な非刺激性賦形剤と混合することにより製造することができる。そのような材料としては、カカオバター及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０３４７】
本発明の核酸分子は、滅菌媒体中で非経口的に投与することができる。薬剤は、使用するビヒクル及び濃度に応じて、ビヒクル中に懸濁されていてもよく、溶解されていてもよい。アジュバント、例えば局所麻酔剤、保存剤及び緩衝剤をビヒクル中に溶解することも有利である。
【０３４８】
上述した症状の治療には、体重１キログラムあたり１日あたり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇのオーダーの投与量レベルが有用である（被験者あたり１日あたり約０．５ｍｇ〜約７ｇ）。担体物質と組み合わせて１回投与量形を生成することができる活性成分の量は、治療される宿主及び投与の特定のモードに依存して様々である。投与量単位形は、一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含む。
【０３４９】
特定の被験者についての特定の投与量レベルは、種々の因子、例えば、用いる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、及び排出速度、薬剤の組み合わせ、及び治療をしている特定の疾患の重篤性に依存することが理解されるであろう。
【０３５０】
ヒト以外の動物に投与するためには、組成物を動物飼料又は飲料水に加えてもよい。動物が治療上適当な量の組成物を飼料とともに接種できるよう、動物飼料及び飲用水組成物を処方することが便利であろう。飼料又は飲料水に加えるように組成物をプレミックスとして製造することも便利であろう。
【０３５１】
本発明の核酸分子はまた、他の治療用化合物と組み合わせて被験者に投与して、全体的治療効果を高めることができる。ある適応症の治療に複数の化合物を用いることにより、副作用の存在を低下させながら有益な効果を高めることができる。
【０３５２】
１つの実施形態においては、本発明は、特定の細胞タイプに本発明の核酸分子を投与するのに適した組成物を含む。例えば、アシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳＧＰｒ）（Ｗｕ及びＷｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２）は、肝細胞に独特であり、分枝鎖ガラクトース末端糖タンパク質、例えばアシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）に結合する。別の例においては、多くのガン細胞中で葉酸レセプターが過剰発現されている。そのような糖タンパク質、合成グリココンジュゲート、又は葉酸のレセプターへの結合は、オリゴサッカライド鎖の分枝の程度に強く依存する親和性で生ずる。例えば、三触角構造は、二触角又は一触角鎖より高い親和性で結合する（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ及びＦｉｅｔｅ，１９８０，Ｃｅｌｌ，２２，６１１−６２０；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ他，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７，９３９−９４５）。Ｌｅｅ及びＬｅｅ（１９８７，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．，４，３１７−３２８）は、ガラクトースと比較してレセプターに対してより高い親和性を有するＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトースアミンを炭水化物成分として用いることによりこの高い特異性を得た。この「クラスタリング効果」はまた、マンノシル末端糖タンパク質又はグリココンジュゲートの結合及び取込についても記載されている（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ他，１９８１、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｅｎｔ．、２４、１３８８−１３９５）。ガラクトース、ガラクトサミン又は葉酸に基づくコンジュゲートを使用して外来性化合物を細胞膜を超えて輸送することにより、例えば、肝疾患、肝臓のガン、又は他のガンの治療に標的化デリバリー法を提供することができる。また、バイオコンジュゲートの使用により、治療に必要な治療用化合物の必要用量を低下させることができる。さらに、本発明の核酸バイオコンジュゲートを使用することにより、治療薬の生物利用性、薬力学、及び薬物動態学的パラメータを調節することができる。そのようなバイオコンジュゲートの非限定的な例は、Ｖａｒｇｅｅｓｅ他，米国特許出願第１０／２０１，３９４号、（２００１年８月１３日出願）；及びＭａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃｅｔａｌ、米国特許出願第６０／３６２，０１６号（２００２年３月６日出願）に記載されている。
【０３５３】
あるいは、本発明のある種のｓｉＮＡ分子は、細胞中で真核生物プロモーターから発現させることができる（例えば、Ｉｚａｎｔ及びＷｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９，３４５；ＭｃＧａｒｒｙ及びＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，１９８６  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，３９９；Ｓｃａｎｌｏｎ他，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８，１０５９１−５；Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ他，１９９２  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｄｒｏｐｕｌｉｃ他，１９９２Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ６６，１４３２−４１；Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ他，１９９１  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，５５３１−４；Ｏｊｗａｎｇ他，１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ他，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｓａｒｖｅｒ他，１９９０  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，１２２２−１２２５；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｇｏｏｄ他，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，４，４５）。当業者は、真核生物細胞中で任意の核酸を適当なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることができることを認識するであろう。そのような核酸の活性は、酵素的核酸によりそれらを一次転写産物から放出させることにより増大させることができる（Ｄｒａｐｅｒ他，ＷＯ９３／２３５６９号国際公開公報、Ｓｕｌｌｉｖａｎ他，ＷＯ９４／０２５９５号国際公開公報；Ｏｈｋａｗａ他，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．，２７，１５−６；Ｔａｉｒａ他，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９，５１２５−３０；Ｖｅｎｔｕｒａ他，１９９３  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３２４９−５５；Ｃｈｏｗｒｉｒａ他，１９９４  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２５８５６）。
【０３５４】
本発明の別の態様においては、本発明のＲＮＡ分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡベクター中に挿入された転写ユニットから発現させることができる（例えばＣｏｕｔｕｒｅ他，１９９６、ＴＩＧ．、１２、５１０を参照）。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドであってもウィルスベクターであってもよい。ｓｉＮＡを発現するウィルスベクターは、限定されないが、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、又はアルファウィルスに基づいて構築することができる。他の実施形態においては、ｐｏｌＩＩＩに基づくコンストラクトを用いて、本発明の核酸分子を発現させる（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、米国特許５、９０２、８８０及び６、１４６、８８６を参照）。ｓｉＮＡ分子を発現しうる組換えベクターは、上述のようにデリバリーされ、標的細胞中に残留することができる。あるいは、核酸分子の過渡的発現を与えるウィルスベクターを用いることもできる。そのようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することができる。いったん発現されれば、ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用して、ＲＮＡｉ応答を生ずる。ｓｉＮＡ分子を発現するベクターの輸送は、全身的（例えば、静脈内又は筋肉内投与により）、患者から外植された標的細胞に投与した後、被験者に再導入することにより、又は所望の標的細胞中への導入を可能とする他のいずれかの手段により、行うことができる（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ他，１９９６，ＴＩＧ．，１２，５１０を参照）。
【０３５５】
１つの態様においては、本発明は、少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、ｓｉＮＡ二本鎖の一方又は両方の鎖、又は自己ハイブリダイズしてｓｉＮＡ二本鎖を生ずる１本の自己相補的鎖をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列は、そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で動作可能なように連結することができる（例えば，Ｐａｕｌ他，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５０５；Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ及びＴａｉｒａ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，４９７；Ｌｅｅ他，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，５００；及びＮｏｖｉｎａ他，２００２，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ａｄｖａｎｃｅ  ｏｎ  ｌｉｎｅ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照）。
【０３５６】
別の態様においては、本発明は、以下を含む発現ベクターを特徴とする：ａ）転写開始領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩの開始領域）；ｂ）転写終止領域（例えば真核生物ｐｏｌＩ、ＩＩ又はＩＩＩの終止領域）；及びｃ）本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を含み、前記配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、前記開始領域及び前記終止領域に動作可能なように連結されている。ベクターは、必要に応じて、本発明のｓｉＮＡをコードする配列の５’側又
は３’側に動作可能なように連結されたタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；及び／又はイントロン（介在配列）を含んでいてもよい。
【０３５７】
ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のプロモーターにより推進させることができる。ｐｏｌ  ＩＩ又はｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写産物は、全ての細胞において高いレベルで発現される。あるタイプの細胞におけるあるｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列（エンハンサー、サイレンサー等）の性質に依存する。原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素が適当な細胞中で発現される限り、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた用いられる（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ及びＭｏｓｓ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，６７４３−７；Ｇａｏ及びＨｕａｎｇ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，２８６７−７２；Ｌｉｅｂｅｒｅｔ．ａｌ．，１９９３ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，２１７，４７−６６；Ｚｈｏｕ他，１９９０Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０，４５２９−３７）。何人かの研究者が、そのようなプロモーターから発現した核酸分子が哺乳動物細胞中で機能しうることを示している（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ他，１９９２  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，２，３−１５；Ｏｊｗａｎｇ他，１９９２  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０８０２−６；Ｃｈｅｎ他，１９９２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０，４５８１−９；Ｙｕ他，１９９３  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，６３４０−４；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒ他，１９９２，ＥＭＢＯ  Ｊ．
，１１，４４１１−８；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ他，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０，８０００−４；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，１９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，２２５９；Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ及びＣｅｃｈ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２，１５６６）。より詳細には、転写ユニット、例えばＵ６小核（ｓｎＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）及びアデノウィルスＶＡＲＮＡをコードする遺伝子に由来するものは、細胞中において高濃度の所望のＲＮＡ分子（例えばｓｉＮＡ）を生成するのに有用である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他，（上掲）；Ｃｏｕｔｕｒｅ及びＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ他，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２２，２８３０；Ｎｏｏｎｂｅｒｇ他，米国特許第５，１６２４，８０３号明細書；Ｇｏｏｄ他，１９９７，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４，４５；Ｂｅｉｃｒｅｌｍａｎ他，ＷＯ９６／１８７３６号国際公開公報）。上述のｓｉＮＡ転写ユニットは、哺乳動物細胞中に導入するために種々のベクター中に組み込むことができる。ベクターとしては、限定されないが、プラスミドＤＮＡベクター、ウィルスＤＮＡベクター（例えばアデノウィルス又はアデノ随伴ウィルスベクター）、又はウィルスＲＮＡベクター（例えばレトロウィルス又はアルファウィルスベクター）が挙げられる（総説については、Ｃｏｕｔｕｒｅ及びＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，１９９６，（上掲）を参照）。
【０３５８】
別の観点においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を、そのｓｉＮＡ分子の発現を可能とする様式で含む発現ベクターを特徴とする。１つの実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；及びｃ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み；この配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、開始領域及び終止領域に動作可能なように連結されている。
【０３５９】
他の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）オープンリーディングフレーム；及びｄ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み、この配列は、オープンリーディングフレームの３’−末端に動作可
能なように連結されており、配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、開始領域、オープンリーディングフレーム及び終止領域に動作可能なように連結されている。さらに他の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；及びｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み；この配列は、核酸分子の発現及び／又はデリバリーを可能とする様式で、開始領域、イントロン及び終止領域に動作可能なように連結されている。
【０３６０】
他の実施形態においては、発現ベクターは、ａ）転写開始領域；ｂ）転写終止領域；ｃ）イントロン；ｄ）オープンリーディングフレーム；及びｅ）ｓｉＮＡ分子の少なくとも一方の鎖をコードする核酸配列を含み、この配列は、オープンリーディングフレームの３’−末端に動作可能なように連結されており、配列は、ｓｉＮＡ分子の発現及び／又はデ
リバリーを可能とする様式で、開始領域、イントロン、オープンリーディングフレーム及び終止領域に動作可能なように連結されている。
【０３６１】
ＣＨＲＭ３の生物学及び生化学
コリン作動性反射は、呼吸器の収縮及び粘膜の腺分泌の根底をなし、ムスカリン受容体に媒介される。ムスカリン性コリン（アセチルコリン）受容体は、Ｇタンパク質共役受容体のより大きなファミリーに属する。哺乳動物におけるムスカリン性アセチルコリン受容体は、個別の遺伝子によりコードされた５つのサブタイプ（Ｍ１〜Ｍ５）からなる。これらの受容体は、全身に広く発現し、末梢及び中枢神経系において多様な機能を果たしている。これらの受容体の機能の多様性は、アセチルコリンのリガンド結合を特徴とし、アデニル酸シクラーゼ阻害、ホスホイノシチドの変性、及びカリウムチャネルの調節を含む。
【０３６２】
ムスカリン受容体は、中枢及び末梢神経系におけるアセチルコリンの多様な効果に影響を与える。例えば、ムスカリン性コリン作動性受容体３は、平滑筋の収縮をコントロールし、これが刺激を受けると、呼吸管における腺組織の分泌をもたらす。Ｍ３受容体の刺激は、百日咳毒素不感受性Ｇ（ｑ）タンパク質を活性化し、次いでホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）が活性化され、イノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）及びジアシルグリセロール（ＤＡＧ）が放出される（Ｓｐｅｃｔｏｒ編．，１９９９，Ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｐｐｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｗｅｒ  Ａｉｒｗａｙｓ，１９９９，Ｖｏｌｕｍｅ  １３４，ｐ１６−１７）。ＩＰ３の放出は、カルシウムの放出を媒介するが、ＤＡＧはプロテインキナーゼＣを活性化し、これらの組み合わせにより気道、胃腸、膀胱、血管及び他の組織の平滑筋をスムースに収縮させる。Ｍ３受容体は、大小の気道に広範に分布するが、平滑筋及び粘膜下腺細胞に高度に局在化している。これらの位置において、Ｍ３受容体活性は、平滑筋細胞の収縮及び粘膜下腺細胞の開口分泌を誘導する。アトロピン、臭化イプラトロピウム等の非選択性Ｍ３受容体アンタゴニスト及びダリデナシン及びレバトロペート（ｒｅｖａｔｒｏｐａｔｅ）等の選択性Ｍ３受容体アンタゴニストは、全てコリンにより誘導される平滑筋収縮並びに平滑筋細胞及び粘膜下腺細胞からの開口分泌をそれぞれ阻害する（Ｓｐｅｃｔｏｒ編．，１９９９，Ａｎｔｉｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｐｐｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｗｅｒ  Ａｉｒｗａｙｓ，１９９９，Ｖｏｌｕｍｅ  １３４，ｐ１６−１７）。
【０３６３】
かくして、ＣＨＲＭ３を標的とする短鎖干渉核酸分子の使用により、気道のＭ３受容体に誘導される平滑筋の収縮及び粘膜の腺分泌に関連する、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、過敏性腸症候群、及び細胞又は組織内のＣＨＲＭ３のレベルに関連又は応答する、他の任意の形質、疾患又は症状（例えば、アルツハイマー病、尿失禁、及び他の症状、例えば、Ｃｈｏｉ他、ＷＯ０１／０２９７１６号を参照）に、単独で又は他の治療法と共に用いられる、疾患及び症状に対する新規な治療剤が提供される。
【実施例】
【０３６４】
以下は本発明の核酸の選択、単離、合成及び活性を示す非限定的な例である。
【０３６５】
実施例１：ｓｉＮＡコンストラクトのタンデム合成
本発明の例示的ｓｉＮＡ分子は、切断可能なリンカー、例えば、スクシニル系リンカーを用いて、タンデムで合成する。本明細書に記載されるタンデム合成の後に、１段階精製プロセスを行って、ＲＮＡｉ分子を高収率で得る。この方法はハイスループットＲＮＡｉスクリーニングを支えるｓｉＮＡ合成に非常に適しており、マルチカラム又はマルチウエルの合成プラットフォームに容易に適合させることができる。
【０３６６】
５’末端ジメトキシトリチル（５’−Ｏ−ＤＭＴ）基がそのまま残るｓｉＮＡオリゴ及びその相補鎖のタンデム合成（トリチルオン合成）が完了した後、オリゴヌクレオチドを上述のようにして脱保護する。脱保護の後、ｓｉＮＡ配列鎖を自発的にハイブリダイズさせる。このハイブリダイゼーションにより、一方の鎖が５’−Ｏ−ＤＭＴ基を保持し、相補鎖が末端５’−ヒドロキシルを含む二本鎖が得られる。新たに形成された二本鎖は、１つの分子のみがジメトキシトリチル基を有するにもかかわらず、日常的な固相抽出精製（トリチルオン精製）の間、単一の分子として振る舞う。これらの鎖は安定な二本鎖を形成するため、オリゴの対を例えばＣ−１８カートリッジを用いて精製するためには、このジメトキシトリチル基（又は同等の基、例えば他のトリチル基又は他の疎水性成分）のみが必要である。
【０３６７】
タンデムリンカー、例えば逆位デオキシ脱塩基スクシネート又はグリセリルスクシネートリンカー（図１を参照）又は同等の切断可能なリンカーを導入する時点までは、標準的なホスホルアミダイト合成化学を用いる。用いることができるリンカー結合条件の非限定的な例には、活性化剤、例えばブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢｒＯＰ）の存在下で、妨害塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）及び／又はＤＭＡＰを使用することが含まれる。リンカーを結合させた後、標準的な合成化学を用いて第２の配列の合成を完了し、末端の５’−Ｏ−ＤＭＴはそのまま残す。合成後、得られたオリゴヌクレオチドを本明細書に記載される方法にしたがって脱保護し、適当な緩衝液、例えば、５０ｍＭＮａＯＡｃ又は１．５ＭＮＨ4Ｈ2ＣＯ3で反応を停止させる。  
【０３６８】
ｓｉＮＡ二本鎖の精製は、固相抽出、例えば、１カラム容量（ＣＶ）のアセトニトリル、２ＣＶのＨ２Ｏ、及び２ＣＶの５０ｍＭＮａＯＡｃで調整したＷａｔｅｒｓＣ１８ＳｅｐＰａｋｌｇカートリッジを用いて、容易に行うことができる。サンプルを負荷し、１ＣＶのＨ2Ｏ又は５０ｍＭＮａＯＡｃで洗浄する。失敗配列は１ＣＶの１４％ＡＣＮ（水性；５０ｍＭＮａＯＡｃ及び５０ｍＭＮａＣｌを含む）で溶出する。次にカラムを１ＣＶのＨ2Ｏ等で洗浄し、例えば、１ＣＶの１％水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）をカラムに通し、次にさらに１ＣＶの１％水性ＴＦＡをカラムに加えて約１０分間放置することにより、カラム上で脱トリチル化を行う。残りのＴＦＡ溶液を除去し、カラムをＨ2Ｏで、次に１ＣＶの１ＭＮａＣｌ及び再度のＨ2Ｏで洗浄する。次に、ｓｉＮＡ二本鎖生成物を、例えば、１ＣＶの２０％ＣＡＮ水溶液を用いて溶出する。
【０３６９】
図２は、精製したｓｉＮＡコンストラクトのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の例を示し、ここで、各ピークはｓｉＮＡ二本鎖の個々のｓｉＮＡ鎖の計算質量に対応する。同じ精製ｓｉＮＡは、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）で分析したときに３つのピークを与える。１つのピークはおそらくは二本鎖ｓｉＮＡに対応し、２つのピークはおそらく個々のｓｉＮＡ配列鎖に対応する。同じｓｉＮＡコンストラクトのイオン交換ＨＰＬＣ分析では単一のピークしか示されない。以下に記載されるルシフェラーゼレポーターアッセイを用いる精製ｓｉＮＡコンストラクトの試験は、別々に合成したオリゴヌクレオチド配列鎖から生成したｓｉＮＡコンストラクトと比較して、ＲＮＡｉ活性が同じであることを示した。
【０３７０】
実施例２：任意のＲＮＡ配列中の潜在的ｓｉＮＡ標的部位の同定
目的とするＲＮＡ標的、例えばウィルス又はヒトｍＲＮＡ転写産物の配列を、例えばコンピュータフォールディングアルゴリズムを用いることにより、標的部位についてスクリーニングする。非限定的な例においては、Ｇｅｎｂａｎｋ等のデータベースから得られる遺伝子又はＲＮＡ遺伝子転写産物の配列を用いて、標的に対して相補性を有するｓｉＮＡ標的を生成する。そのような配列は、データベースから得ることができるか、又は当該技術分野において知られるように実験的に決定することができる。既知の標的部位、例えば、リボザイム又はアンチセンス等の他の核酸分子を用いた研究に基づいて有効な標的部位であると決定されている標的部位、又は疾患又は健康状態と関連していることが知られている標的、例えば変異又は欠失を含む部位を用いて、これらの部位を標的とするｓｉＮＡ分子を設計することができる。種々のパラメータを用いて、標的ＲＮＡ配列中でいずれの部位が最も適当な標的部位であるかを判定することができる。これらのパラメータには、限定されないが、二次又は三次ＲＮＡ構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の種々の領域間のホモロジーの程度、又はＲＮＡ転写産物中の標的配列の相対的位置が含まれる。これらの判定に基づいて、ＲＮＡ転写産物中の任意の数の標的部位を選択して、例えば、インビトロＲＮＡ切断アッセイ、培養細胞、又は動物モデルを用いることにより、効力についてｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることができる。非限定的な例においては、用いるべきｓｉＮＡコンストラクトのサイズに基づいて、転写産物中のいずれかの位置の１〜１０００個の標的部位を選択する。当該技術分野において知られる方法、例えば標的遺伝子発現の有効な減少を判定するマルチウエル又はマルチプレートアッセイを用いて、ｓｉＮＡ分子をスクリーニングするためのハイスループットスクリーニングアッセイを開発することができる。
【０３７１】
実施例３：ＲＮＡ中のｓｉＮＡ分子標的部位の選択
以下の非限定的工程を用いて、所定の遺伝子配列又は転写産物を標的とするｓｉＮＡの選択を行うことができる。
【０３７２】
１．標的配列をインシリコで解析して、標的配列中に含まれる特定の長さの全てのフラグメント又はサブ配列、例えば２３ヌクレオチドフラグメントのリストを作成する。この工程は、典型的にはあつらえのＰｅｒｌスクリプトを用いて行うが、市販の配列分析プログラム、例えば、Ｏｌｉｇｏ、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、又はｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅも同様に用いることができる。
【０３７３】
２．場合によっては、ｓｉＮＡは２以上の標的配列に対応する。これは、例えば、同じ遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合、２以上の遺伝子の異なる転写産物を標的とする場合、又はヒト遺伝子と動物ホモログとの両方を標的とする場合に生じうる。この場合には、それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し、次にリストを比較して、各リスト中でマッチング配列を見いだす。次に、サブ配列を、所定のサブ配列を含む標的配列の数にしたがってランク付けする。この目的は、標的配列のほとんど又はすべてに存在するサブ配列を見いだすことである。あるいは、ランク付けにより、標的配列にユニークなサブ配列、例えば変異体標的配列を同定することができる。このような方法により、変異体配列を特異的に標的とし、正常な配列の発現に影響を及ぼさないｓｉＮＡの使用が可能となるであろう。
【０３７４】
３．場合によっては、ｓｉＮＡのサブ配列は、１又は複数の配列中には存在しないが、所望の標的配列中に存在する。これは、ｓｉＮＡが標的とされないままでいるべきパラロガスファミリーのメンバーを有する遺伝子を標的とする場合に生じうる。上述のケース２におけるように、それぞれの標的について特定の長さのサブ配列のリストを生成し、次にリストを比較して、標的遺伝子中に存在するが標的ではないパラログ中には存在しない配列を見いだす。
【０３７５】
４．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して、ＧＣ含量にしたがってランク付けすることができる。３０〜７０％のＧＣを含有する部位が好ましく、４０−６０％のＧＣを含有する部位がさらに好ましい。
【０３７６】
５．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して、自己フォールディング及び内部ヘアピンにしたがってランク付けすることができる。内部フォールディングがより弱いことが好ましい。強いヘアピン構造は回避すべきである。
【０３７７】
６．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して、配列中にＧＧＧ又はＣＣＣの連続を有するか否かにしたがってランク付けすることができる。いずれかの鎖にＧＧＧ（又はさらに多いＧ）が存在すると、オリゴヌクレオチド合成に問題が生じることがあり、ＲＮＡｉ活性を妨害する可能性がある。したがって、よりよい配列が利用可能である限り、これは回避する。ＣＣＣはアンチセンス鎖にＧＧＧを配置するため、標的鎖中で検索する。
【０３７８】
７．ランク付けされたｓｉＮＡサブ配列をさらに分析して、配列の３’末端にジヌクレオチドＵＵ（ウリジンジヌクレオチド）を、及び／又は配列の５’末端にＡＡ（アンチセンス配列に３’ＵＵを生ずる）を有するか否かにしたがってランク付けする。これらの配列により、末端ＴＴチミジンジヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子を設計することが可能となる。
【０３７９】
８．上述のようにランク付けされたサブ配列のリストから４個又は５個の標的部位を選択する。次に、例えば、２３ヌクレオチドを有するサブ配列において、それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の右側２１ヌクレオチドをｓｉＮＡ二本鎖の上側（センス）鎖用に設計し合成し、一方、それぞれの選択された２３−ｍｅｒサブ配列の左側２１ヌクレオチドの逆相補鎖をｓｉＮＡ二本鎖の下側（アンチセンス）鎖用に設計し合成する（表２及び３を参照）。末端ＴＴ残基が配列にとって望ましい場合には（パラグラフ７に記載されるように）、オリゴを合成する前にセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方の２つの３’末端ヌクレオチドをＴＴで置き換える。
【０３８０】
９．ｓｉＮＡ分子をインビトロ、培養細胞又は動物モデル系においてスクリーニングして、最も活性なｓｉＮＡ分子、又は標的ＲＮＡ配列中の最も好ましい標的部位を同定する。
【０３８１】
１０．核酸配列を選択する際に、他の設計指針を用いることができる。例えば、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ他，２００４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，２００４年２月１日，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ９３６、及びＵｉ−Ｔｅｉ他，２００４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３２，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７を参照。
【０３８２】
別のアプローチでは、ＣＨＲＭ３の標的配列に特異的なｓｉＮＡコンストラクトのプールを用いて、培養された気道平滑筋（ＡＳＭ）又は粘膜下腺（漿液性又は粘液性）細胞等のＣＨＲＭ３  ＲＮＡを発現する細胞の標的部位をスクリーニングする。このアプローチにおいて用いられる一般的な戦略を図９に示す。そのような非限定的な例は、配列番号１〜３２０のいずれかの配列を有するプールである。ＣＨＲＭ３を発現する細胞（例えば、培養された気道平滑筋（ＡＳＭ）又は粘膜下腺（漿液性又は粘液性）細胞）に、ｓｉＮＡコンストラクトのプールを用いてトランスフェクションし、ＣＨＲＭ３の阻害に関連する表現型を示す細胞を選別する。ｓｉＮＡコンストラクトのプールは、適当なベクター（例えば、図７及び図８を参照）に挿入された発現カセットから発現させることができる。正の表現型の変化（例えば、増殖能の低下、ＣＨＲＭ３  ｍＲＮＡレベル又はＣＨＲＭ３タンパク質の発現の低下）を示す細胞に由来するｓｉＮＡを選別し、標的ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ配列内の最も好適な標的部位を決定する。
【０３８３】
実施例４：ＣＨＲＭ３を標的とするｓｉＮＡの設計
ｓｉＮＡの標的部位は、実施例３に記載されるｓｉＮＡ分子のライブラリを用いて、あるいは本明細書の実施例６に記載されるようなインビトロｓｉＮＡシステムを用いて、ＣＨＲＭ３ＲＮＡ標的の配列を分析し、必要に応じてフォールディング（ｓｉＮＡの標的へのアクセス可能性を判定するために分析される任意の所与の配列の構造）に基づいて標的部位に優先順位を付けることにより、選択した。ｓｉＮＡ分子は、それぞれの標的に結合することができるように設計し、必要に応じて個々にコンピュータフォールディングにより分析して、ｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用しうるか否かを評価した。種々の長さのｓｉＮＡ分子を選択して、活性を最適化することができる。一般に、標的ＲＮＡと結合するかさもなくばこれと相互作用する十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選択されるが、種々の長さ又は塩基組成のｓｉＮＡ二本鎖に適応させるように、相補性の程度を調節することができる。そのような方法論を用いることにより、ｓｉＮＡ分子は、任意の既知のＲＮＡ配列、例えば、任意の遺伝子転写産物に対応するＲＮＡ配列中の部位を標的とするよう設計することができる。
【０３８４】
化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを設計して、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保存しながら、インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性及び／又は改良された薬物動態学、局在化、及びデリバリー特性を提供することができる。本明細書に記載される合成方法及び一般に当該技術分野において知られる合成方法を用いて、本明細書に記載される化学修飾を合成的に導入する。次に、血清及び／又は細胞／組織抽出物（例えば肝臓抽出物）中で、合成ｓｉＮＡコンストラクトをヌクレアーゼ安定性についてアッセイする。合成ｓｉＮＡコンストラクトはまた、適当なアッセイ、例えば本明細書に記載されるルシフェラーゼレポーターアッセイ又はＲＮＡｉ活性を定量しうる他の適当なアッセイを用いて、ＲＮＡｉ活性についても平行して試験する。ヌクレアーゼ安定性及びＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡコンストラクトは、さらに改変して、安定性及び活性のアッセイにおいて再評価することができる。次に、任意の選択されたＲＮＡを標的とするいずれかのｓｉＮＡ配列に安定化活性ｓｉＮＡコンストラクトの化学的修飾を適用して、例えば、標的スクリーニングアッセイにおいて用いて、治療薬を開発するためのｓｉＮＡ化合物のリードを拾い上げることができる（例えば、図１１を参照）。
【０３８５】
実施例５：ｓｉＮＡの化学合成及び精製
ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡメッセージ中の種々の部位、例えば、本明細書に記載されるＲＮＡ配列中の標的配列と相互作用するよう設計することができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は、上述した標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は、本明細書に記載される方法を用いて化学的に合成することができる。対照配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子の配列を標的配列に相補的ではないようにスクランブル化することにより、合成することができる。一般に、ｓｉＮＡコンストラクトは、本明細書に記載されるように、固相オリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成することができる（例えば、Ｕｓｍａｎ他．，米国特許第５，８０４，６８３号；第５，８３１，０７１号；第５，９９８，２０３号；第６，１１７，６５７号；第６，３５３，０９８号；第６，３６２，３２３号；第６，４３７，１１７号；第６，４６９，１５８号明細書；Ｓｃａｒｉｎｇｅ他．，米国特許第６，１１１，０８６号；第６，００８，４００号；第６，１１１，０８６号明細書を参照（いずれもその全体を参照として本明細書に組み込まれる））。
【０３８６】
非限定的な例においては、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において知られるように、ホスホルアミダイト化学を用いて段階的様式で合成する。標準的なホスホルアミダイト化学においては、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル、２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル、３’−Ｏ−２−シアノエチルＮ、Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト基、及び環外アミン保護基（例えば、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４−アセチルシチジン、及びＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオシドを使用する。あるいは、Ｓｃａｒｉｎｇｅ（上掲）により記載されるように、ＲＮＡの合成において２’−Ｏ−シリルエーテルを酸不安定性２’−Ｏ−オルトエステル保護基と組み合わせて用いてもよい。異なる２’化学は異なる保護基を必要とし、例えば、Ｕｓｍａｎ他，米国特許第５，６３１，３６０号明細書（その全体を参照として本明細書に組み込まれる）に記載されるように、２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオシドにはＮ−フタロイル保護を用いることができる。
【０３８７】
固相合成の間に、各ヌクレオチドを順番に（３’−から５’−方向に）固体支持体結合オリゴヌクレオチドに付加する。鎖の３’末端の最初のヌクレオシドを種々のリンカーを用いて固体支持体（例えば、調整多孔ガラス又はポリスチレン）に共有結合させる。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホルアミダイト、及び活性化剤を混合して、第１のヌクレオシドの５’末端上に第２のヌクレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる。次に支持体を洗浄し、未反応５’−ヒドロキシル基を無水酢酸等のキャッピング試薬を用いてキャッピングして、不活性な５’−アセチル成分を得る。次に３価リン結合を酸化してより安定なリン酸結合とする。ヌクレオチド付加サイクルの最後に、適当な条件下で（例えば、トリチル系の基については酸性条件、シリル系の基についてはフッ化物を用いて）、５’−Ｏ−保護基を切断する。それぞれの次のヌクレオチドについてこのサイクルを繰り返す。
【０３８８】
合成条件を改変して、例えば、合成すべきｓｉＮＡの特定の化学組成に応じて、異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホルアミダイト濃度、異なる接触時間、異なる固体支持体及び固体支持体リンカー化学を用いることにより、カップリング効率を最適化することができる。ｓｉＮＡの脱保護及び精製は、一般に記載されているようにして行うことができる（Ｕｓｍａｎ他．，米国特許第５，８３１，０７１号，米国特許第６，３５３，０９８，米国特許第６，４３７，１１７号明細書，及びＢｅｌｌｏｎ他，米国特許第６，０５４，５７６号，米国特許第６，１６２，９０９号，米国特許第６，３０３，７７３号明細書又はＳｃａｒｉｎｇｅ（上掲）（これらはすべてその全体を参照として本明細書に組み込まれる））。さらに、脱保護条件を改変して、可能な限り最高の収量及び純度のｓｉＮＡコンストラクトを得る。例えば、本出願人は、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは不適切な脱保護条件下で分解しうることを見いだした。そのようなオリゴヌクレオチドは、水性メチルアミンを用いて約３５℃で３０分間脱保護する。２’−デオキシ−２’−フルオロ含有オリゴヌクレオチドがリボヌクレオチドをも含む場合には、水性メチルアミンで約３５℃で３０分間脱保護した後、ＴＥＡ−ＨＦを加え、反応液をさらに１５分間約６５℃に維持する。
【０３８９】
実施例６：ｓｉＮＡ活性を評価するための、ＲＮＡｉインビトロアッセイ
ＲＮＡｉを無細胞システムにおいて再現するインビトロアッセイを用いて、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡ標的を標的とするｓｉＮＡコンストラクトを評価する。アッセイは、Ｔｕｓｃｈｌら（１９９９，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１３，３１９１−３１９７）及びＺａｍｏｒｅら（２０００，Ｃｅｌｌ，１０１，２５−３３）に記載され、ＣＨＲＭ３標的ＲＮＡ用に適合させた系を含む。シンシチウム胚盤葉に由来するショウジョウバエ抽出物を用いてインビトロでＲＮＡｉ活性を再構築する。標的ＲＮＡは、ＣＨＲＭ３を発現する適当なプラスミドからＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写することにより、又は本明細書に記載されるように化学合成により作製する。センス及びアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば各２０μＭ）は、緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中９０℃で１分間、次に３７℃で１時間インキュベートすることによりアニーリングさせ、次に溶解緩衝液（例えば１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングは、アガロースゲルを用いてＴＢＥ緩衝液でゲル電気泳動し、臭化エチジウムで染色することによりモニターすることができる。ショウジョウバエの溶解物は、ＯｒｅｇｏｎＲハエからの０−２時間齢の胚を用いて調製し、酵母糖蜜寒天上に回収し、絨毛膜を除去し溶解する。溶解物を遠心分離し、上清を単離する。アッセイは、５０％溶解物［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ（１０−５０ｐＭの最終濃度）、及びｓｉＮＡ（１０ｎＭの最終濃度）を含む１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］溶解緩衝液を含有する反応混合物を含む。反応混合物はまた、１０ｍＭのクレアチンリン酸、１０μｇ／ｍｌのクレアチンホスホキナーゼ、１００μＭのＧＴＰ、１００μＭのＵＴＰ、１００μＭのＣＴＰ、５００μＭのＡＴＰ、５ｍＭのＤＴＴ、０．１Ｕ／μＬのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、及び１００μＭの各アミノ酸を含む。酢酸カリウムの最終濃度は１００ｍＭに調節する。反応は氷上で予め組立て、２５℃で１０分間プレインキュベートした後にＲＮＡを加え、２５℃でさらに６０分間インキュベートする。４倍容量の１．２５×  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で反応を停止させる。標的ＲＮＡの切断は、ＲＴ−ＰＣＲ分析又は当該技術分野において知られる他の方法によりアッセイし、反応からｓｉＮＡが省略されている対照反応と比較する。
【０３９０】
あるいは、アッセイ用の内部標識した標的ＲＮＡを［α−32Ｐ］ＣＴＰの存在下でインビトロ転写により調製し、スピンクロマトグラフィーによりＧ５０セファデックスカラムを通し、さらに精製することなく標的ＲＮＡとして用いる。必要に応じて、標的ＲＮＡはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて５’−32Ｐ末端標識してもよい。アッセイは上述のようにして行い、標的ＲＮＡ及びＲＮＡｉにより生成する特異的ＲＮＡ切断産物をゲルのオートラジオグラフィーで可視化する。切断率は、無傷の対照ＲＮＡ又はｓｉＮＡなしの対照反応からのＲＮＡ、及びアッセイにより生成する切断産物を表すバンドをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）で定量することにより決定する。
【０３９１】
１つの実施形態においては、このアッセイを用いて、ｓｉＮＡに媒介されるＲＮＡｉ切断のためのＣＨＲＭ３  ＲＮＡ標的の標的部位を決定する。すなわち、例えば、標識した標的ＲＮＡの電気泳動によりアッセイ反応を分析することにより、又はノーザンブロットにより、並びに当該技術分野において知られる他の方法論により、複数のｓｉＮＡコンストラクトをＣＨＲＭ３  ＲＮＡ標的のＲＮＡｉに媒介される切断についてスクリーニングする。
【０３９２】
実施例７：ＣＨＲＭ３標的ＲＮＡのインビボでの核酸阻害
上述したようにして、ヒトＣＨＲＭ３ＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子を設計し、合成する。これらの核酸分子は、例えば以下の方法を用いることにより、インビボで切断活性について試験することができる。ＣＨＲＭ３ＲＮＡ中の標的配列及びヌクレオチドの位置は表２及び３に示される。
【０３９３】
２つのフォーマットを用いて、ＣＨＲＭ３を標的とするｓｉＮＡの効力を試験する。第１に、例えば、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ又はＡ３７５細胞を用いて、細胞培養において試薬を試験して、ＲＮＡ及びタンパク質の阻害の程度を決定する。本明細書に記載されるように、ｓｉＮＡ試薬（例えば、表２及び３を参照）をＣＨＲＭ３標的に対して選択する。これらの試薬を適当なトランスフェクション試薬により、例えば、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ又はＡ３７５細胞にデリバリーした後、ＲＮＡ阻害を測定する。増幅のリアルタイムＰＣＲモニタリング（例えば、ＡＢＩ７７００Ｔａｑｍａｎ（登録商標））を用いて、アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量を測定する。無関係標的に対して、又は同じ全体の長さ及び化学を有するがそれぞれの位置でランダムに置換されているランダム化ｓｉＮＡ対照に対して作製したオリゴヌクレオチド配列の混合物に対して、比較を行う。標的に対して一次及び二次のリード試薬を選択し、最適化を行う。最適なトランスフェクション試薬濃度を選択した後、リードｓｉＮＡ分子を用いてＲＮＡの阻害の経時変化を測定する。さらに、細胞播種フォーマットを用いて、ＲＮＡ阻害を判定することができる。
【０３９４】
ｓｉＮＡの細胞へのデリバリー
細胞（例えば、ＨＵＶＥＣ、ＨＭＶＥＣ又はＡ３７５細胞）は、トランスフェクションの前日に、例えば、ＥＧＭ−２（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で１ｘ１０５細胞／ウェルで６−ウエルディッシュに播種する。ｓｉＮＡ（例えば最終濃度２０ｎＭ）及びカチオン性脂質（例えば最終濃度２μｇ／ｍｌ）を、ポリスチレン管によりＥＧＭ基礎培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、３７℃で３０分間複合体化させる。ボルテックスした後、複合体化したｓｉＮＡを各ウェルに加え、示される時間インキュベートする。最初の最適化実験のためには、細胞を例えば、１ｘ１０３で９６ウエルプレートに播種し、記載されるようにしてｓｉＮＡ複合体を加える。ｓｉＮＡの細胞へのデリバリーの効率は、脂質と複合体化した蛍光ｓｉＮＡを用いて決定する。６ウエルディッシュ中の細胞をｓｉＮＡとともに２４時間インキュベートし、ＰＢＳですすぎ、２％パラホルムアルデヒド中で室温で１５分間固定する。ｓｉＮＡの取り込みは蛍光顕微鏡を用いて可視化する。
【０３９５】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）（リアルタイムＰＣＲの増幅量のモニタリング）及び光サイクラーによるｍＲＮＡの定量
ｓｉＮＡのデリバリーの後、例えば、６ウェル用にはＱｉａｇｅｎＲＮＡ精製キットを、又は９６ウエルアッセイ用にはＲｎｅａｓｙ抽出キットを用いて、細胞から総ＲＮＡを調製する。Ｔａｑｍａｎ分析のためには、５’末端に共有結合させたレポーター染料（ＦＡＭ又はＪＯＥ）及び３’末端にコンジュゲート化したクエンチャー染料ＴＡＭＲＡを有する二重標識プローブを合成する。１段階ＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、ＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００配列Ｄｅｔｅｃｔ又はで、１０μｌの総ＲＮＡ、１００ｎＭのフォワードプライマー、９００ｎＭのリバースプライマー、１００ｎＭのプローブ、１ＸＴａｑＭａｎＰＣＲ反応緩衝液（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭＭｇＣｌ２、３００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、１０ＵのＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＰＥ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び１０ＵのＭ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から構成される５０μｌの反応液を用いて行う。熱サイクリング条件は、４８℃で３０分間、９５℃で１０分間、次に９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を４０サイクルからなるものでありうる。ｍＲＮＡレベルの定量は、段階的に希釈した総細胞ＲＮＡ（３００、１００、３３、１１ｎｇ／ｒｘｎ）から生成した標準に対して行い、平行してＴａｑＭａｎ反応で測定したβ−アクチン又はＧＡＰＤＨｍＲＮＡに対して標準化する。目的とする各遺伝子について、上側プライマー及び下側プライマー、及び蛍光標識したプローブを設計する。特定のＰＣＲ産物中へのＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ染料のリアルタイム取り込みは、ガラスキャピラリー管で光サイクラーを用いて測定することができる。対照ｃＲＮＡを用いて、各プライマー対について標準曲線を作成する。値は、各サンプルにおいてＧＡＰＤＨに対する相対的発現として表す。
【０３９６】
ウェスタンブロッティング
核抽出物は、標準的なマイクロ調製手法（例えば、及びｒｅｗｓ及びＦａｌｌｅｒ，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９，２４９９を参照）を用いて調製することができる。例えばＴＣＡ沈殿を用いて、上清からのタンパク質抽出物を調製する。等量の２０％ＴＣＡを細胞上清に加え、氷上で１時間インキュベートし、５分間の遠心分離によりペレット化する。ペレットをアセトンで洗浄後乾燥し、水に再懸濁する。細胞蛋白質抽出物を１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰａｇｅ（核抽出物）又は４−１２％Ｔｒｉｓ−グリシン（上清抽出物）ポリアクリルアミドゲルに流し、ニトロセルロース膜に移す。非特異的結合は、例えば、５％無脂乳とともに１時間インキュベートすることによりブロッキングすることができ、次に一次抗体を用いて４℃で１６時間反応させる。洗浄した後、二次抗体、例えば（１：１０、０００希釈）を室温で１時間適用し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）でシグナルを検出する。
【０３９７】
実施例８：ＣＨＲＭ３遺伝子発現の下方制御の評価に有用な動物モデル
動物モデルにおける抗−ＣＨＲＭ３剤の有効性を評価することは、ヒトに対する臨床試験を行う上で重要な必要条件である。Ｄａｗｋｉｎｓ他，２００１，Ｔｈｏｒａｘ，５６，９７２−９７７は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の動物モデルに関する総説論文である。Ｗｒｉｇｈｔ他，２００２，Ｃｈｅｓｔ，１２２，３０１ｓ−３０６ｓは、タバコの煙により誘発されたＣＯＰＤの動物モデルについて記述している。Ｚｈａｎｇ他，２００４，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１１３，３２０−３２６は、無水トリメリック酸粉末の皮膚曝露により感作したブラウンノルウェーラットにおける喘息様二相気道応答を用いた喘息の動物モデルについて記述している。Ｗｉｌｄｅｒ他、１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０，１３２６−１３３４は、アレルギー性喘息の誘発に関するマウスモデルについて記述している。Ｇｒｕｂｂ他、１９９９，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．，７９（１  Ｓｕｐｐｌ），Ｓ１９３−２１４は、嚢胞性線維症のマウスモデルについての総説論文である。Ｌｉ他、２００３，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１，８３は、嚢胞性線維症のフェレットモデルについて記述すると共に、ブタ、ヒツジ、及びウサギ等の他の数種の動物の嚢胞性線維症の他のモデルについて概説している。Ｓｕｇｉｍｏｔｏ他、２０００，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４８，１−７及びＳｈｉｍｉｚｕ他、２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．，１６１，１６４８−５４は、アレルギー性鼻炎のラットモデルについて記述している。これらのモデルは全て、ＣＨＲＭ３遺伝子発現を調節する本発明の核酸組成物の、臨床応用に向けた有効性の全臨床段階での評価用途に適用することができる。
【０３９８】
実施例９：ＲＮＡｉに媒介されたＣＨＲＭ３発現の阻害
ｓｉＮＡコンストラクト（表３）の、例えば、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ又はＨＴ２９細胞におけるＣＨＲＭ３  ＲＮＡ発現の減少の有効性について試験を行う。細胞を、トランスフェクションの約２４時間前に、９６ウェルのプレートに、トランスフェクション時に細胞が７０〜９０％コンフルエントであるように、５，０００〜７，５００個／ウェル、１００μｌ／ウェルずつプレーティングする。トランスフェクションは、アニールしたｓｉＮＡをトランスフェクション試薬（リポフェクタミン２０００、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ社）に、体積が５０μｌ／ウェルになるよう混合し、室温で２０分間インキュベートする。ｓｉＮＡトランスフェクション混合物を細胞に加え、ｓｉＮＡの最終濃度を１５０μｌの体積中に２５ｎＭとする。ｓｉＮＡによる処理を３回行うために、それぞれのｓｉＮＡトランスフェクション混合物を３つのウェルに加える。引き続きｓｉＮＡトランスフェクション混合物の存在下で細胞を３７℃で２４時間インキュベートする。２４時間経過時に、処理した細胞のそれぞれのウェルからＲＮＡを調製する。トランスフェクション混合物の上澄み液をまず取り除き、廃棄後、細胞を溶解し、それぞれのウェルからＲＮＡを調製する。処理後の標的遺伝子の発現を、標的遺伝子及び規格化のためのコントロール遺伝子（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニット）に対するＲＴ−ＰＣＲにより評価する。３つのデータを平均し、それぞれの処理についての標準偏差を決定する。規格化したデータをグラフにし、活性なｓｉＮＡによる標的ｍＲＮＡの減少率を、それぞれの逆位コントロールｓｉＮＡとの比較により決定する。
【０３９９】
非限定的な例において、化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクト（表３）の、ＰＣ３細胞におけるＣＨＲＭ３  ＲＮＡ発現の減少の有効性について、上述のとおり試験を行う。活性なｓｉＮＡを、未処理の細胞、無関係なｓｉＮＡコントロールコンストラクト（３２０７２／３２０７５）と適合させた組み合わせ、及びトランスフェクションコントロールとの比較により評価した。結果を図２２にまとめて示す。図２２は、ＣＨＲＭ３  ＲＮＡの種々の部位を標的とする化学修飾されたｓｉＮＡコンストラクトについての結果を示す。図２２に示すように、活性なｓｉＮＡコンストラクトは、細胞培養実験において適当なコントロールとの比較によりＣＨＲＭ３  ｍＲＮＡのレベルにより決定されたように、ＣＨＲＭ３遺伝子の発現を有意に阻害する。
【０４００】
実施例１０：適応
今回のＣＨＲＭ３に関する研究における一連の知識より、研究、診断、及び治療に使用するために、ＣＨＲＭ３の活性をアッセイする方法及びＣＨＲＭ３の発現を調節することができる化合物が必要であることが示される。本明細書で述べたように、本発明の核酸分子をＣＨＲＭ３のレベルに関連する病的状態を診断するためのアッセイに使用できることに加えて、核酸分子をＣＨＲＭ３のレベルに関連する病的状態の治療のために使用することができる。
【０４０１】
ＣＨＲＭ３発現の調節に関連する可能性のある特定の症状及び疾患としては、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、ぜんそく、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、肺血管収縮、炎症、アレルギー、呼吸障害、呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、肺高血圧症、肺血管収縮、肺気腫、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、尿失禁等の、呼吸器及び肺疾患及び症状、及び／又は、細胞又は組織内のＣＨＲＭ３のレベルに、単独で又は他の治療と組み合わせることにより関連又は応答する、他の任意の疾患又は症状が挙げられるが、これらに限定されない。
【０４０２】
抗コリン剤、抗炎症剤、気管支拡張剤、アデノシン阻害剤、アデノシンＡ１受容体阻害剤、アトロピン、臭化イプラトロピウム等の非選択性Ｍ３受容体アンタゴニスト及びダリフェナシン及びレバトロペート等の選択性Ｍ３受容体アンタゴニストは全て、本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）と併用又は同時使用が可能な薬剤の非限定的な例である。当業者は、本明細書に記載された疾患及び症状を治療するために用いられる他の化合物及び治療法も、同様に本発明の核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）と併用することが可能であり、したがって本発明の範囲内に属することを認識するであろう。
【０４０３】
実施例１１：診断への応用
本発明のｓｉＮＡ分子は、種々の応用において、例えば、臨床、工業、環境、農業及び／又は研究の設定において、種々の診断用途、例えば分子標的（例えばＲＮＡ）の同定に用いることができる。そのようなｓｉＮＡ分子の診断における使用は、再構成されたＲＮＡｉ系、例えば、細胞溶解物又は部分的に精製された細胞溶解物を利用することを含む。本発明のｓｉＮＡ分子を診断手段として使用し、疾患に罹患した細胞内の遺伝的浮動及び変異を検査するか、又は細胞において内因性の又は外来の（例えばウィルス）ＲＮＡの存在を検出することができる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡの構造との間の密接な関係により、分子のいずれの領域においても、標的ＲＮＡの塩基対形成及び３次元構造を変更する変異を検出することができる。本発明に記載されるｓｉＮＡ分子を複数使用することにより、インビトロ並びに細胞及び組織におけるＲＮＡの構造及び機能に重要なヌクレオチド変化をマッピングすることができる。ｓｉＮＡ分子による標的ＲＮＡの切断を使用して、遺伝子の発現を阻害し、疾患又は感染の進行における特定の遺伝子産物の役割を明らかにすることができる。このようにして、他の遺伝子標的を疾患の重要な介在物として明らかにすることができる。これらの実験は、組み合わせ療法の可能性を提供することにより、疾患進行のよりよい治療につながるであろう（例えば、異なる遺伝子を標的とする多数のｓｉＮＡ分子、既知の小分子阻害剤と組み合わせたｓｉＮＡ分子、ｓｉＮＡ分子及び／又は他の化学的又は生物学的分子と組み合わせた間欠的治療）。本発明のｓｉＮＡ分子の他のインビトロにおける使用は当該技術分野においてよく知られており、これには、疾患、感染又は関連する健康状態に伴うｍＲＮＡの存在の検出が含まれる。そのようなＲＮＡは、ｓｉＮＡ分子で処理した後、標準的な方法論、例えば蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使用して切断産物の存在を判定することにより検出する。
【０４０４】
特定の例においては、標的ＲＮＡの野生型又は変異型のみしか切断できないｓｉＮＡ分子をアッセイに使用する。第１のｓｉＮＡ分子（すなわち、野生型の標的ＲＮＡのみを切断するもの）を用いて試料中の野生型ＲＮＡの存在を同定し、第２のｓｉＮＡ分子（すなわち、変異型の標的ＲＮＡのみを切断するもの）を用いて試料中の変異型ＲＮＡを同定する。反応対照として、野生型及び変異型の両方のＲＮＡの合成基質を両方のｓｉＮＡ分子で切断し、反応におけるｓｉＮＡ分子の相対効率及び「非標的」ＲＮＡ種を切断しないことを明らかにする。合成基質からの切断産物は、試料集団中の野生型及び変異型ＲＮＡの分析のためのサイズマーカーの生成にも役立つ。したがって、それぞれの分析は２つのｓｉＮＡ分子、２つの基質、及び１つの未知の試料を必要とし、これらを組み合わせて６つの反応を行う。切断産物の存在を、ＲＮＡｓｅ保護アッセイを用いて確認し、各ＲＮＡの完全長及び切断フラグメントをポリアクリルアミドゲルの１レーンで分析できるようにする。標的細胞における変異体ＲＮＡの発現及び所望の表現型の変化の推定されるリスクへの洞察を得るために、必ずしも結果を定量する必要はない。その蛋白質産物が表現型（すなわち、疾患に関連するか又は感染に関連する）の発生に関与することが示唆されるｍＲＮＡの発現はリスクを確立するのに十分である。同等の比活性のプローブを両方の転写産物に使用すれば、ＲＮＡレベルの定性的比較で十分であり、初期の診断のコストが低減する。ＲＮＡレベルを定性的に比較するにしても定量的に比較するにしても、より高い変異型と野生型の比率はより高いリスクと相関関係があるであろう。
【０４０５】
本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示す。本明細書において引用される全ての参考文献は、それぞれの参考文献が個々にその全体が本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に、本明細書の一部として引用される。当業者は、本発明が、その目的を実施し、記載される結果及び利点、並びに本明細書に固有のものを得るためによく適合していることを容易に理解するであろう。
【０４０６】
本明細書に記載される方法及び組成物は、現在のところ好ましい態様の代表的なものであり、例示的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、特許請求の範囲において定義される本発明の精神の中に包含される変更及び他の用途をなすであろう。
【０４０７】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明に対して種々の置換及び改変をなすことが可能であることを容易に理解するであろう。すなわち、そのような追加の態様は、本発明及び特許請求の範囲の範囲内である。本発明は、ＲＮＡｉ活性を媒介する改良された活性を有する核酸コンストラクトを得るために本明細書に記載される化学的修飾の種々の組み合わせ及び／又は置換を試験することを当業者に教示する。そのような改良された活性は、改良された安定性、改良された生物利用性、及び／又はＲＮＡｉを媒介する細胞応答の改良された活性化を含むことができる。したがって、本明細書に記載される特定の態様は限定ではなく、当業者は、改良されたＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ分子を同定するために、過度の実験なしに本明細書に記載される修飾の特定の組み合わせを試験しうることを容易に理解することができる。
【０４０８】
本明細書に例示的に記載されている発明は、本明細書に特定的に開示されていない任意の要素又は限定なしでも適切に実施することができる。すなわち、例えば、本明細書における各例において「・・・を含む」、「・・・から本質的になる」及び「・・・からなる」という用語は、他の２つのいずれかと置き換えることができる。本明細書において用いられる用語及び表現は、説明の用語として用いるものであり、限定ではない。そのような用語及び表現の使用においては、示されかつ記載されている特徴又はその一部の均等物を排除することを意図するものではなく、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち、好ましい実施形態及び任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが、当業者には本明細書に記載される概念の変更及び変種が可能であり、そのような変更及び変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０４０９】
さらに、発明の特徴及び態様がマーカッシュ群又は他の代替群の用語で記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群又は他の群の個々のメンバー又はサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【０４１０】
表１
ＣＨＲＭ３受入番号
NM＿000740
Homo sapiens cholinergic receptor, muscarinic 3 (CHRM3), mRNA
gi|4502818|ref|NM＿000740.1|[4502818]
U29589
Human m3 muscarinic acetylcholine receptor (CHRM3) gene, complete cds
gi|903978|gb|U29589.1|HSU29589[903978]
X15266
Homo sapiens gene for muscarinic acetylcholine receptor HM3
gi|32323|emb|X15266.1|HSACM3[32323]
AB041395
Homo sapiens CHRM3 gene for muscarinic acetylcholine receptor m3, complete cds
gi|7592980|dbj|AB041395.1|[7592980]
AF498917
Homo sapiens muscarinic acetylcholine receptor M3 (CHRM3) mRNA, complete cds
gi|20302972|gb|AF498917.1|[20302972]
AK074575
Homo sapiens cDNA FLJ90094 fis, clone HEMBA1005545, highly similar to MUSCARINIC
ACETYLCHOLINE RECEPTOR M3
gi|22760104|dbj|AK074575.1|[22760104]
AF385589
Homo sapiens m3 muscarinic cholinergic receptor (CHRM3) mRNA, partial cds
gi|14573540|gb|AF385589.1|AF385589[14573540]
AF279779
Homo sapiens clone N10 NTera2D1 teratocarcinoma, m3 muscarinic acetylcholine
receptor mRNA, partial cds
gi|11095820|gb|AF279779.1|AF279779[11095820]
【０４１１】
【表１】
2007525206.tif 000009
【０４１２】
【表２】
2007525206.tif 000010
【０４１３】
【表３】
2007525206.tif 000011
【０４１４】
【表４】
2007525206.tif 000012
【０４１５】
【表５】
2007525206.tif 000013
【０４１６】
【表６】
2007525206.tif 000014
【０４１７】
【表７】
2007525206.tif 000015
【０４１８】
【表８】
2007525206.tif 000016
【０４１９】
【表９】
2007525206.tif 000017
【０４２０】
【表１０】
2007525206.tif 000018
【０４２１】
【表１１】
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【０４２２】
【表１２】
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【０４２３】
【表１３】
2007525206.tif 000021
【０４２４】
【表１４】
2007525206.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０４２５】
【図１】ｓｉＮＡ分子を合成するスキームの非限定的な例を示す図である。
【図２】本発明の方法により合成された精製ｓｉＮＡ二本鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を示す図である。
【図３】ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の提唱されるメカニズムの非限定的な例を示す図である。
【図４】本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す図である。
【図５】本発明の化学修飾された特定のｓｉＮＡ配列の非限定的な例を示す図である。
【図６】本発明の種々のｓｉＮＡコンストラクトの非限定的な例を示す図である。
【図７】ｓｉＮＡヘアピンコンストラクトを生成するための発現カセットを作製するために用いられるスキームの概略図である。
【図８】発現カセットを作製して二本鎖ｓｉＮＡコンストラクトを生成するために用いられるスキームの概略図である。
【図９】特定の標的核酸配列、例えばメッセンジャーＲＮＡ中のｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉの標的部位を決定するために用いられる方法の概略図である。
【図１０】例えば、本発明のｓｉＮＡ配列の３’末端を安定化させるために用いることができる、種々の安定化化学（１−１０）の非限定的な例を示す図である。
【図１１】ヌクレアーゼに耐性であるがＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持している本発明の化学的に修飾されたｓｉＮＡコンストラクトを同定するために用いられる戦略の非限定的な例を示す図である。
【図１２】直鎖及び二本鎖コンストラクト並びにこれらの非対称誘導体を含む、リン酸化された本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図１３】本発明の化学修飾された末端リン酸基の非限定的な例を示す図である。
【図１４Ａ】標的核酸配列内で同定された回文配列及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的なＤＦ０コンストラクトをデザインするために用いられる方法論の非限定的な例を示す図である。
【図１４Ｂ】標的核酸配列内で同定された回文配列及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的なＤＦ０コンストラクトをデザインするために用いられる方法論の非限定的な例を示す図である。
【図１４Ｃ】標的核酸配列内で同定された回文配列及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的なＤＦ０コンストラクトをデザインするために用いられる方法論の非限定的な例を示す図である。
【図１４Ｄ】標的核酸配列内で同定された回文配列及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的なＤＦ０コンストラクトをデザインするために用いられる方法論の非限定的な例を示す図である。
【図１５】対象となる標的核酸配列に相補的な配列を有するＤＦ０コンストラクトに導入された回文配列及び／又は反復核酸配列を用いた、自己相補的なＤＦ０コンストラクトをデザインの非限定的な例を示す図である。
【図１６】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有する、多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図１７】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有する、単一のポリヌクレオチド配列を有する多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図１８】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる２つの別個のポリヌクレオチド配列を有し、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図１９】それぞれが異なる標的核酸配列をＲＮＡｉに誘導された分解を媒介することができる別個の領域を有し、多機能性ｓｉＮＡコンストラクトはさらに自己相補的、回文又は反復領域を有し、そのため異なる標的核酸配列に対しＲＮＡ干渉を媒介するより分子鎖の短い二機能性ｓｉＮＡコンストラクトの構築が可能になる、単一のポリヌクレオチド配列を有する多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子の非限定的な例を示す図である。
【図２０】多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子が、どのようにして、異なるタンパク質、例えばサイトカイン及び対応する受容体、異なるウィルス菌株、ウィルス及びウィルスの感染又は複製に関与する細胞タンパク質、又は疾患の維持または進行に関与する共通の又は多様な生物学的経路に関与する異なるタンパク質をコードする個別のＲＮＡ分子等の２つの個別の標的核酸分子を標的にするかの非限定的な例を示す図である。
【図２１】多機能性の本発明のｓｉＮＡ分子が、どのようにして、ＲＮＡの交互コード領域、ＲＮＡのコーディング及び非コーディング領域、又はＲＮＡの交互スプライス変異領域等の、同一標的核酸分子内の２つの個別の標的核酸配列を標的にするかの非限定的な例を示す図である。
【図２２】ＰＣ３細胞中で、ＣＨＲＭ３  ｍＲＮＡを標的とする化学修飾されたｓｉＮＡに媒介されたＣＨＲＭ３  ｍＲＮＡの減少の非限定的な例を示す図である。
【図１】
2007525206.tif 000023
【図２】
2007525206.tif 000024
【図３】
2007525206.tif 000025
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2007525206.tif 000029
【図８】
2007525206.tif 000030
【図９】
2007525206.tif 000031
【図１０】
2007525206.tif 000032
【図１１】
2007525206.tif 000033
【図１２】
2007525206.tif 000034
【図１３】
2007525206.tif 000035
【図１４Ａ】
2007525206.tif 000036
【図１４Ｂ】
2007525206.tif 000037
【図１４Ｃ】
2007525206.tif 000038
【図１４Ｄ】
2007525206.tif 000039
【図１５】
2007525206.tif 000040
【図１６】
2007525206.tif 000041
【図１７】
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【図１８】
2007525206.tif 000043
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2007525206.tif 000047
【国際調査報告】
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2007525206.tif 000049
2007525206.tif 000050
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