(57)【要約】  検体検出に使用する試薬が蛍光エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターを含み、エネルギーアクセプターは一般式（Ｉ）のものであり、試薬のエネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の距離は検出されるべき適切な検体によって調節されうる。
2007518844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体の検出に使用するための試薬であって、蛍光エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターを含み、前記エネルギードナーおよび前記エネルギーアクセプターは、それらが互いに十分に近接しているときには、エネルギードナーの励起に続いて、エネルギーを無放射的にエネルギードナーからエネルギーアクセプターに移動させて、エネルギードナーの蛍光を消滅させ、前記エネルギーアクセプターは下記一般式で表され、
【化１】
2007518844.tif 000013
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々が単独で、Ｈ、電子供与性置換基、または電子求引性置換基であり、または、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも２つが電子供与性基であることを条件として、リンカー構造に結合しており、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、各々が単独で、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルであり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各々が単独で、水素、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルキルであり、または、Ｒ１およびＲ４の基の対、Ｒ１およびＲ５の基の対、Ｒ２およびＲ６の基の対、Ｒ２およびＲ７の基の対、Ｒ３およびＲ８の基の対、Ｒ３およびＲ９の基の対、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数は、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のすべてが水素でないことを条件として、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された、アリール、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基であり、
試薬の前記エネルギードナーと前記エネルギーアクセプターとの間の距離は、検出されるべき適切な検体によって変更可能であるところの試薬。
【請求項２】
エネルギードナーとエネルギーアクセプターとが、共有結合によって共に連結されている、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
エネルギードナーおよびエネルギーアクセプター間の前記共有結合が、試薬のエネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の距離を増加するために、分裂可能である、請求項２に記載の試薬。
【請求項４】
エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターが、ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド類似配列またはポリペプチド配列を介して連結されており、前記配列は、検出されるべき適切な検体によって、試薬のエネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の距離を変化させるように、変更可能な配座を有している、請求項２に記載の試薬。
【請求項５】
エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターが、非共有結合によって共に連結されている、請求項１に記載の試薬。
【請求項６】
前記非共有結合が、エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターのうちの一方に連結している検体結合剤と、エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターのうちの他方に連結している検体類似体との間に存在し、前記非共有結合は、試薬のエネルギードナーおよびエネルギーアクセプター間の距離を増加するように、適切な検体によって、崩壊可能である、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
前記検体結合剤が、レクチンである、請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記検体類似体が、グルコース類似体である、請求項６または７に記載の試薬。
【請求項９】
前記検体類似体が、デキストランである、請求項８に記載の試薬。
【請求項１０】
エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターが、検体の存在なしでは連結されない、請求項１に記載の試薬。
【請求項１１】
リンカー構造が、Ｒ３で、エネルギーアクセプターに結合しており、架橋基が任意的に存在しており、前記リンカー構造が、前記架橋基において、エネルギーアクセプターに結合している、請求項１から１０のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項１２】
前記電子供与性置換基が、アミノ、第一級アミン、第二級アミン、Ｏ−アルキル、アルキル、Ｓ−アルキル、アミド、エステル、ＯＨおよびＳＨから選択される、請求項１から１１のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項１３】
Ｒ１〜Ｒ３の１つまたは複数が、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換された、ジメチルアミノ、ジエチルアミノまたはメチルエチルアミノである、請求項１２に記載の試薬。
【請求項１４】
電子求引性置換基が存在し、前記電子求引性置換基は、ＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、エステル、ＣＯＯ−、アミド、ＣＨＯ、ケト、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、およびＳＯ３−アルキルから選択される、請求項１から１３のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項１５】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のうちの少なくとも１つが、Ｏ−アルキルである、請求項１から１４のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項１６】
Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数が、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基である、請求項１から１５のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項１７】
Ｒ１０〜Ｒ１５が、それぞれＯ−メチルまたはＯ−エチルである、請求項１から１４のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項１８】
ハライド、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＮＯ３−、カルボキシレート、ＣｌＯ４−、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋から選択された１つまたは複数の対イオンをさらに含む、請求項１から１７のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項１９】
リンカー構造が存在し、前記リンカー構造は、活性エステル、イソチオシアネート、酸クロライド、アルデヒド、アジド、α−ハロゲン化ケトンおよびアミンから選択されたリンカーエレメントと反応パートナーとの反応によって形成される、請求項１から１８のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項２０】
前記反応パートナーが、ポリサッカリド、ポリヌクレオチドおよびタンパク質から選択される、請求項１９に記載の試薬。
【請求項２１】
前記リンカーエレメントが、活性エステルであり、そして、スクシンイミジルおよびペンタフルオロフェニル活性エステルから選択される、請求項１９または２０に記載の試薬。
【請求項２２】
前記エネルギードナーが、アレキサフロール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標））である、請求項１から２１のいずれか１つに記載の試薬。
【請求項２３】
下記の一般式で表される色素化合物であって、
【化２】
2007518844.tif 000014
式中、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、各々が単独で、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、Ｏ−アルキルまたはＳ−アルキルであり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各々が単独で、水素、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはアルキルであり、Ｒ２０およびＲ４の基の対、Ｒ２０およびＲ５の基の対、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数は、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のすべてが水素でないことを条件として、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換された、アリール、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基であり、
Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、各々が単独で、Ｈ、アルキルまたはアリールであり、Ｒ１６およびＲ１７の基の対、および、Ｒ１８およびＲ１９の基の対のうちの１つまたは複数は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換されたアルキレンであり、
Ｒ６およびＲ１６の基の対、Ｒ７およびＲ１７の基の対、Ｒ８およびＲ１８の基の対、および、Ｒ９およびＲ１９の基の対の１つまたは複数は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換された、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンであり、そして、
Ｒ２０は、活性エステル、イソチオシアネート、酸クロライド、α−ハロゲン化ケトンおよびアジドから選択されたリンカーエレメントである
ところの色素化合物。
【請求項２４】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５の少なくとも１つが、アルキルである、請求項２３に記載の色素化合物。
【請求項２５】
Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数が、ＳＯ３、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換された、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基である、請求項２４に記載の色素化合物。
【請求項２６】
Ｒ２０が、以下の構造を有するリンカーエレメントであり、
【化３】
2007518844.tif 000015
式中、
Ｒ２１は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された、Ｈ、アルキルまたはアリールであり、Ｒ２２は、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンであり、Ｒ２１およびＲ２２は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された環の一部であり、そして、
Ｒ２３は、Ｏ−スクシンイミジル、Ｏ−ペンタフルオロフェニル、Ｃｌまたはα−ハロゲン化アルキルである、
請求項２３から２５のいずれか１つに記載の色素化合物。
【請求項２７】
Ｒ１０〜Ｒ１５が、それぞれＯ−メチルまたはＯ−エチルである、請求項２３から２６のいずれか１つに記載の色素化合物。
【請求項２８】
ハライド、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＮＯ３−、カルボキシレート、ＣｌＯ４−、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋から選択された１つまたは複数の対イオンをさらに含む、請求項２３から２７のいずれか１つに記載の色素化合物。
【請求項２９】
請求項１から２２のいずれか１つに記載した試薬を使用して、検体を検出または測定する方法であって、
前記試薬をサンプルと接触させ、
前記試薬およびサンプルに、エネルギードナーの吸収スペクトル内の波長の光を照射し、
前記エネルギードナーの蛍光を測定することによって、エネルギードナーおよびエネルギーアクセプター間の無放射エネルギーの移動を検出し、そして、
蛍光測定を検体の存在または濃度と関連付ける
ステップを含む方法。
【請求項３０】
蛍光強度測定または時間分解蛍光測定によって、前記エネルギードナーの蛍光を測定する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
サンプルの蛍光測定値を、既知濃度の検体を使用した蛍光測定値と比較することによって、検体を測定する、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
検体を検出するための、検体および試薬の複合体であって、前記試薬は、蛍光エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターを含み、前記エネルギードナーおよび前記エネルギーアクセプターは、それらが互いに十分に近接しているときには、エネルギードナーの励起に続いて、エネルギーを無放射的にエネルギードナーからエネルギーアクセプターに移動させて、エネルギードナーの蛍光を消滅させ、前記エネルギーアクセプターは下記一般式で表され、
【化４】
2007518844.tif 000016
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々が単独で、Ｈ、電子供与性置換基、または電子求引性置換基であり、または、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも２つが電子供与性基であることを条件として、リンカー構造に結合しており；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、各々が単独で、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルであり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各々が単独で、水素、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルキルであり、または、Ｒ１およびＲ４の基の対、Ｒ１およびＲ５の基の対、Ｒ２およびＲ６の基の対、Ｒ２およびＲ７の基の対、Ｒ３およびＲ８の基の対、Ｒ３およびＲ９の基の対、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数は、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のすべてが水素でないことを条件として、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された、アリール、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基であり、
前記検体の存在によって、前記エネルギードナーと前記エネルギーアクセプターとの間の距離が変更される
ところの複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体の検出に使用する試薬、かかる試薬において使用する適切な色素化合物、かかる試薬を使用する検体の検出および測定の方法、ならびに検体およびかかる試薬の複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体の検出および測定の方法は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）に依存する。
【０００３】
ＦＲＥＴは、２つの色素種の電子的励起状態間の距離依存性の相互作用であり、励起エネルギーが光子の放出を伴わずにドナーからアクセプターへ移動する。
【０００４】
ＦＲＥＴの効率は、分子間隔の６乗の逆数に依存する。［参照文献１．Ｂ．Ｗｉｅｂ  Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒ、Ｇ．Ｃｏｋｅｒ  ＩＩＩ，Ｓ．−Ｙ．「Ｓｉｍｏｎ  Ｃｈｅｎ、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｄａｔａ」、ＶＣＨ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９４；２．「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｒ．Ｌａｋｏｗｉｃｚ（Ｅｄ．）、２．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９］。したがって、ＦＲＥＴの検出は、ドナーで標識された種とアクセプターで標識された種との間の距離を決定するために使用することができる。これは、例えばこれら２つの種が互いに結合されているかどうかを判定するために使用することができる。
【０００５】
ＦＲＥＴの要件は、
−  ドナーとアクセプターは接近していなければならない（通常は１０〜１００Å）。
【０００６】
−  アクセプターの吸収スペクトルは、ドナーの蛍光放出スペクトルと重なっていなければならない。
【０００７】
−  ドナーとアクセプターの遷移双極子の配向は、ほぼ平行でなければならない。
【０００８】
ＦＲＥＴは、ドナーの蛍光の強度低下と寿命短縮の原因となる。アクセプターが蛍光性であれば、ＦＲＥＴは、アクセプターの蛍光強度を増加させる原因にもなる可能性がある。ドナーとアクセプターが同じである場合は、ＦＲＥＴは蛍光脱分極の原因になる。
【０００９】
ＦＲＥＴは、サンプルにドナーの吸収スペクトル内の光を照射し、これらの特性のいずれかを測定することによって検出することができる。
【００１０】
簡単なＦＲＥＴアッセイは、検体をドナーで標識し、検体結合剤をアクセプターで標識する（あるいは逆にする）ことによって行うことができる。検体が検体結合剤と結合していない場合は、ドナーとアクセプターとの間の距離が大きいのでＦＲＥＴは起こらない。
【００１１】
検体が検体結合剤に結合している場合は、ドナーとアクセプターとの間の距離は小さいのでＦＲＥＴが起こる。
【００１２】
したがって、ＦＲＥＴの検出を、検体の存在の有無および／または検体の濃度を決定するために使用することができる。
【００１３】
標識検体と無標識検体が競合している場合は、競合ＦＲＥＴアッセイを行うことができる。この場合は、無標識検体の濃度が増加するにつれて、結合した標識検体は少なくなる。これはＦＲＥＴの起こり方が少なくなることを意味する。
【００１４】
したがって、ＦＲＥＴの検出は検体濃度の判定にも使用することができる。
【００１５】
この種のアッセイは、グルコース濃度の測定に使用することができる。グルコースは、レクチンと呼ばれる１群のタンパク質と可逆的に結合する。コンカナバリンＡはレクチンの一例である。アッセイ成分は、例えば標識コンカナバリンＡ（検体結合性試薬）および標識グルコースまたは標識グルコ−ス類似体である。デキストランは適切なグルコース類似体である。グルコース（検体）がコンカナバリンＡと結合すると、標識グルコースまたは標識デキストランに取って換わり、ＦＲＥＴの起こり方が少なくなる。
【００１６】
あるいは、ドナーとアクセプターとを同じ種に付けて単一のＦＲＥＴ試薬を形成することができる。そのような試薬の例は「分子ビーコン」である。
【００１７】
分子ビーコンは、配列の一方の末端にドナーが付いた一本鎖のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体配列からなる。相補的アクセプターは、配列のもう一方の末端に付いている。
【００１８】
結合していない分子ビーコンは軸と輪の構造で存在する。分子ビーコンの両端の配列が出会って結合して軸を創り出し、このプローブの残りの部分は出会うことがなく結合しないで輪になる。このように折りたたまれて、プローブの一端のドナーはもう一方の端のアクセプターの隣にある。このドナーとアクセプターの近接がＦＲＥＴの発生を可能にする。
【００１９】
このプローブが標的を認識し結合すると、この分子ビーコン構造は展開する。これがアクセプターをドナーから離してＦＲＥＴは起こることができなくなる。
【００２０】
したがって、ＦＲＥＴは、特定の標的が存在するかどうかを判定するために使用することができる。
【００２１】
分子ビーコンは、相補的な一本鎖ポリヌクレオチド配列を検出するために使用することができる。あるいは、それらは他の非ヌクレオチド種を検出するために使用することができる。かかる分子ビーコンは、アプタマーと呼ばれている。例えば、アプタマーはタンパク質を検出するために使用することができる。
【００２２】
分子ビーコンには、ビーコンが結合していないときに起こるＦＲＥＴに依存しているという潜在的な不都合がある。インビボアッセイの間には、ビーコンの配列が体内の酵素によって分裂されることがある。これはＦＲＥＴを減少させる。ビーコンの分解に起因するＦＲＥＴの減少は、ビーコンの標的への結合に起因するＦＲＥＴの減少と区別することができず、したがって得られる結果には信頼性がない可能性がある。
【００２３】
この問題に対処する代替分子ビーコンの１つは、デュアルプローブである。これは２本の一本鎖ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類似体配列を含み、１つはエネルギードナーで、１つは相補的エネルギーアクセプターで標識されている。デュアルプローブは、デュアルプローブの双方の部分の配列に対して相補的である一本鎖ポリヌクレオチド標的配列の検出に使用される。デュアルプローブの部分が両方とも標的と結合するとＦＲＥＴが起こる。デュアルプローブが結合していないときにはＦＲＥＴは起こらないので、デュアルプローブの分解はＦＲＥＴの発生には影響しない。したがって、分解が結果の信頼性を損なうことはない。
【００２４】
分子ビーコンに類似の試薬をポリペプチドから形成することができる。
【００２５】
ＦＲＥＴは免疫アッセイにも使用することができる。
【００２６】
ＦＲＥＴで使用するドナーとアクセプターとの選択は重要であり、次の因子を考慮に入れる必要がある。
【００２７】
ドナーは高い量子収率を有していなければならない。
【００２８】
適切なアクセプターは、ドナーの放出スペクトルと重なる吸収スペクトルを有していなければならない。例えば、ＱＳＹ２１（商標）は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ２１（商標）と共に使用するのに適切なドナーである。アクセプターが、様々な種類のドナーと共に使用できるように、幅の広い吸収スペクトルを有することが望ましい。
【００２９】
アクセプターも蛍光性の種である場合は、アクセプターの直接励起から生じるバックグラウンドの蛍光が生じ、ドナーの蛍光と共に検出される。アクセプターの放射をフィルターにかけると、フィルタリングが十分にシャープでない場合は、ドナーの蛍光シグナルのロスが生じる。この問題を回避するために、ダブシルおよびＱＳＹ（商標）などの非蛍光性アクセプターを使用することができる。あるいは、放出スペクトルが、ドナーの放出スペクトルから大きく離れているアクセプターを選択することによってこの問題を回避することもできる。
【００３０】
ドナーまたはアクセプターが検体または検体結合剤と結合している場合は、一部のドナーの放出スペクトルおよび一部のアクセプターの吸収スペクトルはシフトする。これは望ましくないことである。
【００３１】
ＦＲＥＴアッセイをインビボで使用する場合は、ドナーは５５０〜約６００ｎｍで蛍光を発し、アクセプターは約６５０ｎｍで吸収することが望ましい。これがドナーの蛍光とインビボのより短い波長での自動蛍光との重なりを回避する。フルオレセインは４９５ｎｍで蛍光を発するので、インビボでの使用には理想的ではない。
【００３２】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）はインビボでの使用に適切な放出スペクトルを有する色素である。この色素は５９４ｎｍで吸収し、６２０ｎｍで蛍光を発する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３３】
本発明者らはここに、ＦＲＥＴで使用するための新規なアクセプター類（ＨＭＣＶ色素）を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
これらのアクセプターは安定化されたカルベニウムイオンであり、構造的にはクリスタルバイオレットやマラカイトグリーンに関連している。これらのアクセプターは、Ｂｏ  Ｗ．Ｌａｕｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９８、１２０、１２２５５−１２２６３に記載されているトリオキサトリアングレニウム（ｔｒｉｏｘａｔｒｉａｎｇｕｌｅｎｉｕｍ）系を合成するときの中間体から誘導することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
したがって、本発明は第１の態様において、検体の検出に使用するための、エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターを含む試薬であって、エネルギードナーおよびエネルギーアクセプターは、それらが相互に十分に近接しているときには、エネルギードナーの励起に続いてエネルギーを無放射的にエネルギードナーからエネルギーアクセプターに移動させてエネルギードナーの蛍光を消滅させるような試薬を提供し、エネルギーアクセプターは下記一般式のものである。
【００３６】
【化５】
2007518844.tif 000003
【００３７】
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々が単独で、Ｈ、電子供与性置換基、または電子求引性置換基であるか、あるいはＲ３は、リンカー構造に連結しており、ただし、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも２つは電子供与性基であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、各々が単独で、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルであり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各々が単独で、水素、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルキルであり、または、Ｒ１およびＲ４の基の対、Ｒ１およびＲ５の基の対、Ｒ２およびＲ６の基の対、Ｒ２およびＲ７の基の対、Ｒ３およびＲ８の基の対、Ｒ３およびＲ９の基の対、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数は、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のすべてが水素でないことを条件として、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された、アリール、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基であり、
試薬の前記エネルギードナーと前記エネルギーアクセプターとの間の距離は、検出されるべき適切な検体によって変更可能である。
【００３８】
本明細書で使用する「電子供与性置換基」という用語は、これらだけに限られるものではないが、アミノ、第一級アミン、第二級アミン、アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アミド（ＮＨＣＯＲ）、エステル（ＯＣＯＲ）、ＯＨ、ＳＨおよび電子が豊富なアリールを含む。
【００３９】
本明細書で使用する「電子求引性置換基」という用語は、これらだけに限られるものではないが、ＣＯＯＨ、エステル（ＣＯＯＲ）、ＣＯＯ−、アミド（ＣＯＮＲ２）、ＣＨＯ、ケト（ＣＯＲ）、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、および電子不足アリールを含む。
【００４０】
電子が豊富なアリール／電子不足アリールは、電子供与性の置換基を有するアリールまたは電子求引性の置換基を有するアリールと定義することができる。
【００４１】
本明細書で使用する「アルキル」および「アルキレン」という用語は、直鎖、分岐および環状の基、飽和および不飽和の基（三重結合を含む基を含む）、１つまたは複数の置換基を含む基、ならびに１つまたは複数のヘテロ原子を含む基を含む。Ｃ１〜Ｃ６アルキル基が好ましい。
【００４２】
本明細書で使用する「Ｏ−アルキレン」、「Ｎ−アルキレン」および「Ｓ−アルキレン」という用語は、それぞれへテロ原子が基中の任意の位置にある基を含む。Ｃ１〜Ｃ７のＯ−アルキレン、Ｎ−アルキレンおよびＳ−アルキレンならびにＣ２〜Ｃ７アルキレンが好ましい。
【００４３】
エステル置換基に言及しているところでは、置換基はカルボニル部分を介して（Ｒ（Ｃ＝Ｏ）ＯＲとして）、またはアルコキシ部分を介して（ＲＯ（Ｃ＝Ｏ）Ｒとして）連結されていればよい。同様に、アミド置換基に言及しているところでは、置換基はカルボニル部分を介して（ＲＣＯＮＲ２として）、または窒素部分を介して（Ｒ（ＮＲ）ＣＯＲとして）連結されていればよい。
【００４４】
好ましい一実施形態では、エネルギードナーとエネルギーアクセプターとは共に非共有結合によって連結されている。非共有結合は、エネルギードナーの１つに連結している検体結合剤とエネルギーアクセプターとの間およびもう一方のエネルギードナーに連結している検体類似体とエネルギーアクセプターとの間に存在しうる。この非共有結合は適切な検体によって、試薬のエネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の距離を増すように崩壊しうる。
【００４５】
この実施形態において適切には、検体結合剤はレクチンであり、かつ／または検体類似体はグルコース類似体である。例えば、検体類似体はデキストランであってもよい。この系は、グルコースの検出および／または先に論じたように測定に使用することができる。
【００４６】
レクチンはエネルギードナーに結合され、検体類似体はエネルギーアクセプター（例えば、デキストラン−ＨＭＣＶおよびコンカナバリンＡ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標））に結合されることが好ましい。デキストランは、コンカナバリンＡよりも重い標識をすることができる。デキストランがフルオロフォアで標識されると、寿命ベースのアッセイにおいてシグナルを希釈する過剰な蛍光を生じる。
【００４７】
代替実施形態では、エネルギードナーとエネルギーアクセプターとは共に共有結合によって連結されている。エネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の共有結合は、分裂することができて、試薬のエネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の距離が増す。適切には、エネルギードナーとエネルギーアクセプターはポリヌクレオチド配列もしくはポリヌクレオチド類似の配列またはポリペプチド配列を介して連結されており、これらの配列は、検出されるべき適切な検体によって、試薬のエネルギードナーとエネルギーアクセプターとの間の距離を調節するように調節しうる配座を有している。この場合は、試薬は先に論じた「分子ビーコン」である。
【００４８】
他の代替実施形態では、エネルギードナーとエネルギーアクセプターとは、検体が存在しないときには連結されていない。この試薬は、先に論じた「デュアルプローブ」になりうる。
【００４９】
好ましくは、リンカー構造は、Ｒ３または架橋基が存在している位置においてエネルギーアクセプターに結合しており、場合によっては架橋基においてエネルギードナーに結合している。
【００５０】
好ましくは、電子供与性置換基は、アミノ、第一級アミン、第二級アミン、Ｏ−アルキル、アルキル、Ｓ−アルキル、アミド、エステル、ＯＨおよびＳＨから選択される。
【００５１】
好ましくは、Ｒ１〜Ｒ３の１つまたは複数はジメチルアミノ、ジエチルアミノまたはメチルエチルアミノであり、場合によってはＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で置換されている。
【００５２】
好ましい実施形態では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれジメチルアミノである。あるいは、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ場合によっては置換されたメチルエチルアミノでもよい。
【００５３】
好ましくは、電子求引性置換基が存在し、電子求引性置換基はＮＯ、ＮＯ２、ＣＮ、ＣＯＯＨ、エステル、ＣＯＯ−、アミド、ＣＨＯ、ケト、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、およびＳＯ３−アルキルから選択される。
【００５４】
好ましくは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５の少なくとも１つはＯ−アルキルである。
【００５５】
適切には、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうち１つまたは複数は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換された、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基である。
【００５６】
好ましくは、Ｒ１０〜Ｒ１５は、それぞれＯ−メチルまたはＯ−エチルである。
【００５７】
好ましくは、試薬はさらにはＢＦ４−、ＰＦ６−、ＮＯ３−、カルボキシレート、ＣｌＯ４−、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋から選択された１つまたは複数の対イオンを含み、そのため本試薬は全体としては荷電していない。
【００５８】
好ましくは、リンカー構造が存在し、それは活性エステル、イソチオシアネート、酸クロライド、アルデヒド、アジド、α−ハロゲン化ケトンおよびアミンから選択されたリンカーエレメントと反応パートナーの反応によって形成される。適切には、反応パートナーは、ポリサッカリド、ポリヌクレオチドまたはタンパク質から選択される。適切には、リンカーエレメントは、活性エステルであり、スクシンイミジルおよびペンタフルオロフェニル活性エステルから選択される。
【００５９】
適切には、エネルギードナーは、アレキサフロール（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標））である。
【００６０】
本試薬は、検体のインビボ検出に使用することができる。例えば、本試薬は体内にインプラントされるセンサーに含めることができる。適切には、センサーは長期間本体から隔離されるように表皮内にインプラントされる。適切なセンサー構成は国際公開第０２／３０２７５号に詳細に記載されている。この場合には、本試薬に光を照射し、インプラントされたセンサー上の皮膚層を通して試薬の蛍光を測定することが可能なはずである。
【００６１】
あるいは、本試薬は、部分的に体内にインプラントされてはいるが、対外に突き出ているセンサー内に含めることができる。このようなセンサーは針の形態をとることができる。この場合には、本試薬を針の穴を通して照射することができ、試薬の蛍光は同じ経路で検出することができ、光が皮膚層を通過することはない。
【００６２】
センサーは検体を浸透しうるものでなければならない。
【００６３】
この第２の態様では、本発明は、試薬を閉じ込める半浸透性の膜を含み、前記のように検体の検出に使用するためのセンサーに関する。
【００６４】
第３の態様では、本発明は下記一般式を有する色素化合物に関する。
【００６５】
【化６】
2007518844.tif 000004
【００６６】
式中、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、各々が単独で、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、Ｏ−アルキルまたはＳ−アルキルであり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各々が単独で、水素、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、またはアルキルであり、Ｒ２０およびＲ４の基の対、Ｒ２０およびＲ５の基の対、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数は、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のすべてが水素でないことを条件として、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換された、アリール、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基であり、
Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、各々が単独で、Ｈ、アルキル（好ましくはＣ１〜Ｃ５アルキル）またはアリールであり、Ｒ１６およびＲ１７の基の対、Ｒ１８およびＲ１９の基の対のうちの１つまたは複数は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換されたアルキレン（好ましくはＣ３〜Ｃ７アルキレン）であり、
Ｒ６およびＲ１６の基の対、Ｒ７およびＲ１７の基の対、Ｒ８およびＲ１８の基の対、およびＲ９およびＲ１９の基の対の１つまたは複数は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で置換された、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンであり、
Ｒ２０は、活性エステル、イソチオシアネート、酸クロライド、α−ハロゲン化ケトン、アジドおよびアミンから選択されたリンカーエレメントである。
【００６７】
適切には、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５の少なくとも１つはアルキルである。
【００６８】
好ましい実施形態では、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、それぞれメチルまたはエチルである。あるいは、Ｒ１６およびＲ１８は、それぞれメチルであり、Ｒ１７およびＲ１９は、それぞれ２の位置がＳＯ３−で置換されたエチルである。
【００６９】
適切には、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびとＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５のうちの１つまたは複数は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基でる。
【００７０】
好ましくは、Ｒ２０は、以下の構造を有するリンカーエレメントである。
【００７１】
【化７】
2007518844.tif 000005
【００７２】
式中、Ｒ２１は、Ｈまたは、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で置換された、アルキルまたはアリールであり、Ｒ２２は、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレン（好ましくはＣ２〜Ｃ６）であり、Ｒ２１およびＲ２２は、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンの１つまたは複数で任意的に置換された、環の一部（好ましくはＣ３〜Ｃ７）であり、
Ｒ２３は、ο−スクシンイミジル、ο−ペンタフルオロフェニル、Ｃｌまたはα−ハロゲン化アルキルである。
【００７３】
好ましくは、Ｒ１０〜Ｒ１５は、それぞれＯ−メチルまたはＯ−エチルである。
【００７４】
好ましくは、本色素化合物は、さらにハライド、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＮＯ３−、カルボキシレート、ＣｌＯ４−、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋およびＺｎ２＋から選択された１つまたは複数の対イオンを含む。
【００７５】
第４の態様では、本発明は先に記載した試薬を使用して、検体を検出または測定するための方法に関するものであり、この方法は、以下のステップを含む：
前記試薬をサンプルと接触させ、
前記試薬およびサンプルに、エネルギードナーの吸収スペクトル内の波長の光を照射し、
前記エネルギードナーの蛍光を測定することによって、エネルギードナーおよびエネルギーアクセプター間の無放射エネルギーの移動を検出し、そして、
蛍光測定を検体の存在または濃度と関連付ける。
【００７６】
適切には、エネルギードナーの蛍光を、強度ベースの蛍光測定または時間分解蛍光測定によって測定する。好ましくは、サンプルの蛍光測定値を、既知濃度の検体を使用した蛍光測定値と比較することによって検体を測定する。
【００７７】
照射に使用する光は、好ましくは５５０ｎｍを超える波長を有する。
【００７８】
第５の態様では、本発明は、検体と検体検出用試薬との複合体に関し、試薬は、蛍光性エネルギードナーとエネルギーアクセプターとを含み、エネルギードナーとエネルギーアクセプターとが相互に十分近いときに、エネルギードナーの励起に続いてそれからエネルギーをエネルギーアクセプターへ無放射的に移動させて、エネルギードナーの蛍光を消滅させるものであり、エネルギーアクセプターは下記一般式で表される。
【００７９】
【化８】
2007518844.tif 000006
【００８０】
式中、
Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、各々が単独で、Ｈ、電子供与性置換基、または電子求引性置換基であり、または、Ｒ３は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも２つが電子供与性基であることを条件として、リンカー構造に結合しており；Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、各々が単独で、Ｈ、ハロゲン、アルキル、アリール、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキルであり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５は、各々が単独で、水素、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルキルであり、または、Ｒ１およびＲ４の基の対、Ｒ１およびＲ５の基の対、Ｒ２およびＲ６の基の対、Ｒ２およびＲ７の基の対、Ｒ３およびＲ８の基の対、Ｒ３およびＲ９の基の対、Ｒ４およびＲ１０の基の対、Ｒ５およびＲ１１の基の対、Ｒ６およびＲ１２の基の対、Ｒ７およびＲ１３の基の対、Ｒ８およびＲ１４の基の対、Ｒ９およびＲ１５の基の対のうちの１つまたは複数は、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４およびＲ１５のすべてが水素でないことを条件として、ＳＯ３−、ＰＯ３２−、ＯＨ、Ｏ−アルキル、ＳＨ、Ｓ−アルキル、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、エステル、アミド、ハロゲン、ＳＯ−アルキル、ＳＯ２−アルキル、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨ−アルキル、ＳＯ２Ｎ−ジアルキル、ＳＯ３−アルキル、ＣＮ、第二級アミンまたは第三級アミンのうちの１つまたは複数で任意的に置換された、アリール、アルキレン、Ｏ−アルキレン、Ｓ−アルキレンまたはＮ−アルキレンからなる架橋基であり、
前記検体の存在によって、前記エネルギードナーと前記エネルギーアクセプターとの間の距離が変更される。
【００８１】
本発明を、実施例で例示された、グルコース投与−応答曲線を示す図１およびｐＨ＝７．４のＰＢＳ５０ｍＭ緩衝液中のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４とＨＭＣＶ−１−デキストランのノーマライズされた吸収−放出スペクトル（０．７μＭ溶液中のＡＦ５９４の５７０ｎｍにおける励起）を示す図２で例示された好ましい実施形態を参照しつつさらに説明する。
【実施例】
【００８２】
色素化合物４の調製
合成方法および材料
別途に言及しない限り、使用した試薬はすべて標準級のものであった。エーテルおよびＴＨＦは、ナトリウム／ベンゾフェノンを加えて窒素下で蒸留することによって乾燥した。ベンゼンは、ナトリウムを加えて放置することによって乾燥した。ＮＭＲスペクトルは２５０または４００ＭＨｚのスペクトロメーターで得た。ＦＡＢＭＳスペクトルは、マトリックスとして１，４−ジシアノブタンを使用して得た。
【００８３】
元素分析は、コペンハーゲン大学化学科元素分析研究室、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔｓｐａｒｋｅｎ  ５、２１００、コペンハーゲン、デンマークで行った。
【００８４】
トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）カルベニウムテトラフルオロボレート（１−ＢＦ４）。乾燥エーテル（５０ｍＬ）中のブロモベンゼン（２４．５ｇ、１５６ｍｍｏｌ）を、乾燥エーテル（１００ｍＬ）中のリチウム線（２．３０ｇ、３２８ｍｍｏｌ）に加えることによって、フェニルリチウムの溶液を調製した。乾燥ベンゼン（１００ｍＬ）中の１，３，５−トリメトキシベンゼン（２５．１ｇ、１４９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をアルゴン気流中、室温で７０時間攪拌した。乾燥ベンゼン（１５０ｍＬ）中のジエチルカーボネート（５．３０ｇ、４５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を３日間還流した。冷却した反応混合物を、ＮａＯＨ溶液（３００ｍＬ、１Ｍ）中に注ぎ入れた。相分離させ、水層をエーテルで抽出した。有機相を合わせてＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過して透明黄色の溶液を得た。ＨＢＦ４水溶液（１２ｍＬ、５０％、約１００ｍｍｏｌ）を加えると直ちに濃青色のカルベニウム塩の沈殿を生じた。暗紫色の沈殿をろ別し、乾燥エーテルで十分に洗浄し、固体ＫＯＨで乾燥して粗生成物２６．０ｇ（９６％）を得た。アセトニトリル溶液に水を加えることによる再沈殿、続いてメタノールからの再結晶化で純粋な化合物を総合収率７０％で得た。１Ｈ  ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）；δ６．０５（６Ｈ，ｓ）、３．９９（９Ｈ，ｓ）、３．５９（１８Ｈ，ｓ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１６９．７０、１６６．４７、１６３．９３、１１８．６２、９１．５３、５６．５２、５６．３６。ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ  ５１３（Ｍ＋）。ＵＶ−ｖｉｓ  λｍａｘ（ｎｍ（ｌｏｇ  ∈））（ＣＨ２Ｃｌ２）；５８４（４．５５）、４６７（３．９８）、３２２（３．６８）、２８７（４．０２）。元素分析：Ｃ２８Ｈ３３Ｏ９ＢＦ４の計算値：Ｃ，５６．０１；Ｈ，５．５０。実測値：Ｃ，５５．６９；Ｈ，５．６４。
【００８５】
トリス（２，４，６−トリメトキシフェニル）カルベニウムクロライド（１−Ｃｌ）。
【００８６】
この化合物は、１−ＢＦ４と類似の方法で調整した（１，３，５−トリメトキシベンゼン１５．０ｇから出発して）。ＨＢＦ４の代わりに気体のＨＣｌを、加水分解し乾燥した反応混合物中に気泡で通した。濃い紫色の結晶性沈殿をろ別し、乾燥エーテルで十分に洗浄し、固体ＫＯＨで乾燥して粗生成物１０．１ｇ（６６％）を得た。ＭＳ（ＦＡＢ＋）、１Ｈ  ＮＭＲ、および１３Ｃ  ＮＭＲのスペクトルは、ＢＦ４塩のスペクトルと同一であった。
【００８７】
ＨＭＣＶ−１の合成：
【００８８】
【化９】
2007518844.tif 000007
【００８９】
４ａ（ＢＦ４−）：４−（メチルアミノ）酪酸塩酸塩（１．３６ｇ、８．８ｍｍｏｌ）、１（５．０ｇ、８．３ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（５ｍＬ）を、アセトニトリル（１２０ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を乾燥窒素雰囲気中、３０〜３５℃で２２時間攪拌した。ジメチルアミン水溶液（４０％溶液４０ｍＬ）を加え、反応混合物をさらに４日間攪拌した。溶媒および過剰のジメチルアミンを真空下で除去し、残った物質をクロロホルムに溶解させた。クロロホルム溶液を食塩水で２回洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥後、溶媒を蒸発させ、生成物をＣＨ２Ｃｌ２／エーテルから再沈殿させた。収量：濃青色粉末４．４ｇ（７０％）。
【００９０】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ  ６２４（Ｍ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ８．３４．（１Ｈ，ｂｓ）、６．０３（２Ｈ，ｓ）、５．８３（４Ｈ，ｓ）、３．４９（２Ｈ，ｍ）、３．４６（６Ｈ，ｓ）、３．４４（１２Ｈ，ｓ）、３．１２（３Ｈ，ｓ（マスクで隠れている））、３．０８（１２Ｈ，ｓ）、１．９４（２Ｈ，ｔ）、１．７０（２Ｈ，ｍ）。
【００９１】
ＨＭＣＶ−１（Ｃｌ−）：ＴＳＴＵ（２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、０．８ｇ、２．６ｍｍｏｌ）を、４ａ（０．９ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．５５ｇ、４．５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１５ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を密閉フラスコ中で２時間攪拌後、ＨＣｌ水溶液（２Ｍ、４ｍＬ）で酸性化し氷冷したほぼ飽和のＮａＣｌ溶液（約１５０ｍＬ）中に注ぎ入れた。水相をクロロホルム（２×１５０ｍＬ）で抽出した。クロロホルム相を合わせて食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ２Ｃｌ２／エーテルから再沈殿させて濃青色粉末（０．８０ｇ、８４％）を得た。
【００９２】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ  ７２１（Ｍ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ  １Ｈ−ＮＭＲ  ｂｒ．（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）；δ５．８８（２Ｈ，ｓ）、５．８５（４Ｈ，ｓ）、３．６０（２Ｈ，ｓ）、３．４６（１２Ｈ，ｓ）、３．４５（６Ｈ，ｓ）、３．１５（１２Ｈ，ｓ）、３．１２（３Ｈ，ｓ）、２．８５（４Ｈ，ｓ）、２．８０（２Ｈ，ｔ）、１．９５（２Ｈ，ｍ）。
【００９３】
ＨＭＣＶ−２の合成：
【００９４】
【化１０】
2007518844.tif 000008
【００９５】
４ｂ（ＰＦ６−）：ＮＭＰ（Ｎ−メチル−２−ピロリドン、２０ｍＬ）中に懸濁させたピペリジン−４−カルボン酸（イソニペコチン酸）（０．２１５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）を、１（１．０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）のＮＭＰ３０ｍＬ中溶液に加えた。反応混合物を８０〜１００℃のオイルバス中で２時間（反応混合物が輝く赤色になるまで）加熱し、室温で一晩放置した。ジメチルアミン（３３％無水エタノール溶液１０ｍＬ）を加え、反応混合物を室温でさらに２４時間攪拌した。反応混合物を、ＫＰＦ６水溶液（０．２Ｍ、４００ｍＬ）中に注ぎ入れ、ＨＣＬ水溶液（２Ｍ）を沈殿が生じるまで少量ずつ加えた。青色沈殿をろ別し、純水で洗浄、乾燥し、ＤＣＭに溶解させ、ろ過し、エーテルを加えて沈殿させた。収量：濃青色粉末０．８５ｇ（６４％）。
【００９６】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ  ６３６（Ｍ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，内部溶媒基準１．９４ｐｐｍ）：δ６．０３（２Ｈ，ｓ）、５．８１（４Ｈ，ｓ）、３．９０（２Ｈ，ｍ）、３．４８（１２Ｈ，ｓ）、３．４７（６Ｈ，ｓ）、３．１４（１２Ｈ，ｓ）、３．０４（２Ｈ，ｍ）、２．６１（１Ｈ，ｍ）、２．１５（１Ｈ，ｂｒ）、１．９７（２Ｈ，ｍ）、１．７１（２Ｈ，ｍ）。
【００９７】
ＨＭＣＶ−２（ＰＦ６−）：ＴＳＴＵ（２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（０．７２ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を、４ｂ（０．８ｇ、１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．４７ｇ）のアセトニトリル（１５ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を密閉フラスコ中で２時間攪拌後、ＨＣｌ水溶液（２Ｍ，４ｍＬ、約４ｍｍｏｌ）で酸性化した冷たいＮａＣｌ溶液（約１００ｍＬ）中に注ぎ入れた。水相をクロロホルム（２×１００ｍＬ）で抽出した。クロロホルム相を合わせて食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。ろ過したクロロホルム相にろ過助剤（１０ｇ）を加え、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＣＨＣｌ３／ＭｅＣＮ  ５：１）仕上げは、溶媒の蒸発（最初の青色の画分を集めた）およびＣＨ２Ｃｌ２／エーテルからの再沈殿後、濃青色粉末（０．５５ｇ、６２％）を与えた。
【００９８】
ＭＳ（ＦＡＢ＋）：ｍ／ｚ  ７３２（Ｍ＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，内部溶媒基準２．５０ｐｐｍ）：δ６．０８（２Ｈ，ｓ）、５．８４（４Ｈ，ｓ）、４．９３（２Ｈ，ｍ）、３．４５（１２Ｈ，ｓ）、３．４４（６Ｈ，ｓ）、３．１４（１２Ｈ，ｓ）、３．１４（２Ｈ，ｍ（マスクで隠れている））、２．８２（４Ｈ）、２．０３（２Ｈ，ｍ）、１．７４（２Ｈ，ｍ）。（ＣＤＣｌ３，内部溶媒基準７．７６ｐｐｍ）δ５．９４（２Ｈ，ｓ）、５．７０（４Ｈ，Ｓ）、３．８０（２Ｈ，ｍ）、３．５３（１２Ｈ，ｓ）、３．１８（６Ｈ）、３．１６（２Ｈ，ｍ（マスクで隠れている））、２．９７（１Ｈ，ｍ）、２．８５（４Ｈ，ｓ）、２．１９（２Ｈ，ｍ）、２．０４（２Ｈ，ｍ）。
【００９９】
ＨＭＣＶ−３の合成：
ＨＭＣＶ−３の前駆体４ｃの合成は、２つの合成経路によって達成される。Ａ：ＨＭＣＶ−１およびＨＭＣＶ−２の合成で使用した方法と類似の「ワンポット」法では、リンカーを含むアミノ基（４−（Ｎ−メチルアミノ）酪酸）が最初に導入され、続いてスルホン酸で置換された２つのアミノ官能基（Ｎ−メチルタウリン）が導入される（スキーム３）。方法Ｂでは、順序が逆になって２ステップで行われ、２ヵ所置換された生成物３ｃの単離を伴う（スキーム４）。
【０１００】
【化１１】
2007518844.tif 000009
【０１０１】
【化１２】
2007518844.tif 000010
【０１０２】
４ｃ（Ｎａ＋）（方法Ａ）：４−（メチルアミノ）酪酸塩酸塩（０．２７５ｇ、１．８ｍｍｏｌ）、１（１．０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）、およびジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）のＤＭＳＯ（２５ｍＬ）溶液を、室温で２０時間攪拌後、Ｎ−メチルタウリンナトリウム（２．０ｇ、１２ｍｍｏｌ）、ジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）およびＤＭＳＯ（２０ｍＬ）を加えた。次に反応混合物を約７０℃で２日間、室温で２日間攪拌した。反応混合物を、シリカを通してろ過し、続いてメタノールで十分に洗浄した。青色のろ液を濃縮し、酢酸エチルを加えると粗生成物が粘着性の青いワックスとなって沈殿した。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ  ５：２）で、青色の固体（最初の青色画分／帯）が得られ、これを熱エタノールに溶解させてから（熱）ろ過することによってさらに精製した。エタノール溶液を冷却後もう一度濾過し、沈殿をエタノールで洗浄した（白色の物質が残る）。青色のエタノール溶液を蒸発して４ｃを０．３ｇ（１８％）得た。
【０１０３】
ＭＳ（ＦＡＢ＋，グリセロール）：ｍ／ｚ  ８１２（ＭＨ２＋）、８３４（ＭＮａＨ＋）、８５６（ＭＮａ２＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，内部溶媒基準３．３５ｐｐｍ）：δ５．９８（６Ｈ，ｓ）、３．９５（４Ｈ，ｔ）、３．６２（２Ｈ，ｔ）、３．５７（６Ｈ，ｓ）、３．５６（１２Ｈ，ｓ）、３．２１（３Ｈ，ｓ）、３．２０（６Ｈ，ｓ）、３．１５（４Ｈ，ｔ）、２．４１（２Ｈ，ｔ）、１．９９（２Ｈ，ｍ）。
【０１０４】
４ｃ  方法Ｂによる：
３ｃ（Ｎａ＋）：Ｎ−メチルタウリンナトリウム（１．３ｇ、８ｍｍｏｌ）、および１（１．０ｇ、１．７ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２５ｍＬ）溶液を室温で３日間攪拌した。酢酸エチル（約５００ｍＬ）を加えると青色の沈殿（および赤色の母液）が得られた。固体物質を無水エタノール（約１５０ｍＬ）中で加熱還流し、室温で一晩放置した。沈殿をろ別し、メタノールに溶解させてシリカ（５ｃｍの層）を通してろ過し、シリカはメタノールで洗浄した。溶媒の蒸発およびメタノール／酢酸エチルからの再沈殿で青色粉末（１．１ｇ、８８％）を得た。
【０１０５】
ＭＳ（ＦＡＢ＋，グリセロール）：ｍ／ｚ  ７２７（ＭＨ２＋）、７４９（ＭＮａＨ＋）、７６５（ＭＮａＫ＋）、７７１（ＭＮａ２＋）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，内部溶媒基準３．３５ｐｐｍ）：δ６．２０（２Ｈ，ｓ）、５．９８（４Ｈ，ｓ）、４．００（４Ｈ，ｔ）、３．８７（３Ｈ，ｓ）、３．５８（１２Ｈ，ｓ）、３．５６（６Ｈ，ｓ）、３．２８（６Ｈ，ｓ）、３．１７（２Ｈ，ｔ）。
【０１０６】
４ｃ（Ｎａ＋）：３ｃ（０．５ｇ、０．６７ｍｍｏｌ）、４−（Ｎ−メチルアミノ）酪酸塩酸塩（０．５ｇ、３．２６ｍｍｏｌ）、および乾燥Ｎａ２ＣＯ３（０．５ｇ）のＤＭＳＯ（７ｍＬ）溶液を７０℃で３日間攪拌した。冷却した反応物から酢酸エチルの添加によって粗生成物沈殿させて、粘着性の青色の物質（約１．１ｇ）を得た。カラムクロマトグラフィー（シリカ、ＭｅＣＮ／ＭｅＯＨ  ５：２）は、溶媒の蒸発後に生成物４ｃ（０．２５ｇ、４４％）を青色固体として与えた。
【０１０７】
ＭＳ（ＦＡＢ＋，グリセロール）：ｍ／ｚ  ８１２（ＭＨ２＋）
【０１０８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，内部溶媒基準３．３５ｐｐｍ）：δ５．９８（６Ｈ，ｓ）、３．９５（４Ｈ，ｔ）、３．６２（２Ｈ，ｔ）、３．５７（６Ｈ，ｓ）、３．５６（１２Ｈ，ｓ）、３．２１（３Ｈ，ｓ）、３．２０（６Ｈ，ｓ）、３．１５（４Ｈ，ｔ）、２．４１（２Ｈ，ｔ）、１．９９（２Ｈ，ｍ）。
【０１０９】
【化１３】
2007518844.tif 000011
【０１１０】
ＨＭＣＶ−３（Ｎａ＋）：ＴＳＴＵ（２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、０．２０ｇ、０．６ｍｍｏｌ）を、４ｃ（０．２５ｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．０６ｇ）の乾燥ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を密閉フラスコ中で２時間攪拌し、次に酢酸エチルを加えることによって粗生成物を沈殿させた。粘着性の青色物質をフィルターからメタノールで洗い出して高真空で乾燥した。カラムクロマトグラフィー（シリカ、Ｈ２Ｏ／ＭｅＣＮ  １：１０）仕上げは、溶媒の蒸発（高真空、室温）およびメタノール／酢酸エチルからの再沈殿の後、濃青色の粉末（０．２５ｇ、９０％）を与えた。
【０１１１】
ＭＳ（ＦＡＢ＋，グリセロール）：ｍ／ｚ  ９０９（ＭＨ２＋）、９３１（ＭＮａＨ＋）、９４７（ＭＫＨ＋）、
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，内部溶媒基準３．３５ｐｐｍ）：δ５．９９（４Ｈ，ｓ）、５．９４（２Ｈ，ｓ）、３．９５（４Ｈ，ｔ）、３．６８（２Ｈ，ｔ）、３．５７（１２Ｈ，ｓ）、３．５８（２Ｈ，マスクで隠れている）、３．５５（６Ｈ，ｓ）、３．２１（９Ｈ，ｓ）、３．１６（４Ｈ，ｔ）、２．８８（４Ｈ，ｓ）、２．８０（２Ｈ，ｓ）、２．１３（２Ｈ，ｍ）。
【０１１２】
ＨＭＣＶ−１のアミノデキストランへの付加
アミノデキストラン（１３０ｍｇ、分子量１１０，０００、０．５ｍｍｏｌＮＨ２／ｇデキストラン）を、炭酸ナトリウム水溶液６．５ｍＬ（１５ｍＭ、ｐＨ＝８．５）に加えてデキストラン濃度１８２μＭ、２０ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。この溶液３．０ｍＬに、攪拌しながらＨＭＣＶ−１（５．６５ｍｇ、ＤＭＳＯ２００μＬ中）を１０μＬずつ１０分間かけて加えた。溶液を室温で１時間攪拌し、リン酸緩衝液（Ｈ２ＰＯ４−／ＨＰＯ４２−１０ｍＭ、Ｋ＋４ｍＭ、Ｎａ＋１４５ｍＭ、Ｃａ２＋０．１ｍＭ、Ｍｎ２＋０．１ｍＭ、ｐＨ＝７．４）に対して完全に透析した（３ｍＬ透析スライド、膜の排除分子量１２，０００〜１４，０００）。標識デキストランの濃度は透析中の希釈から決定した。標識率（ＤＯＬ値）は、得られた溶液の一連のＵＶ−可視スペクトルから決定した（３．２ｍＬ、デキストラン濃度１６８μＭ、ＤＯＬ＝１０）。
【０１１３】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）への付加
Ｃｏｎ  Ａ（Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ、Ｓｉｇｍａ）溶液は以下のように作成した。メチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（０．９７ｇ）、ＣａＣｌ２水溶液（０．１Ｍ）３０μＬ、およびＭｎＣｌ２水溶液（０．１Ｍ）３０μＬを、０．５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ＝８．５）２０ｍＬ中で混合した。次にＣｏｎＡ（１．００ｇ〜１５０ｍｇタンパク質）を加え、懸濁液を１時間激しく攪拌した。溶液を遠心分離し、上澄み液を採った。この溶液１３．０ｍＬに、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）（１０．０ｍｇ、乾燥ＤＭＳＯ８００ｍＬ中）を２０μＬずつ１０分間かけて加えた。得られた青色の溶液を１時間攪拌し、次に無水コハク酸（１８．２ｍｇ、乾燥ＤＭＳＯ８６７μＬ中）を２０μＬずつ１０分間かけて加えた。溶液をさらに１．５時間攪拌し、その後１５ｍＬの透析スライドに移し、ＨＭＶＣ−１−デキストラン合成に関して記載したものと同じ緩衝液に対して透析した。緩衝液には成長を防ぐために２ｍＭのＮａＮ３を加えた。（１５．４ｍＬ、タンパク質ダイマー濃度５９μＭ、ＤＯＬ＝４．０）
【０１１４】
色素化合物４で標識された検体結合性試薬のＦＲＥＴアッセイにおける使用
好ましい実施形態のグルコース測定アッセイ化学は、先に論じたようにコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）に向かってのデキストランとグルコースの間の競争に基づいている。
【０１１５】
Ｃｏｎ  Ａは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）（ＡＦ５９４）（ドナー）で標識されており、デキストランは、ＡＦ５９４の放射帯の中で吸収する無蛍光色素ＨＭＣＶ−１（アクセプター）で標識されている。
【０１１６】
蛍光の寿命は周波数領域蛍光分析で測定される。励起光の強度が変調して、励起ドナーが同じ周波数で変調され、励起状態の寿命によって遅延された光を発する。この結果、励起光と放射される蛍光の間で位相のシフトが生じる。
【０１１７】
本発明者らは、ＡＦ５９４で標識された（ＣｏｎＡ）を糖結合性のレクチンとして選択し、ＨＭＣＶ−１で標識されたデキストランをグルコース類似体として選択した。使用したドナーおよびアクセプター色素、［ＡＦ５９４］および［ＨＭＣＶ−１］、の大部分の濃度は、すべての実験を通じて一定であり、両者の比は１：６であった。これはＦｏｒｓｔｅｒ理論の、ドナー濃度はアクセプター濃度より大幅に少ないという条件と一貫している。
【０１１８】
［参照文献：Ｏ．Ｊ．Ｒｏｌｉｎｓｋｉ、Ｄ．Ｊ．Ｓ．Ｂｉｒｃｈ、Ｌ．Ｊ．ＭｃＣａｒｔｎｅｙ、Ｊ．Ｃ．Ｐｉｃｋｕｐ、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．Ｂ：Ｂｉｏｌ．５４、２６−３４、２０００］Ｆｏｅｓｔｅｒ理論は、ＣｏｎＡがドナーで標識され、高分子糖デキストランがアクセプターで標識される場合に、最もよく満たされるということは本発明者らが発見したことである。
【０１１９】
測定
ドナーコンジュゲート、アクセプターコンジュゲートおよびＰＢＳ緩衝液（５０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ＝７．４、イオン強度はＮａＣｌで１５０ｍＭに調節）を混合して、ＣｏｎＡのアッセイ化学組成物中の最終濃度が２０μＭ、デキストラン濃度が５０μＭとなるようにした。（［ＣｏｎＡ］／［Ｄｅｘ］）モル比は０．４０であり、（［ＡＦ５９４］／［ＨＭＣＶ−１］）濃度比は０．１６であった。２本のセルロースホローファイバー（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．製、再生セルロース、ファイバー外径２１６μｍ、ファイバー内径２００μｍ、排除分子量１３ｋＤａ、再注文番号１３２２９４）にアッセイ化学組成物を充填し、ＰＢＳ緩衝液が入っている蛍光セル中に置かれた特製ホルダー内に取り付けた。
【０１２０】
励起位相シフトは位相変調蛍光計（ＩＳＳ，Ｉｎｃ．、Ｃｈａｍｐａｉｇｎ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｋｏａｌａ製）を使用して測定した。光源は黄色ＬＥＤであった。５４０〜５９０ｎｍの光を透過させるＸＦ１０６７バンドパスフィルター（Ｇｌｅｎｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｌｔｄ．製）を励起チャンネルおよび参照チャンネルに設置した。放射チャンネルには、６１０〜６９０ｎｍの光を透過させるＸＦ３０６１バンドパスフィルター（Ｇｌｅｎｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｌｔｄ．製）を取り付けた。
【０１２１】
グルコースの用量反応は、ＰＢＳ緩衝液を次々とグルコース含有量を０ｍＭから５０ｍＭまで増したＰＢＳ緩衝液で置き換えることによって測定した。
【０１２２】
結果を表１および図１に示す。
【０１２３】
【表１】
2007518844.tif 000012
【０１２４】
前記のアッセイシステムを固定ブタのインビボ実験で試験した。アッセイ試薬をホローファイバーに装填したものを針で皮膚の皮下組織内に置いた。位相測定から得られた結果は、インビトロ実験と比較してわずかな位相シフトを示したが、全血グルコースに関する参照値と非常によく関連付けることができた。
【０１２５】
本発明の好ましい実施形態のアクセプターは、既知のアクセプターを超えるいくつかの利点を有する。
【０１２６】
第１に、ＨＭＣＶアクセプターは、広く強い吸収スペクトル（５５０〜７００ｎｍ）を有する。このことは、これらがさまざまなドナーと共に使用することができることを意味する（図２参照）。
【０１２７】
第２に、これらのアクセプターは、長波長で吸収する。このことは、これらがインビボにおいて自動蛍光が測定を妨害しない波長で使用するのに適していることを意味する。
【０１２８】
第３に、これらの色素の中心炭素原子は、芳香環部分のオルト置換基によって遮蔽されており、この位置での還元的、酸化的、または求核的な攻撃のいずれかで開始される分解過程も防止する。
【０１２９】
第４に、これらのアクセプターの吸収スペクトルは、検体または検体結合性試薬への結合によって顕著には影響されない。このことは、これらのアクセプターの性能は予測可能であることを意味する。
【０１３０】
第５に、これらのアクセプターは、蛍光を出さず、バックグラウンドの蛍光シグナルに寄与しない。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】グルコース投与−応答曲線を示す図である。
【図２】吸収−放出スペクトルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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