(57)【要約】【課題】本発明は、癌、特に転移癌の治療、管理、又は予防のために設計された方法及び組成物に関する。【解決手段】一実施態様では、本発明の方法は、EphA4に結合してEphA4に対してアゴニストとして作用する１つ又は複数の抗体を有効な量投与することを含む。別の実施態様では、本発明の方法は、EphA4に結合して、軟寒天中での癌細胞コロニー又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を抑制する１つ又は複数の抗体を有効な量投与することを含む。別の実施態様では、本発明の方法は、非癌細胞ではなく、癌細胞で露出しているEphA4エピトープに選択的に結合する１つ又は複数の抗体を有効な量投与することを含む。別の実施態様では、本発明の方法は、EphA4に極めて低いKoffで結合する１つ又は複数の抗体を有効な量投与して、EphA4発現を低減し、それによって腫瘍の細胞成長及び／又は転移を抑制することを含む。本発明は、本発明の１つ又は複数のEphA4抗体を、単独で、あるいは癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤と組み合わせて含む医薬組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、治療有効量の、EphA4アゴニスト抗体であるEphA4抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体を、前記患者に投与することを含む方法。
【請求項２】
未処置の癌細胞におけるEphA4リン酸化レベルと比較して、癌細胞におけるEphA4リン酸化が、前記投与によって増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
未処置の癌細胞における75 kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化レベルと比較して、癌細胞における75kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化が、前記投与によって増強される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
未処置の癌細胞におけるEphA4発現レベルと比較して、癌細胞におけるEphA4発現が、前記投与によって低減される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
軟寒天中でのコロニー形成、あるいは三次元基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を、前記EphA4抗体が抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
既に存在する、軟寒天中でのコロニー形成、あるいは基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を、前記EphA4抗体が低減する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記低減がアポトーシス又は壊死によって生じる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞間接触をしていない細胞で発現された場合に、前記EphA4抗体がEphA4に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
リガンドと安定して相互作用することができないEphA4に、前記EphA4抗体が結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
自らのリガンドに結合しないEphA4に、前記EphA4抗体が結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌が上皮細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が内皮細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌細胞の組織型を有する非癌細胞と比較して、EphA4を過剰発現する細胞を前記癌が含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記癌が、皮膚、肺、結腸、乳房、前立腺、膀胱、又は膵臓の癌であるか、あるいは腎細胞癌又はメラノーマである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌が転移癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記EphA4抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記EphA4抗体がヒト化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記EphA4抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４及び８にそれぞれ含まれるEA44可変重鎖アミノ酸配列又は軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記重鎖及び／又は軽鎖の配列における少なくとも３つのCDRが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記EphA4 CDRのうち少なくとも４つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記EphA4 CDRのうち少なくとも５つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
６つの前記EphA4 CDRすべてが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
EphA4抗体でない抗癌治療の投与を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記追加の癌治療がEphA2抗体の投与を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記追加の癌治療が、化学療法、生物学的療法、免疫療法、放射線療法、ホルモン療法、及び手術からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
治療有効量の、アゴニスト抗体であるEphA4抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項２８】
前記EphA4抗体がモノクローナル抗体である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記EphA4抗体がヒト化されている、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記EphA4抗体がヒトである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４及び８にそれぞれ含まれるEA44可変重鎖アミノ酸配列又は軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
少なくとも３つの前記可変重鎖配列及び／又は可変軽鎖配列が、EA44における対応するCDRと同一である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記EphA4抗体CDRのうち少なくとも４つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記EphA4抗体CDRのうち少なくとも５つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
６つの前記EphA4抗体CDRすべてが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
EphA4抗体でない抗癌剤を含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記抗癌剤がEphA2抗体である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記EphA2抗体がモノクローナルである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
前記抗癌剤が化学療法薬、放射線療法薬、ホルモン療法薬、生物学的療法薬、又は免疫療法薬である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
EphA4に特異的に結合する抗体であって、その結合によってEphA4の少なくとも１つの活性に対してアゴニストとして作用する抗体。
【請求項４１】
前記EphA4の活性が、EphA4のリン酸化である、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４２】
前記EphA4の活性が、75kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化である、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
EphA4に特異的に結合する抗体であって、その結合が癌細胞表現型を抑制する抗体。
【請求項４４】
前記結合が、癌細胞の、軟寒天中でのコロニー形成、あるいは、三次元基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を抑制する、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４５】
前記結合が、癌細胞の、軟寒天中でのコロニー形成、あるいは、三次元の基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を低減する、請求項４３に記載の抗体。
【請求項４６】
前記低減が癌細胞の壊死又はアポトーシスによって引き起こされる、請求項４５に記載の抗体。
【請求項４７】
EphA4に特異的に結合する抗体であって、その結合が、EphA4が細胞間接触部になく、かつEphrinA4リガンドに結合していない場合にのみ起こる抗体。
【請求項４８】
モノクローナル抗体である、請求項４０から４２、又は請求項４７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項４９】
前記抗体がヒト化されている、請求項４０から４２、又は請求項４７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５０】
前記抗体がヒトである、請求項４０から４２、又は請求項４７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５１】
前記抗体が誘導体である、請求項４０から４２、又は請求項４７のいずれか一項記載の抗体。
【請求項５２】
誘導体でない抗体との比較において、延長されている生体内半減期を有する、請求項５１に記載の抗体。
【請求項５３】
請求項４０から４２、又は請求項４７のいずれか一項記載の抗体を産生する細胞系。
【請求項５４】
癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体を同定する方法であって：
ａ．軟寒天、又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中で培養された、EphA4を発現する細胞を、抗体エピトープ結合に適した条件下でEphA4に特異的に結合する抗体と接触させること；及び
ｂ．前記細胞が軟寒天中でコロニーを形成する能力、又は前記三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中で管状ネットワークを形成する能力を測定することを含み、
前記抗体が接触しなかった、EphA4を発現する細胞との比較において、前記細胞の、コロニー又は管状ネットワークを形成する能力の低減が検出されることによって、前記抗体が癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体であることを示す、前記方法。
【請求項５５】
癌細胞表現型を有する癌細胞を殺すEphA4抗体を同定する方法であって：
ａ．軟寒天中でコロニーを形成しているか、あるいは三次元の基底膜又は細胞外マトリックス調製物中で管状ネットワークを形成している、EphA4を発現する癌細胞を、抗体エピトープ結合に適した条件下でEphA4に特異的に結合する抗体と接触させること；及び
ｂ．前記コロニー又は管状ネットワークの低減を測定することを含み、
前記抗体が接触しなかった、EphA4を発現する細胞のコロニー又は管状ネットワークとの比較において、前記コロニー又は管状ネットワークの低減が検出されることによって、前記抗体が癌細胞表現型を有する癌細胞を殺すEphA4抗体であることを示す、前記方法。
【請求項５６】
癌細胞表面に露出しているEphA4エピトープに選択的に結合するEphA4抗体を同定する方法であって：
ａ．第１グループの細胞が非癌細胞であり、第２グループの細胞が癌細胞である２つのグループの、EphA4を発現する細胞に対して接触させること；及び
ｂ．前記抗体がEphA4に結合する能力を測定することを含み、
前記第２グループの細胞では抗体結合が検出されるが、前記第１グループの細胞では検出されないことによって、前記抗体が、癌細胞表面に露出しているEphA4エピトープに選択的に結合するEphA4抗体であることを示す、前記方法。
【請求項５７】
前記測定が免疫蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーを使用する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
癌治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、治療有効量のEphA4アンチセンス核酸分子を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項５９】
癌治療を必要とする患者における、第１の治療に対する完全又は部分的な治療抵抗性を有する癌を治療する方法であって、治療有効量の、EphA4アゴニスト抗体であるEphA4抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体を投与することを含む第２の治療を前記患者に施すことを含む方法。
【請求項６０】
前記第１の治療が、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、又は放射線療法である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ホルモン療法がタモキシフェン投与を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記第２の治療が化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、又は放射線療法の投与を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記第１の治療が前記第２の治療と同時に実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
癌治療を必要とする患者における、非癌性の過増殖細胞疾患又は障害を治療する方法であって、治療有効量の、EphA4アゴニスト抗体であるEphA4抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体を前記患者に投与することを含む、前記方法。
【請求項６５】
前記EphA4抗体が、癌細胞表面に露出しているEphA4エピトープに選択的に結合し、非癌細胞には結合しない、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
未処置の過増殖非癌細胞におけるEphA4リン酸化レベルとの比較において、過増殖非癌細胞におけるEphA4リン酸化が前記投与によって増強される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
未処置の過増殖非癌細胞におけるEphA4発現レベルと比較して、過増殖非癌細胞におけるEphA4発現が、前記投与によって低減される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
前記過増殖非癌細胞が上皮細胞である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
同じ組織型を有する非過増殖非癌細胞と比較して、EphA4を過剰発現する過増殖非癌細胞を前記患者が有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記非癌性の過増殖細胞疾患又は障害が、喘息、乾せん、炎症性腸疾患、平滑筋再狭窄、内皮再狭窄、クローン病、又は慢性閉塞性肺疾患である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７１】
前記EphA4抗体がモノクローナル抗体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７２】
前記EphA4抗体がヒト化されている、請求項６４に記載の方法。
【請求項７３】
前記EphA4抗体がヒト抗体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７４】
可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４及び８にそれぞれ含まれるEA44可変重鎖アミノ酸配列又は軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項７５】
前記可変重鎖及び前記可変軽鎖における少なくとも３つのCDRが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７６】
前記EphA4抗体CDRのうち少なくとも４つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７７】
前記EphA4抗体CDRのうち少なくとも５つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７８】
６つの前記EphA4抗体CDRすべてが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項６４に記載の方法。
【請求項７９】
癌を有することが既知であるか、又は疑われる患者における癌治療の有効性を診断、予後診断、又はモニターする方法であって：
ａ．抗体EphA4結合に適した条件下で前記患者の細胞を、EphA4アゴニスト抗体であるEphA4抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、露出したEphA4エピトープの抗体と接触させること；及び
ｂ．前記細胞に対するEphA4抗体の結合を測定することを含み、
対照より高いレベルのEphA4抗体結合を検出することによって、患者が癌を有することを示す、前記方法。
【請求項８０】
前記細胞が腫瘍細胞組織の全血、痰、尿、血清、又は微細針吸引液に由来する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞が、前記患者から得られた冷凍又は固定された組織又は細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
前記検出が、前記患者体内における前記EphA4抗体結合の映像化を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
前記患者が転移癌を有する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
前記EphA4抗体が、露出したEphA4エピトープの抗体である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
EphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体であるEphA4抗体又は抗体断片であって、可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列が、配列番号４及び８にそれぞれ含まれるEA44可変重鎖アミノ酸配列又は軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％のアミノ酸配列同一性を有する、前記EphA4抗体又は抗体断片。
【請求項８６】
前記可変軽鎖及び可変重鎖における少なくとも３つのCDRが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項８５に記載のEphA4抗体。
【請求項８７】
そのCDRのうち少なくとも４つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項８５に記載のEphA4抗体。
【請求項８８】
そのCDRのうち少なくとも５つが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項８５に記載のEphA4抗体。
【請求項８９】
それの、６つのCDRすべてが、EA44における対応するCDRと同一である、請求項８５に記載のEphA4抗体。
【請求項９０】
請求項８５から８９のいずれか一項に記載の抗体を産生する細胞系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、それぞれが引用により全体として本明細書に組み込まれている2003年6月6日出願の米国特許仮出願第60/476909号、及び2003年9月16日出願の米国特許仮出願第60/503356号の優先権を主張する。
(１．発明の分野)
本発明は、過増殖細胞疾患(特に癌)の治療、管理、又は予防のために設計された方法及び組成物に関する。本発明の方法は、EphA4に特異的な１つ又は複数の抗体、好ましくはモノクローナル抗体を有効量、投与することを含み、該抗体はEphA4アゴニストであり、癌細胞表現型(軟寒天中でのコロニー形成、又は、MATRIGEL(商標)などの三次元基底膜もしくは細胞外膜調製物中での管状ネットワーク形成)を抑制し、非癌細胞ではなく癌細胞で選択的に露出されているかもしくは増加しているEphA4エピトープに選択的に結合し、かつ／又は、3×10-3s-1未満のKoffでEphA4に結合する。本発明は、本発明の１つ又は複数のモノクローナル抗体を、単独で、あるいは癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤と併せて含む医薬組成物も提供する。診断方法と、治療上有用な、EphA4に特異的な抗体をスクリーニングする方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
(２．発明の背景)
(癌)
新生物すなわち腫瘍は、制御されていない異常な細胞増殖から生じる新生物の塊体であって、これは良性であることも、悪性であることもある。良性腫瘍は、通常、局在化した状態を維持する。悪性腫瘍は、集合的に癌と呼ばれる。「悪性」という用語は、通常、その腫瘍が、隣接した身体構造に侵入し、これらを破壊し、遠隔の部位にまで広がり、死を引き起こしうることを意味する(総説として、Robbins及びAngellの論文(1976、Basic Pathology、2d Ed.、W. B. Saunders Co.、Philadelphia、pp. 68-122)を参照)。癌は身体の多くの部位で発生しうるものであり、出所に応じて挙動が異なる。癌細胞は、それらが発生した身体部分を破壊し、次に、身体の他の部分に広がって、そこでそれらは新たな増殖を開始し、さらなる破壊を引き起こす。
【０００３】
毎年、120万人以上のアメリカ人が癌になる。癌は、米国における第２の主要死亡症例であり、さらに、現在の動向が続く場合には、2010年までに癌が第１の死亡原因になると予測されている。米国の男性にとっては、肺癌及び前立腺癌が最も死亡率の高い癌である。米国の女性にとっては、肺癌及び乳癌が最も死亡率の高い癌である。米国の男性のうち２人に１人が、その人の一生の間のある時点で癌と診断されるであろう。米国の女性のうち３人に１人が、その人の一生の間のある時点で癌と診断されるであろう。
癌を治癒させる療法は未だ見出されていない。手術、化学療法、及び放射線療法などの、現在における治療選択肢は、有効性に乏しいか、重大な副作用を伴うことが多い。
【０００４】
(転移)
生命に最も危険な癌の形態は、腫瘍細胞の集合が身体における遠方かつ異質の部位にコロニー形成する能力を獲得したときに生じることが多い。これらの転移性細胞は、異なった組織での細胞コロニー形成を通常、抑制する制限を乗り越えることによって生き残る。例えば、典型的な乳腺上皮細胞は、肺に移植しても一般的には成長もしないし、生き残ることもないであろう。それにもかかわらず、肺転移は乳癌で罹患状態及び死亡を引き起こす主要原因となっている。最近の証拠は、一次腫瘍の臨床症状が現れるかなり以前に、転移性細胞が身体全体に広がりうることを示唆している。これらの微小転移性細胞は、一次腫瘍の検出及び除去の後、何ヶ月も、あるいは何年間も休止状態にある場合もある。したがって、転移性細胞が異質な微環境中で成長及び生存するのを可能にする機構をさらによく理解することは、転移癌と戦うために設計された治療法と、転移を早期発見及び位置特定するための診断法とを改良するのに極めて重要である。
【０００５】
(癌細胞シグナル伝達)
癌は、シグナル伝達の異常による疾患である。異常な細胞シグナル伝達は、細胞が成長及び生存する際の足場依存性の制限を無効にする(Rhimらの論文(Critical Reviews in Oncogenesis 8: 305、1997)；Patarcaの論文(Critical Reviews in Oncogenesis 7: 343、1996)；Malikらの論文(Biochimica et Biophysica Acta 1287: 73、1996)；Canceらの論文(Breast Cancer Res Treat 35: 105、1995))。ECMへの固着によってチロシンキナーゼ活性が誘導され、実際に、悪性細胞の中では、通常、チロシンキナーゼの機能又は発現が増強されている(Rhimらの論文(Critical Reviews in Oncogenesis 8: 305,1997)；Canceらの論文(Breast Cancer Res Treat 35: 105、1995)；Hunterの論文(Cell 88: 333、1997))。悪性細胞の成長にチロシンキナーゼ活性が必要であるという証拠に基づいて、チロシンキナーゼを標的として新規の治療学が用いられている(Levitzkiらの論文(Science 267: 1782、1995)；Kondapakaらの論文(Molecular & Cellular Endocrinology 117: 53、1998)；Fryらの論文(Current Opinion in BioTechnology 6: 662、1995))。残念ながら、腫瘍細胞を特異的に標的とすることに関連した障害によって、これらの薬物の適用が制限されることが多い。詳細には、良性組織の機能及び生存に、チロシンキナーゼ活性が必須であることがしばしばある(Levitzkiらの論文(Science 267: 1782、1995))。付帯的な毒性を最小にするには、腫瘍細胞で選択的に過剰発現されているチロシンキナーゼを同定して、その後、それを標的にすることが極めて重要である。
【０００６】
(EphA4)
EphA4は脳、心臓、肺、筋肉、腎臓、胎盤、膵臓(Foxらの論文(Oncogene 10: 897、1995))、及びメラニン細胞(Eastyらの論文(Int. J. Cancer 71: 1061、1997))で発現される受容体チロシンキナーゼである。EphA4は、細胞膜に固着しているリガンド(エフリンA1、A2、A3、A4、A5、B2、及びB3；Pasqualeの論文(Curr. Opin. in Cell Biology 9: 608、1997)に結合し、リガンドB61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L、及びElk-L3；Martoneらの論文(Brain Research 771: 238、1997)にも結合し、そして、リガンド結合はチロシン残基におけるEphA4自己リン酸化を導く(Ellisらの論文(Oncogene 12: 1727、1996))。EphA4におけるチロシンリン酸化は、細胞質チロシンキナーゼp59fynなど、Src相同2/3(SH2/SH3)ドメインを有するタンパク質に対する結合領域を生成する(Ellisらの論文(同上)；Chengらの論文(Cytokine and Growth Factor Reviews 13: 75、2002))。Xenopus胚でEphA4が活性化されると、カドヘリン依存的な細胞接着の減失が導かれ(Winningらの論文(Differentiation 70: 46、2002)；Chengらの論文(同上))、これによって、腫瘍血管形成におけるEphA4の役割が示唆されるが、癌の進行におけるEphA4の役割は明らかでない。EphA4は、乳癌、食道癌、及び膵癌では、調節されていないことが明らかになった(Kuangらの論文(Nucleic Acids Res. 26: 1116、1998)；Mericらの論文(Clinical Cancer Res. 8: 361、2002)；Nemotoらの論文(Pathobiology 65: 195、1997)；Logsdonらの論文(Cancer Res. 63: 2649、2003))が、それにもかかわらずメラノーマ組織では下方制御されている(Eastyらの論文(同上))。
【０００７】
(癌治療)
抗転移薬の開発に対する障壁の１つは、これらの薬物を設計して、評価するのに使用されるアッセイシステムにあった。従来のほとんどの癌治療は、急速に成長する細胞を標的とする。しかし、癌細胞は必ずしもより急速に増殖するわけではなく、その代わりに、正常細胞には非許容な条件下で生存し、増殖する(Lawrence及びSteegの論文(1996、World J. Urol. 14: 124-130))。正常細胞の挙動と、悪性細胞の挙動との間にある、これらの根本的な相違が、治療ターゲティングの機会を提供する。微小転移性腫瘍が既に身体中に広がっているというパラダイムは、異質かつ三次元の微環境という状況で、潜在的化学療法薬の評価を行う必要性を強調する。多くの標準的な制癌剤アッセイは、通常の細胞培養条件下(すなわち単層増殖)で、腫瘍細胞の成長又は生存を測定する。しかし、二次元アッセイにおける細胞挙動は、in vivoでの腫瘍細胞の挙動を信頼性をもって予測するものではないことが多い。
【０００８】
現在、癌治療では、患者の新生細胞を根絶する手術、化学療法、ホルモン療法、及び／又は放射線療法が関与しうる(例えば、Stockdaleの論文「癌患者管理の原則」(1998、Scientific American: Medicine、vol. 3、Rubenstein及びFederman編、Chapter 12、Section IV)を参照)。最近では、癌治療に、生物学的療法又は免疫療法も関与しうる。これらのアプローチはすべて、患者にとって重大な不利益をもたらすことのあるものである。例えば手術は、患者の健康状態によって禁忌であることもあれば、患者にとって容認できないものであることもある。さらに、手術では、腫瘍組織が完全に除去されないこともある。放射線療法は、放射線照射に対して、腫瘍組織が正常組織より高い感受性を示す場合にのみ有効であり、さらに、放射線療法はしばしば重大な副作用を引き出すことがある。ホルモン療法は、単独の薬剤として与えられることがめったになく、効果的であることもあるが、多くは、他の治療によって癌細胞の大部分が除去された後に、癌の再発を予防又は遅延させるために使用される。生物学的療法／免疫療法は、その数が限定されており、それぞれの治療は、通常、極めて特定のタイプの癌にのみ効果的である。
【０００９】
化学療法に関しては、癌治療に利用可能な様々な化学療法薬がある。癌化学療法薬の大部分は、DNA合成を、直接的にあるいはデオキシリボヌクレオチド３リン酸前駆体の生合成を阻害することによって間接的に阻害して、DNA複製と、付随する細胞分裂とを阻止することによって作用する(例えば、Gilmanらの論文「Goodman及びGilmanの治療法の薬学的基礎」(Eighth Ed.、Pergamom Press、New York、1990))。これらの薬剤には、ニトロソ尿素などのアルキル化剤、メトトレキセート及びヒドロキシ尿素などの抗代謝産物、ならびにエトポシド、キャンパセシン(campathecins)、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシンなどの他の薬剤が含まれ、これらは必ずしも細胞周期特異的ではないが、DNA複製に対して作用を有するため、Ｓ期にある細胞を殺す。他の薬剤、詳細にはコルヒチン、ならびにビンブラスチン及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイドは、微小管集合を妨害し、有糸分裂停止を引き起こす。化学療法プロトコールでは、通常、治療の有効性を増大させるために、化学療法薬の組合せを投与する。
【００１０】
様々な化学療法薬が利用可能であるのにもかかわらず、化学療法には多くの欠点がある(例えば、Stockdaleの論文「癌患者管理の原則」(1998、Scientific American: Medicine、vol. 3、Rubenstein及びFederman編、ch. 12、sect. 10)を参照)。ほとんどすべての化学療法薬は毒性を有し、化学療法は重大で、かつしばしば危険な副作用を引き起こし、これには、重度の悪心、骨髄抑制、免疫抑制などが含まれる。加えて、化学療法薬を併用投与しても、多くの腫瘍細胞が化学療法薬に対して耐性を有するか、あるいは耐性を発達させる。実際、治療プロトコールで使用される特定の化学療法薬に対して耐性を有するそれらの細胞は、他の薬剤に対して、特定の治療で使用された薬物の作用機構とは異なった機構で作用する薬剤に対してさえも耐性を有すると判明することが多く、この現象は多面的薬剤耐性又は多剤耐性と呼ばれる。したがって、多くの癌が薬剤耐性のために、標準的な化学療法薬治療プロトコールに対して抵抗性であることが分かる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
代替の癌治療、特に、手術、放射線療法、化学療法、及びホルモン療法などの標準的な癌治療に対して抵抗性であることが判明している癌の治療に対する重大な必要性がある。さらに、癌は、１つの方法のみで治療されることがまれである。したがって、癌を治療するための新規の治療薬と、癌を治療するための新規かつより効果的な、治療の組合せとを開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
(３．発明の概要)
EphA4は多くの癌で過剰発現されている。発明者らは、EphA4に対するEphA4抗体の結合によって、細胞の増殖及び／又は転移挙動が低減されうること、そして、EphA4、及び約75キロダルトン(kDa)のEphA4関連タンパク質のリン酸化が引き起こされうることを見出した。本発明者らは、腫瘍形成及び転移において、EphA4がEphA2と同様の役割を果たしていると考える。2003年5月12日に、弁護士側整理番号第10271-097-999として出願された、「EphA2モノクローナル抗体及びその使用方法」という題の、同時係属中の米国特許出願第10/436782号に記載の通り、EphA2に対してアゴニストとして作用する抗体、すなわちEphA2シグナル伝達を引き起こす抗体は、実際にEphA2発現を低減し、腫瘍の細胞増殖及び／又は転移を抑制する。発明者らは、EphA4の抗体結合が、細胞-ECM接着を減弱し、細胞の球形化を誘導するのに十分であることを発見した。細胞-ECM接着は、物理的な接着と、細胞増殖、移動、侵襲、及び分化に関する決定を含めた、細胞挙動における多くの側面を支配する細胞内シグナル伝達とを提供すると一般的に理解されている。したがって、EphA4に対するEphA4抗体の結合は、EphA4のリン酸化の増大及び細胞-ECM接着の減弱と相関している。いかなる作用機序に拘泥するものでもないが、EphA4に対してアゴニストとして作用する抗体又は他の分子は、EphA4の自己リン酸化を誘導し、それによって、それに続くEphA4の分解又は発現の下方制御を引き起こすことによって過増殖又は悪性細胞挙動を抑圧するのかもしれない。したがって、一実施態様では、本発明のEphA4抗体は、EphA4シグナル伝達に対してアゴニストとして作用し、EphA4及びEphA4関連75kDaタンパク質のリン酸化を増強する(「EphA4アゴニスト抗体」)。
【００１３】
加えて、癌細胞は、非癌細胞とは異なる表現型形質、例えば、軟寒天などの三次元基質におけるコロニーの形成、あるいは、三次元の基底膜、又はMATRIGEL(商標)などの細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク又は網状マトリックスの形成を示す。非癌細胞は、軟寒天中でコロニーを形成せず、三次元の基底膜又は細胞外マトリックス調製物中で明らかな球状構造を形成する。本発明者らは、EphA4を発現する癌細胞の、軟寒天中での成長が、抗EphA4抗体によって低減されうることも見出した。したがって、本発明は、EphA4に特異的に結合し、かつ、軟寒天中でのコロニー形成、あるいは、三次元基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成などの癌細胞表現型のうち１つ又は複数を阻害する抗体も提供する(「癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体」)。そのような癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体に癌細胞を曝露すると、細胞がこれらの基質中でコロニー形成又は管状ネットワーク形成する能力が阻止又は低減される。さらに、ある実施態様では、そのような癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体を、既に確立している癌細胞のコロニーに添加することによって、既存の癌細胞コロニーの減少又は消滅が引き起こされ、換言すれば、例えば壊死又はアポトーシスを通して、過増殖及び／又は転移性の細胞の殺害が導かれる。
【００１４】
癌細胞に存在するEphA4は、細胞内局在性、リガンド結合特性、又はタンパク質構成(例えば、構造、細胞膜中での配向性)における相違によって、非癌細胞のEphA4からさらに識別できる。非癌細胞では、EphA4の発現が低レベルである。しかし、通常、癌細胞は細胞間接触の減少を示し、これによってEphA4-リガンド結合が減弱されうる。さらに、EphA4の過剰発現によって、リガンドとの比較におけるEphA4の過剰が引き起こされ、それによって、リガンドに結合していないEphA4の量が増大することがある。その結果、EphA4の細胞内分布又は膜配向の変化によって、癌細胞における、リガンドが接近できない部位へのEphA4の局在化が引き起こされうる。さらに、癌細胞では、EphA4はリガンド結合特性が改変されることがあり(例えばコンフォメーション変化によって)、それによって、細胞間結合に局在するか否かに関係なく、リガンドとの安定した相互作用ができなくなっているかもしれない。それぞれの場合で、これらの変化によって、非癌細胞では露出していない、EphA4上のある特定のエピトープが癌細胞で露出されることがある。したがって、本発明は、EphA4に特異的に結合するが、好ましくは癌細胞では露出しているが非癌細胞では露出していないEphA4エピトープに結合する抗体を提供する(「露出したEphA4エピトープの抗体」)。癌細胞では選択的に露出又は増大しているが、非癌細胞ではしていないEphA4エピトープに選択的に結合するそのようなEphA4抗体に癌細胞を曝露することによって、癌細胞を治療用又は予防用抗体の標的とし、非癌細胞を除外しながら、それらの癌細胞の増殖能を阻止又は減弱させる。
【００１５】
EphA4に非常に低いKoff率で結合する抗体は、EphA4発現を減少させ、かつ／又はEphA4分解を誘導し、さらにそれによって、腫瘍細胞の増殖及び／又は転移、ならびに／あるいは過増殖細胞の増殖を阻害するのにとりわけ有用でありうる。したがって、本発明は、3×10-3s-1未満のKoffでEphA4に結合し、かつ好ましくはEphA4アゴニストである抗体を提供する。
【００１６】
本発明は、EphA4に結合しかつEphA4に対してアゴニストとして作用する抗体、癌細胞表現型を阻害し非癌細胞ではなく癌細胞で選択的に露出又は増大しているEphA4のエピトープに選択的に結合する抗体、及び／又は3×10-3s-1未満のKoffを有する抗体、好ましくはモノクローナル抗体のスクリーニング及び同定を提供する。詳細には、本発明の抗体は、EphA4の細胞外ドメインに結合して、好ましくはEphA4シグナル伝達及びEphA4自己リン酸化を引き起こし、癌細胞表現型を抑制して、非癌細胞ではなく癌細胞で露出したEphA4エピトープに選択的に結合し、かつ／あるいは3×10-3s-1未満のKoffを有する。本発明の抗体はさらに、EphA4抗体によるEphA4の架橋に続いてチロシン残基がリン酸化される75kDaタンパク質など、EphA4関連タンパク質のEphA4シグナル伝達及びリン酸化を変調するのに用いることもできる。この75kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化を変調する抗体は、治療薬としての価値を有することができる。特定の実施態様では、本発明は、EphA4scFv抗体であるEphA4-44/EA44を提供する(本明細書では、EA44及びEphA4-44は同一の抗体、すなわち、EphA4に結合し、かつ2004年6月10日にATCCに「EA44」として寄託されているEphA4-44 scFvクローンを指す)。好ましい実施態様では、本発明は、可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４及び８に含まれるEA44可変重鎖アミノ酸配列又は軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するか、あるいは同一であるEphA4抗体を提供する。他の好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は６つすべてのCDRが、EA44における対応するCDRと同一であるEphA4抗体を提供する。他の特定の実施態様では、本発明は、抗EphA4 scFvクローン８、１８、２０、３６、及び４１を提供する。
【００１７】
詳細には、本発明は、EA44 VH CDR1(配列番号２２)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)及びVH CDR3(配列番号２６)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)及びVH CDR1(配列番号２２)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH1 CDR1、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR1(配列番号２８)、EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)、あるいは、図７に記載のEA44 VH CDR及びVL CDRの任意の組合せを含む(もしくは、からなる)抗体を提供する。
【００１８】
別の実施態様では、EphA4アゴニスト抗体は、配列番号２１、２３、又は２５のヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされたVH CDRを含む。別の実施態様では、EphA4アゴニスト抗体は、配列番号２７、２９、又は３０のヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされたVL CDRを含む。別の実施態様では、EphA4アゴニスト抗体は、それぞれ配列番号２１、２３、又は２５、及び配列番号２７、２９、又は３０のヌクレオチド配列を有する核酸配列によってコードされたVH CDR及びVL CDRを含む。
【００１９】
したがって、本発明は、対象におけるEphA4の過剰発現を伴う疾患、特に癌、特に転移癌を予防、治療、又は管理するために設計された医薬組成物、ならびに予防プログラム及び治療プログラムに関し、これらは、EphA4に特異的に結合してアゴニストとして作用する抗体、癌細胞表現型(軟寒天中でのコロニー形成、又はMATRIGEL(商標)などの三次元基底膜もしくは細胞外膜調製物中での管状ネットワーク形成など)を抑制する抗体、非癌細胞ではなく癌細胞で選択的に露出又は増大しているEphA4のエピトープに選択的に結合し、かつ3×10-3s-1未満のKoffを有する抗体の１つ又は複数を投与することを含む。好ましい実施態様では、EphA4抗体は、軟寒天中に既に形成されたコロニーの大きさを低減し、かつ／あるいは三次元基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成の程度を低減する。一実施態様では、癌が上皮細胞由来である。別の実施態様では、癌が皮膚癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、乳癌、又は膀胱癌であるか、あるいは腎細胞腫又はメラノーマである。好ましい実施態様では、癌が膵臓癌である。別の好ましい実施態様では、予防、治療、又は管理されるべき癌の中の癌細胞がEphA4を過剰発現する。好ましい実施態様では、細胞間接触の減少、細胞内局在の変化、又はリガンドと比較したEphA4量の増大の結果、一部のEphA4がリガンドに結合していない。さらなる好ましい実施態様では、EphA4アゴニストは、可変重鎖配列及び／又は可変軽鎖配列が、配列番号２２、２４、２６、２８、３０、及び３２に含有される、EA44の可変重鎖配列又は可変軽鎖配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有するEphA4抗体である。他の好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は６つすべてのCDRが、EA44における対応するCDRと同一であるEphA4抗体を提供する。他の特定の実施態様では、本発明は、抗EphA4 scFvクローン８、１８、２０、３６、及び４１を提供する。
【００２０】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、腫瘍の転移を予防、治療、又は管理するのに使用される。本発明の抗体は、他の１つ又は複数の癌治療と組み合わせて投与することができる。詳細には、本発明は、対象の癌を予防、治療、又は管理する方法を提供し、この方法は、本発明のEphA4抗体の投与を除外した、１つ又は複数の化学療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法、及び／又は放射線療法の治療上又は予防上有効な量の投与と組み合わせて、あるいは手術と組み合わせて、本発明の１つ又は複数のEphA4抗体を治療上又は予防上有効な量、前記対象に投与することを含む。好ましい実施態様では、１つ又は複数のEphA2抗体と組み合わせて、１つ又は複数のEphA4抗体を投与する。
【００２１】
他の実施態様では、本発明のEphA4抗体は、限定されるものではないが、癌、喘息、慢性閉塞性肺疾患、腸管、腸、胃、及び他の重要臓器の炎症性疾患、再狭窄(平滑筋及び／又は内皮の)、クローン病、乾せん、ならびに他の非転移性疾患を含めた、細胞過増殖に関連した疾患又は障害を治療、予防、及び／又は管理するのに使用される。好ましい実施態様では、過増殖細胞が上皮である。好ましい実施態様では、過増殖細胞がEphA4を過剰発現する。好ましい実施態様では、細胞間接触の減少、細胞内局在の変化、又はリガンドと比較したEphA4量の増大の結果、一部のEphA4がEphA4リガンドに結合していない。
【００２２】
本発明の方法及び組成物は、未治療の患者にのみ有用なのではなく、限定されるものではないが、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、放射線療法、及び／又は手術を含めた、現在の標準的癌治療及び実験的癌治療に対して部分的又は完全に抵抗性の患者の治療にも、そして、そのような治療の有効性を改善するにも有用である。したがって、好ましい実施態様では、本発明は、本発明のEphA4抗体の投与を含むもの以外の治療に対して抵抗性又は非反応性であることが示されているか、あるいは抵抗性又は非反応性でありうる癌を治療又は予防するための治療用アゴニスト及び予防用アゴニストを提供する。特定の実施態様では、非EphA4ベースの治療、特にタモキシフェン治療、又はそれにおける耐性がIL-6レベルの増大に関連している治療に対して抵抗性又は非反応性の患者に、非抵抗性又は反応性を患者に与えるために、本発明の１つ又は複数のEphA4抗体を投与する。以前にはその患者が抵抗性又は非反応性であった治療は、その後、治療効果もって投与することができる。
【００２３】
加えて、本発明は、本発明のEphA4抗体を得るためのスクリーニングの方法を提供し、詳細には、抗体は、通常の免疫技法を用いて、EphA4、特にEphA4の細胞外ドメインに対する結合によってスクリーニングすることができる。一実施態様では、アゴニストEphA4抗体を同定するために、EphA4シグナル伝達、例えばEphA4リン酸化、及び／又は75kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化の増大を誘導する能力、ならびに／あるいはEphA4を分解する能力によって、EphA4抗体をスクリーニングすることができる。
【００２４】
別の実施態様では、癌細胞表現型を抑制する抗体を同定するために、癌細胞の、軟寒天中でのコロニー形成を阻止もしくは低減する能力、又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を減弱もしくは抑制する能力によって、あるいは癌表現型の減弱を検出する任意の他の方法、例えば、細胞増殖の接触阻害の増大(例えば、単層細胞培養におけるコロニー形成の減少)を検出する任意のアッセイによって、抗EphA4抗体をスクリーニングすることができる。好ましい実施態様では、軟寒天中に既にあるコロニーの大きさを減少させる能力、又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状マトリックス形成の程度を抑制する能力、特に細胞(詳細には癌細胞、より詳細には転移性癌細胞、ただし、他の過増殖細胞も含める)の壊死又はアポトーシスを誘導する能力によって、抗体をスクリーニングする。さらに、抗体は、他の抗癌剤、例えば、ホルモン剤、化学療法剤、生物学的薬剤、又は他の抗癌剤の存在下で、軟寒天中でのコロニー形成及び／又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を抑制もしくは減少させるそれらの能力によってスクリーニングすることもできる。
【００２５】
別の実施態様では、非癌細胞ではなく癌細胞で露出したEphA4エピトープに選択的に結合する抗体を同定するために、リガンド、例えばエフリンＡ４に結合しておらず、かつ細胞間接触に局在していないEphA4に選択的に結合する能力によって、抗体をスクリーニングすることができる。望ましい結合特性を有するものを得るために、候補抗体をスクリーニングするには、当技術分野で知られている、細胞における抗体結合／局在性を測定する任意の方法を用いることができる。特定の実施態様では、抗体の結合特性を測定するのに、免疫蛍光顕微鏡検査又はフローサイトメトリーを用いる。この実施態様では、リガンドに結合している場合、及び細胞間接触に局在している場合にはEphA4に対する結合が乏しいが、細胞表面の遊離EphA4には良好に結合する抗体が本発明に包含される。別の特定の実施態様では、EphA4抗体は、細胞ベースのアッセイ又はELISAアッセイを用いて、EphA4に対する結合を、それらがリガンド(例えば細胞に固定されたリガンド又は精製されたリガンド)と競合する能力によって選択する。
【００２６】
別の実施態様では、3×10-3s-1未満のKoff率を有する抗体を同定するために、当技術分野で周知の抗体結合速度論アッセイ(例えば、BIACORE(商標)アッセイなど、表面プラズモン共鳴に基づいたアッセイ)を用いて抗体をスクリーニングする。
他の実施態様では、本発明は、本発明のEphA4抗体以外の、EphA4タンパク質レベルを低下させる治療薬、例えば、限定されるものではないが、EphA4に特異的なアンチセンス核酸、EphA4発現のRNA干渉を媒介する二本鎖EphA4RNA、抗EphA4リボザイムなどを投与することによって、同様に、EphA4の他の阻害剤、例えば、EphA4の低分子阻害剤を投与することによって、癌を治療、予防、又は管理する方法を提供する。
【００２７】
本発明は、本発明のEphA4抗体を用いて、EphA4ベース又は非EphA4ベースの癌治療の有効性を評価する診断方法をさらに提供する。一般的に、EphA4発現が増大していることは、より侵襲性かつ転移性の癌に関連している可能性がある。したがって、特定の治療によるEphA4発現の低減は、その治療が癌の侵襲性及び／又は転移可能性を低下させていることを示す。本発明の診断方法は、癌の経過又は癌治療の結果を、予後診断又は予測するのに用いることもできる。特定の実施態様では、本発明の診断方法は、転移を画像化又は位置決定する方法と、原発腫瘍部位から遠位の組織及び体液、例えば全血、痰、尿、血清、微細針吸引液(すなわち生検試料)を用いた診断及び予後診断する方法(原発腫瘍の組織及び体液を用いた方法と同様に)とを提供する。他の実施態様では、本発明の診断方法は、in vivoの、転移を画像化及び位置決定する方法と、診断及び予後の方法とを提供する。そのような実施態様では、転移性原発腫瘍を、本発明の抗体、好ましくは露出したEphA4エピトープの抗体を用いて検出する。本発明の抗体は、冷凍又は固定された細胞又は組織の免疫組織学的分析に用いることもできる。加えて、本発明の抗体及び診断方法は、癌ではない過増殖疾患(特にEphA4の過剰発現に関連した疾患)、例えば、限定されるものではないが、喘息、乾せん、炎症性腸疾患、再狭窄、クローン病、前立腺上皮細胞内新生物(PIN)、慢性閉塞性肺疾患などの治療(EphA4ベース又は非EphA4ベースの治療)を、診断、予後診断、又はモニターするのに使用することもできる。
別の実施態様では、本発明の医薬組成物又は診断試薬を含むキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
(３．１  定義)
本明細書で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、別の分子の活性、活性化、又は機能を増強する化合物なら、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、大分子、又は小分子(10kD未満)を含めたいかなる化合物も意味する。EphA4アゴニストは、EphA4及び／又は75kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化、ならびにEphA4タンパク質の分解の増大を引き起こす。EphA4に対してアゴニストとして作用するEphA4抗体は、癌細胞表現型(例えば、軟寒天中でのコロニー形成、あるいは、三次元基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成)も抑制することもあれば、そうではないこともあり、また、非癌細胞との比較において癌細胞では露出しているEphA4エピトープに選択的に結合することもあれば、そうではないこともあり、さらに、低いKoff率を有することもあれば、そうではないこともある。
【００２９】
「EphA4に免疫特異的に結合する抗体又はその断片」という用語は、本明細書で使用される場合、EphA4ポリペプチド又はEphA4ポリペプチド断片に特異的に結合し、かつ、他のポリペプチドには特異的に結合しない抗体又はその断片を意味する。EphA4ポリペプチド又はその断片に免疫特異的に結合する抗体又は断片は、他の抗原と非特異的に交差反応しない(例えば、非EphA4タンパク質、例えばBSAとの競合によって結合が失われることがない)ことが好ましい。EphA4ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体又は断片は、例えばイムノアッセイ、又は当業者に知られている他の技法によって同定することができる。本発明の抗体には、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えによって生成された抗体、イントラボディー、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含める)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、単鎖Fv(scFv)、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド連結Fv(sdFv)(二重特異性sdFvを含める)、及び抗イディオタイプ(抗Id)抗体、ならびに上記のうち任意のもののエピトープ結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。詳細には、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、EphA4抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位(例えば抗EphA4抗体の１つ又は複数の相補性決定領域(CDR))を含有する分子が含まれる。アゴニスト抗体、又はEphA4ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する断片は、EphA4に対して選択的にアゴニストとして作用し、かつ他の活性に対しては有意にアゴニストとして作用しないことが好ましい。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、遠位の部位に転移する能力を有し、かつ非癌細胞のものと異なる表現型形質、例えば、軟寒天などの三次元基質中でのコロニー形成、又は三次元の基底膜、もしくはMATRIGEL(商標)などの細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク又は網状マトリックスの形成を示す細胞が関与する疾患を意味する。非癌細胞は、軟寒天中でコロニーを形成せず、三次元の基底膜又は細胞外マトリックス調製物中で明らかな球状構造を形成する。癌細胞は、それらの発生中様々な機構を通して、特徴的な一組の機能的能力を取得する。そのような能力には、アポトーシスの回避、成長シグナルにおける自己充足性、反増殖シグナルに対する非感受性、組織浸潤／転移、無制限の増殖能、及び持続的血管形成が含まれる。「癌細胞」という用語は、前悪性の癌細胞、及び悪性の癌細胞の両方を包含するものとする。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「癌細胞表現型を抑制する」という句は、化合物が、癌細胞の、軟寒天中でのコロニー形成、又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を阻止もしくは低減する能力、あるいは癌表現型の減弱を検出する任意の他の方法、例えば、細胞増殖の接触阻害の増大(例えば単層細胞培養におけるコロニー形成の減少)を検出するアッセイを阻止もしくは低減する能力を意味する。癌細胞表現型を抑制する化合物は、軟寒天中に既に確立されている癌細胞のコロニーに添加された場合にはコロニーの低減又は消滅、あるいは三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成の程度の低減又は消滅も引き起こす。癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体は、EphA4に対してアゴニストとして作用することもあれば、そうでないこともあり、低Koff率を有することもあれば、そうでないこともある。
【００３２】
「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸残基置換、欠失、又は付加の導入によって改変されている、EphA4ポリペプチド、EphA4ポリペプチドの断片、EphA4ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、又はEphA4ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。また、「誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、改変されている、すなわち任意のタイプの分子がこのポリペプチドに共有結合されることによって改変されている、EphA4ポリペプチド、EphA4ポリペプチドの断片、EphA4ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体、又はEphA4ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体断片も意味する。限定ではなく例として挙げれば、EphA4ポリペプチド、EphA4ポリペプチドの断片、抗体、又は抗体断片は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド生成、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解、細胞リガンド、又は他のタンパク質などに連結することによって改変することができる。EphA4ポリペプチド、EphA4ポリペプチドの断片、抗体、又は抗体断片の誘導体は、限定されるものではないが、特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた、当業者に公知の技法を用いた化学修飾によって改変することができる。さらに、EphA4ポリペプチド、EphA4ポリペプチドの断片、抗体、又は抗体断片の誘導体は、１つ又は複数の非古典的なアミノ酸を含有してもよい。一実施態様では、ポリペプチド誘導体は、本明細書に記載のEphA4ポリペプチド、EphA4ポリペプチドの断片、抗体、又は抗体断片と同様又は同一の機能を有する。別の実施態様では、EphA4ポリペプチド、EphA4ポリペプチドの断片、抗体、又は抗体断片の誘導体は、無改変のポリペプチドと比較した場合に、改変されている活性を有する。例えば、誘導体抗体又はその断片は、エピトープにより強固に結合する場合、あるいはプロテアーゼ分解に対してより強い抵抗性を有する場合がある。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはマウス又はヒトにおいて、抗原性又は免疫原性活性を有するEphA4ポリペプチドの一部分を指す。免疫原性活性を有するエピトープは、動物で抗体応答を引き起こすEphA4ポリペプチドの一部分である。抗原活性を有するエピトープは、当技術分野で周知の任意の方法、例えばイムノアッセイによって測定されるように、抗体が免疫特異的に結合するEphA4ポリペプチドの一部分である。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００３４】
本明細書に記載する「断片」という用語には、EphA4ポリペプチドに免疫特異的に結合するEphA4ポリペプチド又は抗体のアミノ酸配列のうち少なくとも5個の連続したアミノ酸残基、少なくとも10個の連続したアミノ酸残基、少なくとも15個の連続したアミノ酸残基、少なくとも20個の連続したアミノ酸残基、少なくとも25個の連続したアミノ酸残基、少なくとも40個の連続したアミノ酸残基、少なくとも50個の連続したアミノ酸残基、少なくとも60個の連続したアミノ基、少なくとも70個の連続したアミノ酸残基、少なくとも80個の連続したアミノ酸残基；少なくとも90個の連続したアミノ酸残基、少なくとも100個の連続したアミノ酸残基、少なくとも125個の連続したアミノ酸残基、少なくとも150個の連続したアミノ酸残基、少なくとも175個の連続したアミノ酸残基、少なくとも200個の連続したアミノ酸残基、又は少なくとも250個の連続したアミノ酸残基を含むペプチド又はポリペプチドが含まれる。抗体断片は、エピトープに結合する断片であることが好ましい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である非ヒト(例えばマウス)抗体の形態を意味する。大部分において、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン(レシピエン抗体)であり、その中で、受容者の超可変領域残基が、望ましい特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の超可変領域残基(ドナー抗体)で置換されている。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基で置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエン抗体にも、ドナー抗体にも見出されない残基を含むことがある。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するために行われる。通常、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その中では、すべて又は実質的にすべての超可変領域が、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、かつ、すべて又は実質的にすべてのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものであろう。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むであろう。一部の実施態様では、ヒト化抗体が誘導体である。そのようなヒト化抗体は、１つ又は複数の非ヒトCDRに、アミノ酸残基置換、欠失、又は付加を含む。非誘導体ヒト化抗体と比較した場合、ヒト化抗体誘導体は、実質的に同程度の結合を有することも、さらに良い結合を有することも、さらに悪い結合を有することもある。特定の実施態様では、CDRの１、２、３、４、又は５アミノ酸残基が、置換、除去、又は付加(すなわち変異)されている。抗体のヒト化に関するさらに詳細は、欧州特許第239400号、第592106号、及び第519596号；国際公開第91/09967号及び第93/17105号；米国特許第.5225539号、第5530101号、第5565332号、第5585089号、第5766886号、及び第6、407213号；ならびに、Padlanの論文(1991、Molecular Immunology 28(4/5): 489-498)；Studnickaらの論文(1994、Protein Engineering 7(6): 805-814)；Roguskaらの論文(1994、PNAS91: 969-973)；Tanらの論文(2002、J. Immunol. 169: 1119-25)；Caldasらの論文(2000、Protein Eng. 13: 353-60)；Moreaらの論文(2000、Methods 20: 267-79)；Bacaらの論文(1997、J. Biol. Chem. 272: 10678-84)；Roguskaらの論文(1996、Protein Eng. 9: 895-904)；Coutoらの論文(1995、Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s)；Coutoらの論文(1995、Cancer Res. 55: 1717-22)；Sandhuの論文(1994、Gene 150: 409-10)；Pedersenらの論文(1994、J. Mol. Biol. 235: 959-73)；Jonesらの論文(1986、Nature 321: 522-525)；Reichmannらの論文(1988、Nature 332: 323-329)；及びPrestaの論文(1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596)を参照のこと。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「過増殖細胞障害」という用語は、その障害の疾病状態又は症候を、細胞過増殖が引き起こすか、又はこれに寄与する、腫瘍ではない障害を意味する。一部の実施態様では、過増殖細胞障害が、過増殖している上皮細胞を特徴とする。過増殖上皮細胞障害には、喘息、COPD、肺線維症、気管支反応性亢進、乾せん、脂漏性皮膚炎、及び嚢胞性繊維症が含まれるが、これらに限定されない。他の実施態様では、過増殖細胞障害は、過増殖している内皮細胞を特徴とする。過増殖内皮細胞障害には、再狭窄、過増殖性血管疾患、ベーチェット症候群、アテローム硬化症、及び黄斑変性症が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用する場合、「超可変領域」という用語は、抗原結合の原因となる、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「CDR」(すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４(L1)、５０〜５６(L2)、及び８９〜９７(L3)、ならびに重鎖可変ドメインにおける３１〜３５(H1)、５０〜６５(H2)、及び９５〜１０２(H3)；Kabatらの論文「免疫学的に重要なタンパク質の配列」(5th Ed. Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD. (1991))からのアミノ酸残基、及び／又は「超可変ループ」(すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６〜３２(L1)、５０〜５２(L2)、及び９１〜９６(L3)、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２(H1)、５３〜５５(H2)、及び９６〜１０１(H3)；Chothia及びLeskの論文(1987、J. Mol. Biol. 196: 901-917))からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク領域」すなわち「FR」残基は、本明細書に定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３８】
本明細書で使用する場合、「組み合わせて」という用語は、複数の予防薬及び／又は治療薬の使用を意味する。「組み合わせて」という用語の使用は、過増殖細胞障害、特に癌を患う対象に予防薬及び／又は治療薬を投与する順序を限定しない。第１の予防薬又は治療薬は、第２の予防薬又は治療薬の投与の前(例えば、1分間、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間前)に、同時に、後(例えば、1分間、5分間、15分間、30分間、45分間、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間、又は12週間後)に、過増殖細胞障害、特に癌を患ったか、患っているか、又は患いやすい対象に投与することができる。予防薬又は治療薬は、本発明の薬剤がもう一方の薬剤と共に作用して、それらを別の方法で投与した場合より増大した利益を提供できるように、順番に、そしてある時間間隔以内に対象に投与する。追加のいかなる予防薬又は治療薬も、追加の他の予防薬又は治療薬と、任意の順序で投与することができる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「忍容性が低い」という句は、患者が、治療による副作用に苦しみ、そのため、有害作用、及び／又は副作用による害が治療の恩恵を上回るため、患者が治療から利益を得ず、かつ／又は治療の継続を望まない状態を意味する。
本明細書で使用される場合、「管理する」、「管理すること」、及び「管理」という用語は、対象が予防薬又は治療薬の投与から得る有益な効果を意味し、この場合、予防薬又は治療薬は疾患の治療をもたらさない。ある実施態様では、疾患の進行又は悪化を阻止するために、１つ又は複数の予防薬又は治療薬を対象に投与して、疾患を「管理する」。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「新生」という用語は、遠位の部位に転移する能力を有し、かつ非新生細胞のものと異なる表現型形質、例えば、軟寒天などの三次元基質中でのコロニー形成、又は三次元の基底膜、もしくはMATRIGEL(商標)などの細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク又は網状マトリックスの形成を示す細胞が関与する疾患を意味する。非新生細胞は、軟寒天中でコロニーを形成せず、三次元の基底膜又は細胞外マトリックス調製物中で明らかな球状構造を形成する。新生細胞は、それらの発生中様々な機構を通して、特徴的な一組の機能的能力を取得する。そのような能力には、アポトーシスの回避、成長シグナルにおける自己充足性、反増殖シグナルに対する非感受性、組織浸潤／転移、無制限の増殖能、及び持続的血管形成が含まれる。したがって、「非新生」とは、癌細胞が関与しない状態、疾患、又は障害を意味する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、「非反応性／抵抗性」という句は、化学療法、放射線療法、手術、ホルモン療法、及び／又は生物学的療法／免疫療法、なかでも特定の癌に対する標準的な治療プログラムなど、現在利用可能な治療(例えば癌治療)の１つ又は複数で治療された患者を記述するのに使用し、この場合、その治療は、患者の治療に臨床上適しておらず、そのため、これらの患者が追加の効果的な治療を必要とし、例えば、治療の効果を受けないままでいる。この句は、治療には反応するが、副作用、再発、耐性の発達などになお苦しむ患者を記述することもある。様々な実施態様において、「非反応性／抵抗性」は、少なくとも何らかの有意な部分の癌細胞が殺されないでいるか、あるいはそれらの細胞分裂が停止していないことを意味する。癌細胞が「非反応性／抵抗性」であるかどうかの判定は、当技術分野で承認されている「抵抗性」の意味をそのような文脈で用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法によってin vivo又はin vitroで行うことができる。様々な実施態様において、癌が「非反応性／抵抗性」であるとは、癌細胞の数が治療期間中に有意に減少していないか、あるいは増大している場合である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「増強する」という用語は、通常の用量又は承認されている用量における治療薬の有効性向上を意味する。
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、対象における疾患の開始、再発、又は拡散を、予防薬又は治療薬の投与の結果として防止することを意味する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「予防薬」という用語は、EphA4過剰発現及び／又は細胞過増殖疾患、特に癌に関連した疾患又は障害の開始、再発、又は拡散の防止に使用できるいかなる薬剤も指す。ある実施態様では、「予防薬」という用語は、EphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、露出したEphA4エピトープの抗体、又は低いKoffでEphA4に結合する抗体を指す。ある他の実施態様では、「予防薬」という用語は、本発明の癌化学療法薬、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法(例えば免疫療法)、及び／又はEphA4抗体を指す。他の実施態様では、複数の予防薬を組み合わせて投与することができる。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「予防上有効な量」は、細胞過増殖疾患、好ましくは癌の開始、再発、又は拡散の防止をもたらすのに十分な予防薬の量を指す。予防上有効な量は、限定されるものではないが、過増殖疾患に罹りやすいもの、例えば、遺伝学的に癌に罹りやすいか、あるいは以前に発癌性物質に曝露されたものを含めた対象における、過増殖疾患、特に癌の開始、再発、又は拡散を防止するのに十分な予防薬の量も指すことがある。予防上有効な量は、過増殖疾患の防止に予防上の恩恵を提供する予防薬の量も指すことがある。さらに、本発明の予防薬に関する予防上有効な量は、過増殖疾患の防止における予防上の恩恵を提供する、単独の、あるいは他の薬剤と組み合わせた際の予防薬の量も意味する。本発明のEphA4抗体の量に関して使用される場合、この用語は、全体的に予防を向上させる量、あるいは予防の有効性を促進するか、又は別の予防薬との相乗作用を与える量を包含することがある。
本明細書で使用される場合、「プロトコール」には、投薬スケジュールと、投薬プログラムとが含まれる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「副作用」という句は、予防薬又は治療薬の望ましくない有害な作用を包含する。有害な作用は常に望ましくないが、望ましくない作用は必ずしも有害であるわけではない。予防薬又は治療薬による有害な作用は、有害であるか、不快であるか、又は危険であろう。化学療法による副作用には、限定されるものではないが早期形成性及び遅形成性の下痢及び鼓腸などの胃腸毒性、悪心、嘔吐、無食欲、白血球減少症、貧血、好中球減少症、無力症、腹部のけいれん、発熱、疼痛、体重の減失、脱水状態、脱毛症、呼吸促迫、不眠症、眩暈感、粘膜炎、口内乾燥、ならびに腎不全と、便秘、神経及び筋への影響、腎臓及び膀胱に対する一時的又は恒久的な損傷、インフルエンザ様症状、体液貯留、ならびに一時的又は恒久的な不妊症とが含まれるが、これらに限定されない。放射線療法による副作用には、疲労感、口内乾燥症、及び食欲不振が含まれるが、これらに限定されない。生物学的療法／免疫療法による副作用には、投与部位における皮疹又は膨張、発熱、冷感、及び疲労感などのインフルエンザ様症状、消化管疾患、及びアレルギー反応が含まれるが、これらに限定されない。ホルモン療法による副作用には、悪心、妊娠障害、うつ病、食欲不振、眼疾患、頭痛、及び体重変動が含まれるが、これらに限定されない。患者が通常経験する望ましくない他の効果も多数あり、当技術分野で知られている。多くは、「医師用添付文書集(Physicians' Desk Reference)」(56th ed.、2002)に記載されている。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「単鎖Fv」及び「scFv」という用語は、抗体のVHドメイン及びVLドメインを含む抗体断片を指し、その際、これらのドメインは、単一ペプチド鎖内に存在している。通常、Fvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインとの間にさらに、scFvが抗原結合性に望ましい構造を形成できるようにするポリペプチドリンカーを含む。scFvに関する総説には、Pluckthunの論文(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、vol. 113、Rosenburg及びMoore編Springer Verlag、New York、pp. 269-315 (1994))を参照のこと。特定の実施態様では、scFvに、二重特異性scFv及びヒト化scFvが含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、互換性をもって使用される。本明細書で使用される場合、対象は、好ましくは、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、及びラットなど)及び霊長類(例えば、サル及びヒト)などの哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、疾患又は障害の症候の根絶、軽減、又は改善を意味し、とりわけ、１つ又は複数の治療薬の投与の結果による原発性、局部性、又は転移性の癌組織の根絶、除去、改変、又は管理を意味する。ある実施態様では、かかる用語は、そのような疾患を患っている対象に、１つ又は複数の治療薬を投与することの結果として、癌の拡散を最小にするか、又は遅延させることを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「治療薬」という用語は、EphA4の過剰発現及び／又は細胞過増殖疾患もしくは障害、特に癌に関連した疾患又は障害の予防、治療、又は管理に使用できるいかなる薬剤も指す。ある実施態様では、「治療薬」という用語は、EphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、露出したEphA4エピトープの抗体、又は3×10-3s-1未満のKoffでEphA4に結合する抗体、EphA4リガンドもしくはEphA4結合性断片、又はその誘導体などの、EphA4にアゴニストとして作用する非抗体薬剤、あるいは、EphA4 RNAi、アンチセンスなどのEphA4発現を低下させる薬剤を指す。ある他の実施態様では、「治療薬」という用語は、本発明の癌化学療法薬、放射線療法、ホルモン療法、生物学的療法／免疫療法、及び／又はEphA4抗体を指す。他の実施態様では、複数の治療薬を組み合わせて投与することができる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」は、EphA4過剰発現及び／又は細胞過増殖疾患に関連した疾患又は障害を治療又は管理するのに十分な治療薬の量を指し、好ましくは、原発性、局部性、又は転移性の癌組織を破壊、改変、管理、又は除去するのに十分な量を指す。治療上有効な量は、過増殖疾患の開始を遅延するかあるいは最小にするのに、例えば癌の拡散を遅延するかあるいは最小にするのに十分な治療薬の量を指すこともある。治療上有効な量は、癌の治療又は管理で治療効果を提供する治療薬の量を指すこともある。さらに、本発明の治療薬に関する治療上有効な量は、過増殖疾患又は癌の治療又は管理における治療上の恩恵を提供する、単独の、あるいは他の治療と組み合わせた際の治療薬の量も意味する。本発明のEphA4抗体の量に関して使用される場合、この用語は、全体的な治療を向上させるか、望ましくない作用を低減又は回避するか、あるいは治療の有効性を促進するか又は別の治療薬との相乗作用を与える量を包含することがある。
【００５０】
(５．発明の詳細な説明)
本発明は、ある特定の癌細胞ではEphA4が調節されておらず、抗EphA4抗体は、軟寒天中での細胞接着及び成長など、ある特定の癌細胞挙動を減弱するという発明者らの発見に一部基づいている。抗EphA4
1抗体は、EphA4及びEphA4-関連タンパク質のリン酸化を促進する。本発明者らは、癌及び細胞増殖において、EphA4がEphA2と同様の役割を演じていると考える。EphA2に対してアゴニストとして作用するEphA2モノクローナル抗体は、癌細胞におけるEphA2発現のレベルを減少させることによって、癌細胞の増殖及び侵襲性を抑制することができる(「EphA2モノクローナル抗体及びその使用方法」と題した、2003年5月12日に出願の同時係属中の米国特許出願第10/436782を参照のこと)。EphA4活性の低下、又はEphA4シグナル伝達の他の結果によって、悪性の癌細胞増殖が選択的に抑制されうる。詳細には、EphA4のアゴニストモノクローナル抗体によって、EphA4レベルの低下、ならびにEphA4及び／又は75kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化が実現されうる。いかなる作用機序に拘泥されるものではないが、この細胞成長及び／又は転移の抑制は、EphA4シグナル伝達を刺激して(すなわちアゴニストとして作用して)、それによって、EphA4の分解に導くEphA4リン酸化を引き起こすことによって実現されうる。癌細胞増殖の減弱は、EphA4レベルの減少によって、また、それ故、リガンド非依存性のEphA4シグナル伝達の減弱によって起こりうる。EphA4活性の低減は、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は、非癌細胞ではなく癌細胞で露出したEphA4エピトープに選択的に結合する抗体によっても実現されうる。加えて、EphA4に低いKoff(例えば3×10-3s-1未満)で結合する抗体も、EphA4レベルを低下させうる。
【００５１】
加えて、発明者らは、EphA4に対する抗体結合が、細胞挙動の変化を引き起こすのに十分であることを見出した。詳細には、EphA4を発現する細胞に対するEphA4抗体の結合は、細胞-ECM接着を減弱し、細胞の球形化を誘導する。細胞-ECM接着は、物理的な接着と、細胞の成長、移動、侵襲、及び分化に関する決定を含めた、細胞挙動の多くの側面を支配する細胞内シグナル伝達とを提供するものと一般に理解されている。この理解と一致して、細胞と、その微環境との相互作用の変化は、多くの様々な疾患状態の開始又は進行を連結している。例えば、ECM接着の増強は、移動及び成長を促進し、それによって、限定されるものではないが、癌；腸(IBD)、腸(クローン病)、胃、及び他の重要臓器の炎症性疾患；喘息；CORD及び、他の肺の過増殖疾患；ならびに、平滑筋又は内皮細胞の成長及び移動の増大によって生じる臨床徴候である再狭窄を含めた過増殖疾患の引き金となりうる。したがって、EphA4抗体は、非癌性状態の治療全般、特に細胞-ECM接着に関連した状態の治療に有用でありうる。
【００５２】
したがって、本発明は、EphA4の過剰発現に関連した疾患及び障害、ならびに／又は細胞過増殖疾患及び障害の治療、抑制、及び管理を提供する方法及び組成物に関する。本発明の特定の態様は、癌細胞の増殖及び侵襲、特にEphA4を過剰発現する癌細胞のそれらを抑制する化合物を含む方法及び組成物に関する。本発明はさらに、上皮細胞由来の癌、特に、ヒトの乳腺、肺、皮膚、前立腺、膀胱、及び膵臓の癌、腎細胞腫、ならびにメラノーマの転移の治療、抑制、又は管理の方法及び組成物に関する。本発明のさらに他の組成物及び方法には、本発明のEphA4抗体と組み合わせた他のタイプの活性成分が含まれる。他の実施態様では、本発明の方法は、細胞過増殖に関連した他の疾患又は障害、例えば、限定されるものではないが、喘息、乾せん、再狭窄、COPDなどを治療、予防、又は管理するのに使用する。
【００５３】
本発明は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び生物学的療法など、現在もしくは標準の癌治療に対して部分的又は完全に抵抗性である癌又は他の過増殖細胞障害もしくは疾患の治療、抑制、及び管理の方法に関する。
本発明は、本発明のEphA4抗体、特に露出したEphA4エピトープの抗体を用いた、癌治療の有効性を評価する、EphA4ベース又は非EphA4ベースの診断方法をさらに提供する。本発明の診断方法は、癌の進行を予後診断又は予測するのにも使用することができる。特定の実施態様では、本発明の診断方法は、転移を画像化又は位置決定する方法と、原発腫瘍部位から遠位の組織及び体液を用いた診断及び予後診断する方法(原発腫瘍の組織及び体液を用いた方法と同様に)とを提供する。他の実施態様では、本発明の診断方法は、in vivoで、画像化又は位置決定する方法と、診断及び予後診断する方法を提供する。
【００５４】
追加の実施態様では、本発明は、軟寒天中での細胞コロニー形成、ならびに／あるいは、三次元の基底膜、及びMATRMEL(商標)などの細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を低減する能力によって薬剤をスクリーニングすることによる、抗癌剤、特に抗転移癌剤を得るためのスクリーニング方法を提供する。好ましい実施態様では、本発明は、軟寒天中に既に存在する細胞コロニー形成、及び／又は三次元の基底膜中での管状ネットワーク形成の程度を低減する能力をアッセイすることによる、過増殖疾患及び障害を治療及び予防する薬剤を得るためのスクリーニング方法を提供する。本発明者らは、軟寒天中での細胞コロニー形成、及び／又は、MATRIGEL(商標)中での管状ネットワーク形成の抑制が転移抑制活性のはるかに良い指標であり、標準的な細胞培養アッセイによって同定されないであろう潜在的転移抑制剤を同定しうることを見出した。
【００５５】
(５．１  抗体)
上記に論じたように、本発明は、EphA4に免疫特異的に結合して、EphA4シグナル伝達に対してアゴニストとして作用し(「EphA4アゴニスト抗体」)；癌細胞表現型を抑制し、例えば、軟寒天中でのコロニー形成、又は、三次元の基底膜、もしくはMATRIGEL(商標)などの細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を抑制し(「癌細胞表現型を抑制する抗体」)；非癌細胞ではなく癌細胞で選択的に露出又は増大しているEphA4エピトープに選択的に結合し(「露出したEphA4エピトープの抗体」)；かつ／あるいは、3×10-3s-1未満のKoffでEphA4に結合する抗体(好ましくはモノクローナル抗体)又はその断片の投与を包含する。一実施態様では、これらの抗体は、EphA4の細胞外ドメインに結合し、そして、好ましくはEphA4に対してアゴニストとして作用し、例えば、EphA4リン酸化及び／又は75 kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化を増大し、そして、好ましくはEphA4分解を引き起こす。別の実施態様では、これらの抗体は、EphA4の細胞外ドメインに結合し、そして、好ましくは抑制も行い、そして、なおさらに好ましくは、軟寒天中でのコロニー形成、又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成の程度を低減する(例えば壊死及びアポトーシスなどの殺細胞機構によって)。他の実施態様では、これらの抗体は、ホルモン剤、生物学的薬剤、化学療法薬、又は他の薬剤など、別の抗癌剤の存在下で、癌細胞表現型を抑制又は低減する。別の実施態様では、これらの抗体は、癌細胞では露出しているが、非癌細胞では遮断されているエピトープにおいてEphA4の細胞外ドメインに結合する。別の実施態様では、これら抗体は、好ましくは1×10-3s-1未満のKoffで、より好ましくは3×10-3s-1未満のKoffで、EphA4の細胞外ドメインに結合する。他の実施態様では、これらの抗体は、10-3s-1未満、5×10-3s-1未満、10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、又は10-10s-1未満のKoffでEphA4に結合する。
【００５６】
さらに好ましい実施態様では、これらの抗体は、EphA4エピトープに結合し、かつ／あるいは、EphA4結合に関して競合し、これがELISA又は他の任意の適切な免疫アッセイによってアッセイされる。抗EphA4 scFv EA44を発現する細胞は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定の下に、American Type Culture Collection(P. O. Box 1549、Manassas、VA 20108)に2004年6月1日に寄託され、アクセッション番号＿＿が割り当てられており、これを参照により本明細書に組み込む。特定の実施態様では、本発明は、EphA4 scFv抗体であるEphA4-44/EA44を提供する(本明細書において、EA44及びEphA4-44は同一の抗体を指すが、これはすなわち、EphA4-44 scFvクローンがEphA4に結合し、2004年6月10日に「EA44」としてATCCに寄託されたのである)。好ましい実施態様では、本発明は、可変重鎖及び／又は可変軽鎖のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号４及び８に含まれるEA44可変重鎖アミノ酸配列又は軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％の配列同一性を有するEphA4抗体を提供する。他の好ましい実施態様では、本発明は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は６つすべてのCDRが、EA44における対応するCDRと同一であるEphA4抗体を提供する。他の特定の実施態様では、本発明は、抗EphA4 scFvクローン８、１８、２０、３６、及び４１を提供する。最も好ましい実施態様では、これらの抗体は、ヒト抗体であるか、あるいはヒト化されている抗体である。
【００５７】
他の実施態様、EphA4抗体は、EA44 VH CDR1(配列番号２２)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)及びVH CDR3(配列番号２６)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)及びVH CDR1(配列番号２２)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH１  CDR1、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR1(配列番号２８)、EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR2(配列番号２４)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR1(配列番号２８)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR2(配列番号３０)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR2(配列番号２４)、VL CDR1(配列番号２８)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR1(配列番号２２)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)；EA44 VH CDR2(配列番号２４)、VH CDR3(配列番号２６)、VL CDR1(配列番号２８)、VL CDR2(配列番号３０)及びVL CDR3(配列番号３２)、あるいは、図７に記載するEA44 VH CDR及びVL CDRの任意の組合せを含む。
【００５８】
本発明の抗体には、モノクローナル抗体、合成抗体、組換えによって生成された抗体、イントラボディー、多重特異性抗体(二重特異性抗体を含める)、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、scFvクローン８、１８、２０、３６、４１、及びEA44などの単鎖Fv(scFv)(二重特異性scFvを含める)、Fab断片、F(ab')断片、ジスルフィド連結Fv(sdFv)、及び上記の任意のもののエピトープ結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。詳細には、本発明の方法で使用される抗体には、免疫グロブリン分子と、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわちEphA4に免疫特異的に結合しかつEphA4のアゴニストであり、癌細胞表現型を抑制又は低減し、非癌細胞ではなく癌細胞で露出しているEphA4エピトープに選択的に結合し、かつ／あるいは、3×10-3s-1未満のKoffでEphA4に結合する、抗原結合部位を含有する分子とが含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又はサブクラスのものでもよい。
【００５９】
本発明の方法で使用される抗体は、鳥類及び哺乳類(例えば、ヒト、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ)を含めたいかなる動物起源のものでもよい。これらの抗体は、ヒトモノクローナル抗体、又はヒト化されたモノクローナル抗体であることが好ましい。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、さらに、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、あるいはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウス又は他の動物から単離された抗体が含まれる。
【００６０】
本発明の方法で使用される抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又は多重特異性である。多重特異性抗体は、EphA4ポリペプチドの異なったエピトープに免疫特異的に結合しても、又はEphA4ポリペプチドと、異種ポリペプチド又は固形担体物質などの異種エピトープとの両方に免疫特異的に結合してもよい。例えば、国際公開第93/17715号、第92/08802号、第91/00360号、及び第92/05793；Tuttらの論文(1991、J. Immunol. 147: 60-69)；米国特許第4474893号、第4714681号、第4925648号、5573920号、及び第5601819号；ならびにKostelnyらの論文(1992、J. Immunol. 148: 1547-1553)を参照のこと。
【００６１】
好ましい実施態様では、本発明の抗体は二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー(bispecific T cell engagers)(BiTE)である。二重特異性Ｔ細胞エンゲイジャー(BiTE)は、Ｔ細胞を、標的の抗原特異的排除に向け直すことができる二重特異性抗体である。BiTE分子は、分子の一端にＴ細胞抗原(例えばCD3)に結合する抗原結合性ドメインを有し、さらに、標的細胞上の抗原に結合する抗原結合ドメインを有する。BiTE分子は、最近、参照により本明細書に組み込まれている国際公開第99/54440号に記載された。この公開は、CD19及びCD3抗原(CD19×CD3)に対する結合部位を含む新規の単一鎖多機能ポリペプチドについて記載する。この分子は、Ｂ細胞上のCD19に結合するもの、及びＴ細胞上のCD3に結合する抗体の２つの抗体に由来する。これらの異なった抗体の可変領域が１つのポリペプチド配列によって連結され、それによって単一分子を生成する。また、単一鎖二重特異性抗体を生成する、柔軟なリンカー用いた、特異的結合ドメインの可変重鎖(VH)及び可変軽鎖(VL)の連結も記載されている。
【００６２】
本発明の一実施態様において、EphA4に免疫特異的に結合する抗体又はリガンドは、BiTE分子の一部を含むであろう。例えば、EphA4に結合する抗体のVH及び／又はVL(好ましくはscFV)を、上述の分子のものなど、抗CD3結合部分に融合して、それによって、EphA4を標的とするBiTE分子を生成することができる。EphA4に対する抗体の可変重鎖及び／又は軽鎖に加えて、EphA4に結合する他の分子、例えば、エフリンA1、A2、A3、A4、A5、B2、及びB3；B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L、及びElk-L3も、BiTE分子を含むことができる。別の実施態様では、BiTE分子は、他のＴ細胞抗原(CD3以外)に結合する分子を含むことができる。例えば、CD2、CD4、CD8、CD1 1a、TCR、及びCD28などのＴ細胞抗原に免疫特異的に結合するリガンド及び／又は抗体は、本発明の一部であると企図する。このリストは網羅的であることを意図するものではなく、Ｔ細胞抗原に免疫特異的に結合できる他の分子も、BiTE分子の一部として使用できることを例示するものである。これらの分子には、抗体のＶＨ及び／又はＶＬ部分、あるいは天然リガンド(例えば、その天然リガンドがCD3であるＬＦＡ３)が含まれうる。本発明の一実施態様では、BiTE分子がEphA4アゴニストである。別の実施態様では、BiTE分子がEphA4アンタゴニストである。
【００６３】
本発明に従って使用される「結合ドメイン」は、自然の抗体、遊離scFv断片、又はそれらの対応する免疫グロブリン鎖の１つ、好ましくはVH鎖のように、エピトープに特異的に結合できる三次元構造を含むドメインを意味する。したがって、前記ドメインは、抗体又は免疫グロブリン鎖のVHドメイン及び／又はVLドメインを含むことができ、好ましくは少なくともVHドメイン、あるいは、より好ましくは、柔軟なポリペプチドリンカーで連結されたVHドメイン及びVLドメイン(scFv)を含む。その一方、本発明のポリペプチドに含有される前記結合ドメインは、Ｔ細胞上の抗原又は細胞抗原を認識する抗体又は免疫グロブリン鎖における少なくとも１つの相補性決定領域(CDR)を含みうる。この点において、本発明のポリペプチド中に存在する結合ドメインは、抗体のみに由来するではなく、天然に存在する表面受容体又はリガンドなど、他のＴ細胞合タンパク質又は細胞抗原結合タンパク質にも由来しうることが留意される。本発明の一実施態様では、上述したポリペプチドの前記第１のドメイン又は第２のドメインは、天然抗体に由来するＶＨ領域及びＶＬ領域を模擬するものか、又はそれらに対応するものであることがさらに企図される。本発明のポリペプチドに対する結合部位を提供する抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクロナール抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、合成抗体、Fab、Fv、又はscFv断片などの抗体断片、あるいは、化学的に改変された、これらいずれかの誘導体でありうる。
【００６４】
本発明の方法で使用される抗体には、改変された誘導体、すなわち任意のタイプの分子を抗体に共有結合することによって改変された誘導体が含まれる。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド生成、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解、及び細胞リガンド又は他のタンパク質への連結などによって改変された抗体が含まれる。多数の化学修飾のうち任意のものを、限定されるものではないが、特異的な化学開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた既知の技法によって実行することができる。加えて、誘導体は、１つ又は複数の非古典的なアミノ酸を含有してもよい。
【００６５】
本発明は、ラクダ化単一ドメイン抗体(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、Muyldermansらの論文(2001、Trends Biochem. Sci. 26: 230)；Nuttallらの論文(2000、Cur. Pharm. Biotech. 1: 253)；Reichmann及びMuyldermansの論文(1999、J. Immunol. Meth. 231: 25)；国際公開第94/04678号及び第94/25591号；米国特許第6005079号を参照)を含めた単一ドメイン抗体を包含する。一実施態様では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように改変されているEphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、露出したEphA4エピトープの抗体、又は3×10-3s-1未満のKoffでEphA4に結合するEphA4抗体のいずれかのVHドメインのアミノ酸配列を有する２つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。別の実施態様では、本発明は、EphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、露出したEphA4エピトープの抗体、又は3×10-3s-1のKoffでEphA4に結合するEphA4抗体における１つ又は複数のVH CDRを含む２つのVHドメインを含む単一ドメイン抗体を提供する。
【００６６】
本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトの体内での半減期(例えば血清中半減期)が、15日間超、好ましくは20日間超、25日間超、30日間超、35日間超、40日間超、45日間超、2ヶ月超、3ヶ月超、4ヶ月超、又は5ヶ月超である抗体又はその断片の使用を包含する。本発明の抗体又はその断片の、哺乳動物、好ましくはヒトの体内での半減期が延長されることによって、哺乳動物における前記抗体又は抗体断片の血清力価がより高くなり、それによって、前記抗体又は抗体断片の投与頻度が低減され、かつ／あるいは、投与するべき前記抗体又は抗体断片の濃度が低減される。生体内半減期が延長されている抗体又はその断片は、当業者に知られている技法によって生成することができる。例えば、生体内半減期が延長されている抗体又はその断片は、FcドメインとFcRn受容体との相互作用に関与するものとして同定されているアミノ酸残基を改変(例えば置換、除去、又は付加)することによって、生成することができる(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、国際公開第97/34631号及び第02/060919号を参照のこと)。生体内半減期が延長されている抗体又はその断片は、高分子量ポリエチレングリコール(PEG)などのポリマー分子を、前記抗体又は抗体断片に結合させることによって生成することができる。前記抗体又は抗体断片へのPEGの結合は、多機能のリンカーを用いて、又は用いずに、前記抗体又は抗体断片のＮ末端又はＣ末端へのPEGの部位特異的結合によって、あるいはリジン残基に存在するエプシロンアミノ基を介して行うことができる。生物活性の喪失が最小となる、線状又は分枝状の重合体誘導体化が用いられるであろう。結合の度合いは、抗体へのPEG分子の適切な結合を確実にするために、SDS-PAGE及び質量分析によって詳しくモニターされるであろう。反応しなかったPEGは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーによって抗体PEG結合体から分離されるであろう。
【００６７】
例えば、アミノ酸置換をもたらす部位特定的突然変異誘発及びPCR媒介突然変異生成を含めた、当業者に知られている標準的な技法は用いて、抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。誘導体は、元の抗体又はその断片と比較して、15アミノ酸未満の置換、10アミノ酸未満の置換、5アミノ酸未満の置換、4アミノ酸未満の置換、3アミノ酸未満の置換、又は2アミノ酸未満の置換を含んでいることが好ましい。好ましい実施態様では、誘導体は、必須でないことが予測されている１つ又は複数のアミノ酸残基で行われた保存的なアミノ酸置換を有する。
【００６８】
本発明は、EphA4に免疫特異的に結合して、EphA4に対してアゴニストとして作用し、かつ／又は癌細胞表現型を阻害し、癌細胞で露出したEphA4エピトープに選択的に結合し、かつ／又は3×10-3s-1未満のKoffでEphA4に結合する抗体又はその断片をさらに包含し、前記抗体又は抗体断片は、EphA4抗体の１つ又は複数のCDRのアミノ酸配列に少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも99％同一な１つ又は複数のCDRのアミノ酸配列を含む。２つのアミノ酸配列の同一性のパーセントの決定は、BLASTタンパク質検索を含めた、当業者に知られている任意の方法で行うことができる。
【００６９】
特定の実施態様では、本発明は、scFvクローンEA44の１つ又は複数のCDRのアミノ酸配列に少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも99％同一な１つ又は複数のCDRのアミノ酸配列を含む抗体又は抗体断片を包含する。別の実施態様では、本発明は、EphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体である組換え体EphA4抗体又は抗体断片を包含し、前記抗体は、EA44抗体の可変軽鎖又は可変重鎖における相補性決定領域(CDR)のうち少なくとも１つを含み、EA44の可変重鎖及び軽鎖配列のアミノ酸配列は。
別の特異的な実施態様では、本発明は、EphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体であるEphA4抗体又は抗体断片を包含し、その際、前記抗体は、EA44抗体の可変軽鎖及び／又は可変重鎖における相補性決定領域(CDR)のうち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つすべてを含む。
【００７０】
(５．１．１  抗体結合体)
本発明は、異種薬剤に、組換えによって融合されているか、あるいは化学的に結合(共有結合及び非共有結合の両方を含める)されている抗体又はその断片(あるいは、EphA4リガンド及びそのEphA4結合性断片などの他の治療薬)の使用を包含する。異種薬剤は、ポリペプチド(又はその部分、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、又は少なくとも100アミノ酸までのポリペプチド)、核酸、小分子(1000ダルトン未満)、又は無機もしくは有機化合物でありうる。融合は、必ず直接的である必要がなく、リンカー配列を介してなされることもある。異種薬剤に融合又は結合された抗体は、当技術分野で知られている方法を用いて、障害の進行をin vivoで検出、治療、管理、又はモニターするのに使用することができる。例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、国際公開第93/21232号；欧州特許第439095号；Naramuraらの論文(1994、Immunol. Lett. 39: 91-99)；米国特許5474981号；Gilliesらの論文(1992、PNAS 89: 1428-1432)；及びFellらの論文(1991、J. Immunol. 146: 2446-2452)を参照のこと。ある実施態様では、検出、治療、管理、又はモニターされるべき障害が、EphA4を過剰発現する悪性の癌である。他の実施態様では、検出、治療、管理、又はモニターされるべき障害が、EphA4を過剰発現する前悪性の癌である。特定の実施態様では、前悪性の癌が、高度前立腺上皮細胞内新生物(PIN)、乳房の腺管癌、又は複合母斑である。
【００７１】
本発明は、抗体断片に融合又は結合された異種薬剤を含む組成物をさらに含む。例えば、異種ポリペプチドを、Fab断片、Fd断片、Fv断片、F(ab)2断片、又はその断片に、融合又は結合させることができる。抗体の部分にポリペプチドを融合又は結合する方法は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5336603号、第5622929号、第5359046号、第5349053号、第5447851号、及び第5112946号；欧州特許第307434号及び第367166号；国際公開第96/04388号及び第91/06570号；Ashkenaziらの論文(1991、PNAS 88: 10535-10539)；Zhengらの論文(1995、J. Immunol. 154: 5590-5600)；及びVilらの論文(1992、PNAS 89: 11337-11341)を参照のこと(前記引用文献を参照によりその全体において本明細書に組み込む)。
【００７２】
遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリング、及び／又はコドンシャフリングの技法(集合的に「DNAシャッフリング」と呼ばれる)を用いて、追加の融合タンパク質を生成することができる。DNAシャッフリングは、本発明の抗体又はその断片の活性を改変する(例えばより高い抗原親和性及びより低い解離速度をもつ抗体又はその断片)のに用いることができる。全般的には、米国特許第5605793号、第5811238号、第5830721号、第5834252号、及び第5837458号；ならびに、Pattenらの論文(1997、Curr. Opinion Biotechnol. 8: 724-33)；Harayamaの論文(1998、Trends Biotechnol. 16: 76)；Hanssonらの論文(1999、J. Mol. Biol. 287: 265)；及び、Lorenzo及びBlascoの論文(1998、BioTechniques 24: 308)を参照のこと(これらの特許及び刊行物のそれぞれを参照によりその全体として本明細書に組み込む)。抗体もしくはその断片、又はコードされている抗体もしくはその断片は、誤りがちなPCR(error-prone PCR)、ランダムヌクレオチド挿入、又は他の方法によるランダム変異誘発を行うことによって組換え前に改変することができる。抗体又は抗体断片をコードするポリヌクレオチドの、EphA4に免疫特異的に結合する１つ又は複数の部分を、１つ又は複数の異種薬剤の１つ又は複数の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断片などと再結合することができる。
【００７３】
一実施態様では、本発明の抗体、又はその断片もしくは変種を、精製を容易にするために、ペプチドなどのマーカー配列に結合させる。好ましい実施態様では、マーカーアミノ酸配列がヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くは市販されているが、なかでもpQEベクター(QIAGEN, Inc.、9259 Eton Avenue、Chatsworth、CA、91311)に提供されているタグなどがある。Gentzらの論文(1989、PNAS 86: 821)に記載の通り、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。他の精製に有用なペプチドタグには、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素である「HA」タグ(Wilsonらの論文(1984、Cell 37: 767)及びFlagタグが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
他の実施態様では、本発明の抗体、又はその断片もしくは変種を、診断薬又は検出可能な薬剤に結合させる。そのような抗体は、臨床試験手順の一部として、特定の治療の有効性を判定するなど、癌の発達もしくは進行をモニター又は予後診断するのに有用でありうる。加えて、そのような抗体は、前悪性の癌(例えば、高度前立腺上皮細胞内新生物(PIN)の、乳房の腺管癌、又は複合母斑)の発生又は進行をモニター又は予後診断するのに有用でありうる。一実施態様では、露出したEphA4エピトープの抗体を、診断薬又は検出可能な薬剤に結合させる。
【００７５】
そのような診断及び検出は、限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンなどの蛍光物質；限定されるものではないが、ルミノールなどの発光物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリンなどの生物発光性物質；限定されるものではないが、ビスマス(213Bi)、炭素(14C)、クロム(51Cr)、コバルト(57Co)、フッ素(18F)、ガドリニウム(153Gd、159Gd)、ガリウム(68Ga、67Ga)、ゲルマニウム(68Ge)、ホルミウム(166Ho)、インジウム(115In、113In、112In、111In)、ヨウ素(131I、125I、1231、121I)、ランタン(140La)、ルテチウム(177Lu)、マンガン(54Mn)、モリブデン(99Mo)、パラジウム(103Pd)、リン(32P)、プラセオジミウム(142Pr)、プロメチウム(149Pm)、レニウム(186Re、188Re)、ロジウム(105Rh)、ルテニウム(97Ru)、サマリウム(153Sm)、スカンジウム(47Sc)、セレニウム(75Se)、ストロンチウム(85Sr)、硫黄(35S)、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、スズ(113Sn、117Sn)、トリチウム(3H)、キセノン(133Xe)、イッテルビウム(169Yb、175Yb)、イットリウム(90Y)、亜鉛(65Zn)などの放射性物質；様々なポジトロン放射断層撮影を用いるポジトロン放出金属、及び非放射性の常磁性金属イオンを含む検出可能な物質に抗体を結合することによって達成できる。
【００７６】
他の実施態様では、本発明の抗体、又はその断片もしくは変種を、細胞毒、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊薬、治療薬、又は放射性金属イオン、例えばα放射体などの治療薬に結合させる。細胞毒又は細胞毒性薬剤には、細胞に有害ないかなる薬剤も含まれる。これらの例には、パクリタクセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロマイド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポサイド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジオキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイドかプロカインかテトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、エピルビシン、及びシクロホスファミド、ならびにこれらの類似体又は相同体が含まれる。治療薬には、代謝拮抗剤(例えば、メトトレキセート、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシルダカルバジン)、アルキル化剤(例えば、メクロエタミン、チオエパ(thioepa)、クロランブシル、メルファラン、カルムスチン(BCNU)及びロムスチン(CCNU)、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、ならびにシスジクロロジアミンプラチナ(II)(DDP)シスプラチン)、アントラサイクリン系(例えばダウノルビシン(以前にはダウノマイシン)及びドキソルビシン)、抗生物質類(例えば、ダクチノマイシン(以前にはアクチノマイシン)、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン(anthramycin)(AMC))ならびに有糸分裂阻害剤(例えばビンクリスチン及びビンブラスチン)が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
他の実施態様では、本発明の抗体、又はその断片もしくは変種を、治療薬又は所与の生物反応を改変する薬物部分に結合させる。治療薬又は薬物部分は、古典的な化学治療薬に限定されるものと解釈するべきではない。例えば、薬物部分は、望ましい生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドでありうる。そのようなタンパク質には、例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、コレラ毒素、又はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、組織プラスミノーゲンアクチベータ、アポトーシス物質、例えば、TNF-α、TNF-β、AIM  I(国際公開第97/33899号を参照)、AIM  II(国際公開第97/34911号を参照)、Fasリガンド(Takahashiらの論文(1994、J. Iminunol.、6: 1567)、及びVEGI(国際公開第99/23105号を参照)、血栓薬又は抗血管新生剤、例えばアンギオスタチン又はエンドスタチンなどのタンパク質；又は、例えばリンフォカイン(例えば、インターロイキン-1(「IL-1」)、インターロイキン-2(「IL-2」)、インターロイキン-6(「IL-6」)、か粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM-CSF」)、及び顆粒球コロニー刺激因子(「G-CSF」)などの生物反応調節剤、もしくは成長因子(例えば成長ホルモン(「GH」))が含まれることがある。
【００７８】
他の実施態様では、本発明の抗体、又はその断片もしくは変種を、放射性物質、又は放射性金属イオンを結合するのに有用な大環状キレート剤(放射性物質の例に関して上記参照)などの治療薬に結合させる。ある実施態様では、大環状キレート剤は、リンカー分子を介して抗体に結合可能な1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-N,N,'N",N"四酢酸(DOTA)である。そのようなリンカー分子は、当技術分野で公知であり、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれている、Denardoらの論文(1998、Clin Cancer Res. 4: 2483-90)；Petersonらの論文(1999、Bioconjug. Chem. 10: 553)；及びZimmermanらの論文(1999、Nucl. Med. Biol. 26: 943-50)に記載されている。
特定の実施態様では、結合される抗体は、非癌細胞ではなく癌細胞で露出したEphA4エピトープに選択的に結合するEphA4抗体である(すなわち、露出したEphA4エピトープの抗体)。別の特定の実施態様では、結合される抗体がEA2ではない。さらに別の実施態様では、結合される抗体が、EA44抗体の可変軽鎖又は可変重鎖を含む。
【００７９】
抗体に治療用部分を結合する技法は周知であり、例えば、Arnonらの論文「癌治療における薬物の免疫ターゲッティングに用いるモノクローナル抗体」(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら(編)、pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985))；Hellstromらの論文「薬物送達に用いる抗体」(Controlled Drug Delivery (2nd Ed.)、Robinsonら(編)、pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987))；Thorpeの論文「癌治療における細胞毒性薬の抗体担体：概観」(Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら(編)、pp. 475-506 (1985))；「癌治療における、放射性同位元素標識された抗体の治療適用の分析、結果、及び将来の展望」(Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら(編)、pp. 303-16 (Academic Press 1985))、及びThorpeらの論文(1982、Immunol. Rev. 62: 119-58)を参照されたい。抗体をポリペプチド部分に融合又は結合させる方法は当技術分野で公知である。例えば、米国特許第5336603号、第5622929号、第5359046号、第5349053号、第5447851号、及び第5112946号；欧州特許第307434号及び第367166号；国際公開第96/04388号及び第91/06570号；Ashkenaziらの論文(1991、PNAS 88: 10535-10539)；Zhengらの論文(1995、J. Immunol. 154: 5590-5600)；及びVilらの論文(1992、PNAS 89: 11337-11341)を参照のこと。ある部分への抗体の融合は、必ずしも直接的である必要がなく、リンカー配列を介してなされることもある。そのようなリンカー分子は当技術分野で公知であり、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれている、Denardoらの論文(1998、Clin Cancer Res. 4: 2483-90)；Petersonらの論文(1999、Bioconjug. Chem. 10: 553)；Zimmermanらの論文(1999、Nucl. Med. Biol. 26: 943-50)；Garnettの論文(2002、Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 171-216)に記載されている。
【００８０】
別法として、参照により全体として本明細書に組み込まれている、Segalによる米国特許第4676980号に記載の通り、抗体を二次抗体に結合させて、抗体異種結合体を形成させることもできる。
抗体は、固形担体に結合させてもよく、これは特に、標的抗原のイムノアッセイ又は精製に有用である。そのような固形担体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
(５．１．２  抗体を生成する方法)
抗体又はその断片は、抗体を合成するための、当技術分野で知られている任意の方法で、詳細には、化学合成によって、あるいは、好ましくは組換え体発現技法によって生成することができる。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、遺伝子組換え技法、ファージディスプレイ技法、又はこれらの組合せを含めた、当技術分野で知られている様々な技法を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で知られており、例えば、Harlowらの論文「抗体：実験室マニュアル(Antibodies: A Laboratory Manual)」(Cold Spring Harbor Laboratory Press、2nd ed.、1988)；Hammerlingらの論文(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier、N.Y.、1981))(前記引用文献を参照によりその全体において本明細書に組み込む)に教示されているものを含めたハイブリドーマ技法を用いて生成することができる。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術で生成された抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、それが生成された方法ではなく、任意の真核、原核、又はファージクローンを含めた、単一のクローンに由来する抗体を意味する。
【００８２】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を生成し、それらを得るためのスクリーニングを行う方法は、当技術分野で、慣例的かつ周知のものである。簡潔には、マウスをEphA4(完全長タンパク質又はそのドメイン、例えば細胞外ドメイン)で免疫化することができ、例えばEphA4に特異的な抗体がマウス血清中に検出されて、ひとたび免疫応答が検出されれば、マウスの脾臓を採取し、脾細胞を単離する。脾細胞は、その後、周知の技法によって、任意の骨髄腫細胞、例えばATCCから得ることのできる細胞系SP20に由来する細胞に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限定希釈によってクローン化する。ハイブリドーマクローンは、その後、本発明のポリペプチドに結合できる抗体を分泌する細胞を得るために、当技術分野で知られている方法でアッセイする。腹水液は、通常、高レベルの抗体を含有するが、マウスを陽性ハイブリドーマクローンで免疫化することによって産生することができる。
【００８３】
したがって、モノクローナル抗体は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養し、その際、このハイブリドーマは、好ましくは、EphA4又はその断片で免疫化されたマウスから単離された脾細胞を、骨髄腫細胞と融合させることによって生成されたものであり、その後、融合から生じるハイブリドーマをスクリーニングして、EphA4に結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンを得ることによって生成することができる。
特定のEphA4エピトープを認識する抗体断片は、当業者に公知の任意の技法によって生成することができる。例えば、本発明のFab及びF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を生成)又はペプシン(F(ab')2断片を生成)などの酵素を用いた、免疫グロブリン分子のタンパク質分解による切断によって生成できる。F(ab')2断片は、可変領域、軽鎖定常領域、及び重鎖のCH1ドメインを含有する。さらに、本発明の抗体は、当技術分野で知られている様々なファージディスプレイ法を用いて生成することができる。
【００８４】
ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面に提示される。詳細には、VHドメイン及びVLドメインをコードするDNA配列を、動物cDNAライブラリー(例えばリンパ組織のヒト又はマウスcDNAライブラリー)から増幅する。VHドメインをコードするDNAと、VLドメインをコードするDNAとを、scFvリンカーを用いて、PCRで再結合し、ファージミドベクター(例えばpCANTAB 6又はpComb 3 HSS)にクローニングする。ベクターをE. coliにエレクトロポレートし、E. coliがヘルパーファージに感染する。これらの方法で使用されるファージは、通常、fd及びM13を含めた繊維状ファージであり、VHドメイン及びVLドメインは、通常、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIに組換えによって融合される。注目しているEphA4エピトープに結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原を用いて、例えば、標識された抗原、又は固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉されている抗原を用いて、選択又は同定することができる。本発明の抗体を作製するのに使用できるファージディスプレイ法の例には、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれているBrinkmanらの論文(1995、J. Immunol. Methods 182: 41-50)；Amesらの論文(1995、J. Immunol. Methods 184: 177)；Kettleboroughらの論文(1994、Eur. J. Immunol. 24: 952-958)；Persicらの論文(1997、Gene 187: 9)；Burtonらの論文(1994、Advances in Immunology 57: 191-280)；国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；国際公開第90/02809号、第91/10737号、第92/01047号、第92/18619号、第93/11236号、第95/15982号、第95/20401号、及び第97/13844号；米国特許第5698426号、第5223409号、第5403484号、第5580717号、第5427908号、第575753号、第5821047号、第5571698号、第5427908号、第5516637号、第570225号、第5658727号、第5733743号、及び第5969108号に開示されているものが含まれる。
【００８５】
ファージは、EphA4、詳細には、EphA4の細胞外ドメインに対する結合によって、スクリーニングすることができる。EphA4に対してアゴニストとして作用する活性(例えば、EphA4リン酸化の増強、EphA4レベルの低減)、又は癌細胞表現型を抑制する活性(例えば、軟寒天中でのコロニー形成、あるいは、MATRIGEL(商標)などの三次元基底膜又は細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成の低減)、又は非癌細胞ではなく癌細胞で露出しているEphA4エピトープに対する選択的な結合(例えば、細胞間接触してリガンドに結合しているEphA4に対して貧弱に結合し、一方、リガンドにも結合せず、細胞間接触もしていないEphA4に対して良好に結合する)によっても、スクリーニングできる。
【００８６】
上記参考文献に記載されている通り、ファージを選択した後、ファージから得られた抗体コード領域を単離して、ヒト抗体又は任意の他の望ましい抗原結合性断片を含めた、抗体全体を生成するのに用いることができ、さらに、例えば以下に記載される通り、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、及び細菌を含めた任意の望ましい宿主で発現させることができる。国際公開第９２／２２３２４号；Mullinaxらの論文(1992、BioTechniques 12: 864)；Sawaiらの論文(1995、AJRl 34: 26)；及びBetterらの論文(1988、Science 240: 1041(前記引用文献を参照によりその全体において本明細書に組み込む)に開示されているものなど、当技術分野で知られている方法を用いて、Fab、Fab'、及びF(ab')2断片を組換えによって生成する技法も利用することができる。
【００８７】
抗体全体を生成するには、VH又はVLのヌクレオチド配列、制限部位、及び制限部位を保護する隣接配列を含むPCRプライマーを用いて、scFvクローン中のVH又はVL配列を増幅することができる。当業者に公知のクローン技法を用いて、PCR増幅されたVHドメインを、VH定常領域、例えばヒトガンマ４定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、PCR増幅されたVLドメインを、VL定常領域、例えばヒトカッパ又はラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。VHドメイン又はVLドメインを発現するためのベクターは、EF-1αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメイン用のクローニング部位、定常ドメイン、及びネオマイシンなどの選択マーカーを含むことが好ましい。VHドメイン及びVLドメインは、必要とする定常領域を発現する１つのベクターにクローニングすることもできる。その後、これらの重鎖変換ベクター及び軽鎖変換ベクターを、当業者に公知の技法を用いて、細胞系に同時形質移入して、完全長抗体、例えばIgGを発現する安定的又は一時的細胞系を生成する。
【００８８】
ヒトにおけるin vivoでの使用と、in vitroでの検出アッセイとを含めた一部の使用には、ヒト抗体又はキメラ抗体を用いるのが望ましい場合がある。ヒト対象の治療療法には、完全なヒト抗体が、とりわけ望ましい。ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いた上述のファージディスプレイ法を含めた、当技術分野で知られている様々な方法によって、ヒト抗体を作製することができる。それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第4444887号及び第4716111号；国際公開第98/46645号、第98/50433号、第98/24893号、第98/16654号、第96/34096号、第96/33735号、及び第91/10741号も参照のこと。
【００８９】
ヒト抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生成することもできる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、又は相同組換によってマウス胚幹細胞に導入することができる。別法として、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域をマウス胚幹細胞に導入することもできる。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換によるヒト免疫グロブリン座の導入と、別々に、あるいは同時に、非機能性にすることができる。詳細には、ＪＨ領域のホモ接合欠失によって、内在性抗体の生成を阻止する。改変された胚幹細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入してキメラマウスを生成する。その後、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を生ませる。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドのすべて又は一部で通常の方法で免疫化する。抗原に対して産生されたモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技法を用いて、免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって保持されているヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成を行い、それに続いて、クラススイッチと、体細胞変異とを起こす。したがって、そのような技法を用いて、治療法上有用なIgG、IgA、IgM、及びIgE抗体を生成することが可能である。ヒト抗体を生成するこの技術に関する概要には、Lonberg及びHuszarの論文(1995、Int. Rev. Immunol. 13: 65-93)を参照のこと。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を生成するこの技法に関する詳細な考察、ならびにそのような抗体を生成するプロトコールには、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれている国際公開第98/24893号、第96/34096号、及び第96/33735号；米国特許第5413923号、第5625126号、第5633425号、第5569825号、第5661016号、第5545806号、第5814318号、及び第5939598号を参照のこと。加えて、Abgenix, Inc.(Freemont、CA)及びMedarex(Princeton、NJ)などの会社に、選択された抗原に対して産生されるヒト抗体を、上述の技法と同様のものを用いて提供するように依嘱することができる。
【００９０】
キメラ抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域と有する抗体など、その抗体の異なった部分が、異なった免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体を生成する方法は当技術分野で公知である。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれている、Morrisonの論文(1985、Science 229: 1202)；Oiらの論文(1986、BioTechniques 4: 214)；Gilliesらの論文(1989、J. Immunol. Methods 125: 191-202)；米国特許第5807715号、第4816567号、及び第4816397号を参照のこと。非ヒト生物種に由来する１つ又は複数のCDRと、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを含むキメラ抗体は、例えば、CDR移植(欧州特許第239400号；国際公開第91/09967号；米国特許第5225539号、第5530101号、及び第5585089号)、ベニアリング(veneering)又は再表面化(resurfacing)(欧州特許第592106号；欧州特許第519596号；Padlanの論文(1991、Molecular lmmunology 28(4/5): 489 498；Studnickaらの論文(1994、Protein Engineering 7: 805)；及びRoguskaらの論文(1994、PNAS 91: 969)、及び鎖シャフリング(米国特許第556533２号)を含めた当技術分野で知られている様々な技法を用いて生成することができる。
【００９１】
抗原結合を改変するために、好ましくは改善するために、フレームワーク領域のフレームワーク残基が、しばしばCDRドナー抗体からの対応する残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、CDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリングを行って、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、配列比較をして、特定の位置における珍しいフレームワーク残基を同定することによって同定する(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている米国特許第5585089号；及びRiechmannらの論文(1988、Nature 332: 323を参照のこと)。
【００９２】
ヒト化抗体は、所定の抗原に結合することができ、かつ実質的にヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するフレームワーク領域と、実質的に非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するCDRとを含む抗体、又はその変種もしくは断片である。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、そして典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、その中では、すべて又は実質的にすべてのCDR領域が、非ヒト免疫グロブリン(すなわちドナー抗体)のものに対応し、かつ、すべて又は実質的にすべてのフレームワーク領域が、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域(Fc)、通常ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むことが好ましい。通常、この抗体は、軽鎖と、少なくとも重鎖の可変ドメインとの両方を含有するであろう。この抗体は、重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びCH4領域も含むことがある。ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、及びIgEを含めた任意のクラスの免疫グロブリン、そしてIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4を含めた任意のイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは、補体結合定常ドメインであり、その場合、ヒト化抗体は、細胞毒活性を示すことが望ましく、そして、通常は、そのクラスがIgG1である。そのような細胞毒活性が望ましくない場合には、定常ドメインは、IgG2クラスのものでよい。ヒト化抗体は、複数のクラス又はイソタイプに由来する配列を含むことができ、望ましいエフェクター機能を最適化するために、特定の定常ドメインを選択することは、当技術分野における通常の技術に包含される。ヒト化抗体のフレームワーク領域及びCDR領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、ドナーCDR又はコンセンサスフレームワークを、少なくとも１つの残基の置換、挿入、又は欠失によって変異させ、その部位におけるCDR残基又はフレームワーク残基が、コンセンサスにも、移入抗体にも対応しないようにすることができる。しかし、そのような変異は広範なものとはならないであろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも75％、より頻繁には90％、最も好ましくは95％超が、親のフレームワーク領域(FR)及びCDR配列のものに対応するであろう。ヒト化抗体は、限定されるものではないが、CDR-移植(欧州特許第239400号；国際公開第91/09967号；米国特許第5225539号、第5530101号、及び第5585089号)、ベニアリング又は再表面化(欧州特許第592106号及び第519596号；Padlanの論文(1991、Molecularlmmunology 28(4/5): 489-498)；Studnickaらの論文(1994、Protein Engineering 7(6): 805-814)；及びRoguskaらの論文(1994、PNAS 91: 969-973)、鎖シャフリング(米国特許第5565332号)、ならびに、例えば、米国特許第6407213号、第5766886号、第5585089号、国際公開第9317105号、Tanらの論文(2002、J. Immunol. 169: 1119-25)、Caldasらの論文(2000、Protein Eng. 13: 353-60)、Moreaらの論文(2000、Methods 20: 267-79)、Bacaらの論文(1997、J. Biol. Chem. 272: 10678-84)、Roguskaらの論文(1996、Protein Eng. 9: 895-904)、Coutoらの論文(1995、Cancer Res. 55 (23 Supp): 5973s-5977s)、Coutoらの論文(1995、Cancer Res. 55: 1717-22)、Sandhuの論文(1994、Gene 150: 409-10)、Pedersenらの論文(1994、J. Mol. Biol. 235: 959-73)、Jonesらの論文(1986、Nature 321: 522-525)、Riechmannらの論文(1988、Nature 332: 323)、及びPrestaの論文(1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596)に開示された技法を含めた当技術分野で知られている様��な技法を用いて生成することができる。抗原結合を改変するために、好ましくは改善するために、フレームワーク領域のフレームワーク残基が、しばしばCDRドナー抗体からの対応する残基で置換されるであろう。これらのフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法によって、例えば、CDRとフレームワーク残基との相互作用のモデリングを行って、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定し、配列比較をして、特定の位置における珍しいフレームワーク残基を同定することによって同定する(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれているQueenら、米国特許第5585089号；及びRiechmannらの論文(1988、Nature 332: 323)を参照のこと)。
【００９３】
さらに、本発明の抗体は、次に、当業者に周知の技法を用いて、抗イディオタイプ抗体を生成するのに利用することができる(例えば、Greenspan及びBonaの論文(1989、FASEB J. 7: 437-444)；ならびに、Nissinoffの論文(1991、J. Immunol. 147: 2429-2438)を参照)。本発明は、本発明の抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの使用を利用する方法を提供する。
【００９４】
(５．１．３  抗体をコードするポリヌクレオチド)
本発明の方法は、例えば上記に定義された、高いストリンジェンシー、中程度、又は低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリッド形成するポリヌクレオチドを包含する。
当技術分野で知られている任意の方法によって、ポリヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。抗体のアミノ酸配列は知られているので、当技術分野で周知の方法を用いて、これらの抗体をコードするヌクレオチド配列を決定することができる。すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸を生成するように組み立てる。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができ(例えば、Kutmeierらの論文(1994、BioTechniques 17: 242)に記載されている)、これは、簡潔には、抗体をコードする配列の部分を含有する重複したオリゴヌクレオチドの合成を行い、それらのオリゴヌクレオチドをアニール及び連結し、その後、連結されたオリゴヌクレオチドをPCRで増幅するものである。
【００９５】
別法として、抗体をコードするポリヌクレオチドは、適当な供給源からの核酸から生成することができる。特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが利用可能でないが、抗体分子の配列が既知である場合、この免疫グロブリンをコードする核酸を、適当な供給源から化学的に合成するか、あるいは、その配列の３’末端及び５’末端にハイブリッド形成できる合成プライマーを用いたPCR増幅によって、又は、同定するべき特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて、例えばその抗体をコードするcDNAライブラリーからのcDNAクローンをクローニングすることによって、適当な供給源(例えば、本発明の抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞など、その抗体を発現する任意の組織又は細胞から作製された抗体cDNAライブラリー又はcDNAライブラリー、あるいは、そのような組織又は細胞から単離された核酸、好ましくはポリＡ＋  RNA)から取得することができる。PCRによって生成された増幅核酸は、その後、当技術分野で周知の任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターの中にクローニングすることができる。
【００９６】
ひとたび抗体のヌクレオチド配列が決定されれば、異なったアミノ酸配列を有する抗体を生成するため、例えば、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を生成するために、例えば、組換えDNA技法、部位特異的変異誘発、PCRなど、当技術分野で周知の、ヌクレオチド配列を操作する方法(例えば、参照によりその全体において本明細書に組み込まれている、Sambrookらの論文「分子クローニング、実験室マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)」(1990、2d Ed.、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY)、及びAusubelら編の論文「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(1998、John Wiley Sons、NY)に記載の技法)を用いて、抗体のヌクレオチド配列を操作することができる。
【００９７】
特定の実施態様では、通常の組換えDNA技法を用いて、１つ又は複数のCDRをフレームワーク領域に挿入する。このフレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域でも、コンセンサスフレームワーク領域でもよく、好ましくはヒトフレームワーク領域である(ヒトフレームワーク領域のリストには、例えば、Chothiaらの論文(1998、J. Mol. Biol. 278: 457-479)を参照こと)。フレームワーク領域とCDRとを組み合わせて生成されたポリヌクレオチドは、EphA4に特異的に結合する抗体をコードすることが好ましい。上記で論じた通り、１つ又は複数のアミノ酸置換をフレームワーク領域中に作製することができ、このアミノ酸置換は、抗原に対する抗体の結合を改善することが好ましい。さらに、そのような方法は、１つ又は複数の鎖内ジスルフィド結合を欠失した抗体分子を生成するために、鎖内ジスルフィド結合に参加する１つ又は複数の可変領域システイン残基のアミノ酸置換又は欠失を作製するのに用いることができる。上記ポリヌクレオチドに対する他の改変は、本発明に包含され、当技術分野の技術に含まれる。
【００９８】
(５．１．４  抗体の組換体発現)
本発明の抗体、又はその誘導体、類似体、もしくは断片(例えば、本発明の抗体の重鎖もしくは軽鎖、又は本発明の一本鎖抗体もしくはその部分)の組換体発現は、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。ひとたび、本発明の抗体分子、又は抗体の重鎖もしくは軽鎖、あるいはその部分(必ずしも必要ではないが、好ましくは、重鎖又は軽鎖可変ドメインを含有する)をコードするポリヌクレオチドが得られれば、当技術分野で周知の技法を用いた組換えDNA技法によって、抗体分子の生産に供するベクターを生成することができる。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製する方法を、本明細書に記載する。当業者に周知の方法を用いて、抗体コード配列と、適切な転写及び翻訳制御シグナルとを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、in vitroの組換えDNA技法、合成技法、及びin vivoの遺伝子組換えが含まれる。したがって、本発明は、プロモーターに作用可能に連結した、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変ドメイン、又はその部分、あるいは重鎖もしくは軽鎖CDRを含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく(例えば、国際公開第86/05807号及び第89/01036号；ならびに米国特許第5122464号を参照)、重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖方の全体を発現するために、この抗体の可変ドメインをそのようなベクターにクローニングすることができる。
【００９９】
発現ベクターは、従来の技法によって宿主細胞に導入し、形質移入細胞は、その後、本発明の抗体を生成するために、従来の技法によって培養する。したがって、本発明は、異種プロモーターに作用可能に連結した、本発明の抗体もしくはその断片、あるいはその重鎖もしくは軽鎖、又はその部分、あるいは本発明の一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体を発現するために好ましい実施態様では、以下に詳述する通り、免疫グロブリン分子全体を発現するために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターを、宿主細胞で同時発現することができる。
【０１００】
本発明の分子抗体を発現するために、様々な宿主-発現ベクター系を利用することができる(例えば、米国特許第5807715号参照)。そのような宿主-発現系は、それによって、注目しているコード配列を生成し、続いて精製することができる媒体を表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換又は形質移入された場合、本発明の抗体分子をin situで発現することのできる細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含有する、組換え体バクテリオファージDNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された、細菌(例えばE. coli及びB. subtilis)などの微生物；抗体コード配列を含有する、組換え体酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、Saccharomyces pichia)；抗体コード配列を含有する、組換え体ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞システム；抗体コード配列を含有する、組換え体ウイルス発現ベクターに感染したか、又は組換え体プラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換された植物細胞システム(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV；タバコモザイク病ウイルス、TMV)；あるいは、哺乳類細胞ゲノムに由来するプロモーター(例えばメタロチオネインプロモーター)又は哺乳類ウイルス(例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含有する組換え体発現コンストラクトを保持する哺乳類細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、293、NS0、及び3T3細胞)が含まれるが、これらに限定されない。組換え体抗体分子の発現のため、特に組換え体抗体分子全体の発現のためには、好ましくは、Escherichia coliなどの細菌細胞、より好ましくは真核細胞が使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要中期初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併用する、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)などの哺乳類細胞は、抗体の有効な発現系である(Foeckingらの論文(1986、Gene 45: 101)；及びCockettらの論文(1990、BioTechnology 8: 2)。特定の実施態様では、EphA4に免疫特異的に結合してEphA4に対してアゴニストとして作用し、癌の細胞表現型を抑制し、非癌細胞ではなく癌細胞で選択的に露出又は増大しているEphA4エピトープに選択的に結合し、かつ／あるいは3×10-3s-1未満のKoffを有する抗体又はその断片をコードするヌクレオチド配列の発現を、構成的プロモーター、誘導プロモーター、又は組織特異的プロモーターによって調節する。
【０１０１】
細菌システムでは、発現ベクターの数を、発現される抗体分子に意図されている使用に応じて有利に選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物の生成のために、そのようなタンパク質を多量に生成することになっている場合には、容易に精製することのできる融合タンパク質産物の、高レベルでの発現を指示するベクターが望ましいことがある。そのようなベクターには、E. coli発現ベクターpUR278(Rutherらの論文(1983、EMBO12: 1791))；ｐＩＮベクター(Inouye及びInouyeの論文(1985、Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109)；Van Heeke及びSchusterの論文(1989、J. Biol. Chem. 24: 5503-5509))；及び同様のものが含まれるが、これらに限定されない。pUR278では、抗体コード配列を個別に、融合タンパク質が生成されるようにlac Zコード領域とインフレームにベクターに連結することができる。pGEXベクターも、外来のポリペプチドをグルタチオン5-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現するのに使用することができる。一般的には、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン-アガロースビーズに吸着及び結合させて、それに続いて、遊離グルタチオンの存在下で溶出することによって、溶解した細胞から容易に精製することができる。pGEXベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をGST部分から放出することができるように、トロンビン又は因子Xaプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１０２】
昆虫システムでは、外来遺伝子を発現するベクターとして、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)が用いられる。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞で増殖する。抗体コード配列は、個別にウイルスの非必須領域(例えばポリヘドリン遺伝子)にクローニングして、AcNPVプロモーター(例えばポリヘドリンプロモータ)の制御下に配置することができる。
【０１０３】
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用できる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合には、注目している抗体コード配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列に連結することができる。このキメラ遺伝子は、その後、in vitro又はin vivoの組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの必須ではない領域(例えば領域E1又はE3)に挿入することによって、生存可能であり、かつ感染宿主で抗体分子を発現することができる組換えウイルスが得られるであろう(例えば、Logan及びShenkの論文(1984、PNAS 8 1: 355-359)を参照)。挿入された抗体コード配列の効率の良い翻訳には、特定の開始シグナルも必要となることがある。これらのシグナルは、ATG開始コドンに隣接した配列を含む。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外来性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方における、様々な起源のものでよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、及び転写ターミネーターなどの包含によって促進されることがある(例えば、Bittnerらの論文(1987、Methods in Enzymol. 153: 516-544)を参照)。
【０１０４】
加えて、宿主細胞系は、挿入配列の発現を変調するか、所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングするものを選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾(例えばグリコシル化)及びプロセシング(例えば切断)は、そのタンパク質の機能に重要でありうる。異なった宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾に独特かつ特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾及びプロセッシングを確実にするために、適切な細胞系又は宿主系を選択することができる。このために、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を有する真核細胞宿主細胞が使用されることがある。そのような哺乳類宿主細胞には、CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O、NS1、及びT47D、NS0(いかなる免疫グロブリン鎖も内在的に産生しないマウス骨髄腫細胞株)、CRL7O3O、ならびにHsS78Bst細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
組換えタンパク質の長期的かつ高収率の生産には、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞系を操作／作製することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを用いる代わりに、適当な発現調節エレメント(例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など)、及び選択的マーカーによって制御されたDNAで宿主細胞を形質転換することができる。外来DNAの移入に続いて、操作／作製された細胞を、濃縮培地中で１〜２日間成長させて、その後、選択培地に切り換えることができる。組換えプラスミド中の選択的マーカーは、選択に対する耐性を与えて、細胞がプラスミドをそれらの染色体に安定に組み込み、増殖してフォーカスを形成するのを可能にし、次に、このフォーカスがクローン化されて、細胞系に育成される。この方法は、抗体分子を発現する細胞系を操作／作製するのに有利に用いることができる。このような操作／作製された細胞系は、抗体分子と直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に特に有用でありうる。
【０１０６】
限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerらの論文(1977、Cell 11: 223)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska及びSzybalskiの論文(1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202))、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowyらの論文(1980、Cell 22: 8-17)を含めた、多数の選択系を用いることができ、これらの遺伝子はそれぞれ、tk-、hgprt-、又はaprt-細胞で利用することができる。また、代謝拮抗剤耐性は、以下の遺伝子、すなわち、メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr(Wiglerらの論文(1980、PNAS 77: 357)；O'Hareらの論文(1981、PNAS 78: 1527))；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるgpt(Mulligan及びBergの論文(1981、PNAS 78: 2072)；アミノグルコシドG-418に対する耐性を与えるneo(Wu及びWuの論文(1991、Biotherapy 3: 87)；Tolstoshevの論文(1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573)；Mulliganの論文(1993、Science 260: 926)；ならびに、Morgan及びAndersonの論文(1993、Ann. Rev. Biochem. 62: 191)；Mayの論文(1993、TIB TECH 11: 155-))；及び、ハイグロマイシンに対する耐性を与えるhygro(Santerreらの論文(1984、Gene 30: 147))の選択基盤として用いることができる。望ましい組換え体クローンを選択するために、当技術分野で公知の、組換えDNA技術の方法を慣行的に適用することができ、そのような方法は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれている、Ausubelら(編)の論文「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(John Wiley & Sons、NY (1993))；Krieglerの論文「遺伝子移入及び発現：実験室マニュアル(Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual)」(Stockton Press、NY (1990))；及びDracopoliら(編)の論文「人類遺伝学の現在のプロトコール(Current Protocols in Human Genetics)」(Chapters 12 and 13、John Wiley Sons、NY (1994))；Colberre Garapinらの論文(1981、J. Mol. Biol. 150: 1)に記載されている。
【０１０７】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増強することができる(総説には、Bebbington及びHentschelの論文「哺乳類細胞にクローンニングした遺伝子を発現するための遺伝子増幅に基づいたベクターの使用」(DNA cloning、Vol.3.、Academic Press、New York、1987)を参照)。抗体を発現するベクターシステムのマーカーが増殖可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルを増大させると、マーカー遺伝子のコピー数が増大するであろう。増幅された領域は抗体遺伝子と結合しているので、抗体の産生も増大するであろう(Crouseらの論文(1983、Mol. Cell. Biol. 3: 257)。
【０１０８】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち、重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクターと、軽鎖に由来するポリペプチドをコードする第２のベクターとで同時形質移入することができる。２つのベクターが同一な選択的マーカーを含有してもよく、これは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの等しい発現を可能にする。別法として、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードして、発現することのできる単一のベクターを用いることもできる。そのような状況では、毒性を有する遊離重鎖が過剰となるのを回避するため、重鎖の前に軽鎖を配置するべきである(Proudfootらの論文(1986、Nature 322: 52))；及びKohlerの論文(1980、PNAS 77: 2197)。重鎖及び軽鎖のコード配列は、cDNA又はゲノムのDNAを含むことができる。
【０１０９】
ひとたび本発明の抗体分子が組換え発現によって生成されれば、免疫グロブリン分子を精製するための、当技術分野で知られている任意の方法、例えばクロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニィティークロマトグラフィー、特にプロテインＡの後における特異的抗原に対するアフィニィティークロマトグラフィー、サイズ分離カラムクロマトグラフィー)、遠心法、分別溶解、又はタンパク質を精製するための他の任意の標準技法によって精製することができる。さらに、本発明の抗体又はその断片は、本明細書に記載の異種ポリペプチド配列、又は別の方法で当技術分野で知られている、精製を容易にする異種ポリペプチド配列に融合させることができる。
【０１１０】
(５．２  EnhA4リガンド融合タンパク質)
本発明は、異種薬剤、特に抗体のＦｃ領域に組換えによって融合されるか、又は化学的に結合されて(共有結合及び非共有結合の両方を含める)、融合タンパク質を生成しているEphA4リガンド、例えば、エフリンA1、A2、A3、A4、A5、B2、及びB3；B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L、及びElk-L3、又はそのリガンド断片(好ましくはEphA4に結合して、そのシグナル伝達を引き起こす断片)を含む融合タンパク質の使用を包含する(Capan及びLaskyによる米国特許第5116964号を参照)。異種薬剤は、ポリペプチド(又は、その部分、好ましくは少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30、少なくとも40、少なくとも50、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、又は少なくとも100アミノ酸のポリペプチ)、核酸、小分子(1000ダルトン未満)、又は他の有機化合物でありうる。融合は、必ずしも直接的である必要がなく、リンカー配列を介してなされることもある。そのような融合タンパク質は、当技術分野で知られている方法を用いて、in vivoで、障害の進行を検出、治療、管理、又はモニターするのに用いることができる。好ましい実施態様では、EphA4リガンド融合タンパク質がEphA4アゴニストとして使用される。
【０１１１】
(５．３  予防方法／治療方法)
本発明は、対象におけるEphA4の過剰発現に関連した疾患もしくは障害及び／又は細胞過増殖障害、好ましくは癌を治療、予防、又は管理する方法を包含し、この方法は、EphA4アゴニスト抗体、又は癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体、又は3×10-1s-1未満のKoffでEphA4に結合するEphA4抗体の１つ又は複数、好ましくは１つ又は複数のモノクローナル(又は、単一抗体種を提供する何らかの他の供給源からの抗体)EphA4アゴニスト抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、露出したEphA4エピトープの抗体、又は3×10-1s-1未満のKoffでEphA4に結合するEphA4抗体を投与することを含む。特定の実施態様では、治療、予防、又は管理される障害が、悪性の癌である。別の特定の実施態様では、治療、予防、又は管理される障害が、前悪性の癌である。
【０１１２】
一実施態様では、本発明の抗体は、EphA4過剰発現、過増殖障害、及び／又は癌に関連した疾患又は障害の治療、予防、又は管理に有用な他の１つ又は複数の治療薬と組み合わせて投与することができる。ある実施態様では、本発明の１つ又は複数のEphA4抗体を、癌の治療に有用な他の１つ又は複数の治療薬と同時に、哺乳動物好ましくはヒトに投与する。「同時に」という用語は、正確に同じ時間に予防薬又は治療薬を投与することに限定されるものではなく、代わりに、本発明の抗体がもう一方の薬剤と共に作用して、それらを別の方法で投与した場合より増大した利益を提供できるように、本発明のEphA4抗体と、他の薬剤とを、順番にある時間間隔以内に対象に投与することを意味する。例えば、それぞれの予防薬又は治療薬は、同時に、又は、異なった時点に任意の順序で順番に投与することができるが、同時に投与しない場合には、望ましい治療又は予防効果を提供するように、それらを十分に短い時間内に投与するべきである。各治療薬は、任意の適切な形態で、任意の適当な経路によって、別々に投与することができる。他の実施態様では、本発明のEphA4抗体を、手術の前、同時に、又は手術の後に投与する。この手術は、局所腫瘍を完全に除去するか、あるいは大きな腫瘍の大きさを縮小させることが好ましい。手術は、予防処置として、又は痛みを軽減するために行うこともある。
【０１１３】
別の特定の実施態様では、本発明の治療及び予防の方法は、限定されるものではないが、EphA4に特異的なアンチセンス核酸、RNAiを媒介する二本鎖のEphA4RNA、及び抗EphA4リボザイムなどのEphA4発現の阻害剤(下記セクション５．５を参照)、又は、EphA4活性の低分子阻害剤又はアゴニストなど、EphA4抗体以外の、EphA4活性のアゴニストを投与することを含む。
別の実施態様では、本発明の１つ又は複数のEphA4アゴニスト薬を、１つ又は複数のEphA2アゴニスト薬と組み合わせて投与する(2004年5月12日に出願された、Kinchらによる米国特許出願第10/436783を参照)。
【０１１４】
様々な実施態様で、予防薬又は治療薬は、1時間未満の間隔で、約1時間の間隔で、約1時間から約2時間の間隔で、約2時間から約3時間の間隔で、約3時間から約4時間の間隔で、約4時間から約5時間の間隔で、約5時間から約6時間約の間隔で、約6時間から約7時間の間隔で、約7時間から約8時間の間隔で、約8時間から約9時間の間隔で、約9時間から約10時間の間隔で、約10時間から約11時間の間隔で、約11時間から約12時間の間隔で、24時間を超えない間隔で、又は48時間を超えない間隔で投与する。好ましい実施態様では、２種類以上の成分を、患者の来診時に、その同じ来診の時間内に投与する。
【０１１５】
本明細書に提供する投与の用量及び頻度は、治療上有効、及び予防上有効という用語によって包含される。この用量及び頻度はさらに、通常、投与される特定の治療薬又は予防薬、癌の重症度及びタイプ、投与経路、そして、患者の年齢、体重、反応、及び過去の病歴に応じた各患者に特異的な因子によって異なるであろう。適切な治療プログラムは、当業者が、そのような因子を考慮し、例えば文献に報告されている用量、及び「医師用添付文書集(Physician's Desk Reference)」(56th ed.、2002)で推奨されている用量に従って、選択することができる。
【０１１６】
(５．３．１  患者集団)
本発明は、本発明の１つ又は複数のEphA4抗体を、それを必要とする対象に、治療上又は予防上有効な量投与することによって、EphA4過剰発現及び／又は過増殖細胞疾患、特に癌に関連した疾患又は障害を治療、予防、及び管理する方法を提供する。別の実施態様では、本発明のEphA4抗体を、他の１つ又は複数の治療薬と組み合わせて投与することができる。対象は、非霊長類(例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、及びラットなど)、ならびに霊長類(例えば、マカクザルなどのサル、及びヒトなど)などの哺乳動物であることが好ましい。好ましい実施態様では、対象がヒトである。
【０１１７】
本発明によって包含される方法によって治療できる癌の特定の例には、EphA4を過剰発現する癌が含まれるが、これらに限定されない。別の実施態様では、癌が上皮細胞由来のものである。そのような癌の例は、肺、大腸、前立腺、乳房、及び皮膚の癌である。他の癌には、膀胱及び膵臓の癌、腎細胞腫、ならびにメラノーマが含まれる。さらに他の癌は、下記セクション５．２．１．１に、限定ではなく例として記載する。特定の実施態様では、本発明の方法を、原発腫瘍からの転移を治療及び／又は予防するのに用いることができる。
【０１１８】
本発明の方法及び組成物は、癌を患っているかあるいは癌を患うことが予測される対象／患者に、例えば、特定のタイプの癌に対する遺伝的素質を有する、発癌性物質に曝露された、あるいは特定の癌からの寛解傾向にある対象／患者に、１つ又は複数の本発明のEphA4抗体を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「癌」は、原発性、又は転移性の癌を指す。そのような患者は、以前に癌の治療を受けている場合もあれば、受けていない場合もある。本発明の方法及び組成物は、第一線の癌治療として用いても、第二線の癌治療として用いてもよい。他の癌治療を受けている患者の治療も、本発明に含まれ、本発明の方法及び組成物は、これらの他の癌治療による何らかの有害な作用、又は不耐が生じる前に用いることができる。本発明は、１つ又は複数の本発明のEphA4抗体を投与して治療抵抗性の患者の症候を治療又は改善する方法も包含する。ある実施態様では、癌が治療抵抗性であるとは、その癌細胞のうち少なくとも何らかの有意の部分が、殺されていないか、あるいは、それらの細胞分裂が停止していないことを意味する。癌細胞が抵抗性であるかどうかの判定は、当技術分野で承認されている「抵抗性」の意味をそのような文脈で用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための、当技術分野で公知の任意の方法によってin vivo又はin vitroで行うことができる。様々な実施態様において、癌が抵抗性であるのは、癌細胞の数が有意に減少していないか、あるいは増大している場合である。本発明は、１つ又は複数のEphA4アゴニスト抗体を投与して、癌に罹る素因を有する患者の癌の開始又は再発を予防する方法も包含する。
【０１１９】
特定の実施態様では、本発明のEphA4抗体、又はEphA4発現を低減する他の治療薬を投与して、特定のホルモン剤、放射線照射、及び化学療法薬に対する癌細胞の耐性、又は低下した感受性を元に戻し、それによって、これらの薬剤のうち１つ又は複数に対して、癌細胞を再び感受性にして、次にそれを投与して(投与を継続して)、転移の予防も含めた、癌の治療又は管理を行うことができる。特定の実施態様では、サイトカインIL-6のレベルが増大している患者に、本発明のEphA4抗体を投与する。IL-6レベルの増大は、化学療法及びホルモン療法など、異なった治療プログラムに対する癌細胞の耐性の発生に関連している。別の特定の実施態様では、本発明のEphA4抗体を、タモキシフェン治療に対して反応性が低下しているかあるいは抵抗性を有する乳癌を患う患者に投与する。別の特定の実施態様では、サイトカインIL-6のレベルが増大している患者に、本発明のEphA4抗体を投与する。IL-6レベルの増大は、化学療法及びホルモン療法など、異なった治療プログラムに対する癌細胞の耐性の発生に関連している。
【０１２０】
代替の実施態様では、本発明は、他の治療に対して抵抗性を有することが判明したがこれらの治療をもう受けていない患者に、１つ又は複数の本発明のEphA4抗体を、任意の他の治療と組み合わせて投与することによって、患者の癌を治療する方法を提供する。ある実施態様では、本発明の方法によって治療される患者は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、又は生物学的療法／免疫療法によって、既に治療されている患者である。このような患者には、治療抵抗性である患者と、既存の癌治療で治療されたにもかかわらず癌を有する患者とが含まれる。他の実施態様では、患者は既に治療されていて、疾患活動性がなく、本発明の１つ又は複数のアゴニスト抗体は、癌の再発を予防するために投与される。
【０１２１】
好ましい実施態様では、既存の治療が化学療法である。特定の実施態様では、既存の治療には、限定されるものではないが、メトトレキセート、タキソール、メルカプトプリン、チオグアニン、ヒドロキシ尿素、シタラビン、シクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシン、デカルバジン、プロカルビジン(procarbizine)、エトポシド、カンパテシン(campathecins)、ブレオマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、プリカマイシン、ミトキサントロン、アスパラギナーゼ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビ、パクリタクセル、ドセタクセルなどの投与を含めた化学療法が含まれる。このような患者には、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は、生物学的療法／免疫療法で治療された患者も含まれる。このような患者には、癌を治療するために手術を受けた患者も含まれる。
【０１２２】
別法として、本発明は、放射線療法を受けているか、あるいは受けたことのある患者を治療する方法も包含する。これらには、化学療法、ホルモン療法、及び／又は、生物学的療法／免疫療法で、治療されているか、あるいは以前に治療された患者も含まれる。このような患者には、癌を治療するために手術を受けた患者も含まれる。
他の実施態様では、本発明は、ホルモン療法、及び／又は、生物学的療法／免疫療法を受けているか、あるいは受けたことのある患者を治療する方法も包含する。これらには、化学療法及び／又は放射線療法で、治療されているか、あるいは以前に治療された患者も含まれる。このような患者には、癌を治療するために手術を受けた患者も含まれる。
【０１２３】
加えて、本発明は、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は、生物学的療法／免疫療法に代わる手段として、癌を治療する方法も提供し、この場合、上記治療は、毒性が強すぎること、すなわち治療されている対象にとって容認できないかあるいは耐え難い副作用もたらすことが判明しているか、あるいは判明する可能性がある。本発明の方法で治療されている対象は、任意選択で、どの治療が容認できないあるいは耐え難いと判明したかに応じて、手術、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、又は生物学的療法など、他の癌治療で治療することができる。
【０１２４】
他の実施態様では、本発明は、他の癌治療を行わずに、そのような治療に対して抵抗性を有することが判明している人の癌を治療するための、１つ又は複数の本発明のアゴニストモノクローナル抗体の投与を提供する。特定の実施態様では、他の癌治療に対して抵抗性を有する患者に、癌治療の非存在下で１つ又は複数のアゴニストモノクローナル抗体を投与する。
他の実施態様では、EphA4を過剰発現する細胞を伴う前悪性の癌を有する患者に、その障害を治療して、悪性の癌に進行する可能性を低減するために、本発明の抗体を投与することができる。特定の実施態様では、前悪性の癌が、高度前立腺上皮細胞内新生物(PIN)、乳房の腺管癌、又は複合母斑である。
【０１２５】
さらに他の実施態様では、本発明は、過増殖非癌細胞障害、詳細には、限定されるものではないが、喘息、慢性閉塞性肺疾(COPD)、再狭窄(平滑筋及び／又は内皮の)、乾せんなどを含めた、EphA4の過剰発現と関連した障害を治療、予防、及び管理する方法を提供する。これらの方法は、例えば、本発明のEphA4抗体の投与、EphA4発現を抑制する薬剤の投与、併用療法、特定の治療に抵抗性を有する患者への投与などによって、癌を治療、予防、及び管理する上述の方法と同様の方法が含まれる。
【０１２６】
(５．３．１．１  癌)
本発明の方法及び組成物で治療、予防、又は管理できる癌及び関連の障害には、上皮細胞由来の癌が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、癌が膵臓癌である。そのような癌の例には、以下のものが含まれる。すなわち、限定されるものではないが、急性白血病、急性リンパ性白血病、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤血球白血球の白血病などの急性骨髄性白血病などの白血病；限定されるものではないが、慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病などの慢性白血病；真正赤血球増加症；限定されるものではないが、ホジキン病、非ホジキン病などのリンパ腫；限定されるものではないが、くすぶり型多発性骨髄腫などの多発性骨髄腫、非分泌骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞性白血病、孤立性形質細胞腫、及び髄外性形質細胞腫；ワルデンストロームマクログロブリン血症；重要性が未決定のモノクローナル高ガンマグロブリン血症；良性モノクローナル高ガンマグロブリン血症；重鎖病；限定されるものではないが、骨肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟組織肉腫、血管肉腫(血管肉腫)、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫などの骨組織及び結合組織肉腫；限定されるものではないが、グリオーマ、星状細胞腫、脳幹膠腫、上衣細胞腫、乏突起膠腫、非グリア腫瘍、聴神経腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、ピネオサイトーマ、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫などの脳腫瘍；限定されるものではないが腺癌、小葉(小細胞)癌、管内癌、乳腺髄様癌、乳房粘液癌、乳房腺管癌、乳頭癌、変形性骨炎、及び炎症性乳癌を含めた乳癌；限定されるものではないが、クロム親和細胞腫及び副腎皮質癌などの副腎癌；限定されるものではないが、乳頭状もしくは濾胞状甲状腺癌、髄様甲状腺癌、及び組織非形成性甲状腺癌などの甲状腺癌；限定されるものではないが、インシュリノーマ、ガストリン産生腫瘍、グルカゴン産生腫瘍、ビポーマ、ソマトスタチン分泌性腫瘍、カルチノイドなどの膵臓癌、又は膵島細胞腫瘍；限定されるものではないが、クッシング氏病、プロラクチン分泌性腫瘍、先端巨大症、及び尿崩症などの下垂体癌；限定されるものではないが、虹彩メラノーマ、脈絡膜メラノーマ、及び毛様体メラノーマなどの眼メラノーマ、ならびに網膜胚種細胞腫などの眼癌；扁平上皮癌、腺癌、及びメラノーマなどの腟癌；扁平上皮癌、メラノーマ、腺癌、基底細胞腺癌、肉腫、及びパジェット病などの外陰部癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、及び腺癌などの子宮頚部癌；限定されるものではないが、子宮内膜癌、及び子宮肉腫などの子宮癌；限定されるものではないが、卵巣上皮癌、境界型腫瘍、生殖細胞腫瘍、及び間質腫瘍などの卵巣癌；限定されるものではないが、扁平上皮癌、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平細胞癌、肉腫、メラノーマ、プラズマ細胞腫、疣状癌、及び燕麦細胞(小細胞)癌などの食道癌；限定されるものではないが、腺癌、菌状(ポリープ状)癌、潰瘍性癌、表在拡大型癌、散在拡大型癌、悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫などの胃癌；腸癌；肛門癌；限定されるもの��はないが、原発性肝細胞癌、及び肝芽腫などの肝臓癌；腺癌などの胆嚢癌；限定されるものではないが、乳頭状癌、結節性癌、散在性癌などの胆管癌；非小細胞肺癌、扁平上皮癌(類表皮癌)、腺癌、大細胞癌、及び小細胞肺癌などの肺癌；限定されるものではないが、胚細胞腫瘍、セミノーマ、未分化癌、古典的(定常型)セミノーマ、精母細胞性癌、非精上皮腫性癌、胎児性癌、奇形腫癌腫、絨毛膜癌((卵黄嚢腫瘍)、ならびに限定されるものではないが、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫などの前立腺癌などの精巣癌；陰茎癌；限定されるものではないが扁平上皮癌などの口腔癌；基底細胞癌；限定されるものではないが腺癌、粘表皮癌、及び腺様嚢胞癌などの唾液腺癌；限定されるものではないが扁平上皮癌、及びいぼ状癌のなどの咽頭部癌；限定されるものではないが、基底細胞腺癌、扁平上皮癌及びメラノーマ、表在拡大型黒色腫、結節性メラノーマ、悪性黒子メラノーマ、末端性ほくろ性黒色腫などの皮膚癌；限定されるものではないが、腎細胞腫、腺癌、腎癌、線維肉腫、移行細胞癌(腎盂及び／又は子宮)などの腎癌；ウイルムス腫瘍；限定されるものではないが移行細胞癌、扁平上皮癌、腺癌、癌肉腫などの膀胱癌である。加えて、癌には、粘液肉腫、骨原性肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑液膜腫、血管芽細胞腫、上皮癌腫、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、及び乳頭状腺癌が含まれる(そのような障害に関する概説には、Fishmanらの論文(1985、Medicine、2d Ed.、J.B.Lippincott Co. 、Philadelphia)、Murphyらの論文「情報に基づいた決断：癌診断、治療、及び回復のすべてに関する本(Informed Decisions: The Complete Book of Cancer Diagnosis, Treatment, and Recovery)」(1997、Viking Penguin、Penguin Books U.S.A., Inc.、United States of America)を参照のこと)。
【０１２７】
したがって、本発明の方法及び組成物は、以下のものを含めた(ただしこれらに限定されない)様々な癌又は他の異常増殖疾患の治療又は予防に有用である。すなわち、扁平上皮癌を含めた膀胱、乳房、大腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、頚管、甲状腺、及び皮膚のものを含めた癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞性リンパ腫、Ｔ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫を含めたリンパ系統の造血器腫瘍；急性及び慢性の骨肉腫性白血病及び前骨髄球性白血病を含めた骨髄系統の造血器腫瘍；線維肉腫、及び横紋筋肉腫を含めた間充織由来の腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、テラトカルシノーマ、神経芽細胞腫、及びグリオーマを含めた他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経こう腫、及び神経鞘腫を含めた中枢及び末梢の神経系の腫瘍；線維肉腫、及び横紋筋肉腫を含めた間充織由来の腫瘍；ならびに、メラノーマ、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、セミノーマ、甲状腺濾胞癌、及びテラトカルシノーマを含めた他の腫瘍である。アポトーシスにおける染色体異常によって引き起こされる癌も、本発明の方法及び組成物によって治療されるであろうことも企図されている。そのような癌には、濾胞性リンパ腫、p53変異を有する癌腫、乳房、前立腺、及び卵巣のホルモン依存性腫瘍、ならびに、家族性大腸腺腫症及び骨髄異形成症候群などの前癌病変が含まれうるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、皮膚、肺、大腸、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、膵臓、卵巣、又は子宮における悪性腫瘍、増殖性病変(化生及び異形成など)、又は過増殖障害を治療又は予防する。他の特定の実施態様では、肉腫、メラノーマ、又は白血病を、治療又は予防する。
【０１２８】
ある実施態様では、癌が悪性であり、かつEphA4を過剰発現する。他の実施態様では、癌が前悪性であり、かつEphA4を過剰発現する。好ましい実施態様では、本発明の方法及び組成物が、乳癌、大腸癌、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、及びメラノーマの治療及び／又は予防に使用されるが、これらを、限定ではなく例として以下に提供する。
【０１２９】
(５．３．１．２  乳癌の治療)
特定の実施態様では、乳癌の患者に、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を有効な量投与する。別の実施態様では、限定されるものではないが、ドキソルビシン、エピルビシン、ドキソルビシンとシクロホスファミド(AC)との組合せ、シクロホスファミドとドキソルビシンと5-フルオロウラシル(CAF)との組合せ、シクロホスファミドとエピルビシンと5-フルオロウラシル(CEF)との組合せ、ハーセプチン、タモキシフェン、タモキシフェンと細胞毒性化学療法との組合せタキサン(ドセタクセル及びパクリタクセルなど)を含めた、乳癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤の有効な量と組み合わせて、本発明の抗体を投与することができる。別の実施態様では、結節陽性の局所性乳癌の補助薬物療法に、タキサンを追加した標準的なドキソルビシン及びシクロホスファミドと共に、本発明の抗体を投与することができる。
特定の実施態様では、前悪性の乳房腺管癌の患者に、この障害を治療して、悪性乳房癌に進行する可能性を低減するために、本発明のEphA4抗体を投与する。
【０１３０】
(５．３．１．３  大腸癌の治療)
特定の実施態様では、大腸癌の患者に、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を有効な量投与する。別の実施態様では、限定されるものではないが、5-FUとロイコボリンとの組合せ、5-FUとレバミゾールとの組合せ、イリノテカン(CPT-11)、又は、イリノテカンと5-FUとロイコボリン(IFL)との組合せを含めた大腸癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤の有効な量と組み合わせて、本発明の抗体を投与することができる。
【０１３１】
(５．３．１．４  前立腺癌の治療)
特定の実施態様では、前立腺癌の患者に、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を有効な量投与する。別の実施態様では、限定されるものではないが、外部ビーム放射線療法、放射性同位元素(すなわち、I125、パラジウム、イリジウム)の組織間腔皮内移植、ロイプロリド又は他のLHRHアゴニスト、非ステロイド性抗アンドロゲン(フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド)、ステロイド性抗アンドロゲン(酢酸シプロテロン)、ロイプロリドとフルタミドとの組合せ、エストロゲン、例えば、DES、クロロトリアニセン、エチニルエストラジオール、抱合卵胞ホルモンU.S.P.、DES二リン酸など、ストロンチウム89などの放射性同位元素、外部ビーム放射線療法とストロンチウム-89との組合せ、アミノグルテチミド、ヒドロコルチゾン、フルタミド離脱、プロゲステロン、ケトコナゾール、及び低用量のプレドニソンなどの第二線ホルモン療法、あるいは、ドセタクセル、パクリタクセル、エストラムスチン／ドセタクセル、エストラムスチン／エトポシド、エストラムスチン／ビンブラスチン、及びエストラムスチン／パクリタクセルを含めた、対象の症候の改善とＰＳＡレベルの低減を生み出すことが報告されている他の化学療法プログラムを含めた、前立腺癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤の有効な量と組み合わせて、本発明の抗体を投与することができる。
特定の実施態様では、前悪性の高度前立腺上皮細胞内新生物(PIN)の患者に、この障害を治療して、悪性前立腺癌に進行する可能性を低減するために、本発明のEphA4抗体を投与する。
【０１３２】
(５．３．１．５  メラノーマの治療)
特定の実施態様では、メラノーマの患者に、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を有効な量投与する。別の実施態様では、限定されるものではないが、デカルバジン(DTIC)、カルムスチン(BCNU)及びロムスチン(CCNU)などのニトロソ尿素、ビンカアルカロイドと白金化合物とタキサンとを含めた穏やかな単剤活性を有する薬剤、ダートマス療法(Dartmouth regimen)(シスプラチン、BCNU、及びDTIC)、インターフェロンアルファ(IFN-A)、及びインターロイキン-2(IL-2)を含めたメラノーマ癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤の有効な量と組み合わせて、本発明の抗体を投与することができる。特定の実施態様では、放射線療法で症候の軽減といくらかの腫瘍の収縮とを実現するために、メルファラン(L-PAM)を用いた分離式四肢温熱潅流(isolated hyperthermic limb perfusion)(ILP)と組み合わせて、腫瘍壊死因子アルファ(TNFアルファ)の存在下又は非存在下で、多重脳転移、骨転移、及び脊髄圧迫を患う患者に、本発明の１つ又は複数のアゴニストモノクローナル抗体の有効な量を投与することができる。
特定の実施態様では、前悪性の複合母斑を有する患者に、この障害を治療して、悪性メラノーマに進行する可能性を低減するために、本発明のEphA4抗体を投与する。
【０１３３】
(５．３．１．６  卵巣癌の治療)
特定の実施態様では、卵巣癌の患者に、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を有効な量投与する。別の実施態様では、限定されるものではないが、P32治療などの腹腔内放射線療法、全腹部及び骨盤の放射線療法、シスプラチン、パクリタクセル(タキソール)もしくはドセタクセル(タキソテレ)とシスプラチンもしくはカルボプラチンとの組合せ、シクロホスファミドとシスプラチンとの組合せ、シクロホスファミドとカルボプラチンとの組合せ、5-FUとロイコボリンとの組合せ、エトポシド、リポソームドキソルビシン、ゲムシタビン、又はトポテカンを含めた、卵巣癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤の有効な量と組み合わせて、本発明の抗体を投与することができる。プラチナ抵抗性の患者に、タキソール投与と組み合わせて、本発明の１つ又は複数のアゴニストモノクローナル抗体を有効な量投与することが企図されている。プラチナ抵抗性の疾患を有する患者へのイホスファミドの投与と、シスプラチンを基礎として併用療法が不成功であった後の救助化学療法としてのヘキサメチルメラミン(HMM)の投与と、腫瘍に検出可能なレベルの細胞質エストロゲン受容体を有する患者へのタモキシフェンの投与とを含めた、治療抵抗性の卵巣癌を有する患者の治療も含まれる。
【０１３４】
(５．３．１．７  肺癌の治療)
特定の実施態様では、小細胞肺癌の患者に、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を有効な量投与する。別の実施態様では、限定されるものではないが、胸部放射線療法、シスプラチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びエトポシドの単独投与又は併用投与、シクロホスファミドとドキソルビシンとビンクリスチン／エトポシドとシスプラチン(CAV/EP)との組合せ、気管支内レーザ療法による局所緩和、気管支内ステント、及び／又は近接照射療法を含めた肺癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤の有効な量と組み合わせて、本発明の抗体を投与することができる。
【０１３５】
他の特定の実施態様では、非小細胞肺癌の患者に、限定されるものではないが、姑息的な放射線療法、シスプラチンとビンブラスチンとマイトマイシンとの組合せ、シスプラチンとビノレルビンとの組合せ、パクリタクセル、ドセタクセル、又はゲムシタビン、カルボプラチンとパクリタクセルとの組合せ、気管支内病変に対する組織内照射治療、あるいは定位的放射線照射療法を含めた肺癌治療に有用な他の１つ又は複数の薬剤の有効な量と組み合わせて、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を有効な量投与する。
【０１３６】
(５．３．２  他の予防薬／治療薬)
一部の実施態様では、１つ又は複数のモノクローナル抗体の投与による治療を、限定されるものではないが、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、及び／又は、生物学的療法／免疫療法などの治療の１つ又は複数の投与と組み合わせる。予防薬／治療薬には、限定されるものではないが、ペプチド、ポリペプチド、ならびに翻訳後修飾されたタンパク質及び抗体などを含めたタンパク質を含めたタンパク質性分子；小分子(1000ダルトン未満)、無機又は有機的化合物；あるいは、限定されるものではないが、二本鎖もしくは一本鎖のDNA、又は二本鎖もしくは一本鎖のRNA、ならびに三重らせん核酸分子を含めた核酸分子が含まれるが、これらに限定されない。予防薬／治療薬は、任意の既知の生物(限定されるものではないが動物、植物、細菌、真菌、及び原生生物、又はウイルスが含まれる)、あるいは合成分子ライブラリーから得ることができる。
【０１３７】
特定の実施態様では、本発明の方法は、新生阻害剤である予防薬／治療薬の１つ又は複数の投与と組み合わせて、本発明の治療抗体を投与することを包含する。限定されるものではないが、アンギオスタチン(プラスミノーゲン断片)；抗血管形成性アンチトロンビンIII；アンジオザイム(Angiozyme)；ABT-627；Bay 12-9566；ベネフィン；ベバシズマブ；BMS275291；軟骨由来阻害剤(CDI)；CAI；CD59補体断片；CEP-7055；Col 3；コンブレタスタチンA-4；エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)；フィブロネクチン断片；Gro-ベータ；ハロフジノン；ヘパリナーゼ；ヘパリン六糖断片；HMV833；ヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)；IM-862；インターフェロンアルファ／ベータ／ガンマ；インターフェロン誘導タンパク質(IP-10)；インターロイキン-12；クリングル5(プラスミノーゲン断片)；マリマスタット；メタロプロテイナーゼ阻害剤(TIMPs)；2-メソキシエストラジオール；MMI270(CGS27023A)；MoAb IMC- lC11；ネオバスタット；NM-3；パンゼム(Panzem)；PI-88；胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；血小板因子-4(PF4)；プリノマスタット；プロラクチン16kDは断片化する；プロリフェリン関連タンパク質(PRP)；PTK787/ZK222594；レチノイド；ソリマスタット(Solimastat)；スクアラミン；SS3304;SU5416;SU6668;SU11248；テトラハイドロコルチゾル-S；テトラチオモリブデン酸；サリドマイド；トロンボスポンジン-1(TSP-1)；TNP-470；トランスフォーミング成長ファクターベータ(TGF)；バスキュロスタチン(Vasculostatin)；バソスタチン(Vasostatin)(カルレティキュリン断片)；ZD6126;ZD6474；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(FTI)；及びビスホスホン酸塩。
【０１３８】
本発明の医薬組成物、製剤、及びキットを含めた、本発明の様々な実施態様で使用できる抗癌剤の追加の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン(ambomycin)、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン(anthramycin)、アスパラギナーゼ、アスペルリン(asperlin)、アザシチジン、アゼテパ(azetepa)、アゾトマイシン(azotomycin)、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメイレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルブビシン(carubicin hydrochloride)、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロランブシル、シロルマイン(cirolemycin)、シスプラチン、クラドリビン、クリスナトールメシラート、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、ダカルバジン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、デザグアニンメシラート、ジアジクォン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ドアゾマイシン(duazomycin)、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン(elsamitrucin)、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール(erbulozole)、塩酸エソルビシン(esorubicin hydrochloride)、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン(etoprine)、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキン2(組換え体のインターロイキン2、すなわちrIL2を含める)、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ-n1、インターフェロンアルファ-n3、インターフェロンベータ-I a、インターフェロンガンマ-I b、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロエタミン、酢酸メゲステロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキセートナトリウム、メトプリン(metoprine)、メツレデパ、ミチンドミド、マイトカルシン(mitocarcin)、ミトクロミン(mitocromin)、ミトギリン、ミトマルシン(mitomalcin)、マイトマイシン、ミトスペル(mitosper)、ミトタン、塩酸ミトザントロン、ミコフェノール酸、ニトロソ尿素、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン(peliomycin)、ペンタムスチン(pentamustine)、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニマスチン、塩酸プロカルバシン、プロマイシン、塩酸プロマイシン、ピラゾフリン(pyrazofurin)、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフル、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレステロン(trestolone acetate)、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシネート(vinglycinate sulfate)、硫酸ビンレウロシン、酒石酸ビノレルビ、硫酸ビンゾリジン(vinzolidine sulfate)、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾウビシン(zorubicin hydrochloride)である。他の抗癌剤には、20-エピ-1,25ジヒドロキシビタミンD3,5-エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール(adecypenol)、アドゼレシン、アルデスロイキン、ALL-TKアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス(amidox)、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラホリド、新生阻害剤、アンタゴニストD、アンタゴニストG、アンタレリクス(antarelix)、抗-背方化形態形成タンパク質-1、抗アンドロゲン、抗エストロゲン薬、アンチネオプラストン、アフィジコリングリシナート、アポトーシス遺伝子変調因子、アポトーシス調節因子、アプリン酸、ara-CDP-DL-PTBA、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン(asulacrine)、アタメスタン(atamestane)、アトリムスチン、アキシナスタチン(axinastatin)１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキン(azatoxin)、アザチロシン、バッカチンIII誘導体、バラノール(balanol)、バチマスタット、BCR/ABLアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータアレシン(beta-alethine)、ベタクラマイシンＢ(betaclamycin B)、ベツリン酸、bFGF阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ(bistratene A)、ビゼレシン、ブレフレート(breflate)、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリア痘ウイルスIL-2、カペシタビン、カルボキシアミドアミノトリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、CaRest M3、CARN700、軟骨由来抑制物質、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害薬(ICOS)、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリクス、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプ��スト、シス-ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェンアナログ、クロトリマゾール、コリスマイシン(collismycin)Ａ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベスシジン816、クリスナトール、クリプトフィシン(cryptophycin)８、クリプトフィシンＡ誘導体、キュラシンＡ、シクロペンタントラキノン(cyclopentanthraquinone)、シクロプラタム(cycloplatam)、サイペマイシン(cypemycin)、シタラビンオクホスファート、細胞溶解因子、サイトスタチン、ダクリキシマブ(dacliximab)、デシタビン、デヒドトダデムニンＢ、デスロレリン、デキサメサゾン、デキシホスファミド(dexifosfamide)、デキスラゾキサン、デクスベラパミル、ジアジクォン、ダイデムニンＢ、ジドックス(didox)、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ5-アザシチジン、ジヒドロタキソール、ジオクサマイシン(dioxamycin)、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、ズオカルマイシンSA、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、リン酸エトポシド、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチン、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン(fluasterone)、フルダラビン、塩酸フルオロダウノルニシン(fluorodaunorunicin hydrochloride)、ホルフェニメクス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスファム(hepsulfam)、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセタミド、ハイペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン(imidazoacridone)、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インシュリン様成長因子-１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、イオベングアン、イオドクソルビシン(iododoxorubicin)、イポメアノール、イロプラクト(iroplact)、イルソグラジン、イソベンガゾール(isobengazole)、イソホモハリコンドリン(isohomohalicondrin)Ｂ、イタセトロン、ジャスプラキノリド(jasplakinolide)、カハラリド(kahalalide)Ｆ、ラメラリン-Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、レンチナン硫酸、レプトルスタチン(leptolstatin)、レトロゾール、白血病阻害因子、白血球アルファインターフェロン、ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リユープロレリン、レバミソール、リアロゾール、線形ポリアミン類似体、親油性二糖ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド(lissoclinamide)７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ラートテカン(lurtotecan)、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン(lysofylline)、分解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリリジン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害薬、メノガリル、メルバロン(merbarone)、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖RNA、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、メトナフィド、マイトトキシン繊維芽細胞成長因子サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、モノホスホリルリピドＡ＋放線菌細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、多重腫瘍抑制物質１(multiple tumor suppressor 1)ベースの治療、マスタード抗癌剤、マイカペロキシド(mycaperoxide)Ｂ、放線菌細胞壁抽出物、ミリアポロン(myriaporone)、N-アセチルジナリン(N-acetyldinaline)、N-置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスティップ(nagrestip)、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン(napavin)、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン(nemorubicin)、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン(nisamycin)、一酸化窒素変調因子、ニトロキシド抗酸化剤、ニトルリン(nitrullyn)、O6-ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン(okicenone)、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン(oracin)、経口サイトカイン誘発剤(oral cytokine inducer)、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキザウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン(palauamine)、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン(parabactin)、パゼリプチン、ペガスパルガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール(pentrozole)、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニル酢酸、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニール、塩酸ピロカルピン、ピラルビシン、
ピリトレキシム、プラセチン(placetin)Ａ、プラセチンＢ、プラスミノーゲン活性化因子抑制因子、プラチナ錯体、白金化合物、プラチナトリアミン錯体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニソン、プロピルビスアクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、プロテインＡベースの免疫変調薬、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類、タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン(pyrazoloacridine)、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレン結合体、rafアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、rasファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ras阻害剤、ras-GAP阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウム(Re 186)エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、RIIレチナミド、ログレチミド、ロヒツカイン(rohitu ine)、ロムルチド、ロキニメクス、ルビジノン(rubiginone)B1、ルボキシル(ruboxyl)、サフィンゴール、サイントピン(saintopin)、SarCNU、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Sdi 1ミメティック、セムスチン、老化由来抑制物質１(senescence derived inhibitor 1)、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達変調因子、単一鎖抗原結合タンパク質、シゾフィラン、ソブゾキサン、ボロカプタートナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール(solverol)、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルホス酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン(splenopentin)、スポンギスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド(stipiamide)、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン(sulfinosine)、過活性(superactive)血管作動性小腸ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ(suradista)、スラミン、スワンソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオジド、タウロムスチン、タキソール、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフル、テルラピリリウム(tellurapyrylium)、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキサイド、テトラゾミン(tetrazomine)、サリブラスチン(thaliblastine)、サリドマイド、チオコラリン(thiocoraline)、チオグアニン、トロンボポイエチン、トロンボポイエチンミメティック、チマルファシン、サイモポエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、二塩化チタノセン、トプセンチン(topsentin)、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、泌尿生殖洞由来増殖抑制因子、ウロキナーゼレセプターアンタゴニスト、バプレオチド、バリオリン(variolin)Ｂ、ベクターシステム、赤血球遺伝子療法、ベラレソール、ベラミン(veramine)、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、バイタクシン、ボロゾール、ザノテロン(zanoterone)、ゼニプラチン、ジラスコルブ、及びジノスタチンスチマラマーが含まれるが、これらに限定されない。好ましい追加の抗癌剤は��5-フルオロウラシル及びロイコボリンである。
【０１３９】
より具体的な実施態様では、本発明は、好ましくは上述の通り乳癌、卵巣癌、メラノーマ、前立腺癌、大腸癌、及び肺癌を治療するために、限定されるものではないが、表１に開示するものなど、抗癌剤などの治療の１つ又は複数の投与と組み合わせて、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を投与することを含む。
【０１４０】
【表１】
2007522096.tif 000003
2007522096.tif 000004
【０１４１】
本発明は、癌細胞を破壊するために、エックス線、ガンマ線、及び他の線源の放射線照射の使用を含む放射線療法と組み合わせて、本発明のEphA4抗体を投与することを包含する。好ましい実施態様では、外部ビーム放射線照射又は遠隔療法として放射線療法を投与し、この場合、放射線照射は離れた線源から行われる。他の好ましい実施態様では、内部療法又は近接照射療法として放射線療法を投与し、この場合、放射能源は、癌細胞又は腫瘍塊の近くの体内に置かれる。
【０１４２】
癌治療及びそれらの用量、投与の経路、及び推奨される使用は、当技術分野で公知であり、「医師用添付文書集(Physician's Desk Reference)」(56th ed.、2002)などの文献に記載されている。
【０１４３】
(５．４  本発明の抗体の同定)
(５．４．１  アゴニスト抗体)
本発明の抗体は、EphA4受容体に免疫特異的に結合するだけでなく、好ましくは、アゴニストとして作用する(すなわち、EphA4リン酸化を引き起こす)ことができる。アゴニストとして作用する場合、EphA4は、75kDaのEphA4関連タンパク質をリン酸化し、それ自体がリン酸化されて、その後、分解されることがある。候補EphA4抗体をアッセイして、そのアゴニスト活性を決定するのに、EphA4又は75kDaのEphA4関連タンパク質のいずれかのリン酸化、活性、又は発現のレベルをアッセイする、当技術分野で知られている任意の方法を用いることができる(例えば、下記セクション６．２を参照)。
【０１４４】
(５．４．２  癌細胞で露出したEphA4エピトープに選択的に結合する抗体)
本発明の抗体は、好ましくは、非癌細胞又はEphA4リガンドが結合している細胞ではなく、癌細胞(例えば、EphA4を過剰発現する細胞、及び／又はリガンドに結合していない相当量のEphA4を有する細胞)で露出したEphA4エピトープに結合することができる。この実施態様では、本発明の抗体は、非癌細胞では露出していないが、癌細胞では露出しているEphA4エピトープに対して産生された抗体である。
【０１４５】
望ましい結合特性を有するものを得るために、候補抗体をスクリーニングするには、当技術分野で知られている、細胞における候補EphA4抗体の結合／局在性を測定する任意の方法を用いることができる。一実施態様では、抗体の結合特性を測定するのに、免疫蛍光顕微鏡検査を用いる。標準的な技法を用いて、in vitroで増殖する細胞に対する抗体結合の結合を比較することができる。特定の実施態様では、癌細胞に対する抗体結合を、非癌細胞に対する抗体結合と比較する。露出したEphA4エピトープの抗体は、非癌細胞には貧弱に結合するが、癌細胞には良好に結合する。別の特定の実施態様では、非癌性解離細胞(例えば、ＥＧＴＡなどのカルシウムキレート剤で処理される)に対する抗体結合を、分離されていない非癌細胞に対する抗体結合と比較する。露出したEphA4エピトープの抗体は、分離されていない非癌細胞には貧弱に結合するが、分離された非癌細胞には良好に結合する。
【０１４６】
別の実施態様では、抗体の結合特性を測定するのに、フローサイトメトリーを用いる。この実施態様では、EphA4がそのリガンドに架橋されることもあれば、架橋されないこともある。露出したEphA4エピトープの抗体は、架橋されたEphA4には貧弱に結合するが、架橋されていないEphA4には良好に結合する。
別の実施態様では、抗体の結合特性を測定するのに、細胞ベースのアッセイ又はイムノアッセイを用いる。この実施態様では、EphA4リガンド(例えば、エフリンA1、A2、A3、A4、A5、B2、及びB3；B61、AL1/RAGS、LERK4、Htk-L、及びElk-L3)と、EphA4に対する結合を競合できる抗体によって、リガンドがEphA4から置換除去される。このアッセイで使用されるEphA4リガンドは、可溶性タンパク質(例えば組換え発現される)であるか、あるいは細胞表面に発現されて、細胞に固着されるものである。
【０１４７】
(５．４．３  癌細胞表現型を抑制する抗体)
本発明の抗体は、EphA4受容体に免疫特異的に結合するだけでなく、好ましくは、例えば、軟寒天中での癌細胞コロニー形成、又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を抑制する(好ましくは減弱させる)ことができる。当業者は、候補EphA4抗体が、そのような挙動を抑制する能力をアッセイすることができる(例えば、下記セクション６．３を参照)。軟寒天に懸濁された転移性腫瘍細胞は、コロニーを形成したが、良性腫瘍細胞は形成しなかった。軟寒天中でのコロニー形成は、Zelinskiらの論文(2001、Cancer Res. 61: 2301-6)(この開示を参照により全体として本明細書に組み込む)に記載されている通りにアッセイすることができる。アゴニスト活性をアッセイされる抗体は、下層寒天液又は上層寒天液中に含有させることができる。転移性腫瘍細胞は、軟寒天に懸濁して、増殖させることができる。癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体は、コロニー形成を抑制するであろう。
【０１４８】
癌細胞表現型を抑制する抗体を同定するのに使用できる転移性腫瘍細胞に特異的な別の挙動は、MATRIGEL(商標)などの、三次元微環境中での管状ネットワーク形成である。通常、癌細胞は、速やかに管状ネットワークに集合し、これがMATRIGEL(商標)全体に進行的に侵入する。癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体の存在下では、癌細胞は分化した非癌細胞の挙動に類似する球状構造体に集合する。したがって、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体は、それらが、癌細胞の管状ネットワーク形成を抑制する能力によって同定することができる。
【０１４９】
細胞増殖における接触阻害の増大(例えば単層細胞培養におけるコロニー形成の減少)を検出する任意の他の方法も、癌細胞表現型を抑制する抗体を同定するのに使用することができる。
癌細胞のコロニー形成を抑制することに加えて、癌細胞表現型を抑制する抗体は、既に確立されている癌細胞コロニーに添加された場合、細胞殺害によって、例えば壊死又はアポトーシスによって、コロニーの減少又は消滅を引き起こすこともある。壊死及びアポトーシスをアッセイする方法は当技術分野で周知である。
【０１５０】
(５．４．４  低Koff率を有する抗体)
本発明のモノクローナル抗体の、EphA4又はその断片に対する結合親和性、及びモノクローナル抗体-EphA4相互作用の解離速度を、競合結合アッセイによって測定することができる。競合結合アッセイの一例は、無標識のEphA4の量を増大させながら、その存在下で、標識されたEphA4(例えば3H又は125I)を、注目しているモノクローナル抗体と共にインキュベートすること、及び、標識されたEphA4に結合したモノクローナル抗体の検出を含むラジオイムノアッセイである。EphA4に対するモノクローナル抗体の親和性、及び結合解離速度は、スキャッチャードプロット分析によって、データから決定することができる。第２のモノクローナル抗体との競合も、ラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合は、無標識の第２のモノクローナル抗体の量を増大させながら、その存在下で、EphA4を、標識化合物(例えば3H又は125I)に結合されているモノクローナル抗体とインキュベートする。
【０１５１】
好ましい実施態様では、EphA4-EphA4抗体相互作用に関する動態パラメータを特徴付けるために、当技術分野で知られている、表面プラズモン共鳴法に基づいた任意のアッセイを用いて、候補EphA4抗体をアッセイすることができる。本発明には、限定されるものではないが、Biacore AB(Uppsala、Sweden)販売のBIACORE装置、Affinity Sensors(Franklin、MA)販売のIAsys装置、Windsor Scientific Limited(Berks、UK)販売のIBISシステム、日本レーザ電子株式会社(北海道)販売のSPR-CELLIAシステム、及びTexas Instruments(Dallas、TX)販売のSPR検出器Spreeta(商標)を含めた市販されている任意のSPR測定器を用いることができる。SPRベースの技術に関する概説には、参照により全体として本明細書に組み込まれている、Mulletらの論文(2000、Methods 22: 77-91)；Dongらの論文(2002、Review in Mol. Biotech.、82: 303-23)；Fivashらの論文(1998、Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101)；Richらの論文(2000、Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61)を参照されたい。さらに、本発明の方法では、参照により全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第6373577号;第6289286号;第5322798号;第5341215号;及び第6268125号に記載されている、タンパク質間相互作用を測定する、いかなるSPR測定器及びSPRベースの方法も企図されている。
【０１５２】
簡潔には、SPRベースのアッセイでは、結合対のメンバーの１つを表面に固定して、溶液中における、結合対のもう一方のメンバーとの相互作用をモニタリングする。SPRは、複合体の形成又は解離の際に起こる表面近傍の溶剤の屈折率の変化を測定することに基づいている。固定が行われる表面がセンサーチップであり、これがSPR技術の心臓部であるが、これは、金の薄層がコーティングされているガラス表面からなり、表面への分子の結合を最適にするように設計された様々な専門化された表面の基盤を形成している。様々なセンサーチップが、とりわけ上記の会社から市販されているが、それらはすべて、本発明の方法で用いることができる。センサーチップの例には、BIAcore AB, Inc.販売のもの、例えば、センサーチップCM5、SA、NTA、及びHPAが含まれる。本発明の分子は、限定されるものではないが、アミン基を介した共有結合による直接結合、スルフヒドリル基を介した共有結合による直接結合、アビジンコーティングされた表面へのビオチン結合、炭化水素基へのアルデヒド結合、及び、ヒスチジンタグを介したNTAチップとの結合を含めた、当技術分野で知られている不動化の方法及び化学の任意のものを用いてセンサーチップ表面に固定することができる。
【０１５３】
より好ましい実施態様では、EphA4に対するモノクローナル抗体の結合速度及び結合解離速度を測定するのに、BIACORE(商標)反応速度分析を用いる(例えば、下記セクション６．５を参照)。BIACORE(商標)反応速度分析は、固定されたEphA4又はその断片をその表面に有するチップスからの、モノクローナル抗体の結合及び解離を分析することを含む。
【０１５４】
ひとたび全体データセットが収集されれば、その結果得られる結合曲線を、製造会社であるBIAcore, Inc.(Piscataway、NJ)によって供給されたコンピューターアルゴリズムを用いて、グローバルフィッティングを行う。これらのアルゴリズムは、Kon及びKoffの両方を計算し、これから、見かけの平衡結合定数KDを、２つの速度定数の比(すなわちKoff/Kon)として推論する。個々の速度定数がどのようにして得られるかに関する、より詳細な処理は、「BIAevaluaionソフトウェアハンドブック(BIAevaluaion Software Handbook)」(BIAcore, Inc.、Piscataway、NJ)に見出すことができる。生成されるデータの分析は、当技術分野で知られている任意の方法を用いて行うことができる。生成された速度データを解釈する様々な方法に関する概説には、参照により全体として本明細書に組み込まれている、Myszkaの論文(1997、Current Opinion in Biotechnology 8: 50-7)；Fisherらの論文(1994、Current Opinion in Biotechnology 5: 389-95)；O'Shannessyの論文(1994、Current Opinion in Biotechnology、5: 65-71)；Chaikenらの論文(1992、Analytical Biochemistry、201: 197-210)；Mortonらの論文(1995、Analytical Biochemistry 227: 176-85)；及び、O'Shannessyらの論文(1996、Analytical Biochemistry 236: 275-83)を参照されたい。
【０１５５】
EphA4に免疫特異的に結合する抗体は、好ましくは、3×10-3s-1未満、10-3s-1未満、10-4s-1未満、5×10-4s-1未満、10-5s-1未満、5×10-5s-1未満、10-6s-1未満、5×10-6s-1未満、10-7s-1未満、5×10-7s-1未満、10-8s-1未満、5×10-8s-1未満、10-9s-1未満、5×10-9s-1未満、又は10-10s-1未満のKoff率
【０１５６】
【数１】
2007522096.tif 000005
を有する。
【０１５７】
したがって、本発明は、EphA4に特異的に結合する抗体、詳細にはEphA4の細胞外ドメインに結合する抗体を、EphA4を発現する細胞、詳細にはEphA4を過剰発現する(同じ細胞型の非癌細胞と比較して)癌細胞、好ましくは転移性癌細胞とインキュベートして、その後、EphA4リン酸化及び／又はEphA4分解の増大(アゴニスト抗体を得るために)、あるいは、軟寒天中でのコロニー形成又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成の低減(癌細胞表現型を抑制する抗体を得るために)、あるいは、例えば免疫蛍光法によって非発癌細胞と比較した癌細胞に対する抗体結合の増大(露出したEphA4エピトープの抗体を得るために)をアッセイして、それによって、本発明のEphA4抗体を同定することによる、本発明のEphA4抗体を得るためのアッセイ及びスクリーニングの方法を提供する。
【０１５８】
(５．５  核酸分子)
本発明のEphA4抗体に加えて、EphA4に特異的な核酸分子も、EphA4発現を減少させるのに用いることができ、したがって、本発明の方法で用いることができる。
【０１５９】
(５．５．１  アンチセンス)
本発明は、アンチセンス核酸分子、すなわち、EphA4をコードするセンス核酸の全体又は一部に相補的な分子、例えば、二本鎖cDNA分子のコード鎖に相補的であるか、又はmRNA配列に相補的な分子を包含する。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合することができる。アンチセンス核酸は、コード鎖全体に相補的なこともあれば、その一部、例えばタンパク質コード領域(又はオープンリーディングフレーム)の全体又は一部にのみ相補的なこともある。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード鎖における非コード領域の全体又は一部に対してアンチセンスである場合がある。非コード領域(「５’及び３’非翻訳領域」)は、コード領域に隣接し、かつアミノ酸に翻訳されない５’及び３’の配列である。
【０１６０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが、例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、又は50ヌクレオチドでありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当技術分野で知られている操作法を用いた化学合成、及び酵素による連結反応を用いて構築することができる。例えば、アンチセンス核酸(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは、分子の生物学的安定性を増強するように、又は、アンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二本鎖分子の物理的安定性を増強するように設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを用いて化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生成するのに使用できる修飾ヌクレオチドの例には、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルキュェオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルキュェオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、(acp3)w及び2,6-ジアミノプリンが含まれる。別法として、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向でサブクローニングされている発現ベクターを用いて、生物学的に生成することができる(すなわち、挿入された核酸から転写されるRNAは、注目している標的核酸、すなわちEphA4に対してアンチセンス方向のものとなるであろう)。
【０１６１】
通常、本発明のアンチセンス核酸分子は、それらが、選択された本発明のポリペプチドをコードする細胞性mRNA及び／又はゲノムDNAにハイブリッド形成又は結合するように、対象に投与されるか、又はin situで生成させ、それによって、例えば転写及び／又は翻訳を抑制することによって、発現を抑制する。ハイブリダイゼーションは、安定した二本鎖分子を形成する従来のヌクレオチド相補性によることも、例えばDNA二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝の特異的相互作用によることもある。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位における直接注入が含まれる。別法として、アンチセンス核酸分子が、選択された細胞を標的とするように、それを改変して、その後、全身投与することもできる。全身投与用には、例えば細胞表面の受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体にアンチセンス核酸分子を連結することによって、例えば、アンチセンス分子が、選択された細胞の表面で発現される受容体又は抗原に特異的に結合するように、それらを修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載したベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を実現するために、好ましいベクターコンストラクトでは、アンチセンス核酸分子が、pol II又はpol IIIの強いプロモーターの制御下に配置される。
【０１６２】
本発明のアンチセンス核酸分子は、α-アノマー核酸分子である場合がある。α-アノマーの核酸分子は、相補的なRNAと特異的な二本鎖ハイブリットを形成し、その中では、通常のβ-ユニットとは逆に、鎖が相互に対して平行に走行している(Gaultierらの論文(1987、Nucleic Acids Res. 15: 6625))。アンチセンス核酸分子は、2'-o-メチルリボヌクレオチド(Inoueらの論文(1987、Nucleic Acids Res. 15: 6131)、又はRNA-DNAキメラ類似体(Inoueらの論文(1987、FEBSLett. 215: 327)を含むこともできる。
【０１６３】
(５．５．２  リボザイム)
本発明は、リボザイムも包含する。リボザイムは、mRNAなどの一本鎖核酸に相補的な領域を有し、これを切断することができるリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNA分子である。したがって、リボザイム(例えばハンマーヘッド型リボザイム；Haselhoff及びGerlachの論文(1988、Nature 334: 585-591)に記載されている)は、mRNA転写産物と切断を触媒して、それによって、mRNAによってコードされているタンパク質の翻訳を抑制するのに用いることができる。EphA4をコードする核酸分子に対して特異性を有するリボザイムは、EphA4のヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、切断されるヌクレオチド配列に相補的であるTetrahymena L-19 IVS RNAの誘導体を構築することができる(米国特許4987071号及び第5116742号)。別法として、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒RNAを、RNA分子のプールから選択するために、本発明のポリペプチドをコードするmRNAを用いることができる。例えば、Bartel及びSzostakの論文(1993、Science 261: 1411)を参照のこと。
【０１６４】
(５．４．３  RNA干渉)
ある実施態様では、EphA4発現を低減するのにRNA干渉(RNAi)分子を用いる。RNA干渉(RNAi)は、それ自身の配列に対応する遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNA(dsRNA)の能力と定義されている。RNAiは、転写後遺伝子サイレンシング又はPTGSとも呼ばれる。通常、細胞の細胞質で見出されるRNA分子は、一本鎖のmRNA分子のみであるので、細胞は、dsRNAを認識して、２１塩基対を含有する断片(これは二重らせんのほぼ２回転であり、低分子干渉RNA又はsiRNAと呼ばれる)に切断する酵素を有する。断片のアンチセンス鎖は、センス鎖から十分に分離され、そのため、それは、内在性細胞mRNA分子上の相補的なセンス配列とハイブリッド形成する。このハイブリダイゼーションは、二本鎖領域でのmRNA切断の引き金となり、それによって、それがポリペプチドに翻訳されるための性能を破壊する。したがって、特定の遺伝子に対応するdsRNAの導入は、特定の組織において、かつ／あるいは選択された時間に、細胞自体のその遺伝子の発現をノックアウトする。
【０１６５】
二本鎖(ds)RNAは、哺乳類の遺伝子発現を妨害するのに用いることができる(Wianny及びZernicka-Goetzの論文(2000、Nature Cell Biology 2: 70-75)；この開示を参照により全体として本明細書に組み込む)。dsRNAは、EphA4のヌル変異体のものと同じ表現型を生み出すための、EphA4機能の抑制RNA又はRNAiとして用いられる(Wianny及びZernicka-Goetzの論文(2000、Nature Cell Biology 2: 70-75))。
【０１６６】
(５．６  治療上又は予防上の効用の特性分析及び実証)
本発明の予防プロトコール及び／又は治療プロトコールが有する毒性及び有効性は、細胞培養又は実験動物において、例えば、LD50(集団の50％にとって致命的な用量)及びED50(集団の50％に治療上有効な用量)の測定など、標準的な薬学手法を行うことで決定できる。毒性効果を有する用量と、治療効果を有する用量との比が治療係数であり、LD50/ED50という比率として表すことができる。大きな治療係数を示す予防薬及び／又は治療薬が好ましい。毒性副作用を示す予防薬及び／又は治療薬を用いることもできるが、非感染細胞に対する潜在的損傷を最小化して、それによって副作用を低減させるために、そのような薬剤の送達システムが患部組織部位を標的とするように設計する注意が払われるべきである。
【０１６７】
細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、予防薬及び／又は治療薬をヒトに使用するのための、様々な用量を処方するのに用いることができる。そのような薬剤の用量は、毒性がまったく伴わないかほとんど伴わない、ED50を含めた循環濃度の範囲にあることが好ましい。用量は、使用される剤形及び投与経路に応じて、この範囲内で変化させることができる。本発明の方法で使用される任意の治療に関して、治療有効量を、まず細胞培養アッセイで推定することができる。動物モデルにおいて、細胞培養で測定されたIC50(すなわち症候の抑制が最大限度の半分に達する試験化合物の濃度)を含めた血漿中循環濃度の範囲になるように、用量を処方することができる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するのに用いることができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１６８】
本発明に従って用いられた治療の抗癌活性も、SCIDマウスモデル又はマウスEphA4がヒトEphA4で置換されているトランスジェニックマウス、ヒト異種移植片を有するヌードマウス、当技術分野で公知であり、参照により全体として本明細書に組み込まれている、Fiebig及びBurger編の論文「抗癌剤開発における腫瘍モデルの重要性(Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development)」(1999)；Kargerの論文「腫瘍学への貢献(Contributions to Oncology)」(1999)；Boven及びWinograd編の論文「腫瘍学研究におけるヌードマウス(The Nude Mouse in Oncology Research)」(1991)；及び、Teicher編の論文「抗癌剤開発ガイド(Anticancer Drug Development Guide)」(1997)に記載されているハムスター、ウサギなどの動物モデルなど、癌研究用の様々な実験動物モデルを用いることによって測定することができる。
【０１６９】
(５．６．１  治療上又は予防上の効用の実証)
本発明のプロトコール及び組成物は、ヒトで使用する前に、望ましい治療活性又は予防活性に関して、in vitroで、そしてその後in vivoで試験することが好ましい。例えば、特定の治療のプロトコールの投与が指示されるかどうか決定するのに用いることができるin
vitroアッセイには、in vitro細胞培養アッセイが含まれるが、このアッセイでは、患者の組織試料が培養中で生育され、プロトコールに曝露するか、又は他の方法でプロトコールを投与し、組織試料に対するそのようなプロトコールの影響、例えば、EphA4のリン酸化もしくは分解の増大、成長の抑制もしくは低下、ならびに／あるいは、軟寒天中でのコロニー形成、又は三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成を観測する。低レベルの増殖又は接触された細胞の生存は、その治療薬がその患者の状態を治療するのに有効であることを示す。別法として、患者からの細胞を培養する代わりに、腫瘍細胞又は悪性細胞系を用いて、治療薬及び方法をスクリーニングすることもできる。そのような生存及び／又は成長を評価するのに、当技術分野で標準的な多数のアッセイを用いることができ、例えば、細胞増殖は、3H-チミジン取込みを測定することによって、細胞を直接計数することによって、プロトオンコジーン(例えば、fos、myc)又は細胞周期マーカーなどの既知遺伝子の転写活性の変化を検出することによって、アッセイすることができ；細胞生存率は、トリパンブルー染色によって評価することができ、分化は、形態、EphA4のリン酸化又は分解の増大、成長の低下、ならびに／あるいは軟寒天中でのコロニー形成、又は三次元基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中での管状ネットワーク形成の変化に基づいて目視により評価することができる。
【０１７０】
治療で使用するための化合物は、ヒトで試験する前に、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含めた適当な動物モデル系、例えば上記の動物モデルで試験することができる。化合物はその後、適切な臨床試験に用いることができる。
さらに、本明細書に開示した、癌を治療又は予防するための併用療法の予防上及び／又は治療上の効用を評価するのに、当業者に知られている任意のアッセイを用いることができる。
【０１７１】
(５．７  医薬組成物)
本発明の組成物には、医薬組成物の製造に有用なバルク薬物組成物(例えば不純又は未殺菌組成物)と、単位剤形の調製に使用することができる医薬組成物(すなわち対象又は患者に投与するのに適した組成物)が含まれる。そのような組成物は、予防上又は治療上有効な量の、本明細書に開示の予防薬及び／もしくは治療薬又はそれらの薬剤の組合せと、薬学的に許容される担体を含む。本発明の組成物は、予防上又は治療上有効な量の、１つ又は複数の本発明のEphA4抗体及び薬学的に許容される担体、あるいは、EphA4発現を低減する薬剤(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド)及び薬学的に許容される担体を含むことが好ましい。別の実施態様では、本発明の組成物は、追加の治療薬、例えば抗癌剤をさらに含む。
【０１７２】
特定の実施態様では、「薬学的に許容される」という用語は、動物での使用、及び特にヒトにおける使用に関して、連邦政府又は州政府の監督官庁によって承認されているか、米国薬局方協会又は他の広く認知されている薬局方協会においてリストに記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント(例えばフロイントのアジュバント(完全又は不完全な)、又は、より好ましくはChiron(Emeryville、CA)販売のMF59C.1アジュバント)、賦形剤、又は媒体を指す。そのような薬学的担体は、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油、及び同様のものなど、石油、動物、植物、又は合成由来のものを含めた水及び油など、無菌の液体の場合がある。医薬組成物を静脈内に投与する場合、水は好ましい担体である。食塩水、ブドウ糖水、及びグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射液用に用いることができる。適当な製剤賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ソーダ、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、及び同様のものが含まれる。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、又はｐＨ緩衝薬も含有できる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤、及び同様の形態を取ることができる。
【０１７３】
通常、本発明の組成物の成分は、例えば、活性薬の量を表示したアンプル又はサシェなどの密封容器に入れた凍結乾燥した乾燥粉末、又は無水濃縮物として、別々に、あるいは単位剤形中に共に混合して供給する。組成物が注入によって投与される場合には、製薬グレードの無菌水又は食塩水を含有する輸液ボトルに分注することができる。組成物が注射によって投与される場合には、投与の前に成分を混合できるように、滅菌注射用蒸留水又は食塩水のアンプルを準備することができる。
本発明の組成物は、中性型又は塩型として処方することができる。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などに由来するものなど、陰イオンによって形成されたものと、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなど、陽イオンによって形成されたものとが含まれる。
【０１７４】
様々な送達システム、例えば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへの封入、抗体又は抗体断片を発現することができる組換え体細胞、受容体介在性エンドサイトーシス(例えば、Wu及びWuの論文(1987、J.Biol. Chem、262: 4429-4432))、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などが知られており、本発明のアゴニストモノクローナル抗体又は本発明のアゴニストモノクローナル抗体の組合せ、及び癌を予防又は治療するのに有用な予防薬又は治療薬を投与するのに用いることができる。本発明の予防薬又は治療薬を投与する方法には、非経口投与(例えば、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、及び皮下投与)、硬膜外投与、及び粘膜投与(例えば、鼻腔内経路、吸入経路、及び経口経路)が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施態様では、本発明の予防薬又は治療薬を、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与する。予防薬又は治療薬は、任意の好都合な経路で投与でき、例えば、注入又はボーラス注入によって、上皮細胞層又は粘膜皮膚細胞層(例えば、口腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜)を通した吸収によって投与でき、また、生物活性を有する他の薬剤と共に投与することもできる。全身投与することも、又は局所投与することもできる。
【０１７５】
特定の実施態様では、治療を必要とする領域に、本発明の予防薬又は治療薬を局所的に投与するのが望ましいことがある。限定ではなく、例として挙げれば、これは例えば、局所注入によって、注射によって、又はインプラントによって実現でき、前記インプラントは、シアラスチック膜などの膜、又は繊維を含めた、多孔性、非多孔性、又はゼラチン状の物質である。
【０１７６】
さらに別の実施態様では、調節放出又は持続放出システムで予防薬又は治療薬を送達することができる。一実施態様では、調節放出又は持続放出を実現するのにポンプを用いることができる(Langerの論文(同上)；Seftonの論文(1987、CRC Crit. Ref: Biomed. Eng. 14: 20)；Buchwaldらの論文(1980、Surgery 88: 507)；Saudekらの論文(1989、N. Engl. J. Med. 321: 574))。別の実施態様では、本発明の抗体又はその断片の調節放出又は持続放出を実現するのに、重合物質を用いることができる(例えば、Langer及びWise編の論文「調節放出の医学適用(Medical Applications of Controlled Release)」(CRC Pres.、Boca Raton、Florida (1974))；Smolen及びBall編の論文「調節薬生体利用性、医薬品製剤設計、及び性能(Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance)」(Wiley、New York (1984))；Ranger及びPeppasの論文(1983、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61)を参照；Levyらの論文(1985、Science 228: 190)；Duringらの論文(1989、Ann. Neurol. 25: 351)；Howardらの論文(1989、J. Neurosurg. 7 1: 105)；米国特許第5679377号、第5916597号、第5912015号、第5989463号、第5128326号；国際公開第99/15154号及び第99/20253号も参照のこと)。持続放出製剤に使用される重合体の例には、ポリ(2-ヒドロキシメタクリル酸エチル)、ポリメタクリル酸メチル、ポリ(アクリル酸)、ポリ(エチレン-co-酢酸ビニル)、ポリ(メタクリル酸)、ポリグリコリド(PLG)、ポリ無水物、ポリ(N-ビニールピロリドン)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)、ポリラクチド(PLA)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)、及びポリオルトエステルが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、持続放出製剤で使用される重合体は、不活性で、浸出可能な不純物を含まず、貯蔵に安定で、無菌で、生分解性である。さらに別の実施態様では、調節放出又は持続性放出システムを、予防標的又は治療標的の近接に配置することができ、それによって、全身用量の一部のみを必要とする(例えば、Goodsonらの論文(Medical Applications of Controlled Release、supra、vol. 2、pp. 115-138 (1984))を参照)。
【０１７７】
調節放出システムに関しては、Langerによる総説(1990、Science 249: 1527-1533)論じられている。１つ又は複数の本発明の治療薬を含む持続放出製剤を調製するのに、当業者に知られている任意の技法を用いることができる。例えば、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれている、米国特許第4526938号；国際公開第91/05548号及び第96/20698号；Ningらの論文(1996、Radiotherapy & Oncology 39: 179-189)；Songらの論文(1995、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50: 372-397)；Cleekらの論文(1997、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-854)；及びLamらの論文(1997、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-760)を参照のこと。
【０１７８】
(５．７．１  遺伝子治療)
特定の実施態様では、遺伝子治療によって癌を治療、予防、又は管理するために、EphA4発現を低減する核酸(例えばEphA4アンチセンス核酸又はEphA4 dsRNA)を投与する。遺伝子治療とは、発現されているか、あるいは発現できる核酸を対象に投与することによって行われる治療を意味する。本発明のこの実施態様では、アンチセンス核酸は、予防効果又は治療効果を生み出し、媒介する。
当技術分野で利用可能ないかなる遺伝子治療の方法も、本発明に従って用いることができる。例示的方法を以下に記載する。
【０１７９】
遺伝子治療の方法に関する全般的概説には、Goldspielらの論文(1993、Clinical Pharmacy 12: 488)；Wu及びWuの論文(1991、Biotherapy 3: 87)；Tolstoshevの論文(1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573)；Mulliganの論文(1993、Science 260: 926-932)；Morgan及びAndersonの論文(1993、Ann. Rev. Biochem. 62: 191)；ならびに、Mayの論文(1993、TIBTECH 11: 155)を参照されたい。使用できる当技術分野で公知の組換えDNA技術の方法は、Ausubelら編の論文「分子生物学の現在のプロトコール(Current Protocols in Molecular Biology)」(John Wiley & Sons、NY (1993))；及びKrieglerの論文「遺伝子の移入及び発現、実験室マニュアル(Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual)」(Stockton Press、NY (1990))に記載されている。
【０１８０】
好ましい態様では、本発明の組成物は、EphA4発現を低減するEphA4核酸を含み、前記核酸は、適当な宿主で核酸を発現する発現ベクターの一部である。詳細には、そのような核酸はプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導性又は構成的であり、任意選択で、さらに、組織特異的である。別の特定の実施態様では、使用される核酸分子の中で、EphA4発現を低減する核酸、及び任意の他の望ましい配列が、ゲノム中の望ましい部位で相同組換を促進する領域によって挟まれており、それによって、EphA4発現を低減する核酸の染色体内の発現が提供される(Koller及びSmithiesの論文(1989、PNAS 86: 8932)；Zijlstraらの論文(1989、Nature 342: 435))。
【０１８１】
対象への核酸の送達は、直接的である場合があり、その場合、対象が核酸又は核酸を保持するベクターに直接曝露され、あるいは間接的である場合もあり、その場合、細胞がまずin vitroで核酸によって形質転換され、その後、対象に移植される。これらの２つのアプローチは、それぞれin vivo又はex vivoの遺伝子治療として知られている。特定の実施態様では、核酸配列を、in vivoで直接投与する。これは、当技術分野で知られている多数の方法のうち任意のものによって、例えば、適当な核酸発現ベクターの一部としてそれらを構築して、それを投与し、それによってそれらを細胞内に導入することによって、例えば、欠損もしくは弱毒化されているレトロウイルス、又は他のウイルスベクターを用いた感染(米国特許第4980286号を参照)によって、あるいは、裸のDNAの直接注入、又はマイクロ粒子照射の使用(例えば、遺伝子銃；微粒子銃、Dupont)、又は脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション薬剤を用いたコーティング、リポソーム、マイクロ粒子、もしくはマイクロカプセルへの封入によって、あるいは、核に入ることが知られているペプチドにそれらを連結させて投与することによって、受容体介在性エンドサイトーシスを受けるリガンドにそれらを連結させて投与すること(例えば、Wu及びWuの論文(1987、J. Biol. Chem. 262: 4429)を参照)(これは、その受容体を発現する細胞型を特異的に標的にするために用いることができる)などによって実現することができる。別の実施態様では、核酸リガンド複合体を形成させることができ、このリガンドは、エンドソームを破壊するための融合誘導ウイルスペプチドを含み、それによって、核酸がリソゾーム分解を回避できるようになっている。さらに別の実施態様では、核酸は、特異的受容体を標的とすることによって、細胞特異的な取込み及び発現に向けて、in vivoで指向的に送達できる(例えば、国際公開第92/06180号、第92/22635号、第92/20316号、第93/14188号、及び第93/20221号を参照)。別法として、発現のため、核酸を細胞内に導入して、宿主細胞DNAの中に相同組換によって組み込むことができる(Koller及びSmithiesの論文(1989、PNAS 86: 8932)；及びZijlstraらの論文(1989、Nature 342: 435))。
【０１８２】
特定の実施態様では、EphA4発現を低減する核酸配列を含有するウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターを用いることができる(Millerらの論文(1993、Meth. Enzymol. 217: 581)を参照)。これらのレトロウイルスベクターは、宿主細胞DNAへのウイルスゲノムの組み込みと、正しいパッケージングに必要な構成要素とを含有する。遺伝子治療で使用される核酸配列は、対象への核酸の送達を促進する１つ又は複数のベクターにクローニングする。レトロウイルスベクターに関するより詳細な説明は、Boesenらの論文(1994、Biotherapy 6: 291-302)に見出すことができ、この論文は、化学療法に対してさらに抵抗力を有する幹細胞を作製する目的において、mdr1遺伝子を造血幹細胞に送達するための、レトロウイルスベクターの使用について記載する。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の参考文献は、Clowesらの論文(1994、J. Clin. Invest. 93: 644-651)；Kleinらの論文(1994、Blood 83: 1467-1473)；Salmons及びGunzbergの論文(1993、Human Gene Therapy 4: 129-141)；ならびに、Grossman及びWilsonの論文(1993、Curr. Opin. in Genetics Devel. 3: 110-114)である。
【０１８３】
アデノウイルスは、遺伝子治療に使用できる他のウイルスベクターである。遺伝子を呼吸上皮に送達するには、アデノウイルスは特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは、自然に呼吸上皮を感染させ、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスは、非分裂細胞を感染させることができるという利点を有する。Kozarsky及びWilsonの論文(1993、Current Opinion in Genetics Development 3: 499)は、アデノウイルスベースの遺伝子治療の概説を提示する。Boutらの論文(1994、Human Gene Therapy 5: 3-10)は、アデノウイルスベクターを使用した、アカゲザルの呼吸上皮への遺伝子の移入を実証した。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeldらの論文(1991、Science 252: 431)：Rosenfeldらの論文(1992、Cell 68: 143)：Mastrangeliらの論文(1993、J. Clin. Invest. 91: 225)：国際公開第94/12649号：及びWangらの論文(1995、Gene Therapy 2: 775)に見出すことができる。好ましい実施態様では、アデノウイルスベクターが使用される。
【０１８４】
遺伝子治療には、アデノ随伴ウイルス(AAV)の使用も提案されている(Walshらの論文(1993、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300)：及び米国特許第5436146号)。
遺伝子治療への別のアプローチでは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、又はウイルス感染などの方法によって、組織培養の細胞に遺伝子を移入する。通常、移入の方法は、細胞への選択的マーカーの移入を含む。その後、細胞を選択下に置き、移入遺伝子を取り込み、発現している細胞を単離する。その後、それらの細胞を対象に送達する。
【０１８５】
この実施態様では、結果として得られる組換え体細胞のin vivo投与の前に、細胞に核酸を導入する。そのような導入は、限定されるものではないが、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション法、核酸配列を含有しているウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介性遺伝子移入、微小核体媒介性遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含めた、当技術分野で知られている任意の方法によって実行することができる。細胞の中に外来遺伝子を導入するための多数の技法が当技術分野で知られており(例えば、Loeffler及びBehrの論文(1993、Meth. Enzymol. 217: 599)；Cohenらの論文(1993、Meth. Enzymol. 217: 618)を参照)、これらは、受容細胞の必要な発生機能及び生理機能を乱さないという条件において、本発明に従って用いることができる。用いられる技法は、その核酸が細胞によって発現され、好ましくは遺伝性であって、子孫細胞によっても発現されるように、細胞への核酸の安定的な移入を提供するべきである。
この結果得られた組換え体細胞は、当技術分野で知られている様々な方法によって、対象に送達することができる。使用に想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存するが、当業者ならば決定することができる。
【０１８６】
(５．７．２  製剤)
本発明に従った使用に供する医薬組成物は、１つ又は複数の生理的に許容できる担体又は賦形剤を用いて、従来の方法で処方することができる。
したがって、本発明のEphA4アゴニスト抗体又は他の抗EphA4薬(例えばアンチセンス核酸及び他の核酸)及びそれらの生理的に許容される塩及び溶媒和物は、吸入もしくはガス注入(口又は鼻のいずれかを通る)、又は経口投与、非経口投与、又は粘膜投与(頬側投与、膣内投与、直腸投与、舌下投与など)によって投与するために処方することができる。好ましい実施態様では、局所投与又は全身非経口投与が用いられる。
【０１８７】
経口投与用には、医薬組成物は、結合剤(例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン、又はヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微晶性セルロース、又はリン酸水素カルシウム)；潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、又はシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモ澱粉、又はナトリウムデンプングリコレート)；又は、湿潤剤(例えばラウリル硫酸ナトリウム)などの、薬学的に許容される賦形剤を用いた従来の方法によって調製された、例えば錠剤又はカプセル剤の形態を取ることができる。錠剤は、当技術分野で周知の方法でコーティングすることができる。経口投与用の液状製剤は、例えば、溶液、シロップ、又は懸濁液の形態を取ることができ、また、それらは、使用する前に水又は他の適当な媒体を用いて構成するための乾燥生成物として準備することができる。そのような液状製剤は、懸濁剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、又は食用硬化油脂)；乳化剤(例えば、レシチン又はアカシア)；非水性媒体(例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、又は分留植物油)；及び、保存剤(例えば、メチル又はプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸、又はソルビン酸)などの薬学的に許容される添加剤を用いた従来の方法によって調製することができる。製剤は、必要に応じて、緩衝塩、風味剤、着色剤、甘味剤も含有できる。
【０１８８】
経口投与用の製剤は、適切に処方することによって、活性化合物の調節放出を与えることができる。
口腔内投与用には、組成物は従来の方法によって処方された錠剤又はトローチ剤の形態を取ることができる。
吸入法による投与では、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適当な気体などの適当な噴霧剤を使用した気密パック又は噴霧装置からのエアゾールスプレーの形態で、本発明に従った使用に供する予防薬又は治療薬を送達するのが好都合である。気密エアゾールの場合には、用量単位は、計量された量を送達するためにバルブを提供することによって、測定することができる。吸入器又はインサフレーターで使用するための、例えばゼラチンのカプセル剤及びカートリッジは、化合物と、ラクトース又はデンプンなどの適当な粉末ベースとの混合粉末を含有するものを処方することができる。
【０１８９】
予防薬又は治療薬は、非経口注射による投与、例えば、ボーラス注入又は持続注入用に処方することができる。注射用製剤は、添加された保存剤を伴う単位剤形で、例えば、アンプル又は多用量容器中に提供することができる。組成物は、油性又は水性媒体中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンなどの形態を取ることができ、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの添加剤を含有することができる。別法として、活性成分は、使用する前に適当な媒体、例えば発熱因子を含まない滅菌水を用いて構成するための粉末形態にすることもできる。
予防薬又は治療薬は、例えば、ココアバター又は他のグリセリドなどの従来の坐剤ベースを含有する坐剤又は停留浣腸剤などの直腸組成物に処方することもできる。
【０１９０】
前述した製剤に加えて、予防薬又は治療薬は、デポ製剤として処方することもできる。そのような長時間作用する製剤は、皮内移植(例えば皮下又は筋肉内に)によって、あるいは筋肉内注射によって投与してもよい。したがって、例えば、予防薬又は治療薬は、適当な重合物質もしくは疎水性物質(例えば許容される油の中のエマルジョンとして)、又はイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性の誘導体として、例えば、溶性の塩として処方することができる。
本発明は、予防薬又は治療薬が、量を指示するアンプル又はサシェなどの密封容器中に入れられていることも提供する。一実施態様では、予防薬又は治療薬は、凍結乾燥された滅菌乾燥粉末、又は無水の濃縮物として密封容器中に供給され、例えば水又は食塩水を用いて、対象に投与するのに適した濃度に再構成することができる。
【０１９１】
本発明の好ましい実施態様では、様々な化学療法剤、生物学的／免疫療法薬、及びホルモン療法薬の処方及び投与は、当技術分野で知られており、しばしば、「医師用添付文書集(Physician's Desk Reference)」(56th ed.、(2002))に記載されている。例えば、本発明のある特定の実施態様では、本発明の治療薬を、表１に提示した通りに処方して、供給することができる。
本発明の他の実施態様では、放射性同位元素などの放射線療法薬を、カプセル剤の中の液体として、又は飲料として経口的に与えることができる。放射性同位元素は、静脈内注射用に処方することもできる。熟練した腫瘍学者ならば、好ましい処方及び投与経路を決定することができる。
【０１９２】
ある実施態様では、本発明のアゴニストモノクローナル抗体を、静脈内注射用には、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、及び25mg/mlで、繰り返しの皮下投与及び筋肉内注射用には、5mg/ml、10mg/ml、及び80mg/mlで処方する。
組成物は、必要に応じて、活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含有することのできるパック又は分配装置の中に提供される。パックは、例えば、ブリスターパックなどの金属又はプラスチックの箔を含みうる。パック又は分配装置には、投与のための説明書が付随することがある。
【０１９３】
(５．７．３  用量)
癌の治療、予防、又は管理に有効であろう本発明の組成物の量は、標準的な研究技法によって決定することができる。例えば、癌の治療、予防、又は管理に有効であろう組成物の用量は、例えば本明細書に開示した動物モデル、又は当業者に知られている動物モデルなどの動物モデルに組成物を投与することによって、決定することができる。加えて、最適用量範囲を特定するのを補助するために、任意選択で、生体外アッセイを行うこともできる。
好ましい有効用量の選択は、当業者ならば、当業者に知られているいくつかの因子の考慮に基づいて決定することができる(例えば臨床試験で)。そのような因子には、治療又は予防される疾患、関連する症状、患者の体質量、患者の免疫状態、及び投与された医薬組成物の正確さを反映する、当業者に知られている他の因子が含まれる。
【０１９４】
この製剤において用いられるべき正確な用量は、投与経路及び癌の重度にも依存するであろう。そして、これは医師の判断と、各患者の病状とに従って決定するべきである。有効用量は、in vitro又は動物モデルの試験システムから得られた用量反応曲線から推定することができる。
抗体に関しては、患者に投与する用量は、通常、患者の体重の1 kgあたり0.1 mgから100 mgである。患者に投与する用量は、好ましくは患者の体重1 kgあたり0.1 mgから20 mgの間であり、より好ましくは患者の体重1 kgあたり1 mgから10 mgの間である。ヒト抗体及びヒト化抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答のため、通常、他の生物種由来の抗体より、ヒト体内での半減期が長い。したがって、ヒト抗体の投与は、より少ない用量において、かつより少ない頻度で行うことがしばしば可能である。
【０１９５】
患者に投与される他の癌の治療薬に関して、当技術分野で知られている様々な癌治療の典型的な用量を表１に提供した。本発明を前提として、特定の好ましい実施態様は、併用治療プログラムにおいて、単剤の投与に推奨された用量より低い用量で投与することを包含するであろう。
本発明は、癌の予防、治療、管理、又は改善に有効であると以前に考えられていたのより低い用量で、既知の予防薬又は治療薬を投与するいかなる方法も提供する。より低い用量の本発明のアゴニストモノクローナル抗体と組み合わせて、より低い用量の既知の抗癌治療を投与することが好ましい。
【０１９６】
(５．８  キット)
本発明は、本発明のモノクローナル抗体で満たされた１つ又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットを提供する。加えて、癌の治療に有用な１つ又は複数の他の予防薬又は治療薬も、医薬品パック又はキットに含まれることがある。本発明は、１つ又は複数の本発明の医薬組成物の成分で満たされた１つ又は複数の容器を含む医薬品パック又はキットも提供する。場合によっては、製薬品又は生物学的製剤の製造、使用、又は販売を規制する政府機関によって規定されている書式の通知がそのような容器に付随することがあり、この通知は、ヒト投与用の製造、使用、又は販売に関する該政府機関の承認を示すものである。
【０１９７】
本発明は、上記方法で使用できるキットを提供する。一実施態様では、キットは、１つ又は複数の本発明のモノクローナル抗体を含む。別の実施態様では、キットは、１つ又は複数の容器の中に、癌の治療に有用な１つ又は複数の他の予防薬又は治療薬をさらに含む。ある実施態様では、もう一方の予防薬又は治療薬が化学療法剤である。他の実施態様では、予防薬又は治療薬が、生物製剤又はホルモン性治療薬である。
【実施例】
【０１９８】
(６．実施例)
(６．１  ＥｎｈＡ４抗体は細胞挙動の変化を引き起こす)
(細胞接着アッセイ及び細胞球形化アッセイ)
細胞の球形化を検査するために、膵癌細胞系Aspc1細胞を、細胞外膜(extracellular membrane)(ECM)タンパク質で事前にコーティングされた6ウェル培養皿にプレーティングするか、あるいは24ウェル培養皿中にある、ECMタンパク質でコーティングされたカバーガラス上にプレーティングした。細胞を48時間放置して付着させ、その後、EphA4 scFv抗体を含有する培地中、37℃でインキュベートした。対照として、上記の通りにプレーティングし、付着させた細胞のセットを、37℃ではなく0℃でEphA4 scFv抗体とインキュベートした。インキュベーションの後、EphA4-scFvと共にインキュベートされた細胞を洗浄し、抗Ｆlag抗体で処理して、EphA4が結合したscFvの架橋結合を行った。プレート又はカバーガラスを、洗浄、固定、及び染色し、顕微鏡によって可視化した。37℃でEphA4抗体と共にインキュベートされた細胞は、0℃、すなわち細胞が変形しない温度でEphA4抗体と共にインキュベートされた細胞と比較して、細胞の球形化を示した(図１Ａ、Ｂ)。これは、抗EphA4抗体がECMマトリックスに対する接着の低減を引き起こすことをさらに示す。ECM-細胞間接着の低減は、これらのタイプの接着が細胞増殖、生存、移動、及び侵入を促進する細胞内シグナル伝達部位であるので、重要である(Burridge及びChrzanowska-Wodnickaの論文(Annu. Rev. Cell Dev. Biol.、12: 463、1996)、Parsonsの論文(Curr. Opin. Cell Biol.、8: 146、1996))。
【０１９９】
細胞接着アッセイ及び細胞球形化アッセイは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているMiaoらの論文(Nature Cell Biol2: 62、2000)に記載される通りに行うこともできる。細胞接着を検査するためには、簡潔に言うと、様々なECMタンパク質又はポリ-L-リジンで事前にコーティングされた96ウェルプレートに、細胞を三つ組みでプレーティングする。細胞は、１ウェルあたり1×105細胞の密度で、EphA4抗体(又は他のEphA4アゴニスト)の存在下又は非存在下にプレーティングし、37℃に30分間放置して付着させる。非接着細胞をウェルから洗い流し、接着細胞を固定、染色して、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)リーダーで吸収を測定することによって定量化する。EphA4抗体で処理された細胞は、EphA4抗体の非存在下で付着が行われた対照細胞と比較して、ECMタンパク質で処理されたウェルに対する接着の低減を示す。
【０２００】
細胞球形化アッセイに関しては、簡潔に言うと、ECMタンパク質でコーティングされた6ウェル培養皿、又は、24ウェル培養皿中にある、ECMタンパク質でコーティングされたカバーガラスに、細胞をプレーティングする。細胞を48時間放置して付着させ、その後、EphA4抗体(又は他のphA4アゴニスト)を含有する培地又は含有しない培地中で10分間処理する。プレート又はカバーガラスを、洗浄、固定、及び染色し、顕微鏡によって可視化する。EphA4抗体で処理された細胞は、EphA4抗体を含有しない培地で処理された細胞と比較して、細胞の球形化を示し、これは、ECMマトリックスに対する接着の低減を示すものである。
【０２０１】
(６．２  モノクローナル抗体の調製)
(免疫化及び融合)
EphA4の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体は、融合タンパク質EphA4-Ｆｃを用いて産生させた。この融合タンパク質は、ヒトEphA4の細胞外ドメインと、融合タンパク質の分泌を促進するためにそれに連結されたヒト免疫グロブリンとからなる。
0及び7日目に、TiterMaxアジュバント(全容積100μl)中にある5μgのEphA4融合タンパク質を、マウス(Balb/cマウス又はSJLマウスのいずれか)の左中足骨領域に注射する。12及び14日目に、PBS(全容積100μl)中にある10μgのEphA4融合タンパク質を、マウスの左中足骨領域に注入する。15日目に、膝窩リンパ節細胞及び鼠蹊リンパ節細胞を左足及び鼠蹊部から取り出し、P3XBcl-2-13細胞と体細胞融合させる(PEGを用いる)。
免疫化されたSJLマウスから得たリンパ節の融合細胞から、EphA4抗体を産生するハイブリドーマを単離する。
【０２０２】
(抗体スクリーニング)
EphA4に対して免疫応答性のものを得るために、標準的な分子生物学的技法(例えばELISA免疫アッセイ)を用いて、ハイブリドーマのバルク培養(bulk culture)からの上清をスクリーニングすることができる。上清はさらに、EphA4モノクローナル抗体がEphA4に結合するのを阻害する能力に関してスクリーニングする。簡潔には、標識されたEphA4抗体がEphA4融合タンパク質に結合する能力を、無標識のEphA4抗体、又は無標識の他のEphA4結合タンパク質のいずれかの存在下における競合的ELISAによってアッセイする。これらは、添加される無標識の抗体又は結合タンパク質の濃度を増大させるにつれて、EphA4-Ｆｃに結合する標識されたＥＡ４の量を減少させるであろう。
【０２０３】
(６．３  EphA4抗体の使用)
(６．３．１  EphA4のリン酸化)
EphA4抗体は、ASPC1細胞におけるチロシンリン酸化を促進した。抗EphA4モノクローナル抗体(NED 154-567)又は対照の存在下で、細胞を37℃で15分間インキュベートした。その後、細胞溶解液は、エフリンA4 Fc(R & D Systems；Minneapolis、MN)を用いて免疫沈降させ、SDS-PAGEで分離して、抗ホスホチロシン抗体である4G10(Upstate Biotechnology；Lake Placid、NY)及びPY20(BD Transduction Laboratories；Franklin Lakes、NJ)のカクテルを用いてウェスタンブロット解析した。EphA4抗体を用いた処理の後、EphA4リン酸化の増大が観測された。これは、EphA4抗体が、EphA4に対してアゴニストして作用し、さらにEphA4の自己リン酸化を促進する可能性が高いことを示している。
【０２０４】
EphA4 scFv抗体クローンEA44は、EphA4のチロシンリン酸化を強く促進した(６図)。抗EphA4 scFv EA44を発現する細胞は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条項により、2004年6月1日にATCC(American Type Culture Collection)(P.O. Box 1549、Manassas、VA 20108)に寄託され、アクセッション番号＿＿が割り当てられた。EA44におけるVH CDR及びVL CDRのアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号22、24、26、28、30、及び32に含まれている(図７)。示されている抗EphA4 scFv(5μg/ml)と共にAspc1膵癌細胞を氷上でインキュベートした。30分間後に培地を除去し、氷冷PBSで細胞を洗浄し、flagエピトープM2に特異的な抗体を10μg/ml含有する培地を細胞に上層させた。この際、対照試料はEphA4のチロシンリン酸化を誘導することが知られている抗体、mAb9 10μg/mlで処理した。細胞は、scFvクローン8、18、20、36、41、もしくは44、又はmAb9と共に37℃で15分間インキュベートし、氷冷PBSで洗浄し、その後、1％のトリトンX100を含有するトリス緩衝食塩水で溶解させた。EphA4は、細胞溶解液からエフリンA4-Fc(4μg；R & D Systems)を用いて免疫沈降を行い、SDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに転写した。EphA4チロシンリン酸化の状態を、抗pTyr抗体である4G10及びPY20を用いたウェスタンブロット解析によって分析した。図６に見られるように、EphA4のリン酸化はscFvクローン44によって強く促進される。
【０２０５】
EphA4抗体は、EphA4関連タンパク質のチロシンリン酸化も促進した。細胞をLX13  scFv抗体と共にインキュベートし、洗浄し、その後、抗Flag抗体と共にインキュベートしてscFvを細胞表面に架橋結合させた。その後、EphA4をエフリンA4-Fcで免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。図２に見られるように、EphA4の架橋結合(「架橋EphA4」レーン)によって、約75kDaのEphA4関連タンパク質のチロシンリン酸化が、EphA4が架橋結合されなかった細胞(「対照」レーン)における、この約75kDaのEphA4関連タンパク質のリン酸化と比較して増強された。
【０２０６】
(６．３．２  EphA4分解)
EphA4抗体によって媒介される分解を評価することもできる。膵癌細胞系ASPC1又はMiaPaca2などのEphA4陽性細胞の単層培養を、EphA4抗体(10μg/ml)の存在下、37℃でインキュベートする。その後、抗体添加後の以下のタイムポイント、すなわち0、0.5、1、2、4、8、及び24時間後に、1％のトリトンX-100を含有するトリス緩衝食塩水(Sigma、St. Louis、MO)で細胞を溶解させる。タンパク質濃度を測定(BioRad、Hercules、CA)した後に、等量の総タンパク質をSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロース(Protran(商標)、Schleicher and Schuell、Keene、NH)に転写する。EphA4レベルを、市販されているEphA4/Sekモノクローナル抗体(BD Biosciences、San Jose、CA)を用いたウェスタンブロット解析によって可視化する。その後、膜のストリッピングを行い、総タンパク質の添加が試料相互で等しいものであったことを確認するために、パキシリンに特異的な抗体(クローン5H11；Upstate Biotechnology、Lake Placid、NY)で再プロービングする。
【０２０７】
(６．３．３．軟寒天中での成長)
軟寒天中における癌細胞の形成を、本発明の抗体が阻害する能力をアッセイした(そのようなアッセイは、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているZelinskiらの論文(2001、Cancer Res. 61: 2301)の記載の通りにして実施できる)。簡潔には、抗EphA4 LX13 scFv抗体(LX13)又は対照溶液(PBS)の存在下で、細胞を37℃で、7日間、軟寒天中に懸濁した。LX13又はPBSと共にインキュベートした後、細胞を洗浄し、抗LX13二次モノクローナル抗体(二次mab)又はPBSのいずれかと共にインキュベートした。コロニー形成は、顕微鏡観測によって計数した。少なくとも３つの細胞を含有するクラスターを陽性として計数した。図３に見られるように、LX13及び二次mabと共にインキュベートされた細胞(「LX13 ２価」)は、凝集したEphA4を含有し、PBSと共にインキュベートされそれに続いて二次mabのみと共にインキュベートされた細胞(「対照」)、又はLX13で処理されそれに続いてPBSによって処理された細胞(「「LX13」)と比較して、軟寒天中における成長の有意な阻害を示す。
軟寒天中に既に形成されている癌細胞コロニーを除去する、本発明の抗体の能力をアッセイする。アッセイ方法は、上の記載と同様であるが、抗体の添加が、軟寒天中における癌細胞成長の３日目まで行われない点が相違している。
【０２０８】
(６．３．４．乳癌細胞のエストロゲン依存性)
エストロゲン感受性乳癌細胞であるMCF-7細胞に形質移入し、ヒトEphA4を安定的に過剰発現するようにした(MCF-7EPhA4)。対応する対照と比較した、形質移入細胞におけるEphA4の異所的な過剰発現は、ウェスタンブロット分析によって確認される(データは示されていない)。その後の研究には、EphA4を過剰発現する２株のクローン(EphA4-2及びEphA4-3)を選択した。
EphA4の過剰発現は、悪性成長を増強し、エストロゲンの影響を低下させる。軟寒天中における、クローンEphA4-2及びEphA4-3、ならびにベクター単独対照のコロニー形成を、エストロゲンの存在下又は非存在下でアッセイした。
【０２０９】
EphA4-2細胞及びEphA4-3細胞は、エストロゲンの存在下では、対応する対照と比較して２倍を超える、軟寒天中でのコロニー形成の増大を示す(図４、「＋エストロゲン」)。EphA4-2細胞及びEphA4-3細胞は、視野あたり平均4.6コロニーを形成し(図４、「＋エストロゲン」、棒グラフ「EphA4-2」及び「EphA4-3」)、一方、空のベクターで形質移入された対照細胞は、視野あたり２コロニー未満しか形成しない(図４、「＋エストロゲン」、棒グラフ「ベクター」)。
【０２１０】
平行実験を、外来性のエストロゲンの非存在下で行う(図４、「−エストロゲン」の棒グラフ)。実験的に引き起こされるエストロゲンの欠乏は、細胞挙動における対照と、EphA4-2及びEphA4-3細胞との相違を増幅する。MCF-7対照細胞は、軟寒天中でほとんどコロニー形成ができない(図４、「−エストロゲン」領域の棒グラフ「ベクター」、＜１コロニー／視野)が、EphA4-2細胞及びEphA4-3細胞は、より多数のコロニーを形成する(3.4コロニー／視野；図４、「−エストロゲン」の棒グラフ)。EphA4-2細胞及びEphA4-3細胞は、対応する対照より効率的に軟寒天中でコロニー形成し、一方、これらの細胞は、外来性のエストロゲンの非存在下で良好に成長する(図４、「−エストロゲン」の棒グラフ)。したがって、EphA4の過剰発現は、外来性のエストロゲンに対する必要性を低下させる。
【０２１１】
(６．３．５  MATRIGEL(商標)中での管状ネットワーク形成)
MATRIGEL(商標)などの三次元微小環境中における腫瘍細胞の挙動によって、乳腺上皮細胞の分化状態及び病原力を高い信頼性で予測することができる。良性(MCF-10A)又は悪性(MDA-MB-231)の乳腺上皮細胞の単層培養を、MATRIGEL(商標)表面において、EphA4抗体(10μg/ml)又は対照溶液(PBS)の存在下でインキュベートする。MATRIGEL(商標)表面における細胞の挙動は、Zelinskiらの論文(2001、Cancer Res. 61: 2301-6)の記載通りに分析する。簡潔には、MATRIGEL(商標)(Collaborative Biomedical Products、Bedford、MA)による組織培養皿のコーティングを37℃で行い、その後、事前にEphA4抗体又は対照溶液(PBS)と共に氷上で１時間インキュベートされた1×105のMDA-MB-231細胞又はMCF-10A細胞を添加する。細胞をMATRIGEL(商標)上、37℃で24時間インキュベートし、Olympus IX-70倒立光学顕微鏡を用いて細胞挙動を評価する。すべてのイメージは35 mmフィルム(T-Max-400、Kodak、Rochester、NY)に記録する。
【０２１２】
(６．３．６  in vivoでの成長)
本発明の抗体が腫瘍癌成長を抑制する能力をin vivoでアッセイする。簡潔には、MDA-MB-231乳癌細胞を無胸腺マウスに皮下移植する。腫瘍が平均100 mm3の容積にまで成長した後、6 mg/mlのEphA4抗体、又はPBS対照を、マウスに１週間に２回、３週間にわたって腹腔内投与する。腫瘍成長は、腫瘍容積を初期腫瘍容積(100 mm3)で割った比率として評価し、表す。腫瘍成長は、腫瘍容積が1000 mm3に達するまで進行させる。マウスの生存率は、生存しているマウスの比率を、処置後、毎日計数ことによって評価する。
【０２１３】
腫瘍における異常な細胞挙動は、受容体チロシンキナーゼによって調節されていることが多いので、EphA4は、抗体ベースの膵癌治療のための潜在的な治療標的を提供するかもしれない。抗体によって媒介された、別のEph受容体ファミリーメンバー(EphA2)の凝集は、癌細胞が悪性化する可能性を低下させる(Kinch及びCarles-Kinchの論文(Clinical and Experimental Metastasis、20: 59、2003)に概説されている)。EphA4の標的化が同様の結果をもたらすかどうか試験するために、ヒトEphA4に結合するいくつかのscFv断片を試験した。二次抗体を用いてEphA4特異的なscFvを架橋結合させ、これを媒介にしてEphA4を凝集させた。膵癌細胞系であるASPC1をEphA4抗体で処置することによって、多数の生物学的及び生化学的結果が引き起こされた。第１に、細胞外マトリックスに対する細胞接着が低下した(１図)。これは、これらのタイプの接着が細胞増殖、生存、移動、及び侵入を促進する細胞内シグナル伝達部位であるので、重要である(Burridge及びChrzanowska-Wodnickaの論文(Annu. Rev. Cell Dev. Biol.、12: 463、1996)；Parsonsの論文(Curr. Opin. Cell Biol.、8: 146、1996))。第２に、EphA4抗体によって媒介される凝集は、軟寒天コロニー形成アッセイを用いて測定されたように、ASPC1細胞の、足場非依存性の成長を阻害した(図３)。第３に、EphA4活性化は、EphA4及びEphA4関連75kDaタンパク質のチロシンリン酸化をもたらした。まとめると、これらのデータは、抗体によって媒介されたEphA4の活性化によって、膵癌細胞が悪性化する可能性を低下させるシグナル経路が開始されることを示す。
【０２１４】
別系列の実験では、EphA4の上方制御によって、MCF-7乳癌細胞系の足場非依存性成長が促進され、成長のエストロゲン依存性が低下する。MCF-7細胞は、通常、極めて低レベルのEphA4しか発現しないが、この細胞に形質移入を行い、安定した発現株が単離された(EphA4-2及びEphA4-3)。エストロゲン存在下における軟寒天アッセイでは、MCF-7-EphA4細胞は、足場非依存性の成長が、ベクターで形質移入された対照と比較して、2.4倍増大していることが明らかになった(図４)。しかしエストロゲンの非存在下では、EphA4発現細胞は、成長が、同一の対照と比較して、8.5倍増大している。これらのデータは、EphA4を過剰発現する細胞が、EphA4を有しない細胞ほど、成長のための手がかり(マトリックス接着及び成長因子など)に依存していないことを示唆する。これらの実験の結果は、抗体によって媒介されたMCF-7-EphA4細胞の凝集によって、悪性化する可能性の増大が逆転されうることも示唆する。
【０２１５】
(６．４  膵臓腫瘍組織でEPhA4 RNAレベルが増大している)
癌組織におけるEphA4発現を測定するために、患者試料におけるEphA4 RNAレベルを測定した。図５に実証されるように、EphA4 RNAレベルは、正常組織と比較して、膵臓腫瘍組織で増大している。「正常」と標識されている棒グラフ(Ａ)は、52歳の男性患者から得た病理学的に正常な膵臓の組織におけるEphA4 RNAレベルである。「ステージ４原発性」(Ｂ)は、棒グラフＡの組織が採取された同じ52歳の男性患者から得られた、ステージ４Ａ膵臓腺管悪性腺腫を呈している膵臓組織におけるEphA4 RNAレベルを示す。「ステージ２原発性」(Ｃ)は、72歳の男性患者から得られた、ステージ２Ａ膵臓腺管悪性腺腫を呈している膵臓組織におけるEphA4 RNAレベルを示す。「転移性」(Ｄ)は、ステージ２Ｂの転移性膵臓悪性腺腫を呈する71歳の女性患者のリンパ節組織におけるEphA4 RNAを示す。「転移性」(Ｅ)は、ステージ４の転移性膵臓悪性腺腫を呈する57歳の女性患者の網組織におけるEphA4 RNAを示す。「転移性」(Ｆ)は、転移性膵臓悪性腺腫を呈する45歳の女性患者の肝組織におけるEphA4 RNAを示す。癌性及び転移性の組織におけるEphA4発現が対照組織と比較して増大していることは、これらの試料から明らかである。
【０２１６】
(６．５  転移癌を有する患者の治療)
転移性乳癌の患者における、本発明のモノクローナル抗体の薬物動力学及び安全性を評価するための研究が設計される。現在治療を受けている患者は、これらの薬物療法の継続が容認される。
本発明のモノクローナル抗体の単一用量を患者にIV投与し、その後、4週間後から12週間にわたって毎週反復される、同用量でのIV投与の後患者を分析する。26週間のIV投与を通して、本発明のモノクローナル抗体を用いた治療の安全性と、疾患活性の潜在的変化とを評価する。異なったグループの患者を、同様に、ただし1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg、又は8mg/kgの用量を与えて治療し、評価する。
【０２１７】
本発明のモノクローナル抗体は、IV注射用には、5 mg/ml及び10 mg/mlで処方される。反復的な皮下投与には、80 mg/mlの製剤が必要である。本発明のモノクローナル抗体は、研究目的での投与用には100 mg/mlで処方される。
変化を、腫瘍成長の進行によって測定又は判定する。
【０２１８】
(６．６  EphA4抗体の動態分析)
本発明のモノクローナル抗体のKoff率を測定するのに、表面プラズモン共鳴を基づくBIACORE(商標)アッセイを用いる。ハイブリドーマ上清中に存在するIgGを測定に用いる。
【０２１９】
(EphA4の固定)
CM5センサーチップ表面へのEphA4融合タンパク質の固定は、標準的なアミン(NHS/EDCの1：1混和物70μl)結合化学を用いて行う。簡潔には、次に、400 nM EphA4融合タンパク質を10 mM NaOAc、pH 4中に含む溶液を1000〜1100 Ruの密度で活性化された表面に注入する。続いて、1M Et-NH2を70μl注入して、未使用反応エステルの「キャッピング」を行う。同様に、活性化されさらに「キャッピング」された対照表面を、同一のセンサーチップ上にタンパク質なしで調製して、参照表面として用いる。
【０２２０】
(結合実験)
EphA4融合タンパク質表及び対照表面の両方の上に、各EphA4ハイブリドーマ上清250μlを注入し、結合反応を記録する。これらの上清は、希釈せずに使用する。各注入に続いて、少なくとも10分の解離相データを収集する。精製されたEphA4モノクローナル抗体を調製し(250μlの増殖培地あたり1μg、5μg、及び25μg)、陽性対照として用いる。EphA4に結合しない陰性対照モノクローナル抗体も、250μlの増殖培地あたり5μgに調製する。これらの表面を横切る、増殖培地の対照注入も行う。各結合サイクルに続いて、1M NaCl-50mM NaOHの1分間の単一パルス(注入)によってEphA4融合タンパク質表面を再生する。
【０２２１】
(データ評価)
結合データは、「二重参照」として知られている技法で、人為産物のノイズ(ブランク培地の注入)と、非特異的結合(対照表面)との両方を減算することによって修正する。したがって、センサーグラムのオーバーレイは、「正味」の結合曲線を表す。EphA4抗体は、遅いKoff率を有する。
【０２２２】
(７．均等物)
当業者ならば、本明細書に記載した本発明の特定の実施態様に対する多数の均等物を認識し、又は、常例的実験を用いて確認することができよう。かかる均等物は、添付されている特許請求の範囲に包含されるものである。
本明細書で言及した刊行物、特許、及び特許出願のすべてを、あたかも個々の刊行物、特許、又は特許出願を具体的かつ個別的に参照により組み込むものと示されているのと同程度に、引用により本明細書中に取り込む。
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
(４．図面の説明)
【図１】EphA4抗体が細胞球形化を誘導することを示す図である。EphA4に結合する単一鎖Fv抗体(scFv)と共にインキュベートされたAspc1細胞は、37℃でインキュベートされた場合、0℃でインキュベートされた細胞と比較して、細胞の球形化を示す。
【図２】EphA4の架橋が関連75kDaタンパク質のチロシンリン酸化を引き起こすことを示す図である。細胞は、LX13 scFvと共にインキュベートし、その後、抗Flag抗体によって架橋し、エフリンA4-Fcと共に免疫沈降させ、抗ホスホチロシンで染色した。架橋されたEphA4(「架橋EphA4」)は、架橋されていない対照細胞(「対照」)と比較して、EphA4関連75kDaタンパク質のチロシンリン酸化の増大を示す。
【図３】EphA4の凝集が軟寒天中でのASPC1細胞の成長を抑制することを示す図である。EphA4抗体(scFv)で処理された細胞は、次に、この抗体が二次モノクローナル抗体(mab；「LX13 ２価」)で架橋結合され、scFvのみ(「LX13」)又は二次mabのみ(「対照」)で処理された細胞と比較して、軟寒天中でのコロニー形成に有意の減少を示す。
【図４】EphA4の上方制御によって、乳癌細胞株の細胞増殖におけるエストロゲン依存性の低下が引き起こされることを示す図である。通常は、EphA4の発現レベルが極めて低いMCF-7細胞に、空のベクター(「ベクター」)又はEphA4配列を含有するベクターで形質移入した。EphA4の安定した発現体が単離された(クローン２及び３、「EphA4-2」及び「EphA4-3」)。細胞がエストロゲンでインキュベートされた場合、軟寒天アッセイで、MCF7-EphA4細胞は、ベクターで形質移入された対照と比較して、細胞足場非依存性成長において2.4倍の増大を示した(「＋エストロゲン」)。しかしエストロゲン(「−エストロゲン」)の非存在下では、EphA4発現を行う細胞は、ベクターで形質移入された対照と比較して、成長が8.5倍増大した。
【０２２４】
【図５】膵臓腫瘍組織でEphA4 RNAレベルが増大していることを示す図である。棒グラフＡ：52歳の男性から得た病理学的に正常な膵臓組織のEphA4 RNA。棒グラフＢ：棒グラフＡと同じ52歳の男性から得られたステージ４Ａ型膵臓腺管悪性腺腫を呈する膵臓組織におけるEphA4 RNA。棒グラフＣ：72歳の男性から得られたステージ２Ａ膵臓腺管悪性腺腫を呈する膵臓組織のEphA4 RNA。棒グラフＤ：ステージ２Ｂの転移性膵臓悪性腺腫を呈する71歳の女性患者のリンパ節組織におけるEphA4 RNA。棒グラフＥ：ステージ４の転移性膵臓悪性腺腫を呈する57歳の女性患者の網組織におけるEphA4 RNA。棒グラフＦ：転移性膵臓腺癌を呈する45歳の女性の肝臓組織におけるEphA4 RNA。
【図６】抗EphA4 scFvクローン４４がEphA4のチロシンリン酸化を強く誘導することを示す図である。抗EphA4 scFvクローン８、１８、及び２０も、低レベルのEphA4リン酸化を示す、培地中の対照細胞又は抗Flag抗体のみとインキュベートされた細胞と比較して、EphA4チロシンリン酸化を弱く誘導する。
【図７】scFVクローンEphA4-44の配列を示す図である。CDR、VH、及びVLドメインが示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年6月6日(2007.6.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする患者の癌を治療する方法であって、治療有効量の、EphA4アゴニスト抗体であるEphA4抗体、癌細胞表現型を抑制するEphA4抗体、又は露出したEphA4エピトープの抗体を、前記患者に投与することを含む方法。