(57)【要約】  植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるための方法であって：（ｉ）プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来し且つ少なくとも１つの目的配列を含むＲＮＡレプリコン又はその前駆体；及び（ｉｉ）ヘルパーレプリコン又はその前駆体、を含み、ヘルパーレプリコンは、（ａ）ＲＮＡレプリコン（ｉ）の存在下でも非存在下でも植物において全体移行不可能であり、そして（ｂ）ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な１以上のタンパク質を植物において発現可能であり、ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、植物において目的配列を複製可能であるか、又は複製及び発現可能であるが、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現される１以上のタンパク質の非存在下では植物において全体移行できない、前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるためのシステムであって：
（ｉ）  プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来し且つ少なくとも１つの目的配列を含むＲＮＡレプリコンの、１以上のイントロンを含有するＤＮＡ前駆体；及び
（ｉｉ）  ヘルパーレプリコンのＤＮＡ前駆体、
を含み、ヘルパーレプリコンは、
（ａ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の存在下でも非存在下でも植物において全体移行不可能であり、そして
（ｂ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な１以上のタンパク質を植物において発現可能であり、
ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、植物において目的配列を複製可能であるか、又は複製及び発現可能であるが、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現される１以上のタンパク質の非存在下では植物において全体移行できない、前記システム。
【請求項２】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）が、ウイルス粒子組み立ての機能性オリジンが存在しないために植物において全体移行不可能である、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）が、植物においてＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な若しくは有用なコートタンパク質及び／又は移行タンパク質を植物において発現可能である、請求項１又は２に記載のシステム。
【請求項４】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）が、植物においてＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要なタンパク質を発現できない、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）が、コートタンパク質オープンリーディングフレームを欠失しており、目的配列が１ｋｂより長い、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）が、トバモウイルスの成分に基づくか又は含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項７】
トバモウイルスがタバコモザイクウイルスである、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）がトバモウイルスに基づいており、コートタンパク質オープンリーディングフレームが目的配列で置換されている、請求項６又は７に記載のシステム。
【請求項９】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）が、アルファルファモザイクウイルスの成分に基づいているか又は含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１０】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）が、ジャガイモＸウイルスの成分に基づいているか又は含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１１】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）が、ササゲモザイクウイルスの成分に基づいているか又は含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１２】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）の前駆体が、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）をコードする、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）を植物の細胞内で産生可能なＤＮＡである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１３】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）の前駆体又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）の前駆体が、アグロバクテリウムによって運ばれる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるための植物若しくはその種子を更に含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
植物が双子葉植物であり、好ましくはナス科植物であり、より好ましくはタバコ植物であり、最も好ましくはタバコである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１６】
植物がトランスジェニックであり、ＲＮＡレプリコン（ｉ）又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）の細胞間移行に必要な若しくは有用なウイルスタンパク質を発現する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１７】
ウイルスタンパク質がタバコモザイクウイルスの移行タンパク質である、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）が、機能的に重複した領域において相同性を欠いている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項１９】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの組換えが全体移行に必要なタンパク質を発現可能であって、植物において全体移行可能であるＲＮＡレプリコンを作製するであろう領域において、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）が、組換えしやすい相同性を欠いている、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２０】
少なくとも１００ヌクレオチドの配列セグメントにおけるＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの配列相同性が高くても８０％である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２１】
配列セグメントが、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）のレプリカーゼＯＲＦの下流に位置する、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、移行タンパク質ＯＲＦを欠失するが、レプリカーゼＯＲＦ及びＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要なタンパク質をコードするＯＲＦを含有し、後者のＯＲＦはサブゲノムプロモーターの制御下にあり、サブゲノムプロモーターは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）において目的配列の発現を制御するサブゲノムプロモーターが由来するＲＮＡウイルスと異なるＲＮＡウイルス株に由来する、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）の配列とヘルパーレプリコン（ｉｉ）の配列が重複しない、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２４】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体が、ＲＮＡレプリコン（ｉ）のレプリカーゼＯＲＦに１以上のイントロンを含有する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２５】
植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるための方法であって、
（ｉ）  プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来し且つ少なくとも１つの目的配列を含むＲＮＡレプリコンの、１以上のイントロンを含有するＤＮＡ前駆体；及び
（ｉｉ）  ヘルパーレプリコンのＤＮＡ前駆体、
を有する植物の細胞を提供することを含み、ヘルパーレプリコンは、
（ａ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の存在下でも非存在下でも植物において全体移行不可能であり、そして
（ｂ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な１以上のタンパク質を植物において発現可能であり、
ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、植物において目的配列を複製可能であるか、又は複製及び発現可能であるが、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現される１以上のタンパク質の非存在下では植物において全体移行できない、前記方法。
【請求項２６】
植物が、Ｔ−ＤＮＡにレプリコン（ｉ）の前駆体を含有するアグロバクテリウム及び／又はＴ−ＤＮＡにヘルパーレプリコン（ｉｉ）の前駆体を含有するアグロバクテリウムの形質移入により、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）を提供される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
葉などの植物の一部にＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）が提供されるが、植物の他の部分には提供されない、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
目的配列が、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）を提供されない植物の部分において全体的に複製可能であるか、又は複製及び発現可能である、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
植物が双子葉植物であり、好ましくはナス科植物であり、より好ましくはタバコ植物であり、最も好ましくはタバコである、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるための方法であって、
（ｉ）  プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来し且つ少なくとも１つの目的配列を含むＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡ前駆体；及び
（ｉｉ）  ヘルパーレプリコンをコードするＤＮＡ前駆体、
を有する植物細胞を提供することを含み、ヘルパーレプリコンは、
（ａ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の存在下でも非存在下でも植物において全体移行不可能であり、そして
（ｂ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な１以上のタンパク質を植物において発現可能であり、
ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、植物において目的配列を複製可能であるか、又は複製及び発現可能であるが、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現される１以上のタンパク質の非存在下では植物において全体移行できず；そして、
ＲＮＡレプリコン（ｉ）をコードするＤＮＡ前駆体は、ＲＮＡウイルス配列に由来する、ＲＮＡレプリコン（ｉ）のレプリコン機能に関する配列を含有し、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、ＲＮＡレプリコン（ｉ）形成頻度を上昇させる、前記方法。
【請求項３１】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）がプラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来し、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）をコードするＤＮＡ前駆体は、ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）のレプリコン機能に関する配列を含有し、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないヘルパーレプリコンと比較して、ヘルパーレプリコン形成頻度を上昇させる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
植物の細胞にＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）を提供することが、ＤＮＡ前駆体（ｉ）及びＤＮＡ前駆体（ｉｉ）による一過性アグロバクテリウム介在形質転換を含む、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
植物において目的配列から目的タンパク質を発現させるための請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物において目的配列を複製するか又は発現させるためのウイルスベクターシステムに関する。また、本発明は、植物において目的配列を複製及び／又は発現させるための方法を提供する。この方法は、植物、特に作物において目的タンパク質を発現させるために用いることができる。本システムは、多様な異なるウイルスベクターに基づくことができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ウイルスに基づいた発現システムは、植物における迅速なタンパク質産生に用いることができ（概説として：Ｐｏｒｔａ＆Ｌｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ、１９９６、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、２０９−２２１；Ｙｕｓｉｂｏｖら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４０、８１−９４を参照されたい）、機能ゲノミクス研究の強力なツールである（Ｄａｌｍａｙら、２０００、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１２、３６９−３７９；Ｒａｔｃｌｉｆｆら、２００１、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、２５、２３７−２４５；Ｅｓｃｏｂａｒら、２００３、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１５、１５０７−１５２３）。当該分野における数多くの出版物及び特許は、ＤＮＡ及びＲＮＡのウイルスベクターに基づいたシステムについて記載している（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、４２７−４３０；Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、６２２−６２５；Ｍｏｒら、２００３、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、８１、４３０−４３７；ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号；ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号；ＵＳ５９８１２３６号；ＷＯ０２／０８８３６９号；ＷＯ０２／０９７０８０号；ＷＯ９８／５４３４２号）。既存のウイルスベクターシステムは、最高性能の点から見ると、通常狭い宿主範囲に限定されており、最も好ましい宿主におけるそのようなベクターの発現レベルでさえ、システムの生物学的上限をはるかに下回っている。
【０００３】
ＲＮＡウイルスは、ＤＮＡウイルスと比較して高発現レベルを提供するため、発現ベクターとしての使用に最も好適である。植物におけるトランスジェニック物質の全体的な発現に好適なウイルスベクターについて記載する公開特許がいくつかある（ＵＳ５３１６９３１号；ＵＳ５５８９３６７号；ＵＳ５８６６７８５号）。一般に、これらのベクターは、ウイルスタンパク質との翻訳融合体として（ＵＳ５４９１０７６号；ＵＳ５９７７４３８号）、追加のサブゲノムプロモーター（ＵＳ５４６６７８８号；ＵＳ５６７０３５３号；ＵＳ５８６６７８５号）から、又は独立したタンパク質翻訳のためのＩＲＥＳ配列（ＷＯ０２／２９０６８号）を用いて低ポリシストロン性ウイルスＲＮＡから、外来遺伝子を発現することができる。第１のアプローチ  −組換えタンパク質とウイルス構造タンパク質との翻訳融合体（Ｈａｍａｍｏｔｏら、１９９３、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１、９３０−９３２；Ｇｏｐｉｎａｔｈら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、１５９−１７３；ＪＰ６１６９７８９号；ＵＳ５９７７４３８号）は顕著な収率を与える。しかしながら、そのようなアプローチの使用は、組換えタンパク質はウイルスタンパク質と容易に分離できないために制限される。このアプローチの変形の１つは、ウイルス部位特異的プロテアーゼによって認識されるペプチド配列を介した、又は触媒ペプチドを介した、翻訳融合体を使用する（Ｄｏｌｊａら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、１０２０８−１０２１２；Ｇｏｐｉｎａｔｈら、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２６７、１５９−１７３；ＵＳ５１６２６０１号；ＵＳ５７６６８８５号；ＵＳ５４９１０７６号）。
【０００４】
異種サブゲノムプロモーター上に構築されたウイルスベクターを利用する発現方法は、良好なタンパク質産生レベルを提供する（ＵＳ５３１６９３１号）。そのようなベクター及び他の多くのものの最も深刻な不利点は、増幅されるＤＮＡサイズの収容限度である。通常、安定な構築体は１ｋｂ以下のインサートを収容する。このことは、植物の機能ゲノミクスのある分野では、Ｇ．ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（ＷＯ９９３６５１号）が内在遺伝子サイレンシングのために植物ｃＤＮＡライブラリーを発現させるためのＴＭＶに基づいたウイルスベクターの使用について記載しているような深刻な限界ではないかもしれない。更に、そのようなベクターは全体移行可能でコートタンパク質を産生するため、植物の重要な資源は組換えタンパク質の合成に回される。そのような植物ウイルス発現システムを用いてこれまで達成された発現レベルの低さが、これらのシステムが、細菌細胞、真菌細胞、又は昆虫細胞の発現システムのような他の発現システムとほとんど競合しないことの主な理由である。低発現レベルは、植物材料の巨大な背景におけるタンパク質の単離及び精製のための下流部門費用を非常に高くする。したがって、単位植物バイオマスあたりの目的のタンパク質又は産物の収率が増加するにつれて、下流部門処理費用は直ちに減少する。また、そのようなベクターの生物学的安全性は、感染性ウイルス粒子を形成できるために問題である。
【０００５】
ヘルパーウイルスを必要とする代替の２成分システムがＴｕｒｐｅｎによって開発された（ＵＳ５，８１１，６５３号；ＵＳ５，８８９，１９１号；ＵＳ５，９６５，７９４号）；このアプローチは、ウイルスとヘルパーウイルスとのシステムに依拠しており、ヘルパーウイルスはレプリカーゼ機能を提供するが、主要レプリコンはレプリカーゼ活性を欠損している。このシステムは、ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（レプリカーゼ）が、トランスで提供される基質ＲＮＡとともに非効率的に作用するため、実用的ではない。そのような非効率の考えられる説明は、ＴＭＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが１２６ｋＤａタンパク質と１８３ｋＤａリードスルータンパク質とから成るヘテロダイマーである（Ｗａｔａｎａｂｅら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７３、２６３３−２６４０）ということである。このヘテロダイマーの少なくとも１つの成分、１２６ｋＤａタンパク質は、初めにシスで作用するらしいことが示された（Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｋｙ＆Ｄａｗｓｏｎ、２０００、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２７１、９０−９８）。細胞間移行及び全体移行のようにトランスで他のウイルス機能を補完することに関する出版物がいくつかある。ＭＰ及びＣＰは、トランスジェニック宿主によって又は他のウイルスによってトランスで提供することができる。例えば、ＭＰ又はＣＰ遺伝子にフレームシフトを有するＴＭＶ変異体は、接種させたタバコ植物で局所的に又は全体的に感染できなかったが、野生型のＭＰ又はＣＰ遺伝子を発現するトランスジェニックタバコ植物において、失った機能を獲得した（Ｈｏｌｔ＆Ｂｅａｃｈｙ、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８１、１０９−１１７；Ｏｓｂｏｕｒｎ、Ｓａｒｋａｒ＆Ｗｉｌｓｏｎ、１９９０、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７９、９２１−９２５）。これらの研究は異種目的配列を発現させるためのウイルスに基づいたベクターを作製するという問題に取り組んでおらず、むしろ、さまざまなウイルスタンパク質の生物学的機能について研究していた。他の研究は、ＧＦＰを発現するＣＰ欠損ＴＭＶの長距離移行を、ラッカセイロゼットアンブラウイルス（ＧＲＶ）のＯＲＦ３を有するキメラＴＭＶによって補完することについて記載している（Ｒｙａｂｏｖ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ＆Ｔａｌｉａｎｓｋｙ、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１２１２−１２１７０）。しかしながら、結果から得られるように、ＧＦＰを発現するＣＰ欠損ＴＭＶ、及びＧＲＶのＯＲＦ３で置換されたＣＰを有するＴＭＶを共感染させた植物の全体の葉におけるＧＦＰ発現効率は、ＧＦＰを発現する浸透性ＴＭＶを感染させた植物よりも顕著に低かった。この低発現レベルは、全体の葉における２つのウイルスベクターの存在及び競合によるものかもしれない。その上、上記の全ての実験は、全体の葉において感染性ウイルス粒子を形成し、したがって、生物学的安全性の観点から、環境での使用に許容できない。
【０００６】
Ｃ．Ｍａｓｕｔａら（ＵＳ５，３０４，７３１号）によって提唱された他のシステムは、異種目的配列の担体として使用されるサテライトＣＭＶ  ＲＮＡウイルスと、ＣＭＶ  ＲＮＡの複製に必要な機能を提供するヘルパーウイルスとの使用について提唱している。我々の知る限り、このシステムは非常に非効率的である。
【０００７】
先行技術のウイルスに基づいた植物発現システムに関する重大な関心は生物学的安全性である。一方、植物全体及び隣接植物へのウイルス伝播を容易にし、所望の遺伝子産物の収率を増加させるためには、組換えウイルスの高感染性が非常に望まれている。一方、そのような高感染性は、望ましくない植物への伝播が容易に起こり得るため、組換え物質の封じ込めを危うくする。その結果、ウイルスに基づいた、より安全な植物発現システムが非常に望まれている。
【０００８】
現在、全体移行可能であり、技術的応用に必要な収率及び効率を提供可能な植物ＲＮＡウイルスベクター上に構築された、生物学的に安全な大規模トランス遺伝子発現システムは存在しない。既存の浸透性ベクターは、組換え産物の低収率に悩まされている。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、目的タンパク質を高収率で産生するための、環境面で安全な植物ウイルス発現システムを提供することである。本発明の他の目的は、生態学的及び生物学的安全性が改善された、目的ヌクレオチド配列を植物又は植物の部分において複製及び／又は発現させる方法を提供することである。他の目的は、植物において優位性のある大規模タンパク質産生を可能にする効率を有する植物におけるタンパク質産生方法を提供することである。
【発明の開示】
【００１０】
発明の一般的説明
上記目的は、植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるためのシステムによって解決され、このシステムは：
（ｉ）  プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来し且つ少なくとも１つの目的配列を含むＲＮＡレプリコン又はその前駆体；及び
（ｉｉ）  ヘルパーレプリコン又はその前駆体、
を含み、ヘルパーレプリコンは、
（ａ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の存在下でも非存在下でも植物において全体移行不可能であり、そして
（ｂ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な１以上のタンパク質を植物において発現可能であり、
ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、植物において目的配列を複製可能であるか、又は複製及び発現可能であるが、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現される１以上のタンパク質の非存在下では植物において全体移行できない。
【００１１】
更に、本発明は、植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるための方法を提供し、この方法は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）を有する植物の細胞を提供することを含む。本発明は、植物において目的配列を複製するか、又は目的配列を複製し、目的配列を発現させるため、例えば工業的酵素又は医薬タンパク質のような目的タンパク質を植物において産生するために用いることができる、また、本発明は、本発明の方法によって産生されたか又は産生可能なタンパク質に関する。更に、本発明は、植物又は植物細胞におけるタンパク質産生方法を提供する。
【００１２】
重要な態様では、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、植物の細胞核に導入されるＤＮＡ前駆体を介して植物に提供される。これらのＤＮＡ前駆体は、細胞核における転写によってＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）を生成することができる。細胞質におけるＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）の形成及び構築を増加させるため、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の前駆体及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）の前駆体は１以上のイントロンを含有することができる。一般に、ＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＤＮＡ前駆体は、ＲＮＡウイルスの配列に由来するレプリコン機能に関する配列（ＲＮＡレプリコン（ｉ）の場合はレプリカーゼＯＲＦ又はＭＰ  ＯＲＦなど）を含有し、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮することが好ましく、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）の形成頻度を上昇させる。この技術は、１つのＲＮＡレプリコンに関してＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３に詳細に記載されており、本発明においてＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）に適用することができる。
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるための新規原理を特定した。本発明者らは、ウイルス粒子組み立て能を欠損したヘルパーレプリコンは、例えばＤＮＡコピーとしてアグロ送達により植物に提供された場合、局所的に形質移入された組織において十分量のコートタンパク質を発現し、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行を完全に回復させることができることを発見した。更に、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行は、目的配列を発現する全体的に感染した葉をもたらすが、コートタンパク質の量は、コートタンパク質発現ウイルスが目的配列を発現する場合と比較して大きく減少することが発見された。コートタンパク質は、通常、ウイルス感染した植物細胞で最も強く発現されるタンパク質である。しかしながら、本発明のシステム及び方法を用いると、全体的に感染させた細胞の資源がコートタンパク質の発現によって使い果たされることはない。その結果、全体的に感染させた植物細胞における目的配列の発現レベルは慣用のウイルス発現システムよりも高い。更に、全体的に感染させた植物細胞は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）から産生する組み立てられたウイルス粒子が少量であり、２次宿主植物へのＲＮＡレプリコン（ｉ）の伝播が起こる可能性は非常に低い。望ましくない植物へのＲＮＡレプリコン（ｉ）の伝播がまれなイベントで起こる場合、ヘルパーレプリコンが存在しないためにそのような望ましくない植物において全体移行できず、したがって、環境リスクは無視できる。このように、本発明のシステム及び方法は、優れた生物学的安全性／環境安全性を有する。同時に、本発明のシステム及び方法は、植物の一部の感染で、植物の他の部分、好ましくは植物全体において目的配列の複製又は複製及び発現を達成するのに十分であるというウイルス発現システムの重要な特徴を維持している。
【００１４】
本発明の有益な特徴は以下のようにまとめることができる：
１．  システムは、コートタンパク質を有さないＲＮＡレプリコンによって宿主植物全体の感染を提供し、したがって、より大きなＤＮＡインサートを収容できる。
２．  全体の葉における発現は、完全に異種目的配列専用であり、コートタンパク質の発現と全く又はほとんど競合しない。
３．  ウイルスタンパク質（局所的に感染させた葉のヘルパーレプリコンによって産生されるため、コートタンパク質は少量で存在する）及び宿主タンパク質（植物細胞の生合成装置が遮断されているため）の量が少ないため、目的タンパク質又は目的ＲＮＡの、最高の絶対収率及び相対収率を達成することができる。
４．  組み立てられるウイルス粒子の収率は非常に低く、組み立てられるウイルス粒子には全体移行に必要なタンパク質がないため、発現システムは、野生型ウイルスの全ての機能を保持するベクターよりも非常に安全である。
５．  ＲＮＡレプリコン（ｉ）及び場合によりヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＤＮＡ前駆体における、イントロン又は本明細書で定義するような他の機能保存的な相違の組み込みは、細胞質で構築されるＲＮＡレプリコン（及び場合によりヘルパーレプリコン）の効率を上昇させ、競争力のある工業的／大規模タンパク質産生法に必要な効率を提供する。
【００１５】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）の更なる改変は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの組換えによって野生型ウイルスが再構築される危険性を最小限にすることが本明細書に記載される。更に、本発明は、発現させる目的配列のサイズに感知できる限界がなく、複数の遺伝子を同一細胞及び植物において発現させ、高い生態学的及び生物学的安全性パラメータを有する。
【００１６】
本発明のシステム及び方法は、目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるために用いることができる。複製とは、ＲＮＡ産生、即ちＲＮＡレプリコン（ｉ）とともに目的配列が増幅することを意味する。発現とは、目的配列にコードされる目的タンパク質の産生を意味する。本発明のシステム及び方法は、目的タンパク質をＲＮＡレプリコン（ｉ）に存在する目的配列から産生するために用いることが好ましい。
【００１７】
本発明のシステムは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）を含むことができる。好ましくは、システムは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＤＮＡ前駆体を含む。より好ましくは、ＤＮＡ前駆体は、アグロバクテリウムのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに含有される。最も好ましくは、本発明のシステムは、２つのアグロバクテリウム株の混合物であり、１方の株はＴ−ＤＮＡにＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体を含有し、他方の株は、Ｔ−ＤＮＡにヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＤＮＡ前駆体を含有する。本発明のシステムは、レプリコン対、前駆体対、又はこの段落に記載した２つのアグロバクテリウム株の混合物のいずれかを含有する、目的タンパク質を産生するためのキットであり得る。キットは、目的配列を発現する植物又は植物の種子を更に含有することができる。更に、本発明のシステムは、レプリコン対、前駆体対、又は２つのアグロバクテリウム株の混合物のいずれかで処理、感染、又は形質転換された植物であり得る。
【００１８】
本発明のシステム（又はキット）の第１の成分は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）を含む。ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、典型的にはプラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来する。そのようなウイルスの例は、ササゲモザイクウイルス、ジャガイモＸウイルス、及びアルファルファモザイクウイルスである。好ましいウイルスはトバモウイルスであり、最も好ましいウイルスはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びアブラナ科植物感染性トバモウイルスである。プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来するとは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）が典型的にはそのようなウイルスを出発物質として用いて作製されていることを意味する。あるいは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、そのようなウイルス由来の遺伝機能（例えばレプリカーゼ、移行タンパク質）を用いて作製してもよい。ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスとは異なる成分又は遺伝機能を用いて作製することもできる。ＲＮＡレプリコン（ｉ）の前駆体は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）をコードするＤＮＡ前駆体であることができ、ＤＮＡ前駆体は植物の細胞においてＲＮＡレプリコン（ｉ）を産生可能である。以下に更に説明するように、ＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体は、１以上のイントロンを含有することができ；又は例えばＲＮＡレプリコンのレプリコン機能を破壊する場所でスプライシング部位を除去することによってコドンの使用を変化させることにより、それが由来するウイルスに対して改変されていてもよい。
【００１９】
レプリコンであるためには、ＲＮＡレプリコン（ｉ）は植物細胞において自律複製可能でなければならない。自律複製とは、レプリコンがレプリコンの複製を触媒するレプリカーゼ（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）をコードすることを意味する。レプリコンは、レプリカーゼの翻訳に必要な翻訳装置のような宿主細胞の機能を利用することができる。レプリカーゼは、特に細胞質で構築されるＲＮＡレプリコンの効率を上昇させるためにＲＮＡレプリコン（ｉ）がＤＮＡ前駆体として植物の細胞核に提供される場合、１つ又はいくつかのイントロンが提供されてもよい（本明細書に援用されるＰＣＴ／ＥＰ０３／１２５３０号及びＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３号を参照されたい）。
【００２０】
更に、ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、複製又は発現されるべき目的配列を含有する。目的配列は、本発明の方法で発現させて、目的タンパク質を産生させることが好ましい。目的配列は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）が由来するプラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに対して異種であることが好ましい。ＲＮＡレプリコンは、通常、１以上のサブゲノムプロモーター、リボソーム結合部位などのように、目的配列を発現又は複製するために必要な遺伝機能を更に含有する。
【００２１】
ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現される１以上のタンパク質の非存在下では植物において全体移行できない。この特性は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）が由来するＲＮＡウイルスの全体移行に必要なタンパク質をコードするヌクレオチド配列を、このタンパク質がＲＮＡレプリコン（ｉ）から機能性型で発現されないように改変することによって達成できる。機能性型での発現は、タンパク質をコードする配列の部分を変異若しくは欠失させることによって、又はタンパク質の発現に必要な調節配列（例えばサブゲノムプロモーター）を変異若しくは欠失させることによって妨げることができる。好ましい態様では、１つのタンパク質（又はＲＮＡウイルスが全体移行に必要な１より多いタンパク質を含有する場合は複数のタンパク質）が大部分又は完全に欠失している。そのような欠失は、本発明のシステム及び方法にいくつかの更なる利点を追加する：ＲＮＡレプリコン（ｉ）の効率を落とすことなく、より大きな目的配列をＲＮＡレプリコン（ｉ）に含めることができ、目的配列は１ｋｂより大きくてもよい。更に、ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの相同性が低下する。それにより、レプリコン（ｉ）と（ｉｉ）とのあいだの組換えイベントは起こりそうにない。
【００２２】
トバモウイルスのような多くの植物ウイルスでは、全体移行に必要なタンパク質はコートタンパク質である。したがって、ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、コートタンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有しないか、又はコートタンパク質ＯＲＦの実質的な部分を欠失していることが好ましい。代わりに、目的配列はコートタンパク質ＯＲＦの位置を取ることができる。この位置は、多くの植物ウイルスにおいて３’−近傍であり、これは、通常、最も強力に発現されるウイルスＯＲＦの位置である。
【００２３】
植物において、ヘルパーレプリコンの存在下で全体移行可能であるためには、ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、ウイルス粒子組み立ての機能性オリジンを有する必要がある。トバモウイルスの場合、ウイルス粒子組み立てのオリジンは、移行タンパク質（ＭＰ）ＯＲＦに位置する。したがって、ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）が由来するＲＮＡウイルスにおけるウイルス粒子組み立てのオリジンを有する配列セグメント又はＯＲＦを含有することが好ましい。
【００２４】
本発明のシステム及び方法の第２の成分はヘルパーレプリコン（ｉｉ）である。ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な１以上のタンパク質を植物において発現可能であるようにＲＮＡレプリコン（ｉ）を補助する。ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、植物においてＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行を可能にするタンパク質を植物に提供することができる。全体移行に必要なタンパク質は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）において欠失されたか又は発現不可能にされたものに相当することが好ましい。最も好ましくはコートタンパク質である。
【００２５】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）はＤＮＡレプリコンであることができ、ジェミニウイルスのようなＤＮＡウイルス由来であることができる。しかしながら、好ましくは、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）はＲＮＡレプリコンであり、プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスのようなＲＮＡウイルス由来であることができる。ヘルパーレプリコン（ｉｉ）及びＲＮＡレプリコン（ｉ）は、同一又は異なる植物ウイルス、例えばタバコモザイクウイルスのようなトバモウイルスに由来することができる。ＲＮＡレプリコン（ｉ）と同様に、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、植物細胞においてヘルパーレプリコンの複製を触媒可能なレプリカーゼをコードする。
【００２６】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）が植物に存在するかどうかとは無関係に植物において全体移行不可能である。全体移行不可能であることは、さまざまな方法で達成することができる。１つの態様では、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）と全体移行に必要なタンパク質とは両立せず、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要なタンパク質はヘルパーレプリコンに全体移行機能を提供できない。この場合、ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）は異なる植物ウイルスに由来することが好ましく、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）ではなくＲＮＡレプリコン（ｉ）に全体移行機能を提供するコートタンパク質を発現可能であることができる。あるいは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）は同一植物ウイルスに由来する。
【００２７】
好ましい態様では、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、ウイルス粒子組み立ての機能性オリジンを欠失しているため、全体移行不可能である。それにより、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、全体移行に必要なタンパク質、特にコートタンパク質によってパッケージされることができない。ウイルス粒子組み立てのオリジンは機能不全にすることができる。ＴＭＶでは、ウイルス粒子組み立てのオリジンは移行タンパク質（ＭＰ）  ＯＲＦに位置する。ＭＰ  ＯＲＦ内のウイルス粒子組み立てのオリジンも欠失させることができる。ヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＭＰ  ＯＲＦが機能性ＭＰをコードする必要はない。ヘルパーレプリコン（ｉｉ）のための機能性ＭＰが所望の場合、ＭＰは例えばＲＮＡレプリコン（ｉ）によって提供されることができる；更に、ＭＰは、ＭＰに関してトランスジェニックの植物宿主によってコードされることもできる。ウイルス粒子組み立てのオリジンがＭＰ  ＯＲＦに位置する場合、ヘルパーレプリコンがＭＰ  ＯＲＦを欠失していることが最も好ましい。これは、ＭＰ  ＯＲＦを有するＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの相同性が低下するという更なる利点を有し、相同組換えによってＲＮＡウイルスのような野生型を形成する可能性はごくわずかであるため、システム及び方法の生物学的安全性を高める。
【００２８】
ヘルパーレプリコン（ｉｉ）が全体移行可能かどうかは、植物の葉の一部にレプリコン（又はその前駆体）を感染させ、この植物の他の感染していない葉（「全体の葉」）において同じレプリコンの発生を観察することによって実験的に試験することができる（実施例を参照されたい）。全体移行不可能であることは相対的な特性である。ヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、全体移行の可能性が、それが由来するウイルスと比較して実質的に低下している場合、全体移行不可能であるとみなされる。いずれにせよ、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）の全体移行の可能性はＲＮＡレプリコン（ｉ）よりもかなり低く、全体の葉におけるＲＮＡレプリコン（ｉ）からの目的配列の複製又は複製及び発現は、植物ウイルス発現システムを用いたタンパク質発現の典型的な時間枠（約１〜３週間）にある全体の葉において抑制されない。植物においてヘルパーレプリコン（ｉｉ）の全体移行が全く検出できないことが最も好ましい（例えばウエスタンブロッティング又はノーザンブロッティングによって）。
【００２９】
本発明の方法又はシステムに用いる植物は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）の全体移行を可能にするタンパク質をコードする、植物の核染色体に安定に組み込まれた遺伝子を含有しないことが好ましい。そのような状況は、方法又はシステムの生物学的安全性を危うくするからである。
【００３０】
環境安全性及びシステムの効率を高めるには、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）は互いに組換わりがちであるべきではない。これは、レプリコン（ｉ）と（ｉｉ）とのあいだの相同性が低いことによって達成することができる。ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、機能的に重複する領域において相同性がないか又は重複しないことが好ましい。機能的に重複する領域は、同一機能、例えばレプリカーゼＯＲＦ、ＭＰ  ＯＲＦ、又はサブゲノムプロモーターを有するか又はコードするレプリコン内の領域である。そのような領域の相同性は、例えば遺伝コードの縮重を用いてコドンを変化させることによって及び／又は異なる植物ウイルスに由来する、レプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）の機能性領域を使用することによって低下させることができる。
【００３１】
多くの潜在的な組換えイベントは、特定のレプリコンに依存して、レプリコンを変化させないか又は機能的でないレプリコンをもたらす。そのような組換えはシステムの効率を低下させ得るが、環境リスクをもたらさない。最高の環境安全性を達成するには、ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの組換えが、同時に、
（Ａ）  全体移行に必要なタンパク質を発現可能であり、そして
（Ｂ）  植物において全体移行可能である、
レプリコンを作製するであろう領域において、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）が、組換わりやすい相同性を欠失していることが好ましい。
【００３２】
そのようなレプリコンは、慣用の植物ウイルス発現システムにおけるウイルスベクターに適合するであろう。当業者はそのような領域を容易に同定することができる。レプリコン（ｉ）と（ｉｉ）がともにトバモウイルスに基づいており、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）がウイルス粒子組み立ての機能性オリジンを欠失している態様では、そのような領域は、組み立てのオリジンが欠失されたか又は機能不全にされたＭＰ  ＯＲＦの位置の下流である。この領域では、ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの相同性を低下させる必要がある。ＴＭＶでは、ＭＰ  ＯＲＦの３’部分とＣＰサブゲノムプロモーターの５’部分は重複し、ある株では、ＭＰ  ＯＲＦはＣＰ  ＯＲＦの一部を更に含有するため、相同性を低下させるためにコドンの使用を変化させる可能性は、ＣＰサブゲノムプロモーターの機能を害するかもしれないので限定される。コドンの使用を変化させる変わりに、機能性置換を用いることができる。即ち、異なるＲＭＡウイルスに由来するサブゲノムプロモーターのような異なるウイルスに由来する機能性配列を使用することができる。そのようなサブゲノムプロモーターの例は、ＴＭＶ株Ｕ１及びＵ５に由来するＣＰサブゲノムプロモーター又はｃｒＴＭＶ（アブラナ科植物感染性トバモウイルス）のＣＰサブゲノムプロモーターである。例として、ヘルパーレプリコンのＣＰをＴＭＶ株Ｕ１に由来するＣＰサブゲノムプロモーターの制御下におき、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の目的配列をｃｒＴＭＶ又はＴＭＶ株Ｕ５に由来するＣＰサブゲノムプロモーターの制御下におくか、又はその逆であることができる。いずれにせよ、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の目的配列のサブゲノムプロモーター及びヘルパーレプリコンのＣＰのサブゲノムプロモーターは、ＣＰサブゲノムプロモーターである必要がある。そのような態様では、ヘルパーウイルス（ｉｉ）はトバモウイルス（ＴＭＶ）に基づき、５’から３’に向かって、（ａ）トバモウイルス  レプリカーゼＯＲＦ、ＣＰサブゲノムプロモーター、及び機能可能にそれに連結した、ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要なコートタンパク質を含有することができ、粒子組み立てのオリジンを有するＭＰ  ＯＲＦは、実質的に又は完全に欠失されるであろう。上記のように、ヘルパーレプリコンにおけるコートタンパク質のためのサブゲノムプロモーターと、ＲＮＡレプリコン（ｉ）において使用される目的配列又は移行タンパク質のためのサブゲノムプロモーターは、異なるＴＭＶ株に由来することが好ましい。
【００３３】
少なくとも１００ヌクレオチド（好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド）の配列セグメントにおけるＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの配列相同性は高くても９０％でなければならない。そのような配列セグメントは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）のレプリカーゼＯＲＦの下流に位置することが好ましい。好ましくは、少なくとも１００ヌクレオチド（好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド）の配列セグメントにおけるＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの配列相同性は高くても８０％である。より好ましくは、少なくとも１００ヌクレオチド（好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド）の配列セグメントにおけるＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの配列相同性は高くても７０％である。最も好ましくは、少なくとも１００ヌクレオチド（好ましくは少なくとも１５０ヌクレオチド）の配列セグメントにおけるＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの配列相同性は高くても６０％である。非常に好ましい態様では、これらの相同性値は、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＣＰのサブゲノムプロモーター及びＲＮＡレプリコン（ｉ）の目的配列のサブゲノムプロモーターの配列セグメントに当てはまる。
【００３４】
したがって、本発明のシステムは、少なくとも成分（ｉ）及び（ｉｉ）を含有する。本発明のシステムは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）を、植物の細胞においてレプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）が形成する前駆体の形態で含有することができる。ＲＮＡレプリコン（ｉ）の前駆体は、通常、ＲＮＡレプリコン（ｉ）をコードするＤＮＡであり、植物の細胞においてＤＮＡの転写によってＲＮＡレプリコン（ｉ）を形成するために、植物において機能性のプロモーターを有するであろう。同様に、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）がＲＮＡレプリコン（ＲＮＡレプリコン（ｉｉ））である場合、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）の前駆体はＤＮＡであり得る。ＤＮＡ前駆体は、Ｔ−ＤＮＡの左の境界配列及び右の境界配列に隣接され、アグロバクテリウムによって運ばれることができる。本発明の特に好ましい態様では、本発明のシステムは、あるアグロバクテリウムによって運ばれるＴ−ＤＮＡ内にＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体と；他のアグロバクテリウムによって運ばれるＴ−ＤＮＡ内にヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＤＮＡ前駆体を含む。本発明のシステムのためのレプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）の他の前駆体は、植物の遺伝子銃形質転換又は他の形質転換法のためのＤＮＡである。
【００３５】
レプリコンのＤＮＡ前駆体は、典型的には、転写プロモーターに機能可能に連結されているか又は連結可能なＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）をコードする配列を有する。レプリコンをコードするＤＮＡ配列が、転写プロモーターに機能可能に連結されている場合、転写プロモーターは、目的配列の発現を調節可能にするために、誘導性の、組織特異的に又は発生学的に調節されたプロモーターのような調節されたプロモーターであり得る。より好ましくは、プロモーターは構成的プロモーターである。この場合、本発明の方法は、ＤＮＡ前駆体を植物又はその部分に適用することによってスイッチが入る。
【００３６】
本発明のシステムは、本発明の方法を実施するための植物又はその種子を更に含有することができる。原理上、本発明は、感染性ウイルスが公知の如何なる植物を用いても実施することができる。好ましいのは単子葉植物及び双子葉植物を含めた作物であり、後者が好ましい。本発明はタバコ植物によって十分に確立されており、ナス科の他の植物に適用することができる。タバコ及びベンサミアナタバコが最も好ましい。これらの植物は、一般的にヒトの食物連鎖に入らないという更なる利点を有している。
【００３７】
植物は野生型植物でもトランスジェニック植物でもよい。植物のゲノムに安定且つ発現可能に組み込まれたＭＰ遺伝子を、上記のように、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＭＰ機能を補完するために用いることができる。この目的に好ましいＭＰは、タバコモザイクウイルスのＭＰである。
【００３８】
明らかに、本発明の方法に用いる植物、ＲＮＡレプリコン（ｉ）、及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、機能性のシステムを提供するために適切に選択されなければならない。例えば、レプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）は、植物の細胞で複製可能でなければならず、使用されるＭＰは植物において細胞間移行可能であるために機能性でなければならず、使用されるコートタンパク質は植物においてＲＮＡレプリコン（ｉ）に全体移行を提供できなければならない、などである。こうした問題に当業者は精通している。
【００３９】
本発明の方法では、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）、又はそれらの前駆体は植物の細胞に提供される。レプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）は直接植物に提供することができ、ＲＮＡ分子又はパッケージされたウイルス粒子として提供されることができる。あるいは、ＲＮＡレプリコン（ｉ）又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）又はＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＤＮＡ前駆体として植物に提供されることができる。前駆体の種類は、使用する形質転換法の種類に依存する。使用可能な形質転換法を以下に示す。好ましい形質転換法は、アグロバクテリウム介在形質転換である。この場合、植物は、Ｔ−ＤＮＡにレプリコン（ｉ）の前駆体を含有するアグロバクテリウム及び／又はＴ−ＤＮＡにヘルパーレプリコン（ｉｉ）の前駆体を含有するアグロバクテリウムを形質移入することによって、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）を提供される。
【００４０】
植物がＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）又はそれらの前駆体で形質転換される場合、植物の選択された部分は、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によってＲＮＡレプリコン（ｉ）を補完させるため、両方のレプリコンで処理される必要がある。アグロバクテリウム介在形質転換の場合、これは、植物の選択された部分を２つのアグロバクテリウム株の混合物で処理することによって最も容易に達成される。ここで、１つの株はＲＮＡレプリコン（ｉ）をＤＮＡ前駆体としてＴ−ＤＮＡに含有し、他の株はヘルパーレプリコン（ｉｉ）をＤＮＡ前駆体としてＴ−ＤＮＡに含有する。レプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つは一般にＭＰにより細胞間移行可能であるため、植物の細胞が両方のレプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）で形質転換されることが絶対に必要なわけではない。しかしながら、効率のためには、植物の細胞は両方のレプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）で形質転換されることが好ましい。
【００４１】
本発明を完全に使用するには、１枚以上の葉、好ましくは下部の葉のような植物の選択された部分には、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）を提供する必要があるが、植物の他の部分はその必要はない。その後、植物の他の部分、特に全体の葉は、全体移行によってＲＮＡレプリコン（ｉ）が到達するであろう。更に、１以上の植物は、２つのアグロバクテリウム株（例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス株）を含有するアグロバクテリウム懸濁液を噴霧されることができる。ここで、１つはＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体を含有し、他はヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＤＮＡ前駆体を含有する。
【００４２】
本発明の方法に使用できる植物は、本発明のシステムの成分であり得るものに相当する。
複製又は発現された目的配列は、植物から慣用の手段により回収することができる。これらの産物は、植物全体、即ちレプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）を提供された植物材料及びレプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）を提供されなかった植物材料を用いて単離することができる。これらの産物は、ＲＮＡレプリコン（ｉ）によって全体的に感染させた葉のように、レプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）を提供されなかった植物の部分から回収され単離されることが好ましい。
【００４３】
好ましい態様
植物において目的配列を複製するか、又は複製及び発現させるためのシステムであって：
（ｉ）  タバコモザイクウイルスに由来し、機能性コートタンパク質をコードする配列を欠失し、そして少なくとも１つの目的配列を含むＲＮＡレプリコンの、例えばレプリカーゼＯＲＦに１以上のイントロンを含有することが好ましい前駆体を含むＴ−ＤＮＡを含有するアグロバクテリウム；及び
（ｉｉ）  トバモウイルスに由来するヘルパーレプリコンの前駆体を含むＴ−ＤＮＡを含有するアグロバクテリウム、
を含み、ヘルパーレプリコンは、
（ａ）  ウイルス粒子組み立ての機能性オリジンを欠失し、植物において全体移行不可能であり、そして
（ｂ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要なタバコモザイクウイルスコートタンパク質を植物において発現可能であり、
ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、植物において目的配列を複製可能であるか、又は複製及び発現可能であるが、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現されるタバコモザイクウイルスコートタンパク質の非存在下では植物において全体移行できない、前記システム。
【００４４】
植物の葉を上記システムのアグロバクテリウム混合物で共形質転換させることを含む、タバコ植物において目的配列を発現させる方法。
植物において目的配列を発現させる方法であって、
（ｉ）  プラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来し且つ少なくとも１つの目的配列を含むＲＮＡレプリコンの、１以上のイントロンを含有する前駆体を含むＴ−ＤＮＡを含有するアグロバクテリウム；及び
（ｉｉ）  ヘルパーレプリコンの前駆体を含むＴ−ＤＮＡを含有するアグロバクテリウム、を有する植物の細胞を提供することを含み、ヘルパーレプリコンは、
（ａ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の存在下でも非存在下でも植物において全体移行不可能であり、そして
（ｂ）  ＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行に必要な１以上のタンパク質を植物において発現可能であり、
ＲＮＡレプリコン（ｉ）は、植物において目的配列を複製可能であるか、又は複製及び発現可能であるが、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）によって発現される１以上のタンパク質の非存在下では植物において全体移行できず、
ＲＮＡレプリコンの前駆体は、１以上のイントロンを含有するか；又はＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコン（ｉ）のレプリコン機能に関する配列を含有し、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、ＲＮＡレプリコン（ｉ）形成頻度を上昇させる、前記方法。
【００４５】
ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３号の図１〜５及び図９〜１１は、ＲＮＡレプリコンのＤＮＡ前駆体のレプリコン機能に関する配列が、選択された位置で植物ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較してレプリコン形成頻度を上昇させる態様の原理及び例を更に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＲＮＡウイルス由来レプリコン（ＲＮＡレプリコン（ｉ））を用いて目的の配列又はタンパク質を高率で生物学的に安全に全体発現させる方法を提供する。この方法は、全体的に発現される異種配列のサイズの限界やベクターの不安定性の高さなど、既存のＲＮＡウイルスベクターに基づいた発現システムの限界を克服するものである。更に、本方法は、より良いバイオセイフティ特性を与え、ウイルス成分の組換えによる野生型ウイルスの形成を妨げる。本発明のレプリコン（ｉ）及び（ｉｉ）は、そのような組換えを避けるようにデザインすることができる。本明細書に記載のアプローチは、全体の葉を含めた植物全体で目的配列の迅速で高率な発現を可能にする。
【００４７】
我々の知る限り、（ａ）全体移行が欠損しているベクター（機能性コートタンパク質を欠失している）及び（ｂ）不足したコートタンパク質をトランスで提供するトランスジェニック植物の使用に依拠する効率的な２成分システムはない。そのようなシステムは、おそらく、強力な構成的プロモーターのもとでさえ、発現されるコートタンパク質のレベルはベクターの効率的な全体移行を提供するには不十分であるため、実際には有用ではない。更に、トランスジェニック植物の作製は時間がかかり、少量の目的タンパク質又はＲＮＡの迅速な発現を必要とする応用では避けられるはずである。また、構成的プロモーターが全体移行をサポートするのに十分量のコートタンパク質の発現を提供する場合、感染性ウイルス粒子の組み立てが全体の葉で起こるため、システムの生物学的安全性は低いであろう。
【００４８】
全体移行に関与するウイルス配列の同定と、そのような配列の１つを本発明のヘルパーレプリコン（ｉｉ）からトランスで発現させることによりＲＮＡレプリコン（ｉ）の全体移行機能を再構築する可能性とを条件として、さまざまな分類群に属する多くの異なるＲＮＡウイルスが、本発明のＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）の構築に好適である。本発明のＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）の作製に用いることができるＲＮＡウイルスのリストを以下に提示する。引用符付きの分類群名（イタリック体ではない）は、この分類群にはＩＣＴＶで国際的に承認された名称がないことを示す。種名（属名）は標準体で示す。属又は科について正式命名のないウイルスが示されている：
ＲＮＡウイルス：
ｓｓＲＮＡウイルス：科：ブロモウイルス科、属：アルファモウイルス属、基準種：アルファルファモザイクウイルス、属：イラルウイルス属、基準種：タバコ条斑ウイルス、属：ブロモウイルス属、基準種：ブロムモザイクウイルス、属：ククモウイルス属、基準種：キュウリモザイクウイルス；
科：クロステロウイルス科、属：クロステロウイルス属、基準種：ビート黄斑ウイルス、属：クリニウイルス属、基準種：レタス伝染性黄斑ウイルス、科：コモウイルス科、属：コモウイルス属、基準種：ササゲモザイクウイルス、属：ファバウイルス属、基準種：ソラマメ壊疽ウイルス１、属：ネポウイルス属、基準種：タバコ輪点ウイルス；
科：ポティウイルス科、属：ポティウイルス属、基準種：ジャガイモＹウイルス、属：ライモウイルス属、基準種：ライグラスモザイクウイルス、属：バイモウイルス属、基準種：オオムギ縞萎縮ウイルス；
科：セキウイルス科、属：セキウイルス属、基準種：パースニップｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｅｃｋウイルス、属：ワイカウイルス属、基準種：イネｔｕｎｇｒｏ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌウイルス；科：トンブスウイルス科、属：カルモウイルス属、基準種：カーネーション斑紋ウイルス、属：ダイアントウイルス属、基準種：カーネーション輪点ウイルス、属：マクロモウイルス属、基準種：トウモロコシｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｍｏｔｔｌｅウイルス、属：ネクロウイルス属、基準種：タバコ壊死ウイルス、属：トンブスウイルス属、基準種：トマトｂｕｓｈｙ  ｓｔｕｎｔウイルス、属が未分類のｓｓＲＮＡウイルス、属：カピロウイルス科、基準種：リンゴｓｔｅｍ  ｇｒｏｏｖｉｎｇウイルス；
属：カーラウイルス属、基準種：カーネーション潜在ウイルス；属：エナモウイルス属、基準種：エンドウひだ葉モザイクウイルス、
属：フロウイルス属、基準種：土壌伝染性コムギモザイクウイルス、属：ホルデイウイルス属、基準種：オオムギ斑葉モザイクウイルス、属：イダエオウイルス属、基準種：ラズベリーｂｕｓｈｙ  ｄｗａｒｆウイルス；
属：ルテオウイルス属、基準種：オオムギ黄萎ウイルス；属：マラフィウイルス属、基準種：トウモロコシｒａｙａｄｏ  ｆｉｎｏウイルス；属：ポテクスウイルス属、基準種：ジャガイモＸウイルス；属：ソベモウイルス属、基準種：Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  ｂｅａｎ  モザイクウイルス、属：テヌイウイルス属、基準種：イネ縞葉枯ウイルス、
属：トバモウイルス属、基準種：タバコモザイクウイルス、
属：トブラウイルス属、基準種：タバコ茎壊疽ウイルス、
属：トリコウイルス属、基準種：リンゴｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｌｅａｆ  ｓｐｏｔウイルス；属：ティモウイルス属、基準種：カブ黄斑モザイクウイルス；属：アンブラウイルス属、基準種：ニンジンｍｏｔｔｌｅウイルス；
ＴＭＶに基づいた発現システムに加えて、異種目的遺伝子を発現させるためのウイルスベクターが、ジャガイモＸウイルス（Ｍａｌｌｏｒｙら、２００２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０、６２２−６２５）、アルファルファモザイクウイルス（Ｓａｎｃｈｅｓ−Ｎａｖａｒｒｏら、２００１、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．、１４６、９２３−９３９）、及びササゲモザイクウイルス（Ｇｏｐｉｎａｓら、２０００、２６７、１５９−１７３）などの他のいくつかのプラス鎖ｓｓＲＮＡウイルスに基づいて開発された。ＴＭＶに基づいたベクターに関して本発明に記載されたストラテジーを上記ウイルス発現システムに採用することもできる。
【００４９】
本発明に用いるさまざまな種類のＴＭＶに基づいたウイルスベクターの構築（図１）について実施例１〜５に記載する。ベクターｐＩＣＨ８５４３（実施例１）は、（ウイルス粒子）組み立てのオリジンを有するが、コートタンパク質（ＣＰ）コード配列は欠失している。このベクター及びそのイントロン含有誘導体ｐＩＣＨ１７２７２（実施例４）は、初期感染葉において細胞間移行及び目的配列（ＧＦＰ）の発現が可能であり、組み立てのオリジンを含有するが、コートタンパク質が存在しないために全体移行できない。他のベクター対ｐＩＣＨ１０５９５（実施例２）及びｐＩＣＨ１７５０１（実施例５）は、ＭＰに加えて、ＧＦＰの変わりにＣＰをコードし、全体移行可能であり、感染性ウイルス粒子を形成可能である。ベクターｐＩＣＨ１７２７２及びｐＩＣＨ１７５０１の共浸潤（図３）は、全体の葉においてＧＦＰ発現をもたらさない。ＧＦＰは初期接種葉においてのみ強力に発現するが、ウイルスの徴候は全体の葉において明らかに目に見える。この結果の説明は、ＣＰのない発現ベクター（ｐＩＣＨ１７２７２）は、全体移行可能なヘルパーウイルス（ｐＩＣＨ１７５０１）と競合できないというものである。
【００５０】
この問題に取り組みために、ＣＰを発現可能だが組み立てのオリジンを欠失しており、結果として全体移行できないヘルパーウイルスベクター（ヘルパーレプリコン（ｉｉ））ｐＩＣＨ１６６０１及びｐＩＣＨ１６６８４（図１、実施例３）を作製した。これらのヘルパーウイルスベクターを、ＧＦＰを発現するが全体移行できないＲＮＡレプリコン（ｉ）とともに共浸潤すると、全体の葉においてＧＦＰが出現する（図２）。２ベクターシステムで感染させた植物の全体の葉の全可溶性タンパク質は（図４、レーン５〜７）、初期浸潤葉（図４、レーン２）に匹敵する高レベルのＧＦＰを含有していた。ＧＦＰ発現に全体移行するウイルスベクターを用いる場合は、そのようなウイルスベクターはＣＰを主に発現するため（図４、レーン１２〜１４）、この高発現レベルは達成されない。
【００５１】
本発明の２成分システムによって微量ＣＰも全体の葉で産生される（図４、レーン７）。これは、ＣＰの発現及び全体移行が可能な組換えウイルスベクターの存在によって説明することができる。しかしながら、そのような組換え体の相対的な割合は無視できるものであり、上記生産性（発現レベル）に重大な影響を与えない。加えて、そのような組換えの頻度は、重複する区間の長さを短くするか又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）と目的配列を発現するＲＮＡレプリコン（ｉ）とのあいだの相同性を低下させることによって更に低下させ、完全に排除することさえできる。
【００５２】
相同組換えの標的である相同的な機能性領域の減少又は完全な排除は、いくつかのさまざまなアプローチによって達成することができる：領域の削除；相同性の領域内において異なるコドン使用を適用することによるコード領域の改変；指向進化による領域の改変（アプローチの概説としてＴｏｂｉｎら、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１０、４２１−４２７を参照されたい）。ＴＭＶに基づいたウイルスベクターシステムの場合、目的配列を発現するＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）に対し、さまざまなＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）を使用することができる。この目的のために十分に特徴付けられたＲｄＲｐは、例えばＴＶＣＶ、ＴＭＶ−Ｕ１、ＴＭＶ−Ｕ５、又はｃｒＴＭＶのＲｄＲｐである。
【００５３】
しかしながら、ウイルス粒子組み立てのオリジンの上流にある領域間の組換え（レプリコン（ｉ）内）は野生型ウイルス又は野生型ウイルスの全体移行能を有するウイルスを生じないため、ＲｄＲｐコード領域内の相同性は、深刻な組換え問題を引き起こさない。ＲＮＡレプリコン（ｉ）（図１、プラスミドｐＩＣＨ８５４３；ｐＩＣＨ１７２７２を参照されたい）と、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）のＣＰ  ＯＲＦの前に位置するＭＰコード配列の部分（図１、ｐＩＣＨ１６６０１；ｐＩＣＨ１６６８４）との場合、これら領域間の組換えはシステムの効率又は安全性を危うくする野生型ウイルス様レプリコンの形成をもたらすため、より問題なのはＧＦＰの前にあるＭＰ遺伝子の３’端に位置する相同性のある短い領域である。そのような短い領域は、相同性及び望ましくない組換えイベントの機会を排除するために様々な方法で容易に改変することができる。加えて、細胞間移行に必要なＭＰ発現のような、レプリコン（ｉ）及び／又はレプリコン（ｉｉ）のある機能は、トランスジェニック宿主植物によってトランスで提供されることができる（Ｈｏｌｔ＆Ｂｅａｃｈｙ、１９９１、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１８１、１０９−１１７）。そのような態様では、ヘルパーレプリコンのＲｄＲｐと重複するＭＰ  ＯＲＦと組み立てのオリジンのそのような部分のみをＲＮＡレプリコン（ｉ）に残すことができる。一般に、ＲＮＡレプリコン（ｉ）とヘルパーレプリコン（ｉｉ）とのあいだの組換え頻度を低下させるか又は完全に排除するためのさまざまなストラテジーが数多くあり、それらは当業者によって容易に実施されることができる。
【００５４】
一般的説明に記載したように、全体移行可能なウイルスベクターの自律形成をもたらすことができる相同領域を完全に除去するために、ＲＮＡレプリコン（ｉ）が由来するＲＮＡウイルスに対して異種であるヘルパーレプリコンからＣＰ発現を駆動するためのサブゲノムプロモーターを用いることができる。より詳細には、ヘルパーレプリコンからＣＰ発現を駆動するために用いるサブゲノムプロモーターは、ＭＰ及び／又は目的配列の発現を駆動するためにＲＮＡレプリコン（ｉ）において用いられるサブゲノムプロモーターに対して異種である必要がある。ＴＭＶに基づいたシステムの場合、異なるウイルス株に由来するＣＰサブゲノムプロモーターをヘルパーレプリコンに用いることができる。そのような株の例としては、ＴＭＶ−Ｕ１、ＴＭＶ−Ｕ５、ｃｒＴＭＶなどが挙げられる。
【００５５】
興味深いことに、浸潤させた葉においてトランスで更にＭＰを共発現させると、本システムの浸透性ベクターの効率が上昇する。実施例７に示すように、構成的プロモーターの制御下におけるＴＶＣＶ  ＭＰの一過性発現は、ＧＦＰ発現レプリコンの全体移行効率を顕著に上昇させる。これは、細胞間移行可能なヘルパーレプリコンによるトランス補完を介した、より多量のＣＰの産生によって説明できる。追加のＣＰは、より多くのＲＮＡレプリコン（ｉ）を全体移行可能なウイルス粒子にパッケージングするであろう。
【００５６】
植物の細胞にＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）を提供するために、さまざまな方法を用いることができる。ベクターは、アグロバクテリウムによって運ばれるＴｉ−プラスミドベクターによって（ＵＳ５，５９１，６１６号；ＵＳ４，９４０，８３８号；ＵＳ５，４６４，７６３号）、又は粒子銃若しくは微粒子銃（ＵＳ０５１００７９２号；ＥＰ００４４４８８２Ｂ１号；ＥＰ００４３４６１６Ｂ１号）によって植物細胞に形質転換されることができる。マイクロインジェクション（ＷＯ０９／２０９６９６号；ＷＯ０９／４００５８３Ａ１号；ＥＰ１７５９６６Ｂ１号）、エレクトロポレーション（ＥＰ００５６４５９５Ｂ１号；ＥＰ００２９０３９５Ｂ１号；ＷＯ０８／７０６６１４Ａ１号）又はプロトプラストのＰＥＧ介在形質転換、などのような他の植物形質転換法も用いることができる。ベクター送達法の選択は、形質転換される植物種及び用いるベクターに依存する。例えば、微粒子銃は、通常、単子葉植物におけるベクター送達に好ましく、双子葉植物には、アグロバクテリウム介在形質転換が一般により良い結果を与える。
【００５７】
以下に記載する実施例では、タバコ細胞へのアグロバクテリウム介在ベクター送達を用いた。しかしながら、ベクターは、目的植物種の安定な又は一過性の形質転換に好適な標準技術のいずれかにしたがい、植物に組み込むことができる。双子葉植物の形質転換技術は当該技術分野に周知であり、アグロバクテリウムに基づいた技術及びアグロバクテリウムを必要としない技術が含まれる。非アグロバクテリウム技術には、プロトプラスト又は細胞による外来遺伝物質の直接取り込みが含まれる。これらの技術には、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを介在する取り込み、粒子銃介在送達及びマイクロインジェクションが含まれる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．３、２７１７−２７２２（１９８４）；Ｐｏｔｒｙｋｕｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９、１６９−１７７（１９８５）；Ｒｅｉｃｈら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１００１−１００４（１９８６）；及びＫｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７、７０−７３（１９８７）に記載されている。それぞれの場合において、形質転換細胞は、標準技術を用いて完全な植物に再生される。
【００５８】
アグロバクテリウム介在形質転換は、形質転換効率の高さ及び多くのさまざまな植物種を用いる広範な有用性のために、双子葉植物の形質転換には好ましい技術である。アグロバクテリウムによって日常的に形質転換され得る多くの作物種には、タバコ、トマト、ヒマワリ、ワタ、アブラナ、ジャガイモ、ダイズ、アルファルファ及びポプラが含まれる（ＥＰ  ０  ３１７  ５１１（ワタ）、ＥＰ  ０  ２４９  ４３２（トマト）、ＷＯ８７／０７２９９（アブラナ）、米国特許第４，７９５，８５５号（ポプラ））。
【００５９】
本発明の実施例では、、目的遺伝子を一過性発現させるためのアグロバクテリウム介在Ｔ−ＤＮＡ送達法であるアグロ接種を用いた（Ｖａｑｕｅｒｏら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１１１２８−１１１３３）。アグロ接種は、小規模から中規模の組換えタンパク質産生システムにとっても、ベクター最適化システムの要素の１つとしても非常に有用なツールであり、さまざまな構築体の変異体を用いて迅速な結果を得ることができる。
【００６０】
本発明は実施例１〜５に記載のＴＭＶに基づいたベクターに限定されるものではなく、他の植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンに拡大応用することができる。
本発明を用いて植物又は植物細胞において発現され得る目的配列又は遺伝子、それらの断片（機能性又は非機能性）、及びそれらの人工的誘導体には、限定されるものではないが、以下が含まれる：デンプン修飾酵素（デンプン合成酵素、デンプンリン酸化酵素、脱分岐酵素、デンプン分岐酵素、デンプン分岐酵素ＩＩ、顆粒結合性デンプン合成酵素）、ショ糖リン酸合成酵素、ショ糖ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ポリフルクタンスクラーゼ、ＡＤＰグルコース  ピロホスフォリラーゼ、シクロデキストリン  グリコシルトランスフェラーゼ、フルクトシル  トランスフェラーゼ、グリコーゲン合成酵素、ペクチン  エステラーゼ、アプロチニン、アビジン、細菌レバンスクラーゼ、大腸菌ｇｌｇＡタンパク質、ＭＡＰＫ４及び相同分子種、窒素同化／代謝酵素、グルタミン合成酵素、植物オスモチン、２Ｓアルブミン、タウマチン、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（ＦＬＰ、Ｃｒｅ、Ｒリコンビナーゼ、Ｉｎｔ、ＳＳＶＩインテグラーゼＲ、インテグラーゼφＣ３１、又はその活性断片又は変異体）、オイル修飾酵素（脂肪酸デサチュラーゼ、エロンガーゼなどのような）、イソペンテニル  トランスフェラーゼ、Ｓｃａ  Ｍ５（ダイズ  カルモジュリン）、甲虫型毒素又は殺虫活性断片、ユビキチン結合酵素（Ｅ２）融合タンパク質、脂質、アミノ酸、糖、核酸及び多糖類を代謝する酵素、スーパオキシド・ジスムターゼ、不活性なプロ酵素型プロテアーゼ、植物タンパク質毒素、繊維産生植物における形質変更繊維（traits altering fiber）、バチルス・チューリンゲンシス由来の甲虫活性毒素（Ｂｔ２毒素、殺虫性結晶タンパク質（ＩＣＰ）、ＣｒｙＩＣ毒素、δエンドトキシン、ポリオペプチド毒素、プロトキシンなど）、昆虫特異的毒素ＡａＩＴ、セルロース分解酵素、ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｔｉｃｕｓ由来のＥ１セルラーゼ、リグニン修飾酵素、シナモイル  アルコールデヒドロゲナーゼ、トレハロース−６−リン酸合成酵素、サイトカイニン代謝経路の酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ  レダクターゼ、大腸菌無機ピロホスファターゼ、種子貯蔵タンパク質、エルウィニア  ヘルビコラ  リコピン合成酵素、ＡＣＣオキシダーゼ、ｐＴＯＭ３６にコードされるタンパク質、フィターゼ、ケトヒドロラーゼ（ketohydrolase）、アセトアセチルＣｏＡ  レダクターゼ、ＰＨＢ（ポリヒドロキシブタノエート）合成酵素、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の合成に関与する酵素、アシルキャリアータンパク質、ナピン、ＦＡ９、非高等植物フィトエン合成酵素、ｐＴＯＭ５にコードされるタンパク質、ＥＴＲ（エチレン受容体）、色素体ピルビン酸  リン酸  ジキナーゼ、線虫誘導性膜貫通ポアタンパク質、植物細胞の光合成又はプラスチド機能を高める形質、スチルベン合成酵素、フェノールをヒドロキシル化可能な酵素、カテコール  ジオキシゲナーゼ、カテコール  ２，３−ジオキシゲナーゼ、クロロムコネート  シクロイソメラーゼ、アントラニル酸合成酵素、アブラナＡＧＬ１５タンパク質、フルクトース  １，６−ビホスファターゼ（ＦＢＰアーゼ）、ＡＭＶ  ＲＮＡ３、ＰＶＹレプリカーゼ、ＰＬＲＶレプリカーゼ、ポチウイルスコートタンパク質、ＣＭＶコートタンパク質、ＴＭＶコートタンパク質、ルテオウイルス  レプリカーゼ、ＭＤＭＶメッセンジャーＲＮＡ、変異ジェミニウイルス  レプリカーゼ、カリホルニアウンベルラリア  Ｃ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、植物Ｃ１０又はＣ１２：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、Ｃ１４：０選択性アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ｌｕｘＤ）、植物合成酵素因子Ａ、植物合成酵素因子Ｂ、Ｄ６−不飽和化酵素、脂肪酸の生合成及び修飾、例えば植物細胞における脂肪酸のペルオキシソームβ酸化において酵素活性を有するタンパク質、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、３−ケトアシル−ＣｏＡ  チオラーゼ、リパーゼ、トウモロコシ  アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、など；５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素（ＥＰＳＰ）、ホスフィノスリシン  アセチルトランスフェラーゼ（ＢＡＲ、ＰＡＴ）、ＣＰ４タンパク質、ＡＣＣデアミナーゼ、翻訳後切断部位を有するタンパク質、スルホンアミド耐性を付与するＤＨＰＳ遺伝子、細菌ニトリラーゼ、２，４−Ｄ  モノオキシゲナーゼ、アセトラクテート合成酵素又はアセトヒドロキシ酸合成酵素（ＡＬＳ、ＡＨＡＳ）、ポリガラクツロナーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、細菌ニトリラーゼ、制限酵素、メチラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡリガーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ）、ホスファターゼ、トランスフェラーゼなどを含めた細菌又はファージに由来する他の多くの酵素など。
【００６１】
本発明は、工業的酵素（セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、フィターゼなど）及び線維性タンパク質（コラーゲン、クモの糸タンパク質など）を含めた、商業的に価値があり、医薬的に重要なタンパク質の分子農業（molecular farming）及び精製のために用いることができる。ヒト又は動物の健常なタンパク質は、本発明で記載したアプローチを用いて発現させ、精製することができる。そのような目的タンパク質の例としては、とりわけ、免疫応答タンパク質（モノクローナル抗体、１本鎖抗体、Ｔ細胞受容体など）、病原体微生物に由来するものを含めた抗原、コロニー刺激因子、レラキシン、ソマトトロピン（ＨＧＨ）及びプロインスリンを含めたポリペプチドホルモン、サイトカイン及びそれらの受容体、インターフェロン、成長因子及び凝固因子、酵素学的に活性なリソソーム酵素、線溶性ポリペプチド、血液凝固因子、トリプシン、トリプシノーゲン、ａ１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）、ヒト血清アルブミン、グルコセレブロシダーゼ、天然コレラ毒素Ｂ、並びに上記タンパク質の融合体、変異型及び合成誘導体のような機能保存的タンパク質が挙げられる。
【００６２】
レプリコン形成頻度を上昇させる、ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮するレプリコン機能に関する配列
この態様では、ＲＮＡレプリコン（ｉ）をコードするＤＮＡ前駆体は、ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ＲＮＡレプリコン（ｉ）のレプリコン機能に関する配列を含有し、レプリコン機能に関する配列は、ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないＲＮＡレプリコンと比較して、ＲＮＡレプリコン（ｉ）形成頻度を上昇させる。あるいは又は更に、ヘルパーレプリコンはプラス鎖１本鎖ＲＮＡウイルスに由来することができ、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）をコードするＤＮＡ前駆体は、ＲＮＡウイルスの配列に由来する、ヘルパーレプリコン（ｉｉ）のレプリコン機能に関する配列を含有し、レプリコン機能に関する配は、ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、ＲＮＡウイルスの配列との機能保存的な相違を発揮し、その相違は、相違を発揮しないヘルパーレプリコンと比較して、ヘルパーレプリコン形成頻度を上昇させる。
【００６３】
機能保存的な相違はＤＮＡ前駆体のレプリカーゼＯＲＦに存在することが好ましい。ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）が同一ＲＮＡウイルスに基づく場合、ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）の機能保存的な相違を含むレプリカーゼＯＲＦは同一でもよい。更に、機能保存的な相違は、ＭＰ  ＯＲＦ、特にＲＮＡレプリコン（ｉ）のＤＮＡ前駆体に存在することができる。
【００６４】
機能保存的な相違は、植物細胞におけるＲＮＡレプリコン（ｉ）及び／又はヘルパーレプリコン（ｉｉ）の形成頻度が上昇する原因である。レプリコン形成頻度の上昇と相違とのあいだの因果関係は、相違を有するレプリコン機能に関する配列と相違を有さないレプリコン機能に関する配列とのあいだのレプリコン形成頻度を比較することによって実験的に試験することができる。そのような実験的比較は、実施例に記載するように、例えば目的配列を発現するプロトプラストを計数することによって行うことができる。緑色蛍光タンパク質のように容易に検出可能なレポータータンパク質をコードする目的配列をこの目的に用いることが好ましい。更に以下に記載するように、細胞間伝播可能ではないＲＮＡレプリコンとの実験的比較を行うことも好ましい。
【００６５】
機能保存的な相違は、ＲＮＡウイルスの配列の選択された位置で、レプリコン機能に関する配列に導入される。選択された位置は、核で転写されたＲＮＡレプリコンが、機能性レプリコンとして細胞質に出現する可能性が低いことの原因である、ＲＮＡウイルスのレプリコン機能に関する配列内の位置である。そのような選択された位置は、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量、即ち高Ａ含量及び／又は高Ｔ含量（ＲＮＡレベルでは高Ｕ含量）であるか、あるいは潜在スプライシング部位、即ち核のスプライシング装置によってスプライシング部位として認識されることができる配列部分を有することが好ましい。選択された位置は、以下に例示するように、ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイルを解析することによって、ＲＮＡレプリコンが基づくＲＮＡウイルス中に同定することができる。更に、選択された位置は、本発明による（機能保存的）相違を発揮しないＲＮＡレプリコンをコードする異種ＤＮＡで形質転換後、植物細胞において形成されるＲＮＡを解析することによって実験的に同定することができる。この実験解析は、ＲＴ−ＰＣＲによって、好ましくはＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定とともに行うことができる。ＲＴ−ＰＣＲ試験では、レプリカーゼは、細胞質に到達するＲＮＡレプリコンが増幅されるのを妨げるために、例えばフレームシフト変異によって、機能不全にされることが好ましい；そのような増幅は、野生型ウイルスによるＲＮＡ転写物の汚染、又は細胞質において増幅されたＲＮＡレプリコンの過剰発現をもたらし得る。このようにして、ＲＮＡレプリコンを破壊するスプライシングイベントを示す望ましくないスプライシング産物を同定することができる。更に、望ましくないスプライシングの正確な部位を同定し、その後、選択された位置に機能保存的な相違を導入することによって修復することができる。
【００６６】
したがって、本発明は、植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において目的配列を発現させる方法も提供し、ここで、（Ａ）植物、植物の部分、又は植物細胞培養物は機能保存的な相違を欠失するＤＮＡ前駆体を提供され、（Ｂ）ＤＮＡ前駆体に由来するＲＮＡを、レプリコン機能に関する配列における望ましくないスプライシング産物に関して試験し（例えばＲＴ−ＰＣＲによって）、（Ｃ）（例えばＲＴ−ＰＣＲ産物の配列において）選択された位置を望ましくないスプライシングイベントの位置として同定し、（Ｄ）本発明による機能保存的な相違（例えばイントロン）を、工程（Ｃ）において工程（Ａ）のＤＮＡ前駆体中に同定された選択された位置又はその近傍に、本発明のレプリコン（ｉ）又は（ｉｉ）をコードするＤＮＡ前駆体を産生するために導入し、本発明による植物、植物の部分、又は植物細胞培養物において、例えば本発明の異種ＤＮＡで一過性に形質転換された植物から目的配列を発現する。
【００６７】
機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコン形成頻度に対する選択された位置の有害効果を抑制することによってレプリコン形成頻度を上昇させる。機能保存的な相違は、ＲＮＡレプリコンをコードする配列のレプリコン機能に関する配列において高Ａ／Ｔ含量を低下させることによる、ＲＮＡレプリコンにおける高Ａ／Ｕ含量の低下を含むことができる。高Ａ／Ｕ含量は、相違が機能保存的であることを条件として、少なくとも部分的な欠失又はＧ／Ｃ塩基による少なくとも部分的な置換（例えば遺伝コードの重複を用いて）によって低下させることができる。更に、植物ＲＮＡウイルスに由来する配列のＡ／Ｕに富んだ領域に隣接する潜在スプライシング部位を除去することができる。そのような機能保存的な相違は、１つの又は好ましくはいくつかの選択された位置に導入することができる。
【００６８】
好ましい機能保存的な相違は、植物ＲＮＡウイルスの配列に由来する配列のＡ／Ｕに富んだ位置の近傍又はその中に、１以上のイントロン、最も好ましくは核イントロン、又は核イントロンを形成可能な１以上の配列の挿入を含む。驚くべきことに、Ａ／Ｕに富んだ位置又はその近傍へのイントロンの導入はＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させることがわかった。いくつかのイントロンを導入することができ、さまざまな数の導入イントロンについて本明細書に例を示す。１より多いイントロンの効果は累積的である。更に、イントロンの挿入は、他の選択された位置における他の機能保存的な相違と組み合わせることができる。
【００６９】
図８は、発現すべき目的配列内ではあるが、核イントロンを形成可能な配列の導入に関する例を示す。図８の例では、イントロンは、リコンビナーゼで触媒される異種ＤＮＡの一部の反転によって２つの半イントロンから形成される。この原理は、ＲＮＡレプリコンのレプリコン機能に関する配列に応用することもできる。２つの異なるＲＮＡレプリコンが同一細胞で形成される態様では、２つの異なるレプリコン間の組換えは、異なるレプリコン上に存在する２つの半イントロンから１つのイントロンを形成することができる。更に、ＲＮＡレプリコンは、いずれもレプリコンではない２つの前駆体間の組換えによって形成することができる。この場合も、異なる前駆体分子に由来する２つの半イントロンから１つのイントロンを組み立てることができる。
【００７０】
植物又は植物の部分（例えば葉）は、目的配列の一過性発現のために本発明のＤＮＡ前駆体で一過性に形質転換されることが好ましい。「一過性形質転換」という用語は、植物染色体へ異種ＤＮＡを好適に組み込むための形質転換細胞を選択することなくＤＮＡ前駆体を導入することを意味する。一過性形質転換は、通常、ＤＮＡ前駆体によってコードされる配列の一過性発現を提供する。一過性形質転換は、上記形質転換法のいずれかで達成することができる。例えば、植物を逆さにしてアグロバクテリウ懸濁液にサッと漬け、真空にし、そして真空から迅速に開放することによるアグロ浸潤が好ましい。
【００７１】
ＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡ前駆体は、転写プロモーター、好ましくは構成的転写プロモーターに機能可能に連結されていることが好ましい。他の態様では、植物はタバコ属に属し、レプリコン機能に関する配列は、トバモウイルス、好ましくはタバコモザイクウイルスに由来する。特に好ましい態様では、茎及び全ての葉を含めたタバコ植物は、アグロ浸潤によって一過性に形質転換される。後者の態様は、本発明の方法の大規模な応用に用いることができる。大規模な応用では、本方法は、多くの植物（少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１００の植物）に同時に適用される。
【００７２】
植物ＲＮＡウイルス（例外はウイロイドである  −植物細胞核で増幅する小さな非コードＲＮＡ−  概説としてＤｉｅｎｅｒ，Ｔ．Ｏ．、１９９９、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．、１５、２０３−２２０；Ｆｌｏｒｅｓ，Ｒ．、２００１、ＣＲ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＩＩＩ、３２４、９４３−９５２を参照されたい）は、細胞質で発生するが、植物の核では決して発生しないことが知られている。したがって、ＲＮＡウイルスの配列は、プレｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ前駆体が含まれるプロセシングされたＲＮＡの細胞質への輸送を含めた複雑なプロセシング工程のシリーズに関与するモチーフの存在により、核のＲＮＡプロセシングイベントに抵抗するように適応されい。５’端キャッピング、スプライシング、３’端生成、ポリアデニル化、分解、塩基及び糖修飾、並びに修復（プラスチド及びミトコンドリアにおいて）などのプロセシングイベントについて重点的に研究されている。しかしながら、そうしたイベントの多くの要素は依然として未知のままである。核のプレｍＲＮＡの最も劇的な変化は、介在ＲＮＡ配列（イントロン）が初期転写産物から除去され、同時にエクソンが連結するプロセスであるプレｍＲＮＡスプライシングのあいだに起こる。スプライシングは、uridilateに富んだ小さなリボ核タンパク質粒子を含む複雑な構造であるスプライソームによって介在される。スプライソームは、２つの連続工程でスプライシング反応を行う：第１工程  −上流エクソン／イントロン接合部位の５’スプライス部位を切断してラリアートを形成；そして第２工程  −イントロン／下流エクソン接合部位の３’スプライス部位を切断し、上流と下流のエクソンを連結（概説として：Ｋｒａｍｅｒ，Ａ．、１９９６、Ａｎｎｕ．Ｒｅｗ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６５、３６７−４０９；Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＧＧ．＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９９６、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３２、１−４１を参照されたい）。イントロン配列に隣接する５’及び３’スプライス部位ジヌクレオチド（５’／ＧＵ；ＡＧ／３’）は、高等植物で高度に保存されており、単一Ｇ置換は、スプライシング活性を関心部位で放棄するかもしれない。驚くべきことに、植物と動物とのあいだでスプライス部位が高度に保存されているにもかかわらず、植物の異種イントロンは、通常、スプライシングされないか又は不正確にスプライシングされる（ｖａｎ  Ｓａｎｔｅｎ，ＶＬ．ら、１９８７、Ｇｅｎｅ、２５３−２６５；Ｗｉｅｂａｕｅｒ，Ｋ．、Ｈｅｒｒｅｒｏ，Ｊ．Ｊ．、Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，Ｗ．１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、８、２０４２−２０５１）。植物ウイルスＲＮＡは核のＲＮＡプロセシング装置に抵抗するための進化圧下になかったことを考慮すると、これらのＲＮＡは、いったん核環境に置かれると、スプライシングを含めたそのようなプロセシングの対象になる可能性が非常に高い。発現ベクターをＤＮＡ前駆体として植物又は植物細胞に導入し、一過性発現を提供する場合は、発現ベクターに機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を顕著に上昇させる機能保存的改変を施すことによってこれらの問題に取り組む。ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの効率を上昇させるには、ウイルス由来配列のそのような改変が最も問題の核心を突く解決策であると考えられる。本発明では、ＲＮＡレプリコン形成効率を上昇させるのに重要であるため、植物ＲＮＡウイルス由来配列内の改変（機能保存的な相違）に主に焦点を当てる。
【００７３】
機能保存的な相違（例えばイントロン）を導入することによって、予想外にもけた違いの改善を見出した。発現ベクターｐＩＣＨ８５４３（参考実施例１、図６Ａ）のＲＮＡウイルス由来配列を、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて、潜在イントロン及びＲＮＡスプライシング部位の存在に関して解析したところ、核のＲＮＡプロセシング装置によってスプライシングされ得るイントロン様領域の存在を示した（ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図２の丸で囲んだ領域を参照されたい）。エクソン／イントロン予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｓ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ＧＥＮＳＣＡＮ．ｈｔｍｌ）又はスプライシングシグナル予測プログラム（ｈｔｔｐ：／／１２５．ｉｔｂａ．ｍｉ．ｃｎｒ．ｉｔ／〜ｗｅｂｇｅｎｅ／ｗｗｗｓｐｌｉｃｅｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）など、さまざまな生物について、潜在的に問題のある領域（選択された位置）を植物ウイルスＲＮＡ配列内に同定するために使用できるプログラムは他にも多く存在する。
【００７４】
全ての既存のプログラムは理想的ではなく、誤りがちであることを考慮すると、潜在的に問題のある領域は実験的に決定することもできる。これは、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．、１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）、又はさまざまな転写産物の濃度を正確に定量するのに好適な、リアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、６、９９５−１００１）と呼ばれるより進歩したバージョンのような日常的な技術を用いて、核環境で試験されているＤＮＡベクター由来の転写産物を解析することによって行うことができ、好ましくは、ＰＣＲ増幅産物の配列決定を伴う。本発明の機能保存的な相違は、例えばＡ／Ｕに富んだ領域（イントロン様）をＧ／Ｃに富んだ領域（エクソン様）に置換することを伴うサイレント変異を導入することにより、例えばイントロン様配列をエクソン様配列で置換することによって、ＲＮＡプロファイルを劇的に変化させる（ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図３の丸で囲んだ領域を参照されたい）。植物イントロンは、エクソンとは異なり、通常Ａ／Ｔ（Ｕ）に富んでいる（Ｌｏｒｋｏｖｉｃ，ＺＪ．ら、２０００、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．５、１６０−１６７；Ｂｒｏｗｎ，ＪＷ．＆Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＣＧ．、１９９８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４９、７７−９５；Ｃｓａｎｋ，Ｃ．ら、１９９０、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１８、５１３３−５１４１；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３）が、例外がある。例えば単子葉植物では、Ｇ／Ｃに富んだイントロンが発見された（Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ、１９８９、Ｃｅｌｌ、５８、４７３−４８３；Ｇｏｏｄａｌｌ＆Ｆｉｌiｐｏｗｉｃｚ、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０、２６３５−２６４４）。本発明を実施するために、高Ａ／Ｔ（Ｕ）含量の選択された位置には、少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６５％、最も好ましくは８０％以上のＡ／Ｔ（Ｕ）含量を有する少なくとも長さ２０ヌクレオチドの配列区間だけでなく、純粋にＡ／Ｔ（Ｕ）を含有する配列の並びの６〜１９ヌクレオチドのより短い区間（「アイランド」）も含まれる。ここで、高Ａ／Ｕ含量の位置には、ＵよりもＡに富んだ配列、Ａに富んだ配列、ＡよりもＵに富んだ配列、及びＵに富んだ配列が含まれる。更に、転写された目的配列は、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＭＡ．１９８９、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１８、３４０−３５６）によって、核酸配列に変化を引き起こす翻訳後修飾（例えばＲＮＡスプライシング）について試験することができる。元のＲＮＡ転写産物に由来する配列の欠失のような翻訳後修飾を受けやすいＲＮＡ内に領域を検出するためにＲＴ−ＰＣＲを使用することは、当該技術分野に熟知した者にとって些細な作業である。参考実施例２では、Ａ／Ｕに富んだ領域の改変がＧＦＰ発現細胞数を少なくとも１０倍増加させることを明らかにした。これは、ｐＩＣＨ１５４６６（改変ベクター、図６Ａ）及びｐＩＣＨ１４８３３（対照ベクター、図６Ａ）でアグロ浸潤させた領域を比較することに��って図７に明確に示されている。移行タンパク質（ＭＰ）の除去は、初期感染部位から隣接細胞への細胞間移行が起こらないため、機能性ＲＮＡレプリコンを有する初代培養細胞の正確な計数を可能にする。参考実施例３では、多くの潜在スプライス部位を含有する、他のＵに富んだイントロン様領域の改変（ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図２Ｂ）、及び移行タンパク質（ＭＰ）のサブゲノムプロモーターの遮蔽（ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図４、丸で囲んである）を行った。この改変は、ウイルスベクターｐＩＣＨ１５９０からのレプリコン形成頻度の上昇に劇的な効果を示した。プロトプラスト計数実験で立証したように（参考実施例３）、試験したタバコ種ベンサミアナタバコ及びタバコに関し、未改変ベクターｐＩＣＨ１４８３３と比較しておよそ１００倍上昇した（図７Ａ、７Ｂの対応する浸潤領域を参照されたい）。一般に、本明細書に記載のアプローチを用いることにより、ＲＮＡレプリコン形成頻度をおよそ３００倍に上昇させることができる。即ち、機能性レプリコンを有する細胞の割合が約０．２％（対照ベクター）から５０％を越える割合（改変ベクター）まで上昇する。これは限界ではなく、１００％の頻度に達することは実現可能であると考えられる。
【００７５】
そのように高率なレプリコン形成は、同一植物細胞内で２以上の異なる遺伝子を２つの異なるＲＮＡレプリコン（ＲＮＡレプリコン（ｉ）及びヘルパーレプリコン（ｉｉ）のような）から発現させる道を開く。例えば２以上の植物ＲＮＡウイルスに基づいたベクターを用いて異なる遺伝子を共発現させる（実施例４及び５）。「先着順」の原則はウイルスベクターでは特に真実であるため、２以上のレプリコンの同調した開放を同一細胞で同時に達成することはそのような共発現に重要である。異なるウイルスベクターは通常伝播領域で重複しないため又はそのような重複は重要でないため、全体移行又は細胞間移行は役立たない。単純な計算によって、同一植物細胞で２つのレプリコンから２つの目的配列の共発現を達成するための技術の重要性を明らかにする。機能性レプリコン形成頻度が全細胞のわずか０．２％である非最適化ウイルスベクターの場合、２つの遺伝子を２つの異なるＲＮＡレプリコンから共発現する細胞の割合は０．２×０．２＝０．０４％であるが、機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させた構築体（全細胞の５０％又は１／２）の場合、細胞の割合は０．５×０．５＝０．２５又は２５％、例えば約６２５倍高いであろう。最高性能ベクターを用いると（例えばｐＩＣＨ１６１９１、図７Ｃ）、機能性レプリコンを有する細胞の割合はおよそ９０％に達する（図７Ｃ、右上）。これは、２つの異なる目的配列を２つの独立したレプリコンから発現させるためにそのようなベクターを使用することにより、全細胞の約８０％で共発現が起こり得ることを意味する。技術は更に改良することができ、１００％共発現を達成できる可能性は非常に高いと思われる。
【００７６】
ＲＮＡレプリコンから発現されるべき異種目的配列における機能保存的な相違は、特にレプリコン機能に関する配列における相違を組み合わせて、ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためにも使用されるかもしれないことに留意することは重要である。例えば、目的配列内に、レプリコンの形成及び／又はプロセシングに必要な改変を導入することができる。
【００７７】
本発明の重要な態様では、レプリコン形成頻度は、核イントロンをレプリコン機能に関する配列に挿入することにより上昇する（参考実施例４）。ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のコード領域へのイントロンの組み込みは（参考実施例４及び８）、本明細書に定義したような機能保存的な相違を有するベクターからのレプリコン形成頻度を顕著に（少なくとも５０倍）上昇させる（図７Ａ、７Ｂ）（図６Ａ、６ＢのｐＩＣＨ１５０３４、ｐＩＣＨ１５０２５、ｐＩＣＨ１５４９９）。シロイヌナズナ由来の６つの挿入されたイントロンを含有するベクターに関するＲＮＡプロファイルが、ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図５に示されている。他の例では（参考実施例７）、ＭＰ配列へのイントロンの挿入はレプリコン形成頻度を少なくとも１００倍上昇させる。
【００７８】
本発明を実施するために多くの核イントロンを用いることができる。そのようなイントロンの例としては、イネのｔｐｉ遺伝子、Ａｃｔ１遺伝子及びｓａｌＴ遺伝子由来のイントロン（Ｒｅｔｈｍｅｉｅｒら、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１２、８９５−８９９；Ｘｕら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１００、４５９−４６７；ＭｃＥｌｒｏｙら、１９９０、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、２、１６３−１７１）；トウモロコシのＡｄｈ１遺伝子、ＧａｐＡ１遺伝子、アクチン遺伝子及びＢｚ１遺伝子由来のイントロン（Ｃａｌｌｉｓら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、１、１１８３−１１２００；Ｄｏｎａｔｈら、１９９５、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２８、６６７−６７６；Ｍａａｓら、１９９１、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１６、１９９−２０７；Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ＆Ｍｅｔｔｌｅｒ、１９９２、ＷＥ  Ｃｏｈｎ、Ｋ  Ｍｏｌｄａｖｅ編、『核酸研究及び分子生物学の進歩』、第４２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ２２９−２５７内）、ペチュニア  ルビスコ遺伝子ＳＳＵ３０１由来のイントロン（Ｄｅａｎら、１９８９、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、１、２０１−２０８）、シロイヌナズナ  Ａ１  ＥＦ１α遺伝子、ＵＢＱ１０遺伝子、ＵＢＱ３遺伝子、ＰＡＴ１遺伝子由来のイントロン（Ｃｕｒｉｅら、１９９３、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８、４２８−４３６；Ｎｏｒｒｉｓら、１９９３、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１、８９５−９０６；Ｒｏｓｅ＆Ｌａｓｔ、１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１１、４５５−４６４）及び他の多くのものが挙げられる。合成イントロンも本発明に用いることができる。最小の使用可能なイントロン又はそれらの部分は、通常内部のイントロン配列に隣接する、スプライスドナー及びアクセプター部位に限定され得る。イントロンのサイズは好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、より好ましくは１００〜２００ヌクレオチドである必要があるが、実際にはイントロンのサイズに限定はない。しかしながら、構築体サイズは、操作に好適なように維持される必要がある。イントロンの由来、その構造及びサイズはベクターの性質に応じて個別に選択することができる。選択されたイントロン又は対応するイントロン部分の効率を試験するために、一過性発現実験を用いることができる。
【００７９】
上記改変は累積効果を有し、例えば、イントロン挿入をＭＰサブゲノムプロモーターの改変と組み合わせると、レプリコン形成頻度の上昇はおよそ３００倍であり得る（参考実施例５）。ＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させるためのイントロン挿入に好ましい領域は、本明細書において選択された位置という。そのような位置は「イントロン様」構造を含むことができる。これは、ＭＰ、実際にはＭＰサブゲノムプロモーターのように問題のある領域の極近傍へのイントロンの挿入によって確認される（参考実施例７）。レプリコン形成頻度に１００倍の増加が観察された。「エクソン様」領域へのイントロンの挿入は、イントロン様領域への挿入のような明白な効果を有さない（参考実施例６）。
【００８０】
本特許出願によって優先権が主張される２００４年１月２３日出願の欧州特許出願第０４００１４６０．７号の内容、及び国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０１２７４３の内容は本明細書に援用される。
【００８１】
実施例
ＴＭＶ及びアブラナ科植物感染性トバモウイルスのようなトバモウイルスの遺伝的特徴に関する情報はＷＯ０２／０２９０６８号に見出すことができる。
【実施例１】
【００８２】
ＧＦＰを発現するＴＭＶに基づいたＲＮＡベクターの構築
ＧＦＰを含有するｃｒ−ＴＭＶに基づいたウイルスベクターｐＩＣＨ８５４３（図１）は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１２５３０に記載されている（以下も参照されたい）。このクローンは、シロイヌナズナ  アクチン２プロモーター、ＴＶＣＶ  ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、移行タンパク質のためのキメラ配列（ＴＶＣＶ／ｃｒ−ＴＭＶ）、ＧＦＰコード配列、ｃｒ−ＴＭＶの３’非翻訳領域、及び最後にＮｏｓターミネーターを含有し、バイナリーベクターにクローン化されている。このクローンはコートタンパク質コード領域を欠失している。ｐＩＣＨ８５４３でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、針のないシリンジでベンサミアナタバコ植物の１枚の葉に浸潤させた。浸潤後４日に、ＧＦＰ蛍光焦点が浸潤領域に見られるであろう。蛍光は浸潤させた葉において数週間続いたが、接種していない上部の葉には移行しなかった。
【００８３】
ベクターｐＩＣＨ８５４３の構築
いくつかのクローニング工程で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するレプリコンを作製した。得られた構築体ｐＩＣＨ８５４３は、順に：シロイヌナズナ  アクチン２プロモーターの７８７ｂｐ断片（ＡＣＴ２、参考文献Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶの断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するためにチミン５６０６がシトシンに変わっている）、配列「ｔａａ  ｔｃｇ  ａｔａ  ａｃｔ  ｃｇａ  ｇ」、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶの３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、及び最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを含有する。断片全体を、ＣａｒｂＲ  ｐＢＩＮ１９由来バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ１０のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだにクローニングした。
【実施例２】
【００８４】
ＣＰを発現するＴＭＶに基づいたＲＮＡベクターの構築
アブラナ科植物感染性トバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈−ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８、２８７−２９８）のクローン化ｃＤＮＡは、モスクワ大学（ロシア）のＡｔａｂｅｋｏｖ教授から入手した。ＴＶＣＶ  ＣＰを発現するウイルスベクターを、ＴＶＣＶ  ｃＤＮＡ由来のＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ断片（ＭＰの部分、完全なＣＰコード配列、及びＴＶＣＶの３’非翻訳領域を含有）をｐＩＣＨ８５４３にサブクローニングすることによって作製した。得られたクローンｐＩＣＨ１０５９５（図１）は、バイナリーベクター内のシロイヌナズナ  アクチン２プロモーターとＮｏｓターミネーターとのあいだにクローン化した完全なＴＶＣＶ  ｃＤＮＡを含有する。ｐＩＣＨ１０５９５でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。３週間後、浸潤させていない上部の葉は、ウイルス感染を示す、しわの寄った黄色い外観を示した。クマシー染色を伴うポリアクリルアミドゲル電気泳導（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロット解析により、全体の葉が多量のコートタンパク質を発現し、ｐＩＣＨ１０５９５が機能性であることが明らかになった。
【００８５】
ｐＩＣＨ１０５９５によって産生されたＣＰがｐＩＣＨ８５４３のＲＮＡレプリコンをトランスでパッケージできるかどうかを試験するため、２つのクローンをベンサミアナタバコ葉に共浸潤させた。浸潤後５日に、接種させた葉領域においてＧＦＰが検出できた。しかしながら、上部の葉では浸潤後３週間でもＧＦＰを全く検出できなかった。この時点で、接種させた植物は、野生型ウイルスを接種させた植物の典型的な兆候を示した：対照の未接種植物よりも短く、そして上部の葉にはしわが寄り、黄色がかっていた。ＰＡＧＥ及びゲルのクマシー染色は全体の葉でＣＰを発現したことを示したが、ＧＦＰタンパク質は全く検出できなかった。ウエスタンブロット解析も、接種させた葉ではＧＦＰを検出したが、全体の葉におけるＧＦＰの検出には失敗した。結論として、野生型ウイルスは目的遺伝子（ＧＦＰなど）を発現するウイルスアンプリコンをトランスで移行できない。
【実施例３】
【００８６】
組み立てのオリジンを欠失したＣＰ発現クローンの構築
先の実施例では、下部の葉をＣＰ発現クローンとＧＦＰ発現クローンとの混合物で最初に浸潤させた場合、野生型ウイルスのみが接種させていない上部の葉において検出される。ＣＰクローンは複製及び移行にとても効率的であるため、ＧＦＰ発現クローンは、有効に競合して全体移行することができない。ＣＰ発現クローンの全体移行を妨げるために、ＣＰサブゲノムプロモーターの上流に位置するＭＰの部分に相当する、ウイルス（ＣＰ発現クローン）の組み立てのオリジン（ＯＡＳ）を含有すると推定される領域を除去した。得られたクローンｐＩＣＨ１６６０１（図１）はｐＩＣＨ１０５９５に類似するが、塩基対４９６６−５４５４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）を欠失している。ｐＩＣＨ１６６０１でアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ｐＩＣＨ８５４３とともにベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。１２日後、浸潤させていない上部の葉の葉脈にＧＦＰ蛍光が見られた。その後、翌日以降、ＧＦＰ蛍光は葉脈から葉組織へと広がり、葉領域の部分をカバーした。ＰＡＧＥ及びクマシー染色並びにウエスタンブロット解析は、ＧＦＰタンパク質が全体の葉で産生されたことを示した。したがって、ＣＰ発現クローンからＯＡＳを除去することによって、ＣＰをトランスで提供することにより目的クローンの全体移行を可能にする。
【実施例４】
【００８７】
目的遺伝子を含有する構築体へのイントロン付加は全体移行を向上させる
ＣＰ発現クローンと目的クローンの共発現効率を浸潤領域において向上させるために、異種目的配列を含有する構築体のＲｄＲｐ及びＭＰにイントロンを挿入した。ｐＩＣＨ８５４３を、シロイヌナズナの１０のイントロンをＲｄＲｐ（イントロン１〜１０、付録中の配列）の１８４４位、２２２８位、２５８８位、２９４４位、３１４３位、３３８１位、３６７２位、３８５０位、４２９９位、４４９７位（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）の位置に、２つのイントロンをＭＰ（イントロン１１〜１２）の５２８７位及び５４４４位に付加することにより改変した。得られたクローンｐＩＣＨ１７２７２（図１）を、ｐＩＣＨ１６６０１とともにベンサミアナタバコ葉に共浸潤させた。全体の葉において、イントロンのないクローンを用いた場合よりも早く、浸潤後７日にＧＦＰが出現し始めた。
【実施例５】
【００８８】
ＣＰ発現構築体へのイントロン付加は目的配列を含有する構築体の全体移行を向上させる
浸潤領域のより多くの細胞においてＣＰの発現を増加させるため、イントロン１〜９（上記）を、ｐＩＣＨ１６６０１の、ｐＩＣＨ１７２７２の構築について記載したのと同じ位置に付加した。加えて、ＭＰサブゲノムプロモーター領域を、あまりＴがなく、よりＧＣに富んだ配列に置換した。その結果、ｂｐ４５８５〜５４６０の配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）は付録に示したＳｅｑ１で置換され、構築体ｐＩＣＨ１６６８４を得た（図１）。ｐＩＣＨ１６６８４をｐＩＣＨ１７２７２とともにベンサミアナタバコ葉に共浸潤させた。浸潤後７日に、全体の葉にＧＦＰが出現した（図２）。イントロンのないクローンを用いたときよりも多くのＧＦＰ発現組織を得た。
【００８９】
６つのイントロン（イントロン１〜３及び７〜９、ｐＩＣＨ１７２７２の構築について記載）をｐＩＣＨ１０５９５に付加することによって、更なるＣＰ発現構築体を作製した。この構築体ｐＩＣＨ１７５０１（図１）は、完全なＭＰを含有し、したがって、ＯＡＳを含有する。この構築体をｐＩＣＨ１７２７２とともに共浸潤させた。浸潤葉領域でＧＦＰを発現したが、上部の全体の葉には移行しなかった（図３）。ＣＰ発現アンプリコンのみが全体の葉に発見された。これは、イントロンの存在が全体移行に十分ではなく、ＣＰ発現クローンからのＯＡＳの除去が必須であることを示している。
【実施例６】
【００９０】
目的遺伝子は全体の葉において高レベルで発現される
本明細書に記載のアプローチを、ＣＰを同一分子から目的遺伝子として発現する慣用ベクターを用いて得た全体移行と比較するために、ＧＦＰとＣＰをともに発現する対照構築体ｐＩＣＨ１７３４４を作製した（図１）。この構築体はｐＩＣＨ１７２７２に類似するが、３’ＮＴＲの３’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０のｂｐ６２７４〜６３１２に相当する）がタバコマイルドクリーンモザイクウイルス（ＴＭＧＭＶ）Ｕ５変異株の１００５ｂｐの３’末端配列（ｂｐ５４９８〜６５０２）に置換されている。ｐＩＣＨ１７３４４でアグロバクテリウムＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。接種後７日に、全体の葉でＧＦＰ蛍光が検出された。ＰＡＧＥ及びクマシー染色による解析は、ｐＩＣＨ１７３４４を接種させた植物の全体の葉において、ＧＦＰよりもＣＰのほうが多く産生されたことを示した（図４）。逆に、ｐＩＣＨ１６６８４とｐＩＣＨ１７２７２との混合物を接種させた植物の全体の葉では、全く又はほとんどＣＰが存在しなかった（図４）。したがって、本発明では、全体の葉で最も発現したタンパク質は、ＣＰではなく目的遺伝子に相当する。
【００９１】
ｐＩＣＨ１６６８４とｐＩＣＨ１７２７２との混合物を接種させた植物の全体の葉において、ｐＩＣＨ１７３４４を接種させた場合よりも少ないが、いくらかのＣＰが産生される。これは、ｐＩＣＨ１６６８４とｐＩＣＨ１７２７２とのあいだの組換えの結果として起こり、野生型ＣＰ発現ウイルスを産生する可能性が最も高い。関連するが異なるウイルス（例えばＴＭＶ株Ｕ１）に基づいたＣＰ発現クローンを作製することによって２つのクローン間の相同性を低下させることにより、そのような組換えイベントを低下又は排除させることができる。
【実施例７】
【００９２】
浸潤させた葉におけるＭＰの一過性トランス発現
変異ＯＡＳを有するクローンｐＩＣＨ１６６０１及びｐＩＣＨ１６６８４（図１）は、ＭＰの一部の欠失により（ＭＰを発現する第２のアンプリコンとともに共発現させなければ）細胞間移行することができない。したがって、限られた数の細胞のみが浸潤葉領域においてＣＰを発現する。浸潤領域の全ての細胞におけるＭＰのトランス発現は、より多くのＣＰ発現細胞を生じ、したがって、ＧＦＰ及びＣＰ構築体を共発現するより多くの細胞を生じ、最終的に、より効率的な全体移行をもたらすと判断した。３５Ｓプロモーターの制御下でＴＶＣＶ  ＭＰ遺伝子を含有する構築体を作製した。この構築体ｐＩＣＨ１０７４５（図５Ａ）を、ｐＩＣＨ１７２７２及びｐＩＣＨ１６６８４とともに共浸潤させた（図５Ｂ）。ＧＦＰ発現アンプリコンの全体移行は、そのようなＭＰの一過性トランス補完を用いると（図５Ｂ）、ＭＰ構築体を用いなかった場合（図２を参照されたい）よりも顕著に効率的であった。
【００９３】
参考実施例
以下の参考実施例は、ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の実施例１〜１１に対応する。
【参考実施例１】
【００９４】
ＴＭＶに基づいたＲＮＡベクターの構築
アブラナ科植物感染性のトバモウイルス（ｃｒ−ＴＭＶ；Ｄｏｒｏｋｈｏｖら、１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５０、５−８）及びカブ葉脈−ｃｌｅａｒｉｎｇウイルス（ＴＶＣＶ；Ｌａｒｔｅｙら、１９９４、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３８、２８７−２９８）のクローン化ｃＤＮＡを、ロシアのモスクワ大学のＡｔａｂｅｋｏｖ教授より入手した。いくつかのクローニング工程で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するウイルスベクターを作製した。得られた構築体、ｐＩＣＨ８５４３（図６Ａ）は、順に：シロイヌナズナ  アクチン２プロモーター（ＡＣＴ２、参考文献  Ａｎら、１９９６、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２６６５４、ｂｐ５７９６２〜５８７４８）由来の７８７ｂｐ断片、ＴＶＣＶの５’端（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７、ｂｐ１〜５４５５）、ｃｒ−ＴＭＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ５４５７〜５６７７、コートタンパク質ＣＰの開始コドンを除去するためにチミン５６０６がシトシンに変わっている）の断片、配列「ｔａａ  ｔｃｇ  ａｔａ  ａｃｔ  ｃｇａ  ｇ」、合成ＧＦＰ（ｓＧＦＰ）遺伝子、ｃｒ−ＴＭＶ  ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ６０７８〜６３１２）、及び最後にノパリン合成酵素（Ｎｏｓ）ターミネーターを含有する。断片全体を、ＣａｒｂＲ  ｐＢＩＮ１９由来のバイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ１０のＴ−ＤＮＡの左の境界（ＬＢ）と右の境界（ＲＢ）とのあいだにクローン化した。ｐＩＣＨ８５４３で、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、ベンサミアナタバコの葉に浸潤させた。３ｄｐｉで出現したＧＦＰ蛍光の焦点は、増殖してコンフルエントになった。驚くべきことに、浸潤領域の大部分の細胞が、ウイルスの複製及び移行により、最終的にＧＦＰを発現したとしても、ＧＦＰを発現する多くの独立した焦点によって検出されたように、わずかな細胞画分のみがウイルス複製を開始していた。３５Ｓプロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子を有するベンサミアナタバコ葉の浸潤は、浸潤領域のほとんど全ての細胞においてＧＦＰ発現をもたらすため（図示していない）、限定要因は植物細胞へのＤＮＡ送達ではないことが明らかになった。
【００９５】
この観察を確認するため、ＭＰに変異を有するウイルスベクター構築体を構築した。ｐＩＣＨ１４８３３と呼ばれるこの構築体は、ｐＩＣＨ８５４３に類似するが、ＭＰ遺伝子における、ＭＰに存在するＥｃｏＲＩ部位の上流３８９ｂｐの欠失により異なっている。この欠失を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片の配列を、配列番号１４として付録に示す。完全なウイルス構築体（ＡＣＴ２プロモーターからＮｏｓターミネーターまで）を、ｐＢＩＮ１９由来ＫａｎＲ  バイナリーベクターであるｐＩＣＢＶ４９のＴ−ＤＮＡの左の境界と右の境界とのあいだにクローン化した。ＭＰ内の欠失のために、この構築体から産生されるレプリコンは細胞間移行できないが、細胞内で自律複製可能である。ＭＰを、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターのような構成的プロモーターからトランスで提供すれば、細胞間移行を回復させることができる。
【００９６】
ＭＰ発現構築体を作製するために、ＴＶＣＶ  ＭＰ遺伝子をＰＣＲでクローン化ＴＶＣＶ  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２９３７０、ｂｐ４８０２〜５６２８）から増幅させ、３５Ｓプロモーター制御下のバイナリーベクターにサブクローニングした。ｐＩＣＨ１０７４５と呼ばれる得られた構築体（図示していない）と、ｐＩＣＨ１４８３３で、アグロバクテリウム株ＧＶ３１０１を形質転換し、一晩培養物のさまざまな希釈物を、浸潤培地がアセトシリンゴンを欠失する以外はＥｎｇｌｉｓｈと同僚らによって記載されたようにして（１９９７、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、１２、５９７−６０３）ベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。ｐＩＣＨ１４８３３単独の浸潤は、浸潤領域内にわずかなＧＦＰ発現細胞を出現させた。浸潤領域から調製したプロトプラストの計数により、合計５００個のプロトプラストのうち、わずか１〜３個のプロトプラスト（０．２〜０．６％）がＧＦＰを発現したことを発見した。ｐＩＣＨ１４８３３とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤により、それぞれの初期ＧＦＰ発現細胞から増殖した、ＧＦＰを発現する焦点を形成させた。最終的に、細胞間移行により、浸潤領域の大部分の細胞がＧＦＰを発現した（図７Ａ）。
【００９７】
トバモウイルスのようなＲＮＡウイルスは細胞質で複製し、核には決して入らない。したがって、核のプレｍＲＮＡプロセシング装置に曝されない環境で展開している。その結果、核で人工ウイルス構築体から生成したＲＮＡレプリコン転写産物が、ＲＮＡプロセシング装置に認識されず、適切にプロセシングされないことは驚くべきことではない。その上、ウイルスベクター由来のＲＮＡレプリコンは、非常に大きい：レプリコンがＴＭＶに基づく場合はおよそ７，０００ヌクレオチドである。非常にわずかな植物遺伝子がそのように大きなサイズを有し、そのような遺伝子の大部分は、プレｍＲＮＡのプロセシングや核からの輸送を容易にし、プロセシングされた転写産物の安定性を向上させるイントロンを含有する。したがって、本発明者らは、正確なプロセシング及び正しくプロセシングされた転写産物の核から細胞質への輸送の効率を増加させるプレｍＲＮＡの修飾は、ウイルス複製を開始する細胞数の増加をもたらすであろうと仮定した。核へのＤＮＡ送達後、より効率的にウイルス複製を開始することができるＲＮＡウイルスに基づいたベクターを作製するために使用できるアプローチが２つあることがわかった：（１）  １つのアプローチは、望ましくないプロセシングイベント（潜在スプライス部位を用いた選択的スプライシングイベント、又は未成熟終止イベントなど）を誘導するかもしれない配列特徴の除去である；（２）  第２のアプローチは、適切にプロセシングされる転写産物の量を増加させ、核から細胞質へのＲＮＡの輸送を改善し、及び／又は転写産物の安定性を向上させるためのイントロンの付加である。
【参考実施例２】
【００９８】
イントロン様配列の除去は、細胞質におけるウイルスＲＮＡレプリコン形成頻度を上昇させる
ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いてｐＩＣＨ４３５１由来のＲＮＡレプリコンの配列を解析し、選択的スプライシングイベントを誘導するかもしれないいくつかのイントロン様配列特徴に気づいた。そのような特徴の１つは、ＲｄＲＰの初めにある０．６ｋｂのウリジンに富んだ領域である（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のヌクレオチド８２７〜１４６２に相当する）（ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図２Ａ）。ｐＩＣＨ１４８３３では、この領域を、５４ヌクレオチド置換によってオリジナル配列とは異なる、ＰＣＲで変異させた配列に置換した（配列番号１５として付録に示す配列；ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図３を参照されたい）。Ｔに富んだ配列を、よりＧＣに富んだ配列に置換するために５２ヌクレオチドを置換した。ＲｄＲＰタンパク質配列が変化しないように、全てのヌクレオチド置換をサイレントにした。この変異断片は、それぞれ推定の潜在スプライスドナー及びアクセプター部位を除去するために導入した２つのヌクレオチド置換も含有する（８２９位及び１４５９位；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対する座標）。これらの変異の効果を試験するために、得られたクローンｐＩＣＨ１５４６６（図６Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５（トランスの移行タンパク質）とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させた。浸潤後８日に、ｐＩＣＨ１５４６６を浸潤させた領域にＧＦＰ発現細胞数の１０倍増加が観察された（ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、図７）。これは、ウイルスアンプリコンに由来するイントロン様配列の除去により、望ましくない選択的スプライシングイベントが妨げられ、より効率的にウイルス複製を開始させることを示唆している。ｐＩＣＨ１５４６６とｐＩＣＨ１０７４５との共浸潤により、非改変レプリコンと類似の速度で改変レプリコンの細胞間移行をもたらす。これは、ＲＮＡ配列の改変はウイルスベクターの細胞間移行に影響しなかったことを示している。
【参考実施例３】
【００９９】
ＭＰサブゲノムプロモーターにおけるイントロン様配列の除去
第２の潜在的に問題のある領域は、ＭＰサブゲノムプロモーターに相当する（ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図２Ｂ）。この領域は非常にＴに富んでおり、イントロン配列に非常に似ている。結果として、イントロン予測プログラムによって配列近傍に多くの潜在スプライスドナー及びアクセプター部位が予測される。残念なことに、サブゲノムプロモーター機能に影響を及ぼすことなく、この領域を容易に修飾することはできない。サブゲノムプロモーターに関し、全領域を完全に変異させ、ＭＰ発現の予測される損失を補うためにトランスでＭＰを提供することにした。また、この構築体からＭＰは発現されないため、目的遺伝子の発現を駆動するのに必要なＣＰサブゲノムプロモーターを含有する３’配列以外は、ＭＰ配列の大部分を欠失させることにした。したがって、ｐＩＣＨ１４８３３の３８３ｂｐ断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７のｂｐ４５８４〜５４５５）を、２９７ｂｐ変異断片（配列番号１６）で置換した。得られた構築体ｐＩＣＨ１５９００（図６Ａ）を、ｐＩＣＨ１０７４５とともに又は伴わずに、ベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。興味深いことに、ｐＩＣＨ１４８３３を浸潤させた葉領域と比較して、複製を開始する細胞数の莫大な増加を検出した。浸潤葉領域から調製したＧＦＰ発現プロトプラストの計数により、この改変は、未改変ｐＩＣＨ１４８３３と比較して、ウイルス複製を開始する細胞数を８０〜１００倍増加させると概算している。ｐＩＣＨ１５９００をｐＩＣＨ１０７４５（ｐ３５Ｓ−ＭＰ発現カセット）とともに共浸潤させたところ、細胞間移行により、ＧＦＰ蛍光の増加を検出した。しかしながら、たとえ細胞間移行がなくとも、多くの細胞は既にＧＦＰを発現していたので、この増加は非常に限られたものであった。ｐＩＣＨ１５９００を含有するアグロバクテリウム懸濁液の１０００倍希釈液（６００ｎｍの計算されたＯＤがおよそ０．００４に相当する）を、ｐＩＣＨ１０７４５を含有する５倍希釈したアグロバクテリウム懸濁液（６００ｎｍの計算されたＯＤがおよそ０．８に相当する）とともに共浸潤させたところ、分離したＧＦＰ発現焦点を生じた。蛍光焦点は、ｐＩＣＨ１４８３３を用いて得られた対照焦点と同様に明るく、同一サイズであった。これは、ｐＩＣＨ１５９００の改変及びトランスでのＭＰの送達は、複製レベル、目的遺伝子の発現及び細胞間移行に関し、レプリコンの機能性を傷つけないことを示している。同一構築体（ｐＩＣＨ１４９３３及びｐＩＣＨ１５９００、ｐＩＣＨ１０７４５とともにか又は伴わない）をタバコ葉に共浸潤させた。ｐＩＣＨ１５９００における改変は、ベンサミアナタバコと同様に、複製を開始する細胞数を増加させた（ｐＩＣＨ１４８３３と比較して）。
【参考実施例４】
【０１００】
イントロンの付加は、細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
ウイルスプロレプリコン配列へのイントロンの付加が、複製開始頻度を上昇させるかどうかについて試験した。ＲｄＲＰの２つの異なる領域に３つの異なるシロイヌナズナのイントロンをそれぞれ含有する２つの構築体ｐＩＣＨ１５０２５及びｐＩＣＨ１５０３４を作製した（図６Ａ）。ｐＩＣＨ１５０２５は、ＲｄＲＰの中央にイントロンを含有するようにデザインしたが、ｐＩＣＨ１５０３４はＭＰサブゲノムプロモーターの上流のＲｄＲＰの３’端にイントロンを含有する。シロイヌナズナのゲノムＤＮＡから、ＰＣＲでイントロンを増幅し、計画されたイントロン/エクソン接合部位が重複するプライマーを用いてＰＣＲによりウイルス配列に組み込んだ。イントロンを含有する断片を、ＡｖａＩ―ＨｉｎｄＩＩＩ断片（付録の配列番号１７）としてｐＩＣＨ１４８３３にサブクローニングし、ｐＩＣＨ１５０２５を作製するか、又はＰｓｔＩ−ＮｃｏＩ断片（付録の配列番号１８）としてサブクローニングし、ｐＩＣＨ１５０３４を作製した。
【０１０１】
２つの構築体を別個にベンサミアナタバコ葉にアグロ浸潤させ、ｐＩＣＨ１４８３３と比較した。２つの構築体はウイルス複製を開始する細胞数を顕著に増加させた（図７Ａ）。この増加は、ｐＩＣＨ１４８３３に対し約５０倍の改善であると推定された。また、２つの構築体を、ＭＰ発現クローンとともに共浸潤させ、細胞間移行はイントロンのないクローンと同一であることがわかった。２つの構築体をタバコでも試験したところ、ベンサミアナタバコと同様の改善が観察された（図７Ｂ）。
【０１０２】
６つ全てのイントロンを含有する第３のクローンｐＩＣＨ１５４９９を作製した（図６Ｂ、図７Ａ、図７Ｂ）。この構築体をベンサミアナタバコ及びタバコにおいて試験した。この構築体は、３つのイントロンを有するそれぞれ個々の構築体よりも効率的であったが、改善は加法的であるよりも少なかった。
【参考実施例５】
【０１０３】
イントロンの付加及びイントロン様配列の除去は、細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの形成頻度を上昇させる
１つの構築体におけるイントロン様特徴の除去及び追加イントロンの付加は、２種類の改変がウイルス複製開始の改善に寄与できることを示した。ｐＩＣＨ１５４９９の６つのイントロンをｐＩＣＨ１５９００にサブクローニングした。これは、変異させたＭＰサブゲノムプロモーター領域を含有する。得られたクローンｐＩＣＨ１５８６０（図６Ｂ）をベンサミアナタバコ葉に浸潤させたところ、ＧＦＰを発現する全てのプロトプラストのおよそ５０％〜９０％の範囲内で、いずれの親クローンよりも顕著によく機能することがわかった（図７）。最高性能の構築体は、ＲｄＲＰ領域及び改変ＭＰサブゲノムプロモーター領域内にイントロンを含有する（ｐＩＣＨ１６１９１、図７Ｃ）。全く改変されていないクローンとの比較では、これは８０〜３００倍の改善を表す。また、この構築体をＭＰ発現構築体（ｐＩＣＨ１０７４５）とともに共浸潤させたところ、改変は細胞間移行又は複製を傷つけないことがわかった。
【参考実施例６】
【０１０４】
全てのイントロン付加が細胞質における機能性ＲＮＡレプリコンの出現頻度を上昇させるわけではない
２つの異なるシロイヌナズナのイントロンをＲｄＲＰの初めに挿入し、クローンｐＩＣＨ１５４７７を得た（この領域の配列を付録に配列番号１９として示す）。この領域の配列は、イントロンの付加前に既に非常に「エクソン様」である（例えば潜在スプライス部位がなくＧＣに富んでいる）。この構築体を用いてもウイルス複製開始の改善が全く見られなかった。したがって、いずれのイントロンの付加もウイルスベクターを改善しないであろう。イントロンの挿入又は突然変異誘発のために選択された位置は重要なパラメータであると思われる。例えば、ＭＰサブゲノムプロモーターのような問題のある構造の近傍領域にされた全てのイントロン挿入又はヌクレオチド置換は大きな改善をもたらしたが、既に「エクソン様」の配列へのイントロン挿入は改善させなかった。
【参考実施例７】
【０１０５】
ＭＰ配列へのイントロンの挿入はウイルスレプリコン形成頻度を上昇させる
初めに、制限酵素ＡｖｒＩＩによる消化、フィリング及び再連結により、ＭＰ内にフレームシフトを作製した。次に２つのイントロンをＭＰに挿入した。得られたクローンｐＩＣＨ１６４２２（図６Ｂ）をベンサミアナタバコ葉に浸潤させた。機能性ウイルスレプリコンを含有する細胞数に約１００倍の増加が検出された。
【参考実施例８】
【０１０６】
ＭＰ含有ベクターへのイントロンの挿入は、自律性の機能性クローンのウイルス複製開始頻度を上昇させる
ｐＩＣＨ１５４９９由来のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＩＣＨ８５４３へサブクローニングした。得られたクローン１６７００（図６Ｂ）は、ＲｄＲＰに６つのイントロンを有する完全なウイルスベクターを含有していた。このクローンをベンサミアナタバコ葉に浸潤させ、複製を効率的に開始させた。このクローンも、追加のＭＰをトランスで提供することなく、細胞間移行できた。
【参考実施例９】
【０１０７】
染色体に安定に組み込まれた不活性レプリコンの活性化
トランスジェニック植物をイントロン含有ウイルスベクター構築体で安定に形質転換することも可能である。植物生長を阻害する有害なウイルス複製を避けるために、ベクターの一部をアンチセンス方向で存在させることによって、不活性クローン（プロレプリコン）を作製することができる（図８）。反転断片の先端に組換え部位及びイントロン配列を組み込むことにより、適切なリコンビナーゼを用いることによって、この断片を正しい方向に「反転」させることができる。組換え部位はスプライシングによってレプリコンから完全に排除されるであろう。プロレプリコン中のイントロンは、組換え及び転写後、複製を効率的に開始させることができる。１つの特定の例では、組換え部位は、目的遺伝子内及びプロレプリコンの下流に位置する。そのような構造は組換え前の遺伝子発現を妨げる。組換え部位がＲｄＲＰ内及びプロモーターの上流のようなプロレプリコンの他の領域に位置する場合は他の構造を考慮することができる。組換え部位のイントロン配列は、先に記載したように、組換え部位をレプリコンから完全に除去するだけでなく、ウイルス複製効率を上昇させるという利点を有する。
【０１０８】
反転部分は、ベクターの３’端（図８に示すように）、図９に示すように中央又は５’端に位置することができる。ＲｄＲＰに６つの追加イントロンを含有する２つの構築体ｐＩＣＨ１２６９１（組換え部位に１つのイントロンのみを含有する）及びｐＩＣＨ１６８８８を作製した。ｐＩＣＨ１２６９１のＴ−ＤＮＡ領域全体の配列を配列番号２０に示す。ｐＩＣＨ１６８８８はｐＩＣＨ１２６９１に類似するが、更に、ｐＩＣＨ１５０２５（配列番号１７）において記載した３つのイントロン、及びｐＩＣＨ１５０３４（配列番号１８）において記載した３つのイントロンを含有し、それぞれこれらの構築体と同一位置に挿入されている。以下のように、カナマイシン選択を用いてベンサミアナタバコをｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８で安定に形質転換した。構築体ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＧＶ３１０１）に別個に固定し、微細な改変を伴うが、Ｈｏｒｓｈ及び同僚らによって記載されたようにして（１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１）、タバコ植物のアグロバクテリウム介在葉ディスク形質転換に別個に用いた。１ｍｇ／Ｌのα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、０．５ｍｇ／Ｌの６−ベンズアミノプリン（ＢＡＰ）、２００μＭアセトシリンゴン（ＡＳ）、ｐＨ５．５〜５．６を添加したムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）基本培地中のアグロバクテリウム懸濁液内で葉ディスクを３０分間共培養した。次に、葉ディスクを滅菌ワットマン（登録商標）ろ紙の上に置いて過剰な液体を除去し、固体共培養培地（上記のように添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）の上に移し、暗所において２２〜２３℃で４８時間培養した。共培養後、葉ディスクを選択再生培地（１ｍｇ／Ｌ  ＢＡＰ、０．１ｍｇ／Ｌ  ＮＡＡ、１ｍｇ／Ｌ  ＭＥＳ（ｐＨ５．７〜５．８）、３００ｍｇ／Ｌセファタキシム、５０ｍｇ／Ｌカナマイシンを添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）の上に置いた。再生培地で３〜６週間培養後、カナマイシン耐性植物細胞から再生した苗条を発根選択培地（３００ｍｇ／Ｌセファタキシム、アグロバクテリウムの排除を容易にするための２００ｍｇ／Ｌ  ｔｉｍｅｎｔｉｎ  、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン、ｐＨ５．７〜５．８を添加したＭＳ上に調製した０．８％アガー）の上に移した。再生した形質転換体を温室に移し、針の無いシリンジでインテグラーゼ発現構築体（ｐＩＣＨ１０８８１：アクチン２プロモーター  −  φＣ３１インテグラーゼ；又はｐＩＣＨ１４３１３：トウモロコシ転移因子Ｓｐｍプロモーター  −  φＣ３１インテグラーゼ）を含有するアグロバクテリウム懸濁液を浸潤させることによって試験した。ｐＩＣＨ１２６９１の形質転換体よりも多くのｐＩＣＨ１６８８８形質転換体が、インテグラーゼ構築体を浸潤させた後、ウイルス複製焦点を発現した（図１０）。加えて、ｐＩＣＨ１６８８８の形質転換体は、浸潤あたり、より多くのウイルス複製開始焦点を示した。
【参考実施例１０】
【０１０９】
植物ウイルスＲＮＡ配列は潜在的に不安定な領域を含有する
選択された植物ＲＮＡウイルスのＲＮＡプロファイル、及び十分に特徴付られた植物遺伝子（ＡｔＤＭＣ１）のＲＮＡプロファイルの解析を、ＮｅｔｇｅｎｅＩＩサーバープログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＧｅｎｅ２／）を用いて行った。ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図９に示すＡｔＤＭＣ１のＲＮＡプロファイルは、以前にｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡの配列を比較することによって同定された１４のイントロン（丸で囲まれている）の存在を明確に反映している。２つの植物ウイルスのＲＮＡプロファイルは、植物の核環境に置かれるとＲＮＡの安定性に問題を引き起こし得る領域（ＰＣＴ／ＥＰ０４／０１２７４３の図１０、１１を参照されたい）を有することは明らかである。ブロムモザイクウイルス、ＴＭＶの異なる株、及び他の多くのもののような他のいくつかの植物ＲＮＡウイルスの代表的なもののＲＮＡプロファイルについて解析した（図示していない）。それらの全ては、ＤＮＡ前駆体として植物細胞に送達されると植物ＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの形成効率を落としかねない潜在的に問題のある領域を有している。
【参考実施例１１】
【０１１０】
最適化ベクターは他の種で機能する
変異させた領域（ｐＩＣＨ１５４６６において記載）及び１６のイントロン（ｐＩＣＨ１５８６０の６つのイントロン、ｐＩＣＨ１６４２２の２つのイントロン及び８つの追加イントロンを含む）を含有する完全に最適化した構築体を作製した。要約すれば、この構築体は、以下の位置に挿入されたイントロンを含有する（ＴＶＣＶ配列、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＲＵ０３３８７に対して示す）：ヌクレオチド２０９、ヌクレオチド８２８、ヌクレオチド１１６９、ヌクレオチド１３７８、ヌクレオチド１６２２、ヌクレオチド１８４４、ヌクレオチド２２２８、ヌクレオチド２５８９、ヌクレオチド２９４４、ヌクレオチド３１４３、ヌクレオチド３３８１、ヌクレオチド３６７２、ヌクレオチド３８５０、ヌクレオチド４２９９、ヌクレオチド５２８７、ヌクレオチド５４４４。
【０１１１】
サトウダイコンでこの構築体の発現について試験した。以下に記載するようにして植物全体の浸潤を行った。ｐＩＣＨ１８７１１を有するアグロバクテリウムを、５０μｇ／ｍｌリファンピシン及び５０μｇ／ｍｌカナマイシン（バイナリーベクターに対して選択）を含有する３００ｍｌのＬＢに接種し、飽和するまで増殖させた。細菌を４８００ｇで１０分間沈殿させ、３Ｌの浸潤バッファー（１０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に再懸濁し、飽和アグロバクテリウム培養物を１０倍希釈した。浸潤溶液を含有するビーカーを、溶液にさっと浸した植物の地上部とともに乾燥器（直径３０ｍｍ）の中においた。ＫＮＦ  Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ（フライブルグ、ドイツ）製のＰＭ  １６７６３−８６０．３型ポンプを用いて２分間真空を施し、０．５〜０．９ｂａｒに達した。植物を標準条件の温室に戻した。
【０１１２】
ｐＩＣＨ１８７１１を浸潤させた植物の葉でＧＦＰ発現が高かった（図１１）。逆に、イントロンを含有しないｐＩＣＨ１６７００を浸潤させた対照植物では、小さなスポットがほんのわずかに見られたであろう（図示していない）。
【０１１３】
付録
配列番号１：イントロン１
【０１１４】
【化１】
2007518412.tif 000002
【０１１５】
配列番号２：イントロン２
【０１１６】
【化２】
2007518412.tif 000003
【０１１７】
配列番号３：イントロン３
【０１１８】
【化３】
2007518412.tif 000004
【０１１９】
配列番号４：イントロン４
【０１２０】
【化４】
2007518412.tif 000005
【０１２１】
配列番号５：イントロン５
【０１２２】
【化５】
2007518412.tif 000006
【０１２３】
配列番号６：イントロン６
【０１２４】
【化６】
2007518412.tif 000007
【０１２５】
配列番号７：イントロン７
【０１２６】
【化７】
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【０１２７】
配列番号８：イントロン８
【０１２８】
【化８】
2007518412.tif 000009
【０１２９】
配列番号９：イントロン９
【０１３０】
【化９】
2007518412.tif 000010
【０１３１】
配列番号１０：イントロン１０
【０１３２】
【化１０】
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【０１３３】
配列番号１１：イントロン１１
【０１３４】
【化１１】
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【０１３５】
配列番号１２：イントロン１２
【０１３６】
【化１２】
2007518412.tif 000013
【０１３７】
配列番号１３：Ｓｅｑ１
【０１３８】
【化１３】
2007518412.tif 000014
【０１３９】
配列番号１４（ｐＩＣＨ１４８３３のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片）：
【０１４０】
【化１４】
2007518412.tif 000015
【０１４１】
配列番号１５（ｐＩＣＨ１５４６６の部分）：
【０１４２】
【化１５】
2007518412.tif 000016
【０１４３】
配列番号１６（ｐＩＣＨ１５９００の部分）：
【０１４４】
【化１６】
2007518412.tif 000017
【０１４５】
配列番号１７（ｐＩＣＨ１５０２５の部分）：（下線を付したイタリック体で示した３つのイントロンを含有する）
【０１４６】
【化１７】
2007518412.tif 000018
【０１４７】
配列番号１８（ｐＩＣＨ１５０３４の部分）：（下線を付したイタリック体で示した３つのイントロンを含有する）
【０１４８】
【化１８】
2007518412.tif 000019
【０１４９】
配列番号１９（ｐＩＣＨ１５４７７の断片、下線を付したイタリック体で示した１つのイントロンを含有する）
【０１５０】
【化１９】
2007518412.tif 000020
【０１５１】
配列番号２０：ｐＩＣＨ１２６９１のＴ−ＤＮＡ領域、ここで、配列セグメントは以下の機能を有する：
ヌクレオチド１〜２５：左の境界（反対鎖）、
ヌクレオチド８６〜１４８４：Ｎｏｓプロモーター  −  ＮＰＴＩＩコード配列  −  Ｎｏｓターミネーター（反対鎖上）、
ヌクレオチド１５０６〜１５５２：ＡｔｔＰ組換え部位（反対鎖）、
ヌクレオチド１５５３〜１５９９：イントロン５’部分（反対鎖）、
ヌクレオチド１６００〜２０２２：ＴＶＣＶ  ＲｄＲＰ５’部分（反対鎖）、
ヌクレオチド２０２３〜２８０９：シロイヌナズナ  アクチン２プロモーター（反対鎖）、
ヌクレオチド２８３６〜２９０３：ＡｔｔＢ組換え部位、
ヌクレオチド２９０４〜２９５９：イントロン３’部分、
ヌクレオチド２９６０〜７９９１：ＴＶＣＶ  ＲｄＲＰ３’部分  −  ＭＰ５’部分、
ヌクレオチド７９９２〜８１６８：ｃｒ−ＴＭＶ  ＭＰ３’端、
ヌクレオチド８２４８〜８９６７：ＧＦＰコード配列、
ヌクレオチド８９６１〜９２１５：ｃｒ−ＴＭＶ３’非翻訳領域、
ヌクレオチド９２３４〜９４９７：Ｎｏｓターミネーター、
ヌクレオチド９５４９〜９４７３：Ｔ−ＤＮＡ  右の境界（反対鎖）：
【０１５２】
【化２０−１】
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【０１５３】
【化２０−２】
2007518412.tif 000022
【０１５４】
【化２０−３】
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【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、植物細胞においてＲＮＡウイルスに基づいたレプリコンの形成頻度を上昇させるためにデザインしたベクターｐＩＣＨ８５４３、ｐＩＣＨ１７２７２、ｐＩＣＨ１０５９５、ｐＩＣＨ１６６０１、ｐＩＣＨ１７５０１、ｐＩＣＨ１６６８４、ｐＩＣＨ１７３４４のＴ−ＤＮＡ領域のスキームを表す。いくつかの構築体は番号が付されたイントロンを含有する。番号は付録に示したイントロンに対応する。ｐＩＣＨ８５４３、ｐＩＣＨ１７２７２、及びｐＩＣＨ１７３４４は本発明のＲＮＡレプリコン（ｉ）である。ｐＩＣＨ１６６０１及びｐＩＣＨ１６６８４は本発明のヘルパーレプリコン（ｉｉ）である。Ａｃｔ２−シロイヌナズナ  アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲｐ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域；ＣＰ−ウイルスコートタンパク質；Ｔｎｏｓ−ノパリン合成酵素の転写終止領域。
【図２】図２は、ｐＩＣＨ１７２７２及びｐＩＣＨ１６６８４で共浸潤させた２つの植物の全体のベンサミアナタバコ葉を示す。
【図３】図３は、ｐＩＣＨ１７２７２及びｐＩＣＨ１７５０１を共浸潤させたベンサミアナタバコ植物を示す。左の写真は、右側の写真において丸で囲まれた浸潤領域をＵＶ光下で示す。ＧＦＰ発現は共浸潤領域に独占的に見られる。
【図４】図４は、ベンサミアナタバコの浸潤させた全体の葉から抽出した全可溶性タンパク質のＳＤＳゲル電気泳導分離（クマシー染色）を示す。レーン：１．  ｐＩＣＨ１６６０１の上部非浸潤葉組織        ２．  ｐＩＣＨ８５４３の浸潤領域        ３．  分子量マーカー        ４．  ＴＶＣＶを感染させた植物の全体の葉        ５，６．  ｐＩＣＨ１６６８４及びｐＩＣＨ１７２７２を共浸潤させた植物の全体の葉        ７．  ｐＩＣＨ１６６０１及びｐＩＣＨ１７２７２を共浸潤させた植物の全体の葉        ８．  分子量マーカー        ９．  ｐＩＣＨ８５４３の浸潤領域        １０．  ＴＶＣＶを感染させた植物の全体の葉        １１．  ｐＩＣＨ１６６０１の上部非浸潤葉組織        １２〜１４．  ｐＩＣＨ１７３４４の全体の葉
【図５】図５は、ベクターｐＩＣＨ１０７４５のＴ−ＤＮＡ領域（Ａ）の概略図、並びにｐＩＣＨ８５４３、ｐＩＣＨ１６６８４、及びｐＩＣＨ１０７４５を共浸潤させた植物の全体のベンサミアナタバコ葉である。
【図６Ａ】図６Ａは、本発明の機能保存的な相違を有するベクターと有さないベクターのＴ−ＤＮＡ領域の概略図である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本発明の機能保存的な相違を有するベクターと有さないベクターのＴ−ＤＮＡ領域の概略図である。
【図７Ａ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域についてベクター（ｐＩＣＨ）同定番号が示されている。図７Ａ−ベンサミアナタバコ、アグロ浸潤後８日。
【図７Ｂ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域についてベクター（ｐＩＣＨ）同定番号が示されている。図７Ｂ−タバコ、アグロ浸潤後８日。
【図７Ｃ】図７は、ベンサミアナタバコ及びタバコの葉におけるウイルス構築体のアグロ浸潤後のＧＦＰ発現を示す。各浸潤領域についてベクター（ｐＩＣＨ）同定番号が示されている。図７Ｃ−アグロ浸潤後５日に単離したベンサミアナタバコのプロトプラスト。右の写真の多くの光点は、非常に高いレプリコン形成頻度及びＧＦＰ発現を示す。
【図８】図８は、本発明によりデザインされたＲＮＡウイルスに基づいたレプリコン前駆体の概略図であり、非誘導状態で目的遺伝子（ＧＦＰ、Ｇで示す）の発現レベルはゼロである。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終止領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ  アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図９】図９は、構築体ｐＩＣＨ１２６９１及びｐＩＣＨ１６８８８のＴ−ＤＮＡ領域を表す。Ｐ−転写プロモーター；Ｔ−転写終止領域；ＳＭ−選択可能マーカー遺伝子；Ａｃ２−シロイヌナズナ  アクチン２遺伝子のプロモーター；ＲｄＲＰ−ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＭＰ−ウイルス移行タンパク質；ＮＴＲ−ウイルス３’非翻訳領域。
【図１０】図１０は、ｐＩＣＨ１２６９１又はｐＩＣＨ１６８８８のＴ−ＤＮＡ領域を有する安定に形質転換された異なるベンサミアナタバコ株の葉をＵＶ光下で示す。葉はインテグラーゼを提供するベクター（ｐＩＣＨ１０８８１又はｐＩＣＨ１４３１３）でアグロ浸潤されている。
【図１１】図１１は、ｐＩＣＨ１８７１１でアグロ浸潤後１週間のサトウダイコンの葉を日光（左）及びＵＶ（右）照射で示す。右の写真の光斑は、ＧＦＰ蛍光を示す。下部に示す構築体中のイントロン（斑点のある四角）には番号が付されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2007518412.tif 000028
【図６Ａ】
2007518412.tif 000029
【図６Ｂ】
2007518412.tif 000030
【図７Ａ】
2007518412.tif 000031
【図７Ｂ】
2007518412.tif 000032
【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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2007518412.tif 000039
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