(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を動物に投与することを含む、前記動物において免疫応答を調節するための新規方法に関する。さらに、本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を含有する医薬組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を調節し、ヘルパーＴ細胞媒介性免疫応答を調節し、インターフェロン−γ媒介性免疫応答を調節し、免疫機能亢進疾患を治療し、ヘルパーＴ細胞媒介性疾患を治療し、ヘルパーＴ細胞媒介性免疫応答を調節するための薬剤の調製におけるＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの使用。
【請求項２】
前記調節が抑制であり、前記リガンドがＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アゴニストである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記アゴニストが、ＩＬ−２７、ＩＬ−２７の活性フラグメント、又はＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を増強するＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアゴニスト抗体と特徴付けられる、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記調節が活性化であり、前記リガンドがＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アンタゴニストである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１結合親和性を保持する不活性ＩＬ−２７フラグメント、又はＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を抑制する、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアンタゴニスト抗体である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記ヘルパーＴ細胞がＴｈ１又はＴｈ２である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記免疫疾患が、自己免疫疾患、過敏性疾患、アレルギー又は喘息である、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記免疫疾患又はヘルパーＴ細胞媒介性疾患が、後天性免疫不全症候群；急性膵炎；アジソン病；アルコール性肝硬変を含むアルコール誘導性肝損傷；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性脈管炎；自己免疫性肝炎誘導性肝損傷；胆汁性肝硬変；ＡＩＤＳ誘導性悪液質を含む、悪液質／食欲不振；多発性骨髄腫及び骨髄性白血病及び他の白血病などの癌、並びに腫瘍転移；慢性疲労症候群；クロストリジウム菌関連性下痢を含むクロストリジウム菌関連疾患；鬱血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全及び冠状動脈バイパス移植を含む、冠状動脈状態及び徴候；若年発症１型糖尿病、真性糖尿病及びインスリン抵抗性を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連状態；精巣上体炎；エリスロポエチン抵抗性；発熱；線維筋痛又は痛覚消失症；糸球体腎炎；対宿主性移植片病／移植片拒絶反応；グレーブス病；ギラン−バレー症候群；橋本病；溶血性貧血；出血性ショック；痛覚過敏；潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患；変形性関節症、慢性関節リウマチ、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患合併関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘導性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛、及び巨細胞性動脈炎を含む、関節の炎症状態及びリウマチ性疾患；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；炎症性腸疾患；脳虚血を含む虚血；川崎病；記憶障害；肺疾患；ループス腎炎；多発性硬化症；重症筋無力症；筋障害性神経炎症性疾患；神経毒性；眼変性及びブドウ膜炎を含む眼疾患及び状態；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；天疱瘡；歯周病；毛孔性紅色粃糠疹；早産；前立腺炎及び関連状態；乾癬及び関連状態；乾癬性関節炎；肺線維症；再灌流損傷；リウマチ熱；慢性関節リウマチ；サルコイドーシス；強皮症；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；シェーグレン症候群、睡眠障害；脊椎関節症；全身性エリテマトーデス；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷及び整形外科手術から生じる炎症状態；移植片拒絶反応；ブドウ膜炎；脈管炎；あるいは挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患過程から生じる炎症状態と特徴付けられる、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
（ｉ）有効量のＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンド；及び
（ｉｉ）製薬上許容される担体
を特徴とする、医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドが、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質である、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記物質が、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記物質が、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記物質が、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記物質が、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
免疫反応性亢進を治療する、極性化Ｔ細胞を抑制する、Ｔｈ１媒介性疾患を治療する、Ｔｈ２媒介性疾患を治療する、ＩＦＮ−γ媒介性疾患を治療する、ＩｇＥ媒介性疾患を治療する、喘息を治療する、又はアレルギーを治療する上で使用される、ＷＳＸ活性上昇剤。
【請求項１６】
前記物質が、ＩＬ−２７、ＩＬ−２７の活性フラグメント、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体、又はＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体と特徴付けられる、請求項１５において特徴付けられる使用のための物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が全体として参照してここに組み込まれる、２００３年１月３１日出願の米国特許仮出願第６０／４４４，４９４号及び２００３年１１月１０日出願の米国特許仮出願第６０／５１９，０７４号の優先権を主張する。
【０００２】
この研究は、一部が、国立衛生研究所の補助金第ＡＩ４１１５８、ＡＩ４２３３４及びＡＩ３５９１４号によって援助された。米国政府はこの援助により本発明に権利を有しうる。
【０００３】
本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を動物に投与することを含む、動物において免疫応答を調節するための新規方法に関する。さらに、本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＷＳＸ−１は、配列と構造の両方においてＩＬ−１２Ｒのβ２鎖に相同なクラスＩサイトカイン受容体である。この受容体は、休止期／未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞によって高発現される。最近の試験は、サブユニットＥＢＩ３及びＩＬ−２７ｐ２８から成るヘテロ二量体サイトカイン、ＩＬ−２７ＲをＷＳＸ−１についてのリガンドと特定した。クラスＩサイトカイン受容体ファミリーの成員であるＥＢＩ３はＩＬ−１２ｐ４０と有意の構造相同性を共有し、またＩＬ−２７ｐ２８はＩＬ−１２ｐ３５と密接に関連する。ＩＬ−１２／ＩＬ−１２ＲとＩＬ−２７／ＷＳＸ−１リガンド／受容体対の間の構造的類似性に加えて、機能的類似性を示すという報告もある。ＩＬ−１２ＲはＴｈ１型応答の発現において決定的な役割を果たすが、ＷＳＸ−１欠損細胞は、初期Ｔｈ１分化の間にＩＦＮ−γ産生障害を有することが報告された。さらに、組換えＩＬ−２７は、ＩＬ−１２と同様に、高度精製未処置ヘルパーＴ細胞においてＴｈ１分化を促進することができる。これらの試験の結果、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１は、ＩＬ−１２／ＩＬ−１２Ｒ相互作用のように、Ｔｈ１応答の初期分化における重要な因子であるという初期コンセンサスが得られた。
【０００５】
最近の試験は、ＩＬ２７及びその受容体であるＷＳＸ−１を未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴｈ１分化のプロモーターと述べているが、出願人は、この受容体を通してのシグナル伝達はＴ細胞活性の強さと持続期間を制限することに関与すると判定した。ＷＳＸ−１欠損マウスを細胞内病原体、トキソプラズマ原虫に感染させると、前記マウスは、炎症性サイトカインの産生と寄生生物複製の制御を特徴とする、防御的Ｔ細胞応答を確立する。しかし、感染ＷＳＸ−１−／−マウスはこれらの防御応答を下方調節することができず、致死的なＴ細胞媒介性炎症疾患を発現する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでの合意理解に反して、我々は、トキソプラズマ原虫に感染したＷＳＸ−１欠損マウスは、強力なＴｈ１型応答を発現し、寄生生物複製を制御することができるが、この防御応答を下方調節することができずに、致死的なＴ細胞媒介性炎症疾患を発現することを明らかにした。この病理は、過剰のＩＦＮ−γ産生、高度活性化Ｔ細胞の存続、及びインビボでのＴ細胞増殖の上昇によって特徴付けられた。ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１極性化は増殖及びＩＦＮ−γ分泌の上昇を導いたので、その表現型はインビトロで再現することができた。しかし、これらの試験はまた、非極性化条件下で、最適ＩＦＮ−γ産生のためにＷＳＸ−１が必要であることも確認した。さらなる分析は、外因性ＩＬ−２７が、伝統的に細胞活性化に結び付けられてきたが、最近になって免疫機能の阻害にも関連付けられたＳＴＡＴファミリー成員：ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５を活性化できることを明らかにした。合わせて考えると、これらの所見は、ＷＳＸ−１がトキソプラズマ原虫に対するＩＦＮ−γ媒介性免疫の生成には必要でないことを明らかにし、Ｔ細胞媒介性免疫機能亢進の強力なアンタゴニストとしてのＷＳＸ−１の新規機能を特定する。
【０００７】
そこで、我々は、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、免疫反応性亢進を治療するための方法を見出した。そのような物質は、ＩＬ−２７、その活性フラグメント、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体、及び、ＷＳＸ−１はＩＬ−２７ＲＰＰと共にヘテロ二量体受容体ＩＬ−２７Ｒの一部であるので、二量体ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体、及びＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。そのような物質はまた、極性化Ｔ細胞の機能を抑制するため、Ｔｈ１媒介性疾患を治療するため、Ｔｈ２媒介性疾患を治療するため、ＩＦＮ−γ媒介性疾患を治療するため、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する非リンパ系細胞（例えばマスト細胞）の応答を調節するため、及びＩｇＥ媒介性疾患（例えば喘息、アレルギー等）を治療するためにも使用しうる。そのような物質は、以下でさらに詳細に開示するように、多くの自己免疫疾患を治療するために使用しうる。
【０００８】
我々はまた、免疫系の低下を有する患者を治療する上で有用である、免疫応答を上昇させるための方法を見出した。そのような免疫抑制は、例えば疾患又は化学療法から生じうる。この方法は、ＩＬ−２７Ｒ及び／又はＩＬ−２７Ｒ／ＷＱＳＸ−１に結合する物質の有効量を投与することを含み、ＩＬ−２７によるＩＬ−２７Ｒの活性化を妨げる。そのような物質は、ＩＬ−２７に結合する抗体、ＥＢ１３（ＩＬ−２７のサブユニット）に結合する抗体、ＩＬ２７ｐ２８（同じくＩＬ−２７のサブユニット）に結合する抗体、可溶性形態のＷＳＸ−１、可溶性形態の二量体ＩＬ−２７Ｒ、可溶性形態のＩＬ−２７ＲＰＰ、及び非活性化ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドを含む。そのような物質は、以下でさらに詳述するように、免疫抑制に関連する多くの疾患及び状態を治療するために使用しうる。
【０００９】
さらに本発明によれば、（ａ）ＩＬ−２７Ｒ受容体を含む細胞を被験物質で治療すること；（ｂ）ＩＬ−２７受容体活性への前記被験物質の作用を判定すること、を含む、前述した方法において有用な分子をスクリーニングするための方法も提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物において免疫応答を調節するための方法に関する。
【００１１】
本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてヘルパーＴ細胞媒介性免疫応答を調節するための方法に関する。
【００１２】
本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてインターフェロン−γ媒介性免疫応答を調節するための方法に関する。
【００１３】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物において免疫機能亢進を治療するための方法に関する。
【００１４】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてヘルパーＴ細胞媒介性疾患を治療するための方法に関する。
【００１５】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてヘルパーＴ細胞媒介性免疫応答を調節するための方法に関する。
【００１６】
本発明はさらに、
（ｉ）有効量のＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンド；及び
（ｉｉ）製薬上許容される担体
を含有する医薬組成物に関する。
【００１７】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、免疫反応性亢進を治療する方法に関する。
【００１８】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、極性化Ｔ細胞を抑制する方法に関する。
【００１９】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、Ｔｈ１媒介性疾患を治療する方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、Ｔｈ２媒介性疾患を治療する方法に関する。
【００２１】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、ＩＦＮ−媒介性疾患を治療する方法に関する。
【００２２】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、ＩｇＥ媒介性疾患を治療する方法に関する。
【００２３】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、喘息を治療する方法に関する。
【００２４】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、アレルギーを治療する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（定義）
文脈によって異なる要求が為されない限り、単数用語は複数を包含し、複数用語は単数を包含する。
【００２６】
本明細書全体を通じて、「ＷＳＸ−１」、「ＩＬ−２７Ｒ」及び「ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１」という用語に言及する。これらの用語はＩＬ−２７の受容体を表わすために交換可能に使用されることが了解されねばならない。
【００２７】
ここで使用する「リガンド」という用語は、選択的に且つ化学量論的に、共有結合又は非共有結合のいずれかで、もう１つ別の分子上の１又はそれ以上の特定部位に結合する又は結合することができる、分子又は分子のドメインを指す。リガンドの非制限的な例は、抗体とその抗原、ホルモンとその受容体、及び酵素とその基質を含む。
【００２８】
（疾患の治療に関連する用語）
「患者」という用語は、ヒト及び動物被験体を包含する。「調節すること」という用語は、過程の活性の程度又は作用の程度を調節すること又は調整することを指す。「調節すること」は、活性化、増幅、減衰及び抑制を包含する。
【００２９】
「作用すること」という用語は、生物活性、機能、健康又は状態がその生物の全般的健康及び福利と一致するように維持される、増強される、低減される又は治療される、生物の生物活性、機能、健康又は状態への作用を生じさせる過程を指す。
【００３０】
生物の生物活性、機能、健康又は状態を「増強すること」という用語は、上昇させること、強化すること、強めること又は改善することの過程を指す。
【００３１】
障害、状態又は疾患（自己免疫疾患を含む）の「治療」又は「治療すること」は、その少なくとも１つの症状の緩和、その重症度の軽減、又は疾患又は状態の治療後にある程度の頻度で起こるより重篤な疾患への進行の遅延又は予防を包含する。治療は、疾患が完全に治癒されることを意味する必要はない。有用な治療薬は、疾患の重症度を軽減する、疾患又はその治療に関連する１又はそれ以上の症状の重症度を軽減する、又は患者の生活の質の改善を提供する、又は疾患、障害又は状態の治療後にある程度の頻度で起こりうるより重篤な疾患の発症を遅延させるだけでよい。例えば疾患が慢性関節リウマチである場合は、治療薬は、関節の腫脹を軽減しうる、罹患関節の数を減少させうる、又は骨喪失を遅延又は阻止しうる。ＳＬＥ患者は、数ある中でも特に皮膚病変、発熱、衰弱、関節炎、リンパ節腫脹、胸膜炎、心膜炎及び／又は貧血などの症状を有しうる。そのような症状は、例えば視覚検査、写真撮影、体温の測定、握力、又は関節サイズ、及び／又は赤血球濃度を調べるための血液の顕微鏡検査を含む、数多くある従来の手法のいずれかによって判定することができる。本発明は、特定疾患、障害又は状態の重症度あるいはそれによって引き起こされる症状の重症度を反映する指標である基線値に比べて持続的な改善を誘導する、あるいは一部又はすべての場合に疾患、障害又は状態の治療に続発するより重篤な疾患の発症を遅延又は予防するのに十分な量及び期間で薬剤を患者に投与することを含む、治療のための方法を包含する。本発明は、ここで述べる物質による治療の前、治療後及び／又は治療中の他の治療薬による可能な処置を排除しない。
【００３２】
疾患又は医学的状態は、自然に生じる又は実験的に誘導される疾患又は医学的状態がＴｈ１細胞の増殖又は分化上昇に関連する場合、「Ｔｈ１媒介性疾患」又は「Ｔｈ１媒介性障害」とみなされる。Ｔｈ１媒介性疾患は、（１）ヒト、動物又は細胞培養において正常に認められるレベルを超えるＴｈ１細胞のレベル；（２）Ｔｈ１細胞の増殖又は分化を上方調節する物質の投与によって動物において実験的に模倣することができる、前記疾患又は医学的状態に関連する病理学的所見；又は（３）前記疾患又は医学的状態の実験動物モデルにおいて誘導される病理が、Ｔｈ１細胞の増殖又は分化を阻害する物質での治療によって阻止又は排除できること、によって特定されうる。大部分のＴｈ１媒介性疾患では、前記の３つの条件のうち少なくとも２つが満たされる。
【００３３】
急性及び慢性Ｔｈ１媒介性疾患の非排他的なリストは、以下のものを含むがこれらに限定されない：急性膵炎；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；アルツハイマー病；ＡＩＤＳ誘導性悪液質を含む、悪液質／食欲不振；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性脈管炎；慢性疲労症候群；クロストリジウム菌関連性下痢を含むクロストリジウム菌関連疾患；鬱血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）及び冠状動脈バイパス移植を含む、冠状動脈状態及び徴候；多発性骨髄腫及び骨髄性白血病（例えばＡＭＬ又はＣＭＬ）及び他の白血病などの癌、並びに腫瘍転移；糖尿病（例えばインスリン依存性糖尿病）；子宮内膜症；発熱；線維筋痛；糸球体腎炎；対宿主性移植片病／移植片拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；変形性関節症、乾癬性関節炎及び慢性関節リウマチを含む、関節の炎症状態；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；脳虚血（例えば、各々が神経変性を導きうる、外傷、てんかん、出血又は卒中の結果としての脳損傷）を含む虚血；川崎病；記憶障害；肺疾患（例えばＡＲＤＳ）；多発性硬化症；ミオパシー（例えば、特に敗血症における、筋タンパク質代謝）；神経毒性（例えばＨＩＶによって誘導される）；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；歯周病；早産；乾癬；再灌流損傷；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；あるいは挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患過程から生じる炎症状態。
【００３４】
疾患又は医学的状態は、自然に生じる又は実験的に誘導される疾患又は医学的状態がＴｈ２細胞の増殖又は分化上昇に関連する場合、「Ｔｈ２媒介性疾患」とみなされる。Ｔｈ２媒介性疾患は、（１）ヒト、動物又は細胞培養において正常に認められるレベルを超えるＴｈ２細胞のレベル；（２）Ｔｈ２細胞の増殖又は分化を上方調節する物質の投与によって動物において実験的に模倣することができる、前記疾患又は医学的状態に関連する病理学的所見；又は（３）前記疾患又は医学的状態の実験動物モデルにおいて誘導される病理が、Ｔｈ２細胞の増殖又は分化を阻害する物質での治療によって阻止又は排除できること、によって特定されうる。大部分のＴｈ２媒介性疾患では、前記の３つの条件のうち少なくとも２つが満たされる。
【００３５】
急性及び慢性Ｔｈ２媒介性疾患の非排他的なリストは、以下のものを含むがこれらに限定されない：急性膵炎；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；アルツハイマー病；ＡＩＤＳ誘導性悪液質を含む、悪液質／食欲不振；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性脈管炎；慢性疲労症候群；クロストリジウム菌関連性下痢を含むクロストリジウム菌関連疾患；鬱血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）及び冠状動脈バイパス移植を含む、冠状動脈状態及び徴候；多発性骨髄腫及び骨髄性白血病（例えばＡＭＬ又はＣＭＬ）及び他の白血病などの癌、並びに腫瘍転移；糖尿病（例えばインスリン依存性糖尿病）；子宮内膜症；発熱；線維筋痛；糸球体腎炎；対宿主性移植片病／移植片拒絶反応；出血性ショック；痛覚過敏；炎症性腸疾患；変形性関節症、乾癬性関節炎及び慢性関節リウマチを含む、関節の炎症状態；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；脳虚血（例えば、各々が神経変性を導きうる、外傷、てんかん、出血又は卒中の結果としての脳損傷）を含む虚血；川崎病；記憶障害；肺疾患（例えばＡＲＤＳ）；多発性硬化症；ミオパシー（例えば、特に敗血症における、筋タンパク質代謝）；神経毒性（例えばＨＩＶによって誘導される）；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；歯周病；早産；乾癬；再灌流損傷；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；あるいは挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患過程から生じる炎症状態。
【００３６】
「ＩＦＮ−γ媒介性疾患」という用語は、炎症、感染及び自己免疫疾患を含むが、これらに限定されない。ここで使用する「自己免疫疾患」は、患者の免疫応答が患者自身の構成成分に向けられる疾患状態及び状況を指す。例えばＩＦＮ−γ媒介性疾患は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患、多発性硬化症、アジソン病、糖尿病（Ｉ型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、乾癬性関節炎、アテローム性動脈硬化症、エリスロポエチン抵抗性、対宿主性移植片病、移植片拒絶反応、自己免疫性肝炎誘導性肝損傷、胆汁性肝硬変、アルコール性肝硬変を含むアルコール誘導性肝損傷、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、及び脈管炎を含むが、これらに限定されない。ＩＦＮ−γは、ウイルス感染から身体を保護すること及び免疫応答のいくつかの態様を調節することを含む、多数の機能を有するサイトカインであるので、ＩＦＮ−γ活性の上昇はいくつかの病理学的状態に寄与しうる。「ＩＦＮ−γ媒介性疾患」という用語はまた、ＩＦＮ−γのレベル上昇又はＩＦＮ−γの感受性上昇に関連するいずれの医学的状態も包含する。付加的なＩＦＮ−γ媒介性疾患は：急性膵炎；ＡＬＳ；アルツハイマー病；ＡＩＤＳ誘導性悪液質を含む、悪液質／食欲不振；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；慢性疲労症候群；クロストリジウム菌関連性下痢を含むクロストリジウム菌関連疾患；鬱血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）及び冠状動脈バイパス移植を含む、冠状動脈状態及び徴候；多発性骨髄腫及び骨髄性白血病（例えばＡＭＬ又はＣＭＬ）及び他の白血病などの癌、並びに腫瘍転移；発熱；糸球体腎炎；対宿主性移植片病／移植片拒絶反応；出血性ショック；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；脳虚血（例えば、各々が神経変性を導きうる、外傷、てんかん、出血又は卒中の結果としての脳損傷）を含む虚血；記憶障害；多発性硬化症；ミオパシー（例えば、特に敗血症における、筋タンパク質代謝）；神経毒性（例えばＨＩＶによって誘導される）；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；歯周病；神経毒性；早産；乾癬；再灌流損傷；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；顎関節疾患；睡眠障害；ブドウ膜炎；あるいは挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患過程から生じる炎症状態；若年発症１型糖尿病、真性糖尿病及びインスリン抵抗性（例えば肥満に関連する）を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連状態；線維筋痛又は痛覚消失症；痛覚過敏；肺疾患（例えば成人呼吸促進症候群及び肺線維症）；神経炎症性疾患；眼変性及びブドウ膜炎を含む、眼疾患及び状態；毛孔性紅色粃糠疹（ＰＲＰ）；前立腺炎（細菌性又は非細菌性）及び関連状態；乾癬及び関連状態；肺線維症；再灌流損傷；変形性関節症、慢性関節リウマチ、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性��節炎、スティル病、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患合併関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘導性（「敗血症性」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛、及び巨細胞性動脈炎を含む、関節の炎症状態及びリウマチ性疾患；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷及び整形外科手術から生じる炎症状態を含む。
【００３７】
「ＩｇＥ関連疾患」という用語は、免疫グロブリンＥの産生上昇に関連する疾患、障害及び状態を指す。そのような疾患、障害及び状態は、喘息、アレルギー等を含む。
【００３８】
「ＷＳＸ−１活性」及び「ＩＬ−２７Ｒ活性」という用語は、これまでに又は今後に、ＩＬ−２７と、ＩＬ−２７Ｒ又はＷＳＸ−１として様々に知られるその受容体との相互作用に関連することが認められた生物活性を指す。例として、ＷＳＸ−１活性は、感染に対する抵抗性、感染が誘導するサイトカイン産生（ＩＦＮ−γを含む）、及び添付の図面及び開示資料及び方法に示すようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞のレベルの調節を含むが、これらに限定されない。
【００３９】
「選択的結合剤」という用語は、対象とするタンパク質に選択的に結合する分子を指す。選択的結合剤は、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質又は低分子量化合物を含みうる。本発明の選択的結合剤であるタンパク質の例は、可溶性受容体（すなわち天然に生じる膜結合タンパク質の細胞外ドメインの全部又は一部を有するが、膜貫通ドメイン又は細胞内ドメインを有さないタンパク質）；抗体及びそのフラグメント；抗体及び可溶性受容体の変異体、誘導体及び融合タンパク質；ペプチド模倣剤化合物；及び有機模倣剤化合物を含む。好ましい実施形態では、選択的結合剤は、酵素切断、ペプチド合成又は組換え手法を含むがこれらに限定されない、公知の手法によって提供される、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、可溶性又は結合形態で標識することができる抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）並びにそのフラグメント、領域又は誘導体などの抗体である。本発明の選択的結合剤は、対象タンパク質の、その同族受容体又はリガンドへの結合を阻害する、それぞれの対象タンパク質の部分に結合することができる。
【００４０】
（選択的結合剤についてのアッセイ）
対象タンパク質の少なくとも１つの生物活性を部分的に又は完全に模倣する又は阻害する（例えばＩＬ−２７の活性を模倣する）選択的結合剤を特定するためのスクリーニング方法が本発明によって提供される。対象タンパク質の生物活性を阻害することは、タンパク質のその同族受容体への結合を阻害すること、インビトロ又はインビボアッセイによって測定されるようなその活性を阻害することを含むが、これらに限定されない。対象タンパク質の生物活性を模倣することは、タンパク質の同族受容体への結合、及びインビトロ又はインビボアッセイによって測定されるような対象タンパク質に類似した生物活性を生じさせることを含むが、これらに限定されない。インビトロアッセイは、タンパク質のその同族受容体又はリガンドへの結合を検出して、そのような結合の速度又は程度を上昇させる又は低下させる能力に関して選択的結合剤をスクリーニングするために使用しうるものを含む。１つの種類のアッセイでは、可溶性受容体などのポリペプチドを固体支持体（例えばアガロース又はアクリルビーズ）に固定し、選択的結合剤の存在下又は不在下でその同族リガンドを添加する。選択的結合剤の存在下又は不在下での可溶性受容体とその同族リガンドの結合の程度を測定する。結合は、例えば放射性標識、蛍光標識又は酵素反応によって検出することができる。
【００４１】
あるいは、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ニュージャージー州）などの表面プラズモン共鳴検出器システムを用いて結合反応を実施してもよい。結合反応は製造者のプロトコールに従って実施しうる。
【００４２】
前述したようなインビトロアッセイは、多数の選択的結合剤を迅速にスクリーニングするために好都合に使用しうる。前記アッセイは、ファージディスプレイにおいて生成される化合物、合成ペプチド及び化学物質合成ライブラリーをスクリーニングするために自動化しうる。
【００４３】
選択的結合剤はまた、ポリペプチドを発現する細胞及び細胞系統を使用した細胞培養においてもスクリーニングしうる。細胞及び細胞系統は哺乳動物から入手しうるが、好ましくはヒト又は他の霊長動物、イヌ又は齧歯動物ソースから入手する。一例として、細胞表面での受容体と同族リガンドの結合を選択的結合剤の存在下又は不在下で評価し、そのリガンドに対するビオチニル化抗体を用いたフローサイトメトリーによって結合の程度を測定する。
【００４４】
本発明の選択的結合剤は、放射免疫測定法、競合結合測定法、直接及び間接サンドイッチ測定法（ＥＬＩＳＡ）、及び免疫沈降法などの公知の検定法において使用しうる（Ｓｏｌａ，モノクローナル抗体：技術のマニュアル（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ），ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７年））。
【００４５】
（可溶性タンパク質物質に関連する用語）
「半減期延長剤」という用語は、治療タンパク質の分解を防ぐ及び／又は半減期を上昇させる、毒性を低下させる、免疫原性を低下させる、又は生物活性を上昇させる分子を指す。例示的なビークルは、Ｆｃドメイン（好ましい）並びに線状重合体（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デキストラン等）；分枝鎖重合体（例えば１９８１年９月１５日発行のＤｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒらへの米国特許第４，２８９，８７２号；１９９３年７月２０日発行のＴａｍへの米国特許第５，２２９，４９０号；１９９３年１０月２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔらへの国際公開第９３／２１２５９号参照）；脂質；コレステロール群（ステロイドなど）；炭水化物又はオリゴ糖（例えばデキストラン）；サルベージ受容体に結合する何らかの天然又は合成タンパク質、ポリペプチド又はペプチド；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むアルブミン；ロイシンジッパードメイン、及び他のそのようなタンパク質及びタンパク質フラグメントを含む。ビークルは以下でさらに説明する。
【００４６】
「天然Ｆｃ」という用語は、単量体又は多量体のいずれかの形態の、全抗体の消化から生じる非抗原結合フラグメントの配列を含む分子又は配列を指す。天然Ｆｃのもとの免疫グロブリンソースは、好ましくはヒト起源であり、免疫グロブリンのいずれかでありうるが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃ’は、共有結合（すなわちジスルフィド結合）及び非共有結合によって二量体又は多量体形態に連結されうる単量体ポリペプチドで作られる。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニットの間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に依存して１−４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（例えばＥｌｌｉｓｏｎ等（１９８２年），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９参照）。ここで使用する「天然Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量体形態に対して包括的である。
【００４７】
「Ｆｃ変異体」という用語は、天然Ｆｃから修飾されているが、まだサルベージ受容体、ＦｃＲｎについての結合部位を含む分子又は配列を指す。国際公開第９７／３４６３１号（１９９７年９月２５日公開）及び第９６／３２４７８号は、例示的なＦｃ変異体、並びにサルベージ受容体との相互作用を述べており、その全体が参照してここに組み込まれる。それ故、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子又は配列を含む。さらに、天然Ｆｃは除去しうる部位を含む。それらは、本発明の融合分子には必要でない構造特性又は生物活性を与えるからである。そこで、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合の形成、（２）選択宿主細胞との不適合性、（３）選択宿主細胞における発現時のＮ末端の異質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、又は（７）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、に影響を及ぼす又は関与する１又はそれ以上の天然Ｆｃ部位又は残基を欠く分子又は配列を含む。Ｆｃ変異体は以下でさらに詳述する。
【００４８】
「Ｆｃドメイン」という用語は、前記で定義した天然Ｆｃ及びＦｃ変異体分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然Ｆｃに関して、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化されたか又は他の手段によって生産された、単量体又は多量体形態の分子を含む。
【００４９】
（抗体に関連する用語）
「抗原」という用語は、抗体などの選択的結合剤によって結合されうる、及び付加的に、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を生産するために動物において使用できる、分子又は分子の部分を指す。抗原は１又はそれ以上のエピトープを有してもよい。
【００５０】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体に特異的に結合することができる何らかの決定基、好ましくはポリペプチド決定基を含む。一部の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面群を含み、一部の実施形態では、特異的三次元構造特性及び／又は特異的電荷特徴を有しうる。エピトープは、抗体によって結合される抗原の領域である。一部の実施形態では、抗体は、タンパク質及び／又は高分子の複合体混合物中でその標的抗原を選択的に認識するとき、抗原に特異的に結合すると言われている。好ましい実施形態では、抗体は、その解離定数が約１０ｎＭ以下であるとき、より好ましくは解離定数が約１００ｐＭ以下であるとき、最も好ましくは解離定数が約１０ｐＭ以下であるとき、抗原に特異的に結合すると言う。
【００５１】
「抗体」又は「抗体ペプチド」は、無傷抗体、又は特異結合に関して無傷抗体と競合するその結合フラグメントを指し、キメラ、ヒト化、完全ヒト、及び二重特異性抗体を含む。一部の実施形態では、結合フラグメントを組換えＤＮＡ手法によって生産する。付加的な実施形態では、無傷抗体の酵素又は化学的切断によって結合フラグメントを生産する。結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメント、重鎖、軽鎖及び一本鎖抗体を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
「重鎖（Ｈ鎖）」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長重鎖及びそのフラグメントを含む。完全長重鎖は、可変領域ドメイン、ＶＨ、及び３つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。ＶＨドメインはポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインはカルボキシル末端に位置する。
【００５３】
「軽鎖（Ｌ鎖）」という用語は、結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有する完全長軽鎖及びそのフラグメントを含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、ＶＬ及び定常領域ドメイン、ＣＬを含む。重鎖と同様に、軽鎖の可変領域ドメインはポリペプチドのアミノ末端に位置する。
【００５４】
「Ｆａｂフラグメント」は、１本の軽鎖と１本の重鎖のＣＨ１及び可変領域から成る。Ｆａｂ分子の重鎖は別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００５５】
「Ｆａｂ’フラグメント」は、１本の軽鎖と、２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ’）２分子を形成できるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に定常領域のより多くを含む１本の重鎖を含む。
【００５６】
「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」は、２本の軽鎖と、２本の重鎖の間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるように、ＣＨ１とＣＨ２ドメインの間に定常領域の一部を含む２本の重鎖を含む。
【００５７】
「Ｆｖ領域」は、重鎖と軽鎖の両方からの加減領域を含むが、定常領域を持たない。
【００５８】
「一本鎖抗体」は、重鎖と軽鎖の可変領域がフレキシブルリンカーによって連結されて、抗原結合領域を形成する一本鎖ポリペプチドを形成したＦｖ分子である。一本鎖抗体は、その開示が参照してここに組み込まれる、国際公開第８０／０１６４９号及び米国特許第４，９４６，７７８号及び同第５，２６０，２０３号において詳細に論じられている。
【００５９】
「多重特異性」又は「多機能性」抗体以外の「二価抗体」は、一部の実施形態では、同じ抗原特異性を有する結合物を含むと理解される。
【００６０】
「二重特異性」又は「二元機能性」抗体は、２つの異なる重／軽鎖対と２つの異なる結合部位を有するハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって生産しうる。例えばＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ（１９９０年），Ｃｌｉｎ．ＥＸｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等（１９９２年），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３参照。
【００６１】
本発明に従った抗体結合及び特異性の評価において、過剰の抗体が結合パートナーに結合する抗原の量を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％又はそれ以上（インビトロ競合結合測定法において測定される）低下させるとき、抗体は、結合パートナーへの抗原の接着を「実質的に阻害する」。
【００６２】
ここで使用する「免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメント」という用語は、少なくとも免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを含むポリペプチドフラグメントを指す。本発明の免疫学的に機能性の免疫グロブリンフラグメントは、抗原に結合する、抗原がその結合パートナーに結合するのを防ぐ、抗原と結合パートナーの結合から生じる生物学的応答を妨げる、又はそれらの何らかの組合せを実施することができる。
【００６３】
「物質」の語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子、又は生物材料から生成される抽出物を意味する。
【００６４】
（ＤＮＡ及びタンパク質製剤の用語）
組換えＤＮＡを作製する、オリゴヌクレオチド合成を実施する、及び組織培養及び形質転換（例えば電気穿孔、形質移入又はリポフェクション）を実施するためには従来の手法が使用しうる。酵素反応及び精製手法は、製造者の仕様書に従うか又は当技術分野で一般に実施されるように又はここで述べるように実施しうる。前記手法及び手順は、一般に当技術分野で周知の従来の方法に従って及び本明細書全体を通じて引用し、論じる様々な一般的及びより特定の参考文献で述べられているように実施しうる。例えば、参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，２００１年，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク州参照。特定の定義が為されていない限り、ここで述べる分析化学、合成有機化学、及び医学及び製薬化学に関連して使用される命名法、実験手順及び手法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬剤の調製、形成及び送達、及び患者の治療には標準手法が使用しうる。
【００６５】
「単離ポリヌクレオチド」という用語は、該ポリヌクレオチドが、（１）該ポリヌクレオチドが天然で結合している他のポリヌクレオチドの全部又は一部に（共有結合的又は非共有結合的に）結合していない、（２）天然では結合していない分子に結合している、又は（３）天然ではいかなる他のポリヌクレオチドとも結合しては生じない、ことを意味する。そのような単離ポリヌクレオチドは、合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ、又はそれらの組合せでありうる。
【００６６】
ここで言及する「単離タンパク質」という用語は、該タンパク質が、（１）通常は共に認められる他のタンパク質の少なくとも一部を含まない、（２）同じソースから、例えば同じ種からの他のタンパク質を基本的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現される、（４）天然で結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約５０％から分離されている、（５）その「単離タンパク質」が天然で結合しているタンパク質の部分と（共有結合又は非共有結合相互作用によって）結合していない、（６）天然では結合していないポリペプチドと作動可能に（共有結合又は非共有結合相互作用によって）結合している、又は（７）天然では生じない、ことを意味する。合成起源のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ、又はそれらの組合せがそのような単離タンパク質をコードしうる。好ましくは、単離タンパク質は、その治療、診断、予防、研究又は他の用途に干渉する、その天然環境において認められるタンパク質又はポリペプチド又は他の夾雑物を実質的に含まない。
【００６７】
「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、天然タンパク質、すなわち天然に生じる、特に非組換えの細胞によって、又は遺伝子操作された又は組換え細胞によって生産されるタンパク質の配列を有する分子を意味し、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、又は天然タンパク質の１又はそれ以上のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を有する分子を含む。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、特に抗体、又はそのような抗体の１又はそれ以上のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を有する配列を含む。「ポリペプチドフラグメント」という用語は、アミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失、及び／又は内部欠失を有するポリペプチドを指す。一部の実施形態では、フラグメントは少なくとも５〜約５００アミノ酸の長さである。一部の実施形態では、フラグメントが少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０アミノ酸の長さであることは認識される。特に有用なポリペプチドフラグメントは、結合ドメインを含む機能性ドメインを包含する。抗体の場合は、有用なフラグメントは、ＣＤＲ領域、重鎖又は軽鎖の可変領域、抗体鎖の部分又は単に２つのＣＤＲを含むその可変領域等を含むが、これらに限定されない。
【００６８】
「天然に生じる」及び「天然の」という用語は、これらの用語が適用される生体物質（分子、配列、タンパク質複合体、細胞等）が天然で認められ、人によって操作されていないことを意味する。例えば、天然でのソースから単離することができ、人によって故意に改変されていない、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に生じている。同様に、「非天然に生じる」又は「非天然の」という用語は、天然では認められない又は人によって構造的に改変された又は合成された物質を指す。
【００６９】
「作動可能に連結された」という用語は、この用語が適用される成分が、適切な条件下でそれらの固有の機能を実施することを可能にする関係にあることを意味する。例えばタンパク質コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列の転写活性と適合性の条件下でそのタンパク質コード配列の発現が達成されるようにタンパク質コード配列に連結されている。
【００７０】
「制御配列」という用語は、該ポリヌクレオチド配列が、それが連結されているコード配列の発現及びプロセシングを生じさせることができることを意味する。そのような制御配列の性質は宿主生物に依存しうる。特定実施形態では、原核生物についての制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含みうる。他の特定実施形態では、真核生物についての制御配列は、転写因子についての１又は複数の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列及び転写終結配列を含みうる。一部の実施形態では、「制御配列」は、リーダー配列及び／又は融合パートナー配列を含みうる。
【００７１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０塩基の長さの一本鎖又は二本鎖核酸重合体を意味する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態でありうる。前記修飾は、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、２’、３’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾、及びホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート及びホスホロアミデートなどのヌクレオチド間結合修飾を含む。この語は、一本鎖及び二本鎖形態のＤＮＡを包含する。
【００７２】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、２００塩基以下の長さを含むポリヌクレオチドを意味する。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは１０〜６０塩基の長さである。より好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０〜４０塩基の長さである。オリゴヌクレオチドは、例えば突然変異型遺伝子の構築における使用のためには、一本鎖又は二本鎖のいずれでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドでありうる。
【００７３】
「天然に生じるヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾又は置換糖類あるいは修飾又は置換塩基を有するヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート及びホスホロアミデート等のような結合を含む。例えば、その開示が参照してここに組み込まれる、ＬａＰｌａｎｃｈｅ等（１９８６年），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９０８１；Ｓｔｅｃ等（１９８４年），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎ等（１９８８年），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９；Ｚｏｎ等（１９９１年），Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ６：５３９；Ｚｏｎ等（１９９１年），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，編），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード、イギリス；Ｓｔｅｃ等、米国特許第５，１５１，５１０号；ＵｈｌｍａｎｎとＰｅｙｍａｎ（１９９０年），Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３参照。本発明のオリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテン又は抗原標識を含む、標識を含みうる。
【００７４】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に移入するために使用される分子（例えば核酸、プラスミド又はウイルス）を意味する。
【００７５】
「発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、それに作動可能に連結された１又はそれ以上の異種コード領域の発現を指令する及び／又は制御する（宿主細胞に関して）核酸配列を含むベクターを指す。発現構築物は、それに作動可能に連結されたコード領域の転写、翻訳及び、イントロンが存在する場合は、ＲＮＡスプライシングに影響を及ぼす又は制御する配列を含みうるが、これらに限定されない。
【００７６】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換された又は形質転換されることができ、それによって対象とする選択遺伝子細胞を発現する細胞を意味する。この語は、その子孫がもとの親細胞と形態又は遺伝子構成において同じであるか否かに関わらず、前記選択遺伝子が存在する限り、親細胞の子孫を包含する。
【００７７】
「形質導入」という用語は、通常はファージによる、１つの細菌から別の細菌への遺伝子の移入を意味する。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得及び移入を指す。
【００７８】
「形質移入」という用語は、細胞による異種又は外来性ＤＮＡの取込みを意味し、外来性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたとき、細胞は「形質移入」されたことになる。多くの形質移入手法が当技術分野において周知であり、ここで開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍ等，１９７３年，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，２００１年，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ），ｉｄ．；Ｄａｖｉｓ等，１９８６年，分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及びＣｈｕ等，１９８１年，Ｇｅｎｅ  １３：１９７参照。そのような手法は、１又はそれ以上の外来性ＤＮＡ成分を適切な宿主細胞に導入するために使用できる。
【００７９】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝形質の変化を指し、細胞が新しいＤＮＡを含むように改変されたとき、その細胞は形質転換されたことになる。例えば、細胞が形質移入、形質導入又は他の手法によってその天然の状態から遺伝的に修飾されている場合、その細胞は形質転換されている。形質移入又は形質導入後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体内に物理的に組み込まれることによって細胞のＤＮＡと再結合しうるか、又は複製されずにエピソームエレメントとして一過性に保持されうるか、又はプラスミドとして独立して複製されうる。形質転換ＤＮＡが細胞分裂によって複製されるとき、細胞は「安定に形質転換された」とみなされる。
【００８０】
「同一性」という用語は、２又はそれ以上のポリペプチド分子あるいは２又はそれ以上の核酸分子の配列間の、それらの配列を比較することによって決定される関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、２又はそれ以上のヌクレオチドあるいは２又はそれ以上のアミノ酸の間の一致度によって決定される、場合に応じて核酸分子又はポリペプチドの間の配列類縁性の程度を意味する。「同一性」は、特定数学モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって指定される、ギャップ整列（もしあれば）を伴った２又はそれ以上の配列の小さい方の間での同一一致度の割合を測定する。
【００８１】
「類似性」という用語は、当技術分野では関連する概念に関して使用される；しかしながら、「同一性」と異なって、「類似性」は、同一一致度と保存的置換一致度の両方を含む類縁性の測定を指す。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０の同一アミノ酸配列を有し、残りがすべて非保存的置換である場合は、同一性及び類似性の割合はいずれも５０％である。同じ例で、保存的置換が存在するさらに５つの位置がある場合は、同一性の割合は５０％のままであるが、類似性の割合は７５％（１５／２０）となる。それ故、保存液置換が存在する場合は、２個のポリペプチドの間の類似性の割合は、それら２個のポリペプチドの間の同一性の割合よりも高くなる。
【００８２】
関連核酸及びポリペプチドの同一性及び類似性は、公知の方法によって容易に算定することができる。そのような方法は、計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，編），１９８８年，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；バイオコンピューティング：情報科学とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ），（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，編），１９９３年，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；配列データのコンピュータ分析、パート１（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １），（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編），１９９４年，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１９８７年，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ’Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編），１９９１年，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク；Ｃａｒｉｌｌｏ等，１９８８年，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３；及びＤｕｒｂｉｎ等，１９９８年，生物学的配列分析（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに述べられているものを含むが、それらに限定されない。
【００８３】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験する配列の間に最大の一致度を与えるように設計する。同一性を決定する方法は、公的に使用可能なコンピュータプログラムの中で述べられている。２つの配列の間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ．等，１９８４年，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン大学，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，メリーランド州２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等，１９９０年，前出）から公的に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用しうる。
【００８４】
２つのアミノ酸配列を整列するために一部のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域だけのマッチングをもたらすことがあり、２つの完全長配列の間に有意の関係が存在しないにもかかわらず、この小さな整列領域は非常に高い配列同一性を有しうる。従って、一部の実施形態では、選択アラインメント法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸にわたるアラインメントを生じる。
【００８５】
例えばコンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン大学，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）を使用して、配列同一性の割合を決定しようとする２つのポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸の最適マッチング（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）のために整列する。一部の実施形態では、ギャップ開始ペナルティー（平均対角の３倍として算定される；「平均対角」は、使用する比較行列の対角の平均である；「対角」は、特定比較行列によって各々の完全なアミノ酸マッチングに与えられるスコア又は数字である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常はギャップ開始ペナルティーの１／１０である）、並びにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較行列を前記アルゴリズムと共に使用する。一部の実施形態では、標準比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列についてはＤａｙｈｏｆｆ等，１９７８年，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２；ＢＬＯＳＵＭ６２比較行列についてはＨｅｎｉｋｏｆｆ等，１９９２年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９参照）も前記アルゴリズムによって使用される。
【００８６】
一部の実施形態では、ポリペプチド配列比較のためのパラメータは、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ等（１９７０年），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較行列：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ等（１９９２年）、前出からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
を含む。
【００８７】
ＧＡＰプログラムは前記パラメータに関して有用でありうる。一部の実施形態では、前記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用したポリペプチド比較（末端ギャップについてのペナルティーを伴わない）のためのデフォルトパラメータである。
【００８８】
アミノ酸に言及するのに使用される「天然に生じる」という用語は、２０個の慣例的なアミノ酸を指す。参照してここに組み込まれる、免疫学―一合成（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），第２版，（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂとＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編），Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，マサチューセッツ州（１９９１年）参照。ペプチド類似体は、一般に製薬業界では鋳型ペプチドに類似した特性を有する非ペプチド薬剤として使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は「ペプチド模倣剤（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ、又は、ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称される。参照してここに組み込まれる、Ｆａｕｃｈｅｒｅ（１９８６年），Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；Ｖｅｂｅｒ＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５年，ＴＩＮＳ  ｐ．３９２；及びＥｖａｎｓ等（１９８７年），Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９参照。そのような化合物は、しばしばコンピュータ分子モデリングを援用して開発される。治療上有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣剤は、類似の治療又は予防作用をもたらすために使用しうる。一般に、ペプチド模倣剤は、ヒト抗体などのパラダイムペプチド又はポリペプチド（すなわち生化学特性又は薬理活性を有するペプチド又はポリペプチド）に構造的に類似するが、当技術分野で周知の方法によって、場合により−ＣＨ２−ＮＨ−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−，−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＳＯ−から選択される結合によって置換された１又はそれ以上のペプチド結合を有する。同じタイプのＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の１又はそれ以上のアミノ酸の体系的な置換（例えばＬ−リシンの代わりにＤ−リシン）が、一部の実施形態においてより安定なペプチドを生成するために使用しうる。加えて、例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、コンセンサス配列又は実質的に同一の変形コンセンサス配列を含む制約ペプチドを当技術分野で周知の方法によって生成しうる（参照してここに組み込まれる、Ｒｉｚｏ＆Ｇｉｅｒａｓｃｈ，１９９２年，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７）。
【００８９】
「標識」又は「標識された」という用語は、例えば放射性標識アミノ酸の組込み、又はマークされたアビジンによって検出できるビオチン成分（例えば、好ましくは光学的又は比色定量方法によって検出できる蛍光マーカー、化学発光マーカー又は酵素活性などの検出可能なマーカーを含むストレプトアビジン）のポリペプチドへの結合による、検出可能なマーカーの組込みを指す。一部の実施形態では、標識は治療的でもありうる。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が当技術分野において公知であり、ここで開示する方法において好都合に使用しうる。ポリペプチドについての標識の例は、以下のものを含むが、これらに限定されない：放射性同位元素又は放射性核腫（例えば３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン又はランタニド蛍光体）、酵素標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光標識、ビオチニル基などのハプテン標識、及び二次レポーターによって認識されるあらかじめ定められたポリペプチドエピトープ（例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体についての結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。一部の実施形態では、標識は、潜在的な立体障害を低減するために様々な長さのスペーサー（（ＣＨ２）ｎ［式中、ｎ＜約２０］など）によって結合される。
【００９０】
「生体試料」という用語は、生体又は以前の生体からの何らかの量の物質を含むが、これらに限定されない。そのような生体は、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ及び他の動物を含むが、これらに限定されない。そのような物質は、血液、血清、尿、細胞、器官、組織、骨、骨髄、リンパ、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、滑液マクロファージ、内皮細胞、血管組織（特に炎症血管組織）及び皮膚を含むが、これらに限定されない。「薬剤（“ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ”及び“ｄｒｕｇ”）」という用語は、患者に適切に投与したとき所望治療効果を誘導することができる化学的化合物又は組成物を指す。
【００９１】
「実質的に純粋な」及び「実質的に精製された」という用語は、存在する主要な（すなわちモルベースで組成物中の他のいかなる個別種よりも豊富である）種である化合物又は種を意味する。一部の実施形態では、実質的に精製された分画は、その種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む場合、組成物である。一部の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、その組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％以上を含む。一部の実施形態では、その組成物が基本的に単一高分子種から成る場合、その種は基本的に均一に精製されている（夾雑種は従来の検出方法によっては組成物中で検出できない）。
【００９２】
（アミノ酸）
２０個の天然に生じるアミノ酸及びそれらの略語は従来の使用法に従う。参照してここに組み込まれる、免疫学―一合成（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），第２版，（Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂとＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，編），Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，マサチューセッツ州（１９９１年）参照。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）や、−、−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸などの非天然アミノ酸、及び他の非慣例的なアミノ酸も、本発明のポリペプチドのための適切な成分でありうる。非慣例的なアミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、−カルボキシグルタメート、−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似アミノ酸及びイミノ酸（例えば４−ヒドロキシプロリン）を含む。ここで使用するポリペプチド表示法では、標準使用法及び一般慣例に従って、左側方向がアミノ末端方向であり、右側方向がカルボキシル末端方向である。
【００９３】
同様に、特に異なる記載がない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端である；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向を５’側方向と称する。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への付加の方向を転写方向と称する；ＲＮＡ転写産物の５’末端に対して５’側にある、ＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「上流配列」と称する；ＲＮＡ転写産物の３’末端に対して３’側にある、ＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域を「下流配列」と称する。
【００９４】
天然に生じるアミノ酸残基は、共通の側鎖特性に基づいてクラスに分類しうる：
１）疎水性：ノルロイシン（Ｎｏｒ又はＮｌｅ）、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００９５】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスの１つの成員と同じクラスの別の成員との交換を含む。保存的アミノ酸置換は、典型的には生体系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然に生じるアミノ酸残基を含みうる。これらは、ペプチド模倣剤及び他の逆転又は反転形態のアミノ酸成分を含む。
【００９６】
非保存的置換は、これらのクラスの１つの成員と別のクラスからの成員との交換を含みうる。そのような置換残基は、例えば非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域内、又は分子の非相同領域内に導入しうる。
【００９７】
そのような交換を行うときには、一部の実施形態によれば、アミノ酸の疎水親水指数を考慮しうる。各々のアミノ酸は、その疎水性と電荷特性に基づいて疎水親水指数が割り当てられている。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）である。
【００９８】
タンパク質に相互作用性の生物学的機能を与える上での疎水親水アミノ酸指数の重要性は当技術分野において了解されている（例えばＫｙｔｅ等，１９８２年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３１参照）。一部のアミノ酸は、類似の疎水親水指数又はスコアを有する他のアミノ酸で置換されて、なおも類似の生物活性を保持しうることが知られている。疎水親水指数に基づいて変更を行う場合、一部の実施形態では、その疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれる。一部の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、さらに一部の実施形態では、±０．５以内であるものが含まれる。
【００９９】
また、同様のアミノ酸置換は、特にそれによって創造される生物学的に機能性のタンパク質又はペプチドがここで開示する免疫学的実施形態における使用を意図されている場合、親水性に基づいて有効に実施しうることも当技術分野において了解されている。一部の実施形態では、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわちそのタンパク質の生物学的性質と相関する。
【０１００】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変更を行う場合、一部の実施形態では、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が含まれ、一部の実施形態では、±１以内であるものが含まれ、さらに一部の実施形態では、±０．５以内であるものが含まれる。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを特定しうる。これらの領域は「エピトープコア領域」とも称される。
【０１０１】
例示的なアミノ酸置換を表１に示す。
【表１】
2007525415.tif 000002
【０１０２】
当業者は、周知の手法を用いてここで述べるポリペプチドの適切な変異体を決定することができる。一部の実施形態では、当業者は、活性にとって重要でないと考えられる領域を標的することにより、活性を破壊することなく変更しうる分子の適切な領域を特定する。他の実施形態では、当業者は、類似のポリペプチド間で保存されている分子の残基及び部分を特定することができる。さらなる実施形態では、生物活性又は構造にとって重要であると考えられる領域でも、生物活性を破壊することなく又はポリペプチドの構造に有害な影響を及ぼすことなく保存的アミノ酸置換に供しうる。
【０１０３】
加えて、当業者は、活性又は構造にとって重要な類似ポリペプチド内の残基を特定する構造−機能試験を検討することができる。そのような比較を考慮して、当業者は、類似のタンパク質における活性又は構造にとって重要なアミノ酸残基に対応する、あるタンパク質内のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、そのような予測上の重要アミノ酸残基を、化学的に類似のアミノ酸置換のために選択しうる。
【０１０４】
当業者はまた、類似ポリペプチドにおいて三次元構造及びその構造に関連するアミノ酸配列を分析することができる。そのような情報に鑑みて、当業者は、その三次元構造に関して抗体のアミノ酸残基のアラインメントを予測しうる。一部の実施形態では、タンパク質の表面上にあると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与しうるので、当業者は、そのような残基に根本的な変更を加えないことを選択しうる。さらに、当業者は、各々の所望アミノ酸残基において一アミノ酸置換を含む試験変異体を生成しうる。前記変異体を、次に、当業者に公知の活性測定法を用いてスクリーニングすることができる。そのような変異体は、適切な変異体についての情報を収集するために使用しうる。例えば、特定アミノ酸残基への変更が活性の破壊、望ましくない活性低下又は不適切な活性をもたらすことが発見された場合、そのような変化を有する変異体を回避することができる。言い換えると、そのような常套的実験から収集した情報に基づいて、当業者は、単独又は他の突然変異との組合せでのさらなる置換を回避すべきアミノ酸を容易に判定することができる。
【０１０５】
多くの学術公表文献が二次構造の予測を取り上げてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６年，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：４２２−４２７；Ｃｈｏｕ等，１９７４年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−２４５；Ｃｈｏｕ等，１９７４年，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２２；Ｃｈｏｕ等，１９７８年，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８；Ｃｈｏｕ等，１９７９年，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；及びＣｈｏｕ等，１９７９年，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４参照。さらに、現在、二次構造の予測を助けるためのコンピュータプログラムが使用可能である。二次構造を予測するために１つの方法は、ホモロジーモデリングに基づく。例えば３０％超の配列同一性又は４０％超の類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、しばしば類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達は、ポリペプチド又はタンパク質構造内の潜在的な折りたたみの数を含む、二次構造の高い予測性を提供している。Ｈｏｌｍ等，１９９９年，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７：２４４−２４７参照。所与のポリペプチド又はタンパク質内には限られた数の折りたたみが存在すること、及びひとたび決定的な数の構造が解明されれば、構造予測は劇的により正確になるであろうことが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ等，１９９７年，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−３７６）。
【０１０６】
二次構造を予測するさらなる方法は、「スレッディング」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７年，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｖｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌ等，１９９６年，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ等，１９９１年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ等，１９９０年，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ等，１９８７年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：４３５５−４３５８）、及び「進化的関連」（Ｈｏｌｍ，１９９９年，ｓｕｐｒａ；及びＢｒｅｎｎｅｒ，１９９７年，ｓｕｐｒａ）を含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、抗体変異体は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較してグリコシル化部位の数及び／又はタイプが変化した、グリコシル化変異体を含む。一部の実施形態では、タンパク質変異体は、天然タンパク質よりも多い又は少ない数のＮ結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ［式中、Ｘとして表わされるアミノ酸残基は、プロリン以外のアミノ酸残基でありうる］を特徴とする。この配列を創造するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合糖鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、既存のＮ結合糖鎖を除去する。また、１又はそれ以上のＮ結合グリコシル化部位（典型的には天然に生じるもの）が排除されて、１又はそれ以上のＮ結合グリコシル化部位が創造される、Ｎ結合糖鎖の再編成が提供される。付加的な好ましい抗体変異体は、１又はそれ以上のシステイン残基が、親アミノ酸配列から欠失している又は別のアミノ酸（例えばセリン）に置換されているシステイン変異体を含む。システイン変異体は、不溶性封入体の単離後のように、抗体を生物学的に活性な立体配座にリフォールディングしなければならないときに有用であると考えられる。システイン変異体は一般に天然タンパク質よりも少ないシステイン残基を有し、典型的には非対合システインから生じる相互作用を最小限に抑えるために偶数を有する。
【０１０８】
一部の実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、及び／又は（５）そのようなポリペプチドに他の物理化学的又は機能的性質を与える又は性質を改変するものである。一部の実施形態では、天然に生じる配列（一部の実施形態では、ポリペプチドの、分子間接合を形成するドメインの外側の部分）に、単一又は多数のアミノ酸置換（一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換）を施しうる。好ましい実施形態では、保存的アミノ酸置換は、典型的には親配列の構造特性を実質的に変化させない（例えば置換アミノ酸は、親配列に生じるらせんを破壊する又は親配列を特徴付ける他の種類の二次構造を分断する傾向があってはならない）。当技術分野で認識されているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、各々が参照してここに組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，編），１９８４年，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎとＣｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．ＢｒａｎｄｅｎとＪ．Ｔｏｏｚｅ，編），１９９１年，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ニューヨーク，ニューヨーク州；及びＴｈｏｒｎｔｏｎ等（１９９１年），Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：１０５の中に述べられている。
【０１０９】
（抗体の作製）
天然に生じる抗体の構造単位は、典型的には四量体を含む。各々のそのような四量体は、２つの同一対のポリペプチド鎖から成り、各々の対は一本の完全長「Ｌ」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）と１本の完全長「Ｈ」鎖（典型的には約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を持つ。各々の鎖のアミノ末端部分は、典型的には、典型的に抗原認識の役割を担う約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各々の鎖のカルボキシ末端部分は、典型的には、エフェクター機能の責任を担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、典型的にはκ及びλ軽鎖と分類される。重鎖は、典型的にはμ、δ、γ、α又はεと分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと規定する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含むがこれらに限定されないサブクラスを有する。ＩｇＡは、同様に、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに細別される。完全長軽鎖及び重鎖内で、典型的には、約１２又はそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域が可変領域と定常領域を連結し、重鎖は約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．７，第２版，（Ｐａｕｌ，Ｗ．，編），１９８９年，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州参照（その全体が参照してここに組み込まれる）。各々の軽鎖／重鎖対の可変領域の組合せが、典型的には抗原結合部位を形成する。
【０１１０】
重鎖と軽鎖の各々の可変領域は、典型的には、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって連結された４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む同じ一般構造を示す。各々の対の２本の鎖からのＣＤＲは、典型的にはそのフレームワーク領域によって整列され、そのアラインメントが特定エピトープへの結合を可能にすると考えられる。Ｎ末端からＣ末端までに、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、典型的にはＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを含む。各々のドメインへのアミノ酸の割当ては、典型的にはＫａｂａｔ  免疫学的重要性のあるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（１９８７年及び１９９１年，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，メリーランド州）、Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７、又はＣｈｏｔｈｉａ等，１９８９年，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３の定義に従う。
【０１１１】
抗体は、モノクローナル抗体の開発と共に薬剤として有用且つ関心対象となった。モノクローナル抗体は、培養中の連続細胞系統によって抗体分子を生産する何らかの方法を用いて作製される。モノクローナル抗体を作製するための適切な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒ  らのハイブリドーマ法（１９７５年，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；及びＢｒｏｄｅｕｒ等，１９８７年，モノクローナル抗体製造の技術及び応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ），（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ニューヨーク），ｐｐ．５１−６３）を含む。
【０１１２】
モノクローナル抗体は治療薬としての使用のために修飾しうる。一例は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定種に由来する又は特定抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応配列と同一又は相同であるが、鎖の残りの部分は、別の種に由来する又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体である。他の例は、所望生物活性を示すことを条件として、そのような抗体のフラグメントである。米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ等（１９８５年），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５参照。関連する開発が「ＣＤＲ移植」抗体であり、これは、抗体が、特定種からの又は特定抗体クラス又はサブクラスに属する１又はそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むが、その抗体の残りの部分は、別の種に由来する又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体における対応配列と同一又は相同である。
【０１１３】
もう１つの開発は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野において周知である。（米国特許第５，５８５，０８９号及び同第５，６９３，７６２号参照）。一般に、ヒト化抗体は非ヒト動物によって生産され、一部のアミノ酸残基、典型的には抗体の非抗原認識部分からのアミノ酸残基を、対応するアイソタイプのヒト抗体における前記残基に相同になるように修飾される。ヒト化は、例えば当技術分野で述べられている方法（Ｊｏｎｅｓ等，１９８６年，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等，１９８８年，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，１９８８年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）を用いて、ヒト抗体の対応領域を齧歯動物可変領域の少なくとも一部で置換することによって実施できる。
【０１１４】
より新しく、より有望であるのは、抗原をヒトに接触させないヒト抗体の開発である（「完全ヒト抗体」）。内因性マウス免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体のレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を使用して、場合により担体に結合した、抗原（典型的には少なくとも６個の隣接アミノ酸を有する）での免疫によってそのような抗体が生産される。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ等，１９９３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ等，１９９３年，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ等，１９９３年，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３参照。これらの方法の一例では、マウスＨ及びＬ免疫グロブリン鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能化し、ヒト重及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノム内に挿入することによってトランスジェニック動物を作製する。次に、完全な修飾未満を有する部分的修飾動物を交雑育種して、すべての所望免疫系修飾を有する動物を得る。免疫原を投与したとき、これらのトランスジェニック動物は、可変領域を含むヒト（マウスではなく）アミノ酸配列を有するこれらの抗原に免疫特異的な抗体を生産する。参照してここに組み込まれる、国際公開第９６／３３７３５号及び同第９４／０２６０２号参照。付加的な方法は、参照してここに組み込まれる、米国特許第５，５４５，８０７号、国際公開第９１／１０７４１号、同第９０／０４０３６号、及び欧州特許第５４６０７３号及び欧州特許出願公開第５４６０７３号に述べられている。ヒト抗体はまた、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって又はここで述べるようなハイブリドーマ細胞における発現によって生産しうる。
【０１１５】
完全ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリー（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔａｌ．，１９９１年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；及びＭａｒｋｓ等，１９９１年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１に開示されているような）から作製することもできる。これらの過程は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの展示を通しての免疫選択、及びその後の、選択抗原へのそれらの結合によるファージの選択を模倣する。そのような手法の１つが、参照してここに組み込まれる、国際公開第９９／１０４９４号に述べられており、これは、そのようなアプローチを使用したＭＰＬ及びｍｓｋ受容体についての高親和性及び機能性アゴニスト抗体の単離を述べている。
【０１１６】
ひとたびそのような抗体をコードするヌクレオチド配列が決定されれば、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化、及び完全ヒト抗体も、組換え法によって作製しうる。前記抗体をコードする核酸を、当技術分野で一般的に知られる材料と手順を使用して宿主細胞に導入し、発現させる。
【０１１７】
本発明は、１又は複数のモノクローナル抗体の使用を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、重鎖及び軽鎖免疫グロブリン分子をコードするヌクレオチド配列、及び前記分子を含むアミノ酸配列、特にその可変領域に対応する配列を提供する。好ましい実施形態では、特にＣＤＲ１からＣＤＲ３までの、相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する配列が提供される。さらなる好ましい実施形態では、本発明は、そのような免疫グロブリン分子を発現するハイブリドーマ細胞系統及びそれらから生産されるモノクローナル抗体を提供する。
【０１１８】
酵母人工染色体（ＹＡＣ）においてメガ塩基サイズのヒト遺伝子座をクローニングし、再構築して、マウス生殖細胞系にそれらを導入できることは、非常に大きな又は大まかに位置づけられた遺伝子座の機能成分を解明すること並びにヒト疾患の有用なモデルを生成することへの好都合なアプローチを提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト等価物で置換するためにそのようなテクノロジーを利用することは、発生の間のヒト遺伝子産物の発現及び調節、他の系とのそれらの連絡、及び疾患の誘導と進行へのそれらの関与について固有の洞察を提供する。
【０１１９】
そのような戦略の重要な実際的適用は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、抗体のプログラムされた発現と構築の基礎となる機構並びにＢ細胞発現におけるそれらの役割を検討する好機を提供する。さらに、そのような戦略は、特に治療薬としての使用のための、完全ヒトモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の生産のソースを提供する。完全ヒト抗体は、マウス又はマウス誘導体化Ｍａｂに対する内因性の免疫原性及びアレルギー性応答を最小限に抑え、及びそれにより、治療適用において投与される抗体の効果と安全性を高めると期待される。完全ヒト抗体は、その治療が抗体の反復投与を必要とする、変形性関節症、慢性関節リウマチ及び他の炎症状態などの慢性及び再発性ヒト疾患の治療において使用できる。
【０１２０】
当業者、マウスがマウス抗体の不在下でヒト抗体を生産するように、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントを有する、マウス抗体の産生を欠損したマウス系統を工作することができる。大きなヒトＩｇフラグメントは、大きな可変遺伝子多様性並びに抗体産生と発現の適切な調節を保存しうる。抗体の多様化と選択のためのマウス機構及びヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如を利用することにより、これらのマウス系統において複製されたヒト抗体パートリーは、ヒト抗原を含むいずれの対象抗原に対しても高い親和性の抗体を生成する。ハイブリドーマテクノロジーを用いて、所望特異性を有する特異的ヒトＭＡｂを生産し、選択しうる。
【０１２１】
一部の実施形態では、当業者は、キメラ抗体を作製するためにそのようなマウスにおいてヒト可変領域と共にヒト以外の種からの定常領域を使用することができる。本発明の抗体は、そのような動物を完全長抗原又はそのフラグメントで免疫することによって作製できる。例えば、国際公開第９３／１２２２７号参照。
【０１２２】
本発明の抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲを、同じ又は別の種からのフレームワーク領域（ＦＲ）に移植することができる。一部の実施形態では、抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲをコンセンサスヒトＦＲに移植しうる。コンセンサスヒトＦＲを創造するために、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列からのＦＲを、コンセンサスアミノ酸配列を特定するように整列する。抗体重鎖又は軽鎖のＦＲを異なる重鎖又は軽鎖からのＦＲで置換することができる。抗ＩＬ−１Ｒ１抗体の重鎖及び軽鎖のＦＲ内のまれなアミノ酸は、典型的には置換せず、残りのＦＲアミノ酸は置換することができる。まれなアミノ酸は、それらが通常ＦＲ内では認められない位置にある特異的アミノ酸である。本発明の抗体からの移植可変領域は、本発明の抗体の定常領域とは異なる定常領域と共に使用できる。あるいは、移植可変領域は一本鎖Ｆｖ抗体の部分である。ＣＤＲ移植は、例えば、参照してここに組み込まれる、米国特許第６，１８０，３７０号、同第５，６９３，７６２号、同第５，６９３，７６１号、同第５，５８５，０８９号及び同第５，５３０，１０１号に述べられている。
【０１２３】
本発明の抗体は、好ましくはマウスの抗体産生細胞に挿入された実質的な部分のヒト抗体産生遺伝子座を有し、内因性マウス抗体の産生を欠損するようにさらに操作されたトランスジェニックマウスを用いて作製される。そのようなマウスはヒト免疫グロブリン分子及び抗体を生産することができ、マウス免疫グロブリン分子及び抗体を生産しないか又は実質的に低い量を生産する。この結果を達成するために試料されるテクノロジーは、本明細書の中で開示する特許、特許出願及び参考文献に開示されている。好ましい実施形態では、当業者は、参照してここに組み込まれる、国際公開第９８／２４８９３号に開示されている方法を使用しうる。また、参照してここに組み込まれる、Ｍｅｎｄｅｚ等，１９９７年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６も参照のこと。
【０１２４】
本発明のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）及び他の物質は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５年，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の標準体細胞ハイブリダイゼーション手法を含む、様々な手法によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手法が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を作製するための他の手法、例えばＢリンパ球のウイルス又は癌遺伝子形質転換が使用できる。
【０１２５】
好ましい実施形態では、再編成されていないヒト重（μ及びγ）鎖及びκ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子小遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む、「ＨｕＭａｂ」マウスと称されるマウスを、内因性μ及びκ鎖遺伝子座を不活性化する標的突然変異と共に使用して、ヒトモノクローナル抗体を作製することができる。Ｌｏｎｂｅｒｇ等，１９９４年，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９。従って、前記マウスは、マウスＩｇＭ又はκの低い発現、及び免疫に応答して、導入されたヒト重及び軽鎖導入遺伝子は高親和性ヒトＩｇＧ  κモノクローナル抗体を生成するクラス変換及び体細胞突然変異を受ける。Ｌｏｎｂｅｒｇ等、前出；ＬｏｎｂｅｒｇとＨｕｓｚａｒ，１９９５年，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；ＨａｒｄｉｎｇとＬｏｎｂｅｒｇ，１９９５年，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６。ＨｕＭａｂマウスの作製は、その内容すべてが全体として参照してここに組み込まれる、Ｔａｙｌｏｒ等，１９９２年，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ等，１９９３年，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ等，１９９４年，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ等，１９９４年，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４年，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ等，１９９４年，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ＆Ｈｕｓｚａｒ，１９９５年，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ＆Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５年，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等，１９９６年，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１の中で詳細に述べられている。さらに、そのすべての開示が全体として参照してここに組み込まれる、すべてＬｏｎｂｅｒｇとＫａｙへの米国特許第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，７８９，６５０号；同第５，８７７，３９７号；同第５，６６１，０１６号；同第５，８１４，３１８号；同第５，８７４，２９９号；及び同第５，７７０，４２９号；並びにＳｕｒａｎｉらへの米国特許第５，５４５，８０７号；１９９３年６月２４日公開の国際公開第９３／１２２７号；１９９２年１２月２３日公開の同第９２／２２６４６号；及び１９９２年３月１９日公開の同第９２／０３９１８号参照。
【０１２６】
好都合には、完全ヒトモノクローナル抗体は以下のように作製される。ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むトランスジェニックマウスを対象とする抗原で免疫する。抗体を発現するマウスからリンパ系細胞（Ｂ細胞など）を得る。そのような回収した細胞を骨髄型細胞系統と融合して不朽ハイブリドーマ細胞系統を作製し、対象抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統を特定するためにそのようなハイブリドーマ細胞系統をスクリーニングし、選択する。一部の実施形態では、対象抗原に特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統の作製が提供される。
【０１２７】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はハイブリドーマ系統によって作製される。これらの実施形態では、本発明の抗体は、典型的には約４ｐＭ−１００ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を有するそれらの関連抗原に結合する。
【０１２８】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプであり、ＩｇＧ２アイソタイプが最も好ましい。本発明の好ましい実施形態では、抗体はヒトκ軽鎖及びヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖を含む。特定実施形態では、前記抗体の可変領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプについての定常領域外の定常領域に連結される。一部の実施形態では、本発明の抗体は、哺乳動物細胞における発現のためにクローニングされた。
【０１２９】
一部の実施形態では、抗体の重及び軽鎖への保存的アミノ酸置換（及びそのコードするヌクレオチドへの対応する修飾）は、非置換抗体と類似の機能的及び化学的性質を有する抗体を生成する。これに対し、抗体の機能的及び／又は化学的性質における実質的な改変は、（ａ）例えばシート又はらせんコンフォメーションとしての、置換の領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のかさを維持すること、への作用が有意に異なる重及び軽鎖のアミノ酸配列における置換を選択することによって達成しうる。
【０１３０】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷にほとんど又は全く影響がないようなに天然アミノ酸残基を非天然残基で置換することを含みうる。さらに、ポリペプチド内の天然残基はまた、「アラニンスキャニング突然変異」（Ｗｅｌｌｓ，１９９１年，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０２：３９０（編  Ｊ．Ｊ．Ｌａｎｇｏｎｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ロンドン）について先に述べられているように、アラニンで置換しうる。
【０１３１】
所望アミノ酸置換（保存的又は非保存的）は、そのような置換を所望する時点で当業者によって決定されうる。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、抗体の重要な残基を特定するため、又はここで述べる抗体の親和性を上昇させる又は低下させるために使用できる。
【０１３２】
代替的実施形態では、本発明の抗体をハイブリドーマ細胞系統以外の細胞系統において発現させうる。これらの実施形態では、特定抗体をコードする配列を、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換のために使用できる。これらの実施形態によれば、例えばウイルス（又はウイルスベクター）にポリヌクレオチドをパッケージングし、そのウイルス（又はベクター）で宿主細胞に形質導入することを含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための公知の方法を用いて、又は当技術分野において公知の形質移入手法によって、形質転換を実施することができる。そのような手法は、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，９１２，０４０号、同第４，７４０，４６１号及び同第４，９５９，４５５号（そのすべてが参照してここに組み込まれる）によって例示されている。一般に、使用される形質転換手法は、形質転換される宿主に依存しうる。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に導入するための方法は当技術分野において周知であり、デキストランを介した形質移入、リン酸カルシウム沈降法、ポリブレンを介した形質移入、プロプラスト融合、電気穿孔、リポソーム内へのポリヌクレオチドの被包、及び核へのＤＮＡの直接微量注入を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
本発明の方法の一部の実施形態によれば、本発明の抗体の重鎖定常領域、重鎖可変領域、軽鎖定常領域又は軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準連結手法を用いて適切な発現ベクターに挿入する。好ましい実施形態では、重又は軽鎖定常領域が適切な可変領域のＣ末端に付属し、発現ベクターに連結される。ベクターは、典型的には使用する特定宿主細胞において機能性であるように選択される（すなわちベクターは、遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こりうるように宿主細胞の機構と適合性である）。発現ベクターの総説については、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編），１９９０年，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｖｏｌ．１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．ニューヨーク州．参照。
【０１３４】
典型的には、宿主細胞のいずれかにおいて使用される発現ベクターは、プラスミドの維持のため及び外来性ヌクレオチド配列のクローニングと発現のための配列を含む。一部の実施形態では集合的に「隣接配列」と称されるそのような配列は、典型的には以下のヌクレオチド配列の１又はそれ以上を含む：プロモーター、１又はそれ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、スプライス供与及び受容部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現するポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択マーカーエレメント。これらの配列の各々を以下で論じる。
【０１３５】
場合により、ベクターは、「タグ」コード配列、すなわちポリペプチドコード配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子（前記オリゴヌクレオチド配列はポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓなど）をコードする）、又は市販の抗体が存在するＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）又はｍｙｃなどのもう１つ別の「タグ」を含みうる。このタグは、典型的にはポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの抗体のアフィニティー精製又は検出のための手段として使用できる。アフィニティー精製は、例えばタグに対する抗体をアフィニティー基質として使用するカラムクロマトグラフィーによって実施できる。場合により、その後、切断のための特定ペプチダーゼを使用することなどの様々な手段によってタグを精製ポリペプチドから除去することができる。
【０１３６】
隣接配列は、同種（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は系統から）、異種（すなわち宿主細胞の種又は系統以外の種から）、雑種（すなわち２以上のソースからの隣接配列の組合せ）、合成又は天然でありうる。それ自体、隣接配列のソースは、隣接配列が宿主細胞機構において機能性であり、宿主細胞機構によって活性化されうることを条件として、いかなる原核又は真核生物、脊椎又は無脊椎動物、あるいは植物であってもよい。
【０１３７】
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当技術分野において周知のいくつかの方法のいずれかによって入手しうる。典型的には、ここで有用な隣接配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに特定されており、それ故適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適切な組織ソースから単離することができる。一部の場合には、隣接配列の完全なヌクレオチド配列が既知でありうる。この場合は、核酸合成又はクローニングについてここで述べる方法を用いて隣接配列を合成しうる。
【０１３８】
隣接配列の全部又は一部だけが既知である場合は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、及び／又はオリゴヌクレオチド及び／又は同じ又は別の種からの隣接配列フラグメントなどの適切なプローブでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって隣接配列を入手しうる。隣接配列が既知でない場合は、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントを、例えばコード配列又はさらに別の遺伝子（１又は複数）を含みうるＤＮＡのより大きな断片から単離しうる。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、それに続いて、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，カリフォルニア州）又は当業者に既知の他の方法を用いた単離によって達成しうる。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者には容易に明らかである。
【０１３９】
複製起点は、典型的には市販されている原核生物発現ベクターの一部であり、複製起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。選択ベクターが複製起点部位を含まない場合は、公知の配列に基づいて化学合成し、ベクターに連結しうる。例えばプラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，マサチューセッツ州）からの複製起点は大部分のグラム陰性菌に適しており、様々なウイルスの起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、あるいはＨＰＶ又はＢＰＶなどのパピローマウイルス）が哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターにとっては必要でない（例えばＳＶ４０起点は、ウイルス初期プロモーターも同時に含むというだけの理由でしばしば使用される）。
【０１４０】
転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結させるのに役立つ。通常、原核細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントとそれに続くポリＴ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローニングされるか又はベクターの一部として市販のものが購入されるが、ここで述べるような核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。
【０１４１】
選択マーカー遺伝子は、選択培地で増殖する宿主細胞の生存と増殖のために必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば原核生物宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリン又はカナマイシン、に対する耐性を与える；（ｂ）細胞の栄養素要求性欠損を補う；又は（ｃ）複合又は規定培地からは得られない不可欠の栄養組成物を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も、原核及び真核生物の両方の宿主細胞において選択のために使用しうる。
【０１４２】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用しうる。増幅は、増殖又は細胞の生存にとって必須のタンパク質の生産のためにより必要とされる遺伝子が、連続的な世代の組換え細胞の染色体内で一般に縦列に反復される過程である。哺乳動物細胞のための適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びプロモーターなしチミジンキナーゼを含む。哺乳動物細胞形質転換体を、形質転換体だけがベクター内に存在する選択遺伝子によって独自に生存に適応する選択圧下に置く。形質転換細胞を、培地中の選択剤の濃度を連続的に上昇させ、それによって選択遺伝子と別の遺伝子をコードするＤＮＡの両方の増幅を導く条件下で培養することによって選択圧を課す。その結果として、増幅されたＤＮＡから高い量のポリペプチドが合成できる。
【０１４３】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始のために必要であり、シャイン−ダルガーノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、典型的にはプロモーターの３’側及び発現されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。
【０１４４】
真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化を所望する場合などの、一部の場合には、グリコシル化又は収率を改善するために様々なプレ又はプロ配列を操作しうる。例えば特定シグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変化させうる、若しくは、やはりグリコシル化に影響しうるプロ配列を付加してもよい。最終タンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の第一アミノ酸に対して）、完全には除去されなかった、発現に付随する１又はそれ以上の付加的なアミノ酸を有しうる。例えば最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に認められる１又は２個のアミノ酸残基を有しうる。あるいは、一部の酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合は、わずかにトランケートされた形態の所望ポリペプチドを生じることがある。
【０１４５】
本発明の発現及びクローニングベクターは、典型的には宿主生物によって認識され、抗体をコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子（一般に約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンの上流（すなわち５’側）に位置する非転写配列である。プロモーターは、慣例的に２つのクラス：誘導的プロモーターと構成的プロモーター、の１つに分類される。誘導的プロモーターは、栄養素の存在又は不在あるいは温度変化などの培養条件の何らかの変化に応答して、それらの制御下にあるＤＮＡから高いレベルの転写を開始させる。一方、構成的プロモーターは、継続的な遺伝子産物の生産を開始させる；すなわち、遺伝子発現への制御はほとんど若しくは全く存在しない。様々な潜在的宿主細胞によって認識される数多くのプロモーターが周知である。適切なプロモーターは、ソースＤＮＡからのプロモーターを制限酵素消化によって除去し、所望プロモーター配列をベクターに挿入することにより、本発明の抗体を含む重鎖又は軽鎖をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０１４６】
酵母宿主と共に使用するための適切なプロモーターも当技術分野において周知である。酵母エンハンサーが酵母プロモーターと共に好都合に使用される。哺乳動物宿主細胞と共に使用するための適切なプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得たものを含むが、これらに限定されない。他の適切な哺乳動物プロモーターは、異種哺乳動物プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターを含む。
【０１４７】
興味深いと考えられる付加的なプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ，１９８１年，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピート内に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ等，１９８０年，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ等，１９８１年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等，１９８２年，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ等，１９７８年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等，１９８３年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５）を含むが、これらに限定されない。組織特異性を示し、トランスジェニック動物において使用されてきた、以下の動物転写制御領域も興味深い：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ等，１９８４年，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚ等，１９８６年，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６年）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７年，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ等，１９８４年，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ等，１９８７年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ系及びマスト細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ等，１９８６年，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ等，１９８７年，ＧｅｎｅｓとＤｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ等，１９８５年，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒ等，１９８７年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ等，１９８７年，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄系細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ等，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓ等，１９８６年，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳の乏突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ等，１９８７年，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５年，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；及び視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ等，１９８６年，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１４８】
エンハンサー配列は、高等真核生物による、本発明の抗体を含む軽鎖又は重鎖をコードするＤＮＡの転写を高めるために、ベクターに挿入しうる。エンハンサーは、転写を高めるようにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さの、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは比較的方向及び位置に依存しない。それらは、転写単位の５’側及び３’側で認められている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテイン及びインスリン）が知られている。典型的には、しかしながら、ウィルスのエンハンサーが使用される。当技術分野において公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが、真核生物プロモーターの活性化のための例示的なエンハンサーエレメントである。エンハンサーは核酸分子の５’側又は３’側の位置でベクターにスプライシングされうるが、典型的にはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１４９】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築しうる。そのようなベクターは、所望隣接配列の全部を含んでいてもよく又は含んでいなくてもよい。ここで述べる隣接配列の１又はそれ以上が既にベクター内に存在していない場合は、個別に入手して、ベクターに連結しうる。各々の隣接配列を得るために使用される方法は、当業者には周知である。
【０１５０】
ベクターを構築し、軽鎖又は重鎖あるいは軽鎖と重鎖をコードする核酸分子をベクターの適切な部位に挿入した後、完成したベクターを増幅及び／又はポリペプチド発現のために適切な宿主細胞に挿入しうる。抗体のための発現ベクターの、選択宿主細胞への形質転換は、形質移入、感染、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔、微量注入、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介した形質移入、又は他の公知の手法を含む、周知の方法によって実施しうる。選択される方法は、一部には使用する宿主細胞のタイプに依存する。これらの方法や他の適切な方法は当業者に周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に述べられている。
【０１５１】
宿主細胞は、適切な条件下で培養したとき、抗体を合成し、その後それを培地から（宿主細胞が抗体を培地中に分泌する場合）又はそれを生産する宿主細胞から直接（抗体が分泌されない場合）収集することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望発現レベル、活性のために望ましい又は必要なポリペプチド修飾（グリコシル化又はリン酸化など）及び生物活性分子への折りたたみの容易さなどの、様々な因子に依存する。
【０１５２】
発現のための宿主として使用可能な哺乳動物細胞系統は、当技術分野において周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、及び多くの他の細胞系統を含むがこれらに限定されない、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．）より入手可能な多くの不朽化細胞系統を含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、どの細胞系統が高い発現レベルを有し、構成的結合特性を備えた抗体を生産するかを判定することによって細胞系統を選択しうる。もう１つの実施形態では、それ自体の抗体を産生しないが、異種抗体を産生し、分泌する能力を有するＢ細胞系統からの細胞系（例えばマウス骨髄腫細胞系ＮＳ０及びＳＳＰ２／０）を選択しうる。
【０１５３】
（他の薬剤の調製）
当業者は、ここで上述した手法を用いて、ＩＬ−２７Ｒ受容体及びＷＳＸ−１の可溶性フラグメントなどの付加的な薬剤を調製することができる。さらに本発明によれば、そのような物質は、ポリマー（例えばＰＥＧ又はデキストラン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、トランスサイレチン（ＴＴＲ）、ロイシンジッパードメイン又はＦｃドメイン（これが好ましい）などの半減期延長剤に結合しうる。半減期延長剤と前記物質は、その物質のＮ又はＣ末端を通して結合しうる。好ましい半減期延長剤はＦｃドメインであり、好ましいＦｃドメインはＩｇＧ  Ｆｃドメインである。
【０１５４】
「製薬上許容される塩、エステル又は溶媒和物」は、所望薬理活性を有し、生物学的又はそれ以外でも有害ではない当技術分野該化合物の塩、エステル又は溶媒和物を指す。塩、エステル又は溶媒和物は、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチル酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、硫酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩及びウンデカン酸塩などの無機塩で形成されうる。塩基性塩、エステル又は溶媒和物の例は、アンモニウム塩；ナトリウム及びカリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム及びマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ジシクロヘキシルアミン塩などの有機塩基との塩；Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン；及びアルギニン、リシン等のようなアミノ酸との塩を含む。また、塩基性窒素含有基は、塩化、臭化及びヨウ化メチル、エチル、プロピル及びブチルなどの低級アルキルハロゲン化物；硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル及びジアミルなどのジアルキル硫酸塩；塩化、臭化及びヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリルなどの長鎖ハロゲン化物；臭化ベンジル及びフェネチルアルアルキルハロゲン化物；その他などの物質で四級化しうる。それによって水溶性又は油溶性又は分散性生成物が得られる。
【０１５５】
（発明の対象）
本発明は、免疫応答を調節するための方法及び有効量のＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドを含有する医薬組成物に関する。
【０１５６】
最近の論文は、ＩＬ−２７Ｒ及びその受容体、ＷＳＸ−１を天然ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴｈ１分化のプロモーターとして述べているが、出願人は、この受容体を通してのシグナル伝達はＴ細胞活性の強度と期間を制限することに関与すると判定した。ＷＳＸ−１欠損マウスを細胞内病原体、トキソプラズマ原虫に感染させたとき、前記マウスは、炎症性サイトカインの産生と寄生生物複製の抑制によって特徴付けられる、防御的Ｔ細胞応答を確立する。しかし、感染ＷＳＸ−１−／−マウスはこれらの防御応答を下方調節することができず、致死的なＴ細胞媒介性炎症性疾患を発現する。この病理は、インビボでのＩＦＮ−＿の過剰産生、Ｔ細胞高度活性化の持続及びＴ細胞増殖亢進によって特徴付けられた。合わせて考えると、これらの所見は、ＷＳＸ−１がこの寄生生物感染に対するＩＦＮ−γ媒介性免疫の生成には必要でないことを明らかにし、Ｔ細胞媒介性免疫機能亢進の強力なアンタゴニストとしてのこの受容体の新しい機能を特定する。
【０１５７】
これまでの合意理解に反して、我々は、トキソプラズマ原虫に感染したＷＳＸ−１欠損マウスは、強力なＴｈ１型応答を発現し、寄生生物複製を制御することができるが、この防御応答を下方調節することができず、致死的なＴ細胞媒介性炎症性疾患を発現することを明らかにした。この病理は、インビボでのＩＦＮ−γの過剰産生、Ｔ細胞高度活性化の持続及びＴ細胞増殖亢進によって特徴付けられた。その表現型は、増殖とＩＦＮ−γ分泌の上昇を導くＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１極性化としてインビトロで再現することができた。しかし、この作業はまた、非極性化条件下で、ＷＳＸ−１が最適ＩＦＮ−γ産生のために必要であることを確認した。さらなる分析は、外来性ＩＬ−２７が、伝統的に細胞活性化に結び付けられてきたが、最近になって免疫機能の阻害にも関連付けられたＳＴＡＴファミリー成員：ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５を活性化できることを明らかにした。合わせて考えると、これらの所見は、ＷＳＸ−１がトキソプラズマ原虫に対するＩＦＮ−γ媒介性免疫の生成には必要でないことを明らかにし、Ｔ細胞媒介性免疫機能亢進の強力なアンタゴニストとしてのＷＳＸ−１の新規機能を特定する。
【０１５８】
細胞内病原体への抵抗性におけるＩＬ−１２の重要性を考慮して、出生前乳児及び免疫無防備状態成人の重要な日和見病原体である偏性細胞内寄生生物、トキソプラズマ原虫に対する免疫におけるＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の役割を調べるための実験を実施した。この病原体に対する抵抗性は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生によって支配されるＩＬ−１２依存性Ｔｈ１型応答の発現を特徴とする。強力な防御応答は寄生生物複製の抑制をもたらすが、この応答を適切に調節できないことから、炎症性サイトカインの過剰産生によって特徴付けられる重篤なＣ細胞媒介性免疫疾患を導きうる。
【０１５９】
（本発明の方法）
主として、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１受容体−リガンド相互作用がＩＦＮ−γ産生を上昇させうることを示したインビトロ実験に基づき、ＷＳＸ−１がＴｈ１型応答の発現のために必須の受容体であるというコンセンサスが生じた。しかし、本発明の開示は、トキソプラズマ症又はインビトロ培養の間に起こる強いＴｈ１極性化条件下で、ＷＳＸ−１はＴｈ１エフェクター細胞の発現のために必要ではないことを明らかにする。意外にも、トキソプラズマ原虫によるＷＳＸ−１欠損マウスの感染を通して、我々はこの受容体についての調節的役割を見出した。ＷＳＸ−１−／−動物は、持続的なＩＦＮ−γ応答及びＴ細胞増殖亢進に結びつく高度活性化Ｔ細胞の蓄積を示す。
【０１６０】
抗原用量及びサイトカイン環境が、天然ＣＤ４＋Ｔ細胞のエフェクターＴｈ１及びＴｈ２細胞への分化における決定的な因子であることは広く確立されている。さらに、Ｔ細胞は、エフェクター機能を獲得するだけでなく、活性化を抑制し、それによって免疫応答の期間と強度を制限するためにも増殖しなければならない。
【０１６１】
Ｔ細胞分化におけるＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の役割は、これまでに極性化サイトカインと組み合わせたＣｏｎＡを用いて評価されているので、これらの細胞の増殖亢進が短縮されたサイトカイン産生を導き、それが次にＴｈ１分化の欠損として解釈されるということは可能である。我々はここで、高度極性化条件下でＴＣＲ連結を通してＴ細胞が活性化されるとき、Ｔｈ１型応答の負の調節因子としてのＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の重要な役割が存在することを示す。これらの所見は、ＩＬ−２７のＥＢＩ３成分を持たないマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞が、インビトロでそれらの野生型対応物よりも有意に多くのＩＦＮ−γを産生したという最近の報告と一致する。ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞が、Ｔｈ１エフェクター細胞になるための能力に内因性の欠陥を有していないことは明らかであるが、組換え型ＩＬ−２７は、天然Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を上昇させるためにＩＬ−１２と相乗作用しうることが報告された。それ故、ＩＬ−２７がＳＴＡＴ−１を活性化し、それによってＴｈ１分化におけるキー転写因子、Ｔ−ｂｅｔの発現を誘導する能力は、極性化サイトカインの濃度が制限されているとき、最大Ｔｈ１分化のために決定的に重要でありうる（図６Ａ）。しかし、急性トキソプラズマ症によって誘導されるような高いＩＬ−１２濃度に関しては、Ｔ−ｂｅｔのＩＬ−２７誘導性発現の必要は存在せず、それ故トキソプラズマ原虫の抑制のために必須であるＩＦＮ−γ応答の発現において、ＩＬ−２７ではなくＩＬ−１２の中心的な役割を確認する。
【０１６２】
感染の間に、病原体抑制後にＴ細胞応答を下方調節する能力は、適切な免疫応答の重要な機能であるが、この過程を媒介する機構についてはほとんど知られていない。我々の研究では、ＩＬ−１２又はＩＬ−２７のいずれかによる天然細胞の処置後に、ＳＴＡＴ４リン酸化は検出できなかった。天然ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上に機能性ＩＬ−１２Ｒが存在しないことは、このアッセイにおけるＩＬ−１２の相対的不活性を説明するが、天然ヒトリンパ球におけるＷＳＸ−１シグナル伝達に関する最近の報告は、機能性受容体発現にもかかわらず、ＩＬ−２７はＳＴＡＴ４を活性化できないことを示唆する。さらに、この所見は、外来性ＩＬ−２７がＷＳＸ−１形質移入マウス細胞系においてＳＴＡＴ４リン酸化を導かないことを示すこれまでの研究と一致する。それでもやはり、ＷＳＸ−１がＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５を活性化できるという認識は、Ｔ細胞応答の負の調節に関与する経路についての洞察を提供する。これらのＳＴＡＴファミリー成員のチロシンリン酸化はこれまで免疫細胞の活性化と関連付けられてきたが、それらはまた、免疫機能亢進を防ぐ上でも重要な役割を有することが明らかになりつつある。ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α／β及びＩＬ−６のようなサイトカインは類似のＳＴＡＴ経路を活性化し、免疫応答に強い抑制作用を及ぼすことができる。これらの抑制過程を支配する分子機構についてはほとんど知られていないが、いくつかの試験は、ＳＴＡＴ１が増殖及びＴｈ１細胞によるＩＦＮ−γ産生の負の調節因子であることを示した。加えて、骨髄造血前駆細胞におけるＳＴＡＴ３の除去は、マウスにおける免疫介在大腸炎の発症を引き起こす一方、ＳＴＡＴ３βイソフォームの生殖細胞の除去は、ＬＰＳ誘導型ショックからの回復を低下させる。したがって、ＩＬ−２７を介したＳＴＡＴ活性化が存在しないことは、トキソプラズマ原虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスにおいて認められるＴ細胞機能亢進についての分子機構を提供しうる。しかし、ＷＳＸ−１依存性ＳＴＡＴ活性化がＴ細胞応答を直接阻止できるのかどうか、又はＳＯＣＳファミリー成員などの他のトランス作用性因子を通して、エフェクターＴ細胞が増殖及び生存刺激に対して応答する能力を制限するように働くのかどうかはまだ不明である。ＳＯＣＳ１欠損マウスは、トキソプラズマ原虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスと同様の重度の肝疾患を自然に発現するが、初期試験は、ＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞によるＳＯＣＳ１のインビトロ発現低下を明らかにしなかった。
【０１６３】
クルーズトリパノソーマによるＷＳＸ−１−／−マウスの感染も免疫疾患の発症をもたらすので、Ｔ細胞応答の下方調節におけるＷＳＸ−１の役割はトキソプラズマ症に限定されないと思われる。他の研究も、ＷＳＸ−１−／−マウスが腸内蠕虫、ネズミ鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ  ｍｕｒｉｓ）に感染したとき、寄生生物の排除亢進に結びつく過大のＴｈ２応答を発現することを認めている（未公表データ）。その結果、Ｌ．ｍａｊｏｒに対するＷＳＸ−１−／−マウスの高い感受性についてのこれまでの報告を単にＴｈ１応答の生成不能に帰することはできない。抵抗性マウス系統は、Ｌ．ｍａｊｏｒで攻撃誘発したとき急性Ｔｈ２応答を生じるので、ＷＳＸ−１依存性のＳＴＡＴ−１活性化の不在と組み合わせた、この急性ＩＬ−４産生を調節する能力の欠如は、防御的Ｔｈ１型細胞の初期生成を阻害し、それによってＷＳＸ−１−／−マウスにおける疾患消散を遅延させうる。この仮説の裏づけとして、ＩＬ−４のインビボでの中和は、Ｌ．ｍａｊｏｒを抑制するＷＳＸ−１−／−マウスの能力を回復することが認められ、これらの実験において、ＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞は、同様に処置した野生型マウスよりも多くのＩＦＮ−γを産生することが認められた（未公表データ）。
【０１６４】
合わせて考えると、この研究は、ＷＳＸ−１の１つの役割は、免疫応答の極性化ではなくその反応速度を制御することであること、及びこの受容体を通してのシグナル伝達は、感染誘導性Ｔ細胞エフェクター機能の一般的な負の調節因子として働きうることを指示する。その結果、Ｔ細胞機能亢進の抑制におけるＷＳＸ−１の役割についての我々の測定は、Ｔ細胞媒介性炎症性疾患に関する直接の臨床的意味を有しており、免疫に基づく療法のための新しい標的である。
【０１６５】
免疫応答を調節する上でのＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１相互作用の重要性をさらに明らかにするため、我々は、腸内生息蠕虫、ネズミ鞭虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスのＴヘルパー（Ｔｈ）２型免疫応答の発現を示した。野生型マウスと異なり、ＷＳＸ−１−／−マウスは、Ｔｈ２サイトカインの産生上昇、腸杯細胞及びマスト細胞応答の上昇、及びネズミ鞭虫の排除促進を示した。マスト細胞はまた、ＷＳＸ−１を発現することが示され、ＩｇＥを介したマスト細胞依存性アナフィラキシーのモデルにおいてＷＳＸ−１−／−マウスは血管透過性の大きな変化を示した。重要な点として、ＷＳＸ−１−／−マウスにおける寄生生物誘導性Ｔｈ２応答の促進は、野生型マウスにおけるＴｈ１応答の遮断がＴｈ２応答の増強又はネズミ鞭虫に対する抵抗性をもたらさなかったことから、ＩＦＮ−γ産生の内因性欠損によるものではないと思われた。さらに、インビトロアッセイは、Ｔｈ２極性化条件下で刺激した未処置ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞が、野生型細胞と比較して増殖亢進及びＩＬ−５及びＩＬ−１３の高いレベルの分泌を示すことを明らかにし、そして外来性ＩＬ−２７が、野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−４の産生を抑制することが示された。
【０１６６】
上記で述べたように、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１が最適Ｔｈ１型応答のために必要であるという初期合意は、ＷＳＸ−１−／−マウスが、低いＩＦＮ−γ応答の結果としてネズミ鞭虫に対してより抵抗性であるという仮説を導いた。実際に、ＷＳＸ−１−／−マウスがネズミ鞭虫に対して高い抵抗性を示すという所見がこの仮説を裏付けた。しかし、ＷＳＸ−１−／−マウスはＩＦＮ−γ産生の早発性欠損を有していないと思われたので、野生型マウスにおけるＴｈ１応答の遮断は抵抗性上昇をもたらさないという所見は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１シグナル伝達がＴｈ２応答の阻害に関与することを示唆した。さらに、インビトロでのＴｈ２極性化条件下で、ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ２サイトカインの産生上昇を示し、一方ＩＬ−２７は野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＬ−４の産生を下方調節することができ、Ｔｈ２細胞応答の負の調節因子としてＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の直接の役割を裏付けた。
【０１６７】
これまでの研究は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１相互作用が非極性化条件下でＩＦＮ−γの産生を促進しうることを示したが、ここで提示する結果は、インビトロ及びインビボでＴｈ２応答の発現を調節する上でのＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の役割を特定する。これらのデータは、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１シグナル伝達の不在下でのＴｈ２型応答の上昇を明らかにした多様な実験系における試験と一致する。加えて、最近の試験は、ＩＬ−２７が、Ｔｈ２応答の発現のために必須の転写因子であるＧＡＴＡ３についてのｍＲＮＡのレベルを下方調節できることを示したが、これがＩＬ−２７の直接の作用であるのか又は他の阻害作用の二次的な結果であるのかは不明のままである。これらの実験系の一部においては、これらの作用はこれまでＩＦＮ−γ応答の低下に帰せられてきたが、ここで提示するデータは、２型免疫の調節におけるＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の役割の再評価を促す。例えばＬｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ感染に対するＷＳＸ−１−／−マウスの感受性上昇は、単にこれまでに報告されているようなＩＦＮ−γ産生の欠損によるものではなく、ＷＳＸ−１の不在下でのＴｈ２サイトカイン応答亢進の結果でもあると考えられる。この仮説の裏づけとして、Ｌ．ｍａｊｏｒに感染したＷＳＸ−１−／−マウスにおけるインビボでのＩＬ−４の枯渇は、ＩＦＮ−γ産生及び防御免疫を回復させた。
【０１６８】
ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に関する現在までの大部分の研究は、リンパ球機能の調節におけるこのサイトカイン／受容体相互作用の役割に集中してきたが、マスト細胞が高レベルのＷＳＸ−１を発現することができ、ＩＬ−２７に応答できるという所見は予想外であった。しかし、今や、他の細胞型が機能性ＩＬ−２７Ｒを発現することが明らかになりつつある；マクロファージ、樹状細胞並びにマスト細胞がこの受容体を発現すること、及び一次ヒトマスト細胞はＩＬ−２７に応答してＳＴＡＴ３を活性化できることが報告された。受身皮膚アナフィラキシーのモデルにおいてＷＳＸ−１不在下でマスト細胞応答が増強されるという所見は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１相互作用が、多数の細胞型において免疫活性を下方調節するための一般的な機構を提供しうることを明らかにする。我々のデータは、Ｔｈ２応答の阻害におけるＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の直接の役割を指示するが、これまでの試験は、マスト細胞がＩＬ−４を産生する能力が感染誘導性Ｔｈ２応答の発現に寄与することを明らかにしている。
【０１６９】
ＷＳＸ−１−／−マウスが、強力な１型免疫を誘導する２つの寄生生物、トキソプラズマ原虫又はクルーズトリパノソーマに感染したとき、免疫を介した慢性炎症を発現するという所見は、ここで開示する他の研究と共に、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１が病原体誘導性Ｔｈ１及びＴｈ２型応答に阻害作用を及ぼすという概念を裏付ける。それ故、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１シグナル伝達は活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に負の調節シグナルを送達し、それによってＴ細胞応答を制限することができると思われる。ＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞のそのような増殖応答亢進は、細胞生存率上昇、細胞周期進行の促進、又はＩＬ−２のような増殖因子に対する感受性上昇の相関的要素でありうる。しかし、我々の試験は、ＩＬ−２７がＴ細胞増殖を阻害しないことを認め、ＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞の増殖応答亢進とｒＩＬ−２７の作用との間の相違についての根拠は不明である。作用機構についての特定の理論に縛られずに、１つの可能な説明は、異なるＩＬ−２７Ｒ成分が異なる機能活性を媒介すること、又はＴ細胞増殖の調節に関与する付加的なリガンドが存在することであると考えられる。インビボでのＴｈ２応答の抑制におけるＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１相互作用の役割の特定は、この経路が、喘息、アレルギー及び自己免疫を含む、Ｔｈ２サイトカイン産生異常に関連する多くの炎症状態の治療のための実現可能な治療標的であることを明らかにする。
【０１７０】
合わせて考慮すると、これらの試験は、Ｔｈ２型応答の生得的及び適応性成分に関連する種々の要素を制限する上での、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１のさらなる新しい役割を明らかにする。そこで我々は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１相互作用が、付加的に、Ｔｈ２型応答に関連する炎症状態の治療のための標的であることを示した。
【０１７１】
それ故、本発明は、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物において免疫応答を調節するための方法に関する。
【０１７２】
もう１つの態様では、前記調節は抑制であり、前記リガンドはＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アゴニストである。
【０１７３】
もう１つの態様では、前記アゴニストは、ＩＬ−２７、ＩＬ−２７の活性フラグメント、及びＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を増強するＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアゴニスト抗体から成る群より選択される。
【０１７４】
もう１つの態様では、前記調節は活性化であり、前記リガンドはＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アンタゴニストである。
【０１７５】
もう１つの態様では、前記アンタゴニストは、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１結合親和性を保持する不活性ＩＬ−２７フラグメント、又はＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を抑制する、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアンタゴニスト抗体である。
【０１７６】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてＴ細胞媒介性免疫応答を調節するための方法に関する。
【０１７７】
もう１つの態様では、前記調節は抑制であり、前記リガンドはＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アゴニストである。
【０１７８】
もう１つの態様では、前記アゴニストは、ＩＬ−２７、ＩＬ−２７の活性フラグメント、及びＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を増強するＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアゴニスト抗体から成る群より選択される。
【０１７９】
もう１つの態様では、前記調節は活性化であり、前記リガンドはＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アンタゴニストである。
【０１８０】
もう１つの態様では、前記アンタゴニストは、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１結合親和性を保持する不活性ＩＬ−２７フラグメント、又はＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を抑制する、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアンタゴニスト抗体である。
【０１８１】
もう１つの態様では、前記ヘルパーＴ細胞はＴｈ１である。
【０１８２】
もう１つの態様では、前記ヘルパーＴ細胞はＴｈ２である。
【０１８３】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてインターフェロン−γ媒介性免疫応答を調節するための方法に関する。
【０１８４】
もう１つの態様では、前記調節は抑制であり、前記リガンドはＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アゴニストである。
【０１８５】
もう１つの態様では、前記アゴニストは、ＩＬ−２７、ＩＬ−２７の活性フラグメント、及びＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を増強するＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアゴニスト抗体から成る群より選択される。
【０１８６】
もう１つの態様では、前記調節は活性化であり、前記リガンドはＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１アンタゴニストである。
【０１８７】
もう１つの態様では、前記アンタゴニストは、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１結合親和性を保持する不活性ＩＬ−２７フラグメント、又はＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１活性を抑制する、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１に対するアンタゴニスト抗体である。
【０１８８】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物において免疫機能亢進を治療するための方法に関する。
【０１８９】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物において免疫機能亢進疾患を治療するための方法に関する。
【０１９０】
もう１つの態様では、前記免疫疾患は、自己免疫疾患、過敏性疾患、アレルギー及び喘息から成る群より選択される。
【０１９１】
もう１つの態様では、前記免疫疾患は、後天性免疫不全症候群；急性膵炎；アジソン病；アルコール性肝硬変を含むアルコール誘導性肝損傷；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性脈管炎；自己免疫性肝炎誘導性肝損傷；胆汁性肝硬変；ＡＩＤＳ誘導性悪液質を含む、悪液質／食欲不振；多発性骨髄腫及び骨髄性白血病及び他の白血病などの癌、並びに腫瘍転移；慢性疲労症候群；クロストリジウム菌関連性下痢を含むクロストリジウム菌関連疾患；鬱血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全及び冠状動脈バイパス移植を含む、冠状動脈状態及び徴候；若年発症１型糖尿病、真性糖尿病及びインスリン抵抗性を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連状態；精巣上体炎；エリスロポエチン抵抗性；発熱；線維筋痛又は痛覚消失症；糸球体腎炎；対宿主性移植片病／移植片拒絶反応；グレーブス病；ギラン−バレー症候群；橋本病；溶血性貧血；出血性ショック；痛覚過敏；潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患；変形性関節症、慢性関節リウマチ、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患合併関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘導性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛、及び巨細胞性動脈炎を含む、関節の炎症状態及びリウマチ性疾患；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；炎症性腸疾患；脳虚血を含む虚血；川崎病；記憶障害；肺疾患；ループス腎炎；多発性硬化症；重症筋無力症；筋障害性神経炎症性疾患；神経毒性；眼変性及びブドウ膜炎を含む眼疾患及び状態；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；天疱瘡；歯周病；毛孔性紅色粃糠疹；早産；前立腺炎及び関連状態；乾癬及び関連状態；乾癬性関節炎；肺線維症；再灌流損傷；リウマチ熱；慢性関節リウマチ；サルコイドーシス；強皮症；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；シェーグレン症候群、睡眠障害；脊椎関節症；全身性エリテマトーデス；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷及び整形外科手術から生じる炎症状態；移植片拒絶反応；ブドウ膜炎；脈管炎；あるいは挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患過程から生じる炎症状態、から成る群より選択される。
【０１９２】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてヘルパーＴ細胞媒介性疾患を治療するための方法に関する。
【０１９３】
もう１つの態様では、前記ヘルパーＴ細胞媒介性疾患は、後天性免疫不全症候群；急性膵炎；アジソン病；アルコール性肝硬変を含むアルコール誘導性肝損傷；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症；喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；自己免疫性脈管炎；自己免疫性肝炎誘導性肝損傷；胆汁性肝硬変；ＡＩＤＳ誘導性悪液質を含む、悪液質／食欲不振；多発性骨髄腫及び骨髄性白血病及び他の白血病などの癌、並びに腫瘍転移；慢性疲労症候群；クロストリジウム菌関連性下痢を含むクロストリジウム菌関連疾患；鬱血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全及び冠状動脈バイパス移植を含む、冠状動脈状態及び徴候；若年発症１型糖尿病、真性糖尿病及びインスリン抵抗性を含む糖尿病；子宮内膜症、子宮内膜炎及び関連状態；精巣上体炎；エリスロポエチン抵抗性；発熱；線維筋痛又は痛覚消失症；糸球体腎炎；対宿主性移植片病／移植片拒絶反応；グレーブス病；ギラン−バレー症候群；橋本病；溶血性貧血；出血性ショック；痛覚過敏；潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む炎症性腸疾患；変形性関節症、慢性関節リウマチ、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患合併関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば川崎病）、脳血管炎、ライム病、ブドウ球菌誘導性関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛、及び巨細胞性動脈炎を含む、関節の炎症状態及びリウマチ性疾患；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；例えば角膜移植に関連しうるような、炎症性眼疾患；炎症性腸疾患；脳虚血を含む虚血；川崎病；記憶障害；肺疾患；ループス腎炎；多発性硬化症；重症筋無力症；筋障害性神経炎症性疾患；神経毒性；眼変性及びブドウ膜炎を含む眼疾患及び状態；骨粗鬆症；癌関連疼痛を含む疼痛；パーキンソン病；天疱瘡；歯周病；毛孔性紅色粃糠疹；早産；前立腺炎及び関連状態；乾癬及び関連状態；乾癬性関節炎；肺線維症；再灌流損傷；リウマチ熱；慢性関節リウマチ；サルコイドーシス；強皮症；敗血症性ショック；放射線療法からの副作用；シェーグレン症候群、睡眠障害；脊椎関節症；全身性エリテマトーデス；顎関節疾患；甲状腺炎；組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷及び整形外科手術から生じる炎症状態；移植片拒絶反応；ブドウ膜炎；脈管炎；あるいは挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患過程から生じる炎症状態、から成る群より選択される。
【０１９４】
本発明はさらに、ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量を、その必要のある動物に投与することを含む、その必要のある動物においてヘルパーＴ細胞媒介性疾患を調節するための方法に関する。
【０１９５】
もう１つの態様では、前記ヘルパーＴ細胞はＴｈ１である。
【０１９６】
もう１つの態様では、前記ヘルパーＴ細胞はＴｈ２である。
【０１９７】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、免疫反応性亢進を治療する方法に関する。
【０１９８】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０１９９】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２００】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２０１】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２０２】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、極性化Ｔ細胞を抑制する方法に関する。
【０２０３】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２０４】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２０５】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２０６】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２０７】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、Ｔｈ１媒介性疾患を治療する方法に関する。
【０２０８】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２０９】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２１０】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２１１】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２１２】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、Ｔｈ２媒介性疾患を治療する方法に関する。
【０２１３】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２１４】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２１５】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２１６】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２１７】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、ＩＦＮ−γ媒介性疾患を治療する方法に関する。
【０２１８】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２１９】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２２０】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２２１】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２２２】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、ＩｇＥ媒介性疾患を治療する方法に関する。
【０２２３】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２２４】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２２５】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２２６】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２２７】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、喘息を治療する方法に関する。
【０２２８】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２２９】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２３０】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２３１】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２３２】
本発明はさらに、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質の有効量を投与することを含む、アレルギーを治療する方法に関する。
【０２３３】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２３４】
もう１つの態様では、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２３５】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２３６】
もう１つの態様では、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２３７】
（本発明の医薬組成物）
本発明はまた、
（ｉ）式Ｉの化合物の有効量；及び
（ｉｉ）製薬上許容される担体
を含有する医薬組成物に関する。
【０２３８】
もう１つの態様では、医薬組成物は、
（ｉ）ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドの有効量；及び
（ｉｉ）製薬上許容される担体
を含有する。
【０２３９】
もう１つの態様である、請求項２８の医薬組成物において、前記ＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドは、ＷＳＸ−１活性を上昇させる物質である。
【０２４０】
もう１つの態様である、請求項２９の医薬組成物において、前記物質は、ＩＬ−２７又はその活性フラグメントを含む。
【０２４１】
もう１つの態様である、請求項２９の医薬組成物において、前記物質は、ＷＳＸ−１上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２４２】
もう１つの態様である、請求項２８の医薬組成物において、前記物質は、ＩＬ−２７Ｒ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２４３】
もう１つの態様である、請求項２８の医薬組成物において、前記物質は、ＩＬ−２７ＲＰＰ上のエピトープに結合するアゴニスト抗体を含む。
【０２４４】
本発明の新規医薬組成物は、前述した活性物質の治療上有効な量を含む。この有効量は、一般に１日につき患者の体重キログラム当り活性物質約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇを含む。この有効量は、患者の身体状態及び当技術分野で周知の他の因子に依存して変化しうる。さらに、活性物質のこの用量は、所望治療効果を与えるために単回又は多回投与単位として投与することができる。所望する場合は、他の治療薬を本発明によって提供されるものと同時に使用することができる。
【０２４５】
本発明の化合物は、好ましくは製薬上許容される担体によって患者に送達される。そのような担体は当技術分野において周知であり、一般に固体又は液体形態である。本発明に従って調製しうる固体形態の医薬製剤は、粉末剤、錠剤、分散性顆粒、カプセル、カシェ剤及び坐薬を含む。一般に、固体形態の製剤は約５重量％〜約９０重量％の活性物質を含有する。
【０２４６】
好ましい実施形態では、本発明はまた、本発明の１又は複数の抗体又は他の物質の治療上有効な量を、製薬上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤及び／又はアジュバントと共に含有する医薬組成物を提供する。好ましくは、許容される製剤材料は、使用される用量及び濃度で受容者に非毒性である。好ましい実施形態では、治療上有効な量の抗ＩＬ−１Ｒ１抗体を含有する医薬組成物が提供される。
【０２４７】
一部の実施形態では、前記医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出の速度、吸着又は浸透を改変する、維持する又は保存するための製剤材料を含みうる。そのような実施形態において、適切な製剤材料は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸など）；容積補助剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；ニ糖類；及び他の糖質（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色料、着香料及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トリメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性促進剤（スクロース又はソルビトールなど）；張度促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又はカリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達媒体；希釈剤；賦形剤及び／又は製薬佐剤を含むが、これらに限定されない。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，編），１９９０年，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ参照。
【０２４８】
固体担体は、希釈剤、着香料、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤又は錠剤崩壊剤としても働きうる１又はそれ以上の物質である；被包材料でもありうる。粉末剤では、担体は、粘性活性化合物と混和されている、微細に分割された固体である。錠剤では、活性化合物を、適切な割合で必要な結合特性を有する、所望の形状と大きさに圧縮された担体と混合する。適切な固体担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、滑石、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ろう、ココアバター等を含む。「製剤」という用語は、その中で有効成分が（他の担体と共に又は他の担体なしで）担体によって取り囲まれており、それ故有効成分が担体と結合しているカプセルを提供しうる担体として、被包材料を有する活性化合物の製剤を包含することが意図されている。同様に、カシェ剤が包含される。錠剤、粉末剤、カシェ剤及びカプセルは、経口投与に適した固体投与形態として使用できる。便利さ又は患者の受け入れやすさの理由から所望する場合は、本発明に従って調製される医薬錠剤は、当技術分野で周知の手法を使用して、チュアブル形態として提供されうる。
【０２４９】
坐薬を調製するには、最初に脂肪酸グリセリドの混合物又はココアバターなどの低融点ろうを溶融し、攪拌することなどによって有効成分をその中に均質に分散させる。次に溶融した均質な混合物を都合のよい大きさの鋳型に注ぎ入れ、放置して冷却させ、それによって凝固させる。
【０２５０】
液体形態の製剤は、溶液、懸濁液及び乳剤を含む。一例として、非経口注射用の水又は水／プロピレングリコール溶液が挙げられる。液体製剤はまた、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液として製剤することができる。経口使用に適する水溶液は、有効成分を水に溶解し、所望に応じて適切な着色料、着香料、安定剤及び増粘剤を添加することによって製剤できる。経口使用に適する水性懸濁液は、微細に分割された有効成分を、粘性物質、すなわち天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び他の周知の懸濁化剤と共に水に分散することによって作製できる。液体医薬製剤は、１００重量％までの当該活性物質を含有しうる。
【０２５１】
一部の実施形態では、医薬製剤中の主要媒体又は担体は、水性又は非水性のいずれでもよい。例えば適切な媒体又は担体は、おそらく非経口投与用の組成物に共通する他の物質を補足した、注射用蒸留水、生理食塩水又は人口脳脊髄液でありうる。中性緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合した食塩水はさらなる例示的媒体である。好ましい実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液又は約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトール又はその適切な代替物をさらに含みうる。本発明の一部の実施形態では、組成物は、所望の純度を有する選択組成物を任意の製剤物質と混合することによって凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で保存用に製剤しうる。（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，第１８版（１９９０年，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ１８０４２）。さらに、一部の実施形態では、前記生成物を、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤しうる。
【０２５２】
また、使用の直前に、経口又は非経口投与用の液体形態製剤に変換することが意図された固体形態製剤も適切な担体として考慮される。そのような液体形態は、溶液、懸濁液及び乳剤を含む。これらの特定固体形態製剤は、単位投与形態として最も好都合に提供され、それ自体で、単一液体投与単位を提供するために使用される。あるいは、液体形態への変換後、注射器、茶さじ又は他の計量容器であらかじめ定められた用量の液体形態製剤を測定することによって多数の個別液体用量が得られるように、十分な固体が提供されうる。多数の液体容量がそのようにして調製されるとき、起こりうる分解を遅延させるために前記液体用量の未使用部分を低温に（すなわち冷蔵下に）維持することが好ましい。液体形態に変換することを意図された個体形態製剤は、活性物質に加えて、着香料、着色料、安定剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含みうる。有用な液体形態製剤を調製するために使用される液体は、水、等張水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール等、並びにそれらの混合物でありうる。当然ながら、使用される液体は投与経路に応じて選択される。例えば多量のエタノールを含む液体製剤は非経口使用に適さない。
【０２５３】
医薬製剤はまた、単位投与形態でありうる。そのような形態では、製剤は適切な量の有効成分を含む単位用量に細分される。単位投与形態は、包装された製剤、別々に分けられた量の製剤を含む包装、例えば包装された錠剤、バイアル又はアンプル中のカプセル及び粉末でありうる。単位投与形態はまた、カプセル、カシェ剤又は錠剤自体であるか、又は包装された形態の、適切な数のこれらのいずれかでありうる。
【０２５４】
本発明の医薬製剤は、安息香酸、ソルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン及びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの、当技術分野で周知の１又はそれ以上の防腐剤を含みうる。防腐剤は一般に、医薬組成物の約１重量％まで、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の量で存在する。
【０２５５】
本発明のための有用な緩衝剤は、医薬組成物の約１重量％まで、好ましくは約０．０５〜約０．５重量％の量のクエン酸−クエン酸ナトリウム、リン酸−リン酸ナトリウム及び酢酸−酢酸ナトリウムを含む。有用な懸濁化剤又は増粘剤は、医薬組成物の約２０重量％まで、好ましくは約１重量％〜約１５重量％の量の、メチルセルロースのようなセルロース、アルギン酸及びその誘導体のようなカラゲナン、キサンタンガム、ゼラチン、アカシア及び微結晶セルロースを含む。
【０２５６】
使用しうる甘味料は、当技術分野で周知の、天然及び人工甘味料を含む。キシロース、リボース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、デキストロース、スクロース、マルトース、部分加水分解デンプン又はトウモロコシシロップ固体などの単糖類、ニ糖類及び多糖類、及びソルビトール、キシリトール、マンニトール及びそれらの混合物などの糖アルコールのような甘味料は、医薬組成物の約１０重量％〜約６０重量％、好ましくは約２０重量％〜約５０重量％の量で使用しうる。サッカリン及びナトリウム又はカルシウムなどのサッカリン塩、シクラミン酸塩、アセスルファーム−Ｋ、アスパルテーム等及びそれらの混合物のような水溶性人工甘味料は、組成物の約０．００１重量％〜約５重量％の量で使用しうる。
【０２５７】
本発明の医薬製品において使用しうる着香料は、医薬組成物の約０．５重量％〜約５重量％の量の、個別の及び混合された、天然及び人工着香料、及びペパーミントなどのミント類、メントール、バニラ、人工バニラ、チョコレート、人工チョコレート、シナモン、様々な果実フレーバーを含む。
【０２５８】
本発明において有用な着色料は、組成物の約６重量％までの量で組み込みうる色素を含む。好ましい色素である二酸化チタンは、約１％までの量で組み込みうる。また、着色料は、Ｆ．Ｄ．＆Ｃ．染料等として知られる、食品、医薬品及び化粧品適用に適する他の染料を含みうる。そのような染料は一般に、医薬組成物の約０．２５重量％まで、好ましくは約０．０５重量％〜約０．２重量％の量で存在する。すべてのＦ．Ｄ．＆Ｃ．及びＤ．＆Ｃ．染料及びそれらの対応する化学構造の完全な列挙は、そのテキストが参照してここに組み込まれる、ｔｈｅ  Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍｅｒ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ５中の、ｐ．８５７−８８４に認められる。
【０２５９】
有用な可溶化剤は、アルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を含み、着香料を可溶化するために使用しうる。可溶化剤は一般に、医薬組成物の約１０重量％まで、好ましくは約２重量％〜約５重量％の量で存在する。
【０２６０】
本発明の組成物において所望するときに使用しうる潤滑剤は、シリコーン油又は置換及び非置換ポリシロキサン、例えばジメチコンとしても知られるジメチルポリシロキサンなどの液体を含む。他の周知の潤滑剤も使用しうる。
【０２６１】
（併用療法）
本発明の化合物が他の合成又は天然に生じる物質と有意の有害相互作用を示すとは予想されない。そこで、本発明の化合物は、免疫応答を調節するために有用な他の化合物及び組成物と組み合わせて投与しうる。特に本発明の化合物は、本発明の他の化合物、他の免疫調節物質等と組み合わせて投与しうる。
【０２６２】
本発明の治療薬は、炎症性疾患又は自己免疫疾患などの様々な疾患、障害及び状態を予防する又は治療するために単独で又は他の治療薬と組み合わせて投与することができる。疾患、障害又は状態、及び治療の所望レベルに依存して、２、３又はそれ以上の薬剤を投与しうる。これらの薬剤は、同じ製剤中又は治療キット中に含めることによって一緒に提供されるか、又は別々に提供されうる。遺伝子治療によって投与するときは、そのタンパク質薬剤をコードする遺伝子を、場合により同じプロモーター領域の制御下で、同じベクターに含めるか、又は別々のベクターに含めうる。前述したクラスの中で特に好ましい分子は次の通りである。
【０２６３】
ＩＬ−１阻害因子：ＩＬ−１ｒａタンパク質及び可溶性ＩＬ−１受容体。最も好ましいＩＬ−１阻害因子はアナキンラである。
【０２６４】
ＴＮＦ−α阻害因子：可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ型（ｓＴＮＦ−ＲＩ；−ＲＩはｐ５５受容体とも呼ばれる）；可溶性腫瘍壊死因子受容体ＩＩ型（ｐ７５受容体とも呼ばれる）；及びＴＮＦ受容体に結合するモノクローナル抗体。国際公開第９８／２４４６３号に述べられているｓＴＮＦ−ＲＩ、エタナーセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））及びＡｖａｋｉｎｅ（登録商標）が最も好ましい。例示的なＴＮＦ阻害因子は、欧州特許第４２２３３９号、同第３０８３７８号、同第３９３４３８号、同第３９８３２７号及び同第４１８０１４号に述べられている。
【０２６５】
セリンプロテアーゼ阻害因子：ＳＬＰＩ、ＡＬＰ、ＭＰＩ、ＨＵＳＩ−Ｉ、ＢＭＩ及びＣＵＳＩ。ＳＬＰＩはＬＰＳ応答を阻害することが示されたので、これらの阻害因子はまた、例示的なＬＰＳ調節因子とみなされることもある。Ｊｉｎ等（１９９７年），Ｃｅｌｌ  ８８（３）：４１７−２６（参照してここに組み込まれる）。
【０２６６】
一部の実施形態では、最適医薬製剤は、例えば意図される投与経路、送達様式及び所望用量などの考慮すべき事柄に依存して、当業者によって決定される。例えばその開示が参照してここに組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出、ｐ．１４３５−１７１２参照。一部の実施形態では、そのような組成物は、本発明の治療薬の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。
【０２６７】
（本発明の化合物の合成）
本発明の組成物は、当業者の公知の手法を用いて及びここで詳細に述べるように、分子生物学の標準手法によって容易に調製しうる。
【０２６８】
生成物及び中間体は、例えば１又はそれ以上の単純な溶媒蒸発、再結晶化、蒸留、昇華、ろ過、ポリメラーゼ連鎖反応、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ウエスタンブロット法、薄層クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えば逆相ＨＰＬＣ）、カラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、ラジカルクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー、摩砕、塩析沈殿、二相分離、ポリマー沈殿、熱変性、等電点分離、透析等を含む、当業者に公知の１又はそれ以上の標準精製手法を用いて単離又は精製しうる。
【０２６９】
適切なＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１リガンドは、場合により低分子化合物として合成しうると想定される。そのような本発明の化合物は、有機化学の標準手法によって容易に調製しうる。そのような低分子化合物の調製において、当業者は、前記分子の他の部分に関する所望反応を実施する間、出発化合物又は中間体上の様々な反応性官能基を保護しなければならない場合があることを了解する。所望反応が完了した後又はいずれかの所望時点で、通常はそのような保護基を、例えば加水分解又は水素化分解手段によって除去する。そのような保護及び脱保護工程は有機化学において慣例的である。当業者は、本発明の化合物の調製において有用であると考えられる保護基の教示に関して、「有機化学における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」ＭｃＯｍｉｅ，編，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，ニューヨーク州；及び「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」Ｇｒｅｅｎｅ，編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，ニューヨーク州（１９８１年）を参照できる。
【０２７０】
化学合成の生成物及び中間体は、例えば１又はそれ以上の単純な溶媒蒸発、再結晶化、蒸留、昇華、ろ過、薄層クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（例えば逆相ＨＰＬＣ）、カラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、ラジカルクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィー、摩砕等を含む、１又はそれ以上の標準精製手法を用いて単離又は精製しうる。
【０２７１】
（投与経路）
本発明の化合物及び組成物の投与経路は、当業者に周知である（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”、前出参照）。前記化合物及び組成物は、従来の非毒性の製薬上許容される担体、アジュバント及び媒体を含む投与製剤中で、経口的、非経口的、吸入スプレーによって、局所的、直腸的、鼻内、口内、膣経路で、又は移植レザバーによって投与しうる。ここで使用する非経口という用語は、皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、クモ膜下腔内、病巣内、門脈内、心室内、胸骨内、眼内、脳室内、大脳内（脳実質内）、及び頭蓋内注射又は注入手法；持続放出システム又は移植装置によるものを含む。一部の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって又は注入によって持続的に又は移植装置によって投与しうる。
【０２７２】
中枢神経系標的として治療上有効であるためには、前記化合物及び組成物は、末梢血管から投与された場合に血液脳関門を容易に貫通するべきである。血液脳関門を貫通できない化合物は、心室内経路によって効果的に投与しうる。
【０２７３】
前記化合物及び組成物は、無菌注射用製剤の形態で、例えば無菌注射用水性又は油性懸濁液として、投与しうる。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤と懸濁化剤を使用して当技術分野で公知の手法に従って製剤しうる。無菌注射用製剤はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液でありうる。使用しうる、許容される媒体及び溶媒の中でも特に、リンガー液及び等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、無菌不揮発性油が溶媒又は懸濁媒質として慣例的に使用される。このために、合成モノ又はジグリセリドなどのいかなる混合不揮発性油も使用しうる。オリーブ油及びヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化形態を含む、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などの脂肪酸が注射用製剤の調製において有用である。これらの油性溶液又は懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤を含みうる。
【０２７４】
加えて、本発明の１つの態様では、前記化合物及び組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液又は溶液の形態で経口投与しうる。この様式で投与される薬剤は、錠剤及びカプセルなどの固体投与形態の調合において慣例的に使用される担体と共に又は担体なしで製剤することができる。錠剤は、ラクトース及びトウモロコシデンプンなどの担体、及び／又はステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含みうる。カプセルは、ラクトース及び乾燥トウモロコシデンプンを含む希釈剤を含みうる。水性懸濁液は、有効成分と組み合わせた乳化剤及び懸濁化剤を含みうる。経口投与形態は、甘味料、着香料、着色料またはそれらの組合せをさらに含みうる。一部の実施形態では、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大であり、プレシステミック分解が最小であるときに胃腸管の部位で製剤の活性部分を放出するように設計しうる。本発明の物質の吸収を促進するために付加的な置換基を含めることができる。
【０２７５】
本発明の医薬組成物は、好ましくは錠剤の製造に適する非毒性賦形剤との混合物中に１又は複数の本発明の物質の有効量を含むように提供される。錠剤を無菌水又は別の適切な媒体に溶解することにより、溶液を単位投与形態で調製しうる。適切な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸又は炭酸水素ナトリウム、ラクトース又はリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；又はデンプン、ゼラチン又はアカシアなどの結合剤；又はステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又は滑石などの潤滑剤を含むが、これらに限定されない。
【０２７６】
本発明の医薬組成物は、非経口送達用に選択されうる。前記組成物は、吸入用又は経口的などの消化管を通しての送達用に選択されうる。そのような製薬上許容される組成物の調製は当技術分野の技術範囲内である。
【０２７７】
製剤成分は、好ましくは投与部位に許容される濃度で存在する。一部の実施形態では、組成物を生理的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持するために緩衝剤が使用される。
【０２７８】
非経口投与を考慮するとき、本発明における使用のための治療組成物は、製薬上許容される媒体中に所望物質を含む、発熱物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態で提供されうる。非経口注射に特に適する媒体は、その中に抗ＩＬ−１Ｒ１抗体が適切に保存された無菌等張溶液として製剤されている無菌蒸留水である。一部の実施形態では、当該製剤は、デポー注射剤によって送達できる生成物の制御又は持続放出を提供しうる、注射用ミクロスフェア、バイオ腐食性粒子、高分子化合物（ポリ乳酸又はポリグリコール酸など）、ビーズ又はリポソームなどの物質を伴う所望分子の製剤を含みうる。一部の実施形態では、循環中の存在期間の持続を促進する作用を有する、ヒアルロン酸も使用しうる。一部の実施形態では、所望抗体分子を導入するために移植可能な薬剤送達装置を使用しうる。
【０２７９】
本発明の医薬組成物は吸入用に製剤することができる。これらの実施形態では、物質を吸入用乾燥粉末として製剤する。好ましい実施形態では、吸入溶液はまた、エーロゾル送達のための推進薬と共に製剤しうる。一部の実施形態では、溶液を噴霧化しうる。肺投与及びそのための製剤方法は、化学修飾タンパク質の肺送達を述べる、参照してここに組み込まれる国際公開第９４／２００６９号の中でさらに説明されている。
【０２８０】
当該化合物はまた、坐薬の形態で直腸投与しうる。これらの組成物は、室温で固体であるが直腸温度では液体であり、それ故直腸で溶けて薬剤を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって調製できる。そのような物質は、ココアバター、蜜蝋及びポリエチレングリコールを含む。
【０２８１】
さらに、当該化合物は、特に治療の対象である状態が、下部消化管を含む、局所適用によって容易にアクセスできる領域又は器官を含むとき、局所投与しうる。適切な局所製剤は、そのような領域又は器官用に容易に調製できる。例えば下部消化管への局所適用は、直腸坐薬製剤（上記参照）又は適切な注腸製剤として実施することができる。
【０２８２】
本発明の化合物及び組成物の持続投与又は持続送達は、特定の状態のために好都合であろうと想定される。継続投与は輸液ポンプなどの機械的手段によって実施しうるが、他の様式の持続又は準持続投与も実施しうると想定される。例えばそのような投与は、皮下又は筋肉注射並びに経口丸剤によって実施しうる。
【０２８３】
リポソーム担体、バイオ腐食性粒子又はビーズ及びデポー注射などの、様々な他の持続又は制御送達手段を製剤するための手法も、当業者に公知である。
【０２８４】
持続又は制御送達製剤中に本発明の物質を含有する製剤を含む、付加的な医薬製剤は当業者に明白である。リポソーム担体、バイオ腐食性微粒子又は多孔性ビーズ及びデポー注射などの、様々な他の持続又は制御送達手段を製剤するための手法も、当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御放出を述べる、参照してここに組み込まれる国際公開第９３／１５７２２号参照。持続放出製剤は、成形された製品、例えば薄膜又はマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスを含みうる。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及び欧州特許出願第０５８４８１号に開示されているような）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ等，１９８３年，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ等，１９８１年，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２年，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ等，前出）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号）を含みうる。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの手法のいずれかによって調製できるリポソームを含みうる。例えばＥｐｐｓｔｅｉｎ等，１９８５年，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２；欧州特許出願公開第０３６，６７６号；同第０８８，０４６号及び同第１４３，９４９号参照。
【０２８５】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、典型的には無菌製剤として提供される。滅菌は、滅菌ろ過膜を通してのろ過によって実施できる。組成物を凍結乾燥するときは、この方法を用いた滅菌を凍結乾燥及び再溶解の前又は後のいずれかに実施しうる。非経口投与用組成物は、凍結乾燥形態で又は溶液として保存できる。非経口用組成物は一般に、無菌アクセス口を有する容器、例えば静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって貫通できる栓を有するバイアルに納められる。
【０２８６】
ひとたび医薬組成物が製剤されれば、それを溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体として、あるいは脱水又は凍結乾燥粉末として、無菌バイアル中で保存しうる。そのような製剤は、即時使用形態で又は投与の前に再溶解される（例えば凍結乾燥）形態のいずれかで保存しうる。
【０２８７】
本発明はまた、単回投与単位を生成するためのキットを提供する。本発明のキットは、各々が、乾燥タンパク質を有する第一容器と水性製剤を有する第二容器の両方を含みうる。本発明の一部の実施形態では、単一及び多区画型前充填注射器（例えば液体注射器又はライオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが提供される。
【０２８８】
本発明の組成物はまた、所望分子が吸収された又は被包された膜、スポンジ又は別の適切な物質の移植によって局所的に投与しうる。一部の実施形態では、移植装置を使用する場合、装置を適切な組織又は器官に移植することができ、拡散、時限放出ボーラス又は持続投与によって所望分子の送達が実施される。
【０２８９】
また、本発明に従った医薬組成物をエキソビボで使用することが望ましい場合がある。そのような場合には、患者から採取した細胞、組織又は器官を医薬組成物に接触させ、その後前記細胞、組織及び／又は器官を患者の体内に戻す。
【０２９０】
特に、本発明の物質は、当該ポリペプチドを発現し、分泌するために、ここで述べるような方法を用いて、遺伝子操作した一定の細胞を移植することによって送達することができる。一部の実施形態では、そのような細胞は、動物又はヒト細胞でありえ、自家、異種又は組織移植片に関して異種でありうる。一部の実施形態では、前記細胞は不朽化しうる。他の実施形態では、免疫応答の可能性を低下させるため、周辺組織の浸潤を回避するように被包しうる。さらなる実施形態では、被包材料は、典型的には、タンパク質生成物の放出は許容するが、患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性ポリマー包囲物（エンクロージャー）又は膜である。
【０２９１】
治療的に使用される医薬組成物の有効量は、例えば治療の背景及び目的に依存する。当業者は、治療のための適切な用量レベルが、一部には、送達される分子、本発明の物質が使用される適応症、投与経路、及び患者のサイズ（体重、体表面積又は器官の大きさ）及び／又は状態（年齢及び全般的健康）に依存して変化することを認識する。一部の実施形態では、臨床医は、最適治療効果を得るために容量を調整し、投与経路を修正しうる。典型的な用量は、前述した因子に依存して、約０．１ｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲でありうる。好ましい実施形態では、用量は、約０．１ｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは１ｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；又はさらに一層好ましくは５ｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。
【０２９２】
投与頻度は、使用する製剤中の個々の物質の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は、所望効果を実現する用量に達するまで組成物を投与する。組成物は、それ故、単回投与として、又は時間をかけて２回又はそれ以上の投与（同じ量の所望分子を含んでもよく又は同じ量を含まなくてもよい）として、又は移植装置又はカテーテルによる持続注入として投与しうる。適切な用量のさらなる洗練は当業者によって常套的に行われ、当業者が常套的に実施する作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量−反応データの使用を通して確認しうる。
【０２９３】
（用量）
およそ、有効成分化合物又は組成物約０．００１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量レベルが前記状態の治療において有用であり、好ましいレベルは２００ｍｇ／日〜１６００ｍｇ／日の範囲である。本発明の化合物及び組成物は、通常１日に２回又は３回投与しうる。１日２回の低用量（２００〜３００ｍｇ）から出発し、必要に応じてゆっくりとより高い用量に進むことが好ましい戦略である。単回投与形態を生成するために担体材料と配合しうる有効成分の量は、治療する宿主及び個々の投与様式に依存して異なる。
【０２９４】
しかし、特定患者についての特定用量レベルは、使用する特定化合物の活性；患者の年齢、体重、全般的健康、性別及び食事；投与の時間；排出速度；併用薬剤；治療する特定疾患の重症度；及び投与の形態を含む、様々な因子に依存することは了解される。当業者は、そのような因子の変動性を認識し、単に常套的な実験を用いて特定用量レベルを確立することができる。
【実施例】
【０２９５】
以下の実施例は本発明の例示であり、本発明の限定となることを意図しない。特に異なる指示がない限り、すべてのパーセンテージは最終組成物の１００重量％に基づく。
【０２９６】
（一般的実験手順）
実験動物。対照として使用した、４〜６週齢の野生型Ｃ５７Ｂ／６マウスを商業供給者から購入した。ＷＳＸ−１−／−マウスは、特定病原体感染防止環境においてホモ接合体として交配し、飼育した。４〜６週齢のＩＬ−１２ｐ４０−／−及びＲＡＧ−２−／−マウスを商業供給者から購入し、ＩＬ−１０−／−マウスはインハウスで交配飼育した。ＩＦＮ−γ欠損マウスは商業供給者から購入した。すべての動物を、機関のガイドラインに従って特定病原体感染防止条件下で飼育した。すべての実験において、５〜８週齢でマウスを感染させ、実験群は３〜５匹の動物を含んだ。
【０２９７】
トキソプラズマ原虫感染。トキソプラズマ原虫のＭＥ４９系統をＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ及びＣＢＡ／ＣａＪマウスにおいて維持した。ＭＥ４９ブラディゾイトシストを、先に述べられているように（Ｃａｉ等，２０００年）ドナーマウスから作製した。マウスをｉ．ｐ．又は経口投与のいずれかによって２０個のトキソプラズマシストで攻撃誘発した。草稿全体を通じて、特に異なる記載がない限り感染はｉ．ｐ．で実施した。寄生生物負荷を評価するため、マウスをトキソプラズマ原虫にｉ．ｐ．感染させ、７日後に、腹腔洗浄を実施した。サイトスピン作製のために細胞を収集し、感染細胞の数を顕微鏡で評価した（ｎ＝３／群、マウス当り少なくとも５００細胞を計数した）。組織検査のために、０日間（未感染）又は１２日間トキソプラズマ原虫に感染させた動物から肺、心臓、脾臓及び肝臓を採取した。器官を１０％ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋して、切片にし、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。Ｔ細胞をインビボで除去するために、感染後７、８及び９日目にＷＳＸ−１−／−マウスを指示抗体で処置した。内毒素不含αＣＤ４（ＧＫ１．５）及びαＣＤ８（Ｈ３５−１７．２）ｍＡｂをハイブリドーマから増殖させた。
【０２９８】
ネズミ鞭虫感染及び抗原。ネズミ鞭虫を遺伝的に感受性のある又は免疫無防備状態の動物において維持した。感染後３５〜４２日の間に、成体鞭虫を単離し、５００Ｕ／ｍｌペニシリン及び５００ｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中で２４時間培養した。ネズミ鞭虫排出−分泌Ａｇを４時間目と２４時間目に単離し、透析して、滅菌ろ過し、ブラッドフォードアッセイによってタンパク質濃度を測定した。リンパ球再刺激において抗原製剤５０ｇ／ｍｌを使用した。培養の２４時間後に産みつけられた卵を収集し、無菌水で３回洗って、室温で６週間インキュベートし、４℃で保存した。０日目にマウスを１５０〜２００個の感染幼虫包蔵卵に感染させ、感染後種々の日に鞭虫負荷を評価した。
【０２９９】
ＩＬ−２７及びＷＳＸ−１  ｍＲＮＡレベルの検出。ＩＬ−２７及びＷＳＸ−１レベルをＲＴ−ＰＣＲによって測定した。トキソプラズマ原虫感染後のｍＲＮＡ発現のエキソビボ分析のために、０日間（未感染）及び７日間感染させておいた野生型マウスから全脾細胞を単離した。ネズミ鞭虫感染後のｍＲＮＡ発現のエキソビボ分析のために、トリゾールを使用して全腸間膜リンパ節（以下「ＭＬＮ」）細胞懸濁液からｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡを単離するための当技術分野で公知の標準手順を使用した後、メッセージレベルを定量するためにＰＣＲを３４サイクル使用した：９５℃、３０秒／６０℃、３０秒／７２℃、１分。あらゆる反応の等しい負荷を評価するためにβ−アクチン発現を内部対照として使用した。ＩＬ−２７ｐ２８（２個の２０量体）、ＥＢＩ３（１個の２０量体と１個の２３量体）及びＷＳＸ−１（２個の２０量体）を使用した。詳細な配列は、その全体が参照してここに組み込まれる、出願人の公表文献、Ｖｉｌｌａｒｉｎｏ等，ＩＬ−２７Ｒ（ＷＳＸ−１）は感染中のＴ細胞機能亢進を抑制するために必須である（Ｔｈｅ  ＩＬ−２７Ｒ（ＷＳＸ−１）Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｔｏ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｉｔｙ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９：６４５−６５５（２００３年）に見出される。
【０３００】
エキソビボリコール試験（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｒｅｃａｌｌ  ａｓｓａｙ）のための脾細胞の単離と培養。感染／非感染野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの脾臓を採取し、単細胞懸濁液中に分離して、０．８６％（重量／容量）塩化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ）を使用して赤血球を除去した。細胞を３回洗浄し、完全ＲＰＭＩ  １６４０（１０％熱不活化ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン、可欠アミノ酸及びβ−メルカプトエタノール）に再懸濁した後、９６穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において最終容量２００μｌ中２×１０５細胞／穴の細胞密度で平板培養した。指示されている場合は、細胞を平板結合αＣＤ３抗体１μｇ／ｍｌ）で刺激するか又は可溶性トキソプラズマ抗原（ｓＴＡｇ、２５μｇ／ｍｌ）と共に培養した。フローサイトメトリー実験については、細胞を２４穴プレート（Ｃｏｓｔａｒ）において最終容量１ｍｌ中２×１０６細胞／穴の最終密度で培養した。
【０３０１】
サイトカイン産生分析。ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２３及びＩＬ−２のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。脾細胞リコール試験及びインビトロ分化試験の両方のために、７２時間の培養後に上清を収集した。フローサイトメトリーによる細胞内ＩＦＮ−γの検出のため、すべての細胞をブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、１０μｇ／ｍｌ）で２時間処理した後、固定し、サポニンで透過化した。ＣＤ４又はＣＤ８（ＰＥ複合、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）についての表面染色と組み合わせたＡＰＣ複合ＩＦＮ−γ  ｍＡＢ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いてサイトカインを検出した。
【０３０２】
エキソビボ活性化及び増殖分析。脾細胞を、ＣＤ４又はＣＤ８（ＦＩＴＣ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のいずれかと組み合わせた活性化マーカー、ＣＤ２５（ＰＥ）及びＣＤ６２Ｌ（ＡＰＣ）の表面発現に関してエキソビボで直接染色した。ＢｒｄＵ取込み試験のために、マウスを分析の前に３日間ＢｒｄＵ（０．８ｍｇ／マウス、ｉ．ｐ．）で処置した。感染後指示された時点で、腸間膜リンパ節を単離し、細胞をＣＤ４又はＣＤ８の表面に関して染色した後、固定した。取り込まれたＢｒｄＵを検出するため、細胞をＴｗｅｅｎ−２０（０．０５％）で透過化し、ＤＮＡアーゼＩ溶液で処理して、ＦＩＴＣ複合ＢｒｄＵ  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色した。
【０３０３】
未処置脾細胞のインビトロ分化。インビトロアッセイのために、未処置動物から脾細胞を単離し、塩化アンモニウムを用いて赤血球を溶解して、磁気ビーズ分離法（Ｍｕｌｌｅｎ等，２００１年）によってＣＤ８＋及びＮＫ１．１＋細胞を除去した。標準プロトコール（Ｍｕｌｌｅｎ等，２００１年）に従って細胞をＣＦＳＥ（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で標識し、その後可溶性αＣＤ３抗体（０．１μｇ／ｍｌ）、可溶性αＣＤ２８抗体（０．５μｇ／ｍｌ）、及び組換えヒトＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ、Ｃｈｉｒｏｎ）で刺激した。非極性化条件のために、細胞をＩＬ−１２（１０μｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）に対する中和抗体と共に培養した。Ｔｈ１極性化条件のために、培養物に組換えマウスＩＬ−１２（５ｎｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）及び中和αＩＬ−４（１０μｇ／ｍｌ）抗体を添加した。
【０３０４】
最初に、３日間の培養後、上清を収集して、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ濃度を測定した。次に、残りの細胞をホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）及びイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で４時間刺激し、ＢＦＡ（１０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）で２時間処理して、その後表面ＣＤ４及びＣＦＳＥ取込みと組み合わせて細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した。
【０３０５】
インビトロシグナル伝達アッセイ。未処置ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉＴ細胞を、ＦＡＣＳソーティング（Ｐｆｌａｎｚ等，２００２年）によって野生型脾臓から精製した。細胞を一晩媒質中で休息させ、その後組換えサイトカインで１５分間刺激した。使用したサイトカインは、ＩＬ−２、５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＩＬ−１２、２００ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＩＦＮ−α、５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＩＦＮ−γ、５０ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＩＬ−２７、５０ｎｇ／ｍｌ（ＤＮＡＸ、ｉｎ−ｈｏｕｓｅ  ｈｙｐｅｒｋｉｎｅｓ）であった。刺激後、細胞を溶解し、ウエスタンブロット法（Ｈｉｂｂｅｒｔ等，２００３年）によって全及びチロシン単離リン酸化ＳＴＡＴタンパク質に関してプローブした。すべてのホスホ−ＳＴＡＴ抗体はＮＥＢ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から、ＳＴＡＴ−１はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓから、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−４及びＳＴＡＴ−５はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚから入手した。
【０３０６】
インビボ除去。中和αＩＬ−１２  ｍＡｂ、Ｃ１７．８、αＩＦＮ−γ  ｍＡｂ、ＸＭＧ．６及びαＩＬ−４  ｍＡｂ、１１Ｂ１１、２ｍｇ／用量を感染後０、４、８及び１２日目に腹腔内投与した。対照マウスには等量の精製ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，セントルイス，ミズーリ州）を投与した。
【０３０７】
リンパ球精製及びサイトカインアッセイ。リンパ球をＭＬＮから採取し、αＣＤ８及びＮＫ１．１  ＦＩＴＣ複合ｍＡｂと組み合わせた磁気ビーズを用いてＣＤ８＋及びＮＫ１．１＋細胞を除去した。１０％熱不活化ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、可欠アミノ酸及びβ−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ  １６４０に細胞を再懸濁し、９６穴プレートにおいて４×１０５細胞／穴で平板培養した。抗原特異的リコール応答のために、細胞を単独で又はネズミ鞭虫抗原、５０ｇ／ｍｌの存在下で７２時間培養した。分泌されたＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３及びＩＦＮ−γをサンドイッチＥＬＩＳＡによって定量した。細胞内ＩＦＮ−γの検出のため、感染の１４日後に、リンパ球を前述したように精製し、ｒＩＬ−４、５０ｎｇ／ｍｌ及びαＩＬ−１２  ｍＡｂ、Ｃ１７．８、１０ｇ／ｍｌの存在下に、いずれも１ｇ／ｍｌのαＣＤ３とαＣＤ２８で刺激した。７２時間後、細胞をＰＭＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、イオノマイシン、５００ｎｇ／ｍｌ及びブレフェルジンＡ（以下「ＢｆＡ」）、１０ｇ／ｍｌで３〜５時間パルスし、表面ＣＤ４と共に細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した。感染の２１日後に細胞内ＩＦＮ−γの検出のために、ＭＬＮ細胞をαＣＤ３で１８時間刺激し、ＢｆＡと共に２時間インキュベートした後、細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  サイトメーターで細胞を獲得し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。示されている図上の点はすべて１００−１０４の対数軸を有する。
【０３０８】
インビトロ分化アッセイ。脾細胞を未処置動物から単離し、ＣＦＳＥ、５ｇ／ｍｌで標識して、Ｔｈ２極性化条件下に可溶性αＣＤ３  ｍＡｂ、０．１ｇ／ｍｌ、可溶性αＣＤ２８  ｍＡｂ、０．５ｍｇ／ｍｌ、及びｒＩＬ−２、１０Ｕ／ｍｌで、組換えマウスＩＬ−２７と共に又は組換えマウスＩＬ−２７なしで、ｒＩＬ−４、５０ｎｇ／ｍｌ及びαＩＬ−１２  ｍＡｂ、１０ｇ／ｍｌで、３〜４日間刺激した。一次刺激に関して、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖及び細胞内ＩＬ−４産生をフローサイトメトリーによって測定した。二次刺激に関しては、細胞を４日目に採取し、洗浄して、中和条件下にαＣＤ３で２４時間歳刺激した。その後ＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の分泌レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。
【０３０９】
寄生生物特異的ＩｇＧ２α応答の評価。寄生生物特異的ＩｇＧ２α応答を捕獲ＥＬＩＳＡによって定量した。Ｉｍｍｕｌｏｎ  ＩＶ平板を、炭酸／炭酸水素緩衝液中４℃で一晩、ネズミ鞭虫ＥＳ  Ａｇ、５ｇ／ｍｌで被覆した。遮断後、ＰＢＳ中３％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、初期２０倍希釈からの８回連続２倍希釈の血清を平板に添加した。ストレプトアビジン−ＨＲＰと組み合わせたビオチニル化ラットα−マウスＩｇＧ２αを用いて寄生生物特異的抗体を検出した。
【０３１０】
杯細胞応答の分析。盲腸中央部の１ｃｍセグメントを切除し、無菌ＰＢＳで洗って、１０％中性緩衝ホルマリンに２４時間固定した。組織を常套的に処理し、標準組織学的手法を用いてパラフィン包埋した。５ｍ切片を切り出し、腸杯細胞の検出のためにヘマトキシリンとエオシン又はアルシアンブルー−過ヨウ素酸シッフで染色した。１００クリプト単位当りの細胞数を数えることによって腸杯細胞応答の計数を実施した。抗ｍＲＥＬＭβ抗体、免疫ブロット法におけるその使用、並びに便タンパク質を単離するために使用される条件はこれまでに記述されている。
【０３１１】
組織学に関するマスト細胞応答の分析。１ｃｍの長さの盲腸を単離し、ＰＢＳ中で洗って、カルノワ液に固定した後、その後の処理と染色を行った。０．５ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌ、ｐＨ０．５中の０．５％トルイジンブルーで５ｍ切片を一晩染色し、１％エオシン液で対比染色することによってマスト細胞を検出した。４０フィールド当りのトルイジンブルー陽性マスト細胞の計数を、各時点で３〜４匹のマウスに関して実施した。ＭＭＣＰ−１＋マスト細胞の免疫組織化学的検出をパラホルムアルデヒド固定組織に関して実施した。市販のキットを使用して血清マスト細胞プロテアーゼ−１、ＭＭＣＰ−１を測定した。
【０３１２】
マスト細胞の増殖：受動的皮膚アナフィラキシー。ｔｅｒｔ−アミルアルコール：ＰＢＳ、１：４０中２．５％２，２，２−トリブロモエタノール３００ｌの腹腔内注射によってマウスを麻酔した。次にインビボでマスト細胞を、右耳の背面基部への皮内注射により、ＰＢＳ２５Ｌ中の抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ２５ｎｇで感作し、ＰＢＳ  ２５ｌを左耳の背面基部に注入した。２４時間後に再びマウスを麻酔し、静脈内眼窩後注射により、１％エバンスブルー２００ｌ中のＤＮＰ−ＨＳＡ  １００ｇで攻撃誘発した。攻撃誘発の３０分後、マウスを安楽死させ、耳を採取して、ホルムアミド１ｍＬ中５５℃で４８時間インキュベートした。次に各々の試料からホルムアミド３００ＬのＯＤを、９６穴プレートリーダーにおいて６１０ｎｍで測定した。
【０３１３】
（実施例１）
ＷＳＸ−１はトキソプラズマ原虫に対する抵抗性のために必須である
トキソプラズマ原虫に対する抵抗性の発現と調節におけるＩＬ−２７Ｒ／ＷＳＸ−１の役割を評価するために、感染がこのサイトカイン又はその受容体の発現上昇をもたらすかどうかを調べるための試験を実施した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにトキソプラズマ原虫ＭＥ４９系統の２０シストを腹腔内経路（ｉ．ｐ．）で接種した。７日後、感染及び非感染マウスの全脾細胞からｍＲＮＡを単離した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、脾臓におけるＩＬ−２７ｐ２８、ＥＢＩ３及びＷＳＸ−１についてのｍＲＮＡのレベルを評価した。感染の７日後、ＩＬ−２７ｐ２８及びＥＢＩ３についてはｍＲＮＡレベルの上方調節が存在したが、非攻撃誘発マウスにおけるＷＳＸ−１  ｍＲＮＡの構成的レベルは感染によって評価しうる程度には変化しなかった（図１Ａ）。ＩＬ−２７  ｍＲＮＡのこの感染誘導性上昇の有意性を調べるために、３回の実験を代表する、各群当り４匹の野生型、ＷＳＸ−１−／−及びＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスをトキソプラズマ原虫に感染させ、生存率を観察した。野生型マウスはこの感染の急性期を越えて生存することができたが、ＷＳＸ−１−／−動物は、ＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスと同様に、１５日目までに死亡した（図１Ｂ）。マウスを経口的又は腹腔内経路のいずれで感染させた場合も同様の結果が認められた。
【０３１４】
ＩＬ−１２欠損マウスの早期死亡は寄生生物数を抑制することができなかったことに関連するので、感染ＷＳＸ−１−／−マウスを寄生生物複製の徴候に関して検査した。感染後７日目に、腹腔洗浄を実施し、サイトスピン作製のために細胞を収集し（ｎ＝３／群）、トキソプラズマ原虫に感染した細胞のパーセンテージを評価した。感染ＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスで認められた高い寄生生物負荷に対し、野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスでの腹腔滲出液の分析はほとんど感染細胞を示さず、感染野生型又はＷＳＸ−１−／−動物の心臓、肺、脾臓又は肝臓においては明らかな寄生生物複製は存在しなかった（図１Ｃ；データは示していない）。野生型及びＷＳＸ−１−／−動物を１２日間感染させた後、肝臓を切除し、組織学的分析用に調製した；野生型マウスと異なり、ＷＳＸ−１−／−マウスは、１２日間の感染後に肝臓及び肺において顕著な免疫浸潤物と壊死を発現した（図１Ｅ−１Ｈ；データは示していない）。肝臓における病理は、骨髄外造血の領域及び末梢血管拡張の発症を導く肝細胞の喪失によってさらに特徴付けられた（図１Ｈ）。さらに、感染ＷＳＸ−１−／−マウスの脾臓は、解体された小胞構造と高い数のアポトーシス細胞を含んでいた。
【０３１５】
これまでの研究は、トキソプラズマ症の実験モデルにおいてＣＤ４＋Ｔ細胞を致死的免疫疾患の発現に結び付けてきたので、Ｔ細胞が感染ＷＳＸ−１−／−マウスの急性死亡を媒介するのかどうかを調べるための試験を実施した。ＷＳＸ−１欠損マウスをトキソプラズマ原虫で攻撃誘発し、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋  Ｔ細胞を除去する抗体で処置して、感染の経過を観測した。感染後７、８及び９日目に、マウスをＰＢＳ（対照）、αＣＤ４  ｍＡＢ  ５００μｇ又はαＣＤ８  ｍＡＢ  ５００μｇ（ｎ＝３／群、３回の実験の代表）でマウスを処置した。感染後５、６及び７日目のαＣＤ８の投与は感染ＷＳＸ−１−／−マウスの死亡までの時間を変化させなかったが、αＣＤ４を用いた同じレジメンは早期死亡を予防した（図１Ｄ）。合わせて考えると、これらの試験は、ＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスと異なって、トキソプラズマ原虫に対するＷＳＸ−１−／−マウスの高い感受性は寄生生物複製を制御する能力の欠如によるものではなく、ＣＤ４＋Ｔ細胞依存性の免疫媒介性疾患の結果であることを明らかにする。
【０３１６】
（実施例２）
トキソプラズマ原虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスにおけるサイトカイン産生の上昇
ＷＳＸ−１の不在がどのようにしてトキソプラズマ原虫に対する免疫応答に影響を及ぼすのかを調べるため、この感染に対する抵抗性に結びつくサイトカインの産生を観測するための動態分析を実施した。感染後０、７及び１１日目に（Ｘ軸）、野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスから血清を採取し、ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ−１２ｐ４０（Ａ）又はＩＦＮ−γ（Ｂ）の循環レベルを測定した。指示されている時点で（Ｘ軸）、野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの全脾細胞を可溶性トキソプラズマ抗原（ｓＴＡｇ、２５μｇ／ｍｌ）又は平板結合αＣＤ３抗体（１μｇ／ｍｌ）と共に７２時間培養し、ＩＬ−１２ｐ４０（ＢとＣ）、ＩＦＮ−γ（ＥとＦ）、ＩＬ−１０（ＧとＨ）及びＩＬ−２（Ｉ）産生に関して検定した（ｎ＝３／群、３回の別々の実験の代表）。野生型、ＷＳＸ−１−／−及びＩＬ−１０−／−マウスをトキソプラズマ原虫に感染させ、生存率を観測した。野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスの感染は極めて高い血清ＩＬ−１２濃度を導いたが、感染後１１日目までに下方調節された（図２Ａ）。感染マウスからの全脾細胞を可溶性トキソプラズマ抗原（ｓＴＡｇ）又はαＣＤ３で刺激することにより、ＩＬ−１２産生の同様のプロフィールが得られた（図２Ｂ及び２Ｃ）。同様に、血清中のＴＮＦ−α及びＩＬ−２３レベルの分析は、野生型とＷＳＸ−１−／−マウスの間で有意差を示さなかった。この急性炎症反応は全身ＩＦＮ−γレベルの著明な上昇を導き、７日後には、前記レベルは野生型とＷＳＸ−１−／−マウスの間で同等であった。
【０３１７】
しかし、感染後１１日目までに、野生型マウスではＩＦＮ−γの血清レベルが下方調節されたのに対し、ＷＳＸ−１−／−動物はまだ高い濃度の循環ＩＦＮ−γを有していた（図２Ｄ）。感染マウスからの脾リコール応答においても同様の傾向が認められた。やはり、感染後０日目と７日目に、ｓＴＡｇ又はαＣＤ３で刺激したとき両群からの脾細胞は同様の量のＩＦＮ−γを産生した（図２Ｅ及び２Ｆ）。感染後１１日目に、ｓＴＡｇ又はαＣＤ３による刺激は、ＷＳＸ−１−／−脾細胞が野生型コホートと比較して著明なレベルのＩＦＮ−γを産生することを誘導した（図２Ｅ及び２Ｆ）。加えて、ＷＳＸ−１−／−脾細胞はまた、これらの培養において野生型Ｔ細胞の４倍のＩＬ−２を産生した（図２Ｉ）。
【０３１８】
感染ＷＳＸ−１−／−マウスの表現型、特に致死的免疫疾患に結びつくＩＦＮ−γの過剰産生は、トキソプラズマ原虫で攻撃誘発したＩＬ−１０−／−マウスのものに類似する（図２Ｊ）。しかし、ｓＴＡｇ又はαＣＤ３で刺激したとき感染野生型とＷＳＸ−１−／−マウスからの脾細胞は同様の量のＩＬ−１０を産生したので（図２Ｇ及び２Ｈ），この調節システムの欠損がＷＳＸ−１−／−マウスの急性死亡に寄与するとは考えられない。さらに、ＷＳＸ−１−／−マウスは急性の感染誘導性ＩＬ−１２産生を下方調節することができるが、ＩＬ−１０−／−マウスはこのサイトカインの高いレベルを維持した（図２Ｋ）。ＷＳＸ−１−／−マウスとＩＬ−１０−／−マウスの間でのこの相違は、感染ＷＳＸ−１−／−マウスで認められるＩＦＮ−γ応答の増強は、ＩＬ−１０が感染誘導性ＩＬ−１２産生を抑制できないことによるものではなかったことを示している（図２Ｌ）。
【０３１９】
（実施例３）
トキソプラズマ原虫感染ＷＳＸ−１−／−マウスにおけるＴ細胞応答の増強
ＣＤ４＋Ｔ細胞は急性トキソプラズマ症に対するＷＳＸ−１−／−マウスの感受性に関与し、感染ＷＳＸ−１欠損マウスからの脾細胞は高いレベルのＩＦＮ−γを分泌するので、Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を評価するために単細胞分析を用いた。０、７及び１０日間感染させた野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの脾細胞を単離し、平板結合αＣＤ３抗体で１８時間刺激した後、ＣＤ４及び細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した。非感染野生型及びＷＳＸ−１からのＣＤ４＋Ｔ細胞は、αＣＤ３による１８時間の刺激後ＩＦＮ−γをほとんど産生せず、感染後７日目には、野生型とＷＳＸ−１−／−動物の両方において同様のパーセンテージの細胞がＩＦＮ−γを産生した（図３Ａ）。しかし、感染後１１日目まで、野生型コホートと比較して２倍以上のＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γを生産していた（８５％対４２％）（図３Ａ）。さらに、１０日間感染させたＷＳＸ−１−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、野生型細胞よりも多くの細胞当りサイトカインを産生した（図３Ａ）。野生型脾細胞はＩＦＮ−γを産生するためにエキソビボでの刺激を必要としたが、ＷＳＸ−１−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の１２．０％は、培地単独での培養の１２時間後にＩＦＮ−γに関して染色陽性であった（図３Ｂ）。トキソプラズマ原虫に１１日間感染させた野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスから脾細胞を単離した。細胞を培地中で１２時間休息させるか又はαＣＤ３抗体で７２時間刺激した後、ＣＤ４及び細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した。フローサイトメトリーについては、ＣＤ４＋事象だけを表示しており、長方形の枠は対照ｍＡｂと比較した特異的ＩＦＮ−γ染色を指示する；ＩＦＮ−γ＋細胞のパーセンテージを水平方向に示し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の値を垂直方向に示している。ＷＳＸ−１−／−Ｔｈ１細胞はまた、それらの野生型相対物よりも長くＩＦＮ−γ産生を維持することができた。αＣＤ３で７２時間刺激したとき、１４日間感染させたＷＳＸ−１−／−マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の２５％がまだＩＦＮ−γを分泌しており、一方野生型ＩＦＮ−γ産生細胞はほとんど残っていなかった（図３Ｂ）。
【０３２０】
どのようにしてＴ細胞応答の発現がＷＳＸ−１の不在によって影響を受けるのかをさらに評価するために、受容体欠損マウスをトキソプラズマ原虫に感染させ、Ｔ細胞による様々な活性化マーカーの発現を測定した。野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスを０、７及び１０日間感染させた後、脾細胞を単離し、エキソビボで直接ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２Ｌの発現に関して染色した。図中の数字は、各々の指示されている四分画におけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示し、太字はＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ６２Ｌｌｏｗのパーセンテージを示す。図２及び３に示すＩＦＮ−γの産生に従って、感染後７日目までに、野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて活性化Ｔ細胞の数（ＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ６２Ｌｌｏｗ）の同等の上昇が認められた（図４Ａ）。ＩＦＮ−γ産生の低下及び抗トキソプラズマ応答の全般的下方調節と一致して、野生型マウスにおける活性化Ｔ細胞の数は感染の１０日後に低下したが、ＷＳＸ−１−／−マウスにおけるＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ６２Ｌｌｏｗ  ＣＤ４＋Ｔ細胞の発生率はさらに上昇した（図４Ａ）。ＩＦＮ−γの産生及び活性化マーカーの発現に関する同様のプロフィールが、感染ＷＳＸ−１−／−マウスからのＣＤ８＋Ｔ細胞についても認められた。
【０３２１】
トキソプラズマ原虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスでは高い数の活性化Ｔ細胞が存在したが、この蓄積の根拠は不明のままであった。これまでの報告は、ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞がインビトロで増殖応答を増強することを示しているので、ＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞のインビボでの増殖を評価するための試験を実施した。野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスを経口的にトキソプラズマ原虫に感染させ、ＢｒｄＵで３日間治療して、感染後０、１０及び１４日目に犠牲にし、感染後種々の時点で、この合成ヌクレオチドの取込みをＣＤ４＋Ｔ細胞において測定した。野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスを０、７及び１０日間感染させた後、脾細胞を単離し、エキソビボで直接ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２Ｌの発現に関して染色した。数字は、各々の指示されている四分画におけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示し、太字はＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ６２Ｌｌｏｗのパーセンテージを示す。やはり、ＩＦＮ−γ産生及び活性化マーカー発現と同様に、取り込まれたＢｒｄＵの量は、感染後０及び１０日目に野生型とＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋リンパ球の間で同等であった（図４Ｂ）。２週間後、野生型免疫応答の抑制は、ＢｒｄＵを取り込んだＣＤ４＋Ｔ細胞の数の減少に反映された。これに対し、このより遅い時点で、ＢｒｄＵを取り込んだＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の個体群は増大し続けていた（図４Ｂ）。これまでにインビトロで報告されていた現象である、この増殖応答の増強は、ＷＳＸ−１−／−マウスの急性トキソプラズマ原虫感染の間に起こる病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞の蓄積に寄与すると考えられる。合わせて考慮すると、これらの試験は、ＷＳＸ−１はトキソプラズマ原虫による攻撃誘発後の高度活性化Ｔｈ１エフェクターＴ細胞の生成にとって必要ではないが、この受容体は、感染が誘導するＴｈ１応答の強さと期間を調節するために必要であることを指示する。
【０３２２】
（実施例４）
ＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞はトキソプラズマ原虫による感染後に内因性機能亢進を示す
トキソプラズマ原虫による感染はＷＳＸ−１−／−マウスにおいて活性化Ｔｈ１細胞の個体群増加を導いたが、この高い存続性が細胞自律性であるのか又は変化した付属細胞機能によって媒介されるのかは不明であった。この問題を調べるために、非感染マウスから脾細胞を単離し、付着細胞を除去して、７５×１０６の野生型又はＷＳＸ−１−／−細胞をＲＡＧ−２−／−マウスに養子移入した。７日後、マウスをトキソプラズマ原虫に感染させ、感染後１１日目に、野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの全脾細胞を可溶性トキソプラズマ抗原又は平板結合αＣＤ３抗体と共に７２時間培養し、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮ−γ産生を定量した（ｎｇ／ｍｌ）。感染後１１日目に、脾細胞を単離し、エキソビボで直接ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２Ｌの発現に関して染色した。数字は、各々の指示されている四分画におけるＣＤ４＋細胞のパーセンテージを示し、太字はＣＤ２５ｈｉｇｈ／ＣＤ６２Ｌｌｏｗのパーセンテージを示す。これらの再形成されたマウスにおけるＴ細胞応答の分析は、感染ＷＳＸ−１−／−マウスにおけるように、養子移入したＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞がリコール応答の間に高いレベルのＩＦＮ−γを産生したことを明らかにした（図５Ａ）。さらに、ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＦＮ−γを産生する可能性が３倍高く（６７％対２０％）、野生型コホートと比較したとき活性化マーカーの高い発現を有していた（図５Ｂ及び５Ｃ）。これらのデータは、感染に続く機能亢進がＴ細胞に内因性であり、ＷＳＸ−１−／−マウスの付属細胞画分の欠損によるものではないことを指示する。
【０３２３】
（実施例５）
ＷＳＸ−１はインビトロでのＴｈ１分化のために必要ではない
上記で提示したデータと異なって、これまでの報告は、ＩＬ−２７／ＷＳＸ−１が最適Ｔｈ１分化のために必要であると示唆してきた。それ故、ＷＳＸ−１欠損のＣＤ４＋Ｔ細胞応答への影響をさらに評価するためにインビトロ試験を実施した。未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞を非感染野生型又はＷＳＸ−１−／−脾臓から精製し、ＣＦＳＥで染色して、（Ａ）非極性化条件（α−ＩＬ−１２及びα−ＩＬ−４）又は（Ｂ）Ｔｈ１極性化条件（ｒＩＬ−１２プラスα−ＩＬ−４）下で、可溶性αＣＤ３（０．１μｇ／ｍｌ）及びαＣＤ２８（０．５μｇ／ｍｌ）で活性化した。最初に、７２時間の培養後、上清を収集し、ＩＦＮ−γの分泌レベルをＥＬＩＳＡによって測定した。次に、同じ培養からの残りの細胞をＰＭＡ及びイオノマイシンで４時間刺激した後、ＣＦＳＥ及びＣＤ４と組み合わせてＩＦＮ−γに関する細胞内染色を実施した。ＣＦＳＥプロフィールに基づき、各々の個別世代における細胞数を算定し、中性（Ａ）及びＴｈ１（Ｂ）極性化条件下での野生型及びＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞に関するデータを各々の表に示している。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、すべての培養においてＩＬ−２７ｐ２８及びＥＢＩ３  ｍＲＮＡの高い発現を明らかにし、これらの試験におけるＩＬ−２７の存在の可能性が高いことを指示した。未処置野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞を非極性化条件下で（αＩＬ−１２、αＩＬ−４）活性化したとき、小さな割合の野生型細胞がＩＦＮ−γの産生にコンピテントとなり、上清中に低濃度のタンパク質が検出された（図６Ａ）。平行培養中で、低いパーセンテージのＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γに関して陽性染色されたが、ＩＦＮ−γはほとんど全く分泌されなかった（図６Ａ）。細胞分化を追跡するためにＣＦＳＥ標識を使用することにより、ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の小さいが再現可能な増殖能力の上昇を認めた（図６Ａ）。それ故、これまでの試験と一致して、ＩＬ−２７／ＷＳＸ−１は、非極性条件下で活性化された未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの最適産生のために必須である。しかし、他のエフェクター機能の調節におけるＩＬ−２７／ＷＳＸ−１の役割は、ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の小さいが再現可能な増殖能力の上昇によって明らかにされた（図６Ａ）。
【０３２４】
未処置野生型とＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ１極性条件下で（αＩＬ−１２、αＩＬ−４）分化したとき、ＩＦＮ−γを産生する野生型とＷＳＸ−１−／−細胞のパーセンテージには有意差がなかった（図６Ｂ）。しかし、同じ培養物からの上清の分析は、ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞が野生型コホートよりも２〜３倍多くのＩＦＮ−γを分泌したことを明らかにした（図６Ｂ）。
【０３２５】
さらに、ＷＳＸ−１−／−培養物からのＣＤ４＋Ｔ細胞では増殖の著明な上昇も認められた（図６Ｂ）。これらのデータは、Ｔｈ１条件下で活性化されたとき、野生型とＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞はＩＦＮ−γの同様の発生率を生じさせるが、高い増殖の故に、より多くの総ＷＳＸ−１欠損ＩＦＮ−γ細胞が蓄積し、それによって分泌タンパク質濃度の有意の上昇を導くことを指示する。それ故、インビトロで又はトキソプラズマ原虫によるインビボでの感染の間に強い極性化ＩＬ−１２濃度が存在する場合、ＩＦＮ−γ産生を高めるＩＬ−２７／ＷＳＸ−１の能力が過剰になる。さらに、これらのデータは、ＩＬ−２７／ＷＳＸ−１は、増殖及びサイトカイン産生のような、いくつかのエフェクター機能の調節において重要な役割を果たすが、ＷＳＸ−１欠損ＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ１分化における内因性の欠陥を有していないことを明らかにする。
【０３２６】
（実施例６）
ＩＬ−２７シグナル伝達は異種ＳＴＡＴ活性化を導く
上記で提示したデータは、野生型とＷＳＸ−１−／−マウスの両方が、トキソプラズマ原虫による感染後に活発なＴｈ１型防御応答を発現するが、野生型マウスがこの応答を下方調節できるのに対し、ＷＳＸ−１−／−マウスはそれができないことを明らかにしている。さらに、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を下方調節できないことは、ＷＳＸ−１−／−マウスにおける感染誘導性の死亡に寄与する。これらの試験は、ＷＳＸ−１−／−マウスで認められる重症免疫疾患についての細胞機序を提供するが（図１Ｈ）、それらは、組換えＩＬ−２７がＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ応答を増強しうることを示したこれまでの試験と一致しない。それ故、Ｔ細胞機能へのＩＬ−２７／ＷＳＸ−１の刺激及び阻害作用についての基礎を探索するために、未処置ＣＤ４５ＲＢＨｉ  ＣＤ４＋Ｔ細胞をインビトロでｒＩＬ−２７によって処理し、このサイトカインによって活性化されるシグナル伝達経路を検討した。未処置ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉＴ細胞を野生型脾臓から選別し、一晩休息させて、その後ｒＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ又はｒＩＬ−２７（すべて５０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。次に細胞を溶解し、全又はチロシンリン酸化ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−３及びＳＴＡＴ−５をウエスタンブロット法によって検出した。ＷＳＸ−１と他のクラスＩサイトカイン受容体の構造的相同性に基づき、ＩＬ−２７はＪａｋ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化すると考えられた。細胞を様々なサイトカインで刺激し、ＳＴＡＴ１、３及び５をリン酸化する能力を評価した。ＩＬ−２又はＩＬ−１２による未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞の刺激はＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３又はＳＴＡＴ５を活性化することができず、一方外来性ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γはＳＴＡＴ１とＳＴＡＴ３の活性化をもたらしたが、ＳＴＡＴ５は活性化しなかった。
【０３２７】
これに対し、ＩＬ−２７による刺激はＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−３及びＳＴＡＴ−５のチロシンリン酸化の上昇を導いた（図７）。これらのデータは、ＷＳＸ−１シグナル伝達がＳＴＡＴ−１のリン酸化を導くという最近の報告（Ｈｉｂｂｅｒｔ等，２００３年；Ｔａｋｅｄａ等，２００３年）と一致するが、ＩＬ−２７が未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞においてＳＴＡＴ−３及びＳＴＡＴ−５も活性化できるという所見は、ＩＬ−２７／ＷＳＸ−１によって使用されるシグナル伝達経路についての我々の知識を拡大するものである。
【０３２８】
（実施例７）
ネズミ鞭虫による感染はＩＬ−２７  ｍＲＮＡ発現の上昇を導く
これまでの試験は、マクロファージ及びＤＣ系統がＬＰＳ刺激後にＩＬ−２７  ｍＲＮＡの発現を上昇させることを明らかにした。加えて、原生動物病原体、トキソプラズマ原虫による感染後にＩＬ−２７／ＷＳＸ−１  ｍＲＮＡの上方調節がインビボで報告されている。しかし、蠕虫寄生生物による感染などのＴｈ２誘導性刺激への暴露後のＩＬ−２７／ＷＳＸ−１の発現についてはほとんど知られていなかった。野生型Ｃ５７Ｂ／６マウスを経口的にネズミ鞭虫に感染させ、感染後０（すなわち非感染）、７及び１４日目に、ｍＲＮＡをＭＬＮから単離し、ＩＬ−２７ｐ２８、ＥＢＩ３、ＷＳＸ−１及びβ−アクチンの発現を定量するためにＲＴ−ＰＣＲを実施した。野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスをネズミ鞭虫に１４日間感染させ、腸内幼虫負荷を顕微鏡によって検査した。野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスをネズミ鞭虫に１４日間感染させ、ＭＬＮ細胞を単離して、ネズミ鞭虫抗原、５０ｇ／ｍｌで４８時間刺激した。分泌されたＩＬ−４及びＩＬ−５の濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。ネズミ鞭虫による野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの経口的攻撃誘発は、感染後１８〜２１日の間に鞭虫の排出を導く防御的Ｔｈ２応答の生成をもたらした。感染後０、７及び１４日目のＣ５７ＢＬ／６マウスの排出ＭＬＮ中のＷＳＸ−１、ＥＢＩ３及びＩＬ−２７ｐ２８  ｍＲＮＡのレベルを分析するためのＲＴ−ＰＣＲの使用は、ＷＳＸ−１及びＥＢＩ３についてのｍＲＮＡのレベルは構成的であるが、ＩＬ−２７ｐ２８  ｍＲＮＡのレベルにはネズミ鞭虫感染後に著明な上昇があったことを明らかにした。合わせて考慮すると、これらのデータは、ネズミ鞭虫による感染に応答して、この寄生生物に対する免疫応答を調節しうるＩＬ−２７の産生が存在することを明らかにする。
【０３２９】
（実施例８）
ＷＳＸ−１−／−マウスの感染はＴｈ２応答の増強によって媒介される鞭虫排出促進を導く
ネズミ鞭虫に対する免疫におけるＩＬ−２７／ＷＳＸ−１相互作用の役割を評価するために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６及びＷＳＸ−１−／−マウスに感染卵を接種し、感染後２１日目に鞭虫負荷を測定した。この時点で、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは鞭虫を排出しており、ＷＳＸ−１−／−マウスは類似の表現型を示した。これらのデータは、ＷＳＸ−１−／−マウスがネズミ鞭虫に対する防御免疫を発現しうることを明らかにしたが、ＷＳＸ−１の不在がこの応答の動態に影響を及ぼしたかどうかは不明であった。それ故、野生型とＷＳＸ−１−／−マウスをネズミ鞭虫で攻撃誘発し、感染後１４日目に鞭虫負荷を評価した。この時点で、感染野生型マウスは高い数のネズミ鞭虫ウイルスを保有しており、防御的Ｔｈ２応答がまだ確立されていなかったことを指示した。これに対し、この早い時点で、感染ＷＳＸ−１−／−マウスは寄生幼虫を排出していた。
【０３３０】
ＷＳＸ−１−／−マウスにおけるネズミ鞭虫に対する抵抗性増強がＴｈ２応答の上昇に関連するかどうかを調べるために、感染後１４日目に野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからＭＬＮ細胞を単離し、寄生生物特異的サイトカイン応答を分析した。感染ＷＳＸ−１−／−マウスからのＭＬＮ細胞は、感染野生型マウスからの細胞と比較して有意に高いレベルのＩＬ−４及びＩＬ−５を分泌した。ＷＳＸ−１−／−マウスで認められたネズミ鞭虫に対する抵抗性増強が２型エフェクターサイトカイン応答によるものであったかどうかを確認するため、αＩＬ−４  ｍＡｂを感染ＷＳＸ−１−／−マウスに投与した。感染の１４日後、αＩＬ−４による処置は、野生型とＷＳＸ−１−／−マウスにおいて同等の感染確立を導いた。これらのデータは、ＷＳＸ−１−／−マウスにおいて、Ｔｈ２応答の上昇がネズミ鞭虫に対する抵抗性増強を媒介することを指示する。
【０３３１】
（実施例９）
ＷＳＸ−１の不在下での杯細胞及びマスト細胞応答の増強
我々は、ネズミ鞭虫に対する抵抗性のために必要な防御的Ｔｈ２型応答の発現が杯細胞過形成及びマスト細胞症に関連することを確認した。ネズミ鞭虫に対するＷＳＸ−１−／−マウスの抵抗性増強についての基礎をより良く理解するために、いくつかのアプローチを使用して、野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて腸杯細胞及びマスト細胞応答を比較した。杯細胞ムチンを視覚化するために染色したマウス腸組織の組織学的切片の分析は、非感染野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて同様の数の杯細胞が認められることを明らかにした。しかし感染後１４日目に、野生型マウスは感染誘導性杯細胞過形成の徴候を示さなかったのに対し、ＷＳＸ−１−／−マウスは腸杯細胞過形成及びムチン産生の劇的な上昇を示した。
【０３３２】
これらの杯細胞応答をさらに特徴付けるために、ウエスタンブロット法及び免疫組織化学を使用して、Ｔｈ２応答の間に刺激される杯細胞特異的タンパク質、ＲＥＬＭβの発現を検討した。これらの試験は、非感染野生型マウスが無視しうるレベルのＲＥＬＭβしか発現しないのに対し、非感染ＷＳＸ−１−／−マウスはこのタンパク質のより高いレベルを発現することを明らかにした。さらに、感染の１４日後に、野生型マウスはこのタンパク質の低いレベルを発現し、ＷＳＸ−１−／−マウスはＲＥＬＭβレベルの著明な上昇を示した。合わせて考慮すると、これらの試験は、ＷＳＸ−１−／−マウスがネズミ鞭虫による感染後に杯細胞応答の増強を示すことを明らかにしており、これらのデータは、これらのマウスにおけるＴｈ２応答の上昇及びこの寄生生物に対する抵抗性増強と一致する。
【０３３３】
腸マスト細胞を視覚化するために染色した組織学的切片の分析は、非感染野生型とＷＳＸ−１−／−マウスが同様の数のマスト細胞を有することを明らかにした。感染の１４日後、腸杯細胞の検出のために盲腸中央部切片を染色し、１００クリプト単位当りの杯細胞の数を顕微鏡検査によって計数した。感染後１４日目に、野生型マウスではこれらの数は有意に上昇しなかったのに対し、ＷＳＸ−１−／−マウスはマスト細胞数の著名な上昇を示した。この感染誘導性マスト細胞症は、同じ時点で野生型マウスでは認められなかったマスト細胞プロテアーゼの血清レベル上昇を伴った。これらのデータは、ネズミ鞭虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスが、寄生生物特異的Ｔｈ２応答及びこの寄生生物に対する抵抗性増強の確立と相関する、強いマスト細胞応答を発現することを確認するものである。感染ＷＳＸ−１−／−マウスで認められたマスト細胞症はＴｈ２応答増強の結果であろうと思われたが、マスト細胞と脾ＣＤ４＋Ｔ細胞に関するＷＳＸ−１のレベルの比較は、マスト細胞が高レベルのＷＳＸ−１を発現することを明らかにし、これらの結果は、ＷＳＸ−１がマスト細胞機能の調節において直接の役割を有しうることを指示した。
【０３３４】
マスト細胞応答の調節におけるＷＳＸ−１の役割をインビボでより直接的に評価するために、野生型とＷＳＸ−１−／−マウスを使用して、受身皮膚アナフィラキシーのＩｇＥ媒介性マスト細胞依存モデルにおいてマスト細胞応答を検定した。これらの試験では、野生型とＷＳＸ−１−／−マウスを抗ＤＮＰ−ＩｇＥの皮内注射でプライムし、２４時間後にエバンスブルー溶液中のＤＮＰ−ＢＳＡで攻撃誘発した。再攻撃誘発は、アナフィラキシーと、血管透過性の大きな変化をもたらすマスト細胞由来の伝達物質の迅速な放出を導き、エバンスブルーの血管外遊出は血漿滲出の代理マーカーを提供する。これらのアッセイにおいて、再攻撃誘発は野生型マウスにおいてエバンスブルーの血管外遊出を導いたが、これらのレベルはＷＳＸ−１の不在下で有意に上昇した：野生型、ｎ＝１１；ＷＳＸ−１−／−、ｎ＝１０、ｐ＝０．００３６  ステューデントｔ検定。合わせて考慮すると、これらの試験は、ＷＳＸ−１がマスト細胞応答の負の調節因子として働きうることを明らかにする。
【０３３５】
（実施例１０）
ＷＳＸ−１−／−マウスにおける増強されたＴｈ２応答及びネズミ鞭虫の迅速な排出はＩＦＮ−γ産生の欠損とは無関係である
合わせて考慮すると、上記で論じた試験は、ＷＳＸ−１−／−マウスがネズミ鞭虫に対する抵抗性増強を発現することを明らかにしているが、これらの所見は、Ｔｈ２応答上昇の基礎となる機構を取り上げていない。ＩＬ−２７／ＷＳＸ−１はＩＦＮ−γの産生を促進することができるので、ＷＳＸ−１−／−マウスでのＴｈ１応答の一次欠損が感染マウスにおいてそれに準じたＴｈ２応答を導く可能性がある。この仮説は、ＩＬ−１２とＩＦＮ−γが、ネズミ鞭虫による慢性感染後の防御的Ｔｈ２サイトカイン応答の発現を損傷しうることを明らかにした試験によって裏付けられる。
【０３３６】
ＩＦＮ−γの産生の欠損が感染ＷＳＸ−１−／−マウスにおけるＴｈ２応答上昇に寄与するかどうかを調べるために、１４日間感染させた野生型又はＷＳＸ−１−／−マウスからのＭＬＮ細胞がＩＦＮ−γを産生する能力を評価した。１４日間感染させた野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからのＭＬＮ細胞を単離し、前述したようにαＣＤ３／αＣＤ２８で４８時間刺激した。細胞を、表面ＣＤ４と組み合わせて細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した。これらの実験において、ネズミ鞭虫Ａｇによる刺激は無視しうるレベルのＩＦＮ−γの産生を生じた。しかし、αＣＤ３によるこれらの動物からのＭＬＮ細胞の刺激は、野生型対照と比較したとき、ＩＦＮ−γを産生するＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞のより高い発生率が存在することを明らかにした。これらの所見は、ネズミ鞭虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスにおいてＩＦＮ−γ産生の早期欠損が存在しないことを示しており、インビボでＷＳＸ−１非依存性ＩＦＮ−γ応答を特定した最近の報告と一致する。それにもかかわらず、ＩＦＮ−γ産生の欠損が２型免疫の加速を生じさせるかどうかを調べるために、Ｔｈ１応答の不在が、ネズミ鞭虫に感染した野生型マウスにおけるサイトカイン産生と鞭虫排出にどのように影響するかを評価するための試験を実施した。
【０３３７】
野生型マウスを、感染の前及び感染の間にαＩＬ−１２プラスαＩＦＮ−γで処置し、感染後１４日目に応答を観測した。野生型マウスをネズミ鞭虫で攻撃誘発し、感染後０、４、８及び１２日目に中和αＩＬ−１２及びαＩＦＮ−γ  ｍＡｂ、２ｍｇ／用量で処置した。感染の１４日後に、未処置野生型、未処置ＷＳＸ−１−／−及びｍＡｂ処置野生型マウスからＭＬＮ細胞を単離した。すべての群について、平均腸内幼虫負荷を顕微鏡検査によって測定し、３つの独立した実験の代表とする。細胞をネズミ鞭虫Ａｇで刺激し、分泌されたＩＬ−５とＩＬ−１３の濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。これらの試験において、αＩＬ−１２及びαＩＦＮ−γの投与はＩＬ−５及びＩＬ−１３の小さな上昇をもたらしたが、これらのレベルはＷＳＸ−１−／−マウスで認められたものよりも著明に低かった。さらに、ＷＳＸ−１−／−マウスと異なって、αＩＬ−１２プラスαＩＦＮ−γによる処置は、杯細胞過形成、ＲＥＬＭβの発現上昇又はネズミ鞭虫の迅速な排出をもたらさなかった。ＩＦＮ−γ−／−マウスをネズミ鞭虫で攻撃誘発したときも同様の結果が得られた。合わせて考慮すると、これらの試験は、ＷＳＸ−１−／−マウスで認められた２型応答増強は、野生型マウスにおけるインビボでのＴｈ１応答の遮断後には再現されないことを明らかにし、ネズミ鞭虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスで認められるＴｈ２応答の増強がＩＦＮ−γ産生の欠損とは無関係であることを示している。
【０３３８】
（実施例１１）
インビトロでのＩＬ−２７／ＷＳＸ−１によるＴｈ２応答の阻害
上記に提示したデータは、ネズミ鞭虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスにおけるＴｈ２応答の増強を明らかにしているが、これがＴ細胞機能への直接作用によるものであるかどうかは不明であった。この問題を調べるために、ＷＳＸ−１の不在又はＩＬ−２７の添加が、内因性Ｔｈ１応答が遮断されるＴｈ２極性化条件下でＣＤ４＋Ｔ細胞応答の発現にどのような影響を及ぼすかを測定する試験を実施した。
【０３３９】
未処置野生型及びＷＳＸ−１−／−脾細胞をＴｈ２極性化条件下にαＣＤ３プラスαＣＤ２８で刺激し、αＩＬ−１２、ｒＩＬ−４及びＣＤ４＋Ｔ細胞増殖とサイトカイン産生を検定した。ポリクローナル刺激は、これらの培養においてＩＬ−２７  ｍＲＮＡのレベル上昇及び野生型細胞におけるＷＳＸ−１についてのｍＲＮＡの持続発現に結びつき、インビトロでの機能的ＩＬ−２７／ＷＳＸ−１シグナル伝達の存在を示唆した。一次刺激のために、野生型とＷＳＸ−１−／−脾細胞を非感染マウスから単離し、Ｔｈ２極性化条件下に可溶性αＣＤ３／αＣＤ２８で活性化した。７２時間後、細胞を、表面ＣＤ４と組み合わせて細胞内ＩＬ−４に関して染色した。３日間の一次刺激後、ＩＬ−４に関する細胞内染色は、ＩＬ−４＋である野生型とＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の同等の発生率を明らかにした。
【０３４０】
二次刺激のために、野生型又はＷＳＸ−１−／−脾細胞を前記のように９６時間活性化し、洗浄して、計数し、中性条件下に平板結合αＣＤ３、１ｇ／ｍｌで再刺激した。２４時間後、ＩＬ−５及びＩＬ−１３の分泌濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。増殖アッセイのために、未処置野生型及びＷＳＸ−１−／−脾細胞をＣＦＳＥで標識した後、前記のように一次刺激を与えた。これらの細胞の二次刺激後、無視しうるレベルのＩＬ−４タンパク質が検出されたが、野生型培養と比較してＷＳＸ−１−／−ではＩＬ−５及びＩＬ−１３産生の有意の上昇が存在した。培養中での３又は４日後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖をフローサイトメトリーによって視覚化した。３又は４日間の一次刺激中に第１〜６増殖世代における細胞数を計数する。結果は４つの独立した実験を代表する。一次刺激の間の増殖応答の分析は、刺激後３日目に、第１から第４増殖世代において存在するＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加があったことを明らかにした。刺激後４日目までに、ＷＳＸ−１−／−ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答増強はさらに一層明白となり、第５及び第６世代で認められるＷＳＸ−１−／−Ｔ細胞のパーセンテージは著明に上昇した。さらに、少なくとも１増殖サイクルを受けることによって抗原刺激に応答した細胞のパーセンテージの指標である、応答ＣＤ４＋Ｔ細胞の発生率が、野生型培養と比較してＷＳＸ−１−／−においてより高かった：野生型、３４％；ＷＳＸ−１−／−、４６％。ＷＳＸ−１の不在下で認められるＴｈ２応答増強と一致して、組換えＩＬ−２７を野生型ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養に添加したとき、生産されるＩＬ−４レベルの著明な低下が認められた。しかし、これらの実験において、これらの作用は増殖レベルの低下には結びつかなかった。合わせて考慮すると、これらのインビトロ試験は、ＩＬ−２７／ＷＳＸ−１相互作用はＴｈ２エフェクター細胞機能の負の調節因子であり、ネズミ鞭虫による感染後にＷＳＸ−１−／−マウスで認められるＴｈ２応答増強の基礎であることを指示する。
【０３４１】
図９〜１３は、模擬形質移入又はＩＬ−２７形質移入２９３細胞のいずれかからの馴化培地で刺激した野生型及びＷＳＸ−１ノックアウトマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。ＩＬ−２７シグナル伝達の測定及び応答細胞の細胞系統を特定するための表面マーカーとして、細胞内ホスホ−ＳＴＡＴ１に関して細胞を染色している。データは、全血において、２つの主要細胞型が応答することを示す；ＣＤ４Ｔ細胞、及び現在のところはその散乱特性によってのみ特性付けられているが、非リンパ系の性質を持つと思われる細胞型、マスト細胞又はおそらく好塩基球。図１４は、血管透過性の測定である６１０ｎｍで読み取ったＯＤを示す。このデータは、これら２つの主要細胞型がＩＬ−２７受容体を発現するだけでなく、ＩＬ−２７Ｒが両方の細胞型に関して機能的にコンピテントであることを示す。
【０３４２】
前記のように本発明を説明したが、本発明が多くの方法で修正又は改変されうることは明白である。そのような修正及び改変は本発明の精神と範囲からの逸脱とみなされるべきではなく、そのような修正及び改変はすべて特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０３４３】
【図１Ａ】ＩＬ−２８ｐ２８、ＥＢＩ３、ＷＳＸ−１及びβ−アクチンについてのｍＲＮＡの発現レベルを示すタンパク質ゲルを表わす写真である。
【図１Ｂ】トキソプラズマ原虫に感染した野生型、ＷＳＸ−１−／−及びＩＬ−１２ｐ４０−／−マウスの生存時間を示すグラフである。
【図１Ｃ】トキソプラズマ原虫に感染した細胞のパーセンテージを示すグラフである。
【図１Ｄ】トキソプラズマ原虫に感染したＷＳＸ−１−／−マウスの生存率を示すグラフである。
【図１Ｅ−Ｈ】感染前及び１２日間感染した後の野生型及びＷＳＸ−１−／−動物の肝組織を示す組織スライドである。
【図１Ｆ】感染前及び１２日間感染した後の野生型及びＷＳＸ−１−／−動物の肝組織を示す組織スライドである。
【図１Ｇ】感染前及び１２日間感染した後の野生型及びＷＳＸ−１−／−動物の肝組織を示す組織スライドである。
【図１Ｈ】感染前及び１２日間感染した後の野生型及びＷＳＸ−１−／−動物の肝組織を示す組織スライドである。
【図２Ａ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおける感染後０、７及び１１日目のＩＬ−１２ｐ４０の循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｂ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて可溶性トキソプラズマ抗原と共に培養した脾細胞におけるＩＬ−１２ｐ４０の循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｃ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて平板結合αＣＤ３抗体と共に培養した脾細胞におけるＩＬ−１２ｐ４０の循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｄ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおける感染後０、７及び１１日目のＩＦＮ−γの循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｅ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて可溶性トキソプラズマ抗原と共に培養した脾細胞におけるＩＦＮ−γの循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｆ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて平板結合αＣＤ３抗体と共に培養した脾細胞におけるＩＦＮ−γの循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｇ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて可溶性トキソプラズマ抗原と共に培養した脾細胞におけるＩＬ−１０の循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｈ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて平板結合αＣＤ３抗体と共に培養した脾細胞におけるＩＬ−１０の循環レベルを示すグラフである。
【図２Ｉ】野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスにおいて平板結合αＣＤ３抗体と共に培養した脾細胞におけるＩＬ−２産生を示すグラフである。
【図２Ｊ】トキソプラズマ原虫に感染させた野生型、ＷＳＸ−１−／−及びＩＬ−１０−／−マウスの生存率を示すグラフである。
【図２Ｋ】感染前及び感染後１０日目の野生型、ＷＳＸ−１−／−及びＩＬ−１０−／−マウスからの脾細胞におけるＩＬ−１２ｐ４０濃度を示すグラフである。
【図２Ｌ】感染前及び感染後１０日目の野生型、ＷＳＸ−１−／−及びＩＬ−１０−／−マウスからの脾細胞におけるＩＦＮ−γ濃度を示すグラフである。
【図３Ａ】０、７及び１０日間感染させた野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの脾細胞を示す、ＣＤ４及び細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した一連のフローサイトメトリー写真である。
【図３Ｂ】１１日間感染させた野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの脾細胞を示す、ＣＤ４及び細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した一連のフローサイトメトリー写真である。
【図４Ａ】０、７及び１０日間感染させた野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの脾細胞を示す、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２Ｌの発現に関して染色した一連のフローサイトメトリー写真である。
【図４Ｂ】感染させ、感染後０、１０及び１４日目の犠牲に先立って３日間治療した野生型及びＷＳＸ−１−／−マウスからの脾細胞を示す、ＣＤ４及びＢｒｄＵの組込みに関して染色した一連のフローサイトメトリー写真である。
【図５Ａ】ＲＡＧ−２−／−マウスに養子免疫移入した野生型及びＷＳＸ−１−／−細胞におけるＩＦＮ−γ産生を示す一対のグラフである。
【図５Ｂ】感染後１１日目に単離した脾細胞を示す、ＣＤ４及び細胞内ＩＦＮ−γに関して染色した一対のフローサイトメトリー写真である。
【図５Ｃ】感染後１１日目に単離した脾細胞を示す、ＣＤ４、ＣＤ２５及びＣＤ６２Ｌに関して染色した一対のフローサイトメトリー写真である。
【図６Ａ】非感染野生型又はＷＳＸ−１−／−脾臓から精製した未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す、ＣＦＳＥで染色し、非極性化条件下に可溶性αＣＤ３で活性化した、フローサイトメトリー写真と２つのグラフである。
【図６Ｂ】非感染野生型又はＷＳＸ−１−／−脾臓から精製した未処置ＣＤ４＋Ｔ細胞を示す、ＣＦＳＥで染色し、極性化条件下にＴｈ１可溶性αＣＤ３で活性化した、フローサイトメトリー写真と２つのグラフである。
【図７】ｒＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−γ又はｒＩＬ−２７による未処置ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢｈｉＴ細胞の刺激後に検出された、総及びチロシンリン酸化ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５を示すウエスタンブロット法の写真である。
【図８】ＷＳＸ−１に対する抗体で免疫沈降させた一次骨髄由来マウスマスト細胞、自発的不朽化ＢＭ由来マウスマスト細胞系（Ｔ＊）又はＣＤ４＋脾細胞（９×１０ｅ６）を示す写真である。ブロットを同じ抗ＷＳＸ−１抗体でプローブした。
【図９】模擬形質移入又はＩＬ−２７形質移入２９３細胞のいずれかからの馴化培地で刺激した野生型及びＷＳＸ−１ノックアウトマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。細胞は、ＩＬ−２７シグナル伝達の測定及び応答細胞の細胞系統を特定するための表面マーカーとして、細胞内ホスホ−ＳＴＡＴ１に関して染色している。データは、全血中で、２つの主要細胞型が応答することを示している：ＣＤ４  Ｔ細胞、及び現在はその散乱特性だけによって特徴付けられているが、非リンパ系の性質を持つと思われる細胞型：マスト細胞又はおそらく好塩基球。このデータは、これら２つの主要細胞型がＩＬ−２７受容体を発現するだけでなく、ＩＬ−２７Ｒが両方の細胞型に関して機能的にコンピテントであることを示している。
【図１０】模擬形質移入又はＩＬ−２７形質移入２９３細胞のいずれかからの馴化培地で刺激した野生型及びＷＳＸ−１ノックアウトマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。細胞は、ＩＬ−２７シグナル伝達の測定及び応答細胞の細胞系統を特定するための表面マーカーとして、細胞内ホスホ−ＳＴＡＴ１に関して染色している。データは、全血中で、２つの主要細胞型が応答することを示している：ＣＤ４  Ｔ細胞、及び現在はその散乱特性だけによって特徴付けられているが、非リンパ系の性質を持つと思われる細胞型：マスト細胞又はおそらく好塩基球。このデータは、これら２つの主要細胞型がＩＬ−２７受容体を発現するだけでなく、ＩＬ−２７Ｒが両方の細胞型に関して機能的にコンピテントであることを示している。
【図１１】模擬形質移入又はＩＬ−２７形質移入２９３細胞のいずれかからの馴化培地で刺激した野生型及びＷＳＸ−１ノックアウトマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。細胞は、ＩＬ−２７シグナル伝達の測定及び応答細胞の細胞系統を特定するための表面マーカーとして、細胞内ホスホ−ＳＴＡＴ１に関して染色している。データは、全血中で、２つの主要細胞型が応答することを示している：ＣＤ４  Ｔ細胞、及び現在はその散乱特性だけによって特徴付けられているが、非リンパ系の性質を持つと思われる細胞型：マスト細胞又はおそらく好塩基球。このデータは、これら２つの主要細胞型がＩＬ−２７受容体を発現するだけでなく、ＩＬ−２７Ｒが両方の細胞型に関して機能的にコンピテントであることを示している。
【図１２】模擬形質移入又はＩＬ−２７形質移入２９３細胞のいずれかからの馴化培地で刺激した野生型及びＷＳＸ−１ノックアウトマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。細胞は、ＩＬ−２７シグナル伝達の測定及び応答細胞の細胞系統を特定するための表面マーカーとして、細胞内ホスホ−ＳＴＡＴ１に関して染色している。データは、全血中で、２つの主要細胞型が応答することを示している：ＣＤ４  Ｔ細胞、及び現在はその散乱特性だけによって特徴付けられているが、非リンパ系の性質を持つと思われる細胞型：マスト細胞又はおそらく好塩基球。このデータは、これら２つの主要細胞型がＩＬ−２７受容体を発現するだけでなく、ＩＬ−２７Ｒが両方の細胞型に関して機能的にコンピテントであることを示している。
【図１３】模擬形質移入又はＩＬ−２７形質移入２９３細胞のいずれかからの馴化培地で刺激した野生型及びＷＳＸ−１ノックアウトマウスからの全血のフローサイトメトリー分析を示すグラフである。細胞は、ＩＬ−２７シグナル伝達の測定及び応答細胞の細胞系統を特定するための表面マーカーとして、細胞内ホスホ−ＳＴＡＴ１に関して染色している。データは、全血中で、２つの主要細胞型が応答することを示している：ＣＤ４  Ｔ細胞、及び現在はその散乱特性だけによって特徴付けられているが、非リンパ系の性質を持つと思われる細胞型：マスト細胞又はおそらく好塩基球。このデータは、これら２つの主要細胞型がＩＬ−２７受容体を発現するだけでなく、ＩＬ−２７Ｒが両方の細胞型に関して機能的にコンピテントであることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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