(57)【要約】哺乳動物細胞（好ましくはヒト細胞）を培養して、組換えタンパク質または内因性タンパク質の産生を改善するための方法が教示される。細胞株（特に初代培養物から確立された細胞株）の増殖および長期生存のための方法もまた提供される。種々のレベルの選択されたアミノ酸を含み、種々の増殖因子および微量元素が補充された細胞培養培地もまた提供される。さらに、これらの培地は、必要に応じて無血清であり、好ましくはグルコース以外のエネルギー源を使用する。これらの培地は、ヒト胎児細胞の初代培養および長期培養に特に適切である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３０００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度で存在するフルクトースから本質的になる一次エネルギー源を有する、無血清細胞培養培地の組成物。
【請求項２】
ｐＨ７．２および重量オスモル濃度２９０ｍＯｓｍを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
さらなる成分として、少なくとも１つの細胞外マトリクス因子を有する、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項４】
ヒト膵臓上皮管細胞の培養に最適化された、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項５】
ヒト腎臓細胞の培養に最適化された、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項６】
ヒト胎児細胞の初代培養物を確立するために最適化された、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項７】
以下のおよそのレベルで以下の成分：
塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０〜２７０（ｍｇ／Ｌ）；塩化カリウム（ＫＣｌ）、１５０〜５００（ｍｇ／Ｌ）；硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、０．００６〜０．０２（ｍｇ／Ｌ）；硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水物）、３０〜１１０（ｍｇ／Ｌ）；塩化マグネシウム−６ＨＯ、１５〜６０（ｍｇ／Ｌ）；およびフルクトース、１０００〜３０００（ｍｇ／Ｌ）
を含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項８】
以下のおよそのレベルで以下の成分：
亜セレン酸ナトリウム（ＮａＳｅＯ３−５Ｈ２Ｏ）、０．００６〜０．０２（ｍｇ／Ｌ）；メタバナジン酸アンモニウム、１．５×１０−４〜５．３×１０−４（ｍｇ／Ｌ）；モリブデン酸−４Ｈ２Ｏ（アンモニウム）、１．５×１０−３〜５．６×１０−３（ｍｇ／Ｌ）；硫酸銅ＩＩ−５Ｈ２Ｏ、３．７５×１０−４〜１．２×１０−３（ｍｇ／Ｌ）；硫酸鉄ＩＩ−７Ｈ２Ｏ、０．１〜０．４（ｍｇ／Ｌ）；硫酸マンガン、２×１０−５〜７×１０−５（ｍｇ／Ｌ）；および硫酸亜鉛−７Ｈ２Ｏ、０．１〜０．４（ｍｇ／Ｌ）
を含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項９】
以下のおよそのレベルで以下の成分：
Ｌ−アラニン、１０〜４０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−アスパラギン（遊離塩基）、８〜３５（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、２〜１０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ、６０〜２５０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−アスパラギン酸、１０〜５０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−シスチン−２ＨＣｌ、３０〜１３０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−システイン−ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ、２〜１５（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−グルタミン酸、２０〜１２０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−グルタミン、３００〜１２００（ｍｇ／Ｌ）；グリシン、１０〜５０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ−Ｈ２Ｏ、１５〜７５（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−イソロイシン、３５〜１５０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−ロイシン、３５〜１５５（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−リジン−ＨＣｌ、５０〜２３０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−メチオニン、１０〜４５（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−フェニルアラニン、２０〜１００（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−プロリン、１５〜８０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−セリン、１５〜７０（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−トレオニン、３５〜１４５（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−トリプトファン、５〜２５（ｍｇ／Ｌ）；Ｌ−チロシン（二ナトリウム塩）、３５〜１５５（ｍｇ／Ｌ）；およびＬ−バリン、３０〜１４０（ｍｇ／Ｌ）
を含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１０】
以下のおよそのレベルで以下の成分：
ビオチン、５．６×１０−３〜１．７×１０−２（ｍｇ／Ｌ）；Ｄ−Ｃａ−パントテネート、１．４〜４．３（ｍｇ／Ｌ）；塩化コリン、３．４〜１０．５（ｍｇ／Ｌ）；葉酸、１．５〜４．８（ｍｇ／Ｌ）；Ｉ−イノシトール、５〜１６（ｍｇ／Ｌ）；ナイアシンアミド、１．０〜４．５（ｍｇ／Ｌ）；ピリドキサールＨＣｌ、１．０〜４．５（ｍｇ／Ｌ）；ピリドキシン−ＨＣｌ、９．２×１０−３〜２．８×１０−２（ｍｇ／Ｌ）；リボフラビン、０．１〜０．５（ｍｇ／Ｌ）；チアミン−ＨＣｌ、１．４〜４．５（ｍｇ／Ｌ）；およびビタミンＢ−１２、０．０２０〜０．０７５（ｍｇ／Ｌ）
を含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１１】
ＨＥＰＥＳ（４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）緩衝液を約５〜５０ｍＭの濃度で含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１２】
以下のおよそのレベル以下で以下の成分：
プトレシン−２ＨＣｌ、０．０２〜０．０８（ｍｇ／Ｌ）；チオクト酸、０．０３〜０．１０（ｍｇ／Ｌ）；ピルビン酸ナトリウム、５５〜１６５（ｍｇ／Ｌ）；およびリノール酸、０．０１〜０．０４（ｍｇ／Ｌ）
を含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１３】
以下のおよそのレベルで以下の成分：
０．１〜１００μｇ／ｍｌの最終濃度の成長ホルモン；０．１〜１００μｇ／ｍｌの最終濃度のトランスフェリン；０．０００５〜０．０５ＩＵ／ｍｌの最終濃度のソマトトロピン；０．１〜１０μｇ／ｍｌの最終濃度の下垂体抽出物；０．５〜１００μｇ／ｍｌの最終濃度のアプロチニン；０．１〜１００ｎｇ／ｍｌそして好ましくは１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度の表皮増殖因子；および０．１〜５０μｇ／ｍｌの最終濃度のフィブロネクチン
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１４】
以下のおよそのレベルで以下の成分：
０．１〜１０μＭの最終濃度のエタノールアミン；０．１〜１０μＭの最終濃度のホスホエタノールアミン；１〜２５ｐＭの最終濃度のトリヨードサイロニン；１〜１００ｎＭの最終濃度のセレン；０．１〜５０ｎＭの最終濃度のヒドロコルチゾン；０．１〜５０μＭの最終濃度のフォルスコリン；および０．１〜５０の最終濃度のヒレグリン
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の細胞培養培地。
【請求項１５】
無血清細胞培養培地の組成物であって、示した最終濃度で存在する以下の成分：
１８０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム、２９８ｍｇ／Ｌの塩化カリウム、０．０１２６ｍｇ／Ｌの硝酸カリウム、６８ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、３７ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム、６２００ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１２００ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４３ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム、８８ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム（二塩基性）、０．０１２６ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、３．５１×１０−４ｍｇ／Ｌのメタバナジン酸アンモニウム、３．７２×１０−３ｍｇ／Ｌのモリブデン酸、７．５×１０−４ｍｇ／Ｌの硫酸銅ＩＩ、０．２５ｍｇ／Ｌの硫酸鉄ＩＩ、４．５３×１０−５ｍｇ／Ｌの硫酸マンガン、０．２５９ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、２０００ｍｇ／Ｌのフルクトース、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０４８ｍｇ／Ｌのプトレシン、０．０６１８ｍｇ／Ｌのチオクト酸、１１０．０３ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、０．０２５ｍｇ／Ｌのリノール酸、２０．１７３ｍｇ／Ｌのｌ−アラニン、１７．５ｍｇ／Ｌのｌ−アスパラギン（遊離塩基）、１２２．０１ｍｇ／Ｌのｌ−アスパラギン、２４．９９ｍｇ／Ｌのｌ−アスパラギン酸、６３．９８ｍｇ／Ｌのｌ−シスチン、５．２６８ｍｇ／Ｌのｌ−システイン、５６．９ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、６００ｍｇ／Ｌのｌ−グルタミン、２３．２５ｍｇ／Ｌのグリシン、３５．６９ｍｇ／Ｌのｌ−ヒスチジン、７４．６８ｍｇ／Ｌのｌ−イソロイシン、７７．４３ｍｇ／Ｌのロイシン、１１３．１６ｍｇ／Ｌのｌ−リジン、２２．３４ｍｇ／Ｌのｌ−メチオニン、４７．６９ｍｇ／Ｌのｌ−フェニルアラニン、３８．３６ｍｇ／Ｌのｌ−プロリン、３２．５５ｍｇ／Ｌのｌ−セリン、７０．０７ｍｇ／Ｌのｌ−トレオニン、１１．８１ｍｇ／Ｌのｌ−トリプトファン、７５．１７ｍｇ／Ｌのｌ−チロシン、６９．３１ｍｇ／Ｌのｌ−バリン、１．１３×１０−２ｍｇ／Ｌのビオチン、２．８７ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａ−パントテネート、６．９９ｍｇ／Ｌの塩化コリン、３．２ｍｇ／Ｌの葉酸、１０．４５ｍｇ／ＬのＩ−イノシトール、２．８１ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド、２．８ｍｇ／Ｌのピリドキサール、１．８５×１０−２ｍｇ／Ｌのピリドキシン、０．２９１ｍｇ／Ｌのリボフラビン、２．９ｍｇ／Ｌのチアミン、４．９９×１０−２ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２
を有する、組成物。
【請求項１６】
細胞の培養のための方法であって、３０００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度で存在するフルクトースから本質的になる一次エネルギー源を有する無血清細胞培養培地に、該細胞の増殖に適切な条件下で細胞を接種する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
前記細胞が、以下の生物学的系：
中枢神経系：脳−大脳（ニューロン、グリアなどを含む、灰白質および白質）および脳−小脳、眼、脳幹（橋、髄質，中脳）、脊髄；内分泌系：副腎（皮質および髄質）、卵巣、膵臓（ランゲルハンス島および外分泌膵）、副甲状腺、下垂体（腺性下垂体および神経下垂体）、精巣、甲状腺（濾胞上皮、傍濾胞細胞、甲状腺膠質など）；胸部系：胸部（小葉、管、筋上皮細胞など）；造血系：脾臓、扁桃、胸腺、骨髄（リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、赤血球前駆体、巨核球、肥満細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、末梢血細胞（好中球、リンパ球、単球、好塩基球、好酸球、赤血球、血小板）；呼吸器系：肺（気管支、細気管支、肺胞など）；心血管系：心臓、血管（動脈、静脈など）；胃腸系：食道、胃（底）、小腸（回腸、空腸または十二指腸）、結腸、肝臓（門脈三管、肝細胞など）、唾液腺；尿生殖器系：腎臓、尿路、膀胱、尿管、尿道、ファローピウス管、膣、胎盤、前立腺、子宮、頸部；筋骨格系：骨格筋；皮膚系：皮膚（表皮、付属器、真皮）；末梢神経系：末梢神経；中皮細胞：胸壁由来の内層細胞、腹壁由来の内層細胞、心膜または胃腸、心臓および／もしくは肺のサンプルの表面由来の内層細胞などの組織
からなる群より選択される組織から単離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞が、哺乳動物胎児組織から単離される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００３年９月１８日出願の米国仮出願第６０／５０４，６７４号の優先権を主張する。米国仮出願第６０／５０４，６７４号は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
発明の分野は、細胞生物学の分野にある。より詳細には、発明の分野は、ヒト組織から単離された細胞を増殖させるための細胞培養培地に関する。特に、発明の分野は、好ましくはフルクトースを主要エネルギー源として含む無血清培養培地に関する。この培地は、初代ヒト細胞培養物の確立および増殖を支持し、そして長期細胞培養に用いられ得る。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インビトロ細胞培養系の使用は、細胞生物学の分野で、そしてヒト疾患の根底にある作用機構の理解に重要である。広範な種々の哺乳動物細胞型は、正常組織または疾患状態の組織（例えば、腫瘍および転移物）のいずれかから、哺乳動物の器官および組織から単離されている。種々の細胞型はしばしば、個々の栄養必要要件を有し、それゆえ、異なる細胞型の栄養必要要件を満たす多くの異なる培地が特異的に開発されている。これらの培地の多くは、血清（例えば、ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）、ＨＳ（ウマ血清）およびＣＳ（仔ウシ血清））を添加物として含む。血清の使用は、細胞を大規模に培養する場合、コストを非常に高くし得る。さらに、血清の使用は、小規模でさえも、問題であり得る。なぜなら、血清は、ロットによって変動し得る、特性がわからない多数の成分を含むからである。さらに、血清は、増殖阻害因子および分化因子を含み、そして遺伝物質を不安定にして、細胞の遺伝的変化、そして最終的には細胞の老化をもたらす（Ｌｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６（４７９８）：２００−２（１９８７年４月１０日）（非特許文献１））。
【０００４】
無血清の化学的に規定された培地の使用は、これらの課題の全てを解決する。Ｆ−１２：ＤＭＥ（１：１  ｖ／ｖ）は、元々、化学的に規定された無血清系中での細胞の増殖のために開発された（Ｍａｔｈｅｒら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２０：１９１−２００，１９７９（非特許文献２）；Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５８：９４−１０９，１９７９（非特許文献３））。この培地は、血清有りまたは無しの条件で、広範な種々の細胞に用いられ得る。培地ＮＣＴＣ−１３５は、無血清細胞培養増殖のために処方された別の培地である（Ｅｖａｎｓら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６：４３９−４４８，１９６４（非特許文献４））。
【０００５】
Ｔｓａｏらは、ヒト表皮細胞の増殖のための、特定の増殖因子およびホルモンを補充した、ＭＣＤＢ  １５２と称される栄養培地を処方した（Ｔｓａｏ，Ｍ．Ｃ．ら，Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１１０：２１９−２２９（１９８２）（非特許文献５））。この培地のさらなる改良は、ＭＣＤＢ  １５３として公知の培地の開発につながる（Ｂｏｙｃｅ，Ｓ．Ｔ．およびＨａｍ，Ｒ．Ｇ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８１：３３−４０（１９８３）（非特許文献６）を参照のこと）。これらの培地の使用は、多能性基底表皮幹細胞の継続した継代についての適切な遺伝的プログラミングを維持するために必要である、高いクローニング効率の保持に必要な増殖因子、ホルモンおよびＣａ２＋についての必要要件のより正確な特徴付けにつながる。Ｗｉｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：３１−４４（１９８４）（非特許文献７）および米国特許第５，８３４，３１２号（特許文献１）ならびにそれらの中で考察される種々の培地もまた参照のこと。
【０００６】
培養において細胞を増殖させるための多くの培地は、文献に記載されているかまたは市販されている。特異的細胞培養での必要性に最適な培地を導くことは、増殖速度の上昇、高い細胞密度への増殖、細胞分化の段階および量の制御、タンパク質分泌の増加、表現型安定性および遺伝的安定性の上昇、ならびに多くの細胞型についての老化の排除を含め、細胞増殖の改善につながり得る。
【０００７】
増殖について細胞培養培地を最適化する際に、グルコースレベルを調節することは、高細胞密度条件における細胞増殖能力を変化させ得る。グルコースレベルはまた、細胞増殖速度に対して重要である。培養中に細胞が代謝するにつれ、乳酸がしばしば解糖の副産物として生成される。これはｐＨの急激な低下につながり、最終的には細胞死を引き起こす。細胞培養培地における主要炭素エネルギー源としてのフルクトースの使用は、理論的に、乳酸の生成減少につながる。
【０００８】
何人かの研究者は、ヒト線維芽細胞のような細胞の増殖および形態学的局面に対するフルクトースとグルコースとの代謝効果を比較した。他の研究者は、フルクトースとガラクトースとを比較した。例えば、Ｄｅｌｈｏｔａｌらは、ヒトの皮膚線維芽細胞および肝臓細胞を培養する際にグルコースの代わりにフルクトースを使用した場合の４〜５倍低いラクテート産生を報告した（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２０（９）：６９９−７０６，１９８４）（非特許文献８）。Ｄｅｌｈｏｔａｌら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２３（５）：３５５−６０（１９８７年５月）（非特許文献９）；Ｗｏｌｆｒｏｍら，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１４９（２）：５３５−４６（１９８３年１２月）（非特許文献１０）；Ｂａｒｎｇｒｏｖｅｒら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ７８：１７３−８９（１９８５）（非特許文献１１）；Ｌｏｗら，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ  ６０：７３−９（１９８５）（非特許文献１２）もまた参照のこと。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのフルクトースまたはグルコースのいずれかを含む細胞培養培地の使用を比較する、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３（３）：１６１−７３（１９９３）（非特許文献１３）もまた参照のこと。これらの研究努力にもかかわらず、グルコースは、大部分の市販の細胞培養処方物において、依然として主な炭素エネルギー源である。
【０００９】
細胞培養研究の大多数は、確立された細胞株を用いるが、初代細胞培養物の使用は、いくつかの場合に好ましい。極めて頻繁に樹立される細胞株は、腫瘍のような疾患状態の組織または染色体変化を起こした細胞から誘導される。インビボの状態から最近取り出されたインビトロでの細胞の特性を研究するために、初代培養物がしばしば必要とされる。器官または組織における細胞間の複雑な相互作用を考慮すると、組織から単離した１つの特定の細胞型から初代培養物を誘導することは、問題があり得る。しかし、１つの特定の細胞型の初代培養物を確立することは、培養培地中に存在する栄養、付着因子および増殖因子の最適化によって達成され得る。
【特許文献１】米国特許第５，８３４，３１２号明細書
【非特許文献１】Ｌｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６（４７９８）：２００−２（１９８７年４月１０日）
【非特許文献２】Ｍａｔｈｅｒら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２０：１９１−２００，１９７９
【非特許文献３】Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ５８：９４−１０９，１９７９
【非特許文献４】Ｅｖａｎｓら，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６：４３９−４４８，１９６４
【非特許文献５】Ｔｓａｏ，Ｍ．Ｃ．ら，Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１１０：２１９−２２９（１９８２）
【非特許文献６】Ｂｏｙｃｅ，Ｓ．Ｔ．およびＨａｍ，Ｒ．Ｇ．，Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８１：３３−４０（１９８３）
【非特許文献７】Ｗｉｌｌｅ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２１：３１−４４（１９８４）
【非特許文献８】Ｄｅｌｈｏｔａｌら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ２０（９）：６９９−７０６，１９８４）
【非特許文献９】Ｄｅｌｈｏｔａｌら，Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２３（５）：３５５−６０（１９８７年５月）
【非特許文献１０】Ｗｏｌｆｒｏｍら，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１４９（２）：５３５−４６（１９８３年１２月）
【非特許文献１１】Ｂａｒｎｇｒｏｖｅｒら，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ７８：１７３−８９（１９８５）
【非特許文献１２】Ｌｏｗら，Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ  ６０：７３−９（１９８５）
【非特許文献１３】Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉら，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３（３）：１６１−７３（１９９３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、種々の組織からの初代哺乳動物細胞培養物の増殖を支持する培養培地を調製することである。本発明の別の目的は、無血清であって小規模細胞培養と大規模細胞培養との両方において使用され得る培養培地を提供することである。多用途であるが規定されていない細胞培養培地は、種々の初代組織から新たな細胞株および資源を作製する目的で極めて有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、好ましくはフルクトースを主要なエネルギー源として含む無血清培養培地を提供する。これらの培養培地は、組織から単離された初代哺乳動物細胞を確立および増殖させるために、そして培養中の確立された細胞株の増殖のために有用である。この培地は、ヒト胎児細胞の初代培養および長期培養に特に適切である。特定の実施形態では、本発明の培地において本発明の方法に従って培養された細胞は、好ましくは、ヒト胎児の膵臓管上皮細胞、腎臓細管上皮細胞、または前立腺上皮細胞である。
【００１２】
本発明に従って細胞を培養する１つの方法は、細胞培養系に細胞を接種する工程、および細胞増殖を促進するために適切な条件下でこの細胞培養系を維持する工程を包含する。約１０〜約４０時間の集団倍加時間は、このような方法において達成された細胞増殖を特徴付ける。さらに、細胞は、継代して培養されて、所望の数の集団倍化が達成され得る。
【００１３】
好ましい実施形態では、この培地は、本明細書中でＩ３Ｆと呼ばれ、そして基本培地栄養、フルクトース、および特定の二価の塩の選択された組合せを含む。
【００１４】
Ｉ３Ｆ培地の１つの特に好ましい実施形態では、以下の成分が示した最終濃度で存在する：１８０ｍｇ／Ｌの塩化カルシウム、２９８ｍｇ／Ｌの塩化カリウム、０．０１２６ｍｇ／Ｌの硝酸カリウム、６８ｍｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、３７ｍｇ／Ｌの塩化マグネシウム、６２００ｍｇ／Ｌの塩化ナトリウム、１２００ｍｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４３ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム、８８ｍｇ／Ｌのリン酸ナトリウム（二塩基性）、０．０１２６ｍｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム、３．５１×１０−４ｍｇ／Ｌのメタバナジン酸アンモニウム、３．７２×１０−３ｍｇ／Ｌのモリブデン酸、７．５×１０−４ｍｇ／Ｌの硫酸銅ＩＩ、０．２５ｍｇ／Ｌの硫酸鉄ＩＩ、４．５３×１０−５ｍｇ／Ｌの硫酸マンガン、０．２５９ｍｇ／Ｌの硫酸亜鉛、２０００ｍｇ／Ｌのフルクトース、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．０４８ｍｇ／Ｌのプトレシン、０．０６１８ｍｇ／Ｌのチオクト酸、１１０．０３ｍｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、０．０２５ｍｇ／Ｌのリノール酸、２０．１７３ｍｇ／Ｌのｌ−アラニン、１７．５ｍｇ／Ｌのｌ−アスパラギン（遊離塩基）、１２２．０１ｍｇ／Ｌのｌ−アスパラギン、２４．９９ｍｇ／Ｌのｌ−アスパラギン酸、６３．９８ｍｇ／Ｌのｌ−シスチン、５．２６８ｍｇ／Ｌのｌ−システイン、５６．９ｍｇ／Ｌのグルタミン酸、６００ｍｇ／Ｌのｌ−グルタミン、２３．２５ｍｇ／Ｌのグリシン、３５．６９ｍｇ／Ｌのｌ−ヒスチジン、７４．６８ｍｇ／Ｌのｌ−イソロイシン、７７．４３ｍｇ／Ｌのロイシン、１１３．１６ｍｇ／Ｌのｌ−リジン、２２．３４ｍｇ／Ｌのｌ−メチオニン、４７．６９ｍｇ／Ｌのｌ−フェニルアラニン、３８．３６ｍｇ／Ｌのｌ−プロリン、３２．５５ｍｇ／Ｌのｌ−セリン、７０．０７ｍｇ／Ｌのｌ−トレオニン、１１．８１ｍｇ／Ｌのｌ−トリプトファン、７５．１７ｍｇ／Ｌのｌ−チロシン、６９．３１ｍｇ／Ｌのｌ−バリン、１．１３×１０−２ｍｇ／Ｌのビオチン、２．８７ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａ−パントテネート、６．９９ｍｇ／Ｌの塩化コリン、３．２ｍｇ／Ｌの葉酸、１０．４５ｍｇ／ＬのＩ−イノシトール、２．８１ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド、２．８ｍｇ／Ｌのピリドキサール、１．８５×１０−２ｍｇ／Ｌのピリドキシン，０．２９１ｍｇ／Ｌのリボフラビン、２．９ｍｇ／Ｌのチアミン、４．９９×１０−２ｍｇ／ＬのビタミンＢ１２。この得に好ましい実施形態のｐＨは、７．２であり、そして重量オスモル濃度は２９０ｍＯｓｍである。これらの成分の濃度は、培養中の特定の細胞型の増殖を最適化するために、本発明の教示に従って適切かつ好ましい範囲内で変動し得る。
【００１５】
本発明の細胞培養培地は、望ましくは、増殖因子が補充され、そして培養が所望される個々の細胞型に従って最適化される。このような補充および最適化は、当該技術範囲内である。いくつかの好ましい実施形態では、本発明は、以下のおよそのレベル（または有効数字１桁内の）にて以下の増殖因子のいずれかまたは全てが補充され得る、細胞培養培地である：１０μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０ｎｇ／ｍｌの（組換えヒトまたは他の供給源および／もしくは種の）表皮増殖因子、０．００５ＩＵ／ｍｌの（ブタまたは他の種の）ソマトトロピン、１μｌ／ｍｌの（ブタまたは他の種の）下垂体抽出物、および１０μｇ／ｍｌのアプロチニン。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の細胞培養培地および細胞培養方法は、ヒト胎児細胞の初代培養物を確立するために特によく適合されている。さらなる特に好ましい実施形態では、本発明は、膵臓組織から単離したヒト膵臓上皮管細胞、前立腺組織から単離したヒト前立腺上皮細胞、または腎臓組織から単離したヒト腎臓上皮細胞の初代培養物を確立する際に培養培地が利用される方法である。他の実施形態では、類似の方法を用いて、他の組織から（例えば、以下の生物学的系の組織からなる群から）単離された細胞が培養される：中枢神経系：脳−大脳（ニューロン、グリアなどを含む、灰白質および白質）および脳−小脳、眼、脳幹（橋、髄質、中脳）、脊髄；内分泌系：副腎（皮質および髄質）、卵巣、膵臓（ランゲルハンス島および外分泌膵）、副甲状腺、下垂体（腺性下垂体および神経下垂体）、精巣、甲状腺（濾胞上皮、傍濾胞細胞、甲状腺膠質など）；胸部系：胸部（小葉、管、筋上皮細胞など）；造血系：脾臓、扁桃、胸腺、骨髄（リンパ球、単球／マクロファージ、顆粒球、赤血球前駆体、巨核球、肥満細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、末梢血細胞（好中球、リンパ球、単球、好塩基球、好酸球、赤血球、血小板）；呼吸器系：肺（気管支、細気管支、肺胞など）；心血管系：心臓、血管（動脈、静脈など）；胃腸系：食道、胃（底）、小腸（回腸、空腸または十二指腸）、結腸、肝臓（門脈三管、肝臓細胞など）、唾液腺；尿生殖器系：腎臓、尿路、膀胱、尿管、尿道、ファローピウス管、膣、胎盤、前立腺、子宮、頸部；筋骨格系：骨格筋；皮膚：皮膚（表皮、付属器、真皮）；末梢神経：末梢神経；中皮細胞：胸壁由来の内層細胞（ｌｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌ）、腹壁由来の内層細胞、心膜または胃腸、心臓および／もしくは肺のサンプルの表面由来の内層細胞など。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、本発明は、１μＭの最終濃度のエタノールアミン、１μＭの最終濃度のホスホエタノールアミン、５ｐＭの最終濃度のトリヨードサイロニン、２５ｎＭの最終濃度のセレン、１ｎＭの濃度のヒドロコルチゾン、１０ｎＭの最終濃度のプロゲステロン、１μＭの最終濃度のフォルスコリン、および１０ｎＭの最終濃度のヒレグリンが補充され得る細胞培養培地である。
【００１８】
なお別の特に好ましい実施形態では、本発明は、細胞外マトリクス因子（例えば、フィブロネクチンまたはラミニン）が補充され得る細胞培養培地である。
【００１９】
別の特に好ましい実施形態では、本発明は、培養培地がヒト膵臓上皮管細胞の培養において利用される方法を包含する。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、胎児腎臓組織から単離されたヒト腎臓細胞（特に胎児腎臓上皮細胞）初代培養物を確立する際に培養培地が利用される方法である。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、本発明は、ヒト胎児腎臓上皮細胞の培養および拡大（２回から８回の継代）において培養培地が利用される方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（好ましい実施形態の説明）
（定義）
用語「細胞培養培地」および「培養培地」とは、脊椎動物細胞が培養において増殖する水性環境をいう。この培地は、生理化学的環境、栄養環境およびホルモン環境を包含する。伝統的に、この培地は、細胞の増殖または生存に必要な栄養因子および増殖因子の添加によって処方されている。
【００２３】
「規定培地」とは、培養において細胞の生存および増殖に必要な栄養必要要件およびホルモン必要要件を含み、その結果、培地成分が既知の培地をいう。本発明の方法によって提供される規定培地は、その培地の通常の環境とは異なり得る、特定の細胞にとっての局所環境を確立する。
【００２４】
表現「細胞の生存を増強する」とは、細胞培養において特定の細胞の生存可能な寿命の持続期間を延長する作用をいう。
【００２５】
語句「細胞の増殖を増強する」とは、細胞培養における細胞分裂の速度および／または程度を、未処理細胞と比較して上昇させる工程を包含する。細胞培養における細胞増殖の増加は、本明細書中に開示される細胞培養培地中で培養する前と後とで細胞数を計数することにより検出され得る。増殖程度は、培養物中の有糸分裂像の百分率および数の顕微鏡検査ならびにコンフルエンシーの程度によって定量され得る。細胞増殖はまた、通常用いられる他の方法によって定量され得る。
【００２６】
用語「長期培養物」とは、適切な栄養および増殖因子を含む培養培地中に配置された場合に、静止状態に入らずに、生存および増殖をし得る細胞をいう。特定の好ましい実施形態では、細胞は「長期培養」において少なくとも好ましくは４０回、より好ましくは６０回の細胞培養集団倍化にわたって継代される。
【００２７】
用語「継代」または「分ける」とは、細胞の継代培養、または新鮮な栄養混合物の添加を伴う１つの培養容器から別の培養容器への細胞の（希釈を伴うかまたは伴わない）移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）もしくは移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）をいう。
【００２８】
用語「初代培養物」とは、組織から直接単離され、互いに解離しており、適切な栄養および増殖因子を含む培養培地中に配置された場合に生存および／または増殖が可能である細胞をいう。
【００２９】
用語「静止状態」とは、培養中の細胞が増殖期になるのが中止されて分裂がとまった状態をいう。
【００３０】
「無血清培地」とは、動物血清を欠く培地をいう。培養中の特定の細胞の生存または増殖に必要である、血清中に代表的に見出されるホルモン、増殖因子、輸送タンパク質、付着因子、ペプチドホルモンなどは、代表的には規定された補充物として無血清培地に添加される。
【００３１】
脊椎動物細胞培養物、特にヒト由来細胞培養物においては、「老化」は、有限の細胞培養、すなわち、有限の集団倍化数を超えて増殖することができないことに寄与し得る特性である。
【００３２】
特定の成分混合物を決定すること、次いで特定の細胞によって必要とされる規定培地を提供することは、細胞培養の当業者によって達成され得る。所定の細胞株についての必要要件を決定するためのいくつかの公知のアプローチが存在する。選り抜きの方法は、細胞株に依存する。適切な接種物密度の選択のみを必要とし、増殖促進効果に関する培地成分の種々の組合せの試験から始まることを必要とする方法についてのバリエーションという、いくつかの可能性は公知である。あるいは、細胞が所望の生成物を生成し、その生成物を培地中に分泌するならば、試験は、所望の生成物の分泌レベルに対するそれらの効果に関する、培地成分の種々の組合せのものであり得る。
【００３３】
培養において哺乳動物細胞を増殖させるために用いられる栄養混合物は代表的に、以下のカテゴリーのうちの１以上からの少なくとも１つの成分を提供する：通常、炭水化物（例えば、グルコースもしくはグルタミン、または他の糖（例えば、スクロース、ガラクトース、マンノース、フルクトースなど））の形態の、炭素源またはエネルギー源、とりわけ窒素を提供する、「必須」アミノ酸および「非必須」アミノ酸、酵素反応における補因子である低濃度のビタミン、低濃度で必要とされる他の有機化合物（例えば、脂肪酸およびリン脂質前駆体を含む、脂肪および脂肪可溶性成分）、低濃度（通常、マイクロモル濃度範囲）で必要とされる、無機化合物と定義される微量元素または天然に存在する元素および無機塩。
【００３４】
細胞培養培地の栄養補充は、当該分野で周知である。無血清培地について通常用いられる補充物の例およびそれらの有効濃度は、ＭａｔｈｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８）の表８．２に示される。本発明の栄養混合物は、公知の方法に従って、例えば以下のカテゴリーによる、１以上の成分が必要に応じて補充され得る：ホルモンおよび他の増殖因子（例えば、インスリン、テストステロン、トランスフェリンおよび表皮増殖因子）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ（４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジン−エタンスルホン酸；４−［２−Ｈｙｄｒｏｘｅｔｈｙｌ］−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｒｉｃ  ａｃｉｄ））および細胞外マトリクスタンパク質（例えば、フィブロネクチン）。
【００３５】
培養培地は、種々の間隔で（例えば、ほぼ１日に１回から５日に１回）取替えられ得、そして細胞は、約３３℃〜約３８℃の間、好ましくは約３７℃の、生理学的に受容可能な温度で培養され得る。
【００３６】
本発明の細胞培養系は、本明細書中に記載されたとおりの細胞培養培地、および現在一般に使用されるかまたは本明細書以下で同定される基板のような、細胞についての基板（例えば、金属を含む基板、プラスチックを含む基板、ポリウレタン型ポリマーを含む基板、ガラスを含む基板、コラーゲンを含む基板、ゲルを含む基板、中空繊維を含む基板、フィブロネクチンを含む基板、ラミニンを含む基板、ヘパリン硫酸、プロテオグリカンを含む基板、上記のいずれかから構成されるかもしくは上記のいずれかでコーティングされたマイクロキャリア、または組織等価物）を含む。本発明における使用のための細胞培養系の選択は、細胞培養物が供される剪断力、気体環境、ならびに提供される細胞および培地の特定の必要要件を考慮に入れて、当該分野で一般に公知の方法に従って行われる。
【００３７】
本発明の細胞培養培地は、組織培養ディッシュ、チューブ、ウェル、中空繊維バイオリアクター、発酵槽、スピナーフラスコ、回転瓶などにおける使用に特によく適合している。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、フルクトースを主な炭素エネルギー源として含む無血清細胞培養培地を記載する。本発明の開発は、この細胞培養培地が、種々のヒト組織由来の初代培養物の確立および増殖を支持し得るという知見に一部基づく。この最も広い形態では、本発明は、主な炭素源としてのフルクトースならびに特定のレベルのカルシウム塩、マグネシウム塩およびカリウム塩を含む哺乳動物細胞培養培地を包含する。これらの無機塩およびフルクトース、適切な濃度範囲、ならびに好ましい濃度範囲（１リットルあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）による）を以下の表１に列挙する。
【００３９】
【表１】
2007505625.tif 000002
便宜のために、この培地の固体成分は、一緒に合わせられ、そしてこの混合物が１単位として保存され得る。
【００４０】
種々の無機金属塩（通常、微量元素と呼ばれる）もまた、本発明において、代表的にある濃度レベルで存在する。これらの微量元素および適切な濃度範囲（１リットルあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）による）を以下の表２に列挙する。
【００４１】
【表２】
2007505625.tif 000003
便宜のために、これらの微量元素は通常、（好ましくは、培地に添加される場合の所望の最終濃度よりも約１０，０００倍高い）１つの濃縮ストック水溶液として調製される。表２に列挙される濃度は、培養培地における最終濃度である。
【００４２】
２０種の必須アミノ酸および非必須アミノ酸シスチンの全てもまた、本発明の培地において、ある濃度レベルで存在する。これらのアミノ酸ならびに適切な濃度および好ましい濃度（１リットルあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）による）を以下の表３に列挙する。
【００４３】
【表３】
2007505625.tif 000004
種々のビタミンもまた、代表的には、本発明において、ある濃度レベルで存在する。これらのビタミンならびに適切な濃度および好ましい濃度（１リットルあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）による）を以下の表４に列挙する。
【００４４】
【表４】
2007505625.tif 000005
本発明の実施において用いられる別の補充物は、約５ｍＭ〜約５０ｍＭの適切な濃度の、好ましくは５ｍＭ〜２５ｍＭ、そしてより好ましくは約１０ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度の、ＨＥＰＥＳ（４−［２−ヒドロキシエチル］−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）緩衝剤である。他の一般に公知の有機緩衝剤もまた、本発明の実施において用いられ得る。
【００４５】
他の有機補充物は、本発明において、ある濃度レベルで用いられる。これらの補充物ならびにそれらの適切な濃度および好ましい濃度（１リットルあたりのミリグラム（ｍｇ／Ｌ）による）を以下の表５に列挙する。
【００４６】
【表５】
2007505625.tif 000006
本発明の細胞培養培地は、表１〜表５に列挙した成分のうちのいくつかまたは全てを含み得る。
【００４７】
いくつかの適用については、この細胞培養培地には望ましくは、成長ホルモン（例えば、最終濃度０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌのインスリン、最終濃度０．１μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、最終濃度０．０００５ＩＵ／ｍｌ〜０．０５ＩＵ／ｍｌ、好ましくは０．００５ＩＵ／ｍｌのソマトトロピン（ブタまたは他の種）、最終濃度０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、好ましくは１μｇ／ｍｌのブタ（または他の種）の下垂体抽出物、および最終濃度０．５μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０μｇ／ｍｌのアプロチニン）が補充される。これらの成長因子に加えて、この細胞培養培地は、いくつかの好ましい適用については、（組換えヒトまたは他の種もしくは供給源の）表皮増殖因子を最終濃度０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌで含み得る。
【００４８】
別の好ましい実施形態では、この細胞培養培地には、望ましくは、最終濃度０．１μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ、好ましくは５μｇ／ｍｌのフィブロネクチンが補充される。
【００４９】
他の好ましい実施形態では、この細胞培養培地には、望ましくは、最終濃度０．１μＭ〜１０μＭ、好ましくは１μＭのエタノールアミン、最終濃度０．１μＭ〜１０μＭ、好ましくは１μＭのホスホエタノールアミン、最終濃度１ｐＭ〜２５ｐＭ、好ましくは５ｐＭのトリヨードサイロニン（ｔｒｉｉｏｄｉｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、最終濃度１ｎＭ〜１００ｎＭ、好ましくは２５ｎＭのセレン、最終濃度０．１ｎＭ〜５０ｎＭ、好ましくは１ｎＭのヒドロコルチゾン、最終濃度０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１μＭのフォルスコリン、および最終濃度０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１０μＭのヒレグレンが補充される。
【００５０】
本発明の細胞培養培地は好ましくは、その必須エネルギー源としてのフルクトースを、本明細書中に提供される置換基から選択される少なくとも１つの選り抜きのさらなる成分との組合せで有し、そして所望される特定の細胞または細胞株の増殖を最適化するために調整される。
【００５１】
（培地の調製）
本発明のこの細胞培養培地の調製は、当該分野で周知の従来方法を用いる。好ましい方法に従って、培地の調製に使用すべき容器を純水で２回リンスし、そして容器にアルミニウム箔をかぶせて遮光する。この容器に、固体および他の成分の充分な取り込みを許容する、所望の最終体積よりも少ない体積まで純水を入れる。便利でかつ満足のいく体積は、最終的な所望の体積より１０〜２５パーセント（１０〜２５％）少ない。各成分の所望のｇ／Ｌに、必要とされるリットル数を掛けて、添加されるその成分のグラム量を得る。必要な量の各固体成分を量る。ここで含まれる固体成分は、アミノ酸、ビタミン、フルクトースおよび無機塩（例えば、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩、銅塩、鉄塩、マンガン塩および亜鉛塩）であると考えられる。便宜のために、これらの固体は、一緒に混合されて１工程で純水に添加され得る。
【００５２】
重炭酸ナトリウムの添加後、培地を１５〜２０分間混合する。次いでｐＨをチェックし、６．５と７．２との間にすべきである。次いで、ｐＨは、好ましくは液体形態（１０Ｍ）または固体形態の水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて（しかし、他のｐＨ調整手段が本発明に包含される）７．２０に調整されるべきである。ｐＨが調整されたら、ＨＥＰＥＳを添加し、そして培地を１５〜２０分間混合する。重量オスモル濃度（培地中の溶解した固体総量の尺度、１リットルあたりの浸透圧モル数で測定される）を適切なレベルに調整する。満足のいく範囲は、２９０ｍＯｓｍ〜３２５ｍＯｓｍである。この重量オスモル濃度は、浸透圧計を用いて便利にチェックされ得る。浸透圧計を、１００ｍＯｓｍ標準および５００ｍＯｓｍ標準について二連で用いた後、この培地の３つのサンプルをチェックする。３つのサンプルを平均し、そして重量オスモル濃度を所望のレベルにするために必要な塩の量を計算する。
【００５３】
例：所望の重量オスモル濃度が２９０ｍＯｓｍであり、３つの読み取り値の平均が８２．３３であるならば、所望の重量オスモル濃度を達成するために必要とされる塩（塩化ナトリウムまたは他の任意の適切な塩）の量について本発明に従って好ましくは用いられる計算は以下の通りとなる：
・３つの読み取り値の平均を所望の重量オスモル濃度から差し引く。
・この結果に固定乗数（この例では０．０３１）を掛ける。
・この結果に所望の最終体積を掛ける。
・この結果が、所望の重量オスモル濃度を達成するために必要とされる塩（ＮａＣｌ）のグラム量である。
【００５４】
４０リットルという所望の最終体積について、本発明の好ましい実施形態についての計算は、以下である：
２９０−８２．３３＝２０７．６７×０．０３１＝６．４３７ｇ／Ｌ×４０リットル＝２５７．５１グラムのＮａＣｌ。
【００５５】
塩を添加し、そして培地を３０〜４５分間混合し、再度、この培地の３つのサンプルをチェックする。この培地は、所望の重量オスモル濃度レベルになっているはずである。
【００５６】
培養フードにおいて、培地を滅菌フィルター（好ましくは０．２２μｍのフィルターまたはファイナー（ｆｉｎｅｒ））に通してガラス培地瓶または他の適切な保存容器に入れる。
【００５７】
本発明の細胞培養培地の全ては、使用前に再構成するための乾燥調製物または濃縮調製物として処方および包装され得る。本発明の好ましい実施形態では、この培地は、培地成分の全てまたはいくつかを含む乾燥粉末として調製される。便宜のために、各成分は、諸定量で計量され得、そして成分のサブグループ（例えば、塩またはアミノ酸）が一緒に合わされてアミノ酸補充物混合物として保存され得る。次いで、乾燥培地が再構成される際に残りの任意の成分が添加され得る。再構成は、使用の直前に行われ得る。あるいは、この培地は、再構成されて包装され得る。約４℃で保存される乾燥粉末としてのこの培地の貯蔵寿命は、少なくとも数年である。乾燥粉末から調製されたかまたは再構成されたかのいずれかの液体培地は安定性がより低いが、約４℃で好ましくは暗所で保存した場合、約６週間から２ヶ月以上安定である。
【００５８】
再構成は、本明細書中に記載される相対濃度が存在する限り、この培地成分の他方のベースである重炭酸塩の濃縮ストックを添加することにより実施され得る。これらの成分が固体として添加される場合、再構成は、無菌の脱イオン水、純水または他の組織培養グレードの水を添加することにより達成される。この培地は、公知の方法に従って、使用前に滅菌される。
【００５９】
上記の工程は、本発明の基本培地の調製を構成する。抗生物質（好ましくはゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ〜１５０μｇ／ｍｌ）および／またはペニシリン（５Ｕ／ｍｌ〜１０Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ））は、必要とみなされた場合は添加され得る。濾過後、さらなる補充物（例えば、微量元素または増殖因子を含む）はこの培地に添加され得る。微量元素は好ましくはストック溶液として調製され、そして所望の最終濃度を達成するように添加される。成長因子は好ましくは、この培地を使用する直前に、所望の最終濃度になるように添加されるべきである。いくつかの実施形態では、他の糖が本発明の培地を補充するために用いられ得る。この糖としては通常、グルコース、スクロースおよびガラクトースが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
（この培地の用途、方法および細胞）
本発明の培地は、種々の組織由来のヒト細胞の初代培養に特に有用である。これらの培地で組織調製物を培養することは、長期培養物を確立するために用いられ得る主に上皮細胞である初代培養物の確立に適切であり、頻繁に、この初代培養物の確立をもたらし得る。これらの細胞は、迅速に確立される傾向があり、さらに何代か継代培養され得、そして現在公に利用可能な培地において確立された細胞と比較した場合、より早い集団倍化時間を有し得る。
【００６１】
本発明の方法に従って培養される細胞は、本明細書中に記載の通りに組織供給源から入手されてもよく、またはそれら自体が、予め培養中の細胞であり得る。細胞は、形質転換されていても形質転換されていなくてもよく、または当該分野において一般に実施される他の方法に従って不死化されていてもよい。
【００６２】
組織から生成されるべき細胞については、細胞は代表的に、この細胞を含む組織を切り刻み、それによって組織の部分構造体または遊離細胞を得て、次いで部分構造体または細胞を濃縮し、持続した細胞分裂を支持し得る本発明の培養培地中に、この濃縮された部分構造体または細胞を再懸濁し、この培養物をインキュベートし、そしてこの培養物を定期的に継代することによって調製される。本発明はさらに、クローン株を調製する方法を提供し、この方法は、上記のとおり細胞培養物を調製する工程、この培養物をコンフルエントな細胞層になるまで培養する工程、細胞を解離させる工程、最初のプレーティングのために本発明の馴化培地を含む別の培養容器にこの細胞を接種する工程、個々のコロニーの細胞を収集する工程、２回目のプレーティングのためにこのコロニーを別の培養容器に接種する工程、および得られた細胞を定期的に継代する工程を包含する。
【００６３】
本発明は、本明細書中に教示される方法を用いて調製された拡大細胞培養物、診断アッセイにおける、治療処置における、および所望のタンパク質産物の産生のための、このような細胞培養物の使用方法を提供する。
【００６４】
細胞培養における用途のために、本発明の培地には代表的に、選択された細胞が接種される。好ましくは、この接種物の体積は、この培地の体積の約５分の１（以下）の桁にあるが、この接種物体積からの何らかのバリエーションが、一般に公知の方法に従ってなされ得る。接種後、この細胞培養物は、温度、光、酸素および二酸化炭素の濃度のような要因を考慮して、適切な環境に維持される。
【００６５】
調製された培地は、種々の哺乳動物細胞の培養に使用され得る。初代培養物の場合、酵素で消化した組織は、これらの酵素を中和するために処理され、そして／またはこれらを除去するために徹底的に洗浄され、培地に再懸濁され、次いで培養プレート上にプレーティングされる。連続細胞培養の場合、これらの細胞は代表的に、この培地に所望の濃度で再懸濁され、そしてプレートから取り出され、洗浄され、次いで培養プレート上にプレーティングされる。ある好ましい方法では、これらの培養プレートには、適切な付着を確実にするために基底膜タンパク質（例えば、フィブロネクチン）が予めコーティングされる。
【００６６】
得られる細胞集団は拡大され得、そして種々の生物学的アッセイにおける使用のために収集され得る。さらに、これらの細胞は、長期間培養され得、そして本発明の実施に従って、細胞集団の顕著な拡大（１０倍〜１０００倍）を伴って所望の期間にわたって継代され得る細胞株をもたらし得る。あるいは、この培養培地自体が収集されて、これらの細胞によって分泌されたタンパク質または他の有機化合物についてアッセイされ得る。
【００６７】
本発明の培地は、上記の通り、種々の細胞培養系において細胞を培養するために用いられ得る。このような系は、単層として細胞を培養するために、または好ましくは細胞を懸濁して培養するために用いられる。これらの細胞は、小規模培養物（すなわち、約２リットル以下の体積で）増殖され得る。あるいは、そして特定の実施形態では好ましくは、これらの細胞は、大規模体積で（例えば、スピナーフラスコ中では約１６リットルまで、または動物細胞からの生物学的化合物の商業的生産のために設計された発酵槽中では約８０リットル以上）で培養される。
【００６８】
細胞自体または細胞の内部の生物学的化合物は、培養の所望の最終産物であり得る。そうであれば、これらは収集され得、そして培養培地から分離され得る。本発明の教示に従って増殖されて回収された細胞は、（例えば、損傷を受けた組織または罹病組織の再生のために）個体内でのこのような細胞の増殖を必要とする個体への送達に、または細胞産物の送達のためのインビボ系として適切である。本発明の方法はまた、個体から誘導された所望の細胞の生存および／または増殖を増強するために用いられ得る。このことは、個体への自己移植片を促進する。あるいは、これらの細胞によって培地中に分泌されるタンパク質または他の有機化合物は、培養の所望の最終産物であり得る。この状況では、この培地は細胞から分離され得、次いで目的の化合物がこの培地から精製され得る。
【００６９】
（選択される好ましい実施形態）
ある好ましい実施形態では、本発明は、３０００ｍｇ／Ｌ〜１０００ｍｇ／Ｌの濃度で存在するフルクトースから本質的になる一次エネルギー源を有する無血清細胞培養培地の組成物を包含する。
【００７０】
別の実施形態では、この培養培地組成物は、示した濃度範囲の以下の無機塩からなる：
２７０ｍｇ／Ｌ〜０ｍｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム、５００ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、０．０２ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌの濃度の硝酸カリウム、１１０ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの濃度の硫酸マグネシウム（無水物）、および６０ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌの濃度の塩化マグネシウム。
【００７１】
別の実施形態では、培養培地の組成物は、示した濃度範囲の以下の無機塩からなる：２７０ｍｇ／Ｌ〜０ｍｇ／Ｌの濃度の塩化カルシウム、５００ｍｇ／Ｌ〜１５０ｍｇ／Ｌの濃度の塩化カリウム、０．０２ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌの濃度の硝酸カリウム、１１０ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの濃度の硫酸マグネシウム（無水物）、および６０ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌの濃度の塩化マグネシウム。
【００７２】
これらの実施形態および他の実施形態のあるものでは、本発明の組成物は、示した濃度範囲の以下の無機金属塩（通常、微量元素と呼ばれる）からなる細胞培養培地を含む：０．０２ｍｇ／Ｌ〜０．００６ｍｇ／Ｌの濃度の亜セレン酸ナトリウム、５．３×１０−４ｍｇ／Ｌ〜１．５×１０−４ｍｇ／Ｌの濃度のメタバナジン酸アンモニウム、５．６×１０−３ｍｇ／Ｌ〜１．５×１０−３ｍｇ／Ｌの濃度のモリブデン酸（アンモニウム）、１．２×１０−３ｍｇ／Ｌ〜３．７５×１０−４ｍｇ／Ｌの濃度の硫酸銅ＩＩ、０．４ｍｇ／Ｌ〜０．１ｍｇ／Ｌの濃度の硫酸鉄ＩＩ、７×１０−５ｍｇ／Ｌ〜２×１０−５ｍｇ／Ｌの濃度の硫酸マンガン、および０．４ｍｇ／Ｌ〜０．１ｍｇ／Ｌの濃度の硫酸亜鉛。
【００７３】
なお他の実施形態では、本発明の培養培地は、示した濃度範囲の以下のアミノ酸からなる：４０ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−アラニン、３５ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−アスパラギン（遊離塩基）、１０ｍｇ／Ｌ〜２ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、２５０ｍｇ／Ｌ〜６０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−アルギニン、５０ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−アスパラギン酸、１３０ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−シスチン、１２０ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−グルタミン酸、１２００ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−グルタミン、５０ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度のグリシン、７５ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−ヒスチジン、１５０ｍｇ／Ｌ〜３５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−イソロイシン、１５５ｍｇ／Ｌ〜３５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−ロイシン、２３０ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−リジン、４５ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−メチオニン、１００ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−フェニルアラニン、８０ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−プロリン、７０ｍｇ／Ｌ〜１５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−セリン、１４５ｍｇ／Ｌ〜３５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−トレオニン、２５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−トリプトファン、１５５ｍｇ／Ｌ〜３５ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−チロシン、および１４０ｍｇ／Ｌ〜３０ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−バリン。
【００７４】
さらに他の実施形態では、本発明は、示した濃度範囲の以下のビタミンからなる培養培地を提供する：１．７×１０−２ｍｇ／Ｌ〜５．６×１０−３ｍｇ／Ｌのビオチン、４．３ｍｇ／Ｌ〜１．４ｍｇ／ＬのＤ−Ｃａ−パントテネート、１０．５ｍｇ／Ｌ〜３．４ｍｇ／Ｌの塩化コリン、４．８ｍｇ／Ｌ〜１．５ｍｇ／Ｌの葉酸、１６ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／ＬのＩ−イノシトール、４．５ｍｇ／Ｌ〜１ｍｇ／Ｌのナイアシンアミド、４．５ｍｇ／Ｌ〜１ｍｇ／Ｌのピリドキサール、２．８×１０−２ｍｇ／Ｌ〜９．２×１０−３ｍｇ／Ｌのピリドキシン、４．５ｍｇ／Ｌ〜１．４ｍｇ／Ｌのチアミン、および０．０７５ｍｇ／Ｌ〜０．０２ｍｇ／ＬのビタミンＢ−１２。
【００７５】
これらの実施形態のあるものでは、培養培地は、示した濃度範囲の以下の種々の成分からなる：１０〜１５ｍＬ／Ｌ（ｖ／ｖ）の濃度のＨＥＰＥＳ、０．０８ｍｇ／Ｌ〜０．０２ｍｇ／Ｌの濃度のプトレシン、０．１ｍｇ／Ｌ〜０．０３ｍｇ／Ｌの濃度のチオクト酸、１６５ｍｇ／Ｌ〜５５ｍｇ／Ｌの濃度のピルビン酸ナトリウム、０．０４ｍｇ／Ｌ〜０．０１ｍｇ／Ｌの濃度のリノール酸、および１５ｍｇ／Ｌ〜２ｍｇ／Ｌの濃度のｌ−システイン。
【００７６】
特定の好ましい実施形態では、この培養培地は、示した濃度範囲の以下の成分からなる：
【００７７】
【表６−１】
2007505625.tif 000007
【００７８】
【表６−２】
2007505625.tif 000008
【００７９】
【表６−３】
2007505625.tif 000009
本発明の特に好ましい実施形態では、一次エネルギー源はフルクトースであり、この培養培地は動物の血清を含まない。
【００８０】
以下の実施例は、本発明の実施のための好ましい形態を例示するが、本発明の使用をこれらの実施例へのみ限定すると解釈されるべきでない。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：培養におけるヒト腎臓細胞の増殖）
初代ヒト腎臓細胞を腎臓組織から得るために、そしてこれらを持続可能な細胞培養において増殖させるために、以下の例示的な方法を記載する。ゲンタマイシンおよび／またはペニシリン−ストレプトマイシンを所望の濃度で含むかまたは含まない本発明の培地を調製する。ヒトまたは動物被験体由来の腎臓または腎臓組織をこの洗浄培地に移す。腎臓外膜を鉗子で除去する。腎臓を７０％エタノールに短時間漬け、そして新たな洗浄培地に移す。腎臓を新たな無菌のペトリ皿に移し、そして弯剪刀で切り刻む。組織を１０ｍｌの洗浄培地に再懸濁し、そして１２００ｒｐｍで４分間、遠心分離機においてペレットにする。この組織片を望ましくは、コラゲナーゼ／ジスパーゼ（ｄｉｓｐａｓｅ）（０．０１％〜０．２％）を含む本発明の培地に一晩または約２４時間にわたって再懸濁する。洗浄培地を除去し、そして別の１０ｍｌの新たな洗浄培地を用いてこの洗浄工程を繰り返す。この洗浄培地を除去し、そしてインスリン、トランスフェリン、表皮増殖因子、ソマトトロピン、ブタ下垂体抽出物、アプロチニン、およびゲンタマイシンを補充した本発明の培地（この特定の実施形態を本明細書中で「増殖培地」という）７ミリリットル（７ｍｌ）に細胞ペレットを再懸濁する。これらの細胞の最初のプレーティングにおいて、この増殖培地に５μｇ／ｍｌの濃度のフィブロネクチンをさらに補充する。
【００８２】
この細胞懸濁物を１０ｃｍの無菌培養皿に均等に分配する。プレーティングの２４時間後、３ミリリットルの増殖培地をこの培養物に添加する。増殖培地を２〜３日毎に新たな増殖培地に取替える。腎臓上皮細胞の得られる初代細胞培養物は、５μｇ／ｍｌの濃度でフィブロネクチンを予めコーティングした１０ｃｍプレートに１０日毎に（または必要に応じて）継代され得る。
【００８３】
このプロトコルは、マウス、ラット、ブタ、ヒトおよび胎児ヒトのものを含むがこれらに限定されない、種々の哺乳動物腎臓組織に適切である。
【００８４】
ヒト胎児腎臓で実施したこのプロトコルの結果を図１に示す。左上のパネルは、初代培養での細胞を示す。右上のパネルは、継代数４回での細胞を示す。左下のパネルは、継代数６回での細胞を示す。右下のパネルは、継代数７回での細胞を示す。この段階での大きな百分率の細胞は静止状態にあり、増殖を停止している。
【００８５】
（実施例２：ヒト胎児腎臓細胞の増殖）
在胎齢１０週〜１８週の間のヒト胎児腎臓を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｌａｍｅｄａ  Ｃｏｕｎｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から得た。腎臓を調達し、湿った氷上の組織培養培地に入れて研究室に輸送した。到着したらすぐに、この腎臓を洗浄培地（ペニシリン／ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを含む冷ＰＢＳ）に移した。外膜を鉗子で除去し、そして腎臓を７０％エタノール中で短時間洗浄し、次いで洗浄培地で２回リンスした。この腎臓を、乾燥した１００ｍｍ培養皿中で手術用鋏により１ｍｍ角に切り刻んだ。組織片を、本明細書中で「Ｉ／３Ｆ」または「Ｉ３Ｆ」という規定無血清培地１０ｍｌにプレーティングした。
【００８６】
この実施例のために用いた培地は、以下の成分を含んでいた：０．１８ｇ／Ｌの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、０．２９８ｇ／Ｌの塩化カリウム（ＫＣｌ）、０．００００１２６２９ｇ／Ｌの硝酸カリウム（ＫＮＯ３）、０．０６８ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）（無水物）、０．０３７ｇ／Ｌの塩化マグネシウム−６Ｈ２Ｏ、６．２ｇ／Ｌの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、１．２ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、０．０４３ｇ／Ｌのリン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４−Ｈ２Ｏ）、０．０８８ｇ／Ｌの二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、０．００００１２６２９ｇ／Ｌの亜セレン酸ナトリウム（ＮａＳｅＯ３−５Ｈ２Ｏ）、０．００００００３５１ｇ／Ｌのメタバナジン酸アンモニウム、０．０００００３７２ｇ／Ｌのモリブデン酸−４Ｈ２Ｏ（アンモニウム）、０．００００００７５ｇ／Ｌの硫酸銅ＩＩ−５Ｈ２Ｏ、０．０００２５０２ｇ／Ｌの硫化鉄ＩＩ−７Ｈ２Ｏ、４．５３Ｅ−０８ｇ／Ｌの硫酸マンガン、０．０００２５８９ｇ／Ｌの硫酸亜鉛−７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌのフルクトース、３．５７ｇ／ＬのＨｅｐｅｓ、０．００００４８３ｇ／Ｌのプトレシン−２ＨＣｌ、０．００００６１８ｇ／Ｌのチオクト酸、０．１１００３ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム、０．００００２５２３ｇ／Ｌのリノール酸、０．０２０１７３ｇ／ＬのＬ−アラニン、０．０１７５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン（遊離塩基）、０．００４５ｇ／ＬのＬ−アスパラギン−Ｈ２Ｏ、０．１２２０１ｇ／ＬのＬ−アルギニン−ＨＣｌ、０．０２４９９３ｇ／ＬのＬ−アスパラギン酸、０．０６３９８ｇ／ＬのＬ−システイン−２ＨＣｌ、０．００５２６８ｇ／ＬのＬ−システイン−ＨＣｌ−Ｈ２Ｏ、０．０５６９１３ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸、０．６ｇ／ＬのＬ−グルタミン、０．０２３２５３ｇ／Ｌのグリシン、０．０３５６９１ｇ／ＬのＬ−ヒスチジンＨＣｌ−Ｈ２Ｏ、０．０７４６８２ｇ／ＬのＬ−イソロイシン、０．０７７４３６ｇ／ＬのＬ−ロイシン、０．１１３１６２ｇ／ＬのＬ−リジン−ＨＣｌ、０．０２２３４４ｇ／ＬのＬ−メチオニン、０．０４７６８８ｇ／ＬのＬ−フェニルアラニン、０．０３８３５９ｇ／ＬのＬ−プロリン、０．０３２５５３ｇ／ＬのＬ−セリン、０．０７００７３ｇ／ＬのＬ−トレオニン、０．０１１８１２ｇ／ＬのＬ−トリプトファン、０．０７５１６８８ｇ／ＬのＬ−チロシン（二ナトリウム塩）、０．０６９３１６ｇ／ＬのＬ−バリン、０．００００１１２９９ｇ／Ｌのビオチン、０．００２８７１４ｇ／ＬのＤ−Ｃａパントテネート、０．００６９８８ｇ／Ｌの塩化コリン、０．００３１９７２ｇ／Ｌの葉酸、０．０１０４４６ｇ／ＬのＩ−イノシトール、０．００２８１０９８ｇ／Ｌのナイアシンアミド、０．００２８ｇ／ＬのピリドキサールＨＣｌ、０．００００１８５１ｇ／Ｌのピリドキシン−ＨＣｌ、０．０００２９１２８ｇ／Ｌのリボフラビン、０．００２９０１１ｇ／ＬのチアミンＨＣＬ、０．００００４９９ｇ／ＬのビタミンＢ１２、ｐＨ７．２、重量オスモル濃度２９５ｍＭ。
【００８７】
これらの組織片を１５ｍｌ遠心管に移し、そしてこれらの組織片を１０００×ｇで５分間遠心分離した。これらの組織片を、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、表皮増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、ソマトトロピン（０．００５ＩＵ／ｍｌ）、ブタ下垂体抽出物（０．２％）、ニワトリ血清（０．１％）、ゲンタマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１×）およびコラゲナーゼ／ジスパーゼ（０．１％）を含むＩ３Ｆ培地に再懸濁し、そして４℃で一晩インキュベートした。翌日、消化された組織片を１０００×ｇで５分間遠心分離し、そしてＩ３Ｆ培地で２回洗浄した。ペレットを、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、表皮増殖因子（２０ｎｇ／ｍｌ）、ソマトトロピン（０．００５ＩＵ／ｍｌ）、ブタ下垂体抽出物（０．２％）およびニワトリ血清（０．１％）を含む１０ｍｌのＩ３Ｆ培地に再懸濁し、そしてフィブロネクチンで予めコーティングした１０ｃｍプレートにおいて培養した。
【００８８】
これらの培養条件下で、ヒト胎児腎臓細胞は、基質でコーティングされたプレートに結合し、そして単層として増殖した。培養培地を週に２回取り替えた。
【００８９】
細胞を収集するために、細胞の単層を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス基本塩溶液で１回リンスし、ハンクス基本塩溶液中１０ｍＭ  ＥＤＴＡにおいて３７℃で１５分間インキュベートした。細胞を、穏やかなピペッティングによって培養表面から剥離した。細胞懸濁物を、１０００×ｇにて５分間の遠心分離によりペレットにした。上清を除去し、そして細胞を、非変性アジュバントを適切に含む無血清培地（Ｉ３Ｆ培地）中に再懸濁した。
【００９０】
（実施例３：ヒト膵臓管細胞の拡大およびインスリン産生細胞への分化のための新規方法）
島細胞移植の進展の制限要因の１つは、インスリン産生細胞の充分な供給のままである。本発明者らは、ヒト先祖膵臓細胞から出発して、インビトロでのβ細胞分化を改善するための細胞培養モデルを調査した。以下により充分に記載されるように、ヒト膵臓上皮管細胞（ｈＰＥＤ）を単離し、次いで規定された無血清「管培地」（ＤＭ）において維持した。この特定の培地は、これらの細胞が迅速に分裂して均質な上皮単層を形成することを可能にする。しかし、これらの規定された条件は、インスリン分泌β細胞の増殖を支持しない。β細胞へのそれらの分化を促進するために、本発明者らは、第２の無血清規定「島培地」（ＩＭ）を開発した。ｈＰＥＤ細胞に対するＤＭからＩＭへの移植の効果を最初に、比較Ｃｔ法を用いてインスリンｍＲＮＡレベルを調べるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより追跡した。興味深いことに、ＩＭ培地中での７日間のインキュベーション後、インスリン転写産物レベルの変化が観察された。ＤＭ中のものと比較して、ＩＭ中で維持したｈＰＥＤ細胞におけるインスリン転写産物レベルの顕著な増加が存在した（約１５〜２０倍）。さらに、この最初の観察を広げるために、本発明者らは、ヒト特異的ＣペプチドＥｌｉｓａを用いて培養中のＣペプチド分泌を測定した。細胞あたりのＣペプチドタンパク質レベルは、細胞がＩＭ培地中で培養される条件において顕著に高く、凝集物を形成した（約１０倍）。
【００９１】
本実施例において提示した研究は、未分化集団の拡大のための第１の培地（ＤＭ）、およびインスリン分泌細胞を促進および支持する第２の培地（ＩＭ）を利用する２段階無血清プロセスを確認する。本発明の培地を用いてこれらの方法に従って生成された細胞は、島移植に適切である有意な数のインスリン分泌細胞を生じる。このような細胞はまた、糖尿病個体における正常血糖の修復を促進するために有用である。
【００９２】
本発明者らは、顕微解剖によって、ヒト胎児膵臓（在胎齢１３〜２４週）に付着した全ての過剰な結合組織を除去した。この組織を、０．５ｍｍ３〜１ｍｍ３片に切り刻んだ。次いで、切り刻んだ膵臓片を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中にそれぞれ溶解した以下の成分を１ｍｌあたり１マイクログラム（μｇ／ｍｌ）含む消化混合物中で３７℃にて２０分間にわたって酵素消化に供した：４型コラゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、大豆トリプシンインヒビター（「ＳＴＩ」）（Ｓｉｇｍａ）、およびヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）。消化期間の後、組織混合物をピペットで粉砕して、細胞の均質な懸濁物を達成した。次いで、これらの細胞を、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）勾配を介する９００ｒｐｍで１５分間の遠心分離によって洗浄した。この勾配は、任意の適切な市販の組織培養培地または本発明において教示される培地中に溶解された５％（ｗ／ｖ）組織培養グレードのＢＳＡから構成された。組織培養培地の適切な例は、Ｆ１２：ＤＭＥ（５０：５０）である。細胞の体積および勾配の体積は、好ましくは１：１の比であった。
【００９３】
上清を捨て、そして細胞ペレットを、示す最終濃度で以下の増殖因子を補充した本発明の培地中に再懸濁した：１０μｇ／ｍｌの組換えヒトインスリン（ｒｈインスリン）、１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌの表皮増殖因子（ＥＧＦ）、１μＭ濃度のエタノールアミン、１μＭ濃度のホスホエタノールアミン、５ｐＭ濃度のトリヨードサイロニン、２５ｎＭ濃度のセレン、１ｎＭ濃度のヒドロコルチゾン、１０ｎＭ濃度のプロゲステロン、１μＭ濃度のフォルスコリン、１０ｎＭ濃度のヒレグリン、５μｌ／ｍｌまたは７５μｇ／ｍｌタンパク質濃度のブタ下垂体抽出物、および２５μｇ／ｍｌのアプロチニン。
【００９４】
再懸濁した細胞を、フィブロネクチンで予めコーティングした２４ウェル無菌組織培養プレート中に均等に分配した。この２４ウェル組織培養プレートを、本発明の培地中に希釈した５μｇ／ｍｌフィブロネクチンの溶液で予めコーティングした。この組織培養プレートを、使用の少なくとも３０分前に予めコーティングした。在胎齢期１３週と１６週との間の膵臓（ｐａｎｃｒｅａｔｉ）から抽出した細胞を、２４ウェル組織培養プレートの６つのウェルに均等に分配した。在胎齢期１７週と２４週との間の膵臓（ｐａｎｃｒｅａｔｉ）から抽出した細胞を、２４ウェル組織培養プレートの１２のウェルに均等に分配した。本発明の培地のこの特に好ましい実施形態は抗生物質も抗真菌剤も含まないので、これらの細胞を、初代培養調製物全体の一般的夾雑を最少にするために別のウェルにプレーティングした。
【００９５】
上記培養条件下で、膵臓管細胞およびいくつかの夾雑間葉細胞は、２４時間以内にプレート表面に付着した。これらの細胞は、広がって分裂し始めて、最終的には単層型細胞培養物を形成した。この培養物は、培養７日後〜１０日後に約７５パーセント（７５％）コンフルエンシーに達し、そしてここで１：２の分配比で継代培養または継代するのに適切であった。これらの細胞から培地を除去し、そしてとっておいた。この培地を「馴化」培地という。次いでこれらの細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてコラゲナーゼ／ジスパーゼ溶液（必要に応じてＳＴＩ）で３７℃にて約１５分間解離させた。（いくつかの実施形態では、この解離工程は省略され得る。）次いで、これらの細胞を上記のとおりに５％  ＢＳＡ勾配で洗浄し、そしてより大きな細胞培養容器（例えば、１００ｍｍ無菌培養皿）にプールした。この細胞培養培地を、１：３の比の「馴化」培地を用いて２〜３日毎に新たな培地に取替えた。この培地を０．２ミクロンのフィルターに通して、細胞培養物へのその再導入前にあらゆる細胞または粒子状物質を除去することが推奨されるが、他の一般に公知の培地精製方法または培地清澄化方法が本発明の教示に従って用いられ得る。本発明の濾過された馴化培地は、再使用の前に約４℃〜約６℃で約４週間〜約６週間〜約８週間保存され得る。これらの細胞は、代表的には、７５％のコンフルエンシーに達した後に継代培養され得るが、これらは、より早くもしくはより遅く継代培養されてもよく、または任意の所望のコンフルエンシーにおいて生物学的アッセイにおいて使用されてもよい。
【００９６】
３つの異なる培養培地においてこのプロトコルを実施した結果を図２に示す。第１のパネルは、市販の培地ＣＭＲＬ  １０６６（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）において３日間にわたって確立され、次いで上記に列挙した増殖因子を補充したＦ：１２−ＤＭＥ（５０：５０）培地中で培養したヒト胎児膵臓管初代培養物を示す。第２のパネルは、増殖因子補充物を含み、そして最終濃度１５ｍＭでグルコースが添加された本発明の培地において培養された同じ細胞調製物を示す。第３のパネルは、上記に列挙した増殖因子を補充した本発明の培地において培養された同じ細胞調製物を示す。形態学的に、第３のパネルは、上皮様細胞のより均質な集団を示す。第１のパネルおよび第２のパネルは、形態学的に本質的に線維芽細胞様である夾雑している間質細胞を伴う、上皮様細胞の「島」を示す。
【００９７】
本発明の培地において細胞を培養することによって達成された細胞集団がより多くの膵臓管細胞を含むことを確認するために、サイトケラチン１９およびビメンチンのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベルを測定した。これは、ｍＲＮＡレベルを定量し得る当該分野で周知の任意の方法を用いて実施され得る。この特定の例では、相対的な定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００および７０００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ機器およびソフトウェアをＧｉｂｓｏｎら（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６（１０）：９９５−１００１，１９９６）に以前に記載された通りに用いて実施した。
【００９８】
このｍＲＮＡ分析の結果を図３に示す。パネルＡでは、（ａ）上記の通り、市販のＣＭＲＬ  １０６６、次いでＦ：１２−ＤＭＥ培地で調製した初代細胞培養物、（ｂ）本発明の培地で調製した初代細胞培養物、および（ｃ）グルコースを最終濃度１５ｍＭで添加した本発明の培地で調製した初代細胞培養物についてのサイトケラチン１９のｍＲＮＡ分析の結果を示す。サイトケラチン１９は、当該分野で通常用いられる上皮細胞マーカーである（例えば、Ｂｏｕｗｅｎｓら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４３（１１）：１２７９−８３（１９９４年１１月）を参照のこと）。本発明の培地において培養した細胞は、サイトケラチン１９のｍＲＮＡ発現において、内部標準と比較して約２４倍の増加を有した。このｍＲＮＡ発現における増加は、本実施例に記載されるＣＭＲＬからＦ：１２−ＤＭＥ培地へと進んで培養された細胞、または１５ｍＭグルコースを添加した本発明の培地において培養された細胞のいずれかにおいて見出される発現レベルの約２倍である。
【００９９】
パネルＢは、上記の通り、初代培養物に対するビメンチンｍＲＮＡ分析の結果を示す。ビメンチンは、当該分野で通常使用される線維芽細胞マーカーである（例えば、Ｆｒａｎｋｅら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，２３（１）：４３−４９（１９８２）、およびＫａｈｎら，Ｃａｎｃｅｒ  ５１（４）：６４５−５３（１９８３年２月１５日）を参照のこと）。上記のデータと一貫して、本発明の培地において培養された培地は、本実施例に記載されたようにＣＭＲＬ、次いでＦ：１２−ＤＭＥ培地において培養した細胞、または１５ｍＭグルコースを添加した本発明の培地において培養した細胞のどちらかと比較して約半分のビメンチンｍＲＮＡを発現した。
【０１００】
パネルＣは、上記の通り、初代培養物に対するインスリンｍＲＮＡ分析の結果を示す。これらの細胞は初代膵臓管細胞であるので、それらのインスリン産生能力は、培養中に保持されるはずである。３つ全ての培地条件におけるこれらの初代培養細胞は、市販の成体膵臓ｃＤＮＡと比較した場合、２５，０００倍よりもさらに多いインスリンｍＲＮＡを示した。Ｉ３Ｆで培養した細胞におけるインスリンｍＲＮＡレベルは最低であったが、このｍＲＮＡレベルは、依然として、他の２つの培地条件のほぼ１標準偏差以内にある。
【０１０１】
さらに、上記に列挙した通りの初代培養物の増殖速度を、細胞数に相関する酵素アッセイを用いて、８日間の培養の経過にわたって測定した。培養の早期部分では、本発明の培地において培養した細胞の増殖速度はより遅かったが、培養８日目の終わりには、細胞数は、他の２つの培地条件と実質的に同じであった。さらに、本発明の培地において培養した細胞は対数増殖期にあるようであったが、他の２つの条件の細胞の増殖速度は横ばい状態になっているようであった。このことは、これらの細胞が静止期に入っていることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、継代０回目（初代培養物）、４回目、６回目および７回目のヒト胎児肝臓組織の確立および培養を示す。これらの細胞を、本明細書中の実施例１に従う増殖補充物を有するＩ３Ｆ培地中で増殖させた。
【図２】図２は、３つの異なる培地中で増殖させたヒト膵臓上皮管細胞の初代培養物の比較を示す。パネルＡでは、細胞をＣＭＲＬ  １０６６培地中で３日間確立し、そしてＦ１２：ＤＭＥ（５０：５０  ｖ／ｖ）培地中で培養した。パネルＢでは、細胞を確立し、そして１５ｍＭグルコースを添加したＩ３Ｆ培地中で培養した。パネルＣでは、細胞を確立し、そしてＩ３Ｆ培地中で培養した。
【図３】図３は、線維芽細胞の細胞マーカー（ビメンチン）および上皮細胞マーカー（サイトケラチン１９）のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）レベル、ならびにヒト膵臓上皮管細胞の初代培養物の増殖速度を示す。パネルＡでは、ビメンチンｍＲＮＡレベルを、ＣＭＲＬ  １０６６培地中で３日間確立され、そしてＦ１２：ＤＭＥ（５０：５０  ｖ／ｖ）培地中で培養された細胞、１５ｍＭグルコースを添加したＩ３Ｆ培地中で確立および培養された細胞、ならびにＩ３Ｆ培地において確立および培養された細胞において測定した。ポジティブコントロールとして、商業的に購入した成人ヒト膵臓ｃＤＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）を用いた。そして結果を、このポジティブコントロールと比較した場合の（−）倍効果によって表す。パネルＢでは、サイトケラチン１９（ｃｋ１９）ｍＲＮＡレベルを、パネルＡに記載と同じ条件で測定した。パネルＣでは、インスリンｍＲＮＡレベルを、パネルＡに記載と同じ条件で測定した。
【図１】
2007505625.tif 000010
【図２】
2007505625.tif 000011
【図３】
2007505625.tif 000012
【国際調査報告】
2007505625.tif 000013
2007505625.tif 000014