(57)【要約】【課題】ヒトの胚性幹細胞株及びその製造方法を提供する。【解決手段】ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植することにより製造された核移植卵由来の胚性幹細胞株は、所望の様々な細胞種類に分化することができる。【選択図】図１
2007516720.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの体細胞の核を脱核されたヒトの卵子に移植することにより得られる核移植卵由来の胚性幹細胞。
【請求項２】
受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託された細胞株であることを特徴とする請求項１に記載の胚性幹細胞。
【請求項３】
下記のステップを含む胚性幹細胞株の製造方法：
（１）ヒトの体細胞を培養して供与核細胞を用意するステップと、
（２）ヒトの卵子を脱核して受核卵子を用意するステップと、
（３）前記供与核細胞の核を前記受核卵子に移植し、前記供与核細胞の核と前記受核卵子を融合することにより核移植卵を製造するステップと、
（４）前記核移植卵をリプログラミング、活性化及び生体外培養させて胚盤胞を形成するステップ、及び
（５）前記胚盤胞から内細胞塊を分離し、前記内細胞塊を未分化のままで培養して胚性幹細胞株を樹立するステップ。
【請求項４】
前記胚性幹細胞株は、受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託されたものであることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項５】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、２０時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項６】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、６時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、３時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、２時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（４）における活性化は、前記核移植卵をカルシウムイオノフォアで処理した後、６−ジメチルアミノプリンで処理して行われることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項１０】
前記カルシウムイオノフォアの濃度は、５μＭ〜１５μＭであることを特徴とする請求項９に記載の胚性幹細胞の製造方法。
【請求項１１】
前記カルシウムイオノフォアの濃度は、約１０μＭであることを特徴とする請求項９に記載の胚性幹細胞の製造方法。
【請求項１２】
前記６−ジメチルアミノプリンの濃度は、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭであることを特徴とする請求項９に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項１３】
前記６−ジメチルアミノプリンの濃度は、約２．０ｍＭであることを特徴とする請求項９に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項１４】
前記ステップ（４）における生体外培養は少なくとも２以上の培地を用いて連続して行われ、前記各培地は相異なる組成を持つものであることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項１５】
前記生体外培養は、相異なる組成を持つ２種類の培地を連続して用いて行われることを特徴とする請求項１４に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項１６】
前記生体外培養は、Ｇ１．２培地及びＳＮＵｎｔ−２培地を順次に用いることにより行われることを特徴とする請求項１５に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項１７】
前記ステップ（４）は、２０時間以内で核移植卵をリプログラミングし、前記核移植卵を５μＭ〜１５μＭの濃度のカルシウムイオノフォアで処理し、さらに１．５ｍＭ〜２．５ｍＭの濃度の６−ジメチルアミノプリンで処理した後、Ｇ１．２培地及びＳＮＵｎｔ−２培地において前記核移植卵を生体外培養することにより行われることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項１８】
前記内細胞塊は、下記のステップを含む方法によりステップ（５）における胚盤胞から分離されることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法：
（１）胚盤胞から透明帯またはその一部を除去するステップ、及び
（２）その結果として生じる胚盤胞から栄養膜を除去して内細胞塊を分離するステップ。
【請求項１９】
前記ステップ（５）における内細胞塊は、請求項１に記載の胚性幹細胞株から分化された細胞を含む栄養細胞層上において培養されることを特徴とする請求項３に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項２０】
ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植することにより製造された核移植卵由来の胚性幹細胞株から分化された神経前駆細胞。
【請求項２１】
前記胚性幹細胞株は、受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託されたものであることを特徴とする請求項２０に記載の神経前駆細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載の神経前駆細胞を製造する方法であって、
（１）胚性幹細胞株を培養して胚芽体(embryoid body)を形成するステップと、
（２）前記胚芽体を、前記胚芽体の細胞を神経前駆細胞に分化させるのに適した因子の存在下で培養するステップと、
（３）神経前駆細胞のマーカーを発現する細胞を選別及び培養して神経前駆細胞を得るステップと、を含むことを特徴とする神経前駆細胞の製造方法。
【請求項２３】
前記胚性幹細胞株は、受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託されたものであることを特徴とする請求項２２に記載の神経前駆細胞の製造方法。
【請求項２４】
前記ステップ（２）における因子は、レチノイン酸と、アスコルビン酸と、ニコチンアミドと、Ｎ−２補充剤と、Ｂ−２７補充剤と、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム(sodium selenite)及びフィブロネクチンの混合物と、よりなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項２２に記載の神経前駆細胞の製造方法。
【請求項２５】
請求項３に記載のステップ（４）における生体外培養を行うために用いられる培地であって、
９５〜１１０ｍＭのＮａＣｌと、７．０〜７．５ｍＭのＫＣｌと、２０〜３０ｍＭのＮａＨＣＯ3と、１．０〜１．５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4と、３〜８ｍＭの乳酸ナトリウムと、１．５〜２．０ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏと、０．３〜０．８ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏと、０．２〜０．４ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、１．２〜１．７ｍＭのフルクトースと、６〜１０mg／mlのヒト血清アルブミンと、０．７〜０．８μｇ／mlのカナマイシンと、１．５〜３％の必須アミノ酸と、０．５〜１．５％の非必須アミノ酸と、０．７〜１．２ｍＭのＬ−グルタミンと、０．３〜０．７％のインシュリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムの混合物と、を含む培地。
【請求項２６】
前記培地は、
９９．１〜１０６ｍＭのＮａＣｌと、７．２ｍＭのＫＣｌと、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3と、１．２ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4と、５ｍＭの乳酸ナトリウムと、１．７ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏと、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏと、０．３ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、１．５ｍＭのフルクトースと、８mg／mlのヒト血清アルブミンと、０．７５μｇ／mlのカナマイシンと、２％の必須アミノ酸と、１％の非必須アミノ酸と、１ｍＭのＬ−グルタミンと、０．５％のインシュリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムの混合物と、を含むことを特徴とする請求項２５に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は胚性幹細胞株及びその製造方法に係り、さらに詳しくは、ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植して形成された核移植卵を胚盤胞まで培養し、前記胚盤胞から分離した内細胞塊を培養して得た胚性幹細胞株及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
通常、幹細胞とは、人体を構成するあらゆる種類の成熟した機能性の細胞に分化できる未分化細胞を言う。例えば、造血幹細胞は、最終的に、各種の種類の血球細胞のうちいずれかに分化することができる。胚幹（embryonic stem；ＥＳ）細胞は、胚様由来の多能性の細胞であるため、人体を構成するあらゆる種類の器官、組織、細胞に分化・発達可能な能力をもっている。
【０００３】
１９８１年に行われたマウスＥＳ細胞株の樹立は、ヒトＥＳ細胞の発達のための相当な技術及びパラダイムを提供していた。ＥＳ細胞の発達は、マウスの奇形癌種（teratocarcinoma；一部の同種繁殖された系統の生殖腺にできる腫瘍）に関する研究から始まっている(Evans & Kaufman, et al., Nature, 292:154-156 (1981))。
【０００４】
ボングソらは、生体外において受精されたヒトの胚様から出た細胞の短期間での培養及び維持方法について報告している（Bongso et al., Human Reproduction, 9:2110-2117 (1994)）。ボングソらによって分離された細胞は、多能性の幹細胞に見られると予想されるモルフォロジーは持っていたものの、かかる初期の研究は、適切な栄養細胞層を利用できていなかったが故に、長期に亘っての培養は行うことができなかった。
【０００５】
赤毛猿またはマーモセットサルの胚盤胞からの霊長類のＥＳ細胞の製造が報告されている。かかる霊長類のＥＳ細胞は2倍体ではあるが、ヒトのＥＳ細胞と極めて類似している。
【０００６】
猿及びヒトのＥＳ細胞に関する研究は、これらのＥＳ細胞はその表現型の観点から幾分マウスのＥＳ細胞と違ったところがあるものの、多能性の幹細胞がヒトの胚盤胞から由来する可能性があることを示唆している(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848 (1995))。
【０００７】
１９９８年にトムソンらによって開発された多能性のヒト幹細胞株の特性は、下記の通りである(Thomson et al., Science, 282:1145-1147 (1998))：
（１）ＳＳＥＡ−３（stage-specific embryonic antigen-3）、ＳＳＥＡ−４（stage-specific embryonic antigen-4）、ＴＲＡ−１−６０（tumor rejection antigen 1-60）、ＴＲＡ−１−８１（tumor rejection antigen 1-81）及びアルカリ性ホスファターゼを発現する。
【０００８】
（２）高いテロメラーゼ活性を示す。
【０００９】
（３）マウスへの注入時に３胚葉細胞に分化する。
【００１０】
（４）栄養細胞に依存する。
【００１１】
（５）ヒトの白血病抑制因子（ｈＬＩＦ）に反応しない。
【００１２】
トムソンらは、不妊治療中のカップルから贈与された上記の胚盤胞からＥＳ細胞を得た。詳しくは、ＥＳ細胞の樹立を抑えると予想される栄養外胚葉を免疫手術的な方法により除去し、内細胞塊（inner cell mass；ＩＣＭ）をマウスの胚芽由来の繊維芽栄養細胞層にプレーティングし、短い付着及び拡張期間を経た後、別の栄養細胞層上にさらにプレーティングした。トムソンらの方法は、培地または培養システムの点からは、マウスのＥＳ細胞プロトコルとは大した違いはないものの、相対的に高い成功率を達成していた。
【００１３】
ヒトにおける多能性ＥＳ細胞の分離及び哺乳動物における体細胞核移植技術の発展(Solter, Nat. Rev. Genet., 1:199-207 (2000))は、ヒトにおいても、体細胞核移植を用いて組織修復及び移植用の医薬の研究に応用できる未分化細胞の無限な源泉を提供できる可能性をもたらしている。かような「治療的なクローニング」の考え方は、体細胞の核を脱核された卵子に移植することを採用する(Lanza et al., Nat. Med., 5:975-977 (1999))。
【００１４】
ウシにおけるＥＳ−類似細胞の生産(Cibelli et al., Nat. Biotechnol., 16:642-646 (1998))、及びクローニングされた胚盤胞の内細胞塊からのマウスＥＳ細胞の生産(Munsie et al., Curr. Biol., 10:989-992 (2000); Wakayama et al., Science, 292:740-743 (2001)) 、さらには、クローニングされたヒト胚芽を８〜１０細胞期まで発達(Cibelli et al., J. Regen. Med., 2:25-31 (2001))させることに関する以前の報告は、細胞治療的なクローニングの可能性を提供している。
【００１５】
たとえ、ヒトではなく、哺乳類の卵子を用いてＥＳ細胞株が得られるということが多数の論文に記述されてはいるが、現在のところ、核移植の技術分野においてヒトの卵子からＥＳ細胞株を製造したという報告は何らなされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
しかしながら、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、核移植されたヒトの卵子を培養することで胚性幹細胞株を樹立することに成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
そこで、本発明の目的は、ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植して形成された核移植卵由来の胚性幹細胞株を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、
（１）ヒトの体細胞を培養して供与核細胞を用意するステップと、
（２）ヒトの卵子を脱核して受核卵子を用意するステップと、
（３）前記供与核細胞の核を前記受核卵子に移植し、前記供与核細胞の核と前記受核卵子を融合することにより核移植卵を製造するステップと、
（４）前記核移植卵をリプログラミング、活性化及び生体外培養させて胚盤胞を形成するステップと、
（５）前記胚盤胞から内細胞塊を分離し、前記内細胞塊を未分化のままで培養して胚性幹細胞株を樹立するステップと、を含む胚性幹細胞株の製造方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらに他の目的は、本発明に従い製造された核移植卵の生体外培養に適した培地を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植して形成された核移植卵由来の胚性幹細胞株から分化された神経細胞または神経前駆細胞を提供することである。
【００２１】
本発明のさらに他の目的は、
（１）胚性幹細胞株を培養して胚芽体を形成するステップと、
（２）前記胚芽体を、前記胚芽体の細胞を神経前駆細胞に分化させるのに適した製剤の存在下で培養するステップと、
（３）神経前駆細胞のマーカーを発現する細胞を選別及び培養して神経前駆細胞を得るステップと、を含む、
ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植して形成された核移植卵由来の胚性幹細胞株から分化された神経細胞を製造する方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本願明細書中で用いられる用語「核移植」とは、体細胞（または、「供与核細胞」とも呼ばれる。）の核を脱核された卵子（または、「受核卵子」とも呼ばれる。）に移植する過程を意味し、かかる過程によって得られた細胞を「核移植卵」と呼ぶ。なお、この明細書中で用いられる用語「体細胞」とは、単一の染色体（ｎ）を持つ生殖細胞を除き、２倍体の染色体（２ｎ）を持つ、人体を構成するあらゆる細胞を意味する。
【００２３】
また、本願明細書中で用いられる用語「自家核移植卵」とは、体細胞の核を脱核された卵子に移植して得た核移植卵であり、前記核移植卵由来の幹細胞または前記幹細胞から分化された特定の細胞または組織を受ける予定である患者から分離された体細胞の核を脱核された卵子に移植して得た核移植卵を意味する。
【００２４】
従って、本発明の際立った長所又は利益は、自家核移植卵由来の特定の細胞または組織を受ける患者が、そのような細胞または組織が患者自分の遺伝子型を持っているため、免疫拒否反応を示さない又は有害な副作用に苦しまないであろう点にある。
【００２５】
本願明細書中で用いられる用語「胚性幹細胞」とは、胚様から由来して様々な成熟細胞種類に分化できる能力を持っている未分化の細胞を言う。通常、「胚性」又は「胚芽」とは、受精してから約８週までの受精卵、またはそれに相当する発生段階にある核移植卵を言う。胚芽は、受精卵の分割の繰り返しにより発生し、通常、内細胞塊及び外部栄養膜細胞を含む胚盤胞の段階を有する。
【００２６】
このため、本願明細書中で用いられる用語「自家核移植卵由来の胚性幹細胞株または自家核移植された胚性幹細胞株」は、自家核移植卵から分離された内細胞塊由来の幹細胞株を意味する。
【００２７】
なお、本願明細書中で用いられる用語「神経前駆細胞」とは、ニューロンと、星状細胞、乏突起膠細胞、シュワン細胞、衛星細胞、上衣細胞及び小グリア細胞のグリアなどの神経細胞に分化される細胞を言う。
【００２８】
本発明は、
（１）ヒトの体細胞を培養して供与核細胞を用意するステップと、
（２）ヒトの卵子を脱核して受核卵子を用意するステップと、
（３）前記供与核細胞の核を前記受核卵子に移植し、前記供与核細胞の核と前記受核卵子を融合することにより核移植卵を製造するステップと、
（４）前記核移植卵をリプログラミング、活性化及び生体外培養させて胚盤胞を形成するステップと、
（５）前記胚盤胞から内細胞塊を分離し、前記内細胞塊を未分化のままで培養して胚性幹細胞株を樹立するステップと、を含む胚性幹細胞株の製造方法を提供する。
【００２９】
以下、本発明による胚性幹細胞株の製造方法を詳述する。
【００３０】
ステップ１：供与核細胞の製造
ヒトの体細胞を培養して供与核細胞を用意する。ヒト由来の体細胞が供与核細胞として使用可能であり、その核を脱核されたヒトの卵子に供与する。
【００３１】
ヒトから得られる体細胞であれば、特に制限無しに供与核細胞として使用可能である。なお、商業的な目的でヒトの細胞を保存する機関から得られた体細胞を用いることもできる。ヒトの皮膚細胞、神経細胞、卵管上皮細胞または卵丘細胞などが好ましい体核細胞の例である。
【００３２】
本発明による自家核移植卵を製造する場合に、体細胞としては、前記核移植卵由来の幹細胞、前記幹細胞から分化された特定の細胞、または組織を移植される患者から分離されたものを用いることが好ましい。
【００３３】
これらの供与核細胞は、例えば、マザー・アンド・バーンズの方法(Animal Cell Culture Methods: vol.57 of Methods in Cell Biology (Mather & Barnes eds., Academic Press, 1998))を応用して培養することにより細胞株として作製することができる。
【００３４】
本発明の好ましい一実施の形態によれば、前記培養の一様態は、得られた体細胞に子宮灌流液及びＰ／Ｓ抗生剤（ペニシリン１０，０００ＩＵ、ストレプトマイシン１０ｍｇ）入りリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を添加し、遠心分離して洗浄した後、ヒト血清（ＨＳ；human serum）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；non-essential amino acid）及びＰ／Ｓ抗生剤入りＤＭＥＭ（Dulbeccoo’s modified Eagle medium）において３９℃、５％のＣＯ2の条件下で培養する。
【００３５】
特に、卵丘細胞を供与核細胞として用いる場合、卵丘・卵母細胞複合体をヒアルロニダーゼで処理して卵子を囲んでいる卵丘細胞層を分離し、卵丘細胞層にトリプシン−ＥＤＴＡ溶液を添加して３９℃、５％のＣＯ2の飽和湿度培養器内に静置した後、遠心分離して洗浄し、上記の条件下で培養して供与核細胞として用いる。
【００３６】
ステップ２：受核卵子の製造
本発明において、受核卵子とは、自分（すなわち、卵子）の核を欠如し、外部から体細胞の核を受ける卵子を言う。
【００３７】
本発明においては、当業界における公知の方法(Yuzpe et al., J. Reprod. Med., 34:937-942 (1989))に従いヒトの卵子から過排卵卵子を採取し、あるいは、商業的な目的でヒトの卵子を保存する機関から卵子を入手した後、培養して成熟した卵子を用意することができる。例えば、５％のヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）入りＧ１．２培地（Vitro Life、Goteborg、Sweden）において５％のＣＯ2の条件下で約４時間培養することにより卵子を成熟させることができる。
【００３８】
次いで、前記成熟した卵子からそれを囲んでいる卵丘細胞を除去した後、卵子の透明帯の一部を除去し、第１の極体を含む細胞質を除去して脱核された受核卵子を作製することができる。
【００３９】
本発明においては、一様態として、下記のようにして脱核が行われる。成熟した卵子をヒアルロニダーゼが溶解されている洗浄用の培養液に入れて卵丘細胞を物理的に除去した後、前記Ｇ１．２培地で洗浄する。その後、卵丘細胞の除去された卵子の透明帯を切開して切開窓を設けた後、これを介して、卵子の全体の細胞質の１０〜１５％に見合う分の第１の極体を含む細胞質を除去して脱核する。次いで、脱核された卵子を前記Ｇ１．２培地で洗浄して前記Ｇ１．２培地に静置する。
【００４０】
脱核後、例えば、ＵＶ検出器を用いてＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.）で染色された細胞質体を観察することにより、脱核の有無を再確認することが好ましい。
【００４１】
ステップ３：核移植卵の製造及び電気融合
前記ステップ１の方法と同様にして用意された供与核細胞をステップ２に従い得られた脱核された受核卵子に移植し、次いで、電気融合させて核移植卵を作製する。
【００４２】
体細胞核を受核卵子に移植するために、体細胞の核だけを受核卵子に移植しても良く、体細胞の全体を受核卵子に移植しても良い。
【００４３】
本発明において、核移植及び電気融合は、下記のようにして行うことができる。
【００４４】
先ず、前記ステップ２に従い得られたＧ１．２培地に静置されている脱核された卵子をＧ１．２培地で洗浄し、移植用のピペットを用いて供与核細胞をＰＨＡ−Ｐ（phytohemagglutin−Ｐ）溶液にある脱核卵子の透明帯に設けられている切開窓に注入して核移植卵を作製する。次いで、その結果として生じた核移植卵をＧ１．２培地で洗浄し、その培地に静置させる。
【００４５】
続けて、前記静置された核移植卵を細胞操作機を用いて電気融合させる。核移植卵のあるＧ１．２培地にマンニトール溶液を添加した後、核移植卵を含有するマンニトール溶液を細胞操作機に接続されている両電極の間に詰め込んだ後、体細胞（供与核細胞）を（＋）電極に向かせて核移植卵を位置させる。次いで、電圧：０．７５〜２．００ｋＶ／ｃｍ、時間：１０〜１５μｓ、回数：約１秒置きに１〜５回の条件下で直流電流を通電して核移植卵を電気融合させる。
【００４６】
最後に、融合された核移植卵をマンニトール溶液とＧ１．２培地で洗浄する。このときに用いられるマンニトール溶液は、ＨＥＰＥＳ緩衝溶液にＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）及びマンニトールが溶解されているｐＨ７．２〜７．４の溶液である。
【００４７】
ステップ４：核移植卵のリプログラミング、活性化及び生体外培養
前記ステップ３に従い製造された核移植卵に精子と卵子が出会って形成された通常の受精卵と同様な発達過程を経させるためには、リプログラミング時間、活性化方法及び体外培養培地などの幾つかの重要な要素を適切に設定する必要がある。
【００４８】
本発明においては、体細胞の核が移植された前記核移植卵を活性化させて培養することにより、正常的な受精及び発達過程と殆ど同じ環境を造成する。すなわち、前記ステップ３において電気融合させた核移植卵をリプログラミング時間の経過後に活性化させ、胚盤胞の段階まで生体外培養する。
【００４９】
リプログラミング時間とは、受核卵子と供与核細胞を電気融合させてから活性化させるまで核移植卵を静置する時間のことであり、これは、核移植卵の発達能力（特に、胚盤胞の形成率）に影響を及ぼすことがある。前記リプログラミング時間は、体細胞の遺伝子の発現パターンを核移植卵の発達に適する所要パターンに戻す上で必要となる。この時間は、クロマチン再構築に重要な役割を果たし、生体内（in vivo）と生体外（in vitro）において核移植卵の発達能力を決めるものであると知られている。
【００５０】
本発明におけるリプログラミング時間は、２０時間以内、好ましくは、６時間以内、より好ましくは３時間以内、さらに好ましくは約２時間である。
【００５１】
上記のリプログラミング時間が経過後に核移植卵を活性化させるが、本発明において利用可能な活性化方法は、カルシウムイオノフォア、イオノマイシン、エタノール、タイロード(Tyrode)溶液（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, U.S.A.）及びピューロマイシンなどの化学物質による化学的な刺激または物理的な刺激などを含む。本発明においては、リプログラミング時間が経過した核移植卵にカルシウムイオノフォアを処理する活性化方法が好適に用いられ、カルシウムイオノフォアを処理した後、６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）を処理する活性化方法が好適に用いられる。ここで、前記カルシウムイオノフォアの濃度は５μＭ〜１５μＭであることが好ましく、約１０μＭであることがより好ましい。さらに、６−ＤＭＡＰの濃度は１．５ｍＭ〜２．５ｍＭであることが好ましく、約２．０ｍＭであることがより好ましい。前記カルシウムイオノフォア及び６−ＤＭＡＰの濃度が前記各範囲内に入る場合、前記核移植卵は効率よく活性化することが可能になる。
【００５２】
このとき、６−ＤＭＡＰ及びカルシウムイオノフォアの両方ともを体外培養用の培地に溶解させて用いることが好ましい。体外培養用の培地としては、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＨＣＯ3、ＮａＨ2ＰＯ4、ＣａＣｌ2、乳酸ナトリウム、葡萄糖、フェノールレッド、ＢＳＡ、カナマイシン、必須アミノ酸（ＥＡＡ；essential amino acid）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、グルタミンなどを含むＧ１．２培地（Vitro Life、Goteborg、Sweden）を用いることが好ましい。
【００５３】
加えて、核移植卵の効率よい生体外培養のために、当業界において公知のように、様々なエネルギー基質で培養培地を補充したり、あるいは、胚芽発達の段階別に有効成分を含有する２以上の培地を用いた順次的な培養システムを用いることが好ましい。本発明において利用可能な順次的な培養システムは、商業的に入手可能な培養システムであってもよい。例えば、前記生体外培養は、Ｇ１．２／Ｇ２．２培地（Vitro Life、Goteborg、Sweden）などの相異なる組成を持つ２種類の培地を順次に用いることにより行われてもよい。
【００５４】
好ましい生体外培養培地には、アミノ酸を持つ「ヒト変形合成卵管液（human modified synthetic oviductal fluid with amino acids；hmSOFaa)培地」が含まれるが、この培地を「ＳＮＵｎｔ−２培地」と命名する。前記ｈｍＳＯＦａａ培地は、ｍＳＯＦａａ培地（Choi et al., Theriogenology, 58:1187-1197 (2002)）のエネルギー物質であるグルコースをフルクトースに置換し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に代えてヒト血清アルブミン（human serum albumin；ＨＳＡ）を添加することにより製造されたものである。ここで、ｍＳＯＦａａ培地は、ウシ胚様の培養に汎用されている。
【００５５】
具体的に、前記「ＳＮＵｎｔ−２培地」は、（１）９５〜１１０ｍＭのＮａＣｌ、（２）７．０〜７．５ｍＭのＫＣｌ、（３）２０〜３０ｍＭのＮａＨＣＯ3、（４）１．０〜１．５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、（５）３〜８ｍＭの乳酸ナトリウム、（６）１．５〜２．０ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、（７）０．３〜０．８ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、（８）０．２〜０．４ｍＭのピルビン酸ナトリウム、（９）１．２〜１．７ｍＭのフルクトース、（１０）６〜１０mg／mlのＨＳＡ、（１１）０．７〜０．８μｇ／mlのカナマイシン、（１２）１．５〜３％の必須アミノ酸、（１３）０．５〜１．５％の非必須アミノ酸、（１４）０．７〜１．２ｍＭのＬ−グルタミン及び（１５）０．３〜０．７％のＩＴＳ（インシュリン：１．０ｇ／Ｌ、トランスフェリン：０．５５ｇ／Ｌ及び亜セレン酸ナトリウム：０．６７ｍｇ／Ｌの混合物）により構成されている。好ましくは、「ＳＮＵｎｔ−２培地」は、下記表１に示す含量の成分よりなる。
【００５６】
【表１】
2007516720.tif 000003
【００５７】
*ＩＴＳ：インシュリン１．０ｇ／Ｌ、トランスフェリン０．５５ｇ／Ｌ及び亜セレン酸ナトリウム０．６７ｍｇ／Ｌの混合物
他方、本発明による順次的な培養システムとしては、相異なる培地の組み合わせを用いることができる。例えば、１次培養はＧ１．２培地において、２次培養はＳＮＵｎｔ−２培地において培養を行う２段階の培養システムであることが好ましい。
【００５８】
ステップ５：透明帯またはその一部の除去
前記ステップ４に従い得られた胚盤胞から由来した胚性幹細胞を得るためには、上述した過程により培養された胚盤胞の透明帯またはその一部を除去する必要がある。
【００５９】
本発明における胚盤胞から透明帯またはその一部を除去する方法としては、通常の方法がいずれも制限無しに使用可能である。例えば、プロナーゼ処理、酸性タイロード溶液及びレーザー切開などの物理的な方法などが挙げられる。
【００６０】
好ましくは、本発明においては、プロナーゼ処理を用いる。プロナーゼは、ＰＢＳ、Ｇ２培地（Vitro Life、Goteborg、Sweden）またはＳ２培地（Scandinavian IVF Sciences、Goteborg、Sweden）に溶解して用いる。例えば、一様態として、ＰＢＳとＳ２培地を１：１で混合した培地にプロナーゼを溶解して用いることができる。胚盤胞から透明帯を除去するために、約０．１％のプロナーゼを透明帯が除去されるのに十分な時間をかけて適用する。ここで、適用時間は、好ましくは、約１−２分間、より好ましくは、１−１．５分間である。
【００６１】
ステップ６：栄養膜細胞の除去及び内細胞塊の分離
このようにして透明帯が除去されると、栄養膜細胞が露出される。この栄養膜細胞は、内細胞塊から完全に分離されることが好ましい。本発明においては、栄養膜細胞を内細胞塊から分離するために通常用いる方法、例えば、抗体を用いる免疫手術的な方法またはピペットを用いる機械的な方法が両方とも採用可能である。
【００６２】
本発明の好適な具体例においては、栄養膜細胞の表面にあるエピトープに反応する抗体を栄養膜細胞に処理して栄養膜細胞を分離する免疫手術的な方法を用いる。より好ましくは、補体処理と前記免疫手術的な方法を併用する。この場合、抗体及び補体の処理は個別的に、または同時に行うことができる。好適な抗体及び補体の組み合わせは、抗胎盤性のアルカリ性ホスファターゼ抗体（anti−ＡＰ）及び子ウサギ補体(baby rabbit complement)または抗ヒト血清抗体及びモルモット補体などを含む。
【００６３】
抗体及び補体は、ＳＮＵｎｔ−２、Ｇ２．２またはＳ２培地などに希釈して用いる。好ましくは、抗胎盤性のアルカリ性ホスファターゼ抗体はＳ２培地で１：２０の割合で希釈して用い、他の抗体及び補体は１：１で希釈して用いることが好ましい。
【００６４】
本発明においては、透明帯の除去された胚盤胞に抗体を処理した後、補体を処理することが好ましい。胚盤胞は、抗体で約３０分間処理することが好ましい。抗体に露出後、胚盤胞は、ＳＮＵｎｔ−２、Ｇ２．２またはＳ２培地などで洗浄し、その後、補体で処理することが好ましい。このとき、適用時間は約３０分であることが好ましい。
【００６５】
前記胚盤胞をＳＮＵｎｔ−２、Ｇ２．２またはＳ２培地で洗浄して栄養膜細胞またはその一部を胚盤胞から分離することができる。このとき、栄養膜細胞の分離は物理的な手段により行うことができ、好ましくは、このような分離は、小さな穴を持つピペットを用いた胚盤胞含有溶液のピペット操作など当業界における周知の方法により行うことができる。
【００６６】
このような過程を経て透明帯及び栄養膜細胞を除去し、内細胞塊、すなわち、残留部分を得る。
【００６７】
ステップ７：繊維芽栄養細胞層における内細胞塊の培養
前記ステップ６に従い分離された内細胞塊は、その未分化の状態を保持するように繊維芽栄養細胞層において培養する。場合によっては、ｈＬＩＦ（白血病抑制因子）は、栄養細胞層の代わりに内細胞塊を未分化の状態に保持する上で用いるが、ヒト細胞の場合に、高濃度ＬＩＦの場合であっても、繊維芽栄養細胞層がなければ細胞を未分化の状態に保持することができない。このため、通常、胚性幹細胞と関わる胚外分化及び細胞死滅を誘導しない条件とは、繊維芽栄養細胞層上において培養することを言う。
【００６８】
繊維芽栄養細胞層を製造するために、マウス及び／またはヒトの繊維芽細胞を用いることが好ましい。これらは単体で、または混合して用いることができる。より好ましくは、患者の自家核移植卵由来の胚性幹細胞から分化された細胞を栄養細胞層として用いる（本発明者は、これを自家栄養細胞層と称する）。最も好ましくは、自家核移植卵由来の胚性幹細胞から繊維芽細胞に分化された細胞を栄養細胞層として用いる。このような細胞の利用により、究極的に得たい自家核移植された胚性幹細胞が他の細胞、つまり、由来の異なる繊維芽栄養細胞層を構成する細胞によって汚染されることを防ぐことができる。
【００６９】
ヒト由来の繊維芽細胞は、マウス繊維芽細胞と適するように混合して最適な幹細胞の生長及び分化の抑制を図ることができる。
【００７０】
繊維芽細胞層の細胞密度は、その安定性及び性能に影響を及ぼす。細胞密度としては、１ｃｍ2当たりに、約２．５×１０4個のヒト繊維芽細胞と７．０×１０4個のマウス繊維芽細胞を持つような密度が最適である。マウス繊維芽細胞を単体で用いるときには、７．５×１０4-１．０×１０5細胞／ｃｍ2の密度が好適である。この栄養細胞層は、ＥＳ細胞を添加する６−４８時間前に樹立されることが好ましい。
【００７１】
好ましくは、マウスまたはヒトの繊維芽細胞は、継代数の少ない細胞である。繊維芽細胞の質は、幹細胞を支持する能力に影響を及ぼす。胚芽の繊維芽細胞が特に好適に用いられるが、胚芽の繊維芽細胞は、マウス繊維芽細胞の場合に１３．５日目の胎児から、そしてヒトの繊維芽細胞の場合には胚芽または胎児の組織から得ることができ、通常の細胞培養プロトコルを用いて培養することができる。
【００７２】
マウス胚様の繊維芽細胞を取り扱うに当たって、基本的なガイドラインは、トリプシンの利用を極力抑えて過密化を回避することを含む。このような取扱いがなされていない胚芽の繊維芽細胞は、未分化ＥＳ細胞の生長を支持することができない。新たに製造されたマウス胚様の繊維芽細胞の各バッチは、これらが幹細胞の保持に適しているかどうかを確認するために、先ずテストを受ける必要がある。
【００７３】
新たな１次胚芽繊維芽細胞の方が、冷凍−解凍された繊維芽細胞に比較して幹細胞の再生を支持する上で一層好適である。しかしながら、幾つかのバッチは、繰り返し的な冷凍及び解凍を経てからも、それらの潜在的な支持力を有することがある。
【００７４】
一部のマウス系統は、他の系統よりも幹細胞の維持に一層好適な胚様繊維芽細胞を生産することができる。例えば、同種繁殖された１２９／ＳｖまたはＣＢＡ系統または１２９／ＳｖとＣ５７／Ｂ１６系統の異種交配により生産されたマウス由来の繊維芽細胞が幹細胞の保持に最適であることが立証されている。
【００７５】
他方、栄養細胞は、これらの成長を阻止するように処理されることが好ましい。幾つかの方法が利用可能であるが、例えば、放射線の照射またはマイトマイシンＣなどの化学物質を処理する。最も好ましくは、栄養細胞をマイトマイシンＣで処理する。
【００７６】
このような繊維芽栄養細胞層は、通常、ゼラチンで処理された皿上において培養され、好ましくは、０．１％のゼラチンで処理される。
【００７７】
繊維芽栄養細胞層は、ＥＳ培地において維持可能である。好適なＥＳ培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、２０％の血清置換物、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭのグルタミン及びペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、ヒト組換え繊維芽細胞成長因子（fibroblast growth factor；ｂＦＧＦ）（４ｎｇ／ｍｌ）が補われている培地である。
【００７８】
ＥＳ培地には、幹細胞の成長または生存を促進可能な、あるいは、幹細胞の分化が抑制可能な可溶性の成長因子をさらに補うことができる。これらの因子は、例えば、ヒトの多能性幹細胞因子または胚性幹細胞の再生因子などを含む。
【００７９】
分離された内細胞塊は、少なくとも６日以上培養可能であり、この段階で細胞のコロニーができる。このコロニーは、原則としては、未分化幹細胞により構成されている。未分化幹細胞の分離は、当業界における１以上の周知の方法により達成可能であるが、マイクロピペットを用いることが好ましい。この物理的な分離は、Ｃａ2+／Ｍｇ2+の無いＰＢＳ培地またはディスパーゼなどの細胞の分離に有効な酵素処理と並行可能である。
【００８０】
ステップ８：胚性幹細胞の継代培養
前記ステップ７に従い培養された幹細胞を栄養細胞層から取って新たな栄養細胞層に移した後、これを形態学的に未分化の状態で増殖する上で十分な時間をかけて培養することができる。
【００８１】
このとき、細胞は、５−７日間培養することが好ましい。その後、未分化の幹細胞コロニーが観察され始める。幹細胞は、高い核／細胞質の割合、顕著な核小体、凝縮されたコロニーの形成及びはっきりとした細胞の境界によって形態学的に確認可能である。
【００８２】
未分化幹細胞の増殖は、幹細胞コロニーから未分化の幹細胞凝集体を分離することから始まる。この分離は、化学的または物理的な手段など当業界における公知の方法によって行われる。より好ましくは、幹細胞は、Ｃａ2+／Ｍｇ2+の無いＰＢＳ培地で洗浄したり、あるいは、物理的な方法または両方法を組み合わせてコロニーから分離することができる。より好ましくは、物理的な方法により破砕して継代する。
【００８３】
本発明の一具体例において、Ｃａ2+／Ｍｇ2+の無いＰＢＳ培地が細胞同士の付着力を低減する上で利用可能である。前記培地において約１５−２０分間培養すると、細胞は次第に栄養細胞層から互いに分離され始め、結局として、目的サイズの凝集体に分離可能である。細胞の分離が不十分に行われている場合には、マイクロピペットの尖った角部を用いた物理的な分離が凝集体の分離及び切断に有効になることがある。
【００８４】
選択的な化学的な方法は、酵素の利用を含む。酵素は単体で、または物理的な方法と併用可能であり、酵素としては、ディスパーゼを用いることが好ましい。
【００８５】
他の具体例として、コロニーの物理的な切断後に、ディスパーゼを用いて前記コロニーから凝集体を分離する混合方式が挙げられる。コロニーの切断は、Ｃａ2+／Ｍｇ2+を含有するＰＢＳ培地において行う。マイクロピペットの尖った角部は、コロニーを約１００個の細胞を含む凝集体に切断する上で利用可能である。凝集体が分離されると、直ちにこれを広い穴付きマイクロピペットで取ってＣａ2+／Ｍｇ2+含有のＰＢＳ培地で洗浄した後、新たな繊維芽栄養細胞層に移す。
【００８６】
この培養過程において、幹細胞が未分化の状態を維持しているかどうかを確認する必要がある。未分化の胚性幹細胞は、上述したように、形態学的な特性を持っている。幹細胞を確認可能な他の方法としては、細胞マーカーまたは多能性細胞の特徴的な遺伝子の発現を測定することが挙げられる。
【００８７】
多能性細胞の特徴的な遺伝子または独特な系統の例は、必ずしもこれに制限されるものではないが、幹細胞のマーカーとして、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、Ｏｃｔ−４（オクターマ−４）、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４を含む。幹細胞に独特な他の遺伝子は、ジェネシス、ＧＤＦ−３及びクリプトを含む。このような遺伝子の発現プロファイルは、逆転写−重合酵素連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）、分化遺伝子発現方法及びマイクロアレイ分析などの公知の方法によって得られる。
【００８８】
好ましくは、幹細胞は、ＳＳＥＡ−４、ＧＣＴＭ−２抗原、ＴＲＡ１−６０を含むヒトの多能性幹細胞マーカーとの免疫反応の有無によって確認可能である。好ましくは、これらの細胞は、転写因子としてＯｃｔ−４を発現し、且つ、正常２倍体核型を保持している。
【００８９】
幹細胞の成長過程及びこれらの分化または未分化状態の維持は、培養培地に分泌される幹細胞に特異的なタンパク質の定量測定やＥＬＩＳＡまたは関連技術を用い、細胞の固定された顕微標本の分析によりモニタリングすることができる。これらの幹細胞に特異的なタンパク質は、ＣＤ抗原の可溶性の形態またはＧＣＴＭ−２抗原を含み、且つ、これらのタンパク質は、細胞マーカーを検出したり、または遺伝子の発現を測定することによりモニタリングすることができる。
【００９０】
なお、本発明は、ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植して形成された核移植卵由来の胚性幹細胞株から分化された神経細胞または神経前駆細胞を提供する。
【００９１】
さらに、本発明は、
（１）胚性幹細胞株を培養して胚芽体を形成するステップと、
（２）前記胚芽体を、前記胚芽体の細胞を神経前駆細胞に分化させるのに適した製剤の存在下で培養するステップと、
（３）神経前駆細胞のマーカーを発現する細胞を選別して培養して神経前駆細胞を得るステップと、を含む、
ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植して形成された核移植卵由来の胚性幹細胞株から分化された神経前駆細胞を製造する方法を提供する。
【００９２】
以下では、本発明による、ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植して形成された核移植卵由来の胚性幹細胞株から分化された神経前駆細胞を製造する方法を段階別に詳述する。
【００９３】
ステップＡ：胚芽体の生成
以上において得られた自家核移植卵由来の胚性幹細胞株（核移植胚性幹細胞、またはｎｔＥＳ細胞）を神経前駆細胞に分化させるための最初の段階は、ｎｔＥＳ細胞を胚芽体として生成することである。幹細胞から胚芽体を形成する方法は、当業界において既に公知である(Zhang et al., Nat. Biotechnol., 19:1129-1133 (2001))。
【００９４】
具体的に、本発明は、一様態として、培養されたｎｔＥＳ細胞コロニーを非接着性の培養皿に移して３日〜５日間２０％の血清置換物入りＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において培養することにより、胚芽体を生成することができる。前記培養に際し、通常、１日の経過後に、浮遊胚芽体（約４０〜６０個の胚芽体／皿）が生え始める。このとき、前記胚芽体を新たな皿に移しながら、残留する栄養細胞を除去することが好ましい。その後、このようにして生成された胚芽体は、（ポリオルニチン／ラミニンでコートされた）接着性の皿にプレートする。
【００９５】
ステップＢ：因子による神経前駆細胞への分化誘導
本発明において、前記ステップＡに従い得られた胚芽体を神経前駆細胞に分化可能に誘導する化学物質としては、特に制限はないが、例えば、ＩＴＳＦ（インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びフィブロネクチンの混合物）、レチノイン酸、アスコルビン酸、ニコチンアミド、Ｎ−２補充剤（１００Ｘ、１７５０２−０４８; Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.）及びＢ−２７補充剤（５０Ｘ、１７５０４−０４４；Gibco, Grand Island, NY, U.S.A.）などが挙げられる。これを培地に添加して培養し続け、拡張及び分化を誘導することにより、ｎｔＥＳから分化された神経前駆細胞を得ることができる。
【００９６】
本発明の好適な一具体例において、上記のステップＡに従い生成された胚芽体を１日間さらに培養した後、ＩＴＳＦ、すなわち、インシュリン（約２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（約１００μｇ／ｍｌ）、亜セレン酸ナトリウム（約３０ｎＭ）及びフィブロネクチン（約５μｇ／ｍｌ）で補われたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において５日〜１０日間培養して、ｎｔＥＳ細胞の神経前駆細胞への分化を誘導することができる。
【００９７】
ステップＣ：神経前駆細胞マーカーを発現する細胞の選別及び培養
前記ステップＢに従い分化された細胞から、神経前駆細胞マーカー、例えば、ネスチンを発現する細胞を選別した後、これを培養することにより自家核移植された胚性幹細胞株から分化された神経前駆細胞を得ることができる。また、得られた神経前駆細胞から特定な所望の神経細胞型への分化が誘導可能であり、この分化の誘導は、化学物質を用いた誘導などの通常の方法により行われる。
【００９８】
本発明の好適な具体例において、神経前駆細胞マーカーに陽性を示す細胞を選別し、Ｎ−２補充剤、ラミニン、ｂＦＧＦで補われたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において５〜７日間培養して細胞の拡張を誘導し、その後、これをｂＦＧＦを除き、Ｎ−２補充剤及びラミニンだけで補われたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において８日〜１４日間培養する。
【００９９】
胚性幹細胞をいかなる種類の細胞にも分化させることが可能であることは周知である。このため、本発明による胚性幹細胞株は、種々な類型の細胞を提供する立派な供給源になりうる。例えば、胚様幹細胞は、細胞の分化に適した培地及び条件下で培養することにより、造血幹細胞、神経細胞、β細胞、筋肉細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞などへの分化が誘導可能になる。このときの培地及び培養条件は、当業界において周知である。
【０１００】
このため、本発明による胚性幹細胞株は、数多くの治療的及び診断的な応用を有する。特に、ＥＳ細胞は糖尿病、パーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、大脳麻痺及び癌などの数多くの疾患の治療のための細胞移植治療法に利用可能である。さらには、自家核移植卵由来の自家胚性幹細胞は、治療途中やそれ以降に免疫拒否反応の副作用がないことから、細胞移植治療法に一層有効である。
【０１０１】
以下、実施例を挙げて本発明を一層詳述する。但し、これらの実施例は単に本発明を一層詳しく説明するためのものであり、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例に何ら制限されないことは、当業界における通常の知識を持った者にとって明らかである。
【０１０２】
下記の実施例に用いられるＧ１．２培地及びＧ１ｖｅｒ．３培地（Vitro Life、Goteborg、Sweden）は、特に断りのない限り、５％のＨＳＡ入り培地である。
【実施例】
【０１０３】
＜実施例１＞
卵子及び供与核細胞の製造
卵子寄贈者を身体及び精神検査により詳しくスクリーニングした後、卵胞刺激ホルモン（follicle stimulation hormone；ＦＳＨ）を連続して注入して過排卵を誘導した。
【０１０４】
ヒト絨毛性の性腺刺激ホルモン（human chorionic gonadotropin；ｈＣＧ）を卵子寄贈者に注入した後、３６時間目に卵丘・卵母細胞複合体（cumulus-oocyte complex；ＣＯＣｓ）を回収してＧ１．２培地（Vitro Life、Goteborg、Sweden）において、３７℃、５％のＣＯ2の飽和湿度培養器を用いて４０分間培養した。卵丘・卵母細胞複合体は、０．１％（ｗ／ｖ）のヒアルロニダーゼ（Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.）で１時間に亘って処理して、卵丘細胞を分散させた。
【０１０５】
卵子は、卵丘・卵母細胞複合体から卵丘細胞を分散することにより得られた。この後、マウスピペットを用いて卵丘細胞を剥がした後、Ｇ１．２培地で洗浄した。ここで、モード径：１０−１２mmの卵丘細胞が供与核細胞として選ばれた。
【０１０６】
＜実施例２＞
卵子の脱核及び細胞融合
実施例１に従い得られた卵子をＧ１．２培地において１〜２時間に亘って培養することにより、脱核前に核の成熟を誘導した。続けて、脱核、核移植及び電気融合を下記のようにして行った。
【０１０７】
（２−１）卵子の脱核及び体細胞の核移植
卵子をＧ１．２培地で１回洗浄し、５ｍｌのＧ１．２培地にヒアルロニダーゼ０．０５ｇを溶解させた溶液１１１μｌとＧ１．２培地１ｍｌを混合して最終的な濃度を０．１％（ｗ／ｖ）に調整したヒアルロニダーゼ溶液内に卵子を移した後、卵丘細胞を除去し、Ｇ１．２培地で３回洗浄して静置させた。次いで、７．５μｇ／ｍｌの濃度になるようにＤＭＳＯにサイトカラシンＢを溶解させた溶液１μｌと１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）入りＧ１．２培地１ｍｌを混合したサイトカラシンＢ溶液に卵子を移し、微細な操作機で静置された卵子の透明帯を切開して切開窓を設けた後、これを介して全体細胞質の１０〜１５％に見合う分の第１の極体を含む卵子の細胞質を除去することにより卵子を脱核させた。
【０１０８】
図３は、固定用のピペット１と切開用のピペット２により卵子３の透明帯を切開する過程を示す。 また、図４は、卵子の第１の極体と核を除去する脱核過程を示す。図４から明らかなように、卵子３を回転させて切開窓を垂直に位置させ、固定用のピペット１を卵子の下部に位置させて卵子が下方に動かないように支持した後、切開用のピペット２を卵子の上から軽く押下して卵子を脱核させた。このようにして脱核された卵子をＧ１．２培地で３回洗浄し、Ｇ１．２培地に静置させた。
【０１０９】
その後、１％のＢＳＡ入りＰＢＳの４μｌの微小滴に存在する供与核細胞を、４００μｌのＧ１．２培地と１００μｌのＰＨＡ−Ｐ溶液（１０ｍｌのＧ１．２培地に５ｍｇのＰＨＡ−Ｐを溶解させた溶液）を混合して得られた溶液４μｌの微小滴に存在する脱核卵子に固定用のピペットと移植用のピペットを用いて移植した。供与核細胞と脱核卵子を含有する前記微小滴に、蒸発防止のための鉱油を塗布した。
【０１１０】
図５は、脱核された卵子に供与核細胞を移植する過程を示す。 図５から明らかなように、脱核された卵子３が固定用のピペット１により固定され、移植用のピペット４が脱核卵子の切開窓に注入された後、油圧で供与核細胞を注入して核移植卵を作製した。このようにして作製された核移植卵をＧ１．２培地で３回洗浄した後、同じ培地に静置させた。
【０１１１】
（２−２）電気融合による核移植卵の作製
ＢＴＸ−電子細胞操作機（BTX Inc., San Diego, CA, U.S.A.）を用いて核移植卵を電気融合させた。
【０１１２】
０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．２）に０．１ｍＭのＭｇＳＯ4、０．０５％のＢＳＡ及び０．２８ｍＭのマンニトールを溶解させて得られたマンニトール溶液２０μｌの微小滴、Ｇ１．２培地１０μｌと前記マンニトール溶液１０μｌを混合して得られた２０μｌの微小滴、そして、Ｇ１．２培地２０μｌの微小滴を用意した。前記（２−１）に従い製造した核移植卵を、先ず、Ｇ１．２培地１０μｌと前記マンニトール溶液１０μｌを混合して得られた２０μｌの微小滴中に１分間静置した後、マウスピペットを用いて前記核移植卵を前記マンニトール溶液２０μｌの微小滴に移して１分間静置させた。次いで、核移植卵をＢＴＸ−電子細胞操作機に接続されている両電極の間に分注されたマンニトール溶液に入れ、供与核細胞を（＋）電極に向かせて核移植卵を位置させた。電圧：１ｋＶ／ｃｍ、時間：１５μｓ、回数：１秒置きに２回の条件下で直流電流を通電して核移植卵を電気融合させた。融合された核移植卵をＧ１．２培地１０μｌと前記マンニトール溶液１０μｌを混合して得られた２０μｌの微小滴中に１分間静置させ、Ｇ１．２培地２０μｌの微小滴に移した後、Ｇ１．２培地で３回洗浄した。
【０１１３】
＜実施例３＞
核移植卵のリプログラミング、活性化及び生体外培養
実施例２に従い得られた核移植卵は、正常的な胚の発生を誘導する上で主な１因子である精子による活性化を受けないため、人工的な刺激が必要となる。人為的な胚の発生のための最適な条件を設定するために、下記表２〜４に示すように、核移植卵をリプログラミング時間の経過後に各種の方法により活性化させ、さらに生体外培養した。
【０１１４】
先ず、リプログラミング時間が胚盤胞の形成率に及ぼす影響を調べるために、リプログラミング時間をそれぞれ約２、４、６、２０時間に変化させ、活性化方法及び生体外培養の条件を下記表２のように設定した。これより、リプログラミング時間が約２時間となったときに、最高の胚盤胞の形成率が得られることが分かる。
【０１１５】
【表２】
2007516720.tif 000004
【０１１６】
*カルシウムイオノフォアＡ２３１８７
また、活性化方法が胚盤胞の形成率に及ぼす影響を調べるために、固定された（約２時間）リプログラミング時間が経過した核移植卵を、下記表３に示すように、Ｇ１．２培地において３７℃、５分間カルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５または１０μＭ；Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.）またはイオノマイシン（５または１０μＭ；Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.） で処理した後、Ｇ１．２培地で数回洗浄し、２．０ｍＭの６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ；Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.）を含むＧ１．２培地に移して３７℃、５％のＣＯ2、５％のＯ2及び９０％のＮ2で４時間活性化させた。その後、これを同じ培養条件下で生体外培養した。下記表３より、１０μΜのカルシウムイオノフォアを処理し、その後、２．０ｍＭの６−ＤＭＡＰを順次に処理するような活性化方法が最高の胚盤胞の形成率を示すことが確認できた。
【０１１７】
【表３】
2007516720.tif 000005
【０１１８】
*カルシウムイオノフォアＡ２３１８７
さらに、生体外培養の条件が胚盤胞の形成率に及ぼす影響を調べるために、前記最適なリプログラミング時間及び活性化後に核移植卵をＧ１．２培地で勢いよく洗浄し、１０μｌのＧ１．２培地の微小滴またはＳＮＵｎｔ−２培地において３７℃、５％のＣＯ2、５％のＯ2及び９０％のＮ2の条件下で４８時間培養した。培養後に分離した核移植卵を新たなＧ２．２培地またはＳＮＵｎｔ−２培地に移してさらに６日間培養した。生体外培養培地の代表例はＧ２．２培地(Vitro Life, Goteborg, Sweden)であり、それはアラニン、アラニル−グルタミン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、塩化カルシウム、パントテン酸カルシウム、塩化コリン、シスチン、葉酸、グルコース、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ヒト血清アルブミン、イノシトール、イソロイシン、ロイシン、クジン、硫酸マグネシウム、メチオニン、ニコチンアミド、ペニシリンＧ、フェニルアラニン、塩化カリウム、プロリン、ピリドキサルＨＣＬ、リボフラビン、セリン、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、乳酸ナトリウム、ピルビン酸ナトリウム、チアミン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン及び水を含む。
【０１１９】
【表４】
2007516720.tif 000006
【０１２０】
*カルシウムイオノフォアＡ２３１８７
表４より、Ｇ１．２培地において１次培養を行い、さらにＳＮＵｎｔ−２培地において２次培養を行うことにより、最高の胚盤胞の形成率が得られることが確認できた。
【０１２１】
要するに、核移植卵は、２時間のリプログラミング時間を経た後、１０μＭのカルシウムイオノフォアで処理し、２．０ｍＭの６−ＤＭＡＰで処理して活性化した後、Ｇ１．２培地において１次培養を行い、ＳＮＵｎｔ−２培地において２次培養を行うことにより、最適な胚の発生が得られる。
【０１２２】
前記最適な条件下で、さらに６６個の核移植卵をリプログラミング、活性化及び生体外培養して１９個の胚盤胞（２９％）を得た。胚盤胞から生じた本発明による核移植卵の前記割合は、ウシ（約２５％）（Kwun et al., Mol. Reprod. Dev., 65:167-174 (2003)）及び豚（約２６％）（Hyun et al., Biol. Reprod., 69:1060-1068 (2003); Kuhholzer et al., Biol. Reprod., 64:1635-1698 (2004)）において樹立されたＳＣＮＴ方法により観察されたものに匹敵すべきものである。
【０１２３】
＜実施例４＞
透明帯の除去及び栄養膜細胞の除去と内細胞塊の分離
前記実施例３に従い得られた胚盤胞に０．１％のプロナーゼ（Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.）を１分間適用して透明帯を除去した後、１００％の抗ヒト血清抗体（Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.）で２０分間処理し、３７℃、５％のＣＯ2の条件下で１０μＭのモルモット補体（Life Technologies, Rockville, MD, U.S.A.）にさらに３０分間露出させることにより、栄養膜細胞を除去して内細胞塊を分離した。
【０１２４】
＜実施例５＞
内細胞塊の培養
実施例４に従い分離された内細胞塊は、０．１％のゼラチンでコートされた組織培養皿を用い、マイトマイシンＣで不活性化された１次マウス（Ｃ５７ＢＬ breed）胚芽の繊維芽細胞栄養細胞層（７．５ｘ１０4細胞／cm2）において培養した。培養培地としては、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Life Technologies, Rockville, MO, U.S.A.）に２０％の血清置換物、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１％の非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、繊維芽細胞成長因子（Life Technologies, Rockville, MD, U.S.A.）（４ｎｇ／ｍｌ）が補われた培地を用いた。初期のＥＳ細胞培養中に、培地は、ヒト組換え白血病抑制因子（Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.）（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）で補った。前記培養は、未分化のｎｔＥＳ細胞コロニーが発現するまで６日以上行った。ｎｔＥＳ細胞コロニーの形成後、５日または７日おきにマイクロピペットを用いて機械的にｎｔＥＳ細胞を分離した。
【０１２５】
このようにして得られた自家核移植卵由来の胚性幹細胞を「ｈｎｔＥＳ」と命名し、２００３年１２月２９日付でブダペスト協約下の国際寄託機関である韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ；大韓民国ソウル市鍾路区蓮建洞２８番地、ソウル大学校医科大学癌研究所内）に寄託し、受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２を付与された。
【０１２６】
＜実験例１＞
核型分析による実施例５に従い得られたヒトｎｔＥＳ細胞の確認
上記の実施例５に従い得られた未分化ｎｔＥＳ細胞のコロニーを０．１ｍＭのＣａ2+及び０．１ｍＭのＭｇ2+を含有するＰＢＳで洗浄した後、クエン酸−アセトン−ホルムアルデヒド（混合比：２５：６５：８（ｖ／ｖ／ｖ））で４℃、１時間固定し、０．１ｍＭのＣａ2+及び０．１ ｍＭのＭｇ2+を含むＰＢＳで１回洗浄した。ｎｔＥＳ細胞のアルカリ性ホスファターゼの活性度を検証するために、ＡＰキット（Sigma Co., St. Louis, MO, U.S.A.）を用いた。ｎｔＥＳ細胞の独特な表面抗原を調べるために、下記のモノクローセル抗体を１次抗体として用い、免疫組織化学分析を行った：Ｏｃｔ−４（ＳＣ−５２７９; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.); ＳＳＥＡ−１（ＭＣ４８０）、ＳＳＥＡ−３（ＭＣ６３１）及びＳＳＥＡ−４（ＭＣ−８１３−７０; Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA, U.S.A.); ＴＲＡ−１−６０及びＴＲＡ−１−８０(Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.)
前記１次抗体を、ビオチン化２次抗体及びアビジン−ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ接合体を含有するVectastatin ＡＢＣキット（Vector laboratory, Burlingame, CA, U.S.A.）で探知した。
【０１２７】
ゲノムＤＮＡ及びヒトのＳＴＲ（human short tandem repeat）マーカーに対し、自動化されたＡＢＩ ３１０遺伝分析器（Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.）上においてSTR AMP FLSTR PROFILERキット（Applied Biosystems, Foster City, CA, U.S.A.）を用いてＤＮＡ指紋法による分析を行った。その分析結果を図６Ａ〜図６Ｄに示す。
【０１２８】
図６Ａ〜図６Ｄによれば、前記実施例１〜５に従い得られた核移植卵由来の胚性幹細胞株の核型の分析結果と、前記胚性幹細胞株に核を提供した女性の体細胞核型の分析結果が同じであることが分かる。このため、本発明に従い得られた胚性幹細胞株は、単位生殖により活性化された卵子からのものではなく、ある女性の体細胞核を移植して製造された核移植卵由来のものであることが分かる。
【０１２９】
＜実験例２＞
奇形腫分析によるヒトのｎｔＥＳ細胞の確認
実施例５に従い得られた未分化のｎｔＥＳ細胞１００個コロニーを培養皿から分離して１ｍｌの注射器に入れ、ＳＣＩＤマウス（ＫＲＩＢＢ；Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Korea）の生殖腺に注入した後、８週間培養した。形成された奇形腫をパラフィンで固定して免疫組織化学検査を行い、３胚葉細胞が生成されているかどうかを確認した。その分析結果を図７に示す。
【０１３０】
図７によれば、実施例５に従い得られたｎｔＥＳ細胞は、生殖腺に３胚葉（軟骨Ａ：内胚葉、腸管Ｂ：中胚葉、及び神経管Ｃ：外胚葉）を形成していることが分かる。これより、本発明に従い得られたｎｔＥＳ細胞は、種々の組織に分化できる能力を持った多能性の胚性幹細胞であることが分かる。
【０１３１】
＜実験例３＞
免疫組織化学染色による胚芽体の形成確認
前記実施例５に従い得られたヒトｎｔＥＳ細胞コロニーを０．１％トリプシン／１ｍＭのＥＤＴＡで処理して分離した後、プラスチック製のペトリ皿に移した。ヒトｎｔＥＳ細胞は、ｈＬＩＦ及びｂＦＧＦ無しにＤＭＥＭ／ＤＭＥＭＦ１２培地において１４日間培養した。パラフィンの固定のために、ｎｔＥＳ細胞はＰＢＳに溶解された１％の低溶融温度のアガロースに移し、４２℃まで冷却させた。その結果、ｎｔＥＳ細胞を含む固体化されたアガロースをＰＢＳに溶解された４％のパラホルムアルデヒドに固定させ、パラフィンに埋め込んだ。パラフィン埋め込み細胞の個々の６ｍｍセクションをスライドに配置し、免疫組織化学分析を行った。このときに用いられた抗体は、下記の通りである：α−１−フェトプロテイン（１８−０００３）、サイトケラチン（１８−０２３４）、デスミン（１８−００１６）、ニューロフィラメント（１８−０１７１）及びＳ−１００（１８−００４６）は、ゼメッド社（South San Francisco, CA, U.S.A.）から購入し、ＨＮＦ−２−α（ＳＣ−６５５６）、ＢＭＰ−４（ＳＣ−６８９６）、筋肉Ｄ（ＳＣ−７６０）及びＮＣＡＭ（ＳＣ−７３２６）はサンタクルーズバイオテクノロジー（Santa Cruz, CA, U.S.A.）社から購入した。前記抗体を１次抗体として用い、ビオチン抗ウサギ、抗マウスまたは抗ヤギ抗体を２次抗体として用いた。前記免疫反応をストレプトアビジン接合のホースラディシュ・ペルオキシダーゼ及びジアミノベンジジン・クロマゲンで探知し、その結果を図８に示す。
【０１３２】
図８によれば、実施例５に従い得られたｎｔＥＳ細胞から、内胚葉マーカータンパク質であるα−１−フェトプロテイン（Ａ）、サイトケラチン７（Ｂ）及びＨＮＦ−２−α（Ｃ）と、中胚葉マーカータンパク質であるＢＭＰ−４（Ｄ）、筋肉Ｄ（Ｅ）及びデスミン（Ｆ）、そして、外胚葉マーカータンパク質であるニューロフィラメント（Ｇ）、Ｓ−１００（Ｈ）及びＮＣＡＭ（Ｉ）が発現していることが確認でき、その結果、前記ｎｔＥＳ細胞が胚芽体を形成可能であることが確認できた。これより、本発明に従い得られた細胞は、胚性幹細胞であることが分かる。
【０１３３】
＜実施例６＞
神経前駆細胞への分化
（６−１）未分化ＥＳ細胞の拡張
上記の実施例５に従い得られたヒトの未分化ｎｔＥＳ細胞を、３７℃、５％のＣＯ2の条件下で、２％のゼラチンでコートされた培養皿に充填された、細胞分裂が不活性化されたマウス胚様の繊維芽細胞栄養細胞層において培養した。前記培養に際し、ＤＭＥＭ Ｆ／１２（１：１）、２０％のノックアウト血清置換物、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１ｍＭのＬ−グルタミン及び抗生剤（１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ）よりなる培地を用い、毎日のように交換した。
【０１３４】
（６−２）胚芽体の生成
培養されたｎｔＥＳ細胞コロニーを集めて非接着性の培養皿に移し、３７℃、５％のＣＯ2の条件下で培養した。培養培地は、４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦがないことを除いては、前記（６−１）において用いられた培地と同じ培地を用いた。１日の経過後に、ＥＳ細胞コロニーは、浮遊胚芽体（〜５０／皿）として生え始めた。このとき、胚芽体を新たな皿に移しながら、残留する栄養細胞はいずれも除去した。加えて、４日間の培養後に生成された胚芽体は、（ポリオルニチン／ラミニンでコートされた）接着性の皿にプレートした。
【０１３５】
（６−３）ネスチン陽性細胞の選別
接着性の皿において１日間培養した後、分化する胚芽体をＩＴＳＦ（インシュリン：２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン：１００μｇ／ｍｌ、亜セレン酸ナトリウム：３０ｎＭ及びフィブロネクチン：５μｇ／ｍｌ）で補われたＤＭＥＭ／Ｆ１２に移して３７℃、６日間培養した。このようにして培養された細胞は、ネスチン抗体（Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.）を０．０１ＭのＰＢＳ、１％のＢＳＡ、５ｍＭのＥＤＴＡ入り溶液で１／１０００に希釈した溶液において３７℃、４０分間培養した。新たな前記ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で洗浄した後、細胞をフィコエリスチン（phycoerythrine；ＰＥ）接合の２次抗体（Chemicon, Temecula, CA, U.S.A.）でさらに３０分間培養した後、新たな前記ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で３回洗浄してネスチン陽性細胞を選別した。
【０１３６】
（６−４）ネスチン陽性細胞の拡張
前記実施例（６−３）に従い選別されたネスチン陽性細胞をＮ−２補充剤、ラミニン（１ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で補われたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において６日間培養することにより拡張した。
【０１３７】
（６−５）神経前駆細胞への分化
その後、ネスチン陽性の細胞をｂＦＧＦを除去し、Ｎ−２補充剤及びラミニン（１ｎｇ／ｍｌ）で補われたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地において３７℃、１０日間培養して分化を誘導した。
【０１３８】
本発明による自家核移植卵由来の幹細胞から分化された神経前駆細胞を図２に示す。
【０１３９】
以上、本発明の特定な具体例について述べたが、特許請求の範囲により定義された発明の範囲内である限り、当業者による種々の変形及び変更が可能であることは言うまでもない。
寄託された微生物または他の生物学的な物質に関する言及
【０１４０】
【表５】
2007516720.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
本発明の上述した、そして他の目的と特徴は、添付図面と結び付けて行われる下記の本発明の説明から一層明らかになる：
【図１】本発明による核移植卵由来のＥＳ細胞の未分化コロニーの写真である（Ａ；ｘ１００、Ｂ；ｘ２００）。
【図２】本発明に従い得られた未分化コロニーにＩＴＳＦ（すなわち、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム及びフィブロネクチン）を添加して分化された神経前駆細胞の蛍光染色写真である（ｘ４００）。
【図３】固定用のピペット１と切開用のピペット２により卵子３の透明帯を切開する過程を示す写真である。
【図４】固定用のピペット１と切開用のピペット２により卵子３の第１の極体と核を除去する過程を示す写真である。
【図５】固定用のピペット１と移植用のピペット４により脱核された受核卵子３に体細胞を移植する過程を示す写真である。
【図６Ａ】Ａ〜Ｄは、本発明に従い製造された核移植卵由来の胚性幹細胞株の核型と、及び前記胚性幹細胞株を樹立するために用いられる核を提供した女性患者の体細胞の核型を分析した結果を示す写真である。
【図６Ｂ】Ａ〜Ｄは、本発明に従い製造された核移植卵由来の胚性幹細胞株の核型と、及び前記胚性幹細胞株を樹立するために用いられる核を提供した女性患者の体細胞の核型を分析した結果を示す写真である。
【図６Ｃ】Ａ〜Ｄは、本発明に従い製造された核移植卵由来の胚性幹細胞株の核型と、及び前記胚性幹細胞株を樹立するために用いられる核を提供した女性患者の体細胞の核型を分析した結果を示す写真である。
【図６Ｄ】Ａ〜Ｄは、本発明に従い製造された核移植卵由来の胚性幹細胞株の核型と、及び前記胚性幹細胞株を樹立するために用いられる核を提供した女性患者の体細胞の核型を分析した結果を示す写真である。
【図７】本発明による未分化細胞コロニーを免疫不全マウスの生殖腺に注入した後に形成された奇形腫内において確認された３胚葉細胞の写真である（Ａ：軟骨、Ｂ：腸管、Ｃ：神経管（Ａ、Ｂ、Ｃ；ｘ２００））。
【図８】本発明による胚性幹細胞株から胚芽体の形成有無を確認した結果を示す写真である（Ａ、Ｂ、Ｃ：内胚葉、Ｄ，Ｅ，Ｆ：中胚葉、Ｇ、Ｈ、Ｉ：外胚葉、Ａ）α−１−フェトプロテイン、Ｂ）サイトケラチン、Ｃ）ＨＮＦ−２−α、Ｄ）ＢＭＰ−４、Ｅ）筋肉Ｄ、Ｆ）デスミン、Ｇ）ニューロフィラメント、Ｈ）Ｓ−１００、Ｉ）ＮＣＡＭ）。
【図１】
2007516720.tif 000008
【図２】
2007516720.tif 000009
【図３】
2007516720.tif 000010
【図４】
2007516720.tif 000011
【図５】
2007516720.tif 000012
【図６Ａ】
2007516720.tif 000013
【図６Ｂ】
2007516720.tif 000014
【図６Ｃ】
2007516720.tif 000015
【図６Ｄ】
2007516720.tif 000016
【図７】
2007516720.tif 000017
【図８】
2007516720.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】平成18年9月14日(2006.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの体細胞の核を脱核されたヒトの卵子に移植することにより得られる核移植卵由来の胚性幹細胞。
【請求項２】
受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託された細胞株であることを特徴とする請求項１に記載の胚性幹細胞。
【請求項３】
ヒト体細胞及びヒト卵子由来の胚盤胞を調製するための方法であって：
（１）ヒトの体細胞を培養して供与核細胞を用意するステップと、
（２）ヒトの卵子を脱核して受核卵子を用意するステップと、
（３）前記供与核細胞の核を前記受核卵子に移植し、前記供与核細胞の核と前記受核卵子を融合することにより核移植卵を製造するステップと、及び
（４）前記核移植卵をリプログラミング、活性化及び生体外培養させて胚盤胞を形成する、
を含んで成る方法。
【請求項４】
前記ステップ（２）が前記卵子細胞の透明帯の一部を切開し、そして当該卵子を押すことにより第一の極体を含む細胞質を除去することを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（２）がさらに前記切開及び除去の前に周囲の卵丘細胞を前記卵子から取り除くことを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（２）が、前記ヒト卵子を固定用ピペットで固定し；卵子の透明帯の一部を切開用のピペットで切開し；前記固定用ピペットにより支持された前記卵子から第一の極体及び核を、前記切開工程を通じて設けた穴から、前記切開用のピペットで前記卵子を押すことにより取り除く；ことを含む、請求項３記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（２）が細胞質全体の１０〜１５％に相当する第一の極体を含む細胞質部分を取り除くことを含む、請求項３記載の方法。
【請求項８】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、２０時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、６時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、３時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、約２時間以内で行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップ（４）における活性化は、前記核移植卵をカルシウムイオノフォアで処理した後、６−ジメチルアミノプリンで処理して行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記カルシウムイオノフォアの濃度は、５μＭ〜１５μＭであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記カルシウムイオノフォアの濃度は、約１０μＭであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記６−ジメチルアミノプリンの濃度は、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記６−ジメチルアミノプリンの濃度は、約２．０ｍＭであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ステップ（４）における生体外培養は少なくとも２以上の培地を用いて連続して行われ、前記各培地は相異なる組成を持つものであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体外培養は、相異なる組成を持つ２種類の培地を連続して用いて行われることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体外培養は、Ｇ１．２培地及びＳＮＵｎｔ−２培地を順次に用いることにより行われることを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ（４）は、２０時間以内で核移植卵をリプログラミングし、前記核移植卵を５μＭ〜１５μＭの濃度のカルシウムイオノフォアで処理し、さらに１．５ｍＭ〜２．５ｍＭの濃度の６−ジメチルアミノプリンで処理した後、Ｇ１．２培地及びＳＮＵｎｔ−２培地において前記核移植卵を生体外培養することにより行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
請求項３に記載の方法によって調製した胚盤胞。
【請求項２２】
胚性幹細胞株の製造方法であって：
（１）ヒトの体細胞を培養して供与核細胞を用意するステップと、
（２）ヒトの卵子を脱核して受核卵子を用意するステップと、
（３）前記供与核細胞の核を前記受核卵子に移植し、前記供与核細胞の核と前記受核卵子を融合することにより核移植卵を製造するステップと、
（４）前記核移植卵をリプログラミング、活性化及び生体外培養させて胚盤胞を形成するステップ、及び
（５）前記胚盤胞から内細胞塊を分離し、前記内細胞塊を未分化のままで培養して胚性幹細胞株を樹立するステップ、
を含んで成る方法。
【請求項２３】
前記ステップ（２）が前記卵子細胞の透明帯の一部を切開し、そして当該卵子を押すことにより第一の極体を含む細胞質を除去することをふくむ、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ステップ（２）がさらに前記切開及び除去の前に周囲の卵丘細胞を前記卵子から取り除くことを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記ステップ（２）が、前記ヒト卵子を固定用ピペットで固定し；卵子の透明帯の一部を切開用のピペットで切開し；前記固定用ピペットにより支持された前記卵子から第一の極体及び核を、前記切開工程を通じて設けた穴から、前記切開用のピペットで前記卵子を押すことにより取り除く；ことを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（２）が細胞質全体の１０〜１５％に相当する第一の極体を含む細胞質部分を取り除くことを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記胚性幹細胞株は、受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託されたものであることを特徴とする請求項２２に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項２８】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、２０時間以内で行われることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、６時間以内で行われることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、３時間以内で行われることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
前記ステップ（４）におけるリプログラミングは、２時間以内で行われることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記ステップ（４）における活性化は、前記核移植卵をカルシウムイオノフォアで処理した後、６−ジメチルアミノプリンで処理して行われることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記カルシウムイオノフォアの濃度は、５μＭ〜１５μＭであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記カルシウムイオノフォアの濃度は、約１０μＭであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記６−ジメチルアミノプリンの濃度は、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭであることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記６−ジメチルアミノプリンの濃度は、約２．０ｍＭであることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ステップ（４）における生体外培養は少なくとも２以上の培地を用いて連続して行われ、前記各培地は相異なる組成を持つものであることを特徴とする請求項２２に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項３８】
前記生体外培養は、相異なる組成を持つ２種類の培地を連続して用いて行われることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体外培養は、Ｇ１．２培地及びＳＮＵｎｔ−２培地を順次に用いることにより行われることを特徴とする請求項１５に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項４０】
前記ステップ（４）は、２０時間以内で核移植卵をリプログラミングし、前記核移植卵を５μＭ〜１５μＭの濃度のカルシウムイオノフォアで処理し、さらに１．５ｍＭ〜２．５ｍＭの濃度の６−ジメチルアミノプリンで処理した後、Ｇ１．２培地及びＳＮＵｎｔ−２培地において前記核移植卵を生体外培養することにより行われることを特徴とする請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記内細胞塊は、下記のステップを含む方法によりステップ（５）における胚盤胞から分離されることを特徴とする請求項２２に記載の方法：
（１）胚盤胞から透明帯またはその一部を除去するステップ、及び
（２）その結果として生じる胚盤胞から栄養膜を除去して内細胞塊を分離するステップ。
【請求項４２】
前記ステップ（５）における内細胞塊は、請求項１に記載の胚性幹細胞株から分化された細胞を含む栄養細胞層上において培養されることを特徴とする請求項１に記載の胚性幹細胞株の製造方法。
【請求項４３】
請求項２２記載の方法により調製された幹細胞系。
【請求項４４】
ヒトの体細胞核を脱核されたヒトの卵子に移植することにより製造された核移植卵由来の胚性幹細胞株から分化された神経前駆細胞。
【請求項４５】
前記胚性幹細胞株は、受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託されたものであることを特徴とする請求項４４に記載の神経前駆細胞。
【請求項４６】
請求項４４に記載の神経前駆細胞を製造する方法であって、
（１）胚性幹細胞株を培養して胚芽体(embryoid body)を形成するステップと、
（２）前記胚芽体を、前記胚芽体の細胞を神経前駆細胞に分化させるのに適した因子の存在下で培養するステップと、
（３）神経前駆細胞のマーカーを発現する細胞を選別及び培養して神経前駆細胞を得るステップと、を含むことを特徴とする神経前駆細胞の製造方法。
【請求項４７】
前記胚性幹細胞株は、受託番号第ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００９２号で寄託されたものであることを特徴とする請求項４６に記載の神経前駆細胞の製造方法。
【請求項４８】
前記ステップ（２）における因子は、レチノイン酸と、アスコルビン酸と、ニコチンアミドと、Ｎ−２補充剤と、Ｂ−２７補充剤と、インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム(sodium selenite)及びフィブロネクチンの混合物と、よりなる群から選ばれるものであることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
請求項３又は２２に記載のステップ（４）における生体外培養を行うために用いられる培地であって、
９５〜１１０ｍＭのＮａＣｌと、７．０〜７．５ｍＭのＫＣｌと、２０〜３０ｍＭのＮａＨＣＯ3と、１．０〜１．５ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4と、３〜８ｍＭの乳酸ナトリウムと、１．５〜２．０ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏと、０．３〜０．８ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏと、０．２〜０．４ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、１．２〜１．７ｍＭのフルクトースと、６〜１０mg／mlのヒト血清アルブミンと、０．７〜０．８μｇ／mlのカナマイシンと、１．５〜３％の必須アミノ酸と、０．５〜１．５％の非必須アミノ酸と、０．７〜１．２ｍＭのＬ−グルタミンと、０．３〜０．７％のインシュリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムの混合物と、を含む培地。
【請求項５０】
前記培地は、
９９．１〜１０６ｍＭのＮａＣｌと、７．２ｍＭのＫＣｌと、２５ｍＭのＮａＨＣＯ3と、１．２ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4と、５ｍＭの乳酸ナトリウムと、１．７ｍＭのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏと、０．５ｍＭのＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏと、０．３ｍＭのピルビン酸ナトリウムと、１．５ｍＭのフルクトースと、８mg／mlのヒト血清アルブミンと、０．７５μｇ／mlのカナマイシンと、２％の必須アミノ酸と、１％の非必須アミノ酸と、１ｍＭのＬ−グルタミンと、０．５％のインシュリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムの混合物と、を含むことを特徴とする請求項４９に記載の培地。
【国際調査報告】
2007516720.tif 000019
2007516720.tif 000020
2007516720.tif 000021