(57)【要約】  本発明は、有機表面に生体分子を共有結合的に固定化するために使用される光反応性架橋剤により、有機表面に生体分子を共有結合的に固定化する方法に関する。この固定化は、前記プローブ生体分子及び光反応性重合体の塗布並びにその後の架橋プロセスにより行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  分子あたり少なくとも２つの光反応基を持つ少なくともひとつの重合体及び／又は共重合体を含む少なくともひとつのプローブ生体分子を溶解すること、更に
b)  前記a) 項からの混合物を表面に塗布して、適切な波長の光の照射により表面に共有結合的に固定化すること
を特徴とする有機表面にプローブ生体分子を共有結合的に固定化する方法。
【請求項２】
前記重合体は膨張可能な重合体であり、そこには重合体鎖あたり少なくとも２つの同一又は異なる光架橋基が存在すること、及び／又は前記共重合体は膨張可能な共重合体であり、そこには重合体鎖あたり少なくとも２つの同一又は異なる光架橋基が存在することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記重合体及び／又は共重合体は印刷により表面に塗布され、次いで後に架橋されることを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
ベンゾフェノン又はその誘導体、アントラキノン又はその誘導体、ニトロフェニルアジド及びチミジン又はそれらの誘導体が光反応基として使用されることを特徴とする請求項１ないし３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記光反応基が紫外線反応性であることを特徴とする請求項１ないし４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１により定義された工程(b)における塗布が印刷によるパターン形成をもたらすことを特徴とする請求項１ないし５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記重合体表面がシクロオレフィン共重合体、ポリスチロール、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリメチルメタクリレートからなることを特徴とする請求項１ないし６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
相補的結合パートナー（受容体／リガンド）の固有相互作用系パートナーがプローブ生体分子として使用されることを特徴とする請求項１ないし７いずれか１項記載の方法。
【請求項９】
相補的結合パートナーの前記固有相互作用系が核酸と相補性核酸との相互作用、ペプチド核酸（PNA）と核酸との相互作用、或いは酵素／基質、受容体／リガンド、レクチン／糖質、抗体／抗原、アビジン／ビオチン又はストレプトアビジン／ビオチンの相互作用に基づくことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記核酸はDNA又はRNA又はそれらの類似物であることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記DNA又はRNAはオリゴヌクレオチドであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体はポリクロナール、モノクロナール、キメラ又は「単鎖」抗体、又は機能性断片又はそのような抗体の誘導体であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１ないし１２いずれか１項に記載の方法により製造できる、共有結合的に表面に固定化されたプローブ生体分子を有する有機表面。
【請求項１４】
請求項１ないし１２いずれか１項に記載の方法により製造でき、パターンを形成して共有結合的に固定化されたプローブ生体分子を有する有機表面。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の有機表面のセンサーチップとしての使用。
【請求項１６】
請求項１３又は１４に記載の有機表面を有する医学用又は診断用計器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、重合体表面又は自己組織化単分子膜により改質された無機物表面などの有機表面に、プローブ生体分子を共有結合的に固定化するための光反応性架橋剤を用いてプローブ生体分子を共有結合的に固定化する方法に関する。光反応基を有する重合体又は共重合体が架橋剤として使用されるが、使用後にそれらはプローブ生体分子を結合するとともに、表面への共有結合を確保する。
【背景技術】
【０００２】
最近では分析技術がますます重要性を増しており、双機能分子（linker）からなる自己組織化単分子膜（self-assembled monolayers, SAMs) に基づいて開発された多数の固相システムがある。前記自己組織化単分子膜によって特定のプローブ生体分子が固体担体表面に結合又はコンジュゲートされ、次いでそれらは適切なマーカー（例えば放射性、染色、蛍光マーカー）を用いて検出できる。
【０００３】
電子工学におけるマイクロチップに類似して、前記システムに対して「センサーチップ」という名称が用いられている。「バイオチップ」という用語も、そのようなセンサーチップへのオリゴヌクレオチド又は抗体などの生体分子のコンジュゲーション（いわゆる「バイオコンジュゲーション」）に対して用いられる。担体表面への結合は、直接的或いは間接的のいずれでも行われ得る。間接結合の例は、プローブとしての固定化された相補的オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによる検出すべき核酸シーケンスの結合である。この場合のプローブの使用には、生体巨大分子の相互作用の自然的特異性という利点がある。
【０００４】
典型的なセンサーチップ製造において、金属又は半金属の酸化物、例えば酸化アルミニウム、石英ガラス、ガラスからなる表面が双機能分子（いわゆる「リンカー」）溶液に浸漬されるが、これらの分子は例えばハロゲンシラン基(クロルシラン基など）又はアルコキシラン基を有しており、自己組織化単分子膜（SAM）が形成されるように担体表面に結合される。この場合に、前記膜の厚さは数オングストロームにすぎない。リンカーをプローブ又はプローブ分子に結合するのは、適切な追加的官能基、例えばアミノ基又はエポキシ基である（特許文献１）。多数のプローブ又はトレーサー分子、特に生物起源の分子を多数の担体表面に結合するための適切な双機能リンカーは、当業者に公知である。参照すべきは、例えばG.T.ハーマンソン著「バイオコンジュゲート・テクニック」、アカデミック・プレス社、1996年刊（非特許文献１）である。
【０００５】
これらの反応性（それゆえ敏感な）表面、例えばエポキシ基、アルデヒド又はアミノ官能基を持つ表面の不利はそれらの制約的な保存安定性（数週間）にあり、それらは気密状態で、及び／又は暗室内に保存する必要がある。更に、生体分子又は表面への結合のゆえに、長期的安定性に欠ける。これらの結合部位のすべてが加水分解などの作用にさらされるため、使用上の有用性及び分野が著しく限定される。特に現行の諸方法では、親水性表面又は親水性被覆を有する表面への印刷時に、滴下物が移動して印刷結果を損なうというリスクが排除できない。
【０００６】
しかし、従来の方法によって例えば核酸を非反応性重合体又は合成物質／プラスチック表面（例えばセンサー／バイオチップの製造用プローブとして）に固定化することは複雑であり、多大なコストを要する。
【特許文献１】EP １１７６４２２ A1
【特許文献２】EP １１４４６７７ A2
【非特許文献１】G.T.ハーマンソン著「バイオコンジュゲート・テクニック」、アカデミック・プレス社、1996年刊
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、発明の目的は、重合体表面又は有機物により改質された無機基質などの有機表面にプローブ生体分子を共有結合的に固定化するための容易で迅速に実施できる方法を提供することである。本発明の別の目的は、先行技術に比べて極めて高い担体基質への結合能力を達成することにある。以前の方法、例えば特許文献２では、この問題に対する満足な解決策を提供することができなかった。本発明の更に別の目的は、安定した結合化学及び親水性及び疎水性表面に対する印刷能力の改良を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的は、本発明に基づく以下の技術的手法により達成される。
a)  分子あたり少なくとも２つの光反応基を持つ少なくともひとつの重合体及び／又は共重合体を含む少なくともひとつのプローブ生体分子を溶解すること、更に
b)  前記a) 項からの混合物を表面に塗布して、適切な波長の光の照射により該表面に共有結合的に固定化すること。
【０００９】
好ましい実施形態において重合体は多数の光架橋性化合物からなるため、架橋時に生体分子は重合体に共有結合し、重合体分子は基質に共有結合し、更に重合体鎖は相互に架橋する。
【００１０】
本発明の利点は、粘性媒体を不活性表面（例えばシラン化ガラス担体又は市販合成材料から生成された基質）に印刷する可能性であり、前記媒体は適切な波長を持つ光の照射により容易に固定化できる。同時にこのプロセスは、偽三次元マトリックスが形成されるように、結合できる検体量を著しく増加させる。更に、重合体ゲルに対する印刷中の媒体の移動効果などの三次元マトリックスに関する従来からの課題が、この方法により解消される。しかも、反応性（それゆえ敏感な）表面への印刷を行う必要がなくなる。エポキシ、アルデヒド又はアミノ官能基を持つ表面は、反応性表面の例である。反応性表面は安定性が制約されていることが多いため（数週間）、気密密封して保存しなければならない。いずれの反応性表面も、数年にわたり安定性を維持するポリスチロール又はポリメチルメタクリルレート(PMMA)などからなる担体が使用できることを意味しない。本発明の別の利点は例えば重合体表面をプラズマ加工などの予備的加工工程により親水化する必要のないことであるが、それは前述した本発明の方法の代わりの形態において表面に例えば結合された（膨張性、濡れ性）共重合体により表面のアクセスが確立されるからである。これとは別に、基質（センサー表面など）の表面特性も容易かつ極めて正確に調整できる。ここに述べた方法を用いて容易に調整できる重要な表面特性の一例が、濡れ性である。更に別の利点は分析方法の簡略化であり、基本的には使用する滴下量のみを決定すればよく、固定化されたプローブ数はそれから直接導き出される。これは、例えばSAMへのDNAの結合に対する従来技術の方法では容易でない。
【００１１】
本発明は更に共有固定化されたプローブ生体分子を持つ重合体表面などの有機表面に関するものであり、好ましくはパターンを形成する（その上への印刷などによる）が、該表面は上に定義されたひとつの方法に基づいて得ることができる。
【００１２】
本発明は、固定化されたプローブ生体分子を有してパターンを形成する重合体表面などの有機表面のセンサーチップとしての使用に関する。更に追加的実施形態に従って、本発明は、重合体表面などの有機表面或いはそれにより得られたセンサーチップを有する医学用又は診断用装置にも関する。
【００１３】
本発明の有利な、及び／又は好ましい実施形態は、従属請求項の範囲の目的である。
【００１４】
好ましい方法において、光反応基はベンゾフェノン又はその誘導体、アントラキノン又はその誘導体、ニトロフェニルアジド及びその誘導体、チミジン又はその誘導体から選択できる。その他の適切な光架橋剤は従来技術において公知であり、例えばピアース社 (www.piercenet.com) などの企業から入手できる。但し、一般的には、照射下で遊離基や他の反応基を形成できるあらゆる化学基が使用できる。
【００１５】
本発明の方法に対して、重合体表面、例えばシクロオレフィン共重合体（COCs）、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン又はポリメチルメタクリレート（PMMA,プレキシガラス）からなる表面は、適切な有機表面の例である。チコナ社は、商標名「Topas」（トパス）により適切なCOCを販売している。ここで明言すべきは、使用される光反応基に関連する本発明の方法が任意の有機表面に対して適合していることである。例えば、自己組織化単分子膜（SAMs）により被覆された無機基質などの有機分子による被覆表面も、この目的に適合している。これらのSAM自体は完全に不活性であり得るため、例えば純アルキルシランから成る。有機基質のほかに、遊離基プロセスにより有機分子とともに安定した結合（オルガノボロン化合物など）を形成できるその他の基質も適合している。
【００１６】
本発明の方法において、プローブ生体分子は例えば相補的結合パートナー（受容体／リガンド）の特異的相互反応系の一方のパートナーとなり得る。
【００１７】
受容体の例として下記の物質が挙げられるが、それらに限定されるものではない：核酸類及びそれらの誘導体（RNA、DNA、LNA、PNA）、蛋白質、ペプチド、ポリペプチド類及びそれらの誘導体（グルコサミン、抗体、酵素)、並びにアラキドン酸などの脂肪酸類及び少なくとも第２の分子との特異的相互作用をなすその他の化合物。追加的に受容体として挙げられるのは大きな複合構造体、例えばリポソーム、膜及び膜断片、細胞、細胞ライセート、細胞断片、胞子及び微生物である。
【００１８】
リガンドの例として下記の物質が挙げられるが、それらに限定されるものではない：核酸類及びそれらの誘導体（RNA、DNA、LNA、PNA）、蛋白質、ペプチド、ポリペプチド類及びそれらの誘導体（グルコサミン、抗体、酵素)、並びにアラキドン酸などの脂肪酸類及び少なくとも第２の分子との特異的相互作用をなすその他の化合物。追加的に受容体として挙げられるのは大きな複合構造体、例えばリポソーム、膜及び膜断片、細胞、細胞ライセート、細胞断片、胞子及び微生物である。
【００１９】
特異的結合パートナーの特異的相互反応系は、例えば相補的核酸と核酸との相互作用、ペプチド核酸（PNA）と核酸との相互作用、或いは酵素／基質、受容体／リガンド、レクチン／糖質、抗体／抗原、アビジン／ビオチン又はストレプタビジン／ビオチンの相互作用に基づくことができる。
【００２０】
明らかに核酸とみなすことができるのは、DNA又はRNA、例えばオリゴヌクレオチド又はアプタマー、或いは(www.proligo.com.) で入手できるいわゆる「LNA」、或いは(www.mosaic-technoligies.com) で入手できる商標「Acrydite」などの重合体に埋め込み可能なDNAである。ペプチド核酸（PNAs）も別オプションである。
【００２１】
抗体としては、例えばポリクロナール、モノクロナール、キメラ又は「単鎖」抗体、又は機能性断片、或いはそのような抗体の誘導体を挙げることができる（ここで「機能性」とは、断片／誘導体が必ずしも免疫反応を惹起することなく、抗体に結合できることを意味する）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下に、本発明は核酸がプローブ生体分子として使用される具体的な実施形態及び実施例について詳しく説明されるが、それらに限定されるわけではない。
【実施例】
【００２３】
共重合体の製造
図１において１で表された共重合体は、紫外線反応基２からなる単量体３、例えば4-メタクリロキシベンゾフェノン、ジメチルアクリルアミド及びメタクリル酸などの反応性親水性単量体を含む。
【００２４】
例えば適切な共重合体は、適当な溶媒中の単量体溶液（例えばクロロフォルム中の10%（体積／体積）単量体）に1% AIBN（アゾビスイソブチロニトリル）を添加した100:1（モル／モル）混合物におけるジメチルアクリルアミドと4-メタクリロキシベンゾフェノンの共重合化により製造できる。次に、得られた共重合体はジエチルエーテルにより析出できる。
【００２５】
共重合体１は、例えば適切な溶媒中で膨張し、かつ例えばDNAなどの5’ オリゴチミン改質された核酸と混合できる。
【００２６】
生体分子４と図１の左側に示されている前記のように得られた共重合体１との混合物は、ここで（DNA成分量を決定するために）分析されるとともに、印刷による基質としてほぼあらゆる有機重合体表面５に塗布できる（図１、右側）。重合体の固定化及び生体分子４との架橋は、例えば波長260 nmでの紫外線照射により達成される。
【００２７】
この重合体は、次に当業者に公知の方法によりPMMA基質に印刷できる。改質された重合体の固定化は、一方で重合体に含まれるベンゾフェノン基と260 nmでの紫外線照射により活性化された基質との間の光励起された架橋反応により、他方でオリゴチミンと重合体との間の光励起された架橋反応により、及び／又はベンゾフェノンと核酸との間の光励起された架橋反応により達成される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、生体分子と共重合体の架橋に関する概略図である。
【図１】
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【国際調査報告】
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