(57)【要約】  本発明は、これらのタンパク質の凍結乾燥物を熱処理することによるウイルス不活性化工程を包含する、寒冷沈降性タンパク質を得るための方法であって、該タンパク質を凍結乾燥物の形態にする前に、これらのタンパク質へ、アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸および三塩基性クエン酸ナトリウムからなる混合物を含有する安定化および可溶化製剤を添加する初期工程を包含する方法に関する。本発明はまた、該方法に従って導入された安定化および可溶化製剤を含有する少なくとも１つの寒冷沈降性タンパク質からなりそして治療的使用に適した濃縮物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質の凍結乾燥化形態の熱処理によるウイルス不活性化工程を包含する、寒冷沈降性タンパク質を得るための方法であって、該タンパク質を凍結乾燥化形態へ変換する前に、該タンパク質へ、アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含む安定化および可溶化製剤を添加する初期工程を包含することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記製剤が、アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの前記混合物から構成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アルギニンが２５〜５０ｇ／ｌの濃度で存在することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルギニンの濃度が３５〜４５ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記クエン酸三ナトリウムが０．５〜約１２ｇ／ｌの濃度で存在することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記疎水性アミノ酸がロイシン、イソロイシンまたはそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ロイシン、イソロイシンまたはそれらの混合物が、５〜１５ｇ／ｌの濃度で存在することを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ロイシンまたはイソロイシンあるいはそれらの混合物の濃度が、９〜１１ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
グリシンおよび／またはリシンが前記製剤に添加されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
グリシンおよびリシンが、各々、１〜５ｇ／ｌの濃度で存在することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
グリシンおよびリシンのこれらの濃度の各々が、１．５〜２．５ｇ／ｌであることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記凍結乾燥が、−４０℃〜−３０℃の温度で４８時間行われることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルス不活性化の熱処理が、８０℃〜９０℃の温度で７２時間行われることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記寒冷沈降性タンパク質の液体組成物への安定化および可溶化製剤の添加前に、ウイルス不活性化ならびに／あるいは溶媒−洗浄剤によるおよび／または３５ｎｍのフィルターにおけるナノ濾過による該液体組成物からの除去のうち少なくとも１つの追加の工程を更に包含することを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
全ての寒冷沈降性タンパク質に適用可能であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
第ＶＩＩＩ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンから選択されるタンパク質の少なくとも１つに適用可能であることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって導入された安定化および可溶化製剤を含む少なくとも１つの寒冷沈降性タンパク質の濃縮物。
【請求項１８】
治療的使用に意図される請求項１７に記載の濃縮物。
【請求項１９】
８０℃〜９０℃の温度での熱処理および再溶解後、得られる溶液が、０．２０±０．０２μｍの多孔性を有するフィルターにおいて約２ｍｌ／ｃｍ２の濾過性を有することを特徴とする、請求項１７または１８に記載の凍結乾燥化フィブリノーゲン濃縮物。
【請求項２０】
アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含むことを特徴とする、凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理へ供されるように意図される寒冷沈降性タンパク質のための安定化および可溶化製剤。
【請求項２１】
アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの前記混合物から構成されることを特徴とする、請求項２０に記載の安定化および可溶化製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に寒冷沈降または冷アルコール沈降により、凍結乾燥工程および該凍結乾燥化プロダクトの引き続いてのウイルス不活性化の熱処理工程を使用する、血漿から寒冷沈降性タンパク質を得るための方法であって、該タンパク質の液体組成物の凍結乾燥とウイルス不活性化の熱処理後の該凍結乾燥化形態の容易な再溶解とを可能にする、安定化および可溶化製剤の添加工程を包含する方法に関する。本発明の範囲において、用語“タンパク質”は、単独のまたはこのような他のタンパク質との混合物としての、特に治療的使用のための、該タンパク質そのもの、ならびにこのようなタンパク質を含有する濃縮物およびフラクションも同様に包含することが理解される。これらの濃縮物およびフラクションは、先行技術において公知のヒトまたは動物血漿の分別方法によって得られる。また、用語“寒冷沈降性タンパク質の液体組成物”は、凍結したヒトまたは動物血漿を解凍する際のその寒冷不溶性、あるいは血漿への有機溶媒（例えば、エタノール）の添加による寒冷沈降反応時のその不溶性を特徴とする、少なくとも１つのタンパク質を含む液体組成物を意味する。
【背景技術】
【０００２】
治療における使用（特に、血友病のような遺伝性出血トラブルの場合）のために、ヒト血漿から得られる治療製品（例えば、凝固因子）を使用することは、血液産物中のウイルスの存在に起因して、非常に危険にさらされ得、これは、血友病患者に高リスクである。個々のドナーの厳格な選択にもかかわらず、種々のウイルス、特に肝炎およびＡＩＤＳ、ならびに未知のウイルス（これは、自らが血液産物によって伝染可能であると示し得る）の伝染の継続した危険性が存在している。
【０００３】
従って、ウイルス伝染は、ドナー血漿から得られそして治療的使用に意図される種々の精製フラクションの適切な処理によって回避されるべきである。このため、血漿から得られる種々のタンパク質フラクションへ適用される種々のウイルス不活性化および除去方法が、周知である。例えば、溶媒洗浄剤処理（solvent-detergent treatmetns）、限外濾過およびナノ濾過（nanofiltration）、低温殺菌または延長加熱（extended heating）が、言及され得る。延長熱処理の場合、これは、通常、予備凍結乾燥へ供された血漿タンパク質フラクションへのみ適用され得、最適なウイルス不活性化を得るためには、５０〜１００時間の期間における少なくとも７０℃の加熱温度を必要とする。しかし、このような厳しい熱処理条件下では、敏感でかつ熱不安定性の血漿タンパク質は分解し、これは、それらの生物学的機能の重大な減少を生じさせる。
【０００４】
この欠点の解決法を見出すために、血漿タンパク質のための保護賦形剤および安定剤が、凍結乾燥前に、タンパク質の液体組成物へ前もって添加され、組み合わさった２つの目的を満たす。第一の目的は、一方で、凍結乾燥の間、考慮されるタンパク質を、そして他方で、保存の間、凍結乾燥化タンパク質を安定化させる必要性を満たし、そして第二の目的は、ウイルス不活性化の熱処理の間、凍結乾燥化タンパク質を保護する必要性に対応する。
【０００５】
特許EP 0 094 611に開示されている、凍結乾燥された血漿からのタンパク質フラクション、第ＶＩＩＩ因子またはフィブリノーゲンの加熱方法は、６０℃の温度で７２〜９６時間、乾燥プロダクトを加熱することからなる。熱処理の間の安定化賦形剤の特定の組成物は、この特許において記載されていない。
【０００６】
カナダ特許1 260 389は、６８℃で約７２時間の乾燥加熱に対してこれらのタンパク質を安定化させるために、凍結乾燥前に、血漿タンパク質の液体組成物へ、８０より重い分子量を有する非極性アニオンのような賦形剤（特に、糖、還元糖およびアミン酸）を組み込むことを記載している。しかし、アミノ酸と還元糖との会合は、メイラード化合物へと至り、その特性は、処理されるタンパク質の安全性（活性、免疫原性、アレルギー等）の原因とならない。この処理は、真空または不活性雰囲気において行われなければならない。
【０００７】
安定化賦形剤の大部分は、３０〜９６時間、６０℃〜６８℃の温度範囲での、その乾熱処理の間、血漿タンパク質フラクションを保護すると判明し得る（P. Thomas, British Journal of Haematology, 70, 1998, 393-395およびJ.A. Levyら, The Lancet , June 22, 1985, 1456-1457）。しかしながら、これらの条件下でのこのような処理後、ウイルス力価の減少にもかかわらず、それでも感染症（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＢＣおよびパルボウイルスＢ１９）が伝染され得ることが示された（前述のP. Thomas）。それらの効果的な除去の観点から、より高温へ、凍結乾燥化血漿タンパク質フラクションを加熱することが提案された。そして、Ｓ．Ｊ．Ｓｋｉｄｍｏｒｅら（Journal of Medical Virology, 30, 1990, 50-52）は、８０℃の温度で７２時間の凍結乾燥化第ＶＩＩＩ因子濃縮物の熱処理が、ＨＣＶ非Ａおよび非Ｂウイルスの伝染を回避することを示した。そして、米国特許5 831 027は、８０℃の温度で７２時間の、血漿の寒冷沈降物から得られた凍結乾燥化タンパク質（フィブリノーゲン）の熱処理方法を開示しており、これは、可能なウイルス（例えば、ＨＢＶ、ＨＢＣまたはパルボウイルスＢ１９）を含まないフィブリノーゲンを得ることを可能にする。凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理の両方の間、フィブリノーゲン組成物を保護するために添加される安定化賦形剤は、スクロースおよび／またはアミノ酸（アルギニン）、トリス緩衝液およびクエン酸ナトリウムを含む。Ｌ．Ｗｉｌｋｅｌｍａｎら（Virus Inactivation in Plasma Products, Curr. Stud Hematol Blood Transfus., Basel, Karger, 1989, no56, 55-69）はまた、凍結乾燥前および８０℃で７２時間のウイルス不活性化の熱処理前に、第ＶＩＩＩ因子への賦形剤の添加の必要性を示している。記載される賦形剤は、ＮａＣｌ、クエン酸ナトリウム、トリス、ＣａＣｌ２およびスクロースである。
【０００８】
その上、凍結乾燥およびウイルスの不活性化の熱処理へ供されている、血漿分別によって得られる種々のタンパク質は、それらの臨床使用の前に、好適な媒体における再構成（reconstitution）を必要とするので、これは、ヨーロッパ薬局方によって推奨される要件に従う比較的短時間で行われるのが容易であるべきである。この点において、Ｓｙｎｔｈａｍｉｎ  １７％（Travenol Laboratories Ltd.）（静脈投与に適した天然アミノ酸の混合物）を凍結乾燥前に含有する凍結乾燥化寒冷沈降物中の第ＶＩＩＩ因子の加熱安定性の研究（J. Margolisら, The Lancet, December 8, 1984, 1345）は、８０℃で１６時間の熱処理が、その活性がゼロに等しくなる程度の第ＶＩＩＩ因子の分解に至るだけでなく、記載の工程後の該寒冷沈降物の再溶解の不可能性に至ることを示した。米国特許5 399 670は、その凍結乾燥前に第ＶＩＩＩ因子溶液へアルギニンを添加する工程を包含する、注射用の精製水中における凍結乾燥化第ＶＩＩＩ因子複合体の組成物の溶解または再構成を促進する方法を開示している。この特許は、ウイルス不活性化の熱処理を記載していない。ヒスチジンおよびアルブミンの添加もまた提供され得る。前に引用した米国特許5 831 027に記載の安定化賦形剤はまた、治療的使用の前に純水中における凍結乾燥化フィブリノーゲンの溶解を好むように意図されている。
【０００９】
にもかかわらず、安定化製剤の選択は、血漿タンパク質の特異性によって支配されている。従って、Ｎ．Ｈｅｉｍｂｕｒｇｅｒら（Virus Inactivation in Plasma Products., Curr Stud Hematol Blood Transfus., Basel, Karger, 1989, No56, 23-33）による論文を参照すると、特定の安定化製剤は、所定の問題の活性タンパク質を含有するたった１つのタンパク質フラクションに好適化され得ると通常考えられる。更なる困難性は、より複雑なタンパク質フラクションが考慮される場合において、特に、血漿フラクションから得られる全ての凝固および止血タンパク質が考慮される場合において見られる。更に、考慮されるフラクションが凍結乾燥され、次いで乾熱処理に供されるように意図される場合、炭水化物（特に、スクロース）は、血漿タンパク質フラクションの安定化および再溶解のための賦形剤として有効に使用され得るが、それらの効果はウイルス不活性化を減速させる（前述のN. Heimburgerら）。従って、その様式で処理されたタンパク質フラクションは、完全にウイルスフリーではないかもしれず、そして従ってそれらの臨床使用は制限される。更には、いくつかの炭水化物（例えば、マルトースまたはスクロース）は、腎欠陥（kidney deficiency）および／または糖尿病に罹患する被験体には、安全に使用され得ない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、凝固および止血を担ういくつかのタンパク質（特に、寒冷沈降性タンパク質）の医療的必要性を考慮して、本出願人は、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物へ添加されると、一方で、その凍結乾燥の間および後、全ての考慮される問題の活性タンパク質に、そして他方で、ウイルス破壊に必要な熱的衝撃に対して、十分な保護を付与し、そして、同時に（in the time）、これらのタンパク質の凍結乾燥化形態の再可溶化の短縮された時間を可能にする、治療的使用と適合性の、単純な、炭水化物フリーかつトリス緩衝液フリーの組成物を開発することを試みた。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的のために、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物へのアルギニンの添加が、凍結乾燥の間および後に保護的効果を提供すると共に、それらの凍結乾燥化形態の溶解を可能にするが、ウイルスの不活性化の熱処理に対するそれらの安定性を確実にしないことを考慮して、本出願人は、アルギニンへのその添加が熱変性に対する保護を提供する、単独または混合物の、種々の化合物を検査した。従って、本出願人は、驚くべきことに、アルギニン（非常に親水性のアミノ酸）へ、Ｋｙｔｅら（J. Mol. Biol., 157, 105-132, 1982）に従う最も疎水性の酸から好ましくは選択される少なくとも１つの疎水性アミノ酸とクエン酸三ナトリウムとを添加することが、ウイルス不活性化の熱処理後の凍結乾燥化形態の可溶化の顕著な改善と共に、凍結乾燥の間および後の寒冷沈降性タンパク質の安定化を可能にすることを見出した。
【００１２】
従って、本発明は、タンパク質の凍結乾燥化形態の熱処理によるウイルス不活性化工程を包含する、寒冷沈降性（cryoprecipitable）タンパク質を得るための方法であって、該タンパク質を凍結乾燥化形態へ変換する前に、該タンパク質へ、アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含む安定化および可溶化製剤（stabilizing and solubilizing formulation）を添加する初期工程を包含することを特徴とする方法に関する。
【００１３】
従って、本発明の方法における安定化および可溶化製剤の添加は、凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理後、該最後の１つが厳しいとしても、血漿から得られる寒冷沈降性タンパク質の生物学的活性の満足ゆくレベルを維持することを可能にし、そして、短縮された再溶解時間を可能にすると共に、凍結乾燥化形態の再構成された溶液の透明性を保存する。その上、この製剤は、かなりの時間の節約を伴う、容易性、普遍性および工業規模での容易な実施という利点を有する。
【００１４】
好ましくは、本発明の方法において使用される安定化および可溶化製剤は、前記アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの比類のない混合物から構成される。これら３つの化合物からもっぱら構成されるこのような製剤は、最小であるが有効な数の添加物の存在のおかげで、特に、工業規模における製造の減少された時間および費用を伴うという利点を示す。
【００１５】
任意の疎水性アミノ酸（前述のＫｙｔｅらに従う）、例えば、バリンおよびフェニルアラニンが、本発明の枠内において好適であるが、有利な選択はロイシン、イソロイシンまたはそれらの混合物である。
【００１６】
安定化および可溶化製剤はまた、一方で、上述の処理前に寒冷沈降性タンパク質の液体組成物のｐＨを調節することを可能にし、そして、他方で、その保護効果を増大させることを可能にするクエン酸三ナトリウムを含有する（但し、濃度が調節される）。
【００１７】
最後に、グリシンおよび／またはリシンが、該安定化および可溶化製剤に更に添加され得る。
【００１８】
また、必要であれば、当該分野において公知の安定化添加剤（stabilizing additives）が添加され得る。
【００１９】
本発明の文脈において、問題の３成分の混合物を含む安定化および可溶化製剤は、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物へ添加され得るか、あるいは、寒冷沈降性タンパク質が、問題の３成分の混合物を含む該製剤の水溶液に溶解され得る。
【００２０】
該安定化製剤のために考慮される種々の添加剤の濃度は、期待される安定化効果を得る目的をもって当業者によって選択される。有利には、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物１リットル当たりの各添加剤の濃度は、以下である：
−  アルギニン、２５〜５０ｇ／ｌそして好ましくは３５〜４５ｇ／ｌ（米国特許5 399 670を参照）；
−  クエン酸三ナトリウム、０．５〜約１２ｇ／ｌ；
−  ロイシン、イソロイシンおよびそれらの混合物、５〜１５ｇ／ｌ、そして好ましくは９〜１１ｇ／ｌ；ならびに
−  グリシンおよび／またはリシン、各々、１〜５ｇ／ｌ、そして好ましくは１．５〜２．５ｇ／ｌ。
【００２１】
本発明の枠内において、タンパク質の予め凍結された液体組成物の凍結乾燥は、当業者に公知の実施条件に従って、現在の装置を使用しての従来の方法に従って行われる。有利には、凍結乾燥は、−４０℃〜−３０℃の温度で約４８時間行われる。
【００２２】
ウイルス不活性化の熱処理は、ウイルスを効果的に不活性化するような様式で行われる。それは、好ましくは、８０℃〜９０℃の温度で７２時間行われる。
【００２３】
ウイルス不活性化の熱処理は、ウイルスフリー凍結乾燥化プロダクトを得ることを可能にするが、該方法は、ウイルスの全体のおよび完全な不活性化および除去を最終的に確実にするために、寒冷沈降性タンパク質の液体組成物への安定化および可溶化製剤の添加の工程の前に、少なくとも１つの追加のウイルス不活性化ならびに／あるいは溶媒洗浄剤および／またはナノ濾過（例えば、３５ｎｍのフィルターにおける）による該液体組成物の除去工程を包含し得る。
【００２４】
従って、該方法の実施は、凍結乾燥化およびウイルス不活性化寒冷沈降性タンパク質へと導き、これは、液体の薬学的に適合性の媒体（例えば、注射用精製水）中に一旦再構成されると、患者へ直接注射され得る。この寒冷沈降性タンパク質の治療品質は、該安定化および可溶化製剤のおかげで得られ、これは、全ての上述の処理（特に、ウイルス不活性化および除去処理）の使用を可能にすると共に、これらの処理された寒冷沈降性タンパク質の生物学的活性および該凍結乾燥化形態の溶解特性が維持される。
【００２５】
本発明の方法に従って使用される安定化および可溶化製剤は、当業者に公知の血漿分別法によって得られる、寒冷沈降性タンパク質（例えば、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチン）に適用する。該安定化および可溶化製剤はまた、Ｗｉｃｋｅｒｈａｕｓｅｒら（Vox Sang., 35, 18-31, 1978）によって記載されるような、トリス緩衝液における可溶化／抽出およびアルミナゲルにおける吸着によって例えば得られる、半精製タンパク質の種々の濃縮物に適用する。第ＶＩＩＩ因子およびフォン・ビルブラント因子に富む、このようにして得られる濃縮物は、特許EP 0 094 611に開示される条件下で加熱され得る。
【００２６】
この製剤はまた、凝固因子の各々に富む精製タンパク質またはフラクション（例えば、例えば特許EP 0 359 593に開示されているクロマトグラフィー方法の実施後に特に得られるもの）の安定化および可溶化に好適であり、その後凍結乾燥されそしてウイルス不活性化の熱処理に供される。その上、この製剤は、Ｋｉｓｌｅｒら（Vox Sang., 7, 1962, 414-424）によって記載されるような、冷アルコール沈降反応（cold alcohol precipitation）によって血漿の寒冷沈降物からまたは血漿から得られる精製フィブリノーゲンの安定化に好適である。本発明の文脈において、当業者に公知の任意の分別技術による寒冷沈降物からのフィブリノーゲンの精製の間、その治療的活性に損傷を与えない、低含有量の第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）が常に伴うことに注意すべきである。
【００２７】
この方法は、特に有利であり、何故ならば、それが、全ての寒冷沈降性タンパク質、あるいはそれから、そして特に、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンから選択される少なくとも１つのタンパク質に適用され得るためである。
【００２８】
本発明はまた、本発明の方法に従って安定化および可溶化製剤を含む、特に治療的使用のための、少なくとも１つの寒冷沈降性タンパク質の濃縮物に関する。
【００２９】
最後に、本発明は、アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物を含む、凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理へ供されるように意図された寒冷沈降性タンパク質のための安定化および可溶化製剤に関する。好ましくは、該安定化および可溶化製剤は、アルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸およびクエン酸三ナトリウムの混合物から構成される。
【００３０】
以下の実施例は、その範囲を限定することなく、本発明を示す。
【実施例】
【００３１】
実施例１
大部分について第ＶＩＩＩ因子、フォン・ビルブラント因子、第ＸＩＩＩ因子、フィブリノーゲンおよびフィブロネクチンからなる寒冷沈降物を、表１に与えられる化合物の混合物を含む本発明の安定化および可溶化製剤（溶液Ａ）中に再溶解させた。タンパク質の濃度は約１５ｇ／ｌである。
【００３２】
【表１】
2007516187.tif 000002
【００３３】
該混合物の均質化後、このようにして得られる溶液を、０．４５μｍのフィルターで濾過し、そして５ｍｌを採取してそしてバイアルに入れる。その後、該溶液を、−３０℃で４８時間、凍結乾燥に供する。それを、前者のものと同一の寒冷沈降物［しかし、これは、それぞれトリス（２．４ｇ／ｌ）、クエン酸三ナトリウム（５．８８ｇ／ｌ）およびＮａＣｌ（１．１６ｇ／ｌ）の混合物を含む標準製剤（溶液Ｂ）中に再溶解させた］を含む参照溶液を用いて、同様に処理する。
【００３４】
凍結乾燥に続いて、両方の得られた凍結乾燥化寒冷沈降物（即ち、一方は、本発明の製剤を含み、そして他方は、標準製剤を含む）を、注射用の精製水５ｍｌに再溶解させる（それぞれ、溶液Ａ’および溶液Ｂ’と呼ぶ）。次いで、得られた凍結乾燥化形態の可溶化と共に、凍結乾燥間、全体としての考慮されるタンパク質を保護または安定化する標準製剤の能力および本発明のそれを評価するために、実験を行った。その目的のために、当業者に公知の方法によって、種々のタンパク質の活性および量と共に、以下の３つのパラメータを、各溶液Ａ’およびＢ’について評価する：再溶解前の凍結乾燥化形態の外観、注射用の精製水中における凍結乾燥化形態の再溶解時間、およびこのようにして得られる溶液の濁度。種々の測定結果を表２に示し、表中、容積の単位は、注射用の精製水５ｍｌで再構成された凍結乾燥化プロダクトの溶液に関する。
【００３５】
【表２】
2007516187.tif 000003
【００３６】
得られた結果は、まず第一に、寒冷沈降性タンパク質への本発明の製剤（溶液Ａ）の添加は、標準製剤（溶液Ｂ）と比較して、凍結乾燥化形態の再溶解時間を顕著に減少させる（約４０％）ことを可能にすることを示している。また、製剤Ａは、濁度のよりよい結果をもたらし、このことは、溶液Ｂと比較して、水に不溶性の分解産物の減少された存在を示唆していることが言及される。両方の場合において、溶液ＡおよびＢは、凍結乾燥後、考慮されるタンパク質の同一の量および活性を全体で回復させる。
【００３７】
実施例２
上述の寒冷沈降物からの凍結乾燥化タンパク質の両方（即ち、一方は、本発明の製剤を含み、そして他方は標準製剤を含む）を、８０℃で７２時間、乾燥加熱する。本発明の製剤（溶液Ａ）を含む寒冷沈降物の加熱された凍結乾燥化タンパク質を、注射用の精製水５ｍｌにおいて再構成する（溶液Ａ”）。標準製剤（溶液Ｂ）を含む寒冷沈降物の加熱された凍結乾燥化タンパク質は、再溶解できないことが言及される。この再溶解の不可能性は、加熱変性されたそして不溶性のタンパク質の存在によって説明され得、これは、溶液Ｂは、熱処理の間これらのタンパク質を安定化しないことの指標である。しかし、実施例１のそれらの凍結乾燥化形態を用いて行われたウイルス不活性化の熱処理後も、考慮されるタンパク質の全体を安定化および可溶化する、本発明の製剤の能力を評価するために、実施例１におけるように、同一の実験を行う。測定の種々の結果を表３に示し、表中、容積の単位は、精製された注射用水５ｍｌで再構成された凍結乾燥化プロダクトの溶液に関する。
【００３８】
【表３】
2007516187.tif 000004
【００３９】
それぞれ表１および２から引き出される溶液Ａ’およびＡ”について得られた測定結果の比較は、驚くべきことに、溶液Ａ（本発明の製剤）は、それらの生物学的機能の顕著な損失無しに、凍結乾燥後に得られるものと比較して、熱処理されたタンパク質の再溶解に必要な時間を非常に大きく減少（約５０％）させることを可能にすることを示している。
【００４０】
実施例３
Ｋｉｓｔｌｅｒらの方法によって寒冷沈降物から単離および精製されたフィブリノーゲンのバッチを、クエン酸三ナトリウム（２．５ｇ／ｌ）、リシン（２ｇ／ｌ）およびグリシン（２ｇ／ｌ）の混合物から構成されるコントロール製剤（溶液Ｃ）中に、１５ｇ／ｌの割合で溶解させた。フィブリノーゲンの濃縮溶液をこのようにして得る。種々のアミノ酸をこの溶液へ添加して、加熱の前および後の凍結乾燥化フィブリノーゲンの再溶解時間に対するそれらの影響を研究する。アミノ酸の得られる溶液および濃度を、表４に示す。
【００４１】
【表４】
2007516187.tif 000005
【００４２】
その後、種々の溶液（溶液Ｃ〜Ｃ５）を濾過し、そして各溶液１０ｍｌを、実施例１に従う凍結乾燥および熱処理に供する。それぞれの凍結乾燥化プロダクトを、注射用の精製水１０ｍｌに溶解し、そして該凍結乾燥化プロダクトの完全な再溶解に必要な時間を測定する。結果を表５に示す。
【００４３】
【表５】
2007516187.tif 000006
【００４４】
結果は、本発明の溶液Ｃ５が、最短時間の再溶解を生じさせることを示している。
【００４５】
また、添加されるアミノ酸の性質に依存して、考慮されるフィブリノーゲン溶液が凍結乾燥および該乾燥形態の加熱の間安定化される能力を示すために、前述の再構成された溶液の濁度測定を行った。表６は、凍結乾燥された溶液Ｃ〜Ｃ５の加熱前および加熱後の濁度の測定値を示している。
【００４６】
【表６】
2007516187.tif 000007
【００４７】
結果は、疑いの余地無く、本発明の製剤（溶液Ｃ５）が、加熱の前および後で、再構成された溶液の濁度の最小の差異をもたらすことを示しており、それは、その増加が４２．９％である溶液Ｃと比較して、たった８．２％増加した。
【００４８】
実施例４
フィブリノーゲンの他のバッチを含有する、実施例３からの溶液Ｃ、Ｃ３およびＣ５を、凍結乾燥し、そして８０℃で７２時間加熱する。その後、対応の凍結乾燥化形態を、注射用精製水１０ｍｌに溶解し、そして、当業者に公知の方法によって、以下のパラメータを測定する：
再溶解時間、不溶性マルチマー（multimers）の量、濁度および再構成された溶液の濾過性（filterability）。特に濾過性は、タンパク質（本ケースにおいてはフィブリノーゲン）の変性度（degree of denaturation）を評価することを可能にするが、粒子、フィブリル（fibrils）またはマルチマーの量に比例し得る変性の因子を規定することは可能にしない。同様に、マルチマー含有量はまた、フィブリノーゲンの変性度に比例し、そして電気泳動（ＳＤＳＰａｇｅ）によって測定される。濾過性分析は、試験される溶液を１０ｍｌ含有する注射器を使用して、該溶液の滅菌を確実にするために十分な多孔性を有するフィルター（即ち、０．２０±０．０２μｍのものでありそして２５ｍｍ直径のもの）によって回収され濾過された溶液の容積の測定からなる。回収され濾過された容積は、分解産物による該フィルターの詰まりの重要性を表している。従って、回収される容積が多いほど、フィブリノーゲンの分解はより低い。種々の測定結果を、表７に示す。
【００４９】
【表７】
2007516187.tif 000008
【００５０】
４つの上記で分析されたパラメータは、本発明の製剤（溶液Ｃ５）が、加熱されたフィブリノーゲンの凍結乾燥化形態の安定化および再溶解に特に好適であることを示唆している。再構成された凍結乾燥化フィブリノーゲンは、約２ｍｌ／ｃｍ２のフィルターの表面に関連する濾過性を有している。
【００５１】
熱処理の厳しい条件下でさえ、フィブリノーゲンに関しての本発明に従う溶液Ｃ５の安定化および可溶化力を実証するために、フィブリノーゲンの種々のバッチを含有する溶液Ｃ３およびＣ５を、凍結乾燥し、そして９０℃で７２時間加熱した。上記の４つのパラメータの検査に加えて、フィブリノーゲンの分解産物（degradation products of fibrinogen；ＤＰＦ）の量の測定からなる追加の分析を行った。この実施例の枠内において、ＤＰＦ（μ／ｍｌ）は、フィブリノーゲンの変性時に生成される種々のサイズのペプチドである。この値が高いほど、その分解が高く、そして例えば血餅（clots）を形成しやすくなる。種々の測定結果を、表８に示す。
【００５２】
【表８】
2007516187.tif 000009
【００５３】
上記の結果は、非常に厳しい加熱条件にもかかわらず、本発明の製剤（溶液Ｃ５）が、凍結乾燥および９０℃で７２時間の熱処理後、依然として、フィブリノーゲンの保護を与えそして可溶化を可能にすることを実証しており、これは、検査されたパラメータの良好な値で示されている。再構成されたフィブリノーゲンの凍結乾燥化形態はまた、約２ｍｌ／ｃｍ２のフィルターの表面に関連する濾過性を有している。
【００５４】
実施例５
この実施例は、凍結乾燥されそして８０℃で７２時間加熱されるように意図されるフィブリノーゲン溶液の安定化および可溶化に対する、本発明の製剤（溶液Ａ）中に含有されるクエン酸三ナトリウムの濃度の影響に関する。寒冷沈降物から得られるフィブリノーゲンのバッチを、溶液Ａ（ここで、クエン酸三ナトリウムの濃度は、溶液ごとに異なった）中において１５ｇ／ｌの割合で可溶化しそして均質化した。それぞれ０．５ｇ／ｌ、１ｇ／ｌ、２ｇ／ｌおよび１１．２ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウムを含有する、それぞれ溶液Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４という４つの溶液が得られた。その後、これらの溶液を実施例１に記載のように濾過し、そして各溶液５ｍｌを採取してそしてバイアルに入れた。フィブリノーゲンを含有する上記４つの溶液を、実施例１に記載される凍結乾燥および熱処理に供した。その後、一方で、４つの非加熱の凍結乾燥化フィブリノーゲンを、そして他方で、加熱したものを、注射用精製水５ｍｌに再溶解し、上記４つの溶液Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４を作製した。いずれの前処理にも供されていない溶液（コントロール溶液に対応する）と比較しての、凍結乾燥の間フィブリノーゲンを保護しそして該凍結乾燥化形態の加熱後それを可溶化させる能力に対する、本発明の製剤中のクエン酸三ナトリウムの濃度の影響を評価するために、実験を行った。その目的のために、当業者に公知の方法によって、以下のパラメータを、各溶液Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＡ４について測定する：注射用精製水中における凍結乾燥化形態の再溶解時間、このようにして得られる溶液の濁度、不溶性マルチマーの量、フィブリノーゲンの重量および凝固性フィブリノーゲンの量。種々の測定結果を表９に示し、表中、容積の単位は、注射用精製水５ｍｌで再構成された凍結乾燥化プロダクトの溶液に関する。
【００５５】
【表９】
2007516187.tif 000010
【００５６】
得られた結果は、本発明の上記製剤の１つにおけるクエン酸三ナトリウムの０．５〜約１２ｇ／ｌの値の範囲において選択される濃度は、コントロール溶液と比較して、凍結乾燥および熱処理の間のフィブリノーゲンの満足いく安定化を可能にするだけでなく、乾燥加熱されたフィブリノーゲンと比較して、凍結乾燥されたフィブリノーゲンの再溶解の全体的に同一の時間を維持することを可能にすることを示している。
【００５７】
実施例６
この実施例は、一方で凍結乾燥される、そして他方で８０℃で７２時間加熱される、フィブリノーゲン溶液中に含有される第ＸＩＩＩ因子の安定化に対する、本発明に従う製剤（溶液Ａ）中に含有されるクエン酸三ナトリウムの濃度の影響に関する。寒冷沈降物から得られたこれら２つのタンパク質を、それぞれ２．５ｇ／ｌ（溶液Ａ）および１１．２ｇ／ｌ（溶液Ａ４）のクエン酸三ナトリウムを含有する本発明（実施例１）に従う２つの製剤中において、１５ｇ／ｌの割合で再溶解し（フィブリノーゲン＋第ＸＩＩＩ因子）、そして均質化した。凍結乾燥前に、溶液ＡおよびＡ４を、実施例１に記載の処理に供した。フィブリノーゲンおよび第ＸＩＩＩ因子の凍結乾燥化形態の両方（一方で加熱せず、そして他方で加熱した）を、その後、注射用精製水５ｍｌに再溶解して、上記溶液ＡおよびＡ４の両方を作製した。伝統的な分析方法によって、ＩＵ／ｍｌ（注射用精製水）で表されるＦＸＩＩＩおよびＩＵ／ｍｌで表されるＦＸＩＩＩ−抗原の活性、ならびにＦＸＩＩＩ：ＦＸＩＩＩ−抗原の活性の割合（Ｒと呼ぶ）を測定した。種々の測定結果を、表１０に示す。
【００５８】
【表１０】
2007516187.tif 000011
【００５９】
結果は、熱処理されなかった凍結乾燥化形態と比較して、熱処理された場合の各凍結乾燥化形態について、割合Ｒの僅かな減少を示している。更に、割合Ｒの減少は、該クエン酸塩含有量が高い場合ほど、より重要性が低いことが言及される。更には、この表は、１つの溶液のクエン酸塩の濃度が他のものと比較して増加する場合（この場合、溶液ＡおよびＡ４）、およびこれらが凍結乾燥される場合、割合Ｒもまた増加することを表している。同一の現象が、凍結乾燥化形態が加熱される場合に言及される。従って、クエン酸塩の濃度は、ＦＸＩＩＩの安定化に影響を与え、これはまた、種々の活性の値によって実証される。
【００６０】
実施例７
この実施例において、実施例５に従って調製された４つの溶液を、凍結乾燥および熱処理（８０℃で７２時間）後に再構成する。以下の表１１は、ＩＵ／ｍｌ（注射用精製水）で表されるＦＸＩＩＩ活性およびＩＵ／ｍｌで表されるＦＸＩＩＩ−抗原、ならびに活性ＦＸＩＩＩ：ＦＸＩＩＩ−抗原の割合（Ｒと呼ぶ）の測定値を示しており、溶液中のクエン酸塩濃度の変化に依存している。
【００６１】
【表１１】
2007516187.tif 000012
【００６２】
得られた結果は、本発明の製剤中のクエン酸三ナトリウムの濃度が高いほど、ＦＸＩＩＩの分解が低いということを示している。
【手続補正書】
【提出日】平成17年5月11日(2005.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１９】
０．２０±０．０２μｍの多孔性を有するフィルターにおいて約２ｍｌ／ｃｍ２の濾過性を示すように、請求項１３に記載の方法によって得られる再構成された凍結乾燥化フィブリノーゲンからなる、請求項１７または１８に記載の濃縮物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】
３５〜４５ｇ／ｌの濃度で存在するアルギニン、少なくとも１つの疎水性アミノ酸、および０．５〜１２ｇ／ｌの濃度で存在するクエン酸三ナトリウムの混合物を含むことを特徴とする、凍結乾燥およびウイルス不活性化の熱処理へ供されるように意図される寒冷沈降性タンパク質のための安定化および可溶化製剤。
【国際調査報告】
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