(57)【要約】  緩衝剤、シクロデキストリン、等張性剤及び酸化防止剤を含む溶液である、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を含む安定化された液体医薬組成物が本発明において記載される。好ましくは、インターフェロンはインターフェロンβ−１ａであり、シクロデキストリンはＨＰＢＣＤである。本発明の製剤は室温で安定であり、したがって、製剤貯蔵のための費用を低下させ、且つ取り扱い時における起こり得る「過ち」に関して患者に対する安全性を増大させているという利点をもたらす。実際、室温で安定であるそのような製剤を有することは、有害な事象（例えば、免疫原性）に潜在的に関わる分解産物が形成する危険性を低下させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝剤、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、等張性剤及び酸化防止剤を含む溶液である、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を含む安定化された液体医薬組成物。
【請求項２】
前記インターフェロンがＩＦＮ−βである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＩＦＮ−βが組換えヒトＩＦＮ−βである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記緩衝剤が、約３〜約６である指定されたｐＨの±０．５単位の範囲内で組成物のｐＨを維持するために十分な量で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ｐＨが３．８である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記緩衝剤が約５ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記緩衝剤が約５０ｍＭの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記緩衝剤が酢酸塩緩衝剤である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記等張性剤がマンニトールである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記等張性剤が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記等張性剤が約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記酸化防止剤がメチオニンである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記酸化防止剤が約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記酸化防止剤が約０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記インターフェロンが約１０μｇ／ｍｌ〜約８００μｇ／ｍｌの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記シクロデキストリンが５００倍モル過剰から７００倍モル過剰までの対インターフェロンモル比で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記インターフェロンが、約４４μｇ／ｍｌ、８８μｇ／ｍｌ又は２７６μｇ／ｍｌの濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
水溶液である前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
静菌剤をさらに含む前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記静菌剤がベンジルアルコールである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記静菌剤が約０．１％〜約２％の濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記静菌剤が約０．２％又は０．３％の濃度で存在する、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記等張性剤がマンニトールであり、前記酸化防止剤がメチオニンであり、前記インターフェロンがインターフェロン−βである、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
下記の液体製剤：
【表１】
2007513925.tif 000012
である、前記請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
計算量の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、酸化防止剤及び等張性剤を緩衝化された溶液に加えること、及び次いで、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を加えることを含む、請求項１から２４までのいずれかに記載の安定化された液体医薬組成物を調製するための方法。
【請求項２６】
請求項１から２４までのいずれかに記載の液体医薬組成物を含む、使用前の貯蔵のために無菌且つ適切な状態で密封された容器。
【請求項２７】
単回投薬投与のための事前に充填されたシリンジである、請求項２６に記載の容器。
【請求項２８】
バイアルである請求項２６に記載の容器。
【請求項２９】
自己注射器用のカートリッジである請求項２６に記載の容器。
【請求項３０】
単回投薬投与又は多回投薬投与のためのものである請求項２６から２９までのいずれかに記載の容器。
【請求項３１】
請求項１から２４までのいずれかに記載の医薬組成物により充填された第１の容器と、静菌剤の溶液の充填された第２のカートリッジとを含む、請求項２６から２９までのいずれかに記載の医薬組成物を多回投薬投与するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全体として、緩衝剤、シクロデキストリン、等張性剤及び酸化防止剤を含む溶液である、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を含む安定化された液体医薬組成物、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インターフェロンは、サイトカイン、すなわち細胞間のメッセージを伝達し、且つ感染を引き起こす微生物を殺すことを助けることによって、また生じた何らかの損傷を修復することによって免疫系において不可欠な役割を果たす可溶性のタンパク質である。インターフェロンは自然の状態では感染細胞によって分泌され、１９５７年に初めて同定された。この名称は、インターフェロンがウイルスの複製及び増殖を「妨害（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）」するという事実に由来する。
【０００３】
インターフェロンは抗ウイルス活性及び抗増殖活性の両方を示す。生化学的性質及び免疫学的性質に基づいて、天然に存在するヒトインターフェロンは３つの大きなクラスに分類される：インターフェロン−α（白血球）、インターフェロン−β（繊維芽細胞）及びインターフェロン−γ（免疫）。α−インターフェロンは、現在、毛様細胞性白血病、性病性疣贅、カポジ肉腫（後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患している患者を一般には苦しめるガン）及び慢性の非Ａ非Ｂ肝炎を処置するために米国及び他の国々において承認されている。
【０００４】
さらに、インターフェロン（ＩＦＮ）は、ウイルス感染に応答して身体によって産生される糖タンパク質である。インターフェロンは、保護された細胞においてウイルスの増殖を阻害する。より低分子量のタンパク質からなることにより、ＩＦＮはその作用において著しく非特異的である。すなわち、ある１つのウイルスによって誘導されたＩＦＮは広範囲の他のウイルスに対して効果的である。しかし、インターフェロンは種特異的である。すなわち、ある１つの種によって産生されたＩＦＮは同じ種又は近縁種の細胞においてのみ抗ウイルス活性を刺激する。ＩＦＮは、その潜在的な抗腫瘍活性及び抗ウイルス活性のために利用されることになった最初のサイトカイン群であった。
【０００５】
３つの主要なＩＦＮは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γと称される。このような主要な種類のＩＦＮは最初、その起源細胞に従って分類されていた（白血球、繊維芽細胞又はＴ細胞）。しかし、数タイプが１種の細胞によって産生され得ることが明らかになった。したがって、現在、白血球ＩＦＮはＩＦＮ−αと、繊維芽細胞ＩＦＮはＩＦＮ−βと、Ｔ細胞ＩＦＮはＩＦＮ−γと呼ばれる。第４のタイプのＩＦＮ（リンパ芽球様ＩＦＮ）も存在し、これは「ナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）」細胞系（これはバーキットリンパ腫に由来する）において産生される。ナマルワ細胞系は白血球ＩＦＮと繊維芽細胞ＩＦＮの混合物を産生するようである。
【０００６】
インターフェロンユニット又はインターフェロンに対する国際単位（Ｕ又はＩＵ（国際単位を表す））が、５０％の細胞をウイルス損傷から保護するために必要な量と定義されるＩＦＮ活性の尺度として報告されている。生物活性を測定するために使用され得るアッセイは、記載されるような細胞傷害作用阻害アッセイである（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ他、１９８１；Ｆａｍｉｌｌｅｔｔｉ，Ｐ．Ｃ．他、１９８１）。インターフェロンについてのこの抗ウイルスアッセイにおいて、約１ユニット／ｍｌのインターフェロンは、５０％の細胞障害作用を生じさせるために必要な量である。ユニット数は、国立衛生研究所によって提供されるＨｕ−ＩＦＮ−βについての国際基準標準物に関して決定される（Ｐｅｓｔｋａ，Ｓ．、１９８６）。
【０００７】
どのクラスのＩＦＮもいくつかの異なったタイプを含有する。ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γはそれぞれ、単一遺伝子の産物ある。
【０００８】
ＩＦＮ−αとして分類されるタンパク質は、約１５のタイプを含有する最も多様な一群である。ＩＦＮ−α遺伝子のクラスターが第９染色体上に存在し、このクラスターは少なくとも２３の遺伝子を含有し、そのうちの１５個が活性であり、転写される。成熟型ＩＦＮ−αはグリコシル化されていない。
【０００９】
ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βはすべて、同じ長さ（１６５アミノ酸又は１６６アミノ酸）である類似する生物活性を有する。ＩＦＮ−γは長さが１４６アミノ酸であり、αクラス及びβクラスとそれほど密接に似ていない。ＩＦＮ−γのみがマクロファージを活性化することができ、又はキラーＴ細胞の成熟化を誘導することができる。これらの新しいタイプの治療剤は、腫瘍に対する生物の応答に対して作用を及ぼし、それにより、免疫調節による認識に影響を及ぼすので、生物応答修飾剤（ＢＲＭ）と呼ばれることがある。
【００１０】
ヒト繊維芽細胞インターフェロン（ＩＦＮ−β）は抗ウイルス活性を有し、新生物細胞に対するナチュラルキラー細胞を刺激することもできる。ヒト繊維芽細胞インターフェロンは、ウイルス及び二本鎖ＲＮＡによって誘導される約２０，０００Ｄａのポリペプチドである。組換えＤＮＡ技術によってクローン化された繊維芽細胞インターフェロンに対する遺伝子のヌクレオチド配列（Ｄｅｒｙｎｋ他、１９８０）から、タンパク質の完全なアミノ酸配列が推定された。その長さは１６６アミノ酸である。
【００１１】
Ｓｈｅｐａｒｄ他（１９８１）は、その抗ウイルス活性を無効にした塩基８４２における変異（１４１位において、Ｃｙｓ→Ｔｒｙ）、及び、ヌクレオチド１１１９〜１１２１の欠失を有する変化体クローンを記載した。
【００１２】
Ｍａｒｋ他（１９８４）は、塩基４６９（Ｔ）を（Ａ）で置換し、これにより１７位におけるＣｙｓ→Ｓｅｒのアミノ酸交換を生じさせることによって人工的な変異を挿入した。得られるＩＦＮ−βは、「天然型」ＩＦＮ−βと同じくらい活性であり、長期の貯蔵（−７０℃）の期間中、安定であることが報告された。
【００１３】
Ｒｅｂｉｔ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ−組換えヒトインターフェロン−β）は、多発性硬化症（ＭＳ）のためのインターフェロン治療において最近開発されたものであり、哺乳動物の細胞系から産生されるインターフェロン（ＩＦＮ）−β−１ａである。その推奨される国際一般名（ＩＮＮ）は「インターフェロンβ−１ａ」である。
【００１４】
タンパク質ベースのすべての医薬品の場合と同様に、治療剤としてのＩＦＮ−βの使用において克服しなければならない１つの大きな障害は、医薬製剤におけるその不安定性から生じ得る薬学的効力の喪失である。
【００１５】
医薬製剤におけるポリペプチドの活性及び効力を脅かす物理的不安定性には、変性、並びに可溶性及び不溶性の凝集物の形成が含まれ、一方、化学的不安定性には、加水分解、イミド形成、酸化、ラセミ化及び脱アミド化が含まれる。これらの変化のいくつかが、対象のタンパク質の薬学的活性の喪失又は低下を生じさせることが知られている。他の場合では、これらの変化の正確な影響は不明であるが、生じる分解生成物は、望ましくない副作用に対する潜在的可能性のために医薬品として受け入れられないと依然として見なされている。
【００１６】
医薬組成物におけるポリペプチドの安定化は、試行錯誤が大きな役割を果たす領域を依然として残している（このことは、Ｗａｎｇ（１９９９）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、１８５：１２９〜１８８；Ｗａｎｇ及びＨａｎｓｏｎ（１９８８）、Ｊ．Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．、４２；Ｓ３〜Ｓ２６によって総説される）。その安定性を増大させるためにポリペプチド医薬製剤に加えられる賦形剤には、緩衝剤、糖、界面活性剤、アミノ酸、ポリエチレングリコール及びポリマーが含まれるが、これらの化学的添加剤の安定化作用はタンパク質に依存して変化する。
【００１７】
シクロデキストリンは環状のオリゴ糖である。最も一般的なシクロデキストリンは、α−シクロデキストリン（これは６個のグルコース残基の環から構成される）、β−シクロデキストリン（これは７個のグルコース残基の環から構成される）、及びγ−シクロデキストリン（これは８個のグルコース単位の環から構成される）である。シクロデキストリンの内部空洞は親油性であり、一方で、シクロデキストリンの外側は親水性であり、この組み合わさった性質は、特に医薬品に関連して、シクロデキストリン類の広範囲の研究をもたらしており、多くの包接複合体が報告されている。β−シクロデキストリンはその空洞サイズのために特別に注目されているが、その比較的低い水溶性（２５℃で約１．８％ｗ／ｖ）及び付随する腎毒性により、医薬品分野でのその使用が制限される。天然シクロデキストリンの性質を変える様々な試みにより、ヘプタキス（２，６−ジ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、ヘプタキス（２，３，６−トリ−Ｏ−メチル）−β−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン及びβ−シクロデキストリン−エピクロロヒドリンポリマーなどが開発されている。医薬品研究における様々なシクロデキストリン及びそれらの使用の包括的な総説については、Ｐｉｔｈａ他、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒ（編者：Ｓ．Ｄ．Ｂｒｕｃｋ）、Ｖｏｌ．Ｉ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ、１２５頁〜１４８頁（１９８３）を参照のこと。さらにより最近の総説については、Ｕｅｋａｍａ他、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖｏｌ．３（１）、１〜４０（１９８７）；Ｕｅｋａｍａ、Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８７年、編者：Ｄ．Ｄ．Ｂｒｅｉｍｅｒ及びＰ．Ｓｐｅｉｓｅｒ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｂ．Ｖ．（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、１８１〜１９４（１９８７）；及び、Ｐｅｇｉｎｇｔｏｎ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｂｒｉｔａｉｎ、４５５頁〜４５８頁（１９８７年５月）を参照のこと。シクロデキストリンの、特にペプチド送達及びタンパク質送達のこの分野における使用が、Ｔ．Ｉｒｉｅ他によってＡｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、Ｖｏｌ．３６、１０１〜１２３（１９９９）に総説されており、ヒツジ成長ホルモン、インターロイキン−２及びウシインスリンの場合における例が、Ｂｒｅｗｓｔｅｒ他、１９９１、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８（６）、７９２〜７９５に記載される。
【００１８】
国際特許出願公開ＷＯ９０／０３７８４及び米国特許第５，９９７，８５６号は、シクロデキストリンによるポリペプチド（特に、タンパク質）の可溶化及び／又は安定化のための方法を記載する。しかし、インターフェロンの安定化に関するデータはこの文書には何ら報告されていない。
【００１９】
米国特許第６，５８２，７２８号は、シクロデキストリンをさらには含有し得る、インターフェロン−βを含有し、且つヒト血清アルブミンもまた含有する肺投与のための乾燥粉末組成物を記載する。しかし、この場合でさえ、シクロデキストリンをも含有するインターフェロン組成物の安定化に関するデータはこの文書には何ら報告されていない。
【００２０】
国際特許出願公開ＷＯ２００３／００２１５２は、インターフェロン分子と、シクロデキストリンの特定の誘導体（すなわち、スルホアルキルエーテルシクロデキストリン）とを含む安定化された組成物を記載する。
【００２１】
したがって、このタンパク質の溶解性を改善し、且つ凝集物形成に対してタンパク質を安定化し、それにより、医薬品としてのその有用性を高める生理学的に適合し得る安定化剤を含むＩＦＮ−βのさらなる医薬組成物が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明は、インターフェロン（ＩＦＮ）を含む安定化された医薬組成物、その調製方法及びその使用を対象とする。具体的には、本発明の主要な目的は、緩衝剤、シクロデキストリン、好ましくは等張性剤、及び酸化防止剤を含む溶液である、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を含む安定化された液体医薬組成物を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の組成物は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の非存在下で好ましくは調製され、したがって、この薬学的賦形剤を含まない。そのような組成物は、本明細書中では「ＨＳＡ非含有」ＩＦＮ医薬組成物として示され、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を含む。
【００２４】
本発明の一実施形態によれば、本発明の組成物はまた静菌剤を含む。
【００２５】
本明細書中で使用される「インターフェロン」又は「ＩＦＮ」は、文献においてそのようなものとして定義される任意の分子を包含することが意図され、これには、例えば、上記の「発明の背景」の節で述べられた任意のタイプのＩＦＮが含まれる。具体的には、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γが上記の定義に含まれる。ＩＦＮ−βが、本発明による好ましいＩＦＮである。本発明に好適なＩＦＮは、例えば、Ｒｅｂｉｆ（登録商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）、Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）（Ｂｉｏｇｅｎ）又はＢｅｔａｆｅｒｏｎ（登録商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）として市販されている。本発明によれば、ヒト起源のインターフェロンの使用も好ましい。インターフェロンという用語は、本明細書中で使用されるとき、その塩、機能的誘導体、変化体、アナログ及び活性なフラグメントを包含することが意図される。
【００２６】
本明細書中で使用される用語「インターフェロン−β（ＩＦＮ−ｂｅｔａ又はＩＦＮ−β）」は、生物流体からの単離によって得られるような、或いは原核生物宿主細胞又は真核生物宿主細胞からＤＮＡ組換え技術によって得られるような繊維芽細胞インターフェロン（具体的には、ヒト起源の繊維芽細胞インターフェロン）、並びにその塩、機能的誘導体、変化体、アナログ及び活性なフラグメントを包含することが意図される。好ましくは、ＩＦＮ−βはインターフェロンβ−１ａを意味することが意図される。
【００２７】
本明細書中で使用される用語「ムテイン」は、野生型ＩＦＮと比較して、生じる生成物の活性をかなり変化させることなく、天然ＩＦＮのアミノ酸残基の１つ又は複数が異なるアミノ酸残基によって置換されているか、又は欠失しているか、或いは１つ又は複数のアミノ酸残基がＩＦＮの天然配列に付加されているＩＦＮのアナログを示す。このようなムテインは、知られている合成技術及び／又は部位特異的変異誘発技術によって、或いは、その好適な任意の他の知られている技術によって調製される。好ましいムテインには、例えば、Ｓｈｅｐａｒｄ他（１９８１）又はＭａｒｋ他（１９８４）によって記載されるムテインが含まれる。
【００２８】
任意のそのようなムテインは、好ましくは、例えば、ＩＦＮと実質的に類似する活性又はさらに一層良好な活性を有するような、ＩＦＮのアミノ酸配列を十分に複製するアミノ酸の配列を有する。インターフェロンの生物学的機能は当業者には広く知られており、また、生物学的標準物が確立され、例えば、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｌｉｎｋｓ／ＮＩＢＳＣ）から入手可能である。
【００２９】
ＩＦＮ活性を決定するための様々なバイオアッセイが記載されている。ＩＦＮアッセイを、例えば、Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ他（１９８１）による記載のように行うことができる。したがって、任意の所与のムテインが、実質的に類似する活性を有するか、又はＩＦＮよりもさらに一層良好な活性を有するかどうかを日常的な実験によって決定することができる。
【００３０】
ＩＦＮのムテイン（これは本発明に従って使用することができる）、又はそれをコードする核酸は、本明細書中に示される教示及び指針に基づいて、過度な実験を用いることなく、当業者によって日常的に得ることができる置換ペプチド又は置換ポリヌクレオチドのような実質的に対応する配列の有限な集合を含む。
【００３１】
本発明によるムテインのための好ましい変化は、「保存的」置換として知られているものである。本発明のポリペプチド又はタンパク質の保存的なアミノ酸置換では、グループのメンバー間の置換が分子の生物学的機能を保持するように十分に類似する物理化学的性質を有するグループ内の同義的アミノ酸を含むことができる。アミノ酸の挿入及び欠失もまた、特に、挿入又は欠失が少数のアミノ酸（例えば、３０個未満、好ましくは、１０個未満）を伴うだけであり、且つ機能的な立体配座にとって重要なアミノ酸（例えば、システイン残基）を除去しないか、又はそのようなアミノ酸と入れ替わらないならば、それらの機能を変化させることなく、上記で定義された配列において行われ得ることは明らかである。そのような欠失及び／又は挿入によって作製されるタンパク質及びムテインは本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
好ましくは、同義的アミノ酸群は、表Ｉに定義されるアミノ酸群である。より好ましくは、同義的アミノ酸群は、表ＩＩに定義されるアミノ酸群であり、最も好ましくは、同義的アミノ酸群は、表ＩＩＩに定義されるアミノ酸群である。
【００３３】
【表１】
2007513925.tif 000002
【００３４】
【表２】
2007513925.tif 000003
【００３５】
【表３】
2007513925.tif 000004
【００３６】
本発明において使用されるＩＦＮのムテインを得るために使用することができるタンパク質におけるアミノ酸置換を作製する例には、任意の知られている方法ステップが含まれる：例えば、米国特許第４，９５９，３１４号、同第４，５８８，５８５号及び同第４，７３７，４６２号（Ｍａｒｋ他）；米国特許第５，１１６，９４３号（Ｋｏｔｈｓ他）；米国特許第４，９６５，１９５号（Ｎａｍｅｎ他）；米国特許第４，８７９，１１１号（Ｃｈｏｎｇ他）；及び、米国特許第５，０１７，６９１号（Ｌｅｅ他）などに示される方法ステップ；並びに米国特許第４，９０４，５８４号（Ｓｈａｗ他）に示されるリシン置換タンパク質。ＩＦＮ−βの具体的なムテインが、例えば、Ｍａｒｋ他（１９８４）によって記載されている。
【００３７】
用語「融合タンパク質」は、例えば、体液における長時間の滞留時間を有する別のタンパク質に融合された、ＩＦＮ又はそのムテインを含むポリペプチドを示す。したがって、ＩＦＮを別のタンパク質又はポリペプチド（例えば、免疫グロブリン又はそのフラグメント）などに融合することができる。
【００３８】
本明細書中で使用される「機能的誘導体」は、残基上の側鎖或いはＮ末端基又はＣ末端基として存在する官能基からこの分野で知られている手段によって調製され得るＩＮＦの誘導体、並びにそれらのムテイン及び融合タンパク質を包含し、それらが依然として医薬的に許容され得る限り、すなわちＩＦＮの活性と実質的に類似するタンパク質の活性を破壊せず、且つそれを含有する組成物に毒性の性質を与えない限り、本発明に含まれる。このような誘導体は、例えば、抗原性部位を遮蔽し、且つ体液におけるＩＦＮの滞留を延ばすことができるポリエチレングリコール側鎖を含むことができる。他の誘導体では、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第一級アミン若しくは第二級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル成分（例えば、アルカノイル基又はカルボン酸アロイル基）により形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又はアシル成分により形成される遊離ヒドロキシル基（例えば、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基）のＯ−アシル誘導体が含まれる。
【００３９】
ＩＦＮの「活性な分画物」、又はムテイン及び融合タンパク質として、本発明は、前記分画物が、対応するＩＦＮと比較して、著しく低下した活性を有しないならば、タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意のフラグメント又は前駆体を単独で、或いはそれに結合した関連する分子又は残基（例えば、糖残基若しくはリン酸残基、又はタンパク質分子の凝集体、又は自身による糖残基）と一緒に包含する。
【００４０】
本明細書中における用語「塩」は、上記に記載されるタンパク質又はそのアナログのカルボキシル基の塩及びアミノ基の酸付加塩の両方を示す。カルボキシル基の塩を、この分野で知られている手段によって形成させることができ、これには、無機塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、第一鉄塩又は亜鉛塩など、及び、有機塩基との塩、例えば、アミン（例えば、トリエタノールアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、プロカインなど）により形成される塩が含まれる。酸付加塩には、例えば、鉱酸（例えば、塩酸又は硫酸など）との塩、及び、有機酸（例えば、酢酸又はシュウ酸など）との塩が含まれる。当然のことではあるが、任意のそのような塩は、本発明に関連したタンパク質（ＩＦＮ）の生物活性（すなわち、対応する受容体に結合し、且つ受容体のシグナル伝達を開始させる能力）を保持しなければならない。
【００４１】
本発明によれば、組換えヒトＩＦＮ−β及び本発明の化合物の使用がさらに特に好ましい。
【００４２】
特別な種類のインターフェロン変化体が最近では記載されている。いわゆる「コンセンサスインターフェロン」はＩＮＦの天然に存在しない変化体である（米国特許第６，０１３，２５３号）。本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の化合物はコンセンサスインターフェロンとの組合せで使用される。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、ヒトインターフェロンコンセンサス（ＩＮＦ−ｃｏｎ）は、天然に存在するヒト白血球インターフェロンサブタイプ配列の大部分を表すＩＦＮ−αのサブセットに共通するそのようなアミノ酸残基を主として含む天然に存在しないポリペプチドで、すべてのサブタイプに共通するアミノ酸が存在しないそのような位置の１つ又は複数において、その位置において主として存在するアミノ酸を含み、且つ少なくとも１つの天然に存在するサブタイプにおけるその位置に存在しないいずれかのアミノ酸残基をいかなる場合でも含まないポリペプチドを意味するものとする。ＩＦＮ−ｃｏｎは、米国特許第４，６９５，６２３号、同第４，８９７，４７１号及び同第５，５４１，２９３号に開示されるＩＦＮ−ｃｏｎ１、ＩＦＮ−ｃｏｎ２及びＩＦＮ−ｃｏｎ３と称されるアミノ酸配列を包含するが、これらに限定されない。ＩＦＮ−ｃｏｎをコードするＤＮＡ配列を上記の特許に記載されるように作製することができ、又は他の標準的な方法によって作製することができる。
【００４４】
さらなる好ましい実施形態において、融合タンパク質はＩｇ融合を含む。この融合は直接的であり得るか、或いは長さが１アミノ酸残基〜３アミノ酸残基ほどの短さであり得るか、又はそれよりも長いこと（例えば、１３アミノ酸残基の長さ）が可能である短いリンカーペプチドを介して可能である。前記リンカーは、例えば、配列Ｅ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）（配列番号１）のトリペプチド、又はＩＦＮの配列と、免疫グロブリン配列との間に導入されたＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ（配列番号２）を構成する１３アミノ酸リンカー配列であり得る。得られる融合タンパク質は、改善された性質（例えば、体液における延長された滞留時間（半減期）、増大した比活性、増大した発現レベルなど）を有することができ、又は融合タンパク質の精製が容易になる。
【００４５】
さらなる好ましい実施形態において、ＩＦＮはＩｇ分子の定常領域に融合される。好ましくは、ＩＦＮは、例えば、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインのような重鎖領域に融合される。Ｉｇ分子の他のイソ型もまた、本発明に従って融合タンパク質を作製するために好適である（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のイソ型、或いは、例えば、ＩｇＭ又はＩｇＡのような他のＩｇクラス）。融合タンパク質はモノマーであり得るか、或いはマルチマー（ヘテロマルチマー又はホモマルチマー）であり得る。
【００４６】
さらなる好ましい実施形態において、機能的誘導体は、アミノ酸残基上の１つ又は複数の側鎖として存在する１つ又は複数の官能基に結合した少なくとも１つの成分を含む。好ましくは、そのような成分はポリエチレン（ＰＥＧ）成分である。ＰＥＧ化を、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９９／５５３７７に記載される方法などの知られている方法によって行うことができる。
【００４７】
単回投薬又は多回投薬として個体に投与される投薬量は、薬物動態学的性質、投与経路、患者の状態及び特性（性別、年齢、体重、健康状態、体格）、症状の程度、同時治療、処置頻度、並びに所望される効果を含めた様々な要因に依存して変化する。
【００４８】
ヒトＩＦＮ−βの標準的な投薬量は、１日あたり８００００ＩＵ／ｋｇ〜２０００００ＩＵ／ｋｇ、又は１日あたり６ＭＩＵ（百万国際単位）／人〜１２ＭＩＵ／人、又は２２μｇ（マイクログラム）／人〜４４μｇ／人の範囲である。本発明によれば、ＩＦＮは、好ましくは、１日あたり１人につき約１μｇ〜５０μｇ（より好ましくは、約１０μｇ〜３０μｇ、又は約１０μｇ〜２０μｇ）の投薬量で投与される。
【００４９】
本発明による有効成分の投与は、静脈内経路、筋肉内経路又は皮下経路によって可能である。ＩＦＮについての好ましい投与経路は皮下経路である。
【００５０】
ＩＦＮはまた、毎日、又は１日おきに、又はより少ない頻度で投与することができる。好ましくは、ＩＦＮは、１週間に１回、２回又は３回で投与される。
【００５１】
好ましい投与経路は皮下投与であり、これは、例えば、１週間に３回、投与される。さらなる好ましい投与経路は筋肉内投与であり、これは、例えば、１週間に１回、施すことができる。
【００５２】
再発寛解型ＭＳの本発明による処置におけるＩＦＮ−βの投薬は、使用されるＩＮＦ−βのタイプに依存する。
【００５３】
本発明によれば、ＩＦＮが、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）で作製された組換えＩＦＮ−β１ｂである場合、これはＢｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）の商標で市販されているが、ＩＦＮを、好ましくは、１人あたり約２５０μｇ〜３００μｇ又は８ＭＩＵ〜９．６ＭＩＵの投薬量で２日毎に皮下に投与することができる。
【００５４】
本発明によれば、ＩＦＮが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で作製された組換えＩＦＮ−β１ａである場合、これはＡｖｏｎｅｘ（登録商標）の商標で市販されているが、ＩＦＮを、好ましくは、１人あたり約３０μｇ〜３３μｇ又は６ＭＩＵ〜６．６ＭＩＵの投薬量で１週間に１回、筋肉内に投与することができる。
【００５５】
本発明によれば、ＩＦＮが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で作製された組換えＩＦＮ−β１ａである場合、これはＲｅｂｉｆ（登録商標）の商標で市販されているが、ＩＦＮを、好ましくは、１人あたり約２２μｇ〜４４μｇ又は６ＭＩＵ〜１２ＭＩＵの投薬量で１週間に３回（ＴＩＷ）、皮下に投与することができる。
【００５６】
用語「安定性」は、（生物学的効力の維持を含めて）本発明のインターフェロンの製剤の物理的安定性、化学的安定性及び立体配座的安定性を示す。タンパク質製剤の不安定性は、タンパク質分子の化学的分解、又はタンパク質分子が凝集して、より高次のポリマーを形成すること、脱グリコシル化、グリコシル化の修飾、酸化、或いは本発明において含まれるインターフェロンポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を低下させる任意の他の構造的修飾によって引き起こされ得る。
【００５７】
「安定な」又は「安定化された」溶液又は製剤は、それにおけるタンパク質の分解、修飾、凝集、生物活性の喪失などの程度が、受け入れられ得るほど抑制され、且つ時間とともに受け入れられ得ないほど増大しないものである。好ましくは、製剤は少なくとも６０％又は約６０％（より好ましくは、少なくとも７０％又は約７０％、最も好ましくは、少なくとも８０％又は約８０％）の表示されたインターフェロン活性を２４ヶ月の期間にわたって維持する。本発明の安定化されたＩＦＮ組成物は、好ましくは、少なくとも約６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、より好ましくは、少なくとも２０ヶ月、さらにより好ましくは、少なくとも約２２ヶ月、最も好ましくは、少なくとも約２４ヶ月の貯蔵寿命を、２℃〜８℃で貯蔵されたときに有する。
【００５８】
本発明のＩＦＮ医薬組成物の安定性をモニターするための様々な方法が、本明細書中に開示される実施例に記載されるそのような方法を含めてこの分野では利用可能である。したがって、本発明の液体医薬組成物の貯蔵時におけるＩＦＮ凝集物の形成を、溶液における可溶性ＩＦＮの変化を経時的に測定することによって容易に明らかにすることができる。溶液中の可溶性ポリペプチドの量は、ＩＦＮの検出に適合した数多くの分析アッセイによって定量することができる。そのようなアッセイには、例えば、下記の実施例において記載されるようにサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）−ＨＰＬＣ及びＵＶ吸収分光分析法が含まれる。
【００５９】
液体製剤における貯蔵期間中の可溶性凝集物及び不溶性凝集物の両方の測定を、例えば、可溶性凝集物として存在する可溶性ポリペプチドのそのような部分と、凝集していない生物学的に活性な分子形態で存在するそのような部分とを識別するために、下記の実施例において記されるような分析的超遠心分離を使用して達成することができる。
【００６０】
表現「多回投薬使用」は、２回以上の注射（例えば、２回、３回、４回、５回、６回又はそれ以上の注射）のためのインターフェロン製剤の単回用のバイアル、アンプル又はカートリッジの使用を包含することが意図される。注射は、好ましくは、少なくとも１２時間又は約１２時間、少なくとも２４時間又は約２４時間、少なくとも４８時間又は約４８時間などから、好ましくは、１２日又は約１２日までの期間にわたって行われる。注射は一定の間隔を置くことができ、例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間又は７２時間の間隔を置くことができる。
【００６１】
用語「緩衝剤」又は用語「生理学的に許容され得る緩衝剤」は、製剤での医薬的使用又は獣医学的使用のために安全であることが知られ、且つ製剤のために所望されるｐＨ範囲で製剤のｐＨを維持又は制御するという作用を有する化合物の溶液を示す。適度な酸性ｐＨから適度な塩基性ｐＨでｐＨを制御するための好適な緩衝剤には、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、アルギニン、ＴＲＩＳ及びヒスチジンのような化合物が含まれるが、これらに限定されない。「ＴＲＩＳ」は２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオールを示し、また、その任意の薬理学的に許容され得る塩を示す。好ましい緩衝剤は、生理的食塩水又は許容され得る塩を含む酢酸塩緩衝液である。
【００６２】
本発明における使用のために意図される「シクロデキストリン」は、β−シクロデキストリンのヒドロキシプロピル誘導体、ヒドロキシエチル誘導体、グルコシル誘導体、マルトシル誘導体及びマルトトリオシル誘導体、並びにγ−シクロデキストリンの対応する誘導体である。ヒドロキシアルキル基化体は１つ又は複数のヒドロキシル基を含有する（例えば、ヒドロキシプロピル（２−ヒドロキシプロピル、３−ヒドロキシプロピル）、ジヒドロキシプロピルなど）。グルコシル誘導体、マルトシル誘導体及びマルトトリオシル誘導体は１つ又は複数の糖残基（例えば、グルコシル又はジグルコシル、マルトシル又はジマルトシル）を含有することができる。シクロデキストリン誘導体の様々な混合物を同様に使用することができる（例えば、マルトシル誘導体及びジマルトシル誘導体の混合物）。本発明において使用される具体的なシクロデキストリン誘導体には、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰＣＤ又はＨＰＢＣＤ）、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン（ＨＥＢＣＤ）、ヒドロキシプロピル−γ−シクロデキストリン（ＨＰＧＣＤ）、ヒドロキシエチル−γ−シクロデキストリン（ＨＥＧＣＤ）ジヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（２ＨＰＢＣＤ）、グルコシル−β−シクロデキストリン（Ｇ１−β−ＣＤ又はＧ１ＢＣＤ）、ジグルコシル−β−シクロデキストリン（２ＧＧ１−β−ＣＤ又は２Ｇ１ＢＣＤ）、マルトシル−β−シクロデキストリン（Ｇ２−β−ＣＤ又はＧ２ＢＣＤ）、マルトシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ２−γ−ＣＤ又はＧ２ＧＣＤ）、マルトトリオシル−β−シクロデキストリン（Ｇ３−β−ＣＤ又はＧ３ＢＣＤ）、マルトトリオシル−γ−シクロデキストリン（Ｇ３−γ−ＣＤ又はＧ３ＧＣＤ）及びジマルトトリオシル−β−シクロデキストリン（２Ｇ２−β−ＣＤ又は２Ｇ２ＢＣＤ）、並びにこれらの混合物（例えば、マルトシル−β−シクロデキストリン／ジマルトシル−β−シクロデキストリンなど）が含まれる。
【００６３】
本発明の組成物において使用されるヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは市販されており、本発明による好ましいシクロデキストリンである。
【００６４】
或いは、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンは、知られている方法によって、特に、Ｐｉｔｈａ他（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、２９、７３〜８２（１９８６））の最適化された手順の使用によって調製することができる。
【００６５】
「等張性剤」は、生理学的に許容され、且つ製剤と接触している細胞膜を横断する水の正味の流れを防止するために好適な張性を製剤に与える化合物である。グリセリンなどの化合物が、知られている濃度でそのような目的のために一般に使用される。他の好適な等張性剤には、例えば、アミノ酸又はタンパク質（例えば、グリシン又はアルブミンなど）、塩（例えば、塩化ナトリウム）及び糖（例えば、デキストロース、マンニトール、スクロース及びラクトース）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、等張性剤はマンニトールである。
【００６６】
用語「酸化防止剤」は、酸素又は酸素由来フリーラジカルが他の物質と相互作用することを防止する化合物を示す。酸化防止剤は、物理的安定性及び化学的安定性を高めるために医薬品系に一般に添加される数多くの賦形剤の１つである。酸化防止剤は、酸素にさらされたとき、又はフリーラジカルの存在下で、いくつかの薬物又は賦形剤とともに生じる酸化プロセスを最小限に抑えるか、又は遅らせるために添加される。このようなプロセスは、光、温度、濃縮時の水素、微量金属の存在又は過酸化物によって触媒され得ることが多い。亜硫酸塩、重亜流酸塩、チオウレア、メチオニン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の塩、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）及びブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）が、薬物における酸化防止剤として頻繁に使用される。ナトリウムＥＤＴＡは、そうでない場合には酸化反応を触媒する金属イオンをキレート化することによって酸化防止剤の活性を高めることが見出されている。最も好ましい酸化防止剤はメチオニンである。
【００６７】
用語「静菌剤」は、抗菌剤として作用させるために製剤に添加される化合物又は組成物を示す。本発明の保存されたインターフェロン含有製剤は、好ましくは、商業的に実現可能な多回使用製造物であるための保存有効性についての法定指針又は規制指針を満たす。静菌剤の例には、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサールが含まれる。好ましくは、静菌剤はベンジルアルコールである。
【００６８】
好ましい実施形態において、本発明は、緩衝剤、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、等張性剤及び酸化防止剤を含む溶液である、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を含む安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００６９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、前記インターフェロンがＩＦＮ−β（例えば、組換えヒトＩＦＮ−βなど）である安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、前記緩衝剤が、３．８又は約３．８のｐＨ値を含めて、約３〜約６（例えば、３．０又は約３．０〜約６．０のｐＨ値など）である指定されたｐＨの±０．５単位の範囲内で前記組成物のｐＨを維持するために十分な量で存在する安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７１】
別の好ましい実施形態において、本発明は、前記緩衝剤が約５ｍＭ〜５００ｍＭの濃度（例えば、５０ｍＭ又は約５０ｍＭの濃度など）で存在する安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７２】
別の好ましい実施形態において、本発明は、前記緩衝剤が酢酸塩緩衝剤である安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７３】
別の好ましい実施形態において、本発明は、前記等張性剤がマンニトールである安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、本発明は、前記等張性剤が約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度（例えば、５０ｍｇ／ｍｌ又は約５０ｍｇ／ｍｌの濃度など）で存在する安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７５】
別の好ましい実施形態において、本発明は、酸化防止剤がメチオニンである安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７６】
別の好ましい実施形態において、本発明は、酸化防止剤が、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度（例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ又は約０．１ｍｇ／ｍｌの濃度など）を含めて、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、前記インターフェロンが約１０μｇ／ｍｌ〜約８００μｇ／ｍｌの濃度（例えば、４４μｇ／ｍｌ又は約４４μｇ／ｍｌ、８８μｇ／ｍｌ又は約８８μｇ／ｍｌ、或いは、２７６μｇ／ｍｌ又は約２７６μｇ／ｍｌの濃度など）で存在する安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、前記シクロデキストリンが約５００倍モル過剰から約７００倍モル過剰までの対インターフェロンモル比で存在する安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００７９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、水溶液である安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００８０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、静菌剤（例えば、ベンジルアルコールなど）をさらに含む安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００８１】
別の好ましい実施形態において、本発明は、静菌剤をさらに含み、静菌剤が、０．１％又は約０．１％〜約２．０％の濃度（例えば、０．２％又は約０．２％或いは０．３％又は約０．３％の濃度など）を含めて、約０．１％〜約２％の濃度で存在する安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００８２】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、等張性剤がマンニトールであり、酸化防止剤がメチオニンであり、且つインターフェロンがインターフェロンβである安定化された液体医薬組成物を提供する。
【００８３】
別のさらなる好ましい実施形態において、本発明は、下記の液体製剤である安定化された液体医薬組成物を提供する：
【表４】
2007513925.tif 000005
【００８４】
別の実施形態において、本発明は、本発明による安定化された液体医薬組成物を調製するための方法を提供する。この場合、前記方法は、計算量の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、酸化防止剤及び等張性剤を緩衝化された溶液に加えること、及び、次いで、インターフェロン（ＩＦＮ）、或いはそのイソ型、ムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を加えることを含む。
【００８５】
別の実施形態において、本発明は、本発明による液体医薬製剤を含む、使用前の貯蔵のために無菌且つ適切な状態で密封された容器を提供する。そのような容器の例は、自己注射器用のバイアル又はカートリッジである。本発明による容器は単回投薬投与又は多回投薬投与のためのものである。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明は、単回投薬投与のための事前に充填されたシリンジである本発明による容器を提供する。
【００８７】
別の好ましい実施形態において、本発明は、本発明による医薬組成物の多回投薬投与のためのキットを提供する。この場合、キットは、本発明による医薬組成物により充填された第１の容器と、静菌剤の溶液の充填された第２のカートリッジとを含む。
【００８８】
好ましくは、製剤におけるＩＦＮ−βの濃度は１０μｇ／ｍｌ又は約１０μｇ／ｍｌ〜８００μｇ／ｍｌ又は約８００μｇ／ｍｌであり、より好ましくは、２０μｇ／ｍｌ又は約２０μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌ又は約５００μｇ／ｍｌであり、より特に好ましくは、３０μｇ／ｍｌ又は約３０μｇ／ｍｌ〜３００μｇ／ｍｌ又は約３００μｇ／ｍｌであり、最も好ましくは、４４μｇ／ｍｌ、８８μｇ／ｍｌ又は２６４μｇ／ｍｌ、或いは約４４μｇ／ｍｌ、約８８μｇ／ｍｌ又は約２６４μｇ／ｍｌである。
【００８９】
好ましくは、本発明の製剤は約３．０〜４．５又は約４．５の間のｐＨを有し、より好ましくは、３．８又は約３．８のｐＨである。好ましい緩衝剤は酢酸塩であり、好ましい対イオンはナトリウムイオン又はカリウムイオンである。酢酸塩生理的食塩水緩衝液がこの分野では広く知られている。溶液全体における緩衝剤濃度は、５ｍＭ又は約５ｍＭ、９．５ｍＭ又は約９．５ｍＭ、１０ｍＭ又は約１０ｍＭ、５０ｍＭ又は約５０ｍＭ、１００ｍＭ又は約１００ｍＭ、１５０ｍＭ又は約１５０ｍＭ、２００ｍＭ又は約２００ｍＭ、２５０ｍＭ又は約２５０ｍＭと、５００ｍＭ又は約５００ｍＭとの間で変化させることができる。好ましくは、緩衝剤濃度は１０ｍＭ又は約１０ｍＭである。特に好ましいものは、３．８のｐＨを有する、酢酸イオンが５０ｍＭの緩衝液である。
【００９０】
好ましくは、本発明の組成物において、酸化防止剤（例えば、メチオニン）は０．０１ｍｇ／ｍｌ又は約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ又は約５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、より好ましくは、０．０５ｍｇ／ｍｌ又は約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ又は約０．３ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し、最も好ましくは、０．１ｍｇ／ｍｌ又は約０．１の濃度で存在する。
【００９１】
好ましくは、液体製剤における等張性剤（例えば、マンニトール）の濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ又は約０．５ｍｇ／ｍｌ〜５００ｍｇ／ｍｌ又は約５００ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは、１ｍｇ／ｍｌ又は約１ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ又は約２５０ｍｇ／ｍｌであり、より特に好ましくは、１０ｍｇ／ｍｌ又は約１０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ又は約１００ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは、５０ｍｇ／ｍｌ又は約５０ｍｇ／ｍｌである。
【００９２】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、等張性剤がマンニトールであり、酸化防止剤がメチオニンであり、且つインターフェロンがインターフェロンβである本発明による組成物を提供する。
【００９３】
別の好ましい実施形態において、本発明は、液体組成物が下記である本発明による組成物を提供する：
【表５】
2007513925.tif 000006
【００９４】
本発明は液体製剤を包含する。好ましい溶媒は注射用水である。
【００９５】
液体製剤は単回投薬又は多回投薬であり得る。多回投薬のために意図される本発明のそのような液体インターフェロン製剤は、好ましくは、静菌剤、例えば、フェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンセトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサールを含む。特に好ましいものは、フェノール、ベンジルアルコール及びｍ−クレゾールであり、より好ましいものはベンジルアルコールである。静菌剤は、製剤を、１２時間又は約１２時間或いは２４時間又は約２４時間〜１２日又は約１２日（好ましくは、６日又は約６日〜１２日又は約１２日）までであり得る多回投薬の注射の期間を通して（注射のために好適である）本質的に細菌非含有で維持するために効果的である濃度をもたらす量で使用される。静菌剤は、好ましくは、０．１％又は約０．１％（静菌剤の質量／溶媒の質量）〜２．０％又は約２．０％の濃度で存在し、より好ましくは、０．２％又は約０．２％〜１．０％又は約１．０％の濃度で存在する。ベンジルアルコールの場合、０．２％又は０．３％の濃度が特に好ましい。
【００９６】
静菌剤はまた、単回投薬製剤にも存在させることができる。
【００９７】
本発明の製剤におけるインターフェロンの範囲は、再構成したとき、約１．０μｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度をもたらす量を包含する。だが、それよりも低い濃度及びより高い濃度を使用することができ、そのような濃度は、意図された送達ビヒクルに依存し、例えば、溶液製剤は、経皮パッチ、肺方法、経粘膜法、又は浸透圧ポンプ法若しくはマイクロポンプ法とは異なる。インターフェロン濃度は、好ましくは、５μｇ／ｍｌ又は約５μｇ／ｍｌ〜２ｍｇ／ｍｌ又は約２ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは、１０μｇ／ｍｌ又は約１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌ又は約１ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは、３０μｇ／ｍｌ又は約３０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ又は約１００μｇ／ｍｌである。
【００９８】
好ましくは、本発明の製剤は、２４ヶ月の期間を通して包装時におけるインターフェロン活性の少なくとも６０％又は約６０％（より好ましくは、少なくとも７０％又は約７０％、最も好ましくは、少なくとも８０％又は約８０％）を保持する。
【００９９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明は、前記のような液体医薬組成物を製造するための方法を提供する。
【０１００】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、有効成分と、前記のような賦形剤とを含む溶液を設置することを含む、包装された医薬組成物を製造するための方法を提供する。
【０１０１】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、前記のような医薬組成物を含むバイアルと、そのような溶液が最初の使用の後の２４時間又は約２４時間又はそれ以上の期間にわたって保持され得ることを述べる書面の媒体とを含む、ヒトでの薬学的使用のための製造物を提供する。好ましくは、書面の媒体は、溶液が１２日又は約１２日まで保持され得ることを述べる。
【０１０２】
多回投薬製剤の最初の使用の後、製剤は少なくとも２４時間又は約２４時間（好ましくは、４日又は約４日、５日又は約５日、或いは６日又は約６日、より好ましくは、１２日までの期間）保たれ、且つ使用することができる。製剤の最初の使用の後、製剤は、好ましくは、室温よりも低い温度（すなわち、２５℃又は約２５℃よりも低い温度）で、より好ましくは、１０℃又は約１０℃よりも低い温度で、より好ましくは、２℃又は約２℃〜８℃又は約８℃で、最も好ましくは、５℃又は約５℃で貯蔵される。
【０１０３】
本発明の製剤は、計算量の賦形剤を緩衝化された溶液に加えること、及び、次いで、インターフェロンを加えることを含むプロセスによって調製することができる。
【０１０４】
得られる溶液は、その後、バイアル、アンプル又はカートリッジに入れられる。このプロセスの様々な変法が当業者によって認識される。例えば、成分が加えられる順序、さらなる添加剤が使用されるかどうか、製剤が調製される温度及びｐＨはすべてが、使用される濃度及び投与手段のために最適化され得る因子である。
【０１０５】
多回投薬使用製剤の場合、静菌剤を、有効成分（インターフェロン）を含有する溶液に加えることができ、或いは別個のバイアル又はカートリッジにおいて保ち、その後、使用時に有効成分を含有する溶液に混合することができる。
【０１０６】
本発明の製剤は、認められているデバイスを使用して投与することができる。このような単回バイアルシステムを含む例には、溶液を送達するための自己注射器デバイス又はペン型注射器デバイス（例えば、Ｒｅｂｉｊｅｃｔ（登録商標）など）が含まれる。
【０１０７】
現時点で特許請求される製造物は包装材を含む。包装材は、規制当局により要求される情報に加えて、製造物が使用され得る条件を提供する。本発明の包装材は、最終的な溶液を調製し、且つ２つのバイアルの（湿潤／乾燥）製造物について２４時間又はそれ以上の期間にわたってそのような最終的な溶液を使用するために、必要ならば、患者への指示を提供する。単回バイアルの溶液製造物については、表示は、そのような溶液が２４時間又はそれ以上の期間にわたって使用され得ることを示す。現時点で特許請求される製造物は、ヒトでの医薬製造物の使用のために有用である。
【０１０８】
安定な保存された製剤は透明な溶液として患者に与えることができる。溶液は単回使用のためのものであり得るか、或いは多数回再使用することができ、且つ患者処置の１回又は多数回のサイクルのために十分であり得るし、したがって、現在利用可能であるよりも好都合な処置療法を提供する。
【０１０９】
本明細書中に記載される安定な、又は保存された製剤又は溶液のいずれかにおけるインターフェロンは、この分野で広く知られているように、ＳＣ注射又はＩＭ注射；当業者により理解される経皮的手段、肺手段、経粘膜手段、インプラント手段、浸透圧ポンプ手段、カートリッジ手段、マイクロポンプ手段、経口的手段又は他の手段を含む様々な送達方法によって、本発明に従って患者に投与することができる。
【０１１０】
用語「バイアル」は、広義には、含有される無菌状態において固体形態又は液体形態でインターフェロンを保持するために好適な入れ物を示す。本明細書中において使用されるようなバイアルの例には、シリンジ、ポンプ（浸透圧ポンプを含む）、カテーテル、経皮パッチ、肺スプレー又は経粘膜スプレーによってインターフェロンを患者に送達するために好適なアンプル、カートリッジ、ブリスターパッケージ、又は他のそのような入れ物が含まれる。非経口投与、肺投与、経粘膜投与又は経皮投与のための製造物を詰めるために好適な様々なバイアルがこの分野では広く知られており、また認められている。
【０１１１】
用語「処置」は、本発明の関連では、疾患発症後の病理学的発達の弱化、減少、低下又は軽減をはじめとする、疾患の進行に対する任意の有益な効果を示す。
【０１１２】
ＩＦＮ、或いはそのイソ型、ムテイン、誘導タンパク質、機能的誘導体、活性な分画物、又は塩を含む本発明の医薬組成物は、このポリペプチドによる治療に応答し得る臨床的適応症の診断、防止及び処置（局所的又は全身的）のために有用である。そのような臨床的適応症には、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）、脳及び／又は脊髄の障害又は疾患（これには、多発性硬化症が含まれる）；自己免疫疾患（これには、リウマチ様関節炎、乾癬、クローン病が含まれる）；及びガン（これには、乳ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン及び結腸ガンが含まれる）が含まれる。
【０１１３】
一実施形態において、本発明は、中枢神経系（ＣＮＳ）、脳及び／又は脊髄を冒す障害又は疾患（これには、多発性硬化症が含まれる）；自己免疫疾患（これには、リウマチ様関節炎、乾癬、クローン病が含まれる）；及びガン（これには、乳ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン及び結腸ガンが含まれる）を処置するための医薬製剤の調製のための、本発明の組成物の使用を含む。
【０１１４】
別の実施形態において、本発明は、その必要性のある患者において本発明の組成物の投与を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）、脳及び／又は脊髄を冒す障害又は疾患（これには、多発性硬化症が含まれる）；自己免疫疾患（これには、リウマチ様関節炎、乾癬、クローン病が含まれる）；及びガン（これには、乳ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン及び結腸ガンが含まれる）を処置する方法を提供する。
【０１１５】
本発明の別の実施形態において、本発明の組成物は、中枢神経系（ＣＮＳ）、脳及び／又は脊髄を冒す障害又は疾患（これには、多発性硬化症が含まれる）；自己免疫疾患（これには、リウマチ様関節炎、乾癬、クローン病が含まれる）；及びガン（これには、乳ガン、前立腺ガン、膀胱ガン、腎臓ガン及び結腸ガンが含まれる）を処置するのに有用である。
【０１１６】
本明細書中で引用されるすべての参考文献（雑誌の論文又は要約、公開又は非公開の米国特許出願又は外国特許出願、発行された米国特許又は外国特許、或いは任意の他の参考文献を含む）は、引用された参考文献に示されるすべてのデータ、表、図及び本文を含めて、全体が参考として本明細書中に組み込まれる。加えて、本明細書中で引用される参考文献において引用される参考文献の全内容もまた、全体が参考として組み込まれる。
【０１１７】
知られている方法工程、従来の方法工程、知られている方法又は従来の方法に対する参照は、本発明の任意の局面、記載又は実施形態が関連技術分野おいて開示、教示又は示唆されることを決して承認するものではない。
【０１１８】
具体的な実施形態の前記記載は本発明の一般的な特質を十分に明らかにするものであるので、他の実施形態では、この技術分野の技能における知識（本明細書中で引用される参考文献の内容を含む）を適用することによって、過度な実験を行うことなく、また、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、そのような具体的な実施形態を様々な適用のために容易に改変及び／又は適合化することができる。したがって、そのような適合化及び改変は、本明細書中に示される教示及び指針に基づいて、開示された実施形態の様々な均等物の意味に含まれることが意図される。本明細書中における表現法又は用語法は、本明細書の用語法又は表現表が、当業者の知識との組合せで、本明細書中に示される教示及び指針に照らして当業者によって解釈され得るように、記述のためであって、限定のためでないことを理解しなければならない。
【実施例】
【０１１９】
下記の略号はそれぞれ下記の定義を示す：
ｃｍ（センチメートル）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｍｉｎ（分）、ｍＭ（ミリモル濃度）、ｍＬ（ミリリットル）、ｎｍ（ナノメートル）、ＢＨＴ（ブチル化ヒドロキシトルエン）、ＣＤ（円二色性）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＨＰＢＣＤ（ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＩＦＮ（インターフェロン）、ＩＭ（筋肉内）、ＯＤ（光学濃度）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＲＭＢＣＤ（ランダム置換されたメチル−β−シクロデキストリン）、ＳＣ（皮下）、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）、ＴＲＩＳ（２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）、ＵＶ（紫外）、ＷＦＩ（注射用水）。
【０１２０】
方法
比濁法測定
タンパク質の凝集を、ＵＶ可視分光光度計システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ４０）を使用して３６０ｎｍにおいて３０分間モニターした。
【０１２１】
予備研究により、タンパク質が適切な凝集挙動を示す操作条件を確立した。すなわち、ポリプロピレンバイアルにおける、ＰＢＳでの３０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ１０，０００の溶液（０．２μｍφでろ過）による１：２でのインターフェロンβ−１ａバルクの希釈、その後、Ｔ＝６２±２℃での１０分間の恒温水浴におけるインキュベーション。
【０１２２】
加熱及びＰＥＧを、タンパク質会合プロセスを熱変性及び排除体積効果によりそれぞれ高めるために使用した。ＵＶ可視分析を、３ｍＬのサンプル体積を含有するセルにおいて行った（最終的なインターフェロンβ−１ａの濃度＝０．１１６ｍｇ／ｍＬ）。
【０１２３】
それぞれの濁度分析を少なくとも三連で繰り返し、光学濃度（ＯＤ）３６０ｎｍ対時間の平均曲線を報告する。タンパク質単独の凝集を種々の濃度での賦形剤の存在下におけるインターフェロンβ−１ａと比較した。
【０１２４】
円二色性測定
ＣＤ測定を、ペルチェ温度コントローラーを備えたＪａｓｃｏ  Ｊ８１０分光旋光計を用いて行った。サンプルを栓付きの１ｃｍ石英セルに含有し、熱走査のために、磁石による撹拌速度は約１５０ｒｐｍであった。
【０１２５】
遠ＵＶスペクトル（２６０〜１８５ｎｍ）のために、約４４μｇ／ｍｌのタンパク質濃度、０．２ｎｍの分解能、及び、２秒の応答時間を伴う２ｎｍ／分の走査速度、並びに３回の積算を用いた。
【０１２６】
インターフェロンβ−１ａの二次構造の熱的摂動をモニターするために、温度の関数としての２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルを、１℃／分の温度上昇速度及び６０秒の遅延時間を使用して０．２℃の間隔で２５℃〜８５℃の間で追跡した。
【０１２７】
それぞれの測定を、コントロールとしてのインターフェロンβ−１ａバルクに対して、また、種々の濃度の賦形剤を含有するインターフェロンβ−１ａ溶液に対して少なくとも三連で行った。
【０１２８】
サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｃ）分析
安定性研究の所定の時点での液体インターフェロンβ−１ａ製剤を、インターフェロンβ−１ａの純度及びアッセイ（回収％として表される）を明らかにするためにＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０１２９】
使用した操作条件は下記の通りであった：
・クロマトグラフィーカラム：ＴＳＫ  Ｇ２０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍＩＤｘ３０ｃｍ、５μ、１２５Å）；
・注入体積：１００μＬ；
・カラム温度：室温；
・サンプル温度：室温；
・流速：０．５ｍＬ／分；
・移動相：７０％（ｖ／ｖ）精製水（ＭＩＬＬＩＱ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）−３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル−０．２％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ；
・処理時間：２７分；
・平衡時間：３分；
・波長：２１４ｎｍ；
・校正曲線を、２５μｇから１００μｇまでの範囲で、インターフェロンβ−１ａアッセイを定量するために用いた。
【０１３０】
材料
・インターフェロンβ−１ａバルク（Ｓｅｒｏｎｏ  Ｓ．Ａ．、バッチ：Ｇ４Ｄ０２４）
・ＰＥＧ１００００（ポリエチレングリコール）
・Ｌｕｔｒｏｌ  Ｆ６８（ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロック共重合体）
・Ｌ−メチオニン
・Ｄ−マンニトール
・Ｌ−アスコルビン酸
・リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４±０．１）（組成：ＫＨ２ＰＯ４、０．１９ｇ／Ｌ；Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．３８ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ、８ｇ／Ｌ）
・ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン
【０１３１】
装置
・ＴＳＫカラムＧ２０００を備えたＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ及びＰＥ）
・ＵＶ可視分光光度計システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ４０）
・ペルチェ温度コントローラーを備えたＪａｓｃｏ  Ｊ８１０分光旋光計
・浸透圧計（ＯＳＭＯＭＡＴ  ０３０Ｄ、Ｇｏｎｏｔｅｃｈ）
・ｐＨ−電導度計ＭＰＣ２２７−Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ
・分析天秤ＡＧ２４５及びＡＧ２８５（Ｍｅｔｔｌｅｒ  Ｔｏｌｅｄｏ）
・校正済みのピペット（Ｇｉｌｓｏｎ）
・磁石式撹拌装置ホットプレート（Ｓｔｕａｒｔ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
・超音波浴、Ｆａｌｃ
・温度計
【０１３２】
結果及び考察
比濁法アッセイ
濁度法によって検出される、ＨＰＢＣＤ、マンニトール及びＬ−メチオニンのインターフェロンβ−１ａ凝集に対する影響を下記に報告する。アスコルビン酸ナトリウムの塩もまた、凝集増強作用を有する賦形剤の例として含められる。
【０１３３】
図１は、下記の種々の濃度のＨＰＢＣＤの存在下におけるインターフェロンβ−１ａの凝集速度論を示す：１．１９ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１５０倍モル過剰）、３．９７ｍｇ／ｍＬ（５００倍モル過剰）、５．５６ｍｇ／ｍＬ（７００倍モル過剰）、及び、７．９４ｍｇ／ｍＬ（１０００倍モル過剰）。調べられた濃度範囲において、この賦形剤はインターフェロンβ−１ａの脱安定化を完全には回避しないこと、及び、中間のモル比率が最も良い阻害効果を示すことを認めることができる。
【０１３４】
７００倍モル過剰を、インターフェロンβ−１ａ製剤の調製及びさらなる物理化学的特長づけ（例えば、円二色性）のための基準濃度として選んだ。シクロデキストリンの濃度は、濃度が、調製で使用されたインターフェロンβ−１ａの量に依存して変化し、且つそれに従って計算され得るので、インターフェロンβ−１ａに対するモル比（倍モル過剰）としてより良好には表される。
【０１３５】
その後、インターフェロンβ−１ａの凝集に対するマンニトールの影響をモニターしたが、図２に示されるように、著しい影響が、使用した条件（ＰＥＧ／ＰＢＳでの６２℃）のもとでの４０，０００倍モル過剰（これは３７．３５ｍｇ／ｍＬに対応する）でさえ、見出されなかった。
【０１３６】
しかし、マンニトールを、非経口投与のために必要な等張性に達するためにインターフェロンβ−１ａ液体製剤に加えた。
【０１３７】
最後に、Ｌ−メチオニンを比濁法実験で調べた。図３は、種々の濃度のＬ−メチオニンの存在下でのインターフェロンβ−１ａの凝集速度論を示す（０．１１６ｍｇ／ｍＬ、ＰＥＧ／ＰＢＳ中、６２±２℃で１０分間のインキュベーションの後）。
【０１３８】
Ｌ−メチオニンは、タンパク質凝集に対して、ＨＰＢＣＤよりも小さい阻害効果を有することを認めることができる。調べられた最大濃度でさえ、Ｌ−メチオニンはインターフェロンβ−１ａの脱安定化を完全には回避せず、曲線は、インターフェロンβ−１ａコントロールと類似する「プラトー状態」に達している。
【０１３９】
図４には、インターフェロンβ−１ａ単独、並びに４００倍モル過剰のメチオニン（０．３０８ｍｇ／ｍＬ）及び／又は７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤ（５．５６ｍｇ／ｍＬ）の存在下でのインターフェロンβ−１ａの凝集速度論が報告される。
【０１４０】
この実験は、これら２つの賦形剤のインターフェロンに対する相乗作用を最終的には評価するために行われた。メチオニンが、シクロデキストリンの活性に加えて、タンパク質凝集に対する保護作用を全く発揮しないことが明らかである。
【０１４１】
上記検討の後、ＨＰＢＣＤが、凝集に対するインターフェロンβ−１ａの安定化において大きな役割を果たしていることが確認され、タンパク質とシクロデキストリンとの間での相互作用を円二色性によってさらに調べた。
【０１４２】
図５におけるタンパク質凝集に対する「負の作用」を有する賦形剤の例として、種々の濃度のアスコルビン酸塩の存在下でのインターフェロンβ−１ａの濁度速度論が報告される。
【０１４３】
６２±２℃での１０分間のインキュベーションの後におけるＰＥＧ／ＰＢＳ中でのインターフェロンβ−１ａ（０．１１６ｍｇ／ｍＬ；５．１６μＭ）の凝集に対する、５０倍モル過剰（０．０４５ｍｇ／ｍＬ）、１５０倍モル過剰（０．１３６ｍｇ／ｍＬ）、５００倍モル過剰（０．４５３ｍｇ／ｍＬ）及び１０，０００倍モル過剰（９．０７ｍｇ／ｍＬ）のＬ−アスコルビン酸塩の影響を図５に示す。
【０１４４】
タンパク質凝集に対する影響が濃度依存的な様式で変化することを認めることは興味深いことである。高濃度では、負荷電が脱安定化作用を示すようであり、一方で、より低いモル比では、この賦形剤は阻害的影響を有するようである。
【０１４５】
しかし、タンパク質凝集を妨げると考えられる濃度（０．４５３ｍｇ／ｍＬ、これは、５００に等しい賦形剤／インターフェロンβ−１ａモル比に対応する）を特定することが可能であった。
【０１４６】
その後、アスコルビン酸塩を、その酸化防止作用を特異的な抗凝集作用と組み合わせる目的により、インターフェロンβ−１ａ製剤のための可能な賦形剤として選んだ。
【０１４７】
円二色性
図６には、２５℃〜８５℃の間での熱誘導によるアンフォールディング、及び、インターフェロンβ−１ａバルクサンプル（約４４μｇ／ｍＬ）の遠ＵＶスペクトルが報告される。推定されるＴｍ値が６４．９７±０．３１℃であり、一方、スペクトル解析では、変性前及び変性後のα−らせん含有量における顕著な違い（例えば、それぞれ４８．０％対４１．２％など）が示されることを認めることができる。
【０１４８】
比較として、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含有する類似したサンプルを、インターフェロンβ−１ａのモル量に対して７００倍のモル過剰（これは、タンパク質凝集が比濁法実験において部分的に阻害される濃度である）において円二色性によって分析した。図７には、熱変性曲線が、約４４μｇ／ｍＬのインターフェロンβ−１ａ及び２．１１ｍｇ／ｍＬのＨＰＢＣＤ（７００倍モル過剰）を含有する溶液について報告される。推定される融解温度値は６５．４６±０．５０℃であり、これは、同じ操作条件でのタンパク質単独に関する値（６４．９７℃）と一致していた（図５を参照のこと）。
【０１４９】
タンパク質の融解温度は、試験された添加剤の存在下では一定しているが、熱的アンフォールディングの可逆性は非常に異なっている。ＨＰＢＣＤの存在下では、変性前の状況と、変性後の状況との間でのインターフェロンβ−１ａのα−らせんの差が明らかにより小さいこと（約４％の差、対して、タンパク質単独については約７％）を認めることができる。このことは、シクロデキストリンがインターフェロンβ−１ａの不可逆的反応（例えば、アンフォールディング後の熱誘導による凝集など）を妨げているかもしれないか、又はタンパク質のリフォールディングを助けているかもしれないことを示唆している。アンフォールディングを可逆的にする配合組成物を見出すことは、実際、長期間の安定性（貯蔵寿命）のためには、融解温度を上昇させることよりも重要であり得るので、これらの観測結果は非常に興味深いものである（Ａｒａｋａｗａ他、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、４６（１−３）：３０７〜３２６（２００１）もまた参照のこと）。
【０１５０】
インターフェロンβ−１ａとアスコルビン酸ナトリウム塩との相互作用をより良く特徴づけるために、ＣＤ分析を、５００倍モル過剰のアスコルビン酸塩を含有するインターフェロンβ−１ａサンプルについて行った。実際、速度論的濁度研究では、アスコルビン酸塩−インターフェロンβ−１ａ溶液は、５００に等しいモル比では、タンパク質凝集を全く示さなかったことが明らかにされた。
【０１５１】
図８には、インターフェロンβ−１ａ（約４４μｇ／ｍＬ）単独、及び、５００倍モル過剰のアスコルビン酸塩（０．１９４ｍｇ／ｍＬ）の存在下でのインターフェロンβ−１ａ（約４４μｇ／ｍＬ）のＣＤシグナル（２２２ｎｍ）に対する温度の影響が示される。アスコルビン酸塩を含有するサンプルの場合、Ｔｍ値を推定するために実験曲線を近似することができなかった。このことは、タンパク質に対するこの賦形剤の変性作用を示唆している。
【０１５２】
実際、融解転移の前後における上記サンプルの二次構造の比較により、融解前の状況において既に存在するα−らせんの非常に低い残留が確認された：例えば、３５．０（同じ条件でのインターフェロンβ−１ａバルクの４８．０に対して）。インターフェロンβ−１ａの二次構造は、融解転移後、アスコルビン酸塩の存在によってさらに一層変化し、２８．８％に低下した（図９を参照のこと）。
【０１５３】
この結果は、比濁法で示された保護的作用とは対照的であり、アスコルビン酸塩が、タンパク質を時間とともに脱安定化させ得るインターフェロンβ−１ａの立体配座的変化を誘導しているかもしれないことを示唆している。この理由のために、アスコルビン酸ナトリウムを含有する液体製剤を調製し、２５℃での安定性を保ち、所定の時点でＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０１５４】
安定性研究
上記結果の後、表１及び表２に示される組成を有する２つのインターフェロンβ−１ａ液体製剤を調製し、ＦＯＲＭ１の場合には２５℃及び５０℃で、ＦＯＲＭ２の場合には２５℃で一定時間保った。
【０１５５】
コントロールとして、インターフェロンβ−１ａバルク（同じ組成で酢酸塩緩衝液において５０ｍＭ）もまた調べた。
【０１５６】
【表６】
2007513925.tif 000007
【０１５７】
【表７】
2007513925.tif 000008
【０１５８】
安定性研究からのサンプルを、方法の節で記載されたようにＳＥ−ＨＰＬＣによって分析した。結果を、表３（ＦＯＲＭ１）、表４（ＦＯＲＭ２）及び表５（インターフェロンβ−１ａバルク／コントロール）に報告する。
【０１５９】
【表８】
2007513925.tif 000009
【０１６０】
【表９】
2007513925.tif 000010
【０１６１】
【表１０】
2007513925.tif 000011
【０１６２】
表３における結果から、ＨＰＢＣＤを含有するインターフェロンβ−１ａ液体製剤が２５℃及び５０℃で１ヶ月にわたって安定であることを明らかに認めることができる。凝集レベルは非常に低く、モノマー含有量は５０℃で１週間後でさえ９０％を超えている。加えて、質量回収は９０％を超えている。このことはまた、不溶性凝集物の形成がシクロデキストリンの存在によって最小限に抑えられていることを示している。
【０１６３】
比較において、インターフェロンβ−１ａバルク単独は、両方の検討された温度（表５を参照のこと）で凝集する傾向を有する：５０℃では、１週間後、モノマー含有量は８３％に低下し、同時に、質量回収は約７３％でしかなかった。
【０１６４】
後者の結果は、インターフェロンβ−１ａの凝集及び立体配座的安定性に対するＨＰＢＣＤの有益な効果を示唆する比濁法及び円二色性の測定と一致している。
【０１６５】
最後に、ＦＯＲＭ２（これはアスコルビン酸塩を含む）に関連する表４に示される結果は、この製剤が２５℃において安定でないことを示している。ダイマー及び凝集物の著しい増大、並びに質量回収の並行した低下が２５℃で１ヶ月後に記録された。さらに、不明のピークがクロマトグラムに現れ、このことは、ＣＤの結果によってもまた示唆されるように、おそらくは変化した立体配座が存在することを示唆している。このことが、アスコルビン酸塩を含有する製剤の安定性がより高い温度（例えば、５０℃）では発揮されなかった理由であった。
【０１６６】
後者の場合、比濁法分析により得られたこの最初の有望な結果を、タンパク質の立体配座的安定性に対する既知の賦形剤の影響をモニターすることができる円二色性などの代わりの方法を用いて確認することが重要であった。
【０１６７】
より高いｐＨでの比濁法アッセイ
液体製剤のより広いｐＨ範囲（すなわち、約３．０〜約４．０のｐＨ）におけるＨＰＢＣＤのインターフェロンβ−１ａ凝集に対する影響を調べた。
【０１６８】
この方法は、本質的には、以前に記載された比濁法アッセイであった。すなわち、インターフェロンβ−１ａバルクを、ＰＢＳにおける３０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ１０，０００の溶液（０．２μｍφでろ過され、少量の１Ｎ  ＮａＯＨを加えることによって適正に塩基性にされたもの）により１：２で希釈し、その後、Ｔ＝６２±２℃で１０分間、恒温水浴においてインキュベーションした。タンパク質凝集を、ＵＶ可視分光光度計システム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌａｍｂｄａ４０）を使用して３６０ｎｍにおいて３０分間モニターした。それぞれの濁度分析を二連で繰り返した。光学濃度（ＯＤ）３６０ｎｍ対時間の平均曲線を報告する。タンパク質単独の凝集をシクロデキストリンの存在下でのインターフェロンβ−１ａと比較した。
【０１６９】
ＰＢＳによる１：１での５０ｍＭ酢酸塩緩衝液（すなわち、ＩＦＮバルクの媒体）の希釈は４．４の最終溶液ｐＨをもたらす。したがって、この目的は、より高い最終ｐＨについてタンパク質凝集を調べることであった。
【０１７０】
図１０は、７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤ（５．５６ｍｇ／ｍＬ）の非存在下及び存在下でのインターフェロンβ−１ａの凝集速度論を示す（この場合、分析された溶液のｐＨは室温で４．７に等しい）。
【０１７１】
ｐＨの増大はＩＦＮの凝集の程度を高めるが、シクロデキストリンの存在はタンパク質の脱安定化を依然として部分的に阻害することを認めることができる。この実験について計算された相対的なパーセントＯＤ（すなわち、賦形剤の存在下及び非存在下での３０分後のＯＤ３６０ｎｍのパーセント比率）は６６％であり、より低いｐＨでの通常的な操作条件で観測された値（５２．７％）と大きく異なっていない。
【０１７２】
研究を、図１１に示されるように、より高いｐＨ（すなわち、５．１）に拡大した。ＩＦＮの凝集に対する、７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤ（５．５６ｍｇ／ｍＬ）及び５００倍モル過剰のＲＭＢＣＤ（３．３８ｍｇ／ｍＬ）の影響を調べた。ｐＨの増大に起因したより顕著なタンパク質の脱安定化、及び、速度論的傾向がほぼ完全に存在しないこと（すなわち、分析開始時におけるプラトー領域）を認めることができる。注目される発見は、ＩＦＮの凝集がシクロデキストリンの存在によって依然として部分的に阻害され、相対的なパーセントＯＤがＨＰＢＣＤの場合における６９．７％に等しいことである（この場合、利点をメチル誘導体の使用によって何ら認めることができない）。
【０１７３】
第３のｐＨ値を調べた。図１２は、ｐＨ５．７でのＰＥＧ／ＰＢＳにおけるＩＦＮの凝集速度論、及び、７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤの添加の影響を示す。この賦形剤はタンパク質の脱安定化を回避しないが、ＩＦＮのコントロールに対して、その程度を著しく低下させる（６２．５％の相対的なパーセントＯＤ）。
【０１７４】
上記の検討は、安定化賦形剤としてのＨＰＢＣＤの使用が、タンパク質バルクよりも高いｐＨ（すなわち、ｐＨ３．８±０．５）での液体製剤に拡大され得ることを示している。
【０１７５】
結論
・いくつかのインターフェロンβ−１ａ液体製剤を調製し、室温（２５℃）及び加速条件（５０℃）での安定性を保った。
・最も安定な製剤は、Ｌ−メチオニン、ＨＰＢＣＤ及びマンニトールを含有する。ＳＥ−ＨＰＬＣの結果は、モノマー含有量が５０℃で１週間後又は２５℃で１ヶ月後において９０％を超えていることを示している。
・ＨＰＢＣＤの好ましい結果が予測され、インターフェロンβ−１ａ凝集に対するこの賦形剤（及び、部分的には同様に、Ｌ−メチオニン）の濃度依存的な阻害作用を示した比濁法測定によって確認された。さらに、ＣＤ分析は、ＨＰ−β−シクロデキストリンの存在下では、融解転移後におけるインターフェロンβ−１ａのα−らせんの喪失が明らかに小さいことを示した。
・インターフェロンβ−１ａバルクは、同じ貯蔵条件で保たれたとき、異なる安定性プロフィルを示す。モノマー含有量が５０℃で１ヶ月後において８３％に低下した。
注目すべきことに、２５℃では、１ヶ月後におけるモノマー含有量は依然として９７％に等しく、これは驚くほど高い。この結果は、バルクがｐＨ３．８での酢酸塩緩衝液を含有するという事実によって説明することができる。この条件は、それ自体が、インターフェロンβ−１ａに対するある程度の安定化作用を有する。
・安定性研究における明らかな負の結果が、アスコルビン酸塩を含有する製剤に関して見出された。ＳＥＣにより、２５℃で１ヶ月後において（６０％への）顕著なモノマー喪失が示される。同時に、インターフェロンβ−１ａの立体配座に対する負の影響もまたＣＤ分析によって示された。
【０１７６】
薬学的製造
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液の調製
１Ｍ水酸化ナトリウムの溶液をＷＦＩにおいて調製した。
【０１７７】
０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．８）（１００ｍＬ）の調製
８０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を含有するメスフラスコにおいて、０．２８６ｍＬの酢酸（氷酢酸）を加え、振とう後、０．５００ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨを加え、水を１００ｍＬまで加える：ｐＨ＝３．８±０．０５。
【０１７８】
賦形剤溶液の調製
酢酸塩緩衝液におけるＨＰＢＣＤ及びＬ−メチオニンの高濃度（１０倍）溶液をポリプロピレン製メスフラスコにおいて調製する。
【０１７９】
ポリプロピレン製フラスコにおいて、５ｇのマンニトールを含有する適量の５０ｍＭ酢酸塩緩衝液を加える。溶液を、３回ひっくり返すことによって均一にする。
【０１８０】
薬物溶液の配合
必要量Ｂ（ｇ）のインターフェロンβ−１ａ薬物を必要量の賦形剤溶液Ｖ（ｇ）に加え、穏やかに撹拌して均一にする。
【０１８１】
シリンジの充填
１ｍｌのガラス製シリンジに０．５ｍｌの最終溶液を無菌的に充填することができる。
【０１８２】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】下記の種々の濃度のＨＰＢＣＤの存在下での、６２±２℃で１０分間のインキュベーションの後におけるＰＥＧ／ＰＢＳ中でのインターフェロンβ−１ａ（０．１１６ｍｇ／ｍＬ；５．１６μＭ）の凝集速度論を示す図である：１．１９ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１５０倍モル過剰）、３．９７ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して５００倍モル過剰）、５．５６ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して７００倍モル過剰）、及び、７．９４ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１０００倍モル過剰）。Ｙ軸には、比濁法に正比例する３６０ｎｍで測定された光学濃度が報告される（Ｃａｎｃｅｌｌｉｅｒｉ他、ＢＩＯＰＯＬＹＭＥＲＳ、ＶＯＬ．１３、７３５〜７４３、１９７４）。
【図２】ＰＢＳ／ＰＥＧ１００００における（６２±３℃で１０分間のインキュベーションの後での）０．１１６ｍｇ／ｍＬ（５．１μＭ）のインターフェロンβ−１ａの凝集に対する１０，０００倍モル過剰、２０，０００倍モル過剰及び４０，０００倍モル過剰のマンニトールの影響を示す図である。
【図３】下記の種々の濃度のＬ−メチオニンの存在下におけるインターフェロンβ−１ａの凝集速度論を示す図である：０．０７７ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１００倍モル過剰）、０．１５８ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して２０５倍モル過剰）、０．３０８ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して４００倍モル過剰）、０．７６９ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１０００倍モル過剰）、及び、７．６９ｍｇ／ｍＬ（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１００００倍モル過剰）。
【図４】インターフェロンβ−１ａ単独、並びにインターフェロンβ−１ａのモル量に対して４００倍モル過剰のメチオニン（０．３０８ｍｇ／ｍＬ）及び／又はインターフェロンβ−１ａのモル量に対して７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤ（５．５６ｍｇ／ｍＬ）の存在下でのインターフェロンβ−１ａの凝集速度論を示す図である。
【図５】６２±２℃で１０分間のインキュベーションの後におけるＰＥＧ／ＰＢＳ中でのインターフェロンβ−１ａ（０．１１６ｍｇ／ｍＬ；５．１６μＭ）の凝集に対する、インターフェロンβ−１ａのモル量に対して５０倍モル過剰のＬ−アスコルビン酸塩（０．０４５ｍｇ／ｍＬ）、インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１５０倍モル過剰のＬ−アスコルビン酸塩（０．１３６ｍｇ／ｍＬ）、インターフェロンβ−１ａのモル量に対して５００倍モル過剰のＬ−アスコルビン酸塩（０．４５３ｍｇ／ｍＬ）、及び、インターフェロンβ−１ａのモル量に対して１００００倍モル過剰のＬ−アスコルビン酸塩（９．０７ｍｇ／ｍＬ）の影響を示す図である。
【図６】インターフェロンβ−１ａバルク（約４４μｇ／ｍＬ）の熱変性（すなわち、２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルに対する温度の影響）を図の上側に、融解転移の前（実線）及び融解転移の後（破線）での相対的なＣＤスペクトルを図の下側に示す図である。以降、それぞれのＣＤＮＮ（円二色性ニューラルネットワーク）解析（４回の分析の平均）を報告する。注：融解転移曲線又は熱変性は２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルに対する温度の影響を表す。すべてのＣＤグラフはＹ軸にモル楕円率をｄｅｇＭ−１ｃｍ−１（Ｙ軸）として有する。表において、２００ｎｍ〜２６０ｎｍの範囲におけるαらせんの残留が、融解前／融解後のＣＤＮＮ解析（４回の分析の平均）におけるＩＦＮの立体配座的安定性の比較のために検討されている。
【図７】インターフェロンβ−１ａ（約４４μｇ／ｍＬ）及びＨＰＢＣＤ（２．１１ｍｇ／ｍＬ）（インターフェロンβ−１ａのモル量に対して７００倍モル過剰）を含有する溶液についての熱変性曲線、すなわちモル楕円率（ｄｅｇＭ−１ｃｍ−１）として表される２２２ｎｍにおけるＣＤシグナルに対する温度の影響を、タンパク質単独（破線）と比較して図の上側（実線）に、融解転移の前（実線）及び融解転移の後（破線）での相対的なＣＤスペクトルを図の下側に示す図である。以降、それぞれのＣＤＮＮ（円二色性ニューラルネットワーク）解析（４回の分析の平均）を報告する。
【図８】インターフェロンβ−１ａ単独（破線の曲線）、及び、インターフェロンβ−１ａのモル量に対して５００倍モル過剰のＬ−アスコルビン酸Ｎａの存在下でのインターフェロンβ−１ａ（実線の曲線）の熱変性を示す図である。
【図９】融解転移の前（実線の曲線）及び融解転移の後（破線の曲線）でのＣＤスペクトル［インターフェロンβ−１ａ／アスコルビン酸塩、５００倍］及びそれぞれのＣＤＮＮ解析（上記参照）を示す図である。
【図１０】６２±２℃で１０分間のインキュベーションの後におけるＰＥＧ／ＰＢＳ（最終ｐＨ＝４．７）中でのインターフェロンβ−１ａ（０．１１６ｍｇ／ｍＬ；５．１６μＭ）の凝集速度論、及び、７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤ（５．５６ｍｇ／ｍＬ）の影響を示す図である。Ｙ軸には、比濁法に正比例する３６０ｎｍで測定された光学濃度が報告される。
【図１１】６２±２℃で１０分間のインキュベーションの後におけるＰＥＧ／ＰＢＳ（最終ｐＨ＝５．１）中でのインターフェロンβ−１ａ（０．１１６ｍｇ／ｍＬ；５．１６μＭ）の凝集速度論、並びに７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤ（５．５６ｍｇ／ｍＬ）及び５００倍モル過剰のＲＭＢＣＤ（３．３８ｍｇ／ｍＬ）の影響を示す図である。
【図１２】６２±２℃で１０分間のインキュベーションの後におけるＰＥＧ／ＰＢＳ（最終ｐＨ＝５．７）中でのインターフェロンβ−１ａ（０．１１６ｍｇ／ｍＬ；５．１６μＭ）の凝集速度論、及び、７００倍モル過剰のＨＰＢＣＤ（５．５６ｍｇ／ｍＬ）の影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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