(57)【要約】  脂質膜に対してより安定した結合を形成することができ、これによって、オリゴヌクレオチドリンカーが脂質膜に導入される工程の制御に改善を生じさせるオリゴヌクレオチド構造物が提供される。脂質小胞を含む、脂質膜オリゴヌクレオチド付着を形成する方法が提供される。一般的に、オリゴヌクレオチドは、脂質膜に付着していることができる２つ以上の疎水性のアンカー部分を含む。該部分は、オリゴヌクレオチドの末端に付加されるか、または、第１鎖と第２鎖が２重鎖を形成している場合には、一方の鎖の同じ側の末端に付加され、２重鎖の一部を成していない他方の末端は自由なまま別の鎖とハイブリダイズできるようになっていることが可能である。オリゴヌクレオチドを付着させている脂質小胞は、バイオセンサーに使用することができ、膜タンパク質を含むことが可能である。
2007525500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質膜に付着することができる疎水性アンカー部分を少なくとも２個含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記疎水性アンカー部分がその末端に存在する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
核酸の第１および第２の鎖を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記２つの鎖が、第１鎖の末端が２重鎖区画の一部ではなく、及び疎水性アンカー部分から自由な形で、前記２重鎖区画において互いにハイブリダイズしている、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
２つの疎水性アンカー部分が、前記第１および第２の鎖の末端に隣接して共有結合している、請求項２または３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ｎ＞０の整数であるｎ、それぞれが末端に疎水性アンカー部分を備えた追加の鎖であって、第１の追加鎖が前記第２の鎖にハイブリダイズし、第２の追加鎖が第１の追加鎖にハイブリダイズし、第ｎ鎖が第（ｎ−１）鎖にハイブリダイズする前記追加の鎖を含む、請求項３または４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
第１および第２の鎖を含む請求項２に記載のオリゴヌクレオチドであって、前記２つの鎖が、第１の鎖が自由に第３の鎖とハイブリダイズできるような形で２重鎖区画において互いにハイブリダイズしている、前記オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記第１の鎖が、両末端に疎水性アンカー部分を有する、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記第３の鎖が末端に疎水性アンカー部分を有して、第１および第３の鎖が隣接する疎水性アンカー部分を有する、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
疎水性アンカー部分が、ステロイド、脂肪酸、疎水性ペプチド、および脂質から選択される、請求項１から８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
疎水性アンカー部分がコレステロールまたはこの誘導体である、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
疎水性アンカー部分が、スペーサー基、または、十分な数のハイブリダイズしていない核酸ユニットによって２重鎖区画から間隔を置かれている、請求項３から１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
表面に固定されたリンカー、または別の脂質膜に付着しているリンカーに対する特異的結合によって連接されるよう適合され、利用可能することができる、請求項１から１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
表面に固定されている、請求項１から１１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
第１の鎖が第２の鎖よりも長く、前記第１および第２の鎖が、第２の鎖の末端を含む２重鎖区画を有する、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
第１の鎖が、第２の鎖よりも本質的に２倍の核酸モノマー量を有し、前記第１および第２の鎖が、それぞれ、これらの遊離した５’末端および３’末端に付着したコレステロール分子を有する、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ＰＮＡ−ペプチド複合体を形成することができるペプチド核酸（ＰＮＡ）の区画を含む、請求項１から１５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
第１の鎖が３０量体のＤＮＡであり、第２の鎖が、１２個の相補性塩基を有する１５量体のＤＮＡである、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
脂質膜に付着した請求項１から１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む、脂質小胞。
【請求項１９】
電気化学的に検出可能なレポーター分子を含む、請求項１７に記載の脂質小胞。
【請求項２０】
生物学的機能性を示す生物活性化合物を含む、請求項１１に記載の脂質小胞。
【請求項２１】
前記生物活性化合物が膜タンパク質である、請求項２１に記載の脂質小胞。
【請求項２２】
請求項１８から２１に記載の複数の小胞を含む、表面に固定された構造物であって、前記小胞が、任意の表面固定化リンカー、別の脂質小胞に付着したリンカー、または表面に固定されている請求項１３に記載のオリゴヌクレオチドに対する特異的結合によって連接されるよう適合され、利用できるようになっている、前記構造物。
【請求項２３】
請求項１３に記載の表面に固定された構造物を含むバイオセンサー。
【請求項２４】
脂質膜に付着したリンカーを形成する方法であって、２つ以上の疎水性アンカー部分を有する請求項１から１７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドが脂質膜に接触して、同じ膜の隣接する部位において前記部分による前記オリゴヌクレオチドの直接的付着が行われる、前記方法。
【請求項２５】
前記膜が脂質小胞を形成する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記膜が２層膜である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
付着が不可逆的である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
今日、水溶性タンパク質に関し、タンパク質チップ技術における急速な進歩が遂げられている（Ｋｏｄａｄｅｋ，Ｔ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００１，８，１０５−１１５）が、全プロテオーム構成のシグネチャーを作成するためには、病気診断および治療薬にとって共通の標的であるタンパク質の重要なグループを構成する膜タンパク質にも対応できなければならない。しかしながら、この種類のタンパク質は、しばしば、このフォーマット上で解析するのが極めて難しいタンパク質群であるとされる。実際、膜タンパク質に基づいた最初の低密度タンパク質チップは、つい最近になって報告され（Ｆａｎｇ，Ｙ．；Ｆｒｕｔｏｓ，Ａ．  Ｇ．；Ｌａｈｉｒｉ，Ｊ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００２，１２４，（１１），２３９４−２３９５）、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）を含む脂質膜の微量分注（ｍｉｃｒｏ−ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）によって作製されたアレイが示された。膜タンパク質のアレイによる解析の可能性を十分に検討するために、繋留された脂質小胞が最も有望な代替的方法として最近になって出現してきたが、とりわけこれらによって、膜タンパク質による物質の膜透過輸送を測定できる可能性が提示されている（Ｓｔａｍｏｕ，Ｄ．；Ｄｕｓｃｈｌ，Ｃ．；Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅ，Ｅ．；Ｖｏｇｅｌ，Ｈ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ２００３，４２，（４５），５５８０−５５８３）。さまざまなタイプの小胞を予め画定された領域以上に置くのを制御する方法が、まだかなりの程度欠けている。ＤＮＡハイブリダイゼーション検出のシグナル増幅のために既に利用されているＤＮＡ標識された小胞という概念（Ｐａｔｏｌｓｋｙ，Ｆ．；Ｌｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２０００，１２２，（２），４１８−４）を、ｃＤＮＡアレイ上で部位選択的に結合するためにＤＮＡ標識された生体分子を利用するという概念（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ，Ｃ．  Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２，２９７，（５５７８），６２）と組み合わせることによって、本発明者ら（Ｓｖｅｄｈｅｍ，Ｓ．；Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｉ．；Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｃ．；Ｗｉｎｇｒｅｎ，Ｃ．；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．；Ｈｏｅｏｅｋ，Ｆ．，Ｃｈｅｍ  ＢｉｏＣｈｅｍ  ２００３，（４），３３９−３４３）およびその他（Ｙｏｓｈｉｎａ−Ｉｓｈｉｉ，Ｃ．；Ｂｏｘｅｒ，Ｓ．  Ｇ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００３，１２５，（１３），３６９６−３６９７）により、ＤＮＡタグを付けた脂質小胞を部位選択的および配列特異的に結合させるために低密度ｃＤＮＡアレイを使用することが最近になって明らかにされている。化学的に活性のある脂質へのＤＮＡの共有結合を利用する（Ｙｏｓｈｉｎａ−Ｉｓｈｉｉ，Ｃら、および  ｔｈｅ  ａｒｔｉｃｌｅ  Ｐａｔｏｌｓｋｙ，Ｆ．  ；Ｋａｔｚ，Ｅ．；Ｂａｒｄｅａ，Ａ．；Ｗｉｌｌｎｅｒ，Ｉ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １９９９，１５，（１１），��７０３−３７０６）代わりに、本発明者らは、脂質膜の疎水性内部に自発的に係留させるためにコレステロールで修飾されたｓｓ−ＤＮＡを利用した。このＤＮＡ係留法には、さらに３倍の利点がある。これは、この方法が、（ｉ）より迅速であり（数時間に対し何十分か）、（ｉｉ）化学的に修飾された脂質を導入する必要がなく、および、（ｉｉｉ）天然の膜成分を利用し、これによって、取り込まれた膜成分上にある化学的な反応性をもつ脂質ヘッドグループによって引き起こされる副作用のリスクをなくすためにそうなる。しかし、コレステロールによるＤＮＡの脂質膜への係留は比較的弱いことが判明しているため、小胞当りのＤＮＡ数を定量的に制御することは面倒である。また、さまざまにＤＮＡタグを付された小胞の、ＤＮＡアレイに対する部位選択的な仕分けは、異なってタグ付けされた小胞間でＤＮＡ交換が起こるため、並行してではなく、連続したやり方で行う必要がある（Ｓｖｅｄｈｅｍら、Ｙｓｈｉｎａ−Ｉｓｈｉｉらによって記載された上記論文参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
（発明の概要）
本発明は、脂質膜に対してより安定した結合を形成することができ、これによって、オリゴヌクレオチドリンカーが脂質膜に導入される工程の制御に改善を生じさせるオリゴヌクレオチド構造物を提供することを目的とする。また、本発明は、脂質膜オリゴヌクレオチド付着を形成する方法、および、このようなオリゴヌクレオチドを備えた脂質小胞、ならびにこのような小胞を形成する方法も目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
（発明の説明）
本発明を理解することを容易にするため、いくつかの用語を以下のように定義する。
【０００４】
本明細書において、「小胞」または「リポソーム」という用語は、通常、脂質膜でできている球状の構造体（直径５ｎｍから２０μｍ）であって、タンパク質、糖脂質、ステロイド、または他の膜関連成分を含むことができるか、または含むことができない構造体を意味する。「リポソーム」および「小胞」という用語は、本明細書において同義的に使用される。小胞は、天然に（例えば、細胞の細胞質の中に存在していて、分子を輸送し、および、特異的な細胞機能を区画化する小胞）、または合成によって生じさせることができる（例えば、リポソーム）。ここで、「小胞」という用語は、脂質を含む粒子であって、親水性の外部と疎水性の内部を有する粒子である「ミセル」に対しても使用される。
【０００５】
本明細書において、「ヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、および、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（ロックト核酸）、およびモルホリノ核酸アナログなどの核酸アナログを意味するが、これらに限定されるものではない。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログからなる任意のヌクレオチドにも関連する。
【０００６】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、短い単鎖ポリヌクレオチド鎖を意味する。オリゴヌクレオチドは、典型的には長さが１００残基以下であるが、本明細書においては、より長いポリヌクレオチドを含むことも意図されている。この用語は、上記に定義されているヌクレオチドのあらゆる組合せであって、ヌクレオチドのポリマーを形成するものを意味する。
【０００７】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、しばしばワトソン‐クリック型ハイブリダイゼーションと呼ばれる本質的に相補的な核酸の対合、ならびにフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）型ハイブリダイゼーションと呼ばれるハイブリダイゼーションに関して用いられる。本明細書において、「固定化」という用語は、物質の動きを拘束するが、必ずしも規制しない形で、化学的またはこの他の方法で物質をトランスデューサーの表面に付着または捕捉させることを意味する。本明細書において、「分析物」という用語は解析の対象となる任意の物質を意味する。
【０００８】
本明細書において、「バイオセンサー」という用語は、一部または全体が生体分子から成る任意のセンサー装置を意味する。従来の意味では、この用語は、「生化学シグナルを電気シグナルに変換する適切な変換装置と密接に連結する固定化された生体物質（酵素、抗体、全細胞、細胞小器官、またはこれらを組み合わせたものなど）から成る解析ツールまたは解析システム」（Ｇｒｏｎｏｗ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ９，３３６，１９８４）を意味する。
【０００９】
本明細書において、「多重層」という用語は、少なくとも第１の層の上に形成された第２の層から成る構造物を意味する。それぞれの層は相互に作用し合うことも、し合わないことも可能である。
【００１０】
本明細書において、「生物活性化合物」という用語は、他の物質または化合物と相互作用する能力がある生体化合物を意味する。このような生物活性化合物は、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、脂質、炭水化物、およびこれらを組み合わせたものを含むが、これらに限定されるものではない。「レセプター」および「生物活性化合物」という用語は、本明細書において同義のものとして使用される。
【００１１】
本明細書において、「膜タンパク質」という用語は、脂質層の脂質膜に結合または挿入されているタンパク質またはポリペプチドを意味するが。
【００１２】
本明細書において、「外向きに突出した化合物」という用語は、表面から突出している部分をもった化合物を意味する。小胞の場合のように表面が本質的に球状である場合、この用語は、化合物が表面から周囲に向かって突き出ていることを意味する。
【００１３】
本明細書において、「表面」という用語は最も広義に用いられるべきである。構造物をこの上に固定化することができる支持手段として使用することができるすべての化合物を含む。
【００１４】
本明細書において、「結合するのに適合したリンカー」という用語は、リンカーが、別の化合物に結合する能力がある化合物を含むことを意味する。
【００１５】
本明細書において、「結合に使用可能なリンカー」という用語は、あるリンカーが、結合するのに適合してはいるが、別のリンカーにまだ結合していないこと、または、このリンカーの結合部位のすべてがまだふさがれていないことを意味する。
【００１６】
最も一般的に言えば、本発明は、脂質膜に付着可能な少なくとも２つの疎水性アンカー部分を含むオリゴヌクレオチドに言及する。アンカー部分は、膜の隣接部位における疎水性相互作用により脂質膜に直接結合する役割を果たしており、本質的には、確立されている技術によって多くの生物学的機能を備えることができ、および、本発明者らの並行出願であるＳＥ  ０３  ０１０３８−６および下記においてさらに説明されているようなタイプの多層表面を作り上げるためのリンカーとして働くことができる。
【００１７】
また一般的に言えば、本発明は、脂質膜付着性リンカーを形成する方法であって、２個以上の疎水性アンカー部分をもつオリゴヌクレオチドが脂質膜と接触することにより、同じ膜の隣接部位において、該部分によって該オリゴヌクレオチドを直接付着させる方法に言及する。好適には、膜が脂質小胞を形成し、この膜は２層膜である。この方法によって、オリゴヌクレオチドが驚くほど強力に、実質的に不可逆的に膜に結合することが可能となる。
【００１８】
好適には、疎水性アンカー部分はオリゴヌクレオチドの末側に位置しており、脂質膜は小胞の一部となっている。１つの態様において、オリゴヌクレオチドは、核酸の第１の鎖および第２の鎖を含んでおり、これら２本の鎖は、第１の鎖の末端側が２重鎖区画の一部とならず、疎水性アンカー部分から自由な形で、互いにハイブリダイズして２重鎖区画となっている。好適には、疎水性アンカー部分が該第１および第２の鎖の隣接末端に共有結合している。
【００１９】
別の態様において、多価オリゴヌクレオチドが集合して、脂質膜に複数（２つより多い）の付着点を設けることができる。本発明者らは、より高い水溶性を有する、より長い核酸を使用する結果として、疎水性アンカーユニットの数を増やす必要が生じる可能性があると考える。このために、本発明は、代わりに、第１および第２の鎖に加えて、ｎ本のさらに別の鎖を含むオリゴヌクレオチドを目的とする（ｎは正の整数とする）。ｎ本のさらに別の鎖はそれぞれ、末端の疎水性アンカー部分を備えており、この中で、第１の追加鎖は上記第２の鎖にハイブリダイズし、第２の追加鎖は第１の追加鎖にハイブリダイズし、第ｎ鎖は第（ｎ−１）鎖にハイブリダイズする。
【００２０】
さらに別の態様において、オリゴヌクレオチドは、複数の脂質小胞などの多重層膜構造物、または、化学的または生物学的に活性のある表面を設計するときに役立つ別の集合物を作出するための連接物を構成すると解することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、第１および第２の鎖が、これら２本の鎖が、第１の鎖が自由に第３の鎖とハイブリダイズできるような形で２重鎖領域において互いにハイブリダイズしている、第１および第２の鎖を含む。第１の鎖の自由末端は、例えば、標識用物質、抗体、周囲の液体から所望の物質を抽出することができる捕捉用物質、または、特異的結合能力をもつ従来の物質のような別の物質を含むこともできる。本態様の１つの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、末端に疎水性アンカー部分を有するか、有しない第３の鎖がハイブリダイズする、両末端に疎水性アンカー部分をもった第１の鎖であって、この第１および第３の鎖が隣接する疎水性アンカー部分を有するようになる第１の鎖を含む。
【００２１】
疎水性アンカー部分は、例えば、ステロイド、脂肪酸、疎水性ペプチドおよび脂質から選択され、最も好適には、疎水性アンカー部分は、コレステロールまたはこの誘導体である。
【００２２】
脂質膜の疎水性部と最適に会合する可能性のある、適切に柔軟な構築物を形成するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、スペーサー基、または十分な数のハイブリダイズしない核酸ユニットによって２重鎖区画から間隙を置いて隔てられている疎水性アンカー部分を有する。２重鎖区画の鎖長によって最適な柔軟性／剛性をもったオリゴヌクレオチド構造物を得るために、鎖化学（ｃｈａｉｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を改変することも可能である。
【００２３】
オリゴヌクレオチドは、一般的に、表面に固定されたリンカー、または別の脂質膜に付着したリンカーへの特異的結合によって連接されるよう適合させて利用することができる。連接は、核酸のハイブリダイゼーションを介して、または、当業者によって十分に理解されている別の種類の特異的結合によってもたらすことができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ＰＮＡ−ペプチド複合体を形成することができるペプチド核酸（ＰＮＡ）の区画を含むことができる。または、オリゴヌクレオチドは、直接表面に固定することができ、例えば、第１鎖の自由末端によって、脂質膜か、または別の適切な化合物もしくは構造物に直接固定することができる。本技術分野における当業者に公知または利用可能な核酸を表面に固定できるようにする数多くの経路があるため、これに関連しては、これ以上検討する必要はない。
【００２４】
本発明の好適な実施態様によれば、第１の鎖は第２の鎖よりも長い（すなわち、より多くの核酸ユニットを含む）。第１および第２の鎖は、第２鎖の末端を含む２重鎖領域を有する。適切な一例によれば、第１の鎖は、核酸モノマーの量が第２の鎖の本質的に２倍であり、該第１および第２の鎖は、それぞれ、遊離した５’末端および３’末端に付着したコレステロール分子をもつ。具体的な例では、オリゴヌクレオチドは、第１鎖が３０量体のＤＮＡであり、第２鎖が、相補的な１２塩基を有する１５量体のＤＮＡである。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは、脂質小胞に好適に付着することができる。このように形成された脂質小胞は、さまざまな追加的機能を持つように設計することが可能である。例えば、このような脂質小胞は、電気化学的に検知可能なリポーター分子を、参照として本明細書に組み込まれる国際公開公報第ＷＯ  ０２／０８１７３９号および第ＷＯ  ０２／０８１７３８号に概説されているような形で含むことができる。脂質小胞は、上記のＳＥ０３０１０３８−６においてより詳細に考察されているように、膜タンパク質など、生物学的機能性を示す生体活性化合物を含むことができる。
【００２６】
本発明は、上記の特徴をもつ膜付着性オリゴヌクレオチドを有する複数の小胞を含む、表面に固定された構造物をさらに目的とする。このような構造物を構築するために、小胞は、表面に固定されたリンカー、別の脂質小胞に付着したリンカー、または上記したタイプの表面に固定されたオリゴヌクレオチドのいずれかに特異的結合によって連接されるよう適合され、使用できるようになっている。表面に固定された構造物は、一般的に、バイオセンサーに使用することができるが、数多くの別の応用法も考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
多価性の相互作用を利用する自然の方法を模倣することによって、本発明者らは、本研究において、脂質膜に結合する、コレステロールに基づくＤＮＡの強度を向上させる新規の方法を提示する（Ｍａｍｍｅｎ，Ｍ．；Ｃｈｏｉ，Ｓ．  Ｋ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．  Ｍ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １９９８，３７，（２０），２７５５−２７９４）。それぞれ３’末端と５’末端がコレステロールで修飾されている１５量体ＤＮＡと３０量体ＤＮＡをハイブリダイズさせることによって、２価性のコレステロールに基づくＤＮＡの結合を行った（図１）。
【００２８】
水を脱イオン化して濾過した（ＭｉｌｌｉＱ装置、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。以下のＤＮＡ鎖：
５’−ＴＡＧＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−ＣＣＣ−ＣＣ−３’（ＤＮＡＡ’）；５’−ＴＡＴ−ＴＴＣ−ＴＧＡ−ＴＧＴ−ＣＣＡ−ＣＣＣ−ＣＣ−３’（ＤＮＡＢ’）；５’−ＴＧＴ−ＡＣＧ−ＴＣＡ−ＣＡＡ−ＣＴＡ−ＣＣＣ−ＣＣ−３’（ＤＮＡＡ）；５’−ＴＧＧ−ＡＣＡ−ＴＣＡ−ＧＡＡ−ＡＴＡ−ＣＣＣ−ＣＣ−３’（ＤＮＡＢ）；５’−ＴＡＧ−ＴＴＧ−ＴＧＡ−ＣＧＴ−ＡＣＡ−ＡＡＧ−ＣＡＧ−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＣＣＣ−３’（ＤＮＡＣ）；５’−ＴＡＴ−ＴＴＣ−ＴＧＡ−ＴＧＴ−ＣＣＡ−ＡＧＣ−ＣＡＣ−ＧＡＧ−ＡＴＣ−ＣＣＣ−３’（ＤＮＡＤ）；５’−ＣＣＣ−ＧＡＴ−ＣＴＣ−ＣＴＧ−ＣＴＴ−３’（ＤＮＡＣ’）；５’−ＣＣＣ−ＧＡＡ−ＣＴＣ−ＧＴＧ−ＧＣＴ−３’（ＤＮＡＤ’）
は、３’末端をビオチン（ｂｉｏｔｉｎ−ＤＮＡＢ）またはコレステロール（ｃｈｏｌ−ＤＮＡＡ；ｃｈｏｌ−ＤＮＡＢ；ｃｈｏｌ−ＤＮＡＢ’）で、または、５’末端をコレステロール（ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ、ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ’、ｃｈｏｌ−ＤＮＡＤ、ｃｈｏｌ−ＤＮＡＤ’）で誘導体化されている（ＭｅｄＰｒｏｂｅ社、ノルウェー）。ＤＮＡ複合体（バッファーＩ中２０μＭ：１０ｍＭトリス、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ８．０）およびタンパク質（ビオチン標識されたＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社、水に１ｍｇ／ｍＬ）、ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ社、バッファーＩＩ中１ｍｇ／ｍＬ：１０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）の保存溶液を一定分量に分けて−２０℃で保存した。１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社、米国アラバマ州（ＡＬ、ＵＳＡ））をクロロフォルムに溶解させた。蛍光性小胞については、０．５％（ｗ／ｗ）のＬｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢ  １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ローダミン−ＤＨＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国）または２−（１２−（７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ドデカノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＮＢＤ−ＨＰＣ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社、米国）を脂質溶液に加えた。溶媒をＮ２下で蒸発させた（＞１ｈ）後、バッファー（５ｍｇ／ｍＬ）中で水和させ、それぞれ１１×の０．１および０．０３μｍポリカーボネート膜から押し出して、Ｎ２下４℃で保存した。小胞１個当りほぼ４個のＤＮＡに相当する０．５％（ｗ／ｗ）のｃｈｏｌ−ＤＮＡを小胞溶液に加えてＤＮＡの標識を行った。保存溶液を所定の濃度になるようバッファーＩＩに溶解して全ての実験を行った。基質（金またはＳｉＯ２のいずれかを有するＡＴカット水晶、ｆｏ＝５ＭＨｚ）およびＱＣＭ−Ｄ計器（Ｑ−センスＤ３００）は、スエーデンのキューセンス社（Ｑ−ｓｅｎｓｅ）から入手した。結晶は、１０ｍＭ  ＳＤＳ（＞１５分）で洗浄した後、水で２回濯ぎ、乾燥させ（Ｎ２）て、ＵＶ−オゾン処理（１０分）を行った。画像化に使用した顕微鏡は、ツァイス社（Ｚｅｉｓｓ）のＡｘｉｏｐｌａｎ  ２蛍光顕微鏡であった。ＳｉＯ２で被覆された結晶を、３ｎＭのＴｉおよび１００ｎＭのＡｕを、マスクを通して蒸発させることによりパターン化した。
【００２９】
３０量体の鎖上にある１２塩基を、１５量体鎖上の１２塩基に相補的になるよう選択して、構築物の詳細な設計を画定した。これらの鎖をインキュベートして形成された２重鎖が、依然として１対のハイブリダイズしない（３Ｃ）スペーサーによって２重鎖領域から隔てられている２つのコレステロール部分を近傍に来させるよう配列を選択した。
【００３０】
図１ａは、既述された（ＣＡ  Ｋｅｌｌｅｒら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎ．  ７５  （３），１３９７−１４０２）通りにして形成されたＳＰＢ被覆ＳｉＯ２表面に濃度を上げながら、ｃｈｏｌ−ＤＮＡＡを段階的に加えたときの、散逸観測（ＱＣＭ−Ｄ）測定値による石英微量天秤から得られたｆ（結合質量参照）の変化を示す。ＳＰＢ被覆ＳｉＯ２被覆されたＱＣＭセンサーの表面上にＳＰＢが自然に形成された後（ｔ＝２から４分）、濃度を上げながら（青）ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣを加えて得られたｆの経時変化は、流速２５０μＬ／分で５、１０、２５、５０、１００ｎＭであった。１００ｎＭで飽和結合した後、このシステムをバッファーで念入りに洗浄して、ラングミュアの吸着作用に合致する完全に可逆的な結合を実証し（ＤＮＡフィルムに捕捉された水がＱＣＭによって感知されるため（例えば、１４参照）、ｆの変化を、結合質量の量を定量するために使用することはできないが、結合質量対濃度の相対的な比較のためだけに利用した）、Ｋｄ（＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）値およびｋｏｆｆ値が、それぞれ１６．７±４ｎＭおよび約５．８×１０−４ｓ−１であることを明らかにした（３０量体のｃｈｏｌ−ＤＮＡＣを加えると、ｃｈｏｌ−ＤＮＡＡおよびｃｈｏｌ−ＤＮＡＢの反応速度と同じような反応速度を示す（図示せず））。
【００３１】
図１ｂに関して、図１ａで示されている実験状況におけると同じタイプのデータが、事前に（３０分間のインキュベーション）ハイブリダイズさせておいたｃｈｏｌ−ＤＮＡＣおよびｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ’からなるＤＮＡ構築物を、濃度を上げながら加えると得られた：２５、３７．５、５０および７５ｎＭおよび５ｎＭのみ。飽和結合した後、溶液を純粋なバッファーＩＩに交換した。また、挿入図として示されているのは、ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ／ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ’の２重鎖構築物上に１５個の遊離した突出塩基に相補的なｃｈｏｌ−ＤＮＡＢを加えたときのものである。２個のコレステロール部分をもつ２重鎖構築物（ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ／ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ’）の結合は、濃度とは無関係に不可逆的結合を示す（図１ｂ参照）。これは、ラングミュア法に基づくデータ解析を排除するが、１価の結合に比べて、ｋｏｆｆが１桁以上少なくなることを示している。したがって、１価および２価の結合についてｋｏｎは同じであるとの前提（Ｍ  Ｍａｍｍｅｎら、による上記引用論文参照）の下では、親和定数（１／Ｋｄ）は、２価の結合では少なくとも１桁大きい。たとえ、結合強度の上昇が、これよりも大きく、さらに、理論値である（１／Ｋｄ）２に近づいたとしても、最も重要な観察結果は、結合が不可逆的であるということである。
【００３２】
第１に、このことは、２価の結合を用いて、脂質膜領域当りのＤＮＡ数を正確に制御することができるということを意味している。第２に、完全に相補的なビオチン−ＤＮＡＢを加えると急速に結合すること（図２ｂの挿入図）は、詳細なＤＮＡハイブリダイゼーション反応速度を調べるためにこの鋳型が適していることを示している。第３に、さまざまにＤＮＡ修飾された小胞の間におけるＤＮＡの交換が顕著に減少する可能性が高い。
【００３３】
後者の仮説を検討するために、ｃｈｏｌ−ＤＮＡＡで修飾された平坦なＳＰＢによって囲まれているため、最も単純な「ｃＤＮＡアレイ」である可能性があるものを含む、ビオチン−ＤＮＡＢ修飾された金スポットを作製して２価のコレステロール結合を調べた（図２）。
【００３４】
既述したように作製したＤＮＡアレイの略図を示す図２（左）について（Ｓｖｅｄｈｅｍらによる上記論文参照）。要するに、ビオチン−ＢＳＡ（１０μγ／μＬ）を周囲のＳｉＯ２よりもＡｕスポットに優先的に吸着させて表面のパターンを変更した後、ＰＯＰＣ脂質小胞溶液（２０マイクログラム／ｍＬ）を加えて、周囲のＳｉＯ２基質をＳＰＢで修飾させた一方で、ビオチン−ＢＳＡで修飾された金スポットには弱い吸着しか起こらなかった（Ｓｖｅｄｈｅｍら）。次いで、引き続き（ｉ）ニュートラアビジン（１０．０マイクログラム／ｍＬ）、ビオチン−ＤＮＡＢ（０．１マイクロＭ）、およびｃｈｏｌ−ＤＮＡＡ（０．１マイクロＭ）を加えた。図２（右）は、それぞれｃｈｏｌ−ＤＮＡＡ’およびｃｈｏｌ−ＤＮＡＢ’で修飾されているローダミン標識された小胞（ｅｘｃ．＝５５０ｎＭ／ｅｍ．＝５９０ｎＭ）およびＮＢＤ標識された小胞（ｅｘｃ．＝４６０ｎＭ／ｅｍ．＝５５０ｎＭ）（顕微鏡写真ｉおよびｉｉ）と、それぞれｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ／ｃｈｏｌ−ＤＮＡＣ’およびｃｈｏｌ−ＤＮＡＤ／ｃｈｏｌ−ＤＮＡＤ’からなる２価結合したＤＮＡ構築物との混合物に、ＤＮＡ修飾された基質を曝露することによって得られた、さまざまにＤＮＡタグ付けされた小胞の選別を説明する顕微鏡写真（ｉからｉｖ）を示す。ＤＮＡ濃度を小胞１個あたり約４個のＤＮＡになるよう調整した。曝露する前に、小胞の懸濁液を５分間インキュベートし、３０分後、画像ｉｉ）およびｉｖ）について緑色フィルター（ｅｘｃ．＝４５０から４９０ｎＭ／ｅｍ．＝５１５から５６５ｎＭ）を用いて、画像ｉ）およびｉｉ）については赤色フィルター（ｅｘｃ．＝５４６ｎＭ／ｅｍ．＝５９０ｎＭ）を用いて解析した。
【００３５】
２つのタイプの小胞の混合物から並行選抜することを評価するために、「ｃＤＮＡアレイ」を２つのタイプの小胞懸濁液に曝露した。一方は、それぞれｃｈｏｌ−ＤＮＡＡ’およびｃｈｏｌ−ＤＮＡＢ’によって修飾されている２種類の別々に蛍光標識された小胞（赤と緑）を含んでいた（図１ａ参照）。もう一方は、それぞれ固定されたｃｈｏｌ−ＤＮＡＡおよびｃｈｏｌ−ＤＮＡＢに相補的な１本鎖領域を有する、２価結合したＤＮＡ構築物を介して別個に修飾された同じタイプの小胞を含んでいた（図１ｂの挿入図参照）。実際、２価結合したＤＮＡによってタグ付けされた小胞を含む小胞懸濁液は、表面上の予め画定された領域に配列特異的および部位選択的に結合する（図２のｉｉｉおよびｉｖ）一方で、１価結合により修飾された小胞は、どちらの領域にも分布しているように見える（図２のｉおよびｉｉ）。ＳＰＢ基質上の蛍光が全体的により低いのは、ビオチン−ＤＮＡＡよりもｃｈｏｌ−ＤＮＡＢのカバー率が少ないためであり、また、図ｉｖ．）のスポット上の蛍光ドットが弱いのは、ＳＰＢ形成過程でビオチン−ＢＳＡに非特異的に吸着した脂質小胞に対してｃｈｏｌ−ＤＮＡＡが結合するためである（図面の説明を参照）。
【００３６】
たとえ、２価コレステロールに基づく結合の強度が、活性型脂質ヘッドグループに共有結合すると得られるものよりも必ずしも高くなってはいないとしても、本発明者らは、原理の単純さ、および、例えば、細胞によって産生されるか、元の細胞膜から形成される脂質小胞などの非常に多様な脂質集合体など、この広い応用範囲を重視している（公表予定）。
【００３７】
さらに、制御されたフロー条件下におけるハイブリダイゼーションを検出するためにＤＮＡ修飾されたＳＰＢを上手に使用すること（図１ｂ）は、薬剤−ＤＮＡ、タンパク質−ＤＮＡ、およびＤＮＡ−ＤＮＡの相互作用を研究するための興味深い鋳型を指向する。ＤＮＡによるカバー率は正確に制御することができ、これが固定化されたＤＮＡの場合に重要であることが知られているため、これは特にそうである（Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｃ．；Ｒｏｄａｈｌ，Ｍ．；Ｈｏｏｋ，Ｆ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓｙ  ２００３，７５，（１９），５０８０−５０８７、およびＳｈｃｈｅｐｉｎｏｖ，Ｍ．  Ｓ．；ＣａｓｅＧｒｅｅｎ，Ｓ．  Ｃ．；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．  Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９７，２５，（６），１１５５−１１６１）。さらに、広く使用されているストレプトアビジンの鋳型であって、これらの目的のために使用されるものは、一定の場合に、好ましくない非特異的なタンパク質結合を誘導する可能性があるが、この場合は、この可能性が顕著に低くなっている可能性がある。
【００３８】
最後に、ＤＮＡを構成単位として利用して２価結合を構築する本発明者らの手段は、多価の相互作用をもたらすＤＮＡ構築物にまで容易におよぶため、例えば、本技術分野における最近の理論的発展を裏付けるための基礎研究を行うための簡単なモデルシステムを含む（Ｋｉｔｏｖ，Ｐ．  Ｉ．；Ｂｕｎｄｌｅ，Ｄ．  Ｒ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００３，１２５，（５２），１６２７１−１６２８４）。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、２価コレステロールに基づくオリゴヌクレオチド、および、さまざまなコレステロール−ＤＮＡ集合体を段階的に加えたとき、散逸観測（ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）の測定値による石英微量天秤から得られた結合質量の変化を示す。
【図２】図２は、明細書において作製および記載されているＤＮＡアレイの略図と、さまざまにＤＮＡタグ付けされた小胞の選別を例示する顕微鏡写真とを示す。
【図３】図３は、脂質膜への付着に利用することができる２個より多くの疎水性アンカー部分をもつ多価オリゴヌクレオチドの略図例を示す。
【図１】
2007525500.tif 000003
【図２】
2007525500.tif 000004
【図３】
2007525500.tif 000005
【国際調査報告】
2007525500.tif 000006
2007525500.tif 000007
2007525500.tif 000008