(57)【要約】本発明は、アミノ酸残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される重鎖定常領域由来の少なくとも１つのアミノ酸が、未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸とは異なる別のアミノ酸で置換され、これによって未改変のＦｃ融合タンパク質に比較して、ＦｃＲｎについての結合親和性および／または血清半減期が変更されている、改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。上記重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、ヒトＩｇＧ２Ｍ３分子、ヒトＩｇＧ３分子およびヒトＩｇＧ４分子からなる群より選択される、改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未改変のＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ結合親和性に対して変化したＦｃＲｎ結合親和性を有する改変Ｆｃ融合タンパク質であって、少なくともアミノ酸残基２５０および４２８が、未改変のＦｃ融合タンパク質に存在する残基とは異なる免疫グロブリン重鎖定常領域を含む、改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項２】
前記改変したＦｃ融合タンパク質が、ヒト抗体の重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項３】
前記ヒト抗体の重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、ヒトＩｇＧ２Ｍ３分子、ヒトＩｇＧ３分子およびヒトＩｇＧ４分子からなる群より選択される、請求項２に記載の改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の改変Ｆｃ融合タンパク質であって、
（ａ）アミノ酸残基２５０が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択され；そして／または、
（ｂ）アミノ酸残基４２８が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される、
改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項５】
請求項１に記載の改変Ｆｃ融合タンパク質であって、
（ａ）アミノ酸残基２５０がグルタミン酸であり、かつアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンであるか；または
（ｂ）アミノ酸残基２５０がグルタミンであり、かつアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンであるか；または
（ｃ）アミノ酸残基２５０がグルタミンであり、かつアミノ酸残基４２８がロイシンである、
改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項６】
前記改変抗体が、ｐＨ８．０よりもｐＨ６．０でＦｃＲｎについて高い親和性を有する、請求項１に記載の改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項７】
天然に存在するＩｇＧクラスの抗体のＦｃ領域と実質的に同一のＦｃ領域を含み、少なくともアミノ酸残基２５０および４２８が、天然に存在するＩｇＧクラスの抗体に存在する残基とは異なる、Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項８】
前記天然に存在する抗体が、ヒト抗体である、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項９】
前記天然に存在するＩｇＧクラスの抗体が、ヒトＩｇＧ１分子、ヒトＩｇＧ２分子、ヒトＩｇＧ３分子およびヒトＩｇＧ４分子からなる群より選択される重鎖定常領域を含む、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質であって、
（ａ）アミノ酸残基２５０が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびチロシンからなる群より選択され；そして／または
（ｂ）アミノ酸残基４２８が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンからなる群より選択される、
Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１１】
前記重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０が、グルタミンである、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１２】
前記重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８が、ロイシンである、請求項７に記載のＦｃ融合タンパク質。
【請求項１３】
免疫グロブリン重鎖定常領域を含む改変Ｆｃ融合タンパク質であって、残基２５０および４２８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、対応する未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸残基とは異なり、インビボにおける平均排出半減期が、対応する未改変のＦｃ融合タンパク質の平均排出半減期よりも少なくとも約１．８倍長い、改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１３に記載の改変Ｆｃ融合タンパク質であって、
（ａ）アミノ酸残基２５０がグルタミン酸であり、かつアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンであるか；または
（ｂ）アミノ酸残基２５０がグルタミンであり、かつアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンであるか；または
（ｃ）アミノ酸残基２５０がグルタミンであり、かつアミノ酸残基４２８がロイシンである、
改変Ｆｃ融合タンパク質。
【請求項１５】
アミノ酸残基２５０および４２８を、Ｆｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基で置換する工程を包含する、Ｆｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期を改変するための方法。
【請求項１６】
未改変のＦｃ融合タンパク質と比較して、ＦｃＲｎについての改変された結合親和性および／または改変された血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質を産生する方法であって、以下：
（ａ）ＩｇＧ重鎖の少なくとも１つの定常領域をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結された適切なプロモーターを含む発現ベクターを調製する工程であって、少なくともアミノ酸残基２５０および４２８が、未改変の抗体に存在する残基とは異なる残基で置換される、工程；
（ｂ）該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換させる工程；ならびに
（ｃ）該形質転換された宿主細胞を培養して、該改変されたＦｃ融合タンパク質を産生する工程；
を包含する、方法。
【請求項１７】
アミノ酸残基２５０がグルタミン酸もしくはグルタミンで置換されるか、またはアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンもしくはロイシンで置換される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって：
（ａ）アミノ酸残基２５０がグルタミン酸で置換され、かつアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンで置換されるか；または
（ｂ）アミノ酸残基２５０がグルタミンで置換され、かつアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンで置換されるか；または
（ｃ）アミノ酸残基２５０がグルタミンで置換され、かつアミノ酸残基４２８がロイシンで置換される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫学およびタンパク質工学の分野に関する。詳細には、本発明は、改変Ｆｃ融合タンパク質であって、そのＦｃ領域における１つ以上のアミノ酸改変の結果として、ＦｃＲｎについて変更された結合親和性および変更された血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ネイティブの抗体分子は、２つの同一の重鎖と２つの同一の軽鎖とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。抗体のパパイン消化によって、２つのフラグメントであるＦａｂおよびＦｃが生じる。Ｆｃフラグメントは、ＣＨ２、ＣＨ３およびヒンジ領域の部分からなる。ヒトＩｇＧ分子では、Ｆｃフラグメントは、Ｃｙｓ２２６に対してＮ末端のヒンジ領域のパパイン切断によって生成される。従って、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、２２６位置のアミノ酸残基からＣ末端へのストレッチングとして規定される（ナンバリングは非特許文献１のＥＵインデックスに従う；ＥＵナンバリングスキームを本明細書の以降において用いる）。
【０００３】
Ｆｃ領域は、ＩｇＧクラスの抗体の血清半減期を維持するために重要であることが理解されている（非特許文献２）。ＩｇＧ抗体の血清半減期が新生児（ｎｅｏｎａｔａｌ）Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対するＦｃの結合によって媒介されるということが研究によって見出されている。ＦｃＲｎは、膜貫通α鎖と可溶性β鎖（β２ミクログロブリン）からなるヘテロ二量体である。ＦｃＲｎはクラスＩ  ＭＨＣ分子と２２〜２９％の配列同一性を共有しており、ＭＨＣペプチド結合グルーブの非機能的バージョンを有する（非特許文献３）。ＦｃＲｎのα１およびα２ドメインは、Ｆｃ領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインと相互作用する（非特許文献４）。
【０００４】
ＦｃＲｎが抗体の血清半減期を調節し得る方法について、あるモデルが提唱している。このモデルによれば、ＩｇＧｓは、非特異的な飲作用を通じて内皮細胞によって取り込まれ、次いで酸性エンドソームに入る。ＦｃＲｎは酸性のｐＨ（＜６．５）においてエンドソーム中でＩｇＧに結合して、ＩｇＧを塩基性のｐＨ（＞７．４）で血流中に放出する。従って、ＦｃＲｎはリソソーム分解経路からＩｇＧをサルベージする。血清ＩｇＧレベルが低下する場合、より多いＦｃＲｎ分子がＩｇＧ結合のために利用可能であり、その結果ＩｇＧの増大した量がサルベージされる。逆に、血清のＩｇＧレベルが上昇する場合、ＦｃＲｎは飽和して、それによって、飲作用を受けて分解されるＩｇＧの割合が増大する（非特許文献５）。
【０００５】
上記のモデルと一致して、多くの研究の結果が、抗体のＦｃＲｎ結合についての親和性と血清半減期との間の相関を支持している（非特許文献５）。重要な事に、このような相関は、野性型の親分子よりもＦｃＲｎについて高い親和性を有する操作された抗体に対して拡大されている。変異原性研究に基づく多数の刊行物および特許によってこの相関は支持される（例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、および特許文献５を参照のこと）。さらに、特許文献６は、ＢＲ９６抗体の３１０〜３３１位置のアミノ酸の欠失または置換であって、その推定される毒性を軽減するための欠失または置換を開示している。
【０００６】
２００３年１０月１５日出願の特許文献７（その全体が参照によって本明細書に援用される）および対応する特許文献８は、未改変の抗体に対して変更されたＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期を有する改変された抗体を提供するＦｃ重鎖定常領域の２５０、３１４および４２８位置での変異を開示している。
【０００７】
分子生物学の技術における進歩によって、複数の機能的ドメインを有する新規なキメラポリペプチドの調製が可能になった。このようなキメラポリペプチドに最も共通なのは、免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質である。これらのタンパク質は、無関係のタンパク質またはタンパク質フラグメントに融合された、抗体、代表的にはマウス抗体またはヒト抗体のＦｃ領域、からなる。このようなＦｃ融合タンパク質は、インビトロおよびインビボでタンパク質機能を研究するために有用であり、そして臨床的設定において潜在的な治療的および診断的用途を有する。
【０００８】
抗体の定常領域に対してポリペプチドを融合させるかまたは結合体化させる（すなわち、Ｆｃ融合タンパク質を作成する）ための方法は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される、例えば、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７および特許文献１８、特許文献１９、特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４、特許文献２５および特許文献２６、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、および非特許文献１５に記載されている。
【特許文献１】米国特許第６，１６５，７４５号明細書
【特許文献２】米国特許第６，２７７，３７５号Ｂ１明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００２／００９８１９３号明細書
【特許文献４】国際公開第９７／３４６２１号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０２／０６０９１９号パンフレット
【特許文献６】国際公開第９８／０５７８７号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願公開第１０／６８７，１１８号明細書
【特許文献８】国際公開第０４／０３５７５２号パンフレット
【特許文献９】米国特許第５，３３６，６０３号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，６２２，９２９号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，３５９，０４６明細書
【特許文献１２】米国特許第５，３４９，０５３号明細書
【特許文献１３】米国特許第５，４４７，８５１号明細書
【特許文献１４】米国特許第５，７２３，１２５号明細書
【特許文献１５】米国特許第５，７８３，１８１号明細書
【特許文献１６】米国特許第５，９０８，６２６号明細書
【特許文献１７】米国特許第５，８４４，０９５号明細書
【特許文献１８】米国特許第５，１１２，９４６号明細書
【特許文献１９】欧州特許第３０７，４３４号明細書
【特許文献２０】欧州特許第３６７，１６６号明細書
【特許文献２１】欧州特許第３９４，８２７号明細書
【特許文献２２】国際公開第９１／０６５７０号パンフレット
【特許文献２３】国際公開第９６／０４３８８号パンフレット
【特許文献２４】国際公開第９６／２２０２４号パンフレット
【特許文献２５】国際公開第９７／３４６３１号パンフレット
【特許文献２６】国際公開第９９／０４８１３号パンフレット
【非特許文献１】Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ、１９９１年
【非特許文献２】ＷａｒｄおよびＧｈｅｔｉｅ，「Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９５年、第２巻、ｐ．７７−９４
【非特許文献３】ＳｉｍｉｓｔｅｒおよびＭｏｓｔｏｖ，「Ｎａｔｕｒｅ」、１９８９年、第３３７巻、ｐ．１８４−１８７
【非特許文献４】Ｒａｇｈａｖａｎら、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、１９９４年、第１巻、ｐ．３０３−３１５
【非特許文献５】ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ，「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２０００年、第１８巻、ｐ．７３９−７６６
【非特許文献６】Ｇｈｅｔｉｅら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、１９９７年、第１５巻、ｐ．６３７−６４０
【非特許文献７】Ｓｈｉｅｌｄｓら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００１年、第２７６巻、ｐ．６５９１−６６０４
【非特許文献８】Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、２００２年、第１６９巻、ｐ．５１７１−５１８０
【非特許文献９】Ｈｉｎｔｏｎら、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」、２００４年、第２７９巻、ｐ．６２１３−６２１６
【非特許文献１０】Ｋｉｍら、「Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９９年、第２９巻、ｐ．２８１９−２８２５
【非特許文献１１】Ｈｏｒｎｉｃｋら、「Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．」、２０００年、第４１巻、ｐ．３５５−３６２
【非特許文献１２】Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９１年、第８８巻、ｐ．１０５３５−１０５３９
【非特許文献１３】Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、「Ｎａｔｕｒｅ」、１９８８年、第３３１巻、ｐ．８４−８６
【非特許文献１４】Ｚｈｅｎｇら、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９５年、第１５４巻、ｐ．５５９０−５６００
【非特許文献１５】Ｖｉｌら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９２年、第８９巻、ｐ．１１３３７−１１３４１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、改変されたＦｃ融合タンパク質であって、対応する未改変のＦｃ融合タンパク質に対して変更されたＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。Ｆｃ融合タンパク質および他の生物活性分子のインビボにおける半減期（すなわち、本発明の血清または他の組織における持続性）は、Ｆｃ融合タンパク質（または任意の他の薬学的な分子）の投与の量および頻度を決定する重要な臨床的パラメーターである。従って、半減期の増大（または減少）を有するＦｃ融合タンパク質を含むこのような分子は、重要な薬学的重要性の分子である。
【００１０】
本発明は、改変されたＩｇＧ定常ドメイン（好ましくはヒトＩｇＧ由来）またはそのＦｃＲｎ結合部分（好ましくはＦｃまたはヒンジＦｃドメイン）の存在のおかげでインビボ半減期の増大（または減少）を有する、改変された分子（好ましくはＦｃ融合タンパク質）に関するが、このＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントは、ＦｃＲｎについての親和性を増大（または低下）するように改変（好ましくはアミノ酸置換によって）される。
【００１１】
特定の実施形態では、本発明は、改変されたＩｇＧクラスのＦｃ融合タンパク質であって、そのインビボ半減期が、ヒンジ−ＦｃドメインとＦｃＲｎレセプターとの相互作用に関与することが構造的研究によって同定された位置におけるアミノ酸残基の変化によって伸ばされている（かまたは減少される）Ｆｃ融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、対応する未改変のＦｃ融合タンパク質のインビボの平均排出半減期よりも少なくとも約１．３倍長い半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質はまた、改変されたＦｃ融合タンパク質（または他の分子）の変更された（すなわち、増大または低下した）バイオアベイラビリティ（例えば、粘膜面または他の標的組織への輸送）を示し得るということに注目すべきである。
【００１２】
好ましい実施形態では、改変されたＦｃ融合タンパク質（またはそのフラグメント）は、ｐＨ８．０よりもｐＨ６．０においてＦｃＲｎについて高い親和性を示す。すなわち、ＦｃＲｎ結合親和性のｐＨ依存性は、野性型ｐＨ依存性に似ている。別の実施形態では、本発明のこの改変されたＦｃ融合タンパク質は、未改変のＦｃ融合タンパク質のｐＨ依存性プロフィールに対して変更されたｐＨ依存性プロフィールを示し得る。このような変更されたｐＨ依存性プロフィールは、治療または診断の適用において有用である。
【００１３】
ある実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質の改変は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣのような他のエフェクター機能を変更することなくＦｃＲｎ結合および／または血清半減期を変更する。特に好ましい実施形態では、本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃγレセプターまたはＣ１ｑに対する結合において変化を示さない。別の実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質の改変は、増大した（または低下した）エフェクター機能および増大した血清半減期を生じ得る。特に好ましい実施形態では、本発明の改変されたＦｃ融合タンパク質は、増大（または低下した）ＡＤＣＣ活性および増大した血清半減期を有し得る。
【００１４】
好ましい実施形態では、本発明は、ＩｇＧクラスの改変されたＦｃ融合タンパク質であって、アミノ酸残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される重鎖定常領域由来の少なくとも１つのアミノ酸が未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸残基で置換される、Ｆｃ融合タンパク質を提供する。好ましくは、この置換によって、未改変のＦｃ融合タンパク質に対して、この改変されたＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎについての結合親和性および／または血清半減期が変更される。本発明はさらに、未改変のＦｃ融合タンパク質に比較してＦｃＲｎについて増大した結合親和性および増大した血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質であって、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０がグルタミン酸またはグルタミンで置換されるか；または重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンまたはロイシンで置換される改変融合タンパク質を提供する。
【００１５】
本発明はさらに、未改変のＦｃ融合タンパク質に比較してＦｃＲｎについて増大した結合親和性および／または増大した血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質であって、（ａ）重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０がグルタミン酸で置換され、かつ重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンで置換されるか；（ｂ）重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０がグルタミンで置換され、かつ重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８がフェニルアラニンで置換されるか；または（ｃ）重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０がグルタミンで置換され、かつ重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８がロイシンで置換される、改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、改変Ｆｃ融合タンパク質に比較して、ＦｃＲｎについて低下した結合親和性および／または減少した血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質であって、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基３１４が、未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸とは異なる別のアミノ酸で置換される改変融合タンパク質を提供する。
【００１７】
本発明はさらに、改変Ｆｃ融合タンパク質に比較して、ＦｃＲｎについて低下した結合親和性および／または減少した血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質であって、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンもしくはチロシンで置換されるか；または重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシンおよびバリンで置換される改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【００１８】
本発明はまた、Ｆｃ領域または定常領域であって、天然に存在するクラスＩｇＧ抗体のものと実質的に同一であり、残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が天然に存在するＩｇＧクラスの抗体に存在するアミノ酸とは異なり、これによって天然に存在する抗体の重鎖定常領域を有するＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質に対してこのＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期が変更しているＦｃ融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、天然に存在するＩｇＧクラスの抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４分子の重鎖定常領域を含む。また好ましい実施形態では、天然に存在するＩｇＧクラスの抗体に対して実質的に同一である定常領域を有するＦｃ融合タンパク質の重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０はグルタミン酸もしくはグルタミンであり；または重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８は、フェニルアラニンまたはロイシンである。他の好ましい実施形態では、天然に存在するＩｇＧクラスの抗体に対して実質的に同一である定常領域を有するＦｃ融合タンパク質は、２５０位置にグルタミン酸残基、そして４２８位置にフェニルアラニン残基を有するか；またはアミノ酸残基２５０は、グルタミンであり、かつアミノ酸残基４２８はフェニルアラニンであるか；またはアミノ酸残基２５０はグルタミンであり、かつアミノ酸残基４２８はロイシンである。
【００１９】
ある実施形態では、天然に存在するＩｇＧクラスの抗体定常領域に対して実質的に同一である定常領域を有するＦｃ融合タンパク質は、天然に存在する抗体に存在するアミノ酸残基とは異なる３１４位置のアミノ酸残基を含み、これによって天然に存在する抗体に対してＦｃＲｎ結合親和性が低下し、そして／または血清半減期が低下している。実施形態は、Ｆｃ融合タンパク質であって、アミノ酸残基３１４がアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンであるＦｃ融合タンパク質を包含する。１つの好ましい実施形態では、アミノ酸残基３１４はアルギニンである。
【００２０】
他の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、天然に存在するＩｇＧクラスの抗体定常領域に存在するＦｃ領域に対して実質的に同一のＦｃ領域を含み、そしてアルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンまたはチロシンからなる群より選択されるアミノ酸残基を２５０位置で含み、それによって天然に存在する抗体に対してＦｃＲｎ結合親和性が低下し、そして／または血清半減期が低下している。同様に、４２８位置におけるアミノ酸残基は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシンまたはバリンからなる群より選択されるアミノ酸残基で置換されてもよく、これによって天然に存在する抗体に対してＦｃＲｎ結合親和性が低下し、そして／または血清半減期が低下している。
【００２１】
本発明はさらに、ＩｇＧクラスのＦｃ融合タンパク質を改変する方法を提供するが、この方法は、アミノ酸残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される重鎖定常領域由来の少なくとも１つのアミノ酸を、未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換する工程であって、これによってこの未改変のＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎについての結合親和性および／または血清半減期の変更が生じる工程を包含する。
【００２２】
本発明はさらに、未改変のＦｃ融合タンパク質に比較して、ＦｃＲｎについて変更された結合親和性および／または変更された血清半減期を有するＩｇＧクラスの改変Ｆｃ融合タンパク質を産生する方法を提供するが、この方法は、
（ａ）免疫グロブリン重鎖の少なくとも１つの定常領域をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結された適切なプロモーターを含む発現ベクター（好ましくは複製可能な発現ベクター）を調製する工程であって、アミノ酸残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される重鎖定常領域由来の少なくとも１つのアミノ酸が、未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換され、これによってＦｃＲｎ結合および／または血清半減期における変更が生じる工程と；
（ｂ）このベクターを用いて宿主細胞を形質転換させる工程と；
（ｃ）この形質転換された宿主細胞を培養して、この改変されたＦｃ融合タンパク質を産生する工程とを包含する。
【００２３】
本発明はまた、重鎖定常領域またはＦｃ領域を含む改変されたＩｇＧクラス抗体フラグメントであって、残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、未改変のＩｇＧクラス抗体に存在するアミノ酸残基とは異なるＩｇＧクラス抗体フラグメントを提供する。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、天然に存在するＩｇＧクラス抗体の重鎖定常領域またはＦｃ領域と実質的に同一の重鎖定常領域またはＦｃ領域を含む改変されたＩｇＧクラスの抗体フラグメントであって、残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が、天然に存在するＩｇＧクラス抗体に存在するアミノ酸残基とは異なる抗体フラグメントを提供する。
【００２５】
本発明は、本明細書に記載される改変Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド配列を提供する。１実施形態では、本発明は、ＩｇＧクラスの部分的または全長の重鎖、例えば、定常領域、Ｆｃ領域またはＣＨ２−ＣＨ３領域であって、本明細書に記載される変異（置換）で改変されているものをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜５７から選択される配列に対して少なくとも９０％同一である配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２６】
本発明はまた、本明細書に記載の改変Ｆｃ融合タンパク質のポリペプチド分子をコードするアミノ酸配列を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１〜５７より選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００２７】
本発明はまた、上記のような改変Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子、またはＩｇＧクラスの抗体の改変された部分的もしくは全長の重鎖、例えば、本明細書に記載される変異（置換）を有する、定常領域、Ｆｃ領域またはＣＨ２−ＣＨ３領域をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターを提供する。
【００２８】
本発明は、本明細書に記載されるように、このようなポリヌクレオチド分子を含むベクターで形質転換された宿主細胞を包含する。好ましい実施形態では、本明細書に記載される改変Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのような原核生物、または酵母、植物、昆虫および哺乳動物を含む真核生物の多細胞生物に由来する。
【００２９】
本発明はまた、変更された半減期を有する本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質、タンパク質および他の生物活性分子を用いる予防および治療の薬学的組成物および方法を包含する。また、変更された半減期を有する本発明の改変されたＦｃ融合タンパク質、タンパク質および他の生物活性分子を用いる診断の方法も包含される。好ましい実施形態では、本発明のアミノ酸置換は、治療または診断のＦｃ融合タンパク質の血清半減期を伸ばすために用いられ得る。例えば、本発明は、対応する未改変のＦｃ融合タンパク質の半減期よりも少なくとも約１．３倍長いインビボ排出半減期を有するＩｇＧクラスの改変された治療用または診断用Ｆｃ融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、この改変された治療用または診断用Ｆｃ融合タンパク質は、対応する未改変のＦｃ融合タンパク質の半減期よりも少なくとも約１．５倍、１．８倍、１．９倍または２．０倍より長いインビボ排出半減期を有する。別の好ましい実施形態では、本発明のアミノ酸改変はまた、治療用または診断用のＦｃ融合タンパク質の血清半減期を低下させるために用いられ得る。このような治療用または診断用のＦｃ融合タンパク質は、当該分野で周知であり、そして本発明の以下の詳細な説明に列挙される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ｉ．変更されたＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質）
本発明がさらに完全に理解され得るように、いくつかの定義を示す。
【００３１】
本明細書において用いる場合、「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、γ（γ１、γ２、γ３、γ４）、δ、εおよびμの定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎｓ）」（約２５ｋＤａまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端でκまたはλの可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）、およびＣＯＯＨ末端のκまたはλの定常領域遺伝子によってコードされる。全長の免疫グロブリン「重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎｓ）」（約５０ｋＤａまたは４４６アミノ酸）は、重鎖可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上述の定常領域遺伝子、例えば、γ（約３３０アミノ酸をコードする）の１つによって同様にコードされる。
【００３２】
抗体の１つの型は、免疫グロブリン鎖の２つの同一の対であって、各々の対が１つの軽鎖および１つの重鎖を有する対からなる四量体である。各々の対では、軽鎖および重鎖の可変領域は一緒になって、抗原に対する結合を担い、そして定常領域は、抗体のエフェクター機能を担う。四量体抗体に加えて、免疫グロブリンは、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂおよび（Ｆａｂ’）２、ならびに二機能性のハイブリッド抗体を含む種々の他の形態で（例えば，ＬａｎｚａｖｅｃｃｈｉａおよびＳｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０５〜１１１（１９８７））、そして単鎖で（例えば、各々が本明細書において参照によって援用される、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３（１９８８）、およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６（１９８８））存在してもよい。
【００３３】
本明細書において用いる場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語はまた、免疫グロブリンの、遺伝子操作されるかそうでなければ改変された形態、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、異種結合体化抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）および四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ））、ならびに例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖフラグメントを含む抗体の抗原結合フラグメントを包含する。この用語はまた、免疫グロブリンの遺伝子操作型またはそうでなければ改変型、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、異種結合体化抗体（例えば、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体および四重特異性抗体）、ならびに例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧおよびｓｃＦｖフラグメントを含む抗体の抗原結合フラグメントを包含する。
【００３４】
本明細書において用いる場合、「ヒト（ｈｕｍａｎ）」抗体とは、下に記載されるように、そして例えば、参照によって本明細書に援用される米国特許第５，９３９，５９８号（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら）に記載されるように、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を包含し、そしてヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニック動物で内因性の免疫グロブリンを発現しない動物から単離された抗体を包含する。
【００３５】
本明細書において用いる場合「ＩｇＧクラスの抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ＩｇＧ  ｃｌａｓｓ）」とは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の抗体をいう。重鎖および軽鎖におけるアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）；このＥＵナンバリングスキームを本明細書の以降において用いる）のナンバリングである。
【００３６】
本明細書において用いる場合、「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、少なくとも２つの遺伝子の融合から得られる発現産物をいう。「Ｆｃ融合タンパク質（Ｆｃ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」とは、無関係のタンパク質またはタンパク質フラグメントに対して融合されるかまたは結合体化された抗体のＦｃ領域または定常領域を含むキメラポリペプチドである。
【００３７】
本発明は、Ｆｃ領域のアミノ酸配列が天然に存在するかまたは以前に改変された（例えば、キメラ）抗体において見出されるＦｃ領域または定常領域のアミノ酸配列に対して変更されている「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」Ｆｃ融合タンパク質を提供する。例えば、前に設計された機能的なＦｃ融合タンパク質（すなわち、「未改変（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）」Ｆｃ融合タンパク質）はさらに、ＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期の所望の特性を得るために、本発明による変異で操作され（すなわち「改変され」）てもよい。本発明で有用な変更されたＦｃ融合タンパク質のあり得る改変体は多く、そして１つだけまたは２〜３のアミノ酸の変化から、例えば定常領域の完全な再設計までにおよぶ。定常領域における変化は、一般に、種々のＦｃγレセプターとの結合相互作用および／または他の免疫グロブリンエフェクター機能のような特徴を改善または変更（すなわち、増大または低下）するために行なわれる。好ましい実施形態では、本発明は、未改変のＦｃ融合タンパク質に対して変更された血清半減期またはＦｃＲｎ結合親和性を有する「改変された」Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【００３８】
本発明は、Ｆｃドメインが任意の種の「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）」抗体のＦｃ領域または定常領域に由来する、「改変された」（すなわち変異の）Ｆｃ融合タンパク質を作製するために用いられ得る。「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）」抗体とは、宿主動物によって産生される抗体をいう。非限定的な例示の本発明の「天然に存在する」抗体としては、ヒト、ニワトリ、ヤギおよびげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスターおよびウサギ）そしてヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたトランスジェニックげっ歯類を含むげっ歯類によって産生される抗体が挙げられる（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｌｏｎｂｅｒｇら、ＷＯ９３／１２２２７；米国特許第５，５４５，８０６号；およびＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＷＯ９１／１０７４１；米国特許第６，１５０，５８４号を参照のこと）。
【００３９】
本発明の「改変された」Ｆｃ融合タンパク質はまた、対応する天然に存在する抗体に対して機能的に等価である遺伝子操作された抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化抗体）由来の「未改変の（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ）」Ｆｃ融合タンパク質から操作されてもよい。改善された安定性および／または治療的有効性を提供するように遺伝子操作された抗体由来のＦｃ融合タンパク質が好ましい。遺伝子操作された抗体の例としては、機能的または結合の有用性を有意に有害に変更しない、アミノ酸残基の保存的置換、およびアミノ酸の１つ以上の欠失または付加を有する抗体が挙げられる。結合または機能の有用性が維持される限り、置換は、１つ以上のアミノ酸を変更または改変することから、ある領域の完全な再設計におよんでもよい。本発明のＦｃ融合タンパク質は、翻訳後に変更されてもよい（例えば、アセチル化およびリン酸化）し、または合成的に変更されてもよい（例えば、標識基の付加）。
【００４０】
本発明はまた、「未改変の」Ｆｃ融合タンパク質から操作された「改変された」Ｆｃ融合タンパク質であって、その生物活性部位、例えば、リガンド結合部位、Ｆｃレセプター結合部位、または補体結合部位が、野性型に比較してそのような活性を増大または低下するような遺伝子操作によって以前に改変されているＦｃ融合タンパク質を作製するために用いられてもよい。
【００４１】
さらに、本発明は、天然の抗体と同じアミノ酸配列を有する組み換え抗体に由来するＦｃドメインを有する「改変された」Ｆｃ融合タンパク質を作製するために用いられてもよい。それらは、原核生物および真核生物の両方の発現系を含む任意の発現系において、またはファージディスプレイ方法を用いて作製され得る（例えば、その全体が参照によって本明細書に援用される、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらＷＯ９２／０１０４７；米国特許第５，９６９，１０８号を参照のこと）。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「天然に存在するＩｇＧクラスの抗体定常領域に対して実質的に同一の定常領域を有するＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ  ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｔｏ  ａ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ  ｃｌａｓｓ  ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ）」とは、Ｆｃ融合タンパク質であって、存在する任意の定常領域が天然に存在するＩｇＧクラスの抗体の定常領域のアミノ酸配列に対して実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、そして好ましくは少なくとも約９５％同一であるＦｃ融合タンパク質をいう。
【００４３】
２つ以上のアミノ酸またはヌクレオチド配列の文脈において「同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」パーセントという用語は、下に記載するデフォールトパラメータを用いるＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを用いて、またはマニュアルアラインメントおよび視覚的検査によって、測定した場合、同じであるかまたは同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定の割合を有する（すなわち、比較ウインドウまたは指定の領域にまたがって最大一致について比較かつ整列した場合、特定の領域にまたがって約６０％同一、好ましくは７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性）２つ以上の配列またはサブ配列をいう（例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにあるＮＣＢＩウェブサイトのＢＬＡＳＴの説明を参照のこと）。そこで、このような配列は「実質的に同一（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）」と呼ばれる。この定義はまた、試験配列の相補体をいうか、またはそれに適用されてもよい。この定義はまた欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列、ならびに天然に存在する、例えば、多形性または対立遺伝子改変体、および人工の改変体を包含する。配列同一性を測定するための周知のアルゴリズムは、ギャップなどを説明し得る。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５のアミノ酸またはヌクレオチド長の領域にまたがって、さらに好ましくは５０〜１００のアミノ酸またはヌクレオチド長の領域にまたがって存在する。
【００４４】
本発明のＦｃ融合タンパク質は、任意の認識された免疫グロブリンアイソタイプを含んでもよいが、４つのＩｇＧアイソタイプが好ましく、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が特に好ましい。１実施形態では、本発明はまた、重鎖定常領域または本明細書に開示の１つ以上のアミノ酸置換で改変されたＦｃ領域を含むあるポリペプチドまたはこの単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。次いで、改変されたＩｇＧ抗体フラグメントに相当するこれらの単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、改変されたＦｃ融合タンパク質を生成するために用いられ得る。米国特許第５，８３４，５９７号（その全体が参照によって本明細書に援用される）に記載される、低下したエフェクター機能、例えば、ＩｇＧ２Ｍ３および他のＩｇＧ２変異体を有するように変異された定常領域を有する抗体由来のＦｃ融合タンパク質が包含される。好ましい局面では、本発明の未改変および改変されたＦｃ融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Ｍ３、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む。
【００４５】
さらに、本発明の「改変された」Ｆｃ−融合タンパク質は、任意の所定の動物のＩｇＧサブクラス由来のＦｃ領域を含んでもよい。例えば、ヒトでは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むＩｇＧクラス；マウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３を含むＩｇＧクラス；ラットではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３を含むＩｇＧクラス。特定のＩｇＧサブクラス、例えば、ラットＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ２ｃは、例えば、ＩｇＧ１よりも高いクリアランス速度を有することが公知である（Ｍｅｄｅｓａｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２０９２〜２１００（１９９８））。従って、ＩｇＧ１以外のＩｇＧサブクラスを用いる場合、特にＩｇＧ１のものを有するＩｇＧ１配列とは異なるＣＨ２およびＣＨ３ドメインでは、１つ以上の残基を置換して、これによって他のタイプのＩｇＧのインビボ半減期を増大させることが有利であり得る。
【００４６】
本発明の「改変された」Ｆｃ融合タンパク質を作製するために用いられる無関係のタンパク質またはタンパク質フラグメント（すなわち、非免疫グロブリン部分）は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物に由来してもよい。好ましくは、このタンパク質は、ヒト、げっ歯類、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリの抗体由来である。
【００４７】
なかでも、本発明によって提供される「改変された」Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択されるＩｇＧ重鎖定常領域由来の少なくとも１つのアミノ酸が未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸とは異なる別のアミノ酸で置換されるＩｇＧクラスの抗体（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体）である。重鎖中の残基のナンバリングは、ＥＵインデックスのものである（Ｋａｂａｔら、前掲）。本発明によれば、置換は、２５０、３１４または４２８の位置単独で行なわれても、またはそれらの任意の組み合わせで、例えば２５０位および４２８位で、または２５０位および３１４位で、または３１４位置および４２８位置で、または２５０位置、３１４位および４２８位で行なわれてもよく、好ましい組み合わせは２５０位および４２８位である。各々の位置について、置換アミノ酸は、未改変のＦｃ融合タンパク質の位置に存在するアミノ酸とは異なる任意のアミノ酸残基であってもよい。これらの部位の１つ以上での改変は、本発明によれば、このようにして、未改変のＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎについての結合親和性および／または血清半減期に比較して、改変されたＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎについての結合親和性および／または血清半減期を変更する。
【００４８】
３１４位については、置換するアミノ酸残基は、トレオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、これには、限定はしないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、バリン、トリプトファンまたはチロシンが挙げられる。
【００４９】
３１４位については、置換するアミノ酸残基は、ロイシン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、これには、限定はしないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンが挙げられる。
【００５０】
４２８位については、置換するアミノ酸残基は、メチオニン以外の任意のアミノ酸残基であってもよく、これには、限定はしないが、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、ロイシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、トレオニン、バリン、トリプトファンまたはチロシンが挙げられる。
【００５１】
本発明は、上記のアミノ酸置換の少なくとも１つを含む改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。例えば、本発明は、２５０、３１４および／または４２８の位置で上述の置換基の２つを含む変異したＩｇＧ１定常領域を提供する。本発明によって提供される定常領域のいくつかの特異的な置換（すなわち、変異）のアミノ酸配列は、表１に開示される（配列番号１〜５７）。
【００５２】
【表１】
2007531707.tif 000002
本発明の「改変された」Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトおよびインビトロの検出アッセイにおけるこの改変Ｆｃ融合タンパク質のインビボ使用を含む多くの用途を有し、本発明によって改変されている（すなわち、変異されている）ヒトＦｃ融合タンパク質を使用することが好ましいかもしれない。
【００５３】
例えば、本発明は、治療用Ｆｃ融合タンパク質の改変をしてインビボ半減期を増大させ、これによって治療用Ｆｃ融合タンパク質のより少ない有効投薬量および／またはより少ない頻度の投薬を可能にする。インビボ半減期を増大するためのこのような改変はまた、同様に診断用Ｆｃ融合タンパク質を改善するためにも有用であり得る。例えば、診断用Ｆｃ融合タンパク質の増大した血清半減期によって、より低用量の投与で十分な診断感度を達成することが可能になる。あるいは、血清半減期の減少は、診断用Ｆｃ融合タンパク質の急速なクリアランスが所望される適用において有利であり得る。
【００５４】
本発明は、未改変のＦｃ融合タンパク質に比較してＦｃＲｎについて増大した結合親和性および／または増大した血清半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質であって、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０または４２８が未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸残基とは異なる別のアミノ酸残基で置換されている改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。好ましくは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０は、グルタミン酸またはグルタミンで置換される。あるいは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８は、フェニルアラニンまたはロイシンで置換される。
【００５５】
１実施形態では、この改変されたＦｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ２、またはＩｇＧ２Ｍ３、またはＩｇＧ３、またはＩｇＧ４分子の重鎖定常領域を含む。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Ｍ３、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４は、２５０位でトレオニン残基を、そして４２８位でメチオニン残基を有する。本発明によれば好ましくは、２５０位のトレオニン残基は、グルタミン酸（Ｔ２５０Ｅ）またはグルタミン（Ｔ２５０Ｑ）で置換されて、４２８位のメチオニン残基は、フェニルアラニン（Ｍ４２８Ｆ）またはロイシン（Ｍ４２８Ｌ）で置換される。
【００５６】
本発明は、未改変のＦｃ融合タンパク質および／または２５０位または４２８位のみに上記のアミノ酸置換を有する改変されたＦｃ融合タンパク質に比較して、ＦｃＲｎについての増大した結合親和性および／または増大した血清半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質を提供する。このアミノ酸改変は、以下の置換のいずれか１つであってもよい：
１）重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０が、グルタミン酸で置換され、かつ重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８が、フェニルアラニンで置換される；
２）重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０が、グルタミンで置換され、かつ重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８が、フェニルアラニンで置換される；
３）重鎖定常領域由来のアミノ酸残基２５０が、グルタミンで置換され、そして重鎖定常領域由来のアミノ酸残基４２８が、ロイシンで置換される。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、改変されたＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎについての結合親和性および／または血清半減期は、少なくとも約３０％、５０％、８０％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または１００倍まで増大される。
【００５８】
あるいは、本発明は、未改変のＦｃ融合タンパク質に比較してＦｃＲｎについて減少した結合親和性および／または減少した血清半減期を有する改変されたＦｃ融合タンパク質であって、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基３１４が未改変のＦｃ融合タンパク質に存在するアミノ酸残基とは異なる別のアミノ酸残基で置換されている改変Ｆｃ融合タンパク質を提供する。３１４位置でアミノ酸置換を有する改変Ｆｃ融合タンパク質は、減少した結合親和性を示すことが示されており、このことは、抗体の血清半減期の減少が所望される場合、３１４位が改変されるべきであるということを示唆する。好ましくは、重鎖定常領域由来のアミノ酸残基３１４は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンで置換される。さらに好ましくは、アミノ酸置換は、３１４位においてロイシンからアラニンまたはアルギニンである。
【００５９】
（ＩＩ．変更されたＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質の産生）
本発明は、変更されたＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質を産生するための方法を提供する。一般に、この方法は、本明細書に記載される１つ以上の位置（例えばアミノ酸残基２５０、３１４および４２８）でアミノ酸を置換することによってＩｇＧクラスの所定のＦｃ融合タンパク質を改変する工程を包含する。これらの改変は、化学的に達成されても、または標準的な組み換えＤＮＡ技術を用いるランダムもしくは部位指向性の変異誘発によって達成されてもよい。例えば、部位指向性の変異誘発は、未改変のＦｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡにアミノ酸置換を導入するために用いられ得る。次いで、この得られた変異ＤＮＡを発現ベクターに挿入して、宿主細胞に送達し、ここで改変された融合タンパク質を産生して、分泌して最終的に精製する。
【００６０】
（Ｆｃ融合タンパク質）
本明細書の方法で有用な融合タンパク質は、標準的な組み換えＤＮＡ技術によって、またはタンパク質合成技術、例えば、ペプチドシンセサイザーの使用によって、産生され得る。例えば、融合タンパク質をコードする核酸分子は、自動化ＤＮＡシンセサイザーを含む従来の技術によって合成され得る。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子フラグメントの間の相補的なオーバーハングを生じるアンカープライマーを用いて行なうことが可能で、これは引き続いてアニーリングされて再増幅され、キメラ遺伝子配列を生成し得る（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．（１９９２）を参照のこと）。さらに、生物活性分子をコードする核酸は、この生物活性分子が定常ドメインまたはそのフラグメントに対してインフレームで連結されるように、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントを含む発現ベクターにクローニングされてもよい。
【００６１】
抗体の定常領域に対するポリペプチドの融合または結合体化のための方法は、当該分野で公知である。例えば、その各々がその全体において参照によって本明細書に援用される、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，７２３，１２５号、同第５，７８３，１８１号、同第５，９０８，６２６号、同第５，８４４，０９５号および同第５，１１２，９４６号；欧州特許公開番号ＥＰ０３０７４３４；ＥＰ０３６７１６６；ＥＰ０３９４８２７；ＰＣＴ国際公開ＷＯ９１／０６５７０、ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９６／２２０２４、ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９９／０４８１３；Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５３５〜１０５３９（１９９１）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４〜８６（１９８８）；Ｚｈｅｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０〜５６００（１９９５）；およびＶｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１１３３７〜１１３４１（１９９２）を参照のこと。
【００６２】
本発明の方法で用い得る生物活性タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列は、当業者に利用可能な任意の情報（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ、文献または慣用的なクローニングによって）から得ることが可能であり、そしてＦｃＲｎについて増大した親和性を有する定常ドメインまたはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列は、本明細書に記載の技術を用いて生成される変異体の配列分析によって決定されてもよいし、またはＧｅｎｂａｎｋもしくは文献から得てもよい。融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必須のエレメントを含むベクターに挿入されてもよい。種々の宿主ベクター系は、タンパク質コード配列を発現するために本発明において利用され得る。これらとしては、限定はしないが、ウイルスで感染された哺乳動物細胞系（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母のような微生物；またはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌が挙げられる。ベクターの発現エレメントは、強度および特異性が変化する。利用される宿主ベクター系に依存して、任意の多数の適切な転写および翻訳エレメントが用いられ得る。
【００６３】
（Ｆｃ融合タンパク質の改変）
一般に、インビボ安定性の変更された改変Ｆｃ融合タンパク質は、このようなタンパク質をコードするＤＮＡセグメントが改変された抗体の定常領域とインフレームで、上流または下流のいずれかで、このベクターが、定常領域と作動可能に連結されたこのようなタンパク質を含む融合タンパク質を発現し得るような位置で、組み換えベクター中に作動可能に連結されることによって作製され得る。例えば、制限エンドヌクレアーゼを用いる遺伝子操作による、この様式におけるＤＮＡセグメントの操作のための技術は、本発明の開示、およびＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）のような参照の両方に照らして当業者に公知である。
【００６４】
好ましくは、未改変のＦｃ融合タンパク質に比較して、ＦｃＲｎについての変更された結合親和性および変更された血清半減期を有するＩｇＧクラスの改変されたＦｃ融合タンパク質は、
（ａ）免疫グロブリン重鎖の少なくとも１つの定常領域および適切な融合部分をコードするＤＮＡに対して作動可能に連結された適切なプロモーターを含む複製可能な発現ベクターを調製する工程であって、アミノ酸残基２５０、３１４および４２８からなる群より選択される重鎖定常領域由来の少なくとも１つのアミノ酸が、未改変の重鎖に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸で置換され、これによってＦｃＲｎ結合および／または血清半減期における変更が生じる工程と；
（ｂ）このベクターを用いて宿主細胞を形質転換させる工程と；
（ｃ）この形質転換された宿主細胞を培養して、この改変されたＦｃ融合タンパク質を産生する工程と、を包含する方法によって産生され得る。
【００６５】
工程（ａ）においてＤＮＡを生成するため、アミノ酸置換は、限定はしないが、部位指向性変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８〜４９２（１９８５））、ＰＣＲ変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ１７７〜１８３（１９９０））およびカセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ  ３４：３１５〜３２３（１９８５））を含む変異誘発によって導入され得る。好ましくは、部位指向性変異誘発は、実施例に開示される、オーバーラップ−エクステンションＰＣＲ法によって行なわれる（Ｈｉｇｕｃｈｉ，「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ６１〜７０（１９８９））。
【００６６】
オーバーラップ−エクステンション（ｏｖｅｒｌａｐ−ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）ＰＣＲの技術（Ｈｉｇｕｃｈｉ，同書）を用いて、標的配列（出発ＤＮＡ）に任意の所望の変異（単数または複数）を導入することができる。例えば、オーバーラップ−エクステンション方法における初回のＰＣＲは、外側のプライマー（プライマー１）と内部変異誘発プライマー（プライマー３）を用い、別に第二の外側プライマー（プライマー４）と内部プライマー（プライマー２）を用いて標的配列を増幅して、２つのＰＣＲセグメント（セグメントＡおよびＢ）を作製する工程を包含する。内部変異誘発プライマー（プライマー３）は、所望の変異（単数または複数）を特定する標的配列に対するミスマッチを含むように設計される。２回目のＰＣＲでは、初回のＰＣＲの産物（セグメントＡおよびＢ）を、２つの外側のプライマー（プライマー１および４）を用いてＰＣＲによって増幅する。得られた全長ＰＣＲセグメント（セグメントＣ）を、制限酵素で消化して、得られた制限フラグメントを適切なベクターにクローニングする。
【００６７】
変異誘発の初回工程として、出発ＤＮＡを変異誘発ベクターに作動可能に連結する。所望のアミノ酸置換を反映するようにプライマーを設計する。１実施形態では、インビトロ変異誘発のために用いられるベクターは、タンパク質発現を指向するために用いられ得る。従って、所望の変異を有するＤＮＡを含む発現ベクターが作製されるように、オーバーラップ−エクステンションＰＣＲで得られたＤＮＡを変異誘発ベクター中にクローニングして戻してもよい。出発ＤＮＡは、改変されるアミノ酸残基が含まれる限り、未改変のＦｃ融合タンパク質全体、未改変のＦｃ融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖全体、重鎖の定常領域、または未改変のＦｃ融合タンパク質の重鎖定常領域の一部をコードするＤＮＡであってもよい。
【００６８】
未改変のＦｃ融合タンパク質全体をコードするＤＮＡが変異誘発のための出発ＤＮＡとして用いられる場合、改変Ｆｃ融合タンパク質の全体は、本明細書に記載の方法の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を行なうことによって産生し得る。変異誘発のための出発ＤＮＡが重鎖定常領域の一部、例えばＣＨ２−ＣＨ３セグメントまたはＦｃドメインをコードするＤＮＡである場合、このような改変された部分的重鎖をコードする得られたＤＮＡを、残りの融合部分とインフレームで最初に接続して、その結果、工程（ａ）における本明細書において記載された改変を有するＦｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡが生成される。改変された部分的重鎖および残りの融合部分をコードするＤＮＡの接続は、分子生物学の当該分野で公知の標準的な分子クローニング技術、例えば、制限消化およびライゲーションを用いることによって達成され得る（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第三版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１））。
【００６９】
一般には、Ｆｃ融合タンパク質をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を保証する、発現ベクター（単数または複数）における配列を制御するように作動可能に連結され得る。このような制御配列としては、シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、および転写終止配列が挙げられる（全ての目的のためにその全体が参照によって本明細書に援用される、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３（１９８９）；ＷＯ  ９０／０７８６１；Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９〜１１５４（１９９２）；「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ」，Ｂｏｏｒｅｂａｅｃｋ編、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７）を参照のこと）。発現系および調節のためのさらなる方法および戦略は以下に記載される。
【００７０】
宿主細胞を、リポソーム、リン酸カルシウム、エレクトロポレーションなど（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、前掲）のような当該分野で公知の技術を用いることによって形質転換する。好ましくは、宿主細胞は、リポソーム法を用いて一過性にトランスフェクトされる。さらに好ましくは、宿主細胞は、エレクトロポレーション法を用いて安定にトランスフェクトされる。本発明の改変されたＦｃ融合タンパク質を産生するために用いられる宿主細胞は、当該分野で公知の種々の培地中で培養され得る。
【００７１】
（Ｆｃ融合タンパク質のための発現系）
Ｅ．ｃｏｌｉは、本発明のＤＮＡ配列をクローニングおよび／または発現するために特に有用な原核生物宿主の１つである。使用に適切な他の微生物宿主としては、桿菌、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよび他の腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、および種々のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種が挙げられる。これらの原核生物宿主ではまた、宿主細胞と適合する発現制御配列（例えば、複製起点）を代表的には含む発現ベクターを作製し得る。さらに、多数の種々の周知のプロモーター、例えば、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、βラクタマーゼプロモーター系、またはλファージ由来のプロモーター系が存在し得る。プロモーターは代表的には、必要に応じてオペレーター配列を用いて発現を制御し、そして、転写および翻訳を開始および終了するために、リボソーム結合部位配列などを有する。
【００７２】
他の微生物、例えば、酵母も、発現のために用いられ得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは好ましい宿主であり、適切なベクターは、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素を含む、プロモーター、および必要に応じて、複製起点、終止配列などのような発現制御配列を有する。
【００７３】
植物および植物細胞培養物は、本発明のＤＮＡ配列の発現のために用いられ得る（ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：１７２〜１８９（１９９１）；Ｂｅｎｖｅｎｕｔｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７：８６５〜８７４（１９９１）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：２８１〜２９３（１９９０）；Ｈｉａｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：７６〜７８（１９８９））。好ましい植物宿主としては、例えば、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ，Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｒｕｓｔｉｃａおよびＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍが挙げられる。本発明の改変されたＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を発現するための好ましい発現カセットは、プラスミドｐＭＯＧ１８であり、これには改変Ｆｃ融合タンパク質をコードする挿入されたポリヌクレオチド配列がＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターに対して複製されたエンハンサーとともに作動可能に連結されている；ｐＭＯＧ１８は、Ｓｉｊｍｏｎｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：２１７〜２２１（１９９０）の方法に従って用いられる。あるいは、植物における改変Ｆｃ融合タンパク質の発現のための好ましい実施形態は、Ｈｉａｔｔら（前出）の方法に従うが、Ｈｉａｔｔら（前出）によって用いられる免疫グロブリン配列のための本発明の改変されたＦｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が置き換えられている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓ  Ｔ−ＤＮＡベースのベクターはまた、本発明のＤＮＡ配列を発現するために用いられ得る；好ましくはこのようなベクターは、スペクチノマイシン耐性または別の選択マーカーをコードするマーカー遺伝子を含む。
【００７４】
昆虫細胞培養物も、代表的にはバキュロウイルスベースの発現系を用いて、本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質を産生するために用いられ得る。改変Ｆｃ融合タンパク質は、Ｐｕｔｌｉｔｚら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：６５１〜６５４（１９９０）の方法に従って、改変Ｆｃ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を発現することによって生成されてもよい。
【００７５】
微生物および植物に加えて、哺乳動物細胞培養物がまた、本発明のポリペプチドを発現および生成するために用いられ得る（「Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ」，Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）。哺乳動物細胞が現実には好ましい、なぜならインタクトなＦｃ融合タンパク質を分泌し得る多数の適切な宿主細胞株が当該分野で開発されているからであり、これにはＣＨＯ細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、好ましくは骨髄腫細胞株など、または形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマが挙げられる。これらの細胞のための発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９〜６８（１９８６））および必須の情報処理部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写終止配列を含んでもよい。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターである。一般には、選択マーカー、例えば、ネオ発現カセットが発現ベクターに含まれる。
【００７６】
融合タンパク質の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーターまたはエンハンサーによって制御され得る。融合タンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するために用いられ得るプロモーターとしては、限定はしないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４〜３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７〜７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１〜１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９〜４２（１９８２））、テトラサイクリン（Ｔｅｔ）プロモーター（Ｇｏｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７〜５５５１（１９９５））；原核生物発現ベクター、例えば、βラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７〜３７３１（１９７８））、またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１〜２５（１９８３））；また、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２：７４〜９４（１９８０）の「Ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」も参照のこと；ノパリンシンテターゼプロモーター領域を含む植物発現ベクター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９〜２１３（１９８３））またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．９：２８７１（１９８１））、および光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５〜１２０（１９８４））；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント、例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を示して、トランスジェニック動物に利用されている以下の動物の転写制御領域：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９〜６４６（１９８４）；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９〜４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５〜５１５（１９８７））；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５〜１１２（１９８５））、リンパ球において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７〜６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３〜５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：��４３６〜１４４４（１９８７））、精巣、乳房、リンパおよび肥満細胞において活性であるマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５〜４９５（１９８６））、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８〜２７６（１９８７））、肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９〜１６４８（１９８５）；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：３〜５８（１９８７））；肝臓において活性なα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：１６１〜１７１（１９８７））、骨髄細胞において活性であるβグロブリン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８〜３４０（１９８５）；Ｋｏｌｌｉａｎｓら、Ｃｅｌｌ  ４６：８９〜９４（１９８６））；脳の乏突起膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３〜７１２（１９８７））；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３〜２８６（１９８５））；神経細胞において活性であるニューロン特異的エノラーゼ（ｎｅｕｒｏｎａｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｏｌａｓｅ）（ＮＳＥ）（Ｍｏｒｅｌｌｉら、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１〜８３（１９９９））；神経細胞において活性である脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子制御領域（Ｔａｂｕｃｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５３：８１８〜８２３（１９９８））；アストロサイトにおいて活性であるグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター（Ｇｏｍｅｓら、Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３２：６１９〜６３１（１９９９）；Ｍｏｒｅｌｌｉら、Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：５７１〜８３（１９９９））および視床下部において活性である生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２〜１３７８（１９８６））。
【００７７】
特定の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質の発現は、構成的プロモーターによって調節される。別の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーターによって調節される。これらの実施形態によれば、このプロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。特定の実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質コード核酸に対して作動可能に連結されたプロモーター、１つ以上の複製起点および必要に応じて１つ以上の選択マーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターが用いられる。
【００７８】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、配列をコードする融合タンパク質は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部分のリーダー配列に対して連結されてもよい。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボの組み換えによってアデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非本質的な領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能であって、感染した宿主においてＦｃ融合タンパク質分子を発現し得る組み換えウイルスを生じる（例えば、ＬｏｇａｎおよびＳｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３５５〜３５９（１９８４）を参照のこと）。特定の開始シグナルがまた、挿入された融合タンパク質コード配列の効率的な翻訳に必要であり得る。これらのシグナルとしてはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。
【００７９】
さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために所望のコード配列のリーディングフレームとインフェーズでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の種々の起点であり得る。
【００８０】
発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの包含によって増強され得る（Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４（１９８７）を参照のこと）。
【００８１】
融合タンパク質をコードする遺伝子のインサートを含む発現ベクターは、３つの遺伝的アプローチによって同定され得る：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無、および（ｃ）挿入された配列の発現。最初のアプローチでは、発現ベクター中の融合タンパク質をコードする遺伝子の存在は、融合タンパク質をコードする挿入された遺伝子に対して相同である配列を含むプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第二のアプローチでは、組み換えベクター／宿主系は、このベクターにおける融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の挿入によって生じる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成など）の有無に基づいて同定および選択され得る。例えば、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、融合タンパク質インサートをコードする遺伝子を含む組み換え体は、マーカー遺伝子機能がないことによって同定され得る。第三のアプローチでは、組み換え発現ベクターは、組み換え体によって発現される遺伝子産物（すなわち、融合タンパク質）をアッセイすることによって同定され得る。このようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系における融合タンパク質の物理的または機能的特性、例えば抗生物活性分子の抗体との結合に基づいてもよい。
【００８２】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または遺伝子産物を所望の特定の様式に改変して処理する宿主細胞株が選択され得る。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導因子の存在で上昇され得る；このように、遺伝子操作された融合タンパク質の発現は制御され得る。
【００８３】
さらに、種々の宿主細胞が翻訳および翻訳後のプロセシングおよび改変（例えば、タンパク質のグリコシル化またはリン酸化）について特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の所望の改変およびプロセシングを確実にするように選択され得る。例えば、細菌系における発現は、非グリコシル化産物を生成して、酵母における発現は、グリコシル化産物を生成する。遺伝子産物の一時的な転写、グリコシル化およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞機構を保有する真核生物宿主細胞が用いられ得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、限定はしないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、そして詳細には、神経細胞株、例えばＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺヒト神経芽細胞腫（Ｓｕｇｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．７３：５１〜５７（１９８４））、ＳＫ−Ｎ−ＳＨヒト神経芽細胞腫（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ７０４：４５０〜４６０（１９８２））、Ｄａｏｙヒト小脳髄芽腫（Ｈｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：１１４４〜１１４８（１９９２））、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧグリア芽細胞腫（Ｋｒｕｓｅら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２８Ａ：６０９〜６１４（１９９２））、ＩＭＲ−３２ヒト神経芽細胞腫（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３０：２１１０〜２１１８（１９７０））、１３２Ｎ１ヒト星状細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：４８１６（１９９７））、ＭＯＧ−Ｇ−ＣＣＭヒト星状細胞腫（Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ４９：２６９（１９８４））、Ｕ８７ＭＧヒトグリア芽細胞腫−星状細胞腫（Ａｃｔａ  Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７４：４６５〜４８６（１９６８））、Ａ１７２ヒトグリア芽細胞腫（Ｏｌｏｐａｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５２：２５２３〜２５２９（１９９２））、Ｃ６ラットグリオーマ細胞（Ｂｅｎｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １６１：３７０〜３７１（１９６８））、Ｎｅｕｒｏ−２ａマウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６５：１２９〜１３６（１９７０））、ＮＢ４１Ａ３マウス神経芽細胞腫（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：１１８４〜１１９０（１９６２））、ＳＣＰヒツジ脈絡叢（Ｂｏｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４８：２１１〜２２１（１９９４））、Ｇ３５５−５、ＰＧ−４ネコ正常星状細胞（Ｈａａｐａｌａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５３：２７〜８３３（１９８５））、Ｍｐｆフェレット脳（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  １８：５２〜９６０（１９８２））など、および正常細胞株、例えば、ＣＴＸ  ＴＮＡ２ラット正常脳皮質（Ｒａｄａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６４６７〜６４７１（１９９２））、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどが挙げられる。さらに、異なるベクター／宿主発現系が、プロセシング反応を種々の程度まで発効し得る。
【００８４】
長期間にわたる、組み換えタンパク質の高い収率の産生、安定な発現が好ましい。例えば、Ｆｃ融合タンパク質を安定に発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、など）によって制御されるＤＮＡおよび選択マーカーで形質転換されてもよい。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、富化培地中で１〜２日間増殖させられてもよく、次いで選択培地に切り換えられる。組み換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性を付与して、細胞がその染色体にプラスミドを安定に組み込んで、増殖して焦点を形成することを可能にし、これが次にクローニングされて、細胞株に増殖され得る。この方法は、示差的に発現されるかまたは経路の遺伝子のタンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に用いられ得る。このように操作された細胞株は、示差的に発現されるかまたは経路の遺伝子のタンパク質の内因性の活性に影響する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【００８５】
限定はしないが以下を包含する、多数の選択システムが用いられ得る：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９９７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａおよびＳｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６（１９６２））、そしてアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））遺伝子は、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗剤耐性が、メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））という遺伝子についての選択の基礎として用いられ得る。
【００８６】
（精製）
改変Ｆｃ融合タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元または非還元のタンパク質ゲル分析を用いるゲル電気泳動、または当該分野で公知の任意の他の技術によって確認される。ＥＬＩＳＡはまた、改変Ｆｃ融合タンパク質の発現およびそのＦｃ融合タンパク質の量の両方を検出するために用いられ得る。
【００８７】
本明細書に記載される改変Ｆｃ融合タンパク質は、細胞内で生成されても、細胞膜周辺腔で生成されても、または培地中に直接分泌されてもよい。好ましくは、本発明における改変Ｆｃ融合タンパク質は、培養培地に分泌される。改変Ｆｃ融合タンパク質を生成する宿主細胞培養物の培地を収集して、細胞の破片を遠心分離によってスピンダウンする。この上清を収集して、タンパク質発現アッセイに供する（さらに詳細には実施例を参照のこと）。
【００８８】
本発明のＦｃ融合タンパク質が組み換え発現によって一旦生成されれば、限定はしないが濾過およびクロマトグラフィー（例えば、プロテインＡによるアフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびゲル濾過）、遠心分離、示差的な溶解度を包含する当該分野で公知の技術を用いて、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技術によって、この融合タンパク質は精製され得る。薬学的処方物における使用のためのＦｃ融合タンパク質の最小の受容可能な純度は、９０％であり、９５％が好ましく、９８％がさらに好ましく、そして９９％以上が最も好ましい。
【００８９】
（Ｆｃ融合タンパク質の結合アッセイ）
産生されたＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎについての結合親和性は、ＦｃＲｎに対する結合の最適条件であるｐＨ６．０で競合結合アッセイを行うことによって検出され得る。結合親和性は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ビーズのような固体基板上にＦｃＲｎを固定することによって試験され得る。あるいは、結合親和性は、ＥＬＩＳＡを用いて評価され得る。好ましくは、本発明は、細胞ベースの系において競合結合アッセイを行なうことによって結合親和性を試験する。産生された改変Ｆｃ融合タンパク質および未改変のＦｃ融合タンパク質の連続希釈を、細胞株、好ましくはＮＳ０細胞株上で発現されたＦｃＲｎに対する結合について比較する。競合結合アッセイを行なうための実験手順は、以下の実施例に詳細に記載される。
【００９０】
本発明における実験によって、同様の結合親和性の結果が、精製されたＦｃ融合タンパク質またはＦｃ融合タンパク質を産生する細胞の培養上清で達成され得るということが示される。従って、結合親和性の所望の変更が達成されていることを確実にするために、上清を直接用いて、産生されたＦｃ融合タンパク質のＦｃＲｎについての結合親和性を試験してもよい。このような確認後、産生されたＦｃ融合を、さらに複雑な精製手順に供する。
【００９１】
直接結合アッセイをまた、改変Ｆｃ融合タンパク質がｐＨ依存性の様式でＦｃＲｎに対して結合することを確認するために行なうべきである。詳細には、ＦｃＲｎに対する改変Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性は、ｐＨ６．０およびｐＨ８．０の両方で試験する（さらに詳細には実施例を参照のこと）。一般に、改変Ｆｃ融合タンパク質の結合親和性はｐＨ６．０でｐＨ８．０の結合親和性を超えるはずである。
【００９２】
生物学的な安定性（または血清半減期）は、種々のインビトロまたはインビボの手段によって測定され得る。例えば、放射性標識タンパク質を用いることおよび時間の関数として血清放射能のレベルを測定することによって、または時間の関数としてＥＬＩＳＡを用いて血清に存在する（特異性が公知の）インタクトなＦｃ融合タンパク質のレベルをアッセイすることによって、特に好ましくは、血清半減期の増大およびクリアランス速度の低下によって証明されている生物学的安定性の増大の測定による。インビボの薬物動態学的パラメーターを測定するためのアッセイ方法（例えば、インビボの平均排出半減期）は、以下の実施例に、そして本明細書の参照によって本明細書に援用される、２００３年１０月１５日出願、米国特許出願第１０／６８７，１１８号に記載される。本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質は好ましくは、その対応する未改変のＦｃ融合タンパク質のインビボ排出半減期よりも少なくとも約１．３倍長いインビボ半減期を示し、そしてより好ましくは、この改変Ｆｃ融合タンパク質は、対応する未改変のＦｃ融合タンパク質のインビボ排出半減期よりも少なくとも約１．５倍、１．８倍、１．９倍または２．０倍より大きい半減期を有する。別の実施形態では、本発明のアミノ酸改変はまた、治療用または診断用のＦｃ融合タンパク質の血清半減期を低下させるために用いられ得る。
【００９３】
（ＩＩＩ．変更されたＦｃＲｎ結合親和性および／または血清半減期を有する改変ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の使用）
上記の改変Ｆｃ融合タンパク質を作製する方法は、改善された生物学的安定性を有する一連の治療化合物の生成において用いられ得る。このような化合物としては、例えば、インターロイキン−２、インスリン、インターロイキン−４およびインターフェロンγ、さらにはＴ細胞レセプターが挙げられる。本発明の組み換えＦｃドメインはまた、反復投与の必要性を軽減する可能性がある、広範な薬物を安定化するのにおける使用における利用が意図される。しかし、本発明の方法は、ヒトの投与のためのタンパク質の産生のみには限定されず、そして安定性の増大した大量の任意のタンパク質を産生するために使用されてもよく、例えば、免疫プロトコールにおいて、獣医による動物の処置において、またはげっ歯類のインビボ治療モデルにおいて、用いられてもよい。
【００９４】
改変Ｆｃ融合タンパク質は、種々の治療適用を有する。改変Ｆｃ融合タンパク質は、改変Ｆｃ融合タンパク質の投与から利益を享受し得る、疾患または障害に罹患しているかまたはその素因がある患者を処置するために用いられ得る。Ｆｃ融合タンパク質で処置され得る条件としては、ガン；炎症状態、例えば、喘息、自己免疫疾患およびウイルス感染などが挙げられる。
【００９５】
本明細書に記載されるＦｃ融合タンパク質によって処置され得るガンとしては、限定はしないが、乳癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、消化管癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌および種々のタイプの頭頚部癌が挙げられる。
【００９６】
自己免疫疾患としては、限定はしないが、アジソン病、耳の自己免疫疾患、ブドウ膜炎のような眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、潰瘍性大腸炎および脈管炎が挙げられる。
【００９７】
本発明における血清半減期の低下した改変Ｆｃ融合タンパク質は、疾患または外来の微生物の破壊または排除が所望される、疾患または障害の処置において用いられ得る。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、ガン、炎症性障害、感染および組織の除去が所望される他の状態を処置するために用いられ得る。Ｆｃ融合タンパク質は、より迅速な生物学的クリアランス時間が投与される任意のタンパク質の免疫原性の減少を生じるという点で一般に有用である。他の適用としては、抗体ベースのまたはＦｃ融合タンパク質ベースの画像化レジメン、Ｆｃ融合タンパク質ベースのまたは抗体ベースの薬物除去、またはより短い半減期を有する免疫毒素の作製が挙げられる。
【００９８】
血清半減期の増大を有する改変ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質は、抗組織因子（ＴＦ）Ｆｃ融合タンパク質であっても、抗ＩｇＥＦｃ融合タンパク質であっても、そして抗インテグリンＦｃ融合タンパク質であってもよい。作用の所望の機構は、リガンドレセプター結合対をブロックするためであってもよい。増大した血清半減期を有する改変Ｆｃ融合タンパク質はまた、アゴニストＦｃ融合タンパク質であってもよい。Ｆｃ融合タンパク質はまた、ワクチンのような治療因子として用いられ得る。このようなワクチンの免疫の投与量および頻度は、Ｆｃ融合タンパク質の延長した半減期に起因して減少する。
【００９９】
本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質は、薬学的組成物に処方されてもよい。従って、本発明はまた、改変Ｆｃ融合タンパク質の治療上有効な用量を投与するための方法および組成物を提供する。正確な用量は、処置の目的に依存しており、周知の技術を用いて当業者によって確認可能である（例えば、Ａｎｓｅｌら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（第６版、Ｍｅｄｉａ，Ｐａ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）；「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ」（第１〜３巻、ＩＳＢＮ番号０８２４７８５７６２、０８２４７６９１８Ｘ、０８２４７１２６９２、０８２４７１６９８１）編、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９９２）；Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｊｒ．，「Ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ」（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９９）；およびＧｌｏｒｉａ  Ｐｉｃｋａｒ，「Ｄｏｓａｇｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ」（Ｄｅｌｍａｒ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，１９９９））。当該分野で周知のとおり、生理学的分解のための調節、全身対局所の送達、および新規なプロテアーゼ合成の速度、ならびに年齢、体重、全体的な健康、性別、食餌、投与時間、薬物相互作用および条件の重篤度が必要であり得、そして当業者によって慣用的な実験で確認可能である。
【０１００】
薬学的処方物は、投与の方法に依存して種々の単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与のために適切な単位投薬形態としては、限定はしないが、粉末、錠剤、丸剤、カプセルおよびトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）が挙げられる。抗体は経口投与されるとき、消化から保護されるべきであることが理解される。これは代表的には、この分子と組成物とを複合してそれらを酸性および酵素的な加水分解に対して耐性にさせることによって、またはこの分子を適切に耐性のキャリア、例えば、リポソームまたは保護バリアにパッケージングすることによって、達成される。消化からの因子の保護の手段は、当該分野で周知である。
【０１０１】
投与のための処方物は共通して、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤、好ましくは水性キャリアに溶解された本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質を含む。種々の水性キャリア、例えば、緩衝化生理食塩水などが用いられ得る。これらの溶液は、無菌でありかつ一般には、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調製剤および緩衝化剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどのような、薬学的に受容可能な添加物質を含んでもよい。これらの処方物における活性因子の濃度は、広範に変化してもよく、そして選択される投与の特定の様式および患者の必要性に従って、液体の容積、粘性、体重などに主に基づいて選択される（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９８０）；およびＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ，「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」（Ｈａｒｄｍａｎら、編、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．，１９９６））。
【０１０２】
本明細書に提供される薬学的処方物はまた、処置される特定の適応に必要な２つ以上の活性成分、好ましくはお互いに対して有害に影響しない相補的な活性を有する活性成分を含み得る。このような分子は適切には、意図される目的に有効である量で組み合わせて存在する。
【０１０３】
上記の薬学的処方物の活性成分は、マイクロカプセル中に、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）に、マクロエマルジョンに、または徐放性調製物に取り込まれてもよい。このような技術は、当業者に公知である（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９８０）を参照のこと）。
【０１０４】
本発明は、本明細書に記載の改変ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。親の投与のための組成物は一般に、ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の溶液、または受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアに溶解されたそのカクテルを含む。種々の水性キャリア、例えば、水、緩衝化水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどが用いられ得る。これらの溶液は無菌であり、そして一般には粒子状物質を含まない。この組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて、ｐＨ調製剤および緩衝化剤、毒性調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムのような、薬学的に受容可能な添加物質を含んでもよい。これらの処方物におけるＦｃ融合タンパク質の濃度は、広範に、すなわち、約０．０１％未満、通常少なくとも約０．１％から５重量％程度の大きさまで変化してもよく、そして選択される投与の特定の様式に従って、液体の容積、および粘性に主に基づいて選択される。静脈内注入のための代表的な組成物は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル溶液、および１０ｍｇ〜１００ｍｇのＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質を含むように作製され得る（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」（第１５版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９８０）を参照のこと）。
【０１０５】
本発明のＦｃ融合タンパク質を含む薬学的組成物は、非経口的な皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内、そして所望の場合、局所免疫抑制の処置のためには、病巣内投与を含む任意の適切な方法によって投与され得る。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が挙げられる。さらに、Ｆｃ融合タンパク質は適切には、パルス注入によって、特に漸減する用量のＦｃ融合タンパク質を用いて投与される。
【０１０６】
本発明のＦｃ融合タンパク質またはそのカクテルを含む組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与され得る。治療適用においては、組成物は、特定の疾患によって既に影響されている患者に対して、その条件およびその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。これを達成するために十分な量は、「治療上有効な用量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」として規定される。この使用のために有効な量は、この条件の重篤度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般には、１用量あたり約０．０１〜約１００ｍｇの改変Ｆｃ融合タンパク質におよび、１患者あたり１〜１０ｍｇの用量が一般に用いられる。
【０１０７】
予防的適用では、改変Ｆｃ融合タンパク質またはそのカクテルを含む組成物を、まだ疾患状態にない患者に投与して、その患者の耐性を強化する。このような量は、「予防上有効な用量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」として規定される。この使用では、正確な量はやはり、賢者の健康状態および免疫の一般的レベルに依存するが、一般には１用量あたり０．１〜１００ｍｇ、特に１患者あたり１〜１０ｍｇの投薬量におよぶ。
【０１０８】
組成物の単回または複数回の投与は、処置する医師によって選択される用量レベルおよびパターンで行なわれてもよい。任意の事象では、薬学的処方物は、患者を有効に処置するために十分な量の本発明の変異Ｆｃ融合タンパク質を提供すべきである。
【０１０９】
本発明の改変Ｆｃ融合タンパク質はまた、種々の非治療目的のために用いられ得る。それらは、親和性精製剤として用いられ得る。それらはまた、特定の細胞、組織、または血清において目的の抗原の発現を検出する工程のような、診断アッセイにおいて有用であり得る。診断適用のためには、Ｆｃ融合タンパク質は代表的には、放射性同位体、蛍光標識および種々の酵素基質標識を含む検出可能部分で標識される。Ｆｃ融合タンパク質はまた、任意の公知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接および間接のサンドイッチアッセイおよび免疫沈降アッセイにおいて使用され得る。Ｆｃ融合タンパク質はまた、インビボ診断アッセイに用いられてもよい。一般には、Ｆｃ融合タンパク質は、抗原またはそれを発現する細胞が免疫シンチグラフィーを用いて局在化され得るように放射性核種で標識される。
【０１１０】
キットはまた、細胞活性に対する保護もしくは検出において、または選択された細胞表面レセプターの存在もしくは疾患の診断のために、改変Ｆｃ融合タンパク質を利用するのに提供され得る。従って、本発明の組成物は、通常容器中に凍結乾燥形態で、単独でまたは所望の細胞タイプに特異的なさらなるＦｃ融合タンパク質と組み合わせて、提供され得る。標識もしくは毒素と結合体化されても、または結合体化されなくてもよい改変Ｆｃ融合タンパク質が、緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、炭酸塩など、安定化剤、殺生剤、不活性なタンパク質、例えば、血清アルブミンなど、および使用上の注意書きのセットとともにキットに含まれる。一般には、これらの物質は、活性なＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の量に基づいて約５重量％未満で存在し、そして通常は、やはりＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質濃度に基づいて少なくとも約０．００１重量％の総量で存在する。高頻度に、活性成分を希釈するための不活性な増量剤または賦形剤を含むことが所望され、この賦形剤は、総組成物の約１〜９９重量％で存在してもよい。改変ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質に結合し得る第二の抗体がアッセイで使用される場合、これは、通常別のバイアルに存在する。この第二の抗体は代表的には、標識に結合体化されて、上記のＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質処方物と類似の方式で処方される。
【０１１１】
本明細書に引用される各々の引用文献は、その全体が本明細書において参照によって明白に援用される。以下の実施例は、例示の目的で提供されるものであり、限定の目的ではない。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
本実施例は、本発明において用いられるＦｃ融合発現ベクターを記載する。
【０１１３】
ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：３６１３〜３６２１（１９９７））の誘導体であるＦｃ融合発現プラスミドｐＭＪ００１の構成要素は以下のとおりである。図１に示されるとおり、ＥｃｏＲＩ部位から時計回りに進んで、レセプター／Ｆｃ融合単位は、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントとして、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要前初期（ｍａｊｏｒ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）（ＩＥ）プロモーターおよびエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ  ４１：５２１〜５３０（１９８５））で開始する。ｈｃＭＶ領域には、ヒト腫瘍壊死因子レセプターＩＩ（ＴＮＦ−ＲＩＩ）（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：１０１９〜１０２３（１９９０））の細胞外ドメインに結合された、Ｍ１９５シグナル配列（Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９〜１１５４（１９９２））からなるＸｂａＩ−ＰｉｎＡＩフラグメントが続く。ＴＮＦ−ＲＩＩ領域は、可塑性のリンカー領域を介して、ＰｉｎＡＩ−ＳｐｈＩフラグメントとして、ヒトγ−１重鎖定常領域（Ｅｌｌｉｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１〜４０７９（１９８２））の一部を含む改変ゲノムＤＮＡフラグメントに対してインフレームで融合され、このフラグメントは、ヒンジ（Ｈ）、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンと介在イントロン、ならびにＣＨ３のあとにｍＲＮＡ処理のためのポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）シグナルを含む。
【０１１４】
ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合遺伝子には、プラスミドｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、前掲）由来のＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとしてとられた、転写に必要なＳＶ４０由来の調節エレメントと一緒に、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）をコードする遺伝子が続く。ｇｐｔ遺伝子の機能は、哺乳動物細胞へのプラスミドのトランスフェクション後に選択性の薬物耐性マーカーを提供することである。ＳｐｈＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントはまた、細菌の複製起点およびＥ．ｃｏｌｉにおける選択のためのアンピシリン耐性遺伝子を含む、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４３：７７〜９０（１９７９））の一部を含む。
【０１１５】
ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、前掲）の誘導物である、Ｆｃ−融合発現プラスミドｐＭＪ０２６の構成要素は（図２を参照のこと）、２つを除いて、発現プラスミドｐＭＪ００１について上記された構成要素と同一である。第一に、ｐＭＪ０２６のＸｂａＩ−ＰｉｎＡＩフラグメントは、ヒトインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）遺伝子（Ｍｉｎｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２４８〜２５０）に結合されたＭ１９５シグナル配列（Ｃｏら、前掲）から構成される。第二に、ＩＬ−１３領域は、可塑性のリンカー領域を介して、ＰｉｎＡＩ−ＮａｅＩフラグメントとして、ヒトγ−１重鎖定常領域（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の一部を含む改変ｃＤＮＡフラグメントに対してインフレームで融合され、このフラグメントは、介在イントロンなしで、ヒンジ（Ｈ）の１０個のカルボキシ末端アミノ酸、ならびにＣＨ２およびＣＨ３のエキソンを含む。
【０１１６】
ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、前掲）の誘導物である、Ｆｃ−融合発現プラスミドｐＭＪ０４１（図３を参照のこと）の構成要素は、以下の改変はあるが、発現プラスミドｐＭＪ０２６について上記された構成要素と同一である。ｐＭＪ０４１のＸｂａＩ−ＮａｅＩフラグメントは、ｐＭＪ０２６について上記されるように、ヒトγ１重鎖定常領域（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の一部を含む、同じ改変されたｃＤＮＡフラグメントに対してインフレームで融合された、そのシグナル配列が先行するヒトリンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ−３）遺伝子（Ｗａｌｌｎｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：９２３〜９３２（１９８７））のＣＤ２結合部分から構成される。
【０１１７】
（実施例２）
本実施例は、本発明において用いられるＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合プラスミドの構成および変異誘発を記載する。
【０１１８】
（プラスミドの構築）
ヒトＴＮＦ−ＲＩＩは、ヒト末梢血単核球から調製されたｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによってクローニングした。ヒトＴＮＦ−ＲＩＩ遺伝子の細胞外ドメインは、５’末端においてＭ１９５重鎖シグナルペプチド（Ｃｏら、前掲）の隣接するＮｈｅＩ部位およびＣ末端部分を、そして３’末端において隣接するＰｉｎＡＩ部位を付加するためにＰＣＲによって改変された。ゲノムのヒトγ−１重鎖定常領域は、ＰＣＲによって改変されて、５’末端で隣接するＰｉｎＡＩ部位、そして３’部位でヒンジに融合された配列Ｇｌｙ−ＧｌｙおよびＳｐｈＩ部位からなる合成ジペプチドリンカーが付加された。ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、前掲）の誘導物である、発現ベクターｐＭＪ００１（図１を参照のこと）は、ゲノムのヒトκ定常領域を含むＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを、Ｍ１９５重鎖シグナル配列（Ｃｏら、前掲）のＮ末端部分を含むＸｂａＩ−ＮｈｅＩフラグメント、ヒトＴＮＦ−ＲＩＩ（Ｓｍｉｔｈら、前掲）の細胞外ドメインに結合されたＭ１９５重鎖シグナル配列のＣ末端部分をコードするＮｈｅＩ−ＰｉｎＡＩフラグメント、およびゲノムヒト免疫グロブリンγ−１遺伝子（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）のヒンジＦｃ部分を含むＰｉｎＡＩ−ＳｐｈＩフラグメントからなるＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントで置換することによって構築された。
【０１１９】
（変異誘発）
オーバーラップ−エクステンションＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ、「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ６１〜７０（１９８９））を用いて、ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合発現ベクターにおいて、ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域の２５０位および４２８位（Ｋａｂａｔら、前掲のＥＵインデックスに従ってナンバリングした）でアミノ酸置換を生成した。Ｔ２５０Ｑ変異体を生成するために、変異誘発プライマーＪＸＴ２５０Ｑ１（５’−ＡＡＣ  ＣＣＡ  ＡＧＧ  ＡＣＣ  ＡＡＣ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＴＣＴ  ＣＣＣ  Ｇ−３’）（配列番号５８）およびＪＸＴ２５０Ｑ２（５’−ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＴＴＧ  ＧＴＣ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＴＧ−３’）（配列番号５９）を用いて、プラスミドｐＭＪ００１のＦｃ領域を改変した。初回のＰＣＲは、左側のフラグメントについては、外側プライマーＭＪ−１３（５’−ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＡＣＧ  ＡＴＣ  ＣＣＡ  ＡＣＡ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  Ｇ−３’）（配列番号６０）およびＪＸＴ２５０Ｑ２を、そして右側のフラグメントについては、外側プライマーＭＪ−１４（５’−ＴＡＴ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＣＧ  ＣＡＣ  ＴＡＡ  ＡＡＡ  Ｃ−３’）（配列番号６１）およびＪＸＴ２５０Ｑ１を用いた。ＰＣＲ反応は、Ｅｘｐａｎｄ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて、９４℃で２分間インキュベートすること、続いて、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で６０秒間の２５サイクル、続いて７２℃で７分間のインキュベーションによって行なった。このＰＣＲ生成物を、低融点アガロースゲルで泳動し、このゲルから切り出して、７０℃で融解させた。左側および右側のフラグメントを合わせるための２回目のＰＣＲは、上記のとおり、外側プライマーＭＪ−１３およびＭＪ−１４を用いて、９４℃で２分間インキュベートすること、続いて、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で９０秒間の３５サイクル、続いて７２℃で７分間のインキュベーションによって行なった。最後のＰＣＲ産物は、低融点アガロースゲルで泳動し、予期されるサイズのＤＮＡフラグメントを切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。精製されたフラグメントを、ＰｉｎＡＩおよびＳｐｈＩで消化して、上記のようにゲル精製して、ｐＭＪ００１における対応する部位の間にクローニングした。
【０１２０】
Ｍ４２８Ｌ変異体を生成するために、変異原性プライマーＪＸＭ４２８Ｌ１（５’−ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＴＣＴ  ＧＣ−３’（配列番号６２）およびＪＸＭ４２８Ｌ２（５’−ＡＧＡ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＣＡＴ  ＣＡＧ−３’）（配列番号６３）を用いて、ｐＶｇ１（Ｃｏら、前掲）由来の中間プラスミドのＦｃ領域を変異誘発させた。初回のＰＣＲは、左側のフラグメントについては、外側プライマーＪＸ０８０（５’−ＣＣＴ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ−３’）（配列番号６４）およびＪＸＭ４２８Ｌ２を、そして右側のフラグメントについては、外側プライマーＮＴ２４４（５’−ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＣＴＣ  Ａ−３’）（配列番号６５）およびＪＸＭ４２８Ｌ１を用いた。左側および右側のフラグメントを合わせるための２回目のＰＣＲは、上記のとおり、外側プライマーＪＸ０８０およびＮＴ２４４を用いて行なった。最後のＰＣＲ産物は、ゲル精製して、ＮｈｅＩおよびＥａｇＩで消化して、中間プラスミドにサブクローニングした。Ｍ４２８Ｌ変異を含むＢｓｒＧＩ制限フラグメントを、この中間プラスミドから切り出して、ゲル精製し、ｐＭＪ００１における対応する部位の間にクローニングした。
【０１２１】
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌの二重変異体を生成するために、Ｔ２５０Ｑ変異を含むｐＭＪ００１プラスミド改変体のＢｓｒＧＩ制限フラグメントを、上記のとおり、Ｍ４２８Ｌ変異を含む中間プラスミド由来の対応するフラグメントで置換した。
【０１２２】
プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて調製し、そしてヌクレオチド置換は、配列決定によって確認した。大規模プラスミドＤＮＡ調製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて行なった。ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ発現プラスミドのコード領域をヌクレオチド配列決定によって確認した。
【０１２３】
（結果）
増大した血清半減期を有すると期待される新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）に対する親和性の増大を有するヒトＦｃ融合タンパク質変異体を同定するために、いくつかのアミノ酸置換を、ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質のヒトγ１重鎖Ｆｃ領域の２５０位および４２８位（Ｋａｂａｔら、前掲のＥＵインデックスに従ってナンバリングした）で生成した。野性型アミノ酸は２５０位および４２８位でＦｃ／ＦｃＲｎの境界付近に位置するが、これらの残基は、ＦｃとＦｃＲｎとの間のｐＨ依存性の相互作用に直接寄与しないと考えられる。従って、これらの位置でのアミノ酸置換は、ｐＨ依存性結合を維持しながらＦｃＲｎについてのＦｃの親和性を増大し得る。従って、野性型のＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質（配列番号６６）に加えて、一重変異体Ｍ４２８Ｌ（配列番号６７）および二重変異体Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（配列番号６８）を含む一重変異体および二重変異体の両方を生成した。
【０１２４】
（実施例３）
本実施例は、本発明において用いられるＩＬ−１３／Ｆｃ融合発現ベクターの構築および変異誘発を記載する。
【０１２５】
（プラスミド構築）
ヒトＩＬ−１３は、ＰＭＡおよび抗ＣＤ２８抗体で活性化されたヒト末梢血単核球から調製されるｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによってクローニングされた。ヒトＩＬ−１３遺伝子を、ＰＣＲによって改変して、５’末端で隣接するＮｈｅＩ部位、およびＭ１９５重鎖シグナルペプチド（Ｃｏｌｅら、前掲）のＣ末端部分、そして３’末端で隣接するＰｉｎＡＩ部位を付加した。ヒトｃＤＮＡγ−１重鎖定常領域を、ＰＣＲによって改変して、５’末端で隣接するＰｉｎＡＩ部位、そして３’末端で部分的ヒンジに融合された配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＡｌａおよびＮａｅＩ部位からなる合成ペプチドリンカーを付加した。ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、前掲）の誘導体である、発現ベクターｐＭＪ０２６（図２を参照のこと）は、ゲノムのヒトκ定常領域を含むＸｂａＩ−ＮａｅＩフラグメントを、Ｍ１９５重鎖シグナル配列（Ｃｏら、前掲）のＮ末端部分を含むＸｂａＩ−ＮｈｅＩフラグメントと、ヒトＩＬ−１３（Ｍｉｎｔｙら、前掲）に結合されたＭ１９５重鎖シグナル配列のＣ末端部分をコードするＮｈｅＩ−ＰｉｎＡＩフラグメントと、ヒト免疫グロブリンγ−１ｃＤＮＡ配列（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の部分的ヒンジＦｃ部分を含むＰｉｎＡＩ−ＮａｅＩフラグメントとからなるＸｂａＩ−ＮａｅＩフラグメントで置換することによって構築された。
【０１２６】
（変異誘発）
ＰＣＲを用いて、ＩＬ−１３／Ｆｃ融合発現ベクターにおいて、ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域の２５０位および４２８位（Ｋａｂａｔら、前掲のＥＵインデックスに従ってナンバリングした）でアミノ酸置換を生成した。ＯＳＴ５７７−ＩｇＧ１野性型または二重変異体Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ（Ｈｉｎｔｏｎら、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０４／０３５７５２）のいずれかを安定に発現する細胞株から単離したＲＮＡを用いて、一本鎖ｃＤＮＡを生成した。得られたｃＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ反応物中で用いて、Ｅｘｐａｎｄｅ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、９４℃で２分間インキュベートすること、続いて、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で６０秒間の３５サイクル、続いて７２℃で７分間のインキュベーションによって行なった。このＰＣＲ反応は、外側プライマーＭＪ−２４（５’−ＡＣＴ  ＡＣＣ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＧＧＧ  ＧＣＴ  ＧＣＡ  ＧＡＣ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＡＣＡ−３’（配列番号６９）およびＭＣ１２４（５’−ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＡＧＣ  ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＣＴ−３’）（配列番号７０）を用いて行なった。このＰＣＲ産物を低融点アガロースゲル上で泳動して、予想されるサイズのＤＮＡフラグメントを切り出して、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）を用いて精製した。精製されたフラグメントを、ＰｉｎＡＩおよびＮａｅＩで消化して、上記のようにゲル精製して、ｐＭＪ０２６における対応する部位の間にクローニングした。
【０１２７】
プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて調製し、そしてヌクレオチド置換は、配列決定によって確認した。大規模プラスミドＤＮＡ調製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて行なった。ＩＬ−１３／Ｆｃ融合発現プラスミドのコード領域をヌクレオチド配列決定によって確認した。
【０１２８】
（結果）
ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質のヒトγ１重鎖Ｆｃ領域の２５０位および４２８位（Ｋａｂａｔら、前掲のＥＵインデックスに従ってナンバリングした）でアミノ酸置換を生成した。野性型アミノ酸は２５０位および４２８位でＦｃ／ＦｃＲｎの境界付近に位置するが、これらの残基は、ＦｃとＦｃＲｎとの間のｐＨ依存性の相互作用に直接寄与しないと考えられる。従って、これらの位置でのアミノ酸置換は、ｐＨ依存性結合を維持しながらＦｃＲｎについてのＦｃの親和性を増大し得る。従って、野性型のＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質（配列番号７１）に加えて、野性型Ｆｃ融合タンパク質に対する比較のために、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体（配列番号７２）型を生成した。
【０１２９】
（実施例４）
本実施例は、本発明において用いられるＬＦＡ−３／Ｆｃ融合プラスミドの構築および変異誘発を記載する。
【０１３０】
（プラスミド構築）
ＬＦＡ−３シグナルペプチドが先行する、ヒトＬＦＡ−３のＣＤ２結合部分（Ｗａｌｌｎｅｒら、前掲）を生成して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）技術を用いてＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によってクローニングして、改変して、５’末端に隣接するＸｂａＩ部位を、そして３’末端に隣接するＰｉｎＡＩ部位を付加した。ヒトｃＤＮＡγ−１重鎖定常領域をＰＣＲによって改変して、５’部位で隣接するＰｉｎＡＩ部位を、そして３’部位で部分的ヒンジに融合された配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＡｌａおよびＮａｅＩ部位からなる合成ペプチドリンカーを付加した。ゲノムヒトκ定常領域を含むＸｂａＩ−ＮａｅＩフラグメントを、ＬＦＡ−３シグナル配列およびＣＤ２結合遺伝子配列（Ｗａｌｌｎｅｒら、前掲）およびヒト免疫グロブリンγ−１ｃＤＮＡ配列（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の部分的ヒンジ−Ｆｃ部分からなるＸｂａＩ−ＮａｅＩフラグメントで置換することによって、ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅ、前掲）の誘導体である発現ベクターｐＭＪ０４１を構築した。第一に、ゲノムヒトκ定常領域を含むＸｂａＩ−ＮａｅＩフラグメントを、ＬＦＡ−３シグナル配列およびＬＦＡ−３遺伝子（Ｗａｌｌｎｅｒら、前掲）のＣＤ２結合部分を含むＸｂａＩ−ＰｉｎＡＩフラグメントと、ヒト免疫グロブリンγ−１  ｃＤＮＡ配列（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の部分的ヒンジ−Ｆｃ部分を含むＰｉｎＡＩ−ＮａｅＩフラグメントとからなるＸｂａＩ−ＮａｅＩフラグメントで置換することによって、ｐＶｒ．ｒｇ（Ｃｏｌｅら、前掲）に由来する中間発現ベクターを構築した。次いで、ＰＣＲを用いて、ＰｉｎＡＩクローニング部位およびＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａリンカーを取り除いた。初回のＰＣＲには、左側のフラグメントについては、外側プライマーＭＢＲ３（５’−ＣＣＡ  ＴＡＧ  ＡＡＧ  ＡＣＡ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＣＣ−３’）（配列番号７３）およびＭＪ−５９（５’−ＧＡＧ  ＴＴＴ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＣ−３’）（配列番号７４）を、そして右側のフラグメントについては、外側プライマーＭＣ１２４およびＭＪ−６０（５’−ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＡＴＧ  ＴＣＧ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＣＡＴ  ＧＣＣ−３’）（配列番号７５）を用いた。テンプレートとして上述の中間ベクターを用いるＰＣＲ反応物は、Ｅｘｐａｎｄ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、９４℃で２分間インキュベートすること、続いて、９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で７５秒間の２５サイクル、続いて７２℃で７分間のインキュベーションによって行なった。左側および右側のフラグメントを合わせるための２回目のＰＣＲは、上記のとおり、外側プライマーＭＢＲ３およびＭＣ１２４を用いて、９４℃で２分間のインキュベーション、続いて９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間および７２℃で９０秒間の２５サイクル、続いて７２℃で７分間のインキュベーションによって行なった。最終のＰＣＲ産物は、ゲル精製して、ＸｂａＩおよびＮａｅＩで消化して、中間ベクターにおける対応する部位にサブクローニングして、ｐＭＪ０４１を得た（図３を参照のこと）。
【０１３１】
（変異誘発）
ＰＣＲを用いて、ＩＬ−１３／Ｆｃ融合発現ベクターについて上記されたとおり、ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合プラスミドにおいて、ＩｇＧ１重鎖Ｆｃ領域の２５０位および４２８位（Ｋａｂａｔら、前掲のＥＵインデックスに従ってナンバリングした）でアミノ酸置換を生成した。
【０１３２】
プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて調製し、そしてヌクレオチド置換は、配列決定によって確認した。大規模プラスミドＤＮＡ調製は、ＥｎｄｏＦｒｅｅ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標））を用いて行なった。ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合発現プラスミドのコード領域をヌクレオチド配列決定によって確認した。
【０１３３】
（結果）
ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質のヒトγ１重鎖Ｆｃ領域の２５０位および４２８位（Ｋａｂａｔら、前掲のＥＵインデックスに従ってナンバリングした）でアミノ酸置換を生成した。野性型アミノ酸は２５０位および４２８位でＦｃ／ＦｃＲｎの境界付近に位置するが、これらの残基は、ＦｃとＦｃＲｎとの間のｐＨ依存性の相互作用に直接寄与しないと考えられる。従って、これらの位置でのアミノ酸置換は、ｐＨ依存性結合を維持しながらＦｃＲｎについてのＦｃの親和性を増大し得る。従って、野性型のＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質（配列番号７６）に加えて、野性型Ｆｃ融合タンパク質に対する比較のために、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体（配列番号７７）型を生成した。
【０１３４】
（実施例５）
本実施例は、本発明において用いられるＦｃＲｎ発現ベクターを記載する。
【０１３５】
ゲノムヒトκ定常領域を含むＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントを、Ｍ１９５重鎖シグナル配列（Ｃｏら、前掲）のＮ末端部分を含むＸｂａＩ−ＮｈｅＩフラグメントと、０．７ｋｂ  ＮｈｅＩ−ＰｉｎＡＩフラグメントと、マウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０〜３６１６（１９８５））によって認識される、リンカーペプチドに隣接する、ヒトｃ−ｍｙｃデカペプチドをコードする合成ＰｉｎＡＩ−ＥａｇＩフラグメントと、その後ろのヒト分解促進因子（Ｃａｒａｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２５：５４５〜５４９（１９８７））由来のＧＰＩ連結シグナル、およびヒト免疫グロブリンγ−１遺伝子（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）のポリＡシグナルを含むＥａｇＩ−ＳｐｈＩフラグメントとからなるＸｂａＩ−ＳｐｈＩフラグメントで置換することによって、ｐＶｋ．ｒｇ（Ｃｏｌｅ、前掲）の誘導体である発現ベクターｐＤＬ１７２を構築した。
【０１３６】
ヒトβ２ミクログロブリン（β２ｍ）およびヒト新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）α鎖の細胞外ドメインを、ヒト末梢血単核球から調製されたｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによってクローニングした。ヒトＦｃＲｎα鎖の遺伝子をＰＣＲによって改変して、５’末端において隣接するＮｈｅＩ部位およびＭ１９５重鎖シグナルペプチドのＣ末端部分を、そして３’末端において隣接するＰｉｎＡＩ部位を付加し、これを用いてｐＤＬ１７２のＮｈｅＩ−ＰｉｎＡＩフラグメントを置き換えて、発現ベクターｐＤＬ１７２＋ＨｕＦｃＲｎを得た。ヒトβ２ｍ遺伝子をＰＣＲによって改変して、それぞれ５’末端および３’末端に、隣接するＸｂａＩおよびＳａｌＩ部位を付加して、内部ＥｃｏＲＩ部位を除去した。得られたＸｂａＩ−ＳａｌＩフラグメントを、中間ベクターであって、その５’末端でｈＣＭＶ  ＩＥプロモーターおよびエンハンサー（Ｂｏｓｈａｒｔら、前掲）を含むＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントに隣接し、その３’末端でマウス免疫グロブリンγ−２ａ遺伝子（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７〜１５５３（１９９２））のポリアデニル化シグナルを含むＳａｌＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに隣接し、その後にヒト補体遺伝子Ｃ２（Ａｓｈｆｉｅｌｄら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：４１９７〜４２０７（１９９１））の転写ターミネーターを含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントが続く、中間ベクターにサブクローニングした。機能的なヒトβ２ｍ転写単位を含む得られたＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントをｐＤＬ１７２＋ＨｕＦｃＲｎの固有のＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、本明細書において以降ではｐＤＬ２０８と呼ばれる、発現ベクターｐＤＬ１７２＋ＨｕＦｃＲｎ＋Ｈｕβ２ｍを得る（図４を参照のこと）。
【０１３７】
（実施例６）
本実施例は、変異体ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の発現および精製を記載する。
【０１３８】
（細胞培養）
ヒト腎臓細胞株２９３−Ｈ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、本明細書において以降では２９３培地と呼ばれる、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標）、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および２ｍＭ  Ｌグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を含有するＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標）、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で、３７℃で７．５％  ＣＯ２インキュベーター中で維持した。一過性のトランスフェクション後のＦｃ融合タンパク質の発現および精製のために、２９３−Ｈ細胞を、本明細書において以降では低ＩｇＧ  ２９３培地と呼ばれる、１０％低ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））および２ｍＭ  Ｌグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を含有するＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標）、またはＨｉｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＨＳＦＭ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））中でインキュベートした。
【０１３９】
マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））を含有するＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標））中で３７℃で７．５％  ＣＯ２インキュベーター中で維持した。安定なトランスフェクション後のＦｃ融合タンパク質の発現および精製のために、ＮＳ０細胞を、２％低ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））を含有するＨＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））中でインキュベートした。
【０１４０】
（一過性のトランスフェクション）
２９３Ｈ細胞を、プラスミドｐＭＪ００１、ｐＭＪ０２６またはそれぞれのＦｃ領域に変異を含む改変体で一過性にトランスフェクトした。大規模の一過性トランスフェクションのために、１トランスフェクションあたり約７×１０６個の細胞をＴ−７５フラスコ中で２５ｍｌの２９３培地にプレートして、コンフルエンスまで一晩増殖させた。翌日、２４μｇの野性型または変異したプラスミドを１．５ｍｌのＨＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））と合わせた。別の試験管では、６０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）試薬および１．５ｍｌのＨＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））を合わせて、室温で５分間インキュベートした。１．５ｍｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）２０００−ＨＳＦＭ混合物を、１．５ｍｌ  ＤＮＡ−ＨＳＦＭ混合物と穏やかに混合して、室温で２０分間インキュベートした。２９３−Ｈ細胞をカバーする培地を吸引して低−ＩｇＧ２９３培地または２％低ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））を含有するＨＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））で置き換え、次いでリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体をこの細胞に滴下して加えて、回旋することによって穏やかに混合し、この細胞を７．５％  ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で５〜７日間インキュベートし、その後に上清を回収した。
【０１４１】
（安定なトランスフェクション）
ＮＳ０細胞を、ｐＭＪ０２６、ｐＭＪ０４１またはそれぞれのＦｃ領域に変異を含む改変体で安定にトランスフェクトした。約１×１０７個の細胞を１回洗浄して、１ｍｌのそのままのＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標））中に再懸濁して、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）中に移して、氷上で１０分間インキュベートした。４０μｇのプラスミドをＦｓｐＩを用いて直線化して、氷上で細胞と穏やかに混合し、次いでこの細胞を、１．５ｋＶ、３μＦに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて２回パルスすることによってエレクトロポレーションして、氷に１０分間戻した。この細胞を、４０ｍｌのＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標））、１０％  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））に希釈して、４つの９６ウェルプレート中に１００μｌ／ウェルでプレートした。４８時間後、１００μｌ／ウェルのミコフェノール酸（ＭＰＡ）選択培地（ＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標））、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標）、１×ＨＴ  Ｍｅｄｉａ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｈｙｂｒｉ−Ｍａｘ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｉｕｓ，ＭＯ）、２５０μｇ／ｍｌキサンチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１μｇ／ｍｌミコフェノール酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））、および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））または２×ＭＰＡ選択培地を添加した。ほぼ単独のコロニーを含むウェル由来のミコフェノール酸耐性ＮＳ０トランスフェクト体を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））を含むＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標）中で増殖して、２％低ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））を含有するＨＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標））に適合させた。
【０１４２】
（Ｆｃ融合の精製）
ｐＭＪ００１および改変体での一過性のトランスフェクションからの培養上清を遠心分離によって回収して、濾過滅菌した。濾過した上清のｐＨを１／７５容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０の添加によって調節した。上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．０で事前に平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に流し込んだ。このカラムを同じ緩衝液で洗浄して、結合したＦｃ融合タンパク質を１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶出させた。約１／５０容積の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０の添加による中和後、プールしたタンパク質画分を、ＰＢＳ  ｐＨ６．０で事前に平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に流し込んだ。流出物を収集して、ＯＤ２８０が０．１を超える画分をプールして、２ｍｌ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）濃縮器（５０，０００ダルトンＭＷＣＯ）（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）ＡＧ、Ｈａｎｎｏｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。次いでサンプルを、０．２μｍ  Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶマイクロフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて濾過滅菌した。精製したＦｃ融合タンパク質の濃度は、２８０ｎｍの吸収を測定することによってＵＶ分光法によって決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝１．８Ａ２８０）。
【０１４３】
ｐＭＪ０２６および改変体での一過性トランスフェクション由来の培養上清を、遠心分離によって収集して滅菌濾過した。濾過上清のｐＨを１／５０容積の１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０の添加によって調節した。上清を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．０で事前に平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に流し込んだ。このカラムを同じ緩衝液で洗浄して、結合したＦｃ融合タンパク質を２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出させた。１／５０容積の１．５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．５の添加による中和後、プールした抗体画分を、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．０で事前に平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に流し込んだ。上記のように、流出物を収集して、ＯＤ２８０が０．１を超える画分をプールして、約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、濾過滅菌した。精製したＦｃ融合タンパク質の濃度は、２８０ｎｍの吸収を測定することによってＵＶ分光法によって決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝２．０Ａ２８０）。
【０１４４】
ｐＭＪ０２６、ｐＭＪ０４１またはそれぞれのＦｃ領域に変異を含む改変体での安定なトランスフェクション由来の培養上清を、遠心分離によって収集して滅菌濾過した。上清を、５００ｍＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．０を補充したＰＢＳで事前に平衡化した１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＨＰカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に流し込んだ。このカラムを同じ緩衝液で、続いてＰＢＳで洗浄して、結合したＦｃ融合タンパク質を５０ｍＭのグリシン、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５で溶出させた。１／１０容積の１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８の添加による中和後、プールした抗体画分を、ＰＢＳ  ｐＨ６．０で事前に平衡化した５ｍｌのＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に流し込んだ。上記のとおり、流出物を収集して、ＯＤ２８０が０．１を超える画分をプールして、約０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、濾過滅菌した。精製したＦｃ融合タンパク質の濃度は、２８０ｎｍの吸収を測定することによってＵＶ分光法によって決定した（１ｍｇ／ｍｌ＝２．０Ａ２８０）。
【０１４５】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
精製されたＦｃ融合タンパク質の５μｇのサンプルを還元条件下でＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）上で泳動して、製造業者の推奨に従ってＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎＫｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を用いて染色した。
【０１４６】
（結果）
野性型および変異ヒトγ−１Ｆｃ領域は、ヒトＴＮＦ−ＲＩＩ（Ｓｍｉｔｈら、前掲）の細胞外ドメイン、およびヒトγ−１（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の重鎖定常領域のヒンジ−Ｆｃ領域を含む、ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質として発現された。上記のとおり、野性型または変異体Ｆｃ融合発現ベクターを、ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質の発現のために２９３−Ｈ細胞に一過性にトランスフェクトして、発現されたタンパク質をプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１４７】
精製したＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって特徴付けた。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、精製されたＦｃ融合タンパク質は、約７０ｋＤの分子量を有する優勢な種から構成されることが示された（データ示さず）。
【０１４８】
野性型および変異体のヒトγ−１Ｆｃ領域はまた、ヒトＩＬ−１３（Ｍｉｎｔｙら、前掲）、およびヒトγ−１（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の重鎖定常領域のヒンジ−Ｆｃ領域を含む、ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質として発現された。上記のとおり、野性型または変異体のＦｃ融合発現ベクターを、ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質の発現のために２９３−Ｈ細胞に一過性にトランスフェクトするか、またはＮＳ０細胞に安定にトランスフェクトして、発現されたタンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１４９】
精製したＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けた。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、精製されたＦｃ融合タンパク質は、約５０ｋＤの分子量を有する優勢な種から構成されることが示された（データ示さず）。
【０１５０】
野性型および変異体のヒトγ−１Ｆｃ領域はまた、ヒトＬＦＡ−３（Ｗａｌｌｎｅｒら、前掲）、およびヒトγ−１（Ｅｌｌｉｓｏｎら、前掲）の重鎖定常領域のヒンジ−Ｆｃ領域を含む、ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質として発現された。上記のとおり、野性型または変異体のＦｃ融合発現ベクターを、ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質の発現のためにＮＳ０細胞に安定にトランスフェクトした。発現されたタンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０１５１】
精製したＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特徴付けた。還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、精製されたＦｃ融合タンパク質は、約４５ｋＤの分子量を有する優勢な種から構成されることが示された（データ示さず）。
【０１５２】
（実施例７）
本実施例は、変異体ＩｇＧ１Ｆｃ融合タンパク質の競合的結合分析を記載する。
【０１５３】
（細胞培養）
マウス骨髄腫細胞株ＮＳ０を、１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））を含有するＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標））中で維持した。表面上に組み換え体、ＧＰＩ連結ヒトＦｃＲｎを発現するＮＳ０トランスフェクト体を２×ＭＰＡ選択培地中で維持した。
【０１５４】
（ヒトＦｃＲｎ細胞株）
ＮＳ０細胞をｐＤＬ２０８で安定にトランスフェクトした。約１×１０７個の細胞を１回洗浄して、１ｍｌのそのままのＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標））中に再懸濁して、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に移して、氷上で１０分間インキュベートした。４０μｇのプラスミドｐＤＬ２０８をＦｓｐＩを用いて直線化して、氷上で細胞と穏やかに混合し、次いでこの細胞を、１．５ｋＶ、３μＦに設定したＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（商標）ＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて２回パルスすることによってエレクトロポレーションして、氷に１０分間戻した。この細胞を、２０ｍｌのＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標））、１０％  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（商標））に希釈して、２つの９６ウェルプレート中に１ウェルあたり１００μｌでプレートした。４８時間後、ＭＰＡ選択培地でこの培地を置換した。ほぼ単独のコロニーを含むウェル由来のミコフェノール酸耐性ＮＳ０トランスフェクト体を、ＭＰＡ選択培地中で増殖させて、ＦＡＣＳ（商標）によって約３週間後にスクリーニングした。１試験あたり約１．５×１０５個の細胞を、１０μｇ／ｍｌのビオチン化マウス抗ヒトβ２ミクログロブリン抗体（Ｃｈｒｏｍａｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，Ａｐｔｏｓ，ＣＡ）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ染色緩衝液（ＦＳＢ）（ＰＢＳ、１％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ３）中で、氷上において１時間インキュベートさせた。この細胞を４ｍｌのＦＳＢで１回洗浄し、次いで２０ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＦＩＴＣ結合体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）を含有する２５μｌのＦＳＢ中で３０分間、氷上で暗野においてインキュベートさせた。この細胞を４ｍｌのＦＳＢを用いて１回洗浄して、１％ホルムアルデヒドに再懸濁した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、ヒトβ２ｍに対する抗体結合についてサンプルを分析した。最高のみかけの染色を有するいくつかのクローンをＦＡＣＳｔａｒセルソーター（ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてサブクローニングして、ＤＭＥＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（商標））１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ（登録商標））、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））中で増殖させて、上記のようにＦＡＣＳ（商標）によって再試験した。ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）と命名された１つのサブクローン、クローン７−３を引き続く結合アッセイに用いた。
【０１５５】
（競合結合アッセイ）
各々の精製されたＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質の一連の希釈を細胞株ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）、クローン７−３上のヒトＦｃＲｎに対する結合について、ビオチン化ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質に対して競合させた。約２×１０５細胞／試験をＦＡＣＳ結合緩衝液（ＦＢＢ）（０．５％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）ｐＨ８．０中で１回洗浄して、ＦＢＢ、ｐＨ６．０中で１回洗浄し、次いで、事前混合したビオチン化（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質（８．３μｇ／ｍｌ）およびＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質競合相手（２０８μｇ／ｍｌ〜０．１０２μｇ／ｍｌの２倍連続希釈）を含むＦＢＢ，ｐＨ６．０の１００μｌ中に再懸濁した。この細胞をＦｃ融合タンパク質混合物とともに氷上で１時間インキュベートして、ＦＢＢ、ｐＨ６．０中で２回洗浄し、ＦＢＢ，ｐＨ６．０中で２．５μｇ／ｍｌまで希釈した２５μｌのストレプトアビジン−ＲＰＥ結合体（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）中に再懸濁した。氷上で暗野における３０分間のインキュベーション後、この細胞をＦＢＢ、ｐＨ６．０中で２回洗浄して、１％ホルムアルデヒドに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＦＡＣＳ（商標）によってＦｃＲｎに対するＦｃ融合タンパク質結合についてサンプルを分析した。平均チャネル蛍光（ｍｅａｎ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＭＣＦ）を競合相手の濃度に対してプロットして、ＩＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて算出した。
【０１５６】
各々の精製したＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質の一連の希釈物をビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で標識されたヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｆｒｉｃｈ）に対して競合させた。競合結合アッセイは、上記のとおり、細胞株ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）クローン７−３を用いて行なった。細胞は、上記のように２回洗浄して、事前混合したビオチン化ヒトＩｇＧ（８．３μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質競合相手（２０８μｇ／ｍｌ〜０．１０２μｇ／ｍｌの２倍連続希釈または２１９μｇ／ｍｌ〜０．０３７μｇ／ｍｌの３倍連続希釈）を含むＦＢＢ，ｐＨ６．０の１００μｌ中に再懸濁し、次いで上記のように処理して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１５７】
各々の精製したＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質の一連の希釈物をビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で標識されたヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｆｒｉｃｈ）に対して競合させた。競合結合アッセイは、上記のとおり、細胞株ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）、クローン７−３を用いて行なった。細胞は、上記のように２回洗浄して、事前混合したビオチン化ヒトＩｇＧ（８．３μｇ／ｍｌ）およびＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質競合相手（２１９μｇ／ｍｌ〜０．０３７μｇ／ｍｌの３倍連続希釈）を含むＦＢＢ，ｐＨ６．０の１００μｌ中に再懸濁し、次いで上記のように処理して、フローサイトメトリーによって分析した。
【０１５８】
（結果）
ＦｃＲｎに対する野性型ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質およびその変異体の相対的な結合を、表面上でヒトＦｃＲｎを安定に発現するトランスフェクトされたＮＳ０細胞株を用いて決定した。上記のとおり、精製されたＦｃ融合タンパク質を競合結合アッセイにおいてＦｃＲｎ結合について試験した。漸増濃度の未標識の競合相手を、飽和濃度未満の標識ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質ＦＢＢ、ｐＨ６．０の存在下で細胞株ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）、クローン７−３とともにインキュベートさせた。
【０１５９】
ＭＣＦデータ対競合相手の濃度のプロットによって、タンパク質結合親和性のアッセイについて予想される代表的なシグモイド曲線形状が示された。二重変異体（Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ）は、単独変異体（Ｍ４２８Ｌ）よりもヒトＦｃＲｎに対してわずかに優れた結合を示し、そして野性型ＴＮＦ−ＲＩＩ／Ｆｃ融合タンパク質よりもヒトＦｃＲｎに対して再現可能に約２倍優れた結合であった。
【０１６０】
精製ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質を、競合結合アッセイにおいてＦｃＲｎ結合について試験した。漸増濃度の未標識の競合相手を、ＦＢＢ，ｐＨ６．０中の飽和濃度未満の標識ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で細胞株ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）、クローン７−３とともにインキュベートさせた。表２にまとめるとおり、野性型ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質のＩＣ５０値は約８μｇ／ｍｌであったが、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体のＩＣ５０は約０．５μｇ／ｍｌであった。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体は、このＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質の野性型バージョンに比較して結合の約１５倍の増大を示した。
【０１６１】
【表２】
2007531707.tif 000003
ａ変異体については、最初の文字は野性型のアミノ酸を示し、数はＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、前掲）による位置を示し、そして二番目の文字は変異体アミノ酸を示す。
ｂｎは独立したアッセイの数を示す。
ｃＩＣ５０値（±Ｓ．Ｄ．）は、μｇ／ｍｌ（最終の競合相手濃度に基づく）で表しており、実施例７に記載されるように、ＦＢＢ，ｐＨ６．０中のビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対する競合結合アッセイから算出した。
ｄヒトＦｃＲｎに対する相対的な結合は、変異体のＩＣ５０に対する野性型ＩＬ−１３／Ｆｃ−融合タンパク質のＩＣ５０値の比として算出した。
【０１６２】
高次構造については、安定なトランスフェクションから精製したＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質をまた、上記のような競合結合アッセイにおいてＦｃＲｎ結合について試験した。表３に要約したとおり、野性型ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質についてのＩＣ５０は約８μｇ／ｍｌであったが、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体についてのＩＣ５０は約０．６μｇ／ｍｌであった。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体は、このＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質の野性型バージョンに比較して結合の約１４倍の増大を示した。
【０１６３】
【表３】
2007531707.tif 000004
ａ変異体については、最初の文字は野性型のアミノ酸を示し、数はＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、前掲）による位置を示し、そして二番目の文字は変異体アミノ酸を示す。
ｂｎは独立したアッセイの数を示す。
ｃＩＣ５０値（±Ｓ．Ｄ．）は、μｇ／ｍｌ（最終の競合相手濃度に基づく）で表しており、実施例７に記載されるように、ＦＢＢ，ｐＨ６．０中のビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対する競合結合アッセイから算出した。
ｄヒトＦｃＲｎに対する相対的な結合は、変異体のＩＣ５０に対する野性型ＩＬ−１３／Ｆｃ−融合タンパク質のＩＣ５０値の比として算出した。
【０１６４】
安定なトランスフェクションから精製したＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質を、競合結合アッセイにおいてＦｃＲｎ結合について試験した。漸増濃度の未標識の競合相手を、ＦＢＢ，ｐＨ６．０中の飽和濃度未満の標識ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で細胞株ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）、クローン７−３とともにインキュベートさせた。競合相手の濃度に対するＭＣＦデータのプロットによって、タンパク質結合親和性のアッセイについて予想される代表的なシグモイド曲線形状が示された。表４にまとめるとおり、野性型ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質のＩＣ５０値は約３μｇ／ｍｌであったが、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体のＩＣ５０は約０．１５μｇ／ｍｌであった。Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ二重変異体は、このＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質の野性型バージョンに比較して結合の約２２倍の増大を示した。
【０１６５】
【表４】
2007531707.tif 000005
ａ変異体については、最初の文字は野性型のアミノ酸を示し、数はＥＵインデックス（Ｋａｂａｔら、前掲）による位置を示し、そして二番目の文字は変異体アミノ酸を示す。
ｂｎは独立したアッセイの数を示す。
ｃＩＣ５０値（±Ｓ．Ｄ．）は、μｇ／ｍｌ（最終の競合相手濃度に基づく）で表しており、実施例７に記載されるように、ＦＢＢ，ｐＨ６．０中のビオチン化ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に対する競合結合アッセイから算出した。
ｄヒトＦｃＲｎに対する相対的な結合は、変異体のＩＣ５０に対する野性型ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質のＩＣ５０値の比として算出した。
【０１６６】
（実施例８）
本実施例は、変異体のＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質のｐＨ依存性結合分析を記載する。
【０１６７】
（ｐＨ依存性結合および遊離アッセイ）
安定なトランスフェクションから精製したＩＬ−１３およびＬＦＡ−３野性型および変異体Ｆｃ融合タンパク質を、ヒトＦｃＲｎに対する結合について比較して、次いで細胞株ＮＳ０  ＨｕＦｃＲｎ（ｍｅｍｂ）、クローン７−３を用いて、単一点結合および遊離アッセイにおいて種々のｐＨ値で遊離させた。１試験あたり約２×１０５個の細胞をＦＢＢ、ｐＨ８．０中で１回、そしてＦＢＢ、ｐＨ６．０中で１回洗浄して、次いで、ＦＢＢ、ｐＨ６．０に含まれる精製Ｆｃ融合タンパク質（５μｇ／ｍｌ）の１００μｌ中に再懸濁した。この細胞を氷上で１時間インキュベートして、ＦＢＢ、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５または８．０中で２回洗浄して、適切なｐＨのＦＢＢ中で０．３４μｇ／ｍｌに希釈した２５μｌのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣ結合体化抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）中に再懸濁した。氷上で暗野における３０分間のインキュベーション後、この細胞を適切なｐＨのＦＢＢ中で２回洗浄して、１％ホルムアルデヒドに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＦＡＣＳ（商標）によってＦｃＲｎに対するＦｃ融合タンパク質結合についてサンプルを分析した。
【０１６８】
（結果）
ＦｃＲｎに対するＩｇＧの結合は、ｐＨ依存性であることが公知である：ＩｇＧは、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対して強力に結合するが、ｐＨ８．０では弱い。より長い血清半減期を有する変異体Ｆｃ融合タンパク質を操作するために、ｐＨ８．０でのＦｃＲｎからのｐＨ依存性の放出は維持したままで、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対する結合を増大することが望ましい。結合がｐＨ依存性であることを確認するため、ヒトＦｃＲｎを安定に発現するトランスフェクトされたＮＳ０細胞株に対する結合についてＦｃ融合タンパク質を試験して、次いでｐＨ６．０〜ｐＨ８．０におよぶｐＨ値で遊離させた。上記のとおり、細胞を、ＦＢＢ，ｐＨ６．０中の飽和濃度未満の抗体とともにインキュベートさせ、ＦＢＢ、ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５または８．０を用いて洗浄して、ＦＡＣＳ（商標）によって結合を分析した。
【０１６９】
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異を有する改変ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＦｃＲｎに対するｐＨ依存性の結合を示した。結合（ＭＣＦによって測定した場合）は、ｐＨ６．０で最強であって、ｐＨ値がｐＨ６．５、７．０、７．５および８．０に増大するにつれて徐々に減少した。未改変の野性型ＩＬ−１３／Ｆｃ融合物の結合（ＭＣＦによって測定した場合）は、極めて類似したｐＨ依存性を示した。
【０１７０】
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異を有する改変ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質はまた、ヒトＦｃＲｎに対してｐＨ依存性の結合を示した。改変ＩＬ−１３／Ｆｃ融合タンパク質と同様に、結合（ＭＣＦによって測定した場合）は、ｐＨ６．０で最強であって、ｐＨ値がｐＨ６．５、７．０、７．５および８．０に増大するにつれて徐々に減少した。ここでも、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異体の測定されたｐＨ依存性は、未改変の野性型ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質について観察されたｐＨ依存性と酷似していた。
【０１７１】
（実施例９）
本実施例は、ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質についてのＣＤ２結合の分析を記載する。
【０１７２】
（Ｊｕｒｋａｔ細胞での結合アッセイ）
精製したＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質を、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）でＣＤ２に対する結合について試験した。１試験あたり約２×１０５個の細胞をＦＢＢ、ｐＨ７．５中で２回洗浄して、次いで、ＦＢＢ、ｐＨ７．５に１２５μｇ／ｍｌで含まれるＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質の１００μｌ中に再懸濁した。この細胞を氷上で１時間インキュベートして、ＦＢＢ、ｐＨ７．５中で２回洗浄して、ｐＨ７．５のＦＢＢ中で０．３４μｇ／ｍｌに希釈した２５μｌのヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣ結合体化抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に再懸濁した。氷上で暗野における３０分間のインキュベーション後、この細胞をｐＨ７．５のＦＢＢ中で２回洗浄して、１％ホルムアルデヒドに再懸濁した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（ＢＤ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、ＦＡＣＳ（商標）によってＣＤ２に対する結合についてサンプルを分析した。
【０１７３】
（結果）
Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異を有する改変ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質は、野性型ＬＦＡ−３／Ｆｃ融合タンパク質に対して類似のＣＤ２結合プロフィールを示した。これらの結果によってＴ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異がＣＤ２結合に影響しないことが示される。
【０１７４】
（実施例１０）
本実施例は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ特徴およびインビボ血清半減期のアッセイを記載する。
【０１７５】
ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質変異体のＦｃＲｎに対する親和性は、種々の方法、例えば、適切なバイオセンサーチップに結合体化された可溶性ＦｃＲｎを用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、またはトランスフェクトされた細胞の表面上で発現されるＦｃＲｎを用いる競合結合実験を行なうことによってインビトロで測定され得る。インビトロ親和性実験において用いられるＦｃＲｎは、マウス、アカゲザル、カニクイザル、ヒヒまたはヒト由来のものであってもよい。
【０１７６】
所望の特性を有するヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質変異体の血清半減期（例えば、インビボ排出半減期）は、適切な実験動物（例えば、内因性ＦｃＲｎの欠損した系統を含むマウス、およびヒトＦｃＲｎについてはトランスジェニックマウス（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５２８〜３５３３（２００３）またはサル）またはヒトに対して体重１ｋｇあたり０．１〜１０ｍｇの範囲のタンパク質のＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の用量を注射すること、次いで、ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の予想される血清半減期にまたがる種々の時間で血清サンプルを採取すること、そしてＥＬＩＳＡのような適切な技術によってインタクトなＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質の存在についてこのサンプルをアッセイすることによってインビボで測定され得る。次いで、このデータを分析して、この改変されたＩｇＧ融合タンパク質が増大したインビボ排出半減期を示すか否かを確認し得る。
【０１７７】
上記の実施例は決して、本発明の真の範囲を限定するものではなく、むしろ例示的な目的のために提示されているということが理解される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々の個々の刊行物または特許出願が参照によって援用されることを詳細にかつ個々に示されるかのように、参照によって本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１はＦｃ融合ベクターｐＭＪ００１の制限マップである。
【図２】図２は、Ｆｃ融合ベクターｐＭＪ０２６の制限マップである。
【図３】図３は、Ｆｃ融合ベクターｐＭＪ０４１の制限マップである。
【図４】図４は、ヒトＦｃＲｎベクターｐＤＬ２０８の制限マップである。
【図１】
2007531707.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2007531707000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月11日(2006.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2007531707000001.app
【国際調査報告】
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2007531707.tif 000119
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