(57)【要約】  酸化還元酵素によって作用される基板を収容する流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーであって、（ａ）第１の基板と、（ｂ）前記第１の基板の上の作用電極および基準電極と、（ｃ）試験メーター装置と電気的に接続するため前記電極に接続された導電性トラックと、（ｄ）前記第１の基板の一部を覆う第２の基板と、（ｅ）内部にチャネルを有し前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも１つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有する。前記作用電極が、（ｆ）樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、（ｇ）前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、（ｈ）前記ベース層および前記最上層の少なくとも１つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸化還元酵素によって作用される基板を収容する流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーであって、
（ａ）第１の基板と、
（ｂ）前記第１の基板の上の作用電極および基準電極と、
（ｃ）試験メーター装置と電気的に接続するため前記電極に接続された導電性トラックと、
（ｄ）前記第１の基板の一部を覆う第２の基板と、
（ｅ）内部にチャネルを有し前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも１つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有し、
前記作用電極が、
（ｆ）樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、
（ｇ）前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、
（ｈ）前記ベース層および前記最上層の少なくとも１つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える、バイオセンサー。
【請求項２】
前記緩衝剤が、リン酸塩、ＡＤＡ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＡ、およびＡＣＥＳからなるグループ、またはｐＫａが７．４±１である緩衝剤から選択される、請求項１に記載のバイオセンサー。
【請求項３】
前記緩衝剤のｐＨが７〜１０である、請求項１または２に記載のバイオセンサー。
【請求項４】
前記緩衝剤のｐＨが７〜８．５である、請求項３に記載のバイオセンサー。
【請求項５】
前記最上層にシステム安定剤をさらに含み、前記酵素によって作用されないポリオールからなる、請求項１〜４のいずれかに１項に記載のバイオセンサー。
【請求項６】
前記システム安定剤がトレハロースである、請求項５に記載のバイオセンサー。
【請求項７】
前記酸化還元酵素がグルコースオキシダーゼである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項８】
前記ベース層も、細かく分離された炭素またはグラファイトの粒子を含有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項９】
白金族金属または酸化物の前記細かく分離された粒子が、前記細かく分離された炭素またはグラファイトの表面に運ばれる、請求項８に記載のバイオセンサー。
【請求項１０】
前記細かく分離された粒子が炭素を包含し、前記ベース層が炭素の活性部位を遮断するための遮断剤をさらに含む、請求項８または９に記載のバイオセンサー。
【請求項１１】
前記遮断剤がタンパク質またはポリオールからなる、請求項１０に記載のバイオセンサー。
【請求項１２】
前記遮断剤がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはトレハロースである、請求項１１に記載のバイオセンサー。
【請求項１３】
前記酸化還元酵素が実質的に前記最上層に配置されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項１４】
酵素に対する緩衝剤の比率が１０〜７０ｍｏｌ／ｋｇの範囲である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項１５】
前記酵素に対する緩衝剤の比率が２０〜４０ｍｏｌ／ｋｇの範囲である、請求項１４に記載のバイオセンサー。
【請求項１６】
前記毛管流路が第１および第２の基板の両方の平行端縁から前記電極へ延びる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のバイオセンサー。
【請求項１７】
酸化還元酵素によって作用される基板を含む流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーを製造する方法であって、
（ａ）上部に作用電極および基準電極を有する第１の基板と、試験メーター装置との電気的に接続のために前記作用電極および基準電極に接続される導電性トラックとを取り、
（ｂ）細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物を含有するインクと樹脂結合剤とを前記導電性トラックの１つに印刷することによって前記作用電極を形成し、
（ｃ）前記印刷インクを乾燥させて、樹脂によって互いに結合された前記白金族金属または白金族金属酸化物からなる導電性ベース層を形成させまたは形成可能にし、
（ｄ）緩衝剤からなるまたは緩衝剤を含有するコーティング媒質で前記ベース層をコーティングすることにより、前記ベース層に最上層を形成し、
（ｅ）前記印刷インクおよび前記コーティング媒質の少なくとも１つにおいて前記酸化還元酵素の触媒活性量を提供し、
（ｆ）前記第１の基板の一部を覆う第２の基板を提供し、
（ｇ）内部にチャネルを有し前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置され、前記チャネルと隣接する表面とが、メッシュを含有せず前記基板の少なくとも１つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を一緒に規定するスペーサ層を提供する、方法。
【請求項１８】
前記コーティング媒質が前記緩衝剤を含有するコーティング液であり、前記方法が前記ベース層に最上層を形成するためにさらに前記コーティング液を乾燥させまたは乾燥可能にする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記コーティング液が滴下コーティングによって塗布される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ベース基に塗布されるコーティング液の容積が９０〜１６０ｎｌの範囲である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記コーティング液がスプレーコーティングによって塗布される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素が前記コーティング媒質の中で提供される、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記コーティング液中の緩衝剤の濃度が３００ｍｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
酵素に対する緩衝剤の比率が１０〜７０ｍｍｏｌ／ｇの範囲である、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記酵素に対する緩衝剤の比率が２０〜４０ｍｍｏｌ／ｇの範囲である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝剤がリン酸塩またはＡＤＡからなる、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記インク中の前記細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物が、細かく分離された炭素またはグラファイトの粒子の表面に運ばれる、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記コーティング液のｐＨが７〜８．５の範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の基板にＵＶ硬化型組成物を印刷し、その後に前記組成物を硬化させることによって、前記スペーサ層が形成される、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記スペーサ層が両面粘着テープからなる、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の基板が、親水性の内面を有するプラスチック材を備える、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記親水性の内面が熱密封性粘着剤からなり、それによって、前記第２の基板が熱および圧力の作用によって前記スペーサ層に粘着される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体内の検体濃度を例えば全血中のグルコースを測定するためのバイオセンサーに関する。また、本発明はこのバイオセンサーの製造方法を提供する。バイオセンサーは、通常、導電性の基板に積層または混合された酵素からなる酵素電極を備えている。この電極は、適切な検体の存在下でその酵素の触媒活性に電流滴定的に反応する。
【背景技術】
【０００２】
電流滴定的バイオセンサーは公知技術である。典型的には、酵素は、以下の反応によって過酸化水素を生成する酸化還元酵素、例えば、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、または、乳酸オキシダーゼである。
【０００３】
検体＋Ｏ２−[オキシダーゼ]  →  酸化生成物＋Ｈ２Ｏ２
過酸化物は一定電位電極で以下のように酸化される。
【０００４】
Ｈ２Ｏ２  →  Ｏ２＋２Ｈ＋＋２ｅ−
電極上の白金中心に過酸化水素が電気化学的に酸化されることにより、検体濃度に比例する電流を生成する電子の移動が過酸化物から電極へ生じる。グルコースが検体である場合、酸化生成物はグルコノラクトンである。日本国特許公開第５６−１６３４４７号は、白金電極に固定されたグルコースオキシダーゼを使用するシステムを記載する。この電極は、導電性の炭素ベース上の一層の固定酵素からなる。このベースは、フルオロカーボン樹脂結合剤を１０重量部まで含む成形グラファイトから形成され、その上に薄い（１μｍ未満）の白金フィルムが堆積されている。その発明は、白金表面に直接酵素を固定することによる問題を回避し、迅速な反応時間（５秒）、高感度、および耐久性を持つ酵素電極を生成すると言われている。しかしながら、米国特許第４９７０１４５号によれば、こうした電極を用いた近年の実験は、そのような利益を導き出せない。
【０００５】
米国特許第４９７０１４５号は、本質的に樹脂結合炭素またはグラファイトからなる不均質な多孔質基板であって、その基板を介して実質的に不均一に分散させられた白金族金属を持った不均質な多孔質基板と、多孔質基板の表面に吸収または固定された酵素の触媒作用的な活性量とを備える酵素電極を記載している。この電極は、酵素を基板に架橋することにより、または９０分間室温で酵素の緩衝液に多孔性基板を浮遊させることにより製造される。あるいは、電極への酵素の吸着は電気吸着法によって実施され、電極のベース材料は酵素溶液内の正電位で６０分間浮遊される。この電極は、反応時間が早く（保護膜がなければ１〜２秒、膜があれば１０〜３０秒）、安定性に優れると言われている。作用範囲は広いと言われ、電極は通常よりも実質的に低い作動電位を必要とし（通常は６５０ｍＶのところが３２５ｍＶ）、その作動電位で低い背景を示す。
【０００６】
米国特許第５１６０４１８号は、酵素と、細かく分離された白金族金属または酸化物との実質的に均一の混合物の薄膜からなる簡素な酵素電極を開示している。任意で、白金と結合されまたはパラジウムで処理され細かく分離された炭素またはグラファイトを使用してもよく、また任意で結合剤を使用してもよい。この膜は、それらの成分を含有する懸濁液をスクリーン印刷することで製造され得る。
【０００７】
前述のような先行技術のシステムが感度に関して遮断されることが多く、その結果、計測の精度が低くなることを発明者は見出した。また、必ずしも酵素の不安定性に関係しないが時間経過につれ感度が段階的に減衰することを発明者は見出した。
【０００８】
過酸化物から電極へ電子が運ばれた後に生じる電気信号のもう一つの測定方法として、あるバイオセンサーには、電子担体が、すなわち酸化型で酵素から電子を受け取った後に還元状態で電子を電極へと運び、そこで再度酸化される「媒介物」が含まれる。媒介物の先行技術の例には、フェロセン、フェロセン誘導体、フェリシアン化物、オスミウム複合体、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ナイル青、およびメドラ青（Medola Blue）が含まれる。例えば、米国特許第５７０８２４７号、米国特許第６２４１８６２号、米国特許第６４３６２５６号、国際公開第９８／５５８５６号、および国際公開第９９／１３１００号を参照。酸化還元媒介物を使用して酵素と電極との間に電子を運ぶバイオセンサーは、「媒介バイオセンサー」と呼ばれる。
【０００９】
媒介バイオセンサーは、化学的不安定性を含めた多数の問題を被っている。媒介物は特別な酸化還元状態で存在して機能しなければならないため、還元形態が空気によって酸化された場合には計測される電流は減少する。また、酸素は、電子を受け取って、媒介電極の電位で酸化されない過酸化物を形成することにより干渉することもある。電極の電位を増大させて酸化物を酸化する場合には、血液中に溶解されている他の試料から、例えばパラセタモール、アスコルビン酸塩、および尿酸からシステムが干渉されやすくなる。このように、血液中の酸素濃度が変化することによって、媒介システムにおいて測定されるグルコース反応は変化する。
【００１０】
使い捨てバイオセンサーにとって望ましい属性には以下のようなものが含まれる：
・校正後に変動係数（ＣＶ）を少なくするために、背景に関係する低い干渉；
・電子が許容するだけの高感度；
・安定性；
・優れた精度；
・再現可能な製造；
・迅速な反応；
・低コスト。
【００１１】
また、バイオセンサーは、少ない検体量を使って十分に正確な読み取り（例えば、数マイクロリットル未満の全血試料から血糖濃度の読み取り）を行うことができることが望ましい。米国特許第６４３６２５６号では、少ない検体量（２マイクロリットル未満）を必要とするバイオセンサーは、多層構造を有する媒介バイオセンサーによって達成される。この構造は、印刷スペーサ層によって分離されるとともに試料の導入用に一端で開いたキャビティを形成した２つの基板からなる。このキャビティは、スペーサ層を覆うモノフィラメントメッシュで充填され、界面活性剤またはカオトロピック剤でコーティングされている。このメッシュは、作用電極および基準電極を覆うとともに、上方の基板を越えて延びて一端でメッシュの露出領域を提供する。露出領域への液体試料の塗布はメッシュを溢れさせ、液体がメッシュを介して毛管作用により電極へ運ばれる。
【００１２】
メッシュの存在は、バイオセンサーの製造中に作用電極上に試薬を拡散させやすくするが、製造工程の複雑性を高める。また、作用電極を越えて試薬に拡散することは、作用電極が適切に処理されていることを確かめるにさらなる試薬が必要であることを意味する。
【００１３】
本発明は、少なくとも上記の基準のいくつかの点で向上された酵素電極およびバイオセンサーを提供することを追求するものである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様によれば、酸化還元酵素によって作用される基板を収容する流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーが提供され、そのバイオセンサーは、
（ａ）第１の基板と、
（ｂ）前記第１の基板の上の作用電極および基準電極と、
（ｃ）試験メーター装置と電気的に接続するため前記電極に接続された導電性トラックと、
（ｄ）前記第１の基板の一部を覆う第２の基板と、
（ｅ）内部にチャネルを有し前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置されるとともに、前記チャネルが隣接する面と協働してメッシュを含まず前記基板の少なくとも１つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を規定するようにしたスペーサ層とを有し、
前記作用電極が、
（ｆ）樹脂によって互いに結合され細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物の粒子からなる導電性ベース層と、
（ｇ）前記ベース層の上で緩衝剤からなる最上層と、
（ｈ）前記ベース層および前記最上層の少なくとも１つに前記酸化還元酵素の触媒活性量とを備える。
【００１５】
用語「非媒介」は、本明細書において、酸化還元型の媒介物の著しい量を含まない作用電極を有するバイオセンサーを指す。好ましくは、作用電極は、何らの酸化還元型の媒介物を含有していない。このため、グルコースオキシダーゼなどの酸化還元酵素を用いる場合には、測定される電流の全てまたは実質的に全てが、電極における過酸化物の酸化から生じる。
【００１６】
毛管流路がメッシュを含まないため、緩衝剤を含し塗布された液体は吸上げ作用によって作用電極から離れて運ばれることはない。バイオセンサーは、最上層内のより少量の緩衝材および／または他の試料を使って製造されてもよい。スペーサは、相対的に薄く、例えば６０〜１２０μｍであり、毛管流路の容積を減少させて、バイオセンサーがより少ない試料容積を必要とするようにしてもよい。これにより、バイオセンサーを被験者の身体の別の試料部位で使用することが可能になる。血液試料は、通常、被験者の指を刺すことによって採取されて、従来のバイオセンサーへの塗布のために比較的大きな血液の滴を提供する。指先には比較的多数の神経終末があるため、指先を刺すことにより痛みが伴われ、被験者が非常に頻繁に血糖レベルを調べるのを防ぐことできる。本発明によるバイオセンサーを使って、代替部位から読み取りを行う、例えば神経終末のより少ない被験者の上腕から読み取りを行うので、試料採取にはあまり痛みを伴わない。試料の容積は約０．８μｌでよい。
【００１７】
少ない試料容積の採取を容易にするために、毛管流路は両方の基板に対向する端縁から電極へ延びて、試料をバイオセンサーに導入する地点で１つの基板が他方のものを越えて延びるリップがないようにすることが好ましい。リップの存在により、試料のいくらかまたは全てが残留する浪費スペースが提供される。
【００１８】
バイオセンサーの毛管充填を助長するために、毛管流路を規定する主要な表面の少なくとも１つは親水性であり、全血などの生体液によって容易に湿らされるようにしている。
【００１９】
最上層に緩衝剤を提供することにより、増大された安定性および感度とともに、従来の非媒介バイオセンサーよりも早い反応時間を得ることができることを発明者は見出した。発明者が考えている感度および反応時間の増大は、ストリップ上での高い緩衝能力を提供することにより達成される。過酸化水素の酸化は、緩衝材によって中和される水素イオンを作り出す。これには２つの効果がある。酵素周辺の局所的なｐＨを維持することによって酵素活性を維持し、それをもっと効率にする過酸化水素の酸化の平衡を移す。また、過酸化水素の酸化の効率を向上させることは、酸化還元酵素によって利用可能である大きな酸素の再循環をもたらす。また、酵素に対する緩衝剤の比率が望ましい反応の直線性を得る際におよび適当な感度の下限を得るために重要であることを発明者は見出した。さらに、最大の感度を達成するために緩衝剤および酵素が特別な閾値濃度を超える必要があり、この濃度を超えると酵素に対する緩衝剤の比率を使ってバイオセンサーの血糖への反応の特性を「調節」することを発明者が見出した。それは、実験結果という状況において後述されるだろう。
【００２０】
好ましい緩衝剤には、リン酸塩、ＡＤＡ、ＭＯＰＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＡＣＡ、およびＡＣＥＳが含まれ、またはｐＫａが７．４±１である緩衝剤が含まれる。緩衝剤のｐＨの範囲は、システムの特定な化学特性に左右される。好ましい範囲は、ｐＨ７〜１０、特に７〜８．５である。特に好ましい緩衝剤は、ｐＨが約８のリン酸塩およびｐＨが約７．５のＡＤＡである。
【００２１】
白金族金属または酸化物は、米国特許第５１６０４１８号で記述されているように、ベース層が電気的な導電性であるのに十分な量の中に存在している。あるいは、ベース基は、細かく分離された炭素またはグラファイトの粒子も含有してもよい。便宜上、用語「触媒」は本明細書中では細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物を指すために用いられている。触媒は炭素またはグラファイトの粒子の表面に運ばれてもよい。好ましい態様では、触媒は、炭素またはグラファイトの粒子と親密な表面接触、例えば白金と合金になった炭素またはパラジウム処理された炭素と親密な表面接触をする。触媒は、粒子の表面に吸着、結晶化、または堆積されてもよい。
【００２２】
樹脂は、ベース層内で白金族金属または酸化物を結合するのに役立つ何らかの適合性を有する結合材料または結合剤、例えば、ポリエステル樹脂、エチルセルロース、またはエチルヒドロキシエチルセルロース（ＥＨＥＣ）を含んでもよい。
【００２３】
作用電極は、触媒を含むインクをベース基板に印刷し、印刷されたインクを乾燥させてベース層を形成し、次に緩衝剤からなるまたは緩衝剤を含むコーティング媒質の塗布により最上層を形成することによって製造されてもよい。コーティング媒質は好ましくは流体であり、特に緩衝剤を溶解した水溶液である。ただし、コーティング媒質は、例えばスプレーによって粘着性のベース層に塗布され緩衝材からなるまたは緩衝材を含む乾燥粉末からなる。コーティング液を塗布した時に最上層を形成する好適な方法には、印刷、スプレー、インクジェット印刷、ディップコーティング、またはスピンコーティングが含まれる。好ましいコーティング技術はコーティング液の滴下コーティングであり、本発明は、この好ましい方法を参照して明細書中で記載されるだろう。コーティング液をベース層に正確に滴下コーティングすることにより、必要になるコーティング液の容量は、例えば１２５ｎｌまで減少されてもよい。
【００２４】
好ましい実施の形態では、酵素は、最上層に緩衝剤を設けられている。この配置は、酵素がより効率的に働くとともに白金族金属または酸化物が最適に働くレベルと典型的に異なるレベルまで、最上層の局所的環境でのｐＨの調節を容易にする。
【００２５】
システム安定剤は有利には最上層に含まれてもよい。好適な安定剤には、酵素によって作用されるものとは異なるポリオール、例えば、酵素がグルコースオキシダーゼであるトレハロース、マンニトール、ラクチトール、ソルビトール、またはスクロースが含まれる。システム安定剤は、容器封入して貯蔵時に３次構造の変化を妨げることによって、または酵素分子の周囲の水分活性を取り替えることによって酵素を安定化してもよい。グルコースオキシダーゼ酵素はきわめて安定な酵素であることが分かっており、安定剤の添加はこの酵素を保護するのに必須のものではない。安定剤は、空気酸化のために炭素表面を塞ぐとともに白金めっきされた炭素樹脂のベース層をコーティングすることによって、長期間の触媒パッシベーション効果を低下するのを助けると考えられている。
【００２６】
炭素粒子がベース層内に存在する場合、炭素粒子上の活性部位を遮断するために遮断剤がその層に任意で含まれても良い。これにより、炭素活性の貯蔵安定性および均一性が高められる。適切な遮断剤には、システム安定剤およびタンパク質も、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が含まれる。高い表面の炭素の代わりにグラファイト粒子が使用された場合、その粒子は高い導電性を持つが、グラファイトの活性部位の数は炭素よりもはるかに少ないため遮断剤はあまり望ましくない。表面積が小さく表面の活性群が少なければ少ないほど、両者は干渉を低減させる傾向がある。検体が０ｍＭの場合、干渉は、関連される表面積である容量成分から主になる。
【００２７】
基板は、塗布されるコーティングと両立するあらゆる好適な熱安定性材料で形成されても良い。熱安定性は、製造過程で印刷の良好な表示を確保するために重要である。好ましい基板は、Ｖａｌｏｘ  ＦＲ−１熱成形ポリエステルフィルム（ポリ（ブチレンテレフタレート）コポリ（ビスフェノール−Ａ／テトラブロモビスフェノール−Ａ−カーボネート）である。その他の好適な基板は、当業者にとって公知であり、例えば、ＰＶＣ、ポリ（エテルスルフォン）（ＰＥＳ）、ポリ（エテルエテルケトン）（ＰＥＥＫ）、およびポリカーボネートである。
【００２８】
酵素はあらゆる好適な酸化還元酵素、例えばグルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、またはラクテートオキシダーゼであっても良い。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、酸化還元酵素によって作用される基板を含む流体の存在下で前記酵素の触媒活性を電流滴定的に示す非媒介バイオセンサーを製造する方法が提供され、その方法は、
（ａ）上部に作用電極および基準電極を有する第１の基板と、試験メーター装置との電気的に接続のために前記作用電極および基準電極に接続される導電性トラックとを取り、
（ｂ）細かく分離された白金族金属または白金族金属酸化物を含有するインクと樹脂結合剤とを前記導電性トラックの１つに印刷することによって前記作用電極を形成し、
（ｃ）前記印刷インクを乾燥させて、樹脂によって互いに結合された前記白金族金属または白金族金属酸化物からなる導電性ベース層を形成させまたは形成可能にし、
（ｄ）緩衝剤からなるまたは緩衝剤を含有するコーティング媒質で前記ベース層をコーティングすることにより、前記ベース層に最上層を形成し、
（ｅ）前記印刷インクおよび前記コーティング媒質の少なくとも１つにおいて前記酸化還元酵素の触媒活性量を提供し、
（ｆ）前記第１の基板の一部を覆う第２の基板を提供し、
（ｇ）内部にチャネルを有し前記第１の基板と前記第２の基板との間に配置され、前記チャネルと隣接する表面とが、メッシュを含有せず前記基板の少なくとも１つの端縁から前記電極へ延びる毛管流路を一緒に規定するスペーサ層を提供する。
【００３０】
本発明のその他の態様および利点は、以下の明細書、図面、および請求項において明らかになる。
【００３１】
本発明は一例として以下の図面を参照してさらに記述されるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
ＢＳＡ−白金／炭素の調製
２５０ｍｌのガラス瓶において、Ｍｉｌｅｓ社製のＢＳＡ６．４ｇをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）８０ｍｌに溶解し、ＭＣＡ社製の１０％白金／ＸＣ７２Ｒ炭素２０ｇを常に撹拌しながら徐々に添加した。その瓶を回転ミキサーに置き室温で２時間インキュベーションした。
【００３３】
Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１（商標登録）の２枚のろ紙を使用してブフナー漏斗を準備した。混合物をこの漏斗および炭素に注ぎ、ＰＢＳ約１００ｍｌで３回洗浄した。できるだけ多くの液体を抽出するために、真空によって炭素のケーキを通して約５分間吸引する。プラスチック製の容器の中に炭素のケーキを注意深くこすり落とし、へらで押しつぶした。それから、この炭素をオーブンに３０℃で一晩置いて乾燥させた。この手順の目的は、炭素上の活性部位を遮断して炭素特性の貯蔵安定性および再現性を助けることである。
【００３４】
白金族金属／炭素インクの調製
ＢＳＡ−白金／炭素を、ポリマー結合剤としてのＭｅｔｅｃｈ８１０１のポリエステル樹脂と、インクの溶媒としてのブチルセロソルブアセテート（ＢＣＡ）との中で調整した。
【００３５】
インクの組成（Ｉ）
Ｍｅｔｅｃｈ８１０１の樹脂    ４５．３２％
ＢＳＡ−白金／炭素          １８．６７％
グラファイト            ９．７７％
ＢＣＡ／シクロヘキサノン     ２３．２６％
Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）     ２．９８％
Ｔｗｅｅｎ２０は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社によって供給される界面活性剤である。Ｔｗｅｅｎは、ＩＣＩＡｍｅｒｉｃａｓ社の登録商標である。溶媒はＢＣＡおよびシクロヘキサノンの５０％ｖ／ｖ混合物である。グラファイトは、英国ウースターシャー州イヴシャムのＧＳＩｎｏｒｇａｎｉｃｓ社からのＴｉｍｒｅｘＫＳ１５（粒径１６μｍ未満）であった。
【００３６】
Ｔｗｅｅｎ２０の樹脂と溶媒の約半分とを最初に混合した後に、炭素留分およびグラファイトを添加した。最初に、この組成を手で混合した後に、３重ロールミルに数回通した。それから、残った溶媒をインクに加え、インクが印刷に好適な粘度になるまで混合した。
【００３７】
さらなる試験組成にはインク内のＧＯＤが以下のように含まれた。
【００３８】
インクの組成（ＩＩ）
Ｍｅｔｅｃｈ８１０１の樹脂    ４４．６８％
ＢＳＡ−白金Ｐｔ／炭素        １８．４２％
グラファイト                    ９．６４％
ＢＣＡ／シクロヘキサノン      ２２．９４％
Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）      ２．９４％
グルコースオキシダーゼ          １．３８％
滴下コーティング溶液の調製
コーティング溶液は水を主成分とし、高濃度の緩衝液、好ましくはｐＨ８のリン酸塩からなる。緩衝能力がイオン強度よりも重要であることが明らかになっている。本実施例では、この溶液はグルコースオキシダーゼおよびシステム安定剤を含有し、本実施例ではトレハロースを含有する。
【００３９】
試料の滴下コーティング溶液
緩衝液 ＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４  ３８５ｍＭ、ｐＨ８   Ｓｉｇｍａ社
酵素   グルコースオキシダーゼ      ４０８０Ｕ／ｍｌ     Ｂｉｏｚｙｍｅ社
安定剤 トレハロース  １％   Ｓｉｇｍａ社
好ましい範囲
緩衝液 ３００〜１０００ｍＭ、ｐＨ７〜１０
酵素   ５００〜１２０００Ｕ／ｍｌ（１．８５〜４４．４ｍｇ／ｍｌ）
安定剤 ０．５〜３０％
グルコースオキシダーゼの活性度は、材料１ミリグラムにつき約２７０単位である（この酵素は他の凍結乾燥剤および安定剤とともに調製されているため、タンパク質１ミリグラムにつき約３６０単位）。
【００４０】
酵素がベース層内に、例えばインク組成ＩＩを用いて調製されたベース層内に位置する場合、滴下コーティング溶液は緩衝液のみを、任意で安定剤とともに含有してもよい。
【００４１】
製造方法
グルコース試験ストリップ（バイオセンサー）を、スクリーン印刷および滴下コーティング技術の組み合わせを用いて製造した。また、印刷およびコーティング技術における当業者にとって本質的に公知である他の印刷および／またはコーティング技術を用いてもよい。この例示された方法は図のみとする。それぞれの場合において種々の工程の実施順序は最終製品に影響を及ぼさずに変更されても良いことは理解されるだろう。図１〜図４はいずれも、上の列が加工工程を示し、下の列がバイオセンサーの逐次的積み重ねを示す。
【００４２】
図１によれば、ベース基板２はポリエステル（Ｖａｌｏｘ（商標登録））から形成される。英国のＧｗｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社の製品番号Ｃ８０１３０Ｄ１の導電性カーボンペーストとして、導電性トラック４を基板２の上に印刷した。このインクの目的は、メーターインタフェースと、基準および作用電極との間に導電性トラックを設けることである。印刷後に、このインクを１分間、１３０℃の強制空気乾燥機で乾燥させた。導電性カーボン４の表層に印刷された第２のインクは、英国のＧｗｅｎｔ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ社の製品番号Ｃ６１００３Ｄ７のシルバー／シルバー塩化物ポリマーペーストである。このインク６は、接触領域または作用領域の上には印刷されない。このインク６は本システムの基準電極２２を形成する。それを１分間、１３０℃の強制空気乾燥機で乾燥させる。本明細書で用いる用語「基準電極」がそのような技術において公知である対電極としても機能する基準電極であることは、理解されるだろう。
【００４３】
次の層は、導電性カーボン４の上に印刷される白金族金属炭素インクで（インク組成ＩまたはＩＩ）である。このインクを１分間、９０℃の強制空気乾燥機で乾燥させ、厚さ約１２μｍの導電性ベース層８を形成する。その後に、誘電体層１０が、作用電極および基準電極が設置される作用領域１２を除いて印刷される。この誘電層１０は、英国のＡｐｏｌｌｏ社からのＭＶ２７である。この層の目的は、システムを絶縁することである。それを１分間、９０℃の強制空気乾燥機で乾燥させる。場合によっては、ベース層８は誘電体層１０の後に印刷可能である。ただし、誘電体層１０を次に塗布することにより印刷の耐容要件のいくらかが取り除かれるので、ベース層８を最初に印刷するのが好ましい。
【００４４】
それから、ＢｉｏＤｏｔ滴下コーティング装置を用いて、滴下コーティング層をベース層８に塗布する。滴下コーティング溶液の使用量は１２５ｎｌであり、それは一滴として塗布される。この滴下コーティング層を１分間、５０℃の強制空気乾燥機で乾燥させる。
【００４５】
次に、スペーサ層１４を誘電体層１０の上に塗布する。図１に示す実施例では、スペーサ層１４は厚さ約９０μｍの両面粘着テープから形成される。このテープは、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９０１１８であり、２つの３２μｍのＡＳ−１１０アクリル医療用粘着層を持った２６μｍのＰＥＴ担体からなる。
【００４６】
互いの先端部に積み重ねられた、例えば、倉庫内または試験メーターのカートリッジ内に積み重ねられたバイオセンサーでは、基板の端縁からの粘着剤のはみ出しを減少または排除し、隣接するバイオセンサー同士を接着しやすくするのが望ましい。この目的のためにスペーサ１４として使用するのに好ましい材料は、Ｉｒｅｌａｎｄ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、Ｒａｈｅｅｎ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｐａｒｋ、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｒｅｌａｎｄ社からの製品番号６１−８９−０３である。このスペーサ材料は、３６μｍのＰＥＴ膜の各側面上の感圧接着剤（ＰＳＡ）２５〜２９μｍからなる。さらに別のスペーサは、Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｒｅｌａｎｄ社の製品番号６４−１４−０４であり、それは２３μｍのＰＥＴ膜の各側面上にＵＶ硬化型ＰＳＡを有する。この粘着層はいずれも厚さ３１〜３５μｍである。推奨される硬化条件は、Ｄ−バルブ（鉄でドープ処理された水銀）、１つのランプ、フルパワー、およびベルトスピード２０ｍ／分である。これらの条件下で期待されるエネルギーは、ＵＶＡ＝３５７Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＢ＝０．１２８Ｊ／ｃｍ２、ＵＶＣ＝０．０１０Ｊ／ｃｍ２である。
【００４７】
スペーサ１４は、バイオセンサーの毛管流路を決定するチャネル１６を有する。第２の基板すなわち蓋１８をスペーサ１４に接着する。蓋１８は、親水性熱密封粘着剤「ＨＹ９」約１２．５μｍでコーティングされた５０μｍのＰＥＴテープ（Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９０１１９）からなる。蓋１８は、狭い排出口１９を設けられて、毛管流路からの空気を逃がすことができる。最後に、第２の基板１８を切断して最終的なバイオセンサー２０を作る。あるいは、スペーサ１４を最初に第２の基板１８に接着し、次に第１の基板に接着させることもできる。この順序の利点は、第２の基板１８の両方の部分がスペーサ１４によって正しい位置に保持されている間に、第２の基板１８を切断して排出口１９を設けることができる点である。
【００４８】
バイオセンサー２０は、基準電極２２および作用電極２４を有する。作用電極２４は、第１の基板２の上の導電性カーボン層４の上のベース層８と、緩衝液を含む表層とからなる。
【００４９】
大規模製造の場合には、最初に単一のブランクまたはウェブの上で互いに接続され、好ましくは２倍の基板長の深さで接続される複数の基板が設けられても良いし、ブランクまたはウェブ全体の上で実施される種々の加工工程の後に、複数のバイオセンサー２０を製造する最終分離工程が続いた。
【００５０】
バイオセンサー２０は、スペーサ１４の中のチャネル１６と、蓋１８の内面と、第１の基板２とによって規定される（誘電体層１０によって大部分覆われる）毛管流路を有する。この流路は、基板２、１８のそれぞれの対立する短い端縁から基準電極および作用電極２２、２４へ延びている。蓋１８の内面は、親水性になるように処理されて、血液による湿りを容易にする。酵素としてのグルコースオキシダーゼとともに、このバイオセンサーは血糖を測定するために用いられる。ユーザーは、自分の上腕などのような代替部位を針で刺して皮膚上に小さな血液の滴を作るとともに、その血液が置かれた皮膚にバイオセンサー２０の適切な短い端縁を接触させることによって、読み取りを行うことができる。血液は迅速に作用領域１２に吸引され、既知の手段で導電性トラック４に接続されたメーター（図示せず）によって読み取り可能な電流を作り出す。試料の量は約０．８ｎｌで十分である。
【００５１】
代替の実施の形態が図２で示される。加工工程は以下を除いて図１と同じである。ＵＶ−硬化型樹脂（Ｎｏｒ−Ｃｏｔｅ  ０２−０６０  Ｈａｌｆｔｏｎｅ  Ｂａｓｅ）を誘電体層１０の上にスクリーン印刷するとともに、ＵＶ光（１２０ｗ／ｃｍ中圧水銀蒸気放電ランプ）３０ｍ／分までで樹脂を硬化させることによってスペーサ１４を形成する。この樹脂は、アクリレートオリゴマー（２９〜５５％）、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン（５〜２７％）、およびアクリレートモノマー（６〜２８％）からなる。チャネル１６に加え、スペーサ１４は、毛管流路から空気を逃がすための排出口チャネル１５を有する。蓋１８は排出口の出口を必要とせず、親水性熱密封粘着剤（「ＨＹ９」でコーティングされたＡｄｈｅｓｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９０１１９）でコーティングされた内面を有する単一のユニットとして形成されている。蓋１８は、１〜２秒の熱および圧力（１００℃、４００ｋＰａ）の作用によってスペーサ１４に接着される。
【００５２】
次に、図３を参照すると、さらなる実施の形態が例示される。本実施の形態は、図２と同じ構造を有するが、（図２と同じＵＶ硬化型樹脂から形成された）スペーサ１４ａではチャネル１６ａは１つの長い端縁から他方の端縁へ延びている。この構成により、毛管の開口部は１つの長い端縁に設けられ、空気の排出口が他方の端縁に設けられる。
【００５３】
図４のバイオセンサーは、図３と類似の構造を有するが、導電性トラック４、導電性インク６、およびベース層８は配列されて、作用電極２４および基準電極２２が流路の中で並ぶように配置されている。この配置は、図１および図２に示すのと同じ効果を有するが、バイオセンサーの１つの長い端縁の開口部を介して試料が塗布される。毛管流路を介して流れる血液は、両方の電極の上にほぼ均一かつ同時に流れ、そのことは再現性および正確性において望ましい。
【００５４】
試験手順
試験手順は、試験ストリップをポテンシオスタット（定電位電解装置）に接続することを伴う。試料を、この実施例では静脈全血（ＷＢ）の試料を注入後に、電位３５０ｍＶを作用電極および基準電極を通して作用させる。この電位を１５秒間維持し、その後に電流を測定する。反応グラフを作成するのにこの電流を使用する。図５〜図１３の結果は、インク組成Ｉと、それぞれＧＯＤおよび緩衝剤を含有する種々の滴下コーティング組成とを用いて得られた。試験ストリップは、図１に示す構造を有した。滴下コーティング（１２５ｎｌ）の後に、部分的に構成された試験ストリップは、積層の前に４日間、室温および低湿度で静置し、切断および注封を行った。
【００５５】
図５は、リン酸カリウム緩衝剤３８５ｍＭに対してＧＯＤレベル（酵素に対する緩衝剤の比率）の変化の結果を示す。それぞれの溶液においてトレハロースはＧＯＤと同じ濃度（１００ｍｌにつき数ｇ）で存在した。０．８３ｍＭ〜４１．５ｍＭの静脈血グルコース濃度に対して結果をプロットした。この結果が示していることは、ＧＯＤの増加（緩衝剤／酵素の比を約２０ｍｍｏｌ／ｇから減少）が、より高いグルコース濃度に渡ってグルコースの感度の増大を与えることである。８００ｍＭまで増加された緩衝剤の濃度とのさらなる実験が示唆していることは、３８５ｍＭまたは６００ｍＭでの変化よりも少ないように見えるので、安定性が若干向上されることである。しかしながら、ＧＯＤの濃度を増加（比率を減少）させることは、ストリップの安定性を向上させるのに大きな効果を有するようである。ＧＯＤレベルの増加は、低いグルコースの濃度の感度に影響を与え、反応を平坦化させる。このため、酵素の挿入を増加させることは、ボトムエンドの感度を低減させる可能性がある損失を除いて、試験ストリップの安定性を向上させる。
【００５６】
図６は、ＧＯＤの挿入を１００ｍｌあたり０．３９ｇから７．７ｇへの変更と、同量のトレハロースとの結果を描いている。ＧＯＤの減少により低い濃度の反応が改善される。また、高いＧＯＤと高い緩衝剤の濃度とが、ある範囲のグルコースレベルで反応を低下させる傾向があることを見出した。この影響は、滴下コーティング溶液内の種々の濃度で酵素に対する緩衝剤の比率（ｍｍｏｌ／ｇ）を変更する結果を描く図８〜図１２から観察される。
【００５７】
図７に示すように、トレハロース濃度を変更しても、低いグルコースの濃度に対しての反応に影響がほとんどない。トレハロースのより高いレベルは、低いグルコースレベルでの感度にとっての損失を持つバイオセンサーの安定性を高めるから好適である。
【００５８】
図１３は、最上層の滴下コーティングと比較されたスプレーコーティングの結果を示す。滴下コーティングは、ＢｉｏＤｏｔ装置から１２５ｎｌの一滴を用いた。スプレーコーティング装置は、距離１ｃｍあたり容積０．４μｌで（ベース層８よりもわずかに広い）幅約４ｍｍの噴霧化されたスプレーを生成した。特に、高い血糖濃度値に対しては、濃度が高ければ高いほど大きな反応がもたらされる。３８５ｍＭおよび３８．５ｍｍｏｌ／ｇで滴下コーティングされた作用電極は、同じ濃度値においてスプレーコーティングされた作用電極よりも顕著に大きな反応を示した。
【００５９】
個々の実施の形態の内容で明確に記載された本発明の特定の特徴は、単一の実施の形態での組み合わせでも提供可能であることが理解される。これとは逆に、簡潔に述べるために単一の実施の形態の内容で記載された本発明の種々の特徴は、個別にまたは任意の適切な小さな組み合わせで提供可能である。
【００６０】
本発明は具体的な実施の形態を参照して記述されたが、本発明の変更および変形は添付の請求項で規定された発明の範囲から逸脱しないで解釈されることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】本発明の異なる実施の形態によるバイオセンサーの形成の段階を示す。
【図２】本発明の異なる実施の形態によるバイオセンサーの形成の段階を示す。
【図３】本発明の異なる実施の形態によるバイオセンサーの形成の段階を示す。
【図４】本発明の異なる実施の形態によるバイオセンサーの形成の段階を示す。
【図５】本発明の一態様によるバイオセンサーに負荷された種々の酵素の電流反応を示すグラフである。
【図６】特定の緩衝剤用の静脈血グルコース反応に負荷する酵素の効果を示すグラフである。
【図７】静脈血グルコース反応でのトレハロースの滴下コーティング濃度の効果を示すグラフである。
【図８】緩衝剤に対する酵素の比率を変化させることによって本発明の数態様によるバイオセンサー用の静脈血グルコース反応を示すグラフである。
【図９】緩衝剤に対する酵素の比率を変化させることによって本発明の数態様によるバイオセンサー用の静脈血グルコース反応を示すグラフである。
【図１０】緩衝剤に対する酵素の比率を変化させることによって本発明の数態様によるバイオセンサー用の静脈血グルコース反応を示すグラフである。
【図１１】緩衝剤に対する酵素の比率を変化させることによって本発明の数態様によるバイオセンサー用の静脈血グルコース反応を示すグラフである。
【図１２】緩衝剤に対する酵素の比率を変化させることによって本発明の数態様によるバイオセンサー用の静脈血グルコース反応を示すグラフである。
【図１３】種々のコーティング技術により製造された本発明によるバイオセンサーの結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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