(57)【要約】本発明は新規な免疫原、ＭＴＡ（５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン）に高い特異性を有する新規な抗体、この抗体を用いた治療及び製剤、及びスペルミジンシンターゼの活性を測定する高感度なアッセイを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと特異的に結合するモノクロナル抗体。
【請求項２】
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する反応性を１００％とした場合に、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンに対する交差反応性が０．１％以下である請求項１記載のモノクロナル抗体。
【請求項３】
該交差反応性が０．０１％以下である請求項１記載のモノクロナル抗体。
【請求項４】
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する反応性を１００％とした場合に、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンに対する交差反応性が０．１％以下であるポリクロナル抗体。
【請求項５】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2007531724.tif 000024
（式中、ｎは１以上の整数、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲは活性エステルである）
で表される化合物。
【請求項６】
一般式（Ｉ）で表される化合物においてｎが５である請求項５記載の化合物。
【請求項７】
Ｒが以下の式（ＩＩ）：
【化２】
2007531724.tif 000025
で表される請求項６記載の化合物。
【請求項８】
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンのプリン基にキャリアタンパクを結合させることを特徴とする免疫原。
【請求項９】
一般式（ＩＩＩ）：
【化３】
2007531724.tif 000026
（式中、ｎは１以上の整数、Ｘはキャリアタンパクである）で表される請求項８記載の免疫原。
【請求項１０】
一般式（ＩＩＩ）で表される化合物においてｎが５である請求項９記載の免疫原。
【請求項１１】
Ｘがカギアナカサガイのヘモシアニンである請求項１０記載の免疫原。
【請求項１２】
請求項８から１０のいずれかに記載の免疫原に対する請求項４記載のポリクロナル抗体。
【請求項１３】
請求項８から１０のいずれかに記載の免疫原に対する請求項１から３のいずれかに記載のモノクロナル抗体。
【請求項１４】
５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと特異的に結合するモノクロナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１５】
受託番号がＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０２２６である請求項１４記載のハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項１５に記載のハイブリドーマによって産生される請求項１から３のいずれかに記載のモノクロナル抗体。
【請求項１７】
標識されたものである請求項１から４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１８】
該標識が、酵素、蛍光物質、着色ビーズ、放射性同位元素、金属類、またはビオチンである請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
標識がペルオキシダーゼである請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
標識がユウロピウムクリプテートである請求項１８記載の抗体。
【請求項２１】
請求項１から４のいずれかに記載の抗体を用いたアッセイ法。
【請求項２２】
抗体を用いたアッセイ法がＥＬＩＳＡ法である請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
抗体を用いたアッセイ法がホモジニアスアッセイ法である請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該ホモジニアスアッセイ法が蛍光共鳴エネルギー転移を用いたアッセイ法である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
スペルミジンシンターゼの活性を測定するものである請求項２１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
変形性関節症の治療・予防剤を探索するものである請求項２１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
変形性関節症の治療の必要がある被験者を治療する方法であって、
被験者の治療に十分効力のある量のスペルミジン生合成を阻害する抗体を被験者に投与することを含む方法。
【請求項２８】
スペルミジンシンターゼに関する疾患の治療の必要がある被験者を治療する方法であって、
被験者の治療をするためにスペルミジンシンターゼの生合成の実質的な阻害効果を有する抗体を被験者に投与することを含む方法。
【請求項２９】
疾患が、癌、骨粗しょう症、アルツハイマー病、そして高血圧を含む増殖性疾患である請求項２７もしくは２８の方法。
【請求項３０】
抗体が、請求項１から４、１２から１３、もしくは１６から２０のいずれかの抗体である請求項２７もしくは２８の方法。
【請求項３１】
請求項１から４、１２から１３、もしくは１６から２０のいずれかの抗体を含む薬学的組成物。
【請求項３２】
さらに薬学的に許容される担体を含む請求項３１の組成物。
【請求項３３】
請求項５から７のいずれかの化合物を含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００４年４月５日に出願された日本出願特願２００４−１１１３７３号の優先権を主張するものである。この出願の内容は、本明細書中に引用することにより本出願に援用される。
【０００２】
本明細書中には、種々の特許や科学技術文献が引用されている。これらの文献の内容は、より詳細にこの発明が属する技術水準を完全に示すものとして、そのまま本明細書中に引用することにより本出願に援用される。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（以下ＭＴＡともいう。）に対する特異性の高い抗体を提供する。さらに、この抗体を用いたアッセイ法やこの抗体の薬学的用途を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（背景技術）
スペルミジンシンターゼ（以下ＳＰＤＳともいう。）は、以下に示す反応式によりスペルミジンを合成する。スペルミジンは塩基性低分子有機化合物であるポリアミンの１種であり、タンパク質及び核酸合成の盛んな組織中に多く含まれている。スペルミジンは核酸との相互作用による核酸の安定化と構造変化に関っており、種々の核酸合成系への促進作用を有し、タンパク質合成系の活性化等の多岐にわたる生理的作用を示す物質として知られている。そのため、動物組織におけるスペルミジンシンターゼの活性測定方法の研究が行われてきた。
【化１】
2007531724.tif 000002
【０００５】
スペルミジン（Spermidine）は、３つの生物活性ポリアミンの中の１つであり、他の２つはプトレッシン（putrescine）とスペルミン（spermine）である。ポリアミンは、細胞増殖と細胞分化の制御に重要な細胞成分のグループを構成する。それらの正確な機能はまだ解明されていないが、ポリアミンは複製、転写、および翻訳などの多くの細胞過程において重要な役割を果たしていることが示唆されている。
【０００６】
ポリアミン生合成経路は、２つの高度に制御される酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ornithine decarboxylase）およびＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（S-adenosylmethionine decarboxylase）、並びに、２つの構成的に発現される酵素、スペルミジンシンターゼおよびスペルミンシンターゼからなる。スペルミジンシンターゼは、プトレッシン（１,４−ジアミノブタン）の３−アミノプロピレーション（3-aminopropylation）を触媒してスペルミジンを産生する７４ｋＤａの蛋白質である。スペルミジンの生合成は、ＳＡＭ脱炭酸酵素によるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）のＳアデノシル−３−メチルチオプロパンアミン（脱炭酸化ＳＡＭ）への脱炭酸反応、及びオルニチン脱炭酸酵素によるオルニチンのプトレッシンへの脱炭酸反応を必要とする。そして脱炭酸化ＳＡＭは、スペルミジンシンターゼと反応して、この酵素のアミノプロピル化形態を産生し、そしてそれはアミノプロピル基をプトレッシンに転移してスペルミジンおよび５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）を産生する。活性酵素は、２つの同一サブユニットの二量体であり、補酵素を必要とせず、且つアミノプロピル供与体としてｄｃＡｄｏＭｅｔおよび受容体としてプトレッシンを使用する。
【０００７】
プトレッシン、スペルミジンおよびスペルミンは、軟骨を含む多くの生体組織において見つけられている。それらの形成（ＯＤＣにより触媒される）は、骨において軟骨の形質転換（transformation）が誘導される期間に観察される。副甲状腺ホルモン（グリコサミノグリカンの合成を刺激する）は、ＯＤＣ活性を誘導し且つ培養下の分化したウサギ肋骨軟骨細胞のポリアミンレベルを増加させる。休息中の軟骨は、プトレッシンを欠いている。骨化している軟骨は、休息中の区域に比べてより多くのポリアミンを含有している（組織重量およびＤＮＡ量に基づく）。骨化している区域のスペルミジン量は５倍高く、スペルミン量は約２倍である。スペルミジン／スペルミン比は、骨化している軟骨において１．７であり、休息中の区域においては０．６９である。スペルミジンのみが、セファロース４Ｂ―タイプＩＩコラーゲンのカラムからプロテオグリカンサブユニットを置換する能力を示した〔Franco Vittur et al．（１９８６）．A possible role for polyamines in cartilage in the mechanism of calcification. Biochimica et Biophysica Acta 881:38-45〕。
【０００８】
プロテオグリカンユニットとコラーゲンとの相互作用におけるポリアミンの効果を、プロテオグリカンサブユニットを充填したセファロース４Ｂ―コラーゲンのカラムからのプロテオグリカンの溶出により試験した。プトレッシンおよびスペルミンには効果がないにもかかわらず、スペルミジンはプロテオグリカンサブユニットを置換する強い能力を示した、即ちプロテオグリカンサブユニットの約９０％が前記カラムから除去された。スペルミンおよびスペルミジンは、軟骨で産生されたアルカリホスファターゼの活性を増加させた。スペルミジンは、経骨性軟骨（preosseous cartilage）の休息中の区域の細胞において観察された。細胞染色は消失し、増殖している細胞および円柱細胞（columnar cells）の区域と接近している。スペルミジンの染色は、軟骨細胞の肥大（hypertrophy）が開始された円柱細胞の境界（limit）のマトリックス中においてのみ顕著である。３つのポリアミンのなかで、スペルミジンは最も多く：スペルミジン／スペルミンの高モル比は、急速な成長の指標として採用されている。スペルミジンの最大量は、骨化している領域において認められている。
【０００９】
ポリアミン代謝
前駆体であるプトレッシンおよび脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニン（ｄｃＡｄｏＭｅｔ）の合成は、２つの脱炭酸酵素、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ,ＥＣ４．１．１．１７）およびＳ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＡｄｏＭｅｔＤＣ, ＳａｍＤＣ, ＥＣ４．１．１．５１）の作用により誘発される。これらの酵素は、成長因子およびそれらのレベルを増加させる他の刺激の双方により並びにポリアミン自身（それらの活性を低減させる）により非常に高度に制御される。これらの因子（agents）の組み合わせ効果は、ポリアミンレベルを細胞の成長および分化に必要なレベルに調整することである。ＯＤＣおよびＡｄｏＭｅｔＤＣの活性の交代（Alternation）は、ポリアミンレベルを制御する主な原動力である。アミノプロピル転移酵素、プトレッシンアミノプロピル転移酵素（ＰＡＰＴ, スペルミジンシンターゼ, ＥＣ２．５．１．６）およびスペルミジンアミノプロピル転移酵素（ＳＡＰＴ, スペルミンシンターゼ, ＥＣ２．５．１．２２）の活性は、主にそれらの基質の有効性により制御される。ポリアミンは、細胞内でのそれらのデノボ合成に加えて、特定の輸送系による摂取の結果としても取得できる。この輸送系は、細胞内ポリアミン含有量によりネガティブに、また成長因子および癌遺伝子によりポジティブに制御される。前記輸送系の存在およびポリアミン枯渇による前記輸送系の活性の増強が、ポリアミン合成の阻害効果の改善における重要な因子である。外因性のポリアミンの摂取は、これらの阻害剤（抗腫瘍因子としての）の臨床試験が不成功であったことの重要な要因であろう。最終的に、ポリアミンレベルは、相互交換（interconversion）、酸化および流出（efflux）の結果として変化させることが可能である。ポリアミンの末端の窒素原子の酸化は、主に細胞外に局在すると思われるＣｕ+2含有酸化酵素により達成されるが、細胞からそれらを完全に除くことは達成されていない。細胞からのポリアミンの相互交換および流出は、ポリアミンのアミノプロピル端をアセチル化してＮ−アセチルスペルミンおよびＮ−アセチルスペルミジンを形成するスペルミジン／スペルミン−Ｎ−アセチル転移酵素（ＳＳＡＴ, ＥＣ２．３．１．５７）の作用によって促進される。これらのアセチル誘導体は、細胞の多価陰イオン（polyanions）とそれほど強くない程度で結合し、排除されるか又は迅速に代謝される。それらは、ポリアミン酸化酵素（ＰＡＯ）と称されるＦＡＤ依存性酸化酵素により内部の窒素原子を酸化され、Ｎ−アセチルアミノプロパノールを分離し、そしてスペルミンをスペルミジンに、そしてスペルミジンをプトレッシンへと転換させる。この経路の制限要因はＳＳＡＴの活性である。ＳＳＡＴは通常非常に低いが、ポリアミンの細胞内含有量の増加により又は毒性刺激の適用により多大に誘導され、膜および細胞オルガネラからのポリアミンの放出を生じさせる。生理的な条件下において、ＰＡＯは非アセチル化ポリアミンに対する活性を若干有しているか又は有していない。
【００１０】
スペルミジンシンターゼの活性を測定する手法としては、基質であるプトレシンや脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニン（以下ｄｃＳＡＭともいう。）を14Ｃで標識してイオン交換クロマトグラフィー（J. Biol. Chem 1969年、第244巻、p682）、ペーパー電気泳動法（Biochem. J, 1978年、第169巻、p709）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等により測定する方法（Journal of Chromatography 1981年、第226巻、p208）が報告されている。しかし、これらの方法はいずれも反応後に測定対象を分離する工程を要するために非効率的であり時間を要していた。
【００１１】
また、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）によりＳＰＤＳの酵素活性を測定する方法が報告されている（Journal of Chromatography 1988年、第440巻、p141、J. Biochem. Mol. Biol. 1997年、第30巻、p403、J. Biochem. Mol. Biol.1997年、第30巻、p443）。一般的にこのような免疫学的手法により検出を行うには特異性の高い抗体が必要である。先行技術は反応副産物の５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する抗体を用いているが、いずれもポリクロナル抗体であり、しかもその抗体価（titer）は２,０００倍程度と低かった。また５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと類似構造を有する脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンとの交差反応性は約１％であり特異性も低かった。このような抗体では固相酵素免疫測定法（以下ＥＬＩＳＡともいう）を始めとする免疫学的検出方法への適用が難しく、その検出能を十分に引き出せない場合がありその改善が望まれていた。
【００１２】
変形性関節症（ＯＡ）は、よく知られた、消耗性（debilitating）で、治療に金のかかる疾患であり、現在不治の疾患である。新規の治療アプローチが明らかに必要とされている。本疾患は、軟骨細胞の異常機能、関節の軟骨組織内の軟骨細胞の終末分化（terminal differentiation）および骨形成開始、および正常軟骨マトリックスの崩壊によって特徴づけられる。
【００１３】
ＯＡの疫学
ＯＡ〔間違って変性関節疾患（degenerative joint disease）とも称される〕は、可動関節性（diarthrodial）〔可動性（movable）、滑膜が裏打ちされた（synovial-lined）〕の関節の不全（failure）を代表する疾患である。特発性（一次性）ＯＡ（本疾患の最も一般的な形態）において、如何なる素因（predisposing factor）も明らかとはなっていない。
【００１４】
二次性ＯＡは、特発性（idiopathic）ＯＡと病理学的に区別できないが、その根底にある原因を何かの原因に帰属させることはできる。ＯＡは、全てのヒトの関節障害において最も一般的な疾患であり、米国および全世界において最も蔓延している関節炎状態である。様々な試験の臨床評価に基づくＯＡ罹患率の推測は、７０歳を越える集団の９０％を越えるヒトがＯＡを有していることを示している。本発明は、本疾患の療法および予防の新規手段の開発を課題とする。
【００１５】
ＯＡの病因
ＯＡは、関節軟骨の欠陥のある全体性（defective integrity）、加えて関節の周縁（margins）に存在する硬骨（bone）の相関する変化、に関連する関節の症状（symptom）および徴候（signs）を生じる状態の不均一なグループである。ＯＡは、特発性（即ち、一次性）または他の病状（炎症性、生化学性、内分泌関連、代謝性、および解剖学的もしくは発生学的な異常）に対しての二次性の何れかであろう。年齢は、ＯＡの最も大きなリスク因子であるが、重い外傷および反復性の関節の使用もＯＡの重要なリスク因子である。ＯＡにおける関節の関与のパターンは、以前の職業（vocational）または副業（avocational）での過重負担によっても影響される。
【００１６】
本疾患は、２つの一般的な段階、即ち、（１）代償性（compensated）および（２）代償不全性（decompensated）の段階を有している。現在、多くの研究者は、主な変化が軟骨細胞外マトリックスにおいて外因性の原因（即ち、負荷、負傷など）によって発生するとの印象をもっている。軟骨のコラーゲンネットワークにおける欠陥は明白であり、そしてリソゾーム酵素および分泌されたプロテアーゼ（ＭＭＰｓ、プラスミン、カテプシン）が、おそらく軟骨マトリックスにおいて最初に観察される変化の原因となっている。それらの合成および分泌は、ＩＬ−１または他の因子（例えば、機械的な刺激）によって刺激される。疾患の初期段階において、補償的な細胞応答が活性化される。軟骨細胞によって分泌されるＴＩＭＰおよびＰＡＩ−１のようなプロテアーゼ阻害剤は、プロテアーゼ活性に対向することにより系を安定化させる。ＩＧＦ−１およびＴＧＦ−βなどの成長因子は、損傷を治癒させる修復プロセスに関係しており、少なくとも軟骨細胞系統（chondrogenic lineage）の細胞の増殖を活性化することによって前記プロセスを安定化する。最終的に、これは肥大性（hypertrophic）軟骨細胞の蓄積を生じる。後者の細胞は、プロテオグリカン（ＰＧ）濃度が増大する際に発現する顕著な生合成活性を有しており、軟骨の肥厚に関係している（「代償性」ＯＡ）。代償性の機構は、幾年にもわたり適度な機能的状態に関節を維持し得る。しかしながら、修復組織は持続することはなく、ＰＧ合成の速度は軟骨の厚さが完全になくなることに伴って減少する。これはＯＡの代償不全段階を示している。関節軟骨の崩壊に続いて、組織障害の部位への前駆細胞の移動を生じる。これらの細胞は、増殖して４つの細胞タイプに分化する、即ち、骨芽細胞（osteoblasts）、軟骨芽細胞（chondroblasts）、軟骨吸収細胞（chondroclasts）および線維芽細胞であり、これらは協力して関節空間に突出する骨増殖体（osteophytes）と称される骨様の構造体を形成し、このようにしてその動きが阻害されることになる。最終的に、徐々に軟骨の硬骨による置換が生じる。
【００１７】
この現象の原因は、知られていない。１つの可能性は、ＯＡにおいて関節軟骨細胞または滑膜線維芽細胞の正常な阻害的な成長の制御が変化することである。これは、正常な関節軟骨には認められない２タイプの細胞の蓄積を可能にするものであり、これらの細胞とは、（１）修正された特性を有する未成熟の間葉（mesenchymal）および骨髄の細胞、並びに（２）肥大性関節軟骨細胞（hypertrophic articular chondrocytes）である。以前の結果は、肥大性軟骨細胞が脈管形成性（angiogenic）および骨形成性（osteogenic）因子の分泌によって骨形成（osteogenesis）を引き起こし得ることを明瞭に示している〔Horner, A., Bishop, N. J., Bord S., Beeton, C., Kelsall, A. W., Coleman, N. and Compston, J. E. (1999). Immunolocalisation of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human neonatal growth plate cartilage. J. Anat. 194: 519-524〕。
【００１８】
ＯＡにおける治療上の干渉（therapeutic interference）は、３つの主なプロセスを標的とするものである。３つのプロセスとは、即ち、
・初期の軟骨障害の阻止
認可された治療戦略の一つ、関節への物理的圧力の減少を推奨することと、メタロプロテアーゼの阻害剤による治療との組み合わせ；
・後期段階での全体の軟骨破壊の阻止または減弱
軟骨リハビリテーション（即ち、完全に機能的な関節軟骨組織を産生することができる成熟軟骨細胞への、間葉の前駆体の適切な分化の促進）につながるプロセスの治療的な活性化を意味している；
・疾患の終結段階における骨増殖体形成の阻止または減弱
関節軟骨の部位での異所性（ectopic）の骨形成の治療的な阻害を意味している。
それ故、発明者は、前駆細胞の軟骨細胞への分化を刺激もしくは阻害する、および／または、前駆細胞の骨芽細胞への分化を刺激もしくは阻害する特定の因子をコードする標的遺伝子の同定を試みた。
既知の骨形成因子であるＩＬ−１、ＦＧＦ−２および機械的ストレスに起因する遺伝子発現の変化は、ＯＡ発症と関連するものであり、それ故、治療介入により妨害されるべき現象である。驚くべきことに、ＦＧＦ−２によりアップレギュレートされた遺伝子の一つがスペルミジンシンターゼ遺伝子であることが本発明者らによって見つけられた（米国特許第６６９６４５４号参照、この内容は本出願に援用される）。このことは、スペルミジンシンターゼ遺伝子がＯＡ経路に関与しているだろうことを示唆していた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明の課題は、ＭＴＡと特異的に結合するポリクロナル抗体及びモノクロナル抗体およびこれらを利用した高感度のアッセイ法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
従来は、過ヨウ素酸酸化法（Erlangerら、1964）によりＭＴＡの糖部分を開環してキャリアタンパクを結合した一般式（ＩＶ）
【化２】
2007531724.tif 000003
（式中、Ｘはキャリアタンパクである）
で示される免疫原により抗体を作製していた。
【００２１】
しかし本発明者らは鋭意工夫を重ねてＭＴＡの塩基部分にリンカーを導入した一般式（ＩＩＩ）
【化３】
2007531724.tif 000004
（式中、ｎは１以上の整数、Ｘはキャリアタンパクである）
で示される免疫原を用いることによりＭＴＡを特異的に認識する抗体を作製することができることを見出した。
【００２２】
すなわち本発明は、以下の発明を包含するものである。
［１］５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと特異的に結合するモノクロナル抗体。
［２］５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する反応性を１００％とした場合に、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンに対する交差反応性が０．１％以下である上記［１］記載のモノクロナル抗体。
［３］該交差反応性が０．０１％以下である上記［１］記載のモノクロナル抗体。
［４］５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する反応性を１００％とした場合に、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンに対する交差反応性が０．１％以下であるポリクロナル抗体。
［５］一般式（Ｉ）：
【化４】
2007531724.tif 000005
（式中、ｎは１以上の整数、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲは活性エステルである）
で表される化合物。
［６］一般式（Ｉ）で表される化合物においてｎが５である［５］記載の化合物。
［７］Ｒが以下の式（ＩＩ）：
【化５】
2007531724.tif 000006
で表される［６］記載の化合物。
［８］５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンのプリン基にキャリアタンパクを結合させることを特徴とする免疫原。
［９］一般式（ＩＩＩ）：
【化６】
2007531724.tif 000007
（式中、ｎは１以上の整数、Ｘはキャリアタンパクである）
で表される上記［８］記載の免疫原。
［１０］一般式（ＩＩＩ）で表される化合物においてｎが５である上記［９］記載の免疫原。
［１１］Ｘがカギアナカサガイのヘモシアニンである上記［１０］記載の免疫原。
［１２］上記［８］から［１０］のいずれかに記載の免疫原に対する上記［４］記載のポリクロナル抗体。
［１３］上記［８］から［１０］のいずれかに記載の免疫原に対する上記［１］から［３］のいずれかに記載のモノクロナル抗体。
［１４］５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと特異的に結合するモノクロナル抗体を産生するハイブリドーマ。
［１５］受託番号がＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０２２６である上記［１４］記載のハイブリドーマ。
［１６］上記［１５］に記載のハイブリドーマによって産生される上記［１］から［３］のいずれかに記載のモノクロナル抗体。
［１７］標識されたものである上記［１］から［４］のいずれかに記載の抗体。
［１８］該標識が、酵素、蛍光物質、着色ビーズ、放射性同位元素、金属類、またはビオチンである上記［１７］記載の抗体。
［１９］標識がペルオキシダーゼである上記［１８］記載の抗体。
［２０］標識がユウロピウムクリプテートである上記［１８］記載の抗体。
［２１］上記［１］から［４］のいずれかに記載の抗体を用いたアッセイ法。
［２２］抗体を用いたアッセイ法がＥＬＩＳＡ法である上記［２１］記載の方法。
［２３］抗体を用いたアッセイ法がホモジニアスアッセイ法である上記［２１］記載の方法。
［２４］該ホモジニアスアッセイ法が蛍光共鳴エネルギー転移を用いたアッセイ法である上記［２３］記載の方法。
［２５］スペルミジンシンターゼの活性を測定するものである上記［２１］から［２４］のいずれかに記載の方法。
［２６］変形性関節症の治療・予防剤を探索するものである上記［２１］から［２５］のいずれかに記載の方法。
【００２３】
本発明の抗体を用いることによって５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを高感度で検出することが可能となり、ＥＬＩＳＡ法やホモジニアスアッセイなど迅速、簡便で高感度なアッセイが可能となった。また本発明の抗体はスペルミジンシンターゼの活性の測定、さらには変形性関節症の治療・予防剤の探索に利用できる。
さらに別の側面では、本発明は疾患の治療が必要である被検者の治療方法に関するものである。この方法は、前記被験者に、ＭＴＡを実質的に阻害するのに有効である量のＭＴＡ阻害剤を被験者に投与することを含み、これによって前記被験者を治療する方法である。
【００２４】
前記疾患には、スペルミジンシンターゼが関与するものであり、好ましくは変形性関節症であるがガンを初めとする増殖性疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病および高血圧症である。スペルミジンシンターゼやスペルミジン生合成経路におけるその他の酵素の活性が病的要因であるいずれの疾患の治療にも期待できる。
【００２５】
阻害剤としては、上記の（１）〜（４）、（１２）〜（１３）及び（１６）〜（２０）に記載されたいずれかの抗体、場合によっては担体と結合したもの、これらの抗体を含む組成物および／もしくは上記の（５）〜（７）のような抗体を含む化合物が好ましく、これらは全て本明細書に述べられている。本発明のこのような側面は、開示されている抗体もしくは化合物を含む薬学的組成物を提供することになる。
【００２６】
記載されている抗体及び化合物は本質的にはポリアミン生合成経路の阻害剤である。そして、これらは単独でもしくは、場合によってはその他の活性成分を添加した薬学的組成物として、哺乳類被験者のＯＡの治療に用いられる。
【００２７】
記載されている抗体、化合物及び組成物は治療用組成物、好ましくはＯＡの治療用として使用できるかもしれない。好適な態様によれば、本発明の組成物は更に随意的に薬学的または獣医学的に許容される単体、賦形剤および／または希釈剤を含んでいてもよい。
【００２８】
動物モデル
本明細書に記載されている種々の試験系に加えて、本発明の化合物の薬効評価は次に挙げる試験系によって評価できる。：インビトロ細胞培養、エックスビボ細胞培養、エックスビボ器官培養およびインビボ動物モデルである。これらの試験系では、ＭＴＡもしくはスペルミジンシンターゼを内在性もしくは外在性のいずれかの様式で発現されてもよい。この試験系は、随意的に内在性および／または外因性の因子を更に含んでいてもよく、該因子はスペルミジンの発現に対して適切な条件を提供し、且つ軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の何れか１つを決定するための終点の指標の検出に対して適切な条件を提供する。
【００２９】
選択した試験アッセイ系に依存して、軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生の阻害は、様々な方法で観察することができる。その方法は、細胞内染色アッセイ（免疫組織化学を含む）および観察可能なパラメータに影響するアッセイ（例えば、細胞周期の変化などの生理学的なリードアウト）を含む。
【００３０】
好適な態様によると、前記候補阻害剤の効果を評価するために、本発明の方法に使用される試験系は、インビトロでトランスフェクションした細胞培養（cell culture）である。試験される細胞は、外因性に発現するスペルミジンシンターゼを保持する。
【００３１】
代替となる態様において、評価の目的で本発明の方法に使用される試験系は、エックスビボ骨培養であり、これは内在性に発現するスペルミジンシンターゼを含んでいる。好ましくは、使用される骨培養は、胚の骨培養（embryonic boneculture）である。
【００３２】
別の代替となる試験系は、インビボ系であり、これは動物モデル系である。本発明の方法によると、評価目的の動物モデルの使用は、終点の指標として関節炎の発生を利用可能とする。終点の指標として使用される関節炎の発生は、例えば、前記動物の足（ｐａｗ）の厚さを測定することにより決定されてもよい。足のサイズにおいてコントロールで観察された増加よりも少ない如何なる増加も、前記試験候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生、或いは関節炎の発生の阻害の指標である。
【００３３】
好適な一試験系において、適切な動物モデルは、トランスジェニックマウスであってもよい。
【００３４】
更に別の好適なインビボ試験系において、内在性のスペルミジンシンターゼを発現している関節炎哺乳類モデルは、本発明の評価方法によって使用されてもよい。この態様によると、前記関節炎動物により、終点の指標として関節炎の発生を利用することができる。
【００３５】
特に好適な態様によると、前記関節炎哺乳類は、関節炎ラットまたは関節炎マウスであってもよい。
【００３６】
別の代替となる試験系は、動物モデルのインビボ系であってもよい。本発明の方法によると、評価目的で動物モデルを使用することにより、関節炎の発生を終点の指標として利用できる。終点の指標として使用する場合、関節炎の発生は、試験動物の足の厚さを測定することにより決定し得る。足の厚さの増加がコントロールに比べて低いことが、試験する候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生、或いは関節炎の発生の阻害の指標である。
【００３７】
好適な一試験系において、適切な動物モデルは、外因性にスペルミジンシンターゼを発現しているトランスジェニックマウスであってもよい。より具体的には、前記トランスジェニックマウスは、コラーゲン・タイプＩＩプロモータの支配下でスペルミジンシンターゼ遺伝子を発現する。
【００３８】
この特定の態様によると、このインビボ試験系を使用した候補スペルミジンシンターゼ阻害剤の効果の評価は、通常スペルミジン生合成を生じる条件下で、試験する候補阻害剤を前記トランスジェニックマウスに適用することを伴う。これらの特に適切な条件は、例えば、前記候補阻害剤の適用前にＳＡＭなどのスペルミジンシンターゼ基質を、試験されるトランスジェニックマウスに供給することであってもよい。
【００３９】
更に別の好適なインビボ試験系において、内在性スペルミジンシンターゼを発現している関節炎哺乳類モデルは、本発明の評価方法に使用し得る。この態様によると、関節炎動物を使用することで関節炎の発生を終点の指標に利用できる。関節炎の発生は、検査した関節炎哺乳類の足の厚さを測定することにより決定されてもよい。コントロールと比較した際の足のサイズの低い増加は、前記試験する候補阻害剤による軟骨細胞増殖、軟骨細胞最終分化、脈管形成および破骨発生のうちの何れか１つの阻害、並びに関節炎の発生の阻害の指標である。それ故、関節炎動物試験系での前記候補阻害剤の効果は、これまで議論したような分化および増殖の終点を使用して更に検査される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
「５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン」は、スペルミジンまたはスペルミンなどのポリアミンが生合成される過程において、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニン等から産生される。５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンは各臓器におけるポリアミンシンターゼの活性測定のほか、腫瘍のマーカーとしても用いられる。
【００４１】
「脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニン」は、ポリアミン生合成過程でスペルミジンシンターゼもしくはスペルミンシンターゼの基質として、スペルミジンやスペルミン等の合成にアミノプロピル基供与体として利用される。なお、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）から脱炭酸化酵素による脱炭酸反応によって生成する。
【００４２】
「交差反応性（以下、cross reactivityともいう。）」は、免疫交差反応性のことをいう。ある抗原で免疫することにより得られた抗体が別の抗原（関連抗原）とも結合反応を示すときに、この反応を交差反応という。目的とする抗原とその抗体の反応量を基準とした場合に関連抗原とその抗体との反応量の程度を交差反応性として示すことができる。本明細書中においてはＭＴＡとｄｃＳＡＭの親和性の相対値（％）で示した。値が低いほど交差反応性が低く、目的の抗原に対して特異性を有することを示す。主に目的抗原と関連抗原の構造が非常に類似しているために起こることが多い。
【００４３】
本発明抗体においても、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンはその構造が類似していることにより交差反応が起きると考えられる。その測定法の一例を実施例に示す。本発明にかかるポリクロナル抗体は５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する反応性を１００％とした場合に、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンに対する交差反応性が０．１％以下であるポリクロナル抗体である。また本発明にかかるモノクロナル抗体は５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと特異的に結合するモノクロナル抗体であり、好ましくは５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンに対する反応性を１００％とした場合、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンに対する交差反応性が０．１％以下であるモノクロナル抗体であり、さらに好ましくは該交差反応性が０．０１％以下であるモノクロナル抗体である。
【００４４】
「抗体価（titer）」とは、血清反応において、抗血清の単位容量中に含まれている、抗原に対して結合する抗体量をいう。実際の測定は抗血清の希釈系列に対して一定量の抗原を加えて行い、測定値は反応の生じる終末点における希釈倍数であらわす。
【００４５】
「親和性（affinity）」とは抗原抗体間の結合力をいう。本明細書中においては、抗体に対する標識ＭＴＡの結合量を５０％阻害するＭＴＡもしくはｄｃＳＡＭの濃度（ＩＣ５０値）を指標として親和性を示した。ＩＣ５０値はlogistic曲線による回帰モデル（Rodbardら、Synposium on RIA and related procedures in medicine, P165, Int．Atomic Energy Agency, 1974）で算出した。
【００４６】
「ハプテン」とは、部分的な、または不完全な抗原である。ハプテンは主として低分子量の物質であり、単独では抗体の産生を刺激する能力はないが、化学的方法や架橋剤によりキャリアタンパクと結合させて人工抗原として免疫するとハプテンに対する抗体を得ることができる。本発明においては５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンは低分子化合物であるため単独で抗体を産生することは難しいと考えられることから通常は異種のタンパク質や合成ポリペプチドなどのキャリアタンパクとの複合体を調製して免疫原に用いた。
【００４７】
ハプテンをキャリアタンパクと結合させる場合、通常は反応性官能基を導入したハプテンの誘導体を作製する。この誘導体を本明細書中では「活性化ハプテン」という。活性化ハプテンには特異性の高い抗体を作製するために適当な長さのリンカー（架橋）を用いることができる。また、抗体が認識するのはハプテンの部分構造であるが、この認識部位は反応性官能基の導入位置により影響を受けるので、目的とする抗体に応じて、反応性官能基の導入部位を適切に選択することが重要である。
【００４８】
本発明にかかる「活性化ハプテン」は、従来のようにヌクレオチド体の糖部分について反応性を高めたものではなく塩基部分のプリン基に反応性官能基を導入したことを特徴とするものであり、好ましくは一般式（Ｉ）
【化７】
2007531724.tif 000008
（式中、ｎは１以上の整数、−Ｃ（＝Ｏ）−ＯＲは活性エステルである）
で示される化合物のように６位のＮＨ基に反応性官能基を導入したものである。
【００４９】
反応性官能基とハプテンを架橋するリンカーはいずれの長さでも良いが、例えば直鎖状アルキレン鎖であれば、好ましくは炭素数１以上の長さを有するものであり、さらに好ましくは１〜１０の長さを有するものであり、特に好ましくは炭素数５を有するものである。また反応性官能基はキャリアタンパクのアミノ残基と結合する反応性が高いものであればよく、好ましくは活性エステル体（例えば、コハク酸イミド体、フタルイミド体、マレイミド体など）である。活性化ハプテンは、特に好ましくは、式（Ｖ）
【化８】
2007531724.tif 000009
で表される化合物である。
【００５０】
「キャリアタンパク」には、抗原性を高めることが知られている各種のタンパクをいずれも使用できる。その例としては、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシチオグロブリン（ＢＴＧ）、カギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）などの高分子物質のほかに合成ポリペプチドなどを例示できる。
【００５１】
「免疫原」とは、本明細書で使用される場合、生物において免疫応答を生じる、または引き起こす能力を有する物質を表す。本発明の免疫原としては５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの抗原決定基になりうる部分構造を有する活性化ハプテンとキャリアタンパクとを連結してなり、好ましくは５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンのプリン基にキャリアタンパクを結合させたものであり、より好ましくは一般式（ＩＩＩ）：
【化９】
2007531724.tif 000010
（式中、ｎは１以上の整数、Ｘはキャリアタンパクである）
で表される免疫原であり、さらに好ましくはｎが１〜１０である免疫原であり、特に好ましくはｎが５である免疫原である。またＸはカギアナカサガイのヘモシアニンが好ましい。
【００５２】
本発明の抗体の製造に用いられる免疫原は、活性化ハプテンとキャリアタンパクを用いて、Antibodies：A Laboratory Manual,(1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press）等に記載されている活性エステル法により作製することができる。またAntibodies：A Laboratory Manual,(1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press）等に記載のその他の方法、例えば、カルボジイミド法やグルタルアルデヒド法やジアゾ法によっても作製できる。
【００５３】
ポリクロナル抗体は、例えば免疫原で免疫した哺乳動物から採血することにより得られる。該方法において、免疫原で免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。今回はモノクロナル抗体とポリクロナル抗体の性能を同一種で比較するために、マウスを被免疫動物として用いた。
【００５４】
免疫方法は一般的方法により、例えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に２〜３週間間隔で数回投与する。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり５０〜１００μｇ程度とする。ここで前記アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジュバントなどを例示できる。最終免疫後３〜１０日目に哺乳動物の採血を行うことによって、抗血清を得ることができる。抗血清についてはそのままでも、また精製してポリクロナル抗体としても使用できる。
【００５５】
ポリクロナル抗体の精製方法の例としては非特異的精製法と特異的精製法が挙げられる。非特異的精製法とは塩析法やイオン交換クロマトグラフィ法などにより主にイムノグロブリン画分を取得することを目的とする。特異的精製法としては固定化抗原によるアフィニティクロマトグラフィー法などが挙げられる。
【００５６】
モノクロナル抗体の製造方法は、免疫原で免疫した哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）と哺乳動物の形質細胞腫細胞（ミエローマ細胞）との融合細胞（ハイブリドーマ、hybridoma）を作製し、これより所望の５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを認識するモノクロナル抗体を産生するクローンを選択し、該クローンを培養することにより実施できる。このモノクロナル抗体の製造は、基本的には常法に従うことができる（Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497.(1975）参照）。
【００５７】
該方法において、免疫原で免疫される哺乳動物は、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが望ましく、マウス、ラットなどが用いられる。免疫方法についてはポリクロナル抗体の作製の場合と同様とする。但し最終免疫後３〜１０日目に免疫動物から脾臓細胞を採取する。
【００５８】
得られた免疫細胞からハイブリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら 1994）等に記載されている方法により、継体培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、センダイウイルスやポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることができる。ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質細胞腫細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞はｐ３ｘ６３−Ａｇ８．ＵＩなどの公知のものを利用できる。
【００５９】
ハイブリドーマは、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択し、コロニーが確認された段階で、培養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる（スクリーニングする）ことにより目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。
【００６０】
スクリーニングする方法としては、例えば、スポット法、凝集反応法、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法などの一般に抗体の検出に用いられている種々の方法が挙げられるが、好ましくは、例えば後記実施例に詳述するように、ハイブリドーマの培養上清について、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンとの反応性を指標とするＥＬＩＳＡ法に従い実施される。このスクリーニングによって、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンと特異的に反応する目的抗体産生株をスクリーニングすることができる。
【００６１】
スクリーニングの結果得た目的抗体産生株のクローニングは、通常の限界希釈法、軟寒天法などにより実施できる。クローニングされたハイブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培養することができる。この培養によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、ハイブリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔に、ハイブリドーマを接種して、所望抗体をマウス腹水として大量に回収することもできる。
【００６２】
上記ハイブリドーマの一具体例としては、常法に従って得られるハイブリドーマ（クローンＭＴＡ−７Ｈ８）、即ち、後記実施例記載の６−［５−（２,５−ジオキシピロリジン−１−イルオキシ）ペンチル］−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンとＫＬＨからなる免疫原により作製されたハイブリドーマを例示することができる。このハイブリドーマ（「マウスハイブリドーマＭＴＡ−７Ｈ８」）は、国際寄託当局に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０２２６である（このハイブリドーマは、既に、平成１６年３月２日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にも寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭＰ−Ｐ１９７０７である）。本発明の抗体を産生するハイブリドーマを含有する培養上清およびマウスの腹水は、精製あるいは修飾することなく粗製抗体液として用いることができる。またこれらは常法に従って、硫酸アンミモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィ法などにより精製して、精製抗体とすることができる。
【００６３】
本発明抗体は、以下の理化学的および免疫学的性質を有している。
（１）特異性：脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンとの交差反応性が０．１％以下、さらには０．０１％以下を示す。
（２）免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ1（ｋ）に属する。
（３）分子量：重鎖５０ｋＤａ、軽鎖２７ｋＤａ
【００６４】
上記のように抗体を用いてアッセイを行うにあたって、通常は抗体の挙動を検出可能とするため抗体そのものが種々の物質で標識されうる。抗体を標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら1994年）等に記載されている常法を用いることにより行うことができる。種々の物質としては化学発光物質、酵素、蛍光物質、着色ビーズ、放射性同位元素、元素、金属類、ビオチンが挙げられる。以下に具体例を示すがこれらに限定されるものではない。化学発光物質とは例えばルミノールやアクリジニウムエステルなどをさす。酵素とは例えばβ−ガラクトシダーゼやアルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどをさす。蛍光物質とは例えばユウロピウムクリプテートやＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）やＲＩＴＣ（tetramethylrhodamin isothiocyanate）などをさす。着色ビーズとは例えばプロテインＡビーズ、wheat germ agglutinin（ＷＧＡ）ビーズ、ストレプトアビジンビーズなどをさす。放射性同位元素とは例えば14Ｃや125Ｉや3Ｈなどをさす。元素とは例えばユウロピウムなどのランタニド元素をさす。金属類とは例えばフェリチンや金コロイドなどをさす。特に本発明において好ましい標識の形態はユウロピウムクリプテートである。
【００６５】
ユウロピウムクリプテートは、希土類元素のユウロピウムイオンをトリスビピリジンの環状構造（クリプテート）の中央部に配座した蛍光物質である。クリプテートがなす特徴的な「籠」状構造が水分子からユウロピウムイオンを保護するとともに、クリプテートが吸収した励起光エネルギーを効率よくユウロピウムイオンに転移する。
【００６６】
本発明には上記のように標識したものであってもなくても、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの抗体を用いたアッセイを含むものとする。抗体を用いたアッセイには競合的な測定でも非競合的な測定でも良い。また、ホモジニアスアッセイ法（均一系による測定）でもヘテロジニアスアッセイ法（不均一系による測定）でもよい。具体的には、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射線免疫測定法（ＲＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定（ＴＲ−ＦＩＡ）、化学発光免疫測定法、イムノブロット法、ウエスタンブロット法、免疫染色法などの常法に従うことができる。なお、アッセイには治療剤・予防剤の開発を目的とする薬物スクリーニングを含むものとする。また疾患の診断に関するものも含むものとする。
【００６７】
本発明抗体を用いるアッセイの好ましい具体的方法としては、ＥＬＩＳＡ法が挙げられる。ＥＬＩＳＡ法とは、酵素で標識された抗体または抗原を用い、抗体または抗原の量を標識酵素の活性度により定量する方法である。酵素で標識された抗原抗体結合物と遊離型の標識抗原、または抗体を分離するのに固相化された抗体や抗原が用いられる。固相はアガロース、マイクロタイタープレートの内面、ラテックス粒子等が利用できる。ＥＬＩＳＡ法として具体的には競合法イムノアッセイや２抗体サンドイッチイムノアッセイなどが挙げられる。また標識酵素としては西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰともいう）やアルカリフォスファターゼ等が挙げられるが好ましくは西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼである。
【００６８】
本発明抗体を用いるアッセイの好ましいその他の具体的方法としては、ホモジニアスアッセイ法が挙げられる。ホモジニアスアッセイ法とは、測定が終始溶液状態（均一系）で行われる測定法をさす。洗浄工程を一切必要としないにもかかわらず精度の高いデータを得ることができるアッセイ法である。また、固相を必要としないのでアッセイのミニチュア化が容易であり、貴重な試薬の節約及びコスト、労力の削減に威力を発揮するのでハイスループットスクリーニング法にも応用できる。代表的なものとしてＳＰＡ法（Scintillation Proximity Assay）、蛍光偏光測定法（fluorescence polarization; FP）、蛍光共鳴エネルギー転移（fluorescence resonance energy transfer；以下ＦＲＥＴともいう）を用いたアッセイ法などがあげられる。
【００６９】
ホモジニアスアッセイ法の好ましい一例としてはＦＲＥＴを用いたアッセイ法が挙げられる。ＦＲＥＴとはドナーおよびアクセプターと称される２種類の蛍光物質間のエネルギー転移を利用した手法である。
【００７０】
ＦＲＥＴを用いたアッセイ法のうち、好ましい実施形態としてホモジニアス時間分解蛍光法（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence；以下ＨＴＲＦ法ともいう、登録商標）が挙げられる。ＨＴＲＦ法はユウロピウムクリプテートとＸＬ６６５（藍藻由来蛍光性タンパクであるアロフィコシアニンの誘導体）からなる２種類の蛍光標識物質を用いた、ＦＲＥＴの原理を利用した測定方法である。ＨＴＲＦでは、ユウロピウムクリプテートに３３７ｎｍの励起光を照射すると６２０ｎｍの長寿命蛍光を発するが、免疫複合体の形成などで近傍にＸＬ６６５が存在する場合、ユウロピウムクリプテートからＸＬ６６５へ蛍光共鳴エネルギー転移が起こり、エネルギーを吸収したＸＬ６６５から６６５ｎｍの長寿命蛍光が生ずる原理に基づいて測定を行う。蛍光測定と二波長測定（６２０・６６５ｎｍ）の組み合わせにより擬陽性をもたらすカラークエンチング（インナーフィルター効果）の影響やバックグラウンド蛍光の影響を受けにくく、完全な均一系の測定を可能とする。
【００７１】
ホモジニアスアッセイ法の好ましいその他の一例としては、ＳＰＡ法（登録商標）が挙げられる。ＳＰＡ法は、ＳＰＡビーズに結合させた抗体と、ＲＩ標識した抗原を用いる。該抗体が抗原に結合するとＳＰＡビーズに近接するため抗原により放射されるβ線がＳＰＡビーズ内のシンチレーターに到達し発光するのでこれを測定する。結合していない抗原は測定に影響がないので、抗体と結合していない抗原を除去することなく測定することが可能である。
【００７２】
スペルミジンシンターゼ（ＳＰＤＳ）は、脱炭酸化Ｓ−アデノシルメチオニンのアミノプロピル基をプトレシンへ転移してスペルミジンに変換する反応を触媒する。このとき反応副産物として５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンが生じる。よって５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンを特異的、高感度に検出できる本発明のアッセイ法はスペルミジンシンターゼの活性測定に有用である。
【００７３】
さらに本発明のアッセイ法はスペルミジンシンターゼの活性を阻害するような被験物質のスクリーニングに使用することができる。かかるスクリーニングは被験物質の存在下、発現ベクターなどにより調製したリコンビナントスペルミジンシンターゼ（精製または部分精製品）を、該酵素の基質（ｄｃＳＡＭやプトレシンなど）との結合を可能にする条件下（例えば０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．４、室温）に維持し、被験物質が該酵素の基質の結合を阻害するか否かを調べること、すなわち副生産物である５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの生産量を評価する。このとき被験物質は、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物（低分子化合物等）、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などのいずれであってもよい。またこれらを含む試料であってもよい。
【００７４】
またスクリーニング方法に従う候補物質の選別は、被験物質を添加した例えばアッセイプレートのウェルにおける５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの検出値が被験物質を添加しないウェルにおける５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの検出値に比して変動することをもって、当該被験物質を候補物質として選別することができる。例えば、５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの検出値の抑制・減少の程度としては、被験物質を添加したウェルにおける５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの検出値が被験物質を添加しないウェルにおける５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの検出値と比較して例えば１０％、好ましくは３０％、特に好ましくは５０％以上の減少または増加を示す場合、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００７５】
スクリーニングにより選別された候補物質はスペルミジンシンターゼが関与することが知られている疾患、例えば変形性関節症、ガンを始めとする増殖性疾患、骨粗鬆症、アルツハイマー病、高血圧症の予防・治療剤になりうるものである。本発明のアッセイ法は好まししい実施形態は変形性関節症の治療・予防剤を探索するのに利用するものである。
【００７６】
変形性関節症（ＯＡ）とは慢性の関節炎を伴う関節疾患で、関節の構成要素の退行変性により、軟骨の破壊と骨、軟骨の増殖性変化を来たす疾患である。一次性のものと外傷や疾患による二次性のものとがある。主に荷重関節を侵し、老年者によく見られる。最近、ヒトの関節軟骨前駆細胞（ＨＭＳＣ）の遺伝子プロファイリングがなされ、骨形成因子（osteogenic factors）であるbasic fibroblast growth factor 2（ｂＦＧＦ−２）がスペルミジンシンターゼをコードする遺伝子の転写を活性化することが報告されている。これは、ポリアミン生合成経路、特にスペルミジンの生合成、より具体的にはスペルミジンシンターゼが、変形性関節症（以下ＯＡともいう。）と潜在的に関与していることを示している。よってスペルミジンシンターゼの反応を制御することはＯＡの疾患の治療・予防に役立つことが推察され、さらにこの酵素の阻害剤は上記の疾患の治療薬・予防薬として有用であると考えられる（ＷＯ０２／０５８６２３）。
【００７７】
上述のように、別の側面として、本発明は、ＯＡ治療の必要がある被験者を治療する方法に関する。この方法は、この方法によって前記被験者が治療されるように前記被験者にスペルミジン生合成の実質的な阻害を阻害する効果的なスペルミジン生合成の阻害剤の量を投与することを含む。
【００７８】
「治療」とは、疾患状態の緩和およびその進行の緩和を意味し、特定の疾患に関連する症状の部分的な又は完全な除去をも含んでいる。また、「治療」とは、疾患を予防するか又はその発症を遅延させることを意味してもよい。
【００７９】
好適な態様において、本発明の方法は、哺乳類被験者、好ましくは、ヒトを治療することを意図している。それ故、「患者」、「哺乳類被験者」または「必要がある被験者」という用語によって、その治療が望まれる任意の哺乳類を意味しており、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、およびネコの被験者、好ましくはヒト患者を含んでいる。
【００８０】
本発明の治療方法は、必要がある被験者に前記阻害剤の効果量を投与することを含む。本明細書に使用される「効果量」は、選択される結果を達成するのに必要な量を意味する。例えば、本発明の阻害剤または組成物の効果量は、変形性関節症の病状の治療に効果的な量である。
【００８１】
本発明は、更にＯＡを治療する治療組成物を提供する。本発明のこの組成物は、活性成分としてポリアミン生合成経路の１以上の工程の阻害剤を含む。好ましくは、前記阻害剤は、スペルミジン生合成の阻害剤である。
最も好ましくは、前記阻害剤は、スペルミジンシンターゼ阻害剤である。本発明の組成物に含まれる具体的な阻害剤は、上記のリストに記載されたものである。
【００８２】
本発明の組成物および方法は、ヒトのＯＡ治療を特に意図しているが、他の哺乳類も含まれる。これらの組成物は、治療される被験者に直接投与してもよい、またはそれらの投与前にそれらをオボアルブミンもしくは血清アルブミンなどの担体蛋白質と結合させることが望ましい。治療の処方は、任意の通常の投薬処方で投与し得る。処方は、典型的には少なくとも１つの活性成分（上記で定義されたような）と共に１以上のその活性成分に許容される担体を含む。
【００８３】
好適な態様によると、本発明の組成物は、更に薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤および／または希釈剤を随意的に含む。
【００８４】
薬理学及び薬物輸送
本発明の化合物もしくは薬学的組成物は、各患者の臨床症状、投与の部位と方法、投与のスケジュール、患者の年齢、性別、体重、医療従事者にとって公知のその他の要因を考慮に入れ、適正な医療行為に従って投与し、服用される。
【００８５】
本明細書において薬学的に「有効な量」とは、つまり、本分野で公知のかかる検討によって決定される。前記量は、生存率の改善若しくは回復の迅速化、又は症候や当業者によって適切な基準として選択されたその他の指標の改善若しくは消去など（これらに限定されない）の改善を達成するために有効な量でなければならない。
【００８６】
本明細書に例示されているマウスその他の実験動物に比べて、ヒトは長期にわたり治療を受けるのが一般的であり、治療の長さは、病気経過の長さや薬物の効力に比例する。
【００８７】
本発明の方法では、本発明の前記化合物は、様々な方法で投与することができる。本発明の化合物は、化合物として又は薬学的に許容される塩として投与することができ、単独で又は薬学的に許容される担体、希釈剤、アジュバント、及び賦形剤と組み合わせた活性成分として投与することができることに留意しなければならない。前記化合物は経口、皮下、又は非経口的に投与することができ、非経口投与には、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内投与、並びにクモ膜下内及び注入技術が含まれる。前記化合物のインプラントも有用である。治療を受ける前記患者は、温血動物であり、特に、ヒトを含む哺乳動物である。一般に、薬学的に許容される担体、溶液、希釈剤、賦形剤、アジュバント及び賦形剤並びにインプラント担体とは、本発明の活性成分と反応しない不活性な無毒の固体又は液体充填剤、希釈剤又は封入物質を指す。
【００８８】
本発明の化合物を非経口的に投与する場合には、単位用量の注射可能な形態（例えば、溶液、懸濁液、エマルジョン）中に調合するのが一般的であろう。注射に適した薬学的調合物には、無菌水溶液又は分散液及び注射可能な無菌溶液又は分散液に戻すための無菌粉末が含まれる。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。
【００８９】
適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いることによって、分散液の場合には必要とされる粒径を維持することによって、及び界面活性剤を用いることによって維持することができる。化合物組成物用の溶媒系として、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、大豆油、トウモロコシ油、ヒマワリ油、又はピーナッツ油などの非水性賦形剤やミリスチン酸イソプロピルなどのエステルを使用してもよい。さらに、抗微生物防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、緩衝液など前記組成物の安定性、無菌性、等張性を増大させる様々な添加物を加えることもできる。微生物の作用の抑制は、様々な抗細菌剤や抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸）によって確保することができる。多くのケースで、例えば、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含めることが望ましいであろう。吸収を遅らせる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを使用することによって、注射可能な医薬形態を長時間吸収させることができる。しかしながら、本発明では、使用する全ての賦形剤、希釈剤、又は添加剤が前記化合物に適合しなければならないであろう。
【００９０】
無菌の注射可能な溶液は、所望により、他の様々な成分を加えた必要量の適切な溶媒中に、本発明を実施する際に使用される前記化合物を取り込ませることによって調製することができる。
【００９１】
本発明の薬理学的調合物は、様々な賦形剤、アジュバント、添加物、希釈剤などの任意の適合的な担体を含有する注射可能な調合物中に入れて患者に投与することができ、あるいは、本発明で使用する化合物は、徐放性の皮下インプラント又は標的デリバリーシステム、たとえばモノクローナル抗体、ベクターによるデリバリー、イオン導入、ポリマーマトリックス、リポソーム、及びミクロスフェアの形態で、非経口的に患者に投与することができる。本発明において有用なデリバリーシステムの例には、米国特許第５,２２５,１８２号、第５,１６９,３８３号、第５,１６７,６１６号、第４,９５９,２１７号、第４,９２５,６７８号、第４,４８７,６０３号、第４,４８６,１９４号、第４,４４７,２３３号、第４,４４７,２２４号、第４,４３９,１９６号、及び第４,４７５,１９６号に記されているものが含まれる。これ以外のこのようなインプラント、デリバリーシステム、及びモジュールは、当業者に周知である。
【００９２】
本発明で使用される前記化合物の薬理学的調合物は、患者に経口投与することができる。化合物を錠剤、懸濁液、溶液、エマルジョン、カプセル、粉末、シロップなどに入れて投与するなどの慣用法を使用することができる。前記化合物を経口又は静脈注射でデリバーし、生物活性を保持する公知の技術が好ましい。ある実施形態では、本発明の前記化合物は、血液レベルを適切なレベルにするためにまず静脈内注射によって投与することができる。次いで、患者の血液レベルを経口投薬形態によって維持するが、患者の症状に応じて、上述のように、他の投与形態を使用することも可能である。
【００９３】
一般に、ヒトにおける化合物の有効量は、１日あたり体重１ｋｇあたり１ｎｇから２０−１００ｍｇであり、好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり０．０１ｎｇから２−１０ｍｇであり、１〜２週間もしくはそれ以上の期間、好ましくは、２４〜４８時間の間、１日あたり１回もしくは２、３回もしくはそれ以上の回数を服用するか、１〜２週間もしくはそれ以上の期間点滴をする。また、ここで開示した症状のいくつかについては、数年に渡り、もしくは生涯にわたって投与することも予測できる。
【００９４】
本発明を例示的に説明してきたが、これまで使用してきた用語は、限定なものではなく記述的な性質で解釈されることを意図していることを理解しなければならない。
【００９５】
上記教示に照らして、本発明に数多くの修飾及び変形を加えることが可能であることが明らかである。従って、具体的に記載されていなくても、記載されている発明の範囲の中で、本発明を実施できることを理解しなければならない。
【００９６】
本出願を通じて、様々な文献が著者と年度によって参照されており、米国特許を含む特許が番号によって参照されている。これらの文献と特許の開示内容全体は、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、本出願に参考文献として援用される。
【００９７】
ここでのあらゆる文献の引用は、そのような文献が適切な先行技術もしくは、本出願におけるいずれかの請求項の特許性について考慮すべき資料であることを認めることを意図するものではない。いずれの文献についての内容もしくは日付に関する見解は、出願時において出願人が利用できた情報に基づいており、そのような見解の正当性を認めることではない。
【実施例】
【００９８】
さらに詳細を述べることなしに、この分野における当業者であれば、上述の記載をもって本発明を最大限で実施できると思われる。そのため、以下の好ましい具体例は単なる例示であり、いかなる場合であっても請求項の発明を限定するものとして構成するものではない。
【００９９】
ここに特に明示していないがその分野において知られている標準的な分子生物学の手法は一般的には、サムブルークら、「Molecular cloning ：A laboratory manual、Cold Springs Harbor Laboratory、ニューヨーク」（１９８９年、１９９２年）及びオーズベルら「Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons 、バルチモア、メリーランド」（１９８８年）に従うものとする。
【０１００】
ここに特に明示していないがその分野において知られている標準的な有機合成の手法は一般的に「Organic Syntheses ：第１〜７９巻、著者多数、J Wiley 、ニューヨーク」（１９４１〜２００３年）、ガーベルトら「Organic Syntheses workbook, Wiley-VCH, ベインハイム」（２０００年）、スミス＆マーチ「Advanced Organic Chemistry, Wiley-Interscience, 第５版」（２００１年）に従うものとする。
【０１０１】
ここに特に明示していないがその分野において知られている標準的な医薬品化学の手法は一般的に「Comprehensive Medical Chemistry」シリーズ（著者多数、Pergamon Press）に従うものとする。
【０１０２】
以下において、実施例および実験例により本発明をより具体的にするが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０３】
実施例１
以下の合成スキームに従って活性化ハプテンである６−［５−（２,５−ジオキシピロリジン−１−イルオキシ）ペンチル］−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（化合物８）を合成した。
合成スキーム１
【化１０】
2007531724.tif 000011
【０１０４】
２’,３’−イソプロピリデンアデノシンの合成
【化１１】
2007531724.tif 000012
９β−Ｄ−リボフラノシルアデノシン（アデノシン）（１）（６．６８ｇ, ２５ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）溶液に、２,２−ジメトキシプロパン（１３ｇ, １２５ｍｍｏｌ, ５ｍｏｌ ｅｑ．）及び無水ｐ−トルエンスルホン酸（１．１９ｇ, ６．２６ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合物を窒素気流下７０℃で７時間加熱撹拌し、４０℃にて約３０ｍｌまで減圧濃縮した。この濃縮液を５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１２５ｍｌ）に注ぎ入れ、１５０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を５０ｍｌの水で２回、５０ｍｌの飽和食塩水で洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去した。この黄色油状残渣（約８ｇ）を１５０ｍｌの酢酸エチルに加温して溶かし、この溶液を室温で５時間さらに０℃で３０分間撹拌し析出した結晶を濾過、析出晶を酢酸エチル及びジエチルエーテルで洗浄し、化合物２（４．１ｇ, １３．３ｍｍｏｌ, ５３％）を得た。
IR (Nujol, cm-1) 3350 (sh), 3240, 3180, 1685 (s).
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.38 (3H, s), 1.65 (3H, s), 3.72 - 3.86 (1H, m), 3.95 - 4.02 (1H, m), 4.55 (1H, s), 5.10 - 5.25 (2H, m), 5.86 (3H, d, J = 4.8 Hz), 6.57 (1H, dd, J = 1.8, 11.4 Hz), 7.84 (1H, s), 8.32 (1H, s).
【０１０５】
２’,３’−イソプロピリデン−５’−（ｐ−トルエンスルホニル）アデノシンの合成
【化１２】
2007531724.tif 000013
２’,３’−イソプロピリデンアデノシン（２）（４．０ｇ, １３ｍｍｏｌ）の無水ピリジン４０ｍｌ溶液に、窒素気流下−２０℃でｐ−トルエンスルホニルクロリド（２．９７ｇ, 約１５．６ｍｍｏｌ, １．２ｍｏｌ ｅｑ．）の無水ピリジン６ｍｌ溶液を滴下して加えた後、この混合物を遮光下４日間放置した。この反応混合物に、未反応の試薬を処理する為、水（４．０ｍｌ）を−２０℃で加え１５分間撹拌後、更に水（２００ｍｌ）を注ぎ入れ８０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を５０ｍｌの水で２回、８０ｍｌの５％硫酸で２回、次いで５０ｍｌの飽和食塩水で３回洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去した。この黄色油状残渣をカラムクロマトグラフィー（Merck silica gel No. 9385, 230 400 mesh: 50 g）に付し、酢酸エチルで溶出することにより結晶性残渣（約６ｇ）を得、次いでジエチルエーテルで洗浄し、化合物３（４．４９ｇ, ９．７５ｍｍｏｌ, ７５％）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3 + D2O) δ: 1.37 (3H, s), 1.59 (3H, s), 2.40 (3H, s), 4.20 - 4.36 (2H, m), 4.44 - 4.53 (1H, m), 5.05 (1H, dd, J=3.4, 6.2 Hz), 5.34 (1H, dd, J = 1.8, 6.2 Hz), 6.05 (1H, d, J = 18 Hz), 7.19 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.63 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.84 (1H, s), 8.23 (1H, s).
【０１０６】
２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化１３】
2007531724.tif 000014
ナトリウムチオメトキシド（５．０ｇ, ７１．４ｍｍｏｌ, ８．２４ｍｏｌ ｅｑ．）のジメチルホルムアミド‐メタノール（２：１,３５ｍｌ）溶液に、窒素気流下０℃で２’,３’−イソプロピリデン−５’−（ｐ−トルエンスルホニル）アデノシン（３）（４ｇ, ８．６７ｍｍｏｌ）を加えた後、この混合溶液を遮光下５℃で３日間放置した。この反応液を３０℃以下で約２０ｍｌまで減圧濃縮し、この濃縮液を２５０ｍｌの冷水へ注ぎ入れ１００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を５０ｍｌの冷水で３回、５０ｍｌの飽和食塩水で２回洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去し結晶性残渣を得、酢酸エチルより再結晶し化合物４（２．８ｇ, 約８．３ｍｍｏｌ, ９５％）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.41 (3H, s), 1.62 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.67 - 2.91 (2H, m), 4.36 - 4.48 (1H, m), 5.07 (1H, dd, J = 2.2, 3.4 Hz), 5.52 (1H, dd, J = 2.2, 6.2 Hz), 5.64 (2H, br), 6.09 (1H, d, J = 2.2 Hz), 7.93 (1H, s), 8.36 (1H, s).
【０１０７】
６−（５−エトキシカルボニルペンチル）−２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化１４】
2007531724.tif 000015
２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（４）（１．５０ｇ, ４．４５ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に、窒素気流下室温で水素化ナトリウム（１１２ｍｇ, ４．６７ｍｍｏｌ）を徐々に加えた後、２時間撹拌した。次いで、この混合物に６−ブロムヘキサン酸エチル（１．０４ｇ, ４．６７ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）を滴下して加え、この反応混合物を室温で１時間、さらに６０℃で２時間撹拌した反応液は、６０ｍｌの冷水へ注ぎ入れ４０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を３０ｍｌの冷水で３回、３０ｍｌの飽和食塩水で２回洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去して得た油状残渣をカラムクロマトグラフィー（Merck silicagel, Lobar column size B）に付し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（１：１）で溶出することにより無色油状の化合物５（１．４ｇ, ２．９２ｍｍｏｌ, ６２．５％）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.25 (3H, t, J = 7.0 Hz), 1.40 (3H, s), 1.45 - 1.53 (2H, m), 1.62 (3H, s), 1.64 - 1.79 (4H, m), 2.10 (3H, s), 2.31 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.68 - 2.90 (2H, m), 3.56 - 3.76 (2H, m), 4.09 (2H, q, J = 7.0 Hz), 4.36 - 4.45 (1H, m), 5.08 (1H, dd, J = 3.2, 6.6 Hz), 5.53 (1H, dd, J = 1.8, 6.2 Hz), 5.86 (1H, br), 6.07 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.86 (1H, s), 8.36 (1H, s).
【０１０８】
６−（５−エトキシカルボニルペンチル）−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化１５】
2007531724.tif 000016
６−（５−エトキシカルボニルペンチル）−２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（５）（７００ｍｇ, １．４６ｍｍｏｌ）、０．１Ｎ塩酸（５ｍｌ）とテトラヒドロフラン（１０ｍｌ）の溶液をＴＬＣで原料がなくなるまで５０℃で反応させた。この反応液を５０℃で約１ｍｌまで減圧濃縮し、この濃縮液に５％炭酸水素ナトリウム水溶液（１０ｍｌ）を加え、２０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機層を１０ｍｌの水で２回、５ｍｌの飽和食塩水で洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去した。抽出残渣をカラムクロマトグラフィー（Merck silica gel, Lobar column size A x 2）に付し、酢酸エチル−アセトン（３：１）で溶出することにより無色結晶性の化合物６（２５０ｍｇ, ０．５６９ｍｍｏｌ, ３９％）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3 + D2O) δ: 1.25 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.38 - 1.56 (2H, m), 1.59 - 1.81 (4H, m), 2.18 (3H, s), 2.31 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.85 (2H, d, J = 5.4 Hz), 3.53 - 3.78 (2H, m), 4.12 (2H, q, J = 7.2 Hz), 4.32 - 4.45 (2H, m), 4.54 (1H, t, J = 5.2 Hz), 5.94 (1H, d, J = 4.8 Hz), 8.00 (1H, s), 8.29 (1H, s).
【０１０９】
６−（５−カルボキシルペンチル）−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化１６】
2007531724.tif 000017
６−（５−エトキシカルボニルペンチル）−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（６）（２５０ｍｇ, ０．５６９ｍｍｏｌ）、２Ｎ水酸化ナトリウム（１ｍｌ）とメタノール（５ｍｌ）の溶液を窒素気流下６０℃で１時間撹拌した。この反応液を３０℃以下で約１ｍｌまで減圧濃縮後、３ｍｌの水で希釈した水溶性溶液を酸性（ｐＨ３）になるまで酢酸（２４０ｍｇ, ４ｍｍｏｌ）を加え析出した結晶を濾過し、化合物７（２２３ｍｇ, ０．５４１ｍｍｏｌ, ９５％）を得た。
1H NMR (200MHz, DMSO-d6) δ: 1.23 - 1.41 (2H, m), 1.44 - 1.68 (4H, m), 2.06 (3H, s), 2.20 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.47 - 2.58 (2H, m), 2.72 - 2.94 (2H, m), 3.98 - 4.08 (1H, m), 4.13 (1H, t, J = 5.4 Hz), 4.75 (1H, t, J = 5.4 Hz), 5.50 (3H, br), 5.90 (1H, d, J = 1.8 Hz), 7.82 (1H, br), 8.21 (1H, s), 8.36 (1H, s).
【０１１０】
６−［５−（２,５−ジオキシピロリジン−１−イルオキシ）ペンチル］−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化１７】
2007531724.tif 000018
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１２５ｍｇ, １．０８ｍｍｏｌ）、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣＤ・ＨＣｌ, ２０７ｍｇ, １．０８ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）溶液に、６−（５−カルボキシルペンチル）−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（７）（２２３ｍｇ, ０．５４１ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）溶液を、窒素気流下室温で３０分間で滴下して加えた後、４０℃で３時間３０分間撹拌した。この反応混合物を２５ｍｌの冷水へ注ぎ入れ２５ｍｌの酢酸エチルで２回抽出し、有機層を１０ｍｌの冷水で２回、５ｍｌの飽和食塩水で洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去して得た油状残渣をカラムクロマトグラフィー（Merck silica gel, Lobar column size A ×2）に付し、酢酸エチル−アセトン（３：１）で溶出することにより無色油状の化合物８（２３１ｍｇ, ０．４５５ｍｍｏｌ, ８０％）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.50 - 1.64 (2H, m), 1.68 - 1.90 (4H, m), 2.18 (3H, s), 2.63 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.77 - 2.89 (6H, m), 3.47 (1H, br), 3.68 (2H, br), 4.35 - 4.51 (2H, m), 4.57 (1H, t, J = 5.4 Hz), 5.91 (1H, d, J = 6.0 Hz), 6.01 (1H, br), 6.46 (1H, br), 7.97 (1H, s), 8.29 (1H, s).
【０１１１】
実施例２
６−（３−アミノ）プロピル−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成法
合成スキーム２
【化１８】
2007531724.tif 000019
【０１１２】
６−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル−２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化１９】
2007531724.tif 000020
２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（４）（３３８ｍｇ, １ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に、窒素気流下室温で水素化ナトリウム（３１ｍｇ, １．２８ｍｍｏｌ）を徐々に加えた後、２時間撹拌した混合物に、３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピルブロマイド（３１０ｍｇ, １．３ｍｍｏｌ）と無水ジメチルホルムアミド（０．３ｍｌ）の溶液を滴下して加えた。この反応混合物を室温で１時間、さらに６０℃で２時間撹拌した反応液は、２０ｍｌの冷水へ注ぎ入れ２０ｍｌの酢酸エチルで２回抽出した。有機層を１０ｍｌの冷水で３回、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去して得る油状残渣をカラムクロマトグラフィー（Merck silica gel, Lobar column size A）に付し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（２：３）で溶出することにより無色油状の化合物９（２４２ｍｇ, ０．５ｍｍｏｌ, ５０％）を得た。
1H NMR (200MHz, CDCl3) δ: 1.40 (3H, s), 1.46 (9H, s), 1.62 (3H, s), 1.75 - 1.90 (2H, m), 2.11 (3H, s), 2.67 - 2.91 (2H, m), 3.22 (2H, dd, J = 6.0, 12.2 Hz), 3.73 (2H, br), 4.35 - 4.46 (1H, m), 5.08 (1H, dd, J = 3.0, 6.2 Hz), 5.26 (1H, br), 5.52 (1H, dd, J = 2.2, 6.2 Hz), 6.07 (1H, d, J = 2.2 Hz), 6.18 (1H, br), 7.87 (1H, s), 8.36 (1H, s).
【０１１３】
６−（３−アミノ）プロピル−２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化２０】
2007531724.tif 000021
６−（３−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）プロピル−２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（９）（２４２ｍｇ, ０．５ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（０．５ｍｌ）とジクロロメタン（２．５ｍｌ）の溶液をＴＬＣで原料がなくなるまで４０℃で反応させた。この反応液を２５℃以下で減圧留去し、この残渣に飽和炭酸カリウム水溶液（１０ｍｌ）を加え、２０ｍｌの酢酸エチルで抽出した。有機層を５ｍｌの水で２回、５ｍｌの飽和食塩水で洗浄後、抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮して溶媒を除去した。抽出残渣を分取薄層クロマトグラフィー（Merck silica gel, thin layer plates KGF 254; 0.5 mm, 20 cm×20 cm, development and elution solvent; ethyl acetate-acetic acid-water = 3 : 1 : 1）によって、無色粉末の化合物１０（１８０ｍｇ, ０．４７ｍｍｏｌ, ９４％）を得た。
【０１１４】
６−（３−アミノ）プロピル−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシンの合成
【化２１】
2007531724.tif 000022
６−（３−アミノ）プロピル−２’,３’−イソプロピリデン−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン（１０）（１８０ｍｇ, ０．４７ｍｍｏｌ）と２Ｎ硫酸（５ｍｌ）の溶液を室温で終夜放置した。この反応液に５％炭酸カリウム水溶液を加えｐＨ９に調整後、減圧留去して結晶性残渣を得、２０ｍｌの無水エタノールで抽出した。この抽出液を減圧濃縮して溶媒を除去して得た抽出残渣（１４０ｍｇ）を分取薄層クロマトグラフィー（Merck silica gel, thin layer plates KGF 254; 0.5 mm, 20 cm×20 cm, development and elution solvent; ethyl acetate-acetic acid-water = 3 : 1 : 1）ならびにＨＰ−２０カラムクロマトグラフィー（Mitsubishi Kasei; 75 - 150 μm, 5 g）に付し、エタノール−水−２８％アンモニア水（１０：９：１）で溶出することにより無色油状の化合物１１（約４０ｍｇ）を得た。
1H NMR (200MHz, CD3OD) δ: 1.80 - 1.95 (2H, m), 2.12 (3H, s), 2.80 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.91 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.70 (2H, br), 4.23 (1H, dd, J = 5.8, 10.2 Hz), 4.33 (1H, t, J = 4.8 Hz), 4.68 - 5.00 (6H, m), 6.00 (1H, d, J = 5.2 Hz), 8.26 (1H, s), 8.28 (1H, s).
【０１１５】
実施例３
ＭＴＡの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識
実施例２に従って合成した６−（３−アミノ）プロピル−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン０．６３ｍｇ（１．８μｍｏｌ）に蒸留水０．０５ｍｌ及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．１ｍｌを加えて溶解し、これにスルフォスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ピアス社製）１．１９ｍｇ（２．７μｍｏｌ）を含む水溶液０．２ｍｌを加えて、室温で２時間反応した。逆相ＨＰＬＣ（カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−Ａ、６．０Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、溶離条件：アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、０〜５０％、２０ｍｉｎ、リニアグラディエント、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２６０ｎｍ）を行って、マレイミド化ＭＴＡ画分（１４．７分）を分取し、減圧下に溶媒を留去したのち２０％メタノール／蒸留水０．４ｍｌに溶解した。一方、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ロシュ社製）１．１ｍｇ（２７ｎｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．２ｍｌにスルフォスクシンイミジル６−［３’−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド］ヘキサノエート（ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、ピアス社製）０．４３ｍｇ（８１０ｎｍｏｌ）を含む水溶液０．０５ｍｌを加え、室温で２時間反応させた。０．１Ｍメルカプトエチルアミン溶液０．０５ｍｌを加えて室温で１時間静置した後、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＰＤ−１０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に反応液を通して低分子物質を除去した。ＨＲＰ０．１１５μｇ（２．９ｎｍｏｌ）を含む画分０．２ｍｌに上記のマレイミド化ＭＴＡ２８μｇ（４９ｎｍｏｌ）を加え、４℃で３日間反応した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ−１０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に反応液を通して低分子物質を除去し、ＨＲＰ標識ＭＴＡを得た。
【０１１６】
実施例４
ＭＴＡを認識するモノクロナル抗体および該抗体を産生するハイブリドーマの作製
（１）免疫原の調製および免疫
キャリアタンパクとしてカギアナカサガイのヘモシアニン（ＫＬＨ、ピアス社製）を用いた。ＫＬＨ２０ｍｇのバイアルに蒸留水を２ｍｌ加え、リン酸塩緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．２）溶液とした。これに実施例１に従って合成した６−［５−（２,５−ジオキシピロリジン−１−イルオキシ）ペンチル］−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン３．８ｍｇ（７．５μｍｏｌ）を含むＤＭＦ溶液０．１９ｍｌを滴加し、室温で２時間反応させてコンジュゲートを調製した。反応液を蒸留水に対して４℃で透析し、次いで凍結乾燥した。乾燥重量１８．４ｍｇのコンジュゲートを得、これを免疫原とした。
【０１１７】
免疫原１．３ｍｇを生理食塩水０．５ｍｌに溶かし、フロイントの完全アジュバント（ディフコ社製）０．８ｍｌを加えてエマルジョンとした。その０．１ｍｌ（０．１ｍｇ）をＡ／ＪｊｍｓＳｌｃマウス（６週齢、雌）に、３週間隔で５回腹腔内投与して免疫した。細胞融合に供したマウスはその３日前に免疫原０．１ｍｇを含む生理食塩水０．１ｍｌを腹腔内にブースター投与した。
【０１１８】
（２）抗体を産生するハイブリドーマおよび該ハイブリドーマを用いたＭＴＡ−７Ｈ８抗体の作製
上記（１）の手法に従って免疫したマウスから最終投与３日後にマウスの脾臓を摘出して脾臓細胞を回収した。脾臓細胞１．０×１０8個とマウスミエローマ細胞（ｐ３×６３−Ａｇ８．ＵＩ、東京腫瘤研究所）２×１０7個を５０％のポリエチレングリコール４０００を用いて融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地で選択した。細胞融合１０日目に特異抗体産生細胞のスクリーニングを行った。スクリーニングに用いたＥＬＩＳＡは次の通りである：９６穴マイクロタイタープレート（ヌンク社製）の各ウェルに、１μｇの抗マウスＩｇＧ抗体（シバヤギ社製）を含むＰＢＳ（０．１５ＭＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．４））を１００μｌ加えて４℃で１６時間固定した。これらのウェルをＰＢＳ２００μｌで１回洗浄した後、ブロックエース（大日本製薬社製）を２００μｌ加えて４℃で１６時間放置してブロッキングを行った（抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレート）。各ウェルを緩衝液Ａ（０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％Proclin150、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４））３００μｌで１回洗浄した後、緩衝液Ｂ（０．５％ウシ血清アルブミン、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．０５％Proclin150、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４））５０μｌとハイブリドーマ培養上清５０μｌを加えて室温で３時間反応させた。次いで、各ウェルを緩衝液Ａ３００μｌで３回洗浄し、緩衝液Ｂで２０ｎｇ／ｍｌとしたＨＲＰ標識ＭＴＡを１００μｌ添加して４℃で１６時間反応させた。各ウェルを再度洗浄後、TMB+ Substrate- Chromogen（ダコ社製）を１００μｌ添加して室温で３０分間発色させた。次いで、１規定硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、1420 ARVO SXマルチラベルカウンタ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１１９】
特異抗体の産生が陽性を示したウェルのハイブリドーマを、限界希釈法により２回クローニングして、ＭＴＡを認識するモノクロナル抗体を産生するハイブリドーマのクローンを獲得した。
【０１２０】
得られたハイブリドーマの培養上清について、マウスモノクロナル抗体アイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社製）を用いて、ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを決定した。新たに得られたモノクロナル抗体は、ＭＴＡ−７Ｈ８と命名し、そのアイソタイプはＩｇＧ1（ｋ）であった。
【０１２１】
本発明のモノクロナル抗体ＭＴＡ−７Ｈ８を産生するハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）に、平成１６年３月２日付けで受託番号ＦＥＲＭＰ−Ｐ１９７０７として、ブダペスト条約に基づいて寄託され、その後、日本の特許生物寄託センター（ＩＰＯＤ）に寄託され、その受託番号はＦＥＲＭ−ＡＢＰ１０２２６である。
【０１２２】
マウス抗血清の抗体価
免疫マウスより採取した抗血清を緩衝液Ｂで１０倍に薄める操作を繰り返し、１,０００〜１,０００,００００倍の希釈系列を調製した。上記抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレートを３００μｌの緩衝液Ａで１回洗浄した後、抗血清希釈液を１００μｌ加えて室温で３時間反応させた。次いで、各ウェルを３００μｌの緩衝液Ａで３回洗浄し、緩衝液Ｂで２０ｎｇ／ｍｌとしたＨＲＰ標識ＭＴＡを１００μｌ添加して４℃で一晩反応させた。各ウェルを３００μｌの緩衝液Ａで３回洗浄した後、TMB+ Substrate- Chromogen（ダコ社製）を１００μｌ添加して室温で３０分間発色させた。次いで、１規定硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、1420 ARVO SXマルチラベルカウンタ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度が１．０となる抗血清の希釈倍率を抗体価とした。測定の結果、本発明のポリクロナル抗体（抗血清）の抗体価は１０００,０００倍と従来技術の５００倍の値を示した。
【０１２３】
抗ＭＴＡ抗体のＭＴＡおよびｄｃＳＡＭに対する反応性
緩衝液Ｂを用いて、ＭＴＡについては０．２−２００ｐｍｏｌ／ｍｌの１０倍希釈系列を、ｄｃＳＡＭについては２−２,０００ｐｍｏｌ／ｍｌの１０倍希釈系列を調製した。上記抗マウスＩｇＧ抗体固相化プレートの各ウェルを３００μｌの緩衝液Ａで１回洗浄した後、緩衝液Ｂで１０ｎｇ／ｍｌとしたＭＴＡ−７Ｈ８、または１,０００,０００倍に薄めたマウス抗血清を１００μｌ加えて室温で３時間反応させた。次いで、各ウェルを３００μｌの緩衝液Ａで３回洗浄し、ＭＴＡまたはｄｃＳＡＭの希釈液５０μｌと、緩衝液Ｂで４０ｎｇ／ｍｌとしたＨＲＰ標識ＭＴＡを５０μｌ添加して４℃で一晩反応させた。各ウェルを３００μｌの緩衝液Ａで３回洗浄した後、TMB+ Substrate- Chromogen（ダコ社製）を１００μｌ添加して室温で３０分間発色させた。次いで、１規定硫酸を１００μｌ添加して反応を停止し、1420 ARVO SXマルチラベルカウンタ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を用いて、各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０１２４】
ＭＴＡ−７Ｈ８の反応性の結果を図１に示した。縦軸には各濃度ポイントにおける吸光度（Ｂ値）のゼロ濃度における吸光度（Ｂ0値）に対する割合（Ｂ値／Ｂ0値（％））を算出したものを、横軸にＭＴＡあるいはｄｃＳＡＭの濃度をプロットした競合曲線を作成した。図中の白丸はｄｃＳＡＭに対する反応性を、黒丸はＭＴＡに対する反応性を示す。ＭＴＡおよびｄｃＳＡＭの競合曲線における親和性（ＩＣ５０値）はそれぞれ０．４ｎＭ、５０μＭであった。このようにＭＴＡ−７Ｈ８はＭＴＡに対して高い反応性を示すばかりでなく、前駆体であるｄｃＳＡＭに対する交差反応性も０．０００８％と極めて小さいことから、本抗体を用いてＭＴＡを特異的に検出できることを確認した。また、本発明のポリクロナル抗体（抗血清）のＭＴＡおよびｄｃＳＡＭの競合曲線における親和性（ＩＣ５０値）はそれぞれ４ｎＭ、３００μＭであり、交差反応性は０．００１％であることから従来技術のポリクロナル抗体（１％）よりも大きく優れていた。以上の結果は、従来技術（J. Biochem. Mol. Biol., 1997, Vol.30, p403）とともに表１にまとめた。
【表１】
2007531724.tif 000023
【０１２５】
実施例５
モノクロナル抗体ＭＴＡ−７Ｈ８の精製
Ｂａｌｂ／ｃマウス１匹あたり、１×１０7個の実施例４で得たハイブリドーマをラボプロダクツ社へ供与して腹水化を委託した。得られた腹水を１０,０００×ｇで２０分間遠心分離してその上清をＰＢＳで２倍に希釈した後、プロテインＧセファロースカラム（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に通した。ＰＢＳでカラムを十分に洗浄後、０．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）で抗体を溶出し、直ちに１Ｍトリス緩衝液を加えて中和した。得られた溶出液に等量の飽和硫酸アンモニウムを加えて４℃で３０分間放置することで塩析した。塩析物を１０,０００×ｇで２０分間遠心分離して回収した。得られた沈殿をＰＢＳに溶解し、さらにＰＢＳに対して４℃で一晩透析して精製モノクロナル抗体とした。
【０１２６】
実施例６
マウス抗ＭＴＡポリクロナル抗体の精製
実施例２に従って合成した６−（３−アミノ）プロピル−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン０．６３ｍｇ（１．８μｍｏｌ）を含む０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）１．５ｍｌをAminoLink固定化キット（ピアス社製）のカップリングゲル１．５ｍｌに加え、以下キットの手順書に従ってＭＴＡ固定化ゲルを含むカラムを調製した。予め０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したカラムに、前述の免疫マウスの血清を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３倍に薄めたものを加えた。同緩衝液で十分にカラムを洗浄した後、６ｍＭ 塩酸で抗体を溶出させて、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して４℃で透析し、ポリクロナル抗体を精製した。
【０１２７】
実施例７
リコンビナントヒトスペルミジンシンターゼの調製
発現ベクターの構築にはインビトロジェン社のGatewayテクノロジーを利用した。ヒトＳＰＤＳ遺伝子をＰＣＲで増幅し、制限酵素サイトＳａｃＩとＮｏｔＩを介してエントリーベクターｐＥＮＴＲ１１に挿入し、エントリークローンを得た。３×ＦＬＡＧタグ（シグマ社製）とGateway Vector Conversion SystemのReading Frame Cassette Aを連結した遺伝子をＰＣＲで増幅し、ＮｈｅＩとＫｐｎＩの制限酵素サイトを介してｐＳｈｕｔｔｌｅベクター（クロンテック社製）に挿入し、デスティネーションベクターとした。エントリークローンとデスティネーションベクターをClonase存在下混合してａｔｔサイト間の部位特異的組み換えを誘導することにより、Ｎ末に３×ＦＬＡＧタグを繋いだヒトＳＰＤＳの発現ベクターをクローニングした。発現ベクターはEndoFree Plasmid Maxi kit（キアゲン社製）を用いて精製した。
【０１２８】
リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）と発現ベクターを用いて、手順書に従ってＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来、アメリカンタイプカルチャーコレクション社より入手）をトランスフェクトした。３日間培養した後、細胞を回収して少量のＴＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ トリス緩衝液（ｐＨ７．４））に懸濁させ、超音波で破砕した。ＴＢＳで平衡化した抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２）アガロースカラム（シグマ社製）に細胞破砕液を通し、ＴＢＳで十分に洗浄した。次いで、０．１ｍｇ／ｍｌの３×ＦＬＡＧペプチド（シグマ社製）を含むＴＢＳをカラムに通して溶離液を１ｍｌごとに分取した。各画分１μｌの活性を後述のＨＴＲＦ法で測定して活性のある画分を混合し、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％グリセロール、０．０５ｍＭ ｄｃＳＡＭを添加して−８０℃で保存した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＭＴＡ抗体を用いたウエスタンブロット法により、精製したＳＰＤＳの純度を確認した。
【０１２９】
実施例８
ＥＬＩＳＡ法によるスペルミジンシンターゼの活性測定
上述のリコンビナントヒトスペルミジンシンターゼを緩衝液Ｃ（０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４））で希釈し、９６ウェルアッセイプレート（コーニング社製）へ５０μｌ添加した。さらに基質混合液（０．４ｍＭ ジチオトレイトール、０．１ｍＭ ｄｃＳＡＭ、１．３ｍＭ プトレシン、０．４ｍＭ アデニン、０．１％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４））５０μｌを加えて室温で反応させた。反応後、２０ｍＭ ４−メチルシクロヘキシルアミン（東京化成工業社製）を含む緩衝液Ｃを１００μｌ各ウェルへ添加して反応を停止した。反応液１０μｌを、上述の抗マウスＩｇＧ抗体を固相化したマイクロタイタープレートへ移し、緩衝液Ｂで５０ｎｇ／ｍｌとしたＨＲＰ標識ＭＴＡ４０μｌと緩衝液Ｂで４０ｎｇ／ｍｌとしたＭＴＡ−７Ｈ８モノクロナル抗体５０μｌを加えて室温で一晩反応させた。反応後、各ウェルを緩衝液Ａ３００μｌで３回洗浄し、TMB+ Substrate- Chromogen（ダコ社製）を０．１ｍｌ添加して室温で３０分間発色させた。次いで、１規定硫酸１００μｌを添加して反応を停止し、1420 ARVO SXマルチラベルカウンタ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）で各ウェルの４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。各ウェルのＭＴＡ量を上記競合曲線より算出し、酵素量、反応時間あたりのＭＴＡ産生量を酵素活性とした。
【０１３０】
（結果）
ＥＬＩＳＡによるスペルミジンシンターゼの活性測定の結果を図２に示す。スペルミジンシンターゼの濃度と反応時間に依存してＭＴＡ産生量は増加していることが確認された。また、スペルミジンシンターゼの既知阻害剤である４−メチルシクロヘキシルアミンを酵素反応時添加したときの測定結果を図３に示す。４−メチルシクロヘキシルアミンの濃度に依存してＭＴＡの産生は阻害され、ＩＣ５０値は文献値１．７μＭ（Shirahata et al., Biochem. Pharma., 1991.）と同等な１．０μＭであった。すなわち、本法で検出されるＭＴＡは、スペルミジンシンターゼによりプトレシンがスペルミジンに変換された結果を反映しており、本法でスペルミジンシンターゼの活性を測定できることが確認された。またスペルミジンシンターゼの阻害剤の探索を実施する場合は１０％ＤＭＳＯに溶解した被験物質１μｌを予めプレートのウェルに添加しておき、上記の反応を行った。本法によりＭＴＡ産生量を検出することによって被験物質の阻害活性を測定した。
【０１３１】
実施例９
ＨＴＲＦ法によるスペルミジンシンターゼの活性測定
（１）新規モノクロナル抗体ＭＴＡ−７Ｈ８のユウロピウムクリプテート標識
ＭＴＡ−７Ｈ８モノクロナル抗体６９０μｇ（４．６ｎｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）７７０μｌに溶かし、クリプテートＴＢＰモノスベレート（ＣＩＳバイオインターナショナル社製）１００μｇ（６８ｎｍｏｌ）を加えて室温で１時間反応させた。反応液につき、ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に通して低分子物質を除去し、ユウロピウムクリプテート標識ＭＴＡ−７Ｈ８モノクロナル抗体を得た。
【０１３２】
（２）ＭＴＡのクロスリンクドアロフィコシアニン（ＸＬ６６５）標識
ＸＬ６６５（ＣＩＳバイオインターナショナル社製）７．７ｍｇ（７４ｎｍｏｌ）を０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）１．１ｍｌに溶かし、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、ピアス社製）１４０μｇ（４４３ｎｍｏｌ）を添加して室温で２０分間反応させ、さらに終濃度１０ｍＭのジチオトレイトールを加えて１０分間反応させることによりＸＬ６６５にシステイン基を導入した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰＤ−１０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に反応液を通して低分子物質を除去し、ＸＬ６６５を３．４ｍｇ（３３ｎｍｏｌ）含む画分１．３ｍｌへ上述のマレイミド化ＭＴＡ溶液を６６０ｎｍｏｌ加えて４℃で一晩反応させた。反応液に３００μｇ（２．４μｍｏｌ）のＮ−エチルマレイミドを加え、室温で１０分間放置した後、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＰＤ−１０（アマシャムファルマシアバイオテック社製）に通して低分子物質を除去し、ＸＬ６６５標識ＭＴＡを得た。
【０１３３】
（３）スペルミジンシンターゼの活性測定
緩衝液Ｃで希釈したスペルミジンシンターゼを３８４ウェルアッセイプレート（黒色、コーニング社製）へ１０μＬ添加した。次いで、上記基質混合液１０μｌを加え、室温で反応させた。３０ｍＭの４−メチルシクロヘキシルアミンと２６０ｎｇ／ｍｌのＸＬ６６５標識ＭＴＡを含む緩衝液Ｄ（０．５％ウシ血清アルブミン、０．６Ｍフッ化カリウムを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．４）を各ウェルへ２０μｌ添加して反応を停止した。さらに、緩衝液Ｄで２８８ｎｇ／ｍｌとしたユウロピウムクリプテート標識抗ＭＴＡ−７Ｈ８抗体を各ウェルへ２０μｌ添加し、室温で１６時間反応させた後、Rubystar (BMG Labtechnologis社製）で各ウェルの蛍光測定を行った。各ウェルのＭＴＡ量を標準曲線から算出し、酵素量、反応時間あたりのＭＴＡ産生量を酵素活性とした。
【０１３４】
（結果）
ＨＴＲＦ法における標準曲線を図４に示す。図中の白丸はｄｃＳＡＭに対する反応性を、黒丸はＭＴＡに対する反応性を示す。ＭＴＡのＩＣ５０値は２０ｎＭでＥＬＩＳＡと比べると感度が低下するものの高感度を維持し、尚且つ、基質ｄｃＳＡＭに対する交差反応は０．０２％以下と極めて小さいため、本法によりスペルミジンシンターゼの活性測定が可能であった。ＨＴＲＦ法によるスペルミジンシンターゼの活性測定の結果を図５に示す。スペルミジンシンターゼの濃度と反応時間に依存してＭＴＡ産生量は増加していることが確認された。また、既知阻害剤である４−メチルシクロヘキシルアミンを酵素反応時添加して測定した結果を図６に示す。４−メチルシクロヘキシルアミンの濃度に依存してＭＴＡ産生は阻害され、ＩＣ５０値は１．１μＭで、ＥＬＩＳＡの結果と同等の値を示した。すなわち、本法で検出されるＭＴＡは、スペルミジンシンターゼによりプトレシンがスペルミジンに変換された結果を反映しており、本法でスペルミジンシンターゼの活性を測定できることが確認された。またスペルミジンシンターゼの阻害剤の探索を実施する場合は１０％ＤＭＳＯに溶解した被験物質１μｌを予めプレートのウェルに添加しておき、上記の反応を行った。本法によりＭＴＡ産生量を検出することによって被験物質の阻害活性を測定した。
【０１３５】
実施例１０
ＳＰＡ法を利用したＭＴＡの定量
（１）ＭＴＡの125Ｉ標識
放射性ヨウ素［125Ｉ］−ボルトン−ハンター試薬（パーキンエルマーライフサイエンス社製）９×１０6Ｂｑについて溶媒を減圧下に留去し、これに実施例２に従って合成した６−（３−アミノ）プロピル−５’−デオキシ−５’−メチルチオアデノシン１３μｇを含む２０％メタノール水１０μｌ及び２５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．１）３０μｌを加えて４℃で一晩反応させた。反応液につき逆相高速液体クロマトグラフィー（装置：島津社製ＬＣ−６Ａ、カラム：ＹＭＣ−ＰａｃｋＯＤＳ−Ａ６．０Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ（ＹＭＣ社製）、溶離液：Ａ；１０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ；６０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸、Ａ→Ｂ、リニアグラディエント（２５ｍｉｎ）、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ）を行って１６分付近に溶出する125Ｉ標識ＭＴＡ（約２．６×１０6Ｂｑ）を分取した。
【０１３６】
（２）ＭＴＡの定量
マイクロタイタープレート（IsoPlate-96、白色、パーキンエルマーライフサイエンス社製）に、測定緩衝液Ｅ（０．５％ウシ血清アルブミンを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４））で２０ｍｇ／ｍｌとした抗マウス抗体結合ＳＰＡＰＶＴビーズ（アマシャムファルマシアバイオテック社製）５０μｌ、ＭＴＡ標準液５０μｌ、測定緩衝液Ｅで１２,０００Ｂｑ／ｍｌとした125Ｉ標識ＭＴＡ５０μｌを連続して添加し、最後に１,０００ｎｇ／ｍｌマウスポリクロナル抗体を含む測定緩衝液Ｅ５０μｌを添加して室温で一晩反応させた。反応後、各ウェルの放射能をマイクロプレートシンチレーションカウンタ（Top Count NXT、パーキンエルマーライフサイエンス社製）で測定し、標準曲線を作成した。
【０１３７】
（結果）
ＳＰＡ法で得られた標準曲線を図７に示す。ＭＴＡのＩＣ５０値は１０μＭと上述のＥＬＩＳＡやＨＴＲＦ法と比べて劣るものの、ｄｃＳＡＭとの交差反応は０．１％以下と小さく、本法によりＭＴＡの定量が可能であることが確認された。本法を利用することによりスペルミジンシンターゼの活性が測定できる。またスペルミジンシンターゼの阻害剤の探索を実施する場合は１０％ＤＭＳＯに溶解した被験物質１μｌを予めプレートのウェルに添加しておき、上記の反応を行った。本法によりＭＴＡ産生量を検出することによって被験物質の阻害活性を測定した。
【０１３８】
実施例１１
ＨＰＬＣによるスペルミジンの定量法
文献に報告されている手法（Saeki et al. J. Chromatogr. 1978. 221-229.）に準じて実施した。上記と同様に酵素反応液（全量４０μL）を調製し、４−ＭＣＨＡの代わりに５０ｍＭ 塩酸を１０μｌ加えて反応を停止させた。酵素反応液に１０％トリクロロ酢酸１０μｌを加えて遠心分離することで得た上清２０μｌ及びスペルミジン標準液２０μｌに、５００ｍＭ 炭酸ナトリウム２０μｌと２０ｍＭ ダンシルクロライドのアセトニトリル溶液４０μｌを加えて４０℃で３０分間反応させた。反応後、反応液を遠心分離することにより得た上清２０μｌをＨＰＬＣの試料とした。ダンシル化スペルミジンは逆相ＨＰＬＣ（カラム；Cadenza CD-C18、４．６ｍｍＩ．Ｄ．Ｘ７５ｍｍ、移動相Ａ：５０ｍＭ ギ酸アンモニウム（ｐＨ５．０）／アセトニトリル（９０：１０、ｖ／ｖ）、移動相Ｂ：５０ｍＭ ギ酸アンモニウム（ｐＨ５．０）／アセトニトリル（１０：９０、ｖ／ｖ）、グラジェント溶出条件：５５％Ｂ（０〜３ｍｉｎ）→１００％Ｂ（３〜１０ｍｉｎ）、流速；１ｍｌ／ｍｉｎ、蛍光検出；励起波長３６０ｎｍ、測定波長５１０ｎｍ）で分離定量した。スペルミジン標準液で検量線を作成し、酵素反応液のスペルミジン含量を計算した。
【０１３９】
（結果）
本発明の方法では、ＳＰＤＳの生成物のスペルミジンではなく、ＭＴＡを指標として測定している。ＳＰＤＳの反応によってスペルミジンとＭＴＡが同数生成される。本発明の方法でＳＰＤＳの活性を特異的に測定できているかどうか調べるため、ＳＰＤＳにより生成されたスペルミジンをＨＰＬＣで定量して、本発明の方法の結果と比較した。反応液のポリアミンをダンシル化した上で、ＨＰＬＣでダンシル化スペルミジンを分離した。ここで採用したＨＰＬＣの分離条件で、ダンシル化スペルミジンの保持時間はおよそ１３分間であった。本発明の方法の結果とＨＰＬＣの結果の相関を図８に示す。ＭＴＡ濃度（ｘ）はスペルミジン濃度（ｙ）とよく一致した（ｙ＝１．１３１５ｘ＋１３０．４８ｎｍｏｌ／Ｌ、Ｒ2＝０．９９３１、ｎ＝２８）。この実験結果は、本発明の方法でＳＰＤＳの活性を特異的に測定できることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】本発明のモノクロナル抗体ＭＴＡ−７Ｈ８のＭＴＡおよびその前駆体ｄｃＳＡＭに対する反応性を示すグラフである。
【図２】本発明のＥＬＩＳＡでＳＰＤＳの活性を測定した結果を示したグラフである。ＡはＭＴＡの標準曲線、Ｂは各酵素量で反応した結果得たＥＬＩＳＡの測定値を標識ＭＴＡの結合率に換算して表したグラフ、Ｃは、各酵素量におけるＭＴＡ産生量をＡとＢの結果を基に算出した結果を示すグラフである。
【図３】本発明のＥＬＩＳＡにより４−メチルシクロヘキシルアミンのＳＰＤＳに対する阻害活性を測定した結果を示したグラフである。
【図４】本発明のモノクロナル抗体ＭＴＡ−７Ｈ８のＨＴＲＦ法におけるＭＴＡおよびその前駆体ｄｃＳＡＭに対する反応性を示すグラフである。
【図５】本発明のＨＴＲＦ法でＳＰＤＳの活性を測定した結果を示したグラフである。ＡはＭＴＡの標準曲線、Ｂは各酵素量で反応した結果得たＨＴＲＦ測定値を標識ＭＴＡの結合率に換算して表したグラフ、Ｃは各酵素量におけるＭＴＡ産生量をＡとＢの結果を基に算出した結果を示すグラフである。
【図６】本発明のＨＴＲＦ法により４−メチルシクロヘキシルアミンのＳＰＤＳに対する阻害活性を測定した結果を示したグラフである。
【図７】本発明のモノクロナル抗体ＭＴＡ−７Ｈ８のＳＰＡ法におけるＭＴＡおよびその前駆体ｄｃＳＡＭに対する反応性を示すグラフである。
【図８】本発明の方法により測定したＭＴＡの量とＨＰＬＣにより測定したスペルミジンの量は互いに相関していることを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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