(57)【要約】  組換えＨＭＰＶ（ｒＨＭＰＶ）および関連する免疫原性組成物および方法を提供する。キメラおよびＨＭＰＶベクターウイルスを含み、本開示に従って提供されるｒＨＭＰＶは、ヒトを含む受容性の哺乳動物被験者中で感染性があり、弱毒化している。ｒＨＭＰＶは、ＨＰＩＶに対して、１種または複数種の非ＨＭＰＶ病原体に対して、あるいはＨＭＰＶおよび非ＨＭＰＶ病原体に対して免疫応答を引き出す免疫原性組成物に有用である。組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを組み込んだ単離ポリヌクレオチド分子およびベクターも提供する。
2007524372.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）であって、
１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変を含む、部分的なまたは完全な、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムと、
主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、および大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）と
を含むｒＨＭＰＶ。
【請求項２】
前記ｒＨＭＰＶが複製能を有する、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３】
前記組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムが、ポリペプチドをコードする検出可能な異種配列をさらに含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４】
前記検出可能な異種配列がレポーターをコードする、請求項３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項５】
前記レポーターが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む、請求項４に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項６】
前記検出可能な異種配列が、ＨＭＰＶの転写の遺伝子開始シグナルおよび遺伝子終止シグナルと機能しうる形で連結している、請求項３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項７】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２のＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失、あるいは１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２のＯＲＦの発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項８】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２のＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで機能的なタンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項９】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型ＳＨタンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＳＨ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで配列番号５に示す配列を含むＳＨタンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＧ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型Ｇタンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＧ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで配列番号６に示す配列を含むＧタンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＳＨおよびＧのＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型ＳＨタンパク質および野生型Ｇタンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＳＨ  ＯＲＦおよびＧ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１６】
前記ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの発現を低下または消失させる前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、前記ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの１つまたは複数の潜在的翻訳開始コドンを除去するか、あるいは１つまたは複数のインフレームの終止コドンを前記ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦ中に導入する１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項１５に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、配列番号１に示すｒＨＭＰＶ配列の１つまたは複数の核酸の置換を含む、請求項１６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型Ｍ２−２タンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＭ２−２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含んで野生型Ｍ２−１タンパク質が産生しないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２１】
前記ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの発現を低下または消失させる前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、前記ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの翻訳開始コドンを除去し、さらに前記ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの各読み枠におけるさらなるＡＴＧトリプレットを除去する１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項２０に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、配列番号１の１つまたは複数の位置での置換を含む、請求項２１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２４】
前記部分的なまたは完全な欠失が、配列番号１のＭ２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項２３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変により、前記ｒＨＭＰＶにおいて少なくとも１つの目的とする表現型変化が生じ、前記表現型変化が、少なくとも１つの、細胞培養における増殖特性の変化、哺乳動物宿主の上気道または下気道における増殖特性または毒性の変化、ウイルスのプラークサイズの変化、温度に対する感受性または適応の変化、細胞変性効果の変化、転写またはゲノム複製の効率の変化、インターフェロンに対する感受性の変化、１つまたは複数の遺伝子の発現効率の変化、あるいは免疫原性の変化を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２６】
ウイルス増殖が、対応する野生型ＨＭＰＶ株の増殖と比べて約５０〜１００倍以上弱毒化するように、前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変により、上気道、下気道、またはその両方におけるウイルス増殖の変化が生じる、請求項２５に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶにおけるＭ２−１またはＬタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸置換が生じる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２８】
複製能を有する単離された組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）であって、部分的なまたは完全な組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム、主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、および大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）を含み、前記組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中の１つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントの順番が、野生型ＨＭＰＶと比べて変化するように、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが再構成されているｒＨＭＰＶ。
【請求項２９】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノム中でＳＨ、Ｇ、またはＦ遺伝子またはゲノムセグメントの順番が変化している、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３０】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムのＭ遺伝子の後ろかつＦ遺伝子の前に挿入されたＳＨ遺伝子またはゲノムセグメントおよびＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３１】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムのＭ遺伝子の後ろかつＦ遺伝子の前に挿入された、少なくとも２コピーのＳＨ遺伝子またはゲノムセグメントおよび少なくとも２コピーのＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３２】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＦ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３３】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３４】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＦ遺伝子またはゲノムセグメントおよびＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３５】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＧ遺伝子またはゲノムセグメントおよびＦ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３６】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムにおける１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＧまたはＦ遺伝子またはゲノムセグメントの１つまたは複数のさらなるコピーの挿入を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３７】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたｒＨＭＰＶのＧ遺伝子またはゲノムセグメント、Ｆ遺伝子またはゲノムセグメント、あるいはその両方の１つまたは複数のさらなるコピーを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３８】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたｒＨＭＰＶのＧ遺伝子またはゲノムセグメントの単一のさらなるコピーを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３９】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたｒＨＭＰＶのＦ遺伝子またはゲノムセグメントの単一のさらなるコピーを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４０】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、Ｇ-Ｆの順序でさらなる１コピーのｒＨＭＰＶのＧ遺伝子およびさらなる１コピーのｒＨＭＰＶのＦ遺伝子を含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４１】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、Ｆ−Ｇの順序でさらなる１コピーの組換えＨＭＰＶのＧ遺伝子およびさらなる１コピーの組換えＨＭＰＶのＦ遺伝子を含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４２】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、Ｇ−Ｆ−Ｆの順序ででさらなる１コピーのｒＨＭＰＶのＧ遺伝子またはゲノムセグメントおよびさらなる２コピーのｒＨＭＰＶのＦ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４３】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、異なるパラミキソウイルスに由来する１つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントをさらに含んでキメラ組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを形成する、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４４】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、異なるパラミキソウイルスに由来する１つまたは複数のＮ、ＰまたはＭ遺伝子を含む、請求項４３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４５】
前記パラミキソウイルスがトリメタニューモウイルスを含む、請求項４４に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４６】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、異なる亜型のＨＭＰＶに由来する１つまたは複数のｒＨＭＰＶ遺伝子またはゲノムセグメントをさらに含んでキメラ組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを形成する、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４７】
製剤上許容される担体中に、請求項１から４６に記載の、免疫学的に有効な量の、複製能を有する単離された組換えヒトメタニューモウイルスのいずれか１つを含む免疫原性組成物。
【請求項４８】
ヒトメタニューモウイルスに対して被験者中で免疫応答を誘導する方法であって、請求項１から４６に記載の、治療有効量の、複製能を有する単離された組換えヒトメタニューモウイルスのいずれか１つを被験者に投与するステップを含み、それによってヒトメタニューモウイルスに対して被験者中で免疫応答が誘導される方法。
【請求項４９】
前記組換えヒトメタニューモウイルスを、１０３〜１０７ＰＦＵの投与量で投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換えヒトメタニューモウイルスを上気道に投与する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記組換えヒトメタニューモウイルスを噴霧、液滴またはエアロゾルにより投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
複製能を有する単離された組換えウイルスであって、パラミキソウイルスゲノムまたはアンチゲノム、主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、およびヒトメタニューモウイルスに由来する１つまたは複数の組換え遺伝子またはゲノムセグメントを含む組換えウイルス。
【請求項５３】
ヒトメタニューモウイルスＦ遺伝子を含む、請求項５２に記載の組換えウイルス。
【請求項５４】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスまたはパラインフルエンザウイルスである、請求項５２に記載の組換えウイルス。
【請求項５５】
機能しうる形で連結した転写プロモーター、部分的なまたは完全な、組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）ゲノムまたはアンチゲノム、および転写終止配列を含む発現ベクター。
【請求項５６】
前記ｒＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムが、１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変を含む、請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項５７】
ヒトメタニューモウイルスの生物学的活性を抑制する抗ウイルス性化合物をスクリーニングする方法であって、
主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、および異種配列の発現の際に前記生物学的活性と相関するポリペプチドをコードする検出可能な前記異種配列を組み込むように改変した、部分的なまたは完全な、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを含む組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）を用意するステップと、
前記ｒＨＭＰＶを含む試験試料またはＨＭＰＶによる感染を受容する宿主細胞を、ＨＭＰＶの前記生物学的活性を抑制することができる、１つまたは複数の抗ウイルス性作用因子を含むと予想される試験化合物または試験化合物ライブラリーにさらすステップと、
前記試験化合物または試験化合物ライブラリーの不在下で、ｒＨＭＰＶを含む対照試料または適切な制御条件下の宿主細胞を用意するステップと、
前記試験および対照試料中で異種配列を検出して、前記対照試料と比べた前記試験試料での前記生物学的活性の増大または低下を判定して、前記試験試料中の前記抗ウイルス性化合物の有無を判定するステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２００３年２月２８日に出願の米国仮特許出願第６０／４５１，１１９号、および２００３年６月１３日に出願した米国仮特許出願第６０／４７８，６６７号の利益を主張するものである。どちらの仮出願も、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
開示の分野
本発明は、ウイルス学の分野に関し、より具体的には、組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）を作製する方法、弱毒化している、防御効力があるなど所望の特性を有する、複製能を有する誘導体を作製する方法、ならびに免疫予防および療法におけるｒＨＭＰＶの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）は、オランダで、急性呼吸器疾患にかかっている乳児および小児から最初に回収されたウイルスである（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７１９〜７２４、２００１；Ｄｅ  Ｊｏｎｇら、ＷＯ０２／０５７／３０２  Ａ２）。
【０００４】
ＨＭＰＶの流行は世界規模であり、このウイルスは、疾患の徴候、および幼い幼児ならびにすべての年齢の個人において感染し疾患を引き起こす能力に関して、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶまたはＨＲＳＶ）と類似している（総説については、ＨｅｉｋｋｉｎｅｎおよびＪａｒｖｉｎｅｎ、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：５１〜５９、２００３を参照）。
【０００５】
ＨＭＰＶは、エンベロープ付きのウイルスであり、約１３ｋｂのＲＮＡマイナス一本鎖であるゲノムを有することを特徴とする。推定上このウイルスは、非セグメント型マイナス鎖ＲＮＡウイルスまたはモノネガウイルスを含むモノネガウイルス目のパラミキソウイルス科、ニューモウイルス亜科、メタニューモウイルス属に分類されている。モノネガウイルスは、非セグメント型マイナス鎖ＲＮＡウイルスとも呼ばれる。パラミキソウイルス科は、パラミキソウイルス亜科（Paramyxovirinae）およびニューモウイルス亜科（Pneumovirinae）という２つの亜科（それぞれパラミキソウイルスおよびニューモウイルスとも呼ばれる）を有する。
【０００６】
他のいくつかのモノネガウイルスは、小児科または他の科の患者集団における呼吸器疾患の重要な作用因子であり、例えば、ＲＳＶ、ならびにヒトパラインフルエンザウイルス１、２および３型（ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３）がある。これらのウイルスはＨＭＰＶといくつかの類似点があるが、その配列は、本明細書で開示されるＨＭＰＶウイルスと異なっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ＨＭＰＶについては最近にしか記載がないため、その増殖、取り扱いおよび安定性について文書化されたものが少なく、特徴付けを容易にするための十分に確立されたまたは広く利用可能な基準株、変異株、報告されているワクチン候補、あるいは基準となるウイルス特異的抗体または同等の試薬または系または実験動物モデルが存在しない。ＨＭＰＶはいくつかの呼吸器疾患に関係するので、特に幼い幼児の間でこの病原体に起因する重大な健康上の問題を緩和するために、安全かつ有効なワクチンを製造する方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
特定の実施形態の簡単な要約
ＨＭＰＶは、ヒト呼吸器疾患の重要な作用因子である。感染性の組換えＨＭＰＶを回収するための方法および組成物を本明細書において提供する。ＨＭＰＶのタンパク質産物をすべてコードする完全な核酸配列を含めて、組換えＨＭＰＶを本明細書において開示する。確定した所定の構造および表現型変化を感染性ＨＭＰＶに導入するための組成物および方法を開示し、弱毒化型のＨＭＰＶ、ならびに免疫原性、安全性、防御効力、およびワクチンの適用範囲の幅に関して質が向上するように改変された型のＨＭＰＶも開示する。したがって、被験者にＨＭＰＶに対する免疫応答を生起させるための方法を開示する。その方法は、被験者に弱毒化ＨＭＰＶを投与し、それによって免疫応答を発生させるステップが含まれる。１組のウイルスＯＲＦの同定についても記載し、その発現は、ウイルスの転写およびＲＮＡの複製を指令し、ｃＤＮＡから完全に感染性ＨＭＰＶを産生するのに十分である。
【０００９】
前記および他の特徴および利点は、添付図面を参照して進める下記のいくつかの実施形態の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【００１０】
図面の簡単な説明
（後述の「図面の簡単な説明」の項を参照のこと。）
配列表
添付した配列表に列挙した核酸およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に規定されている標準的な、ヌクレオチド塩基についての略語およびアミノ酸についての３文字コードを用いて示している。各核酸配列の一鎖のみを示すが、その相補的な鎖は、示した鎖を参照することによってそれが含まれるものと理解されるべきである。添付した配列表では、：
配列番号１は、プラスのセンス鎖ＤＮＡとしての、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ（株８３）のゲノムの核酸配列を示す。
【００１１】
配列番号２は、プラスのセンス鎖ＤＮＡとしての、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ（株７５）のゲノムの核酸配列を示す。
【００１２】
配列番号３は、プラスのセンス鎖ＤＮＡとしての、ＧＦＰを発現する転写カセットを有する組換えＨＭＰＶ（株８３）のゲノムの核酸配列を示す。
【００１３】
配列番号４は、ＨＭＰＶ（株８３）Ｍ２−１タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１４】
配列番号５は、ＨＭＰＶ（株８３）ＳＨタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１５】
配列番号６は、ＨＭＰＶ（株８３）Ｇタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１６】
配列番号７は、ＨＭＰＶ（株８３）Ｌタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１７】
配列番号８は、ＨＭＰＶ（株７５）ＳＨタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１８】
配列番号９は、ＨＭＰＶ（株７５）Ｇタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００１９】
配列番号１０は、ＨＭＰＶ（株００−１）ＳＨタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２０】
配列番号１１は、ＨＭＰＶ（株００−１）Ｇタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２１】
配列番号１２は、ＨＭＰＶ（株００−１）Ｌタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２２】
配列番号１３は、ＨＲＳＶＡ２のＬタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２３】
配列番号１４は、ＨＰＩＶ３のＬタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２４】
配列番号１５は、ＨＰＩＶ１のＬタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２５】
配列番号１６は、ＢＰＩＶ１のＬタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００２６】
配列番号１７は、ＨＭＰＶ（株００−１）３’リーダーの核酸配列を示す。
【００２７】
配列番号１８は、ＨＭＰＶ（株８３）３’リーダーの核酸配列を示す。
【００２８】
配列番号１９は、ＡＰＶの３’リーダーの核酸配列を示す。
【００２９】
配列番号２０は、ＲＳＶの３’リーダーの核酸配列を示す。
【００３０】
配列番号２１は、ＨＭＰＶ（株００−１）５’トレイラーの核酸配列を示す。
【００３１】
配列番号２２は、ＨＭＰＶ（株８３）５’トレイラーの核酸配列を示す。
【００３２】
配列番号２３は、ＡＰＶの５’トレイラーの核酸配列を示す。
【００３３】
配列番号２４は、ＲＳＶの５’トレイラーの核酸配列を示す。
【００３４】
配列番号２５は、ＨＭＰＶ（株８３）ＧＳ共通配列の核酸配列を示す。
【００３５】
配列番号２６は、別の核酸を割りつけた、ＨＭＰＶ（株８３）ＧＳ共通配列の核酸配列を示す。
【００３６】
配列番号２７は、別の核酸を割りつけた、ＨＭＰＶ（株８３）ＧＳ共通配列の核酸配列を示す。
【００３７】
配列番号２８は、ＨＭＰＶ（株８３）ＧＥ共通配列の核酸配列を示す。
【００３８】
配列番号２９は、別の核酸を割りつけた、ＨＭＰＶ（株８３）ＧＥ共通配列の核酸配列を示す。
【００３９】
配列番号３０は、別の核酸を割りつけた、ＨＭＰＶ（株８３）ＧＥ共通配列の核酸配列を示す。
【００４０】
配列番号３１は、ＲＳＶ  Ｍ２のＧＳ配列の核酸配列を示す。
【００４１】
配列番号３２は、塩基が一様に保存されている、ＨＭＰＶ（株８３）ＧＳ共通配列の核酸配列を示す。
【００４２】
配列番号３３は、ｒＨＭＰＶのクローニングおよび発現に使用したポリリンカーの核酸配列を示す。
【００４３】
配列番号３４は、ＨＭＰＶ（株８３／７５）ＧＥ共通配列の核酸配列を示す。
【００４４】
配列番号３５は、ＨＭＰＶ（株８３／７５）ＧＳ共通配列の核酸配列を示す。
【００４５】
配列番号３６は、プラスのセンス鎖ＤＮＡとしての、ＨＭＰＶ（株００−１）のゲノムの核酸配列を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
数種の実施形態の詳細な説明
一実施形態では、ウイルス配列をコードする１種または複数種の単離ポリヌクレオチド分子から、感染性の、自己複製する組換えＨＭＰＶを生成するための方法および組成物を提供する。一般に、この方法および組成物では、細胞または無細胞系で１種または複数種の発現ベクターを同時発現させ、そのベクターは、感染性ＨＭＰＶ粒子を生成するために、部分的なまたは完全な組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム、ならびにＨＭＰＶのＮ、Ｐ、およびＬタンパク質をコードする１種または複数種のポリヌクレオチド分子を含む。特定の実施形態では、組換えＨＭＰＶを産生させるための方法および組成物には、Ｍ２−１遺伝子の発現がさらに含まれる。
【００４７】
通常、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子はｃＤＮＡである。したがって、組換えＨＭＰＶをコードするｃＤＮＡやその均等物などのポリヌクレオチドを、本明細書において開示する。組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子を組み込む発現ベクターおよび構築物も、本明細書において開示する。
【００４８】
ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム、ならびにＮ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬタンパク質は、すべて単一の発現ベクターから作製することができる。しかし、ゲノムまたはアンチゲノムは、別個の発現ベクターによって作製することができ、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬタンパク質は、１つ、２つ、またはそれ以上のさらなる発現ベクターによって生成することができる。１つまたは複数のＮ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬタンパク質は、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムの発現によって供給することができる。これらのタンパク質は、同じまたは異なるＨＭＰＶによる同時感染によって供給することもできる。したがって、いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＮ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬタンパク質は、異種ＨＭＰＶ由来である。
【００４９】
前記の方法に従って生成された、感染性の組換え自己複製ウイルス粒子を開示する。この粒子には、完全なウイルス、ならびにウイルスタンパク質の１つまたは複数の必須でないタンパク質または必須でない部分（例えば、細胞質、膜貫通または細胞外ドメイン）を欠くウイルスが含まれる。１つまたは複数のこのような必須でない成分（例えば、ＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、Ｍ２−２のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または同等の付属ＯＲＦ由来の遺伝子またはゲノムセグメント、あるいは１つまたは複数の他のＯＲＦのセグメント、あるいは遺伝子間のまたは他の非コードまたは非必須ゲノム成分）を欠く、本開示のウイルスは、本明細書において不完全ウイルスまたは「サブウイルス（ｓｕｂｖｉｒａｌ）粒子」と呼ばれる。例示的なサブウイルス粒子は、遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質、タンパク質の機能ドメインなどを含めて、完全なウイルス（すなわち、完全なゲノムまたはアンチゲノム、ヌクレオキャプシドおよびエンベロープを含む構築されたウイルス粒子）に存在するどんな選択された構造成分をも欠如し得る。例えば、本開示のサブウイルス粒子は、ゲノムまたはアンチゲノムを含む感染性のヌクレオキャプシド、ならびにＮ、Ｐ、およびＬ遺伝子産物を含み得る。他のサブウイルス粒子は、他の必須でない構造成分の間にある必須でない遺伝子および／またはその産物の部分的なまたは完全な欠失あるいは置換によって生成する。
【００５０】
通常、本明細書で開示される方法によって生成される完全なウイルスおよびサブウイルス粒子は、ＨＭＰＶによる感染を受容する哺乳動物宿主で複数回複製することによって感染性および自己複製性を有する。この宿主には、当技術分野で広く知られ受け入れられている様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ哺乳動物細胞集団、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルが含まれ、これらにより、ヒト（マウス、ハムスター、コットンラット、アフリカミドリザルおよびチンパンジーを含めた非ヒト霊長類を含む）、ならびに血清陰性および血清陽性の乳児、小児、若年者、および成人を含むヒトにおけるＨＭＰＶ活性が合理的に予想される。しかし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの複製に高度に欠陥があるウイルスおよびサブウイルス粒子を生成することもできる。
【００５１】
一実施形態では、ポリヌクレオチド分子は、野生型ＨＭＰＶ（ゲノムまたはアンチゲノム）の配列をコードする。「野生型」という用語は、天然に存在する供給源から単離されたとき、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子とは、集団中で最も頻繁に観察され、したがって「正常」型または「野生型」の遺伝子と任意に称されるものである。他の実施形態では、ゲノムまたはアンチゲノムは、生物学的に誘導された変異ＨＭＰＶの１つまたは複数の突然変異、あるいは、組換えウイルスに所望の表現型上の効果が生じるように選択される１つまたは複数のポリヌクレオチド挿入、欠失、置換、または再構成を含めて、組換えによって導入された突然変異のどんな組合せをも含み得る。
【００５２】
したがって、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムは、本明細書で開示される方法を用いて作製して、操作するまたはマーキングする目的で、組換えによって導入する制限部位マーカー、または翻訳的にサイレントの点突然変異を組み込むように操作できる。他の実施形態では、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド分子に、組換えによって導入する１つまたは複数の弱毒化突然変異を組み込むことができる。具体的な例では、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムに、組換えによって導入する１つまたは複数の温度感受性（ｔｓ）または宿主域（ｈｒ）弱毒化（ａｔｔ）する突然変異を組み込む。
【００５３】
組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムに、生物学的に誘導された変異ＨＭＰＶ株で、または他の変異非セグメント型マイナス鎖ＲＮＡウイルスで同定された１つまたは複数の弱毒化する突然変異を組み込むことができる。例えば、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、ＳＨ、Ｆ、またはＧタンパク質、あるいは３’リーダーから選択される遺伝子外(extragenic)配列、あるいはＭ２のＧＳ配列などの制御シグナルにおける突然変異がある。その突然変異が１つまたは複数の特定のアミノ酸残基の変異である場合、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムに、その突然変異を特定するコドン内の複数のヌクレオチド変化を組み込んで、復帰変異に対してその改変を安定化することができる。
【００５４】
組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムは、増殖の特徴、弱毒化、温度感受性、低温適応性、プラークのサイズ、宿主域制限における変化や、免疫原性の変化など、表現型の変化を特定するさらなるヌクレオチド改変を含み得る。このさらなる改変により、１つまたは複数のＨＭＰＶのＮ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２−１、Ｍ２−２および／またはＬ遺伝子、ならびに／あるいは３’リーダー、５’トレイラー、ＧＳやＧＥ配列などのシス作用配列、および／または、ＨＰＭＶゲノムもしくはアンチゲノムの遺伝子間領域を変化させることができる。例えば、フレームシフト突然変異、翻訳開始部位を変化させる突然変異、遺伝子のＯＲＦにおける１つまたは複数の終止コドンの導入、あるいは転写シグナルにおける突然変異により、１つまたは複数のＨＭＰＶ遺伝子の全体または一部を欠失させることもでき、あるいは遺伝子の発現を低下または消失させることもできる。いくつかの実施形態では、ＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、もしくはＭ２−２遺伝子またはＯＲＦの部分的または完全欠失、あるいは生存可能な、複製能を有する感染性ウイルス構築物をやはり産する１つまたは複数のＨＭＰＶ遺伝子の発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド変化によって、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを改変する。他の実施形態では、サイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限部位マーカー、または哺乳動物宿主で防御免疫応答を引き出すことができる微生物病原体タンパク質など、非ＨＭＰＶ分子をコードするように組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを改変する。
【００５５】
組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムは、キメラＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを形成するために、１つまたは複数の異種病原体の１つまたは複数の抗原決定基をコードする１つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグメント（核酸配列）と連結している、一部のまたは完全なＨＭＰＶ「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムを含み得る。抗原決定基をコードする異種遺伝子またはゲノムセグメントは、過剰な遺伝子またはゲノムセグメントとして、一部のまたは完全なＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムの非コード領域に隣接させてまたはその領域内に付加することもでき、あるいは、一部のＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内の１つまたは複数の対応する遺伝子またはゲノムセグメントと置換することもできる。異種遺伝子またはゲノムセグメントは、１つまたは複数の異種コード配列、および／あるいは遺伝子以外の３’リーダーもしくは５’トレイラー領域、ＧＳシグナル、ＧＥシグナル、編集領域、翻訳開始部位、遺伝子間(intergenic)領域、または３’もしくは５’非コード領域を含む１つまたは複数の異種調節成分を含み得る。
【００５６】
さらなる実施形態では、異種病原体は、１つまたは複数の異種ニューモウイルス（例えば、異種ＨＭＰＶまたはＲＳＶ）であり、異種遺伝子またはゲノムセグメントは、１つまたは複数のＨＭＰＶまたはＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｍ、ＳＨ、Ｇ、Ｆ、Ｍ２−１、Ｍ２−２および／またはＬタンパク質あるいはその断片をコードする。したがって、抗原決定基は、異種ＨＭＰＶまたはＲＳＶのＧ、ＳＨおよびＦ糖タンパク質、ならびにその抗原ドメイン、断片およびエピトープ由来となる可能性があり、これらは、一部のまたは完全なＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内に付加されまたは置換されたものである。いくつかの例では、異種ＨＭＰＶまたはＲＳＶのＧ、ＳＨおよびＦ糖タンパク質をコードする遺伝子を、一部のＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内のＨＭＰＶの対応するＧ、ＳＨおよびＦ遺伝子と置換する。さらなる例では、異種ＨＭＰＶまたはＲＳＶのＧ、ＳＨおよびＦ糖タンパク質をコードする遺伝子を、ＨＭＰＶ配列に加えて発現させる。このようにする場合、複数の異種ニューモウイルスの抗原決定基をコードする複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントを、一部のまたは完全なＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内に付加するまたは組み込むことができる。他の実施形態では、ヒトにおいて宿主域制限を示すＡＰＶまたは関連ニューモウイルスに由来する１つまたは複数の遺伝子を使用して、ヒトでの対応する遺伝子を置換して、弱毒化誘導体および他の改良特性を実現する。
【００５７】
開示された組換えヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）を使用して、感染に感受性のある被験者に、１種または複数種のＨＭＰＶに対する、またはＨＭＰＶおよび１つまたは複数の非ＨＭＰＶ病原体に対する所望の免疫応答を発生させることができる。本明細書で開示される組換えＨＭＰＶは、感染した哺乳動物宿主に単特異性または多特異性の免疫応答を引き出すことができるが、免疫感作した宿主で許容されない疾患症状を引き起こさないよう十分に弱毒化されている。完全なウイルスおよびサブウイルス粒子を含めた弱毒化ウイルスは、細胞培養上清に存在していてもよいし、培養物から単離してもよいし、あるいは部分的にまたは完全に精製してもよい。ウイルスはまた、望まれる場合には、凍結乾燥させることもでき、貯蔵のためにまたは宿主への送達のために様々な他の成分と組み合わせることができる。
【００５８】
生理的に許容される担体および／またはアジュバントおよび単離された弱毒化組換えＨＭＰＶウイルスを含む免疫原性組成物も、本明細書において開示する。一実施形態では、免疫原性組成物は、弱毒化と免疫原性の適切な均衡を特定する、少なくとも１つの、少なくとも２つの、またはそれより多い弱毒化する突然変異または他のヌクレオチドの改変を有する組換えＨＭＰＶを含む。具体的な例では、免疫原性組成物は、弱毒化ウイルス１０３〜１０７ＰＦＵの投与量で製剤化することができる。免疫原性組成物は、単一のＨＭＰＶ株に対して、あるいは複数のＨＭＰＶ株もしくは血清型、またはＲＳＶおよび／もしくはＨＰＩＶなどの他の病原体に対して免疫応答を引き出す弱毒化する組換えＨＭＰＶを含み得る。これに関して、組換えＨＭＰＶは、製剤中で、他のＨＭＰＶ株と、または弱毒化生ＲＳＶなど他の候補ウイルスと組み合わせることができる。哺乳動物被験者の免疫系を刺激して、１種または複数種のＨＭＰＶに対する、またはＨＭＰＶおよび非ＨＭＰＶ病原体に対する免疫応答を引き出す方法も、本明細書において開示する。したがって、単一のＨＭＰＶに対して、複数種のＨＭＰＶに対して、あるいは、１種または複数種のＨＭＰＶ、およびＲＳＶなどの非ＨＭＰＶ病原体に対して免疫応答を誘導する方法を、本明細書において提供する。
【００５９】
開示された組換えＨＭＰＶを使用して、複数種のＨＰＭＶに対して、あるいは１種または複数種のＨＭＰＶ、および非ＨＭＰＶ病原体に対して、単特異性の免疫応答または多特異性の免疫応答を引き出すことができる。あるいは、１種のＨＭＰＶに対して、複数種のＨＭＰＶに対して、あるいは、１種または複数種のＨＭＰＶ、およびＲＳＶなどの非ＨＭＰＶ病原体に対して免疫応答を引き出すために、異なる免疫原的特徴を有する組換えＨＭＰＶを、混合物の状態で組み合わせることもでき、調整された治療プロトコルの中で別々に投与することもできる。一例では、上気道に、例えば、噴霧器、液滴(droplet)またはエアロゾルによって免疫原性組成物を投与する。
【００６０】
ウイルスの転写およびＲＮＡ複製を誘導するのに十分な、作動可能な１組のウイルスオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、本明細書において開示する。感染性ウイルスに、またはウイルスの配列をコードする単離ポリヌクレオチド分子の発現に基づいてウイルスの活性を決定する、この１組のＯＲＦを用いた診断アッセイを提供する。一例では、クラゲ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する組換えＨＭＰＶなど、検出可能なマーカーまたは標識を発現する感染性ＨＭＰＶ組換えウイルスを、本明細書において開示する。これらの手段または関連する手段は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＨＭＰＶ感染を決定し特徴付けるのに有効である。例示的な一実施形態では、検出可能な標識を発現する組換えＨＭＰＶを、生物学的試料（例えば、ＨＭＰＶに感染している恐れがある、または呼吸の症状を示している患者の血清）中でＨＭＰＶ中和抗体を検出するためのアッセイおよび関連組成物に利用することができる。さらなる実施形態では、検出可能な標識を発現する組換えＨＭＰＶを使用して、抗ウイルス活性について化合物をスクリーニングすることができる。
【００６１】
特記しない限り、技術用語は、通常の使用法に従って使用する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎら、Ｇｅｎｅｓ  ＶＩＩ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ発行、２０００（ＩＳＢＮ  ０１９８７９２７６Ｘ）；Ｋｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ発行、１９９４（ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）；およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．発行、１９９５（ＩＳＢＮ  ０４７１１８６３４１）；ならびに他の類似した参照文献に見ることができる。
【００６２】
本明細書で使用する「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形の語は、特に明らかに示される状況でない限り、複数の指示物を含む。同様に、「または（ｏｒ）」という語は、特に明らかに示される状況でない限り、「および（ａｎｄ）」を含むものとする。また、本明細書で使用する「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。したがって、「ＡまたはＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）ことを意味する。核酸またはポリヌクレオチドについて所与の塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および分子量または分子質量値がすべて近似値であり、説明のために提供したものであることをさらに理解されたい。本明細書に記載したものと類似したまたは同等の方法および物質を、本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および物質を下記に記載する。本明細書に挙げた刊行物、特許出願、特許、および他の参照文献はすべて、その全体が参照により組み込まれる。紛争の場合に、本明細書は、語句の説明を含めて、法的規制となるであろう。さらに、この物質、方法および例は、例示的なものに過ぎず、限定するものでないとする。
【００６３】
上記に記載のように、新規の組換えＨＭＰＶを生成し使用するための方法および組成物を本明細書において提供する。組換えＨＭＰＶは、ヒトおよび他の哺乳動物において感染性かつ免疫原性であり、１種または複数種のＨＭＰＶあるいは他のニューモウイルスに対して免疫応答を発生させる免疫原性組成物として有用である。したがって、組換えＨＭＰＶを使用して、例えば、ＲＳＶおよび／あるいは１種または複数種のＨＭＰＶあるいは他のニューモウイルスの株、血清型、または亜型に対して免疫応答を発生させることができる。選択したＨＭＰＶおよび１つまたは複数のさらなる病原体に対して、例えば複数種のＨＭＰＶに対して、またはＨＭＰＶ、およびＲＳＶやパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）などの非ＨＭＰＶウイルスに対して免疫応答を引き出すのに使用することができるキメラＨＭＰＶを本明細書において提供する。引き出された免疫応答には、体液性応答および／または細胞性応答のどちらかまたは両方が関与し得る。ＨＭＰＶを弱毒化して、弱毒化と免疫原性の所望の均衡を得ることができる。
【００６４】
ＨＭＰＶおよび他の病原体に対する所望の免疫応答を引き出す作用因子として有用な弱毒化ＨＭＰＶを設計し作製する方法を、本明細書において提供する。したがって、本明細書で開示される方法を用いて、確定されたゲノム配列および予想可能な特徴を有する組換えＨＭＰＶを作製することができる。
【００６５】
例示的な組換えＨＭＰＶ（ｒＨＭＰＶ）は、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを含み、ＨＭＰＶの主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、および大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）（図１、および図３７で提供する例示的な配列情報を参照）をコードする（またはコードするもののアンチセンスを含む）。さらなる実施形態では、ｒＨＭＰＶは、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム、Ｎ、Ｐ、およびＬタンパク質、ならびにＨＭＰＶのＭ２−１タンパク質を組み込むことができる。さらなる実施形態では、１つまたは複数のＮ、Ｐ、Ｌ、および／またはＭ２−１タンパク質は変異タンパク質または部分タンパク質であってもよいし、あるいは、対応する同種タンパク質または異種ＨＭＰＶもしくはＡＰＶなどの非ＨＭＰＶウイルスのタンパク質断片を含んでいてもよい。１つまたは複数のさらなるＨＭＰＶタンパク質は、様々な組合せで組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムと同時に発現して、一連の感染性ウイルスをもたらすことができる。本明細書で使用する「組換えＨＭＰＶ」または「ｒＨＭＰＶ」という用語は、１つまたは複数の必須でないウイルス成分を欠く組換えによって生成されたサブウイルス粒子、天然のウイルス成分をすべて有する完全ウイルス、過剰なタンパク質、抗原決定基または他のさらなる成分を含むウイルスを含む。組換えウイルスは、主にクローン化ｃＤＮＡから生成される。
【００６６】
下記の実施例に示すように、例示的な野生型株のＨＭＰＶのゲノムＲＮＡについて完全な共通配列を決定した。このように同定された配列を使用して、全長のアンチゲノムｃＤＮＡを作製し、野生型のｒＨＭＰＶを回収した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのｒＨＭＰＶの生物学的な特性から、その例示的なｒＨＭＰＶ配列が野生型ウイルスに相当することが実証される。この重要な知見から、本明細書で開示される組換えＨＭＰＶ配列が真の野生型ウイルスのものであることが実証される。このｒＨＭＰＶは、弱毒化生ＨＭＰＶ、およびＨＭＰＶを基礎とするキメラ、および免疫原性組成物に使用することができるベクターの生成のための、組換えによる弱毒化突然変異導入の新規の土台として役立つ。
【００６７】
本明細書で開示されるように、感染性組換えＨＭＰＶは、組換えによる同時発現系によって作製することができ、この系は、確定された変化を組換えＨＭＰＶ中に導入することを可能にし、高い頻度および忠実度で、確定されたゲノム配列を有するＨＭＰＶの生成をもたらす。これらの改変は、所定の確定された弱毒化突然変異を有する弱毒化生ウイルス株の開発を含めた多種多様な適用の際に有用である。感染性ＨＭＰＶは、細胞内でまたは無細胞で、転写し複製するヌクレオキャプシドを発生させるウイルスタンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドと一緒に、ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡをコードする１つまたは複数の単離ポリヌクレオチド分子を同時に発現させることによって生成することができる。「感染性ウイルス」とは、そのゲノムを宿主細胞の細胞質に送達する能力を有するウイルス粒子である。
【００６８】
ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡは、細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで、選択したウイルスタンパク質と同時発現させて感染性ＨＭＰＶを形成するように構築する。「ＨＭＰＶアンチゲノム」とは、単離されたプラスのセンス鎖ポリヌクレオチド分子であり、後代のＨＭＰＶゲノムの合成用の鋳型として役立つ。一実施形態では、複製中間体ＲＮＡ、またはアンチゲノムに相当するプラスのセンス型のＨＭＰＶゲノムであるｃＤＮＡを構築する。これにより、プラスのセンス鎖転写物が、転写し複製するヌクレオキャプシドを発生させるのに必要なタンパク質をコードする相補配列とハイブリダイズする可能性が最小となる。「複製能を有するウイルス」とは、ウイルスの後代を生み出す感染を惹起することができるウイルス粒子である。
【００６９】
ある実施形態では、組換えＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムは、それにコードされているウイルスまたはサブウイルス粒子を感染性とするのに必要なその遺伝子またはその一部しか含まない。さらに、その遺伝子またはその一部は、複数のポリヌクレオチド分子によってもたらされる可能性があり、すなわち、遺伝子は、別々のヌクレオチド分子に由来する相補性などによってもたらされる可能性がある。他の実施形態では、ＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムは、ウイルスの増殖、複製、および感染に必要なすべての機能をコードし、ヘルパーウイルス、あるいはプラスミドまたはヘルパー細胞系統によってもたらされるウイルス機能の関与は必要ない。
【００７０】
「組換えＨＭＰＶ粒子」とは、組換え発現系に直接的にまたは間接的に由来するか、あるいはそれから生成されたウイルスまたはサブウイルス粒子から増殖したＨＭＰＶまたはＨＭＰＶ様のウイルスまたはサブウイルス粒子である。組換え発現系は、組換え発現ベクターを使用することができ、そのベクターは、少なくとも、遺伝子成分またはＨＭＰＶ遺伝子発現の際に調節の役割を有する成分、例えばプロモーターと、ＨＭＰＶ  ＲＮＡへと転写される構造配列またはコード配列と、適当な転写開始および終止配列との集合体を含む、機能しうる形で連結した転写単位を含む。第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的に関係するように配置されているとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「機能しうる形で連結」している。
【００７１】
ｃＤＮＡによって発現されたＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムから感染性ＨＭＰＶを生成するために、ＲＮＡ複製を可能とするヌクレオキャプシドを生成するのに必要であり、後代のヌクレオキャプシドにＲＮＡの複製能と転写能をどちらも付与する、そのＨＭＰＶまたは異種ウイルスのタンパク質とともに、ゲノムまたはアンチゲノムを同時発現させる。そのゲノムヌクレオキャプシドによる転写から、他のＨＭＰＶタンパク質がもたらされ、増殖性感染が惹起される。あるいは、増殖性感染に有用なさらなるＨＭＰＶタンパク質を、同時発現により供給することもできる。
【００７２】
特定の実施形態では、転写し複製するＨＭＰＶヌクレオキャプシドを生成するのに必要なタンパク質をコードする相補配列が、１つまたは複数のヘルパーウイルスによってもたらされる。そのようなヘルパーウイルスは、野生型である可能性もあり、あるいは変異型である可能性もある。一実施形態では、ヘルパーウイルスは、ＨＭＰＶ  ｃＤＮＡによってコードされるウイルスと表現型上区別することができる。例えば、ヘルパーウイルスと免疫学的に反応するが、ＨＭＰＶ  ｃＤＮＡによってコードされるウイルスと反応しないモノクローナル抗体を提供することが望ましい可能性がある。そのような抗体は、中和抗体である可能性がある。ある実施形態では、その抗体をアフィニティークロマトグラフィーに使用して、組換えウイルスからヘルパーウイルスを分離することができる。そのような抗体を得る助けとするために、変異をＨＭＰＶ  ｃＤＮＡ中に導入して、ＨＭＰＶ糖タンパク質遺伝子中でなど、ヘルパーウイルスから抗原多様性をもたらすことができる。
【００７３】
例えば、選択したプロモーター（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター）の制御下にある各ｃＤＮＡにより、トランスフェクトしたプラスミドからのＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム、およびタンパク質の発現を実現することができ、そのｃＤＮＡは、適切な発現系（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼでは、Ｗｙａｔｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１０：２０２〜２０５、１９９５に記載のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニア（vaccinia）ウイルスＭＶＡ組換え株など）を用いた感染、トランスフェクションまたは形質導入によって供給される。ウイルスタンパク質、および／またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼはまた、形質転換哺乳動物細胞（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１〜２５９、１９９９を参照）によって供給することもでき、あるいは、予め形成したｍＲＮＡまたはタンパク質のトランスフェクションによって供給することもできる。
【００７４】
使用するＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムは、例えば、クローン化ｃＤＮＡセグメントをアセンブリして完全ゲノムまたはアンチゲノムの集合体とすることによって、あるいはＨＭＰＶ  ｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡの逆転写コピーのＰＣＲなど（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：A Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９０に記載のもの）によって構築することができる。例えば、適当なプロモーター（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター）からアンチゲノムの左側末端を含むｃＤＮＡを含む最初の構築物を作製し、それを、プラスミド、コスミド、ファージまたはＤＮＡウイルスベクターなど適当な発現ベクター中に構築することができる。突然変異誘発、および／またはアセンブリを促進するように設計された独特の制限部位を含む合成ポリリンカーの挿入によってベクターを改変することができる。調製を容易にするために、Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＨＭＰＶタンパク質を１つまたは複数の別個のベクター中に構築することができる。アンチゲノムプラスミドの右側末端は、隣接するリボザイムや、単一のまたは直列のＴ７転写終止配列など、所望されるさらなる配列を含む可能性がある。リボザイムは、単一の非ウイルス性ヌクレオチドを含む３’末端をもたらすハンマーヘッド型のものでもよく、あるいは、非ＰＩＶヌクレオチドがない３’末端をもたらす肝炎δウイルスのリボザイム（Ｐｅｒｒｏｔｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：４３４〜４３６、１９９１）など、他のどんな適切なリボザイムでもよい。
【００７５】
ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡを構築する代替の手段には、サブユニットｃＤＮＡ成分の数を１個または２個に減らす（例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５６９５〜５６９９、１９９４に記載の）様々なＰＣＲ条件を用いたＲＴ−ＰＣＲがある。他の実施形態では、様々なプロモーター（例えば、Ｔ３、ＳＰＱまたはハンマーヘッド型など様々なリボザイム）を使用することができる。様々なＤＮＡベクター（例えば、コスミド）を、よりサイズが大きいゲノムまたはアンチゲノムをよりよく収容するために、増殖に使用することができる。
【００７６】
ＨＭＰＶの「感染性クローン」、または「感染性ｃＤＮＡ」とは、感染性ウイルス粒子中に直接組み込むことができ、感染性ＨＭＰＶウイルスまたはサブウイルス粒子のゲノムを生成する鋳型として役立ち得るゲノムまたはアンチゲノムＨＭＰＶ  ＲＮＡへと転写されることができる、合成またはその他のｃＤＮＡまたはその産物、ならびにＲＮＡを意味する。上記に示したように、様々な従来技術（例えば、部位特異的突然変異誘発）によって、感染性ＨＭＰＶクローン中へと、ゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピー中へと確定された変異を導入することができる。本明細書に記載のように、完全なゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡを構築するためにゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡ細断片を使用することは、小さなｃＤＮＡ構築物が大きなｃＤＮＡ構築物より操作しやすく、次いで構築して完全なｃＤＮＡにすることが容易である場合、各領域を別々に操作できるという利点がある。
【００７７】
ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離ポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ）を、トランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入などにより、増殖性のＨＭＰＶ感染を支持することができる細胞中に導入することができる。使用する例示的な細胞は、ＨＥｐ−２、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＲＣ−５、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）、およびＶｅｒｏ細胞である。例えば、リン酸カルシウムが媒介するトランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １４：７２５、１９７８；Ｃｏｒｓａｒｏら、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３、１９８１；Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６、１９７３）、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１〜８４５、１９８２）、ＤＥＡＥ−デキストランが媒介するトランスフェクション（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ＮＹ、１９８７）、陽イオン脂質が媒介するトランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎら、Ｆｏｃｕｓ  １５：７３〜７９、１９９３）または市販されているトランスフェクション用試薬、例えばリポフェクタミンＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）などによって単離ポリヌクレオチド配列を培養細胞中に導入することができる。
【００７８】
ＨＭＰＶの感染性クローンを供給することにより、ＨＭＰＶゲノム（またはアンチゲノム）内に、組換えによる広範囲の改変をもたらすことができ、所望の表現型変化を特定する規定された突然変異が生じる。組換えＨＭＰＶを生成するための、本発明で開示される組成物および方法は、例えば、選択したＨＭＰＶタンパク質の機能または発現を変化させる確定された突然変異を用いた、ＨＭＰＶの分子生物学および病原性の機構の詳細な分析および操作の準備を可能にする。これらの方法および組成物を用いて、サイレントの偶発的な突然変異と、所望の表現型変化の原因である突然変異を容易に区別し、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中に組み込まれたものについて、表現型特異的な突然変異を選択することができる。この際、ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中で、ｃＤＮＡの構築中または構築後に、ヌクレオチドの様々な挿入、欠失、置換、および再構成を行うことができる。例えば、都合のよい制限酵素部位を用いて、特定の所望のヌクレオチド配列を合成し、ｃＤＮＡ中の適当な領域に挿入することができる。あるいは、部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング（ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）突然変異誘発、ＰＣＲによる突然変異誘発のような技術、または当技術分野で周知の他のそのような技術を使用して、ｃＤＮＡ中に突然変異を導入することができる。
【００７９】
組換えによるＨＭＰＶの改変により、改良型の候補ウイルスの生成を誘導して、例えば、ウイルスの弱毒化および免疫原性の促進、望ましくない免疫病理と関係があるエピトープの除去、抗原連続変異への適応などを行うことができる。これらのおよび他の目的を達成するために、本明細書で開示される組成物および方法は、多種多様な改変をＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中に導入して、感染性の組換えＨＭＰＶに組み込むことを可能にする。例えば、抗原決定基（例えば、防御抗原または免疫原性エピトープ）をコードする外来遺伝子または遺伝子セグメントをＨＭＰＶクローン内に付加して、ＨＭＰＶに対しても、その抗原決定基が由来する他のウイルスまたは病原性作用因子に対しても免疫誘導能がある組換えＨＭＰＶを得ることができる。あるいは、サイトカインなど免疫系の調節因子をコードする外来遺伝子全体をまたは一部を挿入して、候補ウイルスの免疫原性を高めることもできる。ＨＭＰＶクローン内に含まれ得る他の突然変異は、例えば、異種遺伝子または遺伝子セグメント（例えば、糖タンパク質遺伝子の細胞質側の尾部をコードする遺伝子セグメント）の、ＨＭＰＶクローンにおける同等の遺伝子または遺伝子セグメントとの置換である。あるいは、ＨＭＰＶクローン内の遺伝子の相対的な順番を変化させることもでき、ＨＭＰＶゲノムのプロモーターまたは他の調節成分をアンチゲノムでのその対応物と置換することもでき、あるいは、（例えば、遺伝子の発現を妨げる終止コドンの導入が関与する機能消失によって）選択したＨＭＰＶ遺伝子を非機能的にすることもできる。さらに、主要な防御抗原をコードするような遺伝子のコドン選択を改変して、翻訳の効率を向上させることができる。ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムの様々な非コード領域またはコード領域における独特の制限部位の挿入など、ＨＭＰＶクローンにおける他の改変によって、操作を容易にすることができる。さらに、非翻訳遺伝子配列または遺伝子間領域を短くし、または除去して、外来配列を挿入する能力を増大させることができる。
【００８０】
上記に示したように、ウイルスを弱毒化し、ウイルスの毒性に影響を及ぼし、またはその他の形で組換えウイルスの表現型を変化させるさらなる突然変異を導入することにより、使用する組換えＨＭＰＶの表現型を調整するのが望ましいことが多い。当業者なら、ＨＭＰＶに突然変異を生成し、それを単離し特徴付けて、弱毒化突然変異株（例えば、温度感受性（ｔｓ）、低温継代型（ｃｐ）、低温適応型（ｃａ）、小プラーク型（ｓｐ）、宿主域制限型（ｈｒ）突然変異株）を得、弱毒化の表現型を特定する遺伝子変化を同定する方法および手順を容易に認識することができる（例えば、Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７；１９９８年５月２２日出願の米国特許出願第０９／０８３，７９３号；１９９９年１２月１０日出願の米国特許出願第０９／４５８，８１３号；１９９９年１２月１０日出願の米国特許出願第０９／４５９，０６２号；１９９７年５月２３日出願の米国仮出願第６０／０４７，５７５号（国際公開ＷＯ９８／５３０７８号に該当）、および１９９７年９月１９日出願の米国仮出願第６０／０５９，３８５号を参照）。したがって、ハムスターまたはげっ歯類および非ヒト霊長類モデル系を含むヒトの活性と合理的に相関する受容モデル系において、生物学的に誘導され、組換えにより生成された弱毒化ＨＭＰＶの複製、免疫原性、遺伝的安定性および免疫原的効力について決定する方法を本明細書で提供する。
【００８１】
さらなる実施形態では、弱毒化または他の所望の表現型をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸の点突然変異の導入によってｒＨＭＰＶ候補を構築する。このような突然変異では、所与の座位で１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を置換することを含み得るか、所与の座位で１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を小さく欠失させることを含み得る。これらの変異は、本明細書において「点突然変異」と称され、特定の各変異が限局性であることを示す。例えば、典型的な突然変異では、対応するコドン中の１、２または３ヌクレオチドを置換することによって単一のアミノ酸を変化させることができる。他の例として、３ヌクレオチドを一緒に欠失させることにより、コードされたタンパク質中の単一のアミノ酸を欠失させることができる。点突然変異は、１つまたは複数のＨＭＰＶタンパク質中の荷電アミノ酸を非荷電のものに体系的に置換する、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシンまたはアルギニンをアラニンに置換することなどによって経験的に同定することができる。
【００８２】
あるいは、弱毒化を起こすアミノ酸の置換および他の突然変異は、存在するモノネガウイルスの突然変異、例えば、異なる「生物学的に誘導された」ＨＭＰＶ、ＡＰＶなどの非ヒトニューモウイルス、またはＲＳＶやＰＩＶなどの非ＨＭＰＶウイルスにおける突然変異を指針として使用して考案することができる。「生物学的に誘導された」とは、組換えＤＮＡ法によって生成されていないどんなウイルスをも意味する。したがって、生物学的に誘導されたＨＭＰＶには、例えば、野生型ゲノム配列を有する天然に存在するＨＭＰＶ、基準の野生型ＨＭＰＶ配列と比べて対立遺伝子または変異ゲノム異型を有するＨＭＰＶ、例えば弱毒化の表現型を特定する変異を有するＨＭＰＶを含む、天然に存在するすべてのＨＭＰＶが含まれる。同様に、生物学的に誘導されたＨＭＰＶには、とりわけ、直接の組換えＤＮＡ操作を使用しない人工的な突然変異誘発および選択の手順による親のＨＭＰＶに由来するＨＭＰＶ変異体が含まれる。組換えＨＭＰＶ内に組み込まれる、生物学的に誘導されたＨＭＰＶおよび他の非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスにおける弱毒化突然変異は、天然に存在する可能性もあり、あるいは、それを野生型ＨＭＰＶ株中に導入し、その後周知の突然変異誘発および分析の手順で同定し特徴付けることができる。例えば、化学的突然変異原を添加する、細胞培養中にウイルスが増殖する間の化学的な突然変異誘発を行うことにより、増殖が制限される変異を導入するために、準最適温度で継代されているウイルスを選択することにより、または、細胞培養中に小プラーク（ｓｐ）を生成する突然変異したウイルスを選択することにより、不完全な弱毒化親ＨＭＰＶまたは他の異種ウイルス突然変異株を生成することができる。さらに、組換えによる方法で作製された、存在するモノネガウイルスにおける既知の突然変異も、ＨＭＰＶにおける所望の突然変異を考案する指針として役立ち得る。異種ウイルスにおけるそのような既知の突然変異は、特異的突然変異誘発によって意図的に導入されたものである可能性もあり、あるいは、ＤＮＡを操作し、ウイルスを回収し増殖させるプロセスの間に自然に生じたものである可能性もあり、あるいは、組換えの後に変異原にさらされ、生物学的に誘導されたウイルスで突然変異を発生させる上記に記載のような表現型の変化を促進するように設計された形で継代された、組換えにより誘導されたウイルスで生じたものである可能性もある。
【００８３】
特定の実施形態では、ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを組換えにより改変して、異種の変異型の非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスで同定された弱毒化突然変異のアミノ酸の位置に対応するアミノ酸の位置に弱毒化突然変異を組み込む。そのウイルスは、生物学的に誘導されたものである可能性もあり、組換えに由来するものである可能性もある。通常の配列のアライメントおよび他の分析に基づいて、組換えＨＭＰＶ中に「移入」（すなわち、アライメントによって同定された相同なまたは対応する位置での、置換、欠失または挿入を潜在的に含む、同一の保存的または非保存的突然変異の導入）するために、異種ＨＭＰＶまたは非ＨＭＰＶウイルスで以前に同定された突然変異をＨＭＰＶでの対応する位置に位置付けされる。多くの場合、特にアミノ酸同一性の百分率が十分である（例えば、同一性が約３５〜４０％以上である）または高い（例えば、同一性が少なくとも約８０％、９０％、９５％や９９％など、７０％以上である）場合、対象とする２つの配列のアライメントによって、ＨＭＰＶでの対応する残基が十分に同定される。他の場合、特にアミノ酸の関連性が十分でない（例えば、同一性が約３５％未満である）とき、対応する位置を同定するためのマーカーとして役立つ、保存されている残基を確実に獲得し同定するために、アライメント中にさらなる異種の関連ウイルスを含むことができる。一実施形態では、「十分である」または「高い」または「高くない」という用語に関係する配列同一性の百分率は、本明細書で使用する異種ウイルスを異なる血清型または分類の群と比較する状況で使用する。
【００８４】
このような候補の突然変異を広く集めたものは、本開示のｒＨＭＰＶへの移入に使用可能である（例えば、Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ７２：１７６２〜１７６８、１９９８；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４〜１３８１、１９９９；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６０：１２５〜３５、１９９９；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６１：３１９〜３０、１９９９；Ｎｅｗｍａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２４：７７〜９２、２００２；Ｆｅｌｌｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６：１９０〜２０１、２０００；１９９８年５月２２日出願の米国特許出願第０９／０８３，７９３号；１９９９年１２月１０日出願の米国特許出願第０９／４５８，８１３号；１９９９年１２月１０日出願の米国特許出願第０９／４５９，０６２号；１９９７年５月２３日出願の米国仮出願第６０／０４７，５７５号（国際公開ＷＯ９８／５３０７８号に該当）；１９９７年９月１９日出願の米国仮出願第６０／０５９，３８５号；２００１年１１月２１日出願の米国仮出願第６０／３３１，９６１号の優先権を主張する、２００２年１１月２１日出願の米国特許出願第１０／３０２，５４７号；および２００２年９月１８日出願の米国仮出願第６０／４１２，０５３号を参照）。
【００８５】
これらの実施形態の中では、異種の変異ウイルス中で同定された変化と保存的に対応する突然変異の対象部位における変化をコードするように、受容側の組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを改変することが所望されることが多い。例えば、対応する野生型の配列と比べるとアミノ酸の置換が変異ウイルス中の突然変異部位の印となる場合、組換えＨＭＰＶでの対応する残基で類似した置換を行うことができる。一例では、置換により、変異ウイルスタンパク質中に存在する置換された残基と同一のまたは保存されているアミノ酸が特定される（下記の保存的な置換についての記載を参照）。しかし、（例えば、野生型の残基の機能を乱すまたは障害する他の任意のアミノ酸を用いることにより）変異タンパク質中の置換された残基に関して非保存的に、変異部位で元のアミノ酸残基を変化させることも可能である。例示的な突然変異が同定され、本開示の組換えＨＭＰＶ中にそれが移入されているマイナス鎖ＲＮＡウイルスには、特に、ＨＭＰＶの異種の株、他の非ＨＭＰＶニューモウイルス（例えば、ヒトＲＳＶ、ウシＲＳＶ、ＡＰＶ、マウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ））、ＰＩＶ（例えば、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＢＰＩＶ３、およびＭＰＩＶ１）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、シミアンウイルス（simian virus）５（ＳＶ５）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルス（canine distemper virus）（ＣＤＶ）、狂犬病ウイルス（ＲａＶ）、ならびに水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）がある。
【００８６】
図２６Ａ〜２６Ｆに示すように、異種ウイルスにおいて所望の表現型変化を特定する１つまたは複数の対応する突然変異部位は、（例えば、指定の位置で示唆されている野生型の残基が、例えば置換によって変化するとき）従来の配列とのアライメントをとることによって同定される。ＨＭＰＶでの対応する変異の標的部位（例えば、図２６Ａ〜２６Ｆにおける囲み部位を参照）は、組換えＨＭＰＶ中に変異を移入して、弱毒化または他の目的とする表現型変化を起こすために、それによって位置付けられる。より具体的には、比較する異種の変異体とＨＭＰＶ配列の間で一致するアミノ酸が、（例えば、ＨＭＰＶアンチゲノムｃＤＮＡの部位特異的突然変異作製を含む組換え工学技術による）組換えＨＭＰＶ中への対象突然変異の同一のまたは保存的な移入の標的部位となる。ある実施形態では、マイナス一本鎖ＲＮＡウイルス中で同定された弱毒化および他の所望の突然変異はそれによって標的とされ、本開示の組換えＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノム内の対応する位置へと移入される（例えば、置換による突然変異誘発によって、同一にまたは保存的に複製される）。他の組換え変異ＲＮＡウイルスの合理的な設計についての関連する方法が、例えば、２０００年１０月１９日にＷＯ００／６１７３７号として公開され、２００２年１月８日出願の米国内段階の出願第０９／９５８，２９２号に該当し、１９９９年４月１３日出願の米国特許仮出願第６０／１２９，００６号の優先権を主張する、２０００年４月１２日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／０９６９５号に記載されている。本開示のこの態様に関係するさらなる記載が、Ｎｅｗｍａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２４：７７〜９２、２００２；Ｆｅｌｌｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０；２７６：１９０〜２０１、２０００；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６０：１２５〜３５、１９９９；およびＤｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６１：３１９〜３０、１９９９にある。
【００８７】
例示的な一実施形態では、ＨＭＰＶのＬ遺伝子と、Ｌタンパク質中で弱毒化を起こす置換が１つまたは複数同定されている他のモノネガウイルスのＬ遺伝子との間でアミノ酸配列のアラインメントをとる。本開示のこの実施形態を図２６Ａ〜２６Ｆに示し、これらの図は、ＨＭＰＶの推定されるＬタンパク質の様々なセグメントの、弱毒化突然変異が位置付けられている多数の他のモノネガウイルスＬタンパク質の対応するセグメントとの配列アライメントを示す。図２６Ａ〜２６Ｆに例示するように、異種のマイナス鎖ＲＮＡウイルスのＬ遺伝子中で同定された様々な突然変異を組換えＨＭＰＶ中に組み込んで、弱毒化または他の所望の表現型変化を生じさせることができる。これらの図は、ＨＭＰＶ野生型ウイルスと示されているウイルス（例として、異なるＨＭＰＶ、ＲＳＶ、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、およびＢＰＩＶ３を含む）の間の例示的な一部のＬ遺伝子配列のアライメントを提供するものである。弱毒化突然変異の例には、生物学的な由来のまたは組換え由来のウイルス中で同定されたものが含まれる。このアライメントを使用して、異種ウイルスにおける既知の弱毒化突然変異を含む領域を同定する。
【００８８】
図２６Ａ〜２６Ｆは、ｒＨＭＰＶ中に移入する、Ｌ遺伝子における様々な例示的弱毒化突然変異の同定および地図作製を示すものである（左側の数値が、示している部分配列における最初の残基の位置基準数値を示し、右側の数値が部分配列における末端の残基の位置基準数値を示していることに留意されたい）。図２６Ａに、ＲＳＶ低温継代型温度感受性（ｃｐｔｓ）変異体ｃｐｔｓ５３０のＬ遺伝子における変異によって特定される、Ｌタンパク質におけるフェニルアラニン５２１のロイシンへの（Ｆ５２１Ｌ）置換を示す（Ｊｕｈａｓｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５８１４〜９、１９９９）。アルギニン５８８−アラニン（Ｒ５８８Ａ）およびアスパラギン酸５８９−アラニン（Ｄ５８９Ａ）の、弱毒化を起こす二重突然変異も示すが、これはＲＳＶで最初に生じたものである（Ｔａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０２：２０７〜１６、２００２）。図２６Ｂに、ＰＩＶ３  ｃｐ４５ワクチン候補中で同定された、弱毒化を起こすチロシン９４２−ヒスチジン（Ｙ９４２Ｈ）およびロイシン９９２−チロシン（Ｌ９９２Ｙ）突然変異の位置を示す（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３１７６２〜８、１９９８；２００１年１１月２１日出願の米国仮出願第６０／３３１，９６１号の優先権を主張する、２００２年１１月２１日出願の米国特許出願第１０／３０２，５４７号；および２００２年９月１８日出願の米国仮出願第６０／４１２，０５３号）。図２６Ｃに、ＢＰＩＶ３中で最初に同定された、弱毒化を起こすイソロイシン１１０３−バリン（Ｉ１１０３Ｖ）突然変異（Ｈａｌｌｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８８：３４２〜５０、２００１）、ＰＩＶ３  ｃｐ４５中で同定された、弱毒化を起こすスレオニン１５５８−イソロイシン（Ｔ１５５８Ｉ）突然変異（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３１７６２〜８、１９９８）、および弱毒化ｃｐＲＳＶワクチン候補で同定されたシステイン３１９−チロシン（Ｃ３１９Ｙ）突然変異（Ｃｏｎｎｏｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８：４７８〜８４、１９９５）の位置を示す。図２６Ｄに、ｃｐｔｓ２４８  ＲＳＶ中で同定された、弱毒化を起こすグルタミン８３１−ロイシン（Ｑ８３１Ｌ）突然変異（Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２５：４１９〜２２、１９９６）、ＲＳＶ変異体ｃｐｔｓ５３０／１０９中で同定された、弱毒化を起こすメチオニン１１６９−バリン（Ｍ１１６９Ｖ）突然変異（Ｊｕｈａｓｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５１７６〜８０）、ＲＳＶ変異体ｃｐｔｓ２４８／４０４中で同定されたアスパラギン酸１１８３−グルタミン酸（Ｄ１１８３Ｅ）突然変異（Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２５：４１９〜２２、１９９６）、および組換えＲＳＶで特徴付けられた、弱毒化を起こすＣ９クラスターを構成する６種の点突然変異の組合せ：アスパラギン酸１１８７−アラニン（Ｄ１１８７Ａ）、リシン１１８８−アラニン（Ｋ１１８８Ａ）、アルギニン１１８９−アラニン（Ｒ１１８９Ａ）、グルタミン酸１１９０−アラニン（Ｅ１１９０Ａ）、グルタミン酸１２０８−アラニン（Ｒ１２０８Ａ）、およびアルギニン１２０９−アラニン（Ｒ１２０９Ａ）の位置を示す。図２６��に、ＲＳＶ  ｃｐｔｓ５３０／１０３０の、弱毒化を起こすチロシン１３２１−アスパラギン（Ｙ１３２１Ｎ）突然変異（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８７１〜７、１９９９）、および弱毒化ｃｐＲＳＶ誘導体のヒスチジン１６９０−チロシン（Ｈ１６９０Ｙ）突然変異（Ｃｏｎｎｏｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８、４７８〜８４、１９９５）の位置を示す。図２６Ｆに、ｃｐｔｓＲＳＶ変異体２４８／９５５中で同定された、弱毒化を起こすアスパラギン４３−イソロイシン（Ｎ４３Ｉ）突然変異、およびＬ遺伝子をＢＰＩＶ３のもので置換されたＨＰＩＶ３からなるキメラウイルスｒＨＰＩＶ３−ＬＢ中で特徴付けられた、弱毒化を起こすスレオニン１７１１−イソロイシン（Ｔ１７１１Ｉ）突然変異の位置を示す（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：１１４１〜８、２００３）。
【００８９】
前記のアライメントは、例えば、ＲＳＶ配列中のＦ５２１残基が、調べた大部分の他のモノネガウイルスの間で（パラミキソウイルス２４種のうち２３種で、ラブドウイルス３種のうち１種で）正確に保存され、特に、ＨＭＰＶ中に存在することを示すものである。対応する残基のアミノ酸の位置が、各Ｌタンパク質で同じでなく、様々な個々の分子における長さ、ならびに他の位置にある短い欠失および挿入の違いが反映されることに留意されたい。したがって、対応する残基は、ＨＭＰＶではＦ４５６である。比較によるこの地図作製分析から、ＨＭＰＶでのＦ４５６残基が、同一の、保存的な、またはさらに非保存的なアミノ酸置換（例えば、ロイシンによる、あるいはロイシンと比べて保存的なまたは非保存的なアミノ酸によるＦ４５６残基の置換）の標的として同定される。同じアライメント（図２６Ａ）から、Ｄ５８９の割りつけも各配列で正確に保存されていることが示される。Ｒ５８８の割りつけは、それぞれで保存されていないが、ＨＭＰＶでリシンが一致して割りつけられていることによって示されている。ＰＩＶ３  ｃｐ４５の、弱毒化を起こすチロシン９４２−ヒスチジン（Ｙ９４２Ｈ）およびロイシン９９２−チロシン（Ｌ９９２Ｙ）突然変異に関して、どちらの場合でも正確なアミノ酸の割りつけは保存されていないが、その割りつけ全体にわたって種々の高度に保存された残基が存在することから、これらの位置が対応していることが示される（図２６Ｂ）。この場面での位置の対応は、アライメントをとった対応する突然変異標的部位から（そこを占めるアミノ酸が、野生型（例えば、弱毒化していない親株）での対応する残基と比べて、構造上の特徴において同一であれ、保存的であれ、または相違的であれ）、ＨＭＰＶ野生型配列から異なる残基まで（すなわち、残基の同一性が、異種の変異体での対応する残基と比べて、構造上同じであり、保存的であり、または異なるものまで）に突然変異を生成した後のｒＨＭＰＶにおいて弱毒化または他の所望の表現型がしばしば生じることを示唆するものである。
【００９０】
前記のＬ遺伝子突然変異に加えて、組換えＲＳＶのＰタンパク質で報告された２種の温度感受性（ｔｓ）突然変異、すなわちグリシン１７２−セリンおよびグルタミン酸１７６−グリシン（Ｌｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２８７１〜８０、２００２）を移入して、対応するＨＭＰＶの残基であるそれぞれグリシン２１３およびグルタミン酸２１７の一方または両方を変化させることにより、ｒＨＭＰＶのＰに、予測された弱毒化の表現型を生じさせることができる。同様に、バリン２６７−イソロイシンの置換を特定する、弱毒化誘導体ｃｐＲＳＶのＮタンパク質における突然変異（Ｃｏｎｎｏｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８：４７８〜８４、１９９６）は、ＨＭＰＶではセリン２６８に位置し、ｒＨＭＰＶにおける、Ｉｌｅまたは他による、この残基の保存的なまたは非保存的な置換によって、さらなる弱毒化誘導体を同定するのに有用な候補を得ることができる。同様な形で、ｃｐＲＳＶのＦタンパク質における２種の突然変異、すなわちグルタミン酸２１８−アラニンおよびスレオニン５２３−イソロイシン（Ｃｏｎｎｏｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８：４７８〜８４、１９９６）は、ＨＭＰＶのＦタンパク質ではそれぞれリシン１８８およびスレオニン４８９に対応し、したがってこれがｒＨＭＰＶにおける弱毒化を起こすアミノ酸の置換を導入する標的部位となる。
【００９１】
他の実施形態では、シス作用性の調節配列または他の非コード配列における突然変異を異種ウイルス（生物学的にまたは他の形で誘導された、変異ＨＭＰＶの同じまたは異なる株、亜型、種、ＲＳＶ、ＰＩＶ、ＡＰＶなど）で同定し、本開示のｒＨＭＰＶ中にそれを組み込む。例えば、ＧＳおよびＧＥモチーフの同定によって、それらが突然変異誘発の標的とみなされる。この短く限定された性質のシグナルでは、各位置での突然変異の影響を体系的に評価しやすい。これらのようなＲＮＡシグナルにおける突然変異については、ミニレプリコン系ならびに完全なウイルスにおいて容易にアッセイを行うことができる。
【００９２】
図２８に、シス作用性ＲＮＡシグナルが関与する突然変異を移入する例を示す。ＲＳＶのｃｐｔｓ２４８／４０４誘導体で同定された強力な弱毒化点突然変異には、Ｍ２遺伝子のＧＳシグナルにおける点突然変異が関与する：具体的には、９番目の位置にあるＴ残基（プラスのセンス側）がＣに変化していた（例えば、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４７：２３２〜９、１９９８を参照）。示されているＨＭＰＶのＧＳシグナルでは、９番目の位置にあるＴ残基は、示されているＨＭＰＶ遺伝子のそれぞれで保存されている（図２８）。この置換は、どんなＨＭＰＶ遺伝子でも行うことができる。
【００９３】
前記の記載に従って、異種ウイルスで同定された、大きな一団の所望の突然変異を、配列関連性が低い場合でもｒＨＭＰＶ中に「移入」することができる。これらの実施形態では、対応する野生型または最終的な変異型のアミノ酸の割りつけが異種ウイルスのものと同一であることは厳格に要求されない。また、アミノ酸を置換するのではなく、１個または数個のアミノ酸を欠失させる、あるいは１個または数個のアミノ酸を挿入することも可能である。置換によるＨＭＰＶの突然変異を設計する際に、有用な戦略は、その位置で考えられる代替のアミノ酸の割りつけをすべて評価することである。これは、この位置が関与する全範囲の考えられる弱毒化の表現型を評価するのに有用な方法であり、それによって、一連の温度感受性および弱毒化を示す変異体を作製することができる（例えば、２００１年１１月２１日出願の米国仮出願第６０／３３１，９６１号の優先権を主張する、２００２年１１月２１日出願の米国特許出願第１０／３０２，５４７号；および２００２年９月１８日出願の米国仮出願第６０／４１２，０５３号を参照）。さらに、野生型と、弱毒化の表現型が生じないことが認められている、考えられる代替のどんなアミノ酸の割りつけの両方を比べてもヌクレオチドの違いが最大数となるように、置換のコドンを選択することができる。これには、弱毒化の表現型が消失する復帰変異または突然変異の可能性を低下させる効果がある。具体的には、任意の単一ヌクレオチドの位置での復帰変異の頻度は１０−４〜１０−５と推定され、したがって、２ヌクレオチドの位置での復帰変異／突然変異の頻度は１０−８〜１０−１０であり、３ヌクレオチドが関与する復帰変異／突然変異の頻度は１０−１２〜１０−１５である。したがって、複数のヌクレオチドの置換が関与する点突然変異により、遺伝的および表現型上の安定性を大きく増大させることができる。また、単一のアミノ酸または複数のアミノ酸が欠失するように突然変異を設計することができ、それによって復帰変異の可能性を低下させることができる。
【００９４】
どんなウイルスタンパク質に関する弱毒化を起こす突然変異をも移入する、本明細書で提供する手段および記載に従って同じ戦略を適用することができるが、描いている地図作製の実施がＬタンパク質でのアミノ酸変化が関与する例に限定されていることから、図２６Ａ〜２６Ｆに示した突然変異は例示的なものに過ぎないことに留意されたい。例えば、組換えＲＳＶのＰタンパク質中に生じた２つのｔｓ突然変異、すなわちグリシン１７２−セリンおよびグルタミン酸１７６−グリシン（Ｌｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：２８７１〜８０、２００２）は、ＨＭＰＶ  Ｐの残基の、それぞれグリシン２１３およびグルタミン酸２１７に対応する。弱毒化誘導体ｃｐＲＳＶのＮタンパク質における突然変異、すなわちバリン２６７−イソロイシン（Ｃｏｎｎｏｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８：４７８〜８４、１９９６）は、ＨＭＰＶではセリン２６８に対応する。また、ｃｐＲＳＶのＦタンパク質における２つの突然変異、すなわちグルタミン酸２１８−アラニンおよびスレオニン５２３−イソロイシン（Ｃｏｎｎｏｒｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２０８：４７８〜８４、１９９６）は、ＨＭＰＶ  Ｆタンパク質ではそれぞれリシン１８８およびスレオニン４８９に対応する。したがって、どんなヌクレオチドまたはアミノ酸配列に存在する望ましい表現型上の性質を有するどんな既知の突然変異も、本開示の新規の手段および方法を使用する、ｒＨＭＰＶ  ＲＮＡまたはタンパク質での対応する残基の突然変異による、ｒＨＭＰＶにおける組込みに有用な候補である。
【００９５】
弱毒化または他の望ましいアミノ酸置換の突然変異を考案するための他の方法では、「荷電アラニン変化（ｃｈａｒｇｅ−ｔｏ−ａｌａｎｉｎｅ）」または「アラニンスキャニング」によって突然変異を生成し、この場合、例えば、１つまたは複数の荷電アミノ酸残基をそれぞれアラニン残基に変化させる（Ｗｅｒｔｍａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３２：３３７〜５０、１９９２；ＨａｓｓｅｔｔおよびＣｏｎｄｉｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４５５４〜５８、１９９４；Ｔａｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３０２：２０７〜１６、２００２）。典型的な標的は１対の残基であるが、単独でも、あるいはより多くの組合せでも残基を変化させることができる。コードされたタンパク質全体にわたって残基を体系的に変化させる（「スキャンする」）ことはしばしば有用である。Ｌタンパク質が弱毒化モノネガウイルスで最も一般的な突然変異座位であるが、どんなタンパク質も標的となる可能性がある。あるいは、この戦略の利点の一つは、利用可能な変異体中に提示されていないタンパク質を標的とすることができることである。この戦略は、本明細書で開示される方法を用いて容易に対処することができる。特に、ミニレプリコン系は、Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２−１タンパク質における突然変異をスクリーニングするための方法をもたらす。その戦略では、Ｌタンパク質をコードするものなど、適当な支持プラスミド中に突然変異を導入し、レポーター遺伝子を含むミニゲノムの複製および転写を誘導することができるかどうか評価する。例えば、３２℃および３７℃（または３５℃〜４１℃の範囲における任意の温度）で複製物においてアッセイを行って、低い許容温度で作動し、高い温度で抑制されるｔｓ突然変異を同定する。これは、初期スクリーニングを行うための、より迅速で技術的に簡単な方法をもたらし、その後適当な突然変異を完全な組換えウイルス中に導入することができる。
【００９６】
したがって、本明細書で開示される方法を用いて、免疫原性組成物を開発する目的で、またはウイルスタンパク質を精製するなど他の目的で、ＨＭＰＶに性質の改良をもたらす突然変異を発生させることができる。所与の位置での考えられるアミノ酸またはヌクレオチドの割りつけをすべて評価することや、野生型へと、または野生型の表現型を生じさせる代替の割りつけへと戻る可能性がほとんどないコドン選択を伴うアミノ酸変化を行うことなどにより、突然変異を最適化することができる。遺伝子の順番の変化や、プロモーターに近接した位置への主要な防御抗原遺伝子の移動など、ウイルス主鎖を根本的に変える他の変化を行うことができる。重要なことに、ｒＨＭＰＶ中にこれらの様々な改変を組み合わせて導入して、免疫原性組成物に使用するための、または他の目的のウイルスを開発することができる。本明細書に記載の方法は、臨床試験に対応して組換えウイルス中にさらなる弱毒化突然変異を導入するなど、必要なときにウイルスの体系的な改変を可能にする。
【００９７】
上記に示したように、十分に弱毒化している、生物学的に誘導されたＨＭＰＶまたは他のウイルス変異体の生成を、いくつかの既知の方法によって実現することができる。そのような手順の１つでは、部分的に弱毒化したウイルスを、細胞培養の際に、徐々に低い、弱毒化を起こす温度で継代する。例えば、細胞培養の際に次善の温度で継代することによって、部分的に弱毒化した変異体を生成する。したがって、低温適応型（ｃａ）変異体または他の部分的に弱毒化したＨＭＰＶ株を、培養の際の継代によって低い温度での効率的な増殖に適応させる。低温で継代する間に変異ＨＭＰＶをこのように選択すると、部分的に弱毒化した親株と比べて、誘導体株に残っているどんな毒性も実質的低下する。あるいは、部分的に弱毒化した親ウイルスに化学的な突然変異誘発を施すことにより、特異的な突然変異を生物学的に誘導されたＨＭＰＶ中に導入することができ、例えば、ｔｓ突然変異を、またはすでにｔｓであるウイルスの場合、弱毒化および／または弱毒化した誘導体のｔｓ表現型の安定化を促進するのに十分なさらなるｔｓ突然変異を導入する。ｔｓ突然変異をＨＭＰＶ中に導入する手段には、一般に知られている手順に従った、５−フルオロウリジンなど突然変異原の存在下でのウイルスの複製がある。他の化学的突然変異原を使用することもできる。この目的で特に扱いやすい標的が、ポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子であることが判明しているが、ほとんどどんなＨＭＰＶ遺伝子でも、ｔｓ突然変異によって弱毒化させることができる。例示的な弱毒化ＨＭＰＶにおける複製の温度感受性のレベルを、許容温度でのその複製をいくつかの制限的な温度での複製と比較することによって決定することができる。ウイルスの複製が、許容温度でのその複製と比べて１／１００以下に低下する最も低い温度を、「遮断（ｓｈｕｔｏｆｆ）温度」と称する。実験動物およびヒトでは、ＨＭＰＶの複製と毒性は、どちらも変異体の遮断温度と相関する。
【００９８】
生物学的におよび組換えにより誘導されたＨＭＰＶ、ならびに他の非セグメント化マイナス鎖ＲＮＡウイルスから、本明細書における教示によって、大量の「メニュー（ｍｅｎｕ）」の弱毒化突然変異が同定可能であり、組換えＨＭＰＶにおける弱毒化、免疫原性および遺伝的安定性のレベルを調整するために、そのそれぞれを他のどんな突然変異とも組み合わせることができる。この関連では、多数の組換えＨＭＰＶ候補は、１つまたは複数の、好ましくは２つ以上の、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ、または他の異種ウイルス変異体に由来する突然変異、例えば、ＡＰＶ、ＨＰＩＶ、ＢＰＩＶ３、および／またはＲＳＶで同定された突然変異のいずれか１つまたは組合せを含む。好ましい組換えＨＭＰＶは、このように同定された複数の突然変異を組み込むことができる。各突然変異を特定するコドンにおける複数のヌクレオチドの置換により、組換えＨＭＰＶにおける復帰変異に対してこれらの変異を安定化させることが多い。
【００９９】
上記に記載の「メニュー」中に蓄積された突然変異を、所望された通りに、単独でまたは組み合わせて導入して、適当なレベルの弱毒化、免疫原性、弱毒化の表現型からの復帰変異に対する遺伝的抵抗性などに組換えＨＭＰＶを調整する。前記の記載によれば、ｃＤＮＡから感染性組換えＨＭＰＶを生成できることによって、組換えＨＭＰＶ内に特異的に設計された変化を導入することが可能になる。特に、生物学的に誘導された、弱毒化したＨＭＰＶ株における特定の突然変異、例えばｔｓ、ｃａ、ａｔｔおよび他の表現型を特定する突然変異のさらなる同定に、感染性組換えＨＭＰＶを使用することができる。これによって同定された所望の突然変異および他の方法を、組換えＨＭＰＶ候補株中に導入する。ｃＤＮＡからウイルスを生成できることにより、独立してまたは選択したものを種々に組み合わせて、全長ｃＤＮＡクローン中にこれらの突然変異を日常的に組み込むことができ、その後、導入された突然変異を含む救済された組換えウイルスの表現型を容易に決定することができる。
【０１００】
所望の表現型、例えば、ｃａまたはｔｓ表現型に関係する特定の突然変異を同定し、感染性組換えＨＭＰＶ中に組み込むことにより、同定された突然変異での、またはそれに近接した範囲内でのさらなる部位特異的な改変を同定する。生物学的に誘導されたＨＭＰＶで生じている弱毒化突然変異のほとんどは単一ヌクレオチド変化であるが、組換え技術によって、他の「部位特異的な」突然変異を組換えＨＭＰＶ中に組み込むこともできる。本明細書で使用する部位特異的突然変異には、変化したヌクレオチド（例えば、野生型ＨＭＰＶ配列から、選択した変異ＨＭＰＶ株の配列から、または突然変異誘発を施した親組換えＨＭＰＶクローンから変化したもの）約１〜約３個、最大約５〜１５個以上の挿入、置換、欠失または再構成が含まれる。選択した、生物学的に誘導された点突然変異で、またはその領域内で、このような部位特異的突然変異を組み込むことができる。あるいは、種々の他の状況で、組換えＨＭＰＶクローン内に、例えば、シス作用性調節配列、またはタンパク質の活性部位、結合部位、免疫原性エピトープなどをコードするヌクレオチド配列にまたはその近くに突然変異を導入することができる。
【０１０１】
部位特異的組換えＨＭＰＶ変異体は、通常は所望の弱毒化の表現型を保持しているが、弱毒化と無関係の変化した表現型の性質、例えば、増強されたまたは広い免疫原性、および／あるいは増殖性の向上をさらに示す可能性がある。所望の部位特異的変異体のさらなる例には、弱毒化点突然変異を特定するコドン中にさらなる安定化ヌクレオチド突然変異が組み込まれるように設計された組換えＨＭＰＶ変異体がある。可能であれば、親変異体または組換えＨＭＰＶクローン中の弱毒化するアミノ酸変化を特定するコドンに、２つ以上のヌクレオチドの置換を導入し、弱毒化の表現型からの復帰変異に対する遺伝的抵抗性がより大きい組換えＨＭＰＶを得る。他の実施形態では、部位特異的なヌクレオチドの置換、付加、欠失または再構成を、例えば、シス作用性調節成分を構築するか、または存在するその調節成分を除去するのに標的とするヌクレオチドの位置に比べて上流または下流に、例えば約１〜約３、約５〜１０、最大で１５ヌクレオチド以上５’または３’に導入する。
【０１０２】
単一および複数の点突然変異および部位特異的突然変異に加えて、組換えＨＭＰＶに対する変化には、遺伝子発現を増大させ、低下させ、消失させ、または他の形で変化させる、１つまたは複数の遺伝子又はゲノムセグメントの欠失、挿入、置換または再構成がある。組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを改変して、例えば、開始コドンのコード割りつけを変化させる突然変異、あるいは１つまたは複数の終止コドンを導入する突然変異を組み込むことにより、１つまたは複数の非必須な遺伝子の発現を低下または消失させることができる。あるいは、対応するタンパク質が部分的にもしくは完全に機能を有さなくなるように、またはタンパク質の発現を完全に阻害するように、１つもしくは複数の非必須な遺伝子またはゲノムセグメントの全体もしくは一部を欠失させることもできる。Ｇ遺伝子とＳＨ遺伝子をどちらも欠失した例示的な変異体を含めて、Ｇ、ＳＨおよび／またはＭ２−２のＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を示す、本開示のこれらの態様内の例示的な組換えＨＭＰＶを本明細書において開示する。免疫原性組成物の開発に極めて望ましい表現型上の性質を有する、これらのおよび他の組換え体を設計し選択することができる。例えば、これらの改変から、（ｉ）細胞培養における増殖特性の変化、（ｉｉ）哺乳動物の上気道および／または下気道における弱毒化、（ｉｉｉ）ウイルスのプラークサイズの変化、（ｉｖ）細胞変性効果の変化、（ｖ）免疫原性の変化、ならびに（ｖｉ）ＲＮＡ複製および遺伝子発現の変化を含めて、１つまたは複数の所望の表現型上の変化を特定することができる。
【０１０３】
したがって、組換えＨＭＰＶは、１つまたは複数の部分的なまたは完全な遺伝子欠失、ノックアウト突然変異、またはＨＭＰＶ遺伝子の発現を単に低下または増大させる突然変異を組み込むことができる。これは、例えば、選択したコード配列内でのフレームシフト突然変異または終止コドンの導入、翻訳開始部位の変化、遺伝子の位置の変化、あるいは上流の開始コドンの導入によるその発現速度の変化、ＧＳおよび／またはＧＥ転写シグナルの変化による表現型の変化、あるいはＲＮＡ編集部位の改変（例えば、増殖、転写上の温度制限など）によって実現することができる。いくつかの例では、例えば、複数の翻訳終止コドンを転写ＯＲＦ中に導入し、開始コドンを変化させ、または編集部位を改変することにより、１つまたは複数の遺伝子、例えば、ＳＨ、Ｇ、またはＭ２−２のＯＲＦの発現が、遺伝子またはそのセグメントの欠失なしに翻訳または転写レベルで消失している組換えＨＭＰＶを提供する。一実施形態では、Ｍ２−２のＯＲＦの部分的欠失と組み合わせて、潜在的な翻訳開始コドンをどちらも除去することによって、Ｍ２−２のＯＲＦの発現を消失させる。これらのまたは他の形のノックアウトウイルスは、組織培養中に増殖速度の低下および小さなプラークサイズをしばしば示す。したがって、ウイルス遺伝子の発現を消失または変化させる、さらなる新しい型の弱毒化突然変異を本明細書において提供する。これに関して、あるいは、記載のように、標的タンパク質の合成を回復させる可能性がある訂正突然変異を有効に除外する欠失突然変異により、遺伝子またはゲノムセグメントの欠失なしで生じたノックアウトウイルスの表現型を発生させることもできる。当技術分野で周知の代替の設計および方法（例えば、Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１６：３０９〜３１６、１９９６；Ｒａｄｅｃｋｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１７：４１８〜４２１、１９９６；Ｋａｔｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：５７８〜５８７、１９８７；およびＳｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７７：３１４〜３２２、１９９６に記載のもの）を用いて、他の遺伝子ノックアウトを行うことができる。
【０１０４】
組換えＨＭＰＶ構築物中に導入することができるヌクレオチドの改変により、ベクターのゲノムまたはアンチゲノム、あるいは異種の供与体遺伝子又はゲノムセグメント中で、少数の塩基（例えば、１５〜３０塩基から最大３５〜５０塩基以上）、大きな固まりのヌクレオチド（例えば、約５０〜１００、約１００〜３００、約３００〜５００、約５００〜１，０００塩基）、またはほぼ完全なまたは完全な遺伝子（例えば、約１，０００〜１，５００ヌクレオチド、約１，５００〜２，５００ヌクレオチド、約２，５００〜５，０００ヌクレオチド、約５，０００〜６０，０００ヌクレオチド以上）を、変化の性質に応じて変化させることができる（すなわち、少数の塩基を変化させて、免疫原性エピトープを挿入しまたは消失させあるいは小さなゲノムセグメントを変化させることができるが、大きな固まりの塩基は、遺伝子または大きなゲノムセグメントを付加し、置換、欠失させまたは再構成するときに関係する）。
【０１０５】
関連する態様では、本開示は、生物学的に誘導されたＨＭＰＶに由来する組換えＨＭＰＶクローンに導入する追加の突然変異、例えば、さらに改変された組換えＨＭＰＶにおいて同じまたは異なる遺伝子に関与するさらなる型の突然変異を伴うｃａおよびｔｓ突然変異を提供する。それぞれのＨＭＰＶ遺伝子は、発現レベルについて選択的に変化させることもでき、あるいは、単独でまたは他の所望の改変と組み合わせて、その全体または一部を付加し、欠失させ、置換または再構成して、新規の性質を示す組換えＨＭＰＶを得ることもできる。したがって、生物学的に誘導されたＨＭＰＶおよび／または非ＨＭＰＶ変異体から導入された弱毒化突然変異に加えてまたはそれと組み合わせて、本開示は、感染性ＨＭＰＶクローンの組換え工学に基づいて、組換えＨＭＰＶの表現型を現弱化するまたはその他の形で改変する、一連の追加の方法をも提供する。部分的に弱毒化した感染性クローン中に組み込むための、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中の供与体または受容側の遺伝子またはゲノムセグメントを含めて、標的遺伝子またはゲノムセグメントをコードする単離ポリヌクレオチド配列中に様々な変化を発生させることができる。より具体的には、組換えＨＭＰＶで所望の構造上のおよび表現型上の変化を実現するために、本開示により、親ゲノムまたはアンチゲノムから選択したヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を欠失させ、置換し、導入し、または再構成する改変、ならびに組換えＨＭＰＶ内で遺伝子全体またはゲノムセグメントを欠失させ、置換し、導入しまたは再構成する突然変異の導入が可能となる。
【０１０６】
したがって、例えば、選択したＨＭＰＶコード配列内に終止コドンを導入するか、またはその翻訳開始部位またはＲＮＡ編集部位を変化させ、機能しうる形で連結したプロモーターに対してＨＭＰＶ遺伝子の位置を変化させ、上流の開始コドンを導入して発現速度を変化させ、（例えば、位置を変化させ、存在する配列を変化させ、または存在する配列を異種配列と置換することにより）ＧＳおよび／またはＧＥ転写シグナルを改変して表現型（例えば、増殖、転写上の温度制限など）を変化させ、ウイルス複製、選択した遺伝子の転写、または選択したタンパク質の翻訳における量的なまたは質的な変化を特定する様々な他の欠失、置換、付加および再構成を行うことにより、選択した遺伝子の発現を単に変化または消失させる、組換えＨＭＰＶにおける改変を提供する。これに関して、増殖に非必須などんなＨＭＰＶ遺伝子またはゲノムセグメントも、組換えＨＭＰＶ中で除去しまたはその他の形で改変して、毒性、病原性、免疫原性および他の表現型上の特徴に対する所望の効果を得ることができる。コード配列に加えて、非コード領域、リーダー領域、トレイラー領域および遺伝子間領域を同様に欠失させ、置換しまたは改変することができ、その表現型上の効果を、例えば、ミニレプリコンの使用、および本明細書に記載の組換えＨＭＰＶによって容易に分析することができる。
【０１０７】
これらの変化に加えて、組換えＨＭＰＶ構築物における遺伝子の順番を変化させることができ、ＨＭＰＶゲノムのプロモーターをそのアンチゲノムの対応物と置換することができまたはその逆も同様に可能であり、遺伝子の一部を除去しまたは置換することができ、遺伝子全体を欠失させることができる。配列中での異なるまたはさらなる改変を行って、様々な遺伝子間領域またはその他の場所における独特の制限部位の挿入など、操作を容易にすることができる。非翻訳遺伝子配列を除去して、外来配列を挿入する許容量を増大させることができる。
【０１０８】
本開示の組換えＨＭＰＶ構築物中に組み込む他の突然変異には、シス作用性シグナルを対象とする突然変異があり、例えば、ＨＭＰＶミニゲノムの突然変異分析によってこれを容易に同定することができる。例えば、リーダー、トレイラーおよび／または隣接配列の挿入および欠失分析から、ウイルスプロモーターおよび転写シグナルが同定され、ＲＮＡ複製または転写の様々な程度の低下に関係する一連の突然変異がもたらされる。このシス作用性シグナルの（各位置が順にそれぞれのヌクレオチド代替物に改変される）飽和突然変異誘発を使用して、ＲＮＡ複製または転写に影響を及ぼす多数の突然変異を同定することもできる。これらの突然変異のうちいずれも、本明細書に記載のキメラＨＭＰＶアンチゲノムまたはゲノム中に挿入することができる。完全アンチゲノムｃＤＮＡを用いたトランス作用性タンパク質およびシス作用性ＲＮＡ配列の評価および操作は、上記で組み込まれた参照文献中に記載のＨＭＰＶミニゲノムの使用によって援助される。
【０１０９】
組換えＨＭＰＶ内のさらなる突然変異は、ＲＮＡ複製および転写における変化と関係する、ゲノムの３’末端の、アンチゲノム由来のその対応物との置換またはその逆を含み得る。例示的な一実施形態では、天然の配列を、合成によって作製され、効率のよい翻訳と整合するように設計されたものと置換することにより、防御ＨＮおよび／またはＦ抗原など特定のＨＭＰＶタンパク質の発現レベルを増大させることができる。これに関して、コドンの使用法が哺乳動物ウイルスタンパク質の翻訳レベルにおいて重要なファクターとなり得ることが示されている（Ｈａａｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．６：３１５〜３２４、１９９６）。組換えＨＭＰＶの１つまたは複数の免疫原性糖タンパク質をコードするｍＲＮＡのコドン使用法を組換えの方法によって最適化すると、これらの遺伝子の発現が高められる。
【０１１０】
他の例示的な実施形態では、選択したＨＭＰＶ遺伝子またはＨＭＰＶベクター内に組み込まれた供与体の遺伝子の翻訳開始部位の周囲にある配列（好ましくは、ＡＵＧ開始部位と比べて−３位にあるヌクレオチドを含む）を、単独でまたは上流の開始コドンの導入と組み合わせて改変して、翻訳の上方制御または下方制御を指定することによって遺伝子発現を調節する。あるいは、または本明細書で開示される、組換えによる他の改変と組み合わせて、ウイルスの任意の選択した遺伝子の転写ＧＳまたはＧＥシグナルを変化させることにより、組換えＨＭＰＶの遺伝子発現を調節することもできる。代替の実施形態では、組換えＨＭＰＶ候補における遺伝子発現のレベルを、転写のレベルで改変する。一態様では、ＨＭＰＶ遺伝子地図における選択した遺伝子の位置を、よりプロモーターの近くの位置にまたはプロモーターから離れた位置に変えることができ、それによって、その遺伝子の発現の効率がそれぞれよくまたは悪くなる。この態様によれば、特定の遺伝子の発現調節を行うことができ、相互に位置を置換した遺伝子の発現レベルにおける同等の低下をしばしば伴う野生型のレベルと比べて２倍から、より一般には４倍から、最大１０倍以上の遺伝子発現の低下または増大が生じる。これらのおよび他の転位変化により、例えば、ＲＮＡ複製に関与する、または抗原発現の増大など他の所望の特性を有する、選択したウイルスタンパク質の発現低下に起因して、弱毒化の表現型を有する新規の組換えＨＭＰＶが生じる。
【０１１１】
後者の場合では、Ｆ、Ｇ、およびＳＨが含まれると予想される抗原性糖タンパク質またはその抗原決定基のうちいずれか１つまたはその組合せを、例えば、対象の遺伝子またはゲノムセグメントのプロモーターとの相対位置を変えることにより、高いレベルでまたは低いレベルで（または他の形で免疫原的活性が高まった状態で）作製することができる。例えば、ＨＭＰＶのＳＨ、ＧおよびＦのＯＲＦの野生型遺伝子の順番は、それぞれ遺伝子位置６、７および４に位置する。１つまたは複数のこれらの遺伝子のプロモーターとの近さを組換えによって変えることにより、その発現、および／または通常「上流」および「下流」にある遺伝子の発現が調節される。遺伝子の再配置による、または第２の複製物の付加による遺伝子発現の変化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖の増大または低下など他の所望の効果を有する可能性がある。例示的な実施形態では、ＳＨ、Ｇ、およびＦなどの推定される防御抗原遺伝子を、単独で、２つ組で、または３つ組でプロモーターのより近くに置くことで、より効率よく発現する。本明細書に記載のように、ＳＨ−Ｇ遺伝子対の位置が、例えば、その遺伝子対をその野生型遺伝子の順番の位置であるＭ２遺伝子の後からＦ遺伝子の前の位置に移動させることによって変化した「プロモーター移動（ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｓｈｉｆｔｅｄ）」したＨＭＰＶの例示的実施形態を提供する。この結果、ＲＳＶのものに似たゲノムのその領域の遺伝子の順番となった。他の例示的実施形態では、ＳＨ−Ｇ対をＦ遺伝子の上流に移動させ、その対の第２の複製物を挿入すると、複数コピーのＳＨおよびＧの予想抗原が得られた。さらなる実施形態では、１つまたは複数のＧおよびＦタンパク質を含む予想抗原の発現を、（その野生型遺伝子の順番がＨＭＰＶゲノム地図においてそれぞれ７番目および４番目の遺伝子位置にある）これらの遺伝子をよりプロモーターに近い位置にプロモーター相対移動させることによって改変する。
【０１１２】
他の実施形態では、好都合には免疫原性組成物で有用な組換えＨＭＰＶを便利にも改変して、循環ウイルス中の抗原連続変異に適応させることができる。これに関して、下記の実施例に、ＨＭＰＶゲノムの完全な配列を提供し、配列の相違の点で抗原亜型のＨＲＳＶと一般に遺伝子的に類似する、２つの異なる抗原亜型のＨＭＰＶを代表するＨＭＰＶ単離物の完全なゲノム配列の詳細な比較をも提供する。その予想抗原性糖タンパク質遺伝子の構造の詳細な地図作製を含めて、これらの異なる抗原亜型を同定し特徴付けることにより、複数のＨＭＰＶ株に対して免疫感作する、かつ／または抗原連続変異に適応させる二価の免疫原性組成物を含めた、１つまたは複数のＨＭＰＶ株に対する免疫応答を引き出す免疫原性組成物中に使用する新規の組換えＨＭＰＶが構築される。通常、組換えＨＭＰＶは、１つまたは複数のＳＨ、Ｇ、および／またはＦ糖タンパク質の改変を有する。例えば、１つのＨＭＰＶ株または群に由来する特定の抗原決定基（例えば、その免疫原性領域またはエピトープ）をコードするＳＨ、Ｇ、および／またはＦ遺伝子全体、あるいはゲノムセグメントを、異なるＨＭＰＶ株または群の受容側のクローンにおける対応する領域を置換することにより、あるいは複数の抗原の形態が組換えウイルス中に示されるように１つまたは複数コピーの遺伝子を付加することにより、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡ中に組み込むことができる。次いで、改変された組換えＨＭＰＶから産生される後代ウイルスを、複数の出現中のＨＭＰＶ株に対する免疫感作プロトコルで使用することができる。
【０１１３】
本開示の特定の態様では、ＨＭＰＶコード配列または非コード配列（例えば、プロモーター、ＧＥ、ＧＳ、遺伝子間または他のシス作用性成分）を異種（例えば、非ＨＭＰＶ）対応物と置換することによって、考えられる様々な弱毒化のまたは他の表現型上の効果を有するキメラＨＭＰＶが得られる。例えば、ＡＰＶまたは他の非ＨＭＰＶウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＳＶ５、ＳＶ４１、ＮＤＶ、ＰＩＶ）のタンパク質、タンパク質ドメイン、遺伝子またはゲノムセグメントを、組換えＨＭＰＶの「バックグラウンド」ゲノムまたはアンチゲノム中に移入することにより、宿主域および他の所望の効果を作り出すことができ、異種または「供与体の」遺伝子またはゲノムセグメントは、例えば、異種配列またはタンパク質が、生物学的に相互作用するＨＭＰＶ配列またはタンパク質（すなわち、ウイルス転写、翻訳、集合などについて、置換された配列またはタンパク質と通常協同する配列またはタンパク質）と、より一般には、宿主域制限において、許容性宿主と非許容性宿主の間で異なる細胞性タンパク質または細胞環境のいくつかの他の面と適合しないことから、ヒト細胞内で効率的に機能しない。例示的な実施形態では、ＡＰＶ、マウスのニューモウイルス、またはＲＳＶ配列が、本明細書に記載のＨＭＰＶの構造および機能の面に基づくＨＭＰＶ中への導入に選択される。
【０１１４】
ＨＭＰＶと非ヒトニューモウイルスまたは他のマイナス鎖ＲＮＡウイルス、例えばＡＰＶ、ＲＳＶ、ＨＰＩＶ、ＭＰＩＶ１（センダイウイルス（Sendai virus））、ＢＰＩＶ３、ＳＶ５、ＳＶ４１、および／またはＮＤＶ（例えば、２０００年６月１日出願のＳｃｈｍｉｄｔらによる米国特許出願第０９／５８６，４７９号（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０４３２０号に該当）；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８９２２〜９、２０００で開示されているもの）とのキメラの構築に基づく、組換えＨＭＰＶ候補を弱毒化する方法を、本明細書において提供する。例示的な実施形態では、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを、非ＨＭＰＶパラミキソウイルスに由来するＮ、Ｐ、Ｍ、またはＬのＯＲＦなどの異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせる。
【０１１５】
パラミキソウイルスは、エンベロープ付きのＲＮＡウイルスであり、これには２つの亜科（パラミキソウイルス亜科（Paramyxovirinae）およびニューモウイルス亜科（Pneumovirinae））が含まれる。パラミキソウイルス亜科は、レスピロウイルス（Respirovirus）（パラインフルエンザウイルス１および３を含む）、ルブラウイルス（Rubulavirus）（パラインフルエンザウイルス２および４ならびに流行性耳下腺炎ウイルスを含む）およびモルビリウイルス（Morbillivirus）（麻疹ウイルスおよびイヌジステンパーウイルスを含む）を含めて、５つの異なる属を有する。ニューモウイルス亜科は、２つの属、すなわちニューモウイルス（ＲＳＶを含む）およびメタニューモウイルス（ＨＭＰＶを含む）を有する。パラミキソウイルスは、６〜１１種のタンパク質をコードする。すべてのパラミキソウイルスに共通のタンパク質には、ＲＮＡゲノムと堅く結合してヌクレオキャプシドを形成するヌクレオキャプシドＮタンパク質、ヌクレオキャプシドと結合するリンタンパク質Ｐおよび大Ｌポリメラーゼタンパク質、ウイルスエンベロープの内面と結合するマトリックスＭタンパク質、侵入を媒介する膜貫通融合Ｆ糖タンパク質、ならびにウイルスに応じて糖タンパク質Ｇ、または血球凝集素ＨＡまたは血球凝集素ノイラミニダーゼＨＮと呼ばれる付着タンパク質が含まれる。ＲＳＶの非構造ＮＳ１およびＮＳ２タンパク質、ＲＳＶでみられるＭ２−１およびＭ２−２タンパク質、本明細書で開示されるように、ＨＭＰＶにおける、流行性耳下腺炎ウイルス、シミアンウイルス５、ＲＳＶおよびＨＭＰＶでみられるＳＨタンパク質、特定のパラインフルエンザウイルスでみられるＣ、ＤおよびＶタンパク質などの他のタンパク質は、いくつかのウイルスでみられるが、他のウイルスではみられない。非ＨＭＰＶのＨＮ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｆ、Ｇ、およびＳＨタンパク質、ならびにそのタンパク質をコードする核酸の配列は、当技術分野で知られている（Ｌａｍｂ，ＲＡおよびＫｏｌａｋｏｆｓｋｙ，Ｄ．Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第４版のｐｐ  １３０５〜１３４０、ＫｎｉｐｅおよびＨｏｗｌｅｙ（編）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１；Ｃｈａｎｏｃｋ、ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｌｌｉｎｓ、同書のｐｐ  １３４１〜１３７９；Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣｈａｎｏｃｋおよびＭｕｒｐｈｙ、同書のｐｐ  １４４３〜１４８５を参照）。
【０１１６】
したがって、非ＨＭＰＶの１つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせてキメラＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを形成するＨＭＰＶに由来するまたはそれを模範として作られた、部分的なまたは完全な「バックグラウンド」ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを含むキメラＨＭＰＶを本明細書において提供する。一実施形態では、この型のキメラＨＭＰＶは、１つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせた、部分的または完全なＨＭＰＶバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムを組み込んでいる。通常、部分的なまたは完全なバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムは、受容側の主鎖として働き、その対応物である非ＨＭＰＶウイルスの異種遺伝子またはゲノムセグメントがその中に組み込まれる。対応するウイルス由来の異種遺伝子またはゲノムセグメントは、「供与体」の遺伝子またはポリヌクレオチドとなり、バックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムと組み合わせて、またはその中で置換されて、寄与しているウイルスの一方または両方と比べて表現型上の新規の特徴を示すキメラＨＭＰＶが生じる。例えば、選択した受容側ＨＭＰＶ株内で異種遺伝子またはゲノムセグメントを付加しまたは置換すると、改変しない受容体および／または供与体の対応する表現型と比べて弱毒化の増大または低下、増殖の変化、免疫原性の変化、あるいは他の所望の表現型変化が生じる可能性がある（例えば、２０００年６月１日出願のＳｃｈｍｉｄｔらによる米国特許出願第０９／５８６，４７９号；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８９２２〜９、２０００を参照）。
【０１１７】
キメラＨＭＰＶ内での異種置換物または付加物として使用するのに選択することができる遺伝子およびゲノムセグメントには、ＨＭＰＶのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｍ２、ＳＨ、Ｇおよび／またはＬタンパク質またはその一部をコードする遺伝子またはゲノムセグメントがある。さらに、他のウイルスでみられるタンパク質（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、ＲＳＶウイルス、およびＳＶ５ウイルスでみられるＳＨタンパク質）をコードする遺伝子およびゲノムセグメントを、本開示のさらなるキメラＨＭＰＶ組換え体内に組み込むことができる。異種ウイルス由来の調節領域、例えば、遺伝子外の３’リーダーまたは５’トレイラー領域、およびＧＳ、ＧＥ、遺伝子間領域、あるいは３’または５’非コード領域は、組換えＨＭＰＶ内での置換物または付加物としても有用である。例示的な態様では、１つまたは複数の非ＨＭＰＶ遺伝子またはゲノムセグメントを有するキメラＨＭＰＶは、例えば、ハムスターや非ヒト霊長類などヒトＨＭＰＶ感染の哺乳動物モデルの気道において高度の宿主域制限を示す。より詳細な実施形態では、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｍ２、ＳＨ、Ｇおよび／またはＬ遺伝子およびゲノムセグメントから選択された、１つまたは複数のＡＰＶまたはＲＳＶの遺伝子またはゲノムセグメントを、部分的または完全なＨＭＰＶバックグラウンドゲノムまたはアンチゲノムに付加するまたは置換することによってＨＭＰＶを弱毒化する。
【０１１８】
一実施形態では、本開示の免疫原性組成物内で使用するキメラＨＭＰＶが示す宿主域制限の程度は、それぞれの非ＨＭＰＶの「供与体」株が示す宿主域制限の程度と同等である。例えば、その制限は、真の宿主域の表現型を有するはずであり、すなわち、それは、問題とする宿主に特異的であるはずであり、適切な細胞系統でのｉｎ  ｖｉｔｒｏの複製を制限しないはずである。さらに、１つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントを有するキメラＨＭＰＶは、ＨＭＰＶ感染に感受性の宿主において所望の免疫原性応答を引き出す。したがって、本開示は、宿主域効果に基づいて、ＨＭＰＶおよび他の病原体に対する免疫原性組成物の開発用に生ＨＭＰＶウイルスベクターを弱毒化するための新たな基礎を提供する。
【０１１９】
キメラＨＭＰＶにおいてもたらされる宿主域表現型効果と組み合わせて、キメラウイルスの弱毒化を増大しまたは低下させる、さらなる突然変異を導入することにより、弱毒化の表現型を調整することがしばしば所望される。したがって、さらなる実施形態では、得られるウイルスまたはサブウイルス粒子中で弱毒化の表現型を特定する１つまたは複数の弱毒化突然変異を導入することにより、キメラゲノムまたはアンチゲノムをさらに改変した、弱毒化したキメラＨＭＰＶが得られる。これは、新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）発生し、合理的な設計の突然変異誘発戦略に従って弱毒化効果を有するかどうか試験された突然変異を含み得る。あるいは、存在する生物学的に誘導された変異ＨＭＰＶまたは非ＨＭＰＶ中で弱毒化突然変異を同定し、その後本開示のキメラＨＭＰＶ中にそれを組み込むこともできる。例示的な突然変異により、ＲＮＡ調節配列中のまたはコードされたタンパク質中の損傷が特定される。
【０１２０】
特定のキメラＨＭＰＶでは、ヒトでのＨＭＰＶ複製および免疫原的活性とかなり相関する受容性の動物モデル（例えば、ハムスター、アカゲザルまたはチンパンジー）の下気道および／または上気道での複製を特徴とする弱毒化は、（例えば、感染してから３〜８日後の間に測定したときに）対応する野生型株または変異親株の増殖と比べて、全体にわたって少なくとも約１／２、しばしば約１／５、１／１０、または１／２０、好ましくは１／５０〜１／１００、最小で１／１０００以下まで低下している。
【０１２１】
本明細書で開示される方法では、組換えまたはキメラＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中にまたはそれに近接させて、さらなる遺伝子またはゲノムセグメントを挿入することができる。例えば、組換えゲノムまたはアンチゲノム内での任意の様々な部位に、例えば、Ｎの３’の位置に、Ｎ／Ｐ、Ｐ／Ｍ、Ｍ／Ｆ、Ｆ／Ｍ２、Ｍ２／ＳＨ、ＳＨ／Ｇ、および／またはＧ／Ｌ遺伝子間に、あるいはＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムの他の非コード領域に種々の過剰な異種遺伝子またはゲノムセグメントを挿入することができる（図１を参照）。挿入した遺伝子は、受容側の遺伝子と共通の制御下に置くこともでき、あるいは、独立した１組の転写シグナルの制御下に置くこともできる。これに関して対象とする遺伝子には、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−２〜ＩＬ−１８、例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１８（ＩＬ−１８））、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）、または顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子がある（例えば、１９９９年７月１３日に出願の米国仮出願第６０／１４３，４２５号の優先権を主張する、２０００年７月１２日出願の米国出願第０９／６１４，２８５号を参照）。これらのさらなるタンパク質の同時発現により、組換えＨＭＰＶに対する免疫応答を量的にかつ／または質的に改変し向上させる能力がもたらされる。
【０１２２】
さらなる実施形態では、組換えＨＭＰＶ候補中への異種ヌクレオチド配列の挿入を別々に使用して、例えば、上気道について候補組換え体の弱毒化のレベルを調節する。したがって、どちらも外来タンパク質の発現を誘導し、動物宿主中でウイルスを弱毒化するヌクレオチド配列を組換えＨＭＰＶ中に挿入すること、またはヌクレオチド挿入を別々に使用して候補ウイルスを弱毒化することが可能である。弱毒化に対する遺伝子挿入の効果を支配する規則を明らかにするために、様々な長さの遺伝子単位を野生型ＨＭＰＶ主鎖に導入し、弱毒化に対する遺伝子単位長の効果を調べる。この点で新規の遺伝子単位挿入はかなりのＯＲＦを含まないことが意図され、それによってその遺伝子の発現タンパク質の効果と独立に遺伝子単位長の効果を識別することが可能になる。これらの異種配列を、様々なサイズの、例えば、長さ約１５０ｎｔｓ以上から長さ最大３，０００ｎｔｓ以上の過剰な遺伝子単位として挿入することができる。長さ約１，０００または２，０００ｎｔｓの遺伝子単位（ＧＵ）挿入により、哺乳動物被験者の上気道でｒＨＭＰＶ候補がかなり弱毒化される。さらに、遺伝子単位挿入は、候補ウイルスの弱毒化にも第２のウイルスに対する免疫原性応答の誘導にも二重の効果を有する。交互に、ＨＭＰＶ遺伝子の３’非コード領域（ＮＣＲ）での遺伝子伸長は、さらなるタンパク質を発現させることができず、それ自体も弱毒化し得る。本開示のこの方法の中で、遺伝子挿入長は、弱毒化の決定要素である（例えば、２００１年１１月２１日出願の米国仮出願第６０／３３１，９６１号の優先権を主張する、２００２年１１月２１日出願の米国特許出願第１０／３０２，５４７号；および２００２年９月１８日出願の米国仮出願第６０／４１２，０５３号を参照）。
【０１２３】
ｒＨＭＰＶ内のウイルス遺伝子またはゲノムセグメント全体の変化が関与する欠失、挿入、置換および他の突然変異によって高度に安定な候補が生じ、これは免疫抑制された個体の場合特に重要である。多数のこれらの変化により、得られた株の弱毒化が生じるが、他の変化によって異なる型の所望の表現型変化が特定される。例えば、付属（すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖に必須でない）遺伝子は、宿主の免疫に特異的に干渉するタンパク質をコードする優れた候補である（例えば、Ｋａｔｏら、ＥＭＢＯ．Ｊ．１６：５７８〜８７、１９９７を参照）。候補ウイルスにおけるこのような遺伝子の除去によって、毒性および病原性が低下し、かつ／または免疫原性が向上する可能性がある。
【０１２４】
より詳細な実施形態では、組換えにより改変して異種病原体の１つまたは複数の抗原決定基を組み込んだＨＭＰＶ「ベクター」ゲノムまたはアンチゲノムを使用して、キメラＨＭＰＶを構築する。ベクターゲノムまたはアンチゲノムは、部分的なまたは完全なＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを含み、弱毒化突然変異などヌクレオチドの改変をそれ自体に組み込むことができる。ベクターゲノムまたはアンチゲノムを改変して、異種遺伝子またはゲノムセグメントの組込みによってキメラ構造を形成する。より具体的には、異種の抗原決定基をコードする１つまたは複数の「供与体」ヌクレオチド配列と組み合わせて、部分的なまたは完全なベクターまたは「バックグラウンド」ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを組み込んだ組換えウイルスを得る、ｃＤＮＡに基づくウイルス回収系によって本開示のキメラＨＭＰＶを構築する。例示的な実施形態では、ＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムを改変して、１つまたは複数の異種マイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば、他のＨＭＰＶ、ＲＳＶ、ＰＩＶ、または麻疹ウイルス）の抗原決定基をコードする１つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントを組み込む。このように構築されたキメラＨＭＰＶは、例えば、特定のＨＭＰＶに対して、または非ＨＭＰＶ病原体に対して免疫応答を引き出すことができる。あるいは、ＨＭＰＶに基づくキメラウイルスを使用して、複数のＨＰＩＶに対して、１種または複数種のＨＭＰＶ、およびＲＳＶ、ＰＩＶや麻疹ウイルスなどの非ＰＩＶ病原体に対して多特異性の免疫応答を引き出す組成物および方法をも提供する。
【０１２５】
これに関して、キメラＨＭＰＶは、異種病原体の１つまたは複数の抗原決定基をコードする１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドを組み込んでいる、部分的なまたは完全なヒトＨＭＰＶを組み込むことができる。これらの異種ポリヌクレオチドをＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムに付加してまたはその中で置換して、キメラＨＭＰＶ組換え体を得ることができる。したがって、キメラＨＭＰＶウイルスは、選択された宿主において異種病原体に対する免疫応答を引き出す能力を獲得する。さらに、キメラウイルスは、ベクターＨＭＰＶと異種病原体の一方または両方と比べて、表現型上の他の新規な特徴を示すことができる。新規な免疫原的特徴をもたらすのに加えて、異種遺伝子またはゲノムセグメントを付加または置換すると、改変しないベクターおよび供与体のウイルスの対応する表現型と比べて弱毒化の増大または低下、増殖の変化、あるいは他の所望の表現型変化が与えられる可能性がある。
【０１２６】
異なるＨＭＰＶまたは非ＨＭＰＶウイルスの異種遺伝子またはゲノムセグメントを、過剰なゲノム成分として、ｒＨＭＰＶの部分的なまたは完全なゲノムまたはアンチゲノムに付加することができる。あるいは、１つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントを、ＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内で欠失させる、対応する遺伝子またはゲノムセグメントの、野生型遺伝子の順番の位置に対応する位置で、ｒＨＭＰＶ中に置換することができる。さらなる実施形態では、異種遺伝子またはゲノムセグメントの発現をそれぞれ増強または低下させるベクターゲノムまたはアンチゲノム内の対応する遺伝子またはゲノムセグメントの、野生型遺伝子の順番の位置と比べて、よりプロモーターに近いまたはプロモーターから離れた位置で、異種遺伝子またはゲノムセグメントを付加または置換することができる。キメラＨＭＰＶの作製に有用なさらなる方法および組成物は、特定の既知の技術、例えばＰＩＶウイルスについて開示されているもの（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１７６２〜１７６８、１９９８；Ｔａｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２９５５〜２９６１、１９９８；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４〜１３８１、１９９９；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌａｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：５０３〜５１０、１９９９；Ｔａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１１００〜１１０８、１９９９；Ｔａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１３５９〜１３６６、２０００；１９９８年５月２２日出願の米国特許出願第０９／０８３，７９３号；１９９９年１２月１０日出願の米国特許出願第０９／４５８，８１３号；１９９９年１２月１０日出願の米国特許出願第０９／４５９，０６２号；１９９７年５月２３日出願の米国仮出願第６０／０４７，５７５号（国際公開ＷＯ９８／５３０７８号に該当）；および１９９７年９月１９日出願の米国仮出願第６０／０５９，３８５号）を使用する。
【０１２７】
キメラタンパク質、例えば、異なるＨＭＰＶまたは非ＨＭＰＶ病原体の異種外部ドメイン（管腔または細胞外空間に伸長する膜貫通表面タンパク質の一部である外部ドメイン）と融合して、異種病原体に対して免疫応答を引き出す融合タンパク質となる、ＨＭＰＶベクターに特異的な細胞質側の尾部および／または膜貫通ドメインを有する免疫原性糖タンパク質を発現するキメラＨＭＰＶを構築することもできる。例えば、ＲＳＶのＦ、ＳＨ、Ｍ２、またはＧ糖タンパク質に由来する糖タンパク質外部ドメインをコードする異種ゲノム断片は、対応するＨＭＰＶ糖タンパク質の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするゲノム断片と連結して、ＲＳＶに対して免疫応答を引き出すキメラ糖タンパク質を形成することができる。
【０１２８】
簡潔に述べると、キメラ糖タンパク質を発現するＨＭＰＶは、主要なヌクレオキャプシドタンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質、大ポリメラーゼタンパク質、および改変してキメラ糖タンパク質をコードするＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムを含む。キメラ糖タンパク質は、第２の、抗原として異なるＨＭＰＶまたは非ＨＭＰＶ病原体の１つまたは複数の異種抗原ドメイン、断片、またはエピトープを組み込んでいる。一実施形態では、これは、ＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノム内で、１つまたは複数の抗原性ドメイン、断片、またはエピトープをコードする、第２のウイルスの１つまたは複数の異種ゲノムセグメントを置換することによって実現し、それによって、組換えゲノムまたはアンチゲノムが、親ベクターウイルスと抗原として異なるキメラ糖タンパク質をコードする。いくつかの例では、異種ゲノムセグメントまたはセグメント群は、糖タンパク質外部ドメインあるいはその免疫原性部分またはエピトープをコードすることができる。異種ゲノムセグメントは、異種または「供与体」の糖タンパク質の他の部分、例えば、ベクターゲノムまたはアンチゲノムで対応する糖タンパク質外部ドメインと膜貫通ドメインで置換された外部ドメインと膜貫通領域の両方を含むこともできる。
【０１２９】
本明細書で用いられる「遺伝子」という用語は一般に、対象ゲノム、例えば、ＨＭＰＶゲノムの一部を指し、これは、ｍＲＮＡをコードし、一般にＧＳシグナルの付いた上流の末端から開始し、ＧＥシグナルの付いた下流の末端で終了する。遺伝子という用語はまた、特にＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ３のＣタンパク質などのタンパク質が、独特のｍＲＮＡからではなく追加したＯＲＦから発現される場合に、「翻訳オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」という用語と交換可能である。すべてのモノネガウイルスのウイルスゲノムはまた、ウイルスの複製および転写に必要なプロモーターの一部を有する、遺伝子外のリーダーおよびトレイラー領域、ならびに非コード領域および遺伝子間領域を含む。転写は、３’末端から開始し、遺伝子の境界でみられる保存された短いモチーフによって誘導される、連続した停止と開始の機構によって進行する。各遺伝子の上流の末端はＧＳシグナルを含み、このシグナルはそのそれぞれのｍＲＮＡの開始を指示する。各遺伝子の下流の末端はＧＥモチーフを含み、このモチーフはポリアデニル化および終止を指示する。本開示は、転写シグナルおよび挿入部位の作動的な同定をもたらし、ゲノム内でのＧＳ、ＧＥおよび潜在的な挿入部位の同定をもたらす。
【０１３０】
キメラＨＭＰＶを構築するために、１つまたは複数のＨＭＰＶ遺伝子またはゲノムセグメントの全体または一部を欠失し、挿入しまたは置換することができる。このことは、部分的なまたは完全な欠失、挿入および置換が、任意の１つまたは複数のＨＭＰＶ遺伝子またはゲノムセグメントのＯＲＦおよび／またはシス作用性調節配列と関係し得ることを意味する。「ゲノムセグメント」とは、ＨＭＰＶゲノムに由来する任意の長さの連続したヌクレオチドを意味し、それは、ＯＲＦ、遺伝子、または遺伝子外領域の一部でもよく、あるいはその組合せでもよい。いくつかの例では、連続した少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約５０、または少なくとも約１００ヌクレオチドを欠失させ、挿入しまたは置換する。対象ゲノムセグメントが抗原決定基をコードするとき、ゲノムセグメントは、哺乳動物宿主中で体液性または細胞媒介免疫応答を引き出すことができる少なくとも１つの免疫原性エピトープをコードする。ゲノムセグメントは、免疫原性断片またはタンパク質ドメインをコードすることもできる。例えば、供与体のゲノムセグメントは、複数の、反復するまたは異なる免疫原性ドメインまたはエピトープを含む、組換えにより合成された配列を含めて、複数の免疫原性ドメインまたはエピトープをコードすることができる。
【０１３１】
キメラＨＭＰＶは、広範囲の非ＨＭＰＶ病原体の１つまたは複数の主要な抗原決定基を発現するように作製することができる。本明細書で開示される方法は一般に、例えば、病原体の中でも、Ａ亜型およびＢ亜型ＲＳＶ、ＨＭＰＶ、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、１型および２型ヒト免疫不全ウイルス、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバー（Epstein Barr）ウイルス、フィロウイルス（filovirus）、ブンヤウイルス（bunyavirus）、フラビウイルス（flavivirus）、アルファウイルス（alphavirus）およびインフルエンザウイルス由来の抗原決定基の組込みに適応可能である。免疫原性組成物の開発の標的とすることができる病原体には、ウイルスおよび細菌病原体、ならびに原生動物および多細胞病原体がある。これに関する多数の重要なヒト病原体に由来する有用な抗原決定基は知られており、またはキメラＨＭＰＶ内に組み込まれるかどうか容易に確認されている。したがって、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質；ＲＳＶのＦ、Ｇ、ＳＨおよびＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒト乳頭種ウイルスＬ１タンパク質、１型または２型ヒト免疫不全ウイルスｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスのｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬおよびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタインバーウイルスｇｐ３５０タンパク質；フィロウイルスＧタンパク質、ブンヤウイルスＧタンパク質、フラビウイルスＥおよびＮＳ１タンパク質、ならびにアルファウイルスＥタンパク質を含めて、前記の例示的な病原体について主要抗原が同定されている。これらの主要抗原、ならびに列挙した病原体および他の病原体について当技術分野で知られている他の抗原は、全長タンパク質ならびにその成分をなす抗原性ドメイン、断片およびエピトープを含めて、多数のその抗原決定基が、そのそれぞれの免疫原的活性について同定され、位置付けられ、特徴付けられている程度まで十分に特徴付けられている。
【０１３２】
本明細書で開示されるキメラＨＭＰＶの方法で使用する多様な病原体の主要抗原を同定し特徴付ける多数の例示的な地図作製研究の中に、例えば、ＰＩＶの免疫原性糖タンパク質を対象とするエピトープ地図作製研究がある。その対象の方法および手段を例示すると、ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３７５〜３８２、１９８９）は、ＨＰＩＶ３の融合（Ｆ）糖タンパク質の抗原構造、生物学的特性、および天然の異型を調べるのに使用した２６種のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（１４種が中和するもの、１２種が中和しないもの）について記載した。研究室で選択された抗原異型およびＰＩＶ３の臨床単離物の分析から、その一団のＭＡｂが少なくとも２０種のエピトープを認識し、そのうち１４種が中和に関与するものであることが示唆された。競合的結合アッセイから、１４種の中和エピトープが、３つの重複しない主要な抗原性領域（Ａ、Ｂ、およびＣ）および１つの架橋部位（ＡＢ）に組織化され、６種の非中和エピトープが、４つの部位（Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）を形成することが確認された。ほとんどの中和ＭＡｂは非相互の競合的結合反応に関与し、このことから、これらが他の中和エピトープの構造変化を誘導することが示唆された。これらのおよび関連する方法は、異種ウイルスの中で、本開示のＨＭＰＶベクターによる発現の候補となる抗原決定基を容易に決定するのに役立つ。
【０１３３】
本開示内で使用する他の抗原決定基は、ＲＳＶで同定され特徴付けられている。例えば、Ｂｅｅｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２９４１〜２９５０、１９８９では、ＲＳＶのＡ２株の融合糖タンパク質に特異的な１８種の中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を使用して、ＲＳＶの中和および融合に関与するエピトープの詳細な位相的作動的地図を構築した。競合的結合アッセイで、３つの重複しない抗原性領域（Ａ、Ｂ、およびＣ）および１つの架橋部位（ＡＢ）が同定された。１３種のＭＡｂ抵抗性変異体（ＭＡＲＭ）が選択され、ＭＡＲＭまたはＲＳＶ臨床株を用いたＭＡｂの中和パターンから、最低で１６種のエピトープが同定された。抗体で６種に選択された部位ＡおよびＡＢのエピトープを有するＭＡＲＭは小プラークの表現型を示し、これはＦ分子の生物学的に活性のある領域における変化と一致する。ＭＡＲＭの分析から、これらの中和エピトープが、位置的に異なっているが構造的に相互依存している領域を占め、その領域は独特の生物学的または免疫学的性質を有することも示唆された。次いで、１８種の抗Ｆ  ＭＡｂを用いた交差中和アッセイで、２３種の臨床単離物（１８種がＡ亜型、５種がＢ亜型）を使用することによって、Ｆエピトープにおける抗原異型を調べた。この分析から、分子上の不変領域、可変領域、および超可変領域が同定され、ＲＳＶのＦ糖タンパク質の中和エピトープにおける抗原異型が、累積されない遺伝子不均一性の結果生じることが示唆された。１６種のエピトープのうち、８種はＡ亜型またはＢ亜型の臨床単離物２３種すべてで、または１種を除いてすべてで保存されていた。全長タンパク質およびその成分をなす抗原性ドメイン、断片およびエピトープを含めて、これらの抗原決定基はすべて、上記に記載の新規の免疫応答を引き出す、本開示のキメラＨＭＰＶ内への組込みの有用な候補となる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５１：６２６〜６３３、１９８５；Ｃｏｅｌｉｎｇｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３７５〜３８２、１９８９；Ｆｅｎｎｅｒら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：３３５〜３４０、１９８６；Ｆｅｍｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１７１：２６６〜２７１、１９８２；Ｓａｔｏら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１３９７〜１４０９、１９８５；Ｗａｌｓｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５０５〜５１３、１９８６およびＯｌｍｓｔｅｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：４１１〜４２０、１９８９も参照）。
【０１３４】
異種ＨＭＰＶおよび非ＨＭＰＶ病原体の抗原決定基を発現させるために、多数の方法および構築物を本明細書において提供する。特定の詳細な実施形態では、抗原性タンパク質をコードする遺伝子（例えば、ＲＳＶのＦまたはＧ遺伝子）のＯＲＦを含む転写単位を、ＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムの様々な位置に付加し、それによって例示的なキメラ「ベクター」候補が得られる。例示的な実施形態では、感染性のある弱毒化した候補を生成するために、ＲＳＶ由来の防御抗原をコードする異種ヌクレオチド配列を組み込んだキメラＨＭＰＶを作製する（１９９７年４月３日公開の国際公開ＷＯ９７／１２０３２号、および１９９５年９月２７日出願の米国仮特許出願第６０／００７，０８３号に該当する１９９６年９月２７日出願の米国特許出願第０８／７２０，１３２号；１９９６年７月１５日出願の米国特許仮出願第６０／０２１，７７３号；１９９７年５月９日出願の米国仮特許出願第６０／０４６，１４１号；１９９７年５月２３日出願の米国特許仮出願第６０／０４７，６３４号；１９９８年１月２２日公開の国際公開ＷＯ９８／０２５３０号に該当する１９９７年７月１５日出願の米国特許出願第０８／８９２，４０３号；２０００年１０月１９日公開の国際公開ＷＯ００／６１６１１号に該当し、１９９９年４月１３日出願の米国仮特許出願第６０／１２９，００６号の優先権を主張する１９９９年４月１３日出願の米国特許出願第０９／２９１，８９４号；２００１年１月１８日公開の国際公開ＷＯ０１／０４３３５号に該当し、１９９９年４月１３日出願の米国仮特許出願第６０／１２９，００６号、１９９９年７月９日出願の６０／１４３，０９７号、および１９９９年７月９日出願の６０／１４３，１３２号の優先権を主張する２０００年６月２３日出願の米国特許出願第０９／６０２，２１２号；２０００年１０月１９日公開の国際公開ＷＯ００／６１７３７号；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１１５６３〜１１５６７、１９９５；Ｂｕｋｒｅｙｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６６３４〜４１、１９９６；Ｊｕｈａｓｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５８１４〜５８１９、１９９７；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７；Ｈｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３７：２４９〜２６０、１９９７；Ｂａｒｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５〜１２７１、１９９７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４７：２３２〜９、１９９８ａ；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４４６７〜４４７１、１９９８ｂ；Ｊｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６〜２１４、１９９８；ならびにＷｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３４３８〜３４４２、１９９９；ならびにＢｕｋｒｅｙｅｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２３６７〜７２、１９９９を参照）。本明細書に組み込むまたは示す他の報告および議論は、本開示の中で有用なＲＳＶの抗原決定基を同定し特徴付けるものである。
【０１３５】
１つまたは複数のＲＳＶの抗原決定基を組み込むＨＭＰＶキメラは、抗原性ＲＳＶ糖タンパク質、タンパク質ドメイン（例えば、糖タンパク質の外部ドメイン）、あるいは１つまたは複数の免疫原性エピトープをコードする異種遺伝子またはゲノムセグメントと組み合わせたＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムを含み得る。一実施形態では、ＲＳＶのＳＨ、Ｍ２、Ｆ、および／またはＧ遺伝子由来の１つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントを、ＨＭＰＶベクターゲノムまたはアンチゲノムと組み合わせて、キメラＨＭＰＶ候補を形成する。これらの構築物のうち特定のものは、キメラタンパク質、例えば、場合によってはＨＭＰＶに対してもＲＳＶに対しても多価の免疫応答を引き出す新規の弱毒化したウイルスを得るために対応するＲＳＶ糖タンパク質の外部ドメインと融合させたＨＭＰＶの細胞質側の尾部および／または膜貫通ドメインを有する融合タンパク質を発現する。
【０１３６】
特定の実施形態では、所定の計画でｒＨＭＰＶを含む免疫原性組成物を投与し、１種または複数種のさらなる免疫原性成分、例えばＲＳＶまたはＰＩＶに対する第２の免疫原性組成物を抗ＨＭＰＶ組成物の前または後に投与することは有用である。ＲＳＶおよびＨＰＩＶ３は、生後最初の４カ月以内にかなりの疾患を引き起こすが、ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２が引き起こす疾患のほとんどは、６カ月齢後に生じる（Ｃｈａｎｏｃｋら、Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｋｎｉｐｅら（編）中のｐｐ．１３４１〜１３７９、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、２００１；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１中のｐｐ．１２０５〜１２４３、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６；Ｒｅｅｄら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７５：８０７〜１３、１９９７）。したがって、特定の連続した免疫感作プロトコルでは、他のウイルスを対象とする第２の免疫原性組成物の投与の前、それと同時に（例えば、組み合わせた免疫原性組成物として）、またはそれに続けて、ＨＭＰＶに対して免疫応答を引き出す、本明細書に記載の免疫原性組成物を投与する。一実施形態では、ＨＭＰＶに対して、またはＨＭＰＶおよびＲＳＶに対して免疫応答を引き出す免疫原性組成物を生後早期に１回、２回またはそれ以上投与し、その最初の投与は１カ月齢で、またはそれより前に行い、その後ＨＰＩＶ１および／またはＨＰＩＶ２に対する免疫原性組成物を約４カ月齢および６カ月齢で投与する。あるいは、ＨＭＰＶ、ＲＳＶ、および１種または複数種のＰＩＶに対する免疫原性成分を、同時にあるいは複数成分の免疫原性組成物として投与すると有利である可能性がある。
【０１３７】
したがって、ＨＭＰＶ、ＲＳＶ、および１種または複数種のＰＩＶを含めた複数の病原性作用因子に関して、組合せの免疫原性組成物、および協調的な免疫感作プロトコルを本明細書において提供する。例示的な実施形態では、ＨＭＰＶ、ＲＳＶおよび／またはＰＩＶ３に対する早期の免疫感作を標的とするように、これらの方法および製剤を一時的に選択する。例示的な免疫感作の順序の一つでは、ＨＭＰＶ、ＲＳＶおよび／またはＰＩＶ３に対する１つまたは複数の弱毒化した生の免疫原性組成物を、早くも１カ月齢で（例えば、１カ月齢および２カ月齢で）使用し、その後一価または二価のＰＩＶおよび／またはＰＩＶ２の免疫原性組成物を４カ月齢および６カ月齢で使用する。本明細書で開示される方法を使用して、協調的に、例えば、混合物中で同時に、または規定の時間的な順序で（例えば、日毎または週毎の順序で）別々に１つまたは複数のキメラＨＭＰＶ候補を含めた複数の免疫原性組成物を投与することができ、好ましくは各ウイルスが、例えば異なる異種防御抗原を発現する。このような協調的な／時系列の免疫感作戦略は、複数の呼吸器のウイルス病原体に対する二次抗体応答を誘導することができ、乳児期早期に複数の病原体に対して免疫感作する必要に駆られた、非常に強力なかつ極めて柔軟な免疫感作法を提供する。
【０１３８】
上記に示したように、本開示は、広範囲の変化をＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム内で組換えにより生じさせ、それによって所望の表現型変化を特定する確定された突然変異が得られる。様々な従来の技術（例えば、部位特異的突然変異誘発）によって、ゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡ複製物中に確定された突然変異を導入することができる。ゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡ細断片を使用して、本明細書に記載の完全なゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡを構築することは、各領域を別々に操作することができる利点があり、小さなｃＤＮＡ構築物は、大きなｃＤＮＡ構築物より良好な操作容易性をもたらし、次いで完全なｃＤＮＡを構築することが容易である。したがって、完全なアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡ、あるいは選択したその細断片を鋳型として、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発に使用することができる。これは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）のＭＵＴＡ−ｇｅｎ（登録商標）キットを使用するなど、一本鎖ファージミド型の中間体を介して、あるいはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のＣｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）突然変異誘発キットなど二本鎖プラスミドを鋳型として直接使用する方法により、あるいは対象とする突然変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーまたは鋳型を使用するＰＣＲによって行うことができる。次いで、変異した細断片から完全なアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡを構築することができる。様々な他の突然変異誘発技術は既知であり、本開示のＨＭＰＶアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡ中に対象とする突然変異を生成する際の使用に、それを通常通りに適合させることができる。
【０１３９】
したがって、例示的な一実施形態では、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＭＵＴＡ−ｇｅｎｅ（登録商標）ファージミドｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キットを用いることによって突然変異を導入する。簡単に述べると、ＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡをプラスミドｐＴＺ１８Ｕ中にクローン化し、これを使用してＣＪ２３６細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換する。ファージミド調製物を、製造業者の推奨の通りに調製する。オリゴヌクレオチドは、ゲノムまたはアンチゲノムの所望の位置で変化したヌクレオチドの導入による突然変異誘発用に設計する。遺伝子変化したゲノムまたはアンチゲノムを含むプラスミドを次いで増幅する。
【０１４０】
突然変異は、単一のヌクレオチド変化から、１つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントを含む大きなｃＤＮＡセグメントの導入、欠失または置換まで様々であり得る。ゲノムセグメントは、構造的および／または機能的ドメイン、例えば、タンパク質の細胞質、膜貫通または外部ドメイン、異なるタンパク質との結合または他の生化学的相互作用を媒介する部位などの活性部位、エピトープ部位、例えば、抗体結合および／または体液性もしくは細胞媒介免疫応答を刺激する部位などに対応し得る。これに関して有用なゲノムセグメントは、タンパク質の小さな機能的ドメイン、例えばエピトープ部位をコードするゲノムセグメントの場合で約１５〜３５ヌクレオチドから、約５０、約７５、約１００、約２００〜５００、および約５００〜１５００ヌクレオチド以上である。
【０１４１】
規定された突然変異を感染性の組換えＨＭＰＶ中に導入できることは、ＨＭＰＶの病原性のおよび免疫原性の機構を操作することを含めて、多数の応用を有する。例えば、タンパク質発現レベルを消失または低下させる、あるいは変異タンパク質が生じる突然変異を導入することにより、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｍ２、ＳＨ、Ｇおよび／またはＬタンパク質を含めたＨＭＰＶタンパク質の機能を操作することができる。本開示の方法および組成物の範囲内で、プロモーター、遺伝子間領域や転写シグナルなど、様々なゲノムＲＮＡ構造の特徴を通常通りに操作することもできる。例えば、その救済(rescue)依存的な段階が、過度に抑制的であるので複製に非依存的な感染性ウイルスで回復できないことがあるこの変異体を特徴付ける際に有用である、ＨＭＰＶミニゲノムを使用するアッセイ（Ｄｉｍｏｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２７７２〜８、１９９３、その全体を本明細書に組み込む）と並行して完全なアンチゲノムｃＤＮＡを使用することにより、トランス作用性タンパク質およびシス作用性ＲＮＡ配列の効果を容易に決定することができる。
【０１４２】
組換えＨＭＰＶ内の遺伝子またはゲノムセグメントの特定の置換、挿入、欠失または再構成（例えば、選択したタンパク質またはタンパク質の領域、例えば細胞質側の尾部、膜貫通ドメインまたは外部ドメイン、エピトープ部位または領域、結合部位または領域、活性部位または活性部位を含む領域などをコードするゲノムセグメントの置換）を、同じまたは異なるＨＭＰＶあるいは他の供給源に由来する、存在する「対応物(counterpart)」遺伝子またはゲノムセグメントとの構造的なまたは機能的な関係で行う。このような改変によって、野生型または親ＨＭＰＶあるいは他のウイルス株と比べて所望の表現型変化を有する新規の組換え体が得られる。例えば、この型の組換え体は、本開示のｒＨＭＰＶの外部ドメインと融合した、ＨＭＰＶの１種の、またはＰＩＶやＲＳＶなど非ＨＭＰＶウイルスの細胞質側の尾部および／または膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質を発現することができる。この型の他の例示的な組換え体は、重複した免疫原性領域などの重複したタンパク質領域を発現する。
【０１４３】
本明細書で用いられる「対応物」遺伝子、ゲノムセグメント、タンパク質またはタンパク質領域とは、通常異種の供給源に由来するもの（例えば、異なるＨＭＰＶ遺伝子に由来するもの、あるいは異なるＨＭＰＶの型または株中の同じ（すなわち、相同なまたは対立遺伝子である）遺伝子またはゲノムセグメントを示すもの）である。これに関して選択される典型的な対応物は、全体的な構造の特徴を共有し、例えば、各対応物は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、外部ドメイン、結合部位または領域、エピトープ部位または領域などの同等なタンパク質またはタンパク質構造ドメインをコードし得る。対応物ドメインおよびそれをコードするゲノムセグメントは、ドメインまたはゲノムセグメント異型中で共通する生物学的活性によって規定される一連のサイズおよび配列異型を有する種の集合を包含する。
【０１４４】
組換えＨＭＰＶを作製するための、本明細書で開示する対応物遺伝子またはゲノムセグメント、ならびに他のポリヌクレオチドは、選択されたポリヌクレオチドである「基準配列」と、例えば、他の選択された対応物配列と実質的な配列同一性を有することが多い。本明細書で用いられる「基準配列」とは、配列比較のための基礎として使用する確定された配列、例えば、全長ｃＤＮＡまたは遺伝子のセグメント、あるいは完全なｃＤＮＡまたは遺伝子の配列である。一般に、基準配列は、少なくとも長さ２０ヌクレオチドであり、頻繁には少なくとも長さ２５ヌクレオチドであり、しばしば少なくとも長さ約５０ヌクレオチドである。２つのポリヌクレオチドが、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で同様の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含み得るため、かつ（２）２つのポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は通常、配列類似性がある局所領域を識別し比較する「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」にわたって、２つのポリヌクレオチド配列を比較することによって行われる。本明細書で使用する「比較ウインドウ」とは、連続した少なくとも２０ヌクレオチド位置の概念的なセグメントを指し、連続した少なくとも２０ヌクレオチドの基準配列とポリヌクレオチド配列を比較することができ、比較ウインドウ中でのポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントを行うために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比べて２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、１９８１）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、１９７０）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性の方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４、１９８８）のための検索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または閲覧によって比較ウインドウのアライメントをとるのに最適な配列のアライメントを行うことができ、様々な方法で生じた最良のアライメント（すなわち、比較ウインドウにわたって配列類似性の最高の百分率が得られたもの）を選択する。「配列同一性」という用語は、比較ウインドウにわたって２つのポリヌクレオチド配列が同一（すなわち、ヌクレオチド単位に基づいて）であることを意味する。「配列同一性の百分率」という用語は、比較ウインドウにわたって最適にアライメントをとった２つの配列を比較して算出するものであり、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）がどちらの配列にもある位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較���インドウ中の位置の合計数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けると配列同一性の百分率が得られる。本明細書で用いられる「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチド配列の性質を示すものであり、この場合、ポリヌクレオチドは、少なくとも２０ヌクレオチドの位置の比較ウインドウにわたって、頻繁には少なくとも２５〜５０ヌクレオチドのウインドウにわたって基準配列と比較して配列同一性が少なくとも８５％であり、好ましくは配列同一性が少なくとも９０〜９５％であり、より一般には配列同一性が少なくとも９９％である配列を含み、配列同一性の百分率は、比較ウインドウにわたって基準配列の合計２０％以下である欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列と基準配列を比較することによって算出する。基準配列は、大きな配列の一部でもよい。
【０１４５】
これらのポリヌクレオチド配列の関係に加えて、組換えＨＭＰＶによってコードされるタンパク質またはタンパク質の領域はまた、選択された基準ポリペプチドと通常保存的な関係を有するように、すなわち、実質的な配列同一性または配列類似性を有するように選択される。ポリペプチドに適用する場合、「配列同一性」という用語は、ペプチドが対応する位置で同一のアミノ酸を共有することを意味する。「配列類似性」という用語は、ペプチドが対応する位置で同一のまたは類似のアミノ酸を有すること（すなわち、保存的置換）を意味する。「実質的な配列同一性」という用語は、２つのペプチド配列が、初期設定のギャップ重みづけ（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）を用いたプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアライメントをとったとき、少なくとも９０％の配列同一性、少なくとも９５％の配列同一性またはそれ以上（例えば、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）など少なくとも８０％の配列同一性を有することを意味する。「実質的な類似性」という用語は、２つのペプチド配列が、対応する配列類似性の百分率を有することを意味する。好ましくは、同一でない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によっても異なる。保存的なアミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有する群のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有する群のアミノ酸は、セリンおよびスレオニンであり、アミドを含む側鎖を有する群のアミノ酸は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有する群のアミノ酸は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有する群のアミノ酸は、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄を含む側鎖を有する群のアミノ酸は、システインおよびメチオニンである。例示的な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書で使用する、天然に存在する２０種のアミノ酸の略記は、従来の慣習に従っている（Ｉｍｍｎｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｅ．Ｓ．ＧｏｌｕｂおよびＤ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡ、１９９１）。従来のアミノ酸２０種の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など非天然アミノ酸、乳酸、および他の非従来型アミノ酸は、本開示のポリペプチドに適した成分である可能性がある。非従来型アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似したアミノ酸ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）がある。さらに、アミノ酸は、グリコシレーション、リン酸化などにより修飾することができる。
【０１４６】
候補ウイルスを選択するために、生存性、弱毒化および免疫原性の基準を、周知の方法に従って決定する。免疫原性組成物中で最も望ましいウイルスは、生存力を維持し、安定した弱毒化の表現型を有し、免疫感作した宿主中で（低いレベルであっても）複製を示し、所望の免疫応答を引き出すのに十分な受容体において免疫応答の発生を有効に引き出さなければならない。組換えＨＭＰＶは、生存力があるだけでなく適当に弱毒化され、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝的により安定であり、すなわち免疫応答を刺激し、場合によっては、複数の改変によって引き出された免疫応答を拡大する、例えば、異なるウイルス株または亜型に対する免疫応答を誘導する、あるいは異なる免疫学的基準、例えば、分泌型対血清イムノグロブリン、細胞性免疫などによって媒介される応答を刺激する能力を保持している。
【０１４７】
よく知られ一般に受け入れられている様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルで組換えＨＭＰＶを試験して、十分な弱毒化、表現型復帰変異に対する抵抗性、および免疫原性について確認することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、改変したウイルス（例えば、多重に弱毒化したＨＭＰＶ、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ、または組換えＨＭＰＶ）を、例えば、ウイルス複製の温度感受性すなわちｔｓ表現型があるかどうか、小プラークが生じるかどうか、または他の所望の表現型があるかどうかを試験する。改変したウイルスを、ＨＭＰＶ感染の動物モデルでさらに試験する。様々な動物モデルが記載されており、本明細書に組み込まれる様々な参照文献中にその概要が示されている。ＨＭＰＶ候補の弱毒化および免疫原的活性を評価するための、げっ歯類および非ヒト霊長類を含むＨＭＰＶモデル系は、当技術分野で広く受け入れられ、そこから得られたデータは、ヒトにおけるＨＭＰＶの感染、弱毒化および免疫原性とよく相関する。
【０１４８】
前記の記載に従って、本開示はまた、免疫原性組成物で使用する感染性の単離された組換えＨＭＰＶを提供する。免疫原性組成物の成分である弱毒化ウイルスは、単離され、通常は精製された形で存在する。「単離された」とは、感染した個体の鼻咽頭など、野生型ウイルスの生来の環境以外に存在するＨＭＰＶを指すことを意味する。より一般には、単離されたとは、細胞培養のまたは他の人工培地の成分として弱毒化ウイルスを含むことを意味し、そこで、調節された設定でそれを増殖させ、特徴付けることができる。例えば、感染した細胞を培養し、細胞培養物から分離し、安定化剤を加えることによって弱毒化したＨＭＰＶを作製することができる。
【０１４９】
免疫原性組成物での使用では、本開示にしたがって生成した組換えＨＭＰＶを、製剤中に直接使用することもでき、所望された通りに、技術者に周知の凍結乾燥プロトコルを使用して凍結乾燥することもできる。凍結乾燥ウイルスは、約４℃で通常維持される。使用の準備のとき、凍結乾燥ウイルスを、安定化溶液中で、例えば、本明細書でさらに記載するように、ＳＰＧ、Ｍｇ＋＋およびＨＥＰＥＳを含み、アジュバントを含むまたは含まない食塩水中で戻す。
【０１５０】
ＨＭＰＶを基礎とする免疫原性組成物は、有効成分として、本明細書に記載の通りに生成した、免疫学的に有効な量の組換えＨＭＰＶを含む。生理的に許容される担体および／またはアジュバントとともに、改変したウイルスを宿主中に導入することができる。有用な担体は、当技術分野でよく知られており、それには、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などがある。得られた水性溶液は、上記で示したように、そのまま使用するために包装することもでき、あるいは、凍結乾燥し、投与前に凍結乾燥製剤を滅菌溶液と組み合わせることもできる。組成物は、生理的に近い条件が必要なとき、ｐＨ調整緩衝剤、等張性調整剤、湿潤剤など、製剤上許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリル酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含んでもよい。許容されるアジュバントには、当技術分野でよく知られている多数の他の適切なアジュバントの中でも、不完全フロイントアジュバント、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノリン脂質Ａ；Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＩＮ）およびＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）がある。
【０１５１】
エアロゾル、液滴、経口、局所または他の経路によって組換えＨＭＰＶ組成物で免疫感作させると、宿主の免疫系は、ＨＭＰＶタンパク質、例えばＦおよびＧ糖タンパク質に特異的な抗体を産生することによって免疫原性組成物に反応する。本明細書に記載の通りに作製した、免疫学的に有効な量の組換えＨＭＰＶで免疫感作させた結果、その宿主は、少なくとも部分的に、または完全に、標的ＨＭＰＶまたは非ＨＭＰＶ病原体による感染に対して免疫になり、あるいは、それによる中程度または重度の感染の発生に対して、特に下気道の感染の発生に対して抵抗性になる。
【０１５２】
免疫原性組成物を投与する宿主は、ＨＭＰＶまたは選択した非ＨＭＰＶ病原体による感染に感受性であり、その宿主が、免疫感作する株の抗原に対して免疫応答を生じさせることができるどんな動物でもよい。したがって、様々なヒトでのおよび獣医学上の使用のための免疫原性組成物を製造する方法を提供する。
【０１５３】
ＨＭＰＶ感染に感受性があり、またはその他の形でその感染の危険がある宿主に組換えＨＭＰＶを含む組成物を投与して、宿主自身の免疫応答能を高める。このような量を、「免疫学的に有効な量」と定義する。この使用では、有効投与量内で投与すべき組換えＨＭＰＶの正確な量は、宿主の健康状態および体重、投与形態、製剤の性質などに依存するが、一般に、１宿主当たりウイルス約１０３〜約１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）以上であり、より一般には、１宿主当たりウイルス約１０４〜１０６ＰＦＵである。いずれにしても、製剤は、宿主の患者で対象病原体に対して検出可能な免疫応答を引き出すのに十分な量の、本開示の改変ＨＭＰＶをもたらすべきである。
【０１５４】
組換えＨＭＰＶを他のＨＭＰＶ血清型または株のウイルスと組み合わせて、複数のＨＭＰＶ血清型または株に対して所望の免疫応答を引き出すことができる。あるいは、本明細書に記載のように、１つのウイルス中に作製した複数の血清型または株の防御エピトープを組み合わせることにより、複数のＨＭＰＶ血清型または株に対する免疫応答を実現することもできる。通常、異なるウイルスを投与するときに、これらは混合した状態であり、同時に投与されるが、これらを別々に投与することもできる。１つの株での免疫感作によって、同じまたは異なる血清型の異なる株に対して免疫感作することができる。
【０１５５】
いくつかの例では、組換えＨＭＰＶ免疫原性組成物を、他の作用因子、特に他の小児期のウイルスに対する免疫応答を誘導する免疫原性組成物と組み合わせることが望ましいことがある。本開示の他の態様では、他の病原体の防御抗原をコードする配列を、本明細書に記載のように感染性ウイルスを生成するのに使用する組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中に組み込むことにより、組換えＨＭＰＶをＲＳＶなど他の病原体の防御抗原のベクターとして使用することができる。
【０１５６】
すべての被験者において、投与する組換えＨＭＰＶの正確な量、ならびに投与の時期および反復回数は、患者の健康状態および体重、投与形態、製剤の性質などに基づく従来の方法を使用して決定する。投与量は、一般に１患者当たりウイルス約１０３〜約１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）以上であり、より一般には、１患者当たりウイルス約１０４〜１０６ＰＦＵである。いずれにしても、製剤は、例えば、数ある方法の中で特に、血球凝集反応阻止、補体結合、プラーク中和反応、および／または固相酵素免疫検定法によって決定することができる抗ＨＭＰＶまたは他の抗病原体免疫応答を有効に刺激しまたは誘導するのに十分な量の弱毒化組換えＨＭＰＶをもたらすべきである。これに関して、個人はまた、上気道疾患の徴候および症状についてモニターされる。チンパンジーへの投与の場合と同様に、その弱毒化ウイルスは、受容者の鼻咽頭中で、野生型ウイルスの約１／１０またはそれより低いレベルで、または不完全に弱毒化したウイルスのレベルと比べて約１／１０またはそれより低いレベルで増殖する。
【０１５７】
新生児および小児では、十分なレベルの免疫を引き出すのに複数の投与が必要となる可能性がある。投与は、生後最初の１カ月以内に開始し、小児期を通じて、天然の（野生型の）ＨＭＰＶ感染に対して免疫応答を維持するのに必要な、２カ月、６カ月、１年および２年などの間隔をおいて行うべきである。同様に、反復または重度ＨＭＰＶ感染を特に受けやすい成人、例えば、医療従事者、保育所勤務者、幼い子供がいる家族の一員、老人、心肺機能に障害がある個人などは、免疫応答を確立しかつ／または維持するのに複数回の免疫感作を必要とする可能性がある。分泌型および血清の中和抗体の量を測定することにより誘導免疫レベルをモニターし、所望のレベルの免疫応答を維持するのに必要な投与量を調整し、または接種を反復することができる。さらに、別の候補ウイルスが、別の受容者群への投与について示唆されることがある。例えば、サイトカイン、またはＴ細胞エピトープに富む追加のタンパク質を発現する工学的に作製されたＨＭＰＶは、小児ではなく成人に特に利点がある可能性がある。
【０１５８】
ＨＭＰＶに基づく免疫原性組成物を、ＨＭＰＶの他の亜型または株の抗原を発現するウイルスと組み合わせて、複数のＨＭＰＶ亜型または株に対して免疫応答を引き出すことができる。あるいは、候補ウイルスは、本明細書に記載のように、１つのＨＭＰＶクローン中に、工学的に作製された複数のＨＭＰＶ株または亜型の防御エピトープを組み込むこともできる。
【０１５９】
組換えＨＭＰＶ免疫原性組成物は、個人がその後野生型ＨＭＰＶに感染したとき、肺炎や細気管支炎など重篤な下気道疾患を軽減または緩和する免疫応答の発生を引き出す。天然に循環しているウイルスは依然として、特に上気道で感染を引き起こすことができるが、接種の結果として鼻炎が生じる可能性は非常に大きく低下する。野生型ウイルスのその後の感染によって抵抗の追加を起こすことができる。免疫感作後、検出可能なレベルの宿主の血清および分泌型の抗体が生じ、これは、同種の（同じ亜型の）野生型ウイルスをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで中和することができる。
【０１６０】
一実施形態では、組換えＨＭＰＶ候補は、ヒトに自然に感染する野生型ウイルスと比べて、かなりの毒性の低下を示す。ウイルスは、感染の症状が免疫感作した個人のほとんどで生じないように、十分に弱毒化している。いくつかの例では、弱毒化ウイルスは、免疫感作していない個人に播種する能力を依然として有する可能性がある。しかし、その毒性は、重度の下気道感染が免疫感作した宿主で生じないように十分抑制されている。
【０１６１】
組換えＨＭＰＶ候補の弱毒化のレベルは、例えば、免疫感作した宿主の気道中に存在するウイルスの量を定量し、野生型ＨＭＰＶ、または候補株として評価されている他の弱毒化ＨＭＰＶによって生じる量と比較することによって決定することができる。例えば、弱毒化ウイルスは、チンパンジーなどの高度に感受性である宿主の上気道中での複製がより高度に、例えば野生型ウイルスの複製レベルと比較して１／１０〜１／１０００未満に制限される。上気道でのウイルスの複製に関係する鼻漏の発生をさらに減らすために、有用な候補ウイルスは、上気道でも下気道でも複製のレベルの制限を示すべきである。しかし、弱毒化ウイルスは、免疫感作した個人中で所望の免疫応答を引き出すように、ヒトにおいて十分に感染性であり免疫原性でなければならない。感染した宿主の鼻咽頭におけるＨＭＰＶのレベルを決定する方法は、文献中でよく知られており、本明細書で開示される方法および組成物によって容易となる。
【０１６２】
本開示の免疫原性組成物によってもたらされた誘導免疫レベルは、分泌型および血清の中和抗体の量を測定することによってモニターすることもできる。この測定に基づいて、所望のレベルの免疫応答を維持するのに必要な投与量を調整し、または免疫感作を反復することができる。さらに、別の候補ウイルスが、別の受容者群に有利であることもある。例えば、Ｔ細胞エピトープに富む追加のタンパク質を発現する工学的に作製された組換えＨＭＰＶは、小児ではなく成人に特に利点がある可能性がある。
【０１６３】
他の実施形態では、気道の一過性遺伝子治療のベクターとして、組換えＨＭＰＶを使用する。この実施形態によれば、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムは、対象とする遺伝子産物をコードすることができる配列を組み込んでいる。対象とする遺伝子産物は、ＨＭＰＶ発現を制御するものと同じまたは異なるプロモーターの制御下にある。組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを、Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＨＭＰＶタンパク質と同時発現させることによって生成され、対象とする遺伝子産物をコードする配列を含む感染性組換えＨＭＰＶを患者に投与する。投与は通常、治療される患者の気道に対するエアロゾルによる、噴霧器による、または他の局所適用によって行われる。所望の遺伝子産物の治療または予防レベルの発現が生じるのに十分な量で、組換えＨＭＰＶを投与する。この方法の範囲内で投与することができる代表的な遺伝子産物は、例えば、インターロイキン２、インターロイキン４、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、および他のサイトカイン、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒素、癌抑制遺伝子、アンチセンスＲＮＡ、および他の候補抗原を含めて、好ましくは一過性発現に適している。
【０１６４】
下記の実施例は、限定ではなく例示の目的で提供するものである。これらの実施例は、ｃＤＮＡからＨＭＰＶを回収するための新規逆遺伝学系の開発、および新規組換えＨＭＰＶ候補を構築するためのこの系の使用について記載している。したがって、本開示の主題を、下記の非限定的な実施例によって例示される。
【０１６５】
実施例
モノネガウイルスは一般に、ヌクレオキャプシド中に堅く包まれたＲＮＡの一本のマイナスのセンス鎖を含むゲノムを有する。ヌクレオキャプシドと結合し、３’端で始まりサブゲノムｍＲＮＡを生成する一連の停止−開始機構によって遺伝子の線状アレイをコピーするプロセスによってゲノムの転写を指令する、ウイルスにコードされたポリメラーゼが存在する。複製はアンチゲノムと呼ばれる完全なプラスのセンス鎖のコピーの合成を含み、次いでこれが後代のゲノムを生成するための鋳型として働く。新たに合成されるウイルス糖タンパク質は、原形質膜に運ばれそこに蓄積する。ヌクレオキャプシドが改変型原形質膜のこれらの領域と結合し、出芽により脂質エンベロープが得られると、後代のウイルスが形成される。
【０１６６】
ＲＳＶ、次にＨＰＩＶ３は、乳児および幼い子供のウイルスによる下部気道疾患に関する入院の主な原因である（Ｃｏｌｌｉｎｓら、第４版、「Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」中、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｅｄｓ．、Ｖｏｌ．１、ｐｐ．１４４３〜１４８５、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＷｉｌｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、フィラデルフィア、２００１；Ｃｒｏｗｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：４１５〜４２１、１９９５；Ｍａｒｘら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７６：１４２３〜１４２７、１９９７）。ＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２は、咽頭気管支炎（クループ）の主な病因物質であり、肺炎および細気管支炎を引き起こすこともある（Ｃｈａｎｏｃｋら、第４版、「Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」中、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｅｄｓ．、Ｖｏｌ．１、ｐｐ．１３４１〜１３７９、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−ＷｉｌｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、フィラデルフィア、２００１）。ＲＳＶおよびＰＩＶは、成人の気道疾患の重要な原因である。利用可能な証拠によって、ＨＭＰＶもヒト気道疾患、特に乳児および子供の重要な物質であるが、あらゆる年齢群で発生することが示される（Ｂｏｉｖｉｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８６：１３３０〜６、２００２）。
【０１６７】
細胞培養においてＨＭＰＶはゆっくりと非効率的に複製し、研究室内でそれを維持し研究するのは比較的骨が折れることになる。さらに、ウイルスの感染を活性化させるために、トリプシンが培地中に存在しなければならないことが報告されており、このことがウイルスを首尾よく伝播させるために必要な長時間のインキュベーションを複雑にしている。実際、ＨＭＰＶ伝播における難点によって、世界中の多くの病院および研究施設での細胞培養における気道用試料の数十年の広範囲の培養にもかかわらず、なぜそれが重要な気道の病原体としての検出を以前に免れたかの説明が与えられる。
【０１６８】
ＲＳＶおよびＰＩＶを作製するための方法は当分野で知られており、これらのウイルスに対する免疫応答を誘導するための組成物が記載されてきている（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１７６２〜１７６８、１９９８；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４〜１３８１、１９９９；Ｔａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：３６２０〜３６３１、２００１；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｊ．ＶｉｒｏＬ  ７４：６８２１〜６８３１、２０００；１９９８年５月２２日に出願された米国特許出願第０９／０８３，７９３号；１９９９年１２月１０日に出願された米国特許出願第０９／４５８，８１３号；１９９９年１２月１０日に出願された米国特許出願第０９／４５９，０６２号；１９９７年５月２３日に出願された米国仮出願第６０／０４７，５７５号（国際公開Ｎｏ．ＷＯ９８／５３０７８に対応）；１９９７年９月１９日に出願された米国仮出願第６０／０５９，３８５号；１９９９年１２月１０日に出願された米国仮出願第６０／１７０，１９５号；および２０００年１２月８日に出願された米国特許出願第０９／７３３，６９２号（国際公開Ｎｏ．ＷＯ０１／４２４４５Ａ２に対応）を参照のこと、それぞれ参照により本明細書に組み込まれている）。しかしながらＨＭＰＶは、モノクローナル抗体などの利用可能な参照試薬または利用可能な参照ウイルス株、ならびにＨＭＰＶを検出および分析するための確立された方法が存在しない対照的な状況をもたらす。ＨＭＰＶの分子生物学に関する知識は依然として未熟な状態であり、これは以前は主に他のウイルスからの推定に基づくものであった。ＨＭＰＶはごく最近同定され、その特徴付けは非常に不完全であるので、免疫原および診断組成物中に使用するための適切に弱毒化され、免疫原性があり、遺伝的に安定しているＨＭＰＶを作製するためには、多くの難題が存在した。これらの目標を容易にするためには、ｃＤＮＡから組換え感染性ＨＭＰＶを作製して、所定の弱毒化突然変異体の開発および段階的導入、既存の遺伝子の欠失、改変又は再編成、外来遺伝子の導入、株間の防御抗原の交換、およびＨＭＰＶ株間およびＨＭＰＶと他の関連ウイルスの間の、弱毒化または他の目的とする突然変異体の交換を含む操作の開始地点として働かせること、ならびに免疫原性組成物、ベクターおよび免疫処置法を得るための追加的なツールを提供することが必要である。本開示は、ｃＤＮＡからの組換え感染性ＨＭＰＶ、およびこのｃＤＮＡを含む弱毒化突然変異体の作製、ならびに既存の遺伝子内の特異的欠失および置換、異種核酸配列の導入、ならびに他の方法、およびＨＭＰＶに対する免疫応答を引き起こすように設計された方法において使用される組成物を記載する。
【実施例１】
【０１６９】
ＨＭＰＶのゲノムに関する完全な共通配列の決定
この実施例は、ＨＭＰＶの完全なゲノム配列を提供する。この分析の主題のウイルス株は、株ＣＡＮ９７−８３であり（Ｐｅｒｅｔら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８５：１６６０〜３、２００２）、ここでは以後株８３またはＣＡＮ８３と呼ぶ。ウイルスＲＮＡの非クローン化ＲＴ−ＰＣＲ産物を直接分析することによって配列を決定し、これによって生存力のあるウイルスの共通配列または主要配列を表す。このウイルスの毒性、したがって野生型状態は、以下の実施例中に記載したように、チンパンジーにおいて鼻腔内接種の後に、気道疾患の徴候を誘導する能力によって確認した。完全な真正野生型ＨＭＰＶの配列の決定は、明確な配列のＨＭＰＶを作製するシステムを開発する際に必要なステップであり、免疫原性組成物および方法における使用に特有である。
【０１７０】
細胞系およびウイルス
ＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２３）、Ｖｅｒｏ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）およびＬＬＣ−ＭＫ２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７．１）細胞を、５％ウシ胎児血清、いくつかの場合硫酸ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補充したＯｐｔｉＭＥＭＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧＩＢＣＯ）中に維持した。ＢＳＲＴ７／５細胞は、形質転換されＴ７ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現する、ベビーハムスター腎臓２１（ＢＨＫ−２１）細胞である（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ．７３：２５１〜９）。これらは、グルタミンおよびアミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および５％ウシ胎児血清を補充したＧｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ中に維持した。ＢＳＲＴ７／５細胞を、２継代毎にゲネチシン（１ｍｇ／ｍｌ）選別に供した。生物学的および組換えＨＭＰＶを、血清の不在下および５μｇ／ｍｌのトリプシンの存在下において、Ｖｅｒｏ、ＬＬＣ−ＭＫ２、またはＢＳＲＴ７／５細胞中に伝播させた。
【０１７１】
ウイルス粒子ＲＮＡの単離
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の融合した単層をＨＭＰＶに感染させ、５μｇ／ｍｌのトリプシンの存在下において３２℃でインキュベートした。感染後１０〜１４日で、浄化した上清を採取した。ウイルス粒子ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）は、製造者の教示書に従いＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して浄化した上清から直接単離した。あるいは、ウイルスはスクロース勾配遠心分離によって精製した。上清および感染細胞はラバーポリスマンを用いて削ぎ落とすことによって採取し、ＨＥＰＥＳ緩衝液およびＭｇＳＯ４とそれぞれ５０ｍＭおよび０．１Ｍの最終濃度で混合させ、次いで３サイクルの凍結および解凍に供した。混合物を低速遠心分離によって浄化し、ウイルスは４℃で一晩７０００ｒｐｍでの遠心分離によってペレット状にした。ウイルスのペレットは、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液および０．１ＭのＭｇＳＯ４を含むＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に再懸濁させた。ウイルスの懸濁液を３０〜６０％のスクロース勾配で層状にし、ＳＷ２８ローター中において２６，０００ｒｐｍで９０分間遠心分離にかけた。上部ウイルス含有分画を回収し、ＴＥＮ（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、０．１ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）に希釈し、９０分間ＳＷ２８ローター中において２５，０００ｒｐｍでの遠心分離によって、ウイルス粒子をペレット状にした。ウイルスのペレットはＴＥＮに再懸濁させ、製造者の教示書に従いＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してアリコートからｖＲＮＡを直接単離した。
【０１７２】
逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応およびヌクレオチド塩基配列決定
公開されているＨＭＰＶ株００−１の一部分の配列から作製した特異的プライマーを使用して、ｖＲＮＡを逆転写した。大抵の場合、これらはＲＴ−ＰＣＲ産物を生成することができず、これら２つの株間のヌクレオチド配列の違いをおそらく反映する。したがって、他のモノネガウイルスとの類似性によって、ＨＭＰＶ株間でより高度に保存されているであろうシス作用性シグナルを含むと思われる、００−１配列中のＯＲＦ間の領域に基づいて追加のプライマーを設計した。この戦略によって株８３のＲＴ−ＰＣＲ産物が得られ、これから、配列分析によって、株８３特異的プライマーを設計するための情報が得られた。精製したＲＮＡは５０ｐｍｏｌの異なるプライマーと水中に１４μｌの最終体積で混合させ、変性およびアニーリングステップ用に７０℃で５分間、６０℃で２５分間インキュベートした。次いで、５μｌの５×ファーストストランド緩衝液ＩＩ、１μｌの１０ｍＭデオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、２μｌの０．１Ｍジチオスレイトール、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、反応混合物に加えた。ＲＴによるｃＤＮＡの合成は、４４℃で１時間および５１℃で３０分間行い、ＲＮＡ二次構造体の形成は最小限にした。ＰＣＲは逆転写ｃＤＮＡ産物に、５０ｐｍｏｌのそれぞれの特異的な正方向および逆方向プライマー、５μｌの１０×Ｐｆｘ増幅用緩衝液、１μｌのｄＮＴＰ混合物、３μｌのＭｇＳＯ４および１μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼを合計体積５０μｌで使用して行った。ＰＣＲはＰｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ−２００；ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で以下のように行った：９４℃で３分間、次いで９４℃で４０秒間、５５℃で４０秒間、および１分間／Ｋｂ、６８℃、３０サイクル、および６８℃で７分間の最終伸長反応。ＯＲＦ内でのプライマー処理用に００−１株の配列から設計したＲＴおよびＰＣＲプライマーは大抵、８３株から首尾よく生成されたＲＴ−ＰＣＲ産物ではなく、００−１株に対する配列の違いをおそらく反映する。したがって、プライマーはウイルスＯＲＦに隣接する半保存配列モチーフから設計し（図８参照）、これによってｃＤＮＡの首尾よい生成が達成された。ｃＤＮＡ産物のヌクレオチド配列は、ＡＢＩ３１００シークエンサーおよびＢｉｇ−Ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｒｅａｄｙ反応キットｖ１．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲ産物を直接配列分析することによって測定した。最後に、重複するＲＴ−ＰＣＲ産物から配列を構築した。
【０１７３】
ＨＭＰＶゲノムの３’端を地図作製および塩基配列決定するために、ｖＲＮＡをｃＤＮＡに転換し、製造者によって指定されたのと同様に、ｃＤＮＡ端の迅速な増幅用の３’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）を使用して増幅させた。簡潔に述べると、ｖＲＮＡを、ポリＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、次にオリゴ（ｄＴ）を用いてプライマー処理するファーストストランドｃＤＮＡ合成、ならびにこのキットに供給されたＨＭＰＶ特異的逆方向プライマーおよび正方向ＵＡＰプライマーを使用するＰＣＲを使用して、その３’端においてポリアデニル化させた。次いでＲＡＣＥ産物を、このキットに供給された内部ＨＭＰＶ特異的逆方向プライマーおよびＡＵＡＰプライマーを使用して、ネステッドＰＣＲ用の鋳型として使用して、反応の特異性を向上させた。最後に、増幅させたｃＤＮＡネステッドＰＣＲ産物を直接塩基配列決定した。
【０１７４】
ＨＭＰＶゲノムの５’端を地図作製および塩基配列決定するために、ｖＲＮＡをファーストストランドｃＤＮＡ合成、末端のトランスフェラーゼによる尾部化、およびこのキットに供給されたＡＡＰプライマーを使用して、ｃＤＮＡ５’端の迅速な増幅用の５’ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ、バージョン２．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）により指定されたのと同様のＰＣＲ増幅によって処理した。次いで、増幅させたｃＤＮＡ  ＲＡＣＥ産物を、このキットに供給された内部ＨＭＰＶ特異的プライマーおよびＡＵＡＰプライマーを使用して、ネステッドＰＣＲ用の鋳型として使用して、反応の特異性を向上させた。最後に、増幅させたｃＤＮＡネステッドＰＣＲ産物を直接塩基配列決定した。
【０１７５】
ＨＭＰＶゲノムの５’および３’端は、ゲノムＲＮＡ連結およびＲＴ−ＰＣＲ、次に塩基配列決定によっても確認した。簡潔に述べると、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、スクロース勾配により精製したウイルスから単離したｖＲＮＡを、１０ＵのＴ４ＲＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）の存在下において、３時間２５℃および３時間３７℃で連結させた。連結端の接合部に対応するｃＤＮＡを、ＨＭＰＶ特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより増幅させた。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ネステッドＰＣＲ用の鋳型として使用して、ＨＭＰＶ内部特異的プライマーを使用して、反応の特異性を向上させた。最後に、ネステッドＰＣＲ産物を平滑末端ベクター（ｐＳＴＢｌｕｅ−１；Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、２０のクローンを塩基配列決定し、これによって２つの以前は特徴付けされていなかったＨＭＰＶゲノムの末端の長さ、含有量および配列を確認した。
【０１７６】
ＨＭＰＶ株８３の完全な配列は１３３３５ヌクレオチド長であると決定され、これは図３７Ａ〜３７Ｄ中に示す。この配列は非クローン化ＲＴ−ＰＣＲ産物から直接決定したものであり、したがって毒性で野生型の、真正の主要な、共通配列を表す。この発見によって、完全な感染ウイルスおよびクローン化ｃＤＮＡから組換えによって改変された誘導体を回収するための、逆方向の遺伝システムの開発における必要なステップが与えられる。ＨＭＰＶ株００−１のゲノムの一部分を表す、部分的な配列が公開されている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９５：１１９〜１３２、２００２）。
【０１７７】
ＨＭＰＶ８３のゲノム地図を図１に示す。ＲＳＶ、原型肺炎ウイルスと比較すると、ＨＭＰＶはＮＳ１およびＮＳ２遺伝子を欠いており、重要な遺伝子順序の違いを含む。詳細には、ＲＳＶ中ではＳＨ−Ｇ遺伝子対はＦ−Ｍ２遺伝子対に先行し、一方ＨＭＰＶ中ではＳＨ−ＧはＦ−Ｍ２に続く。ＨＭＰＶ遺伝子の同定は、その予想タンパク質産物がＲＳＶ中の対応物であるＯＲＦ（Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｍ２−１およびＬ）と有意なアミノ酸配列関連性を示すＯＲＦの存在に基づいて行い、あるいは配列の関連性が不明確である場合は、ゲノム位置によって、および予想タンパク質（Ｍ２−２、Ｇ、ＳＨ）の特徴によって遺伝子の同定を行った。これらの分析では、ＲＳＶを比較用に選択した。なぜなら、そのタンパク質のすべてが直接同定されており、大抵の場合、機能が割りつけられているからである。いくつかの場合、予想されたＨＭＰＶタンパク質の大きさは、そのＲＳＶ対応物の大きさとは相当異なっていた。例えば、推定ＨＭＰＶ  ＳＨタンパク質はＲＳＶのそれより１８０％大きく（６４アミノ酸と比較して１７９アミノ酸）、ＨＭＰＶ  Ｇタンパク質は２７％短く（２９８アミノ酸と比較して２１９アミノ酸）、いくつかの特有の構造特徴、例えば保存システインヌース（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｎｏｏｓｅ）（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５６２５〜９、１９８７）およびＣＸ３Ｃケモカインドメイン（Ｔｒｉｐｐら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７３２〜８、２００１）などを欠いていた。推定ＨＭＰＶおよびＬタンパク質でさえも、提案されたＲＳＶ対応物よりそれぞれ２２％長く７％短い、長さの有意な差異を示した。
【０１７８】
ＨＭＰＶゲノムの両端を、地図作製および塩基配列決定した。３’リーダーおよび５’尾部領域の推定配列を図２に示す。この分析によって、１つまたは複数の他の遺伝子が、ＲＳＶのＮＳ１およびＮＳ遺伝子に相当する、Ｌ遺伝子に続く、あるいはＮ遺伝子に先行し得る可能性を排除した。ＨＭＰＶ８３のリーダー領域および尾部領域と、ＡＰＶ（Ｒａｎｄｈａｗａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９８４９〜９８５４、１９９７）およびＲＳＶ（Ｍｉｎｋら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５：６１５〜６２４、１９９１）のそれを比較することによって、それぞれの端の最初の２２〜２３ヌクレオチド間の高度の配列同一性が示され、これらの保存配列が重要な機能ドメインとなるという考えと一致した。ＲＳＶの場合、ＲＳＶゲノムの最初の１１ヌクレオチドが、転写とＲＮＡ複製の両方に必要な主要なプロモーターとなることが直接実証された（Ｆｅａｎｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１６６３〜１６７２、２００２）。
【０１７９】
このように、公開されている株００−１の一部分の配列は、ゲノムおよびアンチゲノムプロモーターの主要なエレメントを欠いているようであり、おそらくいかなるＨＭＰＶプロモーターも欠いている。ＨＭＰＶゲノムのいずれかの端の最初の１２ヌクレオチド内に、他の肺炎ウイルスと比較して、少なくとも１つ（３’リーダー）または２つ（５’トレイラー）の配列の違いが存在したことは注目すべきことである。したがって、ＡＰＶまたはＲＳＶの末端を使用して、キメラ分子を構築することにより不完全なＨＭＰＶ００−１配列を補う手段は、いずれの末端にも真正ＨＭＰＶ配列を生成しなかったと思われる。これらの個々の違いの機能上の有意性は完全には解明されていないが、ＲＳＶを用いた研究によって、ゲノムプロモーター内の任意の点突然変異が、転写またはＲＮＡ複製あるいはこの両方に影響を与え、大抵の場合これらの影響は重大であったことが示された（Ｆｅａｎｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：１６６３〜１６７２、２００２）。任意の事象において、免疫原性組成物中で使用するための組換えＨＭＰＶを工学処理するための遺伝システムを開発するためには、本明細書で提供する改変された真正の野生型配列で始めることが重要である。この配列を開始地点として使用した。この配列が実際に真正であり機能的ウイルスをコードしているという確認は、感染性、野生型様組換えウイルスを回収することによって得られる。この実証は、以下の実施例中に与える。
【０１８０】
モノネガウイルスのゲノムＲＮＡの他の重要な特徴は、３’および５’端は典型的には末端相補性を示し、アンチパラレル式に並べると、両端が相補的であることを意味する。これは、それぞれの端に、保存プロモーターの中心をおそらく示す保存配列が存在することを示す。この末端相補性は、図３中にＨＭＰＶ８３およびＡＰＶに関して示す。典型的なモノネガウイルスに関しては、両端は少なくとも最初の１２ヌクレオチドに関して高度の相補性を示し、さらにしばしば、典型的にはこの領域内では、相補性は正確であるか、あるいはせいぜい１つのミスマッチがある。図３中に示すように、ＡＰＶゲノムには実際、最初の１３ヌクレオチドに関して正確なマッチがあり、一方驚くことに、ＨＭＰＶ８３ゲノムには２つの隣接するミスマッチがある。これはさらに、不完全な配列に基づきＨＭＰＶ遺伝システムを開発するための、他の肺炎ウイルスからの推定によって、真正ＨＭＰＶ配列を生成することができなかったことを示す。
【０１８１】
ＨＭＰＶ８３の配列は、株００−１に関して公開された配列と比較していくつかの違いを含んでいた。例として、図４は、ＳＨのＯＲＦが株００−１の配列中よりも８３配列中で４コドン早く終わり、より短いＳＨタンパク質を生成したことを示す。さらに、ＨＭＰＶ８３配列中のＧのＯＲＦは、Ｇタンパク質を１７アミノ酸短くした欠失を含んでおり、Ｆ遺伝子とＭ２遺伝子の間の遺伝子間領域は、４１ヌクレオチドではなく８３に関しては１３ヌクレオチドであった。図４に示す有意性などの違いの有意性は、本発明の開示の逆方向の遺伝子系を用いて直接評価することができる。
【０１８２】
ＨＭＰＶ株８３の予想タンパク質と他の肺炎ウイルスのタンパク質の間の、アミノ酸配列同一性の割合を図５に示す。後の実施例によって、株８３と他のＨＭＰＶ株７５の間のさらに広範囲の比較が得られ、これは本開示の一部分を形成し、提案するＨＭＰＶ亜型の間およびその中の、配列多様性の程度を実証することに留意しなければならない。図５に示すすべての肺炎ウイルス中で、完全な感染ウイルスを回収するための逆方向の遺伝システムは、ウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）およびヒトＲＳＶ亜型Ａの場合においてのみ報告されていることは注目すべきことである。これは、ＰＶＭがほぼ６５年間知られてきており１９８０年代後半に始まった広範囲の分子分析の主題であるという事実にもかかわらず、ＡＰＶがほぼ２５年間知られてきており分子分析の主題でもあるという事実にもかかわらず成立する。それらの開発の相当な関心にもかかわらず、逆方向の遺伝システムは依然として利用可能ではないという事実は、このようなシステムを生み出す困難を示す。すでに記したように、ＨＲＳＶとＢＲＳＶは、２つの遺伝子（ＮＳ１およびＮＳ２）の欠失、および他の遺伝子（ＳＨおよびＧ）の再編成に関してＨＭＰＶと異なる。ＨＲＳＶとＢＲＳＶは、予想ＨＭＰＶタンパク質のアミノ酸配列同一性に関してもＨＭＰＶと大幅に異なる。３つの潜在的なＨＭＰＶタンパク質（ＳＨ、Ｇ、およびＭ２−２）は、それらの推定上のＨＲＳＶ対応物とわずか６〜１５％の配列同一性を共有し、一方低い配列同一性の値（例えば、２５％未満の同一性）はせいぜい、相同性が薄いタンパク質、あるいは代替的に無関係なタンパク質に対応すると一般にみなされる。逆に、Ｌタンパク質の場合、配列同一性の割合の最高値はわずか４６％である。したがってＨＭＰＶは、ウイルスを回収するための逆方向の遺伝システムが開発されている、任意のウイルスと非常に異なる。この文脈では、ＨＭＰＶ中のタンパク質の機能は、関連ウイルス、さらに非常に関連があるウイルスの関連タンパク質に関して得た結果からの推測によって、容易に予測することはできないことにさらに留意しなければならない。簡潔に述べると、ヌクレオチド配列からタンパク質を推定する際に、初期の不確かさが存在する。例えば、ＡＰＶ中のＭ２−２ＯＲＦの存在が報告されているにもかかわらず、利用可能な証拠によって、このＯＲＦは発現されないことが示唆されるが（Ａｈｍａｄｉａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．ＶｉｒｏＬ．８０：２０１１〜２０１６、１９９９）、これは明らかにＲＳＶ中で発現され、ＲＮＡ合成を調節する際の役割を有することが示されてきている（ＢｅｒｍｉｎｇｈａｍおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１２５９〜１１２６４、１９９９；Ｊｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４〜８２、２０００）。したがって、ＯＲＦの存在のみが有意性を証明するものではない。他の例では、フィロウイルス科では、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスが、この２つのウイルス間で非常に関係がある、ＶＰ３０と呼ばれるタンパク質を発現する。しかしながら、この２つのタンパク質は異なる機能を有する（Ｗｅｉｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８５３２〜９、２００２；Ｍｕｈｌｂｅｒｇｅ���ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２３３３〜４２、１９９９）。しかしながらこれらは、ヌクレオチド配列のみに基づいてタンパク質の存在および機能を予測する際の、不確かさの２つの例である。これは、タンパク質機能を実証するためにここに与える、直接的な関連アッセイの重要性を強調する。これらは本開示中に２つの形で表す：（ｉ）適切なウイルスタンパク質と共に供給されると、転写および複製することができるミニレプリコンの開発、および重要なのは（ｉｉ）ｃＤＮＡから完全に完全な感染ウイルスを回収するためのシステムの開発、これはゲノムおよびそのコードされるＲＮＡ、ならびにタンパク質産物および感染ウイルスの、全エレメントの機能の分析の基盤を与える。
【０１８３】
図６に示すように、ＨＭＰＶ８３の予想Ｍタンパク質のアミノ酸配列を使用して、ＨＭＰＶとパラミキソウイルス科の他のメンバーの間の系統発生の関係を推定した。この図中に示すように、パラミキソウイルス科は、本明細書ではそれぞれ肺炎ウイルスおよびパラミキソウイルスと呼ぶ、２つの亜科、ニューモビリナエ（Pneumovirinae）とパラミクソビリナエ（Paramyxovirinae）からなる。これらの亜科は属、肺炎後ウイルスであるＨＭＰＶの属にさらに分けられる。感染性組換えウイルスを生成するためのシステムは、この属のいかなるメンバーに関しても以前は存在しなかった。この分析によって、ＲＳＶなどの肺炎ウイルスからの、特にセンダイ、はしか、おたふくかぜ、ヒトパラインフルエンザ、およびさらによく知られておりさらに広く特徴付けされているパラミキソウイルス科のメンバーを構成するニューキャッスル病ウイルスなどの、パラミキソウイルスからの進化の距離および特徴のさらなる証拠が与えられた。
【実施例２】
【０１８４】
ＧＦＰ転写カセットを含む全長ＨＭＰＶアンチゲノムｃＤＮＡクローンの構築、および感染性組換えＨＭＰＶの回収
ＨＭＰＶ株８３に関して決定した完全な真正の共通配列（図３７Ａ〜３７Ｄ）によって、感染性組換えウイルスを生成するためのシステムを設計するための基盤が与えられた。図７は、完全な共通配列から設計した、ＨＭＰＶ株８３の完全なアンチゲノムをコードするｃＤＮＡクローンの構築を示す。３つの別個のクローン化サブゲノム断片を作製した：断片１は推定Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子を含んでおり、上流（左）側、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｐｒ）用に加えたプロモーター近く、および右手側、マーカーとして推定Ｎ−Ｆ遺伝子間領域に加えたＮｈｅＩ部位近くに広がる。Ｔ７プロモーターを設計して３つの非ウイルスＧ残基を、アンチゲノムの５’端、Ｔ７プロモーターの効率を改善するために選択した形状に加えた。断片２は推定Ｆ、Ｍ２、ＳＨおよびＧ遺伝子を含んでおり、上流側、加えたＮｈｅｌ部位近く、下流側、天然に存在するＡｃｃ６５Ｉ部位近くに広がる。Ｎｈｅｌ部位は、ｃＤＮＡ−由来のＨＭＰＶと生物学的に誘導されたＨＭＰＶを区別するためのマーカーとして働く。断片３は推定Ｌ遺伝子、次にリボザイム内に本来存在するＲｓｒＩＩ部位近くに広がる、半分のデルタ型肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶｒｉｂｏ）からなる。それぞれのクローン化ｃＤＮＡ断片の配列を確認した。ＨＭＰＶ８３アンチゲノムｃＤＮＡのクローン化および発現用のベクターはｐＢＳＫＳＩＩであり、これはデルタ型肝炎ウイルスリボザイム、次にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｔ）の終止配列(terminator)を含み、組換えＨＰＩＶ１、ＨＰ１Ｖ２およびＨＰＩＶ３を回収するために以前に使用されたベクターｐ３／７に由来するものであった（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｉ．Ｖｉｒｏｌ  ７４：８９２２〜９、２０００；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：２７０〜９、２００３；Ｎｅｗｍａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２４：７７〜９２、２００２）。このベクターは、ＡｖａＩ、ＡａｔＩＩ、Ｎｈｅｌ、およびＡｃｃ６５Ｉ部位を含むポリリンカーを挿入することによって改変し、次いでこれが働いて断片１、２および３制限部位を受け入れた。詳細には、このポリリンカーは、以下の配列ＣＣＣＧＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧＧＧＴＡＣＣＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＴＣＣＧ（配列番号３３；ＳｍａＩおよびＲｓｒＩＩ部位はイタリック（下線）で示す）からなり、これをＤｕｒｂｉｎらのベクターｐ３／７（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７）のＳｍａＩ部位とＲｓｒＩＩ部位の間に挿入した。最終的なｃＤＮＡは、５’端に３つの加えられた非ウイルスＧ残基を含む、完全な１３３３５ヌクレオチドのＨＭＰＶ８３アンチゲノムをコードしている。完全なｐＨＭＰＶ−８３組換えプラスミド（「アンチゲノムプラスミド」）は、１６３３３ｂｐを含む。
【０１８５】
低い増殖、ならびに確立された基準試薬およびＨＭＰＶに関するアッセイの欠如によって、ｃＤＮＡから回収される組換えＨＭＰＶの回収および同定が複雑になる可能性があることは予想された。したがって、そのマーカー遺伝子の発現を容易に調べることができると思われる、検出可能な標識をコードする外来性マーカー遺伝子を挿入するために、アンチゲノムｃＤＮＡを改変するための戦略を採った。選択した遺伝子は、蛍光顕微鏡下での観察時に緑色の蛍光発光によって、その存在を目に見える状態にすることができる、よく知られているマーカーまたは標識ＧＦＰ、刺胞動物タンパク質をコードする。ＧＦＰのｃＤＮＡは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．のＥｎｈａｎｃｅｄ  ＧＦＰのｃＤＮＡであった。ＨＭＰＶ生成と直接関係がある、この方式での検出可能なマーカーの発現によって、生存力の消失または生殖不能がない生細胞中での、組換えＨＭＰＶによるＧＦＰの発現を調べ、したがってトランスフェクションおよび継代の全段階におけるｒＨＭＰＶの回収を検出および定量化することができる。
【０１８６】
この戦略の障害の中には、ＨＭＰＶ転写に関する直接の情報の欠如、および遺伝子境界の直接的地図作製の欠如があった。したがって、外来性ＯＲＦと結合すると、ＨＭＰＶ転写プログラム中に発現することが可能であると思われる配列を同定することが必要であった。ＨＭＰＶ増殖を害さずに外来性遺伝子の挿入体を収容することができると思われる、ＨＭＰＶゲノム内の部位を同定することも必要であった。典型的なモノネガウイルスゲノムの転写は３’端またはその近くで始まり、それによって個々の遺伝子が個々の別々のｍＲＮＡに転写される、一連の停止−開始機構によって進行する。典型的には、モノネガウイルスの転写は、ウイルス遺伝子に隣接する短い配列モチーフによって導かれる。例えば、最も完全に特徴付けられている肺炎ウイルスであるＲＳＶの遺伝子は、それぞれの遺伝子の上流端に高度に保存された１０ヌクレオチドのＧＳシグナル、およびそれぞれの遺伝子の下流端に半保存された１２〜ｌ３ヌクレオチドＧＥシグナルを含む。ＲＳＶのｍＲＮＡを感染細胞から単離し、それらの末端を直接地図作製および塩基配列決定したとき、これらのモチーフが最初に示された。ＧＳシグナルが個々の遺伝子の転写の開始を指示し、ＧＥシグナルはポリアデニル化および停止を指示すると考えられる。ポリメラーゼは鋳型と結合した状態であり、遺伝子間領域で交差して隣の遺伝子で転写を再開する。ＲＳＶの場合、ｍＲＮＡ端の分析によって、遺伝子の配列が予想外に複雑であったことが示された。詳細には、Ｌ遺伝子のＧＳシグナルは他のシグナルと異なることが分かっており、その下流ではなくその上流近辺内に位置することがさらに分かった。他の例として、Ｍ２−１およびＭ２−２のＯＲＦは、２つのｍＲＮＡではなく１つのｍＲＮＡ中に含まれることが分かった。さらに、ＯＲＦに関してＲＳＶのＧＳの間隔とＧＥシグナルには一貫性がなく、したがってＧＳシグナルがＯＲＦと重複し、あるいは代替的に８５ヌクレオチドもＯＲＦから離れていた場合が存在した。同様に、いくつかのＲＳＶのＧＥシグナルはそれぞれのＯＲＦと重複し、１７３ヌクレオチドもＯＲＦから離れていた。さらに、ＲＳＶ遺伝子間の間隔は不規則であり、前述の重複遺伝子から５６ヌクレオチドも離れていた遺伝子の範囲であった。これは、推定ＯＲＦおよび考えられる配列モチーフの位置に基づく、予想遺伝子境界が不確かであることを示す。しかしながら、本発明の開示の方法は、適切な転写シグナルおよび挿入部位の直接的な同定をもたらす。
【０１８７】
図８に示すように、ＨＭＰＶ株８３の完全な配列を、考えられるＧＳおよびＧＥモチーフに関して調べた。ＯＲＦ間に位置することに基づいて、およびそれらの間の部分的な配列保存を示すことによって、これらのモチーフを同定した。例えば、推定ＨＭＰＶのＧＳモチーフは配列ＧｇＧＡｃＡＡｇＴｇａａａＡＴＧを有し、上記の場合のヌクレオチドの割りつけは、それぞれの推定遺伝子中で保たれる。ＲＳＶとは非常に対照的に、推定ＧＳシグナルは、そのそれぞれの推定ＯＲＦの開始部分、およびそれぞれの推定ＧＳシグナルに対して位置１４〜１６に位置する推定開始ＡＴＧコドンと、非常に接近していることが分かった。ＬのＯＲＦの前には２つの考えられるＧＳ配列が存在し、そのいずれかは提案された共通配列に適切に適合したことに留意すべきである。これらの１つを図８に示し、一方第２の配列は、１８ｎｔ上流（７１０２−ＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＣＣ）に位置する。典型的には、モノネガウイルス遺伝子はそれぞれ１つのＧＳ部位を有し、これらのうちのどれがＨＭＰＶＬ遺伝子に関して機能的であるのかは判っていない。しかしながら、このことは現在、ＲＴ−ＰＣＲによって推定ＬｍＲＮＡの５’端を地図作製すること、またはミニレプリコン系における機能に関してそれぞれの考えられるＧＳシグナルを試験すること、または完全なアンチゲノムにおけるそれぞれの考えられるシグナルを破壊すること、およびウイルス回収および増殖の効率に関してそれぞれの突然変異体を評価することによって、本発明の開示の方法により容易に決定することができる。
【０１８８】
推定ＧＥモチーフは配列ＡＧＴｔａａｔｔａＡＡＡＡを有し、前述の場合、それぞれの推定遺伝子中の割りつけは保存される。詳細には１つのＨＭＰＶシグナルも基準として使用するために直接同定されたわけではないので、これらのモチーフ中の限られた数の高度に保存されたヌクレオチドの割りつけは、それらの同定を推論的なものにした。これらの保存モチーフはＧＳおよびＧＥシグナルの主要部分を含むようであるが、ここに記載したいずれかの配列は、活性の完全な消失無しで１または数ヌクレオチド一端または両端で短縮することができること、あるいはいずれかの側に加えられる１つまたは複数の追加的ヌクレオチドが、いずれかのシグナルの活性に影響を与える可能性があることを発見したのは、驚くことではないと思われる。配列データのみから転写シグナルを推定することの不確かさを示すものとして、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎらは、遺伝子間の２つの異なる型の共通配列を記載しており、その１つは前述の配列に対応する（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９５：１１９〜１３２、２００２）。この点において、この筆者達は、２つの遺伝子、ＦおよびＬに関するこの個々の共通配列を明らかに同定することができたと結論付け（ただし前述のように、Ｌ遺伝子に関するＧＳシグナルである２つの候補が存在すると思われる）、いくつかの他の遺伝子中に「変異体」を発見し、Ｇ遺伝子の対応物を検出することはできず、「他の［異なる］反復配列を、Ｇ以外のそれぞれのｈＭＰＶのＯＲＦの下流に発見した」ことを記し、存在する場合これらの配列モチーフが転写シグナルとして働く可能性があるということに関する、さらなる不確かさが生じた。したがって、外来性配列をＨＭＰＶによる発現に適したものにすることができると思われる転写シグナルを、直接同定することが重要であった。
【０１８９】
遺伝子発現を与えることができる配列シグナルを直接同定するために、Ｎ遺伝子の１６クレオチドの推定ＧＳ配列および１３ヌクレオチドの推定ＧＥ配列を、ＧＦＰのＯＲＦを含むｃＤＮＡと結合させた。この形状では、ＧＳシグナル中に存在したＡＴＧが、ＧＦＰのＯＲＦのそれに置き換わっていた。図９に示すように、この転写カセットをヌクレオチド４１の後のＨＭＰＶアンチゲノムのｃＤＮＡに挿入し、ＧＦＰ遺伝子が５’から３’方向に最初に配置しているアンチゲノムを生成させた。対応するＨＭＰＶ−ＧＦＰゲノム中では、ＧＦＰ遺伝子が最もプロモーターに近い遺伝子であると思われる。アンチゲノムｒＨＭＰＶ−ＧＦＰのｃＤＮＡの完全な配列（図３８Ａ〜３８Ｄ）、および側面に位置するプラスミド領域は、配列分析によって確認した。
【０１９０】
ＨＭＰＶの最初の４つのＯＲＦ、すなわち推定Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２−１のＯＲＦを選択し、別のプラスミド中で発現させて回収を補充した。この最初の回収プロトコルは、（エンベロープの要素と反対に）「内部タンパク質」であると予想したタンパク質に焦点を当てた。ＨＭＰＶゲノムを調べることによって、その考えられる生成物が、それぞれＲＳＶのＮ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬタンパク質と４１％、３１％、３６％、および４６％の同一性を共有するＯＲＦを同定し（図５）、これらのＯＲＦを封入用の候補として選択した。推定Ｍ２−１  ＨＭＰＶのＯＲＦも回収に含めた。なぜなら、それは考えられる内部タンパク質であり、ＲＳＶ、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスに関する試験によって、考えられるＭ２−１対応物はＲＮＡ合成と関係がある可能性があることが示されるからである。この点において、推定Ｍ２−１対応物は、それらの高度な関連性にもかかわらず、エボラウイルスおよびマールブルグウイルスにおいて異なる役割を果たすらしいことが記される（Ｗｅｉｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：８５３２〜９、２００２；Ｍｕｈｌｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２３３３〜４２、１９９９）。さらに、推定ＨＭＰＶ  Ｍ２−１タンパク質は、Ｃｙｓ−７／Ｃｙｓ−１５／Ｃｙｓ−２１／Ｈｉｓ−２５モチーフを含み（完全な推定ＨＭＰＶ  Ｍ２−１のアミノ酸配列に従い番号処理したもの、本明細書ではＣｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフと呼ぶ）、これはヌクレオチドまたは核酸と相互作用する際に役割を示す可能性がある、考えられる亜鉛結合ドメインである。他方で、推定Ｍ２−２のＯＲＦは最初の回収系中には含まれず、外観上対応するＭ２−２のＯＲＦは発現されないという、ＡＰＶからの証拠が存在する（Ａｈｍａｄｉａｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８０：２０１１〜２０１６、１９９９）。
【０１９１】
ＨＭＰＶのＧ、ＦおよびＳＨタンパク質のＯＲＦは、最初の回収系には含めなかった。なぜなら、推定アミノ酸配列中の推定疎水性シグナルおよびアンカーの存在に基づいて、これらのＯＲＦは膜貫通表面タンパク質をコードすると予想したからである。特に、予想ＨＭＰＶのＦタンパク質は、ＲＳＶのそれと３６％のアミノ酸配列関連性を共有する。ＨＭＰＶとＲＳＶの間の推定ＧおよびＳＨタンパク質のアミノ酸同一性の割合は、それぞれ１５％および６％である。この大幅な一次構造の逸脱にもかかわらず、考えられる糖鎖付加部位の存在などの、アミノ酸配列の他の特徴によって、本明細書のこれらのタンパク質の同定が支援される。エンベロープタンパク質が、ゲノム転写およびＲＮＡ複製において知られている役割を有していないことは、当分野で一般に認められている。このことが、これらの追加的ＯＲＦの発現は、おそらくウイルス粒子構築の効率を増大させることによって回収を容易にすることができるという、可能性を排除するわけではない。しかしながら、本開示の重要な態様は、ＨＭＰＶ回収に必要な支持プラスミドの最小の相補体の同定に関する。ひとたび最小の回収要素が成功であることが示された後、他の実施形態をここで構築して、それを評価して回収の効率を最適化することができる。例えば、別のプラスミドからのＭ２−１のＯＲＦの発現は、回収には必要ではないことが本明細書では示されているが、それにもかかわらずＭ２−１のＯＲＦは、転写またはＲＮＡ複製あるいはＨＭＰＶ複製のいくつか他の側面に影響を与えるために機能することができると思われる、望ましい相補体である可能性がある。したがって、Ｔ７転写プロモーターおよび終止配列の制御下においてＮ、Ｐ、ＬおよびＭ２−１のＯＲＦが位置した発現プラスミドを構築した。
【０１９２】
推定ＨＭＰＶヌクレオキャプシドおよびポリメラーゼタンパク質をコードする支持プラスミドを、以下のように調製した（図１０）：推定Ｎタンパク質を発現する支持プラスミドを調製するために、ｖＲＮＡには、推定ＮのＯＲＦの開始部分（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド５５〜７６）でハイブリダイズするように設計したプラスのセンス鎖プライマー、および推定ＮのＯＲＦの端（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド１２３９〜１２２０）でハイブリダイズするように設計した逆方向プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを施した。このＰＣＲ産物にＸｈｏＩを用いた消化を施し、ＡｆｌＩＩＩを用いた部分的消化を施し、推定ＮのＯＲＦが天然に存在するＡｆｌＩＩＩを含み、部分的消化は末端部位で切断され内部では切断されないいくつかの産物を生成すると思われるので、このことを行った。この産物をｐＴＭ１に挿入し（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３〜３３２、１９９７；Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３４：７４〜８３、１９９７；Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８６：６１２６〜３０、１９８９）、これをＮｃｏＩ（ＡｆｌＩＩＩと適合性があるオーバーハング部を切断する）およびＸｈｏＩで消化し、完全な推定ＮのＯＲＦを含むクローンを選択し、その配列を確認した。
【０１９３】
ＨＭＰＶの推定ＰのＯＲＦを含む支持プラスミド（ｐＴ７−Ｐ）（図１０）を構築するために、ｖＲＮＡには、推定ＰのＯＲＦの開始部分（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド１２６３〜１２７９）でハイブリダイズするように設計したプラスのセンス鎖プライマー、および推定ＰのＯＲＦの端（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド２１４７〜２１３２）でハイブリダイズするように設計した逆方向プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを施した。このＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、ｐＴＭ１にクローン化し、これをＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化した。最終的なクローン化組換えプラスミドにおいて、ＨＭＰＶ挿入体および側面に位置するプラスミド領域の配列は、配列分析によって確認した。
【０１９４】
ＨＭＰＶ用の比較可能な推定Ｍ２−１支持プラスミド（ｐＴ７−Ｍ２−１）を作製した（図１０）。ｖＲＮＡには、推定Ｍ２−１のＯＲＦの開始部分（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド４７２４〜４７４０）でハイブリダイズするように設計したプラスのセンス鎖プライマー、および推定Ｍ２−１のＯＲＦの端（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド５２８７〜５２７２）でハイブリダイズするように設計した逆方向プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを施した。このＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＴＭ１にクローン化し、これをＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化した。最終的なクローン化組換えプラスミドにおいて、ＨＭＰＶ挿入体および側面に位置するプラスミド領域の配列は、配列分析によって確認した。
【０１９５】
ＨＭＰＶの推定ＬのＯＲＦを含む支持プラスミド（ｐＴ７−Ｌ；図１０）を、２つの重複断片のＲＴ−ＰＣＲ増幅によって作製し、ｐＴＭ１ベクターに別々にクローン化した。第１の断片を、推定ＬのＯＲＦの開始部分（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド７１３３〜７１５７）でハイブリダイズするように設計したプラスのセンス鎖プライマー、および特有のＡｖｒＩＩ（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド１０８９２〜１０８９７）制限部位（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド１１０３７〜１１０１８）と下流でハイブリダイズするように設計した逆方向プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅させ、第２の断片は、特有のＡｖｒＩＩ部位（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド１０８４５〜１０８６６）と上流でハイブリダイズするように設計したプラスのセンス鎖プライマー、および推定ＬのＯＲＦの端（ＨＭＰＶゲノム中のヌクレオチド１３１５０〜１３１２４）でハイブリダイズするように設計した逆方向プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによって増幅させた。次いで第１の断片を、大腸菌ポリメラーゼＩのＢａｍＨＩおよびＫｌｅｎｏｗ断片によって処理して、平滑末端を作製し、ＡｖｒＩＩによって消化し、ｐＴＭ１にクローン化し、これをＮｃｏＩおよびＫｌｅｎｏｗ酵素によって処理し、ＡｖｒＩＩによって消化した。最後に、推定ＬのＯＲＦの第２の断片を、ＡｖｒＩＩおよびＸｈｏＩによって消化し、中間構築体にクローン化し、同じ酵素によって処理し、最終的な構築体ｐＴ７−Ｌを作製した。最終的なクローン化組換えプラスミドにおいて、ＨＭＰＶ挿入体および側面に位置するプラスミド領域の配列は、配列分析によって確認した。
【０１９６】
これらの支持プラスミドの最初の機能的評価を得るために、ミニレプリコン系を開発した。クローン化ｃＤＮＡを構築し、Ｔ７プロモーターからのその発現が、３’から５’方向に：ＨＭＰＶゲノムのリーダー端および隣接する推定ＮのＧＳシグナル、次に細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするＯＲＦのマイナスのセンス鎖コピー、次に推定ＬのＧＥシグナルおよびＨＭＰＶゲノムのトレイラー端（ｔｒａｉｌｅｒ  ｅｎｄ）を含む、マイナスのセンス鎖ミニレプリコンＲＮＡ、またはミニゲノムをもたらすようにした。前に記載したのと同様にＨＤＶリボザイムによって、正確な３’端を作製した。このミニゲノム中では、ＣＡＴ遺伝子は推定ＨＭＰＶのＧＳおよびＧＥシグナルの制御下にあると思われ、サブゲノムｍＲＮＡとして発現されると思われる。ミニゲノムプラスミドを、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬと共にＨＥｐ−２細胞にトランスフェクトし、支持プラスミドは、ｖＴＦ−７、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウイルス組換え体によって同時に同時感染させた。トランスフェクション後４８時間で、細胞内ＲＮＡを単離し、ＣＡＴのｃＤＮＡに特異的な二本鎖プローブを使用する、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。この分析によって、Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子とミニゲノムプラスミドの同時発現によって、適切な大きさのＲＮＡ種が生成して、後代のミニゲノム、アンチゲノム、およびサブゲノムＣＡＴのｍＲＮＡとなったことを実証した。このアッセイでは、Ｍ２−１遺伝子をさらに加えることによって、ＲＮＡ産物の概略が変わることはなかった。これによってこのアッセイでは、Ｎ、ＰおよびＬの同時発現はＲＮＡ複製および転写を元に戻すことが示された。これらの発見は、Ｍ２−１の発現がｍＲＮＡの効率のよい合成を得るために必要である、ＲＳＶとは非常に対照的である（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８１〜８５、１９９６；ＦｅａｒｎｓおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５８５２〜６４、１９９９）。これらの予備的結果は、ＨＭＰＶのＲＮＡ合成におけるＭ２−１の任意の役割を排除するものではない、なぜならＭ２−１は、ミニゲノムの複製および転写には必要とされないが、完全な組換えウイルスによる感染を開始させるためには必須である可能性がある、１つまたは複数の機能を有する可能性があると考えられるからである。本開示は、ウイルス回収、遺伝子発現、および複製におけるＭ２−１（およびＭ２−２）の役割を迅速に評価するための方法を提供する。
【０１９７】
ｃＤＮＡから感染性組換えＨＭＰＶを生成する能力を試験するために、全長ＨＭＰＶ−ＧＦＰアンチゲノムプラスミドを、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬプラスミドと共に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するベビーハムスター腎臓２１（ＢＨＫ−２１）細胞であるＢＳＲＴ７／５細胞にコトランスフェクトした（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１〜５９、１９９９）。ウェル当たり５μｇのアンチゲノムプラスミド、それぞれ２μｇのＮおよびＰ支持プラスミド、ならびにそれぞれ１μｇのＭ２−１およびＬ支持プラスミドを含む６ウェル皿において、トランスフェクションを行った。トランスフェクションは、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、トリプシンまたは血清を含まない培地中で行った。トランスフェクション後１日で、トリプシンを５μｇ／ｍｌまで加えた。さらに、細胞を活性状態に保つために、典型的には細胞は、トランスフェクション後１日または２日で１：３の割合に分けて再接種した。他の代替的な変形では、新たなトリプシンをトランスフェクションの１日後に加え、細胞を１時間または複数時間インキュベートし、細胞を培地に削ぎ落とし、懸濁液全体を新たなＬＬＣ−ＭＫ２またはＶｅｒｏ細胞に継代した。約１２〜２４時間後、この培地は５μｇ／ｍｌのトリプシンを含む新たな培地に交換した（他に記さない限り、５μｇ／ｍｌのトリプシンは通常使用した濃度であった）。
【０１９８】
トランスフェクション後、一連の日数で蛍光顕微鏡によって調べると、緑色の細胞が目に見える状態になり、これらは最初は散乱した単離細胞からなり、２つ以上の細胞からなる小さな細胞増殖巣を後に形成し、ＨＭＰＶと一致する細胞変性効果を示した。トランスフェクション単層を新しい培養物に分けると、１種の緑色の細胞が１日以内に目に見える状態になり、一連の日数で多細胞のシンシチウムに発達した。ＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡によって調べ、トランスフェクション後８日で写真撮影した。細胞病理学の性質は、生物学的に誘導されたＨＭＰＶによって生じた性質と区別がつかなかった。回収したウイルスは、ＨＭＰＶと一致した動態および細胞病理性で、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中において複製した。
【０１９９】
生殖不能を害さずに生きた細胞中での感染を調べる能力を使用して、増殖を改善するための条件を迅速に調べることができる。例えば、インキュベーション中にさらに多量を加えることによるトリプシンの補充によって、さらに多数の感染細胞が生じたことが分かった。予備実験では、２日間隔で２．５または５μｇ／ｍｌの濃度まで新たなトリプシンを加えることによって、最高レベルのＧＦＰ発現およびウイルス伝播がもたらされた。しかしながら、その最高レベルは十分なシンシチウム形成とも関係が有り、これはさらに迅速な細胞死および低い収率を引き起こす可能性がある。放出される感染ウイルスのアッセイ（ＧＦＰマーカーの発現によっても容易になるアッセイ）と組み合わせた他の実験は、インキュベーションの条件、および感染ウイルスの生成に最適なトリプシンのレベルを確認するのに役立つであろう。今日までに分かっている最も最適なスケジュールは、５μｇ／ｍｌの新たなトリプシンを２日または３日間隔で加えることとなっている。
【０２００】
回収したウイルスで感染させた細胞によるＧＦＰの発現は、このウイルスはｃＤＮＡ由来であり、汚染している生物学的に誘導されたＨＭＰＶではなかった証拠を与えた。組換えＨＭＰＶとしてのウイルスのさらなる同定は２つの方法、免疫蛍光法によって、およびＮｈｅＩ制限部位マーカーの検出によって行った。この免疫蛍光アッセイでは、生物学的に誘導されたＨＭＰＶで感染させたハムスター由来の抗体は、推定の回収したｒＨＭＰＶ−ＧＦＰで感染させた細胞と特異的に反応した。このアッセイ用に、前に記載したのと同様に組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰを回収するために、ＢＳＲＴ７／５細胞をトランスフェクトした。４日後、細胞を再度１：３の割合に分けて、さらに９日間カバーガラス上でインキュベートした。インキュベーションは、５μｇ／ｍｌのトリプシンの存在下で行った。細胞は４℃で１５分間８０％アセトンを用いて固定し、次にＨＭＰＶで感染させたハムスター由来の血清と共にインキュベートし、次にハムスターＩｇＧに特異的であり蛍光タグＡｌｅｘａ−４８８で標識した、ヤギ抗体と共にインキュベートした。同じ領域の細胞を、蛍光条件下で可視光線を用いて共焦点顕微鏡によって目に見える状態にした。ＨＭＰＶ感染培養物中の細胞増殖巣に特異的であった強い蛍光が、これによって実証された。
【０２０１】
関連アッセイ系では、ＲＴ−ＰＣＲを行って、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰゲノムＲＮＡ中の、ヌクレオチド２７１９〜３８９４（ＧＦＰを含まない野生型ＨＭＰＶ配列中でのそれらの位置に従い番号処理した）を増幅させた（図１２Ａ）。このＲＴ−ＰＣＲ手順によって、鋳型が生物学的に誘導されたＨＭＰＶで感染させた細胞または組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰ由来のＲＮＡであったとき、予想された大きさの生成物が生じたが、後者の場合のみｃＤＮＡがＮｈｅｌによって切断され、組換えウイルスが由来した組換えアンチゲノムｃＤＮＡに特異的な別のＮｈｅｌ部位の存在を確認した。ＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅はＲＴの添加に依存し、この鋳型は実際にウイルスＲＮＡでありＤＮＡを含んでいなかったことが示された。Ｍ２−１支持プラスミドを支持プラスミドの群から削除すると、感染性組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰも回収した。これらの結果によって、Ｍ２−１は回収用には必要とされないことが示唆されるが、ＲＳＶの場合に見出したのと同様に、Ｍ２−１はアンチゲノムプラスミドから発現されると考えられる（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９５：２５１〜２５５、１９９９）。さらに、Ｍ２−１の同時発現は、回収に対していくらかの定性的または定量的影響がある可能性がある。典型的な実験において、Ｍ２−１の存在下で３倍を超える感染ウイルスを回収した観察結果によって、このことが示唆される。ＨＭＰＶの回収に必要とされるタンパク質の最小の相補体は、Ｎ、ＰおよびＬであると考えられる。
【０２０２】
挿入したＧＦＰコード配列の発現も、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって特徴付けした。細胞は生物学的に誘導されたＨＭＰＶ８３、ｒＨＭＰＶ、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰで感染させ、あるいは擬似感染させ、全細胞内ＲＮＡを３日後に単離し、ＧＦＰまたはＭ遺伝子に特異的な二本鎖ＤＮＡプローブを用いた、ノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した。図１２Ｂに示すように、ＧＦＰ特異的プローブはｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ感染細胞由来のＲＮＡのみとハイブリダイズし（レーン４）、挿入した転写カセットから転写された予想７４６−ｎｔの（ポリＡを含まない）ＧＦＰのｍＲＮＡである、適切な大きさの多量のＲＮＡバンドを検出した。これによって、推定ＨＭＰＶのＧＳおよびＧＥ転写シグナルは外来性ＯＲＦの状況で実際に機能して、単シストロン性ＧＦＰのＲＮＡの効率のよい合成を指示したことが示された。ＧＦＰプローブは、少量でありＧＦＰ−Ｎ、ＧＦＰ−Ｎ−ＰおよびＧＦＰ−Ｎ−Ｐ−Ｍ読み過ごしｍＲＮＡを表すようであるいくつかの大きなＲＮＡ、ならびにｒＨＭＰＶ−ＧＦＰゲノムおよびアンチゲノムＲＮＡを含むのに適切な大きさであった大きな薄いバンドともハイブリダイズした。非常に低レベルの読み過ごしｍＲＮＡによって、ＧＦＰ転写カセットの端部の終止は非常に効率がよく、したがって、ＨＭＰＶのＧＢシグナルは実際に正しく認められたことが示された。Ｍ特異的プローブを用いた分析によって、それぞれのウイルスにおいて、予想８５３−ｎｔの単シストロン性ＭｍＲＮＡであると予想した適切な大きさのバンド、およびＰ−ＭおよびＮ−Ｐ−Ｍ読み過ごしｍＲＮＡを表すバンドを同定した。ＭプローブによってそれぞれのウイルスのゲノムおよびアンチゲノムＲＮＡのバンドも検出し、これらはｒＨＭＰＶ−ＧＦＰの場合、ＧＦＰ転写カセットが存在するために、ＨＭＰＶ８３またはｒＨＭＰＶより７４８ｎｔ大きいと思われる（図１２Ｂ、レーン６、７および８）。
【０２０３】
ＧＦＰ遺伝子を欠く組換えＨＭＰＶを回収する能力を試験するために、図１１に示すＨＭＰＶアンチゲノムを発現するが、ＧＦＰ挿入体を欠くプラスミドを、Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬ支持プラスミドと共にＢＲＳＴ７／５細胞にトランスフェクトした。組換えＨＭＰＶの回収は、前に記載した間接的な免疫蛍光アッセイによって、単細胞中および細胞増殖巣中のウイルス抗原を検出することによって確認した。
【０２０４】
回収した組換えＨＭＰＶ株８３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多サイクルの複製の効率に関して、生物学的に誘導された株８３単離体と比較した。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を細胞当たり０．０１のプラーク形成単位（ＰＦＵ）で接種して、５μｇ／ｍｌのトリプシンの存在下において３２℃でインキュベートした。培地のアリコートを２４時間間隔で採取し、急速に凍結させた。その後アリコートを、新たなトリプシンを含む培地に希釈し、プラークアッセイにより平行して分析して、感染力価を測定した。図１３に示すように、組換えＨＭＰＶは、試験した１０日間で効率よく複製した。ｒＨＭＰＶの複製の効率は、その生物学的に誘導された対応物のそれとほとんど区別がつかなかった。クローン化ｃＤＮＡから完全に野生型様ウイルスを回収する能力によって、これらのｃＤＮＡを構築するために使用した配列は完全に機能的であり、したがって真性、機能的、原型の野生型ＨＭＰＶおよびそのコードタンパク質を定義することが示された。これは注目に値する。なぜならこれらのウイルスは、高頻度の突然変異を示すからである（したがって配列は機能的であるとは考えられない）。前述のように構築の後に、ｒＨＭＰＶアンチゲノムｃＤＮＡのその全体を塩基配列決定し、その結果、その配列は設計したものとまったく同様であったことを確認した。したがってこの実験によって、（ｉ）原型ＨＭＰＶの正確なゲノム配列、および（ｉｉ）この配列を表すクローン化ｃＤＮＡを回収するための条件を確定した。この証明された原型システムによって、ＨＭＰＶの他の株を迅速に回収するため、およびクローン化ｃＤＮＡ中間体に導入する変化によるＨＭＰＶの系統的改変のための基盤が与えられる。最後に、野生型組換えＨＭＰＶを正確に再構築する能力は、本明細書に開示する方法の確実さおよび正確さを示す。このことはさらに、以下の実施例中に記載する多数の改変型誘導体を回収する能力によって実証される。
【０２０５】
次に組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多サイクルの増殖の効率に関してｒＢＭＰＶと比較して、転写カセットを加えることの影響を評価した。図１４に示すように、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰは試験した１０日間で複製し、その効率は同時に、ｒＨＭＰＶと比較して１０倍を超えて低下した。しかしながら、１０日間の最後では、最終的な力価は非常に類似していた。したがって外来性の挿入体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ複製に対する劇的な影響なしでＨＭＰＶによって収容することができ、したがって、このような挿入体を含む組換えウイルスは実際に製造することができる。ＨＭＰＶ複製を助長するものとして同定された実験動物を使用する実験において、以下の実施例中に記載する実験において、現在経験的に決定できるように、このような挿入体はｉｎ  ｖｉｖｏで弱毒化される可能性もある。
【実施例３】
【０２０６】
望ましい表現型の変化を指定する所定の突然変異体を含む、組換えＨＭＰＶ誘導体の開発
ｃＤＮＡから感染性ｒＨＭＰＶを生成する能力によって、突然変異体を感染性ＨＭＰＶに計画的に導入して、免疫原性組成物中で使用するのに望ましい特性、例えば温度感受性、低温適応性、宿主域制限、改善されたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製、低い反応性、高い安全性、十分な抗原の発現、高い遺伝型または表現型の安定性、広い免疫原範囲、高い免疫原性、および弱毒性などを有する組換えウイルス候補を開発する基盤が与えられる。十分な抗原の発現を生み出すためおよび／または精製ウイルスタンパク質の調製を容易にするためなどの、他の適用例においても利点を有する突然変異体を考案することができる。それぞれのアンチゲノムは、感染ウイルスの回収を指示する能力に関してアッセイすることができ、回収した突然変異ウイルスは、増殖および細胞病理性、温度感受性、プラーク形態、および他の特性に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの影響に関して評価することができる。したがって適切な突然変異ウイルスは、ＨＭＰＶ活性用の細胞培養および予想動物モデルにおいて、マウス、ハムスター、コトンラットを含めたヒト被験者、および非ヒト霊長類、ならびに臨床試験において、増殖効率、抗原の発現、温度感受性、プラーク形態、細胞病理性、弱毒性、病原性、屈性、遺伝型および表現型の安定性、免疫原性、安全性、および防御効率に関して評価することができる。
【０２０７】
望ましい突然変異体の１つのタイプは、ＨＭＰＶゲノム由来の配列の欠失を含む。例えば、それぞれのＨＭＰＶ遺伝子またはＯＲＦ、あるいはそれらの一部分は、その全体または一部分が、単独で、あるいは他の遺伝子またはＯＲＦと組み合わさって系統的に欠失して、特に免疫原性組成物内で使用するための改善された性質を有するウイルスを得ることができる。例示的な遺伝子またはＯＲＦには、ＳＨ、Ｇ、Ｍ２−２およびＭ２−１のＯＲＦがあるが、非コード遺伝子などの非ＯＲＦ配列あるいは遺伝子外領域またはシス作用性シグナルの全体または一部分を含めた、任意の遺伝子またはＯＲＦあるいはゲノム領域またはその一部分を含むことができる。完全な遺伝子を欠失させる戦略の一例として、それぞれその周囲の推定ＧＳおよびＧＥシグナルセットを有する、推定ＳＨおよびＧのＯＲＦが別々または一緒に欠失しているアンチゲノムｃＤＮＡを設計した（図１５）。これらの構築体を作製するために、野生型ＧＦＰを改変して、ＢｓｉＷＩおよびＢｓｒＧＩ部位を、位置５４５９および６０９９（ＧＦＰを含まない完全なアンチゲノムに対して番号処理したもの、本文書を通じて従う慣例）に挿入した。これらの位置は、それぞれＭ２−ＳＨおよびＳＨ−Ｇ遺伝子間領域内にある。これら２つの部位のいずれかでの切断によってオーバーハング部であるＧＴＡＣが生成し、これは、Ｇ−Ｌ遺伝子間領域内の位置６９５９に位置する天然のＡｃｃ６５Ｉ部位の場合も同様である。（図１５）。したがって、ＳＨおよびＧ遺伝子に隣接するこれら３つの適合性のある制限部位の存在によって、適切な酵素ペアを用いた切断、次に再連結による、１つまたは２つの遺伝子の欠失が容易になる。これによって、ＳＨ（ΔＳＨ）またはＧ（ΔＧ）遺伝子あるいは両方（ΔＳＨ／Ｇ）を欠いたｒＨＭＰＶ−ＧＦＰアンチゲノムをコードするｃＤＮＡが得られた。それぞれのアンチゲノムｃＤＮＡを、Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２−１支持プラスミドの存在下で、ＢＳＲ−Ｔ７細胞中で感染ウイルスの回収を指示する能力に関して評価した。それぞれの場合、感染ウイルスを容易に首尾よく回収した。次いでこれらをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび実験動物中での増殖の動態および有効性に関して評価して、弱毒性を含めた有利な性質を定義することができると思われる。図１６に示すように、それぞれのウイルス中の予想した欠失の存在を、それぞれの回収したゲノムのＳＨ−Ｇ領域のＲＴ−ＰＣＲ分析によって確認した。さらに、ＲＴ−ＰＣＲ産物の限定的なヌクレオチド塩基配列決定によって、欠失の接合部の配列を確認した。
【０２０８】
ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＳＨ、ΔＧおよびΔＳＨ／Ｇ突然変異体を、細胞当たり０．０１ＰＥＵのインプットでの感染の後に、多サイクルのＬＬＣ−ＭＫ２細胞の複製の効率に関してｒＨＭＰＶ−ＧＦＰおよびｒＨＭＰＶと比較した（図１７Ａ）。この実験では、遺伝子欠失突然変異体はＧＦＰマーカー遺伝子を含んでおり、したがってｒＨＭＰＶ−ＧＦＰと比較すべきである。注目すべきことに、１つの遺伝子、ＳＨまたはＧの欠失を含むｒＨＭＰＶ−ＧＦＰは、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ単独より３〜１０倍効率よく複製した。したがってこれらの遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製に必須であるわけではなく、実際それらの消失によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製適性が改善された。このことは、ゲノムがより短いことおよび転写単位の消失による増殖の利点を反映する可能性があるが、ＳＨまたはＧタンパク質が存在しないことによって、増殖が幾分改善される可能性があるとも考えられる。このことは、転写開始コドンを除去し停止コドンを導入するヌクレオチド置換を行うことによって、ＳＨおよび／またはＧの転写を失くし、それによって遺伝子数、ゲノムの長さ、および転写されるｍＲＮＡの数を保ちながらタンパク質の発現を失くすことにより、本明細書に開示する方法によって容易に調べることができる。ＳＨとＧの両方を欠くｒＨＭＰＶ−ＧＦＰは、完全なｒＨＭＰＶ−ＧＥＰのそれと同様の効率で複製し、１つの解釈として、遺伝子の欠失およびゲノムの短縮から生じる可能性があるあらゆる利点は、ＳＨとＧの両方が存在しないことによる複製適性のわずかな消失によって、打ち消されたことが示唆された。したがって、ＨＭＰＶ免疫原性組成物の生成はＳＨまたはＧの欠失によって改善される可能性があるが、両方の欠失は最適ではない可能性がある。さらに、いずれかの遺伝子の欠失は、１つまたは複数の追加の外来性遺伝子を収容するｒＨＭＰＶの能力を増大させる可能性がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらのウイルスの効率のよい複製を考えると、実験動物およびヒトボランティアにおけるＨＭＰＶ複製、免疫原性、および病原性に対する、これらの遺伝子欠失の影響を評価することが現在可能であると思われる。
【０２０９】
ΔＳＨ、ΔＧおよびΔＳＨ／Ｇ突然変異体の並行した第２のペアを、ＧＦＰマーカー遺伝子を欠くｒＨＭＰＶ株８３の主鎖内に作製した。この第２のペアの突然変異体由来のそれぞれのウイルスを、直ちに回収し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで伝播させた。次いでこれらをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび実験動物中での増殖の動態および有効性に関して評価して、免疫原性および弱毒性を含めた有利な特性を定義することができると思われる。ＧＦＰ遺伝子の存在は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの突然変異ウイルスの特徴付けを容易にする可能性があるが、ＧＦＰ遺伝子は免疫原性組成物を開発するための候補中には含まれないのが好ましいと思われる。したがって、適切に、ＧＦＰを含むか含まない突然変異体、または両方を迅速に生成することができることが有利である。
【０２１０】
ＧＦＰマーカー遺伝子を欠くｒＨＭＰＶΔＳＨとΔＧウイルスのペアを、ｉｎ  ｖｉｖｏでの複製に関して評価した（図１７Ｂ）。ゴールデンシリアンハムスターに、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ８３、ｒＨＭＰＶ、ｒＨＭＰＶΔＳＨ、ｒＨＭＰＶΔＧ、またはｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇを鼻腔内感染させた。それぞれの群からの６匹の動物を３日後または５日後に犠牲にし、鼻甲介および肺を採取し、ホモジェナイズし、限界希釈によりウイルス力価を測定することによって分析した（図１７Ｂ）。いくつかの場合では、第３日と第５日の間で力価の違いが観察され、最も顕著なのは第３日と第５日の肺中のＨＭＰＶ８３、ｒＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶΔＳＨの高い力価であった。しかしながら、一般に、この２日間の力価は安定したパターンをたどった。組換えによって誘導したＨＭＰＶは、その生物学的に誘導された親ＨＭＰＶ８３の効率と同様の効率でｉｎ  ｖｉｖｏで複製した。したがって、ｒＨＭＰＶは野生型に似たｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖性を有していたようであり、候補ワクチンとしての弱毒化した誘導体を開発するための適切な開始点となる。
【０２１１】
興味深いことに、ＨＭＰＶの複製がＳＨ遺伝子の欠失によって大幅に低下することはなかった（図１７Ｂ）。実際ΔＳＨウイルスは、おそらくゲノムが短かく遺伝子数が少ないために、その野生型対応物よりもわずかに良好に複製した。これに対して、Ｇ遺伝子の欠失によって、鼻甲介中で２．９（第５日）〜３．２（第３日）ｌｏｇ１０の複製の低下、および肺中で０．３（第５日）〜２.３（第３日）ｌｏｇ１０の低下がもたらされた。ｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇ二重欠失ウイルスは、ウイルス力価の同様の顕著な低下を示した。したがって、これらの突然変異ウイルスは、ｉｎ  ｖｉｖｏでは十分に弱毒化している。
【０２１２】
考えられる免疫原性および防御効率を評価するために、ｒＨＭＰＶ、ｒＨＭＰＶΔＳＨ、ｒＨＭＰＶΔＧおよびｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇウイルスを、他のハムスターに鼻腔内投与した（図１７Ｃ）。血清サンプルを２７日後に採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＭＰＶの感染性を中和する能力に関して分析した（図１７Ｃ）。これは、十分に弱毒化したΔＧおよびΔＳＨ／Ｇウイルスは、それらが十分に弱毒化されていても、ＨＭＰＶ中和血清抗体の高い力価を誘導したことを示す。免疫処置後第２８日に、これらの動物を野生型ＨＭＰＶで鼻腔内をチャレンジし、動物を３日後に犠牲にし、鼻甲介および肺を採取し、限界希釈によってウイルス力価を測定した（図１７Ｃ）。これによって、ｒＨＭＰＶまたはｒＨＭＰＶΔＳＨを感染させた動物において、チャレンジによるウイルス複製は検出することができなかったことが示された。興味深いことに、ｒＨＭＰＶΔＧまたはｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇを感染させた動物にも、肺中での検出可能なチャレンジによるウイルス複製はなく、低レベルのチャレンジによるウイルス複製のみを鼻甲介中で検出した。したがって、それらの強く弱毒化された性質にもかかわらず、ｒＨＭＰＶΔＧおよびｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇウイルスは免疫原性であり、ＨＭＰＶのチャレンジに対して非常に防御的であった。これらのウイルスは有望なワクチン候補となる。特に、Ｇ遺伝子の欠失によって、有望なワクチン候補が得られると思われることは注目すべきことであった。なぜならＧタンパク質は、感染を開始させる際に重要な接着性タンパク質であると考えられており、ＨＲＳＶ中の対応する欠失によって、マウス中では複製せず（Ｔｅｎｇら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８９、２８３〜２９６、２００１）、ヒト中では過剰に弱毒化した（Ｋａｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１３９６１〜１３９６６）ウイルスが生成したからである。
【０２１３】
ＨＭＰＶの遺伝子間領域の欠失または他の改変は、改善された表現型の性質を得るための重要な戦略を与える。例えば、ＨＭＰＶ株８３の遺伝子間領域は、２ｎｔ（Ｎ／Ｐ）〜１９０ｎｔ（Ｇ／Ｌ）の長さの範囲である。ＲＳＶに関する以前の文献によって、１つの遺伝子間領域が１００ｎｔ長より長かった場合、プラークの大きさが減少したことが示された（Ｂｕｋｒｅｙｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１１０１７〜２６、２０００）。ＨＭＰＶ株８３の天然に存在する遺伝子間領域の２つ、すなわちＳＨ／Ｇ（１２４ｎｔ）およびＧ／Ｌ（１９０ｎｔ）は１００ｎｔ長より長い。したがって、これらまたは他の遺伝子間領域の長さを減少させることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの複製を改善するための戦略が与えられ、一方で遺伝子間の長さを増大させることによって、望むようにウイルスを弱毒化させるための戦略が与えられる。
【０２１４】
他の例として、Ｍ２−２のＯＲＦが不活性であった組換えＨＭＰＶを回収した（図１８Ａ）。示したＭ２−１のＯＲＦはヌクレオチド位置４７２４で始まり、位置５２８７で終わる。示したＭ２−２のＯＲＦはおそらく位置５２３５または５２４７で始まり、５４５０で終わり、したがってＭ２−１のＯＲＦと重複する。Ｍ２−２のＯＲＦが不活性である突然変異体ＨＭＰＶを作製するために、１種のヌクレオチド置換基を位置５２３６および５２４８に導入し、これによって重複するＭ２−１のＯＲＦ中のアミノ酸コードの割りつけを変えずに、２つの潜在的な翻訳開始コドンを除去した（図１８Ａ）。第３のヌクレオチド置換を位置５２７２で行い、これによって転写停止コドンをＭ２−２のＯＲＦに導入した。さらに、ヌクレオチド５２８９〜５４４０を削除し、これによってＭ２−２のＯＲＦの大部分を削除した。これらの変化を、野生型ｒＨＭＰＶアンチゲノムｃＤＮＡ、およびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰアンチゲノムｃＤＮＡに導入した。それぞれの場合、ΔＭ２−２ウイルスをｃＤＮＡから首尾よく回収した。ｒＨＭＰＶΔＭ２−２およびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２−２ウイルスを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多段階の増殖動態に関して、そのそれぞれの親、ｒＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰと比較した（図１８Ｂ）。これによって、それぞれのΔＭ２−２ウイルスは、多くの時間地点でそのｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ親より幾分非効率的に複製したが、実験の終点、１３時間までには力価が非常に類似したことが示された。これらの突然変異体は、ワクチン設計のために興味深い。なぜならそれらは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖に多大な影響を与えず（このことはワクチン製造には必要である）、ｉｎ  ｖｉｖｏではおそらく弱毒化しているからである。これらは図１７ＢおよびＣに示すハムスターモデルで評価し、以下の後の実施例中により十分に説明する。次いでノーザンブロットハイブリダイゼーションを使用して、ΔＭ２−２ウイルスによる細胞内ＲＮＡの合成を調べた。図１８Ｃに示すように、ΔＭ２−２ウイルスによるゲノムおよびアンチゲノムの合成は、野生型ＨＭＰＶのそれと大きく異なるわけではなかった。しかしながら、ΔＭ２−２ウイルスは一定レベルのｍＲＮＡ合成を指令し、それは複製ゲルレーンからのゲノムの量に標準化すると、野生型ＨＭＰＶの量の８．７倍まで及んだ。ウイルス複製の同時の増大がないタンパク質合成の上方制御は、ワクチンウイルスに非常に望ましいと思われる。この表現型は、ヒトＲＳＶのΔＭ２−２突然変異体の表現型と似ているが、同一ではない。ＲＳＶに関しては、ΔＭ２−２突然変異体は、ここでは観察されなかったｍＲＮＡの蓄積の遅延を示し、ＨＭＰＶに関しても観察されなかったゲノムおよびアンチゲノムの蓄積の遅延および低下を示した。ＨＭＰＶとＲＳＶの間の他の予想外の違い、すなわちＨＭＰＶ  Ｍ２−１のＯＲＦを害する能力、またはＨＭＰＶのウイルスの生存力を消失させずにＭ２−１およびＭ２−２を完全に削除する能力を本明細書に記載するが、一方いずれかの突然変異体はＲＳＶには致命的であった。
【０２１５】
図１９に示す他の適用例では、一連の１つのアミノ酸置換基を、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰの予想Ｍ２−１タンパク質中に存在するシステイン−ヒスチジンモチーフ中に導入した。この「Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１」モチーフは、Ｍ２−１アミノ酸位置７、１５、および２１の３つのシステイン残基、および位置２５の１つのシステイン残基からなる（図１９）。このモチーフは、ＲＳＶおよび他の肺炎ウイルス中に正確に保存されている。ＲＳＶでは、このモチーフの完全性はＭ２−１の転写の進行および抗停止機能に必要不可欠であり、感染性組換えウイルスの回収に必要不可欠である（ＨａｒｄｙおよびＷｅｒｔｚ  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７４：５８８０〜５８８５、２０００；Ｔａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８〜１１３３５、２００１）。ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰのＭ２−１タンパク質に導入したアミノ酸置換基は以下のものであった：システイン−７−セリン（Ｃ７Ｓ）、システイン−１５−セリン（Ｃ１５Ｓ）、およびヒスチジン−２５−セリン（Ｈ２５Ｓ）。対照として、このモチーフの近くで見られるがこのモチーフの一部であるとは考えられない、アミノ酸チロシン−９−セリン（Ｙ６Ｓ）およびアスパラギン−２５−セリン（Ｎ２５Ｓ）：を含む、２つの他の突然変異体を作製した。これらの突然変異体のそれぞれは、感染ウイルスとして容易に回収した。図２０に示すように、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰのＣ７Ｓ、Ｙ１９Ｓ、Ｃ１５Ｓ、Ｎ１６Ｓ、Ｈ２５ＳおよびΔＭ２−１突然変異体は、ＬＩＣ−ＭＫ２細胞中での多サイクルの増殖に関して、ｒＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰと並行して評価した。これらの突然変異体はｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ親と比べて一定範囲の増殖効率を示し、Ｙ９Ｓ突然変異体はより有効に複製し、Ｃ７Ｓ突然変異体は同等に複製し、他の突然変異体は幾分非効率的に複製した。それにもかかわらず、Ｈ２５Ｓ突然変異体以外は、第１３日の最終力価が、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ親のそれとほぼ同等であった。
【０２１６】
ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰのＭ２−１のＯＲＦを含む他の突然変異体において、ＡＴＧ翻訳開始部位をＴＡＧ停止コドンに変え、図２１に示すように、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２−１を表す突然変異体を生成させた。次のＡＴＧコドンはＯＲＥから遠く、１８７個のコドンのコドン１３４に位置しており、したがってこの突然変異体は、Ｍ２−１の合成を無効にするはずである。この同じ突然変異体において、他の停止コドンを３つのリーディングフレームそれぞれの下流近くに導入して、考えられるリボソームの進入およびＯＲＦへの通過をさらに除外した。ＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＭ２−１突然変異体は、感染ウイルスとして容易に回収した。
【０２１７】
この群のＭ２−１のＯＲＦの突然変異体を迅速かつ効率よく回収する能力は、ｃＤＮＡ系回収システムは、所定の変化を有するｒＨＭＰＶ変異体を迅速に開発するための確固たる方法であることを、さらに実証するものとなった。いくつかのこれらの突然変異体は、それらの直接の親であるＨＭＰＶ−ＧＦＰよりも効率よく複製したという発見によって、このような突然変異体は免疫原性組成物中に使用する価値があるであろうことが示唆される。なぜなら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける改善された複製はｒＨＭＰＶの生成を非常に容易にし、タンパク質系免疫原性組成物用のＨＭＰＶ抗原の改善された供給源である可能性もあるからである。これらの実施形態では、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰは親として使用した。なぜなら、ＧＦＰマーカーの発現がｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特徴付けを容易にするからである。これらの形態は実験動物において直接評価することもでき、マーカーの存在は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルス局在化に対する考えられる影響の分析を容易にすると思われる。さらに、ΔＳＨ、ΔＧおよびΔＳＨ／Ｇウイルスに関して前に行ったのと同様に、非ＧＦＰ型を容易に作製することができ、これは臨床的評価に適していると思われる。Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフ、およびＭ２−１のＯＲＦ全体はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの効率のよい増殖には必要とされないという発見は、まったく予想外であった。それは特に、Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフおよびＭ２−１タンパク質に関しては、感染性ＲＳＶの回収に必要不可欠であることが以前に示されたからである（Ｔａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１１３２８〜１１３３５、２００１）。さらに、ＲＳＶのＣｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフの突然変異、またはＲＳＶのＭ２−１のＯＲＦの不活性化によって、組換えＲＳＶの回収が妨げられたことを別個に確認した。Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフはｉｎ  ｖｉｔｏでの効率のよいＨＭＰＶの複製には必要とされないが、このモチーフおよびこのタンパク質は機能的理由でＨＭＰＶ中に保存されており、ＨＭＰＶ複製またはその宿主との相互作用のいくつかの面に寄与すると、予想することが妥当である。したがって、これらの突然変異体のいくつかはｉｎ  ｖｉｖｏで弱毒化しており、生弱毒性のＨＭＰＶの免疫原性組成物に封入するのに有用であることが見出されると、予想することが妥当である。
【０２１８】
他の例示的な実施形態では、ＨＭＰＶのＭ２遺伝子を、そのＧＳおよびＧＥシグナル、ならびにＭ２−１およびＭ２−２のＯＲＦを含めて、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰから完全に削除した（図２２Ａ）。生成したｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＭ２（１＋２）ウイルスは直ちに回収し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで伝播させた。ΔＭ２−２、ΔＭ２−１、およびΔＭ２（１＋２）ウイルスを、ＬＬＣ−ＭＫ２およびＶｅｒｏ細胞中での多サイクルの複製の効率に関して、野生型ＨＭＰＶと比較した（図２２Ｂ、それぞれ上側および下側パネル）。この実験は、増殖を目に見える状態にするのを容易にするために、ＧＦＰを発現する型のウイルスを用いて行って、ＧＦＰの発現は他の点ではこの実験とは関係がなかった。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞では、それぞれのＭ２突然変異ウイルスは、野生型の１０倍を超えて非効率的に複製した。これに対して、Ｖｅｒｏ細胞では、それぞれのＭ２欠失ウイルスは、野生型ＨＭＰＶのそれ以上の最終力価まで増殖した。ＬＬＣ−ＭＫ２とＶｅｒｏ細胞との１つの重要な違いは、後者がＩ型インターフェロンの構造遺伝子を欠いていることである。したがってこの結果によって、Ｍ２欠失ウイルスは野生型ＨＭＰＶよりもインターフェロンに敏感であったことが示唆された。さらに、Ｍ２欠失ウイルスが、Ｖｅｒｏ細胞中で効率よく複製したという観察結果は重要である。なぜなら、これは、ヒト用ワクチンを調製するための認められている細胞基質だからである。
【０２１９】
Ｍ２欠失ウイルスのインターフェロン感受性を直接評価するために、Ｖｅｒｏ細胞を一定範囲の濃度のＩ型インターフェロンで一晩予備処理して、抗ウイルス状態を誘導した。ΔＭ２（１＋２）およびΔＭ２−２ウイルスの複製する能力を、野生型ＨＭＰＶおよび野生型ＨＲＳＶと比較して、インターフェロン処理した細胞において評価した。感染をモニタリングする目的で、この実験で使用したそれぞれのウイルスはＧＦＰを発現したが、ＧＦＰの存在は、他の点では結果とは関係がなかった。細胞単層は細胞当たり１ＰＦＵのｍｏｉで感染させ（またはＲＳＶの場合０．０１の感染多重度（ｍｏｉ）、そのより効率のよい増殖を反映）、４日間インキュベートした。対照の単層は、並行して擬似インターフェロン処理し、感染させ、処理した。培地上清を採取し、プラークアッセイによって分析してウイルス力価を測定した。それぞれのインターフェロン処理培養物とその対応する擬似インターフェロン処理対照の間の低下倍数を計算し、図２２Ｃに示す。したがって、野生型ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰの複製は、擬似インターフェロン処理対照と比較して、インターフェロンの量を増大することによって１／５〜１／１６８０に低下した。これに対して、ΔＭ２（１＋２）およびΔＭ２−２ウイルスはさらに感受性が強く、最低濃度でそれぞれ１／１９および１／１３に低下し、最高濃度では完全に阻害された。インターフェロンに対して高い感受性を示すウイルスは、典型的にはｉｎ  ｖｉｖｏでは弱毒化している。したがってこれらの結果は、これらのウイルスは弱毒化誘導体である候補であることを示唆する。
【０２２０】
本開示の他の例示的な実施形態は、遺伝子順序を変えて弱毒性を得ること、抗原発現を増大させること、またはいくつか他の望ましい表現型を得ることを含む。以下の実施例では、ＨＭＰＶのＦタンパク質を主要な防御抗原として同定し、ＧおよびＳＨもウイルス粒子表面タンパク質として同定し、これによってこれらは、おそらく防御抗原となる。野生型の遺伝子順序では、ＳＨ、ＧおよびＦは遺伝子位置６、７および４にそれぞれ位置する。ＨＭＰＶの転写は極性勾配を示し、その中ではプロモーター近くの遺伝子が下流の遺伝子より効率よく発現されると予想される。したがって、プロモーター近くにＳＨ、Ｇ、およびＦなどの推定防御抗原遺伝子が、単独で、対として、あるいはトリプレットとして配置されることによって、より効率のよい発現がもたらされるであろう。この適用例では、ウイルスがそれぞれの１つのコピーを保持し、あるいは遺伝子を第２のコピーとして挿入することができるように、１つまたは複数のＨＭＰＶ防御抗原の２つのコピーをウイルスが現在発現するように、遺伝子をそれらの野生型の位置からこの位置に移動させることができる。遺伝子の再配置または第２のコピーの添加による遺伝子発現の変化には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの十分な増殖または低下した増殖などの、他の望ましい効果がある可能性がある。
【０２２１】
改善された性質を有するＨＭＰＶ誘導体を開発するための、遺伝子の位置を「移動させる」この戦略を示すと、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ中のＳＨ−Ｇ遺伝子対の位置を変えた（図２３Ａ）。「順序１番」で示す１つの構築体では、ＳＨ−Ｇ遺伝子対をその位置から動かし、その前にＭ２遺伝子をＦ遺伝子の前の位置に動かした。これによって、ＲＳＶのそれを模倣したゲノムのその領域の遺伝子順序、すなわち：Ｍ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌをもたらした。したがって、４つの遺伝子の位置は「順序１番」、すなわちＳＨおよびＧ（それぞれ２位置上流に移動）ならびにＦおよびＭ２（それぞれ２位置下流に移動）に変わった。したがって、任意の遺伝子または遺伝子の組合せはゲノム内で移動させることができ、十分な抗原発現、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの改善された増殖、および弱毒化を含めた望ましい表現型をもたらすことができる、遺伝子発現の変化を得ることができる。図２３Ｂに示すように、ＲＳＶ順序１番と呼ばれる突然変異体の動態および複製の程度は、その直接の親であるｒＨＭＰＶ−ＧＦＰのそれと区別がつかなかった。これによって、遺伝子順序の変更は容易に行うことができ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで効率よく複製し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの弱毒性または改善された抗原発現などの望ましい性質に関して評価することができる感染ウイルスをもたらすことができることが示された。
【０２２２】
図２３Ａに示す他の順列として、ＳＨ−Ｇ対をｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ中においてＦ遺伝子の上流に動かし、その対の第２のコピーを挿入し、「順序２番」の構築体を作製した。したがって、この構築体はＳＨおよびＧ遺伝子の２つのコピーを含み、これらは潜在的な防御抗原である。この場合、Ｆ−Ｍ２遺伝子対はウイルスプロモーターに対して合計４位置下流に移動させており、Ｌ遺伝子はここでは、親の野生型ＨＭＰＶと比較して２位置さらに下流である。「遺伝子移動」のさらに他の戦略は、推定防御抗原ＧおよびＦ遺伝子をそれらの通常の位置から、それぞれ７番目および４番目の遺伝子として、ＨＭＰＶ遺伝子地図中でプロモーター近くの位置に移動させることに関する。図２４Ａに示すように、それぞれの遺伝子は個別に、あるいは対として動かすことができる。図２４Ａに示す構築体の場合、プロモーター近くの挿入部位は、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ構築体を作製するためのＧＦＰ転写カセットを挿入するために使用した挿入部位（図９）と同じであり、そこからは効率のよい発現が実証されている。これらは好ましいシグナルおよび挿入部位を表すが、他のシグナルおよび挿入部位を容易に評価し、本発明の開示の方法によって使用することができる。好ましい挿入部位は、示した遺伝子間領域、またはＯＲＦの外側の遺伝子の領域、および推定転写シグナル中に存在し、したがってＨＭＰＶ複製に影響を与えずに改変に適応する可能性が高い、挿入部位であると思われる。以下の実施例は、ＨＭＰＶの異なる株間であまり保存されていないゲノム領域の同定を与え、これらが必要不可欠である可能性は低いことを示唆し、好ましい挿入部位を同定するための他の指針となる。転写カセットは、そのアンチゲノムｃＤＮＡクローン中への挿入の後に、挿入したＯＲＦが１組のＧＳとＧＥシグナルの側面に位置し、主鎖中のそれぞれの遺伝子が同様に１組の転写シグナルに隣接するように、設計するのが好ましいはずである。図２４Ａに示す遺伝子を移動させた構築体では、プロモーター近くの位置へのＧおよび／またはＦ遺伝子の挿入は、通常のアンチゲノム位置からの対応するコピーの欠失を伴い：Ｇが第１または第２の位置に移動した場合、ヌクレオチド６１０１〜６９６０が欠失してＧがその本来の位置から欠失し、Ｆが移動した場合、ヌクレオチド３０５３〜４７１０が欠失して本来存在するＦのコピーが欠失した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのこれらのウイルスの多段階の増殖動態の分析によって（図２４Ｂ）、それぞれが野生型の親より幾分か非効率的に複製したが、１遺伝子移動の突然変異体（ｒＨＭＰＶ−Ｇ１およびＦ１）の最終的な力価は、ｒＨＭＰＶの親のそれと同一であり、一方で二重遺伝子移動の突然変異体はほんの少し低かったことが示された。
【０２２３】
図２５Ａに示すように、他のペアの代表的ウイルスを構築し、その中でＧおよびＦ遺伝子はプロモーター近くの位置に挿入したが、それらの本来の位置の遺伝子のコピーは乱れていない状態であった。したがってｒＨＭＰＶ＋Ｇ１および＋Ｆ１は、示した遺伝子の２つのコピーを含む（名称中の記号「＋」は、遺伝子を「移動させた」のではなく、付加したことを示すことを記す）。同様に、ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２および＋Ｆ１Ｇ２は、示した位置に追加的コピーそれぞれＧおよびＦを含んでおり、ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２Ｆ３は、示した位置にＧの１つの追加的コピーおよびＦの２つの追加的コピーを含んでいた。興味深いことに、これらのウイルスの多サイクルの増殖動力学は、それらのｒＨＭＰＶ親と比較して幾分低下したが（図２５Ｂ）、しかしながらそれらの中で、様々な添加型突然変異体が同様の速度で増殖した。したがって、ＧＦＰに関しても観察したように、１つの遺伝子を加えることは幾分弱毒性があったが、１つまたは２つより多くの遺伝子をさらに加えることは、比較的大きいＦ遺伝子の場合でもほとんど効果がなかった。この個々の実験における複製のレベルは安定状態にならず、最終的なウイルス収量は測定しなかった。これらの個々の構築体では、加えた遺伝子は同じウイルス株のものであった。しかしながら、異なる株由来の１つまたは複数の遺伝子、抗原的差異を有する遺伝子などを、取り込ませることも可能であるはずである。したがって例えば、２つの異なる株を表すＦとＧの対を発現する、ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２ウイルスを作製し、広い免疫応答を誘導すると思われる１つの二価組換えウイルスを生成させることが可能であると思われる。
【０２２４】
回収したｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３のゲノム中の付加的遺伝子の存在および完全性を、Ｖｅｒｏ細胞の３回の継代の後に、回収したウイルス由来の全ＲＮＡに行ったＲＴ−ＰＣＲにより調べた。ＲＴ−ＰＣＲは、ＨＭＰＶのリーダー領域とハイブリダイズする正方向プライマー、およびＮ配列とハイブリダイズする逆方向プライマーを用いて行い、これによって約４．１ｋｂの、タンデムＧ１Ｆ２Ｆ３余剰遺伝子を含むのに適した大きさの、１つの主要なバンドを得た（図示せず）。余剰Ｇ１Ｆ２Ｆ３遺伝子の配列は、ＲＴ−ＰＣＲによるウイルスＲＮＡの共通配列の塩基配列決定によって、直接決定することはできないと思われる。なぜなら、ＧまたはＦに特異的なプライマーは、Ｇの２つのコピーおよびＦの３つのコピーのそれぞれに作用し、それぞれの遺伝子の分析を個々に妨げると思われるからである。したがって、３つの別個の重複セグメント中の余剰遺伝子を、ＲＴ−ＰＣＲによって最初に増幅させた。第１のＲＴ−ＰＣＲセグメントは、リーダー領域由来の正方向（プラスのセンス鎖）プライマー（これはＲＴプライマーとしても働いた）、およびＦ遺伝子（ＦＧＳシグナルの８４０ｎｔ下流）由来の逆方向プライマーを使用した：この後者のプライマーはＦのそれぞれのコピーに働くと思われるが、プロモーター近くのコピー（Ｆ２、ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３中と同様に番号処理）から働き、この正方向プライマーと組み合わせて最も効率がよいと思われ、リーダー、Ｇ１遺伝子、および約８４０ｂｐのＦ２遺伝子を含む１．６ｋｂまでの断片を作製し、これを配列分析用にゲル電気泳動によって精製した。第２のセグメントは、ＦＧＳの約６７０ｎｔ下流に位置するＲＴ／正方向プライマー、およびＦＧＳの５５４ｎｔ下流に位置する逆方向プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅させた：この正方向プライマーはＦの３つすべてのコピーに働き、逆方向プライマーはＦの３つすべてのコピーに働くと思われるが、Ｆ２とＦ３における働きが、Ｆ２遺伝子の下流の９７８ｂｐ部分およびＦ３の５５４ｂｐの上流部分を含む、ＰＣＲ断片（１．５ｋｂまで）の首尾のよい増幅をもたらす唯一の組合せであると思われ、これを配列分析用にゲル電気泳動によって精製した。第３の断片は、Ｆの上流端（ＦＧＳシグナルの１４ｎｔ下流）由来のＲＴ／正方向プライマー、およびＮの上流端由来の逆方向プライマーを用いて作製した：この正方向プライマーはＦの３つすべてのコピーに働くと思われるが、Ｆ３における働きが最も効率がよく、Ｆ３遺伝子の大部分、および１２０ｂｐのＮ遺伝子を含む約１．７５ｋｂの生成物を生成すると思われ、これを配列分析用にゲル電気泳動によって精製した。これによって、突然変異体を含まないＧ１Ｆ２Ｆ３余剰遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ共通配列が得られ、すべてのＧＳ／ＧＥシグナルおよび遺伝子間配列は正確であり、これらの加えた遺伝子は組換えウイルスにおいて安定して回収されたことが示された。
【０２２５】
ウイルスの遺伝子発現に対する遺伝子添加の影響を測定するために、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ８３、ｒＨＭＰＶ、またはｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３で、細胞を擬似感染または感染させ、全細胞内ＲＮＡを３日後に単離し、Ｆ、ＧまたはＭ遺伝子に対する二本鎖プローブを用いたノーザンブロット分析を施した（図２５Ｃ）。Ｆプローブによって１６４４ｎｔのＦのｍＲＮＡである適切な大きさの主要なバンド、ならびにゲノムおよびアンチゲノムのかすかなバンドを検出し、これはｒＨＭＰＶ＋ＧＩＦ２３の場合、３つの加えた遺伝子コピーの存在のため、ＨＭＰＶ８３またはｒＨＭＰＶと比較して４００８ｎｔ大きいと思われる（図２５Ｃ、レーン４）。Ｆプローブによって検出した、非常に少量の読み過ごしｍＲＮＡが存在した。Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析によって、ＨＭＰＶ８３およびｒＨＭＰＶと比較したｒＨＰＭＶ＋Ｇ１Ｆ２３に関するゲノムおよびアンチゲノムの量は、それぞれ０．９および０．５であったことが示された（ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３中に存在したＦ遺伝子の２つの正確なコピーに補正した）。これに対して、ＨＭＰＶ８３およびｒＨＭＰＶと比較したｒＨＰＭＶ＋Ｇ１Ｆ２３に関するＦのｍＲＮＡの相対量は、それぞれの場合６であった。ゲノムおよびアンチゲノムのそれぞれの値に正規化すると、これはＨＭＰＶ８３およびｒＨＭＰＶと比較して、６．６〜１２倍高いｒＨＰＭＶ＋Ｇ１Ｆ２３に関するＦのｍＲＮＡレベルに対応した。
【０２２６】
Ｇプローブを用いたノーザンブロット分析によって、それぞれの３つのウイルスに関して、７１１−ｎｔのＧのｍＲＮＡである適切な大きさの主要なバンド、およびＳＨ−ＧおよびＭ−ＳＨ−Ｇ読み過ごしｍＲＮＡに対応するバンド、ならびにアンチゲノムおよびゲノムＲＮＡに対応するバンドを検出した（図２５Ｃ、レーン６、７および８）。Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ分析によって、ＨＭＰＶ８３およびｒＨＭＰＶと比較したｒＨＰＭＶ＋Ｇ１Ｆ２３に関するゲノムおよびアンチゲノムの量は、それぞれ１．０および０．５であったこと（ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３中に存在したＧ遺伝子の正確なコピーに補正した）、前述のＦプローブに関して観察したのと非常に類似した値が示された。これに対して、ＨＭＰＶ８３およびｒＨＭＰＶと比較したｒＨＰＭＶ＋Ｇ１Ｆ２３に関するＧのｍＲＮＡの相対量は、それぞれ１４倍および１５倍であった。これは、ＨＭＰＶ８３およびｒＨＭＰＶと比較したｒＨＰＭＶ＋Ｇ１Ｆ２３に関する、１４〜３０倍高いレベルのＧのｍＲＮＡに対応すると思われる。したがって、ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３ウイルスによるＧおよびＦ遺伝子の発現は、実際大幅に増大した。
【０２２７】
ＨＭＰＶに対する改良型免疫原性組成物を設計するためのさらに他の戦略は、コドンの使用が効率のよい翻訳と一致するように、防御抗原をコードするＯＲＦを改変することである。具体的には、所与のＯＲＦ中の多くのコドンに関して、遺伝コードの縮重によって、アミノ酸コードの割りつけを変えずにコドンの２つ以上の選択が可能になる。いくつかの場合、特定のコドンの選択は効率のよい翻訳と関係があることが示されているが、一方で逆に、他のコドンの選択は低効率の翻訳と関係がある。したがって、ＨＭＰＶ抗原をコードするＯＲＦを再改変して、効率のよい翻訳と一致するコドンの選択を含ませることができる。その本来のゲノム位置のＯＲＦ、および移動しているＯＲＦ、または挿入されたＯＲＦに、これを行うことができる。
【０２２８】
本開示の他の例示的な実施形態は、１つの弱毒性ＨＭＰＶの主鎖を使用して、２つ以上のＨＭＰＶ株、亜型または血清型に対する免疫原性組成物を作製することに関する。この適用例では、株８３などのＨＭＰＶの弱毒性誘導体の防御抗原遺伝子を単独で、あるいは異種ＨＭＰＶの対応する遺伝子とまとめて置換する。弱毒性である親のＨＭＰＶの大部分の弱毒化突然変異が、防御抗原遺伝子以外の遺伝子に存在すると仮定すると、これによって、親の弱毒性主鎖が異種株の防御抗原を有するキメラウイルスがもたらされる。このキメラウイルスは、したがってそれ自体を投与することができ、あるいは本来の親と組み合わせて、２ウイルスに対する２ウイルス用の二価免疫原性組成物を作製することができる。このプロセスは、必要に応じて他の異種株に繰り返すことができる。
【０２２９】
本開示のさらに他の例示的な実施形態は、ＧＦＰによって実施例ＩＩ中に例示する、１つまたは複数の外来性ＯＲＦをコードする１つまたは複数の転写カセットの添加に関する。この適用例では、外来性遺伝子をＨＭＰＶ転写シグナルの制御下に置き、ゲノム中、ウイルスの生存力を害さない位置、例えば遺伝子間領域または遺伝子非コード領域などに挿入する。このようにして、異種病原体、または免疫調節分子の防御抗原をコードするタンパク質などの、様々な外来性タンパク質を発現させることができる。
【０２３０】
さらに他の例示的な実施形態では、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを組換えによって改変して、Ｌタンパク質中のアミノ酸位置４５６にフェニルアラニンからロイシンの突然変異、Ｆ４５６Ｌで示される突然変異を組み込んだ。この特定の突然変異は、他の異種の突然変異非セグメント化ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス中の、弱毒化突然変異体をコードする位置に対応する、アミノ酸配列アラインメントによって示唆された。図２６Ａ中の配列アラインメントは、ＲＳＶ低温継代温度感受性（ｃｐｔｓ）突然変異体ｃｐｔｓ５３０のＬ遺伝子中の突然変異によって示される、Ｌタンパク質中のフェニルアラニン−５２１からロイシン（Ｆ５２１Ｌ）への置換を示す（Ｊｕｈａｓｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５８１４〜９、１９９９）。ＲＳＶ配列中の野生型Ｆ５２１残基は、調べた他のモノネガウイルスの間で正確に保存されており、特にＨＭＰＶ中に存在する。対応する残基のアミノ酸位置はそれぞれのＬタンパク質中で同じではなく、様々な個々の分子中の他の場所の、長さならびに小さな欠失および挿入の違いを表すことを記さなければならない。したがって対応する残基は、ＨＭＰＶ中ではＦ４５６である。この比較地図作製分析から、ＨＭＰＶ中のＦ４５６残基を同一、保存、またはさらに非保存アミノ酸置換の標的として同定する（例えば、Ｆ４５６残基とロイシンの置換、あるいはロイシンと比較した保存または非保存アミノ酸の置換）。この特定の実施例では、Ｆ４５６Ｌ突然変異体をｒＨＭＰＶ−ＧＦＰに導入し、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−Ｆ４５６Ｌで示す組換えウイルス中で容易に回収した。図２７に示すように、この突然変異体は、その直接の親であるｒＨＭＰＶ−ＧＦＰの効率と区別不能であった効率、効率のよいウイルス回収、評価および生成に重要な特性で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて複製した。したがって、この突然変異体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのその表現型特性を決定するための、さらなる評価用の優れた候補である。図２６Ｂ〜２６Ｆおよび２８の考察を含めた、この一般的戦略の他の記載事項は、本開示の方法に基づいて弱毒性誘導体を迅速に設計するための他の戦略と共に上記で示してある。
【０２３１】
生弱毒ワクチン候補を作製するためのさらに他の戦略は、哺乳動物または鳥類ウイルスを使用して抗原的に関係があるヒトウイルスに対して免疫処置することを含む、「Ｊｅｎｎｅｒｉａｎ」手法である。この手法は、ヒトの天然痘に対する最初のワクチンとしての、Ｅｄｗａｒｄ  Ｊｅｎｎｅｒの成功した牛痘の使用にちなんで名づけられている。この手法は、進化しておりその本来の動物宿主中で効率よく複製するウイルスは非効率的に複製し、したがって非天然ヒト宿主中で弱毒性であり、宿主域の制限を表すという概念に基づく。このような宿主域の制限は典型的には、非常に安定した表現型、多くのヌクレオチドの凝集効果、および動物とヒトウイルス対応物の間のアミノ酸配列の違いである。多くの遺伝子座に基づく表現型は、変化に抵抗力があると思われる。
【０２３２】
「Ｊｅｎｎｅｒｉａｎ」ワクチンの他の例は、それぞれのヒトウイルスに対するワクチン候補としての、ウシロタウイルスまたはウシＰＩＶの使用を含む。これは動物ウイルスの使用を含むことができる。なぜならそれは、ワクチンとしてのウシＰＩＶの直接的な使用によって示されるように、生来の形で与えられるからである（Ｋａｒｒｏｎら、Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  Ｊ  １５：６５０〜６５４、１９９６）。あるいは、いくつかの遺伝子は動物ウイルスに由来しいくつかの遺伝子はヒトウイルスに由来するように、ウイルスを改変することができる。このような場合、主要な防御抗原は、誘導される免疫がヒトウイルスに対して最も有効であるようにヒトウイルスに由来し、１つまたは複数の他の遺伝子は、それらが宿主域の制限を与えるように動物ウイルスに由来することが好ましい。１つのこのような状況には、ヒトウイルスとウシパラインフルエンザ３型ウイルスの間のキメラがあり：１つの場合、弱毒化ウシウイルス主鎖は、防御ＨＮおよびＦ抗原遺伝子がヒトウイルスの遺伝子に置換され、これによって弱毒化ウシウイルス主鎖とヒトウイルスの抗原決定基を組み合わせたように改変され（Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８９２２〜８９２９、２０００）、第２の場合ヒトウイルスは、ヌクレオキャプシドＮタンパク質の１つの遺伝子とそのウシウイルス対応物の遺伝子を置換することによって弱毒化された（Ｂａｉｌｌｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：３１８８〜３１９５、２０００）。驚くことに、これらのウシ／ヒトキメラウイルスのそれぞれが、げっ歯類および非ヒト霊長類において満足がいくほど弱毒性かつ免疫原性であり、両方共に臨床試験用に好ましい。
【０２３３】
図３０Ａは、ＨＭＰＶのＮ、ＰまたはＭのＯＲＦと、ＡＰＶ亜型Ｃ由来の対応するＯＲＦを個別に置換することによって構築した、キメラＨＭＰＶワクチン候補を示す。アミノ酸レベルでは、ＨＭＰＶとＡＰＶ−ＣのＮ、ＰおよびＭ遺伝子は、それぞれ９０、６９、および８９％同一である。比較のため、そのヒトＰＩＶ主鎖中への置換が有望なワクチン候補をもたらした、ウシパラインフルエンザ３型ウイルスのＮタンパク質もこの範囲内にあり、そのヒトウイルス対応物と８５％同一であった。さらに、ＨＭＰＶとあまり密接には関係がないＡＰＶのＡ、ＢおよびＤ亜型が存在し、その高度の相違性が高度の弱毒性をもたらす可能性がある他の置換ＯＲＦの源を与える。
【０２３４】
図３０のパネルＢ、ＣおよびＤは、キメラＮ（図Ｂ）、Ｐ（図Ｃ）、およびＭ（図Ｄ）遺伝子の構築を示す。それぞれの図中、上部の配列は本来のＮ、ＰまたはＭのＨＭＰＶ遺伝子を含むｃＤＮＡの配列であり、それぞれの図の下部の配列は、ＨＭＰＶのＯＲＦがそのＡＰＶ対応物に置換されたｃＤＮＡである。本来のＨＭＰＶのｃＤＮＡおよびキメラＨＭＰＶ／ＡＰＶのｃＤＮＡは、それぞれの認識配列の内側で切断して４ｎｔのオーバーハング部が生じる、酵素の制限認識部位（示したＢｂｓＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｆｕＡＩ）に隣接するように構築した。これら個々の酵素の実際の切断部位は配列特異的ではないので、本来のＨＭＰＶ配列を有するように、切断部位を設計することができる。これによって、図３０Ｅに示すように、１ステップでＮ、ＰおよびＭ遺伝子を一緒に連結させることができる。ＨＭＰＶおよびＨＭＰＶ／ＡＰＶ遺伝子の任意の組合せを連結させることができる。例えば、ＨＭＰＶ／ＡＰＶ  ＮとＨＭＰＶ  ＰおよびＨＭＰＶ  Ｍの連結によって、ＮのＯＲＦのみがＡＰＶに由来するウイルスが生成すると思われる。単一、二重または三重のＯＲＦの置換を容易に行うことができる。これは弱毒性の宿主域の突然変異体を導入するための１つの戦略、すなわち主鎖がＨＭＰＶに由来し、ＡＰＶ由来の１つまたは複数の個々のＯＲＦを導入する戦略を表す。本発明の開示の方法によって行うこともできる別の戦略は、全長ＡＰＶゲノムで始め、推定保護抗原の遺伝子、すなわちＧ、ＦおよびＳＨを、あらゆる組合せが望ましいそれらのＨＭＰＶ対応物に置換することに関する。これによって、ＨＭＰＶの抗原決定基とＡＰＶの弱毒性主鎖が結合するだろう。
【実施例４】
【０２３５】
改良型免疫原性組成物を開発するための、ＨＭＰＶの異なる抗原亜型間の遺伝的多様性の分析
ｖａｎ  ｄｅｎ  ＨｏｏｇｅｎらがＨＭＰＶの単離を最初に記載したとき、彼らは様々な単離体（株とも呼ぶ）の間に相当な多様性が存在したことを述べ、「ｈＭＰＶ単離体のこれらの亜型はｈＭＰＶの異なる血清型を表すと、推測することは興味深い」と記した（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７１９〜２４、２００１）。「血清型」は、一次免疫処置の後に、ＨＭＰＶの亜型間にわずかな抗原交差反応性が存在することを意味し、それぞれのための個別のワクチンの開発が必要になると思われる。ＨＭＰＶの亜型が抗原交差反応性を示す場合でも、亜型内で比較して亜型間の中和および防御が大幅に低下するような、十分な抗原多様性が存在すると思われ、両方のこのような亜型をＨＭＰＶに対する有効な免疫原性組成物中に封入することが、必要となる可能性がある。配列の多様性もＰｅｒｅｔらによって、ただしゲノムの小さなセグメントの分析の後に報告され、彼らはＨＭＰＶの２つの「主要な群または系統」が存在する可能性があることを述べた（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８５：１６６０〜３、２００２）。このことは、いくつかのＨＭＰＶ単離体のＮ、Ｐ、ＭおよびＦ遺伝子の近年の配列分析によっても支持される（Ｂａｓｔｉｅｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．９３：５１〜６２、２００３）。循環ＨＭＰＶ株間の配列および抗原多様性の程度は、疫学、ウイルス検出、および免疫原性組成物の開発に非常に重要である。本明細書に記載した株８３および００−１は、示した亜型の１つのメンバーであり、したがって、第２の亜型を表す第３の株を分析した（７５）。３つの株の比較によって、亜型間の（株８３または００−１と７５）、あるいは亜型内（株８３と７５）の遺伝的多様性の程度の指標を得た。
【０２３６】
株７５のゲノムの完全な共通配列（図３９Ａ〜３９Ｄ）を、株８３に関して前の実施例Ｉに記載した一般的手順を使用して決定した。この分析では、株７５のゲノム末端の配列を、実施例Ｉに記載したのと同様の３’および５’ＲＡＣＥによって決定した。株８３はその全容が明確な配列を作製したが、株７５は、ＳＨおよびＧ遺伝子中のいくつかの位置が２つの割りつけの混合物を含んでいた配列を作製した。これによってその単離体は、元の臨床サンプル中に存在したかあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの継代中に生じた準種の変異体を表す可能性がある、２つ以上のウイルスの混合物であったことが示唆された。ＳＨおよびＧ遺伝子に広がるクローン化ＲＴ−ＰＣＲ産物を分析することによって、２つの異なるウイルスをおそらく表す、２つの密接に関係がある配列のペアが生じた。１つの複製能を有するＨＭＰＶ７５ウイルスに明確に属すると思われる配列を得るために、単離体をプラーク精製による生物学的クローニングに施した。８つの別個のプラーク精製調製によって、クローン化ｃＤＮＡ配列の２群の１つのそれと一致したＳＨおよびＧの領域中に、同一の共通配列が生じた。この配列は主要成分であるようであり、ＨＭＰＶ７５であると解釈した。
【０２３７】
株７５のゲノムは、株８３の１３，３３５および株００−１の推定長１３，３７８と比較して、１３，２８０ヌクレオチド長である。交差亜型の比較を示す、株８３および７５のゲノム地図を図２９に示す。全体的に、この２つのゲノムは、それぞれ２つのＲＳＶ抗原亜型ＡおよびＢを表す（それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ７４５６８およびＡＦ０１３２５４）ＲＳＶのＡ２株とＢ１株の間の８１％と比較して、８０％のヌクレオチド同一性を共有していた。同様に、単離体７５のヌクレオチド配列（図３９Ａ〜３９Ｄ）は、単離体００−１の配列（００−１の配列が入手不能であった領域は除く）と８０％同一であり、第２の交差亜型の比較を表す。亜型間の比較を表す、単離体８３の配列（図３７Ａ〜３７Ｄ）と００−１の配列は、９２％同一であった。本明細書でさらに詳細に述べるように、２つのＨＭＰＶ亜型の間の相違のレベルには、ＲＳＶの２つの抗原亜型間のそれと相当な類似性がある。この発見は予想外のものであり相当な意義がある。なぜなら、疫学および免疫原性組成物の開発に関するＲＳＶの多様性の重要性に関する広範囲の情報が存在し、これによって、特に全体の程度が類似しているので、ＨＭＰＶ亜型の間の相違を考慮するのに非常に有用な状況が与えられる。本明細書に記すように、ＨＭＰＶとＲＳＶの多様性の間にはある程度の違いが存在したが、ここでもＲＳＶは、これらの違いを評価するのに有用な基準を与える。
【０２３８】
パラミキソウイルス科の大部分の属に関しては、それぞれのゲノムのヌクレオチドの長さがちょうど６の倍数であるという、「６の法則」が存在する（Ｋｏｌａｋｏｆｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８９１〜８９９、１９９８）。多くの場合、ヘキサマー間隔に対するシス作用性シグナルの配置も保存型をたどる。しかしながら、ＨＭＰＶの複製および遺伝子発現は、以下の知見に基づく相の要件の支配を受けていないと思われる：（ｉ）３つの入手可能な単離体の配列は、前述のように長さが異なる；（ｉｉ）２から９までの整数は、３つのゲノムそれぞれに均一に分けられない、および（ｉｉｉ）単離体内または間の遺伝子境界の相の、明らかな型は存在しなかった。前の実施例中に示したように、相の要件の不在は、広く様々な長さを有するいくつかの組換えウイルス突然変異体を回収する能力によっても示唆される。このような要件の不在は予想外であり、組換えＨＭＰＶの構築を非常に容易にするであろう。
【０２３９】
２つのＨＭＰＶの遺伝的亜型を表す完全なゲノム配列の有用性は、亜型間の示したＨＭＰＶ転写シグナルの関連性を調べるための機会を与える。これは図３１に示し、２つの亜型間の推定ＧＳ、ＧＥと遺伝子間配列を比較する。ＧＳシグナルとＧＥシグナルは、異なる遺伝子間および２つの亜型間で広範囲の配列同一性を示し、いくつかの残基は全配列中で正確に保存された。これに対して、遺伝子間領域は亜型間でわずか４８％の同一性を示し、推定ＧＳおよびＧＥシグナルの一部分ではなかった非コード遺伝子領域は、わずか５４％の同一性を示した。配列同一性のパターンのこの顕著な違いは、前の実施例ＩＩにおいてＧＦＰ発現カセットによって示した転写活性に関する機能分析と組み合わせて、これらの重要なシス作用性シグナルを明確に示すための指針および実験法を与える。逆に、遺伝子間領域、および非翻訳、非シグナル遺伝子領域などの領域を同定することによって、遺伝子挿入、遺伝子再編成および他の遺伝的改変に関する修飾が許容されると思われる可能性が高い領域が指摘され、免疫原性組成物に使用するための組換えウイルスの生成を容易にするであろう指針が与えられる。
【０２４０】
ＧＳシグナルを含むと思われる、それぞれの遺伝子の上流端における保存配列は、１６ヌクレオチド、コンセンサス：ＧＧＧＡＣＡＡｎＴｎｎｎＡＡＴＧからなる（図３１）。今日までに塩基配列決定されているあらゆるＨＭＰＶ単離体の、ＧＳシグナルの１つの希な特徴は、主要なＯＲＦの始まりである位置１４〜１６におけるＡＴＧの存在である（図８および３１）。株７５および００−１のＳＨ遺伝子中には、ＧＳ位置８〜１０に追加的な上流ＡＴＧが存在する：しかしながら、その好ましくない配列状況のために、この開始部位を使用する可能性はない。本開示の方法によって、位置１４〜１６のＡＴＧがＨＭＰＶのＧＳシグナルの機能的要素であるかどうか、あるいはこの翻訳開始部位の保存された間隔が遺伝子発現において何か他の役割を果たすかどうか、決定することができる。これは、完全な組換えウイルスまたはミニゲノム系を使用して容易に行うことができる。それぞれのＨＭＰＶ遺伝子の下流端は、推定１２〜１５ヌクレオチドのＧＥモチーフ（コンセンサス：ＡＧＴＴＡｎｎｎＡＡＡＡＡ）によって描写され、（プラスのセンス鎖中は）高度に保存されたＡＧＴＴＡペンタマー、次にあまり保存されていないＡ／Ｔ多量トリヌクレオチド、次に４〜７Ａ残基の区域からなる。ＧＥモチーフに似た配列も、ＨＭＰＶリーダー領域の下流端近くに存在し（図３１）、本開示の方法によって、この機能がＧＥシグナルに似ているかかどうか明らかになるであろう。
【０２４１】
図３２は、様々な個々のＯＲＦおよびそれらのコードするタンパク質に関する、２つのＨＭＰＶ亜型（株８３と７５）の間および亜型内（株８３と００−１）の、ヌクレオチド同一性およびアミノ酸配列同一性の割合を示す。２つの亜型間のヌクレオチド配列同一性に関しては、ＨＭＰＶのＯＲＦはＳＨとＧ以外は８１〜８７％のヌクレオチド同一性を共有しており、これらは実質的にはさらに相違していた（それぞれ６９％および５９％の同一性）。このパターンは、様々なＯＲＦのヌクレオチド同一性の割合が、さらに相違したＭ２−２、ＳＨおよびＧのＯＲＦ（それぞれ６９％、７７％、および６７％の同一性、図３２）以外８１〜８５％同一であった、ＨＲＳＶの２つの亜型のそれと似ていた。前述のように、遺伝子間領域および非コード遺伝子領域（ＧＳおよびＧＥシグナル除く）は、ＲＳＶに関するそれぞれ４２％および約５０％の値と比較して、亜型間でそれぞれ４８％および５４％の同一性であった（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９０１〜２９０６、１９８８）。したがって、ＨＭＰＶのＧのコード配列は、一般にＨＭＰＶ非コード遺伝子配列よりもごくわずかに保存された（５９％と５４％）。ＳＨタンパク質、特にＧタンパク質をコードするＯＲＦの、広範囲のヌクレオチド配列の相違も、同じ亜型の２つの株間で見られた（株８３と００−１、図３２）。
【０２４２】
図３２は、２つの亜型（株８３と株７５）の間、および亜型内（株８３と００−１）の、様々なＨＭＰＶタンパク質のアミノ酸配列関連性も示す。プロテオーム全体に関しては、ＨＭＰＶ亜型は、ＲＳＶ亜型間の８８％の同一性と比較して、９０％のアミノ酸配列同一性を共有していた。個々のタンパク質に関しては、最も保存されたＨＭＰＶタンパク質は、Ｎ、Ｍ、Ｆ、Ｍ２−１、およびＬ（亜型間で９４％以上の同一性）、次にＰおよびＭ２−２（８５％〜８９％）、次に相違(divergent)ＳＨ（５９％）およびＧ（３７％）タンパク質であった。ＳＨおよびＧは、アミノ酸レベルでの関連性の割合がヌクレオチドレベル未満であった唯一のタンパク質であり、アミノ酸置換が優先的に保たれたことが示唆された。
【０２４３】
亜型間のＨＭＰＶの配列多様性のパターンは、ＲＳＶのそれと一般的な類似性を有する（図３２）。ＲＳＶに関しては、「内部」ウイルス粒子タンパク質およびＦタンパク質は、一群の高度に保存された種を構成したが、一方Ｍ２−２、ＳＨおよびＧタンパク質はさらに相違した。ＨＭＰＶとＲＳＶの間の３つの違いが特に顕著であった：（ｉ）ＨＭＰＶのＭ２−２タンパク質は、そのＲＳＶ対応物（６１％）よりも著しく保存された（亜型間で８９％のアミノ酸配列同一性）；（ｉｉ）ＨＭＰＶのＦタンパク質も、ＲＳＶの場合より保存された（亜型間で９５％の同一性と８９％）；および（ｉｉｉ）ＨＭＰＶのＳＨおよびＧタンパク質は、それらのＲＳＶ対応物よりも著しく相違した（それぞれ７２％と５５％と比較して、それぞれ亜型間で５９％と３７％の同一性）。図３２は、亜型内（株８３と００−１）のＨＭＰＶタンパク質も比較する。大部分のタンパク質に関して、アミノ酸同一性の割合は非常に高く（９５％以上）、ＳＨおよびＧタンパク質はさらに相違していた（それぞれ８５％と７０％の同一性）。ＨＭＰＶ亜型内のＧの７０％という配列同一性の値は、７亜型のＢ株の分析（Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５４２５〜５４３４、１９９１）から、ＲＳＶのＧに関して報告された９１％という値よりはるかに低い。したがって、ＨＭＰＶのＳＨタンパク質、特にＧタンパク質は、亜型内および亜型間でそれらのＨＲＳＶ対応物の場合よりも著しく相違した。この発見は予想外であったし、重要である。なぜなら、このことはこれらの抗原が、２つの亜型を有意な防御抗原として同定した後にそれらを免疫原性組成物中に示すことが重要であるための、抗原であろうことを示すからである。ＨＭＰＶタンパク質が防御抗原であるかどうかを評価するための試験は、以下に示す。
【０２４４】
ＨＭＰＶのＭ２−２のＯＲＦとタンパク質が、２つの推定亜型間で高レベルの同一性を示したことを発見したことも驚きであった。なぜなら、ＲＳＶのＭ２−２はあまり保存されないからである（図３２）。ＲＳＶの場合、Ｍ２−２のタンパク質は、感染性組換えウイルス中においてそのＯＲＦを破壊することによって、改変されたウイルス増殖およびＲＮＡ合成がもたらされたという観察によって、機能的遺伝子の産物として同定された（ＢｅｒｍｉｎｇｈａｍおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１１２５９〜１１２６４、１９９９；Ｊｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：７４〜７８、２０００）。前述のように、Ｍ２−２のＯＲＦが非機能的になっているｒＨＭＰＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで依然として生存力があるが、その表現型は依然として完全に定義されていない。ＨＭＰＶ亜型間のＭ２−２のＯＲＦに関する高レベルの配列保存性によって、それが十分な生成物をコードすることが示唆され、免疫原性組成物中のその不在は弱毒性および有用性を示す可能性がある。ＲＳＶのＭ２−２のＯＲＦはリボソームの停止−再開始機構によって発現され、これによってＭ２−１のＯＲＦを出るリボソームは、重複Ｍ２−２のＯＲＦにおいて翻訳を二重逆転および開始させるようである（Ａｈｍａｄｉａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：２６８１〜２６８９）。ＨＭＰＶのＭ２−２のＯＲＦに関しては、Ｍ２−１のＯＲＦの翻訳停止コドンの３８および５０ヌクレオチド上流に位置する、２つの考えられるメチオニル翻訳開始部位が存在する。これら２つの部位は、ここで比較する３つすべての株間で正確に保存されており、高度に保存された配列中に埋め込まれている。これは、交差亜型の比較の有用性は、重要である可能性がある構造的特徴を同定するのに有用であり、その考えられる機能的役割を、本開示の方法により完全な組換えウイルスまたはミニゲノムを使用して、試験することができる他の例である。
【０２４５】
ＨＭＰＶのＦ、ＳＨおよびＧタンパク質は、３つのＲＳＶ表面糖タンパク質Ｆ、ＳＨおよびＧに対応するようであるが、ＨＭＰＶとＨＲＳＶ対応物の間にはＦに関してのみ明らかな配列関連性が存在した（３３％のアミノ酸同一性）。ＲＳＶに関しては、ＧおよびＦが唯一の有意な中和抗原であり、主要な防御抗原である。ＨＭＰＶのＦタンパク質は、以下の実施例においてＨＭＰＶの中和および防御抗原として同定する。考えられる中和および防御抗原としての、残りのＨＭＦＶタンパク質の状態は、同じ方法によって決定することができる。ＲＳＶのＦタンパク質は亜型間で高度の抗原関連性を有し（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３１６３〜３１６６）、その配列関連性と一致し（図３２）、ＨＲＳＶ交差亜型の中和および保護に対する主要な貢献因子である。ＨＭＰＶのＦに関しては、亜型間のアミノ酸配列同一性はＲＳＶよりさらに高く、このことは同様に、ＨＭＰＶ亜型間の交差中和および交差保護に有意に貢献すると予想することが妥当である。逆に、ＨＭＰＶ亜型間およびＨＭＰＶ亜型中のＧタンパク質の高度の相違は、ＲＳＶの場合よりもさらに高い程度で、交差中和および交差保護に対するその寄与を損なう可能性がある。
【０２４６】
図３３は、ＳＨ（図３３Ａ）およびＧ（図３３Ｂ）タンパク質に関する、亜型間および亜型内のアミノ酸配列アラインメントを示す。ＨＭＰＶのＳＨタンパク質は、そのＲＳＶ対応物と同様に、そのアミノ末端（図３３Ａ、枠で囲った配列）、ならびに細胞質アミノ末端および細胞外カルボキシ末端近くに位置する、疎水性シグナル／アンカー配列の近くに原形質膜中において挿入される、ＩＩ型糖タンパク質であると予想される。株７５、８３、および００−１のＳＨタンパク質は長さが異なり（それぞれ１７７、１７９、および１８３アミノ酸、図３３Ａ）、ＲＳＶ中のそれらの６４または６５アミノ酸の対応物より相当長かった。予想細胞外ドメインは、その１つが３つの単離体すべてで保存されているＮ結合糖鎖付加用の２〜４個のモチーフ、および３つの単離体すべての残基７５〜８１内に集中する、３または４個のＯ糖鎖付加の可能性がある部位（Ｈａｎｓｅｎら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１５：１１５〜１３０、１９９８）を有する（図３３Ａ）。さらに、３つの単離体のＳＨタンパク質は、９または１０個のシステイン残基を含み、これらは大部分が細胞外ドメインに存在し、そのうちの９個は３つの単離体すべての間で保存されている。異なる単離体のＳＨタンパク質間の長さおよびアミノ酸配列の違いは、細胞外ドメインに集中した。
【０２４７】
ＨＭＰＶのＧタンパク質（図３３Ｂ）も、ＲＳＶのＧタンパク質と一般的類似性を有する（ただし有意な配列関連性はない）、ＩＩ型表面タンパク質である。株７５、８３、および００−１のＧタンパク質のアミノ酸長は２３６、２１９、および２３６であり、ＲＳＶ中のそれらの２８９〜２９９アミノ酸の対応物より相当短かった。ＨＭＰＶのＧタンパク質は、そのＲＳＶ対応物と同様に、高い割合のセリンおよびスレオニン残基（１３％のデータベース平均と比較して、３つの単離体に関して３２〜３５％）、および幾分か高レベルのプロリン残基（５％の平均と比較して７〜８．５％）を含む。株８３、−７５、および００−１は、それぞれ１、４および４個の、外部ドメイン中においてＮ結合糖鎖付加の可能性がある受容体部位を有していた。それぞれのＨＭＰＶのＧタンパク質は、Ｏ結合炭水化物用の４０を超える予想受容体部位を含んでおり（図示せず）：ＲＳＶとの類似性によって、これらのすべてが使用されるわけではない可能性があり、使用されるのは異種のものである可能性がある。セリン、スレオニン、プロリン残基、およびＯ結合糖に関する予想部位は、予想細胞外ドメインに集中しており、ＲＳＶの場合に考えられるように、この領域が長く広い、十分に糖鎖付加した「ムチン様」構造を有することが示唆された。
【０２４８】
ＨＭＰＶのＧタンパク質は、細胞外ドメインに局在する多くのアミノ酸相違を有する点において、ＲＳＶのタンパク質にも似ている（図３３Ｂ）。詳細には、組み合わせた細胞質ドメインと膜貫通ドメインは、亜型間および亜型内で２５％および６１％の同一性という細胞外ドメインに関する著しく低い値と比較して、それぞれ亜型間および亜型内で６４％および９６％同一であった。比較用に、２５％のアミノ酸配列同一性という値は、パラミキソウイルス属およびルブラウイルス属またはアブラウイルス属などの、異なる属由来のＰＩＶの結合ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼタンパク質に関して観察された値に匹敵し、亜型Ｈ１、Ｈ２およびＨ３間でインフルエンザＡヘマグルチニン糖タンパク質に関して観察された、４２〜６６％の同一性という値より相当低い。
【０２４９】
ＨＭＰＶのＧタンパク質は、そのＲＳＶ対応物の優れた特徴のいくつかを欠いている。ＨＭＰＶのＧタンパク質は、全ＲＳＶ株間で正確に保存されておりウシＲＳＶ中で部分的に保存されている、ＲＳＶのＧの細胞外ドメイン中の保存された１３アミノ酸ドメインを欠いている（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：５６２５〜５６２９、１９８７；ＴｅｎｇおよびＣｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：６１６４〜６１７１、２００２）。実際、ＨＭＰＶのＧの外部ドメインは、３つの単離体すべての間で保存されていた、３個を超える隣接アミノ酸は含まなかった。ＨＭＰＶのＧは、１３アミノ酸保存ドメインと部分的に重複し、システインヌースを形成し、ＣＸ３Ｃケモカインモチーフを含む、ＨＲＳＶのＧ中の４つの保存された密接に配置するシステイン残基も欠いている（Ｔｒｉｐｐら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：７３２〜７３８  ２００１）。図３３Ｂ中の３つのＨＭＰＶのＧタンパク質は、わずか１個または２個のシステイン残基をそれぞれ含んでおり、唯一保存されていたのは、脂肪酸アシル化の可能性がある受容体部位を表す内面の細胞質ドメインであった。ＨＭＰＶのＧは、分泌形を生成しＨＲＳＶ亜型間で保存されている、ＨＲＳＶのＧのＯＲＦ中の第２のメチオニル翻訳開始コドンの対応物も欠いている（Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４５３８〜４５４６、１９９４）。単離体ＣＡＮ７５のみが適切に位置する潜在的な対応物（メチオニン−４３）を有し、これは第２のメチオニル残基ではなく第４の残基である。したがって、その存在または不在が亜型間で一貫している配列の特徴を比較することによって、突然変異分析用の考えられる標的としての構造的特徴の同定、および本発明の開示の方法に従い免疫原性組成物中で使用するための、キメラ組換えウイルスの構築が助けられる。
【０２５０】
ＨＭＰＶのＳＨおよびＧタンパク質の高レベルの相違は、これらのタンパク質中でのアミノ酸の変化の保持に関する優先性が存在するという考えと一致する。これらの相違がそれぞれのタンパク質の細胞外ドメインに集中したことは、特に注目に値する（図３３Ａ、Ｂ）。Ｆ、ＧおよびＳＨのＯＲＦの細胞外ドメインに関して、ヌクレオチドコード配列をコドン毎に調べることによって、１つのヌクレオチド変化を含むコドンの７５％が、ＳＨの５０％およびＦの７％と比較して、アミノ酸置換と関係があったことが示された。本明細書の発見に基づくと、ＨＭＰＶのＧ（それより低い程度でＳＨ）中のヌクレオチド置換当たりの異常な頻度のアミノ酸置換は、２つの要因：（ｉ）宿主の免疫性に由来する可能性がある、アミノ酸の変化に関する選択圧、および（ｉｉ）その示される広範囲の、折りたたまれていない性質が原因である可能性がある、置換に耐えるタンパク質の能力を反映することが示唆される。これに対して、ＨＭＰＶのＦはＨＲＳＶのＦに似ているようであり、これは主要なＨＲＳＶ中和および防御抗原としてのその状態にもかかわらず、より高度に保存されたタンパク質の１つである。これはおそらく、この折りたたまれた球状糖タンパク質中の、アミノ酸置換に関する機能的および構造的制約を反映する。ＨＭＰＶに関するヌクレオチドおよびアミノ酸置換の時間的規模は知られていないが、ＨＲＳＶに関しては抗原的変化、したがって長年の緩慢な蓄積をおそらく反映する違いを検出することは困難であることが記された。これらの知見は、ＳＨおよびＧの多様性は、ＨＭＰＶの疫学、ウイルス検出、および有効な免疫原性組成物の開発に関する重要な考慮事項であることを示す。
【０２５１】
結論として、この実施例は、２つの示したＨＭＰＶ遺伝的亜型間に存在する遺伝子的多様性の量を明確にし、全体として亜型間の多様性は、十分に特徴付けられているＲＳＶ抗原亜型の間で見られる多様性と程度が類似しているが、いくつかの特異的な違いを観察したことを示す。２つの相違ＨＭＰＶ亜型を比較することによって、転写シグナルモチーフの同定をさらに具体化した。逆に、非シグナル、非タンパク質コード遺伝子領域、および遺伝子間領域などの、あまり保存されていない領域を同定することによって、遺伝的操作の影響を受ける可能性がある部位として、これらの部位を選択する際の指針が与えられる。重要なことに、Ｆ糖タンパク質は２つの亜型間で高度に保存されることが示され、これによって、広い交差反応性の免疫原性組成物を生成させるために、本開示の組換えＨＭＰＶおよびキメラ組換えＨＭＰＶ中に取り込ませるための、この表面タンパク質の有用性が強調される。逆に、他の２つのウイルス表面タンパク質、ＳＨとＧは、亜型間で高度に相違していることが実証され、したがってこれらは組換えＨＭＰＶおよびキメラ組換えＨＭＰＶ中で使用して、交差亜型免疫性ではなく亜型特異的な免疫性に貢献させる（ただしこれらは、本明細書に前に記載したように、多効果の免疫原性組成物中に使用されることが多い）。抗原レベルでの２つの遺伝的亜型の多様性を本明細書において特徴付けし、主要な中和および防御抗原としてのＦタンパク質の重要性を実証する。
【実施例５】
【０２５２】
ＨＭＰＶの感染性および免疫原性を評価するための実験動物の使用
７５および８３株に対するハムスターポリクローナル抗ＨＭＰＶ抗体の作製
ＨＭＰＶはげっ歯類動物モデル中で感染性があり、モデル宿主中でのＨＭＰＶ特異的抗体の生成によって特徴付けられる免疫応答を誘導することができることを実証するために、３グループの８〜１０週齢のゴールデンシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）に、約１０３〜１０４のＴＣＩＤ５０のＨＭＰＶ株７５と８３の混合物、ＨＭＰＶ７５のみ、またはＨＭＰＶ８３のみを鼻腔内（ＩＮ）感染させた。前の実施例に記載したのと同様に、株７５および８３（それぞれＣＡＮ７５およびＣＡＮ８３とも呼ぶ）は、ＨＭＰＶの２つの遺伝的亜型を表し、したがってそれぞれの亜型由来のウイルスの生物学的特性の評価を与え、特に亜型間の抗原多様性の指標となる。血清サンプルを免疫処置後第２８日または第４４日に回収し、間接免疫蛍光法によってＨＭＰＶ感染したサル腎臓細胞（ＬＬＣ−ＭＫ２）を検出するそれらの能力に関して調べた。ガラススライド上のＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧＩＢＣＯ）で増殖させたＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、ＨＭＰＶ株７５と８３の混合物、株７５のみ、または株８３のみで感染させ、５μｇ／ｍｌのトリプシンと共にＯｐｔｉＭＥＭ培地中において３２℃でインキュベートした。感染後約７０時間で、以前に記載されたのと同様に（ＳｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓおよびＭｃＢｒｉｄｅ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１１１７〜２４、１９９６）、ＰＢＳに溶かした３％のホルムアルデヒドおよび０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を用いて、細胞を固定し浸透処理した。間接免疫蛍光法を、ＨＭＰＶ７５＋８３を接種した動物から集めたハムスター血清に行い、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗シリアンハムスターＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を間接免疫蛍光法用に使用した。対照として、ＨＭＰＶに血清反応陽性の成人のヒト由来の血清も使用して、類似の間接免疫蛍光法アッセイにおいて、ＨＭＰＶ感染細胞を検出した。免疫蛍光を検出し、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、マンハイム、ドイツ）で画像を回収した。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＮＴ／ＳＰソフトウェア（バージョン１．６．５８７）、Ｉｍａｒｉｓ  ３．１．１（Ｂｉｔｐｌａｎｅ  ＡＧ、チューリッヒ、スイス）、およびＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５．５（Ａｄｏｂｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、画像を処理した。ＨＭＰＶ株７５および８３で感染させたヒト血清およびハムスター由来の血清は、ＨＭＰＶ株７５または８３のいずれかに感染したＬＬＣ−ＭＫ２細胞を検出することができ、ＩＮ投与したＨＭＰＶはハムスター中で感染性かつ免疫原性であることが実証された。株７５のみあるいは株８３のみを与えた動物由来の血清を、本明細書に記載したようにさらに分析した。
【０２５３】
ＨＭＰＶ株７５および８３に対するウサギポリクローナル抗体の作製
以前に記載されたのと同様に（Ｃｌｅｍｏｎｓら、Ｌａｂ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．４２：３０７〜１１、１９９２）、特定の病原体を含まないウサギ（Harlan Sprague Dawley）に、滅菌したプラスチック製のウィッフルボールを外科手術によって埋め込み、約１０５のＴＣＩＤ５０のＨＭＰＶ株７５と８３をウィッフルボールに注射することによって免疫処置した。チャンバー中に存在した流体を第２９日に回収し、従来の手順に従いスクロース勾配遠心分離によって精製し濃縮したＨＭＰＶ調製物を注射することによって、動物に２回の追加抗原刺激を与えた：第１回目の追加抗原刺激は第２９日に行い、第２回目は第５７日に行った。チャンバー中に存在する流体を、第７１日に再度回収した。これらの血清は、本明細書に記載したように分析した。
【０２５４】
ウイルス力価および血清抗体の感染性の中和アッセイ
以前に記載されたのと同様に（Ｎｅｗｍａｎら、Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２４：７７〜９２、２００２）、ウイルス力価を、９６ウェルプレート上のＬＬＣ−ＭＫ２単層培養物に施したウイルスの一連の１０倍希釈によって定量化し、次いでこれを５μｇ／ｍｌの加えたトリプシンと共にＯｐｔｉＭＥＭ培地中において、３７℃で７日間インキュベートした。ウイルス感染した単層は、前に記載した株７５と８３の混合物によるＩＮ感染によって産生したハムスターポリクローナル抗血清、次にペルオキシダーゼ結合ウサギ抗シリアンハムスターＩｇＧからなる二次抗体とのインキュベーションによって検出した。結合した抗体−抗原複合体は、ＥＣＬ発色性基質を用いて行うイムノペルオキシダーゼ染色によって検出した。
【０２５５】
ＨＭＰＶ特異的抗血清による中和に対するＨＭＰＶの感受性を、熱不活化ハムスター、ウサギまたはチンパンジー血清を用いて行った終点希釈中和アッセイを使用して測定した。ハムスターおよびウサギ血清は、前に記載したのと同様に調製した。本明細書でさらに記載するように、チンパンジー血清は３１匹の収容動物由来のものであった。簡潔に述べると、約１００〜２００ＴＣＩＤ５０のＨＭＰＶ７５または８３をそれぞれ含む複製物のアリコートを、熱不活化血清サンプルから調製した希釈系列由来のアリコートと混合させ、３７℃で１時間インキュベートした。次いでウイルス−抗血清混合物を９６ウェルプレート中のＬＬＣ−ＭＫ２単層に移し、細胞を３２℃で１時間インキュベートした。単層をＯｐｔｉＭＥＭで２回洗浄して血清を除去し、５μｇ／ｍｌの加えたトリプシンを補充したＯｐｔｉＭＥＭを上層した。次いで細胞を３２℃で７日間インキュベートし、前に記載したのと同様に、感染した単層は、ポリクローナルハムスター抗−ＨＭＰＶ７５＋８３抗血清、ならびにペルオキシダーゼ結合ウサギ抗シリアンハムスターＩｇＧおよびＥＣＬ発色性基質を用いた、イムノペルオキシダーゼ染色によって検出した。中和力価は、培養物の感染が５０％低下した、抗体の最も高い希釈値として読み取る。このアッセイを使用して、感染動物由来の血清のＨＭＰＶの中和力価を測定し、このアッセイをさらに使用して動物をスクリーニングし、それらが以前にＨＭＰＶに曝されたかどうか測定した。
【０２５６】
ＨＭＰＶ−ＧＦＰウイルスの有用性によって、現在は中和アッセイを簡潔にすることができる。この場合、ＨＭＰＶ−ＧＦＰウイルス（約１００〜２００ＴＣＩＤ５０）の複製物のアリコートを、前述の血清の希釈系列のアリコートと混合させ、３２℃で１時間インキュベートし、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に移すと思われる。細胞を洗浄して血清を除去し、５μｇ／ｍｌの加えたトリプシンを補充したＯｐｔｉＭＥＭを上に施し、３２℃で７日間インキュベートすると思われる。感染細胞は、蛍光顕微鏡によって直接眼に見える状態にすることができると思われる。中和終点は緑色蛍光の出現によって示され、感染を示すと思われる。ＨＭＰＶ−ＧＦＰおよび抗体のインキュベーションの時間、細胞基質の選択、および細胞のインキュベーションの時間などの、このアッセイの詳細の多くは、必要に応じて変えることができる。特に、ＨＭＰ−ＧＦＰの使用は、細胞を蛍光顕微鏡によって調べて、アッセイ値を読み取る最適時間を選択することができることを意味する。ウイルス滴定の有効性を、ＧＦＰの視覚化および免疫染色によって比較し、同一であることを見出した。しかしながら、ＧＦＰによる検出がより容易であった。なぜなら、ウイルス感染の進行、および最適時間でのプレート読み取り値を調べることができるからである。これに対して、免疫染色は１回しか行うことができず、肉眼により細胞病理性を推測することによってタイミングを決定し、これはより定性的であり正確ではない。他の利点は、ＧＦＰは直接読み取ることができるが、一方で免疫染色は、抗体および現像試薬を必要とする、多段階の時間のかかる方法であることである。さらに、免疫染色で必要とされる洗浄ステップは、細胞単層に対する障害またはその除去をもたらすことが多く、このことがアッセイを複雑にするかあるいは台無しにする可能性がある。したがって、抗体滴定（または抗ウイルス性物質の評価）用の指標ウイルスとしてｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを使用することによって、よりよい滴定法がもたらされる。
【０２５７】
株８３および７５の抗原関連性の評価
前の実施例中に記載したように、ＨＭＰＶ単離体は２つの遺伝子的亜型に分けることができることが示唆されてきている（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７１９〜２４；Ｐｅｒｅｔら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８５：１６６０〜３、２００２）。前の実施例は、２つの示した亜型間の遺伝子的多様性のレベルを詳細に記載した。この実施例（および実施例ＶＩ）も、この２つの亜型間の抗原的差異の量を記載する。循環ＨＭＰＶ株間の抗原的多様性の程度は、疫学および有効な免疫原性組成物の開発に非常に重要である。
【０２５８】
株７５と８３の間の抗原関連性を、交差中和試験によって調べた。前に記載したように、勾配精製ＨＭＰＶ７５または８３の非経口的免疫処置、次に同じ物質の追加抗原刺激によって、抗血清をウサギ中で産生し、それぞれのステップの後に血清を得た。さらに、前に記載したように、ハムスターを株７５または８３でＩＮ感染させ、血清を得た。これらの個々の血清を、株７５と８３の両方を中和する能力に関してアッセイした。したがって、これによって、いずれかの株に曝した動物由来の抗体が同種株の感染性を中和する能力と、異種株を中和するその能力が比較されると思われる。広範囲の抗原的差異が存在する場合、それぞれの血清は、同種株と比較して異種株を中和する際に、はるかに有効性が低いはずである。
【０２５９】
表１に示すように、株８３または７５を鼻腔内感染させることによってハムスターを免疫処置し、第４４日に血清を回収し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれぞれの株を中和する能力を評価した。株７５を感染させた１１匹の動物の中には、同種の７５株が異種の８３株より効率よく中和される、一貫したパターンは存在しなかった：４匹の動物は同種の株をより効率よく中和したが（最大の差異を示す動物２１６４に関しては、３．０ｌｏｇ２の差異まで）、１匹（動物２１６８）は差異を示さず、残りは同種の株をさらに非効率的に中和した（３．０ｌｏｇ２の差異まで、動物２１７４）。逆に、株８３を感染させた全１０匹の動物は、０．４ｌｏｇ２（動物２２０３）〜３．４ｌｏｇ２（動物２２０１）の範囲の差異で、異種の７５株より効率よく同種の８３株を中和した血清を生成した。したがって、２つの異種亜型を表すＨＭＰＶ株のそれぞれが、同種および異種ウイルスを効率よく中和した抗体を誘導したが、株８３を感染させた動物由来の抗体は、異種および同種ウイルスを中和する際に幾分非効率的であるようであった。
【０２６０】
さらに表１に示すように、ウサギをＨＭＰＶのいずれかの株で免疫処置し、次いで同じ株で追加抗原刺激し、一次免疫処置後および追加抗原刺激後の血清を回収し、同種および異種の亜型ウイルスを中和する能力に関して試験した。ウサギの最初の免疫処置によって、ＨＭＰＶのいずれかの株に対する比較的低い中和力価、≦４．３ｌｏｇ２〜８．４ｌｏｇ２の範囲の力価を有する血清が得られた。これらの一次血清に関しては、同種株と異種株の中和効率の間に一貫した差異は存在しなかった。追加抗原刺激の後、力価は６．９ｌｏｇ２〜１１．４ｌｏｇ２の範囲で相当高く、大抵の場合、同種株に対する中和力価は、異種株に対する中和力価より大きかった。しかしながら、その差異は比較的適度であり、差異なし〜２．６ｌｏｇ２の差異の範囲であった。例えば、免疫処置し株７５で追加抗原刺激した動物Ｒ０３０は、同種株７５に対して１１．４ｌｏｇ２の力価、および異種株８３に対して９．９ｌｏｇ２の力価を有しており、１．５ｌｏｇ２の差異に対応した。株７５で免疫処置し追加抗原刺激した他のウサギ（Ｒ０３１）は、異種株８３より４倍（２．０ｌｏｇ２）効率よく同種株７５を中和した血清を生成した。逆の状況、株８３で免疫処置し追加抗原刺激した動物（Ｒ０３２およびＲ０３３）では、追加抗原刺激後の力価は、異種株と同種株に関する差異を示さなかったか（動物Ｒ０３）、あるいは０．５ｌｏｇ２高い同種および異種の力価を示した（動物Ｒ０３３）。したがって、８匹の免疫処置後および追加抗原刺激後のウサギ血清のうち、１つは低い同種および異種の力価を有しており、３つは差異がなく、４つはさらに高い同種および異種の力価を有しており、最大の差異は２．６ｌｏｇ２であった。これは高い同種および異種の反応性の傾向を示すが、パターンおよび低い程度の一貫性のない性質は、この２つの株がｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に高度の交差中和性を示すという解釈と一致する。したがって、感染後ハムスターの血清に関して観察した高度の抗原関連性を、最初の免疫処置時および追加抗原刺激後にウサギ血清で確認した。
【０２６１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された高度の抗原交差反応性は、少なくとも１つの主要なＨＭＰＶ中和抗原または主要なエピトープが、ＨＭＰＶ亜型間で保存されていることを示す。前の実施例に示した遺伝的分析によって、３つのＨＭＰＶ表面タンパク質Ｆ、ＳＨおよびＧの中では、Ｆ糖タンパク質が亜型間で高度に保存されたことが示された。これに対して、ＳＨおよびＧ糖タンパク質は非常に様々であり、いずれのタンパク質も細胞外ドメイン中に３個を超える隣接保存アミノ酸は有しておらず、保存された抗原部位はほとんどあるいはまったく存在しないであろうことが示唆された。ＨＭＰＶの中和および防御抗原は以前にすでに同定されていた。ＲＳＶの場合、ＦおよびＧ表面タンパク質が、唯一の有意な中和抗原および主要な防御抗原であり（Ｃｏｎｎｏｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１６３４〜１６３７  １９９１）、ヒトＰＩＶの場合、２つの表面タンパク質ＦおよびＨＮも中和抗原および主要な防御抗原である。後の実施例（実施例ＶＩ）は、いずれかの遺伝的亜型による感染に対する防御を付与する際に有効な、主要ＨＭＰＶ中和抗原および防御抗原の同定を示す。
【表１】
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【０２６２】
チンパンジーにおけるＨＭＰＶ血清抗体の罹患率
３１匹の飼育チンパンジー（pan troglodytes）を、抗原としてＨＭＰＶ株７５または８３を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染中和アッセイを使用して、ＨＭＰＶ株７５または８３に対する血清中和抗体の存在に関してスクリーニングした（表２）。１９匹の動物（６１％）が、いずれか一方または両方のＨＭＰＶ株に関して血清反応陽性であることが分かった。ＨＭＰＶ株７５に対する血清中和抗体の力価は、検出不能（≦１．０ｌｏｇ２）〜≧９．６ｌｏｇ２の範囲であった。ＨＭＰＶ株８３に対する血清中和抗体の力価は、≦１．０ｌｏｇ２）〜８．６ｌｏｇ２の範囲であった。１２匹の動物（３９％）が、検出可能なＨＭＰＶ−７５中和力価を有しておらず：これら１２匹の動物は株８３にも血清反応陰性であった。４匹の他の動物は株７５に対して血清反応陽性であったが、株８３に対しては血清反応陰性であった。これら４匹の動物は非常に低い中和抗体力価（２．６〜４．０ｌｏｇ２）を有しており、それらの特異性は一時的である。チンパンジーにおいてＨＭＰＶ抗体が保有されることから、これらの動物は、おそらくそれらの調教師から、飼育中にＨＭＰＶに容易に感染する可能性があることが示される。動物から動物への伝播があることも考えられ、おそらく実際にはそうであろう。ヒトまたは他の動物からの接触によって感染するこれらの動物の能力は、ＨＭＰＶに対する許容性の強い指標である。非常に少数の動物が２つの株の１つのみに関して血清反応陽性であったという知見によって、これらの株が霊長類において抗原的に非常に関係があり、ただ１つのＨＭＰＶの血清型を表す可能性があることが示唆される。
【表２】
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【０２６３】
チンパンジーおよびサルのＨＭＰＶ感染：ウイルス複製、免疫原性およびＨＭＰＶに事前に曝した影響
前に記載したＨＭＰＶ中和アッセイによって、血清反応陽性または血清反応陰性として同定した、チンパンジーに感染するＨＭＰＶ株７５および８３の能力を評価した。表３に示すように、８匹の動物を４つのグループに編成し（グループ当たり２匹の動物）：グループ１は株７５および８３に血清反応陰性であった。グループ２およびグループ４は、両方の株に血清反応陽性であった。グループ３は８３に血清反応陰性であり、株７５に対する低い中和力価または検出不能な中和力価を有していた。グループ１および２は株７５を投与し、グループ３および４は株８３を投与した。これらの動物に、部位当たり１ｍｌ、１×１０５．２ＴＣＩＤ５０／ｍｌの示したウイルスを、鼻腔内（ＩＮ）および気管内（ＩＴ）接種した。それぞれの部位でウイルスを複製させる機会を与えるために、投与は鼻腔内（ＩＮ）および気管内（ＩＴ）経路によるものとした（Ｈａｌｌら、Ｖｉｔｕｓ  Ｒｅｓ．２２：１７３〜８４、１９９２；Ｃｒｏｗら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：７８３〜７９０、１９９４）。以前に記載されたのと同様に（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１７９：１３４５〜５１、１９９９；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２６０：１２５〜３５、１９９９）、動物を収容し試料を回収した。これらの動物を接種後１６日間臨床観察した。鼻咽頭スワブを感染後第１日〜第１０日および第１２日に回収し、感染後第２、４、６、８、１０、および１２日に気管洗浄液を回収した。４匹の血清反応陰性の動物（グループ１および３）のそれぞれが、感染後第７、８、９および１０日に鼻汁を有していた。肺のうっ血およびノイズが明らかであったため、予防措置として、グループ１および３は第８日にペニシリンで始めた。グループ１中の動物のうちの１匹は、感染後第８日のＴＬサンプルでは濃い粘液を有しており、乏しい食欲を有していた。血清反応陽性の動物（グループ２および４）は、試験の行程を通じて病気の徴候を示さなかった。したがって、ＨＭＰＶ血清反応陰性のチンパンジーは、７５および８３ＨＭＰＶ株による感染の後に病気を発症する可能性があり、これらのウイルスはチンパンジー中で感染性があり毒性であることが実証される。組換えＨＭＰＶ株８３ウイルスは、Ｍ／Ｆ遺伝子間領域中のＮｈｅＩマーカーの作製に関して、わずか４ヌクレオチドの違いだけその生物学的に誘導された親とは異なるので（図７）、ゲノムおよび表現型の特性の点で、それは「野生型」ウイルスであるとも考えられる。重要なことに、両方の株に対して血清反応陽性であった動物は、いずれかの株によるチャレンジの後に疾患から防御された。これは、ＨＭＰＶに対する免疫処置の可能性を実証する、最初の観察結果であると思われる：なぜなら、自然な暴露が疾患を防御するからであり、本開示の組換えＨＭＰＶを含む適切な免疫原性組成物を用いた免疫処置によって、望ましい免疫応答も誘導されると予想することが妥当である。これらの結果は、４．６（動物ＡＯＡ００３）〜７．０（動物ＡＯＡ００１）ｌｏｇ１０の血清中和抗体の力価は、ＨＭＰＶ疾患からの防御を与えるのに十分であることを示す。チンパンジーに関して得た結果は、チンパンジーとヒトの間の密接な進化上の��係を考慮すると非常に関連がある。
【表３】
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【０２６４】
表３に記載する、ＨＭＰＶ感染チンパンジーから採取した鼻咽頭スワブおよび気管洗浄液中のウイルス力価は、免疫染色によって検出したウイルス感染性を用いる終点希釈アッセイによって測定した。表４中に示すように、チンパンジーは、比較的低レベルのウイルスを発散した。これは特に、両方の株に血清反応陰性であったグループ１の動物、および株８３に血清反応陰性であったグループ３に関して注目に値し：動物、これらのグループ中のすべての動物は、感染に応じて臨床的疾患の徴候を示したが、鼻咽頭スワブから回収したウイルスの平均のピーク力価は１．９〜３．２ｌｏｇ１０の範囲であり、気管洗浄液からの力価は１．８〜２．０ｌｏｇ１０であった。グループ２および４の動物由来の、ＨＭＰＶに血清反応陽性であったスワブおよび洗浄液は、検出可能なＨＭＰＶを欠いていたか、非常に低い力価を有していた（１．５ｌｏｇ１０）。したがって、疾患の徴候の欠如は、低レベルまたは検出不能レベルのウイルスの発散と関係があった。疾患症状の存在下での、低レベルのＨＭＰＶ発散の間の明らかな不一致は、おそらくは宿主の免疫因子による不活性化、またはチンパンジーの気道の内側の上皮細胞中でのＨＭＰＶの高レベルの細胞結合による、分泌物から感染性ウイルスを回収する難しさを表す可能性がある。チンパンジーはヒトと密接に関連性があるので、これによって、ヒト分泌物中のＨＭＰＶの検出は非効率的でもあり得るという可能性が生じる。実質的なＨＭＰＶ発散を検出できないことは予想外であった。なぜならＲＳＶは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは不安定であり細胞と結合するが、しかしそれにもかかわらず、ＨＭＰＶ感染チンパンジーの場合より１００〜１０００倍高いレベルで、ＲＳＶ関連の病状を示すＲＳＶ感染チンパンジーから発散することが知られているからである（Ｂｅｌｓｈｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１：１５７〜１６２、１９７７）。あるいは、チンパンジー中のＨＭＰＶ複製のレベルは実際には低い可能性があるが、疾患症状の発症をもたらす免疫またはケモカイン媒介の病状を、感染が誘発する可能性がある（Ｇｌａｓｓら、Ｃｕｒｔ．Ｏｐｉｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：４６７〜４７３）。
【０２６５】
感染後４〜６週で採取した血清サンプルは、それぞれの実験グループに関して高レベルの血清中和抗体を含んでおり、実験による感染前に血清反応陰性または血清反応陽性であった動物間で、明らかな差異はなかった。免疫処置後の力価は７．４〜１０．２ｌｏｇ１０の範囲であり、臨床疾患からの防御と関係があった４．６〜７．０ｌｏｇ１０の範囲より相当高かった。興味深いことに、この小さなサンプル中には、株７５と８３の間の抗原的差異の証拠は存在しなかった。詳細には、いずれかの株で免疫処置した血清反応陰性の動物（グループ１および３）は、免疫処置ウイルスとは無関係に、株８３に対する力価よりも幾分高い株８３に対する力価を有する抗体を生成した。
【０２６６】
一次感染で使用した株に血清反応陰性であった動物は、次に異種ＨＭＰＶ株でチャレンジした。表４に示すように、両グループの動物が交差的チャレンジから完全に防御され、１つのＨＭＰＶ系統による以前の感染によって、異種系統による後の感染からチンパンジーが保護されることが示された。したがって、ヒトに最もよく似ている実験動物では、いずれかの遺伝的亜型を表すＨＭＰＶ株によって誘導された免疫性が、異種亜型由来のＨＭＰＶ株による感染を防御した。
【０２６７】
チンパンジーより豊富に存在し、安価であり、収容が容易なサルにおいて、ＨＭＰＶ７５と８３の複製および免疫原性を調べたことも興味深かった。２２匹のアカゲザルおよび２０匹のアフリカミドリザルを、ＨＭＰＶに対する血清中和抗体に関してスクリーニングし、それぞれの動物はＨＭＰＶに対して血清反応陰性であった（≦１．０ｌｏｇ２）。この限られたサンプリングによって、これら２種のサルは飼育中のＨＭＰＶによる暴露により、容易に感染しないことが示唆された。それぞれの種の４匹の動物に、１０５．２ＴＣＩＤ５０のＨＭＰＶ株ＣＡＮ７５またはＣＡＮ８３のいずれかを気管内感染させた。それぞれの種の４匹の動物に、それぞれの部位に１０５．２ＴＣＩＤ５０のＨＭＰＶ株ＣＡＮ７５またはＣＡＮ８３のいずれかを気管内感染させ、鼻咽頭スワブサンプルを感染後第１〜１０日および第１２日に採取し、気管洗浄液サンプルを感染後第２、４、６、８、１０日および第１２日に採取した（表５）。これらのサンプルを、終点希釈によってウイルス力価に関してアッセイした。いずれのサルにおいても、病気が発症することはなかった。感染したアカゲザルは、０．９〜２．６ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の範囲の、非常に低いウイルスの力価を有していた（表５）。さらに、血清中和抗体の免疫処置後の力価も比較的低く、６．３〜８．４ｌｏｇ２の範囲であった。したがって、アカゲザルはＨＭＰＶの複製を持続させるが、複製のレベルは低い。
【０２６８】
感染したアフリカミドリザル（表５）は、２．２〜４．９ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の範囲の力価のＨＭＰＶを発散し、９．４〜１０．９ｌｏｇ２の範囲の力価の血清中和抗体を生成した。アフリカミドリザルの鼻咽頭および気管から回収したサンプル中の、ＨＭＰＶ複製の時間行程を図３５に示し、ウイルスの発散が６日間を超える広範囲で起こったことが示される。これらのデータによって、アフリカミドリザルはＨＭＰＶの複製を許容し、特に免疫原性組成物に使用するためのｒＨＭＰＶ誘導体の複製および免疫原性を評価するための、適切な霊長類宿主となることが示された。特に、ウイルスおよび抗体の最高の力価を、本発明の開示の組換えＨＭＰＶによって表される株である、株８３に関して得た。この点において、ほぼ５ｌｏｇ１０までのＨＭＰＶ複製および付随する免疫原性を調べる能力によって、弱毒化突然変異体の取り込みによる複製および免疫原性に対する影響を、評価するための広い窓口が与えられる。
【０２６９】
最初の感染後３０日で、アフリカミドリザルを異種ＨＭＰＶ株でチャレンジした（表５）。両グループの動物が交差的チャレンジから完全に防御され、１つのＨＭＰＶ系統による以前の感染によって、異種株による後の感染に対する耐性が与えられたことが示された。これらのデータによって、アフリカミドリザルは、ＨＭＰＶ免疫原性組成物の防御効率を評価するための適切な霊長類宿主となることが示される。
【０２７０】
前に記載した研究は、血清反応陰性動物における株７５または８３に対する主要な抗体応答に関するデータを与え、同種および異種の亜型ウイルスを中和する生成した抗体の能力を記載する。これらのデータをアーチェッティ−ホルスフォールの式（ＡｒｃｈｅｔｔｉおよびＨｏｒｓｆａｌｌ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９２：４４１〜４６２、１９５０）により統計的に分析して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和に基づいて抗原関連性の程度を決定した。それぞれの種を別々に計算し、２つのＨＭＰＶ亜型の関連性の割合は、それぞれハムスター、アカゲザルおよびアフリカミドリザルからのデータに基づき、それぞれ４８％、６４％および９９％であったことが示された。これを、それぞれ動物およびヒト血清の分析に基づく、ＲＳＶの２つの亜型に関する２５％および３１％という値と比較する（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３１６３〜３１６６、１９８７；Ｈｅｎｄｒｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５７：６４０〜６４７、１９８８）。これらのデータは、２つのＨＭＰＶ遺伝的亜型は抗原的に十分関連があり、異なる血清型、あるいはおそらく有意な抗原亜型さえも表さないことを示す。２つのＨＭＰＶ亜型に関するこの高度の関連性はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの中和に基づくものであり、したがってある程度慎重に解釈する必要がある。なぜなら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの交差中和は、ただ１つの高度に保存された抗原によって媒介される可能性があるが、一方でｉｎ  ｖｉｖｏでの交差防御は２つ以上の抗原の貢献を必要とする可能性があり、あるいは追加的な抗原を含ませることによって高まる可能性があるからである。それにもかかわらず本発明の知見は、ＨＭＰＶの遺伝的多様性はＨＭＰＶワクチンによって容易に提供することができ、このようなワクチンはただ１つのＨＭＰＶ株とならなければならない可能性があるということを初めて示すものである。
【表４】
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【表５】
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【０２７１】
ＨＭＰＶ複製の小動物モデルの開発
ＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶ誘導体の評価を、ｉｎ  ｖｉｖｏでの複製および免疫原性を評価するための小動物モデルの有用性によってさらに容易にする。ハムスターに１０６ＴＣＩＤ５０の株８３または７５のいずれかを鼻腔内感染させ、動物は第３、４、５、６または７日に犠牲にし、鼻甲介および肺をウイルス滴定用に採取しアッセイした。表６に示すように、それぞれのウイルスは、鼻甲介中では６ｌｏｇ１０より大きいピーク力価に、下部気道中では３．６〜４．４ｌｏｇ１０に複製した。したがって、ハムスターは両方の亜型の株の複製を許容した。表１（および表７）に示すように、株８３を用いた感染は、異種株に対して１０．３〜１２．３ｌｏｇ１０の血清中和抗体の力価を誘導し、株７５を用いた感染は、同種株に対して７．９〜９．９ｌｏｇ１０の力価を誘導した。株７５の外見上の低い免疫原性の基盤は知られていないが、この発見は、この同じ実験中のそれぞれの株に関するウイルスの複製および免疫原性を測定する他の試験において、確認する必要があると思われる。本発明のデータは、ハムスターはＨＭＰＶ複製を比較的許容することを示し、ＨＭＰＶの複製および免疫原性を評価するための好都合な小動物モデルを与える。
【０２７２】
表４に示したチンパンジーでも調べたのと同様に、ハムスターモデルを使用して、２つのＨＭＰＶ遺伝的亜型間の交差防御を評価した。ハムスターのグループはＨＭＰＶのいずれかの株で、または陰性対照としてＬ１５希釈液で感染させた。６週間後、ハムスターをＨＭＰＶのいずれかの株でチャレンジし、第４日の気道中の肺チャレンジウイルスの複製のレベルを、前に記載したのと同様に測定した。表７中に示すように、いずれかのＨＭＰＶ株による事前の感染は、上部気道中で同種および異種ＨＭＰＶ株に対する高レベルの防御を誘導した。下部気道は、いずれかの株によるチャレンジから完全に防御された。さらに、最初の感染後第３１日に血清を回収し、アッセイしてそれぞれの株に対する中和力価を測定した（表７）。その結果は、表１で前に示した結果と非常に類似していた：ＣＡＮ８３を用いた感染は、同種および異種株を中和する際に適度に有効であった抗体を誘導したが、ＣＡＮ７５を用いた感染によって誘導された抗体は、同等の有効性で同種および異種株を中和した。これらの交差防御データおよび逆中和アッセイによって、ＣＡＮ８３およびＣＡＮ７５は抗原的に十分関連があることが示された。
【表６】
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【表７】
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【実施例６】
【０２７３】
中和抗体を誘導するヒトパラインフルエンザＩ型ウイルス（ＨＰＩＶ１）の構築、および２つのＨＭＰＶ遺伝子的亜型に対する防御効率
ＨＭＰＶのＦタンパク質単独で血清中和抗体を誘導し、ＨＭＰＶチャレンジに対する防御を与える能力を調べるために、ＣＡＮ８３のＦタンパク質を発現する組換えＨＰＩＶ１（ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３）を、ＨＰＩＶ１Ｎ遺伝子の上流に挿入されＨＰＩＶ１ＧＳおよびＧＥ転写シグナルに隣接するＣＡＮ８３のＦタンパク質のＯＲＦを含む、ＨＰＩＶ１アンチゲノムｃＤＮＡ（図３６Ａ）からｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて回収した。Ｆタンパク質の発現は、感染細胞の間接免疫蛍光法によって確認した（図３６Ｂ）。したがって、ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３はＨＰＩＶ１の全タンパク質およびＨＭＰＶのＦタンパク質を発現するだろう。
【０２７４】
ハムスターのグループを、３３日後にＣＡＮ８３、野生型ｒＨＰＩＶ１、ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３またはＬ１５培地で免疫処置し、血清を回収し、ＣＡＮ７５およびＣＡＮ８３株を中和する能力に関して試験した。表８に示すように、ＣＡＮ８３またはｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３で免疫処置した動物由来の血清は、ウイルスの両方の株を効率よく中和した。それぞれの場合、同種ＣＡＮ８３株の中和は、異種ＣＡＮ７５株より幾分か効率がよかった。ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３感染動物由来の血清の平均中和力価は、ＣＡＮ８３感染動物から観察した力価より１．２ｌｏｇ２低く、ＣＡＮ８３と比較したこの実験のハムスター中でのｒＨＰＩＶ１複製の低い力価と非常に一致する。したがって、ウイルス複製のレベルを調整すると、１つのＣＡＮ８３抗原のみを発現するｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３ベクターは、ＣＡＮ８３中和抗体の誘導においてＣＡＮ８３自体と同等に有効であった。
【０２７５】
免疫処置後５０日で、ｒＨＰＩＶ１、ＣＡＮ７５またはＣＡＮ８３を用いた鼻腔内感染によって動物をチャレンジした。表８に示すように、ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３を事前に感染させた動物には、上部気道中においてＣＡＮ７５およびＣＡＮ８３チャレンジウイルスそれぞれの、複製レベルの１２５倍および１５８倍の低下があった。動物は下部気道中は完全に防御された。ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３ウイルスもＨＰＩＶ１チャレンジに対して防御し、このウイルスが３つの気道病原体、すなわちＣＡＮ７５、ＣＡＮ８３およびＨＰ１Ｖ１に対して防御することができたことが示された。現在はこの方法を使用して、中和抗体の誘導に対する他のＨＭＰＶタンパク質のそれぞれの相対的貢献度、およびチャレンジウイルスの複製に対する耐性を決定することもできる。重要なことに、これらの発見によって、主要な中和および防御抗原としてのＨＭＰＶのＦタンパク質が同定される。さらに、ＣＡＮ８３株のＦタンパク質は、ＣＡＮ８３とＣＡＮ７５の両方に対して有効であった中和抗体および防御を誘導した。これによって、ＨＭＰＶの全株に対して有効なワクチンを開発する際の、この特異的抗原の重要性が強調される。
【表８】
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【実施例７】
【０２７６】
ＨＭＰＶの２つの推定抗原亜型の防御抗原を発現するＨＭＰＶ組換えウイルスの構築
前に記載したように、ＨＭＰＶの異なる株は、特にＳＨおよびＧタンパク質の遺伝子的多様性を示す可能性があり、２つの主要な遺伝子的亜型が存在するようである。前の実施例は、２つの亜型に対して有効な主要な中和および防御抗原としての、ＨＭＰＶのＦタンパク質を同定した。したがって、それはＨＭＰＶワクチン中に含めるのに好ましい抗原である。前の実施例は、いずれかの亜型由来の１つのＨＭＰＶによる感染による２つの遺伝子的亜型に対して、高度の防御免疫を得ることができることを示した。さらにＦタンパク質は、２つの亜型に対して有効な中和および防御抗原として同定した。しかしながら、最適な免疫原性および防御効率は、片方または両方の亜型由来のＳＨまたはＧタンパク質を含ませることによって、あるいは両方の亜型由来のＦタンパク質を含ませることによって得られる可能性がある。さらに、利用可能な情報によって、ＲＳＶおよびＰＩＶとほぼ同様に、ＨＭＰＶは人生初期の重大な気道疾患の重要な原因であることが示される。したがって、ＨＭＰＶに対する免疫原性組成物はおそらく、ＲＳＶおよびＰＩＶを対象とする免疫原性組成物として、人生においてほぼ同時に投与されると思われる（場合によっては、乳児および一部の成人被験体用の組合せ配合または同等の免疫処置プロトコル）。したがって、本開示のいくつかの態様は、多数の抗原的に異なる株に対する高い有効性をもたらす、広範囲のＨＭＰＶ免疫原性組成物を与える。いくつかの実施形態では、投与しなければならない別個のウイルスの数を減らすことも有利である：多数の別個のウイルスからなる免疫原性組成物は、開発および配合するのがさらに困難である。なぜなら、それぞれのウイルスが安全かつ免疫原性であることを、個別および組合せで確認しなければならず、ウイルス干渉などの問題が配合を複雑にする可能性があるからである。本開示の方法は、これらおよび関連する問題を処理する免疫原性組成物の設計における、柔軟性および多機能性を与える。
【０２７７】
１つの例示的な戦略では、異種の免疫原タンパク質、またはその抗原決定基（例えば、断片またはエピトープ）をそれぞれコードする１つまたは複数のＯＲＦを転写カセットに改変し、ＨＭＰＶのゲノムに挿入することができる。例えば図３４に示すように、ＨＭＰＶ株７５のＧ、ＦまたはＳＨ表面タンパク質をコードするＯＲＦを、株８３由来のＧＳおよびＧＥシグナルに隣接するように改変し、ＨＭＰＶ株８３の主鎖中に挿入する。これによって、追加的遺伝子を含み株８３の全遺伝子および株７５の表面タンパク質抗原を発現する、キメラウイルスが生成する。したがってこのキメラウイルスは、２つのＨＭＰＶ抗原亜型を表す抗原を発現する。これは免疫原性組成物の範囲を広げることの必要性、およびこのような組成物中に含まれなければならない別個のウイルスの数を最大にする必要性を満たすことを提言する。ＨＭＰＶ主鎖中に挿入するのに好ましい異種株ＨＭＰＶ遺伝子は、Ｆ遺伝子であると思われる。なぜならＦは、主要なＨＭＰＶ中和および防御抗原として直接同定されたからである。第２の好ましい遺伝子はＧ遺伝子である。なぜなら、そのコードされているタンパク質はＨＭＰＶ株間で非常に相違しているようであり、Ｆタンパク質に関する９８％の同一性と比較して、株００−１と８３の間でわずか７０％のアミノ酸同一性を示すからである。同様に、ＳＨタンパク質は、キメラウイルス中に挿入するための第３の好ましい遺伝子である。なぜなら、それも比較的相違しているようであり、株００−１と８３の間で８５％の配列同一性を示すからである。図３４に示した例は、ＧＦＰの発現用に使用したのと同じ転写シグナルおよびゲノム挿入部位を使用した。しかしながら、本開示の方法によって、他のシグナルまたは挿入部位を試験することができる。さらに図３４の例は、ＨＭＰＶの異種株由来のＯＲＦに関するものであったが、ＲＳＶ、ＨＰＩＶ１、２または３、他の異種ウイルスまたは病原体、および顆粒−マクロファージコロニー刺激因子などの免疫調節タンパク質などの、他の分子由来のＯＲＦなどの他の異種ＯＲＦに、同じ戦略を適用することができる。このようにして、ＨＭＰＶ主鎖を使用して、異種の非ＨＭＰＶの表面タンパク質を有する他のウイルスを作製することができる。したがって本開示のキメラウイルスは単独で投与することができ、あるいは本来の親または他のｒＨＭＰＶと組み合わせて、マルチウイルスまたは多効果の免疫原性組成物を作製することができる。
【実施例８】
【０２７８】
ＨＭＰＶを阻害する化合物をスクリーニングする方法
本開示は、Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２−１タンパク質単独の発現は、ＨＭＰＶ転写およびＲＮＡ複製を指示するのに十分であることを実証する。このことは２通りで記した。第１に、これらのタンパク質の発現は、ＨＭＰＶゲノムに由来しレポーター遺伝子を有するｃＤＮＡをコードするミニレプリコンの、転写およびＲＮＡ複製を指示するのに十分であった。第２に、これらのタンパク質の発現は、ｃＤＮＡをコードするアンチゲノム由来の完全な感染性ＨＭＰＶの回復を開始させるのに十分であった。定義によりアンチゲノムはゲノムの相補体であり、転写用の直接の鋳型として働くことはできない。したがって、ＲＮＡ複製と転写の両方は、増殖性感染を開始させるために供給したタンパク質の指示の下で起こったに違いなく、Ｎ、Ｐ、ＬおよびＭ２−１はすべてのＨＭＰＶのＲＮＡ合成期を指示するのに十分であることを示す。したがって本開示は、ＨＭＰＶの１つまたは複数の活性（例えば転写、翻訳、増殖、感染性、毒性、免疫原性など）を阻害する化合物をスクリーニング、同定、設計、および特徴付けするための、新規で容易に実施される方法を与える。
【０２７９】
さらに本開示は、ＨＭＰＶ複製サイクル中の任意の段階で作用する抗ウイルス性化合物の、スクリーニング、同定および設計をもたらす、完全なＨＭＰＶによる感染を調べる新たな容易な方法を与える。本開示は、抗ウイルス性化合物のウイルス標的を同定し、それによってＨＭＰＶを阻害する際に有効な化合物の改善された設計をもたらすための方法をさらに与える。
【０２８０】
ＨＭＰＶに対して有効な可能性がある抗ウイルス性化合物には、生物学的方法または組換え法によって得られるモノクローナルまたはポリクローナル抗体、ペプチドまたはタンパク質断片（Ｌａｍｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｉｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：２１８６〜２１９１、１９９６）、糖誘導体、ポリイオン性ポリマー、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡ干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）を仲介することができる二本鎖ＲＮＡ（ＢｉｔｋｏおよびＢａｎｋ、ＢＭＣ  Ｍｉｒｃｏ．１：３４〜４４、２００１）、および小分化合物（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ７：１９３〜２０２、１９９６；Ｐｒｉｎｃｅ、Ｅｘ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ  １０：１９７〜３０８、２００２）がある。一般に、本発明の方法は、溶液中、細胞抽出物中、細胞培養物中、およびｉｎ  ｖｉｖｏでＨＭＰＶを阻害することができる任意の抗ウイルス性化合物に適用することができる。抗ウイルス性化合物は、例えば結合、進入（融合）、ＲＮＡ合成、およびウイルス粒子構築を阻害することによって作用することができ、他の場合、それらの作用の特異的標的を完全に解明することはできない（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ７：１９３〜２０２、１９９６；Ｐｒｉｎｃｅ、Ｅｘ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｒｕｇｓ  １０：１９７〜３０８、２００２）。抗ウイルス性物質は、インターフェロン介在の抗ウイルス状態を刺激することなどにより、宿主の免疫応答を高めることによって作用することもできる（Ｐｌａｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８８７４〜９、１９９８）。さらに、抗ウイルス性物質を抗炎症性物質と組み合わせて、疾患のさらなる低下に影響を与えることができる（Ｐｒｉｎｃｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８２：１３２６〜１３３０、２０００）。
【０２８１】
本開示の一実施形態では、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを使用して抗ウイルス性化合物をスクリーニングする。１つの例示的な戦略では、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを試験化合物または化合物のライブラリー（例えば、１つまたは複数の抗ウイルス性物質をおそらく含む化合物または化合物のライブラリー）で処理し、細胞を感染させる能力に関して擬似治療した対照のｒＨＭＰＶ−ＧＦＰと比較する。吸収期の後、潜在的な抗ウイルス性化合物を含む接種物を、望むならば洗浄によって除去することができる。例えば組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰによるＧＦＰマーカー遺伝子の発現による緑色蛍光の増大によって示されるように、その存在または発現レベルまたは検出が１つまたは複数のＨＭＰＶの活性と関係がある、検出可能な標識またはシグナルの観察または測定によって、感染の行程中に無菌状態を害さずに生きている細胞において測定することができる方法によって、感染性を典型的にはアッセイする。あるいは、抗ウイルス性物質を感染の期間中、培地上層に含ませることができる。あるいは、化合物の不在下で感染を開始させることができ、化合物を後に加えることができる。１つまたは複数のＨＭＰＶの活性を阻害することができる化合物を同定すること以外に、これらのアッセイは、例えば化合物がウイルスを直接中和すること、または後の遺伝子発現を阻害すること、またはウイルス伝播を阻害することによって作用するかどうかなど、化合物の作用形態の指標を与えることができる。ＧＦＰは代表的な標識またはマーカーとして与えられるが、広範囲の有用な「レポーター配列」（例えばレポーター遺伝子）、および検出可能な標識およびマーカーの発現を指示する他の配列が当分野でよく知られており、その存在、活性レベルまたは発現が１つまたは複数の選択したＨＭＰＶの活性と関係がある検出可能な「シグナル」物質として、容易に使用することができる。この文脈における代表的な代替マーカーおよび／または標識には、特にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼ、および当分野で日常的に使用される多数の他の知られているレポーター配列がある。これは、様々な高スループットのスクリーニングプロトコルにおいて有用であろう、レポーターウイルスまたはサブウイルス構築体を設計する能力を与える。
【０２８２】
本開示の関連態様内では、前に記載したように、１つまたは複数のウイルスＯＲＦをそれぞれ欠くｒＨＭＰＶ変異体の有用性によって、抗ウイルス性化合物の考えられるウイルス標的を同定するための、非常に有用なツールおよび方法がもたらされる。例えば、化合物が完全なＨＭＰＶの感染性を阻害する場合、前述のΔＳＨ、ΔＧ、ΔＳＨ／Ｇ、およびΔＭ２−２変異体などの、様々な遺伝子を欠く一群のｒＨＭＰＶに対して、それを試験する（例えば、その有効性および／または標的遺伝子またはタンパク質特異性に関して）。抗ウイルス性化合物の標的を同定する代替的方法および補完的方法は、化合物の存在下でウイルスを強制的に増殖させることを含む（必要な場合、最小または最適以下の阻害濃度で存在する）。これらの条件下では、主題の阻害化合物に対する高い耐性が発達した、大きな一群の有用な変異体が出現することが予想される。このような変異体の配列分析によって、おそらく高い耐性の原因である突然変異を同定することができる。本発明の開示の方法によって、高い耐性を与える疑いがある突然変異体を、個別または組合せでｒＨＭＰＶ中に導入することができ、ＧＦＰなどの好都合なレポーター遺伝子を発現する耐性ｒＨＭＰＶは、ＨＭＰＶ調節および抗ウイルス性物質の開発の他の段階を容易にするための、さらに他のツールおよび方法をもたらすと思われる。例えば、耐性ウイルスにおいて同定された突然変異を導入することによって、それらが耐性を与え継代中に起こる偶発的な突然変異とそれらを区別することを、直接確認する方法が提供される。これによって薬剤耐性と関係があるウイルス遺伝子の直接的な同定がもたらされ、これはさらなる薬剤開発の重要なツールである。他の例として、前述のようにＨＭＰＶ−ＧＦＰを使用して、迅速かつ正確にアッセイしＨＭＰＶに対する抗体を検出することができる。これは、免疫抑制剤または治療剤としてＨＭＰＶを中和することができる、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を開発するための試験において、有利である可能性がある。これには、例えば一群中の個体の血清状態を決定するための、疫学的試験における用途もある。さらにそれは、例えば実験用免疫原性組成物、または抗ウイルス性化合物の有効性を評価する状況などに応じて、実験動物または臨床被験者中のＨＭＰＶ抗体レベルの変化を調べるための容易な方法を提供する。さらに、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子の発現は、実験動物を含めた個体のＨＭＰＶ感染および免疫性を検出および定量化し、それによってウイルスの疾患検出、親和性に関するアッセイをもたらすため、および／または他の抗ウイルス性物質を同定し評価するための有用なマーカーを提供する。
【０２８３】
本開示の他の実施形態では、好都合なレポーター遺伝子を発現するｒＨＭＰＶは、スクリーニング用組成物、および無細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに基づく方法内で、容易に使用することができる。例えば、ヌクレオキャプシド調製物は、アルカリホスファターゼまたはいくつか他の高感度で検出される酵素またはマーカーなどの、レポーター遺伝子を発現するｒＨＭＰＶを感染させた細胞から作製することができる。複製のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを構築することができ、それを使用して、発現されたレポーター遺伝子を検出するように設計した高スループット形式で、抗ウイルス活性に関して化合物をスクリーニングすることができる。これは好都合なレポーター遺伝子の発現に基づいてよく、あるいは代替的に、マーカー遺伝子または１つまたは複数のＨＭＰＶ遺伝子を表すＲＮＡの検出に基づいてよい。例えば、このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏの反応混合物中に生じたｍＲＮＡは、マトリックス結合オリゴｄＴによって、洗浄後に反応混合物を除去することによってｉｎ  ｓｉｔｕで捕捉することができ、生成するハイブリッドは、レポーター酵素またはリガンドで標識したプローブを用いる、二次的なハイブリダイゼーションによって検出することができる。このようなアッセイをさらに改変して、例えばＲＮＡ複製の生成物、または改変された転写の指標としての遺伝子接合部の読み過ごし(read-through)を特異的に標的化することができる。
【０２８４】
ＨＭＰＶ転写およびＲＮＡ複製を指示するのに有用かつ／あるいは十分なタンパク質として、Ｎ、Ｐ、Ｌ、および場合によってはＭ２−１を同定することによって、抗ウイルス活性に関して化合物をスクリーニングするための他の新しい方法がもたらされる。一実施形態では、これら４つのタンパク質を、レポーター遺伝子をコードするミニレプリコンと共に細胞内で発現させることができ、再構成されたＨＭＰＶ転写およびＲＮＡをもたらすことができる。これを使用して化合物、特にＨＭＰＶ転写、ＲＮＡ複製、およびヌクレオキャプシドの構築および機能に対して有効な化合物をスクリーニングすることができる。あるいは、Ｎ、Ｐ、Ｌ、およびＭ２−１タンパク質を、組換えバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、細菌または任意の他の適切な発現系を使用して高レベルで発現させることができ、これらを精製して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＲＮＡ合成、タンパク質−タンパク質相互作用、またはタンパク質−ＲＮＡ相互作用などの再構成したアッセイにおいて使用することができる。あるいは、Ｎ、Ｐ、Ｌ、およびＭ２−１タンパク質を、例えばよく知られているＦＬＡＧタグ（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．１１：１〜１６、１９９７）などの、モノクローナル抗体によって認識されるヘキサ−ヒスチジンタグまたはエピトープを取り込ませることにより、組換えによって標識することができる。これらにより、親和性クロマトグラフィーによりこれらの成分を精製するための基礎が得られ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの開発を容易にする。さらに、このような標識遺伝子を組換えＨＭＰＶによる感染の文脈から表現すると、それは、考えられる細胞およびウイルスの結合パートナーを単離し同定する方法をもたらす。このような結合パートナーは、様々な方法によって同定することができる。例えばいくつかの場合、結合パートナーは、それらをゲル電気泳動によって視覚化し、タンパク質の塩基配列決定の従来法によって同定することができるほど、十分な量存在する。少量の結合パートナーは、トリプシンによる切断およびタンパク質の塩基配列決定と結び付けた質量分析法によって、複合混合物から同定することができる。ウイルスおよび細胞の結合パートナーを同定することによって、ＨＭＰＶを阻害する化合物の開発を導くためのさらなる情報が与えられる。
【０２８５】
本開示は好ましい実施形態を強調することによって記載してきたが、好ましい実施形態の変形を使用することができ、本明細書に詳細に記載した以外の方法で本開示を実施することが考えられることは、当業者には明らかであろう。したがって本開示は、特許請求の範囲によって規定される本開示の思想および範囲内に含まれる、あらゆる変更形態を含む。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】ＨＭＰＶ株ＣＡＮ９７−８３（以後８３またはＣＡＮ−８３と称する）およびＲＳＶ株Ａ２の、２つのゲノムの比較を示す、マイナスのセンス鎖ゲノムの概略図である。白抜きのバー（ｏｐｅｎ  ｂａｒ）で表す、提示した遺伝子間領域で分離された影付きのボックス（ｓｈａｄｅｄ  ｂｏｘ）として個々に提示した遺伝子を示す。３’の遺伝子外リーダー領域および５’遺伝子外トレイラー領域も白抜きのボックスとして示す。仮定のＨＭＰＶ遺伝子の割りつけは、ＯＲＦに基づき、その潜在的なタンパク質は、ＲＳＶ由来の既知のタンパク質と部分的なアミノ酸配列の同一性または構造的な類似性を示す。ＨＭＰＶが、ＲＳＶに存在するＮＳ１およびＮＳ２遺伝子（ボックス）に対する見かけ上の対応物を欠き、推定される１対のＦおよびＭ２遺伝子が、ＨＭＰＶではＳＨ−Ｇ遺伝子対の前にあるが、ＲＳＶでは後ろにある（ＳＨ−Ｇの位置の違いを点線で示す）ことに留意されたい。Ｍ２およびＬ遺伝子は、ＲＳＶでは重複しているが、ＨＭＰＶではそうではない可能性がある。どちらのウイルスでも、Ｍ２遺伝子は、黒塗りのバー（ｆｉｌｌｅｄ  ｂａｒ）として描く２つのＯＲＦであるＭ２−１およびＭ２−２を含む。改変されない推定ウイルスタンパク質のアミノ酸の長さを示す。それぞれのＲＳＶタンパク質は、直接同定されている；提示したＨＭＰＶタンパク質は、本開示の前に直接同定されていない。略記（ＲＳＶとの類似によってＨＭＰＶに割りつける）：Ｎ、主要ヌクレオキャプシドタンパク質；Ｐ、ヌクレオキャプシドリンタンパク質；Ｍ、ウイルス粒子内部マトリックスタンパク質；Ｍ２−１およびＭ２−２、Ｍ２  ｍＲＮＡにおける、それぞれ第１と第２のＯＲＦの産物；ＳＨ、疎水性小タンパク質；Ｇ、付着に関与する大量に糖鎖付加されたタンパク質；Ｆ、侵入に関与する融合タンパク質；Ｌ、大ポリメラーゼタンパク質；ＮＳ１およびＮＳ２、それぞれ非構造タンパク質１および２。この図およびこの後の図では、比率が一定ではない。
【図２】ＨＭＰＶ株８３（それぞれ配列番号１８および配列番号２２）、トリニューモウイルス（ＡＰＶまたはＡＭＰＶ、それぞれ配列番号１９および配列番号２３）、およびＨＲＳＶ株Ａ２（それぞれ配列番号２０および配列番号２４）のゲノムの３’リーダー領域（上部）間、５’トレイラー領域（下部）間および隣接する領域間の配列のアライメントを示す図である。配列は、ゲノムの（マイナス）センス鎖である。ＨＭＰＶ８３とＡＰＶとＲＳＶとの間で２つ以上同じであるヌクレオチドの割りつけに影をつけている；最適にアライメントをとるために導入された配列ギャップをダッシュで示す。各配列の左側末端の上にあるバーは、その空間および配列が、どんなＨＭＰＶでも以前に決定していなかった領域を示す。ＨＭＰＶ株００−１の３’リーダー領域と５’トレイラー領域（それぞれ配列番号１７および配列番号２１）で入手可能な部分配列を最上部に示す：ＨＭＰＶ８３のものと同じ株００−１でのヌクレオチドの割りつけは星印で示すが、異なる場合はそのヌクレオチドを示す。配列：ＡＰＶ（Ｒａｎｄｈａｗａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９８４９〜５４、１９９７）、ＲＳＶ（Ｍｉｎｋら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８５：６１５〜２４、１９９１）、ＨＭＰＶ００−１（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｏｇｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．７：７１９〜２４、２００１）。
【図３】ＨＭＰＶ株８３（上部；それぞれ、配列番号１８の塩基１〜４１および配列番号２２の塩基１〜４０）およびＡＰＶ（下部；それぞれ、配列番号１９の塩基１〜４１および配列番号２３の塩基１〜４２）のゲノムの３’末端と５’末端の間の配列のアライメントを、相補的なヌクレオチドをボックスに囲って示す図である。これは、ＡＰＶの２末端の最後の１３ヌクレオチドが完全な相補性を示すが、ＨＭＰＶは、意外にも２つの非相補的ヌクレオチドを有することを示すものである。以前には入手できなかったＨＭＰＶの配列を、配列の上（リーダー、Ｌｅ鎖）または下（トレイラー、Ｔｒ鎖）に実線で示す。
【図４】ＨＭＰＶ株８３と００−１の間のヌクレオチドおよびアミノ酸の長さの違いについていくつかの例を示す図である。Ｇにおける違いを、部分的アミノ酸配列（上部のアライメント；それぞれ配列番号６のアミノ酸１９０〜２１９および配列番号１１のアミノ酸１９０〜２３６）および部分的ヌクレオチド配列（第２のアライメント；それぞれ配列番号１の塩基６８７１〜６９２９および配列番号３６のアミノ酸６８８６〜６９６４）で示す。ＨＭＰＶ８３Ｇのアミノ酸配列（上部のアライメント）またはＨＭＰＶ８３アンチゲノムの完全なヌクレオチド配列（第２のアライメント）に従って、配列に番号を付けている。違いの例には、（１）８３のＳＨタンパク質が、終止コドンが前にあるために４ａａ短いこと；（２）８３のＧタンパク質が、終止コドンが前にあるために１７ａａ短く、その後下流にある非コード領域が欠失していること；および（３）００−１のＦ遺伝子とＭ２遺伝子の間の遺伝子内領域が４１ヌクレオチド（ｎｔ）であるのと比べて、８３では１３ｎｔであることがある。これらを総合すると、株８３のＧのＯＲＦおよびそれにコードされたＧタンパク質は、株００−１のものより１７アミノ酸と同じだけ短いことが示される。
【図５】ＨＭＰＶの他の２株（００−１、および９７−８２）、３種の異なる抗原型のＡＰＶ（Ａ、ＢおよびＣ）、ヒトＲＳＶの２つの亜型（ＡおよびＢ）、ウシＲＳＶ（ＢＲＳＶ）、およびマウスの肺炎ウイルス（ＰＶＭ、ＨＲＳＶのマウスでの対応物）と比較した、ＨＭＰＶ８３の予測された推定タンパク質のアミノ酸配列同一性の百分率を示す表である。ＨＭＰＶが、ＡＰＶのＣに最も密接に関係することに留意されたい。ＮＤは、示した被験者について比較を行わなかったことを示す。
【図６】推定されるマトリックスＭタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づく、ＨＭＰＶと他のパラミキソウイルスの間で推定される系統発生的な関係を示す系統樹である。ニューモウイルス亜科およびパラミキソウイルス亜科は、パラミキソウイルス科の２つの亜科である。他の分類名は、属を指す。数は、１００で割ったアミノ酸配列の相違の程度（非同一性の百分率）を指す；したがって、０．２はアミノ酸の違いが２０％であることを指す。メタニューモウイルス属のトリのウイルスはほぼ２５年にわたって知られているが、感染性組換えウイルスを回収し改変する系は、この属のどのウイルスでも報告がないことに留意されたい。
【図７】完全な共通ゲノム配列から設計された、ＨＭＰＶ株８３の完全なアンチゲノムをコードするｃＤＮＡの構築を示す図である。３つの別々のサブゲノムクローン断片を作製した：断片１は、推定Ｎ、ＰおよびＭ遺伝子を含み、上流（左）側に、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｐ）の付加プロモーターで、右側に、推定Ｍ〜Ｆ遺伝子間領域にマーカーとして付加されたＮｈｅＩ部位で境界が付けられている。ＮｈｅＩ部位の導入に関与する配列変化を示す。Ｔ７プロモーターは、３つの非ウイルスＧ残基をアンチゲノムの５’末端に付加するように設計され、Ｔ７プロモーターの効率を高めるように構造が選択された。断片２は、推定Ｆ、Ｍ２、ＳＨおよびＧ遺伝子を含み、上流側に、付加されたＮｈｅＩ部位で、下流側に、天然に存在するＡｃｃ６５Ｉ部位で境界が付けられている。断片３は、Ｌ遺伝子、その後にあるδ肝炎ウイルスリボザイム（ＨＤＶｒｉｂｏ）（ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：４３４〜６、１９９１）の一部からなり、そのリボザイム内に天然に存在するＲｓｒＩＩ部位で境界が付けられている。ＨＭＰＶ８３アンチゲノムｃＤＮＡをクローン化し発現させるためのベクターは、ｐＢＳＫＳＩＩであり、これは、以前に記載された改変ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ベクターの誘導体であり（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：４２７２〜７、１９９７）、δ肝炎ウイルスリボザイム、その後にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｔ）の終止配列を含む。このベクターは、ＡｖａＩ、ＡａｔＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＡｃｃ６５Ｉ部位を含むポリリンカーの挿入によって改変され、これが、クローン断片１、２および３を受容するように働く。最終的なｃＤＮＡは、３つの付加された非ウイルスＧ残基を５’末端に含む、１３３３５ヌクレオチドの完全なＨＭＰＶ８３アンチゲノムをコードする。この完全なｐＨＭＰＶ−８３組換えプラスミド（「アンチゲノムプラスミド」）は、１６３３３ｂｐを含む。
【図８】その完全な配列中で主要なＯＲＦ間に位置する半保存性配列モチーフの同定に基づく、ＨＭＰＶ株８３の推定転写シグナルを示す図である。配列は、プラスの（ｍＲＮＡ）センス鎖である。その完全な配列中でほとんどのＯＲＦの前にある半保存性配列モチーフを、推定遺伝子開始（ＧＳ）シグナルとして示し、最も高度に保存されている配列のいくつかを大文字で示し、両側に隣接する配列を小文字で示す。個々のＧＳモチーフは、それぞれがその前にある推定ＯＲＦにしたがって命名する（配列番号１、Ｎについては塩基２９〜６４；Ｐについては塩基１２３７〜１２７２；Ｍについては塩基２１５４〜２１８９；Ｆについては塩基３０４１〜３０７６；Ｍ２については塩基４６９８〜４７３３；ＳＨについては塩基５４５５〜５４９０；Ｇについては塩基６２０６〜６２４１；およびＬについては塩基７１０７〜７１４２）。共通配列を下段に示す（配列番号２５）。別の割りつけを行うことができる位置については、これを共通配列の下に示す（配列番号２６および２７）。この分析によって、ＧＳシグナルの主要な成分は、１６ヌクレオチド以内に含まれ、その位置１、３、４、６、７、９、および１４〜１６が正確に保存され、１４〜１６は可能性のある翻訳開始部位としても働く。同様に、完全な配列中でほとんどのＯＲＦの後にある半保存性配列モチーフを、推定遺伝子終止（ＧＥ）シグナルとして示し、最も高度に保存されている配列のいくつかを大文字で示し、両側に隣接する配列を小文字で示す。個々のＧＥモチーフは、それぞれがその後にある推定ＯＲＦにしたがって命名する（配列番号１、Ｎについては塩基１２３０〜１２４９；Ｐについては塩基２１４１〜２１６６；Ｍについては塩基３００２〜３０３２；Ｆについては塩基４６８０〜４７１０；Ｍ２については塩基５４４０〜５４６７；ＳＨについては塩基６０７７〜６１０７；Ｇについては塩基６９１２〜６９４２；およびＬについては塩基１３２２３〜１３２５３）。共通配列を下段に示す（配列番号２８）。別の割りつけを行うことができる位置については、これを共通配列の下に示す（配列番号２９および３０）。この分析によって、ＧＥシグナルの主要な成分は、１２〜１３ヌクレオチド以内に含まれ、その位置１〜３および１０〜１２が正確に保存されている。
【図９】ＨＭＰＶの転写ＧＳおよびＧＥシグナルの制御下にあるクラゲＧＦＰのＯＲＦを含む転写カセットの構築、およびＨＭＰＶ株８３アンチゲノムｃＤＮＡクローン中のアンチゲノム位置４１の後へのこのカセットの挿入を示す図である。３’リーダー領域の一部を表す配列（配列番号１の塩基２３〜４１）、および推定されるＮのＧＳシグナル、および推定されるＮのＯＲＦの開始部分（配列番号１の塩基４２〜６６）を下部に示す。ＧＦＰの転写カセットは、７１４ヌクレオチドのｃＤＮＡからなり、ＧＦＰのＯＲＦを含み、このＯＲＦは、上流側で、保存されている、推定されるＮのＧＳシグナル（配列番号１の塩基４２〜５７）を表す１６ヌクレオチド（ＧＦＰのＯＲＦの開始ＡＴＧを含む）と隣接し、下流側で、遺伝子間（ＩＧ）領域として機能するように設計されたトリヌクレオチドＡＧＴがその後にある、推定されるＦのＧＥシグナル（配列番号１の塩基４６８５〜４６９７；ＧＦＰのＯＲＦの終止コドンを含む）を表す１３ヌクレオチドと隣接する。トリヌクレオチド遺伝子間領域を含めた転写カセット全体の長さは、７４８ヌクレオチドである。ＦのＧＥシグナルは、天然に存在するＰａｃＩ部位（イタリック体）を含む。
【図１０】ＨＭＰＶ株８３の提唱されるヌクレオキャプシドおよびポリメラーゼタンパク質に対応するＯＲＦ：Ｎ、Ｐ、Ｍ２−１およびＬを含む支持プラスミドを含む発現ベクターの構築を示す図である。それぞれのＲＳＶのＯＲＦとの配列関連性に基づいて（例えば、図５を参照）、これらのＯＲＦの一部を明らかにした。各ＯＲＦは、Ｔ７転写プロモーター（Ｔ７ｐ）および終止配列（Ｔ７ｔ）の制御下に置かれた。ＬのｃＤＮＡは、２つの重複した部分から構築した。各ＯＲＦは、ＨＭＰＶ８３の共通配列と同等であった。
【図１１】この場合付加マーカー遺伝子としてＧＦＰを発現する、組換え型のＨＭＰＶ株８３を回収する戦略を示す図である。ＨＭＰＶ−ＧＦＰアンチゲノムをコードするプラスミド、ならびにＮ、Ｐ、ＬおよびＭ２−１支持プラスミドを、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを構成的に発現するように作製した仔ハムスター腎−２１（ＢＨＫ−２１）細胞系統の誘導体であるＢＳＲ  Ｔ７／５細胞（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２５１〜２５９．１９９９）中にトランスフェクトする。この支持プラスミドを、推定されるＨＭＰＶヌクレオキャプシドおよびポリメラーゼタンパク質をコードするように構築した。この戦略により、アンチゲノムをＨＭＰＶヌクレオキャプシド／ポリメラーゼタンパク質と一緒に発現させると、転写およびＲＮＡ複製に機能的なＨＭＰＶヌクレオキャプシドの自己アセンブリの成分がもたらされる。次いで、これらのヌクレオキャプシドは、ＨＭＰＶのＲＮＡおよびタンパク質をすべて発現し、ｒＨＭＰＶを産生する増殖性感染を導く。
【図１２Ａ】図１２Ａは、回収された組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰ（株８３）が、アンチゲノムｃＤＮＡ中に作製され、生物学的に誘導された親株８３中に存在しないＮｈｅＩ部位を含むことを示すアガロースゲルのデジタル化画像である。Ｔ２５フラスコ内のＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、トランスフェクトしたＢＳＲ  Ｔ７／５細胞（初回継代）の上清のアリコートに感染させ、トリプシン５μｇ／ｍｌの存在下で、３２℃でインキュベートした。感染後１１日目に、１５００ｒｐｍで５分間遠心することによって、上清１ｍｌを回収し清澄にし、これを使用して、製造業者の推奨に従ってＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてウイルスゲノムＲＮＡを抽出した。このＲＮＡに、Ｍ遺伝子（ＧＦＰを除いたＨＭＰＶアンチゲノム中のヌクレオチド２７１９〜２７３８）内でハイブリダイズするように設計されたプラスのセンス鎖プライマーを使用して逆転写反応（ＲＴ）を施した。ＲＴプライマー、およびＦ遺伝子（ＧＦＰを除いたＨＭＰＶアンチゲノム中のヌクレオチド３８９４〜３８７６）内でハイブリダイズするように設計された逆向プライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。各ＲＴ−ＰＣＲ反応物のアリコートを、ＮｈｅＩで消化した。アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって、このＲＴ−ＰＣＲ産物を分析した。レーン：１および７、分子量マーカー；２、組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰ感染細胞上清由来のＲＮＡについてＲＴ酵素を省いてアッセイを行った陰性対照；レーン３および４、それぞれ、組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰ、および生物学的に誘導されたＨＭＰＶを表すＲＮＡ由来のＲＴ−ＰＣＲ産物；レーン５および６、ＮｈｅＩで消化した、それぞれ、組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰ、および生物学的に誘導されたＨＭＰＶを表すＲＮＡ由来のＲＴ−ＰＣＲ産物。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰウイルスによって発現されたＧＦＰ  ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示すナイロン膜のデジタル化画像である。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、１細胞当たり３ＰＦＵのＭＯＩで、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ８３（レーン２および６）、ｒＨＭＰＶ（レーン３および７）、またはｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ（レーン４および８）に模擬感染（レーン１および５）または感染させた。３日後、細胞内の総ＲＮＡを単離し、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、荷電ナイロン膜に移し、ＧＦＰ（レーン１〜４）またはＭ遺伝子（レーン５〜８）に特異的な二本鎖３２Ｐ標識ＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションによって分析した。個々のＲＮＡ種の識別名および理論上のサイズを示す。このことから、ＧＦＰ転写カセットが、適当なサイズの単一のｍＲＮＡとして主に発現して、単シストロン性のＧＦＰ  ｍＲＮＡとなったことが示された。
【図１３】生物学的に誘導されたＨＭＰＶ８３と比較した、回収された組換えＨＭＰＶ（株８３）（ｒＨＭＰＶ）の多段階の増殖を示すグラフである。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に、１細胞当たり０．０１プラーク形成単位（ｐｆｕ）接種し、トリプシン５μｇ／ｍｌの存在下で、３２℃でインキュベートした。２４時間間隔でアリコートを得、急速冷凍し、ＨＭＰＶ感染ハムスターの回復期血清でプラークアッセイおよび免疫染色を行うことによって、ウイルスの力価を測定した。各時点は２つのウェルで表し、各ウイルス力価測定を二連で行った。平均を示す。
【図１４】図１３について上記に記載のように行った、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における組換えＨＭＰＶと比較した組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰの多段階の増殖を示すグラフである。２つの別々の感染（ａおよびｂ）を各ウイルスについてモニターし、二連で各アリコートの力価を測定し、その平均を示す。
【図１５】単独での、ならびにｒＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ（株８３）由来のものと組み合わせての、それぞれが、導入されたＢｓｉＷＩおよびＢｓｒＧＩ制限部位を含むＳＨおよびＧ遺伝子の欠失を示す図である。推定されるＳＨおよびＧのＯＲＦを含むアンチゲノムｃＤＮＡクローン領域を、推定されるＧＳおよびＧＢ転写シグナルおよび推定される遺伝子間領域とともに示す。ＢｓｉＷＩおよびＢｓｒＧＩ部位は、ＨＭＰＶ−ＧＦＰの遺伝子間領域の、推定されるＭ２〜ＳＨおよびＳＨ〜Ｇ中にそれぞれ導入した。各場合では、変異配列（小さな場合ではヌクレオチド置換物）を、野生型配列の下部に示す。制限部位は、ＧＦＰを除いた野生型ＨＭＰＶ配列（配列番号１）における最初の残基の位置に従って番号が付けられ、この決まりは本開示全体にわたって従うものである。天然に存在するＡｃｃ６５Ｉ配列をも示す。これらの各制限部位のその同系の酵素による切断により、適合可能なオーバーハングすなわちＧＴＡＣが離れ、それは他のそれぞれと適合可能であることに留意されたい。したがって、適当な対の酵素で切断し再連結することにより、遺伝子を容易に欠失させることができる。この結果、記載したように関連する遺伝子間領域の長さに小さな変化が生じる。これらの各アンチゲノムｃＤＮＡを使用して、感染性の変異性ウイルスを回収することに成功した。
【図１６】回収された組換えＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＳＨ、ΔＧおよびΔＳＨ／Ｇウイルスがそれぞれ、ＳＨおよびＧ遺伝子の領域内で適当なサイズの欠失を含むことを示す、アガロースゲルのデジタル化画像である。図１２について前記に記載した手順に従って、ＳＨおよびＧ遺伝子にまたがるプライマー、特に、Ｍ２内でハイブリダイズするように設計されたプラスのセンス鎖プライマー、Ｌ遺伝子内でハイブリダイズするように設計されたマイナスのセンス鎖プライマーを用いて、ウイルスＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲに供した。そのＲＴ−ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色によって分析した。レーン：１および８、分子量マーカー；レーン３、回収された組換えＨＭＰＶ由来のＲＮＡに、ＲＴ酵素を省いてＲＴ−ＰＣＲの手順を施した陰性対照；レーン２および４〜７、示したウイルスを表すＲＴ−ＰＣＲ産物。
【図１７Ａ】図１７Ａは、図１３について上記に記載のようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で行った、ｒＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰと比較したｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＳＨ、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＧ、およびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＳＨ／Ｇの多段階の増殖を示すグラフである。ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ中に欠失を導入したので、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰは、この比較について「野生型」と同等である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ゴールデンシリアン（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｓｙｒｉａｎ）ハムスターの上気道（鼻甲介）および下気道（肺）における生物学的に誘導されたＨＭＰＶ８３、ならびに組換えにより誘導されたｒＨＭＰＶ、ｒＨＭＰＶΔＳＨ、ｒＨＭＰＶΔＧ、およびｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇの複製の効率を示すグラフである。１２匹からなる群の動物を、鼻内から、０．１ｍｌ中に１動物当たり５．０×１０５ＴＣＩＤ５０の投与量で下記のウイルス：生物学的に誘導されたＨＭＰＶ８３、ｒＨＭＰＶ、ｒＨＭＰＶΔＳＨ、およびｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇ、０．１ｍｌ中に１動物当たり１．６×１０５ＴＣＩＤ５０の投与量で下記のウイルス：ｒＨＭＰＶΔＧに感染させた。各群６匹の動物を３および５日目に犠牲にし、その鼻甲介および肺を回収し、ウイルスの力価を決定する限界希釈法によって分析した。このことから、ｒＨＭＰＶが、生物学的に誘導されたその親株（ＨＭＰＶ８３）と同様の効率でｉｎ  ｖｉｖｏで複製し、ｒＨＭＰＶΔＳＨウイルスの複製が有意に低下せず、ｒＨＭＰＶΔＧおよびΔＳＨ／Ｇウイルスの複製が大きく低下したが、ウイルス複製は各場合で検出可能であったことが明らかとなった。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、示したＨＭＰＶ欠失突然変異ウイルスによる免疫感作の防御効力を示すグラフである。６匹からなる群のゴールデンシリアンハムスターを図１７Ｂに記載のように感染させ、２７日後、血清試料を採取し、分析してＨＭＰＶの中和血清抗体の力価を決定した。これらの力価を下部に示す。次いで、１動物当たり５．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０の生物学的に誘導された野生型ＨＭＰＶ８３を鼻内に点滴注入することによって、その動物を２８日目にチャレンジした。３日後、動物を犠牲にし、その鼻甲介および肺を回収し、ホモジナイズし、ウイルスの力価を決定する限界希釈法によって分析した。このことから、ｒＨＭＰＶまたはｒＨＭＰＶΔＳＨを投与していた動物ではチャレンジウイルスの検出可能な複製が認められなかったが、ｒＨＭＰＶΔＧまたはｒＨＭＰＶΔＳＨ／Ｇを最初に投与していた動物では、肺でチャレンジウイルスの複製が検出できず、以前に感染していない対照と比べて鼻甲介で複製が低下したことが示された。
【図１８Ａ】図１８Ａは、感染性ｒＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ（株８３）における、それぞれが導入されたＢｓｉＷＩ部位を含む、推定されるＭ２−２のＯＲＦの消失を示す図である。推定されるＭ２−１およびＭ２−２のＯＲＦを含むアンチゲノムｃＤＮＡクローンの領域を示し、各ＯＲＦを水平な実線で描く。位置５２３６および５２４８で（配列番号１：ＧＦＰを除いた完全なアンチゲノムｃＤＮＡに従って番号が付けられる）２つのヌクレオチドが置換され、これによりＭ２−２のＯＲＦで２つの潜在的な翻訳開始コドンが消失する。位置５２７２（配列番号１）で第３の置換が行われ、これによって、インフレームの終止コドンが導入される。さらに、ヌクレオチド５２８９〜５４４０（配列番号１）が欠失し、Ｍ２−２のＯＲＦのほとんどが除去されていた。ΔＭ２−２変異体は、ｒＨＭＰＶとｒＨＭＰＶ−ＧＦＰのどちらの主鎖でも回収することに成功し、それぞれｒＨＭＰＶΔＭ２−２およびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２−２と称した。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで回収したウイルスの多段階の増殖動態の評価を示すグラフである。多段階の増殖動態に関して、ｒＨＭＰＶΔＭ２−２およびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２−２ウイルスを、ｒＨＭＰＶおよびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰと比較し、図１３について上記に記載のようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞中でそれを得た。ｒＨＭＰＶΔＭ２クローン＃１および＃２は、２つの姉妹ｃＤＮＡクローンに独立に由来するウイルスを表す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰおよびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２−２によって発現された細胞内ＲＮＡのノーザンブロット分析を示すナイロン膜のデジタル化画像である。示されるように、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の複製の単層を、１細胞当たり３ＰＦＵのＭＯＩでどちらかのウイルスに感染させ、３２℃でインキュベートした。示されるように、感染してから９時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、および７２時間後で単層を回収し、細胞内ＲＮＡを精製用に処理した。そのＲＮＡ調製物を、Ｎ遺伝子を表す鎖特異的リボプローブを用いたノーザンブロットハイブリダイゼーションによって分析した：上部のパネルは、マイナスのセンス鎖プローブによるハイブリダイゼーションを検出するものであり、したがって、示されるように、アンチゲノムおよびＮ関連ｍＲＮＡを表し、下部のパネルは、複製のペアのゲルレーン（同じ膜上に並行して移したものであり、次いでそれを切断し、複製のペアを別々にハイブリダイズさせる）のプラスのセンス鎖リボプローブによるハイブリダイゼーションを検出するものであり、ゲノムを表す。ノーザンブロットの下は、示されるように、Ｎに、またはＦに特異的なプローブによるハイブリダイゼーションに関する４つの実験からの算出値である。各実験では、各時点でのＮ関連のまたはＦ関連の総ｍＲＮＡ量を、複製のゲルレーンからのアンチゲノム量（同じ膜上に並行して移したものであり、次いでそれを切断し、複製を別々にハイブリダイズさせる）で割った。次いで、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２−２ウイルスについての各時点の値を、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰについての対応する時点の値を１．０として比較して標準化した。したがって、こうして、野生型ＨＭＰＶと比較したΔＭ２−２変異体のｍＲＮＡ発現効率の比較が得られる。
【図１９】ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ（株８３）のＭ２−１タンパク質のＣｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフ中への単一アミノ酸置換の導入を示す図である。このモチーフは、３つのシステイン残基（Ｃ７、Ｃ１５およびＣ２１）および１つのヒスチジン残基（Ｈ２５）からなる；それは、ＲＳＶおよび他のニューモウイルスでも見られ、したがって保存されているニューモウイルスモチーフを表す。示したアミノ酸配列は、推定される完全なＭ２−１アミノ酸配列（配列番号４）のメチオニン（Ｍ）１〜アスパラギン（Ｎ）２６である。この各変異体を、感染性組換えウイルスとして回収することに成功した。
【図２０】図１３について上に記載のようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で行われ、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰおよびｒＨＭＰＶと比較した、Ｍ２−１のＯＲＦのＣｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフ中に突然変異を含むｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ誘導体の多段階の増殖を示すグラフである。この変異体には、Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフにおける単一アミノ酸点突然変異が関与する：Ｃ７Ｓ、Ｙ９Ｓ、Ｃ１５Ｓ、Ｎ１６ＳおよびＨ２５Ｓ。この突然変異をｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ中に導入し、したがって、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰは、この比較について「野生型」または親株と同等である。
【図２１】ＡＴＧ翻訳開始部位（影付きの部分）をＴＡＧ翻訳終止コドンに置換し、各読み枠におけるさらなるＡＴＧトリプレット（下線の部分）を終止コドンに置換することによる、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ（株８３）におけるＭ２−１のＯＲＦのサイレンシングを示す図である。最上の第1行は、Ｍ２−１  ｍＲＮＡの上流末端のヌクレオチド配列（完全なＨＭＰＶアンチゲノム配列；配列番号１におけるヌクレオチド４７１１〜４７７５に相当）を示す。第２行は、ヌクレオチド置換（小文字）を示し、これをｒＨＭＰＶ−ＧＦＰのＭ２−１配列中に導入してｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＭ２−１を得る。第３行は、ＨＭＰＶのＭ２−１タンパク質（配列番号４）の最初の１７アミノ酸を示し、第４行は、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＭ２−１における点突然変異によって導入されたコード変化を示し、Ｍ２−１のＯＲＦにおける終止コドンを星印で示す。Ｍ２−１のＯＲＦにおけるフレームの合う次のＡＴＧはＯＲＦ（配列番号４）の合計１８７コドンのうちコドン１３４にあることに留意されたい。この変異体を、感染性組換えウイルスとして回収することに成功した。
【図２２Ａ】図２２Ａは、導入されたＢｓｉＷＩ部位を含む感染性ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ（株８３）における完全Ｍ２遺伝子の欠失を示す図である。推定されるＭ２−１およびＭ２−２のＯＲＦを含むアンチゲノムｃＤＮＡクローンの領域を示し、各ＯＲＦを水平な実線で描く。全体で７５９ヌクレオチドとなるヌクレオチド４７０１〜５４５９（配列番号１）を欠失させると、変異体ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−ΔＭ２（１＋２）が得られた。この変異体を、感染性組換えウイルスとして回収することに成功した。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、インターフェロンの構造遺伝子を欠くＶｅｒｏ細胞（下部のパネル）に対してＩ型インターフェロンを発現する能力があるＬＬＣ−ＭＫ２細胞（上部のパネル）におけるＭ２−１および／またはＭ２−２タンパク質のコードが変化したウイルスの増殖効率の比較を示すグラフである。細胞を１細胞当たり０．０１ＰＦＵで感染させ、トリプシン５μｇ／ｍｌの存在下で、３２℃でインキュベートした。２４時間間隔でアリコートを得、急速冷凍し、ＨＭＰＶに感染していたハムスター由来の回復期血清でプラークアッセイおよび免疫染色を行うことによって、ウイルスの力価を測定した。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、Ｉ型インターフェロンに対するＨＭＰＶΔＭ２（１＋２）およびΔＭ２−２変異体の感受性の増大を示す表である。複製のＶｅｒｏ細胞培養物を、細胞１．５×１０６個につき示された量のインターフェロンで１晩処理した。示された量の野生型ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２（１＋２）、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰΔＭ２−２、または、ＧＦＰ遺伝子を発現する組換えＲＳＶであるｒｇＲＳＶを細胞に感染させた。ＧＦＰマーカーは、実験の間ウイルスの増殖を視覚的にモニターして、回収する適当な時間を判断するのに使用したが、他の場合はこの実験に無関係である。細胞を４日目に回収し、各ウイルスの収量を決定し、並行して模擬のインターフェロン処理、感染および回収を行ったさらなる複製の培養物と比較した。その結果を、各インターフェロン処理培養物をその非処理対応物と比較した低下倍数として表す。
【図２３Ａ】図２３Ａは、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ（株８３）の遺伝子の２つの再構成の構築を示す図である。野生型遺伝子の順番を、ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰアンチゲノムｃＤＮＡクローンのＭ〜Ｌ領域について最上部に示す。示した制限部位は、図７および１５において上記に示した通りに導入したものであり（制限部位は、ＧＦＰを除いた野生型ＨＭＰＶ配列である配列番号１における最初の残基の位置に従って番号が付けられている）、これを使用して、推定されるＳＨとＧの遺伝子対の順番を再構成した。ＮｈｅＩが関与する最連結部は、他方の部位と適合せず、各末端を埋めて平滑にし、その後平滑末端連結を行うことを余儀なくされた。遺伝子再構成の２例を示す：「順番１」と称する変異体では、ＳＨ−Ｇ遺伝子対とＦ−Ｍ２遺伝子対を交換し、それによってＲＳＶのものと似た局所遺伝子の順番、すなわちＭ−ＳＨ−Ｇ−Ｆ−Ｍ２−Ｌとなった。この変異体を、感染性ウイルスとして回収することに成功した。その次の変異体である「順番２」では、同様なＲＳＶ様の遺伝子の順序となったが、ＳＨ−Ｇ遺伝子対が重複していた。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、図１３について上記に記載のように行われ、その直接の親株ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ、ならびにｒＨＭＰＶと比較した、これらの変異体の１つであるｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ−順番＃１の多段階の増殖動態を示すグラフである。クローン＃３および＃１３は、２つの姉妹ｃＤＮＡクローンに独立に由来するウイルスを表す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＨＭＰＶ（株８３）のＦおよび／またはＧ遺伝子の、それぞれ４番目および７番目の遺伝子であるその本来の位置から、プロモーターに近接した位置１または２への移動を示す図である。上側のボックスで示すように、推定されるＦおよびＧのＯＲＦを、推定されるＧＳ（それぞれ配列番号１の塩基３０５４〜３０６９および６２１９〜６２３４）とＧＥ（配列番号１の塩基４６８５〜４６９７）シグナルと隣接するように作製し、ＨＭＰＶアンチゲノムｃＤＮＡクローン中にそれを個々に挿入した。３’リーダー領域の一部（配列番号１の塩基２３〜４１）および推定されるＮのＧＳシグナルおよび推定されるＮのＯＲＦの開始部分（配列番号１の塩基４２〜６６）を表す配列を示す。転写シグナルおよび挿入部位の選択が、図９において上記に示したｒＨＭＰＶ−ＧＦＰ構築物の場合と同じであり、挿入遺伝子を遺伝子の順番で最初に置くことに留意されたい。下側のボックスで示すように、単一遺伝子再構成の場合と同じ転写シグナルおよび挿入部位を用いて、推定されるＦおよびＧのＯＲＦを対として、Ｇ１−Ｆ２またはその逆のＦ１−Ｇ２の順番で挿入した。感染性ウイルスを各構築物から回収することに成功した。これらのウイルスを、ｒＨＭＰＶ−Ｆ１、−Ｇ１、−Ｆ１Ｇ２、およびＧ１Ｆ２と称したが、その番号は、遺伝子の順番におけるその遺伝子の位置を示している。ウイルスの名称で、移動した遺伝子の前にある「−」の記号は、その移動した遺伝子が、遺伝子の順番でのその正常の位置から除去されたことを示している。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで回収したウイルスの多周期の増殖動力学を示すグラフである。回収したｒＨＭＰＶ−Ｇ１、−Ｆ１、Ｆ１Ｇ２、およびＧ１Ｆ２ウイルスを、図１３について上記に記載のようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞での多段階の増殖に関して、そのｒＨＭＰＶ親株と比較した。
【図２５Ａ】図２５Ａは、Ｆおよび／またはＧ遺伝子の１つまたは複数の過剰複製物が、プロモーター近接位置１、２または３に配置され、さらにＦおよび／またはＧ遺伝子が正常のゲノムの位置に存在しているｒＨＭＰＶの代表を示す図である。ＧおよびＦ遺伝子を、プロモーター近接位置１中に個々に挿入し（ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１、または＋Ｆ１）、または対として、それぞれの２つの可能な順番で位置１および２に挿入し（ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２、または＋Ｆ１Ｇ２）、またはＧ１Ｆ２の対として、またＦのさらなる複製物を第３の位置に挿入した（ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２，３）。遺伝子挿入の詳細な構造は、図２４Ａに示す通りであった。名称で、名称の付いた遺伝子または複数遺伝子の前にある「＋」の記号は、それが／それらが、その正常位置で１つまたは複数付加されたことを示す。付加遺伝子には影を付けている。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多周期の増殖動力学を示すグラフである。回収したウイルスを、図１３について上記に記載のようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞での多段階の増殖に関して、そのｒＨＭＰＶ親株およびｒＨＭＰＶ−ＧＦＰと比較した。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、ｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３によって発現された細胞内ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示すナイロン膜のデジタル化画像である。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、１細胞当たり３ＰＦＵのＭＯＩで、ＨＭＰＶ８３（レーン２、６および１０）、ｒＨＭＰＶ（レーン３、７および１１）、またはｒＨＭＰＶ＋Ｇ１Ｆ２３（レーン４、８および１２）に模擬感染（レーン１、５および９）または感染させた。３日後、細胞内の総ＲＮＡを単離し、１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で電気泳動し、荷電ナイロン膜に移し、Ｆ（レーン１〜４）、Ｇ（レーン５〜８）またはＭ遺伝子（レーン９〜１２）に特異的な二本鎖３２Ｐ標識ＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションによって分析した。個々のＲＮＡ種の識別名および理論上のサイズを示す。
【図２６Ａ】Ａ〜Ｆは、異種ウイルス（示される通り、ＨＲＳＶＡ２、配列番号１３；ＨＰＩＶ３、配列番号１４；ＨＰＩＶ１、配列番号１５；またはＢＰＩＶ３、配列番号１６）での弱毒化する突然変異の地図作製に基づく突然変異作製の標的であるＨＭＰＶ株８３のＬタンパク質（配列番号７）におけるアミノ酸の位置を示す図である。ＨＭＰＶ株００１、配列番号１２は、比較用のアライメント中に含まれる。左の数値は、示された部分的アミノ酸配列における最初の残基の位置基準を示し、右の数値は、部分的配列における最後の残基の位置基準数を示す。より高度に保存されたまたは類似した残基を影付きで示す。ダッシュは、アライメントを最適にするために導入した特定の配列におけるギャップを示す。
【図２６Ｂ】Ａ〜Ｆは、異種ウイルス（示される通り、ＨＲＳＶＡ２、配列番号１３；ＨＰＩＶ３、配列番号１４；ＨＰＩＶ１、配列番号１５；またはＢＰＩＶ３、配列番号１６）での弱毒化する突然変異の地図作製に基づく突然変異作製の標的であるＨＭＰＶ株８３のＬタンパク質（配列番号７）におけるアミノ酸の位置を示す図である。ＨＭＰＶ株００１、配列番号１２は、比較用のアライメント中に含まれる。左の数値は、示された部分的アミノ酸配列における最初の残基の位置基準を示し、右の数値は、部分的配列における最後の残基の位置基準数を示す。より高度に保存されたまたは類似した残基を影付きで示す。ダッシュは、アライメントを最適にするために導入した特定の配列におけるギャップを示す。
【図２６Ｃ】Ａ〜Ｆは、異種ウイルス（示される通り、ＨＲＳＶＡ２、配列番号１３；ＨＰＩＶ３、配列番号１４；ＨＰＩＶ１、配列番号１５；またはＢＰＩＶ３、配列番号１６）での弱毒化する突然変異の地図作製に基づく突然変異作製の標的であるＨＭＰＶ株８３のＬタンパク質（配列番号７）におけるアミノ酸の位置を示す図である。ＨＭＰＶ株００１、配列番号１２は、比較用のアライメント中に含まれる。左の数値は、示された部分的アミノ酸配列における最初の残基の位置基準を示し、右の数値は、部分的配列における最後の残基の位置基準数を示す。より高度に保存されたまたは類似した残基を影付きで示す。ダッシュは、アライメントを最適にするために導入した特定の配列におけるギャップを示す。
【図２６Ｄ】Ａ〜Ｆは、異種ウイルス（示される通り、ＨＲＳＶＡ２、配列番号１３；ＨＰＩＶ３、配列番号１４；ＨＰＩＶ１、配列番号１５；またはＢＰＩＶ３、配列番号１６）での弱毒化する突然変異の地図作製に基づく突然変異作製の標的であるＨＭＰＶ株８３のＬタンパク質（配列番号７）におけるアミノ酸の位置を示す図である。ＨＭＰＶ株００１、配列番号１２は、比較用のアライメント中に含まれる。左の数値は、示された部分的アミノ酸配列における最初の残基の位置基準を示し、右の数値は、部分的配列における最後の残基の位置基準数を示す。より高度に保存されたまたは類似した残基を影付きで示す。ダッシュは、アライメントを最適にするために導入した特定の配列におけるギャップを示す。
【図２６Ｅ】Ａ〜Ｆは、異種ウイルス（示される通り、ＨＲＳＶＡ２、配列番号１３；ＨＰＩＶ３、配列番号１４；ＨＰＩＶ１、配列番号１５；またはＢＰＩＶ３、配列番号１６）での弱毒化する突然変異の地図作製に基づく突然変異作製の標的であるＨＭＰＶ株８３のＬタンパク質（配列番号７）におけるアミノ酸の位置を示す図である。ＨＭＰＶ株００１、配列番号１２は、比較用のアライメント中に含まれる。左の数値は、示された部分的アミノ酸配列における最初の残基の位置基準を示し、右の数値は、部分的配列における最後の残基の位置基準数を示す。より高度に保存されたまたは類似した残基を影付きで示す。ダッシュは、アライメントを最適にするために導入した特定の配列におけるギャップを示す。
【図２６Ｆ】Ａ〜Ｆは、異種ウイルス（示される通り、ＨＲＳＶＡ２、配列番号１３；ＨＰＩＶ３、配列番号１４；ＨＰＩＶ１、配列番号１５；またはＢＰＩＶ３、配列番号１６）での弱毒化する突然変異の地図作製に基づく突然変異作製の標的であるＨＭＰＶ株８３のＬタンパク質（配列番号７）におけるアミノ酸の位置を示す図である。ＨＭＰＶ株００１、配列番号１２は、比較用のアライメント中に含まれる。左の数値は、示された部分的アミノ酸配列における最初の残基の位置基準を示し、右の数値は、部分的配列における最後の残基の位置基準数を示す。より高度に保存されたまたは類似した残基を影付きで示す。ダッシュは、アライメントを最適にするために導入した特定の配列におけるギャップを示す。
【図２７】図１３について上記に記載のようにＬＬＣ−ＭＫ２細胞で行われ、ｒＨＭＰＶと比較した、Ｆ４５６Ｌ突然変異を含む（図２６Ａを参照）ｒＨＭＰＶ−ＧＦＰの多周期の増殖を示すグラフである。クローン＃３および＃７は、２つの姉妹ｃＤＮＡクローンに独立に由来するウイルスを表す。
【図２８】野生型（ＷＴ）ＲＳＶ（配列番号３１）のＭ２遺伝子のＧＳシグナル、およびｃｐｔｓ２４８／４０４  ＲＳＶ変異体（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：４４６７〜４４７１、１９９８）のＭ２遺伝子のＧＳシグナルにおける位置９での高度に弱毒化するＴからＣへのヌクレオチド置換を示す図である。推定されるＨＭＰＶのＧＳシグナルすべての間で高度に保存されている、一致するＴ残基が存在する。個々のＧＳモチーフは、それぞれがその前にある推定ＯＲＦにしたがって命名する（配列番号１、Ｎについては塩基４１〜５７；Ｐについては塩基１２４９〜１２６５；Ｍについては塩基２１６６〜２１８２；Ｆについては塩基３０５３〜３０６９；Ｍ２については塩基４７１０〜４７２６；ＳＨについては塩基５４６７〜５４８３；Ｇについては塩基６２１８〜６２３４；およびＬについては塩基７１１９〜７１３５）。下部の配列（配列番号３２）は、株８３におけるシグナルすべての間で正確に保存されている、推定されるＨＭＰＶのＧＳシグナル中のそれらの位置を大文字で示し、それは９位にＴを含む。
【図２９】２つの推定される遺伝的なＨＭＰＶ亜型を代表し、したがってＨＭＰＶ免疫原性組成物を設計する際に考慮しなければならない多様性を示す、生物学的に誘導されたＨＭＰＶ株８３およびＣＡＮ９８−７５（以後７５またはＣＡＮ７５と称する）のゲノム構造の概略図である。個々の遺伝子をボックスで示し、推定タンパク質（Ｍ２の場合、２つの予測タンパク質Ｍ２−１およびＭ２−２）の非改変アミノ酸長（イタリック体）と一緒に、完全なゲノム配列内の遺伝子の長さおよび境界をヌクレオチド単位で示す。遺伝子外の３’リーダー領域、５’トレイラー領域および遺伝子間領域のヌクレオチドの長さを下線で示す。
【図３０Ａ】潜在的なワクチン候補となる、ＨＭＰＶおよびＡＰＶの遺伝子で構築するキメラウイルスの構築を示す図である。Ａ部は、ＨＭＰＶ８３、およびＮ、ＰまたはＭのＯＲＦが、そのＡＰＶ対応物（影の付いていないボックス）に個々に置換された誘導体のゲノムを示す。
【図３０Ｂ−Ｅ】潜在的なワクチン候補となる、ＨＭＰＶおよびＡＰＶの遺伝子で構築するキメラウイルスの構築を示す図である。Ｂ、ＣおよびＤ部は、ＨＭＰＶ（各ボックスの上の線）のそれぞれＮ、Ｐ、およびＭ遺伝子を含むｃＤＮＡの、示されている置換されたＡＰＶのＯＲＦ（各ボックスの下の線）を含む版と比較した構造を示す。各ＯＲＦは、影付きのボックスとして示され、ＨＭＰＶのＧＳ（配列番号１、リーダー／ＮのＧＳシグナルについては塩基１２〜５７；ＮのＧＥ／ＰのＧＳシグナルについては塩基１２３５〜１２６５；およびＰのＧＥ／ＭのＧＳシグナルについては塩基２１４６〜２１８２）およびＧＥ（配列番号１、Ｎの部分的なＧＥシグナルについては塩基１２３５〜１２４２；Ｐの部分的なＧＥシグナルについては塩基２１４６〜２１５１；およびＭのＧＥシグナルについては塩基３００７〜３０３７）転写シグナル（ボックスで囲っている）と隣接する。ＡＰＶのＭ遺伝子の場合、ＯＲＦをＧＥシグナルと分離する６４ｎｔの非コード配列が欠失している（−６４ｎｔｓ  ｎｃ）。ＧＥおよびＧＳシグナルは、示される通り、下記のリストから選択される制限部位と順に隣接する：ＢｂｓＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｂｓＩ。これらの各部位は、認識配列（下線の部分）からなり、認識部位（下線部分の４ヌクレオチド、太線）の外側の第２の部位が配列非依存的な形で切断されて、５’の突き出た４ｎｔのオーバーハングが離れる特性を有する。ここで、示される通り、そのオーバーハングはＴＡＡＴまたはＧＴＡＧであり、この位置での天然のＨＭＰＶの割りつけと一致する。Ｅ部は、Ｎ、Ｐ、およびＭのｃＤＮＡをＨＭＰＶ主鎖中に同時に連結するために、隣接するＭｌｕＩおよびＮｈｅＩ部位に加えて、４ｎｔのオーバーハングを利用する新規の構築戦略を示す。この戦略により、これを使用して、単一ＨＭＰＶ遺伝子の置換（Ａ部の場合）を行うのに、または２つまたは３つの遺伝子を同時に置換するのに所望されるどんな組合せでも、ＨＭＰＶおよびＡＰＶのＮ、ＰおよびＭ遺伝子を混合することができる。
【図３１】プラスのセンス鎖の配列として示される、ＨＭＰＶ株８３（配列番号１）および７５（配列番号２）の予測される遺伝子の境界、シス作用性ＧＳおよびＧＥシグナル、ならびに遺伝子間領域の比較を示す図である。最上部のアライメントは、リーダー／Ｎ遺伝子の境界を、具体的には、リーダー領域の最後の１６〜１８ヌクレオチド、その後にＮ遺伝子の最初の１５ヌクレオチドを示す。第２のアライメントは、Ｎ／Ｐ遺伝子の境界を、具体的には、Ｎ遺伝子の最後の１５ヌクレオチド、その後に隣接した遺伝子間領域、その後にＰ遺伝子の最初の１５ヌクレオチドを示す。その後に続くアライメントは、Ｐ／Ｍ、Ｍ／Ｆ、Ｆ／Ｍ２、Ｍ２／ＳＨ、ＳＨ／Ｇ、Ｇ／Ｌ、およびＬ／トレイラーの境界を示す。各遺伝子の末端（遺伝子末端）および開始部（遺伝子開始部）で保存されている配列モチーフを太い大文字で示し、共通配列を下記に示す（配列番号３４および３５）。これらの保存されているモチーフ内の位置に番号を付けている。翻訳終止および開始コドンに下線を付けている。遺伝子間配列を示す：長い遺伝子間領域の場合は、上流および下流の末端の最初の５ヌクレオチドだけを示し、示さないヌクレオチドの数を示す。共通配列内の各割りつけでは、この配列対の２つ（ＨＭＰＶ８３対７５）だけが、どちらの亜型配列中でも異種の割りつけを有する可能性があった。
【図３２】ＨＭＰＶ亜型における相違の規模および予想される有意性について評価するための基準として本明細書で使用する、亜型間の比較を表す、ＨＭＰＶ８３対ＨＭＰＶ３５の；亜型内の比較を表す、ＨＭＰＶ８３対ＨＭＰＶ００−１の；および２つの十分に特徴付けられているＲＳＶの抗原亜型ＡとＢ間の比較を表す、ＲＳＶ  Ａ２対ＲＳＶ  Ｂ１の予測されるタンパク質およびＯＲＦ間のアミノ酸およびヌクレオチド配列同一性の百分率（後者は括弧に入れて示す）を示す表である。完全な予測タンパク質に基づいて、アミノ酸配列同一性を算出した；ＧおよびＳＨの場合、長さの相違に起因するカルボキシ末端側のアライメントでのオーバーハングは、算出の際に含めなかった。対応するＯＲＦのヌクレオチド配列同一性を括弧に入れて示すが、これは、隣接する非コード配列を除いたタンパク質コード配列に基づくものである。比較では、ＨＭＰＶ遺伝子間領域は、亜型間で４８％の同一性があり、保存されている転写シグナルを除いた非コード遺伝子配列は５４％同一であったが、これと比較してＲＳＶでは値は４２％と約５０％であった（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：２９０１〜２９０６、１９８８）。
【図３３Ａ】ＨＭＰＶ株７５（それぞれ配列番号８および９）、８３（それぞれ配列番号５および６）および００−１（それぞれ配列番号１０および１１）のＳＨ（図３３Ａ）タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。これは、推定されるＨＭＰＶ遺伝子亜型間（７５対８３）および亜型内（８３対００−１）の比較を含む。株７５および００−１では、８３のものと異なる割りつけを示す：ダッシュは、アライメントを最適にし、対応するアミノ酸が存在しないことを示すために導入したギャップを示す。各アライメントの下にある星印は、３つの配列すべての間でアミノ酸が同一であることを示す；小さな点は、３つすべての間でアミノ酸が類似することを示す。推定されるシグナル／膜貫通ドメインは、ボックスで囲っている。Ｎ結合炭水化物のモチーフに下線を付けている（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ、ここでＸはプロリンではない）。Ａのパネルでは、３つすべてのＳＨタンパク質間で保存されているシステイン残基を大きな点で示し、ＳＨタンパク質のＯ結合グリコシレーション（Ｈａｎｓｅｎら、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１５：１１５〜１３０、１９９８）の潜在的部位は以下の通りである：ＨＭＰＶ８３では、７５、７７、７８、８１；ＨＭＰＶ７５では、７８、７９、８１；００−１では、７７、７８、８１。
【図３３Ｂ】ＨＭＰＶ株７５（それぞれ配列番号８および９）、８３（それぞれ配列番号５および６）および００−１（それぞれ配列番号１０および１１）のＧ（図３３Ｂ）タンパク質のアミノ酸配列のアライメントを示す図である。これは、推定されるＨＭＰＶ遺伝子亜型間（７５対８３）および亜型内（８３対００−１）の比較を含む。株７５および００−１では、８３のものと異なる割りつけを示す：ダッシュは、アライメントを最適にし、対応するアミノ酸が存在しないことを示すために導入したギャップを示す。各アライメントの下にある星印は、３つの配列すべての間でアミノ酸が同一であることを示す；小さな点は、３つすべての間でアミノ酸が類似することを示す。推定されるシグナル／膜貫通ドメインは、ボックスで囲っている。Ｎ結合炭水化物のモチーフに下線を付けている（Ｎ−Ｘ−Ｔ／Ｓ、ここでＸはプロリンではない）。各ウイルスのＧタンパク質の外部ドメインは、Ｏ結合炭水化物の４０を超える潜在的受容部位を含んでいた。
【図３４】ＨＭＰＶの２つの異なる抗原亜型を表すＨＭＰＶ株に特異的な抗原を有する、キメラＨＭＰＶウイルスの設計を示す図である。株８３のアンチゲノムｃＤＮＡクローンを主鎖（３’リーダー領域の一部を表す配列（配列番号１の塩基２３〜４１）、および推定されるＮのＧＳシグナル、および推定されるＮのＯＲＦの開始部（配列番号１の塩基４２〜４６）を示す）として使用し、株８３由来の転写シグナル（保存されている、推定されるＮのＧＳシグナルを表す配列番号１の塩基４２〜５７、および推定されるＦのＧＥシグナルを表す配列番号１の塩基４６８５〜４６９７を含む）の制御下にある株７５の推定されるＧ、Ｆ、またはＳＨの表面タンパク質をコードするＯＲＦからなる転写カセットを設計した。次いでこの転写カセットを、プロモーター近接部位で株８３の主鎖中に挿入する。二価免疫原性構築物を構築するためのこの戦略は、同じ株８３の転写シグナル、および図９におけるＨＭＰＶ−ＧＦＰ構築物で示した挿入部位を使用する。
【図３５】アフリカミドリザルの上気道および下気道におけるＨＭＰＶ株７５および８３の毎日の複製レベルを示すグラフである。鼻内および気管内経路によって、指示のウイルスを１０５ＴＣＩＤ５０で同時に感染させた動物から、接種後示した日に鼻咽頭（上部のパネル）または気管洗浄（下部のパネル）標本での毎日の平均ウイルス力価を得た：株７５（●）、株８３（黒塗り四角）。
【図３６】図３６Ａ、Ｂは、ＨＭＰＶ  ＣＡＮ８３のＦタンパク質を発現する組換えＨＰＩＶ１ベクター（ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３）の構築および発現を示す、図およびデジタル化画像である。ＮのＯＲＦの翻訳開始コドン（ＨＰＩＶ１ｎｔ１１９〜１２１）の１ヌクレオチド前に、ＭｌｕＩ制限部位（ＨＰＩＶ１ｎｔ１１３〜１１８）を作製することによってＨＰＩＶ１ゲノムを改変した。ＨＭＰＶ株ＣＡＮ８３のＦのＯＲＦ（長さ１６２０ｎｔであり、５３９ａａのポリペプチドをコードする；配列番号１の塩基３０５４〜４６９７）を、その後に４ヌクレオチドＴＡＡＴ、ならびにＧＥシグナル、ＣＴＴ遺伝子間領域、およびＧＳシグナルからなるＨＰＩＶ１遺伝子結合部を伴うように、ＰＣＲによって作製した。全体のカセットの長さは１６５６ｎｔであり、ＭｌｕＩ部位への挿入の際、６塩基の規則に従い、かつＨＰＩＶ１のＧＳシグナル配列の位相を維持するようにそれを設計した。ＧＳおよびＧＥシグナルを示す（図３６Ａ）。Ｎ遺伝子内にある予測ウイルスプロモーターの一部を示す（図３６Ａ）。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、示したように、ｒＨＰＩＶ１−Ｆ８３、ＨＭＰＶ  ＣＡＮ８３、ｒＨＰＩＶ１に感染させまたは模擬感染させ、７２時間インキュベートし、示したように、抗ＨＭＰＶポリクローナルハムスター血清またはＨＰＩＶ１  ＨＮタンパク質に対する２つのマウスモノクローナル抗体の混合物を用いた間接免疫蛍光法によって分析した（図３６Ｂ）。
【図３７Ａ】Ａ〜Ｄは、プラスのセンス鎖ＤＮＡとして示される、生物学的に誘導された株８３のゲノムの完全な配列である（配列番号１）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４９も参照されたい。
【図３７Ｂ】Ａ〜Ｄは、プラスのセンス鎖ＤＮＡとして示される、生物学的に誘導された株８３のゲノムの完全な配列である（配列番号１；図３７Ａ続き）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４９も参照されたい。
【図３７Ｃ】Ａ〜Ｄは、プラスのセンス鎖ＤＮＡとして示される、生物学的に誘導された株８３のゲノムの完全な配列である（配列番号１；図３７Ｂ続き）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４９も参照されたい。
【図３７Ｄ】Ａ〜Ｄは、プラスのセンス鎖ＤＮＡとして示される、生物学的に誘導された株８３のゲノムの完全な配列である（配列番号１；図３７Ｃ続き）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４９も参照されたい。
【図３８Ａ】Ａ〜Ｄは、ＧＦＰを発現する転写カセットを有する組換え株８３のゲノムの完全な配列である。この組換え株が本開示のｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを例示する（配列番号３）。
【図３８Ｂ】Ａ〜Ｄは、ＧＦＰを発現する転写カセットを有する組換え株８３のゲノムの完全な配列である（図３８Ａ続き）。この組換え株が本開示のｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを例示する（配列番号３）。
【図３８Ｃ】Ａ〜Ｄは、ＧＦＰを発現する転写カセットを有する組換え株８３のゲノムの完全な配列である（図３８Ｂ続き）。この組換え株が本開示のｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを例示する（配列番号３）。
【図３８Ｄ】Ａ〜Ｄは、ＧＦＰを発現する転写カセットを有する組換え株８３のゲノムの完全な配列である（図３８Ｃ続き）。この組換え株が本開示のｒＨＭＰＶ−ＧＦＰを例示する（配列番号３）。
【図３９Ａ】生物学的に誘導され、生物学的にクローン化されたＨＭＰＶ  ＣＡＮ７５のゲノムの完全な配列である（配列番号２）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４８も参照されたい。
【図３９Ｂ】生物学的に誘導され、生物学的にクローン化されたＨＭＰＶ  ＣＡＮ７５のゲノムの完全な配列である（配列番号２；図３９Ａ続き））。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４８も参照されたい。
【図３９Ｃ】生物学的に誘導され、生物学的にクローン化されたＨＭＰＶ  ＣＡＮ７５のゲノムの完全な配列である（配列番号２；図３９Ｂ続き）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４８も参照されたい。
【図３９Ｄ】生物学的に誘導され、生物学的にクローン化されたＨＭＰＶ  ＣＡＮ７５のゲノムの完全な配列である（配列番号２；図３９Ｃ続き）。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ２９７７４８も参照されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月15日(2007.2.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）であって、
１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変を含む、部分的なまたは完全な、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムと、
主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、および大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）と
を含むｒＨＭＰＶ。
【請求項２】
前記ｒＨＭＰＶが複製能を有する、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３】
前記組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムが、ポリペプチドをコードする検出可能な異種配列をさらに含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４】
前記検出可能な異種配列がレポーターをコードする、請求項３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項５】
前記レポーターが緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む、請求項４に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項６】
前記検出可能な異種配列が、ＨＭＰＶの転写の遺伝子開始シグナルおよび遺伝子終止シグナルと機能しうる形で連結している、請求項３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項７】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２のＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失、あるいは１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２のＯＲＦの発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項８】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２のＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで機能的なタンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項９】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＳＨ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型ＳＨタンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＳＨ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで配列番号５に示す配列を含むＳＨタンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＧ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型Ｇタンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１２】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＧ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで配列番号６に示す配列を含むＧタンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＳＨおよびＧのＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型ＳＨタンパク質および野生型Ｇタンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＳＨ  ＯＲＦおよびＧ  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１５】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１６】
前記ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの発現を低下または消失させる前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、前記ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの１つまたは複数の潜在的翻訳開始コドンを除去するか、あるいは１つまたは複数のインフレームの終止コドンを前記ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦ中に導入する１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項１５に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１７】
前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、配列番号１に示すｒＨＭＰＶ配列の１つまたは複数の核酸の置換を含む、請求項１６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２−２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含んで野生型Ｍ２−２タンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項１９】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、配列番号１のＭ２−２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２０】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含んで野生型Ｍ２−１タンパク質が産生されないようになっている、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２１】
前記ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの発現を低下または消失させる前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、前記ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの翻訳開始コドンを除去し、さらに前記ｒＨＭＰＶのＭ２−１  ＯＲＦの各読み枠におけるさらなるＡＴＧトリプレットを除去する１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項２０に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のヌクレオチド置換が、配列番号１の１つまたは複数の位置での置換を含む、請求項２１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２３】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶのＭ２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項７に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２４】
前記部分的なまたは完全な欠失が、配列番号１のＭ２  ＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失を含む、請求項２３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変により、前記ｒＨＭＰＶにおいて少なくとも１つの目的とする表現型変化が生じ、前記表現型変化が、少なくとも１つの、細胞培養における増殖特性の変化、哺乳動物宿主の上気道または下気道における増殖特性または毒性の変化、ウイルスのプラークサイズの変化、温度に対する感受性または適応の変化、細胞変性効果の変化、転写またはゲノム複製の効率の変化、インターフェロンに対する感受性の変化、１つまたは複数の遺伝子の発現効率の変化、あるいは免疫原性の変化を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２６】
ウイルス増殖が、対応する野生型ＨＭＰＶ株の増殖と比べて約５０〜１００倍以上弱毒化するように、前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変により、上気道、下気道、またはその両方におけるウイルス増殖の変化が生じる、請求項２５に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２７】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、ｒＨＭＰＶにおけるＭ２−１またはＬタンパク質の１つまたは複数のアミノ酸置換が生じる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項２８】
複製能を有する組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）であって、部分的なまたは完全な組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム、主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、および大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）を含み、前記組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノム中の１つまたは複数の遺伝子またはゲノムセグメントの順番が、野生型ＨＭＰＶと比べて変化するように、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが再構成されているｒＨＭＰＶ。
【請求項２９】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノム中でＳＨ、Ｇ、またはＦ遺伝子またはゲノムセグメントの順番が変化している、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３０】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムのＭ遺伝子の後ろかつＦ遺伝子の前に挿入されたＳＨ遺伝子またはゲノムセグメントおよびＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３１】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムのＭ遺伝子の後ろかつＦ遺伝子の前に挿入された、少なくとも２コピーのＳＨ遺伝子またはゲノムセグメントおよび少なくとも２コピーのＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３２】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＦ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３３】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３４】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＦ遺伝子またはゲノムセグメントおよびＧ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３５】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたＧ遺伝子またはゲノムセグメントおよびＦ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項２８に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３６】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムにおける１つまたは複数のｒＨＭＰＶのＧまたはＦ遺伝子またはゲノムセグメントの１つまたは複数のさらなるコピーの挿入を含む、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３７】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたｒＨＭＰＶのＧ遺伝子またはゲノムセグメント、Ｆ遺伝子またはゲノムセグメント、あるいはその両方の１つまたは複数のさらなるコピーを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３８】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたｒＨＭＰＶのＧ遺伝子またはゲノムセグメントの単一のさらなるコピーを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項３９】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダー配列の後ろかつＮ遺伝子の前に挿入されたｒＨＭＰＶのＦ遺伝子またはゲノムセグメントの単一のさらなるコピーを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４０】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、Ｇ-Ｆの順序でさらなる１コピーのｒＨＭＰＶのＧ遺伝子およびさらなる１コピーのｒＨＭＰＶのＦ遺伝子を含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４１】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、Ｆ−Ｇの順序でさらなる１コピーの組換えＨＭＰＶのＧ遺伝子およびさらなる１コピーの組換えＨＭＰＶのＦ遺伝子を含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４２】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、Ｇ−Ｆ−Ｆの順序ででさらなる１コピーのｒＨＭＰＶのＧ遺伝子またはゲノムセグメントおよびさらなる２コピーのｒＨＭＰＶのＦ遺伝子またはゲノムセグメントを含む、請求項３６に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４３】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、異なるパラミキソウイルスに由来する１つまたは複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントをさらに含んでキメラ組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを形成する、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４４】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、異なるパラミキソウイルスに由来する１つまたは複数のＮ、ＰまたはＭ遺伝子を含む、請求項４３に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４５】
前記パラミキソウイルスがトリメタニューモウイルスを含む、請求項４４に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４６】
前記ｒＨＭＰＶのゲノムまたはアンチゲノムが、異なる亜型のＨＭＰＶに由来する１つまたは複数のｒＨＭＰＶ遺伝子またはゲノムセグメントをさらに含んでキメラ組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを形成する、請求項１に記載のｒＨＭＰＶ。
【請求項４７】
製剤上許容される担体中に、請求項１から４６のいずれか１項に記載の、免疫学的に有効な量の、複製能を有する組換えヒトメタニューモウイルスのいずれか１つを含む免疫原性組成物。
【請求項４８】
ヒトメタニューモウイルスに対して被験者中で免疫応答を誘導する方法での使用のための、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項４９】
１０３〜１０７ＰＦＵの用量で前記組換えヒトメタニューモウイルスを含んでなる、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５０】
上気道への投与のための、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５１】
噴霧、液滴またはエアロゾルの形態である、請求項４７に記載の免疫原性組成物。
【請求項５２】
複製能を有する組換えウイルスであって、パラミキソウイルスゲノムまたはアンチゲノム、主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、およびヒトメタニューモウイルスに由来する１つまたは複数の組換え遺伝子またはゲノムセグメントを含む組換えウイルス。
【請求項５３】
ヒトメタニューモウイルスＦ遺伝子を含む、請求項５２に記載の組換えウイルス。
【請求項５４】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスまたはパラインフルエンザウイルスである、請求項５２に記載の組換えウイルス。
【請求項５５】
機能しうる形で連結した転写プロモーター、部分的なまたは完全な、組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）ゲノムまたはアンチゲノム、および転写終止配列を含む発現ベクター。
【請求項５６】
前記ｒＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムが、１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変を含む、請求項５５に記載の発現ベクター。
【請求項５７】
ヒトメタニューモウイルスの生物学的活性を抑制する抗ウイルス性化合物をスクリーニングする方法であって、
主要なヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオキャプシドリンタンパク質（Ｐ）、大ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）、および異種配列の発現の際に前記生物学的活性と相関するポリペプチドをコードする検出可能な前記異種配列を組み込むように改変した、部分的なまたは完全な、組換えＨＭＰＶゲノムまたはアンチゲノムを含む組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）を用意するステップと、
前記ｒＨＭＰＶを含む試験試料またはＨＭＰＶによる感染を受容する宿主細胞を、ＨＭＰＶの前記生物学的活性を抑制することができる、１つまたは複数の抗ウイルス性作用因子を含むと予想される試験化合物または試験化合物ライブラリーにさらすステップと、
前記試験化合物または試験化合物ライブラリーの不在下で、ｒＨＭＰＶを含む対照試料または適切な制御条件下の宿主細胞を用意するステップと、
前記試験および対照試料中で異種配列を検出して、前記対照試料と比べた前記試験試料での前記生物学的活性の増大または低下を判定して、前記試験試料中の前記抗ウイルス性化合物の有無を判定するステップを含む方法。
【請求項５８】
１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変を含有する組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）ゲノムまたはアンチゲノムを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、１つまたは複数のＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２のＯＲＦの部分的なまたは完全な欠失、あるいは１つまたは複数のＳＨ、Ｇ、Ｍ２−１、Ｍ２−２、またはＭ２遺伝子の発現を低下または消失させる１つまたは複数のヌクレオチド置換を含む、請求項５８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６０】
前記１つまたは複数の弱毒化するヌクレオチド改変が、以下のいずれか：
ｉ）  Ｃ７Ｓ、Ｙ９Ｓ、Ｃ１５Ｓ、Ｎ１６Ｓ、およびＨ２５Ｓからなる群より選択される、Ｃｙｓ３−Ｈｉｓ１モチーフ中の突然変異；
ｉｉ）  Ｆ５２１Ｌ、Ｒ５８８Ａ、Ｄ５８９Ａ、Ｙ９４２Ｈ、Ｌ９９２Ｙ、Ｉ１１０３Ｖ、Ｔ１５５８Ｉ、Ｃ３１９Ｙ、Ｑ８３１Ｌ、Ｍ１１６９Ｖ、Ｄ１１８３Ｅ、Ｄ１１８７Ａ、Ｋ１１８８Ａ、Ｒ１１８９Ａ、Ｅ１１９０Ａ、Ｅ１２０８Ａ、Ｒ１２０９Ａ、Ｙ１３２１Ｎ、Ｈ１６９０Ｙに相当する、Ｌ遺伝子中の突然変異
をもたらす点突然変異である、請求項５８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６１】
組換えヒトメタニューモウイルス（ｒＨＭＰＶ）ゲノムまたはアンチゲノムと、さらにレポーター遺伝子を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【国際調査報告】
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