(57)【要約】  本発明は、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子（ｍｐｔｐＡまたはｍｐｔｐＢ）を含んでおり、活性を有するチロシンホスファターゼを発現させることができない、マイコバクテリア突然変異株を提供する。本発明は、この突然変異株をマイコバクテリウム・テュバキュローシスまたはマイコバクテリウム・ボビスのいずれかから作製する方法を提供する。ｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子は、内部配列を、活性遺伝子の発現を阻害する抗生物質耐性マーカー遺伝子に置き換えることによって改変することができる。さらに、本発明は、マイコバクテリウム突然変異株を作製することに用いることができる、改変されたｍｐｔｐＡまたはｍｐｔｐＢを有する組換えベクターを提供する。本発明は、新しい抗結核剤を開発するための標的候補として用いることができる、マイコバクテリウムの毒性および発病におけるチロシンホスファターゼｍｐｔｐＡまたはｍｐｔｐＢの機能を評価する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５の配列を含んでいるｍｐｔｐＡと、配列番号１６の配列を含んでいるｍｐｔｐＢとから選択される、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子をゲノム中に有するマイコバクテリア突然変異株であって、活性を有するチロシンホスファターゼを発現することができない、マイコバクテリア突然変異株。
【請求項２】
前記マイコバクテリア株は、マイコバクテリウム・テュバキュローシス（M. tuberculosis）とマイコバクテリウム・ボビス（M. bovis）とから成る群から選択される、請求項１記載の株。
【請求項３】
配列番号１５の配列を含んでいる、改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項４】
前記ベクターはｐＡＫΔＡである、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
配列番号１５の配列を含んでいる、改変されたｍｐｔｐＢ遺伝子を有する組換えベクター。
【請求項６】
前記ベクターはｐＢＫΔＢである、請求項５記載の組換えベクター。
【請求項７】
前記改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子は、第１の抗生物質耐性マーカー遺伝子に置き換えられている内部領域を含んでいる、請求項３から請求項６のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項８】
前記抗生物質耐性マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンまたはクロラムフェニコールから選択される抗生物質、好ましくはハイグロマイシン、への耐性を与える、請求項７記載の組換えベクター。
【請求項９】
バックボーンに挿入されている第２の抗生物質マーカー遺伝子をさらに有する、請求項３から請求項６のいずれかに記載の組換えベクター。
【請求項１０】
前記第２の抗生物質マーカー遺伝子は、カナマイシンまたはゲンタマイシンから選択される抗生物質への耐性を与える、請求項９記載の組換えベクター。
【請求項１１】
配列番号１５の配列を含んでおり、かつ、改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子を表す、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２】
配列番号１６の配列を含んでおり、かつ、改変されたｍｐｔｐＢ遺伝子を表す、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３】
改変されたチロシンホスファターゼをゲノム中に有するマイコバクテリア突然変異株を作製する方法であって、
（ａ）マイコバクテリア株からゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
（ｂ）設計したプライマーを用いて、ステップ（ａ）の前記ゲノムＤＮＡからチロシンホスファターゼ遺伝子とフランキング配列とを増幅して、ＤＮＡ断片を得るステップと、
（ｃ）シークエンシングと制限酵素消化分析とによって、ステップ（ｂ）の前記断片を特性分析するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の前記断片を非複製型ベクターにクローニングするステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の前記非複製型ベクターにおける前記断片を、挿入、欠失、変異、または置換から選択されるステップを実行することによって、改変するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の前記断片内に第１の抗生物質耐性マーカー遺伝子を挿入して、配列番号１５の配列を含んでいるｍｐｔｐＡ、または、配列番号１６を含んでいるｍｐｔｐＢから選択される、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子を有する非複製型ベクターを得るステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の前記非複製型ベクターのバックボーンに第２の抗生物質耐性マーカー遺伝子をクローニングして、組換えベクターを得るステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）の前記組換えベクターをマイコバクテリア株に導入するステップと、
（ｉ）前記第１の抗生物質耐性マーカー遺伝子を使用して、一次組換えマイコバクテリア株を選択するステップと、
（ｊ）前記第１の抗生物質耐性マーカー遺伝子を含んでいる、ステップ（ｉ）の前記一次組換えマイコバクテリア株を培養するステップと、
（ｋ）前記ベクターバックボーン内に存在する前記第２の抗生物質耐性遺伝子への感受性を持つ、ステップ（ｊ）の二次組換えマイコバクテリア株を選択するステップと、
（ｌ）ステップ（ｋ）の前記二次組換えマイコバクテリウム株を培養して、活性化マクロファージおよび動物個体中で阻害された成長を示す前記改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子を含んでいる前記組換えマイコバクテリウム株を得るステップと、
を含んでいる方法。
【請求項１４】
前記マイコバクテリアの種は、マイコバクテリウム・テュバキュローシス（M. tuberculosis）とマイコバクテリウム・ボビス（M. bovis）とから成る群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ｂ）において、設計された前記プライマーは、ｍｐｔｐＡとそのフランキング領域を増幅する場合には配列番号１から配列番号４の配列のいずれかから選択され、ｍｐｔｐＢとそのフランキング領域を増幅する場合には配列番号５から配列番号８の配列のいずれかから選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記チロシンホスファターゼ遺伝子は、配列番号１１のｍｐｔｐＡ遺伝子である、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記チロシンホスファターゼ遺伝子は、配列番号１２のｍｐｔｐＢ遺伝子である、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
前記ステップ（ｂ）において、前記ＤＮＡ断片は、配列番号１３の配列を含んでいる配列である、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ（ｂ）において、前記ＤＮＡ断片は、配列番号１４の配列を含んでいる配列である、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の抗生物質耐性マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンまたはクロラムフェニコールから選択される抗生物質、好ましくはハイグロマイシン、への耐性を与える、請求項１３記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の抗生物質耐性マーカー遺伝子は、抗生物質カナマイシンへの耐性を与える、請求項１３記載の方法。
【請求項２２】
前記組換えベクターはｐＡＫΔＡである、請求項１３記載の方法。
【請求項２３】
前記組換えベクターはｐＢＫΔＢである、請求項１３記載の方法。
【請求項２４】
前記ベクターは、エレクトロポレーションによって、またはファージを通じて導入される、請求項１３記載の方法。
【請求項２５】
前記一次組換えマイコバクテリア株は、ハイグロマイシンまたはクロラムフェニコールから選択される抗生物質を使用することよって選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項２６】
前記ステップ（ｋ）における前記二次組換えマイコバクテリア株は、ハイグロマイシンまたはクロラムフェニコールには耐性を持つが、前記第２の抗生物質カナマイシンには感受性を持つ、請求項１３記載の方法。
【請求項２７】
配列番号１から配列番号４のいずれかから選択されるｍｐｔｐＡ遺伝子とフランキング領域とを増幅するようにされているプライマー配列。
【請求項２８】
配列番号５から配列番号８のいずれかから選択されるｍｐｔｐＢ遺伝子とフランキング領域とを増幅するようにされているプライマー配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、活性を有するチロシンホスファターゼを発現することができず、活性化マクロファージ内および動物個体内における生存能力が阻害された、弱毒化されたマイコバクテリア突然変異株を提供する。また、本発明は、ゲノム中のチロシンホスファターゼ遺伝子が改変されているマイコバクテリア突然変異株を作製する方法も提供する。また、本発明は、マイコバクテリアの毒性および発病に関するチロシンホスファターゼの役割を評価する方法を提供し、これらが新しい抗結核剤を開発するための標的候補であることを明らかにする。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口の三分の一は、無症候に結核菌マイコバクテリウム・テュバキュローシス（M. tuberculosis）に感染している。毎年８００万人が新たに発病し、毎年３００万人がこの病気で死亡している（非特許文献１３）。ＨＩＶが出現し、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの多剤耐性株が出現したことによって、この問題は複雑になっている（非特許文献１８；非特許文献６；非特許文献１１）。この病気の現在の治療では、通常、イソニアジド、ピラジナミド、リファンピシン、およびエタンブトールを用いた併用化学療法を行う。一般的に、有効な治療には６ヶ月の期間が必要であるため、患者が治療指示に従わなくなることがしばしばあり、気分が回復し始めた時点で投薬を中止してしまう。このことは、細菌の薬剤耐性形態の発生につながり、これらは通常の薬物療法において生き残ることができる。多剤耐性結核（ＭＤＲ−ＴＢ）は、少なくともイソニアジドおよびリファンピシン（これらは最も強力な２つの抗結核剤である）に対して抵抗性を持つ結核菌に起因する病気と定義されている。治療方法がこのように不確実であるため、新しい標的に作用することができ、かつ患者においてこれらの薬剤への耐性が確立されないように比較的短期間に効果を発揮できる新しい薬剤の開発が求められている。本発明は、そのような標的に特異的で短期間の治療に有用な抗結核剤の開発につなげることができる。
【０００３】
様々な原核生物の塩基配列を解析することにより、病原菌には真核生物と同様のセリン／スレオニンホスファターゼおよびチロシンホスファターゼが存在することが示されている。仮性結核菌エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）、ネズミチフス菌サルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、腸管病原性大腸菌などの様々な病原菌において、チロシンホスファターゼが主たる毒性決定因子として作用することが示されている（Guan and Dixon, 1990；Galyov et al., 1993；非特許文献２０）。
【０００４】
プロテインチロシンホスファターゼの１つであるＹｏｐＨは、エルシニア菌の毒性プラスミドにコードされ、基本的な毒性因子だと考えられている（非特許文献１０）。ＹｏｐＨは、分泌、転座、およびシャペロン結合に関与するアミノ末端配列、プロリンの豊富な中央のＳＨ３結合ドメイン、真核生物のプロテインチロシンホスファターゼのドメインに相同なカルボキシル末端触媒ドメイン、を含むいくつかのドメインを有する（非特許文献３５）。ＹｏｐＨはＦｃ受容体媒介性食作用および補体媒介性食作用の両方を阻害するため、ＹｏｐＨは一般的な食作用機構を破壊するとされている（非特許文献３１；非特許文献１４）。第１および第２のＹｏｐＨ基質であるｐ１３０ｃａｓおよびパキシリンは、インテグリンをアクチン細胞骨格に結合するときに関与するタンパク質であり、第３のＹｏｐＨ基質は、チロシンキナーゼである（非特許文献２７；非特許文献８）。ＹｏｐＨタンパク質の役割として考えられるのは、細菌性外膜タンパク質インベイシンと細胞のβ１インテグリンとの相互作用によって仲介される細菌の取り込みを、ＹｏｐＨプロテインが阻害することである。このモデルによると、インベイシンの結合は、細胞内の標的に対するチロシンリン酸化を行うよう刺激し、その結果、細胞骨格が再構築され、細菌が取り込まれることになる。ＹｏｐＨは、この活動に必要なタンパク質を脱リン酸化する。最近の研究では、ＹｏｐＨは、マクロファージ内のＡｋｔ経路およびホスファチジルイノシトール３キナーゼ依存性のインターロイキン２の分泌も抑制することが示されている（非特許文献３４）。
【０００５】
サルモネラ・ティフィムリウムは、モジュラードメインを有するチロシンホスファターゼＳｐｔＰをコードしている。ＳｐｔＰのアミノ末端は、緑膿菌シュードモナス・エルギノーザ（P. aeruginosa）由来のエキソトキシンＳ（Exotoxin S）およびエルシニア菌（Yersinia spp.）由来のＹｏｐＥと配列相同性を示す。エキソトキシンＳは、シュードモナス・エルギノーザが宿主細胞を損傷させるときに用いるＡＤＰリボシルトランスフェラーゼであり、シュードモナス・エルギノーザの毒性因子として知られている。ＳｐｔＰのカルボキシル末端は、真核生物のプロテインチロシンホスファターゼと相同性を示す。ＳｐｔＰプロテインのカルボキシル末端は、ＹｏｐＨ、および真核生物のプロテインチロシンホスファターゼの触媒ドメインと相同である。４８１番目のシステイン残基は、その触媒活性に必須であり、この保存されたシステイン残基に変異が生じると、ホスファターゼ活性が消失してしまう（非特許文献２０）。Kanigaらは、ｓｐｔＰ突然変異体は、経口感染したＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓で定着することができないことを示した。ＳｐｔＰは、細胞骨格のダイナミクスにおいて重要な役割を果たす２つの宿主ＧＴＰ結合タンパク質、Ｒａｃ−１およびＣｄｃ４２に対して、ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）の活性を有することがin vitroで示されている（非特許文献１５）。ＳｐｔＰのＧＡＰ活性は、サルモネラ菌の侵入後にアクチン細胞骨格を再構築する、Ｃｄｃ４２およびＲａｃを通じたシグナリングを抑制できることが示唆されている。FuとGalanは、精製したＧＳＴ−ＳｐｔＰを培養細胞に微量注入すると、アクチン細胞骨格が破壊され、ストレスファイバーが消失することを示している（非特許文献１５）。
【０００６】
先行技術：
相同組換えによる対立遺伝子交換は、遺伝子機能、毒性因子の特定、および栄養要求性突然変異体の開発を研究するための強力なツールである。「遺伝子ノックアウト」法は、野生型遺伝子を非機能的な対応遺伝子に置き換える。そのような標的突然変異は、哺乳類、真核生物、および細菌の細胞における遺伝子機能を研究するのに広く用いられている（非特許文献１６；非特許文献２４；非特許文献２９；非特許文献７；非特許文献４；非特許文献３；非特許文献２；非特許文献１７；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献５；非特許文献２８）。
【０００７】
マイコバクテリウム・テュバキュローシスのゲノムの塩基配列を解析することで、１１のセリン／スレオニンキナーゼと２つのチロシンホスファターゼの存在が明らかになった（非特許文献１２）。既知のチロシンホスファターゼと相同の配列を有する２つの遺伝子は、遺伝子に特異的なプライマーとマイコバクテリウム・テュバキュローシスのゲノムＤＮＡとを使用することでＰＣＲ増幅され、原核生物発現ベクターｐＧＥＸ５ｘ−３にクローニングされ、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌から精製された（非特許文献２１）。このＧＳＴ融合タンパク質は、ミエリン塩基性タンパク質のホスホチロシン残基を脱リン酸化することができたが、ミエリン塩基性タンパク質のホスホセリン残基とホスホスレオニン残基を脱リン酸化することはできなかった。触媒モチーフにおけるシステイン残基の特定部位突然変異誘発によって（ＭｐｔｐＡの場合には１１番目のシステイン、ＭｐｔｐＢの場合には１６０番目のシステイン）酵素活性が阻害された（非特許文献２１）。サザンブロット分析によって、ｍｐｔｐＡは、マイコバクテリア属の成長の速い種および成長の遅い種に存在することが明らかになった。しかしながら、ｍｐｔｐＢは、成長の遅い種には存在していたが、成長の速い種であるマイコバクテリウム・スメグマティス（M. smegmatis）には存在しないことが判明した（非特許文献２１）。本発明は、マイコバクテリアの毒性および発症に関するチロシンホスファターゼの役割が知られていないため、着手されたものである。
【非特許文献１】Andersson, K., Carballeira, N., Magnusson, K. E., Persson, C., Stendahl, O., Wolf-Watz, H. and Fallman, M. (1996) YopH of Yersinia pseudotuberculosisinterrupts early phosphotyrosine signaling associated with phagocytosis. Mol. Microbiol20: 1057-1069.
【非特許文献２】Azad, A. K., Sirakova, T. D., Fernandes, N. D. and Kolattukudy, P. E. (1997) Gene knockout reveals a novel gene cluster for the synthesis of a class of cell wall lipids unique to pathogenic mycobacteria. J Biol Chem 272: 16741-16745.
【非特許文献３】Azad, A. K., Sirakova, T. D., Rogers, L. M. and Kolattukudy, P. E. (1996) Targeted replacement of the mycocerosic acid synthase gene in Mycobacterium bovisBCG produces a mutant that lacks mycosides. Proc Natl Acad Sci93: 4787-4792.
【非特許文献４】Balasubramanian, V., Pavelka, M. S., Bardarov, S. S., Martin, J., Weisbrod, T. R., McAdam, R. A., Bloom, B. R. and Jacobs, W. R. Jr. (1996) Allelic exchange in Mycobacterium tuberculosis with long linear recombination substrates. J Bacteriol 178: 272-279.
【非特許文献５】Bardarov, S., Kriakov, J., Carriere, C., Yu, S., Vasmonde, C., Adam, R. M., Bloom, B. R., Haffull, G. F. and Jacobs, W. R. Jr. (1997) Conditionally replicating mycobacteriophages: a system for transposon delivery to Mycobacterium tuberculosis. Proc Natl AcadSci 94 : 10961-10966.
【非特許文献６】Barnes, P. F., Bloch, A. B., Davidson, P. T. and Snider, D. E. (1991) Tuberculosis in patients with human immunodeficiency virus infection. N. Eng. J. Med. 324: 1644-1650.
【非特許文献７】Baulard, A., Kremer, L. and Locht, C. (1996) Efficient homologous recombination in fast growing and slow growing mycobacteria. J Bacteriol 178: 3091-3098.
【非特許文献８】Black, D. S., and Bliska, J. B. (1997) Identification of p130cas as a substrate of Yersinia YopH (Yop51), a bacterial protein tyrosine phosphatase that translocates into mammalian cells and targets focal adhesions. EMBO J 16: 2730-2744.
【非特許文献９】Bliska, J. B. and Black, D. S. (1995) Inhibition of the Fc receptor-mediated oxidative burst in macrophages by the Yersinia pseudotuberculosis tyrosine phosphatase. Infect Immun 63: 681-685.
【非特許文献１０】Bliska, J. B., Guan, K., Dixon, J. E. and Falkow, S. (1991) Tyrosine phosphatasehydrolysis of host proteins by an essential Yersiniavirulence determinant. Proc Natl AcadSci 88: 1187-1191.
【非特許文献１１】Bloch, A. B., G. M. Cauthen, G. M. Onorato, K. G. Dansbury, G. D. Kelly, C. R. Driver and D. E. Snider (1994) Nation-wide survey of dug resistant tuberculosis in the United   States. J. Am. Med. Assn. 271: 665-671.
【非特許文献１２】Cole, S. T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T. , Churcher, C., Harris, D., Gordon, S. V., Eiglmeier, K., Gas, S., Barry, C. E., Tekaia, F. , Badcock, K., Basham, D., Brown, D., Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R., Devlin, K., Feltwell, T. , Gentles, S., Hamlin, N., Holroyd, S., Hornsby, T., Jagels, K., Krogh, A., McLean, J., Moule, S., Murphy, L., Oliver, K., Osborne, J., Quail, M. A., Rajandream, M. A., Rogers, J., Rutter, S., Seeger, K., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Sulston, J. E., Taylor, K., Whitehead, S. and Barrel, B. G. (1998) Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544.
【非特許文献１３】Dye, C., Scheele, S., Dolin, P., Pathania, V., and Ravglione, R. C. (1999) Global burden of tuberculosis-estimated incidence, prevalence, and mortality by country. J. Am. Med. Assn. 282: 677-686.
【非特許文献１４】Fallman, M., Andersson, K., Hakansson, S., Magnusson, K. E., Stendahl, 0., and Wolf-Watz, H. (1995) Yersiniapseudotuberculosis inhibits Fcreceptor mediated phagocytosis in J774 cells. Infect Immun63: 3117-3124.
【非特許文献１５】Fu, Y., and Galan, J. E. (1999) A Salmonella protein antagonizes Rac-1 and Cdc42 to mediate host-cell recovery after bacterial invasion. Nature 401: 293- 297.
【非特許文献１６】Guilhot, C., Gicquel, B. and Martin, C. (1992) Temperature sensitive mutants of the Mycobacterium plasmid pAL5000. FEMS Microbiol Lett98: 181-186.
【非特許文献１７】Hinds, J., Mahenthiralingam, E., Kempsell, K. E., Duncan, K., Stokes, R. W., Parish, T., and Stoker, N. G. (1999) Enhanced gene replacement in mycobacteria. Microbiology 145: 519-527.
【非特許文献１８】Horsburgh, C. R. (1991). Mycobacterium avium complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome N. Eng. J. Med. 324: 1332-1338.
【非特許文献１９】Jayashankar, K. and Ramanathan, V. D. (1999) Biochemical and histochemical changes relating to fibrosis following infection with Mycobacterium tuberculosis in the guinea pig. Indian J Med Res 110: 91-97.
【非特許文献２０】Kaniga, K., Uralil, J., Bliska, J. B. , and Galan, J. E. (1996) A secreted tyrosine phosphatase with modular effectordomains in bacterial pathogen Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol 21: 633-641.
【非特許文献２１】Koul, A., Choidas, A., Treder, M., Tyagi, A. K., Drlica, K., Singh, Y. , and Ullrich, A. (2000) Cloning and characterization of secretorytyrosine phosphatase of Mycobacterium tuberculosis. J. Bacteriol182: 5425-5432.
【非特許文献２２】Mandel, M. and Higa, A. (1970) Calcium dependent bacteriophage infection. J Mol Biol 53: 159-162.
【非特許文献２３】Mitchison, D. A. (1964) The virulence of tubercle bacilli from patients with pulmonary tuberculosis in Indiaand other countries. Bull Int Union Against Tuberculosis 35: 287.
【非特許文献２４】Myers, R. S., and Stahl, F. W. (1994) Chi and RecBCD enzymes of Escherichia Coli. Annu Rev Genet. 28: 49-70.
【非特許文献２５】Parish, T., Gordon, B. G., McAdam, R. A., Duncan, K., Mizrahi, V. and Stoker, N. G. (1999) Production of mutants in amino acid biosynthetic genes of Mycobacterium tuberculosis by homologous recombination. Microbiology 145: 3497-3503.
【非特許文献２６】Pelicic, V., Jackson, M., Reyrat, J. M., Jacobs, W. R., Gicquel, B. and Guilhot, C. (1997) Efficient allelic exchange and transposon mutagenesis in Mycobacterium tuberculosis. Proc NatlAcad Sci 94: 10955-10960.
【非特許文献２７】Persson, C., Carballeira, N., Wolf-Watz, H. and Fallman, M. (1997) The PTPase YopHinhibits uptake of Yersinia, Tyrosine phosphorylation of p130CaS and FAK, and the associated accumulation of these proteins in peripheral focal adhesions. EMBO J 16: 2307-2318.
【非特許文献２８】Raynaud, C., Guilhot, C., Rauzier, Y., Bordat, Y., Pelicic, V., Manganelli, R., Smith, I., Gicquel, B. and Jackson, M. (2002) Phospholipases C are involved in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol45: 203-217.
【非特許文献２９】Reyrat, J. M., Berthet, F. X. and Gicquel, B. (1995) The ureaselocus of Mycobacterium tuberculosis and its utilization for the demonstration of allelic exchange in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin. Proc Natl Acad Sci 92: 8768-8772.
【非特許文献３０】Riley, M. and Labedan, B. (1997) Protein evolution viewed through Escherichia Coli protein sequences: introduction of the notion of a structural segment of homology, the module. J Mol Biol 268: 857-868.
【非特許文献３１】Ruckdeschel, K. A., Roggenkamp, A., Schubert, S. and Heesemann, J. (1996) Differential contribution of Yersinia enterolitica virulence factors to evasion of microbicidal action of neutrophils. Infect Immun 64: 724-733.
【非特許文献３２】Sambandamurthy, V. K., Wang, X., Chen, B., Russell, R. G., Derrick, S., Collins, F. M., Morris, S. L. and Jacobs, W. R. (2002) A pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis is highly attenuated and protects mice against tuberculosis. Nature Medicine 8: 1171-1174.
【非特許文献３３】Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. In a laboratory manual. Cold Spring HarbourLaboratory Press, Cold Spring Harbour, NY.
【非特許文献３４】Sauvonnet, N., Lambermont, I., Vari der Bruggen, P. and Cornelis, G. R. (2002) YopHinhibits monocyte chemoattractantprotein 1 expression in macrophages and T-cell proliferation through inactivation of the phosphatidylinositol 3-kinase pathway. Mol Microbiol 45: 805-815.
【非特許文献３５】Sory, Mi. P., Boland, A., Lambermont, I. and Cornelis, G. R. (1995) Identification of the YopE and YopH domains required for secretion and internalization into the cytosol of macrophages using the cyaA gene fusion approach. Proc NatlAcad Sci 92: 11998-12002.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の主たる目的は、ゲノム中のチロシンホスファターゼが改変されているマイコバクテリア株であって、活性を有するチロシンホスファターゼを発現することができないマイコバクテリア株を作製することである。マイコバクテリアの種は、マイコバクテリウム・テュバキュローシスとマイコバクテリウム・ボビス（M. bovis）とから成る群から選択される。
【０００９】
本発明の別の目的は、マイコバクテリア、特にマイコバクテリウム・テュバキュローシスの毒性および発病におけるチロシンホスファターゼの役割を評価する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ＭｐｔｐＡに関連付けられるチロシンホスファターゼ活性を持たない、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの突然変異株を作製することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、ＭｐｔｐＢに関連付けられるチロシンホスファターゼ活性を持たない、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの突然変異株を作製することである。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、ｍｐｔｐＡ遺伝子とそのフランキング領域とを含む組換えベクターであって、ｍｐｔｐＡの内部領域がハイグロマイシン耐性遺伝子に置き換えられている組換えベクターを構築することである。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、ベクターバックボーンに第２の抗生物質耐性マーカー、特にカナマイシン耐性マーカーを挿入し、組換えベクターｐＡＫΔＡを得ることである。
【００１４】
本発明の別の目的は、ｍｐｔｐＢ遺伝子とそのフランキング領域とを含む組換えベクターであって、ｍｐｔｐＢの内部領域がハイグロマイシンへの耐性遺伝子に置き換えられている組換えベクターを構築することである。
【００１５】
本発明のさらに別の目的は、ベクターバックボーンに第２の抗生物質耐性マーカー、特にカナマイシン耐性マーカーを挿入し、組換えベクターｐＢＫΔＢを得ることである。
【００１６】
本発明の別の目的は、アルカリ変性させたベクターｐＡＫΔＡを使用し、相同組換えによって、マイコバクテリア株のゲノム中のｍｐｔｐＡを改変することである。
【００１７】
本発明の別の目的は、マイコバクテリアのｍｐｔｐＡ突然変異株のゲノムにおいて、ｍｐｔｐＡをコードする遺伝子が改変されていることを、サザンブロット分析および免疫ブロット分析によって確認することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、活性化マクロファージ中のマイコバクテリアの生存におけるＭｐｔｐＡの役割を評価することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、動物個体中のマイコバクテリアの生存におけるＭｐｔｐＡの役割を評価することであり、ＭｐｔｐＡを新しい抗結核剤を開発するうえでの標的候補とすることができる。
【００２０】
本発明の別の目的は、紫外線照射したベクターｐＢＫΔＢを使用し、相同組換えによって、マイコバクテリアのゲノム中のｍｐｔｐＢを改変することである。
【００２１】
本発明の別の目的は、ｍｐｔｐＢ突然変異株のゲノムにおいて、ｍｐｔｐＢをコードする遺伝子が改変されていることを、サザンブロット分析および免疫ブロット分析によって確認することである。
【００２２】
本発明の別の目的は、活性化マクロファージ中のマイコバクテリアの生存におけるＭｐｔｐＢの役割を評価することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、動物中のマイコバクテリアの生存におけるＭｐｔｐＢの役割を評価することであり、ＭｐｔｐＢを新しい抗結核剤を開発するうえでの標的候補とすることができる。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子を有する、弱毒化されたマイコバクテリア突然変異株であって、活性を有するチロシンホスファターゼを発現することのできない、マイコバクテリア突然変異株に関する。本発明は、特に、マイコバクテリウム・テュバキュローシスおよびマイコバクテリウム・ボビスの突然変異株を提供する。
【００２５】
本発明は、２つのチロシンホスファターゼ遺伝子ｍｐｔｐＡおよびｍｐｔｐＢと、マイコバクテリアの毒性および発病におけるプロテインチロシンホスファターゼの役割とに関する。
【００２６】
また、本発明は、新しい抗結核剤の開発の標的候補としての２つのマイコバクテリアチロシンホスファターゼ（ＭｐｔｐＡおよびＭｐｔｐＢ）にも関する。
【００２７】
さらに、本発明は、ゲノムにおいてチロシンホスファターゼ遺伝子が改変されており、チロシンホスファターゼ遺伝子の活性を有する産物を発現することのできない弱毒化されたマイコバクテリア突然変異株を作製する方法を提供する。さらに、本発明は、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子（ｍｐｔｐＡまたはｍｐｔｐＢ）を有する組換えベクターを提供する。
【００２８】
さらに、組換えベクターは、ｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子の中に、一次組換えマイコバクテリアの選択に有用な、選択マーカーを含んでいる。
【００２９】
さらに、組換えベクターｐＡＫΔＡまたはｐＢＫΔＢを得るために、ベクターのバックボーンに第２の抗生物質耐性マーカーが挿入されている。
【００３０】
さらに、組換えベクターを使用して、マイコバクテリアの突然変異株を作製することができる。この場合、相同組換えを使用して、マイコバクテリアの野生型株の活性を有するチロシンホスファターゼ遺伝子を、二重交差法（double cross-over event）によって、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子に置き換えることができる。
【００３１】
さらに、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子の中の抗生物質耐性マーカーの存在によって、マイコバクテリアの突然変異株を選択することができる。
【００３２】
さらに、本発明は、マイコバクテリア、特に、マイコバクテリウム・テュバキュローシスおよびマイコバクテリウム・ボビスの突然変異株を作製するために使用することができる。
【００３３】
さらに、本発明は、マイコバクテリア、特にマイコバクテリウム・テュバキュローシスの毒性および発病におけるチロシンホスファターゼの役割を評価する方法を提供する。さらに、改変されたチロシンホスファターゼを有するマイコバクテリアの突然変異株は、活性化マクロファージおよび動物個体中での低い生存率を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明は、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子をゲノム中に有するマイコバクテリア株であって、活性を有するチロシンホスファターゼを発現させることができないマイコバクテリア株を提供する。さらに、マイコバクテリアの種は、マイコバクテリウム・テュバキュローシスとマイコバクテリウム・ボビスとから成る群から選択される。
【００３５】
本発明は、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子が、改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子のいずれかである、マイコバクテリア株を提供する。改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子は配列番号１５に示してあるとおりであり、改変されたｍｐｔｐＢ遺伝子は配列番号１６に示してあるとおりである。
【００３６】
本発明は、改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子を有する組換えベクターをさらに提供する。さらに、構築される組換えベクターは、ｐＡＫΔＡまたはｐＢＫΔＢのいずれかである。
【００３７】
本発明の別の側面は、配列番号１１に示されているｍｐｔｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列が改変されている組換えベクターに関する。
【００３８】
さらに、本発明は、配列番号１２に示されているｍｐｔｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列が改変されている組換えベクターに関する。
【００３９】
本発明は、ｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子が、挿入、欠失、変異、または置換によって改変されている組換えベクターを提供する。
【００４０】
さらに、本発明は、具体的には、ｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子がその内部領域を選択に使用することのできる抗生物質耐性マーカー遺伝子に置き換えることによって改変されている組換えベクターを提供する。
【００４１】
本発明の別の側面は、抗生物質耐性マーカー遺伝子によって、ハイグロマイシンまたはクロラムフェニコール（好ましくはハイグロマイシン）への耐性が与えられる組換えベクターを提供する。
【００４２】
さらに、本発明は、カナマイシン耐性の第２の抗生物質マーカー遺伝子がバックボーンに含まれている組換えベクターを提供する。
【００４３】
本発明は、チロシンホスファターゼ遺伝子の野生型の核酸配列と改変された形態の両方を提供する。本発明は、配列番号１１に示されているマイコバクテリアチロシンホスファターゼＡをコードするｍｐｔｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列と、配列番号１５に示されている改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列とを提供する。本発明は、配列番号１２に示されているマイコバクテリアチロシンホスファターゼＢをコードするｍｐｔｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列と、配列番号１６に示されている改変されたｍｐｔｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列とを提供する。
【００４４】
本発明の別の実施形態は、ゲノム中に改変されたチロシンホスファターゼを有するマイコバクテリア突然変異株を作製する方法であって、
（ａ）マイコバクテリア株からゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
（ｂ）ＤＮＡ断片を得るために、特異的なプライマーを使用してステップ（ａ）のゲノムＤＮＡからチロシンホスファターゼ遺伝子とそのフランキング配列とを増幅するステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の断片を特性分析するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）の断片を非複製型ベクターにクローニングするステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）の非複製型ベクター中の断片を改変するステップと、
（ｆ）ステップ（ｅ）の断片内に抗生物質耐性マーカー遺伝子を挿入して、改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子を含んだ非複製型ベクターを得るステップと、
（ｇ）ステップ（ｆ）の非複製型ベクターバックボーンに第２の抗生物質耐性マーカー遺伝子をクローニングして、組換えベクターを得るステップと、
（ｈ）ステップ（ｇ）の組換えベクターをマイコバクテリア株に導入するステップと、
（ｉ）第１の抗生物質選択マーカー遺伝子を使用して、一次組換えマイコバクテリア株を選択するステップと、
（ｊ）第１の抗生物質耐性マーカー遺伝子を含んでいる、ステップ（ｉ）の一次組換えマイコバクテリア株を培養するステップと、
（ｋ）ベクターバックボーン内に存在する第２の抗生物質耐性遺伝子への感受性を持つ、ステップ（ｊ）の二次組換えマイコバクテリア株を選択するステップと、
（ｌ）ステップ（ｋ）の二次組換えマイコバクテリア株を培養するステップであって、組換えマイコバクテリア株が、活性化マクロファージおよび動物個体中で不完全な成長を示す改変されたチロシンホスファターゼ遺伝子を含んでいる、ステップと、
を含んでいる方法に関する。
【００４５】
さらに、本発明は、マイコバクテリアの種がマイコバクテリウム・テュバキュローシスとマイコバクテリウム・ボビスとから成る群から選択される方法を提供する。本発明の別の側面は、特異的なプライマーが、ｍｐｔｐＡとフランキング領域を増幅する場合には配列番号１から配列番号４の配列から成る群から選択され、ｍｐｔｐＢとフランキング領域を増幅する場合には配列番号５から配列番号８の配列から成る群から選択される、方法を提供する。
【００４６】
本発明は、ｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子が、挿入、欠失、変異、または置換によって、具体的には、ｍｐｔｐＡ遺伝子またはｍｐｔｐＢ遺伝子の内部領域を抗生物質耐性マーカー遺伝子、好ましくはハイグロマイシン耐性遺伝子に置き換えることによって改変される、方法をさらに提供する。
【００４７】
本発明は、カナマイシンへの耐性を与える第２の抗生物質マーカー遺伝子が、組換えベクターのバックボーンに挿入される、方法を提供する。
【００４８】
本発明のさらに別の側面は、組換えベクターｐＡＫΔＡまたはｐＢＫΔＢのいずれかを使用して、マイコバクテリアのゲノム中のチロシンホスファターゼ遺伝子を改変することである。
【００４９】
本発明は、相同組換えを使用して、マイコバクテリアの活性を有するチロシンホスファターゼ遺伝子を二重交差法によって改変された遺伝子に置き換えて、マイコバクテリア突然変異株を作製する、方法をさらに提供する。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、活性化マクロファージおよび動物個体中のマイコバクテリアの毒性および発病におけるＭｐｔｐＡおよびＭｐｔｐＢの役割を評価することである。
【００５１】
さらに、本発明は、マイコバクテリア突然変異株が弱毒化され、活性化マクロファージ中および動物個体中で生存する能力が阻害されていることを示す。
【００５２】
さらに、本発明は、抗結核剤の開発の標的候補である、マイコバクテリアの２つのチロシンホスファターゼＭｐｔｐＡおよびＭｐｔｐＢに関する。
【００５３】
（Ａ）組換えベクターｐＡＫΔＡの構築
ＭｐｔｐＡに関連するチロシンホスファターゼを欠失している突然変異株を使用して、マウスのマクロファージ中のマイコバクテリウム・テュバキュローシスの生存におけるプロテインチロシンホスファターゼの役割と、この突然変異体がモルモットに病気を引き起こす能力におけるプロテインチロシンホスファターゼの役割とを調べた。
【００５４】
野生型のチロシンホスファターゼ遺伝子を改変して、マイコバクテリアの突然変異株を作製した。マイコバクテリアのゲノムは、２つのチロシンホスファターゼＭｐｔｐＡおよびＭｐｔｐＢについてコードしている。実施例３に示すＣＴＡＢ標準方法を用いてマイコバクテリア株からゲノムＤＮＡを抽出した。表１および実施例４に示す特異的なプライマーを使用して、ゲノムからｍｐｔｐＡ遺伝子を増幅した。
【００５５】
マイコバクテリウム・テュバキュローシスのゲノム配列に基づいて、ｍｐｔｐＡ（配列番号１１）とその上流および下流のフランキング領域とを増幅するためのプライマーを設計した。マイコバクテリウム・テュバキュローシスＤＮＡをテンプレートとして、ｍｐｔｐＡのＯＲＦの上流１１３５ｂｐとｍｐｔｐＡのＯＲＦの最初の１５６ｂｐとを含むＤＮＡ断片を、プライマーＡ（配列番号１）と、５'末端にＮｄｅＩサイトを含むプライマーＢ（配列番号２）を用いて増幅した。アンプリコンを末端修復し、ＥｃｏＲＶで消化したベクターｐＬｉｔｍｕｓ−３８に挿入し、ベクターｐＬｉｔＡ１を得た。実施例５に示すように、ライゲーション産物で大腸菌を形質転換させた。実施例６に示すように、形質転換体からプラスミドを分離した。実施例７に示すように、制限酵素消化によって組換え体を処理した。
【００５６】
ＭｐｔｐＡのＣ末端領域に対応するｍｐｔｐＡのＯＲＦの１６７ｂｐと、ｍｐｔｐＡのＯＲＦの下流１２４０ｂｐとを含む別のＤＮＡ断片を、遺伝子に特異的なプライマーである５'末端にＮｄｅＩサイトを含むプライマーＣ（配列番号３）と、５'末端にＢｓｐＨＩサイトを含むプライマーＤ（配列番号４）とを使用することによって、ＰＣＲ増幅した。アンプリコンを末端修復し、ＥｃｏＲＶで消化したベクターｐＬｉｔｍｕｓ−３８に挿入し、ベクターｐＬｉｔＡ２を得た。ベクターｐＬｉｔＡ１をＮｄｅＩおよびＳｃａＩで消化し、ｍｐｔｐＡのＯＲＦの最初の１５６ｂｐとｍｐｔｐＡのＯＲＦの上流１１３５ｂｐとを含む大きい方のＤＮＡ断片を、実施例８および実施例９に示すように標準的な方法でゲル精製した。同様に、ベクターｐＬｉｔＡ２をＮｄｅＩおよびＳｃａＩで消化し、ＭｐｔｐＡのＣ末端領域に対応するｍｐｔｐＡのＯＲＦの１６７ｂｐと、ｍｐｔｐＡのＯＲＦの下流１２４０ｂｐとを含む小さい方のＤＮＡ断片をゲル精製した。次いで、ｐＬｉｔＡ１の消化によって得られた大きな断片と、ｐＬｉｔＡ２の消化によって得られた小さな断片とをライゲートし、ｐＬｉｔΔＡを得た。ｍｐｔｐＡに特異的なプライマーであるプライマーＢ（配列番号２）およびプライマーＣ（配列番号４）は、重複していなかったので、その結果、ベクターｐＬｉｔΔＡには、ＯＲＦの中央領域１１２ｂｐが欠失しているｍｐｔｐＡのコード領域が含まれていた。ベクターｐＬｉｔΔＡは、配列番号１３に示すヌクレオチド配列を有する。ベクター中のインサート配列を、実施例１１に示すシークエンシングによって分析した。
【００５７】
また、ベクターは、上流１１３５ｂｐおよび下流１２４０ｂｐのフランキング配列と、ＭｐｔｐＡのＯＲＦの欠失部位にハイグロマイシン耐性遺伝子を挿入するためのＮｄｅＩサイトを１つ含んでいた。ハイグロマイシン耐性遺伝子をｐＬｉｔ２８ｒｅｓ−ｈｙｇ−ｒｅｓからＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として切り出し、末端修復し、ＮｄｅＩで消化して末端修復したｐＬｉｔΔＡに挿入し、ｐＬｉｔΔＡＨを得た。ベクター中のインサート配列を、実施例１１に示すシークエンシングによって分析した。ベクターｐＬｉｔΔＡＨは、配列番号１５に示すヌクレオチド配列を持つインサートを有する。
【００５８】
ｍｐｔｐΔＡ：：ｈｙｇｒを含んだ４.８ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＬｉｔΔＡＨからＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片として切り出し、ＸｂａＩで消化したｐＪＱ２００ＳＫ（非複製自殺ベクター）に挿入し、ｐＪＱΔＡを得た。カナマイシン耐性のための第２の抗生物質耐性マーカーを、以下に述べるようにベクターのバックボーンに挿入した。
【００５９】
カナマイシンへの耐性を与える遺伝子を、ＮｈｅＩ−ＢｓｔＥII断片としてｐＳＤ５から切り出し、末端修復し、ＳｍａＩで消化したｐＪＱΔＡに挿入し、ｐＡＫΔＡを得た。この組換えベクターｐＡＫΔＡは、ハイグロマイシン耐性遺伝子の両側に、標的ＤＮＡとマイコバクテリアゲノムとの間の組換えがｍｐｔｐＡ遺伝子座で生じるための１.３ｋｂおよび１.４ｋｂの相同領域を有する。
【００６０】
組換えベクターｐＡＫΔＡは、改変されたｍｐｔｐＡ遺伝子（配列番号１５）と、バックボーン内に第２の抗生物質耐性マーカーとを有する。
【００６１】
（Ｂ）組換えベクターｐＢＫΔＢの構築
マイコバクテリウム・テュバキュローシスのｍｐｔｐＢを破壊するためにベクターｐＢＫΔＢを構築した。実施例３に示すＣＴＡＢ標準方法を用いてマイコバクテリア株からゲノムＤＮＡを抽出した。表１および実施例４に示す特異的なプライマーを使用して、ゲノムからｍｐｔｐＢの遺伝子（配列番号１２）を増幅した。
【００６２】
マイコバクテリウム・テュバキュローシスのゲノム配列に基づいて、ｍｐｔｐＢ（配列番号１２）とその上流および下流のフランキング領域とを増幅するためのプライマーを設計した。マイコバクテリウム・テュバキュローシスＤＮＡをテンプレートとして、ｍｐｔｐＢのＯＲＦの上流１０４５ｂｐとｍｐｔｐＢのＯＲＦの最初の３５６ｂｐとを含むＤＮＡ断片を、プライマーＥ（配列番号５）と、プライマーＦ（配列番号６）とを用いてＰＣＲ増幅した。アンプリコンを末端修復し、ＥｃｏＲＶで消化したベクターｐＬｉｔｍｕｓ−３８に挿入し、ベクターｐＬｉｔＢ１を得た。実施例５に示すように、ライゲーション産物で大腸菌を形質転換させた。実施例６に示したように、形質転換体からプラスミドを分離した。実施例７に示すように、制限酵素消化によって組換え体を処理した。
【００６３】
ＭｐｔｐＢのＣ−末端領域に対応するｍｐｔｐＢのＯＲＦの３６７ｂｐと、ｍｐｔｐＢのＯＲＦの下流１１４０ｂｐとを含む別のＤＮＡ断片を、遺伝子に特異的なプライマーであるプライマーＧ（配列番号７）とプライマーＨ（配列番号８）とを使用することによって、ＰＣＲ増幅した。アンプリコンを末端修復し、ＥｃｏＲＶで消化したベクターｐＬｉｔｍｕｓ−３８に挿入し、ベクターｐＬｉｔＢ２を得た。ベクターｐＬｉｔＢ１をＮｄｅＩおよびＳｃａＩで消化し、ｍｐｔｐＢのＯＲＦの最初の３５６ｂｐとＯＲＦの上流１０４５ｂｐとを含む大きい方のＤＮＡ断片を、キアゲンのゲル抽出キットを使用してゲル精製した。同様に、ｐＬｉｔＢ２をＮｄｅＩおよびＳｃａＩで消化し、ＭｐｔｐＢのＣ末端領域に対応するｍｐｔｐＢのＯＲＦの３６７ｂｐと、ＯＲＦの下流１１４０ｂｐとを含む小さい方のＤＮＡ断片をゲル精製した。次いで、ｐＬｉｔＢ１の消化によって得られた大きな断片と、ｐＬｉｔＢ２の消化によって得られた小さな断片をライゲートし、ｐＬｉｔΔＢを得た。ｍｐｔｐＢに特異的なプライマーであるプライマーＦ（配列番号６）およびプライマーＧ（配列番号７）は、重複していなかったので、その結果、ベクターｐＬｉｔΔＢは、（ＯＲＦの中央領域から１０８ｂｐが欠失している）ｍｐｔｐＢのコード領域と、上流１０４５ｂｐおよび下流１１４０ｂｐのフランキング配列と、ｍｐｔｐＢのＯＲＦの欠失部位にハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを挿入するためのＮｄｅＩサイトを１つ含んでいた。ベクターｐＬｉｔΔＢは、配列番号１４に示すヌクレオチド配列を有する。ベクター中のインサート配列を、実施例１１に示すシークエンシングによって分析した。
【００６４】
ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットをｐＬｉｔ２８ｒｅｓ−ｈｙｇ−ｒｅｓからＢａｍＨＩ−ＸｂａＩ断片として切り出し、末端修復し、ＮｄｅＩで消化して末端修復したｐＬｉｔΔＢに挿入し、ｐＬｉｔΔＢＨを得た。ベクター中のインサート配列を、実施例１１に示すシークエンシングによって分析した。ベクターｐＬｉｔΔＢＨは、配列番号１６に示すヌクレオチド配列を持つインサートを有する。
【００６５】
ｍｐｔｐΔＢ：：ｈｙｇｒを含んだ４.９ｋｂのＤＮＡ断片を、ｐＬｉｔΔＢＨからＳｐｅＩ−ＮｈｅＩ断片として切り出し、ＸｂａＩで消化したｐＪＱ２００ＳＫ（非複製自殺ベクター、Pelicic et al.（１９９６年））に挿入し、ｐＪＱΔＢを得た。カナマイシン耐性のための第２の抗生物質耐性マーカーを、以下に述べるようにベクターバックボーンに挿入した。
【００６６】
カナマイシンへの耐性を与える遺伝子を、ＮｈｅＩ−ＢｓｔＥII断片としてｐＳＤ５から切り出し、末端修復し、ＳｍａＩで消化したｐＪＱΔＢに挿入し、ｐＢＫΔＢを得た。ベクターｐＢＫΔＢは、ハイグロマイシン耐性遺伝子の上流および下流に、標的ＤＮＡとマイコバクテリアゲノムとの間の組換えが生じるための、それぞれ１.４ｋｂおよび１.５ｋｂの相同領域を有する。
【００６７】
組換えベクターｐＢＫΔＢは、改変されたｍｐｔｐＢ遺伝子（配列番号１６）と、バックボーン内に第２の抗生物質耐性マーカーとを有する。
【００６８】
（Ｃ）マイコバクテリアのゲノム中のｍｐｔｐＡの改変と、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの毒性および発病におけるその役割
マイコバクテリウム・テュバキュローシスの発病におけるＭｐｔｐＡの役割を評価するために、配列番号１５に示す改変されたｍｐｔｐＡ配列を有する非複製型ベクターｐＡＫΔＡを用いてｍｐｔｐＡ突然変異株を構築した。組換えベクターｐＡＫΔＡは、ｍｐｔｐＡのコード領域と、ｍｐｔｐＡの上流１１３５ｂｐおよび下流１２４０ｂｐのフランキング配列とを含んでいる。ＭｐｔｐＡのコード領域の一部（１１２ｂｐ）を削除し、ｐＡＫΔＡにおいてハイグロマイシンへの耐性を与える遺伝子に置き換えた。非複製型ベクターｐＡＫΔＡおよびアルカリ変性させたｐＡＫΔＡを用いて、マイコバクテリウム・テュバキュローシス・アードマン（Erdman）株にエレクトロポレーションを行った結果、ハイグロマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加した７Ｈ１０プレート上で、それぞれ３９個および２個のハイグロマイシン耐性形質転換体が得られた。エレクトロポレーションの詳細は、実施例１２に示す。アルカリ前処理は、実施例１３に示すとおりである。すべての形質転換体は、ハイグロマイシン耐性遺伝子についてＰＣＲ陽性であり、このことは、プラスミドによって担持されるｍｐｔｐΔＡ::ｈｙｇｒがマイコバクテリアゲノムに組み込まれたことを示唆する。相同組換えによる対立遺伝子の交換では、結果としてハイグロマイシン耐性遺伝子は組み込まれるが、ベクターのバックボーン（カナマイシン耐性遺伝子を含む）はマイコバクテリアゲノムに組み込まれることはないはずである。したがって、遺伝子に特異的なプライマーを用いて、形質転換体をＰＣＲでカナマイシン耐性遺伝子についてスクリーニングした。ｐＡＫΔＡのエレクトロポレーションで得られた形質転換体はカナマイシンカセットについてＰＣＲ陽性であったのに対して、アルカリ変性したｐＡＫΔＡのエレクトロポレーションで得られた２つの形質転換体はカナマイシンカセットについてＰＣＲ陰性であった。これらの結果は、アルカリ変性したＤＮＡのエレクトロポレーションで得られた形質転換体では、ｍｐｔｐＡ遺伝子座における相同組換えが起きたことを示している。したがって、相同組換えが起きたかどうかのスクリーニングでは、ハイグロマイシンには耐性を持つがカナマイシンには感受性を持つ形質転換体を選択した。
【００６９】
マイコバクテリアゲノム中のｍｐｔｐＡが破壊されたことを、ｍｐｔｐＡに特異的なＤＮＡプローブ（配列番号１１）を使用してサザンブロット分析によって確認した。サザンブロットハイブリダイゼーションと核酸プローブの作製については、実施例１４および実施例１５に示す。相同部位において対立遺伝子が交換されると、予測されるように、２つのｈｙｇｒｋａｎｓ形質転換体に対応するレーンでは、野生型株（２.１ｋｂ）のものよりも２ｋｂ長い、単一の４.１ｋｂの断片が観察された。どちらのｈｙｇｒｋａｎｓ形質転換体においてもバンドのサイズが２.０ｋｂ増大したことは、ｍｐｔｐＡの１１２ｂｐの内部断片をハイグロマイシン耐性遺伝子に置き換えたことに一致している（図１（Ａ））。全細胞ライセートの免疫ブロット分析（実施例１０に示す）では、ｍｐｔｐＡの破壊の結果として、突然変異株においてＭｐｔｐＡの発現が見られなかった（図１（Ｂ））。
【００７０】
マイコバクテリウム・テュバキュローシスの細胞内生存におけるＭｐｔｐＡの役割を調べるために、静止状態の、およびＩＦＮ−γによって活性化された状態の、マウスマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ.１における、ｍｐｔｐＡ突然変異株およびその親株の生存率を比較した。感染後０，２，４，６，８日後に、細胞内で生存していた細菌の数を算出した。静止状態のマクロファージにおいては、ｍｐｔｐＡ突然変異株と親株のいずれも、類似する細胞内成長パターンを示した。初期時（０日）においては、細菌数はウェルあたり約２×１０４個であった。後半になると、細菌数が増大し、感染後８日においてピーク値２×１０５個に達した。これらの結果は、マイコバクテリウム・テュバキュローシスのｍｐｔｐＡ突然変異株と親株のいずれも、静止状態のマクロファージにおいては同程度の感染および増殖能力を示すことを示している（図２（Ａ））。しかしながら、ＩＦＮ−γ活性化マウスマクロファージにおいては、２種類の株は生存能力が異なっていた。活性化マクロファージにおいては、感染後２日後、４日後、６日後に、それぞれ野生型細菌の約４５％、５０％、７０％の死滅が観察されたのに対し、ｍｐｔｐＡ突然変異株では、感染後２日後、４日後、６日後に、それぞれ７０％、９５％、９８％の死滅が観察された（図２（Ｂ））。これらの観察結果は、ｍｐｔｐＡの破壊によって、ＩＦＮ−γ活性化マクロファージ中でマイコバクテリウム・テュバキュローシスが生存する能力が阻害されたことを示している。マクロファージにおけるインビトロの研究の詳細は、実施例１６に示す。
【００７１】
マイコバクテリウム・テュバキュローシスの発病においてＭｐｔｐＡが何らかの役割を果たすかどうかを調べる目的で、１６匹ずつのグループにしたモルモットに、５×１０７ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの親株、突然変異株、または相補株を皮下的に感染させた。モルモットは、感染後３週間および６週間で安楽死させた。安楽死させたときは２回とも（グループあたり７匹）、脾臓および肺におけるコロニー形成単位の数を計測した（各グループについてｌｏｇ１０ｃｆｕとして表す）。
【００７２】
ｍｐｔｐＡ突然変異株は、テュバキュローシスのモルモットモデルにおいては成長力が大幅に弱まっていた。感染後３週間において、ｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットの脾臓における細菌数は、親株（ｌｏｇ１０５.９９±０.２７、図３（Ａ））と比較して、１／９に減少（ｌｏｇ１０５.０９±０.２３）しているのが観察された。ｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットの肺においても、親株に感染したモルモットの肺における数（ｌｏｇ１０３.９５±０.３２）と比較して、同様のｃｆｕの減少（ｌｏｇ１０３.０７±０.１３）が観察された（図４（Ａ））。親株に感染したモルモットの脾臓および肺における細菌数と比較したときのｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットにおける細菌数の差は、感染後６週間では１／９から１／９０に増大した。ｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットにおける細菌数は、脾臓ではｌｏｇ１０４.８３±０.４３、肺では３.７１±０.３０であったのに対して、親株に感染したモルモットにおける細菌数は、脾臓では６.７３±０.３３、肺では５.６２±０.３８であった（それぞれ図３（Ｂ）、図４（Ｂ））。ｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットの脾臓および肺における細菌数の減少は、統計的に有意であることが判明した（脾臓の場合にはｐ＜０.００２、肺の場合にはｐ＜０.００１）。
【００７３】
組織の損傷の程度を調べるために、様々なグループの肝臓および肺の切片を組織学的に分析した。図５は、感染後３週間におけるモルモットの肉芽腫の平均割合と、肝臓の肉芽腫における細胞構成とを示す。感染後３週間において、親株に感染したモルモットは、５.４％の肝臓肉芽腫を示した。肝臓肉芽腫は、１０％のリンパ球と、８％のマクロファージと、８２％の類上皮細胞とから構成されていた。ｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットの場合、１０％の肝臓肉芽腫が観察され、この肉芽腫は、２１％のリンパ球と、１１％のマクロファージと、６８％の類上皮細胞とで構成されていた（図５）。
【００７４】
肺の場合、感染したモルモットの肉芽腫組織の割合と肉芽腫の細胞構成とにおいて、株間で大きな差は観察されなかった。親株に感染したモルモットでは、１４％の肺肉芽腫を示し、この肉芽腫は３０％のリンパ球と７０％のマクロファージとから構成されていた。ｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットの場合には、２１.５％の肺肉芽腫が観察され、この肉芽腫は、３０％のリンパ球と７０％のマクロファージとで構成されていた。図６は、親株またはｍｐｔｐＡ突然変異株に感染したモルモットの、感染後３週間における肝臓および肺の代表的な切片を示す。モルモットによる研究の詳細は、実施例１７に示す。
【００７５】
（Ｄ）マイコバクテリウム・テュバキュローシスのｍｐｔｐＢの改変と、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの発病に対するその影響
マイコバクテリウム・テュバキュローシスの発病においてＭｐｔｐＢが何らかの役割を果たすかを調べるために、配列番号１６に示す改変されたｍｐｔｐＢ配列を有する非複製自殺ベクターｐＢＫΔＢを用いて、マイコバクテリウム・テュバキュローシスのｍｐｔｐＢ突然変異株を作製した。標的ベクターｐＢＫΔＢは、ｍｐｔｐＢのコード領域と、上流１０４５ｂｐおよび下流１１４０ｂｐのフランキング配列とを含んでいる。ＭｐｔｐＢのコード領域の一部（１０８ｂｐ）を削除し、ｐＢＫΔＢにおいてハイグロマイシンへの耐性を与える遺伝子に置き換えた。このベクターは、相同部位における対立遺伝子の交換が起きたかどうかを調べる負のスクリーニングのために、第２の抗生物質選択マーカーとしてカナマイシンへの耐性を与える遺伝子もそのバックボーンに担持している。
【００７６】
ｐＢＫΔＢと、紫外線照射したｐＢＫΔＢとを用いて、マイコバクテリウム・テュバキュローシスのエレクトロポレーションを行った結果、それぞれ、２２個、３個のハイグロマイシン耐性形質転換体が得られた。エレクトロポレーションの詳細は、実施例１２に示す。紫外線照射は、実施例１３に示すとおりである。ＰＣＲ分析によって、すべての形質転換体にハイグロマイシンカセットが含まれていることが明らかになり、このことは、これらのコロニーが自然発生的な耐性突然変異体ではなく、マイコバクテリアゲノムに自殺ベクターを組み込んだことによって生じたことを示している。相同組換えによる対立遺伝子の交換では、結果としてハイグロマイシン耐性遺伝子は組み込まれるが、ベクターバッボーン（カナマイシン耐性遺伝子を含む）はマイコバクテリアゲノムに組み込まれることはないはずである。したがって、相同組換えが起きたかどうかのスクリーニングのために、ハイグロマイシンには耐性を持つがカナマイシンには感受性を持つ形質転換体を選択した。未処理ＤＮＡのエレクトロポレーションで得られた全ての形質転換体はカナマイシン耐性であったのに対し、紫外線照射によって前処理したＤＮＡのエレクトロポレーションで得られた３つの形質転換体はカナマイシンへの感受性を持っていた。このことは、紫外線照射したＤＮＡのエレクトロポレーションで得られた３つのｈｙｇｒｋａｎｓ形質転換体では、相同部位における対立遺伝子の交換が起きたことを示唆している。
【００７７】
ｍｐｔｐＢ遺伝子の破壊について、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの親株から単離したゲノムＤＮＡと３つのｈｙｇｒｋａｎｓ形質転換体から単離したゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーション分析によって評価した。実施例１５に示すように、ｍｐｔｐＢ（配列番号１２）のコード領域全体を含むＤＮＡ断片をプローブとして使用した。サザンブロット分析（実施例１４に示す）によって、親株には１.８５ｋｂのバンドが存在するのに対して、３つのｈｙｇｒｋａｎｓ形質転換体においては、ｍｐｔｐＢの１０８ｂｐの内部断片をハイグロマイシン耐性遺伝子カセットに置き換えたことによって予測されるように、３.８ｋｂのバンドが観察された（図７（Ａ））。これらの結果は、３つのｈｙｇｒｋａｎｓ形質転換体の全てにおいてｍｐｔｐＢが破壊されたことを示している。突然変異株におけるＭｐｔｐＢの発現について、ウサギのＭｐｔｐＢに対するポリクローナル血清を用いて分析した。ウェスタンブロット分析（実施例１０に示す）では、３つの突然変異株の全てにおいてＭｐｔｐＢが発現しないことが示された（図７（Ｂ））。突然変異株のエレクトロコンピテントセルへのｐＳＤ５−ｍｐｔｐＢのエレクトロポレーションを行うことによって、相補株を構築した。ｐＳＤ５−ｍｐｔｐＢのエレクトロポレーションによって、相補株においてＭｐｔｐＢの発現が回復した（図７（Ｂ））。
【００７８】
ｍｐｔｐＢ遺伝子の破壊がマイコバクテリウム・テュバキュローシスの細胞内生存に与える影響を調べる目的で、静止状態およびＩＦＮ−γ活性化状態のマウスマクロファージに、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型またはｍｐｔｐＢ突然変異株のいずれかを感染させた。感染後０，２，４，６，８日後に、細胞内で生存していた細胞内細菌の数を調べた。親株とｍｐｔｐＢ突然変異株のいずれも、すべての時点において類似する細胞内成長パターンを示した（図８（Ａ））。初期時（０日）においては、細菌数は約１０４ｃｆｕ／ウェルであったが、後になると細菌数が増大し、感染後８日においてピーク値１０５ｃｆｕに達した。これらの結果は、親株とｍｐｔｐＢ突然変異株のいずれも、静止状態のマウスマクロファージにおいて同程度の感染能力および増殖能力を示すことを示している。しかしながら、活性化マクロファージにおいては、これら２つの株は生存能力が異なった。野生型のマイコバクテリウム・テュバキュローシスとｍｐｔｐＢ突然変異株の数は、初期時においては、最大であり、かつ同程度であった（〜１０４ｃｆｕ／ウェル、０日）。後になると、いずれの場合にも細菌数の減少が観察された。野生型のマイコバクテリウム・テュバキュローシスは、感染後４日、６日において、それぞれ５０％、２８.６％に減少したのに対し、ｍｐｔｐＢ突然変異株の場合にはずっと大幅な減少が見られ、感染後４日、６日において、それぞれ１０％、４％まで減少した（図８（Ｂ））。これらの観察は、ｍｐｔｐＢ遺伝子の破壊によって、ＩＦＮ−γ活性化マクロファージ中のマイコバクテリウム・テュバキュローシスの生存能力が阻害されたことを示している。マクロファージにおけるin vitroの研究の詳細は、実施例１６に示す。
【００７９】
ｍｐｔｐＢ遺伝子の破壊が生体内におけるマイコバクテリウム・テュバキュローシスの生存に何らかの影響を及ぼすかを調べる目的で、８匹ずつのグループにしたモルモットに、５×１０５ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの親株、突然変異株、相補株のいずれかを皮下的に感染させた。モルモットは、感染後３週間および６週間で安楽死させた。安楽死させたときは２回とも、脾臓をホモジナイズし、生菌を計測した（各グループについてｌｏｇ１０ｃｆｕとして表す）。
【００８０】
感染後３週間において、突然変異株に感染したモルモットの平均合計スコアは２６であり、これは、親株（２８）および相補株（３０）に感染したモルモットの場合におけるスコアと同程度であった（図９（Ａ））。これらの結果は、感染後３週間においてモルモットを安楽死させた時点での、様々なグループにおいて得られた脾臓のｃｆｕに相応する。突然変異株に感染したモルモットの脾臓における細菌数はｌｏｇ１０３.７１であり、これは、親株（ｌｏｇ１０３.７３）および相補株（ｌｏｇ１０３.６８）に感染したモルモットの脾臓における細菌数と同程度であった（図１０（Ａ））。しかしながら、突然変異株に感染したモルモットの６週間の最後のときの合計スコア（１２）は、親株（３５、ｐ＜０.０２）および相補株（３３、ｐ＜０.０２）に感染したモルモットの合計スコアよりも大幅に低かった（図９（Ｂ））。突然変異株に感染したモルモットは、親株（ｌｏｇ１０４.７７、ｐ＜０.００２）および相補株（ｌｏｇ１０４.４５、ｐ＜０.００３）に感染したモルモットの脾臓における細菌数と比較して、脾臓における細菌数の大幅な減少（ｌｏｇ１０３.０７）を示した（図１０（Ｂ））。すなわち、ｍｐｔｐＢ突然変異株に感染したモルモットでは、親株または相補株の場合と比較して、合計スコアが約１／３に減少し、脾臓における細菌数が１／５０〜１／７０に減少した。
【００８１】
様々なグループにおける動物の肝臓および肺の切片を組織学的に分析し、器官の形態と、肉芽腫の存在およびその程度と、浸潤細胞のタイプおよびその数とを調べた。３週間では、親株、突然変異株、または相補株に感染したモルモットの肝臓および肺において、組織学的に大きな差は観察されなかった。感染後３週間では、モルモットの３つのグループすべてにおいて、肉芽腫の程度および構成に差は見られなかった。肝臓の場合、肉芽腫は、主として類上皮細胞とリンパ球とで構成されていたのに対し、肺の肉芽腫は、主としてリンパ球とマクロファージ、いくつかの類上皮細胞とで構成されていた（図１１（Ａ）および図１１（Ｂ））。感染後６週間においては、野生型および相補株に感染したモルモットの場合、肝臓の切片に、類上皮細胞とリンパ球とから成る明確な複数の肉芽腫が見られた。しかしながら、ｍｐｔｐＢ突然変異株に感染したモルモットの肝臓組織は、類上皮細胞の存在に関して明らかに異なった性質を示し、リンパ球は数個のみであった。肺組織の場合には、野生型および相補株に感染したモルモットでは、リンパ球とマクロファージとから成る大規模な肉芽腫が見られた。対照的に、突然変異株に感染したモルモットの肺組織では、主としてリンパ球から成る、部分的に組織化された肉芽腫が見られた（図１２（Ａ）および図１２（Ｂ））。モルモットによる研究の詳細は、実施例１７に示す。
【００８２】
統計分析
データは、算術平均±標準誤差として表す。スチューデントｔ検定を使用して、データの統計的有意性について分析した。モルモットのグループ間の差異は、ｐ値が０.０５より小さい場合に有意であるとみなした。
【００８３】
【表１】
2007526753.tif 000002
【実施例】
【００８４】
以下の方法は、本発明を説明する目的で示しており、本発明の範囲を制限するようには解釈されないものとする。
【００８５】
実施例１：使用した試薬および化学物質の入手元
培養物を成長させるための培地を含め、試薬、化学物質、および酵素は、標準的な調達先から購入した。
【００８６】
実施例２：細菌株の培養（大腸菌およびマイコバクテリア）
大腸菌は、ＬＢ（Luria Bertani）培地、あるいは、アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、またはハイグロマイシン（１５０μｇ／ｍｌ）のいずれかの抗生物質を添加した２ＸＹＴ培地、のいずれかにおいて成長させた。マイコバクテリウム・テュバキュローシス・アードマン株は、０.５％のグリセロール、０.２％のツイーン８０（Tween-80）、および１×ＡＤＣ添加物を添加したミドルブルック７Ｈ９培地において成長させた。培養物は、３７℃で２００ｒｐｍの一定の振盪を与えながら成長させた。固体培地は、大腸菌にはＬＢ寒天培地を含んでいるものを、マイコバクテリウム・テュバキュローシスには、０.５％のグリセロール、１×ＯＡＤＣ添加物、および適切な抗生物質を含む７Ｈ１０／７Ｈ１１培地を含んでいるものを用いた。
【００８７】
実施例３：マイコバクテリアからのゲノムＤＮＡの単離
マイコバクテリアを２〜３のＡ６００ｎｍまで成長させ、培養物にグリシンを最終濃度が１％になるように加えた。グリシンを加えてから２４時間後に、室温、１０分間、８,０００ｒｐｍでの遠心分離によって細胞を回収した。５００μｌのＴＥＧ溶液にペレットを再懸濁し、５０μｌのリゾチーム（２０μｇ／ｍｌ）を加えた。３７℃で一晩インキュベートした後、１００μｌの１０％ＳＤＳと５０μｌのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えることによって溶解を行った後、５５℃において４０分間インキュベートした。細胞ライセートに２００μｌのＮａＣｌと１６０μｌのＣＴＡＢとを加え、懸濁液を６５℃で１０分間インキュベートした。ライセートは、フェノール（トリス−塩酸（ｐＨ８.０）であらかじめ平衡化したもの）によって二回、およびクロロホルムによって二回抽出した。１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の冷やしたエタノールとを加えることによって、ＤＮＡを沈殿させた。次いで、ＤＮＡペレットを７０％のエタノールで洗浄し、オートクレーブ処理した１００μｌの再蒸留水に再懸濁した。
【００８８】
実施例４：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲによる遺伝子の増幅は、製造業者の推奨事項に従って実行した。すべてのＰＣＲ反応は、Ｔａｑ／Ｐｆｕ混合物を用いて実行した。使用したオリゴヌクレオチドの配列は、表１に示すとおりである。代表的な増幅反応は、１０ｎｇのテンプレートＤＮＡと、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液と、２００μＭのｄＮＴＰと、それぞれ２０ｐｍｏｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマーと、１.５ｍＭのＭｇＣｌ２と、１ＵのＴａｑ／Ｐｆｕ混合物（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを９：１の割合で混合）とを含んでいた。
【００８９】
代表的な増幅反応は、以下の反応を有する。
１．９４℃で５分間の初期変性。
２．９４℃で４５秒間の変性、５５℃〜６５℃で１分間のアニーリング、７２℃での１分間の伸長、を３０サイクル。
３．７２℃で１０分間の最終的な伸長。
【００９０】
ＰＣＲ産物を１.２％のアガロースゲルを用いて分離し、上述したようにキアゲンのゲル抽出キットを使用することによって精製した。
【００９１】
実施例５：大腸菌の形質転換
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株および大腸菌ＨＢ１０１株をＬＢ培地において成長させ塩化カルシウム法を使用することによってコンピテントセルを作製した（非特許文献３３）。高い形質転換効率の細胞を作製するため、大腸菌株を３０℃で０.４〜０.６のＡ６００ｎｍまで成長させ、その後４℃で２時間冷やした。４℃、６,０００ｒｐｍで１５分間、培養物をペレットにすることによって細胞を回収した。細胞ペレットを氷冷した緩衝液（trituration buffer）（元の培養物体積の１／２０）に再懸濁し、あらかじめ冷やした緩衝液で元の培養物の体積になるまで希釈した。氷上で４５分間インキュベートした後、４℃、６,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって細胞を回収した。細胞ペレットを、氷冷した緩衝液（元の体積の１／１０）に静かに再懸濁した。静かにかき回しながらグリセロールを最終濃度１５％（ｖ／ｖ）になるまで少しずつ（drop wide）加えていき、コンピテントセルを、以後使用するまで、それぞれ１ｍｌのアリコートに−７０℃で保管した。
【００９２】
形質転換は、MandelとHigaによって記載された方法（非特許文献２２）によって行った。ライゲーション産物またはスーパーコイルＤＮＡを２００μｌの細胞と混合し、氷上で３０分間インキュベートした。次いで、細胞に４２℃で熱ショックを４５秒間与え、氷上で２分間インキュベートした。氷上でのインキュベートの後、８００μｌのＬＢ培地を細胞に加え、２００ｒｐｍで一定の振盪を与えながらサンプルを３７℃で１時間インキュベートした。適切な抗生物質を添加したＬＢ寒天プレート上で形質転換体を選択した。
【００９３】
実施例６：大腸菌形質転換体からのプラスミドＤＮＡの作製
これは、以下のプロトコルに従って個別に実行した。
【００９４】
Ａ）プラスミドＤＮＡのミニプレップ法
（i）アルカリ溶菌法による
１つのコロニーを、適切な抗生物質を含んだ３ｍｌの２ＸＹＴ培地に植菌し、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩成長させた。４℃、６０００ｒｐｍ、２分間の遠心分離によって細胞を回収した。細胞ペレットを、リゾチーム（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を含んだ２００μｌのＴＥＧ溶液に再懸濁し、懸濁液を室温で１０分間インキュベートした。１０分間のインキュベートの後、新たに調製した４００μｌのアルカリ−ＳＤＳ溶液を加えて転倒混和した。氷上で５分間インキュベートした後、３００μｌの３Ｍ酢酸カリウムを加え、転倒混和し、氷上でさらに１０分間インキュベートした。細胞ライセートを、４℃、１２,０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、フェノール／クロロホルム抽出を行い、次いでクロロホルム抽出を行った。５４０μｌのイソプロパノール（０.６ｖ／ｖ）を加えてＤＮＡを沈殿させた後、室温、１２,０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。ペレットを、冷やした７０％エタノールで二度洗浄し、空気乾燥させ、５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【００９５】
（ii）沸騰溶菌法による
培養細菌を、上述したように成長させて回収した。細胞ペレットを、リゾチーム（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を含んだ６００μｌのＳＴＥＴ溶液に再懸濁した。室温で１５分間インキュベートした後、細胞懸濁液を１００℃で２分間沸騰させた。そのままの状態の細胞ライセートを、室温、１２,０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、清浄な細胞ライセートを作製した。６００μｌのアンモニア混合溶液を加えることによってＤＮＡを沈殿させ、室温、１２,０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって回収した。ペレットを、冷やした７０％エタノールで二度洗浄し、空気乾燥させ、５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【００９６】
（iii）キアゲンミニプレップキットによる
培養細菌を、上述したように成長させて回収した。ペレットを２５０μｌの緩衝液Ｐ１において再懸濁し、室温で５分間インキュベートした。５分間のインキュベートの後、２５０μｌの緩衝液Ｐ２を加え、転倒混和することによって混合した。５分間のインキュベートの後、３５０μｌの緩衝液Ｎ３を加え、氷上で５分間インキュベートした。４℃、１２,０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、清浄な細胞ライセートを作製した。Ｑｉａカラムに上澄みを通過させた後、５００μｌの緩衝液ＰＢによって洗浄した。次いで、７５０μｌの緩衝液ＰＥでカラムを二度洗浄した。精製したＤＮＡを、１００μｌの溶出緩衝液で溶出した。
【００９７】
Ｂ）ＤＮＡのマキシプレップ法
アルカリＳＤＳ法（非特許文献３３）によって、プラスミドＤＮＡを大量に分離した。１つのコロニーを、適切な抗生物質を含んだ２００ｍｌの２ＸＹＴ培地に植菌し、２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃において一晩成長させた。４℃、６０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって細胞を回収した。細胞ペレットを、リゾチーム（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）を含んだ４ｍｌの溶液Iに再懸濁した。サンプルを氷上で３０分間インキュベートした。氷上での３０分間のインキュベートの後、新たに調製した８ｍｌの溶液IIを加え、サンプルを氷上でさらに１５分間インキュベートした。次いで、６ｍｌの溶液IIIを加え、氷上で１０分間インキュベートした。４℃、１２,０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離をかけることによって、清浄な細胞ライセートを作製した。１０.８ｍｌのイソプロパノール（０.６ｖ／ｖ）を加え、細胞ライセートからＤＮＡを沈殿させた。室温で１０分間インキュベートした後、室温、１２,０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって、プラスミドＤＮＡを回収した。ペレットを、冷やした７０％エタノールで二度洗浄し、空気乾燥させ、７５０μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。ＤＮＡをＲＮＡアーゼＡ（２０μｇ／ｍｌ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルムで抽出した。２.５倍量の冷やした無水エタノールと酢酸ナトリウムとを最終濃度が０.３Ｍになるように加えることによって、水相のＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを−７０℃で１５分間インキュベートし、４℃、１２,０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によってＤＮＡを回収した。ペレットを、７０％のエタノールで二度洗浄し、空気乾燥させ、１００μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。
【００９８】
実施例７：クローニングを目的とするＤＮＡ操作
制限酵素によるＤＮＡの消化：
制限酵素によるＤＮＡの消化は、製造業者の推奨事項に従って、指定の温度で行った。分析を目的とした消化は２０μｌの反応体積において行い、実験の準備としての消化は１００μｌの反応体積において行った。
【００９９】
ＤＮＡ末端の脱リン酸化：
仔牛小腸由来のホスファターゼを用いて、ＤＮＡ断片からの５'リン酸基を除去した。１×緩衝液においてＤＮＡを酵素（１Ｕ）とともに３７℃で３０分間インキュベートした後、５６℃で３０分間インキュベートした。反応混合物を６５℃で１０分間インキュベートして酵素を非活性化した後、フェノール／クロロホルム抽出を行い、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、オートクレーブ処理した１０μｌの再蒸留水に再懸濁した。
【０１００】
ＤＮＡ断片の５'突出末端の充填：
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を用いて、５'突出末端を有するＤＮＡ断片を末端修復した。ＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）を酵素（１μｇのＤＮＡあたり１〜２Ｕ）とともに２００μＭのｄＮＴＰを含んだ１×緩衝液中で２５℃において１５分間インキュベートした後、７５℃で１５分間熱失活させた。
【０１０１】
ＤＮＡ末端のライゲーション：
すべてのライゲーション反応は、容積１０μｌ中で２５℃において３〜４時間行った。各反応は、一般に、１００ｎｇの消化されたベクターＤＮＡと、モル濃度１：３および１：５（ベクター：インサート）のインサートＤＮＡ断片と、１ｍＭのＡＴＰおよび４０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼを含んだ１×リガーゼ緩衝液とを含んでいた。ライゲーション混合物は、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株のコンピテントセルの形質転換に使用し、適切な抗生物質を添加した適切なＬＢ寒天上で形質転換体を選択した。
【０１０２】
実施例８：アガロースゲル電気泳動
アガロースゲル電気泳動は、基本的に説明されているように行った（非特許文献３３）。サイズが５００ｂｐより大きいＤＮＡ断片は、０.８％のアガロースゲルで分離し、２５０〜５００ｂｐの範囲内のＤＮＡ断片は、１.２％のアガロースゲルで分離した。これらのゲルを使用し、０.５μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含んだ１×ＴＡＥ緩衝液中で電気泳動を行った。
【０１０３】
実施例９：アガロースからのＤＮＡの溶出
キアゲンゲル抽出キットを使用することによって、アガロースゲルからＤＮＡを溶出した。ゲルを切り出し、３倍量のＱＧ緩衝液中でアガロースが溶けるまで５５℃でインキュベートした。次いで、サンプルをＱｉａカラムに通し、カラムをＰＥ緩衝液で二度洗浄し、５０μｌの溶出緩衝液でＤＮＡを溶出させた。
【０１０４】
実施例１０：免疫ブロット分析
タンパク質のサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、バイオ・ラッドのミニトランスブロットセル（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）を用いて、４０ｍＡで一晩、または１８０ｍＡで２時間、ハイボンドＣエクストラメンブレンに転写した。メンブレンへのタンパク質の転写を、染色剤ポンソーＳで染色することで確認した。メンブレンを２％乳汁で室温にて２時間ブロッキングした。次いで、ポリクローナル血清の１：１０,０００の希釈溶液中でブロットを室温にて２時間インキュベートした。抗体の非特異的な結合を防止するために、希釈溶液は２％乳汁−ＰＢＳＴで調製した。次いで、ＰＢＳＴでブロットを三度洗浄した。洗浄後、１：２,５００の希釈濃度のペルオキシダーゼ標識のヤギ抗ウサギイムノグロブリンＧ抗体溶液中でインキュベートした。１時間のインキュベートの後、ＰＢＳＴによってブロットを三度洗浄し、１０μｌ／ｍｌの３０％の過酸化水素水と０.５ｍｇ／ｍｌの３,３'ジアミノベンジジン四塩酸塩とを含んだＰＢＳを加え、免疫反応バンドを可視化した。
【０１０５】
実施例１１：ＤＮＡシークエンシング
シークエンシング用のＤＮＡサンプルは、キアゲンのプレップスピンプラスミドキットを使用して、それぞれの形質転換体の３ｍｌの培養物から調製した。ＡＢＩのプリズム３７７シークエンサーとローダミン・ダイターミネータ物質とを使用することによって、ＤＮＡサンプルのシークエンシングを行った。
【０１０６】
５００ｎｇの二本鎖ＤＮＡと、３.２ｐｍｏｌのベクターに特異的なオリゴヌクレオチドを使用することによって、ＰＥ−２４００サーモサイクラー（Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, Connecticut, USA）で、シークエンシングＰＣＲ反応の準備をした。シークエンシング反応の完了後、酢酸ナトリウムとエタノールとを使用して伸長生成物を沈殿させ、組み込まれていないターミネータを除去した。次いで、４％ロングレンジャーゲルにサンプルを入れた。サンプルレーンを、ＤＮＡシークエンシングアナリシス３.０ソフトウェア（ABI-Prism, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）で分析した。
【０１０７】
実施例１２：マイコバクテリウム・テュバキュローシスのエレクトロポレーション
マイコバクテリウム・テュバキュローシスの培養物を、３７℃において２００ｒｐｍで振盪しながら、０.８のＡ６００ｎｍまで成長させた。回収する前に、細胞を氷上で１時間冷やした。４℃、６，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって、細胞をペレットにした。冷やしたグリセロール（１０％）で二度洗浄し、１ｍｌの冷やしたグリセロール（１０％）に再懸濁し、以後使用するまで、それぞれ１００μｌのアリコートに−７０℃で保管した。
【０１０８】
エレクトロポレーションを行うため、約２μｇのＤＮＡを２０μｌの細胞と混合し、氷上に１５分間保持した。その後、電界強度１６ｋＶ／ｃｍ（ギャップ幅０.１５ｃｍのキュベットを使用して、入力４００Ｖ、キャパシタンス３３０μＦ、抵抗８ｋΩ、出力２.４ｋＶ）において細胞にパルスを与えた。１ｍｌの７Ｈ９培地中で３７℃、２００ｒｐｍ、２４時間培養し、細胞を回復させた。ＡＤＣを添加して適切な抗生物質を含んだミドルブルック７Ｈ１０寒天プレート上で形質転換体を選択した。プレートを３７℃で１４〜２１日間インキュベートした。
【０１０９】
実施例１３：アルカリおよび紫外線によるＤＮＡの前処理
マイコバクテリウム・テュバキュローシスのコンピテントセルへのエレクトロポレーションの前に、１９９９年にHindsらによって説明されている方法（非特許文献１７）に従って、標的ＤＮＡをアルカリで前処理した。０.２ｍＭのＥＤＴＡを含んだ２０μｌの０.２ＭのＮａＯＨ中で、３７℃で３０分間、ベクターを変性させた。１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウムと、２.５倍量の冷やしたエタノールを加えることによって、変性したＤＮＡを沈殿させた。サンプルを−７０℃で１５分間インキュベートすることによって、ＤＮＡを沈殿させ、４℃、１２,０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離によって回収した。ペレットを冷やした７０％のエタノールで二度洗浄して塩を除去し、空気乾燥させ、１０μｌの再蒸留水に再懸濁した。紫外線前処理は、ＵＶストラタリンカー１８００（Amersham）中で、１００−ｍＪｃｍ−２で５分間、ＤＮＡに紫外線を照射した。ＤＮＡのアルカリおよび紫外線による前処理の際には、上述したようにキアゲンカラムによってＤＮＡを調製した。
【０１１０】
実施例１４：サザンブロットハイブリダイゼーション
ゲノムＤＮＡをマイコバクテリウム・テュバキュローシスから単離し、適切な制限エンドヌクレアーゼによる制限消化を行った。消化された断片を、１×ＴＡＥゲル泳動緩衝液中で、低電圧（４０Ｖ）において１.２％のアガロースゲルで一晩かけて分離した。ゲルを０.１Ｎの塩酸に１０分間浸すことによって、ＤＮＡ断片を脱プリン化した後、再蒸留水によって洗浄した。次いで、ゲルを変性緩衝液（１.５ＭのＮａＣｌ、０.５ＭのＮａＯＨ）に浸すことによって、ＤＮＡを変性させた。次いで、再蒸留水でＤＮＡを洗浄し、中和緩衝液（１Ｍのトリス（ｐＨ７.４）、１.５ＭのＮａＣｌ）において中和させた。次いで、２０×ＳＳＣにおける一晩の毛管転写（capillary transfer）によって、ＤＮＡをハイボンドＮメンブレンに転写した（Southern 1975）。このメンブレンを空気乾燥させ、７００ｍＪにおける２分間の紫外線照射によって、ＤＮＡをハイボンドＮメンブレンに架橋させた。５０％の脱イオン化したホルムアミドと、５×ＳＳＣと、５×デンハルト溶液と、５０ｍＭのトリス−ＣＩ（ｐＨ７.５）と、２００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡとを含んだ溶液において、ブロットを４２℃において一晩プレハイブリダイズした。次いで、熱変性させたプローブをブロットに加え、４２℃において１４〜１６時間のハイブリダイゼーションを行った。最初に、２×ＳＳＣおよび０.１％のＳＤＳ中でブロットを室温において３０分間洗浄し、次いで、０.２×ＳＳＣおよび０.１％のＳＤＳ中で室温において３０分間洗浄し、次いで、０.２×ＳＳＣおよび０.２％のＳＤＳ中で６５℃において３０分間洗浄した。次いで、ブロットを空気乾燥させ、サランラップで包み、オートラジオグラフィーを行った。
【０１１１】
実施例１５：核酸プローブの調製
遺伝子に特異的なプライマーを使用することによって、標識するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅した。キアゲンのゲル抽出キットを使用してアンプリコンを精製し、５０μｌの反応体積でＮＥブロットキットを使用し、末端の標識を行った。標識反応は、１００ｎｇのテンプレートＤＮＡと、１×クレノウ緩衝液（ランダムプライマーを有する）と、１ｍＭのｄＧＴＰと、１ｍＭのｄＣＴＰと、１ｍＭのｄＴＴＰと、１０μＣｉの[α３２Ｐ]ｄＡＴＰと、１Ｕのクレノウ断片とで構成されていた。テンプレートＤＮＡを１００℃で５分間変性させ、氷中に２分間保持し、ｄＮＴＰおよび酵素を加え、３７℃で２時間、末端の標識を行った。キアゲンヌクレオチド除去キットを使用して、組み込まれていないｄＮＴＰを除去し、ラベル化されたプローブをブロットに加えた。
【０１１２】
実施例１６：マイコバクテリウム・テュバキュローシスによるマウスのマクロファージ細胞株の生体外感染
マウスのマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ.１（静止状態、または５０Ｕｍｌ−１のｒＩＦＮ−γに１６時間暴露することによって活性化させたもの）を、ウェルあたり２×１０５個の密度で６ウェルのプレートに蒔いた。感染させる前に、細胞株を１×ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で一度洗浄し、その後、熱不活化した１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に培地を置き換えた。細菌株をＤＭＥＭで二度洗浄し、５％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭに再懸濁した。１：１０（マクロファージ：細菌）のＭＯＩで、細胞を野生型株または突然変異株で感染させた。５％のＣＯ２雰囲気下で、３７℃で細胞をインキュベートした。感染後６時間に細胞を１×ＨＢＳＳで二度洗浄し、ＦＣＳ（１０％）、抗生物質−抗真菌剤（１％）、およびアミカシン（２０μｇ／ｍｌ）を添加した２ｍｌのＤＭＥＭでオーバーレイした。０，２，４，６，８日後に、感染した細胞を１ｍｌの０.１％トリトンＸ−１００中で１５分間溶解させた。１０倍段階希釈液をＭＢ７Ｈ１０培地に２枚ずつプレーティングし、プレートを３７℃で３週間インキュベートし、各時点における細菌数を調べた。
【０１１３】
実施例１７：モルモットにおける毒性の研究
チロシンホスファターゼの破壊がマイコバクテリウム・テュバキュローシスの毒性に与える影響について、実験結核症のモルモットモデルで評価した。この研究は、チェンナイの結核研究センターにおいて行った。ハイデラーバードのインド国立実験動物科学センター（ＮＣＬＡＳ）から、体重が２００〜４００ｇの範囲の、ダンカン−ハートリー株のランダムブレッド（Random-Bred）のモルモットを得た。
【０１１４】
モルモットをそれぞれ１６匹のグループに分けた。各グループは、８匹のオスと８匹のメス、計１６匹のモルモットで構成されていた。以下に示す微生物のいずれかを、微生物ごとにグループが異なるようにモルモットに皮下的に感染させ、感染後３週間および６週間後に８匹ずつのモルモット（４匹のオスおよび４匹のメス）を安楽死させた。
【０１１５】
高用量（５×１０７）
ａ）マイコバクテリウム・テュバキュローシス・アードマン株
ｂ）ｍｐｔｐＡ突然変異株
低用量（５×１０５）
ｃ）マイコバクテリウム・テュバキュローシス・アードマン株
ｄ）ｍｐｔｐＢ突然変異株
ｅ）ｍｐｔｐＢ相補株
【０１１６】
全ての微生物について盲検化し、２６Ｇ注射針を備えた１ｍｌのツベルクリン注射筒を用いて、各調製液をそれぞれ別々にモルモットに皮下的に感染させた。
【０１１７】
安楽死の後、以下の調査を行った。
１）モルモットの総体重
２）感染した器官、すなわち肝臓、脾臓、および肺の重量
３）器官への病理学的な総損傷のスコア（死後スコア）
４）脾臓および肺からの結核菌の生菌数算定（細菌計測）
５）肝臓および肺の組織病理学的評価
【０１１８】
モルモットの総体重は、実験の開始時と、それ以降安楽死まで毎週測定した。肝臓、肺、脾臓、およびリンパ節を無菌条件下で切り出し、感染した器官の重量を測定した。脾臓および肺における細菌数を計測した。肉芽腫の形成と肉芽腫の細胞構成とを組織病理学的に分析するために、肝臓組織および肺組織の一部を１０％のホルマリンで固定した。
【０１１９】
死後スコア：
Mitichisonによって説明された方法を用い（非特許文献２３）、モルモットにおける病気の進行速度に基づいて毒性を測定した。モルモットの死後検査で、結核症の全体的な程度を、０〜１００を範囲とするスコアとして評価した。器官における可視病巣の程度は、表５に記載されているようにスコア化した。各グループの平均スコアを計算した。
【０１２０】
脾臓および肺からの結核菌の生菌数算定：
脾臓および肺の一部を切り出し、重量を測定して滅菌したグラインディングチューブの中に入れた。テフロンホモジナイザーを用いて器官を５ｍｌの再蒸留水中でホモジナイズした。蒸留水および１０μｌの均質なホモジェネートの１０倍段階希釈液（１０−１，１０−２，１０−３，１０−４）を調製し、各希釈液をそれぞれ二つのＬＪスロープに植菌した。このＬＪスロープを３７℃でインキュベートし、４週間後と６週間後にｃｆｕを記録した。各グループについて、器官あたりのｃｆｕの値と器官の平均ｃｆｕを計算した。この検出方法の感度は細菌数５００であった。
【０１２１】
肝臓および肺の組織病理学：
モルモットの肝臓および肺を切り出し、１０％のホルムアルデヒドが入っている、あらかじめ重量を測定した瓶に入れた。肝臓および肺からの組織の２つの小片（２ｃｍ×厚さ２ｃｍ）を、次の処理まで１０％のホルマリンで固定した。これらの器官の小片を、７０％アルコールおよび９５％アルコールで２時間洗浄し、洗浄後にイソプロパノールで２時間処理した。組織を確実に完全に脱水するために、イソプロパノール処理は二度繰り返した。次いで、小片をキシレン中で１５〜２０分間インキュベートし、最後に、溶けたパラフィンワックスに埋め込んだ。パラフィンに埋め込んだ組織を、ミクロトーム（Reichert, Germany）を使用して５μｍの微細な切片にし、スライドガラス上に固定した。染色前に、切片の脱パラフィンを行った。最初に、スライドをキシレンに５分間、二度浸し、その後に３分間のイソプロパノール処理を二度行った。最後に、ワックスの残りを完全に取り除くために、スライドを９５％のアルコールで処理した。
【０１２２】
肉芽腫の存在を調べるために、切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。切片を水で洗浄し、ヘマトキシリンで５分間染色した。蒸留水で洗浄し、スライドから余分な染色を取り除いた。次いで、エオシン溶液で１分間対比染色し、水で洗浄し、空気乾燥させた。顕微鏡下でスライドを観察できるように、ＤＰＳマウントをスライドにマウントし、カバーグラスで覆った。切片における肉芽腫の比率と、細胞浸潤の程度およびタイプとを、顕微鏡を使用してすでに説明されている方法で評価した（Ridley, 1977；非特許文献１９）。パラメータとして、代表的な肉芽腫のサイズ、乾酪壊死の量、好中球、マクロファージ、巨細胞、類上皮細胞、およびリンパ球の相対的な数、肉芽腫においてリンパ球が形成されていた程度、肉芽腫が生じていた程度、について組織切片を分析し、チロシンホスファターゼの破壊がマイコバクテリウム・テュバキュローシスの毒性に与える影響を調べた。各組織について少なくとも４つの異なる切片を分析した。
【０１２３】
統計分析：
データは、算術平均±標準誤差として表してある。スチューデントｔ検定を使用して、データの統計的有意性について分析した。モルモットのさまざまなグループ間の差異は、ｐ値が０.０５より小さい場合に有意であるとみなした。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】（Ａ）マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）およびｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ１およびＭＴ２）のサザンブロット分析。マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）およびｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ１およびＭＴ２）のゲノムＤＮＡ（３μｇ）をＮｏｔＩによって消化し、１.２％のアガロースゲルで分離し、ハイボンドＮメンブレンに転写し、３２Ｐで標識したｍｐｔｐＡのＤＮＡ断片をプローブとして使用した。標準ＤＮＡのサイズは、ゲルの左側に示し、ハイブリダイゼーション処理断片のサイズはゲルの右側に示す。（Ｂ）マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）とｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ１およびＭＴ２）のサザンブロット分析。マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）およびｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ１およびＭＴ２）からのゲノムＤＮＡ（３μｇ）をＰｖｕIIによって消化し、１.２％のアガロースゲルで分離し、ハイボンドＮメンブレンに転写し、３２Ｐで標識したｍｐｔｐＡのＤＮＡ断片をプローブとして使用した。標準ＤＮＡのサイズは、ゲルの左側に示し、ハイブリダイゼーション処理断片のサイズはゲルの右側に示してある。（Ｃ）マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）およびｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ１およびＭＴ２）におけるＭｐｔｐＡの発現の免疫ブロット分析。マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型およびｍｐｔｐＡ突然変異株におけるＭｐｔｐＡの発現を免疫ブロット法により分析した。株を７Ｈ９培地において対数増殖期の中期まで成長させた。等量の全細胞ライセートタンパク質（４０μｇ）を、１２.５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ハイボンドＣエクストラメンブレンに転写し、ウサギにおけるＭｐｔｐＡに対するポリクローナル血清を使用することによって、ＭｐｔｐＡの発現を分析した。
【図２】静止状態のマクロファージおよび活性化マクロファージにおけるマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型およびｍｐｔｐＡ突然変異株の生存。マウスのマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ.１に、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型およびｍｐｔｐＡ突然変異株を１：１０（マクロファージ：細菌）のＭＯＩで別々に感染させた。感染後の異なる時点（０，２，４，６，８日後）でマクロファージを溶解し、７Ｈ１０プレート上にプレーティングすることによって細胞内のマイコバクテリアの数を見積もった（Ａ：静止状態のマクロファージの場合、Ｂ：活性化マクロファージの場合）。この実験を２回行うことを２度繰り返した。データは、４個の値全ての平均±標準誤差として示している。
【図３】５×１０７ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）またはｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ）のいずれかを皮下的に感染させ、感染後３週間（Ａ）および６週間（Ｂ）で安楽死させたモルモットの脾臓における細菌数。脾臓を５ｍｌの蒸留水でホモジナイズし、脾臓のホモジェネートの１０倍段階希釈液をＬＪスロープ上にプレーティングした。感染後３週間（Ａ）および６週間（Ｂ）で安楽死させたモルモットの脾臓の細菌数を求め、ｌｏｇ１０ｃｆｕに変換し、ｙ軸に平均±標準誤差として示す。ｘ軸にはマイコバクテリア株の種類を示す。
【図４】５×１０７ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）またはｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ）のいずれかを皮下的に感染させ、感染後３週間（Ａ）および６週間（Ｂ）で安楽死させたモルモットの肺における細菌数。肺の一部を５ｍｌの蒸留水でホモジナイズし、肺のホモジェネートの１０倍段階希釈液を、ＬＪスロープ上にプレーティングした。感染後３週間（Ａ）および６週間（Ｂ）で安楽死させたモルモットの肺の細菌数を求め、ｌｏｇ１０ｃｆｕに変換し、ｙ軸に平均±標準誤差として示す。ｘ軸にはマイコバクテリア株の種類を示す。
【図５】５×１０７ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）またはｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ）のいずれかを皮下的に感染させ、感染後３週間で安楽死させたモルモットの肝臓および肺の組織病理像。無菌条件下で肝臓および肺の一部を切除し、１０％ホルマリンで固定した。５μｍ厚の組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、倍率１０倍で組織病理学的解析を行った。動物の３つのグループすべてについて、肝臓（Ａ）および肺（Ｂ）の代表的な切片を示す。対照組織像として、未感染のモルモットの肝臓および肺の切片を使用した。
【図６】５×１０７ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）またはｍｐｔｐＡ突然変異株（ＭＴ）のいずれかを皮下的に感染させ、感染後６週間で安楽死させたモルモットの肝臓および肺の組織病理像。マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型、ｍｐｔｐＡ突然変異株、および相補株に感染した動物の肝臓および肺の切片（５μｍ）を固定および処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡を用いて倍率１０倍で観察した。動物の３つのグループすべての肝臓（Ａ）および肺（Ｂ）の代表的な切片を示す。対照組織像として、未感染のモルモットの肝臓および肺の切片を使用した。
【図７】（Ａ）マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型およびｍｐｔｐＢ突然変異株（ＭＴ１，ＭＴ２，ＭＴ３）のサザンブロット分析。マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）およびｍｐｔｐＢ突然変異株（ＭＴ１，ＭＴ２，ＭＴ３）からのゲノムＤＮＡ（３μｇ）を、ＮｏｔＩで消化し、１.２％のアガロースゲルで分離し、ハイボンドＮメンブレンに転写し、３２Ｐで標識したｍｐｔｐＢのＤＮＡ断片をプローブとして使用した。標準ＤＮＡのサイズは、ゲルの左側に示し、ハイブリダイゼーション処理バンドのサイズはゲルの右側に示す。（Ｂ）マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）とｍｐｔｐＢ突然変異株（ＭＴ１，ＭＴ２，ＭＴ３）の免疫ブロット分析。マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型とｍｐｔｐＢ突然変異株におけるＭｐｔｐＢの発現を免疫ブロット法により分析した。株を７Ｈ９培地において対数増殖期の中期まで成長させた。等量の全細胞ライセートタンパク質（４０ｇ）を、１２.５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ハイボンドＣエクストラメンブレンに転写し、ウサギにおけるＭｐｔｐＢに対するポリクローナル血清を使用してＭｐｔｐＢの発現についてブロット分析を行った。
【図８】マクロファージ中のマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型およびｍｐｔｐＢ突然変異株の生存。マウスのマクロファージ細胞株Ｊ７７４Ａ.１に、マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型およびｍｐｔｐＢ突然変異株を１：１０（マクロファージ：細菌）のＭＯＩで別々に感染させた。感染後の異なる時点（０，２，４，６，８日後）でマクロファージを溶解し、ＭＢ７Ｈ１０プレート上にプレーティングすることによって細胞内のマイコバクテリアの数を見積もった（Ａ：静止状態のマクロファージの場合、Ｂ：活性化マクロファージの場合）。この実験を２回行うことを２度繰り返した、データは、４個の値すべての平均±標準誤差として示している。
【図９】５×１０５ｃｆｕの野生型（ＷＴ）、ｍｐｔｐＢ突然変異株（ＭＴ）、および相補株（ＣＴ）に感染させ、感染後３週間（Ａ）および６週間（Ｂ）において安楽死させたモルモットの死後の合計スコア。安楽死のときに、脾臓、肝臓、肺、リンパ節、および感染部位における病理学上の損傷の程度に応じて、Mitchisonによって記載された方法で各器官にスコアを割り当てた。個々の器官について得られるスコアを合計することによって、各動物の合計スコアを算出し、ｙ軸に平均±標準誤差として示す。ｘ軸にはマイコバクテリア株の種類を示す。
【図１０】５×１０５ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型（ＷＴ）、ｍｐｔｐＢ突然変異株（ＭＴ）、または相補株（ＣＴ）のいずれかを感染させ、感染後３週間（Ａ）および６週間（Ｂ）で安楽死させたモルモットの脾臓における細菌数。脾臓を５ｍｌの蒸留水でホモジナイズし、脾臓のホモジェネートの１０倍段階希釈液をＬＪスロープ上にプレーティングした。感染後３週間（Ａ）および６週間（Ｂ）で安楽死させたモルモットの脾臓における細菌数を求め、ｌｏｇ１０ｃｆｕに変換し、ｙ軸に平均±標準誤差として示す。ｘ軸にはマイコバクテリア株の種類を示す。
【図１１】５×１０５ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型、ｍｐｔｐＢ突然変異株、または相補株のいずれかを感染させ、感染後３週間で安楽死させたモルモットの肝臓および肺の組織病理学像。無菌条件下で肝臓および肺の一部を切り出し、１０％ホルマリンで固定した。組織の５μｍ厚の組織切片をヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、倍率１０倍で組織病理学的に解析した。モルモットの３つのグループすべての肝臓（Ａ）および肺（Ｂ）の代表的な切片を示す。対照組織像として、未感染のモルモットの肝臓および肺の切片を使用した。
【図１２】５×１０５ｃｆｕのマイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型、ｍｐｔｐＢ突然変異株、または相補株のいずれかを感染させ、感染後６週間で安楽死させたモルモットの肝臓および肺の組織病理学的な観察像。マイコバクテリウム・テュバキュローシスの野生型、ｍｐｔｐＢ突然変異体、および相補株を感染させたモルモットの肝臓および肺の切片（５μｍ）を固定および処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡で倍率１０倍で観察した。モルモットの３つのグループすべての肝臓（Ａ）および肺（Ｂ）の代表的な切片を示す（挿入写真は高倍率（２０倍））。対照組織像として、未感染のモルモットの肝臓および肺の切片を使用した。
【図１】
2007526753.tif 000003
【図２】
2007526753.tif 000004
【図３】
2007526753.tif 000005
【図４】
2007526753.tif 000006
【図５】
2007526753.tif 000007
【図６】
2007526753.tif 000008
【図７】
2007526753.tif 000009
【図８】
2007526753.tif 000010
【図９】
2007526753.tif 000011
【図１０】
2007526753.tif 000012
【図１１】
2007526753.tif 000013
【図１２】
2007526753.tif 000014
【配列表】
2007526753000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月11日(2006.5.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2007526753000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
配列番号１６の配列を含んでいる、改変されたｍｐｔｐＢ遺伝子を有する組換えベクター。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
前記抗生物質耐性マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンまたはクロラムフェニコールから選択される抗生物質への耐性を与える、請求項７記載の組換えベクター。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２０】
前記第１の抗生物質耐性マーカー遺伝子は、ハイグロマイシンまたはクロラムフェニコールから選択される抗生物質への耐性を与える、請求項１３記載の方法。
【国際調査報告】
2007526753.tif 000031
2007526753.tif 000032
2007526753.tif 000033
2007526753.tif 000034