(57)【要約】 本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） を使用した、ＨＣＶ遺伝子発現の調節に有効な化合物、組成物、および方法に関する。本発明はまた、ＨＣＶ 遺伝子発現経路および／または小核酸分子を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による活性に含まれる、その他の遺伝子の発現または活性の調節に有効な化合物、組成物、および方法にも関する。特に、本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ） 分子等の小核酸を特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式ＭＦ−ＩＩＩ
【化１】
2007505606.tif 000092
を持つ構造を有する多機能ｓｉＮＡ分子であって、式中、
（ａ） Ｘ、Ｘ'、Ｙ およびＹ'はそれぞれ独立して約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、
（ｂ） Ｘは領域Ｙ'に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、 （ｃ）Ｘ' は領域Ｙに存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、（ｄ）ＸおよびＸ' はそれぞれ独立して第一および第二のＨＣＶ標的核酸配列、またはその一部と安定して相互作用するに足る長さであり、
（ｅ） Ｗは配列Ｙ'およびＹを結合するヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを示し、また
（ｆ） 前記多機能ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉を介して第一および第二のＨＣＶ標的配列の切断を指示する、
ことを特徴とする多機能ｓｉＮＡ。
【請求項２】
Ｗが配列Ｙ'の３'端と配列Ｙの３'端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項３】
Ｗが配列Ｙ'の３'端と配列Ｙの５'端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項４】
Ｗが配列Ｙ'の５'端と配列Ｙの５'端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項５】
Ｗが配列Ｙ'の５'端と配列Ｙの３'端を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項６】
末端リン酸基が配列Ｘ、Ｘ'、Ｙ 、またはＹ' のいずれかの５' 端に存在する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ 分子。
【請求項７】
Ｗが生分解性リンカーを介して配列ＹとＹ' を結合する、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項８】
Ｗがコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、またはポリマーをさらに含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項９】
配列Ｘ、Ｘ'、Ｙ 、またはＹ'のいずれかが３' 末端キャップ部を含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ 分子。
【請求項１０】
前記末端キャップ部が逆位のデオキシ脱塩基部分である、請求項９に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１１】
前記末端キャップ部が逆位のデオキシヌクレオチド部分である、請求項１０に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１２】
前記末端キャップ部がジヌクレオチドである、請求項１０に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１３】
前記ジヌクレオチドがジチミジン（ＴＴ）である、請求項１２に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１４】
前記ｓｉＮＡ分子がリボヌクレオチドを含まない、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１５】
前記ｓｉＮＡ分子が１つ以上のリボヌクレオチドを含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１６】
前記ｓｉＮＡにおける任意のプリンヌクレオチドが２'−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチドである、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ 分子。
【請求項１７】
前記ｓｉＮＡにおける任意のプリンヌクレオチドが２'−デオキシプリンヌクレオチドである、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１８】
前記ｓｉＮＡにおける任意のピリミジンヌクレオチドが２'−デオキシ−２'−フルオロピリミジン・ヌクレオチドである、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項１９】
Ｘ、Ｘ'、Ｙ 、およびＹ'がそれぞれ独立して約１９から約２３ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項２０】
前記第一および第二のＨＣＶ 標的配列がそれぞれＨＣＶ ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ 分子。
【請求項２１】
前記第一のＨＣＶ標的配列がＨＣＶ ＲＮＡ配列であり、前記第二のＨＣＶ標的配列がＨＣＶ感染または複製に必要な細胞性標的ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項２２】
前記第一のＨＣＶ標的配列がＨＣＶ感染または複製に必要な細胞性標的ＲＮＡ配列であり、前記第二のＨＣＶ標的配列がＨＣＶ ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子。
【請求項２３】
前記第一および第二のＨＣＶ標的配列がそれぞれＨＣＶ感染または複製に必要な細胞性標的ＲＮＡ配列である、請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ 分子。
【請求項２４】
前記細胞性標的ＲＮＡ配列が、Ｌａ 抗原、ＦＡＳ、ＦＡＳリガンド、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）、細胞性ＰＫＲタンパク質、ｅｌＦ２Ｂガンマ、ｅｌＦ２ガンマ、ヒトＤＥＡＤボックスタンパク質（ＤＤＸ３）、およびポリピリミジン・トラクト結合タンパク質から選択される、請求項２１または２２に記載の多機能ｓｉＮＡ 分子。
【請求項２５】
請求項１に記載の多機能ｓｉＮＡ分子および許容できる担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２００３年９月１６日に出願された米国特許出願番号１０／６６７，２７１の一部継続であり、これは２００３年２月２０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０４３の一部継続であり、これは２００２年３月２６日に出願されたマックスウィジェン（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）ＰＣＴ／ＵＳ０２／０９１８７の一部出願であり、２００２年８月５日に出願されたマックスウィジェン（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）ＵＳＳＮ６０／４０１，１０４の利点を要求するものである。本出願は２００４年５月２４日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／１６３９０の一部継続でもあり、これは２００４年４月１６日に出願された米国特許出願番号１０／８２６，９６６の一部継続であり、これは２００４年１月１４日に出願された米国特許出願番号１０／７５７，８０３の一部継続であり、これは２００３年１１月２４日に出願された米国特許出願番号１０／７２０，４４８の一部継続であり、これは２００３年１０月２３日に出願された米国特許出願番号１０／６９３，０５９の一部継続であり、これは２００３年５月２３日に出願された米国特許出願番号１０／４４４，８５３の一部継続であり、これは２００３年２月２０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５３４６の一部継続であり、また、２００３年２月２０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０５０２８の一部継続であり、いずれも２００２年２月２０日に出願された米国仮出願番号６０／３５８，５８０、２００２年３月１１日に出願された米国仮出願番号６０／３６３，１２４、２００２年６月６日に出願された米国仮出願番号６０／３８６，７８２、２００２年８月２９日に出願された米国仮出願番号６０／４０６，７８４、２００２年９月５日に出願された米国仮出願番号６０／４０８，３７８、２００２年９月９日に出願された米国仮出願番号６０／４０９，２９３、および２００３年１月１５日に出願された米国仮出願番号６０
／４４０，１２９の利点を要求するものである。本出願はまた、２００４年４月３０日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／１３４５６の一部継続であり、これは２００４年２月１３日に出願された米国特許出願番号１０／７８０，４４７の一部継続であり、これは２００３年４月３０日に出願された米国特許出願番号１０／４２７，１６０の一部継続であり、これは２００２年５月１７日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０２／１５８７６の一部継続であり、２００１年５月１８日に出願された米国仮出願番号６０／２９２，２１７、２００２年３月６日に出願された米国仮出願番号６０／３６２，０１６、２００１年７月２０日に出願された６０／３０６，８８３、および２００１年８月１３日に出願された米国仮出願番号６０／３１１，８６５の利点を要求するものである。本出願はまた、２０００年１２月３日に出願された米国特許出願番号１０／７２７，７８０の一部継続である。本出願はまた、２００４年２月１０日に出願された米国仮出願番号６０／５４３，４８０の利益を要求するものである。本出願は、記載した全出願の利益を主張し、全出願は参照することにより図を含むその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ） 遺伝子発現および／または活性の変調に影響される形質、疾患および状態の研究、診断、および治療用の化合物、組成物、および方法に関する。本発明はまた、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）遺伝子発現経路、もしくはそのような形質、疾患、および状態の持続または進行を媒介する、その他の細胞過程に含まれる遺伝子の発現および／または活性の調節に影響される形質、疾患、状態に関連する化合物、組成物、および方法も対象としている。特に、本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ） 遺伝子発現に対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ） を媒介できる低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子等の小核酸分子に関する。そのような小核酸分子は、例えば、ＨＣＶ 感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、および／またはＨＣＶ感染に伴って対象または生物体において起こるその他の疾患状態を阻止、抑制、または軽減する組成物の提供において有用である。
【背景技術】
【０００３】
以下はＲＮＡｉに関する関連技術の考察である。この考察は、以下に続く発明をより分かりやすくすることを唯一の目的として提供される。要約は、下記のいかなる研究をも、請求の範囲に記載の発明に対する先行技術として認めるものではない。
【０００４】
ＲＮＡ干渉は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される動物における配列特定転写後遺伝子抑制を意味する（ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら，２０００年、セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３； ファイヤー（Ｆｉｒｅ） ら，１９９８年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６； ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ） ら，１９９９年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８６、９５０−９５１； リン（Ｌｉｎ） ら，１９９９年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０２、１２８−１２９； シャープ（Ｓｈａｒｐ），１９９９年， 遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．）、１３：１３９−１４１； およびストラウス（Ｓｔｒａｕｓｓ），１９９９年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８６、８８６）。植物においてこれに相当するプロセス（ハイフェッツ（Ｈｅｉｆｅｔｚ） ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／６１６３１）は一般に転写後遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡサイレンシングと呼ばれ、菌類においてはクエリングとも呼ばれる。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防ぐために様々な植物相および門が一般的に共有する進化的に保存された細胞防御機構であると考えられている（ファイヤー（Ｆｉｒｅ） ら，１９９９年，トレンド遺伝学誌（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，１５，３５８）。外来遺伝子発現からのそのような保護は、ウィルス感染または特に同種の一本鎖ＲＮＡまたはウィルスゲノムＲＮＡを破壊する細胞応答を介したホストゲノムへのトランスポゾン要素のランダムな統合から派生した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の生成に応答して発生することができる。細胞にｄｓＲＮＡが存在すると、まだ完全には解明されていない機序を通じてＲＮＡｉ応答を誘発する。この機序は、リボヌクレアーゼＬによるｍＲＮＡの非特定切断を生じるタンパク質キナーゼＰＫＲおよび２'、５'−オリゴアデニル酸合成酵素のｄｓＲＮＡ媒介性活性に起因するインターフェロン応答性といった二本鎖ＲＮＡ特定のリボヌクレアーゼを含む他の既知の機序とは異なるようである（例として、米国特許６，１０７，０９４；５，８９８，０３１； クレメンス（Ｃｌｅｍｅｎｓ） ら，１９９７年，ジャーナル・オブ・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサーチ誌（Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．，１７，５０３−５２４；アダ（Ａｄａｈ）ら，２００１年，カレント・メディカル・ケミストリー誌（Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，８，１１８９を参照）。
【０００５】
細胞に長鎖ｄｓＲＮＡが存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレアーゼＩＩＩ酵素の活性が誘発される（バス（Ｂａｓｓ），２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２３５；ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ）ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３；ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄｅｔ） ら、２０００，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０４，２９３）。ダイサーはｄｓＲＮＡを低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られる短鎖ｄｓＲＮＡへの処理に関与する（ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ） ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３；バス（Ｂａｓｓ），２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２３５； バースタイン（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ） ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０９，３６３）。ダイサー作用から派生する低分子干渉ＲＮＡは、一般的に約２１から約２３ヌクレオチド長であり、約１９の塩基対二重鎖で構成される（ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ） ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３； エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ） ら，２００１年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。ダイサーは、２１および２２ヌクレオチドの低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）を、翻訳調整に関わる保存構造の前駆ＲＮＡから切除する場合にも関与している（ハットヴァーグナー（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ）ら，２００１年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９３，８３４）。ＲＮＡｉ応答は、一般にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ） と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体も特徴とする。これはｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を持つ一本鎖ＲＮＡの切断を媒介する。標的ＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中間で発生する（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。
【０００６】
ＲＮＡｉは様々な類系で研究されている。ファイヤー（Ｆｉｒｅ） ら（１９９８年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６） は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ） において初めてＲＮＡｉを観察し、バハミアン（Ｂａｈａｍｉａｎ） とザーブル（Ｚａｒｂｌ）（１９９９年， 分子細胞生物学誌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１９，２７４−２８３） およびウィアニー（Ｗｉａｎｎｙ） とゲッツ（Ｇｏｅｔｚ）（１９９９年，ネイチャー細胞生物学誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２，７０）は哺乳類系においてｄｓＲＮＡが媒介するＲＮＡｉについて記述している。ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ） ら（２０００年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡとともに導入されるショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ） ら（２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４９４） およびトゥッシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４） は、ヒト胚腎臓およびＨｅＬａ細胞を含む培養哺乳類細胞内の合成２１ヌクレオチドＲＮＡの二重鎖導入によって誘導されるＲＮＡｉについて記述している。ショウジョウバエ胚の溶解物における最近の研究（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７およびトゥッシュル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）によって、効率的なＲＮＡｉ活性の媒介に必須のｓｉＲＮＡ長、構造、化学組成、および配列に対する特定の要件が明らかになった。これらの研究は、３' 端ジヌクレオチド突出部を含む場合、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ 二重鎖が最も活性であることを示している。さらに、一方または両方のｓｉＲＮＡ鎖を２'−デオキシ（２'−Ｈ）または２'−Ｏ−メチルヌクレオチドと完全に置換した場合はＲＮＡｉを不活性化したのに対し、３' 端ｓｉＲＮＡ 突出ヌクレオチドを２'−デオキシヌクレオチド（２'−Ｈ ）と置換した場合は耐性を示した。またｓｉＲＮＡ二重鎖の中心にある単一のミスマッチ配列も、ＲＮＡｉを不活性化することを示した。加えて、これらの研究は標的ＲＮＡにおける切断部位がガイド配列の３' 端ではなくｓｉＲＮＡガイド配列の５'端によって定義されることも示している（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ）ら，２００１年，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。他の研究によって、ｓｉＲＮＡ二重鎖の標的相補鎖上にある５'−リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であること、およびｓｉＲＮＡ 上に５'−リン酸を維持するためにＡＴＰが利用されることが明らかになっている（ニカネン（Ｎｙｋａｎｅｎ） ら，２０００１年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０７，３０９）。
【０００７】
研究では、２−ヌクレオチド３'−突出部を持つ２１−量体ｓｉＲＮＡ二重鎖の３'端ヌクレオチド突出部分をデオキシリボヌクレオチドと置換してもＲＮＡｉ活性に悪影響を与えないことが証明されている。ｓｉＲＮＡの各末端にある４つまでのヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドと置換する場合は優れた耐性を持つが、デオキシリボヌクレオチドを完全に置換する場合はＲＮＡｉが不活性化されることが報告されている（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７およびトゥッシェル（Ｔｕｓｃｈｌ ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）。さらに、エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ） ら（ 前述） は、ｓｉＲＮＡを２'−Ｏ −メチルヌクレオチドと置換することで完全にＲＮＡｉ が不活性化されることも報告している。リー（Ｌｉ）らの国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４、およびビーチ（Ｂｅａｃｈ）らの国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６は、少なくとも１つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含むためにｓｉＲＮＡがリン酸−糖骨格またはヌクレオシドのいずれかを修飾することがあると仮定しているが、そのような修飾がｓｉＲＮＡにおいてどの程度耐性を持つかということは想定しておらず、そのような修飾ｓｉＲＮＡに関する詳細な説明も例証も提供されていない。またクロイツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒｅｔ）等のカナダ特許出願番号２，３５９，１８０も、二本鎖ＲＮＡ依存タンパク質キナーゼＰＫＲ、特に２'−アミノまたは２'−Ｏ−メチルヌクレオチド、および２'−Ｏまたは４'−Ｃ メチレン橋を含むヌクレオチドの活性に対抗するためのｄｓＲＮＡ構成に使用する特定の化学修飾について記述している。しかし、クロイツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ） らも同様に、それらの修飾がどの程度ｄｓＲＮＡ分子において耐性を持つかについての例証または説明を提供していない。
【０００８】
パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ ）ら（２０００年，分子細胞誌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ），６，１０７７−１０８７） は、長い（＞２５ｎｔ） ｓｉＲＮＡ転写物を使用して、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）におけるｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学修飾をテストした。その著者らは、チオリン酸ヌクレオチド類似体をＴ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼに組み込むことによってチオリン酸残基をそれらｓｉＲＮＡ 転写物に導入することについて記述しており、２つのホスホロチオエート修飾塩基を持つＲＮＡのＲＮＡｉとしての有効性を著しく低減したことを観察した。さらに、パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）らは、２つ以上の残基のホスホロチオエート修飾がインビトロでＲＮＡを著しく不安定化したため、干渉作用を分析できなかったと報告した（前記１０８１ページ）。またこの著者らは、長いｓｉＲＮＡ転写物におけるヌクレオチド糖の２' 位での特定の修飾をテストし、特にウリジンからチミジンおよび／またはシチジンからデオキシシチジンへの置換の場合に、デオキシヌクレオチドをリボヌクレオチドと置換することで干渉作用が大幅に減少することを発見した（同様）。さらに、彼らはｓｉＲＮＡ のセンスおよびアンチセンス鎖、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−イオドウラシル、ウラシルの３−（アミノアリル）ウラシル、およびグアノシンのイノシンにおいて、置換を含む特定の塩基修飾のテストを行った。４−チオウラシルおよび５−ブロモウラシルの置換は耐性を持つように思われたが、パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ）はイノシンがいずれかの鎖に組み込まれた場合に干渉作用を著しく減少させると報告した。またパリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ） は、５−イオドウラシルおよび３−（ アミノアリル） ウラシルをアンチセンス鎖に組み込むことで、ＲＮＡｉ活性も大幅に減少することを報告した。
【０００９】
長鎖ｄｓＲＮＡの使用について記述されている。例えば、ビーチ（Ｂｅａｃｈ） ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６）は、内生的に派生したｄｓＲＮＡを使用して遺伝子発現を減衰させる特定の方法について説明している。トゥッシェル（Ｔｕｓｃｈｌ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７５１６４）は、ショウジョウバエのインビトロＲＮＡｉシステムについて、また特定の機能的ゲノムアプリケーションおよび特定の治療用アプリケーションに対する特定のｓｉＲＮＡ 分子の使用について説明している。しかし、トゥッシェル（Ｔｕｓｃｈｌ）（２００１年，化学と生物化学誌（Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，２３９−２４５）は、インターフェロン応答性を活性化する危険性があるため、ＲＮＡｉを遺伝性疾患またはウィルス感染の治療に使用することについて疑問視している。リー（Ｌｉ）ら（国際ＰＣＴ 公開ＷＯ００／４４９１４）は、特定の標的遺伝子の発現を減衰するために、特定の長い（１４１−４８８塩基対）酵素合成したｄｓＲＮＡまたはベクター発現したｄｓＲＮＡの使用について説明している。ツェルニッカ−ゲッツ（Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６）は、特定の長さ（５５０−７１４塩基対）の酵素合成したｄｓＲＮＡ分子またはベクター発現したｄｓＲＮＡ 分子を使用して、哺乳類細胞における特定遺伝子の発現を抑制する方法について説明している。ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９） は、線虫類における遺伝子発現の抑制に使用するため、特定の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を細胞に導入する特定の方法について説明している。プラティンク（Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ） ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８４６） は、特定の長鎖ｄｓＲＮＡ分子を使用して、細胞内の特定表現型の付与の原因である特定の遺伝子を識別する方法について説明している。メロー（Ｍｅｌｌｏ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８）は、ｄｓＲＮＡ 媒介性ＲＮＡｉに関与する特定遺伝子の識別について説明している。パチャック（Ｐａｃｈｕｃｋ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／６３３６４）は、特定の長さ（少なくとも２００ヌクレオチド）のｄｓＲＮＡ構成について記述している。デション・ダパイェット（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０９）は、特定の抗ウィルス剤と結合する特定のｄｓＲＮＡで構成される特定の組成物について説明している。ウォーターハウス（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／５３０５０および１９９８年米国サイエンスアカデミー会報（ＰＮＡＳ），９５，１３９５９−１３９６４） は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、植物細胞における核酸の形質発現を減少させる方法について説明している。ドリスコール（Ｄｒｉｓｃｏｌｌ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／４９８４４） は、標的生物体において遺伝子のサイレンシングを促進するために使用する特定のＤＮＡ発現構成について触れている。
【００１０】
様々なＲＮＡｉおよび遺伝子サイレンシングシステムに関する他の報告もある。例えば、パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ） ら（２０００年， 分子細胞（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ），６，１０７７−１０８７）は、シー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）のｕｎｃ−２２遺伝子を標的とする特定の化学修飾ｄｓＲＮＡについて説明している。グロスニクラウス（Ｇｒｏｓｓｎｉｋｌａｕｓ）（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３８５５１）は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、植物におけるポリコーム遺伝子発現を制御する特定の方法について説明している。チュリコフ（Ｃｈｕｒｉｋｏｖ ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／４２４４３）は、特定のｄｓＲＮＡを使用して、生物体の遺伝子特性を修飾する特定の方法について説明している。コゴニ（Ｃｏｇｏｎｉ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／５３４７５） は、アカパンカビのサイレンシング遺伝子を分離する特定の方法およびその使用について説明している。リード（Ｒｅｅｄ） ら（ 国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／６８８３６）は、植物における遺伝子サイレンシングの特定の方法について説明している。ホルネル（Ｈｏｎｅｒ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７０９４４） は、特定のｄｓＲＮＡ を使用して、パーキンソン病モデルとして遺伝子組み換え線虫類を用いた薬物スクリーニングの特定方法について説明している。ディーク（Ｄｅａｋ ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／７２７７４）は、ショウジョウバエにおいてＲＮＡｉに関連する特定のショウジョウバエ由来の遺伝子産物について説明している。アルンド（Ａｒｎｄｔ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９２５１３） は、ＲＮＡｉ を強化する要素を使用することによって遺伝子発現を媒介する特定の方法について説明している。トゥシュリル（Ｔｕｓｃｌｉｌ） ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／４４３２１）は、特定の合成ｓｉＲＮＡ 構成について説明している。パチャック（Ｐａｃｈｕｋ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／６３３６４）およびサティシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／０４３１３）は、特定の長さ（２５０塩基対以上）のｄｓＲＮＡ、ベクター発現したｄｓＲＮＡ を使用して、特定のポリヌクレオチド配列の機能を抑制する特定の方法および組成物について説明している。エチェベッリ（Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉ） ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／３８８０５）は、ＲＮＡｉを介して識別される特定のシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）遺伝子について説明している。クロイツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ）ら（国際ＰＣＴ公開国際ＰＣＴ公開ＷＯ０２／０５５６９２、ＷＯ０２／０５５６９３およびＥＰ１１４４６２３Ｂｌ） はｄｓＲＮＡを使用した遺伝子発現の抑制方法について説明している。グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら（国際ＰＣＴ公開国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／４９０２９およびＷＯ０１／７０９４９、ＡＵ４０３７５０１） は、特定のベクター発現したｓｉＲＮＡ分子について説明している。ファイヤー（Ｆｉｒｅ ）ら（米国特許６，５０６，５５９）は、ＲＮＡｉを媒介する特定の長さのｄｓＲＮＡ（２９９−１０３３塩基対）構成を使用したインビトロ遺伝子発現の抑制方法について説明している。マルティネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ ）ら���２００２年， セル誌（Ｃｅｌｌ），１１０，５６３−５７４） はＨｅｌａ細胞におけるＲＮＡ干渉を媒介する特定の５'−リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡを含む特定の一本鎖ｓｉＲＮＡ構成について説明している。ハーボース（Ｈａｒｂｏｒｔｈ）ら（２００３年，アンチセンス核酸薬剤開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ），１３，８３−１０５） は、化学的および構造的に修飾した特定のｓｉＲＮＡ分子について説明している。チウ（Ｃｈｉｕ） とラナ（Ｒａｎａ）（２００３年，ＲＮＡ，９，１０３４−１−４８） は、化学的および構造的に修飾した特定のｓｉＲＮＡ分子について説明している。ウルフ（Ｗｏｏｌｆ） ら（国際ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４６２６およびＷＯ０３／０６４６２５）は化学修飾した特定のｄｓＲＮＡ構成について説明している。
【００１１】
マキャフリー（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ） ら（２００２年， ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１８，３８−３９）は、マウスにおけるキメラＨＣＶＮＳ５Ｂプロテイン／ルシフェラーゼ転写を標的とする特定のｓｉＲＮＡ構成の使用について説明している。
【００１２】
ランドール（Ｒａｎｄａｌｌ ）ら（２００３年，米国科学アカデミー紀要誌（ＰＮＡＳ ＵＳＡ），１００，２３５−２４０） は、ヒト肝細胞癌細胞株Ｈｕｈ７におけるＨＣＶ ＲＮＡを標的とする特定のｓｉＲＮＡ 構成について説明している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ） によって、ＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、および／またはＨＣＶ感染に伴って起こるその他の疾患状態の持続または進行に関連する遺伝子の発現を調節するのに有効な、化合物、組成物、および方法に関する。本発明はまた、小核酸分子を使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）による、ＨＣＶ遺伝子発現経路および／または活性に関与する他の遺伝子の発現または活性の調節に有効な化合物、組成物、および方法に関する。特に、本発明は、ＨＣＶ 遺伝子および／またはＨＣＶ遺伝子の発現および／または感染経路に関与する他の遺伝子（細胞遺伝子または宿主遺伝子）の発現を調節するために使用される、低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ） 分子等の小核酸分子および方法を特徴とする。
【００１４】
本発明のｓｉＮＡは非修飾であっても、化学修飾されたものであってもよい。本発明のｓｉＮＡは、化学合成、ベクター発現、または酵素合成されることができる。本発明は、細胞中のＨＣＶ 遺伝子発現または活性をＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ ）によって調節できる様々な化学修飾された合成低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子も特徴とする。化学修飾したｓｉＮＡを使用することで、インビボヌクレアーゼ分解に対する耐性および／または細胞摂取が増加し、野生型ｓｉＲＮＡ分子の様々な特性を改善することができる。さらに、先に公開された研究に反し、複数の化学修飾を有するｓｉＮＡはそのＲＮＡｉ活性を保持する。本発明のｓｉＮＡ分子は、治療用、動物用、診断用、標的の確認用、ゲノム上の発見用、遺伝子工学用、および薬理ゲノミクス上の応用を含む、様々なアプリケーションにおける有効な試薬および方法を提供する。
【００１５】
１つの態様においては、本発明は、独立してまたは共同して、ＨＣＶおよび／またはＨＣＶ 感染、肝不全、肝細胞癌、および肝硬変の維持または進行に関連する細胞タンパク質をコードする遺伝子、例えば表１のジンバンクアクセッション番号で参照され、本明細書では概してＨＣＶと呼ばれるそれらの配列を含む配列をコードする遺伝子の発現を調節する、１つ以上のｓｉＮＡ分子および方法を特徴とする。本発明の様々な側面および態様に関する以下の記述は、本明細書では概してＨＣＶと呼ばれる典型的なＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）遺伝子を参照して提供される。しかし、そのような参照は単に典型例を示したにすぎず、本発明の様々な側面および態様は、本明細書で記載されるようなＨＣＶに対する細胞内標的と同様に、ＨＣＶ変異、ＨＣＶ遺伝子のスプライスバリアント、および異種系統のＨＣＶをコードする遺伝子等、ＨＣＶの代替遺伝子を発現するその他の遺伝子も対象とする。様々な側面および態様は、ＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、および肝硬変の維持および／または進行に関連する細胞タンパク質をコードする遺伝子を含む、ＨＣＶ 経路に含まれるその他の遺伝子、または、ＨＣＶライフサイクルにおいて使用される細胞タンパク質等、ＨＣＶ感染に関連するその他のタンパク質を発現するその他の遺伝子も対象とする。このような追加の遺伝子について、本明細書で記載するＨＣＶのための方法を使用して標的部位を分析することができる。従って、その他の遺伝子の抑制およびそのような抑制の影響は、本明細書に記載するように実行されることができる。すなわち「ＨＣＶ」という用語は、以下で定義するように、また記載した態様において挙げるように、遺伝子発現、複製および／またはＨＣＶ活性の経路に含まれる細胞遺伝子と同様、異種系統のＨＣＶ、変異ＨＣＶ遺伝子、およびＨＣＶ遺伝子のスプライスバリアントのポリペプチドを含むＨＣＶポリペプチドをコードする遺伝子等、ＨＣＶ感染の進行および維持に関連する遺伝子を包含することが意図されている。また、「ＨＣＶ」という用語は、以下で定義するように、また記載した態様において挙げるように、本明細書に記載されるようなＨＣＶ感染に関連するＨＣＶウィルス性遺伝子産物および細胞遺伝子産物を包含することが意図されている。従って、「ＨＣＶ」という用語を参照して本明細書に記載する各態様は、本明細書で定義される「ＨＣＶ」という用語が適用されるすべてのウィルス、細胞およびウィルスタンパク質、ペプチド、ポリペプチド、および／またはポリヌクレオチド分子に当てはまる。
【００１６】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶマイナス鎖、例えばジンバンクアクセッション番号ＨＰＣＫ１Ｓ１、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ−ｌｂ株、ＨＣＶ−Ｋ１−Ｓ１クローン）、完全ゲノム； ジンバンクアクセッション番号Ｄ５０４８３，９４１０ｎｔ． に対するＲＮＡｉ 特異性を持つｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００１７】
１つの態様においては、本発明は、独立してまたは共同して、細胞受容体、細胞表面分子、細胞性酵素、細胞転写因子、および／ またはサイトカイン等のＨＣＶ感染に対する細胞内標的を代表する遺伝子発現、二次メッセンジャー、および、細胞アクセサリー分子、例えば、限定されないが、Ｌａ抗原（例えばコスタ−マッティオーリ（Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ）ら，２００４年，分子細胞生物学誌（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２４，６８６１−７０， 例としてジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００３１４２を参照）；ＦＡＳ （例としてジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００００４３）またはＦＡＳリガンド（例としてジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０００６３９）； インターフェロン調節因子（ＩＲＦ； 例としてジンバンクアクセッション番号ＡＦ０８２５０３．１）； 細胞性ＰＫＲタンパク質キナーゼ（例としてジンバンクアクセッション番号Ｎｏ．ＸＭ＿００２６６１．７）； ヒトの真核型転写開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂガンマ； 例としてジンバンクアクセッション番号ＡＦ２５６２２３， および／またはｅｌＦ２ガンマ；例としてジンバンクアクセッション番号Ｎｏ．ＮＭ＿００６８７４．１）； ヒトＤＥＡＤボックスタンパク質（ＤＤＸ３； 例としてジンバンクアクセッション番号ＸＭ＿０１８０２１．２）； およびポリピリミジン・トラクト結合タンパク質のようなＨＶＣの３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ） トラクトに結合する細胞性タンパク質（例としてジンアクセッション番号ＮＭ＿０３１９９１．１およびＸＭ＿０４２９７２．３）を調節する１つ以上のｓｉＮＡ分子、ならびに方法を特徴とする。そのような細胞内標的をまた、本明細書では概して「ＨＣＶ標的」、特に「宿主標的」と呼ぶ。
【００１８】
ＨＣＶゲノムの高い配列多様性のため、広範な治療用途のためのｓｉＲＮＡ分子の選択はウィルスゲノムの保存領域を含むであろう。１つの態様においては、本発明はＨＣＶゲノムの保存領域を標的とするｓｉＮＡ分子に関する。ＨＣＶゲノムの保存領域に関する例は、５’−非コード領域（ＮＣＲ、５’ −非翻訳領域（ＵＴＲ） とも呼ばれる）、コアタンパク質コード領域の５’端および３’−ＮＣＲを含むがこれらに限定されない。ＨＣＶゲノムＲＮＡは、５’−キャップ構造の翻訳を独立して媒介する５’−ＮＣＲの内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む（ワン（Ｗａｎｇ）ら，１９９３年，ウィルス学雑誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７，３３３８−４４）。臨床的に単離されたサブタイプによりＨＣＶ ＲＮＡゲノムの全長配列は均一ではなく、これは少なくとも１５ある（シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ），１９９５年，肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ），２１，５７０−５８３）。しかし、ＨＣＶの５’−ＮＣＲ 配列は既知のすべてのサブタイプにわたり高度に保存されており、これはおそらく共通のＩＲＥＳ 機序を保存するためであろう（オカモト（Ｏｋａｍｏｔｏ） ら，１９９１年， 一般ウィルス学誌（Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌ．，７２，２６９７−２７０４）。従って、ｓｉＮＡ分子は、５’ＮＣＲ配列等の保護領域を標的とすることにより、ＨＣＶの異なる分離株を標的とするようにデザインできる。様々なＨＣＶ分離株の保護領域を標的とするようにデザインされたｓｉＮＡ分子は、多様な患者におけるＨＣＶ複製の十分な抑制が可能であり、ＨＣＶゲノムの非保護領域における突然変異により進化するＨＣＶ類似種に対してｓｉＮＡ分子の実効性を確保する。記載のとおり、単一のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子をＨＣＶの保存されるヌクレオチド配列と相互作用するようにデザインすることにより、ＨＣＶの分離株すべてに対して標的とされることができる（例として、様々なＨＣＶ分離株のＲＮＡ に存在すると予想される配列）。
【００１９】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡ分子は約１５から約２８塩基対を含む。
【００２０】
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ） を介してＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで二本鎖低分子干渉核酸分子は第一および第二鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２８ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の分子の第一鎖はｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨＣＶ ＲＮＡの切断を指示するようＨＣＶＲＮＡ に対する十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＮＡ分子の第二鎖は第一鎖に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ） を介してＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで二本鎖低分子干渉核酸分子は第一および第二鎖を含み、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２３ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の分子の第一鎖はｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨＣＶ ＲＮＡの切断を指示するようＨＣＶＲＮＡ に対する十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含み、前期ｓｉＮＡ分子の第二鎖は第一鎖に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ） を介してＨＣＶ ＲＮＡ の切断を支持する化学修飾した二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ ）分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２８ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の一方の鎖はｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨＣＶＲＮＡ の切断を指示するようＨＣＶ ＲＮＡ に対する十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ） を介してＨＣＶ ＲＮＡ の切断を支持する化学修飾した二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ ）分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖は約１８から約２３ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の一方の鎖はｓｉＮＡ分子がＲＮＡ干渉を介してＨＣＶＲＮＡ の切断を指示するようＨＣＶ ＲＮＡ に対する十分な相補性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２４】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示するｓｉＮＡ分子を特徴とし、例えばＨＣＶ遺伝子またはＲＮＡはＨＣＶをコードする配列を含む。１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡの切断を指示するｓｉＮＡ分子を特徴とし、例えばここでＲＮＡのＨＣＶ遺伝子はＨＣＶ遺伝子発現に関与するＨＣＶの非コーディング配列または調節要素を含む。
【００２５】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡはＨＣＶ遺伝子またはＨＣＶ遺伝子ファミリー（例として、異なるＨＣＶ株）の発現を抑制するために使用され、ここで前記遺伝子または遺伝子ファミリーの配列は配列相同性を共有する。そのような相同配列は、例えば配列アラインメントを使用して、当該技術分野において知られるように識別することができる。ｓｉＮＡ分子は、例えば完全に相補的な配列を使用して、または追加の標的配列を提供することができる非正準塩基対（例えばミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対）を組み込んで、そのような相同配列を標的とするようにデザインすることができる。ミスマッチが識別される場合、非正準塩基対（例、ミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対）を使用して２以上の遺伝子配列を標的とするｓｉＮＡ分子を生成できる。限定を目的としない例において、ＵＵおよびＣＣ塩基対といった非正準塩基対を使用して、配列相同性を共有する、異なるＨＣＶ標的の配列をターゲティングできるｓｉＮＡ分子を生成する。このように、本発明のｓｉＮＡを使用する利点は、単一のｓｉＮＡを、相同遺伝子の間に保存されるヌクレオチド配列に相補的な核酸配列を含めてデザインすることができることである。この方法によると、２以上のｓｉＮＡ分子を使用して異なる遺伝子を標的とする代わりに、単一のｓｉＮＡを使用して２以上の遺伝子の発現を抑制することができる。
【００２６】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有するｓｉＮＡ 分子を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡ分子は、表１に示すジンバンクアクセッション番号を持つ配列等、ＨＣＶをコードする配列を有する任意のＲＮＡに相補的な配列を含む。別の態様においては、本発明はＨＣＶ ＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子は、例えば表１には示されていないが当該技術分野においては例えばＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、または肝硬変の維持および／または進行に関連することが知られているその他の突然変異ＨＣＶ遺伝子等、様々なＨＣＶをコードする配列を有するＲＮＡに相補的な配列を含む。表ＩＩＩおよびＩＶまたは本明細書に別途記載される化学修飾は、本発明の任意のｓｉＮＡ構造に適用することができる。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用することができ、それによってＨＣＶ遺伝子発現のサイレンシングを媒介することができるヌクレオチド配列を含み、ここで例えば前記ｓｉＮＡは、ＨＣＶ遺伝子の複写または翻訳を調節し、ＨＣＶ遺伝子の発現を防ぐ細胞過程によりＨＣＶ遺伝子の発現制御を媒介する。
【００２７】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、形質、疾患または状態に関連するハプロタイプ多型（例として、ＨＣＶ感染または複製に関与する細胞遺伝子）から生じるタンパク質の発現を下方制御または抑制するために使用される。遺伝子またはタンパク質あるいはＲＮＡレベルの分析を使用して、そのような多型を持つ対象、または本明細書に記載する疾患、状態、形質、遺伝子型または表現型が進行する危険性のある対象を識別することができる。（例えばシルベストリ（Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ） ら，２００３年，国際癌学会誌（Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．，１０４，３１０−７を参照）。それらの対象は、本発明のｓｉＮＡ分子およびＨＣＶ遺伝子の発現疾患の治療に有効な他の組成物を用いた治療等の治療を受けることができる。このように、ＨＣＶタンパク質またはＲＮＡレベルの分析を使用して対象の治療の種類および一連の治療計画を決定することができる。タンパク質またはＲＮＡレベルのモニタリングを使用して、治療の結果を予測したり、疾患、状態、または形質に関連する特定タンパク質のレベルおよび／または作用を調節する化合物および組成物の有効性を判断したりすることができる。
【００２８】
本発明の１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子はＨＣＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を持つアンチセンス鎖を含む。ｓｉＮＡ はセンス鎖をさらに含み、ここで前記センス鎖はＨＣＶのヌクレオチド配列またはその一部を含む。
【００２９】
１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子はＨＣＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を持つアンチセンス領域を含む。ｓｉＮＡ分子はセンス領域をさらに含み、ここで前記センス領域はＨＣＶのヌクレオチド配列またはその一部を含む。
【００３０】
別の態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域にＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列または配列の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。別の態様においては、本発明は、例えばｓｉＮＡ構造のアンチセンス領域等、ＨＣＶ遺伝子配列またはその一部を含む配列に相補的な領域を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。
【００３１】
１つの態様においては、ＨＣＶｓｉＮＡ構造のアンチセンス領域は、配列番号１−６９６または１３９３−１４６６のいずれかを有する配列に相補的な配列を含む。１つの態様においては、ＨＣＶ構成のアンチセンス領域は、表ＩＩおよびＩＩＩならびに図４および５に記載のアンチセンス配列番号のいずれかを有する配列を含む。１つの態様においては、ＨＣＶ構成のセンス領域は、表ＩＩおよびＩＩＩならびに図４および５に記載のセンス配列番号のいずれかを有する配列を含む。
【００３２】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は配列番号１−２０２７のいずれかを含む。配列番号１−２０２７に示される配列は限定的なものではない。本発明のｓｉＮＡ分子は、任意の連続したＨＣＶ配列（例として、約１５から約２５以上、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５以上連続したＨＣＶヌクレオチド）を含むことができる。
【００３３】
さらに別の態様においては、本発明は、例えばｓｉＮＡ構造のアンチセンス配列等、表Ｉに示されるジンバンクアクセッション番号で表される配列を含む、配列または配列の一部に相補的な配列を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。表ＩＩＩ およびＩＶまたは本明細書に記載される化学修飾は、本発明の任意のｓｉＮＡ構造に適合することができる。
【００３４】
本発明の１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを持つアンチセンス鎖を含み、ここで前記アンチセンス鎖はＨＣＶまたはＨＣＶタンパク質をコードするＲＮＡ配列またはその一部に対して相補的であり、またここで前記ｓｉＮＡは約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを持つセンス鎖をさらに含み、ここで前記センス鎖および前記アンチセンス鎖は、各鎖において少なくとも約１５のヌクレオチドが他方の鎖に対して相補的である別々のヌクレオチド配列である。
【００３５】
本発明の１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０） ヌクレオチドを持つアンチセンス領域を含み、ここで前記アンチセンス領域はＨＣＶまたはＨＣＶタンパク質をコードするＲＮＡ配列に対して相補的であり、またここで前記ｓｉＮＡ約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを持つセンス領域をさらに含み、ここで前記センス領域および前記アンチセンス領域は、センス領域が少なくとも約１５のアンチセンス領域に対して相補的であるヌクレオチドを含む直鎖状分子に含まれる。
【００３６】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はＨＣＶ遺伝子によりコードされるＲＮＡ の発現を調節するＲＮＡｉ活性を持つ。ＨＣＶ 遺伝子は、互いにある程度の配列相同性を共有することができるため、異なるＨＣＶ標的間で共有される配列または特定のＨＣＶ標的に固有の代替配列のいずれかを選択することによって、ｓｉＮＡ分子を一群のＨＣＶ遺伝子（例、異なるＨＣＶ株の一群）または代替の特定ＨＣＶ遺伝子（例、耐性突然変異体、耐性菌、またはその他の多型変異体）を標的とするようにデザインできる。そのため１つの態様においては、１つのｓｉＮＡ分子を持つ一群のＨＣＶ遺伝子を標的とするようにｓｉＮＡ分子をデザインして、複数のＨＣＶ 遺伝子変異体間で相同性を持つＨＣＶ ＲＮＡ 配列の保存領域を標的とすることができる。従って、１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ 分子は対象または生物体における１つ以上のＨＣＶ株の発現を調節する。別の態様においては、高度の特異性のためｓｉＮＡ 分子がＲＮＡｉ活性を媒介する必要がある特定遺伝子の特定のＨＣＶ ＲＮＡ配列（例、単一のＨＣＶ株またはＨＣＶ一塩基多型（ＳＮＰ）に固有の配列を標的とするようｓｉＮＡ分子をデザインすることができる。
【００３７】
１つの態様においては、ＲＮＡ干渉遺伝子サイレンシング応答のメディエーターとして作用する本発明の核酸分子は、二本鎖核酸分子である。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は約１５から３０（例、例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの間に約１５から約３０の塩基対を含む二重鎖で構成される。また別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、約１９塩基対および３' 端モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチド突出部を持つ約２１ヌクレオチドの二重鎖等の約１から約３（例、約１、２、または３）ヌクレオチドの突出端を持つ二重鎖核酸分子を含む。また別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、両端が平滑であるか、代替として片端が平滑である平滑末端を持つ二重鎖核酸分子を含む。
【００３８】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶタンパク質をコードするＲＮＡ等のＨＣＶ発現核酸分子に対して特異性を持つ、１つ以上の化学修飾したｓｉＮＡ構造を特徴とする。１つの態様においては、本発明は本明細書に記載される１つ以上の化学修飾を含むＨＣＶ発現核酸分子に対して特異性を持つＲＮＡ ベースのｓｉＮＡ分子（例、２’−ＯＨヌクレオチドを含むｓｉＮＡを特徴とする。そのような化学修飾の限定を目的としない例は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５−Ｃ −メチルヌクレオチド、および末端グリセリルおよび／または逆位のデオキシ脱塩基残基の結合を含むがこれらに限定されない。これらの化学修飾は、様々なｓｉＮＡ構造（例、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ構造）で使用される場合に細胞内のＲＮＡｉ活性を保存すると同時に、それら化合物の血清安定性を劇的に向上させる。さらに、パリッシュ（Ｐａｒｒｉｓｈ） ら（前述）により公開されたデータに反し、出願人は複数の（１より大きい）ホスホロチオエート置換が優れた耐性を持ち、血清安定性において化学修飾したｓｉＮＡ構造を十分に向上させることを明示する。
【００３９】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら、修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドを使用して、安定性、活性、および／または生物学的利用能等の特性をインビトロまたはインビボで改良することができる。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ 分子内に存在するヌクレオチドの総数に占める割合として修飾ヌクレオチドを含むことができる。このように、本発明のｓｉＮＡ分子は概して約５％から約１００％の修飾ヌクレオチド（例、約５％、１０％、１５％ 、２０％ 、２５％ 、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％ 、６５％ 、７０％ 、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％ 、または１００％の修飾ヌクレオチド）を含むことができる。あるｓｉＮＡ分子内に存在する修飾ヌクレオチドの実際の割合は、そのｓｉＮＡ 内に存在するヌクレオチドの総数によるであろう。ｓｉＮＡ分子が一本鎖である場合、修飾割合はその一本鎖ｓｉＮＡ分子内に存在するヌクレオチドの総数に基づくことがある。同様に、ｓｉＮＡ分子が二本鎖である場合、修飾割合はセンス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づくことがある。
【００４０】
本発明の一側面は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とする。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は１つ以上の化学修飾を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約２１ヌクレオチド長である。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。別の態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子は１つ以上のリボヌクレオチドを含む。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを独立して含み、ここで各鎖は他の鎖のヌクレオチドに対して相補的である約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖はＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に対し相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖は遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
別の態様においては、本発明はＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示し、アンチセンス領域を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで前記アンチセンス領域はＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に対し相補的であるヌクレオチド配列、およびセンス領域を含み、ここで前記センス領域はＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては、アンチセンス領域およびセンス領域は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを独立して含み、ここで前記アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに対して相補的である約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。
【００４２】
別の態様においては、本発明はＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示し、センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖低分子干渉（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで前記アンチセンス領域はＨＣＶ 遺伝子によりコードされるＲＮＡのヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、前記センス領域は前記アンチセンス領域に対して相補的であるヌクレオチド配列を含む。
【００４３】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は平滑末端、すなわち突出するヌクレオチドを全く含まない端を含む。例えば、本明細書に記載する修飾（例、化学式ＩからＶＩＩのヌクレオチドまたは「Ｓｔａｂ００」から「Ｓｔａｂ３２」（表ＩＶを参照）を含むｓｉＮＡ構造またはその任意の組み合わせ（表ＩＶを参照）を含む）および／または本明細書に記載の任意の長さを持つ本発明のｓｉＮＡ分子は、平滑末端または突出するヌクレオチドを持たない末端を含むことができる。
【００４４】
１つの態様においては、本発明の任意のｓｉＮＡ分子は１つ以上の平滑末端、すなわち突出するヌクレオチドを全く含まない端を含むことができる。１つの態様においては、平滑末端ｓｉＮＡ分子は前記ｓｉＮＡ分子の各鎖に存在するヌクレオチド数と同数の塩基対を持つ。別の態様においては、ｓｉＮＡ 分子は１つの平滑末端を含み、例えばここでアンチセンス鎖の５' 端およびセンス鎖の３' 端は突出するヌクレオチドを持たない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は１つの平滑末端を含み、例えばここでアンチセンス鎖の３'端およびセンス鎖の５'端は突出するヌクレオチドを持たない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は２つの平滑末端を含み、例えばここでアンチセンス鎖の５'端およびセンス鎖の３'端と同様に、アンチセンス鎖の３' 端およびセンス鎖の５'端は突出するヌクレオチドを持たない。平滑末端ｓｉＮＡ分子は、例えば約１５から約３０のヌクレオチド（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を含むことができる。平滑末端ｓｉＮＡ分子に存在する他のヌクレオチドは、例えばＲＮＡ干渉を媒介するｓｉＮＡ分子の活性を調節するため、ミスマッチ、バルジ、ループ、またはゆらぎ塩基対を含むことができる。
【００４５】
「平滑末端」とは左右対称の末端または突出するヌクレオチドを持たない二本鎖ｓｉＮＡ分子の末端を意味する。二本鎖ｓｉＮＡ分子の二本の鎖は、末端に突出するヌクレオチドを持たず、互いに一直線に並んでいる。 例えば、平滑末端ｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域およびアンチセンス領域の間で相補的な末端ヌクレオチドを含む。
【００４６】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡ分子はオリゴヌクレオチド断片の集合であり、ここで第一断片はｓｉＮＡ分子のセンス領域を含み、第二断片はｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。前記センス領域は、ポリヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカー等のリンカー分子を介してアンチセンス領域に結合される。
【００４７】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御する、またはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡ分子は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）塩基対を含み、ここで前記ｓｉＮＡ分子の各鎖は１つ以上の化学修飾を含む。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方の鎖はＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に対し相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖は遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては、二本鎖ｓｉＮＡ 分子の一方の鎖はＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に対し相補的であるヌクレオチド配列を含み、二本鎖ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖は遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含む。別の形態において、ｓｉＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含み、各鎖は他の鎖のヌクレオチドに対して相補的である少なくとも約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。例えば、ＨＣＶ遺伝子は表Ｉに記載の配列を含むことができる。
【００４８】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含まない。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はリボヌクレオチドを含む。
【００４９】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ 分子はＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス領域を含み、前記ｓｉＮＡはＨＣＶ遺伝子のヌクレオチド配列またはその一部に実質的に類似するヌクレオチド配列を含むセンス領域をさらに含む。別の態様においては、アンチセンス領域およびセンス領域はそれぞれ約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０） ヌクレオチドを含み、前記アンチセンス領域はセンス領域のヌクレオチドに対して相補的である約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。例えば、ＨＣＶ遺伝子は表Ｉに記載の配列を含むことができる。別の態様においては、ｓｉＮＡは二本鎖核酸分子であり、ここで前記ｓｉＮＡ分子の二本の各鎖は約１５から約４０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０） ヌクレオチドを独立して含み、また、ここで前記ｓｉＮＡ分子の一方の鎖は、ＨＣＶ遺伝子の核酸配列またはその一部に対して相補的である少なくとも約１５（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５以上）ヌクレオチドを含む。
【００５０】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、センス領域およびアンチセンス領域を有し、アンチセンス領域は、ＨＣＶ遺伝子、あるいはその一部によって、コードされたＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、センス領域は、アンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有する。１つの態様においては、ｓｉＮＡ 分子は、２つの別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、１つの断片は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域を有し、もう一方の断片はアンチセンス領域を有する。別の態様においては、センス領域は、リンカー分子を介してアンチセンス領域に結合する。別の態様においては、センス領域は、ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチドリンカーのような、リンカー分子を介してアンチセンス領域に結合する。ＨＣＶ遺伝子は、例えば、表１に記載の配列を有する。
【００５１】
別の態様においては、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域を有す、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御、あるいはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、アンチセンス領域は、ＨＣＶ遺伝子あるいはその一部によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有し、ｓｉＮＡ分子は、１つ以上の修飾ピリミジンまたは／あるいはプリンヌクレオチドを有する。１つの態様においては、センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルピリミジンヌクレオチド、あるいは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の態様においては、センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。別の態様においては、センス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’ −デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。１つの態様においては、アンチセンス領域のピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ −メチル、あるいは２’ −デオキシプリンヌクレオチドである。前述のｓｉＮＡ分子のうちの、別の態様においては、センス鎖の非相補的領域（例、突出領域）に含まれるヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
【００５２】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御、あるいはＨＣＶＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ｓｉＮＡ分子は、２つの別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、１つの断片は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域を有し、もう一方の断片はアンチセンス領域を有し、センス領域を有する断片は、断片の５’ 端、３’端、あるいは５’および３’端の両方にある末端キャップ部分を含む。１つの態様においては、末端キャップ部は逆位のデオキシ脱塩基部分、あるいはグリセリル部分である。１つの態様においては、ｓｉＮＡ 分子の２断片のそれぞれは、単独で、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、あるいは３０） のヌクレオチドを有する。別の態様においては、ｓｉＮＡ 分子の２断片のそれぞれは、単独で、約１５から約４０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、あるいは４０）のヌクレオチドを有する。限定を目的としない例においては、ｓｉＮＡ 分子の２断片のそれぞれは、約２１のヌクレオチドを有する。
【００５３】
１つの態様においては、本発明は、最低１つの修飾ヌクレオチドを有するｓｉＮＡ分子を特徴とし、修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。ｓｉＮＡは、長さでは、例えば、約１５から４０のヌクレオチドであり得る。１つの態様においては、ｓｉＮＡに含まれる全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡの修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシジチンあるいは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の態様においては、ｓｉＮＡの修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−フルオロシチジン、および少なくとも１つの２’−デオキシ−２’ −フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡ に含まれる全ウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡ に含まれる全シチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡに含まれる全アデノシンヌクレオチドは、２’ −デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡに含まれる全グアノシンヌクレオチドは、２’ −デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡ は、さらに少なくとも１つの、ホスホロチオエート結合のような、修飾ヌクレオチド間結合を有し得る。１つの態様においては、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを持つ場所のような、リボヌクレアーゼによる切断に敏感な、ｓｉＮＡの具体的に選択された場所に存在する。
【００５４】
１つの態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子に少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを導入することから成る、リボヌクレアーゼによる切断に対するｓｉＮＡ分子の安定性を増すための方法を特徴とし、該修飾ヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡに含まれる全ピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡ の修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロシジチンあるいは２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。別の態様においては、ｓｉＮＡの修飾ヌクレオチドは、少なくとも１つの２’ −フルオロシチジン、および少なくとも１つの２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドを含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡ に含まれる全ウリジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡに含まれる全シチジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡに含まれる全アデノシンヌクレオチドは、２’ −デオキシ−２’−フルオロアデノシンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡに含まれる全グアノシンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンヌクレオチドである。ｓｉＮＡ は、さらに少なくとも１つの、ホスホロチオエート結合のような、修飾ヌクレオチド間結合を有し得る。１つの態様においては、２’−デオキシ−２’ −フルオロヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチドを持つ場所のような、リボヌクレアーゼによる切断に敏感な、ｓｉＮＡ の具体的に選択された場所に存在する。
【００５５】
１つの態様においては、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域を有す、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御、あるいはＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域は、ＨＣＶ遺伝子あるいはその一部によってコードされたＲＮＡ のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、センス領域はアンチセンス領域に相補的なヌクレオチド配列を有し、アンチセンス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−デオキシ−プリンヌクレオチドを有する。ほかの態様では、アンチセンス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。上記態様のいずれかにおいて、アンチセンス領域は、アンチセンス領域の３’端に、ホスホロチオエートクレオチド間結合を有し得る。あるいは、上記態様のいずれかにおいて、アンチセンス領域は、アンチセンス領域の３’端に、グリセリル修飾を有し得る。前述のｓｉＮＡ 分子いずれかの別の態様においては、アンチセンス鎖の非相補的領域（例、突出領域）に含まれるヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。
【００５６】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、疾患特異的な対立遺伝子と関連する、一塩基多型（ＳＮＰ）を有する配列のような、対象または生命体において起こる、特定のＨＣＶ疾患に関連する対立遺伝子に特有な配列を持つ、内在性の転写の一部に相補的な配列を有する。そのため、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、対立遺伝子に関連する疾患、状態、あるいは特徴に対して選択的なＲＮＡｉを媒介する特異性を提供するために、特定の対立遺伝子に特有な配列に相補的な配列を有し得る。
【００５７】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を下方制御、あるいはＨＣＶＲＮＡ の切断を指示する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ｓｉＮＡ分子は、２つの別々のオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、１つの断片は、ｓｉＮＡ分子のセンス領域を有し、もう一方の断片はアンチセンス領域を有する。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、二本鎖核酸分子で、各鎖は約２１ヌクレオチドの長さであり、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対になっており、ここでｓｉＮＡ分子の各断片の少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の断片のヌクレオチドと塩基対にはなっていない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、二本鎖核酸分子で、各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対であり、少なくとも約１５（例、１５、１６、１７、１８、あるいは１９）の塩基対を形成し、ここでｓｉＮＡ 分子の片端、あるいは両端は、平滑末端である。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の、２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれは、２’−デオキシ−チミジンのような、２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対である。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、センス領域とアンチセンス領域を持つ約１９から約２５の塩基対の二本鎖核酸分子で、アンチセンス領域の約１９のヌクレオチドは、ＨＣＶ遺伝子によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部と塩基対である。別の態様においては、アンチセンス領域の約２１のヌクレオチドは、ＨＣＶ遺伝子によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部と塩基対である。上記の例のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を有する断片の５’端は、任意でリン酸基を含み得る。
【００５８】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶＲＮＡ配列の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、（例、ここで前記標的ＲＮＡ配列は該ＨＣＶ経路に関与するＨＣＶ遺伝子によってコードされる）、ここでｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを全く含まず、二本鎖ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０ヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子は、２１ヌクレオチド長である。ｓｉＮＡ構造を有する非リボヌクレオチドの例は、表ＩＶに示す安定化反応の組み合わせで、Ｓｔａｂ７／８、Ｓｔａｂ７／１１、Ｓｔａｂ８／８、Ｓｔａｂ１８／８、Ｓｔａｂ１８／１１、Ｓｔａｂ１２／１３、Ｓｔａｂ７／１３、Ｓｔａｂ１８／１３、Ｓｔａｂ７／１９、Ｓｔａｂ８／１９、Ｓｔａｂ１８／１９、Ｓｔａｂ７／２０、Ｓｔａｂ８／２０、Ｓｔａｂ１８／２０、Ｓｔａｂ７／３２、Ｓｔａｂ８／３２、あるいはＳｔａｂ１８／３２のような、センス／アンチセンス化学反応の任意の組み合わせである（例、Ｓｔａｂ７、８、１１、１２、１３、１４、１５、１７、１８、１９、２０、あるいは３２のセンス鎖あるいはアンチセンス鎖、あるいはそのいずれかの組み合わせを持つ任意のｓｉＮＡ）。
【００５９】
１つの態様においては、本発明は、ＲＮＡ干渉を介してＨＣＶ ＲＮＡ の切断を指示する化学合成した二本鎖ＲＮＡ分子を特徴とし、ここで前記ＲＮＡ分子の各鎖は約１５から約３０ヌクレオチド長であり、ＲＮＡ分子の一鎖は、ＲＮＡ干渉を介してＨＣＶ ＲＮＡの切断を指示するため、ＲＮＡ分子のＨＣＶ ＲＮＡに対して十分な相補性を持つヌクレオチド配列を含み、またＲＮＡ分子の少なくとも一鎖は、デオキシヌクレオチド、２'−０−メチルヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、２'−０−メトキシエチルヌクレオチド等のような、しかしこれに限定されない、本明細書に記載の１つ以上の化学修飾ヌクレオチドを任意で有する。
【００６０】
１つの態様においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む薬物を特徴とする。
【００６１】
１つの態様においては、本発明は、本発明のｓｉＮＡ分子を含む有効成分を特徴とする。
【００６２】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制し、下方制御し、減少させる二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とし、ここでｓｉＮＡ 分子は、１つ以上の化学修飾を含み、二本鎖ｓｉＮＡの各鎖は、独立して約１５から約３０あるいはそれ以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０以上）のヌクレオチド長である。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学修飾を有する二本鎖核酸分子で、ｓｉＮＡ分子の２つの断片それぞれが、独立して約１５から約４０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、２３、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０） のヌクレオチドを含み、鎖のうちの１本は、ＲＮＡ をコードするＨＣＶのヌクレオチド配列、あるいはその一部に相補的である、少なくとも１５のヌクレオチドを含む。限定を目的としない例においては、ｓｉＮＡ分子の２断片のそれぞれは、約２１のヌクレオチドを有する。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子で、各鎖は約２１ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片の約１９ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ 分子のもう一方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対になっており、ここでｓｉＮＡ 分子の各断片の少なくとも２つの３’末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の断片のヌクレオチドと塩基対にはなっていない。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学修飾を含む二本鎖核酸分子で、各鎖は約１９ヌクレオチド長であり、ｓｉＮＡ分子の各断片のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対であり、少なくとも約１５（例、１５、１６、１７、１８、または１９） の塩基対を形成し、ここでｓｉＮＡ分子の片端、あるいは両端は、平滑末端である。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の、２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれは、２’ −デオキシ−チミジンのような、２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の全ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の断片の相補的ヌクレオチドと塩基対である。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子は、センス領域とアンチセンス領域を持ち、１つ以上の化学修飾を有する、約１９から約２５の塩基対の二本鎖核酸分子で、アンチセンス領域の約１９のヌクレオチドは、ＨＣＶ遺伝子によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部と塩基対である。別の態様においては、アンチセンス領域の約２１のヌクレオチドは、ＨＣＶ遺伝子によってコードされたＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部と塩基対である。上記の例のいずれにおいても、前記アンチセンス領域を有する断片の５’端は、任意でリン酸基を含み得る。
【００６３】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制し、下方制御し、減少させる二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子の使用を特徴とし、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つは、ＨＣＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子に含まれるピリミジンヌクレオチドの大半は、糖修飾を含む。
【００６４】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制し、下方制御し、減少させる二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで二本鎖ｓｉＮＡ 分子の鎖の１つは、ＨＣＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子に含まれるピリミジンヌクレオチドの大半は、糖修飾を含む。
【００６５】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制し、下方制御し、減少させる二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで二本鎖ｓｉＮＡ 分子の鎖の１つは、プロテイン、あるいはその一部をコードするＨＣＶＲＮＡのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子に含まれるピリミジンヌクレオチドの大半は、糖修飾を含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドを含み、ここで各鎖は、もう一方の鎖のヌクレオチドに相補的である、少なくとも約１５のヌクレオチドを含む。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子は、２つのオリゴヌクレオチド断片から組み立てられ、ここで１つの断片は、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を含み、もう一方の断片はｓｉＮＡ 分子のセンス領域のヌクレオチド配列を有する。１つの態様においては、センス鎖は、ポリヌクレオチドリンカーあるいは非ヌクレオチドリンカーのような、リンカー分子を介してアンチセンス鎖に結合する。さらに別の態様においては、センス鎖に含まれるピリミジンヌクレオチドは、２’ −デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−デオキシプリンヌクレオチドである。別の態様においては、センス鎖に含まれるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、センス領域に含まれるプリンヌクレオチドは、２’−Ｏ −メチルプリンヌクレオチドである。また別の態様においては、アンチセンス鎖に含まれるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖に含まれるいずれのプリンヌクレオチドも、２’ −デオキシプリンヌクレオチドである。別の態様においては、アンチセンス鎖は１つ以上の２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド、および１つ以上の２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドを含む。別の態様においては、アンチセンス鎖に含まれるピリミジンヌクレオチドは、２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり、アンチセンス鎖に含まれるいずれのプリンヌクレオチドも、２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである。さらに別の態様においては、センス鎖は、３’端および５’端を含み、ここで末端キャップ部分（例、逆位のチミジンのような、逆位のデオキシ脱塩基部分あるいは逆位のデオキシヌクレオチド部分）は、センス鎖の５’端、３’端、あるいは５’および３’端の両方に存在する。別の態様においては、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の３’端にホスホロチオエートクレオチド間結合を含む。別の態様においては、アンチセンス鎖は、３’端にグリセリル修飾を含む。別の態様においては、アンチセンス鎖の５’端には、任意でリン酸基が含まれる。
【００６６】
ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子の、上述のいずれの態様においても、ここで二本鎖ｓｉＮＡ 分子に含まれるピリミジンヌクレオチドの大半は、糖修飾を含み、ｓｉＮＡ分子の２本鎖のそれぞれが、約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドを含み得る。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖の相補的ヌクレオチドと塩基対である。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖の約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖の相補的ヌクレオチドと塩基対であり、ここでｓｉＮＡ分子の各鎖のうち少なくとも２つの３’ 末端ヌクレオチドは、ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖のヌクレオチドと塩基対ではない。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各断片の、２つの３’末端ヌクレオチドのそれぞれは、２’−デオキシ−チミジンのような、２’−デオキシ−ピリミジンヌクレオチドである。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子の各鎖は、ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖の相補的ヌクレオチドと塩基対である。１つの態様においては、アンチセンス鎖の約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）のヌクレオチドは、ＨＣＶ ＲＮＡ、あるいはその一部のヌクレオチド配列と塩基対である。１つの態様においては、アンチセンス鎖の約１８から約２５（例、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）のヌクレオチドは、ＨＣＶ ＲＮＡ、あるいはその一部のヌクレオチド配列と塩基対である。
【００６７】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つは、ＨＣＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子に含まれるピリミジンヌクレオチドの大半は、糖修飾を含み、またここで該アンチセンス鎖の５’端には、任意でリン酸基が含まれる。
【００６８】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つは、ＨＣＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、もう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子に含まれるピリミジンヌクレオチドの大半は、糖修飾を含み、またここでアンチセンス鎖のヌクレオチド配列、あるいはその一部は、ＨＣＶ ＲＮＡの非翻訳領域のヌクレオチド配列、またはその一部に相補的である。
【００６９】
１つの態様においては、本発明は、ＨＣＶ遺伝子の発現を抑制する二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子の鎖の１つは、ＨＣＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列、あるいはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖であり、ここでもう一方の鎖は、アンチセンス鎖のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖であり、ここで二本鎖ｓｉＮＡ分子に含まれるピリミジンヌクレオチドの大半は、糖修飾を含み、またここでアンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、ＨＣＶ ＲＮＡ に含まれるＨＣＶ ＲＮＡ のヌクレオチド配列、またはその一部に相補的である。
【００７０】
１つの態様においては、本発明は、医薬的に許容できる担体または希釈剤中の、本発明のｓｉＮＡ分子で構成される組成物を特徴とする。
【００７１】
限定を目的としない例において化学修飾したヌクレオチドを核酸分子に導入することで、体外からデリバリーされた野生型ＲＮＡ分子に伴うインビボの安定性および生物学的利用能に関する潜在的な限界を克服する強力なツールが提供される。例えば、化学修飾した核酸分子は血清中でより長い半減期を持つため、化学修飾した核酸分子を使用することで、低用量の特定核酸分子で指定の治療効果を挙げることが可能になる。さらに、特定の化学修飾は、特定の細胞または組織のターゲティングおよび／または核酸分子の細胞摂取を向上させることによって、核酸分子の生物学的利用能を改善できる。そのため、例えばすべてのＲＮＡ核酸分子と比較する場合等、化学修飾した核酸分子の活性が野生型核酸分子と比べて低い場合でも、修飾した核酸分子の安定性および／またはデリバリーが向上したことによって、その分子の全体活性は野生型分子と比べて優れている。野生型の未修飾ｓｉＲＮＡとは異なり、化学修飾したｓｉＮＡ は、ヒトにおいてインターフェロンを活性化する可能性を最小限に抑えることもできる。
【００７２】
ここに記載するｓｉＮＡ分子の任意の例において、本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、前記アンチセンス領域の３'端にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。ここに記載するｓｉＮＡ分子の任意の例において、アンチセンス領域は、約１つから約５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を前記アンチセンス領域の５' 端に含むことができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の任意の例において、本発明のｓｉＮＡ分子の３'末端ヌクレオチド突出部は、核酸糖、塩基、または骨格で化学修飾したリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の任意の例において、３'末端ヌクレオチド突出部は１つ以上のユニバーサル塩基リボヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載するｓｉＮＡ分子の任意の例において、３' 末端ヌクレオチド突出部は、１つ以上の非環状ヌクレオチドを含むことができる。
【００７３】
本発明の１つの態様は、核酸分子の発現を許可する方法で、少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。本発明の別の態様は、そのような発現ベクターを含む哺乳類細胞を提供する。哺乳類細胞はヒト細胞であってもよい。ｓｉＮＡ分子の発現ベクターはセンス領域およびアンチセンス領域を含むことができる。アンチセンス領域は、ＲＮＡまたはＤＮＡに相補的な配列を含むことができ、センス領域はアンチセンス領域に相補的な配列を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を持つ２つの個別の鎖を含むことができる。ｓｉＮＡ分子は相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を持つ単一の鎖を含むことができる。
【００７４】
１つの態様においては、本発明は、細胞内または再構成インビトロシステムにおいて、ＨＣＶに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は化学式Ｉ
【化２】
2007505606.tif 000002
を持つ骨格修飾ヌクレオチド間で構成される１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のヌクレオチドを含み、式中、ＲＩおよびＲ２はそれぞれ、自然発生する、または化学修飾できる任意のヌクレオチド、非ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドであり、ＸおよびＹはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、アルキル、または置換アルキルであり、ＺおよびＷはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ −アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、またはアセチルであり、ここでＷ、Ｘ、Ｙ、およびＺは任意ですべてＯとは限らない。別の態様においては、本発明の骨格修飾はホスホノ酢酸および／またはチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間結合を含む（例として、シーハン（Ｓｈｅｅｈａｎ） ら，２００３年，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），３１，４１０９−４１１８を参照）。
【００７５】
化学式Ｉを持つ化学修飾ヌクレオチド間結合は、例えば、任意のＺ、Ｗ、Ｘ、および／またはＹはそれぞれ硫黄原子を含む場合、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方等のｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３' 端、５' 端、またはその両方に１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の化学式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５'端に化学式Ｉを持つ約１つから約５つ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学修飾ヌクレオチド間結合を含むことができる。別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に、１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の化学式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を持つピリミジンヌクレオチドを含むことができる。さらに別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に、１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の化学式Ｉの化学修飾ヌクレオチド間結合を持つプリンヌクレオチドを含むことができる。別の態様においては、化学式Ｉのヌクレオチド間結合を持つ本発明のｓｉＮＡ分子は、化学式ＩからＶＩＩのいずれかを持つ化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むこともできる。
【００７６】
１つの態様においては、本発明は、細胞内または再構成インビトロシステムにおいて、ＨＣＶに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は化学式ＩＩ
【化３】
2007505606.tif 000003
を持つ１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のヌクレオチド、または非ヌクレオチドを含み、式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれＨ、ＯＨ，アルキル、置換アルキル、アルカリル、またはアラルキル、Ｆ，Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ 、Ｏ−アルキル−ＯＨ 、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ 、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキラミノ、ポリアルキラミノ、置換シリル、または化学式ＩまたはＩＩのグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、またはＣＦ２であり、Ｂはアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、または標的ＲＮＡに相補的または非相補的な任意の他の非自然発生塩基、等のヌクレオシド塩基、またはフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、または標的ＲＮＡに対して相補的または非相補的な任意の他の非自然発生ユニバーサル塩基、等の非ヌクレオシド塩基である。
【００７７】
化学式ＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは、例えば、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方等、ｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３' 端、５'端、またはその両方に１つ以上の化学修飾ヌクレオチドまたは化学式ＩＩの非ヌクレオチドを含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１つから約５つまたはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５' 端に含むことができる。別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は約１つから約５つまたはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩの化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３'端に含むことができる。
【００７８】
１つの態様においては、本発明は細胞または再構成インビトロシステムにおいて、ＨＣＶに対するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は化学式ＩＩＩ
【化４】
2007505606.tif 000004
を持つ１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含み、式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれＨ、ＯＨ，アルキル、置換アルキル、アルカリル、またはアラルキル、Ｆ，Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓアルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ 、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ 、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキラミノ、ポリアルキラミノ、置換シリル、または化学式ＩまたはＩＩのグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦ、またはＣＦ２であり、Ｂはアデニン、グアニン、ウラシル、シトシン、チミン、２−アミノアデノシン、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、または標的ＲＮＡに相補的または非相補的な任意の他の非自然発生塩基、等のヌクレオシド塩基、またはフェニル、ナフチル、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ネブラリン、ピリドン、ピリジノン、または標的ＲＮＡに対して相補的または非相補的な任意の他の非自然発生ユニバーサル塩基、等の非ヌクレオシド塩基である。
【００７９】
化学式ＩＩＩの化学修飾したヌクレオチドまたは非ヌクレオチドは、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方等、ｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の化学式ＩＩＩの化学修飾したヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３' 端、５' 端、またはその両方に含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１つから約５つまたはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩＩの化学修飾したヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３'端、５'端、またはその両方に含むことができる。別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、約１つから約５つまたはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の化学式ＩＩＩの化学修飾したヌクレオチドまたは非ヌクレオチドをセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３' 端に含むことができる。
【００８０】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は化学式ＩＩ またはＩＩＩを持つヌクレオチドを含み、ここで、化学式ＩＩまたはＩＩＩ を持つヌクレオチドは逆位構造にある。例えば、化学式ＩＩまたはＩＩＩを持つヌクレオチドは、一方または両方のｓｉＮＡ鎖の３'端、５'端、またはその両方といった、３'−３'、３'−２'、２'−３'、または５'−５' 構造にあるｓｉＮＡ構造と結合される。
【００８１】
１つの態様においては、本発明は細胞または再構成インビトロシステムにおいて、ＨＣＶに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は化学式ＩＶ
【化５】
2007505606.tif 000005
を持つ５' 末端リン酸基を含み、式中、Ｘ およびＹはそれぞれＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、またはアルキルハロであり、ＺおよびＷはそれぞれＯ、Ｓ、Ｎ、アルキル、置換アルキル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、アルカリル、アラルキル、アルキルハロ、またはアセチルであり、またＷ、Ｘ、Ｙ、およびＺは必ずしもすべてＯではない。
【００８２】
１つの態様においては、本発明は例えば、標的ＲＮＡに相補的な鎖等の標的相補鎖上に化学式ＩＶの５' 端リン酸基を持つｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで、ｓｉＮＡ 分子はすべてのＲＮＡｓｉＮＡ 分子を含む。別の態様においては、本発明は標的相補鎖上に化学式ＩＶ の５' 末端リン酸基を持つｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでｓｉＮＡ分子は一方または両方の鎖の３'端に約１つから約４つの（ 例、約１、２、３、または４）デオキシリボヌクレオチドを持つ約１つから約３つの（例、約１、２、または３）ヌクレオチド３'末端ヌクレオチド突出部も含む。別の態様においては、化学式ＩＶの５'末端リン酸基は、例えば、化学式ＩからＶＩＩのいずれかの化学修飾を持つｓｉＮＡ分子といった本発明のｓｉＮＡ分子の標的相補鎖上に存在する。
【００８３】
１つの態様においては、本発明は細胞または再構成インビトロシステムにおいて、ＨＣＶに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ ）分子を特徴とし、ここで、化学修飾は１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。例えば、限定を目的としない例において、本発明は一方のｓｉＮＡ 鎖に約１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を持つ化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）を特徴とする。さらに別の態様においては、本発明は両方のｓｉＮＡ鎖にそれぞれ約１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を持つ化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） を特徴とする。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖またはその両方にあるｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方のオリゴヌクレオチド鎖に存在し得る。本発明のｓｉＮＡ 分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３'端、５'端、またはその両方に１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。例えば、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５' 端に約１つから約５つまたはそれ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の連続したホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡ分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のピリミジンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。さらに別の限定を目的としない例において、本発明の典型的なｓｉＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のプリンホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。
【００８４】
１つの態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで、センス鎖は１つ以上、例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２'−デオキシ−２'−フルオロ、および／または約１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意でセンス鎖の３' 端、５' 端、またはその両方に末端キャップ分子を含み、またここで、該アンチセンス鎖は約１つから約１０またはそれ以上、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２' −デオキシ−２'−フルオロ、および／または約１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意でアンチセンス鎖の３'端、５'端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、１つ以上、例えばセンスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または同一の鎖あるいは異なる鎖の３'端、５' 端、またはその両方に存在する末端キャップ分子の有無に関わらず、２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチルおよび／または２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
【００８５】
別の態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここで、センス鎖は約１つから約５つ、具体的には約１、２、３、４、または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２' −デオキシ−２'−フルオロ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意でセンス鎖の３' 端、５' 端、またはその両方に末端キャップ分子を含み、またここで、アンチセンス鎖は約１つから約５つまたはそれ以上、具体的には約１、２、３、４、５、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２'−デオキシ−２'−フルオロ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意でアンチセンス鎖の３' 端、５' 端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、該センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、同一または異なる鎖に存在する約１つから約５、またはそれ以上、たとえば約１、２、３、４、５、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または３'端、５'端、またはその両方に末端キャップ分子を持つか否かに関わらず、２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチルおよび／または２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
【００８６】
１つの態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでアンチセンス鎖は、１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または約１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２'−デオキシ−２'−フルオロ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意で末端キャップ分子をセンス鎖の３' 端、５' 端、またはその両方に含み、またここでアンチセンス鎖は、約１つから約１０またはそれ以上、具体的には約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２'−デオキシ−２'−フルオロ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意でアンチセンス鎖の３' 端、５' 端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合および／または同一または異なる鎖に存在する３' 端、５' 端、またはその両方に末端キャップ分子を持つか否かに関わらず、２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチルおよび／または２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
【００８７】
別の態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子を特徴とし、ここでアンチセンス鎖は、約１つから約５つ以上、具体的には約１、２、３、４、５、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２'−デオキシ−２'−フルオロ、および／または１つ以上（ 例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意でセンス鎖の３' 端、５' 端、またはその両方に末端キャップ分子を含み、またここで、アンチセンス鎖は、約１つから約５つ以上、具体的には約１、２、３、４、５、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチル、２'−デオキシ−２'−フルオロ、および／または１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のユニバーサル塩基修飾ヌクレオチド、および任意でアンチセンス鎖の３' 端、５'端、またはその両方に末端キャップ分子を含む。別の態様においては、センスおよび／またはアンチセンスｓｉＮＡ鎖の１つ以上、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のピリミジンヌクレオチドは、約１つから約５つ、例えば約１、２、３、４、５、またはそれ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、および／または同一または異なる鎖に存在する３' 端、５' 端、またはその両方に末端キャップ分子を持つか否かに関わらず、２'−デオキシ、２'−Ｏ−メチルおよび／または２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチドで化学修飾される。
【００８８】
１つの態様においては、本発明はｓｉＮＡ分子の各鎖に約１つから約５つ以上、
（具体的には約１、２、３、４、５、またはそれ以上）のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を持つ化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とする。
【００８９】
別の態様においては、本発明は２'−５' ヌクレオチド間結合を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。２'−５'ヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ配列鎖の一方または両方の３' 端、５' 端、またはその両方に存在し得る。さらに、２'−５' ヌクレオチド間結合は、ｓｉＮＡ配列鎖の一方または両方にある様々な他の位置に存在でき、例えばｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖にあるピリミジンヌクレオチドの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド間結合は２'−５' ヌクレオチド間結合を含むことができ、またはｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖にあるプリンヌクレオチドの約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド間結合は２'−５' ヌクレオチド間結合を含むことができる。
【００９０】
別の態様においては、本発明の化学修飾したｓｉＮＡ分子は、２つの鎖を持つ二重鎖を含み、その一方または両方の鎖を化学修飾することができ、ここで、各鎖はそれぞれ約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長であり、ここで二重鎖は約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を持ち、またここで、化学修飾は化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれかを持つ構造を含む。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、２つの鎖を持つ二重鎖を含み、その一方または両方の鎖は化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ化学修飾で化学修飾することができ、ここで各鎖はそれぞれ２−ヌクレオチド３'末端ヌクレオチド突出を持つ約２１のヌクレオチドで構成され、またここで二重鎖は約１９の塩基対を持つ。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は一本鎖ヘアピン構造を含み、ここでｓｉＮＡは、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を持つ約３６から約７０（例、約３６、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチド長であり、またここでｓｉＮＡは、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ化学修飾で化学修飾される約４２から約５０（例、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）のヌクレオチドを持つ線状オリゴヌクレオチドを含み、ここで線状オリゴヌクレオチドは、約１９から約２１（例、１９、２０、または２１）の塩基対および２−ヌクレオチド３' 末端ヌクレオチド突出部を持つヘアピン構造を形成する。別の態様においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ 分子はステムループモチーフを含み、ここでｓｉＮＡのループ部分は生分解が可能である。例えば、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は、インビボのｓｉＮＡ分子の、ループ部分の分解によって約２ヌクレオチドを含む３'末端ヌクレオチド突出部等の３' 末端突出部を持つ二本鎖ｓｉＮＡ 分子を生成できるようにデザインされる。
【００９１】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はヘアピン構造を含み、ここで、ｓｉＮＡ は約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５，１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）の塩基対を持つ、約２５から約５０（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド長であり、またここで、前記ｓｉＮＡは化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造で構成される１つ以上の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ１つ以上の化学修飾で化学修飾される約２５から約３５（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５） ヌクレオチドを持つ線状オリゴヌクレオチドを含み、ここで前記線状オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５） の塩基対および本明細書に記載のように化学修飾できる５'末端リン酸基（例えば、化学式ＩＶを持つ５' 末端リン酸基）を持つヘアピン構造を形成する。別の態様においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを含み、ここでｓｉＮＡのループ部分は生分解が可能である。別の態様においては、本発明の線状ヘアピンｓｉＮＡ分子は非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分で構成される。
【００９２】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は非対称のヘアピン構造を含み、ここで、ｓｉＮＡは約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５） の塩基対を持つ、約２５から約５０（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド長であり、またここで、前記ｓｉＮＡは化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造で構成される１つ以上の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ 分子は、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ１つ以上の化学修飾で化学修飾される約２５から約３５（例、約２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５）ヌクレオチドを持つ線状オリゴヌクレオチドを含み、ここで前記線状オリゴヌクレオチドは、約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）の塩基対および本明細書に記載のように化学修飾できる５'末端リン酸基（例えば、化学式ＩＶを持つ５' 末端リン酸基）を持つ非対称ヘアピン構造を形成する。１つの態様においては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子はステムループモチーフを含み、ここでｓｉＮＡのループ部分は生分解が可能である。別の態様においては、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は非ヌクレオチドリンカーを含むループ部分で構成される。
【００９３】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子はセンス領域およびアンチセンス領域を含む個別のポリヌクレオチド鎖を持つ非対称の二本鎖を含み、ここで、前記アンチセンス領域は、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長であり、ここで、前記センス領域は約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチド長であり、ここで前記センス領域および前記アンチセンス領域は少なくとも３つの相補的ヌクレオチドを持ち、またここで前記ｓｉＮＡは化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ構造で構成される、１つ以上の化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ 分子は、センス領域およびアンチセンス領域を含む個別のポリヌクレオチド鎖を持つ非対称の二本鎖構造を含み、ここで前記アンチセンス領域は、約１８から約２３（例、約１８、１９、２０、２１、２２、または２３）ヌクレオチド長であり、前記センス領域は約３から約１５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５）ヌクレオチド長であり、ここで前記センス領域およびアンチセンス領域は少なくとも３つの相補ヌクレオチドを持ち、またここで前記ｓｉＮＡは化学式Ｉ−ＶＩＩ またはその任意の組み合わせを持つ構造で構成される１つ以上の化学修飾を含むことができる。別の態様においては、非対称の二本鎖ｓｉＮＡ 分子は、本明細書に記載のように化学修飾できる５' 末端リン酸基（例えば、化学式ＩＶを持つ５' 末端リン酸基）を持つこともできる。
【００９４】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、環状核酸分子を含み、ここで、前記ｓｉＮＡは約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）の塩基対を持つ約３８から約７０（例、約３８、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０）ヌクレオチド長であり、ここで前記ｓｉＮＡは化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれか、またはその任意の組み合わせの構造を持つ化学修飾を含むことができる。例えば、本発明の典型的な化学修飾ｓｉＮＡ分子は、化学式Ｉ −ＶＩＩのいずれか、またはその任意の組み合わせを持つ化学修飾で化学修飾される約４２から約５０（ 例、約４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０） ヌクレオチドを持つ環状オリゴヌクレオチドを含み、ここで、前記環状オリゴヌクレオチドは、約１９塩基対および２ループを持つダンベル型構造を形成する。
【００９５】
別の態様においては、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は２つのループモチーフを含み、ここで、前記ｓｉＮＡ分子の１方または両方のループ部分は、生分解が可能である。例えば、本発明の環状ｓｉＮＡ分子は、インビボのｓｉＮＡ 分子の、ループ部分の分解によって約２ヌクレオチドを含む３' 末端ヌクレオチド突出部等の３'末端突出部を持つ二本鎖ｓｉＮＡ分子を生成できるようにデザインされる。
【００９６】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば化学式Ｖ
【化６】
2007505606.tif 000006
を持つ化合物等の少なくとも１つ（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の脱塩基部分を含み、式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３はそれぞれＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ 、Ｏ−アルキル−ＯＨ 、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ 、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ−アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルカラミノ、ポリアルキラミノ、置換シリル、または化学式ＩまたはＩＩを持つグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝Ｏ、ＣＨＦまたはＣＦ２である。
【００９７】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば化学式ＶＩ
【化７】
2007505606.tif 000007
の化合物といった少なくとも１つ（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の逆位脱塩基部分を含み、式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＲ１３はそれぞれＨ、ＯＨ 、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ 、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ 、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ −アルキル、アルキル−Ｏ−アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルカラミノ、ポリアルキラミノ、置換シリル、または化学式ＩまたはＩＩを持つグループであり、Ｒ９はＯ、Ｓ、ＣＨ２、Ｓ＝ Ｏ、ＣＨＦまたはＣＦ２であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８またはＲ１３のいずれかが本発明のｓｉＮＡ分子との結合点となる。
【００９８】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば化学式ＶＩＩ
【化８】
2007505606.tif 000008
を持つ化合物等の少なくとも１つ（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の置換ポリアルキル部分を含み、式中、ｎ はそれぞれ１から１２までの整数であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はそれぞれＨ、ＯＨ、アルキル、置換アルキル、アルカリルまたはアラルキル、Ｆ、ＣＬ、Ｂｒ、ＣＮ 、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキル、Ｏ−アルケニル、Ｓ−アルケニル、Ｎ−アルケニル、ＳＯ−アルキル、アルキル−ＯＳＨ、アルキル−ＯＨ、Ｏ−アルキル−ＯＨ 、Ｏ
−アルキル−ＳＨ、Ｓ−アルキル−ＯＨ 、Ｓ−アルキル−ＳＨ、アルキル−Ｓ −アルキル、アルキル−Ｏ −アルキル、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、アミノアルキル、アミノ酸、アミノアシル、ＯＮＨ２、Ｏ−アミノアルキル、Ｏ−アミノ酸、Ｏ−アミノアシル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルカラミノ、ポリアルキラミノ、置換シリル、または化学式Ｉを持つグループであり、またＲ１、Ｒ２またはＲ３は本発明のｓｉＮＡ分子との結合点となる。
【００９９】
別の態様においては、本発明は化学式ＶＩＩを持つ化合物を特徴とし、ここで、Ｒ１およびＲ２はヒドロキシル（ＯＨ）グループ、ｎ ＝１であり、Ｒ３はＯを含み本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖の３' 端、５' 端、またはその両方との結合点、または本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子の一本鎖ｓｉＮＡ分子との結合点、または本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子との結合点である。本明細書において、当該修飾は「グリセリル」と呼ばれる（例えば、図１０の修飾６）。
【０１００】
別の態様においては、本発明の化学修飾ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩのいずれかを持つ部分）は、本発明のｓｉＮＡ分子の３'端、５' 端、またはその両方に存在する。例えば、化学修飾ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分）は、前記ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖、センス鎖、またはその両方の３'端、５' 端、またはその両方に存在し得る。別の態様においては、化学修飾ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分） は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ 分子のセンス鎖の５'端、３'端に、またアンチセンス鎖の３'端に存在する。別の態様においては、化学修飾ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５' 端、３'端の、またアンチセンス鎖の３' 端の末端位置に存在する。別の態様においては、化学修飾ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５' 端、３'端の、またアンチセンス鎖の３' 端の２つの末端位置に存在する。別の態様においては、化学修飾ヌクレオチドあるいは非ヌクレオチド（例、化学式Ｖ、ＶＩまたはＶＩＩを持つ部分）は、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５' 端、３'端の、またアンチセンス鎖の３' 端の最後から２番目の位置に存在する。加えて、化学式ＶＩＩ を持つ部分は、本明細書に記載のヘアピンｓｉＮＡ分子の３' 端、あるいは５' 端に存在し得る。
【０１０１】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は化学式ＶまたはＶＩを持つ脱塩基残基を含み、ここで化学式ＶまたはＶＩを持つ脱塩基残基は例えばｓｉＮＡ鎖の一方または両方の３' 端、５'端、またはその両方に３−３'、３−２'、２−３'、または５−５' 構造に結合される。
【０１０２】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばそのｓｉＮＡ 分子の５' 端、３'端、５'端と３'端の両方、またはその任意の組み合わせに１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドを含む。
【０１０３】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばそのｓｉＮＡ分子の５' 端、３' 端、５'端と３'端の両方、またはその任意の組み合わせに１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の非環状ヌクレオチドを含む。
【０１０４】
１つの態様においては、本発明は、センス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでセンス領域に存在する任意（ 例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
【０１０５】
１つの態様においては、本発明は、センス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでセンス領域に存在する任意（ 例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドであり（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）、ここで前記センス領域に存在する３’末端ヌクレオチド突出部を含む任意のヌクレオチドは２’ −デオキシヌクレオチドである。
【０１０６】
１つの態様においては、本発明は、センス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでセンス領域に存在する任意（ 例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
【０１０７】
１つの態様においては、本発明は、センス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここでセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての）ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでセンス領域に存在する任意（ 例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）、ここで前記センス領域に存在する３’末端ヌクレオチド突出部を含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１０８】
１つの態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての） ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでアンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
【０１０９】
１つの態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての） ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでアンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであり（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）、ここで前記アンチセンス領域に存在する３’末端ヌクレオチド突出部を含む任意のヌクレオチドは２’−デオキシヌクレオチドである。
【０１１０】
１つの態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての） ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでアンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）。
【０１１１】
１つの態様においては、本発明は、アンチセンス領域を含む化学修飾した本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここでアンチセンス領域に存在する任意の（例、１つ以上または全ての） ピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであり（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、またここでアンチセンス領域に存在する任意（例、１つ以上またはすべて）のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。
【０１１２】
１つの態様においては、本発明は、センス領域およびアンチセンス領域を含む細胞またはインビトロシステム内のＨＣＶに対しＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ ）を媒介できる本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで前記センス領域に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは２'−デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチド（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２'−デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２'−デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、およびセンス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは２’−デオキシプリンヌクレオチド（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドであるか、代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−デオキシプリンヌクレオチドである）であり、ここでアンチセンス領域に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは２’ −デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチド（例ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’ −デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２' −デオキシ−２'−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、およびアンチセンス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。センス領域および／またはアンチセンス領域は、本明細書に記載または図１０に示す任意の修飾等、センスおよび／またはアンチセンス配列の３' 端、５' 端、またはその両端に任意で存在する末端キャップ修飾を持つことができる。前記センスおよび／アンチセンス領域は、さらに任意で約１つから約４つ（例、約１、２、３、または４）の２'−デオキシヌクレオチドを持つ３'端ヌクレオチド突出部を含むことができる。前記突出ヌクレオチドは、さらに１つ以上（例、約１、２、３、４以上）のホスホロチオエート、ホスホノ酢酸、および／またはチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間結合を含むことができる。これら化学修飾したｓｉＮＡ の限定を目的としない例を、本明細書の図５および５ならびに表ＩＩＩおよびＩＶに示す。これらの記載した態様いずれかにおいて、センス領域に存在するプリンヌクレオチドは代替として２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）であり、アンチセンス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチド２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。また、これらの態様のいずれかにおいて、センス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは代替としてプリンリボヌクレオチド��例、ここですべてのプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドがプリンリボヌクレオチドである）であり、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）。さらに、これらの態様のいずれかにおいて、センス領域に存在する、および／またはアンチセンス領域に存在する１つ以上のプリンヌクレオチドは、代替として２’−デオキシヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されるグループから選択される（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２'−デオキシヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２'−メトキシエチルヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、および２'−Ｏ−メチルヌクレオチドで構成されるグループから選択されるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２'−デオキシヌクレオチド、ロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチド、２'−メトキシエチルヌクレオチド、４'−チオヌクレオチド、および２'−Ｏ −メチルヌクレオチドで構成されるグループから選択される）。
【０１１３】
別の態様においては、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖にあるが、任意でセンス鎖および／またはアンチセンス鎖とセンス鎖の両方にある本発明のｓｉＮＡ分子に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、自然発生リボヌクレオチドと同様の特徴または特性を持つ修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明はノーザン構造（例、ノーザン擬似回転サイクル、センガー（Ｓａｅｎｇｅｒ），核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）， スプリンガー−ヴァーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）ら，１９８４年を参照）を持つ修飾ヌクレオチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。そのように、好ましくは本発明のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖にあるが、任意でセンス鎖および／またはアンチセンス鎖とセンス鎖の両方にある本発明のｓｉＮＡ分子に存在する化学修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡｉを媒介する能力を維持すると同時に、ヌクレアーゼ分解に対する耐性を示す。ノーザン構造を持つヌクレオチドに関する限定を目的としない例は、ロックト核酸（ＬＮＡ） ヌクレオチド（例、２'−Ｏ，４'−Ｃ−メチレン−（Ｄ−リボフラノシル） ヌクレオチド）、２'−メトキシエトキシ（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２'−メチル−チオ−エチル、２'−デオキシ−２'−フルオロヌクレオチド、２'−デオキシ−２'−クロロヌクレオチド、２'−アジドヌクレオチド、および２'−Ｏ−メチルヌクレオチドを含む。
【０１１４】
１つの態様においては、本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子のセンス鎖は、逆位のデオキシ脱塩基部分等の末端キャップ部（例えば図１０を参照）をセンス鎖の３’端、５’ 端、または３’端および５’端の両方に含む。
【０１１５】
１つの態様においては、本発明は細胞または再構成インビトロシステム内でＨＣＶに対してＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる本発明の化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで化学修飾は化学修飾したｓｉＮＡ分子に共有結合するコンジュゲートを含む。本発明で予定されるコンジュゲートに関する限定を目的としない例は、ヴァーギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）ら，２００３年４月３０日出願の米国特許出願１０／４２７，１６０に記載のコンジュゲートおよびリガンドを含み、参照することにより図を含むその全体が本出願に組み込まれる。別の態様においては、コンジュゲートは生分解性リンカーを介して化学修飾ｓｉＮＡ分子と共有結合する。１つの態様においては、前記コンジュゲート分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３' 端で結合される。別の態様においては、コンジュゲート分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の５'端で結合される。さらに別の態様においては、コンジュゲート分子は化学修飾ｓｉＮＡ分子のセンス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方の３'端および５' 端、またはその任意の組み合わせと結合する。１つの態様においては、本発明のコンジュゲート分子は、細胞等の生体系への化学修飾したｓｉＮＡ分子のデリバリーを促進する分子を含む。別の態様においては、化学修飾したｓｉＮＡ分子に結合するコンジュゲート分子は、ポリエチレングリコール、ヒト血清アルブミン、または細胞摂取を媒介できる細胞受容体用のリガンドである。化学修飾したｓｉＮＡ 分子に結合できる本発明で予定される特定コンジュゲートの例は、ヴァーギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）らの米国特許出願１０／２０１，３９４に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。使用されるコンジュゲートのタイプおよび本発明のｓｉＮＡ 分子のコンジュゲートの範囲は、ＲＮＡｉ 活性を媒介するｓｉＮＡの能力を維持しながら、向上した薬物動態プロファイル、生物学的利用能、および／またはｓｉＮＡ構造の安定性について評価することができる。そのようにして、当業者は様々なコンジュゲートで修飾したｓｉＮＡ構造をスクリーニングし、当該技術分野において一般に知られているように、例えば動物モデルにおいて、ｓｉＮＡコンジュゲート複合体がＲＮＡｉを媒介する能力を維持しながら改善された特性を持つかどうかを判断することができる。
【０１１６】
１つの態様においては、本発明は本発明の低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡはヌクレオチド、非ヌクレオチド、またはｓｉＮＡのセンス領域をｓｉＮＡのアンチセンス領域に結合する混合ヌクレオチド／非ヌクレオチドリンカーをさらに含む。１つの態様においては、本発明のヌクレオチドリンカーは２２ヌクレオチド長のリンカーであり、例えば３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長でアルことができる。別の態様においては、前記ヌクレオチドリンカーは、核酸アプタマーであってもよい。本明細書で使用する「アプタマー」または「核酸アプタマー」とは、標的分子に対して特異的に結合する核酸分子を意味し、ここで核酸分子はその自然な状態において標的分子によって認識される配列を含む配列を持つ。代替として、アプタマーは標的分子と結合する核酸分子であってもよく、ここで標的分子は核酸と自然に結合しない。標的分子は関連の任意の分子であってよい。例えば、前記アプタマーを使用して、タンパク質のリガンド結合ドメインに結合することができ、それによって自然発生するリガンドとタンパク質との相互作用を回避することができる。これは限定を目的としない例であり、当業者であれば当該技術分野において一般に知られている技術を使用して他の態様を容易に実施できる（例えば、ゴールド（Ｇｏｌｄ）ら，１９９５年，生化学アニュアルレビュー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４，７６３； ブロディー（Ｂｒｏｄｙ） とゴールド（Ｇｏｌｄ），２０００年，生物工学会誌（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），７４，５； サン（Ｓｕｎ），２０００年分子治療学カレントオピニオン（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｌｔｅｒ．），２，１００； クッサー（Ｋｕｓｓｅｒ），２０００年，生物工学会誌（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．），７４，２７； ハーマン（Ｈｅｒｍａｎｎ） とパテル（Ｐａｔｅｌ），２０００年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２８７，８２０；およびジャヤセナ（Ｊａｙａｓｅｎａ），１９９９年，臨床化学誌（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），４５，１６２８を参照）。
【０１１７】
さらに別の態様においては、本発明の非ヌクレオチドリンカーは、脱塩基ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミド、ペプチド、炭水化物、脂質、ポリ炭化水素、または他のポリマー化合物（例、２から１００エチレングリコール単位を持つポリエチレングリコール等）を含む。特定の例は、シーラ（Ｓｅｅｌａ） とカイザー（Ｋａｉｓｅｒ）， 核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０年，１８：６５３５および核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９８７年，１５：３１１３； クロード（Ｃｌｏａｄ） とシェパーツ（Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ）， 米国化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１９９１年，１１３：６３２４； リチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ） とシェパーツ（Ｓｃｈｅｐａｒｔｚ）， 米国化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９）１年，１１３：５１０９マ（Ｍａ）ら，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３年，２１：２５８５および生物化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９９３年，３２：１７５１； デュラン（Ｄｕｒａｎｄ）ら，核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０年，１８：６３５３；マカーディ（ＭｃＣｕｒｄｙ） ら，ヌクレオシドとヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ），１９９１年，１０：２８７； イシュク（Ｊｓｃｈｋｅ） ら，テトラヒドロン通信（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９３年，３４：３０１； オノ（Ｏｎｏ） ら，生物化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），１９９１年，３０：９９１４， アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ） ら，国際公開ＷＯ８９／０２４３９；ウスマン（Ｕｓｍａｎ ）ら，国際公開ＷＯ９５／０６７３１； ドゥーディッチ（Ｄｕ
ｄｙｃｚ） ら，国際公開ＷＯ９５／１１９１０、およびフェレンツ（Ｆｅｒｅｎｔｚ） とヴェルディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）， 米国化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．），１９９１年，１１３：４０００に記載のものを含み、それらはすべて参照することにより本明細書に組み込まれる。さらに「非ヌクレオチド」は１つ以上のヌクレオチド単位として核酸鎖に組み込むことができる任意のグループまたは化合物を意味し、糖および／またはリン酸塩置換のいずれかを含み、また残基はその酵素活性を示すことができる。前記グループまたは化合物は、例えば糖のＣ１位においてアデノシン、グアニン、ウラシル、またはチミン等の一般に認識されているヌクレオチド塩基を含まない場合は、脱塩基であってよい。
【０１１８】
１つの態様においては、本発明は細胞または再構成インビトロシステム内でＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介できる化学修飾した低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、ここで、２つの個別のオリゴヌクレオチドの集合であるｓｉＮＡ分子の一方または両方の鎖はいかなるリボヌクレオチドも含まない。例えば、ｓｉＮＡ分子は単一オリゴヌクレオチドの集合であってよく、ここでｓｉＮＡのセンス領域およびアンチセンス領域は、オリゴヌクレオチドに存在するいかなるリボヌクレオチド（例、２'−ＯＨ グループを持つヌクレオチド）も持たない個別のオリゴヌクレオチドを含む。別の例において、ｓｉＮＡ 分子は単一オリゴヌクレオチドの集合であってよく、ここでｓｉＮＡのセンス領域およびアンチセンス領域は、本明細書に記載のヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーによって結合されるか、または円状になり、ここで、オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドに存在するいかなるリボヌクレオチド（例、２'−ＯＨグループを持つヌクレオチド）も持たない。驚くべきことに、出願人はｓｉＮＡ分子内のリボヌクレオチド（例、２'−ヒドロキシルグループを持つヌクレオチド）の存在はＲＮＡｉ 活性のサポートに必要不可欠ではないことを発見した。そのように、１つの態様においては、ｓｉＮＡ内のすべての位置は化学式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、またはＶＩＩ、あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチド等の化学修飾したヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドを含むことができ、細胞におけるＲＮＡｉ活性をサポートするｓｉＮＡ分子の能力をある程度維持することができる。
【０１１９】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞または再構成インビトロシステム内でＲＮＡｉ活性を媒介する一本鎖ｓｉＮＡ分子であり、前記ｓｉＮＡ分子は標的核酸配列に対する相補性を持つ一本鎖ポリヌクレオチドを含む。別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ 分子は５'−端リン酸基を含む。別の態様においては、本発明の前記一本鎖ｓｉＮＡ分子は５' −端リン酸基および３'−端リン酸基（例、２'，３'−環状リン酸）を含む。別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子は、約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチドを含む。さらに別の態様においては、本発明の前記一本鎖ｓｉＮＡ 分子は、本明細書に記載の１つ以上の化学修飾ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含む。例えば、ｓｉＮＡ分子内のすべての位置は、科学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれか、またはその任意の組み合わせを持つヌクレオチド等の化学修飾ヌクレオチドを含むことができ、細胞におけるＲＮＡｉ 活性をサポートするｓｉＮＡ分子の能力をある程度維持することができる。
【０１２０】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞または再構成インビトロシステム内でＲＮＡｉ活性を媒介する、標的核酸配列に対する相補性を持つ一本鎖ポリヌクレオチドを含む一本鎖ｓｉＮＡ分子であり、ここでｓｉＮＡ内に存在する１つ以上のピリミジンヌクレオチドは２’−デオキシ−２’ −フルオロピリミジンヌクレオチド（例、ここですべてのピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドであるか、または代替として複数のピリミジンヌクレオチドが２’−デオキシ−２’−フルオロピリミジンヌクレオチドである）、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチド（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２’−Ｏ−メチルプリンヌクレオチドである）であり、また本明細書に記載または図１０に示すような任意の修飾、つまり、前記アンチセンス配列の３' 端、５' 端、または３'端と５'端の両方に任意で存在する末端キャップ修飾等が含まれる。さらにｓｉＮＡは、前記ｓｉＮＡ分子の３'端に任意で約１つから４つ以上（例、約１、２、３、または４以上）の末端２' −デオキシヌクレオチドを含み、ここで末端ヌクレオチドは、さらに１つ以上（例、１、２、３、または４以上）のホスホロチオエート、ホスホノ酢酸、および／またはチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間結合を含むことができ、またここでｓｉＮＡ は任意で５'端リン酸基等の末端リン酸基をさらに含む。それらの態様のいずれかにおいて、アンチセンス領域に存在する任意のプリンヌクレオチドは代替として２'−デオキシプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２'−デオキシプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２' −デオキシプリンヌクレオチドである）。また、それらの態様のいずれかにおいて、前記ｓｉＮＡに存在する任意のプリンヌクレオチド（例、センス領域および／またはアンチセンス領域に存在するプリンヌクレオチド）は、代替としてロックト核酸（ＬＮＡ）ヌクレオチドであってもよい（例、ここですべてのプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドがＬＮＡヌクレオチドである）。また、それらの態様のいずれかにおいて、ｓｉＮＡに存在する任意のプリンヌクレオチドは、代替として２'−メトキシエチルプリンヌクレオチドである（例、ここですべてのプリンヌクレオチドが２'−メトキシエチルプリンヌクレオチドであるか、または代替として複数のプリンヌクレオチドが２'−メトキシエチルプリンヌクレオチドである）。別の態様においては、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ分子に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、自然発生リボヌクレオチドと同様の特性または特徴を持つ修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明はノーザン構造（例、ノーザン擬似回転サイクル、センガー（Ｓａｅｎｇｅｒ）， 核酸構造の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）， スプリンガー−ヴァーラグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ） ら，１９８４年を参照）を持つ修飾ヌク���オチドを含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。そのように、本発明の一本鎖ｓｉＮＡ 分子に存在する化学修飾ヌクレオチドは、好ましくはＲＮＡｉ媒介能力を維持しながらヌクレアーゼ分解に対する耐性を持つ。
【０１２１】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は化学修飾したヌクレオチドまたは非ヌクレオチド（例、化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれかを持つ、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等）をｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖または領域内にある代替的位置に含む。例えば、そのような化学修飾を、ｓｉＮＡの３’端または５’端からの第一または第二いずれかの鎖をはじめ、ＲＮＡベースのｓｉＮＡ分子のその他いかなる位置に導入してもよい。限定を目的としない例において、ｓｉＮＡの各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の二本鎖ｓｉＮＡ 分子は、各鎖の位置１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９および２１が化学修飾されている（例、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを持つ化合物を有する、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等）ことを特徴とする。限定を目的としない別の態様においては、ｓｉＮＡ の各鎖が２１ヌクレオチド長である本発明の二本鎖ｓｉＮＡ分子は、各鎖の位置２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０が化学修飾されている（例、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを持つ化合物を有する、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、または２’−Ｏ−メチルヌクレオチド等）ことを特徴とする。そのようなｓｉＮＡ分子は本明細書に記載のように末端キャップ部および／または骨格修飾をさらに含むことができる。
【０１２２】
１つの態様においては、本発明は（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、および（ｂ） 細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１２３】
１つの態様においては、本発明は（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡ のセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一またはほぼ同様の配列を含む）、および（ｂ） 細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１２４】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明の複数のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ分子の１つが複数のＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡ のセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列とほぼ同様の配列を含む）、また（ｂ）細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、複数のｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内にある２以上のＨＣＶ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
【０１２５】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖がＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列とほぼ同様の配列を含む）、および（ｂ） 細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内にある２つ以上のＨＣＶ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
【０１２６】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ遺伝子の複数のＲＮＡに相補的な複数の配列を含み、ｓｉＮＡのセンス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一またはほぼ同様の配列を含む）、および（ｂ） 細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を細胞に導入することを含む、細胞内の複数のＨＣＶ遺伝子の発現を調節する方法を特徴とする。
【０１２７】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は体外アプリケーションにおける試薬として使用される。例えば、ｓｉＮＡ試薬は、治療効果を挙げるため対象に移植される組織または細胞に導入される。細胞および／または組織は、後に移植を受ける生物体または対象から採取するか、または移植前に別の生物体または対象から採取してよい。細胞または組織が、望ましい表現型を取得するか、またはインビボで移植された場合に機能を実施できるように、ｓｉＮＡ分子を使用して、細胞または組織内の１つ以上の遺伝子発現を調節することができる。１つの態様においては、特定のターゲット細胞を患者から抽出する。それらの抽出細胞は、それらの細胞によるｓｉＮＡの摂取に適した条件下で（例、カチオン脂質、リポソーム等のデリバリー試薬を使用するか、または細胞へのｓｉＮＡのデリバリーを促進するエレクトロポレーション等の技術を使用して）、特定のヌクレオチド配列を標的とするｓｉＮＡと細胞内で接触される。その後、前記細胞は同一の患者または他の患者に再導入される。１つの態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成する（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、および（ｂ）細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を特定の生物体から採取した組織外植片の細胞に導入することを含む、組織外植片内のＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。別の態様においては、前記方法はさらに、その生物体におけるＨＣＶ 遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、組織を採取した生物体または別の生物体に組織外植片を再導入することを含む。
【０１２８】
１つの態様においては、本発明は（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含み、センス鎖配列が標的ＲＮＡの配列と同一またはほぼ同様の配列を含む、） および（ｂ） 組織外植におけるＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物体から採取した組織外植細胞に導入することを含む、組織外植片における遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。別の態様においては、前記方法はさらに、その生物体におけるＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、組織を採取した生物体または別の生物体に組織外植片を再導入することを含む。
【０１２９】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明の複数のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つが複数のＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む、） および（ｂ） 細胞内の複数のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、複数のｓｉＮＡ分子を特定の生物体から採取した組織外植片の細胞に導入することを含む、組織外植片内の１つより多いＨＣＶ 遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。別の態様においては、前記方法はさらに、その生物体における複数のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、組織を採取した生物体または別の生物体に組織外植片を再導入することを含む。
【０１３０】
１つの態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成する（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む、） および（ｂ） 対象または生物体内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象または生物体に導入することを含む、対象または生物体内のＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。ＨＣＶタンパク質またはＲＮＡのレベルは当該技術分野において知られる様々な方法を使用して測定できる。
【０１３１】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明の複数のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つが複数のＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む）、および（ｂ） 対象または生物体内の複数のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、複数のｓｉＮＡ分子を対象または生物体に導入することを含む、対象または生物体内の１つより多いＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。ＨＣＶタンパク質またはＲＮＡのレベルは当該技術分野において知られるように測定できる。
【０１３２】
１つの態様においては、本発明は（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖がＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補性を持つ一本鎖配列を含む、） および（ｂ） 細胞内のＨＣＶ 遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ 分子を細胞に導入することを含む、細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１３３】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに対し相補性を持つ一本鎖配列を含む、） および（ｂ） 細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子をインビボまたはインビトロで細胞と接触させることを含む、細胞内の１つより多いＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１３４】
１つの態様においては、本発明は（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖がＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに相補的な配列を含む、） および（ｂ） 細胞内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を特定の生物体から採取した組織外植片の細胞と接触させることを含む、組織外植片（ 例、肝移植）内のＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。別の態様においては、前記方法はさらに、その対象または生物体におけるＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、組織を採取した対象または生物体もしくは別の対象または生物体に組織外植片を再導入することを含む。
【０１３５】
１つの態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明の複数のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡが複数のＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに対し相補性を持つ一本鎖配列を含む、） および（ｂ） 組織外植片内の複数のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、複数のｓｉＮＡ 分子を特定の生物体から採取した組織外植片の細胞に導入することを含む、組織外植片内（例、肝移植）の１つより多いＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。別の態様においては、前記方法はさらに、その対象または生物体における複数のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、組織を採取した対象または生物体もしくは別の対象または生物体に組織外植片を再導入することを含む。
【０１３６】
１つの態様においては、本発明は（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに対し相補性を持つ一本鎖配列を含む、） および（ｂ） 対象または生物体内のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、ｓｉＮＡ分子を対象または生物体に導入することを含む、対象または生物体内のＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１３７】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学修飾可能な本発明の複数のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡがＨＣＶ遺伝子のＲＮＡに対し相補性を持つ一本鎖配列を含む、） および（ｂ） 対象または生物体内の複数のＨＣＶ遺伝子発現を調節（例、抑制）するのに適した条件下で、複数のｓｉＮＡ分子を対象または生物体に導入することを含む、対象または生物体内の１つより多いＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１３８】
１つの態様においては、本発明は、生物体における遺伝子発現の調節（例、抑制）に適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物体におけるＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１３９】
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における遺伝子発現の抑制発現の調節（ 例、抑制）に適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物体におけるＨＣＶ感染を治療または阻止する方法を特徴とする。
【０１４０】
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における遺伝子発現の抑制発現の調節（例、抑制）に適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物体における肝不全を治療または阻止する方法を特徴とする。
【０１４１】
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における遺伝子発現の抑制発現の調節（ 例、抑制）に適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物体における肝細胞癌を治療または阻止する方法を特徴とする。
【０１４２】
１つの態様においては、本発明は、対象または生物体における遺伝子発現の抑制発現の調節（ 例、抑制）に適した条件下で、対象または生物体を本発明のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物体における肝硬変を治療または阻止する方法を特徴とする。
【０１４３】
別の態様においては、本発明は、対象または生物体における複数の遺伝子発現の調節（例、抑制）に適した条件下で、対象または生物体を本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子と接触させることを含む、対象または生物体における１つより多いＨＣＶ遺伝子発現を調節する方法を特徴とする。
【０１４４】
本発明のｓｉＮＡ分子は、様々なＲＮＡ分子のＲＮＡｉターゲティングを通じて標的（例、ＨＣＶ）遺伝子発現を下方制御するか、または抑制するようにデザインできる。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して標的遺伝子に対応する様々なＲＮＡを標的とする。そのようなＲＮＡの限定を目的としない例にはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、標的遺伝子の代替ＲＮＡスプライスバリアント、標的遺伝子の転写後修飾ＲＮＡ、標的遺伝子のプレｍＲＮＡ、および／またはＲＮＡテンプレートが含まれる。代替スプライシングが適切なエクソンを使用することで区別される一群の転写を生成する場合、本発明を使用して適切なエクソンを通じて遺伝子発現抑制することができ、特に、遺伝子ファミリーメンバーの機能を抑制または区別することができる。例えば、代替としてスプライスされた膜貫通型ドメインを含むタンパク質は、膜結合型および分泌型の両方で発現することができる。本発明を使用して膜貫通型ドメインを含むエクソンを標的とすることで、タンパク質の分泌型に対向する膜結合型の製薬ターゲティングの機能的結果を判別することができる。それらＲＮＡ分子の標的に関連する本発明のアプリケーションの限定を目的としない例は、治療医薬アプリケーション、医薬品発見アプリケーション、分子診断および遺伝子機能アプリケーション、および例えば本発明のｓｉＮＡ分子を用いた単一のヌクレオチド多型マッピングを使用した遺伝子マッピングを含む。そのようなアプリケーションは、既知の遺伝子配列または発現配列標識（ＥＳＴ）から取得可能な部分配列を使用して実行できる。
【０１４５】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を使用して、ＨＣＶファミリー遺伝子（例、既知の全ＨＣＶ株、関連ＨＣＶ株グループ、分岐ＨＣＶ株グループ）等、１つまたは複数の遺伝子ファミリーに対応する保存配列を標的とする。そのようにして、複数のＨＣＶ標的をターゲットとするｓｉＮＡ 分子は治療効果を高めることができる。さらに、ｓｉＮＡを使用して、様々なアプリケーションにおける遺伝子機能の経路を特徴づけることができる。例えば、本発明を使用して、経路における標的遺伝子の活性を抑制し、遺伝子機能分析、ｍＲＮＡ機能分析、または翻訳分析において未同定の遺伝子の機能を判別することができる。本発明を使用して、医薬品開発に向けた様々な疾患および状態に関与する潜在的な標的遺伝子経路を判別することができる。本発明を使用して、例えば増殖性疾患、障害および状態に関与する遺伝子発現の経路を理解することができる。
【０１４６】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子および／または方法を使用して、例えばジンバンクアクセッション番号で本明細書に参照されるＲＮＡ配列をコードする遺伝子、例えば表Ｉに示されるジンバンクアクセッション番号等、ジンバンクアクセッション番号で参照されるＲＮＡをコードする遺伝子の発現を下方制御する。
【０１４７】
１つの態様においては、本発明は（ａ）事前設定された複雑性を持つｓｉＮＡ構造のライブラリを生成すること、（ｂ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ標的部位を判別するのに適した条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡ構造を試験することから成る方法を特徴とする。１つの態様においては、（ａ） のｓｉＮＡ分子は例えば約２３ヌクレオチド長といった固定長の鎖を持つ。別の態様においては、（ａ） のｓｉＮＡ分子は異なる長さであり、例えば約１５から約３０（ 例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の鎖を持つ。１つの態様においては、アッセイには本明細書に記載の再構成インビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては、アッセイには標的ＲＮＡが発現する細胞培養システムを含むことができる。別の態様においては、標的ＲＮＡの断片は、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット解析、またはＲＮＡｓｅタンパク質アッセイによって、検出可能なレベルの切断を分析し、標的ＲＮＡ配列内の最適標的部位を判断する。前記標的ＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られるように、例えばクローニングおよび／またはインビトロシステムの転写、およびインビボシステムにおける細胞発現によって取得することができる。
【０１４８】
１つの態様においては、本発明は（ａ）４N等の事前設定された複雑性を持つｓｉＮＡ構造のランダムなライブラリを生成すること（ここでＮは各ｓｉＮＡ構造鎖における塩基対ヌクレオチドの数を示す（例、１９塩基対とともに２１ヌクレオチドセンスおよびアンチセンス鎖を持つｓｉＮＡ構造の場合、前記複雑性は４19である））、および（ｂ）標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ 標的部位を判別するのに適した条件下で、上記（ａ）のｓｉＮＡ構造を試験することから成る方法を特徴とする。別の態様においては、（ａ） のｓｉＮＡ分子は例えば約２３ヌクレオチド長といった固定長の鎖を持つ。さらに別の態様においては、
（ａ）のｓｉＮＡ分子は異なる長さであり、例えば約１５から約３０（ 例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の鎖を持つ。１つの態様においては、アッセイには本明細書の実施例６に記載の再構成インビトロｓｉＮＡ アッセイを含むことができる。別の態様においては、前記アッセイには標的ＲＮＡが発現する細胞培養システムを含むことができる。別の態様においては、ＨＣＶＲＮＡの断片は、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット解析、またはＲＮＡｓｅタンパク質アッセイによって、検出可能なレベルの切断を分析し、標的ＨＣＶ ＲＮＡ配列内の最適標的部位を判断する。前記標的ＨＣＶ ＲＮＡ配列は、当該技術分野において知られるように、例えばクローニングおよび／またはインビトロシステムの転写、およびインビボシステムにおける細胞発現によって取得することができる。
【０１４９】
別の態様においては、本発明は（ａ）標的遺伝子によりコードされるＲＮＡ標的の配列を分析すること、（ｂ）（ａ）のＲＮＡの１つ以上の領域に対して相補的な配列を持つ１つ以上のセットのｓｉＮＡ分子を合成すること、および（ｃ） 標的ＲＮＡ配列内のＲＮＡｉ配列を判別するのに適した条件下で、
（ｂ） のｓｉＮＡ分子を試験することから成る方法を特徴とする。１つの態様においては、（ｂ） のｓｉＮＡ分子は例えば約２３ヌクレオチド長といった固定長の鎖を持つ。別の態様においては、（ｂ） の前記ｓｉＮＡ 分子は異なる長さであり、例えば約１５から約３０（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）ヌクレオチド長の鎖を持つ。１つの態様においては、アッセイには本明細書に記載の再構成インビトロｓｉＮＡアッセイを含むことができる。別の態様においては、前記アッセイには標的ＲＮＡが発現する細胞培養システムを含むことができる。標的ＲＮＡの断片は、例えばゲル電気泳動、ノーザンブロット解析、またはＲＮＡｓｅ タンパク質アッセイによって、検出可能なレベルの切断を分析し、標的ＲＮＡ配列内の最適標的部位を判断する。前記標的ＲＮＡ 配列は、当該技術分野において知られるように、例えばクローニングおよび／またはインビトロシステムの転写、およびインビボシステムにおける発現によって取得することができる。
【０１５０】
「標的部位」とは、標的配列に相補的なそのアンチセンス領域内に配列を含むｓｉＮＡ構造により媒介される切断の「標的」とされる標的ＲＮＡ内の配列を意味する。
【０１５１】
「検出可能なレベルの切断」とは、標的ＲＮＡのランダムな分解によって生成されるＲＮＡのバックグラウンドから切断産物を識別するのに十分な標的ＲＮＡの切断（および切断された生成ＲＮＡの形成）を意味する。標的ＲＮＡの１−５％ の切断産物の生成は、検出の大部分の方法でバックグラウンドからの検出に十分である。
【０１５２】
１つの態様においては、本発明は、医薬的に許容できる担体または希釈剤に化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を含む組成物を特徴とする。別の態様においては、本発明は、医薬的に許容できる担体または希釈剤中の１つまたは複数の遺伝子を標的とする化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を含む医薬組成物を特徴とする。別の態様においては、本発明は、対象における疾患または状態の診断に適した条件下で、本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象における疾患または状態の診断方法を特徴とする。別の態様においては、本発明は、対象における疾患または状態の治療または予防に適した条件下で、本発明の組成物を単独、または１つ以上の他の治療化合物と組み合わせて、対象に投与することを含む、対象における疾患または状態を治療または予防する方法を特徴とする。さらに別の態様においては、本発明は、対象あるいは生物体におけるＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変の抑制、削減、または予防に適した条件下で、本発明の組成物を対象に投与することを含む、対象あるいは生物体におけるＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変を抑制、削減、または予防する方法を特徴とする。
【０１５３】
別の態様においては、本発明は、（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含む）（ｂ） 細胞、組織、
、対象、または生物体におけるＨＣＶ標的遺伝子発現の調節に適した条件下で、細胞、組織、対象、または生物体へｓｉＮＡ分子を導入すること、および（ｃ）細胞、組織、対象、または生物体における任意の表現型変化を試験することによって遺伝子機能を判別することから成るＨＣＶ遺伝子標的を確認する方法を特徴とする。
【０１５４】
別の態様においては、本発明は、（ａ） 化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を合成すること（ここでｓｉＮＡ鎖の１つがＨＣＶ標的遺伝子のＲＮＡに対して相補的な配列を含む）、（ｂ） 生体系におけるＨＣＶ標的遺伝子発現の調節に適した条件下で、生体系へｓｉＮＡ分子を導入すること、および（ｃ） 生体系における任意の表現型変化を試験することによって遺伝子機能を判別することから成る、ＨＣＶ標的を確認する方法を特徴とする。
【０１５５】
「生体系」とはヒトあるいは動物を含む生物源から精製されたまたは未精製フォームの材料を意味するがそれらに限定されず、ここで、前記システムはＲＮＡｉ活性に必要な要素を含む。「生体系」という語は、例えば、細胞、組織、対象、または生物体、あるいはその抽出物を含む。また生体系という語は、インビトロ環境で使用できる再構成ＲＮＡｉシステムを含む。
【０１５６】
「表現型の変化」とは、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ） との結合、またはそれを用いた処理に応答して生じる細胞への任意の検出可能な変化を意味する。そのような検出可能な変化は、当該技術分野において知られている方法で試験できる形状、サイズ、増殖、運動性、タンパク質発現またはＲＮＡ 発現、あるいは他の物理的または化学的変化を含むが、それらに限定されない。また、前記検出可能な変化は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等のレポーター遺伝子／分子の発現、発現したタンパク質の識別に使用される様々なタグ、あるいは試験できる任意の他の細胞要素を含む。
【０１５７】
１つの態様においては、本発明は、例えば細胞、組織、対象、または生物体等の生体系におけるＨＣＶ標的遺伝子発現の調節に使用できる化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とする。別の態様においては、本発明は、例えば細胞、組織、対象、または生物体等の生体系における２以上のＨＣＶ標的遺伝子発現の調節に使用できる、化学修飾可能な本発明の２以上のｓｉＮＡ分子を含むキットを特徴とする。
【０１５８】
１つの態様においては、本発明は、化学修飾可能な本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子を含む細胞を特徴とする。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含む前記細胞は哺乳類細胞である。さらに別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子を含む前記細胞はヒト細胞である。
【０１５９】
１つの態様においては、化学修飾可能な本発明のｓｉＮＡ分子の合成は、（ａ） 前記ｓｉＮＡ 分子の２つの相補鎖の合成、（ｂ） 二本鎖ｓｉＮＡ分子の取得に適した条件下における２つの相補鎖のアニールから成る。別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は、固相オリゴヌクレオチド合成による。さらに別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子の２つの相補鎖の合成は、固相タンデムオリゴヌクレオチド合成による。
【０１６０】
１つの態様においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の第一オリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで前記第一オリゴヌクレオチド配列鎖は、ｓｉＮＡの第二オリゴヌクレオチド配列鎖の合成用骨格として使用できる切断可能なリンカー分子を含む）、（ｂ） 前記第一オリゴヌクレオチド配列鎖の骨格上にあるｓｉＮＡの第二オリゴヌクレオチド配列を合成すること（ここで前記第二オリゴヌクレオチド配列はさらにｓｉＮＡ二重鎖を精製するのに使用できる化学部分を含む）、（ｃ）２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズして安定した二重鎖を形成するために適した条件下で、（ａ） のリンカー分子を切断すること、および（ｄ）第二オリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用して、ｓｉＮＡ二重鎖を精製することを含む、ｓｉＮＡ二重鎖分子の合成方法を特徴とする。１つの態様においては、上記（ｃ）における前記リンカー分子の切断は、メチラミン等のアルキラミン塩基を使用して、例えば、加水分解条件下で前記オリゴヌクレオチドの脱保護中に生じる。１つの態様においては、前記合成方法は、制御核ガラス（ＣＰＧ） またはポリスチレン等の強固な支持体上の固相合成を含む。ここで、（ａ） の第一配列は、強固な支持体を骨格として使用して、スクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。第二鎖の合成用骨格として使用される（ａ）の前記切断可能なリンカーは、固支持体被覆リンカーとして同様の反応度を含むことができるので、固支持体被覆リンカーおよび（ａ）の切断可能なリンカーの切断は同時に発生する。別の態様においては、結合したオリゴヌクレオチド配列の分離に使用できる（ｂ）の化学部分は、例えばジメトキシトリチルグループ等の、本明細書に記載のトリチル−オン合成方法で使用できるトリチルグループを含む。さらに別の態様においては、ジメトキシトリチルグループ等の前記化学部分は、例えば酸性条件下を使用して精製中に除去される。
【０１６１】
別の態様においては、ｓｉＮＡ合成方法は、溶液相合成またはハイブリッド相合成であり、ここで、ｓｉＮＡ二重鎖の両鎖は、第二配列の合成用骨格として作用する第一配列に結合している切断可能なリンカーを使用して並行して合成される。個別のｓｉＮＡ配列鎖のハイブリダイゼーションに適した条件下で前記リンカーを切断すると、二本鎖ｓｉＮＡ分子が形成される。
【０１６２】
別の態様においては、本発明は、（ａ）ｓｉＮＡ分子の１つのオリゴヌクレオチド配列鎖を合成すること（ここで前記配列は別のオリゴヌクレオチド配列の合成用骨格として使用できる切断可能なリンカー分子を含む）、（ｂ）（ａ） の骨格上にある第一配列鎖に対して相補性を持つ第二オリゴヌクレオチド配列を合成すること（ここで前記第二配列は二本鎖ｓｉＮＡ分子のもう一方の鎖を含みまたここで前記第二配列はさらに結合オリゴヌクレオチド配列を分離するのに使用できる化学部分を含む）、（ｃ ）切断可能なリンカーで結合される両方のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖を含む全長配列を分離するのに適した条件下、および２つのｓｉＮＡオリゴヌクレオチド鎖をハイブリダイズして安定した二重鎖を形成するために適した条件下で、第二オリゴヌクレオチド配列鎖の化学部分を利用して（ｂ）の生成物を精製することを含む、ｓｉＮＡ二重鎖分子を合成する方法を特徴とする。１つの態様においては、上記（ｃ）における前記リンカー分子の切断は、例えば、加水分解条件下で前記オリゴヌクレオチドの脱保護中に生じる。別の態様においては、上記（ｃ）における前記リンカー分子の切断は、オリゴヌクレオチドの脱保護後に生じる。別の態様においては、前記合成方法は、制御核ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン等の強固な支持体上の固相合成を含み、ここで、（ａ） の第一配列は、強固な支持体を骨格として使用して、スクシニルリンカー等の切断可能なリンカー上で合成される。第二鎖の合成用骨格として使用される（ａ）の前記切断可能なリンカーは、固支持体被覆リンカーとして同様の反応度または異なる反応度を含む。そのため、固支持体被覆リンカーおよび（ａ）の切断可能なリンカーの切断は、同時または連続的に発生する。１つの態様においては、結合したオリゴヌクレオチド配列の分離に使用できる（ｂ）の化学部分は、例えばジメトキシトリチルグループ等のトリチルグループを含む。
【０１６３】
別の態様においては、本発明は、（ａ） 第一および第二配列を持つオリゴヌクレオチドを合成する（ここで第一配列は第二配列に対して相補的であり、第一オリゴヌクレオチド配列は切断可能なリンカーを介して第二配列と結合される、またここで末端５'保護グループ、例えば５'−Ｏ−ジメソキシトリチルグループ（５'−Ｏ−ＤＭＴ）は第二配列を持つオリゴヌクレオチド上に残る）、（ｂ） 前記オリゴヌクレオチドを脱保護することによって２つのオリゴヌクレオチド配列を結合するリンカーを切断すること、および（ｃ）例えば、本明細書に記載のトリチル−オン合成方法を使用して、二本鎖ｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で（ｂ）の生成物を精製することを含む、単一合成プロセスにおいて二本鎖ｓｉＮＡ 分子を生成する方法を特徴とする。
【０１６４】
別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の合成方法は、スカリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ） らの米国特許５，８８９，１３６；６，００８，４００； および６，１１１，０８６に記載の方法を含み、それら全体は参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１６５】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここで、前記ｓｉＮＡ構造は、例えば、ｓｉＮＡ構造のヌクレアーゼ抵抗を増加させる化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれか、あるいはその任意の組み合わせを持つ１つ以上の化学修飾等の、１つ以上の化学修飾を含む。
【０１６６】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれか、あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）高いヌクレアーゼ抵抗を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ）のｓｉＮＡ 分子を組み立てることを含む、ヌクレアーゼ抵抗の高いｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１６７】
別の態様においては、本発明は、（ａ） 化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか（例、表ＩＶに記載の、ｓｉＮＡモチーフ）あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ） のｓｉＮＡ分子を試験することから成る、改良された毒性プロフィール（例、弱毒化した、あるいは免疫刺激特性を持たない）を持つｓｉＮＡ分子生成する方法を特徴とする。
【０１６８】
別の態様においては、本発明は、（ａ） 化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか（例、表ＩＶに記載の、ｓｉＮＡモチーフ）あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）インターフェロン応答性を刺激しないｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することから成る、細胞、対象、または生物体における、インターフェロン応答性を刺激しない（例、インターフェロン応答性がない、あるいは弱小化したインターフェロン応答性）ｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１６９】
「改良された毒性プロフィール」とは、化学修飾されたｓｉＮＡ構造が、より少ない修飾、あるいは改良された毒性を与える際に、あまり効果的でない修飾を持つ、未修飾ｓｉＮＡまたはｓｉＮＡ 分子と比較して、細胞、対象、または生物体において毒性の減少を示すことを意味する。限定を目的としない例において、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、より少ない修飾、あるいは改良された毒性を与える際に、あまり効果的でない修飾を持つ、未修飾ｓｉＮＡまたはｓｉＮＡ分子と比較して、細胞、対象、または生物体において、減少した、あるいは弱小化した免疫刺激反応と関連する。１つの態様においては、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含まない。１つの態様においては、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、５未満（例、１、２、３、または４リボヌクレオチド）のリボヌクレオチドを含む。１つの態様においては、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、Ｓｔａｂ７、Ｓｔａｂ８、Ｓｔａｂ１１、Ｓｔａｂ１２、Ｓｔａｂ１３、Ｓｔａｂ１６、Ｓｔａｂ１７、Ｓｔａｂ１８、Ｓｔａｂ１９、Ｓｔａｂ２０、Ｓｔａｂ２３、Ｓｔａｂ２４、Ｓｔａｂ２５、Ｓｔａｂ２６、Ｓｔａｂ２７、Ｓｔａｂ２８、Ｓｔａｂ２９、Ｓｔａｂ３０、Ｓｔａｂ３１、Ｓｔａｂ３２、またはその任意の組み合わせを含む（表ＩＶを参照のこと）。１つの態様においては、指定のｓｉＮＡ 分子と関連する免疫刺激反応のレベルは、例えば、ｓｉＮＡ分子に化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか（例、表ＩＶに記載の、ｓｉＮＡモチーフ）あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドによって、および
（ｂ）インターフェロン反応を刺激しないｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ） のｓｉＮＡ分子を試験することによって、当該技術分野において知られている方法で測定できる。
【０１７０】
「改良された毒性プロフィール」とは、化学修飾されたｓｉＮＡ構造が、より少ない修飾、あるいは改良された毒性を与える際に、あまり効果的でない修飾を持つ、未修飾ｓｉＮＡまたはｓｉＮＡ 分子と比較して、細胞、対象、または生物体において毒性の減少を示すことを意味する。限定を目的としない例において、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、より少ない修飾、あるいは改良された毒性を与える際に、あまり効果的でない修飾を持つ、未修飾ｓｉＮＡまたはｓｉＮＡ分子と比較して、細胞、対象、または生物体において、減少した、あるいは弱小化した免疫刺激反応と関連する。１つの態様においては、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、リボヌクレオチドを含まない。１つの態様においては、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、５未満（例、１、２、３、または４リボヌクレオチド）のリボヌクレオチドを含む。１つの態様においては、改良された毒性プロフィールを持つｓｉＮＡ分子は、Ｓｔａｂ７、Ｓｔａｂ８、Ｓｔａｂ１１、Ｓｔａｂ１２、Ｓｔａｂ１３、Ｓｔａｂ１６、Ｓｔａｂ１７、Ｓｔａｂ１８、Ｓｔａｂ１９、Ｓｔａｂ２０、Ｓｔａｂ２３、Ｓｔａｂ２４、Ｓｔａｂ２５、Ｓｔａｂ２６、Ｓｔａｂ２７、Ｓｔａｂ２８、Ｓｔａｂ２９、Ｓｔａｂ３０、Ｓｔａｂ３１、Ｓｔａｂ３２、またはその任意の組み合わせを含む（表ＩＶを参照のこと）。１つの態様においては、指定のｓｉＮＡ 分子と関連する免疫刺激反応のレベルは、例えば、特定のｓｉＮＡ分子の免疫刺激反応を計る試験において、ＰＫＲ／インターフェロン反応、増殖、Ｂ細胞活性化、および／またはサイトカイン生成のレベルを判別することによって、当該技術分野において知られている方法で測定できる。（例えば、ライファー（Ｌｅｉｆｅｒ） 等、２００３年、ジャーナル・オブ・イミュノセラピー（Ｊ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）２６、３１３−９、および米国特許出願番号５９６８９０９を参照のこと。その全体は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１７１】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡ構造は、前記ｓｉＮＡ 構造のセンス鎖およびアンチセンス鎖間の結合親和力を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
【０１７２】
別の態様においては、本発明は、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれかあるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖間の高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することから成る、ｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖間の高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１７３】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここでｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ構造のアンチセンス鎖と細胞内の相補標的ＲＮＡ配列との間の結合親和力を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
【０１７４】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここでｓｉＮＡ構造は、ｓｉＮＡ構造のアンチセンス鎖と細胞内の相補標的ＤＮＡ配列との間の結合親和力を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
【０１７５】
別の態様においては、本発明は、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれかあるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖および相補標的ＲＮＡ配列との間の高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することから成る、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖および相補標的ＲＮＡ 配列との間の高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１７６】
別の態様においては、本発明は、化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれかあるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖および相補標的ＤＮＡ配列との間の高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することから成る、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖および相補標的ＤＮＡ 配列との間の高い結合親和力を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１７７】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡ構造は、化学修飾したｓｉＮＡ構造に対して配列相同性を持つ追加の内因性ｓｉＮＡ 分子を生成できる細胞ポリメラーゼのポリメラーゼ活性を調節する本明細書に記載の複数の化学修飾を含む。
【０１７８】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学式Ｉ−ＶＩＩ を持つヌクレオチドまたはその任意の組み合わせをｓｉＮＡ分子に導入する、および（ｂ）化学修飾したｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を持つ追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成できるポリメラーゼ活性の高い細胞ポリメラーゼを媒介できるｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、化学修飾したｓｉＮＡ分子に対して配列相同性を持つ追加の内因性ｓｉＮＡ分子を生成できるポリメラーゼ活性の高い細胞ポリメラーゼを媒介できるｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１７９】
１つの態様においては、本発明は細胞内でＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介する化学修飾したｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここで、前記化学修飾は、ｓｉＮＡと標的ＲＮＡ 分子、ＤＮＡ分子および／またはタンパク質あるいはそのようなｓｉＮＡ構造によって媒介されるＲＮＡｉの有効性を低下させる方法においてＲＮＡｉに必須の他の要素との相互作用に大きく影響しない。
【０１８０】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれか、あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）高いＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、ＨＣＶに対して高いＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１８１】
また別の態様においては、本発明は（ａ）化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）標的ＲＮＡに対して高いＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、ＨＣＶ標的ＲＮＡに対して高いＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１８２】
また別の態様においては、本発明は（ａ）化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれか、あるいはその任意の組み合わせを持つヌクレオチドをｓｉＮＡ分子へ導入すること、および（ｂ）標的ＤＮＡに対して高いＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下でステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、ＨＣＶ標的ＤＮＡに対して高いＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１８３】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここで前記ｓｉＮＡ構造は、前記ｓｉＮＡ 構造の細胞摂取を調節する本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。
【０１８４】
別の態様においては、本発明は（ａ）化学式Ｉ−ＶＩＩ のいずれかを持つヌクレオチドまたはその任意の組み合わせをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ） 高い細胞摂取を持つｓｉＮＡ 分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、高い細胞摂取を持つＨＣＶに対するｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０１８５】
１つの態様においては、本発明はＨＣＶに対してＲＮＡｉを媒介するｓｉＮＡ構造を特徴とし、ここで、前記ｓｉＮＡ構造は、例えばポリエチレングリコールのようなポリマーコンジュゲート、または前記ｓｉＮＡ構造の薬物動態を改善する同等のコンジュゲートを結合することによって、または特定のインビボ組織型または細胞タイプを標的とするコンジュゲートを結合することによって、ｓｉＮＡ構造の生物学的利用能を高める本明細書に記載の１つ以上の化学修飾を含む。そのようなコンジュゲートの限定を目的としない例は、ヴァーギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）らの米国特許出願１０／２０１，３９４に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
１つの態様においては、本発明は（ａ）コンジュゲートをｓｉＮＡ分子構造に導入すること、および（ｂ） 高い生物利用能を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、高い生物利用能を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。そのようなコンジュゲートは、自然発生タンパク質リガンドから派生するペプチド等の細胞受容体用リガンド、細胞ＺＩＰコード配列を含むタンパク質局在化配列、抗体、核酸アプタマー、葉酸およびＮ−アセチルガラクトサミン等のビタミンおよび他の補因子、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマー、リン脂質、コレステロール、スペルミンまたはスペルミジン等のポリアミン、等を含むことができる。
【０１８７】
１つの態様においては、本発明は標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで、前記第二配列は、ガイド配列としてＲＮＡ干渉を効果的に媒介せず、および／またはＲＮＡｉを促進する細胞タンパク質によって認識されない方法で化学修飾される。
【０１８８】
１つの態様においては、本発明は標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで、前記第二配列はガイド配列として、または標的核酸（例、ＲＮＡ）配列に対して相補的な配列としてＲＮＡｉ経路に入るのを回避する方法で、デザインまたは修飾される。そのようなデザインまたは修飾は、ｓｉＮＡの活性を強化し、および／または本発明のｓｉＮＡ分子の特異性を向上させることが期待される。それらの修飾は任意のオフターゲット効果および／または付随する毒性を最小限にすることも期待される。
【０１８９】
１つの態様においては、本発明は標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで、前記第二配列はＲＮＡ干渉を媒介するためのガイド配列として作用することができない。
【０１９０】
１つの態様においては、本発明は標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで、前記第二配列は末端５'−ヒドロキシル（５'−ＯＨ ）または５'−リン酸基を持たない。
【０１９１】
１つの態様においては、本発明は標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで、前記第二配列は前記第二配列の５' 端に末端キャップ部分を含む。１つの態様においては、前記末端キャップ部分は、逆位の脱塩基、逆位のデオキシ脱塩基、逆位のヌクレオチド部分、図１０に示すグループ、アルキルまたはシクロアルキルグループ、ヘテロサイクル、または前記第２配列がガイド配列またはＲＮＡｉのテンプレートとして作用するＲＮＡｉ活性を回避する他のグループを含む。
【０１９２】
１つの態様においては、本発明は標的ＲＮＡ配列に対して相補的な第一ヌクレオチド配列またはその一部、および前記第一配列に対して相補性を持つ第二配列を含む二本鎖低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子を特徴とし、ここで、前記第二配列は前記第二配列の５'端および３' 端に末端キャップ部分を含む。１つの態様においては、各末端キャップ部分はそれぞれ、逆位の脱塩基、逆位のデオキシ脱塩基、逆位のヌクレオチド部分、図１０に示すグループ、アルキルまたはシクロアルキルグループ、ヘテロサイクル、または前記第２配列がガイド配列またはＲＮＡｉのテンプレートとして作用するＲＮＡｉ活性を回避する他のグループを含む。
【０１９３】
１つの態様においては、本発明は（ａ）１つ以上の化学修飾をｓｉＮＡ 分子構造に導入する、および（ｂ）高い特異性を持つｓｉＮＡ分子の分離に適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、標的核酸（例、遺伝子またはそれに対応するＲＮＡ 等のＤＮＡまたはＲＮＡ）の発現を下方制御または抑制するための高い特異性を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。別の態様においては、特異性の向上に使用される前記化学修飾は、ｓｉＮＡ分子の５' 端、３' 端、またはその両方に末端キャップ修飾を含む。前記末端キャップ修飾は、例えば図１０に示す構造（例、逆位のデオキシ脱塩基部分）、または前記ｓｉＮＡ分子（例、センス鎖）の一部をオフターゲット核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介不能にする任意の他の化学修飾を含むことができる。限定を目的としない例において、ｓｉＮＡ分子はそのアンチセンス配列のみが対応する標的ＲＮＡ 配列の分解が媒介されるＲＩＳＣ のガイド配列として機能できるようにデザインされる。これは、ＲＮＡｉ機構によるガイド配列としてのセンス鎖認識を回避する化学修飾を前記センス鎖に導入し、ｓｉＮＡのセンス配列を不活性化することで実現できる。１つの態様においては、そのような化学修飾は、前記ｓｉＮＡ のセンス鎖の５' 端に任意の化学グループを含むか、またはセンス鎖のＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としての機能を不活性化する任意の他のグループを含む。それら修飾は、例えばセンス鎖の５' 端がフリーの５'−ヒドロキシル（５'−ＯＨ）またはフリーの５'−リン酸基（例、リン酸、二リン酸塩、三リン酸塩、環状リン酸等）を持たない分子にする。そのようなｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例は、本明細書において「Ｓｔａｂ９／１０」、「Ｓｔａｂ７／８」、「Ｓｔａｂ７／１９」、「Ｓｔａｂ１７／２２」、「Ｓｔａｂ２３／２４」、「Ｓｔａｂ２４／２５」、および「Ｓｔａｂ２４／２６」（例、Ｓｔａｂ７、９、１７、２３、または２４センス鎖を持つ任意のｓｉＮＡ）化学反応およびそのバリアント（表ＩＶ参照のこと）として記載され、ここで、前記ｓｉＮＡのセンス鎖の５'端および３' 端はヒドロキシルグループまたはリン酸基を含まない。
【０１９４】
１つの態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子の鎖またはその一部がＲＮＡｉ活性のテンプレートまたはガイド配列として作用するのを防ぐ１つ以上の化学修飾をｓｉＮＡ分子構造に導入することを含む、標的核酸（例、遺伝子またはそれに対応するＲＮＡ等のＤＮＡまたはＲＮＡ）の発現を下方制御または抑制するための高い特異性を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。１つの態様においては、前記ｓｉＮＡ分子の不活性な鎖またはセンス領域は、前記ｓｉＮＡ分子のセンス鎖またはセンス領域、すなわち、標的核酸配列に対して相補性を持たない前記ｓｉＮＡの鎖または領域である。１つの態様においては、そのような化学修飾は、５'−ヒドロキシル（５'−ＯＨ ）または５'−リン酸基を含まない前記ｓｉＮＡのセンス鎖の５' 端または領域に任意の化学グループを含むか、またはセンス鎖またはセンス領域のＲＮＡ干渉を媒介するガイド配列としての機能を不活性化する任意の他のグループを含む。そのようなｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例は、本明細書において「Ｓｔａｂ９／１０」「Ｓｔａｂ７／８」、、「Ｓｔａｂ７／１９」「Ｓｔａｂ１７／２２」「Ｓｔａｂ２３／２４」「Ｓｔａｂ２４／２５」、および「Ｓｔａｂ２４／２６」（例、Ｓｔａｂ７、９、１７、２３、または２４センス鎖を持つ任意のｓｉＮＡ）化学反応およびそのバリアント（表ＩＶ参照のこと）として記載され、ここで、前記ｓｉＮＡのセンス鎖の５' 端および３'端はヒドロキシルグループまたはリン酸基を含まない。
【０１９５】
１つの態様においては、本発明は（ａ） 複数の未修飾ｓｉＮＡ分子を生成すること、（ｂ） 標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性なｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ） のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすること、（ｃ） 化学修飾（例、本明細書に記載の化学修飾または当該技術分野において知られる化学修飾）を（ｂ）の活性ｓｉＮＡ分子に導入することを含む、標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性なｓｉＮＡ 分子をスクリーニングする方法を特徴とする。１つの態様においては、前記方法はさらに、標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性な化学修飾ｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ｃ）の化学修飾ｓｉＮＡ 分子の再スクリーニングを含む。
【０１９６】
１つの態様においては、本発明は（ａ）複数の化学修飾ｓｉＮＡ分子（例、本明細書に記載のｓｉＮＡ分子、または当該技術分野において知られるｓｉＮＡ分子）を生成すること、および（ｂ）標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性な化学修飾ｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子をスクリーニングすることを含む、標的核酸配列に対するＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性な化学修飾ｓｉＮＡ分子をスクリーニングする方法を特徴とする。
【０１９７】
「リガンド」という語は、受容体等の別の化合物と直接的あるいは間接的に相互作用できる薬剤、ペプチド、ホルモン、または神経伝達物質といった任意の化合物または分子を意味する。リガンドと相互作用する前記受容体は、細胞の表面に存在することができ、あるいは代替として細胞間受容体であってよい。前記リガンドと前記受容体の相互作用によって生化学反応が生じるか、あるいは単なる物理的相互作用または関連となる。
【０１９８】
別の態様においては、本発明は（ａ） 賦形剤処方をｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ） 高い生物利用能を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、高い生物利用能を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。そのような賦形剤は、シクロデキストリン、脂質、カチオン脂質、ポリアミン、リン脂質、ナノ粒子、受容体、リガンド等のポリマーを含む。
【０１９９】
別の態様においては、本発明は、（ａ） 化学式Ｉ−ＶＩＩのいずれかを持つヌクレオチドまたはその任意の組み合わせをｓｉＮＡ分子に導入すること、および（ｂ） 高い生物学的利用能を持つｓｉＮＡ分子を分離するのに適した条件下で、ステップ（ａ）のｓｉＮＡ分子を試験することを含む、高い生物学的利用能を持つ本発明のｓｉＮＡ分子を生成する方法を特徴とする。
【０２００】
別の態様においては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ） は、本発明のｓｉＮＡ化合物と共有結合することができる。結合されたＰＥＧは、好ましくは約１００から約５０，０００ダルトン（Ｄａ） の任意の分子量を持つ。
【０２０１】
本発明を単独または試薬の少なくとも１つを持つキットの構成要素として使用し、ＲＮＡのインビトロまたはインビボ導入を実施して、サンプルおよび／または対象を試験することができる。例えば、前記キットの好ましい構成要素は、本発明のｓｉＮＡ分子および本明細書に記載のように細胞へのｓｉＮＡの導入を促進する担体を含む（例、脂質および当該技術分野において知られる他のトランスフェクション方法を使用する、例としてベージェルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ） らの米国特許６，３９５，７１３） を参照）。例えば、遺伝子機能および／または作用の判定、または薬物最適化、および薬物発見において前記キットを標的の確認に使用することができる（例としてウスマン（Ｕｓｍａｎ） らの米国特許出願６０／４０２，９９６を参照）。そのようなキットには、ユーザーが本発明を実施できるよう指示も含まれている。
【０２０２】
本請求で使用する「低分子干渉核酸」、「ｓｉＮＡ」、「低分子干渉ＲＮＡ」、「ｓｉＲＮＡ」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾低分子干渉核酸分子」という語は、例えばＲＮＡ干渉「ＲＮＡｉ」または遺伝子サイレンシングを配列特異的な方法で媒介することで、遺伝子の発現またはウィルスの増殖を抑制または下方制御できる任意の核酸分子を意味する。例として、ザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ） ら，２０００年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０１，２５−３３； バス（Ｂａｓｓ），２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４２８−４２９；エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ） ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４９４−４９８； およびクラウツァー（Ｋｒｅｕｔｚｅｒ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４８９５； ツェルニッカ−ゲッツ（Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ） ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３６６４６； ファイヤー（Ｆｉｒｅ）， 国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３２６１９； プラティンク（Ｐｌａｅｔｉｎｃｋ） ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／０１８４６： メロおよびファイヤー（Ｍｅｌｌｏ ａｎｄ Ｆｉｒｅ）， 国際ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２９０５８； デュシャン−デュパイエット（Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ）， 国際ＰＣＴ公開ＷＯ９９／０７４０９；およびリー（Ｌｉ）ら，国際ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４９１４；オールシャー（Ａｌｌｓｈｉｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８１８−１８１９；ヴォルペ（Ｖｏｌｐｅ） ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３３−１８３７； ジニュウェイン（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２１５−２２１８； およびホール（Ｈａｌｌ） ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２３２−２２３７； ハトヴァグナー（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ） とザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２０５６−６０； マクマヌス（ＭｃＭａｎｕｓ） ら，２００２年，ＲＮＡ，８，８４２−８５０； レインハルト（Ｒｅｉｎｈａｒｔ） ら，２００２年，遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖ．，１６，１６１６−１６２６； およびラインハルト（Ｒｅｉｎｈａｒｔ） とバーテル（Ｂａｒｔｅｌ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３１を参照）。本発明のｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を本明細書の図４−６および表ＩＩに示す。例えば、前記ｓｉＮＡ は自己相補センス領域およびアンチセンス領域を含む二本鎖のポリヌクレオチド分子であってよく、ここで、前記アンチセンス領域は標的核酸分子ヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス領域は前記標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を持つ。前記ｓｉＮＡは２つの個別のオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、もう一方はアンチセンス鎖であり、ここで、前記アンチセンスおよびセンス鎖は自己相補であり（例、各鎖は他の鎖にあるヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むた��、前記アンチセンス鎖およびセンス鎖は二重鎖または二本鎖構造を形成し、例えばここで、前記二本鎖領域は約１５から３０、つまり約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基対である）、前記アンチセンス鎖は標的核酸分子にあるヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖は前記標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む（例、前記ｓｉＮＡ分子の約１５から約２５、またはそれ以上のヌクレオチドは、前記標的核酸またはその一部に対応するヌクレオチドに相補的である）。代替として、前記ｓｉＮＡは単一のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ここで、前記ｓｉＮＡの自己相補センス領域およびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって結合される。前記ｓｉＮＡは自己相補センス領域およびアンチセンス領域を持つ二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造のポリヌクレオチドであってよく、ここで、前記アンチセンス領域は、個別の標的核酸分子にあるヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス領域は、前記標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を持つ。前記ｓｉＮＡは２つ以上のループ構造および自己相補センス領域およびアンチセンス領域を含むステムを持つ環状一本鎖ポリヌクレオチドであってよく、ここで、前記アンチセンス領域は標的核酸分子にあるヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、前記センス領域は前記標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を持ち、またここで、前記環状ポリヌクレオチドはインビボまたはインビトロのいずれかで処理してＲＮＡｉを媒介できる活性ｓｉＮＡ分子を生成することができる。またここで、前記ｓｉＮＡは、標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を持つ一本鎖ポリヌクレオチドを含むこともでき（例えば、ここでそのようなｓｉＮＡ分子は標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部のｓｉＮＡ 分子内に存在する必要がない）、ここで、前記一本鎖ポリヌクレオチドはさらに、５'−リン酸等の末端リン酸基を含むことができ（例として、マルティネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ） ら，２００２年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１１０，５６３−５７４およびシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ） ら，２００２年，分子細胞（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ），１０，５３７−５６８を参照）、または５'，３'−二リン酸塩であってよい。特定の態様において、本発明のｓｉＮＡ分子は、個別のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含み、ここで、前記センス領域およびアンチセンス領域は当該技術分野において知られるヌクレオチドリンカー分子または非ヌクレオチドリンカー分子によって共役的に結合されるか、あるいは代替として、イオン相互作用、水素結合、フォン−デル−ワールス相互作用、疎水性相互作用および／またはスタッキング相互作用によって非共役的に結合される。特定の態様において、本発明のｓｉＮＡ分子は標的遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様において���、本発明のｓｉＮＡ分子は前記標的遺伝子の発現を抑制する方法で、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用する。本請求で使用するように、ｓｉＮＡ分子はＲＮＡのみを含むそれらの分子に限定する必要はないが、化学修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含する。特定の態様において、本発明の低分子干渉核酸分子はヌクレオチドを含む２'−ヒドロキシ（２' −ＯＨ）が欠如している。出願人は、ＲＮＡｉを媒介するために２'−ヒドロキシグループを持つヌクレオチドの存在を必要としない特定の態様における低分子干渉核酸について、また任意でリボヌクレオチド（例、２'−ＯＨグループを持つヌクレオチド）を含まない本発明の低分子干渉核酸分子について記載している。しかし、ＲＮＡｉをサポートするためにｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないそのようなｓｉＮＡ分子は、１つ以上の結合リンカー、あるいは２'−ＯＨ グループを持つ１つ以上のヌクレオチドを含む他の結合されたまたは関連するグループ、部分、または鎖を持つ。任意で、ｓｉＮＡ分子はヌクレオチド位に約５、１０、２０、３０、４０、または５０％のリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の修飾された低分子干渉核酸分子は、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」とも呼ばれる。本請求で使用する場合、ｓｉＮＡという語は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾オリゴヌクレオチド、化学修飾ｓｉＲＮＡ 、転写後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ ）等、の配列特異的なＲＮＡｉを媒介できる核酸分子を説明するのに使用される他の語に等しいことを意味する。さらに、本明細書で使用されるＲＮＡｉという語は、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳抑制、または後成等、の配列特異的なＲＮＡｉ を媒介できる核酸分子を説明するのに使用される他の語に等しいことを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子を後成的に抑制された遺伝子に転写後レベルまたは転写前レベルで使用することができる。限定を目的としない例において、本発明のｓｉＮＡ分子による遺伝子発現の後成的規制は、遺伝子発現を変質するクロマチン構造またはメチル化型のｓｉＮＡ媒介性修飾の結果生じる（例として、ヴァーデル（Ｖｅｒｄｅｌ） ら，２００４年， サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０３，６７２−６７６； パル−バードラ（Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａ） ら，２００４年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３０３，６６９−６７２； オールシャー（Ａｌｌｓｈｉｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８１８−１８１９； ヴォルペ（Ｖｏｌｐｅ） ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３３−１８３７；ジニュウェイン（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２１５−２２１８； およびホール（Ｈａｌｌ） ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２３２−２２３７を参照）。
【０２０３】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は二重鎖形成オリゴヌクレオチド「ＤＦＯ」である（例として、図１４−１５および２００３年１２月３日出願のヴァイシュ（Ｖａｉｓｈ）らの米国特許出願１０／７２７，７８０および２００４年５月２４日出願の国際ＰＣＴ出願番号、米国特許０４／１６３９０を参照）。
【０２０４】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は多機能ｓｉＮＡである（例として、図１６−２１および２００４年２月１０日出願のジャダティ（Ｊａｄｈａｔｉ ）らの米国特許出願６０／５４３，４８０および２００４年５月２４日出願の国際ＰＴＣ出願番号、米国特許０４／１６３９０を参照）。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡは、例えば、２つ以上のＨＣＶ ＲＮＡ領域を標的とする配列を含むことができる（例として表ＩおよびＩＩＩの標的配列を参照）。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡは、細胞受容体、細胞表面分子、細胞性酵素、細胞転写因子、および／またはサイトカイン、二次メッセンジャー、および、Ｌａ抗原等ＨＣＶ ライフサイクルに含まれるＨＣＶ ＲＮＡおよび１つ以上の細胞内標的を標的とする配列を含むことができる（例えばコスタ−マッティオーリ（Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ） ら，２００４年，分子細胞生物学誌（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２４，６８６１−７０，例としてジンバンクアクセッション番号ＮＭ００３１４２を参照）（例、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ； 例としてジンバンクアクセッション番号ＡＦ０８２５０３１）； 細胞性ＰＫＲタンパク質キナーゼ（例としてジンバンクアクセッション番号ＸＭ００２６６１．７）； ヒトの真核型転写開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂガンマ；例としてジンバンクアクセッション番号ＡＦ２５６２２３， および／またはｅｌＦ２ガンマ；例としてジンバンクアクセッション番号Ｎｏ．ＮＭ−００６８７４．１）； ヒトＤＥＡＤボックスタンパク質（ＤＤＸ３； 例としてジンバンクアクセッション番号ＸＭ０１８０２１．２）； およびポリピリミジン・トラクト結合タンパク質のようなＨＶＣの３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ）トラクトに結合する細胞性タンパク質（例としてジンアクセッション 番号０３１９９１．１およびＸＭ−０４２９７２．３）を含むがこれらに限定されない。
【０２０５】
本請求で使用する「非対称ヘアピン」とは、アンチセンス領域、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含むことができるループ部分、およびアンチセンス領域より少なく、前記センス領域が前記アンチセンス領域を持つ塩基対に対して相補的なヌクレオチドを十分に持ち、ループを持つ二重鎖を形成するに足るヌクレオチドを含むセンス領域を含む線状ｓｉＮＡ分子を意味する。例えば、本発明の非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は細胞またはインビトロシステム内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例、約１５から約３０、または約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を持つアンチセンス領域、および約４から約１２（例、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２）ヌクレオチドを持つループ領域、および前記アンチセンス領域に相補的な約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドを持つセンス領域を含むことができる。前記非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子は、化学修飾可能な５'端リン酸基を含むこともできる。前記非対称ヘアピンｓｉＮＡ分子のループ部分は、本明細書に記載のヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、または共有結合分子を含むことができる。
【０２０６】
本請求で使用する「非対称二重鎖」とは、センス領域およびアンチセンス領域を含む２つの個別の鎖を持つｓｉＮＡ分子を意味し、ここで前記センス領域はアンチセンス領域より少なく、前記センス領域が前記アンチセンス領域を持つ塩基対に対して相補的なヌクレオチドを十分に持ち、ループを持つ二重鎖を形成するに足るヌクレオチドを含む。例えば、本発明の非対称二重鎖ｓｉＮＡ分子は細胞またはインビトロシステム内でＲＮＡｉを媒介するのに十分な長さ（例、約１５から約３０、または１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド）を持つアンチセンス領域、および前記アンチセンス領域に相補的な約３から約２５（例、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）のヌクレオチドを持つセンス領域を含むことができる。
【０２０７】
「調節」とは、遺伝子の発現またはＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が上方制御または下方制御されることを意味する。そのため、発現、レベル、または活性はモジュレーターが不在の場合に観察される場合より高いかまたは低くなる。例えば、「調節」は「抑制」を意味することができ、「調節」という語の使用はこの定義に限定されない。
【０２０８】
「抑制」、「下方制御」、または「削減」とは、遺伝子の発現、またはＲＮＡ分子のレベル、あるいは１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードする同等のＲＮＡ分子、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸分子（例、ｓｉＮＡ）が不在の場合に観測されるレベルより低くなる。１つの態様においては、ｓｉＮＡ分子を用いた抑制、下方制御、または削減は、不活性または弱力化した分子が存在する場合に観察されるレベルより低い。別の態様においては、ｓｉＮＡ分子を用いた抑制、下方制御、または削減は、例えば、スクランブル配列またはミスマッチを持つｓｉＮＡ分子が存在する場合に観察されるレベルより低い。別の態様においては、本発明の核酸分子を用いた抑制、下方制御、または削減は、前記核酸分子が不在の場合より存在する場合のほうが大きい。１つの態様においては、遺伝子発現を用いた抑制、下方制御、または削減は、標的核酸分子の切断（例、ＲＮＡ）または翻訳の抑制を媒介するＲＮＡｉ 等転写後遺伝子抑制と関連する。１つの態様においては、遺伝子発現を用いた抑制、下方制御、または削減は、転写後遺伝子抑制と関連する。
【０２０９】
「遺伝子」または「標的遺伝子」は、例えば、ポリペプチドをコードする構造遺伝子を含むがそれに限定されない核酸配列等、ＲＮＡをコードする核酸を意味する。遺伝子または標的遺伝子は、機能的ＲＮＡ（ｆＲＮＡ）または低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小核小体ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびその前駆ＲＮＡ等の非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ） をコードすることもできる。そのような非コードＲＮＡは、機能的または規制的細胞過程に関与するｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡの活性の調節におけるｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉の場合に標的核酸分子として機能することができる。そのため、疾患につながる異常なｆＲＮＡまたはｎｃＲＮＡ活性を本発明のｓｉＮＡ 分子で調節することができる。ｆＲＮＡおよびｎｃＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子を使用して、遺伝子刷り込み、転写、翻訳、または核酸処理（例、アミノ基転移、メチル化等）といった細胞過程に介在することで、生物体または細胞の遺伝子型または表現型を操作あるいは変質させることもできる。前記標的遺伝子は、細胞、内在性遺伝子、トランス遺伝子、または例えば、感染後細胞内に存在するウィルス等の病原体の遺伝子といった外来遺伝子から採取した遺伝子であってよい。標的遺伝子を含む細胞は、例えば、植物、動物、任意の生物体、原生動物、ウィルス、細菌、または菌類等の任意の生物体から採取できるか、またはこれらに含まれる。植物の限定を目的としない例は、単子葉植物、双子葉植物、または裸子植物を含む。動物の限定を目的としない例は、脊椎動物または無脊椎動物を含む。菌類の限定を目的としない例は、カビまたはイースト菌を含む。レビューは、例えば、スナイダーアンドガーシュタイン（Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｇｅｒｓｔｅｉｎ），サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），３００，２５８−２６０を参照のこと。
【０２１０】
「非正準塩基対」は、反転ミスマッチ、単一水素結合ミスマッチ、トランス型ミスマッチ、三重塩基相互作用、および四重塩基相互作用を含むミスマッチおよび／またはゆらぎ塩基対といった任意の非ワトソン−クリック塩基対を意味する。そのような非正準塩基対の限定を目的としない例は、ＡＣ逆転フーグスティーン、ＡＣゆらぎ、ＡＵ逆転フーグスティーン、ＧＵゆらぎ、ＡＡＮ７アミノ、ＣＣ２−カルボニル−アミノ（Ｈ１）−Ｎ３−アミノ（Ｈ２）、ＧＡ剪断、ＵＣ４−カルボニル−アミノ、ＵＵイミノ−カルボニル、ＡＣ逆転ワトソン−クリック、ＧＣＮ３−アミノ−アミノＮ３、ＡＡＮ１−アミノ対称、ＡＡＮ７−アミノ対称、ＧＡＮ７−Ｎ１アミノ−カルボニル、ＧＡ＋カルボニル−アミノＮ７−Ｎ１、ＧＧＮ１−カルボニル対称、ＧＧＮ３−アミノ対称、ＣＣカルボニル−アミノ対称、ＣＣＮ３−アミノ対称、ＵＵ２−カルボニル−イミノ対称、ＵＵ４−カルボニル−イミノ対称、ＡＡアミノ−Ｎ３、ＡＡＮ１−アミノ、ＡＣアミノ２−カルボニル、ＡＣＮ３−アミノ、ＡＣＮ７−アミノ、ＡＵアミノ−４−カルボニル、ＡＵＮ１−イミノ、ＡＵＮ３−イミノ、ＡＵＮ７−イミノ、ＣＣカルボニル−アミノ、ＧＡアミノ−Ｎ１、ＧＡアミノ−Ｎ１、ＧＡアミノ−Ｎ７、ＧＡ カルボニル−アミノ、ＧＡＮ３−アミノ、ＧＣアミノ−Ｎ３、ＧＣカルボニル−アミノ、ＧＣＮ３−アミノ、ＧＣＮ７−アミノ、ＧＧ アミノ−Ｎ７、ＧＧカルボニル−イミノ、ＧＧＮ７−アミノ、ＧＵアミノ−２−カルボニル、ＧＵカルボニル−イミノ、ＧＵイミノ−２−カルボニル、ＧＵＮ７−イミノ、ｐｓｉＵ イミノ−２−カルボニル、ＵＣ４−カルボニル−アミノ、ＵＣ イミノ−カルボニル、ＵＵイミノ−４−カルボニル、ＡＣＣ２−Ｈ−Ｎ３、ＧＡカルボニル−Ｃ２−Ｈ、Ｗイミノ−４−カルボニル２カルボニル−Ｃ５−Ｈ、ＡＣアミノ（Ａ）Ｎ３（Ｃ ）−カルボニル、ＧＣイミノアミノ−カルボニル、Ｇｐｓｉイミノ−２−カルボニルアミノ−２−カルボニル、およびＧＵイミノアミノ−２−カルボニル塩基対を含む。
【０２１１】
「ＨＣＶ」は、本明細書で、表Ｉ に示すＨＣＶジンバンクアクセッション番号によってコードされたＣ型肝炎ウィルスまたはＨＣＶ活性を有するＨＣＶタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのいずれかを意味する。また、「ＨＣＶ」という用語は、ＨＣＶ活性を有するＨＣＶタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドのいずれかをコードする核酸配列を言及する。「ＨＣＶ」という用語はまた、その他ＨＣＶアイソフォーム、変異ＨＣＶ遺伝子、ＨＣＶ遺伝子のスプライスバリアントおよびＨＣＶ遺伝子多型等その他のＨＣＶコードする配列も含めて意味する。１つの態様においては、「ＨＣＶ」という用語は、本明細書で細胞タンパク質または宿主タンパク質あるいは当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはＨＣＶ感染および／または複製に関与するタンパク質を言及する。
【０２１２】
「相当配列」とは、例えば遺伝子、遺伝子転写および／または非コードポリヌクレオチド等の１つ以上のポリヌクレオチド配列で共有される核酸配列を意味する。例えば、相同配列は遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォーム、あるいはサイトカインおよびその対応する受容体といった完全に異なる遺伝子等、関連するが異なるタンパク質をコードする２つ以上の遺伝子で共有されるヌクレオチド配列であってよい。相同配列は非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、規制配列、イントロン、および転写制御または規制部位といった２つ以上の非コードポリヌクレオチドで共有されるヌクレオチド配列であってよい。また相同配列は、２以上のポリヌクレオチド配列で共有される保存配列領域を含むこともできる。前記相同配列は、部分的に相同な配列も本発明によって検討されるため（例、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％ 、８８％、８７％、８６％ 、８５％、８４％、８３％ 、８２％、８１％、８０％ 等）、完全に相同（ 例、１００％）である必要はない。
【０２１３】
「保存配列領域」は、世代間またはある生体システムまたは生物体から別の生体システムまたは生物体で大幅に変化しないポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列の１つ以上の領域を意味する。前記ポリヌクレオチドはコードおよび非コードＤＮＡおよびＲＮＡを含むことができる。
【０２１４】
「センス領域」とは、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域に対して相補性を持つｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子の前記センス領域は標的核酸配列とともに相同性を持つ核酸配列を含むことができる。
【０２１５】
「アンチセンス領域」とは、標的核酸配列に対して相補性を持つｓｉＮＡ分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、ｓｉＮＡ分子のアンチセンス領域は、任意で前記ｓｉＮＡ分子のセンス領域に対して相補性を持つ核酸配列を含むことができる。
【０２１６】
「標的核酸」とは、発現または活性が調節される任意の核酸配列を意味する。前記標的核酸は、ＤＮＡ またはＲＮＡであってよい。
【０２１７】
「相補性」とは、従来のワトソン−クリックまたは他の非従来的なタイプによって、核酸が別の核酸配列との水素結合を形成できることを意味する。本発明の核分子を参照して、相補配列を持つ核酸分子の結合自由エネルギーは、例えば核酸の関連機能にＲＮＡｉ活性を促進させるのに十分である。核酸分子の結合自由エネルギーの判定は、当該技術分野においてよく知られている（例、ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）ら，１９８７年，量子生物学シンポジウム（ＣＳＨ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．ＬＩＩ） ｐｐ．１２３−１３３； フライヤー（Ｆｒｉｅｒ） ら，１９８６年， 米国科学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８３：９３７３−９３７７； ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ） ら，１９８７，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：３７８３−３７８５を参照）。３７８３−３７８５）． 相補率は、第二核酸配列とともに水素結合（例、ワトソン−クリック塩基対）を形成できる核酸分子における隣接残基の割合を示す（例、１０ヌクレオチドを持つ第二核酸配列と塩基対となる第一オリゴヌクレオチドにある全１０ヌクレオチド中５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドは、それぞれ５０％、６０％、７０％、８０％、９０％および１００％相補であることを示す）。「完全に相補」とは、核酸配列のすべての隣接残基が第二核酸配列における同数の隣接残基と水素結合することを意味する。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、１つ以上の標的核酸分子あるいはその一部に相補的な約１５から約３０以上（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上）のヌクレオチドを含む。
【０２１８】
１つの態様においては、ＨＣＶ遺伝子発現を下方制御または減少させる本発明のｓｉＮＡ分子は、対象または生物体におけるＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、または肝硬変の治療、阻止および減少に使用される。
【０２１９】
本発明の１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の各配列は、それぞれ約１５から３０ヌクレオチド長であり、特定の態様においては約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ二重鎖はそれぞれ、約１５から約３０の塩基対（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）を含む。別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子の１つ以上の鎖はそれぞれ、標的核酸分子に相補的な約１５から約３０のヌクレオチド（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０）を含む。更に別の態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ヘアピンまたは環状構造が約３５から約５５（例、約３５、４０、４５、５０または５５）ヌクレオチド長、あるいは約３８から約４４（例、約３８、３９、４０、４１、４２、４３、または４４）ヌクレオチド長を含み、および約１５から約２５（例、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）塩基対を含む。
【０２２０】
例として、表ＩＩに本発明のｓｉＮＡ分子を示す。例として、表ＩＩＩおよび／または図４−５に本発明の合成ｓｉＮＡ分子を示す。
【０２２１】
本明細書に使用する「細胞」とは、通常の生物学的意味において使用され、多細胞生物体全体、特にヒトを示すものではない。前記細胞は、例えば鳥類、植物およびヒト、ウシ、羊、猿、ブタ、犬、および猫といった哺乳類等の生物体に存在し得る。前記細胞は原核（例、細菌細胞）または真核（例、ヒトまたは植物細胞）であってよい。前記細胞は体細胞または生殖細胞系起源、全能性または多能性、分割または非分割であってよい。また前記細胞は配偶子または胚、幹細胞、または完全に分化した細胞から派生するかまたはそれらを含んでもよい。
【０２２２】
本発明のｓｉＮＡ分子は直接追加されるか、またはカチオン脂質と複合、リポソーム内に包含、あるいは標的細胞または組織にデリバリーすることができる。核酸または核酸複合体は、生体高分子に組み込まれるか否かに関係なく、直接の皮下投与、経皮投与、または注射を通じて生体外または生体内の関連組織に局所的に投与することができる。特定の態様において、本発明の核酸分子は表ＩＩ−ＩＩＩ および／または図４−５に示す配列を含む。そのような核酸分子の例は、基本的にそれらの表および図において定義される配列を含む。さらに、表ＩＶ に記載される化学修飾構造は本発明のｓｉＮＡ配列に適用することができる。
【０２２３】
別の側面において、本発明は本発明の１つ以上のｓｉＮＡ分子を含む哺乳類細胞を提供する。１つ以上のｓｉＮＡ分子は同一または異なる部位を独立して標的とすることができる。
【０２２４】
「ＲＮＡ」とは、少なくとも１つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とはＰ−Ｄ−リボ−フラノーゼ部分にヒドロキシルグループを持つヌクレオチドを意味する。前記の語は、１つ以上のヌクレオチドの追加、削除、置換および／または変質によって、自然発生するＲＮＡとは異なる変質ＲＮＡとともに、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡ等の分離されたＲＮＡ、基本的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組み換えによって生成されたＲＮＡを含む。そのような変質は、例えば前記ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおけるｓｉＮＡの末端または内部への非ヌクレオチド材の追加を含むことができる。本発明のＲＮＡ分子にあるヌクレオチドは、自然発生でないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド等の非標準ヌクレオチドを含むこともできる。これらの変質ＲＮＡは自然発生ＲＮＡの類似体と呼ばれる。
【０２２５】
「対象」とは外植細胞の提供者または被提供者、あるいはその細胞自体である生物体を意味する。また「対象」とは本発明の核酸分子を投与できる生物体も意味する。対象はヒトまたはヒト細胞を含む哺乳類または哺乳類細胞であってよい。
【０２２６】
本明細書で使用する「ホスホロチオエート」という語は、化学式Ｉを持つヌクレオチド間結合を示し、ここでＺおよび／またはＷは硫黄原子を含む。このため、ホスホロチオエートという語はホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を意味する。
【０２２７】
本明細書で使用する「ホスホノ酢酸」という用語は、化学式Ｉを持つヌクレオチド間結合を示し、ここでＺおよび／またはＷはアセチルまたは保存アセチルグループを含む。
【０２２８】
本明細書で使用する「チオホスホノ酢酸」という用語は、化学式Ｉを持つヌクレオチド間結合を示し、ここでＺはアセチルまたは保存アセチルグループを含み、Ｗは硫黄原子を含むか、あるいは代替としてアセチルまたは保存アセチルグループを含み、Ｚは硫黄原子を含む。
【０２２９】
本明細書で使用する「ユニバーサル塩基」という用語は、ほとんど違いのない野生型ＤＮＡ ／ＲＮＡ塩基を用いて塩基対を形成するヌクレオチド塩基類似体を示す。ユニバーサル塩基の限定を目的としない例は、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチルおよび他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、および当該技術分野において知られる３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、および６−ニトロインドールといったニトロアゾール誘導体を含む（例として、ロークス（Ｌｏａｋｅｓ）， 核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），２９，２４３７−２４４７を参照）。
【０２３０】
本明細書で使用する「非環状ヌクレオチド」という用語は、非環状リボース糖を持つ任意のヌクレオチドを意味し、例えば前記リボースカーボン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５）は、前記ヌクレオチドから離れて単独で存在するか、または組み合わされて存在している。
【０２３１】
本発明の核酸分子を単独で、または他の薬剤と組み合わせてあるいは結合して使用することで、対象または生物体におけるＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、および／または肝硬変の治療、抑制、減少、または阻止に使用することができる。例えば、治療に適した条件下で、前記ｓｉＮＡ分子を単独で、または１つ以上の薬剤と併用して対象に投与するか、または当業者に明示の他の適切な細胞に投与することができる。
【０２３２】
更に別の態様においては、前記ｓｉＮＡ分子をその他の既知の治療法と併用して対象または生物体におけるＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、および／または肝硬変の治療、抑制、減少、または阻止に使用することができる。例えば、前記分子を１つ以上の既知の化合物、治療薬、または手順と併用して、ＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、および／ または肝硬変の治療、抑制、減少、または阻止に使用することができる。
【０２３３】
１つの態様においては、本発明は、ｓｉＮＡ分子の発現を可能にする方法で、本発明の少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。例えば、ベクターは二重鎖を含むｓｉＮＡ分子の両鎖をコードする配列を含むことができる。ベクターはまた、自己相補であり、よってｓｉＮＡ分子を形成する単一の核酸分子をコードする配列も含むことができる。当該発現ベクターの限定を目的としない例は、ポール（Ｐａｕｌ）ら，２００２年，ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，５０５； ミヤギシおよびタイラ（ＭｉｙａｇｉｓｈｉａｎｄＴａｉｒａ），２００２年，ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，４９７； リー（Ｌｅｅ） ら、２００２年， ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），１９，５００； およびノビナ（Ｎｏｖｉｎａ） ら，２００２年， ネイチャーメディシン誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）， アドバンスにオンライン出版ｄｏｉ；１０．１０３８／ｎｍ７２５．に示す。１０．１０３８／ｎｍ７２５。
【０２３４】
別の態様においては、本発明は、哺乳類細胞を特徴とし、例えば、本発明の発現ベクター等ヒト細胞である。
【０２３５】
更に別の態様においては、本発明の発現ベクターは、例えば表Ｉに示すジンバンクアクセッション番号のジンバンクアクセッション番号により参照されたＲＮＡ分子に対する相補性を有するｓｉＮＡ分子用の配列を含む。
【０２３６】
１つの態様においては、本発明の発現ベクターは、同一または異なる２つ以上のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
【０２３７】
本発明の別の側面は、標的ＲＮＡ分子と相互作用しおよび標的ＲＮＡ分子（例、本明細書でジンバンクアクセッション番号により参照された標的ＲＮＡ分子）をコードする遺伝子を下方制御するｓｉＮＡ分子が、ＤＮＡもしくはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される。組み替えベクターは、ＤＮＡプラスミド、もしくはウィルスベクターであることができ、ｓｉＮＡを発現するウィルスベクターは、これに限定はしないが、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、もしくはアルファウィルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ分子を発現可能な組み替えベクターは、本明細書で述べられるように供給され、標的細胞内で存続する可能性がある。代替として、ウィルスベクターは、ｓｉＮＡ分子の一時的発現を提供するものとして使用できる。当該ベクターは、必要があれば繰り返し投与が可能である。いったん発現されると、ｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡ 干渉（ＲＮＡｉ）を介して遺伝子機能または発現を結合および下方制御する。ｓｉＮＡ発現ベクターのデリバリーは、静脈内または筋内投与、対象から過去に移植され、同じ対象へ再導入された標的細胞への投与、または、望ましい標的細胞への導入を可能にするだろう在来の方法等、全身性であってよい。
【０２３８】
「ベクター」という用語は、望ましい核酸のデリバリーに使用されるすべての核酸および／またはウィルスベース技術を意味する。
【０２３９】
本発明の他の機能および利点は、その好ましい態様に関する以下の記述および特許請求の範囲から明白となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２４０】
図面の簡単な説明
図１は、ｓｉＮＡ分子の合成スキームの限定を目的としない例を示す。相補ｓｉＮＡ 配列鎖、鎖１および鎖２は縦一列に合成され、固定支持体上の固相合成に使用される切断可能なリンカーと同一または異なるヌクレオチドコハク酸塩または脱塩基コハク酸塩等の切断可能な結合で結合される。合成は固相または液相のいずれかであり、表示の例において、合成は固相合成である。合成を実施して、ジメソキシトリチル基等の保護基が縦列オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドで維持する。オリゴヌクレオチドの切断および脱保護時に、２つのｓｉＮＡ鎖を同時にハイブリダイズし、ｓｉＮＡ二重鎖を形成することによって、例えばトリチルを精製方法に適用して末端保護基を持つ二重鎖／オリゴヌクレオチドのみを分離する等、末端保護基の特性を利用して前記二重鎖を精製することができる。
【０２４１】
図２は、本発明の方法によって合成した精製ｓｉＮＡ二重鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。表示される２つのピークは、個別のｓｉＮＡ配列鎖の予測質量に対応する。この結果は、単純なトリチル−オン精製方法を使用し、縦列合成で生成されたｓｉＮＡ二重鎖を単一体として精製することができることを示す。
【０２４２】
図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の限定を目的としない機構図案を示す。例えばウィルス、トランスポゾン、または他の外来ＲＮＡ等の外来一本鎖ＲＮＡからＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により生成される二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ） は、ｓｉＮＡ 二重鎖を順に生成するダイサー（ＤＩＣＥＲ）酵素を活性化する。代替として、発現したｓｉＮＡの合成を適切な手段で細胞に直接導入することができる。標的ＲＮＡを認識する活性ｓｉＮＡ複合体に形成の結果として、ＲＩＳＣ エンドヌクレアーゼ複合体により標的ＲＮＡが分解されるか、またはＲＮＡ 依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）により追加のＲＮＡが合成され、これによってダイサーを活性化し、追加のｓｉＮＡ分子を生成することでＲＮＡｉ応答を増幅することができる。
【０２４３】
図４Ａ−Ｆは、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。図中、Ｎは任意のヌクレオチド（アデノシン、グアニン、シトシン、または任意でチミジン）を示し、例えばチミジンは丸括弧で指定した突出領域（ＮＮ）で置換することができる。ｓｉＮＡ構造のセンスおよびアンチセンス鎖に対する様々な修飾を示す。
【０２４４】
図４Ａ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、存在するすべてのヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドを除いてリボヌクレオチドであり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載の他の化学修飾を含むことができる。アンチセンス鎖は、任意で３'末端グリセリル部分を持つ２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列に対して任意で相補的であり、また存在するすべてのヌクレオチドは、（Ｎ Ｎ） ヌクレオチドを除いてリボヌクレオチドであり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載の他の化学修飾を含むことができる。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、前記アンチセンス鎖における前記（ＮＮ）ヌクレオチドと任意で結合する。
【０２４５】
図４Ｂ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは２'デオキシ−２'フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、また、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ） ヌクレチオドを除き、メチル２' −Ｏメチル修飾されたヌクレチオドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、ここで述べられているその他化学修飾を構成する。前記センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは２'デオキシ−２'フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、また、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレチオドを除き、メチル２'−Ｏメチル修飾されたヌクレチオドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、ここで述べられているその他化学修飾を構成する。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、前記センスおよびアンチセンス鎖における前記（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
【０２４６】
図４Ｃ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み５'−及び３'−末端キャップ部分を有し、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ） ヌクレチオドを除き、２'−デオキシ２' −フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、本明細書に記載されているその他化学飾を構成する。アンチセンス鎖は、任意で３'末端グリセリル部分を持つ２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ 配列に対して任意で相補的であり、また存在するすべてのピリミジンヌクレオチドは、（Ｎ Ｎ） ヌクレオチドを除いて２'−デオキシ２'−フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基、または本明細書に記載の他の化学修飾を含むことができる。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、前記アンチセンス鎖における前記（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
【０２４７】
図４Ｄ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み５'−及び３'−末端キャップ部分を有し、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ） ヌクレチオドを除き、２−'デオキシ２−'フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、本明細書に記載されているその他化学修飾を構成し、またここでは全てのプリンヌクレオチドは２−'デオキシ修飾されたヌクレオチドである可能性がある。アンチセンス鎖は、任意で３'末端グリセリル部分を持つ２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ 配列に対して任意で相補的であり、ここでは、すべてのピリミジンヌクレオチドは２'デオキシ−２'フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、また、すべてのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレチオドを除き、メチル２' −Ｏメチル修飾されたヌクレチオドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、ここで述べられているその他化学修飾を構成する。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、アンチセンス鎖における（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。
【０２４８】
図４Ｅ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み５'−及び３'−末端キャップ部分を有し、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ） ヌクレチオドを除き、２'−デオキシ２' −フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、本明細書に記載されているその他化学修飾を構成する。センス鎖は２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３' −ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは２'デオキシ−２'フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、また、すべてのプリンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ）ヌクレチオドを除き、メチル２'−Ｏ メチル修飾されたヌクレチオドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、ここで述べられているその他化学修飾を構成する。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、アンチセンス鎖における前記（ＮＮ）ヌクレオチドと任意で結合する。
【０２４９】
図４Ｆ：センス鎖は２１ヌクレオチドを含み５'−及び３'−末端キャップ部分を有し、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは任意で塩基対であり、すべてのピリミジンヌクレオチドは（Ｎ Ｎ） ヌクレチオドを除き、２−'デオキシ２−'フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、本明細書に記載されているその他化学修飾を構成し、またここでは全てのプリンヌクレオチドは２−'デオキシ修飾されたヌクレオチドである可能性がある。アンチセンス鎖は、任意で３'−末端グリセリル部分を持つ２１ヌクレオチドを含み、ここで２つの末端３'−ヌクレオチドは、標的ＲＮＡ配列に対して任意で相補的であり、ここでは、１つ３'−末端ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート結合のヌクレオチドを有し、すべてのピリミジンヌクレオチドは２'デオキシ−２'フルオロ修飾されたヌクレオチドである可能性があり、また、すべてのプリンヌクレオチドは（ＮＮ）ヌクレチオドを除き、メチル２'−Ｏメチル修飾されたヌクレチオドである可能性があり、リボヌクレチオド、デオキシヌクレチオド、ユニバーサル塩基、ここで述べられているその他化学修飾を構成する。ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは本明細書に記載の他の修飾ヌクレオチド間結合等の修飾ヌクレオチド間結合は「ｓ」で表示され、前記アンチセンス鎖における前記（Ｎ Ｎ）ヌクレオチドと任意で結合する。Ａ−Ｆ構造配列アンチセンス鎖は本発明の標的核酸配列を構成する。さらに、グリセリル部分（Ｌ）が、図４Ａ −Ｆに示されている構造のようにアンチセンス鎖の３'−端に見られる場合は、修飾ヌクレチオド結合は任意である。
【０２５０】
図５Ａ−Ｆは、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。Ａ−Ｆ により、図４Ａ−Ｆに記載された化学修飾をＨＣＶｓｉＮＡ配列に適合する。そのような化学修飾は、任意のＨＣＶ配列および／または細胞標的配列に適合されることができる。
【０２５１】
図６は、本発明の異なるｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。表示の例（構造１、２、および３）は１９の代表的な塩基対を持つが、本発明の異なる実施形態は本明細書に記載の任意の数の塩基対を含む。括弧付きの領域は、例えば約１、２、３、または４ヌクレオチド長、好ましくは約２ヌクレオチド長のヌクレオチド突出部を示す。構造１および２をＲＮＡｉ活性に対して個別に使用することができる。構造２は生分解性リンカーとして任意で指定できるポリヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカーを含むことができる。一実施形態において、構造２に示されるループ構造は生分解性リンカーを含むことができ、その結果としてインビボおよび／またはインビトロで構造１を形成する。別の態様においては、構造３を使用して、同じ原理で構造２を生成することができ、ここでリンカーを使用して、インビボおよびインビトロで活性ｓｉＮＡ構造２を生成し、任意で別の生分解性リンカーを利用して、インビボおよびインビトロで活性ｓｉＮＡ構造１を生成することもできる。上述の通り、ｓｉＮＡ構造の安定性および／または活性をインビボまたはインビトロおよび／またはインビトロで使用するｓｉＮＡ構造のデザインに基づいて調節することができる。
【０２５２】
図７Ａ−Ｃは、ｓｉＮＡヘアピン構造を生成するために発現カセットを生成するのに使用するスキームを図示する。
【０２５３】
図７Ａ：ＤＮＡオリゴマーが、同一配列（ｓｉＮＡのセンス領域）を所定のＨＣＶ標的配列に有する領域に従い５'−制限部位（Ｒ１） 配列で合成され、ＨＣＶ標的配列では、センス領域が例えば、約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド（Ｎ）長を含み、例えば、約３から約１０ヌクレオチドを含む所定の配列（Ｘ）のループ配列に従っている。
【０２５４】
図７Ｂ：合成構造は、こうしてＤＮＡポリメラーゼにより、結果としてにＨＣＶ標的配列に対して特異性を有し、自己相補センスおよびアンチセンス領域を有するｓｉＮＡ 転写になる自己相補配列を有するヘアピン構造を生成するよう拡大する。
【０２５５】
図７Ｃ：構造は、配列を線状にするため熱せられ（例、約９５度）、これにより第一鎖の３'−制限配列のプライマーに利用する相補の第二ＤＮＡ鎖の拡大を可能にする。二本鎖ＤＮＡは、そうして細胞内の発現用に適切なベクターに挿入される。構造は、３'−末端ヌクレオチド突出が転写に起因するので、例えば、ポール（Ｐａｕｌ） ら、２００２年、ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２９、５０５−５０８に記載の通り、制限領域の設計および／またはポリ−Ｕ終端領域の利用によりデザインすることができる。
【０２５６】
図８Ａ−Ｃは、二本鎖ｓｉＮＡヘアピン構造を生成するために発現カセットを生成するのに使用するスキームを図示する。
【０２５７】
図８Ａ：ＤＮＡオリゴマーが、同一（ｓｉＮＡのセンス領域）配列を所定のＨＣＶ標的配列に有する領域に従い５'−制限部位（Ｒ１） 配列で合成され、ＨＣＶ標的配列では、センス領域が例えば、約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド（Ｎ）長を含み、および所定の配列（Ｘ）のループ配列に隣接する３'−制限部位（Ｒ２）に従っている。
【０２５８】
図８Ｂ：合成構造は、こうしてＤＮＡポリメラーゼにより自己相補配列を有するヘアピン構造を生成するよう拡大する。
【０２５９】
図８Ｃ：構造は、Ｒ１およびＲ２に特定される制限酵素により、細胞内の発現用に適切なベクターに挿入される二本鎖ＤＮＡを生成するよう処理される。転写カセットは、Ｕ６プロモーター領域がｓｉＮＡの個別のセンスおよびアンチセンス鎖を生成するｄｓＤＮＡの各側に位置するようデザインされている。ポリＴ終端配列は、派生転写中のＵ突出部を生成する構造に追加できる。
【０２６０】
図９Ａ−Ｅは、メッセンジャーＲＮＡ等、特定の標的核酸配列内のｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉ の標的部位を判定するのに使用する方法を図示する。
【０２６１】
図９Ａ：ｓｉＮＡオリゴヌクレオチドのプールを合成し、ここでｓｉＮＡ構造のアンチセンス領域は標的核酸配列上の標的部位に対して相補性を持ち、またセンス領域はｓｉＮＡの前記アンチセンス領域に対して相補的な配列を含む。
【０２６２】
図９Ｂ及びＣ：（図９Ｂ）配列は、プールされてベクターに挿入されるので、細胞内の（ 図９Ｃ）ベクターの転写がｓｉＮＡ の発現に起因する。
【０２６３】
図９Ｄ：前記標的核酸配列の調節に関連する表現型の変化に基づいて細胞を分類する。
【０２６４】
図９Ｅ：分類した細胞からｓｉＮＡを分離し、一定の順序に配列して前記標的核酸配列内で有効な標的部位を識別する。
【０２６５】
図１０は、例えば、本発明のｓｉＮＡ配列の３'端を安定化するのに使用できる異なる安定した化学的性質（１−１０） の限定を目的としない例を示し、（１）［３−３'］ −逆位デオキシリボー［５'−３'］−３' −デオキシリボヌクレオチド；（４）
ス；（２） デオキシリボヌクレオチド；（３）［５' −３'］−リボヌクレオチド；（５）
［５'−３'］−３' −Ｏ−メチルリボヌクレオチド；（６）３' −グリ［３'−５'］−３'−デオキシリボヌクレオチド；（８）セリル；（７）［３'−３'］−デオキシリボヌクレオチド；（９）［５'−２'］ −デオキシリボヌクレオチド； および（１０）［５−３'］ −ジデオキシリボヌクレオチドを含む。図に示す修飾および未修飾骨格に加え、それらの化学的性質を、例えば化学式Ｉを持つ骨格修飾等の本明細書に記載の異なる骨格修飾と組み合わせることができる。さらに、表示の５'末端修飾に対する２'−デオキシヌクレオチドは、例えば化学式Ｉ−ＶＩＩまたはその任意の組み合わせを持つ修飾等、本明細書に記載の別の修飾または未修飾ヌクレオチドであってよい。
【０２６６】
図１１は、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持しながらヌクレアーゼに抵抗する本発明の化学修飾したｓｉＮＡ構造の識別に使用する方法の限定を目的としない例を示す。知識に基づいたデザインパラメータに基づいて、化学修飾をｓｉＮＡ構造に導入する（例、２' −修飾、塩基修飾、骨格修飾、末端キャップ修飾等を導入する）。前記修飾構造を適切なシステム（例、ヌクレアーゼ抵抗には表示のヒト血清、またはＰＫ／デリバリーパラメータには動物モデル）において試験した。同一のアプローチを使用して、高い薬物動態プロファイル、デリバリーおよびＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡコンジュゲート分子を識別することができる。次にＲＮＡｉ活性を維持しながら特定の特徴を有する首位のｓｉＮＡ構造を識別し、さらに修飾して再度アッセイすることができる。同一のアプローチを使用して、高い薬物動態プロファイル、デリバリーおよびＲＮＡｉ活性を持つｓｉＮＡコンジュゲート分子を識別することができる。
【０２６７】
図１２は、本発明の線形二本鎖構造及びその非対称派生を含むリン酸化ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示す。
【０２６８】
図１３は、本発明の化学的修飾されたリン塩酸酸化端グループの限定を目的としない例を示す。
【０２６９】
図１４Ａは、パリンドロームおよび／または標的核酸配列において識別される反復核酸配列を利用する自己相補ＤＦＯ構造のデザインに使用される方法の限定を目的としない例を示す。（ｉ） パリンドロームまたは反復配列は核酸標的配列において識別される。（ｉｉ） 配列は前記標的核酸配列および前記パリンドローム配列に相補的となるようデザインされる。（ｉｉｉ） 相補配列の非パリンドローム／反復部位の逆位反復配列は、相補配列の３' 端に付加され、核酸標的に対する配列相補性を持つ自己相補ＤＦＯ分子を生成する。（ｉｖ） 前記ＤＦＯ分子は自己組織化し、二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。図１４Ｂは、二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の限定を目的としない代表的な態様を示す。図１４Ｃは、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己組織化スキームの限定を目的としない例を示す。図１４Ｄは、遺伝子発現の調節につながる標的核酸配列との相互作用が後に続く、代表的な二重鎖形成オリゴヌクレオチド配列の自己組織化スキームの限定を目的としない例を示す。
【０２７０】
図１５は、問題となる任意の標的核酸配列に配列相補性を持つＤＦＯ構造に組み込まれるパリンドロームおよび／または反復核酸配列を利用した自己相補ＤＦＯ構造のデザインに関する限定を目的としない例を示す。パリンドローム／ 反復配列を組み込むことによって、二重鎖を形成するようにＤＦＯ構造をデザインすることができる。ここで、各鎖は例えばＲＮＡｉによって標的遺伝子の発現の調節を媒介することができる。最初に標的配列を識別する。ここでヌクレオチドまたは非ヌクレオチド修飾（ＸまたはＹで表示）を、人工パリンドローム（図ではＸＹＸＹＸＹで表示）を生成する相補配列に導入する。逆反復の非パリンドローム／反復相補配列は前記相補配列の３' 端に付加され、前記核酸標的に対して配列相補性を含む自己相補ＤＦＯを生成する。前記ＤＦＯは自己組織化して二本鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。
【０２７１】
図１６は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能ｓｉＮＡ分子に関する限定を目的としない例を示す。図１６Ａは、第一標的核酸配列（相補領域１）に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示す。 ここで、第一および第二相補領域は多機能ｓｉＮＡにある各ポリヌクレオチド配列の３'端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。図１６Ｂは、第一標的核酸配列（相補領域１）に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示し、ここで、第一および第二相補領域は多機能ｓｉＮＡ にある各ポリヌクレオチド配列の５'端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。
【０２７２】
図１７は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる区別できる領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子に関する限定を目的としない例を示す。図１７Ａは、第一標的核酸配列（相補領域１）に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ 分子の限定を目的としない例を示し、ここで、第二相補領域は多機能ｓｉＮＡにあるポリヌクレオチド配列の３'端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。図１７Ｂは、第一標的核酸配列（相補領域１） に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示し、ここで、第一相補領域は多機能ｓｉＮＡにあるポリヌクレオチド配列の５'端に位置する。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。一実施形態において、これら多機能ｓｉＮＡ構造は、図１６で示した多機能ｓｉＮＡ構造を生成するためインビボまたはインビトロのいずれかで処理される。
【０２７３】
図１８は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能ｓｉＮＡ分子に関する限定を目的としない例を示し、ここで多機能ｓｉＮＡ構造はさらに自己相補的な、パリンドローム、あるいは反復領域を含み、それによって、異なる標的核酸配列に対してＲＮＡ 干渉を媒介することのできる、より短い二機能のｓｉＮＡ 構造が可能になる。図１８Ａは、第一標的核酸配列（相補領域１）に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示し、ここで、第一および第二相補領域は多機能ｓｉＮＡにある各ポリヌクレオチド配列の３'端に位置し、ここで第一および第二相補領域は、さらに自己相補的な、パリンドロームあるいは反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ 二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。図１８Ｂ は、第一標的核酸配列（相補領域１）に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示し、ここで、第一および第二相補領域は多機能ｓｉＮＡにある各ポリヌクレオチド配列の５'端に位置し、ここで第一および第二相補領域は、さらに自己相補的な、パリンドロームあるいは反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ 二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。
【０２７４】
図１９は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる区別できる領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子に関する限定を目的としない例を示し、ここで多機能ｓｉＮＡ 構造はさらに自己相補的な、パリンドロームあるいは反復領域を含み、それによって、異なる標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介することのできる、より短い二機能のｓｉＮＡ構造が可能になる。図１９Ａ は、第一標的核酸配列（相補領域１）に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示し、ここで、第二相補領域は多機能ｓｉＮＡにあるポリヌクレオチド配列の３'端に位置し、ここで第一および第二相補領域は、さらに自己相補的な、パリンドロームあるいは反復地域を含む。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ 二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。図１９Ｂ は、第一標的核酸配列（相補領域１）に対して相補的な第一領域、および第二標的核酸配列（相補領域２）に対して相補的な第二領域を持つ多機能ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示し、ここで、第一相補領域は多機能ｓｉＮＡ にあるポリヌクレオチド配列の５'端に位置し、ここで第一および第二相補領域は、さらに自己相補的な、パリンドロームあるいは反復領域を含む。多機能ｓｉＮＡ構造の各ポリヌクレオチド配列の破線部分は、ｓｉＮＡ二重鎖の対応部分に関して相補性を持つが、標的核酸配列に対する相補性は持たない。一実施形態において、それら多機能ｓｉＮＡ 構造はインビボまたはインビトロで処理され、図１８に示す多機能ｓｉＮＡ構造を生成する。
【０２７５】
図２０は、例えばサイトカインおよびそれに対応する受容体、異なるウィルス鎖、ウィルス感染または複製に関与するウィルスおよび細胞タンパク質、または疾患の維持または進行に関与する一般的または分岐生物経路に関与するウィルスおよび細胞タンパク質といった異なるタンパク質をコードする個別のＲＮＡ分子等の、２つの独立した標的核酸分子を本発明の多機能ｓｉＮＡ 分子がどのように標的とすることができるかに関する限定を目的としない例を示す。多機能ｓｉＮＡ 構造の各鎖は、標的核酸分子を分離するための相補性を持つ領域を含む。前記多機能ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ 複合体に利用されて対応する標的のＲＮＡ 干渉媒介性切断を開始するようにデザインされる。それらのデザインパラメータは、ｓｉＮＡ構造の各末端の不安定化を含むことができる（例として、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）等、２００３年、細胞（Ｃｅｌｌ）、１１５、１９９−２０８を参照）。そのような不安定化は、例えばグアノシン−シジチン塩基対、代替塩基対（例、ゆらぎ）を使用して、または当該技術分野において知られる末端ヌクレオチド位における化学修飾ヌクレオチドを不安定化することで実現できる。
【０２７６】
図２１は、ＲＮＡの代替のコード領域、ＲＮＡのコード領域および非コード領域、あるいはＲＮＡ のスプライスバリアント領域のような、同一標的核酸分子内の２つの独立した標的核酸分子配列を、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子がどのように標的とすることができるかに関する限定を目的としない例を示す。多機能ｓｉＮＡ構造の各鎖は、標的核酸分子の個別の領域に相補性を持つ領域を含む。多機能ｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡの各鎖がＲＩＳＣ複合体に利用されて対応する標的領域のＲＮＡ干渉媒介性切断を開始するようにデザインされる。それらのデザインパラメータは、ｓｉＮＡ構造の各末端の不安定化を含むことができる（例として、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）等、２００３年、細胞（Ｃｅｌｌ）、１１５、１９９−２０８を参照）。そのような不安定化は、例えばグアノシン−シジチン塩基対、代替塩基対（例、ゆらぎ）を使用して、または当該技術分野において知られる末端ヌクレオチド位における化学修飾ヌクレオチドを不安定化することで実現できる。
【０２７７】
図２２は、コントロール（２９５９３／２９６００） との比較で、様々な濃度（１ｎＭ 、５ｎＭ、１０ｎＭ、および２５ｎＭ）のｓｉＮＡ構造によるＨＣＶ／ポリオウィルスキメラ（２９５７９／２９８６；２９５７８／２９５８５）のウィルス複製抑制を示す用量反応試験の限定を目的としない例を示す。
【０２７８】
図２３は、コントロール（２９５９３／２９６００） との比較で、様々な濃度（１ｎＭ 、５ｎＭ、１０ｎＭ、および２５ｎＭ）のｓｉＮＡ構造（２９５７９／２９５８６） によるＨＣＶ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す用量反応試験の限定を目的としない例を示す。
【０２７９】
図２４は、コントロール（３００５２／３００５４） との比較で、化学修飾ｓｉＲＮＡ 構造（３００５１／３００５３）によるＨＣＶ ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す限定を目的としない例を示す。
【０２８０】
図２５は、コントロール（３００５６／３００５８） との比較で、化学修飾ｓｉＲＮＡ 構造（３００５５／３００５７）によるＨＣＶ ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す限定を目的としない例を示す。
【０２８１】
図２６は、脂質コントロールおよび逆位ｓｉＮＡコントロール構造２９５９３／２９６００との比較で、１０ｎＭ処理のＨＣＶ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製を標的とする幾つかの化学修飾ｓｉＲＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。
【０２８２】
図２７は、脂質コントロールおよび逆位ｓｉＮＡコントロール構造２９５９３／２９６００との比較で、２５ｎＭ処理の化学修飾ｓｉＲＮＡ構造によるＨＣＶ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す限定を目的としない例を示す。
【０２８３】
図２８は、未処理の細胞（「細胞」）、リポフェクタミンを導入した細胞（「ＬＦＡ２Ｋ」）、および逆位のｓｉＮＡコントロール構造（「Ｉｎｖ」）との比較で、２５ｎＭ処理のＨｕｈ７ＨＣＶ レプリコンシステムのウィルス複製を標的とする幾つかの化学修飾ｓｉＲＮＡ 構造の限定を目的としない例を示す。
【０２８４】
図２９は、未処理の細胞（「細胞」）、リポフェクタミンを導入した細胞（「ＬＦＡ」） および逆位のｓｉＮＡコントロール構造（「Ｉｎｖ」）との比較で、５、１０、２５、および１００ｎＭ処理のＨｕｈ７ＨＣＶレプリコンシステムにおいてＨＣＶ ＲＮＡの２９１、３００、および３０３位を標的とする化学修飾ｓｉＮＡ分子（Ｓｔａｂ４／５、表ＩＶを参照）を使用する用量反応試験の限定を目的としない例を示す。
【０２８５】
図３０は、未処理細胞（「細胞」）、脂質移入された細胞（「脂質」） および逆位ｓｉＮＡコントロール構造（「Ｉｎｖ」）との比較で、２５ｎＭ処理の化学修飾ｓｉＲＮＡ構造（Ｓｔａｂ７／８、表ＩＶを参照）によるＨｕｈＨＣＶウィルス複製抑制を示す限定を目的としない例を示す。
【０２８６】
図３１は、逆位ｓｉＮＡコントロール構造との比較で、ｓｉＮＡ分子（Ｓｔａｂ７／８， 表ＩＶを参照）を用いた用量反応試験の結果を示す限定を目的としない実験例を示す。 Ｈｕｈ７ＨＣＶ レプリコンシステムにおけるＨＣＶ３２７位を標的とし、５、１０、２５、５０，１００ｎＭ処理のｓｉＮＡ 分子を用いる。
【０２８７】
図３２は、ｓｉＮＡ／インターフェロン併用治療が、インターフェロンのみと比較してＨｕｈ７細胞のＨＣＶサブゲノムレプリコンシステムにおいて０−１００ｎＭ ｓｉＮＡを利用し試験された試験結果を示す。
【０２８８】
図３３は、０．１から１０ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位３０４および３２７（ＭＦ３６４４７／３４５８８／３８３１０） および部位２８２および３０４（ＭＦ３４５８８／３６４４５／３８３１１）を標的とする多機能ｓｉＮＡが、無関係の多機能ｓｉＮＡコントロール（ＭＦコントロール）および部位３０４（３４５８３／３４５８８）および３２７（３４５８５／３２２０１）および部位２８２（３４５８１／３４５８６）および３０４（３４５８３／３４５８８）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、プールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２８９】
図３４は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位２８２および３０４（ＭＦ３８３１４／３８２９４／３８３００） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位２８２（３３１３９／３８２９４）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造と部位２８２（３３１３９／３８２９４）および３０４（３３１４９／３８３００） を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、個別にプールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９０】
図３５は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位２８２および３０４（ＭＦ３８３１４／３８２９７／３８３００） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位２８２（３３１３９／３８２９７）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造と部位２８２（３３１３９／３８２９７）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、個別にプールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９１】
図３６は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位３２７および３０４（ＭＦ３８３１２／３７７９１／３８３００） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位３２７（３１７０３／３７７９１）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造と部位３２７（３１７０３／３７７９１）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、個別にプールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９２】
図３７は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位３２７および３０４（ＭＦ３８３１２／３８３０２／３８３００） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位３２７（３１７０３／３８３０２）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造と部位３２７（３１７０３／３８３０２）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、個別にプールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９３】
図３８は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶ ＲＮＡの部位３２７および２８２（ＭＦ３８３１３／３８３０２／３８２９７） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位３２７（３１７０３／３７７９１）および２８２（３３１３９／３８２９４）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと部位３２７（３１７０３／３８３０２）および２８２（３３１３９／３８３９７）を標的とする別の個別ｓｉＮＡ 構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、プールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９４】
図３９は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位２８２および３０４（ＭＦ３８３１４／３８２９７／３８３００） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位２８２（３３１３９／３８２９４）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと部位２８２（３３１３９／３８２９７）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする別の個別ｓｉＮＡ 構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、プールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９５】
図４０は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位３２７および３０４（ＭＦ３８３１２／３８３０２／３８３００） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位３２７（３１７０３／３７７９１）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと部位３２７（３１７０３／３８３０２）および３０４（３３１４９／３８３００）を標的とする別の個別ｓｉＮＡ 構造のプ―ルと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、プールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９６】
図４１は、０．１から２５ｎＭの未処理の細胞およびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡ）を伴い、ＨＣＶＲＮＡの部位２８２および３２７（ＭＦ３８３１３／３８２９７／３８３０２） を標的とする化学的に安定した多機能ｓｉＮＡが、部位２８２（３３１３９／３８２９４）および３２７（３１７０３／３７７９１）を標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと部位２８２（３３１３９／３８２９７）および３２７（３１７０３／３８３０２）を標的とする別の個別ｓｉＮＡ 構造のプールと評価された用量反応試験の結果を示す。ｓｉＮＡ構造の化合物番号は表ＩＩＩに示す。図で示す通り、多機能ｓｉＮＡ構造は、プールされたｓｉＮＡ構造に対応し同等の活性を示す。
【０２９７】
図４２Ａ−４２Ｈは、本発明の連結された多機能ｓｉＮＡ 構造の限定を目的としない例を示す。表示の例において、リンカー（例、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー）は２つのｓｉＮＡ領域（例、２つのセンス、２つのアンチセンス、または代替として１つのセンス領域および１つのアンチセンス領域）を結合する。第一標的配列および第二標的配列に対応する個別のセンス（またはセンスおよびアンチセンス）配列は、多機能ｓｉＮＡにおいてそれらに対応するセンスおよび／またはアンチセンス配列に対してハイブリダイズする。さらに、選択的または高いデリバリーおよび／または薬物動態特性を目的として、様々なコンジュゲート、リガンド、アプタマー、ポリマーまたはレポーター分子をリンカー領域に接続することができる。
【０２９８】
図４３は、様々なデンドリマーベースの多機能ｓｉＮＡデザインの限定を目的としない例を示す。
【０２９９】
図４４は、様々な超分子の多機能ｓｉＮＡデザインの限定を目的としない例を示す。
【０３００】
図４５は、３０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの限定を目的としない例を示す。３０塩基対の二重鎖は、ダイサーによっていずれかの末端から２２および８塩基対生成物に切断される（８塩基対部分は表示せず）。表示を簡略化するため、ダイサーにより生成される突出部は表示しないが、補うことができる。３つの標的配列を示す。必要な配列の重複単位はグレーのボックスで表示する。安定した化学的性質において試験する場合、親３０塩基対ｓｉＮＡのＮ'は、ダイサー切断が可能な２'−ＯＨ 位の部位を提示している。ダイサーＲＮａｓｅＩＩＩによる３０量体二重鎖の処理では精密に２２＋８に切断されるのではなく、一連の近似する生成物（初期位として２２＋８を持つ）が生成される。そのため、ダイサーによる処理で一連の活性ｓｉＮＡが産出される。
【０３０１】
図４６は、４０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの限定を目的としない例を示す。４０塩基対の二重鎖は、ダイサーによっていずれかの末端から２０塩基対生成物に切断される。表示を簡略化するため、ダイサーにより生成される突出部は表示しないが、補うことができる。４つの標的配列を示す。必要な配列の重複単位はグレーのボックスで表示する。このデザイン形式はより大きなＲＮＡに拡大することができる。化学的に安定したｓｉＮＡ がダイサーにより結合される場合、次に戦略的に配置されたリボヌクレオチド結合によってデザイナー切断生成物が可能になり、我々の多機能デザインのレパートリーをさらに拡大することができる。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断生成物によって、例えば約３から約１５ヌクレオチドの範囲で重複する標的配列単位を持つ多機能ｓｉＮＡ構造を実現することができる。
【０３０２】
図４７は、ＨＢＶの２６３位を標的とする多機能ｓｉＮＡ 構造を可能にするダイサーによるＨＢＶ ＲＮＡの抑制の限定を目的としない例を示す。ｓｉＮＡアンチセンス鎖（例、３'−ＴＴ突出部を持つ二重鎖における２１ヌクレオチド鎖）の最初の１７ヌクレオチドが標的ＲＮＡに対して相補的である場合、２５ｎＭで強固なサイレンシングが観察された。同一形式で１６ヌクレオチドのみが相補性を持つ場合、８０％のサイレンシングが認められた。
【０３０３】
図４８は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの限定を目的としない例を示す。１つの態様においては、コンジュゲート、リガンド、アプタマー、ラベル、または他の部分を多機能ｓｉＮＡの一領域に結合することで高いデリバリーまたは薬物動態プロファイリングが実現する。
【０３０４】
図４９は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの限定を目的としない例を示す。１つの態様においては、コンジュゲート、リガンド、アプタマー、ラベル、または他の部分を多機能ｓｉＮＡの一領域に結合することで高いデリバリーまたは薬物動態プロファイリングが実現する。
【０３０５】
本発明の核酸分子の作用機序
以下の考察は、現在知られている低分子干渉ＲＮＡを介したＲＮＡ干渉の機構を論じるものであり、従来技術に限定する意図はなく、従来技術を承認するものではない。出願人は、本明細書にて化学的に修飾された低分子干渉核酸がｓｉＲＮＡ分子同様に類似の、または改善されたＲＮＡｉを媒介する能力を有すること、また、改良された安定性とインビボ活性を有すると期待されることを示し、従って、本考察はｓｉＲＮＡのみに限定されず、ｓｉＮＡ全体に応用され得る。「ＲＮＡｉを媒介する改良された能力」または「改良されたＲＮＡｉアクティビティー」という用語は、インビトロまた／もしくはインビボでＲＮＡｉアクティビティーを測定したものを含んで意味し、ＲＮＡｉ アクティビティーはＲＮＡｉ を媒介するｓｉＮＡの活性と本発明のｓｉＮＡ の安定性、双方の反映である。本発明では、全てのＲＮＡ、複数のリボヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡもしくはｓｉＮＡと比較して、これらの活性による結果はインビトロまた／もしくはインビボで上昇し得る。ある場合においては、ｓｉＮＡ分子の活性または安定性は低下し得るが（すなわち１０倍未満）、ｓｉＮＡ分子の全体的な活性はインビトロまた／もしくはインビボで改良された。
【０３０６】
ＲＮＡ干渉は、動物における低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）によって媒介される配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングの過程を指す（ファイヤー（Ｆｉｒｅ ）ら，１９９８年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６）。植物においてこれに相当する過程は、一般的に転写後遺伝子サイレンシング、またはＲＮＡサイレンシング、菌類ではクエリングとも呼ばれる。転写後の遺伝子サイレンシング過程は、外来遺伝子の発現を阻止するために使用される進化的に保存された細胞防御機構であると考えられ、一般に多様な植物相および門に共通である（ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら，１９９９年，トレンド遺伝学誌Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ），１５，３５８）。外来遺伝子からのそのような保護は、ウィルス感染から、または特に同種の一本鎖ＲＮＡまたはウィルスゲノムＲＮＡを破壊する細胞応答による、転位因子の宿主ゲノムへの任意の融合から生じた、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ ）の生成に応じて進化してきた可能性がある。細胞内におけるｄｓＲＮＡの存在は、未だ特性が完全には明らかにされていない機序によってＲＮＡｉ応答を誘発する。この機序は、ｄｓＲＮＡ に媒介されるプロテインキナーゼＰＫＲの活性化の結果起こる反応と、リボヌクレアーゼＬによる非特異的なｍＲＮＡ切断の結果起こる２'、５'−オリゴアデニル生成とで異なるようである。
【０３０７】
長鎖ｄｓＲＮＡが細胞内に存在すると、ダイサーと呼ばれるリボヌクレーゼＩＩＩ酵素の活性を刺激する。ダイサーは、ｄｓＲＮＡが低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）として知られるｄｓＲＮＡ の短い断片になる過程に関わっている（バースタイン（Ｂｅｒｓｔｅｉｎ ）ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０９，３６３）。ダイサー活性によって生じる低分子干渉ＲＮＡは、一般的に約２１から約２３ヌクレオチドの長さで、約１９塩基対の二重鎖を含む。ダイサーは、２１および２２ヌクレオチドの低分子一時ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ） を、翻訳調整に関わる保存構造の前駆ＲＮＡから切除する場合にも関与している（ハットヴァーグナー（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ）ら，２００１年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９３，８３４）。ＲＮＡｉ反応はＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と一般的に呼ばれる、ｓｉＲＮＡとの相同配列を持つ一本鎖ＲＮＡの切断を媒介するｓｉＲＮＡを含むエンドヌクレアーゼ複合体としての役割がある。標的ＲＮＡの切断はｓｉＲＮＡ二重鎖であるガイド配列に相補的な中央の領域で行われる（エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ）等、遺伝子と発生誌）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，１５，１８８）。加えて、ＲＮＡ干渉は、おそらくクロマチン構造を制御し、それによって標的遺伝子配列の転写を防ぐという細胞機構を通じた、短いＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ）によって媒介される遺伝子サイレンシングにも関わっている可能性がある（例えば以下の文献を参照：オールシャー（Ａｌｌｓｈｉｒｅ），２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８１８−１８１９； ヴォープ（Ｖｏｌｐｅ） ら，２００２年， サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，１８３３−１８３７； ジニュウェイン（Ｊｅｎｕｗｅｉｎ）２００２年， サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２１５−２２１８； ホール（Ｈａｌｌ） ら，２００２年，サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ），２９７，２２３２−２２３７）。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、転写物であるＲＮＡとの相互作用を介して、または特定の遺伝子配列との相互作用の代わりとして遺伝子サイレンシングの媒介に使われる可能性があり、そのような相互作用は転写レベルまたは転写後レベルで遺伝子サイレンシングを引き起こす。
【０３０８】
ＲＮＡｉは様々なシステムで研究されてきた。ファイヤー（Ｆｉｒｅ）ら，１９９８年、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），３９１，８０６， は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｃｅ） で初めてＲＮＡｉを観察した。ウィアニー（Ｗｉａｎｎｙ） とゲッツ（Ｇｏｅｔｚ），１９９９年， ネイチャー細胞生物学誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．）２，７０， は、マウスの胚においてＲＮＡｉはｄｓＲＮＡによって媒介されていると述べた。ハモンド（Ｈａｍｍｏｎｄ） ら，２０００年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４０４，２９３）は、ｄｓＲＮＡとともに導入されるショウジョウバエ細胞におけるＲＮＡｉについて記述している。エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら，２００１年，ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ），４１１，４９４，は、ヒトの胚の腎臓およびＨｅＬａ細胞を含むほ乳類の細胞における２１ヌクレオチドの二重鎖の合成ＲＮＡの導入によるＲＮＡｉ誘導について述べた。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） の胚ライセートにおける最近の研究では、ｓｉＲＮＡ の長さ、構造、化学組成、配列といった効率的なＲＮＡｉ活性の媒介に最も重要な特定の必要条件が明らかになった。これらの研究は、２１ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ二重鎖は３' 端の２ヌクレオチドの突出を含んでいる場合に最も活性が高いという事を示した。更に、片方または双方のｓｉＲＮＡ鎖を２'デオキシ、または２'−Ｏ −メチルヌクレオチドで置換した場合ＲＮＡｉアクティビティーは消滅し、一方でｓｉＲＮＡヌクレオチド３' 端のデオキシヌクレオチドによる置換は耐用性を示した。ｓｉＲＮＡ 二重鎖の中央のミスマッチ配列も、同様にＲＮＡｉ活性を消滅させる事が示された。加えて、これらの研究は標的ＲＮＡの切断部位の位置はｓｉＲＮＡの３' 端ではなく５'端によって規定されるという事も示された（エルバシール（Ｅｌｂｅｒｓｈｉｒ） ら，２００１年，欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．，２０，６８７７）。ｓｉＲＮＡ 二重鎖の標的相補鎖の５'リン酸がｓｉＲＮＡ活性に必要であり、ｓｉＲＮＡの５' リン酸部分の維持にＡＴＰが用いられると別の研究が示したが（ ニカネン（Ｎｙｋａｎｅｎ） ら，２００１年，セル誌（Ｃｅｌｌ），１０７，３０９）、一方で、外因的に導入された場合には５'リン酸が欠けているｓｉＲＮＡ 分子は活性であり、ｓｉＲＮＡ 構造の５' リン酸化がインビボで起こるのかもしれないと示唆されている。
【０３０９】
本発明の二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）
１つの態様として、本発明は、二重鎖オリゴヌクレオチドへと自己集合することができる二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ） を含むｓｉＮＡ分子を特徴とする。本発明の二重鎖形成オリゴヌクレオチドは、化学的に合成するか、転写単位および／またはベクターから発現することができる。本発明のＤＦＯ分子は、様々な治療、診断、農業、畜産、標的の確認、ゲノム上の発見、遺伝子工学、薬理ゲノミクス上の応用に、有用な試薬と方法を提供する。
【０３１０】
本明細書においては便宜上、二重鎖形成オリゴヌクレオチドまたはＤＦＯ分子と呼ぶが、これらに限定されない特定のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的な調節の有力なメディエーターであることを、出願人は本明細書で示す。二重鎖オリゴヌクレオチドになるよう自己集合するようデザインされた、二重鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれの鎖が、標的核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む線状のポリヌクレオチド配列群である点において、本発明のオリゴヌクレオチドは、当該分野で知られている他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ 、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。従って本発明の核酸分子は、二重鎖のそれぞれの鎖に同じポリヌクレオチド配列を含み、それぞれの鎖が標的核酸分子に相補的なヌクレオチド配列を含む、機能的な二重鎖へと自己集合することができる。
【０３１１】
概して、二重鎖のオリゴヌクレオチドは、一つの鎖のオリゴヌクレオチド配列が二つ目の鎖のオリゴヌクレオチド配列と相補的である、二つの異なるオリゴヌクレオチド配列の集合によって形成され、そのような二重鎖オリゴヌクレオチドは二つの分離したオリゴヌクレオチドが集合するか、または、当該分野ではしばしばヘアピン様ステムループ構造（例えば、ｓｈＲＮＡ、または短鎖ヘアピンＲＮＡ） と呼ばれる、二重鎖構造を形成するように折り畳まった一つの分子から形成される。当該分野で知られる二重鎖のそれぞれの鎖に全て共通の特徴があるこれらの二重鎖オリゴヌクレオチドには、特徴的なヌクレオチド配列がある。
【０３１２】
当該分野で知られる二重鎖核酸分子とは異なり、出願人は、新規の、潜在的な費用効率が高い、一本鎖または線状のオリゴヌクレオチドから二重鎖核酸分子を形成する簡便な方法を開発した。二重鎖オリゴヌクレオチドの二つの鎖は、同じヌクレオチド配列を持ち、非共有結合で互いに結合された本発明に従って形成された。前述の二重鎖オリゴヌクレオチド分子は、合成後に当該分野で既知の手法と試薬によって容易に結合することができ、本発明の範囲内である。１つの態様においては、二重鎖を形成する本発明（二重鎖形成オリゴヌクレオチド） の一本鎖オリゴヌクレオチドは、第一の領域と第二の領域を含み、第二の領域は第一の領域のヌクレオチド配列の逆方向反復のヌクレオチド配列を含むか、もしくは、二重鎖の片方の鎖のヌクレオチド配列が二本目の鎖のヌクレオチド配列と同一である二重鎖オリゴヌクレオチドを、自己集合して形成するような部分を含む。上述の二重鎖形成オリゴヌクレオチドの限定を目的としない例が図１４および１５に描かれている。これらの二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ） は状況に応じて特定のパリンドロームまたは反復配列を含んでいてもよく、そのようなパリンドロームまたは反復配列は、ＤＦＯの第一の領域と第二の領域の間に存在する。
【０３１３】
１つの態様においては、本発明は、二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ ＤＦＯ）中に標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列である二重鎖を形成する自己相補的な核酸配列を含むＤＦＯ分子であることを特徴とする。ＤＦＯ分子は自己相補配列を単独で、またはそのような自己相補配列による集合の結果生じた二重鎖を含む可能性がある。
【０３１４】
１つの態様においては、本発明の二重鎖形成オリゴヌクレオチド（ＤＦＯ）は第一の領域と第二の領域を含み、第二の領域はＤＦＯ分子が二重鎖ヌクレオチドに自己集合できるように第一の領域のヌクレオチド配列の逆方向反復のヌクレオチド配列を含む。 そのような二重鎖オリゴヌクレオチドは、遺伝子発現を調節する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） として作用することができる。本発明のＤＦＯ分子によって二重鎖形成された二重鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれの鎖は、標的核酸分子（例えば、標的ＲＮＡ）の同じヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列領域を含む可能性がある。
【０３１５】
１つの態様においては、本発明は、二重鎖オリゴヌクレオチドへと自己集合できる一本鎖のＤＦＯであることを特徴とする。出願人は意外にも、自己相補性のヌクレオチド領域を有する一本鎖オリゴヌクレオチドが容易に二重鎖オリゴヌクレオチド構造に自己集合できるということを見いだした。このようなＤＦＯは、配列特異的に遺伝子発現を阻害することができる二重鎖へと自己集合することができる。本発明のＤＦＯ分子は、第二領域のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を持つ第一領域を含み、その第一領域の配列は標的核酸（例えばＲＮＡ）に相補的である。ＤＦＯは、二重鎖オリゴヌクレオチドそれぞれの鎖の一部分が標的核酸配列に相補的な配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを形成することができる。
【０３１６】
１つの態様においては、本発明の二重鎖オリゴヌクレオチドは、二重鎖オリゴヌクレオチドの二本の鎖は互いに共有結合で結合されていない、また、二重鎖オリゴヌクレオチドのそれぞれの鎖は標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列と同一の配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでいるという点を特徴とする（ 例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。別の態様においては、二重鎖オリゴヌクレオチドの二本の鎖は少なくとも約１５、望ましくは約１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの同一のヌクレオチド配列を共有している。
【０３１７】
１つの態様においては、本発明のＤＦＯ分子は化学式ＤＦＯ−Ｉ：
【化９】
2007505606.tif 000009
の構造を有し、式中、Ｚは任意に１か所以上が修飾されていてもよいヌクレオチド（２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、またはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）を含んだ、例えば約２から２４ヌクレオチドの偶数の長さ（例えば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２または２４ヌクレオチド）のパリンドロームまたは反復核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を示し、Ｘ'は、Ｘかその一部に相補的なヌクレオチド配列を持つ約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは、末端リン酸基を含むが、これは存在していてもしていなくてもよく、式中の配列ＸおよびＺは、標的核酸配列またはその一部に相補的な核酸配列を単独または同時に含み、その長さは標的核酸配列またはその一部と相互作用するのに十分な長さ（例えば、塩基対）であり、例えば、Ｘは配列Ｘやその一部に相補的な、約１２から約２１以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）の長さのヌクレオチドを単独で含むことができる（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。限定を目的としない他の例では、ＸおよびＺのヌクレオチド配列の長さは共に、標的ＨＣＶ ＲＮＡ やその一部に相補的なＸが存在している場合には、約１２から２１、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）のヌクレオチドである。更に、限定を目的としない他の例では、Ｘが存在しない場合、標的ＲＮＡやその一部（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）に相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは約１２から約２４、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、またはそれ以上） のヌクレオチドである。更に別の限定を目的としない例では、Ｘが存在している場合、標的ＨＣＶＲＮＡまたはその一部と相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２４もしくはそれ以上のヌクレオチド（例、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、またはそれ以上）である。１つの態様においては、Ｘ、Ｚ、およびＸ'は、Ｘおよび／またはＺは、標的ＲＮＡやその一部のヌクレオチド配列と相互作用するのに十分な長さ（例えば、塩基対）のヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチドである（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ'の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸの長さは同一ではない。別の１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＺ、またはＺおよびＸ'、またはＸ、ＺおよびＸ'の長さは同一あるいは相違のどちらかである。
【０３１８】
ある配列が、本明細書中で他の配列と相互作用するのに「十分な」長さ、（ すなわち塩基対）と述べられている場合には、二つの配列間に形成される結合の数（例えば、水素結合）が二つの配列が相互作用させる条件かで二重鎖を形成することができる十分な長さを意味する。そのような条件は、インビトロ（例えば、診断やアッセイ目的）もしくはインビボ（治療上の目的）であり得る。そのような長さを決定するのは容易で日常的作業である。
【０３１９】
１つの態様においては、本発明は、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）：
【化１０】
2007505606.tif 000010
を有する二重鎖ヌクレオチド構造を特徴をとし、式中、Ｚは１か所以上の修飾されたヌクレオチド（２−アミノプリン、２−アミノ−１，６−ジヒドロプリン、またはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）を含んだ、例えば約２から２４ヌクレオチドの偶数の長さ（例えば、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、または２２または２４ヌクレオチド）のパリンドロームまたは反復配列様の核酸配列を含み、Ｘは、例えば約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を示し、Ｘ' は、Ｘかその一部に相補的なヌクレオチド配列を持つ約１から２１ヌクレオチドの間（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ｐは、末端リン酸基を含むが、これは存在していてもしていなくてもよく、式中の配列ＸおよびＺは、標的核酸配列またはその一部に相補的な核酸配列をそれぞれ単独で含み（ 例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）、その長さは標的核酸配列またはその一部と相互作用するのに十分な長さである（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。例えば、Ｘの配列は標的ＲＮＡやその一部に相補的な、約１２から約２１以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）の長さのヌクレオチドを単独で含むことができる（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。限定を目的としない他の例では、ＸおよびＺのヌクレオチド配列の長さは共に、（Ｘが存在している場合） 標的ＲＮＡやその一部に相補的な、約１２から２１、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上）のヌクレオチドである（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。更に、限定を目的としない他の例では、Ｘが存在しない場合、標的ＨＣＶＲＮＡ やその一部に相補的なＺのヌクレオチド配列の長さは約１２から約２４、もしくはそれ以上（例えば、約１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、またはそれ以上）のヌクレオチドである。１つの態様においては、Ｘ、Ｚ、およびＸ'は、Ｘおよび／またはＺは、標的ＲＮＡやその一部のヌクレオチド配列と相互作用するのに十分な長さ（例えば、塩基対）のヌクレオチド配列を含んでいるオリゴヌクレオチドである（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ'の長さは同一である。別の１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ' の長さは同一ではない。別の１つの態様においては、オリゴヌクレオチド、ＸおよびＺ、またはＺおよびＸ'、またはＸ、ＺおよびＸ'の長さは同一か相違のどちらかである。１つの態様においては、化学式Ｉ（ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチドの構造は、１つ以上、具体的には１、２、３、もしくは４のミスマッチを含み、このようなミスマッチの範囲が標的遺伝子の発現を阻害する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を減少させることはない。
【０３２０】
１つの態様においては、本発明のＤＦＯ分子は化学式ＤＦＯ−ＩＩ：
【化１１】
2007505606.tif 000011
の構造を有し、式中、ＸおよびＸ' は約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドをそれぞれ独立に含み、式中のＸは例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、Ｘ' は配列Ｘまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、ｐは、末端リン酸基を含むが、これは存在していてもしていなくてもよく、式中のＸは標的核酸配列（例えば、ＨＣＶＲＮＡ）もしくはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、その長さは標的核酸配列またはその一部と相互作用（例えば塩基対）するのに十分な長さである。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ' の長さは同一である。別の１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ' の長さは同一ではない。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ'の長さは、比較的安定な二重鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分な長さである。
【０３２１】
１つの態様においては、本発明は化学式ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）：
【化１２】
2007505606.tif 000012
を有する二重鎖オリゴヌクレオチド構造を特徴とし、 式中、ＸおよびＸ' は約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドをそれぞれ独立に含み、式中のＸは例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、Ｘ' は配列Ｘまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する例えば約１２ヌクレオチドから約２１ヌクレオチドの長さ（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドを含み、ｐは、末端リン酸基を含むが、これは存在していてもしていなくてもよく、式中のＸは標的核酸配列（例えばＲＮＡ）もしくはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）、その長さは標的核酸配列またはその一部と相互作用（ 例えば塩基対） するのに十分な長さである（例、ＨＣＶ ＲＮＡ標的）。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ'の長さは同一である。別の１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ' の長さは同一ではない。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ'の長さは、比較的安定な二重鎖オリゴヌクレオチドを形成するのに十分な長さである。１つの態様においては、化学式ＩＩ （ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチドの構造は、１つ以上、具体的には１、２、３、もしくは４のミスマッチを含み、このようなミスマッチの範囲が標的遺伝子の発現を阻害する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を減少させることはない。
【０３２２】
１つの態様においては、本発明は化学式ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）：
【化１３】
2007505606.tif 000013
を有するＤＦＯ分子を特徴とし、 式中、Ｚは、１か所かそれ以上の他のヌクレオチドと塩基対形成を容易にすることができる非標準の、もしくは修飾されたヌクレオチド（例、２−アミノプリンまたはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）を場合によって含んだ、パリンドロームもしくは反復核酸配列を含む。Ｚは、標的核酸（例えば、ＨＣＶＲＮＡ）分子のヌクレオチド配列と相互作用（例えば塩基対）するのに十分な長さ、望ましくは少なくとも１２ヌクレオチドの長さで、具体的には約１２から約２４ヌクレオチド（例えば約１２、１４、１６、１８、２０、２２もしくは２４ヌクレオチド）であることができる。ｐは末端リン酸基を表し、これは存在していてもしていなくてもよい。
【０３２３】
１つの態様においては、化学式ＤＦＯ−Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ）、ＤＦＯ−Ｉ（ｂ）、ＤＦＯ−ＩＩ（ａ）またはＤＦＯ−ＩＩのいずれかを含むＤＦＯ分子は、本明細書で述べられた、しかしこれに限定されない、例えば化学式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを含むヌクレオチドや、表ＩＶに述べられた安定化反応、もしくは本明細書で述べられた様々な態様のような他の修飾ヌクレオチドや非ヌクレオチドとのいずれかの組み合わせの化学修飾を含む。
【０３２４】
１つの態様においては、化学式ＤＦＯ −Ｉ、ＤＦＯ−Ｉ（ａ） およびＤＦＯ−Ｉ（ｂ）を有するＤＦＯ構造のＺのパリンドロームまたは反復配列または修飾されたヌクレオチド（２−アミノプリンまたはユニバーサル塩基といった修飾された塩基を含むヌクレオチド）は、標的核酸配列の一部分と相互作用できる化学修飾されたヌクレオチド（例えば、ワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基を形成することができる、修飾された塩基アナログ）を含む。
【０３２５】
１つの態様においては、例えば化学式ＤＦＯ−ＩまたはＤＦＯ −ＩＩを有するＤＦＯといった本発明のＤＦＯ分子は、約１５から約４０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド）を含む。１つの態様においては、本発明のＤＦＯ分子は１つ以上の化学修飾を含む。限定を目的としない例において、化学修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドの本発明の核酸への導入は、外因的に供給された修飾されていないＲＮＡ分子特有のインビボでの安定性と生物学的利用能の潜在的な限界を乗り越える強力なツールを提供する。例えば、化学修飾された核酸は血清中または細胞内または組織内でより長い半減期を持つ傾向にあるため、化学修飾された核酸分子の利用は特定の核酸分子の用量をより少なくすることができる。更に、特定の化学修飾は、半減期を改善するだけでなく核酸分子の特定の器官や細胞、組織へのターゲティングを容易にし、および／または核酸分子の細胞への取込みを改善することによって、生物学的利用能および／または核酸分子の作用強度を向上させる。従って、化学修飾された核酸分子の活性が、インビトロで野生型の／修飾されていない核酸分子との比較で、例えば修飾されていないＲＮＡと比較した場合に活性が減少したとしても、安定性と作用強度、効果持続期間、生物学的利用能、および／または分子の供給が改善されるために、修飾された核酸分子の全体的な活性は野生型または修飾されていない核酸分子より高い可能性がある。
【０３２６】
本発明の多機能または多標的のｓｉＮＡ分子
１つの態様においては、本発明は、細胞や組織、または生物体といった生体系のなかで、１つかそれ以上の遺伝子の発現を調節する多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ ）分子を含むことを特徴とする。本発明の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子は、ＨＣＶ、細胞／宿主標的核酸配列の２以上の領域を標的とすることができ、もしくは２以上の別々の標的核酸分子の配列を標的とすることができる（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡもしくは細胞／宿主ＲＮＡ標的）。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、化学的に合成するか、転写単位および／またはベクターから発現することができる。本発明の多機能ｓｉＮＡ 分子は、治療、診断、農業、畜産、標的の確認、ゲノム上の発見、遺伝子工学、および薬理ゲノミクス上の応用へとヒトへの様々な応用のための有用な試薬や方法を提供する。
【０３２７】
本明細書においては便宜上、多機能低分子干渉核酸分子または多機能ｓｉＮＡ分子と呼ぶが、これに限定されない特定のオリゴヌクレオチドが、遺伝子発現の配列特異的な調節の有力なメディエーターであることを、出願人は本明細書で示す。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、多機能ｓｉＮＡ構造のそれぞれの鎖が、１つ以上の標的核酸分子の異なる核酸配列に相補的な核酸配列を含むようにデザインされている点で、当該分野で知られている他の核酸配列（例えば、ｓｉＲＮＡ 、ｍｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど）とは異なる。本発明の単一の多機能ｓｉＮＡ分子（概して二重鎖分子）は、従って１つ以上（例えば２、３、４、５、もしくはそれ以上）の異なる標的核酸、標的分子を標的とすることができる。本発明の核酸分子は、同じ標的核酸配列の１つ以上（例えば、２、３、４、５、もしくはそれ以上）の領域を標的とすることもできる。このような本発明の多機能ｓｉＮＡ 分子は、１つ以上の標的核酸分子発現の下方調節や阻害に有用である。例えば、本発明の多機能ｓｉＮＡ 分子は、ウィルスおよびウィルスタンパク質、ウィルスの感染および／または複製に対応する細胞のタンパク質、もしくは異なる系統の特定のウィルスをコードする核酸分子を標的とすることができる（ 例、ＨＣＶ）。１つの多機能ｓｉＮＡ構造で１つ以上の標的核酸分子の発現を抑制または阻害することによって、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、ある疾患に関連した経路のうちの複数の標的の同時阻害を提供することができる一群の有効な治療薬となる。このような同時阻害は、個々の前臨床および臨床開発努力もしくは複雑な規制認可手続きの必要なしに、相乗的な治療上の処置戦略を提供することができる。
【０３２８】
標的核酸分子（例えば、メッセンジャーＲＮＡまたはＨＣＶ ＲＮＡ）の１つ以上の領域を標的とする多機能ｓｉＮＡ分子の利用は、遺伝子発現の有効な阻害を提供すると期待される。例えば、本発明の単一の多機能ｓｉＮＡ構造は、標的核酸分子（例、ＨＣＶ ＲＮＡ）の保存された領域と可変領域の双方を標的とすることができ、それによって単一遺伝子によってコードされた異種系統バリアントまたはウィルス、もしくはスプライスバリアントの下方調節や阻害を可能にし、もしくは宿主標的核酸分子のコード領域および非コード領域双方のターゲティングを可能にする。
【０３２９】
概して、二重鎖のオリゴヌクレオチドは、１つの鎖のオリゴヌクレオチド配列が２つ目の鎖のオリゴヌクレオチド配列と相補的である２つの異なるオリゴヌクレオチド配列の集合によって形成され、そのような二重鎖オリゴヌクレオチドは概して２つの分離したオリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ） が集合することによって形成される。代わりに、二重鎖はそれ自身が折り畳まる単一分子（例えば、ｓｈＲＮＡ 、または短鎖ヘアピンＲＮＡ）から形成されていてもよい。これらの二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を媒介し、二重鎖オリゴヌクレオチドのたった１か所のヌクレオチド配列領域（ガイド配列、もしくはアンチセンス配列）が標的核酸配列（例、ＨＣＶまたは宿主ＲＮＡ）に相補的であり、もう一方の鎖（センス配列）は標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいるという、いずれにも共通の特徴を持つということが当該分野で知られている。概して、アンチセンス配列は活性型のＲＩＳＣ複合体に保持され、配列特異的ＲＮＡ干渉の媒介のためにアンチセンス配列と標的配列の相補的な塩基対形成を用いて、ＲＩＳＣを標的ヌクレオチド配列へ導く。ある培養細胞系では、ある種の非修飾ｓｉＲＮＡは「オフターゲット」効果を示すということが当該分野で知られている。このオフターゲット効果は、ＲＩＳＣ 複合体中のｓｉＲＮＡのアンチセンス配列の代わりのセンス配列の関与に関係しているとの仮説が設けられている（例えば、シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ） 等、２００３年、セル誌（Ｃｅｌｌ）、１１５、１９９−２０８を参照）。この例では、センス配列はＲＩＳＣ複合体を、本来の標的配列とは異なる配列（ オフターゲット配列）へと導き、その結果オフターゲット配列の阻害が起ると考えられている。これらの二重鎖核酸分子では、それぞれの鎖は異なる標的核酸配列に相補的である。但し、これらのｄｓＲＮＡによって影響されるオフターゲットは完全には予測することができず、非特異的である。
【０３３０】
当該分野で知られる二重鎖核酸分子とは異なり、出願人は、単一の多機能ｓｉＮＡ構造を用いて１つ以上の標的核酸配列の発現を下方調節もしくは阻害する新規の、潜在的な費用効率が高い、簡便な方法を開発した。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、二重鎖または部分的に二重鎖になるようデザインされ、そのようなそれぞれの鎖の一部分、もしくは多機能ｓｉＮＡの領域は、選んだ標的核酸配列に相補的である。このように本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は互いに相補的な標的配列に限定されず、むしろあらゆる２つの異なる標的核酸配列である。本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、それぞれの鎖もしくは多機能ｓｉＮＡ分子の領域が標的核酸配列に相補的であり、標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介するのに適切な長さ（例えば、約１６から約２８ヌクレオチドの長さで、約１８から約２８ヌクレオチドの長さであると望ましい）であるようにデザインされている。標的核酸配列と、多機能ｓｉＮＡ の鎖もしくは領域の間の相補性は、ＲＡＮ干渉による標的核酸配列の切断に十分（少なくとも約８塩基対）でなければならない。本発明の多機能ｓｉＮＡは、前述のシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ） 等が述べたような、あるｓｉＲＮＡ 配列に見られるオフターゲット効果を最低限にすると期待される。
【０３３１】
２９塩基対と３６塩基対の間の長さのｄｓＲＮＡ（トゥーシュル（Ｔｕｓｃｈｌ ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許０２／４４３２１）はＲＮＡｉを媒介しないということが報告されてきた。 これらｄｓＲＮＡは非活性型である１つの理由は、ＲＩＳＣ複合体が効果的多コピーの標的ＲＮＡと相互作用できないように標的ＲＮＡ配列と相互作用し、その結果、効力とＲＮＡｉ過程の効率の著しい低下を招いている、鎖の代謝回転もしくは解離の欠如かもしれない。出願人は意外にも、本発明の多機能ｓｉＮＡはこの障害を乗り越え、ＲＮＡｉ過程の効率と効力を向上させることができる点を見いだした。上述のような本発明の態様においては、約２９から約３６塩基対の間の長さの多機能ｓｉＮＡは、多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖の一部がＲＮＡｉ を効果的に媒介するに十分な長さ（例えば約１５から約２３塩基）の標的核酸に相補的であるヌクレオチド配列領域と、標的核酸に相補的でないヌクレオチド配列領域を含むようにデザインすることができる。相補的な部分と非相補的な部分両方を多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖に持つことによって、多機能ｓｉＮＡは、阻害的な代謝回転もしくは解離（それぞれの鎖の長さがそれぞれの標的核酸配列に対するＲＮＡｉ を媒介するには長すぎる場合）なしに標的核酸配列に対してＲＮＡ干渉を媒介することができる。更に、本発明の内部重複配列を有する多機能ｓｉＮＡ分子のデザインは、多機能ｓｉＮＡ分子を、ＲＮＡ干渉のために好ましい（少ない）サイズにすることや、治療薬（例えば、それぞれの鎖が独立的に約１８から約２８ヌクレオチドの長さの場合）として利用するのに適切なサイズにすることができる。限定を目的としない例を、添付の図１６−２１、および４２にて説明する。
【０３３２】
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は第一の領域と第二の領域を含み、多機能ｓｉＮＡの第一の領域は第一の標的核酸分子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、多機能ｓｉＮＡの第二の領域は第二の標的核酸分子の核酸配列に相補的な核酸配列を含む。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は第一の領域と第二の領域を含み、多機能ｓｉＮＡの第一の領域は第一の標的核酸分子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、多機能ｓｉＮＡ の第二の領域は第二の標的核酸分子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の態様においては、多機能ｓｉＮＡの第一の領域と第二の領域は、相補性をある程度共有する別々の核酸配列を含むことができる（例えば、約１から１０の相補ヌクレオチド）。ある態様においては、多機能ｓｉＮＡ構造は、当該分野で知られている方法と試薬によって容易に合成後に結合される、別々の核酸配列を含むことができる。代わりに、多機能ｓｉＮＡ の第一の領域と第二の領域は、ヘアピンもしくはステムループ構造にあるような、ある程度の自己相補性をもつ単一の核酸配列を含むことができる。そのような二重鎖およびヘアピン様の多機能低分子干渉核酸の、限定を目的としない例を図１６および１７にてそれぞれ説明する。これらの多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は、特定の重複ヌクレオチド配列を含むことができ、そのような重複ヌクレオチド配列は多機能ｓｉＮＡの第一の領域と第二の領域の間に存在する（図１８および１９の例を参照）。
【０３３３】
１つの態様においては、本発明は多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子を特徴とし、多機能ｓｉＮＡ分子においては多機能ｓｉＮＡのそれぞれの鎖は独立に、異なる標的核酸配列に相補的な核酸配列の第一の領域と、標的配列に相補的でない第二のヌクレオチド配列を含む。それぞれの鎖の標的核酸配列は、同一の標的核酸分子、または異なる標的核酸分子にある。
【０３３４】
１つの態様においては、多機能ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで（ａ）第一の鎖は標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域１）と標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（非相補領域１）を含み、（ｂ） 第一の鎖のヌクレオチド配列に相補的な標的ヌクレオチド配列とは異なる標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域２）と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（非相補領域２）を含み、（ｃ） 第一の鎖の相補領域１は、２本目の鎖の非相補領域２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列と、１本目の鎖の非相補領域１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本目の鎖の相補領域２を含む。相補領域１および相補領域２の標的核酸配列は、同一の標的核酸分子、または異なる標的核酸分子の中にある。
【０３３５】
１つの態様においては、多機能ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで（ａ） 第一の鎖は、遺伝子（ 例えば、ＨＣＶまたは宿主遺伝子）に由来する標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域１）と標的ヌクレオチド配列に相補配列を持たない領域（非相補領域１）を含み、（ｂ） 多機能ｓｉＮＡの２本目の鎖は、相補領域１の遺伝子とは異なる遺伝子由来の標的核酸配列に相補的な配列を有する領域（相補領域２） と、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（ 非相補領域２）を含み、（ｃ） 第一の鎖の相補領域１は、２本目の鎖の非相補領域２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列と、１本目の鎖の非相補領域１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本目の鎖の相補領域２を含む。
【０３３６】
別の１つの態様においては、多機能ｓｉＮＡは２つの鎖を含み、ここで（ａ）第一の鎖は、遺伝子（例えば、ＨＣＶまたは宿主遺伝子）に由来する標的核酸配列に相補的な配列を持つ領域（相補領域１）と相補領域１の標的ヌクレオチド配列に相補配列を持たない領域（非相補領域１）を含み、（ｂ） 多機能ｓｉＮＡの２本目の鎖は、相補領域１の核酸配列とは異なる遺伝子由来の標的核酸配列に相補的な配列を有する領域（相補領域２）を含むが、もし相補領域１の標的核酸配列および相補領域２の標的核酸配列の双方が同じ遺伝子に由来する場合には、相補領域２の標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を持たない領域（非相補領域２）を含み、（ｃ） 第一の鎖の相補領域１は、２本目の鎖の非相補領域２のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列と、１本目の鎖の非相補領域１のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む２本目の鎖の相補領域２を含む。
【０３３７】
１つの態様においては、本発明は、多機能ｓｉＮＡが、第一の配列が標的核酸分子中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含んだ配列と、第二の配列が同一標的核酸分子中の別々のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含んだ配列の、２つの相補核酸配列を含む、多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）分子であることを特徴とする。第一の配列の第一領域は、第二配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的でもあり、第二の配列の第一領域は第一の配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的であることが望ましい。
【０３３８】
１つの態様においては、本発明は、多機能ｓｉＮＡが、第一の配列が第一の標的核酸分子中のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一の領域を含んだ配列と、第二の配列が第二の標的核酸分子中の別々のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含んだ配列の、２つの相補核酸配列を含む、多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ） 分子であることを特徴とする。第一の配列の第一領域は、第二配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的でもあり、第二の配列の第一領域は第一の配列の第二領域のヌクレオチド配列に相補的であることが望ましい。
【０３３９】
１つの態様においては、本発明は、第一領域および第二領域を含み、その第一領域は第一の標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含み、第二領域は別の第二の標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含む、多機能ｓｉＮＡ 分子であることを特徴とする。
【０３４０】
１つの態様においては、本発明は、第一領域および第二領域を含み、その第一領域は標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含み、第二領域は別の同一標的核酸分子中の核酸配列に相補的な約１８から約２８ヌクレオチドの間の核酸配列を含む、多機能ｓｉＮＡ 分子であることを特徴とする。
【０３４１】
１つの態様においては、本発明は、多機能ｓｉＮＡの１本の鎖が第一の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含み、２本目の鎖が第二の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する第一領域を含む、二重鎖の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ） 分子であることを特徴とする。第一および第二の標的核酸配列は同一標的核酸分子に存在するか、もしくは同一の標的核酸分子中の異なる領域であってもよい。上述のような本発明のｓｉＮＡ分子は異なる遺伝子の発現、同一遺伝子のスプライスバリアント、１つ以上の遺伝子転写物の変異領域と保存領域の両方、または同一遺伝子あるいは異なる遺伝子もしくは遺伝子転写物のコード配列と非コード配列の両方を標的として利用することができる。
【０３４２】
１つの態様においては、本発明の標的核酸分子は、単一のタンパク質をコードする。別の態様においては、標的核酸分子は２以上のタンパク質（例えば１、２、３、４、５もしくはそれ以上のタンパク質）をコードする。上述のような本発明の多機能ｓｉＮＡ構造はいくつかのタンパク質の発現を下方調節もしくは阻害するのに利用することができる。例えば、多機能ｓｉＮＡ 分子は、一本の鎖にウィルスゲノム（例えば、ＨＣＶ）に由来する第一の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、第二の鎖は二つのタンパク質をコードする遺伝子（ＨＣＶライフサイクルに含まれる２つの異なる宿主タンパク質）に由来する標的核酸分子中に存在する第二の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する領域を含み、特定の生物学的経路を、例えばウィルスゲノム（例えば、ＨＣＶ ＲＮＡ）、およびウィルス感染およびウィルスライフサイクル（例えば、Ｌａ抗原またはインターフェロン調節因子）に含まれる１つ以上の宿主ＲＮＡを標的にすることによって、下方調節、阻害もしくは遮断するのに利用することができる。
【０３４３】
限定を目的としない別の態様においては、多機能ｓｉＮＡ分子は、一本の鎖がウィルスもしくはウィルスタンパク質（例えばＨＩＶ ）をコードする標的核酸分子に由来する第一の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有し、第二の鎖が細胞のタンパク質（例えばＨＩＶのＣＣＲ５受容体のようなウィルス受容体）をコードする標的核酸分子中に存在する第二の標的核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を有する領域を含み、ウィルスやウィルスの感染もしくは複製に必要な細胞タンパク質を標的とすることによって、ウィルスの複製と感染を下方調節、阻害、もしくは遮断するために利用することができる。
【０３４４】
限定を目的としない別の態様においては、多機能ｓｉＮＡ分子は、１本の鎖がウィルスゲノム（例えば、ＨＩＶＲＮＡ）のような標的核酸分子内に存在する第一の標的核酸配列（例えば保存配列）に相補的なヌクレオチド配列を有し、第二の鎖がウィルスタンパク質（例えば、ＨＣＶタンパク質）に由来する標的核酸分子内に存在する第二の標的核酸配列（例えば保存配列）に相補的なヌクレオチド配列を有する領域を含み、ウィルスやウィルスの感染もしくは複製に必要な細胞タンパク質を標的とすることによって、ウィルスの複製と感染を下方調節、阻害、もしくは遮断するために利用することができる。
【０３４５】
１つの態様においては、本発明は、ウィルスの異なる系統、アイソタイプ、もしくは型、およびこれらのウィルスの異なる系統、アイソタイプ、もしくは型によってコードされる遺伝子に存在する、保存されたヌクレオチド配列を活用している（ 例、ＨＣＶ）。１本の鎖がウィルスの様々な系統、アイソタイプ、もしくは型の間で保存されている標的核酸配列に相補的である配列を含み、もう一方の鎖がウィルスによってコードされているタンパク質の間で保存されている標的核酸配列に相補的である配列を含むという具合に多機能ｓｉＮＡをデザインすることによって、単一の多機能ｓｉＮＡを用いて、選択的また効果的にウィルスの複製もしくは感染を阻害することが可能である。
【０３４６】
１つの態様においては、本発明の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は第一領域と第二領域を含み、第一領域は第一のウィルス系統のＨＣＶウィルスＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含み、第二領域は第二のウィルス系統のＨＣＶウィルスＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては、第一および第二領域は異なるウィルス系統もしくは分類、もしくはウィルス系統の共通または保存されたＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
【０３４７】
１つの態様においては、本発明の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は第一領域と第二領域を含み、第一領域は、１つ以上のＨＣＶウィルス（例えば１つ以上のＨＣＶの系統）をコードするＨＣＶウィルスＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含み、第二領域は１つ以上のインターフェロンアゴニストタンパク質をコードするウィルスＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。１つの態様においては、第一領域は異なるＨＣＶウィルス系統もしくは分類、もしくはＨＣＶウィルス系統の共通または保存されたＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。限定を目的としないインターフェロンアゴニストタンパク質の例は、ＲＮＡ サイレンシングを阻害もしくは抑制ができるいずれのタンパク質を含む（例えばＥ３ＬまたはＮＳ１のようなＲＮＡ 結合タンパク質かそれに同等なもの、例としてリー（Ｌｉ） 等、２００４年、米国サイエンスアカデミー会報（ＰＮＡＳ）、１０１、１３５０−１３５５を参照）。
【０３４８】
１つの態様においては、本発明の多機能低分子干渉核酸（多機能ｓｉＮＡ）は第一領域と第二領域を含み、第一領域はＨＣＶウィルスＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含み、第二領域はＨＣＶウィルスの感染および／または複製に関わる細胞ＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含む。限定を目的としないウィルスの感染および／または複製に関わる細胞ＲＮＡの例は、細胞性受容体、細胞性表面分子、細胞性酵素、細胞性転写因子および／ または細胞分裂、二次メッセンジャー、および細胞性アクセサリー分子を含み、細胞性アクセサリー分子は、Ｌａ抗原、ＦＡＳ、インターフェロンアゴニストタンパク質（例えばＥ３ＬまたはＮＳ１のようなＲＮＡ結合タンパク質かそれに同等なもので、例としてリー（Ｌｉ） 等、２００４年、米国サイエンスアカデミー会報（ＰＮＡＳ）、１０１、１３５０−１３５５を参照）、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）、細胞性ＰＫＲタンパク質キナーゼ（ＰＫＲ）、ヒトの真核型転写開始因子２Ｂ （ｅｌＦ２Ｂガンマおよび／またはｅｌＦ２ガンマ）、ヒトＤＥＡＤボックスタンパク質（ＤＤＸ３）、ポリピリミジン・トラクト結合タンパク質のようなＨＶＣの３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ） トラクトに結合する細胞性タンパク質を含むがこれらに限定されないとする。
【０３４９】
１つの態様においては、本発明の二重鎖多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−Ｉ：
【化１４】
2007505606.tif 000014
の構造を含み、式中、５'−ｐ−ＸＺＸ'−３' および５'−ｐ−ＹＺＹ'−３' はそれぞれ、独立に約２０ヌクレオチドと約３００ヌクレオチド、望ましくは約２０と約２００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチド、約２０と約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約４０ヌクレオチド、約２４と約３８ヌクレオチド、もしくは約２６と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸＺは第一のＨＣＶ標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、ＹＺは第二のＨＣＶ標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、Ｚは自己相補的な約１から２４ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、もしくは２４ヌクレオチド）の長さの核酸配列を含み、ＸはＹ' 内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、ＹはＸ'内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、それぞれのｐは、独立に存在しているか欠損しているそれぞれ末端リン酸基を含み、ＸＺおよびＹＺはそれぞれ、独立に第一および第二の標的核酸配列もしくはその一部と安定に相互作用（すなわち塩基対）するのにそれぞれ十分な長さがある。例えば、ＸおよびＹはそれぞれ、標的ＲＮＡもしくはその一部のような、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的な、約１２から２１もしくはそれ以上の長さのヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）の配列を独立に含む。限定を目的としない別の態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列もしくはその一部に相補的なＸおよびＺを合わせたヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１ヌクレオチドもしくはそれ以上（約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）である。限定を目的としない別の態様においては、第二のＨＣＶ標的核酸配列もしくはその一部に相補的なＹおよびＺを合わせたのヌクレオチド配列の長さは、約１２から約２１ヌクレオチドもしくはそれ以上（約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）である。１つの態様においては、第一のＨＣＶ 標的核酸配列および第二のＨＣＶ標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡ または宿主ＲＮＡ）。別の態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列および第二のＨＣＶ標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（ 例、ＨＣＶ ＲＮＡおよび宿主ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｚ はパリンドロームもしくは反復配列を含む。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ'の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ' の長さは同一ではない。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ' の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ'の長さは同一ではない。１つの態様においては、化学式Ｉ（ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチド構造は、標的遺伝子の発現を阻害する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を著しく損なわない程度で、１つ以上の、具体的には１、２、３、もしくは４つのミスマッチを含む。
【０３５０】
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−ＩＩ：
【化１５】
2007505606.tif 000015
の構造を含み、式中、５'−ｐ−ＸＸ'−３' および５'−ｐ−ＹＹ'−３' はそれぞれ、独立に約２０ヌクレオチドと約３００ヌクレオチド、望ましくは約２０と約２００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチド、約２０と約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチドと約４０ヌクレオチド、約２４と約３８ヌクレオチド、もしくは約２６と約３８ヌクレオチドの間の長さのオリゴヌクレオチドであり、Ｘは第一の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、Ｙは第二の標的核酸配列に相補的な核酸配列を含み、ＸはＹ'内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、ＹはＸ'内に存在するヌクレオチド配列に相補的な約１から約１００ヌクレオチド、望ましくは約１から約２１ヌクレオチド（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド）の長さのヌクレオチド配列を含み、それぞれのｐは、独立に存在していたり欠損しているそれぞれ末端リン酸基を含み、ＸおよびＹはそれぞれ、独立に第一および第二の標的核酸配列もしくはその一部と安定に相互作用（すなわち塩基対）するのにそれぞれ十分な長さがある。例えば、ＸおよびＹはそれぞれ、ＨＣＶ標的ＲＮＡもしくはその一部のような、異なる標的核酸分子中の標的ヌクレオチド配列に相補的な、約１２から２１もしくはそれ以上の長さのヌクレオチド（例えば、約１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１もしくはそれ以上）の配列を独立に含む。１つの態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列および第二のＨＣＶ標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（ 例、ＨＣＶ ＲＮＡまたは宿主ＲＮＡ）。別の態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列および第二のＨＣＶ標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡ および宿主ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｚはパリンドロームもしくは反復配列を含む。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ' の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＸおよびＸ'の長さは同一ではない。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ' の長さは同一である。別の態様においては、オリゴヌクレオチドＹおよびＹ'の長さは同一ではない。１つの態様においては、化学式Ｉ（ａ）の二重鎖オリゴヌクレオチド構造は、標的遺伝子の発現を阻害する二重鎖オリゴヌクレオチドの効力を著しく損なわない程度で、１つ以上の、具体的には１、２、３、もしくは４つのミスマッチを含む。
【０３５１】
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−ＩＩＩ：
【化１６】
2007505606.tif 000016
の構造を含み、式中、Ｘ 、Ｘ'、ＹおよびＹ' は、独立に、約１５ヌクレオチドと約５０ヌクレオチド、望ましくは約１８から約４０ヌクレオチド、もしくは約１９および約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸはＹ'領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ' はＹ領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＸとＸ' はそれぞれ、独立にそれぞれ第一および第二のＨＣＶ標的核酸配列、もしくはその一部と安定な相互作用（すなわち塩基対） するのに十分な長さであり、Ｗは、Ｙ'配列とＹ配列を結合するヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを指し、多機能ｓｉＮＡ はＲＮＡ干渉による第一と第二のＨＣＶ標的配列の切断を指示する。別の態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列および第二のＨＣＶ 標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡまたは宿主ＲＮＡ）。別の態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列および第二のＨＣＶ標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡおよび宿主ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ'配列の３' 端をＹ配列の３'端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ' 配列の３' 端をＹ配列の５' 端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ'配列の５'端をＹ配列の５'端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ'配列の５' 端をＹ配列の３' 端と結合する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ配列の５' 端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ配列の５'端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ' 配列の５' 端に存在する。１つの態様においては、ＷはＹ配列とＹ'配列を、生分解性リンカーを介して結合する。１つの態様においては、Ｗはコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、もしくはポリマーをさらに含む。
【０３５２】
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−ＩＶ：
【化１７】
2007505606.tif 000017
の構造を含み、式中、Ｘ 、Ｘ'、ＹおよびＹ' は、独立に、約１５ヌクレオチドと約５０ヌクレオチド、望ましくは約１８から約４０ヌクレオチド、もしくは約１９および約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸはＹ'領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ' はＹ領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、ＹとＹ' はそれぞれ、独立にそれぞれ第一および第二のＨＣＶ標的核酸配列、もしくはその一部と安定な相互作用（すなわち塩基対） するのに十分な長さであり、Ｗは、Ｙ'配列とＹ配列を結合するヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを指し、多機能ｓｉＮＡ はＲＮＡ干渉による第一と第二のＨＣＶ標的配列の切断を指示する。別の態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列および第二のＨＣＶ 標的核酸配列は、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡまたは宿主ＲＮＡ）。別の態様においては、第一のＨＣＶ標的核酸配列および第二のＨＣＶ標的核酸配列は、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡおよび宿主ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ'配列の３' 端をＹ配列の３'端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ' 配列の３' 端をＹ配列の５' 端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ'配列の５'端をＹ配列の５'端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ'配列の５' 端をＹ配列の３' 端と結合する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ配列の５' 端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ' 配列の５'端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ配列の５' 端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ'配列の５'端に存在する。１つの態様においては、ＷはＹ配列とＹ'配列を、生分解性リンカーを介して結合する。１つの態様においては、Ｗはコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、もしくはポリマーをさらにに含む。
【０３５３】
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は化学式ＭＦ−Ｖ：
【化１８】
2007505606.tif 000018
の構造を含み、式中、Ｘ、Ｘ、ＹおよびＹ 'は、独立に、約１５ヌクレオチドと約５０ヌクレオチド、のぞましくは約１８から約４０ヌクレオチド、もしくは約１９および約２３ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり、ＸはＹ' 領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ' はＹ領域内に存在するヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、Ｘ、Ｘ'、Ｙ またはＹ' はそれぞれ、独立にそれぞれ第一、第二、第三、または第四のＨＣＶ標的核酸配列、もしくはその一部と安定な相互作用（すなわち塩基対）するのに十分な長さであり、Ｗは、Ｙ' 配列とＹ配列を結合するヌクレオチドリンカーまたは非ヌクレオチドリンカーを指し、多機能ｓｉＮＡはＲＮＡ干渉による第一、第二、第三および／または第四のＨＣＶ標的配列の切断を指示する。１つの態様においては、第一、第二、第三および第四のＨＣＶ標的核酸配列はすべて、同一標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡ または宿主ＲＮＡ）。別の態様においては、第一、第二、第三および第四のＨＣＶ標的核酸配列はそれぞれ、別の標的核酸分子中に存在する（例、ＨＣＶ ＲＮＡおよび宿主ＲＮＡ）。１つの態様においては、Ｗ 領域はＹ'配列の３' 端をＹ配列の３' 端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ'配列の３'端をＹ配列の５'端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ' 配列の５'端をＹ配列の５' 端と結合する。１つの態様においては、Ｗ領域はＹ' 配列の５'端をＹ配列の３' 端と結合する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ配列の５' 端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＸ' 配列の５' 端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ配列の５' 端に存在する。１つの態様においては、末端リン酸基はＹ' 配列の５'端に存在する。１つの態様においては、ＷはＹ配列とＹ' 配列を、生分解性リンカーを介して結合する。１つの態様においては、Ｗはコンジュゲート、ラベル、アプタマー、リガンド、脂質、もしくはポリマーを更に含む。
【０３５４】
１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の（ 例えば、化学式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖを有する）Ｘ領域とＹ領域は、同一標的核酸分子の一部分である別の標的核酸配列に相補的である。１つの態様においては、前述の標的核酸配列は、ＲＮＡ転写物のコード領域内の異なる位置にある。１つの態様においては、前述の標的核酸配列は同一ＲＮＡ転写物のコード領域と非コード領域を含む。１つの態様においては、前述の標的核酸配列は選択的スプライシングを受けた転写物の領域、もしくはそのような選択的スプライシングを受けた転写物の前駆体の領域を含む。
【０３５５】
１つの態様においては、化学式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖのいずれかを有する多機能ｓｉＮＡ分子は、本明細書で限定を目的とせずに述べられるように、例えば、本明細書で述べられたような化学式Ｉ〜ＶＩＩのいずれかを有するヌクレオチド、表ＩＶで述べられるような安定化反応、もしくは本明細書の様々な態様で述べられたような修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドのその他の組み合わせのような化学修飾を含むことができる。
【０３５６】
１つの態様においては、多機能ｓｉＮＡ構造のＺ中のパリンドロームもしくは反復配列もしくは修飾ヌクレオチド（例えば、２−アミノプリンやユニバーサル塩基のような修飾塩基をもつヌクレオチド）は、標的核酸配列（例えば、ワトソンクリック塩基対もしくは非ワトソンクリック塩基対を形成することができる修飾塩基アナログ）の一部と相互作用することができる化学修飾ヌクレオチドを含む化学式ＭＦ−ＩまたはＭＦ−ＩＩを有する。
【０３５７】
１つの態様においては、例えば多機能ｓｉＮＡ分子のそれぞれの鎖に化学式ＭＦ−Ｉ〜ＭＦ−Ｖ を有する本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は、単独で約１５から約４０ヌクレオチド（例えば、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド）を含む。１つの態様においては、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子は１つ以上の化学修飾を含む。限定を目的としない例において、化学修飾されたヌクレオチドおよび／または非ヌクレオチドの本発明の核酸への導入は、外因的に供給された修飾されていないＲＮＡ分子特有のインビボでの安定性と生物学的利用能の潜在的な限界を乗り越える強力なツールを提供する。例えば、化学修飾された核酸は血清中または細胞内または組織内でより長い半減期を持つ傾向にあるため、化学修飾された核酸分子の利用は特定の核酸分子の用量をより少なくすることができる。更に、特定の化学修飾は、半減期を改善するだけでなく核酸分子の特定の器官や細胞、組織へのターゲティングを容易にし、および／または核酸分子の細胞への取込みを改善することによって、生物学的利用能および／または核酸分子の作用強度を向上させる。従って、化学修飾された核酸分子の活性が、インビトロで野生型の／修飾されていない核酸分子との比較で、例えば修飾されていないＲＮＡと比較した場合に活性が減少したとしても、安定性と作用強度、効果持続期間、生物学的利用能、および／または分子の供給が改善されるために、修飾された核酸分子の全体的な活性は野生型または修飾されていない核酸分子より高い可能性がある。
【０３５８】
また別の態様においては、本発明は、２つのアンチセンスｓｉＮＡ 鎖が、互いに一方の端でつなぎ止められた相当するセンス鎖にアニールされるように、それぞれのセンス鎖の一方の端がもう一方のｓｉＮＡ分子のセンス鎖端とつなぎ止められている、２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡ であることを特徴とする（図４２参照）。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０３５９】
１つの態様においては、本発明は、２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５' 端が互いに逆を指して（反対方向で）互いに一方の端でつなぎ止められた（図４２参照）対応するセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の５'端に他のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５'端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡ が集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０３６０】
１つの態様においては、本発明は、２つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５' 端が互いに向き合って互いに一方の端でつなぎ止められた（図４２（Ｂ）参照）対応するセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の３'端に他のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５' 端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０３６１】
１つの態様においては、本発明は、一方のアンチセンスｓｉＮＡ鎖の５' 端が他方のアンチセンス鎖の３' 端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４２２（Ｃ −Ｄ）参照）対応するセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のセンス鎖の３'端に他のｓｉＮＡ分子のセンス鎖の５'端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０３６２】
１つの態様においては、本発明は、一方のセンスｓｉＮＡ鎖の５' 端が他方のアンチセンス鎖の３'端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４２（Ｇ −Ｈ）参照）対応するアンチセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の３'端に他のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５'端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。１つの態様においては、第一のアンチセンス鎖の５'端と第二のアンチセンス鎖の３'端の間の結合は、多機能ｓｉＮＡのそれぞれのアンチセンス鎖の５' 端が標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉による切断を媒介するのに適した遊離の５' 端を持つよう、容易に切断されるような方法（例えば、生分解性リンカー）でデザインされている。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０３６３】
１つの態様においては、本発明は、一方のセンスｓｉＮＡ鎖の３' 端が他方のアンチセンス鎖の３'端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４２（Ｅ ）参照）対応するアンチセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の５'端に他のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の５' 端がつなぎ止められている２つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。１つの態様においては、第一のアンチセンス鎖の５' 端と第二のアンチセンス鎖の５' 端の間の結合は、多機能ｓｉＮＡのそれぞれのアンチセンス鎖の５端が標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉による切断を媒介するのに適した遊離の５'端を持つよう、容易に切断されるような方法（例えば、生分解性リンカー）でデザインされている。テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０３６４】
１つの態様においては、本発明は、一方のセンスｓｉＮＡ鎖の５' 端が他方のアンチセンス鎖の３'端に向き合うよう互いに一方の端でつなぎ止められた（図４２（Ｆ ）参照）対応するアンチセンス鎖にアニールされるように、ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖の３'端に他のｓｉＮＡ分子のアンチセンス鎖の３' 端がつなぎ止められている二つの別々の二重鎖ｓｉＮＡが集合した多機能ｓｉＮＡであることを特徴とする。１つの態様においては、第一のアンチセンス鎖の５' 端と第二のアンチセンス鎖の５' 端の間の結合は、多機能ｓｉＮＡのそれぞれのアンチセンス鎖の５' 端が標的ＲＮＡのＲＮＡ干渉による切断を媒介するのに適した遊離の５'端を持つよう、容易に切断されるような方法（例えば、生分解性リンカー）でデザインされている。本明細書で述べられたように、テザーまたはリンカーは、当該分野で一般的に知られているように、また本明細書で述べられているように、ヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。
【０３６５】
上記態様のいずれにおいても、第一標的核酸配列または第二標的核酸配列はそれぞれ、ＨＣＶ ＲＮＡまたはその一部あるいはＨＣＶ感染または複製に含まれる細胞または宿主標的のポリヌクレオチドコードまたは非コード配列、または細胞受容体、細胞表面分子、細胞性酵素、細胞転写因子、および／またはサイトカイン、二次メッセンジャー、および細胞性アクセサリー分子等ＨＣＶ感染と関連した疾病過程を含み、細胞性アクセサリー分子は、Ｌａ抗原（例えばコスタ−マッティオーリ（Ｃｏｓｔａ−Ｍａｔｔｉｏｌｉ）等、２００４年、分子細胞生物学誌（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２４、６８６１−７０、例としてジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００３１４２を参照）；ＦＡＳ （例としてジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿００００４３）またはＦＡＳリガンド（例としてジンバンクアクセッション番号ＮＭ＿０００６３９）； インターフェロン調節因子（ＩＲＦ； 例としてジンバンクアクセッション番号ＡＦ０８２５０３．１）； 細胞性ＰＫＲタンパク質キナーゼ（ 例としてジンバンクアクセッション番号Ｎｏ．ＸＭ＿００２６６１．７）； ヒトの真核型転写開始因子２Ｂ（ｅｌＦ２Ｂガンマ； 例としてジンバンクアクセッション番号ＡＦ２５６２２３， および／またはｅｌＦ２ガンマ；例としてジンバンクアクセッション番号Ｎｏ．ＮＭ＿００６８７４．１）； ヒトＤＥＡＤボックスタンパク質（ＤＤＸ３； 例としてジンバンクアクセッション番号ＸＭ＿０１８０２１．２）； およびポリピリミジン・トラクト結合タンパク質のようなＨＶＣの３’−ＵＴＲのポリ（Ｕ）トラクトに結合する細胞性タンパク質（例としてジンアクセッション番号０３１９９１．１およびＸＭ＿０４２９７２．３）を含むがこれらに限定されないとする。１つの態様においては、第一ＨＣＶ標的核酸配列は、ＨＣＶ ＲＮＡまたはその一部であり、第二ＨＣＶ標的核酸配列は、ＨＣＶ ＲＮＡの一部である。１つの態様においては、第一ＨＣＶ 標的核酸配列は、ＨＣＶ ＲＮＡ またはその一部であり、第二ＨＣＶ標的核酸配列は、宿主ＲＮＡもしくはその一部である。１つの態様においては、第一ＨＣＶ標的核酸配列は、宿主ＲＮＡまたはその一部であり、第二ＨＣＶ標的核酸配列は、宿主ＲＮＡもしくはその一部である。１つの態様においては、第一ＨＣＶ標的核酸配列は、宿主ＲＮＡまたはその一部であり、第二ＨＣＶ標的核酸配列は、ＨＣＶ ＲＮＡもしくはその一部である。
【０３６６】
核酸分子の合成
１００ヌクレオチド以上の長さの核酸の合成は、自動化された方法では困難であり、そのような分子による治療コストは非常に高額である。本発明では低分子核酸モチーフ（「低分子」とは、１００ヌクレオチド長を越えない核酸モチーフを指し、望ましくは８０ヌクレオチドを越えない長さであり、最も望ましくは５０ヌクレオチドを越えない長さである。例えば、個別のｓｉＮＡオリゴヌクレオチド配列もしくはタンデムに合成されたｓｉＮＡ配列）は、外因的な供給として用いられるのが望ましい。これらの分子の単純な構造は、標的のタンパク質領域および／またＲＮＡ構造に核酸が侵入する能力を上昇させる。典型的な本発明の分子は化学的に合成され、その他は同様にして合成される。
【０３６７】
オリゴヌクレオチド（例、特定の修飾を受けたオリゴヌクレオチド、またはリボヌクレオチドが欠けているオリゴヌクレオチドの部分）は、例えばカラザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ）等、１９９２、酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２１１、３−１９、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９９／５４４５９、ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９５、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３、２６７７−２６８４、ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔ）等、１９９７、分子生物学手法誌（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ、７４、５９、ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）等、１９９８、バイオテクノロジーとバイオ工学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ）６１、３３−４５、およびブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ、米国特許番号６，００１，３１１に述べられているような当該分野で知られているプロトコールを用いて合成された。これら全ての参考文献は、参照することで本明細書に組み込まれる。オリゴヌクレオチドの合成は、５'端のジメトキシトリチルや３'端のホスホラミダイトのような、一般的な核酸保護基とカップリング基を利用する。限定を目的としない例において、小規模合成は３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）核酸合成装置で、２'−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのカップリングステップは２．５分、２'−デオキシヌクレオチドもしくは２'−デオキシ−２−フルオロヌクレオチドのカップリングステップは４５秒の０．２μｍｏｌスケールのプロトコールを用いて行われた。表Ｖは、合成サイクルで用いられた試薬の量と接触回数をまとめている。また、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、プロトジーン社（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ））製造の装置のような９６穴プレート核酸合成装置でサイクルへの最低限の修正で行うことができる。３３倍過剰（６０μＬ中に０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ）の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト、および１０５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬ中に０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ）は、ポリマー結合５'−ヒドロキシルに関連した２’−Ｏ−メチル残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用されることができる。２２倍過剰（４０μＬ中に０．１１Ｍ＝４．４μｍｏｌ）のデオキシホスホラミダイト、および７０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（４０μＬ中に０．２５Ｍ＝１０μｍｏｌ）は、ポリマー結合５'−ヒドロキシルに関連したデオキシ残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用されることができる。３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）核酸合成装置の比色定量法で測定したトリチル分画のカップリングの平均収量は、通常９７．５−９９％である。その他の３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）核酸合成装置のオリゴヌクレオチド合成試薬は、塩化メチレン中に３％ＴＣＡのデトリチル化溶液（ＡＢＩ、キャップ形成はＴＨＦ中に１６％のＮ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ）およびＴＨＦ 中に１０％無水酢酸／１０％の２、６−���チジンで行い、酸化溶液はＴＨＦ中に１６．９ｍＭＩ２、４９ｍＭピリジン、９％の水（パーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．を含む。バーディック＆ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ）の合成グレードのアセトニトリルは、試薬瓶から直接使用した。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中に０．２５Ｍ）は、アメリカ・インターナショナル・ケミカル社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ）より入手した個体から調製した。また、ホスホロチオエート結合の導入には、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬（アセトニトリル中に０．０５Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド）が用いられた。
【０３６８】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドの脱保護は、以下の通り行われた。ポリマー結合のトリチル付きオリゴリボヌクレオチドは４ｍＬのガラスキャップ付きのバイアルに移され、６５℃で１０分間、４０％ メチルアミン水（１ｍＬ）に懸濁された。−２０℃に冷却後、ポリマー担体から上澄が除かれた。担体は１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄され、激しく撹拌され、その後上澄は最初の上澄みに加えられた。オリゴリボヌクレオチドを含む、合わせた上澄は、白色粉末になるまで乾燥された。
【０３６９】
本発明の特定のｓｉＮＡ分子を含むＲＮＡの合成に用いられた方法は、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） 等、１９８７、米国化学学会誌（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．）１０９、７８４５、スケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ） 等、１９９０、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８、５４３３、およびウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９５、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２３−２６７７−２６８４、ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ） 等、１９９７、分子生物学手法誌（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．）７４、５９で述べられた方法に従っており、また、５' 端ではジメトキシトリチル、また３' 端ではホスホラミダイトといった、一般的な核酸の保護基およびカップリング基を用いた。限定を目的としない例において、小規模合成は３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．） 核酸合成装置で、アルキルシリル保護されたヌクレオチドのカップリングステップは７．５分、２'−Ｏ−メチル化ヌクレオチドのカップリングステップは２．５分で０．２μｍｏｌスケールのプロトコールを用いて行われた。表Ｖは、合成サイクルで用いられた試薬の量と接触回数をまとめている。また、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、プロトジーン社（Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ）（カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ））製造の装置のような９６穴プレート核酸合成装置でサイクルへの最低限の修正で行うことができる。３３倍過剰（６０μＬ中に０．１１Ｍ＝６．６μｍｏｌ） の２’−Ｏ−メチルホスホラミダイト、および７５倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（６０μＬ中に０．２５Ｍ＝１５μｍｏｌ） は、ポリマー結合５'−ヒドロキシルに関連した２’−Ｏ−メチル残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用することができる。６６倍過剰（１２０μＬ中に０．１１Ｍ＝１３．２μｍｏｌ） のアルキルシリル（リボ）保護されたホスホラミダイト、および１５０倍過剰のＳ−エチルテトラゾール（１２０μＬ 中に０．２５Ｍ＝３０μｍｏｌ） は、ポリマー結合５'−ヒドロキシルに関連したリボ残基のそれぞれのカップリングサイクルに使用することができる。３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．） 核酸合成装置の比色定量法で測定したトリチル分画のカップリングの平均収量は、通常９７．５−９９％である。その他の３９４アプライドバイオシステムズ社（３９４Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．） 核酸合成装置のオリゴヌクレオチド合成試薬は、塩化メチレン中に３％ＴＣＡのデトリチル化溶液（ＡＢＩ）、キャップ形成はＴＨＦ中に１６％Ｎ−メチルイミダゾール（ＡＢＩ） およびＴＨＦ 中に１０％無水酢酸／１０％２、６−ルチジンで行い、酸化溶液はＴＨＦ中に１６．９ｍＭ Ｉ２、４９ｍＭ ピリジン、９％の水（パーセプティブバイオシステムズ社（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）を含む。バーディック＆ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ ＆ Ｊａｃｋｓｏｎ） の合成グレードのアセトニトリルは、試薬瓶から直接使用した。Ｓ−エチルテトラゾール溶液（アセトニトリル中に０．２５Ｍ）は、アメリ��・インターナショナル・ケミカル社（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｉｎｃ．） より入手した個体から調製した。また、ホスホロチオエート結合の導入には、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ） 試薬（アセトニトリル中に０．０５Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド）が用いられた。
【０３７０】
ＲＮＡの脱保護は、ツーポットまたはワンポットプロトコールのいずれかを用いて行われた。ツーポットプロトコールでは、ポリマー結合のトリチル付きオリゴリボヌクレオチドが４ｍＬ のガラスねじ蓋付きのバイアルに移され、６５℃ で１０分間、４０％メチルアミン水（１ｍＬ）に懸濁された。−２０℃に冷却後、ポリマー担体から上澄が除かれた。担体は１．０ｍＬのＥｔＯＨ：ＭｅＣＮ：Ｈ２Ｏ／３：１：１で３回洗浄され、激しく撹拌され、その後上澄は最初の上澄みに加えられた。オリゴリボヌクレオチドを含む、合わせた上澄は、白色粉末になるまで乾燥された。塩基が脱保護されたオリゴリボヌクレオチドは、無水ＴＥＡ／ＨＦ／ＮＭＰ溶液（ ＨＦが１．４Ｍの濃度になるように、Ｎ−メチルピロリジノン溶液を１．５ｍＬ、ＴＥＡを７５０μＬ、ＴＥＡ・３ＨＦ を１ｍＬを混合した溶液を３００μＬ） に再度懸濁され、６５℃に加熱された。１．５時間後、オリゴマーは１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３でクェンチされた。
【０３７１】
または、ワンポットプロトコールでは、ポリマー結合のトリチル付きオリゴリボヌクレオチドは４ｍＬのガラスねじ蓋付きのバイアルに移され、６５℃ で１５分間、３３％のエタノール性メチルアミン／ＤＭＳＯ：１／１（０．８ｍＬ） 溶液に懸濁される。バイアルを室温にし、ＴＥＡ・３ＨＦ（０．１ｍＬ）が加えられ、バイアルは６５℃ で１５分間加熱された。試料は−２０℃ に冷却され、その後１．５Ｍ ＮＨ４ＨＣＯ３でクェンチされた。
【０３７２】
トリチル付きオリゴマーの精製には、クェンチされたＮＨ４ＨＣＯ３溶液がアセトニトリルで予備洗浄されたＣ−１８を含むカートリッジにロードされ、その後５０ｍＭ ＴＥＡＡが加えられた。ロードされたカートリッジを水で洗浄した後、ＲＮＡは０．５％ＴＦＡで１３分間、脱トリチル化された。カートリッジは次いで水で再び洗浄され、１Ｍ ＮａＣｌで塩が交換され、再び水で洗浄された。オリゴヌクレオチドは次に３０％アセトニトリルで溶出された。
【０３７３】
段階的なカップリングの平均収量は、一般的に＞９８％である（ウィコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ）等、１９９５、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２３、２６７７−２６８４）。当該分野で通常の技術を有する者は、合成の規模が、上述の態様に含むがしかし９６穴フォーマットに限定されない、より大規模もしくは小規模へと適応させることが可能であることを認識する。
【０３７４】
あるいは、本発明の核酸分子は別々に合成し、例えば、ライゲーション（ムーア（Ｍｏｏｒｅ） 等、１９９２、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５６、９９２３、ドレーパー（Ｄｒａｐｅｒ） 等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９３／２３５６９、シャバロヴァ（Ｓｈａｂａｒｏｖａ） 等、１９９１、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１９、４２４７、ベロン（Ｂｅｌｌｏｎ）等、１９９７、ヌクレオシドとヌクレオチド誌（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、１６、９５１、ベロン（Ｂｅｌｌｏｎ） 等、１９９７、バイオコンジュゲート化学（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）８、２０４）、もしくは合成および／また脱保護の後に、ハイブリダイゼーションによって、合成後に互いに結合することも可能である。
【０３７５】
本発明のｓｉＮＡ分子は、本明細書の実施例１に記載のように、タンデム合成法によって合成することも可能であり、ここで両方のｓｉＮＡ鎖が、単一な連続したオリゴヌクレオチド断片、あるいは切断可能なリンカーによって隔てられた鎖として合成され、後にハイブリダイズし、ｓｉＮＡ二重鎖の精製を可能にする別々のｓｉＮＡ断片または鎖を供給するために、続いて切断されるリンカーはポリヌクレオチドリンカーもしくは非ヌクレオチドリンカーであることができる。本明細書で記載の通り、ｓｉＮＡ のタンデム合成は、９６穴もしくは類似のより大きいマルチウェルプラットフォームのようなマルチウェル／ マルチプレート双方の合成に容易に適応することができる。本明細書で記載の通り、ｓｉＮＡのタンデム合成は、バッチリアクター、合成カラムなどを採用した大規模合成プラットフォームに容易に適応することができる。
【０３７６】
ｓｉＮＡ分子は、二本の別々の核酸鎖、または断片から組み立てられ、ここで一方の断片がセンス領域を含み、もう一方の断片がＲＮＡ分子のアンチセンス領域を含む。
【０３７７】
本発明の核酸分子は、例えば、２' −アミノ、２'−Ｃ−アリル、２'−フルオロ、２'−Ｏ−メチル、２'−Ｈのようなヌクレアーゼ耐性基で修飾することによって（総説には、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、１９９２、生化学サイエンスの傾向（ＴＩＢＳ）１７、３４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、１９９４、核酸シンポジウムシリーズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．）３１、１６３を参照）、安定性を向上させるために広範囲に修飾することができる。ｓｉＮＡ構造は、通常の方法を用いてゲル電気泳動によって精製するか、もしくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、前述のウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ） 等を参照、当該文献は参照することによりその全体が本申請に組み込まれる）で精製することができ、水に再懸濁される。
【０３７８】
本発明の別の側面では、本発明のｓｉＮＡ分子はＤＮＡもしくはＲＮＡベクターに挿入された転写単位から発現される。組み替えベクターは、ＤＮＡプラスミド、もしくはウィルスベクターであることができる。ｓｉＮＡを発現するウィルスベクターは、これに限定はしないが、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、もしくはアルファウィルスに基づいて構築することができる。ｓｉＮＡ 分子を発現可能な組み替えベクターは、本明細書で述べられるように供給され、標的細胞内で存続する可能性がある。または、ｓｉＮＡ分子の一時的な発現を提供するウィルスベクターが使用できる。
【０３７９】
本発明の核酸分子活性の最適化
修飾（塩基、糖および／またリン酸）の化学合成された核酸分子は、血清リボヌクレアーゼによる分解が妨げられ、その効力が増大する可能性がある（例、エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ） 等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９２／０７０６５、ペロート（Ｐｅｒｒａｕｌｔ） 等、１９９０、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）、３４４、５６５、ピーケン（Ｐｉｅｋｅｎ） 等、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２５３、３１４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、１９９２、生化学サイエンスの傾向（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．）１７、３３４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９３／１５１８７、ロッシー（Ｒｏｓｓｉ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９１／０３１６２、スプロート（Ｓｐｒｏａｔ） 米国特許番号５，３３４，７１１、ゴールド（Ｇｏｌｄ）等、米国特許番号６，３００，０７４、前述のバーギン（Ｂｕｒｇｉｎ） 等を参照のこと。これら全ては、参照することで本明細書に組み込まれる）。上述の全ての文献は、本明細書で述べた核酸分子の塩基、リン酸および／また糖部分に対する様々な化学修飾について述べている。細胞内での効果を高める、また核酸分子から塩基を取り除くような、オリゴヌクレオチド合成の時間を短縮し必要な試薬を減らすような修飾が望ましい。
【０３８０】
核酸分子にヌクレアーゼの安定性と効力の著しい向上をもたらすことのできる、糖、塩基、リン酸修飾について述べている当該分野の例がいくつかある。例を挙げると、オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アルキル、２’−フルオロ、２’−Ｏ −メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ，ヌクレオチド塩基修飾（総説として、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、１９９２、生化学サイエンスの傾向（ＴＩＢＳ）、１７、３４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） 等、１９９４、核酸シンポジウムシリーズ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ．）３１、１６３、バーギン（Ｂｕｒｇｉｎ） 等、１９９６、生化学誌（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３５、１４０９０を参照）といったヌクレアーゼ耐性基での修飾によって、安定性を向上させ、および／また生物学的活性を向上させるために修飾される。核酸分子の糖修飾は当該分野において広範囲に述べられてきた（エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９２／０７０６５、ペロート（Ｐｅｒｒａｕｌｔ） 等、ネイチャー誌（Ｎａｔｕｒｅ）、１９９０、３４４、５６５−５６８、ピーケン（Ｐｉｅｋｅｎ） 等、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９１、２５３、３１４−３１７、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） およびシダーグレン（Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、生化学サイエンスの傾向（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．、１９９２、１７、３３４−３３９、ウスマン（Ｕｓｍａｎ ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９３／１５１８７、スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）米国特許番号５，３３４，７１１、および、べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）等、１９９５、生化学雑誌（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７０、２５７０２、べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９７／２６２７０、べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ ）等、米国特許番号５，７１６，８２４、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） 等、米国特許番号５，６２７，０５３、ウールフ（Ｗｏｏｌｆ） 等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９８／１３５２６、１９９８年４月２０出願のトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）等、米国特許出願６０／０８２、４０４、カーペイスキー（Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ）等、１９９８、テトラヒドロン通信（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、３９、１１３１、アーンショー（Ｅａｒｎｓｈａｗ）およびゲイト（Ｇａｉｔ）、１９９８、バイオポリマー（核酸科学）（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４８、３９−５５、ヴァーマ（Ｖｅｒｍａ）およびエックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、１９９８、生化学アニュアルレビュー（Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６７、９９−１３４、およびバーリナ（Ｂｕｒｌｉｎａ）等、１９９７、生体無機医薬品化学（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．）、５、１９９９−２０１０を参照のこと。これら全ての参考文献は、参照することにより、その全体が本明細書に組み込まれる）。上述の文献は、糖、塩基、および／またはリン酸やそのような修飾を、触媒作用を調節せずに核酸分子に組み込む位置を決定するための一般的な方法と戦略を述べており、参照することで本明細書に組み込まれる。このような内容の観点では、本明細書に記載の通り、本発明のｓｉＮＡ核酸分子を修飾するために、ｓｉＮＡの、細胞内のＲＮＡｉを促進する能力が著しく抑制されない限りは、類似の修飾を用いることができる。
【０３８１】
ホスホロチオエート、ホスオロジチオエート、および／または５'−メチルホスホン酸結合を伴うオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は安定性を向上させる一方、過剰な修飾はある毒性や活性の低下を引き起こす可能性がある。従って、核酸分子をデザインする際にはヌクレオチド間結合の含量は最低限にするべきである。これらの結合の密度減少は、毒性を低下させ、その結果これらの分子の増大した効力と高い特異性をもたらすはずである。
【０３８２】
活性を維持し、または向上させる化学修飾を有する低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ） 分子が提供される。このような核酸はまた一般的に、未修飾核酸よりもヌクレアーゼにより耐久性がある。従って、インビトロおよび／またインビボ活性は著しく低下しないはずである。調節が目的である場合、標的ＲＮＡの翻訳が、望ましくないタンパク質のレベルが低下するに十分長く調節されるまで、外因的に供給される治療用の核酸分子は、好ましくは細胞中で安定しているべきである。この期間は、病状によって数時間から数日の間で様々である。ＲＮＡおよびＤＮＡの化学合成（ウィンコット（Ｗｉｎｃｏｔｔ ）等、１９９５、核酸研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３、２６７７、カラザーズ（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ） 等、１９９２、酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、２１１、３−１９（参照することで本明細書に組み込まれる）） の改良によって、上述のように、ヌクレオチド修飾でヌクレアーゼの安定性を向上させることによって核酸分子を修飾する能力が拡大した。
【０３８３】
１つの態様においては、本発明の核酸分子は１つ以上（ 例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）のＧ−クランプヌクレオチドを含む。Ｇ−クランプヌクレオチドは、修飾シトシンアナログであり、ここでその修飾によってワトソン−クリック型とフーグスティーン型双方に二重鎖中の相補的なグアニン面となる水素結合を可能にする、例えば、リン（Ｌｉｎ ）およびマテウッチ（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ）、１９９８、アメリカ化学学会誌（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１２０、８５３１−８５３２を参照のこと。オリゴヌクレオチド中の１つのＧ−クランプアナログ置換は、相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズした際の、らせんの熱安定性とミスマッチ識別が大幅に向上する結果になる可能性がある。本発明の核酸分子へのこのようなヌクレオチドの含有は、核酸標的、相補配列、もしくはテンプレート鎖への親和性と特異性の双方を向上する結果になる。別の態様においては、本発明の核酸分子は、１つ以上（例、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）の、２’，４’−Ｃメチレンビシクロヌクレオチドのような「ロックト核酸」（ＬＮＡ） ヌクレオチドを含む（ 例として、ウェンゲル（Ｗｅｎｇｅｌ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許００／６６６０４、および国際公開特許９９／１４２２６を参照）。
【０３８４】
別の態様においては、本発明は本発明のｓｉＮＡ分子のコンジュゲートおよび／また複合体を特徴とする。このようなコンジュゲートおよび／また複合体は、細胞のような生体系へのｓｉＮＡ 分子の供給を促進するために利用することができる。本発明によって提供されるコンジュゲートおよび／また複合体は、治療のための化合物を、細胞膜を越えて輸送することによって、薬物動態を変化させることによって、および／また本発明の核酸分子の局在を調節することによって、治療活性を与えることができる。本発明は、小分子、脂質、コレステロール、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、マイナスに帯電したポリマー、および、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミンといったその他のポリマーを含むがこれに限定しない、細胞膜を越える分子のデリバリーのための新規のコンジュゲートおよび／また複合体のデザインと合成を含む。一般的に、述べられた輸送体は、個別に、または多成分系の一部として分解性リンカーと共に、または無しで利用されるようデザインされている。これらの化合物は、異なる組織由来の数多くの細胞タイプへの血清存在下、または非存在化での本発明の核酸分子のデリバリーと局在化を改善すると期待される（スレンガー（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ） およびセック（Ｃｅｃｈ）、米国特許番号５，８５４，０３８参照）。本明細書で述べられる分子のコンジュゲートは、生分解性核酸リンカー分子のような、生分解性のリンカーを介して生物学的に活性がある分子に結合される。
【０３８５】
本明細書で使用される「生分解性リンカー」という語は、例えば、本発明のｓｉＮＡ分子に対して生物学的活性分子、あるいは本発明のｓｉＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖のような、ある分子を他の分子に結合するように生分解性リンカーとしてデザインされた、核酸、または非核酸リンカー分子を指す。生分解性リンカーは、特定の組織や細胞タイプへのデリバリーといった、特定の目的のためにその安定性を調節できるようにデザインされている。核酸に基づく生分解性リンカー分子の安定性は、様々な化学反応を用いることによって調節でき、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、および、２’−Ｏ−メチル、２’−フルオロ、２’−アミノ、２’−Ｏ−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’ −Ｏ−アリル、およびその他の２’−修飾のような、化学的に修飾されたヌクレオチド、もしくは塩基を修飾したヌクレオチドの組み合わせである。生分解性核酸リンカー分子は、例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのような、二量体、三量体、四量体、もしくはより長い核酸分子であってもよく、もしくは、例えば、ホスホラミデートまたはホスホジエステル結合のような、リンに基づく結合を有する単一ヌクレオチドを含んでいてもよい。生分解性核酸リンカー分子は、核酸バックボーン、核酸糖、もしくは核酸塩基の修飾を含んでいてもよい。
【０３８６】
本明細書で使用される「生分解性」という用語は、例えば酵素的な分解、もしくは化学的な分解といった生体系での分解を指す。
【０３８７】
本明細書で使用される「生物学的活性分子」という語は、系の生物学的反応を誘発または修飾する能力をもつ化合物または分子を指す。本発明によって単独または他の分子との組み合わせで検討された生物学的に活性なｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例は、抗生物質、コレステロール、ホルモン、抗ウィルス剤、ペプチド、タンパク質、化学療法剤、低分子、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素的核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、２，５−Ａキメラ、ｓｉＮＡ、ｄｓＲＮＡ、アロザイム、アプタマー、デコイ、およびそのアナログといった治療上の活性分子を含む。本発明の生物学的活性分子は、例えば、脂質、およびポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコールおよびその他のポリエステルのようなポリマーといった、薬物動態を調節できる、および／また他の生物学的活性分子の薬物動態を調節できる分子も含む。
【０３８８】
本明細書で使用される「リン脂質」という語は、少なくとも１つのリン基を含む疎水性分子を指す。例えば、リン脂質は、リン含有基および飽和もしくは不飽和アルキル基、場合によってはＯＨ、ＣＯＯＨ、オキソ、アミン、もしくは置換アリールまたは非置換アリール基を含むことができる。
【０３８９】
外因的にデリバリーされた治療核酸分子（例えば、ｓｉＮＡ分子）は、ＲＮＡの逆転写がＲＮＡ転写物のレベルを減少させるのに十分長い間調節されるまで、場合によっては細胞内で安定である。核酸分子は、有効な細胞内の治療剤として機能するよう、ヌクレアーゼに耐性である。本発明また当該分野で述べられた、核酸分子の化学合成における改良点は、上述のようにそのヌクレアーゼの安定性を向上させるためのヌクレオチド修飾の導入によって、核酸分子の修飾の可能性を拡大した。
【０３９０】
さらに別の態様においては、ＲＮＡｉに関わるタンパク質の酵素活性を維持または向上させるような化学修飾を有するｓｉＮＡ分子が提供される。そのような核酸は、未修飾核酸よりも一般的にヌクレアーゼにより耐性がある。従って、インビトロおよび／またインビボで活性は著しく低下しないはずである。
【０３９１】
核酸に基づく本発明の分子の利用は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とした複数のｓｉＮＡ分子、既知の低分子モジュレーターとカップリングされた核酸分子、もしくは異なるモチーフ、および／また化学薬品また生物学的分子といった分子の併用による断続的な治療）の可能性を提供することによって、より良い治療を導き出すだろう。ｓｉＮＡ分子による対象の治療は、酵素的な核酸分子（リボザイム）、アロザイム、アンチセンス、２，５−Ａオリゴアデニレート、デコイ、およびアプタマーのような異なるタイプの核酸分子の併用も含むことができる。
【０３９２】
別の側面では、本発明のｓｉＮＡ分子は、例えばセンス鎖、アンチセンス鎖のみ、もしくはｓｉＮＡ鎖両方に、１つ以上の５'および／または３'キャップ構造を含む。
【０３９３】
「キャップ構造」は、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端に組み込まれている化学修飾を指す（例として、アダミック（Ａｄａｍｉｃ ）等、米国特許番号５，９９８，２０３を参照のこと。これは参照することで本明細書に組み込まれる）。これらの末端修飾は、核酸分子をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内へのデリバリーおよび／また局在化を助ける。キャップは５' 末端（５' キャップ）または３' 末端（３' キャップ）もしくは両末端に存在することができる。限定を目的としない例において、５' キャップは、グリセリル、逆位のデオキシ脱塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’−セコヌクレオチド、非環状３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環状３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位脱塩基部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分、３’−２’−逆位脱塩基部分、１，４−ブタンジオールリン酸、３’−ホスホラミデート、ヘキシルリン酸、アミノヘキシルリン酸、３’−リン酸、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホン酸部分を含むが、これらに限定はしない。キャップ部分の限定を目的としない例を、図１０に示す。
【０３９４】
３' キャップの限定を目的としない例は、グリセリル、逆位のデオキシ塩基残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノアルキルリン酸、１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸、６−アミノヘキシルリン酸、１，２−アミノドデシルリン酸、ヒドロキシプロピルリン酸、１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環状３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分、５’−５’−逆位脱塩基部分、５’−ホスホラミデート、５’−ホスホロチオエート、１，４−ブタンジオールリン酸、５’−アミノ、架橋および／または非架橋５’−ホスホラミデート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋および／または非架橋メチルホスホン酸、および５’−メルカプト部分を含むが、これらに限定はしない（さらに詳細は、本申請の参考文献に盛り込まれている、ビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ ）およびアイヤー（Ｉｙｅｒ）、１９９３、テトラヒドロン誌（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）４９、１９２５を参照のこと）。
【０３９５】
「非ヌクレオチド」は、糖および／またはリン酸置換基のいずれかを含む、核酸鎖の１つ以上のヌクレオチド単位の位置に組み込まれることができる、任意の基または化合物を意味し、それにより残りの塩基が酵素活性を示すことができる。基または化合物は、一般的に認められるアデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンのようなヌクレオチド塩基を含まないという点において脱塩基であり、よって１' 位の塩基が欠けている。
【０３９６】
「アルキル」基は、直鎖、分岐鎖、および環状アルキル基を含む、脂肪族飽和炭化水素を指す。好ましくは、アルキル基は１から１２の炭素を有する。より好ましくは、１から７の炭素、さらに好ましくは、１から４の炭素を持つ低アルキルである。アルキル基は、置換されていてもよく、未置換であってもよい。。置換されている場合には、望ましい単数または複数の置換基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２またはＮ（ＣＨ３）２、アミノ、またはＳＨである。その語はまた、少なくとも一か所の炭素−炭素二重結合を含み、直鎖、分岐鎖、および環状基を含む、不飽和炭化水素基である、アルケニル基も含む。好ましくは、アルケニル基は１から１２の炭素を有する。 より好ましくは、１から７の炭素、さらに好ましくは、１から４の炭素を持つ低アルケニルである。アルケニル基は、置換されていてもよく、未置換であってもよい。置換されている場合には、望ましい単数または複数の置換基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｎ（ＣＨ３）２、アミノ、またはＳＨである。「アルキル」の語はまた、少なくとも１一か所の炭素−炭素三重結合を含み、直鎖、分岐鎖、および環状基を含む、不飽和炭化水素基である、アルキニル基も含む。好ましくは、アルキニル基は１から１２の炭素を有する。より好ましくは、１から７の炭素、さらに好ましくは、１から４の炭素を持つ低アルキニルである。アルキニル基は、置換されていてもよく、未置換であってもよい。置換されている場合には、望ましい単数または複数の置換基は、ヒドロキシル、シアノ、アルコキシ、＝Ｏ、＝Ｓ、ＮＯ２、またはＮ（ＣＨ３）２、アミノ、またはＳＨである。
【０３９７】
そのようなアルキル基は、アリール、アルキルアリール、炭素環式アリール、ヘテロ環式アリール、アミドおよびエステル基を含むことができる。「アリール」基は、共役π電子系を持つ少なくとも１つの環を有し、炭素環式アリール、ヘテロ環式アリール、ビアリール基を含む芳香族基を指し、それらの全ては任意に置換されていてもよい。アリール基の単数または複数の置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、ＯＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアミノ基が望ましい。「アルキルアリール」基は、アリール基（ 上述）に共有的に結合したアルキル基（ 上述）を指す。炭素環アリール基は、芳香環の環原子が全て炭素原子である基である。炭素原子は任意に置換されていてもよい。ヘテロ環アリール基は、芳香環の環原子として、１から３のヘテロ原子を有し、残りの環原子が炭素原子である基である。適切なヘテロ原子は酸素、硫黄、および窒素を含み、またフラニル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−低アルキルピロロ、ピリミジル、ピラジニル、イミダゾリル、および同様の基を含み、いずれも任意で置換される。「アミド」は、Ｒがアルキル、アリール、アルキルアリール、もしくは水素のいずれかである場合の、Ｃ（Ｏ）−ＮＨ −Ｒを指す。「エステル」は、Ｒがアルキル、アリール、アルキルアリール、もしくは水素のいずれかである場合の、−Ｃ（Ｏ）−ＯＲ’を指す。
【０３９８】
本請求で使用する「ヌクレオチド」という語は、当該分野で認められているような天然の塩基（標準）、および当該分野でよく知られている修飾塩基を指す。そのような塩基は、一般的にヌクレオチド糖部分の１'位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖、およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは、非修飾、もしくは糖、リン酸および／または塩基部分で修飾されていてもよく、（また、ヌクレオチドアナログ、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチド、などと互換的に呼ばれる。例として、前述のウスマン（Ｕｓｍａｎ） およびマックスウィッゲン（ＭｃＳｗｉｇｇｅｎ）、エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９２／０７０６５、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） 等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９３／１５１８７、前述のウールマン（Ｕｈｌｍａｎ）およびパイマン（Ｐｅｙｍａｎ）を参照のこと。これらは全て参照することで本明細書に組み込まれる）。リンバック（Ｌｉｍｂａｃｈ） 等、１９９４、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２２、２１８３に要約されているように、当該分野で知られている修飾核酸塩基の例がいくつかある。限定を目的としない核酸分子に導入可能な塩基修飾一部の例は、イノシン、プリン、ピジリン−４−オン、ピジリン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、５−リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、もしくは６−アザピリミジン、もしくは６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、およびその他を含む（バーグン（Ｂｕｒｇｉｎ） 等、１９９６、生化学誌（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３５、１４０９０、前述のウールマン（Ｕｈｌｍａｎ） およびパイマン（Ｐｅｙｍａｎ）。この側面で「修飾塩基」は、１' 位の、またはそれに同等に位置する、アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシル以外のヌクレオチド塩基を指す。
【０３９９】
１つの態様においては、本発明は、一つ以上のホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホン酸、ホスホトリエステル、モルフォリノ、アミデートカルバミン酸、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホン酸、スルホンアミド、スルファミン酸、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、および／またアルキルシリル、置換基を含む、リン酸骨格修飾された修飾ｓｉＮＡ 分子を特徴とする。オリゴヌクレオチド骨格修飾の概説としては、ハンジカー（Ｈｕｎｚｉｋｅｒ）およびリューマン（Ｌｅｕｍａｎｎ）、１９９５、「最新合成方法における、核酸アナログ：合成と特性（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ）」、ＶＣＨ，３３１−４１７、およびメスメーカー（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ） 等、１９９４、「アンチセンス研究の炭水化物修飾における、オリゴヌクレオチドのための新規のバックボーン交換（Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｆｎｅｎｔｓ ｆｏｒ ＯｌｉｇｏＴａｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、ＡＣＳ、２４−３９を参照のこと。
【０４００】
「脱塩基」は、塩基が欠けた、またはその他の化学基を１'の塩基の位置に有する糖部分を意味する。例として、アダミック（Ａｄａｍｉｃ）等、米国特許番号５，９９８，２０３を参照のこと。
【０４０１】
「非修飾ヌクレオシド」は、β−Ｄ−リボ−フラノースの１' 位の炭素に結合したアデニン、シトシン、グアニン、チミン、もしくはウラシル塩基の一つを指す。
【０４０２】
「修飾ヌクレオシド」は、非修飾ヌクレオチド塩基、糖および／またはリン酸の化学構造に修飾を含む任意のヌクレオチド塩基を指す。限定を目的としない修飾核酸の例は、化学式Ｉ−ＶＩＩおよび／また本明細書で述べられたその他の修飾として示されている。
【０４０３】
本発明で述べられたような２'−修飾ヌクレオチドと結合している場合、「アミノ」は、修飾され得る、または未修飾の２’−ＮＨ２または２’−Ｏ−ＮＨ２を指す。このような修飾基は、例えば、エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）等、米国特許番号５，６７２，６９５、およびマチューリック−アダミック（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ）等、米国特許番号６，２４８，８７８で述べられており、双方とも参照することでその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４０４】
核酸のｓｉＮＡ構造への様々な修飾は、これらの分子の利用を向上させるために行い得る。このような修飾は、有効期限、インビトロでの半減期、安定性、例えば、細胞膜の透過性を向上させ、また標的細胞の認識能や結合能を与えることによって、標的部位へのそのようなオリゴヌクレオチドの導入の簡便さを向上させることになる。
【０４０５】
核酸分子の投与
本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞または組織内のＨＣＶのレベルに関連する、あるいは反応するＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、および／または任意の他の形質、疾患、状態を治療、予防、抑制、または軽減に使用するために、単独で、もしくは他の療法と組み合わせて適応させることができる。１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、およびその形成または組成物は、当該技術分野において一般的に知られているように、肝臓に投与される（例として、ウェン（Ｗｅｎ）等、２００４、胃腸病学世界誌（Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１０、２４４−９；ムラオ（Ｍｕｒａｏ） 等、２００２、薬学研究（Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．、１９、１８０８−１４；リョウ（Ｌｉｕ） 等、２００３、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０、１８０−７；ホン（Ｈｏｎｇ） 等、２００３、薬学および薬学ジャーナル（Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５４、５１−８；ヘルマン（Ｈｅｒｒｍａｎｎ）等、２００４、ウィルス学アーカイブ（Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ．、１４９、１６１１−７およびマツ）ノ（Ｍａｔｓｕｎｏ）等、２００３、遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０、１５５９−６６．を参照のこと）。
【０４０６】
例えば、ｓｉＮＡ分子は、リポソームを対象へ投与するための担体、希釈剤、およびその塩を含むデリバリー手段を含むことが可能であり、および／また医薬的に許容できる製剤として存在することが可能である。核酸分子のデリバリーの方法はアクタール（Ａｋｈｔａｒ）等、１９９２、細胞生物学の傾向（ＴｒｅｎｄｓＣｅｌｌ Ｂｉｏ．、２、１３９、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療学のためのデリバリー戦略（Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）アクタール（Ａｋｈｔａｒ）編、１９９５、モウラー（Ｍａｕｒｅｒ） 等、１９９９、分子膜生物学誌（Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ． Ｂｉｏｌ．、１６、１２９−１４０、ホフランド（Ｈｏｆｌａｎｄ）およびフアン（Ｈｕａｎｇ）、１９９９、実験薬理学ハンドブック（Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１３７、１６５−１９２、およびリー（Ｌｅｅ）等、２０００、米国）癌学会シンポジウムシリーズ（ＡＣＳ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．、７５２、１８４−１９２、で述べられており、これらは全て参照することで本明細書に組み込まれる。べーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ）等、米国特許番号６，３９５，７１３、およびサリヴァン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ） 等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９４／０２５９５、は更に核酸分子のデリバリーのための一般的な方法を述べている。これらのプロトコールは、事実上、任意の核酸分子のデリバリーに利用できる。核酸分子は、当該分野の技術者に知られている様々な方法で細胞に投与することができ、その方法には、リポソームへの封入、イオン導入による方法、もしくは生分解性ポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン（例として、ゴンザレス（Ｇｏｎｚａｌｅｚ）等、１９９９、バイオ結合化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１０、１０６８−１０７４、ワン（Ｗａｎｇ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許０３／４７５１８、および国際公開特許０３／４６１８５を参照）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ） およびＰＬＧＡミクロスフェア（例として、米国特許番号６，４４７，７９６および米国特許番号２００２１３０４３０を参照）、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェア、またはタンパク質性ベクター（オヘア（Ｏ’ Ｈａｒｅ） およびノーマンド（Ｎｏｒｍａｎｄ）、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許００／５３７２２）といった他の担体への組み込みによる方法が含まれるが、これらに限定しない。別の態様においては、本発明の核酸分子は、ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）もしくはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−トリ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ ）の誘導体のようなポリエチレンイミンとその誘導体との調剤もしくは複合体とすることも可能である。１つの態様においては、本発明の核酸分子は、参照することでその全体が本明細書に組み込まれる米国特許番号２００３００７７８２９に記載の通り調剤される。
【０４０７】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、参照することにより図を含めた全体が本明細書に組み込まれる米国特許番号２００１０００７６６６で述べられたような膜破壊剤との複合体とされる。別の態様においては、膜破壊剤、または媒介物およびｓｉＮＡ分子は、本申請の参考文献により図を含めた全体が組み込まれる米国特許番号６，２３５，３１０で述べられたような、脂質である陽イオン性脂質またはヘルパー脂質分子と共に複合体とされる。
【０４０８】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、参照することにより図を含めた全体が本明細書に組み込まれる米国特許番号２００３０７７８２９および国際特許協力条約文献番号、国際公開特許００／０３６８３および国際公開特許０２／０８７５４１で述べられたようなデリバリー系との複合体とされる。
【０４０９】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子、および製剤もしくはその組成物は、直接、または局所的に（例えば、局在的に）、真皮または濾胞に当該分野で一般的に知られているように投与された（ 例として、ブランド（Ｂｒａｎｄ）、２００１、分子治療学カレントオピニオン（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、３、２４４−８、レグニア（Ｒｅｇｎｉｅｒ ）等、１９９８、薬剤標的雑誌（Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ）、５、２７５−８９、カニッカナン（Ｋａｎｉｋｋａｎｎａｎ）、２００２、バイオドラッグ（ＢｉｏＤｒｕｇｓ）、１６、３３９−４７、ライト（Ｗｒａｉｇｈｔ） 等、２００１、薬理学と治療誌（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、９０、８９−１０４、およびプリート（Ｐｒｅａｔ） およびドゥジャーディン（Ｄｕｊａｒｄｉｎ）、２００１、科学技術と実践： 薬理科学誌（ＳＴＰ ＰｈａｒｍａＳｃｉｅｎｃｅｓ）、１１、５７−６８、およびヴォート（Ｖｏｇｔ）等、２００３、デルハウターツ（Ｈａｕｔａｒｚｔ）、５４、６９２−８を参照）。
【０４１０】
１つの態様においては、本発明のデリバリー系は、例えば水性および非水性のゲル、クリーム、複合的な乳剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水性の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基剤および粉末を含み、また溶解剤、浸透促進剤（例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコール、およびアミノ酸）、親水性ポリマー（ 例えば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。１つの態様においては、医薬的に許容できる担体は、リポソームあるいは経皮的エンハンサーである。本発明で利用可能なリポソームの例は、以下を含む：（１） セルフェクチン（ＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ）、１：１．５（Ｍ／Ｍ） 陽イオン性脂質のリポソーム製剤、Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラメチル−Ｎ，ＮＩ，ＮＩＩ，ＮＩＩＩ−テトラパルミット−ｙ−スペルミンとジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、（２） サイトフェクチンＧＳＶ（Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ ＧＳＶ）、２：１（Ｍ／Ｍ） 陽イオン性脂質のリポソーム製剤および（３）ＤＯＴＡＰ（Ｎ−［ｌ−（２，３−ジＤＯＰＥ （グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、オレオイルオキシ）−Ｎ，Ｎ， Ｎ−トリメチル−メチル硫酸アンモニウム］（ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）、および（４） リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）、３：１（Ｍ／Ｍ）多価陽イオン性脂質のリポソーム製剤ＤＯＳＰＡおよび天然脂質のＤＯＰＥ（ギブコＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）。
【０４１１】
１つの態様においては、本発明のデリバリー系は、パッチ、錠剤、座薬、膣座薬、ゲルおよびクリームを含み、溶解剤やエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、アミノ酸）、またその他の溶媒（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルとその誘導体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやヒアルロン酸のような親水性ポリマー）のような賦形剤を含むことができる。
【０４１２】
１つの態様においては、本発明の経粘膜のデリバリー系は、パッチ、錠剤、座薬、膣座薬、ゲルおよびクリームを含み、溶解剤やエンハンサー（例えば、プロピレングリコール、胆汁酸塩、アミノ酸）、またその他の溶媒（例えば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルとその誘導体、ヒドロキシプロピルメチルセルロースやヒアルロン酸のような親水性ポリマー）のような賦形剤を含むことができる。
【０４１３】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、ポリエチレンイミン（例えば線状または分岐したＰＥＩ）および／または、ガラクトースＰＥＩ、コレステロールＰＥＩ、抗体誘導体ＰＥＩ、およびポリエチレングリコールＰＥＩ（ＰＥＧ−ＰＥＩ）誘導体のような、例えばグラフトされたＰＥＩ（ 例として、参照することで本明細書に組み込まれる、オグリス（Ｏｇｒｉｓ ）等、２００１、米国製薬科学者協会薬理科学誌（ＡＡＰＳ ＰｈａｒｍＳｃｉ）、３、１−１１、ファーグソン（Ｆｕｒｇｅｓｏｎ）等、２００３、バイオコンジュゲート化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１４、８４０−８４７、クナース（Ｋｕｎａｔｈ）等、２００２、医薬研究誌（Ｐｈｒａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９、８１０−８１７、チョイ（Ｃｈｏｉ） 等、２００１、韓国化学学会紀要（Ｂｕｌｌ． Ｋｏｒｅａｎ Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２２、４６−５２、ベッティンガー（Ｂｅｔｔｉｎｇｅｒ） 等、１）９９９、バイオコンジュゲート化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１０、５５８−５６１、ピーターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）等、２００２、バイオコンジュゲート化学誌（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、１３、８４５−８５４、アーバッカー（Ｅｒｂａｃｈｅｒ） 等、１９９９、遺伝子医薬誌プレプリント（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｐｒｅｐｒｉｎｔ）、１、１−１８、ゴッドビー（Ｇｏｄｂｅｙ）等、１９９９、米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、９６、５１７７−５１８１、ゴッドビー（Ｇｏｄｂｅｙ） 等、１９９９、放出制御誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ）、６０、１４９−１６０、ディーボルド（Ｄｉｅｂｏｌｄ） 等、１９９９、生物学化学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２７４、１９０８７−１９０９４、トーマス（Ｔｈｏｍａｓ） およびクリバノフ（Ｋｌｉｂａｎｏｖ）、２００２、米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、９９、１４６４０−１４６４５、サガラ（Ｓａｇａｒａ）、米国特許番号６，５８６，５２４を参照） を含むポリエチレンイミン誘導体と共に調剤または複合体とされる。
【０４１４】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は、バイオコンジュゲートを含み、例えばヴァーギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）等、米国特許出願１０／４２７，１６０、２００３年４月３０日申請、米国特許番号６，５２８，６３１、米国特許番号６，３３５，４３４、米国特許番号６，２３５，８８６、米国特許番号６，１５３，７３７、米国特許番号５，２１４，１３６、米国特許番号５，１３８，０４５で述べられる核酸結合体がある。
【０４１５】
従って、本発明は、安定剤、緩衝剤および同等の許容できる担体を用いた、１つ以上の本発明の核酸を含む医薬組成物であることを特徴とする。本発明のポリヌクレオチドは、医薬組成物を処方するための安定剤、緩衝剤やそういったようなものを含む、または含まない標準的な方法で対象に投与（例えば、ＲＮＡ 、ＤＮＡもしくはタンパク質）、および導入される可能性がある。リポソームデリバリー機序が望まれる場合には、リポソーム形成のための標準的なプロトコールに従うことができる。本発明の組成物は、調剤され、クリーム、ゲル、オイル、およびその他の当該分野で知られている局所的、真皮、または経皮的な投与に適した組成物として使用してもよい。
【０４１６】
本発明は、述べられている化合物の医薬的に許容できる剤形も含む。これらの剤形は、例えば、塩酸塩、臭化水素塩、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸といった、例えば酸添加塩のような上述化合物の塩を含む。
【０４１７】
薬理成分もしくは製剤とは、例えば、全身投与、細胞または例えばヒトを含む対象へといった投与に適切な形の成分または製剤をさす。適切な形は、一つは用途、または例えば経口、経皮、もしくは注入による、といった摂取経路によって決まる。そのような形は成分または製剤が標的細胞（すなわち細胞へのデリバリーには、マイナスに荷電した核酸が望ましい）への到達を妨げないようにしなければならない。例えば、血流へ注入される薬理成分は可溶性でなければならない。その他の要素は当該技術分野で知られており、毒性および成分または製剤が効果を発揮するのを妨げるような剤形というような考察を含む。
【０４１８】
１つの態様においては、本発明のｓｉＮＡ分子は全身投与により医薬的に許容可能な組成物または製剤で対象に投与される。「全身投与」とは、インビボの体内吸収もしくは薬剤の血流への蓄積の後、全身くまなく分配されることを意味する。全身吸収にいたる投与経路は、静脈内、皮下、腹腔内、吸引、経口、肺内、および筋肉内を含むが、これに限定しない。これらそれぞれの投与経路は、本発明のｓｉＮＡ 分子を到達可能な病変組織に曝す。循環に対する薬剤全体の比率は、分子量またはサイズの関数として示されている。本発明の化合物を含んでいるリポソーム、またはその他の薬剤担体の利用は、例えば網膜内皮系（ＲＥＳ）の組織といった特定の組織タイプへ薬剤が局在する可能性が潜在的にある。リンパ球やマクロファージのような細胞の表面との薬剤の会合を可能にすることができるリポソーム製剤は、また有用である。このアプローチは、異常細胞に対するマクロファージやリンパ球の免疫認識の特異性の利点を活かして、標的細胞への薬剤のデリバリーを向上させることができる。
【０４１９】
「医薬的に許容できる製剤」または「医薬的に許容できる組成物」とは、望ましい活性のために最も適切な肉体的な部位で、本発明の核酸分子の効果的な分配を可能にする組成物または製剤を意味する。本発明の核酸分子を含む製剤のための適切な物質の限定を目的としない例は、（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｐ８５のような）Ｐ−糖タンパク質阻害剤、持続放出デリバリーするポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコイド）マイクロスフェアのような生分解性のポリマー（エマーリックＤ．Ｆ．（Ｅｍｅｒｉｃｈ， ＤＦ） 等、１９９９、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，８，４７−５８）、ポリシアノアクリル酸ブチルでできたような薬剤が入ったナノ粒子を含む。本発明の核酸分子のためのデリバリー戦略のその他の限定を目的としない例は、ボアード（Ｂｏａｄｏ） 等、１９９８、薬理科学誌（Ｊ．Ｐｌｉａｒｍ． Ｓｃｉ．、８７、１３０８−１３１５、タイラー（Ｔｙｌｅｒ） 等、１９９９、欧州生化学学会連合通信（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４２１、２８０−２８４、パードリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）等、１９９５、米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、９２、５５９２−５５９６、ボアード（Ｂｏａｄｏ）、１９９５、応用薬剤デリバリー総説誌（Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．、１５、７３−１０７、アードリアン−ヘラーダ（Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ） 等、１９９８、核酸研究誌（Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２６、４９１０−４９１６、およびタイラー（Ｔｙｌｅｒ）等、１９９９、米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳＵＳＡ）、９６、７０５３−７０５８で述べられた素材を含む。
【０４２０】
本発明は、ポリ（エチレングリコール）油脂（ＰＥＧ修飾された、または長期循環リポソーム、またはステルスリポソーム）および本発明の核酸分子を含む表面修飾されたリポソームを含む成分の利用も特徴とする。これらの剤形は、標的組織における薬剤（例、ｓｉＮＡ）の蓄積を増加させる手段を提供する。この種類の薬剤担体は、オプソニン作用や単核食作用形（ＭＰＳまたはＲＥＳ）による排除に耐性であり、そのために血液循環時間が長くなり、封入された薬剤への組織暴露が向上する（レーシック（Ｌａｓｉｃ）等、化学総説誌（Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ．、１９９５、９５、２６０１−２６２７、イシワタ（Ｉｓｈｉｗａｔａ）、化学薬理学紀要（Ｃｈｅｒｒａ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．）、１９９５、４３、１００５−１０１１）。このようなリポソームが、腫瘍に選択的に、おそらく血管外遊出し血管新生された標的組織での捕捉によって、蓄積するのが示されている（レーシック（Ｌａｓｉｃ ）等、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９５、２６７、１２７５−１２７６、オク（Ｏｋｕ）、１９９５、生化学と生物物理学会報（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、１２３８、８６−９０）。長期循環リポソームは、特に、ＭＰＳ組織に蓄積することで知られている旧来の陽イオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡ の薬物動態と薬力学を向上させる（リュー（Ｌｉｕ） 等、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）１９９５、４２、２４８６４−２４８７０、チョイ（Ｃｈｏｉ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９６／１０３９１、アンセル（Ａｎｓｅｌｌ） 等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９６／１０３９０、ホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）等、国際特許協力条約文献番号、国際公開特許９６／１０３９２）。長期循環リポソームはまた、代謝上活動的である肝臓や脾臓のようなＭＰＳ組織に蓄積するのを防ぐ能力に基づいて、陽イオン性のリポソームと比較して薬剤をヌクレアーゼ分解から大いに保護すると思われる。
【０４２１】
本発明はまた、医薬的に許容できる担体または希釈剤中の目的とする化合物の薬学的に効果的な量を含む、保存または投与のために調製された組成物も含む。治療上の使用で許容できる担体または希釈剤は薬学分野でよく知られており、例えば、レミントンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック出版社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、（Ａ．Ｒ．ジェナーロ（Ａ．Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ） 編、１９８５）に記載されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。例えば、保存料、安定剤、色素と香料剤が提供される。これらは、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。加えて、抗酸化剤と懸濁化剤を使用してもよい。
【０４２２】
医薬的に効果的な用量は、病状の防止、発生の抑制、もしくは治療（ある程度の症状、好ましくは全ての症状の緩和）に必要な用量である。医薬的に効果的な用量は、疾患のタイプ、用いられる組成物、投与の経路、治療される哺乳類のタイプ、考慮すべき特定の哺乳類の肉体的な特徴、併用薬剤、および当該技術分野の熟練者に認知されるであろうその他の要因によって決まる。概して、陰性に帯電したポリマーの効能次第で、体重当たり、一日当たり、０．１ｍｇ／ｋｇ と１００ｍｇ／ｋｇの間の量の活性成分が投与される。
【０４２３】
本発明の核酸分子およびその製剤は、経口的に、局所的に、非経口的に、吸引やスプレーで、もしくは経直腸的に、従来の非毒性の医薬的に許容できる担体、アジュバント、および／また溶剤を含む、用量単位の製剤が投与され得る。本明細書で使用される場合の、非経口的という用語は、経皮的、皮下、血管内（例、静脈内）、筋肉内、またはくも膜下注射または輸液技術および同等のものを含む。加えて、本発明の核酸分子と医薬的に許容できる担体を含む医薬製剤が提供される。１つ以上の本発明の核酸分子は、１つ以上の非毒性の医薬的に許容できる担体、および／また希釈剤、および／またアジュバント、および必要に応じて他の活性成分と共同して存在することができる。本発明の核酸分子を含む医薬組成物は、例えば錠剤、トローチ、薬用キャンディー、水性または油性の懸濁液、分散可能な粉末か顆粒、乳液、ハードまたはソフトカプセル、またはシロップまたはエリキシル剤といった、経口での使用に適切な形であり得る。
【０４２４】
経口で使用する意図の配合は、医薬組成物の製造のために当該分野で知られている任意の方法に従って調製することができ、そのような配合は医薬品として洗練された口当たりの良い調合になるように、１つ以上の甘味料、香料、着色料、または保存料を含むことができる。錠剤は、非毒性の医薬的に許容できる錠剤の製造に適切な賦形剤との混合として活性成分を含む。それらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウムや炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性の希釈剤や、例えばコーンスターチやアルギニン酸のような整粒および崩壊剤、例えばデンプン、ゼラチンまたはアカシアのような結合剤、および例えばステアリン酸マグネシウムやステアリン酸、もしくはタルクのような潤滑剤であり得る。錠剤はコーティングなし、または従来法によってコーティングしてもよい。ある場合には、そのようなコーティングは消化管での分散と吸収を遅らせ、長い期間に渡って作用を持続させるための、従来技術で調製されることができる。例えば、モノステアリン酸グリセリンやジステアリン酸グリセリンのような時間遅延剤が用いられる。
【０４２５】
経口で使用する製剤は、活性成分が、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、もしくはカオリンといった不活性の固形希釈剤と混合されて入っている、硬質ゼラチンカプセルである場合や、もしくは活性成分が水または例えばピーナッツオイル、流動パラフィン、またはオリーブオイルといったオイル溶剤に混合された、ソフトゼラチンカプセルであることができる。
【０４２６】
水性懸濁液は、水性懸濁液を製造するのに適切な賦形剤との混合物として活性物質を含む。そのような賦形剤は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウムやメチルセルロース、ヒドロプロピル−メチルセルロース、アルギニン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、アカシアガムのような懸濁剤であり、分散剤や湿潤剤は、例えば、レシチンのような天然リン脂質、または例えばステアリン酸ポリオキシエチレンのような酸化アルキレンと脂肪酸の天然の縮合生成物、または例えばヘプタデカチレンオキシセタノールのような酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートのようなエチレンオキサイドと脂肪酸とヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物、またはポリエチレンソルビタンモノオレエートのようなエチレンオキサイドと脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物であることができる。水性懸濁液は、例えばエチル、またはｎ−プロピル−ｐ−パラオキシ安息香酸といった１つ以上の保存料、もしくは１つ以上の着色料、１つ以上の香料、および１つ以上のサッカロースやサッカリンのような甘味料を含むことができる。
【０４２７】
油性懸濁液は、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはココナッツオイルのような植物性オイル、もしくは流動パラフィンのような鉱物油中に活性成分を懸濁することによって調剤することができる。油性懸濁液は、例えば蜜ろう、固形パラフィン、もしくはセチルアルコールのような増粘剤を含むことができる。甘味料と香料が、口当たりの良い経口製剤になるよう加えられることができる。これらの組成物はアスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存することができる。
【０４２８】
水の添加による水性懸濁液の調製に適切な分散可能な粉末および顆粒は、分散剤、もしくは湿潤剤、懸濁剤、および１つ以上の保存料との混合剤として活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤、または懸濁剤は、既に上で例示されたものである。例えば甘味料、香料、着色料といった付加的な賦形剤が与えられることができる。
【０４２９】
本発明の医薬組成物は、水中油型乳剤の剤形もあり得る。油層は植物油または鉱物油、またはその混合物であり得る。適切な乳化剤は、例えばアカシアガム、トラガカントガムといった天然のガムや、例えばダイズレシチン、および、例えばソルビタンモノオレエートといった脂肪酸とヘキシトール、無水物由来のエステルまたは部分エステルといった天然のリン脂質や、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートのような部分エステルとのエチレンオキサイドとの縮合生成物であり得る。また乳液は、甘味料と香料を含むことができる。
【０４３０】
シロップやエリキシル剤は、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコース、またはサッカロースといった甘味料とともに調剤され得る。そのような製剤は、粘滑剤、保存料、および香料と着色料を含むことができる。医薬組成物は注射可能な滅菌水性懸濁液、または油性懸濁液の形に含まれることができる。この懸濁液は、上述の当該分野で知られている適切な分散剤もしくは湿潤剤、および懸濁剤を用いて調製され得る。滅菌注射製剤は、例えば１，３−ブタンジオール溶液のような、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶剤の滅菌注射溶液、または懸濁液であることができる。許容できる賦形剤および溶媒のなかで使用できるものは、水、リンガー溶液、等張の塩化ナトリウム溶液である。加えて、滅菌された不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として通常用いられる。この目的のために、合成モノグリセリド、もしくはジグリセリドを含めて、任意の平凡な不揮発性油が用いられ得る。加えて、オレイン酸のような脂肪酸が注射製剤に用いられる。
【０４３１】
本発明の核酸分子は、例えば、経直腸投与のための薬剤として、座薬の形でも投与することができる。これらの配合は、通常の温度では固体だが、直腸の温度では液体で、従って直腸で融けて薬剤が放出されるような、適切な刺激性のない賦形剤と混合して薬剤を調製することができる。そのような素材には、ココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。
【０４３２】
本発明の核酸分子は、滅菌溶媒で非経口的に投与することができる。薬剤は、溶媒と用いられる濃度によるが、溶媒に懸濁もしくは溶解することができる。局部麻酔、保存料、緩衝剤のような都合の良い補助剤を溶媒に溶解することができる。
【０４３３】
体重キログラム当たり、一日当たり約０．１ｍｇから約１４０ｍｇ のオーダーの投与量レベルが上述の病状の治療に有用である（対象辺り、一日当たり、約０．５ｍｇから約７ｇ）。一回の投薬形態にするために担体物質と混合される活性成分の量は、治療されるホストと特定の投与方法によって様々である。投薬量単位の様式は通常約１ｍｇから約５００ｍｇの間の活性成分を含む。
【０４３４】
任意の特定対象への特定の投与量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食習慣、投与の時間、投与経路、および排出率、薬剤の組み合わせと治療中の特定の疾患の重症度を含む様々な要因によって決まることが分かっている。
【０４３５】
ヒト以外の動物への投与には、配合は動物飼料や飲み水に加えることができる。動物が医薬的に適切な量の組成物をその食餌と共に摂取するように、動物飼料や飲み水の組成物として調剤すると便利である可能性がある。飼料もしくは飲み水に添加するプレミックスとして組成物を提示するのも便利である可能性がある。
【０４３６】
本発明の核酸分子は、全体的な治療効果を増大させるために、その他の治療化合物との組み合わせで対象に投与することができる。ある徴候を治療するための多数の化合物の使用は、薬効を増大させる一方で副作用を軽減することができる。
【０４３７】
１つの態様においては、本発明は特定の細胞タイプへの本発明の核酸分子の投与に適した組成物を含む。例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰｒ）（ウー（Ｗｕ） およびウー（Ｗｕ）、１９８７、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）２６２、４４２９−４４３２） は肝細胞に独特であり、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）のような分岐したガラクトース末端をもつ糖タンパク質に結合する。別の態様においては、葉酸受容体は多くのガン細胞で過剰発現されている。そのような糖タンパク質、合成糖結合体、または葉酸の受容体への結合は、オリゴ糖鎖の分岐の度合いに強く依存した親和性によって行われ、例えば、三分岐構造（ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）、二分岐鎖（ｂｉａｎｔｅｎｎａｒｙ）、単鎖（ｍｏｎｏａｎｔｅｎｎａｒｙ）より強い親和性で結合する（バエンツィガー（Ｂａｅｎｚｉｇｅｒ） およびフィート（Ｆｉｅｔｅ）、１９８０、セル誌（Ｃｅｌｌ）、２２、６１１−６２０、コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ） 等、１９８２、生物化学雑誌（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７、９３９−９４５）。リー（Ｌｅｅ）およびリー（Ｌｅｅ）、１９８７、糖結合体雑誌（Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．、４、３１７−３２８、は、ガラクトースと比較して受容体に対してより高い親和性を有するＮ−アセチル−Ｄ −ガラクトサミンを炭水化物部位として用いてこの高特異性を得た。「クラスター形成効果」は、マンノシル末端糖タンパク質または糖結合体の結合および取り込みについて述べられている（ポンピポム（Ｐｏｎｐｉｐｏｍ）等、１９８１、医化学雑誌（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ）、２４、１３８８−１３９５）。外因化合物を、細胞膜を越えて輸送するためのガラクトース、ガラクトサミン、または葉酸の結合体の利用は、例えば肝臓疾患の治療、肝臓癌、またはその他の癌を標的としたデリバリーアプローチを提供することができる。バイオコンジュゲートの利用は、治療に必要な治療化合物の必要用量の低減をも提供することができる。さらに、治療上の生物利用能、薬力学上、薬物動態上のパラメーターは本発明の核酸バイオコンジュゲートの利用を通じて調節することができる。限定を目的としないそのようなバイオコンジュゲートの例が、ヴァーギース（Ｖａｒｇｅｅｓｅ）等、米国特許出願１０／２０１，３９４、２００１年８月１３日申請、およびマトゥリック−アダミック（Ｍａｔｕｌｉｃ−Ａｄａｍｉｃ ）等、米国特許出願６０／３６２，０１６、２００２年３月６日申請、で述べられている。
【０４３８】
代替として、本発明の特定のｓｉＮＡ分子は真核生物プロモーターの細胞内で発現することができる（ 例、アイザン（Ｉｚａｎｔ） およびワイントローブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）、１９８５、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２２９、３４５、マクギャリー（ＭｃＧａｒｒｙ） およびリンドキスト（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）、１９８６、米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ）８３、３９９、スキャンロン（Ｓｃａｎｌｏｎ） 等、１９９１、米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ）、８８、１０５９１−５、カシャニ−サベット（Ｋａｓｈａｎｉ ）−Ｓａｂｅｔ）等、１９９２、アンチセンス研究開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲｅｓＤｅｖ．、２、３−１５、ドロパリック（Ｄｒｏｐｕｌｉｃ） 等、１９９２、ウィルス学雑誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、６６、１４３２−４１、ウィラシンゲ（Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ）等、１９９１、ウィルス学雑誌（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６５、５５３１−４、オジュワンゲット（Ｏｊｗａｎｇｅｔ ）等、１９９２、米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ）、８９、１０８０２−６、チェン（Ｃｈｅｎ） ）等、１９９２、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、４５８１−９、サーバー（Ｓａｒｖｅｒ） 等、１９９０、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４７、１２２２−１２２５、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ） 等、１９９５、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３、２２５９、グッド（Ｇｏｏｄ）等、１９９７、遺伝子治療誌（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）、４、４５）。当業者は、任意の核酸は適切なＤＮＡ／ＲＮＡから真核性細胞内で発現することができると認識する。そのような核酸の活性は、酵素核酸による一次転写産物からの放出で増加することができる（ドレイパー（Ｄｒａｐｅｒ） 等、ＰＣＴＷＯ９３／２３５６９、およびサリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）等、１９９１、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９、５１２５−３０、ベンチュラ（Ｖｅｎｔｕｒａ） 等、１９９３、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１、３２４９−５５、チョウリラ（Ｃｈｏｗｒｉｒａ） 等、１９９４、生物化学雑誌（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６９、２５８５６）。
【０４３９】
本発明の別の側面において、本発明のＲＮＡ分子はＤＮＡ またはＲＮＡベクターに挿入された転写単位（例えばクチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ）等、１９９６、ティーアイジー（ＴＩＧ．）、１２、５１０を参照）から発現されることができる。組み替えベクターは、ＤＮＡプラスミド、もしくはウィルスベクターであることができる。ｓｉＮＡを発現するウィルスベクターは、これに限定はしないが、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、もしくはアルファウィルスに基づいて構築することができる。別の態様においては、ポリメラーゼＩＩＩベースの構造は本発明の核酸分子発現に使用される（例えばトンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、米国特許番号５，９０２，８８０および６，１４６，８８６を参照）。ｓｉＮＡ分子発現が可能な組み替えベクターは上述のようにデリバリーされ、標的細胞内にとどまることができる。代替として、ウィルスベクターを使用して核酸分子の一時的発現を提供することができる。そのようなベクターは必要に応じて繰り返し投与されることができる。一度発現すると、ｓｉＮＡ分子は標的ｍＲＮＡと相互作用しＲＮＡｉ応答を生成する。ｓｉＮＡ分子発現ベクターのデリバリーは、静脈内または筋肉内投与、または対象から外植された標的細胞への投与、続いてその対象への再導入、または望ましい標的細胞への導入を可能にするその他の任意の方法等による全身性であることができる（クチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ） 等、１９９６、ティーアイジー（ＴＩＧ．）、１２、５１０を参照）。
【０４４０】
一側面において本発明は少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。前記発現ベクターは、ｓｉＮＡ二重鎖の一方または両方の鎖、もしくはｓｉＮＡ二重鎖に自家交雑する単一の自己相補的な鎖をコードすることができる。本発明のｓｉＮＡ 分子をコードする核酸配列は、ｓｉＮＡ分子の発現を可能にする方法で使用可能なように結合することができる（例えばポール（Ｐａｕｌ）等、２００２、ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９、５０５、ミヤギシ（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ） およびタイラ（Ｔａｉｒａ）、２００２、ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９、４９７、リー（Ｌｅｅ）等、２００２、ネイチャーバイオテクノロジー誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９、５００、およびノビナ（Ｎｏｖｉｎａ） 等、２００２、ネイチャーメディシン誌（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、電子版デジタルオブジェクト識別子：１０．１０３８／ｎｍ７２５を参照）。
【０４４１】
別の側面において、本発明はａ）転写開始領域（例、真核性ポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ 開始領域）、ｂ ）転写終結領域（例、真核性ポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ終結領域）、および、ｃ） 少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み、ここで前記配列は前記開始領域および前記終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能にする方法で使用可能なように結合している、発現ベクターを特徴とする。ベクターは任意で本発明のｓｉＮＡ をコードする配列の５’側または３’側に結合するタンパク質の読み取り枠（ＯＲＦ）、および／またはイントロン（介在配列）を含むことができる。
【０４４２】
ｓｉＮＡ分子配列の転写は、真核性ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ１）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ） のプロモーターから開始されることがある。ｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩ プロモーターからの転写は細胞内において高いレベルで発現され、所定の細胞タイプにおける所定のｐｏｌＩＩレベルは周辺に存在する遺伝子調節配列の性質による（エンハンサー、サイレンサー等）。原核生物ＲＮＡ ポリメラーゼ酵素は適切な細胞内で発現されることを条件として、原核生物ＲＮＡポリメラーゼプロモータ−も使用される（エルロイ−ステイン（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ） およびモス（Ｍｏｓｓ）、１９９０、米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８７、６７４３−７、ガオ（Ｇａｏ） およびファング（Ｈｕａｎｇ）１９９３、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１、２８６８−７２、リーバー（Ｌｉｅｖｅｒ） 等、１９９３、酵素学手法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７、４７−６６、チョウ（Ｚｈｏｕ）等、１９９０、分子細胞生物学（Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１０、４５２９−３７）。複数の調査員がそのようなプロモーターから発現する核酸分子が哺乳類細胞において機能し得ることを実証した（例、カシャニ−サベット（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ） 等、１９９２、アンチセンス研究開発（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．，Ｄｅｖ．、２、３−１５、オジュワング（Ｏｊｗａｎｇ） 等、１９９２、米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、８９、１０８０２−６、チェン（Ｃｈｅｎ）等、１９９２、核酸リサーチ（Ｎｕｍｅｒｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０、４５８１−９、ユー（Ｙｕ）等、１９９３、米国化学アカデミー会報（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９０、６３４０−４、リュイリエール（Ｌ'Ｈｕｉｌｌｉｅｒ） 等、１９９２、欧州分子生物学協会誌（ＥＭＢＯ Ｊ．、４４１１−８、リジューイック（Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚ ）等、１９９３、米国化学アカデミー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、９０、８０００−４、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）等、１９９５、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２３、２２５９、スレンガ−（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ）およびセック（Ｃｅｃｈ）、１９９３、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６２、１５６６）。さらに詳しくは、Ｕ６低分子核（ｓｎＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ ）およびアデノウィルスＶＡ ＲＮＡをコードする遺伝子から派生したような転写単位は、細胞中のｓｉＮＡのような高濃度の望ましいＲＮＡ分子を生成するのに有効である（トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ） 等（上述）、クチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ）およびスティンチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）、１９９６（ 上述）、ヌーンバーグ（Ｎｏｏｎｂｅｒｇ） 等、１９９４、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、２２、２８３０、ヌーンバーグ（Ｎｏｏｎｂｅｒｇ）等、米国特許番号５，６１４，８０３、グッド（Ｇｏｏｄ）等、１９９７、遺伝子療法（Ｇｅｎｅｔｈｅｒ．、４、４５、ベーゲルマン（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ） 等、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９６／１８７３６）。上述のｓｉＮＡ転写単位は、プラスミドＤＮＡベクター、ウィルスＤＮＡベクター（アデノウィルスまたはアデノ随伴ウィルスベクター等）またはウィルスＲＮＡベクター（レトロウィルスまたはアルファウィルスベクター）を含むがこれに限定されない、哺乳類細胞に導入する様々なベクターに組み込むことができる（クチュール（Ｃｏｕｔｕｒｅ） およびスティンチコム（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ）、１９９６（上述）を参照）。
【０４４３】
本発明の別の側面は、ｓｉＮＡ分子の発現を可能にする方法で本発明のｓｉＮＡ分子の少なくとも１つをコードする核酸配列を含む発現ベクターを特徴とする。発現ベクターは、１つの態様において、ａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、およびｃ）少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子の鎖をコードする核酸配列を含み、ここで前記配列は前記開始領域および前記終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能にする方法で使用可能なように結合している。
【０４４４】
別の態様においては、発現ベクターはａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）読み取り枠、およびｄ）少なくとも１つの本発明のｓｉＮＡ分子の鎖をコードする核酸配列を含み、ここで前記配列は読み取り枠の３’端に使用可能なように結合しており、前記配列は前記開始領域、前記読み取り枠および前記終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能にする方法で使用可能なように結合している。さらに別の態様においては、発現ベクターはａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）イントロン、ｄ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子をコードする核酸配列を含み、ここで前記配列は前記開始領域、前記イントロンおよび前記終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能にする方法で使用可能なように結合している。
【０４４５】
別の態様においては、発現ベクターはａ）転写開始領域、ｂ）転写終結領域、ｃ）イントロン、ｄ）読み取り枠、およびｅ）少なくとも１つのｓｉＮＡ分子の鎖をコードする核酸配列を含み、ここで前記配列は読み取り枠の３’端に使用可能なように結合しており、前記配列は前記開始領域、前記イントロン、前記読み取り枠および前記終結領域にｓｉＮＡ分子の発現および／またはデリバリーを可能にする方法で使用可能なように結合している。
【０４４６】
ＨＣＶ生物学および生物化学
１９８９年、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）はＲＮＡウィルスであると判別され、非Ａ型非Ｂ型ウィルス性肝炎として認識された（チュ−（Ｃｈｏｏ） 等、１９８９、サイエンス誌（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４４、３５９−３６２）。ＨＩＶのようなレトロウィルスとは異なり、ＨＣＶはＤＮＡ複製段階を経由せず、宿主染色体に結合するウィルスゲノムは検出されていない（ホートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ）等、１９９１年、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１４、３８１−３８８）。むしろ、コーディング（プラス）鎖の複製は、ＨＣＶ ＲＮＡのプラス鎖のコピーを複数生成させる複製（マイナス）鎖の製造により媒介される。前記ゲノムは、ポリプロテインに翻訳される単一の大きな読み取り枠からなる（カトウ（Ｋａｔｏ）等、１９９１、欧州生化学学会連合通信（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、２８０、３２５−３２８）。このポリプロテインはその後翻訳後切断を受け、複数のウィルスタンパクを生成する（ラインバッハ（Ｌｅｉｎｂａｃｈ） 等、１９９４年、ウィルス学誌（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、２０４、１６３−１６９）。
【０４４７】
ＨＣＶの９．５−キロベースゲノムの検査により、ウィルス性核酸は高い確率で突然変異をする可能性があることが実証された（スミス（Ｓｍｉｔｈ） 等、１９９７、分子進化（Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．）４５、２３８−２４６）。この突然変異の確率は、約７０％の配列同一性を共有する複数の特異的な遺伝子型の進化を導いた（シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｄｓ）等、１９９４、一般ウィルス学誌（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．）７５、１０５３−１０６１）。これらの配列が進化的に極めて現実的でないことに留意することは重要である。例えば、ヒトとチンパンジーのような霊長類の遺伝的同一性は、約９８％である。さらに、患者個人におけるＨＣＶ感染はＲＮＡレベルにおいて９８％の同一性を持つ特異的で進化する複数の準種からなることが実証された。従って、ＨＣＶゲノムは超可変であり連続的に変化する。ＨＣＶゲノムは超可変であるが、高度に保存されるゲノムの３つの領域がある。これらの保存される配列は、コアタンパク質コーディング領域の５’端と同様、５’ および３’コード領域において発生し、ＨＣＶポリプロテインの翻訳と同様、ＨＣＶＲＮＡ複製に不可欠であると考えられている。従って、これらの保存されるＨＣＶゲノム領域を標的とする治療薬は、広範囲にわたるＨＣＶ遺伝子型に十分な影響を持つ可能性がある。さらに、ＨＣＶゲノムの保存された領域に特有の酵素核酸により薬剤耐性が生じることは考えにくい。対照的に、ウィルスプロテアーゼ等の酵素の抑制を標的とする治療法では、これらのウィルス性のコードされた酵素のＲＮＡがＨＣＶゲノムの超可変な部分に位置するため、薬剤耐性菌を選択することになると考えられる。
【０４４８】
ＨＣＶに対する初期暴露後、患者の肝臓酵素には一時的上昇がみられ、これは炎症過程が生じていることを示す（オールター（Ａｌｔｅｒ） 等、シーフＬＢ（Ｓｅｅｆｆ ＬＢ）、ルイスＪＨ（Ｌｅｗｉｓ ＪＨ）編肝臓学における現在の展望（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、ニューヨーク、プレナムメディカルブックカンパニー（Ｐｌｅｎｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏ）、１９８９、８３−８９）。８３−８９）． この肝臓酵素の上昇は、初期暴露の少なくとも４週間後に生じ、最長２ヶ月間続くことがある（ファルシ（Ｆａｒｃｉ） 等、１９９１年、ニューイングランド薬学誌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３２５、９８−１０４）。肝臓酵素の上昇前に、ＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して血清中のＨＣＶ ＲＮＡを検出することが可能である（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ） 等、１９９３、アメリカ胃腸病学誌（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ 、８８、２４０−２４３）。疾病のこの段階は急性期と呼ばれており、ＨＣＶ感染による急性ウィルス性肝炎患者の７５％が無症候であるため、通常は検知されない。これらの患者の残り２５％は黄疸または肝炎のその他の症状を発症する。
【０４４９】
急性ＨＣＶ感染は両性疾患であるが、血清中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ） レベルの持続的な上昇および循環ＨＣＶＲＮＡの連続的存在により証明されるように、急性ＨＣＶ 患者の８０％、が慢性肝疾患に移行する。（ シャーロック（Ｓｈｅｒｌｏｃｋ）、１９９２、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、３３９、８０２）。１０から２０年間にわたる慢性ＨＣＶ感染の自然な進行は、患者の２０から５０％において肝硬変につながり（デイビス（Ｄａｖｉｓ）等、１９９３、病原菌と疾病（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）、２，１５０、１５４）、ＨＣＶ感染の肝細胞癌への進行は十分に立証されている（リャン（Ｌｉａｎｇ ）等、１９９３、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１８、１３２６−１３３３、トン（Ｔｏｎｇ） 等、１９９４、西欧薬学誌（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、１６０、１３３−１３８）。肝硬変および／または肝細胞癌へもっとも進行すると考えられる亜母集団を判断する研究は行われておらず、従ってすべての患者に同等の進行の危険性がある。
【０４５０】
肝細胞癌と診断された患者の生存は、初期診断後わずか０．９から１２．８ヶ月であること（タカハシ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ）等、１９９３、アメリカ胃腸病学誌（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）、８８、２４０−２４３）に留意することは重要である。化学療法薬を用いた肝細胞癌の治療は、効果が立証されておらず、また肝臓の今範囲におよぶ腫瘍浸潤のため手術によって効果を得るのは患者のわずか１０％であろう。（トリンシェット（Ｔｒｉｎｃｈｅｔ）等、１９９４、プレスメディシン（Ｐｒｅｓｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、２３、８３１−８３３）。原発性肝細胞癌の攻撃的性質を前提とすると、手術に代わって実行しうる唯一の治療は肝移植である（ピッチルマイヤー（Ｐｉｃｈｌｍａｙｒ） 等、１９９４、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２０、３３Ｓ−４０Ｓ）。
【０４５１】
肝硬変への進行の際、慢性ＨＣＶ感染の患者には臨床兆候が見られ、これは最初の原因に関わらず慢性肝硬変にはよく起こることである。（ダミコ（Ｄ’Ａｍｉｃｏ） 等、１９８６、消化器系疾患および科学（Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、３１、４６８−４７５）。３１，４６８−４７５）。 これらの臨床兆候は、出血性食道静脈瘤、腹水症、黄疸、および脳症が含まれることがある。（ザキムＤ（Ｚａｋｉｍ Ｄ）、ボイヤーＴＤ（Ｂｏｙｅｒ ＴＤ）、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）肝疾患のテキスト第２版第１巻、１９９０、Ｗ．Ｂ． サンダースカンパニー（Ｗ．Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ）、フィラデルフィア）。肝硬変の初期段階では、患者は代償性として分類され、肝臓組織の損傷が生じていても患者の肝臓がまだ血流中の代謝産物を解毒化できる段階である。加えて、代償性肝疾患患者のほとんどは無症候であり、症状のある小数の患者も消化不良および脱力感等の軽度の症状を訴えるのみである。肝硬変の後期段階では、患者は非代償性と分類され、血流中の代謝産物を解毒化する能力が減退している段階である。上述した臨床兆候が存在するのはこの非代償性段階である。
【０４５２】
１９８６年、ダミコ（Ｄ’Ａｍｉｃｏ） らは、アルコール性およびウィルス性肝硬変両方の患者１１５５人について臨床兆候および生存率について記述している（ダミコ（Ｄ’Ａｍｉｃｏ）（上述））。１１５５人の患者のうち、研究開始時には７０％が無症候であったにもかかわらず、４３５人（３７％） が代償性疾患であった。残り７２０人の患者（６３％） は非代償性肝疾患であり、７８％ が腹水症、３１％ が黄疸、１７％が出血、および１６％が脳症の病歴を持っていた。肝細胞癌は代償性疾患を持つ７人（０．５％） の患者および非代償性疾患を持つ３０人（２．６％） の患者に見られた。
【０４５３】
６年にわたる進行で、代償性肝硬変を持つ患者は年間１０％の割合で非代償性疾患の臨床兆候を発症した。ほとんどの場合において、代償不全の最初の現れは腹水症であった。加えて、肝細胞癌は６年間の研究が終了するまでに、初期に代償性疾患を示した５９人の患者に発症した。
【０４５４】
生存については、ダミコ（Ｄ’Ａｍｉｃｏ）の研究では、この研究のすべての患者の５年生存率はわずか４０％であることが示されている。初期に代償性疾患を持っていた患者の６年生存率は５４％であり、一方初期に非代償性疾患を持っていた患者の６年生存率はわずか２１％であった。アルコール性肝硬変患者とウィルス関連の肝硬変患者の生存率の間には大きな違いはなかった。ダミコ（Ｄ’Ａｍｉｃｏ）の研究における患者の死の主な原因は、肝疾患４９％、肝細胞癌２２％、および出血１３％ であった（ダミコ（Ｄ’Ａｍｉｃｏ）（上述））。
【０４５５】
慢性Ｃ型肝炎はゆっくり進行する肝臓の炎症性疾患であり、１０年から２０年かけて肝硬変、肝不全、および／または肝細胞癌につながり得るウィルス（ＨＣＶ） により媒介される。米国では、ＨＣＶ感染が米国において年間新たに５０，０００件の急性肝炎の原因となると見積もられている（Ｃ型肝炎管理に関するＮＩＨコンセンサス開発会議声明書（ＮＩＨ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ）、１９９７年３月）。米国におけるＨＣＶの患者数は１．８％と見積もられており、疾病対策予防センター（ＣＤＣ）は慢性的に感染しているアメリカ人の数は約４，５００万人と認識している。またＣＤＣ は年間最大１０，０００人の死亡が慢性ＨＣＶ感染によるものであるとも推定している。
【０４５６】
慢性ＨＣＶ感染の治療における、インターフェロン（ＩＦＮ−アルファ）を用いるよく管理された多数の臨床試験は、週３回の治療により、約５０％（４０％−７０％）の患者において６ヶ月の治療が終了するまでに血清ＡＬＴ値が低下することを実証した（デイビス（Ｄａｖｉｓ）等、１９８９、ニューイングランド薬学誌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３２１、１５０１−１５０６、マルセラン（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ）等、１９９１、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１３、３９３−３９７、トン（Ｔｏｎｇ） 等、１９９７年、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２６、７４７−７５４、トン（Ｔｏｎｇ） 等、１９９７年、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、２６、１６４０−１６４５）。しかし、インターフェロン治療中止後、反応のあった患者の約５０％が再発し、結果として血清ＡＬＴ濃度約２０−２５％の正常化により判断されるような”耐久性”反応割合が生じた
。
【０４５７】
ＨＣＶ ＲＮＡの直接測定は、分岐ＤＮＡまたは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析のいずれかを使用することにより可能である。概して、ＲＴ−ＰＣＲ法はより慎重を期すものであり、臨床経過のより正確な評価をもたらす（トン（Ｔｏｎｇ）等（上述））。臨床的エンドポイントとしてＨＣＶ ＲＮＡ値の変化を使用したＩ型インターフェロン治療を６ヶ月間検査した研究により、患者の最大３５％が治療終了までにＨＣＶ ＲＮＡを消失することが実証された（マルセラン（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ）等（上述））。しかし、ＡＬＴエンドポイントを用いた場合、患者の約５０％が治療中止後６ヶ月以内に再発し、結果として耐久性ウィルス応答が生じたのはわずか１２％ であった（マルセラン（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ）等（上述））。４８週間の治療を検査した研究により、持続性ウィルス学的応答は最大２５％ であることが実証された（ＮＩＨコンセンサス声明書（ＮＩＨ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ）、１９９７）。従って、Ｉ型インターフェロンを用いた慢性ＨＣＶ感染治療用の基準は、現在のところ、ＨＣＶ ＲＮＡ濃度の変化を有効性の一次評価として使用する４８週間の治療である（フーフナグル（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ）等、１９９７、ニューイングランド薬学誌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３３６、３４７−３５６）。
【０４５８】
Ｉ型インターフェロンを用いた治療の結果生じる副作用は、（１） インフルエンザ様症状、（２）神経精神症状、（３） 検査所見の異常、および（４） 種々雑多の、大まかに４つのカテゴリーに分けることができる（ダシェコ（Ｄｕｓｈｅｉｋｏ） 等、１９９４、ウィルス性肝炎学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖ ｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）、１、３−５）。インフルエンザ様症状の例には、疲れ、発熱、筋肉痛、倦怠感、食欲不振、品脈、悪寒、頭痛、および関節痛が含まれる。インフルエンザ様症状は、通常短期間であり投薬最初の４週間の後で和らぐ傾向にある（ダシェコ（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ ）等（上述））。神経精神副作用には興奮性、無気力、情緒の変化、不眠症、認知変化、および鬱病が含まれる。これらの神経精神副作用の最重要点は、鬱病および鬱病歴のある患者にはＩ型インターフェロンを与えてはならないということである。検査所見の異常には、顆粒球、血小板および、程度は低いにせよ赤血球を含む骨髄性細胞の減少が含まれる。血球数におけるこれらの変化が重要な臨床的続発症につながることは稀である（ダシェコ（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ）等（上述））。加えて、トリグルセリド濃度の増加ならびに血清中アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ濃度の上昇が見られた。最後に、甲状腺異常が報告された。これらの甲状腺異常は通常、インターフェロン治療の中止後に改善可能であり、治療中は適切な投薬により制御することが可能である。種々雑多な副作用には、吐き気、下痢、腹痛および背痛、掻痒、脱毛症、および鼻漏が含まれる。概して、ほとんどの副作用は、治療の４から８週間後に和らぐ（ダシェコ（Ｄｕｓｈｉｅｋｏ）等（上述））。
【０４５９】
ＨＣＶ遺伝子および細胞／宿主遺伝子を標的とする低分子干渉核酸分子およびの使用は、ＨＣＶライフサイクルと関連して標的としており、従ってＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、もしくは対象または生物体におけるＨＣＶ遺伝子の調節（例、抑制）に対応するその他の疾病または症状の治療および診断に使用することができる新規治療薬を提供する。
【０４６０】
以下は、本発明の核酸の選択、単離、合成および活性を示す、限定を目的としない例である。
【実施例１】
【０４６１】
ｓｉＮＡ構造のタンデム合成
典型的な本発明のｓｉＮＡ 分子を、例えばスクシニルに基づくリンカーのような切断可能なリンカーを用いて、タンデムに合成する。本明細書で述べたように、タンデム合成の後、高収量でＲＮＡｉ分子を供給するワンステップ精製過程が行われた。このアプローチは、高処理能力のＲＮＡｉスクリーニングの一助としてｓｉＮＡ合成に適しており、マルチカラムもしくはマルチウェルシステムプラットホームに容易に適応することができる。
【０４６２】
ｓｉＮＡ オリゴと５'端のジメトキシトリチル（５'−Ｏ−ＤＭＴ） 基がそのまま残った（トリチルオン合成）相補オリゴのタンデム合成の完了後、オリゴヌクレオチドは上述のように脱保護される。脱保護後、ｓｉＮＡ配列鎖は自然にハイブリダイズされる。このハイブリダイゼーションは、一方の鎖が５'−Ｏ−ＤＭＴ基を保持し、一方で相補鎖が末端５'−ヒドロキシルを含む二重鎖を生じる。一方の分子のみがジメトキシトリチル基を持つにも関わらず、新規に形成された二重鎖は、ルーチンの固相抽出精製（トリチルオン精製）のあいだ単一分子のように振舞う。この鎖は安定な二重鎖由来であるため、このジメトキシトリチル基（またはその他のトリチル基、またはその他の疎水性部分のような同等の基）だけで、例えばＣ１８カートリッジを用いることによって、一対のオリゴを精製することができる。
【０４６３】
逆位のデオキシ脱塩基コハク酸、またはグリセリルコハク酸リンカー（図１参照）、または同等の切断可能なリンカーのようなタンデムリンカーを導入する目的で、標準的なホスホラミダイト合成化学反応を用いる。限定を目的としないリンカーカップリング条件で利用可能な例は、ブロモトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒＯＰ） のような活性化試薬の存在下で、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＡ）および／またＤＭＡＰのような障害塩基を含む。リンカーをカップリングした後、標準的な合成化学反応を利用して末端の５'−Ｏ−ＤＭＴをそのまま残したままの第二の配列の合成を完了させる。合成の後、この結果合成されたオリゴヌクレオチドを、本明細書に記載した過程に従って脱保護し、例えば５０ｍＭ ＮａＯＡｃまたは１．５Ｍ ＮＨ４Ｈ２ＣＯ３のような適切なバッファーでクェンチする。
【０４６４】
二重鎖ｓｉＮＡの精製は、例えば、ウォーターズ社（Ｗａｔｅｒｓ ）のＣ１８ＳｅｐＰａｋｌｇカートリッジを用いて、１カラム容量（ＣＶ）のアセトニトリル、２ＣＶのＨ２Ｏ、および２ＣＶの５０ｍＭ ＮａＯＡｃ で、固相抽出精製を用いて容易に達成される。試料をロードした後、１ＣＶのＨ２Ｏまたは５０ｍＭ ＮａＯＡｃで洗浄する。故障配列をＩＣＶ１４％ ＡＣＮ （５０ｍＭ ＮａＯＡｃ と５０ｍＭ ＮａＣＩの水溶液）で溶出する。カラムをその後、例えば１ＣＶのＨ２Ｏ で洗浄し、次いで、例えば１ＣＶの１％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液をカラムに通した後、２回目の１ＣＶの１％のＴＦＡ酢酸水溶液をカラムに加え約１０分間放置することによって、カラム上、脱トリチル化を行う。残留ＴＦＡ溶液を除き、カラムをＨ２Ｏ、次いで１ＣＶの１Ｍ ＮａＣｌ、さらにＨ２Ｏ で洗浄する。二重鎖ｓｉＮＡ産物をその後、例えば、１ＣＶの２０％ＣＡＮ水溶液を用いて溶出する。
【０４６５】
図２は、精製されたｓｉＮＡ 構造のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の例であり、それぞれのピークは、ｓｉＮＡ二重鎖のそれぞれのｓｉＮＡ鎖の計算上の質量に一致する。同一の精製ｓｉＮＡは、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）による解析では三つのピークを与え、一つのピークはおそらく二重鎖ｓｉＮＡに相当し、二つのピークはおそらく分離したｓｉＮＡ配列鎖に相当する。同一のｓｉＮＡ構造のイオン交換ＨＰＬＣ分析では、単一ピークのみを示す。精製ｓｉＮＡ構造の、後述のルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたテストでは、別々に合成されたオリゴヌクレオチド配列鎖から生成されたｓｉＮＡ構造と比較して、同等のＲＮＡｉ活性が示された。
【実施例２】
【０４６６】
任意のＲＮＡ配列中の潜在的ｓｉＮＡ標的部位の特定
ウィルスやヒトｍＲＮＡ転写物のような、関連のＲＮＡ標的の配列は、例えば、コンピューターの折り畳みアルゴリズムを用いることによって標的部位を選別する。限定を目的としない例において、ジンバンクのようなデータベース由来の遺伝子配列またはＲＮＡ 遺伝子転写物を用いて、標的に相補性を持つｓｉＮＡ標的を作成する。このような配列はデータベースから得ることができ、もしくは当該分野で知られているように、実験的に決定することができる。例えば変異や欠失を含んでいるリボザイム、またはアンチセンス、または疾患や病状、形質、遺伝子型もしくは表現型に関連していることが知られているそれらの部位、といった、例えばその他の核酸分子の研究に基づく効果的な標的部位であると決定された既知の標的部位は、その部位を標的とするｓｉＮＡ分子のデザインに用いることができる。標的ＲＮＡ中のどの部位が最も適切な標的部位かを決定するには、様々なパラメーターが用いられる。これらのパラメーターは、ＲＮＡの２次、３次構造、標的配列のヌクレオチド塩基組成、標的配列の様々な領域間の相同性の程度、またはＲＮＡ転写物中の標的配列の相対位置を含むが、これらに限定されない。これらの決定に基づいて、ｓｉＮＡ分子の効率を審査するためにＲＮＡ転写物中に任意の数の標的部位を、例えば、インビトロＲＮＡ切断アッセイ、細胞培養、または動物モデルを用いて選ぶことができる。限定を目的としない例において、用いられるｓｉＮＡ構造のサイズに応じ、転写産物内に１から１０００の任意の標的部位が選ばれる。当該分野で知られているマルチウェルまたはマルチプレートアッセイ、またはｓｉＮＡの組み合わせライブラリーのスクリーニングアッセイ方法を用いることによって、ｓｉＮＡ分子のスクリーニングのための標的遺伝子の発現の効果的な減少を測定する高処理能力のスクリーニングアッセイが開発可能である。
【実施例３】
【０４６７】
ＲＮＡ中の部位を標的とするｓｉＮＡ分子の選択
以下の限定を目的としない方法を用いて、遺伝子配列または転写物を標的とするｓｉＮＡを選択することができる。
【０４６８】
１． 標的配列は、標的配列中に含まれる全ての断片のリスト、または特定の長さの部分配列、例えば２３ヌクレオチドの断片のリストとしてコンピューター上で解析される。この手法は、一般的には特注のパールスクリプトを用いて行われるが、オリゴ（Ｏｌｉｇｏ）、マックベクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）、またはＧＣＧウィスコンシンパッケージ（ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ） でも同様に使用することができる。
【０４６９】
２．ある態様においてｓｉＮＡは１つより多い標的配列に対応し、それは例えば同じ遺伝子の異なる転写物を標的としたり、１つより多い遺伝子の異なる転写物を標的とする、またはヒト遺伝子と動物の相同遺伝子両方を標的とする事例である。この場合、特定の長さの部分配列のリストがそれぞれの標的に対して作成され、次にそれぞれのリストで一致する配列を見つけるために比較が行われる。ほとんどの、または全ての標的配列に存在している部分配列を見つけるのを目的として、部分配列は任意の配列を含む標的配列の数によって順位付けされる。あるいは、この順位付けは変異標的配列のような、標的配列に固有の部分配列を特定することができる。このようなアプローチは、正常配列の発現には影響せずに変異配列を特異的に標的とするためのｓｉＮＡ使用を可能にするであろう。
【０４７０】
３．ある態様においては、ｓｉＮＡ部分配列が望ましい標的配列には存在するが、１つ以上の配列では欠失しており、このようなパラログファミリー遺伝子が存在する遺伝子をｓｉＮＡが標的とする場合には、パラログは標的から外れることになる。上述の事例２として、特定の長さの部分配列のリストがそれぞれの標的に対して作成され、次にそれぞれのリストで標的遺伝子に存在するが、標的としないパラログには存在しない配列を見つけるために比較が行われる。
【０４７１】
４．順位付けされたｓｉＮＡ 部分配列はさらに解析され、ＧＣ含有量によって順位付けされることができる。ＧＣを３０−７０％含んでいる部位に優先順位が与えられ、ＧＣを４０−６０％含んでいる部位にさらに優先順位が与えられる。
【０４７２】
５．順位付けされたｓｉＮＡ 部分配列はさらに解析され、自己折り畳みと内部ヘアピンによって順位付けされることができる。弱い内部折り畳みが優先で、強いヘアピン構造は避けられる。
【０４７３】
６．順位付けされたｓｉＮＡ 部分配列はさらに解析され、配列中にＧＧＧまたはＣＣＣ の連続があるかどうかによって順位付けされることができる。いずれかの鎖のＧＧＧ（ もしくは更に多くのＧ） は、オリゴヌクレオチド合成に問題を生じる場合があり、またＲＮＡｉ活性を妨げる恐れがあり得るので、ほかに適切なふさわしい配列があれば避ける。 ＣＣＣ は、アンチセンス鎖にＧＧＧが対応するので、標的鎖で調査される。
【０４７４】
７．順位付けされたｓｉＮＡ 部分配列は更に解析され、配列の３'端にＵＵのジヌクレオチド（ウリジンジヌクレオチド）を有するかどうか、および／または配列の５' 端にＡＡ（アンチセンス配列に３' ＵＵをもたらす）があるかどうかによって順位付けされることができる。これらの配列は、ＴＴチミジンジヌクレオチド末端のｓｉＮＡ分子をデザインできる。
【０４７５】
８．上述したような順位付けされた部分配列のリストから、４つか５つの標的部位を選ぶ。例えば、２３ヌクレオチドを有する部分配列においては、それぞれ選ばれた２３塩基長の配列の右２１ヌクレオチドがデザインされ、ｓｉＮＡ二重鎖の上側の（センス）鎖として合成され、一方、それぞれ選ばれた２３塩基長の配列の左２１ヌクレオチドの逆方向の相補ヌクレオチドがデザインされ、ｓｉＮＡ 二重鎖の下側の（アンチセンス）鎖として合成される（表ＩＩおよびＩＩＩ参照）。末端ＴＴ残基が（第７段落で述べたように）配列に望まれる場合、センスおよびアンチセンス双方の鎖の二つの３' 末端ヌクレオチドはオリゴの合成前にＴＴに置き換えられる。
【０４７６】
９．ｓｉＮＡ分子を、最も活性が高いｓｉＮＡ分子を特定するため、または標的ＲＮＡ 配列中の最も望ましい標的部位を特定するために、インビトロ、細胞培養、または動物モデル系で選択する。
【０４７７】
１０．標的核酸配列を選択する際にはその他のデザイン考察を使用することができ、例えばレナルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）等、２００４、 ネイチャーバイオテクノロジー電子出版（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、２００４年２月１日、電子版デジタルオブジェクト識別子：１０．１０．１０３８／ｎｂｔ９３６およびウイテイ（Ｕｉ−Ｔｅｉ） 等、２００４、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、３２、電子版デジタルオブジェクト識別子：１０．１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｈ２４７を参照のこと。
【０４７８】
代替のアプローチにおいて、ＨＣＶ標的配列に特異的なｓｉＮＡ構造のプールは、ヒト肝細胞（Ｈｕｈ７）細胞のようなＨＣＶ ＲＮＡを発現している細胞の標的部位の選択に用いられる（例えばランドール（Ｒａｎｄａｌｌ） 等、２００３、米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、１００、２３５−２４０を参照）。
【０４７９】
このアプローチに用いられる一般的な戦略を図９に示す。限定を目的としないこのようなプールの例は、配列番号１−２０２７のいずれかを含むプールである。ＨＣＶを発現している細胞はｓｉＮＡ構造のプールでトランスフェクションされ、ＨＣＶ抑制に関連した表現型を示す細胞が分類される。ｓｉＮＡ構造のプールは、適切なベクターに挿入された転写カセットから発現されることができる（例えば図７および図８を参照）。表現型の変化（例、ＨＣＶｍＲＮＡレベルの減少またはＨＣＶタンパク質発現の減少）で陽性を示している細胞由来のｓｉＮＡは、標的ＨＣＶ ＲＮＡ 配列内の最も適切な標的部位を決定するために配列される。
【実施例４】
【０４８０】
ＨＣＶ標的ｓｉＮＡデザイン
ｓｉＮＡ標的部位をＨＣＶＲＮＡ標的の配列解析によって選び、任意で、実施例３で述べたようなｓｉＮＡ分子のライブラリを用いて、あるいは本明細書の実施例６で述べられるようなインビトロｓｉＮＡシステムを用いて、折り畳み基盤（ｓｉＮＡの標的への接近可能性を決定するために解析された任意の配列の構造）上の標的部位の優先順位付けを行った。ｓｉＮＡ分子はそれぞれの標的に結合できるようデザインされ、任意でｓｉＮＡ分子が標的配列と相互作用できるかどうか評価するために、個別にコンピューターで折り畳みが解析された。様々なｓｉＮＡ分子の長さが、活性を最適化するために選ばれる可能性がある。概して、標的ＲＮＡと結合または相互作用するのに十分な数の相補的ヌクレオチド塩基が選ばれるが、相補性の度合いはｓｉＮＡ 二重鎖に適応するように調節することができ、または長さや塩基組成は様々である。このような方法を用いることにより、例えば任意の遺伝子転写物に相当するＲＮＡ配列のように、任意の既知のＲＮＡ配列中の部位を標的とするようにｓｉＮＡ分子をデザインすることができる。
【０４８１】
化学的に修飾されたｓｉＮＡ 構造は、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保ちつつ、インビボでの全身投与のためのヌクレアーゼ安定性、および／また薬物動態、局在、およびデリバリー特性を提供するようにデザインされる。本明細書で述べられるように、本明細書で述べるような、または当該分野で一般的に知られている合成的な方法を用いて化学的修飾を合成的に導入する。次に、合成ｓｉＮＡ構造の、血清中、および／また細胞／組織抽出物（例えば肝臓抽出物）中のヌクレアーゼ安定性を試験する。本明細書で述べられたルシフェラーゼレポーターアッセイのような適切なアッセイ、またはその他のＲＮＡｉ活性を定量できるその他の適切なアッセイを用いて、合成ｓｉＮＡ構造のＲＮＡｉ活性も並行して試験する。ヌクレアーゼ安定性とＲＮＡｉ活性の両方を有する合成ｓｉＮＡ構造は、更に修飾され、安定性と活性アッセイで再評価されることができる。例えば治療成果をもたらす主要なｓｉＮＡ組成物（例、図１１を参照）を選ぶための標的スクリーニングアッセイで、安定化された活性なｓｉＮＡ 構造の化学修飾を、任意の選ばれたＲＮＡを標的とする任意のｓｉＮＡ配列に適合し使用することができる。
【実施例５】
【０４８２】
ｓｉＮＡの化学合成と精製
ｓｉＮＡ分子は、例えば、本明細書で述べられるＲＮＡ配列中の標的配列のような、ＲＮＡ メッセージ中の様々な部位と相互作用するようデザインすることができる。ｓｉＮＡ分子の一方の鎖の配列は、上述の標的部位配列に相補的である。ｓｉＮＡ分子は本明細書で述べられる方法を用いて化学的に合成することができる。コントロール配列として用いられる不活性ｓｉＮＡ分子は、標的配列と相補的にならないようにｓｉＮＡ分子の配列を混ぜ合わせることによって合成することができる。概して、ｓｉＮＡ構造は本明細書で述べられたような固相オリゴヌクレオチド合成法を用いて合成することができる（例えば、その全体を参照することによりすべて本明細書に組み込まれる、ウスマン（Ｕｓｍａｎ ）等、米国特許番号５，８０４，６８３；５，８３１，０７１；５，９９８，２０３；６，１１７，６５７；６，３５３，０９８；６，３６２，３２３；６，４３７，１１７；６，４６９，１５８；スケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）等、米国特許番号６，１１１，０８６；６，００８，４００；６，１１１，０８６を参照）。
【０４８３】
限定を目的としない例において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、当該分野で知られているようなホスホラミダイト化学反応を用いる段階的な方法で合成される。標準的なホスホラミダイト化学反応は、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル、２'−Ｏ−タートブチルジミチルシリル、３'−Ｏ−２−シアノエチルｌＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト基、および環外アミノ保護基（例、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４アセチルシチジン、およびＮ２−イソブチリルグアノシン）のいずれかを含むヌクレオチドの利用を伴う。あるいは、上述のスケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ）によって述べられるようなＲＮＡ合成における、酸に不安定な２'−Ｏ−オルトエステル保護基との結合に２'−Ｏ−シリルエステルを用いることができる。異なる２’化学反応は、例えば、その全体を参照することにより本明細書に組み込まれる、ウスマン（Ｕｓｍａｎ）等、米国特許番号５，６３１，３６０で述べられている、Ｎ−フタロイル保護に利用できる２’−デオキシ−２’−アミノヌクレオチドのように、異なる保護基を要求することができる。
【０４８４】
固相合成の間、それぞれのヌクレオチドは連続的に（３'−から５'−方向に）固相支持体結合オリゴヌクレオチドに加えられる。鎖の３' 端の最初のヌクレオチドは、様々なリンカーを用いて、固相（例、調節された微細孔ガラスまたはポリスチレン）に共有的に結合されている。ヌクレオチド前駆体であるリボヌクレオチドホスホラミダイト、および活性化剤が混合すると、最初のヌクレオチドの５' 端に第二のヌクレオチドホスホラミダイトのカップリングが生じる。支持体を洗浄し、未反応の５'−ヒドロキシル基を無水酢酸のようなキャップ試薬でキャップして、不活性な５'−アセチル部分を生成する。三価のリン結合をより安定なリン酸結合にするために酸化する。ヌクレオチド添加サイクルの終わりに、適切な条件下（例、トリチルに基づく基では酸性条件、シリルに基づく基にはフッ素）で５'−Ｏ−保護基を切断する。各部分配列ヌクレオチドごとにこのサイクルを繰り返す。
【０４８５】
カップリング効率を最適化するために、例えば、合成されるｓｉＮＡの特定の化学組成によって、異なるカップリング時間、異なる試薬／ホスホラミダイト濃度、異なる接触回数、異なる固相支持体、および固相支持体リンカー化学反応を用いることによって、合成条件を変更することができる。ｓｉＮＡの脱保護および精製は、ウスマン（Ｕｓｍａｎ） ら、米国特許番号５，８３１，０７１、米国特許番号６，３５３，０９８、米国特許番号６，４３７，１１７、およびベロン（Ｂｅｌｌｏｎ）米国特許番号６，０５４，５７６、米国特許番号６，１６２，９０９、米国特許番号６，３０３，７７３、あるいは、上述のスケアリンジ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ） に概して述べられているように実行されることができ、これらの文献は参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。加えて、脱保護の条件は可能な限り最高の収量とｓｉＮＡ構造の純度が得られるように変更することができる。例えば、出願人は、２'−デオキシ−２' −フルオロヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドが、不適切な脱保護条件下で分解する場合があることを観察した。このようなオリゴヌクレオチドを、メチルアミン水を用いて約３５℃で、３０分間脱保護する。２' −デオキシ−２'−フルオロを含むヌクレオチドがリボヌクレオチドも含む場合には、メチルアミン水を用いて約３５℃ で、３０分間脱保護した後、ＴＥＡ−ＨＦを加え、約６５℃でさらに１５分間反応を維持する。
【実施例６】
【０４８６】
ｓｉＮＡ活性評価のためのインビトロＲＮＡｉアッセイ
無細胞系でＲＮＡｉを再現するインビトロアッセイを用いて、ＨＣＶ ＲＮＡ標的をターゲティングするｓｉＮＡ構造の評価を行う。このアッセイは、トゥッシェル（Ｔｕｓｃｈｌ） 等、１９９９、遺伝子と発生誌（Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１３，３１９１−３１９７およびザモーレ（Ｚａｍｏｒｅ） 等、２０００、セル誌（Ｃｅｌｌ）、１０１、２５−３３によって述べられる、ＨＣＶ標的ＲＮＡとともに使用する目的に適合したシステムを含む。ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） のシンチウム胚盤葉由来の抽出液を用いて、インビトロのＲＮＡｉ活性を再構成する。標的ＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて適切なプラスミドからインビトロ転写することによって、または本明細書で述べるような化学合成によって作成される。センスおよびアンチセンスｓｉＮＡ鎖（例えば、それぞれ２０ｕＭ）を、緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ 、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中、９０℃ で１分間、次いで３７℃で１時間のインキュベートによってアニールし、溶解緩衝液（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）で希釈する。アニーリングはＴＢＥ緩衝液中のエチジウムブロマイドで染色したアガロースゲルでゲル電気泳動し、モニターすることができる。オレゴンＲ（Ｏｒｅｇｏｎ Ｒ） 系のハエの、酵母を塗ったモラセス寒天上で回収したゼロから２時間の胚を用いて、ショウジョウバエ溶解液を調製する。溶解液を遠心分離機にかけ、上澄を分離する。アッセイは、５０％溶解液［ｖｏｌ／ｖｏｌ］、ＲＮＡ （終濃度１０−５０ｐＭ）、および１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］のｓｉＮＡを含む（終濃度１０ｎＭ）溶解緩衝液を含んでいる反応混合液を含む。反応混合液は、１０ｍＭクレアチンリン酸、１０ｕｇ．ｍｌクレアチンホスホキナーゼ、１００ｕＭＧＴＰ、１００ｕＭ ＵＴＰ 、１００ｕＭ ＣＴＰ 、５００ｕＭ ＡＴＰ、５ｍＭ ＤＴＴ、０．１Ｕ／ｕＬ ＲＮａｓｉｎ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、およびそれぞれ１００ｕＭのアミノ酸も含む。酢酸カリウムの終濃度は１００ｍＭに調節する。反応液を氷上で予め混合し、ＲＮＡを加える前に２５℃ で１０分間プレインキュベートし、その後２５℃ でさらに６０分間インキュベートする。反応液を４倍量の１．２５ｘ受動的溶解緩衝液（Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）） でクェンチする。標的ＲＮＡの切断を、ＲＴ−ＰＣＲ解析、または当該分野で知られているその他の方法でアッセイし、反応液からｓｉＮＡが除外されたコントロール反応と比較する。
【０４８７】
あるいは、アッセイのために内部標識された標的ＲＮＡを、［ａｌｐｈａ−３２Ｐ］ＣＴＰ 存在下でのインビトロ転写で調製し、スピンクロマトグラフィーによってＧ５０セファデックスカラムに通し、更なる精製なしに標的ＲＮＡとして用いる。任意で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ酵素を用いて標的ＲＮＡを５'−３２Ｐ−末端標識する。アッセイを上述のように実行し、ＲＮＡｉによって生じた標的ＲＮＡと特異的ＲＮＡ切断産物を、ゲルのオートラジオグラフで視覚化する。切断の割合を、無傷のコントロールＲＮＡ、またはｓｉＮＡなしのコントロール反応からのＲＮＡ とアッセイによって生じた切断産物を表すバンドの、ホスホイメージャー（登録商標）（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｉｍａｇｅｒ（登録商標））による定量によって測定する。
【０４８８】
一実施形態において、このアッセイは、ｓｉＮＡに媒介されるＲＮＡｉ切断のためのＨＣＶＲＮＡ標的の標的部位を決定するために用いられ、ここで複数のｓｉＮＡ構造は、ＲＮＡｉに媒介されたＨＣＶ ＲＮＡ標的の切断のために、例えば標識された標的ＲＮＡの電気泳動によって、またはノーザンブロット、同様に当該分野でよく知られているその他の方法によって、アッセイ反応液が解析されることにより選択される。
【実施例７】
【０４８９】
ＨＣＶ標的ＲＮＡの核酸阻害
ヒトＨＣＶ ＲＮＡを標的としたｓｉＮＡ分子は、上述のようにデザインされ合成される。これらの核酸分子は、例えば以下のような方法を用いて、インビボでの切断活性を試験することができる。ＨＣＶ ＲＮＡ内における標的配列およびヌクレオチド位置を表ＩＩおよびＩＩＩに示す。
【０４９０】
ＨＣＶを標的とするｓｉＮＡの効率を試験するために、二つの形式が用いられる。第一は、ＲＮＡおよびタンパク質阻害の程度を測定するため、試薬を細胞培養で、例えばヒト肝細胞癌（Ｈｕｈ７） を使用して試験する。ｓｉＮＡ試薬（例、表ＩＩおよびＩＩＩ参照）は、本明細書に記載のようにＨＣＶ 標的に対して選択される。ＲＮＡ阻害は、例えば上皮角化細胞への適切なトランスフェクション媒介物によるこれらの試薬のデリバリー後に測定される。アクチンに対する標的ＲＮＡの相対量は、増幅のモニターであるリアルタイムＰＣＲ（例えば、アプライドバイオシステムズ社７７００タックマン（ＡＢＩ７７００ＴＡＱＭＡＮ））を用いて測定される。無関係の標的にとなったオリゴヌクレオチド配列の混合物、または同一の全長と化学組成であるが各位置のヌクレオチドがランダムに置換された、ランダムに選ばれたｓｉＮＡコントロールに対して、比較を行う。標的への第一および第二の主要試薬を選び、最適化を行う。最適なトランスフェクション媒体の濃度を選択した後、主要ｓｉＮＡ分子でＲＮＡ阻害の経時的解析を実行する。加えて、ＲＮＡ阻害を測定するために、細胞プレーティングフォーマットを用いることもできる。
【０４９１】
加えて、ＲＮＡ阻害を測定するために、細胞プレーティングフォーマットを用いることもできる。ＨＣＶ ＲＮＡのｓｉＮＡ干渉阻害をアッセイするための複数の標的スクリーンの限定を目的としない例を、図２８に示す。ｓｉＮＡ構造（表ＩＩＩ）は、２５ｎＭでＨｕｈ７細胞にトランスフェクションされ、ＨＣＶ ＲＮＡは未処理細胞（表の「細胞」の列）およびリポフェクタミン（表の「ＬＦＡ２Ｋ」の列）を用いてトランスフェクションされた細胞と比較して定量される。図２８に示すように、いくつかのｓｉＮＡ構造は、Ｈｕｈ７レプリコンシステムにおいてＨＣＶ ＲＮＡ発現の顕著な阻害を示す。このシステムはライス（Ｒｉｃｅ）等、米国５，８７４，５６５および米国６，１２７，１１６に記載され、参照することにより両書は本明細書に組み込まれる。
【０４９２】
細胞へのｓｉＮＡのデリバリー
ＨＣＶ下位ゲノムレプリコンクローンＡまたはアバ（Ａｖａ．）５を用いて安定的にトランスフェクションされるＨｕｈ７ｂ細胞に、トランスフェクションの前日に、例えばＤＭＥＭ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ） 中の９６ウェルプレートでウェルあたり８．５ｘ１０３細胞で種子を蒔く。ｓｉＮＡ（終濃度は例えば２５ｎＭ）およびカチオン脂質リポフェクタミン２０００（例、終濃度０．５ｕｌ／ウェル）を、オプティメム（Ｏｐｔｉｍｅｍ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃で２０分間、ポリプロピレンマイクロチューブで混合する。渦形成後、複合ｓｉＮＡを各ウェルに加え、２４−２７時間インキュベートする。
【０４９３】
タックマン（ＴＡＱＭＡＮ）治療時間ＰＣＲ増幅モニタリングおよびライトサイクラー（Ｌｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ）によるｍＲＮＡの定量
総ＲＮＡは、例えば大規模な抽出のためのアンビオンＲｎアクオス（Ａｍｂｉｏｎ Ｒｎａ ｑｕｅｏｕｓ）４−ＰＣＲ精製キット、または９６ウェルアッセイのためのアンビオンＲｎアクオス（Ａｍｂｉｏｎ Ｒｎａｑｕｅｏｕｓ）−９６精製キットを使用し、ｓｉＮＡデリバリーに続いて細胞から調製される。タックマン（Ｔａｑｍａｎ）解析には、二色素標識されたプローブがレポーター色素、ＦＡＭまたはＪＯＥで合成され、５'端に共有結合され、クエンチャー色素のＴＡＭＲＡは３'端に結合される。ワンステップＲＴ−ＰＣＲ増幅は、例えば、アプライドシステムズ社プリズム７７００（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００）配列検出機で、１０μｌのトータルＲＮＡ、１００ｎＭのフォワードプライマー、９００ｎＭ のリバースプライマー、１００ｎＭのプローブ、１Ｘタックマン（Ｔａｑｍａｎ）ＰＣＲ反応緩衝液（パーキンエルマー・アプライドシステムズ社（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、５．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰをそれぞれ１００μＭ、０．２Ｕリボヌクレアーゼ阻害剤（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、０．０２５Ｕアンプリタックゴールド（ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ）（パーキンエルマー・アプライドシステムズ社（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））および０．２ＵＭ−ＭＬＶ逆転酵素（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））、で構成される５０μｌの反応液を用いて行われる。温度サイクリング条件は、４８℃で３０分、９５℃で１０分、次いで４０サイクルの９５℃で１５秒、６０℃で１分、で構成されるｋどえる。標的ｍＲＮＡレベルの定量は、全細胞ＲＮＡの希釈系列（３００、１００、３０、１０ｎｇ／反応）から生成された標準に対する相対値として測定され、同時に実行された３６Ｂ４ｍＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのタックマン（Ｔａｑｍａｎ）反応に対して標準化される。ＨＣＶレプリコンＲＮＡ定量には、以下のようなネオマイシン遺伝子に対して特異的なＰＣＲプライマーおよびプローブを使用した。
ネオフォワードプラーマー、５’−ＣＣＧＧＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＡＴＴＣ−３’（配列番号：２０３２）ネオリバースプライマー、５’−ＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧ−３’（配列番号：２０３３ネオプローブ、５’ＦＡＭ−ＡＣＡＴＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＧＡＧＣＡＣＧＴＡＣ−ＴＡＭＡＲＡ３’（配列番号：２０３４）である。標準化には、以下のような３６Ｂ４ＰＣＲ プライマーおよびプローブを使用した。
ＥＭＩ１７３．２３６Ｂ４−フォワードプライマー、５’−ＴＣＴＡＴＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＣＡＡＡＣＧＡ−３’（配列番号：２０３５）３６Ｂ４リバースプライマー、５’−ＣＴＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＧＧＡＡＧＧＴＧ−３’（ 配列番号：２０３６）３６Ｂ４プローブ、５’ＶＩＣ−ＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧＴＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＴＡ−ＴＡＭＡＲＡ３’ （配列番号：２０３７）である。
【０４９４】
ウェスタンブロッティング
核抽出物は、標準的な微量調製技術を用いて調製することができる（例として、アンドリュー（Ａｎｄｒｅｗｓ） およびフォーラー（Ｆａｌｌｅｒ）、１９９１、核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９、２４９９参照）。例えば、ＴＣＡ沈澱を用いて、上澄からタンパク質抽出物が調製される。等量の２０％ＴＣＡを細胞上澄に加え、氷上で１時間インキュベートし、５分間の遠心でぺレットにする。ぺレットをアセトンで洗浄し、乾燥し、水に再懸濁する。細胞のタンパク質抽出物を、１０％ ビス−トリスのニューペイジ（ＮｕＰａｇｅ）（核抽出物）または４−１２％トリス−グリシン（上澄抽出物）のポリアクリルアミドゲルで泳動させ、ニトロセルロース膜上にトランスファーする。非特異的な結合は、例えば５％の脱脂粉乳で１時間、次いで一次抗体で、４°Ｃで１６時間インキュベートすることによってブロックすることができる。次いで、洗浄、二次抗体を（１：１０，０００希釈）例えば室温で１時間塗布し、スーパーシグナル試薬（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ ｒｅａｇｅｎｔ）（ ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））でシグナルを検出する。
【実施例８】
【０４９５】
ＨＣＶ遺伝子発現のダウンレギュレーション評価に有効なモデル
細胞培養
細胞培養におけるＨＣＶの複製についての報告はあるが（以下を参照）、これらのシステムは再生が難しく、信頼するに足る証明はなされていない。従って、インターフェロンおよびリバビリン等、その他の抗ＨＣＶ治療の発展の事例と同じく、動物実験における安全性を実証した後、出願人は臨床的実現可能性の研究を直接進めることができる。
【０４９６】
最近のいくつかの報告は、ヒト細胞株におけるＨＣＶのインビトロ成長を立証している。（ミズタニ（Ｍｉｚｕｔａｎｉ）等、生化学生検リサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ）、１９９６、２２７（３）、８２２−８２６、タガワ（Ｔａｇａｗａ） 等、消化器内科学および肝臓学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１９９５、１０（５）、５２３−５２７、クリビエ−ル（Ｃｒｉｂｉｅｒ） 等、一般ウィルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、７６（１０）、２４８５−２４９１、セイップ（Ｓｅｉｐｐ） 等、一般ウィルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９７、７８（１０）２４６７−２４７８、ラコバッチ（ｌａｃｏｖａｃｃｉ） 等、リサーチウィルス学（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９７、１４８（２）１４７−１５１。ラコバッチ（ｌｏｃａｖａｃｃｉ）等、肝臓学誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１９９７、２６（５）、１３２８−１３３７、イトウ（Ｉｔｏ）等、一般ウィルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９６、７７（５）、１０４３−１０５４、ナカジマ（Ｎａｋａｊｉｍａ） 等、一般ウィルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９６、７０（５）、３３２５−３３２９、ミズタニ（Ｍｉｚｕｔａｎｉ） 等、一般ウィルス学誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９６、７０（１０）、７２１９−７２２３、バリ（Ｖａｌｌｉ） 等、リサーチウィルス学（Ｒｅｓ Ｖｉｒｏｌ）、１９９５、１４６（４）、２８５−２８８、カトウ（Ｋａｔｏ）等、生化学生検リサーチコミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ）、１９９５、２０６（３）、８６３−８６９）。８６３−８６９）。 ＨＣＶの複製は、ヒト肝細胞から派生した細胞株と同じく、ＴおよびＢ細胞株の両方について報告されている。ＲＴ−ＰＣＲベースのアッセイまたはｂ−ＤＮＡアッセイのいずれかを使用して、低レベル複製の検出を記録した。ＨＣＶ細胞培養に関する最近のほとんどの出版物は最大６ヶ月間の複製を記録していることに留意することは重要である。しかし、これらの細胞株で観測されるＨＣＶレベルの複製は、抗ウィルス化合物のスクリーニングに十分なほど堅固ではなかった。
【０４９７】
ＨＣＶに感染し得る細胞株に加えて、いくつかのグループによって、ＨＣＶゲノムの全長あるいは一部のｃＤＮＡクローンを持つ細胞株の形質転換の成功例が報告されている（ハラダ（Ｈａｒａｄａ） 等、総合ウィルス学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、１９９５、７６（５）１２１５−１２２１；（ ハラマツ（Ｈａｒａｍａｔｓｕ） 等、ウイルス性肝炎ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）１９９７、４Ｓ（１）：６１−６７； ダッシュ（Ｄａｓｈ）等、米国病理学誌（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）１９９７、１５１（２）：３６３−３７３； ミズノ（Ｍｉｚｕｎｏ） 等、胃腸病学（Ｇａｓｔｅｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ）１９９５、１０９（６）：１９３３−４０； ユー（Ｙｏｏ） 等、ウィルス学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１９９５、６９（１）：３２−３８）。
【０４９８】
ヒト肝細胞癌細胞株、Ｈｕｈ７、においてうまく複製できるサブゲノムＨＣＶ ＲＮＡ レプリコンの近年の発展は、信頼できる細胞培養モデルへ向けて大幅な前進を表している。これらのレプリコンは、Ｈｕｈ７細胞で複製可能なＲＮＡｓ の選択を可能にするＨＣＶ非構造性遺伝子のネオマイシン遺伝子上流を含む。当初、ＲＮＡ複製は、低い頻度で検出された（ローマン（Ｌｏｈｍａｎｎ）等、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９９９、２８５：１１０−１１３） が、ＮＳＳＡ領域における細胞適応変異を持つレプリコンの識別により、複製効率が１０，０００倍に改善された（ブライト（Ｂｌｉｇｈｔ）等、科学（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０００、２９０：１９７２−１９７５）。翻訳、タンパク質処理、およびＲＮＡ複製のようなＨＣＶ生活環の段階は、サブゲノムレプリコン機序において繰り返されるが、初期の事象（ウィルス結合および脱殻）やウィルス集合は見られない。ＨＣＶの構造遺伝子をそのレプリコンに含んだ結果、ＨＣＶコアおよび外膜タンパク質を生成するが、ウィルス集合は起こらない（ピーツマン（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ）等、ウィルス学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）２００２、７６：４００８−４０２１）。そのようなレプリコン機序が、ＨＣＶ ＲＮＡのｓｉＲＮＡ媒介による阻害の研究に使用されてきた。例えば、ランダル（Ｒａｎｄａｌｌ ）等、２００３、ＰＮＡＳ ＵＳＡ、１００、２３５−２４０を参照のこと。
【０４９９】
いくつかの細胞培養機序において、陽イオン性脂質がオリゴヌクレオチドの細胞培養における生物学的利用能を向上させることが示されてきた（ベネット（Ｂｅｎｎｅｔ） 等、１９９２、分子薬理学（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）、４１、１０２３−１０３３）。一実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、細胞培養実験用に陽イオン性脂質と複合される。ＳｉＮＡと陽イオン性脂質の混合物は、細胞を加える直前に血清を含まないＤＭＥＭ内に調製される。ＤＭＥＭ を加えた混和剤を室温に温め（約２０−２５℃）、陽イオン性脂質を望ましい最終濃度になるように加え、その溶液を短くボルテクスにかける。ＳｉＮＡ分子を望ましい最終濃度になるように加え、再び溶液を短くボルテクスにかけ、１０分間室温でインキュベートする。容量反応試験において、１０分間のインキュベーションに続き、前記ＲＮＡ／ 脂質複合体を連続してＤＭＥＭに希釈する。
【０５００】
動物モデル
動物モデルにおける抗ＨＣＶ 剤の有効性を評価するのは、人間への臨床試験のための重要な必要条件である。ＨＣＶ感染のための最善の特性を持つ動物は、チンパンジーである。また、チンパンジーおよび人間において、ＨＣＶ感染から生じる慢性肝炎は非常に似通っている。臨床上適切ではあるが、チンパンジーモデルには、いくつかの実践上の障害があり、この利用は困難である。これらには、高い費用、長時間のインキュベーションの必要性、および十分な数量の動物の不足が含まれる。これらの要因により、多くのグループは、Ｃ型慢性肝炎の感染に齧歯動物モデルの開発を試みてきた。直接の感染は不可能であるが、いくつかのグループによって、ＨＣＶゲノムのいずれかの部分、あるいは全体の齧歯動物への安定したトランスフェクションが報告されてきた（ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）等、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）１９９５、２２（３）：８４７−８５５； ガラン（Ｇａｌｕｎ） 等、感染性疾患ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ）１９９５、１７２（１）：２５−３０；コイケ（Ｋｏｉｋｅ）等、総合ウィルス学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１９９５、７６（１２）３０３１−３０３８；パスキネリ（Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ）等、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）１９９７、２５（３）：７１９−７２７；ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）
等、高松妃シンポジア（Ｐｒｉｎｃｅｓｓ Ｔａｋａｍａｔｓｕ Ｓｙｍｐ）１９９５、２５：１４３０１４９；マリヤ（Ｍａｒｉｙａ）等、総合ウィルス学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）１９９７、７８（７）１５２７−１５３１；タケハラ（Ｔａｋｅｈａｒａ） 等、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）１９９５、２１（３）：７４６−７５１；カワムラ（Ｋａｗａｍｕｒａ）等、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）１９９７、２５（４）：１０１４−１０２１）。加えて、ＨＣＶに感染した人間の肝臓を免疫システムが損なわれたネズミに移植すると、動物の血液中に長期に渡ってＨＣＶＲＮＡ が検出できるようになる。
【０５０１】
Ｃ型肝炎ウィルスをインビトロ動物モデルに発現させる方法が開発された（ビーリング（Ｖｉｅｒｌｉｎｇ）、ＰＣＴ国際特許公開番号ＷＯ９９／１６３０７）。ＨＣＶに感染した生存肝細胞は重症複合免疫不全マウスホストの肝臓実質に移植される。重症複合免疫不全マウスホストはその後生存状態に保たれ、それにより、形態論的に無傷の生存人間肝細胞はドナー細胞に留まり、Ｃ型肝炎ウィルスは留まっている人間肝細胞において複製される。このモデルは酵素核酸インビトロによるＨＣＶ抑制の研究に対する効果的な手段を示している。
【０５０２】
このように、これらのモデルはＨＣＶ発生の抑制における発明ｓｉＮＡモジュールの効果を評価する際に用いられることが可能である。これらのモデルとその他モデルは、同様に、前臨床環境における発明ｓｉＮＡモジュールの安全性と効果を評価する際に用いられることができる。
【実施例９】
【０５０３】
ＨＣＶ発現のＲＮＡｉ媒介性抑制
ｓｉＮＡ構造（表ＩＩＩ）は、例えばＨｕｈ７細胞において，ＨＣＶ ＲＮＡ発現減少の効果を目的としテストされる。細胞は、導入の際の細胞が７０−９０％の融合性をもつよう、導入のおよそ２４時間前に９６ウェルプレートに５，０００−７，０００細胞／ウェル、１００ｇｌ／ウェルにて培地される。導入には、アニールされたｓｉＮＡｓが導入試薬（リポフェクタミン２０００インビトロジェン）５０ｕｌ／ウェル量で混合され、室温で２０分間培養される。ｓｉＮＡ 導入混合液は細胞に加えられ１５０ｕｌ量において最終ｓｉＮＡ濃度２５ｎＭ となるようにする。ｓｉＮＡ 導入混合液はそれぞれ３つのウェルに加えられ、ｓｉＮＡ処理が３重構成となるようにする。細胞は、ｓｉＮＡ導入混合液が継続して存在する条件のもと３７℃ で２４時間インキュベートされる。２４時間後に、ＲＮＡは処理細胞の各ウェルから調製される。導入混合液をもつ上澄はまず取り除かれ、廃棄され、その後細胞は溶解され、ＲＮＡ が各細胞から調整される。処理に従った標的遺伝子発現は標的遺伝子および制御遺伝子の標準化を目的としＲＴ−ＰＣＲにより評価される（３６Ｂ４、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット）。３重化されたデータは平均値がとられ、各処理の移動標準値が決定する。標準化されたデータはグラフ化され、活性化ｓｉＮＡ による標的ＲＮＡのパーセント減少が該当する逆位対照ｓｉＮＡｓとの関連において決定される。
【実施例１０】
【０５０４】
ヒーラ細胞内キメラＨＣＶ／ポリオウイルスのｓｉＮＡ抑制
キメラＨＣＶ／ポリオウイルスのｓｉＮＡ抑制は、ヒーラ細胞内の２１ヌクレオチドｓｉＮＡ二重鎖を用いて調査された。７つのｓｉＮＡが設計され、ＨＣＶＲＮＡの高度に保存されている５’非翻訳域（ＵＴＲ）における３域を標記とする。ｓｉＮＡは、ＨＶＣ の５’−ＵＴＲ依存２つの細胞培養システムにおいて選別される。一つはＨＣＶ／ルシフェラーゼ遺伝子の翻訳を必要とし、他方はキメラＨＣＶ／ポリオウイルス（ＰＶ） の複製を含む（ブラット（Ｂｌａｔｔ） 等、米国出願特許０９／７４０、３３２、２０００年１２月１８日申請。これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。ＨＣＶ／ＰＶシステムを対象とした導入は、ヒーラ細胞（ピルビン酸ナトリウム添加のＤＭＥＭ及び５％ＦＢＳ を有する１００ｍＭのＨＥＰＥＳにて培養）においてカオチン脂質またはＬＥＡ２Ｋ を用い、ｓｉＮＡ濃度１０ｎＭまたは２５ｎＭで行われた。ヒーラ細胞はＨＣＶ／ＰＶウイルスと、ｍｏｉ＝０１ｐｆｕ／細胞で３０分間血清を含まない培養液にてイノキュレイトされた。イノキュラムは取り除かれ、８０μｌの培養液が２０μｌの導入混合液と合わせて加えられた。細胞と上澄は導入後２０−２４時間冷凍された。プレートはそれぞれ３冷凍― 解凍サイクルを経た後、上澄が収集された。上澄はヒーラ細胞上で３日間滴定濃度調整されたのち、染色され数量が数えられた。図２４−２７に示される結果はｐｆｕ／ｍｌ×１０5の場合の報告である。
【０５０５】
同一領域（１つのヌクレオチドによって移された）を標的とする２つのｓｉＮＡ（２９５７９／２９５８６および２９５７８／２９５８５、表ＩＩＩ参照）は、両方のシステムにおいて活性である（図２２参照）。例えばＨＣＶＰＶ複製において、逆位のｓｉＮＡ制御２９５９３／２９６００（図２２）をＩＣ５０＝−２．５ｎＭ（図２３）と比較して、ｓｉＮＡ処理細胞において、＞８５％の減少が観察された。インビボで適用するためにヌクレア−ゼ耐性のあるｓｉＮＡを開発するために、ｓｉＮＡには、安定化させる化学修飾を持つよう修飾することができる。そのような修飾は、一方あるいは両方のｓｉＮＡ鎖に、ホスホロチオエート結合（Ｐ＝Ｓ）、２’−メチルヌクレオチド、２’−フルオロ（Ｆ） ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、ユニバーサル塩基ヌクレオチド、５’および／または３’端修飾、および本請求で述べたようなその他の様々なヌクレオチドおよび非ヌクレオチド修飾を含む。このような系統的なアプローチを使用して、活性ｓｉＮＡ分子はヌクレア−ゼに対して大幅な耐性を持つと特定されてきた。これらの構造のいくつかは、ＨＣＶ ／ポリオウィルスキメラシステムでテストされ、ウィルスの複製に大幅な減少を示した（図２４−２７参照）。図２４−２７に示したＳｉＮＡ構造は、表ＩＩＩで相互参照および識別できる化合物番号によって参照される。ＳｉＮＡ活性は、該当する制御と比較されている（未処理細胞、スクランブル／不活性コントロール配列、あるいはトランスフェクションコントロール）。図２４は化学修飾ｓｉＮＡ構造３００５１／３００５３を使用した、ＨＣＶ ／ポリオウィルスキメラシステム内でのＨＣＶ ＲＮＡ抑制を示し、その構造は、３’および５’ 端に逆位のデオキシ脱塩基ヌクレオチド、いくつかのホスホロチオエート結合、および５−ニトロインドールヌクレオチドを有する。図２５は化学修飾ｓｉＮＡ構造３００５５／３００５７を使用した、ＨＣＶ／ポリオウィルスキメラシステム内でのＨＣＶ ＲＮＡ抑制を示し、その構造は、３’および５’端に逆位のデオキシ脱塩基ヌクレオチド、いくつかのホスホロチオエート結合、および５−ニトロインドールヌクレオチドを有する。図２６および２７は、未修飾ｓｉＮＡ構造（２９５８６／２９５７９）、および化学修飾ｓｉＮＡ構造３０４１７／３０４１９、３０４１７／３０４２０、３０４１８／３０４１９、およびそれぞれ１０ｎＭ、２５ｎＭのｓｉＮＡ で、その組み合わせを使用した、ＨＣＶ／ポリオウィルスキメラシステム内でのＨＣＶ ＲＮＡ抑制を示している。図２４−２７に示す通り、本発明のｓｉＮＡ構造は、ＨＣＶ／ポリオウィルスキメラシステムにおいてＨＣＶ ＲＮＡの強力な抑制を可能にする。そういったことから、化学修飾した、ヌクレア−ゼ耐性のあるｓｉＮＡ分子を含めたｓｉＮＡ構造は、慢性ＨＣＶ感染の治療にとって重要な種類の治療薬に相当する。
【実施例１１】
【０５０６】
ＨＣＶレプリコンシステムにおけるＨＣＶ ＲＮＡ発現のｓｉＮＡ抑制
ＨＣＶレプリコンシステムはＨＣＶ ＲＮＡを標的としたｓｉＮＡ の有効性を確認するために用いられた。試薬は細胞培養中Ｈｕｈ７細胞を用いてテストされ、（例えばランドール（Ｒａｎｄａｌｌ） 等、２００３、米国科学アカデミー会報（ＰＮＡＳ ＵＳＡ）、１００、２３５−２４０を参照）ＲＮＡの範囲とタンパク質抑制を決定する。ｓｉＮＡは本明細書に記載の通り、ＨＣＶ標的に対して選択された。ＲＮＡ抑制はこれらの試薬が適した導入粒子によりＨｕｈ７細胞へデリバリーされた後に測定された。標的ＲＮＡの相対量は、リアルタイムの増幅ＰＣＲ モニタリングを用いアクチンに対して測定された（例  ＡＢＩ７７００タックマン（Ｔａｑｍａｎ）（ｇ）。関連のない標的に対して設計されたオリゴヌクレオチド配列の混合、または同等の全体の長さ及び化学反応をもつランダムなｓｉＮＡコントロールに対して比較がなされるが、各部位にてランダムに置き換えされたヌクレオチドを持つものとする。第１または第２の主要試薬は標的と実行される最適化に対して選択された。最適化導入物質の濃度選択後、主要ｓｉＮＡモジュールを用いＲＮＡの経時的抑制が実行された。さらに、細胞平板様式はＲＮＡ抑制を決定するために用いることができる。アッセイｓｉＮＡに対する複数標的スクリーンの限定を目的としない例は、ＨＣＶ ＲＮＡ抑制を対象とし、図２８に示されている。ｓｉＮＡ試薬（表ＩＩＩ）２５ｎＭはＨｕｈ７細胞及び未処理細胞との比較において数量化されたＨＣＶ ＲＮＡ （図中「細胞」カラム）、カオチン性脂質（図中「ＬＦＡ２Ｋ」カラム）と導入された細胞、及び合致した逆異抑制（「Ｉｎｖ」） に導入された。図中に示されている通り、いくつかのｓｉＮＡ構造はＨｕｈ７レプリコンシステムにおけるＨＣＶ ＲＮＡ発現の重要な抑制を示している。化学修飾されたｓｉＮＡ構造は、その後上記の通り、図３０に示される化学ｓｉＮＡ構造スクリーンのＳｔａｂ７／８（ 表ＩＶ参照）の非制限の例を用いて選別された。濃度５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、及び１００ｎＭでの化学修飾されたｓｉＮＡ構造（Ｓｔａｂ４／５、表ＩＶ参照）を用いた用量反応の研究は、合致する化学的な逆位コントロールと比較され、図２９に示されており、そこにおいては、５ｎＭ、１０ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ及び１００ｎＭ 濃度でのＳｔａｂ７／８構造の用量反応は、合致する化学的な逆位コントロールと比較され、図３１に示されている。
【実施例１２】
【０５０７】
Ｈｕｈ７細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンの複製におけるインターフェロン／ｓｉＮＡ 混合治療の効果
ＨＣＶ複製の抑制におけるＲＮＡｉとインターフェロンの混合使用を調査するために、ｓｉＮＡとインターフェロンの混合治療をＨｕｈ７細胞内のＨＣＶサブゲノムレプリコンにおいて分析した。ＨＣＶ サブゲノムレプリコンクローンＡを含有するＨｕｈ７細胞は、９６ウェルプレートに、１ウェル９、６００細胞の密度で培地され３７℃ で一晩インキュベートされた。その後細胞はインターフェロンのみ、ｓｉＮＡのみ、または逆位配列コントロールのみで処理、ｓｉＮＡまたは逆位コントロールとの混合インターフェロンで処理された。準最適化用量は、ＨＣＶを標的としたｓｉＮＡの存在する中で、インターフェロン抗ウイルス作用の可能性のある増強作用を観察するために使用された。細胞はＨＣＶを標的とするｓｉＮＡｓ（３１７０３／３１７０７）、または逆位配列コントロール（３１７１１／３１７１５）と５、１０、２５、５０、または１００ｎＭで、溶媒のみで０．３５ｕｌ／ウェルのリポフェクタミン２０００、または１．７ユニット／ｍｌのインターフェロン（アムジェン）が加えられた溶媒を用いて導入された。細胞はその後４８または７２時間培養され、その間全ＲＮＡをインビテック社（Ｉｎｖｉｔｅｋ）の９６ウェルＲＮＡ分離キットを用いて分離する。ＨＣＶレプリコンからのＲＮＡのレベルを定量するために、プローブとプライマーを用い、レプリコンのネオマイシン耐性領域に対してリアルタイムのＲＴ−ＰＣＲ が実施された。結果は図３２に示されている。レプリコンＲＮＡのレベルは細胞ＧＡＰＤＨｍＲＮＡ のレベルに標準化された。これらのデータはインターフェロンのみの場合との比較において、ｓｉＮＡ／ インターフェロン治療の効果の増強作用を示している。
【実施例１３】
【０５０８】
ＨＣＶレプリコンシステムにおける多機能ｓｉＮＡのＨＣＶ ＲＮＡ発現抑制
ＲＮＡｉを介してＨＣＶ ＲＮＡ内の異なる部位を標的とする多機能ｓｉＮＡ構造の使用を調査するため、Ｈｕｈ７細胞のＨＣＶサブゲノムレプリコンにて多機能ｓｉＮＡ処理のアッセイを行った。ＨＣＶ ＲＮＡの部位３０４および３２７、または部位２８２および３０４のいずれかを標的とする多機能ｓｉＮＡ構造と、ＨＣＶ ＲＮＡの部位３０４および３２７、または部位２８２および３０４を個別に標的とするｓｉＮＡ分子のプールとを比較した。ＨＣＶサブゲノムレプリコンクローンＡを含有するＨｕｈ７細胞は、９６ウェルプレートに１ウェルにつき９，６００細胞の密度にて培地され、３７℃で一晩インキュベートされた。その後細胞を、個別のｓｉＮＡ、プールされたｓｉＮＡ、多機能ｓｉＮＡ、無関連の多機能多機能ｓｉＮＡコントロールおよびトランスフェクションコントロール（ＬＦＡのみ）にて処理した。そして、細胞を３７℃ にて４８時間または７２時間インキュベートし、インビテック社（Ｉｎｖｉｔｅｋ）の９６ウェルＲＮＡ分離キットを用いて全ＲＡＮを分離した。ＨＣＶレプリコンからのＲＮＡのレベルを定量するため、レプリコンのネオマイシン耐性領域にプローブおよびプライマーを用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実施した。０．１、１．０および１０ｎＭにてアッセイを行った非修飾の多機能ｓｉＮＡ構造の用量反応結果を図３３に示す。一方、修飾した多機能ｓｉＮＡ構造の結果は図３４〜４１に示す。レプリコンＲＮＡのレベルは細胞ＧＡＰＤＨｍＲＮＡのレベルに対して標準化された。これらのデータは、複数の部位を標的とする多機能ｓｉＮＡ構造のＨＣＶ ＲＮＡ発現抑制効果は、各部位を個別に標的とする個別ｓｉＮＡ構造のプールと同等であることを証明するものである。
【実施例１４】
【０５０９】
多機能ｓｉＮＡデザイン
一度、多機能ｓｉＮＡ構造のための標的部位が特定されると、ｓｉＮＡのそれぞれの鎖は、例えば、約１８と約２８ヌクレオチドの間で異なる標的核酸配列に相補的である、相補領域の範囲がデザインされる。それぞれの相補領域は、約４から約２２ヌクレオチドの標的配列に相補的でないが、その他の配列の相補領域に相補を含む、直近の隣接領域と共にデザインされる（例として、図１６を参照）。ヘアピン構造も同様にデザインすることができる（例として、図１７を参照）。異なる標的核酸配列と共通の相補、パリンドローム、または反復配列は、多機能ｓｉＮＡ構造全体の長さの短縮に用いることができる（例
として、図１８と１９を参照）。
【０５１０】
限定を目的としない例において、多機能ｓｉＮＡは二つの別々の核酸配列を標的とするようデザインされた。目標は、二つの異なるｓｉＮＡを一緒にして、二つの異なる標的に対して活性の一つのｓｉＮＡにすることである。ｓｉＮＡは、それぞれの鎖の５'が、下に斜体で示されたような二つのｓｉＲＮＡの一つの「アンチセンス」配列で始まるように結合された。
３’ ＴＴＡＧＡＡＡＣＣＡＧＡＣＧＵＡＡＧＵＧＵＧＧＵＡＣＧＡＣＣＵＧＡＣＧＡＣＣＧＵ５’
配列番号２０３８
５’ ＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＣＣＡＵＧＣＵＧＧＡＣＵＧＣＵＧＧＣＡＴＴ３’
配列番号２０３９
【０５１１】
ＲＩＳＣは、２つの鎖をいずれも５'端から取り込むと予想される。つまり、それぞれの鎖を運ぶ二種類の活性ＲＩＳＣの集団があることになる。それぞれの鎖の５'の１９ｎｔは、個別の標的配列の分解におけるガイド配列として作用する。
【０５１２】
別の態様においては、多機能ｓｉＮＡ分子のサイズは、重複を見つける、または個別のｓｉＮＡの長さを切り詰める、のいずれかによって短縮される。以下に述べられる例は、任意の第一の標的配列に対して、第二の標的配列中の共通の相補配列が見つかり得るということを示している。
【０５１３】
一方とは独立に生成された、二つの長い配列の間に生じると期待される、数多くの短いポリヌクレオチド配列（例えば、１４ヌクレオチド未満）の自然発生的な一致が検証された。均一なランダム発生プログラムＳＡＳ Ｖ８．１を用いたシミュレーションが、｛ＡＣＧＵ｝の文字の繰り返しで生成される４，０００文字の文字列に利用された。この配列は、次にＳ１を位置（１，２．．．ｎ）から、Ｓ２を位置（２，３．．．．ｎ＋ｌ）から、Ｓ４０００−ｎ＋ｌを位置（４０００−ｎ＋１，．．．，４０００）から、配列を完全に最後のセットまでとることによって作られた、ほぼ４０００の重複した組に切断された。この過程は第二の４０００文字の文字列で繰り返された。（サイズｎの）同一のセットの存在が、二つの文字列の間の配列の同一性が、分類および一致−結合ルーチンによって照合された。この過程は９−１１文字のセットで繰り返された。結果は、長さｎ＝９文字で平均５５の一致配列（３９から７２の範囲）、サイズｎ＝１０で１３の共通セット、および１１文字の平均で４つ（０から６の範囲）の一致、であった。４０００の選択の最初の文字列の長さは、両方の核酸分子のコード領域のおよその長さである。この単純なシミュレーションは、他方とは独立に生成された任意の二つの長いコード領域が、多機能ｓｉＮＡ構造の長さを短縮するのに用いることができる、短い共通配列を持つということ示唆している。この例において、サイズが９の共通配列は、偶然だけで＞１％の確立で生じた。
【０５１４】
別の態様においては、多機能ｓｉＮＡ構造の長さは、それぞれの標的配列の相同配列で塩基対を少なくしても、効果的なＲＮＡｉ活性を許容できるかどうかを判断することによって短縮される。もしそうであるなら、多機能ｓｉＮＡの全体の長さは下に示されるように短縮することができる。以下の仮説的な例において、４ヌクレオチド（ 太字）は、それぞれ１９ヌクレオチドのｓｉＮＡ'１'とｓｉＮＡ'２' 構造から減らされる。その結果の多機能ｓｉＮＡは、３０塩基対の長さである。
【０５１５】
その他の多機能ｓｉＮＡデザイン
単一ｓｉＮＡ分子が複数の標的をサイレンスできるような３種類の更なる多機能ｓｉＮＡ デザインが提示される。第一の方法は、ｓｉＮＡ（または多機能ｓｉＮＡ ）を結合するためのリンカーを利用する。この方法で、干渉反応を誘因する見込みのある長い連続したＲＮＡを作ること無しに、多くの強力なｓｉＮＡを結合できるようになる。第二の方法は、重複している、または結合された多機能デザインのデンドリマー状の伸長であるか、あるいは、それに代わる超分子形式でのｓｉＮＡの編成である。第三の方法は、長さが３０塩基対以上のらせんを用いる。これらのｓｉＮＡのダイサーによる作用で、新しい、活性型の５'アンチセンス端を露呈する。従って、長いｓｉＮＡは、本来の５'端で規定される部位と、ダイサー作用によって作られた新しい末端によって規定される部位とを標的にすることができる。従来型の多機能ｓｉＮＡ（センスおよびアンチセンス鎖がそれぞれ標的を規定する）との併用で用いた場合、このアプローチは例えば４つかそれ以上の部位を標的とするように用いることができる。
【０５１６】
Ｉ．テザー二機能ｓｉＮＡ
基本的なアイディアは、二つのアンチセンスｓｉＮＡ鎖が単一のセンス鎖にアニールされた、多機能ｓｉＮＡのデザインへの新しいアプローチである。センス鎖オリゴヌクレオチドは、リンカー（例えば、本申請で述べられた非ヌクレオチドリンカー）と、アンチセンスｓｉＮＡ 鎖にアニールする二つの断片を含む（ 図４２参照）。リンカーは、任意にヌクレオチドに基づくリンカーを含むことができる。いくつかの見込みのある利点と、このアプローチのバリエーションは以下を含むが、これらに限定されない。
【０５１７】
１．前記の二つのアンチセンスｓｉＮＡは独立している。従って、標的部位の選択は、二つの部位の間の保存配列のための要求によって制約されない。任意の二つの高度に活性なｓｉＮＡは、多機能ｓｉＮＡを形成するために組み合わされることができる。
【０５１８】
２．相同性、二つの遺伝子（ 例えば、異なるＨＣＶ株）に存在する配列を標的とするｓｉＮＡを有する標的部位の組み合わせが用いられた場合、そのデザインは二つ以上の部位を標的とするように利用することができる。例えば単一の多機能ｓｉＮＡは、２つの異なるＨＣＶ ＲＮＡ（二つのＲＮＡ の間の保存配列を標的とする多機能ｓｉＮＡの一方のアンチセンス鎖を用いる）および宿主ＲＮＡ（宿主ＲＮＡを標的とする多機能ｓｉＮＡの第ニアンチセンス鎖を用いる（例、Ｌａ抗原またはＦＡＳ）のＲＮＡ を標的にするために利用できる。このアプローチによって、１つ以上のＨＣＶ株、および１つ以上の宿主ＲＮＡ を、単一の多機能ｓｉＮＡを用いて標的とすることができるようになる。
【０５１９】
３．遺伝子を標的とするために、センス鎖とアンチセンス鎖の両方を用いる多機能ｓｉＮＡ は、テザー多機能デザインに組込むこともできる。このことは、単一の複合体で６４以上の部位を標的とする可能性を残している。
【０５２０】
４．二つ以上のアンチセンス鎖ｓｉＮＡを、単一のテザーセンス鎖にアニールすることができ得る。
【０５２１】
５．このデザインは、長く続くｄｓＲＮＡを回避する。従って、インターフェロン反応を起こしにくい。
【０５２２】
６．リンカー（または、本申請で述べられたコンジュゲートのように、それに結合した修飾）は、複合体の薬物動態学特性を向上させる、またはリポソームへの組み込みを向上させることができる。リンカーに導入された修飾は、直接ｓｉＮＡに結合された場合と同一程度には、ｓｉＮＡ 活性に影響を与えないはずである（例として、図４８および４９を参照）。
【０５２３】
７．センス鎖は、コンジュゲートの結合部位を更に提供するために、アニールされたアンチセンス鎖をこえて延長できる。
【０５２４】
８．複合体の極性は、両方のアンチセンスの３' 端がリンカーと近隣するように、および、５' 端がリンカーと離れているように、またはその組み合わせになるように、切り替えることができる。
【０５２５】
デンドリマーおよび超分子ｓｉＮＡ
デンドリマーｓｉＮＡアプローチにおいて、ｓｉＮＡの合成は、最初にデンドリマーの鋳型を合成することから始め、次いで様々な機能的ｓｉＮＡが結合される。様々な構造が図４３に描かれている。結合できる機能的ｓｉＮＡの数は、用いられるデンドリマーのサイズによってのみ限定される。
【０５２６】
多機能ｓｉＮＡへの超分子アプローチ
超分子形式は、デンドリマー合成の難問を単純化する。この形式において、ｓｉＮＡ鎖は標準的なＲＮＡ化学反応によって合成され、次いで様々な相補鎖がアニーリングされる。個々の鎖の合成は、１つのｓｉＮＡの５' 端にアンチセンス、センス配列を含み、ヘクサエチレングリコールのような、核酸または合成リンカーが続き、今度は他のｓｉＮＡのセンス鎖が５'から３' 方向に続く。従って、ｓｉＮＡ鎖の合成は、標準的な３' から５' の方向で行える。代表的な三機能、または四機能のｓｉＮＡの例は、図４４に描かれている。類似の原理に基づいて、様々な鎖のアニーリング効率が達成される限り、より多機能なｓｉＮＡ構造をデザインすることができる。
【０５２７】
ダイサー作用可能な多機能ｓｉＮＡ
多標的の生物情報学的解析を用いて、異なる標的配列の間で共有される同一配列が、約２から約１４ヌクレオチド長の範囲で同定されることができる。これらの同一領域は、ダイサーによる作用が二次機能的な５'アンチセンス部位を露呈するように、延長されたｓｉＮＡらせん（ 例えば、＞３０塩基対）の中にデザインされることができる（例えば図４５参照）。例えば、最初のｓｉＮＡアンチセンス鎖の１７ヌクレオチド（例、３'ＴＴ 突出を有する二重鎖中の２１ヌクレオチド鎖）が標的ＲＮＡに相補的である場合、強いサイレンシングが２５ｎＭで観察された。８０％サイレンシングが、同一形式での僅か１６ヌクレオチド相補で観察された（図４７参照）。
【０５２８】
約３０から４０以上の塩基対のｓｉＮＡデザインへのこの特性の組み込みの結果、更なる多機能ｓｉＮＡ構造が生じる。図４５の例は、ダイサー−リボヌクレアーゼＩＩＩによる処理の後、いかにして３０塩基対の二重鎖が３つの異なる配列を標的にできるかを図解している。つまりこれらの配列は、ウィルスと宿主因子のメッセージのような、同一ｍＲＮＡ上、または別のＲＮＡ上、あるいは所定の経路に沿った複数のポイント（例えば、炎症カスケード） に、存在できる。更に、４０塩基対の二重鎖は、四つの標的配列を標的とする単一の二重鎖を提供するために、二機能デザインを直列に組み合わせることができる。更により広範なアプローチは、５つまたは６つの標的を一つの多機能二重鎖でサイレンスするための相同性配列（例えば、ＶＥＧＦＲ−１／ＶＥＧＦＲ−２） を含むことができる。図４５の例は、この達成方法を示している。３０塩基対二重鎖は、ダイサーによってどちらかの端から２２および８塩基対産物に切断される（８ｂ．ｐ． 断片は示されていない）。提示を容易にするため、ダイサーによって作られた突出は示されないが、補われることができる。３つの標的配列が示される。重複した必要な配列の同一性は、灰色の四角で示される。親の３０ｂ．ｐ． のｓｉＮＡのＮ' は、２' −ＯＨ位置の推奨部位であり、もしこの化学反応の安定性がテストされたのであれば、ダイサー切断を可能にする。なお、ダイサー−リボヌクレアーゼＩＩＩによる３０塩基長二重鎖の作用は、正確な２８＋８には切断しないが、むしろ一連の非常に関連した産物（原発部位では２２＋８）を産生する。従って、ダイサーによる作用は一連の活性ｓｉＮＡを生じる。別の限定を目的としない例を、図４６に示す。４０塩基対の二重鎖は、ダイサーによってどちらかの端から２０塩基対の産物に切断される。提示を容易にするため、ダイサーによって作られた突出は示されないが、補われることができる。４つの標的配列は、青、水色、赤、オレンジの４色で示されている。重複した必要な配列の同一性は、灰色の四角で示される。このデザイン形式は、より大きなＲＮＡに拡大できる。化学的に安定したｓｉＮＡがダイサーによって結合した場合、計画的に配置されたリボヌクレオチド結合は、我々の、更に広範囲な多機能的デザインのレパートリーをもたらす、意図的に作られた切断産物を可能にすることができる。例えば、約２２ヌクレオチドのダイサー標準に限定されない切断産物により、標的配列が同一の多機能ｓｉＮＡ構造が、例えば、約３から約１５ヌクレオチドの範囲で重複できるようになる。
【０５２９】
このアプローチの別の重要な側面は、そのエスケープ変異を制限する能力である。内部標的部位を露出する過程によって、アンチセンス５' 端の８ヌクレオチドに相補的なエスケープ変異が、確実にｓｉＮＡの効果を減少させないようにできる。約１７ヌクレオチドの相補がＲＩＳＣに媒介される標的切断に必要な場合、これによって例えば、８／１７または４７％で起こり得るエスケープ変異が制限されるだろう。
【実施例１５】
【０５３０】
適応症
ＨＣＶリサーチにおける現在の一連の知識は、リサーチや、診断、および治療に使用するために、ＨＣＶ活性を試験する方法、およびＨＣＶ発現を制御することのできる化合物の必要を示唆している。本請求で述べた通り、本発明の核酸分子は、ＨＣＶのレベルに関連した病状を診断するアッセイに使用できる。加えて、前記核酸分子は、ＨＣＶのレベルに関連した病状の治療に使用できる。
【０５３１】
ＨＣＶ発現の変調に関連付けられる特定の変性および病状には、ＨＣＶ感染、肝不全、肝細胞癌、肝硬変、および／またはＨＣＶ感染に関連付けられるその他の病状が含まれるが、それらに限定はされない。
【実施例１６】
【０５３２】
インターフェロン
インターフェロンは、前記疾病および／または本請求で述べた状態を治療するために、本発明のｓｉＮＡ分子と併せて使用することができる化合物のクラスの、限定を目的としない例を表す。タイプＩインターフェロン（ＩＦＮ）は、自然のサイトカインの種類で、ＩＦＮ−β 、およびＩＦＮ−ω と同様、２５ＩＦＮ−αより大きいファミリーを含む（ぺスタ（Ｐｅｓｔａ）、１９８６、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．）１１９、３−１４）。進化的には同一の遺伝子に由来するが（ディアズ（Ｄｉａｚ） 等、１９９４、ゲノム学（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）２２、５４０−５５２）、これらの分子の一次配列には多くの相違点があり、生物学的活動における進化的分岐を意味している。全てのタイプＩのＩＦＮは、ＩＦＮを細胞表面受容体に結合することから始まる生物学的効果の共通なパターンを共有する（プレッファー（Ｐｆｅｆｆｅｒ） およびストロビシ（Ｓｔｒｕｌｏｖｉｃｉ）、１９９２、インターフェロン 原理と医学的応用（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｓ． バロン（Ｂａｒｏｎ）、Ｄ．Ｈ．（クーペンハーヴァー）Ｃｏｏｐｅｎｈａ ｖｅｒ 、Ｆ． ディアンザニ（Ｄｉａｎｚａｎｉ）、Ｗ．Ｒ． フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ） ジュニア、Ｔ．Ｋ．ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ ）ジュニア、Ｇ．Ｒ．キンペル（Ｋｉｍｐｅｌ）、Ｄ．Ｗ．（ナイセル）、Ｇ． Ｊ．スタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、およびＳ．Ｋ．タイリング（Ｔｙｒｉｎｇ） 編の中のＩＦＮ−α／βの膜貫通型二次伝達物質（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒｓ ｆｏｒ ＩＦＮ−α／β 、１５１−１６０））。結合にヤヌスチロシンキナーゼおよびＳＴＡＴタンパク質を含む、チロシンキナーゼの活性が続き、それはいくつかのＩＦＮに刺激された遺伝子産物の産出につながる（ ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ） 等、１９９４、サイエンティフィックアメリカン（Ｓｃｉ． Ａｍ．、２７０、６８−７５）。ＩＦＮに刺激された遺伝子産物は、抗ウィルス性、抗増殖性、また免疫調節効果、サイトカインの誘導、およびＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ規制を含む、タイプＩのＩＦＮの、多表現型遺伝の生物学的効果に関与する（ペストカ（Ｐｅｓｔｋａ） 等、１９８７、年報：生化学（Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ）５６、７２７）。ＩＦＮに刺激された遺伝子産物の例には、２−５−オリゴアデニル酸シンセターゼ（２−５ＯＡＳ）、Ｐ２−ミクログロブリン、ネオプテリン、ｐ６８キナーゼ、およびＭｘタンパク質が含まれる（チェバス（Ｃｈｅｂａｔｈ ）およびレヴェル（Ｒｅｖｅｌ）、１９９２、インターフェロン原理と医学的応用（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｓ． バロン（Ｂａｒｏｎ）、Ｄ．Ｈ．（クーペンハーヴァー）Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ 、Ｆ． ディアンザニ（Ｄｉａｎｚａｎｉ）、Ｗ．Ｒ．フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ）ジュニア、Ｔ．Ｋ ．ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ） ジュニア、Ｇ．Ｒ．キンペル（Ｋｉｍｐｅｌ）、Ｄ．Ｗ．（ナイセル）、Ｇ．Ｊ ．スタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、および���．Ｋ．タイリング（Ｔｙｒｉｎｇ）編の中の２−５Ａシステム：２−５Ａシンセターゼ、アイソスピーシーズおよび機能（Ｔｈｅ２−５Ａ ｓｙｓｔｅｍ：２−５Ａ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ， ｉｓｏｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）２２５−２３６； サミュエル（Ｓａｍｕｅｌ）、１９９２、インターフェロン原理と医学的応用（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｓ． バロン（Ｂａｒｏｎ）、Ｄ．Ｈ．（クーペンハーヴァー）Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ、Ｆ． ディアンザニ（Ｄｉａｎｚａｎｉ）、Ｗ．Ｒ． フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ） ジュニア、Ｔ．Ｋ．ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ） ジュニア、Ｇ．Ｒ．キンペル（Ｋｉｍｐｅｌ）、Ｄ．Ｗ．（ナイセル）、Ｇ．Ｊ． スタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、およびＳ ．Ｋ．タイリング（Ｔｙｒｉｎｇ） 編の中のＲＮＡ依存Ｐ１／ｅＩＦ−２αタンパク質キナーゼ（Ｔｈｅ ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＰ１／ｅＩＦ−２α ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）２３７−２５０； ホリスバーガー（Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ）、１９９２、インターフェロン原理と医学的応用（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｓ．バロン（Ｂａｒｏｎ）、Ｄ．Ｈ．（ クーペンハーヴァー） Ｃｏｏｐｅｎｈａｖｅｒ 、Ｆ． ディアンザニ（Ｄｉａｎｚａｎｉ）、Ｗ．Ｒ． フライシュマン（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ）ジュニア、Ｔ．Ｋ．ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）ジュニア、Ｇ．Ｒ．キンペル（Ｋｉｍｐｅｌ）、Ｄ．Ｗ．（ナイセル）、Ｇ．Ｊ．スタントン（Ｓｔａｎｔｏｎ）、およびＳ．Ｋ．タイリング（Ｔｙｒｉｎｇ） 編の中のＭＸタンパク質： 作用の機能および機序（ＭＸ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ａｃｔｉｏｎ）２１５−２２４）。全てのタイプＩのＩＦＮは類似した生物学的効果を有するが、全ての活性が各タイプＩのＩＦＮに共有されているわけではなく、また多くの場合、各ＩＦＮの特殊型によって、活性の程度は相当大幅に異なる（フィッシュ（Ｆｉｓｈ） 等、１９８９、ジャーナルオブインターフェロンリサーチ（Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．）９、９７−１１４、； オーゼス（Ｏｚｅｓ） 等、１９９２、ジャーナルオブインターフェロンリサーチ（Ｊ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．）１２、５５−５９）。より具体的には、異なる特殊型のＩＦＮ−αおよび分子雑種のＩＦＮ−αの特性の研究が、薬理学的特性における相違を示してきた（ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）、１９８７、ジャーナルオブインターフェロンリサーチ（ＪＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．７、５４５−５５１）。これらの薬理学的な相違は、たったの３つのアミノ酸残基の変更から生じ得る（ リー（Ｌｅｅ）等、１９８２、癌リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４２、１３１２−１３１６）。
【０５３３】
８５から１６６のアミノ酸が、既知のＩＦＮ−α特殊型に保存されている。ＩＦＮ−α の偽遺伝子を除き、約２５の既知の区別できるＩＦＮ−α特殊型がある。これらの非対立性特殊型の対比較は、一時配列の相違は２％から２３％わたることを示している。自然発生のＩＦＮに加えて、コンセンサスインターフェロン（ＣＩＦＮ）として知られている、非天然組換え型タイプＩインターフェロンは、治療用の化合物として合成されてきた（トン（Ｔｏｎｇ） 等、１９９７、肝臓学（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）２６、７４７−７５４）。
【０５３４】
インターフェロンは現在、伝染性および自己免疫疾患および癌を含む、少なくとも１２の異なる適応症に使用されている（ボードン（Ｂｏｒｄｅｎ）、１９９２、ニューイングランド薬学誌（Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ．）３２６、１４９１−１４９２）。自己免疫疾患に関して、ＩＦＮは、関節リウマチ、多発性硬化症、およびクローン病の治療に利用されてきた。癌の治療に関しては、ＩＦＮはそれだけ、あるいは多くの異なる化合物と組み合わせて使用されてきた。ＩＦＮが使用されてきた癌の具体的なタイプには、扁平上皮癌、メラノーマ、副腎腫、血管腫、有毛細胞白血病、およびカポジ肉腫が含まれる。伝染性の疾患の治療において、ＩＦＮはマクロファージの食作用活性およびリンパ球の細胞毒性を増加させ、細胞の病原菌の増殖を抑制する。ＩＦＮが治療に使用されてきた具体的な適応症には、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ６および１１（例、陰部疣贅（レーベンサール（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ）等、１９９１、ニューイングランド薬学誌（Ｎ． Ｅｎｇｌ．Ｊ． Ｍｅｄ．）３２５、６１３−６１７、慢性肉芽腫症、およびＣ型肝炎ウィルスが含まれる。
【０５３５】
慢性ＨＣＶ感染の治療における、インターフェロン（ＩＦＮ−アルファ）を用いるよく管理された多数の臨床試験は、週３回の治療により、約５０％（４０％−７０％）の患者において６ヶ月の治療が終了するまでに血清ＡＬＴ値が低下することを実証した（デイビス（Ｄａｖｉｓ）等、１９８９、ニューイングランド薬学誌（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３２１、１５０１−１５０６、マルセラン（Ｍａｒｃｅｌｌｉｎ）等、１９９１、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ）、１３、３９３−３９７、トン（Ｔｏｎｇ）等、１９９７年、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２６、７４７−７５４、トン（Ｔｏｎｇ）等、１９９７年、肝臓学会誌（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２６、１６４０−１６４５。しかし、インターフェロン治療中止後、反応のあった患者の約５０％が再発し、結果として血清ＡＬＴ濃度約２０−２５％の正常化により判断されるような「耐久性」反応割合が生じた。さらに、臨床的エンドポイントとしてＨＣＶ ＲＮＡ値の変化を使用したＩ型インターフェロン治療を６ヶ月間検査した研究により、患者の最大３５％が治療終了までにＨＣＶ ＲＮＡを消失することが実証された（トン（Ｔｏｎｇ）等、１９９７（上述） 。しかし、ＡＬＴエンドポイントを用いた場合、患者の約５０％が治療中止後６ヶ月以内に再発し、結果として耐久性ウィルス応答が生じたのはわずか１２％であった（２３。４８週間の治療を検査した研究により、持続性ウィルス学的応答は最大２５％であることが実証された。
【０５３６】
ペグ化されたインターフェロン、すなわちポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコンジュゲートされたインターフェロンはインターフェロンで特性が向上することが実証された。ＰＥＧコンジュゲートによって得られる利点には、ＰＥＧ化していないインターフェロンと比較して薬物動態プロファイルが向上し、ひいては投与計画便利化、耐性の向上、抗ウイルス効果の向上が挙げられる。かかる向上はポリエチレングリコールインターフェロンアルファ−２ａ（ロッシュ社（Ｒｏｃｈｅ）製ペガシス（ＰＥＧＡＳＹＳ）およびポリエチレングリコールインターフェロンアルファ−２ｂ（エンゾン／シェリングプラウ社（Ｅｎｚｏｎ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ）ビラフェロンペグ（ＶＩＲＡＦＥＲＯＮ ＰＥＧ）ペグイントロン（ＰＥＧ−ＩＮＴＲＯＮ）双方の臨床試験において証明されている。
【０５３７】
インターフェロンおよびポリエチレングリコールインターフェロンとの併用におけるｓｉＮＡ分子は、ＨＣＶの治療または上述のいかなる徴候の治療における有効性を向上させる可能性がある。ＨＣＶ感染に関連するＲＮＡを標的とするｓｉＮＡ分子は、個別でも、またはインターフェロンおよびポリエチレングリコールインターフェロンといったその他の療法と併用しても使用することができ、また、有効性を高めるためにも用いることができる。
【実施例１７】
【０５３８】
診断上の利用
本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、治療、工業、環境、農業、および／また研究のような様々な応用における標的分子（例えば、ＲＮＡ）の特定のような、様々な診断上の応用に利用することができる。そのようなｓｉＮＡ分子の診断上の利用は、例えば、細胞溶解液または部分精製された細胞溶解液を用いる、ＲＮＡｉ再構成システムの利用を伴う。本発明のｓｉＮＡ分子は、例えば、疾患細胞中の遺伝的浮動や変異を検査するための、または、細胞中のウィルスＲＮＡのような内因性または外因性の存在を検出するための診断手段として用いることができる。ｓｉＮＡ活性と標的ＲＮＡの構造間の密接な関係故に、塩基対と標的ＲＮＡの３次元構造が変わり、分子の任意の領域の変異を検出することができる。本発明で述べられた複数のｓｉＮＡ分子を用いることにより、ＲＮＡの構造、また細胞と組織内同様にインビトロでの機能に重要なヌクレオチドの変化をマップすることができる。ｓｉＮＡ分子と標的ＲＮＡの切断は、遺伝子発現の阻害や特定の遺伝子産物の疾患または感染の進行における役割を明らかにするのに用いることができる。この方法で、その他の遺伝子標的が疾患の重要な調節因子として明らかにされる可能性がある。これらの実験は、併用療法（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のｓｉＮＡ分子、既知の低分子阻害剤と結合したｓｉＮＡ分子、またはｓｉＮＡ分子および／またその他の化学的または生物学的分子との断続的な併用治療）の可能性を提供することによって、疾患進行へのより良い治療を導き出すだろう。本発明のｓｉＮＡ分子のその他のインビトロ利用は、当該分野でよく知られており、疾患、感染症、または関連の病体に関連するｍＲＮＡの存在の検出を含む。このようなＲＮＡは、例えば、蛍光共鳴放射転移（ＦＲＥＴ）のような標準的手法を用いて、ｓｉＮＡによる治療後、切断産物の存在の測定によって検出される。
【０５３９】
特定の態様において、標的ＲＮＡの野生型のみ、または変異型のみを切断するｓｉＮＡ 分子がアッセイに用いられる。第一のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡの野生型のみを切断するもの） は、試料中の野生型ＲＮＡの存在を確認するのに用いられ、第二のｓｉＮＡ分子（すなわち、標的ＲＮＡ の変異型のみを切断するもの）は試料中の変異型ＲＮＡを確認するのに用いられる。反応コントロールとして、反応中のｓｉＮＡの相対的効率、また「標的でない」ＲＮＡ種は切断されていないことを示すために、野生型および変異ＲＮＡ双方の合成基質が双方のｓｉＮＡ分子によって切断される。合成基質からの切断産物は、試料群中の野生系と変異ＲＮＡの解析のためのサイズマーカーを作るのに役立つ。すなわち、それぞれの解析には、二つのｓｉＮＡ分子、二つの基質、および一つの未知の試料で、合計６つの反応が必要である。切断産物の存在は、それぞれのＲＮＡの全長および切断断片がポリアクリルアミドゲルの１レーンで解析できる、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて検出される。変異ＲＮＡの発現と標的細胞における望ましい表現系が変化するという想定される危険性の洞察を得るために、結果の定量が絶対に必要というわけではない。表現系の発展にタンパク質産物が関わっている（すなわち、疾患に関係した、または感染に関係した）ｍＲＮＡの発現は、危険を証明するに十分である。もし比較可能な特定の活性のプローブが双方の転写物に用いられるなら、ＲＮＡレベルの定性的な比較で十分であり、初期診断の費用を低減する。ＲＮＡレベルが定性的に、または定量的に比較されるかどうかに関わらず、野生型に対する変異型のより高い比率は、より高い危険性と相関している。
【０５４０】
本明細書の中で述べられた全ての特許と出版物は、本発明が属する技術分野の熟練者のレベルを表すものである。本開示に引用された全ての参考文献は、各文献を参照することでその全体が個別に本申請に組み込まれるのと同様に、本申請に組み込まれる。
【０５４１】
当業者は、目的を遂行するために本発明はよく適合されていること、また、述べられた目的と利点を達成していることを容易に理解することであろう。好ましい態様の目下の代表例として本明細書で述べられた方法と組成物は例示的なものであり、本発明の範囲の限定を目的としない。当業者に見いだされるだろう変更やその他の用途は、請求の範囲によって定義される、本発明の精神に含まれるものである。
【０５４２】
当業者には、様々な置換と修飾は本明細書で開示される本発明が、本発明の範囲と精神から離れることなく行われ得るということが容易に理解できるだろう。従って、このような付加的な態様は本発明および請求項の範囲に含まれる。本発明は当業者に、本申請で述べられた、ＲＮＡｉ活性を媒介するための活性が向上した核酸構造を作成するための、様々な化学修飾の組み合わせおよび／または置換を試験することを悟らせる。このように向上された活性には、向上された安定性、向上された生物学的利用能、および／またＲＮＡｉを媒介する細胞反応の向上された活性化を含む可能性がある。従って、本明細書で述べられた個別の態様は限定を目的とせず、当業者は、容易に本明細書で述べられた修飾の個別の組み合わせを、ＲＮＡｉ活性が向上したｓｉＮＡ分子特定のための無駄な実験を行うことなく試験できることが容易に理解できる。
【０５４３】
本申請で適切に述べられた本発明は、本明細書で具体的に開示されなかった、任意の要素や要素群、制限項目または制限項目群が欠落していても実践することができる。従って、例えば、本明細書のそれぞれの態様において、「含む」「原則的に構成される」および「構成される」のいずれの語も、他の二つのいずれかと置き換えてられてよい。使用された用語や表現は、説明の用語として用いられるのであって、限定のためではなく、このような用語や表現で示され述べられた特徴、またはその一部分である任意の同等のものを排除する意図はなく、請求された本発明の範囲で、様々な修飾が可能であることが認識される。従って、本発明は好ましい例によって具体的に開示されているが、本明細書で開示されたコンセプトの任意の特性、変形、およびバリエーションは当業者によって行われることができること、そして説明と添付特許請求の範囲によって明確にされたように、変形およびバリエーションは、本発明の範囲であると考えられるということが理解されるべきである。
【０５４４】
加えて、当業者であれば、本発明の特性や側面がマークーシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ ）グループまたは、他の代替グループの観点で述べられている場合には、本発明が、マークーシュ（Ｍａｒｋｕｓｈ） グループまたはその他のグループにおける任意の個々メンバーまたはサブグループのメンバーの観点でも述べられていることを認識するであろう。
【０５４５】
表１：ＨＣＶアクセッション番号
【表１−１】
2007505606.tif 000019
【０５４６】
【表１−２】
2007505606.tif 000020
【０５４７】
【表１−３】
2007505606.tif 000021
【０５４８】
【表１−４】
2007505606.tif 000022
【０５４９】
表２：ＨＣＶ ｓｉＮＡおよび標的配列
【表２−１】
2007505606.tif 000023
【０５５０】
【表２−２】
2007505606.tif 000024
【０５５１】
【表２−３】
2007505606.tif 000025
【０５５２】
【表２−４】
2007505606.tif 000026
【０５５３】
【表２−５】
2007505606.tif 000027
【０５５４】
【表２−６】
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【０５５５】
【表２−７】
2007505606.tif 000029
【０５５６】
【表２−８】
2007505606.tif 000030
【０５５７】
【表２−９】
2007505606.tif 000031
【０５５８】
【表２−１０】
2007505606.tif 000032
【０５５９】
【表２−１１】
2007505606.tif 000033
【０５６０】
【表２−１２】
2007505606.tif 000034
【０５６１】
【表２−１３】
2007505606.tif 000035
【０５６２】
【表２−１４】
2007505606.tif 000036
【０５６３】
【表２−１５】
2007505606.tif 000037
【０５６４】
【表２−１６】
2007505606.tif 000038
【０５６５】
【表２−１７】
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【０５６６】
【表２−１８】
2007505606.tif 000040
【０５６７】
【表２−１９】
2007505606.tif 000041
【０５６８】
【表２−２０】
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【０５６９】
【表２−２１】
2007505606.tif 000043
【０５７０】
ｓｉＮＡ構造の上側配列および下側配列の３'−端は、例として１、２、３または４ヌクレオチド長、好ましくは２ヌクレオチド長の突出配列を含むことができ、ここで下側配列の突出配列は任意で標的配列部に相補的である。本表の上側配列および下側配列はさらに、例として図４および５に示される典型的なｓｉＮＡ 構造といった化学式Ｉ〜ＶＩＩを有する化学修飾、または表ＩＶに記載の修飾もしくはそれらのいかなる組み合わせを有する化学修飾をさらに含むことができる。
【０５７１】
表３：ＨＣＶ合成修飾ｓｉＲＮＡ構成
【表３−１】
2007505606.tif 000044
【０５７２】
【表３−２】
2007505606.tif 000045
【０５７３】
【表３−３】
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【０５７４】
【表３−４】
2007505606.tif 000047
【０５７５】
【表３−５】
2007505606.tif 000048
【０５７６】
【表３−６】
2007505606.tif 000049
【０５７７】
【表３−７】
2007505606.tif 000050
【０５７８】
【表３−８】
2007505606.tif 000051
【０５７９】
【表３−９】
2007505606.tif 000052
【０５８０】
【表３−１０】
2007505606.tif 000053
【０５８１】
【表３−１１】
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【０５８２】
【表３−１２】
2007505606.tif 000055
【０５８３】
【表３−１３】
2007505606.tif 000056
【０５８４】
【表３−１４】
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【０５８５】
【表３−１５】
2007505606.tif 000058
【０５８６】
【表３−１６】
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【０５８７】
【表３−１７】
2007505606.tif 000060
【０５８８】
【表３−１８】
2007505606.tif 000061
【０５８９】
【表３−１９】
2007505606.tif 000062
【０５９０】
【表３−２０】
2007505606.tif 000063
【０５９１】
【表３−２１】
2007505606.tif 000064
【０５９２】
【表３−２２】
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【０５９３】
【表３−２３】
2007505606.tif 000066
【０５９４】
【表３−２４】
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【０５９５】
【表３−２５】
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【０５９６】
【表３−２６】
2007505606.tif 000069
【０５９７】
【表３−２７】
2007505606.tif 000070
【０５９８】
【表３−２８】
2007505606.tif 000071
【０５９９】
【表３−２９】
2007505606.tif 000072
【０６００】
【表３−３０】
2007505606.tif 000073
【０６０１】
【表３−３１】
2007505606.tif 000074
【０６０２】
【表３−３２】
2007505606.tif 000075
【０６０３】
【表３−３３】
2007505606.tif 000076
【０６０４】
【表３−３４】
2007505606.tif 000077
【０６０５】
【表３−３５】
2007505606.tif 000078
【０６０６】
【表３−３６】
2007505606.tif 000079
【０６０７】
【表３−３７】
2007505606.tif 000080
【０６０８】
【表３−３８】
2007505606.tif 000081
【０６０９】
【表３−３９】
2007505606.tif 000082
【０６１０】
【表３−４０】
2007505606.tif 000083
【０６１１】
【表３−４１】
2007505606.tif 000084
【０６１２】
【表３−４２】
2007505606.tif 000085
【０６１３】
【表３−４３】
2007505606.tif 000086
大文字＝リボヌクレオチド ｕ，ｃ ＝２'−デオキシ−２'−フルオロＵ，ＣＴ＝チミジンＢ＝逆位のデオキシ脱塩基部分ｓ＝ホスホロチオエート接合Ａ＝デオキシアデノシンＧ＝デオキシグアノシンＧ＝２'−Ｏ−メチルグアノシンＡ＝２'−Ｏ−メチルアデノシンＬ＝ｈｅｇＳ＝ヘキセセリンギルコールスペーサー（ｈｅｘｅｔｈｅｌｙｎｅｇｉｙｃｏｌ Ｓｐａｃｅｒ）； スペーサー−１８（グレンリサーチ社（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）１０−１９−１８−ｘｘ） P＝末端リン酸
【０６１４】
表４：化学修飾したｓｉＮＡ構造の安定化学反応の、限定を目的としない例
【表４−１】
2007505606.tif 000087
【０６１５】
【表４−２】
2007505606.tif 000088
キャップ＝任意の末端キャップ、例として図１０を参照。全Ｓｔａｂ００−３２の化学反応は３'−末端チミジン（ＴＴ）残基から構成できる。全Ｓｔａｂ００−３２の化学反応は、通常約２１のヌクレオチドから成るが、ここに説明されている通り変えてもよい。Ｓ＝センス鎖ＡＳ＝ アンチセンス鎖
＊Ｓｔａｂ２３は３'−キャップに隣接する１つのリボヌクレオチドを有する。
＊Ｓｔａｂ２４およびＳｔａｂ２８は５'−末端に１つのリボヌクレオチドを有する。
＊Ｓｔａｂ２５、Ｓｔａｂ２６およびＳｔａｂ２７は５'−末端に３つのリボヌクレオチドを有する。
＊Ｓｔａｂ２９、Ｓｔａｂ３０およびＳｔａｂ３１、５'−末端から３つ目までのヌクレオチド部位のいずれのプリンもリボヌクレオチドである。ｐ＝ホスホロチオエート結合
【０６１６】
表５：Ａ．２．５μｍｏｌ 合成サイクルＡＢＩ３９４装置
【表５−１】
2007505606.tif 000089
【０６１７】
表５：Ｂ．０．２μｍｏｌ 合成サイクルＡＢＩ３９４装置
【表５−２】
2007505606.tif 000090
【０６１８】
表５：Ｃ．０．２μｍｏｌ 合成サイクル９６ウェル装置
【表５−３】
2007505606.tif 000091
・待ち時間にはデリバリーの間の接触時間は含まれない。
・タンデム合成にはリンカー分子の二重カップリングを使用する。
【図面の簡単な説明】
【０６１９】
【図１】図１は、ｓｉＮＡ分子の合成スキームの限定を目的としない例を示す。
【図２】図２は、本発明の方法によって合成した精製ｓｉＮＡ二重鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルを示す。
【図３】図３は、ＲＮＡｉに関与する標的ＲＮＡ分解の限定を目的としない機構図案を示す。
【図４】図４は、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。
【図５】図５は、本発明の化学修飾ｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。
【図６】図６は、本発明の異なるｓｉＮＡ構造の限定を目的としない例を示す。
【図７】図７は、ｓｉＮＡヘアピン構造を生成するために発現カセットを生成するのに使用するスキームを図示する。
【図８】図８は、二本鎖ｓｉＮＡヘアピン構造を生成するために発現カセットを生成するのに使用するスキームを図示する。
【図９】図９は、メッセンジャーＲＮＡ等、特定の標的核酸配列内のｓｉＮＡ媒介性ＲＮＡｉ の標的部位を判定するのに使用する方法を図示する。
【図１０】図１０は、本発明のｓｉＮＡ配列の３'端を安定化するのに使用できる異なる安定した化学的性質の例を示す。
【図１１】図１１は、ＲＮＡｉ活性を媒介する能力を保持しながらヌクレアーゼに抵抗する本発明の化学修飾したｓｉＮＡ構造の識別に使用する方法の例を示す。
【図１２】図１２は、本発明の線形二本鎖構造及びその非対称派生を含むリン酸化ｓｉＮＡ分子の限定を目的としない例を示す。
【図１３】図１３は、本発明の化学的修飾されたリン塩酸酸化端グループの限定を目的としない例を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、パリンドロームおよび／または標的核酸配列において識別される反復核酸配列を利用する自己相補ＤＦＯ構造の例を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、パリンドロームおよび／または標的核酸配列において識別される反復核酸配列を利用する自己相補ＤＦＯ構造の例を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、パリンドロームおよび／または標的核酸配列において識別される反復核酸配列を利用する自己相補ＤＦＯ構造の例を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、パリンドロームおよび／または標的核酸配列において識別される反復核酸配列を利用する自己相補ＤＦＯ構造の例を示す。
【図１５】図１５は、パリンドロームおよび／または反復核酸配列を利用した自己相補ＤＦＯ構造の例を示す。
【図１６】図１６は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能ｓｉＮＡ分子にの例を示す。
【図１７】図１７は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる区別できる領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の例を示す。
【図１８】図１８は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる２つの個別のポリヌクレオチド配列を含む本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の例を示す。
【図１９】図１９は、異なる標的核酸配列の切断を対象としたＲＮＡｉをそれぞれ媒介できる区別できる領域を含む単一のポリヌクレオチド配列を含む、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子の例を示す。
【図２０】図２０は、２つの独立した標的核酸分子を本発明の多機能ｓｉＮＡ 分子がどのように標的とすることができるかに関する例を示す。
【図２１】図２１は、同一標的核酸分子内の２つの独立した標的核酸分子配列を、本発明の多機能ｓｉＮＡ分子がどのように標的とすることができるかに関する例を示す。
【図２２】図２２は、ｓｉＮＡ構造によるＨＣＶ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す。
【図２３】図２３は、ｓｉＮＡ構造 によるＨＣＶ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す。
【図２４】図２４は、化学修飾ｓｉＲＮＡ 構造によるＨＣＶ ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す。
【図２５】図２５は、化学修飾ｓｉＲＮＡ 構造によるＨＣＶ ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す。
【図２６】図２６は、化学修飾ｓｉＲＮＡ構造の例を示す。
【図２７】図２７は、化学修飾ｓｉＲＮＡ構造によるＨＣＶ／ポリオウィルスキメラのウィルス複製抑制を示す。
【図２８】図２８は、化学修飾ｓｉＲＮＡ 構造の例を示す。
【図２９】図２９は、化学修飾ｓｉＮＡ分子を使用する用量反応試験の例を示す。
【図３０】図３０は、化学修飾ｓｉＲＮＡ構造によるＨｕｈＨＣＶウィルス複製抑制を示す。
【図３１】図３１は、ｓｉＮＡ分子を用いた用量反応試験の結果を示す。
【図３２】図３２は、ｓｉＮＡ／インターフェロン併用治療の試験結果を示す。
【図３３】図３３は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図３４】図３４は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図３５】図３５は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図３６】図３６は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図３７】図３７は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図３８】図３８は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図３９】図３９は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図４０】図４０は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図４１】図４１は、多機能ｓｉＮＡによる用量反応試験の結果を示す。
【図４２】図４２は、本発明の連結された多機能ｓｉＮＡ 構造の限定を目的としない例を示す。
【図４３】図４３は、様々なデンドリマーベースの多機能ｓｉＮＡデザインの限定を目的としない例を示す。
【図４４】図４４は、様々な超分子の多機能ｓｉＮＡデザインの限定を目的としない例を示す。
【図４５】図４５は、３０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの限定を目的としない例を示す。
【図４６】図４６は、４０ヌクレオチドの前駆ｓｉＮＡ構造を使用して多機能ｓｉＮＡデザインを可能にするダイサーの限定を目的としない例を示す。
【図４７】図４７は、ＨＢＶの２６３位を標的とする多機能ｓｉＮＡ 構造を可能にするダイサーによるＨＢＶ ＲＮＡの抑制の限定を目的としない例を示す。
【図４８】図４８は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの限定を目的としない例を示す。
【図４９】図４９は、本発明の追加多機能ｓｉＮＡ構造のデザインの限定を目的としない例を示す。
【図１】
2007505606.tif 000093
【図２】
2007505606.tif 000094
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2007505606.tif 000101
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際調査報告】
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