(57)【要約】励起レーザービームを出力するレーザーと、第１のコア及び第２のコアを有するファイバー部材とを有する走査型顕微鏡。第２のコアは第１のコア内に配置され、レーザーから励起レーザービームを受け、励起レーザービームを試料に供給する。可動ステージは、ファイバー部材の端部及び／または試料を支持し、ファイバー部材の端部及び試料を互いに相対的に移動させる。
2007501447.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
励起レーザービームを出力するレーザーと、
第１のコアと第２のコアとを有し、前記第２のコアが前記第１のコア内に配置され、前記第２のコアが前記レーザーから前記励起レーザービームを受け、前記励起レーザービームを試料に供給するファイバー部材と、
前記ファイバー部材の端部及び前記試料からなる群の少なくとも１つを支持し、前記ファイバー部材の前記端部及び前記試料を互いに相対的に移動させる可動ステージと、
を含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２】
請求項１において、
前記励起レーザービームが前記試料に衝突して前記試料を示す信号を生成し、少なくとも前記第１のコアが前記試料からの前記信号を集めることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項３】
請求項２において、
前記信号が蛍光信号であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項４】
請求項２において、
前記信号がラマン信号であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項５】
請求項２において、
前記信号が前記励起レーザービームの逆反射信号であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項６】
請求項２において、
前記励起レーザービーム及び前記信号を受けるように接続された光学分離系と、
前記光学分離系に接続された光学検出系と、
をさらに含み、
前記光学分離系によって、前記信号が前記光学検出系に供給されることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項７】
請求項１において、
前記第２のコアが前記第１のコア内に前記第１のコアと同軸に配置されていることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項８】
請求項１において、
前記レーザーと前記ファイバー部材との間でレーザーエネルギーを伝達するように、前記レーザーと前記ファイバー部材との間に配置されたファイバーカップラーをさらに含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項９】
請求項１において、
前記ファイバー部材が複数のコアを含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１０】
請求項１において、
前記試料が生体組織であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１１】
請求項１において、
前記ファイバー部材の前記端部に接続され、解像力と前記試料の励起を向上させるレンズをさらに含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１２】
請求項１１において、
前記レンズは屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズであることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１３】
励起レーザービームを出力するレーザー源と、
複数のファイバー部材を有し、前記ファイバー部材のそれぞれが第１のコアと第２のコアとを有し、前記第２のコアが前記第１のコア内に配置され、前記第２のコアが前記レーザー源から前記励起レーザービームを受け、前記励起レーザービームを試料に供給して前記試料から信号を生成するファイバー部材系と、
前記励起レーザービーム及び前記信号を受けるように接続された光学分離系と、
前記光学分離系に接続された光学検出系と、
を含み、
前記光学分離系は、前記信号を前記光学検出系に伝達して検出させることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１４】
請求項１３において、
前記ファイバー部材系及び前記試料からなる群の少なくとも１つを支持し、前記ファイバー部材系及び前記試料を互いに相対的に移動させる可動ステージをさらに含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１５】
請求項１３において、
前記複数のファイバー部材のそれぞれの前記第１のコア及び前記第２のコアが前記試料からの前記信号を集めることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１６】
請求項１３において、
前記信号は蛍光信号であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１７】
請求項１３において、
前記信号はラマン信号であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１８】
請求項１３において、
前記信号が前記励起レーザービームの逆反射信号であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項１９】
請求項１３において、
前記第２のコアが前記第１のコアの内部にそれぞれ同軸に配置されていることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２０】
請求項１３において、
前記ファイバー部材系を介して前記励起レーザービームと前記信号を伝達するために前記ファイバー部材系に接続されたファイバーカップラーをさらに含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２１】
請求項１３において、
前記試料が生体組織であることを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２２】
請求項１３において、
前記ファイバー部材系に接続され、解像力と前記試料の励起を向上させるレンズをさらに含むことを特徴とする走査型顕微鏡。
【請求項２３】
請求項２２において、
前記レンズは屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズであることを特徴とする走査型顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は走査型顕微鏡に関する。より詳細には、本発明は、検出効率を向上させるためにダブルクラッドファイバーを使用した走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
共焦点顕微鏡法は、１９５７年にマーヴィン・ミンスキー（Ｍａｒｖｉｎ  Ｍｉｎｓｋｙ）が発明した。当初はステージ走査を採用し、静止した光ビームの焦点で試料をラスタパターンで移動させることによって像を得ていた。出射ピンホールは走査スポットと共役な像面に配置され、焦点からの信号のみがピンホールを通過し、焦点はずれの信号は検出系に達しない。従って、共焦点顕微鏡は広視野顕微鏡よりも通常は高い解像力を有する。さらに重要なことは、共焦点顕微鏡が三次元像を得るためのセクショニング（断面）性能を有することである。ステージ走査の利点は、イメージングできる領域が顕微鏡光学ではなく走査ステージの移動範囲によって決定されるため、視野を非常に大きくできるということである。しかし、ステージ走査にはその用途を制限する欠点がある。すなわち、大きなステージを正確に移動させるために時間がかかるため、走査速度が非常に遅いということである。また、ステージが移動すると、振動によって試料（特に液体に浸した生物試料）の測定の際に問題が生じる。これらの問題は、１９８０年代後半にレーザー走査共焦点顕微鏡が実用的な機器として開発されたことによって解決された。レーザー走査共焦点顕微鏡では、ビーム走査は対物レンズの入射瞳に結像される２つのガルバノ（検流計）ミラーによって制御される。そのため、入射励起光線の方向のみが入射面において変化し、瞳は走査時に完全に照射されている。従って、対物レンズからのレーザービームの焦点スポットによって試料が走査される。ガルバノミラーによるビーム走査は非常に高い走査速度を有し、試料ステージも移動しないため、試料に振動が加わることはない。しかし、ビーム走査にも欠点がある。すなわち、対物レンズの入射瞳へのレーザービームの入射角は所定の範囲で変化しなければならないため、高価で高品質な対物レンズを使用しても収差が必然的に生じる。また、対物レンズの角度によって視野は大きく制限される。多光子共焦点顕微鏡の発明により、出射ピンホールを省略することによって検出効率が高まった。しかし、基本的な走査メカニズムは上述した共焦点顕微鏡と同様である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
上述したように、ステージ／ビーム走査共焦点顕微鏡は多くの研究分野、特に生物学で必須のツールであるが、それぞれに欠点がある。本発明は、ステージ／ビーム走査の利点を有するとともに、従来の共焦点顕微鏡の主要な欠点を克服する新規なダブルクラッドファイバー共焦点走査型顕微鏡を提供するものである。本発明は、高い柔軟性や低コストといった重要で新しい特徴ももたらすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の原理によれば、レーザーエネルギーを出力するレーザーを有する走査型顕微鏡が提供される。第１のコアと第２のコアとを有するファイバー部材がレーザーに接続されている。ファイバー部材の第２のコアは、第２のコアの第１のクラッドとしても機能する第１のコア内に配置されている。第２のコアは第１のコアよりも小さい。第１のコアは第２のクラッドによって取り囲まれている。ファイバー部材の反対側の端部は可動ステージに取り付けられ、可動ステージとともに移動する。
【０００５】
本発明のさらなる利用可能性は以下の詳細な説明から明らかになるだろう。以下の詳細な説明と実施例は本発明の好適な実施形態を示すものではあるが、単なる例示のみを意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
以下の詳細な説明と添付図面から本発明はさらに良く理解されるだろう。
【０００７】
以下の好適な実施形態の説明は単なる例示であって、本発明あるいは本発明の用途または使用を限定することを意図するものではない。
【０００８】
対物レンズで入射ビームの角度を変化させる従来のビーム走査とは異なり、本発明のビーム走査は光ファイバーを移動させることによって達成することができ、光ファイバーは励起のためにレーザービームを供給するとともに、同一のファイバーに沿って信号を集める。従来のファイバー（シングルモードまたはマルチモードファイバー）は、このように使用することはできない。すなわち、シングルモードファイバー（ＳＭＦ）は励起のための十分なモードを有するが、開口数（ＮＡ）が通常は約０．１と小さいため、信号収集効率が非常に低い。一方、マルチモードファイバーは信号を収集するために適した大きな開口数を有するが、出力モードを厳密に焦点合わせすることができないため、励起効率が悪く、解像力が低い。また、多光子励起の場合には、非常に短いレーザーパルスがマルチモードファイバー内を伝播する際に大きく変形するため、マルチモードファイバーでは励起速度（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）がさらに低下する。
【０００９】
バイオセンシング（ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ）において上述したトレードオフの問題に対処するため、米国仮特許出願第６０／４３４，６０４号に記載されているように、ファイバーによるバイオセンシングの励起・収集効率を高めるためにダブルクラッドファイバーを使用することが考えられる。なお、米国仮特許出願第６０／４３４，６０４号は、この参照によって本願の開示の一部をなすものとする。米国仮特許出願第６０／４３４，６０４号では、図１に示すように、フォトニック結晶ダブルクラッドファイバーを使用した二光子蛍光検出感度（線Ａ）は、従来のＳＭＦ（線Ｂ）と比較して４０倍増加する。
【００１０】
図２は、ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０の概略図である。なお、このダブルクラッドファイバー走査メカニズムに基づく別の構成も考えられ得る。ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０は、レーザービーム１４（励起レーザービーム）を出力することができるレーザー１２を有する。レーザー１２は、ファイバーカップラー１８を介してダブルクラッドファイバー（ファイバー部材）１６に接続されている。具体的には、ダブルクラッドファイバー１６は、インナーコア２０と、アウターコア２２と、アウタークラッド２４と、を含む。なお、インナーコア２０がアウターコア２２及びアウタークラッド２４と同軸であるものとして示しているが、インナーコア２０はアウターコア２２及びアウタークラッド２４と同軸でなくともよい。また、アウターコア２２はインナーコア２０のインナークラッドとしても機能する。従って、アウターコア２２は２つの用途を有することになる。図３（ａ）に示すように、ダブルクラッドファイバー１６は、複数のファイバー１６からなるファイバー部材系１６’であってもよい。
【００１１】
レーザー１２は、レーザービーム１４がダブルクラッドファイバー１６の近位端２６においてインナーコア２０に導入されるように、ファイバーカップラー１８を介してダブルクラッドファイバー１６に接続されている。ダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８は、ダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８から出射するレーザービーム１４を試料３２上で移動させることができる三次元高速走査ステージ３０に接続されている。屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズ等のマイクロレンズ３４をダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８に取り付けてレーザービーム１４の焦点を狭めることにより、高い解像力を達成することができる。試料３２から放出された信号、例えば、蛍光信号、ラマン信号、レーザービーム１４の逆反射は、ダブルクラッドファイバー１６のインナーコア２０及びアウターコア２２を通過して集められ、光学検出系３８に達する前にダイクロイックミラー等の光学分離系３６によって励起レーザービーム１４から分離される。また、不必要な信号が光学検出系３８に達しないようにフィルター４０を使用することができる。
【００１２】
ダブルクラッドファイバー１６では、インナーコアとアウターコア（インナークラッド）の開口数をそれぞれ独立して調整することができる。アウターコアの開口数は、空気中において、高倍率対物レンズと同等の約０．８であってもよい。また、励起光をさらに焦点合わせするために屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズなどのレンズがダブルクラッドファイバー１６に接続されている場合には、レンズの色収差がある場合でも大きなアウターコアが効率的に蛍光を集めることができるため、レンズからダブルクラッドファイバーに戻る蛍光信号の収集効率は高い。この場合、従来のファイバーを使用すると信号収集効率は低下する。
【００１３】
図３（ａ）〜（ｅ）は、ＧＲＩＮレンズから集められた蛍光がダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８で大きなスポットを形成する様子を示している。すなわち、図３（ａ）に示すように、ファイバー部材系１６’は複数のインナーコア２０とアウターコア２２を含む。図３（ｂ）に示すように、励起ビーム３００がダブルクラッドファイバー１６を出射すると、励起ビーム３００はＧＲＩＮレンズ等のレンズ３４を通過し、試料３２上に焦点を結ぶ。励起ビーム３００によって、図３（ｃ）に示すような信号３０２が試料３２から生じる。例えば、信号３０２の半径は約１μｍであってもよい。図３（ｄ）に示すように、信号３０２は再びレンズ３４を通過する。理想的には、信号３０２はダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８に完全に焦点を合わせる。しかし、色収差及び／またはその他の例外のために、信号３０２の大きなフットプリントが形成され、信号３０２は約４９μｍの半径を有する場合がある。従来では、このような大きなフットプリントは一点に集めることができず、系の効率が低下することがあった。しかし、本発明では、大きな開口数を有するアウターコア２２が多くの信号３０２を集めることができるため、検出効率が改善されている。
【００１４】
本発明のダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０は、従来の走査型顕微鏡と比較して多くの利点を有する。例えば、上述したように、ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０は非常に単純な構造を有する。さらに、ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０は、このような新しい走査型顕微鏡の特徴の多くを構成する画期的で基本的に異なる走査メカニズムを有する。
【００１５】
（優れた柔軟性）
本発明のダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０は高い柔軟性を有する。具体的には、ダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８を含む走査ヘッドを走査ステージ３０の小さな移動（すなわち、ｘ−ｙまたはｘ−ｙ−ｚ）によって制御することができるため、励起源と検出に影響を与えることなくダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０を自由に調整することができる。従って、直立または倒立構成あるいは任意の角度で走査イメージングを行うことができる。また、走査ステージ３０は試料上であらゆる走査パターンを容易に達成することができる。さらに、走査ステージ３０は、励起源及び検出系とともにスタンドアローンの顕微鏡を構成するために使用することができる。また、走査ステージ３０は、従来の光学顕微鏡に組み込むユニットとしても使用することができる。例えば、走査ステージ３０はノーズピース（ｎｏｓｅｐｉｅｃｅ）にねじで取り付ける規格部品とすることができる。従って、従来の顕微鏡を上述した機能を有する走査型顕微鏡に容易に改造することができる。
【００１６】
（大きな走査範囲）
従来のビーム走査型顕微鏡とは異なり、ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０の走査範囲は、ダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８を制御するために使用される走査ステージ３０の移動範囲によって決まる。実際に、走査ステージ３０の移動範囲は、１μｍ未満の高い解像力を維持しながら１ｍｍ以上まで増加させることができることが判明した。この特徴によって、大きな試料の全体像を得ることができる。例えば、従来のビーム走査型顕微鏡の走査範囲は、対物レンズの視野が限られているために細胞サイズに過ぎない。一方、ダブルクラッドファイバー１６に基づく新しいビーム走査メカニズムでは、一回の走査で有機体または腫瘍全体をイメージングすることができる。
【００１７】
（高速走査）
実用的な機器を製作するためには高い走査速度が必要である。従来のステージ走査型顕微鏡では、試料及び試料ホルダーとともに大きなステージを移動させるために時間がかかるため、走査速度は通常は非常に遅い。本発明の走査メカニズムでは、軽いファイバー先端を移動させるのみである。ビーム走査に使用されるスキャナミラーと同様に、高速スキャナによってファイバー先端を高速に走査することができる。
試料に対する振動がない
上述した高い走査速度にもかかわらず、ステージ走査とは異なり、試料は走査時に静止したままであるため、試料のイメージングを妨げる振動が生じない。上述した高い走査速度を達成することができるのは、ファイバー先端が軽量であることに加えて、このように試料の振動が発生しないためである。また、ファイバー先端からの遠距離励起（ｆａｒ  ｆｉｅｌｄ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を振動のないビーム走査を達成するために利用しており、走査端と試料との間の相互作用が通常は深刻な問題となる近距離走査光学顕微鏡法では避けられない問題を回避することができる。
【００１８】
（無収差走査）
従来のビーム走査では、対物レンズの入射瞳で励起光の入射角を変化させるために２つのスキャナミラーを使用しており、相当な光軸収差（ｏｆｆ−ａｘｉｓ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ）が発生する。光軸収差を補正した対物レンズを設計・製作することは非常に困難であり、コストもかかる。また、様々な努力が行われてはいるが、特に視野が比較的大きな場合には光軸収差を完全に補償することが困難なため、視野とイメージ品質との間で妥協せざるを得ない。柔軟性のあるダブルクラッドファイバー１６による励起ビームの走査によって、従来のビーム走査に伴う収差の問題を基本的に解決することができる。ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０では、試料の各走査点は等しく照射され、信号は走査範囲全体で均一に集められる。この特徴により、大きな試料の高品質なイメージを得ることができる。
【００１９】
（低コスト）
ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０を製作するためのコストは、スキャナミラーに基づく走査装置を有する従来のビーム走査型顕微鏡よりも非常に低い。上述したように、対物レンズに対する要件は、比較的大きくフラットな視野を達成し、光軸収差を補償するために重要である。また、スキャナミラーを対物レンズの入射瞳に結像するためには高い光学品質を有する撮像系が必要である。これらの要因により、従来のビーム走査型顕微鏡は非常に高価なものとなる。
【００２０】
一方、ダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０では、ファイバーカップラー１８に使用される対物レンズのみがダブルクラッドファイバー１６の近位端２６に光の焦点を結ぶ。従って、ファイバーカップラー１８の対物レンズは、上述の要件を満たすとともに比較的安価に製造することができる。ビーム走査は走査ステージ３０によってダブルクラッドファイバー１６の遠位端２８を制御することによって行われ、従来のビーム走査型顕微鏡で使用されているスキャナミラーと高品質撮像系からなる高価な走査装置は不要である。そのため、ダブルクラッドファイバー１６を使用した新規なビーム走査メカニズムによれば、低コストかつ高性能な顕微鏡を製作することができる。
【００２１】
（Ｃ．ダブルクラッドファイバーアレイ走査型顕微鏡）
以上の説明では、一本のダブルクラッドファイバー１６を使用したダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡１０について述べた。なお、図４に示すようにダブルクラッドファイバー１６の一次元または二次元アレイ２００を使用することによって、走査速度をさらに高めることができることが判明している。
【００２２】
励起光は、ＭＥＭＳスイッチなどの既存の技術を利用してダブルクラッドファイバーアレイ２００に接続することができる。一本のファイバーで走査する代わりにダブルクラッドファイバーアレイ２００で同時に走査した場合には、走査速度はアレイに設けられたダブルクラッドファイバーの数に応じて増加する。例えば、１ｍｍ間隔で設けられ、１つの移動ステージ３０に配置された５本のダブルクラッドファイバー１６を使用する場合には、移動ステージ３０を１ｍｍ移動させることによって５ｍｍのラインを走査することができる。このように、一本のファイバーによる走査と比較して走査速度は５倍となる。ダブルクラッドファイバーの二次元アレイを使用すれば、大きなイメージング領域であっても高い走査速度を維持することができる。
【００２３】
ダブルクラッドファイバーの走査による走査型顕微鏡の新規なメカニズムを提供する。この顕微鏡は、従来のステージ／ビーム走査型顕微鏡の欠点を克服するものであり、優れた柔軟性、大きな走査範囲、高い走査速度、無振動走査、無収差走査、低コストという上述した多くの利点を有する。これらの全ての利点を１つの顕微鏡に統合すれば、広範囲な潜在的用途が期待される。
【００２４】
本発明の説明は単に例示を目的としたものであり、本発明の要旨から逸脱しない変形及び変更も本発明の範囲に含まれることを意図したものである。従って、そのような変形及び変更も本発明の範囲から逸脱するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】シングルモードファイバーとの比較におけるダブルクラッドファイバーを介して検出された二光子蛍光強度を示すグラフである。
【図２】本発明のダブルクラッドファイバー走査型顕微鏡を示す概略図である。
【図３】ＧＲＩＮレンズを使用して励起ビームの焦点を合わせ、蛍光またはその他の信号を集めた場合の計算結果である。収集した蛍光のスポットサイズは半径が約４９μｍであり、ファイバー先端における励起ビームよりも大きい。
【図４】走査ヘッドとして使用されるダブルクラッドファイバーアレイの斜視図である。
【図１】
2007501447.tif 000003
【図２】
2007501447.tif 000004
【図３】
2007501447.tif 000005
【図４】
2007501447.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成18年2月1日(2006.2.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2007501447.tif 000007
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2007501447.tif 000008
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2007501447.tif 000009
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2007501447.tif 000010
【国際調査報告】
2007501447.tif 000011
2007501447.tif 000012