(57)【要約】  軟骨細胞上のＷＩＳＰ−１ポリペプチドの活性を遮断又は抑制するために使用される方法及び組成物が提供される。ＷＩＳＰ−１アンタゴニストは、哺乳動物の軟骨細胞に対するＷＩＳＰ−１の影響を抑制又は中和するように作用する、抗ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン及びＷＩＳＰ−１変異体（及びそれらの融合タンパク質）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
損傷した軟骨組織を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることを含む、前記軟骨組織の治療方法。
【請求項２】
前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド、及びＷＩＳＰ−１変異体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＷＩＳＰ−１ポリペプチドが、ヒトＷＩＳＰ−１のドメイン１のアミノ酸２４〜１１７（配列番号１）からなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＷＩＳＰアンタゴニストがＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記軟骨組織が関節軟骨組織である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビボで哺乳動物の損傷した軟骨組織に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビトロで損傷した軟骨組織に接触させ、その後哺乳動物に移植する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物の軟骨細胞の前駆細胞を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることを含む、軟骨細胞の前駆細胞の分化を刺激する方法。
【請求項１０】
前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド、及びＷＩＳＰ−１変異体からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＷＩＳＰ−１ポリペプチドが、ヒトＷＩＳＰ−１のドメイン１のアミノ酸２４〜１１７（配列番号１）からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＷＩＳＰアンタゴニストがＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビボで哺乳動物の軟骨細胞の前駆細胞に接触させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビトロで軟骨細胞の前駆細胞に接触させ、その後哺乳動物に移植する、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物の軟骨疾患の治療法であって、前記哺乳動物に有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１７】
前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド、及びＷＩＳＰ−１変異体からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＷＩＳＰ−１ポリペプチドが、ヒトＷＩＳＰ−１のドメイン１のアミノ酸２４〜１１７（配列番号１）からなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＷＩＳＰアンタゴニストがＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記軟骨疾患が変性軟骨疾患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記軟骨疾患が関節軟骨疾患である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記関節軟骨疾患が、骨関節炎又はリウマチ様関節炎である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
また、前記哺乳動物を１以上の外科的技術を用いて治療する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、外科的技術の前、後、及び／又はそれと同時に投与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＷＩＳＰアンタゴニスト及び担体、賦形剤及び／又は安定剤、並びに軟骨疾患の治療に前記ＷＩＳＰアンタゴニストを使用するための指示印刷物を含む、キット又は製造品。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
（関連出願）
この出願は、出典明示によりその内容がここに取り込まれる２００３年９月１１日に出願された仮出願番号第６０／５０２０１３号に基づく第１１９条（ｅ）項の優先権を主張する非仮出願である。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、軟骨細胞及び軟骨に関連する疾患の治療においてＷＩＳＰアンタゴニストを使用する方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）は、ＴＧＦ-βを含む多くの因子によって線維芽細胞において誘導される成長因子であり、形質転換された細胞の性質である付着依存性成長（ＡＩＧ）を誘導するＴＧＦ-βの能力に対して必須である。ＣＴＧＦは培養された内皮細胞の成長培地中に存在する血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）二量体のタイプを同定する試みにおいて発見されたものである。米国特許第５４０８０４０号を参照のこと。ＣＴＧＦはまた細胞に対して分裂促進的で化学走性であり、よってこのファミリーの成長因子は、ヒト組織の正常な発達、成長及び修復に所定の役割を担っているものと考えられている。
Ｃｙｒ６１のニワトリオルソログ、ＣＥＦ１０、ヒト、マウス、及びアフリカツメガエルＣＴＧＦ、及びヒト、ニワトリ、及びアフリカツメガエルＮｏｖを含む、ＣＴＧＦに関連したタンパク質が単離され、クローニングされ、配列決定され、ＣＣＮ遺伝子ファミリーに属するものと特徴付けられている。Oemar及びLuescher, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 1483-1489 (1997)。Ｃｙｒ６１は血管形成、腫瘍成長及び血管新生を促進することが見出された。Babic等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6355-6360 (1998)。ｎｏｖ遺伝子は腎臓において本質的に胚形成期に発現され、正常な腎臓に対して、ｎｏｖ発現の変化が鳥類腎芽細胞腫とヒトウイルム腫瘍の双方で検出されている。Martinerie等, Oncogene, 9: 2729-2732 (1994)。Ｗｔ１はｎｏｖ発現をダウンレギュレートし、このダウンレギュレーションが正常な及び腫瘍の腎形成におけるキーとなる要素を表しているかもしれない。Martinerie等, Oncogene, 12: 1479-1492 (1996)。ＣＣＮファミリーの異なったメンバーは様々な可溶性又はマトリクス随伴巨大分子、特に硫酸化された複合糖質と相互作用する（Holt等, J. Biol. Chem., 265:2852-2855 (1990)）。この相互作用はヘパリン-アガロースでのアフィニティクロマトグラフィーによりＣｙｒ６１及びＣＴＧＦを精製するために使用された（Frazier等, J. Invest. Dermatol., 107:404-411 (1996); Kireeva等, Mol. Cell. Biol., 16:1326-1334 (1996)）。Ｃｙｒ６１は分泌されそのヘパリン硫酸に対する親和性のために細胞外マトリックスと細胞表面の双方に伴う（Yang等, Cell. Growth Diff., 2:351-357 (1991))。
【０００４】
ＥＬＭ１は、低転移性マウス細胞において同定された。Hashimoto等, J. Exp. Med., 187: 289-296 (1998)。以下に開示するＷＩＳＰ-１のマウスオルソログであるｅｌｍ１遺伝子は、ＣＴＧＦの他のメンバー、Ｃｙｒ６１／Ｃｅｆ１０及び神経芽細胞腫過剰発現遺伝子ファミリーであり、インビボでのＫ-１７３５マウスメラノーマ細胞の腫瘍成長と転移を抑制する。以下に記載するＷＩＳＰ-２のラットのオルソログであるｒＣｏｐ-１に関する他の最近の文献は、細胞形質転換後のこの遺伝子の発現の消失を記載している。Zhang等, Mol. Cell. Biol., 18:6131-6141 (1998)。
ＣＣＮファミリーメンバー（ｎｏｖを除く）は、細胞増殖、分化、胚形成、及び創傷治癒を調節すると考えられている最初期成長応答性遺伝子である。CCN遺伝子ファミリーのメンバー間の配列相同性は若干高い；しかし、これらのタンパク質のインビトロでの機能は成長刺激（つまり、ヒトＣＴＧＦ）から成長阻害（つまり、ニワトリＮｏｖとおそらくｈＣＴＧＦも）までの範囲にわたる。更に、ＣＴＧＦに対するある種の分子ホモログは、線維形成の防止、ある種の癌に伴う高度に細胞性の過剰な結合組織ストローマ、及び例えば強皮症、ケロイド、好酸球性筋膜炎、結節性筋膜炎、及びデュピュイトラン痙縮のような様々な皮膚疾患を伴う線維性病巣の形成に有用であることが示されている。更に、ＣＴＧＦ発現は乳腺腫瘍の線維ストローマにおいて最近実証されており、癌ストローマの形成が創傷治癒のように類似の線維増殖性成長因子の誘導を含むことを示唆している。ヒトＣＨＧＦはまた進行したアテローム硬化型病巣において非常に高いレベルで発現されるが、正常な動脈では発現されず、アテローム性動脈硬化症においてある役割を果たしている可能性を示唆している。上掲のOemar及びLuescher。
【０００５】
Ｗｎｔは、そのメンバーが回虫、昆虫、軟骨魚、及び脊椎動物で見出されている大きな遺伝子ファミリーによってコードされる。Holland等, Dev. Suppl., 125-133 (1994)。Ｗｎｔは、多くの広範な種が複数の保存Ｗｎｔ遺伝子を有しているので、様々な発生及び生理学的過程において機能するものと考えられる。McMahon, Trends Genet., 8: 236-242 (1992); Nusse及びVarmus, Cell, 69: 1073-1087 (1992)。Ｗｎｔ遺伝子は幾つかの原始細胞型において活性な傍分泌又は自己分泌シグナルとして機能すると考えられる分泌糖タンパク質をコードしている。上掲のMcMahon (1992); 上掲のNusse及びVarmus (1992)。Ｗｎｔ成長因子ファミリーは、ｃＤＮＡクローニングによって、マウスにおいて同定された１０を越える遺伝子（Ｗｎｔ-１、-２、-３Ａ、-３Ｂ、-４、-５Ａ、-５Ｂ、-６、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ａ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１、-１２、及び-１３）（例えば、Gavin等, Genes Dev., 4: 2319-2332 (1990); Lee等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2268-2272 (1995); Christiansen等, Mech. Dev., 51: 341-350 (1995)を参照）及びヒトにおいて同定された少なくとも９つの遺伝子（Ｗｎｔ-１、-２、-３、-５Ａ、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１）を含む。例えば、Vant Veer等, Mol. Cell. Biol., 4:2532-2534 (1984)を参照のこと。
Ｗｎｔ-１プロト癌遺伝子（ｉｎｔ-１）は、ウイルスＤＮＡ配列の挿入のためにマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）によって誘導される乳腺腫瘍から元々は同定された。Nusse及びVarmus, Cell 31: 99-109(1982)。成体マウスにおいて、Ｗｎｔ-１ｍＲＮＡの発現レベルは精子発生の後期段階において精巣にのみ検出される。Ｗｎｔ-１タンパク質は約４２ＫＤａであり、分泌のためのシグナル配列として機能しうるアミノ末端疎水性領域を含んでいる（上掲のNusse及びVarmus, 1992）。Ｗｎｔ-２／ｉｒｐの発現はマウス胎仔及び成体組織中で検出され、その分布はＷｎｔ-１の発現パターンとオーバーラップしない。Ｗｎｔ-３はマウス乳腺腫瘍形成に関連している。マウス胚でのＷｎｔ-３の発現は神経管と肢芽において検出されている。Ｗｎｔ-５ａ転写物は、９．５から１４．５日齢の発達中の前肢及び後肢において検出されており、最も高いレベルは肢の遠位端の外胚葉性頂に濃縮している。上掲のNusse及びVarmus (1992)。最近、Ｗｎｔ-ｘと呼ばれるＷｎｔ成長因子が、骨組織及び骨由来細胞でのＷｎｔ-ｘの発現の検出と共に記載されている（ＷＯ９５／１７４１６）。また、成熟骨芽細胞の維持におけるＷｎｔ-ｘの役割と、治療薬として又は骨関連疾病を治療するための他の治療薬の開発においてＷｎｔ-ｘ成長因子を使用することも記載されている。Ｗｎｔ経路が、軟骨細胞及び骨芽細胞の分化を調節することにより骨格因子の成長、パターン形成及び形態形成に影響している可能性があることが、これまでに開示されている。Gong等、Cell,  107:513-523 (2001); Hartmann等、Development, 127:3141-3159 (2000); Hartmann及びTabin, Cell, 104:341-351 (2001); Rudnicki及びBrown, Dev Biol, 185:104-118 (1997)。
【０００６】
Ｗｎｔは局所の細胞シグナル伝達に役割を担っている可能性がある。生化学的研究により、分泌されたＷｎｔタンパク質の多くが、培地に自由に拡散するよりむしろ細胞表面又は細胞外マトリックスに付随して見出されうることが示された。Papkoff及びSchryver, Mol. Cell. Biol., 10: 2723-2730 (1990)；Bradley及びBrown, EMBO J., 9: 1569-1575 (1990)。
Ｗｎｔ遺伝子における突然変異の研究は、成長調節及び組織パターニングにおけるＷｎｔの役割を示した。ショウジョウバエにおいて、無羽（ｗｇ）はＷｎｔ関連遺伝子をコードし（Rijsewik等, Cell, 50: 649-657 (1987)）、及びｗｇ変異は胚外胚葉、神経形成、及び成虫原基成長のパターンを変えた。Morata及びLawerence, Dev. Biol., 56: 227-240 (1977); Baker, Dev. Biol., 125: 96-108 (1988); Klingensmith及びNusse, Dev. Biol., 166: 396-414 (1994)。線虫においては、ｌｉｎ-４４が非対称的細胞分裂に必要なＷｎｔ相同体をコードする。Herman及びHorvitz, Development, 120: 1035-1047 (1994)。マウスにおけるノックアウト突然変異は、Ｗｎｔが脳の発達（McMahon及びBradley, Cell, 62: 1073-1085 (1990); Thomas及びCappechi, Nature, 346: 847-850 (1990)）、及び腎臓（Stark等, Nature, 372: 679-683 (1994)）、尾芽（Takada等, Genes Dev., 8: 174-189 (1994)）、及び肢芽についての胚原基の成長に必須であることを示した。Parr及びMcMahon, Nature, 374: 350-353 (1995)。乳腺におけるＷｎｔの過剰発現は、乳腺過形成（上掲のMcMahon (1992); 上掲のNusse及びVarmus (1992)）、及び早熟性肺胞発達をもたらす。Bradbury等, Dev. Biol., 170: 553-563 (1995)。
【０００７】
Ｗｎｔ-５ａ及びＷｎｔ-５ｂは７−８日齢のマウス胚の後及び側部中胚葉及び胚外中胚葉において発現される。上掲のGavin等, (1990)。これらの胚性ドメインは多能の造血前駆体及びＨＳＣが誘導されるＡＧＭ領域及び卵黄嚢組織に寄与する。Dzierzak及びMedvinsky, Trends Genet., 11: 359-366 (1995); Zon等, Gluckman及びCoulombel編, Colloque, INSERM, 235: 17-22 (1995)、１９９５年４月３−６日にフランス、パリにてのJoint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failureで紹介；Kanatsu及びNishikawa, Development, 122: 823-830 (1996)。Ｗｎｔ-５ａ、Ｗｎｔ-１０ｂ、及び他のＷｎｔは肢芽において検出され、Ｗｎｔ-７ｂに対して示されたように初期の骨の微環境の発達と様式における可能な役割を示している。上掲のGavin等(1990)；Christiansen等, Devel., 51: 341-350 (1995);上掲のParr及びMcMahon (1995)。
Ｗｎｔ／Ｗｇシグナル伝達経路は、生物体の生物学的発達において重要な役割を果たし、幾つかのヒト癌に関連している。またこの経路は腫瘍抑制遺伝子ＡＰＣも含んでいる。ＡＰＣ遺伝子における突然変異は、ヒト結腸直腸癌の散発性及び遺伝形態の発達と関連している。Ｗｎｔ／Ｗｇシグナルは細胞中でのβ-カテニン／アルマジロの蓄積を導き、βカテニン及びリンパエンハンサー結合因子／Ｔ細胞因子（ＬＥＦ／ＴＣＦ）ＨＭＧｂｏｘ転写因子ファミリーのメンバーからなる二連転写複合体の形成がなされる。この複合体は核に転位し、そこでショウジョウバエの波形縁のウルトラバイソラックス(Ultrabithorax)遺伝子のような、Ｗｎｔ／Ｗｇシグナルの下流の遺伝子の発現を活性化できる。
Ｗｎｔに関するレビューには、Cadigan及びNusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305 (1997)を参照のこと。
【０００８】
Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)は、二つの遺伝子ＷＩＳＰ-１及びＷＩＳＰ-２、及び第３の関連する遺伝子ＷＩＳＰ-３のクローニングと特徴付けを記載している。Pennica等は、これらのＷＩＳＰ遺伝子がＷｎｔ-１シグナル伝達の下流にあり、大腸癌でのＷＩＳＰ発現の異常なレベルが大腸腫瘍形成においてある役割を担っている可能性があると報告している。ＷＩＳＰ-１は最近β-カテニン調節遺伝子として同定されており、その発癌性活性の特徴付けは、ＷＩＳＰ-１がβ-カテニン媒介腫瘍形成に寄与しているかもしれないことを実証した（Xu等, Gene & Develop., 14:585-595 (2000)）。正常なラット腎臓細胞（ＮＲＫ-４９Ｆ）中でのＷＩＳＰ-１過剰発現は形態変換、加速された細胞成長及び亢進された飽和密度を誘導した。また、これらの細胞はヌードマウスに注入されると直ぐに腫瘍を形成し、ＷＩＳＰ-１が腫瘍形成にある種の役割を担っている可能性があることを示唆している（上掲のXu等, 2000）。
Hurvitz等, Nature Genetics, 23:94-97 (1999)は、無関係の個人におけるＷＩＳＰ３の９つの異なった変異が常染色体性劣性骨格疾患である進行性疑性リウマチ様異形成症（ＰＰＤ）を伴うことが見出された。ヒト滑膜細胞、関節軟骨細胞、及び骨髄由来間葉前駆細胞においてＲＴ-ＰＣＲによるＷＩＳＰ３の発現がHurvitz等によって観察された。
【０００９】
１９９８年５月２２日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９８／２１２３６は、成長因子スーパーファミリーの２６ｋＤａメンバーをコードしているヒト結合組織成長因子遺伝子-３（ＣＴＧＦ-３）を開示している。ＷＯ９８／２１２３６は、ＣＴＧＦ-３アミノ酸配列はヒト骨芽細胞ｃＤＮＡクローンから推定され、ＣＴＧＦ-３が卵巣、精巣、心臓、肺、骨格筋、副腎髄質、副腎皮質、胸腺、前立腺、小腸及び大腸のような複数の組織で発現されたことを開示している。
幾人かの研究者は腫瘍におけるプロテオグリカン組成の変化を文献化している。特に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの顕著な生産は様々な悪性腫瘍におけるよく認識された現象である。また、プロテオグリカンを含むデルマタン硫酸であるデコリンの発現は、ヒト癌腫の悪性とよく相関していることが示された（Adany等, J. Biol. Chem., 265:11389-11396 (1990); Hunzlemann等, J. Invest. Dermatol., 104:509-513 (1995)）。デコリンが幾つかの癌腫の成長を抑制することが実証された（Santra 1997）。腫瘍形成性発達におけるデコリンの機能は十分には理解されていないが、腫瘍周囲ストローマ中でのデコリンの発現が侵入新生細胞への宿主結合組織細胞の局所的応答を反映させていると提案された（Stander等, Gene Therapy, 5:1187-1194 (1999)）。
【００１０】
結合組織成長因子／システインリッチ６１／腎性芽細胞腫過剰発現（ＣＮＮ）ファミリーの様々なメンバー及びその各性質と活性の最近のレビューのためには、Brigstock, Endocrine Reviews, 20:189-206 (1999)を参照のこと。
変性軟骨疾患は、広義には、患部の痛み、硬化又は運動能力減退により認識される結合組織の変性又は代謝系の異常により特徴づけられる疾患の群を表す。これらの疾患の原因は、例えば病理的であるか又は外傷や怪我によるものであり得る。
【００１１】
骨関節炎（ＯＡ）は、骨関節症又は変形性関節疾患としても知られ、典型的には関節構造に影響する局所的な変性過程の繰り返しによるものであり、痛みや機能の減退を生じる。ＯＡはしばしば関節の破壊を加速しうる局所的な炎症因子を伴う。ＯＡは、プロテオグリカン（ＰＧ）及びコラーゲンの早期喪失を伴った、軟骨の滑らかな関節表面の破壊に、裂け目の形成とフィブリル化が続き、最後には軟骨の全層喪失により特徴づけられる。ＯＡの症状は、罹患した関節の、特に使用後の局部的な痛みを伴う。病気の進行に従って、症状は、持続的な痛みの感覚、局所的な不快、及び罹患した
ＯＡの局所性に対して、リウマチ様関節炎（ＲＡ）は滑膜、関節の間隙周辺の組織に発症するような全身性炎症疾患である。ＲＡは、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる慢性自己免疫疾患であり、典型的には、小及び大可動関節に影響を及ぼし、進行性の破壊を引き起こす。疾病が進行すると、ＲＡの症状は、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節の形成、さらに早期死亡を含む。ＲＡ及びＯＡの原因又は起源は明らかに異なるが、軟骨破壊に関連するサイトカイン及び酵素は同様のようである。
【００１２】
ペプチド成長因子は、軟骨成長及び軟骨細胞挙動（即ち、分化、移動、分裂、及びマトリクス合成又は分解）の重要な制御因子であると考えられている。F.S.Chen等、Am J. Orthop. 26:396-406 (1997)。軟骨修復を刺激することが既に提唱されていた成長因子には、インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）、Osborn, J. Orthop. Res. 7:35-42 (1989)；Florini & Roberts, J. Gerontol. 35:23-30 (1980)；塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、Toolan等、J. Biomec. Mat. Res. 41:244-50 (1998)；Sah等、Arch. Biochem. Biophys. 308:137-47 (1994)；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、Sato & Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87 (1984)；Chin等、Arthritis Rheum. 34:314-24 (1991)及びトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、Hill & Logan, Prog. Growth Fac. Res. 4:45-68 (1992)；Guerne等、J. Cell Physiol. 158:476-84 (1994)；Van der Kraan等、Ann. Rheum. Dis. 51:643-47 (1992)が含まれる。
インスリン様成長因子（ＩＧＦ-１）は、培養におけるマトリックス合成と細胞増殖の両方を促進し、K. Osborn. J. Orthop. Res. 7: 35-42(1989)、ＩＧＦ-１の不適切な部分は骨関節炎の進行の病因的役割を有しうることである。R.D. Coutts,等, Instructional Course Lect. 47: 487-94, Amer. Acad. Orthop. Surg. Rosemont, IL(1997)。変形関節炎の患者の血清のＩＧＦ-１濃度がコントロールグループよりも低いことが示唆された研究もあるが、他に違いの見られなかった研究もある。にもかかわらず、血清のＩＧＦ-１レベルとＩＧＦ-１に対する軟骨細胞の反応性はともに、年齢に従い減少する。J. R. Florini & S.B. Roberts, J. Gerontrol. 35:23-30(1980)。従って、ＩＧＦ-１の低下した利用性並びにＩＧＦ-１に対する減少した軟骨細胞反応性は、軟骨の恒常性を助長し、年齢の上昇と共に退化させうる。
【００１３】
ＩＧＦ-１は、変形関節炎の抑制治療に提案されている。実際に、ペントサンポリ硫酸ナトリウム（軟骨細胞分解活性阻害剤）と組み合わせたＩＧＦ-１の関節内投与は、組織学的状態の改善をもたらし、分解酵素（中性メタロプロテイナーゼ及びコラゲナーゼ）を正常レベルに近づけ、メタロプロテイナーゼ及びマトリックスコラーゲンの組織阻害剤となる。R.A. Rogachefsky, 等, Ann. NY Acad. Sci. 732: 889-95(1994)。単独で又は軟骨再生を促進する他の成長因子をアジュバンドとしたＩＧＦ-１の使用は、ＷＯ９１／１９５１０、ＷＯ９２／１３５６５、ＵＳ５４４４０４７、及びＥＰ４３４６５２に記載されている。
骨形成タンパク質（ＢＭＰ）は、成長因子の大きな形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）ファミリーのメンバーである。インビトロ及びインビボの研究において、ＢＭＰが間葉細胞の軟骨細胞への分化を促進することが示されている。K. Sato & M. Urist, Clin. Orthop. Relat. Res. 183:180-87 (1984)。さらに骨格成長因子及び軟骨誘導成長因子はＢＭＰと相乗効果があり、これらの成長因子とＢＭＰ及び成長ホルモンの組み合わせは間葉細胞の分化を開始させる。分化した細胞の後の増殖は他の因子により促進される。D.J. Hill & A Logan, Prog. Growth fac. Res. 4: 45-68(1992)。
形質転換成長因子β（ＴＧＦ-β）は、骨芽細胞、軟骨細胞、血小板、活性化リンパ球、及び他の細胞により産生される。R.D. Coutts等, 上掲。ＴＧＦ-βは、標的細胞、用量及び細胞培養条件によって、マトリックス合成及び細胞増殖の促進及び抑制の両方の特性を有す。P. Guerne等, J. Cell Physiol. 158:476-84(1994); H. Van Beuningen等, Ann. Rheum. Dis. 52: 185-91(1993); P. Van der Kraan等, Ann. Rheum. Dis. 51:643-47(1992)。さらに、ＩＧＦ-１と同様に、ＴＧＦ-βの反応性は年齢と共に減少する。P.Guerne等, J. Cell Physiol. 158: 476-84(1994)。しかしながら、ＴＧＦ-βは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ｂＦＧＦ、及びＩＧＦ-１を含む他の成長因子よりも軟骨細胞増殖をより効果的に促進し（Guerne等, 上掲）、軟骨細胞によるプロテオグリカン産生を促進する。ＴＧＦ-βはまた、軟骨細胞の異化作用を促進するサイトカインの影響を抑制調節するVan der Kraan等, 上掲。インビボで、ＴＧＦ-βは、間葉細胞の軟骨細胞への分化と増殖を誘発し、ウサギの関節軟骨で部分的肥厚の欠陥の修復を促進する。E.B. Hunziker & L.Rosenberg, Trans. Osthopaed. Res Soc.19:236(1994)。
【００１４】
研究者の中には軟骨又は軟骨細胞組織を修復する特定の成長因子の使用を中心に扱うものもいれば、他に、軟骨破壊を促進及び／又はマトリックス合成を阻害する分子の活性を抑制することを考えるものもいる。このような分子の１つには、関節内にあるいくつかの組織に不利に作用するサイトカインＩＬ-１αがあり、滑膜炎の発生、及び上方制御マトリックス金属プロテイナーゼ及びプロスタグランジン発現に関連する。V. Baragi等、J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；V.M. Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；C.H. Evans及びP.D. Robbins, J. Keukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；C.H. Evans等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；R. Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；R. Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。ＩＬ-１αに拮抗する手段の一つは、可溶性ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＩＬ-１のそのレセプターへの結合を抑制する天然発生タンパク質での処理によって、軟骨のＩＬ-１の直接的及び間接的な作用を妨げるものである。哺乳動物において、ただ１つのプロテアーゼ、つまりインターロイキン１β-コンバターゼ（ＩＣＥ）は、成熟した活性ＩＬ-１αを特異的に生成することができる。ＩＣＥの阻害は、ＩＬ-１αの生成を阻害することが示されており、関節炎の変性を遅延させうる（Martel-PElletier J.等 Front. Biosci. 4: d694-703）。溶解性ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、軟骨細胞との相互作用からＩＬ-１を防御することによりＩＬ-１の影響を阻害することができる天然発生タンパク質は、関節炎の動物モデルにおいて効果的であることも示されており、関節炎の発生又が進行を防止するその能力について最近ヒトで試験されている。他のサイトカイン、例えばＩＬ-１β、腫瘍壊死因子α、インターフェロンγ、ＩＬ-６及びＩＬ-８は、滑膜線維芽細胞様細胞、軟骨細胞及び／又はマクロファージの活性の増加に関連している。これらのサイトカインの抑制は炎症及び軟骨破壊を防止するのに有益な処理となりうる。実際に、ＴＮＦ-α活性を抑制する分子は、リウマチ様関節炎を有する患者の関節で有益に作用することが示されている。
【００１５】
軟骨マトリックスの分解は、プロテアーゼによるマトリックス分子（プロテオグリカン及びコラーゲン）の切断によると考えられている（Woessner JF Jr.,「Proteases of the extacellular matrix」, in Mow, V., Ratcliffe, A. (eds): Structure and Function of Articular Cartilage. Boca Raton, FL, CRC Press, 1994 及びSmith R.L., Front. In Biosci. 4:d704-712参照）。マトリックス分解に関係する重要な酵素は、まだはっきりと分かっていないが、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）及び「アグリカナーゼ」は関節破壊に重要な役割を有するようである。さらに、プロテイナーゼのセリン及びシステインファイリーのメンバー（例えば、カテプシン及びウロキナーゼ又はプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ及びｔＰＡ））もまた関与しているようである。プラスミン、ウロキナーゼ プラスミノーゲン活性因子（ｕＰＡ）及び組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、メタロプロテイナーゼの活性化の経緯において重要な役割を果たしうる。カテプシンＢ、Ｌ及びＳに近い関係にあるグループはマトリックス分解に関係することが証明され、これらのカテプシンはＯＡにおいて若干増加する。ＩＬ-１、ＴＮＦ-α及びＬＩＦを含む多くのサイトカインは、軟骨細胞でのＭＭＰ発現を誘発する。ＭＭＰの誘発は、ＴＧＦ-β及びＩＬ-４により、少なくともウサギにおいてはＦＧＦ及びＰＤＧＦにより拮抗することができる。動物研究で示されるように、これらのプロテアーゼ（ＭＭＰ及びアグリカナーゼ）の阻害剤は、生体内で障害から関節組織を少なくとも部分的に保護しうる。
また、酸化窒素（ＮＯ）は関節破壊において重要な役割を果たす。Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)。ＩＬ-１等のサイトカインで刺激された場合以外にＮＯを生成しない正常な軟骨と異なり、骨関節炎関節から得られる軟骨は、更なる刺激がないにもかかわらず培地において３日間にわたって大量の酸化窒素を生成する。さらに、ＮＯ生成の抑制は、ＩＬ-１媒介軟骨破壊及び軟骨細胞の死、並びに動物モデルにおいて骨関節炎の進行を防ぐことが証明されている。
【００１６】
（発明の概要）
本出願人は、ＷＩＳＰポリペプチドが軟骨細胞の分化を遮断又は抑制し得ることを見出した。従って現在、そのような活性を拮抗する分子（例えばＷＩＳＰアンタゴニスト）が、例えば骨関節炎を含む軟骨修復に影響する疾患の治療に有用であり得ると考えられている。
一実施態様では、本発明は、損傷した軟骨の治療方法において、上記患部関節組織を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることを含む方法に関する。本発明に使用することが考えられるＷＩＳＰアンタゴニストには、限定されるものではないが、ＷＩＳＰ-１抗体、及びＷＩＳＰ−１の選択ドメインから構成されるＷＩＳＰ−１ポリペプチドが含まれ、これらは以下に更に説明される。場合によっては、組織は軟骨であり、用いられるＷＩＳＰアンタゴニストの量は治療的に有効な量である。好適な実施態様では、疾患は骨関節炎である。本方法は、例えば治療的に有効な量のＷＩＳＰアンタゴニストを哺乳動物に投与することによってインビボで、或いは上記軟骨組織を培養物中の有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させた後、治療した軟骨組織を哺乳動物中に移植することによってエクスビボで実施されうる。また本方法は、ＷＩＳＰアンタゴニストを治療薬として単独で用いるか、或いは有効量の他の薬剤もしくはその他の治療技術と併用することによって、実施されうる。例えば、ＷＩＳＰアンタゴニストはあらゆる標準的な外科的技術と併用することができる。ＷＩＳＰアンタゴニストは標準的な外科技術の前、後、及び／又はそれと同時に投与されうる。
【００１７】
更なる実施態様では、本発明は、傷害によって損傷した軟骨を治療し、又は初期のもしくは持続する損傷を防止する方法において、上記軟骨組織を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることを含む方法に関する。より詳細には、治療される傷害は、マイクロダメージ又は鈍的外傷、軟骨骨折、骨軟骨骨折、腱、半月板、もしくは靱帯の損傷である。特定の態様では、傷害は過剰な機械的ストレス或いはスポーツ損傷又は肥満から生じる他のバイオメカニカルな不安定性の結果のものでありうる。
他の実施態様では、本発明は、軟骨細胞前駆細胞を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることによって軟骨前駆細胞の分化を刺激する方法に関する。
他の実施態様では、本発明は、適切な包装体中にＷＩＳＰアンタゴニストと担体、賦形剤及び／又は安定剤（例えばバッファー）を具備する、キット又は製造物品に関する。キット又は物品は、好ましくは、疾患に起因する軟骨の治療、又は初期のもしくは持続する軟骨組織の損傷を防止するためにＷＩＳＰアンタゴニストを用いるという指示書を含む。或いは、キットは軟骨疾患を治療するためにＷＩＳアンタゴニストを用いるという指示書を含みうる。
【００１８】
本発明のより限定的な実施態様には、哺乳動物の軟骨細胞又は組織を治療する方法において、変性軟骨疾患により損傷した（又は傷害により損傷した）哺乳動物軟骨細胞又は組織を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることを含む。
本発明の種種の実施態様を、以下の請求項により具体的に説明する。
１．損傷した軟骨組織を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることを含む、前記軟骨組織の治療方法。
２．前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド、及びＷＩＳＰ−１変異体からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
３．前記ＷＩＳＰ−１ポリペプチドが、ヒトＷＩＳＰ−１のドメイン１のアミノ酸２４〜１１７（配列番号１）からなる、請求項２に記載の方法。
４．前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
５．前記ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項４に記載の方法。
６．前記軟骨組織が、関節軟骨組織である、請求項１に記載の方法。
７．前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビボで哺乳動物の損傷した軟骨組織に接触させる、請求項１に記載の方法。
８．前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビトロで損傷した軟骨組織に接触させ、その後哺乳動物に移植する、請求項１に記載の方法。
９．哺乳動物の軟骨細胞の前駆細胞を有効量のＷＩＳＰアンタゴニストに接触させることを含む、軟骨細胞の前駆細胞の分化を刺激する方法。
１０．前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド、及びＷＩＳＰ−１変異体からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
１１．前記ＷＩＳＰ−１ポリペプチドが、ヒトＷＩＳＰ−１のドメイン１のアミノ酸２４〜１１７（配列番号１）からなる、請求項１０に記載の方法。
１２．前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体である、請求項１０に記載の方法。
１３．前記ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１２に記載の方法。
１４．前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビボで哺乳動物の軟骨細胞の前駆細胞に接触させる、請求項９に記載の方法。
１５．前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、インビトロで軟骨細胞の前駆細胞に接触させ、その後哺乳動物に移植する、請求項９に記載の方法。
１６．哺乳動物の軟骨疾患の治療法であって、前記哺乳動物に有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを投与することを含む方法。
１７．前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１抗体、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド、及びＷＩＳＰ−１変異体からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
１８．前記ＷＩＳＰ−１ポリペプチドが、ヒトＷＩＳＰ−１のドメイン１のアミノ酸２４〜１１７（配列番号１）からなる、請求項１７に記載の方法。
１９．前記ＷＩＳＰアンタゴニストが、ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
２０．前記ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体が、ヒト抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項１９に記載の方法。
２１．前記軟骨疾患が、変性軟骨疾患である、請求項１６に記載の方法。
２２．前記軟骨疾患が、関節軟骨疾患である、請求項１６に記載の方法。
２３．前記関節軟骨疾患が、骨関節炎又はリウマチ様関節炎である、請求項２２に記載の方法。
２４．また、前記哺乳動物を１以上の外科的技術を用いて治療する、請求項１６に記載の方法。
２５．前記有効量のＷＩＳＰアンタゴニストを、外科的技術の前、後、及び／又はそれと同時に投与する、請求項２４に記載の方法。
２６．ＷＩＳＰアンタゴニスト及び担体、賦形剤及び／又は安定剤、並びに軟骨疾患の治療に前記ＷＩＳＰアンタゴニストを使用するための指示印刷物を含む、キット又は製造品。
【００１９】
（発明の詳細な記載）
Ｉ．定義
「ＷＩＳＰポリペプチド」という用語は、天然配列ヒト及びマウスＷＩＳＰタンパク質及びその遺伝子が少なくともＷｎｔ-１によって誘導されるここに記載される変異体を意味する。この用語には、ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３並びにそれらの変異体が含まれる。このようなＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ-２、及びＷＩＳＰ-３タンパク質は更に以下に記載され、１９９９年５月６日に公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９９／２１９９８及びPennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)に記載されている。
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-１相同体」及びそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-１タンパク質及びそれらの変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、或いは組換え又は合成法によって、或いはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-２相同体」、「ＰＲＯ２６１」及び「ＰＲＯ２６１ポリペプチド」並びにそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-２タンパク質及びそれらの変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、或いは組換え又は合成法によって、或いはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
【００２０】
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-３相同体」及びそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-３タンパク質及びそれらの変異体（ここで更に詳細に定義する）を包含する。ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、或いは組換え又は合成法によって、或いはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」は、天然由来のＷＩＳＰ-１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない、それぞれここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７（１９９９年５月６日に公開のＷＯ９９／２１９９８に示された図３Ａ及び３Ｂ（配列番号：３）において過去にまた提供）又はここに記載した配列番号：３のアミノ酸１から３６７（ＷＯ９９／２１９９８に示された図３Ａ及び３Ｂ（配列番号：４）において過去に提供）を含有する成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドはここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７又はアミノ酸１から３６７の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドはＡＴＣＣ寄託番号第２０９５３３号のコード化ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２１】
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基又は２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。本発明の他の実施態様では、ここに記載した配列番号：３のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基及び２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。本発明の他の実施態様では、それぞれここに記載した配列番号：４のアミノ酸２３から３６７（ＷＯ９９／２１９９８に示された図１（配列番号：１１）において過去に提供）、又はここに記載した配列番号：４のアミノ酸１から３６７（ＷＯ９９／２１９９８に示された図１（配列番号：１２）において過去に提供）を含有する成熟又は全長天然配列マウスＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ＷＯ９９／２１９９８に示された配列番号：２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９を含む、ヒトＷＩＳＰ-１スプライス又は他の天然配列変異体の一つを含むヌクレオチド配列によってコードされるものであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
【００２２】
「天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」又は「天然配列ＰＲＯ２６１ポリペプチド」は、天然由来のＷＩＳＰ-２ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-２ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-２ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：１０のアミノ酸１から２５０とアミノ酸１から２５０を含む、ここに記載した配列番号：１０のアミノ酸１−２４から２５０までを（ＷＯ９９／２１９９８に示された図４（配列番号：１５、１６、及び５６−７７）において過去にまた提供）含有する成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドはここに記載した配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０又はアミノ酸１から２５０の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-２ポリペプチドはＡＴＣＣ寄託番号第２０９３９１号のコード化ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-２は、ＷＯ９９／２１９９８に示された図２のアミノ酸２４から２５１とアミノ酸１から２５１（それぞれ配列番号：１９及び２０）を含む、ＷＯ９９／２１９９８に示された図２のアミノ酸１−２４から２５１までを（配列番号：１９、２０、及び７８−９９）含有する成熟又は全長天然配列マウスＷＩＳＰ-２ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。
【００２３】
「天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」は、天然由来のＷＩＳＰ-３ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-３ポリペプチドの自然に生じる切断又は他の型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-３ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：９のアミノ酸３４から３７２（ＷＯ９９／２１９９８の図６Ａ及び６Ｂ（配列番号：３２）において過去に提供）又はここに記載した配列番号：９のアミノ酸１から３７２（ＷＯ９９／２１９９８に示された図６Ａ及び６Ｂ（配列番号：３３）において過去に提供）をそれぞれ含む成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは、ここに記載した配列番号：８のアミノ酸１６から３５４（ＷＯ９９／２１９９８に示された図７Ａ及び７Ｂ（配列番号：３６）において過去に提供）又はここに記載した配列番号：８のアミノ酸１から３５４（ＷＯ９９／２１９９８に示された図７Ａ及び７Ｂ（配列番号：３７）において過去に提供）をそれぞれ含む成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドはここに記載した配列番号：９のアミノ酸３４から３７２又はアミノ酸１から３７２の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドはここに記載した配列番号：８のアミノ酸１６から３５４又はアミノ酸１から３５４の近接配列を含む。場合によっては、ヒトＷＩＳＰ-３ポリペプチドはＡＴＣＣ寄託番号第２０９７０７号のコード化ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２４】
「ＷＩＳＰ-１変異体」という用語は、配列番号：３のアミノ酸２３から３６７の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-１と、及び／又は配列番号：３のアミノ酸１から３６７の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-１と、及び／又はＷＯ９９／２１９９８に示された図１（配列番号：１１）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス成熟ＷＩＳＰ-１及び／又はＷＯ９９／２１９９８の図１（配列番号：１２）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス全長ＷＩＳＰ-２と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-１ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、配列番号：３の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失され（すなわち、断片）たＷＩＳＰ-１ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは除かれる。
【００２５】
「ＷＩＳＰ-２変異体」又は「ＰＲＯ２６１変異体」という用語は、配列番号：１０のアミノ酸２４から２５０の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-２と、及び／又は配列番号：１０のアミノ酸１から２５０の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-２と、及び／又はＷＯ９９／２１９９８の図２（配列番号：１９）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス成熟ＷＩＳＰ-１及び／又はＷＯ９９／２１９９８の図２（配列番号：２０）に示された推定アミノ酸配列を有するマウス全長ＷＩＳＰ-２と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-２ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、配列番号：１０の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失され（すなわち、断片）たＷＩＳＰ-２ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-２ポリペプチドは除かれる。
【００２６】
「ＷＩＳＰ-３変異体」という用語は、配列番号：９のアミノ酸３４から３７２の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-３と、及び／又は配列番号：９のアミノ酸１から３７２の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-３と、及び／又は配列番号：８のアミノ酸１６から３５４の推定アミノ酸配列を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-３と、及び／又は配列番号：８のアミノ酸１から３５４の推定アミノ酸配列を有するヒト全長ＷＩＳＰ-３と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-３ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、配列番号：９又は配列番号：８の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失され（すなわち、断片）たＷＩＳＰ-２ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-３ポリペプチドは除かれる。
【００２７】
ここに同定されるポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ここで同定されたＷＩＳＰ配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、表１に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００２８】
ここで定義される「ストリンジェントな条件」は、（１）洗浄に低イオン強度及び高温度を用いる、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる、４２℃で、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウム；（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％の硫酸デキストラン溶液中を用いて、４２℃で、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で洗浄；又は（４）１０％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）のバッファー及び５５℃の５０％ホルムアミド、次いで５５℃のＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものである。
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Press, 1989）に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度のストリンジェント条件の例は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハード液、１０％硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中にて３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中にて３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかが理解されるであろう。
【００２９】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端或いは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、或いは、(２)クーマシーブルー或いは好ましくは銀染色を用いた非還元或いは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＷＩＳＰの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列或いは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター或いはリンカーが使用される。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＷＩＳＰポリペプチド及びここで記載されるＷＩＳＰ変異体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００３１】
本発明のＷＩＳＰポリペプチド又はＷＩＳＰ変異体において「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＷＩＳＰポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持する本発明のタンパク質の形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＷＩＳＰポリペプチドによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味する。同様に、「免疫学的」活性とは、本発明の天然又は天然発生ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の生成における、抗原として働く能力を意味する。
本明細書におけるＷＩＳＰアンタゴニストにおける「生物学的活性」は、軟骨細胞の分化（即ち前駆細胞の成熟軟骨細胞への分化）に対するＷＩＳＰ−１の影響を抑制又は遮断するような分子の能力を指すために使用される。場合によっては、軟骨は関節軟骨であり、軟骨の再生及び／又は破壊は外傷又は変性軟骨疾患に関する。例えば、このような生物学的活性は、インビトロ軟骨細胞分化アッセイ及び遺伝子発現分析により定量できる。
「ＷＩＳＰ−１アンタゴニスト」という用語は、ＷＩＳＰ−１の生物学的活性を、部分的に又は完全に、遮断、抑制又は中和するあらゆる分子を指し、以下に限定するものではないが、抗体、イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ−１融合タンパク質、共有結合的に修飾された形態のＷＩＳＰ−１、ＷＩＳＰ−１変異体及びそれらの融合タンパク質、ＷＩＳＰ−１抗体、及び高次オリゴマー形態のＷＩＳＰ−１（二量体、凝集物）、或いはホモポリマー又はヘテロポリマー形態のＷＩＳＰ−１を含む。ＷＩＳＰ−１アンタゴニスト分子が部分的又は完全にＷＩＳＰ−１の生物学的活性を遮断、抑制又は中和するかどうかを決定するには、例えば様々な細胞に対するアンタゴニスト分子の影響を評価するアッセイを行うことができる（実施例参照）。好ましくは、本明細書に記載の本発明に使用されるＷＩＳＰ−１アンタゴニストは、軟骨細胞分化に対するＷＩＳＰ−１の影響を遮断、抑制又は中和することができ、場合によってはそのような能力は本明細書に記載するようなアッセイで決定できる。
【００３２】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に、例えば、単一のモノクローナル抗体、ポリエピトープ特異性を持つ抗体組成物、一本鎖抗体、抗体の断片を含む。本明細書で使用する「抗体」は、本明細書で述べる所望の拮抗的特性の何れかを示すものである限り、無傷免疫グロブリンまたは抗体分子、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（つまり、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体）、および免疫グロブリン断片（例えばFab、F(ab')2、またはFv）を含む。
典型的に、抗体は、特定の抗原に対する結合特性を示すタンパク質またはポリペプチドである。天然の抗体は、通常、２つの同一の軽(L)鎖および２つの同一の重(H)鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。通常、軽鎖の各々は、共有ジスルフィド結合により１つの重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのイソタイプによって異なる。また、各重鎖および軽鎖は、等間隔に並ぶ鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖の一端には可変ドメイン（ＶＨ）があって、それに複数の定常ドメインが続いている。各軽鎖の一端（ＶＬ）には可変ドメインが、他端には定常ドメインがある；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖の可変ドメインと重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている（Chothia他, J. Mol. Biol., 186:651-663, 1985年; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596, 1985年）。任意の脊椎動物の種由来の抗体の軽鎖は、その定常ドメインアミノ酸配列に基づいて、κおよびλと呼ばれる２つの明確に区別される型の一方に割り当てることができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンを複数のクラスに分けることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG およびIgMがあり、これらのうち複数をさらにサブクラス（イソタイプ）、例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3およびIgG-4、ならびにIgA-1およびIgA-2に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインを、それぞれ、α、δ、υ、γおよびμと呼ぶ。
【００３３】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、通常は無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片；ダイアボディ(diabodies)；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
「可変」という用語は、抗体間で配列が異なる可変ドメインの特定の部分を表すために使用され、特定の抗原に対する特定の抗体の各々の結合および特異性に利用される。しかしながら、抗体の可変ドメインにおいて可変性は通常一様に分布してはいない。典型的には、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメイン両方の相補性決定領域（CDR）または高頻度可変領域と呼ばれる３つの染色体部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分をフレームワーク(FR)と呼ぶ。天然の重鎖および軽鎖の各可変ドメインは、大部分がβ−シート構造を取り入れ、３つのCDRにより連結された４つのFR領域を有しており、それらCDRはβ−シート構造を連結するループを形成するか、場合によってはβ−シート構造の一部を形成する。各鎖のCDRはFR領域によって互いに近接して保持されており、別の鎖のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（Kabat, E.A.他、Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, メリーランド州、1987年参照）。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与など、様々な作動体機能を示す。
【００３４】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に指向する。
ここで、モノクローナル抗体は特に、所望の生物学的活性、または特性を有するものである限りにおいて、指定の起源の種、免疫グロブリンのクラス、またはサブクラスに関係なく、定常ドメイン（例えば「ヒト化」抗体）、または重鎖を有する軽鎖、または別の種由来の鎖を有するある種由来の鎖、または異種タンパク質との融合を有する対象の抗体の（高頻度可変を含む）可変ドメインをスプライシングすることにより生成される「キメラ」抗体、ハイブリッド抗体、および組換え抗体、ならびに抗体断片（例えばFab、F(ab’)、F(ab’)2、およびFv）を含む。例えば米国特許第4,816,567号、およびMageらによるMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications 79-97ページ（Marcel Dekker, Inc.: New York, 1987年）を参照のこと。
【００３５】
このように、「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、或いは米国特許第4,816,567号に記載されたような組換えDNA法によって作ることができる(参照)。「モノクローナル抗体」は、また、例えばMcCaffertyらによるNature, 348:552-554（1990年）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、或いはそれらの断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2或いは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の能力を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全て或いはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全て或いはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。
【００３６】
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、および／またはヒト抗体をつくる既知の技術のいずれかを使用して、またはここに開示するようにして、つくられたものである。ヒト抗体のこのような定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも1つのヒト軽鎖ポリペプチド、例えばマウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。ヒト抗体は、様々な従来技術を使用して生成することができる。一実施態様では、ライブラリがヒト抗体を発現する場合、そのようなファージライブラリからヒト抗体を選択する（Vaughan他、 Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996年; Sheets他 PNAS, アメリカ合衆国、95:6157-6162,1998年; HoogenboomおよびWinter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991年; Marks他, J. Mol. Biol., 222:581, 1991年）。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が特異的にまたは完全に非活性化されているマウスに導入することにより生成することができる。実験によりヒト抗体の産生が確認されており、それは遺伝子の再配列、アセンブリ、および抗体のレパートリーを含め、すべての面でヒトに見られる抗体産生に非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、および以下の科学文献に開示されている：Marks他, Bio/Technology, 10: 779-783, 1992年; Lonberg他, Nature, 368: 856-859, 1994年; Morrison, Nature, 368:812-13, 1994年; Fishwild他, Nature Biotechnology, 14: 845-51, 1996年; Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826, 1996年; Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995年。或いは、ヒト抗体は、標的となる抗原を志向する抗体を産生するＢリンパ球（このようなＢリンパ球は個体から回収できるか、またはインビボで免疫することができる）の不死化により調製することもできる。 例えば、Cole他, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985年; Boerner他, J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991年; および米国特許第5,750,373号を参照のこと。
【００３７】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化により生成される免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列のＦｃ領域または変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界はまちまちであるが、ヒトIgG重鎖のFc領域は、通常、約Cys226または約Pro230に位置するアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端まで延びていると定義される（ここではKabat他, 上掲による番号付けシステムを使用した）。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメインおよび１つのＣＨ３ドメインを含み、場合によってはＣＨ４ドメインを含む。
ここで使用する「Ｆｃ領域鎖」という表現は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００３８】
ヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」（「Cγ2」ドメインとも呼ばれる）は、通常、約231位のアミノ酸残基から約340位のアミノ酸残基まで延びている。CH2ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのCH2ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、CH2ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985年)を参照のこと。ここで、CH2ドメインは天然配列のCH2ドメインまたは変異体CH2ドメインとすることができる。
「ＣＨ３ドメイン」は、Fc領域におけるＣ末端からCH2ドメインまでの範囲（つまり、IgGの約341位のアミノ酸から約447位のアミノ酸）を含む。ここでは、CH3領域は、天然配列のCH3ドメインか、または変異体CH3ドメイン（例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたCH3ドメイン：米国特許第5,821,333号参照）とすることができる。このような変異体CH3ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性（例えば二重特異性）抗体をつくることができる。
【００３９】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトIgG1の約Glu216または約Cys226から約Pro230まで延びていると定義される（Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985年）。他のIgGイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖S-S結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、または変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域は、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトIgG1ヒンジ領域である。
「機能的Fc領域」は、天然配列Fc領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、C1q結合、補体依存性細胞障害作用（CDC）、Fｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用（ADCC）、食作用、細胞表面レセプター（例えばＢ細胞レセプター； BCR）の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Fc領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００４０】
「天然配列Fc領域」は、天然に由来するFc領域と同じアミノ酸配列を有する。「変異体ポリペプチドを含む。「変異体Fc領域」には、最低１つのアミノ酸修飾だけが天然配列のFc領域と異なるアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、変異体Fc領域は、天然配列のFc領域、または親ポリペプチドのFc領域と比較した場合に、天然配列Fc領域または親ポリペプチドのFc領域において少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここに開示する突然変異Fc領域は、天然配列のFc領域および／または親ポリペプチドのFc領域に対して、少なくとも約80%の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約90%、さらに好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用」および「ADCC」は、Fcレセプター（FcR）を発現する非特異性の毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞に境界抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ADCC、NK細胞を媒介する一次細胞はFcγRIIIのみを発現し、一方単核細胞はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcR発現は、RavetchおよびKinetによる、Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991年)の、464ページの表３にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するために、インビボADCCアッセイ（例えば米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記載）を行うことができる。そのようなアッセイに有用な作動体細胞には、抹消血単核細胞（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。或いは、またはそれに加えて、目的とする分子のADCC活性をインビボで、例えばClynesらによる PNAS(アメリカ合衆国)、 95:652-656(1998年)に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【００４１】
「ヒト作動体（エフェクター）細胞」は、１以上のFcRsを発現する白血球であり、作動体機能を果たす。好ましくは、細胞は少なくともFcγRIIIを発現し、ADCC作動体機能を果たす。ADCCを媒介するヒト白血球の例には、抹消血単核細胞（PBMC）、ナチュラルキラー（NK）細胞、単核細胞、細胞障害性Ｔ細胞および好中球が含まれ、中でもPBMCとNK細胞が好ましい。作動体細胞はその天然供給源、例えば血液またはPBMCからここに開示するように単離することができる。
「Fcレセプター」および「FcR」という用語は、抗体のFc領域に結合するレセプターを表すために使用される。好ましいFcRは天然配列ヒトFcRである。さらに、好ましいFcRはIgG抗体に結合するもの（ガンマレセプター）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラス のレセプターを含み、それには対立変異体およびそれらレセプターの変形スプライス形式が含まれる。FcγRIIレセプターはFcγRIIA（「活性化レセプター」）およびFcγRIIB（「抑制レセプター」）を含み、それらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターであるFcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫レセプターのトリオシン（tryosine）に基づく活性化モチーフ（ITAM）を有する。阻害するレセプターFcγRIIBは、その細胞質ドメインにある免疫レセプター チロシンベース阻害モチーフ（ITIM）を有する（Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997年に記載）。FcRはRavetchおよびKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991年); Capel他, Immunomethods, 4:25-34(1994年); およびde Haas他, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41(1995年)に説明されている。本明細書で使用する「FcR」という語は、将来同定されるものも含め、その他のFcRを包括する。この用語はまた、母性IgGの胎児への移転をつかさどる新生児レセプターであるFcRnを含む（Guyer他, J. Immunol., 117:587, 1976年;およびKim他, J. Immunol., 24:249, 1994年）。
【００４２】
「補体依存性細胞障害作用」および「CDC」は、補体存在下における標的の溶解を指す。補体の活性経路は補体系（C1q）の第一成分の分子の、同族抗原と複合した分子（例えば抗体）への結合により開始される。補体の活性を評価するため、例えばGazzano-SantoroらによるJ. Immunol. Methods, 202:163(1996年)に記載されているようなCDCアッセイを実行することができる。
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、  Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、VHドメインとVLドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。CDRおよび／またはフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994年); Schier他、Gene, 169:147-155 (1995年);  Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995年); Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995年); およびHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992年)に開示されている。
「抗体の免疫特異的結合」に使用される「免疫特異的」という用語は、抗体の抗原混合部位と抗体により認識される特異的な抗原との間に発生する抗原に特異的な結合の相互作用を意味する。
【００４３】
用語「軟骨疾患」は、疾病又は外傷に因るものを含む、影響した体の部分の痛みの症状、硬直及び／又は動作の制限により更に明らかになる疾患の総称を意味する。「軟骨疾患」の範囲に含まれるのは、「変性軟骨疾患」−少なくとも部分的な、体の結合組織の変性又は代謝異常に特徴づけられ、関節又は筋肉、滑液包（滑膜）、腱及び繊維組織を含む関連構造のみならず、成長板も含む疾患の総称である。一実施態様では、該用語は、滑らかな関節軟骨表面の破壊及び軟骨マトリックスの変性により特徴づけられる「関節軟骨疾患」を含む。更なる病態には、酸化窒素の生成、マトリックス合成の抑制又は減少を含む。
「関節軟骨疾患」の範囲内には、骨関節炎（ＯＡ）及びリウマチ様関節炎（ＲＡ）が含まれる。ＯＡは、関節マージンにおける明白な骨拡張に比例した局在化した軟骨の非対称性破壊によって特徴付けられる。典型的に、ＯＡは、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節に影響を及ぼすが、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常とも関連し、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。また、ＯＡはスポーツ外傷又は肥満により生じるような広範な生体力学不安定の後に現れうる。
【００４４】
リウマチ様関節炎は（ＲＡ）、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。
さらに、「変性軟骨疾患」という用語は、全身性紅斑性狼瘡及び痛風、アミロイドーシス又はフェルティ症候群を含み得る。さらに、該用語は、乾癬性関節炎、急性炎症（例えば、エルシニア関節炎、ピロリン酸関節炎、痛風関節炎（arthritis urica）、敗血性関節炎）、外傷関連関節炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病)、多発性硬化症、糖尿病（例えば、インスリン依存性及びインスリン非依存性）、肥満症、巨細胞関節炎及びシェーグレン症候群を網羅する。
【００４５】
本発明の方法によって治療されるものの少なくとも幾つかの他の免疫性及び炎症性疾患の例には、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症誘発性筋疾患、（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫性汎血球減少症、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少症（特発的血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症）、甲状腺炎（グレーブ疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、自己免疫炎症性疾患、（例えば、アレルギー性筋痛性脳脊髄炎、多発性硬化症、インスリン依存性糖尿病、自己免疫性ぶどう膜炎、甲状腺中毒症、強皮症、全身性紅斑狼瘡、リウマチ様関節炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、限局性腸炎、末梢回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、末端性回腸炎)自己免疫性甲状腺疾患、悪性貧血）及び同種移植の拒絶反応、真性糖尿病、免疫性腎臓疾患（糸状体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び抹消神経系の脱髄性疾患、例えば多発性硬化症 、特発性脱髄性多発神経障害又はギランバレー症候群、及び慢性炎症誘発性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性ウイルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患(例えば、クローン病)、グルテン感受性腸疾患、及びフィップル疾患、水泡性皮膚疾患を含む自己免疫性又は免疫媒介性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及びジンマシン、肺の免疫学的疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び高感受性間質性肺炎、移植片拒絶及び移植片対宿主の疾患を含む、移植関連疾患を含む考案に従って治療することができる。感染性疾患には、ウイルス性疾患、例えばエイズ（ＨＩＶ感染）、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、及びＥ型肝炎、ヘルペス等、細菌性感染症、真菌性感染症、原生動物感染症、寄生虫感染症、及び呼吸器合胞体ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス等、及びアレルギー疾患、例えばアナフィラキシー性過敏症、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、春季カタル、湿疹、じんま疹及び食物アレルギー等が含まれる。
【００４６】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変化の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指し、標的である病理学的状態又は疾患を予防、又は抑制（減少）することが目的である。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。免疫関連疾患の治療では、治療薬は直接的に疾患の病理成分の応答の大きさを低下又は増加させうるし、或いは疾患を他の治療剤による治療、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等に対してより敏感にしうる。
用語「有効量」とは、軟骨の検出可能な改善又は修復を引き起こす、誘発する又は結果的に生じる、ＷＩＳＰアンタゴニストの最小濃度である。更に、「治療的有効量」とは、少なくとも外傷又は変性軟骨疾患から生じる症状を和らげる（例えば、軟骨の検出可能な改善又は修復を引き起こす、誘発する又は結果的に生じる）のに有効な、哺乳動物に投与するＷＩＳＰアンタゴニストの最小濃度（量）である。
【００４７】
「軟骨剤」は、成長因子、サイトカイン、小分子、抗体、ＲＮＡ片又はＤＮＡ片、ウイルス粒子、ペプチド、又は化学物質であってもよく、軟骨に有利な効果をもたらし、ペプチド成長因子、異化アンタゴニスト及び骨-、滑膜-又は抗炎症因子を含みうる。或いは、「軟骨剤」はペプチド成長因子-例えば線維芽細胞成長因子（例えば、ＦＧＦ-１、ＦＧＦ-２、．．．ＦＧＦ-２１、等々）、ＩＧＦ'ｓ（Ｉ及びＩＩ）、ＴＧＦ-βｓ（１-３）、ＢＭＰｓ（１-７）、又は例えば増殖、分化、移動、付着、又は軟骨細胞によるマトリックス産生を変化させることによって軟骨の本質的な修復反応を促進することができる、ＥＧＦ、ＨＢ-ＥＧＦ、ＴＧＦ-β等の上皮成長因子ファミリーのメンバーの任意のものであり得る。或いは、「軟骨剤」は軟骨の異化作用に拮抗する因子（例えば、ＩＬ-１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ-１ｒａ）、ＮＯ阻害剤、ＩＬ１-β転換酵素（ＩＣＥ）阻害剤、ＩＬ-６、ＩＬ-８、ＬＩＦ、ＩＦＮγの活性、ＴＮＦ-α活性を阻害する因子、テトラサイクリン及びその変異体、アポトーシスの阻害剤、ＭＭＰ阻害剤、アグリカナーゼ阻害剤、カテプシン及びウロキナーゼ又は組織プラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ及びｔＰＡ）等のセリン及びシステインプロテイナーゼの阻害剤）であり得る。或いはまた、軟骨剤は下にある骨（即ち、骨因子、例えば、二リン酸エステル又はオステオプロテグリン）又は周囲の滑膜（即ち、滑膜因子）に影響することにより軟骨に直接作用する因子又は抗炎症因子（例えば、抗ＴＮＦ-α（Remicade(登録商標)等の抗ＴＮＦα抗体、並びにEnbrel(登録商標)等のＴＮＦレセプター免疫アドヘシンを含む）、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ-４、ＩＬ-１０、ＩＬ-１３、ＮＳＡＩＤｓ）を含む。軟骨剤の概説としては、例えばMartel-Pelletier等, Front. Biosci. 4: d694-703(1999); Hering , T.M., Front. Biosci. 4: d743-761(1999)を参照のこと。
【００４８】
「慢性」投与とは、急性の様式とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持するために連続的な様式で薬剤を投与することを指す。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ用、又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ハムスターなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４９】
一又は複数の更なる治療薬と「組合わせた」投与には、いずれかの順番による同時的（併用の）及び継続的な投与が含まれる。
ここで用いられる「担体」は、製薬上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、使用用量及び濃度でそこに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性のものである。しばしば、生理学的に許容される担体の例は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びPLURONICSTM(登録商標)、ヒアルロン酸（ＨＡ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００５０】
ＩＩ．本発明の方法と組成物
脊椎動物の胚形成の間、軟骨内骨化と呼ばれるプロセスにおいて軟骨のテンプレートが骨で徐々に置換されることにより、大多数の骨格要素が初めて形成される（参考文献として、例えば、Karsenty, Nature, 423:316-318 (2003); Karsenty及びWagner, Dev Cell, 2:389-406 (2002): Kronenberg, Nature, 423:332-336 (2003); Mariani及びMartin, Nature, 423:319-325 (2003)を参照）。このプロセスは、関係する骨軟骨前駆体間葉系細胞の、凝集物への増殖及び凝縮から始まる。これら凝集物の中心の細胞は、軟骨細胞へ分化し、軟骨の合成を開始する。軟骨テンプレートを取り囲む紡錘状の細胞は縦に整列し、隣接する組織から軟骨細胞を分離する軟骨膜を形成する。テンプレートの遠端部の軟骨細胞は増殖を続け、一方軟骨因子の中央領域の細胞は細胞周期を脱し、肥大する。肥大性軟骨細胞への分化には、軟骨膜の間葉系の骨芽細胞への分化が伴う。骨芽細胞により、骨基質の堆積が起こり、これが軟骨の肥大領域を取り囲む襟状の骨を形成する。血管及び骨原生細胞によって肥大性軟骨が侵出する結果、軟骨が骨に置き換わる。これとは別に、一部の骨格要素、特に頭蓋骨の平な骨では、骨軟骨前駆体細胞が、軟骨テンプレートの形成を飛び越えて直接骨芽細胞に分化する。このプロセスは、膜内骨化と呼ばれる。Ｗｎｔ／β−カテニン経路は、軟骨細胞及び骨芽細胞の分化と関節形成を含む骨発達の複数の局面を調節する分子機構の一つである。Gong等、Cell, 107:513-523 (2001); Hartmann等、Development, 127:3141-3159 (2000); Hartmenn及びTabin, Cell, 104:341-351 (2001); Rudnicki及びBrown, Dev Biol, 185:104-118 (1997)。
【００５１】
骨原生プロセスにおけるＷＩＳＰ−１の役割を研究するため、その組織及び細胞発現の特徴付けを行い、軟骨芽細胞及び造骨細胞の細胞培養モデルにおけるその活性を評価した。胚発生の間、ＷＩＳＰ−１の発現は、軟骨周囲の間充織（間葉）(mesenchyme)の骨芽細胞前駆細胞と骨芽細胞に限定されていた。インビトロでは、ＷＩＳＰ−１誘導が骨芽細胞の分化段階の初期に起こり、成熟骨芽細胞で維持されていた。インサイツ細胞結合分析を用いて、軟骨周囲の間充織及び未分化軟骨細胞とのＷＩＳＰ−１の相互作用を実証した。安定に形質移入したマウスの軟骨細胞株を生成することにより、軟骨細胞前駆体に対するＷＩＳＰ−１の影響を評価した。これらの細胞において、ＷＩＳＰ−１は増殖及び飽和密度を増大させたが、軟骨細胞の分化を抑制した。骨の生成と治癒の類似性により、骨折修復モデルにおけるＷＩＳＰ−１の空間時間的発現も分析した。ＷＩＳＰ−１発現は、骨格発生段階に観察されるパターンを要約するものであった。これらの実験については実施例にさらに記載する。これらデータにより、ＷＩＳＰ−１が、軟骨細胞分化及び増殖を調節する骨芽細胞因子であることが示され、ＷＩＳＰ−１は骨発生及び骨折修復に重要な調節的役割を担うと考えられる。
本発明の方法により、様々なＷＩＳＰアンタゴニストを使用して軟骨疾患並びにその他様々な免疫疾患及び免疫関連疾患の治療を行うことができる。そのようなＷＩＳＰアンタゴニストには、ＷＩＳＰ−１抗体及びそのＷＩＳＰ−１変異体（並びに、エピトープタグ付き又はそのＩｇ融合コンストラクトのような、それらの融合タンパク質）が含まれる。ＷＩＳＰアンタゴニストをインビボ並びにエキソビボで使用してもよい。場合によっては、ＷＩＳＰアンタゴニストを製薬的組成物の形態で使用することができる。これについては後述する。
【００５２】
ＷＩＳＰ−１ポリペプチド変異体も調製できると考えられる。ＷＩＳＰ−１変異体は、コード化ＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化或いは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＷＩＳＰ−１ポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ポリペプチドと比較してアミノ酸配列が変化するポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一のアミノ酸が、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸によって置換されることである。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を完全長又は成熟天然タンパク質によって提示された活性について試験することにより決定される。
【００５３】
ＷＩＳＰ−１ポリペプチド断片も、本発明の範囲内に含まれる。このような断片は、例えば、完全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＷＩＳＰ−１ポリペプチド断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、或いは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるポリペプチド断片の生成を含む。更に他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。
【００５４】
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換と題する以下の表に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、以下の表に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類で更に記載するように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表
2007505131.tif 000002
【００５５】
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile；
（２）中性の親水性：cys, ser, thr；
（３）酸性：asp, glu；
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg；
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro；及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００５６】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)；Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＷＩＳＰ−１ポリペプチドの変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一つ又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085 (1989)］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。更に、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【００５７】
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの適切な高次構造を維持するのに関与しないシステイン残基はいずれも、通常セリンで置換することができ、よって分子の酸化的安定性を改善し、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をＷＩＳＰ−１ポリペプチドに加えることにより、その安定性を向上させることができる。
以下の説明は、主として、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＷＩＳＰ−１ポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＷＩＳＰ−１ポリペプチドを調製することができると考えられる。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サン フランシスコ, カリフォルニア (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（フォスターシティー、カリフォルニア）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望のＷＩＳＰ−１ポリペプチドを生産してもよい。本明細書に記載する方法及び技術は、ＷＩＳＰ−１変異体、ＷＩＳＰ−１の修飾形態及びＷＩＳＰ−１抗体の生産にも同様に適用可能である。
【００５８】
１．ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＷＩＳＰ−１ポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＷＩＳＰ−１ポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は既知の合成手順（例えば、自動核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子或いはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【００５９】
ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術は本技術分野において周知である。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、偽陽性を最少化するために長さ及び明白さが十分でなければならない。好適には、スクリーニングするライブラリのＤＮＡにハイブリダイズした場合にすぐに検出できるように、オリゴヌクレオチドを標識する。標識の方法は本技術分野で周知あり、それらには３２Ｐ−標識化ＡＴＰのような放射標識、ビオチニン化又は酵素標識が含まれる。中程度のストリンジェント条件及び高度のストリンジェント条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、Sambrook等、上掲に開示されている。
このようなライブラリのスクリーニング法において同定された配列を、ＧｅｎＢａｎｋのような公的データベース又はその他の私的な配列データベースに登録されて使用可能な他の既知の配列と比較し、整列させることができる。分子又は完全長配列の定義領域内における配列同一性（アミノ酸又はヌクレオチドのレベルで）を、当技術分野において既知の、本明細書に記載する方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等,に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用して選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることによって得られる。
【００６０】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＷＩＳＰ−１ポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編（IRL Press, 1991）及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
真核細胞の形質移入及び原核細胞の形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等,に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に、原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のＷＯ89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質移入の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００６１】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニング或いは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E.coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD266,710に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。或いは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００６２】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290:140 [1981]；1985年5月2日発行のEP139,383）；クルベロミセス宿主(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号；Fleer等, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)）、例えばクルベロミセスラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574；Louvencourt等, J. Bacteriol.154(2):737-742 [1983]）、クルベロミセス・フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、クルベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、クルベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ ２４,１７８）、クルベロミセスワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、クルベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Van den Berg等, Bio/Technology, 8:135 (1990)）、クルベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクルベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP402,226）；ピチア・パストリス(Pichia pastoris)（EP183,070；Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28:265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデル・マレーシア(Trichoderma reesia)（EP244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)（1990年10月31日発行のEP394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO91/00357）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス（Balance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]；Tilburn等, Gene, 26:205-221 [1983]；Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 [1984]）、及びアスペルギルス・ニガー（Kelly及びHynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００６３】
グリコシル化ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞が多細胞生物から得られる。無脊椎動物細胞の例には、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞、並びに綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコ等の細胞培養物等の植物細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体、並びに、スポドスペラフルギペルダ（毛虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコ等の宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定された。形質移入に使用できる様々なウイルス株、例えば、オートグラファカリフォルニアＮＰＶのＬ−１変異体及びカイコＮＰＶのＢｍ−５株が公に使用可能であり、そのようなウイルスを、本発明により、特にスポドスペラフルギペルダ細胞の形質移入にウイルスとして使用することができる。
しかしながら、脊椎動物細胞に最も関心が向けられており、培養物（組織培養物）における脊椎動物細胞の伝播は常套的手順となっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３又は２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；仔ハムスターの腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ（CHO, Urlaub等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４，Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather等、Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）を含む。
宿主細胞を、ＷＩＳＰ−１ポリペプチド生成のために上記発現ベクター又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘発、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように修正した従来の栄養培地で培養する。
【００６４】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、一つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＷＩＳＰ−１は直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列或いは成熟タンパク質或いはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＷＩＳＰ−１ポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ或いは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセス(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー（1990年4月4日発行のEP362179）、又は1990年11月15日に公開されたWO90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一或いは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６５】
発現及びクローニングベクターは、共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート或いはテトラサイクリンのような抗生物質或いは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素、例えば桿菌のＤ-アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子を供給するタンパク質をコードする。
【００６６】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの例は、ＤＨＦＲ或いはチミジンキナーゼのようにＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分の同定を可能にするものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等により Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているように調製され増殖された、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282:39 (1979)；Kingsman等, Gene, 7:141 (1979)；Tschemper等, Gene, 10:157 (1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６或いはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドコード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン-ダルガーノ(Ｓ．Ｄ．)配列を有する。
【００６７】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17:4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターはEP73,657に更に記載されている。
【００６８】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクター由来のＷＩＳＰポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス（1989年7月5日公開のUK2,211,504）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞株に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００６９】
また、真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＷＩＳＰポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；EP117,060；及びEP117,058に記載されている。
【００７０】
４．宿主細胞の培養
本発明のＷＩＳＰポリペプチドを産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ)、(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ)、シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Hamら, Meth. Enz. 58:44 (1979年), Barnesら, Anal. Biochem. 102:255 (1980年), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について既に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００７１】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、半定量的ＰＣＲ、ＤＮＡアレイ遺伝子発現分析又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。或いは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
或いは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＷＩＳＰポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は本発明のポリペプチドをコードするＷＩＳＰ  ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００７２】
６．ＷＩＳＰポリペプチドの精製
ＷＩＳＰポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン（登録商標）-Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＷＩＳＰ−１ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＷＩＳＰ−１ポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＷＩＳＰ−１ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＷＩＳＰ−１ポリペプチドの性質に依存する。
【００７３】
ＷＩＳＰ−１の可溶性型を本方法においてアンタゴニストとして使用することができる。このようなＷＩＳＰ−１の可溶性型は、以下に示すような変形を含む（イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーへの融合によるものなど）。イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＷＩＳＰ−１イムノアドヘシンは、完全長ポリペプチド、並びにＷＩＳＰ−１の可溶性型又はその断片等の、ＷＩＳＰ−１の様々な形態を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＷＩＳＰ−１ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形態に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、ポリペプチドの可溶性型（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
最も単純で最も直接的なイムノアドヘシン設計は、アドヘシン（例えばＷＩＳＰ−１）の結合ドメインと免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を組み合わせる。通常、本発明のイムノアドヘシンを調整する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸をＣ末端でイムノグロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端融合は不可能である。
【００７４】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、CH2及びCH3ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのFc領域のC末端、又は重鎖のCH1又は軽鎖の対応する領域にN末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンG1(IgG1)のFc領域のN末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、IgGのFcを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はIgG重鎖の(ａ)ヒンジ領域及びCH2及びCH3又は(ｂ)CH1、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインに融合される。
【００７５】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はIgG、IgD及びIgEが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；IgMは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。IgAグロブリン、そして時折IgGグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される： 
(ａ)ＡＣＬ-ＡＣＬ； 
(ｂ)ＡＣＨ-(ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｃ)ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, ＶＬＣＬ-ＡＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(ｄ)ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ, 又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(ｅ)ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(ｆ)(Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【００７６】
簡潔のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
或いは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の3' 末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【００７７】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするDNAと同時発現される。分泌時に雑種重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンcDNA配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするcDNA配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してIg調節配列の存在を必要とする。IgG重鎖定常領域をコードするcDNAは、脾臓又は抹消血リンパ球から取り出されたcDNAライブラリーからの刊行された配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(PCR)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするcDNAとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【００７８】
他の実施態様において、ＷＩＳＰ−１又はＷＩＳＰ−１アンタゴニストは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、又はポリグルタミン酸のような同様の分子に、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); 米国特許第5,716,805号; WO94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniateis等, Nature, 341:24 (1989); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をＷＩＳＰ−１又はＷＩＳＰ−１アンタゴニスト分子の５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【００７９】
また、本発明のＷＩＳＰ−１ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＷＩＳＰ−１ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
また、抗ＷＩＳＰ−１抗体は個々に開示する方法に使用できると考えられる。抗ＷＩＳＰ−１は、モノクローナル抗体であってもよい。
【００８０】
モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)等により記載されたハイブリドーマ法によって調製することができる。ハイブリドーマ法においては、免疫剤を用いてマウス、ハムスター又はその他の適当な宿主動物通常通りに免疫し、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するか、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＷＩＳＰ−１ポリペプチド又はその融合タンパク質、例えばＷＩＳＰ−１ ＩｇＧ融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBLs」)が使用され、或いは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００８１】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＷＩＳＰ−１に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【００８２】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はRPMI-1640倍地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００８３】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、或いは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［Morrisonら, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、或いは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、ＷＩＳＰ−１の特異性を持つ１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
【００８４】
キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を用いる合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いることにより、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築できる。この目的のための適切な試薬の例は、iminothiolate及びメチル−４−mercaptobutyrimidateである。
一本鎖Ｆｖ断片を、Iliades等, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載に従って生産できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に開示されている。抗体の組換え生産及び操作の様々な技術が当技術分野において既知である。当業者によって利用されるそのような技術の例示的実施例を以下に詳述する。
【００８５】
(i)ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者（Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、CDR残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００８６】
(ii)ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞株は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), 及びBrodeur他, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)に記載されている。
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovitsら, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
【００８７】
Mendez他(Nature Genetics 15: 146-156 [1997年])はこの技術をさらに改良し、抗原を投与すると親和性の高い完全ヒト抗体を生成する「ゼノマウスII（Xenomouse II）」と称する系列のトランスジェニックマウスを生成した。これは、上述のように、内因性JHセグメントに欠陥を有するマウスに、メガベースのヒト重鎖座および軽鎖座の生殖細胞系に取り込むことにより達成された。ゼノマウスIIは、約66VH遺伝子、完全なDH及びJH領域および３つの異なる定常領域（μ、δおよびχ）を含む1,020kbのヒト重鎖遺伝子座を有し、また32Vκ遺伝子、JκセグメントおよびCκ遺伝子を含む800kbのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスに生成された抗体は、遺伝子再配列、構成、およびレパートリーを含め、ヒトに見られる抗体に全ての面で非常に類似している。ヒト抗体は、好ましくは、マウス座における遺伝子再配列を抑制する内因性JHセグメントの欠損により、内因性抗体全体にわたって発現する。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553, 1990)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する（体細胞過剰変異）。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すＢ細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks他, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子と軽鎖Ｖ領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したＶドメイン遺伝子の自然に生じる変異体（レパートリー）のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、nM範囲での親和性を有する抗体および抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー（「マザーオブオール ライブラリー（the Mother-of-all libraries）」とも呼ばれる）を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性および特性を有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子と軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる（インプリントする）。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒ���抗体が得られる（1993年4月1日公開のPCT特許出願WO 93/06213を参照）。伝統的なCDR移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワークまたはCDR残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
後述するように、本発明の抗体は、状況に応じて、一量体、抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、そのような二量体または多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。或いは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、または削除し、よって架橋結合を防止する。
【００８８】
(iii)二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＷＩＳＰ−１に対してである。例えば、ＷＩＳＰ−１又はＷＩＳＰ−１変異体及び別のＣＮＮファミリーメンバー（例えばＷＩＳＰ−２、ＷＩＳＰ−３、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、又はＮｏｖ）に特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明に含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の発現に基づく。Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTrauneckerら, EMBO,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【００８９】
さらに好ましい別の方法により、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所最適な収率をもたらす実施態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、1994年3月3日公開の国際公開第94/04690号に開示されている。
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００９０】
(iv)ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために（WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して、調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
【００９１】
(v)抗体断片
一部の実施態様においては、抗ＷＩＳＰ−１抗体（マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び抗体変異体を含む）は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimotoら, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennanら, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してF(ab')2を形成し、F(ab')2分子の構築を促進する。別の実施態様では、組換え宿主細胞の培地からFv、FabまたはF(ab')2断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日公開のWO94/29348および米国特許第4,342,566号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Fab断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。各Fab断片は単一の抗原結合部位、および残存性Fc断片を持つ。ペプシン処理により、２つ抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるF(ab')２が生成される。
抗原消化で生成されるFab断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一定常ドメイン（CH1）も含む。Fab’断片は、それに加えて、抗原ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む、重鎖のCH1ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてFab断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つFab'として、ここではFab'-SHと記載する。F(ab')２抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するFab'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００９２】
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する（JefferisおよびLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; WrightおよびMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Boyd他., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; WittweおよびHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990)、および、糖タンパク質の高次構造及び提示される3次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用（HefferisおよびLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996)に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、アガラクトシル化IgGにおいて、オリゴ糖部分はCH2内空間の外に「とび出し(flip)」、末端Ｎ−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている（Malhotra他, Nature Med. 1:237-243, 1995)。チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるCAMPATH-1H（ヒトリンパ球のCDw52抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルIgG1抗体）からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解（CMCL）が完全に低減したが（Boyd他, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、DMCLの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性（ADCC）に影響することが報告されている。特に、バイセクティングGlcNAcの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(1,4)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII（GnTIII）のテトラサイクリン制御発現を持つCHO細胞で、ADCC活性が向上したことが報告されている（Umana他, Mature Biotech. 17:176-180, 1999)。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる１以上の炭水化物部分を除去し、抗体に１以上の炭水化物部分を加え、グリコシル化の組成（グリコシル化パターン）、グリコシル化の範囲、その他を変更することを意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコードする核酸配列について、１以上のグリコシル化部位の、除去、変更、および/または付加を行うことにより調製することができる。
【００９３】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合かＯ−結合である。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付与を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸）は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素的付与の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創造される。Ｏ−結合のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうち１つの付着を指す。５−ヒロドキシプロリン、または５−ヒドロキシリシンを使用してもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、（Ｎ−結合グリコシル化部位について）上述のトリペプチド配列の１または複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、（Ｏ−結合グリコシル化部位について）元の抗体の配列に対して１以上のセリンまたはトレオニン残基を付加または置換することにより行ってもよい。
【００９４】
抗体のグリコシル化（グリコシル化パターンを含む）は、内在するヌクレオチド配列を変更することなく変更可能である。グリコシル化は抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的治療法としての、組換え糖タンパク質の発現に使用される細胞の種類、例えば抗体が、まれに天然細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンは大きく変化することが予想される（例えばHse他, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997年参照）。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え生産の間のグリコシル化に影響を与える因子には、成長形態、媒地、製剤、培養密度、酸素添加、pH、精製スキームなどが含まれる。オリゴ等製造に関わるある種の酵素の導入又は過剰発現を含む、特定の宿主生物においてなされたグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている（米国特許第5,047,335号、米国特許第5,510,261号および米国特許第5,278,299号）。グリコシル化、または特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼＨ（Endo H）の使用により、糖タンパク質から酵素学的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝学的に設計することができ、例えば多糖類の特定種のプロセシングにおいて欠損をつくることができる。これら同様の技術は当技術分野において既知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、NMR、質量分析、HPLC、GPC、単糖成分分析、連続酵素消化、および高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するHPAEC-PADなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理（通常ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ／エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う）、主にＯ−結合構造を遊離するのに過酷なアルカリ環境を使用しての除去、およびＮ−結合とＯ−結合両方のオリゴ糖を遊離させるための無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれる。
三重特異性抗体も本発明の範囲に含まれる。そのような抗体は、例えばIliades等、上掲尾帯Kortt等, 上掲に記載されている。
【００９５】
本発明の抗体は、細胞障害剤（例えば毒素分子）又はプロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、WO81/01145号を参照)を活性な抗ガン剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、修飾することができる。例えばWO88/07378及びUS4,975,278を参照されたい。この技術は「抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法」（ADEPT）とも呼ばれる。
ADEPTに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗ガン剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；カスパーゼ−３などのカスパーゼ；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。或いは、「アブザイム」としてもまた公知の酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００９６】
酵素は当該分野においてよく知られている技術、例えばヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。或いは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えDNA技術を使用して作成することができる(Neubergerら, Nature 312:604-608(1984))。
さらなる抗体の修飾を考慮する。例えば、抗体を様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマー、或いはポリグルタミン酸等のその他の分子の１つに結合させることができる。または抗体を、例えばコアセルベーション技術又は界面重合（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル）により、コロイド性薬剤送達系（例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）に調製したマイクロカプセルに封入することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980)に開示されている。抗体の血清半減期を増加させるため、例えば、米国特許第5,739,277号に記載のように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に包含してもよい。ここで使用する「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、インビボでＩｇＧ分子の血清半減期を増加させるＩｇＧ分子（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【００９７】
本発明で考慮される変性軟骨疾患はリウマチ様関節炎は（ＲＡ）を含む。ＲＡは、関節の対称性滑膜炎によって特徴付けられる全身性、慢性、自己免疫疾患で、典型的には、小及び大可動関節などに影響を及ぼす。ＲＡが進行すると、その症状には、発熱、体重の減少、皮膚の薄弱、多器官併発、強膜炎、角膜潰瘍、皮下又は骨膜下小結節、さらに早期死亡が含まれる。ＯＡとは対照的に、ＲＡの症状はしばしば、青年期に現れ、関節外症状はあらゆる臓器に影響があり、関節破壊が左右対称で、大及び小関節の両方に同様に生じる。関節外の症状は、関節脈管炎、皮膚及び筋肉の萎縮、皮下小結節、リンパ節症、脾腫、白血球減少症及び慢性貧血が含まれる。更に、ＲＡは、様々な疾患の発症と本質的に異質であり、患者の９０％において病気の経過中の血漿リウマチ因子の形成に関与する。典型的には、ＲＡを有する患者はまた、異常に活発な免疫系を持つ。ＲＡに罹っているかなり多くのヒトは、単球及びマクロファージ上のクラスＩＩ主要組織適合性複合体分子の増大された活性化に関連した遺伝的感受性を有する。これらの組織適合性複合体分子は、これらのクラスＩＩ分子のレセプターを担持する活性化Ｔ細胞に対する抗原の存在に関わる。ＲＡに対する遺伝的素因は、非常に重篤な症状を持つヒト患者における高度に保存された白血球抗原ＤＲのサブタイプＤｗ４、Ｄｗ１４及びＤｗ１５の罹患率によって支持される。
【００９８】
骨関節炎（ＯＡ）は、関節構造に影響を及ぼし、その結果痛み及び機能欠損を引き起こす局所的変成疾病である。ＯＡは２のタイプ：原発性及び二次性に分類される。原発性ＯＡとは、潜在的な因果関係が決定されない変成関節疾病の範囲を意味する。典型的に、原発性ＯＡによって影響を受ける関節は、手の指節間関節、第一腕掌骨関節、股関節、膝、脊椎及びミッドフット（midfoot）の幾つかの関節である。一次性ＯＡにおいて、足首、肘、及び肩などの大関節は容赦される傾向にある。これに対して、二次性ＯＡは決まった怪我又は外傷の結果として生じる。二次性ＯＡは、しばしば、血色素症、アルカプトン尿症などの代謝病、発育性臼蓋形成不全（先天性股関節脱臼）、肢長不一致などの発育異常と関連し、リウマチ様関節炎、痛風、敗血性関節炎及び神経障害性関節炎などの外傷性及び炎症性関節炎を含む。
ＯＡに関する最初の変性は、プロテオグリカンがマトリックスから失われるので、関節軟骨表面の擦り切れ及び線維化として現れる。連続した関節の使用で、表面の線維化が進行し、欠損が軟骨に更に深く入り込み、軟骨組織の一部が失われる。さらに、軟骨の下にある骨（軟骨下骨）が薄くなり、軟骨が失われるので、徐々に骨が露わになる。非対称な軟骨破壊によって醜い傷跡が生じうる。骨増殖体と呼ばれる骨小結節がしばしば軟骨表面の周辺に形成され、場合によっては隣接した浸食領域にまで広がる。これらの骨増殖体の表面が広がると、血管の増殖が生じ、繊維軟骨を含む組織栓の形成を生じる。
【００９９】
軟骨は無血管であるため、軟骨層に生じる損傷は軟骨下骨にまで進入ないが、僅かな内在する複製の潜在力を有する常在性の軟骨細胞の修復作業はなされなくなる。しかしながら、軟骨下骨に浸透した場合、その血管供給は３つの修復過程を生じさせる。この型の損傷に応答して合成される最適以下の軟骨は、その線維マトリックスのためにここで「繊維軟骨」と称されるが、これは、最適以下の生化学及び機能特性を有し、よって更に摩耗及び破壊されやすくなる。罹患又は損傷した関節では、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、例えばコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、アグリカナーゼ、及び他のプロテアーゼの増加した放出は、更なる軟骨の薄化及び欠損を引き起こす。インビトロ研究では、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＴＮＦ-α、ＰＤＧＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＦＮ-γ、ＴＧＦ-β、ＬＩＦ、ＩＬ-２及びＩＬ-６、ＩＬ-８等のサイトカインが滑膜線維芽細胞様細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、及び／又は破骨細胞の活性の代わりをすることができることが示され、これらのサイトカインが生体内でのマトリックスの代謝回転を調節しうることが示唆された。
軟骨の機能特性はその生化学的組成により決定される。軟骨構造は軟骨の引張強度及び硬度に寄与するが、圧縮性（又は弾性）はそのプロテオグリカン成分による。健康な関節軟骨では、ＩＩ型コラーゲンが優性である（約９０−９５％含む）が、少量のＶ、ＶＩ、ＩＸ及びＸＩ型コラーゲンもまた存在する。軟骨プロテオグリカン（ＰＧ）は、架橋結合した硫酸化グリコサミノグリカンを有する、水力学的に大きい集合性ＰＧ、並びにデコリン、バイグリカン及びルミカン等の水力学的により小さい非集合性のＰＧを含む。
【０１００】
軟骨に対する傷害は、３つのカテゴリーに分けられる：（１）微細損傷又は鈍的外傷、（２）軟骨骨折、及び（３）骨軟骨骨折である。
軟骨細胞及び軟骨マトリクスに対する微細損傷は、単一の衝撃により、連続した鈍的外傷により、又は生体力学的に不安定な関節の連続使用によって引き起こされ得る。実際に、変性関節の初期段階に見られるような代謝性又は生化学的変化は、関節軟骨の反復した負荷に関わる動物モデルに複製されうる。Radin等, Clin. Orthop. Relat. Res. 131: 288-93(1978)。このような実施例は、関節炎の関節に見られる軟骨損失の明確なパターンに加えて、疾患における関節軟骨の整合性及び恒常性の欠損に生化学的負荷が関与する役割をはっきりさせる。Radine等, J Orthop Res. 2: 221-234(1984); Radin等, Semin Arthritis Rheum(補足2)21: 12-21(1991); Wei等, Acta Orthop Scand 69:351-357(1998)。軟骨細胞は、基礎的な割合ではプロテオグリカンによって軟骨マトリックスを補充することができるが、コラーゲン網への同時損傷は損失率を増加させ、不可逆性の変性を生じる。Buckwalter等, J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:192-201(1994)。
【０１０１】
軟骨骨折は軟骨下板を破らずに関節表面が破壊されることに特徴づけられる。外傷部位で軟骨細胞壊死が生じると、続いて外傷に隣接する生軟骨細胞の分裂及び代謝活性が増加して線維組織による関節表面の壊裂のライニングを引き起こす。軟骨細胞活性の増加は一時的であり、新しいマトリックス成分の不十分な質と量で修復反応が起こる。
３つのタイプのうち最も重篤である骨軟骨骨折は、潮標（tidemark）又は下の軟骨下プレートをクロスリンクする傷害である。このタイプの傷害において、軟骨下脈管構造の存在により、血管組織で典型的に遭遇する３相の反応が引き起こされる：（１）壊死；（２）炎症；（３）修復である。最初、傷害は血液又は血の固まりで埋められる。生じたフィブリンの固まりは炎症反応を活性化し、血管形成修復組織となり、種々の細胞成分がトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ-β）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、骨形態形成タンパク質、及びインスリン様成長因子を含む、成長因子及びサイトカインを放出する。Buckwalter等、J. Am. Acad. Orthop. Surg. 2:191-201 (1994)。
【０１０２】
骨軟骨骨折に関連する最初の修復反応は、前駆体の軟骨細胞への補充、増殖及び分化に特徴付けられる。間葉幹細胞はフィブリン網に堆積し、最終的には線維軟骨領域となる。F. Shapiro等, J. Bone. Joint Surg. 75: 532-53(1993); N. Mitchell及びN. Shepard, J. Bone Joint Surg. 58:230-33(1976)。これらの幹細胞は、隣接した関節表面よりむしろ下にある骨髄からのものであると考えられ、軟骨細胞へと分化が進む。外傷の後６〜８週で、修復した組織はいくつかのＩ型コラーゲンと共に大部分がＩＩ型であるコラーゲン及びプロテオグリカンのマトリックスに軟骨細胞様細胞を含む。T. Furukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980); J. Cheung等, Arthritis Rheum. 23:211-19(1980); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。しかしながら、この新しく堆積したマトリックスは退化し、軟骨組織はより多くの線維組織及び線維軟骨に置き換わり、コラーゲンの合成はＩＩ型からＩ型に変化する。H.S. Cheung等, J. Bone Joint Surg. 60: 1076-81(1978); D.Hamerman, 「Prospects for medical intervention in cartilage repair」, Joint cartilage degradation: Basic and clinical aspects, Eds. Woessner JF等, (1993); Shapiro等, J. Bone Joint Surg. 75: 532-53(1993); N. Mitchell & N. Shepard, J. Bone joint Surg. 58: 230-33(1976); S.O. Hjertquist & R. Lemperg, Calc. Tissue Res. 8: 54-72(1971)。初期の変性の変化は、表面の線維化、プロテオグリカンの枯渇、軟骨細胞のクローニングと死、及び表面から深層への縦割れを含む。外傷の一年後には、修復した組織は繊維軟骨と硝子軟骨が混在し、大量のＩ型コラーゲンを有し、これは正常な関節軟骨で大した量で見られることはないものである。T. Furukawa等, J. Bone Joint Surg. 62: 79-89(1980)。
【０１０３】
炎症は骨関節炎の初期現象ではないようだが、炎症が骨関節炎関節に生じる。外傷の後及び炎症の間に滑膜ライニングに浸潤する炎症細胞（例えば、単球、マクロファージ、及び好中球）はメタロプロテイナーゼ、並びに分解酵素の更なる放出を助長する能力のある異化サイトカインを産生する。炎症と関節破壊は関節炎の動物モデルの全てにおいて完全な相関は示さないが、炎症を抑制するＩＬ-４、ＩＬ-１０及びＩＬ-１３等の物質は関節炎の動物において軟骨及び骨の病状も減少させる（Martel-Pelletier J.等 Front. Biosci.4:d694-703）。炎症性サイトカインを抑制する物質の使用は、ＯＡ患者に発生する局所性滑膜炎に対抗することによりＯＡの進行を遅らせうる。
ＯＡは、骨の象牙質化を引き起こす関節軟骨の分解のみならず、この組織のいわゆる硬化を生じる軟骨下骨の広範な再造形も伴う。これらの骨の変化は、しばしば局所的な吸収の結果としての軟骨下嚢胞の形成を伴う。骨吸収を抑制する物質、即ちオステオプロテグリン又はビスホスホネートは、関節炎の動物モデルにおいて有望な結果を示した。Kong等, Nature 402:304-308 (1999)。
【０１０４】
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心媒介物は自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産出であり、続いて、免疫媒介炎症が生じ、抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。しかし、Ｔリンパ球は組織ダメージに直接関与しないことが示されており、Ｔリンパ球は自己反応性抗体の発育に必要である。よって、疾患の発生はＴリンパ球に依存している。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節(pauciarticular)、多関節(polyarticular)及び全身性のものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
【０１０５】
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ-Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎(sponylitis)、ライター症候群(反応性関節炎)、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ-Ｂ２７(血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ-Ｂ座位にある定義された対立遺伝子)を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ-Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ-Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が誘発されると仮定されている。
本発明で使用されるＷＩＳＰアンタゴニストは、組換え発現技術を含む任意の適した方法によって調製され得る。組換え発現の技術は、当業者によく知られており、適切な材料と方法はＰＣＴ出願、WO99/21998に記載されている。任意には、ＷＩＳＰアンタゴニストをＣＨＯ細胞、大腸菌又は酵母などの宿主細胞を用いて発現させる。ＷＩＳＰアンタゴニストは完全長ポリペプチド（ここで定義される）、又はその変異体形態、並びにＷＩＳＰポリペプチドの他の変形（例えば免疫グロブリン、エピトープタグ、ロイシンジッパー又は他の非タンパク質様重合体と融合して又は結合して）を含みうる。
【０１０６】
イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＷＩＳＰイムノアドヘシンは、全長ポリペプチドの他に細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列又はＥＣＤ配列フラグメントを含むレセプターの可溶性型のような、ＷＩＳＰの様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＷＩＳＰと抗体又は抗体の特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、レセプターポリペプチドの可溶性型（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型）で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
他の実施態様において、ＷＩＳＰアンタゴニストは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなＷＩＳＰアンタゴニストのペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手（例えば、ロイシンジッパーが融合し、連結する配列又は分子）の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988); WO94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994); Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をＷＩＳＰポリペプチドの５'末端又は３'末端の何れかに融合しうることは理解するであろう。
【０１０７】
また、本発明のＷＩＳＰアンタゴニストは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該アンタゴニストポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＷＩＳＰポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＷＩＳＰポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. 
Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
【０１０８】
本発明で使用され得るＷＩＳＰアンタゴニストの治療的製剤は、所望される程度の純度を持つＷＩＳＰアンタゴニストを、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される(Remington's Pharmaceutical Science 16th edition, Osol, A. Ed. [1980])。このような治療的製剤は、凍結乾燥又は水溶性形態で在り得る。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンズアルコニウムクロリド；ベンズエトニウムクロリド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリン又はヒアルロナンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はTWEEN（商標登録）、PLURONICS（商標登録）、及びポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１０９】
また、ＷＩＳＰアンタゴニストは、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中にカプセル化することにより調製される。このような調製物は、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中にて投与され得る。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16版 (又はさらに新しい版), Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
このようなポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＷＩＳＰアンタゴニストの持続性又は徐放性投与が望まれる場合、マイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」 in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman. eds. , (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及びU.S. Pat No. 5,654,010参照。
【０１１０】
持続性放出製剤の好適な例には、活性分子を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが含まれ、該マトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセルの成形物の形態である。徐放性マトリクスの例は、一又は複数のポリアンヒドリド（例えば、U.S.P.4,891,225；4,767,628）、ポリグリコール酸、ポリ乳酸及び乳酸−グリコール酸の共重合ポリエステル（米国特許出願第3,773,919号; 同第4,767,628号; 同第4,530,840号；Kulkarni等、Arch. Surg. 93:839 (1966)）、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンオキシドアクリル酸、ポリアクリル酸、エチレン-ビニルアセテート、ポリアミド、ポリウレタン、ポリオルトエステル、ポリアセチルニトリル、ポリフォスファゼン、及びポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリル酸)、又はポリ(ビニルアルコール)）のポリマー及びコポリマー、セルロース、アシル置換セルロースアセテート、非分解性ポリウレタン、ポリスチレン、塩化ポリビニル、フッ化ポリビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタミン酸共重合ポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドからなる注射可能なマイクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、及びポリ-Ｄ(-)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。さらに、使用される非生物分解性ポリマーは、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン、エチレンビニル酢酸、ポリエチレングリコール、セルロースアセテートブチレート、及びセルロースアセテートプロピオネートである。
【０１１１】
或いは、持続性放出製剤は、分解性生物材料で構成される。生物分解性ポリマーは、その生物適合性、特異的な分解に対する高い反応性、及び生物学的マトリクス中への活性薬物の取込み容易性により、魅力的な薬物剤形である。例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）は生物学的材料に対する膨潤性の重合性送達媒体としてクロスリンクされ、使用される。U.S.P. 4,957,744；Valle等、Polym. Mater. Sci Eng. 62:731-735 (1991)。また、ポリエチレングリコールで移植されたＨＡポリマーは、生物学的状態における長期間の保存に関連する望ましくない薬物漏出及び変性の両方を低下させる改善された送達マトリクスとしても調製されている。Kazuteru. M., J.Controlled Release 59:77-86 (1999)。使用される更なる生物分解性ポリマーは、ポリ（カプロラクトン）、ポリアンヒドリド、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリシアノアクリレート、ポリ（ホスファジン）、ポリ（ホスホジエステル）、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、分解性及び非毒性ポリウレタン、ポリヒドロキシブチル酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリアルキレンオキサル酸、ポリアルキレンコハク酸、ポリ（リンゴ酸）、キチン及びキトサンである。
【０１１２】
或いは、生物分解性ヒドロゲルは、生物学的材料及び薬物に対してコントロールされた放出送達媒体として使用される。マクロマーの適当な選択を通じて、膜は、広範囲の生物分子に適する透過性、孔サイズ及び分解速度の範囲を有して生産され得る。
或いは、生物材料及び薬物に対する持続性放出送達系は、分散により構成される。分散は、懸濁液又はエマルジョンのいずれかにさらに分類される。生物学的材料に対する送達媒体という点において、懸濁液は液体培地中に分散（多少不均一に）された極微小固体粒子の混合物である。懸濁液の固体粒子は、数ナノメーターから数百ミクロンのサイズにおよび、微粒子、マイクロカプセル及びナノスフェアーを含む。一方、エマルジョンは、少量の乳化剤による懸濁液中に保持される２又は複数の混合できない液体の混合物である。乳化剤は、混合できない液体間に界面状のフィルムを形成し、また、表面活性物質又は界面活性剤としても知られている。エマルジョン形成は、水が連続相で油又は脂肪が分散されている水中油（ｏ／ｗ）、並びに油が連続相で水が分散されている水中油（ｗ／ｏ）の両方であり得る。適切な持続性放出の製剤化の一例は、WO97/25563中に開示される。さらに、生物学的材料と共に使用するためのエマルジョンには、複合エマルジョン、マイクロエマルジョン、ミクロドロプレット及びリポソームが含まれる。ミクロドロプレットは、内部に油層も持つ球状脂質層から構成される単層のリン脂質媒体である。例えば、U.S.P. 4,622,219及びU.S.P. 4,725,442。リポソームは、水溶液と水に不溶な極性脂質とを混合することにより調製されるリン脂質媒体である。
【０１１３】
或いは、ＷＩＳＰアンタゴニストの持続性製剤は、乳酸-グリコール酸共重合ポリマー（ＰＬＧＡ）など、非常に高い生物適合性及び広範囲の生物分解性特性を発揮するポリマーを用いて開発される。ＰＬＧＡの分解産物である乳酸及びグリコール酸は、ヒトの身体から速やかにクリアにされる。さらに、該ポリマーの分解性はその分子量及び組成に依存して、月から年の範囲で調整することができる。さらなる情報については、Lewisによる「Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolide polymer,」 in Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems M, Chasin and R. Langeer, editors(Marcel Dekker:New York, 1990), pp.1-41を参照のこと。
カプセル化されたポリペプチド又は徐放性製剤中のポリペプチドは、放出濃度及び温度において非毒性である「水溶性多価金属塩」と共にポリペプチドを製剤化することで得られる。「多価金属」の例には、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ2+，Ｍｇ2+，Ｚｎ2+，Ｆｅ2+，Ｆｅ3+，Ｃｕ2+，Ｓｎ2+，Ｓｎ4+，Ａｌ2+，及びＡｌ3+）が含まれる。上記多価金属カチオンと共に水溶性塩を形成するアニオンの例には、無機酸及び／又は有機酸によって形成されるものが含まれる。このような水溶性塩は水（２０℃）に少なくとも20 mg/ml、或いは100 mg/ml、或いは200 mg/mlの溶解度を持つ。
【０１１４】
「水溶性多価金属塩」を形成するために用いられる適切な無機酸には、疎水性酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸、及びリン酸が含まれる。用いられる適切な有機酸には、脂肪族カルボン酸及び芳香族酸が含まれる。ここでの定義において脂肪酸とは、飽和又は不飽和Ｃ２−９のカルボン酸（例えば、脂肪族モノ-、ジ-、及びトリ-カルボン酸）として定義されてもよい。一般に、カプセル化されたポリペプチドの安定化を補助するために用いられる水溶性多価金属塩には、例えば、：（１）無機酸のハロゲン金属塩（例えば、塩化亜鉛、塩化カルシウム）、硫酸鉛、硝酸塩、リン酸塩、チオシアン酸塩；（２）脂肪族カルボン酸の金属塩、酢酸カルシウム、酢酸亜鉛、プロピオン酸カルシウム、グリコール酸亜鉛、乳酸カルシウム、乳酸亜鉛及び酒石酸亜鉛：及び（３）安息香酸塩の芳香族カルボン酸金属塩、（例えば、安息香酸亜鉛）及びサリチル酸塩などが含まれる。
インビボ投与に使用する処方のために、それらを無菌にする必要がある。処方は凍結乾燥及び再構成の前又は後に無菌の濾過膜を通して濾過することにより簡単に無菌にすることができる。ここでの治療用組成物は、一般に、無菌のアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液バッグ又はバイアルに入れる。
【０１１５】
インビボの哺乳動物治療のために、投与経路を既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路による注射又は注入、局所的投与、持続放出性又は徐放放出性の手段等の周知の方法に従う。任意には、活性化合物又は製剤を罹患した軟骨領域又は関節に直接注射する。また、本発明により考えられる治療は、遺伝子治療の形態をとりうる。
本発明で利用できる製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobiら, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１１６】
ＷＩＳＰアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約10ng/kgから100mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。
また、ここで使用される製剤は、治療される特定の徴候に必要とされる一以上の活性化合物、互いに不利に影響しない相補的な活性を有する好適なものを含んでいてもよい。ＷＩＳＰアンタゴニストは細胞障害剤、サイトカイン又は成長阻害因子と組み合わせて投与されうる。このような分子は、意図する目的に効果的な量及び組合せで存在する。また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子(ＶＥＧＦ)に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、本発明のポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のＷＩＳＰアンタゴニストを投与する。また他の薬剤、例えばデコリン、バイグリカン、デルマタン硫酸又はヘパリンのような薬剤をＷＩＳＰアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。また、同時投与又は連続投与も考えられる。
【０１１７】
本方法はまた、あらゆる標準的な軟骨の外科的技術と組み合わせて行われうる。標準的な外科的技術は、軟骨シェービング、摩耗性軟骨形成術、レーザー修復、壊死組織切除、軟骨形成術、軟骨下骨侵入のある又はない微小破壊、自家骨軟骨移植、軟骨細胞同種移植、幹細胞自家移植、助軟骨移植、化学刺激、電気刺激、軟骨外自家移植、骨膜自家移植、軟骨足場再生(scaffollds)、シェル（骨関節）自家移植又は同種移植、又は骨切り術を含む、軟骨の治療的な操作に通常用いられる外科的手術である。これらの技術はFrenkel等, Front. Bioscience 4: d671-685(1999)により詳細に記載され、検討されている。
随意的な実施態様では、ＷＩＳＰアンタゴニストは微小破壊手術と組み合わせて使用される。微小破壊手術の技術は当業者に公知であり、一般に哺乳動物の骨髄腔の外科的な穿孔を必要とする。次いで、フィブリン凝塊が形成され、哺乳動物体の欠損を補填する。続いて、繊維軟骨が形成する。
ＷＩＳＰアンタゴニストは、軟骨又は軟骨細胞をエキソビボで処理するために使用することができると考えられる。このようなエキソビボ処理は、移植、特に自家移植に有用である。例えば、ＷＩＳＰアンタゴニストによるこのような軟骨又は軟骨細胞を含む細胞又は組織の処理、任意には、上記のような一以上の他の治療は、レシピエント哺乳動物における移植前に、前駆体軟骨細胞の分化の誘発を軟骨組織の再生に利用することができる。
【０１１８】
軟骨又は軟骨細胞を含む細胞又は組織を、まずドナー哺乳動物から得る。細胞又は組織は外科的に得られ、好ましくは無菌的に得られる。次いで、細胞又は組織をＷＩＳＰアンタゴニストで、任意には上記のような一以上の他の治療と共に処理する。
次いで、処理した細胞又は組織はレシピエント哺乳動物に移植又は注入されうる。レシピエント哺乳動物はドナー哺乳動物と同じ個体であっても、又は他の異なる哺乳動物でもよい。
ここで記載される処理の進行又は効果は、熟練技術者に既知の従来からの技術及びアッセイにより簡単に監視することができる。
ここで記載されるＷＩＳＰアンタゴニストの軟骨又は軟骨細胞における活性又は効果は、様々なインビトロ又はインビボのアッセイを用いて過度の実験なしに測定することができる。
【０１１９】
あるアッセイにおいて、無傷の軟骨におけるＷＩＳＰアンタゴニストの合成的及び予防的可能性を試験することができる。この目的ために、プロテオグリカン（ＰＧ）の合成及び分解、並びに一酸化窒素の放出が、処理した関節軟骨移植片において測定される。プロテオグリカンは、関節軟骨中二番目に大きな有機材料成分である（Kuettner, K.E.等、Articular  Cartilage  Biochemistry. Raven  Press,  New York, USA (1986), p.456；Muir, H., Biochem. Soc. Tran. 11:613-622 (1983)；Hardingham, T. E., Biochem . Soc. Trans. 9;489-497 (1981)）。プロテオグリカンは軟骨の物理的及び化学的性質を決定するのに役立つため、関節の分解の間に生じる軟骨ＰＧｓの減少は、圧縮されたこわばり及び弾性の喪失、水力の透過性の増大、増加した水分含量（膨張）、及びコラーゲンなど他の細胞外組織の変化を導く。従って、ＰＧの喪失は、変性軟骨疾患の進行の初期段階であり、さらに関節の生体力学的及び生化学的安定性を混乱させる。関節軟骨のＰＧｓは、骨格成長及び疾病における有望な役割により、広く研究されてきた。Mow, V.C., & Ratcliffe, A. Biomaterials 13:67-97 (1992)。病気に罹った関節で増大するプロテオグリカンの分解は、ここで記述されるアッセイにおいて比色定量ＤＭＭＢアッセイを用いて外植片培地中でＰＧｓを定量することにより測定される。Farndale及びButtle, Biochem. Biophys. Acta 883:173-177 (1985)。プロテオグリカンへの３５Ｓ-硫酸塩の取り込みは、プロテオグリカン合成の指標として使用される。
【０１２０】
インターロイキン-１α、ＩＬ-１βと変成軟骨性疾病が連関するという証拠は事実である。例えば、高レベルのインターロイキン-１α（ＩＬ-１α）（Pelletier JP等、「Cytokines and inflammation in cartilage degradation」 in Osteoarthritic Edition of Rheumatic Disease Clinics of North America, Eds. RW Moskowitz, Philadelphia, W.D. Saunders Company, 1993, p.545-568)及びＩＬ-１レセプター(Martel-Pelletier等、Arthritis Rheum. 35:530-540 (1992)が病気に罹った関節において見いだされており、ＩＬ-１αが軟骨マトリクスの分解を誘導し、新たなマトリクス分子の合成を阻害する。Baragi等、J. Clin. Invest. 96:2454-60 (1995)；Baragi等、Osteoarthritis Cartilage 5:275-82 (1997)；Evans等、J. Leukoc. Biol. 64:55-61 (1998)；Evans等、J. Rheumatol. 24:2061-63 (1997)；Kang等、Biochem. Soc. Trans. 25:533-37 (1997)；Kang等、Osteoarthritis Cartilage 5:139-43 (1997)。また、ＩＬ-１αと疾患との関連性のため、ＩＬ-１αの存在下においてＷＩＳＰポリペプチドをアッセイすることができる。
【０１２１】
一酸化窒素（ＮＯ）の生産は、ＩＬ-１などの異化作用的サイトカインにより軟骨中で誘発され得る。Palmer, RMJ等、Biochem. Biophys. Res. Commun. 193:398-405 (1993)。また、ＮＯは関節炎の状態で生じる関節破壊にも関与してきた。Ashok等、Curr. Opin. Rheum. 10:263-268 (1998)。正常な（病気ではない又は負傷していない）軟骨とは異なり、インターロイキン-１又はリポ多糖類（ＬＰＳ）などの付加刺激の非存在下でも、骨関節炎の軟骨はエクスビボにおいて有意な量の一酸化窒素を生産する。インビボ動物モデルにより、酸化窒素生成の阻害は関節炎の進行を和らげることが示唆された。Pelletier, JP等, Arthritis Rheum. 7: 1275-86(1998); van de Loo等, Arthritis Rheum. 41: 634-46 (1998); Stichtenoth, D.O. 及びFrolich J. C., Br. J. Rheumatol. 37:246-57 (1998)。インビトロにおいて、一酸化窒素は軟骨細胞の機能に対し、コラーゲン及びプロテオグリカンの合成阻害、細胞死（アポトーシス）の亢進及び細胞外マトリクスへの接着阻害を含む有害な影響を及ぼす。亜硝酸の濃度は、リウマチ様関節炎の患者の液よりも変成軟骨関節炎の患者の関節液中において高いことが示されている。Renoux等、Osteoarthritis Cartilage 4:175-179 (1996)。さらに、動物モデルは、一酸化窒素の生産の阻害は、関節炎の進行を抑えることを示唆する。Pelletier, J.P.等、Arthritis Rheum 7:1275-86 (1998)；van de Loo等、Arthritis Rheum. 41:634-46 (1998)；Stichtenoth, D.O.及びFrolich J.C. Br. J. Rheumatol. 37:246-57 (1998)。また、ＮＯは他の細胞にも影響を及ぼすため、関節中のＮＯの存在は、血管拡張及び透過率を増大させ、白血球によるサイトカインの放出を強化し、血管形成活性を刺激する。従って、軟骨によるＮＯの生産は、疾病の状態と相関し、ＮＯは、関節疾病の腐食性及び炎症性の成分の両方において役割を演じるようであるため、一酸化窒素の生産を減少させる因子は、変成軟骨疾患の治療に対して有益であると思われる。
【０１２２】
ここで記述されるアッセイは、２,３-ジアミノナフタレン（ＤＡＮ）が、定量可能な蛍光産物である１-(Ｈ)-ナフトトリアゾールを形成する酸性条件下で亜硝酸塩と反応する原理に基づいている。ＮＯは亜硝酸塩（ＮＯ２-1）及び硝酸塩（ＮＯ３-1）へと代謝されるため、亜硝酸塩の検出は軟骨組織で（たとえカウント値以下であっても）実際に生産されたＮＯを検出する手段の一つである。
この方法において、血清又は他の成長因子無しの培地で軟骨細胞の生存を促進、助長又は維持するためのＷＩＳＰアンタゴニストの能力が試験される。関節軟骨細胞は、まず細胞外マトリックスの除去により作成され、単層で培養され、マトリックスが枯渇した時に軟骨疾患の後期ステージに近似すると思われる。アッセイは、黄テトラゾリウム塩ＭＴＴを切断して紫のホルマザン結晶を形成する生細胞の能力に基づいて培養される細胞の代謝活性を測定する非職分析アッセイである。この細胞性還元反応は、ピリジンヌクレオチド補助因子ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨに関係する。Berridge, M.V. & Tan, A.S., Arch. Biochem. Biophys. 303: 474(1993)。可溶化した生成物は、ＥＬＩＳＡリーダーで分光光度的に定量される。
【０１２３】
また、他のアッセイはマウスの膝蓋骨（膝頭）におけるプロテオグリカンの合成に対するＷＩＳＰポリペプチドの影響を調べる。本アッセイは無傷の軟骨（骨の下の存在するものも含める）、従って、インビボの軟骨環境に近い条件下のテスト因子を用いる。化合物は、インヴィトロにおいて膝蓋骨に添加されるか、又はエクスビボでの膝蓋骨におけるプロテオグリカンの合成を分析する前にインビボにて膝関節へインジェクトされるかのいずれかである。以前示されたように、インビボで処理された膝蓋骨はエクスビボでのＰＧ合成において明らかな変化を示す。（Van den Berg等、Rheum. Int. 1:165-9 (1982)；Vershure. P.J.等、Ann. Rheum. Dis. 53:455-460 (1994)；及びVan de Loo等、Arthrit. Heum. 38:164-172 (1995)。本モデルにおいて、各動物の対側の関節はコントロールとして使用できる。
これらの試験は、膝の骨関節炎（ＯＡ）を自然に生じるモルモットの系統、Dunkin Hartley (DH)からの関節軟骨移植片においてＰＧ合成の促進及びＰＧ放出の抑制の両方におけるＷＩＳＰポリペプチドの影響を測定する。関節破壊の急速な進行を引き起こす多くの他の動物モデルは、徐々に進行するヒト１次ＯＡよりも２次ＯＡに類似している。対照的にＤＨモルモットは、自然発生的なゆっくりとした進行の非炎症性ＯＡ様変化を有する。これらモルモットの軟骨破壊の高い再現性のあるパターンは、ヒトの疾患に見られるものと似ているので、ＤＨモルモットは骨関節炎のためのよく知られた動物モデルである。Young等、”Osteoarthritis”, Spontaneous animal models of human disease vol.2, pp.257-261, Acad. Press. Ney York. (1979)；Bendele等、Arthritis Rheum. 34:1180-1184；Bendele等、Arthritis Rheum. 31:561-565 (1988)；Jimenez等、Laboratory Animal Science vol.47(6):598-601 (1997)；Wei等, Acta Orthop Scand 69:351-357(1998)。初めに、これらの動物モデルは最小の組織学的変化の存在により検出可能な軽いＯＡを発症する。しかしながら、疾病は進行し、16-18月齢までに関節での中程度から重篤な軟骨変成が観察される。結果として、ＤＨモルモットの軟骨マトリックスでの病気の進行を超えるＷＩＳＰポリペプチドの効果は、関節破壊の異なるステージでＯＡの治療に化合物が治療的効果を有することの示唆となった。
【０１２４】
真性糖尿病（糖尿病）に関係する代謝の変化は、罹患した生物の他の多くの器官及び筋骨格システムに影響する。例えば、ヒトにおいて、筋骨格の損傷及び疾患の発生は、糖尿病になると増加し、糖尿病は関節炎進行の危険要因であるとされる。
糖尿病に類似した病理現象はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の投与により動物に誘発させることができる。Portha B. 等, Diabete Metab. 15: 61-75(1989)。インスリンを産生する膵臓細胞の死滅によって、ＳＴＺは処置した動物の血清インスリンの量を減少させる。ＳＴＺ誘発性糖尿病は、皮膚、骨及び軟骨を含む結合組織の萎縮に関連し、コラーゲン含量を低下させる。Craig, R.G.等, Biochim. Biophys. Acta 1402: 250-260(1998)。このアッセイにおいて、処置したＳＴＺ処理マウスの膝蓋骨をＷＩＳＰポリペプチドの存在下でインキュベートし、結果的なマトリックス合成を分析する。未処理コントロールに対して、ＰＧ合成のレベルを増加又は回復するＷＩＳＰポリペプチドの能力は、治療的潜在性を示唆する。
【０１２５】
本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、例えば、軟骨疾患を治療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性薬剤は、典型的にはＷＩＳＰアンタゴニストである。組成物は、ここで開示されるいずれの又は複数の成分をも含み得る。容器上の又は添付された説明書は、組成物が選択の状態を治療するために使用されることを示す。例えば、説明書は、組成物が変成軟骨関節炎、リウマチ様関節炎又は他の任意の軟骨疾患の治療に有効であることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキストロース溶液などの製薬的に許容される緩衝液を含む第２の容器を具備してもよい。或いは、組成物は、任意の担体、賦形剤及び／又は安定化剤を含んでもよい。さらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０１２６】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
【０１２７】
（実施例）
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して同定されている細胞の供給源はバージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションである。特記しない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えＤＮＡ技術の標準的な手法を用いる：Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press N.Y., 1989; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989; Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., N.Y., 1990; Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.I. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
【０１２８】
以下に記載されるアッセイにおいて、次の方法及び材料を用いた：
材料：
完全長マウスＷＩＳＰ-１（Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)）を、以前ＴＮＦＲ１について記載されているようにして（Ashkenazi等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:10535-10539 (1991)；WO 99/21998）、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のＷＩＳＰ-１配列下流をコードする発現ベクターにクローン化した。得られた組み換え融合タンパク質（ＷＩＳＰ-１-Ｆｃ）はＳｆ９昆虫細胞を用いてバキュロウイルス発現系で合成し、タンパク質ＡセファロースFast Flow（ファルマシア バイオテック社、スウェーデン）カラムでの親和性クロマトグラフィーによって無血清条件培地から精製して均一にした。吸着しなかったタンパク質を1MのＮａＣｌを含有する50mMのリン酸ナトリウムバッファーで洗い流した。ＷＩＳＰ-１-Ｆｃを100mMのグリシン、ｐＨ２．５で抽出し、3MのトリスＨＣｌ、ｐＨ８の０．１量でｐＨを中性にした。透析（20mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、150mM）の後、精製したタンパク質をセントリプレップ-３０（ミリポア株式会社、ベッドフォード、ＭＡ）を用いて限外濾過により濃縮し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及び銀染色によって純度を測定した。
【０１２９】
脂肪酸ウルトラ遊離ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）画分Ｖ及び完全無ＥＤＴＡプロテアーゼ阻害剤反応混液錠は、Roche Molecular Biochemicals（インディアナ州インディアナポリス）製のものであった。ビオチニン化したウマ抗マウスＩｇＧは、Jackson ImmunoResearch Laboratories（ペンシルベニア州ウェストグローブ）から購入した。ＦＩＴＣ抱合ストレプトアビジン及びヘキスト３３３４２は、Molecular Probes（オレゴン州ユージーン）製であった。Renaissance TSA間接増殖キットをNEN Life Science Products（マサチューセッツ州ボストン）から購入した。Vectashieldをマウントした培地をVector（カリフォルニア州バーリンゲイム）から、及びTissue-Tek OCT化合物をMiles（インディアナ州エルクハート）から入手した。２型コラーゲン、ウシインスリン、トランスフェリン及び亜セレン酸ナトリウムをSigma（ミズーリ州セントルイス）から購入した。組換えヒトＢＭＰ−２をR&D Systems（ミネソタ州ミネアポリス）から、組換えヒトＧＤＦ−５をAntigenix America Inc.（ニューヨーク州ハンティントン）から購入した。ＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体を前述したように生成した。Desnoyers等、J Biol Chem, 276:47599-47607 (2001)。
インサイツハイブリダイゼーション
前述のようにして（Holcomb等、Embo J, 19:4046-4055 (2000)）局所的な遺伝子発現を実行し、その際にはマウスＷＩＳＰ−１（ＮＭ＿０１８８６５）のヌクレオチド４４０−１１８０に対応する７４０ｂｐ  ＰＣＲ産物から転写された、３３Ｐ標識化センス及びアンチセンスリボプローブを用いた。
【０１３０】
免疫蛍光法
ＯＣＴ包埋ラットのＥ１８胚の切片（１０μｍ）をＰＢＳで洗浄し、非特異的結合部位を、１．５％の正常なウマ血清を含むＰＢＳ／３％ＢＳＡ中で２０分間遮断した。アビジン／ビオチンブロッキングキットを用いてアビジン及びビオチン結合部位をベクター（カリフォルニア州バーリンゲイム）から遮断し、１μｇ／ｍｌのマウスモノクローナル抗ＷＩＳＰ−１抗体（クローン９Ｃ１０）を用いて１．５％の正常なウマ血清を含むＰＢＳ／３％ＢＳＡ中でスライドを１時間インキュベートし、洗浄して、ＰＢＳ／４％のパラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。切片を洗浄して、ＨＢＳ−Ｃ／３％のＢＳＡ中で、１：２００のビオチニン化したウマ抗マウスＩｇＧを用いて３０分間インキュベートした。スライドを洗浄、固定して、製造者の指示に従ってＴＳＡ間接増幅キットを用いて信号を増幅した。スライドはストレプトアビジン抱合ＦＩＴＣ（１：１０００）で３０分間インキュベートした。切片を洗浄し、１μｇ／ｍｌヘキスト３３３４２を含む培地をマウントしたＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄに載せ、ニコンＥｃｌｉｐｓｅ８００蛍光顕微鏡下で可視化した。
インサイツリガンド結合
ＷＩＳＰ−１−Ｆｃのラット胚切片への結合を、前述のDesnoyers等、J Biol Chem, 276:47599-47607 (2001); Desnoyers等、J Histochem Cytochem, 49:1509-1518 (2001)に記載のインサイツリガンド結合手順を用いて評価した。ＷＩＳＰ−１−Ｆｃを省いたとき、又は抗ヒトＩｇＧ抗体を関連性の無い抗体（抗−ｇｐ  １２０）で置換したとき、シグナルは検出されなかった。ＷＩＳＰ−１−Ｆｃの結合パターンは独特であり、対照のタンパク質（ヒトＩｇＧ）に観察された結合パターンとは異なっていた。
【０１３１】
初生ブタ軟骨細胞の分離
月齢４〜６ヶ月の雌ブタの中手指節骨の関節を無菌で開き、下方に位置する骨から関節軟骨を切り離した。軟骨を、プールし、みじん切りにし、洗浄して、コラゲナーゼを用いて３７℃で一晩消化した。５０μｍのこし器を通して消化物を濾過し、細胞を洗浄し、１０％のＦＢＳ及び４μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを含むＨａｍ−Ｆ１２に１ｃｍ２当たり細胞２５，０００個で播種し、５％のＣＯ２下において３７℃で維持した。細胞に３日毎に養分を与え、５日毎に播種し直した。培養１１日後、初生軟骨細胞の５０−６０％がその軟骨細胞の特性を失っており、双極の紡錘形状と、コラーゲン２からコラーゲン１発現への転換とを特徴とする間充織（間葉）表現型に戻っていた。
細胞結合
分化したブタ初生軟骨細胞へのＷＩＳＰ−１−Ｆｃの結合を、前述のように（Desnoyers等、J Histochem Cytochem, 49:1509-1518 (2001)）実施した。ＷＩＳＰ−１−Ｆｃを省いたとき、又は抗ヒトＩｇＧ抗体を関連性の無い抗体（抗−ｇｐ  １２０）で置換したとき、シグナルは検出されなかった。
【０１３２】
細胞培養
正常ヒト真皮性線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及び正常ヒト肺線維芽細胞（ＮＨＬＦ）をＣａｍｂｒｅｘ（メリーランド州ウォーカーズビル）から購入した。Ｃ５７ＭＧマウス卵巣上皮細胞株は、Ｄｉａｎｅ  Ｐｅｎｎｉｃａ博士（カリフォルニア州ジェネンテック）から提供されたものであった。ＮＩＨ／３Ｔ３マウス線維芽細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１クローン１４マウス頭蓋冠前骨芽細胞、及びマウスＣ２Ｃ１２骨格筋筋芽細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナッサス）から購入した。ＳＴ２マウス骨髄間質細胞及びＡＴＤＣ５マウス胚性癌腫由来軟骨形成細胞はＲＩＫＥＮ（日本国つくば市）から購入した。
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞をＤＭＥとＨａｍ  Ｆ−１２を１：１で混合した（ＤＭＥ／Ｆ１２）培地に、１０％のＦＢＳを補充した集密になるまで維持した。前述のようにして（Wang等、J Bone Miner Res, 14:893-903 (1999)）、骨芽細胞の分化を誘発した。つまり、１０％のＦＢＳを含むα修飾イーグル培地中で細胞を集密化するまで成長させ、５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸で処理した。無機リン酸濃度を３ｍＭまで上昇させ、細胞をさらに２日間処理した。ＳＴ２細胞を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で、及びＣ２Ｃ１２細胞を１５％のＦＢＳを補充したＤＭＥ／Ｆ１２培地中で維持した。骨芽細胞の分化を誘発するため、細胞を成長させて集密化させ、３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２で処理した（Katagiri等、J Cell Biol, 127:1755-1766 (1994); Gong等、Cell, 107:513-523 (2001)）。
ＡＴＤＣ５細胞を、５％のＦＢＳ、１０μｇ／ｍｌのウシインスリン、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン及び３０ｎＭの亜セレン酸ナトリウムを補充したＤＭＥ／Ｆ１２培地中で維持した。高レベルのＷＩＳＰ−１を発現するＡＴＤＣ５細胞（ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ）又はそれよりも低いレベルのＷＩＳＰ−１を発現するＡＴＤＣ５細胞（ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ）を、製造者（Ｒｏｃｈｅ）の指示に従い、Ｆｕｇｅｎｅ６を使用してｐＳＶｉピューロマイシンプラスミドを有するｐＲＫベクターにヒトＷＩＳＰ−１を同時形質移入することにより生成した。４８時間後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地中の細胞を選択した。２週後、クローンを単離し、免疫蛍光法によりＷＩＳＰ−１の発現を評価した。対照細胞株は、空のｐＲＫベクターを形質移入し、その後は同じ手順を用いて生成した。前述のようにして（Nakamura等、Exp Cell Res, 250:351-363 (1999)）ＡＴＤＣ５細胞をＢＭＰ−２又はＧＤＦ−５で処理することにより軟骨細胞の分化を誘発した。
０．５％のＦＢＳを補充した培養培地中の１０ｃｍ２ペトリ皿に１０４個の細胞を播種することにより、ＡＴＤＣ５細胞増殖を測定した。トリプシン処理後、指定の時点において、血球計数器を用いて生細胞をカウントした。
【０１３３】
免疫沈降及びウェスタンブロット分析
安定的に形質移入したＡＴＤＣ５細胞（２×１０６）を４ｍｌの１：１Ｈａｍ  Ｆ−１２：ＤＭＥＭ培地中で一晩培養した。特異的なモノクローナル抗体（Desnoyers等、J Biol Chem, 276:47599-47607 (2001)）を使用し、前述のプロトコル（Tice等、J Biol Chem, 277:14329-14335 (2002)）を用いて培養物及び溶解物からＷＩＳＰ−１を免疫沈降させた。免疫沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢＩＯ-ＲＡＤ）上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ）に電気移入した。ＷＩＳＰ−１をビオチニン化したモノクローナル抗体で免疫検出し、Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ）により可視化した。細胞０．５×１０６個／レーン及び０．２×１０６個／レーン当量を、上清及び細胞溶解物それぞれについて分析した。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（Molecular Research Center／オハイオ州シンシナティ）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。特異的プライマー及び蛍光発生的プローブを用いて遺伝子発現を増幅し、定量化した（Winer等、Anal Biochem, 270:41-49 (1999)）。遺伝子に特異的なシグナルを、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水酵素ハウスキーピング遺伝子に標準化した。各条件につき３組のデータを取り平均化した。全てのＴａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲ試薬はApplied Biosystems（カリフォルニア州フォスターシティ）から購入したものであった。
【０１３４】
アルカリホスファターゼアッセイ
細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ１００を用いて５分間氷上で溶解した。２０μｌの溶解物を８０μｌのＡｔｔｏｐｈｏｓ基質（Roche）に添加し、室温で５分間インキュベートした。蛍光を測定し（４２０ｎｍで励起：５６０ｎｍで発光）、酵素産物の検量線と比較することによりアルカリホスファターゼ活性を決定した。マイクロＢＣＡアッセイキット（Pierce）を使用してタンパク質の内容について細胞溶解物を分析し、アルカリホスファターゼ活性を全体のタンパク質濃度について標準化した。
マウス大腿骨骨折治癒モデル
麻酔した週齢６〜８週の雄Ｃ５７ＢＬ６マウス（Charles River Laboratories）に、上述の手順に従って（Bonnarens及びEinhorn, J Orthop Res, 2:97-101 (1984)）、中軸に固定大腿骨骨折を生成した。全ての動物実験は国際ガイドラインに従って行った。
【０１３５】
ＷＩＳＰ−１の組織分布
インサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行って胚骨格生成の間のＷＩＳＰ−１発現の空間時間的特性を解明した。Ｅ１０．５では、骨形成の前に、軟骨内の骨を発達させる軟骨原基(primordium)由来の軟骨膜間充織においてＷＩＳＰ−１が弱く発現した（データは示さない）。骨格発達の進行につれて、ＷＩＳＰ−１の発現が軟骨原基(anlagen)を取り囲む間葉系細胞層において増大した。Ｅ１２．５では、軟骨外骨化又は膜内骨化が進行中の骨の骨芽細胞においてＷＩＳＰ−１の発現が見られた（図１Ａ）。また、心筋及び皮下中胚葉にもいくらかの発現が認められた（データは示さない）。Ｅ１５．５では、椎骨の骨芽細胞及び関連する骨膜細胞、肋骨、及び骨化が始まった後に長管骨の皮質を形成する幹骨に沿ってＷＩＳＰ−１の発現が大きかった。ＷＩＳＰ−１の発現は、膜内骨化の部位においてさらに顕著であった（図１Ｄ）。シグナルは、発達中の頭蓋冠及び上顎骨の骨芽細胞及び骨膜細胞に顕著であった。軟骨細胞及び骨原性細胞を取り巻くその他の細胞におけるＷＩＳＰ−１の発現は、低いか又は検出不能であった。
発達中の骨の部位におけるＷＩＳＰ−１タンパク質の存在を、Ｅ１８ラット胚において免疫蛍光法により評価した。ＩＳＨの発現特性に非常に近い強い蛍光染色パターンが観察された（図２）。軟骨内骨化及び膜内骨化が起こっている全ての部位で骨芽細胞にＷＩＳＰ−１が見つかった。染色は、発達中の頭蓋冠、下顎骨、鎖骨、椎骨及び助骨に並ぶ骨芽細胞で強かった。軟骨膜及び軟骨芽細胞に染色は観察されなかった。
【０１３６】
分化する骨芽細胞によるＷＩＳＰ−１の発現。
様々な細胞種類においてＷＩＳＰ−１の発現を測定した（図３Ａ）。ＷＩＳＰ−１は、初生のヒト正常肺及び皮膚の骨芽細胞、Ｃ５７ＭＧ卵巣上皮細胞又はＡＴＤＣ５軟骨形成細胞には発現しなかったが、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞及びＣ２Ｃ１２骨格筋前駆細胞に発現した。さらに高いレベルのＷＩＳＰ−１の発現が、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１頭蓋冠前骨芽細胞及びＳＴ２骨芽細胞骨髄間質細胞に見られた。
骨芽細胞分化の間、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及びＳＴ２骨原性細胞株を用いてＷＩＳＰ−１の発現をモニターした（Wang等、J Bone Miner Res 14:893-903 (1999); Gong等、Cell, 107:513-523 (2001)）。それはオステオカルシン発現とアルカリホスファターゼ活性の増大に表されるように、分化培地中に置いたとき、これらの細胞は次第に骨芽細胞表現型を取り込む（図３）。これらの細胞では、ＷＩＳＰ−１の発現レベルが骨芽細胞分化の間に変化せず、常に高いレベルに保たれていた。ＷＩＳＰ−１は前骨芽細胞に発現するので、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１及びＳＴ２細胞の骨芽細胞の系列への関与に先立つ初期のイベントを表していると思われる。これを試験するため、Ｃ２Ｃ１２骨格筋前駆細胞を使用して骨芽細胞の分化転換モデルでＷＩＳＰ−１の発現を測定した（Katagiri等、J Cell Biol, 127:1755-66 (1994)）。これらの細胞では、ＷＩＳＰ−１の発現は、ＢＭＰ−２による骨原性分化転換の誘発後急速に増大した（図３Ｈ）。このような結果は、骨原性系列の細胞によりＷＩＳＰ−１が優勢に発現すること、及びそれがこの表現型を獲得する間に早期に誘発されることを示唆するものである。
【０１３７】
軟骨膜へのＷＩＳＰ−１の結合
骨格発達におけるＷＩＳＰ−１の役割についての理解を深めるため、インサイツでのラット胚の矢状部分に対するその結合を分析した。胎生期Ｅ１４において、ＷＩＳＰ−１は、軟骨原基の軟骨間充織及び濃縮前軟骨芽細胞と相互作用した（図４）。Ｅ１８期では、ＷＩＳＰ−１は、軟骨膜の間葉（間充織）細胞だけに結合し、軟骨芽細胞又は軟骨細胞に関連する蛍光は見られなかった。ＷＩＳＰ−１を使用しなかったとき、又は対照タンパク質で置換したとき、又は関連性の無い抗体を使用したとき、シグナルは検出されなかった。
培養１１日後、間葉系表現型を取り込んだ初生ブタ軟骨細胞を用いてＷＩＳＰ−１の間葉系細胞との相互作用を評価した。ＷＩＳＰ−１の結合は、接着斑のパッチ及び点に付随する不規則なパターンを示した（図５ａ）。隣接する細胞間の接触点において、強い蛍光染色が観察された（図５ｂ）。間葉系細胞とのＷＩＳＰ−１の相互作用は、細胞間の情報交換に関わっていると思われた。
【０１３８】
軟骨細胞前駆体に対するＷＩＳＰ−１の作用
軟骨細胞前駆体に対するＷＩＳＰ−１の活性を、ＷＩＳＰ−１で安定に形質移入したＡＴＤＣ５軟骨細胞株を生成することにより調査した。高レベルのＷＩＳＰ−１を発現する細胞株（ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ）、低レベルのＷＩＳＰ−１を発現する細胞株（ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ）、及び空のベクトルを形質移入した細胞株（ＡＴＤＣ５／対照）を分析した。ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞のＷＩＳＰ−１  ＲＮＡのレベルはＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ細胞の１．８倍であり（データは示さない）、タンパク質のレベルは２倍であった（図６Ａ）。集密化するまで成長させたとき、ＷＩＳＰ−１を発現する細胞株は、対照細胞株よりも高い密度を示した（図６Ｃ）。ＡＴＤＣ５／対照細胞株と比較して、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞株の飽和密度は１．８倍に、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌは１．６倍に上昇した（図６Ｂ）。ＡＴＤＣ５／対照細胞株と親細胞株の集密度に有意な差は無かった（データは示さない）。ＷＩＳＰ−１形質移入体も、ＡＴＤＣ５／対照及び親細胞株と比較して増殖が増大した。１１日後、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ及びＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌの細胞数はそれぞれＡＴＤＣ５／対照細胞株の６及び２．５倍に増大した（図６Ｄ）。ＡＴＤＣ５／対照細胞株及び親細胞株の成長率は同じであった。
様々なＡＴＤＣ５細胞株の分化状態を、それらのコラーゲン２発現レベルを評価することにより試験した。軟骨細胞分化が誘発される前の時点では、コラーゲン２の発現レベルはＡＴＤＣ５／対照及びＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ細胞のレベルと同じであったが、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞では対照細胞株の１０分の１であった（図６Ｅ）。ＢＭＰ−２又はＧＤＦ−５による軟骨細胞分化の誘発によって、ＡＴＤＣ５／対照細胞におけるコラーゲン２の発現が有意に増大した。他方で、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ細胞におけるコラーゲン２の誘発は大幅に減少し、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞では殆どゼロであった。これらの結果は、ＷＩＳＰ−１によって軟骨形成前の細胞増殖及び飽和密度が増大し、軟骨細胞系列に沿ったそれらの進行が妨げられることを示唆するものである。
【０１３９】
骨折修復時のＷＩＳＰ−１発現の誘発。
胚性骨形成を調節するシグナルが骨折修復の間に繰り返されることから、マウスの骨折治癒モデルにおけるＷＩＳＰ−１の一時的発現を評価した（Vortkamp等、Mech Dev, 71:65-76 (1998)）。ＷＩＳＰ−１シグナルは骨折後３日目に顕著に見られ、その後徐々に減少して２１日目には検出されなくなった（図７）。
骨折後３日目及び５日目に、骨膜表面に形成された暫時仮骨内の間葉細胞にＷＩＳＰ−１が見出された。また、骨折部位に隣接する骨膜に並ぶ骨芽細胞に弱い発現が見られた。７日目、暫時仮骨内の線維性骨の島に沿う骨芽細胞においてＷＩＳＰ−１が発現していた。骨折後１４日目、ＷＩＳＰ−１の発現は、硬い仮骨内の線維性骨の島を繋ぐ骨片に沿って凝集する骨芽細胞全体で最も強かった。２１日目までに、再造形された仮骨からＷＩＳＰ−１シグナルは消失した。ＷＩＳＰ−１の一時的な発現のパターンは、骨発達期段階でのその機能を映し出す初期骨折修復における役割を示唆するものである。
【０１４０】
骨格生成では、軟骨形成及び骨形成系と、軟骨細胞又は骨芽細胞におけるそれらの最終分化に、間葉系前駆細胞が関与する（例えば、Karsenty G, Nature, 423:316-318 (2003); Karsenty及びWagner, Dev Cell, 2:389-406 (2002)を参照）。分化プロセスに関わる因子は、最終分化が起こる以前の適切な系統の関係する前駆細胞に存在する。マウスの発達の間、ＷＩＳＰ−１の発現は軟骨の骨格テンプレートを取り囲む多能性間葉系細胞において１０．５日目に始まった。ＷＩＳＰ−１の発現は、発達する頭蓋と付属する骨格の間葉凝縮の間に徐々に増大し、新規に分化した骨芽細胞で最大に達した。１５．５日目までに、ＷＩＳＰ−１は、骨形成の将来的モデルとは無関係に、全ての骨芽細胞に所在していた。ＷＩＳＰ−１は発達初期に発現したが、後に軟骨内プロセスを経て軟骨細胞に分化する間葉細胞凝集物には全く見られなかった。ＷＩＳＰ−１の発現は、軟骨内及び膜間骨形成部位の骨芽細胞系統の細胞に限定されていた。骨格筋前駆体Ｃ２Ｃ１２細胞株を用いたとき、骨芽細胞系統に沿って分化転換するように誘発された細胞において、ＷＩＳＰ−１の発現が次第に増大した。ＷＩＳＰ−１の発現が系統の特異的な前駆細胞に早期に現れることから、ＷＩＳＰ−１は骨芽細胞の分化プロセスに参画していると思われる。
上述のインサイツリガンド結合分析により、発達中の骨の軟骨間充織に対するＷＩＳＰ−１の作用が起こる可能性のある部位が同定された。培養された脱分化初生軟骨細胞を用いて、間葉細胞とのＷＩＳＰ−１の相互作用が確認された。ＷＩＳＰ−１は、デコリン及びビグリカンと相互作用することにより、線維芽細胞表現型の細胞に結合する（Desnoyers等、J Biol Chem, 276:47599-47607 (2001)。デコリンとビグリカンは、発達段階で軟骨及び骨形成の部位に強く発現する小さなロイシンリッチ反復プロテオグリカンである（Wilda等、J Bone Miner Res, 15:2187-96 (2000)）。骨形成におけるそれらの重要性は、ヌルマウスモデル及びヒト疾患において実証されている（Ameye及びYoung, Glycobiology, 12:107R-116R (2002); Chen等、J Bone Miner Res, 17:331-340 (2002); Corsi等、J Bone Miner Res, 17:1180-1189 (2002)）。ＷＩＳＰ−１は、デコリン及びビグリカンと相互作用することにより、軟骨膜の間葉細胞表面に結合し易い。インビボでは、骨芽細胞系統の間葉細胞によって分泌されたＷＩＳＰ−１は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）中に存在するデコリン及びビグリカンと結合可能であった。プロテオグリカンには、成長因子及びサイトカイン貯蔵物という考え方がこれまでに提起されている（Iozzo, Proteoglycans: Structure, Biology and Molecular Interaction, 1-4 (2000)）。この特異的な相互作用により、ＷＩＳＰ−１の拡散範囲、利用性及び活性が調節されると思われる。四肢の発達段階における、細胞外マトリクスタンパク質によって媒介される細胞内伝達の重要性が実証されている（Lonai, J Anat, 202:43-50 (2003)）。つまり、ＥＣＭに繋留されたＷＩＳＰ−１は、軟骨形成系統に関係する隣接間葉細胞に対し、パラ分泌的に作用することができた。
【０１４１】
ＷＩＳＰ−１を用いて安定的に形質移入した軟骨細胞の細胞株では、ＷＩＳＰ−１によって、増殖、飽和密度が増大し、未脱分化間葉細胞に関連する遺伝子の発現が促進される一方、軟骨細胞分化に関連する遺伝子が抑制された。加えて、外因性成長因子の添加により、軟骨細胞分化の誘発が緩和された。総括すると、これらの結果は、ＷＩＳＰ−１が軟骨細胞分化のネガティブな制御因子であることを示すものである。
軟骨細胞の増殖、関与及び分化は、それらの局所的環境、自己分泌及びパラ分泌の制御に依存する（Quarto等、Endocrinology, 138:4966-4976 (1997)）。Ｗｎｔ遺伝子は、脊椎動物の骨格発達における軟骨細胞及び骨芽細胞の分化の重要なパラ分泌制御因子であることが示されている。Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ−５ａ、Ｗｎｔ−７ａ、Ｗｎｔ−１４は軟骨生成をネガティブに制御し、一方Ｗｎｔ−４とＷｎｔ−８は軟骨細胞の成熟を促進する（Rudnicki及びBrown, Dev Biol, 185:104-18 (1997); Hartmann及びTabin, Development, 127:3141-59 (2000); Hartmenn及びTabin, Cell, 104:341-51 (2001); Enomoto-Iwamoto等、Dev Biol, 251:142-56 (2002)）。Ｗｎｔシグナル伝達はまた、発達段階において骨芽細胞分化を促進し、且つ骨の自然発生を制御する（Harada及びRodan, Nature, 423:349-355 (2003)）。Ｗｎｔの制御的活性には、その経路の完全性が必要であり、これはＷｎｔ／βカテニン標的遺伝子が、間葉系前駆細胞の骨芽細胞及び軟骨細胞の分化に関わっていることを示唆するものである（Hartmann及びTabin, Development, 127:3141-59 (2000); Gong等、Cell, 107:513-23 (2001)）。ＷＩＳＰ−１はＷｎｔ／βカテニンの下流遺伝子であるので、骨格生成段階のＷｎｔ制御カスケードのエフェクターを構成することができると思われる（Pennica等、Proc Natl Acad Sci USA, 95:14717-14722 (1998); Xu等, Genes Dev, 14:585-95 (2000)）。
軟骨内骨形成の段階において、間葉細胞が肥大性軟骨細胞に分化することによりそれらの増殖及び濃縮は停止する。骨の適切な大きさと形状は、軟骨原基を形成する間葉細胞の増殖と分化のバランスによって決定する（Kronenberg, Nature, 423:332-6 (2003)）。インビトロでは、ＷＩＳＰ−１は軟骨細胞の分化をネガティブに制御する。発達段階の軟骨内骨形成の部位に発現するため、ＷＩＳＰ−１は軟骨細胞分化の早発性完了を防ぎ、骨格構造の適切な形態形成を保証することができると思われる。或いは、骨芽細胞分化の早期に発現されるＷＩＳＰ−１は、前駆細胞が軟骨細胞系統に復帰することを防ぐことで、表現型の決定に寄与している可能性がある。
【０１４２】
骨が治癒する際に胚性骨格発達を制御する複数の経路が再活性化されることから、骨折修復の間のＷＩＳＰ−１の発現パターンを分析した（Vortkamp等、Mech Dev, 71:65-76 (1998)）。骨の治癒プロセスは、明確に区別される３つの段階、即ち、炎症、回復及びリモデリングを経る（Bolander, Proc Soc Exp Biol Med, 200:165-170 (1992); Sandberg等、Clin Orthop, 289:292-312 (1993)）。第一段階は、炎症性細胞応答の活性化、及び骨折部位を取り囲む間葉幹細胞の補充と増殖によって開始する。回復段階では、軟骨内及び膜間骨合成が起こる。骨膜下の骨の間葉細胞が軟骨細胞へと分化することで、線維軟骨の軟らかいカルスが形成される。徐々に肥大性軟骨細胞へと分化する軟性カルスの軟骨細胞は、血管及び骨原性細胞によって浸潤され、最終的に骨によって置換される。また、損傷を受けた骨に隣接する骨膜間葉細胞は、骨芽細胞へと直接分化し、骨マトリクスの生成を開始して硬いカルスを形成する。初生の骨の形成に続き、広範なリモデリングが起こり、損傷を受けた骨格要素は元の形状と大きさを取り戻す。骨の治癒プロセスの間、ＷＩＳＰ−１の発現は、胚発達段階に観察されるパターンを繰り返した。
骨折直後、ＷＩＳＰ−１は損傷部位を取り巻く間葉細胞において発現した。ＷＩＳＰ−１は早発性の軟骨細胞分化を防ぎ、骨折部位における間葉細胞の成長と蓄積を促進した。回復段階では、ＷＩＳＰ−１の発現は骨膜に並ぶ骨芽細胞及び暫時カルス内の線維性骨の島に限定されていた。これは、ＷＩＳＰ−１が骨マトリクスの生成に参画していることを示唆するものである。骨折から３週間後には、骨は硬質のカルスにより再結合しており、この段階で骨のリモデリングが起こっていた。骨折から２１日後にＷＩＳＰ−１の発現は検出されず、これによりＷＩＳＰ−１は骨のリモデリングプロセスに関与していないと思われた。Ｗｎｔシグナル伝達経路は骨修復の間に誘発され、ＷＩＳＰ−１は骨折の治癒に関与するＷｎｔ下流遺伝子の重要な要素を構成していると思われる（Hadjiargyrou等、J Biol Chem, 277:30177-30182 (2002)）。
【０１４３】
ＣＣＮファミリーの他のメンバーが、骨格生成及び骨恒常性に関係する機能を有することが判明した。Ｃｙｒ６１は、発達中の四肢、肋骨、椎骨及び頭蓋顔面要素の軟骨細胞に発現し、軟骨形成分化を促進する（O'Brien及びLau, Cell Growth Differ, 3:645-654 (1992); Wong等、Dev Biol, 192:492-508 (1997)）。胚形成の間、骨と軟骨周辺の濃縮結合組織及び骨芽細胞にＣＴＧＦの発現が伴っており、これは軟骨細胞と骨芽細胞の増殖及び分化を促進し、ミネラル化に関与していた（Friedrichsen等、Cell Tissue Res, 312:175-88 (2003); Safadi等、J Cell Physiol, 196:51-62 (2003)）。軟骨細胞、破骨細胞、及び骨芽細胞にＮＯＶ発現が見られ、これは骨芽細胞様細胞の成長維持に参画していると思われた（Manara等、Am J Pathol, 160:849-859 (2002)）。ＷＩＳＰ−２の発現は、ＷＩＳＰ−２が骨代謝に関与していると考えられる骨芽細胞及び軟骨細胞に集中している（Kumar等、J Biol Chm, 274:17123-17131 (1999)）。ＷＩＳＰ−３突然変異は進行性偽性リウマチの原因であり、出生後の成長制御と軟骨の恒常性に関係することが提起されている（Hurvitz等、Nat Genet, 23:94-8 (1999)）。
骨発達の間、様々なＣＣＮファミリーのメンバーが、オーバーラップ発現又は排他的発現を示し、個々のメンバーに報告された活性は同様又は反対である。加えて、インテグリン（Lau及びLam, Exp Cell Res, 248:44-57 (1999); Grzeszkiewicz等、J Biol Chem, 276:21943-50 (2001); Leu等、J Biol Chem, 278:33801-33808 (2003)）、低密度リポタンパク関連タンパク質（Segarini等、J Biol Chem, 276: 40659-40667 (2001)）、及びノッチ（Sakamoto等、J Biol Chem, 277:29399-29405 (2002)）を含め、複数の種類のレセプターがこのファミリーに報告されている。
【０１４４】
実施例
特定のＷＩＳＰ−１抗体の結合特異性を試験するためのアッセイを実施した。完全長マウスＷＩＳＰ−１（GenBank取得番号NM_018865）及び完全長ヒトＷＩＳＰ−１（GenBank取得番号AF100779）を、ＷＩＳＰ−１配列の下流でヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域をコードしている発現ベクターにクローニングした。結果として生じる組換え融合タンパク質（ＷＩＳＰ−１−Ｆｃ）を、Ｓｆ９昆虫細胞を用いてバキュロウイルス発現システムで合成し、無血清条件培地からタンパク質Ａ−セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Amersham Pharmacia Biotech）上での親和性クロマトグラフィーにより均一に精製した。完全長ヒトＷＩＳＰ−１も、アミノ末端ヘキサヒスチジンタグ（ＷＩＳＰ−１−Ｈｉｓ）を有する状態で大腸菌株に発現した。細胞溶解物をＮｉ２＋ＮＴＡアガロースカラム（Qiagen）上でクロマトグラフィーにかけた。ＷＩＳＰ−１−Ｈｉｓを０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配で溶出した。次いで溶出されたＷＩＳＰ−１−Ｈｉｓを含む画分をプールし、透析した。哺乳動物の発現系のヒトＷＩＳＰ−１は、ヒトＷＩＳＰ−１（Arnold Levine; Princeton University, Princeton, NJ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーにより安定に形質移入されたＮＲＫ細胞を溶解することにより得られた。対照の細胞溶解物は、空のベクターで安定に形質移入したＮＲＫ細胞を用いて生成した。
様々な発現系のＷＩＳＰ−１（５０ｎｇ）に対し、ＳＤＳポリアクリルアミド上での電気泳動を行い、ポリビニルジフルオライド（polyvinyldifluoride）（ＰＶＤＦ）膜上に電気移入し、異なるＷＩＳＰ−１モノクローナル抗体を用いてプローブした。
ＷＩＳＰ−１抗体３Ｄ１１．Ｄ７（本明細書では「３Ｄ１１」とも呼ぶ）、１１Ｃ２．Ｃ１０（「１１Ｃ２」とも呼ぶ）、９Ｃ１１．Ｃ７（「９Ｃ１１」とも呼ぶ）及び５Ｄ４．Ｆ６（「５Ｄ４」とも呼ぶ）は、バキュロウイルス、細菌及び哺乳動物の発現系から生成されたＷＩＳＰ−１に特異的に結合した。これらの抗体はバキュロウイルス由来のマウスＷＩＳＰ−１に結合せず、対照溶解物のいずれのタンパク質も認識しなかった。ＷＩＳＰ−１抗体６Ｆ８、３Ａ７、１０Ｈ１２、３Ａ１１、６Ｅ３、３Ｈ１０、５Ｇ１及び１０Ｂ１は、バキュロウイルス発現系を用いて生成した場合のみ、ヒト及びマウス両方のＷＩＳＰ−１を認識した。これらの抗体は、細菌又は哺乳動物の発現系に生成されたとき、ヒトＷＩＳＰ−１を認識しなかった。クローン９Ｃ１０由来の抗体は、ウェスタンブロット後はいずれのタンパク質にも結合しなかった。
これらの結果により、ＷＩＳＰ−１抗体３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１１及び５Ｄ４はヒトＷＩＳＰ−１を特異的に認識することができ、ウェスタンブロットによるＷＩＳＰ−１の検出に使用可能であることが示唆される。
【０１４５】
実施例
ＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、９Ｃ１１、５Ｄ４及び３Ｄ１１によって認識されるエピトープを同定するためのアッセイを実施した。
完全長ヒトＷＩＳＰ−１（GenBank取得番号AF100779）を、ＷＩＳＰ−１配列の下流で６つのヒスチジンをコードしているｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２発現ベクター（Clontech Laboratories／カリフォルニア州パロアルト）にクローニングした。また、ヒトＷＩＳＰ−１の１、２、又は３つの領域を取り除くことにより、欠失突然変異体を生成した。結果として生じるコンストラクトも、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２発現ベクターにクローニングした。異なるＷＩＳＰ−１コンストラクトを区別するために使用した命名法はそれに含まれるドメインを意味する。ドメイン１はインシュリン様成育因子結合タンパク質ドメイン（ＩＦＧＢＰ）、ドメイン２はフォンビルブラント因子C（ＶＷＦｃ）ドメインであり、ドメイン３はトロンボスポンジン（ＴＳＰ）ドメイン、及びドメイン４はＣ末端（ＣＴ）ドメインである。可変領域は、ドメイン２と３の間に位置する。
ＷＩＳＰ−１のこれらのドメインをコードする配列を以下に示す。
【０１４６】
ＷＩＳＰ−１コンストラクトの配列
ドメイン１：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTC  （配列番号３）
ドメイン２：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC  （配列番号４）
ドメイン３：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGT  （配列番号５）
ドメイン４：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTG  （配列番号６）
ドメイン１，２：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC  （配列番号７）
ドメイン１，２，３：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGCCAAGAGGCCACGCAAGACCGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCgGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGA  （配列番号８）
ドメイン１，２，４：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTCTGCAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATGACTTCTGCGCTA  （配列番号９）
ドメイン１，３，４：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCGCATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC  （配列番号１０）
ドメイン２，３，４：
GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGCCAAGAGGCCACGCAAGACCGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGA  （配列番号１１）
【０１４７】
細胞（ＨＥＫ  ２９３Ｔ）を異なるコンストラクトを用いて形質移入し、４８時間後に培養培地を回収した。２０μｌのコバルト−アガロースを用いて１時間に亘り１ｍｌの培養培地をインキュベートし、遠心分離して洗浄した。２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー中においてペレットを１００℃で５分間加熱することにより、吸収されたタンパク質を溶出した。試料を電気泳動させてＰＶＤＦに電気移入し、様々なＷＩＳＰ−１抗体でプローブした。
抗体１１Ｃ２、９Ｃ１１及び５Ｄ４は、ドメイン２と３の間に位置する可変領域の最初の１９のアミノ酸を含むＷＩＳＰ−１コンストラクトのみを認識した。ＷＩＳＰ−１抗体３Ｄ１１は、ドメイン１（アミノ酸２４〜１１７）を含むＷＩＳＰ−１コンストラクトのみを認識した。
これらの結果は、抗体１１Ｃ２、９Ｃ１１及び５Ｄ４がＷＩＳＰ−１の可変領域を特異的に認識し、一方抗体３Ｄ１１はＷＩＳＰ−１のドメイン１を特異的に認識することを示唆するものである。
【０１４８】
実施例
ＷＩＳＰ−１抗体９Ｃ１０．Ｆ５（本明細書で「９Ｃ１０」とも呼ぶ）によって認識されるエピトープを同定するためのアッセイを実施した。
様々なＷＩＳＰ−１欠失コンストラクト（上述）を用いて形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来の培養物を、１μｇのＷＩＳＰ−１抗体９Ｃ１０と２０μｌのタンパク質Ａ−アガロースを用いて１時間に亘り室温でインキュベートした。免疫複合体を遠心分離により沈降させ、２０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファー中においてペレットを１００℃で５分間加熱することにより溶出した。試料を電気泳動させてＰＶＤＦに電気移入し、ＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２でプローブした。
抗体９Ｃ１０は、ＷＩＳＰ−１のドメイン１を含むコンストラクトのみを免疫沈降した。これらの結果は、抗体９Ｃ１０がＷＩＳＰ−１のドメイン１を特異的に認識し、免疫沈降に使用可能であることを示唆するものである。
【０１４９】
実施例
ＷＩＳＰ−１抗体９Ｃ１０（炭酸塩バッファー、ｐＨ９．６中２μｇ／ｍｌで１００μｌ）を４℃で一晩Ｍａｘｉｓｏｒｂプレートにコーティングした。２００μｌのＰＢＳ／３％  ＢＳＡで１時間に亘りプレートを遮断した。ＷＩＳＰ−１−Ｆｃ（ＰＢＳ／３％  ＢＳＡ中１００μｌ）の段階希釈により検量線を作成し、１時間インキュベートした。インキュベーションの後、１００μｌのＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎでプレートを洗浄し、ＰＢＳ／３％  ＰＢＳ（ビオチン化１１Ｃ２又は５５Ｂ）中でＷＩＳＰ−１抗体（２μｇ／ｍｌで１００μｌ）を１時間に亘りインキュベートした。ビオチン化１１Ｃ２について、２μｇ／ｍｌのＨＲＰ−抱合ストレプトアビジンを用いて更にプレートをインキュベートした。５５Ｂについては、プレートを洗浄し、ＨＲＰ−抱合ロバ抗ウサギＩｇＧを用いて１時間に亘りインキュベートした。インキュベーション終了時、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む２００μｌのＰＢＳでウェルを６回洗浄し、１００μｌの西洋わさびペルオキシダーゼ色素産生性基質ＴＭＢ（Kirkegaard & Perry Laboratories）を用いてシグナルを可視化した。１Ｍのリン酸１００μｌを用いて反応を止め、４５０ｍｎでのＯＤを測定した。マイクロタイタウェルのコーティングを省略することによる平行インキュベーションにおいて非特異的結合が測定された。ＷＩＳＰ−１−Ｆｃ又はＷＩＳＰ−１抗体を使用しなかったとき、シグナルは生成されなかった。
捕獲用に抗体９Ｃ１０を、検出用に抗体１１Ｃ２及び５５Ｂを用いて、ＷＩＳＰ−１の濃度を最少０．４μｇ／ｍｌまで検出できるＥＬＩＳＡを実施した。このＥＬＩＳＡは、血清のような生体液中のＷＩＳＰ−１タンパク質の検出に有用であった。
【０１５０】
実施例
１０μｇ／ｍｌのヘパリン（Sigma）をウェル当たり５０μｌ用いてＭａｘｉｓｏｒｂプレートを４℃で一晩コーティングした。２００μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡを用いて１時間に亘り非特異的結合部位を遮断した。次いで、段階希釈したＷＩＳＰ−１抗体の存在下で、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中において、６μｇ／ｍｌのｈＷＩＳＰ−１−Ｆｃを５０μｌ用いて１時間に亘りプレートをインキュベートした。ＰＢＳ／０．０５％のＴｗｅｅｎでプレートを洗浄し、２μｇ／ｍｌのＨＲＰ抱合抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃを５０μｌ用いて、ＰＢＳ／３％のＢＳＡ中で更に１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのＨＲＰ基質（ＴＭＢ）を添加した。１Ｍのリン酸を１００μｌ用いて発色を停止させ、４５０ｎｍでのＯＤを測定した。
ＷＩＳＰ−１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４及び９Ｃ１１は、それぞれ１．９、２．５及び３．７μｇ／ｍｌのＩＣ５０でヘパリンに対するＷＩＳＰ−１の結合を抑制した。抗体３Ｄ１１は、ヘパリンに対するＷＩＳＰ−１の結合を中程度に減らし、試験した最高濃度（４０μｇ／ｍｌ）において最大６２％を抑制した。抗体９Ｃ１０はＷＩＳＰ−１ヘパリン結合を減弱せず、無関係な対照抗体と類似の抑制曲線を示した。
これらの結果により、可変領域を認識する抗体が、ＷＩＳＰ−１のヘパリンへの結合を抑制できることが実証された。ドメイン１を認識する２つのＷＩＳＰ−１抗体が、ＷＩＳＰ−１のヘパリンへの結合に対し、殆ど又は全く影響を与えないことから、今のところドメイン１はこの相互作用に参画しているとは考えられない。
【０１５１】
実施例
骨芽細胞分化の間にＷＩＳＰ−１が減少することから、このプロセスへのＷＩＳＰ−１の参画を評価した。Ｃ２Ｃ１２細胞（ＡＴＣＣ）を、空のベクター（ｐＩＲＥＳ  ｐｕｒｏ−２； BD Bioscineces Contech／カリフォルニア州パロアルト）（図９の黒い棒グラフ）、又はＷＩＳＰ−１発現コンストラクト（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ−２にクローニングしたＷＩＳＰ−１； BD Bioscineces Contech／カリフォルニア州パロアルト）（図９のグレーの棒グラフ）を用いて一過性に形質移入した。形質移入から４８時間後、培養培地（１５％のＦＢＳを補充したＤＭＥ／Ｆ１２培地）を、５％のＦＢＳを含むＤＭＥ／Ｆ１２培地（図９Ａ）又は５％のＰＢＳ及び３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含むＤＭＥ／Ｆ１２培地（R & D Systems／ミネソタ州ミネアポリス）（図９Ｂ）によって置換した。図示の時間に以下のアッセイを用いてアルカリホスファターゼの活性を測定した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で細胞を２回洗浄し、氷上で２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトンＸ−１００中で５分間溶解させた。８０μｌのＡｔｔｏｐｈｏｓ基質（Roche）に２０μｌの溶解物を加え、室温で５分間インキュベートした。蛍光を測定し（４２０ｎｍで励起；５６０ｍｎで発光）、酵素産物の検量線と比較することによりアルカリホスファターゼの活性を決定した。マイクロＢＣＡアッセイキット（Pierce／イリノイ州ロックロード）を用いて細胞溶解物をタンパク質内容について分析し、アルカリホスファターゼ活性を全体のタンパク質濃度について標準化した。
ＷＩＳＰ−１の過剰発現は、Ｃ２Ｃ１２細胞の骨芽細胞分化を引き起こすのに十分ではなかった（図９Ａ）が、ＢＭＰ−２前骨芽細胞活性を大きく増強した（図９Ｂ）。ＢＭＰ−２で処理したとき、ＷＩＳＰ−１形質移入細胞は、対照ベクターで形質移入した細胞と比較して、１３〜１４倍のアルカリホスファターゼ活性を示した。前骨芽細胞因子のＷＩＳＰ−１増強は、前駆細胞の骨芽細胞分化を促進することにより系統決定を促進しうる。
【０１５２】
実施例
特異的にＷＩＳＰ−１を標的とする少量のヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）コンストラクトを発現するｐＳＩＲＥＮ−シャトルベクター（BD Biosciences Clonthech／カリフォルニア州パロアルト）を、製造者のプロトコル（プロトコル番号ＰＴ３７３９−１）に従って生成した。以下のオリゴを使用してＷＩＳＰ−１標的化コンストラクトを生成した。
フォワード：５’
-GATCCGATATGTGCCCAGCAGCTTTTCAAGAGAAAGCTGCTGGGCACATATCTTTTTTGCTAGCG-3’  （配列番号１２）、及び
リバース：５”
-AATTCGCTAGCAAAAAAGATATGTGCCCAGCAGCTTTCTCTTGAAAAGCTGCTGGGCACATATCG-3’  （配列番号１３）
対照ｓｈＲＮＡを発現するベクター、又はｓｈＲＮＡ標的化ＷＩＳＰ−１を発現するベクターを用いてC2C12細胞を一過性に形質移入した。形質移入の２４時間後、５％ＦＢＳを含む培地又は５％のＦＢＳ及び３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含む培地で培地（上記実施例に記載）を置換した。上述のアッセイ及び材料を用いて４８時間後にＷＩＳＰ−１の発現及びアルカリホスファターゼ活性を測定した。
ｓｈＲＮＡ対照コンストラクトと比較して、基礎（−ＢＭＰ−２）及びＢＭＰ−２−誘発ＷＩＳＰ−１発現（＋ＢＭＰ−２）は、ＷＩＳＰ−１標的化ｓｈＲＮＡコンストラクトの形質移入により大きく低減した（図１０Ａ）。ＷＩＳＰ−１のノックダウンが不十分であったために、基礎アルカリホスファターゼ活性（−ＢＭＰ−２）は低減しなかったが、ＢＭＰ−２誘発性アルカリホスファターゼ活性（＋ＢＭＰ−２；図１０Ｂ）は大きく緩和された。ＷＩＳＰ−１  ｓｈＲＮＡによるＢＭＰ−２誘発性骨芽細胞分化の抑制は、ＷＩＳＰ−１が前駆細胞の骨芽細胞分化を促進することにより骨形成に参画していることを示唆するものである。
【０１５３】
材料の寄託
次の材料をアメリカ培養細胞系統保存機関, １０８０１  ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア２０１１０−２２０９米国(ＡＴＣＣ)へ寄託した：
表７
材料                  ATCC寄託番号            寄託日
３Ｄ１１．Ｄ７          ＰＴＡ−４６２４              ２００２年９月４日
１１Ｃ２．Ｃ１０        ＰＴＡ−４６２８              ２００２年９月４日
９Ｃ１０．Ｆ５          ＰＴＡ−４６２６              ２００２年９月４日
５Ｄ４．Ｆ６            ＰＴＡ−４６２５              ２００２年９月４日
９Ｃ１１．Ｃ７          ＰＴＡ−４６２７              ２００２年９月４日
【０１５４】
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存培養物が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、関連する米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は損傷した場合、通知時に材料を同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。本発明の範囲は、本明細書に記載の実施例に限定されない。実際には、上記及び本明細書の記載内容に加えて本発明に様々な変更が可能であることは、本明細書より当業者に明らかであり、それら変更は請求の範囲に記載の本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１Ａ−Ｅ】マウス発達段階におけるＷＩＳＰ−１発現のインサイツハイブリダイゼーション分析。左のパネルは暗視野画像を、右のパネルは対応する明視野画像を示す。（Ａ）Ｅ１２．５は中咽頭（*）の頭蓋背部の基部である。Ｅ１５．５では、軟骨内骨化（Ｂ−椎骨；Ｃ−肋骨）及び膜内骨化（Ｄ−上顎骨の口蓋棚内の骨化）が進行中の骨に隣接する骨芽細胞と間葉（間充織）細胞にＷＩＳＰ−１が発現している。ＷＩＳＰ−１の発現はヒト胚下肢に同様に分布していた（Ｅ−頸骨の頭部の外側縁）。元の拡大率：×１００（Ａ）；×４０（Ｂ）；×２００（Ｃ）；×１００（Ｄ）；×２００（Ｅ）。
【図２Ａ−Ｄ】ラット胚Ｅ１８におけるＷＩＳＰ−１の免疫蛍光の局在性。分化する骨芽細胞が頭蓋冠（Ａ）、大腿骨（Ｂ）、及び肋骨（Ｃ、Ｄ）に並んでいる。Ｓ−頭蓋；Ｐ−骨膜；Ｃ−軟骨原基。元の拡大率：×１００（Ａ）；×２００（Ｂ）；×２００（Ｃ）；×４００（Ｄ）。
【図３Ａ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。様々な細胞種類におけるＷＩＳＰ−１の発現を示す。
【図３Ｂ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。アスコルビン酸処理後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるＷＩＳＰ−１の発現を示す。
【図３Ｃ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。アスコルビン酸処理後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるオステオカルシンの発現を示す。
【図３Ｄ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。アスコルビン酸処理後のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞におけるアルカリホスファターゼの活性を示す。
【図３Ｅ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。ＭＢＰ−２処理後のＳＴ２細胞におけるＷＩＳＰ−１の発現を示す。
【図３Ｆ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。ＭＢＰ−２処理後のＳＴ２細胞におけるオステオカルシンの発現を示す。
【図３Ｇ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。ＭＢＰ−２処理後のＳＴ２細胞におけるアルカリホスファターゼの活性を示す。
【図３Ｈ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。ＭＢＰ−２処理後のＣ２Ｃ１２細胞におけるＷＩＳＰ−１の発現を示す。
【図３Ｉ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。ＭＢＰ−２処理後のＣ２Ｃ１２細胞におけるオステオカルシンの発現を示す。
【図３Ｊ】分化する骨芽細胞におけるＷＩＳＰ−１の誘発。ＭＢＰ−２処理後のＣ２Ｃ１２細胞におけるアルカリホスファターゼの活性を示す。
【図４Ａ−Ｆ】マウス胚におけるインサイツＷＩＳＰ−１結合分析。Ｅ１４において、ＷＩＳＰ−１の結合は、肋骨（Ａ）及び椎骨（Ｂ）の凝縮間葉細胞に関連して強い蛍光シグナルを示した。Ｅ１７では、ＷＩＳＰ−１は、発達中の骨の骨芽細胞及び軟骨膜間充織；肋骨の軟骨原基を取り囲む間充織（Ｃ）、頭蓋冠（Ｄ）、橈骨の遠端部の軟骨原基を取り囲む間充織（Ｅ、Ｆ）に結合した。Ｐ−軟骨膜；Ｃ−軟骨原基；Ｓ−頭蓋。元の拡大率：×２００（Ａ）；×４０（Ｂ）；×１００（Ｃ）；×２００（Ｄ）；×２００（Ｅ）；×４００（Ｆ）。
【図５Ａ−Ｂ】分化した軟骨細胞に対するＷＩＳＰ−１の結合。脱分化したブタの初生軟骨細胞に対するＷＩＳＰ−１の結合により、接着班のパッチ及び点に関連して不規則なパターンが示された（Ａ）。隣接する細胞との接点において強い染色が見られた（Ｂ）。元の拡大率：×２００。
【図６Ａ】ＷＩＳＰ−１によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨形成分化の抑制。ＡＴＤＣ５／対照、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ及びＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞株によるＷＩＳＰ−１生産のウェスタンブロット分析を示す。
【図６Ｂ】ＷＩＳＰ−１によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨形成分化の抑制。成長して集密状態となったＡＴＤＣ５細胞株の飽和密度を示す。
【図６Ｃ】ＷＩＳＰ−１によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨形成分化の抑制。成長して集密状態となったＡＴＤＣ５細胞株の顕微鏡写真を示す。
【図６Ｄ】ＷＩＳＰ−１によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨形成分化の抑制。ＡＴＤＣ５（白四角）、ＡＴＤＣ５／対照（黒四角）、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ（白丸）及びＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞(黒丸)の増殖を示す。
【図６Ｅ】ＷＩＳＰ−１によるＡＴＤＣ５細胞の軟骨形成分化の抑制。軟骨細胞の分化を誘発する前（黒い棒）及びＢＭＰ−２（グレイの棒）又はＧＤＦ−５（白の棒）によって分化が誘発された後の、ＡＴＤＣ５／対照、ＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｌ及びＡＴＤＣ５／ＷＩＳＰ−１Ｈ細胞におけるコラーゲン２の相対的発現を示す。
【図７Ａ−Ｆ】骨折修復の間のＷＩＳＰ−１発現のインサイツハイブリダイゼーション分析。左のパネルは明視野画像を、右のパネルは対応する暗視野画像を示す。顕微鏡写真は、骨折後３日目（Ａ）、５日目（Ｂ）、７日目（Ｃ）、１４日目（Ｄ）、２１日目（Ｅ）及び２８日目（Ｆ）のＷＩＳＰ−１の発現の局所性を示している。各画像（拡大率×２００）は、延髄腔が右上に位置するような方向を向いており；皮質（*）及び骨折カルス（矢頭）が顕微鏡写真の大部分を占めている。
【図８Ａ】ヒトＷＩＳＰ−１のコード化ＤＮＡ（配列番号２）及びアミノ酸（配列番号１）配列を示す。
【図８Ｂ】ヒトＷＩＳＰ−１のコード化ＤＮＡ（配列番号２）及びアミノ酸（配列番号１）配列を示す。
【図８Ｃ】ヒトＷＩＳＰ−１のコード化ＤＮＡ（配列番号２）及びアミノ酸（配列番号１）配列を示す。
【図９Ａ−Ｂ】ＷＩＳＰ−１によるＢＭＰ−２誘発性骨芽細胞分化の促進。空のベクター（黒い棒）又はＷＩＳＰ−１発現コンストラクト（グレーの棒）を用いてＣ２Ｃ１２細胞を一過性に形質移入した。形質移入の４８時間後、５％のＦＢＳを含む培地（Ａ）又は５％のＦＢＳと３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含む培地（Ｂ）で培養培地を置換し、図示の時間にアルカリホスファターゼの活性を測定した。
【図１０Ａ−Ｂ】ＷＩＳＰ−１のノックダウンによる骨芽細胞の分化抑制。対照ｓｈＲＮＡを発現するベクター又はｓｈＲＮＡ標的化ＷＩＳＰ−１を発現するベクターを用いてＣ２Ｃ１２細胞を一過性に形質移入した。形質移入の２４時間後、５％のＦＢＳを含む培地又は５％のＦＢＳと３００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を含む培地で培養培地を置換し、４８時間後にＷＩＳＰ−１の発現（Ａ）とアルカリホスファターゼの活性（Ｂ）を測定した。
【図１Ａ−Ｅ】
2007505131.tif 000003
【図２Ａ−Ｄ】
2007505131.tif 000004
【図３Ａ】
2007505131.tif 000005
【図３Ｂ】
2007505131.tif 000006
【図３Ｃ】
2007505131.tif 000007
【図３Ｄ】
2007505131.tif 000008
【図３Ｅ】
2007505131.tif 000009
【図３Ｆ】
2007505131.tif 000010
【図３Ｇ】
2007505131.tif 000011
【図３Ｈ】
2007505131.tif 000012
【図３Ｉ】
2007505131.tif 000013
【図３Ｊ】
2007505131.tif 000014
【図４Ａ−Ｆ】
2007505131.tif 000015
【図５Ａ−Ｂ】
2007505131.tif 000016
【図６Ａ】
2007505131.tif 000017
【図６Ｂ】
2007505131.tif 000018
【図６Ｃ】
2007505131.tif 000019
【図６Ｄ】
2007505131.tif 000020
【図６Ｅ】
2007505131.tif 000021
【図７Ａ−Ｆ】
2007505131.tif 000022
【図８Ａ】
2007505131.tif 000023
【図８Ｂ】
2007505131.tif 000024
【図８Ｃ】
2007505131.tif 000025
【図９Ａ−Ｂ】
2007505131.tif 000026
【図１０Ａ−Ｂ】
2007505131.tif 000027
【国際調査報告】
2007505131.tif 000028
2007505131.tif 000029
2007505131.tif 000030
2007505131.tif 000031