(57)【要約】  増幅反応混合物の特異性および感受性を増強するための方法および組成物を提供する。本発明に係る組成物は、増幅反応中のプライマー凝集体形成の減少を提供する。反応ミックスはdNTPを含むが、このdNTPの一部が非通常のヌクレオチド、例えばdUTPに置換されている。非通常のヌクレオチドの濃度は、典型的には、標準的dNTPのうち1種類の濃度の10%〜50%である。幾つかの組成物においてこの非通常のヌクレオチドは、dNTPミックス中のdTTPの約10%〜約50%を置換しているdUTPである。
2007520237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プライマーに基づく標的核酸配列の増幅のための反応混合物であって、通常のヌクレオチドのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPと、dTTPの一部を置き換えたdUTPとの組み合わせを含み、ここで当該dUTPの包含が、通常のヌクレオチドのみを使用する増幅反応に比較して、増幅反応中のプライマー凝集体の形成を減少させる、反応混合物。
【請求項２】
dUTPが上記反応混合物中のdTTPの約1〜約75%を置換している、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項３】
dUTPが上記反応混合物中のdTTPの約10〜約50%を置換している、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項４】
少なくとも1種類のさらなる非通常のヌクレオチドを含み、ここで上記dUTPおよび少なくとも1種類の非通常のヌクレオチドの合計濃度が、反応混合物中のいずれか1種類の通常のヌクレオチドの75%を超えない、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項５】
プライマー対の各成員が、少なくとも1またはそれ以上のウラシル塩基をその中に組み込んでいる、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項６】
プライマー対の各成員が、そのチミジン塩基の全てをウラシル塩基に置き換えている、請求項5に記載の反応混合物。
【請求項７】
dUTPが約300μMの最終増幅反応濃度を超えない、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項８】
dUTPが約100μMの最終増幅反応濃度を超えない、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項９】
少なくとも1種類のポリメラーゼ酵素をさらに含む、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項１０】
緩衝系をさらに含む、請求項1に記載の反応混合物。
【請求項１１】
標的核酸の増幅中にプライマー凝集を減少させる方法であって、当該方法が、標的核酸を請求項1〜10のいずれか1項に記載の反応混合物と混ぜ合わせる工程；及び通常のヌクレオチドのみを含むdNTPミックスを用いて標的核酸を増幅させた場合と比較して、増幅反応中に形成されるプライマー凝集体のレベルが低下するようにこの標的核酸を増幅する工程を含んで成る、方法。
【請求項１２】
標的核酸配列を増幅する方法であって、当該方法が、試料を請求項1〜10のいずれか1項に記載の反応混合物と混ぜ合わせる工程；及び通常のヌクレオチドのみを含むdNTPミックスを用いて標的核酸を増幅させた場合と比較して、増幅反応中に形成されるプライマー凝集体のレベルが低下するようにこの標的核酸を増幅する工程、を含んで成り、ここで当該方法が、UNGを使用する酵素分解工程を欠失する、方法。
【請求項１３】
反応混合物がソルビトールまたはマンニトールをさらに含む、請求項11または12に記載の方法。
【請求項１４】
標的核酸が二次構造を有する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸の核酸増幅反応中にプライマー凝集体の形成を制限するための組成物であって、当該組成物が、
増幅させようとする標的核酸にとって適当なプライマー対であって、このプライマー対の各成員は1またはそれ以上のウラシル塩基をその中に組み込んでいる、プライマー対；および、
dNTPミックス中に、100〜400μMの通常のヌクレオチドのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTPを含む増幅反応混合物；
を含んで成り、
ここで、ウラシル含有プライマーを使用する核酸の増幅が、各プライマーが標準的塩基のヌクレオチドのみを有している同一プライマー対を利用する増幅反応と比較して、増幅反応中に形成されるプライマー凝集体のレベルの低下をもたらす、
組成物。
【請求項１６】
各プライマーがチミジン塩基の代わりにウラシル塩基のみを展示する、請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
dNTPミックスが4種の通常のヌクレオチドおよびdUTPを含む、請求項15に記載の組成物。
【請求項１８】
dUTPが、dNTPミックス中の約10%〜50%のdTTPを置換している、請求項17に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、2004年2月4日出願の、「増幅効率およびシグナルを増強する方法ならびに組成物」なる表題の米国仮特許出願第60/541999号(これは引用により本明細書の一部とする)に対する優先権を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は一般に、核酸増幅反応の特異性と感受性を増大させるための方法および組成物に関するものであり、より詳細には、増幅反応に関係するプライマーが互いに非特異的にアニーリングしてプライマー凝集体を形成する傾向を低下させるための方法および組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
大量の核酸分子を製造する能力は、分子生物学における幾つかのプロトコルに必要不可欠であると同時にバイオテクノロジーおよび臨床研究における数多くの下流用途の基本的要件である。例えば、増幅された核酸分子はしばしば、クローニング実験、DNA配列決定反応、制限消化反応、およびその後のライゲーション反応に使用され、これらの使用は全て、または或る程度、出発DNA材料の質および量に依存する。したがって、大量の質および配列特異的核酸分子を製造するための信頼できる方法に対する必要性が依然として存在する。
【０００４】
さらに、混合出発物質から核酸分子を検出しそして/または定量する能力は、幾つかの臨床的、工業的および基礎的な研究への適用において有用である。例えば、患者試料中のウイルス核酸配列の鋭敏且つ正確な検出と定量は、正確な診断とそれに続く患者の処置を目指す臨床状況に役立つ。このような検出および定量プロセスは、一般に出発物質中に存在する1またはそれ以上の標的核酸分子の増幅を必要とする。したがって、出発物質に由来する標的核酸配列の検出と定量を容易にする必要(さらに、大量の質および配列特異的核酸分子を製造するための信頼できる方法を必要とする)が依然として存在する。
【０００５】
核酸を増幅するための優れたアプローチは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるものである。PCRは鋳型核酸の指数関数的増加に役立つ簡便なインビトロ増幅プロセスである。成功的なPCR反応の、より重要な面の一つは、標的の鋳型配列とハイブリダイズする特異的プライマーを必要とするプライマー設計である。しかしながら、プライマーが相補的標的に特異的にアニーリングするのは、比較的狭い範囲の反応条件(温度、イオン濃度、変性剤、など)である。さらに、最適なプライマーを選択したとしても、非特異的増幅および/またはプライマー凝集のため、多くのPCR反応は生成物を殆どまたは全く産み出さない。
【０００６】
プライマー凝集は、典型的にはPCR反応において或るプライマーが別のプライマーから伸張する、即ち或るプライマーが別のプライマーの鋳型として作用することが原因で起こり、このプロセスはたとえ安定なプライマーのアニーリングが達成されないとしても起こる。典型的には、プライマーがPCR反応内に凝集体を形成し始めるにつれて、その凝集体は、有効なPCR増幅の妥当な鋳型となる。何故ならこのプライマー凝集体は両方のプライマーアニーリング部位を含んでいるためである。このように、各々のプライマー-凝集体がさらなるラウンドの非特異的増幅の鋳型として作用するため、プライマー凝集体はPCR反応に持続的且つ有害な影響を及ぼす。プライマー凝集の生成は、増幅反応の際、低温、即ち熱循環前における大きな問題であることから、プライマー凝集は典型的には「ホットスタート」技術を用いて対処されてきた。しかしながら、「ホットスタート」法はプライマー凝集を少なくするアプローチにおいて一部成功しているに過ぎないため、この問題の解決のためのさらなる技術が必要とされている。加えて、非特異的増幅が少し増加しただけでも、PCRまたはその他類似の核酸増幅反応の感受性と特異性に著しい損失がもたらされ得る。
【０００７】
したがって、当技術分野において、核酸増幅反応、特にPCR中のプライマー凝集を低下させる、PCR技術および組成物の改善の継続的な必要性が存在する。
【０００８】
関連文献の要約
過去10〜15年間にわたり、汚染を減少させる一般法として増幅反応にヌクレオチドデオキシウリジン三リン酸(dUTP)がウラシルDNAグリコシラーゼ(UDGまたはUNG)と併せて使用されている(ここでdUTPは慣習的には増幅反応混合物中のチミジン三リン酸(TTP)に代わるものである)。米国特許第5418149号は、ウラシルの組み込まれた過去に生成されたアンプリコンを、一般に、新たな標的配列、即ちウラシルを含まない鋳型配列と識別することにより、PCR中の汚染アンプリコンを不活性化する、dUTPの用途を開示している。ウラシル含有DNAをウラシルDNAグリコシラーゼ(UDGまたはUNG)で処理してウラシルを除去し、糖-ホスホジエステルバックボーンを無傷のままとする、即ちUDG処理されたバックボーンが脱塩基部位を有するようにする。これらの脱塩基部位は、熱またはアルカリによる加水分解を受け易く、それによってウラシル含有DNAを断片化し、後の増幅反応の際にそれが増幅不能となるようにする。高温またはアルカリもまたUDGの不活性化を招く。この適用には大過剰のdUTP、典型的には慣習的dNTPに対して通常使用する濃度より充分高い濃度のdUTPを添加する必要がある。
【０００９】
この「クリーンアップ」法の変法が、鎖置換増幅反応(SDA)中のアンプリコンのクリーンアップまたは不活性化についての米国特許第5536649号(‘649)に記載されている。SDAを用いた増幅反応によって生成したアンプリコン内にdUTPを組み込む。ウラシルヌクレオチドが組み込まれたアンプリコンをUDGで処理し、このUDGを、UDGインヒビタータンパク質Ugiの包含によって不活性化する。このSDA増幅効率の増大には高濃度、即ち0.5mM〜4mMのdUTPが必要であることに留意されたい。dUTPはまた、米国特許第6413718号に記載のように、配列決定されたDNAを標的化する方法にも使用されている。上記の増幅反応と同様、dUTPを配列決定された生成物中に組み込み、次いで反応終了時に分解して汚染の問題を排除する。
【００１０】
それ故一般に当分野において、dUTPの組み込みを、ウラシル含有アンプリコンを分解するため、UNGまたは他の類似酵素を使用する酵素的分解工程と一律に組み合わせる。さらに、このdUTPは、典型的には、通常残りの3種の通常のヌクレオチドのうち任意の1種類を充分上回る濃度で、反応混合物中の天然ヌクレオチド三リン酸の一つと完全に置き換える。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約
本発明は、核酸増幅反応の感受性と特異性を改善するための組成物および方法を提供するものであり、この増幅反応は、典型的には変性工程、アニーリング工程、および伸張工程というサイクルを少なくとも一つ含む。本発明に係る組成物および方法は、4種の通常のヌクレオチド全てを含む反応混合物において、デオキシチミジン三リン酸(dTTP)の一部をデオキシウリジン三リン酸(dUTP)に置換するものである。本発明において初めて立証するように、dTTPの一部分のみをdUTPに置換することにより、増幅反応全体にわたってプライマー凝集が減少し、故に非特異的増幅が減少する。加えて、他の非通常的なヌクレオチド、例えばdITPを反応混合物中のdUTPに含め、他の通常のヌクレオチドの一部を置換することができる。
【００１２】
或る観点において、核酸増幅反応においてプライマー凝集体の形成を阻害する方法および組成物を提供し、これはdTTP、dATP、dCPTおよびdGTPの各々を含む増幅反応混合物にdUTPを添加することを含む。好ましい態様では、標準的dNTPミックス中のdTTPの少なくとも10%から最大75%をdUTPで置き換え、次いでこの修飾されたdNTP混合物を増幅反応に使用する。この態様に従う組成物は、5、10、25、40、50、60、70または75%のdTTPがdUTPに置換されたdNTP混合物を包含する。典型的には、各々の反応は標準的dNTPミックス中に約20μM〜約300μMのdUTPを含み、ここで、dUTP濃度は好ましくは最初の任意の1つの通常のヌクレオチド濃度の75%を超えず、dUTPおよびdTTPの合計濃度は他のdNTPの濃度に類似している。したがって、本発明の或る態様は、例えば25%dUTP/75%dTTP、50%dUTP/50%dTTP、75%dUTP/25%dTTPおよび他の4種の各通常のヌクレオチド100%を含み得る。非通常のヌクレオチドの上限75%をここでも超えない限り、他の非通常のヌクレオチドをdUTPと合してdUTPを基礎とするフラクションが作製できることにも留意されたい。本明細書において立証するように、この濃度を超過する量は反応収率に悪影響を及ぼす。
【００１３】
別の観点において、核酸増幅反応中のプライマー凝集および他の非特異的増幅反応を阻害するための1またはそれ以上の塩基類似体を組み込んだプライマーを設計する。一般にこれらの塩基類似体は非通常のヌクレオチドから誘導する。好ましい態様では、この塩基類似体は、チミジン塩基に代わるウラシルである。この態様では、ウラシルはチミジンの塩基対合特異性を維持している。
【００１４】
本発明はさらに、ポリオール、不凍化タンパク質および一定比率のdUTP:dTTPを含むdNTPミックスの組み合わせを含む、核酸増幅反応で使用するための改良核酸増幅反応混合物を提供する。好ましい態様では、1またはそれ以上のこれらのエンハンサーを、両性イオン緩衝剤を含む反応混合物に添加する。本明細書に詳述するように、これらの新規な反応混合物成分は、アンプリコン収量および定量反応のシグナル強度を改善すると共に、増幅反応の感受性を高める。
【００１５】
発明の詳細な説明
本明細書で頻繁に使用する用語の理解を容易にするため、以下の定義を供するが、これらは本発明の開示の範囲を限定する意図はない。
【００１６】
本明細書中使用する「増幅反応」または「核酸増幅反応」とは、DNAポリメラーゼを使用して所望の核酸配列のコピー数を増加させるための任意のインビトロ法を指す。核酸増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(米国特許第4683195および4683202号に記載されており、これらは引用により本明細書の一部とする)、Nucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA)( 米国特許第5409818号に記載されており、引用により本明細書の一部とする)およびStrand Displacement Amplification(SDA)( 米国特許第5455166号に記載されており、これは引用により本明細書の一部とする)を包含する。当分野で周知のように、このような反応は、試料中の1またはそれ以上の標的核酸配列の存在を判定するための数多くの核酸検出法において、そして、その反応によって生成したアンプリコン(群)の量を定量するための多岐にわたる核酸定量法において、有利な用途を見いだせる。
【００１７】
本明細書中使用する「アンチセンス」とは、標的「センス」ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列を指す。
【００１８】
本明細書中使用する「担体タンパク質」とは、牛血清アルブミン(BSA)、Prionex、一本鎖結合タンパク質(SSB)、Cold Water Fish Gelatin、ゼラチン、Gro L、Gro S、DNAK、熱ショックタンパク質70(HSP70)、アポリポタンパク質、およびその他の類似血清アルブミン類を指す。
【００１９】
本明細書中使用する「Ctシフト」または「閾値サイクル」とは、増幅生成物を検出できるサイクルを指し、1.5〜3サイクルのCtシフトは、5〜10倍高い鋳型DNAの投入量に相当する。
【００２０】
本明細書中使用する「核酸」または「NA」とは、デオキシリボ核酸(DNA)およびリボ核酸(RNA)の両者、ならびにそれらが修飾されたおよび/または官能化されたものを指す。同様に、本明細書中使用する「ヌクレオチド」という語は、リボ核酸およびデオキシリボ核酸の両個別単位ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、ならびに標識化ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドを包含する。さらに、「ヌクレオチド」は非天然類似体構造、例えば糖、リン酸塩、および/または塩基単位がない、または他の化学構造に置き換わっているものを包含する。したがって、「ヌクレオチド」という語は、個々のペプチド核酸(PNA)(Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 1994;5(1):3-7)およびロックド核酸(LNA)(Braasch and Corey, Chem. Biol. 2001;8(1):1-7)単位を包含する。
【００２１】
本明細書中使用する「通常のヌクレオチド」とは、特定の核酸中に天然に存在するヌクレオチドを指し、例えばATP、TTP、CTPおよびGTPはDNA中の通常のヌクレオチドである。本発明の目的のためには、通常のヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド、例えばdATP、dTTP、dCTP、およびdGTPをも包含する。
【００２２】
本明細書中使用する「非通常のヌクレオチド」とは、特定の核酸中に天然には存在しないヌクレオチドを指す。非通常のヌクレオチドは天然に存在するヌクレオチド、例えばヒポキサンチンであってもよく、また、通常のヌクレオチドの化学修飾された誘導体もしくは類似体、例えばN-7-メチルグアニン、デオキシウリジンおよびデオキシ-3’-メチルアデノシンであってもよい。例えば、ウラシルはRNA中の天然に存在する通常のヌクレオチドであるが、DNAにおいては非通常的である。非通常のヌクレオチドはデオキシヌクレオチド、例えばdUTP、dITPなどを包含する。他の非通常のヌクレオチドはITPおよびデアザ-dGTPを包含する。
【００２３】
本明細書中使用する「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」またはこれらの文法上の等価物は、共有結合で連結した少なくとも2個のヌクレオチドを意味する。当業者には理解できるであろうが、例えばホスホロチオアートまたはメチルホスホナートといった化学修飾を包含する糖-リン酸バックボーンの様々な修飾を行って、生理環境におけるこのような分子の安定性を増大させることができる。さらに、明瞭な特性を持つ1またはそれ以上の分子と結合させることにより、例えば標識の付加を容易にする目的でこのような分子を機能化することができる。
【００２４】
本明細書中使用する「プライマー凝集体(群)」とは、増幅反応の際の、2またはそれ以上のプライマー分子間の非特異的相互作用(例えばアニーリングその他の相互作用)を指す。プライマー凝集の形成は、増幅反応中の有効なプライマー濃度の低下、ならびに反応の全体的感受性および特異性を低下させる非特異的生成物構築の増加を招く。プライマー凝集体は、プライマー二量体、プライマー三量体、ヘアピン、フィルイン、直接ハイブリッドなどを包含するがこれらに限定される訳ではない。
【００２５】
本明細書中使用する「核酸配列」とは、核酸鎖に沿ったヌクレオチドの順序または配列を指す。幾つかの場合には、これらヌクレオチドの順序が、対応するポリペプチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定し得る。核酸配列はこのようにしてアミノ酸配列をコードする。核酸配列は明記された通り一本鎖であっても二本鎖であってもよく、また、二本鎖および一本鎖配列の両部分を含んでいてもよい。核酸配列は、DNA(ゲノムおよびcDNAの両者)、RNA、またはハイブリッドで構成され、該配列は、配列がデオキシリボ-およびリボ-ヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびにウラシル(U)、アデニン(A)、チミン(T)、シトシン(C)、グアニン(G)、イノシン、キサタニンヒポキサタニン、イソシトシン、イソグアニンなどを包含する塩基の任意の組み合わせを含む。
【００２６】
本明細書中使用する「相補的」または「相補性」とは、ポリヌクレオチド分子中のヌクレオチドが第二のポリヌクレオチド分子中の別のヌクレオチドと塩基対を形成する能力を指す。例えば、配列5’-A-C-T-3’は、配列3’-T-G-A-5’と相補的である。相補性は、部分的(この場合、ヌクレオチドの幾つかのみが塩基対合に従って適合する)である場合も、完全(この場合、全ヌクレオチドが塩基対合に従って適合する)である場合もある。本発明の目的のためには、「実質上相補的」とは、標的塩基対領域の長さ全体で95%またはそれ以上の一致を指す。
【００２７】
本明細書中使用する、本発明の目的のために「単離された」および「精製された」は、互換的であり、細胞残屑から分離されたポリヌクレオチド、例えば標的核酸配列、例えば高分子量DNA、RNAおよびタンパク質を指す。これは、DNAを包含する、細胞残屑から分離される、単離されたRNA試料を包含する。
【００２８】
本明細書中使用する「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は互換的に使用し、アミノ酸ポリマーまたは2もしくはそれ以上の相互作用するまたは結合したアミノ酸ポリマーの組を意味する。
【００２９】
本明細書中使用する「リアルタイムPCR」とは、典型的には蛍光プローブ、ビーコン、および/または挿入色素をプロセスの全サイクルで使用する、定量的PCR技術を指す。
【００３０】
本明細書中使用する「ストリンジェンシー」とは、ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションが起こる条件、即ち、温度、イオン強度、溶媒などを指す。ハイブリダイゼーションは、増幅プロセスのアニーリング工程中にプライマーと鋳型DNAの間で起こるプロセスである。
【００３１】
本発明の態様は、核酸増幅反応、即ちプライマーを基礎とする核酸増幅の際のプライマー凝集を減少させるための方法および組成物を提供する。プライマー凝集の減少は、プライマーを基礎とする増幅反応をより鋭敏且つ特異的にするという二重の効果を有し、高い生成物収量をもたらすことができる。本発明の態様は少なくとも以下の事柄を包含する：
【００３２】
プライマーを基礎とする増幅反応において慣習的dNTPミックス中のdTTPの一部をdUTPに置き換えること。態様は、増幅反応中のプライマー凝集体の形成を減少させる。
【００３３】
プライマーを基礎とする増幅反応において慣習的dNTPミックス中のdTTPの一部を、dUTPおよび少なくとももう1種類の非通常のヌクレオチド、例えばdITPまたはデアザ-dGTPの組み合わせに置き換えること。アンプリコン内へのITP、またはその他の非dUTP様非慣習的塩基の組み込みが、生成物に高率の突然変異を惹起し得ることを考えると、この態様は、アンプリコン内への突然変異の導入が重要な問題でない場合に最も有用である、即ち、生成物の使用または配列決定ではなく生成物の検出に的を絞った増幅反応が、この態様には最も好ましいという事に留意されたい。
【００３４】
増幅反応の際のプライマー凝集体の形成可能性を低下させるため、プライマーの全長にわたり1またはそれ以上のウラシルを組み込んだプライマーの設計を提供する。
【００３５】
両性イオン緩衝製剤、即ちTAPs-trisKCLまたはTAPS-KOH KCL中にdUTP、ソルビトール、またはその他のポリオール、およびAFPを含有させると、特にpHが7.9〜8.1の間である場合に高性能増幅反応ミックス(感受性、特異性、シグナルサイズおよび保存安定性が増す)が提供される。
【００３６】
核酸増幅
或る態様では、本発明は、核酸分子を増幅反応混合物中で増幅反応に付すことを含む、核酸分子を増幅する方法を提供する。この増幅反応混合物は、標準dNTPミックスのdTTPの最大75%をdUTPに置き換えてある。好ましい態様では、dTTPをdUTPに置き換えるが、本発明の範囲は、dUTPの幾らかを他の非通常のヌクレオチドに置き換えることを包含するという事を理解すべきである。典型的には、反応混合物中の、dUTPまたはその他類似の非通常のヌクレオチドの最終濃度は、標準的dNTP濃度が約200μM〜400μMである場合、約20μM〜約300μM、好ましくは20μM〜160μMの間である。典型的には、dTTPに対するdUTPのパーセントは約10%〜約75%、即ちdTTPの約10%〜75%をdUTPに置き換えることができる。
【００３７】
別の態様では、1またはそれ以上の対応チミジン塩基に代わって1またはそれ以上のウラシル塩基を有する、増幅反応に有用で標的核酸にとって適当なプライマーを設計する。このウラシル塩基は、プライマー配列全体で、チミジン塩基の位置するどの場所にあってもよい。DNA分子内での塩基対合に対する特異性のために、ウラシルが好ましい代替塩基であることに留意されたい。
【００３８】
核酸分子は文献記載の手動または自動化増幅法のいずれかに従って増幅できる。核酸増幅は、ヌクレオチドをDNA分子またはプライマー中に組み込み、それにより核酸鋳型に相補的な新しいDNA分子を形成する。形成されたDNA分子およびその鋳型を、さらなるDNA分子を合成するための鋳型として使用することができる。本明細書中使用する一つの増幅反応は、多数回のDNA複製で構成されていてもよい。DNA増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を包含する。一つのPCR反応は10〜100「サイクル」のDNA分子の変性および合成で構成され得る。このような方法は、PCR(米国特許第4683195および4683202号に記載されており、これらは引用により本明細書の一部とする)、Strand Displacement Amplification(SDA)( 米国特許第5455166号に記載されており、引用により本明細書の一部とする)、およびNucleic Acid Sequence-Based Amplification(NASBA)(米国特許第5409818号に記載されており、引用により本明細書の一部とする)を包含するがこれらに限定される訳ではない。例えば、非加熱DNA融解における効率を高めるためにヘリカーゼを使用できるローリングサークル複製系によって増幅が達成することができる(Yuzhakou et al., “Replisome Assembly Reveals the Basis for Asymmetric Function in Leading and Lagging Strand Replication,” Cell 86:877-886(1996)およびMok et al., “The Escherichia coli Preprimosome and DnaB Helicase Can Form Replication Forks That Move at the Same Rate,” J. Biol. Chem. 262:16558-16565(1987)。これらは引用により本明細書の一部とする)。最も好ましくは、核酸分子をPCR増幅技術を用いて本発明方法により増幅する。
【００３９】
好ましい態様では、増幅反応は高温変性工程を含む。高温変性工程にとって好ましい温度は約90℃〜約98℃の範囲であり、93℃〜94℃の温度が特に好ましい。このような好ましい増幅反応は、熱循環増幅反応、例えば約10〜100サイクル、より好ましくは約25〜50サイクル、および約93℃〜約94℃のピーク温度を含むポリメラーゼ連鎖反応を包含する。
【００４０】
好ましい態様では、(a) それらとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが合成できるほど充分詳細に、必要な配列の末端が分かっており、そして(b) この連鎖反応を開始するための配列が少量入手できる。連鎖反応の生成物は、使用された特定プライマーの末端に対応する末端を有する個別的核酸二本鎖となる。
【００４１】
所望の特定核酸配列を含んでいる限り、精製または非精製型の、任意の核酸供給源を出発核酸として利用できる。したがってこのプロセスは、例えばDNAまたはRNA(メッセンジャーRNAを包含する)を利用でき、そのDNAまたはRNAは一本鎖でも二本鎖でもよい。さらに、各々1本ずつの鎖を含むDNA-RNAハイブリッドを利用することもできる。これらの任意の核酸の混合物もまた利用でき、また、同じまたは異なるプライマーを使用して本明細書に記載の前記増幅反応から生成した核酸もまた同様に利用できる。増幅させる核酸は好ましくはDNAである。増幅させようとする特定核酸配列は、大分子の一部であってよく、または、最初個別分子として存在し、その特定配列が核酸全体を構成していることもある。増幅させようとする配列が最初純粋な形態で存在している必要はなく、複雑な混合物の小部分、例えばヒトの全DNAに含まれているβ-グロビン遺伝子の一部、または、特別な生体試料の微量部分のみを構成する、特別な微生物に起因する核酸配列の一部であってもよい。出発核酸は、同じまたは異なっている1以上の所望特定核酸配列を含んでいることがある。故に、この方法は、一つの特定核酸配列を大量に生産するためのみならず、同じまたは異なる核酸分子上に位置する1以上の異なる特定核酸配列を同時に増幅するために有用である。
【００４２】
核酸または核酸群は任意の供給源から取得でき、プラスミドおよびクローニングされたDNAまたはRNA、ならびに細菌、酵母、ウイルス、および植物または動物といった高等生物を包含する任意の供給源由来のDNAまたはRNAを包含する。DNAまたはRNAは、血液、組織材料、例えば絨毛膜絨毛または羊膜細胞から、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,(New York: Cold Spring Harbor Laboratory) pp 280-281(1982)に記載のような種々の技術によって抽出できる。
【００４３】
本発明によって、任意の特定核酸配列を製造することができる。当該配列の両端にある充分な数の塩基が充分詳細に分かっている事のみが必要とされる。その結果、1個のプライマーから合成された伸張生成物が、その鋳型(相補物)から分離した時に他方のプライマーの伸張用鋳型として働き、所定の長さの核酸を生成するように、所望配列中の相対位置で該配列の異なる鎖にハイブリダイズする2個のオリゴヌクレオチドプライマーを製造することができる。該配列の両端の塩基についての知識が多いほど、標的核酸配列のためのプライマーの特異性が高くなり、したがってこのプロセスの効率も高くなる。本明細書中、以降で使用する稼働プライマーは、特に、増幅しようとするフラグメントの末端配列の構成に関して生成に何らかの曖昧さがある場合には、1以上のプライマーを指し得る。例えば、核酸配列がタンパク質配列情報から推測される場合、遺伝コードの縮重に基づくコドン変動の全可能性を表す配列を含むプライマーの収集物を各鎖に使用できる。この収集物由来の一つのプライマーは、増幅させようとする所望配列の末端と相同的である。
【００４４】
オリゴヌクレオチドプライマーは任意の適当な方法、例えばホスホトリエステルおよびホスホジエステル法またはそれらの自動化態様を用いて製造できる。係る自動化態様の一つにおいては、ジエチロホスホロアミダイトを出発物質として使用し、Beaucage et al., Tetrahedron Letters, 22:1859-1862(1981)(これは引用により本明細書の一部とする)に記載のように合成できる。修飾固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する一つの方法が、米国特許第4458006号に記載されており、これを引用により本明細書の一部とする。生物学的供給源から単離したプライマーを使用することも可能である(例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物)。
【００４５】
上に記載のように、或る態様では、チミジン塩基の代わりにウラシル塩基を組み込んでオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ウラシルの添加はプライマー-鋳型相互作用の融解温度を下げ、それにより、プライマーが相互作用してプライマー凝集物を形成する可能性を低下させる。
【００４６】
特定の核酸配列を、その配列を鋳型として含む核酸を用いて製造する。当該核酸が2本の鎖を含む場合、鋳型として使用する前にその核酸の鎖を、別工程で、またはプライマー伸張生成物の合成と同時に、分離する必要がある。この鎖分離は、物理的、化学的、または酵素的手段を包含する任意の適当な変性法によって達成できる。核酸の鎖を分離する一つの物理的方法は、核酸を完全に(>99%)変性するまで加熱することを含む。典型的な熱変性は、約80℃〜105℃の温度と1〜10分間の時間を含み得る。鎖分離は、ヘリカーゼまたは酵素RecA(これはヘリカーゼ活性を持ち、DNAを変性させることが知られている)として知られる種類の酵素由来の酵素によっても誘導できる。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するために好適な反応条件は、Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol.XLIII“DNA: Replication and Recombination” (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978) に記載されており、RecAを使用する技術はC. Radding, Ann, Rev. Genetics, 16:405-37(1982)に概説されており、これを引用により本明細書の一部とする。
【００４７】
増幅させようとする配列を含む元の核酸が一本鎖である場合、1または2個のオリゴヌクレオチドプライマーをここに加えることにより、その相補物を合成する。適当な単一プライマーを加えると、該プライマー、ポリメライゼーションのための物質、および下記の4種のヌクレオチドの存在下でプライマー伸張生成物が合成される。この生成物は当該一本鎖核酸に対し部分的に相補的であり、当該核酸鎖とハイブリダイズして等しくない長さの鎖を持つ二本鎖が形成され、その後これを上記のように一本鎖に分離して2本の分離された相補的一本鎖を作製する。或いは、2個の適当なプライマーを一本鎖核酸に加え、反応を実施する。
【００４８】
元の核酸が増幅させようとする配列を構成している場合、生成されるプライマー伸張生成物は、元の核酸鎖に対し完全に相補的であり、これとハイブリダイズして、一本鎖分子に分離されるべき等長の鎖から成る二本鎖を形成する。
【００４９】
核酸または核酸群の相補鎖が分離されると、その核酸が元々二本鎖であるか一本鎖であるかに拘わらず、その鎖をさらなる核酸鎖の合成のための鋳型として直ちに使用できる。この合成は任意の適当な方法を用いて実施できる。好ましくは、モル過剰(クローニングされた核酸については、通常約1000：1のプライマー：鋳型であり、ゲノム核酸については通常約106：1のプライマー：鋳型)の2個のオリゴヌクレオチドプライマーを、分離した鋳型鎖を含む緩衝液に添加する。ところが本発明に係るプロセスを診断適用に用いる場合、相補鎖の量は未知であるかも知れず、その結果、相補鎖の量に対するプライマーの量を確実に決定できない事は明らかである。しかし実際問題として、増幅しようとする配列が複雑な長鎖核酸鎖の混合物に含まれている場合、添加されたプライマー量は一般に相補鎖(鋳型)の量のモル過剰であろう。該プロセスの効率を改善するためにはモル大過剰が好ましい。
【００５０】
通常のヌクレオチド、好ましくはdATP、dCTP、およびdGTPの、適当量、即ちおよそ200μM/dNTP〜約400μM/dNTPの量を反応混合物に添加する。上に記載したように、好ましい態様では、通常のヌクレオチドdTTPの一部を非通常のヌクレオチドdUTPに置き換える。dUTPによって置き換えられるdTTPのパーセントは最大75%である。好ましい態様は、dUTPがその組成物の20%〜40%を構成するdUTP/dTTP混合物を提供することに留意されたい。dNTPのdTTP部分の75%を超えるdUTP量は、本発明により実現される顕著な性能の向上を付加しなかった事に留意されたい。事実、これら大量のdUTPはこれらの有益な結果に有害な影響、即ち生成物形成の全体的減少をもたらしうる。得られた溶液dATP、dCTP、dGTP、dUTP/dTTPを好ましくは約90℃〜95℃に約1〜10分間、好ましくは15秒間〜2分間加熱する。この加熱時間の後、溶液をプライマーハイブリダイゼーションにとって好ましい約60℃まで冷却する。するとポリメラーゼは、室温より充分高い温度、好ましくは約60〜75℃で核酸合成を行う。前述のように、他の通常のヌクレオチド/非通常のヌクレオチドの組み合わせを本発明に従って使用することもできる。
【００５１】
新たに合成された鎖およびその相補核酸鎖は二本鎖分子を形成し、これが本プロセスの次の工程に使用される。次の工程では、この二本鎖分子の鎖を上記の方法のいずれかを用いて分離し、一本鎖分子を得る。
【００５２】
一本鎖分子上で新たな核酸が合成される。上に指示した条件下で反応を進行させるために必要ならば、さらなるポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびプライマーを加えてもよい。ここでもまた、この合成をオリゴヌクレオチドプライマーの一端から開始して、鋳型の一本鎖に沿って進め、さらなる核酸を製造する。
【００５３】
鎖分離および伸張生成物合成の工程を必要なだけ反復して、所望量の特定核酸配列を製造することができる。生成した特定核酸配列の量は指数関数的に増加する。
【００５４】
第一の核酸または核酸混合物から1以上の特定核酸配列を製造したい時には、適当な数の異なるオリゴヌクレオチドプライマーを利用する。例えば、2種類の異なる特定核酸配列を製造しようとする場合、4個のプライマーを利用する。このプライマーのうち2個は、その特定核酸配列の一つに対して特異的であり、他の2個のプライマーは第二の特定核酸配列に対して特異的である。このようにして、2個の異なる特定配列の各々を本プロセスによって指数関数的に製造できる。無論、核酸配列が同一である場合、プライマー配列は同じである。
【００５５】
本発明は、段階的やり方で(各工程の後で新しい試薬を添加する)、または同時に(全試薬を最初の工程で添加する)、または一部段階的かつ一部同時に(新鮮な試薬を所定の工程数の後に添加する)実施できる。適当な時間が経過して所望量の特定核酸配列が生成した後に、任意の既知の方法で酵素を不活性化することにより、または反応成分を分離することにより、反応を停止させることができる。
【００５６】
したがって、本発明に従って核酸を増幅する際には、dTTPの最大75%をdUTPまたはdUTPと非通常のヌクレオチドの組み合わせに置き換えたdNTP混合物を含む適当な反応ミックス中にポリメラーゼを含む組成物に、核酸分子を接触させる。加えて、この態様と組み合わせて、チミジンの代わりにウラシルを含む適当なプライマーを設計できる。別の態様では、増幅反応ミックスは、dNTPの一部が上記のようにdUTPに置き換わっており、1またはそれ以上のウラシル塩基を含む適当なプライマーを設計できる。
【００５７】
このように、本発明は、増幅反応、例えばPCR、リアルタイムPCR等の際のプライマー凝集体形成を制限または減少させるための、修飾dNTPミックスおよびdNTP含有ミックスを使用する対応方法を提供する。或る態様では、反応混合物中のdNTP混合物の一部をdUTPに置換、例えばdTTPをdUTPに置換する。当分野で周知のように、標的反応内の開始点として標準濃度のdNTP、即ちdNTPあたりおよそ200μM〜400μMをPCRに使用する。或る態様では、標準dNTPミックス中10%〜75%のdTTPをdUTPに置換し、好ましくは標準dNTPミックス中約20%〜約40%のdTTPをdUTPに置換する。本発明の他の態様は、dNTP中に他の非通常のヌクレオチド、例えばdITP、デアザ-dGTP、およびこれらの混合物の使用を包含し、これらをdUTPと合して約10%〜75%のdTTPの代わりに使用する。
【００５８】
非通常のヌクレオチド、例えばdUTPの存在は、プライマー凝集体の形成が最小限であるフィルイン反応の達成を促進する事に留意されたい。一般に、非通常のヌクレオチドの包含は、標準PCRに使用するアニーリング温度に基づく組み込みに関して、熱力学的には、より好ましくない。フィルイン反応が必要でない場合、非通常のヌクレオチド包含の利点は限られている。このように、プライマーフィルイン反応は、プライマー凝集体の数が減少する結果を導く。さらに、特異性が要求される幾つかの態様ではdUTPが好ましいことにも留意されたい。即ち、dUTPはdATPと塩基対を形成するが、他の非通常のヌクレオチドは非特異的であり、dATP、dCTP、dGTPまたはdTTPと対形成できるのである。先行技術でのdUTPの使用は、生成物(アンプリコン)へのdUTPの組み込みと、その後の、UNGによる係る生成物の分解に的を絞っている。dUTPを添加する前にUNG処理をPCR反応上で実施し、汚染UTPを含有する生成物があればそれを次反応の前に分解し、それにより反応特異性が向上する事を確実とした。
【００５９】
これに代わる態様では、プライマー凝集体形成の熱力学的有利性を低下させるため、標準dNTPの代わりにウラシルを提示するよう、プライマーを設計する。例えば、プライマー凝集体形成の状況でのdUTPは、同じ位置のdTTPに比較してより弱い相互作用をする傾向がある。この相互作用強度の低下は、誤対合レベルが高い、または塩基対重複数が少ない場合、即ちプライマーダイマー形成に好適な条件に関連がある。このdUTP含有プライマーは、適切な温度循環PCR条件下でハイブリダイゼーションを維持するための、標的鋳型部位と相互作用する充分な強度を持っている。このように、dUTPの組み込みを含むプライマー設計は、プライマーがその鋳型標的部位にハイブリダイズする相対強度を維持しつつ、プライマー凝集体形成の低下に重点的に有利に働く。本発明の或る態様では、プライマー中の全dTTPがdUTPに置き換わっている。
【００６０】
ポリオールは二次構造を有する鋳型NAのPCRを促進する。
ポリオール、即ち単糖のアルコール誘導体は、幾らかのレベルの二次構造を含む鋳型核酸分子の増幅を促進する。本発明の或る態様では、1またはそれ以上のポリオール化合物を標準増幅反応内に包含させて、標的鋳型核酸(NA)が或る程度の二次構造を有する場合にそのNAの増幅感受性を高める。理論に拘束される訳ではないが、このポリオールは化学的融解剤として鋳型核酸に作用し、それによってより低い変性温度で鋳型の増幅を促進すると考えられる。
【００６１】
本発明は、好ましくは反応混合物に1またはそれ以上のポリオールを含む。特に本発明は、標的増幅配列の二次構造レベルが増大している場合、増幅反応におけるポリオールの包含を提供する。本発明で使用するためのポリオールの例は、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、アラビトール、およびアドニトールなどを包含するがこれらに限定される訳ではない。好ましい態様では、ポリオールは単独のまたは組み合わせたソルビトールまたはマンニトールである。増幅反応におけるポリオール濃度は約100mM〜約500mM、好ましくは約50mM〜約400mMの範囲であってよく、最も好ましくは約100mM〜約300mMである。増幅の際にポリオールと組み合わせてその他の融解または崩壊剤を包含させることが予想できる。例えば、1%〜5%のDMSO、またはその他類似のアルキルスルホキシド、50ng〜約500ngの一本鎖結合タンパク質、約1%〜約5%のn-プロピルスルホキシド溶液、約100mM〜500mMのトレハロース、および、dNTPミックス中、最大75%のdTTPをdUTPで置換することは、全て本発明の範囲内にある。DMSOとソルビトールの組み合わせが増幅反応の際の非特異的増幅を低下させることが示されたことに留意されたい(米国特許第6783940号。引用により本明細書の一部とする)。本明細書に記載のように、プライマー凝集体の形成を減少させるため、DMSOおよびその他類似のアルキルスルホキシドを、ポリオール、糖および/またはベタインと組み合わせて、本発明のdUTP態様と共に、または該態様なしで使用できる。このような組み合わせは、増幅特異性および収率を高めることにより、成績または増幅を促進することにもなる。本発明において、dUTP、アルキルスルホキシド、ポリオールおよびトレハロースのような糖の組み合わせは、プライマー凝集体および非特異的増幅生成物の形成を低下させる実質的利益を提供する。本発明に係る組成物および組み合わせの例を下記の実施例に示す。
【００６２】
理論に拘束される訳ではないが、反応混合物にポリオールを含めることは、幾らかのレベルの二次構造を有する鋳型分子の増幅の際、アンプリコンの収率を高めること、そして複数回の凍結/融解中に緩衝液の安定性を維持すること、という少なくとも二重の役割を果たすと考えられる。
【００６３】
任意の妥当なポリオール供給源を本発明に使用することができ、例えばソルビトールはSigma/Flukaから入手でき、マンニトールはSigma/Flukaから入手できる。
【００６４】
高性能リアルタイムPCR緩衝液の組成
本発明はさらに、増幅反応、好ましくは標準PCRおよびリアルタイムPCRで使用するための高性能増幅混合物を提供する。本発明に係る混合物は、ソルビトール、不凍化タンパク質(AFP1、AFGP、AFP1とAFGPの混合物)、担体タンパク質、核酸ポリメラーゼ、好ましくは好熱性または超好熱性ポリメラーゼを含有し、両性イオン調製物を利用する緩衝系により得られる修飾されたpHを有し得る。例示的両性イオン調製物は、HEPES-KOH、TAPS-Tris、HEPES-Tris、HEPES-KOH、TAPS-KOHまたはTAPS-Trisを包含する。本発明の好ましい態様は、TAPS-KOHおよび/またはTAPS-Tris、最も好ましくはTAPS-Trisを含む系を利用する。これらの混合物にとって好ましいpH範囲は最終用途に依存し、例えばリアルタイムPCRに使用するためのミックスは、約7.9〜約8.7、好ましくは約8.2〜約8.7のpHを持つよう緩衝化する。標準PCRに使用する緩衝剤は、約7.9〜8.9のpHを持つよう修飾する事に留意されたい。好ましい態様では、最終的なカリウム塩濃度は10mMおよび80mMの間である。この緩衝系のdNTPミックスは、約10%〜約50%のdUTP(dNTPミックス中のdTTPの代わりに)、より好ましくは約10%〜約30%のdUTP(dNTPミックス中のdTTPの代わりに)を含有する。さらに、幾つかの態様では、DMSO、SSBP、n-プロピルスルホキシド、および/またはトレハロースをこの高性能緩衝液に含有させることができる。
【００６５】
高性能反応混合物の態様において有用な成分濃度は表1に示す通りである。TAPs-KOHの好ましい濃度は25mMで15mMのKClを伴い、TAPs-Trisの好ましい濃度は25mMで50mMのKClを伴い、いずれも最終的緩衝液のpHは約8である事に留意されたい。両性イオン緩衝剤調製物を用いる態様は、1またはそれ以上のAFP、担体タンパク質、ソルビトール、マンニトール、DMSO、SSBP、および、或るパーセンテージのdTTPまたはその他のdNTPをdUTPのような非通常のヌクレオチドに置換したdNTPミックスを含み得る。典型的には、この組成物は最良の効果のために約7.9および8.2の間のpHを持つ。その他のpHも使用できるが限定的結果となる。
【００６６】
【表１】
2007520237.tif 000003
【００６７】
PCRおよびリアルタイムPCR緩衝液キット
本発明はさらに、本発明に係る組成物態様を包含するキットを提供する。キットは、本発明に係る反応混合物、例えば本発明に係る高性能PCR混合物の態様を包含し、或いは、既定の独立量のdNTP混合物が本発明に係るdUTP/dTTPミックスの態様を有し、これをPCR緩衝液に加えるか、または本発明に結びつけた目的用途に使用する酵素と合する。
【００６８】
本発明を一般的に説明してきたが、以下の実施例を参照することにより本発明をより容易に理解することができる。これらの実施例は例示のために供するものであり、限定を意図するものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例1：増幅反応中にdUTPを組み込むとプライマー凝集体の形成が減少する。
増幅反応の際、dTTPをdUTPに置き換えると、プライマーが5’突出部を有する場合のプライマーダイマーの形成が減少する。GADPHおよびSRYフォワードおよびリバースプライマー、GADPHおよびSRYプローブ、ならびに適当なプラスミド鋳型を有する一連のPCR反応を準備した。各反応に、標準dNTPミックス(10mMのdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP)、または、dATP、dCTPおよびdGTPを10mMの一定に維持し、dTTPの幾らかもしくは全量をdUTPに置換した、修飾dNTPミックスのいずれかを加えた。例えば、20% dUTP反応は、dATP 10mM、dCTP 10mM、dGTP 10mM、dTTP 8mMおよびdUTP 2mMを含有していた。
【００７０】
図1に示すように、プライマーダイマーの形成は、PCR反応条件にdUTPを包含させることにより著しく減少する。dUTP置換は、およそ50%のdTTPをdUTPに置換する場合、ダイマー形成の減少に最大効果を有するように見える。
【００７１】
図2に示すように、PCR反応混合物へのdUTPの含有はプライマーダイマー形成の劇的な減少を惹起する。HotMaster TaqおよびNTCのいずれもがこのプライマーダイマー形成の減少を支持している。表2および3は、三段階熱循環- 95℃で1分間、次いで20秒間、第2段階、53℃で20秒間、および68℃で20秒間 - に用いた反応条件を説明している。
【００７２】
【表２】
2007520237.tif 000004
【００７３】
【表３】
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【００７４】
前記の実施例は、dTTPの最大50%またはそれ以上をdUTPに置換すると、プライマーダイマー形成が減少し、それにより反応条件の特異性および感受性を最大化する結果となることを示している。
【００７５】
実施例2：非通常のヌクレオチドは融解曲線を低温へとシフトさせる。
標準PCR緩衝液において、或るパーセンテージのdNTPを非通常のヌクレオチドに置換することによる、鋳型融解に及ぼす効果を比較するため、以下の実施例を実施した。反応液を表4および5に示すように調製し、表6に概説するプロトコルに従って適当な類似体を用いて実施した。
【００７６】
【表４】
2007520237.tif 000006
【００７７】
【表５】
2007520237.tif 000007
【００７８】
【表６】
2007520237.tif 000008
【００７９】
図3は、1またはそれ以上の標準dNTPを非通常のヌクレオチドに置換すると、標準dNTP組成物に比較して、少しではあるが有意な鋳型融解の促進がもたらされることを示している。このデータは、プライマーアニーリング条件での取り込みに対する熱力学的有利性の低下を示している。
【００８０】
実施例3：dUTPは、リアルタイムPCRの際、Ct、RFUおよび収率に影響を及ぼさない。
前記実施例から、dTTPの代わりにdUTPを加えることで、PCR中のプライマーダイマー形成レベルを低下させる著しい利益が提供される。標準dNTPミックス中のdTTPをdUTPに置換することが、PCR、例えばリアルタイムPCR中の感受性またはシグナルサイズに悪影響を及ぼしたかどうかを判定するため、dTTPの代わりに2.5mM〜7.5mMのdUTPを含む反応の比較を行った。反応は、10mM dTTPの一部を2.5mM dUTPまたは7.5mM dUTPのいずれかに置換する他は実施例1の記載と実質上同様とした。
【００８１】
図4Aに示すように、dTTPの代わりにdUTPを加えても、シグナル増幅および閾値サイクルCtには、殆どまたは全く影響しなかった。さらに、リアルタイムPCRでのdUTPの添加は、この反応の生成物収量に殆どまたは全く影響しなかった(図4Bを参照されたい)。
【００８２】
実施例1および2に示すデータと組み合わせたこの実施例は、収量、シグナルサイズ(RFU)およびCtサイクル感受性を維持しつつプライマーダイマー形成を減少させる事に関して有用なPCR緩衝液を提供する、本発明の有用性を示すものである。
【００８３】
実施例4：ソルビトールとdUTPミックスの組み合わせは鋳型二次構造の除去を促進し、増幅成績を向上させる。
標的化学物質が及ぼす鋳型二次構造への影響を調べるための系を考案した。図5Aおよび5Bに示すように、増幅反応内に1個の鋳型(b-アクチンから誘導)を導入した。二次構造を殆どまたは全く持たない第一の構造(5Aに模式的に示す)、そしてかなりの部分の二次構造を持つ第二の構造(5Bに模式的に示す)である。第二の構造は、GCに富む配列の伸張領域を含み、増幅された時に第一の構造と相違する。他の因子がない場合、二次構造の伸張領域のため、第二の構造からの増幅は殆どまたは全く期待できない。逆に、第一の構造からの増幅は、かなりの生成物形成をもたらす。二次構造が、増幅された第二の構造と共に取り除かれる時にのみ、それによって当該長さの生成物が生成する。
【００８４】
第二の鋳型構造由来の二次構造を融解させる能力に及ぼす標的化学物質の効果を判定するため、実験を行った。第二の構造の増幅の増大は、その二次構造を融解する該化学物質の能力を示唆する。漸増量のソルビトールまたはn-プロイルスルホキシド存在下の漸増量のソルビトールと共に、標準PCR反応中で鋳型をインキュベートした。増幅させた生成物をアガロースゲル上でランさせエチジウムプロミドで染色することにより視覚化した。熱循環は、最初95℃60秒間の工程、その後95℃20秒間、59℃20秒間、および68℃20秒間とし、40回反復した。表7および8は各々図7A、および7Bについての反応条件を示している。
【００８５】
【表７】
2007520237.tif 000009
【００８６】
【表８】
2007520237.tif 000010
【００８７】
図6、7A、および7Bは、単独または他の物質、例えばn-プロピルスルホキシド、dUTP含有dNTPミックス、マンニトールおよび一本鎖結合タンパク質と組み合わせたソルビトールが、鋳型内部の二次構造の量を減少させることにより、長い、そしてしばしばGCに富む鋳型の増幅を促進した事を示している。漸増量のソルビトールと7%のn-プロピルスルホキシドの組み合わせ(図6)は特に二次構造の融解に有効であり、長い鋳型の増幅を可能にしたことに留意されたい。さらに、トレハロース存在下での漸増量のソルビトール(図7Bの右側の図)が、二次構造を含む大きなプラスミドの優先的増幅を惹起した事にも留意されたい。
【００８８】
前記実施例は、単独またはトレハロース、n-プロピルスルホキシド、dUTP含有dNTPミックス、DMSO、マンニトールおよびSSBPと組み合わせたソルビトールの包含が、鋳型DNAの増幅、とりわけ二次構造に富む鋳型DNAの増幅に有用であることを示している。
【００８９】
実施例5：トレハロースと組み合わせたアキルスルホキシドはGCに富む核酸の増幅を促進する。
以下の実施例は、異なるアキルスルホキシド、例えばDMSO、N-プロピルスルホキシド、テトラメチレンスルホキシドとトレハロースまたは他の同様な糖類の組み合わせが、核酸分子、特にGCに富む核酸分子の増幅を促進し、プライマー凝集を減少させることを説明している。
【００９０】
以下の成分を含有する緩衝剤の組み合わせで実験を行った：2.5mM Mg2+を含む1X Tuning buffer、1X TaqMaster PCR Enhanceを含むTuning buffer、N-プロピルスルホキシド(0.5%〜1.75%)を含むTaqMaster、テトラメチレンスルホキシド(0.015% - 0.4%)を含むTaqMaster、DMSO(2%)を含むTaqMaster、グリシルベタイン(Q溶液)約1M最終溶液、およびGC-Melt(Clontech)約0.5M最終。全ての反応をEppendorf Taq DNAポリメラーゼを用いて実施した。50μl反応中、50ngヒトゲノムDNA(Promega)由来の483bp GCリッチβ-アクチンフラグメント 上で、1.5U Taqを使用し35サイクル(95℃5分間；次いで94℃20秒間、59℃10秒間、および72℃20秒間を35X)の増幅反応を行い、全ての反応を2.5mM Mg(Oac)2最終濃度の1X Tuning buffer中で実施した。
【００９１】
各反応は、20の反応に対して算出した以下の成分を含んでいた事に留意されたい：25mM Mg2+を含む10X Tuning Buffer 100μl、10mM dNTPミックス20μl、β-アクチンフォワードおよびリバースプライマー(10μM)20μl、ヒトgDNA(50ng/μl) 20μl、Taq DNAポリメラーゼ(5U/μl) 6μl、および614 MBGW H2O。この組み合わせおよそ40μlを各反応50μlに使用した。残りの10μl容量は、アルキルスルホキシドおよびトレハロース等の異なる組み合わせ、または水のみで構成されていた。
【００９２】
図8および9に示すように、トレハロースによるN-プロピルスルホキシドの滴定は、gDNA上の困難なGCリッチ標的部位の増幅を容易にした。N-プロピルスルホキシドとトレハロースの組み合わせは、Qiagen社製Q溶液/ベタイン(低濃度において特異生成物の収量がより高い)およびClontech社製GC-Melt(より良い収量および特異性)を凌ぐ性能であった。ClontechおよびQ溶液は製造者の明細に従って実施した。テトラメチレンスルホキシドは、これらの実験においてN-プロピルスルホキシドより標的核酸分子を促進する有効性が低かった。
【００９３】
この実施例は、増幅収量の改善および非特異的増幅の低減のためにアルキルスルホキシドとトレハロースのような糖を組み合わせることの有用性を示している。これらの組み合わせは上記のようなポリオールまたはdUTP態様と共に使用できると考えられる。
【００９４】
本発明を具体的な実施例に言及して説明してきた。これらの実施例は本発明を限定する意図は断じてない。本開示の目的のため、本発明に様々な変更および改良を施すことができ、それらは本発明の範囲内にあるという事を理解されたい。当業者が容易に示唆でき、本明細書に開示する本発明の精神に包含され、付記する請求項に定義するその他多くの変更を施すことができる。
【００９５】
本明細書は、特許、特許出願、および刊行物に対する数多くの引用を含んでいるが、これらは各々引用により本明細書の一部とする。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】dNTPにおいて種々のパーセンテージのdTTPをdUTPに置き換えた、PCR由来の反応生成物を示す、染色した1%アガロースゲルである。反応ミックスにdUTPを添加すると、各々の反応中に形成されるプライマーダイマーの量が著しく減少する。
【図２】20%のdTTPをdUTPに置き換えた反応と対照反応を比較するPCR由来の反応性生物を示す、染色した1%アガロースゲルである。dTTPをdUTPに置き換えるとPCR中に形成されるプライマーダイマーの量が著しく減少した。
【図３】非通常のヌクレオチドおよび混合物についての融解曲線の比較をグラフで表している。
【図４Ａ】dTTPをdUTPに置き換えても、リアルタイムPCR中のCtおよびRFUに著しい影響を及ぼさないことを図示している。
【図４Ｂ】dTTPをdUTPに置き換えても、リアルタイムPCR中のCtおよびRFUに著しい影響を及ぼさないことを図示している。
【図５Ａ】ソルビトール二次構造検定に使用したβ-アクチン配列を図示している。図5Aは、極端にGCに富む領域が無い場合の37、55および68℃における遺伝子の二次構造を示し、図5Bは、37、55および68℃においても二次構造を促進するGCリッチ領域を含む同遺伝子を示している。
【図５Ｂ】ソルビトール二次構造検定に使用したβ-アクチン配列を図示している。図5Aは、極端にGCに富む領域が無い場合の37、55および68℃における遺伝子の二次構造を示し、図5Bは、37、55および68℃においても二次構造を促進するGCリッチ領域を含む同遺伝子を示している。
【図６】漸増量のソルビトール存在下での図5Aおよび5Bの鋳型上でのPCR由来反応生成物を示す、染色した1%アガロースゲルである。上方のバンドは二次構造含有分子由来の増幅生成物であって、二次構造の融解を示しており、下方のバンドは、非二次構造含有分子由来の増幅生成物であって、非二次構造含有鋳型が対照レベルの増幅であることを示している。
【図７Ａ】ソルビトール、マンニトール、dUTP、DMSO、一本鎖結合タンパク質およびトレハロースを包含する幾つかの化学物質と組み合わせてPCRを実施した以外は上の図6と同様である。
【図７Ｂ】ソルビトール、マンニトール、dUTP、DMSO、一本鎖結合タンパク質およびトレハロースを包含する幾つかの化学物質と組み合わせてPCRを実施した以外は上の図6と同様である。
【図８】N-プロピルスルホキシドおよびトレハロースまたはテトラメチレンスルホキシドおよびトレハロースを添加した反応を比較する、PCR反応生成物を示す、染色したアガロースゲルである。
【図９】N-プロピルスルホキシドおよびトレハロース、DMSOおよびトレハロースおよびベタインを添加した反応を比較する、PCR反応生成物を示す、染色したアガロースゲルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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