(57)【要約】【課題】  イメージング技術により化学物質の２次元配置を分析する。【解決手段】  偏光光線を放射する光源と、制御層及び／または光反射表面を含む光学アセンブリとが含まれるイメージング方法及び装置を提供する。制御層は、エバネッセント波内の試料アレイの像を最適化するために、生成されたエバネッセント波の特性の制御を有利には可能にする。光反射表面には、レセプタ特異領域の柔軟な制御を有利には可能にするレセプタ／捕捉物質を結合するために用いられる結合手段が含まれる。
2007538256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イメージングのための装置であって、
偏光光線を放射する光源と、
制御層及び光反射表面を含む光学アセンブリとを含み、
前記光線が、前記制御層を通過して前記光反射表面によって反射され、高さ及び強度が制御されたエバネッセント場を前記光反射表面に隣接して供給し、前記光反射表面が、前記エバネッセント場において試料アレイが前記光線の断面において空間的に分布された偏光変化を生じさせるように前記光反射表面上に前記試料アレイを供給するように適合され、
前記装置が、前記試料アレイの像を供給するべく前記光線において前記空間的に分布された偏光変化を検出するように配置された検出器を更に含むことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記制御層が、ガラス、液晶及び／または半導体材料を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記制御層が、エバネッセント場発生を制御するための厚さを有することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記制御層が、エバネッセント場発生を制御するための屈折率を有することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項５】
前記制御層が、エバネッセント場発生を制御するための反射率特性を有することを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記光反射表面が、電位が印加される金属膜を含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記金属膜が、金、銀、チタン及び／またはクロムで構成されることを特徴とする請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記試料アレイが、生体分子物質を含む複数の範囲から形成される２次元アレイを含むことを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項９】
前記生体分子物質が、タンパク質、ぺプチド、炭水化物、脂質及び／またはポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
イメージングのための装置であって、
偏光光線を放射する光源と、
光反射表面を含む光学アセンブリとを含み、
前記光線が、前記光反射表面によって反射され、エバネッセント場を前記光反射表面に隣接して供給し、前記光反射表面が、前記エバネッセント場において試料アレイが前記光線の断面において空間的に分布された偏光変化を生じさせるように前記光反射表面上に前記試料アレイを供給するための結合手段を含み、
前記装置が、前記試料アレイの像を供給するべく前記光線において前記空間的に分布された偏光変化を検出するように配置された検出器を更に含むことを特徴とする装置。
【請求項１１】
前記光反射表面が、半導体、金属、プラスチックからなる群から選択される材料で構成されることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記光反射表面がシランで構成され、前記結合手段がシラン処理剤を含むことを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記光反射表面が金属で構成され、前記結合手段が硫黄含有化合物を含むことを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１４】
前記金属が、金、銀、チタン及び／またはクロムを含むことを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記硫黄含有化合物が、チオールであることを特徴とする請求項１３に記載の装置。
【請求項１６】
前記光反射表面が、プラスチックで構成されることを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１７】
前記結合手段が、生体分子物質への親和性を有することを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１８】
前記試料アレイが、生体分子物質を含む複数の範囲から形成される２次元アレイを含むことを特徴とする請求項１０に記載の装置。
【請求項１９】
前記生体分子物質が、タンパク質、ぺプチド、炭水化物、脂質及び／またはポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
イメージングの方法であって、
制御層及び光反射表面を含む光学アセンブリに偏光光線を照射する過程と、
前記制御層を用いて、高さ及び強度が制御されたエバネッセント場を前記光反射表面に隣接して供給する過程と、
前記エバネッセント場において前記光線の断面において空間的に分布された変化を生じさせる試料アレイを供給する過程と、
前記光学アセンブリから前記偏光光線を出射させる過程とを含み、
前記光線において前記空間的に分布された偏光変化が検出されかつ前記試料アレイの像を供給するように処理されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
前記制御層の光学特性が、前記エバネッセント場の前記高さ及び強度を制御するために用いられることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記制御層の光学特性が、厚さ、屈折率、反射率特性からなる群から選択されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記制御層が、前記制御層の光学特性を制御するために用いられる液晶で構成されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記光反射表面が、金属で構成されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記金属に電位を印加して前記エバネッセント場の前記高さ及び強度を制御する過程を更に含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
イメージングの方法であって、
自身の上に捕捉物質のアレイを供給するための結合手段を有する光反射表面を含む光学アセンブリに偏光光線を照射する過程と、
前記光反射表面の付近にエバネッセント場を供給する過程と、
前記エバネッセント場における所定の分子に結合された捕捉物質のアレイが光線の断面において空間的に分布された偏光変化を生じさせるように所定の分子を供給する過程と、
前記光学アセンブリから前記反射光線を出射させる過程とを含み、
前記光線において前記空間的に分布された偏光変化が検出されかつ処理されて、前記所定の分子に結合された捕捉物質の前記アレイの像を供給することを特徴とする方法。
【請求項２７】
捕捉物質を前記光反射表面に結合させるために前記結合手段が用いられることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記光反射表面が、ガラスで構成されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記結合手段が、前記光反射表面をシラン処理するためのシラン処理剤を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記光反射表面が、金属で構成されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記結合手段が、捕捉物質を誘導体化するかまたは前記光反射表面に結合させるために硫黄含有化合物を含むことを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
イメージング装置と共に使用するためのカセットであって、
自身の上に試料アレイの形成を可能にするような結合手段を含む光反射表面と、
光源から前記光反射表面へ偏光光線を方向付け、それによって前記光反射表面での前記偏光光線の反射が前記試料アレイの近くに制御されたエバネッセント場を生成するように構成された制御層と、
前記光反射表面に結合され、前記試料アレイにわたり分析物を流すための流入口及び流出口を含むフローセルとを含むことを特徴とするカセット。
【請求項３３】
前記光源及び前記制御層が、前記光反射表面での前記光線の１回反射のために構成されていることを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項３４】
前記光反射表面が、半導体、金属、プラスチックからなる群から選択される材料で構成されることを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項３５】
前記光反射表面がシランで構成され、前記結合手段がシラン処理剤を含むことを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項３６】
前記光反射表面が金属で構成され、前記結合手段が硫黄含有化合物を含むことを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項３７】
前記金属が、金、銀、チタン及び／またはクロムを含むことを特徴とする請求項３６に記載のカセット。
【請求項３８】
前記硫黄含有化合物が、チオールを含むことを特徴とする請求項３６に記載のカセット。
【請求項３９】
前記光反射表面が、プラスチックで構成されることを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４０】
前記結合手段が、生体分子物質への親和性を有することを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４１】
前記制御層が、ガラス、液晶及び／または半導体材料を含むことを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４２】
前記制御層が、エバネッセント場発生を制御するための厚さを有することを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４３】
前記制御層が、エバネッセント場発生を制御するための屈折率を有することを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４４】
前記制御層が、エバネッセント場発生を制御するための反射率特性を有することを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４５】
前記光反射表面が、電位が印加される金属膜を含むことを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４６】
前記金属膜が、金、銀、チタン及び／またはクロムで構成されることを特徴とする請求項４５に記載のカセット。
【請求項４７】
前記試料アレイが、生体分子物質を含む複数の範囲から形成される２次元アレイを含むことを特徴とする請求項３２に記載のカセット。
【請求項４８】
前記生体分子物質が、タンパク質、ぺプチド、炭水化物、脂質及び／またはポリヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項４７に記載のカセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、特許文献１の一部継続出願である特許文献２の一部継続出願である。
【０００２】
この出願はまた、特許文献１の一部継続出願である特許文献３の一部継続出願でもある。
【０００３】
この出願はまた、特許文献１の一部継続出願である特許文献４の一部継続出願でもある。
【０００４】
特許文献１ないし４は、引用を以って本明細書の一部となす。
【０００５】
本発明は、光透過物質の境界での内部反射に関連するイメージング技術及び装置に関し、特に、光透過性基板上での物質の存在、成分、品質及び／または空間分布を検出するためのそのような技術及び装置の使用に関する。
【背景技術】
【０００６】
本発明は、バイオチップ（遺伝子チップ、プロテインチップ、マイクロアレイ等とも呼ばれる）のイメージングに関する。基板の表面上に生物学的または化学的に活性スポットのアレイを形成し、検査物質をアレイに接触させてその検査物質の構成成分を識別することは公知である。通常そのような処理は、検査される物質における構成成分の存在に対する検出可能なサインを供給するために、蛍光、エレクトロルミネセンス、電流変化、電圧変化等を示すべく処理されるような、例えば、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡクローン、抗体、ペプチド、レセプタ、酵素、阻害剤等のスポットを必要とする。
【特許文献１】米国特許出願第０９／６１４，５０３号（米国特許第６，５９４，０１１号）
【特許文献２】米国特許出願第１０／６０２，５５５号
【特許文献３】米国特許出願第１０／０４６，６２０号
【特許文献４】米国特許出願第０９／８３８，７００号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の原理に基づき、偏光光線を供給する光源部材からの光は透過基板を通して導かれ、基板の表面で全反射（total internal reflection：ＴＩＲ）などの反射が行われる。全反射については、M. Bom, and E. Wolf, "Principles of Optics", 6th ed., pp 47-51, Pergamon Press, Oxford, 1991 に記載されている。反射光は、偏光感受型２次元アレイ検出器または他の型の検出器によって検出される。試料アレイ（specimen array）によって生じるビームの断面における局所的な偏光状態の変化を利用することで、表面の各ポイントに対して基板表面上で物質のアレイにおける物質の存在及び組成に関する情報が得られる。
【０００８】
光線の断面内の任意の点での全反射は、入射面において偏光させられた光成分と入射面に垂直に偏光させられた成分の間に位相シフトを生じさせる。反射光は２次元アレイ検出器などの偏光感受型検出器によって検出され、この検出器からの信号は次にコンピュータにおいて処理されて試料の表面上の物質に関する２次元情報を提供する。反射ビームの断面における偏光状態の空間的に分布された変化は、検出器内の位置に対応する試料アレイにおける位置における試料内の物質を示す。
【０００９】
本発明の一実施形態に基づき、偏光光線を放射する光源と、制御層及び光反射表面を含む光学アセンブリとを含むイメージング装置が提供される。光線は、制御層を通過して光反射表面によって反射され、高さ及び強度が制御されたエバネッセント場を光反射表面に隣接して供給する。光反射表面は、エバネッセント場における試料アレイが光線の断面において空間的に分布された偏光変化を生じさせるように、光反射表面上に試料アレイを供給するように適合されている。装置は、試料アレイの像を供給するべく光線において空間的に分布された偏光変化を検出するように配置された検出器を更に含む。
【００１０】
本発明の別の実施形態に基づき、光反射表面を有する光学アセンブリを含むイメージング装置が提供される。ここで、光線は、光反射表面によって反射され、エバネッセント場を光反射表面に隣接して供給する。光反射表面には、エバネッセント場における試料アレイが光線の断面において空間的に分布された偏光変化を生じさせるように光反射表面上に試料アレイを供給するための結合手段が含まれる。
【００１１】
本発明の更に別の実施形態に基づき、偏光光線を制御層及び光反射表面を含む光学アセンブリに照射する過程と、制御層を用いて、高さ及び強度が制御されたエバネッセント場を光反射表面に隣接して供給する過程とを含むイメージング方法が提供される。本発明の方法は更に、光線の断面において空間的に分布された変化を生じさせる試料アレイをエバネッセント場において供給する過程と、光学アセンブリから反射光線を出射させる過程とを含み、光線において空間的に分布された偏光変化は検出されかつ試料アレイの像を供給するように処理される。
【００１２】
本発明の更に別の実施形態に基づき、光反射表面を有する光学アセンブリに偏光光線を照射する過程と、エバネッセント場を光反射表面に隣接して供給する過程とを含むイメージング方法が提供される。光反射表面は、光反射表面上に捕捉物質のアレイを供給するための結合手段を有する。イメージング方法は更に、エバネッセント場における所定の分子に結合された捕捉物質のアレイが光線の断面において空間的に分布された偏光変化を生じさせるように所定の分子を与える過程と、光学アセンブリから反射光線を出射させる過程とを含み、光線において空間的に分布された偏光変化は検出されかつ所定の分子に結合された捕捉物質のアレイの像を供給するように処理される。
【００１３】
本発明の更に別の実施形態に基づき、イメージング装置と共に使用するためのカセットが提供される。カセットには、光反射表面上に試料アレイの形成を可能にする結合手段を含む光反射表面と、光反射表面での偏光光線の反射が試料アレイの近くに制御されたエバネッセント場を生成するように光源から前記光反射表面へ偏光光線を方向付けるように構成された制御層と、光反射表面に結合されたフローセルとが含まれる。フローセルには、試料アレイにわたり分析物を流すための流入口及び流出口が含まれる。
【００１４】
本発明の装置及び方法は、水溶液中での物質のイメージングに特に適している。更に、分子薄膜システムの一部として光反射表面上に配置される２次元生体分子アレイへの分析物の取着及び取外しを検出するのに特に適している。種々の用途において、アレイにおいて複数の離散的な試料スポットが呈される。ここで、方法及び装置は、離散的な試料スポットの各々を区別するためにアレイをイメージングすることになる。有利には、蛍光または分子タギングは、本発明において使用に必要でないが、任意選択である。
【００１５】
本発明のこれらのまたは他の機能及び利点は、添付の図面と共に以下に説明する実施形態の詳細な説明から、より容易にはっきりと理解できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、イメージング技術により化学物質の２次元配置を分析するための方法及び装置を含む。既知の偏光状態の偏光光源は、全反射表面（ＴＩＲ表面）などの光反射表面での反射のために構成された全反射部材（ＴＩＲ部材）などの光学アセンブリに方向付けされ、その後、光学アセンブリから出る。本明細書中では、層の厚さが照射光の可干渉距離より短いような層状光学構造で遭遇するような反射の重ね合わせを１回反射と呼ぶ。
【００１７】
化学的試料は、反射光線のエバネッセント場において光反射表面の適所または上方にある。反射後、光線は、例えば偏光子及びカメラなどの偏光感受型２次元検出器または他の型の検出器へ照射される。反射光線の中身は次に、光線の２次元断面で局所的に偏光状態の変化を判定するべく処理されることができる。これは、試料における偏光状態の変化の空間的に分布されたマップを供給する。偏光の変化を判定するために、ヌル状態からのずれを測定するなど、または入射偏光状態と出射偏光状態を比較することにより、種々の技術が利用できる。
【００１８】
エバネッセント場内の物質の屈折率成分は、光反射表面での反射に起因する光線の偏光状態の変化を判定する。光反射表面内でのこの成分の２次元変位は、反射光線の断面にわたって空間的に分布された偏光状態のそれぞれの変位に対応する。
【００１９】
１つの用途において、化学的試料は、それぞれの他の分子（リガンドと呼ぶ）に対する特定の親和性（アフィニティ）を有する分子（ここではレセプタと呼ぶ。一般的には捕捉物質または親和性物質と呼ばれる）の２次元アレイを形成する。この用途では、本発明はアレイ上で分子と捕捉物質との結合の存在または不在または結合速度を示すために利用される。そのようなアレイは、一般に複数の離散的な試料スポットからなる。本発明の方法及び装置は、反射光線の断面における偏光状態の局所的な変化によって表される離散的な試料スポットの各々を区別するためにアレイをイメージングする。
【００２０】
検出器の解像力の制限を前提として、本発明は、領域全体にわたり空間的に分解される非常に高い解像度で、即ちサブオングストロームの範囲で、調査中の試料の厚さ及び／または屈折率成分の測定を可能にする。厚さ及び屈折率測定値が検出器のエレクトロニクスの関数であり、空間解像度が光学アセンブリに対応するオプティクスの関数であることに留意されたい。本発明は、試料が水溶液中にあるような用途において特に有効である。特定の用途では、本発明は、免疫センサ適用時などに、溶液中の生物因子の存在を、エバネッセント場におけるＴＩＲ表面上の抗体への生物因子の取着を測定することによって判定するために用いられる。別の用途では、本発明は、溶液中の核酸配列の存在及び構造を、エバネッセント場における光反射表面上の他の核酸配列への核酸配列の取着を測定することによって判定するために用いられる。本発明の異なる実施形態については以下に詳述する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
図１及び図２は、本発明の一実施形態を具現化した装置を示す。図１に示されるように、装置１０は説明の都合上３つの基本部分からなるものとして説明されることができる。第１の部分には偏光光源アセンブリ１２が含まれ、第２の部分には制御層及び／または光反射表面を含む光学アセンブリ１４が含まれ、第３の部分には例えば２次元アレイ検出器を備えることができる偏光感受型イメージング検出器アセンブリが含まれる。
【００２２】
検出器アセンブリ１６からのデータは、コネクタ２４に沿って電気信号によって、画像ディスプレイを含むユーザアクセスシステム及び特別にプログラミングされたコンピュータなどの処理装置１８へ送信される。データは、画像、データテーブル、グラフとしてまたは他の形式で表示されることができる。偏光光源アセンブリ１２は、既知の偏光状態の偏光光２０を照射するが、これは光線反射が生じる光学アセンブリ１４に変えられるかまたは変わることがある。反射光２２は、変化した偏光状態を有し、検出器アセンブリ１６へと進む。そこではそれは光線の断面にわたり空間的に記録される。記録されたデータは処理装置１８に送信され、処理装置１８では偏光状態の変化が判定されて偏光状態の変化の空間的に分解されたマップを供給する。試料が離散的なスポットのアレイとして提示されるとき、各スポットはスポット領域内で偏光状態の変化に対しイメージングされることになる。
【００２３】
図２は、好適実施形態のより詳細な概略ブロック線図を示す。偏光光源アセンブリ１２は、光源２６と、（光源の性質が光線形成を有用または必要にするようなものであれば）光線形成部材２８と、偏光子３０と、光学リターダ（optical retarder）３２とを有する。
【００２４】
光学アセンブリ１４は、光学面３６を有するような光学素子３４を有する。光学面３６の上の制御層３８と、これらの間の屈折率整合物質（index matching substance）４０も示されている。一例では、試料４２は、制御層３８の光反射表面３９上に配置される。
【００２５】
本発明の一実施形態では、光学素子３４は制御層３８と共に構成されたプリズムであり、光線が光反射表面３９で１回だけ反射され、次にプリズムから出るように、入射光線２０及び出射光線２２に関連付けられている。試料が光学面３６上に直接配置されたら、光学面３６は、光反射表面になることになる。しかし、これは通常の用途ではない。なぜなら、試料（例えばバイオチップ）は、試料スライド３８上に準備され本装置に配置されるのがより簡便だからである。一例では、光反射表面３９を有する制御層３８は試料スライドとして作用することができるか、または制御層３８は試料スライドと協働して作動することができる。どのように組み立てられても、本発明は、光反射表面を有する光学構造を組み込み、光線は光学構造に出入りする間の反射表面で反射する。換言すれば、試料と光学接触する光反射表面があり、それによって全反射に関連するエバネッセント場が試料と相互作用する。
【００２６】
一実施形態では、反射後検出器アセンブリ１６は、偏光子４４と、例えば２次元アレイ検出器４６であって好適にはＣＣＤまたはＣＭＯＳアレイ型のカメラであるようなイメージング検出器とを有する。処理装置１８は、特別にプログラムされたコンピュータ（または処理装置）であり、像を処理してイメージングされた領域の断面にわたり空間的に分解された膜厚変化の表示にするための出力手段である。イメージングは、全反射によって生じる光線の断面における局所的な偏光状態での空間的に分布された変化を検出することによって得られる。これは、表面上の各分解可能なポイントに対する基板表面上の物質のアレイにおける組成及び存在に関する情報を提供する。異なる偏光状態変化は、検出器における位置に対応する試料アレイにおける位置での試料上の物質を示す反射光線の断面に含まれる。
【００２７】
処理装置１８は、データを（コネクタ２４上で）電気信号として受信し、２次元アレイ全体で空間的に偏光状態の変化を特徴付ける。処理装置１８においては、一実施形態では、光処理アセンブリ１２からの入射光の既知の偏光状態と、試料アレイにおいて空間的に分布されたポイントまたはスポットのマップを供給するような光線内で２次元的に空間的に分解された、反射光２２の変化した偏光状態とを比較することによって、分析及び処理が行われる。次に処理装置１８によって偏光シフトが分析され、化学的試料における要素の存在及び物性の情報を供給する。他の公知技術、例えばヌル処理（null processing）を用いて偏光状態の変化を判定することができる。
【００２８】
或いは、光源２６は、ＬＥＤ、ＳＬＤ（スーパールミネッセントダイオード）、白熱光源、またはレーザであることがある。ＬＥＤまたはＳＬＤが用いられるならば、光線形成部材２８がコリメータであるような、図２に示される構成が適切である。白熱光源が用いられるならば、光フィルタも用いられる。一実施形態では、装置のための光源２６は中程度の帯域の準単色光源である。本発明に基づけば、光源２６は中程度の帯域のＬＥＤであるのが好ましい。帯域は約１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内の半値幅（ＦＷＨＭ）波長であるのが好ましく、約３０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲内の半値幅波長であるのがより好ましい。
【００２９】
代替実施形態では、出射光線２２を受光するために偏光子４４の前の位置に光学リターダ３２が代わりに配置されることがある。
【００３０】
図３は、追加の実施形態を示す。光源がレーザ５０であるような実施形態では、レーザによって生じるスペックルパターンにおける極小及び極大のスペックルオフセット変動を与えるように可動ディフューザ５２が適合される。可動ディフューザ５２は、機械式アクチュエータ５４に取着される。機械式アクチュエータ５４は、スペックルオフセット変動を与えるためのモータ及びサーボ装置であるのが好ましい。光線は次に、光線形成素子２８、偏光子３０及び光学リターダ３２の中を進み、光線２０として光源アセンブリ１２から出射する。
【００３１】
偏光子３０は、図２及び図３に示されるような実施形態において、選択された既知の偏光状態の偏光子を備える。偏光子３０は、光線２０の偏光状態の変化及び選択を可能にするようにモータ制御信号によって駆動される機械式アクチュエータを有する型のものであることがある。
【００３２】
上記したように、（図２の）光学素子３４は、単独または屈折率整合物質との組合せのいずれかで、試料が反射光線のエバネッセント場にある限り光学アセンブリを画定するため様々な方法で試料と共に使用されるように配置されることがある。
【００３３】
上記したように、（図２の）試料４２は、光学面３６が光反射表面であることになる場合に光学面３６に直接配置されることができる。しかしこれは不便であり、繰り返し使用は光学面３６の光学品質を低下させる可能性が高い。従って、バイオチップまたは他の化学アッセイ試料が供給されるような一般的な方法と矛盾がないように、試料スライドまたは他の支持装置が用いられる。各スポットの分析を得る目的で構造の上で支持される離散的な試料スポットのアレイを供給することは、バイオチップにおいて一般的である。内面全反射光学素子なる語は、全反射として知られる現象を与えるような既知の光学素子単独または他の素子との組合せを指す。図２は、光反射表面３９を有する制御層３８と組み合わせてのプリズムの使用を示す。
【００３４】
図４は、別の光学的配置を示す。ここでは、制御層６０が屈折率整合物質６２の上に置かれ、屈折率整合物質６２は同様に、上面５８を有する平坦な光学部材５６の上に置かれている。試料６４は光反射表面６６の上に載置され、光反射表面６６は一実施形態では制御層６０の上面である。光線２０は、光学アセンブリに入射し、入射時に屈折し、光反射表面６６での１回反射後に光学部材５６を離れる。試料が反射に関連してエバネッセント場にあるように配置される限り、本発明を実行する際に、全反射及びエバネッセント場を与えるための他のメカニズムを用いることができる。
【００３５】
図５に見られるように、光線２２が通過する反射後検出器アセンブリ１６は、代わりに、偏光子部材７０と、光線形成部材７２と、イメージング検出器７４、例えば２次元アレイ検出器または他の型のイメージング検出器から構成されることができる。
【００３６】
上記の実施形態に与えられているように、光学アセンブリ１４には、光反射表面３９を有する制御層３８が含まれ（図２）、或いは、光学アセンブリには、光反射表面６６を有する制御層６０が含まれる（図４）。
【００３７】
制御層３８及び６０は各々、エバネッセント波のパラメータ、例えば高さ（媒体への波の染み出しに関係する）及び強度（媒体中の波の減衰がどれだけ速いかに関係する）が、試料アレイの像を最適化するために形作られかつ更に制御されることができるように、それぞれの光反射アセンブリに光学素子を与える。厚さ及び光学特性（屈折率及び反射率特性を含む）などの制御層パラメータに依って、制御層３８及び６０は、有利には、バックグランドノイズの柔軟な制御のための試料スライドの特定の領域で及び／またはより鋭くない角度でエバネッセント波の生成の制御を可能にさせる。エバネッセント波の染み出しの深さを制御することによって、キャリヤ媒体からのノイズが低減されることがある。例えば、エバネッセント波の染み出しの深さが、バイオチップがデザインされるレセプタ／リガンド複合体の正味高さより深くなければ、ノイズの寄与及び媒体からのドリフトは最小になることになる。
【００３８】
一例では、制御層は、ガラス、液晶、金属膜及び／または半導体材料で構成されることがある。更なる例では、液晶は電圧をかけられて制御層の光学特性をシャッタ、変調及び／または最適化し、それによって制御層に隣接して生成されるエバネッセント波の制御を可能にすることがある。金属膜には、金、銀、チタン及び／またはクロムが含まれることがある。また別の例では、エバネッセント波の高さ及び強度を制御するために、金属膜の電気伝導度を変化させるように金属膜に電位が印加されることがある。
【００３９】
制御層は、臨界角の鍵である。高屈折率材料は、より少ない傾斜角でのＴＩＲ及びエバネッセント波の生成（及び結果としてイメージング）を可能にさせ、それによってアスペクト比の歪み及び焦点面傾斜を低減することによって像の品質を向上させる。分析物と流体媒体間の屈折率の対比を与える基板材料の使用は、有利である。広がりが大きければ大きいほど、感受性は高い。
【００４０】
制御層３８及び６０はまた、試料４２及び６４とそれぞれ相互作用する光反射表面を供給し、所定の分子の結合のためのレセプタの正確な位置決めを可能にすることがある。光反射表面上に、生体分子物質など所定の分子に対する親和性を有する結合手段が含まれることがある。それゆえ、結合手段は、所定の分子に関する情報が集められるようにレセプタ／捕捉物質を光反射表面に結合するために用いられる。有利には、制御層３８及び６０は、例えば特定のタンパク質を利用してレセプタ特異領域に対する柔軟な制御を可能にする。
【００４１】
制御層３８及び６０には、半導体、金属（金、銀、チタンまたはクロムなど）及び／またはプラスチックから選択される材料で構成される光反射表面が含まれることがある。更なる例では、光反射表面は、シラン材料、例えばガラスで構成されることがあり、結合手段は、光反射表面をシラン処理するために、生体分子への親和性を有するシラン処理剤、例えばエポキシまたはアルデヒドを含むことがある。また更に別の例では、光反射表面は、金属、例えば金、銀、チタン及び／またはクロムで構成されることがあり、結合手段は、捕捉物質を付着させるかまたは光反射表面を追加層のために誘導体化するために、チオールなどの硫黄含有化合物を含むことがある。有利には、チオールは、存在するか、または種々の結合親和力（chemistry）によってタンパク質、核酸、ポリエチレングリコールなどの種々のレセプタ／捕捉物質に容易に結合される。
【００４２】
直接ガラス表面上にレセプタを固定化することは、シッフ塩基、シッフ塩基、エポキシド形成をそれぞれ用いてガラス表面に、そしてレセプタまたは化学的に誘導されたレセプタ部分に、共有結合されたアミノシラン、アルデヒドシラン、エポキシシランのクラスの種々のメンバを用いて行われることがある。合成オリゴヌクレオチドが、反応性部分を付着させることによってよりもむしろホスホラミダイト親和力を用いて、直接ガラスに結合されることもある。
【００４３】
同様に、レセプタ固定化のために表面積を増大させるため、面積エネルギー（ウェッティング）を目的に合わせて作るため、及びリガンド分子によって非特異的吸着を妨げるために、上述のアミン、アルデヒド、またはエポキシ部分を有している直鎖または分枝の炭水化物、脂質、または他の合成ポリマーが用いられることがある。脂質二重層は、生体におけるそのような層に通常存在するレセプタ分子の研究のための固定化層として役立つことがある。表面結合アビジンまたはビオチンは、アビジン化またはビオチン化されたレセプタ分子への中間リンカーまたはさらに別の中間層として役立つことができる。
【００４４】
ニトロセルロースは、表面積の大きな複雑かつ多孔質の表面を有し、分離及び「ブロッティング」実験のために伝統的に用いられる伝統的な電荷に基づく（charge-based）核酸及びタンパク質結合媒体である。これらの技術において伝統的に利用されているよりも薄いニトロセルロースは、本発明内での使用に特に有利である。多孔質ニトロセルロース膜は通常１ミクロン厚またはそれ以上であるが、ニトロセルロースは、フィルム（薄膜）またはスライドなどの固体にキャストされることができる。キャストニトロセルロースは、滑らかな反射表面で約１．６２の屈折率を有し、生体分子結合ポイントのみならず試料スライド基板またはプリズム／格子基板としても用いられることができる。しかし、キャスト材料は表面積が小さく、材料の結合は疎であることになるので、溶蝕、吸着、成長、または機械的手段を用いてλ／２以下に粗面化された表面は有利である。ニトロセルロースの化学的な誘導体化及び表面変化操作も有利であることがある。多孔（マイクロタイター）プレートの製造に用いられる多種多様の他の工業用熱可塑性樹脂（エンジニアリングプラスチック）もまた、レセプタ分子を共有結合するかまたは静電気的に保持するために誘導体化されることができる。透過的でありかつ１．６以上の屈折率を有する工業用熱可塑性樹脂は、さらに高い感受性及び像品質に有利である。
【００４５】
本発明の方法及び装置は、離散的な試料スポットを有する型のバイオチップ、または分析のための離散的なスポットのアレイまたは位置を含むマイクロタイタープレートと組み合わせて用いられることができる。ここで、検出される偏光状態の変化は、反射ビームにおける離散的な位置に空間的に関係している。従って、本明細書中で用いられているように、制御層及び試料は、検査されるのが望ましいような任意の化学的または生物学的アレイを指す。上述の装置及び方法は、水性媒体中における物質のイメージングに特に有益である。
【００４６】
上述のように本発明は、ガラスまたはプラスチック製のチップなどの光透過物質の表面上のバイオチップアレイ要素の結合状態のリアルタイムイメージングのための高感受性の光学イメージングシステムを提供する。大きさがイメージングオプティクスの横解像度と釣り合っている離散的な試料スポットを有するような、２０ｍｍ円形領域に内接される１５ｍｍ四方の典型的な観察されるアレイは、５００万までのセンサフィールドの完全に平行な連続リアルタイム読出をもたらす。表面取着に対するセンサ感受性は、フェムトグラム／ｍｍ２の範囲（例えば１平方ミクロン当たり１ＤＮＡ）である。
【００４７】
図１の装置は、バイオチップ上に反応のパターンをイメージングすることによって作動する。それらの反応は、各スポットで反応する物質の高さ、表面濃度及び／または屈折率の変化を生じさせる。イメージングされる領域は、バイオチップアレイ全体またはバイオチップアレイ全体の一部であり得る。異なる物質のスポットのアレイを与えることによって、スポットを流れた検査物質中の異なる構成成分が、それらの構成成分を識別するように結合する。アレイの異なるスポットにおける種々の物質の位置をコンピュータメモリに含めることによって、図１の装置により生成される像は、検査物質における構成成分を識別し、経時的に連続的にイメージングすることによって反応が生じる速度を決定することもできる。上述の装置によって、バイオチップアレイ上のスポット間で高さ変化率または高さ変化の中間量の比較を許容するのみならず、中間高さ変化の読みが記録されることができ、それゆえ高さ変化率が決定されることができるような短期間の間に、高さの差が動的にイメージングされることができる。
【００４８】
装置及びバイオチップを用いる処理は、以下の通りである。
【００４９】
スポットを有するスライドの表面が光反射表面（一例ではＴＩＲ表面）であるように装置と組み合わせてフローセルにバイオチップ表面を置く。先ず、装置を較正し、それでバイオチップから反射された光が完全に線形の偏光を生じさせる。そして、アナライザをヌルポジションに調整し、線形偏光光を完全に遮断する。
【００５０】
ヌルポジションが達成されるとき、チップ（スライド）表面が初期状態から外れる各領域は、明るいスポットとしてくっきり際立ち、その強度は、ずれによって導かれる厚さ（高さ）の差に直接関係する。標的分子を含む溶液は、バイオチップ表面全体に流される。バイオチップによって反射される光の偏光の変化によって生じる強度変化は、バイオチップ上で生じる厚さ変化を調べるためにアレイを横切って連続的に観察されることがある。検出器で測定される相対強度は、サンプルパラメータと、詳細な「ジョーンズ計算（Jones calculus）」または「ミューラー計算（Mueller calculus）」センサシステムの説明に基づきコンピュータプログラムを用いた偏光素子の設定とに関連する。これらのプログラムを用いて、理論的プロットは得られた測定データの集合にフィットされ、出力のパラメータ変数への依存は可視化されることができる。
【００５１】
手順の開始時に、バイオチップ全体の像が均一に暗くなるように装置が調整される。標的分子が基準プローブに結合し始めると、スポットの像の強度が増す。強度は、親和性の高い相互作用で最高になると予測され、親和性の低い相互作用に対して穏やかな変化が予測される。強度変化の速度は、親和性に関するシステムの制約に関連することがある。例えば、適切に作製されたバイオチップを用いて、１つの手順中に複数のレセプタに対する親和性測定を行うことができる。更に、（スポッティングにおいて異なる濃度のレセプタが用いられるので）結合密度の効果を測定し、立体障害（例えば、形状干渉、込み合いなど）が存在するかどうかを判定し、測定値のダイナミックレンジを示すこともできる。
【００５２】
参照しているのはヌリング（nulling）楕円偏光法であるが、オフヌル（off-null）または位相変調楕円偏光法もまた本発明の範囲内にある。有利には、オフヌル及び位相変調楕円偏光法は共に、より高いレベルの光スループットで２次元検出器（例えば、ＣＣＤ、ＣＭＳＯＳ）のさらに高いノイズ特性を利用することができる。
【００５３】
上記の例ではバイオチップを参照しているが、手順及び結果は一般的に、光反射表面上の化学的感光物質に適用される。
【００５４】
本発明について、光反射表面を有しかつ当該表面上に分子スポットのアレイを有するプリズムに関して上記のように説明してきた。別の実施形態では、これもまた上述のように、プリズム上に配置された別々のスライドまたは制御層の上面のみが光反射表面を形成するように、アレイは、スライドまたは制御層上に形成される。両者の間には屈折率整合液が用いられる。
【００５５】
本発明の上記実施形態は、例証となることを意図しているに過ぎず、何ら限定するものではない。広義な態様において本発明から逸脱しない限りにおいて、種々の変更及び改変がなされることがある。それゆえ、本発明は、特定の構造、寸法または処理パラメータに限定されるものではない。従って、特許請求の範囲の請求項が、本発明の真の精神及び範囲内にある全てのそのような変更及び改変を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の原理に基づく例示的なシステムのブロック線図である。
【図２】図１のシステムの一実施例のブロック線図である。
【図３】図１のシステムの別の部分のブロック線図である。
【図４】図１のシステムの別の部分のブロック線図である。
【図５】図１のシステムの別の部分のブロック線図である。
【図１】
2007538256.tif 000003
【図２】
2007538256.tif 000004
【図３】
2007538256.tif 000005
【図４】
2007538256.tif 000006
【図５】
2007538256.tif 000007
【国際調査報告】
2007538256.tif 000008