(57)【要約】本発明はコメ基質からコメタンパク質濃縮物を生成する方法に関係する。この方法は、可溶化されたコメデンプン分画及び不溶性タンパク質を含む残渣分画を得るために７２℃以下の温度において、約３．０−６．５のｐＨにおいて顆粒デンプン加水分解（ＧＳＨ）活性を有する酵素及び第二デンプン加水分解酵素をコメ基質と接触させて酵素的に加水分解する工程と、コメタンパク質濃縮物を得るために、前記残渣から可溶化されたデンプンを分離する工程を含むことを特徴とする。このコメタンパク質濃縮物は動物飼料及びヒト食品用製剤に用いられる。【選択図】図３
2007531515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コメ基質からコメタンパク質濃縮物を製造する方法であって、
ａ）可溶化されたデンプン分画及び不溶性タンパク質を含む残渣分画を得るために、コメ基質中の大半部分のデンプンを加水分解するのに十分な時間、７２℃以下の温度及び３．０乃至６．５のｐＨにおいて、ｉ）顆粒デンプン加水分解（ＧＳＨ）活性を有する酵素及びｉｉ）第二デンプン加水分解酵素を用いて、コメ基質を酵素的に加水分解する工程と、
ｂ）コメタンパク質濃縮物を得るために、前記残渣から可溶化されたデンプン分画を分離する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記ＧＳＨ活性を有する酵素がグルコアミラ−ゼであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グルコアミラ−ゼがフミコ−ラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、リゾプス(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)、又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株由来であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第二デンプン加水分解酵素がアルファアミラ−ゼであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アルファアミラ−ゼがバクテリア源由来であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＳＨ活性を有する酵素がトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)株又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株中における異種のＧＳＨ酵素の発現により得られることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記コメタンパク質濃縮物を精製する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記コメタンパク質濃縮物を乾燥する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量が少なくとも２０％であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記コメ基質がスラリ−であり、かつ１０乃至５５％の乾燥固形含量を有することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記温度が７０℃及び５５℃の間であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ｃ）可溶化されたデンプン及び不溶性コメタンパク質を含む分画を得るために、ＧＳＨ活性を有する酵素及びデンプン加水分解酵素を用いて、約３．０乃至６．５のｐＨ及び７０℃乃至５５℃の幅の温度において、工程ｂ）で得られたコメタンパク質濃縮物を酵素的に加水分解する工程と、
ｄ）高純度コメタンパク質濃縮物を得るために前記分画を分離する工程とを更に含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程ｄ）で得られた高純度コメタンパク質濃縮物を乾燥する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程ｃ）のデンプン加水分解酵素がアルファアミラ−ゼであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記高純度コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量が少なくとも約６０％であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１又は請求項１２に記載の方法により得られたコメタンパク質濃縮物。
【請求項１７】
請求項１又は請求項１２の方法に従って得られたコメタンパク質濃縮物を含む動物飼料製剤。
【請求項１８】
請求項１又は請求項１２に記載の方法に従って得られたコメタンパク質濃縮物を含むヒト食品用製剤。
【請求項１９】
動物飼料のタンパク質含量を高める方法であって、
ａ）コメ基質中にあるデンプンの６０％を加水分解するのに十分な時間、７２℃以下の温度で、デンプン加水分解酵素及び顆粒デンプン加水分解（ＧＳＨ）酵素酵素を含む酵素の混合物にコメ基質を接触させる工程と、
ｂ）可溶化されたデンプン基質分画及び不溶性タンパク質を含む残渣を得る工程と、
ｃ）コメタンパク質濃縮物を得るために、前記残渣を分離する工程と、
ｄ）動物飼料に前記コメタンパク質濃縮物を添加する工程とを、含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記デンプン加水分解酵素がアルファアミラ−ゼであることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
可溶化されたデンプンを含む分画及び不溶性コメタンパク質を含む残渣を得るために、工程ｄ）において得られた残渣をＧＳＨ酵素及び任意でデンプン加水分解酵素に接触させる工程と、
高純度コメタンパク質濃縮物を得るために、前記残渣を分離する工程と、
前記高純度コメタンパク質濃縮物を動物飼料に添加する工程とを更に含むことを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項２１の方法により得られた高純度コメタンパク質濃縮物を含む動物飼料。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本出願は、２００４年２月２３日に出願された、米国継続出願Ｎｏ．６０／５４７，１５３、標題、「高純度コメタンパク質濃縮物の調製のための方法」、に対して優先権を主張する、この文献の内容を引用により本明細書に援用する。
【０００２】
本発明はコメタンパク質濃縮物及びそれらの調製方法に関係する。この方法は、可溶化された顆粒加水分解物を含む分画及び不溶性コメタンパク質を含む残渣を得るために、コメ基質の変性温度以下の温度及びコメタンパク質の等電点付近のｐＨにおいて、コメ基質を酵素的に加水分解する工程と、並びにコメタンパク質濃縮物及び特に、高純度コメタンパク質濃縮物を得るために、不溶性コメタンパク質を含む残渣から、可溶化されたデンプン加水分解物を含む分画を分離する工程を含む。
【背景技術】
【０００３】
コメは世界の人口の半分以上が食する主要穀物である。タンパク質（８％）及びデンプン（８０％）がコメの主要な構成成分である。コメタンパク質は好ましい食物成分であるけれども、コメは、そのデンプン及びデンプン加水分解物を得るために工業的な処理を受け、コメタンパク質は主に動物用飼料用製品に用いられる。
【０００４】
可溶化されたコメデンプン顆粒加水分解物を製造し、コメタンパク質から分離する方法は知られている。一般的に、コメ粉からコメタンパク質を分離する工程は、高い温度において加熱することによりコメデンプンを可溶化し、この後にデンプンを分解するアミラ−ゼを用いた加水分解をすることにより行う（例えば,  Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  (１９８１)  Ｆｏｏｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３５：  ３８−４２；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  (１９８４)  Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．  ３５：  １１２８−  １１３５；  ａｎｄ  Ｓｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  (１９９７)  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．  ７４：  ４３７−４４１  ａｎｄ  Ｊｕｌｉａｎｏ  Ｂ．Ｏ．  (１９８４)  ＩＮ  ＳＴＡＲＣＨ：  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．  Ｅｄ．  Ｒ．  Ｌ.  Ｗｈｉｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ,  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ５０７−５２８）。より具体的には、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ.  ａｌ.、(Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，７４４，  ９２２)  は従来の高温及び高圧プロセスを用いてコメデンプンを加水分解する方法を開示した。Sloct  et.  al.、  (ＵＳ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．３，９１２，５９０)は、コメデンプンを可溶化し、その後に熱安定性アルファアミラ−ゼを用いた加水分解を行う方法を開示した。Ｅｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９９０，３４４）は、マンナ−ゼ、アルミニウム、及びフィチン酸のレベルを減らし、熱安定性アルファアミラ−ゼと共に高い温度でコメデンプンを可溶化し加水分解することにより、乳児食における消化を改善する、コメタンパク質濃縮物を製造する方法を報告した。
【０００５】
上で報告された方法は、通常90℃くらいの高い温度で実施する。これらの顆粒デンプンを可溶化する温度において、コメの中のタンパク質は変性する。コメタンパク質は、通常、約75℃（Ｊｕ  ｅｔａｌ．，  (２００１)  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  ６６：  ２２９−２３２）において、変性すると報告されている。タンパク質の変性は食料製品の中で機能する多くの性質を損失することになる。例えば、高温処理により生産されたコメタンパク質濃縮物の栄養価及び消化率は、工業的標準として用いられているミルクタンパク質であるカゼインの栄養価よりも低い（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔａｌ．，  (１９９３)  J.  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  ５８：  １３９３−１４０６  ａｎｄ  Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  (１９９３)  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  ５１：  ４６４−４６７）。それゆえ、上述したように、高温調理に起因する、工業的に生産されたコメタンパク質は、主に動物使用市場で販売されている。
【０００６】
デンプンを可溶化しないでコメ基質からコメタンパク質を分解する方法は多くの不利益が存在する。このプロセスは、破壊的且つ高価であり、さらに生産性が低い。加えてこのような工程に通常用いられるアルカリ、酸及び界面活性剤を多く含む化合物は、特に、タンパク質が食品製品に用いられるときには好ましくない。
【０００７】
コメタンパク質は、それらが低刺激性であり（Ｈｅｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，  (１９９６)  Ｃｅｒｅａｌ  Ｆｏｏｄｓ  Ｗｏｒｌｄ  ４１  ：  ８３９−８４３）、メチオニンのような必須アミノ酸を多く含む（Ｔｅｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  (１９７１)  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．  ４８：  ９１−２０２）ことから価値がある。それゆえ、デンプン処理工程において用いたコメ基質から得られるコメが変性されていないことを特徴とする発展した工程により処理されるデンプン副生成物としてのコメタンパク質の量及び質を改善することが望まれている。このタンパク質はヒトにおける食品のようにその後各種製品に適用される。このタンパク質はその後、ヒトの食料用製品等の、各種製品に適用される。例えば、グルタミン酸一ナトリウムの製造における微生物発酵の間、莫大な量のコメ基質が用いられる。
【０００８】
中国だけで、約２．６メ−トルトンのコメ基質が1.0×１０６メ−トルトンを超えるグルタミン酸一ナトリウムの生産に見合うために必要とされる。もし、ＭＳＧ生産が変性タンパク質副生成物とは相反する高純度コメタンパク質濃縮物を生産するならば、多くの利益が得られるだろう。
【０００９】
本発明はコメ濃縮物、特にデンプン処理工程の間に得られた高純度コメタンパク質濃縮物を生産するための方法を提供する。この工程は、タンパク質及びデンプンを含むコメ基質を高い濃度に曝すことを含まず、しかし、その代わりに、コメ基質タンパク質の変性温度以下の能度に基質を曝すことを含む。
【００１０】
本発明の方法により製造されたコメタンパク質濃縮物はヒトにおける食品及び動物における飼料における使用を含む各種製品に用いられる。一般的にコメタンパク質は高レベルの必須アミノ酸を有し、ヒトにおいて低アレルゲン性であることから、本発明に包含される方法に従ってコメタンパク質濃縮物を得ることは更なる利益を有する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明の目的は、第一デンプン加水分解酵素が顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨ）であることを特徴とする、２つのデンプン加水分解酵素にコメ基質を接触させることにより、コメ基質の中に含まれるコメタンパク質の変性温度以下の温度及びコメタンパク質の等電点ｐＨで又はその付のｐＨにおいて顆粒コメ基質を加水分解することによりコメ基質から高純度コメタンパク質濃縮物を調製するための方法を提供することである。
【００１２】
一の側面において、本発明はコメ基質からコメタンパク質濃縮物を製造する方法であって、(ａ)第一デンプン加水分解酵素が顆粒デンプン加水分解(ＧＳＨ)酵素であることを特徴とし、可溶化されたデンプン加水分解物を得るためにコメ基質に含まれるコメタンパク質の変性温度以下の温度及びコメタンパク質の等電点において、１６％〜５５％の乾燥固形含量を有するコメ基質を２のデンプン加水分解酵素の組み合わせに接触させる工程と、及び（ｂ）コメタンパク質濃縮物を得るために可溶化されたデンプン加水分解物を分離する工程を含む方法である。
【００１３】
本発明の一の態様において、変性温度は７０℃以下である、ｐＨは３．０−６．０の間である。
【００１４】
第二の態様において、加水分解酵素は、アルファアミラ−ゼ及びグルコアミラ−ゼである。
【００１５】
第三の態様において、グルコアミラ−ゼはフミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)株(Ｈ−ＧＳＨＥ)又はアスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ株である。
【００１６】
第四の態様において、アルファアミラ−ゼは、バチルス由来であり、特にバチルススレアロセレモフィリス株由来である。
【００１７】
第五の態様において、ＧＳＨＥは組換えトリコデルマ株、特に、フミコ−ラグリセアＧＳＨＥ（ｒＨ−ＧＳＨＥ）又はアスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチＧＳＨＥ（ｒＡ−ＧＳＨＥ）をコ−ドする遺伝子を発現するトリコデルマ株である。
【００１８】
第六の態様において、分離工程から得られたコメタンパク質濃縮物は、少なくとも４０％のタンパク質含量（Ｎ×５．９２）を有する。他の好ましい態様において、分離工程から得られたコメタンパク質濃縮物は、少なくとも６０％のタンパク質含量（Ｎ×５．９２）を有する。他の態様において、コメタンパク質濃縮物は少なくとも約６５％のタンパク質含量を有する高純度コメタンパク質濃縮物である。
【００１９】
第七の態様において、本発明は、本発明に包含される方法に従って得られたコメタンパク質濃縮物に関係する。
【００２０】
第二の側面において、本発明は、コメ基質から高純度コメタンパク質濃縮物を製造する方法に関係し、該方法は、
（ａ）１のデンプン加水分解酵素が、顆粒デンプン加水分解酵素であることを特徴とし、コメ基質の顆粒デンプンの部分を加水分解するのに十分な時間、コメ基質に含まれるコメタンパク質の変性温度以下の温度及び約３．０−６．０の間のｐＨにおいてコメ基質のスラリ−を２のデンプン加水分解酵素と共にインキュベ−ションする工程と、（ｂ）相当量の不溶性コメタンパク質濃縮物を得るために、インキュベ−ションしたスラリ−からデンプン加水分解物を分離する工程とを含む。
【００２１】
この側面の一の態様において、（ｃ）高純度コメタンパク質濃縮物を得るために、この残渣が実質的に全ての基質から遊離されるまで十分な時間の間、デンプン加水分解物と共にコメ基質に含まれるコメタンパク質の変性温度以下の温度で、相当量の不溶性コメタンパク質濃縮物を含む残渣をインキュベ−トする工程と、
（ｄ）高純度コメタンパク質濃縮物を分離する工程とを更に含む。
【００２２】
この側面の第二の態様において、インキュベ−ション温度は約７０℃であり、他の態様においては、インキュベ−ション温度は約６０℃である。
【００２３】
第三の態様において、工程ａ）の第二デンプン加水分解酵素は、アルファアミラ−ゼである。
【００２４】
第四の態様において、前記アルファアミラ−ゼは、バシルス由来であり、特にバシルス・ステアロセレモフィリス由来である。
【００２５】
第五の態様において、顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨＥ）はフミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)株（Ｈ−ＧＳＨＥ）由来のグルコアミラ−ゼである。
【００２６】
第六の態様において、ＧＳＨＥはトリコデルマ株、特にトリコデルマレ−シ株において、発現されたフミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)株由来のＧＳＨＥである。
【００２７】
第七の態様において、インキュベ−ション工程のｐＨは約４．０乃至６．０の間である。
【００２８】
第八の態様において、一方又は両方のインキュベ−ション工程の酵素反応は、約ｐＨ４．０未満の値のｐＨに低めることによって停止される。
【００２９】
第九の態様において、工程（ａ）のインキュベ−ションは約２４時間である。
【００３０】
第十の態様において、９０％より多い顆粒コメデンプンがインキュベ−ション工程（ａ）において加水分解され、更なる態様において、９０％より多い残りのデンプンがインキュベ−ション工程（ｃ）において加水分解される。
【００３１】
第十一の態様において、高純度コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は少なくとも６５％である。
【００３２】
第十二の態様において、コメタンパク質濃縮物は水分含量が１０％未満であることが望ましい。
【００３３】
第三の側面において、本発明は、ここで述べる方法に従って得られた高純度コメタンパク質濃縮物に関係し、前記高純度コメタンパク質濃縮物は少なくとも６５％のタンパク質を含む。
【００３４】
第四の側面において、本発明はコメ基質から高純度コメタンパク質濃縮物を生産する方法に関係し、前記方法は、（ａ）コメ基質のスラリ−をｉ）バチルスステアロセレモフィリスから得られたアルファアミラ−ゼ及びｉｉ）トリコデルマレ−シ宿主細胞の中におけるフミコ−ラグリセアｖａｒ．カワチＧＳＨＥの発現から得られた顆粒デンプン加水分解酵素と共に、コメ基質の顆粒デンプンの少なくとも９０％を加水分解するのに十分な時間、約７０℃乃至５０℃の間の温度、及び約３．０乃至６．０の間のｐＨにおいて、インキュベ−ションする工程と、（ｂ）コメタンパク質濃縮物を含む残渣を得るためにインキュベ−トされたスラリ−からデンプン加水分解物を分離する工程と、（ｃ）少なくとも６５％のタンパク質含量を有する高純度コメタンパク質濃縮物含む残渣を得るために、前記残渣の顆粒デンプンの少なくとも８０％が加水分解するのに十分な時間、７０℃乃至５０℃の間の温度、及び約３．０乃至６．０のｐＨにおいて、アルファアミラ−ゼ及びＧＳＨＥを用いてコメタンパク質濃縮物を含む残渣をインキュベ−ションする工程と、（ｄ）高純度コメタンパク質濃縮物を回収する工程とを含む。
【００３５】
第五の側面において、本発明は動物飼料のタンパク質含量を高める方法であって、
ａ）コメ基質の中のデンプンの６０％を加水分解するのに十分な時間、７２℃以下の温度で、デンプン加水分解酵素及び顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨ）酵素を含む酵素の混合物に、コメ基質を接触させる工程と、
ｂ）可溶化されたデンプン基質及び不溶性タンパク質を含む残渣を得る工程と、
ｃ）コメタンパク質濃縮物を得るために、前記コメタンパク質濃縮物を分離する工程と、
ｄ）動物飼料に前記コメタンパク質の濃縮物を添加する工程とをを含む方法に関係する。
【００３６】
一の態様において、デンプン加水分解酵素はＧＳＨ酵素及びアルファアミラ−ゼを含む。第二の態様において、この方法は更に、可溶化されたデンプン及び不溶性のコメタンパク質を含む分画を得るために顆粒デンプン加水分解酵素を含むデンプン加水分解酵素と共に不溶性タンパク質を含む残渣に接触させる工程と、高純度コメタンパク質濃縮物を得るために、不溶性コメタンパク質を分離する工程と、及び前記高純度コメタンパク質濃縮物を動物に添加する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
幾つかの側面において、本発明は遺伝子工学及び分子生物学の分野において日常的に用いられている技術に関係する。ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ  ａｌ,.  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（２ｎｄ  Ｅｄ．，１９８９）及びＫｒｅｉｇｌｅｒ，  ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ
ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  Ａ    ＭＡＮＵＡＬ（１９９０）；  及び  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ。  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９４）には本発明に用いられるそのような技術が記載されている。
【００３８】
他の違った方法で定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び化学的言語は、本出願に関係する技術分野において当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｉｎｓｂｕｒｙ,  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,  2ｄ  Ｅｄ.,  ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ,  ＮＹ  (1994)及び  Ｈａｌｅ  ａｎｄ  Ｍａｒｈａｍ,  Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ,  Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ,  ＮＹ  (１９９１)は、本発明の技術分野の当業者が利用する、そして本発明において多く用いられている用語の一般的な辞書である。本明細書で述べられているのと同じかあるいは類似の多くの方法及び物質は本発明の実施に用いることができるけれども、本明細書中では特定の好ましい方法及び物質にのみ言及する。
【００３９】
本発明は、以下の定義及び実施例を参照することにより詳細に説明される。本明細書で参照する開示されている全ての配列を含む、全ての特許及び刊行物は参照により本発明の明細書に援用される。
【００４０】
数値範囲は幅を定義している数値を含むものする。
【００４１】
違った形で定義しない限り、核酸は配列は左から右に向かって5’から3’を示し、アミノ酸配列は左から右に向かってアミノ末端からカルボキシ末端を示す。
【００４２】
更に、本明細書で付す標題は本発明の各種側面を限定するものではない。発明は明細書全体を参照して理解されるべきである。
【００４３】
A.定義
「コメ」の語は、Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａの系統に分類される植物を意味する。
【００４４】
「コメ基質」の語は、全粒、粉砕粒、コメグリッツ及びコメ粉のようなコメ（精製又は未精製）の全形態及び植物のあらゆる部分を含む。
【００４５】
「デンプン」という語は、植物の多糖複合体を含むあらゆる物質であって、アミロ−ス及び/又はアミロペクチンを含む化学式(Ｃ６Ｈ１０Ｏ５)Ｘ(Ｘは任意の整数)で表されるあらゆる物質を言う。
【００４６】
「粒デンプン」という語は、ゼラチン化されていない、非加熱(生の)デンプンを言う。
【００４７】
「ゼラチン化」という語は、粘性のある懸濁液を形成するためのデンプンの可溶化を言う。
【００４８】
「コメタンパク質濃縮物」の語は、本発明の方法に従って、コメ基質から可溶化されたコメデンプン分画の大部分を分離することにより得られたタンパク質分画を意味する。このコメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は少なくとも１０％である。
【００４９】
「高純度コメタンパク質濃縮物」の語は、本発明の方法に従って得られた、コメ基質から可溶化されたコメデンプン加水分解物の相当部分の分離から得られたタンパク質分画を意味する。
【００５０】
高純度コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は少なくとも約６０％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、８０％又はそれ以上である。
【００５１】
「タンパク質」の濃度は、１以上のポリペプチドからなる大きい分子量のポリマ−を意味し、そのモノマ−はペプチド結合によりお互いに結合しているアミノ酸である。「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は本明細書において互換的に使用される。アミノ酸残渣を表すのに従来使用されている１文字又は３文字のコ−ドは本明細書において使用する。
【００５２】
「変性温度」の語は、二次及び三次構造が崩壊する結果タンパク質がその機能を失う温度を意味する。通常、この温度において沈殿が生じる。
【００５３】
「等電点」の語は、タンパク質が正味ゼロ電荷になる溶液のｐＨを意味する。
【００５４】
「ＤＥ」又は、「デキストロ−ス当量」の語は、総還元糖の濃度を測定する工業的基準であり、乾燥重量に対する、Ｄ−グルコ−スの割合として計算される。非加水分解粒デンプンのＤＥは０であり、Ｄ−グルコ−スは１００のＤＥを有する。
【００５５】
「総糖含量」の語は、デンプン組成物中に存在する総糖含量を言う。
【００５６】
「乾燥固形成分」及び「ｄｓ」の語は、懸濁液中の化合物(例えば小麦)の乾燥重量成分の総量(ｉｎ  ％)を言う。
【００５７】
「スラリ−」の語は、不溶性物質を含んでいる水溶性混合物を言う。
【００５８】
「ブリックス」の語は、所定の温度における、溶液中の糖含量を測定するための比重単位を言う。従って、「ブリックス」は、溶液中に存在する可溶性糖の量を意味する。このブリックス計測器は、水溶性糖溶液の１００グラム当たりに存在するスクロ−スのグラム数を測定する(可溶性固形含量の総量)。ブリックス測定値は、比重計あるいは、屈折計によって測定される。
【００５９】
「デンプンの加水分解」の語は、水分子の付加を伴うグリコシル結合の切断を意味する。
【００６０】
「コメ基質のデンプンの相当部分の加水分解」又は「コメ基質から可溶化された加水分解物の相当部分の分離」の語は、コメ基質の中の、又は残渣の中の少なくとも８０％のデンプンが可溶化され、及び加水分解されていることを意味する。
【００６１】
「重合度(ＤＰ)」の語は、与えられた糖中の無水グルコピラノ−ス単位の数を言う。ＤＰ１の例は、グルコ−ス及びフルクト−ル等の、単糖である。ＤＰ２の例は、マルト−ス及びスクロ−ス等の二糖である。「ＤＰ４+」(>ＤＰ３)は、重合の程度が３以上であるポリマ−を意味する。
【００６２】
「アミラ−ゼ」の語は、デンプンの加水分解を触媒する酵素を言う。
【００６３】
「アルファアミラ−ゼ」という語は、アルファ１,４グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を言う(Ｅ.Ｃ.３．２.１．１)。これらの酵素もまた、１,４−アルファ結合を有するＤグルコ−ス単位を含む多糖中の１，４−アルファＤグルコシド結合のエキソ及びエンド型加水分解作用を有することが知られている。グリコゲナ−ゼもこれらの酵素と同義である。通常これらの酵素は、アルファ１，４グルカン４−グルカノヒドラ−ゼ、グルカノハイドラ−ゼを含む。
【００６４】
本明細書において互換的に使用される「糖化酵素」及び「グルコアミラ−ゼ」の語は、アミログルコシダ−ゼクラスの酵素を意味する(Ｅ．Ｃ．３．２．１．３、グルコアミラ−ゼ、アルファ１，４−グルカングルコシダ−ゼ)。これらはエキソ作用型酵素であり、アミロ−ス及びアミロペクチンの非還元末端からグルコシル残渣を切り離す。この酵素は、アルファ−１，４結合よりは低い割合ではあるけれども、アルファ１，６−及びアルファ１，３−結合を加水分解する。
【００６５】
「顆粒デンプン加水分解酵素(ＧＳＨＥ)」又は「顆粒デンプン加水分解活性を有する酵素」の語は、グルコアミラ−ゼ活性及び顆粒形態のデンプンを分解する能力を有する酵素を意味する。
【００６６】
本明細書において、「組換え体」という語は、非相同核酸又はタンパク質の導入又は天然核酸又はタンパク質の変性により修飾された、細胞、核酸、タンパク質またはベクタ−又はそのように修飾された細胞由来の細胞についても用いられる。従って、例えば、組換え細胞は、天然(非組換え)型の細胞内に同一の形態では見られない遺伝子を発現する。或いは組換え細胞は、他の方法で豊富に過剰発現する、あるいは、未発現の状態にある、あるいは、全く発現しない、天然遺伝子を有する。
【００６７】
「組み換えＧＳＨＥ」、「組み換えにより発現されたＧＳＨＥ」及び「組み換えにより生産されたＧＳＨＥ」の語は、異種ポリヌクレオチドから宿主細胞において、生産された成熟ＧＳＨＥタンパク質配列を意味する。「ｒ」は組換え体を意味する。ｒＧＳＨＥのタンパク質配列はシグナル配列を含む。一の態様において、ＧＳＨＥはトリコデルマレ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)の株内で発現するフミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)を「ｒＨ−ＧＳＨＥ」と記載する。
【００６８】
「天然のＧＳＨＥ」及び「ｎＧＳＨＥ」の語は組換えＧＳＨＥを発現する糸状菌宿主細胞以下の微生物宿主細胞有機体から提供されるＧＳＨＥを意味する。好ましい天然ＧＳＨＥはフミコ−ラグリセア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ)株又はアスペルギルスアワモリ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ)株である。
【００６９】
「グリコシル化」の語は、糖質部分の付加によるタンパク質の翻訳後調節を意味する。この糖質は、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかに結合し、グルコプロテインになる。グルコプロテインのＮ結合した糖質部分は、アスパラギン残渣のβアミノニトロゲンへグリコシル結合により付加される。Ｏ結合した糖質はセリン又はスレオニン残渣のヒドロキシ基を通じてグリコシル結合する。
【００７０】
「シグナル配列」という語は、細胞の外に成熟タンパク質の分泌を促進するタンパク質のＮ−末端部分に結合するアミノ酸配列部分を言う。この細胞外タンパク質の成熟形成は、分泌過程の間に切除されるシグナル配列を欠いている。
【００７１】
ここで用いる、「遺伝子」の語はポリぺプチド鎖の生成に関するＤＮＡセグメントを意味し、個々のコ−ド断片(エクソン)間の介在配列(イントロン)だけでなく、コ−ド領域に先行または後に続く領域を含む。
【００７２】
ここで用いる、「核酸」の語はＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの一本鎖又は二本鎖形態、及びそれらの化学修飾体を包含する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の語は、ここにおいて互換的に用いる。遺伝子コ−ドの縮退により１以上のコドンが特定のアミノ酸をコ−ドするために使用されることになるので、本発明は特定のアミノ酸配列をコ−ドするポリヌクレオチドを包含する。
【００７３】
「ベクタ−」の語は、１以上の細胞タイプの核酸に所望の配列を導入するためのポリヌクレオチドを意味する。ベクタ−は、クロ−ニングベクタ−、発現ベクタ−、シャトルベクタ−、プラスミド、ファ−ジ粒子、カセット等を含む。
【００７４】
「発現ベクタ−」の語は、適切な宿主におけるＤＮＡの発現に影響を与える適切な制御配列に作動可能に結合しているＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体を意味する。そのような制御配列は、転写に影響するプロモ−タ−、翻訳を制御する追加的なオペレ−タ−配列、ｍＲＮＡ上の適切なリボゾ−ム結合部位をコ−ドする配列、エンハンサ−並びに、転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。
【００７５】
「プロモ−タ−」の語は遺伝子の転写を開始するために結合しているＲＮＡポリメラ−ゼに含まれる調節配列である。このプロモ−タ−は誘発プロモ−タ−又は構築プロモ−タ−である。本発明に用いる好ましいプロモ−タ−はトリコデルマレ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)ｃｂｈ１である。
【００７６】
「転写制御下で」の語は、ポリヌクレオチドの配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の抑制又は促進に寄与するエレメントに作動可能に結合することに依存するということを示唆する文言であると当業者に理解されている。
【００７７】
「翻訳制御下で」の語はｍＲＮＡが形成された後に起こる調節プロセスであることは当業者に理解されている。
【００７８】
本明細書で用いる様に、それらをコ−ドするタンパク質及び遺伝子を説明する場合には、遺伝子についての語は大文字を用いず、イタリック(下線)で示す。例えば、フミコ−ラグリセアＧＳＨＥをコ−ドする遺伝子はｇｌａ１と示す。タンパク質について用いる語はイタリックを用いず最初の文字を大文字で示す。例えば、gla1遺伝子によりコ−ドされるタンパク質はＧｌａ１と示す。
【００７９】
「作動可能に結合」の語は、あるエレメントが機能を発揮するような位置に配置されていることを言う。例えば、プロモ−タ−はそれが配列の転写を制御するならばコ−ド配列に作動可能に結合している。
【００８０】
「選択マ−カ−」の語は導入された核酸又はベクタ−を含む宿主細胞の選択を容易にするために宿主細胞内で発現することができる遺伝子を意味する。選択マ−カ−の例は、抗菌薬(ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコ−ル)又は宿主に栄養上の利益を与える等の代謝的利益を付与する遺伝子であるがこれらに限定されない。
【００８１】
「由来」の語は「〜を起源とする」、「〜から得られた」又は「〜から単離された」の語と同義とする。
【００８２】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、発現ベクタ−又は本発明のＧＳＨＥをコ−ドするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築体に適した宿主を意味する。特に、宿主株は糸状菌である。本発明の好ましい態様において、「宿主細胞」は細胞と糸状菌株、特にトリコデルマレ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)種又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種の細胞から精製されたプロトプラストの両方を含む。
【００８３】
本発明の「糸状菌」は、真核微生物及び真菌門亜門に属する全ての糸状菌を含む(Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，  Ｃ．  Ｊ．  （１９６２），  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｗｉｌｅｙ参照)。これらの菌類はキチン、セルロ−ス、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁からなる栄養菌糸を有することが特徴である。本発明の糸状菌は形態的に、生理機能的に、および遺伝的に、酵母とは別個である。本発明において用いる糸状菌親細胞は、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)、例えば、トリコデルマレ−シ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)(トリコデルマロンギブランギアタム(Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ)として分類されているもの、及び現時点で、ハイポクレアジェコリ−ナ(Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ)に分類されるものを含む)、トリコデルマビリデ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ)、トリコデルマコニンギ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ)、トリコデルマハルジアナム(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ)；ペニシリウム種(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．)；フミコ−ラインソランス(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ)及びフミコ−ラグリセア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ)を含むフミコ−ラ種(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐ．)；クリソスポリウムルクノエンス(Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ)を含むクリソスポリウム種(Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．)；グリオクラディウム種(Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ  ｓｐ．)；アスペルギルスオリザエ(Ａ．ｏｒｙｚａｅ)、アスペルギルスニヅランス(Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ)、アスペルギルスニガ−(Ａ．  ｎｉｇｅｒ)、及びアスペルギルスアワモリ(Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ)を含むアスペルギルス種(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．)；フサリウム種(Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．)、ニュ−ロスポラ種(Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．)、ハイポクレア種(Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐ．)；及びエメリセラ種(Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ  ｓｐ．)であるが、これらに限定されない。参考文献は、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ    ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉ．  ２２８  :  ２１−２６である。
【００８４】
「トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)」又は「トリコデルマ種(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．)」の語は、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)として分類されているもの、あるいは、現時点でトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)と分類されているものを言う。
【００８５】
「接触」の語は、基質を所望の最終産物に転換するために、個々の酵素を所定の基質に対して、十分に近い位置に置くことを意味する。基質と1以上の酵素溶液とを混合することが「接触」であることは、当業者に理解されている。
【００８６】
「インキュベ−ト」の語は、所定の時間の間、所与の条件下において、コメ基質を加水分解酵素と混合することを意味する。
【００８７】
「酵素的転換」の語は、可溶性加水分解された顆粒コメ基質を生産するために、好ましくは、グルコ−スを生産するためにコメ基質を修飾することを意味する。
【００８８】
「スラリ−」の語は、不溶性粒デンプンを含んでいる水溶性混合物を言う。「スラリ−」及び「懸濁液」の語は、本明細書において互換的に使用する。
【００８９】
「培養」という語は、液体または固形培地中の適切な条件下で、微生物細胞の塊を成長させることを言う。ある態様においては、培養は、通常、発酵管あるいは、発酵槽内で行われ、発酵により粒デンプン基質をグルコ−スシロップあるいは他の所望の最終生産物へ転換することを言う。
【００９０】
ここで用いる、「異種」のという語は、宿主細胞中に自然発生していない、ポリヌクレオチド、又は、タンパク質を言う。幾つかの態様において、このタンパク質は商業的に重要な工業タンパク質である。この語は、自然発生遺伝子、変異遺伝子及び/又は合成遺伝子によりコ−ドされるタンパク質も包含する。本明細書で用いる、「内因性の」という語は、宿主細胞中に自然発生するポリヌクレオチドまたは、タンパク質を言う。
【００９１】
「回収」、「単離」及び「分離」の語は、少なくとも１の本来関係のある成分を除去した、分子、タンパク質、細胞、核酸、アミノ酸、又は糖類を言う。これらの語は、実質的に不要なコメタンパク質を含む残渣からの可溶性デンプン加水分解物を含む混合物を分離することも意味する。
【００９２】
本明細書において、細胞に関する「形質転換」、「安定な形質転換」、又は「トランスジェニック」という語は、ゲノムに組み込まれた、又は複数世代を通して保存されるエピソ−ムプラスミドとして非天然(異種)核酸配列を有する細胞を意味する。
【００９３】
本明細書において、「発現」という語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程をいう。当該工程には、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【００９４】
本明細書において、核酸配列を細胞に挿入することに関して用いられる「導入」という語は、「遺伝子導入」、「形質転換」、又は「形質導入」を意味し、及び、核酸配列を真核または原核細胞に組み込むことを含み、ここで、前記核酸配列は、前記細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアＤＮＡ)に組み込まれ、自律レプリコン(ａｕｔｏｍｏｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ)に変換され、又は一時的に発現される(例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ)。
【００９５】
本明細書で用いる「特異活性」の語は、特定条件下において、所定の時間内に酵素調製物により基質を生成物に転換するモル数であると定義される。特異活性は、単位(U)/mgタンパク質で表す。
【００９６】
「酵素活性」の語は基質上での酵素の作用を意味する。
【００９７】
「酵素単位」の語は、最適アッセイ条件において、1分間に１ｍｇの基質を所定の生成物に転換するために必要な酵素の量を意味する。例えば、一の態様において、顆粒デンプン加水分解酵素単位(ＧＳＨＥ  Ｕ)の語は、例えば、５０℃、ｐＨ４．５のアッセイ条件下で顆粒デンプンから1分間に１mgのグルコ−スを精製するために必要なＧＳＨＥの量であると定義される。例えば、一の態様において、アルファアミラ−ゼ酵素単位は、ｐＨ５．２及び４０℃のアッセイ条件下において、１分間に1μモルのデンプン基質を加水分解するアルファアミラ−ゼの量であると定義される。
【００９８】
他の態様において、グルコアミラ−ゼ酵素単位は、６０℃、ｐＨ４．２において、可溶性デンプンから１時間あたりグルコ−スとして計算される残渣糖の１ｍｇを生産する酵素の量をであると定義される。
【００９９】
「ＡＴＣＣ」の語は、バ−ジニア州(ＶＡ)マナッサス(Ｍａｎａｓｓａｓ)20108にある、アメリカン・タイプ・カルチャ−・コレクション(Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｌｔｕｒｅ．  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)(ＡＴＣＣ    ｗｗｗ／ａｔｃｃ．ｏｒｇ)を言う。
【０１００】
「ＮＲＰＬ」の語は、イリノイ州(ＩＬＬ)ピオリア(Ｐｅｏｒｉａ)にある、アグリカルチャラル・リサ−チ・サ−ビス・カルチャ−・コレクション(Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ．  Ｃｕｌｔｕｒｅ．  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ)、あるいは、農務省(ＵＳＤＡ)の北部研究所(Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ)としても知られている、国立農業飼養研究センタ−(Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ)を意味する。
【０１０１】
本明細書で用いる記号、「一つの」及び「この」という語は、他に違った形で定義されていない限り、複数を示す場合にも用いる。
【０１０２】
本明細書で用いる「から成る(ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ)」の語は、「含める」の意味に用い、「含む(ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ)」と等しく用いる。
【０１０３】
B.好ましい態様
コメ基質
本発明の方法に用いられるコメ基質は既知の源から得ることができる。幾つかの好ましい態様において、このコメ基質はコメ粉であり、他の好ましい態様において、このコメ基質は、精米されたコメ基質である。本発明を特定の方法に限定することを意図しないけれども、穀粒から得られたコメ粉は、約６−１０％タンパク質（Ｎ×５．９５）；約７０−８２％の糖質；約９−１２％の水分；約０．４−１．５％の粗脂質；約０．６−０．８％の灰分及び約０．２から０．６％の繊維を含む。
【０１０４】
穀粒中のコメタンパク質は、水にわずかにしか溶けない。これらのタンパク質は主に不溶性（アルカリ可溶性）グルテン（約８０−９０％）；塩溶性グロブリン（約７−１５％）；水溶性アルブミン（約９−１０％）及びアルコ−ル可溶性プロラミン（約２−５％）である。Ｈｏｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７０）  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ．  ４７：  5;  Ｐｅｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８）  ＰＨｙｔｏｃｈｅｍ．  １７：  ３５１，  及びＬａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ  ７１：４０９−４１１参照のこと。
【０１０５】
本発明の幾つかの態様において、コメ基質は水に懸濁される前又は処理される間のウエットグラウンドに先立ち、所望の粒子サイズに粉砕される。本発明に包含される方法の幾つかにおいて、コメ粉等の、コメ基質はスラリ−（通常水溶液）であり、このスラリ−は、ｉ）約１０乃至５５％の乾燥固形含量、ｉｉ）約２０乃至５０％の乾燥固形含量、ｉｉｉ）約２５乃至４５％の乾燥固形含量、ｉｖ）約２０乃至４０％の乾燥固形含量、約２０乃至３５％の乾燥固形含量、及びｖｉ）約３０乃至３５％の乾燥固形含量を有する。
【０１０６】
酵素
顆粒デンプン加水分解酵素
本発明に包含される方法に用いられるデンプン加水分解酵素の少なくとも１つは顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨＥs）である。幾つかの顆粒デンプン加水分解酵素は、グルコアミラ−ゼ活性を有しており、これらの酵素のいくつかはアルファアミラ−ゼ活性を有している（Ｔｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３９：  ８４６−８５５  及びＫａｎｌａｙａｋｒｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｊ．  Ｆｅｒｍｅｎｔ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ６５：  ３７９−３８５参照のこと）。好適なＧＳＨＥ酵素は、組換え及び変異ＧＳＨＥのほかに自然発生ＧＳＨＥであってもよい。自然発生ＧＳＨＥは、フミコ−ラ種(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐ．),  アスペルギルス種(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．)、ムコ−ル種（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）及びルゾプス種(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．)から回収されている。リゾプスオリザエ(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ)ＧＳＨＥは  Ａｓｈｉｋａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８６）  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５０：  ９５７−９６４  及びＵ．Ｓ．Ｐａｔ．No.４，８６３，８６４に記載されている。フミコ−ラグリセア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ)ＧＳＨＥはＡｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２１：  ２２５−２２９及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  １７１２１８に記載されている。この酵素をコ−ドしている遺伝子は、gla1として当業者に知られている。アスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  ｋａｗａｃｈｉ)ＧＳＨＥは、Ｈａｙａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ５３  ：  ９２３−９２９  に記載されている。アスペルギルスシロウサミ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ)ＧＳＨＥ  はＳｈｉｂｕｙａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）  Ａｇｒｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５４：  １９０５−１９１４に記載されている。
【０１０７】
幾つかの好ましい態様において、ＧＳＨＥは、ＡＴＣＣ  １６４５３、ＮＲＲＬ  １５２１９、ＮＲＲＬ  １５２２０、ＮＲＲＬ  １５２２１、  ＮＲＲＬ  １５２２２、ＮＲＲＬ  １５２２３、ＮＲＲＬ  １５２２４及びＮＲＲＬ  １５２２だけでなく、これらを遺伝的に修飾した遺伝子からも発見されている(ＥＰ  ０１７１２１８)。
【０１０８】
一の態様において、ＧＳＨＥは、フミコ−ラグリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）特に、フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)（Ｈ−ＧＳＨＥ）種由来である（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．  Ｎｏ．４，６１８，５７９参照のこと）。
【０１０９】
一の態様において、ＧＳＨＥは、アスペルギルスアワモリ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ)、特に、アスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ(Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  ｋａｗａｃｈｉ)(Ｈａｙａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ５３：  ９２３−９２９参照のこと)。
【０１１０】
一の態様において、ＧＳＨＥは配列番号３で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも  ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％  及び９９％の配列相同性を有する。他の態様において、ＧＳＨＥは、  配列番号３と少なくとも８０％配列相同性を有するアミノ酸を含む。他の態様において、配列番号３のアミノ酸配列を含むＧＳＨＥ、又は配列番号３と少なくとも８０％の配列相同性を有するＧＳＨＥ  は配列番号1と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％及び９９％の配列相同性を有するポリヌクレオチドによりコ−ドされる。
【０１１１】
他の態様において、ＧＳＨＥは配列番号７で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも  ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％  及び９９％の配列相同性を有する。他の態様において、ＧＳＨＥは、配列番号７と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸を含む。他の態様において、配列番号７のアミノ酸配列を含むＧＳＨＥ、又は配列番号６と少なくとも８０％の配列相同性を有するＧＳＨＥは配列番号５と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％及び９９％の配列相同性を有するポリヌクレオチドによりコ−ドされる。
【０１１２】
他の配列に対して、所定のパ−センテ−ジ(例えば、８０％、８５％、９０％、９３％、または９９％)の配列相同性を有するポリヌクレオチド、または、ポリペプチドは、２の配列を整列させて比較したときに、所定の割合の同じ核酸または、同じアミノ酸を有するものを意味する。このアラインメントおよびホモロジ−の相同性または、配列相同性は、例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  (Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８７)  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０,  ｓｅｃｔｉｏｎ  ７．７．１８．に記載されている。好ましいプログラムは、ＧＣＧ  Ｐｉｌｅｕプログラム、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴを含む。他の好ましいプログラムは、ＡＬＩＮＧＮ  Ｐｌｕｓ及びＴＦＡＳＴである。
【０１１３】
更なる態様において、ＧＳＨＥ酵素はリゾプス種（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）由来である。リゾプスニベウス（Ｒ．ｎｉｖｅｕｓ）のコウジ(ｋｏｊｉ)株由来のそのような酵素は、ＣＵ  ＣＯＮＣの取引名で販売されており、あるいは、ＧＬＵＣＺＹＭＥの取引名でリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）由来の酵素が販売されている。
【０１１４】
アルファアミラ−ゼ
本発明に包含されるいくつかの態様において、顆粒デンプン加水分解酵素はアルファアミラ−ゼと組み合わせられる。アルファアミラ−ゼは、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１−３、特に、Ｅ．Ｃ．３．２．１．１の酵素番号を有する。幾つかの態様において、このアルファアミラ−ゼは、熱安定性微生物アルファアミラ−ゼであり、好ましくは糸状菌アルファアミラ−ゼである。好適なアルファアミラ−ゼは、組換え体及び突然変異体アルファアミラ−ゼの他に、天然アルファアミラ−ゼを含む。特に好ましい態様において、このアルファアミラ−ゼは、バチルス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)種由来のものである。好ましいバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種は、バチルススブチルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスレンタス(Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ)、バチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルスコアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、及びバチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）を含む(Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏｓ．５，７６３，３８５、５，８２４，５３２、５，９５８，７３９、６，００８，０２６及び６，３６１，８０９)。特に好ましいアルファアミラ−ゼは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株由来のものであり、バチルスステアロセレモフィリス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐＨｉｌｕｓ）、バチルスアミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）及びバチルスリケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）である。ＡＴＣＣ  ３９７０９、ＡＴＣＣ  １１９４５、ＡＴＣＣ  ６５９８、ＡＴＣＣ  ６６３４、ＡＴＣＣ  ８４８０、ＡＴＣＣ  ９９４５Ａ  及び  ＮＣＩＢ  ８０５９を有するものも好ましい。
【０１１５】
ジェネンカ−インタ−ナショナルインク(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．)より販売されている、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＡＡ、ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ、ＧＺＹＭＥ  Ｇ９９７及び、ノボザイムバイオテック(Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ)より販売されているＴＥＲＭＡＭＹＬ  １２０−Ｌ、ＬＣ、ＳＣ及びＳＵＰＲＡのような、市販のアルファアミラ−ゼも本発明の方法に用いることができる。
【０１１６】
グルコアミラ−ゼ
グルコアミラ−ゼ(ＥＣ．３．２．１．３)はデンプンの非還元末端から連続的にグルコ−ス単位を切り離す酵素である。この酵素は、デンプン、アミロ−ス又はアミロペクチンの直鎖又は分岐鎖のグルコシル結合を加水分解することができる。グルコアミラ−ゼはバクテリア、植物、糸状菌から得ることができるが、本発明に包含される方法に用いるのに好ましいグルコアミラ−ゼは糸状菌株由来のものである。好適なグルコアミラ−ゼは組換え及び変異体グルコアミラ−ゼのほかに自然発生グルコアミラ−ゼも含む。
【０１１７】
アスペルギルス(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ)、リゾプス(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ)、フミコ−ラ(Ｈｕｍｉｃｏｌａ)及びムコ−ル（Ｍｕｃｏｒ）から分泌されるグルコアミラ−ゼは、アスペルギルスアワモリ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ)、リゾプスニベウス(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｖｅｕｓ)、リゾプスオリザエ(Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ)ムコ−ルミエヘ(Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅ)、フミコ−ラグリセア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ)、アスペルギルスシロウサミ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｈｉｒｏｕｓａｍｉ)及び  フミコ−ラ(セルモマイセス)ラニギノ−サ(Ｈｕｍｉｃｏｌａ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）ｌａｎｉｇｉｎｏｓａ)を含む糸状菌株から提供されてきた(Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：  １０９７−１１０２；  ＷＯ  ９２／００３８１  ;  ＷＯ  ００／０４１３６；  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）  Ｐｒｏｔ．  Ｅｎｇ．  ９：  ４９９−５０５；  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７８）  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．  ６１：  ３０１−３０８及び  Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８８）  Ｃａｎ．  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３４：  ２１８−２２３参照のこと)  。
【０１１８】
グルコアミラ−ゼ活性を有する酵素は、商業的に使用されおり、例えば、アスペルギルスニガ−(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ)(取引名、ＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００及びＧＺＹＭＥ  Ｇ９００  ４Ｘ、（ジェネンコ−インタ−ナショナルインク)又はリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）(取引名ＣＵ．ＣＯＮＣ．  新日本ケミカル、日本及び取引名ＧＬＵＣＺＹＭＥ  天野製薬、日本)から提供されている。
【０１１９】
好ましい態様において、本発明に包含される方法又は組成物に用いるＧＳＨＥは、糸状菌株から得られた、宿主株以外の糸状菌のＧＳＨＥをコ−ドしている異種ポリヌクレオチドを発現するために、遺伝子組み換えにより発現されたＧＳＨＥである。
【０１２０】
幾つかの態様において糸状菌株は、アスペルギルス種(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．)トリコデルマ種(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．)フサリウム種(Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．)又はペニシリウム種(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．)である。特に好ましい糸状菌宿主は、アスペルギルスニデュランス(Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ)、アスペルギルスアワモリ(Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ)、アスペルギルスオリザエ(Ａ．  ｏｒｙｚａｅ)、アスペルギルスアキュランタス(Ａ．  ａｃｕｌｅａｔｕｓ)、アスペルギルスニガ−(Ａ．  ｎｉｇｅｒ)、アスペルギルスジャポニクス(Ａ．  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ)、トリコデルマレ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)、トリコデルマビリデ(Ｔ．  ｖｉｒｉｄｅ)、フサリウムオキシスポラウム(Ｆ．  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)、及びフサリウムソラニ(Ｆ．  ｓｏｌａｎｉ)である。アスペルギルス株(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｔｒａｉｎｓ)は  Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  ＡｐｐＬ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３９：  ７３８−７４３及びＧｏｅｄｅｇｅｂｕｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅ  ４１：  ８９−９８に開示されている。好ましい態様において、宿主はトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)株及び特に、トリコデルマレ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)株である。トリコデルマレ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)株は知られており、非限定的な例は、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１３６３１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．２６９２１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６４、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６５、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．５６７６７及びＮＲＲＬ  １５７０９を含む。幾つかの好ましい態様において、宿主株は、ＲＬ−Ｐ３７から提供される。ＲＬ−Ｐ３７は、Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：  ４６−５３に開示されている。
【０１２１】
ｒＧＳＨＥを発現する宿主株は、遺伝子工学の手法により操作されたものである。幾つかの態様において、この糸状菌宿主の各種遺伝子は、前記技術により失活されている。これらの遺伝子は、例えば、エンドグルカナ−ゼ(ＥＧ)及びエキソセロビオハイドラ−ゼ（ＣＢＨ）等のセルロ−ス分解酵素をコ−ドする遺伝子を含む(例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２及びｅｇｌ３)。米国特許Ｎｏ．５，６５０，３２２は、ｃｂｈ１遺伝子及びｃｂｈ２遺伝子における欠失を有するＲＬ−Ｐ３７誘導株を開示する。
【０１２２】
幾つかの態様において、この糸状菌宿主はフミコ−ラグリセア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ)由来のＧＳＨＥをコ−ドするポリヌクレオチドを含んでいる。一の態様において、組換えｒＧＳＨＥは、配列番号３で定義するアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％及び９９％の相同な配列を有する。他の態様において、配列番号３のＧＳＨＥをコ−ドするポリヌクレオチドは、配列番号１で定義される配列と少なくとも７０％の配列相同性を有する。他の態様において、糸状菌宿主は、アスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  Ｋａｗａｃｈｉ)由来のＧＳＨＥをコ−ドするポリヌクレオチドを発現するために遺伝的に修飾されている。一の態様において、rGHSEは、配列番号7で定義されるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９８％及び９９％相同である。他の態様において、配列番号７のＧＳＨＥをコ−ドしているポリヌクレオチドは、配列番号５で定義される配列と少なくとも７０％相同である。
【０１２３】
ベクタ−及び糸状菌形質転換
本発明に従い、本発明に包含されるＧＨＳＥをコ−ドするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ構築体を宿主細胞の中へＧＳＨＥを輸送するために構築する。従って、酵素の形で発現されるＧＨＳＥポリヌクレオチドを、ベクタ−、特に、ＧＳＨＥコ−ド配列に作動可能に結合している調節配列を含む発現ベクタ−を用いて宿主細胞内へ導入する。
【０１２４】
ベクタ−は、糸状菌宿主細胞に導入されたときに宿主細胞の染色体に取り込まれ、置換される任意のベクタ−である。ベクタ−についてのＦｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｓｔｒａｉｎｓ  (ｗｗｗ．  ＦＧＳＣ．  ｎｅｔ)  は参考文献である。適した発現ベクタ−の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  (１９８９)上記  及び  Ａｕｓｕｂｅｌ  （１９８７）上記、にも開示されており、特に好ましい例はＨｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  ｉｎ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ  Ｅｄｓ．  ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  ｐｐ．  ３９６−４２８である。特に有用なベクタ−は、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８、ｐＵＣ１００  及びｐＥＮＴＲ／Ｄである。
【０１２５】
いくつかの態様において、ＧＳＨＥをコ−ドする核酸は、糸状菌宿主細胞内で転写活性を示す、適切なプロモ−タに作動可能に結合している。このプモ−タ−は、宿主細胞に相同又は非相同のいずれかのタンパク質をコ−ドする遺伝子から提供される。好ましくは、このプロモ−タ−は、トリコデルマ宿主の中で有用であり、適した非限定的な例はｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２を含むプロモ−タ−である。一の態様において、このプロモ−タ−は、宿主細胞由来である。例えば、トリコデルマレ−シ(Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ)が宿主細胞の場合、このプロモ−タ−は天然のトリコデルマレ−シ(Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ)プロモ−タ−である。好ましい態様において、このプロモ−タ−は、プロモ−タ−を含み、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｎｏ．Ｄ８６２３５を有するトリコデルマレ−シ(Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ)ｃｂｈ１である。誘発プロモ−タ−は、環境下で活性があるか又は、促進的な調節をするものである。他の態様において、このプロモ−タ−は、糸状菌宿主細胞とは異なる細胞由来である。有用なプロモ−タ−の他の例は、アスペルギルスアワモリ(Ａ．ａｗａｍｏｒｉ)及びアスペルギルスニガ−(Ａ．ｎｉｇｅｒ)のグルコアミラ−ゼ遺伝子を含む(Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ４：  ２３０６−２３１５及びＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：  １５８１−１５８参照のこと)。トリコデルマ−レ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)ｘｌｎ１の遺伝子及びセロビオハイドラ−ゼ1遺伝子のプロモ−タ−も有用である(ＥＰＡ  １３７２８０Ａ１)。
【０１２６】
幾つかの態様において、ＧＳＨＥコ−ド配列は、シグナル配列に作動可能に結合している。このシグナル配列をコ−ドするＤＮＡは、発現されるべきＧＳＨＥ遺伝子に関連していることが好ましい。好ましくは、このシグナル配列はＧＳＨＥをコ−ドしているフミコ−ラグリセア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ)又はアスペルギルスアワモリ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ)遺伝子によりコ−ドされている。より好ましくは、このシグナル配列は、図２Ａ及び図６Ａに示す配列と、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、あるいは、少なくとも９９％相同である。追加的な態様において、糸状菌宿主細胞の中に導入されるＤＮＡ構築体又はベクタ−を含む。このシグナル配列及びプロモ−タ−配列は同じ源から提供される。例えば、幾つかの態様において、シグナル配列は、ｃｂｈ１プロモ−タ−に作動可能に結合しているｃｂｈ１シグナル配列である。
【０１２７】
幾つかの態様において、発現ベクタ−は、転写終了配列を含む。一の態様において、この終了配列及びプロモ−タ−配列は同じ源から提供される。一の態様において、終了配列は、宿主細胞と相同である。特に適した終了配列はトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)株、特にトリコデルマレ−シ(Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ)由来のｃｂｈ１である。他の有用な糸状菌タ−ミネ−タ−は、アスペルギルスアワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）及びアスペルギルスニガ−（Ａ．ｎｉｇｅｒ）グルコアミラ−ゼ遺伝子からのタ−ミネ−タ−である（Ｎｕｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）上記、及びＢｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８４）上記)。
【０１２８】
幾つかの態様において、発現ベクタ−は、選択マ−カ−を含む。好ましい選択マ−カ−の例は、抗菌質耐性を付与するものである(例えば、ハイグロマイシン及びフェロマイシン)。栄養選択マ−カ−もまた本発明に用いることができる。これらの選択マ−カ−は、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ  及びｐｙｒ４として知られている。トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)の形質転換のためのベクタ−システムに有用なマ−カ−は、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、ｃｈａｐｔｅｒ  ６  ｉｎ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｄｓ．  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ  （１９９２），  Ｃｈａｐ．  ６．  及びＫｉｎｇｈｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ  ＦＵＮＧＩ，  Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，  Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，  Ｌｏｎｄｏｎに開示されている。好ましい態様において、選択マ−カ−は、形質転換された細胞がアセトアミドを窒素源として成長できるようになる、アセトアミダ−ゼ酵素をコ−ドするａｍｄＳ遺伝子である(Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８５）  ＥＭ８０Ｊ．  ４：  ４７５−４７９及びＰｅｎｔｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｇｅｎｅ  ６１：  １５５−１６４)。
【０１２９】
ＧＳＨＥをコ−ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクタ−は、所与の糸状菌宿主微生物又は宿主のＤＮＡに組み込まれる、自己複製可能なあらゆるベクタ−である。幾つかの態様においてこの発現ベクタ−はプラスミドである。好ましい態様において、２タイプの遺伝子発現を得るための発現ベクタ−を意図する。
【０１３０】
第一の発現ベクタ−は、全て発現される遺伝子由来の、プロモ−タ−、ＧＳＨＥコ−ド領域、及びタ−ミネ−タ−を有するＤＮＡ配列を含む。幾つかの態様において、ジ−ントランケ−ション(ｇｅｎｇｅ−ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ)が自己の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを除去するために不要なＤＮＡ配列(例えば、不必要なドメインに対するコ−ド)の欠失により得られる。
【０１３１】
第二のタイプの発現ベクタ−は、予め組み立てられ、ハイレベルの転写のために必要な配列及び選択マ−カ−を含む。幾つかの態様において、ＧＳＨＥ遺伝子又はそれらの部分のコ−ド領域は、発現構築物プロモ−タ−及びタ−ミネ−タ−配列の転写制御下であるような、一般的な目的の発現ベクタ−内へ挿入される。幾つかの態様において、遺伝子又はそれらの一部はストロング(ｓｔｒｏｎｇ)ｃｂｈ１プロモ−タ−の下流に挿入される。
【０１３２】
ＧＳＨＥをコ−ドするポリヌクレオチド、プロモ−タ−、タ−ミネ−タ−及び他の配列を含むベクタ−に結合させ、適切なベクタ−内へ挿入するために用いる方法は、当業者に知られている。通常簡便な制限部位において結合を行う。もし、そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドリンカ−が簡便な方法に従って用いられる(Ｓａｍｂｒｏｏｋ  （１９８９）  上記及びＢｅｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｌａｓｕｒｅ，  ＭＯＲＥ  ＧＥＮＥ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＩＯＮＳ  ＩＮ  ＦＵＮＧＩ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  （１９９１）  ｐｐ７０−７６)。すなわち、ベクタ−は既知の組換え技術を用いて構築することができる(例えば、Iｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ)。
【０１３３】
1以上の失活した遺伝子を有する糸状菌宿主細胞を得たいときには、既知の方法が用いられる(米国特許  Ｎｏｓ．５，２４６，８５３、５，４７５，１０１  及びＷＯ  ９２／０６２０９参照のこと)。遺伝子失活は全体又は部分的な欠失、失活させるための部位の挿入、又は遺伝子の意図する機能を付与しない他の手段(遺伝子が機能的なタンパク質として発現させない)を用いて行うことができる。クロ−ンされたトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)種又は他の糸状菌宿主細胞由来の任意の遺伝子(例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１)は欠失させることができる。幾つかの態様において、既知の方法によりプラスミド内へ、失活させるための所望の遺伝子形態を挿入することにより遺伝子欠失を行う。この欠失プラスミドは、選択マ−カ−に必要とされる所望の遺伝子コ−ド領域、及び遺伝子コ−ド配列又はそれらの部分内の適切な制限酵素部位で切断される。欠失されるべき遺伝子の一からのフランキングＤＮＡ配列はマ−カ−のどちからの端に残る(好ましくは約０．５乃至２．０  ｋｂ)。適切な欠失プラスミドは、欠失遺伝子を含み、ＤＮＡフランキング配列を含み、及び一本鎖の直鎖部分として除去される選択マ−カ−を含むフラグメントの形で存在する。
【０１３４】
宿主細胞へのＤＮＡ構築体又はベクタ−の導入は、形質転換、エレクトロポレ−ション、核酸注入、形質導入、リポフェクション仲介及びDEAE−デキストリン仲介形質感染を含む形質感染、カルシウムリン酸ＤＮＡ沈殿によるインキュベ−ション、ＤＮＡコ−トのマイクロプロジェクタイルを用いた高速遺伝子銃及びプロトプラスト融合を含む。一般的な形質転換技術はＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）上記、9章  及びＳａｍｂｒｏｏｋ  （１９８９）  上記、に記載されている。糸状菌の形質転換のより詳しい方法はＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  １６：  ５３−５６に開示されている。特に、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)での異種タンパク質の発現に効果的な方法は、米国特許Nｏｓ．６，０２２，７２５、６，２６８，３２８；Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １３：  ２２７−２３３；  Ｈａｒｋｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ７：  ５９６−６０３;  ＥＰ  ２４４，２３４  ;及び  ＥＰ  ２１５，５９４である。Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ    ａｌ．，  “Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ",  ｉｎ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ,  Ｅｄｓ．  Ｌｅｏｎｇ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋａ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．,  ＮＹ  （１９９２）  ｐｐ．  １２９−１４８も参考文献である。Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｓｃｉ.  ９：  ９９１−１００１はアスペルギルス株の形質転換についての参考文献である。
【０１３５】
ＧＳＨＥのコ−ドする核酸が宿主株の染色体に安定に取り込まれることにより、遺伝的に形質転換体がベクタ−内で構築されることが好ましい。形質転換体はその後既知の技術で精製される。
【０１３６】
幾つかの非限定的な例において、アセトアミドを含む固形培養培地上での成長の速さ及びギザギザの外様よりはむしろスム−スな円形のコロニ−の形成を指標として、ａｍｄＳを含む安定な形質転換体を不安定な形質転換体と区別する。すなわち、幾つかのケ−スにおいて、固形の非選択培地(すなわち、アセトアミド欠失培地)上で形質転換体を育成し、培養培地から胞子を収穫し、アセトアミド含有選択培地上での発芽及び成長する胞子のパ−センテ−ジを決定することにより安定性の更なるテストを行う。代替的に、当該技術分野で知られている他の方法も形質転換体を選択するために用いることができる。
【０１３７】
幾つかの特定の態様において、形質転換のためのトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)種の調製は糸状菌の菌糸からプロトプラストを調製することを含む(Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅｔ．  １６：  ５３−５６参照のこと)。幾つかの態様において、この菌糸は発芽させた発育胞子から得られ、細胞壁を消化しプロトプラストとするための酵素で処理する。このプロトプラストはその後、懸濁培地中に浸透安定剤を存在させることにより保護される。これらの安定剤はソルビト−ル、マンニト−ル、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常これらの安定剤の濃度は、0.8Mから1.2Mの間で変動する。懸濁培地中に１．２Ｍのソルビト−ル溶液を用いることが好ましい。
【０１３８】
トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)種株内へのＤＮＡの取り込みはカルシウム濃度に依存している。通常１０ｍＭ  ＣａＣｌ２乃至５０ｍＭのＣａＣｌ２を取り込み溶液に用る。取り込み溶液中のカルシウムの必要性の他に、通常含まれる他のアイテムは、ＴＥ緩衝液(１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  7.4  ;  １ｍＭ  ＥＤＴＡ)又は１０ｍＭ  ＭＯＰＳ(モルフォリンプロパンスルホン酸(ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ))、ｐＨ6.0及びポリエチレングリコ−ル(ＰＥＧ)である。ポリエチレングリコ−ルは細胞膜を融解し、従って、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)種の細胞質の中に培地の成分を輸送することができると考えられている。この融解が存在することにより、プラスミドＤＮＡの多数のコピ−を宿主細染色体の中に穏やかに組み込むことができる。
【０１３９】
通常、１０５乃至１０７／ｍＬの濃度で、好ましくは２×１０6/mLの浸透処理を受けた、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)種のプロトプラスト又は細胞を含む懸濁液を形質転換に用いる。適切な溶液中(例えば、１．２Ｍソルビト−ル、５０ｍＭ  ＣａＣｌ2)にプロトプラスト又は細胞を含む溶液の１００μＬを所望のＤＮＡと混合する。通常、高濃度のＰＥＧをこの取り込み溶液に添加する。０．１乃至１容量の２５％  ＰＥＧ４０００をプロトプラスト溶液に添加する。しかしながら、プロトプラスト懸濁液に約０．２５容量を添加することが好ましい。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、等も取り込み溶液の中に添加し、形質転換を助ける。同様の手順を他の宿主細胞にも用いることができる。例えば、参照により本明細書に援用することができる米国特許Ｎｏｓ．６，０２２，７２５及び６，２６８，３２８参照のこと。
【０１４０】
通常、混合物を約０℃において１０乃至３０分間インキュベ−トする。所望の遺伝子又はＤＮＡ配列の取り込みを更に高めるために、ＰＥＧを混合物に追加する。２５％  ＰＥＧ４０００を、５乃至１５倍容量の形質転換混合物に添加するが、これより少ない又は大きい容量も採用することができる。２５％ＰＥＧ４０００を約１０倍容量の形質転換混合物に添加することが好ましい。ＰＥＧを添加した後、ソルビト−ル及びＣａＣｌ2溶液を添加する前に、形質転換混合物を室温又は氷上でインキュベ−トする。その後、成長培地の融解されたアリコ−トに更にプロトプラスト懸濁液を添加する。この成長培地においては形質転換体のみが成長することができる。宿主の形質転換及びデンプン加水分解酵素等の他の酵素を宿主細胞の中で異種発現させるために類似の手法及び方法が用いられることは、当業者に知られている。
【０１４１】
細胞培養
Ｐｏｕｒｑｕｉｅ    Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ，  ｅｄｓ．  Ａｕｂｅｒｔ，  Ｊ．  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  ７１−８６，  １９８８及びｌｌｍｅｎ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ６３：  １２９８−１３０６に開示されているように、適切な宿主細胞は生体に必要な塩及び栄養を含んだ標準培地で培養される。市販のイ−ストモルト抽出物(Ｙｅａｓｔ  Ｍａｌｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ  （ＹＭ）)ブロス、ルイアバ−タリン(Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ  （ＬＢ）)ブロス及びシャボウラウドデキストロ−ス(Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  （ＳＤ）)ブロスについての参考文献もある。
【０１４２】
培養条件は、標準的な条件であり、例えば、所望のレベルのＧＳＨＥ発現が得られるまで、振とうシェイカ−又は発酵槽の中において適切な培地を用いて約２８℃で培地をインキュベ−トする。所与の糸状菌に対して好ましい培養条件は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ及びＦｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  （ｗｗｗ．  ＦＧＳＣ．  Ｎｅｔ）のような、サイエンスライブラリ−又は糸状菌の提供先から入手することができる。
【０１４３】
糸状菌の成長が確立した後、細胞はＧＳＨＥ、特に本明細書で定義するＧＳＨＥの発現を引き起こすために効果的な条件に曝される。ＧＳＨＥコ−ド配列が誘発プロモ−タ−の制御下にあるときは、誘発剤、例えば、糖、金属塩又は抗生物質がＧＳＨＥ発現を誘発するのに効果的な濃度で培地に添加される。
【０１４４】
ＧＳＨＥ活性の同定
ＧＳＨＥをコ−ドする異種ポリヌクレオチドで形質転換された細胞株によるＧＳＨＥの発現を評価するために、タンパク質レベル、ＲＮＡレベル又は特に、グルコアミラ−ゼ活性及び/又はグルコアミラ−ゼ生産等のバイオアッセイにる、アッセイを行うことができる。
【０１４５】
通常、ＧＳＨＥの発現を解析するためのアッセイは、ノザンブロッティング、ドットボロッティング(ＤＮＡ又はＲＮＡ解析)、ＲＴ−ＰＣＲ(逆転写ポリメラ−ゼ連鎖反応)、又は適切なラベルプロ−ブを用いたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼ−ション、及び簡便なサザンブロット及びオ−トラジオグラフィ−である。
【０１４６】
加えて、ＧＳＨＥの生産及び/又は発現はサンプルを直接測定、例えば、培養培地中のグルコ−スを直接測定することにより、又はグルコアミラ−ゼ活性を直接測定することにより、発現及び/又は生産を測定することができる。ＧＳＨＥ活性を測定するのに適した基質は、顆粒デンプン基質である。例えば、グルコ−ス濃度は、グルコ−ス試薬キットＮｏ．１５−ＵＶ(シグマケミカル社)又はテクニコンオ−トアナライザ−(Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ  Ａｕｔｏａｎａｌｙｚｅｒ)等の機器等の方法により決定される。Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂ．（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、  ＭＡ）より市販されているグルコ−スオキシダ−ゼキット及びグルコ−スヘキソ−スキットも利用可能である。グルコアミラ−ゼ活性は３，５−ジニトロサリチル酸(ＤＮＳ)法によりアッセイすることができる(Ｇｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｂｉｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ５８：  ４９−５４参照のこと)。一の非限定的な例において、ｒＧＳＨＥは水中に１５％のデンプン固形含量の顆粒デンプンを、乾燥固形ベ−スで、少なくとも９０％、９５％、及び９７％重量グルコ−スに加水分解する能力を有する。
【０１４７】
加えて、タンパク質発現は、細胞、組織切片の免疫組織染色、又は組織培養培地の免疫アッセイ例えば、ウエスタンブロット又はＥＬＡＳＡ等の免疫学的法により評価することができる。そのような免疫アッセイはＧＳＨＥの発現を量的及び質的に評価することに用いることができる。そのような方法の詳細は、当業者に知られており、そのような方法に用いる多くの試薬が市販されいてる。
【０１４８】
典型的なアッセイ方法は、ＥＬＩＳＡ、競合免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接免疫蛍光法及び同種のものを含む。通常、市販の抗体及び/又はキットがＧＳＨＥの発現レベルの定量的イムノアッセイに用いられる。
【０１４９】
本発明の一に態様において、組換え宿主によるｒＧＳＨＥの発現は、培養培地1リットル中1グラムタンパク質以上である。好ましくは、幾つかの態様において、組み換え宿主は、トリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)又はアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主である。幾つかの態様において、組換えトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)宿主により発現されるＧＳＨＥの量は２ｇ／Ｌ培養培地である。他の態様において、組換えトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)宿主によるＧＳＨＥ発現の量は、５g/Ｌ以上である。更なる態様において、組換えトリコデルマ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ)宿主によるＧＳＨＥ発現の量は、１０ｇ／Ｌ以上である。発現されたＧＳＨＥの量は、場合によっては、２０ｇ／Ｌ以上、２５ｇ／Ｌ以上、３０ｇ／Ｌ以上及び５０ｇ／Ｌ培養培地以上である。
【０１５０】
ＧＳＨＥの精製方法
通常、細胞培養の中で生産されるＧＳＨＥ(ｎＧＳＨＥ又はｒＧＳＨＥ)は、培地の中に分泌され、例えば、この培養培地から、不要な成分を除去することにより精製又は単離される。幾つかのケ−スにおいて、ＧＳＨＥは細胞内で生産されるため、細胞溶解物からの回収工程が必要となる。そのようなケ−スにおいて、当業者が通常用いる技術を用いて、細胞から酵素が精製される。このような技術の例は、親和クロマトグラフィ−(Tilbeurgh  et  al.,  (1984)  FEBS  Lett.  16:  215)、イオン交換クロマトグラフィ−法((Goyal  et  al.,  (1991)  Biores.  Technol.  36:  37、Fliess  et  al.,  (1983)  Eur.  J.  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.  17:  314、Bhikhabhai  et  al.,  (1984)  J.Appl.Biochem.  6:  336及びEllouz  et  al.,  (1987)  ChromatograｐＨy  396:  307)、高分解力を有する物質を用いたイオン交換法(Medve  et  al.,  (1998)  J.ChromatograｐＨyA  808:  153)、疎水相互クロマトグラフィ−(Tomaz  and  Queiroz,  (1999)  J.ChromatograｐＨyA  865:  123、二相分離(Brumbauer  et  al.,  (1999)  Bioseparation  7:  287)、エタノ−ル分離、逆相HPLC、シリカ又はDEAE等のカチオン交換によるクロマトグラフィ−、クロマトフォ−シング、DSD−PAGE、硫酸アンモニウム沈殿法及び例えば、SeｐＨadex  G−75を用いたゲルろ過である。
【０１５１】
プロセス条件
コメ基質の顆粒デンプンを加水分解しするために、コメ基質、好ましくはスラリ−形態のものをデンプン加水分解酵素と接触させ、インキュベ−トする。ＧＳＨＥは無細胞抽出物（ＧＳＨＥが培地から単離されている）から提供されるか、又は培養培地(発酵ブロス)からから提供される。
【０１５２】
ＧＳＨＥは、１０乃至５５％の乾燥固形含量になるように、約０．００１乃至１５．０  ＧＳＨＥ  Ｕ／ｇデンプンの間の量を、コメ基質を含む組成物の中に添加する。幾つかの態様において、ＧＳＨＥは、１０乃至５５％の乾燥固形含量になるように、約０．００１乃至１０．０  ＧＳＨＥ  Ｕ／ｇデンプンの間の量を、コメ基質を含む組成物の中に添加する。幾つかの態様において、このＧＳＨＥは約０．０１乃至５．０  ＧＳＨＥ  Ｕ／ｇの間の量になるように添加される。幾つかの態様において、このＧＳＨＥは約０．０１乃至２．０  ＧＳＨＥ  Ｕ／ｇの間の量になるように添加される。幾つかの態様において、このＧＳＨＥは約０．０１乃至１．５  ＧＳＨＥ  Ｕ／ｇの間の量になるように添加される。他の態様において、このＧＳＨＥは約０．０５乃至１．５  ＧＳＨＥ  Ｕ／ｇの間の量になるように添加され、及びこのＧＳＨＥは約０．１乃至１．０  ＧＳＨＥ  Ｕ／ｇの間の量になるように添加される。
【０１５３】
幾つかの好ましい態様において、ＧＳＨＥはグルコアミラ−ゼ活性を有し、第二デンプン加水分解酵素は、アルファアミラ−ゼである。当業者に理解されているように、本発明の方法に用いられるアルファアミラ−ゼの量はアルファアミラ−ゼの酵素活性に依存している。通常、約０．００１乃至５．０ｋｇのアルファアミラ−ゼがコメ基質の１メ−トルトン（MT）当りに添加される。幾つかの態様において、約０．０１乃至５．０ｋｇのアルファアミラ−ゼがコメ基質の１メ−トルトン（MT）当りに添加される。幾つかの態様において、約０．０５乃至４．０ｋｇのアルファアミラ−ゼがコメ基質の１メ−トルトン（MT）当りに添加される。他の態様において、約０．１乃至２．５ｋｇのアルファアミラ−ゼがコメ基質の１メ−トルトン（MT）当りに添加され、る。約０．５乃至１．５ｋｇのアルファアミラ−ゼがコメ基質の１メ−トルトン（MT）当りに添加される場合もある。更なる態様において、このほかの量も用いられる。例えば、約０．０１乃至１．５ｋｇのGZYME  G900又はSPEZYME  FRED（ジェネンコ−インタ−ナショナル、インク）が、デンプン１MTあたりに添加される。他の態様において、これらの酵素は、約０．０５乃至１．０ｋｇの間の量で、約０．１乃至０．６ｋｇの間の量で、約0.2乃至０．６の間の量で及び約０．４乃至０．６ｋｇの量でデンプン１MTあたりに添加される。
【０１５４】
幾つかの態様において、ＧＳＨＥはアルファアミラ−ゼと共にインキュベ−ション間同時にコメ基質に添加される。しかしながら、他の態様においては、ＧＳＨＥとアルファアミラ−ゼは連続的に添加される。通常、加水分解酵素は１乃至６０分の間、及び約１乃至３０分以内に添加される。
【０１５５】
幾つかの態様において、本発明の方法に包含されるＧＳＨＥ単位に対するアルファアミラ−ゼの比(アルファアミラ−ゼ：ＧＳＨＥ)は15：1乃至1：15、幾つかの態様においては、10：1乃至1：10である。他の態様において、この比は5：1乃至1：5であり、更なる態様においては、アルファアミラ−ゼ：ＧＳＨＥの比は4：1乃至1：4である。好ましい態様において、この比は2：1乃至1：4であり、最も好ましい態様においてこの比は、2：1乃至1：2である。
【０１５６】
幾つかの態様において、コメ基質と加水分解酵素を含む混合物はコメ基質に含まれるタンパク質の変性温度以下の温度でインキュベ−トされる。幾つかの態様において、この温度は、約７２℃、７０℃、６８℃、６５℃、６３℃、６０℃、５８℃、５５℃、５０℃、４５℃、及び４０℃以下であるが、１０℃未満ではない。他の態様において、この方法は約７０℃及び５０℃の間の温度で行われる。他の態様において、約７０℃及び５５℃の間の温度、及び約６５℃及び５５℃の間の温度の間の温度で行われる。
【０１５７】
幾つかの態様において、コメ基質及びデンプン加水分解酵素を含む混合物は、約ｐＨ3.0乃至ｐＨ6.5の幅、約ｐＨ3.0乃至ｐＨ6.0の幅、約ｐＨ3.0乃至ｐＨ5.5の幅、約ｐＨ3.5乃至ｐＨ5.0の幅、約ｐＨ3.0乃至ｐＨ４．０の幅、約ｐＨ４．５乃至ｐＨ6.5の幅、及び約ｐＨ５．０乃至ｐＨ6.0の幅のｐＨでインキュベ−トされる。
【０１５８】
幾つかの態様において、コメ基質及びデンプン加水分解酵素（好ましくは、ＧＳＨＥ及びアルファアミラ−ゼ）を含む、上記の条件でインキュベ−トされた混合物は、約２乃至１００時間、約５乃至１００時間、約１０乃至１００時間、約５乃至５０時間、約１０乃至５０時間、及び約10乃至２４時間の間インキュベ−トされる。
【０１５９】
幾つかの態様において、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％の乾燥固形含量のコメ基質が可溶化されたデンプン加水分解物に転換される。幾つかの態様において、コメ基質は完全に可溶化される。好ましくは、可溶化されたデンプン加水分解物はグルコ−スであり、もっとも好ましくは、グルコ−スの生産性は、可溶化された総乾燥固形分のパ−セントにして、少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、及び９９．５％である。
【０１６０】
確実な態様において、少なくとも８０％、８５％、及び９０％のコメ基質の顆粒デンプンが、２４時間以内に可溶化され、加水分解される。他の態様において、少なくとも９５％、のコメ基質の顆粒デンプンが、２４時間以内に可溶化され、加水分解される。更なる態様において、少なくとも９８％のコメ基質の顆粒デンプンが、２４時間以内に可溶化され、加水分解される。
【０１６１】
幾つかの態様において、コメ基質及びデンプン加水分解酵素（例えば、アルファアミラ−ゼ及びＧＳＨＥ）を含む組成物は、約５．０乃至６．０の間のｐＨにおいて、十分な時間（例えば、２乃至９６時間）インキュベ−トされる。幾つかの態様において、インキュベ−トされたスラリ−は約３．０乃至４．０の低いｐＨを示す。この低いｐＨはコメ基質における酵素反応を停止させる。
【０１６２】
十分時間のインキュベ−トの後、可溶化されたコメデンプン加水分解物を含む分画は、実質的に不溶性タンパク質濃縮物を含む残渣を取り去るために、インキュベ−トスラリ−から除去される。分離方法は当該技術分野において知られている。通常、これらの分離方法は、遠心分離、従来のろ過方法及び膜分離方法を含む。
【０１６３】
コメタンパク質濃縮物を含む残渣のタンパク質含量（Ｎｘ５．９５）は、１０％、２０％、３０％、４０、及び５０％より大きい。幾つかの態様において、コメタンパク質濃縮物のタンパク質含量は、約１０％乃至６０％、約１０％乃至５０％、約２０％乃至４５％及び約３０％乃至４０％の間の幅である。
【０１６４】
他の態様において、高純度コメタンパク質濃縮物が得られる。幾つかの態様において、高純度コメタンパク質濃縮物は、第二酵素加水分解工程により得られる。この工程では、実質的に不溶性コメタンパク質濃縮物を含み、第一酵素加水分解工程から得られた、残渣が、残った顆粒又は不溶性デンプンを加水分解するために上で示した温度及びｐＨにおいて、所定の時間インキュベ−トされる。幾つかの態様において、この残渣に残っているデンプンの加水分解酵素の反応は、インキュベ−トのｐＨよりも低いｐＨにすることで停止される。このことは、例えば、約５０℃乃至６０℃の温度において、ｐＨ５．５をｐＨ３．０乃至４．０にまで低めることで達成される。可溶性のコメデンプン加水分解物は、上で述べたように高純度コメタンパク質濃縮物を得るためにこの残渣から分離される。
【０１６５】
この態様において、同じで加水分解酵素が上で述べたように使用されてもよい。好ましい態様において、少なくとも１のデンプン加水分解酵素は、ＧＳＨＥである。他の好ましい態様において、ＧＳＨＥはアルファアミラ−ゼと組み合わせて使用される。他の好ましい態様において、ＧＳＨＥはグルコアミラ−ゼと組み合わせて使用される。しかしながら、この方法における第一及び第二酵素加水分解をこれらの酵素に限定することは意図しない。他の酵素もこれらの工程に使用することがでる。他の酵素には、
セルラ−ゼ、ペクチナ−ゼ、プルラナ−ゼ及びベ−タグルコシダ−ゼを含むがこれらに限定されない。
【０１６６】
高純度タンパク質濃縮物のタンパク質含量（Ｎｘ５．９５）は、通常６０％、６３％、６８％、７０％、及び７５％より大きい。幾つかの態様において、高純度コメタンパク質濃縮物は約６５％以上及び約７０％以上のタンパク質含量を有する。
【０１６７】
この工程に従って得られたコメタンパク質濃縮物又は高純度コメタンパク質濃縮物は、従来の及び既知の技術を用いて乾燥される。例えば、真空乾燥、スプレ−ドライ、凍結乾燥など。幾つかの態様において、本発明により得られたコメタンパク質濃縮物の水分含量は、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、及び２％である。幾つかの態様において、得られた高純度タンパク質濃縮物は、６％、５％、４％、３％、及び２％以下の水分含量になるまで乾燥する。幾つかの態様において、水分含量は約２％乃至５％の間である。
【０１６８】
本発明の方法により得られたタンパク質濃縮物及び高純度タンパク質濃縮物は、従来の高温処理を用いた方法により処理されたデンプンにより得られたタンパク質分画に対して改善された性質を有する。幾つかの態様において、このタンパク質濃縮物及び高純度タンパク質濃縮物は、デンプン処理において従来法を用いて得られたタンパク質における溶解性について比較すると、アルカリにおける溶解性、特にｐＨ１０における溶解性が大きくなっている。幾つかの態様において、ｐＨ１０における溶解性は、少なくとも２０％、少なくとも４０％及び少なくとも５０％である。更なる態様において、このタンパク質濃縮物及び高純度タンパク質濃縮物は、デンプンの処理において従来法を用いて得られた分画の中のタンパク質と比較したときに、酸性ｐＨにおける溶解性、とくにｐＨ２．０における溶解性が改善されているタンパク質を含む。幾つかの態様において、ｐＨ２．０における溶解性は、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％及び少なくとも３０％である。
【０１６９】
更なる態様において、本発明の方法により得られたタンパク質濃縮物及び高純度タンパク質濃縮物は、デンプン処理において従来の方法を用いることにより得られた残渣のタンパク質分画のアミノ酸プロファイルと比較した時に、所定のアミノ酸のパ−センテ−ジが高められている。例えば、幾つかの態様において、グルタミン酸、バリン、ロイシン、プロリン、メチオニン、アルギニン、アスパラギン酸又はアラニンが本発明により得られたタンパク質濃縮物において高い。
【０１７０】
以下の実施例は、特定の好ましい態様及び本発明の側面を説明し、更に詳細に示すために提供され、本発明の範囲を限定するのもではない。すなわち、これらの示唆は本明細書で開示されている工程を更に最適化するために用いられる。
【０１７１】
以下の開示及び実施例の章では、以下の略語を用いる。
【０１７２】
Ｈ−ＧＳＨＥ（天然フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)ＧＳＨＥ）；ｒＨ−ＧＳＨＥ  (トリコデルマレ−シ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｌ)内で発現されたフミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)；ｗｔ％  (重量パ−セント)；℃  (摂氏温度)；ｒｐｍ  (一分間当たりの回転数)；Ｈ２０  (水)；ｄＨ２〇及びＤｉ(脱イオン水)；ｂｐ  (ベ−スペア)；ｋｂ  (キロベ−スペア)；ｋＤ  (キロダルトン)；ｇｍ  (グラム)；μg  (マイクログラム)；ｍｇ  (ミリグラム)；ｎｇ  (ナノグラム)；μl  (マイクロリットル)；ｍｌ及びmL  (ミリリットル)；mm  (ミリメ−タ−)；nm  (ネノメ−タ−)；μm  (マイクロメ−タ)；Ｍ  (モル)；ｍＭ  (ミリモル)；μＭ  (マイクロモル)；Ｕ  (単位)；Ｖ  (ボルト)；ＭＷ  (分子重量)；ｓｅｃ  (秒)；ｍｉｎ  (s)  (分)；ｈｒ  (s)  (時間)；ＭＴ（メ−トルトン）；ＰＡＧＥ  (ポリアクリルアミド電気泳動)；フタル酸緩衝液  (水中20  ｍＭ  のフタル酸ナトリウム、ｐＨ  ５．０)；ＳＤＳ  (ドデシル硫酸ナトリウム)；トリス  (トリス  (ヒドロキシメチル)  アミノメタン)；ｗ／ｖ  (容量対重量)；ｖ／ｖ  (容量対容量)；ジエンコ−(Ｇｅｎｅｎｃｏｒ)  (ジェネンコ−インタ−ナショナル、パロアルト、カリフォルニア)；新日本  (新日本,  日本)；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフ法）；及びｄｓ（乾燥固形含量）。
【０１７３】
一般法
コメ基質−白米粉、エレファントブランド（ＥｌｅｐＨａｎｔ  Ｂｒａｎｄ）はタイ  ベタ−フ−ド社（Tｈａｉ  Ｂｅｔｔｅｒ  Ｆｏｏｄｓ，  Ｃｏ．  ，  Ｌｔｄ．  Ｂａｎｇｐｏｎｇ，  Ｔｈａｉｌａｎｄ）より購入した。
【０１７４】
総タンパク質アッセイ−コメ粉及びコメ基質調製物の総タンパク質含量は、ケルダ−ル法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２Ｂ６０８,  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  of  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  （ＡＡＣＣ）  １９８３,  Ｓｔ  Ｐａｕｌ，  ＭＮ参照のこと）により評価した。タンパク質含量（％）は総窒素に対して5.95のｍｏｒｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒを用いて計算した（Ｊｕｌｉａｎｏ  Ｂ．Ｏ．  （１９８５）  Ｒｉｃｅ：  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ;  AＡＣＣ，  Ｓｔ．  Ｐａｕｌ  ＭＮ）。
【０１７５】
総デンプン含量の評価−総デンプン含量は酵素−酵素デンプン液化及び糖化法により評価した。通常の解析において、乾燥サンプルの２ｇが、１００ｍｌのコ−ルラッシュ（Ｋｏｈｌｒａｕｃｓｈ）フラスコに入れ、ｐＨ７．０のＭＯＰＳ緩衝液、４５ｍｌを添加した。このスラリ−を３０分間よく攪拌した。１．０ｍｌのＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＥＲＤ（Ｈ２Ｏに１：５０希釈）を添加し、３−５分間沸騰させ加熱した。このフラスコは１２１℃に維持したオ−トクレ−ブに１５分間静置した。オ−トクレ−ブのあと、このフラスコを９５℃に維持したウォ−タ−バス内に静置し、１：５０で希釈されたＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤの１０ｍｌを添加し、４５分間インキュベ−トした。ｐＨを４．２に調整し、温度を６０℃に下げ、２０ｍｌのｐＨ４．２の酢酸緩衝液をこの混合物に添加した。糖化は１；１００希釈したＯＰＴＩＤＥＸ  Ｌ−４００（ジェネンコ−  インタ−ナショナル  インク）を１０ｍｌ添加することにより行い、６０℃で１８時間インキュベ−ションを行った。酵素反応は１０分間９５℃に加熱することにより停止した。酵素処理をしていない室温におけるサンプルの水抽出物の可溶性デンプン加水分解物を総糖量から差し引いた。
【０１７６】
オリゴ糖の解析−オリゴヌクレオチドの反応生成物の組成は、屈折率（ＲＩ）検出器（アンスペック社（Ｔｈｅ  Ａｎｓｐｅｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｉｎｃ．）のＥＲＣ−７５１５Ａ検出器）及び５０℃に維持されたＨＰＬＣカラム（Ｒｅｚｅｘ８  ｕ８％  Ｈ，  Ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ）、を装備したHPLC（ベックマン  システム  Ｇｏｌｄ  ３２  Ｋａｒａｔ  Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア、ＵＳＡ）、によって測定した。希硫酸（０．０１Ｎ）を、０．６ｍｌ/分の流速で、移動相として使用した。２０mlの０．４％溶液を、カラムに付加した。このカラムは、糖の分子重量に基づいて、分子を分離する。例えば、ＤＰ１の表記は、グルコ−ス等の単糖類である、ＤＰ２の表記は、マルト−ス等の、二糖類である、ＤＰ３の表記は、マルトトリオ−ス等の三糖類である、そして、ＤＰ４＋の表記は、重合度が４以上のオリゴ糖類である。高分子糖類（Ｈｒ．Ｓｕｇａｒ）の語は、３以上のＤＰを有する糖を言う。
【０１７７】
固形物の相対的可溶化(度)−低温で行われるジェットクッキング工程をコメ基質ｂの可溶化に用いた(米国特許Ｎｏ．３，９１２，５９０)。透明な上清をブリックス(ＡＢＢＥ  リフレクトメ−タ−,  アメリカンオプティカルコ−ポレ−ション(Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ)化学機器部門(Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ)バファロ−、ニュ−ヨ−ク)の測定に用いた。典型的なジェットクッキング工程において、１５０グラムのデンプンを３５０グラムの水に溶解した３０％デンプンスラリ−を１００％可溶化デンプンとして、異なる処理条件下におけるデンプンの相対的可溶化度の計算に用いた。
【０１７８】
典型的なジェットクッキング工程において、３００グラムのコメ粉を７００グラムの水にプラスチックビ−カ−内で溶解し、３０％デンプンスラリ−を調製する。このスラリ−を攪拌し、ＮａＯＨを用いてｐＨを６．０に調整した。バチルスステアルセレモフィリスのアルファアミラ−ゼ（Ｇ−ＺＹＭＥ  Ｇ９９７）(ジェネンコ−  インタ−ナショナルインク)を、０．８ｋｇ／ＭＴ（Ｗ／Ｗｄｓｓ）添加した。このスラリ−を１０５℃に維持した加熱コイル上で、５分間膨張させ、９５℃のウォ−タ−バス内で一部を浸して、蓋をしたエルレンマイア−フラスコの中で２時間置いた。２ｍｌの液化されたサンプルをプラスチックピペットを用いて遠心管へと移し、８０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。この上清のブリックスの値は２７であった。
【０１７９】
Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７によりコメデンプンの可溶化（度）を１００％と仮定すれあｂ、２７のブリックス値は、参考ブリックスを表し、この値は実施例におけるコメ基質の相対的可溶化度を計算するために用いる
ＲＳ＝（ブリックス／参考ブリックス）Ｘ１００％
ここで、ＲＳ＝相対的可溶化度、ブリックス＝試験（Ｅｘｐｔ）ブリックス、及び参考ブリックス＝１００％可溶化ブリックス
実施例
本発明は以下の実施例において詳細に説明される。これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【０１８０】
トリコデルマレ−シ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)におけるフミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)ＧＳＨＥ遺伝子の発現（ｒＨ−ＧＳＨＥ）
フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)ＧＳＨＥ遺伝子のクロ−ニング
凍結スキタリジウムセルモフィリラム(Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｐＨｉｌｕｍ)(ＡＴＣＣ  １６４５３、アナモルフ(ａｎａｍｏｒｐｈ)、フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)の菌糸からゲノムＤＮＡ  (配列番号1)を抽出した。この凍結菌糸をコ−ヒ−ミルの中でドライアイスと一緒に粉砕し、Ｅａｓｙ  ＤＮＡプロトコル(インビトロジェン)によりＤＮＡを抽出した。クロロホルム/フェノ−ル/イソアミルアルコ−ル抽出工程をこの標準的な手順に追加した。ＮＣＢＩ  デ−タベ−ス登録番号＃Ｍ８９４７５  配列にもとづいてＰＣＲプライマ−を消化した。以下のプライマ−はｐＥＮＴＲ／Ｄベクタ−(インビトロジェン)内でクロ−ニングするためのモチ−フを含んでいる。
【０１８１】
このＲＳＨ００３ｆプライマ−は、CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC  (配列番号７)  及びＲＳＨ００４ｒプライマ−の配列はTTAACGCCACGAATCATTCACCGTC(配列番号８)である。
【０１８２】
インビトロジェンゲ−トウェイシステムプロトコルに従ってＰＣＲ生成物をｐＥＮＴＲ／Ｄ内へクロ−ンした。このベクタ−は、その後化学的に有用なＴｏｐ１０大腸菌の中で形質転換され、カナマイシン選択された。幾つかのクロ−ンからのプラスミドＤＮＡが正確なサイズの消化を確認するために制限消化された。いくつかのクロ−ンからのｇｌａ１挿入が配列決定(Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ)された。一のクロ−ンからのプラスミドＤＮＡ、ｐＥＮＴＲ／Ｄ＿Ｎ１３ｐをＴｒｅｘ３ｇｌａｍｄＳ消化ベクタ−ＤＮＡと共にＬＲクロナ−ゼ反応(インビトロジェン  ゲ−トウェイシステム)に添加した。ＬＰクロナ−ゼ反応における組換えは、消化ベクタ−のＣｍＲ及びｃｃｄＢ遺伝子と、ｐＥＮＴＲ／Ｄベクタ−からのフミコ−ラグリセア(Ｈ．ｇｒｉｓｅａ)ｇａｌ１とを置換した。
【０１８３】
組換えは、ｇａｌ１をｃｂｈ１プロモ−タ−とタ−ミネ−タとの間に挿入した。４８及び５０ｂｐの組換え部位配列はそれぞれｇａｌ１の上流及び下流に残っていた。ＬＲクロナ−ゼ反応のアリコ−トは化学的に適したＴｏｐ１０大腸菌内へ形質転換され、一晩、カルベニシリンで選択条件で育成した。いくつかのクロ−ンからのプラスミドＤＮＡが正しい挿入サイズを確認するために適切な消化酵素で消化された。ｃｂｈ１プロモ−タ−：ｇｌａ１：ｃｂｈ１タ−ミネ−タ−：ａｍｄＳを含む発現カセットを切り離すためにクロ−ンからのプラスミドＤＮＡ、ｐＴｒｅｘ３ｇ＿Ｎ１３(図３及び図４参照)をＸｂａｌ１で消化した。６．６ｋｂのカセットを標準技術を用いたアガロ−スゲル抽出法により精製し、上で述べたように公知の入手可能なQM6のトリコデルマレ−シ(Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ)株内で形質転換した。
【０１８４】
このカセットをＳｅｑｕｅｔｅｃｈ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡを用いて配列決定し、ＧＳＨＥに対するＤＮＡを図１(配列番号1)に、アミノ酸配列を図２(配列番号２及び３)に示した。
【０１８５】
トリコデルマレ−シの形質転換
菌糸の胞子を有する約２ｃｍ2のプレ−ト(５日間３０℃でＰＡＤプレ−ト上で育成したもの)を２５０ｍｌの４バッフルの振とうフラスコ内の５０ｍｌのＹＥＧブロス(５ｇ／Ｌイ−スト抽出物及び２０ｇ／Ｌグルコ−ス)に接種し３７℃で１６乃至２０時間２００  ｒｐｍでインキュベ−ションした。インキュベ−ションしたものを５０ｍｌのコニカルチュ−ブ内に移し２５００ｒｐｍで１０分間遠心して菌糸を回収した。上清を別容器に移した。菌糸のペレットは４０ｍｌのフィルタ−ろ過したβ−グルカナ−ゼ溶液を含む２５０ｍｌの０．２２ミクロンＣＡコ−ニングフィルタ−ボトルへ移し、形質転換のためのプロトプラストを育成するために３０℃で２００ｒｐｍで２時間インキュベ−ションした。
【０１８６】
プロトプラストを滅菌ミラクロスから５０ｍｌのコニカルチュ−ブにろ過することにより回収した。それらを、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離することによりペレット形成し、アスピレ−タで乾燥させた。このプロトプラストペレットを、１．２Ｍソルビト−ル５０ｍＬで一度洗浄し、遠沈し、アスピレ−タで乾燥した。２５ｍｌのソルビト−ル/ＣａＣｌ２で洗浄した。このプロトプラストをカウントし、その後、２０００ｒｐｍ、５分間でペレット形成した。上清を別容器に移し、プロトプラストペレットを１ｍｌあたり１．２５×１０8のプロトプラスト濃度を調製するのに十分量のソルビト−ル／ＣａＣｌ2の量の中に懸濁して、プロトプラスト溶液を調製した。
【０１８７】
２０μLまでの発現ベクタ−ＤＮＡ(２０μL以下の容量)のアリコ−トを１５ｍｌのコニカルチュ−ブに入れ、氷上に置いた。その後に２００μLのプロトプラスト懸濁液を５０μLのＰＥＧ溶液とともに各形質転換アリコ−トに添加した。チュ−ブをおだやかに撹拌し、氷上で２０分間インキュベ−トした。２ｍｌのＰＥＧ溶液をアリコ−トチュ−ブに添加し、それらを室温で５分間インキュベ−トした。ソルビト−ル／ＣａＣｌ２溶液、４ｍｌをこのチュ−ブに添加した(総容量が６．２ｍｌになる)。形質転換混合物を３のアリコ−トに約２ｍｌずつ添加した。各３のアリコ−トに３の溶解したトップアガ−を添加することによりオ−バ−レイ混合物を作成し(温度を５０℃に維持し融解状態を保った)、このオ−バ−レイ混合物を形質転換プレ−ト上に注いだ。形質転換プレ−トは３０℃で７日間インキュベ−トした。
【０１８８】
形質転換体のamdS選択を行った。アセトアミド/ソルビト−ルプレ−ト及びオ−バ−レイズ（ｏｖｅｒｌａｙｓ）を形質転換に用いた。選択プレ−トについて、ソルビト−ルを用いないけれども、同じプレ−トを使用した。形質転換体は、アセトアミドを含む新しい選択培地で、単離されたコロニ−を移すことにより精製した。
【０１８９】
本実施例に用いた溶液を以下のように調製した。
【０１９０】
1) ４０ｍｌのβ−D−グルカナ−ゼは、６００ｍｇのβ−D−グルカナ−ゼ(ＩｎｔｅｒＳｐｅｘ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｍａｔｅｏ，  ＣＡ)及び４００ｍｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ２Ｏを含む１．２Ｍのソルビト−ルから調製した。
【０１９１】
2) ５０ｇのＰＥＧ４０００(ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ  Ｐｏｏｌｅ，  Ｅｎｇｌａｎｄ)及び１．４７ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む２００ｍｌ  ＰＥＧはｄＨ２Ｏを用いて調製した。
【０１９２】
3) ソルビト−ル/ＣａＣｌ２は、１．２Ｍのソルビト−ルと５０ｍＭのＣａＣｌ２を含む。
【０１９３】
4) アセトアミド/ソルビト−ルアガ−；
パ−ト1−０．６ｇのアセトアミド(Ａｌｄｒｉｃｈ，  ９９％昇華)、１．６８ｇのＣｓＣｌ、２０ｇのグルコ−ス、２０ｇのＫＨ２ＰＯ４の０．６ｇのＭｇＳＯ・７Ｈ２Ｏ、０．６gのＣａＣｌ２・２Ｈ２０,  １ｍｌの１０００ｘ塩  (以下参照)をｐＨ５．５に調製し,  ｄＨ２Ｏで３００ｍｌにメスアップし、滅菌フィルタ−処理をした。
【０１９４】
パ−トII−２０ｇのノブルアガ−（Ｎｏｂｌｅ  ａｇｅｒ及び２１８ｇのソルビト−ルをｄＨ２Ｏで７００ｍｌにメスアップし、オ−トクレ−ブ滅菌をした。
【０１９５】
パ−トIII−パ−トIの調製物を最終容量を１Ｌにした。
【０１９６】
5)１０００Ｘ塩−５ｇのＦｅＳ０４・７Ｈ２Ｏ,  １．６ｇのＭｎＳ０４・Ｈ２０、１．４ｇのＺｎＳ０４・７Ｈ２Ｏ,  １ｇのＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏを混合し、  ｄＨ２Ｏを用いて容量を１Ｌに調整し、フィルタ−滅菌をした。
【０１９７】
フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)ＧＳＨＥ遺伝子により形質転換されたトリコデルマレ−シ(Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ)の発酵
一般的に、Ｆｏｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （Ｆｏｒｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７８：  ３１９８８−３１９９７)  に説明されている発酵手順は以下のようである。より具体的には、図５に示した各株に対して２回の発酵を行った。１．５ｍｌ凍結スポア懸濁液を５％のグルコ−スを含む０．８Ｌのボゲルズ最小培地(Ｖｏｇｅｌｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｍｅｄｉｕｍ)(Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９７０）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １７Ａ,  ｐｇ  ７９−１４３  及びＤａｖｉｓ，  Ｒｏｗｌａｎｄ，  ＮＥＵＲＯＳＰＯＲＡ，  ＣＯＮＴＲＩＢＵＴＩＯＮＳ  ＯＦ  Ａ  ＭＯＤＥＬ  ＯＲＧＡＮＩＳＭ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖａｒ．  Ｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （２０００）)に接種した。４８時間後、各培地を、１４Ｌのバイオラフィット(Ｂｉｏｌａｆｉｔｔｅ)発酵槽中にある６．２Ｌの同じ培地に移した。発酵は２５℃、７５０ｒｐｍ及び１分間あたり８リットルの空気速度で行った。１時間後、最初に添加されたグルコ−スが全て消費された。２５％（Ｗ／Ｗ）ラクト−スの供給をラクト−スの蓄積による炭素制限が生じないように供給した。グルコ−ス及びラクト−スの濃度は、グルコ−スオキシダ−ゼキット又はラクト−スを切断するβガラクトシダ−ゼを用いたグルコ−スヘキソキナ−ゼアッセイキットにより、それぞれモニタ−された  (Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏ．，  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ)  。発酵の進行具合をモニタ−するため定期的にサンプルを採取した。収集されたサンプルを、５０ｍｌの遠心管に移し、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ(Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  ＭＡ)  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅにおいて３／４スピ−ドで遠心分離した。
【０１９８】
サンプルの上清を、ＭＯＰＳ(モルフォリンプロパンスルホン酸)ＳＤＳ緩衝液及びＬＤＳサンプル緩衝液を用いた条件下で４乃至１２％のＢＩＳ−ＴＲＩＳ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルを用いて電気泳動を行った。結果を図５に示す。レ−ン３、４及び５は、異なる時間におけるrＧＳＨＥの６８ｋＤのバンドが見られた。
【０１９９】
形質転換されたトリコデルマレ−シ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)クロ−ンのＧＳＨＥ活性のアッセイ
酵素活性−ＧＳＨＥ活性は、酵素調製液のアリコ−トを用いて、５０℃、ｐＨ４．５、５  ｍｌの１０％顆粒コ−ンスタ−チを含む０．１Ｍ酢酸バッファ−中で、インキュベ−ションしたときに、１分間あたりに放出される還元糖のミリグラムを用いて決定される。ＧＳＨＥの１の単位は、この条件下で１．０ｍｇの還元糖を１分間放出する。
【０２００】
フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)由来の天然のＧＳＨＥ(nＧＳＨＥ)及びトリコデルマレ−シ(Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ)由来の組換えＧＳＨＥを、フェニルセファロ−スを用いた疎水相互クロマトグラフィ−(Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ,  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ)で処理し、その後にＳＰ−セファロ−スを用いたイオン交換クロマトグラフィ−(Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ)を用いた標準技術により精製した。最初にトリコデルマレ−シ(Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ)クロ−ンにより発現された組換えＧＳＨＥは、ほぼ同じ濃度のタンパク質分画を含んでいた。これらのピ−クをrＧＳＨＥ1及びrＧＳＨＥ２とした。これらのピ−クは、１５００Ｄによる、及び、輸送マススペクトロメ−タ−(ｖｏｙａｇｅｕｒ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ)(Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ,  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ)におけるマトリックス支援レ−ザ−イオン化(ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ)により測定される０．３ｐＨ単位によるマスにおいて、及び製造会社の説明書に従った等電点フォ−カシングゲルにおいて違いが見られた。rＧＳＨＥ１及びrＧＳＨＥ２の、生デンプン加水分解アッセイにより測定された比重、及びＭｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイキット(Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ)  を用いて測定したタンパク質及び溶液中の消散係数のパ−センテ−ジは同じであった(Ａ２８０  ０．１％  ＝  １．９６３)。初期のrＧＳＨＥ発現の後約７２時間、１のみのｒＧＳＨＥが存在していた(rＧＳＨＥ３)(表１参照のこと)。
【表１】
2007531515.tif 000003
【０２０１】
ＧＳＨＥの炭水化物量％は、４Ｎのトリフルオロ酢酸を用いて、１００℃で５時間、酸加水分解をすることにより決定された。測定値は、パラヒドロキシ安息香酸複合体を用いて、放出された還元糖を測定することにより決定された。初期の発現のときに、ｒＧＳＨＥ１及びｒＧＳＨＥ２は総炭水化物含量の２．７０％を占めていた。しかしながら、７２時間後、培地中のｒＧＳＨＥ３の糖化レベルは総炭水化物のうちの０．５７％であった。天然ＧＳＨＥの糖化レベルは１．１２％であった。
【０２０２】
本実施例により得られたｒＧＳＨＥを以下の実施例における組換えＧＳＨＥの源として使用し、ｒＨ−ＧＳＨＥと称した。
【０２０３】
トリコデルマレ−シ(Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ)におけるアスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  ｋａｗａｃｈｉ)ＧＳＨＥの発現
アスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  ｋａｗａｃｈｉ)遺伝子のクロ−ニング
図６で示す配列を有するアスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチＧＳＨＥ遺伝子のクロニング及びトリコデルマレ−シ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）における形質転換は上で述べた方法と同様に行った。
【０２０４】
つまり、実施例１で説明した方法に従って、アスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  ｋａｗａｃｈｉ)株の凍結菌糸からゲノムＤＮＡを抽出した。ＰＣＲプライマ−配列はアスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ(Ａ．  ａｗａｍｏｒｉ  ｖａｒ．  ｋａｗａｃｈｉ)グルコアミラ−ゼ  ＧＡＩ（Ｈａｙａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ.  （１９８９）  Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ５３：  ９２３−９２９)に基づいて設計された。このＧＡＩはＧＳＨＥである。
【０２０５】
用いたプライマ−を以下に示す。
【０２０６】
Ｇａｔｅｗａｙ(インビトロジェン)ディレクショナルモチ−フCACCを含む、CAC  CAT  GTC  GTT  CCG  ATC  TCT  TCT  C  (配列番号１０)を有するＲＳＨ１０ｆプライマ−、及び
CTA  CCG  CCA  GGT  GTC  GGT  CAC  (配列番号10)を有するＲＳＨ１０ｒプライマ−を用いた。
【０２０７】
ＤＮＡ配列を図５(配列番号５)に示す。ベクタ−構築及びトリコデルマレ−シ（Ｔ．  ｒｅｅｓｅｉ）の形質転換の手順は上記と同様に行った。Ａ−ＧＳＨＥ挿入はＳｅｑｕｅｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により配列決定された。ｒＡ−ＧＳＨＥ発現はｒＨ−ＧＳＨＥ発現と同様に検出した。発現のレベルは、2g/Lより高いと検出された。
【実施例２】
【０２０８】
アルファアミラ−ゼによる異なる顆粒デンプン基質の可溶化及び加水分解
１０００ｍｌのステンレスのスチ−ルコンテナ内において、１５０グラムの白米粉を３５０グラムの脱イオン水に懸濁し、３０％ｄｓのスラリ−を調整した。このスラリ−を攪拌し、６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨを５．５に調整した。ステンレスのスチ−ルスタ−ラ−をコンテナの中に置き、ガラスで上に蓋をした。コンテナに酵素を添加する前に、このコンテナを７０℃で１５分プレインキュベ−トした。バチルスステアロセレモフィリス由来のアルファアミラ−ゼ（Ｇ−ｚｙｍｅ  Ｇ９９７、ジェネンコ−インタ−ナショナルインク）は、0.8ｋｇ／ＭＴ（ｗ／ｗ  ｄｓｓ）の濃度で投与したとき顆粒コメ基質を可溶化する能力において、バチルスリケニフォルミス（Ｂａｃｕｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）(ジェネンコ−インタ−ナショナルインク)由来のアルファアミラ−ゼと比較した。酵素を添加した後、懸濁液は攪拌しながら７０℃において２時間インキュベ−トし、ついで６０℃で４８時間インキュベ−トした。各コンテナから、予めきめられた時間間隔で２ｍｌのサンプルをプラスチックピペットを用いて採取し、遠心管に移した。このサンプルは、８０００ｐｒｍで３分遠心分離された。上清を遠心管から回収し、数滴をＬｅｃｉａ  ＡＲ２００  デジタル  ハンド  ヘルド  リフレクトメ−タ−のサンプルウェル内に置いた。ブリックスの値が記録され、相対的可溶化度（ＲＳ）が計算された。この結果を表２に示す。この表は、バチルスステアロセレモフィリス（Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７）のアルファアミラ−ゼがバチルスリケニフォルミスアルファアミラ−ゼ（ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ）よりも顆粒コメデンプンの可溶化に効果的であることを示す。
【表２】
2007531515.tif 000004
【実施例３】
【０２０９】
顆粒コメ基質の可溶化に対するＧ−ＺＹｍｅ  Ｇ９９７の濃度の影響
３０％  ｄｓスラリ−を調製するために、１０００ｍｌのステンレススチ−ルコンテナの中で、１５０ｇのコメ粉に脱イオン水（３５０ｇ）を加え攪拌した。この懸濁液を攪拌し６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調製した。ステンレスのスチ−ルスタ−ラ−をこのコンテナ内に置き、ガラスで蓋をした。このスチ−ルコンテナの懸濁液をアルファアミラ−ゼを添加する前に１５分間６０℃でインキュベ−トした。３つの懸濁液のコンテナを前記のように調整した。Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７を、各コンテナに、０．１、０．２５、及び０．５ｋｇ/ＭＴコメ粉（ｄｓ）の濃度で添加した。酵素を添加した後、この懸濁液を６０℃で２４時間攪拌しながら懸濁した。２ｍｌのサンプルを各コンテナより予め決められた時間間隔で、プラスチックピペットを用いて採取し、遠心管に移した。このサンオウルを８０００ｐｒｍで３分遠心分離した。上清の数滴をこの遠心管から注意深く採取し、ブリックスを測定した。ブリックスの値が記録され、相対的可溶化度（ＲＳ）を計算した。この結果、表３に示すように、０．２５ｋｇ/Ｍｔコメ粉（ｄｓ）以上のＧ−ＺｙｍｅＧ９９７の濃度において、顆粒コメデンプンの可溶化度における有意な差は見られなかった。
【表３】
2007531515.tif 000005
【実施例４】
【０２１０】
顆粒コメデンプンの可溶化におけるｒＨ−ＧＳＨＥの濃度の影響
実施例１で述べたように顆粒デンプン加水分解酵素（ｒＨ−ＧＳＨＥ）を、ｐＨを５．５に調製した３０％水溶性スラリ−中にコメ粉のグラム当たりにして各種の濃度のＧＳＨＥ単位で添加した。このスラリ−を６０℃でインキュベ−ションし、サンプルを異なる時間間隔で採取した。このサンプルを上で説明したように遠心分離し、透明な上清をブリックスの評価に用いた。
【表４】
2007531515.tif 000006
【実施例５】
【０２１１】
０．１ｋｇ／ＭＴコメ粉（ｄｓ）及びＧ−ＺｙｍｅＧ９９７の存在下における顆粒コメデンプンの可溶化に対するｒＨ−ＳＧＨＥの影響
３０％  ｄｓスラリ−を調製するために、１０００ｍｌのステンレススチ−ルコンテナの中で、１５０ｇのコメ粉に脱イオン水（３５０ｇ）を加え攪拌した。この懸濁液を攪拌し６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調製した。ステンレスのスチ−ルスタ−ラ−をこのコンテナ内に置き、ガラスで蓋をした。このスチ−ルコンテナの懸濁液をアルファアミラ−ゼを添加する前に１５分間６０℃でインキュベ−トした。
【０２１２】
懸濁液の２のコンテナを上で述べたように調製した。Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７を０．１ｋｇ／ＭＴコメ粉（ｄｓ）の濃度で投与し、ｒＨ−ＧＳＨＥを０乃至１．０ＧＳＨＥ単位／ｇコメ粉  ｄｓの濃度で添加した。酵素を添加した後、懸濁液を６０℃で２４時間攪拌しながらインキュベ−ションした。２ｍｌの上清をプラスチックのピペットを用いて各コンテナより、予め決められた時間間隔で採取し、遠心管移した。この上清を含む遠心管を８０００ｒｐｍで３分遠心分離した。遠心管から注意深く上清を数滴回収し、ブリックスを測定した。このブリックス値を記録し、相対的可溶化度（ＲＳ）を計算した。他の０．５ｍｌの上清をスクリュ−キャップのついた試験管に移した。この試験管に蓋をし、酵素を失活させるために沸騰水中で１５分間置いた。上清を脱イオン水で、ブリックスが約３になるように希釈した。各試験管を良く混合し、２ｍｌの内容物を０．４５μｍのフィルタ−でオ−トサンプラ−バイアル内へろ過した。この上清の糖組成をＨＰＬＣを用いて解析した。
【０２１３】
表５及び表６に示す結果において、ｒＨ−ＧＳＨＥは、０．１ｋｇ/Ｍｔ  ｄｓｓのＧ−Ｚｙｍｅの存在下において、２４時間後にのみ９０％以上の顆粒コメデンプンの可溶化度が有意に高くなっていた。図７を参照していただきたい。時間に対する可溶化されたデンプンの％をＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７のみの添加と、ｒＨ−ＧＳＨＥ単独、並びに、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７と組み合わせて用いた場合とを比較した。ｒＨ−ＧＳＨＥ及びＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７を組み合わせて用いた場合には、２０時間後に９０％以上の顆粒デンプンが可溶化されたのに対し、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７単独で用いた場合には約５０％、ｒＨ−ＧＳＨＥ単独で用いた時には約２８％の顆粒デンプンが可溶化された。
【０２１４】
更に、ｒＨ−ＧＳＨＥとＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７の組み合わせは、２４時間後にのみ９６％以上のグルコ−スを含むシロップを生産することができた。しかしながら、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７単独では、顆粒コメデンプンの９０％以上を可溶化することもグルコ−ス高含有シロップを生産することもできなかった。
【表５】
2007531515.tif 000007
【表６】
2007531515.tif 000008
【実施例６】
【０２１５】
ｒＨ−ＧＳＨＥ及びＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７の存在下における顆粒コメ基質の可溶化に対するｐＨの影響
３０％  ｄｓスラリ−を調製するために、１０００ｍｌのステンレススチ−ルコンテナの中で、１５０ｇのコメ粉（エレファント  ブランド、タイ  ベタ−  フ−ド社、バンポング  タイランド）に脱イオン水（３５０ｇ）を加え攪拌した。上で説明した４つの懸濁液を調製した。６ＮのＨ２ＳＯ４及び/又は１ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを４．５、５．０及び６．０に調製した。ステンレススチ−ルスタ−ラ−を各コンテ内に置き、各コンテナの上にガラスのカバ−を蓋として置いた。このスチ−ルコンテナを６０℃のウォ−タ−バスに１５分間、酵素を添加する前に置いた。
【０２１６】
ｒＨ−ＧＳＨＥを０．５ＳＧＨＥ単位／コメ粉の濃度で各コンテナに添加し、Ｇ−Ｚｙｍｅ９９７は０．１ｋｇ／ＭＴコメ粉の濃度で添加した。酵素を添加した後、この懸濁液を６０℃で２４時間、攪拌しながら添加した。２ｍｌのサンプルを、プラスチックのピペットを用いて、予め決められた時間間隔で各コンテナから回収し、遠心管に移した。このサンプルを８０００ｒｐｍで３分遠心分離した。この管から回収された上清の数滴をブリックスの測定に用いた。ブリックスの値を記録し、相対的可溶化度を計算し、表７に示した。この結果は、ｐＨ５．０乃至６．０及び６０℃における顆粒コメデンプンの可溶化について有意な差は見られなかったが、ｐＨ４．５においては有意に可溶化度が有意に低いことを示している。
【表７】
2007531515.tif 000009
【実施例７】
【０２１７】
ｐＨ５．５におけるｒＨ−ＧＳＨＥ及びＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７の存在下における顆粒コメ基質の可溶化に対する温度の影響
３０％  ｄｓスラリ−を調製するために、１０００ｍｌのステンレススチ−ルコンテナの中で、１５０ｇのコメ粉（エレファント  ブランド、タイ  ベタ−  フ−ド社、バンポング  タイランド）に脱イオン水（３５０ｇ）を加え攪拌した。この懸濁液を攪拌し６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調製した。上で説明したような懸濁液の４つのコンテナを調製した。ステンレススチ−ルスタ−ラ−を各コンテナ内に置き、ガラスの多いを蓋として各コンテナの上に置いた。このスチ−ルコンテナを酵素を添加する前に、５５℃、６５℃、６５℃、及び７０℃のウォ−タ−バス内に置いた。
【０２１８】
ｒＨ−ＧＳＨＥを１．０ｋｇ／ＭＴ  コメ粉ｄｓ濃度で添加し、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７を０．１ｋｇ/Ｍｔコメ粉ｄｓの濃度で添加した。酵素を添加した後、この懸濁液を２４時間攪拌しながらインキュベ−ションした。２ｍｌのサンプルを、プラスチックピペットを用いて予め決められた時間間隔において各コンテナから回収し、遠心管の中に移した。このサンプルを８０００ｒｐｍにおいて３分間遠心分離した。この遠心から上清の数滴を注意深く回収し、ブリックスを測定した。このブリックスの値を記録し、相対的可溶化度を計算し、表８に示した。この結果は、ｐＨ５．５において６０℃が最適温度であることを示している。
【表８】
2007531515.tif 000010
【実施例８】
【０２１９】
６０℃、ｐＨ５．５における０．１ｋｇ／ＭＴのＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７の存在下における顆粒コメデンプンの可溶化に対するｒＨ−ＧＳＨＥの濃度の影響
３０％  ｄｓスラリ−を調製するために、１０００ｍｌのステンレススチ−ルコンテナの中で、１５０ｇのコメ粉（エレファント  ブランド、タイ  ベタ−  フ−ド社、バンポング  タイランド）に脱イオン水（３５０ｇ）を加え攪拌した。この懸濁液を攪拌し６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調製した。上で説明したような懸濁液の４つのコンテナを調製した。ステンレススチ−ルスタ−ラ−を各コンテナ内に置き、ガラスの多いを蓋として各コンテナの上に置いた。この方法で６のコンテナを用意し、酵素を添加する前に、６０℃のウォ−タ−バスで１５分間インキュベ−ションした。
【０２２０】
Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７は各コンテナに０．１ｋｇ／ＭＴコメ粉ｄｓの割合で添加し、ｒＨ−ＧＳＨＥは０、０．５、１．０、１．５、２．０又は３．０ＧＳＨＥ単位／ｇコメ粉ｄｓの濃度で添加した。酵素添加の後、この懸濁液を６０℃で２４時間、攪拌しながらインキュベ−ションした。２ｍｌのサンプルをプラスチックのピペットを用いて予め決められた時間間隔で回収し、その後遠心管に移した。サンプルを８０００ｒｐｍ３分間遠心分離した。遠心から数滴の上清を注意深く回収し、ブリックスを測定した。ブリックスの値を記録し、相対的可溶化度（ＲＳ）を計算し表９に示した。この結果は、６０℃において、９５％以上のグルコ−ス産性を示し、かつコメデンプンを９０％以上可溶化するための方法を示している。ｒＨ−ＧＳＨＥの濃度が１．５ＧＳＨＥ単位／ｇｄｓ以上高くなるまでは、％ＲＳに有意な差は見られなかった。９０％以上の顆粒コメデンプンを加水分解することは、0.1  ｋｇ  Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７ＭＴ／コメ粉ｄｓ及び１．５ＧＳＨＥ単位のｒＨ−ＧＳＨＥ／ｇコメ粉ｄｓにより達成することができる。
【表９】
2007531515.tif 000011
【実施例９】
【０２２１】
６０℃及びｐＨ５．５における０．５ＧＳＨＥ単位/ｇコメ粉ｄｓ存在下における顆粒コメデンプンの可溶化に対するＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７の影響
３０％  ｄｓスラリ−を調製するために、１０００ｍｌのステンレススチ−ルコンテナの中で、１５０ｇのコメ粉（エレファント  ブランド、タイ  ベタ−  フ−ド社、バンポング  タイランド）に脱イオン水（３５０ｇ）を加え攪拌した。この懸濁液を攪拌し６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調製した。ステンレススチ−ルスタ−ラ−を各コンテナ内に置き、ガラスの多いを蓋として各コンテナの上に置いた。上で説明したような懸濁液の４つのコンテナを調製した。酵素を添加する前に、６０℃のウォ−タ−バスで１５分間インキュベ−ションした。
【０２２２】
ｒＨ−ＧＳＨＥを０．５ＧＳＨＥ単位／ｇコメ粉ｄｓの濃度で添加し、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７の各量を０．１、０．２５、０．５及び１．０ｋｇ／ＭＴコメ粉ｄｓの濃度で添加した。酵素添加の後、この懸濁液を６０℃で２４時間、攪拌しながらインキュベ−ションした。２ｍｌのサンプルをプラスチックのピペットを用いて予め決められた時間間隔で回収し、その後遠心管に移した。サンプルを８０００ｒｐｍ３分間遠心分離した。遠心から数滴の上清を注意深く回収し、ブリックスを測定した。ブリックスの値を記録し、相対的可溶化度（ＲＳ）を計算し表１０に示した。
【０２２３】
この結果は、０．５ｒＨ−ＧＳＨＥの存在し下において、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７の濃度を高めると、顆粒コメデンプンのＲＥに効果的であることを示しており、０．５Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７  ＭＴ／コメ粉ｄｓを用いて９０％以上のＲＳを達成することができた。
【表１０】
2007531515.tif 000012
【実施例１０】
【０２２４】
Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７及び異なる濃度のｒＨ−ＧＳＨＥをインキュベ−ションする間の顆粒コメデンプンの可溶化及び加水分解に対するコメ粉濃度の影響
ａ）３９５ｇ脱イオン水に１０５ｇのコメ粉を含むスラリ−、ｂ）３５７．５ｇ脱イオン水に１４２．５ｇのコメ粉を含むスラリ−、ｃ）３２１．５ｇ脱イオン水に１７８．５ｇのコメ粉を含むスラリ−、を異なるフラスコ内で調製した。このスラリ−のｐＨを６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調整した。Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７を０．２ｋｇ／Ｍｔコメ粉の濃度で添加した。各フラスコに異なる濃度のｒＨ−ＧＳＨＥを添加した。このフラスコを６０℃に維持したウォ−タ−バス内に置いた。この混合物を濃度を均一にするためにインキュベ−ションの間連続的に攪拌した。サンプルを異なる時間間隔で回収し、遠心分離し、上で説明した様にブリックスの測定に用いた。このサンプルをＨＰＬＣ解析に供した。結果を表１１に示す。この結果は、２５％濃度のコメ粉スラリ−をアルファアミラ−ゼ及びｒＨ−ＧＳＨＥと共にインキュベ−ションしたものが、顆粒コメでの可溶化を完全にし、９６％以上のグルコ−スを生産したことを示す。
【表１１】
2007531515.tif 000013
【実施例１１】
【０２２５】
コメタンパク質濃縮物及び高純度コメタンパク質濃縮物のタンパク質の評価
３０％  ｄｓスラリ−を調製するために、１０００ｍｌのステンレススチ−ルコンテナの中で、１５０ｇのコメ粉（エレファント  ブランド、タイ  ベタ−  フ−ド社、バンポング  タイランド）に脱イオン水（３５０ｇ）を加え攪拌した。この懸濁液を攪拌し６ＮのＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ５．５に調製した。このスラリ−を６０℃のウォ−タ−バスの中に置き、酵素を添加する前に混合物を均一にするために連続的に攪拌した。ｒＨ−ＧＳＨＥは１．０ＧＳＨＥ単位／ｇコメ粉の濃度で添加し、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７を０．１ｋｇ／ＭＴコメ粉ｄｓの割合で添加した。酵素を添加した後、この懸濁液を６０℃で２４時間攪拌しながら、９９％以上の顆粒コメが可溶化されるまで、インキュベ−ションした。
【０２２６】
コメタンパク質が最小可溶性を示すｐＨ（ｐＨ３．０−５．０）においてコメデンプンを可溶化することにより可溶化されたコメデンプンから不溶性コメタンパク質の分離を促進することができた。コメデンプンの加水分解の完了の後、インキュベ−ションしたスラリ−をウエットケ−キを得るためにワットマンＮｏ１ろ紙の上でブフナ−ロ−トを用いてろ過した。ウエットケ−キの小部分を脱イオン水で数回洗浄し、６０℃で乾燥した（一工程処理）。残りのウエットケ−キを３００ｇの脱イオン水に再懸濁し、Ｇ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７（０．１ｋｇＭｔコメ粉）及びｒＨ−ＧＳＨＥ（１．０ＧＳＨＥ単位／ｇのコメ粉）と共に更に、１２時間６０℃でインキュベ−ションした。酵素反応を終了させるため、６０℃において、６ＮＨ２ＳＯ４を用いてｐＨ３．５に調整した。ワットマンろ紙によるろ過のためにブフナ−ロ−トを用いて不溶性コメタンパク質を分離した。このケ−キをあらゆる可溶化デンプンを除去するために脱イオン水で洗浄した。このコメタンパク質濃縮物を水分含量が、５．０％未満になるまで乾燥した（二工程処理）。
【０２２７】
おおよそのコメタンパク質の組成を表１２に示す。高温高圧処理からのタンパク質濃縮物は以下のようにして得られた。
【０２２８】
ＳＰＥＺＹＭＥ  ＦＲＥＤ（ジェネンコ−インタ−ナショナルインク）（０．１ｋｇ／ＭＴコメ粉）をコメ基質３０％の水性スラリ−ｐＨ５．５に添加した、このスラリ−を１０５℃に維持した圧力鍋に８分曝し、その後大気圧に曝した。液化工程を９５℃において、更に９０分続けた。液化デンプンのｐＨをｐＨ４．２に調整し、温度を６０℃に下げた。ＯＰＴＩＭＡＸ  ４０６０  ＶＨＰ（ジェネンコ−インタ−ナショナルインクから市販されているグルコアミラ−ゼ及びプルラナ−ゼブレンド）を０．４ｋｇ／ＭＴコメ基質の濃度で添加し、４８時間インキュベ−ションし、少なくとも２回洗浄した。不溶性タンパク質残渣を含むケ−キを得るために、可溶性分を上で説明したように遠心分離した。このタンパク質残渣を脱イオン水で洗浄し、６０℃で乾燥した。
【０２２９】
この結果は、本発明に包含される方法により、コメ基質から顆粒コメデンプンを加水分解することにより、高純度コメタンパク質含量を分離することができた。
【表１２】
2007531515.tif 000014
【実施例１２】
【０２３０】
コメタンパク質濃縮物の水溶解性の評価
コメタンパク質濃縮物は実施例１１の方法に従って調製した。更に従来の高温処理したタンパク質分画も実施例１１の方法に従って調製した。
【０２３１】
タンパク質濃縮物及びタンパク質分画の懸濁液を調製し、ｐＨをＮａＯＨ又はＨ２ＳＯ４のいずれかを用いて、２．０、４．０、６．０、及び１０．０に調整した。この懸濁液を室温において連続的に攪拌し、１５分毎にｐＨを調整した。可溶化したタンパク質を遠心分離で分離し、透明な上清を総窒素（Ｎ）の測定に用いた。タンパク質含量（％Ｐ）を、Ｎ×５．９５として計算した。
【表１３】
2007531515.tif 000015
【実施例１３】
【０２３２】
コメタンパク質濃縮物の可溶化及び加水分解におけるプロテア−ゼ処理の影響
本発明の方法により得られた２．０％コメタンパク質濃縮物と従来方法により得られた２．０％コメタンパク質分画を５０℃で、酸性糸状菌プロテア−ゼ（単位／ｇタンパク質）を用いてインキュベ−ションした。インキュベ−ションの間、サンプルのｐＨを１５分毎に調整した。サンプルは６０分、１２０分、２４０分、３６０分、７２０分に回収し、加水分解されていないタンパク質を沈殿させるため、同僚の１０％トリクロロ酢酸溶液を添加した。このサンプルを５℃で冷却し、ろ過した。透明ろ液の窒素Ｎを解析した（デ−タはしめさず）。
【０２３３】
更なる試験において、本発明の方法により得られたコメタンパク質懸濁液及び従来法により得られた２．０％コメタンパク質分画をヒトの下方消化システムをシミュレ−トするため、ｐＨ７．０及び５５℃において、プロテイナ−ゼ  Ｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｔ）及びＰＲＯＴＥＸ  ６Ｌ（ジェネンカ−）を用いて、インキュベ−ションした。サンプルを異なる時間間隔で、消化し、加水分解されていないタンパク質を１％のＴＣＡを添加することにより沈殿させた。このサンプルを５℃で冷却し、ろ過した。透明炉液のＮを解析した（デ−タしめさず）。
【実施例１４】
【０２３４】
高純度コメタンパク質濃縮物のアミノ酸組成
実施例１１で説明した高純度コメタンパク質ン濃縮物のアミノ酸組成（％）を実施例１１で説明した従来の高温処理により得られたタンパク質分画のアミノ酸組成物と比較した。表１４を参照のこと。高純度タンパク質濃縮物のアミノ酸組成とタンパク質分画のアミノ酸組成を、カゼインのアミノ酸組成物（％）を用いて比較した。カゼインの値は、Ｓｈｉｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  ＪＡＯＣＳ  ７７：  ８８５−８８９  及びＭｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  (１９９３)  Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．  ５８：  １３９３−１３９６より引用した。
【表１４】
2007531515.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、天然のフミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)顆粒デンプン加水分解酵素（ＧＳＨＥ）（配列番号１）をコ−ドするゲノムＤＮＡ配列を示す。想定されるイントロンを太字且つ下線で示す。
【図２Ａ】図２Ａは、フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)のシグナル配列及び成熟アミノ酸配列を示す（配列番号２）。想定されるシグナル配列を太字及び下線で示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、フミコ−ラグリセアｖａｒ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)ＧＳＨＥ（配列番号３）に対する成熟アミノ酸配列を示す。
【図３】図３は、フミコ−ラグリセアＧＳＨＥをコ−ドする核酸の発現に用いられ且つ糸状菌発現ベクタ−にフランキングしているＸｂａ１部位を含む、ｐＴｒｅｘ３ｇ＿Ｎ１３プラスミドの概略図である。このプラスミドにおいて、ａ）ｃｂｈ１プロモ−タ−はトリコデルマレ−シセロビオハイドロラ−ゼのプロモ−タ−であり、ｂ）フミコ−ラグリセアｇｌａ１は、配列番号３のフミコ−ラグリセアＧＳＨＥをコ−ドするポリヌクレオチドであり、ｃ）ａｍｄｓは、アスペルギルスニデュランス汗とアミラ−ゼダ−ゼマ−カ−遺伝子であり、及びｄ）ｃｂｈ１タ−ミネ−タは、トリコデルマレ−シ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）デロビオハイドロラ−ゼのタ−ミネ−タである。
【図４Ａ】図４Ａは、図３のｐＴｒｅｘ３ｇ＿Ｎ１３プラスミドの核酸配列（配列番号４）（１０７３９ｂｐ）を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図３のｐＴｒｅｘ３ｇ＿Ｎ１３プラスミドの核酸配列（配列番号４）（１０７３９ｂｐ）を示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、図３のｐＴｒｅｘ３ｇ＿Ｎ１３プラスミドの核酸配列（配列番号４）（１０７３９ｂｐ）を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、図３のｐＴｒｅｘ３ｇ＿Ｎ１３プラスミドの核酸配列（配列番号４）（１０７３９ｂｐ）を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、図３のｐＴｒｅｘ３ｇ＿Ｎ１３プラスミドの核酸配列（配列番号４）（１０７３９ｂｐ）を示す。
【図５】図５は、天然のアスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチ顆粒デンプン加水分解酵素（Ａ−ＧＳＨＥ）（配列番号５）のゲノムＤＮＡ配列を示す。
【図６】図６は、アスペルギルスアワモリｖａｒ．カワチＧＳＨＥの想定されるシグナル配列（太字及び下線で示す）及び成熟アミノ酸配列（それぞれ配列番号６及び配列番号７）を示す。
【図７】図７は、ｐＨ５．５、６０℃で機能する可溶化されたコメデンプン割合（％）を示す。この図において、ａ）アルファアミラ−ゼ、０．１ｋｇ／ＭＴ  Ｇ９９７におけるＧ−Ｚｙｍｅ  Ｇ９９７（---◇---）；ｂ）１．０ＧＳＨＥ単位／ｇにおける、トリコデルマレ−シ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）において発現されたフミコ−ラグリセアｖ．セルモイデア(Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ  ｖａｒ．  ｔｈｅｒｍｏｉｄｅａ)顆粒デンプン加水分解酵素（---■---）及びｃ）両者の組み合わせ（---▲---）実施例２、表２、実施例４、表４及び実施例５、表５を参照のこと。
【図１】
2007531515.tif 000017
【図２Ａ】
2007531515.tif 000018
【図２Ｂ】
2007531515.tif 000019
【図３】
2007531515.tif 000020
【図４Ａ】
2007531515.tif 000021
【図４Ｂ】
2007531515.tif 000022
【図４Ｃ】
2007531515.tif 000023
【図４Ｄ】
2007531515.tif 000024
【図４Ｅ】
2007531515.tif 000025
【図５】
2007531515.tif 000026
【図６】
2007531515.tif 000027
【図７】
2007531515.tif 000028
【国際調査報告】
2007531515.tif 000029
2007531515.tif 000030
2007531515.tif 000031