(57)【要約】L次元画像をM次元位相にトレーニング、マッピング、および整列させて方位角を得る(112)。次いで、整列させたL次元画像をN次元位相にトレーニングおよびマッピングして、2(N)頂点分類を得る(113)。方位角および2(N)頂点分類を使用して、L次元画像をO次元画像にマッピングする(114)。2007536644.tif 000007
2007536644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、画像を整列および分類する方法：
方位角および／またはさらなるオイラー角を得るために、L次元画像をL次元ニューロン画像のM次元位相アレイにトレーニング、マッピング、および整列させる段階；
頂点および／または近傍分類を得るために、整列させたL次元画像を、頂点を持つL次元ニューロン画像のN次元位相アレイにトレーニングおよびマッピングする段階；および
L次元画像をO次元画像にマッピングする段階。
【請求項２】
画像を超整列させるために、トレーニングおよびマッピングする段階から得られる少なくとも1つのクラスの画像を使用して、トレーニング、マッピング、および整列させる段階を反復する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
頂点および／または近傍部から取られる新たなクラスの画像を使用して、トレーニングおよびマッピングする段階と、次にトレーニング、マッピング、および整列させる段階とを反復することによって、超整列を必要に応じて反復する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
L次元画像をM次元位相にトレーニング、マッピング、および整列させる段階が以下の段階を含む、請求項1記載の方法：
L次元画像を含むデータセットから画像を入力する段階；
近似一致を得るために、データセットおよびM次元位相の計量値、初期学習率、ならびにトレーニングサイクルに少なくとも基づいた開始値を入力する段階であって、M次元位相はL次元画像の位相に基づく段階；
画像および開始値に基づいて、L次元画像の対称性と、方位角および／またはさらなるオイラー角の同一性とを判定する段階；ならびに
L次元画像に方位角を適用することによって、入力したL次元画像を回転整列させる段階。
【請求項５】
方位角および／またはさらなるオイラー角が正しいかどうかを判定するために、開始値および回転整列させたL次元画像を入力する段階を反復する段階をさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項６】
頂点および／または近傍分類を得るためにN次元位相においてM次元画像をトレーニングおよびマッピングする段階が以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法：
N、N次元位相およびL次元画像に基づいた計量値、トレーニングサイクル、ならびに初期学習率を入力する段階；ならびに
入力された情報に基づいて頂点および／または近傍分類を判定する段階。
【請求項７】
以下の段階を含む、ランダム円錐ティルトデータセットにおいて画像を整列および分類する方法：
方位角を得るために、ティルトしていない2次元画像を円柱位相にトレーニング、マッピング、および整列させる段階；
2N頂点分類を得るために、整列させたティルトしていない2次元画像をN次元位相にトレーニングおよびマッピングする段階；ならびに
ティルトした2次元画像を3次元画像にマッピングする段階。
【請求項８】
3次元画像を超整列させるために、トレーニングおよびマッピングする段階から得られる少なくとも1つのクラスの画像を使用して、トレーニング、マッピング、および整列させる段階を反復する段階をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
2N頂点分類から取られる新たなサブセットの画像を使用して、トレーニングおよびマッピングする段階と、次にトレーニング、マッピング、および整列させる段階とを反復することによって、超整列を必要に応じて反復する、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
2次元画像を円柱位相にトレーニング、マッピング、および整列させる段階が以下の段階を含む、請求項7記載の方法：
2次元データセットからティルトしていない画像を入力する段階；
高さに対する外周の比、方位角の望ましい解像度に基づいた特定の外周、初期学習率、および2次元位相に基づいた任意の学習範囲を含む計量値を入力する段階；
入力された情報に基づいて、2次元画像の対称性と、方位角の同一性とを判定する段階；ならびに
入力した2次元画像に方位角を適用することによって、入力した2次元画像を回転整列させる段階。
【請求項１１】
方位角が正しいかどうかを判定するために、計量値および回転整列させたL次元画像を入力する段階を反復する段階をさらに含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
2N頂点分類を得るためにL次元位相における2次元画像をトレーニングおよびマッピングする段階が以下の段階をさらに含む、請求項7記載の方法：
N、超平行六面体の次元、トレーニングサイクル、初期学習率、および初期学習範囲を入力する段階；ならびに
入力された情報に基づいて2N頂点分類を判定する段階。
【請求項１３】
データセットの初めのいくつかの画像がネットワークを偏らせないように初期学習率が低い、請求項6記載の方法。
【請求項１４】
データセットの初めのいくつかの画像がネットワークを偏らせないように初期学習率が低い、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
整列が入力画像のランダム回転に基づいており、従ってどの入力画像の配向にも関係なく、方位軸を直線的に較正する、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
整列が入力画像のランダム回転に基づいており、従ってどの入力画像の配向にも関係なく、方位軸を直線的に較正する、請求項7記載の方法。
【請求項１７】
高さに対する外周の比が小さい外周に基づいて選定され、高解像度の方位角が得られるように、高さに対する外周の比を一定に維持しつつ外周がスケールアップされる、請求項3記載の方法。
【請求項１８】
高さに対する外周の比が小さい外周に基づいて選定され、高解像度の方位角が得られるように、高さに対する外周の比を一定に維持しつつ外周がスケールアップされる、請求項10記載の方法。
【請求項１９】
トレーニングする段階が、L次元ニューロン画像をモーフィングする段階であって、モーフィング後に位相空間において測定するとき、L次元ニューロン画像の漸減する近傍部が類似性が漸増する傾向があるように、入力L次元画像との類似性が漸増するようにする段階を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
マッピングする段階が、L次元ニューロン画像とL次元画像との間の類似性に基づいて行われる、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
入力L次元画像に対してモーフィングするL次元ニューロン画像にランダムピクセル値を使用する、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
マッピングされたL次元画像がL次元ニューロン画像を含む円柱の外周の周囲をどれくらいどの方向に回転しているかを判定するために、マッピングされたL次元画像を再調査する段階を対称性がさらに含む、請求項4記載の方法。
【請求項２３】
L次元画像とL次元ニューロン画像のM次元アレイとの間の計量値および位相が、それらがそれぞれの座標系にマッピングする位置に基づいて、L次元画像の角度および／またはクラス情報を伝達する有意義な座標系をこのような空間において確立するためにマッチされる、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
方位角および／またはさらなるオイラー角が正しいかどうかを判定する段階が、方位角および／またはさらなるオイラー角がしっかりと制約されているかどうかを見るためにチェックする段階を含む、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概して整列および分類手法に関し、さらに詳細には参照要素に依存しない整列および分類手法に関する。
【０００２】
関連出願データ
本願は、35U.S.C. §119(e)の下、全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる2004年5月6日提出の米国仮出願第60/569,361号の優先権を主張する。
【０００３】
政府支援
本発明は、NIHから授与された助成金第EY04110号の政府支援により成された。米国政府は本発明に一定の権利を有しうる。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
高分子の3D(3次元)構造は、x線結晶法では不確かな高分子に対して情報量の多い構造解析を提供する強力な電子顕微鏡技法である単一粒子解析（single particle analysis）によって検討することができる。単一粒子解析を使用する分子相互作用および立体配座変化の解像度および解析は、使用する画像処理方法と共に進展してきている(非特許文献1)。高分子の画像化は雑音バックグラウンドによって不明瞭にされるので(S/N比[SNR]は1を下回ることが多い)、このような方法が必要とされる。雑音は部分的には、試験材料の損傷を最小にするために使用される低い照射レベルが原因である。雑音を軽減するためには、2D画像を同じ3D配向で平均化しなければならず、これはデータセット画像の集合(gallery)における最適な整列を必要とする過程である。次いでシグナルが互いを強化し、雑音が相殺される傾向にある。
【０００５】
他の3D再構築技法と同様に、2D画像整列は、膜二重層またはフィルムにおいて「フェースアップ(face up)」または「フェースダウン(face down)」で画像化される固定化粒子にRCT(random conical tilt)法を適用する場合に重要である。3次元情報を論理的に回復するためには、二重層平面における各データセット画像の回転配向を知らなければならない。これは通常、ティルトしていない画像(0°において「ヘッドオン(head on)」で見られるもの)に共通に回転整列させることによって達成される。ティルトしていない画像について相対的な回転配向(共通整列させるのに必要な所与の画像の回転量)がわかれば、ペアワイズ画像化のために、ティルトした画像についてもわかる。単一粒子解析は原理上は、原子の分析を達成するはずである。しかし実際には、種々の状況がこれを妨害する。
【０００６】
通常は、プロトタイプ参照画像の存在を仮定し、それに対してデータセット画像を整列させることができる。しかし、この仮定は、不均一なデータセットには正しいとされない。別の問題としては、整列は参照画像の選択によって偏ることである。この偏りを少なくする方法の1つは、特定の参照に対して整列する画像を平均化し、改正した参照を与えることである(非特許文献2)。しかし、悪いSNRを有するまたは同じ高分子の異なる像を画像が示す場合には、この手法は、元の参照の特徴を有する平均化された最終的な参照を生ずる。「反復参照フリー整列(iterative reference free alignment)」は、2つの画像をランダムに選択して整列させる。次いでデータセット画像が使い尽くされるまで、第3の選択画像等を用いてこの過程を反復する(非特許文献2)。しかし、選択順序が結果を偏らせるため、この過程はランダムな選択順によって反復されて偏りを少なくしており、この方法は参照の変化する全体的平均を使用するので、厳密には参照フリーではない(非特許文献3)。
【０００７】
データセットの異なる像を示す参照画像を作製し整列させるための「最先端」の技術は、「多変量統計解析/多参照整列(Multi Reference Alignment)」(MSA/MRA；非特許文献4参照)と命名されている。データセット画像間の一部の変動は、構造の差を反映せずに単に位置の差を反映する場合がある(例えば、RCTの場合、平面回転配向において)。そのため、データセットを分類する際に、平面回転差が有効であると考えることは望ましくない。結果として、分類前に画像に相互回転整列を実施し、それによって独立分類変数としての粒子配向を排除しなければならない。
【０００８】
しかし、相関に基づいた技法を使用する整列は、画像集合が均一である場合にのみ十分に規定されている操作である。しかし、代表的なクラスを作製するためには、まずデータセット画像を整列させなければならず、これは代表的なクラスの初期セットを必要とする。この「循環性」に対処するため、作業者は、結果が安定するまで、MSA/MRAを使用して分類および整列の反復サイクルを用いている。しかし、この手法は、「エネルギー」関数の全体的な最小化の達成を保証しない。これらの欠点に加え、MSA/MRAは、最終結果に影響を与える多数の重要な自由変数の主観的なオペレーターの選択に依存する。結果として、このような結果は典型的にはオペレーター依存的である。最後に、MSA/MRAは数ヶ月の処理を費やすことが多い(非特許文献5)。
【０００９】
【非特許文献１】Ueno and Sato, 2001, Science Progress 84(4), 291-309
【非特許文献２】Penczek et al., 1992, Ultramicorscopy 40, 33-53
【非特許文献３】van Heel et al., 2000, Quarterly Rev. Biophysics 33, 307-369
【非特許文献４】Zampighi et al., 2004, J. Struct. Biol. 146, 368-380
【非特許文献５】Bonetta, 2005, Nature Methods 2, 139-144
【発明の開示】
【００１０】
一態様において、本明細書において開発された技法は、上記の技法に共通の、参照を用いる「整列」へとは画像を回転させずに、平面回転配向に相対物を直接分類することによって、RCTによって作製されたデータセット画像を整列または配向させる。選択された参照画像から開始する代わりに、典型的には800万以上のランダムピクセル値から開始する。この手法と各トレーニングサイクル中のデータの十分に小さい影響を合わせると、整列結果は、ネットワークをトレーニングするために使用される画像の順序に関係なくなるので、トレーニングバイアスが排除される。
【００１１】
この整列手法は、整列を達成するための整列および分類の交互サイクルの必要性を回避する。それは、各トレーニングサイクル中に画像の構造差および回転配向の両方を同時に分類する。それは、人工ニューロンの円柱アレイの表面で実施される自己組織化過程である。参照フリー整列後、構造差によりさらに詳細な分類が必要になる場合がある。Zampighi et al.(2004)は、四角平面SOMs'(self organizing maps')の頂点は、膜二重層に包埋されているRCT画像粒子の異なる像をマッピングすることを見出した。しかし、SNRが低い場合またはデータセットが不均一である場合には、2-CUBE SOMによって作製される頂点分割区の均一性は完璧ではない。また、頂点クラスの数は4に限定される。2D SOMから生ずる不均一性および頂点クラスの数に対する重要でない制限を取り除くために、本発明者らは、データセットの主要なクラスがND(N次元)超立方体アレイの頂点に「移動する」、「N次元頂点分割(N Dimensional vertex partitioning)」と呼ばれる方法を開発した。ND超立方体は2Nの頂点を有するので、それは2Nの頂点クラスを分割する。
【００１２】
次元が(少なくともN=4の値に)ステップアップするとき、頂点クラスの平均均一性が改善することを本発明者らは見出した。これは、高Dデータを低Dグリッドにマッピングする際に生ずる高い程度のデータ圧縮によって生ずるのであろう。グリッドの次元が高いほど、データ圧縮は少なく、得られる均一性は大きい。オペレーターが2頂点クラスのデータセットを望む場合には、N=1の値が4頂点クラスには選択され、N=2の値が8頂点クラスには選択され、N=3の値が等々となる。これにより、作製される頂点クラスの数および均一性を制御することができる。
【００１３】
一態様において、本発明者らは、これらの参照フリー方法の組み合わせをSORFA（「Self Organizing, Reference Free Alignment」）と呼ぶ。SORFAは、自己組織化マップの本質的に平行なアーキテクチャおよび位相/計量値(metric)保存性の恩恵を受ける。本明細書において、本発明者らは、あらかじめ決定された標的値を使用しない非管理競合学習方法であるコホネン(Kohonen)自己組織化人工ニューラルネットワーク(Deco and Obradovic, 1996)を使用して、SORFAを実証する。この種類のネットワークの着想および方法論は、哺乳類の脳を含むほとんどのニューラルネットワークは信号処理単位の2Dアレイに存在するという状況に基づいている。入力信号に対するネットワーク応答は、最大励起ニューロン付近に主に集束されている。
【００１４】
一態様において、SORFAは、方位配向および構造差によって画像を分類するためにこの方法論を使用する。それは、ランダムな初期条件に対するSOMの非感受性から恩恵を受ける。さらに、整列のためには、重要なフリーパラメーターは2つだけ：学習率および円柱の外周(circumference)/高さ比である。SORFAの速度は、本質的に平行なアーキテクチャから恩恵を受ける。例えば、アクアポリン0(Aquaporin 0, AQP0)の雑音のある不均一な3,361個の電子顕微鏡(EM)画像のデータセットは、6ヶ月を必要とするMSA/MRA操作と比較して、9分未満で良好に整列された。SORFAは使用がはるかに簡単であり、上記の6ヶ月のMSA/MRA整列で疑われるようなオペレーター誤操作の可能性がかなり低い。これらのAQP0チャネルは、未処理の仔ウシ水晶体線維の原形質膜由来であり、横64Å、MW約118kDのテトラマーである(Konig et al., 1997)。
【００１５】
RCT幾何学で得られるAQP0チャネルの画像は、分類アプローチによる整列を使用してすでに整列され分類されている(Zampighi et al.,2003)。SORFAを適用する際に得られる知識を使用して画像を試験することによって、本発明者らは、AQP0画像を整列および分類した。最後に、本発明者らは、3D再構築物の構造を、AQP0と43.6%の同一性および62.6%の類似性を有する密接に関連する構造的に類似のチャネルであるアクアポリン1(AQP1)の原子モデル(Gonen et al., 2004)と比較した。
【００１６】
発明の態様の詳細な説明
1.  図面の概説
図1A〜1Fは、本発明の一態様による、画像を整列および分類する方法を図示する。一態様において、参照フリー手法を実施し、他の相関に基づいた整列手法に共通の参照要素への依存を回避する。図1A〜1Cは一般的な過程を図示し、図1D〜1FはAQP0画像を使用した具体例を図示する。
【００１７】
図1Aを参照すると、段階101において、L次元画像を使用してM次元位相をトレーニングおよびマッピングして方位角を得る。次いで、方位角を画像に適用して、整列を作製する。次いで、段階102において、整列させたL次元画像を使用してN次元位相をトレーニングおよびマッピングして、頂点および／または近傍分類を得る。段階103において、方位角ならびに頂点および／または近傍分類を使用して、L次元画像をO次元画像にマッピングする(任意)。任意の段階104において、L次元データを超整列(hyperalign)させるために、段階102において得られる1つ以上の頂点クラスからの画像を使用して(またはN次元空間の任意の近傍部にマッピングされた画像を使用して)、段階101(トレーニング、マッピング、および整列段階)を反復する。一部の場合において、超整列させた画像を取り、段階102を反復し、次いで頂点クラスまたはN次元空間の近傍部を取り、頂点または近傍部から取られるこの新たなサブセットの画像を使用して段階101を反復することによって、超整列をさらなる回数反復してもよい。
【００１８】
図1Bは、図1Aの段階101の詳細を記載しており、L次元画像を使用してM次元位相にトレーニングおよびマッピングして方位角を得る。整列の精度を試験するために、算出した方位角を適用することによって入力画像を整列させる。段階105において、L次元画像を含むデータセットからの画像を入力する。段階106において、M次元位相に基づいた計量開始値を入力する。M次元位相はL次元画像の位相に基づく(近似一致を得るため)。段階107において、入力情報に基づいてデータセットの対称性および方位角を判定する。段階108において、方位角を入力L次元画像に適用することによって、入力L次元画像を回転整列させる。段階109において、整列させた画像を新たな入力画像として使用して段階106〜107を反復し、方位角が正しいかどうかを判定する。
【００１９】
図1Cは、図1Aの段階102の詳細を記載しており、整列させたL次元画像を使用してN次元位相をトレーニングおよびマッピングして、頂点および／または近傍分類を得る。段階110において、N次元位相の寸法(計量値)、トレーニングサイクル、初期学習率、および任意の初期学習範囲(initial learning radius)を入力する。段階111において、入力情報に基づいて頂点および／または近傍分類を判定する。
【００２０】
上記に説明したように、図1D〜1Fは、本発明の一態様による、図1A〜1Cに記載する方法の一例を図示する。データセットアクアポリン0(AQP0)をこの例において使用する。このデータセットは例にすぎず、多数の他の種類のデータセットを使用することができることを強調すべきであろう。
【００２１】
図1Dを参照すると、段階112において、2次元のティルトしていない画像(この例ではL=2であることに注意)を使用して、円柱位相をトレーニングおよびマッピングして(この例ではM=3であることに注意)、方位角を得る。次いで、整列を試験することができ、段階113を実施することができるように、方位角をティルトしていない画像に適用して、整列された画像を得る。(AQP0データセットは、ティルトしていないおよびティルトした画像を使用するランダム円錐ティルト(random conical tilt)データセットであることに注意。)  次いで、段階113において、整列させた画像を使用して、整列した2次元のティルトしていない画像をN次元位相にトレーニングおよびマッピングして、2N頂点分類を得る。段階114において、方位角および2N頂点分類を使用して、2次元画像を3次元画像にマッピングする(3D再構築)。段階115において、2次元データを超整列するために、段階113から得られる1つ以上の頂点クラスサブセットを使用して、段階112(トレーニング、マッピング、および整列段階)を反復する。2次元画像の1つ以上の頂点クラスを使用して、段階113を、そして次に段階112を反復することによって、必要に応じて超整列を反復することができる。
【００２２】
図1Eは、図1Dの段階112の詳細を記載しており、L次元画像を使用して円柱位相にトレーニングおよびマッピングして方位角を得る。次いで、方位角を適用することによってL次元画像を整列させる。段階116では、AQP0データセットからの3361個の2次元画像を入力する。段階117では、円柱位相に基づいて5つの開始値を入力する：高さに対する外周の比、方位角の望ましい解像度に基づいた特定の外周、トレーニングサイクル数、初期学習率、および学習範囲。
【００２３】
この段階において、SORFA(Self-Organizing Reference-Free Alignment)は、ランダム円錐ティルトから得られる画像の方位角を分類するのに元々好適である円柱位相から開始することに注意されたい。1つの開始値は公知である(出力グリッド解像度=望ましい円柱外周または角度解像度)が、試験操作で測定するときに誤差を許容できるレベルに制限するためには、2つの開始値を調節しなければならない(初期学習率および円柱の高さに対する外周比)。他のパラメーター(円柱外周、トレーニングサイクルの数、および初期学習範囲)は十分に規定されている。
【００２４】
SORFAは、不均一性が大きいデータセットでは低い初期学習率を必要とする場合があることに注意されたい。例えば、EM画像による試験では、学習率は0.001以下の値に設定される場合がある。低い学習率によれば、最初のいくつかのトレーニング画像がネットワークを偏らせることがない。初期学習率の影響の考察については実施例2を参照されたい。
【００２５】
段階118において、2次元画像の対称性および方位角の同一性が入力情報に基づいて判定される。SORFAは、人工ニューロンの円柱表面上の2つの相互に直交する軸の一方（外周軸）に沿った入力画像の全てのティルトしていない2次元画像の相対的方位角のリスト(出力Bと呼ぶ)を出力する。
【００２６】
SORFAはまた、方位軸を適切に較正(calibrate)するために、対称性の判定(出力Aと呼ぶ)も出力する。
【００２７】
段階119では、アンチ-エイリアシング回転子によって方位角を入力2次元画像に適用することによって入力2次元画像を回転整列させる。
【００２８】
段階120では、段階117〜118を反復して、方位角が正しいかどうかを判定(試験)する。これらの段階は、整列させた画像および同じ開始値を使用して反復される。
【００２９】
試験操作は、操作間の角度の一貫性を判定するための、同じ円柱条件を使用する整列させた画像の再処理である。試験操作において、マッピングした画像角度の平均からの偏差が大きいほど、2つの操作の対応画像間の相対角度偏差が大きい。従って、試験円柱の上から下まで伸張する、画像の最も狭い垂直バンドを求める。これは、試験操作の出力Bの角度分布の標準偏差として定量的に表すことができる。
【００３０】
新たな出力Bは、方位分布の標準偏差を示す。次いで、標準偏差が許容される範囲内であるかどうかを判定する。許容される範囲内でない場合には、処理を段階116に戻して反復するが、段階117では修正した高さに対する外周の比および学習率を用いる。許容される範囲内である場合には、処理を段階121に移す。
【００３１】
図1Fは図1Dの段階113の詳細を記載しており、ティルトしていない2次元画像を使用してN次元位相にトレーニングおよびマッピングして、2N頂点分類を得る。段階121では、値N(例えばN=3の値は8つの頂点クラスを返してくる)、N次元超立方体の辺の長さ(edge length)、トレーニングサイクル、ならびに初期学習率および学習範囲を入力する。
【００３２】
超立方体(または超平行六面体(hyper-parallelepiped))の次元をネットワークのNに設定して、データセットから2N頂点クラスのティルトしていない画像を返す(画像化した高分子の2Nの異なる像を示す)。
【００３３】
段階122では、2N頂点分類が入力情報に基づいて判定される。超立方体の頂点の配置の考察については実施例1を参照されたい。2つのクラスだけが望ましい場合には、円柱から直接収集することができる。さらなる分類は必要ない。
【００３４】
画像を整列および分類する方法であって、L次元画像をL次元ニューロン画像のM次元位相アレイにトレーニング、マッピング、および整列させて、方位角および／またはさらなるオイラー角を得る段階；整列させたL次元画像を頂点を持つL次元ニューロン画像のN次元位相アレイにトレーニングおよびマッピングして、頂点および／または近傍分類を得る段階；およびL次元画像をO次元画像にマッピングする段階を含む方法を提供する本発明の態様は上記されている。一態様において、初期学習率は、データセットの初めのいくつかの画像がネットワークを偏らせないように低く設定する。別の態様において、整列は入力画像のランダム回転に基づき、どの入力画像の配向にも無関係であり、方位軸を直線的に較正する。さらなる態様において、高さに対する外周の比は小さい外周に基づいて選定され、高解像度の方位角が得られるように、高さに対する外周の比を一定に維持しつつ外周をスケールアップする。別の態様において、トレーニングする段階は、L次元ニューロン画像をモーフィングする(morphing)段階であって、モーフィング後に位相空間において測定するとき、L次元ニューロン画像の漸減する近傍部が類似性が漸増する傾向があるように、入力L次元画像との類似性が漸増するようにする段階を含む。さらに別の態様において、マッピングする段階は、L次元ニューロン画像とL次元画像との間の類似性に基づいて実施される。さらに別の態様において、入力L次元画像に対してモーフィングするL次元ニューロン画像にランダムピクセル値を使用する。(ランダム値は完璧にランダムである必要はなく、幾分ひずんでいることに注意。)  別の態様において、対称性は、マッピング後のL次元画像を再調査して、マッピング後のL次元画像が、L次元ニューロン画像を含む円柱の外周の周囲でどれくらいどの方向に回転しているかを判定する段階をさらに含む。さらなる態様において、L次元画像とL次元ニューロン画像のM次元アレイとの間の計量値および位相は、それらがそれぞれの座標系にマッピングする位置に基づいて、L次元画像の角度および／またはクラス情報を伝達する有意義な座標系をこのような空間において確立するためにマッチされる。さらに別の態様において、方位角および／またはさらなるオイラー角が正しいかどうかを判定する段階は、方位角および／またはさらなるオイラー角がしっかりと制約されている(constrained)かどうかを見るためにチェックする段階を含む。本発明はこれらの態様に限定されず、多数の追加的態様が可能であることを当業者は理解するであろう。
【００３５】
2.  材料および方法に関する追加的情報
2.1.  AQP0データセット
AQP0は、高度に保存された水選択性の膜チャネルタンパク質の10個の哺乳類ファミリーの1つに属する。アクアポリンの各モノマーは、テトラマー内にしっかり割り込んでおり、独立した水孔、バレルを形成する6つのティルトしている(1830°)膜貫通αヘリックス、およびヘリックスを接続している5つのポリペプチドループ(A〜E)を含むと考えられている。これらのループのうちの2つ(B=細胞質内およびE=細胞外)は、アクアポリンスーパーファミリー全体に保存されている。各々は、アクアポリン署名モチーフ(signature motif)、すなわちアスパラギンプロリンアラニン(NPA)を含有する。ループBおよびEは部分的にらせんコイル化しており、反対側から二重層に折れ込んで、孔壁の主要な要素を形成している。これら折れ込み(infolding)ループは、狭い孔チャネルにおける水の流動の接続性を維持するために必須であると考えられている。
【００３６】
このようなチャネルのほとんどはx線および電子結晶学によって研究されているが、AQP0はまだ結晶化されていない。各モノマーは以下の3つのドメインからなる曲線的孔経路を含有する：幅約15Åで前庭に広がる外部および細胞質部分；ならびにそれらの間に存在する狭窄部分。後者は、狭く、長さ20Åで、最も狭い地点では径わずか2.8〜3.0Åで、長さわずかアミノ酸1残基の選択性フィルターからなる。疎水性残基で囲まれている長く狭いチャネルとごく少数の溶質結合部位の珍しい組み合わせは、最小限のエネルギー障壁で迅速な水透過を促進するが、ほとんどの他の小分子およびイオンの移動を防止する。これらの珍しい特徴は主に、連続するポリペプチド鎖（各々、αヘリックス、接続ループ、数百の側鎖残基、ならびに細胞質側から延びるアミノおよびカルボキシ末端を含有する）の異なるドメインおよびサブドメイン間の相互作用の可能性が豊富であることによる(Cheng et al., 1997；Murata et al., 2000；Sui et al., 2001；Nemeth Cahalan et al., 2004)。
【００３７】
本発明者らは、Zampighi et al.(2003)に記載されているように作製された3361個のAQP 0(AQP0)画像のデータセットを使用した。精製後のAQP0をリポソームで再構成、凍結割断し、白金および炭素で複数軸(multi axis)シャドーイングし、RCTを使用して0°および50°で画像化した(Radermacher, et al., 1987)。これらの凍結、割断、およびシャドーイング技法により、未変性の立体配座が高度に保持される(Morris et al., 1994)。割断前に大きいリポソーム(径約2μm)をガラスに結合することによって、脂質二重層の局所的な湾曲が平らになり、それによって自由変数としての3つのオイラー(方位)角の2つが効果的に排除された。革新的なパルス-シャドーイングプロトコールはレプリカ安定性を有意に増加し(Zampighi et al., 2003)、白金粒子の成長を制限したと考えられる。
【００３８】
2〜3秒間隔をおいた4秒の暴露2回からなるこのプロトコールを使用することによって、白金粒子径が小さくなったと考えられる。2〜3秒の「冷却」インターパルスによってまた、表層白金原子の動力学エネルギー/移動性が低下されたのかもしれない。これにより粒子サイズが小さくなり、ディウェッティング（dewetting）の動力学が原子移動性によって制約されうる(Woodward and Zasadzinski, 1996)。パルス処理時の見かけの小さい粒子サイズおよび深い浸透もレプリカの機械的安定性を増加する(Zampighi et al., 2003)。シャドーイング後の白金原子の移動が妨害されるので(Woodward and Zasadzinski, 1996)、試料の広範な白金の浸透が生じていることは、得られるレプリカ(図8〜11、14)、特にそれらの凸面および凹面側(図14)の像から明らかである。
【００３９】
2.2.  AQP0データセットの前処理
ティルトした画像およびティルトしていない画像の低域(low pass)フィルタリング、密度逆転、円形マスクの適用、および並進整列(translational alignment)、ならびにティルトしていない画像へのC4対称の賦課(imposition)を、Imagic-5ソフトウェアパッケージ(van Heel et al., 1996)を用いて実施した。ティルトしていない画像のその後の全ての処理は以下に記載するSORFAニューラルネットワークを使用した。画像をあまり強くマスクしないように注意を払う必要があり、そうでないと、適切な整列を妨害する可能性のあるアーチファクトが生ずることがある。SORFAの整列および分類段階のために、ティルトしていない画像を24Åまでフィルタリングした。
【００４０】
2.3.  SORFAの構築
SORFAは、例えば、ファジー(fuzzy)コホネンクラスタリングネットワーク(FKCN)(Pascual et al., 2000)、KerDenSOM(Pascual Montano et al., 2001)、およびパラメーター化自己組織化マップ(PSOM)のようにデータセットの位相を保存しようとするように、トレーニング画像に対してモーフィングする、またはトレーニング画像との類似性の条件に近づく、1以上の次元アレイの人工ニューロン(連続または不連続)、コードブックベクトル、またはテンソルからなるコホネンSOMまたは任意の他のSOMであり、任意の数の異なる位相と計量値間で連続的および／または平行的にスイッチすることができ、1つのSOMの結果が次の入力値である、連続マッピングを達成することができる(Walter and Ritter, 1996)。特に、円柱位相およびN次元超立方体位相の適用は、本明細書において使用するデータの位相特徴にマッチするので、本明細書の焦点である。コホネンSOMの操作の数学的計算はZampighi et al.(2004)に見出すことができる。円柱位相を構築する際、本発明者らは平面グリッドSOMを巻いて、向かい合う端部を継ぎ目なく合わせて円柱アレイの人工ニューロンを形成した(図2参照)。円柱位相を使用する場合には、トレーニングは、ランダムに回転させた画像(ティルトしていない2D EM)をランダムな順にデータセットからネットワークに1つずつ提供し、グリッド画像が徐々に適合されるのを可能にすることによって進行する。図2の文字Rはこの操作を表す。回転はアンチ-エイリアシング回転子によって実施される。
【００４１】
ティルトしていない画像の並進整列はすでに実施されているので、全ての回転は画像中心周囲で実施される。円柱グリッドの表面にデータセットを形成している元の回転していない画像をマッピングすることによって、ネットワークを「トレーニング」した後に結果が円柱グリッドに提示される(図2の文字M)。次いで、データセット画像の方位角を出力円柱の方位角軸から直接読む。距離は、円柱表面に沿ってのみ算出される(詳細は実施例1参照)。データセット画像の方位角が出力円柱の方位角軸から読まれると、それらは画像に適用されて、必要な回転整列を生ずる。次いで、ネットワークの位相をND立方体アレイにスイッチして、作製される頂点クラスの数および頂点クラスの均一性の程度のオペレーター制御を可能にする。この段階のトレーニング中には、画像のランダム回転は必要とされない。Nの値が0〜4のNDアレイの例を図2に示す。これらのアレイには、ニューロンスペースの距離を算出する場合には、単純なユークリッド距離を使用する。これらの特徴的機能は、XMIPP(Marabini, et al., 1996)で、および本発明者らがMicrosoft Windowsに基づくプラットホームで操作するように開発した人工ニューラルネットワークであるSOMULATORで実行された。
【００４２】
2.4.  SORFAの操作
2.4.1.  方位角分類
図2に模式的に示されているように、ティルトしていない入力画像の相対的な方位角を以下の段階を使用して求める。SORFAは、他の2つのオイラー角がしっかりと制約されている場合には、方位角の分類に元々好適である円柱位相で開始される。
【００４３】
オペレーターは、SORFAの位相を円柱にスイッチし、誤差(段階6の試験操作から得られる値)をオペレーターに許容されるレベルに制限するために、3つの開始値：公知の1つ(出力グリッド解像度=円柱外周)および調節する必要がある2つ(学習率および円柱外周/高さ比)を入力する。最終操作のトレーニングサイクル数は、通常約300,000に固定され[カメラのサンプリング率が1/3.1Åを超える場合には、最良の結果を得るためにさらに多い数の反復を必要とする場合があることに注意]、初期学習範囲は自動的に円柱の外周に設定されるが、この要件は融通のきかないものではない。ショートカットとしては、先ず理想的な条件が見つかるまで小さいグリッドを用いて作業し、次いで外周/高さ比をほぼ一定に維持しつつ、望ましい外周にスケールアップすることである。
【００４４】
円柱位相は、規則的もしくは不規則な円柱もしくは超円柱、または円柱位相を有する任意の他の容積もしくは超容積に対応しうることに注意されたい。本明細書の全てのデモンストレーションは規則的な円柱を使用している。不規則な円柱は円錐台である。このような錐台は、円錐の先端を切断して、下底および上底を形成することによって円形のベースを有する円錐面から形成することができる。上底および下底が円形で平行であり、互いに高さに垂直である場合には、3つの変数が独自にこの不規則な円柱を規定する：2つの底面の外周およびそれらを隔てる距離。
【００４５】
オペレーターは、2D画像(またはベクトルもしくはテンソルとして表すことができる任意のND実体)をSORFAに入力し、ネットワークのトレーニングを開始する。操作は典型的には、1.33 GHZ AMD/MP 1500+デュアルプロセッサで数分から数時間続く(入力されるトレーニングサイクルの数に比例する処理時間)。
【００４６】
方位角軸を適切に較正するためには、データセットの全体的な対称性を判定しなければならない。出力「A」(出力A)の検査によって、グリッド画像が円柱周囲1周をどの程度回転しているかが明らかとなり、この値を360°に分割して、対称性の倍数(symmetry fold)を得る。XMIPPまたはSOMULATORディスプレイウィンドウを使用して、円柱の円周方向(水平方向)にスクリーンで画像をスクロールすることができる：この手法は、外周の周囲の画像の動画を再生し、雑音のあるデータセットで回転方向および量を判定するために非常に良好に作動する。
【００４７】
出力「B」(出力B)は、各画像の方位角軸座標に注目することによって、人工ニューロンの円柱表面の2つの相互に垂直な軸の一方(外周軸)に沿った入力画像の相対的方位角のリストを提示する。
【００４８】
2.4.2.  試験操作
アンチ-エイリアシング回転子によって、出力Bに提示される方位角値をデータセット画像に適用することによって、入力画像に回転整列を実施する。トレーニングセットとしての整列された画像および同じ開始値(学習率および円柱外周/高さ比)を使用して上記の段階を反復する。
【００４９】
新たな出力Bは、方位角の分布の標準偏差を与える。この偏差が、望ましい角度解像度について許容される範囲内である場合には、次の段階に進む。許容される範囲内でなければ、最初に戻るが、修正した開始値を用いる。
【００５０】
2.4.3.  構造差分類
データセットの2N頂点クラス(2Nの異なる立体配座、機能状態、または画像化した高分子の像を示す)を得るためには、オペレーターは、ND超立方体位相または多次元矩形グリッド位相にスイッチする。これらの位相は、構造差の分類に元々好適なようである[この時点で、クラスを作製するために、好ましい場合には、MSAなどの他の分類スキームを使用可能であることに注意]。初期学習率0.1で、データセット中の画像数の約(100〜1000)倍に等しい数々のサイクルで、ネットワークを整列された画像でトレーニングする。
【００５１】
2N頂点クラスの各々から約(150〜200)画像が回収され、主要クラスとも呼ばれる。非主要クラスもND超立方体空間の1つ以上の近傍部から回収することができ、各近傍部は均一クラスを示す。速いカメラサンプリング率(>1/3.1Å)、および、低い球面収差(<2×106 nm)、低い電子波長(<.00335087 nm)、低いデフォーカス(defocus)最大値[<(200〜300)nm]等を含むがそれに限定されるわけではない、よりすぐれた解像に必要とされる他の因子の改善は、最良の解像結果を達成するために、より多数の画像を回収する必要があることがある。ND超立方体位相を使用してSORFAをトレーニングし、主要および／または非主要クラスを選択後、オペレーターは、段階10の3Dに直接進むおよび／または3Dに進む前に段階9(超整列、実施例5参照)を実行することによって方位角を精緻化する(または再算出する)選択を有する。
【００５２】
超立方体の頂点の配置に関する考察については、実施例1を参照されたい。2つのクラスだけが望ましい場合には、それらは円柱から直接収集することができる。円柱の最上列にマッピングされた約(150〜200)のティルトしていない入力画像を使用して3D再構築物を作製し、画像化されたタンパク質の1ドメインの1つの立体配座を示す。さらに約(150〜200)の画像を最下列から収集し、それを用いて、同じまたは異なるドメインの別の立体配座を示す第2の3D再構築物を作製する。画像を収集する場合には、最上列または最下列から画像を取り、次いで約(150〜200)が得られるまで追加の列を加える。
【００５３】
2.4.4.  超整列(任意)(実施例5も参照)
段階7 8から作製される選択された主要および／または非主要クラスを各々、段階1〜5の独立した操作の入力画像セットとして使用する(実践の問題として、わずかであってもエイリアシング誤差を有する回転子を使用する単一画像の回転の合成は累進的な誤差を導入するので、元の画像からクラスメンバー画像を集めるのがよいことに注意)。段階5が完了するたびに、新たな出力Bが方位角の分布の標準偏差を与える。この偏差が望ましい角度解像度の許容される範囲内である場合には、段階10の3Dに進む。許容される範囲内でない場合には、この段階を反復するが、修正された開始値を用いる(学習率および円柱外周/高さ比)。
【００５４】
2.5.  方位角分類の設定パラメーター
データセットの最良の整列を得るためには、2つのパラメーターだけは試行錯誤によって決定しなければならない：第1に円柱の高さに対する外周の比、第2に初期学習率。全ての他のパラメーターはかなり十分に規定されている。
【００５５】
2.5.1.  試行錯誤パラメーター
初期学習率
SORFAは通常、不均一性が大きいデータセットの場合には低い学習率を必要とする。例えば、EM画像を用いる試験については、学習率は0.001以下の値に設定するべきであることを本発明者らは見出した。より不均一性が低く、人工的に作製されたデータセットについては、0.01の値で十分である。初期学習率の影響の考察については、実施例2を参照されたい。
【００５６】
(b)高さに対する外周の比
実験的には、他の変数を一定に保持すると、データセットの不均一性が大きいほど、必要な円柱の外周/高さ比は小さいようである。外周/高さ比は、広い範囲において良好に働くことが多い。例えば、3,361画像のAQP0データセットは、外周/高さ比が0.82〜1.22およびそれ以上の範囲で最も低い標準偏差試験操作を生じた(約(167〜182)画像サブセットの超整列には、本発明者らは20.0の外周/高さ比を使用した)。最適な外周/高さ比を決定するためには、非常に小さい外周から開始することが時間を節約する(連続計算時間はグリッドの表面積に比例する)。最良の試験操作が小さいグリッドについて見出されたら、外周/高さ比を一定に維持しつつ、同じ数の反復および学習率を使用して、望ましい大きい外周にスケールアップすることができる。
【００５７】
2.5.2.  十分に規定されているパラメーター
円柱外周
円柱外周は、(角度解像度がとりわけ雑音およびEM画像のサンプリング率によって基本的に制限されることを理解して、)オペレーターが達成することを希望するどの角度解像度にも設定される。例えば、方位角軸が6°増分で較正されることが望まれる場合には、{360°/[(対称性)×(6°)]}=360°/(4×6°)=15ニューロンの円柱外周が使用される。
【００５８】
(b)初期学習範囲(初期ガウス曲線標準偏差)
これは、円柱の最も大きい寸法(通常外周)に設定されるが、典型的には広い範囲の値が働く。
【００５９】
2.6.  初期グリッド画像
グリッド画像の初期ピクセル値はランダム化されることが重要である。コホネンSOMのオペレーターは典型的にはショートカットを使用するが、初期グリッド画像はトレーニングセット自体から選択されて、出力グリッド画像収束に必要な反復数を低下させる。一態様において、このショートカットは円柱位相を使用するSORFAには使用されない。その理由は、全ての回転が方位角軸に限定すべき場合には、高さ軸に沿って画像の小さい回転を導入することによって不均一な集団の全体的な整列を防止するからである。
【００６０】
2.7.  ランダム回転
円柱トレーニング中にデータセット画像をランダムに回転すること(図2の操作「R」)は重要な機能を果たす。第一に、それは、データセットに存在する可能性のある任意の優先的な配向の影響を最小限に抑える。SOMの計量値保存特徴のために、このような配向はネットワークを偏らせ、円柱の方位角軸の較正に非線形性を導入しうる。言い換えると、角度の不均一な提示により、SOMが計量値を保存しようとするために、方位角軸が不均一に較正される。従って、トレーニング中に画像をランダムに回転することは、円柱周囲の回転変動を直線的に較正する手段、すなわち出力グリッドの円柱座標系において方位角軸を直線的に較正する手段である。方位角軸の較正は、トレーニング画像の十分な数のランダムに回転される提示を考えると、任意に線形にすることができる(実施例3)。
【００６１】
方位角軸を直線的に較正することに加えて、ランダム回転は、方位角軸の存在そのものを確実にする助けをする。トレーニングセットの十分な角度変動を確実にして、ネットワークが主要なネットワーク軸の1つに沿って方位角をマッピングすることを保証する(円柱位相では、方位角軸は円柱周囲を巻く)。ネットワークはデータの計量値を保存しようとするので、大量の角度変動(よりランダムに提示される画像)により円柱周囲のマッピングドメインが保証される。
【００６２】
2.8.  トレーニングサイクル
最終的な整列操作のため、本発明者らは、トレーニング中に提示される画像の配向の円滑な分布を求める。これは、方位角軸を直線的に較正するために実施される。これを達成するためには、本発明者らは、約100,000から約300,000の範囲の数多くのトレーニングサイクルを推奨する[1/3.1Åより大きいカメラサンプリング率は最良の結果のためにさらに多数のトレーニングサイクルを必要とする場合があることに注意]。試行錯誤は、この範囲が最良に働くことを示している(実施例3に理論的に証明されている)。最良の円柱高さおよび初期学習率を求める場合は、少ない数の反復を使用し(時間を節約するため)、次いで最終的な整列操作のために300,000にスケールアップすることができる。
【００６３】
2.9.  方位角分類のパラメーターの評価
試験操作のヒストグラムの狭い幅(低い標準偏差)は、方位角整列を評価するためのリトマス試験であることを本発明者らは見出した。本発明者らは、カラム位置に対して、円柱の所与のカラムに対するマッピングの数をプロットすることによって、ヒストグラムを作製した。狭い試験操作が得られる場合にはいつでも、方位(出力Bにおいて得られる)は、視覚検査(図3、4、および6の「整列されたトレーニングセット」の例参照)および方位を公知の値(公知である場合)と比較すると自明な整列を生ずる。
【００６４】
試験操作は、求められた方位角の操作間(段階1 4)の一貫性を判定するための、同じ円柱条件を使用する整列された画像の再処理である。試験操作では、マッピングされた画像角度の平均(画像のほとんどがマッピングされた円柱カラムから外周軸に沿って測定する)からの偏差が大きいほど、2つの操作の対応する画像間の相対的な角度偏差が大きい。従って、試験円柱の上から下まで伸張している、画像の最も狭い垂直バンドを求める。これは、試験操作の出力Bにおける角度分布の標準偏差として定量的に表すことができる。
【００６５】
2.10.  構造差分類のパラメーターの設定および評価
超立方体(または超平行六面体)の次元をネットワークのNに設定して、2Nハイパーグリッド頂点から2N頂点クラスをリターンする(図2)。また、トレーニングサイクル数は、トレーニング画像数の約3倍か、それ以上に設定すべきである。本発明者らは、トレーニング画像数の約100〜1000倍の数々のトレーニングサイクルを使用することが好ましいことを見出した。よりすぐれたクラス均一性は高い値で得られた。学習範囲は超立方体の長さに設定される。学習率は最初は0.1に設定すればよい。
【００６６】
コホネンSOMではマップの全体的な質を測定する単一変数はないので、構造差分類の質の評価は整列の評価ほど容易ではない(Erwin et al., 1992；Kohonen, 2001)。2つの出力変数を考慮しうる：1)量子化誤差；および2)、ランナーアップ(runner up)、ウィニングイメージ(winning image)距離(Kohonen, 2001)。量子化誤差は、出力Aのグリッド画像がトレーニングセットにどれくらいよく類似しているかの全体的な尺度を与え、小さい値がよりすぐれている。ランナーアップ、ウィニングイメージ距離は、データの位相がどれくらいよくマップに保存されているかの尺度である。ここでも小さい値がより望ましい。
【００６７】
2.11.  AQP 1 X線モデルを使用する試験セットの調製
本発明者らは、アクアポリン1(AQP1)x線モデル(Sui et al., 2001)を取り、それを2つに分割した。次いで、各半分を再投影して、正面(head on)から見られる細胞外および細胞質ドメインを得た。これら2つの画像を使用して、それらのコンテンツを全ての角度からランダムに回転させ、Imagic 5を使用してガウス性白色雑音を加えることによって、方位角分類のための試験セットを構築した。
【００６８】
構造差を評価するために第2の試験セットを作製した。2つのx線AQP1投影(直上に記載)を、x線AQP1投影上で3〜6倍の範囲の異なる対称性を賦課することによって作製したさらに6つの画像に連結した。本発明者らはこれらの8つの試験画像をジェネレーター画像と呼ぶ。その理由は、各々を使用して以下のように1クラスの試験画像を作製したからであった：8つのジェネレーター画像は、ガウス性白色雑音を加え、制限付きランダム回転(5°≦θ≦5°)を導入することによって修正された。以下のように試験画像のSNRを算出した：第一に、Imagic 5 Norm Varianceユーティリティを使用して信号の分散(雑音を加える前)を標準化した；次いで、同じユーティリティを使用して規定された分散の雑音を加えた。雑音の分散に対する信号の分散の比はSNRと規定されている(Frank, 1996)。
【００６９】
2.12.  SORFAから得られる方位角およびクラスを使用する三次元再構築
3空間への粒子の配向は3つの独立した変数によって完全に規定されている。RCT(ティルト角を50°に固定)を使用して画像化されるリン脂質二重層に包埋されているタンパク質のレプリカおよび凍結割断中のリポソームの平坦な接着面としてのガラスについては、2つの変数はしっかりと制約されており、自由変数としては効果的に排除される。従って、3D再構築を算出するために粒子配向が未知である1つだけが必要とされる：二重層面の相対的な回転配向(方位)。均一なドメインは、2Dデータを均一なクラスに分配することによって求めることができる。適切に実施されている場合には、タンパク質の細胞質および細胞外ドメインを示す画像は異なる区分にクラスタリングされるはずである。整列および分類操作はSORFAによって実施された。オイラー角を得た後、ティルトした画像を回転させて、ティルト軸をY軸に一致させた。3D再構築は、加重逆投影アルゴリズム(Radermacher et al., 1987；Radermacher, 1988)および別個のラドン変換(Lanzavecchia et al., 1999)に端を発するフーリエ方法を使用することによってコンピュータ計算した。
【００７０】
ティルトした各画像と3D再構築から得られる投影を比較することによってオイラー角を精緻化した。これらの比較により、投影との最近似一致(closest match)に基づいて、新たな角度の画像への割付が可能になった。収束するまで、Harauz and Ottensmeyer(1984)の投影マッチ戦略に依存するこの精緻化を数回反復した。凹面のインプリトはZampighi et al.(2003)によって記載されているように算出した。3D再構築は、白金-炭素レプリカの13(±2)Å厚さに一致するレプリカの厚さ(10.5 15.5Å)を得るように選択したイソ表面(isosurfacing)のレベルでAVSパッケージ(Advanced Visualization System, Inc)を用いて提示した(Eskandari et al., 1998, 2000)。
【００７１】
3.  結果
本発明者らの主要な目標の1つは、平面において異なる配向を有する画像を整列および分類する参照フリー方法を開発することであった。以下に、本発明者らは、人工的に作製したデータセット、次いでAQP0 EM画像を使用した例を記載する。
【００７２】
3.1.  人工的に作製した画像を使用する試験
3.1.1.  方位角分類
本発明者らは、6つの異なるサイズで、平面においてランダムな角度配向の1,200の中身のつまった白色四角の合成集団を作製し(図3、上)、それを使用してネットワークをトレーニングした。第一に、全てのグリッドピクセル値のランダム化はネットワーク出力グリッド画像を初期化した。図示のため、上面から底面までの高さ方向に切断し、平らに置いた大きい四角の矩形(図3の開始条件)として、円柱の表面を示す(外周、水平方向；高さ、垂直方向)。この矩形提示の左および右の境界はニューラルネットワークにおいて互いに接続していることを覚えておかれたい。第1のトレーニング画像(「a」)をランダムに選択し、ランダムに回転させ(この重要性は以下に説明されている)、ネットワークに提供し、出力グリッドはこの画像によって修正(トレーニング)された。次いで、別のトレーニング画像(「b」)をランダムに回転させ、提示した；出力グリッドは再度修正された等々である。以下からわかるように、学習率が閾値以下に低下する場合には、整列結果は順序無関係になるので、特定の順序は無関係である。
【００７３】
トレーニングは30,000サイクル継続した。全てのサイクルの画像提示について、全てのグリッド画像は、提示した画像に対してわずかにモーフィングさせた。そのため、ランダムピクセル状態において初期化したにもかかわらず、観察される最終的なグリッド画像(出力A)は、最終的に、入力した四角に類似した。しかし、出力グリッド画像のモーフィング量はどの地点においても同じではなかった。提示された画像に最も密接に類似しているグリッド画像と規定される「ウィニングイメージ」から離れると、モーフィング量は低下する(提示された画像に対するユークリッド距離が最も小さいグリッド画像で、画像はベクトルとして示されている)。この低下はガウス分布に従うようにされる。本発明者らは、連続的トレーニングサイクルにおいてこの分布の標準偏差を低下させた。モーフィングのレベルも、結果を微調整するために、ネットワークトレーニングが進行するにつれて(直線的に)低下するようにされた(L0=0.1で設定；学習率のこの高い値は、合成データセットでは不均一性が低いので良好に働く)。これらの条件によりグリッドが規則正しくなる：図3において以下を観察すると明白であるように、最初は全体的で、次いで局所的になる。
【００７４】
1)任意の開始位置から出力Aに水平に移動するとき、白い四角画像のサイズは一定を維持するが、角度配向は均一に回転する。
【００７５】
2)任意の開始位置から出力Aに垂直に移動するとき、逆のことが生じる：画像サイズは均一に増加または低下するが、角度配向は一定を維持する。
【００７６】
従って、ネットワークは、出力Aの直交方向において角度の変動およびサイズの変動を分離した。上記の観察から、本発明者らは、出力A画像の局所的および全体的秩序化のために、ビンとして考え、トレーニングセット画像の類似性の最も大きいビンへの選別を用いると、データセットはサイズおよび角度配向により分類されると結論づけた。垂直位置は相対的なサイズを示し、水平位置は相対的な角度配向を示す。本発明者らは、類似性の基準として、画像が示すベクトル間のユークリッド距離を使用することによってマッピングを実施した；ベクトル間の距離が短いほど、対応する類似性は大きい。
【００７７】
出力Bは、マッピング後の各ビンの平均コンテンツを示す。6つのサイズクラスは各々、別個の水平の列の画像に分類されることが観察される。データセットの主要な有限変動(サイズ)のエンドポイントとなる最大および最小サイズを円柱グリッドの最上部および最下部にマッピングした(その理由は、円柱の上部および下部は位相境界であるからである)。各カラムにマッピングした画像の相対的な角度配向は、出力Bの底部の方位角軸によって示される。試験画像の形状(出力グリッド「ビン」にマッピングされている)は円柱外周の周囲に均一に回転するので、軸は90°/15=6°の増分で較正される。すなわち、円柱の第1のカラムにマッピングされる画像(カラム1と規定される、最も左のカラム)は0°の相対的角度を有する。第2のカラムにマッピングされる画像は6°の相対的角度を有する等々であり、マッピングされた画像が84°の相対的角度を有する最後のカラムまで進む。
【００７８】
本発明者らは、試験画像の公知の方位を出力Bから得られる角度と比較して、角度割付が6°以内まで正しいことを判定した。本発明者らは、円柱の外周を増加することによって、回転整列において比例して増加する精度を得た。例えば、90ニューロンの外周を用いる操作において、SORFAを使用して算出される試験画像の方位は公知の値から1°を超えては逸脱しなかった。方位を解像する際の唯一の制限的な物理的因子は試験画像におけるピクセル数自体であるようである。
【００７９】
要約すると、本発明者らは、四角画像のランダムに配向された不均一な混合物を用いて開始した。円柱位相を用いるSORFAを使用し、本発明者らは、1,200の画像全ての方位を適切に決定した。また、SORFAは、トレーニングセットの6つの四角サイズを6つの別個の列に適切に分類した。
【００８０】
3.1.2.  方位角分類の評価
以下の「試験操作」で方位の一貫性を判定した。先ず、本発明者らは、各試験画像の相対的方位を適用することによって試験セットを回転整列させ、次いで上記のように、この整列させた試験セットを使用してネットワークをトレーニングした。トレーニング後、マッピングした画像は2つの隣接するカラムに分類された(図3の試験操作)。これは最適な結果であった。
【００８１】
例えば、0°から6°までの画像がカラム1にマッピングされ、6°から12°までの画像がカラム2にマッピングされる場合には、それぞれ5.9°および6.1°に近接して整列される2つの画像は分離がわずか0.2°であっても別個のカラムにマッピングされうるので、このようになる。数千の画像領域において生じるこの確率または等価物はほぼ確実である。従って、全ての試験操作画像の単一カラムへのマッピングは不可能である可能性が高い。
【００８２】
方位角分類(例えば、矩形、三角形、五角形、六角形、七角形、および八角形の試験セット；データは示していない)を適用する場合に、他の試験画像対称でも矛盾のない結果が得られた。これらの実験から一般則が出現した：試験画像は円柱周囲を(360°/画像対称性)だけ回転する。例えば、6倍対称性を有する六角形は、グリッドの外周軸周囲を(360°/6)=60°回転する。60°の回転は六角形を元の配向に戻すので、これは予想され、変動は無限で、円柱周囲のフルターンを示す。従って、n倍対称性の試験画像については、本発明者らは、カラムからカラムまで[(360°/n)/(外周)]度の増分で円柱の方位角軸にラベルした。逆に、データセットの対称性は、円柱の1フルターン周囲のグリッド画像の回転度数を360°に分割することによって実験的に決定することができる。
【００８３】
3.1.3.  方位角分類に対する雑音の影響
本発明者らは、上記の合成四角形に種々の雑音レベルを加えて方位角分類を実施した。本発明者らが上記と同じ開始パラメーターを使用した場合には、方位角決定の精度または正確さに対する影響は0.07程度の低いSNRを生ずる雑音レベルでは観察されなかった；さらに高い雑音レベルの場合でも、本発明者らは、開始パラメーターを変更することによって良好な整列を得ることができた。
【００８４】
次に、本発明者らは、AQP1の原子モデル(Sui et al., 2001)のランダムに回転させた投影のより現実的な試験セットに雑音を加えてSORFAを適用した(図4の上図)。モデルを真ん中で分割して、正面から見られる細胞質および細胞外ドメインを示す投影を作製した。本発明者らは、種々のレベルの雑音を加えて、2つの面の各々のランダムに回転させた1,200の代表を作製した。次いで、これらの画像を試験セットとして使用して、初期学習率0.1において、円柱位相を用いて5,000サイクルのSORFAをトレーニングした。
【００８５】
図4の出力Bにおいて明白であるように、投影された2つの面は、円柱の上面および底面周囲で完璧に分離された。出力B方位を使用して画像を整列させた後、それぞれの平均(図4の整列されたトレーニングセット平均)は、雑音を加える前は元の画像から識別できなかった。試験操作におけるマッピングされた画像は、ほぼ完全に2つのカラムに制限された(図4の試験操作)。下右側コーナーの数字は、各ビンにおいてマッピングし、平均化した画像の数を示すことに注意されたい。SNR 0.25まで下げた雑音を加える場合には、試験操作のバンド幅は増加しなかった。ティルトしていないAQP0画像はSNRが約1であるので、本発明者らは、このデータセットの解析における雑音の影響を無視した。
【００８６】
3.1.4.  円柱を使用する構造差分類
上記の実験において、円柱は、SNR 0.25まで下げた雑音を加える場合には、AQP1 x線モデルの2つのドメインを完璧に分離した。ヒトの顔から電子顕微鏡写真までの範囲の多種多様の雑音のある試験画像を使用して完璧な分離を得た後、本発明者らは、円柱は、2つだけの雑音のあるクラスからなる雑音のあるトレーニングセットの分類時に本質的に強固であると結論づけた。しかし、雑音のあるクラスの数が2つよりも増加すると、均一なクラスを作製する円柱の能力は迅速に低下する。従って、トレーニングセットを含む3つ以上の雑音のあるクラスが存在する場合には、別の方法を使用するべきである。本発明者らは、このような分類の可能なツールとしてN-CUBEを用いて実験した。
【００８７】
3.1.5.  N-CUBEを使用する構造差分類
本発明者らは、N=0、1、2、3、および4の値に対してN-CUBE SOM試験を実施して、ネットワークが最高8の試験クラスを取り扱う能力を評価した。各クラスは、各々1つの画像の異なる修正：「ジェネレーター画像」であるさまざまな数の要素からなった。修正は配向および透明性のみを変更し、構造を変更しなかった。本発明者らは、制限ランダム回転(5°≦θ≦5°)を導入し、ガウス性白色雑音を加えることによって画像を修正した。8つのジェネレーター画像の2つはx線AQP1モデルの細胞質および細胞外投影である。他の6つは、種々の対称(3倍から6倍)を最初の2つに賦課することによって形成した。
【００８８】
雑音および制限されたランダム回転を導入する目的は、クラスメンバーシップを変更しない変動、つまり空間的配向および透明性のみによって構造的分類をさらに困難にしようとすることである。図5は、左のカラムに8つのクラスのジェネレーター画像を示し、右のカラムに対応する雑音のある回転された試験クラスの各々の一例を示す。(5°≦θ≦5°)のランダム回転変動は、画像整列を雑音のあるEMデータセットにより匹敵させた。適用したランダム変動の本発明者らの選択は、x線AQP1試験セットは、実際のAQP0顕微鏡写真より整列が容易であったという本発明者らの観察に基づいている。例えば、45ニューロンの外周円柱はAQP1試験画像の99%を±1°以内に整列させたが(上記参照)、AQP0画像の82.7%は±2.0°以内のみであった(以下参照)。
【００８９】
本発明者らはまた、1〜8の試験クラス、1から100まで変わるクラスメンバーシップサイズ、種々の量の雑音の組み合わせを使用して、N=0、1、2、3、4についてN-CUBE SOMをトレーニングした。本発明者らは先ず、ノイズも回転も用いないで試験を実施した。ほぼ全ての例において、以下の2つのケースが頂点に近い試験クラスの挙動を説明する。この挙動は、頂点付近または頂点にマッピングされた画像を見ることによって主要な(最も大きい)試験クラスの均一なサブセットをオペレーターが特定するのを助ける。
【００９０】
ケース1：試験クラスの数は≦頂点の数である：同じ試験クラスの各々全てのメンバーは同じ頂点(またはそれらのすぐ近傍の位置)にマッピングする。例えば、図5の右上のパネルは、2つの試験クラスAおよびBが2-CUBE SOM(4頂点)において解析される場合の出力Bを示す。クラスA(49メンバー)およびクラスB(53メンバー)は、正反対の頂点にマッピングする。データセットが2つのクラスだけを含有する場合には、それらは正反対の頂点にほぼいつもマッピングする。図5の真ん中右のパネルは、2つの追加の試験クラスが存在して合計4つになる場合に何が生じるかを示す。クラスA(49メンバー)およびクラスB(53メンバー)と同様に、クラスC(42メンバー)およびクラスD(59メンバー)は頂点にマッピングする。
【００９１】
ケース2：試験クラスの数は>頂点の数である：最も大きいメンバーシップの試験クラスだけが頂点にマッピングする(主要なクラス)。図5の右下は、8つの試験クラスを含有するデータセットが2-CUBE SOM(4頂点)で解析される場合のケースを示す。4つの最も大きい試験クラスだけが4つの頂点にマッピングする：クラスD(59メンバー)、クラスB(53メンバー)、クラスE(51メンバー)、およびクラスG(51メンバー)。4つの小さい試験クラスはエッジの予測不可能な位置にマッピングする。従って、2N主要試験クラスの最大値を頂点周囲に位置決めするためには、N-CUBE SOMを使用するべきである。各形状は、境界がその形状自身である変動のエンドポイントとして考えることができる。主要な形状は、最も大きいマッピングドメインを求めるので、頂点にマッピングしうる。
【００９２】
雑音を徐々に加え、制限されたランダム回転を導入するとき、マッピングされた画像の一部は頂点から逸れ始める。これはおそらく、雑音によって導入される大きな変動がクラス間の十分に規定されている境界を破壊するからであろう。ついには、十分な雑音が加えられると、頂点クラスは、他の試験クラスのメンバーにより汚染される。頂点クラスの均一性に対するNの増加の影響を図1Gに示し、頂点クラスの均一性は、Nが0から4、そしておそらくそれ以上に増加するとき、漸次改善することを明らかにしている。例えば、N=4およびSNR=0.32の場合には、頂点クラスは完璧に均一である。
【００９３】
3.2.  AQP0画像の解析
相対的な方位角は円柱の外周軸から読むことができることおよび主要なクラスはN-CUBEの頂点から読むことができることを理解して、本発明者らは、方位角および主要な構造差によるティルトしていないAQP0画像の分類に進んだ。
【００９４】
3.2.1.  対称化AQP0の方位角分類
凍結割断したAQP0粒子の3,361のティルトしていない画像を使用した。このデータセットは、種々の立体配座の細胞質および／または細胞外面の像からなる。対称性を賦課して、割断面に沈着している種々の厚さの金属層によって生じる任意の画像の不均一性を低下し、整列を改善した[Boonstra et al., (1994)も参照]。このC4対称の使用は、Zampighi et al.(2003)によって記載されているアイゲン(Eigen)画像の解析に基づいた。
【００９５】
45グリッド画像外周の円柱を使用して、90°/45=2°増分で方位角軸を較正した。ネットワークは、0.001の学習率で、300,000サイクルトレーニングした。出力Bを図6に示す。出力Aの最終的なグリッド画像(示していない)は、整列させた画像の平均からほぼ識別不可能であった。試験画像の場合と同様に、本発明者らは、グリッド画像の角度配向は円柱グリッド周囲に均一に回っていることを観察した。画像は上部の最も小さい画像からマッピングし、下部の最も大きい画像に進んだ。
【００９６】
3,361全ての画像の相対的な方位は、画像がどの円柱カラムビンにマッピングされたかに注目することによって、出力Bから読んだ。次に、方位の精度についての試験操作は図6の下部に示す結果を生じた。ここで、画像の82.74%は2つのカラムに分類される。従って、画像の82.74%は、2回のSORFA操作について24°以内に対して正確であった(図6の下部)。
【００９７】
本発明者らは、試験操作の質に対する影響を確認するために、0.0025の高い学習率を用いて整列手法を反復した。この高い学習率の場合には、画像の65.40%は24°以内に対して正確であった。従って、学習率が低いと良好な整列を生じた。これはおそらく、データセットの大量の不均一性のために生じる。低い学習率はトレーニング中に画像をトレーニングする影響を弱め、従ってトレーニングの早期部分から任意の偏りを低下する。しかし、約0.001より低い学習率は、反復回数を最高(out to)300万回まで増加した場合でも(最高10倍増加)、試験操作の標準偏差に全く影響を与えなかった。学習率の低下は、独立したSORFA操作間で得られる方位角の精度にも全く影響を与えなかった。従って、トレーニング画像の低い影響は整列の改善に全く影響しない閾値に到達されたので、学習率を0.001以下にすることは必要なかった。学習率0.0025における第2の操作は、操作間の方位の比較を可能にし、学習率0.0025の2つの操作間の角度再現性を確認した。本発明者らは、0°参照として粒子#124を任意に選択した。2回の操作間の対応する画像の平均角度偏差はわずか±2.47°で、試験操作から予測される値に近かった。従って、整列結果は、トレーニング中に使用される画像の順序に本質的に無関係であった。
【００９８】
3.2.2.  対称化AQP0の構造差分類および3D再構築
円柱位相を適用することによって、AQP0データセットから方位角変動を大幅に排除した後、N-CUBE位相を使用して2D AQP0データの頂点クラスを分割した。本発明者らは、整列させたAQP0画像を使用して、最大2Nの頂点クラスをそれぞれクラスタリングするために、N=1、2、3についてN-CUBE SOMを別個にトレーニングした。同じ数のトレーニングサイクル(300,000)および初期学習率(0.1)を以下の操作に使用した。
【００９９】
N=1については、本発明者らは225×1出力グリッドを使用した。トレーニング後、本発明者らは、2つの頂点およびそのすぐ近傍部から画像を取ることによって2つの頂点クラスを作製した。十分な数の近傍部を使用して、2つの分割区の数を左の分割区では168に、右の分割区では171にした。
【０１００】
N=2については、本発明者らは、ニューロンの数をN=1のケースと同じに維持するために、15×15出力グリッドを使用した。トレーニング後、本発明者らは、頂点の3×3アレイから画像を取ることによって4クラスを作製した。これらのアレイは、3D再構築を作製するために十分な数の画像を含有する最も小さいものであるので使用した(それぞれ、LL、174；LR、167；UR、182；UL、179画像)。
【０１０１】
N=3については、本発明者らは6×6×6出力ハイパーグリッドを使用した。このグリッドは、全てのN3ネットワークのうち、ニューロンの数が、上記のN=1および2のケースの超容積である225に最も近いので選択した。トレーニング後、本発明者らは8つ全ての頂点クラスから3D再構築を作製した。本発明者らは、3D再構築のために十分な数の画像を回収するために、頂点から2×2×2アレイを選択した(それぞれ、136、148、158、159、164、168、174、181画像)。
【０１０２】
本発明者らが、図7に示すクラス平均を以前の研究(Zampighi et al., 2003)において得られたものと比較したとき、SORFACによって作製された出力B頂点クラスは、分類手法による整列によって算出されるクラス(Zampighi et al., 2003)に非常に類似した全体次元および形状を示した。粒子は、N=1では92.1〜112.0Åの範囲であり、N=2では93.9〜106.3Åの範囲であり、N=3では96.0〜106.0Åの範囲であった。Nの増加とオングストローム範囲の低下には相関がある。
【０１０３】
N=2については、出力Bの頂点クラスのうちの3つは同様の八角形の形状を示したが、異なるサイズを示した(図7のクラスA、C、およびD)。第4の頂点クラスは滑らかな正方形状を示した(クラスB)。第2の独立した操作も滑らかな正方頂点クラスを作製した。しかし、今回は、内角ほぼ90°および180°のかなり異なって見える八角形の2つの頂点クラス(図7のクラスE)が出現した。これらの八角形は、第1の操作では頂点以外の位置に位置していた。一方、第1の操作で見られる八角形の頂点クラスは第2の操作では頂点以外の位置に位置していた。しかし、N=3超立方体は上記の形状の全てを占めた。それは、N=1、2および円柱を使用する本発明者らの独立した操作の全てに共通する網羅的な捕獲サイズおよび形状カテゴリーであった(図7)。みかけ上、5つ以上のクラスがN=2ケースでは4つの頂点について競合しており、N=1ケースでは3つ以上が競合している。
【０１０４】
以前の研究と同様に(Zampighi et al., 2003)、頂点クラスを得た後、対応するティルトした像を使用してAQP0の3D型を再構築した。これらは(図8〜10に示す)、外側の凸面および内側の凹面を有するカップとして出現した。粒子の分子エンベロープを示すインプリントは型の凹面から算出した。
【０１０５】
3.2.3.  3D再構築型の集団AおよびB
型の寸法はほぼ同じであったが、構造的な特徴は異なった。本発明者らが、1〜3のNの値についてN立方体アレイを用いて単離したクラスに対応する再構築を調査したとき、本発明者らは、2つの集団の型を同定することができることを観察した。集団Aは、型の凹面側の、24.2〜27.5Å離れている4つの大きな長い窪みによって特徴付けられる。隣接する窪みは互いに対して直角である。集団Bは、型の凹面側のベースに存在する47.5〜51.7Å離れている4つのリング様構造物と、30.0〜38.0Å離れている4つの長い窪み(「フットプリント」)とによって特徴付けられる。各集団の1つ以上のメンバーの一例をそれぞれ図8および9に示す。
【０１０６】
3.2.4.  集団AおよびBと2Dクラスの比較
2D AQP0クラスCおよびD(図7)は集団Aのメンバーである型を生ずることを、本発明者らは見出した。集団Bの型はクラスA、B、およびEによって作製される。小さい2D画像クラスが集団Aの型に対応し、大きい2Dクラスが集団Bの型に対応する。グループFのクラスは、集団AまたはBに属する型を生じた。
【０１０７】
3.3.  集団AとAQP1 x線モデルの細胞外ドメインとの比較
図8の左のパネルに示す型の2つの像において、4つの大きい長円形様の窪み(3D像で窪みとして見られる)が凹面側に存在する。任意の直に接する2つの長円形様の窪みは互いに対して直角であり、24.2Å離れている。これらの特徴は、AQP1 x線モデルの細胞外側に見られる4つの長円形様隆起によく相関している(図8)。x線モデルのこれらの隆起は、αヘリックスに接続している突出しているポリペプチドループに対応すると考えられる(図14の左下のオーバーレイ参照)。隣接ループピークは24.4Å離れている。
【０１０８】
型の窪みと同様に、各長円形ループ密度は、すぐ隣の両方と直交している。型の4つの窪みはインプリントの4つの隆起に対応している(図8の右のパネル)。インプリントおよびx線モデルの4つのピークのうちの2つは図8において矢印で印をつけている。型の主要な窪みの距離、形状および配向は、AQP1 x線モデルの細胞外側の主要な隆起の距離、形状および配向によく相関している。型の断面を取ることによって、本発明者らは、型の内側の長さおよび幅の寸法は平均62.4Åであると判定した。約64Åのx線モデルの寸法はまた、本発明者らが型について算出した値とほぼ同じである。
【０１０９】
3.4.  集団BとAQP1 x線モデルの細胞質ドメインとの比較
集団Bに対応する型の4つの例を図9に示す。これらの再構築物は、集団Aに使用した例と逆にマッピングした頂点クラスに対応する。AQP0の向かい合う側面を示すクラスは平面的な出力グリッドの全く正反対の頂点にマッピングするという観察は公知である(Zampighi et al, 2004)。AQP1 x線モデルの細胞質側を比較のために左下に示す。外側を向いている4つの隆起(「フィンガー」)を見ることができる。細い黒線のエンドポイントは隆起の2つを示す。これらはタンパク質モノマーのアミノ末端に対応し、51.0Åがそれらの間の距離である。これらの隆起は、(細い黒線のエンドポイントによって示される)左真ん中の型に見られる50.0Å離れているリングによく対応する。リングにフィットする「フィンガー」を想像することができる。リングの内径はαヘリックスの径に近い(図11)。アミノ末端の配向マッチの近さならびに型に対するリングおよび孔の位置を図10に図示する。ここで、本発明者らは、AQP1 x線モデルの細胞質側の半分(Zampighi et al., 2004のインプリントにドッキングしている)を本発明者らの型にフィットさせる。x線モデルのアミノ末端は型のリングから直接突出し、背面の4つの孔から出ている。集団Bのケースでは、インプリントと比較して型における方が詳細がわかりやすい。そのため、対応するインプリントは示していない。
【０１１０】
フットプリントの長さおよび幅はx線モデルのカルボキシルテイルの寸法に一致している。N=2および3のフットプリントを図11に示す；それらは長さがそれぞれ20.8Åおよび20.5Åであり、幅はそれぞれ8.5Åおよび7.4Åである。N=1〜3の値についてN立方体アレイを用いて単離されたクラスによって生じる型の孔および窪みの幅もアルファヘリックスの径に非常に近い。フットプリントは、リング間の全ての中間位置において直接見られ、配向の差を示す。
【０１１１】
型が、高いNの値を用いてN立方体アレイを使用することによって単離されるクラスから再構築される場合には、型におけるフットプリントおよびリング様構造物は共にかなり優勢である。おそらくこれは、大きい値のNにおける頂点クラスの均一性の高さによる。N=1の場合には、型はフットプリント/リングを持たない。N=2の場合には、8つの型のうち平均3つ(数回の操作において)がフットプリント/リングを有する。N=3の場合には、8つの型のうち平均6つ(数回の操作において)がフットプリント/リングを有する。
【０１１２】
図10からもわかるように、集団B型の別の特徴は、型の凹面側の床の中心部分は、正の密度のドーム形状領域を提供し、インプリントのゼロ密度のドーム形状領域に対応すると思われるということである。AQP1 x線モデルでは、アミノおよびカルボキシルテイルによって形成される「クラウン」が存在し、クラウンの内側はゼロ密度である。型の断面を取ることによって、本発明者らは、それらの内側の長さおよび幅の寸法は平均64.9Åであると判定した。x線モデルは約64Åにおいて類似している。
【０１１３】
3.5.  完全なチャネル
凍結割断は、チャネルの半分だけを示す構造を露出する。従って、本発明者らは、完全な長さを得るためにそれぞれの半分のチャネルの高さを合成する必要があった。この算出により平均値67.2Åが得られた。
【０１１４】
本発明者らは、実施例4において非対称化AQP0データの解析方法を報告している。
【０１１５】
4.  考察
4.1.  画像再構築手法の論拠
本発明者らの最初の目標は、SOMの顕著な位相、計量値保存および並列処理アーキテクチャを使用することによって2D EMの相対的な回転配向を求める参照フリー技法を開発することであった。SOMが高次元入力データ(例えば、EMセット)を出力グリッドにマッピングする場合には、データの位相構造および計量値を保存する傾向があることが公知である。特に、ネットワークの位相の限界を考慮すると、それは、トレーニングセットの主要な変動の位相を保存する傾向がある。本発明者らは、ランダム配向において画像を用いるSOMの広範囲のトレーニングによって、データセットの主要な線形変数として角度の重みを増加した。これは、出力空間へのマッピングにおいて線形に較正された方位角軸を確立し、トレーニング中に角度の偏りを排除する傾向がある。これは、トレーニング中に大きい規則性で生じる入力を大きい出力ドメインにマッピングするというコホネンの実証から得られる(Kohonen, 2001)。角度の変動は無制限であるので、無制限の座標軸が必要とされた。そうでないと、対称の角度によって増加する任意の方位は同じ軸位置を回復しなければならないので、軸のナンバリングシステムは無意味になると思われる。
【０１１６】
上記を考慮して、本発明者らは、グリッドの位相をデータの位相と一致させようとした。まず、RCT方法を使用する場合には、データの主要な位相特徴を考慮する。粒子は二重層平面において回転が主に自由であるので、データでは位相の点から無制限の回転変動がある(全回転は無制限である)。また、粒子は二重層において一方向または他方向へ「フリップ」されるので、この種類の変動は位相の点から有限である(画像化される粒子の2つのドメインによって)。他の種類の変動には、構造差分類中にネットワークの頂点にマッピングされると思われる分子の立体配座の差が挙げられる。
【０１１７】
上記のマッチングが実施される場合には、グリッド表面にデータの位相を保存する試みの際に、ネットワークは、位相の点から無制限の方向に無制限の変動をマッピングし、グリッドの位相の点から有限の方向に有限の変動をマッピングすると本発明者らは予想した。この方法で出力グリッドの位相をデータにマッチすることによって、本発明者らは、ネットワークはグリッド表面に本質的な座標系を確立することを期待した。
【０１１８】
座標の一方は本発明者らの第1の未知の要素、方位であり；他方は本発明者らの第2の未知の要素、原形質膜における配向であるであろう。情報の第1の部分は、正確に、3D再構築を作製するために必要とされるものであってもよい。SOMは、出力グリッド上の近傍領域に同様のデータセット画像をマッピングすることをコホネン(1982年)は実証した。そのために、本発明者らは、方位角変化は、円柱グリッドの外周の周囲では単調であると予想した。円柱座標のネットワーク系に言及するとき、本発明者らは無制限軸(円柱外周の周囲を巻く軸)を「方位角軸」と呼び(図3の出力Bの底部)、有限軸を「高さ軸」と呼ぶ(図3の出力Bの左端)。
【０１１９】
上記の予想の下、本発明者らは、有限および無制限の出力グリッド位相を実行した。このような1つの位相は、任意の外周の周囲で無制限で、それに垂直な任意の方向において有限である上記の円柱である(円柱の上面および底面は位相の境界である)。本発明者らが予想したように、円柱グリッドを使用してネットワークをトレーニングした後、特定の相対的な方位角に対応する画像を円柱外周の周囲に適当にマッピングし、データセットの主要な有限変動、サイズに対応するものを円柱の高さ方向にマッピングした。言い換えると、方位およびサイズを円柱座標様式でマッピングした。
【０１２０】
2D粒子の参照フリー整列のために円柱出力座標系を使用するこの技法は、「円柱位相-自己組織化、参照フリー整列(Cylindrical Topology-Self Organizing, Reference Free Alignment)」(CT SORFA)と呼ばれる。しかし、円柱は、これらの要件を満たす唯一の位相ではなく、最も簡単なものである。SORFAの独自の特徴は、並進的に整列される2D粒子画像の参照フリー回転整列のためのSOMへの排他的な依存である。学習計数、反復数、学習範囲ならびに円柱の高さおよび外周は全て最終的なマッピングの改善を証明するために変更され、結果をセクション2.5に要約する。
【０１２１】
SORFA方法を、速度およびオペレーター依存的参照の欠如において分類方法による整列と対比した。それは、数ヶ月に対して数時間のコンピュータ処理しか必要としなかった。これは、最良の初期学習率および円柱の最適な外周/高さ比に達するのに必要であった余分な時間を含んだ。図15は、同じ条件下で(反復300,000および学習率0.001において45ニューロン×45ニューロンの円柱)、同じ3,361のAQP0データセットを使用するが、3つの異なる様式の整列(左から右へ)：1：初期の整列されていない画像を使用する；2：SORFA整列されたデータ(整列は約2時間かかった)を使用する；3：MSA/MRA整列されたデータ(整列は6ラウンドのMSA/MRAを使用して約2週間かかった)を使用する、3つの試験操作を示す(一番左の3つ)。図15はまた、同じ試験操作条件を使用して、独立に作製されたMSA/MRA整列されたセットの試験操作も示す(一番右)。データセットはほとんど同一であったが、整列および分類段階のためには24Åの代わりに8Åにフィルタリングした。画像はまた非常にしっかりしたマスクを使用し、3,366画像からなった。オペレーター誤差によって、このMSA/MRA整列された試験操作にダブルピークが生じる可能性があった。図15においてわかるように(一番右)、過剰にしっかりしたマスキングにより、画像は円柱の上半分にマッピングされた。
【０１２２】
SORFAは、人工的に作製した(種々の対称の)試験セットならびに対称化および非対称化EMを収容することを本発明者らは実証した。0.25程度の低い整列のSNRは初期パラメーター変更を必要としないかまたは方位の精度および正確さに実質的に影響を与えない。CT SORFAの回転変動を大幅に除去した後、(研究対象の物体の異なる立体配座および像を示す)より均一なクラスターを分割し、作製される頂点クラスの数を制御するために、位相を円柱からND超立方体にスイッチする。N=1、2、および3の値を使用した。さらに、粒子整列の評価が容易であり、参照画像についての仮定を行う必要がない。
【０１２３】
SOMの計量値保存特徴のために、入力画像の異種性が高いクラスをハイパーグリッドの最大に分離された領域にクラスタリングする。N-CUBEにおけるこれらの領域は正反対の頂点に位置するので、N-CUBESは2N頂点の近接位にこれらのクラスをクラスタリングした。試験画像が完璧に整列されなかった場合でも、主要なクラスの頂点へのマッピングの際のSORFAの強度が実証されている。
【０１２４】
4.2  結果の解釈
4.2.1.  手法および早期所見への関連
N=1、2、3について取られた、分割区からの3D再構築の結果を図8および9に示す。分割の均一性が高次元ハイパーグリッドについて有意に増加した理由は(図1G)、高次元データをさらに高次元ハイパーグリッドにマッピングする場合のデータ圧縮の低下でありうる。高分子の立体配座の変動などの多数の差が存在する場合には、それらはおそらく追加の自由度によって低い次元空間ではなく高い次元空間において良好に分離されうる。おそらく、これは高い次元の頂点分割区における少ない汚染を説明している。欠点は、実際には、全ての主要なクラスが頂点に示されているかどうか、またはNが必要以上に高いかどうかを判定することができないことである。
【０１２５】
型の新たな特徴は、以前の容積が不明であった場合にも正確に配置されている(Zampighi et al., 2003)。これらの容積は、Zampighi et al. (2004)によって測定されるとき、細胞質ドメインのエンベロープの外であり、x線モデルプロジェクトのアミノおよびカルボキシル末端にドッキングしている(図10)。本発明者らは、アミノおよびカルボキシル末端の反対の密度に対応する型の孔およびフットプリントを見ることを期待しており、実際それらは見られる。しかし、フットプリントは、型の中心軸から平均距離25.2Åにおいて孔/リングの間にあいまいに位置している。例えば、非対称化整列の型では(図14および実施例4参照)、本発明者らは、中間位置に異なる角度でフットプリントを見る。フットプリントがカルボキシルテイルによって作製される窪みである場合には、配向変化を説明する方法は、カルボキシルテイルが立体配座を回転および／または変更する能力であると思われる(図11および14に示す)。図11において、カルボキシル末端は隣接モノマーのアミノ末端の近位であると思われる。
【０１２６】
4.3.  将来的適用
上記の例示に使用される、コホネンSOMではなくSOMへのSORFAの将来的適用はすぐれた地形的な秩序；例えばファジー(fuzzy)コホネンクラスタリングネットワーク(FKCN)(Pascual et al., 2000)およびKerDenSOMs(Pascual Montano et al., 2001)およびパラメーター化自己組織化マップ(Parameterized Self-organizing Maps)(PSOM)を作製すると思われ、連続マッピングを達成することができる(Walter and Ritter, 1996)。別の適用は超担体アレイを使用すると思われ、頂点クラスの数は2の倍数に制限されるのではなく、任意の正の整数に設定されると思われる。最後に、低温電子顕微鏡データの角度再構築に必要なオイラー角は、例えば、研究対象の3D物体の低温データセットの位相および対称性に依存して、球形、超球形、トロイダル、ハイパートロイダル等のような他の位相から得ることができる場合がある。SORFAは並列処理されてもよく、直列計算によって簡単に模倣されない。次いで、全てのニューロンを順にではなく同時に比較して更新することができると思われる。このような並列処理アーキテクチャはマイクロチップで実行できると思われる。それは数桁処理を加速することを約束する。例えば2,025ニューロンを用いた45×45ニューロン円柱での処理は、並列処理され、それによって処理時間を数秒以下に短縮する場合には、少なくとも2,025倍速く操作することが期待されると思われる。
【０１２７】
これらの新たな技法は、独立した適用を超えて、よく知られているx線および電子線結晶学空間充填、リボンおよび円柱およびループの利用性、再構築ならびに他の進んだ画像化方法のそれらを拡大することも約束する。主要な利点は、結晶化を使用しないということである。結果として、多数の物体を未処理の立体配座に近い状態で調査することができる。多数の他の期待される適用のうち、新たな技法は、神経生理学ならびに薬物設計および発見に大きな影響を与えると思われる。さらに、物体のサイズとは関係なく、それらは、リボソームなどの超高分子集合体から、反復運動およびわずか数十ミリ秒の暴露が関与する医学的な患者の診断、例えば、高速心MRIの適用を見出す可能性がある。
【０１２８】
本発明は、数多くの修飾および変更が当業者に明らかであるので、例示にすぎないことが意図されている以下の実施例においてさらに特に記載されている。以下の実施例は例示することが意図されているが、本発明を限定しない。
【０１２９】
実施例1.  四次元立方体の頂点の配置および円柱表面の距離の算出
線、四角形および立方体は容易に視覚化されるので、ケースN=1、2および3についての超立方体頂点の配置は容易である。しかし、N=4四次元立方体の可視化は困難である。これにもかかわらず、頂点は、単純に「ニューロンを計数する」ことによって容易に配置される。ニューロン(4空間の座標によって同定される)は、簡単なラスター規則(raster convention)を使用してまず順序づけされる。例えば34=81ニューロンの場合の3×3×3×3超立方体は4空間に以下のようにナンバリングされる：1：(0,0,0,0)、2：(1,0,0,0)、3：(2,0,0,0)、4：(0,1,0,0)、5：(1,1,0,0)、6：(2,1,0,0)、7：(0,2,0,0)、8：(1,2,0,0)、9：(2,2,0,0)、10：(0,0,1,0)、...、81：(2,2,2,2)。長さ、Lニューロンの四次元立方体については、16の頂点は、以下のニューロンを計数することによって配置される(四次元立方体の2D投影は図2参照)。
2007536644.tif 000003
【０１３０】
3×3×3×3超立方体については、L=3である。従って、16の頂点は：V1=1、V2=2、V3=7、...、V16=81に配置される。4立方体をトレーニング後、約(150〜200)画像を、16の頂点の各々および出力四次元立方体の(最高150〜200範囲に数をするために)すぐ近位にマッピングした画像から収集し、16の3D再構築を作製するために使用する。速いカメラのサンプリング速度(>1/3.1Å)および球面収差の低下(<2×106 nm)、電子波長の低下(<.00335087 nm)、ピンぼけ最大(defocus maxima)の低下[<(200〜300)nm]等を含むが、それに限定されるわけではない良好な解像度の達成に要求される他の因子の改善は、最良の結果を達成するために、より多数の画像が収集されることを要求する場合がある。
【０１３１】
円筒表面のウィニング画像から距離を算出する場合には、ネットワークだけが最も短い距離を考慮する。本発明者らは、所与の高さHおよび外周Cの円柱表面の地点を(a, h)(ここで「a」は方位角座標であり、「h」は高さ座標である(結果参照))によって示す。円柱表面の地点(a1, h1)と(a2, h2)の最も短い距離の式は以下のとおり：
min{[(a1-a2)2+(h1-h2)2]1/2, [(C-|a1-a2|)2+(h1-h2)2]1/2}。
【０１３２】
実施例2.  初期学習率に低い値を選択する重要性
各画像の提示が出力グリッドに小さい影響しか与えないように、小さい値の初期学習率により出力グリッド画像は徐々にデータに適合されうる。利点は、グリッドがトレーニング中に初期偏りを生じないことである。十分に低い値の学習率は、整列結果が、ネットワークをトレーニングするために使用される画像の順序に無関係になるので、トレーニングの偏りを排除する。これは、トレーニング中のトレーニング画像の影響の持続的な低下(学習率が持続的に低下し、反復数は対応して増加する)は、独立した操作間の整列精度に影響を与えないからである。高すぎる値の学習率は、(特に、トレーニングセットに不均一性が大きい場合)トレーニングされる円柱の高さ方向のグリッド画像の回転を少量にするので、正しい学習率の選択はトレーニングセットの目標の整列のために重要である。逆に、全ての回転変動が方位角軸方向に限定されることが望まれる。
【０１３３】
初期学習率が、それぞれ、大きすぎる場合または小さすぎる場合には(反復数を、それぞれ、減少または増加することによって代償しないで)、ネットワークはオーバートレーニングまたはアンダートレーニングされる。ネットワークが最適にトレーニングされる場合には、試験操作のヒストグラムは最も狭い分布を有する。ネットワークが最適にトレーニングされる場合には、出力Aのグリッド画像は、全ての画像の整列後の平均に非常に類似しているからほぼ識別不可能まで変わることを本発明者らは実験的に観察している。
【０１３４】
ネットワークがオーバートレーニングされる場合には、全てのグリッド画像は全ての画像の整列後の平均に類似していない；代わりに、別に見える整列後のサブクラスであるものも存在する。トレーニング中、グリッド画像は、ランダム状態から、トレーニングが完了した場合の、全ての整列後の画像の平均に類似しているものまで移動する。さらに、オーバートレーニングの場合には、それらは別個のサブクラスに識別され、視覚による検査の結果明白に明らかである。この方法でグリッド画像を検査することは、試験操作を完了する前に整列の質を迅速に評価するのに有用である(材料および方法参照)。しかし、試験操作は、整列の質を評価するための決定的なツールである。
【０１３５】
実施例3.  トレーニングサイクルの総数の関数としての直線性からの角度偏差
例えば、4倍対称の画像については、方位角の範囲は0°90°である。全てのボックスが以下の方法で標識されている90ボックスシリーズを考慮する：ボックス1、0°〜1°；ボックス2、1°〜2°；等で最後のボックスに至る；ボックス90、89°〜90°。トレーニング中に所与の方位角範囲で画像がネットワークに提示されるときはいつでも所与の角度範囲のボックスに落ちるボールを考える。トレーニング終了時に、正確に同じ数のボールが90ボックスの各々に存在するときはいつでも、トレーニング中に提示される角度の完璧に線形の分布が生じると思われる。この数は平均に等しいと思われる。すなわち、トレーニング中に提示される画像の総数を90で割る。しかし、実際には、分布はランダムなので、他よりもボールが多いボックスもあり、角度分布の非線形性を説明している。線形性からの偏差は平均からの逸脱である。線形性からのこの偏差の全体的な測定値は、全てのボックスの線形性からの全ての偏差の分布の標準偏差である。
【０１３６】
しかし、コホネンネットワークは、線形性からの角度偏差の絶対値に関係しているのではなく、全体の割合に関係している。これは、画像がトレーニングに使用される画像の大きい割合をなす場合には、最終マップにおける画像の影響が大きくなるからである。従って、線形性からの偏差が提示される角度の総計の小さい割合である場合には、影響は少ない。上記を考慮して、本発明者らは、非線形角度提示の影響の尺度を、ボックスの線形性からの逸脱の標準偏差をボールの総数で割って100%倍したものと規定する。
【０１３７】
図12において、線形性からの偏差の割合を、トレーニングサイクルの総数に対してプロットしている。約100,000から約300,000のトレーニングサイクルの間では、本質的に底部の曲線が双曲線に見えることに注意されたい。300,000トレーニングサイクルでは、線形性からの偏差は0.18%である。300,000を超えるトレーニングサイクルでは、非線形性の大きな低下はないので、本発明者らは本発明者らの最終的な整列操作に300,000トレーニングサイクルを選択した。
【０１３８】
実施例4.  非対称化AQP0の分類および3D再構築
非対称化AQP0データセットを、学習率0.001で45×45ニューロン円柱に配列した。出力Aの画像は、グリッドの外周に180°回転しており、大半が2倍対称(示していない)を有することを示しており、出力Bの結果を図13に示す。2倍対称は、一部には、ティルト角が正確に0°でない結果として、ティルトしていない多数の2D画像の伸張による場合がある。次いで、N=2超立方体位相を用いて、整列された画像を使用してSORFAをトレーニングし、出力B結果を図14に示す。非対称化AQP0データセットの算出された方位の精度を定量化し、精緻化するために、4つの頂点に最も近いクラスターを選択した。例えば、右上の頂点クラスを選択して使用し、100ニューロンの円柱外周、10ニューロンの円柱高さ(最良の試験操作)、0.001の学習率および300,000の反復を用いてSORFAを再トレーニングした。画像はグリッド周囲を90°回転しており、このサブセットが全体で4倍対称を有することを示した。出力Aのグリッド画像は整列後の平均に類似している(図13)。この整列されたクラスに対応する3D再構築を図14に示す(右上)。この型は、リングの存在を除いて集団Bの特徴を有する。4つのフットプリントは36.8Å離れている。型の内側の長さは青線で示されており、64.2Åである。
【０１３９】
実施例5.  対称化AQP0の超整列および3D再構築
本発明者らは、画像の整列を「精緻化する」方法も試験した。超整列は、方位を精緻化するためであるが、均一性の大きい(頂点分割区などの)SORFAから作製されるサブセットを使用して、(同じ画像の連続回転によるエイリアシングおよび／または丸め誤差の蓄積を防止するために)整列後の画像または開始画像を再整列することである。サブセットは、構造差分類の後で、N立方体SOM超容積のどこかで近傍から選択される。この手法の一例として、本発明者らは、上記のN=2ケース、約(167 182)画像から頂点分割区を取り、SORFAを用いてそれらを個別に再整列させた(図16参照)。方位角軸解像度は、100ニューロンに対して円柱外周を増加することによって増加された(カラムあたり0.9°)。例えば、5ニューロンの円柱高さは、2立方体SOMの左上頂点クラスについて以下の試験操作統計を生じた(図16参照)：画像の98.3%は±1.8°まで正確であり；96.1%は±1.3°まで正確であり；81.6%は±0.9°まで正確であり；52.0%は±0.4°まで正確である。本発明者らは、5ニューロン多い円柱は、試験操作の標準偏差が最も低かったので、AQP0の超整列操作に使用した。学習率および反復数はそれぞれ0.001および300,000で維持した。
【０１４０】
右下のN=2ケースの頂点分割区からの超整列された3D再構築の一例を図14に示す。
【０１４１】
図の説明
図1.  SORFAの一般な例のケースのフローチャート。
【０１４２】
図2.  SORFAの略図によるダイグラム。データセットおよび初期パラメーターを入力した後、SORFAを円柱位相にスイッチし、開始する。トレーニング後、データセット画像の方位角を円柱外周の周囲にディスプレイする。試験操作を実施して、求めた角度の一貫性を求める。次いで、SORFAをND超立方体アレイにスイッチして、再度トレーニングするが、今度は整列されたセットを使用する。
【０１４３】
図3.  白四角の合成集団の方位角分類。上は、方位角によって分類されるトレーニングセットである。その下は、可視化のために、長さ方向に切断し、平坦においた出力円柱である。それは、トレーニングに開始前のランダム-ピクセル初期条件を示す。トレーニング中、データセット画像は、ランダム角度配向でネットワークに提供される。出力画像は、徐々に、トレーニング画像にモーフィングする。開始条件の下は、トレーニング後の出力Aである；任意の垂直カラムの全ての画像は同じ角度であるが、サイズが異なるが、任意の列の全ての画像は同じサイズであるが、角度が異なる。円柱周囲の出力画像の回転は均一であるので、円周軸は方位角軸と呼ばれてもよい。次いで、出力Aグリッドの最も類似性の大きい位置に割り付けることによってトレーニング画像を分類する(出力Aの左および右側に見られる)。最近似一致グリッド位置にマッピングされているトレーニングセット画像「a」から「d」を示す。マッピング結果を出力Bとして示す。2つ以上の画像を同じグリッド位置にマッピングする場合には、平均画像を提示する。底部の方位角軸は、所与のカラムにマッピングした画像の相対的な角度(出力Bラベルの上部)を示す。角度の決定が正しい場合には、方位角を適用して画像に整列を実施する(「トレーニングセットの整列」参照)。整列の質は、整列される画像が円柱によって再処理される場合に作製される、試験操作の画像の垂直バンドの狭さの程度によって示される。
【０１４４】
図4.  AQP1試験セットの方位角分類。上部は、ランダム角度配向におけるAQP1 x線モデルの2つのドメインのノイズのある投影(SNR=0.32)である。この例では、画像のSNRは0.32である。これらの画像は、図3と同じようにSORFAによって処理した。出力Bは、22°〜36°の方位角の円柱部分を示す。方位角軸は、出力Bにおいて任意の所与のカラムにマッピングされた画像の相対的な角度を示す。次いで、それぞれの方位角を適用することによって、画像に角度整列を実施した。整列された画像の平均は、雑音を加えない元の画像の平均から識別不可能であった。最後に、円柱による整列された画像の再処理は試験操作を実施する。試験操作の画像幅の狭さの程度は整列角度の一貫性を示す。2つのドメインを示す画像は、出力Bおよび試験操作によって円柱の上部および下部に完璧に分割された。
【０１４５】
図5.  N=2の種々の数の試験クラスのマッピングの影響。最も左のカラムは、ノイズおよび制限されたランダム回転を加えることによって8試験クラスを作製するために使用される8ジェネレーター画像を描写する。8クラスの各々の画像の例は第2のカラムに描写する(クラスCおよびDは、AQP1 x線モデルの投影である)。右上のパネルは、データセットが2つの主要なクラスだけからなる場合に、画像がどのように全く反対の頂点にマッピングされるかを示す。真ん中右のパネルは、主要なクラスおよび頂点の数が等しい場合に何が起こるかを例示する：画像は、クラスメンバーシップにより4つの別個の頂点にマッピングする。右下のパネルは、主要なクラスの数が頂点の数を超える場合に何が起こるかを例示する。最も大きい主要なクラスは頂点の最良のコンペティターであり、それらを「誘引する」傾向がある。真ん中のパネルの42画像の頂点クラスは下のパネルの大きい画像クラスへの競合がどのように成功せず、結果として、頂点にマッピングしないか注目すること。
【０１４６】
図6.  AQP0の方位角分類。上は、C-4対称賦課AQP0データ(トレーニング)セットを含む3,361画像の4つである。右は、全ての画像の平均である。平均画像の円形は、データセットが回転整列されていないことを示す。次いで、SORFAを使用してデータセットを処理する。出力Bは、トレーニングセットにおける全ての画像の相対的な方位角を示す。出力Bの所与のカラムにマッピングした全ての画像は、方位角軸によって示されるように、同じ相対的な方位角を有する。次いで、相対的な方位角を画像に適用して、整列されたトレーニングセットを作製し、画像の平均を右に示す。セットの下は試験操作の結果である。試験操作のヒストグラムも一番下に示す。ここで、画像の82.7%は2つのカラムに分類される。従って、画像の82.7%は2°〜4°以内まで正確である。
【０１４７】
図7.  AQP0 2Dクラス。いくつかの構造差分類操作において得られるクラスの種類。Nは、N-CUBE SOMに使用される次元である。N=2について、2つの独立した操作の得られるクラスを示す。クラスA、BおよびEは、特徴的な特徴を有する1つの集団の型を生じた。クラスCおよびDは、別のセットの特徴的な特徴を有する異なる集団の型を生じた。グループFのクラスは、集団AまたはBに属する型を生じた。
【０１４８】
図8.  AQP0集団AメンバーとAQP1 x線モデルの細胞外ドメインの比較。左のパネルの上2つの画像は、集団A型の2つの像である。上の像は、型の凹面に存在する4つの大きな窪みの評価を可能にする。これらの窪みは長円形で、互いに直角である。これらの型の厚い外側の境界は、白金の余分な付着物であり、AQP0の部分ではない。比較のために、AQP1のx線モデルの細胞外ドメインを下に示す。ポリペプチドループは、4つの隆起として突出している。それらの密度も長円形(ovular)であり、互いに直角である。細い黒線は、型の窪み間の25.6Åの距離およびx線モデルの同様に間隔をおいて(24.4Å)隆起したループ間の距離を示す。チャネルの半分だけを示す型のインプリントを算出し、右上のパネルに示す。その下は、チャネル全体を示すx線モデルの別の像である。モデルおよびインプリントの上部の2本の矢印は、比較されている隆起を示す。インプリントの隆起間の距離は24.2Åである。
【０１４９】
図9.  AQP1 x線モデルの細胞質ドメインと比較した集団B代表。集団B型の2つの像を左上のパネルに描写する。12.0Åまで低域フィルタリングされたこの型は、2-CUBE SOMで単離されたクラスから作製された。このクラスは、図10の例のものの反対の頂点にマッピングした。比較のために、AQP1 x線モデルの細胞質側も左のパネルの下に示す。外側を指している4つの隆起(「フィンガー」)が存在する。細い黒線の終点が2つの隆起を描いている。これらはアミノ末端であり、51.0Å離れている(黒線で示されている)。隆起はリングに関連しており、50.0Å離れており、型の底付近に見られる(黒線の終点)。リングに適合するものとフィンガーを考える。この型の負の密度はx線モデルの正の密度に対応していなければならないと思われる。図10は、リングおよびフィンガーは型の同じ深さ位置に対応することを示している。右上のパネルは同じ型を示すが、フィルタリングは7.5Åである。フットプリントはリングの下方によく見られる。右下のパネルは別の集団B型を示すが、N=3である。x線モデルは右下のパネルに示す。1つのアミノ末端はx線モデル上で小さい円で示されており、1つのカルボキシル末端は大きい円で示されている。カルボキシル末端はフットプリント様窪みを出ることが予想される。矢印はアミノおよびカルボキシル末端の考えられる関連を指している。型のフットプリントは、x線モデルのカルボキシル末端と異なる配向を有する。この末端は、提案されている位置に回転されることが必要とされると思われる。図11は、フットプリンントの寸法がカルボキシル末端の寸法に近いことを示している。
【０１５０】
図10.  集団B型のアミノ末端の配向および集団A型のポリペプチドループ。上のパネルにおいて、本発明者らは、AQP1 x線モデルの細胞質側の半分(Zampighi et al., 2003のインプリントにドッキングする)を図9に示す型に適合する。x線モデルのアミノ末端は、型のリングから直接突出して、背面の4つの孔から出ている。下のパネルでは、本発明者らはAQP1 x線モデルの細胞外側の半分(Zampighi et al., 2004のインプリントにドッキングする)を集団A型(図8の2つの像に示す)の隣に並べている。
【０１５１】
図11.  フットプリントの解析。画像の中央および右のカラムは、図9の右のパネルに示すリングおよびフットプリントのトリミングである。画像の一番右のカラムは軸の像を含有し、対応する距離に印をつけるために線を引いてある。左側は、AQP1 x線モデルの細胞質ドメインである。アミノおよびカルボキシル末端は最も外側に見られる。リングがN末端に対応し、フットプリントがC末端に対応する場合には、C末端は配向を変化させなければならないと思われる。これを説明するために考えられる機序は、示すように、ペプチド鎖内の回転であると思われる。
【０１５２】
図12.  線形性からの角度偏差。トレーニングサイクル総数が円柱の方位角軸の線形性に与える影響。本発明者らは、最終操作のトレーニングサイクル数を300,000に設定した。その理由は、このポイントを超える線形性の改善はほとんどないからである。
【０１５３】
図13.  AQP0の非対称化整列および分類。一番左は、非対称化AQP0データセットを形成する3,361画像の6つの例である。整列後、試験操作を実施する。次いで、N=2分類を実施する。次いで、4つの4×4頂点分類をN=2分類から作製して、別個に再整列させる。例は、N=2分類の右上の頂点クラスを使用して示されている。次いで、第2の円柱分類の出力Bを示す。グリッド画像が、一番右に示す最終の整列された平均にとのように類似しているか注目する。一般則として、適切なSORFAのトレーニングの場合には、出力Aの画像の全ては、互いにおよび整列された平均にかなり類似する傾向がある。
【０１５４】
図14.  対称化および非対称化整列および分類から作製されたレプリカ。上のパネルの上半分には、対称化整列および分類によって得られるレプリカの凸面のディスプレイが示されている。上のパネルの下半分には、凹面側の2つの像が示されている。下のパネルの右側には、非対称化AQP0データセットから作製される型が示されている。左側には、AQP1 x線モデルの細胞質ドメインが示されており、青線の終点はアミノ末端を示している。右の型に示される青線の終点はアミノ末端の提案されている位置の2つである。矢印は、型の窪みの配向を説明することができると思われるカルボキシルテイルの可能な回転を示す(矢印によって示されている)。
【０１５５】
図15.  整列されていない、SORFA整列されたおよびMSA/MRA整列されたAQP0画像を使用する試験操作の比較。上の列は、すぐ下に存在する円柱グリッドから作製されるヒストグラムからなる。画像の下の列は、それぞれの試験操作をトレーニングするために使用される画像の平均である。最初のカラムでは、画像はまだ整列されていないので、平均は円形である。カラム2のSORFA操作は整列に約2時間かかった。画像の82.74%(3,361画像のうちの2,781)は、4つの程度の整列範囲に対応して、2つの円柱カラムだけにマッピングした。これは、四角形を有する平均によって明白にされる。カラム3におけるMSA/MRA試験操作は、約2週間の期間にわたって6ラウンドの整列によって進行した。対応するヒストグラムは、データセットが部分的にしか整列されていなかったことを示している。第4のカラムには、MSA/MRAを使用して独立に整列されたデータセットからの試験操作結果が示されている。二重ピークは、「整列」を実施するためにかかった6ヶ月中のどこかで生じたオペレーター誤差の結果である可能性が最も高い。この独立に実施されたMSA/MRA整列に使用したAQP0データを、(他の試験操作と同様に)24Aの代わりに8Aでフィルタリング、さらにしっかりマスクした。過剰なマスキングにより、画像は円柱グリッドの上方部分にマッピングされた。
【０１５６】
図16.  整列および超整列。3,361個のAQP0開始画像を先ずSORFAで整列させ、次に整列試験操作を実施した(上の長方形のボックス)。ここでは、4つの程度の整列画像に対応して、画像の82.74%が2つの円柱カラムだけにマッピングした。次いで、均一なクラスを作製するために、整列された画像を使用して2-CUBE SOM(中央)をトレーニングした。各頂点の9のニューロンにマッピングした画像からなる4つの頂点クラスをここで使用し、それらの平均を示す。9の頂点クラスは、それらの各々にマッピングした画像の数が約(160 180)の望ましい範囲内であったので、使用した。頂点クラスは各々、マッチするティルト画像を配置するために必要とされる均一なクラスターのティルトしていない画像であり、対応する方位角は初期3Dモデルを作製するために必要であった。次いで、SORFA(超整列)を使用して頂点クラス画像の各サブセットを再整列させ、次に試験操作を実施する。これは左上および右下の頂点クラスについてだけ示す。左上の頂点クラスに実施した超整列は以下の統計を生じた：頂点クラス画像の98.32%は3.6度以内までであり。96.09%は2.7度以内までであり、81.56%は1.8度以内であり、51.96%は0.9度以内。右下の頂点クラスに実施した超整列は以下の統計を生じた：78.44%は3.6度以内までであり、68.26%は2.7度までであり、55.69%は1.8度までであり、32.34%は0.9度まで。新たな方位角を超整列によって作製した後、それらを使用して追加の初期3Dモデルを作製する。
【０１５７】
図1G.  頂点クラス汚染に対する雑音の影響。第1の列は、信号対雑音比(SNR)値を示す。第2の列は、この雑音レベルを加えた試験画像の一例を示す。列3 6は、頂点クラス汚染の割合に対してNの変更が与える影響を示す。例えば、12.5%という値は、対応する頂点にマッピングした画像の12.5%が他のクラスからの汚染であることを意味する。
【０１５８】
参考文献
2007536644.tif 000004
2007536644.tif 000005
2007536644.tif 000006
【０１５９】
本発明は上記例を参照しながら説明してきたが、本発明の趣旨および範囲には修飾および変更が包含されることが理解される。よって、本発明は添付の請求の範囲のみによって限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１Ａ−Ｆ】本発明の一態様による、画像を整列および分類するための参照フリー方法を図示するフローチャートを図示する。
【図１Ｇ】本発明の一態様による、頂点-クラスコンタミネーションに対する雑音の影響を図示する。
【図２】本発明の一態様による、単一粒子を整列および分類するための参照フリー方法の略図によるダイアグラムを図示する。
【図３】本発明の一態様による、白い四角の合成集団の方位角分類および整列を図示する。
【図４】本発明の一態様による、AQP1試験セットの方位角分類および整列を図示する。
【図５】本発明の一態様による、N=2についてさまざまな数の試験クラスをマッピングする影響を図示する。
【図６】本発明の一態様による、AQP0の方位角分類および整列を図示する。
【図７】本発明の一態様による、AQP0 2次元頂点クラスを図示する。
【図８】本発明の一態様による、AQP0集団AメンバーとAQP1 x線モデルの細胞外ドメインの比較を図示する。
【図９】本発明の一態様による、AQP1 x線モデル細胞質ドメインと比較したAQP0集団B代表を図示する。
【図１０】本発明の一態様による、集団B型におけるアミノ末端の配向および集団A型におけるポリペプチドループを図示する。
【図１１】本発明の一態様による、フットプリントの解析を図示する。
【図１２】本発明の一態様による、反復数の関数としての直線性からの角度偏差を図示する。
【図１３】本発明の一態様による、AQP0の非対称化方位角分類および整列を図示する。
【図１４】本発明の一態様による、対称化および非対称化整列および分類から作製されるレプリカを図示する。
【図１５】本発明の一態様による、整列されていない、SORFA整列、およびMSA/MRA整列されたAQP0画像を使用した試験操作の比較を図示する。
【図１６】一態様による整列および超整列を図示する。
【図１Ａ】
2007536644.tif 000008
【図１Ｂ】
2007536644.tif 000009
【図１Ｃ】
2007536644.tif 000010
【図１Ｄ】
2007536644.tif 000011
【図１Ｅ】
2007536644.tif 000012
【図１Ｆ】
2007536644.tif 000013
【図１Ｇ】
2007536644.tif 000014
【図２】
2007536644.tif 000015
【図３】
2007536644.tif 000016
【図４】
2007536644.tif 000017
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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