(57)【要約】  本発明は、繊維症疾患、特に強皮症の治療及び/又は予防のためにINSP035を使用することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するためのポリペプチドの使用であって、当該ポリペプチドが、
a)  SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、又はSEQ ID NO:10のうちのいずれかに示されたポリペプチド；
b)  SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:3)、SEQ ID NO:5(SEQ ID NO:6)、SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:8)、又はSEQ ID NO:10(SEQ ID NO:11)で挙げられた配列を有するポリペプチドのヒスチジン標識形態；
c)  SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11のうちのいずれかを含むポリペプチド；
d)  アミノ酸配列が、(a)〜(c)の配列のうちの1つ以上に対して40%又は50%又は60%又は70%又は80%又は90%以上の同一性を有する、(a)〜(c)のうちのいずれかの突然変異タンパク質；
e)アミノ酸配列のいずれの変化も、(a)〜(c)のアミノ酸配列に対する同類アミノ酸置換である、(a)〜(c)のうちのいずれかの突然変異タンパク質；
f)(a)〜(e)のうちのいずれかの塩又はイソ型、融合タンパク質、官能性誘導体、活性画分又は円順列変異誘導体
から成る群から選択される、ポリペプチドの使用。
【請求項２】
線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するための核酸分子の使用であって、当該核酸分子が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11のうちのいずれかに示されたポリペプチドをコードする核酸配列を含み、そして
a)  SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、又はSEQ ID NO:9のうちのいずれかに示された核酸配列；
b)  中ストリンジェント条件下又は高ストリンジェント条件下で(a)の核酸配列の相補体とハイブリダイズする核酸配列；
c)  (a)又は(b)のうちのいずれかの核酸配列であって、前記核酸配列が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11のアミノ酸配列に対する同類アミノ酸置換を有するアミノ酸配列をコードする、核酸配列
から成る群から選択された核酸配列を含む、核酸分子の使用。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、1つ又は2つ以上の部位でグリコシル化されている、請求項1に記載の使用。
【請求項４】
前記融合タンパク質が免疫グロブリン(Ig)融合を含む、請求項1に記載の使用。
【請求項５】
前記Ig融合がFc融合である、請求項4に記載の使用。
【請求項６】
前記官能性誘導体が、1つ又は2つ以上の官能基に結合された1つ以上の部分を含み、当該官能基は、該アミノ酸残基上の1つ又は2つ以上の側鎖として発生する、請求項1に記載の使用。
【請求項７】
前記部分がポリエチレン部分である、請求項6に記載の使用。
【請求項８】
前記核酸分子が発現ベクター内に含まれる、請求項2に記載の使用。
【請求項９】
前記ベクターが遺伝子治療ベクターである、請求項8に記載の使用。
【請求項１０】
線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するために、細胞内の請求項1に記載のポリペプチドの内生的生成を誘発及び/又は促進するためのベクターの使用。
【請求項１１】
線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するための、請求項2に記載の核酸分子を含む細胞の使用。
【請求項１２】
線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するための、請求項1に記載のポリペプチドを発現させる細胞の使用。
【請求項１３】
前記薬剤がさらに、同時の使用、順次の使用又は別々の使用のためのオステオプロテゲリンを含む、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項１４】
前記薬剤がさらに、同時の使用、順次の使用又は別々の使用のためのインターフェロンを含む、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項１５】
前記インターフェロンがインターフェロン-βである、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
前記薬剤がさらに、同時の使用、順次の使用又は別々の使用のための腫瘍壊死因子(TNF)アンタゴニストを含む、請求項1又は2に記載の使用。
【請求項１７】
TNFアンタゴニストがTBPI及び/又はTBPIIである、請求項16に記載の使用。
【請求項１８】
前記線維症疾患が、結合組織病、肺線維症又は肝臓線維症である、請求項1〜17までのいずれか1項に記載の使用。
【請求項１９】
前記結合組織病が強皮症である、請求項18に記載の使用。
【請求項２０】
前記薬剤がさらに、同時の使用、順次の使用又は別々の使用のための強皮症治療薬を含む、請求項19に記載の使用。
【請求項２１】
前記強皮症治療薬が、ハロフギノン、ACE阻害薬、カルシウム・チャネル遮断薬、プロトンポンプ阻害薬、NSAID、例えばイブプロフェン、COX阻害薬、コルチコステロイド、例えばプレドニゾン、テトラサイクリン、ペントキシフィリン、ブシラミン、ゲラニルゲラニル・トランスフェラーゼ阻害薬、ロッテルリン、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ阻害薬、c-プロテイナーゼ阻害薬、リシル-オキシダーゼ阻害薬、リラキシン、ハロフギノン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、エンドセリン-1、一酸化窒素、アンギオテンシンII阻害薬、インターロイキン-10、インターロイキン-8、ロイコトリエンB4、ウルソデオキシコール酸、抗酸化剤又はSARP-1から成る群から選択される、請求項20に記載の使用。
【請求項２２】
線維症疾患を治療及び/又は予防する方法であって、治療及び/又は予防を必要とする患者に、請求項1又は2に記載の有効量の物質を、任意には医薬的に許容可能なキャリヤと一緒に投与することを含む、方法。
【請求項２３】
前記線維症疾患が、結合組織病、肺線維症又は肝臓線維症である、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
前記結合組織病が強皮症である、請求項23に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維症疾患及び結合組織病の分野にある。より具体的には、本発明は、線維症疾患、特に強皮症の治療及び/又は予防のためにINSP035を使用することに関する。INSP035と、インターフェロン、TNFアンタゴニスト又は別の線維症治療薬、例えばOPG及びSART-1との組み合わせも本発明に含まれる。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、腎臓、心臓、肺、肝臓、皮膚及び関節を含む内部器官内の細胞外マトリックス成分の沈積によって特徴付けられる状態である。
【０００３】
肺線維症は、主要な線維症疾患の1つである。突発性肺線維症(IPF)は、未知の病因の、進行性線維症を伴う肺胞壁の慢性炎症によって特徴付けられる。IPF又は突発性間質性肺炎は、突発性間質性肺疾患の事例のうちの50〜60 %の原因となる(IPFに関しては、Khalil N及びO'Connor 2004及びSelman他 2004)。
【０００４】
間質性肺炎の特異的な組織病理学的パターンである通常型間質性肺炎(UIP)が、IPFにおける肺生検で見いだされる古典的なパターンである。低倍率で、組織は異成分から成るように見え、正常な肺部位、間質性炎症部位、線維症部位及び蜂の巣状部位が交互に現れる。間質性炎症は、リンパ球、形質細胞、及びII型肺細胞の過形成と関連する組織球の肺胞中隔浸潤物から成る。線維症ゾーンは、主に密な非細胞性コラーゲンから成るが、しかし初期の活性疾患の部位である増殖性線維芽細胞(線維芽細胞性病巣)の散乱病巣を、通常は肺胞位置に見ることもできる。蜂の巣状領域は、しばしば細気管支上皮によって囲まれ粘液を充填された嚢胞性線維性空隙から成る。粘液中には好中球が溜まる場合がある。平滑筋過形成が線維症部位及び蜂の巣状部位にしばしば発生する。胸膜下及び傍隔壁の分布、斑点状特性、及び一時的な異質性が、UIPを同定する際の最も助けとなる特徴である。
【０００５】
間質性炎症及び線維症の同一パターンが、膠原血管障害(例えばRA、SLE、進行性全身性硬化症、混合型結合組織病、糖尿病)、塵肺(例えば石綿症)、放射線傷害、及び或る特定の薬物誘発型肺疾患(例えばニトロフラントインによる)において発生する。
【０００６】
IPFの臨床経過は進行性であり、メディアン生存期間は診断後、4〜6年である。プレドニゾンが、IRFの事例における通常の治療である。治療に対する応答は様々であるが、しかし、より早い時期の疾患の患者は、瘢痕が優勢を占める前の細胞段階において、コルチコステロイド又は細胞毒性治療で改善する可能性が高いように見える。対症的且つ苦痛緩和的な治療は、低酸素血を緩和するための高い濃度のO2を含み、また細菌感染が発生した場合、抗生物質を含む。肺移植が最終段階の肺疾患の患者において功を奏している。
【０００７】
肝臓の線維症は、肝臓における結合組織の堆積に関する。この堆積は、細胞外マトリックスの生成と分解とのアンバランスから生じ、そして既存の線維の崩壊及び圧縮によって強調される(例えば、Afdhal NH及びNunes D. 2004.  Kershenobich及びWeissbrod. 2003.  Pinzani及びRombouts 2004参照)。
【０００８】
肝臓線維症は、肝細胞の壊死又は傷害に対する共通の応答である。肝細胞の壊死又は傷害は、種々様々な因子、例えば肝臓ホメオスタシスを妨害する任意のプロセス(特に炎症、毒性傷害、又は肝臓血流の変化)及び肝臓の感染(ウィルス性、細菌性、真菌性及び寄生虫性)によって誘発され得る。先天性代謝異常から生じる多数の蓄積症、例えば脂質異常(ゴーシェ病)；グリコーゲン蓄積症(特にIII、IV、VI、IX及びX)；α1-抗トリプシン欠乏症；鉄過剰症候群(ヘモクロマトーシス)及び銅蓄積症(ウィルソン病)に見られる外生的物質の蓄積；(チロシン血症、果糖血症、及びガラクトース血症におけるような)毒性代謝物の蓄積；及びペルオキシソーム病(ツェルヴェーガー症候群)が、しばしば線維症と関連する。多数の化学物質及び薬物、特にアルコール、メトトレキサート、イソニアジド、オキシフェニサチン、メチルドーパ、クロルプロマジン、トルブタミド及びアミドダロンが、線維症を引き起こす。肝循環の妨害(例えば慢性心不全、バッド・キアリ症候群、静脈閉塞病、門脈血栓症)及び胆汁流の慢性閉塞が、線維症を引き起こし得る。最後に、先天性肝線維症は、常染色体劣性奇形である。
【０００９】
正常な肝臓は、糖タンパク質(例えばフィグロネクチン、ラミニン)及びいくつかのプロテオグリカン(例えばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸塩)を含む、コラーゲン・タンパク質(大部分がI、III及びIV型)と非コラーゲン・タンパク質とから成る細胞外マトリックス内に分配された肝細胞と洞様毛細血管とから形成されている。通常は門脈路だけに見いだされる線維芽細胞が、コラーゲン、大型糖タンパク質、及びプロテオグリカンを生成することができる。
【００１０】
他の肝臓細胞(具体的には肝細胞及び脂肪摂取クッパー細胞、及び内皮細胞)も細胞外マトリックス成分を生成することができる。ディッセ空間内の洞様毛細血管内皮細胞の下に位置する脂肪摂取細胞は、線維芽細胞の前駆体であり、過剰の細胞外マトリックスを増殖して生成することができる。コラーゲンの活性沈積からの線維形成の発生は、肝臓細胞の傷害、特に壊死、及び炎症細胞と因果関係にある。これらの細胞から放出される正確な因子は未知であるが、しかし1種又は2種以上のサイトカイン又は脂質過酸化反応の生成物が考えられる。クッパー細胞及び活性化されたマクロファージは、炎症性サイトカインを生成する。新しい線維芽細胞が壊死性肝臓細胞の周りに形成され、コラーゲン合成の増大が、瘢痕化を招く。線維症は活性線維形成、及び正常な又は変化したコラーゲンの分解障害に由来することがある。脂肪摂取細胞、クッパー細胞及び内皮細胞は、I型コラーゲン、いくつかのプロテオグリカン、及び変性コラーゲンのクリアランスにおいて重要である。これらの細胞活性を変化させると、線維症の程度を変えることができる。組織病理学者にとっては、既存の線維の受動的な崩壊及び圧縮から、線維組織がより明らかになり得る。
【００１１】
こうして、コラーゲンの合成の増大又は分解の低減の結果、過剰の結合組織の活性沈積が生じ、このような沈積は肝機能に影響を与える：(1)細胞周囲の線維形成が細胞の栄養摂取を損ない、その結果、肝細胞が萎縮する。(2)ディッセ空間内部で、線維組織が洞様毛細血管の周りに蓄積し、血液から肝細胞への物質の自由な通行を遮る。(3)肝臓細静脈及び門脈路の周りの線維形成が、肝臓の血流を妨害する。門脈枝から洞様毛細血管へ、そして最後に肝静脈へ、肝臓を横切る静脈抵抗が増大する。3つ全てのルートが関与し得る。
【００１２】
門脈路を中心静脈と連関する線維帯はまた、吻合チャネルを促進する。すなわち、正常な肝細胞を迂回する動脈血が、遠心性肝静脈に短絡され、このことは肝機能を損ない、そして肝細胞壊死を際立たせ得る。これらのプロセスが存在する程度は、肝機能不全の規模を決定する。例えば、先天性肝線維症の場合、大きな線維帯が主に門脈領域を巻き込むが、しかし通常、肝実質はそのままにしておく。先天性肝線維症は従って、肝細胞機能を保ったまま門脈圧亢進症として現れる。
【００１３】
強皮症は、器官の欠陥及び死をもたらす皮膚及び内部器官の線維形成によって特徴付けられる結合組織の疾患である(Black他、1998; Clements及びFurst, 1996；例えばVarga J. 2004, Chung及びUtz, 2004.  Rhew及びBarr, 2004参照）。強皮症は多種多様の徴候及び種々の治療上の意味を有している。強皮症は、局所性強皮症、全身性硬化症、強皮症様障害、及びシネ強皮症(Smith, 2000)を含む。局所性強皮症は、線維症及び皮膚に限定される徴候と関連する稀な皮膚病であるのに対して、全身性硬化症は、内部器官の関与に対する可変のリスク、及び皮膚病の範囲の変動を伴う多系疾患である。全身性強皮症は広範性又は限局性であり得る。限局性全身性硬化症は、CREST(石灰沈着症、レイノー食道機能不全、手指硬化症、毛細血管拡張症)と呼ばれる。強皮症様障害は、産業環境暴露に関連すると考えられる。シネ疾患の場合、皮膚の変化なしに内部器官の関与がある。
【００１４】
強皮症及び具体的には全身性硬化症の主な徴候は、不適切な過剰コラーゲン合成及び沈積、線維形成による内皮の機能不全、痙攣、崩壊、及び閉塞である。
【００１５】
強皮症は、100万人当たりの安定罹患率がほぼ19事例という稀な疾患である。強皮症の原因は未知である。しかし、遺伝性素因は重要である。異常は自己免疫、及び内皮細胞及び線維芽細胞の機能の変化を伴う。実際に、全身性硬化症はおそらく、自己免疫疾患のうち最も重症の疾患であり、診断から5年以内の死亡率は50%と報告されている(1991年 Silman)。
【００１６】
診断に関しては、重要な臨床パラメーターは、中手指節関節に対して近位側の皮膚肥厚化である。レイノー現象は強皮症の頻繁なほとんど普遍的な要素である。これは低温暴露時の皮膚の色の変化によって診断される。虚血及び皮膚肥厚化がレイノー病の症状である。
【００１７】
根底を成すいくつかの生物学的プロセスが、疾患の開始、重症性及び進行に関与し、そしてこれらのプロセスは、血管機能不全、内皮細胞の活性化及び損傷、白血球蓄積、自己抗体生成、及び重症の場合には、死を招くことのある制御されない線維形成応答を含む(Clements及びFurst, 1996)。線維芽細胞は、この疾患の病原において重要な役割を有する。強皮症患者から得られた主要な線維芽細胞は、in vivoで見られる疾患の特徴的な特性の多く、すなわち細胞外マトリックス、特にコラーゲン及びフィブロネクチンの合成及び沈積の顕著な増大、並びに成長因子及びサイトカイン、例えばTGFβ及びCTGFの成長因子及びサイトカインの生成変化を示す(Strehlow及びKorn, 1998及びLeRoy, 1974)。
【００１８】
強皮症の治癒的な治療はない。革新的ではあるが高リスクの治療が、自己幹細胞移植を提案した(Martini他、1999)。具体的に言えば、線維形成プロセスをターゲットとする、強皮症の治療は目下のところない(Wigley及びBoling, 2000)。
【００１９】
疾患のリスク及び強皮症の進行に関連する遺伝子を同定することにより、疾患の種々の段階における介入のための効果的な方法を開発することができる。
【００２０】
分泌されるタンパク質INSP035は、国際公開第03/054012号パンフレットにおいて、4-α-螺旋束サイトカイン部分集合に分類される。この部分集合は、これらの螺旋がそれぞれ約15又は25残基を含むため、短鎖と長鎖とにさらに分けられる。長鎖4-α-螺旋束サイトカインLIF、IL-6、CNTF、GH、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、及びレプチンに関して結晶構造が決定された。一次構造においては低い相同度しか示さないものの、これらは三次構造及び官能性受容体エピトープにおいて高い相同性を示す。INSP035は、長鎖サイトカイン群の一員として、そしてより具体的には、レプチンとして同定された。INSP035及びその変異形と類似の配列が、文献において開示されている(国際公開第01/75067号パンフレットにおけるSEQ ID NO:31196及びSEQ ID NO:42492；国際公開第02/074961号パンフレットにおけるSEQ ID NO:13；SwissProt Acc. No. Q9BTA0)。しかし、提供された試験データは、今までのところ、線維症疾患におけるこれらの配列の関与を示していない。
【００２１】
線維芽細胞によって分泌された新規の可溶性サイトカインとして、オステオプロテゲリン(OPG)が1997年に最初に同定された(Simonest他,1997)。OPGは、TNF受容体群の一員であり(Morinaga他、1998, Yasuda他、1998)、そのN末端部分には4つの高システインTNFR様ドメインを含む(Simonet他、1997)。OPG遺伝子は、骨の発達において役割を有し、そしてOPG遺伝子を欠くマウスは、骨粗鬆症表現型及び著しい骨格異常を有した(Min他、2000)。
【００２２】
骨芽細胞及び骨髄間質細胞によって生成されるオステオプロテゲリンは、膜貫通型ドメインを欠いており、直接的なシグナル形成能力を有しない分泌型おとり受容体として作用する。OPGは、その天然型リガンドにオステオプロテゲリン・リガンド(OPGL)を結合することにより作用する。OPGLはRANKL(NF-カッパBリガンドの受容体アクチベーター)としても知られている。OPGとOPGLとの結合は、OPGLがその同族受容体RANKを活性化することを防止する。RANKは、破骨細胞の分化、活性化及び生存にとって重要な破骨細胞受容体である。OPGL又はRANKの除去はまた、重度の骨粗鬆症をもたらす。このことは、骨吸収を調節する上でのこれらのタンパク質の重要な生理学的役割を示している。骨芽細胞及び間質細胞からのOPGとOPGLの分泌は、多数のホルモン及びサイトカインによって、しばしば相互に調節される。従って、OPGは、過剰の破骨細胞活性と関連する疾患のための効果的な治療選択肢であり得る(Kostenuik及びShalhoub, 2001)。in vitroにおいて、OPGは、TNF群の別の一員、つまりTNF関連アポトーシス誘発性リガンド/Apo2リガンド(TRAIL/Apo2L)に、TRAIL-受容体(R)2による結合と比較して、高いアフィニティーを持って結合することも示された(Emery J. 他、1998. Walczak H.他、1997)。加えて、多発性骨髄腫に関する研究において、Shipman及びCroucherは、TRAIL/Apo2Lが骨髄腫細胞内でアポトーシスを誘発し、そしてこのことは、組換えOPG(rOPG)を加えることによって防止することができることを示した(Shipman CM及びCroucher, 2003)。デスドメインとTRAIL-R1とTRAIL-R2とを含有する2つのTRAIL受容体を架橋することによって、TRAILはアポトーシスを誘発する。TRAIL-R3及びTRAIL-R4は、アポトーシス・シグナルを伝達しない受容体である。
【００２３】
国際公開第03/084560号パンフレットにおいて、オステオプロテゲリンを投与する結果、確立された肺線維症動物モデルの疾患が著しく改善された。肺線維症は、強皮症の徴候の1つである。従って、線維症疾患、具体的には強皮症の治療及び/又は予防のための薬剤を調製するために、オステオプロテゲリンを使用することが示唆された。加えて、正常な膵臓及び慢性膵炎におけるTRAIL及びその受容体の発現を決定する際に、Hasel他は、TRAIL受容体発現の変化が炎症性浸潤及び活性線維症の部位内で最も顕著であること、及び線維芽様細胞(FLC)が活性線維症部位においてTRAILを発現させることを示した(Hasel C他、2003)。Taimer他は、TRAIL-R2が肝細胞によって発現されないことに基づいて、TRAIL-R2アンタゴニストが星細胞アポトーシスを誘発することにより線維形成を低減するのに有用であり得ることを提案した(Taimr P.他、2003)。このことは、アポトーシスが肝線維症の消散期中に活性化星細胞の数を低減するための重要なメカニズムであるという観察に基づいている。さらに、Yurovskyは、アルファ2(I)コラーゲンmRNAレベル、及び正常なヒト肺線維芽細胞による総可溶性コラーゲン分泌が、低濃度のTRAIL刺激時には増大させられるのに対して、高濃度のTRAILはこれらの細胞のアポトーシス死を誘発することが見いだされた。彼はまた、自己分泌状に作用するTGFβ生成をトリガーすることにより、TRAILが細胞外マトリックス合成を高めることを示唆した(Yurovsky VV., 2003)。
【発明の開示】
【００２４】
発明の概要
本発明は、INSP035が、対照としてオステオプロテゲリン(OPG)を有する線維芽細胞中の抗アポトーシス分子を選択するように構成されたin vitroアッセイにおいて、TRAILの潜在的インヒビターであるという発見に基づいている。従って、OPGと同様に、INSP035は、線維芽細胞に対する可溶性ヒト組換えTRAILのアポトーシス効果に抗することができ、これにより、線維芽細胞のアポトーシスを一貫して低減する。
【００２５】
従って本発明の第1の目的は、線維症疾患、具体的には強皮症の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するために、INSP035を使用することである。本発明の第2の目的は、線維症疾患、具体的には全身性硬化症の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するために、ISNP035を発現させる細胞、又はISNP035のコード配列を含む発現ベクターを使用することである。INSP035と更なる線維症治療薬、例えばハロフジノン、OPG又はSARP-1とを含む製薬組成物、及びヒトの体内にISNP035を投与することを含む治療方法も本発明の範囲に含まれる。
【００２６】
発明の詳細
本発明は、INSP035が、対照としてオステオプロテゲリン(OPG)を有する線維芽細胞中の抗アポトーシス分子を選択するように構成されたin vitroアッセイにおいて、TRAILの潜在的インヒビターであるという発見に基づいている。従って、OPGと同様に、INSP035は、線維芽細胞に対する可溶性ヒト組換えTRAILのアポトーシス効果に抗することができ、これにより、線維芽細胞のアポトーシスを一貫して低減する(図1参照)。同じアッセイにおいて、レプチン・タンパク質は、TRAIL媒介型アポトーシスに影響を及ぼさず、効果を全く示さなかった(図2参照)。
【００２７】
国際公開第03/084560号パンフレットに示されたように、オステオプロテゲリンを投与する結果、確立された肺線維症動物モデルの線維症が著しく改善される(「発明の背景」の項におけるHasel他及びTaim他も参照)。OPG及びISNP035が共通の機能を共有することに基づいて、そして、TRAILがコラーゲン生成を刺激する(Yurovsky VV. 2003)という発見に基づいて、ISNP035は、線維症の治療に有用であることが示唆される。理論に縛られたくはないが、ISNP035がTRAILインヒビターとして、細胞中に存在するTGFβの量を少なくし、このことが線維症の病原において有害であることが知られているコラーゲン合成を低減するという我々の研究結果に基づいて、ISNP035の作用メカニズムに関する仮説が立てられる。
【００２８】
従って本発明は、線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するためのポリペプチドの使用であって、当該ポリペプチドが、
a)  SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、又はSEQ ID NO:10のうちのいずれかに示されたポリペプチド；
b)  SEQ ID NO:2(SEQ ID NO:3)、SEQ ID NO:5(SEQ ID NO:6)、SEQ ID NO:7(SEQ ID NO:8)、又はSEQ ID NO:10(SEQ ID NO:11)で挙げられた配列を有するポリペプチドのヒスチジン標識形態；
c)  SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11のうちのいずれかを含むポリペプチド；
d)  アミノ酸配列が、(a)〜(c)の配列のうちの1つ以上に対して40%又は50%又は60%又は70%又は80%又は90%以上の同一性を有する、(a)〜(c)のうちのいずれかの突然変異タンパク質；
e)アミノ酸配列のいずれの変化も、(a)〜(c)のアミノ酸配列に対する同類アミノ酸置換である、(a)〜(c)のうちのいずれかの突然変異タンパク質；
f)(a)〜(e)のうちのいずれかの塩又はイソ型、融合タンパク質、官能性誘導体、活性画分又は円順列変異誘導体
から成る群から選択される、ポリペプチドの使用に関する。
【００２９】
本発明はさらに、線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するための核酸分子の使用であって、当該核酸分子が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11のうちのいずれかに示されたポリペプチドをコードする核酸配列を含み、そして
a)  SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4、又はSEQ ID NO:9のうちのいずれかに示された核酸配列；
b)  中ストリンジェント条件下又は高ストリンジェント条件下で(a)の核酸配列の相補体とハイブリダイズする核酸配列；
c)  (a)又は(b)のうちのいずれかの核酸配列であって、前記核酸配列が、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11のアミノ酸配列に対する同類アミノ酸置換を有するアミノ酸配列をコードする、核酸配列
から成る群から選択された核酸配列を含む、核酸分子の使用に関する。
当業者には明らかなように、本発明により、内生的ISNP035の放出を刺激し、又は内生的ISNP035の活性を増強する物質を、線維症疾患、具体的には強皮症の治療及び/又は予防のために等しく使用することができる。前記物質はISNP035自体であってよく、又はTRAILを阻害することができるISNP035の任意の断片であってもよい。
【００３０】
ヒトINSP035の完全長cDNA(ISNP035長形)がクローニングされており、そして添付の配列表のSEQ ID NO:1として示される。対応するアミノ酸配列は、添付の配列表のSEQ ID NO:2として示される。ISNP035長形の第2のメチオニンで始まるヒトISNP035のcDNAがクローニングされており(ISNP035中形)、そして添付の配列表のSEQ ID NO:4として示される。対応するアミノ酸配列は、添付の配列表のSEQ ID NO:5として示される。位置1にイソロイシン置換(Met→Ile)を有する修飾型ISNP035中形が、SEQ ID NO:7で示されるアミノ酸配列を有するように発生させられている。ISNP035長形の第3のメチオニンで始まるヒトISNP035のcDNAがクローニングされており(ISNP035短形)、そして添付の配列表のSEQ ID NO:9として示されている。対応するアミノ酸配列は、添付の配列表のSEQ ID NO:10として示されている。
【００３１】
本明細書中に使用される「治療及び/又は予防」という用語は、疾患の形成、発達、進行、或いは疾患の症状のいずれか1つ又はいくつか又は全ての形成、発達又は進行の任意の減衰、低減、又は部分的、実質的又は完全な予防又は遮断を含む。
【００３２】
本明細書中に使用される「線維症疾患」という用語は、例えば組織の慢性炎症又は修復及び再編成による線維形成に関与する疾患に関する。線維症はヒトの身体の任意の器官、例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓又は腎臓に関与し得る。従って本発明はまた、線維症疾患、例えば肝線維症、肝硬変、肺線維症、間質性肺線維症、デュピュイトラン拘縮、ケロイド及びその他の瘢痕化/創傷治癒異常、術後癒着及び反応性線維症、並びに特に心筋梗塞後の慢性心不全の治療及び/又は予防に関する。ISNP035で治療可能な別の疾患又は障害は、創傷治癒疾患、具体的には、肺の慢性炎症及び最終的には肺表面の線維形成又は瘢痕化を含む、肺内の創傷治癒を含む。肺の炎症に関与する障害は例えば、突発性肺線維症、サルコイドーシス、気管支肺異形成症、線維増殖性ARDS、並びに、肺症状又は全身性疾患、例えば関節リウマチを含む(Krein他、2001)。
【００３３】
線維症は一般に、結合組織の発生又は増殖に関与する。結合組織は所与の器官の官能性特定組織に置き換わる。本発明の好ましい実施態様の場合、線維症疾患は結合組織病である。
【００３４】
好ましい実施態様の場合、結合組織病は強皮症である。
【００３５】
本明細書中に使用される「強皮症」という用語は、全身性硬化症又は全身性強皮症とも呼ばれる疾患に関する。これらの用語は本出願において同義に使用される。全身性硬化症は、原因が未知の慢性疾患であり、皮膚、関節構造、及び内部器官(例えば特に食道、胃腸管、肺、心臓及び腎臓)におけるびまん性線維症；変性変化；及び血管異常によって特徴付けられる。全身性硬化症は局所性、混合型、全身性、限局性又は広範性であってよい。
【００３６】
「強皮症」という用語は好ましくは、局所性、全身性、限局性又は広範性強皮症、並びにオーバーラップ症候群に関する。
【００３７】
局所性強皮症は主に皮膚に影響を及ぼすが、しかしその下側にある筋肉及び骨に影響を与えることもある。しかし局所性強皮症は一般に、内部器官には影響を及ぼさない。局所性強皮症は比較的軽度であり、また、同様の表在的な症状、例えば顕微鏡下の皮膚生検の外見に関して、全身性強皮症に関連し得る。
【００３８】
全身性強皮症は、CREST、限局性及び広範性のようないくつかの症状タイプ又は症状群を含む。これは進行性全身性硬化症、又は家族性進行性全身性硬化症とも呼ばれることがある。全身性強皮症は、例えば皮膚、血管及び/又は内部器官に影響を及ぼすことがある。全身性強皮症は、皮膚に影響を及ぼす場合、最も一般的には手及び/又は顔の皮膚を硬化させ得る。血管に影響を及ぼす場合には、これはレイノー病を引き起こし得る。全身性硬化症の最も重症の形態は、内部器官に影響を与え、身体障害又は死を招くこともある。中でも全身性硬化症は：強皮症肺疾患、強皮症腎クリーゼ、心臓症状、疲労又は限局性CRESTを含む筋肉衰弱、胃腸運動障害及び痙攣、及び中枢、末梢及び自律神経系における異常を含む。神経系異常に関しては、手根管症候群、及びこれに続く三叉神経痛が最も一般的である。
【００３９】
限局性強皮症は、例えば手に限定されることがあるが、顔及び首が関与する場合もある。
【００４０】
広範性強皮症は、皮膚のこわばりを含み、また、手首(又は肘)よりも上に発生する。広範性強皮症にはいくつかの下位カテゴリー、例えば内部器官線維症があるがしかし皮膚のこわばりがない「強皮症なしの強皮症(scleroderma sine scleroderma)」；及び家族内で発生する稀な形態である家族性進行性全身性硬化症、がある。
【００４１】
オーバーラップ症候群とは、強皮症患者がさらに、例えば狼瘡とオーバーラップする広範性強皮症の場合のように他の自己免疫疾患(例えば狼瘡、リウマチ関節炎など)を有する場合を意味する。強皮症症候群は、混合型結合組織病(MCTD)、又は未分化型結合組織病(UCTD)の一部でもあり得る。
【００４２】
本明細書中に使用された「ISNP035」という用語は、添付の配列表のSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11(全てヒト)の配列の全て又は一部を含むタンパク質、並びに、これらの塩又はイソ型、突然変異タンパク質、活性画分、官能性誘導体及び円順列変異誘導体に関する。タンパク質がその生体活性を示すのを可能にするのに十分な同一性がタンパク質間にあり、そしてヒトにおいて実質的な免疫応答を誘発しない限り、ヒト以外の種、例えばマウス又はラットに由来するISNP035を、本発明に従って使用することができる。
【００４３】
本明細書中に使用された「ISNP035」という用語はさらに、強皮症又は他の線維症疾患において所望の活性を示すSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、又はSEQ ID NO:11の任意の断片、部分、ドメイン又はサブドメインに関する。タンパク質断片、種々異なる状態でグリコシル化又はシアリル化された形態、又はタンパク質の1つ又は2つ以上のドメインを、これらが線維症疾患に対して有益な効果、好ましくは完全長タンパク質と少なくとも匹敵する効果を示す限り、本発明に従って使用することができる。有益な効果は、下記実施例に記載されたin vitro又はin vivo試験のうちの1つにおいて、又は線維症疾患、具体的には強皮症における効果を実証するのに十分な他のアッセイにおいて測定することができる。
【００４４】
本発明によれば、ISNP035は天然発生型、すなわち天然型タンパク質であるか又は組換え型タンパク質であってよい。組換え体は、真核細胞、例えば酵母細胞又は哺乳動物細胞、好ましくはCHO細胞、HEK細胞(ヒト酵母腎細胞)又はヒト線維芽細胞又は細胞系において生成することができる。組換え体はさらに原核細胞、例えば大腸菌（E.coli)内で生成することもできる。
【００４５】
好ましくはISNP035は、1つ又は2つ以上の部位においてグリコシル化される。ISNP035は、所与のニーズ及びタンパク質の生成源又は分離源に応じて、非グリコシル化型であってもよい。
【００４６】
本明細書中の「塩」という用語は、ISNP035分子又はこれらの類似体の、カルボキシル基の塩、及びアミノ基の酸付加塩に関する。カルボキシル基の塩は、当業者に知られた手段によって形成することができ、そして、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第二鉄又は亜鉛塩など、及び、例えばアミン、例えばトリエタノールアミン、アルギニン又はリシン、ピペリジン、及びプロカインなどで形成されたもののような、有機塩基を有する塩を含む。酸付加塩は例えば、鉱物酸、例えば塩酸又は硫酸を有する塩、及び有機酸、例えば酢酸又はシュウ酸を有する塩を含む。もちろん、このような塩はいずれも、本発明に該当するISNP035の生体活性を維持しなくてはならず、すなわち線維症疾患、具体的には強皮症に対して有益な効果を発揮しなければならない。
【００４７】
ISNP035のイソ型又はスプライス変異体を、これらが疾患の進行及び/又はその疾患の症状を阻害することができる限り、本発明に従って使用することもできる。
【００４８】
本明細書中に使用される「突然変異タンパク質」という用語は、ISNP035の類似体であって、天然型ISNP035のアミノ酸残基のうちの1つ又は2つ以上が、異なるアミノ酸残基によって置換されているか又は欠失されているか、或いは、ISNP035の天然型配列に1つ又は2つ以上のアミノ酸残基が付加されており、好ましくは野生型ISNP035と少なくとも同じ活性を有するか又はより強力な活性を有するものを意味する。ISNP035の生体活性は例えば、TRAILを阻害する能力に関してISNP035をアッセイすることによって測定することができる。タンパク質間の相互作用を評価するアッセイが当業者によく知られている。このようなアッセイの例は、ELISAタイプの結合アッセイ、免疫沈降アッセイ、又はその他の好適なシステム、例えばBIAcoreシステムにおける測定である。これらの突然変異タンパク質は、周知の合成によって、且つ/又は、特定部位の突然変異誘発技術、又はこれに適した任意のその他の技術によって調製される。
【００４９】
いずれのこのような突然変異タンパク質も好ましくは、ほぼ同様のISNP035活性を少なくとも有するのに十分にISNP035を複製したアミノ酸配列を有する。ISNP035突然変異体の活性はさらに、下記実施例(実施例2)又は国際公開第03/084560号パンフレットに記載された実施例で説明されたアッセイで試験することができる。ISNP035で処理された線維芽細胞内のコラーゲン合成量を測定することが、例えば、ISNP035突然変異タンパク質の活性を評価するのに適した試験であり得る。
【００５０】
本発明による突然変異タンパク質は、ストリンジェント条件下で本発明に従って、ISNP035をコードするDNA又はRNAとハイブリダイズする核酸、例えばDNA又はRNAによってコードされたタンパク質を含む。「ストリンジェント条件」という用語は、ハイブリダイズ条件及びこれに続く洗浄条件を意味し、これらの条件を当業者は従来より「ストリンジェント」と呼ぶ。Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology(上述),
Interscience, N.Y., §§6.3及び6.4(1987, 1992)、及びSambrook他(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F.,及びManiatis, T.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)を参照されたい。
【００５１】
制限はないが、ストリンジェント条件の例は、例えば5分間にわたって2 x SSC及び0.5% SDS中で、15分間にわたって2 x SSC及び0.1% SDS中で、30-60分間にわたって37℃で0.1 x SSC及び0.5% SDS中で、次いで30-60分間にわたって68℃で0.1 x SSC及び0.5% SDS中で、研究中のハイブリッドの計算上のTmを12-20℃下回る温度で洗浄する洗浄条件を含む。当業者には明らかなように、ストリンジェント条件がDNA配列、オリゴヌクレオチド・プローブ(10-40塩基)又は混合型オリゴヌクレオチド・プローブの長さにも依存する。混合型プローブが使用される場合、SSCの代わりに塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)を使用することが好ましい。上述のAusubelを参照されたい。
【００５２】
いずれのこのような突然変異タンパク質も好ましくは、ISNP035とほぼ同様の活性、又はより良好な生体活性を有するのに十分にISNP035のアミノ酸配列を複製したアミノ酸配列を有する。
【００５３】
ISNP035の容易に測定可能な1つの活性は、コラーゲン合成を低減するその能力である。突然変異タンパク質が実質的なコラーゲン低減活性を有する限り、ISNP035とほぼ同様の活性を有すると考えることができる。こうして、所与の突然変異タンパク質がISNP035と同じ活性を少なくとも実質的に有するかどうかを、このような突然変異タンパク質を晒すことを含む日常的な試験によって見極めることができる。
【００５４】
好ましい実施態様の場合、いずれのこのような突然変異タンパク質も、ISNP035の配列と40%以上の同一性又は相同性を有する。より好ましくは、突然変異タンパク質はISNP035の配列と、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、又はより好ましくは90%以上の同一性又は相同性を有する。
【００５５】
同一性は2つ又は3つ以上のポリペプチド配列間又は2つ又は3つ以上のポリヌクレオチド配列間の、これらの配列を比較することにより見極められた関係を反映する。一般に、同一性は、比較される配列の全長にわたる、2つのポリヌクレオチド配列又は2つのポリペプチド配列のそれぞれの正確なヌクレオチド間又はアミノ酸間の一致を意味する。
【００５６】
正確な一致がない配列の場合、「同一性%」を見極めることができる。一般に、比較されるべき2つの配列をアラインメントすることにより、配列間の最大相関を提供する。このことは、アラインメント度を高めるために、一方又は両方の配列内に「ギャップ」を挿入することを含む。比較される配列のそれぞれの全長にわたって(いわゆる広範囲アラインメント、同じ又は極めて類似した長さの配列に特に好ましい)、或いはより短く画定された長さにわたって(いわゆる局所アラインメント、等しくない長さの配列により適している)、同一性%を見極めることができる。
【００５７】
2つ又は3つ以上の配列の同一性及び相同性を比較する方法が当業者によく知られている。こうして例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J他、1984)において入手可能なプログラム、例えばプログラムBESTFIT及びGAPを使用することにより、2つのポリヌクレオチド間の同一性%、及び2つのポリペプチド配列間の同一性%及び相同性%を見極めることができる。BESTFITは、Smith及びWaterman (1981)の「局所的相同性」アルゴリズムを使用し、そして2つの配列間の最良の類似性単一領域を見いだす。配列間の同一性及び/又は類似性を見いだすための他のプログラム、例えばBLASTプログラム群(www.ncbi.nlm.nih.govのNCBIのホームページを介してアクセス可能なAltschul S F他、1990, Altschul S F他、1997)及びFASTA(Pearson W R, 1990; Pearson 1988)も当業者に知られている。
【００５８】
本発明により使用することができるISNP035の突然変異タンパク質、又はこれらのタンパク質をコードする核酸は、本明細書中に提供された教示内容及び指針に基づいて、必要以上の試験を行うことなしに当業者によって日常的に得ることができる置換ペプチド又はポリヌクレオチドと実質的に対応する配列の有限集合を含む。
【００５９】
本発明による突然変異タンパク質の好ましい変化は、「同類」置換として知られるものである。ISNP035ポリペプチド又はタンパク質の同類アミノ酸置換は、群の員の間の置換が分子の生物学的機能を保存するという十分に類似の物理化学的特性を有する、群内の同義アミノ酸を含むことができる(Grantham, 1974)。特にアミノ酸の挿入又は欠失が少数のアミノ酸、例えば30個未満、好ましくは10個未満のアミノ酸に関与するにすぎない場合、そして機能的なコンフォメーションにとって重大なアミノ酸、例えばシステイン残基を除去又は置換しない場合には、アミノ酸の挿入及び欠失を上記配列内で、これらの機能を変化させることなしに行うことができることは明らかである。このような欠失及び/又は挿入によって生成されたタンパク質及び突然変異タンパク質は、本発明の範囲内に含まれる。
【００６０】
好ましくは、同義アミノ酸基は、表Iに定義された基である。より好ましくは、同義アミノ酸基は、表IIに定義された基であり、そして最も好ましくは、同義アミノ酸基は、表IIIに定義された基である。
【００６１】
表I
好ましい同義アミノ酸基
アミノ酸                     同義基
Ser                  Ser, Thr, Gly, Asn
Arg                  Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu                  Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro                  Gly, Ala, Thr, Pro
Thr                  Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala                  Gly, Thr, Pro, Ala
Val                  Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly                  Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile                  Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe                  Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr                  Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys                  Ser, Thr, Cys
His                  Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln                  Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn                  Gln, Asp, Ser, Asn
Lys                  Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp                  Glu, Asn, Asp
Glu                  Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met                  Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp                  Trp
【００６２】
表II
より好ましい同義アミノ酸基
アミノ酸                     同義基
Ser                  Ser
Arg                  His, Lys, Arg
Leu                  Leu, Ile, Phe, Met
Pro                  Ala, Pro
Thr                  Thr
Ala                  Pro, Ala
Val                  Val, Met, Ile
Gly                  Gly
Ile                  Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe                  Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr                  Phe, Tyr
Cys                  Cys, Ser
His                  His, Gln, Arg
Gln                  Glu, Gln, His
Asn                  Asp, Asn
Lys                  Lys, Arg
Asp                  Asp, Asn
Glu                  Glu, Gln
Met                  Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp                  Trp
【００６３】
表III
最も好ましい同義アミノ酸基
アミノ酸                     同義基
Ser                  Ser
Arg                  Arg
Leu                  Leu, Ile, Met
Pro                  Pro
Thr                  Thr
Ala                  Ala
Val                  Val
Gly                  Gly
Ile                  Ile, Met, Leu
Phe                  Phe
Tyr                  Tyr
Cys                  Cys, Ser
His                  His
Gln                  Gln
Asn                  Asn
Lys                  Lys
Asp                  Asp
Glu                  Glu
Met                  Met, Ile, Leu
Trp                  Met
【００６４】
本発明において使用するための、ISNP035ポリペプチド又はタンパク質の突然変異タンパク質を得るのに使用することができるタンパク質中のアミノ酸置換を生成する例は、Mark他の米国特許第4,959,314号、同第4,588,585号、及び同第4,737,462号の各明細書；Koth他の米国特許第5,116,943号明細書、Namen他の米国特許第4,965,195号明細書；Chong他の米国特許第4,879,111号明細書；及びLee他の米国特許第5,017,691号明細書に示されているような、任意の周知の方法工程；及び米国特許第4,904,584号明細書(Shaw他)に示されたリシン置換型タンパク質を含む。
【００６５】
「融合タンパク質」という用語は、別のタンパク質と融合されたISNP035、又はその突然変異タンパク質を含むポリペプチドを意味する。この別のタンパク質は、例えば体液中の滞留時間が長い。例えばヒトの体内の半減期のような分子の生体活性を改善することができるタンパク質の全て又は官能性部分に融合されたISNP035の全て又は官能性部分を含む融合タンパク質が、本発明において好ましい。好ましい実施態様の場合、融合タンパク質は、免疫グロブリン(Ig)融合を含む。免疫グロブリンの全て又は一部に融合されたISNP035の全て又は一部を含む融合タンパク質が、極めて好ましい。融合タンパク質は、単量体又は多量体、ヘテロ又はホモ多量体であってよい。有利には、融合タンパク質は免疫グロブリンの定常領域、具体的には免疫グロブリンのFc部分を含む。免疫グロブリンがIgG1又はIgG2イソ型である実施態様が、本発明に基づいてさらに好ましい。好ましくは、融合はFc融合である。
【００６６】
ISNP035はこうして、別のタンパク質、ポリペプチドなど、例えば免疫グロブリン又はその断片に融合することができる。融合は直接的であるか、又は1〜3アミノ酸残基長又はそれ以上という短さであってよい短リンカー・ペプチド、例えば13アミノ酸残基長を介して形成することができる。前記リンカーは、例えば配列E-F-M(Glu-Phe-Met)のトリペプチド、又はISNP035配列と免疫グロブリン配列との間に導入されたGlu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Metを含む13アミノ酸リンカー配列であってよい。
【００６７】
本明細書中に使用された「官能性誘導体」は、ISNP035の誘導体、及びこれらの突然変異タンパク質及び融合タンパク質に範囲が及ぶ。これらは当業者に知られた手段によって、残基又はN-又はC-末端基上の側鎖として発生する官能基から調製することができ、そしてこれらが医薬的に許容可能なままである限り、すなわち、ISNP035の活性と少なくともほぼ同様のタンパク質の活性を破壊することがなく、そしてこの活性を含有する組成物に毒性を与えることがない限り、本発明に含まれる。従って、好ましい実施態様の場合、官能性誘導体は、アミノ酸残基上の1つ又は2つ以上の側鎖として発生する1つ又は2つ以上の官能基に結合された1つ以上の部分を含む。
【００６８】
本発明によれば、ポリエチレングリコール(PEG)側鎖が極めて好ましい部分である。PEG側鎖は抗原部位をマスキングし、そして、体液中でPEG側鎖が結合された物質の残留時間を延長することができる。その他の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第一又は第二アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分(例えばアルカノイル又は炭素環式アロイル基)とともに形成されたアミノ酸残基の遊離アミノ基のN-アシル誘導体、又はアシル部分とともに形成された遊離ヒドロキシル基(例えばセリル又はトレオニル残基の)のO-アシル誘導体を含む。
【００６９】
ISNP035及びその突然変異タンパク質及び融合タンパク質の「活性画分」は、タンパク質分子のポリペプチド鎖の断片又は前駆体の単独の状態、又は関連分子又は残基、例えば糖又はリン酸塩残基との連関状態、或いは、タンパク質部分又は糖残基単独の凝集体に範囲が及び、ただし前記活性画分がISNP035と少なくともほぼ同様の活性を有するものとする。
【００７０】
本発明によれば、ISNP035は、前記核酸分子を含むベクターの形態でヒトの身体に投与することもできる。従って、本発明はさらに、強皮症又は別の線維症障害の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するために、前記核酸分子を含むベクターを使用することに関する。好ましくは、ベクターは、ISNP035のコード配列の全て又は部分に作用連関されたプロモーターを含む、発現ベクターである。別の好ましい実施態様の場合、ベクターは遺伝子治療ベクターである。遺伝子治療ベクターは、ウィルス由来のベクター、例えばアデノウィルス又はレンチウィルス・ベクターである。
【００７１】
本発明によれば、ISNP035は、ISNP035を生成及び/又は分泌する細胞の形態で、ヒトの身体に投与することもできる。従って、本発明はさらに、強皮症又は任意の他の線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するためのISNP035発現細胞の使用に関し、すなわち、強皮症又は他の線維症疾患を治療及び/又は予防するための細胞療法に関する。細胞は、ISNP035を自然な状態で生成する細胞且つ/又は、組換えISNP035を生成するトランスフェクト型細胞であってよい。好ましいのは、多量のタンパク質を発現させ分泌する細胞、例えば、ISNP035をコードする核酸分子を含む発現ベクターの多数のコピーを担持する過剰発現細胞である。
【００７２】
線維芽細胞は、線維症のメカニズムを表すので、線維症治療及び強皮症治療にとって最も適した細胞である。従って好ましくはISNP035発現線維芽細胞が本発明に従って使用される。
【００７３】
本発明はさらに、線維症疾患の治療用及び/又は予防用の薬剤を製造するためのISNP035の全て又は一部をコードする核酸分子を含むベクターを含む細胞に関する。本発明によるポリペプチドを生成するために遺伝子修飾された細胞も、本発明の範囲に含まれる。
【００７４】
通常はサイレントであるか又は十分でない量のインヒビターを発現させる細胞中におけるISNP035の内生的生成を誘発及び/又は促進するために発現ベクターを使用することも本発明に基づいて考えられる。このように本発明は、所望のタンパク質を生成するための内生的遺伝子活性化(EGA)として知られる技術を利用する。
【００７５】
ISNP035は内生的OPG発現を誘発しないことも判った。このことはISNP035がOPGを介して作用しているのではないことを示す(図3)。このことは、ISNP035とOPGとの組み合わせを用いると、これが線維症の治療において相加的又は相乗的に作用し得ることを示唆する。同様にいくつかの他の治療をISNP035と組み合わせることにより、本発明に基づく相加的又は相乗的効果を得ることができる。従って好ましくは、本発明の薬剤はさらに：
・  オステオプロテゲリン(OPG)；
・  インターフェロン、具体的にはインターフェロン-β；
・  腫瘍壊死因子(TNF)アンタゴニスト、具体的には可溶性TNFR、例えば可溶性pp55(TBPI)及び/又は可溶性p75(TBPII)；
・  更なる強皮症治療薬；
・  強皮症治療薬であって、ハロフギノン、ACE阻害薬、カルシウム・チャネル遮断薬、プロトンポンプ阻害薬、NSAID、例えばイブプロフェン、COX阻害薬、コルチコステロイド、例えばプレドニゾン、テトラサイクリン、ペントキシフィリン、ブシラミン、ゲラニルゲラニル・トランスフェラーゼ阻害薬、ロッテルリン、プロリル-4-ヒドロキシラーゼ阻害薬、c-プロテイナーゼ阻害薬、リシル-オキシダーゼ阻害薬、リラキシン、ハロフギノン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、エンドセリン-1、一酸化窒素、アンギオテンシンII阻害薬、インターロイキン-10、インターロイキン-8、ロイコトリエンB4、ウルソデオキシコール酸、抗酸化剤又はSARP-1から成る群から選択される、強皮症治療薬
を含む。
【００７６】
SARP-1は、線維症疾患、例えば強皮症における有益な効果を有するように示されたタンパク質である(国際公開第02/46225号パンフレット)。国際公開第02/46225号パンフレットに記載されたSARP-1の断片、イソ型、活性画分、融合タンパク質又は官能性誘導体を、本発明に従ってINSP035との組み合わせで使用することもできる。
【００７７】
全ての治療薬は同時、順次又は別個の使用を目的とする。
【００７８】
ISNP035と一緒に上記物質のうちの1種又は2種以上を含む製薬組成物が、本発明の範囲に含まれる。
【００７９】
目下のところ強皮症の治癒手段はないが、現在いくつかの薬剤又は治療を用いて、強皮症症状が治療される。本発明による組み合わせ療法として用いることができるこのような強皮症治療薬は、例えばLeighton (2001)又はWigley及びSule(2001)に要約されており、これら全体を参考のため本明細書中に引用する。
【００８０】
インターフェロンは主として、ウィルス複製及び細胞増殖に対する阻害効果が知られている。例えばインターフェロン-γは、免疫及び炎症応答を促進する上で重要な役割を果たす。インターフェロン-β(IFN-β、I型インターフェロン)は、抗炎症作用の役割を演じると言われている。
【００８１】
本発明のさらに別の実施態様の場合、ISNP035はTNFアンタゴニストとの組み合わせで使用される。TNFアンタゴニストはこれらの活性をいくつかのやり方で発揮する。第1に、アンタゴニストは、十分なアフィニティ及び特異性を持ってTNF分子自体に結合するか又はこれを封鎖することにより、TNF受容体結合に関与するTNFエピトープを部分的又は実質的に中和することができる(以降「封鎖アンタゴニストと呼ぶ)。封鎖アンタゴニストは例えば、TNFに対する抗体であってよい。
【００８２】
或いは、TNFアンタゴニストは、TNF結合後の細胞表面受容体によって活性化されたTNFシグナル伝達経路を阻害することもできる(以降シグナル伝達アンタゴニストと呼ぶ)。TNFアンタゴニストは、TNFが増殖及び免疫グロブリン分泌を引き起こすin vitroの感受性細胞系、例えばヒトB細胞上の天然型TNFの活性に対するTNFアンタゴニストの効果に関して候補に日常的なスクリーニングを施すことによって容易に同定して評価する。アッセイは、候補アンタゴニストを種々に希釈した、例えばアッセイにおいて使用されるTNFのモル量の0.1〜100倍に希釈したTNF配合物、及びTNFを含まないか又はアンタゴニストしか含まない対照を含有する(Tucci他、1992)。
【００８３】
封鎖アンタゴニストが、本発明に従って使用されるのに好ましいTNFアンタゴニストである。封鎖アンタゴニストの中でも、高いアフィニティを持ってTNFと結合し、そして免疫原性が低いポリペプチドが好ましい。可溶性TNF受容体分子、及びTNFに対する中和抗体が特に好ましい。例えば、TNF-RI(p55)及びTNF-RII(p75)の可溶性形態が本発明において有用である。受容体の細胞外ドメイン又は受容体の官能性部分を含む、これらの受容体の切断型形態が、本発明に基づいて、より具体的に好ましいアンタゴニストである。切断型可溶性TNFのI型及びII型受容体が例えば欧州特許第914431号明細書に記載されている。
【００８４】
TNF受容体の切断形態は可溶性であり、そして約30 kDa又は40 kDaのTNF阻害結合タンパク質として尿及び血清中に検出されている。これらのタンパク質はそれぞれTBPI及びTBPIIと呼ばれる(Engelmann他、1990)。TNFアンタゴニスト及び/又はインターフェロンと同時に、又は相前後して、又は別個にISNP035を使用することが本発明において好ましい。
【００８５】
本発明によれば、TBPI及びTBPIIは、ISNP035との組み合わせで使用されるべき好ましいTNFアンタゴニストである。受容体分子の誘導体、断片、領域及び生体活性部分は、本発明に使用することもできる受容体分子と機能上似ている。受容体分子のこのような生体活性の等価物又は誘導体は、受容体分子をコードするポリペプチド又は配列の部分であって、十分なサイズを有し、そして、膜結合型TNF受容体との相互作用が阻害又はブロックされるようなアフィニティを持ってTNFに結合できるものを意味する。
【００８６】
別の好ましい実施態様の場合、ヒトの可溶性TNF-RI(TBPI)が、本発明に従って使用されるべきTNFアンタゴニストである。天然型及び組換え型の可溶性TNF受容体分子、及びこれらの生成方法は、欧州特許第308 378号、同第398,327号及び同第433,900号明細書に記載されている。
【００８７】
疾患の初期段階にTNF-αをブロックすることが有益な場合がある一方、より後の段階において、TNF自体が強皮症に対して有益な効果を発揮し得ることが論じられている(Abraham他、2000)。従って本発明はさらに、特に疾患の進行段階における、強皮症の治療又は予防のためのISNP035及びTNFの組み合わせに関する。本発明に基づいて、TNF-α又はTNF-βを使用することができる。
【００８８】
本発明はさらに、線維症疾患、具体的には強皮症の治療及び/又は予防のための、任意には1種又は2種以上の医薬的に許容可能キャリヤ、希釈剤又は賦形剤と一緒にISNP035を含む製薬組成物に関する。製薬組成物はさらに、上に同定された別の成分、及び具体的にはインターフェロン、TBP又はCOXインヒビターのうちのいずれかを含んでよい。
【００８９】
本発明による製薬組成物は、本発明による核酸分子を含むベクター、又はISNP035を発現させる細胞を含んでもよい。
【００９０】
この医薬の活性成分、すなわち本発明によるポリペプチド、核酸又は細胞、又はこれらの組み合わせ、並びに上述の物質の組み合わせは、種々の方法で個体に投与することができる。投与経路は、皮膚内、経皮(例えば徐放性配合物)、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所及び鼻腔内ルートを含む。任意のその他の治療上効果的な投与ルート、例えば上皮組織又は内皮組織を通した吸収、又は遺伝子治療を用いることもできる。遺伝子治療の場合、活性物質をコードするDNA分子が患者に投与され(例えばベクターを介して)、これにより、活性物質はin vivoで発現させられ分泌させられる。加えて、本発明によるタンパク質は、生体活性物質、例えば医薬的に許容可能な界面活性剤、賦形剤、キャリヤ、希釈剤及びビヒクルの他の成分と一緒に投与することができる。
【００９１】
「医薬的に許容可能な」という用語の定義は、活性成分の生体活性の効果を妨害することがなく、また投与される宿主に対して毒性でない任意のキャリヤを含むものとする。例えば、非経口投与の場合、活性タンパク質は、ビヒクル、例えば生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル溶液中の注射用投与形態で調製することができる。
【００９２】
非経口(例えば静脈、皮下、筋内)投与の場合、活性タンパク質は、医薬的に許容可能な非経口用ビヒクル(例えば水、サリン、デキストロース溶液)、及び等張性(例えばマンニトール)又は化学安定性(例えば保存剤及び緩衝液)を維持する添加剤とともに、溶液、懸濁液、エマルジョン又は凍結乾燥粉末として調製することができる。この配合物は、一般に用いられる技術によって滅菌される。
【００９３】
本発明による活性タンパク質の生体利用効率は、ヒトの体内の分子の半減期を増大させる複合手順を使用することにより、例えば国際公開第92/13095号パンフレットに記載されているようにポリエチレングリコールに分子を連関することによって改善することができる。
【００９４】
活性タンパク質の治療上有効な量は、受容体のタイプ、本発明による物質のその受容体に対するアフィニティ、これにより示される任意の滞留細胞毒性活性、投与ルート、患者の臨床的状態を含む、多くの変数の関数となる。
【００９５】
「治療上有効な量」は、投与されると、本発明による物質がin vivoの疾患の発生又は進行に対して有益な効果をもたらすような量である。単回投与量又は複数回投与量として個体に投与された量は、ISNP035の薬物動態特性、投与ルート、患者の状態及び特徴(性別、年齢、体重、健康状態、サイズ)、症状の程度、併用治療、治療頻度及び所望の効果を含む、種々の因子に応じて変化することになる。確立された投与量範囲は当業者の能力の範囲内で調節され操作される。
【００９６】
本発明によるポリペプチドの所要投与量は、約0.0001〜100 mg/kg、又は約0.01〜10 mg/kg、又は約0.1〜5 mg/kg、又は約1〜3 mg/kgであるが、上述のように投与量は大幅に治療時の判断に委ねられる。本発明の薬剤は毎日、隔日又は1週に3回投与することができる。
【００９７】
一日投与量は通常、所望の結果を得るのに効果的な、複数回に分けられた形態、又は徐放性形態で与えられる。2回目又はそれ以降の投与は、個体への最初又は前回の投与量と同じ量、又はこれよりも少ない量、又はこれよりも多い量の投与量で行うことができる。2回目又はそれ以降の投与は、疾患の発症中又は発症前に投与することができる。
【００９８】
本発明はさらに、線維症疾患、具体的には強皮症を治療及び/又は予防する方法であって、治療及び/又は予防を必要とする患者に、本発明による有効量の物質を、任意には医薬的に許容可能なキャリヤと一緒に投与することを含む、方法に関する。或いは、又はこれに加えて、任意には発現ベクター内に含まれるISNP035又は本発明の核酸分子を生成する細胞を、本発明による投与することができる。
【００９９】
発現ベクターは全身投与することができる。好ましくは、発現ベクターは、筋内注射によって投与される。特に肺線維症が疾患に関与する場合、別の好ましい投与経路は吸入である。特に皮膚が関与する場合、ISNP035配列を含む発現ベクター、又は本発明によるISNP035ポリペプチドの局所投与が、別の好ましい投与ルートである。
【０１００】
本発明はさらに、有効量のISNP035と医薬的に許容可能なキャリヤとを混和することを含む製薬組成物の製造方法、及び、有効阻害量のISNP035を、当該治療及び/又は予防を必要とする宿主に投与することを含む、関節炎の治療及び/又は予防方法に関する。
【０１０１】
学術論文又は概要、公開済又は未公開の特許出願明細書、発行済特許明細書又はその他の参考文献を含む、本発明中に引用された全ての参考文献全体を、参考文献に提供された全てのデータ、表、図面及び本文を含めて、参考のため本明細書中に引用する。加えて、本明細書中に引用された参考文献中に引用された文献の内容全体も、参考のため本明細書中に引用する。
【０１０２】
周知の方法工程、コンベンショナルな方法工程、周知の方法又はコンベンショナルな方法に言及しても、このことは、本発明の特徴、説明又は実施態様が従来技術において開示、教示又は示唆されることの承認には決してならない。
【０１０３】
具体的な実施態様の前記説明により、本発明の全般的な性質が完全に明らかになるので、他者が当業者の知識を応用することによって(本明細書中に引用した参考文献の内容を含む)、本発明の全般的な概念を逸脱することなしに、不必要な試験を行うことなく、このような具体的な実施態様を種々の用途のために容易に変更及び/又は改変することが可能である。従ってこのような改変及び/又は変更は、その意味において、本明細書中に提供された教示及び指針に基づいた、開示された実施態様の等価物の範囲であるものとする。言うまでもなく、本明細書中の語法又は術語は説明を目的としたものであり、制限を有するものではなく、従って本明細書の術語又は語法は、当業者の知識と組み合わせて、本明細書中に示された教示及び指針に照らして、当業者により解釈されるべきである。
以上本発明を説明してきたが、下記実施例を参照すれば、本発明はより容易に理解される。実施例は説明のために提供するものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例1-クローニング及び発現
ISNP035のクローニング、HEK293/EBNA細胞内のISNP035の発現のためのプラスミドの構成、ISNP035を含有するcDNAライブラリー/鋳型の同定、及び哺乳動物細胞におけるISNP035-LONG-6HIS-V1の発現が、国際公開第03/054012号パンフレットの実施例1及び実施例2に記載されている。
【０１０５】
実施例2-可溶性ヒト組換えTRAILで処理された線維芽細胞中のアポトーシスのISNP035による中和
2.1  序文
TNF関連アポトーシス誘発性リガンド(TRAIL)が、オステオプロテゲリン(OPG)のための細胞リガンドの1つであることが判っている。線維芽細胞内のこの生理学的相互作用を模倣する二次アッセイが開発された。このアッセイ、すなわち、可溶性ヒト組換えTRAILで処理された線維芽細胞中のアポトーシスを中和するアッセイは、潜在的に新規のTRAIL受容体及び新規のタンパク質及び抗アポトーシス活性を有する小分子を選択するように指示される。
【０１０６】
2.2  設備及びソフトウェア
96ウェル組織培養プレート(ref costar no 3596)
490 nmフィルターを有する96プレート・リーダー
Graph Pad Prismソフトウェア
【０１０７】
2.3  材料及び試薬
L929マウス線維芽細胞(CCL-1)
(American Tyep cuture collection ATCC)
DMED(32430-027) Gibco BRL
滅菌ウシ胎仔血清
アクチノマイシンD(FLUKA ref 01817)
組換えヒトTrail/TNFS10
Cytotox 96非放射性(Promega G179A)
オステオプロテゲリン(正対照)
INSP035
【０１０８】
2.4  細胞培地
細胞を密集に達するまで成長させた。次いで細胞をトリプシン化し、そして20,000細胞/ウェルでDMEM 2% FCS中に播種した。最終容積は100 μl/ウェルであった。次いで溶液を5% CO2加湿チャンバ内で一晩にわたって37℃でインキュベートした。培地を、最終濃度1 μg/mlのアクチノマイシンDを有するDMEM 2% FCSと交換した。その後、2 ng/mlのrTRAIL(375TEC)を添加することにより、アポトーシスを誘発し、5% CO2加湿チャンバ内で24時間にわたってインキュベートした。次いで調整済培地を取り出し、そして試料を細胞毒性アッセイのために採取した。
【０１０９】
細胞毒性アッセイの際には、rTRAILの存在においてアポトーシスを常に測定した。従って正のエフェクターは2 ng/mlのTRAILであった。TRAILを添加する30分前に、基準分子OPG(10 ng/ml)、ISNP035又はレプチンを添加した。
【０１１０】
2.5  細胞毒性アッセイ
細胞毒性アッセイは、ラクテートデヒドロゲナーゼの生成を測定する比色アッセイである。
【０１１１】
最初に上澄み50 μlをプレートに移した。第2に、アッセイ緩衝液を使用することにより基質混合物をもどした。次いで戻された基質混合物50 μlを上澄みの各ウェルに添加した。その後プレートをカバーして、遮光した状態で、室温で30分間にわたってインキュベートした。次いで停止液50 μlを各ウェルに添加し、吸収度を490 nmで記録した。
【０１１２】
2.6  OPG酵素免疫アッセイ
ISNP035が内生的OPG生成を刺激するか否かをチェックするために、L929細胞を種々の量のISNP035変異体と一緒に96ウェル・プレート内に培養した(細胞毒性アッセイに関して記載したのと同様)。調整済培地50 μlをOPG生成アッセイのために採取した。OPG ELISAキット(BIOMEDICA, Cat. No. BI-20402)を使用して、ISNP035処理から24時間後及び48時間後にOPG生成量を測定した。
【０１１３】
2.7  結論
ISNP035及びその変異体は、対照としてオステオプロテゲリン(OPG)を有する線維芽細胞中の抗アポトーシス分子を選択するように構成されたin vitroアッセイにおいて、TRAILの潜在的インヒビターである(図1参照；他の変異体を用いても同様の曲線を得た)。従って、OPGと同様に、INSP035は、線維芽細胞に対する可溶性ヒト組換えTRAILのアポトーシス効果に抗することができ、これにより、線維芽細胞のアポトーシスを一貫して低減する(図1参照)。同じアッセイにおいて、レプチンは、TRAIL媒介型アポトーシスに影響を及ぼさなかった(図2参照)。
【０１１４】
OPG酵素免疫アッセイの結果は、OPGとは異なる経路を通って作用するISNP035が、線維症疾患の治療及び/又は予防においてOPGと相加的又は相乗的に作用するらしいことを示唆する。
【０１１５】
上記発見、及びTRAILがコラーゲン生成を刺激するという事実に基づいて、ISNP035が線維症疾患の治療及び/又は予防において有用であることが示唆される。
【０１１６】
実施例3-ISNP035のための大腸菌（E.coli)発現構造の発生
Gateway（登録商標）クローニング系と適合可能なプラスミドpENTR-INSP035-6HISを、特定部位突然変異誘発によって突然変異させ、これにより、ISNP035 cDNAの開始コドンの上流にシャイン-ダルガーノ配列(5'AAGGAGATG)を挿入した。次いで、結果として得られた突然変異型プラスミドに、大腸菌（E.coli)発現ベクターpDEST14との組換え反応を施すことにより、pDEST14-SD0INSP035-6HISを形成した。
【０１１７】
3.  特定部位突然変異誘発によるpENTR-INSP035-6HIS内へのシャイン-ダルガーノ配列の挿入
3.1  特定部位突然変異誘発のための遺伝子特異的クローニング・プライマー
PCRプライマー対、ISNP035-MF及びISNP035-MR(表4)を、プライマーがプラスミドpENTR-INSP035-6HIS配列の対向鎖にアニールし、そして各プライマーが、挿入されるべき領域のいずれかの側で15-25塩基にアニールするように構成した。PCRプライマーを、Tmが78℃以上であり、最小GC含有率が40%であり、そして3'末端塩基がG又はCであるように最適化した。Primer Designer Software(Scientific & Educational Software, PO Box 72045, Durham, NC 27722-2045, USA)を使用して、プライマーを構成して最適化した。プライマーをポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法(PAGE)によって精製した。
【０１１８】
3.2  特定部位突然変異誘発
製造業者の指示書に従ってQuikChange（登録商標） 特定部位突然変異誘発キット(Stratagene)を使用して、特定部位突然変異誘発を実施した。突然変異誘発反応を、
-  5 μlの10 X 反応緩衝液、
-  100 ngのプラスミドpENTR-INSP035-6HIS DNA、
-  125 ngのISNP035-MFプライマー、
-  125 ngのISNP035-MRプライマー、
-  1 μlのdNTP混合物、
-  3 μlのQuick Solution、及び
-  1 μlのPfu Turbo DNAポリメラーゼ
を含有する最終容積50 μlでQuikChange突然変異誘発キット(Stratagene)を使用して実施した。
【０１１９】
下記のようにプログラミングされたMJ Research DNA Engineを使用して、熱サイクルを実施した：95℃で1分；95℃で50秒、60℃で50秒、及び68℃で3分を18サイクル；続いて68℃で7分間の付加的な延長サイクル、及び4℃の保持サイクル。
【０１２０】
Dpn I消化によって、メチル化又は半メチル化された親DNA鋳型(試料反応物中のプラスミドpENTR-INSP035-6HIS)を消化した。1 μlのDpn I制限酵素(10 U/μl、Stratagene)を反応混合物に添加し、そして1時間にわたって37℃でインキュベートした。次いで、反応混合物をXL 10-Gold 超感応(supercompetent)細胞(Stratagene)内に下記のように形質転換した。XL10-Gold細胞の50 μlアリコートを氷上で解凍し、そして1 μlのDpn Iで処理されたDNAを添加した。混合物を氷上で30分間にわたってインキュベートし、次いで正確に45秒間にわたって42℃でインキュベートすることによりこれに熱ショックを与えた。試料を2分間にわたって氷に戻し、そして予加熱(42℃)されたNZY培地を250 μl添加した。試料を37℃で1時間にわたって震盪させながら(220 rpm)、インキュベートした。形質転換混合物を、カナマイシン(40 μg/ml)を含有するL-肉汁(LB)プレート上で平板培養した。プレートを37℃で一晩にわたってインキュベートした。
【０１２１】
3.3  プラスミドDNAの調製及び配列決定
試料形質転換プレートから得られた8つのコロニーを、カナマイシン(40 μg/ml)を含有する5 mlのL-肉汁(LB)内に接種し、220 rpmで震盪させながら37℃で一晩にわたって成長させた。Qiaprep Turbo 9600 ロボットシステム(Qiagen)を使用して、プラスミド・ミニプレップDNAを調製した。製造者の指示書に基づいてBigDyeTerminatorシステム(Applied Biosystems cat. no. 4390246)を使用して、21M13及びM13Revプライマーで、プラスミドDNA(150-200 ng)にDNA配列決定を施した。プライマーの配列を表4に示す。Dye-Exカラム(Qiagen)又はMontage SEQ 96クリーンアップ・プレート(Millipore cat. no. LSKS09624)を使用して、配列決定用反応物を精製し、次いでApplied Biolsystem 3700 シーケンサー上で分析した。
【０１２２】
配列分析は、上流のシャイン-ダルガーノ配列を有するISNP035-6HISの配列を含有するクローンを同定した。
【０１２３】
3.4  Gatewayドナー突然変異型ベクター(16318)からE.coli発現ベクターpDEST14へのISNP035-6HISコード配列の移動
次いで、上流のシャイン-ダルガーノ配列(1.5 μl)を有するISNP035-6HISの配列を含有するプラスミドから調製されたプラスミド・ミニプレップDNAを、最終容積10 μl中1.5 μl pDEST14ベクター(0.1 μg/μl)、2 μl LR緩衝液及び1.5 μlのLRクロナーゼ(Invitrogen)を含有する組換え反応物中に使用した。この混合物をRTで1時間にわたってインキュベートし、プロテイナーゼK(2 μg)の添加によって停止し、そしてさらに10分間にわたって37℃でインキュベートした。この反応物のアリコート(1 μl)を使用して、下記のようにエレクトロポレーションによって大腸菌（E.coli) DH 10B細胞を形質転換した： DH10B電気感応(electrocompetent)細胞(Invitrogen)の25 μlアリコートを氷上で解凍し、そしてLR反応混合物1 μlを添加した。混合物を、冷却された0.1 cmエレクトロポレーション・キュベットに移し、そしてBioRad Gene-Pulser（登録商標）を使用して、製造者の推奨するプロトコルに従ってエレクトロポレーションを細胞に施した。室温に予加熱しておいたSOC培地(0.5 ml)を、エレクトロポレーション直後に添加した。混合物を15 mlスナップ・キャップ管に移し、そして、37℃で1時間にわたって震盪させながら(200 rpm)インキュベートした。次いで、形質転換混合物のアリコート(10 μl及び50 μl)を、アンピシリン(100 μg/μl)を含有するL-肉汁(LB)プレート上で平板培養し、そして37℃で一晩にわたってインキュベートした。
【０１２４】
結果として生じたコロニーのうちの6つから得られた5 mlの培養から、Qiaprep Turbo 9600 ロボットシステム(Qiagen)を使用して、プラスミド・ミニプレップDNAを調製した。T7及びpDEST14Rプライマーを使用して、プラスミドDNA(200-500 ng)にDNA配列決定を施した(図4)。次いで、結果として生じたクローン(pDEST14-SD-INSP035-6HIS)のうちの1つのミニプレップ・プラスミドDNAを使用して、例えば大腸菌（E.coli)BL21 DE3細胞をタンパク質生成のために形質転換する。
【０１２５】
【表１】
2007505082.tif 000002
【０１２６】
実施例4-TaqMan分析によるISNP035遺伝子発現レベルの分析
各試料の総RNAを、RT-PCRのためのSuperscript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen, Cat. No. 18080-051)を使用して、最終反応容積20 μlで逆転写した。2 μgの総RNAを50 ngのランダム・ヘキサマー・プライマー、それぞれ10 mMのdATP、dGTP、dCTP及びdTTP、及びDEPC処理水と容積10 μlで組み合わせた。混合物を65℃で5分間にわたってインキュベートし、次いで1分間にわたって氷上で冷却した。別個の管内で下記10 μlのcDNA合成混合物を調製した：2 μl 10X RT緩衝液、4 μl 25mM MgCl2、2 μl 0.1M DTT、1 μl RnaseOUT（登録商標）(40単位/μl)、及び1 μl SuperScript（登録商標）III RT酵素(200単位/μl)。cDNA合成混合物をRNA/プライマー混合物に添加し、静かに混ぜ、そして10分間にわたって25℃で、次いで50分間にわたって50℃でインキュベートした。次いで、85℃で5分間にわたってインキュベートすることにより、RT酵素を不活性化した。混合物を氷上で冷却し、次いで1 μlのE.coli Rnase H(2単位/μl)を添加し、そして混合物を37℃で20分間にわたってインキュベートした。混合物を氷上で冷却し、次いで滅菌水で1/250に希釈した。次いで逆転写酵素反応の希釈物に、TaqMan装置(PE Biosystems 7700)上でリアルタイムPCR分析を施した。
【０１２７】
ヒトINSP035及びハウスキーピング制御遺伝子グリセルアルデヒド3-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のためのPCRプライマーを、Primer Expressソフトウェア(PE Biosystems)を使用して設計した。選択されたプライマーは、h-ISNP035-169F1(AGGGCCCAAGCCAAACC)及びh-ISNP035-281R1 (TCCTGCGCCTGCATCTCC)であった。TaqMan分析に使用するための特異性及び最適なプライマー濃度は、プラスミドpCR-XL-TOPO-INSP035の連続希釈物上でISNP035遺伝子特異的プライマーを試験することにより決定した。GAPDHイントロン配列に対して特異的なプライマーを使用してPCR反応を実施することにより、cDNAの潜在的なゲノムDNA汚染を排除した。4%アガロース・ゲル上でPCR生成物を分析することによって非特異的増幅の不存在を制御して、これにより単一バンドの期待分子量が生成されることを保証した。
【０１２８】
25 μl SYBR Green PCRマスター・ミックス(PE Biosystems)(これに0.5単位のAmpEraseウラシルN-グリコシラーゼ(UNG、PE Biosystems)を予め添加しておく)、300 nMの各増幅プライマー、及び5 μlのRT-PCR生成物を含有する反応容積50 μlで、SYBR GreenリアルタイムPCR反応を実施した。下記のようにプログラミングされたABI PRISM 7700 (TaqMan)検出システムを使用して、サイクルを実施した：50℃で2分を1サイクル；95℃で10分を1サイクル；95℃で15秒、60℃で1分を40サイクル。各反応は2部ずつ行い、そしてその結果を平均した。
【０１２９】
逆転写されたcDNA試料のプライマー特異的領域をこのように増幅し、そしてこれらのサイクル閾値(Ct)を見極めた。各cDNA試料のCt値を下記のようにハウスキーピング遺伝子GAPDHのCt値に対して基準化した。各cDNA試料中のGAPDH遺伝子とINSP035遺伝子との発現レベルの差を、Ct値の差、すなわちデルタ(δ)Ct=Ct(GAPDH)-Ct(INSP035)として表した。次いで、式フォールド差=2(-δCt)に従って、GAPDHに必要なサイクル数に対する、検出可能なISNP035遺伝子発現に必要なサイクル数のフォールド差として、各試料の結果を表した。最後に、100をISNP035のフォールド差で割算することにより、各cDNA試料中のISNP035遺伝子の発現レベルを、GAPDH発現レベル=100%として、GAPDH遺伝子発現レベルに対して示した。
【０１３０】
表5.  RT-PCR(TaqMan)によって測定された種々のヒト組織中のISNP035の発現
【表２】
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【表３】
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【０１３１】
GAPDH発現0.5に対するISNP035の発現レベルの閾値を定義して、TaqMan発現結果は、ISNP035が胎児肝臓、子宮頚、膵臓、副腎、ヒト狼瘡脾臓、潰瘍性大腸炎混合型小腸、及び特に肺において高発現されることを示す。肺及び肝臓内の強力な発現が、肺及び肝臓の線維症内のISNP035の関与を支持する。
【０１３２】
実施例5：ISNP035のin vivo投与は、マウス内のブレオマイシン誘発型肺線維症を防御する
C57BL/6マウスに単回気管内注射用ブレオマイシンを投与する結果、14日以内に肺線維症が急速に誘発される。この誘発は、肺間質内部のコラーゲン沈積の増大によって特徴付けされる(Hattori他、2000. Zuo他、2002. Phillips他、2004)。ISNP035投与が線維症の発生に対する防護効果を有することができるか、又は実際に疾患の重症度を低減するかを見極めるために、ISNP035の毎日の注射の効果を、ブレオマイシン処理マウスにおいて試験することができる。
【０１３３】
試験を完全にするために、マウスを4つの群に分ける。10匹のマウスから成る3つの群に単回気管内注入によってブレオマイシンを投与する。比較のために第4群のマウスが、完全に無処理の、年齢及び性別が合致した個体(ナイーブ・マウス)を含む研究に含まれる。ブレオマイシン処理の次の日から始めて、ISNP035を皮下注射により投与する。1つの群には、高投与量のブレオマイシン(5 mg/kg)を、そして第2の群には、より低い投与量のブレオマイシン(0.5 mg/kg)を与え、そして対照マウスには毎日皮下に生理食塩水を投与する。
【０１３４】
ブレオマイシンで処理された動物は病気になり、体重を急速に減らして死に至る。
【０１３５】
生き残った全てのマウスをバイオマイシン処理から12日後に犠牲にする。肺の組織学的分析は、ISNP035処理動物の結果を明らかにする。ISNP035処理マウスにおいてヒドロキシプロリン含量の低減が観察される(ヒドロキシプロリン含量はコラーゲン沈積の尺度である)。ISNP035処理が肺内のコラーゲン沈積を効果的に低下させることを結論付けることができる。
【０１３６】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図1。TRAILアッセイにおけるISNP035-His修飾型中長形(SEQ ID NO:8)。Y軸はTRAIL阻害のパーセンテージをあらわす。X軸はISNP035の修飾型中形の対数希釈を表す。SEQ ID NO:3(ISNP035-His長形)及びSEQ ID NO:6(ISNP035-His中形)でも同様の曲線が得られた。
【図２】図2。TRAILアッセイにおけるレプチン。Y軸は光学濃度を表す。X軸は、負の対照で始めて、次いで組換えTRAIL、続いてオステオプロテゲリン、そして最後に種々の濃度(10 nmg/ml、100 ng/ml及び1000 ng/ml)のレプチンで実施された種々異なるアッセイを表す。
【図３】図3。ISNP035の添加から24時間後(A)又は48時間後(B)のマウスOPGに対するISNP035の効果。各図面において、Y軸は光学濃度を表し、そしてX軸は、負及び正の対照で初めて、続いて、ISNP035添加量(それぞれ18 μl又は2 μl)に応じて2つのカテゴリーにさらに分けて試験される種々の形のISNP035で実施される種々異なるアッセイを表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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