(57)【要約】  本発明は、細胞においてパーフォリンの発現を駆動できるレトロウイルスベクター、および、細胞において組換えパーフォリンを発現する方法に関する。本発明はまた、組換えパーフォリンポリペプチドおよびそれから得られる核酸分子並びにその使用にも関する。また、このような組換えパーフォリン分子を使用するスクリーニングアッセイ、該スクリーニングアッセイにより同定された化合物、およびその使用も包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できる前記レトロウイルスベクター。
【請求項２】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項３】
モロニーネズミ白血病ウイルス、ネズミ幹細胞ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスを含む群に由来する、請求項１または２に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項４】
ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）に由来する、請求項３に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項５】
ｐＬＸＳＮである、請求項４に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項６】
前記パーフォリン分子が、天然パーフォリン分子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項７】
前記変種が、核酸の欠失、挿入および／または置換を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項８】
前記変種が、血球貪食リンパ組織球症（ＨＬＨ）および／または家族性血球貪食リンパ組織球症（ＦＨＬ）に罹患した個体において同定されるポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項７に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項９】
前記変種が、ＦＨＬに罹患した個体において同定されるポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項８に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１０】
前記変種は、
【表１】
2007526774.tif 000024
を含む群から選択される変異を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項７に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクターを含むパッケージング細胞。
【請求項１２】
ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＴＥ６７１、ＨＴ１０８０、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８５）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、米国特許第５，２７８，０５６号に記載の細胞株、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４２）、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４１）、２９３Ｔ、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７．psi．−２、．psi．−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、．psi．ＣＲＥ、．psi．ＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２を含む群より選択される、請求項１１に記載のパッケージング細胞。
【請求項１３】
ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１２に記載のパッケージング細胞。
【請求項１４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１３に記載のパッケージング細胞。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクターを含むレトロウイルス粒子。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項１７】
胚幹細胞、胚癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、気管支上皮細胞、および免疫細胞を含む群より選択される、原核細胞または真核細胞である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記免疫細胞は、好塩基球、好酸球、リンパ球、好中球、単球、およびナチュラルキラー細胞を含む群より選択される、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１９】
好塩基球である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
ラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を発現させる方法であって、前記方法は、細胞を、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレトロウイルスベクターでトランスフェクトすることを含む、前記方法。
【請求項２２】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を発現させる方法であって、前記方法は、細胞を、請求項１５に記載のレトロウイルス粒子にさらすことを含む、前記方法。
【請求項２３】
前記パーフォリン分子が、天然パーフォリン分子である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記変種が、核酸の欠失、挿入および／または置換を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記変種が、血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）および／または家族性血球貪食リンパ組織球増多症（ＦＨＬ）に罹患した個体において同定されるポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記変種が、ＦＨＬに罹患した個体において同定されるポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記変種が、
【表２】
2007526774.tif 000025
を含む群より選択される変異を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞が、胚幹細胞、胚癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、気管支上皮細胞、および免疫細胞を含む群より選択される、原核細胞または真核細胞である、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫細胞が、好塩基球、好酸球、リンパ球、好中球、単球、およびナチュラルキラー細胞を含む群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、好塩基球である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、ラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
発現されたパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を単離するステップをさらに含む、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法により産生される単離パーフォリン分子またはその単離断片もしくはその単離変種。
【請求項３４】
天然パーフォリン分子である、請求項３３に記載の単離パーフォリン分子。
【請求項３５】
前記変種が、核酸の欠失、挿入、および／または置換を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項３３に記載の単離パーフォリン分子。
【請求項３６】
血球貪食リンパ組織球増多症（ＨＬＨ）および／または家族性血球貪食リンパ組織球増多症（ＦＨＬ）に罹患した個体において同定されるポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項３５に記載の単離変種パーフォリン分子。
【請求項３７】
ＦＨＬに罹患した個体において同定されるポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項３６に記載の単離変種パーフォリン分子。
【請求項３８】
【表３】
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を含む群より選択される変異を含むポリヌクレオチド配列によりコードされる変異パーフォリン分子である、請求項３５に記載の単離変種パーフォリン分子。
【請求項３９】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートする化合物を同定する方法であって、前記方法は、
請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の細胞を得；
前記細胞を試験化合物にさらし；そして
前記試験化合物が、細胞において、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートするかどうかを決定する
ステップを含む、前記方法。
【請求項４０】
前記試験化合物が、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートするかどうかの決定は、前記細胞におけるパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を、前記試験化合物にさらしていない細胞におけるパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現と比較するステップを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートする化合物を同定する方法であって、前記方法は、
請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の、単離パーフォリン分子またはその単離断片もしくはその単離変種を得；
前記単離パーフォリン分子またはその単離断片もしくはその単離変種を、試験化合物および標的細胞にさらし；そして
前記試験化合物が、標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートするかどうかを決定する
ステップを含む、前記方法。
【請求項４２】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートする化合物を同定する方法であって、前記方法は、
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を発現する、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の細胞を得；
前記細胞を、試験化合物および標的細胞にさらし；そして
前記試験化合物が、標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートするかどうかを決定する
ステップを含む、前記方法。
【請求項４３】
前記試験化合物が、標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートするかどうかを決定するステップが、標的細胞に対するパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性を、前記試験化合物にさらさらない場合の標的細胞に対するパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性と比較するステップを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性が、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種が標的細胞を溶解する能力として同定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法により同定される化合物。
【請求項４６】
前記化合物が、細胞においてパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を阻害できる、請求項３９または４０に記載の方法により同定される化合物。
【請求項４７】
前記化合物が、細胞においてパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を増加させることができる、請求項３９または４０に記載の方法により同定される化合物。
【請求項４８】
前記化合物が、細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性を阻害することができる、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法により同定される化合物。
【請求項４９】
前記化合物が、細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性を増強することができる、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法により同定される化合物。
【請求項５０】
細胞においてパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を阻害する方法であって、前記方法は、前記細胞を、請求項４６に記載の化合物にさらすことを含む、前記方法。
【請求項５１】
細胞において、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を増加させる方法であって、前記方法は、前記細胞を、請求項４７に記載の化合物にさらすことを含む、前記方法。
【請求項５２】
細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性を阻害する方法であって、前記方法は、前記細胞を、請求項４８に記載の化合物にさらすことを含む、前記方法。
【請求項５３】
細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性を増強する方法であって、前記方法は、前記細胞を、請求項４９に記載の化合物にさらすことを含む、前記方法。
【請求項５４】
請求項３３〜３８のいずれか１項に記載のパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５５】
請求項４６に記載の化合物と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５６】
請求項４７に記載の化合物と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５７】
請求項４８に記載の化合物と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５８】
請求項４９に記載の化合物と、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５９】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を予防的または治療的に処置する方法であって、前記方法は、前記被験者に、治療有効量の請求項４６または４８に記載の化合物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項６０】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を予防的または治療的に処置する方法であって、前記方法は、前記被験者に、治療有効量の請求項４７または４９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、前記方法。
【請求項６１】
前記疾患が、若年性糖尿病（１型又はインスリン依存性）、移植片対宿主疾患、慢性または急性の同種移植片拒絶、および細胞傷害性Ｔリンパ球により仲介される免疫病態に関連した疾患を含む群より選択される、請求項５９に記載の予防法または治療法。
【請求項６２】
前記疾患が、ウイルス感染（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎）、癌（例えばリンパ腫）、結核、およびパーフォリン欠損症を伴う容態（例えばＨＬＨおよびＦＬＨ）を含む群より選択される、請求項６０に記載の予防法または治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞においてパーフォリンの発現を駆動できるレトロウイルスベクター、および、細胞において組換えパーフォリンを発現させる方法に関する。本発明はまた、組換えパーフォリンポリペプチドおよびそれに由来する核酸分子並びにその使用に関する。また、このような組換えパーフォリン分子を使用するスクリーニングアッセイ、該スクリーニングアッセイにより同定された化合物、およびその使用も包含する。
【０００２】
背景
パーフォリンは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの細胞により分泌される膜破壊タンパク質であるが、これは、顆粒のエキソサイトーシス経路を通じた、破壊のために標的化されたウイルス感染細胞または形質転換細胞の死滅に不可欠である。数多くの研究により、パーフォリン欠損動物およびヒトは重度に免疫抑制されていることが示された。例えば、両方のパーフォリン対立遺伝子が標的化破壊されたマウスは、多くのウイルスおよび他の細胞内病原体（例えばリステリア菌、Listeria monocytogenes）に対して極めて感受性が高い。これらの動物においては、多くの実験腫瘍も拒絶することなく、転移拡大の可能性が高くなっていることが多い。さらに、パーフォリン欠損動物の５０％超が、加齢と共に自然発生的に非常に高悪性度のＢリンパ腫を発達させており、このことは、腫瘍免疫監視が無効であることを示す。これらの動物で発生した腫瘍は、パーフォリン欠損レシピエントには容易に移植できるが、同系の免疫能を有する動物によっては強力に拒絶される。
【０００３】
ＣＴＬの分泌顆粒からは、パーフォリンがグランザイム（アポトーシス促進活性を有するセリンプロテアーゼの１ファミリーである）と共に放出される。パーフォリンと比較すると、グランザイムは、その極めて異なるタンパク質溶解特異性にも関わらず、かなり機能的に重複したところがある。例えば、グランザイムＡおよびＢの両方が欠損したマウスは、奇肢症のように選択されたウイルスに対してのみ異常に感受性であるが、一連の実験腫瘍およびパーフォリン欠損マウスで自然発生的に生じたリンパ腫は拒絶することができる。まとめると、パーフォリンは、顆粒により仲介される全てのウイルス免疫および腫瘍免疫並びに免疫恒常性に対して欠くことのできない唯一の顆粒構成成分であると推察できる。
【０００４】
パーフォリン欠損症候群は、最近になってヒトにおいて記載されたばかりであり、稀な常染色体劣性遺伝疾患である家族性血球貪食リンパ組織球症（ＦＨＬ）を呈する小児の約３０％が、そのパーフォリン対立遺伝子の両方に変異を有することが示された。ＦＨＬは、血球貪食リンパ組織球症（ＨＬＨ）の１つの亜型であり、このＨＬＨには、孤発性に家族歴とは関係なく起こる様々な関連免疫欠損疾患が含まれる。ＨＬＨおよびＦＬＨは、肝臓、脾臓、リンパ節、および中枢神経系における活性化Ｔリンパ球およびマクロファージ（組織球）の大量かつ活発な蓄積、並びに、その後の赤血球および他の血球の貪食により一般に特徴づけられている。
【０００５】
これらの小児の細胞傷害性細胞、特にＣＴＬは、顆粒経路を通じて標的細胞に致命的な打撃を与えることができない。欠陥リンパ球はこのように抗原提示細胞を排除できないので、マクロファージの活性化および蓄積は制御されず、炎症性サイトカインは過剰産生され、これは、発熱、肝臓および脾臓の肥大、並びに脾臓、肝臓、および骨髄における血球貪食という臨床症候群として顕現する。組織学的には、これらの患者のＣＴＬおよびＮＫ細胞は、一般に、その溶解顆粒中の免疫反応性パーフォリンの顕著な減少を示し、これは、パーフォリンタンパク質の不安定性、または、免疫攻撃に応答してのパーフォリン代謝回転の増加を反映している可能性がある。まとめると、ＨＬＨまたはＦＨＬにおける臨床的および病理的知見から、ウイルス特異的Ｔ細胞および抗原提示細胞の増殖が増加し、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスなどの病原体に感染したパーフォリン欠損マウスに見られる免疫応答をダウンレギュレートできないことが暗示される。
【０００６】
パーフォリンの機能は明らかに重要であるにも関わらず、それは分子レベルおよび細胞レベルではあまり依然として解明されていない。精製パーフォリンは、アポトーシスを誘導できないので、その重要な役割は、グランザイムを、標的細胞の細胞質ゾルへと正確に標的化させることに関与し、該細胞質ゾルで、グランザイムのタンパク質溶解活性が、細胞のアポトーシスプログラムを誘導すると考えられている。グランザイムＢ（最も強力なアポトーシス促進グランザイムである）は、特定のアスパラギン酸残基の後で基質を切断することにより（Ａｓｐ−アーゼ活性）、カスパーゼの活性を模倣している。Ｂｉｄ（Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進メンバー）は、グランザイムＢの特に重要な基質であり、切断短縮されたＢｉｄは、内在的アポトーシス経路を活性化することにより細胞死をもたらすことができ、これはミトコンドリアの破壊に中心が置かれている。グランザイムＡは、塩基性残基の後を切断し、カスパーゼ非依存的ＤＮＡ鎖ニッキングを誘導し、一方、マウスグランザイムＣは、ミトコンドリア機能を直接的に破壊することが示されている。単独で高濃度で適用された精製パーフォリンは、標的細胞の溶解も誘導でき、この形態の細胞死は、いくつかの生理的に関連した条件下でも起こる可能性がある。
【０００７】
分子レベルでは、どのようにパーフォリンがその機能を遂行するのか殆ど知られていない。パーフォリンのカルボキシル末端は、シナプトタグミンタンパク質ファミリー（そのいくつかは神経シナプスで小胞輸送に関与している）と非常に似ていると予測されている。１つの壮麗な研究により、パーフォリンの生合成中に、パーフォリンは、未知のプロテアーゼによりそのカルボキシ末端に近い場所で切断され、かさ高いＮ−結合グリカンの付着した短いペプチドが遊離されるという証拠が得られた。これにより、カルボキシル末端におけるカルシウムおよび脂質の結合が可能となり、ＣＴＬ脱顆粒後にパーフォリンが標的細胞膜に挿入することができると予測されている。カルシウム依存的コンフォメーション変化後に、残基２１０〜２４５が、膜への挿入を許容する両親媒性らせん構造を形成すると考えられているが、上皮増殖因子受容体システインリッチドメインに似た別の領域（残基３７５〜４１０）の機能は不明である。アミノ末端に相当する合成ペプチドは、幾分、内在性溶解能を有することも示された。しかし、この観察の生理的関連性は試験されていない。
【０００８】
したがって、ウイルスおよび形質転換細胞に対する免疫応答におけるパーフォリンのかなりの重要性が示され、そして、マウスおよびヒトｃＤＮＡの両方が、独立して、１５年よりも昔にクローニングされていたという事実にも関わらず、パーフォリンの機能は、分子レベルおよび細胞レベルにおいて依然としてあまり解明されていない。このように実質的に進歩がないことは、さらに研究するための、この傷害性タンパク質を合成し貯蔵できる細胞株がないことに主に起因する。
【０００９】
培養細胞株の使用は、様々な研究分野におけるタンパク質機能の研究を大いに支えた。パーフォリンの固有の細胞傷害性により、細胞小器官（ここでタンパク質が合成され、輸送され、後に貯蔵される）に傷害を与えることなくパーフォリンを発現するための適切な自己防御措置を備えた細胞を同定する特殊な必要性が生じた。このような細胞株がないことは、パーフォリンの構造機能研究における主な障害である。数多くの試み（多くは失敗）では、パーフォリンを合成するために細菌発現系が使用されていた。バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるパーフォリン発現は、溶解性問題により信頼性がなく、この方法は、広く使用されるようにはならなかった。それ故、パーフォリン分子の変異解析は全く記載されていない。
【００１０】
文献を調査すると、パーフォリンの発現のために過去に使用された細胞で成功したものは殆どないことが明らかである。明らかに、ＣＴＬおよびＮＫ細胞は、パーフォリンを合成できる理想的な細胞であるが、培養液中でこのような細胞株は殆ど存在できない。リンパ球生物学分野の研究者は、新しく単離されたリンパ球、培養リンパ球腫瘍、または癌遺伝子の導入により不死化された僅かな細胞傷害性株に頼ってきた。どの場合においても、欠点は、これらの細胞中の内因性パーフォリンの存在であり、これはパーフォリンの構造／機能の研究を複雑にする。以前に、マウスＣＴＬ細胞株のＣＴＬＬ−Ｒ８におけるヒトパーフォリンの発現は、内因性パーフォリンの機能を妨害し、これによりトランスフェクトされた細胞株の細胞傷害性は低下したことが示された。理想的には、構造／機能研究には、パーフォリンの発現が欠失しているが、その中にパーフォリン（野生型または変異型）を再導入できるような、細胞株が必要とされる。
【００１１】
本発明は、従来技術の先に述べた問題のいくつかを克服するか、または少なくとも寛解し、そうすることにより、細胞においてパーフォリンまたはその断片もしくはその変種を組換え発現するより効率的で適切な方法を提供する。
【００１２】
文書、研究活動、材料、装置、文献などの考察は、本発明の内容を提供する目的のためだけに、本明細書に含める。これらの項目のいずれかまたは全てが、本出願の各クレームの優先日より前にオーストラリアに存在していたので、従来技術の基礎の一部を形成しているか、あるいは、本発明に関連する分野においては公の一般的な知識であったことは示唆または提示されていない。
【００１３】
発明の概要
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞における、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクター。
【００１４】
本発明のまたさらなる態様において、細胞においてパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターを有するレトロウイルス粒子を産生できるパッケージング細胞が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる態様において、細胞においてパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターを有するレトロウイルス粒子が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる態様において、細胞においてパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の組換え発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞または細胞株が提供される。
【００１７】
本発明の態様において、細胞においてパーフォリンまたはその断片もしくはその変種を発現する方法が提供され、該方法は、細胞を、細胞において該パーフォリンまたはその断片もしくはその変種の組換え発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトすることを含む。
【００１８】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載の方法により産生される、組換えパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を提供する。
【００１９】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートする化合物を同定する方法であって、該方法は、
細胞においてパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動できる本発明に記載のレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞を得；
該細胞を、試験化合物にさらし；そして
該試験化合物が、細胞においてパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートするかどうかを決定する
ステップを含む。
【００２０】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートする化合物を同定する方法であって、該方法は、
本明細書に記載の本発明の方法にしたがって調製された、単離パーフォリン分子またはその単離断片もしくはその単離変種を得；
該単離パーフォリン分子またはその単離断片もしくはその単離変種を、試験化合物および標的細胞にさらし；そして
該試験化合物が、標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートするかどうかを決定するステップを含む。
【００２１】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートする化合物を同定する方法であって、該方法は、
本明細書に記載の本発明の方法にしたがって、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を発現する細胞を得；
該細胞を、試験化合物および標的細胞にさらし；そして
該試験化合物が、標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートするかどうかを決定するステップを含む。
【００２２】
本発明のまたさらなる態様において、本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定された化合物が提供される。
【００２３】
本発明のまた別の態様において、本明細書に記載の組換えパーフォリン分子、および／または本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定されたアゴニストもしくはアンタゴニスト化合物を、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤と共に含む、医薬組成物が提供される。
【００２４】
本発明のまたさらなる態様において、パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を予防的または治療的に処置する方法が提供される。
【００２５】
発明の詳細な説明
細胞におけるレトロウイルスにより仲介される組換えパーフォリンの発現方法
本発明の態様において、細胞において、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種を発現する方法が提供され、該方法は、細胞を、細胞において該パーフォリンまたはその断片もしくはその変種の組換え発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトすることを含む。
【００２６】
本発明は、特に、ＣａＰＯ４沈降法、リポフェクタミンもしくは類似の試薬、または電気穿孔法によるなどの標準的な細胞発現法とは対照的な、レトロウイルス系を使用する組換えパーフォリンの発現に関する。
【００２７】
本明細書の記載および特許請求の範囲全体を通じて、「含む（comprise）」なる語句、およびその語句の変形、例えば「含んでいる（comprising）」および「含む（comprises）」は、他の添加剤または成分または整数またはステップを除外するものではない。
【００２８】
「パーフォリン」、「細胞溶解素」、「孔形成タンパク質（ｐｆｐ）」および「Ｃ９様タンパク質」なる語句は、本明細書において同義語として使用され、好ましくは、様々な形態（天然または合成変種を含む）のパーフォリンポリペプチドおよびその断片を含む。本発明により包含されるパーフォリンの例には、図１に示されるアミノ酸配列を有するヒトパーフォリンが挙げられる。また、マウスおよびラットパーフォリンアイソフォームも包含されるが、他の種に由来するパーフォリン（下等生物、例えば細菌により産生されるものを含む）も考慮される。
【００２９】
パーフォリン遺伝子は、マウスの第１０染色体（Trapaniら、1990、J Exp Med、171:545-557）およびヒトの第１７染色体（Shinkaiら、1989、Immunogenetics、30:452-457）に位置づけられている。エキソン１は非翻訳配列をコードし、全タンパク質が、エキソン２の一部およびエキソン３の全部（これは３’非翻訳領域も含む）によりコードされることが判明した。マウス（Kwonら、1989、Biochem Biophys Res Commun、158:1-10；Lowreyら、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、86:247-251）、ヒト（LichtenheldおよびPodack、1989、J.Immunol.、143:4267-4274）およびラット（Ishikawaら、1989、J.Immunol.、143:3069-3073）パーフォリンをコードするパーフォリンｃＤＮＡのクローニングにより、ヒトおよびマウスパーフォリンが、アミノ酸レベルで約６８％同一であること、並びに、マウスおよびラットパーフォリンは、約８６％同一であることが示される。ヒトおよびマウスのタンパク質は両方共、５３４アミノ酸長であるが、ヒトのリーダーペプチド配列（２１アミノ酸）は、マウス対応物よりも１残基長い。パーフォリンは、２０個のシステイン残基を含み、これは、この３つの種間で完全に保存されており、これらは、１０個の鎖内ジスルフィド結合を形成していると考えられている。
【００３０】
パーフォリンにより形成される孔と補体ＭＡＣ（特にＣ９）により形成される孔の類似性を特筆した早期の機能的研究により、この２種のタンパク質間の構造的および機能的類似性に関する研究に拍車がかかった。しかし、一次配列の解析により、この２種のタンパク質は、パーフォリン分子の中心のあたりの３００アミノ酸配列中に僅か２０％の相同性しか共有しておらず（Shinkaiら、1988、Nature、334:525-527）、残りは、全く類似性を示さないことが示される。この中心部分においては、さらにより高い相同性を有する２個の領域がある。残基２１１〜２４１は、高い両親媒性特徴を示す、補体タンパク質の一領域に相当する。膜に付着した時に、分子内で顕著なコンフォメーション変化が起こり、その結果、この両親媒性αへリックス領域が露出し、脂質膜への挿入が可能となると提唱されている。２番目に強く保存されているドメインは、残基３７６〜４０９の領域であり、これは、ＭＡＣタンパク質にも見られる上皮増殖因子（ＥＧＦ）様反復ドメインに類似性を有する（Shinkaiら、1988、Nature、334:525-527）。この領域に存在する６個の保存されたシステインは、機能的に重要な構造の維持に寄与する分子内ジスルフィド結合を形成する可能性があるか、または、他のパーフォリンモノマーと共に凝集して機能的孔を形成する部位である可能性がある。アミノ末端１００残基およびカルボキシル末端１５０残基は、パーフォリンに対して完全に独特なものである。Ojciusおよび同僚により行なわれた研究では（Ojciusら、1991、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、88:4621-4625）、３４個のＮ末端残基に相当する合成ペプチドの使用により、この領域は、強力な膜破壊特性を有することが実証された。
【００３１】
本明細書に使用した「天然」なる語句は、好ましくは、天然に存在するアミノ酸配列を有するパーフォリンポリペプチド分子（例えば天然タンパク質）を意味する。天然パーフォリン、または天然に生じるパーフォリンは、細胞破壊顆粒の主な構成成分の１つとして同定されることができ、還元およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動時には約６６ｋＤａの分子量で移動することが見出され、非還元条件下ではよりゆっくりと移動し（７０〜７５ｋＤａ）、その天然形態における堅いジスルフィド結合構造の存在が示唆される。カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在下で、パーフォリンモノマーは凝集して脂質二重層をまたぐ管状構造となり、環状の損傷を生じ（直径６〜２０nmで変動）、これは追加のモノマーが徐々に補充されることにより直径が広くなると考えられている。
【００３２】
パーフォリン変種は、天然パーフォリンポリペプチドまたはその断片に少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示す可能性がある。また、変種が、天然パーフォリンポリペプチドまたはその断片に少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９８％同一、さらにより好ましくは少なくとも９９％同一、または最も好ましくは９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む実施形態も考えられる。同一率は、眼により点検および数学的な計算により決定できる。提供される天然に存在する変種およびその断片の中には、天然の生物活性または実質的なその等価体を保持する、天然パーフォリン変種が存在する。また、本明細書において、実質的に生物活性を全く有さない天然に存在する変種も提供される。これらの変種はまた、既知のＨＬＨまたはＦＨＬ変異から得られても、あるいは、経験上または推論上のものでもよい。
【００３３】
パーフォリン変種は、好ましくは、天然型パーフォリンに実質的に相同であるが、１個以上の欠失、挿入または置換のために天然型とは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドを含む。好ましい実施形態は、天然配列と比べて、アミノ酸残基の１〜１０個の欠失、挿入、または置換を含むポリペプチドを含む。所与の配列は、例えば、類似の物理化学的特徴を有する残基により置き換えられていてもよい。このような保存的置換の例は、１個の脂肪族残基を別の脂肪族残基と置換、例えばＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａを互いに；１個の極性残基を別の極性残基と置換、例えばＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、またはＧｌｎとＡｓｎの間で；あるいは、１個の芳香族残基を別の芳香族残基と置換、例えばＰｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを互いに、である。他の保存的置換、例えば類似した疎水性特徴を有する全領域の置換は、当該技術分野において公知である。変種は、天然パーフォリンポリペプチドの切断短縮によって作製されてもよい。本発明により包含されるさらなる変種は、脱グリコシル化パーフォリンポリペプチドもしくはその断片、または、天然パーフォリンと比較して多くのグリコシル化を示すポリペプチドが挙げられるがこれに限定されない。また、水和の増えたパーフォリンポリペプチド変種も包含される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、パーフォリンポリペプチドのアミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置き換えられている。好ましい実施形態において、変異は、飽和変異誘発などにより、無作為に、パーフォリンコード配列の全てまたは一部に沿って導入でき、得られた変異体をパーフォリン活性についてスクリーニングし、天然パーフォリンと比べて、同じ、低下、または上昇したパーフォリン活性を示す変種を同定できる。変異誘発後、コードされたタンパク質を組換え発現でき、該タンパク質の活性は、本明細書に記載の方法により決定できる。
【００３４】
好ましくは、パーフォリンポリペプチドの変種は、アゴニスト（模倣体）として、またはアンタゴニストとして機能する。パーフォリンアゴニストは、パーフォリンの活性を増大できるか、または、天然に存在する形態のパーフォリンの生物活性と実質的に同じ、またはその生物活性の部分集合を保持できる。パーフォリンアンタゴニストは、例えば、パーフォリンにより仲介される活性を競合的にモデュレートすることにより、天然に存在する形態のポリペプチドの１種以上の活性を阻害できる。したがって、特定の生物学的作用は、限られた機能を有する変種で処置することにより誘起させることができる。好ましくは、被験者を、天然に存在する形態のパーフォリンの生物活性の部分集合を有する変種で処置すれば、天然に存在する形態のパーフォリンでの処置と比べて、被験者における副作用は少ない。
【００３５】
本明細書で使用した「パーフォリン活性」、「パーフォリンの生物活性」などは、好ましくは、パーフォリンポリペプチドの細胞溶解活性；すなわち、標的細胞膜に結合し、重合して孔のような膜貫通チャネルを形成し、これにより細胞溶解を引き起こす能力を意味する。該活性はまた、顆粒毒素などの他の毒素および他の分子と相乗作用してアポトーシスを誘導する能力も含む。標的細胞は、天然パーフォリンにより溶解されることのできるどのような細胞でもよい。
【００３６】
パーフォリンの生物活性は、標的細胞溶解の測定、標的細胞へのグランザイムＢ分子の送達、標的細胞膜破壊の測定（例えばイオン輸送の変化による）、標的細胞におけるアポトーシスの誘導、小胞輸送の改変、および一般的な標的細胞死の評価が挙げられるがこれに限定されない、当該技術分野において知られている任意の数の手段により当業者により評価できる。標的細胞は、赤血球（ＲＢＣ）であってもよく、したがって、パーフォリン活性を測定する一般的な手段は、ＲＢＣ溶解試験である。それは、任意の有核細胞でもよい。
【００３７】
好ましい実施形態において、変種は、パーフォリン遺伝子の変異である。より好ましくは、変異は、ＨＬＨ、より好ましくは（ＦＨＬ）に罹患した個体において同定されたパーフォリン遺伝子である。
【００３８】
ＨＬＨ、より好ましくは遺伝子的に連関したＦＨＬは、発熱、肝脾腫、および汎血球減少症により臨床的に特徴づけられる、血球貪食リンパ組織球症候群の一群に属する、常染色体劣性形質として遺伝される先天性疾患である。さらに、神経疾患の併発が、一般に、ＨＬＨまたはＦＨＬの経過中に発症し、終末段階では痙攣、脳神経麻痺、失調症、および昏睡を含み得る徴候が出現する（Haddadら、1997）。臨床症状を伴う頻繁に起こる異常には、高トリグリセリド血症、低フィブリノーゲン血症、およびサイトカインレベル上昇（例えばＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−γ）が挙げられる。組織学的には、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびマクロファージが過剰増殖し、脾臓、肝臓、骨髄（ＢＭ）、リンパ節、および中枢神経系などのいくつかの器官へのその浸潤が認められる。様々な組織（特に骨髄および肝臓）における組織球による血球（特に赤血球）の摂取（すなわち血球貪食）および炎症性サイトカインの放出の証拠により、大量の組織壊死、器官不全、および最終的には小児の死亡がもたらされる。臨床的特長（発熱、脾腫大）、臨床検査的特長（血球減少、高トリグリセリド血症、および／または低フィブリノーゲン血症）、および形態学的特長（血球貪食）の組合せは、疾患の診断基準として役立つが、診断は、死後になされることが多く、疾病の診断は困難であることが示唆される。現在では、ＨＬＨおよびより好ましくはＦＨＬは、骨髄移植と化学療法の組合せによってのみ治癒可能である。この処置投与計画は攻撃的でしばしば衰弱させることから、新しい改良された治療戦略を同定する重要性が強調される。ＨＬＨまたはＦＨＬの臨床像は、細胞溶解性リンパ球が、感染病原体を排除できないことから生じると考えられており、これは、ＬＣＭＶに感染したパーフォリンＧＫＯマウス（ウイルス特異的Ｔ細胞の増殖が増加していることと、免疫応答をダウンレギュレートできないことが、傑出した特長である）で観察された病気発生と類似している。パーフォリン依存的細胞傷害性機序が存在しない中で、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、活性化シグナルおよび増殖シグナルを、機能していないリンパ球に提示し続けていると考えられている。この小児疾病の単一の原因の感染因子は依然として画定されていないが、ウイルス感染、特にヘルペス群のウイルス感染（エプシュタイン・バールウイルスおよびサイトメガロウイルス）が、ＦＨＬに罹患する患者において検出されている（Imashukuら、1999）。パーフォリン遺伝子のコード領域の変異は、ＨＬＨまたはＦＨＬの症例の約３０％を占めていることが判明しているが、これにより、欠陥が、パーフォリンの発現または活性化を支配する調節因子のレベルにも存する可能性も軽視されない。
【００３９】
好ましいパーフォリン変異を表１に示し、この表は、ＦＨＬで現在までに同定された変異のいくつかを列挙し、タンパク質のコード配列および機能に影響を及ぼすと予測されるナンセンス変異、ミスセンス変異、およびフレームシフト変異の分布帯の概要を示す。例えば、Ｔｒｐ３７４の変異（これにより中途終止コドンがもたらされる）は、これまでに最も頻繁に報告されている変異である。この残基は、システインリッチＥＧＦドメイン内に位置し、ヒト、マウス、およびラット遺伝子において保存されている。多くの数のミスセンス変異が、３種の全ての種間で保存されている残基に存在し、これは、このような残基が、タンパク質の機能にとって重要であることを示唆する。パーフォリン分子の特定のドメイン内で起こる変異の位置を、図１に示す。特に興味深いのは、ミスセンス変異であり、これは、これらの重要な残基がどのようにパーフォリン機能に関与しているのかを評価する際に価値あることが分かるだろう。
【００４０】
【表４】
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リーダー＝分子のＮ末端のシグナルペプチド。膜貫通＝推定両親媒性αへリックスドメイン。Ｃ２ドメイン＝Uellnerら（1997、Embo J、16:7287-7296）による分子モデリングにより同定されたＣ２カルシウム結合ドメイン。アミノ酸およびヌクレオチド番号は、２１アミノ酸リーダーペプチドを含む。
【００４１】
パーフォリン変異および多型はまた、以下の実施例の章にも詳述されており、Ａ９１Ｖ、Ｎ２５２Ｓ、Ｒ２２５Ｗ、およびＧ４２９Ｅが挙げられる。
【００４２】
特徴づけられたＨＬＨまたはＦＨＬ変異の結果としてここでは編集されている、不活性化ミスセンスパーフォリン変異のカタログは、パーフォリンの分子的機能および細胞的機能への独特な洞察の可能性を与える。仮説的には、パーフォリン機能のこのような欠陥は、ｍＲＮＡ不安定性、タンパク質折りたたみもしくはプロセシングの欠陥、細胞溶解顆粒への輸送の不完全性、またはＣＴＬからの放出の欠陥を含む、数多くのレベルで起こる可能性がある。第二の欠陥のカテゴリーは、ＣＴＬからのパーフォリンの放出の下流に位置づけられるはずであり、カルシウムの結合および付着あるいは脂質二重層への挿入などの機能が関与するか、または、グランザイムＢの欠陥輸送が原因であるはずである。
【００４３】
出願人は、１アミノ酸の置換Ｇｌｙ４２８ＧｌｕおよびＰｒｏ３４４Ｌｅｕがもたらされる、２個のパーフォリン点変異の性質、または保存パーフォリン配列中の等価な位置を位置づけ、初めて、両方の変異した変種が、顆粒のエキソサイトーシスにより放出されることができるという驚くべき発見に到達した。マウスの配列では、変異は、Ｇｌｙ４２８およびＰｒｏ３４４で起こり、一方、ヒトの配列では、変異は、Ｇｌｙ４２９およびＰｒｏ３４５で起こると推定されている。類似の点変異が、他の種のパーフォリン配列でも、パーフォリン配列中の等価なＧｌｙおよび／またはＰｒｏ部分において起こる可能性がある。これらの知見は、これらの変異を有する患者のＣＴＬに観察されたパーフォリンの枯渇は、免疫攻撃中のパーフォリンの放出が調節されていないことに起因することが暗示される。
【００４４】
したがって、好ましい実施形態において、パーフォリンポリペプチド変種は、天然パーフォリンと比べて、生物活性が低下している。さらに好ましい実施形態において、パーフォリンポリペプチド変種は、マウスパーフォリン配列のＧ４２８および／またはＰ３４４、あるいはヒトパーフォリン配列のＧｌｙ４２９および／またはＰｒｏ３４５に等価である、保存パーフォリンポリペプチド配列中のＧｌｙおよび／またはＰｒｏ残基におけるミスセンス変異を含む。さらに好ましい実施形態において、パーフォリンポリペプチド変種は、出願人により、マウスおよびラットの両方のパーフォリンポリペプチドで保存されていることが判明している残基である、ミスセンス変異Ｇ４２８Ｅおよび／またはＰ３４４Ｌを含む。またさらなる好ましい実施形態において、パーフォリンポリペプチド変種は、出願人により、ヒトパーフォリンポリペプチドで保存されていることが判明している残基である、ミスセンス変異Ｇ４２９Ｅおよび／またはＰ３４５Ｌを含む。
【００４５】
さらに好ましい実施形態において、パーフォリン変種は、天然パーフォリンポリペプチドもしくはその断片およびそれに付着した追加のドメインを含む、融合タンパク質であり、ここでの追加のドメインは、天然でも合成でもよい。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、パーフォリンポリペプチドまたはその断片もしくはその変種に付加された、通常、組換えパーフォリンポリペプチドのアミノ末端に付加された、多くのアミノ酸を含む。このような融合タンパク質は、１）組換えパーフォリンポリペプチドの発現増加；組換えパーフォリンポリペプチドの溶解度の上昇；および、アフィニティ精製においてリガンドとして作用することにより、組換えパーフォリンポリペプチドの精製を補助、が挙げられるがこれに限定されない群より選択される目的を果たすことができる。しばしば、タンパク質溶解切断部位が、融合部分と組換えパーフォリンポリペプチドの接続部位に導入され、これにより、融合タンパク質の精製後に、組換えパーフォリンポリペプチドを融合部分から分離することができる。このような酵素およびその同族認識配列には、第Ｘａ因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが挙げられる。典型的な融合タンパク質は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡをそれぞれ標的組換えポリペプチドに融合させる、当業者に既知の融合発現ベクター（例えばｐＧＥＸ、ｐＭＡＬ、およびｐＲＩＴ５）を使用することにより作製され得る。
【００４６】
本明細書に使用した「断片」なる語句は、好ましくは、パーフォリンポリペプチドまたはその変種の一部を意味する。このような断片は、天然パーフォリンポリペプチドまたはその変種の、好ましくは、少なくとも１アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基を含む。
【００４７】
さらに好ましい実施形態において、パーフォリンポリペプチドの断片は、免疫原性または抗原性領域を含んでいてもよい。それ故、断片は、免疫グロブリンにより認識（すなわち特異的に結合）される、パーフォリンポリペプチドまたはその変種の一部を含んでいてもよい。
【００４８】
さらに好ましい実施形態において、パーフォリンポリペプチドの断片は、生物学的に活性なＣ末端ドメインからなっていてもよい。このような断片は、一般に、本明細書で先に記載したパーフォリン活性の同定における当業者に公知の技術を使用して同定してもよい。パーフォリンポリペプチド断片はまた、パーフォリン特異的抗体および／または抗血清と反応する能力について断片をスクリーニングすることにより同定してもよい。抗血清および抗体は、パーフォリンポリペプチドまたはその変種またはその断片に特異的に結合した場合（すなわち、それらが酵素結合免疫吸着アッセイ［ＥＬＩＳＡ］または他のイムノアッセイにおいてパーフォリンと反応し、関連のないポリペプチドとは検出可能な程までに反応しない場合）、「パーフォリン特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書に記載のように、公知の技術を使用して調製できる（例えば、HarlowおよびLane、Antibodies: A Laboratory Manual、コールドスプリングハーバーラボラトリー、1988を参照）。
【００４９】
パーフォリン分子はまた、本明細書に記載のように、ヌクレオチド配列がパーフォリンポリペプチドまたはその断片もしくはその変種をコードしているような、天然に存在するか、または合成の核酸分子を包含する。「核酸分子」なる語句は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、並びに、例えばヌクレオチド類似体の使用により作成されるＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体を含む。核酸分子は、一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５０】
本明細書に使用した「天然に存在する」核酸分子は、好ましくは、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば天然タンパク質をコードする）ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子を意味する。
【００５１】
本明細書に使用した「遺伝子」および「組換え遺伝子」なる語句は、好ましくは、パーフォリンポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含み、さらに非コード調節配列およびイントロンを含む可能性のある核酸分子を意味する。
【００５２】
例えば、パーフォリン核酸分子は、好ましくは、図１に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９１％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％またはそれ以上相同である、ヌクレオチド配列を含む。参照配列（例えば図１）より長いかまたは長さが同じである核酸分子の場合、全長の参照配列を用いて比較する。単離核酸分子が、参照配列より短い場合、例えば図１に示された配列より短い場合、同じ長さの参照配列の区域を用いて比較する（相同性計算により必要とされるループは全て排除する）。パーフォリン核酸分子は、ヒト、ラット、マウス、トリ、ウマ、および下等生物（例えば細菌）が挙げられるがこれに限定されない任意の種から得られることができる。
【００５３】
細胞に、当業者に既知の任意の手段により、本発明に記載のレトロウイルスベクターを用いてトランスフェクト（または形質導入）してもよい。このような手段には、電気穿孔法、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈降法などが挙げられるがこれに限定されない。
【００５４】
レトロウイルスベクター
本発明は、パーフォリン、その断片またはその変種を最終的に発現する細胞をトランスフェクトするために、パーフォリン、その断片またはその変種をコードする核酸分子を「運ぶ」ためのレトロウイルスベクターの使用を活用する。したがって、本発明のまたさらなる態様において、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞における、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターが提供される。
【００５５】
本明細書に使用した「レトロウイルスベクター」なる語句は、好ましくは、レトロウイルス複製サイクルの特長（例えば、高い感染効率、および、ウイルスにより伝達される情報が標的細胞染色体へと安定に同一線状に組込まれる）を活用した遺伝子導入ビヒクルを意味する。
【００５６】
本発明に有用なレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス、ネズミ幹細胞ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖肉腫ウイルス、および乳癌ウイルスが挙げられるがこれに限定されない、任意の数のレトロウイルスから得られる。好ましい実施形態において、レトロウイルスプラスミドベクターは、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターまたはその誘導体である。より好ましくは、特にヒトまたはマウス初期細胞のトランスフェクションに適用する場合、レトロウイルスプラスミドベクターは、ｐＬＸＳＮである（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ２８２４８）。
【００５７】
レトロウイルスベクターは、好ましくは、１個以上のプロモーターを含む。使用できる適切なプロモーターは、レトロウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Millerら、Biotechniques、Vol.7、No.9、980-990(1989)に記載）、または任意の他のプロモーター（例えば、細胞性プロモーター、例えば真核細胞プロモーター（ヒストン、pol III、およびβ−アクチンプロモーターが挙げられるがこれに限定されない））が挙げられるがこれに限定されない。使用できる他のウイルスプロモーターは、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、およびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられるがこれに限定されない。適切なプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教義から当業者には明らかであろう。
【００５８】
パーフォリンポリペプチドまたはその断片もしくはその変種をコードする核酸配列は、好ましくは、適切なプロモーターの制御下に置かれている。使用できる適切なプロモーターには、アデノウイルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロモーター；または異種プロモーター、例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；誘導性プロモーター、例えばＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンプロモーター；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えばヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；Ｐ−アクチンプロモーター；およびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられるがこれに限定されない。該プロモーターはまた、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードする遺伝子を制御する天然プロモーターであってもよい。
【００５９】
さらに好ましい実施形態において、本発明のレトロウイルスベクターはさらに、形質導入細胞を容易に選択できるように、適切なマーカー遺伝子（本明細書では「選択マーカー」と呼ばれる）を含む。好ましくは、選択マーカーは、形質転換細胞に、抗生物質耐性を付与する薬物耐性遺伝子、形質転換細胞にその検出のための酵素活性を付与するリポーター遺伝子、または当該技術分野において既知の方法により形質転換細胞において検出され得る不活性タンパク質である。例えば、選択マーカーは、紫外線光の下で光学顕微鏡による可視化により形質転換細胞における発現時に検出できる、緑色蛍光タンパク質であってもよい。さらなる例において、Ｎ２／ＺｉｐＴＫＮＥＯベクター（TKNEO、1991、Blood、78:310-317）およびＰＭ５ｎｅｏベクター（1995、Exp.Hematol.23:630-638）の両方が、ネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ）をその選択マーカーとして含む。したがって、これらのベクターでトランスフェクトされた細胞は、遺伝子産物により不活性化される抗生物質（ネオマイシン、Ｇ４１８など）に対する耐性により認識される。
【００６０】
パッケージング細胞
好ましい実施形態において、本発明は、レトロウイルスベクターを「パッケージング細胞」にトランスフェクトするさらなるステップを含む。したがって、本発明のまたさらなる態様において、細胞におけるパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の組換え発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされたパッケージング細胞が提供される。好ましくは、パッケージング細胞は、宿主細胞をさらに感染して組換えパーフォリンを発現させることのできる、感染性粒子を産生できる。
【００６１】
したがって、本発明のさらなる態様において、細胞におけるパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターを有するレトロウイルス粒子が提供される。
【００６２】
本明細書に使用した「パッケージング細胞」なる語句は、好ましくは、組換えウイルスベクターに欠失している要素を提供することにより、感染性組換えウイルスの産生に必要な要素を含む細胞を意味する。典型的には、このようなパッケージング細胞は、ウイルス構造タンパク質（例えばｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を発現できる１個以上の発現カセットを含むが、パッケージングシグナル（例えばpsi）は含んでいない。したがって、パッケージング細胞は、それ自体は空のビリオン粒子しか形成できない。この一般的な方法では、レトロウイルスベクターをパッケージング細胞に導入し、これにより「産生細胞」を創出する。結果として、この産生細胞は、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードするポリヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクターを含むビリオン粒子を製造する。
【００６３】
パッケージング細胞の使用により、複製能のあるウイルスが産生されないことを確実にすることができ、さもなくば宿主内で制御されない感染が起こり得る。パッケージング細胞は、ウイルスキャプシド（ウイルス粒子の核タンパク質コアまたは核酸を覆うタンパク質コート）をコードするタンパク質を発現し、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、パッケージング細胞ゲノム内の異なる部位に位置する。これは、相対的に起こる可能性のある組換え事象を防ぐことができ、さもなくば、ベクターＤＮＡが、複製能のあるレトロウイルスの産生に必要な遺伝子を拾い上げることが可能となる。好ましくは、パッケージング細胞株は、感染できるが、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードするＲＮＡ、そのプロモーター、およびＬＲＴ（パーフォリン遺伝子の適切な発現を可能とする）のみしか含まないレトロウイルスを産生するだろう。
【００６４】
先に記載したレトロウイルスベクター構造物を使用するに適したパッケージング細胞は容易に調製でき（例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９５／３０７６３号および第ＷＯ９２／０５２６６号を参照）、これを使用して、組換えベクター粒子の産生のための産生細胞株（ベクター細胞株とも呼ばれる）を創出できる。本発明の特に好ましい実施形態では、パッケージング細胞株は、ヒト（例えばＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作成され、これにより、ヒト血清中での不活性化に対しても生き延びることのできる組換えレトロウイルスの産生が可能となる。
【００６５】
パッケージング細胞の例には、ＰＧ１３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０６８５）、ＰＡ３１７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９０７８）、米国特許第５，２７８，０５６号に記載の細胞株、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４２）、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４１）、２９３Ｔ、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７．psi．−２、．psi−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、．psi．ＣＲＥ、．psi．ＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびMiller、Human Gene Therapy、1:5-14(1990)に記載のＤＮＡ細胞株が挙げられるがこれに限定されず、これは、その全体を参考文献として本明細書に取り込む。好ましくは、パッケージング細胞株は、ＨＥＫ２９３細胞から得られる。さらにより好ましくは、パッケージング細胞は、ＨＥＫ２９３  １０１細胞から得られる。
【００６６】
レトロウイルスベクターは、当該技術分野で知られている任意の手段により、パッケージング細胞を形質導入できる。このような手段には、電気穿孔法、リポソームの使用、およびＣａＰＯ４沈降法が挙げられるがこれに限定されない。
【００６７】
好ましいパッケージング細胞および産生細胞において、毒性エンベロープタンパク質配列およびヌクレオキャプシド配列は、細胞に全て安定に組み込まれている。しかし、これらの１個以上の配列はまた、エピソーム形態でも存在し得、エピソームから遺伝子発現が起こる可能性もある。
【００６８】
好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、第二世代のパッケージング細胞株である。別の好ましい実施形態において、パッケージング細胞株は、第三世代のパッケージング細胞株である。
【００６９】
プロウイルス（パッケージングシグナルが欠失している）を含む単純なパッケージング細胞株では、組換えにより、望ましくない複製能のあるウイルスが急速に産生されることが判明した。安全性を向上するために、プロウイルスの３’ＬＴＲが欠失している、第二世代の細胞株を産生した。このような細胞では、野生型ウイルスを産生するためには２回の組換えが必要であろう。さらなる改良は、ｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子の、別々の構造物への導入、いわゆる第三世代パッケージング細胞株を含む。これらの構造物は、トランスフェクション中の組換えを防ぐために連続的に導入される。
【００７０】
分裂構造物である第三世代の細胞株では、コドンを変化させることにより、組換えをさらに減少させることができる。遺伝子コードの重複性に基づいたこの技術は、別々の構造物の間の、例えば、ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖオープンリーディングフレーム中のオーバーラップ領域間の相同性を減少させることを目的とする。
【００７１】
パッケージング細胞株は、被包に必要な遺伝子産物を提供するのに有用であり、高力価ベクター粒子産生のための膜タンパク質を提供する。パッケージング細胞は、インビトロで培養される細胞、例えば組織培養細胞株であってもよい。適切な細胞株には、哺乳動物細胞、例えばネズミ線維芽細胞に由来する細胞株またはヒト細胞株が挙げられるがこれに限定されない。好ましくは、パッケージング細胞株は、ヒト細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＴＥ６７１、またはＨＴ１０８０である。
【００７２】
または、パッケージング細胞は、処置すべき個体から得られる細胞、例えば、単球、マクロファージ、血球、または線維芽細胞であってもよい。該細胞は、個体から単離し、パッケージング成分およびベクター成分を生体外に投与して、自己パッケージング細胞を再投与してもよい。
【００７３】
好ましくは、パッケージング細胞株は、本明細書に記載した、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードするポリヌクレオチド配列を含む、感染性レトロウイルスベクター粒子（ビリオン）を産生する。その後、このようなレトロウイルスベクター粒子を使用して、インビトロまたはインビボで、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードするポリヌクレオチド配列を発現させる目的で宿主細胞に形質導入してもよい。したがって、本発明のさらなる態様において、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターを有するレトロウイルス粒子が提供される。
【００７４】
宿主細胞
本発明のさらなる態様において、細胞においてパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の組換え発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞または細胞株が提供される。
【００７５】
好ましくは、宿主細胞または細胞株は、胚幹細胞、胚癌細胞、造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞、気管支上皮細胞、および免疫細胞を含む群より選択される任意の種の真核細胞または細胞株である。宿主細胞はまた、細菌などの下等生物の細胞であってもよい。好ましくは、真核細胞は、好塩基球、好酸球、リンパ球、好中球、単球、およびナチュラルキラー細胞を含む群より選択される免疫細胞である。より好ましくは、免疫細胞は、好塩基球であり、さらにより好ましくは免疫細胞は、ラット好塩基性白血病（ＲＢＬ）細胞である。
【００７６】
細胞組成物
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞組成物を提供する。本明細書で使用した「細胞組成物」は、好ましくは、インビトロでの分散細胞の調製物を意味する。培養細胞の場合、被験者の細胞の少なくとも１０％およびより好ましくは５０％の調製物からなる。または、細胞組成物は、先に述べたレトロウイルス発現ベクターを投与された被験者（インビボまたは生体外）から得られた生物学的組織を意味していてもよい。本明細書で使用した「被験者」は、好ましくは、哺乳動物、例えばヒト、または非ヒト動物（ウマ、ウシ、ヤギ、ラット、またはマウスが挙げられるがこれに限定されない）を意味する。
【００７７】
単離組換えパーフォリンおよびその断片、その変種、またはその変異形態
さらなる態様において、本発明は、本明細書に記載した方法により産生される組換えパーフォリン分子を提供する。好ましい実施形態において、組換えパーフォリン分子は、本明細書に記載した組換えパーフォリンポリペプチドもしくはその断片もしくはその変種、または、該パーフォリンをコードする核酸分子である、単離もしくは精製パーフォリン分子である。さらに好ましい実施形態は、組換えパーフォリン分子が、先に述べた細胞組成物から単離されたものである。
【００７８】
好ましくは、「単離または精製」パーフォリン分子は、細胞または組織源（これからタンパク質が得られる）に由来する細胞材料または他の混入タンパク質を実質的に含まない。「実質的に含まない」なる語句は、好ましくは、約３０％未満、２０％未満、１０％未満、より好ましくは５％（乾燥重量を基準）未満の非パーフォリン分子（本明細書では「混入分子」とも呼ばれる）を有するパーフォリンポリペプチドの調製物を意味する。パーフォリンポリペプチドはまた、好ましくは、培養培地を実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容量の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満を示す。
【００７９】
「単離または精製パーフォリン分子」なる語句はまた、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたパーフォリン核酸分子への言及でもある。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離」なる語句は、ゲノムＤＮＡが天然に会合している染色体から分離された核酸分子を含む。好ましくは、「単離」核酸は、核酸が得られる生物のゲノムＤＮＡにおいて核酸に天然にフランキングしている配列（すなわち、核酸の５’および／または３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、単離核酸分子は、核酸が得られる細胞のゲノムＤＮＡにおいて核酸分子に天然にフランキングしている５’および／または３’ヌクレオチド配列を約５ｋｂ未満、４ｋｂ未満、３ｋｂ未満、２ｋｂ未満、１ｋｂ未満、０．５ｋｂ未満、または０．１ｋｂ未満含む可能性がある。さらに、「単離」核酸分子、例えばｃＤＮＡ分子は、組換え技術により産生される場合、他の細胞材料または培養培地を実質的に含まない可能性があるか、あるいは、化学合成される場合、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。
【００８０】
スクリーニングアッセイ
本発明のまたさらなる態様において、パーフォリンの発現および／または活性をモデュレートする化合物をスクリーニングする方法が提供され、該方法は、
組換えパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動するレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を得るか、あるいは、パーフォリン試料を得；
該細胞またはパーフォリンを、試験化合物にさらし；そして
該試験化合物が、該パーフォリンに結合するか、および／または該パーフォリンの発現および／または活性をモデュレートするかどうか決定するステップを含む。
【００８１】
好ましくは、スクリーニングアッセイは、本発明のパーフォリン分子を発現する宿主細胞を含む。このような宿主細胞は、好ましくは、本明細書に記載した、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、またはＥ．ｃｏｌｉから得られる。その後、パーフォリン分子を発現している細胞（または発現されるパーフォリンポリペプチドを含む細胞画分）を、試験化合物にさらし、パーフォリン分子への結合、あるいは、パーフォリン発現および／または活性のモデュレートを観察する。
【００８２】
さらに好ましい実施形態において、パーフォリン活性をモデュレートする化合物をスクリーニングする方法が提供され、該方法は、
組換えパーフォリンまたはその断片もしくはその変種の発現を駆動するレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を得るか、あるいは、パーフォリン試料を得；
該宿主細胞またはパーフォリンを、試験化合物および標的細胞にさらし；そして
該試験化合物が、該標的細胞に対する、該パーフォリンの活性をモデュレートするかどうかを決定するステップを含む。
【００８３】
標的細胞は、宿主細胞と試験化合物の混合物に直接さらしてもよい。または、標的細胞は、混合物から宿主細胞を除去した後に、試験化合物と、宿主細胞により産生された組換えパーフォリンとの混合物にさらしてもよい。組換えパーフォリンの活性の決定には、宿主細胞が絶えず存在している必要はない。
【００８４】
スクリーニングアッセイはまた、パーフォリンに対する試験化合物の効果を試験するために、好ましくは単離形態のパーフォリン試料を使用してもよい。該化合物は、パーフォリン分子に直接作用することによりパーフォリン活性を阻害する可能性があるか、あるいは、標的細胞でパーフォリンを遮断してパーフォリンの作用を妨害する可能性がある。いずれにしても、パーフォリンの直接的な活性が、標的細胞に対して効果を及ぼさないようにするためにパーフォリンが標的化される。
【００８５】
スクリーニングアッセイにより同定された化合物は、好ましくは、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種に結合し、パーフォリンの発現および／または活性を活性化（アゴニスト作用）または阻害（アンタゴニスト作用）する。好ましくは、同定された化合物（例えば天然または合成タンパク質または薬物）は、天然パーフォリンの活性を増加（アゴニスト作用）および／または減少（アンタゴニスト作用）させる。
【００８６】
本発明の代替的な態様において、パーフォリンの発現および／または活性をモデュレートする化合物をスクリーニングする方法が提供され、該方法は、
パーフォリンにより溶解されることのできる標的細胞を得；
パーフォリン試料を得；
該細胞またはパーフォリンを、試験化合物にさらし；そして
標的細胞に対するパーフォリンの活性がモデュレートされるように、該試験化合物が標的細胞をモデュレートするかどうかを決定するステップを含む。
【００８７】
パーフォリンの活性に影響を及ぼす化合物をスクリーニングするこの代替的な手段は、標的細胞、標的細胞上の受容体、またはパーフォリンが標的化される標的細胞の表面上のリガンドなどの相互作用分子をモデュレートでき、これにより細胞が、パーフォリンに対してより応答性が低くなるか、または、パーフォリンに対してより応答性が高くなる、化合物を同定することに指向される。このスクリーニング法は、パーフォリンそれ自体は変化させないが、パーフォリンが作用する標的細胞または受容体を変化させる化合物を同定する。パーフォリンは、任意の手段により得られる単離パーフォリンとして提供されてもよい。好ましくは、本明細書に記載の方法により産生される組換えパーフォリンとして提供される。
【００８８】
本明細書に使用した「パーフォリン活性」、「パーフォリンの活性」などの語句は、好ましくは、パーフォリンポリペプチドの細胞溶解活性；すなわち、標的細胞膜に結合し、重合して孔のような膜貫通チャネルを形成し、これにより細胞溶解を引き起こす能力を意味する。標的細胞は、天然パーフォリンにより溶解されることのできるどのような細胞であってもよい。好ましい実施形態において、該スクリーニングアッセイにより同定される化合物は、本明細書で先に記載した１種以上のパーフォリン活性を活性化または阻害する。
【００８９】
本明細書で使用した「パーフォリンの発現」、「パーフォリン発現」などの語句は、好ましくは、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードするポリヌクレオチドの集合（concentration）を意味するか、あるいは、パーフォリンポリペプチドまたはその断片もしくはその変種の集合を意味していてもよい。
【００９０】
パーフォリンの活性は、標的細胞溶解の測定、標的細胞へのグランザイムＢ分子の送達、標的細胞膜破壊の測定（例えばイオン輸送の変化による）、標的細胞におけるアポトーシスの誘導、小胞輸送の改変、および一般的な標的細胞死の評価が挙げられるがこれに限定されない、当該技術分野において知られている任意の数の手段により当業者により評価できる。
【００９１】
パーフォリンの発現は、例えばノーザンブロット解析または定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による、好ましくは宿主細胞により発現されるパーフォリンをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の測定、並びに、生物学的試料中のパーフォリン濃度はパーフォリン活性レベルと直接に正比例（しかし必ずしも線形ではない）しているので、宿主細胞中のパーフォリンポリペプチドの測定、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ウェスタンブロット、または本明細書で先に記載したパーフォリン活性の間接的な決定が挙げられるがこれに限定されない、当該技術分野において知られている任意の数の手段により当業者により評価され得る。
【００９２】
別の態様において、パーフォリンの発現および／または活性をモデュレートする、スクリーニングアッセイにより同定された化合物が提供される。これらの化合物は、数多くの化学分類を包含するが、典型的にはそれらは有機分子、好ましくは、分子量５０ダルトン超および約２，５００ダルトン未満の小さな有機化合物である。このような化合物は、タンパク質との構造的相互作用（特に、水素結合）に必要とされる官能基を含むことができ、典型的には、少なくとも１個のアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは少なくとも２個の化学官能基を含む。該化合物はまた、１個以上の上記の官能基で置換された、環式炭素または複素環構造および／または芳香族もしくは多芳香族構造を含んでいてもよい。該化合物はまた、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、またはその組合せが挙げられるがこれに限定されない生体分子を含んでいてもよい。しかし、本発明は、これらの化合物に限定されない。
【００９３】
該化合物には、１）ペプチド、例えば水溶性ペプチド（Ｉｇの尾が付いた融合ペプチドを含む）、並びにランダムペプチドライブラリーのメンバー（例えば、Lamら、1991、Nature 354:82-84；Houghtenら、1991、Nature 354:84-86を参照）、並びにＤおよび／またはＬ立体配置アミノ酸からなるコンビナトリアルケミストリから得られた分子ライブラリー；２）リンペプチド（例えば、ランダムおよび部分的に変性した指向されたリンペプチドライブラリーのメンバー、例えば、Songyangら、1993、Cell 72:767-778を参照）；３）抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ、および単鎖抗体、並びに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ発現ライブラリー断片、および抗体のエピトープ結合断片）；並びに、４）小さな有機および無機分子が挙げられるがこれに限定されない。
【００９４】
該化合物は、合成または天然化合物のライブラリーなどであるがこれに限定されない、様々な入手源から得ることができる。合成化合物ライブラリーは、例えば、Maybridge Chemical Co.（Trevillet、コーンウォール、英国）、Comgenex（プリンストン、ＮＪ州）、Brandon Associates（メリマク、ＮＨ州）、およびMicrosource（ニューミルフォード、コネチカット州）から商業的に入手してもよい。珍しい化学物質ライブラリーは、Aldrich Chemical Company,Inc.（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から入手できる。細菌、真菌、植物、または動物抽出液を含む天然化合物ライブラリーは、例えば、Pan Laboratories（ボセル、ワシントン州）から入手できる。さらに、ランダムオリゴヌクレオチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダム合成および指向合成のために、数多くの手段を利用できる。
【００９５】
または、細菌、真菌、植物、および動物の抽出液の形態の天然化合物ライブラリーを作成してもよい。分子ライブラリーの合成法は、容易に入手できる（例えば、DeWittら、1993、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6909；Erbら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422；Zuckermannら、1994、J.Med.Chem.37:2678；Choら、1993、Science 261:1303；Carellら、1994、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059；Carellら、1994、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061；および、Gallopら、1994、J.Med.Chem.37:1233を参照）。さらに、天然または合成化合物ライブラリーおよび化合物は、容易に、慣用の化学的、物理的および生化学的手段を通じて改変でき（例えば、Blondelleら、1996、Trends in Biotech.14:60）、これを使用してコンビナトリアルライブラリーを作成できる。別のアプローチでは、以前に同定された薬理学的物質を、指向またはランダムな化学的改変、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化にかけることができ、該類似体を、パーフォリンモデュレート活性についてスクリーニングできる。
【００９６】
コンビナトリアルライブラリーを作成するための数多くの方法が当該技術分野において知られており、これには、生物学的ライブラリー；空間的に指定可能な平行固相または液相ライブラリーを含む方法；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；および、アフィニティクロマトグラフィー選択を使用した合成ライブラリー法が挙げられる。生物学的ライブラリーアプローチは、ポリペプチドまたはペプチドのライブラリーに限定されるが、他の４種のアプローチは、ポリペプチド、ペプチド、非ペプチドオリゴマー、または小さな分子化合物ライブラリーにも適用可能である（K.S.Lam、1997、Anticancer Drug Des.12:145）。
【００９７】
化合物が共通の結合部位において競合的に結合するかどうかを決定するために、当該技術分野において一般に知られている方法により溶液中でライブラリーをスクリーニングしてもよい。このような方法は、溶液中（例えば、Houghten、1992、Biotechniques 13:412-421）、またはビーズ上（Lam、1991、Nature 354:82-84）、チップ上（Fodor、1993、Nature 364:555-556）、細菌または胞子上（Ladner 米国特許第５，２２３，４０９号）、プラスミド上（Cullら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1865-1869）、またはファージ上（ScottおよびSmith、1990、Science 249:386-390；Devlin、1990、Science 249:404-406；Cwirlaら、1990、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 97:6378-6382；Felici、1991、J.Mol.Biol.222:301-310よびLadner、米国特許第５，２２３，４０９号）でライブラリーをスクリーングすることを含み得る。
【００９８】
様々な他の試薬もスクリーニングアッセイに含めてもよい。これらは、最適なタンパク質間の結合を促進し、および／または、非特異的またはバックグラウンド相互作用を減少させるために使用される、塩、中性タンパク質（例えばアルブミン、界面活性剤など）のような試薬を含む。アッセイ効率を向上する試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などを使用してもよい。必要な結合をもたらす成分を任意の順序で加える。最適な活性を促進する任意の温度で、典型的には４℃〜４０℃でインキュベートを行なう。インキュベート時間は、好ましくは、最適な活性が得られるように選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするように最適化されていてもよい。通常、０．１〜１時間で十分である。好ましくは、複数のアッセイ混合物を平行して様々な試験物質濃度を用いて行ない、これらの濃度に対する様々な応答を得る。典型的には、これらの濃度のうち１つを陰性対照として、すなわち、０濃度または検出レベルより下で使用する。
【００９９】
既知の薬学的に活性な化合物に対する模倣体の設計もまた、「リード」化合物に基づいた医薬品の開発への既知のアプローチである。これは、活性化合物の合成が困難または費用が高くつく場合、あるいは、特定の投与法には不適切である場合（例えば、ペプチドは消化管中のプロテアーゼにより急速に分解される傾向があるため、経口組成物用には一般に不適切な有効物質である）、望ましい場合がある。模倣体の設計、合成および試験は、一般に、標的特性に関する分子の大規模なスクリーニングを避けるために使用される。
【０１００】
模倣体を設計する場合、第一に、標的特性を決定する際に決定的および／または重要である化合物の特定の領域を決定することが望ましい。ペプチドの場合、これは、ペプチド中のアミノ酸残基を体系的に変化させることにより（例えば各残基を次々と置き換えることにより）実施できる。該化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基は、その「ファルマコフォア」として知られる。
【０１０１】
一旦ファルマコフォアが判明すると、その構造を、その物理的特性（例えば立体化学、結合、サイズ、および／または荷電）にしたがって、一連の入手源からのデータ（例えば、分光学的技術、Ｘ線回折データ、およびＮＭＲ）を使用してモデリングする。コンピューター解析、類似性マッピング（原子間の結合よりもむしろ、ファルマコフォアの荷電および／または容量をモデリングする）および他の技術を、このモデリング法に使用できる。
【０１０２】
このアプローチの変法において、該化合物の３次元構造およびその結合対がモデリングされる。これは、該化合物および／または結合対が結合時にコンフォメーションを変化させる場合に特に有用である可能性があり、これによりモデルは模倣体の設計においてこれを考慮に入れることができる。
【０１０３】
その後、鋳型分子を選択し、ファルマコフォアを模倣した化学基を鋳型に移植できる。鋳型分子およびその上に移植された化学基は簡便に選択でき、よって、模倣体は合成し易く、薬理学的に許容されるようであり、インビボで分解せず、リード化合物の生物学的活性を保持している。その後、見出される模倣体をスクリーニングして、標的特性を示す程度、またはどの程度まで標的を阻害するかを確認する。その後、さらなる最適化または改変を行ない、インビボまたは臨床試験のための１個以上の最終模倣体に到達することができる。
【０１０４】
医薬組成物
本発明のまた別の態様において、本明細書に記載の組換えパーフォリン分子、および／または本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定されたアゴニストまたはアンタゴニスト化合物（本明細書では「活性化合物」とも呼ばれる）を、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤と共に含む医薬組成物が提供される。
【０１０５】
本発明の医薬組成物は、単独で使用しても、または、他の化合物（例えば治療化合物）と併用してもよい。
【０１０６】
このような組成物は、典型的には、組換えパーフォリン、パーフォリンポリペプチド、またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルス発現ベクターでトランスフェクトされた細胞または生物学的組織、該パーフォリンをコードする核酸分子、あるいはパーフォリン特異的抗体を、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、希釈剤、および／または補助剤と共に含む。本明細書で使用した「薬学的に許容されうる担体」なる語句は、医薬投与に適合した、好ましくは、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含む。補助活性化合物もまた、組成物中に取り込んでもよい。
【０１０７】
医薬組成物は、その目的の投与経路に適合性であるように製剤化される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を含む。非経口、皮内、または皮下適用のために使用される溶液剤または懸濁液剤は、以下の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用水、食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩、および張力調整剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整できる。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数回用量のバイアルに封入することができる。
【０１０８】
注射使用に適した医薬組成物は、無菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および、無菌注射溶液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。静脈内投与用の適切な担体は、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ＮＪ州）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、該組成物は無菌でなければならず、容易にシリンジが動く程度まで流動性とすべきである。製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して防御されていなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、または液状ポリエチレングリコールなど）およびその適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持により、または界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持できる。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを取り込むことにより達成できる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、またはソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射組成物の吸収時間延長は、組成物中に、吸収を遅延させる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含めることによりもたらすことができる。
【０１０９】
無菌注射溶液は、適切な媒体中に、必要な量の活性化合物を、必要とされる場合には、先に列挙した成分１種または該成分の組合せと共に取り込み、その後、滅菌ろ過することにより調製できる。一般的に、分散液は、基礎的な分散媒体および先に列挙した中の必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに、活性化合物を取り込むことにより調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、以前に滅菌ろ過したその溶液から、活性成分粉末と任意の追加の所望の成分が得られる。
【０１１０】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤と共に取り込むことができ、錠剤、トローチ剤、またはカシェ剤、例えばゼラチンカプセル剤の形態で使用できる。経口組成物はまた、うがい薬として使用するための液状担体を使用して調製できる。薬学的に適合性の結合剤および／または補助材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、または類似の性質をもつ化合物：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントガム、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル（Primogel）、またはコーンスターチ；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Sterote）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；あるいは、芳香剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ芳香を含むことができる。
【０１１１】
吸入による投与のために、該化合物は、適切な噴射剤（例えば、二酸化炭素などのガス）を含む加圧容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからエアゾルスプレーの形態で送達される。
【０１１２】
全身投与もまた、経粘膜または経皮手段により行なうことができる。経粘膜または経皮投与では、浸透する障壁に適した浸透剤が、製剤中に使用される。このような浸透剤は、一般に当該技術分野において知られており、例えば、経粘膜投与では、洗浄剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔内スプレーまたは坐剤を用いて行なうことができる。該化合物は、坐剤（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの慣用の坐剤基剤を用いる）または直腸送達のための持続浣腸の形態で調製できる。
【０１１３】
経皮投与では、活性化合物は、当該技術分野において一般に知られている、軟膏、ザルベ、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１１４】
１つの実施形態において、活性化合物は、生体からの急速な排除から化合物を防御する担体、例えば、放出制御製剤（インプラントおよびミクロカプセル化送達システムを含む）を用いて調製される。生分解性で生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸を使用できる。このような製剤の調製法は、当業者には明らかであろう。材料はまた、Alza社およびNova Pharmaceuticals,Inc.から商業的に入手できる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を用いて感染細胞に標的化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に許容されうる担体としても使用できる。これらは、当業者に既知の方法にしたがって、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載のように調製できる。
【０１１５】
投与し易くするためと用量を均一にするために、用量単位形態で経口または非経口組成物を製剤化することが有利である。本明細書で使用する「用量単位形態」は、好ましくは、処置される被験者のための単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し、１単位は、必要な薬学的担体と共に、所望の治療効果を生じるように計算された予め決定された量の活性化合物を含む。
【０１１６】
このような化合物の毒性および治療効力は、例えば、ＬＤ５０（個体群の５０％に対して致命的である用量）およびＥＤ５０（個体群の５０％において治療的に効果がある用量）を決定するための、細胞培養液または実験動物における標準的な薬学的手順により決定できる。毒性と治療効果の用量比は、治療係数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現できる。高い治療係数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞に対する傷害の可能性を最小限にし、それにより副作用を低減するために、このような化合物を罹患組織部位に標的化する送達システムの設計には注意を払うべきである。
【０１１７】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用する一連の用量を調合する際に使用できる。用量は、好ましくは、殆どまたは全く毒性を伴わないＥＤ５０を含む循環中濃度の範囲内である。用量は、使用する用量形態および使用する投与経路に応じて、この範囲内で変動する可能性がある。本発明の方法に使用される任意の化合物において、治療有効用量は、最初は、細胞培養アッセイから推定できる。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養液中で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環中血漿中濃度範囲を達成するように調合されていてもよい。このような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーにより測定してもよい。
【０１１８】
個体の有効用量を決定する別の例では、試験被験者の血清中の「遊離」および「結合」化合物のレベルを直接アッセイできる。このようなアッセイは、分子刷り込み技術を通して創造された抗体模倣体および／または「バイオセンサー」を使用し得る。パーフォリン活性をモデュレートできる化合物は、鋳型または「刷り込み分子」として使用され、触媒試薬を用いた重合の前に、重合性モノマーを空間的に構築する。その後の刷り込み分子の除去により、化合物の反復「ネガティブイメージ」を含むポリマーマトリックスが残り、生物学的なアッセイ条件下で分子に選択的に再結合できる。この技術の詳細な概説は、Ansell,R.ら（1996）Current Opinion in Biotechnology 7:89-94およびShea,K.J.（1994）Trends in Polymer Science 2:166-173に見出すことができる。このような「刷り込まれた」親和性マトリックスは、リガンド結合アッセイにかけることができ、これにより、固定モノクローナル抗体成分は、適切な刷り込みマトリックスにより置き換えられる。このような該マトリックスの使用例は、Vlatakis,G.ら（1993）Nature 361:645-647に見出すことができる。アイソトープ標識の使用により、パーフォリンの発現または活性をモデュレートする化合物の「遊離」濃度を容易にモニタリングでき、ＩＣ５０の計算に使用できる。このような「刷り込まれた」親和性マトリックスはまた、蛍光基（標的化合物の局所的かつ選択的な結合時に、その光放射特性は変化しこれにより測定可能となる）を含むように設計することができる。これらの変化は、適切な光ファイバー装置を使用してリアルタイムで容易にアッセイでき、それにより、試験被験者における用量を、その個々のＩＣ５０に基づいて迅速に最適化することが可能となる。このような「バイオセンサー」の基本的な例は、Kriz,D.ら（1995）Analytical Chemistry 67:2142-2144に考察されている。
【０１１９】
本明細書に定義した、治療的に有効な量（すなわち有効用量）の組換えパーフォリン分子は、好ましくは、体重１kgあたり約０．００１〜３０mg、より好ましくは体重１kgあたり約０．０１〜２５mg、さらにより好ましくは体重１kgあたり約０．１〜２０mg、さらにより好ましくは体重１kgあたり約１〜１０mg、２〜９mg、３〜８mg、４〜７mg、または５〜６mgである。該組成物は、１週間に１回、約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、より好ましくは約３〜７週間、さらにより好ましくは約４、５、または６週間投与できる。当業者は、特定の因子（使用する具体的な化合物の活性、被験者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、投与時刻、投与経路、排泄速度、任意の薬物の組合せ、モデュレートすべき発現または活性の程度、疾病または疾患の重症度、以前の処置、並びに存在する他の疾病が挙げられる）が、被験者を効果的に処置するために必要とされる用量および時期に影響を及ぼす可能性があることを認識しているだろう。
【０１２０】
抗体では、好ましい用量は、一般に、１０mg／kg〜２０mg／kgである。しかし、抗体を脳で作用させる場合、５０mg／kg〜１００mg／kgの用量が通常適切である。一般に、一部ヒトの抗体および完全にヒトの抗体は、他の抗体よりも、ヒト体内における半減期がより長い。したがって、より少ない用量およびより回数の少ない投与が可能であることが多い。脂質化などの改変を使用して、抗体を安定化させ、取り込みおよび組織への浸透（例えば脳への浸透）を増強させることができる。抗体の脂質化方法は、Cruikshankら（(1997) J.Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193）により記載されている。
【０１２１】
本明細書に記載した本発明の核酸分子は、ベクターに挿入でき、遺伝子療法ベクターとして使用できる。好ましくは、核酸分子は、レトロウイルスベクターに、最も好ましくはレトロウイルスベクターｐＬＸＳＮに挿入される。遺伝子療法ベクターは、被験者に、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号）または定位的注射（例えば、Chenら、（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:3054-3057）により送達できる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子療法ベクターを含むことができるか、または、徐放性マトリックス（この中に遺伝子送達ビヒクルが包埋されている）を含むことができる。または、完全な遺伝子送達ベクターを無傷で組換え細胞から産生できる場合（例えばレトロウイルスベクター）、医薬調製物は、遺伝子送達システムを産生する１種以上の細胞を含むことができる。
【０１２２】
医薬組成物は、投与説明書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサーに含めることができる。
【０１２３】
処置法
本発明のまたさらなる態様において、パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を予防的または治療的に処置する方法が提供される。
【０１２４】
好ましい実施形態において、予防法または治療法は、疾病、疾病の症状、または疾病の素因を治癒、癒す、寛解、軽減、変化、修復、改善、向上、またはそれに影響を及ぼす目的で、治療物質を、本明細書で先に記載したパーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾病、または疾病の症状、または疾病の素因がある被験者に投与するステップを含む。
【０１２５】
さらに好ましい実施形態において、予防法または治療法は、治療物質を、本明細書で先に記載した、パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾病、または疾病の症状、または疾病の素因がある被験者から得られた単離組織または細胞に投与し、そして、疾病、疾病の症状、または疾病の素因を治癒、癒す、寛解、軽減、変化、修復、改善、向上、またはそれに影響を及ぼす目的で、該組織または細胞を、被験者に再導入するステップを含む。
【０１２６】
「治療物質」には、本明細書に記載した、小分子、ペプチド、抗体、リボザイム、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるがこれに限定されない。予防的および治療的な処置法の両方に関して、このような処置は、遺伝薬理学の分野から得られた知識に基づいて、特別にテーラーメイドしても、改変してもよい。本明細書で使用した「遺伝薬理学」は、好ましくは、遺伝子シークエンス、統計学的遺伝学、および遺伝子発現解析などのゲノム技術を、臨床開発中のおよび市販の薬物に適用することを意味する。より好ましくは、この語句は、患者の遺伝子がどのように薬物に対する自身の応答を決定するかの研究を意味する（例えば、患者の「薬物応答表現型」または「薬物応答遺伝子型」）。したがって、本発明の別の態様は、個々の薬物応答遺伝子型に応じて、本発明のパーフォリン分子またはパーフォリン発現および／または活性をモデュレートする物質（本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより同定されたものなど）を用いて、個々の予防的または治療的処置をテーラーメイドする方法を提供する。遺伝薬理学により、臨床医または医師は、予防的または治療的処置を、処置により最も利点が得られそうな患者に標的化し、毒性薬物関連副作用が起こりそうな患者の処置を回避することができる。
【０１２７】
パーフォリンの発現および／または活性が過剰である場合、いくつかの治療アプローチを利用できる。１つの好ましいアプローチでは、被験者に投与される治療物質は、薬学的に許容されうる担体と共に、パーフォリンの発現および／または活性を阻害し、これにより疾病、疾病の症状、または疾病の素因を治癒、癒す、寛解、軽減、変化、修復、改善、向上、またはそれに影響を及ぼすに有効な量の本明細書で先に記載した阻害性化合物（アンタゴニスト）である。例えば、内因性パーフォリンと競合して結合できる可溶性形態のパーフォリン分子を投与してもよい。このような競合物質の好ましい実施形態は、天然パーフォリンに結合してその生物活性を阻害できるが、それ自体固有のパーフォリン活性は有していない、パーフォリンポリペプチドの断片を含む。パーフォリンアンタゴニストはまた、抗体またはその抗原結合断片（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、およびＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、ｓｃＦＶ分子、およびそのエピトープ結合断片）、天然パーフォリンポリペプチドに結合し、該天然パーフォリンの生物活性を阻害するオリゴヌクレオチドまたはパーフォリン断片または他の小分子を含んでいてもよい。
【０１２８】
アンタゴニストはまた、標的細胞が改変され、もはやパーフォリンに対して応答しないか、または、パーフォリンに対する応答が低下するように、標的細胞に影響を及ぼす化合物の形態をとっていてもよい。ここで処置はパーフォリンそれ自体に指向されず、標的細胞上に指向される。これにより、パーフォリンにより標的化される細胞をより正確に標的化することができ、これにより、さらなる攻撃から該細胞は防御される。
【０１２９】
パーフォリンの発現および／または活性が過剰であり、該発現および／または活性を低下させることが望ましい条件は、当業者により、当該技術分野で知られている診断または予後アッセイのいずれかまたは組合せにより同定できる。例えば、被験者から得られた生物学的試料（例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、および／またはそれから得られる細胞）を、本明細書で先に記載したように、パーフォリンの発現および／または活性について解析できる。このような条件には、若年性糖尿病（１型すなわちインスリン依存性）、移植片対宿主疾患、慢性または急性同種移植片拒絶、および、細胞傷害性Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞により仲介される免疫病態に関連した任意の他の容態が挙げられるがこれに限定されない。
【０１３０】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の予防的および治療的処置法は、若年性糖尿病（１型すなわちインスリン依存性）、移植片対宿主疾患、慢性または急性同種移植片拒絶、および、細胞傷害性Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞により仲介される免疫病態に関連した容態などが挙げられるがこれに限定されない、免疫により仲介される容態の処置および／または予防に適用可能である。
【０１３１】
パーフォリンの発現および／または活性を高めることが望ましい容態の処置でも、いくつかのアプローチを利用可能である。好ましいアプローチでは、被験者に投与される治療物質は、薬学的に許容されうる担体と組み合わせた、内因性パーフォリンの発現および／または活性を活性化する、先に述べたスクリーニングアッセイにより同定された組換えパーフォリンポリペプチドまたは化合物、すなわち、本明細書で先に記載したアゴニストであり、これにより、疾病、疾病の症状、または疾病の素因を治癒、癒す、寛解、軽減、変化、修復、改善、向上、またはそれに影響を及ぼす。このようなアゴニストの好ましい実施形態には、天然パーフォリンに結合し、その生物活性を高めることのできる、パーフォリンポリペプチド断片、およびその断片およびその変種を含む。パーフォリンアゴニストはまた、天然パーフォリンポリペプチドに結合し、該天然パーフォリンの生物活性を高める、抗体またはその抗原結合断片（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラまたは一本鎖抗体、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＡｂ発現ライブラリー断片、ｓｃＦＶ分子、およびそのエピトープ結合断片を含む）または他の小分子も含み得る。
【０１３２】
逆に、アンタゴニストと同様に、本発明はまた、細胞のパーフォリンに対する応答性が高くなるように標的細胞を改変できるアゴニストである化合物を提供する。これは、パーフォリンにより排除されるために標的化され得る細胞を改変するのを支援する。本方法で使用された化合物は、抗体などの同定部分に付着することができ、これにより、該部分は、排除が必要とされる細胞を同定できる。
【０１３３】
アゴニストは、好ましくは、パーフォリン活性の増強が望まれる容態（ウイルス感染に関連した容態（例えばヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎）、様々な癌（例えばリンパ腫）および結核が挙げられるがこれに限定されない）のための治療的または予防的な目的のために使用される。好ましくは、該アゴニストは、細胞傷害性Ｔリンパ球活性の増強が望まれる容態の処置に使用される。該アゴニストはまた、パーフォリン欠損症に関連した容態、例えばＨＬＨおよびより好ましくはＦＨＬのための治療的または予防的な目的のために使用できる。
【０１３４】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の予防目的および治療的処置法は、ウイルス感染（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびＣ型肝炎）、様々な癌（例えばリンパ腫）、結核、細胞傷害性Ｔリンパ球活性の増強が一般に望まれる容態、および、パーフォリン欠損症に関連した容態、例えばＨＬＨおよびより好ましくはＦＨＬの処置および／または予防に適用可能である。
【０１３５】
または、遺伝子療法を使用して、このような療法の必要な被験者（ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトが挙げられるがこれに限定されない）において細胞による内因性パーフォリンの発現を奏功できる。例えば、パーフォリンまたはその生物学的に活性な断片の発現を駆動するレトロウイルスベクターを含む産生細胞（本明細書で先に記載）を、インビボで細胞を遺伝子操作して、インビボで組換えパーフォリンポリペプチドを発現させるために、被験者に投与してもよい。遺伝子療法の概観については、例えば、Human Molecular Genetics、Strachan T.およびRead A.P.、BIOS Scientific Publishers Ltd(1996）の第２０章、Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches、（およびそこに引用されている文献）を参照されたい。
【０１３６】
さらに、標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンスおよびリボザイム分子を、本発明にしたがって使用でき、標的遺伝子の発現レベルを低下させることができる。またさらに、標的遺伝子発現レベルを低下させるために三重らせん分子を使用できる。
【０１３７】
本明細書に使用した「アンチセンス」なる語句は、好ましくは、本明細書で先に記載したパーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードする核酸に相補的、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的、あるいは、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードするｍＲＮＡ配列に相補的である、ヌクレオチド配列を意味する。アンチセンス核酸は、好ましくは、パーフォリンコード鎖全体に相補的であるか、または、その一部にのみ相補的である。さらなる実施形態において、アンチセンス核酸分子は、パーフォリンまたはその断片もしくはその変種をコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」（例えば、５’および３’非翻訳領域）に対してアンチセンスである。
【０１３８】
アンチセンス核酸は、パーフォリンの全コード領域に対して相補的であるように設計できるが、より好ましくは、パーフォリンｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部に対してのみアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、パーフォリンｍＲＮＡの翻訳開始部位の周辺領域に対して相補的であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、またはそれ以上のヌクレオチド長であり得る。
【０１３９】
本発明のアンチセンス核酸は、当該技術分野において知られている手順を使用して、化学合成および酵素ライゲーション反応を使用して作成できる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然ヌクレオチド、あるいは、分子の生物学的安定性を高めるように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸の間に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々に改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用できる）を使用して化学合成できる。アンチセンス核酸はまた、発現ベクター（この中に、核酸がアンチセンス配向でサブクローニングされている）を使用して生物学的に産生できる（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、対象の標的核酸に対してアンチセンス配向である）。
【０１４０】
本発明のさらなる実施形態において、標的遺伝子の発現を阻害するパーフォリン短鎖干渉核酸分子（ｓｉＲＮＡ）を、本発明にしたがって使用し、標的遺伝子の発現レベルを低下させることができる。
【０１４１】
本明細書で使用した「パーフォリン短鎖干渉核酸」、「パーフォリンｓｉＮＡ」、「パーフォリン短鎖干渉ＲＮＡ」、「パーフォリンｓｉＲＮＡ」、「パーフォリン短鎖干渉核酸分子」、「パーフォリン短鎖干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学的に改変されたパーフォリン短鎖干渉核酸分子」は、好ましくは、例えば配列特異的にＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）または遺伝子サイレンシングを仲介することにより、パーフォリンの遺伝子発現を阻害またはダウンレギュレートできる任意の核酸分子を意味する。本発明の任意のｓｉＮＡ配列に化学的改変を加えてもよい。例えば、ｓｉＮＡは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、ここで、アンチセンス領域は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、２個の別々のオリゴヌクレオチドから会合させてもよく、一方の鎖は、センス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンスおよびセンス鎖は、自己相補的であり（すなわち、各鎖は、他の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み；アンチセンス鎖およびセンス鎖が、二重鎖または二本鎖構造を形成する場合、例えば、二本鎖領域は、約１９塩基対である）；アンチセンス鎖は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を含む。または、ｓｉＮＡは、単一のオリゴヌクレオチドから会合しており、ｓｉＮＡの自己相補的センスおよびアンチセンス領域は、核酸を基剤とするまたは核酸を基剤としていないリンカーにより連結されている。ｓｉＮＡは、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有する、ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドでもよく、ここでのアンチセンス領域は、別の標的核酸分子またはその一部のヌクレオチド配列に対して相補的であるヌクレオチド配列を含み、センス領域は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を有する。ｓｉＮＡは、自己相補的センスおよびアンチセンス領域を含む２個以上のループ構造および幹を有する環式一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、ここでのアンチセンス領域は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列を有し、ここで環式ポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロで処理されて、ＲＮＡｉを仲介できる活性ｓｉＮＡ分子を生じることができる。ｓｉＮＡはまた、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含んでいてもよく（例えば、このようなｓｉＮＡ分子は、ｓｉＮＡ分子内に、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列の存在を必要としない）、ここで、一本鎖ポリヌクレオチドはさらに、末端リン酸基、例えば５’−リン酸または５’，３’−二リン酸を含んでいてもよい。好ましい実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、別々のセンスおよびアンチセンス配列または領域を含み、ここでセンスおよびアンチセンス領域は、当該技術分野で知られているヌクレオチドまたは非ヌクレオチドリンカー分子により共有結合的に連結されているか、または、代替的にイオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、および／またはスタッキング相互作用により非共有結合的に連結されている。さらなる実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、パーフォリンまたはその一部をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。別の実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、パーフォリン遺伝子の発現の阻害を引き起こすように、パーフォリンをコードするヌクレオチド配列と相互作用する。本明細書で使用したｓｉＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はないが、さらに、化学的に改変されたヌクレオチドまたは非ヌクレオチドと組み合わせたものを含む、分子も包含する。特定の好ましい実施形態において、本発明のｓｉＮＡ分子は、２’−ヒドロキシ（２’−ＯＨ）を含むヌクレオチドを欠失している。しかし、ＲＮＡｉを支持するためのｓｉＮＡ分子内にリボヌクレオチドの存在を必要としないこのようなｓｉＮＡ分子は、２’−ＯＨ基を有する１個以上のヌクレオチドを含む、付着リンカーもしくはリンカー群、または他の付着もしくは会合した基、部分、または鎖を有していてもよい。場合により、本発明のｓｉＮＡ分子は、ヌクレオチド位の約５、１０、２０、３０、４０、または５０％にリボヌクレオチドを含んでいてもよい。本発明の改変ｓｉＮＡ分子はまた、短鎖干渉改変オリゴヌクレオチド「ｓｉＭＯＮ」とも呼ぶことができる。本明細書に使用したｓｉＮＡなる語句は、好ましくは、配列特異的ＲＮＡｉ、例えば短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短鎖ヘパリンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、短鎖干渉オリゴヌクレオチド、短鎖干渉核酸、短鎖干渉改変オリゴヌクレオチド、化学的に改変されたｓｉＲＮＡ、翻訳後遺伝子サイレンシングＲＮＡ（ｐｔｇｓＲＮＡ）、翻訳サイレンシング、およびその他を仲介することのできる、核酸分子を記載するために使用された他の語句と等価であることを意味する。さらに、本明細書で使用したＲＮＡｉなる語句は、好ましくは、配列特異的ＲＮＡ干渉、例えば翻訳後遺伝子サイレンシング、またはエピジェネティクスを記載するために使用された他の語句と等価であることを意味する。例えば、本発明のｓｉＮＡ分子は、翻訳後レベルまたは翻訳前レベルの両方において遺伝子を後成的にサイレンスさせるために使用できる。非限定的な例において、本発明のｓｉＮＡ分子によるパーフォリン遺伝子発現の後成的な調節は、ｓｉＮＡにより仲介されるクロマチン構造の改変により、パーフォリン遺伝子発現を変化させることから行なわれる。
【０１４２】
本発明のアンチセンスおよび短鎖干渉ＲＮＡ分子は、典型的には、被験者に（例えば、組織部位での直接注射により）投与されるか、あるいは、それらが、パーフォリンをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズまたは結合して、それにより、例えば転写および／または翻訳を阻害することにより、該パーフォリンの発現を阻害することでその場で産生される。または、該分子は、選択細胞を標的化するように改変でき、その後、全身投与できる。全身投与では、アンチセンスまたはｓｉＲＮＡ分子は、例えば、該分子を、細胞表面受容体または抗原に結合するペプチドまたは抗体と連結させることにより、選択細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するように、改変されていてもよい。該分子はまた、ベクターを使用して、またはウイルス機序（例えばレトロウイルスまたはアデノウイルス感染送達）により送達されることもできる。該分子の十分な細胞内濃度を達成するために、該分子が適切なプロモーターの制御下に置かれているベクター構造物。
【０１４３】
さらに別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のα−単位とは対照的に、鎖は互いに平行になっている（Gaultierら（1987）Nucleic Acids Res.15:6625-6641）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら（1987）Nucleic Acids Res.15:6131-6148）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoueら（1987）FEBS Lett.215:327-330）を含んでいてもよい。
【０１４４】
さらに別の実施形態において、本発明のアンチセンス核酸は、リボザイムである。パーフォリンをコードする核酸分子に特異性を有するリボザイムは、本明細書に開示したパーフォリンｃＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な１個以上の配列、および、ｍＲＮＡ切断に関与する既知の触媒配列を有する配列を含み得る（米国特許第５，０９３，２４６号またはHaselhoffおよびGerlach（1988）Nature 334:585-591を参照）。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、パーフォリンをコードするｍＲＮＡ中の切断されるヌクレオチド配列に相補的である、テトラヒメナＬ−１９  IVＳ  ＲＮＡの誘導体を作成できる（例えば、Cechら、米国特許第４，９８７，０７１号；およびCechら、米国特許第５，１１６，７４２号を参照）。または、パーフォリンｍＲＮＡを使用して、ＲＮＡ分子のプールから、特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択することができる（例えば、Bartel,D.およびSzostak,J.W.(1993）Science 261:1411-1418を参照）。
【０１４５】
さらなる実施形態において、パーフォリンの発現は、パーフォリンの調節領域（例えばパーフォリンプロモーターおよび／またはエンハンサー）に相補的なヌクレオチド配列に標的化して、標的細胞におけるパーフォリン遺伝子の転写を妨げる３重らせん構造を形成することにより、阻害することができる（一般的に、Helene,C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6):569-84；Helene,C.ら（1992）Ann.N.Y.Acad.Sci.660:27-36；および、Maher,L.J.（1992）Bioassays 14(12):807-15を参照）。３重らせん形成のために標的化できる可能性ある配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を創造することにより増やすことができる。スイッチバック分子は、５’−３’、３’−５’と交互に合成され、二重鎖の最初の一方の鎖と塩基対を形成し、その後、他方の鎖と塩基対を形成し、かなりの長さのプリンまたはピリミジンが二重鎖の一方の鎖上に存在する必要はなくなる。
【０１４６】
アンチセンス分子は、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を向上させるために、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格において改変されていてもよい。例えば、核酸分子のデオキシリボースリン酸骨格を改変して、ペプチド核酸を作成してもよい（Hyrup B.ら（1996）Bioorganic & Medicinal Chemistry 4(1):5-23を参照）。本明細書に使用した「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」なる語句は、デオキシリボースリン酸骨格が、偽ペプチド骨格により置き換えられ、僅か４個の天然核酸塩基しか保持されていない、核酸模倣体、例えばＤＮＡ模倣体を意味する。ＰＮＡの中性骨格は、低イオン強度の条件下でのＤＮＡおよびＲＮＡへの特異的ハイブリダイゼーションを可能とする。ＰＮＡオリゴマーの合成は、Hyrup B.ら（1996）上記；Perry-O'Keefeら、Proc.Natl.Acad.Sci.93:14670-675により記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコルを使用して実施できる。
【０１４７】
パーフォリン核酸分子のＰＮＡは、治療的および診断的適用に使用できる。例えば、ＰＮＡは、例えば、転写または翻訳の停止を誘導または複製を阻害することにより、遺伝子発現を配列特異的にモデュレートするための、アンチセンスまたはアンチジーン物質として使用できる。パーフォリン核酸分子のＰＮＡはまた、遺伝子の１塩基対変異の解析に（例えば、ＰＮＡ特異的ＰＣＲクランピング）；他の酵素と組み合わせて使用する場合には「人工制限酵素」として（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ（Hyrup B.（1996）上記）；あるいは、ＤＮＡシークエンスまたはハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして（Hyrup B.ら（1996）上記；Perry-O'Keefe上記）使用できる。
【０１４８】
他の実施形態において、アンチセンス分子は、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞の受容体に標的化するため）、または細胞膜（例えば、Letsingerら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6553-6556；Lemaitreら（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:648-652；ＰＣＴ公開公報第ＷＯ８８／０９８１０号を参照）もしくは血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ８９／１０１３４号を参照）を横切る輸送を容易にする物質などの、他の付加基を含んでいてもよい。さらに、アンチセンス分子は、ハイブリダイゼーションを引き起こす切断物質（例えば、Krolら（1988）BioTechniques 6:958-976を参照）または間に介入する物質（例えば、Zon（1988）Pharm.Res 5:539-549を参照）を用いて改変されていてもよい。この目的のために、オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションを引き起こす架橋物質、輸送物質、またはハイブリダイゼーションを引き起こす切断物質）にコンジュゲートしていてもよい。
【０１４９】
変異遺伝子の発現を低下または阻害するためのアンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、および／または三重らせん分子の使用は、正常な標的対立遺伝子により産生されるｍＲＮＡの転写（三重らせん）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）も低下または阻害することができ、よって、存在する正常な標的遺伝子の産物の濃度は、正常な表現型に必要とされる濃度よりも低い可能性がある。このような場合、正常な標的遺伝子活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードし発現する核酸分子を、遺伝子療法により細胞に導入してもよい。
【０１５０】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性により特徴づけられる疾病の処置または予防において核酸分子を使用し得る別の方法は、パーフォリンに特異的なアプタマーの使用を介する。アプタマーは、核酸分子をタンパク質リガンドに特異的に結合させることのできる３次構造を有する核酸分子である（例えば、Osborneら（1997）Curr.Opin.Chem.Biol.1(1):5-9；およびPatel,D.J.（1977年6月）Curr.Opin.Chem.Biol.1(1):32-46を参照）。核酸分子は、多くの場合、治療タンパク質分子よりも簡便に標的細胞に導入され得るので、アプタマーは、多くの効果を有する可能性がある薬物または他の分子を導入することなくパーフォリン活性を特異的に減少させ得る方法を提供する。
【０１５１】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾病または容態の処置と共に、薬理ゲノミクス（すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物もしくは薬物に対するその個体の応答との関係の研究）も考慮してもよい。治療薬の代謝の差異は、薬理学的に活性な薬物の用量と血中濃度の間の関係を変化させることにより、重度な毒性または治療の失敗がもたらされる可能性がある。したがって、医師または臨床医は、パーフォリンの発現および／または活性をモデュレートするために治療剤を投与するかどうかを決定する際、並びに、このような処置の用量および／または治療投与計画をテーラーメイドする際に、関連する薬理ゲノミクス研究で得られた知識の適用を考慮する場合がある。
【０１５２】
薬理ゲノミクスは、罹患者における薬物の体内動態の変化および薬物の異常作用に因り、薬物に対する応答の臨床的に有意な遺伝性の変動を扱う。例えば、Eichelbaum,M.ら（1996）Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.23(10-11):983-985およびLinder,M.W.ら（1997）Clin.Chem.43(2):254-266を参照されたい。一般に、２種類の薬理遺伝学的容態を区別できる。薬物が生体に作用する様式を変化させる（薬物作用の変化）単一因子として伝達される遺伝子学的容態、または、生体が薬物に作用する様式を変化させる（薬物代謝の変化）単一因子として伝達される遺伝子学的容態。これらの薬理遺伝学的容態は、稀な遺伝子欠陥として、または、天然多型として起こる可能性がある。
【０１５３】
「ゲノム全域での関連解析」として知られる、薬物応答を予測する遺伝子を同定する１つの薬理ゲノミクスアプローチは、すでに知られている遺伝子関連マーカー（例えば、ヒトゲノム上の６０，０００〜１００，０００の多型または可変部位からなる「両対立遺伝子性」遺伝子マーカーマップ、その各々が２個の変種を有する）からなるヒトゲノムの高分解能マップに主に依拠する。このような高分解能遺伝子マップは、特定の観察された薬物応答または副作用に関連するマーカーを同定するための第II／III相治験に参加した統計学的に有意な数の患者の各々のゲノムのマップと比較することができる。または、このような高分解能マップは、ヒトゲノム中の数千万個の既知の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の組合せから作成することができる。本明細書に使用した「ＳＮＰ」は、ＤＮＡ鎖中の単一ヌクレオチド塩基に起こる一般的な変化である。例えば、ＳＮＰは、ＤＮＡ１０００塩基ごとに１回起こる可能性がある。ＳＮＰは、疾病過程に関与している可能性があるが、その莫大な数の大半は疾病に関連していない。このようなＳＮＰの発生に基づく遺伝子マップにより、個体を、その個々のゲノム中の特定のＳＮＰパターンに応じて、遺伝子カテゴリーに分類できる。このように、処置投与計画を、このような遺伝子的に類似した個体間で共通である可能性がある形質を考慮して、遺伝子的に類似した個体群にテーラーメイドできる。
【０１５４】
または、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる方法を使用して、薬物応答を予測する遺伝子を同定できる。この方法によれば、薬物の標的をコードする遺伝子（例えばパーフォリン）が知られている場合、個体群においてその遺伝子の全ての一般的な変種をかなり容易に同定でき、ある種の遺伝子は別の種の遺伝子と比べて、特定の薬物応答に関連しているかどうかを決定することができる。
【０１５５】
または、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる方法を使用して、薬物応答を予測する遺伝子を同定できる。例えば、薬物（例えば、本発明に記載のパーフォリン分子またはパーフォリン発現モデュレート物質）を投与された動物の遺伝子発現は、毒性に関連した遺伝子経路が出現しているかどうかの示唆を与えることができる。
【０１５６】
２つ以上の先の薬理ゲノミクスアプローチから作成された情報を使用して、個体の予防的または治療的処置のための、適切な用量および処置投与計画を決定できる。この知識は、投薬または薬物選択に適用すれば、有害反応または治療の失敗を避けることができ、したがって、本明細書で先に記載した治療物質で被験者を処置する場合の治療的または予防的効力を増強することができる。
【０１５７】
パーフォリンの発現および／または活性に対する物質（例えば薬物）の影響のモニタリングは、臨床試験に適用できる。例えば、本明細書に記載のスクリーニングアッセイによりパーフォリンの発現および／または活性を高めると同定された化合物の効力は、パーフォリンの発現および／または活性の低下を示す被験者の臨床試験においてモニタリングできる。または、スクリーニングアッセイによりパーフォリンの発現および／または活性を低下させると決定された物質の効力は、パーフォリンの発現および／または活性の増加を示す被験者の臨床試験においてモニタリングできる。このような臨床試験において、パーフォリン、および好ましくは、例えば、パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う容態に関与している他の遺伝子（すなわち代理マーカー）の発現および／または活性は、特定の細胞の表現型の「読み出し」すなわちマーカーとして使用できる。
【０１５８】
また、当業者により、本明細書で先に記載した処置法は、互いに任意の数の組合せで使用しても、または、当該技術分野において現在使用されている他の処置投与計画と共に使用してもよいことが十分に理解されているだろう。
【０１５９】
本発明に使用される手法の例は、これ以後、より完全に記載されている。しかし、以下の記載は、単なる実例であり、いずれにしても先に記載された本発明の一般性に対する限定と捉えるべきではないことを理解すべきである。
【０１６０】
実施例
実施例１：ＲＢＬ細胞における野生型マウスパーフォリンの発現
Ａ．パーフォリンの発現
以下の記載は、野生型マウスパーフォリンの組換え発現、解析、および評価にために使用される材料および方法を含む。
【０１６１】
ｉ）細胞培養
細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション−ＡＴＣＣ）、２９３Ｔ（ヒト胚腎臓）およびＥＬ−４（マウス胸腺）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２mMのグルタミン（Commonwealth Serum Laboratories、パークビル、メルボルン、オーストラリア（ＣＳＬ））、並びに各１００μg／mlのストレプトマイシンおよびペニシリン（ギブコ、グランドアイランド、ニューヨーク）を補充したダルベッコ改変イーグル（ＤＭＥ）培地中で維持した。該細胞株は、１０％ＣＯ２中３７℃の加湿インキュベーター中に維持した。ＲＢＬ−２Ｈ３および２９３Ｔ細胞を収集するために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＣＳＬ、オーストラリア）を加えて、組織培養フラスコから細胞を脱着させた。細胞を、使用前にＰＢＳで１回洗浄した。
【０１６２】
（ii）野生型マウスパーフォリンをコードするプラスミドベクターの作製
レトロウイルス形質導入を使用したＲＢＬ細胞における野生型マウスパーフォリン（Ｐｆｐ）の発現に関する全体的な戦略を、図２に示した。これは、要約された形態の、以下に概略を示したプロトコルを示した。
【０１６３】
（iii）ＭＳＣＶへのＰｆｐ  ｃＤＮＡのサブクローニング
Ｐｆｐ  ｃＤＮＡをネズミ幹細胞レトロウイルスベクターＭＳＣＶ（メルボルン所在ロイヤルメルボルン病院のSteve Jane博士の御懇意により提供された）にサブクローニングするために、１．８ｋｂのＤＮＡ断片を、その５’にＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位を取り込んだオリゴヌクレオチド（Geneworks、オーストラリア）を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。
【表５】
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【０１６４】
反応に使用された鋳型ＤＮＡは、マウスリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞株ＩＭＳ−ＩＩのＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲを使用して前以て増幅されたパーフォリンｃＤＮＡを含むｐＥＦ−ＰＧＫｐｕｒｏＡ構造物であった。ＰＣＲを、５０μlの容量で準備し、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液中に、５ngの鋳型ＤＮＡ、２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ（プロメガ、ＮＳＷ、オーストラリア）、５０μMのｄＮＴＰミックス、および１２．５ｐｍｏｌの各プライマーを含んでいた。反応は、ＰＴＣ−２００ペルティア・サーマル・サイクラー（MJ Research Inc.、マサチューセッツ州）で行ない、以下のサイクルから構成された：９４℃で２分間を１サイクル（変性）；その後、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間（アニーリング）、７２℃で４．５分間（合成）を２５サイクル、最後に７２℃で７分間を１サイクル。ＰＣＲ産物は、１％（ｗ／ｖ）アガロース／ＴＢＥ（８９mMのトリス−ホウ酸ｐＨ８．０、８９mMのホウ酸、２mMのＥＤＴＡ）ゲル上で電気泳動により分離し、１μlの臭化エチジウム（１０mg／ml）の添加により可視化した。ＤＮＡバンドをゲルから切り出し、Jetsorb DNAゲル抽出キット（Genomed,Inc.、米国）を使用して製造業者の指示にしたがって精製した。
【０１６５】
精製ＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（プロメガ、ＮＳＷ、オーストラリア）で消化することによりサブクローニング用に調製した。反応液は、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ（各々１Ｕ）、１００ngのＤＮＡ、それぞれの酵素に適した制限酵素緩衝液を含み、３７℃で一晩インキュベートされた。消化されたｃＤＮＡ（６０μg）を、リガーゼ緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（プロメガ、オーストラリア）（１Ｕ）を使用して、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで前以て消化しておいたＭＳＣＶ  ＤＮＡ（５０ng）と１４℃で一晩かけてライゲートした。
【０１６６】
（iv）コンピテント細菌の形質転換
Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｔｏｐ  １０Ｆ細菌（１００μl）を、４μlのＭＳＣＶ−Ｐｆｐライゲーションミックス（上記）と混合し、氷上で３０分間インキュベートした。該細菌を、４２℃で４５秒間加熱し、その後、室温で５分間放置した。ルリアベターニブロス（ＬＢブロス）（９００μl）を加え、該ミックスを、３７℃で振とうしながら１時間培養した。その後、形質転換反応液を、アンピシリンおよびテトラサイクリン（各１０μg／ｍＬ）を補充したＬＢ培地プレートに蒔き、３７℃で一晩培養した。形質転換体を無作為に拾い上げ、さらなる解析のために、１０μg／ｍＬのアンピシリンおよびテトラサイクリンを補充した２mlのＬＢブロス中で３７℃で一晩培養した。
【０１６７】
（ｖ）プラスミドＤＮＡの小規模調製
一晩培養液のプラスミドＤＮＡを、ミニプレッププラスミド精製キット（Mo Bio Lab Inc.、米国）を使用して製造業者の指示にしたがって細菌細胞から単離した。プラスミド同定は、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩの制限酵素による消化並びに電気泳動により確認された。ｃＤＮＡ挿入断片を含むミニプレップクローンを完全にシークエンスし、ＰＣＲ関連の変異が導入されていないことを確認した。シークエンスは、自動Big Dyeターミネーター反応プロトコル（製造業者の指示にしたがって）を使用して行ない、ニューサウスウェールズ大学（オーストラリア）の自動ＤＮＡ解析施設で解析した。
【０１６８】
（vi）プラスミドＤＮＡの大規模調製
シークエンスされたＰｆｐＤＮＡの大規模調製は、「アルカリ溶解」法により得、ＣｓＣｌ−臭化エチジウム勾配で精製された。アンピシリンおよびテトラサイクリン（５０μg／ml）を補充したＬＢブロス中の５００mlの一晩培養液の細菌を、ＲＣ−Ｃ Sorval遠心機（Sorval Instruments、デュポン）で４０００rpmで１０分間遠心分離にかけることによりペレット化した。該ペレットを、１０ml溶液１（５０mMグルコース、２５mMトリスＣｌ、ｐＨ８、１０mM  ＥＤＴＡ、ｐＨ８）に再懸濁し、氷上の２０ml溶液２（０．２ＭのＮａＯＨ、１％ＳＤＳ）中で１０分間溶解し、ｐＨを、氷上の１５mlの溶液３（３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ４．８）中で１０分間中和した。細胞破片を、４０００rpmで１０分間遠心分離にかけることにより除去し、プラスミドＤＮＡを含む上清をチーズクロスを通してろ過した。氷上で３５mlのイソプロパノールを加えることによりＤＮＡを１５分間かけて沈降させ、１２，０００rpmで４℃で１５分間かけてペレット化した。該ペレットを、７０％エタノールで洗浄し、その後、無水エタノールで洗浄し、室温で乾燥させ、１０mlのｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。１０．７ｇのＣｓＣｌおよび５００μlの臭化エチジウム溶液（１０mg／ml）をプラスミドＤＮＡに加えることにより、ＣｓＣｌ勾配を作った。３２００rpmで５分間遠心分離にかけて破片をペレット化し、試料を、ベックマンPolyllomor Bell-top Quick-seal遠心管（Beckman Instruments Inc.、米国）に添加し、ベックマンＴＬ−１００超遠心機（Beckman Instruments Inc.）中で５５，０００rpmで２０℃で一晩遠心分離にかけた。ＤＮＡバンドを、２６ゲージ針を用いて回収し、試料を３回等量のイソアミルアルコールで洗浄することにより臭化エチジウムを抽出し、２．５容量の無水エタノールを用いて４℃で一晩かけて沈降させた。試料を、１３，０００rpmで４℃で１５分間かけてペレット化し、７０％エタノール中で洗浄し、乾燥させ、ＴＥ緩衝液ｐＨ７．４中に再懸濁した。ＤＮＡを、１％アガロースゲル上での可視化、および、２６０nmでの吸光度の測定の両方により定量した。
【０１６９】
（vii）レトロウイルス発現系を使用したＰｆｐの発現
レトロウイルス発現系を使用したパーフォリンの発現では、ＭＳＣＶベクターのいくつかの特長を活用した（図３）。バイシストロン性プラスミドは、形質導入細胞の選択を可能とするいくつかの特長を含む：１）両種指向性ＭＳＣＶ５’末端反復配列（ＬＴＲ）；２）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のｃＤＮＡ；３）脳心筋炎内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、並びに４）細菌複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子。ＩＲＥＳは、２個の遺伝子が、同じｍＲＮＡ鎖上で転写されることを可能とし、これにより、マーカーを、転写される主な遺伝子の下流に配置することができ、２個は別々に翻訳される。紫外線光の下で細胞に蛍光を発生させるＧＦＰの発現は、パーフォリンの代理マーカーとして役立ち、高レベルの導入遺伝子を発現している細胞の選択を可能とした。
【０１７０】
（viii）Ｐｆｐ発現のための組換えウイルスの作製
パーフォリン遺伝子をコードするＭＳＣＶ  ＤＮＡ（ＭＳＣＶ−Ｐｆｐ）を、２９３Ｔパッケージング細胞株に一過性にトランスフェクトし、これはウイルス粒子を培養上清中に分泌し、これはＲＢＬ細胞を感染するために後に使用した。両種指向性ヘルパープラスミドの同時トランスフェクションにより、数多くの哺乳動物細胞上の両種指向性受容体により認識されるウイルスエンベロープタンパク質を有するレトロウイルスＤＮＡが得られ、これにより、外来遺伝子の送達は容易になった。最初、２９３Ｔ細胞（５×１０５）を、一晩１００mmのペトリ皿に蒔き、トランスフェクションの３時間前に、培養培地を、新しい完全ＤＭＥＭと交換した。該細胞を、リン酸カルシウム沈降法（ギブコ）により、製造業者の指示にしたがって、ＭＳＣＶベクターＤＮＡまたはＭＳＣＶ−ＰｆｐＤＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション日に、２５μlの２Ｍ  ＣａＣｌ２、１０μgのプラスミドＤＮＡ（１０mMのトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．５中）、１０μgのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードするヘルパープラスミドｃＤＮＡ、並びに２００μlの最終容量とするための水を混合することにより、ＤＮＡ−ＣａＣｌ２溶液を調製した。１００μlの５００mM  ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．１）、１２５μlの２Ｍ  ＮａＣｌ、１０μlの１５０mM  ＮａＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、および最終容量１mlとするための水からなる、沈降緩衝液も調製した。２００μlの沈降緩衝液に、２００μlのＤＮＡ−ＣａＣｌ２溶液を滴下して加え、混合物を常に攪拌した。該混合物を室温で３０分間保ち、得られた微細な沈降物を２９３Ｔパッケージング細胞皿に加えた。細胞を、ＤＮＡ沈降物に２４時間さらし、その後、培地を新しい完全ＤＭＥＭと交換した。４８時間後、細胞を収集し、ＧＦＰの発現について解析した。ＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson、サンホセ、ＣＡ州）を使用したフローサイトメトリーにより測定したＧＦＰ発現により、トランスフェクション効率が決定され、これは上清中のウイルス力価を示した。最も効率的なトランスフェクションの培養上清（３０％を超えるＧＦＰ発現細胞）を回収し、ＲＢＬ細胞の形質導入のために１．５mlずつ分注して保存した（下記参照）。
【０１７１】
（ｉｘ）ウイルス強化上清を用いたＲＢＬ細胞の形質導入
レトロウイルスを使用する形質導入のために、ＲＢＬ細胞を、１mlの完全ＤＭＥＭ中に２×１０５で６ウェルプレートに蒔いた。細胞を、４μg／mlのポリブレンの存在下で、レトロウイルス上清と１２時間間隔で６回混合し、７２時間かけて回収し、その後、ＦＡＣＳｔａｒセルソーターでフローサイトメトリーによりＧＦＰ発現について解析した。最大のＧＦＰ発現を有する個体群中の細胞（５％までの細胞）を、さらに増殖させるために選択し、パーフォリン発現および機能的解析のためにスクリーニングした。
【０１７２】
Ｂ．Ｐｆｐ発現の解析
（ｉ）細胞溶解液の調製
ＭＳＣＶ−Ｐｆｐで形質導入されたＲＢＬ細胞の溶解液を、ウェスタンブロットにより解析し、タンパク質発現についてスクリーニングした。細胞を収集し、ＮＰ−４０溶解緩衝液（２５mM  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７、０．２５mM  ＮａＣｌ、２．５mM  ＥＤＴＡ、０．１％Nonidet-P40（ＮＰ−４０）、０．５mM  ＤＴＴ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ、ドイツ））中に再懸濁（２×１０７／ml）した。細胞を氷上で２０分間インキュベートし、その後、１３０００rpmでペレット化し、細胞破片を除去した。回収された上清を、還元剤（１．５２ｇのトリス塩基、２０mlのグリセロール、２ｇのＳＤＳ、２mlの２−メルカプトエタノール、１mgのブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８、Ｈ２Ｏを用いて１００mlとする）を含む等量の２×の試料緩衝液中に希釈し、９５℃で５分間煮沸し、１０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲルにのせた。
【０１７３】
（ii）タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動および免疫検出
ポリアクリルアミドゲルは、Mini-Protean II Electrophoresis Cell（バイオラッド、米国）の仕様書にしたがって構築した。タンパク質試料を、４．５％濃縮用ゲル（０．８mlの３０％アクリルアミド／ビス、２．９５mlのｄｄＨ２Ｏ、１．２５濃縮用緩衝液、５０μlの１０％ＡＰＳ、１０μlのＴＥＭＥＤ）および１０％分離用ゲル（２．７５mlの３０％アクリルアミド／ビス、３．２５mlのｄｄＨ２Ｏ、２mlの分離用緩衝液、５０μlの１０％ＡＰＳ、１０μlのＴＥＭＥＤ）を通して分解した。電気泳動は、１６０Ｖで泳動緩衝液（０．１％ＳＤＳ、２５mMのトリス−ＨＣｌ、１９２mMのグリシン）中で行なった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離されたタンパク質を、ウェスタン転写緩衝液（４８mMのトリス、３９mMのグリシン、２０％メタノール、ｐＨ９．２）中で、Trans-Blot SD Semi Dry Transfer Cell（バイオラッド、ハーキュリーズ、ＣＡ州、米国）を使用して、ニトロセルロース「イモビロン」膜（ミリポア、ベッドフォード、ＭＡ州）に転写した。転写は、１４Ｖ、０．５Ａで３０分間かけて行なった。膜へのタンパク質の非特異的な結合は、５％脱脂粉乳／ＰＢＳ溶液中で１時間かけて遮断し、その後、５％脱脂乳緩衝液中で１／１０００に希釈された、一次ラット抗マウスパーフォリン抗体のＰ１−８（ストック濃度１．７mg／ml；日本、東京、順天堂大学医学部のH.Yagita博士の御懇意により提供された）でプローブした。膜を、０．０５％／Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中で（３×８分間）洗浄し、結合したラットＩｇを、室温で、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせた二次ヤギ抗ラット抗体（１／１００００希釈度）を用いて１時間かけて検出した。膜を前と同じように洗浄し、結合した抗体を、増強化学発光（ＥＣＬ）検出システム（Amersham International、英国）を使用して可視化し、Ｘ−ＯＭＡＴ  ＡＲ画像化フィルム（Eastman Kodak社、ロチェスター、ＮＹ、米国）に感光した。このウェスタンブロットに使用された膜は、抗チューブリン抗体（シグマ）（１／３０００）でもプローブし、等価なタンパク質が添加されたことを確認した。
【０１７４】
（iii）抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体を用いたＲＢＬ細胞の標識：標識条件の最適化
ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞が、マウス胸腺ＥＬ−４標的細胞を殺滅する能力を、本明細書で以下に記載した４時間の５１Ｃｒ放射アッセイで評価した（２．５章を参照）。アッセイ（以前にShiverら、1991により記載）は、ＲＢＬ細胞上のＦｃε受容体を、ＴＮＰで標識された標的細胞に架橋して、顆粒分泌を刺激する、抗トリニトロフェニル（ＴＮＰ）ＩｇＥ抗体の使用を含む（図４）。抗ＴＮＰ  ＩｇＥの最適結合濃度を決定するために、ＲＢＬ細胞を、様々な条件下で標識し、フローサイトメトリーにより表面結合を検出した。１×１０６個の細胞を、抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体（ストック濃度２μg／ml）を含む様々な希釈度のハイブリドーマ培養上清（オーストラリア、メルボルン、Austin Research InstituteのM.Hogarth博士の御懇意により提供された）で標識した。ＰＢＳ中で１／２、１／１０、１／５０、または１／１００の希釈度の抗体を作り、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、その後、ビオチンコンジュゲート抗マウスＩｇＥ抗体（ファーミンゲン）と共に１．２５μg／mlで１時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、その後、フローサイトメトリーによる解析のために、０．５μg／mlでストレプトアビジン−ＰｅｒＣＰを加えた。抗体の最適結合条件を決定するために、細胞を、１／２の希釈度の抗ＴＮＰ  ＩｇＥハイブリドーマ上清中でインキュベートし、３７℃で１５または６０分間、４℃で１５または６０分間インキュベートした。表面標識の検出のために、細胞を、先に述べた通りにインキュベートし、フローサイトメトリーにより解析した。
【０１７５】
Ｃ．Ｐｆｐ細胞溶解機能の評価
（ｉ）５１ＣｒおよびＴＮＰを用いたＥＬ−４標的細胞の二重標識
以下に概略を示した細胞性細胞傷害アッセイにおける標的細胞として使用するために、ＥＬ−４細胞に５１Ｃｒを添加し、ＴＮＰハプテンで標識した。細胞を、手を加えていないＤＭＥ培地中で２回洗浄し、１００μlの同じ培地中に再懸濁した。該細胞を、１００μＣｉの５１Ｃｒを用いて３７℃で１時間かけて標識し、手を加えていない培地で３回洗浄して、遊離５１Ｃｒを除去した。その後、該細胞を、５×１０６／mlで３７℃の１mMのＴＮＢＳ（フルカ）溶液（ｐＨ７．４）中に１５分間かけて再懸濁することにより、ＴＮＰで標識した。該細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄し、細胞傷害アッセイに使用するために、１×１０６／mlで１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＭＥ培地中に再懸濁した。
【０１７６】
（ii）ＩｇＥ抗体を用いたＲＢＬ細胞の標識
ＲＢＬ細胞を、抗体を含むＰＢＳ中に５×１０６細胞／mlで再懸濁することにより、抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体で標識した。該細胞を、３７℃で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ中で３回洗浄し、細胞傷害アッセイに使用するために、１％ＢＳＡ（ＣＳＬ、オーストラリア）を含むＤＭＥ−Ｍ中に１×１０７／mlで再懸濁した。
【０１７７】
（iii）５１クロム放射細胞傷害アッセイ
細胞死は、１％ＢＳＡを含む２００μl培地中で、様々なエフェクター：標的の比で、ＩｇＥ標識エフェクター細胞と５１Ｃｒ／ＴＮＰ標識標的細胞を混合することにより、５１Ｃｒ放射アッセイにおいて評価した。実験は、９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートで行なった。５１Ｃｒの自然発生的放射は、標的細胞を培地のみと共にインキュベートすることにより決定され、最大放射は、ＨＣｌを最終濃度１Ｍとなるまで添加することにより決定された。陰性対照として、ＥＧＴＡを反応液に加えた（最終２mM）。４時間後、プレートを１５００rpmで遠心分離にかけ、１００μlの上清を収集し、放射された放射能をWizard 1470ガンマカウンターにより測定した。
【０１７８】
細胞傷害性は、自然発生的放射を差し引いた後の５１Ｃｒ比放射率として表現された。比溶解率は、以下のように計算された：１００×［（実験的放射−自然発生的放射）／（最大放射−自然発生的放射）］。
【０１７９】
Ａ．レトロウイルス発現系を使用した、ＲＢＬ細胞におけるパーフォリンの発現
パーフォリンの発現は、ＲＢＬ細胞において、ＭＳＣＶベクターに基づくレトロウイルスにより仲介されるアプローチを使用して達成された。ＭＳＣＶ−Ｐｆｐ構造物を用いて２９３Ｔパッケージング細胞をトランスフェクションすることにより、ＲＢＬ細胞の形質導入に使用されるレトロウイルスの強化された培養培地が得られた。ＧＦＰ発現についての２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析を、トランスフェクション効率の見積もりとして、トランスフェクションの３日後に評価した。以前に徹底的な実験において、３０％を超える２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰの発現は、１．５×１０７ｐｆｕ／mlまでの感染ウイルスのウイルス力価が培養上清中に存在するという信頼性のある指標であることが示された（S Jane博士、ロイヤルメルボルン病院、私信）。それ故、正式なウイルスプラークアッセイは決まりきった通りに行なわなかった。図５で示したように、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐプラスミドでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の５０％を超える細胞が、トランスフェクションの３日後、強力に蛍光を発し、これは、ＧＦＰ発現を示した。これは、空ＭＳＣＶベクターＤＮＡで見られるＧＦＰ発現レベルと同等であった。期待された通り、ヘルパープラスミドのみでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞（青の実線）は、ＧＦＰを発現しなかった。
【０１８０】
次に、ＲＢＬ細胞を、２９３Ｔ細胞トランスフェクションから得られたウイルス上清で形質導入した。その後、フローサイトメトリー解析を、同じように、パーフォリンを発現しているＲＢＬ細胞のマーカーとしてＧＦＰを使用して行なった。図６Ａのヒストグラムプロファイルは、Ｍ１ゲート領域として示される、高レベルのＧＦＰを発現している小さな個体群（典型的には０．１〜５％）を示している。空ＭＳＣＶ−およびＭＳＣＶ−Ｐｆｐ感染細胞の両方を単離し増殖させ、細胞の９５％超が代用マーカーを発現する個体群を得た（図６Ｂ）。系列解析により、細胞において安定なＧＦＰ発現が示され、これは続けて８週間まで培養した。
【０１８１】
その後、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現するように形質導入されたＲＢＬ細胞を、タンパク質の発現について、ウェスタンブロットにより解析した。図７に示したように、パーフォリンに相当する６７ｋＤａの免疫反応性バンドが、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐで形質導入されたＲＢＬ細胞において同定されたが、親ＲＢＬも、改変されていない空のベクターで形質導入されたＲＢＬ細胞もパーフォリンの発現を示さなかった。
【０１８２】
Ｂ．ＩｇＥ抗体を用いてＲＢＬ細胞を標識するための最適条件
細胞傷害アッセイの前置きとして、ＲＢＬ細胞を、抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体で標識し、温度、時間、および抗体濃度に関する、ＩｇＥの最適結合条件を決定した。様々な濃度の抗体と共にインキュベートされたＲＢＬ細胞のフローサイトメトリー解析により、１／２または１／１０の希釈度が飽和結合レベルを達成することが示された（図８Ａ）。細胞傷害アッセイのためにＲＢＬ細胞を標識するために（次の章を参照）、１／２の希釈度を選択した。図８Ｂは、温度およびインキュベート時間を変化させた場合の、抗体結合レベルを示した。最も高い結合レベルは、３７℃で１時間で起こり、４℃で１時間の場合での結合とほぼ等価であった。１５分間のインキュベートでは、幾分結合が弱まった。細胞傷害アッセイのためのＲＢＬ細胞の調製では、細胞を、１／２希釈度の抗体中で３７℃で１時間インキュベートすると結論づけられた。
【０１８３】
Ｃ．ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現するＲＢＬ細胞は、強力な細胞傷害性を獲得した
ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞の細胞傷害能を試験するために、これらの細胞を、抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体で標識し、これをエフェクター細胞として使用し、ＴＮＰで標識された標的細胞を殺滅した。標的細胞死を、４時間の５１Ｃｒ放射アッセイで評価した。図９に示したように、パーフォリンを発現しているＲＢＬ細胞は、ＴＮＰで標識されたＥＬ−４細胞に対して強力な細胞傷害性を示した。最も高い４０：１というＥ：Ｔ比では、ＲＢＬ細胞は、約６０％の５１Ｃｒ比放射を誘導することができ、この細胞死レベルは、エフェクター：標的の比が低くなるとこれも低下した。期待された通り、空ＭＳＣＶベクターで形質導入されたＲＢＬ細胞は、標的細胞を溶解することができず、このことは、この非細胞傷害性細胞株は、パーフォリンを発現する時に、強力な細胞傷害性を付与され得ることが示された。抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体の非存在下ではＲＢＬ細胞に溶解活性は観察されず、このことから、標的細胞への効率的な結合および脱顆粒が溶解に必須であることが示された。同様に、ＴＮＰで標識されなかったＥＬ−４標的細胞は、エフェクター細胞により認識または殺滅されなかった。細胞傷害性実験はまた、時間経過アッセイとして繰り返し、いつ標的細胞の最大溶解が起こるかを決定した。最大５１Ｃｒ放射が６時間後に観察され、５１Ｃｒ放射のプラトーはこの時点を超えた２４時間後までに観察された。標準的な細胞傷害アッセイは、４時間かけて行なうと決定された。なぜなら、この時点は、６時間後に観察された溶解レベルと類似したレベルであったからである。
【０１８４】
Ｄ．パーフォリン発現の再現性：ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現している独立したＲＢＬ細胞株の産生
この方法の再現性を評価するために、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現している複数の独立したＲＢＬ細胞株が産生された。本章を通じて記載されたこのプロトコルを繰り返した：ＭＳＣＶ−Ｐｆｐ構造物を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることにより、４個のさらなる独立したウイルス上清を調製し、続いて、ＲＢＬ細胞を、該ウイルス上清を用いて形質導入し、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐ＃２〜５と呼ばれるＲＢＬ個体群を得た。ウェスタンブロットにより、４個全てのＲＢＬ個体群が、ほぼ等レベルのパーフォリンタンパク質を発現したが、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐ＃５は、チューブリンを添加した対照と比べて僅かにより高いレベルを発現したことが判明した（図１０）。その後、これらの個体群を標準的な５１Ｃｒアッセイに使用して、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐにより達成される溶解の通常範囲を決定した（図１１）。溶解は、４０：１のエフェクター：標的の比において、４個のパーフォリン発現個体群において４０％〜６０％の範囲であることが判明した。期待された通り、図８で先に考察した陰性対照ＲＢＬ細胞を使用することにより有意な溶解は観察されなかった。異なる日におけるＲＢＬ細胞により観察される細胞傷害性の変動を評価するために、アッセイを４個全ての個体群を用いて複数回（ｎ＝６）繰り返し、４０：１のエフェクター：標的の比で、５１Ｃｒ放射の平均値は、５６％＋／−３％であると計算された。このように、後の章で調査される変異機能を、この標準化された殺滅レベルと比較することができた。
【０１８５】
実施例２：ＲＢＬ細胞におけるレトロウイルス発現による２個のミスセンスパーフォリン変異（Ｇ４２９ＥおよびＰ３４５Ｌ）の機能的解析
Ａ．変異マウスパーフォリンｃＤＮＡの作成
患者５（Ｇ４２９Ｅ）および患者６（Ｐ３４５Ｌ）において同定された変異（図１２）を、ＲＢＬ細胞で発現させるために、組換えパーフォリンｃＤＮＡに導入した。変異パーフォリンｃＤＮＡをコードするＭＳＣＶプラスミドは、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐとそれぞれ呼んだ。ＭＳＣＶに挿入された野生型パーフォリンｃＤＮＡ（ＷＴ−Ｐｆｐ）を鋳型として使用して（実施例１参照）、変異を、部位特異的変異誘発ＰＣＲ反応および以下のプライマーを使用して導入した：
【０１８６】
Ｐ５（Ｇ４２９Ｅ）変異の導入に関しては：
【表６】
2007526774.tif 000004
【０１８７】
Ｐ６（Ｐ３４５Ｌ）変異の導入に関しては：
【表７】
2007526774.tif 000005
【０１８８】
ＰＣＲは、Quickchange部位特異的変異誘発キット説明書（ストラタジーン、ＣＡ州）の製造業者の説明書にしたがって準備し、これは、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液中に、５０ngの鋳型ＤＮＡ（ＷＴ−Ｐｆｐ  ＭＳＣＶプラスミド）、２．５単位のＰｆｕポリメラーゼ、５０μMのｄＮＴＰミックス、１２５ngの各プライマーを含んでいた。ＰＣＲは、以下のサイクルから構成された：９５℃で３０秒間を１サイクル、９５℃で３０秒間、５５℃で１分間、および６８℃で５分間（プラスミド１Ｋｂあたり２分間）を１４サイクル。完了後、ＰＣＲ混合液を、３７℃で１０ＵのＤｐｎＩ酵素で１時間かけて消化し、親ＤＮＡ鋳型は消化されたが、新しく合成された変異ＤＮＡは無傷のままであった。メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡを標的化するＤｐｎＩエンドヌクレアーゼを使用して、親ＤＮＡを選択的に消化した。その後、所望の変異を取り込んだＰＣＲから得られたＤＮＡを使用して、ＸＬ−１０ゴールドスーパーコンピテント細胞を形質転換した。形質転換のために、１μlの消化ＤＮＡを１００μlのコンピテントＸＬ−１０ゴールドコンピテント細胞に加え、氷上に３０分間置いた。細胞に４２℃で４５秒間熱ショックを与え、氷上に２分間置き、２００μlのＬＢ−ブロスと共に３７℃で３０分間インキュベートし、その後、ＡｍｐＬＢ寒天プレートに蒔いた。
【０１８９】
ミニプレップおよび大規模ＤＮＡ調製を、実施例１で概略を示した方法にしたがって行なった。ｃＤＮＡクローンをシークエンスし、所望の変異のみが導入されたことを確認した（シークエンスプロトコルについては実施例１を参照）。その後、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐ挿入断片を、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化ＭＳＣＶベクターＤＮＡにサブクローニングした。
【０１９０】
Ｂ．ＲＢＬ細胞における変異パーフォリンタンパク質の発現
ＲＢＬ細胞におけるＰ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐの発現は、実施例１で最適化されたプロトコルを使用して達成された。簡潔には、これには、ウイルス強化上清の作成のための２９３Ｔ細胞のトランスフェクション、ＲＢＬ細胞の形質導入、および高レベルのＧＦＰマーカーを発現しているＲＢＬ細胞の単離のための細胞選別が含まれた。細胞完全体の溶解液を、先に本明細書の実施例１で記載されているように、タンパク質発現について解析した。
【０１９１】
Ｃ．Ｐ５およびＰ６変異Ｐｆｐの細胞溶解機能と、ＷＴ−Ｐｆｐの細胞溶解機能の比較
ＥＬ−４標的細胞に対する、Ｐ５−ＰｆｐまたはＰ６−Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞の細胞溶解機能を、以前に概略を示したように（実施例１）、４時間の５１Ｃｒ放射細胞傷害アッセイにおいて解析した。実施例１に記載のＷＴ  Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞を、パーフォリン機能に関する陽性対照として使用し、空ＭＳＣＶベクターで形質導入されたＲＢＬ細胞を、陰性対照として使用した。
【０１９２】
Ｄ．ＲＢＬ細胞からのリソソーム顆粒の単離
ＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、またはＰ６−Ｐｆｐが、Davisら（J Immunol Methods.2003、276(1-2):59-68）により記載のように、窒素の吹き込みおよび細胞内容物のパーコール密度分画により、ＲＢＬ顆粒から単離された。ＲＢＬ細胞（１×１０９）をＰＢＳ中で３回洗浄し、その後、緩和緩衝液（１００mM  ＫＣＬ、３．５mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８、１．２５mM  ＥＧＴＡ）中に１×１０８／mlで再懸濁し、４℃で４５０psiの窒素吹き込み装置の回転プラットフォーム上で２０分間かけて溶解した。突然除圧した後に細胞溶解液を回収し、核を、４℃で２０００rpmで１０分間遠心分離にかけることにより取り出した。核を、１mlの緩和緩衝液で２回洗浄し、上清を、第一回目の洗浄に由来する上清と共にプールした。プールされた上清を、２０００rpmでさらに５分間遠心分離にかけ、全ての細胞破片を除去した。その後、８mlの調整パーコール（４５mlのパーコールおよび５mlの１０×緩和緩衝液）を、１mMのＡＴＰを含む１２mlの緩和緩衝液と混合することにより、４０％パーコール密度勾配を形成した。５mlの細胞溶解液を、各勾配に添加し、４℃で２０，０００rpmで３５分間遠心分離にかけた。勾配の濃い領域に移動する細胞傷害性顆粒を、シリンジに付いた長い脊椎穿刺針を使用して勾配の底から１mlの画分を収集することにより回収した。画分を、遠心機（ベックマンカウンター）で４℃で１００，０００rpmで３時間かけて（個々に）濃縮し、少量の再懸濁緩衝液中に洗浄することにより、ペレット化したパーコールの表面から顆粒を得た。パーフォリンを放出するために、等容量の２Ｍ  ＮａＣｌに再懸濁し、液体窒素中で凍結および３７℃の水浴で解凍のサイクルを３回行なうことにより、顆粒を破壊した。
【０１９３】
（ｉ）β−ヘキソアミニダーゼアッセイ
５０μlの凍結解凍顆粒抽出液を、３０μlの８mMのｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ．グルコサミニド（シグマ）のＨ２Ｏ溶液および１０μlの０．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）に加えた。反応を、１５０μlの５０mM  ＮａＯＨの添加により室温で３０分後に停止し、試料の光学密度を、４０５nmで測定した。
【０１９４】
（ii）顆粒抽出液によるジャーカット細胞の溶解
ジャーカット細胞を、３７℃で１００μlの未補充のＲＰＭＩ培地中の５０μＣｉの５１クロムで１時間かけて標識した。その後、５１Ｃｒ標識細胞を、２mM  ＥＧＴＡを含むまたは含まないＨＢＳＳ緩衝液（CSL Ltd.）に再懸濁した。アッセイのために、ハンク緩衝食塩水溶液（ＨＢＳＳ）に再懸濁した２×１０４個の細胞を、９６ウェルのＶ底プレートのウェルに加えた。顆粒画分＃８（ウェスタン解析により最も高いパーフォリン含量を含むと決定された）をＨＥ緩衝液で連続希釈し、３７℃で最終容量２００μl中で標的細胞と共に４時間インキュベートした。５１Ｃｒの自然発生的な放射を、標的細胞をＨＥ緩衝液のみと共にインキュベートすることにより決定し、最大放射は、ＨＣｌを最終濃度１Ｍとなるまで加えることにより決定した。４時間後、プレートを１５００rpmで遠心分離にかけ、１００μlの上清を収集し、放射された放射能を、Wizard 1470ガンマカウンターで測定した。細胞傷害性は、自然発生的な放射を差し引いた５１Ｃｒ比放射率として表現した。比溶解率は、以下のように計算した：１００×［（実験的放射−自然発生的放射）／（最大放射−自然発生的放射）］。
【０１９５】
（iii）赤血球溶解アッセイ
ヒツジ赤血球（ｓＲＢＣ）を３回洗浄し、その後、１５０mMのＮａＣｌ中に１０８／ｍＬで再懸濁した。アッセイのために、５０μlの凍結／解凍顆粒抽出液［画分＃８（上記参照）］を、３７℃でｖ底９６ウェルプレート中、２mMのＣａＣｌ２の存在下で、２０μlのｓＲＢＣ懸濁液と共にインキュベートした。最大のヘモグロビン放出を得るために、Ｈ２Ｏを使用して赤血球を溶解した。プレートを１５００rpmで５分間遠心分離にかけ、上清中に放出されたヘモグロビンを、４０５nmでの光学密度を測定することにより推定した。細胞溶解は、最大ヘモグロビン放出率として表現した。
【０１９６】
（iv）ＲＢＬ細胞中のパーフォリンに関するイムノペルオキシダーゼによる染色
約１×１０５個の細胞を、染色手順の前の日に８ウェルチャンバースライドの各ウェルに播種した。細胞を、室温で固定緩衝液（ＰＭＥＤ中３．７％パラホルムアルデヒド）中で１０分間かけて固定し、その後、ＰＢＳ中で３回洗浄した。その後、透過緩衝液（０．１％トリトン−Ｘ、０．５％ＢＳＡ）を５分間かけて加え、細胞を前と同様に洗浄した。細胞を、室温で過ヨウ素酸（０．５％）で１０分間かけて処理し、濯ぎ、内因性過酸化物を、０．３％Ｈ２Ｏ２と共に１５分間インキュベートすることによりクエンチした。遮断緩衝液（１％ＢＳＡ／１％脱脂粉乳／ＰＢＳ）をウェルに３０分間かけて加え、前と同様に２回洗浄した。その後、モノクローナル抗マウスパーフォリン抗体Ｐ１−８を加えた（１／１０００希釈度または２μg／ml）。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、（１／６００）希釈度のビオチンコンジュゲートロバ抗ラットＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch、米国）を加え、細胞を前と同様に洗浄した。ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Dako）を室温で細胞と共に１０分間インキュベートし、３回洗浄し、色素原ＤＡＢ（Dako）を加えることによりＨＲＰシグナルをさらに１０分間かけて検出した。核を可視化するために、核をエオシンで対比染色した。
【０１９７】
（ｖ）ＲＢＬ細胞の脱顆粒
ＲＢＬ細胞に、その顆粒内容物をエキソサイトーシスさせ、パーフォリンの放出を評価した。空ＭＳＣＶ形質導入ＲＢＬ細胞またはＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、もしくはＰ６−Ｐｆｐを発現している細胞（１×１０５）を、先に記載したようにウェルに播種し、３７℃で抗ＴＮＰＩｇＥ抗体（ＰＢＳ中１／２希釈）で３０分間かけて標識した。細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、その後、１×１０６個のＴＮＰ標識ＥＬ−４細胞（実施例１参照）をエフェクター細胞に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＥＬ−４細胞を除去した。脱顆粒前後のそのパーフォリン含量を比較するために、ＲＢＬ細胞を、先に記載のように免疫染色した。
【０１９８】
Ａ．レトロウイルス発現系を使用したＲＢＬ細胞におけるパーフォリンの発現
今回の研究の目的は、ＲＢＬ発現系を使用して、Ｐ５およびＰ６のＦＨＬ患者において発現される２種のパーフォリン変異形態の生合成および機能を特徴づけることであった。それ故、ＷＴマウスパーフォリンの発現のための実施例１で最適化した方法を使用して、ヒトＰ５およびＰ６変異に等価な変異を、ＲＢＬ細胞で発現させるためにマウスパーフォリンに導入した。問題の残基（Ｇ４２９およびＰ３４５）は、ヒト、マウスおよびラットパーフォリンにおいて不変であり、これにより、機能の保存が示唆された。
【０１９９】
２ステップのレトロウイルス形質導入手順は、ここでも、最初に２９３Ｔ細胞をプラスミドＤＮＡでトランスフェクションし、ＲＢＬ細胞の形質導入に必要とされる強化されたウイルス上清を得ることが含まれていた。Ｐ５−ＰｆｐまたはＰ６−Ｐｆｐ発現構造物でトランスフェクションした後の２９３Ｔ細胞の解析により、細胞の５０％超が、ＧＦＰを発現しており、これにより、培養上清中の高いウイルス力価が示唆された（図１３）。蛍光レベルは、ＷＴ−Ｐｆｐおよび空ＭＳＣＶ構造物でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞で見られるものと同等であった（実施例１および図５参照）。レトロウイルス形質導入後、ＧＦＰマーカーを発現しているＲＢＬ細胞の少数の個体群をここでも再度選別し、培養液中で再増殖させて、均一に高いＧＦＰ導入遺伝子の発現を示す細胞個体群を得た。増殖された個体群の解析により、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐをコードするウイルスで形質導入された細胞の９０％超がここで強い蛍光を発している点から、ＧＦＰ発現細胞の選択が確認された（図１４）。合わせて考えると、これらの発現プロファイルにより、変異パーフォリンの発現は、ＷＴ−Ｐｆｐと類似した様式で起こることが示された（ＷＴ−Ｐｆｐ発現については実施例１参照）。
【０２００】
パーフォリンを検出するＰ１−８ｍＡｂを用いた、増殖ＲＢＬ個体群のウェスタンブロット解析により、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐパーフォリンを発現するように形質導入された各細胞個体群においては見かけの分子量６７ｋＤａのパーフォリンタンパク質が認められたが、空ベクターで形質導入された細胞には認められなかった（図１５）。変異パーフォリンタンパク質は、チューブリン添加対照と比べて、ＷＴ−Ｐｆｐと類似したレベルで発現されており、これにより、それぞれのＦＨＬ変異をパーフォリンへ導入しても、ＲＢＬ細胞におけるタンパク質の安定性には影響がないことが示唆された。
【０２０１】
Ｂ．ＷＴおよび変異Ｐｆｐを発現するＲＢＬ細胞により仲介される細胞傷害性
パーフォリン機能に対する導入変異の効果を試験するために、Ｐ５−ＰｆｐまたはＰ６−Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞の細胞傷害能を、４時間の５１Ｃｒ放射アッセイにおいて、ＴＮＰで標識されたＥＬ−４細胞を標的として使用して、ＷＴ−Ｐｆｐを発現している細胞と比較した（図１６）。ＷＴ−Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞で見られる強力な細胞傷害性とは極めて対照的に、変異パーフォリンを発現しているＲＢＬ個体群に応答した標的細胞からの５１Ｃｒ放射は、大きく減少していた。この結果は、数回の実験で、複数のＥ：Ｔ比で再現された。観察される細胞傷害性が欠失していることは、ウェスタンブロットにより以前に示されたように、タンパク質の発現レベルの差異に原因を帰することはできない。
【０２０２】
Ｃ．ＷＴおよび変異パーフォリンは、ＲＢＬ細胞質顆粒に局在する
ＷＴ−Ｐｆｐと比べた、リソソーム顆粒へのＰ５またはＰ６変異パーフォリンの輸送の差異を検出するために、ＲＢＬ細胞中のパーフォリンの細胞下分布を検証した。パーコール分画化ＲＢＬ細胞溶解液のウェスタンブロットにより、画分＃６〜１０にパーフォリンの局在が示され、極大のパーフォリン含量は、画分＃８に認められた（図１７Ａ）。極大パーフォリン発現はまた、リソソーム顆粒の酵素マーカーであるβ−ヘキソ−グルコサミニダーゼの最大活性とも一致していた（図１７Ｂ）（SchwartzおよびAusten、1980；J Invest Dermatol.1980、74(5):349-53）。これにより、ＷＴおよび変異パーフォリンは、分泌顆粒およびリソソーム内に局在していることが示された。これらの知見はまた、画分６〜８が、ＲＢＬ細胞の顆粒に富んだ画分であるとして同定された以前のデータと一致していた。
【０２０３】
分泌顆粒へのパーフォリンの細胞下局在は、さらに、免疫組織化学的染色によっても確認された。図１８に示されるように、ＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、およびＰ６−Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞は、パーフォリンに対して強く染色し、一方、空のベクターで形質導入されたＲＢＬ細胞は、全く染色を示さなかった。視覚的に１００％の細胞がパーフォリンに対して染色し、これは、ＲＢＬ細胞の９５％超に認められたＧＦＰ発現の以前のフローサイトメトリー解析と一致した（図１５）。高倍率の下で点状の細胞質染色が観察され、これは、パーフォリンのリソソーム局在と一致した。高倍率下で、類似の点状染色が、変異Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐの場合でも観察された。
【０２０４】
Ｄ．Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐの脱顆粒機能の調査：顆粒内容物による有核および除核標的細胞の溶解
先に提示した結果により、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐは、両方共、細胞質顆粒において正常に合成され輸送され貯蔵されること、そして、各変異形態は、標的細胞死を誘導できないことが示唆された。しかし、両方の変異パーフォリンは、エキソサイトーシスによりＲＢＬ細胞から放出されることができない可能性もあった。この可能性は、溶解顆粒を精製し、それらを標的細胞に直接適用することにより試験された。したがって、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐは、脱顆粒の欠陥の可能性を迂回するために、その細胞内区画から解離された。その後、ＷＴおよび変異パーフォリンを、有核ジャーカット細胞および除核ｓＲＢＣを溶解する能力について試験した。図１９Ａに示されるように、ＷＴ−Ｐｆｐは、ジャーカット細胞のかなりの溶解を引き起こし、顆粒が希釈されるにつれて明確な用量依存的な効果が見られた。試験した顆粒の最大濃度においては、幾分低いレベルの細胞傷害性が観察され、おそらく、カルシウムイオンの捕獲剤としておそらく作用しているいくつかの阻害性顆粒成分の存在に起因しているのであろう。顆粒を１／３２に希釈することにより、約６５％の比溶解が観察された。この溶解機能は、カルシウムイオンのキレート剤であるエチレングリコテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）の添加により完全に阻害され、このことから、溶解が、パーフォリンを介した機序により進行していることが示された。空のＭＳＣＶで形質導入されたＲＢＬ細胞から得られた顆粒は、ジャーカット細胞の溶解を誘導しなかった。ＷＴパーフォリンとは極めて対照的に、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐを含む顆粒は、Ｃａ２＋の存在下で、標的細胞の傷害を引き起こすことができなかった（図１９Ｂ）。
【０２０５】
類似の実験において、破壊された顆粒を、除核され、パーフォリンにより仲介される膜への傷害に対して感受性がより高い、ｓＲＢＣと混合した（ShiverおよびHenkart、Cell.1991、64(6):1175-81）。ＷＴ−Ｐｆｐにより、１／８の希釈度でヘモグロビン放出により検出されたように、ほぼ完全なＲＢＣ溶解がもたらされ、１／６４の希釈度まで有意な溶解が見られた（図１９Ｃ）。溶血は、アッセイに添加された顆粒材料の量の関数であり、ジャーカット細胞標的と同様に、ＥＧＴＡにより阻害された。Ｐ５−ＰｇｐまたはＰ６−Ｐｆｐを含む顆粒のどちらも、ｓＲＢＣの溶解を引き起こすことはできなかった。
【０２０６】
Ｅ．Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐの脱顆粒機能の調査：脱顆粒前後の細胞質顆粒中のパーフォリン含量の可視化
ＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、およびＰ６−Ｐｆｐが、ＲＢＬ細胞から遊離される能力を、免疫組織化学を使用して直接調べた。ＲＢＬ細胞を抗ＴＮＰＩｇＥ抗体で標識し、それらをＴＮＰで標識されたＥＬ−４細胞と共にインキュベートすることにより、ＲＢＬ細胞を刺激しその顆粒を放出させた。非刺激ＲＢＬ細胞は、ほぼ等量のＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、およびＰ６−Ｐｆｐを発現した（図２０）。ＴＮＰで標識されたＥＬ−４細胞と共にインキュベートした後、ＲＢＬ細胞中の染色レベルは著しく減少し、これにより、パーフォリンのエキソサイトーシスが示された。染色のこの減少は、ＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、またはＰ６−Ｐｆｐが発現されたいずれの場合においても類似していた。これにより、Ｐ５およびＰ６パーフォリンは、顆粒から等しくエキソサイトーシスされることができること、観察された細胞傷害性の欠失は、標的細胞レベルでのパーフォリンの機能不全に起因することが示唆された。
【０２０７】
実施例３：家族性血球貪食リンパ組織球症に伴う２個の推定多型（Ｒ２２５ＷおよびＧ４２９Ｅ）の機能的解析
本研究は、血球貪食リンパ組織球症におけるパーフォリン機能不全の細胞基盤を解明し、パーフォリンの「構造−機能」相関を研究するための手段としての本発明の態様の有用性を実証した。
【０２０８】
Ａ．細胞培養
本文書ではＲＢＬと呼ばれる、細胞株ＲＢＬ−２Ｈ３細胞（ラット好塩基性白血病；アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）および２９３Ｔ（ヒト胚腎臓）を、３７℃の加湿インキュベーター中、１０％ＦＣＳ、２mMグルタミン、並びに各１００μg／mlのストレプトマイシンおよびペニシリンを補充したＤＭＥＭ培地中に維持した。ジャーカットＴ細胞を、上記と同じように補充したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持した。ＲＢＬおよび２９３Ｔ細胞を、３７℃でトリプシン−ＥＤＴＡ溶液（CSL Ltd.）を使用して培養フラスコから脱着させた。
【０２０９】
Ｂ．ＲＢＬ細胞の一過性トランスフェクション
成熟ヒトおよびマウスパーフォリンは各々５３４アミノ酸を有する。しかし、ヒトパーフォリンのリーダー配列は、マウスよりも１アミノ酸長い。これにより、慣用のアミノ酸番号に差異が生じ、これにより、ＨＬＨ患者＃５（Stepp,S.E.ら、1999、Science、286:1957-1959により記載）で変異した２２５位および４２９位のアミノ酸は、以下の実験に特筆されているように、マウスタンパク質の残基２２４および４２８に対応する。重要なことには、アルギニン２２５は非保存残基であり、マウスパーフォリンではトレオニンが存在する。この位置でのアルギニンとトレオニンの等価性を実証するために、本発明者らは、患者＃５のＲ２２５Ｗに対応する、Ｔ２２４Ｒ変種および続いてＴ２２４Ｗ変異体を作成した（１１）。変異は、Transformer（ストラタジーン）部位特異的変異誘発システムを使用して製造業者の指示にしたがって導入した。得られたＷＴｃＤＮＡを、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ発現ベクター（CLONTECH Laboratories,Inc.）にクローニングした。Ｆｃε受容体を発現するＲＢＬ細胞を、１７５ｃｍ２フラスコ中で増殖させてほぼ集密とし、収集し、２回洗浄し、血清を含まないＤＥＭＥに１０７細胞／mlで再懸濁した。２００μＬの細胞懸濁液を、ＷＴもしくは変異パーフォリンｃＤＮＡまたはベクターＤＮＡのみを含む２０μgのｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰと混合し、室温で１０分間インキュベートし、４mm電気穿孔キュベット並びに５００μＦおよび０．２５Ｖのバイオラッドラボラトリーズパルサー中で電気穿孔した。室温で１０分後、細胞を、完全ＤＭＥＭに移した。細胞を１８〜２０時間後に収集し、ＧＦＰ発現細胞をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｔａｒ；Beckton Dickinson）により選別した。
【０２１０】
Ｃ．組換えレトロウイルスの作成およびＲＢＬ細胞におけるパーフォリンの安定な発現
ヒトＧ４２９Ｅ（患者＃５の別のパーフォリン対立遺伝子において同定）に相当するミスセンスパーフォリン変異Ｇ４２８Ｅを、Quickchange部位特異的変異誘発システム（ストラタジーン）を使用して製造業者の指示にしたがって作成した。マウスＷＴおよびＧ４２８ＥパーフォリンをコードするｃＤＮＡを、ＧＦＰ発現のための内部リボソーム進入部位を含むレトロウイルス発現ベクターＭＳＣＶにサブクローニングした。ＲＢＬ細胞のレトロウイルスによる形質導入のために、リン酸カルシウム沈降法により、両種指向性パッケージングプラスミドと共にＭＳＣＶプラスミドを、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトすることによりウイルス上清を作成した。
【０２１１】
４８時間後、ウイルス上清を収集し、１２時間毎に３日間ＲＢＬ細胞に加えた。最大ＧＦＰ発現を示す細胞個体群（全細胞の５％以下）を、続いて、フローサイトメトリーにより解析し、パーフォリンの発現について解析した。
【０２１２】
Ｄ．トランスフェクトＲＢＬ細胞の細胞傷害性の評価
ＲＢＬ細胞の細胞傷害能を、先に詳述したように、ジャーカットＴ細胞標的を使用して４時間の５１Ｃｒ放射アッセイで解析した。簡潔には、５１Ｃｒ標識ジャーカット細胞の表面を、３７℃で１mMのトリニトロベンゾスルホン酸のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で１５分間かけて誘導体化し、補充されていないＤＭＥＭで３回洗浄した。トランスフェクトされたＲＢＬ細胞を収集し、３７℃でアンチトリニトロフェノールＩｇＥｍＡｂ（２μg／ml）で１５分間かけてインキュベートし、補充されていないＤＭＥＭで３回洗浄した。ＲＢＬおよびジャーカット細胞を、３７℃で、９６ウェルプレート中の、１％ＢＳＡを補充された２００μlの血清非含有ＤＭＥＭ中、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で４時間共にインキュベートした。その後、上清を収集し、放射された５１Ｃｒをガンマカウンターで測定した。ジャーカット細胞の５１Ｃｒ全含有量を、５％トリトンＸ１００で溶解された細胞を使用して推定した。クロム比放射率は、１００×［（実験的放射×自然発生的放射］／［全放射−自然発生的放射］）として計算され、平均±ＳＤとして示した。
【０２１３】
Ｅ．ＲＢＬ細胞からのリソソーム顆粒の単離
パーフォリンを、窒素吹き込みおよびパーコール密度分画により、１０９個の安定に発現しているＲＢＬ細胞から単離した。顆粒に富んだ画分を他の細胞下画分と区別するために、ＲＢＬ顆粒マーカー酵素のβ−ヘキソサミニダーゼの活性を以下のように測定した。５０μlの各画分を、３０μlの８mM  ｐ−ニトロフェニルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（シグマアルドリッチ）および１０μlの０．５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）と室温で３０分間かけて混合した。反応を、１５０μＬの５０mM  ＮａＯＨの添加により停止し、４０５nmで吸光度を測定した。
【０２１４】
Ｆ．組換えパーフォリンの発現および膜結合アッセイ
パーフォリンｃＤＮＡを、全て製造業者の指示にしたがって、ｐＦａｓｔＢａｃベクターにクローニングし、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃキット（インビトロジェン）を使用して、ＳＦ９００−II  ＳＦＭ培地中で培養したＳｆ−２１細胞で過剰発現させ、パーフォリンを精製した。少量の組換えＷＴおよびＧ４２８Ｅパーフォリン変異タンパク質が得られた。
【０２１５】
パーフォリンのカルシウム依存的膜結合を研究するために、２×１０６個のヒツジＲＢＣを、１mM  ＣａＣｌ２を補充した２００μlの２０mM  Ｈｅｐｅｓ−１５０mM  ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁した。精製パーフォリンのアリコートを、氷上の細胞懸濁液に５分間かけて加えた。該細胞を１６，０００ｇで１０秒間かけてペレット化し、上清を直ちに除去し、該細胞を氷冷水中に溶解した。溶解液を、１６，０００ｇで４℃で２０分間遠心分離にかけた。該ペレットは１回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ添加緩衝液に溶解し、ウェスタンブロットにより解析した。
【０２１６】
Ｇ．イムノペルオキシダーゼ染色
約１，０００個のＲＢＬ細胞を、染色の１日前に８ウェルチャンバースライドの各ウェルに播種し、一晩培養した。いくつかの実験において、細胞を、ＴＮＰ標識腫瘍標的細胞と共に一過性インキュベートすることにより脱顆粒を引き起こすように誘導した。ＲＢＬ細胞を、３．７％パラホルムアルデヒド中で室温で１０分間かけて固定し、ＰＢＳ中で３回洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５％ＢＳＡ中で５分間かけて透過性とし、その後、前と同じように洗浄した。該細胞を、過ヨウ素酸（０．５％）で１０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を、０．３％Ｈ２Ｏ２を用いて１５分間かけてクエンチした。遮断緩衝液（１％ＢＳＡ／１％脱脂粉乳／ＰＢＳ）を、ラット抗パーフォリンｍＡｂＰ１−８の添加３０分前に加えた。結合したＩｇＧを、ビオチニル化ロバ抗ラットＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories）、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Dako）、および色素原ジアミノベンジジン（Dako）を用いて１０分間かけて検出した。最後に、細胞をエオシンで対比染色し、光学顕微鏡により観察した。
【０２１７】
Ｈ．ウェスタンブロット
安定にまたは一過性にトランスフェクトされたＲＢＬ細胞の細胞溶解液または顆粒抽出液を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシン）ゲル上で分解し、ＰＶＤＦ膜に転写し、ラット抗パーフォリンｍＡｂＰ１−８および抗ラットＨＲＰコンジュゲートＩｇを使用してパーフォリン含量についてアッセイした。シグナルは、化学発光（Amercham Bioscienecs）を使用して検出された。
【０２１８】
Ｇ．結果
電気穿孔効率は、４０％と高く、１回の電気穿孔で１０６個までのＧＦＰ発現細胞が得られた。Ｇ４２９は、ヒト、マウス、およびラットパーフォリンで保存されているが、Ｒ２２５は可変であり、マウスパーフォリンのＴ２２４に相当する。この位置のアルギニンおよびトレオニンの機能的等価性を確認するために、本発明者らは、Ｔ２２４Ｒマウスパーフォリンを発現しているＲＢＬ細胞を作成し、５１Ｃｒ放射アッセイにおいて、ＷＴパーフォリントランスフェクト細胞と同程度に有効であることを見出した。しかし、同じ位置にトリプトファンを有するパーフォリンを発現させることにより（Ｔ２２４Ｗ）、細胞溶解機能は完全に消失した（図２２）。期待された通り、ＷＴタンパク質は、約６７ｋＤの見かけの分子量を有していたが；しかし、トリプトファンの導入により、切断短縮された（約４５ｋＤ）パーフォリンが出現し（図２２）、このことは、変異が、パーフォリンのタンパク質分解切断／プロセシングを促進したことを示唆した。さらに、トランスフェクト細胞の免疫組織化学的解析により、おそらく推定シグナル伝達モチーフの欠失に因り、Ｔ２２４Ｗが誤った場所に局在化することが示された。ＷＴパーフォリンは、分泌顆粒中でのパッケージングに一致した点状の外見を生じたが、Ｔ２２４Ｗパーフォリンは、ＲＢＬ細胞質全体に散在した染色を生じた（図２３Ａ）。本発明者らが、患者＃５により共に遺伝されたＧ４２８Ｅ（ヒトではＧ４２９Ｅ）変異の効果を同じように解析すると、本発明者らは、ＷＴパーフォリンを発現しているＲＢＬ細胞と比べて、５１Ｃｒ放射レベルの低下を観察した（データは示さず）。この低下した活性を正確に定量するために、本発明者らは、ＷＴおよびＧ４２８Ｅパーフォリンを安定に発現する細胞株を産生した。レトロウイルスで形質導入されたＲＢＬ細胞をフローサイトメーターで解析し、最も蛍光の高い細胞（全個体群の０．２〜５％）を選別し、培養液中で増殖すると、約９３％のＧＦＰ陽性細胞が数日後に得られた。これらの細胞は、ＩＬ−１８／ＩＬ−２１活性化マウス一次ＮＫ細胞に等価なレベルでパーフォリンを発現していた（図２４Ａ）。パーフォリンの発現および細胞傷害機能は、何週間にもおよぶ連続培養期間中、安定であり続けた（図示せず）。本発明者らの一過性トランスフェクション実験と一致して、ＷＴパーフォリンを発現しているＲＢＬ細胞は、幅広いＥ：Ｔ比において、ジャーカット標的細胞を溶解する上で効果的であった（図２４Ｂ）。ＷＴとＧ４２８Ｅパーフォリンの間の細胞溶解活性の差異を決定するために、等しいレベルの５１Ｃｒ放射をもたらすのに必要とされるＥ：Ｔ比を比較した。本発明者らは、類似のレベルのＧ４２８Ｅを発現するＲＢＬ細胞は、クロム放射の誘導において、３〜４倍効率が低いことを見出した（図２４Ｂ）。
【０２１９】
その後、本発明者らは、Ｇ４２８Ｅパーフォリンの細胞傷害性の低下の理由を調査し続けた。イムノブロットにより実証されているように（図２４Ｂ）、これは、タンパク質の切断または分解に起因するものではなかった。分泌顆粒への不正確な輸送を除外するために、本発明者らは、安定に形質導入されたＲＢＬ細胞における、ＷＴおよびＧ４８２Ｅパーフォリンの細胞内局在化を調べた。顆粒中に正常な量の変異パーフォリンを見出せば、さらに、遺伝子転写、ｍＲＮＡ安定性もしくは翻訳、またはタンパク質折りたたみの有意な欠陥をも除外されるだろう。ＷＴまたはＧ４２８Ｅパーフォリンを発現するＲＢＬ細胞の溶解液をパーコール勾配で分画し、ウェスタンブロットにより解析すると、パーフォリンは、リソソーム様の分泌顆粒のマーカーであるβ−ヘキソサミダーゼの最大活性を含む画分に一貫して局在していた（図２４Ｃ）。ＷＴおよびＧ４２８Ｅパーフォリンの両方が、区別不能な点状の細胞質染色を示したので、パーフォリンの正しい標的化が、免疫組織化学的染色によっても確認された（図２３Ａ）。Ｇ４２８Ｅパーフォリンもまた、ＲＢＬ  Ｆｃε受容体との架橋時にＷＴパーフォリンと同程度に効率的にエキソサイトーシスにより放出された（図２３Ｂ）。Ｇ４２８Ｅパーフォリンは、ＷＴパーフォリンと等価なレベルで発現され、顆粒に正しく標的化され、顆粒から放出されたので（図２３および図２４、ＢおよびＣ）、変異は、パーフォリンのシナプス後の機能に影響を及ぼす可能性があった。この可能性を試験するために、本発明者らは、バキュロウイルス発現系を使用して組換えＷＴおよびＧ４２８Ｅパーフォリンを作成し精製し、カルシウム依存的なヒツジＲＢＣ膜への結合能を試験した。ＷＴパーフォリンは、強いカルシウム依存的な形質膜結合を示し、実質的に全ての添加されたパーフォリンが結合したが、Ｇ４２８Ｅパーフォリンの結合は顕著に低かった（図２５）。この観察に一致して、組換えＧ４２８Ｅ変異体の細胞溶解活性は、ＷＴパーフォリンの約５％であった（図示せず）。ＲＢＳ細胞は、長年、パーフォリン機能の読み出しとして使用されているが、このモデルの認識される弱点は、パーフォリンが、グランザイムＢの非存在下でもその細胞溶解効果を奏功することである。標的細胞を、グランザイムＢと組換えＧ４２８Ｅパーフォリンにさらしても、パーフォリンの表現型は救出されなかった（図示せず）。それ故、本発明者らの知見は、Ｇ４２８Ｅパーフォリンの活性消失は、グランザイムの不在ではなく、標的細胞膜への結合の消失に起因していることを強く示唆した。
【０２２０】
これは、共に遺伝されるとＨＬＨに見られる破局的な免疫抑制をもたらす、天然パーフォリン変異の機能的基礎を成功裏に画定した最初の研究であった。驚くべきことに、本発明者らは、パーフォリン機能の一部消失は、致命的な疾病を引き起こすに十分である可能性があることを実証した。Ｔ２２４Ｗ変異（ヒトではＲ２２５Ｗに相当する）により、タンパク質の不安定性およびＲＢＬ細胞溶解機能の完全な消失がもたらされたが、Ｇ４２８Ｅ（ヒトではＧ４２９Ｅ）は、ＲＢＬ細胞はＷＴ溶解活性の約２５〜３０％を保持していたので、一部不活性化するだけであった。本発明者らのＲＢＬアッセイの結果に基づいて、等量のＴ２２４ＷおよびＧ４２８Ｅパーフォリンを発現しているＣＴＬは、細胞活性が幾分残留しているが、しかし顕著に低下しているであろうと予測できた。事実、患者＃５のＮＫ細胞は、対照試料の約１５％の溶解活性を示した。本発明者らのデータとこの場合の臨床知見との一致は、本発明者らの実験アプローチが、ＨＬＨで同定された他のパーフォリン変異を解明するための強力な基礎を提供するはずであるという証拠を提供した。
【０２２１】
実施例４：家族性血球貪食リンパ組織球症に関連した２個の推定多型（Ａ９１ＶおよびＮ２５２Ｓ）および２２個のミスセンスパーフォリン変異の機能的解析
Ａ．変異パーフォリンｃＤＮＡの作成
ｐＫＳ（＋）ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされたマウスパーフォリンｃＤＮＡを、製造業者の指示（ストラタジーン）（要請すればオリゴヌクレオチドプライマー配列が提供される）にしたがって、TransformerまたはQuickChangeキットを使用して変異した。臨床の場合と比較して混乱しないために、本発明者らは、本研究を通じて、ヒトパーフォリンのアミノ酸番号を使用した。変異残基の相対的位置は、ヒトおよびマウスのタンパク質形態において同一であった。ＷＴまたは変異パーフォリンＰ３９Ｈ、Ｇ４５Ｅ、Ｖ５０Ｍ、Ｄ７０Ｙ、Ｃ７３Ｒ、Ａ９１Ｖ、Ｗ９５Ｒ、Ｇ１４９Ｓ、Ｆ１５７Ｖ、Ｖ１８３Ｇ、Ｇ２２０Ｓ、Ｔ２２１Ｉ、Ｈ２２２Ｒ、Ｈ２２２Ｑ、Ｉ２２３Ｄ、Ｒ２３２Ｃ、Ｒ２３２Ｈ、Ｎ２５２Ｓ、Ｅ２６１Ｋ、Ｃ２７９Ｙ、Ｒ２９９Ｃ、Ｄ３１３Ｖ、Ｒ３６１Ｗ、およびＱ４８１Ｐを、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ発現プラスミド（BD Biosciences Clontech）にクローニングした。ヒラメに見出される２個の対立遺伝子置換Ｒ２３２ＳおよびＱ４８１Ｅは、同じように発現された。各パーフォリンｃＤＮＡを完全に両鎖共シークエンスし、部位特異的変異誘発の忠実度をチェックした。得られた発現プラスミドは、キアゲンMaxiキットを使用して精製した。
【０２２２】
Ｂ．ＲＢＬ細胞の一過性トランスフェクション
Ｆｃε発現ＲＢＬ細胞を培養し、上記の実施例３Ｂに詳述したように一過性にトランスフェクトした。ＢＧＦＰ発現細胞を、フローサイトメーター（FACStar、ベクトンディッキンソン）を使用して１８〜２０時間後に回収した。数多くの報告により、ＨＬＨ患者のＮＫ細胞におけるパーフォリン発現の欠失が示され、このことから、変異タンパク質の本質的な不安定性が示唆された。この問題に対処するために、また、多くの試料を解析したので、本発明者らは、パーフォリン変種の発現レベルを信頼性をもって比較できなければならなかった。それ故、トランスフェクト細胞を選別する前に、ＦＡＣＳｔａｒフローサイトメーターを、CalibRITE FITC標識蛍光ビーズ（ベクトンディッキンソン）を使用することにより較正した。本発明者らは、このアプローチにより、再現性のあるＷＴパーフォリン発現レベルおよび同等な細胞傷害性を日々得られることを見出した。
【０２２３】
ＲＢＬ細胞の細胞傷害性を、上記の実施例３に記載のように４時間の５１Ｃｒ放射アッセイにおいて、標的としてジャーカットＴ細胞を使用して解析した。一過性にトランスフェクトされたＲＢＬ細胞の細胞溶解液を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（トリス−グリシン）ゲル上で分解し、その後、これをＰ１−８抗パーフォリンまたは抗チューブリン抗体を用いて、続いて、二次ＨＲＰ結合抗ラットまたは抗マウス免疫グロブリンを用いてイムノブロットすることによりパーフォリンまたはチューブリンの発現について解析した。シグナルは、化学発光（アマシャム−ファルマシア）により検出した。
【０２２４】
Ｃ．結果
本実験において、本発明者らは、図２６に列挙したように、様々なパーフォリンドメインに位置づけられたＰＲＦ１の２２個のＨＬＨを引き起こすと疑われるミスセンス変異の機能解析を行なった。他の遺伝子座の欠陥の可能性とは隔離された、パーフォリン機能に対する変異の影響を解析するために、本発明者らは、先に実施例３で詳述したように、ＲＢＬ細胞においてＷＴまたは変異パーフォリンを発現させ、その後、それらがコンジュゲートしたジャーカット標的細胞を溶解する能力を確認した。このアプローチを使用して、本発明者らはまた、様々なパーフォリン分子の可能性あるシナプス前およびシナプス後の機能不全を区別できた。本発明者らはまた、これまでにＰＲＦ１多型と考えられているＡ９１ＶおよびＮ２５２Ｓという２つの変形パーフォリン配列の詳細な解析を行なった。
【０２２５】
ｉ）パーフォリン多型と疑われるＡ９１Ｖの機能解析
所与のレベルの標的細胞死を達成するには約２倍のＲＢＬ細胞が必要であったことに基づいて、Ａ９１Ｖパーフォリンの細胞傷害性活性は、ＷＴに比べて、常に約５０％低下していた（図２７）。同じ基準により、Ｒ２３２Ｈパーフォリンは、Ａ９１Ｖよりも僅かにより活性が低く、ＷＴパーフォリン活性の約３０％の活性をもたらした。重要なことには、二重変異Ａ９１Ｖ／Ｒ２３２Ｈタンパク質は、完全に不活性であった。ウェスタンブロットによるタンパク質発現レベルの解析により、ＷＴタンパク質と比べて、Ａ９１Ｖの発現低下、Ｒ２３２Ｈの発現低下、およびＡ９１Ｖ／Ｒ２３２Ｈパーフォリンのより大幅な発現の低下が示された。これらの観察により、両方の変異が、パーフォリンの折りたたみおよび安定性に影響を及ぼし、ＲＢＬアッセイにおいてその細胞傷害性に対して負の影響を及ぼすようであったことが示唆された。本発明者らはまた、先の実施例３Ｆに記載したように、バキュロウイルス発現系を使用して、組換えヒトＡ９１ＶおよびＷＴパーフォリンを作成した。本発明者らは、Ａ９１Ｖの溶解活性は、ＷＴパーフォリンの１０％未満まで低下したことを見出した（データはここに示さず）。さらに、精製Ａ９１Ｖは、その溶解活性が、４℃で４８時間保存した後に検出不可能なレベルにまで急速に消失したことから、機能的に不安定であった。比較により、ＷＴパーフォリンは、これらの保存条件下で数ヶ月間安定であった。これに基づいて、本発明者らは、Ａ９１Ｖ置換により、タンパク質の折りたたみの誤りが起こり、これがＲＢＬ細胞における安定性の低下の原因であると提唱した。この不安定性は、バキュロウイルに感染させた昆虫細胞から精製されたパーフォリンの場合に増大しており、これはおそらく、昆虫細胞中に適切な細胞内シャペロンが存在しないこと、および／または酸化還元環境の変化に起因するのだろう。全体的に、先のアッセイにより、Ａ９１Ｖ置換は、対立遺伝子頻度が高いという点で異常な型のＰＲＦ１多型であるが、明らかに安定性の低下をもたらし、結果として、パーフォリン溶解活性が一部消失することが示された。本発明者らは、Ａ９１Ｖの細胞傷害活性レベルは一般に、第二対立遺伝子がＷＴであるか、またはさらには健康個体群の１〜４％の症例にように変異がホモ接合体状態で受け継がれた場合、ＨＬＨを防御するのに十分なほどのレベルである可能性があることを提唱した。
【０２２６】
（ii）パーフォリン多型が疑われるＮ２５２Ｓの機能解析
パーフォリン機能に対するＮ２５２Ｓ置換の効果を解明するために、本発明者らは、数個のパーフォリン変異Ｄ２５２Ｎ、Ｄ２５２Ｅ、およびＤ２５２Ｓを作成し、ＲＢＬ細胞傷害性アッセイにおいてその活性を解析し、その結果を図２８に示した。本発明者らは、これら全ての置換は、ＷＴパーフォリン活性を保持していたことを見出した。共優性発現を仮定して、これらの観察により、Ｎ２５２Ｓ対立遺伝子およびその他のＰＲＦ１対立遺伝子２８に不活性化変異を有する個体は、正常パーフォリン活性の約５０％を有することが示唆され、これは、他の研究者により観察されたＨＬＨ患者のＣＴＬ活性のレベルと一致していた。合わせて考えると、本発明者らのデータおよび疫学的研究９により、Ｎ２５２Ｓ置換のみでは、疾病の原因とはなり得ず、しかしむしろ、追加の遺伝子的欠陥に原因がある可能性があることが示された。それ故、本発明者らは、Ｎ２５２Ｓはおそらく真のＰＲＦ１多型を示すと結論づけた。
【０２２７】
ＨＬＨに関連したミスセンス変異の機能解析
今回の研究にいおいて、本発明者らは、様々なＨＬＨ患者で報告された対立遺伝子の組合せにしたがって、パーフォリン変異を分類した。図２９Ａは、ホモ接合性患者に見られる対立遺伝子の結果の概要を示し；図２９Ｂは、パーフォリンの無発現変異（通常、切断短縮）と同時に発現された対立遺伝子の対応するデータを示し、一方、図２９Ｃは、両方の対立遺伝子にミスセンス変異を有する複合性ヘテロ接合性患者のみにおいて同定された対立遺伝子に言及した。このアプローチは、本発明者らの知見が、可能な場合にはいつでも対応する臨床報告の解釈に有用に適用されるように選択した。本発明者らは、所与の変異がシナプス前またはシナプス後の機能不全をもたらすかどうかを調べることにより、ミスセンス変異の解析を始めた。ＲＢＬ細胞における発現レベルの解析により、大半のパーフォリン変異により、不安定／折りたたまれていないタンパク質がもたらされることが判明した。したがって、ウェスタンブロット解析にしたがって、変異Ｐ３９Ｈ、Ｇ４５Ｅ、Ｇ４５Ｒ、Ｖ５０Ｍ、Ｄ７０Ｙ、Ｗ９５Ｒ、Ｇ１４９Ｓ、Ｇ２２０Ｓ、Ｔ２２１Ｉ、Ｈ２２２Ｒ、Ｒ２３２Ｃ、Ｒ２３２Ｈ、Ｅ２６１Ｋ、Ｃ２７９Ｙ、Ｒ２９９Ｃ、Ｒ３６１Ｗ、またはＱ４８１Ｐを有するパーフォリンは、ＲＢＬ細胞において、ＷＴに比べて、検出不可能であるか大きく低下していた。変異タンパク質のシナプス前の欠陥は、分解をもたらす、その折りたたみの誤りまたは異常輸送に関連しているようであった。全ての不安定なパーフォリン変種は、ＲＢＬ細胞をベースとした５１Ｃｒ放射アッセイにおいて検出可能な最小の細胞傷害活性を有していた（図２９Ａ〜Ｃ）。本発明者らはまた、ヒラメパーフォリンの対応する位置に見られる残基を反映するために、アミノ酸置換Ｒ２３２Ｓ（図３０）およびＱ４８１Ｅ（図２９Ｂ）を遺伝子工学した。Ｒ２３２Ｈとは異なり（図２７も参照）、Ｒ２３２Ｓは、正常な活性を示し、一方、Ｒ２３２Ｃ（１名のＨＬＨ患者で報告）１４もまた、機能の重度な消失を示した（図３０）。ヒラメＱ４８１パーフォリンもまた、ＷＴの発現レベル（図２９Ｂ）および活性（データは示さず）を示した。ここで解析した別のグループのパーフォリン変異は、先に記載したものとは極めて異なって発現された。低い発現を示す臨床報告とは対照的に、Ｖ１８３Ｇ（図３１）およびＨ２２２Ｑパーフォリンは、ＲＢＬ細胞において、ＷＴと等価なレベルで発現され（図２９Ｂ）、Ｃ７３Ｒ、Ｆ１５７Ｖ、およびＤ３１３Ｖパーフォリン発現レベルはほんの僅かに低下しただけであった（図３０Ｂ）。続いて、本発明者らは、５１Ｃｒ放射細胞傷害アッセイを使用して、これらの変異パーフォリンの細胞傷害特性を解析した。本発明者らは、ＨＬＨに関与しているＶ１８３Ｇパーフォリンの溶解活性は、ＷＴタンパク質の溶解活性と区別できないことを見出して驚いた（図３１）。本発明者らは、第二対立遺伝子は不活性化Ｃ２７９Ｙ置換を有していたが、Ｖ１８３Ｇ変異は、患者ＶのＨＬＨにおいて原因となる役割を果たしていないようであると結論づけた（図２９Ｃ）。本発明者らの実験観察およびアミノ酸保存の欠失から、本発明者らは、Ｖ１８３Ｇ置換は、ＰＲＦ１の真の多型であり、対応する患者のＨＬＨは、パーフォリンとは独立したいくつかの他の機序により引き起こされている可能性があると推論した。さらに、パーフォリン変異は、ＷＴパーフォリンの機能に対して、認められ得る「ドミナントネガティブ」な効果を及ぼさないようであった。なぜならこの特性は、患者の親のパーフォリン機能に影響を及ぼすことが期待されるからである。保存ヒスチジンの変異Ｈ２２２Ｑにより、ＲＢＬ細胞においてパーフォリンの正常な発現がもたらされたが、トランスフェクトされたＲＢＬ細胞は、検出可能な細胞傷害活性を示さなかった（データは示さず）。類似の結果が、非保存的に置換された残基Ｃ７３Ｒ、Ｆ１５７Ｖ、およびＤ３１３Ｖ変異で観察され、ＲＢＬ細胞でのその発現レベルは、ＷＴパーフォリンに比べて僅かに低下していた。
【０２２８】
結論すると、本発明者らは、ＨＬＨと関連してこれまで報告されていたＰＲＦ１のミスセンス変異および多型の総合的な機能解析を提示した。本発明者らのデータにより、変異パーフォリンの不安定性は、シナプス後機能不全よりも、パーフォリン関連ＨＬＨのより一般的な原因であることが示された。本発明者らは、Ａ９１Ｖ変異は、パーフォリンの安定性および細胞溶解活性に有意に影響を及ぼす点で（タンパク質の正しくない折りたたみに起因する可能性が最も高い）、異常な「多型」の例であることを確立した。Ａ９１Ｖを、ホモ接合性状態の健康個体群の有意な割合が保持しているという事実は、この置換がそれにも関わらずＷＴ機能のかなりの割合を保持しているという本発明者らの実験知見に一致していた。
【０２２９】
実施例５：パーフォリン阻害活性を有する化合物のスクリーニング
Ａ．試薬
本研究で使用される試薬は以下の通りであった：
ＨＥＰＥＳ（シグマ・アルドリッチカタログ番号Ｈ−４０３４）
ＮａＣｌ（ＢＤＨカタログ番号１０２４１．４５）
ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ（ＢＤＨカタログ番号１００７０．４４）
ＢＳＡ（シグマ・アルドリッチカタログ番号Ａ−２１５３）
モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ２０；シグマ・アルドリッチカタログ番号Ｐ−７９４９）
トリトンＸ−１００（シグマ・アルドリッチ）
パーキンエルマースペクトラマックス３８４ウェルプレート（カタログ番号６００７８４９）。
【０２３０】
Ｂ．試験プロトコル
（ｉ）アッセイの概要
【表８】
2007526774.tif 000006
【０２３１】
（ii）アッセイの動態および特徴：
【表９】
2007526774.tif 000007
【０２３２】
（iii）アッセイ試薬および材料：
【表１０】
2007526774.tif 000008
【０２３３】
（iv）アッセイ方法：
０．１μlの化合物／ＤＭＳＯを、少なくとも３０分間は化合物と共に通例のように予めインキュベートし、「パーフォリン−ピンツール移行」法を使用するMiniTrak１IXを使用して、１０μlの緩衝液Ａ中０．５μg／mlのパーフォリンまたは対照にそれぞれ加えた。その後、４０μlのヒツジＲＢＣを、MultiDropを使用するZymark「パーフォリン2v4」法を使用してＲＢＣ緩衝液に加えた。ヒツジＲＢＣの溶解により、反応混合物の濁度が変化し、一方、細胞溶解の阻害により、濁度読取りの変化の減少または消失がもたらされた。阻害性化合物を通例のようにＤＭＳＯに溶かす時に、同濃度のＤＭＳＯを、パーフォリン阻害の陰性対照として使用した。ＤＭＳＯを使用したウェルでは、パーフォリン溶解は阻害されず、濁度の変化は、ＤＭＳＯまたは阻害性化合物の非存在下で観察されたものと等価であった。試料を、最初に、吸光度６５０nm（Envisionで；Envision読取り器オートメーションＡＢＳ＠６５０nmを使用して）で読取りし、３７℃で１５分間インキュベートし、その後、吸光度６５０nmで（Envisionで）読取りして、反応混合物の濁度の変化を評価した。
【０２３４】
Ｃ．実験手順
パーフォリンにより仲介される一次溶解アッセイは、６５０nmの波長での吸光度測定により検出される細胞濁度の測定に基づいていた。したがって、アッセイは、パーフォリンにより仲介されるヒツジＲＢＣの溶解阻害により、化合物の効力を決定する。ヒツジＲＢＣの溶解により、反応混合物の濁度は変化し、一方、細胞溶解阻害により、濁度読取りの変化は減少または消失した。阻害性化合物を通例のようにＤＭＳＯに溶かす時、同濃度のＤＭＳＯを、パーフォリン阻害の陰性対照として使用した。ＤＭＳＯを使用したウェルでは、パーフォリン溶解は阻害されず、濁度の変化は、ＤＭＳＯまたは阻害性化合物の非存在下で観察されたものと等価であった。
【０２３５】
（ｉ）一次スクリーン
一次スクリーンは、２０μMの最終濃度の化合物で行なった。化合物は、１つの点においてアッセイした。
【０２３６】
（ii）二次スクリーン−化合物希釈プレートフォーマット
５個の点の用量−応答が、Ｖ形のポリプロピレン３８４ウェルプレート（Matrical、Cat. No. MP101-3-PP）中に連続希釈された（各希釈シリーズ毎にピペットチップを交換）ストック化合物（＃２３および＃２４の列の対照）を用いて確立され、これから、０．５μlの希釈化合物が、１つのアッセイプレート（SpectraMaxの透明で平底の３８４ウェルプレート、パーキンエルマー Cat. No.6007849）の各ウェルに分配され、すなわち、１つのアッセイプレートにつき６４個までの化合物を試験した。
【０２３７】
（iii）化合物濃度
【表１１】
2007526774.tif 000009
【０２３８】
（iv）データ解析
各々の重複実験から得られたデータを、ソフトウェアActivityBase（登録商標）version5.0.10（ID Business Solutions Ltd）を使用して解析した。パーフォリンにより仲介される細胞溶解の５０％阻害をもたらす試験化合物のモル濃度（ＩＣ５０）は、ＭＳエクセルに基づくプログラムXLfit（version 3.0.5）を使用して、データを下記の式：
ｙ＝Ａ＋（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）ＡＤ））
（式中、
Ａは、曲線のプラトーの底、すなわち、最終の最小ｙ値であり；
Ｂは、曲線のプラトーの頂点、すなわち、最終の最大ｙ値であり；
Ｃは、５０％のｙ値でのｘ値であり（これは、Ａ＋Ｂ＝１００である場合のｌｏｇＩＣ５０を示す）；
Ｄは、ヒル勾配係数であり（このモデルでは、ｘの増加と共にｙが減少する場合に正の値に戻る）；
Ｘは、元来の既知のｘ値であり；
Ｙは、元来の既知のｙ値である）
の４パラメータｌｏｇ関数に当てはめることにより導いた。
【０２３９】
Ｄ．結果
（ｉ）一次スクリーンデータ
【表１２】
2007526774.tif 000010
【０２４０】
（ii）二次スクリーン
一次スクリーンで同定された６１２個の全ての化合物を、続いて、一次スクリーンと同じ方法および３８４ウェルフォーマットを使用して、１００μM、２０μM、４μM、０．８μM、および０．１６μMで試験した。６１２個の化合物の中で、３３３個が、ＩＣ５０＜１００mMでマウスパーフォリンによるヒツジＲＢＣ溶解を再現的に阻害したことが確認された。３３３個の化合物の中で、１３２個が、ＩＣ５０＜２０μMでヒツジＲＢＣの溶解を阻害するとして定義され、最大効力を有することが観察された。
【０２４１】
（iii）三次スクリーン
ＩＣ５０＜２０mMの１３２個の化合物の中の１２９個を、三回目に、マウスパーフォリンの溶解阻害について試験した。この場合、各阻害剤を、１００mM、２５mM、５mM、および１mMで試験した（以下の表を参照）。ヒツジＲＢＣ溶解アッセイの方法は、以下のように変更した：
【０２４２】
化合物／ＤＭＳＯを、パーフォリンまたは対照に加え、９６ウェルＶ底プレートのウェル中で３０分間プレインキュベートした。全ての試薬を先に記載のように調製した。その後、ヒツジＲＢＣ（先に記載のように調製）を加え、該プレートを３７℃で１５分間インキュベートした。その後、該プレートを１５００rpmで周囲温度で３分間遠心分離にかけた。上清を各試験ウェルからピペットを用いて回収し、ヘモグロビン放出を、５４１ｎＭでの吸光度を測定することにより定量した。ＲＢＣからの最大ヘモグロビン放出を、同じ数のヒツジＲＢＣを同じ容量の蒸留水に再懸濁することにより決定した。溶解の陰性対照は、同じ数のヒツジＲＢＣを、パーフォリンを含まない同じ容量の緩衝液Ａ中でインキュベートすることから構成された。各化合物の溶解阻害率を、表に示した。
【０２４３】
【表１３】
2007526774.tif 000011
2007526774.tif 000012
2007526774.tif 000013
2007526774.tif 000014
【０２４４】
結果により、１００μMおよび２５μMにおいて、殆どの化合物は、パーフォリンにより誘導される赤血球の溶解を阻害でき、１μMで使用した場合には、それらの多くは依然として極めて強力であることが実証された。１μMで使用した場合、該化合物の約３０％が依然として強力であった。
【０２４５】
（iii）２０μMの化合物と０．１％、０．５％、および１％ＢＳＡの存在下でのヒツジ赤血球アッセイ
１２９個の化合物の中で、本発明者らは、陰性対照と共に、最も強力（２０μMにおいて）な化合物の中の４６個を選択し、様々な濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下でＳＲＢＣ溶解アッセイを行なった。本発明者らは、該化合物の中の２２個が、依然として、ＢＳＡが０．１％で存在している場合、マウスパーフォリンを少なくとも６０％阻害できることを見出した。
【０２４６】
【表１４】
2007526774.tif 000015
2007526774.tif 000016
【０２４７】
（iv）ＨＥ緩衝液中０．１％ＢＳＡの存在下での有核（ジャーカット）細胞上でのパーフォリンの阻害
その後、０．１％ＢＳＡの存在下で依然としてパーフォリンによるヒツジＲＢＣの溶解を６０％超で阻害することのできる化合物を、８０μM、２０μM、５μM、および１μMで、０．１％ＢＳＡの存在下で、５１Ｃｒ放射アッセイにより、有核細胞（ジャーカットＴリンパ腫細胞）の溶解を阻害する能力について試験した。該化合物を、ＨＥ緩衝液またはＲＰＭＩ培地中で試験し、以下に示したデータは、ＨＥのものである。
【０２４８】
【表１５】
2007526774.tif 000017
2007526774.tif 000018
【０２４９】
結果により、８０μMにおいて、３６個中３５個の化合物が、パーフォリンを６０％以上阻害し；２０μMにおいて、３６個中２４個の化合物が、パーフォリンを６０%以上阻害し；５μMにおいて、３６個中１７個の化合物が、パーフォリンを６０％以上阻害し；１μMにおいて、３６個中９個が、パーフォリンを６０％以上阻害したことが示された。
【０２５０】
（ｖ）ＲＰＭＩ緩衝液中の０．１％ＢＳＡの存在下でのパーフォリンによる有核ジャーカット細胞溶解の阻害
【表１６】
2007526774.tif 000019
【０２５１】
（vi）作用の特異性
阻害剤が、特異的にパーフォリンを阻害したかどうかを試験するために、または、肺炎球菌毒素ニューモリシン（ＰＬＯ）の溶解機能も遮断できたかどうかを試験するために、以下の表の阻害剤を、２０μMで、ＰＬＯにより誘導されるヒツジＲＢＣ溶解を阻害するその能力について試験した。どれもＰＬＯに対する有意な阻害効果はなく、このことは、それらが特異的にパーフォリンを阻害するように作用したことを示す。
【０２５２】
【表１７】
2007526774.tif 000020
2007526774.tif 000021
2007526774.tif 000022
【０２５３】
（vii）ヒツジ赤血球溶解アッセイにおけるマウスおよびヒトパーフォリンの阻害（１μMの化合物を使用）
先に記載したパーフォリン阻害剤の全てのスクリーニングは、マウスパーフォリンを使用して行なった。以下の表の化合物を、同時に、マウスおよびヒトの両方のパーフォリンに対して応答するヒツジＲＢＣ溶解を阻害する能力について試験した。
【０２５４】
【表１８】
2007526774.tif 000023
【０２５５】
結果により、各化合物は、マウスパーフォリンとほぼ等価かまたはさらには僅かにより高い効力でヒトパーフォリンを阻害できることが実証された。例えば、化合物ＩＤ番号５３７００は、マウスパーフォリンを９６．７％阻害し、ヒトパーフォリンを１０３．９％阻害した。
【０２５６】
その後、阻害性化合物４６５５３を選択し、ジャーカット細胞のアポトーシスを誘導する際のパーフォリンおよびグランザイムＢの相乗作用を遮断するその能力についてアッセイした。結果により、阻害性化合物４６５５３は、ジャーカット細胞のアポトーシスを完全に阻害したことが実証された（図３２）。類似の効果が、阻害性化合物３４２３１、７７３６７および３２８４６でも認められた（データはここに示さず）。
【０２５７】
最後に、本明細書に概略を示した本発明の本質から逸脱することなく、様々な他の改変および／または変更を行なってもよいことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】図１は、配列の下のカラーの説明文に示される推定的機能的パーフォリンドメインを示した、ヒトパーフォリンの一次アミノ酸配列およびｃＤＮＡ配列を示す。右の数字は、Ｍｅｔ１開始コドンから始まる、ヌクレオチド（小さなフォント）およびアミノ酸（大きなフォント）の番号を示す。また、ＦＨＬ疾患でこれまで同定されたパーフォリン遺伝子変異のいくつかが示されている。ミスセンス変異は、赤丸で示し、フレームシフトおよびナンセンス変異は白抜きの丸で示す。
【図２】図２は、ＲＢＬ細胞中でマウスパーフォリンを発現させ、その細胞傷害機能を確証するために使用された方法の簡潔な概略を示す。
【図３】図３は、ネズミ幹細胞プラスミドベクター（ＭＳＣＶ）の図を示す。マウスパーフォリンをコードするｃＤＮＡを、ポリリンカー領域のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入した。このバイシストロン性プラスミドは、対象の遺伝子の発現を駆動する長い両種指向性ＭＳＣＶ５’ＬＴＲ、ＧＦＰｃＤＮＡ、並びに１つのｍＲＮＡ転写物からのＧＦＰおよび第二の対象のタンパク質の翻訳を可能にするＩＲＥＳを含む。ＧＦＰの自己発現は、対象の導入遺伝子を発現すると期待される形質導入細胞の迅速な選択を可能とする。
【図４】図４は、エフェクターＲＢＬ細胞とＥＬ−４標的細胞とのＩｇＥ依存的な架橋の図を示す。ＲＢＬ細胞は、抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体を介して、その表面Ｆｃε受容体を、ＴＮＰ標識ＥＬ−４標的細胞と架橋することにより、その顆粒含有物のエキソサイトーシスが引き起こされた。
【図５】図５は、ＭＳＣＶまたはＭＳＣＶ−ＰｆｐプラスミドＤＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現レベルのフローサイトメトリー解析を示す。空ＭＳＣＶベクター（上のパネル）またはＷＴパーフォリンｃＤＮＡを含むＭＳＣＶ（下のパネル）を、高力価ウイルス上清を産生するために、両種指向性ヘルパープラスミドを用いて２９３Ｔパッケージング細胞に同時トランスフェクトした。青の実線は、ヘルパープラスミドのみでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の蛍光ベースライン値を示す。
【図６】図６は、２９３Ｔパッケージング細胞から得られたウイルス上清で形質導入した後のＲＢＬ細胞におけるＧＦＰ発現のフローサイトメトリー解析を示す。Ａ）ＲＢＬ細胞を、ＭＳＣＶベクターまたはパーフォリンｃＤＮＡを含むＭＳＣＶをコードするウイルス上清を用いて形質導入し、３日後にＧＦＰ発現について解析した。バックグラウンドを超える（Ｍ１ゲート）有意な蛍光を発現する少数の細胞（０．２〜２．０％）を単離し、増殖させ、下のパネルの個体群を得た。Ｂ）非形質導入ＲＢＬ細胞（実線）に比べて、高いレベルのＧＦＰ導入遺伝子の発現に基づいて単離されたＲＢＬ細胞を増殖させて、９０％を超える細胞がＧＦＰを発現しているような個体群を得た。
【図７】図７は、ウェスタンブロットによるＲＢＬ細胞におけるパーフォリンの発現を示す。形質導入されていない、または空ベクターで形質導入された（ＭＳＣＶ）、またはパーフォリンで形質導入（ＭＳＣＶ−Ｐｆｐ）されたＲＢＬ細胞の細胞完全体溶解物を、ラット抗マウスパーフォリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｐ１−８でプローブした。左の標識は、タンパク質サイズマーカーの移動を示す。
【図８】図８は、抗ＴＮＰＩｇＥを用いてのＲＢＬ細胞の表面標識のフローサイトメトリー解析を示す。Ａ）ＲＢＬ細胞を、多くの異なる希釈度（１／２、１／２０、１／５０、１／１００）の抗ＴＮＰＩｇＥ抗体で標識し、表面標識に最適の濃度を決定した。結合は、フローサイトメトリーによる解析のために、二次ビオチンコンジュゲート抗マウスＩｇＥ抗体と共にインキュベートし、その後、ストレプトアビジンＰｅｒＣＰと共にインキュベートすることにより検出した。Ｂ）ＲＢＬ細胞を、３７℃または４℃で抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体と共に１５〜６０分間インキュベートし、最大結合のために最適な条件を決定した。
【図９】図９は、４時間の５１Ｃｒ放射アッセイで検出される、ＥＬ−４標的細胞に対する、パーフォリンを発現しているＲＢＬ細胞の細胞傷害機能を示す。パーフォリン発現のために再構成されたＲＢＬ細胞を、抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体で標識し、５１Ｃｒを前以て添加しておいたＴＮＰ標識ＥＬ−４細胞にコンジュゲートさせた。陰性対照のために、アッセイは、架橋ＩｇＥ抗体またはＴＮＰの非存在下でも実施した。空ＭＳＣＶベクターで形質導入されたＲＢＬ細胞を、ＲＢＬ傷害性の基底指標として含めた。全ての細胞を、様々なエフェクター−標的細胞の比でインキュベートした。データ点は、３重に実施したアッセイの平均値（＋／−標準誤差）を示す。
【図１０】図１０は、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐで形質導入されたＲＢＬ個体群におけるパーフォリンの発現を示す。高力価ウイルス上清を生じた４個の独立した２９３Ｔトランスフェクション体を使用して、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現するＲＢＬ細胞を作成した。ＧＦＰ導入遺伝子発現の高さに基づいて単離された細胞を、モノクローナル抗パーフォリン抗体Ｐ１−８でプローブすることにより、パーフォリンタンパク質発現について解析した。膜はまた、タンパク質添加の指示物質としての抗チューブリン抗体でもプローブした。
【図１１】図１１は、４時間の５１Ｃｒ放射アッセイで測定された、ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現している独立したＲＢＬ細胞株の細胞傷害機能を示す。ＭＳＣＶ−Ｐｆｐを発現している４個の独立したＲＢＬ個体群を、５１Ｃｒを添加したＥＬ−４標的細胞と共に様々なエフェクター−標的の比でインキュベートした。エフェクター細胞は、標的細胞上の表面ＴＮＰを認識する抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体を使用することにより脱顆粒が引き起こされた。アッセイのために、空ＭＳＣＶベクターで形質導入したＲＢＬ細胞を、ＲＢＬ傷害性の基底指標として含めた。データ点は、３重アッセイの平均＋／−標準誤差である。このアッセイは、６回の実験の代表である。
【図１２】図１２は、マウスパーフォリンタンパク質の図を示す。ＦＨＬに同定された多くのミスセンス変異の２個が示されている。患者５（Ｐ５＝Ｇ４１９Ｅ）および患者６（Ｐ６＝Ｐ３４５Ｌ）のアミノ酸置換を取り込んだパーフォリン分子のｃＤＮＡを、ＭＳＣＶベクターにサブクローニングした。また、推定的両親媒性αへリックス、システインリッチＥＧＦ様ドメインおよびＣ２リン脂質結合ドメインも示されている。数字は、２１アミノ酸リーダー配列を含む、パーフォリンの残基の番号を示す。
【図１３】図１３は、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−ＰｆｐｃＤＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ発現レベルのフローサイトメトリー解析を示す。Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐ  ｃＤＮＡをコードするＭＳＣＶ  ＤＮＡ構造物を、高力価ウイルス上清の作成のために、両種指向性ヘルパープラスミドを用いて２９３Ｔパッケージング細胞に同時トランスフェクトした。青の実線は、ヘルパープラスミドのみでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞のベースライン基底値を示す。
【図１４】図１４は、２９３Ｔパッケージング細胞トランスフェクション体から得られたウイルス上清で形質導入されたＲＢＬ細胞におけるＧＦＰの発現を示す。ＲＢＬ細胞を、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐ  ｃＤＮＡをコードするＭＳＣＶウイルス上清で形質導入した。高レベルの導入遺伝子を発現している細胞を単離し増殖させて、緑の実線で示される個体群を得た。非形質導入の親ＲＢＬ細胞の蛍光基底値は、紫塗りのプロフィルで示される。
【図１５】図１５は、ウェスタンブロットにより検出された、ＲＢＬ細胞におけるパーフォリンの発現を示す。ＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、Ｐ６−Ｐｆｐまたは空のＭＳＣＶベクターで形質導入されたＲＢＬ溶解物を、モノクローナル抗マウスパーフォリン抗体を用いたイムノブロットにより、パーフォリンの発現について解析した。膜は、同等のタンパク質が添加されたことを確認するために、チューブリン用にも再プローブした。
【図１６】図１６は、ＷＴまたは変異パーフォリンを発現しているＲＢＬ細胞の機能を測定する、４時間の５１Ｃｒ放射細胞傷害性アッセイを示す。ＷＴまたは変異パーフォリン（Ｐ５−ＰｆｐまたはＰ６−Ｐｆｐ）を発現しているＲＢＬ細胞がＴＮＰ標識ＥＬ−４細胞を殺滅する能力を、４時間の５１Ｃｒ放射アッセイで解析した。空のＭＳＣＶベクターで形質導入されたＲＢＬ細胞が、陰性対照としてアッセイに含められた。
【図１７】図１７は、ＲＢＬ細胞からの細胞質顆粒の単離を示す。Ａ）顆粒を、ＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、Ｐ６−Ｐｆｐまたは空のベクターを発現する破壊されたＲＢＬ細胞の密度勾配分画により分画した。勾配画分を、モノクローナル抗パーフォリン抗体Ｐ１−８を使用してウェスタンブロットすることによりパーフォリンの存在について解析した。Ｂ）は、Ａ）に示される勾配画分におけるβ−ヘキソサミニダーゼ活性を示す。
【図１８】図１８は、ＲＢＬ顆粒中のパーフォリンの免疫組織化学的検出を示す。空のベクター（ＭＳＣＶ）、ＷＴ−Ｐｆｐ、または変異パーフォリン（Ｐ５−ｐｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐ）を発現しているＲＢＬ細胞を、抗パーフォリンｍＡｂのＰ１−８を使用してそのパーフォリン含量について染色した。シグナルは、ビオニチル化二次抗体、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、および基質の色素原を使用して検出され、その結果、抗原部位における褐色の沈降物が認められた。全ての形質導入ＲＢＬ細胞内の顆粒も、高倍率で拡大して観察した。ＷＴ−Ｐｆｐを発現している代表的なＲＢＬ細胞は、高倍率の下で観察される典型的な染色を示す。染色は、３回の別々の日に実施した実験の５個の視野の代表である。
【図１９】図１９は、４時間の５１Ｃｒ放射アッセイでアッセイされた、ＲＢＬ細胞から単離された顆粒によるジャーカット細胞の溶解を示す。Ａ）ジャーカット細胞を、ＷＴ−Ｐｆｐおよび空のＭＳＣＶで形質導入されたＲＢＬ細胞から単離された顆粒と共にインキュベートした。アッセイは、顆粒の連続希釈液を使用し、ＥＧＴＡを添加してまたは添加せずに行なった。Ｂ）ジャーカット細胞を、ＷＴ−ＰｆｐＲＢＬ細胞から単離された顆粒と共にインキュベートし、Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−ＰｆｐＲＢＬ細胞から単離された顆粒の機能と比較した。データ点は、３回のアッセイの平均＋／−標準誤差である。アッセイは、３回のこのような実験の代表である。
【図２０】図２０は、ヘモグロビン放出により検出された、ＲＢＬ細胞から単離された顆粒による赤血球の溶解を示す。ＷＴ−Ｐｆｐ、Ｐ５−Ｐｆｐ、またはＰ６−Ｐｆｐを発現しているＲＢＬ細胞から単離された顆粒を、赤血球と共に３０分間インキュベートし、ヘモグロビン放出を測定した。アッセイはまた、ＥＧＴＡの存在下で空のＭＳＣＶで形質導入されたＲＢＬ顆粒と共に実施した。
【図２１】図２１は、パーフォリンについての免疫組織化学的染色により検出された、ＲＢＬ細胞の脱顆粒を示す。ＷＴ−Ｐｆｐまたは変異パーフォリン（Ｐ５−ＰｆｐおよびＰ６−Ｐｆｐ）で形質導入されたＲＢＬ細胞を、抗ＴＮＰ  ＩｇＥ抗体で標識し、ＴＮＰ標識ＥＬ−４細胞の存在下または非存在下でインキュベートし、ＲＢＬ細胞を刺激して脱顆粒させた。その後、全ての細胞を、抗パーフォリンｍＡｂのＰ１−８を使用してそのパーフォリン含量について染色した。シグナルは、ビオニチル化二次抗体、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、および基質の色素原を使用して検出され、その結果、抗原部位における褐色の沈降物が認められた。空のＭＳＣＶで形質導入されたＲＢＬ細胞を、パーフォリン染色のための陰性対照として含めた。染色は、３回の別々の日に実施した実験の５個の視野の代表である。
【図２２】図２２は、ＲＢＬ細胞で発現されるＴ２２４Ｗマウスパーフォリンの細胞傷害活性の低下および切断短縮（truncation）を示す。パーフォリン依存性５１Ｃｒ放射が、抗ＴＮＰ  ＩｇＥの存在下で一過性にトランスフェクトし選別したＲＢＬ細胞と共に４時間インキュベートされたＴＮＰ標識ジャーカット細胞から示される。データ点は、３重の試料の平均±ＳＤとして示され、３回の類似アッセイの代表である。ウェスタンブロット（右）は、ＷＴおよびＴ２２４Ｒパーフォリンと比較した、２回の独立したトランスフェクション実験で発現されるＴ２２４Ｗパーフォリンの切断短縮（Ｔ２２４Ｗ−１およびＴ２２４Ｗ−２）を示す。
【図２３】図２３は、Ｔ２２４ＷおよびＧ４２８Ｅパーフォリンが、ＲＢＬ細胞において違う場所に局在していることを示す。（Ａ）抗パーフォリン抗体Ｐ１−８を用いて実証され、エオシンで対比染色された、パーフォリン発現ＲＢＬ細胞の免疫組織化学。（Ｂ）非標識であるかまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＥで標識されたＲＢＬ細胞を、ＴＮＰ標識標的細胞と共に一過性にインキュベートすることにより脱顆粒を誘導した後に、（Ａ）と同様に染色した（拡大率、４００倍）。
【図２４】図２４は、ＲＢＬ細胞で発現されたＧ４２８Ｅマウスパーフォリンの細胞傷害性活性は低下するが、見かけの分子量は正常であることを示す。（Ａ）ＩＬ１８／ＩＬ−２１活性化マウスＮＫ細胞、および空のベクター（ＧＦＰ）を発現している細胞と比較した、安定に形質導入されたＲＢＬ細胞におけるパーフォリン発現を示すウェスタンブロット。（Ｂ）抗ＴＮＰ  ＩｇＥの存在下で、ＷＴまたはＧ４２８Ｅパーフォリンを安定に発現しているＲＢＬ細胞と共に４時間インキュベートした、ＴＮＰ標識ジャーカット細胞からのパーフォリン依存性５１Ｃｒ放射。データ点は、３回の独立した実験の平均±ＳＤとして示される。ウェスタンブロット（右）は、Ｇ４２８Ｅが、ＷＴパーフォリンと共に移動することを示す。ＧＦＰは、空ベクター対照である。（Ｃ）ＷＴまたはＧ４２８Ｅパーフォリンまたは空のベクター（ＧＦＰ）を安定に過剰発現しているＲＢＬ細胞を溶解し、パーコール密度勾配で分画した。その後、画分を、ウェスタンブロットにより、そのパーフォリン含量およびそのβ−ヘキソサミニダーぜ活性について解析した。
【図２５】図２５は、Ｇ４２８Ｅ変異は、可溶性パーフォリンのカルシウム依存性膜結合を有意に低下させることを示す。等量の組換えＷＴおよび変異パーフォリンを、１mMのＣａＣｌ２の非存在下（−）または存在下（＋）でヒツジ赤血球に結合する能力について試験した。各場合におけるパーフォリンの投入量の合計は（Ｃ）として示される。
【図２６】図２６は、ＨＬＨで同定された２個の共通のパーフォリン多型およびミスセンス変異の位置を示す。パーフォリンの推定ドメインは、ボックスとして示され、数字は、各ドメインについての、およそのアミノ酸の境界を示し、リーダーの最初の残基を残基１と称する。Ｎ末端は、溶解特性を有すると予測され；２個の相同性の低い領域は、他の哺乳動物タンパク質ドメインと有意な類似性は全くなく；両親媒性αへリックスは、補体膜攻撃複合体成分Ｃ５ｂ〜Ｃ９の領域に相同であり；ＥＧＦ様ドメインは、主に高度に保存されたシステイン残基に因り、遍在的なＥＧＦドメインに構造的に類似し；Ｃ２ドメインは、パーフォリンの膜結合に関与するカルシウム結合領域である。アステリスクの付いた残基Ａ９１ＶおよびＮ２５２Ｓは、パーフォリン多型が疑われることを意味する。
【図２７】図２７は、Ａ９１Ｖおよび同時に受け継がれた置換Ｒ２３２Ｓの発現低下およびその機能の部分的消失を示す。Ａ９１Ｖ、Ｒ２３２Ｈ、および二重変異Ａ９１Ｖ／Ｒ２３２Ｈパーフォリンを受け継いだ二卵性双生児において同定されたＰＲＦ１変異の作用が示されている。上のパネルは、それぞれの変異パーフォリンを発現し、材料および方法で記載のように選別された、ＲＢＬ細胞からの細胞完全体の抽出物のウェスタンブロットを示す。グラフは、エフェクター細胞として一過性にトランスフェクトされ選別されたＲＢＬ細胞、および標的として５１Ｃｒ標識ジャーカット細胞を、指定されたエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で使用した、４時間の細胞傷害性アッセイを示す。示されるデータは、４〜９回の独立した実験の平均±ＳＥである。明瞭にするために、データの部分集合（より低いＥ／Ｔ比）が、より大きなプロットで再度示されている。
【図２８】図２８は、残基２５２にセリン置換を有するパーフォリンの正常な発現および機能を示す。一過性トランスフェクトＲＢＬ細胞における、Ｄ２５２Ｓ、Ｄ２５２Ｎ（ヒトパーフォリン）およびＤ２５２Ｅ（ヒラメパーフォリン）の相対的発現を示すウェスタンイムノブロット。線グラフ（真ん中）は、５１Ｃｒ放射細胞傷害性アッセイにおける、Ｄ２５２Ｓパーフォリン（ヒトにおけるＮ２５２Ｓと等価）の溶解活性を示す。棒グラフ（下）は、マウスパーフォリン上に移植された２５２位のパーフォリン変種（ヒラメに見られるＤ２５２Ｅおよびヒトに見られるＤ２５２Ｎ）の溶解能を比較する。示されるデータは、平均±ＳＤであり、３回の独立した実験の代表である。
【図２９Ａ】図２９は、パーフォリンの発現および活性に対するＰＲＦ１のミスセンス変異の解析を示す。ＲＢＬ細胞をトランスフェクトし、列挙した各々のミスセンス変異を有するパーフォリンを発現させ、その後ＦＡＣＳにより選別し、ウェスタンブロット解析および５１Ｃｒ放射細胞傷害アッセイに使用した。特に断りない限り、各々の変異パーフォリンを、ＲＢＬに基づいたアッセイで、少なくとも３回、３０：１、１０：１、および２：１のＥ／Ｔ比で、標的としてジャーカットＴリンパ腫細胞を使用して試験した。変異は、ＨＬＨ患者の遺伝子型にしたがって分類した：（Ａ）ホモ接合型患者で同定されたもの、（Ｂ）複合ヘテロ接合型で同定された変異（ここで、第二の対立遺伝子は、タンパク質のフレームシフトまたは中途終止をコードしていた）、（Ｃ）ＰＲＦ１の両方の対立遺伝子のミスセンス変異を有する複合ヘテロ接合型で同定された変異。ウェスタンイムノブロットは、等しい数のＦＡＣＳ選別ＲＢＬ細胞中の変異パーフォリンの相対的な発現レベルを示す。各患者の元々の文献は、最初の列に上付き文字として示されている。ＨＬＨ診断年齢は、対応する文献に記載されているように、月で示される。イタリック体は、本発明者らにより何処かで以前に解析されたパーフォリン変異を示す。アミノ酸保存は、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のような、哺乳動物およびヒラメのパーフォリンのアミノ酸配列アラインメントから導かれる。
【図２９Ｂ】図２９は、パーフォリンの発現および活性に対するＰＲＦ１のミスセンス変異の解析を示す。ＲＢＬ細胞をトランスフェクトし、列挙した各々のミスセンス変異を有するパーフォリンを発現させ、その後ＦＡＣＳにより選別し、ウェスタンブロット解析および５１Ｃｒ放射細胞傷害アッセイに使用した。特に断りない限り、各々の変異パーフォリンを、ＲＢＬに基づいたアッセイで、少なくとも３回、３０：１、１０：１、および２：１のＥ／Ｔ比で、標的としてジャーカットＴリンパ腫細胞を使用して試験した。変異は、ＨＬＨ患者の遺伝子型にしたがって分類した：（Ａ）ホモ接合型患者で同定されたもの、（Ｂ）複合ヘテロ接合型で同定された変異（ここで、第二の対立遺伝子は、タンパク質のフレームシフトまたは中途終止をコードしていた）、（Ｃ）ＰＲＦ１の両方の対立遺伝子のミスセンス変異を有する複合ヘテロ接合型で同定された変異。ウェスタンイムノブロットは、等しい数のＦＡＣＳ選別ＲＢＬ細胞中の変異パーフォリンの相対的な発現レベルを示す。各患者の元々の文献は、最初の列に上付き文字として示されている。ＨＬＨ診断年齢は、対応する文献に記載されているように、月で示される。イタリック体は、本発明者らにより何処かで以前に解析されたパーフォリン変異を示す。アミノ酸保存は、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のような、哺乳動物およびヒラメのパーフォリンのアミノ酸配列アラインメントから導かれる。
【図２９Ｃ】図２９は、パーフォリンの発現および活性に対するＰＲＦ１のミスセンス変異の解析を示す。ＲＢＬ細胞をトランスフェクトし、列挙した各々のミスセンス変異を有するパーフォリンを発現させ、その後ＦＡＣＳにより選別し、ウェスタンブロット解析および５１Ｃｒ放射細胞傷害アッセイに使用した。特に断りない限り、各々の変異パーフォリンを、ＲＢＬに基づいたアッセイで、少なくとも３回、３０：１、１０：１、および２：１のＥ／Ｔ比で、標的としてジャーカットＴリンパ腫細胞を使用して試験した。変異は、ＨＬＨ患者の遺伝子型にしたがって分類した：（Ａ）ホモ接合型患者で同定されたもの、（Ｂ）複合ヘテロ接合型で同定された変異（ここで、第二の対立遺伝子は、タンパク質のフレームシフトまたは中途終止をコードしていた）、（Ｃ）ＰＲＦ１の両方の対立遺伝子のミスセンス変異を有する複合ヘテロ接合型で同定された変異。ウェスタンイムノブロットは、等しい数のＦＡＣＳ選別ＲＢＬ細胞中の変異パーフォリンの相対的な発現レベルを示す。各患者の元々の文献は、最初の列に上付き文字として示されている。ＨＬＨ診断年齢は、対応する文献に記載されているように、月で示される。イタリック体は、本発明者らにより何処かで以前に解析されたパーフォリン変異を示す。アミノ酸保存は、ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（ＥＭＢＬ−Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のような、哺乳動物およびヒラメのパーフォリンのアミノ酸配列アラインメントから導かれる。
【図３０】図３０は、ＲＢＬにより仲介される細胞傷害性に対する、パーフォリンの２３２残基での様々な置換の効果を示す。Ｒ２３２ＣおよびＲ２３２Ｈ（ＨＬＨ患者において同定された置換）の細胞傷害機能を、ＷＴおよびＲ２３２Ｓ（ヒラメ）パーフォリンのそれと比較した、トランスフェクトＲＢＬ細胞およびジャーカット標的細胞をＥ／Ｔ比で使用した５１Ｃｒアッセイ細胞傷害アッセイが示されている。
【図３１】図３１は、Ｖ１８３Ｇパーフォリンは正常な機能を有するが、Ｃ２７９Ｙ置換によりパーフォリン機能は消失することを示す。推定パーフォリン変異Ｖ１８３Ｇ（上）およびＣ２７９Ｙパーフォリン（下）をＷＴパーフォリンと比較した、トランスフェクトＲＢＬ細胞およびジャーカット細胞をＥ／Ｔ比で使用した５１Ｃｒ放射細胞傷害アッセイが示されている。
【図３２】図３２は、パーフォリンおよびグランザイムＢの相乗的なアポトーシス促進機能を遮断する、阻害性化合物４６５５３を示す。パーフォリンを、１：１０，０００希釈度で使用して、本明細書で先に記載したように、パーフォリン滴定により１０〜２０％の殺滅力を得た。グランザイムＢは、１μg／mlで使用した。説明文：Ｐ（パーフォリン）、Ｉ（阻害性化合物４６５５３）、ｄもしくはＤ（ＤＭＳＯ）、およびＢ（グランザイムＢ）。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2007526774.tif 000031
【図５】
2007526774.tif 000032
【図６】
2007526774.tif 000033
【図７】
2007526774.tif 000034
【図８】
2007526774.tif 000035
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2007526774.tif 000040
【図１４】
2007526774.tif 000041
【図１５】
2007526774.tif 000042
【図１６】
2007526774.tif 000043
【図１７】
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【図１８】
2007526774.tif 000045
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2007526774.tif 000049
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2007526774.tif 000053
【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
2007526774.tif 000058
【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月2日(2006.11.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できるレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現を駆動できる前記レトロウイルスベクター。
【請求項２】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のレトロウイルスベクター。
【請求項３】
請求項１または２に記載のレトロウイルスベクターを含むパッケージング細胞。
【請求項４】
請求項１または２に記載のレトロウイルスベクターを含むレトロウイルス粒子。
【請求項５】
請求項１または２に記載のレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた細胞。
【請求項６】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を発現させる方法であって、前記方法は、細胞を、請求項１または２に記載のレトロウイルスベクターでトランスフェクトすることを含む、前記方法。
【請求項７】
発現されたパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を単離するステップをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法により単離された単離パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種。
【請求項９】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートする化合物を同定する方法であって、前記方法は、
請求項５に記載の細胞を得；
前記細胞を試験化合物にさらし；そして
前記試験化合物が、細胞における、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートするかどうかを決定する
ステップを含む、前記方法。
【請求項１０】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートする化合物を同定する方法であって、前記方法は、
請求項８に記載の単離パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を得；
前記単離パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を、試験化合物および標的細胞にさらし；そして
前記試験化合物が、標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートするかどうかを決定する
ステップを含む、前記方法。
【請求項１１】
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートする化合物を同定する方法であって、前記方法は、
パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種を発現する請求項５に記載の細胞を得；
前記細胞を、試験化合物および標的細胞にさらし；そして
前記試験化合物が、標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートするかどうかを決定する
ステップを含む、前記方法。
【請求項１２】
標的細胞に対する、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性は、パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種が標的細胞を溶解する能力として同定される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
インビトロで細胞におけるパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の発現をモデュレートする方法であって、前記方法は、前記細胞を、請求項９に記載の方法により同定された化合物にさらすことを含む、前記方法。
【請求項１４】
インビトロで細胞に対するパーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の活性をモデュレートする方法であって、前記方法は、前記細胞を、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法により同定された化合物にさらすことを含む、前記方法。
【請求項１５】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を処置するための医薬組成物の製造における、請求項１または２に記載のレトロウイルスベクターの使用。
【請求項１６】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を処置するための医薬組成物の製造における、請求項３に記載のパッケージング細胞の使用。
【請求項１７】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を処置するための医薬組成物の製造における、請求項４に記載のレトロウイルス粒子の使用。
【請求項１８】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を処置するための医薬組成物の製造における、請求項５に記載の細胞の使用。
【請求項１９】
パーフォリンの望ましくない発現および／または活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を処置するための医薬組成物の製造における、請求項８に記載の単離パーフォリン分子またはその断片もしくはその変種の使用。
【請求項２０】
パーフォリンの望ましくない発現を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を処置するための医薬組成物の製造における、請求項９に記載の方法により同定された化合物の使用。
【請求項２１】
パーフォリンの望ましくない活性を伴う疾患のリスクがあるか、あるいは前記疾患に感受性があるか、あるいは前記疾患を有する被験者を処置するための医薬組成物の製造における、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法により同定された化合物の使用。
【国際調査報告】
2007526774.tif 000062
2007526774.tif 000063