(57)【要約】  本発明は、生物材料中の、特に血液試料中のＤＮＡ含有構成成分を集積化、安定化する改良された方法に関する。ＤＮＡ含有試験材料は、溶解結合緩衝系に部分的に溶解され、例えば細胞核のようなＤＮＡ含有構成成分は官能化された固体表面に結合される。その系は、溶解試薬および固体吸着剤を含み、吸着剤の表面は重合性酸またはその誘導体のポリマーで官能化されており、その上にＤＮＡ含有構成成分が結合する。官能化されうる担体材料としては、有機または無機の固体材料が使われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ含有試験材料を、少なくとも一つの溶解試薬および少なくとも一つの固体吸着剤を含む溶解結合緩衝系中に部分的に溶解させ、ＤＮＡ含有構成成分を吸着剤に結合させ、その吸着剤の表面が担体ポリマーおよび／または重合性酸または重合性酸誘導体の酸成分で構成されるポリマーで機能化されていることを特徴とする、ＤＮＡ含有構成成分を集積化および安定化する方法。
【請求項２】
担体ポリマーとして、重合性酸、好ましくはアクリル酸またはメタアクリル酸、または重合性酸の誘導体、好ましくはアクリルアミド、メタアクリルアミドまたはアクリル酸エステルを使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリマーとして、担体ポリマーと酸成分のコポリマーであって、後者はスルホン酸、ホスホン酸またはカルボン酸から選ばれるものを使用することを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
担体ポリマー対酸成分がモノマー比で、９：１から１：１、好ましくは９：１から３：１であるコポリマーを使用することを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項５】
反応混合物中の酸成分含量が１０ｗ／ｗ％と５０ｗ／ｗ％の間、好ましくは１０ｗ／ｗ％と２５ｗ／ｗ％の間であることを特徴とする、請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
酸成分としてビニルスルホン酸誘導体、好ましくはスチレンスルホン酸を使用することを特徴とする、請求項１から５の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
吸着剤が、ポリマーが結合した有機または無機固体担体材料で、好ましくはポリスチレン、ポリスルホン、修飾または非修飾シリカゲル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミドまたはヒドロキシル基をもつポリマーで好ましくはセルロースまたはポリビニルアルコール誘導体から構成されていることを特徴とする、請求項１から６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
吸着剤として、平均径が１−１００マイクロメートル、好ましくは１−３０マイクロメートルの微小粒子を用いることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
吸着剤として、磁性微小粒子を用いることを特徴とする、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
溶解試薬が、少なくとも一つの天然炭水化物、好ましくはオリゴサッカライド、および／または少なくとも一つの錯化剤との混合物として少なくとも一つの界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項１ないし９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
非イオン界面活性剤、好ましくはトリトン、ツイーン、ＮＰ−４０系列の誘導体またはそれらの混合物を使用することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
オリゴサッカライドとして、二糖、好ましくはしょ糖を使用することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
錯化剤として、ＥＤＴＡを使用することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
溶解試薬がトリトンＸ−１００、好ましくは１ｖ／ｖ％のもの、しょ糖、好ましくは２．５モルのもの、および／またはＥＤＴＡ，好ましくは０．５モルのものを含むことを特徴とする、請求項１０から１３の何れか１項記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ含有試験材料として、生物材料、好ましくは血液、白血球分画、バッフィコート、尿、血清、血漿、微生物細胞けんだく液または植物消化物を使用することを特徴とする、請求項１から１４の何れか１項記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ含有構成成分として、細胞小器官、好ましくは細胞核、ミトコンドリアまたは葉緑体、またはＤＮＡ含有たんぱく質複合体またはＤＮＡ含有ウイルスが集積化されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ含有複合体が、好ましくはハロゲン化アルカリおよびハロゲン化アルカリ土類を含有する塩水溶液を用いて固体吸着剤から溶出されることを特徴とする、請求項１から１６の何れか１項記載の方法。
【請求項１８】
塩化アルカリおよび／または塩化アルカリ土類、好ましくは塩化リチウムおよび／または塩化カルシウムを、０．０１−３．０モルの濃度、好ましくは０．０１から１．５モルの濃度で用いることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、生物材料、とりわけ血液試料からの、ＤＮＡ含有構成成分を集積化および安定化するための改良方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ含有試験材料は、溶解結合緩衝系に部分的に溶解され、例えば細胞核のようなＤＮＡ含有構成成分は機能化された固体表面に結合される。その系は、溶解試薬および固体吸着剤を含み、吸着剤の表面は重合性酸またはその誘導体のポリマーで機能化されており、それにＤＮＡ含有構成成分が結合する。機能化されうる担体材料としては、有機または無機の固体材料が使われる。試験材料の残りの構成成分は除去される。続いて、結合した試験材料中のＤＮＡ含有構成成分はさらに精製され、ＤＮＡが既知の技術により単離される。場合により、試験材料のＤＮＡ含有構成成分は特定のイオン強度下で表面から溶離されるが、また固相に結合したＤＮＡ含有構成成分を使用してその後の処理を直接行うこともできる。この発明の特別な実施態様において、固体吸着剤は、磁性的特性および／または１−１００マイクロメートルの範囲の直径をもつ微小粒子の形態を有する。
【０００３】
実験室業務、とりわけ臨床分析におけるＤＮＡの分析法の確立により、核酸精製法に急速な技術的進歩がもたらされた。特に、自動「液体取扱」システムに応用するのに適した核酸単離法が特別に注目されている。これに関連して、吸着剤を磁場で可能な操作をすると抽出過程での手作業が回避され、それにより方法を完全自動にできるので、磁性的特性をもつ吸着剤を用いる固相抽出の考え方が際立っている。
【０００４】
まさに臨床分析、例えば比較的多量の試料材料を用いて単離して一定の最低量および最低濃度のＤＮＡが得られることが期待される主要組織適合複合体（ＭＨＣ、ＨＬＡ分析）の研究において言える。しかし、使用できるピペッティングロボットがどんな場合でも必要な容量を効果的に処理できる能力を有してないので、このような比較的大きな試料量の自動抽出は問題である。血液の細胞性部分は周知のように大部分が赤色の血球（赤血球）から構成されるので、このことは特に血液試料からのＤＮＡの単離に当てはまる。しかし、そのものは核をもたないので、ＤＮＡの単離には不適当である。このため、白い血球すなわち白血球のみに興味がもたれる。
その上、大容量の血液試料を貯蔵することはしばしば場所の問題が起こる。これに関連して、現在のところ、とりわけいわゆるバッフィーコートを貯蔵することにより対応されているが、しかしその製造はもっぱら手作業でしか実施できない。細胞濃度が高いのでそれに続くバッフィーコートからのＤＮＡ単離は困難になる。別の問題は、試料採取直後ではＤＮＡ含有構成成分が不安定であることである。ＤＮＡの分解を防ぐためには、全血およびバッフィーコートは冷却して貯蔵しなければならない。
【０００５】
それ故、本来のＤＮＡ抽出の前に、ＤＮＡ含有細胞あるいは、ＤＮＡ含有試験材料、とりわけ血液中のＤＮＡ含有構成成分が集積化されるという方策が開発されている。
それに対応する方法は、いくつかの作業過程を想定している。ＤＮＡを単離する細胞を例えば遠心分離により集積化し、続いて溶解し、もう一度遠心分離し、その後溶解液をＤＮＡが結合する特定の担体に接触させる。このＤＮＡ含有構成成分集積化の一変法は、赤血球に対するいわゆる溶解緩衝液（赤血球溶解緩衝液、ＲＣＢ）を用いた細胞の化学的溶解、遠心分離による血液のＤＮＡ含有構成成分のペレット化およびそれに続くこのペレットからのＤＮＡ抽出である［Epplen & Lubjuhn (1999) DNA profiling and DNA fingerprinting, Birkhauser Verlag, Berlin, S.55］。
遠心分離過程は核酸の連続自動抽出の障害になるので、この方法は自動化にそれほど適してはいない。遠心機をロボットシステムに組み込むことは可能ではあるが、しかしこの変換は極めてコストが高く技術的に実現が困難である。
【０００６】
別の方法的アプローチは、ＤＮＡ含有血液細胞（例えばＣＤ４細胞）に対する特異的抗体の親和性を利用するものである。磁性粒子と結合したこれらの抗体は、ＤＮＡ含有血液細胞の濃縮と、それにより実際のＤＮＡ単離に関連する容量を減少させる。磁性粒子に結合した特異的抗体によるＤＮＡ含有血球の単離に関する一変法は、ハーディンガムなどが記載している［Hardingham et al. (1993) Cancer Research 53, 3455 - 3458; Lundeberg & Larson (1995) Biotechnology Annual Review 1, 373 - 401］。引用した方法の欠点は、第一に、採用する磁性粒子が高価なことであり、第二に、試験材料の凍結と解凍により細胞が破壊され抗体の特異性が効力を持たなくなるので、この方法は、臨床の現場で一般的となっている凍結した血液試料を使用する際に役に立たない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それ故、この発明は、生物材料とりわけ血液からのＤＮＡ含有構成成分を集積化および安定化する方法を開発することを目的としており、その方法により後続の簡単かつ完全自動化されたＤＮＡ単離が可能であり、そして不都合なまでに大きな試料容量とＤＮＡの単離を妨げる遠心分離過程を回避する材料を提供する方法である。さらに、好都合な温度条件下において試験材料中のＤＮＡの安定な貯蔵が可能にされなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この目的はこの発明により解決されるのであって、そこでは、生物材料が最初の段階で少なくとも一つの溶解試薬および少なくとも一つのポリマーで機能化された表面をもつ固体吸着剤の存在下に部分的溶解に付される。試験材料のＤＮＡ含有構成成分は同時に固体表面に結合し、その表面は、この発明によると、好ましくは重合性酸または重合性酸の誘導体からの、担体ポリマーを含むポリマーから、または上記担体ポリマーと他の重合性酸またはその誘導体好ましくはスルホン酸、ホスホン酸またはカルボン酸から選ばれるものとの混合物を含むポリマーから、構成される。他の重合性酸またはその誘導体は、固体表面の特定の実施態様によると担体材料のそれとは同一ではなく、この発明で酸成分として呼ばれるものでもある、重合性酸またはその誘導体を含む。上清の除去後、結合したＤＮＡ含有構成成分はそれ自体既知の方法にしたがってＤＮＡ単離に付される。そのために、それは最初に溶離することができる。
【０００９】
驚くべきことに、固体吸着剤の機能化された表面に結合するのは、遊離のＤＮＡでなく、多量の無傷の細胞質構成成分、とりわけ血液の白血球核のような細胞核、を含む溶解液中のＤＮＡ構成成分であることが確認された。
この発明による吸着剤上に固定された試験材料のＤＮＡ含有構成成分は、分解性の酵素的または化学的作用に対して保護され安定であり、それ故、とりわけ室温で、不具合なく貯蔵ないしは輸送できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
この発明の方法は、例えば血液試料のような元来大容量のものをＤＮＡ含有構成成分にまで減少させるので、とりわけ大きな試料量からのＤＮＡの単離を容易にする。続いてＤＮＡを単離すべき試験材料の貯蔵可能性は、大きく改善される。
表面ポリマーは、好ましくは、アクリル酸またはメタアクリル酸または例えばアクリルアミド、メタアクリルアミドまたはアクリル酸エステルのようなそれらの誘導体から作られる担体ポリマーから構成される。
さらに、ポリマー表面は、第２成分として重合した酸、好ましくはスルホン酸、ホスホン酸またはカルボン酸、または重合性酸の重合した誘導体、好ましくはスルホン酸またはホスホン酸化合物、とりわけ好ましくは、例えばスチレンスルホン酸のような、ビニルホスホン酸、ビニルスルホン酸またはその誘導体を含むことができる。この発明の精神において好ましいのは、担体ポリマーと酸成分であるスルホン酸またはビニルスルホン酸のコポリマーである。
【００１１】
場合により、例えば酢酸ビニル、ビニル基含有シリル化合物およびステアリン酸ビニルのような、重合可能な二重結合を有する他のモノマー成分を使用することができる。最後に挙げたモノマーの使用は、湿潤可能性または修飾可能性のような、吸着剤の特定の表面特性を得る上で、とりわけ価値が高い。
【００１２】
表面ポリマーは、種々のモノマーが一定の比率で反応したコポリマーの場合、好ましくは担体ポリマー対酸成分が９：１ないし１：１の比率、とりわけ好ましくは９：１ないし３：１の比率の二成分系である。
【００１３】
反応混合物中における重合性酸成分の含有量は、１０ｗ／ｗ％と５０ｗ／ｗ％の間、好ましくは１０ｗ／ｗ％と２５ｗ／ｗ％の間である。好ましくは機能化された表面は質量比率で１０ｗ／ｗ％と５０ｗ／ｗ％の間、とりわけ好ましくは１０ｗ／ｗ％と２５ｗ／ｗ％の間のスチレンスルホン酸を有する。
【００１４】
この発明によるポリマーの担体材料は、その化学的特性に基づいて活性化することが可能なあらゆる無機または有機材料であることができる。同様に、例えばポリマーの可溶性誘導体の網状化により、この発明のポリマー中に埋め込まれる無機または有機材料を使用することができる。これには、例えばポリスチレン、ポリスルホン、修飾または非修飾シリカゲルが属する。とりわけ適当なのは、例えばセルロースのようなヒドロキシル基をもつポリマーであり、さらにとりわけ適当なのはポリビニルアルコール誘導体である。その他、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネートなどを使用することができる。
【００１５】
吸着剤の表面特性を決定するポリマーを担体材料として使用することも、その材料の物理化学的性質が水溶液中における取扱を許す限り、同じく可能である。好ましい変法において、吸着剤の表面にコーティングされたポリマーは、溶解された生物材料中に組み込まれた担体材料および／またはビニルスルホン酸モノマーから構成される。
【００１６】
この発明の別の特別な実施態様では、ＤＮＡ含有構成成分の集積化のための固体担体材料が、外部磁場をかけることにより機械的に処理することができるようになる、磁性特性を有する微小粒子から構成されることである。とりわけ好ましい形態は、磁性特性および１−１００マイクロメートル、好ましくは１−３０マイクロメートル、とりわけ好ましくは３−１０マイクロメートルの範囲の直径をもつ微小粒子を使用することである。このような微小粒子は当業者に既知である。その製造は、例えばＤＥ４３０７２６２およびＵＳ５，６４８，１２４に記載されたような、それ自体既知の方法によりなされる。
【００１７】
この発明による集積化に欠くことができない吸着剤の製造は、例えばペルオキシドフリーラジカルで活性化した表面上にモノマー混合物をコーティングすることのような、例えば当業者に周知のグラフト重合法により、行うことができる。
【００１８】
例えばジアルデヒドで架橋化したポリビニルアルコール誘導体は、高濃度の過酸化水素濃厚溶液で活性化される［Bates & Shanks (1980) J. Macromol. Science Chem. A14, 137-151; Bolto et al. (1978) J. Appl. Polym. Sci. 2, 1977］。同様に、硫酸セリウム（ＩＶ）アンモニウムで部分酸化することによる塩基性表面の活性化についても考えられる［Mukopadhyay et al. (1969) J. Polym. Sci. A-1, 7, 2079］。その他の活性化法は、ベンゾフェノンまたはメチレンブルーのような増感剤による表面の光化学的活性化である。
【００１９】
さらに、固体担体材料上にあるいわゆるアンカー基を介して、吸着剤の表面特性を決定するポリマーの化学的結合が可能である。例えば、担体材料の表面上にあるアミノ基上にポリマーが縮合される。当業者は、どのようにしてアミノ基を担体材料上に置くかを知っている。
固体の有機または無機担体材料の存在下適切な架橋化試薬を用いて、この発明によるポリマーの可溶性誘導体を架橋することにより、吸着剤にこの発明による特性をもたらす。
【００２０】
さらに、重合可能な二重結合を有する別のモノマー成分を追加して使用することにより、吸着剤の表面特性に影響を与えることができる。例えば、酢酸ビニルを作用させ、そのものの重合後の加水分解により吸着剤のぬれ特性が改良される。
【００２１】
好ましくは、固体吸着剤は修飾されていてもよいばらばらの粉末またはろ過剤として使用されることができる。とりわけ好ましいのは、ろ過板中にフィルターマトリックスとして挿入することである。実例はいわゆる「スピンカラム」すなわち卓上遠心操作用クロマトグラフィーカラムとして上記吸着剤を使用することであろう。
【００２２】
ＤＮＡ含有構成成分の集積化のために、溶解の前、同時または後で、好ましくは生物溶液の形で存在する生物材料中へ機能化された吸着剤を組み込むことができる。その時期は、とりわけ吸着剤の状態により決定される。例えば、フィルターマトリックスとして使用する場合、生物試料は好ましくは溶解後、ＤＮＡ含有構成成分が機能化された表面上に結合するように、上記吸着剤と接触される。
【００２３】
ばらばらの粉末としては、固体吸着剤は好ましくは溶解試薬の存在下に生物材料中に組み込まれる。生物材料は溶解され、試験材料のＤＮＡ含有構成成分は機能化された表面上に結合される。
【００２４】
この発明の意図する生物材料は、例えば血液、尿または脳脊髄液のような、体液であることができる。さらに、別の生物材料として、例えば血漿、細胞、バッフィーコート、白血球分画、唾液、精液または生体（例えば真核生物、原核生物のような単細胞生物、多細胞生物、昆虫など）も使用することができる。そのほか、この生物材料として、微生物の培養物、例えば組織または土壌試料のような細胞含有材料、植物またはその他生物の構成成分が含まれる。好ましくは、この発明の方法は血液（ヒト全血）、バッフィーコート、白血球分画および細胞培養物のＤＮＡ含有構成成分の集積化に向いている。
【００２５】
この発明の意図するＤＮＡ含有構成成分は、好ましくは細胞核および、例えばミトコンドリア、葉緑体のような他のＤＮＡ含有オルガネラ、または試験材料に含まれるＤＮＡ含有たんぱく質複合体であり、またＣ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルスなどのようなＤＮＡ含有ウイルスである。
【００２６】
溶解試薬は、場合により浸透ショックの作用をし、細胞膜を開く。他方ボールミル、フレンチプレス、超音波などによる機械的作用、細胞壁溶解酵素による細胞壁ないし細胞膜の酵素的除去および／または表面活性化物質作用のような細胞膜の安定性を妨げる溶解条件も考えられる。
【００２７】
この発明の課題解決のために、溶解試薬として、好ましくは、例えばトリトンＸ-１００、ツイーン２０、ツイーン８０、ＮＰ−４０およびブリ−ジ３５のような界面活性剤剤を含有する溶液が適する。界面活性剤は、単独成分として、またキレート剤の系列の錯体形成剤および／または天然炭水化物、好ましくはオリゴ糖、少なくとも５０％がグルコース単位から構成されるもの、とりわけ好ましくは、例えばしょ糖のような二糖との組み合わせとして使用することができる。さらに、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のようなイオン性界面活性剤も使用することができる。アニオン性界面活性剤ＳＤＳは、ミセル形成により細胞膜の脂質を溶解し、その破壊された構造が細胞自身の酵素にさらに細胞壁破壊の攻撃点を提供する。
【００２８】
場合により、単独または組み合わせとしての溶解試薬に１価または２価カチオンの塩、および／または例えばグルカナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼなどのような細胞壁溶解酵素を加えることができる。
【００２９】
この発明によると、好ましくは０．５ｖ／ｖ％から５ｖ／ｖ％の錯体形成剤および／または０．５ｖ／ｖ％から３ｖ／ｖ％の界面活性剤を含有する溶解試薬が使用され、界面活性剤の容量比１．０ｖ／ｖ％から１．５ｖ／ｖ％が好ましい。とりわけ好ましいのは、トリトン、しょ糖および／またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を含有する溶解試薬である。さらにとりわけ好ましいのは、０．５ＭのＥＤＴＡ、１ｖ／ｖ％のトリトンＸ−１００および２．５Ｍのしょ糖を含む試薬である。
【００３０】
好ましくは、溶解試薬は、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリル酸誘導体および／または重合性酸またはその誘導体、好ましくはスルホン酸誘導体により機能化されたＤＮＡ含有構成成分との結合のための表面を含む磁性微粒子と組み合わせて使用される。
【００３１】
驚くべきことに、例えば細胞核、ミトコンドリア、葉緑体またはＤＮＡ含有たんぱく質複合体、またＤＮＡ含有ウイルスのようなＤＮＡ含有構成成分の吸着剤に対する結合は、細胞膜の破壊の際生じるような部分的溶解の条件下で起る。純粋なＤＮＡはこのような条件下では吸着剤に結合せず、上記の緩衝系を使用する代表的な研究では単離できない。
【００３２】
試験材料の残りの構成成分は除去される。この発明の方法の一態様では、１−１０分間、好ましくは２−５分間の結合期間で、ＤＮＡ含有構成成分を結合した後、ＤＮＡ含有構成成分を結合した吸着材を残りの試験材料から分離する。試験材料中に存在するＤＮＡ含有構成成分は相応に濃縮され、それによりＤＮＡ単離方法中に達成される容量は劇的に減少することができる。この集積化法によると、少なくとも元の試料容量の１／４、好ましくは１／８、とりわけ好ましくは１／１０への容量減少を達成することができる。
【００３３】
結合に引き続き、場合によりＤＮＡ含有構成成分は吸着剤から溶離される。場合によりありうるＤＮＡ含有構成成分の溶離は、溶解した試験材料の廃棄直後または中間的な貯蔵後に行われる。それには、例えば小容量の一定イオン強度の塩水溶液を使用できる。塩としては、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＣａＣｌ２のような、好ましくはハロゲン化アルカリおよびハロゲン化アルカリ土類、とりわけ好ましくはハロゲン化リチウムまたはハロガン化カルシウム、さらにとりわけ好ましくは塩化リチウムおよび塩化カルシウムが単独または互いの混合物として使用される。塩は、水溶液中の単独成分として、または例えば当業者に既知の界面活性剤または錯体形成剤のような他の成分を含む水性緩衝液の構成成分として、０．０１Ｍから３．５Ｍの好ましい濃度、好ましくは０．０１から１．０Ｍの濃度で、使用することができる。
【００３４】
この発明の方法によると、ＤＮＡ含有構成成分の脱離に必要な容量は、生物試料の最初の容量よりかなり少ないので、精製するＤＮＡの濃縮が達成され、少容量での抽出を例えばロボットにより完全自動化で行うことができる。
【００３５】
このようにして結合したＤＮＡ含有構成成分は、場合により貯蔵および溶離後、その実施もまた完全自動化が可能な、それ自体既知の精製法およびＤＮＡ単離法に供することができる。その方法は当業者に既知である。それ故、たとえばフェノール／クロロホルム抽出により、例えば試料中に存在するたんぱく質の除去後、単離するＤＮＡを、例えば酢酸ナトリウムのような塩の添加により、または例えばエタノールまたはイソプロパノールのような有機溶媒好ましくはアルコールの添加により、沈殿させることができ、または既知の固相抽出法、例えばカオトロピックな物質の存在下のシリカ性材料上への結合により、さらに精製することができる。精製はまた、ゲルろ過、ゲル溶離またはイオン交換体により達成できる。上記方法の幾つかは組み合わせることができる。
【００３６】
この発明による集積化段階は、どの自動式の方法がＤＮＡ含有構成成分の集積化に使用するかを決めるのは、吸着剤の技術的な設計のみに左右されるので、完全自動化方法の中に統合することができる。
以下この発明を若干の実施例に基づいて説明するが、発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１
機能化された磁性微小粒子の製造
グルタールアルデヒド［Bolto et al. (1978) J. Appl. Polym. Sci. 2, 1977］で網状化したポリビニルアルコールから構成される磁性微小粒子１ｇを、１時間が経過する間に３０％過酸化水素１０ｍｌで活性化する。粒子をけんだく液から分離し、水で過酸化物がなくなるまで洗浄する。次にこの粒子を、水酸化ナトリウム液でｐＨ７にしたアクリルアミド１．１ｇとスチレンスルホン酸０．５ｇを含有する溶液に加える。硫酸鉄（ＩＩ）４０ｍｇを添加後室温で１時間撹拌する。次いで粒子を吸引ろ過し、水で残留するモノマーおよび接着されなかったポリマーを除去し、ＤＮＡ含有構成成分の集積化のために用意する。
【００３８】
実施例２ａ
ＤＮＡ含有構成成分の集積化
実施例１で製造した磁性粒子１０ｍｇを、血液２ｍｌと１ｖ／ｖ％トリトンＸ−１００含有２．５Ｍしょ糖溶液から構成される溶解緩衝液４ｍｌの混合物に加える。磁性粒子を分散させるために溶液を完全に混合し、室温で１０分間インキュベートする。ついで、容器壁上に永久磁石を置いて粒子を分離し、磁性粒子が失われないように注意しつつ容器内の液体を除去する。
次に結合したＤＮＡ含有構成成分を有する粒子を１．５ＭＮａＣｌ溶液２００マイクロリットルに再けんだくする。再び容器壁上に外部磁場を当てて磁性粒子を集める。次いで上清を別のＤＮＡ集積化法に用いる。
【００３９】
実施例２ｂ
ＤＮＡ含有構成成分の集積化
実施例１で製造した磁性粒子１０ｍｇを、血液２ｍｌと１ｖ／ｖ％トリトンＸ−１００および０．５ＭＥＤＴＡを含有する２．５Ｍしょ糖溶液から構成される溶解緩衝液４ｍｌの混合物に加える。磁性粒子を分散させるために溶液を完全に混合し、室温で１０分間インキュベートする。ついで、粒子を容器壁上の永久磁石設備で分離し、磁性粒子が失われないように注意しつつ容器内の液体を除去する。
次に結合したＤＮＡ含有構成成分を有する粒子を１．５ＭＮａＣｌ溶液２００マイクロリットルに再けんだくする。再び磁性粒子を容器壁上の外部磁場設備で集める。次いで上清を別のＤＮＡ集積化法に提供する。
【００４０】
実施例３
集積化したＤＮＡ含有構成成分の貯蔵
実施例２記載のように集積化を行う。永久磁石により上清からＤＮＡ含有構成成分と粒子の複合体を分離後、この複合体を室温から３０℃で１週間貯蔵し、その後ＤＮＡ単離を行う。単離したＤＮＡ量とその品質は比較のため集積化直後の直接抽出で得たパラメーターに大きさの程度で対応する。
その後に続くＤＮＡ単離の前にさらに１週間４℃で複合体を貯蔵しても、ＤＮＡの量と品質に関して同様の結果が示される。
【手続補正書】
【提出日】平成17年10月14日(2005.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ含有試験材料を、少なくとも溶解試薬および少なくとも固体吸着剤を含む溶解結合緩衝系中に、ＤＮＡ含有構成成分が遊離するように部分的に溶解させ、ＤＮＡ含有構成成分を吸着剤に結合させ、吸着剤の表面はポリマーで機能化され、そのポリマーは担体ポリマーと、および／またはアクリル酸またはメタアクリル酸、アクリルアミド、メタアクリルアミドまたはアクリル酸エステルから選ばれる重合性酸または重合性酸誘導体の酸成分とで、または担体ポリマーおよび酸成分のコポリマーであって後者はスルホン酸、ホスホン酸またはカルボン酸から選ばれるもので構成されることを特徴とする、ＤＮＡ含有構成成分を集積化および安定化する方法。
【請求項２】
別の段階において全ての非ＤＮＡ含有構成成分を吸着剤から除去することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
溶解段階の前、同時または後で生物学的ＤＮＡ含有試験材料の溶液に吸着剤を加えることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
担体ポリマー対酸成分がモノマー比で、９：１から１：１、好ましくは９：１から３：１であるコポリマーを使用することを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項５】
反応混合物中の酸成分の含量が１０ｗ／ｗ％と５０ｗ／ｗ％の間、好ましくは１０ｗ／ｗ％と２５ｗ／ｗ％との間であることを特徴とする、請求項１ないし４の何れか１項記載の方法。
【請求項６】
酸成分としてビニルスルホン酸誘導体、好ましくはスチレンスルホン酸を使用することを特徴とする、請求項１から５の何れか１項記載の方法。
【請求項７】
吸着剤が、ポリマーが結合した有機または無機固体担体材料で、好ましくはポリスチレン、ポリスルホン、修飾または非修飾シリカゲル、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミドまたはヒドロキシル基をもつポリマーで好ましくはセルロースまたはポリビニルアルコール誘導体から構成されていることを特徴とする、請求項１から６の何れか１項記載の方法。
【請求項８】
吸着剤として、平均径が１−１００マイクロメートル、好ましくは１−３０マイクロメートルの微小粒子を用いることを特徴とする、請求項７記載の方法。
【請求項９】
吸着剤として、磁性微小粒子を用いることを特徴とする、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
溶解試薬が、少なくとも一つの天然炭水化物、好ましくはオリゴサッカライド、および／または少なくとも一つの錯化剤との混合物として少なくとも一つの界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項１ないし９の何れか１項記載の方法。
【請求項１１】
非イオン界面活性剤、好ましくはトリトン、ツイーン、ＮＰ−４０系列の誘導体またはそれらの混合物を使用することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
オリゴサッカライドとして、二糖、好ましくはしょ糖を使用することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
錯化剤として、ＥＤＴＡを使用することを特徴とする、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
溶解試薬がトリトンＸ−１００、好ましくは１ｖ／ｖ％のもの、しょ糖、好ましくは２．５モルのもの、および／またはＥＤＴＡ，好ましくは０．５モルのものを含むことを特徴とする、請求項１０から１３の何れか１項記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ含有試験材料として、生物材料、好ましくは血液、白血球分画、バッフィコート、尿、血清、血漿、微生物細胞けんだく液または植物消化物を使用することを特徴とする、請求項１から１４の何れか１項記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ含有構成成分として、細胞小器官、好ましくは細胞核、ミトコンドリアまたは葉緑体、またはＤＮＡ含有たんぱく質複合体またはＤＮＡ含有ウイルスが集積化されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ含有複合体が、好ましくはハロゲン化アルカリおよびハロゲン化アルカリ土類を含有する塩水溶液を用いて固体吸着剤から溶出されることを特徴とする、請求項１から１６の何れか１項記載の方法。
【請求項１８】
塩化アルカリおよび／または塩化アルカリ土類、好ましくは塩化リチウムおよび／または塩化カルシウムを、０．０１−３．０モルの濃度、好ましくは０．０１から１．５モルの濃度で用いることを特徴とする、請求項１７記載の方法。
【国際調査報告】
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