(57)【要約】本発明は、ニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストの投与による、骨髄由来幹細胞（例えば、内皮細胞前駆体、造血幹細胞）のリクルートメントのための方法を特徴とする。本発明の方法は、例えば、骨髄由来幹細胞のリクルートメントによる処置に適した状態（例えば、好中球減少症）の処置に用いられ得る。2007522239.tif 000003
2007522239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、幹細胞またはそれらの子孫の増殖および動員を刺激するための方法であって、哺乳動物に、幹細胞またはその子孫の増殖および哺乳動物の骨髄から哺乳動物の処置部位までの動員を刺激するのに有効な量のニコチン受容体アゴニストを投与する段階を含む方法。
【請求項２】
ニコチン受容体アゴニストがニコチン、ニコチン塩、ニコチン誘導体、ニコチン代謝産物、またはニコチン代謝産物誘導体である、請求項1の方法。
【請求項３】
投与する段階が局所投与による、請求項1記載の方法。
【請求項４】
投与する段階が全身投与による、請求項1記載の方法。
【請求項５】
投与する段階が経口である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
投与する段階が腸管外である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
投与する段階が筋肉内である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
投与する段階が血管内である、請求項1記載の方法。
【請求項９】
処置部位が哺乳動物の血流内にある、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
処置部位が末梢循環内にある、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
処置部位が創傷または潰瘍である、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
幹細胞が造血または間葉系列である、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
アゴニストが、循環中の幹細胞またはそれらの子孫の処置部位への取り込みを刺激するのに有効である、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
アゴニストが、処置部位の創傷治癒を促進するのに有効である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
アゴニストが、免疫細胞の減少に関連した障害を処置するのに有効である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
障害が好中球減少症、白血球減少症、または後天性免疫不全症である、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
後天性免疫不全症が放射線治療に起因する、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
後天性免疫不全症が癌化学療法に起因する、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
アゴニストが、骨髄移植に用いるための哺乳動物から細胞を取得する前に、哺乳動物において免疫細胞を増大させるのに有効である、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
アゴニストが、末梢血において白血球数を増大させるのに有効である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
アゴニストが、骨髄において長期造血幹細胞数を増大させるのに有効である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
アゴニストが、骨髄において短期造血幹細胞数を増大させるのに有効である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
アゴニストが、コチニン、ノルコチニン（norcotinine）、ニコチンN-オキシド、コチニンN-オキシド、3-ヒドロキシコチニン、および5-ヒドロキシコチニンより選択される、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に、幹細胞および前駆細胞の動員およびリクルートメント（recruitment）の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
幹細胞および/または前駆細胞のリクルートメントおよび再生はさまざまな適用において重要である。骨髄移植に先立って、例えば、造血幹細胞のプールの拡大および動員は非常に重要である。放射線照射後または化学療法後の幹細胞区画の再増殖もまた造血幹細胞の拡大または再生を必要とする。幹細胞および/または前駆細胞の増殖および/または動員により恩恵を被る他の障害には、好中球減少症、白血球減少症、後天性免疫不全症などのような血液細胞疾患が含まれる。
【０００３】
内皮前駆細胞に由来する血管の成長を含む血管形成は、幹細胞および/または前駆細胞のリクルートメントおよび/または再生を含む過程のさらなる例である。既存の毛細血管から新規の血管が形成される過程である血管形成および血管新生、ならびにこれらの過程を調節する因子は、胚発生、炎症、および創傷治癒において重要であり、かつ腫瘍成長、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、および慢性炎症疾患などの病的状態にも寄与する（例えば、米国特許第5,318,957号、Yancopoulos et al.（1998）Cell 93:661-4；Folkman et al.（1996）Cell 87；1153-5；およびHanahan et al.（1996）Cell 86:353-64を参照されたい）。
【０００４】
血管新生および血管形成は共に内皮細胞の増殖を伴う。内皮細胞は血管の壁を裏打ちし；毛細血管はほぼ全て内皮細胞から構成される。血管新生過程は、内皮細胞のさらなる増殖を含むだけではなく、内皮細胞によるプロテアーゼの分泌、基底膜の分解、周囲のマトリックスを通過しての移動、増殖、整列、管様構造への分化、および新規の基底膜の合成を含む、一連の追加事象も伴う。血管形成は間葉細胞の血管芽細胞へのリクルートメントおよび分化を伴い、血管芽細胞は次いで内皮細胞に分化して、次に新規の血管を形成する（例えば、Folkman et al.（1996）Cell 87:1153-5を参照されたい）。
【０００５】
異なる性質および作用機構を有するいくつかの血管新生および/または血管形成剤が当技術分野において周知である。例えば、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子（FGF）、形質転換成長因子α（TGF-α）およびβ（TGF-β）、腫瘍壊死因子（TNF）、血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮細胞成長因子（VEGF）、ならびにアンジオジェニンは、強力で、かつ十分に特徴付けられた血管新生促進剤である。さらに、一酸化窒素およびプロスタグランジン（プロスタサイクリンアゴニスト）は共に、VEGFおよびbFGFのような様々な血管新生成長因子の媒介物質であることが示された。しかしながら、これらの化合物のいくつかの、特に全身性作用物質としての治療適用可能性は、さまざまな細胞型に対するそれらの強力な多面的効果により限定される。
【０００６】
血管新生および血管形成は、これらの過程を治療的利点に活用し得ることから、強い関心の的である。血管新生および/または血管形成の刺激は、創傷の治癒、皮膚移植片の血管形成、および血管閉塞または狭窄が存在している部位の側副循環（例えば、冠状動脈、頸動脈、または末梢動脈閉塞症に由来する閉塞の周囲に「バイオバイパス（biobypass）」を形成するため）の増強を補助し得る。さらに、幹細胞および/または前駆細胞のリクルートメントを刺激し得る作用物質の同定は、細胞傷害および/または細胞の枯渇に関連した他の状態（例えば、後天性または遺伝性免疫不全）の処置に有用であり得る。被験体は良好な耐容性を示すが、幹細胞および/または前駆細胞のリクルートメントへの刺激をもたらす点では強力な作用物質のような因子に強い関心が存在する。
【０００７】
文献
Villablanca（（1998）"Nicotine stimulates DNA synthesis and proliferation in vascular endothelial cells in vitro," J: Appl. Physiol. 84:2089-98）は内皮のDNA合成、DNA修復、増殖、および細胞毒性に対するニコチンの影響を、インビトロでウシ肺動脈内皮細胞の培養物を用いて研究した。参考文献Carty et al.（（1996）"Nicotine and cotinine stimulate secretion of basic fibroblast growth factor and affect expression of matrix metalloproteinases in cultured human smooth muscle cells," J Vasc Surg 24:927-35）はニコチンが血管平滑筋細胞を刺激して線維芽細胞成長因子を産生させること、およびいくつかのマトリックスメタロプロテアーゼ（metalloproteinase）の発現も上方調節することを示す。研究者らは、これらのデータは喫煙がアテローム性動脈硬化症および動脈瘤を引き起こし得る機構を示すと提唱している。
【０００８】
Belluardoらによる参考文献（（1998）Acute intermittent nicotine treatment produces regional increases of basic fibroblast growth factor messenger RNA and protein in the tel-and diencephalon of the rat," Neuroscience 83:723-40）はニコチンがラットの脳において線維芽細胞成長因子-2の発現を刺激することを報告した。研究者の提案は、ラットの脳におけるニコチンの神経保護的効果を説明し得る。
【０００９】
Moffett et al.（（1998）"Increased tyrosine phosphorylation and novel cis-actin element mediate activation of the fibroblast growth factor-2（FGF-2）gene by nicotinic acetylcholine receptor. New mechanism for trans-synaptic regulation of cellular development and plasticity," Mol Brain Res 55:293-305)は、ニコチンが神経堤由来の副腎クロム親和性細胞において、チロシンリン酸化を要する特異的な転写経路を用いて、線維芽細胞成長因子-2の発現を刺激することを報告する。著者は、これらの知見がニコチン受容体の活性化が神経発生に関与し得ることを示唆すると提唱している。
【００１０】
Cucina et al.（（1999）"Nicotine regulates basic fibroblastic growth factor and transforming growth factor β1 production in endothelial cells, " Biochem Biophys Res Commun 257:302-12)は、ニコチンが内皮細胞からのbFGFの放出を増大させ、TGFβ1の放出を減少させ、かつ内皮の有糸分裂誘発を増大させることを報告する。著者は、これらの作用がアテローム性動脈硬化症の発症および進行に主要な役割を果たし得ると結論している。
【００１１】
Volm et al.（1999）"Angiogenesis and cigarette smoking in squamous cell lung carcinomas: an immunohistochemical study of 28 cases." Anticancer Res l9（1A）：333-6は肺腫瘍における血管新生が患者の喫煙習慣に関係することを報告する。
【００１２】
Macklin et al.（1998）"Human vascular endothelial cells express functional nicotinic acetylcholine receptors," J. Pharmacol. Exper. Therap. 287:435-9は、内皮細胞が機能的なニコチン性（神経細胞型）およびムスカリン性アセチルコリン受容体を両方とも発現することを報告する。
【００１３】
米国特許第5,318,957号、第5,866,561号；および第5,869,037号は血管新生をもたらすための、さまざまな化合物（ハプトグロビンおよびエストロゲン）ならびに方法（脂肪細胞のアデノウイルス媒介遺伝子治療）の使用について記載する。
【００１４】
Heeschen et al.（（2001）"Nicotine stimulates angiogenesis and promotes tumor growth and atherosclerosis." Nat Med Jul; 7（7）:833-9）は、ニコチンが血管新生を誘導し、かつインビボで毛細血管および側副の成長を増大させることを報告する。
【００１５】
Jacobi et al.（（2001）"Nicotine stimulates wound healing in diabetic mice." Am J Pathol Ju1;161（1）:97-104）は、ニコチンが血管新生を促進することにより、糖尿病マウスにおいて創傷治癒を加速することを報告する。
【００１６】
Heeschen et al.（（2003）"Nicotine promotes arteriogenesis." J Am Coll Cardiol, Feb 5;41（3）:489-96）は、虚血下で、ニコチンが血管新生および動脈形成を促進することを報告する。
【００１７】
Heeschen et al.（（2002）"A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors." J Clin Invest Aug;110（4）:527-36）は、nAChRの薬理学的阻害が炎症性血管新生を阻害し、虚血誘導性血管新生および腫瘍成長を低減したことを報告する。
【００１８】
Zhu et al.（（2003）"Second Hand Smoke Stimulates Tumor Angiogenesis and Growth." Cancer Cell 4（3）: 191-6）はタバコの煙が腫瘍の血管新生および成長を促進することを報告する。
【００１９】
血管新生および血管形成の分野の最近の総説については、例えば、Yancopoulos et al.（1998）Cell 93:661-4；Folkman et al.（1996）Cell 87;1153-5；およびHanahan et al.（1996）Cell 86:353-64を参照されたい。
【００２０】
造血の分野における最近の総説については、例えば、 Kondo et al.（2003）Ann. Rev. Immunol. 21:759-806；Prohaska et al.（2002）Semin. Immunol. 14:377-384；Kondo et a1.（2001）Curr. Opin. Genet. Dev. 11:520-526；およびWeissman et al.（2001）Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 17:387-403を参照されたい。
【発明の開示】
【００２１】
発明の概要
本発明は、ニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストの投与による、骨髄由来幹細胞（例えば、造血幹細胞）および前駆細胞（例えば、内皮細胞前駆体）のリクルートメント/動員、および/または増殖の増大のための方法、ならびにそのような細胞の子孫のリクルートメント/動員、および/または増殖の増大のための方法を特徴とする。本発明の方法は、例えば、骨髄由来幹細胞のリクルートメントによる処置に適した状態（例えば、好中球減少症、白血球減少症など）の処置に用いられ得る。
【００２２】
本発明の一つの目的は、血管新生を増強するために内皮前駆細胞をリクルートする方法を提供することである。
【００２３】
本発明の他の目的は、心筋および脳梗塞、心不全、腸間膜または肢虚血、創傷、ならびに血管閉塞または狭窄のような、組織損傷を含む疾患および病気を（例えば、細胞修復を促進するため）処置および予防する方法を提供することである。
【００２４】
本発明の他の目的は、創傷の治癒、血管形成、および皮膚移植片、筋皮弁または他の外科的に移植された組織の取り込みを促進する方法；または外科的に作製された吻合の治癒を増強するための方法を提供することである。
【００２５】
本発明の他の目的は、骨髄由来幹細胞（例えば、免疫細胞、例えば、好中球、好酸球、T細胞、B細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞など）より発生する細胞の枯渇に関連した状態または疾患（例えば、血液疾患、治療的放射線処置など）を処置する方法を提供することである。
【００２６】
本発明の、これらおよび他の目的、利点、ならびに特徴は、以下にさらに十分に記載される、本発明の方法およびそこで用いられる組成物の詳細を読むことで、当業者には明らかとなる。
【００２７】
定義
「ニコチン受容体アゴニスト」という用語は、ニコチン（これはニコチン誘導体およびニコチン様化合物を含むと理解される）およびニコチン受容体に実質的に特異的に結合し、血管新生の誘導時のような薬理作用、例えば、幹細胞の処置部位へのリクルートメントを提供する他の化合物を包含することを意図する。「ニコチン受容体アゴニスト」は天然由来の化合物（小分子、ポリペプチド、ペプチドなど、特に天然由来の植物アルカロイドなどを含むが、これらに限定されない）、内在性リガンド（例えば、天然の供給源から精製された、組換えにより作製された、または合成の、ならびにそのような内在性リガンドの誘導体および変異体をさらに含む）、ならびに合成された化合物（例えば、小分子、ペプチドなど）を包含する。
【００２８】
「ニコチン」という用語は、自然界から単離および精製されるか、または任意の様式で合成することができ、S-3-(1-メチル-2-ピロリジニル)ピリジンという化学名を有する、ニコチンとして公知の天然由来の植物アルカロイドを意味することが意図される。この用語は、薬理学的に許容される陰イオンを含む、一般に存在する塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩または重硫酸塩、リン酸塩または過リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩または酸性クエン酸塩（acid citrate)、酒石酸塩または酸性酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩（p-toluene sulfonate）、樟脳（camphorate）、およびパモエート塩もまた包含することを意図する。ニコチンは、分子量162.23および図1に示される化学式を有する、無色から淡黄色の、強アルカリ性の、油状の、揮発性の、吸湿性の液体である。
【００２９】
他に特に示さない限り、「ニコチン」という用語は、ニコチンに類似した薬物療法的性質を示す、ニコチンの薬理学的に許容される任意の誘導体または代謝産物をさらに含む。そのような誘導体、代謝産物、および代謝産物の誘導体は当技術分野において公知であり、かつコチニン、ノルコチニン（norcotinine）、ノルニコチン、ニコチンN-オキシド、コチニンN-オキシド、3-ヒドロキシコチニン、および5-ヒドロキシコチニン、またはそれらの薬学的に許容される塩を含むが、これらに必ずしも限定されない。数多くの有用なニコチン誘導体が「Physician's Desk Reference（最新版）」および「Harrison's Principles of Internal Medicine」内に開示される。
【００３０】
「ニコチン受容体」という用語は、「ニコチン受容体アゴニスト」の場合のように、ニコチン受容体の古典的な五量体タンパク質（中央のイオンチャネルの周囲に対称的に配置されたサブユニットにより形成される）、およびニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニスト（例えば、ムスカリン性アセチルコリン受容体）と結合すると、幹細胞または前駆細胞のリクルートメントを刺激する（例えば、血管新生時のように）、ニコチン結合部位を含む任意のタンパク質を包含することを意図する。「ニコチン受容体アゴニスト」という文言中の「ニコチン受容体」という用語の使用は、本発明をニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストが幹/前駆細胞のリクルートメントを刺激する（例えば、ニコチン受容体に結合することにより）際の理論上の機構に限定することを意図せず、むしろ幹/前駆細胞のリクルートメントの刺激を促進するのに用いられ得る、本発明により意図される化合物種を記載する手段である。
【００３１】
本明細書において造血幹細胞（HSC）への言及に用いられるような、「長期」および「短期」という用語は当技術分野において承認されている用語である。一般的に、長期HSC（LTHSC）は自己再生幹細胞である。一般的に、短期HSC（STHSC）は造血系前駆細胞へ分化するようプログラムされている。当技術分野に公知の方法を用いて、ヒトのLTHSCをSTHSCから区別し得る。例えば、ヒトLTHSCは一般的にCD38-であり、一方ヒトSTHSCは一般的にCD38+である。マウスでは、LTHSCは一般的にFlk-2-であり、一方STHSCは一般的にFlk-2+である。例えば、Christiansen and Weissman（（2001）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:14541-14546）、Chen et al.（（2002）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:15468-15473）、Hogan et al. （（2002）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:413-418）、deWynter et al.（（1998）Stem Cells 16:387-396）を参照されたい。
【００３２】
「処置」、「処置する」などの用語は、本明細書において、所望の薬理学的ならびに/または生理学的作用、例えば血管新生および/もしくは血管形成の刺激を獲得することを一般的に意味する。作用は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する点において予防的であり得、ならびに/または疾患および/もしくは疾患に起因する有害作用に対して部分的もしくは完全な治療法である点において治療的であり得る。本明細書において用いられるように、「処置」は、哺乳動物、特にヒトにおける任意の処置を含み、かつ以下を含む：（a）疾患に罹患しやすい状態にあり得るがその疾患を有するとは診断されていない被験体において、疾患もしくは状態の発生を予防すること（例えば、不適切な血管形成に由来する皮膚移植片または再付着された肢の喪失を予防すること）；（b）疾患を阻害すること、例えばその進行を阻止すること；または（c）疾患を緩和すること（例えば、臓器への血流を改善するため、閉塞された血管の周囲に「バイオバイパス」の形成を増強すること）。例えば、本発明の文脈において、血管分布の増大および血流の増大による処置に適した疾患または状態を有する被験体に対して、血管新生および/または血管形成の刺激が用いられる。
【００３３】
「治療的有効量のニコチン受容体アゴニスト」とは、所望の治療効果、例えば、所望のレベルの血管新生および/または血管形成刺激を促進するのに有効な量のニコチン受容体アゴニストを意味する。正確な所望の治療効果は、処置される状態によって異なる。
【００３４】
「単離された」とは、化合物が自然界においてそれに付随する全てのまたはいくつかの構成要素から分離されることを意味する。
【００３５】
「実質的に純粋なニコチン受容体アゴニスト」とは、ニコチン受容体アゴニストが自然界においてそれに付随する構成要素から分離されたことを意味する。典型的に、ニコチン受容体アゴニストは、それが少なくとも50重量%〜60重量%で、それに天然で付随する天然由来の有機分子を含まない場合、実質的に純粋である。一般的に、調製物は少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、および最も好ましくは少なくとも99重量%ニコチン受容体アゴニストである。実質的に純粋なニコチン受容体アゴニストは、例えば、天然の供給源（例えばタバコ）からの抽出、化合物の化学的な合成、または精製および化学修飾の組み合わせにより得られ得る。実質的に純粋なニコチン受容体アゴニストは、例えば、ニコチン受容体アゴニスト活性を有する試料を、そのような活性を提供する因子または因子群について濃縮すること、例えばより高いニコチン受容体アゴニスト活性を有する画分を得ることによっても得られ得る。純度は任意の適切な方法、例えば、クロマトグラフィー、質量分析法、HPLC分析などにより測定され得る。
【００３６】
例えば、ニコチン受容体アゴニストは、その天然の状態においてそれに付随する夾雑物から分離された場合に、天然に付随するそれらの構成要素を実質的に含まない。従って、化学的に合成されたか、または天然にそれが由来する細胞とは異なる細胞系で産生されたニコチン受容体アゴニストは、その天然に付随する構成要素を実質的に含まない。
【００３７】
本明細書において「幹細胞」という用語は、自己再生、および分化した子孫を生成する能力を両方備えた哺乳類細胞を指すのに用いられる（Morrison et a1.（1997）Cell 88:287-298を参照されたい）。一般的に、幹細胞は1つまたは複数の以下の性質もまた有する：非同期的または対称的な複製を行う能力、これにより分裂後2つの娘細胞が異なる表現型を有し得る；広範な自己再生能力；有糸分裂静止型で存在する能力；およびそれらが存在する組織全体のクローン再生、例えば造血幹細胞の造血系全体を再構成する能力。「前駆細胞」は、それらが広範な自己再生能力を通常有さない点で幹細胞と異なり、それらが由来する組織における系列の一部、例えば造血系においてリンパまたは赤血球系しか再生し得ないことが多い。全体を通じて用いられる、「幹/前駆細胞」という用語は、簡単にするために用いられ、限定する意味はなく、幹細胞、前駆細胞、ならびに幹細胞および前駆細胞の両方を包含することを意味する。
【００３８】
幹細胞は、抗体により同定される特異的なエピトープに関連するマーカーの存在、および特異的な抗体の結合の欠損により同定されるような特定のマーカーの欠如の両方により特徴付けられ得る。幹細胞はインビトロおよびインビボの両方における機能アッセイ、特に幹細胞が複数の分化した子孫を生成する能力に関するアッセイによってもまた同定され得る。「幹細胞」は造血幹細胞およびそれらに由来する前駆細胞（米国特許第5,061,620号）；神経堤幹細胞（Morrison et al.（1999）Cell 96:737-749を参照されたい）；胚性幹細胞；間葉系幹細胞；中胚葉系幹細胞；などを含むことを意図するが、これらに必ずしも限定されない。
【００３９】
他の関心対象の造血系「前駆」細胞は、リンパ系、例えば未成熟T細胞およびB細胞集団に向けられた細胞を含む。本発明の方法は、これらの細胞の選択された集団の拡大に有用である。
【００４０】
「間葉系前駆細胞」は、内皮前駆細胞および他の間葉系列の細胞、例えば、結合組織、軟骨組織、軟骨細胞、骨（骨芽細胞）、脂質細胞（脂肪細胞）、および血管外層への発生に向けられた細胞を含むことを意図するが、これらに必ずしも限定されない。
【００４１】
本発明がさらに記載される前に、本発明は記載される特定の態様に限定されず、そのため当然変化することが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることから、本明細書において用いられる術語は、特定の態様について記載する目的のためだけのものであり、限定する意図はないこともまた理解されるべきである。
【００４２】
値の範囲が提供される場合は、文脈が特に明確に示さない限り、下限値の単位の10分の1までと、その範囲の上限および下限値の間に介在する各値、およびその指定範囲内の任意の他の指定値または介在値が、本発明に包含されると理解される。指定範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として、これらの小さな範囲の上限および下限値は独立にそれらの小さな範囲に含まれ得、かつ同様に本発明に包含される。指定範囲が限度の一方または両方を含む場合、これらの含まれる限度のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた本発明に含まれる。
【００４３】
特に定義されない限り、本明細書において用いられる技術および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を用いて本発明の実施または試験を行い得るが、好ましい方法および材料は次に記載される。本明細書において言及される全ての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および/または材料を開示および記載するため、参照により本明細書に組み入れられる。
【００４４】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形の「ある（a）」、「および（and）」および「その（the）」は、特に文脈が明確に示さない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなくてはならない。従って、例えば、「あるニコチン受容体アゴニスト」とはそのような複数のアゴニストを含み、「そのニコチン受容体」とは1つまたは複数のニコチン受容体および当業者に公知のそれらの同等物を含む。
【００４５】
本明細書において議論される刊行物は、本発明の出願日以前のそれらの開示のためだけに提供される。本明細書においていかなる内容も、本発明が先行発明によって、そのような文献に先行する権利はないということの承認として解釈されない。さらに、提供された刊行日は実際の刊行日とは異なる可能性があり、独自に確認する必要があり得る。
【００４６】
発明の詳細な説明
発明の概観
本発明は、ニコチンが血管への内皮前駆細胞のリクルートメントを誘導し、血管新生の誘導を提供するという驚くべき発見に基づく。本発明者らは、末梢白血球数がニコチンにより増加するという、骨髄中の短期および長期造血細胞数の増加に関連した作用もまた見いだした。
【００４７】
本発明者らの最初の調査は、喫煙者において冠状動脈または末梢動脈閉塞後に不適切な副側枝形成が起こることが多いという臨床的な観察に基づいた。つまり、本発明者らは当初ニコチンが血管新生の阻害において役割を果たし得ると考えた。従って、本発明者らは、ディスク血管新生系（disc angiogenesis system）（DAS）において、ニコチンの局所作用を試験することから開始した。予想外のことに、本発明者らは、ニコチンが血管新生剤として、Dell（Penta et al.（1999）J Biol Chem 274（16）:11101-9）およびbFGFを含む、この系で試験されたあらゆる成長因子と同等またはそれ以上に強力であることを発見した。さらなる研究から、ニコチンの強力な血管新生作用が、部分的にシクロオキシゲナーゼカスケード産物により、および部分的にNO合成酵素経路により媒介されることが明らかになった。ディスク血管新生系を用いた研究から、ニコチンが治療的血管新生に有用であり得ることが示唆された。しかしながら、血管新生は非常に複雑な過程であるので、作用物質が治療的血管新生に有用性を有するとの原理の証拠を示すために、その処置のために血管新生を必要とする疾患の動物モデルにおいて作用物質が試験された。従って、研究は動脈閉塞の動物モデル（マウス後肢虚血モデル）において行われた。本発明者らは、この動脈閉塞モデルを用いて、ニコチンが治療的血管新生を誘導するという有力な証拠を得た。
【００４８】
さらに、本発明者らは、ニコチンによる血管新生の誘導は、傷害部位への内皮前駆細胞の動員およびリクルートメントを含むことを発見した。この発見は、ニコチンが幹細胞および前駆細胞の動員およびリクルートメントを誘導でき、従って、例えば、感染、物理的損傷、自己免疫などにより、細胞集団が枯渇された状態を処置するのに用いられ得ることを示唆した。
【００４９】
このように、本発明者らは、タバコの煙の構成要素であるニコチンが、冠状、末梢、または他の閉塞性動脈疾患の処置における血管新生を増強するため；創傷治癒の増強および外科的に移植された組織または臓器（例えば、皮膚移植片もしくは再付着された肢）の血管形成の改善のため；ならびに枯渇したかまたは損傷された成熟細胞集団の再増殖に提供するための幹細胞および前駆細胞のリクルートメントおよび動員のための、新規の治療的アプローチの基礎を提供することを発見した。
【００５０】
ニコチンは、他の従来の血管新生剤と比較して同様のまたは比較的増強されたその効力に鑑みて、治療的血管新生の基礎として、現行の候補に対して顕著な利点を有する。さらに、ニコチンの薬理および薬物動態も既に喫煙との関連で（例えば、禁煙を促進する試みにおいて）十分に特徴付けられており、持続放出および局所送達のための方法も既に集中的に研究されている。ニコチンおよびニコチンアゴニストの製造過程もまた十分に特徴付けられている。さらに、これらの小分子は、複雑な血管新生ペプチドより容易に合成かつ貯蔵される。
【００５１】
従って、本発明は、ニコチン受容体アゴニストの投与による、幹細胞および/または前駆細胞の動員およびリクルートメントのための、方法ならびに組成物を包含する。
【００５２】
ニコチンおよび他のニコチン受容体アゴニスト
本発明の方法は、ニコチン受容体アゴニスト、具体的にはニコチン、ニコチン代謝産物、またはニコチン誘導体の投与により達成される。ニコチン誘導体および類似体の作製のための方法は当技術分野において周知である。米国特許第4,590,278号、第4,321,387号、第4,452,984号、第4,442,292号、および第4,332,945号を参照されたい。
【００５３】
更なる関心対象のニコチン受容体アゴニストは、天然由来の植物アルカロイド（例えば、ロベリン、ロベリン誘導体など）を含むが、これらに必ずしも限定されない。そのような植物由来化合物は、草本調製物（例えば、乾燥タバコ葉の形で、バップ剤として、植物調製物として、など）として、単離された（例えば、それに天然で付随する材料から分離されたかまたは部分的に分離された）形で、または実質的に精製された形で、提供され得る。他のニコチン受容体アゴニストはコリンエステラーゼ阻害剤（例えば、アセチルコリンの局所濃度を増大させるもの）、神経細胞型ニコチン性受容体に特異的に結合し（ムスカリン性受容体への結合が減弱した）、かつ有害副作用が減弱した（例えば、Epidoxidine、ABT-154、ABT-418、ABT-594；Abbott Laboratories（Damaj et al.（1998）J. Pharmacol Exp. Ther. 284:1058-65、同等の効力を有するが、神経細胞型ニコチン性受容体に高度の特異性を有するエピバチジンのいくつかの類似体について記載する）エピバチジンの誘導体を含む。関心対象の、さらなるニコチン受容体アゴニストは、コリン（例えば、トリメチルアミノエタノール（trimethylaminoethanol））（Abood et al.（1988）Pharmacol. Biochem. Behav. 30:403-8）；アセチルコリン（ニコチン受容体に対する内在性リガンド）；などのN-メチルカルバミル（N-methylcarbamyl）およびN-メチルチ-O-カルバミル（N-methylthi-O-carbamyl）エステルを含むが、これらに必ずしも限定されない。
【００５４】
ニコチン受容体アゴニストは当技術分野において周知の方法を用いてもまた容易に同定され得る。例えば、候補ニコチン受容体アゴニストの能力はインビトロでニコチン受容体との結合についてスクリーニングすることができ、かつ候補作用物質が幹細胞および/または前駆細胞をリクルートする能力はインビボで評価され得る（例えば、ディスク血管新生系（DAS）を用いて、後肢虚血モデルにおいてなど）。
【００５５】
薬学的組成物
本明細書を読めば、当業者は、本明細書において記載されるニコチン受容体アゴニストを含む薬学的組成物が幅広い種類の製剤にて提供され得ることを理解する。より具体的には、ニコチン受容体アゴニストは、適切な薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤の組み合わせにより薬学的組成物に調剤することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、およびエアロゾル剤のような、固形、半固形（例えば、ゲル）、液体、または気体状の形態の調製物に調剤され得る。ニコチン受容体アゴニストが天然由来の化合物である場合、薬学的組成物は草本調製物（例えば、タバコ葉の形で、植物材料のバップ剤として、植物調製物として、など）としてもまた提供され得る。
【００５６】
用いられるニコチン受容体アゴニスト製剤は、処置される状態または疾患、投与経路、投与されるニコチン受容体アゴニストの量、および当業者により容易に理解される他の変数に従って異なる。一般的に、および以下により詳細に議論されるように、ニコチン受容体アゴニストの投与は、全身性または局所性のいずれでも良く、経腸（例えば、経口）、腸管外、静脈内、血管内、動脈内、心膜内、筋肉内、腹膜内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）、皮下、皮内、肺内などの経路による投与を含むが、これらに必ずしも限定されない、さまざまな方法により達成され得る。
【００５７】
薬学的な投与形態において、ニコチン受容体アゴニストはそれらの薬学的に許容される塩の形で投与され得、またはそれらは、単独でもしくは他の薬学的に活性な化合物と適切に結合されて、および組み合わされて使用されてもよい。以下の方法および賦形剤は単に例示的なもので、限定するものではない。
【００５８】
ニコチン受容体アゴニストは、植物油もしくは類似の油、合成脂肪族系酸のグリセリド、高級脂肪族系酸のエステル、またはプロピレングリコールのような、水性あるいは非水溶媒にそれらを溶解、懸濁、または乳化することにより、そして望ましい場合、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤、および保存剤のような従来型の添加剤を有する、注射用の調製物に製剤され得る。
【００５９】
局所性、経皮（transcutaneous）、および経皮（transdermal）投与、例えば、ニコチン受容体アゴニストを創傷に直接投与するのに適した製剤は、適切な懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤の使用により同様に調製され得る。局所製剤はまた、例えば、持続放出ペレット剤または放出制御貼付剤への組み込みにより、ニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストの持続的投与を提供するための手段と共に用いられ得る。
【００６０】
ニコチン受容体アゴニストは、生体適合性のゲルにもまた調剤され得、このゲルは局所的に適用される（例えば、創傷治癒を促進させるため）か、または埋込まれ（例えば、内部の処置部位においてニコチン受容体アゴニストの持続放出を提供するため）得る。ゲルを用いた送達のために所望の化合物を調剤するのに適切なゲルおよび方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第5,801,033号；第5,827,937号；第5,700,848号；およびMATRIGEL（商標）を参照されたい）。
【００６１】
経口調製物としては、ニコチン受容体アゴニストは単独で、または錠剤、粉剤、顆粒剤、またはカプセル剤を作製するため、適切な添加剤、例えば、乳糖、マンニトール、コーンスターチ、もしくはジャガイモデンプンのような従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アカシア、コーンスターチ、もしくはゼラチンのような結合剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、もしくはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのような崩壊剤；タルクもしくはステアリン酸マグネシウムのような滑剤；ならびに望ましい場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、および矯味矯臭剤と組み合わされて用いられ得る。
【００６２】
ニコチン受容体アゴニストは、吸入により投与される、エアロゾル製剤として用いられ得る。本発明の化合物は、加圧された許容される噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの中に調剤され得る。
【００６３】
さらに、ニコチン受容体アゴニストは、乳化基剤または水溶性基剤のような、さまざまな基剤と混合することで坐剤にされ得る。本発明の化合物は坐剤により経直腸投与され得る。坐剤は、体温で融解するが室温で凝固する、ココアバター、カーボワックスおよびポリエチレングリコールのような溶剤を含み得る。
【００６４】
シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤のような経口または経直腸投与のための単位用量形態は、各単位用量、例えば茶さじ一杯、テーブルスプーン一杯、錠剤、もしくは坐剤が、1つもしくは複数の阻害剤を含む、規定量の組成物を含むように、提供される。同様に、注射または静脈内投与のための単位用量形態も、滅菌水、生理食塩水、または他の薬学的に許容されるキャリア中の溶液として、組成物中に阻害剤を含み得る。
【００６５】
本明細書において用いられるように、「単位用量形態」という用語は、ヒトおよび/または動物の被験体に対する単位用量として適切な物理的に分離した単位を指し、各単位は、薬学的に許容される希釈剤、キャリア、または溶剤と結合した、所望の作用を産生するのに十分な量で計算された、規定量のニコチン受容体アゴニストを含む。本発明の単位用量形態に関する明細は、用いられた特定の化合物、および達成されるべき効果、ならびに宿主における各化合物に関連した薬力学に依存する。
【００６６】
溶剤、アジュバント、キャリア、または希釈剤のような薬学的に許容される賦形剤は、容易に一般に入手可能である。さらに、薬学的に許容される補助剤、例えばpH調整剤および緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤などが容易に一般に入手可能である。
【００６７】
1つまたは複数のニコチン受容体アゴニストに加え、本発明に記載される薬学的製剤は、追加の活性作用物質を含むか、または同時に投与され得る。例えば、薬学的製剤が血管新生および/または血管形成を促進するために投与される場合、製剤は、一酸化窒素（NO）レベルの増強（例えば、NO合成酵素の活性を増強すること、NOの放出を増強することなどにより）またはプロスタサイクリンレベルの増強（例えば、プロスタサイクリン合成酵素の活性を増強すること、プロスタサイクリンの放出を増強することなどにより）により、さらに血管新生を増強するために、追加の作用物質を含み得る。例示的なNOレベル増強剤は、NOの基質になり得るL-アルギニン、L-リジン、およびこれらのアミノ酸に富んだペプチド；抗酸化剤（例えば、トコフェロール、アスコルビン酸、ユビキノン）または抗酸化酵素（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）のようなNO活性を保つ作用物質；ならびにNO合成酵素の活性を増強する作用物質（例えば、テトラヒドロビオプテリン、またはテトラヒドロビオプテリンの前駆体（例えば、セピアプテリン（sepiapterin）））などを含むが、これらに必ずしも限定されない。例示的なプロスタサイクリンレベル増強剤は、エイコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸のようなプロスタサイクリンの前駆体；ならびにプロスタグランジンE1およびその類似体のようなプロスタノイドなどを含むが、これらに必ずしも限定されない。または、もしくはさらに、本発明に記載される薬学的組成物は、ニコチン受容体以外の経路を介して作用する、幹細胞および/または内皮細胞のリクルートメントの刺激のための追加の作用物質（例えば、血管新生または血管形成において、VEGF、FGF（例えば、aFGF、bFGF）、Del-1など）を含み得る。
【００６８】
特に、局所適用のためにニコチン受容体アゴニストが送達される（例えば、筋肉内径路により）場合、ニコチン受容体アゴニストをゲルまたはマトリックスで提供することが望ましいこともある。ゲルまたはマトリックスは、例えば、その上に、例えば新規の組織が形成し得る、少なくとも最初の基質を提供し得る。例えば、その領域の閉塞をバイパスするため、ゲルまたはマトリックスを虚血部位に押出して、新規血管形成のための経路を形成し得る。
【００６９】
インビボでの幹細胞および前駆細胞の動員/リクルートメントのためのニコチン受容体アゴニストの投与
幹細胞および/または前駆細胞の動員またはリクルートメントを達成するために、ニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストは任意の適切な様式で、好ましくは薬学的に許容されるキャリアと共に投与され得る。当業者は、本発明の文脈において、ニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストを投与する、さまざまな適切な方法が利用可能であること、ならびに複数の経路を用いて特定の化合物を投与可能であっても、特定の経路が他の経路に比較して、より即時性で、より有効な、および/またはより少ない副作用を伴うものを提供し得ることを容易に理解する。一般的に、ニコチン受容体アゴニストは本発明の方法に従って、例えば経腸（例えば、経口）、腸管外、静脈内、動脈内、心膜内、筋肉内、腹膜内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）、皮下、皮内、または肺内経路により投与され得る。
【００７０】
本方法は、幹細胞および/もしくは前駆細胞、またはそのような細胞の子孫の増殖の刺激を提供する。本方法は、幹細胞および/もしくは前駆細胞、またはそのような細胞の子孫の、哺乳動物における骨髄から処置部位への動員の刺激を提供する。処置部位は、血流、末梢循環、リンパ節、創傷または潰瘍などを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様において、方法は循環中の幹細胞またはそれらの子孫の処置部位への取り込みを提供する。
【００７１】
全身性ニコチンに関連した副作用を避けるため、ニコチンを局所的に投与する（単独で、または例えば血管新生の刺激においてNO合成酵素もしくはプロスタサイクリン合成酵素経路の活性を増強するため；もしくは所望の成熟細胞（例えば、内皮細胞）への幹細胞もしくは前駆細胞の発生を促進するために、追加の活性作用物質と共に）のが好ましいことがある。局所投与は、例えば、所望の処置部位での直接注射（例えば、筋肉内注射）、ニコチン受容体アゴニスト製剤の所望の処置部位付近での静脈内導入（例えば、処置部位に供給を行う血管または毛細血管中に）、動脈内または心膜内導入、処置部位内またはその近傍への生体適合性のゲルまたはカプセル中のニコチン受容体アゴニスト製剤の導入（例えば、注射もしくは他の埋込み方法による）、血流の増大および/もしくは血管形成の増大が望ましい、ならびに/または幹細胞もしくは前駆細胞のリクルートメントが望ましい、筋肉あるいは他の組織への直接注射、製剤の直腸導入（例えば、腸の一部分を切除した後に、外科的に形成された吻合の血管形成を促進するための坐剤の形などで）などにより達成されうる。
【００７２】
関心対象の特定の1つの適用において、ニコチン受容体アゴニスト製剤は「バイオバイパス」法に利用され、ここで、冠状動脈バイパス手術のような、より侵襲的な手順を行う代わりに、閉塞された部位の周囲に新規の血管の成長を誘導するためにニコチン受容体アゴニスト製剤が投与される。この態様において、血管新生を刺激するため、ニコチン受容体アゴニスト製剤が虚血組織の領域内および/またはその近位に投与され得る。
【００７３】
いくつかの態様において、ニコチン受容体アゴニストを血管壁に直接送達することが望ましいことがある。血管壁投与の1つの例示的な方法は薬物送達カテーテル、特に血管壁への送達を容易にし得る膨張性のバルーンを含む、薬物送達カテーテルの使用を含む。従って、1つの態様において、本発明の方法は、バルーンカテーテルの膨張による血管壁へのニコチン受容体アゴニストの送達を含み、ここでバルーンは、バルーンの実質的な部分を占めるニコチン受容体アゴニスト製剤を含む。ニコチン受容体アゴニスト製剤は血管壁に接する位置に保持され、血管壁を通した吸着を促進する。一例を挙げれば、カテーテルは、より長い吸着時間にわたりニコチン受容体アゴニストを血管壁に接して保持する間、カテーテルを通じた血液の灌流を可能にする、灌流型バルーンカテーテルである。ニコチン受容体アゴニストの適用に適したカテーテルの例は、米国特許第5,558,642号；第5,554,119号；第5,591,129号などに開示される薬物送達カテーテルを含む。
【００７４】
他の関心対象の態様において、ニコチン受容体アゴニスト製剤は、埋込まれ得る（例えば、処置部位内またはその近傍への注射、処置される組織内へまたはその近傍への押出などにより）生体適合性のゲルの形で送達される。ニコチン受容体アゴニストを含むゲル製剤は、持続的な時間（例えば、数時間、数日間、数週間など）にわたりニコチン受容体アゴニストおよび他の活性作用物質の局所放出を促進するよう設計され得る。ゲルは処置部位内またはその近傍に、例えば針もしくは他の送達装置を用いて、注射され得る。1つの態様において、ゲルは、組織に挿入され、次いで徐々に引き抜かれてゲルの軌跡を残す器具の中または上に配置され、その結果、器具により作製された経路に沿って、幹細胞および/または前駆細胞のリクルートメントが刺激される。この後者の送達方法は、例えばバイオバイパスの道筋を指示するために、特に望ましい可能性がある。
【００７５】
他の態様において、例えば創傷治癒の促進するための、例えば局所的送達のために、ニコチン受容体アゴニスト製剤を局所的に送達することが望ましいことがある。局所的適用は、貼付剤の形で、またはクリーム、泡などの使用により提供され得る、生体適合性のゲルの使用により達成され得る。創傷への適用に適した、いくつかのゲル、貼付剤、クリーム、泡などを、本発明に記載のニコチン受容体アゴニスト製剤の送達のために改変し得る（例えば、米国特許第5,853,749号、第5,844,013号、第5,804,213号、第5,770,229号などを参照されたい）。一般的に、局所的投与は、親水性コロイドまたは湿潤環境を提供する他の材料のようなキャリアを用いて達成される。または、創傷治癒の目的のために、創傷に適用され得るゲルまたはクリーム中の他の作用物質の有無に関わらず、ニコチンアゴニストが供給され得る。そのような適用の例は、保存剤および安定剤と共にニコチンアゴニストならびに他の活性成分を含む、汚染微生物数の少ない、カルボキシメチルセルロースナトリウムを基材とした局所用のゲルとしてである。
【００７６】
他の態様において、ニコチン受容体アゴニスト製剤は、経皮（transdermal）貼付剤を用いることで、局所性または全身性に送達される。いくつかの経皮（transdermal）貼付剤は、禁煙を促進するための、ニコチンの全身性送達に関して当技術分野において周知であり、そのような貼付剤を、本発明に記載される幹細胞および/または前駆細胞のリクルートメントを刺激するのに有効な量のニコチン受容体アゴニストの送達に提供するために改変し得る（例えば、米国特許第4,920,989号；および第4,943,435号、NICOTROL（商標）貼付剤など）。
【００７７】
他の送達方法において、ニコチン受容体アゴニストはイオン注入技術を用いて投与され得る。イオン注入に用いられる方法および組成物は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第5,415,629号；第5,899,876号；第5,807,306号などを参照されたい）。
【００７８】
幹/前駆細胞の動員/リクルートメントの所望の程度は、処置される特定の状態または疾患、ならびに患者の安定性および起こり得る副作用に依存する。適切な用量および適当な投与により、本発明は血管の幅広い発生（例えば、小規模な発生から本質的に完全な発生まで）、ならびに幅広い幹細胞または前駆細胞の動員および/またはリクルートメント（例えば、ある細胞種の完全な再増殖を提供するための十分な数の細胞の動員（例えば、感染、放射線療法、化学療法などの後の免疫無防備状態の宿主に免疫細胞の補充を提供するため；局所傷害部位への幹細胞または前駆細胞の局所的リクルートメントを提供するため（例えば、創傷治癒、局所虚血などにおけるように）））を提供する。
【００７９】
幹/前駆細胞の動員/リクルートメントにおけるニコチン受容体アゴニストの活性は、ニコチン受容体アゴニストにより媒介されるリクルートメントを妨げる化合物の投与により制御され得る。この意味において、本発明は、これらの過程におけるその役割を妨げることにより、ニコチン受容体アゴニストの活性を制御または阻害する手段をもまた提供する。このことは、例えば、ニコチン受容体アゴニストがニコチン受容体を通じてその作用を媒介する能力を阻害する（例えば、ニコチン受容体との結合を阻害することにより）作用物質の投与により達成され得る。例示的なニコチン受容体アンタゴニストはヘキサメトニウムおよびメカミラミンを含む（図1に式が提供される）。または、ニコチン受容体アゴニストにより媒介される活性は、ニコチン受容体シグナル伝達の下流の過程の阻害剤の投与により、制御または阻害され得る。例えば、一酸化窒素合成酵素阻害剤および/またはプロスタサイクリンアンタゴニストを、血管新生の刺激におけるニコチン受容体アゴニストの活性を阻害するために投与し得る。阻害剤は、ニコチン受容体アゴニストに関して記載されたのと同じ様式および投与量で、ヒトなどの哺乳動物に投与され得る。
【００８０】
被験体がニコチン受容体アゴニストに曝露、特に慢性曝露された場合（例えば、喫煙者であり、以前に、特に慢性的な全身性のニコチン曝露を受けた被験体のように）、幹/前駆細胞の動員/リクルートメントの刺激を媒介するニコチン受容体または他のニコチン受容体アゴニスト結合受容体が、ニコチン受容体アゴニストへの事前の曝露または慢性曝露を受けていない被験体に比べ、低レベルで存在することがある。そのような被験体においては、従って、ニコチン結合受容体の増大を刺激するため、最初の治療単位にニコチン受容体アンタゴニストの投与が望ましい。
【００８１】
用量
被験体、特にヒトに投与されるニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストの用量は、本発明の文脈において、妥当な時間枠の間に被験体に所望の治療反応（例えば、治療的に有効な数の幹/前駆細胞の動員/リクルートメント、治療的な血管新生反応など）をもたらすのに十分であるべきである。用量は、利用された特定のニコチン受容体アゴニストの効力および被験体の状態、ならびに処置される被験体の体重により決定される。例えば、ニコチン受容体に対するニコチン受容体アゴニストのレベルもしくは親和性または両方が、化合物の活性の調節において役割を果たし得る。用量の大きさは、特定の化合物の投与に関連し得る任意の有害副作用の存在、性質、および程度によってもまた決定される。
【００８２】
幹/前駆細胞のリクルートメントの刺激におけるニコチンまたはニコチン受容体アゴニストの有効量の決定に当たっては、最小限の有害副作用を伴う所望の作用を達成するため、投与経路、放出系（例えば、丸薬、ゲルまたは他のマトリックス）の動態、およびニコチンアゴニストの効力が考慮される。ニコチン受容体アゴニストは、典型的には、1日から数週間にわたる期間処置される被験体に対し、処置される被験体の臨床状態に一致して投与される。
【００８３】
以下の投与量は、ニコチン、またはニコチンと類似の効力および効能を有するニコチン受容体アゴニストが投与されていると仮定する。当業者には容易に理解されるように、ニコチン受容体アゴニストの投与量は、ニコチンと比較してのそれらの効力および/または効能に従って調整される。経口で、または吸入剤として投与された場合、用量は約0.01mg〜10mgの範囲で、一日1〜20回投与されてもよく、最大で一日総用量は約0.1mg〜100mgであり得る。局所的に適用された場合、全身性作用のためには、貼付剤またはクリームは、約0.01mg〜10mgの範囲内の用量の全身性送達を提供するよう設計される。局所的製剤（例えば、クリーム）の目的が局所作用の提供である場合は、用量は約0.001mg〜1mgの範囲内である可能性が高い。全身性作用のために注射される場合は、ニコチンアゴニストが投与されるマトリックスは、約0.001mg〜1mgの範囲内の用量の全身性送達を提供するよう設計される。局所作用のために注射される場合は、マトリックスは、約0.003mg〜1mgの範囲内の量のニコチンアゴニストを局所的に放出するよう設計される。
【００８４】
投与経路に関わらず、ニコチン受容体アゴニストの用量は任意の適切な期間にわたって（例えば、1時間〜24時間の間、1日〜数日間の間など）投与され得る。さらに、選択された期間にわたって、複数の用量が投与され得る。特に予防的計画において、適切な用量を一日当たりの適切なサブドース（subdose）で投与し得る。正確な処置レベルは、処置される被験体の反応に依存する。いくつかの個体の、ニコチン受容体アゴニストを用いた処置において、「大量投与」計画の利用が望ましいことがある。そのような処置においては、多量のニコチン受容体アゴニストが個体に投与され、化合物が作用するための時間がおかれた後、適切な試薬、例えば、ニコチン受容体アンタゴニストが個体に投与され、活性化合物を無効化するか、またはその全身性の副作用を低減させる。
【００８５】
ニコチン受容体アゴニストにより媒介される血管新生による処置に適した状態
本発明の方法およびニコチン受容体アゴニスト含有組成物を用いて幹/前駆細胞のリクルートメントにより恩恵を被る、さまざまな状態を処置し得る。
【００８６】
1つの態様において、ニコチン受容体アゴニストを用いて、血管新生の刺激、血管形成の刺激、血流の増大、および/または血管分布の増大を提供するために、内皮前駆細胞のリクルートメントを刺激する。この態様におけるニコチン受容体アゴニストの使用は、本明細書において一般的に「治療的血管新生」と呼ばれる。
【００８７】
本発明の方法に従った治療的血管新生に適した状態および疾患の例は、血管の閉塞、例えば動脈、静脈または毛細血管系の閉塞に関連した任意の状態を含む。そのような状態または疾患の具体的な例は、冠動脈閉塞症、頸動脈閉塞症、動脈閉塞症、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、ミオインテマル（myointimal）過形成（例えば、血管手術またはバルーン血管形成、または血管ステント術に由来する）、閉塞性血栓血管炎、血栓障害、血管炎などを含むが、これらに必ずしも限定されない。本発明の方法を用いて予防され得る状態または疾患の例は、心臓発作（心筋梗塞）もしくは他の血管性の死、卒中、血流の減少に関連した肢の死もしくは喪失などを含むが、これらに必ずしも限定されない。
【００８８】
他の形態の治療的血管新生は、創傷または潰瘍の治癒を促進するため；皮膚移植片または再付着された肢の機能および生存能力を維持するために、それらの血管形成を改善するため；外科的吻合（例えば、胃腸手術後の腸の再接合部分におけるような）の治癒を改善するため；ならびに皮膚または毛の成長を改善するための、ニコチン受容体アゴニストの使用を含むが、これらに必ずしも限定されない。
【００８９】
幹細胞および/または前駆細胞の動員および/またはリクルートメントのニコチン受容体アゴニストにより媒介される誘導による処置に適した状態
血管新生および/または血管形成における内皮前駆細胞の刺激に加え、ニコチンまたは他のニコチン受容体アゴニストを用いて、枯渇した成熟細胞の置換の提供、または成熟細胞集団の補充のために、幹細胞および/または前駆細胞の動員および/もしくはリクルートメントおよび/または増殖（例えば、再生）も誘導し得る。「動員」とは、幹細胞および/または前駆細胞の、それらの起源部位（例えば、骨髄）から全身循環への移動の誘導を意味する。「リクルートメント」は幹細胞および/または前駆細胞の、全身循環から局所部位への、例えば、創傷または他の物理的損傷部位、感染部位、臓器などへの移動を指す。動員/リクルートメント過程に加えてかまたはその一部として、ニコチン受容体アゴニストは、幹細胞および前駆細胞の増殖および成熟も誘導し得る。従って、幹および/または前駆細胞の動員またはリクルートメントの方法は、そのような細胞の数の増大を含み得る。
【００９０】
幹細胞および/または前駆細胞の動員による処置に適した状態は、免疫細胞（例えば、好中球、好酸球、T細胞、B細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞）、間葉由来の細胞（例えば、結合組織の細胞、軟骨の細胞、軟骨細胞、骨（骨芽細胞）、脂質細胞（脂肪細胞）、および血管の細胞、例えば内皮細胞）の数の増大による処置に適した状態を含むが、これらに必ずしも限定されない。従って、いくつかの態様において、本発明は免疫細胞の減少に関連した障害の処置を提供する。免疫細胞の減少に関連した障害は、好中球減少症、白血球減少症、後天性免疫不全症などを含むが、これらに限定されない。後天性免疫不全症は、放射線療法、化学療法（例えば、癌化学療法）、ウイルス感染などを含むが、これらに限定されない、任意のさまざまな状態または処置に起因し得る。
【００９１】
いくつかの態様において、本発明は、骨髄細胞（例えば、造血幹細胞、免疫前駆細胞、およびそのような細胞の子孫を含む）の増殖を刺激して、骨髄移植に用いるために被験体から細胞を得る前に、哺乳類の被験体においてそのような細胞の数の増大を提供する方法を提供する。例えば、有効量のニコチン受容体アゴニストが、骨髄ドナー候補の個体に、レシピエントへの移植のために骨髄がドナーから採取される前の適切な時間に投与される。例えば、有効量のニコチン受容体アゴニストが、ドナー候補に対し、前記ドナー個体から骨髄を採取する前、約30分〜約2週間、例えば、約30分〜約1時間、約1時間〜約2時間、約2時間〜約4時間、約4時間〜約8時間、約8時間〜約12時間、約12時間〜約16時間、約16時間〜約24時間、約24時間〜約2日間、約2日間〜約4日間、約4日間〜約7日間、または約1週間〜約2週間の期間に、投与される。
【００９２】
いくつかの態様において、本発明は幹細胞および/または前駆細胞の増殖の刺激を提供し、ここで幹細胞および/または前駆細胞は造血系列である。例えば、いくつかの態様において、ニコチン受容体アゴニストの投与は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、もしくは少なくとも約50%、またはそれより多くの、末梢白血球数の増大を誘導する。他の態様において、ニコチン受容体アゴニストの投与は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、もしくは少なくとも約50%、またはそれより多くの、骨髄中の総細胞数の増大を誘導する。他の態様において、ニコチン受容体アゴニストの投与は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、もしくは少なくとも約50%、またはそれより多くの、骨髄中の短期造血幹細胞の増大を誘導する。他の態様において、ニコチン受容体アゴニストの投与は、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、もしくは少なくとも約50%、またはそれより多くの、骨髄中の長期造血幹細胞の増大を誘導する。
【００９３】
一つの態様において、動員/リクルートされた細胞は間葉系幹細胞である。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、筋肉、腱、および他の結合組織に分化可能な骨髄中の前駆細胞の集団である（Bruder et al.（1998）Clin Orthop（355 Suppl）：S247-56）。ヒトの間葉系幹細胞はSH2、SH3、およびSH4マーカーに対し陽性である。
【００９４】
他の態様において、動員/リクルートされた細胞は造血幹細胞である。造血細胞は、HSC、赤血球、好中球、単球、血小板、マスト細胞、好酸球および好塩基球、BおよびTリンパ球、ならびにNK細胞、ならびに各系列の前駆細胞を包含する。本明細書において用いられるように、造血幹細胞（HSC）は、定義された全ての血液リンパ系列中の子孫を生じ得る、原始または多能性造血幹細胞を指す：限定的な数の幹細胞が、致死的な放射線照射を受けたマウスを完全に再構成し、それらの長期的な生存をもたらし得る。ヒトにおいて、CD34+ Thy-1+ Lin-造血幹細胞は、マウスのc-kit+ Thy-1.1lo Lin-/lo Sca-1+（KTLS）造血幹細胞に相当し、多系列性の造血幹細胞の実質上純粋な集団である。ヒトの造血幹細胞はそれらの表面にCD34、thy-1、SCA-1、およびSCA-2マーカーを提示し；かつ、グリコホリンA、CD3、CD24、CD16、CD14、CD38、CD45RA、CD36、CD2、CDl9、CD56、CD66a、およびCD66bを含み得る系列特異的マーカー；T細胞特異的マーカー、腫瘍特異的マーカーなどについては陰性である。中胚葉系幹細胞の同定に有用なマーカーは、FcγRII、FcγRIII、Thy-1、CD44、VLA-4α、LFA-1β、HSA、ICAM-1、CD45、Aa4.1、Sca-lなどを含む。米国特許第5,035,994号；第5,061,620号；第5,061,620号；およびTerstappen et al.（1992）Blood 79:666-677もまた参照されたい。
【００９５】
他の態様において、動員/リクルートされた幹細胞は神経堤幹細胞である。神経堤幹細胞は低親和性神経成長因子受容体（LNGFR）について陽性であり、かつスルファチド、神経膠線維酸性タンパク質（GFAP）、ミエリンタンパク質P0、ペリフェリン、および神経フィラメントのマーカーについて陰性である。
【００９６】
特に関心対象の態様において、動員された細胞およびリクルートされた細胞は内皮前駆細胞である。
【００９７】
幹/前駆細胞の動員/リクルートメントによる処置に適した例示的な状態は、虚血、免疫不全症（例えば、好中球減少症、白血球減少症、後天性免疫不全症など）、および血友病（例えば、後天性血友病）を含むが、これらに必ずしも限定されない。本発明の方法は、傷害（例えば、機械的、物理的、化学的、放射線、原子力、自己免疫、病原体媒介性傷害など）に由来する損傷の処置にもまた用いられ得る。
【００９８】
幹細胞および/または前駆細胞の動員/リクルートメントによる処置に適した状態は、任意のさまざまな原因に由来し得る。例えば、成熟細胞集団の減少は、疾患または傷害の直接または副次的効果であり得、疾患または傷害の処置（例えば、癌の処置のための化学療法におけるような）に由来し得る。例えば、好中球の枯渇に関連した状態である好中球減少症は、特定の種類の白血病、リンパ腫、もしくは転移癌による骨髄損傷；利尿剤もしくは抗生物質のような薬剤への有害反応；免疫細胞の枯渇を引き起こし得る治療、例えば放射線処置もしくは化学療法；例えば、EBVウイルス（例えば、感染性単核細胞症）、HIVなどにより引き起こされるウイルス感染；細菌感染（例えば、結核）；または自己免疫性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス）に由来し得る。
【００９９】
実施例
以下の実施例は、当業者に対し、どのように本発明を作成し使用するのかについての完全な開示および記載を提供することを目的として示され、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することは意図されず、かつそれらは以下の実験が行われた実験の全てまたは唯一のものであることを表すことも意図されない。使用された数字（例えば、量、温度など）については、正確さを期すよう努力が払われたが、いくらかの実験上の誤差および偏差は考慮されるべきである。特に示されない限り、部分は重量部分であり、分子量は平均重量の分子量であり、温度は摂氏温度であり、かつ圧力は大気圧またはその付近である。標準的な省略形、例えば、bp、塩基対；kb、キロベース；pl、ピコリットル；s、秒；min、分；hr、時間；aa、アミノ酸；kb、キロベース；bp、塩基対；nt、ヌクレオチドなどが使用され得る。
【０１００】
材料と方法
以下は、以下の特定の実施例において用いられた方法および材料の記載である。
【０１０１】
動物
8〜10週齢の雌の野生型C57BL/6Jマウスを用いた。マウスは20〜25グラムの重量であり（Jackson Laboratories, Bar Harbor, MEおよびDepartment of Comparative Medicine（DCM）, Stanford, CA）、以前記載されたように維持された（Maxwell et al.（1998）Circulation 1998 98（4）:369-374）。
【０１０２】
ディスク血管新生系（DAS）
ニコチンがインビボにおいて血管新生を誘導するか否か研究するため、本発明者らはディスク血管新生系（DAS）（Kowalski et al.（1992）Exp Mol Pathol 56（1）: 1 -19；Fajardo et al.（1998）Lab Invest 58:718-7244）を用いた。
【０１０３】
ディスクの調製
DASはポリビニルアルコールスポンジ製のディスク（直径11mm、および厚さ1mm）（Kaneho PVA、Rippey Co., Santa Clara, CA）からなる。両側を、Millipore glue #1（xx70000.00、Millipore）を用いてスポンジに固定した、スポンジディスクと同径の細胞不透過性のニトロセルロースフィルター（Milliporeフィルター、孔径0.45μm、Millipore, SF, CA）で覆った。結果的に、細胞（および血管）はディスクの縁のみを通って貫通または抜け出し得る（Kowalski et al.（1992）Exp Mol Pathol 56（1）:1-19；Fajardo et al.（1998）Lab Invest 58:718-7244）。
【０１０４】
血管新生におけるニコチンの局所作用を研究するため、ニコチンをディスクに直接添加されるペレットに加えた。簡単には、1.5mmの芯（ペレット）をディスク中心から切り取った。層流フード内での組立て前にペレットおよびディスクを滅菌した。ペレットには最大20mcl（μl）のニコチン溶液を加え、その後風乾した。局所的に投与されたニコチンの作用を研究するため、ディスク内に溶剤（PBS, Sigma, Chemical Co., St Louis, MO, n=5）またはニコチン（10-6M, Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI, n=5）のいずれかと共にペレットを置いた。比較のために、いくつかの場合において、ニコチンではなく塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF；20mcg）またはDel-1タンパク質（0.2M）をペレットに添加した。bFGFおよびDel-1は共に血管新生を誘導することが公知である。ペレットを次いで、ペレットからディスクへのニコチンの持続放出を可能とする、エチレン-ビニルアセテートコポリマー（Elvax, Dupont, Chemcentral Corp., Chicago, IL）によりコーティングした。次に、ディスクをmilliporeフィルターで封じる前に、ペレットを再挿入した。
【０１０５】
ニコチンの全身性作用を研究するため、いくつかの場合では、動物がそれらの飲用水中にニコチンを投与された（下記を参照されたい）。
【０１０６】
ディスクの埋込み
マウスを4%抱水クロラール［腹膜内投与（i.p.）、0.1cc/10g体重］を用いて麻酔した。側腹部および胸部の後面を剃毛し、飽和70%イソプロピルアルコールにより清浄化した。側腹部対側から埋込み部位の皮膚を2cm切開した。皮下組織を通しての鈍的切開によりチャネルを作成し、そこに生理食塩水で湿らせたディスクを挿入した。皮膚は5.0絹糸縫合により閉じた（Kowalski et al.（1992）Exp Mol Pathol 56（1）:1-19；Fajardo et al.（1998）Lab Invest 58:718-7244）。
【０１０７】
ディスクの除去および調製
ディスク埋込みの2週間後、マウスを4%抱水クロラールの過量投与（i.p.）および頸椎脱臼により屠殺した。埋込まれたディスク覆う皮膚に隣接して注意深く切開を行い、ディスクを埋込み部位から穏やかに除去した。付着した組織を注意深くディスクから引き離した。ディスクの除去後、1つのフィルターをディスクから分離した。次いで、ディスクを10%ホルマリン中で固定し、パラフィンに平らに包埋した。その後、ディスクの中心を通り、ディスク表面に平行な平面に5μmの切片を作製した。
【０１０８】
結果の定量化
ディスク切片を、光学顕微鏡観察および放射状成長の組織形態計測的（histomorphometric）測定のため、H&Eで染色し、血管結合組織成長の総面積の定量のためにトルイジンブルーで染色した。ビデオ顕微鏡およびコンピュータ支援デジタル画像分析系（NIH Image 1.59b9）を用いて、トルイジンブルー染色されたディスク中の血管結合組織成長の全面積を計算しmm2で表した。以前の研究において記載されたように、総血管結合組織成長面積は、血管により占められたディスクの総面積に正比例する（Kowalski et al.（1992）Exp Mol Pathol 56（1）:1-19；Fajardo et al.（1998）Lab Invest 58:718-7244）。従って、そのような総面積の測定値を血管新生の指数として用いる（Kowalski et al.（1992）前記；Fajardo et al.（1998）前記）。
【０１０９】
血管の連続性の評価
ディスク切片中の微細血管を可視化し、全身性とディスク血管系の間に連続性が存在したことを立証するため、luconylブルー色素を、マウスを安楽死させる前に左頚動脈に注射した。動物を4%抱水クロラール（i.p.、0.1cc/10g体重）を用いて麻酔した。頚部の腹側正中を切開した。頚動脈鞘を露出した後、左頚動脈を神経血管束から分離し、2本の4.0絹糸縫合により固定した。頚動脈を切開し、15cm長のPE10管（Beckton Dickinson, Sparks MD）を頚動脈に導入し、大動脈弁のすぐ遠位の上行大動脈まで進入させた。次いで、約1.0mlのluconylブルーを、1mlの注射器から管を通り胸部大動脈に徐々に注射した。ディスク中の血管結合組織ネットワークにおけるブルー色素の存在は、光学顕微鏡により検出した。顕微鏡観察から、単層の内皮により裏打ちされる微細血管、およびそれらの内腔内に含まれる赤血球が明らかとなった。luconylブルー色素はディスクの血管全体にわたり観察された。
【０１１０】
末梢動脈疾患（PAD）のマウス虚血性後肢モデル
マウスを4%抱水クロラール［腹膜内投与（i.p.）、0.1cc/10g体重］を用いて麻酔した。両後肢の内側面を剃毛し、次いでbetadine溶液を用いて清浄化した。膝から鼠径靱帯に及ぶ1.5cmの縦切開を行った。この切開部を通じ、浅大腿動脈をその全長に渡り切り離した。外腸骨動脈および浅大腿動脈の両方の遠位端を7.0（Ethicon）により結紮し、大腿動脈の完全切除を行った。追加の組のマウスには擬似手術を行った。次いで切開部を5.0絹糸縫合の不連続縫合により閉じた。外科的手順の後、アンピシリン（1mg/10g体重)の腹膜内注射を投与した。
【０１１１】
組織学的研究
組織の調製
手術3週間後、マウスを4%抱水クロラールの過量投与（i.p.）および頸椎脱臼により安楽死させ、毛細血管密度評価のため内転筋および半膜様筋を回収した。簡単には、大腿内側に縦切開を行い、後肢筋全体を露出させた。内転筋および半膜様筋を除去し、直ちにOCT中で凍結した。その後、5μm切片を各筋の中央域から横方向に採取した。切片を風乾し、アセトン中で固定した。
【０１１２】
毛細血管密度測定
内皮細胞を同定するため、アルカリホスファターゼアッセイを用いた免疫組織化学を行った。エオシン対比染色を用いて筋細胞を区別した。光学顕微鏡観察（20×）を用いて、毛細血管および筋細胞を同定および計数した。各切片につき、4つの異なる区域を選択し、各区域あたりの毛細血管および筋細胞の数を決定した。これらの値を平均化し、各実験肢についての毛細血管密度の決定を提供した。毛細血管密度の値が、筋萎縮のために過大評価されていないか、または間質の浮腫のために過小評価されていないことを保証するため、毛細血管密度を同区域内に存在した毛細血管の筋細胞に対する比で表した。
【０１１３】
データ分析
全てのデータを平均値±SEMで示した。統計的有意性は、群間の比較のための対応のない両側t検定により検定した。統計的有意性はp<0.05に対して認められた。
【０１１４】
実施例1：インビボでの血管新生に対するニコチンの全身性作用
全身的に処置されたマウスにおけるニコチンの作用を研究するため、ニコチン（60mcg/ml、n=5）を飲用水に希釈した。ニコチン誘導性の血管新生の機構を、埋込まれたDASを有し、局所的に処置された（DAS内部にニコチン）マウスおよび全身的に処置された（飲用水中にニコチンが希釈された）マウスの両方に対し、インドメタシン（20mcg/ml、Sigma、n=5）および/またはLNNA（6mg/ml、Sigma、n=5）を経口で補給投与することにより研究した。ニコチン、インドメタシン、およびLNNAの濃度を、マウスモデルにおいてこれらの作用物質の経口補給を用いた研究（Maxwell et al.（1998）Circulation 1998 98（4）:369-374；Fulton et al.（1980）Int J Cancer 26（5）:669-73；Rowell et al.（1983）J Pharmacological Methods 9:249-261）に従って決定した。
【０１１５】
基礎条件下（未処置水、溶剤処置ディスク）において、ディスクへの血管結合組織の成長が起こった。血管がディスクに成長していくのを見ることができた。これらの血管は、色素の全身性投与後に、leuconyl色素がディスクの血管系に流入することにより明示されたように、全身循環と連続していた。基礎条件下における血管結合組織のディスクへの成長面積は、10mm2より幾分か大きかった（図2）。ニコチンの全身投与により、血管結合組織の成長は劇的に増大し、面積は35mm2となった（図2）。ニコチンの作用は、NO合成酵素阻害剤のL、ニトロアルギニン（LNNA）、およびインドメタシンにより阻止されたことから、ニコチンの血管新生作用には一酸化窒素およびプロスタサイクリンの両方の合成が必要であることが示された。
【０１１６】
実施例2：インビボでの血管新生に対するニコチンの局所作用
いくつかの動物において、L-アルギニンの局所投与が血管新生の誘導に有効であるか否か決定するため、ディスク血管新生系に挿入されるペレット内にニコチンを置いた（前述）。ニコチンをディスクに置いた（実施例1に記載したように、動物の給水中に投与したのではなく）場合、類似の作用が観察された。基礎条件下における血管結合組織の成長（約10mm2）が約20mm2に増大した（図3）。さらに、インドメタシンまたはLNNAがニコチンの作用を阻止した。これらの研究から、ニコチンの全身または局所投与が血管新生を誘導することが示された。
【０１１７】
実施例3：他の血管新生剤とニコチンの作用の比較
ニコチンの作用を血管新生剤bFGFおよびDel1と比較した。bFGFは既に治療的血管新生についてのヒトでの治験が行われているため、bFGFとの比較は特に重要である。溶剤と比較して、bFGF、Del1およびニコチンはそれぞれ同程度血管新生を増大させた。全身投与されたニコチンは、局所投与されたbFGFおよびDel1に比較して、はるかに血管新生を増強した（図4）。逆説的に、ニコチン全身投与の方が確実にディスク中の局所レベルをより低くしていたにも関わらず、ニコチン全身投与の作用はニコチン局所投与よりも大きかった。この逆説から、研究者はニコチンの全身投与が局所的な血管新生（以下の実施例5を参照されたい）のみならず血管形成（骨髄からの内皮前駆体のリクルートメント）も誘導したと考えられた。筋肉内投与された中間用量のニコチンが最も大きな作用を有した。より高用量の筋肉内ニコチンでは、より少ない血管新生が観察された。
【０１１８】
実施例4：末梢動脈疾患のマウス後肢虚血モデルにおける血管新生の誘導
ニコチンの治療的血管新生作用のより有力な証拠を提供するため、ニコチンの血管新生作用を動脈閉塞症のモデル、マウス虚血性後肢（前述）において試験した。3週間の間、、ニコチン溶液または溶剤の筋肉内注射を連日投与した（50μl）。5群の動物に、0、3、30、300、または3200ng/kgのニコチンを連日筋肉内注射により投与した（図6および図7に、1×（50μlの生理食塩水中に0.0811ngのニコチン（=0.003μg/kg）、10×（50μlの生理食塩水中に0.811ngのニコチン（=0.03μg/kg）、100×（50μlの生理食塩水中に8.11ngのニコチン（=0.3μg/kg）、および1000×（50μlの生理食塩水中に81.1ngのニコチン（=3.2μg/kg）として示す）。図5に示されるように、手術から3週間後、虚血に対する基礎血管新生反応に一致して、毛細血管密度（毛細血管/筋細胞）が、手術されなかった肢（非虚血性）に比較して、手術された肢（虚血性）において増大していた。
【０１１９】
図6および図7に示されるように、ニコチンは対照と比較して虚血に対する血管新生反応を増強した。溶剤の対照では、0.35毛細血管/筋細胞が虚血性肢において検出された。中間用量の0.03μg/kgでは、ニコチンが血管新生反応をほぼ2倍（0.67毛細血管/筋細胞に）にした。最高用量では、血管新生は増大されず；実際のところ、間質の浮腫および筋細胞の壊死という証拠を伴ういくらかの毒性が観察された。非虚血性後肢には血管新生作用が検出されなかったことから（図6）、血管新生作用はニコチン注射部位に局所的にとどまった。従って、これらの用量のニコチンの局所筋肉内投与は全身性の血管新生作用をもたらさなかった。
【０１２０】
これらの研究はヒトの末梢動脈疾患のマウスモデルにおいて、ニコチンが血管新生を増大させること、およびニコチン受容体アゴニストが治療的血管新生に有用であることを示唆する。
【０１２１】
実施例5：ニコチンは内皮前駆細胞のリクルートメントにより血管新生を誘導する
血管新生の誘導におけるニコチンの役割をさらに検討するため、内皮前駆細胞のリクルートメントを研究した。2個体間で交差循環が確立されたマウス並体結合モデル（Eichwald, et al.（1963）J Natl Cancer Inst 30:783-94；Weissman et al.（1984）Transplantation 37:3-6）は、内皮分化能を有する循環中の細胞の血管新生部位への移動をインビボで追跡するのに理想的なアッセイである。一方のパートナーに由来する細胞は、性染色体またはLacZなどのレポーター導入遺伝子の存在のような安定な遺伝マーカーに基づき、もう一方の個体から区別し得る（図8）。所定の細胞型の事前選択を必要とするモデルにおける内在性の偏向を排除すること、および推定前駆細胞と実験上の宿主の間の免疫的または生理的障壁を克服するために必要な操作（例えば、全身放射線照射）を回避することが目標である。高度に近交系の実験用マウスの使用により、コンジェニックおよびトランスジェニックなマーカーを使用して系列追跡実験を行う上で、ずば抜けた汎用性が得られる。マウス並体結合モデルは、内皮前駆体の生物学的および遺伝的プログラムを研究するため、および血管周囲支持構造の発生における循環中の前駆体の役割を確立するにあたっての優れたモデルである。
【０１２２】
並体結合マウス対を、正常な状態および血管新生の後肢虚血モデルを用いた虚血性状態（上述したように）における血管形成への前駆体の動員および取り込み、ならびにニコチンの作用を調べるため、作製した。並体結合のパートナーは、全ての主要組織適合抗原を共有するよう選択され、従って細胞移動および血管新生に対する免疫的障壁を有さなかった。対の一方の動物に特有な遺伝マーカー（例えば、雌のマウスおよび雄のマウスからなる対の場合はY染色体）をアッセイすることで、マウス間での明確な細胞追跡が提供される。モデルは個体を区別する第二の遺伝マーカー（例えば、一方のパートナーに存在し、もう一方には存在しない導入遺伝子）の使用によりさらに最適化され、従って単一の細胞の起源の同定の感度および確度が増大する。
【０１２３】
LacZ導入遺伝子を構成的に発現する、10週齢の雄マウス（マウスA：内皮特異的なβ-ガラクトシダーゼ発現を有する、C57/B16 ROSA 26マウス（Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）、またはtie-2-LacZ（「Sato」）トランスジェニックマウス（Schlager et al.（1995）Development 121（4）:1089-98；Schlager et al.（1997）Proc Natl Acad Sci USA 94（7）:3058-63）のいずれか）を、雌の、齢および株適合マウス（マウスB：C57/B16（LacZ-）マウス（ROSA 26マウスと連結される）、またはC57B16マウス（tie-2-LacZとマウスと連結される）と、それぞれのマウスの前肢および後肢関節の間に連続的な片側性の皮膚切開を行うことで、外科的に連結した。次いで、マウスAとマウスBの下肢関節ならびに皮膚およびそれに付着した皮下組織の吻合を、ナイロン縫合により行い、マウスを回復させた。このモデルを用いた以前の研究で、交差循環が2週間以内に確実に確立することが示された（Eichwald, et al.（1963）J Natl Cancer Inst 30:783-94；Weissman et al.（1984）Transplantation 37:3-6）。これらの動物における交差循環を、静脈内注射後にEvansブルー色素のマウスAからマウスBへの流入を追跡することにより確認した。さらに、末梢血白血球（pbl）を、各パートナーからの寄与について、FACS-gal染色（Fiering et al.（1991）Cytometry 12:291-301）またはY染色体FISHにより試験し、細胞および血漿が共に自由に入れ替わることを保証した。Weissmanらは以前、同系の雄と雌の並体結合が検出可能な抗H-Y免疫応答をもたらさないことを示した（Weissman et al.（1984）Transplantation 37:3-6）。
【０１２４】
LacZ-雌が後肢虚血に曝露される一方、LacZ+雄は曝露されなかった。試験マウスを、飲用水にニコチンを添加する（0.1g/L飲用水）ことにより、全身的にニコチン処置した。対照マウスにはそれらの飲用水中にニコチンを与えなかった。5対の並体結合マウスが試験群および対照群にそれぞれ含まれた。
【０１２５】
虚血性および非虚血性後肢を、虚血の誘導から3週間後に雌マウスから除き、それらの雄パートナー由来の細胞の存在について調べた。後肢における細胞の表現型を共焦点顕微鏡観察により組織学的方法を用いて評価した。CD31およびβ-ガラクトシダーゼについての二重染色により、トランスジェニックマウス由来のEPCを同定した。EPC頻度を、各切片で調べられた総血管数によりトランスジェニック内皮細胞を含む血管数を割ったものと定義した。
【０１２６】
結果
Sato/tie-2/LacZトランスジェニック雄と連結された、対照およびニコチン処置された雌パートナーに由来する虚血性後肢の検査から、Satoマウス由来のEPCが雌マウスの血管新生領域を越えて新規の血管に取り込まれていることが示された。これらのEPCは、それらがCD31（内皮マーカー）およびβ-ガラクトシダーゼ（Satoマウスにおいて、内皮細胞特異的tie-2プロモーター制御下にある）について二重染色されることから、容易に同定された。
【０１２７】
結果を図9に図示する。後肢虚血に反応した血管新生の間に内皮前駆細胞（EPC）を取り込んだ血管の割合は、生理食塩水群では低かった（1.6%）。しかしながら、ニコチンによる生得の血管新生反応の刺激により、血管数およびEPCを取り込んだ血管の割合（7.3%；P<0.001）に著しい増大がもたらされた。
【０１２８】
実施例6：ニコチンは長期および短期の造血幹細胞の集団を増大させる
方法
マウス（C57B16j）に溶剤（蒸留水中の0.4%糖）またはニコチン（100μg/ml）を含む溶液を任意にそれらの飲用水中に投与した。6週間後、末梢血、骨髄、および脾臓を回収した。血液、脾臓、および骨髄中の細胞数を得、蛍光細胞分析分離装置（FACS）のため骨髄細胞を単離した。造血幹細胞（HSC）を検出するため、以下の抗原に対する蛍光標識抗体を用いた：系列抗原（CD3、4、5、および8；B220；Gr1、Mac1、およびTer119）、cKit、Sca1、ならびにFlk2。HSCは従来から、Lin-、cKit+、Sca1+、およびFlk2+と定義されていた。全ての細胞をPI（propidium iodide）を用いて染色し、生細胞を死細胞から分離した。
【０１２９】
結果
屠殺時にはマウスは健康に見えた。ニコチンレベルを測定し、軽度から中程度の喫煙者の血漿中に観察される範囲内にあることを見いだした（87ng/ml）。ニコチン処置された動物において、白血球数が上昇していた（図10）。従って、ニコチンの経口投与は末梢白血球数（WBC）を増大させた。
【０１３０】
さらに、図11に示されるように、骨髄および脾臓の細胞充実度が増大した。図11はニコチンの経口投与が骨髄および脾臓の細胞充実度を増大させた（つまり、BMおよび脾臓の総細胞数が増大された）ことを示すデータを示す。図12に示されるように、骨髄細胞集団のFACS分析から、造血幹細胞（kit/sca+細胞）の著しい増大が明らかとなった。これは、図13Aおよび13Bにそれぞれ示されるような、長期HSC（自己再生細胞）の同等な増大、および短期HSC（前駆体へ分化するよう運命付けられた）の増大に起因した。
【０１３１】
データはニコチンが造血幹細胞を、短期および長期の部分集団の両方とも、増大させたことを示す。さらに、このHSCの増大は、白血球数の増大のみならず、骨髄および脾臓の細胞充実度の増大を導いた。これらのデータは、ニコチン受容体アゴニストが幹細胞および前駆細胞集団を増強し、従って不十分な量のこれらの細胞に関連した欠乏症、または幹細胞治療に応答性であり得る傷害もしくは機能不全を処置するのに有用である。これらの欠乏症は、好中球減少症のような血液疾患；または心筋虚血および心不全において観察されるような不十分な血液供給を含む、さまざまな状態を含む。
【０１３２】
本発明はその特定の態様に関して記載されたが、当業者は、本発明の真の意図または範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を加えることができ、同等物が置換し得ることを理解する。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、過程、過程段階または段階群を、本発明の目的、意図および範囲に適応させるために、多数の変更が加えられ得る。そのような変更は全て、本明細書に添付の特許請求の範囲の範囲内にあると意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ニコチン受容体アゴニストのニコチン、エピバチジン、およびABT-154、ならびにニコチン受容体アンタゴニストのヘキサメトニウムおよびメカミラミンの化学構造を提供する。
【図２】動物モデルにおける経口ニコチンの血管結合組織成長に対する作用を示すグラフである。
【図３】ディスク血管新生系を用いた、動物モデルにおける局所投与されたニコチンの血管結合組織成長に対する作用を示すグラフである。
【図４】血管新生因子Del-1およびbFGFと、局所または全身投与されたニコチンの相対血管新生効力の比較を示すグラフである。
【図５】後肢虚血モデルにおいて、非虚血性肢（対照；「非虚血性」）および虚血性肢（「虚血性」）における相対毛細血管密度を示すグラフである。
【図６】虚血動物モデルにおいて筋肉内投与されたニコチンの毛細血管密度に対する作用を示すグラフである。
【図７】図6の動物の未処置の非虚血性肢における筋肉内投与されたニコチンの毛細血管密度に対する作用を示すグラフである。
【図８】前駆細胞のような循環細胞の移動を追跡するためのアッセイに用いられるマウス並体結合実験モデルの模式図である。
【図９】生理食塩水の対照動物およびニコチン処置された動物について、毛細血管密度（毛細血管/筋細胞）および内皮前駆細胞を取り込んだ新規血管の割合を示すグラフである。
【図１０】末梢白血球数（WBC）に対するニコチン（6週間の経口投与）の作用を示すグラフである。
【図１１】6週間の投与後の骨髄（BM）および脾臓の総細胞集団に対するニコチンの作用を示すグラフである。
【図１２】骨髄中の造血幹細胞（kit/sca+）プールに対するニコチンの作用を示すグラフである。
【図１３】AおよびBはC57B16マウスの骨髄における、長期、自己再生造血幹細胞（LTHSC；図13A）および短期、分化造血幹細胞（STHSC；図13B）に対する、6週間の曝露の作用を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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