(57)【要約】  遺伝子改変細菌を使用したアミノ酸生産用の方法および組成物について開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腸内細菌科の細菌またはコリネ型細菌であって、
（ａ）異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｂ）異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｃ）異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｄ）異種細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｅ）異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｆ）異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｇ）異種細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｈ）異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｉ）異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｊ）異種細菌のｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｋ）異種細菌のＯ−スクシニルホモセリン／アセチルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｌ）異種細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｍ）異種細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｎ）異種細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と
のうちの少なくとも１つを含む細菌。
【請求項２】
前記細菌が大腸菌である請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記細菌がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記配列が、フィードバック阻害が低減されたポリペプチドをコードする、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
前記ポリペプチドが腸内細菌類のポリペプチド、放線菌のポリペプチドまたはその変異体から選択される請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、放射菌類のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを含むコリネ型細菌の生物種のうちの１種のポリペプチドである請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、腸内細菌科のＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉおよび大腸菌の生物種のうちの１種のポリペプチドである請求項５に記載の細菌。
【請求項８】
前記異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体が、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｅ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｆ）Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項１に記載の細菌。
【請求項９】
前記異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体が、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項１に記載の細菌。
【請求項１０】
前記異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体が、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項１に記載の細菌。
【請求項１１】
前記異種細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体が、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項１に記載の細菌。
【請求項１２】
前記細菌が、
（ａ）異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｂ）異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｃ）異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｄ）異種細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｅ）異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｆ）異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｇ）異種細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｈ）異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｉ）異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｊ）異種細菌のｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｋ）異種細菌のＯ−スクシニルホモセリン／アセチルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｌ）異種細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｍ）異種細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｎ）異種細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と
のうちの少なくとも２つを含む請求項１に記載の細菌。
【請求項１３】
前記細菌が、
（ａ）異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｂ）異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｃ）異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｄ）異種細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、
（ｅ）異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｆ）異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｇ）異種細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｈ）異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｉ）異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｊ）異種細菌のｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｋ）異種細菌のＯ−スクシニルホモセリン／アセチルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｌ）異種細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｍ）異種細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、
（ｎ）異種細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と
のうちの少なくとも３つを含む請求項１に記載の細菌。
【請求項１４】
異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子を含む大腸菌またはコリネ型細菌。
【請求項１５】
前記異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体が、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項１４に記載の細菌。
【請求項１６】
異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子を含む大腸菌またはコリネ型細菌。
【請求項１７】
前記異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドが、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項１６に記載の細菌。
【請求項１８】
異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子を含む大腸菌またはコリネ型細菌。
【請求項１９】
前記異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項１８に記載の細菌。
【請求項２０】
異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子を含む大腸菌またはコリネ型細菌。
【請求項２１】
前記異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドが、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項２０に記載の細菌。
【請求項２２】
異種細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子を含む大腸菌またはコリネ型細菌。
【請求項２３】
前記異種細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、
（ａ）マイコバクテリア属の生物種由来の、配列番号７２もしくは配列番号７３と少なくとも８０％同一である細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体とから選択される請求項２２に記載の細菌。
【請求項２４】
異種細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子を含む大腸菌またはコリネ型細菌。
【請求項２５】
前記異種細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、
（ａ）マイコバクテリア属の生物種由来の、配列番号７５もしくは配列番号７６と少なくとも８０％同一である細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と
から選択される請求項２４に記載の細菌。
【請求項２６】
異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子を含む大腸菌またはコリネ型細菌。
【請求項２７】
前記異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、
（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、
（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される請求項２６に記載の細菌。
【請求項２８】
大腸菌またはコリネ型細菌であって、
（ａ）細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｂ）細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｃ）細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｄ）細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と
のうちの少なくとも２つを含む細菌。
【請求項２９】
前記少なくとも２つの遺伝子改変された核酸分子のうち少なくとも１つが、異種ポリペプチドをコードする請求項２８に記載の細菌。
【請求項３０】
前記細菌が（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ａ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、または（ｃ）および（ｄ）を含む、請求項２８に記載の細菌。
【請求項３１】
前記細菌が（ａ）〜（ｅ）のうちの少なくとも３つを含む請求項３０に記載の細菌。
【請求項３２】
前記細菌は、
（ａ）ホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドと、
（ｂ）ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドと、
（ｃ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ・ポリペプチドと
のうち１種または複数のポリペプチドの活性が対照と比較して低減している、請求項２８に記載の細菌。
【請求項３３】
前記細菌が、内在性ｈｏｍ遺伝子または内在性ｔｈｒＢ遺伝子に突然変異を有する請求
項３２に記載の細菌。
【請求項３４】
前記細菌が、内在性ｈｏｍ遺伝子および内在性ｔｈｒＢ遺伝子における突然変異を有する請求項３２に記載の細菌。
【請求項３５】
前記細菌が、内在性ｐｃｋ遺伝子に突然変異を有する請求項３２に記載の細菌。
【請求項３６】
大腸菌またはコリネ型細菌であって、
（ａ）細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｂ）細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｃ）細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｄ）細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｅ）細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｆ）細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｇ）細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｈ）細菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｉ）細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｊ）細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｋ）細菌のセリン・ヒドロキシルメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｌ）細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と
のうちの少なくとも２つを含む細菌。
【請求項３７】
前記少なくとも２つの遺伝子改変された核酸分子のうち少なくとも１つが、異種ポリペプチドをコードする請求項３６に記載の細菌。
【請求項３８】
前記細菌が、（ａ）と、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項３９】
前記細菌が、（ｂ）と、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４０】
前記細菌が、（ｃ）と、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４１】
前記細菌が、（ｄ）と、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）お
よび（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４２】
前記細菌が、（ｅ）と、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４３】
前記細菌が、（ｆ）と、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４４】
前記細菌が、（ｇ）と、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４５】
前記細菌が、（ｈ）と、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４６】
前記細菌が、（ｉ）と、（ｊ）（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４７】
前記細菌が、（ｊ）と、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４８】
前記細菌が（ｋ）および（ｌ）を含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項４９】
前記細菌が（ａ）〜（ｌ）のうちの少なくとも３つを含む請求項３６に記載の細菌。
【請求項５０】
前記細菌は、
（ａ）ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドと、
（ｂ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ・ポリペプチドと、
（ｃ）ホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドと、
（ｄ）ｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドと
のうちの１つまたは複数のポリペプチドの活性が対照と比較して低減されている請求項３６に記載の細菌。
【請求項５１】
前記細菌が、内在性ｈｏｍ遺伝子、内在性ｔｈｒＢ遺伝子、内在性ｐｃｋ遺伝子または内在性ｍｃｂＲ遺伝子に突然変異を有する請求項５０に記載の細菌。
【請求項５２】
前記細菌が、内在性ｈｏｍ遺伝子および内在性ｔｈｒＢ遺伝子に突然変異を有する請求項５０に記載の細菌。
【請求項５３】
前記細菌が、内在性ｈｏｍ遺伝子、内在性ｔｈｒＢ遺伝子、内在性ｐｃｋ遺伝子または内在性ｍｃｂＲ遺伝子のうちの２つ以上に突然変異を有する請求項５０に記載の細菌。
【請求項５４】
大腸菌またはコリネ型細菌であって、
（ａ）細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｂ）細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｃ）細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、
（ｄ）細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と
のうちの少なくとも２つを含む細菌。
【請求項５５】
前記少なくとも２つのポリペプチドのうちの少なくとも１つは、異種ポリペプチドをコードする請求項５４に記載の細菌。
【請求項５６】
前記細菌が、（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ａ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、または（ｃ）および（ｄ）を含む請求項５４に記載の細菌。
【請求項５７】
前記細菌が（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも３つを含む請求項５４に記載の細菌。
【請求項５８】
前記細菌は、
（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ・ポリペプチドと、
（ｂ）ｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドと
のうちの１つまたは複数のポリペプチドの活性が対照と比較して低減されている請求項５４に記載の細菌。
【請求項５９】
前記細菌が内在性ｐｃｋ遺伝子または内在性ｍｃｂＲ遺伝子に突然変異を有する請求項５８に記載の細菌。
【請求項６０】
前記細菌が内在性ｐｃｋ遺伝子および内在性ｍｃｂＲ遺伝子に突然変異を有する請求項５８に記載の細菌。
【請求項６１】
アミノ酸または関連代謝産物を産生する方法であって、
アミノ酸または代謝産物が産生される条件下で請求項１の細菌を培養する工程と、該培養物からアミノ酸または関連代謝産物を含んでなる組成物を回収する工程とからなる方法。
【請求項６２】
前記培養物の少なくとも一部を分画し、前記アミノ酸または代謝産物が豊富な画分を得る工程からさらになる請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
Ｌ−リジンまたは関連代謝産物を産生する方法であって、
Ｌ−リジンが産生される条件下で請求項１または請求項２８の細菌を培養する工程と、培養物からＬ−リジンまたは関連代謝産物を含んでなる組成物を回収する工程とからなる方法。
【請求項６４】
前記培養物の少なくとも一部を分画し、Ｌ−リジンに富む画分を得る工程からさらになる請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンを産生する方法であって、
メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンが産生される条件下で請求項３６の細菌を培養する工程と、培養物からメチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンを含んでなる組成物を回収する工程とからなる方法。
【請求項６６】
前記培養物の少なくとも一部を分画し、メチオニンまたはＳ−アデノシルメチオニンが豊富な画分を得る工程からさらになる請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
イソロイシンまたはスレオニンを産生する方法であって、
イソロイシンまたはスレオニンが産生される条件下で請求項５４の細菌を培養する工程と、培養物からイソロイシンまたはスレオニンを含んでなる組成物を回収する工程とから
なる方法。
【請求項６８】
前記培養物の少なくとも一部を分画し、イソロイシンまたはスレオニンが豊富な画分を得る工程からさらになる請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
変異体細菌タンパク質をコードする単離核酸であって、該細菌タンパク質が、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸または関連代謝産物からのアミノ酸産生を制御し、かつ前記変異体タンパク質が、野生型の該タンパク質と比較して高い活性を有することを特徴とする核酸。
【請求項７０】
前記細菌タンパク質が、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸または関連代謝産物からのアミノ酸産生を制御し、かつ前記変異体タンパク質は、野生型の該タンパク質と比較してＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されている請求項６９に記載の核酸。
【請求項７１】
細菌タンパク質の変異体をコードする単離核酸であって、該細菌タンパク質が、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなり、
前記細菌タンパク質変異体が、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項７２】
Ｓ−アデノシルメチオニンによる前記細菌タンパク質変異体のフィードバック阻害が、前記細菌タンパク質と比較して低減されている請求項７１に記載の核酸。
【請求項７３】
前記アミノ酸変異がアラニンへの変異である請求項７１に記載の核酸。
【請求項７４】
請求項６９に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項７５】
請求項７１に記載の核酸によってコードされるポリペプチド。
【請求項７６】
請求項６９に記載の核酸を含む細菌。
【請求項７７】
請求項７１に記載の核酸を含む細菌。
【請求項７８】
アミノ酸または関連代謝産物を産生する方法であって、
請求項６９に記載の核酸が発現し、アミノ酸が産生されうる条件下で、該核酸を含む遺伝子改変細菌を培養する工程と、該培養物からアミノ酸または関連代謝産物を含んでなる組成物を回収する工程とからなる方法。
【請求項７９】
アミノ酸または関連代謝産物を産生する方法であって、
請求項７１に記載の核酸が発現し、アミノ酸が産生されうる条件下で、該核酸を含む遺伝子改変細菌を培養する工程と、該培養物からアミノ酸または関連代謝産物を含んでなる組成物を回収する工程とからなる方法。
【請求項８０】
細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする単離核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの変異体であり、
該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８１】
細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする単離核酸であって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼの変異体であり、
該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８２】
細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする単離核酸であって、該変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物が、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のア
ミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるｍｃｂＲ遺伝子産物の変異体であり、
該変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物が、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８３】
細菌の変異体アスパルトキナーゼをコードする単離核酸であって、該変異体アスパルトキナーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるアスパルトキナーゼの変異体であり、
該変異体アスパルトキナーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８４】
細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼをコードする単離核酸であって、該変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼの変異体であり、
該変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８５】
細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼをコードする単離核酸であって、該変異体シスタチオニンβ−リアーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ
−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるシスタチオニンβ−リアーゼの変異体であり、
該変異体シスタチオニンβ−リアーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８６】
細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼをコードする単離核酸であって、該変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１５〜Ｘ１６は、それぞれ独立に、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなる５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼの変異体であり、
該変異体ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４またはＺ１６のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８７】
細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼをコードする単離核酸であって、該変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼの変異体であり、
該変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸。
【請求項８８】
細菌の野生型ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼと比較してフィードバック阻害が低減された変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸と、
細菌の野生型Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼと比較してフィードバック阻害が低減された変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸と、
細菌の野生型ｍｃｂＲ遺伝子産物と比較してフィードバック阻害が低減された変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする核酸と、
細菌の野生型アスパルトキナーゼと比較してフィードバック阻害が低減された変異体アスパルトキナーゼをコードする核酸と、
細菌の野生型Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼと比較してフィードバック阻害が低減された変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼをコードする核酸と、
細菌の野生型シスタチオニンβ−リアーゼと比較してフィードバック阻害が低減された変異体シスタチオニンβ−リアーゼをコードする核酸と、
細菌の野生型５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼと比較してフィードバック阻害が低減された変異体ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼをコードする核酸と、
細菌の野生型Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼと比較してフィードバック阻害が低減された変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ変異体をコードする核酸とのうち少なくとも２つ以上を含む細菌。
【請求項８９】
（ａ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの変異体であり、
該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸と、
（ｂ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸であって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、
Ｇ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）
（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０はそれぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔはそれぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）のアミノ酸配列からなるＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼの変異体であり、
該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸と、
（ｃ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸で
あって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、
Ｌ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ４−Ｇ５−Ｘ６−Ｆ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号＿）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ８はバリン、ロイシン、イソロイシンおよびアスパラギン酸から選択され、Ｘ１１はバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択される）のアミノ酸配列からなるＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼの変異体であり、
該細菌タンパク質の変異体が、配列番号＿のＬ１、Ｇ４、Ｘ８、Ｘ１１のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸と
のうちの２つ以上を含む細菌。
【請求項９０】
（ａ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のグリシン２３１、リジン２３３、フェニルアラニン２５１およびバリン２５３の残基のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼであることを特徴とする核酸と、
（ｂ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のグリシン８１、アスパラギン酸２８７、フェニルアラニン２６９の残基のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を有するＴ．ｆｕｓｃａのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼであることを特徴とする核酸と、
（ｃ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のグルタミン酸２５２にアミノ酸変異を有する大腸菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼであることを特徴とする核酸と、
（ｄ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のＭ．ｌｅｐｒａｅのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼのグリシン７３、アスパラギン酸２７８およびチロシン２６０の残基のうち１つまたは複数に対応する残基にアミノ酸変異を有する放線菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼであることを特徴とする核酸と、
（ｅ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼが、配列番号＿のグリシン７３、チロシン２６０およびアスパラギン酸２７８の残基のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を有するヒト結核菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼであることを特徴とする核酸と、
（ｆ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸であって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、配列番号＿のグリシン２２７、ロイシン２２９、アスパラギン酸２３１、グリシン２３２、グリシン２３３、フェニルアラニン２３５、アスパラギン酸２３６、バリン２３９、フェニルアラニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３８３、グリシン３４６およびリジン３４８の残基のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を有するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼであることを特徴とする核酸と、
（ｇ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸であって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、配列番号＿のグリシン２４０、アスパラギン酸２４４、フェニルアラニン３７９およびアスパラギン酸３９４の残基のうち１つまたは複数にアミノ酸変異を有するＴ．ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼであることを特徴とする核酸と
のうちの２つ以上を含む細菌。
【請求項９１】
エピソーム性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼまたはその変異体と、エピ
ソーム性のＯ−アセチルトランスフェラーゼ・スルフヒドリラーゼまたはその変異体とをコードする核酸を含む細菌。
【請求項９２】
前記エピソーム性ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼおよび前記エピソーム性Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼが、前記細菌とは異なる種に由来する請求項９１に記載の細菌。
【請求項９３】
アスパラギン酸由来のアミノ酸を含む動物飼料添加剤の調製方法であって、
（ｄ）アスパラギン酸由来アミノ酸が産生されうる条件下で請求項１、２８、３６および５４のいずれか一項に記載の細菌を培養する工程と、
（ｅ）該細菌の培養により生じたアスパラギン酸由来のアミノ酸の少なくとも一部を含んでなる組成物を回収する工程と、
（ｆ）回収された組成物を濃縮してアスパラギン酸由来のアミノ酸を富化する工程と、
（ｇ）任意選択で、１種または複数の物質を加えて、所望の動物飼料添加剤を得る工程と
からなる方法。
【請求項９４】
前記細菌が大腸菌またはコリネ型細菌である請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記細菌がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記アスパラギン酸由来のアミノ酸が、リジン、メチオニン、スレオニンまたはイソロイシンのうちの１つまたは複数である請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学および分子生物学に関し、より具体的にはアミノ酸生産のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００３年５月３０日に出願された米国特許出願第６０／４７５，０００号および２００４年３月１０日に出願された米国特許出願第６０／５５１，８６０号の優先権の利益を請求する。これら出願の全内容は、本願明細書に援用する。
【０００３】
［背景］
細菌の工業的発酵は、アミノ酸、ヌクレオチド、ビタミンおよび抗生物質などの商業的に有用な代謝産物の生産に使用される。これらの発酵過程に使用される多くの生産用細菌株（産生菌株）は、ランダムな突然変異誘発および突然変異体の選択によって作製されてきた（非特許文献１）。突然変異を誘発された産生菌株およびこれら菌株の誘導体に二次突然変異が蓄積することにより、増殖特性およびストレス寛容性が変化して代謝産物の産生効率が減少する可能性がある。産生菌株および関連細菌に関するゲノム情報が利用可能であれば、クローニングした核酸を、操作していない未処理の宿主株に導入して新しい産生菌株を構築することにより、有害な突然変異が存在しない状態でアミノ酸を産生させることを可能にする機会が提供される（非特許文献２）。同様に、ゲノム情報により、現存する産生菌株の限界を特定し、克服する機会が提供される。
【非特許文献１】デマイン、エイ  エル（Ｄｅｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１８巻：２６〜３１ページ，２０００年
【非特許文献２】オオニシ、ジェイ．ら（Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第５８巻：２１７〜２２３ページ，２００２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、アミノ酸生産用の方法および組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、細菌におけるアミノ酸および関連代謝産物の生産のための組成物および方法に関する。様々な実施形態において、本発明は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物の産生を増大させるために作出された細菌株を特徴とする。この細菌株は、ポリペプチド（例えば、宿主細胞に対して異種または同種のポリペプチド）をコードする１つまたは複数の核酸分子（例えば、組換え核酸分子）を保有するように創られてもよいし、かつ／または該細菌株は（例えば、内在の核酸配列の突然変異によって）ポリペプチドの発現および活性のうち少なくともいずれかが増大もしくは低下するように創られてもよい。当業者に公知の様々な方法によって発現させることが可能なこれらのポリペプチドは、フィードバック阻害が低減された変異体ペプチドなどの変異体ペプチドを含む。これらの変異体ポリペプチドは、野生型のタンパク質と比較して、Ｓ−アデノシルメチオニン、リジン、スレオニンまたはメチオニンなどのアミノ酸生合成経路の産物や中間体によるフィードバック阻害が低減されたものでよい。また、該核酸および該ポリペプチドを含んでなる細菌細胞だけでなく、該核酸によってコードされる変異体ポリペプチドも特徴である。核酸の組合せ、および核酸の組合せを含む細胞も本明細書中に提示される。また、本発明は、コリネ型細菌および腸内細菌科（例えば、大腸菌）の菌株（これらに限定は
されない）など、改良された産生菌株に関する。
【０００６】
アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸由来のアミノ酸または関連代謝産物の産生を制御する細菌ポリペプチドには、例えば、アミノ酸生合成経路の中間体が他の中間体および／または最終産物へ変換されるのを触媒する酵素など、メチオニン、スレオニン、イソロイシン、アスパラギン酸、リジン、システインおよび硫黄の代謝に関わるポリペプチド、ならびにそのような酵素の発現および／または機能を直接制御するポリペプチドが挙げられる。下記に列挙するのは、アミノ酸合成に関わるポリペプチドのリストのほんの一部である。ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ、メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ、シスタチオニンβ−リアーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ／Ｏ−アセチルホモセリン（チオ）−リアーゼ、ＭｃｂＲ遺伝子産物、ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ、アスパルトキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ、ホモセリン・デヒドロゲナーゼ、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、Ｎ−スクシニルＬＬ−ジアミノピメレート・アミノトランスフェラーゼ、テトラヒドロジピコリネートＮ−スクシニルトランスフェラーゼ、Ｎ−スクシニルＬＬ−ジアミノピメレート・デサクシニラーゼ、ジアミノピメレート・エピメラーゼ、ジアミノピメレート・デカルボキシラーゼ、ジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸脱水素酵素、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ、セリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸塩還元酵素、セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼおよびホモセリン・キナーゼ。
【０００７】
宿主の菌種以外の任意の細菌の遺伝子によって異種タンパク質がコードされてもよい。異種遺伝子は、下記の細菌リスト（これに限定はされない）由来の遺伝子でもよい。スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、アミコラトプシス・メディテラネイ（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ）、エルウィニア・クリサンテミ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、シュワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、バチルス・スフェリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、ペクトバクテリウム・クリサンテミ（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）。もちろん、腸内細菌科由来の宿主株にとって異種の遺伝子には、コリネ型細菌由来の遺伝子も含まれる。同様に、コリネ型細菌の宿主株にとって異種の遺伝子には、腸内細菌科の細菌由来の遺伝子も含まれる。特定の実施形態において、宿主株は大腸菌で、異種遺伝子はコリネ型細菌以外の生物種の遺伝子である。特定の実施形態において、宿主株はコリネ型細菌で、異種遺伝子は大腸菌以外の生物種の遺伝子である。特定の実施形態において、宿主株は大腸菌で、異種遺伝子はコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）以外の生物種の遺伝子である。特定の実施形態において、宿主株はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍで、異種遺伝子は大腸菌以外の生物種の遺伝子である。
【０００８】
様々な実施形態において、ポリペプチドは放線菌目の生物から得られる遺伝子によってコードされる。様々な実施形態において、異種の核酸分子は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉまたはコリネ型細菌から得られる。様々な実施形態において、異種タンパク質は、腸内
細菌科の生物から得られる遺伝子によってコードされる。様々な実施形態において、異種の核酸分子は、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉまたは大腸菌から得られる。
【０００９】
様々な実施形態において、宿主細菌（例えば、コリネ型細菌または腸内細菌科の細菌）の、該宿主細菌由来（例えば、コリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌由来）の遺伝子によってコードされるポリペプチドの濃度も上昇している。宿主細菌由来の遺伝子によってコードされるポリペプチドの濃度の上昇は、次のうち１つ、すなわち、天然のプロモーターの下流に宿主細菌由来の遺伝子のコピーが付加的に導入されること；例えば天然のプロモーターよりもアミノ酸産生に適したプロモーターなど、宿主由来または異種生物由来のプロモーターの制御下に宿主細菌由来の遺伝子のコピーが付加的に導入されること；宿主細菌由来の遺伝子に対する天然のプロモーターを、アミノ酸産生に一層適した宿主由来または異種生物由来のプロモーターで置換すること、のうちの１つによって為され得る。タンパク質の濃度を上昇させるために使用されるベクターを、宿主ゲノムに組み込んでもよいし、エピソーム・プラスミドとして存在させてもよい。
【００１０】
様々な実施形態において、宿主細菌のポリペプチド（例えば、内在性ポリペプチドなどの、アミノ酸合成に関わるポリペプチド）の活性が低下している（例えば、対照と比べて低下している）。アミノ酸合成に関わる特定のポリペプチドの活性を低下させることにより、特定のアミノ酸および関連代謝産物の産生を促進することが可能である。１実施形態では、細菌中でジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドの発現が欠けている（例えば、細菌の内在性ｄａｐＡ遺伝子が変異または欠失している）。様々な実施形態において、ｍｃｂＲ遺伝子産物、ホモセリン・デヒドロゲナーゼ、ホモセリン・キナーゼ、メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼのうちの１種または複数のポリペプチドの発現が欠けている。
【００１１】
様々な実施形態において、核酸分子は、例えば大腸菌由来のｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｐｈｏＡ、ｔａｃもしくはλＰＬ／λＰＲプロモーター（またはその誘導体）、またはコリネ型細菌由来のｐｈｏＡ、ｇｐｄ、ｒｐｌＭもしくはｒｐｓＪプロモーターなどのプロモーターを含んでなる。
【００１２】
１態様において、本発明は、（ａ）異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｂ）異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｃ）異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｄ）異種細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｅ）異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｆ）異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｇ）異種細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｈ）異種細菌のＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｉ）異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｊ）異種細菌のｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｋ）異種細菌のＯ−スクシニルホモセリン／アセチルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｌ）異種細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｍ）異種細菌の５−
メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子と、（ｎ）異種細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる核酸分子とのうちの少なくとも１つ（２、３または４つ）を含む宿主細菌（例えば、コリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌）を特徴とする。
【００１３】
様々な実施形態において、核酸分子は単離核酸分子である（例えば、核酸分子は、この核酸分子が由来する生物体内において自然状態では隣接するヌクレオチド配列とは離れている（例えば、核酸分子は、組換え核酸分子である））。
【００１４】
様々な実施形態において、細菌は、２種以上の異なる異種細菌ポリペプチドであって、それぞれ同じタイプのポリペプチドをコードすることを特徴とする異種ポリペプチドをコードする配列からなる核酸分子を含む（例えば、細菌は、第１の生物種由来のアスパルトキナーゼをコードする配列と、第２の生物種由来のアスパルトキナーゼをコードする配列とからなる核酸分子を含む）。
【００１５】
様々な実施形態において、ポリペプチドは腸内細菌科のポリペプチド、放線菌類のポリペプチドまたはそれらの変異体から選択される。様々な実施形態において、ポリペプチドは、放射菌類であるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、およびコリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなど）のうちの１種のポリペプチドである。様々な実施形態において、ポリペプチドは、腸内細菌科のＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉおよび大腸菌のうちの１種のポリペプチドである。
【００１６】
様々な実施形態において、ポリペプチドは、（例えば、野生型のポリペプチドと比較して）フィードバック阻害が低減された変異体ポリペプチドである。様々な実施形態において、細菌はアミノ酸産生に関わる異種細菌の遺伝子産物をさらに含む。様々な実施形態において、細菌は、本明細書に記載の異種細菌ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドをコードする核酸分子）をさらに含む。様々な実施形態において、細菌は、本明細書に記載の細菌ポリペプチドなどの同種細菌のポリペプチド（例えば、宿主種が本来有している細菌ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子をさらに含む。同種細菌のポリペプチドは、高レベルで発現されてもよいし、条件付で発現されてもよいし、その両方でもよい。例えば、同種細菌のポリペプチドをコードする核酸が、野生型よりも高いレベルでポリペプチドを発現させうるプロモーターと機能可能なように結合されてもよいし、該核酸の複数のコピーが細菌内に存在してもよいし、その両方でもよい。
【００１７】
様々な実施形態において、異種細菌のアスパルトキナーゼまたはその機能的変異体は、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｅ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｆ）Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体とから選択される。特定の実施形態において、異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、大腸菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変
異体である。特定の実施形態において、異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００１８】
様々な実施形態において、異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｂ）Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｄ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体とから選択される。特定の実施形態において、異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、大腸菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。様々な実施形態において、異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体とから選択される。特定の実施形態において、異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、大腸菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。
【００１９】
様々な実施形態において、異種細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種細菌のピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのピルビン酸カルボキシラーゼまたはその機能的変異体である。
【００２０】
様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌から選択される。コリネ型細菌には、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、コリネバクテリウム・アセトグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・メラセコーラ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａ）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネ
ス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ブレビバクテリウム・ラクティス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）およびブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号１またはその変異配列からなり、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２またはその変異配列からなり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号３またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号４またはその変異配列からなり、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号５またはその変異配列からなり、およびＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号６またはその変異配列からなり、大腸菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２０３またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２０２またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２０４またはその変異配列からなり、大腸菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２０５またはその変異配列からなり、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、配列番号８（らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ）と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列（例えば、配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）からなり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、配列番号９またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７またはその変異配列からなり、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、配列番号１０またはその変異配列からなり、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｍｅｇｍａｔｉｓのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、配列番号１３またはその変異配列からなり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、配列番号１２またはその変異配列からなり、ならびにＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２０８またはその変異配列からなる。
【００２２】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、２７９位のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異、３０１位のセリンの第６群アミノ酸残基への変異、３１１位のスレオニンの第２群アミノ酸残基への変異、および３４５位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含み、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパルトキナーゼは、２７９位のアラニンのプロリンへの変異、３０１位のセリンのチロシンへの変異、３１１位のスレオニンのイソロイシンへの変異および３４５位のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２３】
様々な実施形態において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、２７９位のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異、３０１位のセリンの第６群アミノ酸残基への変異、３１１位のスレオニンの第２群ア
ミノ酸残基への変異、および３４５位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２４】
様々な実施形態において、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、２７９位のアラニンのプロリンへの変異、３０１位のセリンのチロシンへの変異、３１１位のスレオニンのイソロイシンへの変異および３４５位のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２５】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、２８２位のアラニンの第１群アミノ酸残基への変異、３０４位のセリンの第６群アミノ酸残基への変異、３１４位のセリンの第２群アミノ酸残基への変異、および３４８位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２６】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、２８２位のアラニンのプロリンへの変異、３０４位のセリンのチロシンへの変異、３１４位のセリンのイソロイシンへの変異および３４８位のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２７】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、３２８位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、３３０位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、３５０位のセリンの第２群アミノ酸残基への変異、および３５２位のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２８】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、３２８位のグリシンのアスパラギン酸への変異、３３０位のロイシンのフェニルアラニンへの変異、３５０位のセリンのイソロイシンへの変異および３５２位のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００２９】
様々な実施形態において、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、３２３位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、３２５位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、３４５位のセリンの第２群アミノ酸残基への変異、および３４７位のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３０】
様々な実施形態において、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、３２３位のグリシンのアスパラギン酸への変異、３２５位のロイシンのフェニルアラニンへの変異、３４５位のセリンのイソロイシンへの変異および３４７位のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３１】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、２７９位のアラニンのアラニン以外の第１群アミノ酸への変異、３０１位のセリンの第６群アミノ酸残基への変異、３１１位のスレオニンの第２群アミノ酸残基への変異および３４５位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３２】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、２７９位のアラニンのプロリンへの変異、３０１位のセリンのチロシンへの変異、３１１位のスレオニンのイソロイシンへの変異および３４５位のグリシンのアスパラギン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３３】
様々な実施形態において、大腸菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、３２３位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、３２５位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、３４５位のセリンの第２群アミノ酸残基への変異および３４７位のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３４】
様々な実施形態において、大腸菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、３２３位のグリシンのアスパラギン酸への変異、３２５位のロイシンのフェニルアラニンへの変異、３４５位のセリンのイソロイシンへの変異および３４７位のバリンのメチオニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００３５】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、４５８位のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、４５８位のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００３６】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、４４８位のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、４４８位のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００３７】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、４４９位のプロリンの第４群アミノ酸残基への変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその変異体は、４４９位のプロリンのセリンへの変異を含む。
【００３８】
また、本発明は異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼまたはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００３９】
様々な実施形態において、異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、およびＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、フィードバック阻害が低減された異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、大腸菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機
能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００４０】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、配列番号１５または配列番号１６と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号１５または配列番号１６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、配列番号１７またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、配列番号１４またはその変異配列からなり、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、配列番号１８またはその変異配列からなる。
【００４１】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、８０位のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異、８８位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、および１１８位のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４２】
様々な実施形態において、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、８０位のアスパラギンのイソロイシンへの変異、８８位のロイシンのフェニルアラニンへの変異および１１８位のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４３】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、８９位のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異、９７位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、１２７位のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４４】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、８９位のアスパラギンのイソロイシンへの変異、９７位のロイシンのフェニルアラニンへの変異および１２７位のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４５】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、配列番号１６の９０位のチロシンに対応するアミノ酸残基の、第２群アミノ酸残基への変異、配列番号１６の９８位のロイシンに対応するアミノ酸残基の、第６群アミノ酸残基への変異、および配列番号１６の１２８位のヒスチジンに対応するアミノ酸残基の、第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４６】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、配列番号１６の９０位のチロシンに対応するアミノ酸残基の、イソロイシンへの変異、配列番号１６の９８位のロイシンに対応するアミノ酸残基の、フェニルアラニンへの変異、および配列番号１６の１２８位のヒスチジンに対応するアミノ酸残基の、ヒスチジンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４７】
様々な実施形態において、大腸菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、８０位のアスパラギンの第２群アミノ酸残基への変異、８１位のアラニンの第２群アミノ酸残基への変異、８４位のグルタミン酸の第５群アミノ酸残基への変異、８８位のロイ
シンの第６群アミノ酸残基への変異、および１１８位のヒスチジンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４８】
様々な実施形態において、大腸菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドは、８０位のアスパラギンのイソロイシンへの変異、８１位のアラニンのバリンへの変異、８４位のグルタミン酸のリジンへの変異、８８位のロイシンのフェニルアラニンへの変異および１１８位のヒスチジンのチロシンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００４９】
また、本発明は異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼまたはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００５０】
様々な実施形態において、異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｄ）Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、コリネ型細菌またはその機能的変異体由来のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドである（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドもしくはその機能的変異体、またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドもしくはその機能的変異体）。特定の実施形態において、異種のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、大腸菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００５１】
様々な実施形態において、異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、フィードバック阻害が低減されたＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたは機能的変異体であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号１９またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２０９またはその変異配列からなり、ならびに大腸菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１０、配列番号２１１またはその変異配列のいずれかからなる。
【００５２】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、２３位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、５９位のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、１０４位のバリンのバリン以外の第２群アミノ酸残基への変異、３７８位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、およびホモセリン・デヒドロゲナーゼタンパク質を４２８位リジンアミノ酸残基の後で切断する変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。１実施形態では、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、国際公開公報第９３／０９２２５号パンフレットの配列番号３に記載されるｈｏｍｄｒ配列によってコードされる。
【００５３】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、２３位のロイシンのフェニルアラニンへの変異、５９位のバリンのアラニンへの変異、１０４位のバリンのイソロイシンへの変異および３７８位のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００５４】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、１０位のバリンの第６群アミノ酸残基への変異、４６位のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、および３６４位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００５５】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、１０位のバリンのフェニルアラニンへの変異、４６位のバリンのアラニンへの変異および３７８位のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００５６】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、１０位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、４６位のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、３６２位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、およびホモセリン・デヒドロゲナーゼタンパク質を４１２位アルギニンアミノ酸残基の後で切断する変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、１０位のロイシンのフェニルアラニンへの変異、４６位のバリンのアラニンへの変異および３６２位のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００５７】
様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、１９２位のロイシンの第６群アミノ酸残基への変異、２２８位のバリンの第１群アミノ酸残基への変異、５４５位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、５９５位のアルギニンアミノ酸残基の後方で切断される。
【００５８】
様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、１９２位のロイシンのフェニルアラニンへの変異、２２８位のバリンのアラニンへの変異および５４５位のグリシンのグルタミン酸への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００５９】
様々な実施形態において、大腸菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１１において、３３０位のグリシンの第３群アミノ酸残基への変異、および３５２位のセリンの第６群アミノ酸残基への変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００６０】
様々な実施形態において、大腸菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、
配列番号２１１において、３３０位のグリシンのアスパラギン酸への変異、および３５２位のセリンのフェニルアラニンへの変異から選択される少なくとも１つのアミノ酸変異を含む。
【００６１】
また、本発明は異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００６２】
様々な実施形態において、異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、およびＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍまたはその機能的変異体由来のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドである。特定の実施形態において、異種のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号２２または配列番号２３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体であり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２４またはその変異配列からなり、異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体であり、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１２またはその変異配列からなり、あるいは異種細菌のＯホモセリンアセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、大腸菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体であり、大腸菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１３またはその変異配列からなる。
【００６３】
また、本発明は異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼまたはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００６４】
様々な実施形態において、異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、（ａ）Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｂ）Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体と、（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔ
ａｍｉｃｕｍ由来のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００６５】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２６と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２５またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの異種細菌Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１４またはその変異配列からなる。
【００６６】
また、本発明は異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼまたはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００６７】
様々な実施形態において、異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、およびＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、大腸菌由来のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体である。特定の実施形態において、異種のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００６８】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２７または配列番号２８と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号２７または配列番号２８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号３０またはその変異配列からなり、異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼまたはその機能的変異体であり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２９またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの異種細菌メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼは、配列番号２１５またはその変異配列からなり、大腸菌の異種細菌メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１６またはその変異配列からなる。
【００６９】
様々な実施形態において、細菌は、異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリ
ペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子をさらに含む。
様々な実施形態において、異種細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００７０】
様々な実施形態において、細菌は（ａ）異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、（ｂ）異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、（ｃ）異種のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸分子またはその機能的変異体とのうちの少なくとも１つをさらに含む。特定の実施形態において、異種ポリペプチドまたはその機能的変異体のうち１つ以上は、フィードバック阻害が低減されている。
【００７１】
様々な実施形態において、異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、およびＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００７２】
様々な実施形態において、異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００７３】
様々な実施形態において、異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−アセチルホモ
セリン・スルフヒドリラーゼまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体から選択される。特定の実施形態において、異種のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体は、フィードバック阻害が低減されている。
【００７４】
様々な実施形態において、細菌は異種細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、あるいはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子をさらに含む。
【００７５】
本発明は、（ａ）異種細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、（ｂ）異種細菌のＯ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子と、（ｃ）異種細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする核酸分子とのうちの少なくとも２つを含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。特定の実施形態において、異種細菌ポリペプチドまたはその機能的変異体のうち１つ以上は、フィードバック阻害が低減されている。
【００７６】
別の態様において、本発明は（ａ）細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｂ）細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｃ）細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｄ）細菌のジヒドロジピコリン酸シンターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子のうちの少なくとも１つまたは２つを含む大腸菌またはコリネ型細菌を特徴とする。様々な実施形態において、遺伝子改変された核酸分子は、ゲノムの核酸分子である（例えば、遺伝子のコード領域または調節領域などに突然変異が導入されている、ゲノムの核酸分子）。様々な実施形態において、核酸分子は、組換え核酸分子である。
【００７７】
様々な実施形態において、少なくとも２つの遺伝子改変された核酸分子のうちの少なくとも１つは、異種ポリペプチドをコードする。１実施形態では、細菌は（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ａ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、または（ｃ）および（ｄ）を含む。１実施形態では、細菌は（ａ）〜（ｅ）のうちの少なくとも３つを含む。１実施形態では、細菌は（ａ）ホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドと、（ｂ）ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドと、（ｃ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ・ポリペプチドのうち１種または複数の活性について、対照と比較して低減されている。１実施形態において、細菌は内在性ｈｏｍ遺伝子または内在性ｔｈｒＢ遺伝子の突然変異（例えば、該遺伝子によってコードされるポリペプチドの
活性を低減する突然変異（例えば、触媒領域の突然変異）または該遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現を低減する突然変異（例えば、この突然変異はポリペプチドの発現の早期終止を引き起こす）、あるいは転写物またはタンパク質の安定性もしくは半減期を低減する突然変異））からなる。１実施形態では、細菌は内在性ｈｏｍ遺伝子および内在性ｔｈｒＢ遺伝子に突然変異を有する。１実施形態では、細菌は内在性ｐｃｋ遺伝子に突然変異を有する。
【００７８】
別の態様において、本発明は（ａ）細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｂ）細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｃ）細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｄ）細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｅ）細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｆ）細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｇ）細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｈ）細菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｉ）細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｊ）細菌のメチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｋ）細菌のセリン・ヒドロキシルメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｌ）細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子とのうちの少なくとも１つまたは２つを含む大腸菌またはコリネ型細菌を特徴とする。
【００７９】
様々な実施形態において、少なくとも２つの遺伝子改変された核酸分子のうちの少なくとも１つは、異種ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌は、（ａ）と、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｂ）と、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｃ）と、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｄ）と、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｅ）と、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は（ｆ）と、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｇ）と、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｈ）と、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｉ）と、（ｊ）（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は、（ｊ）と、（ｋ）および（ｌ）のうちの少なくとも１つとを含む。様々な実施形態において、細菌は（ｋ）と（ｌ）とを含む。様々な実施形態において、細菌は（ａ）〜（ｌ）のうちの少なくとも３つを
含む。
【００８０】
一部の実施形態において、細菌は、（ａ）ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドと、（ｂ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ・ポリペプチドと、（ｃ）ホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドと、（ｄ）ｍｃｂＲ遺伝子産物のポリペプチドとのうち１種または複数の活性が、対照と比較して低減されている（例えば、細菌は内在性ｈｏｍ遺伝子、内在性ｔｈｒＢ遺伝子、内在性ｐｃｋ遺伝子もしくは内在性ｍｃｂＲ遺伝子、またはそれらの組合せにおいて突然変異を有する）。
【００８１】
別の態様において、本発明は（ａ）細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｂ）細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｃ）細菌のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子と、（ｄ）細菌のホモセリン・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする配列からなる遺伝子改変された核酸分子とのうちの少なくとも２つを含む大腸菌またはコリネ型細菌を特徴とする。
【００８２】
様々な実施形態において、少なくとも２種のポリペプチドのうちの少なくとも１つは、異種ポリペプチドをコードする。
様々な実施形態において、細菌は（ａ）および（ｂ）、（ａ）および（ｃ）、（ａ）および（ｄ）、（ｂ）および（ｃ）、（ｂ）および（ｄ）、または（ｃ）および（ｄ）を含むか、あるいは（ａ）〜（ｄ）のうちの少なくとも３つを含む。
【００８３】
様々な実施形態において、細菌は（ａ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ・ポリペプチドと、（ｂ）ｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドのうち１つ以上の活性が、対照と比較して低減されている（例えば、細菌は内在性ｐｃｋ遺伝子または内在性ｍｃｂＲ遺伝子に突然変異を有し、例えば、細菌は内在性ｐｃｋ遺伝子および内在性ｍｃｂＲ遺伝子における突然変異を有する）。
【００８４】
また、本発明は、アミノ酸または関連代謝産物を生産する方法であって、アミノ酸または関連代謝産物が産生される条件下で細菌（例えば、本明細書に記載の細菌）を培養する工程と、培養物からアミノ酸または関連代謝産物を含む組成物を回収する工程とからなる方法を特徴とする。この方法は、培養物の少なくとも一部を分画し、アミノ酸または代謝産物に富む画分を得る工程をさらに含むことが可能である。
【００８５】
本発明は、Ｌ−リジンを生産する方法であって、Ｌ−リジンが産生される条件下で、本明細書に記載の細菌を培養する工程と、培養物を回収する工程とからなる方法を特徴とする。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−リジンに富む画分を得るために）分画されてもよい。
【００８６】
別の態様において、本発明はアスパラギン酸由来のアミノ酸を含む動物飼料添加剤の調製法を特徴とし、該方法は、
（ａ）アスパラギン酸由来のアミノ酸が産生される条件下で細菌（例えば、本明細書に記載の細菌）を培養する工程と、
（ｂ）アスパラギン酸由来のアミノ酸の少なくとも一部を含む組成物を回収する工程と、
（ｃ）回収された組成物を濃縮してアスパラギン酸由来のアミノ酸を富化する工程と、
（ｄ）任意選択で、１種または複数の物質を加えて、所望の動物飼料添加剤を得る工程と
のうちの２つ以上からなる。
【００８７】
添加することが可能な物質は、例えば、ゼラチン、セルロース誘導体（例えば、セルロースエーテル）、シリカ、ケイ酸塩、ステアリン酸エステル、砂、糠、穀粉、デンプン、樹脂、アルギン酸塩糖またはその他の物質など、通常の有機または無機の補助剤または担体、ならびに／あるいは通常の増粘剤または結合剤と混合されて安定化されたものが含まれる。
【００８８】
様々な実施形態において、回収される組成物には細菌細胞は含まれない。様々な実施形態において、回収される組成物は、細菌の培養から得られる細菌細胞の１０％、５％、１％、０．５％未満の細菌細胞を含む。様々な実施形態において、組成物は細菌の培養から得られる細菌細胞の少なくとも１％（例えば、少なくとも１％、５％、１０％、２０％、４０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％または最大１００％まで）の細菌細胞を含む。
【００８９】
本発明は、Ｌ−メチオニンを生産する方法であって、Ｌ−メチオニンが産生される条件下で本明細書に記載の細菌を培養する工程と、培養物を回収する工程とからなる方法を特徴とする。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画されてもよい。
【００９０】
本発明は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｓ−ＡＭ）を生産する方法であって、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンが産生される条件下で本明細書に記載の細菌を培養する工程と、培養物を回収する工程とからなる方法を特徴とする。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＳ−ＡＭに富む画分を得るために）分画されてもよい。本発明は、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンを生産する方法であって、Ｌ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンが産生される条件下で、本明細書に記載の細菌を培養する工程と、培養物を回収する工程とからなる方法を特徴とする。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−スレオニンまたはＬ−イソロイシンに富む画分を得るために）分画されてもよい。また、本発明は、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリンおよびその誘導体を生産する方法であって、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリンおよびその誘導体が産生される条件下で、本明細書に記載の細菌を培養する工程と、培養物を回収する工程とからなる方法を特徴とする。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリンおよびその誘導体に富む画分を得るために）分画されてもよい。
【００９１】
本発明は、異種細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００９２】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号５９と少なくとも８０％同一の配列（例えば、配列番号５９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）またはその変異配列からなり、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・
ポリペプチドは、配列番号６０またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号６１またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１７またはその変異配列からなり、大腸菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号２１８またはその変異配列からなる。
【００９３】
本発明は、異種細菌のグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチド（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのグルタミン酸脱水素酵素またはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００９４】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドは、配列番号６２またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドは、配列番号６３またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドは、配列番号６５またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドは、配列番号２１９またはその変異配列からなり、大腸菌のグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドは、配列番号２２０またはその変異配列からなる。
【００９５】
また、本発明は異種細菌のジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓのジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのグルタミン酸脱水素酵素ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００９６】
様々な実施形態において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓのジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号６５またはその変異配列からなる。
また、本発明は、異種細菌の界面活性剤耐性化因子（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｓｃｕｅｒ）ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００９７】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドは、配列番号６８または配列番号６９のいずれかと少なくとも８０％同一の配列（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）またはその変異配列からなり、異種細菌の界面活性剤耐性化因子ポリペプチドは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドまたはその機能的変異体であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドは、配列番号６７またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドは、配列番号６６またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの界面活性剤耐性化因子ポリペプチドは、配列番号２２１またはその変異配列からなる。本発明は、異種細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【００９８】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７２、配列番号７３と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）またはその変異配列からなり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７１またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７０またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７４またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２２２またはその変異配列からなり、大腸菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２２３またはその変異配列からなる。
【００９９】
また、本発明は異種細菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１００】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７５または配列番号７６と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号７５または配列番号７６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７７またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２２４またはその変異配列からなり、大腸菌の５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２２５またはその変異配列からなる。
【０１０１】
本発明は、異種細菌のセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１０２】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号８０または配列番号８１と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号８０または配列番号８１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７８またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号７９またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号８２またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２２６またはその変異配列からなり、大腸菌のセリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２２７またはその変異配列からなる。
【０１０３】
本発明は、異種細菌の５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチド（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌の５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１０４】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドは、配列番号８４またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドは、配列番号８３またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドは、配列番号２２８またはその変異配列からなり、大腸菌の５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ・ポリペプチドは、配列番号２２９またはその変異配列からなる。
【０１０５】
本発明は、異種細菌のセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１０６】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号８５または配列番号８６と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号８５または配列番号８６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号８７またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２３０またはその変異配列からなり、大腸菌のセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２３１またはその変異配列からなる。
【０１０７】
本発明は、異種細菌のＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１０８】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号８８または配列番号８９と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号８８または配列番号８９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号９１またはそ
の変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号９０またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのＤ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ・ポリペプチドは、配列番号９２またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２３２またはその変異配列からなり、大腸菌のセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号２３３またはその変異配列からなる。
【０１０９】
本発明は、異種細菌のリジン輸送体（ｌｙｓｉｎｅ  ｅｘｐｏｒｔｅｒ）ポリペプチド（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリジン輸送体ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのリジン輸送体ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのリジン輸送体ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のリジン輸送体ポリペプチドまたはその機能的変異体、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのリジン輸送体タンパク質またはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１１０】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのリジン輸送体ポリペプチドは、配列番号９３または配列番号９４と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号９３または配列番号９４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのリジン輸送体ポリペプチドは、配列番号９５またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのリジン輸送体ポリペプチドは、配列番号９６またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのリジン輸送体ポリペプチドは、配列番号２３４またはその変異配列からなり、大腸菌のリジン輸送体ポリペプチドは、配列番号２３７またはその変異配列からなる。
【０１１１】
本発明は、細菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ／Ｏ−アセチルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチド（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１１２】
様々な実施形態において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号９７または配列番号９８と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号９７または配列番号９８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）であり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号９９またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−スクシニルホモセリ
ン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号１００またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号１０１またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号２３５またはその変異配列からなり、大腸菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号２３６またはその変異配列からなる。
【０１１３】
本発明は、スレオニン排出因子（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｅｆｆｌｕｘ）ポリペプチド（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのスレオニン排出因子ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのスレオニン排出因子ポリペプチドのホモログまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの推定スレオニン排出因子ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１１４】
様々な実施形態において、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのスレオニン排出因子ポリペプチドは、配列番号１９６またはその変異配列からなり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのスレオニン排出因子ポリペプチドのホモログは、配列番号１９６のホモログまたはその変異配列からなり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの推定スレオニン排出因子ポリペプチドは、配列番号１０２またはその変異配列からなる。
【０１１５】
また、本発明はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの仮想ポリペプチド（配列番号１９８）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの仮想ポリペプチド（配列番号１９８）の細菌ホモログ、（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの仮想ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの仮想ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの仮想ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌の仮想ポリペプチドまたはその機能的変異体、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの仮想ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１１６】
様々な実施形態において、この細菌ホモログは、配列番号１０４または配列番号１０５と少なくとも８０％同一（例えば、配列番号１０４または配列番号１０５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一の配列）のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓの仮想ポリペプチドであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの仮想ポリペプチドは、配列番号１０３またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの仮想ポリペプチドは、配列番号１０６またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの仮想ポリペプチドは、配列番号１０７またはその変異配列からなる。
【０１１７】
また、本発明はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの推定膜ポリペプチド（配列番号２０１）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの推定膜ポリペプチド（配列番号２０１）の細菌ホモログ、（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの推定膜ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの推定膜ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの推定膜ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌の推定膜ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの推定膜ポリペプチドまたはその機能的変異体
、あるいはＰｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの推定膜ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１１８】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの推定膜ポリペプチドは、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの推定膜ポリペプチドは、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０またはその変異配列からなり、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの推定膜ポリペプチドは、配列番号１１５またはその変異配列からなり、Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの推定膜ポリペプチドは、配列番号１１６またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの推定膜ポリペプチドは、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９またはその変異配列からなる。
【０１１９】
また、本発明はＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチド（配列番号１９９）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチド（配列番号１９９）の細菌ホモログ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、大腸菌の薬剤パーミアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体、あるいはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｐｌａｎｔａｒｕｍの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチドまたはその機能的変異体）またはその機能的変異体をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１２０】
様々な実施形態において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチドは配列番号１２０、配列番号１２１またはその変異配列からなり、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチドは配列番号１２２、配列番号１２３またはその変異配列からなり、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍの薬剤パーミアーゼ・ポリペプチドは、配列番号１２４またはその変異配列からなる。
【０１２１】
また本発明は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの仮想膜ポリペプチド（配列番号１９７）、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの仮想膜ポリペプチド（配列番号１９７）の細菌ホモログ、（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの仮想膜ポリペプチドまたはその機能的変異体）をコードする核酸分子を含むコリネ型細菌または大腸菌などの腸内細菌科の細菌を特徴とする。
【０１２２】
様々な実施形態において、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの仮想膜ポリペプチドは、配列番号１２５またはその変異配列からなる。
上記のように、本発明はまた、細菌の変異体タンパク質をコードする核酸を提供する。細菌の変異体ポリペプチドをコードする配列を含む核酸は、該配列が由来する生物において発現させることもできるし、配列が由来する生物以外の生物（例えば、異種の生物）において発現させることもできる。
【０１２３】
１態様において、本発明は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸由来の１種または複数のアミノ酸または関連代謝産物の産生を制御する細菌ポリペプチドの変異体（例えば、野生型の細菌ポリペプチドの変異体）をコードする単離核酸（例えば、核酸発現ベクター）を特徴とする。例えば、該細菌ポリペプチドには、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−
Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）が含まれうる。本発明の細菌ポリペプチド変異体は細菌タンパク質と比較してアミノ酸変異を含み、例えば、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数、あるいは配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２から８、５、３、２または１残基以内のアミノ酸にアミノ酸変異を有する。１実施形態では、細菌ポリペプチド変異体はその他の点では細菌タンパク質とアミノ酸配列について同一であるか、あるいは細菌ポリペプチドに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上同一である（例えば、変異体に含まれる変異は細菌ポリペプチドと比較して５０、４０、２５、１５、１０、７、５、３、２または１未満である）。
【０１２４】
別例として、または加えて、細菌ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＬ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ４−Ｇ５−Ｘ６−Ｆ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ８はバリン、ロイシン、イソロイシンおよびアスパラギン酸から選択され、Ｘ１１はバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択される）を含む。かつ、細菌タンパク質変異体は、例えば、配列番号＿のＬ１、Ｇ４、Ｘ８、Ｘ１１のうち１つまたは複数、あるいはＬ１、Ｇ４、Ｘ８、Ｘ１１から８、５、３、２または１残基以内のアミノ酸にアミノ酸変異を含む。
【０１２５】
様々な実施形態において、Ｓ−アデノシルメチオニンによる細菌ポリペプチド変異体のフィードバック阻害が、例えば、細菌ポリペプチドと比較して（例えば、野生型の細菌タンパク質と比較して）、または基準のタンパク質と比較して低減されている。
【０１２６】
細菌ポリペプチドの変異体におけるアミノ酸変異は、アラニンへの変異（例えば、元の残基がアラニン以外である）または非保存的変異であってもよい。変異は、保存的変異であってもよい。
【０１２７】
また、本発明は、本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とし、例えば、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸由来の１種以上のアミノ酸または関連代謝産物の産生を制御する細菌ポリペプチドの変異体（例えば、野生型細菌ポリペプチドの変異体）であって、該細菌ポリペプチドが配列番号＿または配列番号＿を含み、変異体が該細菌ポリペプチドと比較してアミノ酸変異を含むことを特徴とするポリペプチドなどである。
【０１２８】
また、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸由来の１種以上のアミノ酸または関連代謝産物の産生を制御する細菌ポリペプチドの変異体をコードする核酸を作製する方法も提供される。この方法は、例えば、野生型細菌ポリペプチドのアミノ酸配列におけるモチーフを同定することと、モチーフ内および／またはモチーフ付近（例えば、１０、８、７、５、３、２または１残基以内）で１つ以上のアミノ酸残基（例えば、１、２、３、４または５残基）が変異している変異体をコードする核酸を構築することとを含む。
【０１２９】
様々な実施形態において、細菌ポリペプチドのモチーフは、次のアミノ酸配列、すなわ
ちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）を含み、式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される。様々な実施形態において、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上が変異している。１実施形態では、細菌ポリペプチドの変異体はその他の点では細菌ポリペプチドとアミノ酸配列が同一である。様々な実施形態において、細菌ポリペプチドのモチーフは、次のアミノ酸配列、すなわちＬ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ４−Ｇ５−Ｘ６−Ｆ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号＿）を含み、式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ８はバリン、ロイシン、イソロイシンおよびアスパラギン酸から選択され、Ｘ１１はバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択される。様々な実施形態において、配列番号＿のＬ１、Ｇ４、Ｘ８、Ｘ１１のうち１つ以上が変異している。１実施形態では、細菌ポリペプチド変異体はその他の点では細菌タンパク質とアミノ酸配列が同一である。
【０１３０】
また、本発明は本明細書に記載の核酸を含む細菌を特徴とし、該核酸は、例えば、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸由来の１種以上のアミノ酸または関連代謝産物の産生を制御する細菌ポリペプチドの変異体（例えば、野生型細菌ポリペプチドの変異体）をコードする核酸であって、該細菌ポリペプチドが配列番号＿または配列番号＿を含み、変異体が該細菌ポリペプチドと比較してアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸である。この細菌は、遺伝学的に改変された細菌（遺伝子改変細菌）であってもよく、例えば、核酸を含むように（例えば、エピソーム、または細菌ゲノムの無作為の位置または特定の標的位置のいずれかに核酸が組み込まれる形質転換によって）改変されている細菌、および／または細菌ゲノム内で改変されている（例えば、内在性遺伝子が突然変異誘発によって改変されているか組換えによって置換されている、または内在性遺伝子の上流に異種のプロモーターを含むように改変されている）細菌などであることが可能である。
【０１３１】
また、本発明はアミノ酸または関連代謝産物を生産する方法を特徴とする。この方法は、例えば、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸由来の１種以上のアミノ酸または関連代謝産物の産生を制御する細菌ポリペプチドの変異体（例えば、野生型の細菌ポリペプチドの変異体）をコードする核酸を含む細菌であって、該細菌ポリペプチドが配列番号＿または配列番号＿を含み、変異体が細菌ポリペプチドと比較してアミノ酸変異を含むことを特徴とする細菌（例えば、遺伝学的に改変された細菌）を培養する工程を含むことが可能である。細菌は、核酸が発現し、アミノ酸（または関連代謝産物）が産生される条件下で培養され、アミノ酸（または関連代謝産物）を含む組成物が回収される。この組成物は、例えば、培養上清、加熱またはさもなければ殺菌された細胞、または精製アミノ酸を含みうる。
【０１３２】
１態様において、本発明は細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とする。特定の実施形態において、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、例えば、細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの野生型と比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、核酸は、Ｓ−アデノシルメチオニン
によるフィードバック阻害が低減されたホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、大腸菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６はバリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つまたは複数においてアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１３４】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン２３１、リジン２３３、フェニルアラニン２５１、バリン２５３およびアスパラギン酸２６９の残基のうち１つ以上においてアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１３５】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラー
ゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン８１、アスパラギン酸２８７、フェニルアラニン２６９の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＴ．ｆｕｓｃａのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドである。
【０１３６】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグルタミン酸２５２にアミノ酸変異を含む大腸菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドである。
【０１３７】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿に記載のＭ．ｌｅｐｒａｅのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドのグリシン７３、アスパラギン酸２７８およびチロシン２６０残基のうち１つ以上に対応する残基にアミノ酸変異を含む放線菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの変異体である。
【０１３８】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン７３、チロシン２６０およびアスパラギン酸２７８の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むヒト結核菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドである。
【０１３９】
また、本発明は細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸によってコードされるポリペプチドおよび該核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。本発明の細菌は、細菌の他の変異体タンパク質（例えば、本明細書に記載の細菌の変異体タンパク質などのアミノ酸産生に関わる変異体細菌タンパク質）をコードする核酸をさらに含むことが可能である。
【０１４０】
別の態様において、本発明は、Ｌ−メチオニンまたは関連の中間体、例えばＯ−アセチルホモセリン、シスタチオニン、ホモシステイン、メチオニン、ＳＡＭおよびそれらの誘導体などを産生する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、該核酸が発現し、Ｌ−メチオニン（または関連の中間体）が産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１４１】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とする。特定の実施形態において、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、例えば、細菌の野生型Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドと比較して、フィードバック阻害が低減されている。
【０１４２】
様々な実施形態において、核酸は、Ｓ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されたＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする。
【０１４３】
様々な実施形態において、細菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリンＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリンＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホモセリンＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、大腸菌のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１４４】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。
【０１４５】
様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＬ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ４−Ｇ５−Ｘ６−Ｆ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号＿）（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Ｘ８は、バリン、ロイシン、イソロイシンおよびアスパラギン酸から選択され、Ｘ１１は、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択される）を含むＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドの変異体であり、細菌ポリペプチドの前記変異体は、配列番号＿のＬ１、Ｇ４、Ｘ８、Ｘ１１のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。
【０１４６】
様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン２２７、ロイシン２２９、アスパラギン酸２３１、グリシン２３２、グリシン２３３、フェニルアラニン２３５、アスパラギン酸２３６、バリン２３９、フェニルアラニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３８３、グリシン３４６およびリジン３４８の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１４７】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン２４０、アスパラギン酸２４４、フェニルアラニン３７９およびアスパラギン酸３９４の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＴ．ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドである。
【０１４８】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン３０３、アスパラギン酸３０７、フェニルアラニン４３９、アスパラギン酸４５４の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドである。
【０１４９】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸によりコードされるポリペプチドを特徴とする。
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、他の変異体細菌ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。
【０１５０】
別の態様において、本発明は、Ｌ−メチオニンまたは関連の中間体（例えばホモシステイン、メチオニン、Ｓ−ＡＭまたはそれらの誘導体）を産生する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、Ｌ−メチオニンが産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１５１】
別の態様において、本発明は細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする単離核酸を特徴とする。様々な実施形態において、細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物は、野生型のｍｃｂＲ遺伝子産物と比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、該核酸は、Ｓ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されたｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする。様々な実施形態において、細菌のｍｃｂＲ遺伝子産物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｃｂＲ遺伝子産物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｃｂＲ遺伝子産物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのｍｃｂＲ遺伝子産物および
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのｍｃｂＲ遺伝子産物から選択される。
【０１５２】
別の態様において、本発明は、細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする単離核酸を特徴とし、変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物は、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むｍｃｂＲ遺伝子産物の変異体であり、該変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物は、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする単離核酸を特徴とし、該変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物は、配列番号＿のグリシン９２、リジン９４、フェニルアラニン１１６、グリシン１１８およびアスパラギン酸１３４の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｃｂＲ遺伝子産物である。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１５４】
また、本発明は細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とする。
また、本発明は細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、細菌の他の変異体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。
【０１５５】
また、本発明はＬ−メチオニンを生産する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物をコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、Ｌ−メチオニンが産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１５６】
別の態様において、本発明は細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とする。様々な実施形態において、細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、細菌の野生型アスパルトキナーゼ・ポリペプチドと比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、核酸はＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されたアスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアスパルトキナーゼ・ポリペプチ
ド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、大腸菌のアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１５７】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むアスパルトキナーゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体アスパルトキナーゼは、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１５８】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該アスパルトキナーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン２０８、リジン２１０、フェニルアラニン２２３、バリン２２５およびアスパラギン酸２３６の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１５９】
また、本発明は細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とする。
また、本発明は細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、細菌の他の変異体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。様々な実施形態において、細菌はアミノ酸産生に関わるポリペプチド（例えば、宿主細胞に対して異種もしくは同種のポリペプチドまたはその変異体）をコードする１または複数の核酸分子（例えば、組換え核酸分子）をさらに含む。様々な実施形態において、細菌は、内在性配列に、アミノ酸産生に関わるポリペプチドの活性の減少または増加を（例えば、アミノ酸産生に関わるポリペプチドをコードする内在性配列または例えばプロモーター配列などポリペプチドの発現を制御する配列の突然変異によって）引き起こす突然変異をさらに含む。
【０１６０】
また、本発明は、アミノ酸を生産する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、アミノ酸が産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはアミノ酸に富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１６１】
別の態様において、本発明は細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン／アセチルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド（Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ）をコードする単離核酸を特徴とする。様々な実施形態において、変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼは、野生型のＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドと比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、核酸はＳ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されたＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、大腸菌のＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１６２】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドの変
異体であり、変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１６３】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン７２、リジン７４、フェニルアラニン９０、イソロイシン９２およびアスパラギン酸１０５の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１６４】
また、本発明は細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドをコードする核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とする。
また、本発明は、細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、細菌の他の変異体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。
【０１６５】
また、本発明は、Ｌ−メチオニンを生産する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、Ｌ−メチオニンが産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１６６】
別の態様において、本発明は細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とする。様々な実施形態において、変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、野生型のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドと比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、核酸は、Ｓ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されたシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、大腸菌のシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１６７】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体シスタチオニンβ−リアーゼは、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１６８】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン２９６、リジン２９８、フェニルアラニン３１２、グリシン３１４およびアスパラギン酸３３５の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのシスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１６９】
また、本発明は、細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼをコードする核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とする。
また、本発明は、細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、細菌の他の変異体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。
【０１７０】
また、本発明は、Ｌ−メチオニンを生産する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、Ｌ−メチオニンが産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１７１】
別の態様において、本発明は細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とする。様々な実施形態において、変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、野生型の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドと比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、核酸は、Ｓ−アデノシルメチオニン・ポリペプチドによるフィードバック阻害が低減された５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｓｍｅｇｍａｔｉｓの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフ
ェラーゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、大腸菌の５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１７２】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６（配列番号＿）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含む５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４またはＺ１６のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン７０８、リジン７１０、フェニルアラニン７２５およびロイシン７２７の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１７４】
また、本発明は、細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼをコードする核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とする。
また、本発明は、細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、細菌の他の変異体ポリペプチド
（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。
【０１７５】
また、本発明は、Ｌ−メチオニンを生産する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、Ｌ−メチオニンが産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１７６】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とする。様々な実施形態において、変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドは、野生型のＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドと比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、該核酸は、Ｓ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されたＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌のＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌のＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、大腸菌のＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１７７】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドは、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含む
Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含む。様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
【０１７８】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン２６３、リジン２６５、フェニルアラニン２８２、グリシン２８４およびアスパラギン酸２９１の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＳ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドである。
【０１７９】
様々な実施形態において、アミノ酸変異はアラニンへの変異である。
また、本発明は、細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とする。
【０１８０】
また、本発明は、細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、細菌の他の変異体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。
【０１８１】
また、本発明は、Ｌ−メチオニンを生産する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、Ｌ−メチオニンが産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはＬ−メチオニンに富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１８２】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とする。様々な実施形態において、変異体ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドは、野生型の細菌ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドと比較して、フィードバック阻害が低減されている。様々な実施形態において、核酸は、Ｓ−アデノシルメチオニンによるフィードバック阻害が低減されたホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドをコードする。様々な実施形態において、細菌のホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、ヒト結核菌のホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、大腸菌のホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｅｌａｓｓｅｃｏｌａのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｍｉｎｏｇｅｎｅｓのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチド、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドおよびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｌａｖｕｍのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドから選択される。
【０１８３】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドをコードする単離核酸を特徴とし、該ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドは、配列番号＿のグリシン１６０、リジン１６１、フェニルアラニン１８６、アラニン１８８およびアスパラギン酸２０５の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドである。様々な実施形態において、アミノ酸変異は、アラニンへの変異である（ここで、元の残基はアラニン以外である）。
【０１８４】
また、本発明は、細菌の変異体ホモセリン・キナーゼをコードする核酸によってコードされるポリペプチドを特徴とする。
また、本発明は、細菌の変異体ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネ型細菌である。この細菌は、他の細菌の変異体ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の変異体細菌ポリペプチドなどのアミノ酸産生に関わる変異体細菌ポリペプチド）をコードする１または複数の核酸をさらに含むことが可能である。
【０１８５】
また、本発明は、アミノ酸を生産する方法を特徴とし、該方法は、細菌の変異体ホモセリン・キナーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む遺伝子改変細菌を、核酸が発現し、アミノ酸が産生される条件下で培養する工程と、この培養物を回収する工程とからなる。本培養物は、（例えば、細胞を取り除き、および／またはアミノ酸に富む画分を得るために）分画することが可能である。
【０１８６】
別の態様において、本発明は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸、細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸、細菌の変異型ｍｃｂＲ遺伝子産物ポリペプチドをコードする核酸、細菌の変異体アスパルトキナーゼ・ポリペプチドをコードする核酸、細菌の変異体Ｏ−スクシニルホモセリン（チオール）−リアーゼ・ポリペプチドをコードする核酸、細菌の変異体シスタチオニンβ−リアーゼ・ポリペプチドをコードする核酸、細菌の変異体５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸、および細菌の変異体Ｓ−アデノシルメチオニン・シンセターゼ・ポリペプチドをコードする核酸のうちの２種以上を含む細菌を特徴とする。
【０１８７】
様々な実施形態において、本発明の細菌は、細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸および細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼをコードする核酸を含む。特定の実施形態において、変異体細菌ポリペプチドのうちの少なくとも１種は、（例えば、野生型のポリペプチドと比較して）フィードバック阻害が低減されている。
【０１８８】
別の態様において、本発明は、（ａ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は
、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸と、（ｂ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドが、次のアミノ酸配列、すなわちＧ１−Ｘ２−Ｋ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３−Ｘ１３ａ−Ｘ１３ｂ−Ｘ１３ｃ−Ｘ１３ｄ−Ｘ１３ｅ−Ｘ１３ｆ−Ｘ１３ｇ−Ｘ１３ｈ−Ｘ１３ｉ−Ｘ１３ｊ−Ｘ１３ｋ−Ｘ１３ｌ−Ｆ１４−Ｘ１５−Ｚ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０−Ｘ２１−Ｘ２１ａ−Ｘ２１ｂ−Ｘ２１ｃ−Ｘ２１ｄ−Ｘ２１ｅ−Ｘ２１ｆ−Ｘ２１ｇ−Ｘ２１ｈ−Ｘ２１ｉ−Ｘ２１ｊ−Ｘ２１ｋ−Ｘ２１ｌ−Ｘ２１ｍ−Ｘ２１ｎ−Ｘ２１ｏ−Ｘ２１ｐ−Ｘ２１ｑ−Ｘ２１ｒ−Ｘ２１ｓ−Ｘ２１ｔ−Ｄ２２（配列番号＿）（式中、Ｘ２、Ｘ４〜Ｘ１３、Ｘ１５およびＸ１７〜Ｘ２０は、それぞれ独立に任意のアミノ酸であり、Ｘ１３ａ〜Ｘ１３ｌは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｘ２１ａ〜Ｘ２１ｔは、それぞれ独立に任意のアミノ酸であるかまたは存在せず、Ｚ１６は、バリン、アスパラギン酸、グリシン、イソロイシンおよびロイシンから選択される）を含むＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドの変異体であり、変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のＧ１、Ｋ３、Ｆ１４、Ｚ１６またはＤ２２のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸と、（ｃ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドが、次のアミノ酸配列、すなわちＬ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｇ４−Ｇ５−Ｘ６−Ｆ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号＿）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、Ｘ８はバリン、ロイシン、イソロイシンおよびアスパラギン酸から選択され、Ｘ１１はバリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびメチオニンから選択される）を含むＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドの変異体であり、細菌タンパク質の変異体が、配列番号＿のＬ１、Ｇ４、Ｘ８、Ｘ１１のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むことを特徴とする核酸と、のうちの２つ以上を含む細菌を特徴とする。
【０１８９】
別の態様において、本発明は、（ａ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のグリシン２３１、リジン２３３、フェニルアラニン２５１およびバリン２５３の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドであることを特徴とする核酸と、（ｂ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のグリシン８１、アスパラギン酸２８７、フェニルアラニン２６９の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＴ．ｆｕｓｃａのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドであることを特徴とする核酸と、（ｃ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のグルタミン酸２５２にアミノ酸変異を含む大腸菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドであることを特徴とする核酸と、（ｄ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿に記載のＭ．ｌｅｐｒａｅのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドのグリシン７３、アスパラギン酸２７８およびチロシン２６０のうち１つ以上の残基に対応する残基にアミノ酸変異を含む放線菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドであることを特徴とする核酸と、（ｅ）細菌の変異体ホモセリンＯ−アセチ
ルトランスフェラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のグリシン７３、チロシン２６０およびアスパラギン酸２７８の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むヒト結核菌のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドであることを特徴とする核酸と、（ｆ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のグリシン２２７、ロイシン２２９、アスパラギン酸２３１、グリシン２３２、グリシン２３３、フェニルアラニン２３５、アスパラギン酸２３６、バリン２３９、フェニルアラニン３６８、アスパラギン酸３７０、アスパラギン酸３８３、グリシン３４６およびリジン３４８の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドであることを特徴とする核酸と、（ｇ）細菌の変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸であって、該変異体Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドが、配列番号＿のグリシン２４０、アスパラギン酸２４４、フェニルアラニン３７９およびアスパラギン酸３９４の残基のうち１つ以上にアミノ酸変異を含むＴ．ｆｕｓｃａのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドであることを特徴とする核酸とのうち２つ以上を含む細菌を特徴とする。
【０１９０】
別の態様において、本発明は、エピソーム性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドおよびエピソーム性のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌を特徴とする。様々な実施形態において、細菌はコリネバクテリウムである。様々な実施形態において、エピソーム性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドおよびエピソーム性のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、細菌と同じ生物種のポリペプチドである（例えば、両方ともＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのポリペプチドである）。様々な実施形態において、エピソーム性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドおよびエピソーム性のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、該細菌とは異なる生物種のポリペプチドである。様々な実施形態において、エピソーム性のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドは、野生型のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドと比較してフィードバック阻害が低減された、細菌ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ・ポリペプチドの変異体である。様々な実施形態において、Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドは、野生型のＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドと比較してフィードバック阻害が低減された、細菌Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ・ポリペプチドの変異体である。
【０１９１】
「アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物」は、Ｌ−アスパラギン酸、β−アスパルチルリン酸、Ｌ−アスパラギン酸−β−セミアルデヒド、Ｌ−２，３−ジヒドロジピコリン酸、Ｌ−Δ１−ピペリデイン−２，６−ジカルボン酸、Ｎ−スクシニル２−アミノ−６−ケト−Ｌ−ピメレート、Ｎ−スクシニル２，６−Ｌ，Ｌ−ジアミノピメレート、Ｌ，Ｌ−ジアミノピメレート、Ｄ，Ｌ−ジアミノピメレート、Ｌ−リジン、ホモセリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニルＬ−ホモセリン、シスタチオニン、Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、スレオニン、２−オキソブタン酸、（Ｓ）−２−アセト−２−ヒドロキシブタノエート、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−３−オキソペンタノエート、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタノエート、（Ｒ）−２−オキソ−３−メチルペンタノエート、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アスパラギンを含む。様々な実施形態において、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物は、アスパラギン酸、アスパラギン、リジン、スレオニン、メチオニン、イソロイシンおよびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを含む。「フィードバック阻害が低減された」ポリペプチドまたはその
機能的変異体は、野生型のポリペプチドと比較して阻害因子の存在による阻害を受けにくいポリペプチド、または、該変異体が導入された生物において発現する、変異体に対応する内在性ポリペプチドと比較して、阻害因子の存在による阻害を受けにくいポリペプチドを含む。例えば、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来の野生型アスパルトキナーゼは、それぞれある濃度のリジンまたはリジン＋スレオニンの存在下では、１／１０の活性を示しうる。フィードバック阻害が低減された変異体は、同濃度のリジンの存在下で、例えば、１／５、１／２または野生型のレベルの活性を示しうる。
【０１９２】
「機能的変異体」タンパク質とは、該タンパク質が酵素である場合は野生型タンパク質によって触媒される生合成反応を触媒しうるタンパク質であり、該タンパク質が触媒作用を持たない場合は野生型タンパク質と同様の生物学的機能を提供しうるタンパク質である。例えば、正常時に１または複数の遺伝子の転写を制御するタンパク質の機能的変異体は、細菌に形質転換されたとき、やはり同じ１または複数の遺伝子の転写を制御することになる。特定の実施形態において、機能的変異体タンパク質は、アミノ酸によるフィードバック阻害に対して、少なくとも部分的または完全に耐性である。特定の実施形態において、変異体は、野生型のタンパク質と比較して２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３未満または１つのアミノ酸変異を有する。特定の実施形態において、アミノ酸変異は保存的変異である。変異配列とは、変異体ポリペプチド（例えば機能的変異体ポリペプチド）に対応するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列である。
【０１９３】
基準の配列のアミノ酸に「対応する」アミノ酸は、基準の配列における部位に相同な部位を占める。対応するアミノ酸は、関連の配列のアラインメントにより同定することが可能である。
【０１９４】
本明細書では、「異種の」核酸またはタンパク質とは、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物の生産に使用される宿主生物（種）以外の生物（種）に由来する核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質の機能的変異体を含むことが意図されている。特定の実施形態において、宿主生物がコリネ型細菌である場合、異種遺伝子は大腸菌からは得られない。他の特定の実施形態において、宿主生物が大腸菌である場合、異種遺伝子はコリネ型細菌からは得られない。
【０１９５】
本明細書では、「遺伝子」は、コード配列、プロモーター配列、オペレーター配列、エンハンサー配列、ターミネーター配列、共転写配列（例えば、オペロン由来の配列）および特定のコード配列に関連するその他の制御配列を含む。
【０１９６】
本明細書では、「同種の」核酸またはタンパク質とは、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物の生産に使用される宿主生物と同じ種である生物に由来する核酸もしくはタンパク質、または核酸もしくはタンパク質の機能的変異体を含むことが意図されている。
【０１９７】
当業者には周知のことであるが、野生型酵素の活性または機能をなくすことなく、該酵素の１つ以上のアミノ酸残基について、アミノ酸を別のアミノ酸で置換する特定の置換が許容可能である。本明細書では、「保存的置換」という用語は、タンパク質配列において、あるアミノ酸を同じ保存的置換グループの別のアミノ酸と交換することを指す。保存的アミノ酸置換は当技術分野で公知であり、通常、アミノ酸側鎖の置換基の相対的類似性、例えば疎水性、親水性、電荷、大きさなどを基にしている。１実施形態において、保存的置換とは、一般的に、次のグループ、すなわち、第１群：グリシン、アラニンおよびプロリン、第２群：バリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニン、第３群：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、第４群：セリン、スレオニンおよびシステイン、第５群：リジン、アルギニンおよびヒスチジン、第６群：フェニルアラニン、
チロシンおよびトリプトファンの群内での置換が挙げられる。各群には、タンパク質配列において、その特定の群内の他のアミノ酸のうちのいずれかと置換することが可能なアミノ酸が列挙されている。
【０１９８】
保存的置換のためのアミノ酸のグループ化を設定するためにはいくつかの基準が使用されている。例えば、タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を与える場合のアミノ酸の親水性・疎水性指標の重要性が、一般に当技術分野で知られている（カイト（Ｋｙｔｅ）およびドリトル（Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第１５７巻：１０５〜１３２ページ（１９８２））。あるアミノ酸は、同等の親水性・疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸と置換することが可能であり、かつなおも同等の生物学的活性を保持しうることが知られている。また、アミノ酸の親水性も、保存的アミノ酸のグループ化の設定基準として使用される（米国特許第４，５５４，１０１参照）。
【０１９９】
あるアミノ酸と別のアミノ酸との置換に関する情報は、一般に当技術分野で公知である（例えば、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ：Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、レスク、エイ  エム（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０１９８５０４７４８；「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、ブランデン、シー  アイ（Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｃ．−Ｉ．）、トーゼ、ジェイ（Ｔｏｏｚｅ，Ｊ．）、スウェーデン、ストックホルム所在のＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、１９９９年１月１５日）および「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ウェブスター、ディー  エム（Ｗｅｂｓｔｅｒ，Ｄ．Ｍ．）編、２０００年８月、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６３７５参照）。
【０２００】
一部の実施形態において、異種配列および／または宿主株の遺伝子の核酸配列および／またはタンパク質配列を比較して、相同性を測定することが可能である。相同性の比較は、例えば、対応するアミノ酸を同定するために使用することが可能である。２つの配列間の同一性（％）は、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた上での、該２つの配列によって共有される同一部位の数の関数である（ギャップの考慮は、２つの配列の最適なアラインメントのために必要である）。配列の比較および２つの配列間の同一性（％）の測定は、数学的アルゴリズムを使用して行うことができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、ＧＣＧソフトウェア・パッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）のアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８巻：４４４〜４５３ページ（１９７０））を使用して、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列、ならびにギャップ・ウエイト１２、ギャップ伸長ペナルティー４およびフレームシフト・ギャップペナルティー５を使用して測定することが可能である。
【０２０１】
通常、２つの核酸配列またはタンパク質配列の同一性（％）を測定するためには、最適の比較のために配列をアラインする（例えば、最適のアラインメントを実施するために、第１および第２の核酸配列またはアミノ酸配列のうち一方または両方にギャップを導入することが可能であり、また非相同配列を比較対象から除外することが可能である）。比較のためにアラインされるテスト配列の長さは、基準の配列の長さの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％であることが可能である。次に、対応するヌクレオチド部位またはアミノ酸部位のヌクレオチドまたはアミノ酸を比較する。第１の配列のある部位が、第２の配列の対応する位置と同一のヌクレオチドまたはアミノ酸であるならば、該分子はその部位について同一である（本明細書では「同一」は「相同」と同義である）。
【０２０２】
本明細書に記載のタンパク質配列を「検索配列」として使用して、例えば重複のない（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ）配列データベースに対する検索を実施することが可能である。そのような検索は、アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ）（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜１０ページのＢＬＡＳＴＰプログラムおよびＴＢＬＡＳＴＮプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することが可能である。タンパク質のＢＬＡＳＴ検索は、例えば、Ｂｌｏｓｕｍ６２行列、ワード長３、ギャップ存在コスト１１およびギャップ伸長ペナルティー１を使用して、ＢＬＡＳＴＰプログラムで実施することが可能である。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、米国生命工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に利用可能であり、デフォルト・パラメータを使用することが可能である。また、本明細書に記載の配列を、特定のパラメータまたはデフォルト・パラメータを使用して、ＴＢＬＡＳＴＮ検索の検索配列として使用することも可能である。
【０２０３】
本明細書に記載の核酸配列を「検索配列」として使用して、例えば重複のない配列データベースに対する検索を実施することが可能である。そのような検索は、アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ）（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５巻：４０３〜１０ページのＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することが可能である。ヌクレオチドのＢＬＡＳＴ検索は、核酸レベルでの同一性を評価するために、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて、スコア＝１００、ワード長＝１１として実施することが可能である。タンパク質のＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質レベルでの同一性を評価するために、ＢＬＡＳＴＸプログラムを用いて、スコア＝５０、ワード長＝３として実施することが可能である。比較するためにギャップのあるアラインメントを得るには、アルチュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ）、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５巻：３３８９〜３４０２ページに記載のようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用可能である。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルト・パラメータを使用することが可能である。また、比較のためのヌクレオチド配列のアラインメントは、スミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．第２巻：４８２ページ（１９８１））の局所的相同性アルゴリズム、ニードルマンおよびブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ）（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第４８巻：４４３ページ（１９７０））の相同性アラインメント・アルゴリズム、ピアソンおよびリップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８５巻：２４４４ページ（１９８８））の類似性検索方法により、これらアルゴリズムのコンピュータによる実施（米国ウィスコンシン州マディソンサイエンスドライブ５７５所在のＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）のウィスコンシン遺伝学ソフトウェアパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアルでのアラインメントおよび目視検査（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、１９９５年補足を参照）によって実施することが可能である。
【０２０４】
核酸配列は、ハイブリダイゼーション特性について解析することも可能である。本明細書では、「低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高ストリンジェンシーまたは非常に高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイゼーションする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を説明している。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ニューヨーク所在のジョン・ワイリー・アンド
・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）１９８９年、６．３．１〜６．３．６に記載されている。該参照文献には水性および非水性の方法が記載されており、いずれも使用することが可能である。本明細書に示す特定のハイブリダイゼーション条件は、１）低ストリンジェンシー条件として、約４５℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）でハイブリダイゼーションした後、５０℃以上、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２回洗浄（洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件については５５℃まで上げることができる）、２）中程度のストリンジェンシー条件として、約４５℃、６×ＳＳＣでハイブリダイゼーションした後、６０℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄、３）高ストリンジェンシー条件として、約４５℃、６×ＳＳＣでハイブリダイゼーションした後、６５℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１、２、３または４回以上の洗浄、非常に高いストリンジェンシー条件は、６５℃、０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳでハイブリダイゼーションした後、６５℃、０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回または複数回洗浄、である。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（少なくとも４回以上洗浄）が好ましい条件であり、特に明記しない限りこの条件を使用するべきである。
【０２０５】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細が、添付の図面および詳細な説明に記載されている。本発明のその他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２０６】
［詳細な説明］
本発明は、アスパラギン酸由来のアミノ酸および中間体化合物の発酵生産を改善するタンパク質をコードする核酸を含む、核酸および遺伝子改変細菌を提供する。特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、スレオニン、Ｌ−イソロイシン、ホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリン、ホモシステイン、およびシスタチオニンの生産に関連する核酸および細菌を開示する。本発明の核酸は、これらのアミノ酸、中間体、および関連代謝産物の生合成を、直接的（例えば中間体の酵素的転換によって）あるいは間接的（例えば酵素発現の転写制御またはアミノ酸輸送の制御によって）に調節する代謝経路のタンパク質をコードする遺伝子を含む。該タンパク質をコードする核酸配列は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物の生産に使用される宿主生物（種）以外の細菌種に由来するものであってよい。本発明は、動物飼料添加物中に使用するためのアミノ酸の生産を含めた、細菌およびアミノ酸の生産のための方法も提供する。
【０２０７】
アミノ酸の産生に関与する幾つかの細菌タンパク質の配列を改変することによって、アミノ酸の収率の向上をもたらすことが可能である。改変型または非改変型（例えば野生型）の細菌酵素の発現を制御（例えば、低減または増大）することによって、アミノ酸の産生を増大させることが同様に可能である。本明細書に記載する方法および組成物は、アミノ酸および関連代謝産物の産生を制御する細菌タンパク質（例えば、メチオニン、スレオニン、イソロイシン、アスパラギン酸、リジン、システイン、およびイオウの代謝に関与するタンパク質）、およびこれらのタンパク質をコードする核酸に適用される。これらのタンパク質には、アミノ酸生合成経路の中間体の他の中間体および／または最終産物への転換を触媒する酵素、およびこのような酵素の発現および／または機能を直接制御するタンパク質が挙げられる。操作対象の標的タンパク質には、抑制、減弱化、またはフィードバック阻害などのさまざまな種類の制御の対象となる酵素が含まれる。本明細書に記載する操作および／または発現用のタンパク質を同定するための、細菌種のアミノ酸生合成経路、これらの経路に関与するタンパク質に関する情報、これらのタンパク質の配列へのリンク、ならびにその他の関連情報源は、関連データベースを介してアクセス可能である（エラー発生。ハイパーリンク不可）。ボーノら（Ｂｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８：２０３〜２１０、１９９８年。
【０２０８】
工業生産用にアミノ酸生合成の効率を操作するための戦略には、過剰発現、過少発現（遺伝子破壊または置換を含む）、および特定の遺伝子の条件付き発現、ならびにタンパク質の活性を最適化するための遺伝的改変がある。阻害刺激、例えば生合成経路の最終産物および中間体の存在によるフィードバック阻害に対する、生合成酵素の感受性を低下させることが可能である。例えば、リジンの工業生産に使用されるコリネ型細菌または大腸菌由来の菌株は、一般にリジンによるフィードバック阻害に対して比較的感度が低い。有用なコリネ型細菌菌株は、スレオニンによる阻害にも比較的耐性がある。本明細書に記載する新規の方法および組成物は、アミノ酸産生を促進する。理論によって縛られるわけではないが、これらの方法および組成物は、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ＡＭ）および／またはメチオニンの存在下でのフィードバック阻害の低減によって増強された酵素をもたらすことが可能である。操作用の代表的な標的遺伝子は、細菌のｄａｐＡ、ｈｏｍ、ｔｈｒＢ、ｐｐｃ、ｐｙｃ、ｐｃｋ、ｍｅｔＥ、ｇｌｙＡ、ｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、ｍｃｂＲ、ｌｙｓＣ、ａｓｄ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＨ、およびｍｅｔＫ遺伝子である。これらの標的遺伝子は個別に、あるいはさまざまな組合せで操作することが可能である。
【０２０９】
幾つかの実施形態では、（例えば、内在性遺伝子の突然変異または欠失によって）特定の遺伝子の活性が低下するように菌株を作出することは有用である。例えば、ｈｏｍ、ｔｈｒＢ、ｐｃｋ、またはｍｃｂＲ遺伝子産物のうち１つ以上の活性が低い菌株は、アミノ酸および関連中間体の産生が促進される可能性がある。
【０２１０】
アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物への炭素の流れを誘導する、２つの主要な炭素代謝酵素には、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）およびピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）がある。アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の生合成の最初の工程を図１に示す。２つの酵素はいずれも、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの要素でありアミノ基転移によりアスパラギン酸となるオキサロ酢酸の形成を触媒する。アスパルトキナーゼ（コリネ型細菌ではｌｙｓＣによってコードされている）は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の最初の酵素反応を触媒し、フィードバック阻害とフィードバック抑制の両方によって制御されることが知られている。したがって、この酵素の脱制御は、アスパラギン酸のアミノ酸経路の工業上重要なあらゆるアミノ酸および関連代謝産物（例えばアスパラギン酸、アスパラギン、リジン、メチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン、スレオニン、およびイソロイシン）の生産に重要である。アスパラギン酸由来のアミノ酸への炭素の流れを制御するのに重要な酵素として、これらの酵素のいずれかまたは両方を、（コピー数を増大させること、および強力なプロモーターを使用することのうち少なくともいずれかにより）過剰発現させること、および脱制御させることのうち少なくともいずれかによって、前述のアミノ酸の産生を増大させることが可能である。
【０２１１】
他の生合成酵素を使用して、特定のアミノ酸の産生を増大させることが可能である。Ｌ−リジンの生合成に関与する酵素の例には、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤａｐＡ）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ＤａｐＢ）、ジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼ（Ｄｄｈ）、およびジアミノピメレート・デカルボキシラーゼ（ＬｙｓＡ）がある。リジンの生合成に関与する酵素のリストを表１に示す。これらの酵素それぞれの過剰発現および／または脱制御により、リジンの産生を増大させることが可能である。目的の遺伝子のコピー数を増大させること、および該遺伝子を発現に最適なプロモーター、例えば強力なプロモーターまたは条件付きプロモーターと作動可能なように連結させることのうち少なくともいずれかによって、生合成酵素の過剰発現を行うことが可能である。
【０２１２】
制御酵素全体および特定の制御酵素を過剰発現している菌株中でリジンの生産性を高め
ることが可能である。大腸菌のアスパルトキナーゼおよびジヒドロジピコリン酸シンターゼにおける特定のアミノ酸置換は、フィードバック阻害を低下させることによってリジン産生の向上をもたらす可能性がある。ｌｙｓＣおよび／またはｄａｐＡ（野生型またはフィードバック非感受性対立遺伝子のいずれか）の発現の促進により、リジンの産生が増大する可能性がある。同様に、異種のｌｙｓＣ遺伝子およびｄａｐＡ遺伝子の脱制御された対立遺伝子を、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのコリネ型細菌の菌株中で発現させることができる。同様に、ｐｙｃまたはｐｐｃのいずれかの過剰発現は、リジンの産生を増大させる可能性がある。
【０２１３】
【表１】
2007525951.tif 000002
【０２１４】
メチオニン生合成における工程を図２に示す。メチオニン生合成を制御する酵素の例には、ホモセリン・デヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ）、Ｏ−ホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）、およびＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ（ＭｅｔＹ）がある。過剰発現（目的の遺伝子のコピー数を増大させること、および強力なプロモーターを使用することのうち少なくともいずれかによる過剰発現）、および／またはこれらの酵素それぞれの脱制御によって、メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２１５】
メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＫ）は、メチオニンからのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を触媒する。ｍｅｔＫ発現酵素の活性の低下は、メチオニンのＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンへの転換を妨げ、したがって細菌株由来のメチオ
ニンの収量を増大させる可能性がある。逆に、メチオニンからＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンへの炭素の流れを増大させることを望む場合、ｍｅｔＫ遺伝子を過剰発現させるか、あるいはフィードバック阻害に対する感受性を低下させればよいと思われる。
【０２１６】
［細菌宿主株］
アミノ酸の生産に適した宿主の種類には、大腸菌などの腸内細菌科の細菌、およびコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の菌株がある。以下に列挙するのは、異種遺伝子の発現およびアミノ酸の産生用の宿主株として使用することが可能である生物種および菌株の例である。
【０２１７】
大腸菌 W3110F-IN(rrnD-rrnE)１λ-（大腸菌ストックセンター（E.coli Genetic Stock Center ））
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 （ATCC：米国微生物系統保存機関（American Type Culture Collection））
Corynebacterium glutamicum ATCC 21526 
Corynebacterium glutamicum ATCC 21543 
Corynebacterium glutamicum ATCC 21608 
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 21491
Corynebacterium acetoglutamicum NRRL B-11473
Corynebacterium acetoglutamicum NRRL B-11475
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 
Brevibacterium lactis 
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869
Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11470
Brevibacterium lactofermentum NRRL B-11471
Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799
Brevibacterium lactofermentum ATCC 31269
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium flavum ATCC 21269
Brevibacterium flavum NRRL B-11472
Brevibacterium flavum NRRL B-11474
Brevibacterium flavum ATCC 21475
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 
［有用な遺伝子源を使用するための細菌株］
異種の細菌遺伝子用に適した生物種および菌株には、以下に列挙するものがあるが、これらだけには限られない。
【０２１８】
Mycobacterium smegmatis ATCC 700084 
Amycolatopsis mediterranei
Streptomyces coelicolor A3(2) 
Thermobifida fusca ATCC 27730 
Erwinia chrysanthemi ATCC 11663 
Shewanella oneidensis 
Mycobacterium leprae
Mycobacterium tuberculosis H37Rv
Lactobacillus plantarum ATCC 8014 
Bacillus sphaericus 
アミノ酸の産生を増大させるために使用可能な代表的なタンパク質のアミノ酸配列を表１６に示す。これらのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を表１７に示す。宿主株中で発現し得る配列は、これらの表に示した配列に限られない。
【０２１９】
［アスパルトキナーゼ］
アスパルトキナーゼ（アスパラギン酸キナーゼとも呼ばれる）は、アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の生合成において最初に行われる工程を触媒する酵素である。アスパルトキナーゼのレベルおよび活性は、一般に、生合成経路の１つまたは複数の最終産物（細菌種に応じて、リジンまたはリジン＋スレオニン）によって、いずれもフィードバック阻害（アロステリック制御とも呼ばれる）および転写制御（抑制とも呼ばれる）を介して制御される。コリネ型細菌および大腸菌のアスパルトキナーゼの細菌ホモログを使用して、アミノ酸の産生を増大させることが可能である。コリネ型細菌および大腸菌のアスパルトキナーゼを異種生物中で発現させて、アミノ酸の産生を増大させることが可能である。
【０２２０】
［コリネ型細菌由来のＬｙｓＣタンパク質のホモログ］
コリネ型細菌では、アスパルトキナーゼはｌｙｓＣ遺伝子座によってコードされている。ｌｙｓＣ遺伝子座は重複する２つの遺伝子、ｌｙｓＣαおよびｌｙｓＣβを含む。ｌｙｓＣαおよびｌｙｓＣβは、それぞれアスパルトキナーゼの４７ｋＤおよび１８ｋＤのサブユニットをコードしている。第３のオープンリーディングフレームはｌｙｓＣ遺伝子座と隣接しており、アスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードしている。ａｓｄ開始コドンはｌｙｓＣオープンリーディングフレームの終端から２４塩基対下流で始まり、ｌｙｓＣオペロンの一部分として発現される。
【０２２１】
アスパルトキナーゼタンパク質の一次配列およびｌｙｓＣ遺伝子座の構造は、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）の幾つかの生物種にわたって保存されている。コリネ型細菌由来のタンパク質との関連の高いアスパルトキナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼをいずれもコードする生物の例には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  Ａ３（２）、およびＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａがある。幾つかの場合、これらの生物は、コリネ型細菌と同様に配置されたｌｙｓＣおよびａｓｄ遺伝子を含む。表２は、これらの放線菌由来のタンパク質の、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのアスパルトキナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼタンパク質に対する同一性（％）を示す。
【０２２２】
【表２】
2007525951.tif 000003
【０２２３】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、およびＴｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａなどの供給源の菌株の単離物が利用可能である。それぞれの供給源菌株から調製したゲノムＤＮＡから、ｌｙｓＣオペロンを増幅することが可能であり、得られたＰＣＲ産物を大腸菌／Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍシャトル・ベクター中に連結させることが可能である。次いで、供給源菌株由来のアスパルトキナーゼ酵素のホモログを宿主株中に導入し発現させることが可能である。
【０２２４】
［大腸菌のアスパルトキナーゼＩＩＩホモログ］
コリネ型細菌では、リジンおよびスレオニンによって協調的に行われるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が存在する。対照的に、大腸菌には、リジン、スレオニンまたはメチオニンによって独立にアロステリック制御される３つの異なるアスパルトキナーゼが存在する。大腸菌のアスパルトキナーゼＩＩＩ（および他のイソ酵素）のホモログを、脱制御型アスパルトキナーゼタンパク質の他の供給源として使用することが可能である。コリネ型細菌中でこれらの酵素が発現することによって、経路制御の複雑性を低下させることが可能である。例えば、アスパルトキナーゼＩＩＩの遺伝子はリジンとスレオニンではなくリジンによってのみフィードバック阻害を受ける。したがって、アスパルトキナーゼＩＩＩ対立遺伝子のうちフィードバック耐性の対立遺伝子を発現させる利点には、（１）完全な脱制御の可能性の増大、および（２）ｈｏｍの「漏出（ｌｅａｋｙ）」突然変異体または栄養補給する必要があるスレオニン要求株を構築する必要性がなくなる可能性があること、が挙げられる。これらの特徴は、リジンによるフィードバック阻害の低減をもたらす可能性がある。
【０２２５】
アスパルトキナーゼＩＩＩのイソ酵素をコードする遺伝子は、前に記載した放線菌よりもコリネ型細菌と遠縁の細菌から単離することが可能である。例えば、Ｅ．ｃｈｙｓａｎｔｈｅｍｉおよびＳ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓの遺伝子産物は、大腸菌のｌｙｓＣタンパク質とそれぞれ７７％および６０％同一である（かつＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＬｙｓＣと２６％および３５％同一である）。大腸菌以外の細菌、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉおよびＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ由来の、アスパルトキナーゼＩＩＩまたはその機能的変異体をコードする遺伝子を増幅させて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中で発現するための適切なシャトル・ベクターに連結させることが可能である。
【０２２６】
［脱制御されたアスパルトキナーゼ対立遺伝子の構築］
リジン類似体（例えばＳ−（２−アミノエチル）システイン（ＡＥＣ））または高濃度のリジン（および／またはスレオニン）を使用して、リジン産生が促進された菌株を同定することが可能である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよび大腸菌由来の周知のリジン耐性菌株の大部分は、ｌｙｓＣ遺伝子座に突然変異を有している。重要なことに、ＡＥＣに対する耐性の向上をもたらす特定のアミノ酸置換が同定されてきており、これらの置換は保存性の高い残基に位置している。少なくとも野生型菌株において高いリジン生産性をもたらす特定のアミノ酸置換には、表３に列挙するものがあるが、これらだけには限られない。多くの場合、特定の残基における幾つかの有用な置換が同定されてきている。さらに、さまざまな例において、２つ以上のｌｙｓＣ突然変異を含む菌株が同定されてきている。配列のアラインメントによって、すでにフィードバック耐性（すなわちＡＥＣ耐性）と関係付けられていた残基が、遠縁の細菌由来のさまざまなアスパルトキナーゼタンパク質中で保存されていることが確認されている。
【０２２７】
【表３】
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【０２２８】
標準的な部位特異的突然変異誘発技法を使用して、アロステリック制御を受けないアスパルトキナーゼ変異体を構築することが可能である。ＰＣＲで増幅したｌｙｓＣまたはアスパルトキナーゼＩＩＩ遺伝子を適切なシャトル・ベクターにクローニングした後、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を使用して、表３に列挙したような置換体をコードする改変型対立遺伝子を得る。野生型遺伝子または改変型対立遺伝子のいずれかを含むベクターで、対照ベクターと並行してＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを形質転換することが可能である。得られた形質転換体を、例えばリジン生産性、ＡＥＣへの耐性向上、リジン要求株との相対的な栄養共生、または最も興味深い突然変異対立遺伝子を同定するための当業者に知られているその他の方法に関してスクリーニングすることが可能である。リジン生産性および／または酵素活性を測定するためのアッセイを使用してスクリーニング結果を確認し、有用な突然変異対立遺伝子を選択することが可能である。アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸および関連代謝産物のレベルを定量するための、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＨＰＬＣ−質量分析法（ＭＳ）などのアッセイ技法は当業者に周知である。
【０２２９】
突然変異誘発ＰＣＲなどの方法によって、ｌｙｓＣコード配列内にランダムにアミノ酸置換を導入するための方法を使用することが可能である。これらの方法は当業者にはよく知られており、例えばＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（Ｒ）ＰＣＲ突然変異誘発キット（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して製造者の教示書に従いＰＣＲ法を行って、中程度および高頻度の突然変異を得ることが可能である。
【０２３０】
宿主株に内在するＬｙｓＣ、ＤａｐＡ、Ｐｙｃ、およびＰｐｃタンパク質の存在下において、異種酵素の評価を行うことが可能である。幾つかの場合、異種の生合成タンパク質の機能性を詳細に評価するための試薬を用いることが有用であろう。ＡＥＣ耐性に関する表現型アッセイまたは酵素アッセイを使用して、異種アスパルトキナーゼの野生型および改変型変異体の機能を確認することが可能である。クローニングした異種遺伝子の機能は、大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝学的に解析されている突然変異体に対す
る補完性によって確認することが可能である。多くの大腸菌株が、大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）から公的に入手可能である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの突然変異体も記載されてきている。
【０２３１】
［ジヒドロジピコリン酸シンターゼ］
ｄａｐＡによってコードされているジヒドロジピコリン酸シンターゼは、炭素をスレオニン／メチオニン産生ではなくリジンへの生合成へと送る、分岐点で作用する酵素である。ＤａｐＡはアスパラギン酸−β−セミアルデヒドを２，３−ジヒドロジピコリン酸に転換する。ＤａｐＡの過剰発現は、大腸菌およびコリネ型細菌のいずれにおいてもリジン産生を増大させることが示されている。大腸菌では、ＤａｐＡはリジンによってアロステリック制御されており、一方で既存の証拠から、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでの制御は遺伝子発現のレベルで起こることが示唆されている。ジヒドロジピコリン酸シンターゼ・タンパク質は、放線菌においてＬｙｓＣタンパク質ほどは高くは保存されていない。
【０２３２】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのタンパク質または大腸菌のＤａｐＡタンパク質との相同性を有する、野生型および脱制御型ＤａｐＡタンパク質を発現させて、リジン産生を増大させることが可能である。ｄａｐＡ遺伝子の供給源となり得る候補生物を表４に示す。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓまたはＭ．ｌｅｐｒａｅ由来の周知の配列を使用して、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来の相同遺伝子を同定することが可能である。
【０２３３】
【表４】
2007525951.tif 000005
【０２３４】
リジンによる大腸菌ＤａｐＡのフィードバック阻害を軽減するアミノ酸置換が報告されている。このような置換の例を表５に列挙する。フィードバック阻害を軽減するために改変することが可能な残基の幾つかは、全てのＤａｐＡタンパク質候補において保存されている（例えばＬｅｕ８８、Ｈｉｓ１１８）。この配列保存性から、放線菌由来のタンパク質に同様の置換を行うことによりタンパク質の機能がさらに高まる可能性があることが示唆される。部位特異的突然変異誘発法を使用して、脱制御型ＤａｐＡ変異体を作出することが可能である。
【０２３５】
前述の方法を使用して、ＤａｐＡ単離物をリジン産生の増大について試験することが可能である。例えば、リジン要求性細菌の培養物を、リジンを含まない増殖培地上に播くこ
とが可能であると思われる。部位特異的突然変異誘発法によって得た一群のｄａｐＡ突然変異体を、次いで（形質転換または接合によって）野生型のコリネ型菌株中に導入し、その後リジン要求株を播いた寒天プレート上に広げることが可能であると思われる。フィードバック耐性ｄａｐＡ突然変異体はリジンを過剰生産すると思われるが、過剰生産されたリジンが増殖培地中に排出され、予め寒天プレート上に播かれた栄養要求株の増殖要件を満たすことになると思われる。したがって、ｄａｐＡ突然変異を含むコロニー周辺にリジン要求株が輪状に増殖することにより、所望のフィードバック耐性突然変異体の存在が示されることになる。
【０２３６】
【表５】
2007525951.tif 000006
【０２３７】
［ピルビン酸カルボキシラーゼおよびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ］
ピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）およびホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）は、リジン生合成の直接的供給源であるクエン酸サイクルの中間体、オキサロ酢酸（ＯＡＡ）の合成を触媒する。これらの補充反応は、リジンを含めた幾つかのアミノ酸の収率の向上と関係しており、ＯＡＡ形成を最大にするために重要であることは明らかである。さらに、Ｐ４５８Ｓ置換を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの変異体Ｐｙｃタンパク質は、リジン産生の向上によって実証されたように、高い活性を有することが示されている。プロリン４５８は、放線菌Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（アミノ酸残基４４９）およびＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ（アミノ酸残基４４８）由来のタンパク質を含めた、広範囲のピルビン酸カルボキシラーゼにおいて高度に保存されたアミノ酸部位である。これらのタンパク質における同様のアミノ酸置換によって、補充反応の活性が増大する可能性がある。第３の遺伝子、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ｐｃｋ）は、（糖新生用の）ＯＡＡからのホスホエノールピルビン酸の形成を触媒する酵素を発現し、したがってｐｙｃおよびｐｐｃと機能的に競合する。ｐｙｃおよびｐｐｃの発現を増大させることによって、ＯＡＡ形成を最大にすることが可能である。ｐｃｋ活性の低減または除去によっても、ＯＡＡ形成を改善することが可能である。
【０２３８】
［ホモセリン・デヒドロゲナーゼ］
ホモセリン・デヒドロゲナーゼ（Ｈｏｍ）は、アスパラギン酸セミアルデヒドのホモセリンへの転換を触媒する。コリネ型細菌中では、Ｈｏｍはスレオニンによってフィードバック阻害され、メチオニンによって抑制される。この酵素はリジン部門で競合するジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ＤａｐＡ）反応よりも、アスパラギン酸セミアルデヒドに関する親和性が高いが、下流のスレオニン経路へのわずかな炭素の「流出」がＨｏｍ活性をさらに阻害する可能性があると考えられる。Ｈｏｍのフィードバック耐性変異体、ｈｏｍ
の過剰発現、および／またはｈｏｍ転写の脱制御、あるいはこれらの手法のいずれかの組合せによって、メチオニン、スレオニン、イソロイシン、またはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン産生を増大させることが可能である。Ｈｏｍ活性の低下によって、リジン産生が増大する可能性もある。大腸菌のｍｅｔＬ（アスパルトキナーゼＩＩ−ホモセリン・デヒドロゲナーゼＩＩ）およびｔｈｒＡ（アスパルトキナーゼＩ−ホモセリン・デヒドロゲナーゼＩ）によってコードされる酵素などの、ホモセリン・デヒドロゲナーゼ活性を有する二機能酵素を使用して、アミノ酸産生を増大させることも可能である。
【０２３９】
標的とするアミノ酸を置換して、Ｈｏｍ活性を排除ではなく低下させること、あるいはスレオニンによるフィードバック阻害からＨｏｍを救済することが可能である。Ｈｏｍ活性の低下をもたらす突然変異は、「漏出」Ｈｏｍ突然変異とも呼ばれる。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・デヒドロゲナーゼでは、突然変異させてＨｏｍ活性を増大または低下させることが可能なアミノ酸残基が同定されている。これらの特定のアミノ酸の幾つかは、他の放線菌のＨｏｍタンパク質において充分保存されている（表６参照）。
【０２４０】
【表６】
2007525951.tif 000007
【０２４１】
表中（＊）、ｈｏｍｄｒ突然変異は、国際公開公報第９３／０９２２５号パンフレットの１１ページに記載されている。この突然変異は１９６４位の１塩基対の欠失であり、コドン４２９でｈｏｍｄｒのリーディング・フレームに影響を及ぼしている。その結果フレームシフト突然変異を生じ、約１０アミノ酸の変化および早期停止、または短縮、すなわちポリペプチドの最後の約７残基のアミノ酸の欠失をもたらす。
【０２４２】
ｈｏｍ  ｄｒ遺伝子のカルボキシ末端におけるこの１塩基の欠失は、この酵素のカルボキシル末端のタンパク質配列を根本的に変え、スレオニンと結合部位との相互作用が妨げられるような立体構造の変化をもたらすと考えられる。
【０２４３】
［ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ］
ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）は、メチオニン生合成の最初に行われる工程で作用する（パーク、エスら（Ｐａｒｋ、Ｓ．ｅｔ  ａｌ．）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ８：２８６〜２９４、１９９８）。ＭｅｔＡ酵素は、ホモセリンからＯ−アセチル−ホモセリンへの転換を触媒する。ＭｅｔＡはメチオニン生合成経路の最終産物によって強く制御される。大腸菌では、おそらく２つの別個のアロステリック部位で、Ｓ−ＡＭとメチオニンの両方によるアロステリック制御が起こる。さらにＭｅｔＪおよびＳ−ＡＭは、ｍｅｔＡの転写抑制を引き起こす。コリネ型細菌では、ＭｅｔＡは、大腸菌と同様にメチオニンおよびＳ−ＡＭによってアロステリック阻害を受ける可能性がある。ＭｅｔＡ合成はメチオニンのみによって抑制され得る。さらに、初期の研究により、トリフルオロメチオニン耐性はｍｅｔＡと関係付けられている。Ｓ−ＡＭおよびメチオニンによる負の制御の低下は、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン産生を増大させ得る。ＭｅｔＡ活性の増大は、メチオニンおよびＳ−ＡＭなどのアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させる可能性があり、一方ＭｅｔＡ活性の低下は、スレオニンおよびイソロイシンなどのアミノ酸の形成を促進する可能性がある。
【０２４４】
［Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ］
Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ（ＭｅｔＹ）は、Ｏ−アセチルホモセリンからホモシステインへの転換を触媒する。コリネ型細菌ではメチオニンによってＭｅｔＹが抑制されている可能性があり、０．５ｍＭのメチオニンの存在下では酵素活性は９９％低下する。この阻害はアロステリック制御と遺伝子発現の抑制の複合効果であると考えられる。さらに酵素活性は、メチオニン、ホモセリン、およびＯ−アセチルセリンによって阻害される。Ｓ−ＡＭもＭｅｔＹ活性を調節すると考えられる。脱制御型ＭｅｔＹは、メチオニンまたはＳ−ＡＭ産生を増大させることが可能である。
【０２４５】
［ホモセリン・キナーゼ］
ホモセリン・キナーゼは、ｈｏｍ−ｔｈｒＢオペロンの一部であるｔｈｒＢ遺伝子によってコードされている。ＴｈｒＢはホモセリンをリン酸化する。ホモセリン・キナーゼのスレオニンによる阻害が幾つかの種で観察されている。幾つかの研究は、ホモセリン・キナーゼによるホモセリンのリン酸化が、ある条件下でスレオニン生合成を制限する可能性を示唆している。ＴｈｒＢ活性の増大は、イソロイシンおよびスレオニンなどのアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させる可能性があり、一方ＴｈｒＢ活性の低下は、リジンおよびメチオニンなど（これらに限定はされない）を含めたアミノ酸の形成を促進する可能性がある。
【０２４６】
［メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ］
メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼは、メチオニンをＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｓ−ＡＭ）に転換する。メチオニン・アデノシルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＫ）を下方制御することによって、Ｓ−ＡＭへの転換の阻害によりメチオニンの産生を増大させることが可能である。ｍｅｔＫの発現またはＭｅｔＫの活性を増大させることによって、Ｓ−ＡＭの産生を最大にすることが可能である。
【０２４７】
［Ｏ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ／Ｏ−アセチルホモセリン（チオ）−リアーゼ］
Ｏ−スクシニルホモセリン（チオ）−リアーゼ（ＭｅｔＢ；シスタチオニンγ−シンターゼとしても知られる）は、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンか
らシスタチオニンへの転換を触媒する。ＭｅｔＢの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−ＡＭの産生を増大させることが可能である。
【０２４８】
［シスタチオニンβ−リアーゼ］
シスタチオニンβ−リアーゼ（ＭｅｔＣ）は、シスタチオニンをホモシステインに転換することができる。ホモシステイン産生の増大は、メチオニンの産生を増大させ得る。したがって、ＭｅｔＣの発現または活性の増大は、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させ得る。
【０２４９】
［グルタミン酸デヒドロゲナーゼ］
ｇｄｈ遺伝子によってコードされている酵素グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、α−ケトグルタル酸の還元的アミノ化を触媒してグルタミン酸を産生させる。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの発現または活性を増大させることによって、リジン、スレオニン、イソロイシン、バリン、プロリン、またはトリプトファンの産生を増大させることが可能である。
【０２５０】
［ジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼ］
コリネ型細菌のｄｄｈ遺伝子によってコードされているジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼは、アンモニアおよびＬ−２−アミノ−６−オキソピメレートのＮＡＤＰＨ依存的還元を触媒して、メソ−２，６−ジアミノピメレート、すなわちリジン生合成の代替経路におけるＬ−リジンの直接の前駆体を形成する。ジアミノピメレート・デヒドロゲナーゼの過剰発現は、リジン産生を増大させる可能性がある。
【０２５１】
［界面活性剤耐性化因子（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｓｃｕｅｒ）］
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのαサブユニットと関係があるタンパク質をコードする、界面活性剤耐性化因子（ｄｔｓＲ１）は、界面活性剤耐性遺伝子である。ＤｔｓＲ１の発現または活性を増大させることによって、リジンの産生を増大させることが可能である。
【０２５２】
［５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ］
５−メチルテトラヒドロ葉酸ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＨ）は、ホモシステインのメチオニンへの転換を触媒する。この反応はコバラミン（ビタミンＢ１２）に依存する。ＭｅｔＨの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２５３】
［５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ］
５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステイン・メチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＥ）も、ホモシステインのメチオニンへの転換を触媒する。ＭｅｔＥの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２５４】
［セリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ］
セリン・ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＧｌｙＡ）の発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２５５】
［５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ］
５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼ（ＭｅｔＦ）はメチレンテトラヒド
ロ葉酸からメチルテトラヒドロ葉酸（ホモシステインをメチル化してメチオニンとするための補助因子）への還元を触媒する。ＭｅｔＦの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２５６】
［セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ］
セリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＣｙｓＥ）は、セリンのＯ−アセチルセリンへの転換を触媒する。ＣｙｓＥの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの増大をもたらすことが可能である。
【０２５７】
［Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ］
Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ＳｅｒＡ）は、セリン生合成における最初の工程を触媒し、セリンによってアロステリック阻害される。ＳｅｒＡの発現または活性を増大させることによって、メチオニンまたはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの産生を増大させることが可能である。
【０２５８】
［ＭｃｂＲ遺伝子産物］
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｃｂＲ遺伝子産物は、ＴｅｔＲ−ファミリーの推定上の転写抑制因子として同定されており、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるメチオニン合成を誘導する代謝系の制御に関与する可能性がある（レイら（Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０３（１）：５１〜６５、２００３）。ｍｃｂＲ遺伝子産物は、ｍｅｔＹ、ｍｅｔＫ、ｃｙｓＫ、ｃｙｓｌ、ｈｏｍ、ｐｙｋ、ｓｓｕＤ、およびおそらく他の遺伝子の発現をも抑制する。ＭｃｂＲはＳ−ＡＭまたはメチオニンなどの小分子と共同して発現を抑制すると考えられる。今日までに、Ｓ−ＡＭまたはメチオニンのいずれかの結合を妨げるような特定のＭｃｂＲ対立遺伝子は同定されていない。ＭｃｂＲの発現を低下させること、および／またはＳ−ＡＭによるＭｃｂＲの制御を妨げることによって、アミノ酸産生を増大させることが可能である。
【０２５９】
ＭｃｂＲは、イオウ含有アミノ酸（例えばシステイン、メチオニン）の制御と関係がある。ＭｃｂＲの発現または活性の低下により、ホモセリンに由来する任意のアスパラギン酸ファミリーのアミノ酸（例えばホモセリン、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン、シスタチオニン、Ｌ−ホモシステイン、Ｌ−メチオニン、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）、Ｏ−ホスホ−Ｌ−ホモセリン、スレオニン、２−オキソブタン酸、（Ｓ）−２−アセト−２−ヒドロキシブタン酸、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル−３−オキソペンタン酸、（Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−３−メチルペンタン酸、（Ｒ）−２−オキソ−３−メチルペンタン酸、およびＬ−イソロイシン）の産生が増大する可能性もある。
【０２６０】
［リジン輸送体タンパク質］
リジン輸送体タンパク質（ＬｙｓＥ）は、細胞からのリジンの流出を仲介する特異的なリジンの輸送体である。ｌｙｓＥ遺伝子に欠失があるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは、Ｌ−リジンが１Ｍを超える細胞内濃度に達する可能性がある（エルドマン、エイら（Ｅｒｄｍａｎｎ、Ａ．、ｅｔ  ａｌ．）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：３１１５〜３１２２、１９９３）。この輸送タンパク質の過剰発現または活性の増大は、リジン産生を増大させる可能性がある。
【０２６１】
［排出因子（ｅｆｆｌｕｘ）タンパク質］
相当数の細菌遺伝子が膜輸送タンパク質をコードしている。これらの膜輸送タンパク質の１サブセットが、細胞からのアミノ酸の排出を仲介する。例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍは、スレオニン排出因子タンパク質を発現する。こ
のタンパク質の活性の消失は、スレオニンの多量の細胞内蓄積をもたらす（シミックら（Ｓｉｍｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３（１８）：５３１７〜５３２４、２００１）。排出因子タンパク質の発現または活性を増大させることによって、さまざまなアミノ酸の産生を増大させることが可能である。有用な排出因子タンパク質は、薬剤／代謝産物輸送担体ファミリーのタンパク質を含む。表１６に列挙したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのタンパク質またはそのホモログを使用して、アミノ酸産生を増大させることが可能である。
【０２６２】
［細菌遺伝子の単離］
宿主株中で発現させるための細菌遺伝子を、当分野で知られている方法によって単離することが可能である。例えば、組換え核酸の構築の方法に関して、サムブルック、ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．）およびラッセル、ディー、ダブリュ（Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．）著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２００１）を参照のこと。供給源の菌株由来のゲノムＤＮＡは、周知の方法を使用して調製することが可能であり（例えば、サイトウ、エイチ（Ｓａｉｔｏ、Ｈ．）およびミウラ、ケイ（Ｍｉｕｒａ、Ｋ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．７２：６１９〜６２９、１９６３年を参照のこと）、ＰＣＲ法を使用してゲノムＤＮＡから遺伝子を増幅することが可能である（米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号、サイキら（Ｓａｉｋｉ、ｅｔ  ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：３５０〜１３５４、１９８５）。
【０２６３】
増幅反応用に使用されるＤＮＡプライマーは、目的の遺伝子の領域全体または部分領域を含む二本鎖ＤＮＡの両方の３’末端と相補的なプライマーである。遺伝子の部分領域のみが増幅される場合は、このようなＤＮＡ断片をプライマーとして使用して、染色体ＤＮＡライブラリーから領域全体を含むＤＮＡ断片のスクリーニングを行うことが必要である。遺伝子の領域全体が増幅される場合は、増幅された遺伝子を含むＤＮＡ断片を含んだＰＣＲ反応溶液をアガロース・ゲル電気泳動に供し、次いでＤＮＡ断片を抽出し、細菌系中での発現に適したベクターにクローニングする。
【０２６４】
ＰＣＲ用のＤＮＡプライマーは、例えば供給源の菌株中の既知配列に基づいて、適切に調製することが可能である（リショー、エフら（Ｒｉｃｈａｕｄ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２９７、１９８６）。例えば、目的の異種遺伝子をコードするヌクレオチド塩基を含む領域を増幅させることが可能であるプライマーを使用すればよい。プライマーの合成は、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、アプライドバイオシステムズインコーポレイテッド社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）製のＤＮＡ合成装置モデル３８０Ｂ）を使用することによって、ホスホアミダイト法（Ｔｅｔｒａｈｅｄ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９、１９８１を参照）などの通常の方法によって行うことが可能である。さらにＰＣＲ法は、市販のＰＣＲ装置およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、またはより高性能の他のポリメラーゼを使用することによって、供給業者によって指定された方法に従い行うことが可能である。
【０２６５】
［変異体対立遺伝子の構築］
アミノ酸産生を制御する多くの酵素は、生合成経路の中間体または最終産物によるアロステリック・フィードバック阻害を受ける。フィードバック阻害に関与する残基の置換によって、これらの酵素の有用な変異体を作製することが可能である。例えば、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡによってコードされている）などの酵素は、Ｓ−ＡＭによってフィードバック阻害される。ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの脱制御型変異体を作製するために、我々はホモセリンＯ−アセチルトランスフェラー
ゼのアミノ酸配列内の推定Ｓ−ＡＭ結合残基（Ｓ−ＡＭ結合残基と推定される残基）を同定し、次いでプラスミドを構築して、Ｓ−ＡＭによるアロステリック制御に対して高い耐性を与えることが予想される特異的なアミノ酸置換を含むＭｅｔＡ変異体を発現させた。これらの変異体を発現する菌株では、メチオニンの産生が増大した（以下の実施例を参照）。
【０２６６】
さまざまな酵素におけるその他の推定Ｓ−ＡＭ結合残基には、表９および表１０に列挙した残基があるが、これらだけには限られない。表９および表１０の１つまたは複数の残基を、非保存的残基、またはアラニンで（例えば、野生型の残基がアラニン以外である場合）置換することが可能である。配列のアラインメントから、Ｓ−ＡＭに対するフィードバック感受性に関係があると思われる残基は、遠縁の細菌由来のさまざまなＭｅｔＡおよびＭｅｔＹタンパク質中で保存されていることが確認されている。
【０２６７】
標準的な部位特異的突然変異誘発技法を使用して、アロステリック制御に対する感受性が低下した変異体を構築することが可能である。ＰＣＲ増幅させた遺伝子を適切なシャトル・ベクターにクローニングした後、オリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発を使用して、特異的なアミノ酸置換をコードする改変型対立遺伝子を得る。野生型遺伝子または改変型対立遺伝子を含むベクターを、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、または他の適切な宿主株に、対照ベクターと並行して形質転換することが可能である。得られた形質転換体を、例えばアミノ酸生産性、Ｓ−ＡＭによるフィードバック阻害に対する耐性の向上、目的の酵素の活性、または最も興味深い変異対立遺伝子を同定するための当業者に知られている他の方法に関して、スクリーニングすることが可能である。アミノ酸生産性および／または酵素活性を測定するためのアッセイを使用してスクリーニング結果を確認し、有用な変異対立遺伝子を選択することが可能である。アミノ酸および関連代謝産物のレベルを定量化するための、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＨＰＬＣ−質量分析法（ＭＳ）アッセイなどの技法は当業者には周知である。
【０２６８】
突然変異誘発ＰＣＲなどの方法によって、コード配列内にランダムなアミノ酸置換を生じさせる方法を使用することが可能である（例えば、フィードバック阻害の低下をスクリーニングするため、あるいは変異をさらに導入して強化型の変異配列とするための変異体を産生させるため）。例えば、ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ＰＣＲ突然変異誘発キット（米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を使用して、製造者の教示書に従ってＰＣＲ法を行い、中程度および高頻度の突然変異を得ることが可能である。他の方法も当分野では知られている。
【０２６９】
宿主株に内在する他の酵素の存在下において、酵素の評価を行うことが可能である。幾つかの場合、該生物に内在しない生合成タンパク質（例えばエピソームにより発現されるタンパク質）の機能性を詳細に評価するための試薬を使用することが有用であろう。フィードバック阻害に関する表現型アッセイまたは酵素アッセイを使用して、野生型および変異型の生合成酵素の機能を確認することが可能である。クローニングした遺伝子の機能は、宿主生物（例えば、宿主の大腸菌またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）の遺伝学的に解析されている突然変異体に対する補完性によって確認することが可能である。多くの大腸菌株が、大腸菌ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ｈｔｔｐ：／／ｃｇｓｃ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｙａｌｅ．ｅｄｕ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）から公的に入手可能である。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ突然変異体も記載されてきている。
【０２７０】
［遺伝子の発現］
当分野で知られている方法を使用して、宿主細菌株中で細菌遺伝子を発現させることが可能である。幾つかの場合、細菌遺伝子（例えば、異種遺伝子および／または変異体遺伝
子）の過剰発現が、宿主株によるアミノ酸産生を増大させるであろう。遺伝子の過剰発現は、さまざまな方法によって達成することが可能である。例えば、多数の遺伝子コピーを発現させてもよいし、あるいは遺伝子（例えば、遺伝子の変異体対立遺伝子、または内在性遺伝子）上流のプロモーター、制御要素、および／またはリボソーム結合部位を、宿主株で最適に発現するように改変してもよい。さらに、宿主株が該宿主生物に固有な遺伝子のコピーを既に１つまたは複数有している場合でも、対応する遺伝子がさらに１コピー存在するだけで産生が増大する可能性がある。遺伝子を強力な構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えばｔｒｃ、ｌａｃ）と作動可能なように連結させ、最大のアミノ酸産生を容易にする条件下で誘導することも可能である。ｍＲＮＡの安定性を高めるための方法は当業者に知られており、これを使用してタンパク質が絶えず高レベルで発現されるのを確実にすることが可能である。例えば、キースリング、ジェイ（Ｋｅａｓｌｉｎｇ、Ｊ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：４５２〜４６０、１９９９を参照のこと。培地および培養条件の最適化によって、遺伝子の発現を増大させることも可能である。
【０２７１】
細菌中での遺伝子の発現を容易にするための方法は報告されている。例えば、グエレロ、シーら（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ、Ｃ、ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  １３８（１〜２）：３５〜４１、１９９４；エイクマンス、ビー、ジェイら（Ｅｉｋｍａｎｎｓ、Ｂ．Ｊ．、ｅｔ
ａｌ．）Ｇｅｎｅ  １０２（１）：９３〜８、１９９１；シュバルザー、エーおよびプフラー、エー（Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ、ＡおよびＰｕｂｌｅｒ、Ａ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１）：８４〜７、１９９１；ラバレ、ジェーら（Ｌａｂａｒｒｅ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（４）：１００１〜７、１９９３；マルンブレス、エムら（Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．）Ｇｅｎｅ  １３４（１）：１５〜２４、１９９３；ジェンセン、ピー．アールおよびハマー、ケー（Ｊｅｎｓｅｎ、Ｐ．Ｒ．およびＨａｍｍｅｒ、Ｋ．）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、１５８（２〜３）：１９１〜５、１９９８；マクリデス、エス、シー（Ｍａｋｒｉｄｅｓ、Ｓ．Ｃ．）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６０（３）：５１２〜３８、１９９６；ツチヤら（Ｔｓｕｃｈｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４２８〜４３１、１９８８；米国特許第５，９６５，９３１号；米国特許第４，６０１，８９３号；および米国特許第５，１７５，１０８号を参照のこと。
【０２７２】
目的の遺伝子（例えば異種遺伝子または変異体遺伝子）は、適切なプロモーター、例えば該遺伝子本来のプロモーターまたは宿主株由来のプロモーター、ファージのプロモーター、充分に解析されている大腸菌プロモーターの１つ（例えばｔａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、ａｒａＢＡＤ、またはこれらの変異体など）などと作動可能なように連結されなければならない。他の適切なプロモーターも利用可能である。１実施形態では、異種遺伝子は、宿主株の内在性ホモログのレベルより少なくとも２倍、５倍、または１０倍高いレベルでの該異種遺伝子の発現を可能にするプロモーターと作動可能なように連結される。染色体へ組み込まれることによって遺伝子増幅の過程を助長するプラスミド・ベクターを使用することも可能である。例えば、ラインシャイドら（Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：１２６〜１３２、１９９４）を参照のこと。この方法では、宿主（通常は大腸菌）内では複製し得るがＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍでは複製し得ないプラスミド・ベクターに、完全長の遺伝子をクローニングする。これらのベクターには、例えばｐＳＵＰ３０１（サイモンら（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１、７８４〜７９、１９８３）、ｐＫｌ８ｍｏｂまたはｐＫｌ９ｍｏｂ（シュファーら（Ｓｃｈｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、Ｇｅｎｅ  １４５：６９〜７３、１９９４）、ＰＧＥＭ−Ｔ（米国ウィスコンシン州マディソン所在のプロメガコーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．））、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（シューマン（Ｓｈｕｍａｎ）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：３２６７８〜８４、１９９４；米国特許第５，４８７，９９３号）、ｐＣＲ．ＲＴＭ．Ｂｌｕｎｔ（オランダ国グロニ
ンゲン所在のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；バーナードら（Ｂｅｒｎａｒｄ
ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．、２３４：５３４〜５４１、１９９３）、ｐＥＭ１（シュランプら（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：４５１０〜４５１６、１９９１）またはｐＢＧＳ８（シュプラットら（Ｓｐｒａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  ４１：３３７〜３４２、１９９６）がある。次いで、増幅させる遺伝子を含んだプラスミド・ベクターを、接合または形質転換によってＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの所望の菌株内に入れる。接合の方法は、例えばシュファーら（Ｓｃｈｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０：７５６〜７５９、１９９４）によって報告されている。形質転換の方法は、例えばチアバッチら（Ｔｈｉｅｒｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：３５６〜３６２、１９８８）、ダニカンおよびシブナン（ＤｕｎｉｃａｎおよびＳｈｉｖｎａｎ）（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：１０６７〜１０７０、１９８９）ならびにタウチら（Ｔａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｌｅｔｔ．１２３：３４３〜３４７、１９９４）によって報告されている。遺伝的交差事象による相同的組換えの後では、得られた菌株は、宿主ゲノム中に所望の遺伝子が組み込まれている。
【０２７３】
適切な発現プラスミドは、少なくとも１つの選択可能なマーカーも含み得る。選択可能なマーカーは、宿主細胞において抗生物質耐性を与えるヌクレオチド配列であってよい。これらの選択可能なマーカーには、アンピシリン、セファゾリン、アウグメンチン、セホキシチン、セフタジジム、セフチオファー、セファロチン、エンロフロキシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、チカルシリン、チルミコシン、またはクロラムフェニコール耐性遺伝子がある。他の選択可能なマーカーには、特定の宿主株中に存在する栄養要求性（例えばロイシン、アラニン、またはホモセリン要求性）を補完することが可能な遺伝子がある。
【０２７４】
１実施形態では、異種遺伝子を発現させるために複製型ベクターが使用される。例示的な複製型ベクターには、以下のもの、すなわちａ）選択可能なマーカー、例えば抗生物質マーカー、ｋａｎＲ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｂ）大腸菌の複製起点、Ｐ１５ａ  ｏｒｉ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｃ）Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの複製起点、ｐＢＬ１中で見られる複製起点など；ｄ）プロモーター・セグメント、付随する抑制遺伝子を含んでも含まなくてもよい；およびｅ）ターミネーター・セグメントが含まれうる。プロモーター・セグメントはｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃ、またはλＰＩ／λＰＲ（大腸菌由来）、またはｐｈｏＡ、ｇｐｄ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＪ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来）であってよい。抑制遺伝子は、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃに対してはｌａｃＩ、λＰＩ／λＰＲに対してはｃＩ８５７であってよい。ターミネーター・セグメントは大腸菌のｒｒｎＢ（ｐｔｒｃ９９ａ由来）、Ｔ７ターミネーター（ｐＥＴ２６由来）、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のターミネーター・セグメントであってよい。
【０２７５】
他の実施形態では、異種遺伝子を発現させるために組込み型ベクター（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  ｖｅｃｔｏｒ）が使用される。例示的な組込み型ベクターは：選択可能なマーカー、例えば抗生物質マーカー、ｋａｎＲ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｂ）大腸菌の複製起点、Ｐ１５ａ  ｏｒｉ（ｐＡＣＹＣ１８４由来）など；ｃ）およびｄ）置換されるセグメント（ｐｃｋまたはｈｏｍ遺伝子など）に隣接するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムの２つのセグメント；ｅ）Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子；ｆ）異種遺伝子の発現を調節するためのプロモーター・セグメント、付随する抑制遺伝子を含んでも含まなくてもよい；およびｇ）ターミネーター・セグメントを含むことが可能である。プロモーター・セグメントはｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃ、またはλＰＩ／λＰＲ（大腸菌由来）、またはｐｈｏＡ、ｇｐｄ、ｒｐｌＭ、ｒｐｓＪ（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃ
ｕｍ由来）であってよい。抑制遺伝子は、ｌａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｃＲＢＳ、ｔａｃに対してはｌａｃＩ、λＰＩ／λＰＲに対してはｃＩであってよい。ターミネーター・セグメントは大腸菌のｒｒｎＢ（ｐｔｒｃ９９ａ由来）、Ｔ７ターミネーター（ｐＥＴ２６由来）、またはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のターミネーター・セグメントであってよい。考えられる組込み型または複製型のプラスミド、またはこれらのプラスミドを構築するために使用される試薬は、本明細書に記載するものだけには限られない。他のプラスミドは当業者によく知られている。
【０２７６】
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来のターミネーター・セグメントを使用するために、該ターミネーター配列および隣接する配列を１つの遺伝子セグメントによって供給することが可能である。この場合、前述の要素はプラスミド上で以下の順序、すなわちマーカー；複製起点；置換すべきセグメントに隣接するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍゲノムのセグメント；プロモーター；Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのターミネーター；ｓａｃＢ遺伝子として配置されるであろう。ｓａｃＢ遺伝子は、複製起点とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの隣接セグメントとの間に位置してもよい。組込みおよび切り出しによって、プロモーター、ターミネーター、および目的の遺伝子のみが挿入される。
【０２７７】
前述のプラスミド要素の間の幾つかの可能な位置のうち１つにマルチクローニング部位を配置して、目的の特定の遺伝子（例えばｌｙｓＣなど）のプラスミド中への挿入を容易にすることが可能である。複製型および組込み型ベクターのいずれについても、ＲＰ４ｍｏｂなどの接合移入の起点を加えることによって、大腸菌とＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍとの間の遺伝子の移動を容易にすることが可能である。
【０２７８】
１実施形態では、エピソーム性プラスミドを用いて宿主株中で細菌遺伝子を発現させる。適切なプラスミドには、コリネ型細菌などの選択された宿主株中で複製するプラスミドがある。多くの既知のプラスミド・ベクター、例えばｐＺ１（メンケルら（Ｍｅｎｋｅｌ
ｅｔ  ａｌ．）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：５４９〜５５４、１９８９）、ｐＥＫＥｘ１（エイクマンスら（Ｅｉｋｍａｎｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  １０２：９３〜９８、１９９１）またはｐＨＳ２−１（ソネンら（Ｓｏｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  １０７：６９〜７４、１９９１）などは、潜在性（ｃｒｙｐｔｉｃ）プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１またはｐＧＡ１を基とするものである。使用可能な他のプラスミド・ベクターには、ｐＣＧ４（米国特許第４，４８９，１６０号）、またはｐＮＧ２（サーウォルド−デービスら（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．６６：１１９〜１２４、１９９０）、またはｐＡＧ１（米国特許第５，１５８，８９１号）に基づくベクターがある。別例として、１つまたは複数の遺伝子を、形質導入、トランスポゾン（ベルグ、ディー．イーおよびベルグ、シー．エム（Ｂｅｒｇ、Ｄ．Ｅ．およびＢｅｒｇ、Ｃ．Ｍ．）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１：４１７、１９８３）、Ｍｕファージ（特開平２−１０９９８５号）あるいは相同的組換えまたは非相同的組換え（「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ．、１９７２年）を使用する方法によって宿主微生物の染色体中に組み込むことが可能である。
【０２７９】
さらに、２つ以上の遺伝子を使用するか、あるいは遺伝子を他の生合成経路の遺伝子と組み合わせて使用して、特定の生合成経路、解糖、補充、またはアミノ酸輸送の１つまたは複数の酵素を増強することが、アミノ酸の生産に有利である可能性がある。
【０２８０】
特定の遺伝子産物の発現を同時に弱化させて特定のアミノ酸の産生を最大にすることも有利である可能性がある。例えば、ｍｅｔＫの発現またはＭｅｔＫの活性を弱めることで、メチオニンからＳ−ＡＭへの転換を妨げることによってメチオニン産生を増大させる可
能性がある。
【０２８１】
核酸を宿主細胞に導入する方法は当分野で知られている。例えば、サムブルック、ジェーおよびラッセル、ディー、ダブリュー（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．）著「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第３版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー所在のコールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２００１を参照のこと。適切な方法には、塩化カルシウムを使用する形質転換（マンデル、エムおよびヒガ、エー（Ｍａｎｄｅｌ、Ｍ．およびＨｉｇａ、Ａ．）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５３：１５９、１９７０）、およびエレクトロポレーション（レスト、エム．イー．ファンデルら（Ｒｅｓｔ、Ｍ．Ｅ．ｖａｎ  ｄｅｒ、ｅｔ  ａｌ．）Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２：５４１〜５４５、１９９９）、または接合がある。
【０２８２】
［細菌の培養］
目的の遺伝子（例えば、異種遺伝子、フィードバック阻害が低減された酵素をコードする変異体遺伝子）を含む細菌を、連続培養してもよいし、あるいはバッチ発酵工程（バッチ培養）によって培養してもよい。当業者に知られている他の工業的に使用されている変形工程には、供給バッチ（供給工程）または反復供給バッチ工程（反復供給工程）がある。周知の培養法の要約は、クミエル（Ｃｈｍｉｅｌ）（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  １．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９９１））の教科書、あるいはストルハス（Ｓｔｏｒｈａｓ）（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４））の教科書に記載されている。
【０２８３】
使用する培養培地は、特定の宿主株の要件を満たすものである。さまざまな微生物に適した培養培地についての一般的説明は、米国細菌学協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）の書籍「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（米国ワシントン市、１９８１）に見出すことが可能であるが、培養培地の組成は、生成物の形成を最大にするために単純な増殖要件以外にも変更が加えられることが多いことは、当業者であれば理解しているであろう。
【０２８４】
糖および炭水化物、例えばグルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプンおよびセルロースなど；油および脂質、例えば大豆油、ヒマワリ油、ラッカセイ油およびココナッツ油など；脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸など；アルコール、例えばグリセロールおよびエタノールなど；および有機酸、例えば酢酸などを、炭素の供給源として個別に、あるいは混合物として使用することが可能である。
【０２８５】
窒素を含む有機化合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆タンパク質加水分解物、大豆粉および尿素など、または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムなどを、窒素の供給源として使用することが可能である。窒素の供給源は個別に、あるいは混合物として使用することが可能である。
【０２８６】
リン酸、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、またはナトリウムを含むこれらの塩を、リン供給源として使用することが可能である。
例えば硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、Ｈ２Ｓなどの還元供給源、硫化物、硫化物の誘導体、メチルメルカプタン、チオグリコライト、チオシアネート、およびチオ尿素などのイオウを含む有機および無機化合物を、イオウを含むアミノ酸を調製するためのイオウ供給源として使用することが可能である。
【０２８７】
培養培地は、増殖に必要な金属塩、例えば硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄を含むことも可能である。アミノ酸およびビタミン（例えばコバラミン）などの必須の増殖物質を、前述の物質に加えて使用することが可能である。さらに適切な前駆物質を培養培地に加えてもよい。言及した出発物質は１つのバッチとして培養物に加えてもよいし、あるいは培養中に複数回供給されてもよい。
【０２８８】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カルシウム、アンモニアまたはアンモニア水などの塩基性化合物、あるいはリン酸または硫酸などの酸性化合物を適切な方法で使用して、ｐＨを調節することが可能である。例えば脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用して、気泡の発生を調節することが可能である。例えば抗生物質などの選択作用を有する適切な物質を培地に加えて、プラスミドの安定性を保つことが可能である。好気性条件を保つためには、酸素または酸素を含む気体混合物、例えば空気などを、培養物中に導入する。培養物の温度は典型的には２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。所望の産物が最大限形成されるまで、通常は１０時間〜１６０時間以内で培養を続ける。
【０２８９】
このようにして得た発酵ブロスは、乾燥重量で２．５〜２５重量％の目的のアミノ酸を含み得る。生産用微生物の増殖および代謝が、発酵サイクルのある時期、好ましくは発酵期間の少なくとも３０％の間の炭水化物添加速度によって制限されるように発酵が行われると好都合である可能性もある。例えば、発酵培地中で使用可能な糖の濃度を、この期間中は≦３ｇ／ｌに維持する。
【０２９０】
次いで発酵ブロスをさらに処理することが可能である。バイオマス全部または一部分を、任意の固体−液体分離法、例えば遠心分離、濾過、デカント、またはこれらの組合せなどによって発酵ブロスから取り出してもよいし、あるいはバイオマスが完全にブロス中に含まれたままでもよい。次いで、周知の方法によって、例えば多重効用蒸発器、薄膜蒸発器、流下液膜式蒸発器によって、あるいは逆浸透によって、ブロスから水を除去する。濃縮された発酵ブロスを、次いで凍結乾燥、スプレー乾燥、流動床乾燥などの方法によって、あるいは他の方法によって後処理して、好ましくは自由流動性の微粉末を得ることが可能である。
【０２９１】
この自由流動性の微粉末は、次いで適切な圧縮処理または造粒処理によって、粗粒子状で、容易に自由流動する、保存可能かつほとんど無塵の産物へと転換可能である。造粒または圧縮においては、従来の有機または無機の補助物質または担体、例えばデンプン、ゼラチン、セルロース誘導体、または類似の物質（食品加工において結合剤、ゲル化剤または増粘剤として従来使用されている物質など）、あるいは他の物質、例えばシリカ、ケイ酸（塩）またはステアリン酸（塩）などを使用することが有利である可能性がある。
【０２９２】
しかしながら、別例として、食品加工において周知の従来の有機または無機担体物質、例えばシリカ、ケイ酸（塩）、グリット、ぬか、穀粉、デンプン、糖または他の物質に産物を吸収させることも可能であり、かつ／あるいは従来の増粘剤または結合剤を用いて混合し安定化させることも可能である。
【０２９３】
最後に、ＤＥ−Ｃ−４１００９２０に記載されたのと同様に、フィルム形成物質、例えば金属炭酸塩、シリカ、ケイ酸（塩）、アルギン酸（塩）、ステアリン酸（塩）、デンプン、ゴムおよびセルロースエーテルなどを使用するコーティング処理によって、産物を動
物の胃、特に反芻動物の胃による消化に対して安定な状態にすることが可能である。
【０２９４】
バイオマスが処理中に分離除去される場合、他の無機固体、例えば発酵中に添加される固体は一般に除去される。
本発明の１態様では、バイオマスは７０％まで、好ましくは８０％まで、好ましくは９０％まで、好ましくは９５％まで、および特に好ましくは１００％までの程度まで分離除去することが可能である。本発明の他の態様では、バイオマスの２０％まで、好ましくは１５％まで、好ましくは１０％まで、好ましくは５％までのバイオマスを分離除去し、バイオマスを分離除去しないことが特に好ましい。
【０２９５】
発酵ブロスの溶液中に形成または添加され、該溶液中に存在する有機物質を、適切な処理によって保持または分離することが可能である。これらの有機物質には、場合によって所望のＬ−アミノ酸以外に生産され、場合によっては発酵に使用された微生物により放出される有機副産物が含まれる。該副産物はＬ−リジン、Ｌ−バリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−アラニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、またはＬ−トリプトファンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸を含む。該副産物はビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン）、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、ニコチン酸／ニコチンアミドおよびビタミンＥ（トコフェロール）からなる群から選択されるビタミンを含む。該副産物は、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸またはフマル酸などの１〜３個のカルボキシル基を有する有機酸も含む。最後に、該副産物は糖、例えばトレハロースも含む。該副産物が産物の栄養価を改善する場合、これらの化合物が望まれる場合もある。
【０２９６】
Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸および／またはラセミ混合物Ｄ、Ｌ−アミノ酸を含めたこれらの有機物質を、適切な処理工程中に固体状または液体状の濃縮物または純粋な物質として、必要に応じて加えることも可能である。既述のこれらの有機物質は個別に、あるいは混合物として、得られた発酵ブロスまたは濃縮した発酵ブロスに加えることが可能であり、あるいは乾燥処理または造粒処理中に加えることも可能である。同様に、有機物質または数種類の有機物質の混合物を発酵ブロスに添加すること、他の有機物質または数種類の有機物質の他の混合物を後の処理工程、例えば造粒中に添加することも可能である。前述の産物は、食品添加物、すなわち動物栄養用の食品添加物として使用することが可能である。食品添加物として使用するためのアミノ酸の調製方法に関しては、例えばその内容を本願明細書に援用する、国際公開公報第０２／１８６１３号パンフレットを参照のこと。
【実施例１】
【０２９７】
［アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させるための遺伝子発現用ベクターの構築］
アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生と関係がある遺伝子を発現させるための、プラスミドを作製した。多くの標的遺伝子を図１および図２に示す。これらの図はアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生に直接関与する生合成遺伝子の大部分を示している。これらのプラスミドは、自律的に複製するものでも宿主Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの染色体中に組み込まれるものでもよいが、該プラスミドを報告されているようにエレクトロポレーションによってコリネバクテリウムの菌株中に導入した（フォレッティー、エム、ティーら（Ｆｏｌｌｅｔｔｉｅ、Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６７：６９５〜７０２、１９９３を参照のこと）。全てのプラスミドは、抗生物質カナマイシンに対する耐性を与えるｋａｎＲ遺伝子を含む。形質転換体を、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）を含む培地上で選択した。
【０２９８】
エピソーム性プラスミドからの発現用に、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの低コピー数の潜
在性ｐＢＬ１プラスミドの誘導体を使用してベクターを構築した（サンタマリアら（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２２３７〜２２４６、１９８４を参照のこと）。エピソーム性プラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中でのプラスミドの複製を可能にするレプリカーゼをコードする配列を含み；したがって、これらのプラスミドは、染色体中へ組み込まれずに増幅可能である。プラスミドＭＢ３９６１およびＭＢ４０９４を、本明細書に記載するエピソーム性発現プラスミドを構築するために使用したベクターの骨格とした（図３および４を参照のこと）。プラスミドＭＢ４０９４が含む複製起点は、ＭＢ３９６１と比較してコリネバクテリウム中での使用に関して改善されており；したがって、この骨格を多くの試験用に使用した。ＭＢ３９６１およびＭＢ４０９４のいずれも、ｐＴｒｃ９９Ａ（アマンら（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  ６９：３０１〜３１５、１９８８を参照のこと）由来の制御配列を含む。ｌａｃＩｑ−ｔｒｃ  ＩＰＴＧ誘導性プロモーター・カセットの３’部分は、目的の遺伝子が、該遺伝子の開始部位と隣接するＮｃｏＩ部位を備えたＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ適合性の突出部を含む断片として挿入されうるように、ポリリンカー内に存在する（ＫｐｎＩなどの他のポリリンカー部位をＮｏｔＩ部位の代わりに使用することも可能である）。さらに、改変型ｔｒｃプロモーター（ｔｒｃＲＢＳ）およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｐｄ、ｒｐｌＭ、およびｒｐｓＪプロモーターなどの有用なプロモーターを、ＭＢ３９６１およびＭＢ４０９４骨格のＮｈｅＩ−ＮｃｏＩ断片などの好都合な制限断片に挿入することが可能である。ｔｒｃＲＢＳプロモーターは、発現タンパク質のレベルを増大させることが示された改変型リボゾーム結合部位を含む。遺伝子の発現に関するこれらの検討に使用したプロモーターの配列を表７に示す。
【０２９９】
【表７】
2007525951.tif 000008
【０３００】
2007525951.tif 000009
【０３０１】
遺伝子欠失によって本来のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの遺伝子を不活性化させるためのプラスミドも設計した。幾つかの場合、これらの構築物では本来の遺伝子が欠失し、かつ宿主染色体の欠失の生じた遺伝子座に異種遺伝子が挿入される。表８に、欠失させた内在性遺伝子、および導入された場合には異種遺伝子を列挙する。欠失プラスミドは、欠失事象の標的遺伝子の上流および下流の領域と相同なヌクレオチド配列を含み；場合よっては、これらの配列は不活性化される遺伝子のコード配列の一部を含む。これらの隣接する配列を使用して相同的組換えを容易にする。１回の交差事象により、プラスミドは宿主染色体上の欠失させる遺伝子の上流および下流の部位に送られる。欠失プラスミドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のレバンスクラーゼ遺伝子をコードするｓａｃＢ遺伝子も含む。組込み型プラスミドを含む形質転換体を、カナマイシンを欠くＢＨＩ培地で画線培養した。１日後、１０％スクロースを含むＢＨＩ培地上でコロニーを画線培養した。この手順によって、ｓａｃＢ遺伝子が切除されている菌株が選択されるが、これは、ｓａｃＢ遺伝子がスクロースを重合させてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍに対して有毒なレバンを形成するからである（ジャガー、ダブリューら（Ｊａｇｅｒ、Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５４６２〜５４６５、１９９２を参照のこと）。スクロースを含む培地で形質転換体を増殖させる間に、ｓａｃＢにより組換え事象に関する陽性選択が可能となり、その結果、完全な欠失を生じるか、または、組込み型プラスミドの特定の目的遺伝子の誘導的発現を制御するカセット以外の部分全ての除去がもたらされる（ジャガー、ダブリューら（Ｊａｇｅｒ、Ｗ．、ｅｔ  ａｌ．）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：５４６２〜５４６５、１９９２を参照のこと）。ＰＣＲ、および診断用培地上での増殖を使用して、期待される組換え事象がスクロース耐性コロニー中で起こったことを確認した。図５〜１２Ａに、本明細書に記載する欠失プラスミドを示す。
【０３０２】
【表８】
2007525951.tif 000010
【実施例２】
【０３０３】
［アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を増大させるための遺伝子の単離］
アスパルトキナーゼα（ｌｙｓＣ−α）およびβ（ｌｙｓＣ−β）、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ由来のアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるｌｙｓＣ／ａｓｄのホモログ）の野生型対立遺伝子；アスパルトキナーゼ−ａｓｄ（ｌｙｓＣ−ａｓｄ）、ｄａｐＡ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のｈｏｍ、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ  ｆｕｓｃａ由来のｍｅｔＡおよびｍｅｔＹＡ、ならびにＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ由来のｄａｐＡおよびｐｐｃをコードする遺伝子を、それぞれの生物から単離したゲノムＤＮＡを使用するＰＣＲ増幅によって得る。さらに、場合によっては、それぞれの遺伝子に対応する野生型対立遺伝子を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍから単離する。続いてアンプリコンを配列確認用にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩにクローニングし；特定の場合、活性型の対立遺伝子を産生するためにこれらのベクターにおいて部位特異的突然変異誘発も行う。ゲノムＤＮＡは、３７℃で７２時間ＢＨＩ培地において増殖させたＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓから、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ（商品名）を使用して製造者のキット（米国カリフォルニア州ヴァレンシア所在のキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））の推奨に従って単離する。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のゲノムＤＮＡを単離するためには、「塩析法」（キーザー、ティーら（Ｋｉｅｓｅｒ、Ｔ．、ｅｔ．ａｌ．）著「Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、ｐｐ．１６９〜１７０、英国ノリッジ所在のジョン・アイネス・ファウンデーション（Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、２０００年）に記載されている）を、ＴＹＥ培地（ＡＴＣＣ培地１８７７ＩＳＰ培地１）中で２５℃において７日間増殖させた細胞に使用する。
【０３０４】
Ｔ．ｆｕｓｃａからゲノムＤＮＡを単離するためには、５０℃で５日間ＴＹＧ培地（ＡＴＣＣ培地７４１）中において細胞を増殖させる。１００ｍｌの培養物を遠心分離にかけ（５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間）、４０ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０で２回洗浄する。細胞ペレットを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０に懸濁して最終体積４０ｍｌとする。この懸濁液を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｒ）（米国マサチューセッツ州ニュートン所在のミクロフルイディクスコーポレーション（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に１０サイクル通し回収する。この装置を別のバッファー２０ｍｌで洗浄し回収する。溶解した細胞の最終体積は６０ｍｌである。溶解した細胞の懸濁液からイソプロパノール沈殿によってＤＮＡを沈殿させ、ペレットを２ｍｌのＴＥ  ｐＨ８．０に再懸濁する。サンプルをフェノール／クロロホルムで抽出し、ＤＮＡをイソプロパノールでもう１度沈殿させる。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉからＤＮＡを単離するためには、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｉｐ  ５００／Ｇを使用して、大腸菌に関して説明したのと同様に（Ｑｉａｇｅｎのゲノム・プロトコル）ゲノムＤＮＡを調製した。
【０３０５】
Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ−ａｓｄオペロンのＰＣＲ増幅用に、ｌｙｓＣ遺伝子の上流の配列およびａｓｄの停止コドン近くの配列に従いプライマーを設計する。上流プライマーは５’−ＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＡＴＧＴＧＡＣＧ−３’（配列番号：＿）であり、下流プライマーは５’−ＴＣＡＧＡＧＧＴＣＧＧＣＧＧＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＴＧＣ−３’（配列番号：＿）である。１０μｌの１０×Ｃｌｏｎｅｄ  Ｐｆｕバッファー、８μｌのｄＮＴＰ混合物（それぞれ２．５ｍＭ）、２μｌの各プライマー（２０ｕＭ）、１μｌのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ、１０ｎｇのゲノムＤＮＡおよび水を含む最終反応体積１００μｌの反応混合物中で、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、米国カリフォルニア州ラ・ホーヤ所在）を使用して遺伝子を増幅させる。反応条件は、９４℃で２分間、次に９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で９分間のサイクルを２８サイクルとする。４分間７２℃の最終的な伸長反応で反応を終了させ、次いで反応混合物を４℃まで冷却する。得られた産物を、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のゲ
ル抽出プロトコル、次にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ−のＳｍａＩ部位への平滑末端ライゲーションによって精製する。ライゲーション反応物で大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、青色／白色スクリーニングによって選択する。陽性の形質転換体を処理して、キアゲンの方法によってプラスミドＤＮＡを単離し、塩基配列決定する。ＭＢ３９０２が得られたプラスミドであり、このプラスミドは期待通りの挿入物を含んでいる。
【０３０６】
Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ遺伝子を増幅させるためのプライマー対は：５’−ＡＣＣＧＣＡＣＴＴＴＣＣＣＧＡＧＴＧＡＣ−３’（配列番号：＿）と５’−ＴＣＡＴＣＧＴＣＣＧＣＴＣＴＴＣＣＣＣＴ−３’（ｌｙｓＣ−ａｓｄ）（配列番号：＿）；５’−ＡＴＧＧＣＴＣＣＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＣＣ−３’（配列番号：＿）と５’−ＣＧＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＴＧＴＣＧＴ−３’（ｄａｐＡ）（配列番号：＿）；ならびに５’−ＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＡ−３’（配列番号：＿）と５’−ＴＴＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＣＧＣＡ−３’（ｈｏｍ）（配列番号：＿）である。Ｔ．ｆｕｓｃａ由来のｍｅｔＹＡオペロンを増幅させるためのプライマー対は、５’−ＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣＧＣＣＣＧＴＧＴＧＡ−３’（配列番号：＿）と５’−ＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＴＣＡＣＣＧＣＡＣＣ−３’（配列番号：＿）である。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ遺伝子を増幅させるためのプライマー対は５’−ＴＴＧＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＴＡＴＡＧＣＧ−３’（配列番号：＿）と５’−ＣＣＴＧＴＡＣＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＧＡＧ−３’（ｄａｐＡ）（配列番号：＿）；および５’−ＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＡＡＴＡＴＴＣＣＧＣＣＡ−３’（配列番号：＿）と５’−ＴＴＡＧＣＣＧＧＴＡＴＴＧＣＧＣＡＴＣＣ−３’（ｐｐｃ）（配列番号：＿）である。
【０３０７】
遺伝子の増幅は、上記と同様の方法によって、あるいはエッペンドルフ（ドイツ国ハンブルグ、エッペンドルフ所在）のＴｒｉｐｌｅＭａｓｔｅｒ（Ｒ）ＰＣＲシステムを使用することによって行った。平滑末端ライゲーションを行って、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ−のＳｍａＩ部位にアンプリコンをクローニングした。得られたプラスミドはＭＢ３９４７（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｌｙｓＣ−ａｓｄ）、ＭＢ３９５０（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｄａｐＡ）、ＭＢ４０６６（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｈｏｍ）、ＭＢ４０６２（Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＹＡ）、ＭＢ３９９５（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｄａｐＡ）、およびＭＢ４０７７（Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｐｐｃ）であった。これらのプラスミドを用いて、挿入物の配列確認、続いて発現ベクターへのクローニングを実施した。これらのベクターのサブセットにも部位特異的突然変異誘発を施して、特定の遺伝子の脱制御型対立遺伝子を産生させた。
【実施例３】
【０３０８】
［アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生に関与する遺伝子の活性を増大させるための特異的置換］
部位特異的突然変異誘発を、実施例２に記載した異種遺伝子を含む幾つかのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ  ＩＩ−プラスミドに対して行った。部位特異的突然変異誘発は、ストラタジーンのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）部位特異的突然変異誘発キットを使用して行った。異種アスパルトキナーゼ（ｌｙｓＣ／ａｓｋ）遺伝子用には、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質においてＴ３１１Ｉ、Ｓ３０１Ｙ、Ａ２７９Ｐ、およびＧ３４５Ｄアミノ酸置換に対応する置換突然変異体を構築した。これらの置換は、リジンとスレオニンの組合せによるフィードバック阻害を低下させ得る。いずれの場合も、突然変異型のｌｙｓＣ／ａｓｋ対立遺伝子は、異種ａｓｄ遺伝子を有するオペロン中で発現した。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのフィードバック耐性ｌｙｓＣ対立遺伝子を構築するために使用したオリゴヌクレオチドは、：５’−ＧＧＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＡＴＴＣＡＣＧＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧ−３’（配列番号：＿）および５’−ＣＡＣＧＣＧＣＡＣＡＣＧＴＧＡＡＴＡＴＧＡＴＧＴＣＧＧＴＣＴＴＧＣＣ−３’（Ｔ３１１Ｉ）（配列番号：＿）；５’−ＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＴＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡ−３’（配
列番号：＿）および５’−ＴＴＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＡＴＣＴＴＧＴＡＧＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣ−３’（Ｓ３０１Ｙ）（配列番号：＿）；５’−ＧＡＣＧＴＴＣＣＣＧＧＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＡＡＧＧＴＧＴＴＣＣＧＣ−３’（配列番号：＿）および５’−ＧＣＧＧＡＡＣＡＣＣＴＴＧＧＣＧＧＣＧＴＡＧＣＣＧＧＧＡＡＣＧＴＣ−３’（Ａ２７９Ｐ）（配列番号：＿）；ならびに５’−ＧＴＡＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＡＴＣＧ−３’および５’−ＣＧＡＴＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＴＴＧＴＣＧＡＴＧＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＡＣ−３’（Ｇ３４５Ｄ）（配列番号：＿）であった。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのフィードバック耐性ｌｙｓＣ対立遺伝子を構築するために使用したオリゴヌクレオチドは、：５’−ＣＧＧＧＣＣＴＧＡＣＧＧＡＣＡＴＣＲＴＣＴＴＣＡＣＧＣＴＣＣＣＣＡＡＧ−３’（配列番号：＿）および５’−ＣＴＴＧＧＧＧＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＹＧＡＴＧＴＣＣＧＴＣＡＧＧＣＣＣＧ−３’（Ｓ３１４Ｉ／Ｓ３１４Ｖ）（配列番号：＿）；ならびに５’−ＧＴＣＧＴＧＣＡＧＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＧＧＧＣ−３’（配列番号：＿）および５’−ＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＴＡＣＡＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＧＡＣ−３’（Ｓ３０４Ｙ）（配列番号：＿）であった。
【０３０９】
部位特異的突然変異誘発を行って、アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生と関係がある他のタンパク質の脱制御型対立遺伝子を作製することが可能である。例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｈｏｍ遺伝子のＶ５９Ａ、Ｇ３７８Ｅ、またはカルボキシ末端の短縮に対応する、突然変異体を作製することが可能である。Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ（ＴＭ）部位特異的突然変異誘発キット（ビーディーバイオサイエンシズクロンテック（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を使用して、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ置換体（Ｇ３６２Ｅ）を作製した。オリゴヌクレオチド５’−ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＴＣＴＴＡＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号：＿）および５’−ＣＧＡＣＡＡＡＣＣＧＧＡＡＧＴＧＣＴＣＧＣＣＣ−３’（配列番号：＿）を使用して、突然変異体を構築した。部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｔ．ｆｕｓｃａおよびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ遺伝子の特定の対立遺伝子も作製した（本明細書の実施例５および実施例６を参照されたい）。類似の戦略を使用して、経路の他のタンパク質の脱制御型対立遺伝子を構築することも可能である。例えば、オリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＡＴＣＧＡＡＣＡＧＣＧＣＴＣＧＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＣＣ−３’（配列番号：＿）および５’−ＧＧＣＧＧＴＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＡＧＣＧＣＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号：＿）を使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｐｙｃ突然変異体（Ｐ４５８Ｓ）に対応する、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｐｙｃ遺伝子の置換体を作製することが可能である。部位特異的突然変異誘発を使用して、前述の脱制御型ｄａｐＡ対立遺伝子に対応する置換を導入することも可能である。
【０３１０】
次いで、異種遺伝子（およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ遺伝子）の野生型および脱制御型対立遺伝子を、発現に適したベクターにクローニングした。概略的には、オリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲを実施し、遺伝子をＮｃｏＩ−ＮｏｔＩ断片としてクローニングしやすくした。ＤＮＡ配列の分析を行って、増幅期間中に突然変異が導入されなかったことを確認した。場合によっては、同じプロモーターから２つ以上の異種または内在性の遺伝子を発現させるために合成オペロンを構築した。一例として、ｔｒｃＲＢＳプロモーターからＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡ、ｍｅｔＹ、およびｍｅｔＨ遺伝子を発現させるようにプラスミドＭＢ４２７８を作製した。図１２Ｂ〜１２Ｃは、ｔｒｃＲＢＳプロモーターからｍｅｔＨ遺伝子の停止コドンにわたる、ＭＢ４２７８中のＤＮＡ配列を示す。この構築物中の遺伝子の順序はｍｅｔＡＹＨである。図１２Ｂ〜１２Ｃ中、オープンリーディングフレームを大文字で示す。この構築物が、それぞれのオープンリーディングフレームの前に同一のＤＮＡ伸長部分が先行するように作出されていることに留意されたい。この保存的配列は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍタンパク質が効率良く翻訳されやすくするリボソーム結合配列として働く。類似の遺伝子間配列を使用して、他の合成オペロンを
構築した。
【実施例４】
【０３１１】
［ホモセリン・デヒドロゲナーゼの他のスレオニン非感受性突然変異体の単離］
実施例２でＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒからクローニングしたｈｏｍ遺伝子を、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手したＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異誘発キットを使用するエラー・プローン（ｅｒｒｏｒ  ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲに供する。このキットに指定の条件下で、オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＡＣＧＡＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＴＧＣＧＴＡＣＧＣＧＴＣＣＧＣＴ−３’（ＢｂｓＩ部位を含み、切断によりＮｃｏＩに適合する突出部を生じる）（配列番号：＿）、および５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＣＣＣＧＣＡ−３’（ＮｏｔＩ部位を含む）（配列番号：＿）を使用して、プラスミドＭＢ４０６６からｈｏｍ遺伝子を増幅させる。得られた突然変異群をＢｂｓＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＭＢ４０９４プラスミド骨格中にｔｒｃＲＢＳプロモーターを含むＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化したエピソーム性プラスミドにライゲーションし、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２を形質転換する。形質転換した細胞を、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）、２０ｍｇ／ＬのＡＨＶ（α−アミノ、β−ヒドロキシ吉草酸；スレオニン類似体）および０．０１ｍＭのＩＰＴＧを含む、コリネバクテリウム用の指定培地（ギルエ、エスら（Ｇｕｉｌｌｏｕｅｔ、Ｓ．、ｅｔ
ａｌ．）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：３１００〜３１０７、１９９９を参照）を含む寒天プレート上で平板培養する。３０℃で７２時間の後、得られた形質転換体を、スレオニンを補充した指定培地の寒天プレート（予め指標のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−３３１（ｈｏｍ−ｔｈｒＢΔ）の細胞約１０６個を塗り広げたもの）に対してレプリカ平板培養し、ホモセリン放出についてスクリーニングする。フィードバック耐性と推定される突然変異体は、レプリカ平板培養した形質転換体の周囲に指標菌株が輪状に増殖することによって同定される。これらのコロニーのそれぞれから、前述のプライマー対を使用してｈｏｍ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、アンプリコンを前と同様に消化し、前述のエピソーム性プラスミドにライゲーションする。続いて、これらの推定ｈｏｍ突然変異体のそれぞれを用いてＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＡＴＣＣ１３０３２を再度形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび０．０１ｍＭのＩＰＴＧを含む最小培地寒天プレートで平板培養する。それぞれの形質転換体から１つのコロニーを、１０、２０、５０、および１００ｍｇ／ＬのＡＨＶを含むコリネバクテリウム用の指定培地に対してレプリカ平板培養し、該スレオニン類似体に対する最高レベルの耐性に基づいて仕分ける。それぞれの群からの代表を最小培地中でＯＤ２．０まで増殖させ、遠心分離によって細胞を採取し、チャサグノール、シーら（Ｃｈａｓｓａｇｎｏｌｅ、Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５６：４１５〜４２３、２００１中に参照されるのと同様に、２０ｍＭのスレオニンの存在下および不在下においてホモセリン・デヒドロゲナーゼ活性をアッセイする。フィードバック耐性を示す培養物からｈｏｍ遺伝子をＰＣＲ増幅し、塩基配列を決定する。得られたプラスミドを使用して発現プラスミドを作製し、アミノ酸産生を増大させる。
【実施例５】
【０３１２】
［ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）およびＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ（ｍｅｔＹ）の、フィードバック耐性突然変異体の単離］
Ｔ．ｆｕｓｃａからクローニングした異種ｍｅｔＡ遺伝子を、ストラタジーンから入手したＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異誘発キットを使用するエラー・プローンＰＣＲに供する。このキット指定の条件下で、オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＡＧＴＣＡＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣ−３’（ＢｓｐＭＩ部位を含み、切断によりＮｃｏＩに適合する突出部を生じる）（配列番号：＿）、および５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴ−３’（ＮｏｔＩ部位を含む）（配列番号：＿）を使用して、プラスミ
ドＭＢ４０６２からｍｅｔＡ遺伝子を増幅させる。得られた突然変異アンプリコンを消化し、実施例４に記載のＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化したエピソーム性プラスミドにライゲーションし、次いでＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４２８を形質転換する。ＭＡ−４２８は、組込み型プラスミドＭＢ４１９２で形質転換されているＡＴＣＣ１３０３２の誘導体である。組換え事象に関する選択の後、得られる菌株ＭＡ−４２８は、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの脱制御型ｈｏｍ遺伝子が挿入される形でｈｏｍ−ｔｈｒＢが欠失する。上記の形質転換されたＭＡ−４２８細胞を、カナマイシン（２５ｍｇ／Ｌ）、０．０１ｍＭのＩＰＴＧ、および１００μｇ／ｍｌまたは５００μｇ／ｍｌのトリフルオロメチオニン（ＴＦＭ；メチオニン類似体）を含む最小培地寒天プレート上で平板培養する。３０℃で７２時間の後、得られた形質転換体を、予めＡＴＣＣ（＃２０４５２４）から入手した指標菌株Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｂ−７５８８（ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２、ｕｒａ３−５８、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｔｒｐ１−２８９、ｍｅｔ２、ＨＩＳ３＋）の細胞を約１０６個塗り広げた最小寒天プレートでレプリカ平板培養し、Ｏ−アセチルホモセリンの放出に関してスクリーニングする。フィードバック耐性を推定される突然変異体は、Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨ）の放出によって同定されるが、これはＯＡＨの放出によりレプリカ平板培養した形質転換体の周囲に指標菌株が輪状に増殖することができるからである。
【０３１３】
これらの栄養共生コロニーのそれぞれから、前述のプライマー対を使用してｍｅｔＡ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、ＢｓｐＭＩおよびＮｏｔＩで消化し、実施例４に記載したＮｏｔＩ／ＮｃｏＩで消化したエピソーム性プラスミドにライゲーションする。続いて、これらの推定ｍｅｔＡ突然変異対立遺伝子のそれぞれを用いて、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＡＴＣＣ１３０３２を再度形質転換し、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む最小培地寒天プレートで平板培養する。それぞれの形質転換体からの１つのコロニーを、１００、２００、５００、および１０００μｇ／ｍｌのＴＦＭならびに０．０１ｍＭのＩＰＴＧを含む最小培地でレプリカ平板培養し、該メチオニン類似体に対する最高レベルの耐性に基づいて仕分ける。それぞれの群からの代表を最小培地中でＯＤ２．０まで増殖させ、細胞を遠心分離によって採取し、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を、２０ｍＭのメチオニンまたはＳ−ＡＭの存在下および不在下において、クレディッヒおよびトムキンス（ＫｒｅｄｉｃｈおよびＴｏｍｋｉｎｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：４９５５〜４９６５、１９６６）によって記載された方法によって測定する。フィードバック耐性を示す培養物からｍｅｔＡ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、塩基配列を決定する。得られたプラスミドを使用して発現プラスミドを作製し、アミノ酸産生を増大させる。
【０３１４】
同様の方法で、Ｔ．ｆｕｓｃａ由来のｍｅｔＹ遺伝子を突然変異誘発ＰＣＲに供する。オリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＧＣＡＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧ−３’（ＢｓａＩ部位を含み、切断によりＮｃｏＩに適合する突出部を生じる）（配列番号：＿）、および５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＧＧＴＡＴＧＣＣＴＴＧＧＣＴＧ−３’（ＮｏｔＩ部位を含む）（配列番号：＿）を用いて、前述と同様のエピソーム性プラスミドへのクローニング、およびストラタジーンから入手したＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異誘発キットの仕様書に従い突然変異誘発反応を行う。主な違いは、高レベルのＯ−アセチルホモセリンを既に産生しているＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株を、突然変異ｍｅｔＹ群で形質転換することである。この菌株ＭＩＣｍｅｔ２は、ｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下に前述の脱制御型Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＡ対立遺伝子を含むプラスミドＭＢ４２８６の改変型で、ＭＡ−４２８を形質転換することによって構築する。形質転換後、ｓａｃＢ選択システムにより、内在性ｍｃｂＲ遺伝子座の欠失、および脱制御型の異種ｍｅｔＡ対立遺伝子による置換が可能となる。
【０３１５】
Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＹ変異体で形質転換されたＭＩＣｍｅｔ２菌株を、２５ｍｇ／
Ｌのカナマイシン、０．２５ｍＭのＩＰＴＧ、および阻害濃度の毒性メチオニン類似体（例えば、エチオニン、セレノメチオニン、ＴＦＭ）を含む最小寒天プレート上に塗り広げる。形質転換体は、これら３つの異なるメチオニン類似体の個別あるいは二重または三重の組合せの存在下で増殖し得る。選択プレート上で増殖するコロニーからｍｅｔＹ遺伝子を増幅させ、アンプリコンを消化し、実施例４に記載したエピソーム性プラスミドにライゲーションし、得られたプラスミドでＭＩＣｍｅｔ２を形質転換する。形質転換体を、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含む最小培地寒天プレート上で増殖させる。得られたコロニーを、１０倍程度の毒性メチオニン類似体（エチオニン、ＴＦＭ、およびセレノメチオニン）（および０．０１ｍＭのＩＰＴＧ）を含む寒天プレート上でレプリカ平板培養し、類似体への感受性に基づいて仕分ける。それぞれの群からの代表を最小培地中でＯＤ２．０まで増殖させ、細胞を遠心分離によって採取し、Ｏ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼの酵素活性を、２０ｍＭのメチオニンの存在下または不在下において、クレディッヒおよびトムキンス（ＫｒｅｄｉｃｈおよびＴｏｍｋｉｎｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：４９５５〜４９６５、１９６６）（実施例９参照）の方法の変法によって測定する。フィードバック耐性を示す培養物からｍｅｔＹ遺伝子をＰＣＲ増幅させ、塩基配列決定する。得られたプラスミドを使用して発現プラスミドを作製し、アミノ酸産生を増大させる。Ｔ．ｆｕｓｃａ由来のフィードバック耐性のｍｅｔＹおよびｍｅｔＡ変異体を含む発現プラスミドは以下のように構築する。Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＹＡオペロンは、オリゴヌクレオチド５’−ＣＡＣＡＣＡＣＡＴＧＴＣＡＣＴＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＡＧＣ−３’（ＰｃｉＩ部位を含み、切断によりＮｃｏＩに適合する突出部を生じる、また、第２のコドンをＡｌａ＞Ｓｅｒに変える）（配列番号：＿）、および５’−ＡＴＡＡＧＡＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＴ−３’（ＮｏｔＩ部位を含む）（配列番号：＿）を使用して増幅させる。アンプリコンをＰｃｉＩおよびＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩ、ＨａｅＩＩＩメチラーゼ、およびＮｃｏＩで連続的に処理した前述のエピソーム性プラスミドに、消化断片をライゲーションする。ストラタジーンのＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｒ）部位特異的突然変異誘発キットを使用して行う、部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡおよびｍｅｔＹの上記置換突然変異体を、オペロンとして脱制御型対立遺伝子を発現する１つのプラスミド中に取り込ませる。得られたプラスミドを使用して、アミノ酸産生を増大させる。
【０３１６】
最小培地：脱イオン水（ｐＨ７．２）１リットル当たり、１０ｇのスクロース、１ｇのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、０．２ｇのＫＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、３０μｇのビオチン、および１ｍｌのＴＥ。微量元素溶液（ＴＥ）は、脱イオン水１リットル当たり、８８ｍｇのＮａ２Ｂ４Ｏ７−１０Ｈ２Ｏ、３７ｍｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２７−４Ｈ２Ｏ、８．８ｍｇのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２７０ｍｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、７．２ｍｇのＭｎＣｌ２−４Ｈ２Ｏ、および９７０ｍｇのＦｅＣｌ３−６Ｈ２Ｏを含む（栄養要求性の要件を満たすことが必要であるときは、アミノ酸およびプリンを終濃度３０ｍｇ／Ｌまで補う）。
【実施例６】
【０３１７】
［細菌アミノ酸配列中のＳ−ＡＭ結合残基の同定］
アミノ酸産生を制御する多くの酵素は、Ｓ−ＡＭによるアロステリック性フィードバック阻害を受ける。本発明者らは、（例えば、Ｓ−ＡＭの結合またはＳ−ＡＭ誘導型アロステリック効果に対する耐性を介して）Ｓ−ＡＭ制御に対する耐性を有するこれらの酵素の変異体は、フィードバック阻害に耐性が有するであろうと仮定した。細菌ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ中のＳ−ＡＭ結合モチーフが同定されている（ロスら（Ｒｏｔｈ  ｅｔ
ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３：１７３３３〜１７３４２、１９９８）。ロスら（Ｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．）は、ＥｃｏＲＶ  α−アデニン−Ｎ６−ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ中の、該酵素によるＳ−ＡＭ結合に重要と思われる高度に保存されたアミノ酸モチーフを同定した。本発明者らはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの以下のタンパ
ク質：ＭｅｔＡ、ＭｅｔＹ、ＭｃｂＲ、ＬｙｓＣ、ＭｅｔＢ、ＭｅｔＣ、ＭｅｔＥ、ＭｅｔＨ、およびＭｅｔＫのアミノ酸配列中の関連モチーフを検索した。Ｓ−ＡＭ結合モチーフと推定されるモチーフが、ＭｅｔＡ、ＭｅｔＹ、ＭｃｂＲ、ＬｙｓＣ、ＭｅｔＢ、ＭｅｔＣ、ＭｅｔＨ、およびＭｅｔＫ中で同定された。酵母菌タンパク質中のＳ−ＡＭ結合モチーフと類似している、ｍｅｔＹ中の付加的残基も同定した（ピンタードら（Ｐｉｎｔａｒｄ．ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２０（４）：１３７０〜１３８１、２０００）。
【０３１８】
Ｓ−ＡＭの結合に関与する可能性のある各タンパク質の残基を、表９に列挙する。
【０３１９】
【表９】
2007525951.tif 000011
【０３２０】
2007525951.tif 000012
【０３２１】
他の生物種由来のＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ配列のアラインメントを使用して、Ｓ−ＡＭ結合に関与すると推定される別の残基を同定した。これらの残基を表１０に列挙する。
【０３２２】
【表１０】
2007525951.tif 000013
【０３２３】
ＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ遺伝子を、実施例２中に記載されたのと同様にＣ．ｇｌｕｔａ
ｍｉｃｕｍおよびＴ．ｆｕｓｃａからクローニングした。表１１は、ＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ遺伝子の野生型および突然変異対立遺伝子を発現させるために使用したプラスミドおよび菌株を列挙する。表１２および１３は、発現用に使用したプラスミド、ならびにＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ変異体を作製するための部位特異的突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチドを列挙する。
【実施例７】
【０３２４】
［ＭｅｔＡおよびＭｅｔＹアッセイ用のタンパク質抽出物の調製］
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのシングルコロニーを種培養培地に接種し（以下の実施例１０参照）、３３℃で攪拌しながら２４時間増殖させた。この種培養物を生産用大豆培地（４０ｍＬ）（実施例１０）中で１：２０に希釈し、８時間増殖させた。遠心分離により回収した後、ペレットを等体積の水で１回洗浄した。２５０μｌの溶解バッファー（１ｍｌのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．５、０．５ｍｌの１Ｍ  ＫＯＨ、１０μｌの０．５Ｍ
ＥＤＴＡ、水を加えて５ｍｌとしたもの）、３０μｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル、および等体積の酸で洗浄した０．１ｍｍガラス・ビーズ中にペレットを再懸濁させた。この混合物を、渦流混合してから氷上に１５秒間置き、これを８回繰り返した。４，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離処理後、上清を除去し、１０，０００ｒｐｍで２０分間再度遠心分離にかけた。ブラッドフォード・アッセイを使用して、透明な上清中のタンパク質濃度を測定した。
【実施例８】
【０３２５】
［エピソーム性プラスミドを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株中のＭｅｔＡ活性の定量］
内在性ｍｅｔＡ遺伝子およびエピソーム性ｍｅｔＡ遺伝子を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中のＭｅｔＡ活性を測定した。クレディッヒおよびトムキンス（ＫｒｅｄｉｃｈおよびＴｏｍｋｉｎｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１（２１）：４９５５〜４９６５、１９６６）によって記載されたプロトコルを使用して、粗製タンパク質抽出物中のＭｅｔＡ活性をアッセイした。タンパク質抽出物の調製については実施例７に記載する。簡潔に述べれば、１μｇのタンパク質抽出物をマイクロタイタープレートに加えた。該マイクロタイタープレートの各ウエルに、反応混合物（２５０μｌ；１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、２ｍＭの５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮ）、２ｍＭのＥＤＴＡナトリウム、２ｍＭのアセチルＣｏＡ、２ｍＭのホモセリン）を加えた。反応工程中、ＭｅｔＡ活性によりＣｏＡがアセチル−ＣｏＡから遊離する。ジスルフィド交換がＣｏＡとＤＴＮの間で起こり、チオニトロ安息香酸が産生する。チオニトロ安息香酸の産生を、分光光度計によって追跡する。４１２ｎｍにおける吸光度を、５分毎に３０分間測定した。タンパク質抽出物を含まないウエルを対照として含めた。ＭｅｔＡ活性の阻害は、Ｓ−アデノシルメチオニン（Ｓ−ＡＭ；０．０２ｍＭ、０．２ｍＭ、２ｍＭ）およびメチオニン（０．５ｍＭ、５ｍＭ、５０ｍＭ）を加えることによって測定した。反応混合物をタンパク質抽出物に加える前に、阻害剤を反応混合物に直接加えた。
【０３２６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を、内在性ならびにエピソーム性のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ遺伝子を含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４４２およびＭＡ−４４９由来の粗製タンパク質抽出物中で測定した。エピソーム性のｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ遺伝子は合成オペロンとして発現された；ｍｅｔＡＹオペロンの核酸配列は図１２Ｂ〜１２ＣのｍｅｔＡＹＨオペロンに示す通りであるが、ｍｅｔＨ配列のみを欠いている。ｔｒｃＲＢＳプロモーターを、これらのエピソーム性プラスミド中で使用した。ＭＡ−４４２は、ｍｅｔＡ−ｍｅｔＹの順でエピソーム性遺伝子を発現する。ＭＡ−４４９は、ｍｅｔＹ−ｍｅｔＡの順でエピソーム性遺伝子を発現する。プラスミド上に存在するＭｅｔＡおよびＭｅｔＹ遺伝子の発現を誘導するＩＰＴＧの存在下および不在下で、実験を行った。図１３はＭｅｔＡ活性の経時変化を示す
。８時間および２０時間培養物由来のサンプルでは、遺伝子がＭｅｔＡ−ＭｅｔＹ（ＭＡ−４４２）の配置であったときのみ、ＭｅｔＡ活性が観察された。対照的に、菌株ＭＡ−４４９（ＭｅｔＹ−ＭｅｔＡ）由来の抽出物中のＭｅｔＡ活性は、誘導の有無に関わらず、８時間および２０時間の時点において、タンパク質を含まない対照サンプルに対して有意に増大することはなかった。このデータは、これら２つの遺伝子がｍｅｔＹ−ｍｅｔＡの配置である場合ｍｅｔＡの発現が低いことを示したノーザン・ブロット分析と一致する。
【０３２７】
次に、菌株ＭＡ−４４２由来の抽出物のフィードバック阻害に対する感度を試験した。ＭＡ−４４２抽出物を、５ｍＭのメチオニン、０．２ｍＭのＳ−ＡＭの存在下、あるいはメチオニンまたはＳ−ＡＭを付加せずにアッセイし、ＭｅｔＡ活性は前に記載したのと同様にアッセイした。図１４中に示したように、５ｍＭのメチオニンおよび０．２ｍＭのＳ−ＡＭの存在下でＭｅｔＡ活性が低下した。したがって、ＭｅｔＡのアロステリック抑制を低減することによりＭｅｔＡ活性が増大し、より高レベルのメチオニンの産生が可能になりうる。アロステリック抑制は一層低レベルのメチオニンまたはＳ−ＡＭでも観察されると考えられる。それにもかかわらず、試験したレベルは、メチオニンなどのアミノ酸を産生するために作出した菌株中で生理学的に適切なレベルである。Ｔ．ｆｕｓｃａのエピソーム性ＭｅｔＡを発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株（菌株ＭＡ−５７８およびＭＡ−５７９）、またはＴ．ｆｕｓｃａのエピソーム性ＭｅｔＡとＭｅｔＹの両方を発現する菌株（菌株ＭＡ−４５６およびＭＡ−５７０）を構築し、これらの菌株から抽出物を調製し、ＭｅｔＡ活性に関してアッセイした。それぞれのエピソーム性遺伝子と関係がある制御要素を表１２に列挙する。それぞれの菌株の抽出物中のＭｅｔＡ活性の変化率は、タンパク質１ｎｇ当たりの時間で割ったＯＤ４１２の変化を計算することによって測定した。これらのアッセイの結果は図１５に示す。図１５は菌株ＭＡ−５７８が誘導条件下で約２．７５単位（ＯＤ４１２の変化／時間／１ｎｇタンパク質）の変化率を示し、一方で非誘導条件下での変化率は約１であったことを示している。菌株ＭＡ−５７９は誘導条件下で約２．５の変化率を示し、非誘導条件下では約０．４の変化率を示した。構成的プロモーターの制御下でｍｅｔＡおよびｍｅｔＹを発現する菌株ＭＡ−４５６は、約２．２の変化率を示した。菌株ＭＡ−５７０は誘導条件下で約１の変化率、非誘導条件下では約０．３の変化率を示した。陰性対照サンプル（タンパク質なし）は約０．１の変化率を示した。これらのデータは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＴ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡのエピソームによる発現は、ＭｅｔＡ活性の変化率を増大させることを示す。その増大は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＭｅｔＡのエピソームによる発現に関して観察した増大と類似していた。
【実施例９】
【０３２８】
［エピソーム性プラスミドを含むＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株中のＭｅｔＹ活性の定量］
数種類のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株における、Ｔ．ｆｕｓｃａのエピソーム性ＭｅｔＹのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を測定した。クレディッヒおよびトムキンス（ＫｒｅｄｉｃｈおよびＴｏｍｋｉｎｓ）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１（２１）：４９５５〜４９６５、１９６６）の改変型プロトコルを使用して、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの粗製タンパク質抽出物中のＭｅｔＹ活性をアッセイした。粗製タンパク質抽出物は、記載したのと同様に調製した。簡潔に述べると、９００μｌの反応混合物（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭの硫化ナトリウム９水和物（Ｎａ２Ｓ）、０．２ｍＭのピリドキサール−５−リン酸（ＰＬＰ））を、４５μｇのタンパク質抽出物と混合した。ゼロ時点で、Ｏ−アセチルホモセリン（ＯＡＨ；トロントリサーチケミカルズインコーポレイテッド社（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ））を、０．６２５ｍＭの終濃度となるように加えた。ゼロ時点における反応混合物をすぐに２００μｌ採取した。反応混合物の残りは３０℃でインキュベートした。１０分間隔で３
回２００μｌサンプルを採取した。３０℃から取り出した直後に、１２５μｌの１ｍＭ亜硝酸を加えることによってホモシステインのチオール基をニトロソ化してＳ−ニトロソチオールを形成させて、反応を停止させた。５分後、（過剰の亜硝酸を除去する）３０μｌの０．５％スルファミン酸アンモニウムを加え、サンプルを攪拌した。２分後、４００μｌの検出溶液（０．４Ｎ  ＨＣｌ中の１％ＨｇＣｌ２を１部、０．４Ｎ  ＨＣｌ中の３．４４％スルファニルアミドを４部、０．４Ｎ  ＨＣｌ中の０．１％１−ナフチルエチレンジアミン２塩酸塩を２部）を加え、溶液を攪拌した。水銀イオンの存在下において、Ｓ−ニトロソチオールが迅速に分解して亜硝酸を生じ、スルファニルアミドをジアゾ化し、これがナフチルエチレンジアミンと結合して発色団として安定したアゾ染料を生じる。５分後、溶液をマイクロタイター皿に移し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。タンパク質抽出物を含まない反応物を対照として含めた。
【０３２９】
これらのアッセイの結果を図１６に示す。構成的プロモーターの制御下においてエピソーム性のＴ．ｆｕｓｃａの野生型ｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ対立遺伝子を発現する菌株ＭＡ−４５６は、０．０４の変化率を示した。誘導型プロモーターの制御下においてエピソーム性のＴ．ｆｕｓｃａの野生型ｍｅｔＡおよびｍｅｔＹ対立遺伝子を発現する菌株ＭＡ−５７０は、誘導条件下で約０．０３８の変化率、非誘導条件下では０．０１未満の変化率を示した。したがって、異種ＭｅｔＹの発現は、内在性ＭｅｔＹの酵素活性より有意に高い酵素活性をもたらす。
【０３３０】
【表１１】
2007525951.tif 000014
【０３３１】
2007525951.tif 000015
【０３３２】
【表１２】
2007525951.tif 000016
【０３３３】
【表１３】
2007525951.tif 000017
【実施例１０】
【０３３４】
［アスパラギン酸由来のアミノ酸を産生および検出するための方法］
アスパラギン酸由来のアミノ酸を振とうフラスコで産生するために、それぞれの菌株を寒天プレートから１２５ｍｌのエルレンマイヤー・フラスコ中の１０ｍｌの種培養培地に接種した。この種培養物を、２５０ｒｐｍの振とう装置で３１℃にて１６時間インキュベートした。アミノ酸の産生を調べるための培養物は、１２５ｍｌのエルレンマイヤー・フラスコ中の１０ｍｌのバッチ生産培地で種培養物を１：２０に希釈することによって調製した。適切な場合、ＩＰＴＧを１連の培養物に加えて、ＩＰＴＧ制御型遺伝子の発現を誘導した（終濃度０．２５ｍＭ）。メチオニン発酵は、攪拌しながら（２５０ｒｐｍ）３１℃で６０〜６６時間行った。本明細書で報告する試験に関しては、ほぼ全ての場合、複数の形質転換体を並行して発酵産生し、各形質転換体は２連で増殖させることが多かった。報告されている大部分のデータ・ポイントは、代表的な形質転換体、および同時に増殖させた対照菌株に関する少なくとも２回の発酵の平均を表している。
【０３３５】
培養後、得られたブロス中のアミノ酸レベルを液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣＭＳ）を使用して測定した。約１ｍｌの培養物を採取し、遠心分離にかけて細胞および粒子状残骸をペレット状にした。得られた上清画分を、０．１％ギ酸水溶液で１：５０００に希釈し、１０μＬ分を逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）のＡｔｌａｎｔｉｓ（Ｒ）Ｃ１８、２．１×１５０ｍｍ）に注入した。０．１％ギ酸／アセトニ
トリル（「Ｂ」）と０．１％ギ酸／水（「Ａ」）の勾配混合物（１％Ｂ→５０％Ｂ（４分間）、５０％Ｂ（０．２分間）、５０％Ｂ→１％（１分間）、１％（１．８分間））を使用して、０．３５０ｍＬ／分の流速で化合物を溶出させた。正イオンのエレクトロスプレーイオン化を使用して、三連四重極型質量分析装置を用いて溶出化合物を検出した。この装置をＭＲＭ様式で操作して、アミノ酸を検出した（リジン：１４７→８４（１５ｅＶ）；メチオニン：１５０→１０４（１２ｅＶ）；スレオニン／ホモセリン：１２０→７４（１０ｅＶ）；アスパラギン酸：１３４→８８（１５ｅＶ）；グルタミン酸：１４８→８４（１５ｅＶ）；Ｏ−アセチルホモセリン：１６２→１０２（１２ｅＶ）；およびホモシステイン：１３６→９０（１５ｅＶ））。場合によっては、類似の方法を使用して他のアミノ酸を定量した（例えばホモシスチン、グリシン、Ｓ−アデノシルメチオニン）。同一条件下で注入したアミノ酸標準物との比較によって、個々のアミノ酸を定量した。この質量分析法を使用することによって、ホモセリンとスレオニンを区別することは不可能である。したがって必要な場合は、蛍光標識を用いてサンプルをさらに誘導体化し、液体クロマトグラフィーおよび蛍光検出に供した。この方法を使用してホモセリンおよびスレオニンを解析し、かつＬＣＭＳ法を使用して測定した濃度を確認した。
【０３３６】
［生産アッセイ用の種培養培地］
グルコース          １００ｇ／Ｌ
酢酸アンモニウム    ３ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４          １ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４−４Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ
ビオチン            ５０μｇ／Ｌ
チアミン−ＨＣｌ    ２００μｇ／Ｌ
大豆タンパク質      １５ｍｌ／Ｌ
加水分解産物（合計窒素７％）
酵母エキス          ５ｇ／Ｌ
ｐＨ７．５
［生産アッセイ用のバッチ生産培地］
グルコース          ５０ｇ／Ｌ
（ＮＨ４）２ＳＯ４    ４５ｇ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４          １ｇ／Ｌ
ＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  ０．４ｇ／Ｌ
ＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ
ＭｎＳＯ４−４Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ
ビオチン            ５０μｇ／Ｌ
チアミン−ＨＣｌ    ２００μｇ／Ｌ
大豆タンパク質      １５ｍｌ／Ｌ
加水分解産物（合計窒素７％）
ＣａＣＯ３          ５０ｇ／Ｌ
コバラミン          １μｇ／ｍｌ
ｐＨ７．５
（リジンが生産対象のアスパラギン酸由来のアミノ酸であるとき、コバラミン添加は必要ない）
【実施例１１】
【０３３７】
［異種の野生型ｌｙｓＣおよび突然変異型ｌｙｓＣは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍにおいてリジン産生を増大させる］
アスパルトキナーゼは、コリネバクテリウム中でのリジン産生の律速活性であることが
多い。アスパルトキナーゼ活性を制御するための主な機構は、リジンとスレオニンの組合せによるアロステリック制御である。アスパルトキナーゼおよびアスパラギン酸セミアルデヒド・デヒドロゲナーゼをコードする異種オペロンを、実施例２に記載したのと同様にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒからクローニングした。部位特異的突然変異誘発を使用して、脱制御型の対立遺伝子を作製し（実施例３参照）、これらの改変型遺伝子をコリネバクテリウム中での発現に適したベクター中に挿入した（実施例１）。得られたプラスミドおよび野生型の相当物を、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ野生型菌株ＡＴＣＣ１３０３２およびＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ野生型菌株ＡＴＣＣ１３８６９を含めた菌株に形質転換し、これらをリジン産生に関して分析した（図１７）。
【０３３８】
菌株ＭＡ−００１４、ＭＡ−００２５、ＭＡ−００２２、ＭＡ−００１６、ＭＡ−０００８およびＭＡ−００１９は、ＭＢ３９６１骨格を有するプラスミドを含む（実施例１参照）。生産用培地にＩＰＴＧを加えて、野生型または脱制御型の異種ｌｙｓＣ−ａｓｄオペロンの発現を増大させると、リジンの産生が促進された。菌株ＡＴＣＣ１３８６９は、これらの菌株の形質転換していない対照株である。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのＳ３０１Ｙ、Ｔ３１１Ｉ、およびＧ３４５Ｄ対立遺伝子を含むプラスミドは、リジン産生の増大において最も有効であり、これらの対立遺伝子を改良型ベクターによる発現用に選択した。脱制御型のＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓの対立遺伝子を含む改良型ベクターで、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＡＴＣＣ１３０３２）を形質転換して、菌株ＭＡ−０３３３、ＭＡ−０３３４、ＭＡ−０３３６、ＭＡ−０３６１、およびＭＡ−０３６２を作製した（プラスミドはｔｒｃＲＢＳプロモーターまたはｇｐｄプロモーターのいずれかと、ＭＢ４０４９骨格を含む；実施例１参照）。菌株ＡＴＣＣ１３０３２（Ａ）は、形質転換されていない、菌株ＭＡ−０３３３、ＭＡ−０３３４およびＭＡ−０３３６の対照株である。菌株ＡＴＣＣ１３０３２（Ｂ）は、形質転換されていない、菌株ＭＡ−０３６１およびＭＡ−０３６２の対照株である。菌株ＭＡ−０３３３、ＭＡ−０３３４、ＭＡ−０３３６、ＭＡ−０３６１、およびＭＡ−０３６２はいずれも、リジン産生の改善を示した。例えば菌株ＭＡ−０３３４は、５０ｇ／Ｌグルコースから２０ｇ／Ｌを超えるリジンを産生した。さらに、Ｔ３１１ＩおよびＧ３４５Ｄ対立遺伝子は、ｔｒｃＲＢＳプロモーターまたはｇｐｄプロモーターから発現されると有効であることが示された。
【実施例１２】
【０３３９】
［Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍＧ３６２Ｅ変異体は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１においてホモセリンへの炭素の流れを増大させる］
実施例１１に示したように、アスパルトキナーゼの脱制御によって、アスパラギン酸由来のアミノ酸への炭素の流れが増大した。原理上、アスパルトキナーゼ活性は、脱制御型ｌｙｓＣ対立遺伝子を使用することによって、かつ／あるいはアロステリック制御を仲介する小分子（リジンまたはスレオニン）の排除によって、増大させることが可能であると思われる。図１８（菌株ＭＡ−０３３１）は、ｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座が不活性化されると、高レベルのリジンがブロス中に蓄積したことを示す。ＨｏｍおよびｔｈｒＢは、スレオニンの産生に必要とされる２つのタンパク質、ホモセリン・デヒドロゲナーゼおよびホモセリン・キナーゼをそれぞれコードする。ｔｈｒＢ遺伝子のみが欠失した場合は、リジンの蓄積も観察された（図２１中の菌株ＭＡ−０９３３を参照（ＭＡ−０９３３は１例であるが、ＭＡ−０９３３とＭＡ−０３３１を直接比較することは適切ではない。何故ならこれらの菌株の遺伝的背景は異なるからである）。
【０３４０】
メチオニン経路の中間体への炭素の流れを増大させるために、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ遺伝子の脱制御型と推定される変異体で、ＭＡ−０３３１を形質転換した。同様の戦略を使用して、ｔｈｒＢ欠失のみを含む菌株を作出した。菌株ＭＡ−０３８４、ＭＡ−０３８６、およびＭＡ−０３８９は、それぞれｒｐｌＭ、ｇｐｄ、およびｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下にあるＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍＧ３６２Ｅ変異体を含
む。これらのプラスミドは、部位特異的突然変異誘発法の一部として導入した他の置換（Ｇ４３Ｓ）も含むが、その後の実験から、Ｇ４３Ｓ置換はＨｏｍ活性を増大させないことが示唆された。図１８は、菌株ＭＡ−０３３１、ＭＡ−０３８４、ＭＡ−０３８６、およびＭＡ−０３８９を使用して行った振とうフラスコの実験の結果を示すが、該実験では、リジンおよびホモセリンなどのアスパラギン酸由来のアミノ酸に関してブロスを分析した。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍＧ３６２Ｅ遺伝子を発現する菌株は、リジン産生の劇的な低下、およびホモセリンのレベルの有意な増大を示す。ブロスのホモセリンのレベルは、ＭＡ−０３８９などの菌株中では５ｇ／Ｌを超えていた。ホモセリンの有意なレベルは細胞内で依然として保たれており、一部のホモセリンは他の産物に転換されたと考えられる。ｈｏｍならびにｈｏｍ下流の脱制御型ｌｙｓＣおよび他の遺伝子の過剰発現は、メチオニンを含めたホモセリン系アミノ酸の産生を増大させる可能性がある（以下参照）。
【実施例１３】
【０３４１】
［異種のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）酵素は、アスパラギン酸由来のアミノ酸への炭素の流れを増大させる］
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｐｃ）、およびピルビン酸カルボキシラーゼ（Ｐｙｃ）はオキサロ酢酸（ＯＡＡ）、すなわちアスパラギン酸由来のアミノ酸産生に直接供給されるクエン酸サイクルの中間体の合成を触媒する。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉの野生型ｐｐｃ遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導型ｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下にある発現ベクターにクローニングした。このプラスミドで、リジン高産生菌株ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３を形質転換した（図１９）。菌株をＩＰＴＧの不在下または存在下で増殖させ、アスパラギン酸を含めたアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生に関して分析した。菌株ＭＡ−０３３１はｈｏｍ−ｔｈｒＢΔ突然変異を含み、一方ＭＡ−０４６３は、欠失したｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座にＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンが組み込まれている。このｌｙｓＣ−ａｓｄオペロンはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｇｐｄプロモーターの制御下にある。図１９は、Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉのｐｐｃ遺伝子が、アスパラギン酸の蓄積を増大させたことを示す。この違いは、利用可能なアスパラギン酸の大部分をリジンに転換した菌株中でも検出可能であった。
【実施例１４】
【０３４２】
［異種のジヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）酵素は、リジン産生を増大させる］
ジヒドロジピコリン酸シンターゼは、炭素をホモセリン系アミノ酸の産生ではなくリジンの生合成へと向かわせる分岐点の酵素である。ＤａｐＡはアスパラギン酸−Ｂ−セミアルデヒドを、２，３−ジヒドロジピコリン酸に転換する。Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉおよびＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒの野生型ｄａｐＡ遺伝子を、ｔｒｃＲＢＳおよびｇｐｄプロモーターの制御下の発現ベクターにクローニングした。得られたプラスミドで、高レベルのリジンを産生するように作出された２つの菌株、菌株ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３を形質転換した（実施例１３参照）。Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンの発現を増大させるために、ＭＡ−０４６３を作出した。この操作により、ＤａｐＡ触媒反応の基質であるアスパラギン酸−Ｂ−セミアルデヒドの産生が誘導されると予想される。菌株ＭＡ−０４８１、ＭＡ−０４８２、ＭＡ−０４７２、ＭＡ−０５０１、ＭＡ−０５０２、ＭＡ−０４９２、ＭＡ−０４９７を振とうフラスコ中で増殖させ、リジンを含めたアスパラギン酸由来のアミノ酸に関してブロスを分析した。図２０に示すように、Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉまたはＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｄａｐＡ遺伝子の発現増大によって、ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３をバックグランドとしたうえでのリジン産生が増大する。菌株ＭＡ−０５０２は、５０ｇ／Ｌグルコースの工程でほぼ３５ｇ／Ｌのリジンを産生した。これらの異種ｄａｐＡ遺伝子の脱制御型変
異体を構築することによって、さらなるリジン改良体を作出することが可能であろう。
【実施例１５】
【０３４３】
［高レベルのホモセリンを産生する菌株の構築］
高レベルのホモセリン系アミノ酸を産生する菌株は、遺伝子工学的手法と突然変異誘発法の組合せによって作製することが可能である。１例として、５つの異なる遺伝的操作を行って、＞１０ｇ／Ｌのホモセリンを産生するＭＡ−１３７８菌株を構築した（図２１）。ＭＡ−１３７８を作製するために、野生型Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍを、最初にニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による突然変異誘発（Ｊ．Ｈ．ミラー（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ）著「Ａ  ｓｈｏｒｔ  ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」、コールドスプリングハーバー出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９２年、１４３ページ中に記載された手順に基づく）、次に高レベルのエチオニン（毒性のメチオニン類似体）を含む最小プレート上で増殖したコロニーの選択を実施して突然変異させた。次いで、プラスミドＭＢ４１５４を使用して得られたエチオニン耐性菌株の１つ（ＭＡ−０４２２）において内在性のｍｃｂＲ遺伝子座を欠失させ、菌株ＭＡ−０６２２を作製した。ＭｃｂＲは、メチオニンなどのイオウ含有アミノ酸の産生に必要とされる幾つかの遺伝子の発現を制御する転写抑制因子である（レイ、ディー、エー、ピューラー、エー、およびカリノフスキー、ジェー（Ｒｅｙ、Ｄ．Ａ．、Ｐｕｈｌｅｒ、Ａ．およびＫａｌｉｎｏｗｓｋｉ、Ｊ．、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０３：５１〜６５、２００３）を参照のこと）。幾つかの場合、ＭｃｂＲの不活性化によってホモセリン系アミノ酸のレベルが上昇した菌株が作製されたことが観察された。プラスミドＭＢ４０８４を使用してＭＡ−０６２２のｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させるとリジンおよびホモセリンの蓄積を引き起こしたが、メチオニンおよびメチオニン経路の中間体もそれより低い程度で蓄積した。この操作によりＭＡ−０９３３が得られた。前に記載したように、リジンおよびホモセリンの蓄積は、スレオニン産生の欠如によるｌｙｓＣの脱制御の結果であったと考えられる。アスパラギン酸−Ｂ−セミアルデヒドおよび下流のアミノ酸への炭素の流れをさらに最適化するために、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンを発現するエピソーム性プラスミドでＭＡ−０９３３を形質転換した（菌株ＭＡ−１１６２）。次いで、ホモセリン高産生菌株ＭＡ−１１６２を、ＮＴＧを用いて突然変異誘発し、通常増殖を阻害するレベルの塩化メチオニンメチルスルホニウム（ＭＭＳＣ）を含む最小培地プレート上でコロニーを選択した。ＭＡ−１３７８は、このようなＭＭＳＣ耐性菌株の１つであった。
【実施例１６】
【０３４４】
［異種のホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）酵素は、ホモセリン系アミノ酸への炭素の流れを増大させる］
ＭｅｔＡは、メチオニン生合成を行う工程の酵素である。Ｔ．ｆｕｓｃａの野生型ｍｅｔＡ遺伝子を、発現ベクターのｔｒｃＲＢＳプロモーター制御下にクローニングした。このプラスミドで、ホモセリン高産生菌株を形質転換して、ＭｅｔＡ活性の増大を試験した（図２２および２３）。ＭＡ−０４２８、ＭＡ−０９３３、およびＭＡ−１５１４は、ホモセリン高産生菌株の例であった。ＭＡ−０４２８は、プラスミドＭＢ４１９２（実施例１参照）で処理してｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）発現カセットを組み込んだ、野生型ＡＴＣＣ１３０３２の誘導体である。ノボビオシンを使用して菌株ＭＡ−１３７８からＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロン・プラスミドを脱落させることによって、ＭＡ−１５１４を構築した。この操作を行って、Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡ遺伝子および選択可能なｋａｎＲマーカーを含むエピソーム性プラスミドによる形質転換を可能にした。菌株ＭＡ−１５５９は、ｔｒｃＲＢＳプロモーターの制御下にあるＴ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡ遺伝子を用いた菌株ＭＡ−１５１４の形質転換から得られた。ＭＡ−０９３３については、実施例１５に記載したとおりである。これらのホモセリン高産生菌株のそれぞれにお
いてＴ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡ発現を誘導することにより、培養ブロス中にＯ−アセチルホモセリンが蓄積した。例えば菌株ＭＡ−１５５９は、９ｇ／Ｌを超えるＯＡＨレベルを示した。他の操作を加えて、メチオニンを含めた他の産物へのＯＡＨの転換を誘導することも可能である。
【実施例１７】
【０３４５】
［Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるメチオニン産生に対するｍｅｔＡ変異体の影響］
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのホモセリン・アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＡ）変異体を、ＭｅｔＡをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって作製した（実施例６）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０６２２およびＭＡ−０６９９を、２３３位のリジンがアラニンに変異しているＭｅｔＡ（ＭｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ））をコードする高コピー数プラスミドＭＢ４２３６を用いて形質転換した。このプラスミドは、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＹ遺伝子の野生型コピーも含んでいる。菌株ＭＡ−０６９９は、プラスミドＭＢ４１９２を用いてＭＡ−０６２２を形質転換して、ｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させ、かつｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）発現カセットを組み込むことによって構築した。ｍｅｔＡおよびｍｅｔＹは、改変型のｔｒｃプロモーターの制御下において合成ｍｅｔＡＹオペロンで発現される。この菌株をＩＰＴＧ誘導の存在下または不在下で培養し、メチオニンの生産性をアッセイした。それぞれの菌株からのメチオニン産生を図２４にプロットする。示されるように、ＭＡ−６２２およびＭＡ−６９９の個々の形質転換体は、誘導条件下で培養すると、それぞれ３０００μＭを超えるメチオニンを産生した。構成的プロモーターの制御下でＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍＧ３６２Ｅ変異体を発現するＭＡ−６９９菌株は、ＩＰＴＧの不在下で３０００μＭを超えるメチオニンを産生した。ＩＰＴＧ誘導の結果、１０００〜２５００μＭ高いメチオニン産生がもたらされた。これらのデータは、ＭｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ）の発現がメチオニン産生を増大させることを示している。メチオニン生合成の複数のポイントについて操作を加えることによって、産生をさらに増大させることが可能である。
【０３４６】
［実施例１７］
［Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍにおけるメチオニン産生に対するｍｅｔＹ変異体の影響］
Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＯ−アセチルホモセリン・スルフヒドリラーゼ（ＭｅｔＹ）変異体を、ＭｅｔＹをコードするＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって作製した（実施例６）。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−６２２および菌株ＭＡ−６９９を、２３１位のアスパラギン酸がアラニンに変異しているＭｅｔＹ（ＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ））をコードする高コピー数プラスミドＭＢ４２３８を用いて形質転換した。このプラスミドはＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡ遺伝子の野生型コピーも含み、このｍｅｔＡ遺伝子は実施例１６に記載したように発現される。この菌株をＩＰＴＧ誘導の存在下または不在下で培養し、メチオニン生産性をアッセイした。それぞれの菌株からのメチオニン産生を図２５にプロットする。図示されるように、ＭＡ−６２２の個々の形質転換体は、ＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ）の発現を誘導する条件下で培養すると、それぞれ１８００μＭを超えるメチオニンを産生した。ＭＡ−６２２菌株は、個々の形質転換体によって産生されるメチオニンのレベルに変動がみられた（すなわち、形質転換体１および２は誘導条件下で約１８００μＭのメチオニンを産生し、一方形質転換体３および４は誘導条件下で４０００μＭを超えるメチオニンを産生した）。Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＨｏｍ変異体を発現するＭＡ−６９９菌株は、ＩＰＴＧの不在下で約３０００μＭのメチオニンを産生した。ＩＰＴＧ誘導により、メチオニン産生が１５００〜２０００μＭ増大した。これらのデータは、ＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ）の発現によりメチオニン産生が増大することを示している。菌株ＭＡ−６９９は、ＭＡ−６２２と比べてもメチオニン産生が高かった。菌株ＭＡ−６９９でＭｅｔＹ（Ｄ２３１Ａ）を発現させると、該菌株中のメチオニン産生がさらに増大した。
【０３４７】
ｍｅｔＹの第２の変異体対立遺伝子をＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ中で発現させ、メチオニン産生に対するその影響をアッセイした。Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのＭＡ−６２２株およびＭＡ−６９９株を、２３２位のグリシンがアラニン変異しているＭｅｔＹ（ＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ））をコードする高コピー数プラスミドＭＢ４２３９を用いて形質転換した。該菌株をＩＰＴＧ誘導の存在下または不在下で培養し、メチオニン生産性をアッセイした。それぞれの菌株からのメチオニン産生を図２６にプロットする。図示されるように、ＭＡ−６２２の個々の形質転換体は、ＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ）の発現を誘導する条件下で培養すると、それぞれ１７００μＭを超えるメチオニンを産生した。ＭＡ−６９９菌株は、ＩＰＴＧの不在下で約３０００μＭのメチオニンを産生した。ＩＰＴＧ誘導により、メチオニン産生は２０００〜３０００μＭ増大した。これらのデータは、ＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ）の発現がメチオニン産生を増大させることを示している。菌株ＭＡ−６９９は、ＭＡ−６２２と比べてもメチオニン産生が高かった。菌株ＭＡ−６９９でＭｅｔＹ（Ｇ２３２Ａ）を発現させると、該菌株中のメチオニン産生がさらに増大した。
【実施例１８】
【０３４８】
［ｍｅｔＡおよびｍｅｔＹの野生型および突然変異対立遺伝子を発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株におけるメチオニン産生］
５つの異なるＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株においてメチオニン産生をアッセイした。これらの菌株のうち４つは、表１４に列挙するように、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのエピソーム性のｍｅｔＡ対立遺伝子およびｍｅｔＹ対立遺伝子の固有の組合せを発現する。第５の菌株ＭＡ−６２２は、エピソーム性のｍｅｔＡまたはｍｅｔＹ対立遺伝子を含まない。それぞれの菌株によって産生されたメチオニンの量（ｇ／Ｌ）を表１４に列挙する。
【０３４９】
最高レベルのメチオニン産生は、野生型ｍｅｔＡと変異体ｍｅｔＹの組合せ、または野生型ｍｅｔＹと変異体ｍｅｔＡの組合せのいずれかを発現する菌株で観察された。
【０３５０】
【表１４】
2007525951.tif 000018
【実施例１９】
【０３５１】
［異種遺伝子と天然の遺伝子の両方を使用する遺伝的操作の組合せにより、アスパラギン酸由来のアミノ酸の産生が誘導される］
前述のように、遺伝子の組合せによって、コリネバクテリウムをアスパラギン酸由来のアミノ酸産生用に最適化することが可能である。以下は、多重操作がどのようにしてメチオニンの産生を増大させうるかを示す例である。図２７は、菌株ＭＡ−２０２８およびＭＡ−２０２５による幾つかのアスパラギン酸由来のアミノ酸の産生を、それぞれの親菌株ＭＡ−１９０６およびＭＡ−１９０７の能力とともに示す。ＭＡ−１９０６は、プラスミドＭＢ４２７６を使用してＭＡ−０６２２の本来のｐｃｋ遺伝子座を欠失させて、ｐｃｋをＭ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓのｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄオペロンの構成的発現用カセットで置換することによって構築した。ＭＡ−１９０７は、ＭＢ４２７６でＭＡ−０９３３を同様に形質転換して作製した。ＭＡ−２０２８およびＭＡ−２０２５は、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの合成ｍｅｔＡＹＨオペロン（実施例３参照）の誘導的発現用エピソーム性プラスミドであるＭＢ４２７８を用いて、それぞれの親株を形質転換することによって構築した。親菌株ＭＡ−１９０６およびＭＡ−１９０７は、リジンまたはリジンおよびホモセリンをそれぞれ産生し；メチオニンおよびメチオニン経路の中間体も、これらの菌株によって産生される。リジンおよびホモセリンについての目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンについての目盛りは右側のｙ軸上にある。ＩＰＴＧ誘導によって、ＭＡ−２０２８はリジンのレベルの低下、およびメチオニンのレベルの増大を示した。ＭＡ−２０２５も、ＩＰＴＧ依存的にリジン産生が低下し、かつメチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンの産生が増大した。
【０３５２】
菌株ＭＡ−１７４３は、遺伝子操作の組合せを使用してどのようにメチオニン産生株を作製することが可能であるかを示す別例である。菌株ＭＡ−１７４３は、ｍｅｔＡＹＨ発現プラスミドＭＢ４２７８を用いたＭＡ−１６６７の形質転換によって作製された。ＭＡ−１６６７は、最初に菌株ＭＡ−０４２２（実施例１５参照）をプラスミドＭＢ４０８４で処理してｔｈｒＢを欠失させ、次にプラスミドＭＢ４２８６を使用してｍｃｂＲ遺伝子座を欠失させ、かつｔｒｃＲＢＳ−Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡを含む発現カセットでｍｃｂＲを置換することによって構築した。この例、およびｔｒｃＲＢＳが１コピー組み込まれた他の例では、（アミノ酸産生による判断では）エピソーム性プラスミドに関して見られたほど、発現は強く制御されないようである。これは、阻害剤タンパク質ｌａｃＩｑのレベルの低下によるものである可能性がある。菌株ＭＡ−１７４３のＩＰＴＧ誘導により、Ｏ−アセチルホモセリンを含めたメチオニンおよび経路の中間体の産生が誘導される（図２８；リジンおよびホモセリンに関する目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンに関する目盛りは右側のｙ軸上にある）。
【０３５３】
菌株ＭＡ−１６８８およびＭＡ−１７９０は、ｍｅｔＡＹＨ発現プラスミドＭＢ４２７８を含めた複数の遺伝子を用いて作出した、別の２菌株である（図２９参照；リジンおよびホモセリンに関する目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンに関する目盛りは右側のｙ軸上にある）。ＭＡ−０５６９をＭＢ４２７８で形質転換することによってＭＡ−１６８８を作製した。ＭＡ−０５６９は、ＭＢ４１９２およびＭＢ４１６５を連続的に使用して、最初にｈｏｍ−ｔｈｒＢ遺伝子座を欠失させてｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）発現カセットを組み込み、次いでｍｃｂＲを欠失させることによって構築した。ＭＡ−１７９０の構築には、幾つかの工程を必要とした。最初に、ＭＡ−０４２８のＮＴＧ突然変異誘導体を、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｍｅｔＥ突然変異体の増殖を可能にする能力に基づいて同定した。簡潔に述べると、突然変異を誘発したＭＡ−０４２８細胞の集団を、スレオニンおよび菌叢（１０６個を超える数のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｅｔＥ突然変異体の細胞）を含む最小培地で平板培養した。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｅｔＥ突然変異体は、増殖するためにメチオニンを必要とする。肉眼で調べた後、輪状に増殖したＳａｌｍｏｎｅｌｌａに囲まれたコリネバクテリウムのコロニー（例えばＭＡ−０６００）を単離し、振とうフラスコ分析に供した。次に菌株ＭＡ−６００を前述と同様に突然変異誘発してエチオニン耐性とし、得られた１菌株をＭＡ−０９９３と名付けた。次いでプラスミドＭＢ４１６５を使用してＭＡ−０９９３
からｍｃｂＲ遺伝子座を欠失させ、この操作により得られたのがＭＡ−１４２１であった。ＭＡ−１４２１をＭＢ４２７８で形質転換することによってＭＡ−１７９０を作製した。図２９は、ＩＰＴＧ誘導によりＭＡ−１６８８とＭＡ−１７９０のいずれにおいてもメチオニン産生が刺激され、リジンおよびホモセリンの力価が低下することを示している。
【０３５４】
図３０は、菌株ＭＡ−１６８８およびその親菌株の代謝産物レベルを示す。リジンおよびホモセリンに関する目盛りは左側のｙ軸上にあり；メチオニンおよびＯ−アセチルホモセリンに関する目盛りは右側のｙ軸上にある。菌株ＭＡ−１６６８は、プラスミドＭＢ４２８７を用いたＭＡ−０９９３の形質転換によって作製された。ＭＢ４２８７を用いた操作の結果、ｍｃｂＲ遺伝子座の欠失、およびＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍのｍｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ）−ｍｅｔＢにより置換がもたらされる。菌株ＭＡ−１６６８は約２ｇ／Ｌのメチオニンを産生し、かつ元の菌株に対して低レベルのリジンおよびホモセリンを産生する。菌株ＭＡ−１６６８は、さらなる分子操作を加えて改良する余地がある。
【０３５５】
表１５に、以上の試験で使用した菌株を列挙する。表中の「：：」は、「：：」の後の発現構築物が、「：：」の前に記載された遺伝子座に組み込まれることを示す。ＥｔｈＲ６およびＥｔｈＲ１０は、独立に単離したエチオニン耐性突然変異を表す。Ｍｃｆ３突然変異は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａのｍｅｔＥ突然変異体の増殖を可能にする能力を与える（実施例１９参照）。Ｍｍｓ１３突然変異は、塩化メチオニンメチルスルホニウム耐性を与える（実施例１５参照）。表中、「ｅｐｉｓｏｍａｌ」はエピソーム性であることを意味する。
【０３５６】
【表１５】
2007525951.tif 000019
【０３５７】
2007525951.tif 000020
【０３５８】
2007525951.tif 000021
【０３５９】
2007525951.tif 000022
【０３６０】
2007525951.tif 000023
【０３６１】
【表１６】
2007525951.tif 000024
【０３６２】
2007525951.tif 000025
【０３６３】
2007525951.tif 000026
【０３６４】
2007525951.tif 000027
【０３６５】
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【０３６６】
2007525951.tif 000029
【０３６７】
2007525951.tif 000030
【０３６８】
2007525951.tif 000031
【０３６９】
2007525951.tif 000032
【０３７０】
2007525951.tif 000033
【０３７１】
2007525951.tif 000034
【０３７２】
2007525951.tif 000035
【０３７３】
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【０３７４】
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【０３７５】
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【０３７６】
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【０３７７】
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【０３７８】
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【０３７９】
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【０３８０】
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【０３８１】
2007525951.tif 000044
【０３８２】
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【０３８３】
2007525951.tif 000046
【０３８４】
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【０３８５】
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【０３８６】
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【０３８７】
2007525951.tif 000050
【０３８８】
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【０３８９】
2007525951.tif 000052
【０３９０】
2007525951.tif 000053
【０３９１】
2007525951.tif 000054
【０３９２】
2007525951.tif 000055
【０３９３】
2007525951.tif 000056
【０３９４】
2007525951.tif 000057
【０３９５】
【表１７】
2007525951.tif 000058
【０３９６】
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【０３９７】
2007525951.tif 000060
【０３９８】
2007525951.tif 000061
【０３９９】
2007525951.tif 000062
【０４００】
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【０４０１】
2007525951.tif 000064
【０４０２】
2007525951.tif 000065
【０４０３】
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【０４０４】
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【０４０５】
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【０４０６】
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【０４０７】
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【０４０８】
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【０４０９】
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【０４１０】
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【０４１１】
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【０４１２】
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【０４１３】
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【０４１４】
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【０４１５】
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【０４１６】
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【０４１７】
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【０４１８】
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【０４１９】
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【０４２０】
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【０４２１】
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【０４２２】
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【０４２３】
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【０４２４】
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【０４２５】
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【０４２６】
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【０４２７】
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【０４２８】
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【０４２９】
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【０４３０】
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【０４３１】
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【０４３２】
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【０４３３】
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【０４３４】
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【０４３５】
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【０４３６】
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【０４３７】
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【０４３８】
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【０４３９】
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【０４４０】
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【０４４１】
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【０４４２】
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【０４４３】
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【０４４４】
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【０４４５】
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【０４４６】
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【０４４７】
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【０４４８】
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【０４４９】
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【０４５０】
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【０４５２】
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【０４５３】
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【０４５４】
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【０４５５】
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【０４５６】
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【０４５７】
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【０４５８】
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【０４５９】
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【０４６０】
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【０４６１】
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【０４６２】
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【０４６３】
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【０４６４】
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【０４６５】
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【０４６６】
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【０４６７】
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【０４６９】
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【０４７０】
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【０４７１】
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【０４７２】
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【０４７３】
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【０４７４】
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【０４９３】
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【０４９４】
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【０４９５】
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【０４９６】
本発明の幾つかの実施形態を記載してきた。しかしながら、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、さまざまな変更形態を作製することが可能であることは理解されよう。したがって他の実施形態は、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０４９７】
【図１】アスパラギン酸ファミリーのアミノ酸の生合成を示す図。
【図２】メチオニン生合成経路を示す図。
【図３】プラスミドＭＢ３９６１（ベクター骨格プラスミド）の制限地図。
【図４】プラスミドＭＢ４０９４（ベクター骨格プラスミド）の制限地図。
【図５】プラスミドＭＢ４０８３（ｈｏｍ−ｔｈｒＢ欠失構築物）の制限地図。
【図６】プラスミドＭＢ４０８４（ｔｈｒＢ欠失構築物）の制限地図。
【図７】プラスミドＭＢ４１６５（ｍｃｂＲ欠失構築物）の制限地図。
【図８】プラスミドＭＢ４１６９（ｈｏｍ−ｔｈｒＢ欠失／ｇｐｄ−Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄ置換構築物）の制限地図。
【図９】プラスミドＭＢ４１９２（ｈｏｍ−ｔｈｒＢ欠失／ｇｐｄ−Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｈｏｍ（Ｇ３６２Ｅ）置換構築物）の制限地図。
【図１０】プラスミドＭＢ４２７６（ｐｃｋ欠失／ｇｐｄ−Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ  ｌｙｓＣ（Ｔ３１１Ｉ）−ａｓｄ置換構築物）の制限地図。
【図１１】プラスミドＭＢ４２８６（ｍｃｂＲ欠失／ｔｒｃＲＢＳ−Ｔ．ｆｕｓｃａ  ｍｅｔＡ置換構築物）の制限地図。
【図１２Ａ】プラスミドＭＢ４２８７（ｍｃｂＲ欠失／ｔｒｃＲＢＳ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｍｅｔＡ（Ｋ２３３Ａ）−ｍｅｔＢ置換構築物）の制限地図。
【図１２Ｂ】ＭＢ４２７８（ｔｒｃＲＢＳ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｍｅｔＡＹＨ）の、ｔｒｃＲＢＳプロモーターからｍｅｔＨ遺伝子の停止コドンまでのＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す図。
【図１２Ｃ】ＭＢ４２７８（ｔｒｃＲＢＳ−Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ｍｅｔＡＹＨ）の、ｔｒｃＲＢＳプロモーターからｍｅｔＨ遺伝子の停止コドンまでのＤＮＡ配列のヌクレオチド配列を示す図。
【図１３】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの２つの菌株、ＭＡ−４４２およびＭＡ−４４９由来のＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＭｅｔＡの、ＩＰＴＧの存在下および不在下におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図１４】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの菌株ＭＡ−４４２におけるＭｅｔＡの、メチオニンおよびＳ−ＡＭによる阻害に対する感受性を測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図１５】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４５６、ＭＡ５７０、ＭＡ−５７８、およびＭＡ−４７９中で発現されるＴ．ｆｕｓｃａ  ＭｅｔＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＯ−アセチルトランスフェラーゼ活性を測定するアッセイの結果を示すグラフ。変化率は、ＯＤ４１２の変化を時間で割ったタンパク質１ナノグラム当たりの測定値である。
【図１６】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−４５６およびＭＡ−５７０中で発現されるＴ．ｆｕｓｃａ  ＭｅｔＹのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＭｅｔＹ活性を測定するアッセイの結果を示すグラフ。変化率は、タンパク質１ナノグラム当たりの、時間で割ったＯＤ４１２の変化として定義される。
【図１７】異種の野生型ｌｙｓＣおよび変異型ｌｙｓＣを発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＢ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍの菌株における、リジン産生を測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図１８】Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ｈｏｍ  Ｇ３６２Ｅ変異体の存在下および不在下における、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１でのリジンおよびホモセリン産生を測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図１９】Ｅ．ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｐｐｃの存在下および不在下における、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３中のアスパラギン酸濃度を測定する任意のアッセイの結果を示すグラフ。
【図２０】異種の野生型ｄａｐＡ遺伝子で形質転換したＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０３３１およびＭＡ−０４６３におけるリジン産生を測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図２１】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１３７８およびその親菌株における代謝産物レベルを測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図２２】ＩＰＴＧの存在下および不在下で増殖させたＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０４２８、ＭＡ−０５７９、ＭＡ−１３５１、ＭＡ−１５５９中のホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンのレベルを測定するアッセイの結果を示すグラフ。ＩＰＴＧは、Ｔ．ｆｕｓｃａのｍｅｔＡ遺伝子を有するエピソーム性プラスミドの発現を誘導する。
【図２３】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１５５９およびその親菌株における代謝産物レベルを測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図２４】突然変異ポリペプチドＭｅｔＡ  Ｋ２３３Ａを発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの２つの菌株ＭＡ−６２２およびＭＡ−６９９を発酵させたブロスにおけるメチオニン濃度を示すグラフ。ＩＰＴＧの存在下および不在下で培養した細胞による産生について示す。
【図２５】突然変異ポリペプチドＭｅｔＹ  Ｄ２３１Ａを発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの２つの菌株ＭＡ−６２２およびＭＡ−６９９を発酵させたブロスにおけるメチオニン濃度を示すグラフ。ＩＰＴＧの存在下および不在下で培養した細胞による産生について示す。
【図２６】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの突然変異ポリペプチドＭｅｔＹ  Ｇ２３２Ａを発現するＣ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍの２つの菌株ＭＡ−６２２およびＭＡ−６９９を発酵させたブロスにおけるメチオニン濃度を示すグラフ。ＩＰＴＧの存在下および不在下で培養した細胞による産生について示す。
【図２７】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１９０６、ＭＡ−２０２８、ＭＡ−１９０７、およびＭＡ−２０２５における代謝産物レベルを測定するアッセイの結果を示すグラフ。菌株はＩＰＴＧの存在下および不在下で増殖させた。
【図２８】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１６６７およびＭＡ−１７４３における代謝産物レベルを測定するアッセイの結果を示すグラフ。菌株はＩＰＴＧの存在下および不在下で増殖させた。
【図２９】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−０５６９、ＭＡ−１６８８、ＭＡ−１４２１、およびＭＡ−１７９０における代謝産物レベルを測定するアッセイの結果を示すグラフ。菌株はＩＰＴＧの存在下および／または不在下で増殖させた。
【図３０】Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ菌株ＭＡ−１６６８およびその親菌株における代謝産物レベルを測定するアッセイの結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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