(57)【要約】  本発明は、デンプンのリン酸化に関わるタンパク質、およびそのようなタンパク質をコードする核酸を同定するための方法に関する。本発明はさらに、本発明による方法を用いて同定することができるタンパク質の変化した活性を示す植物細胞および植物に関する。この型の植物細胞および植物は、修飾されたデンプンを合成する。したがって、本発明はまた、本発明よる植物細胞および植物によって合成されるデンプン、ならびに、このデンプンの作製のための方法およびこの修飾デンプンのデンプン誘導体の作製に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非リン酸化α−１，４グルカンと比較して、リン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を有するタンパク質を同定するための方法であって、
ａ）互いに分離された調製物中のタンパク質抽出物を
ｉ  リン酸化α−１，４−グルカン、および
ii  非リン酸化α−１，４−グルカン、
とインキュベーションし、
ｂ）ｉ  工程ａ）ｉのリン酸化α−１，４−グルカンに特異的に結合したタンパク質、
および
ii  工程ａ）iiの非リン酸化α−１，４−グルカンに特異的に結合したタンパク質、
を、互いに分離された調製物中に溶解し、そして
ｃ）工程ｂ）iiで用いられる非リン酸化α−１，４−グルカンと比較して、工程ｂ）ｉで用いられるリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定する、
方法。
【請求項２】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、かつ基質としてリン酸化α−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための方法であって、
ａ）タンパク質抽出物をリン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションし、
ｂ）工程ａ）から得られたリン酸化α−１，４−グルカンに特異的に結合したタンパク質を溶解し、
ｃ）工程ｂ）によって得られたタンパク質をそれぞれ、
ｉ  ＡＴＰおよびリン酸化α−１，４−グルカン、ならびに
ii  ＡＴＰおよび非リン酸化α−１，４−グルカン
と共に、互いに分離した調製物中でインキュベーションし、
ｄ）工程ｃ）ｉまたは工程ｃ）ii におけるインキュベーションの後に得られたそれぞれのα−１，４−グルカンを、さらなるリン酸基の導入について検査し、そして
ｅ）ｃ）ｉによるインキュベーション調製物において有意な量のリン酸基をα−１，４−
グルカンへ導入し、かつｃ）iiによるインキュベーション調製物において有意な量のリン酸基をα−１，４−グルカンへ導入しなかったタンパク質を同定する、
方法。
【請求項３】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を有するタンパク質が、基質としてリン酸化デンプンを用いる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を有するタンパク質が植物起源である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の方法によって得ることができるタンパク質。
【請求項６】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸分子を同定するための方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の方法によりタンパク質を同定し、
ｂ）工程ａ）によって同定されたタンパク質をコードするアミノ酸配列を決定し、
および
ｃ）工程ｂ）によって決定されたアミノ酸を用いて核酸分子を同定する、
方法。
【請求項７】
工程ｂ）によって決定されたアミノ酸配列に基づいた核酸オリゴヌクレオチドを作製し、工程ｃ）によって前記核酸分子を同定する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸分子を同定するための方法であって、
ａ）請求項１〜４のいずれか１項記載の方法によりタンパク質を同定し、
ｂ）工程ａ）によって同定されたタンパク質と特異的に反応する抗体を生成し、
そして
ｃ）工程ｂ）によって生成された抗体を用いて、核酸分子を同定する、
方法。
【請求項９】
請求項６、７、または８のいずれか１項記載の方法によって得ることができる核酸分子。
【請求項１０】
遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、請求項５記載のタンパク質、即ち請求項１〜４のいずれか１項記載の方法によって得ることができるタンパク質の、高い酵素活性を示すことを特徴とする遺伝的に修飾された植物細胞。
【請求項１１】
トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、サゴ、リョクトウ、バナナ、エンドウ、アラビドプシス、ウコン、またはモロコシの植物である、請求項１０記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
【請求項１２】
遺伝的修飾が、請求項９記載の外来性核酸分子、即ち請求項６、７または８のいずれか１項記載の方法により得ることができる外来性核酸分子、の少なくとも１つの植物ゲノム中への導入であることを特徴とする、遺伝的に修飾された植物。
【請求項１３】
対応する野生型植物細胞由来のデンプンに比較して修飾されたデンプンを合成する、請求項１２記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
【請求項１４】
対応する野生型植物由来のデンプンに比較して、高い含量のデンプンリン酸および／または修飾されたリン酸分布を有する修飾デンプンを合成する、請求項１３記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
【請求項１５】
修飾デンプンが、対応する野生型植物細胞由来のデンプンと比較して、デンプンのグルコース分子のＣ−３位置に共有結合で結合したリン酸の高い含量を示すことを特徴とする、請求項１４記載の植物細胞。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか１項記載の遺伝的に修飾された植物細胞を含む植物。
【請求項１７】
トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サゴ、リョクトウ、エンドウ、またはモロコシの植物である、請求項１６記載の植物。
【請求項１８】
トウモロコシまたはコムギの植物である、請求項１７記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デンプンのリン酸化に関与するタンパク質を同定するための方法、およびそのようなタンパク質をコードする核酸に関する。本発明はさらに、本発明による方法を用いて同定可能なタンパク質の高い活性を示す植物細胞および植物に関する。この型の植物細胞および植物は、修飾されたデンプンを合成する。したがって、本発明はまた、本発明による植物細胞および植物によって合成されるデンプン、ならびにこのデンプンの作製方法およびこの修飾されたデンプンのデンプン誘導体の作製に関する。
【０００２】
再生可能な原料源としての植物構成成分に現在帰せられて増大している重要性に関連して、バイオテクノロジー研究の課題の１つは、これらの植物原料を加工産業の必要条件に合致するよう適応させる努力をすることである。さらに、できるだけ多くの応用分野で用いられることになる原料の再生を可能にするために、種々様々の材料を実現することが必要である。
【０００３】
多糖類デンプンは、化学的に一定の基本成分、グルコース分子から構成されるが、種々の分子形の複雑な混合物を構成する。それらは重合と分岐の程度に関して差異を示し、したがってそれらの物理的・化学的特性において、互いに著しく異なる。
【０００４】
α−１，４−グリコシド結合したグルコース単位から構成される本質的に分岐のないポリマーであるアミロースデンプンと、α−１，６−グリコシド結合が加わって分岐が形成される分岐ポリマーであるアミロペクチンデンプンとが区別されている。アミロースとアミロペクチン間のさらに本質的な差は分子量である。デンプンの起源に依存して、アミロースは５×１０5〜１０6Daの分子量を有するのに対し、アミロペクチンの分子量は１０7〜１０8Daである。２つの巨大分子を、その分子量および種々の物理的・化学的特性によって区別することができ、それらは異なるヨウ素結合特性によって、最も容易に可視化することができる。
【０００５】
アミロースは長い間、α−１，４−グリコシド結合したα−Ｄ−グルコースモノマーから成る直鎖状ポリマーであると見なされてきた。最近の研究において、しかし、α−１，６−グリコシド分岐点（約０．１％）の存在が示された（Hizukuri and Takagi, Carbohydr. Res.134,(1984),1-10; Takeda et al., Carbohydr.Res. 132,（1984), 83-92)。
【０００６】
デンプンの機能的特性、例えば溶解度、劣化挙動、水結合能力、被膜形成能力、粘性、糊化特性、凍結融解安定性、酸安定性、ゲル強度およびデンプン粒サイズなどが、とりわけアミロース／アミロペクチン比率、分子量、側鎖分布パターン、イオン含量、脂質およびタンパク質含量、平均デンプン粒サイズ、デンプン粒形態等によって、影響を受ける。デンプンの機能的特性はまた、デンプンの非炭素成分であるリン酸の含量によっても影響を受ける。ここで、共有結合でモノエステルの形でデンプンのグルコース分子へ結合しているリン酸（以下にデンプンリン酸と記述する）と、デンプンに結合したリン脂質の形のリン酸とを区別する。リン酸の含量に加えて、デンプンの機能的特性に対する影響は、この場合デンプン中のリン酸の存在形式（デンプンリン酸またはリン脂質）にも依存する（Jane et al., 1996, Cereal Foods World 41（11), 827-832)。
【０００７】
デンプンリン酸含量は、植物種によって変動する。したがって、あるトウモロコシ突然変異体は、例えば、増加したデンプンリン酸含量（モチトウモロコシ０．００２％、および高アミローストウモロコシ０．０１３％）を有するデンプンを合成するが、従来型のトウモロコシは、痕跡量のデンプンリン酸のみを有する。同様に小量のデンプンリン酸がコムギ（０．００１％）で見出される。しかし、エンバクとモロコシではデンプンリン酸が検出できなかった。イネの突然変異体では、同様に、イネの従来種中（０．０１３％）よりも少ないデンプンリン酸が見出された（モチゴメ０．００３％）。有意な量のデンプンリン酸が、例えばタピオカ（０．００８％）、サツマイモ（０．０１１％）、クズウコン（０．０２１％）またはジャガイモ（０．８９％）のような、塊茎貯蔵または根茎貯蔵デンプンを合成する植物に検出された。上に引用されたデンプンリン酸含量の百分率による値は、各場合におけるデンプンの乾燥重量当たりを示し、Jane et al.(1996, Cereal Foods World 41（11), 827-832) によって決定された。
【０００８】
デンプンリン酸は、重合されたグルコースモノマーのＣ−２、Ｃ−３またはＣ−６位置にモノエステルの形で存在することができる（Takeda and Hizukuri, 1971, Starch/ Staerke 23, 267-272)。植物によって合成されるデンプン中のデンプンリン酸のリン酸の分布は、一般にリン酸基の約３０％から４０％がグルコース分子のＣ−３位置に共有結合により結合されており、リン酸基の約６０％から７０％がＣ−６位置に共有結合により結合されているという事実により特徴付けられる(Blennow et al., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211- 218）。Blennow et al.(2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174) が、様々なデンプンのグルコース分子のＣ−６位置に結合しているデンプンリン酸含量を決定した。それは例えば、ジャガイモデンプン（デンプンmg当たり７．８〜３３．５nmol、型に依存する）、様々なCurcuma種のデンプン（mg当たり１．８〜６３nmol）、タピオカデンプン（デンプン mg当たり２．５nmol）、コメデンプン（デンプンmg当たり１．０nmol）、リョクトウデンプン（デンプン mg当たり３．５nmol）およびモロコシデンプン（デンプンmg当たり０．９nmol）などであった。この著者は、オオムギデンプンおよびトウモロコシの種々のモチ突然変異体のデンプン中には、Ｃ−６位置に結合されたデンプンリン酸を示すことができなかった。今までに、植物の遺伝子型とデンプンリン酸含量の間の関係を明かにすることはできなかった（Jane et al., 1996, Cereal Foods World 41（11), 827-832）。したがって、現在、育種によって植物中のデンプンリン酸含量に影響を及ぼすことはできない。
【０００９】
遺伝子組換え植物では、貯蔵デンプン中のデンプンリン酸の量を変化させることができる。したがって、可溶性でんぷん合成酵素III（Abel et al., 1996, The Plant Journal 10(6), 9891-991)、分岐酵素Ｉ（ＢＥＩ）(Safford et al., 1998, Carbohydrate Polymers 35, 155-168)、分岐酵素II（ＢＥII）(Joblinget al., 1999, The Plant Journal 18, 163-171)、ＢＥＩおよびＢＥII(Schwall et al., 2000, Nature Biotechnology 18, 551- 554）、不均化酵素（ＷＯ ９６ ２７６７３）、または不均化酵素およびＢＥＩ（ＷＯ ９５ ０７３５５）の活性低下を示すジャガイモ植物の貯蔵デンプンは、対応する野生型植物のデンプンと比較して、デンプンリン酸の高い含量を示す。しかし、これらの植物中のデンプンリン酸含量の変化は、これらの植物中で活性が低下している、デンプン中へのリン酸残基の導入に直接関連するタンパク質によるものではない。当該遺伝子組換え植物中のデンプンリン酸含量の増加は、したがって対応するタンパク質の減少によって引き起こされる一次的な効果ではなく、その副次的効果である。前記タンパク質活性の修飾の結果としてのデンプンリン酸含量の増加の理由は、未だに説明されていない。したがって、単に副次的効果によってデンプンリン酸含量に影響を及ぼすタンパク質活性を修飾することによって、特異的にデンプンリン酸の含量を変更することはできない。更に、副次的効果として植物中のデンプンリン酸の含量に対する影響を有するタンパク質活性の修飾は、また同時にデンプン中にさらなる修飾、例えば：アミロース／アミロペクチン比率、および／またはそのようなタンパク質活性の変化の一次的な効果を構成するアミロペクチンの側鎖の長さの変化など、を引き起こす。
【００１０】
これまでに、デンプンのグルコース分子へのリン酸基の共有結合の導入を仲介するタンパク質がただ１つだけ報告された。科学文献中にしばしばＲ１と称されているこのタンパク質は、ジャガイモ塊茎中の貯蔵デンプンのデンプン粒に結合しており(Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477)、α−グルカン水ジキナーゼ（Ｅ．Ｃ．０２．０７．０９．４）酵素活性を有する。Ｒ１に触媒される反応において、遊離体α−１，４−グルカン（デンプン）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）および水が、生成物であるグルカンリン酸（リン酸化デンプン）、一リン酸およびアデノシン一リン酸に変換される。この場合、ＡＴＰのγリン酸残基は水に転移され、ＡＴＰのβリン酸残基はグルカン（デンプン）に転移される。Ｒ１は、インビトロでＡＴＰのβリン酸残基を、α−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−６およびＣ−３位置へ転移する。インビトロの反応で得られるＣ−６リン酸のＣ−３リン酸に対する比率が、植物から単離されるデンプン中に存在する比率に一致する（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171)。ジャガイモデンプン中に存在するデンプンリン酸の約７０％がＣ−６位置で、また約３０％が、Ｃ−３位置でデンプンのグルコースモノマーへ結合しているので、これはＲ１がグルコース分子のＣ−６の位置を好んでリン酸化することを意味する。さらに、トウモロコシのアミロペクチンを用いて、特に、Ｒ１がまだ共有結合で結合したリン酸を含んでいないα−１，４−グルカンをリン酸化することができることが示された（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171)、即ち、Ｒ１はα−１，４−グルカンへ新規にリン酸を導入することができる。
【００１１】
Ｒ１のアミノ酸配列は、既知のピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ領域）および既知のピルビン酸水ジキナーゼ（ＰＰＳ領域）に高度の相同性を示す領域を含み、ＰＰＤＫおよびＰＰＳ領域に保存されたヒスチジン残基を含む。ＡＴＰのリン酸残基のα−１，４−グルカン（デンプン）への転移中に中間生成物として、ＰＰＤＫまたはＰＰＳ領域に保存されたヒスチジン基に共有結合で結合されて存在するリン酸残基を有するリン酸化Ｒ１タンパク質が形成される（Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532)。
【００１２】
Ｒ１タンパク質をコードする核酸配列およびそれに対応するアミノ酸配列が様々な種から記述されている。それらには、例えば、ジャガイモ（ＷＯ ９７ １１１８８、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＹ０２７５２２、Ｙ０９５３３）、コムギ（ＷＯ ００ ７７２２９、ＵＳ ６,４６２，２５６、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＮ９３９２３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＲ２３６１６５）、イネ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＲ６１４４５、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＲ４００８１４）、トウモロコシ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＲ６１４４４、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ.：ＡＲ４００８１３）、ダイズ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＡＲ６１４４６、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ.：ＡＲ４００８１５）、カンキツ類（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＹ０９４０６２）、およびArabidopsis（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ.：ＡＦ３１２０２７）などの種がある。
【００１３】
ジャガイモからのＲ１遺伝子の過剰発現の結果Ｒ１タンパク質の高い活性を示すコムギ植物について、ＷＯ ０２ ３４９２３に記述されている。デンプンリン酸を検出することができなかった対応する野生型の植物と比較して、これらの植物は、グルコース分子のＣ−６位置に有意な量のデンプンリン酸を有するデンプンを合成する。
【００１４】
共有結合により結合されたリン酸基をデンプンに導入する反応を触媒する更なるタンパク質は、これまでに報告されていない。デンプンのグルコース分子のＣ−３位置および／またはＣ−２位置に好ましくリン酸基を導入する酵素もまた知られていない。したがって、植物中のデンプンリン酸の含量を増加させることを別にして、植物によって合成されたデンプン内のリン酸分布を修飾し、および／またはデンプンリン酸の含量をさらに増加させて、植物中のデンプンのリン酸化に特異的に影響を及ぼすために利用できる方法がない。
【００１５】
したがって、高いリン酸含量および／または修飾されたリン酸分布を有する修飾されたデンプンを合成する植物を生成するための方法および手段を提供すること、ならびにそのような修飾されたデンプンを合成する植物細胞および／または植物を提供することが本発明の目的である。
【００１６】
この問題は、特許請求の範囲に記述された実施態様によって解決される。
【００１７】
したがって、本発明は、非リン酸化α−１，４−グルカンと比較してリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を有するタンパク質を同定する方法であって、
ａ）互いに分離された調製物中のタンパク質抽出物を、
ｉ．リン酸化α−１，４−グルカン  および
ii．非リン酸化α−１，４−グルカン
とインキュベーションし、    
ｂ）ｉ．工程ａ）ｉからのリン酸化α−１，４−グルカンに特異的に結合するタンパク質、
および
ii．工程ａ）iiからの非リン酸化α−１，４−グルカンに特異的に結合するタンパ
ク質、
を、互いに分離された調製物中に溶解し、ならびに
ｃ）工程ｂ）ii 中で用いられる非リン酸化α−１，４−グルカンと比べて、工程ｂ）ｉ中で用いられるリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定する、
方法に関する。
【００１８】
非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてＰ−α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、より高い結合活性が存在するα−１，４−グルカンは、デンプン、好ましくは粒状デンプンである。
【００１９】
非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてＰ−α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様は、１２０kDa〜１４５kDaのアミノ酸配列、好ましくは１２０kDa〜１４０kDa、特に好ましくは１２５kDa〜１４０kDa、とりわけ好ましくは１３０kDa〜１３５kDa のアミノ酸配列に由来する分子量を有するタンパク質を同定する方法に関する。
【００２０】
さらなる実施態様では、本発明による方法は、非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてＰ−α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための方法であって、Ｐ−α−１，４−グルカンに対する結合活性が、非リン酸化α−１，４−グルカンに対する結合活性と比べて少なくとも３倍、好ましくは少なくとも４倍、特に好ましくは少なくとも５倍、およびとりわけ好ましくは少なくとも６倍増加している方法に関する。
【００２１】
Ｐ−α−１，４−グルカンまたは非リン酸化α−１，４−グルカンに結合するタンパク質の量を、例えばウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などの、免疫学的方法によって決定することができる。
【００２２】
あるタンパク質と特異的に反応する、即ち特異的に前記タンパク質に結合する抗体を作製する方法は、当業者に公知である（例えば、Lottspeich and Zorbas（Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 参照）。そのような抗体の作製をいくつかの会社（例えば Eurogentec, Belgium）が、請負サービスとして行う。本発明によるタンパク質と特異的に反応する抗体を作製するための可能な方法の１つについて下に述べる（実施例１１を参照のこと）。
【００２３】
非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてＰ−α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を有するタンパク質を同定するための本発明に従う方法を実施することにより得られる溶解Ｐ−α−１，４−グルカン結合タンパク質を、入手できる溶解非リン酸化α−１，４−グルカン結合タンパク質と比較することにより、非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてＰ−α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を有するタンパク質を同定することが可能である。
【００２４】
非リン酸化α−１，４−グルカンに比べてリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、  タンパク質抽出物をＰ−α−１，４−グルカンと工程ａ）ｉによりインキュベーションすることにより得られたＰ−α−１，４−グルカンタンパク質複合体、およびタンパク質抽出物を非リン酸化α−１，４−グルカンと工程ａ）iiによりインキュベーションすることにより得られた非リン酸化α−１，４−グルカンタンパク質複合体は、適切なα−１，４−グルカンに結合しなかったタンパク質から分離される。この場合、分離は操作工程ａ）ｉ、または操作工程ａ）iiの後に、それぞれのインキュベーション溶液について別々に行う。
【００２５】
非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、工程ｂ）iまたはｂ）iiに従って溶解されたタンパク質は、本発明による方法の中で工程ａ）ｉまたは工程ａ）iiに従って用いられるα−１，４−グルカンから分離される。
【００２６】
非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法において、操作工程ｂ）ｉによって得られた溶解されたタンパク質は、単一のタンパク質または複数のタンパク質を含む可能性がある。操作工程ｂ）ii によって溶解されたタンパク質もまた、単一のタンパク質または複数のタンパク質を含む可能性がある。もし溶解されたＰ−α−１，４−グルカン結合タンパク質または溶解された非リン酸化α−１，４−グルカン結合タンパク質がそれぞれ複数の異なるタンパク質を含む場合は、必要ならばこれらを互いに分離する。
【００２７】
非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、操作工程ｂ）ｉによって溶解されたＰ−α−１，４−グルカン結合タンパク質、または操作工程ｂ）ii によって溶解された非リン酸化α−１，４−グルカン結合タンパク質を、本発明による方法を実施する場合には、互いに分離する。
【００２８】
溶解されたＰ−α−１，４−グルカン結合タンパク質、または溶解された非リン酸化α−１，４−グルカン結合タンパク質を、当業者に公知の方法、例えばゲル濾過、クロマトグラフ法、電気泳動などを用いて分離することができる。Ｐ−α−１，４−グルカンに結合する溶解されたタンパク質、または非リン酸化α−１，４−グルカンに結合する溶解されたタンパク質を、好ましくはＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動により、さらに好ましくはさらに後に記述する方法（一般的方法項目９を参照のこと）を用いて、互いに分離する。
【００２９】
本発明のさらなる目的の１つは、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、かつ基質としてリン酸化α−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための方法であって、
ａ）タンパク質抽出物をリン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションし
ｂ）工程ａ）から得られたリン酸化α−１，４−グルカンに特異的に結合するタンパク
質を溶解し、
ｃ）工程ｂ）によって得られたタンパク質を、互いに分離された調製物中で、
ｉ）  ＡＴＰおよびリン酸化α−１，４−グルカン、
ii）  ＡＴＰおよび非リン酸化α−１，４−グルカン、
と、それぞれインキュベーションし、
ｄ）工程ｃ）ｉまたは工程ｃ）ii のインキュベーション後に得られたそれぞれのα−１，４−グルカンについて、さらにリン酸基が導入されたかを検査し、そして
ｅ）ｃ）ｉによるインキュベーション調製物中でα−１，４−グルカンへ有意な量の
リン酸基を導入し、ｃ）iiによるインキュベーション調製物中でα−１，４−グル
カンへ有意な量のリン酸基を導入しなかったタンパク質を同定する、
方法である。
【００３０】
用語「高い結合活性」とは、本発明に関連しては、第２の基質と比較して第１の基質に対する増加したタンパク質の親和性であると、理解しなければならない。すなわち、同じインキュベーション条件下で、第２の基質と比較して第１の基質に増加して結合するタンパク質の量が、第１の基質に対する高い結合活性を示していると理解しなければならない。
【００３１】
用語「α−１，４−グルカン」とは、本発明に関連しては、α−１，４−結合したグルコースの構成単位から主として成るが、さらに分岐としてα−１，６−結合を含むことができるグルカンと、理解されるべきである。α−１，４−グルカンは、好ましくは１５％までの、特に好ましくは１０％までの、およびとりわけ好ましくは５％までのα−１，６−結合を含む。
【００３２】
用語「デンプンリン酸」とは、本発明に関連しては、α−１，４−グルカンのグルコース分子に共有結合により結合しているリン酸基として、理解しなければならない。
【００３３】
用語「非リン酸化α−１，４−グルカン」とは、本発明に関連しては、検出できる量のデンプンリン酸を含んでいないα−１，４−グルカンとして理解しなければならない。
【００３４】
用語「リン酸化α−１，４−グルカン」または「Ｐ−α−１，４−グルカン」とは、本発明に関連しては、デンプンリン酸を含むα−１，４−グルカンとして理解しなければならない。
【００３５】
基本的に、本発明による方法を用いて同定可能なタンパク質は、任意の生物体由来であり得る。タンパク質は、好ましくは植物生物体に、好ましくはデンプン貯蔵植物（トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、サゴ、リョクトウ、バナナ、エンドウ、Arabidopsis、Curcumaまたはモロコシ）に、特に好ましくはジャガイモ、オオムギ、テンサイ、Arabidopsis、またはイネの植物に、およびとりわけ好ましくはArabidopsisまたはイネの植物に、由来する。
【００３６】
本発明による方法のさらなる実施態様では、タンパク質抽出物が、真核細胞から、好ましくは植物細胞から、特に好ましくはデンプン貯蔵植物（トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、サゴ、リョクトウ、バナナ、エンドウ、アラビドプシス、ウコンまたはモロコシ）の細胞に由来する。
【００３７】
基本的にすべての非リン酸化α−１，４−グルカンが、本発明による方法を実施するために、タンパク質抽出物を非リン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションするために適している。好ましくは、非リン酸化植物デンプン、特に好ましくはコムギデンプン、およびとりわけ好ましくはArabidopsis thaliana 突然変異体sex1-3（Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918) の粒状の葉デンプンを用いる。
【００３８】
例えば植物からデンプンを単離する方法は、当業者に公知である。当業者に公知の方法はすべて、基本的に適当な植物種から非リン酸化デンプンを分離するために適している。好ましくは、下に述べる非リン酸化α−１，４−グルカンを分離するための方法が用いられる（一般的方法項目２を参照のこと）。
【００３９】
基本的に、デンプンリン酸を含むすべてのα−１，４−グルカンが、本発明による方法を実施するために、タンパク質抽出物をＰ−α−１，４−グルカンとインキュベーションするために適している。化学的にリン酸化されたデンプンも、この場合、用いることができる。タンパク質抽出物とのインキュベーションに用いられるのは、好ましくは植物Ｐ−α−１，４−グルカン、特に好ましくは、後で酵素によりリン酸化された植物デンプン、とりわけ好ましくは、Arabidopsis thaliana のsex1-3 突然変異体から単離された、後で酵素によりリン酸化された植物粒状デンプンである。
【００４０】
非リン酸化α−１，４−グルカンの後での酵素によるリン酸化は、リン酸残基を非リン酸化α−１，４−グルカンに共有結合の導入により転移する任意の酵素により遂行することができる。好ましくは、水グルカンジキナーゼ活性を有する酵素（Ｒ１タンパク質、Ｅ.Ｃ.：０２．０７．０９.４）(Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532) をこの目的に用いる。好ましくは、精製されたＲ１タンパク質、特にＥ.ｃｏｌｉ中の非相同発現によって生成されたジャガイモのＲ１タンパク質を、後での非リン酸化α−１，４−グルカンの酵素的リン酸化に用いる。
【００４１】
組換え法によりＥ.ｃｏｌｉ中の発現によって産生されたＲ１タンパク質を精製する方法については、Ritte et al.（2002, PNAS 99, 7166-7171) および Mikkelsen et al.（2003, Biochemical Journal 377, 525-532) に記載されている。
【００４２】
本発明による方法を実施する場合、タンパク質抽出物をＰ−α−１，４−グルカンおよび／または非リン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションすることにより、Ｐ−α−１，４−グルカンタンパク質複合体を、タンパク質のＰ−α−１，４−グルカンへの結合の結果として形成することができ、また非リン酸化α−１，４−グルカンタンパク質複合体を、タンパク質の非リン酸化α−１，４−グルカンへの結合の結果として形成することができる。
【００４３】
Ｐ−α−１，４−グルカンタンパク質複合体または非リン酸化α−１，４−グルカンタンパク質複合体中に存在するタンパク質は、本発明による方法を実施するときに溶解される、すなわち、当該タンパク質のそれぞれのα−１，４−グルカンへの結合が破壊される。溶解されたＰ−α−１，４−グルカン結合タンパク質および／または、溶解された非リン酸化α−１，４−グルカン結合タンパク質はこのようにして得られる。基本的に、既存のタンパク質とα−１，４−グルカンの相互作用を妨げるすべての物質を、当該α−１，４−グルカンとそれに結合したタンパク質の間の結合を破壊するために用いることができる。この目的のために好ましいのは界面活性剤を含む緩衝液、特に好ましいのはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む緩衝液、とりわけ好ましいのはさらに下に記述する緩衝液である（一般的方法項目８を参照のこと）。
【００４４】
α−１，４−グルカンをインキュベーション調製物のタンパク質および例えばＡＴＰなどの溶存物質から分離することを可能にする任意の方法を、α−１，４−グルカンをＡＴＰおよび／またはタンパク質から分離するために用いることができる。本発明による方法を実施する場合、可溶性α−１，４−グルカンをタンパク質抽出物のα−１，４−グルカンとのインキュベーションに用いれば、分離は、例えばα−１，４−グルカンの沈澱、好ましくは適当な溶媒による沈澱、特に好ましくはアルコールによる沈澱を含むことができる。選択的にα−１，４−グルカンを結合する物質（例えばコンカナバリンＡ）に結合させることによるα−１，４−グルカンの分離が、溶液中の物質からα−１，４−グルカンを分離するためにも適している。
【００４５】
ここでα−１，４−グルカンの分離に用いられるのは、好ましくは濾過、特に好ましくは遠心分離、とりわけ好ましくはさらに下に記述される方法である（一般的方法項目８を参照のこと）。
【００４６】
本発明による方法を実施する場合は、α−１，４−グルカンからの可溶性タンパク質の分離に導く、例えばクロマトグラフ法、α−１，４−グルカンの沈澱およびその後の遠心分離、酵素によるα−１，４−グルカンの消化、ゲル濾過、などの当業者に公知のすべての方法を、α−１，４−グルカンから可溶性タンパク質を分離するために基本的に用いることができる。溶解されたＰ−α−１，４−グルカン結合タンパク質および／または溶解された非リン酸化α−１，４−グルカン結合タンパク質を、本発明による方法において用いたα−１，４−グルカンから、遠心分離の助けを借りて好ましくは分離する。
【００４７】
本発明のさらなる実施態様において本発明による方法を実施する場合は、パーコールパッドを用いた遠心分離を、α−１，４−グルカンタンパク質複合体を当該複合体に含まれていないタンパク質から分離するために使用する。
【００４８】
さらに下に記述される方法（一般的方法項目８を参照のこと）を好ましくはここで用いて、α−１，４−グルカンに結合していないタンパク質を分離する。パーコールパッドを用いて遠心分離を実行した後には、Ｐ−α−１，４−グルカンに結合していない、または非リン酸化α−１，４−グルカンに結合していないタンパク質は、遠心媒液の上清に存在し、Ｐ−α−１，４−グルカンタンパク質複合体または非リン酸化α−１，４−グルカンタンパク質複合体は、沈殿したペレット中に存在する。遠心媒液の上清を捨て、ペレットを好ましくは、Ｐ−α−１，４−グルカンタンパク質複合体または非リン酸化α−１，４−グルカンタンパク質複合体をさらに精製するためにインキュベーションに用いられた緩衝液で洗浄する。ペレットを好ましくは１度、特に好ましくは２度洗浄する。
【００４９】
基本的に任意の型のタンパク質抽出物を、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化α−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法を実行するために用いることができる。いわゆるタンパク質粗製抽出物および部分的にまたは完全に精製されたタンパク質抽出物の両方を、ここで含むことができる。したがって、例えば、非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法を用いて同定されたタンパク質を用いることが、有利である。非リン酸化１，４−グルカンと比べてリン酸化α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法を用いて同定されたタンパク質を、例えばα−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化α−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法の、工程ａ）およびｂ）を省略して、工程ｃ）の中で直接用いることができる。
【００５０】
基本的に、例えば Scopes（1993, Protein Purification: Principles & Practice, ISSN: 038794072) の中で記述されているような、当業者に公知のすべての一般的方法は、本発明による方法を実施するために原核生物または真核細胞からタンパク質抽出物を生成するために適している。方法の実施のために使用するのに好ましいのは、しかし、植物タンパク質の単離のための方法（例えば、Bollag et al, 1996, in: "Protein Methods", 2nd Edition, Wiley, ISBN: 0-471-11837-0; Dennison, 2003, in: "A Guide to Protein Isolation" 2nd Edition, Kluwer Academic Publishers, ISBN 1-4020-1224-1 中に記載されている)であり、特に好ましいのは、さらに下に記述する方法である（一般的方法項目１を参照のこと）。
【００５１】
本発明による方法を実施するためのタンパク質抽出物のＰ−α−１，４−グルカンまたは非リン酸化α−１，４−グルカンとのインキュベーションは、別々の調製物中で行われる。全方法を実施する間、Ｐ−α−１，４−グルカンのための、または非リン酸化α−１，４−グルカンのための適切な調製物を互いに別々に処理する。この場合、それぞれ同じ量のタンパク質抽出物が、それぞれ同じ量のＰ−α−１，４−グルカンまたは非リン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションされることになる。好ましくはそれぞれ１〜１０mg、特に好ましくは３〜７mg、またとりわけ好ましくは４〜６mgのタンパク質抽出物を、Ｐ−α−１，４−グルカン、または非リン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションする。用いられるＰ−α−１，４−グルカンまたは非リン酸化α−１，４−グルカンの量は、好ましくはそれぞれ１０〜１００mg、特に好ましくは３０〜７０mg、およびとりわけ好ましくは４５〜５５mgである。
【００５２】
本発明による方法を実施するために、様々な緩衝液を、タンパク質抽出物のＰ−α−１，４−グルカンとのインキュベーションに用いることができる。基本的には、同定するべきタンパク質が当該基質へ結合することを可能にする緩衝液はすべて適切である。さらに下に記述された緩衝液（一般的方法種別１を参照のこと）を好ましくは用いる。
【００５３】
用語「α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化α−１，４−グルカンを要求するタンパク質」を、本発明に関連しては、Ｐ−α−１，４−グルカンへリン酸基を共有結合によって導入し、リン酸基転移のための基質としてＰ−α−１，４−グルカンを用いるが、一方、非リン酸化Ｐ−α−１，４−グルカンは当該タンパク質によってリン酸化されない、即ち、非リン酸化Ｐ−α−1,４−グルカンはリン酸化反応用の基質とならない、タンパク質として理解しなければならなない。
【００５４】
さらなる実施態様において、α−１，４−グルカンリン酸化活性を示し、基質としてリン酸化α−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法は、さらなる基質としてＡＴＰを用いるタンパク質を同定する方法に関する。
【００５５】
本発明のこの実施態様では、ＡＴＰがさらなる基質（共基質）として、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し基質としてリン酸化α−１，４−グルカンを要求するタンパク質によって用いられる、即ち当該タンパク質は、ＡＴＰから既にリン酸化されているＰ−α−１，４−グルカンへリン酸残基を転移する。
【００５６】
ＡＴＰを共基質としてＰ−α−１，４−グルカンへのリン酸残基転移に用いるタンパク質の活性を、ラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰ（ラベルＡＴＰ）を用いることによって実証できる。好ましいのは、特異的にβ位置のリン酸残基がラベルされているＡＴＰ、即ちβ位置のリン酸残基のみが標識を有するＡＴＰである。好ましくは放射性ラベルＡＴＰ、特に好ましくはリン酸残基がβ位置で特異的に放射性ラベルされたＡＴＰ、またとりわけ好ましくはリン酸残基が33Ｐによってβ位置で特異的にラベルされたＡＴＰを用いる。もしＰ−α−グルカンリン酸化タンパク質をＰ−α−１，４−グルカンとラベルＡＴＰ存在下でインキュベーションすれば、共有結合によりＰ−α−１，４−グルカンに結合したラベルされたリン酸を検出することができる。この場合、リン酸化反応に用いられるＰ−αグルカンは、デンプンリン酸を含む植物デンプン（ジャガイモデンプン、Curcuma armada、C. zedoaria、C. longa、イネ、リョクトウ、タピオカなどのデンプン）の形で、および酵素によりリン酸化されたＰ−α−１，４−グルカンまたは化学的にリン酸化されたＰ−α−１，４−グルカンの形、の両方で存在することができる。好ましくは、Arabidopsis thalianaの葉のデンプン、特に好ましくは、Ｒ１タンパク質によって酵素的にリン酸化された、Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体からのデンプンを用いる。
【００５７】
タンパク質によりＰ−α−１，４−グルカンに組み入れることができるラベルされたリン酸残基を、例えばラベルされたＰ−α−１，４−グルカンを反応混合液の残りから分離し（例えばエタノール、濾過、クロマトグラフ法、遠心分離などによるα−１，４−グルカンの沈澱による）、それに続いて適切なＰ−α−１，４−グルカン分画中のラベルされたリン酸残基を検出して、実証することができる。同時に、Ｐ−α−１，４−グルカン分画に結合しているラベルされたリン酸基を、例えばＰ−α−１，４−グルカン分画中に存在する放射活性の量を測定して（例えばシンチレーションカウンターにより）、実証することができる。
【００５８】
さらなる実施態様において、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法は、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を有するタンパク質が、基質としてＰ−デンプンを用いる方法に関する。Arabidopsis thaliana のsex1-3 突然変異体から分離されたデンプンを、その後酵素によってリン酸化したものが特に好ましい。本発明による方法のこの好ましい実施態様を実施するために、従って、操作工程ｃ）ｉにおいてリン酸化されたデンプンを用い、操作工程ｃ）ii において非リン酸化デンプンを用いる。
【００５９】
それによってＰ−デンプンをリン酸化するタンパク質を同定することができる。そのようなタンパク質は、適切な植物の遺伝子操作により植物生物体中のデンプンを修飾するためにとりわけ適している。
【００６０】
さらなる実施態様では、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法は、タンパク質がＰ−α−１，４−グルカンへのリン酸基転移中にリン酸化された中間生成物となるタンパク質の同定方法に関する。前記中間生成物は、好ましくは当該タンパク質の自己リン酸化により形成される。
【００６１】
Ｐ−α−１，４−グルカンのタンパク質を介するリン酸化の結果として、中間生成物として生ずるリン酸化されたタンパク質を、Ritte et al.(2002, PNAS 99, 7166-7171)にＲ１タンパク質について記述されているように実証することができる。
【００６２】
自己リン酸化された中間生成物の存在を検出するために、最初にグルカンが存在しない状態で、タンパク質をラベルＡＴＰと、好ましくは特異的にβリン酸位置にラベルされたＡＴＰと、特に好ましくは33Ｐにより特異的にβリン酸位置でラベルされたＡＴＰと、１５〜４５分間、特に好ましくは２０〜４０分、およびとりわけ好ましくは２５〜３０分間、反応調製物１中でインキュベーションする。これと並行して、ラベルＡＴＰの代わりに対応する量の非ラベルＡＴＰを含む反応調製物２を、それ以外は同じ条件下でインキュベーションする。次に、非ラベルＡＴＰを反応混合物１に過剰に加え、非ラベルＡＴＰおよびラベルＡＴＰの混合物（反応混合液１中で以前に用いたのと同じ量のラベルＡＴＰおよび反応混合液１に過剰に加えたのと同じ量の非ラベルＡＴＰ）を反応混合液２に加えて、さらに１分〜５分間、好ましくは２〜５分間、および特に好ましくは３分間インキュベーションし、その後、Ｐ−α−１，４−グルカンを反応混合液１の部分Ａ（部分１Ａ）または反応混合液２の部分Ａ（部分２Ａ）に加える。反応混合物の残存する部分１Ｂおよび部分２Ｂの反応を、タンパク質を変性させることにより止める。反応混合液の部分Ｂを、タンパク質の変性を起こす当業者に公知の方法により、好ましくはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の添加により止めることができる。反応混合物の部分１Ａおよび部分２Ａを少なくとも、さらに１０分間インキュベーションしてから、これらの反応も止める。それぞれの反応混合液の部分Ａまたは部分Ｂ中に存在するα−１，４−グルカンを、反応混合物のそれぞれの残りから分離する。もしそれぞれのα−１，４−グルカンを例えば遠心分離によって分離すると、遠心分離の完了時に、反応混合物の部分Ａまたは部分Ｂそれぞれのα−１，４−グルカンは、沈殿したペレット中に見出され、またそれぞれの反応混合物中のタンパク質はそれぞれの遠心分離の上清に見出される。次に反応混合物の部分１Ａまたは２Ａ、および部分１Ｂまたは２Ｂの上清を、例えばそれぞれ、変性アクリルアミドゲル電気泳動により、続いて得られたアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを行って分析することができる。アクリルアミドゲル電気泳動によって分離された放射性ラベルタンパク質の量を定量するために、例えば当業者に公知の、いわゆる「ホスホイメージング」法を用いることができる。もし反応混合物１の部分Ｂの遠心上清中のタンパク質のオートラジオグラフィーまたは「phosphoimagers」による解析が、反応混合液１の部分Ａの遠心分離上清に比較して、有意に増加した信号を示す場合は、これはαグルカンのリン酸化を仲介するタンパク質が自己リン酸化された中間生成物となることを示す。反応混合物２の部分ＡおよびＢは対照として役立ち、したがって、オートラジオグラフィーまたは「phosphoimagers」による解析において、遠心分離上清に有意に増加した信号を示さないに違いない。
【００６３】
さらに、反応混合物１および２のそれぞれの部分Ａの、それぞれの沈殿したペレット中に残存するα−１，４−グルカンを、必要ならば、それぞれのα−１，４−グルカンを洗浄した後、使用されたラベルＡＴＰに対応する標識を有するデンプンリン酸の存在について調べることができる。もし反応混合物１の部分Ａのα−１，４−グルカンがラベルされたリン酸残基を含み、および、もし反応混合物１の部分Ｂの遠心分離上清のオートラジオグラフィーが、反応混合物１の部分Ａの遠心分離上清に比較して、有意に増加した信号をオートラジオグラフィー中に示す場合は、これはαグルカンのリン酸化を仲介するタンパク質が自己リン酸化された中間生成物として存在することを示す。反応混合物２の部分ＡおよびＢは対照として働き、したがって、α−１，４−グルカンを含む沈殿したペレット中の33Ｐラベルされたα−１，４−グルカンについて有意に増加した信号は示さないはずである。
【００６４】
さらなる実施態様において、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法は、Ｐ−α−１，４−グルカンのグルコース分子の好ましくはＣ−２位置またはＣ−３位置に、特に好ましくはＣ−３位置にリン酸モノエステル結合を導入するタンパク質を同定するための方法に関する。
【００６５】
Ｐ−α−１，４−グルカン中のグルコースモノマーの炭素原子（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）のどの位置がタンパク質またはタンパク質抽出物によって好んでリン酸化されるかを、Ritte et al.(2002, PNAS 99, 7166-7171) に記述されているように、例えばタンパク質またはタンパク質抽出物によりリン酸化されたＰ−α−１，４−グルカンを分析して決定することができる。この目的のために、タンパク質またはタンパク質抽出物によってさらにリン酸化されたＰ−α−１，４−グルカンを、酸を用いて加水分解し、次に陰イオン交換クロマトグラフィーによって分析する。
【００６６】
タンパク質によってリン酸化されたＰ−α−１，４−グルカンを、グルコースモノマーの炭素原子（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）のどの位置が、Ｐ−α−１，４−グルカンにおいてリン酸化されているか決定する目的で、好ましくはＮＭＲによって分析する。
【００６７】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、また基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法の、操作工程ｂ）によって得られたタンパク質を、本発明による方法の工程ｃ）において、ＡＴＰおよびＰ−α−１，４−グルカン、またはＡＴＰおよび非リン酸化α−１，４−グルカンを含む別々の調製物中でインキュベーションする。本発明による方法を実施するために、ラベルされたリン酸残基、特に好ましくは特異的にβ位置でラベルされたリン酸残基、とりわけ特異的にβ位置で放射性ラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰを用いることが望ましい。
【００６８】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための操作工程ｃ）ｉによる、本発明の溶解されたタンパク質とＡＴＰおよびＰ−α−１，４−グルカンとのインキュベーション、または工程ｃ）iiによる非リン酸化α−１，４−グルカンとのインキュベーションは、好ましくは２０℃〜３０℃の温度で、特に好ましくは２３℃〜２７℃、およびとりわけ好ましくは２４℃〜２６℃で行われ、また少なくとも１５分間、好ましくは少なくとも２０分間、特に好ましくは少なくとも３０分間実施される。この場合に用いられるＡＴＰの量は、好ましくは少なくとも０．０５μM、特に好ましくは少なくとも３μM、およびとりわけ好ましくは少なくとも５μMである。用いられるＰ−α−１，４−グルカン、または用いられる非リン酸化α−１，４−グルカンの濃度は、この場合好ましくは少なくとも１mg/ml、特に好ましくは少なくとも１０mg/ml、およびとりわけ好ましくは少なくとも２５mg/mlである。インキュベーションが完了した後、タンパク質抽出物のＰ−α−１，４−グルカンまたは非リン酸化α−１，４−グルカンとの反応を止めることができる。それぞれの反応混合物を当業者に公知のタンパク質を変性させることによる方法により、好ましくはラウリル硫酸ナトリウムを加えて５分間９５℃で熱することにより、止めることができる。α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法の工程ｃ）ｉまたはｃ）ii のそれぞれを実施するときには、タンパク質をＰ−α−１，４−グルカンまたは非リン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションする間、それぞれのインキュベーション調製物のために同一のインキュベーション条件を実行するべきである。
【００６９】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法を実施した後に、操作工程ｃ）ｉによって得られたＰ−α−１，４−グルカン、または操作工程ｃ）ii によって得られた非リン酸化α−１，４−グルカンを、追加のリン酸残基の導入について調べる。リン酸残基が操作工程ｃ）ｉおよび／またはｃ）iiにより当該α−１，４−グルカンへさらに導入されたかどうかを測定するために、操作工程ｃ）ｉおよびｃ）iiで用いられるラベルＡＴＰに用いられる標識を特異的に検出できる任意の方法を用いることができる。例えば、操作工程ｃ）ｉまたはｃ）iiで放射性ラベルＡＴＰを用いる場合、放射性元素の検出のための当業者に公知の方法、例えばオートラジオグラフィー、適当な機器（例えばシンチレーションカウンター、「phosphoimagers」など）による放射活性測定などを用いて、これを実行することができる。
【００７０】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法の操作工程ｂ）で用いられるタンパク質、即ち工程ｃ）ｉでＰ−α−１，４−グルカンへ有意な量のリン酸残基を導入したが、それに比較して工程ｃ）iiで非リン酸化α−１，４−グルカンへは有意な量のリン酸残基を導入しなかったタンパク質を、当業者に公知の方法によって同定することができる。
【００７１】
本発明に関連して、用語「有意な量」とは、対応する対照実験において測定された量よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、特に好ましくは少なくとも６倍、およびとりわけ好ましくは少なくとも８倍高い量であると理解しなければならない。この場合、自然のタンパク質抽出物の代わりに、完全に不活性化されたタンパク質抽出物を含むかまたはタンパク質抽出物を含まないインキュベーション調製物を対照実験として用いることができる。α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を少しも検出することができないタンパク質抽出物は「完全に不活性化されている」と理解される。
【００７２】
非リン酸化α−１，４−グルカンと比較してリン酸化されたα−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定するための本発明による方法を実施する場合に、タンパク質の同定が、当業者に公知の方法を用いて、例えば、エドマン分解、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−飛行時間質量分析法）を用いる質量分析、その後に続くタンパク質の質量プロフィールを含むデータベースとの比較、Ｑ−ＴＯＦ解析またはＴＯＦ／ＴＯＦ解析その他によるアミノ酸配列決定などを含む方法を用いる、当該タンパク質のアミノ酸配列の決定などを用いて遂行できる。当該タンパク質を、好ましくはＱ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳ解析により同定する、特に好ましくはさらに下に記述する方法を用いてタンパク質を同定する（一般的方法項目１０を参照のこと）。
【００７３】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳに続いてタンパク質の質量プロフィールを含むデータベースとの比較を行うことによりタンパク質を決定する場合は、最初に当該タンパク質を前もって酵素で消化し、次に消化して得られるタンパク質断片（ペプチド）の個々の質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析する。当該タンパク質の質量プロフィールが得られる。これらの質量プロフィールは、ペプチド結合を、それが特異的な一連のアミノ酸配列中に含まれている場合にのみ切断する配列特異的なプロテアーゼをタンパク質の消化に用いるので、タンパク質に非常に特異的である。あるプロテアーゼに対する認識配列として働く特別のアミノ酸配列が知られている場合には、特異的なプロテアーゼによるアミノ酸配列の消化後に生成されるであろうペプチドの質量を計算することにより、任意のアミノ酸配列から理論的な質量プロフィールを生成することができる。したがって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳを用いて実際に得られた未知のタンパク質の質量プロフィールを、対応するデータベース中の理論的に決定された質量プロフィールと比較することにより、アミノ酸配列を決定することができる。
【００７４】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、工程ａ）によりタンパク質抽出物をＰ−α−１，４−グルカンとインキュベーションすることにより得られたＰ−α−１，４−グルカンタンパク質複合体を、当該α−１，４−グルカンに結合しなかったタンパク質から分離する。
【００７５】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、本発明による方法の工程ｂ）によって溶解されたタンパク質を、工程ａ）で用いられるＰ−α−１，４−グルカンから分離する。
【００７６】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、本発明による方法を実施するときに操作工程ｂ）によって得られた溶解されたＰ−α−１，４−グルカン結合タンパク質を、互いに分離する。
【００７７】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、タンパク質抽出物を工程ｃ）ｉによりＰ−α−１，４−グルカンと、または工程ｃ）ii により非リン酸化α−１，４−グルカンとインキュベーションすることによって得られたグルカンを、反応混合物中に存在するタンパク質および／または反応混合物中に存在するラベルＡＴＰから分離する。
【００７８】
ここでα−１，４−グルカンの分離に用いるのは、好ましくは濾過であり、特に好ましくは遠心分離であり、とりわけ好ましくはさらに下に記述する方法である（一般的方法項目８を参照のこと）。パーコールパッドを用いて遠心分離を実行した後、反応混合物の可溶物質は遠心分離媒体の上清に存在し、α−１，４−グルカンは沈殿したペレットの中に存在する。
【００７９】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様は、アミノ酸配列から導出された１２０kDa〜１４５kDaの、好ましくは１２０kDa〜１４０kDaの、特に好ましくは１２５kDa〜１４０kDaの、とりわけ好ましくは１３０kDa〜１３５kDaの分子量を有するタンパク質を同定するための方法に関する。
【００８０】
タンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、当該タンパク質の同定の後に、これらのタンパク質をコードするアミノ酸配列が決定される。
【００８１】
アミノ酸配列を本発明により当業者に公知の任意の方法を用いて決定することができる。そのような方法は専門的な文献に十分に記述されており(例えば、Protein Sequencingand Identification UsingTandem Mass Spectrometry, 2000, John Wiley & Sons Inc, ISBN: 0-471- 32249-0; Protein SequencingProtocols, 2002, Smith（Ed.), Edition: 2nd, Humana Press, ISBN: 0-89603-975-7 中に）、また基本的に本発明による方法を実施するために適している。さらに多くの会社が、請負サービスとしてタンパク質の精製および／または配列決定を実施する（例えば、Eurogentec, Searing, Belgium)。
【００８２】
必要なら、タンパク質を同定するための本発明による方法を用いるタンパク質を、それらのアミノ酸配列を決定する前に、さらに精製および／または濃縮することができる。タンパク質の精製および／または濃縮の方法は、専門的な文献に十分に記述されており（例えば、Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Vol.182 1990, Deutscher, Murray P.(Ed.), Academic Press, ISBN: 0-12-182083-1; Isolation and Purification of Proteins: Hatti- Kaul, 2003, Rajni（Ed.); Mattiasson, Bo（Edt), Marcel Dekker Inc, ISBN: 0-8247-0726- 5, Protein Purification Techniques: A Practical Approach.Roe, 2001, Simon（Ed.).The Practical Approach Series, 244. Edition: 2nd. Oxford Univ Press, ISBN: 0-19- 963673-7)、また基本的に本発明による方法を実施するために好適である。
【００８３】
タンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様においては、コードするアミノ酸配列がホスホヒスチジン領域（Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918) を有するタンパク質を同定するための本発明による方法を用いる。ホスホヒスチジン領域は、配列番号５で指定される Arabidopsis thaliana および Oryza sativa 由来のＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジン領域のアミノ酸配列と少なくとも５０％の、特に少なくとも６０％の、好ましくは少なくとも７０％の、特に好ましくは少なくとも８０％の、およびとりわけ好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。
【００８４】
タンパク質を同定するための本発明による方法のさらなる実施態様において、コードするアミノ酸配列がホスホヒスチジン領域(Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918) を有するタンパク質を同定するための本発明による方法を用い、ここで、ホスホヒスチジン領域は２つのヒスチジンを含む。
【００８５】
本発明による方法を用いて、非リン酸化α−１，４−グルカンと比較してＰ−α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質を同定することができる。
【００８６】
本発明による方法を用いて、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質を同定することができる。
【００８７】
したがって、タンパク質を同定するための本発明による方法によって得ることができるタンパク質もまた、本発明の目的である。
【００８８】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を同定する方法であって：
ａ）タンパク質を同定するための本発明による方法を用いて、タンパク質を同定し、
ｂ）工程ａ）によって同定されたタンパク質をコードするアミノ酸配列を決定し、
ｃ）工程ｂ）によって決定されたアミノ酸を用いて、工程ａ）によって同定されたタンパク質をコードする核酸を同定する、
方法もまた本発明の目的である。
【００８９】
本発明による方法を用いて同定されたタンパク質のアミノ酸配列は、既に上に述べたように、当業者に公知の方法を用いて決定することができる。
【００９０】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を同定するための本発明による方法の工程ｂ）によって決定されたアミノ酸配列に基づいて、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を同定することができる。
【００９１】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を、例えば利用可能なデータベース、例えば、ＥＭＢＬ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm）、またはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を詳細に調べることにより、同定することができる。この場合、本発明による方法を実施するときに決定される１つまたは複数のアミノ酸配列を予め所謂クエリーとして定義しておく。その後、このクエリー配列を、選択したデータベースに含まれる配列と統計的コンピュータプログラムにより、比較する。そのようなデータベースクエリー（例えば、ｂｌａｓｔまたはｆａｓｔａ検索）は当業者に公知であり、様々なプロバイダーによって実行することができる。
【００９２】
そのようなデータベースクエリーを、例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で実行する場合は、個別比較調査のために指定される標準設定を用いるべきである。タンパク質配列比較（ｂｌａｓｔｐ）については、これらは次の設定である： Limit entrez＝not activated；Filter＝low complexity activated；Expect value＝１０；word size＝３；Matrix＝BLOSUM62；Gap costs：Existance＝１１，Extension ＝１．
【００９３】
そのようなデータベース検索中に、例えば、本発明による方法を実施する場合に本発明で決定されるアミノ酸配列を、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸分子を同定するために、クエリー配列として用いることができる。記述した方法を用いて、本発明による方法を用いて得ることができ、かつα−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸分子および／またはタンパク質に対して高度の同一性を有する核酸分子および／またはアミノ酸配列もまた、同定することが可能である。
【００９４】
アミノ酸配列から出発してこれらをコードする核酸を同定することができる方法は当業者に公知である（例えば、Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition（2001) Cold SpringHarbour Laboratory Press, Cold SpringHarbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition（2002), ISBN: 0471250929 を参照のこと）。α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードするアミノ酸配列から、当該アミノ酸配列をコードする核酸を、遺伝子コードに従って推論することができる。遺伝子コードから得られる縮退したオリゴヌクレオチドを、基本的に核酸を同定するために用いることができることは当業者に公知である。本発明による方法を実施する場合に得られるアミノ酸配列に由来する配列を構成するオリゴヌクレオチドを、次に合成することができる。これらの合成オリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質をコードする核酸（そのタンパク質のアミノ酸配列から対応するオリゴヌクレオチド配列が導出された）を同定することができる。例えば、前記合成オリゴヌクレオチドをラベルされたプローブとしてハイブリダイゼーションプローブの形で用いる遺伝子ライブラリーの探索により、これを達成することができる。α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を同定するためのさらなる可能性には、本発明による方法を実施する際に得られるアミノ酸配列に由来する合成オリゴヌクレオチドの使用が含まれ、その場合、前記合成オリゴヌクレオチドをいわゆる「プライマー」として用い、ＰＣＲに基づく方法を使用して遺伝子ライブラリーを探索する。遺伝子ライブラリーは例えば、コスミド、ファージミド、プラスミド、ＹＡＣまたはＢＡＣの形で存在する可能性がある。ＤＮＡライブラリーは、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方を含むことができる。いわゆるＲＴ（逆転写）ＰＣＲを用いる場合のＰＣＲに基づいた検索方法については、ｍＲＮＡを用いることがさらに可能である。遺伝子ライブラリー中の、あるいはｍＲＮＡとして存在する核酸を同定するために本発明による方法を実施するための核酸は、この場合任意の生物体から、好ましくは真核生物から、特に好ましくは植物から、とりわけ好ましくは穀物植物から、得ることができる。
【００９５】
α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を同定するための本発明による方法の実施のためには、本発明による方法の工程ｂ）の中で、当該タンパク質をコードするアミノ酸配列全体を決定する必要はなく、当該タンパク質をコードする当該アミノ酸配列の一部分を決定すれば十分であり得る。
【００９６】
本発明のさらなる実施態様は、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を同定する方法であって、
ａ）タンパク質を同定するための本発明による方法を用いてタンパク質を同定し、
ｂ）工程ａ）によって同定されたタンパク質をコードするアミノ酸配列を決定し、
ｃ）工程ｂ）で決定されたアミノ酸配列からスタートして、オリゴヌクレオチドを合成
し、そして、
ｄ）工程ａ）によって同定されたタンパク質をコードする核酸を、工程ｃ）によって合
成されたオリゴヌクレオチドを用いて同定する、
方法に関する。
【００９７】
本発明のさらなる目的は、α−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示すタンパク質をコードする核酸を同定する方法であって、
ａ）タンパク質を同定するための本発明による方法を用いてタンパク質を同定し、
ｂ）工程ａ）によって同定されたタンパク質と特異的に反応する抗体を生成し、
ｃ）工程ｂによって決定された抗体を用いて、核酸を同定する、
方法に関する。
【００９８】
あるタンパク質と特異的に反応する、即ち前記タンパク質に特異的に結合する抗体を作製する方法は当業者に公知である（例えば、Lottspeich and Zorbas（Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4 を参照のこと）。そのような抗体の製造を、いくつかの会社（例えば Eurogentec, Belgium）が、請負サービスとして提供する。
【００９９】
抗体を用いて核酸を同定する方法は、専門家の文献（例えば、Lottspeich und Zorbas（Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad. Verlag., Heidelberg, Berlin, ISBN 3- 8274-0041-4 を参照のこと）の中でしばしば「免疫スクリーニング」と呼ばれ、同じく当業者に公知であり、文献に詳細に記述されている。例えば、いわゆる発現遺伝子ライブラリーをそのような方法を実施するために使用することができ、その場合、得られたクローンがあるタンパク質を発現しているかどうかについて、このタンパク質に対する特異抗体の助けを借りて検索することができる。そのような発現遺伝子ライブラリーを作製するための材料を、作製方法およびそのような発現遺伝子バンクを検索するための方法に関する指示も含めて、購入することができる（例えば Stratagene）。
【０１００】
本発明による方法を用いて、非リン酸化α−１，４−グルカンと比べてＰ−α−１，４−グルカンに対して高い結合活性を示すタンパク質、および／またはα−１，４−グルカンリン酸化酵素活性を示し、基質としてリン酸化されたα−１，４−グルカンを要求するタンパク質をコードする核酸を同定することができる。
【０１０１】
したがって、核酸を同定するための本発明による方法によって得ることができる核酸も、さらに本発明の目的である。
【０１０２】
ブダペスト条約によりthe German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany に、Arabidopsis thaliana 由来の本発明によるタンパク質（Ａ.ｔ.−ＯＫ１）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（Ａ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ）が、番号ＤＳＭ１６２６４の下に２００４年３月８日に寄託され、Oryza sativaからの本発明によるさらなるタンパク質（Ｏ.ｓ.−ＯＫ１）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＭ１５０）が、２００４年３月２４日に番号ＤＳＭ１６３０２の下に寄託された。
【０１０３】
驚くべきことに、本発明によるタンパク質の高い活性を示す遺伝的に修飾された植物細胞または植物が、野生型植物細胞または野生型植物中で合成されたデンプンと比較して、その物理的・化学的性質、特にデンプンリン酸の含量またはリン酸分布が、修飾された修飾デンプンを合成することが見出された。したがってこれは特別な応用によく適している。
【０１０４】
したがって、本発明のさらなる目的は、対応する非遺伝的修飾野生型植物細胞または野生型植物と比較して、本発明によるタンパク質の高い酵素活性を示すことを特徴とする遺伝的に修飾された植物細胞または遺伝的に修飾された植物に関する。
【０１０５】
この場合、遺伝子的修飾は、対応する遺伝的修飾のなかった野生型植物細胞または野生型植物と比較して、本発明による少なくとも１つのタンパク質の活性の増加をもたらす任意の遺伝的修飾でよい。
【０１０６】
本発明に関連して、用語「野生型植物細胞」とは、当該植物細胞を本発明による植物細胞作製用の出発物質として用いたことを、すなわちそれらの遺伝子情報が、導入された遺伝的修飾は別にして、本発明による植物細胞の遺伝子情報に一致することを意味する。
【０１０７】
本発明に関連して、用語「野生型植物」とは、当該植物を本発明による植物作製の出発物質として用いたことを、すなわちそれらの遺伝子情報が、導入された遺伝的修飾は別にして、本発明による植物の遺伝子情報に一致することを意味する。
【０１０８】
本発明に関連して、用語「対応する」とは、いくつかの対象の比較において、互いに比較される当該対象が同じ状態に保たれてきたことを意味する。本発明に関連して、野生型植物細胞または野生型植物と関連して用語「対応する」とは、互いに比較される植物細胞または植物が、同一の栽培条件下で生育され、およびそれらが同じ（栽培）年令を有していることを意味する。
【０１０９】
本発明の枠組みの中で用語「高い活性」とは、この場合本発明によるタンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の増加、および／または細胞内の本発明によるタンパク質量の増加、および／または細胞内の本発明によるタンパク質の酵素活性の増加を意味する。
【０１１０】
発現の増加を、例えば本発明によるタンパク質をコードする転写物の量を、例えば、ノーザンブロット解析またはＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することにより、決定することができる。核酸を同定するための本発明による方法を用いて同定された核酸分子を、この場合好ましく用いて、本発明によるタンパク質の高い発現を決定する。ここで、増加とは、遺伝的修飾のなかった対応する細胞と比較して、転写物の量の少なくとも５０％の、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８５％の、および特に好ましくは少なくとも１００％の、増加を意味する。本発明によるタンパク質をコードする転写物の量の増加とは、また本発明によるタンパク質をコードする検出できる転写物を有しない植物が、本発明による遺伝的修飾の後に、本発明によるタンパク質をコードする検出できる量の転写物を有することを意味する。
【０１１１】
本発明によるタンパク質のタンパク質量の増加（それは当該植物細胞中のこのタンパク質の活性増加をもたらす）を、例えば、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などの免疫学的方法によって決定することができる。免疫学的方法を用いてタンパク質量の増加を測定するために用いることができる抗体の作製法を、さらに下に例として記述する（実施例１１を参照のこと）。ここで増加とは、好ましくは、遺伝的修飾のなかった対応する細胞と比較して、本発明によるタンパク質の量の、少なくとも５０％の、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８５％の、および特に好ましくは少なくとも１００％の増加を意味する。本発明によるタンパク質の量の増加とはまた、本発明によるタンパク質の検出できる量を有しない植物が、本発明による遺伝的修飾後に、検出できる量の本発明によるタンパク質を有することを意味する。
【０１１２】
さらに驚くべきことに、本発明によるタンパク質の低下した活性を示す遺伝的に修飾された植物細胞または遺伝的に修飾された植物が、野生型植物細胞あるいは野生型植物中で合成されるデンプンと比較して、物理的・化学的性質、特にリン酸分布に関する性質が修飾された修飾デンプンを合成することが見出された。したがって、これは特別な応用に一層よく適している。
【０１１３】
したがって、本発明のさらなる目的は、遺伝的修飾のなかった対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、本発明によるタンパク質の低下した酵素活性を示すことを特徴とする遺伝的に修飾された植物細胞または遺伝的に修飾された植物に関する。
【０１１４】
本発明によるタンパク質の低下した活性を示す植物が、高いデンプン（デンプン過剰）表現型を示す。更に、本発明によるタンパク質の低下した活性を示す植物は、野生型植物と比較して正常な成長を示す、すなわち、本発明によるタンパク質の低下した活性によっては、植物の成長が妨げられることはない。したがって本発明によるタンパク質の低下した活性を示す植物は、それらがより多くのデンプン、したがってより多くの炭水化物を含んでいて同時に成長速度の低下を示さないので、農業における栽培に適している。
【０１１５】
本発明は、したがってまた、デンプン過剰表現型を示す本発明による植物細胞および植物に関する。本発明による植物細胞および本発明による植物は、それらの葉の中に暗期の終わりに、対応する野生型植物細胞または野生型植物より、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、特に好ましくは少なくとも６倍、およびとりわけ好ましくは少なくとも８倍多くのデンプンを有する。
【０１１６】
本発明による植物細胞および本発明による植物は、それらの葉の中に明期の終りに対応する野生型植物細胞または野生型植物より、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも１．５倍、特に好ましくは少なくとも１．８倍、およびとりわけ好ましくは、少なくとも２倍多くのデンプンを有する。
【０１１７】
本発明によるタンパク質が低下した活性を示す本発明による植物細胞および本発明による植物を、当業者に公知の様々な方法により作製することができる。これらには、例えば、対応するアンチセンスＲＮＡあるいは二本鎖ＲＮＡコンストラクトの発現、共抑制効果を与える分子またはベクターの調製、本発明によるタンパク質をコードする転写物を特異的に切断する対応して構築されたリボザイムの発現、またはいわゆる「インビボ突然変異誘発」が含まれる。さらに、植物細胞および植物中の本発明によるタンパク質の活性の低下は、抑圧すべきそれぞれの標的遺伝子の、好ましくはＯＫ１遺伝子の、センスおよびアンチセンスＲＮＡ分子の同時発現によっても、引き起すことが可能である。
【０１１８】
さらに、トランスのプロモーター配列の二本鎖ＲＮＡ分子の植物内形成により、このプロモーターの相同コピーのメチル化および転写の不活性化がもたらされる可能性があることがさらに知られている（Mette et al., EMBO J. 19,（2000), 5194-5201）。
【０１１９】
植物細胞または植物中のタンパク質の酵素活性を低下させる別の可能な方法は、いわゆる免疫修飾法である。特異的に植物タンパク質を認識する抗体の植物内発現により、タンパク質・抗体複合体が形成される結果、対応する植物細胞中の当該タンパク質活性の低下が起こることが知られている（Conrad and Manteufel, Trends in Plant Science 6,（2001), 399-402; De Jaeger et al., Plant Molecular Biology 43,（2000), 419-428; Joblinget al., Nature Biotechnology 21,（2003), 77-80)。
【０１２０】
これらの方法はすべて、植物細胞または植物のゲノム中への１つまたは複数の外来性核酸分子の導入に基づいており、したがってまた、本発明による植物細胞をおよび本発明による植物を作製するために基本的に適している。
【０１２１】
本発明のさらなる実施態様では、本発明による植物細胞または本発明による植物は、デンプン貯蔵植物の植物細胞またはデンプン貯蔵植物を含む。デンプン貯蔵植物は、例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サツマイモ、サゴ、リョクトウ、バナナ、エンドウ、Arabidopsis、ウコン、またはモロコシの植物である。特に好ましいのはイネであり、とりわけ好ましいのはコムギ植物である。
【０１２２】
本発明のさらなる実施態様は、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞または本発明による遺伝的に修飾された植物であって、遺伝的修飾が、植物ゲノム中への少なくとも１つの外来性核酸分子の導入であるものに関する。
【０１２３】
この文脈において、用語「遺伝的修飾」とは、植物細胞のゲノムまたは植物のゲノムの中への、相同のおよび／または非相同の外来性核酸分子の導入であって、これらの分子の前記導入は、本発明によるタンパク質の活性の増大または減少をもたらすものを意味する。
【０１２４】
本発明による植物細胞または本発明による植物が、それらの遺伝子情報に関して、外来性核酸分子の導入により修飾される。外来性核酸分子の存在または発現が、表現型の変化をもたらす。「表現型の」変化とは、この場合好ましくは、細胞の一つまたは複数の機能の測定可能な変化を意味する。例えば、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞および本発明による遺伝的に修飾された植物は、導入された核酸分子の存在によりまたはその発現の際に、本発明によるタンパク質の活性の増加または減少を示す。
【０１２５】
本発明に関連して、用語「外来性核酸分子」とは、対応する野生型植物細胞には自然に生じないような、または野生型植物細胞中の特定の空間的配置には自然に生じないような分子、または野生型植物細胞のゲノム中のそれが自然に生じない場所に局在している分子、を意味するものと理解される。好ましくは、外来性核酸分子は、その組合せまたは特異的な空間的配置が植物細胞中に自然には生じない種々の要素から成る組換え分子である。
【０１２６】
原則として、外来性核酸分子は、植物細胞または植物中の本発明によるタンパク質の活性の増加をもたらす任意の核酸分子であってよい。
【０１２７】
本発明に関連して、用語「ゲノム」とは、植物細胞中に存在する遺伝物質の全体を意味すると理解すべきである。細胞核だけでなく、他のコンパートメント（例えばプラスチド、ミトコンドリア）も遺伝物質を含むことは当業者に公知である。
【０１２８】
本発明の好ましい実施態様は、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞または本発明による遺伝的に修飾された植物であって、遺伝的修飾が、少なくとも１つの外来性核酸分子の植物ゲノム中への導入であり、また外来性核酸分子は本発明によるタンパク質をコードする、修飾植物細胞または修飾植物に関する。
【０１２９】
本発明のさらなる実施態様は、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞または本発明による遺伝的に修飾された植物であって、遺伝的修飾は少なくとも１つの外来性核酸分子の植物ゲノム中への導入であり、外来性核酸分子は、本発明による核酸分子を、好ましくはArebidopsis thaliana から、特に好ましくはイネから分離された本発明による核酸分子を含む、修飾植物細胞または修飾植物に関する。
【０１３０】
多くの技術が、植物ホスト細胞へのＤＮＡ導入に利用可能である。これらの技術には、形質転換媒体としてAgrobacterium tumefaciens または Agrobacterium rhizogenes を用いるＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、微粒子銃法によるＤＮＡの導入、ならびに他の可能性が含まれる。
【０１３１】
アグロバクテリウムを介する植物細胞の形質転換の使用は、集中的に研究され、ＥＰ １２０５１６、Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam（1985), Chapter V、Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 および An et al. EMBO J. 4,（1985), 277-287 により十分に記述されている。ジャガイモの形質転換については、例えば Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8,（1989), 29-33 を参照のこと。
【０１３２】
Agrobacterium 形質転換に基づくベクターによる単子葉植物の形質転換についてもまた記述されている（Chan et al., Plant Mol. Biol. 22,（1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6,（1994) 271-282; Denget al, Science in China 33,（1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11,（1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13,（1995), 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153（1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2,（1993), 252-265) 153（1992), 550- 555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2,(1993), 252-265)。単子葉植物の形質転換の別のシステムが、微粒子銃法による形質転換（Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104,（1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11（1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24,（1994), 317- 325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79,（1990), 625-631)、プロトプラスト形質転換、部分的透過性付与細胞のエレクトロポレーション、およびガラス繊維によるＤＮＡの導入である。特にトウモロコシの形質転換については、文献にしばしば記述された（例えば、ＷＯ９５／０６１２８、ＥＰ０５１３８４９、ＥＰ０４６５８７５、ＥＰ０２９２４３５；Fromm et al., Biotechnology 8,（1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2,（1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11（1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80,（1990), 721-726 参照) 。
【０１３３】
他の型の穀類の成功した形質転換についても、既に例えばオオムギ（Wan and Lemaux,上記; Ritala et al.,上記; Krens et al., Nature 296,（1982), 72-74) およびコムギ(Nehra et al., Plant J. 5,（1994), 285-297) について記述されている。上記の方法はすべて本発明の枠組み内において適切である。
【０１３４】
とりわけ、本発明による植物細胞および本発明による植物を、野生型植物細胞および野生型植物から、それらが野生型植物細胞または野生型植物に自然には生じない外来性核酸分子を含んでいるという点で、あるいはそのような分子が本発明による植物細胞のゲノムまたは本発明による植物のゲノム中のそれが野生型植物細胞または野生型植物中では生じない場所に、すなわち異なるゲノム環境に、組入れられて存在するという点で、それぞれ区別することができる。さらに、この型の本発明による植物細胞および本発明による植物は、野生型植物細胞および野生型植物から、それらがゲノム内に安定して組入れられた外来性核酸分子の少なくとも１つのコピーを、野生型植物細胞または野生型植物中で恐らく自然に生ずるそのような分子のコピーに加えて、含んでいるという点でそれぞれ異なる。もし本発明による植物細胞または本発明による植物へ導入された外来性核酸分子が、野生型植物細胞または野生型植物にそれぞれ既に自然に生じている分子の付加的なコピーである場合は、本発明による植物細胞および本発明による植物を野生型植物細胞および野生型植物から、特にこの付加的コピーまたはこれらの付加的コピーがゲノム中のそれが（あるいは、それらが）野生型植物細胞または野生型植物では生じない場所に局在しているという点で、それぞれ区別することができる。これを例えばサザンブロット分析を用いることにより確認することができる。
【０１３５】
更に、本発明による植物細胞また本発明による植物を、好ましくは次の特徴の少なくとも１つによって、野生型植物細胞または野生型植物とそれぞれ区別することができる：導入された外来性核酸分子が、植物細胞または植物に関して非相同の場合は、本発明による植物細胞または本発明による植物が、導入された核酸分子の転写物を有している。これらを、例えばノーザンブロット解析、またはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によって確認することができる。好ましくは、本発明によるタンパク質の高い活性を示す本発明による植物細胞および本発明による植物は、導入された核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。これを、例えば免疫学的方法、特にウエスタンブロット解析によって実証することができる。本発明によるタンパク質の低下した活性を示す本発明による植物細胞および本発明による植物は、前記免疫学的方法を用いて研究するとき、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、当該タンパク質の量の減少を示す。
【０１３６】
もし導入された外来性核酸分子が植物細胞または植物に関して相同である場合は、本発明による植物細胞あるいは本発明による植物を野生型植物細胞または野生型植物と、例えば導入された外来性核酸分子の追加の発現により、それぞれ区別することができる。本発明による植物細胞および本発明による植物は、好ましくは外来性核酸分子の転写物を含む。これを、例えばノーザンブロット解析、またはいわゆる定量ＰＣＲを用いて実証することができる。
【０１３７】
特別の実施態様では、本発明による植物細胞および本発明による植物は、それぞれ遺伝子組換え植物細胞または遺伝子組換え植物である。
【０１３８】
本発明のさらなる実施態様では、本発明による植物細胞および本発明による植物は、遺伝的修飾のなかった野生型植物細胞または野生型植物から分離されたデンプンと比較して修飾されたデンプンを合成する。
【０１３９】
本発明に関連して、用語「修飾デンプン」とは、対応する野生型植物細胞または野生型植物から得ることができる修飾のないデンプンと比較して、デンプンが物理的・化学的特性を変化させたことを意味する。
【０１４０】
さらなる実施態様では、本発明による植物細胞または本発明による植物は、対応する野生型植物細胞または野生型植物から単離したデンプンと比較して、高いデンプンリン酸含量および／または修飾されたリン酸分布を有する修飾デンプンを合成する。
【０１４１】
本発明による方法のさらなる実施態様において、本発明による植物細胞または本発明による植物は、対応する遺伝的修飾のなかった野生型植物細胞または遺伝的修飾のなかった植物と比較して、デンプンリン酸の修飾されたＣ−３／Ｃ−６ 比率を有する修飾デンプンを合成する。特にこの場合、遺伝的修飾のなかった野生型植物細胞または遺伝的修飾のなかった植物から分離された対応するデンプンと比較して、Ｃ−６の位置に結合したデンプンリン酸と比較して、Ｃ−３の位置に結合したデンプンリン酸の高い割合を示すデンプンが好ましい。
【０１４２】
本発明に関連して、用語「リン酸分布」は、α−１，４−グルカンの全デンプンリン酸含量に相対的なグルコース分子のＣ−２の位置、Ｃ−３の位置またはＣ−６の位置に結合したデンプンリン酸の割合として理解しなければならない。
【０１４３】
本発明に関連して、用語「Ｃ−２／Ｃ−３／Ｃ−６比率」を、Ｃ−２位置、Ｃ−３位置またはＣ−６位置にそれぞれ結合したα−１，４−グルカンのデンプンリン酸が、当該α−１、４−グルカンの全デンプンリン酸含量（Ｃ−２位置 ＋ Ｃ−３位置 ＋ Ｃ−６位置）に寄与するデンプンリン酸の割合として理解しなければならない。
【０１４４】
本発明に関連して、用語「Ｃ−３／Ｃ−６比率」を、Ｃ−３位置およびＣ−６位置にそれぞれ結合したα−１，４−グルカンのデンプンリン酸が、当該α−１，４−グルカンのＣ−３位置およびＣ−６位置に結合したデンプンリン酸の和（Ｃ−３位置 ＋ Ｃ−６位置）に寄与する、デンプンリン酸の割合として理解しなければならない。
【０１４５】
本発明のさらなる目的は、修飾デンプンを合成する本発明による植物細胞または本発明による植物であって、その修飾デンプンは、対応する野生型植物細胞または野生型植物からのデンプンと比較して、共有結合でグルコース分子のＣ−３位置でデンプンに結合しているリン酸の高い含量を有することを特徴とする。
【０１４６】
本発明のさらなる目的は、本発明による植物細胞を含む植物である。
【０１４７】
配列の記述
配列番号１：  Arabidopsis thaliana のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列を、ベクターＯＫ１−ｐＧＥＭ−Ｔ および ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７に挿入する。
配列番号２：  Arabidopsis thaliana のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号１に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号３：  Oryza sativa のＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列をベクターＭＩ５０に挿入する。
配列番号４：  Oryza sativa のＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号３に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号５：  Arabidopsis thaliana、Oryza sativa および Sorghum bicolor のＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジン領域をコードするペプチド配列。
配列番号６：  オオムギのＨ.ｖ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号７：  オオムギのＨ.ｖ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号８：  オオムギのＨ.ｖ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号９：  オオムギのＨ.ｖ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、ＴＩＧＲデータベースの「Ｂｌａｓｔ検索」機能を用い、配列番号６、配列番号７および配列番号８に示されたペプチド配列を使用して同定した。
配列番号１０：  オオムギのＨ.ｖ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的なアミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号９に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号１１：  ジャガイモのＳ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号１２：  ジャガイモのＳ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号１３：  ジャガイモのＳ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号１４：  ジャガイモのＳ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号１５：  ジャガイモのＳ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、ＴＩＧＲデータベースで「Ｂｌａｓｔ検索」機能を用い、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に示されたペプチド配列を使用して同定した。
配列番号１６：  ジャガイモのＳ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的アミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号１５に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号１７：  キビのＳ.ｂ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号１８：  キビのＳ.ｂ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号１９：  キビのＳ.ｂ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号２０：  キビのＳ.ｂ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号２１：  キビのＳ.ｂ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に示されたペプチド配列を使用し、ＴＩＧＲデータベースで「Ｂｌａｓｔ検索」機能を用いて同定した。
配列番号２２：  キビのＳ.ｂ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的アミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号２１に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号２３：  コムギのＴ.ａ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号２４：  コムギのＴ.ａ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に含まれるペプチド配列。
配列番号２５：  コムギのＴ.ａ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的核酸配列。この核酸配列は、配列番号２３および配列番号２４に示されたペプチド配列を使用し、ＴＩＧＲデータベースで「Ｂｌａｓｔ検索」機能を用いて同定した。
配列番号２６：  コムギのＴ.ａ.−ＯＫ１タンパク質をコードする部分的アミノ酸配列。示されたアミノ酸配列は、配列番号２５に示された核酸配列から導出することができる。
【０１４８】
一般的方法
下記に本発明による方法を実施するために用いることができる方法について記述する。これらの方法は、本発明の特別の実施態様を構成するが、本発明はこれらの方法に制限されない。記述された方法を変更することによりおよび／または方法の個々の部分を方法の別の部分に置換することにより、同じように本発明を実施できることは、当業者に知られている。
【０１４９】
１．  植物組織からのタンパク質抽出物の作製
【０１５０】
ａ）  植物組織からのタンパク質抽出物の作製
葉材料を収穫直後に液体窒素で凍結し、続いて液体窒素下乳鉢中で均質化する。細かくした葉材料を約３．５倍の体積（用いる葉材料の重量に対して）の冷却した（４℃）結合用緩衝液と混合し、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて、２×１０秒間浸軟した（最高速度）。Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘによる第１の処理の後、第２の処理を実行する前に縮小させた葉材料を氷上で冷却する。その後、処理した葉材料を、１００μmのナイロンメッシュを通し、２０分間遠心した（５０ml遠心管、２０，０００×ｇ、４℃）。
【０１５１】
ｂ）  タンパク質抽出物に含まれるタンパク質の沈澱
工程ａ）による遠心分離によって得られた上清を取り出し、その体積を測定した。タンパク質を沈殿させるために、硫酸アンモニウムを上清に、３０分間かけて氷上で撹拌しながら、７５％（重量／体積）の最終濃度になるまで連続的に加える。上清を続いてもう１時間氷上で撹拌しながらインキュベーションする。上清から沈殿させたタンパク質を、２０，０００×ｇおよび４℃１０分間でペレット化し、続いてペレットを５mlの結合用緩衝液に吸収させる、すなわちペレット中に存在するタンパク質を溶解させる。
【０１５２】
ｃ）  沈殿したタンパク質の脱塩
溶解したタンパク質を、セファデックスＧ２５(Amersham Bioscience, Freiburg, Prod. No. columns: 17-0851-01, Prod. No. Sephadex G25-M: 17-0033-01)を詰めたＰＤ１０カラムを用いて温度４℃で脱塩する、すなわち工程ｂ）の沈澱に用いられた硫酸アンモニウムを溶解したタンパク質から分離する。工程ｂ）に従って溶解されたタンパク質を加える前に、ＰＤ１０カラムを結合用緩衝液と平衡にする。この目的のために、各５mlの結合用緩衝液をカラム上に散布する。続いて、工程ｂ）に従って得られたタンパク質溶液の２．５mlを各カラムへ加え、次に３．５mlの結合用緩衝液によりカラムからタンパク質を溶出させる。
【０１５３】
ｄ）  タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度を、ブラッドフォード分析（Biorad, Munich, Prod. No.500-0006（Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254)）により決定する。 
【０１５４】
ｅ）  結合用緩衝液の組成
結合用緩衝液：    ５０mM        ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（またはＫＯＨ）、ｐＨ７．２
１mM        ＥＤＴＡ、
２mM        ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、
２mM        ベンズアミジン、
２mM        ε−アミノカプロン酸、
０．５mM    ＰＭＳＦ、
０．０２％  トリトンＸ−１００。
【０１５５】
２．  葉のデンプンの単離
【０１５６】
ａ）  植物組織からのデンプン粒の単離
葉材料を収穫直後に液体窒素中で凍結する。葉材料を小分けして乳鉢中で液体窒素下均質化し、全体で約２．５倍の体積（重量／体積）のデンプン緩衝液中に吸収させる。さらにこの懸濁液を、ワーリングブレンダー中最高速度で２０秒間再び均質化する。ホモジネートをナイロンメッシュ（メッシュ幅１００μm）に通し、５分間１，０００×ｇで遠心する。可溶性タンパク質を含む上清を捨てる。
【０１５７】
ｂ）  植物組織から単離されたデンプンの精製
デンプンの上にある緑の物質を、デンプン緩衝液で緑の物質をすすぎ落とすことによって除去した後、工程ａ）から得られたデンプンを含むペレットをデンプン緩衝液に吸収させ、種々のメッシュ幅（６０μm、３０μm、２０μmの順に）のナイロンメッシュに次々と通す。濾液を、１０mlのパーコール・クッション（９５％（v/v）パーコール（Pharmacia, Uppsala, Sweden)、５％（v/v）０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．２）（Ｃｏｒｒｅｘチューブ、１５min、２，０００×ｇ）を用いて、遠心分離する。この遠心分離後に得られた沈殿物をデンプン緩衝液に一度再懸濁し、再び遠心分離する（５min、１，０００×ｇ）。
【０１５８】
ｃ）  デンプンに結合したタンパク質の除去。
工程ｂ）に従って、デンプンに結合したタンパク質を含むデンプン粒を得る。デンプン粒の表面に結合したタンパク質を４回、各回に０．５％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）と１０〜１５分間室温で攪拌下インキュベーションすることにより、除去する。各洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離（５min、５，０００×ｇ）を行う。
【０１５９】
ｄ）  タンパク質を除去されたデンプンの精製
工程ｃ）から得た、表面へ結合したタンパク質を除いたデンプンを、続いて洗浄緩衝液と４回、各場合に室温で攪拌下１０〜１５分インキュベーションすることにより除く。各洗浄工程に続いて、それぞれの洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離（５分、１，０００×ｇ）を行う。これらの精製工程は、主として工程ｃ）でインキュベーション中に用いられるＳＤＳを除去する役割を果たす。
【０１６０】
ｅ）  単離したデンプンの濃度の決定
工程ｄ）で分離されたデンプンの量を光度計で決定する。適当な希釈の後、デンプン懸濁液の光学密度を検量線に対して６００nmの波長で測定する。検量線が直線状である範囲は、０〜０．３吸光単位の間に存在する。
【０１６１】
検量線を生成するために、例えばArabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から分離されたデンプンを真空下で乾燥させ、重さを量り、規定体積の水に吸収させる。このようにして得られた懸濁液を、水の１ml当たり約５μgのデンプン懸濁液を得るまで、数工程で、各工程において水で１対１の比率で希釈する。個々の希釈工程によって得られた懸濁液を光度計により６００nmの波長で測定する。各懸濁液について得られた吸収値を、各懸濁液のデンプン濃度に対してプロットする。得られた検量線は、水ml当たり０μｇのデンプン〜水ml当たり０．３μgのデンプンの範囲で線形の数学関数に従うはずである。
【０１６２】
ｆ）  単離したデンプンの貯蔵
デンプンをそれ以上貯蔵しないでさらなるテストに直接用いてもよいし、または１．５mlエッペンドルフ管に分注して−２０℃で貯蔵してもよい。冷凍デンプンおよび非貯蔵の新鮮に分離されたデンプンの両方を、もし必要なら、例えばインビトロのリン酸化および／または結合テストに関する本発明に記述された方法に用いることができる。
【０１６３】
ｇ）  用いられる緩衝液の組成
１×デンプン緩衝液：  ２０mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ８．０、
０．２mMＥＤＴＡ、
０．５％ トリトンＸ−１００
洗浄緩衝液：          ５０mMＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．２
【０１６４】
３．  同定されたデンプンリン酸化タンパク質の組換え発現
【０１６５】
ａ）  デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むバクテリアの発現ベクターの作製
デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを、例えば「鋳型」として植物組織のｍＲＮＡまたはポリＡ−プラス−ｍＲＮＡを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。この目的のために、先ず、逆転写酵素を用いてデンプンリン酸化タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ鎖を作製し、その後当該ｃＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼにより増幅する。ＰＣＲ反応を実施するための物質、酵素および指示を含むいわゆる「キット」を、購入することができる（例えば、SuperScript(商標) One-Step RT-PCR System, Invitrogen, Prod. No.: 10928-034）。デンプンリン酸化タンパク質をコードする増幅されたｃＤＮＡを、その後、バクテリアの発現ベクター、例えばｐＤＥＳＴ(商標）１７（lnvitrogen)中にクローニングすることができる。ｐＤＥＳＴ(商標）１７は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写を開始するために用いられるＴ７プロモーターを含む。更に、発現ベクターｐＤＥＳＴ(商標）１７は、Ｔ７プロモーターの５’方向にシャイン・ダルガルノ配列を含み、その後に開始コドン（ＡＴＧ）および、いわゆるＨｉｓタグが続く。このＨｉｓタグは直接連続する６つのコドンから成り、各々はアミノ酸ヒスチジンをコードし、また前記開始コドンの読枠中に位置する。デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡのｐＤＥＳＴ(商標）１７中へのクローニングを、翻訳の融合が、開始コドン、Ｈｉｓタグ、およびデンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡのコドン間に生じるように行なう。この結果として、Ｔ７プロモーター上で開始される転写およびその後の翻訳に続いて、そのＮ末端にＨｉｓタグを含む追加のアミノ酸を含むデンプンリン酸化タンパク質が得られる。
【０１６６】
しかし、微生物中での発現に適している他のベクターもまた、デンプンリン酸化タンパク質の発現に用いることができる。発現ベクターおよび関連する発現株は当業者に公知であり、また適当な組合せで適当な業者から購入することができる。
【０１６７】
ｂ）  Escherichia coli中の発現クローンの作製
まず第一に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを染色体的にコードする適切な形質転換受容性E.coli 菌株を工程ａ）で作製された発現プラスミドにより形質転換し、続いて寒天で固めた培地上一晩３０℃でインキュベーションする。適切な発現菌株は、例えば、ＢＬ２１菌株（Invitrogen Prod. No.: C6010-03）であり、これは、ＩＰＴＧ誘導が可能なプロモーター（ｌａｃＺ）の制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを染色体的にコードする。
【０１６８】
形質転換の結果得られたバクテリアコロニーは、当業者に公知の方法により、それらがデンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む必要な発現プラスミドを有しているかどうかを確かめるために調べることができる。同時に、発現クローンが得られる。
【０１６９】
ｃ）  Escherichia coliにおけるデンプンリン酸化タンパク質の発現
まず第一に、予備培養を生成する。このために、工程ｂ）に従って得られた発現クローンを、発現プラスミドの存在を選択するための抗生物質を含む３０mlのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＢ培地）に播種し、一晩３０℃で攪拌下（２５０rpm）インキュベーションする。
【０１７０】
デンプンリン酸化タンパク質発現用の本培養を次に生成する。これを行うために、各々３０℃に予熱された３００mlのＴＢ培地および発現プラスミドの存在を選択するための抗生物質を含む１ L エルレンマイヤーフラスコに、各々１０mlの適切な予備培養を播種し、（６００nmの波長で測定した）光学密度（ＯＤ600）が約０．８になるまで、３０℃で攪拌下（２５０rpm）インキュベーションした。
【０１７１】
もし、デンプンリン酸化タンパク質の発現のために、デンプンリン酸化タンパク質の発現が誘導可能なシステム（例えばＩＰＴＧにより誘導可能なＢＬ２１ E.coli 菌株中の発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７）を用いて開始されるような発現プラスミドを用いる場合は、約０．８のＯＤ600に達したときに、当該（例えばＩＰＴＧ）誘導物質を本培養に加える。誘導物質を加えた後に、本培養液を３０℃で攪拌下（２５０rpm）約１．８のＯＤ600までインキュベーションする。本培養を次に氷上で３０分間冷却し、続いて本培養の細胞を遠心分離（１０分間４，０００×ｇ、４℃）により、培地から分離する。
【０１７２】
４．  デンプンリン酸化タンパク質の精製
【０１７３】
ａ）  デンプンリン酸化タンパク質を発現している細胞の破砕
一般的方法項目３の工程ｃ）で得た細胞を、溶解緩衝液中に再懸濁する。その際、約４mlの溶解緩衝液を約１gの細胞へ加える。次に再懸濁した細胞を氷上で３０分間インキュベーションし、その後、超音波プローブ（Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin electronic, Berlin、設定：サイクル６、７０％、１分間）を用いて、氷による連続冷却下で破砕する。ここで、細胞懸濁液を超音波処理の間に熱しすぎないことを確実にするように注意しなければならない。超音波処理の結果得られた懸濁液を遠心し（１２分２０，０００×ｇ、４℃）、遠心分離の後に得られた上清を、４５μmのポアサイズを有するフィルターを用いて濾過する。
【０１７４】
ｂ）  デンプンリン酸化タンパク質の精製
もし E.coli 細胞中に発現したデンプンリン酸化タンパク質がＨｉｓタグとの融合タンパク質である場合は、Ｈｉｓタグが非常に大きな親和性で結合するニッケルイオンを用いて精製することができる。これを行うために、工程ｄ）で得られた２５mlの濾液を１mlのＮｉ−アガローススラリー（Qiagen, Prod. No.: 30210）と混合し、氷上で１時間インキュベーションする。Ｎｉ−アガローススラリーと濾液の混合物を、続いてポリスチレンカラム（Pierce, Prod. No.:29920）上で展開する。カラムを通過する生成物を捨てる。次に８mlの溶解緩衝液を加えることによりカラムを洗浄し、カラムを通過する生成物を再び捨てる。デンプンリン酸化タンパク質の溶出は、次に、１mlのＥ１緩衝液を２回、続いて１mlのＥ２緩衝液を１回、また続いて１mlＥ３緩衝液を５回、カラムへ区分けして加えることにより起こる。カラムへ適切な溶出緩衝液（Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３緩衝液）の個々の分画を加えることにより生成される、カラムを通過する生成物を、別々の分画に集める。これらの分画の小部分を、次に変性ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くクーマシーブルー染色により分析する。十分な量および満足すべき純度のデンプンリン酸化タンパク質を含む分画を、加圧濾過を用いて４℃で精製し濃縮する。加圧濾過を、例えばＡｍｉｃｏｎセル（Amicon Ultrafiltration Cell, Model 8010, Prod. No.: 5121）を用いて、ＤｉａｆｌｏＰＭ３０膜（Millipore, Prod. No.: 13212）を使用して４℃で実施することができる。しかし、当業者に公知の他の方法も濃縮に用いることができる。
【０１７５】
ｃ）  用いられる緩衝液の組成
溶解緩衝液：      ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
１０mM      イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）、
１mg/mlリゾチーム（緩衝液を用いる直前に加える）
１０ml当たり１／４錠の完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Roche Product No.:1873580）(緩衝液を用いる直前に加える）。
溶出緩衝液Ｅ１：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
５０mM      イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
溶出緩衝液Ｅ２：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
７５mM      イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
溶出緩衝液Ｅ３：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
２５０mM    イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
【０１７６】
５．  Ｒ１タンパク質の組換え発現
Ｒ１タンパク質の組換え発現については、文献（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532) に記載されているが、しかしまた、一般的方法項目３の下に上に記述されたデンプンリン酸化タンパク質の組換え発現に関する方法に従って実施することもできる。
【０１７７】
６．  Ｒ１タンパク質の精製
Ｒ１タンパク質の精製については、文献（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532) に記述されているが、しかし、E. coli 細胞のＲ１の発現によってＨｉｓタグを含むＲ１融合タンパク質が生成される場合は、一般的方法項目４の下に上に記述された、デンプンリン酸化タンパク質の精製に関する方法に従って実施することもできる。
【０１７８】
７．  非リン酸化デンプンから出発するリン酸化デンプンのインビトロにおける作製
【０１７９】
ａ）  非リン酸化デンプンのインビトロにおけるリン酸化
１ml当たり２５mgのデンプン含量を生成するために、デンプンリン酸を含まないデンプン（例えば、一般的方法項目２、の下で上に記述された方法を用いて、Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された）を、Ｒ１緩衝液および精製されたＲ１タンパク質（１mgデンプン当たり約０．２５μgのＲ１タンパク質）と混合する。この反応調製物を、一晩（約１５ｈ）攪拌下室温でインキュベーションする。反応調製物中に存在するデンプンに結合しているＲ１を、反応の完了時に４回、各回約８００μlの０．５％ＳＤＳで洗浄することにより除去する。続いてインビトロでリン酸化されたデンプン中にまだ存在するＳＤＳを５回、各回１mlの洗浄緩衝液で洗うことにより、除去する。すべての洗浄工程を室温で１０〜１５分間攪拌下行なう。各洗浄工程に続けて、それぞれのＳＤＳ緩衝液または洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために、遠心分離（２分間、１０，０００×ｇ）を行う。
【０１８０】
ｂ）  用いられる緩衝液の組成
Ｒ１緩衝液：      ５０mM        ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、
１mM          ＥＤＴＡ、
６mM          ＭｇＣｌ２、
０．５mM      ＡＴＰ
洗浄緩衝液：      ５０mM        ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．２
【０１８１】
８．  リン酸化デンプンまたは非リン酸化デンプンへのタンパク質の結合
【０１８２】
ａ）  Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体の単離
約５０mgのＰ−デンプンまたは約５０mgの非リン酸化デンプンを、個別の調製物中の各タンパク質抽出物約８００μlに再懸濁する。タンパク質抽出物のタンパク質濃度は、各々１ml当たり約４mg〜５mgとするべきである。Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンとタンパク質抽出物のインキュベーションを攪拌下室温１５分間４℃で実施する。インキュベーションの完了時に、反応調製物をパーコールクッション（４ml）を用いて遠心する（１５分、３,５００rpm、４℃）。遠心分離の後、リン酸化デンプン即ちＰ−デンプンに結合していないタンパク質は上清で見つかり、パスツールピペットで除去ことができる。上清を捨てる。遠心分離後に得られたＰ−デンプンおよび非リン酸化デンプンを含み、またそれぞれのデンプンに結合したタンパク質（それぞれ、Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体）を含む沈殿したペレットを２回、各回１mlの洗浄緩衝液で（上記、一般的方法項目７．ｂ）を参照のこと）、３分間４℃攪拌下でインキュベーションすることにより、洗浄した。洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンをそれぞれ分離するために、遠心分離（５分、８０００rpm、４℃で卓上遠心機 Hettich EBA 12Rで）を行った。
【０１８３】
ｂ）  Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体それぞれ中の結合したタンパク質の溶解
工程ａ）で得られたＰ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体をそれぞれ約１５０μlＳＤＳテスト緩衝液中に再懸濁し、室温１５分間攪拌下でインキュベーションする。続いてＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンを、それぞれ溶解されたタンパク質から遠心分離により（１分、１３,０００rpm、室温、Eppendorf 卓上遠心機）、取り除く。Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンの残りをそれぞれすべて除去するために、遠心分離後に得られた上清を再び遠心し（１分、１３,０００rpm、室温、Eppendorf 卓上遠心機）、除去する。その結果、Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンにそれぞれ結合する溶解されたタンパク質が得られる。
【０１８４】
ｃ）  用いる緩衝液の組成
ＳＤＳテスト緩衝液：  １８７．５mM     トリス／ＨＣl、ｐＨ６.８、
６％             ＳＤＳ、
３０％           グリセリン、
〜０．０１５％     ブロモフェノールブルー、
６０mM           ＤＴＥ（新たに添加）
パーコール：    パーコールを、および２５mMＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）から構成される溶液に対して一晩透析する。
【０１８５】
９．  Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の分離    
タンパク質のそれぞれＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンへの結合に関する一般的方法項目８工程ｃ）で得られた溶解されたタンパク質を、各々５分間９５℃でインキュベーションし、続いて変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて分離する。その際、Ｐ−デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質および非リン酸化デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質の等しい体積を、各々アクリルアミドゲルに加える。電気泳動の完了時に得られたゲルを少なくとも一晩コロイド状クーマシーで染色し(Roth, Karlsruhe, Roti-Blue Rod. No.: A152.1)、続いて３０％メタノール、５％酢酸、または２５％メタノール中で脱色する。
【０１８６】
１０．  Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の同定および単離
【０１８７】
ａ）  非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増加した結合活性を有するタンパク質の同定
アクリルアミドゲル電気泳動による分離およびそれに続く染色による可視化（上記一般的方法項目９を参照のこと）の後に、非リン酸化デンプンに結合した後の対応する信号と比較して、Ｐ−デンプンに結合した後に増加した信号を示すタンパク質は、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有する。この手段によって、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を同定することができる。非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を、アクリルアミドゲルから切り出す。
【０１８８】
ｂ）  非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質の同定
工程ａ）に従って同定されたタンパク質をトリプシンにより消化し、得られたペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析して、得られたペプチドの質量を決定する。トリプシンは配列特異的なプロテアーゼである、即ちトリプシンは、タンパク質があるアミノ酸配列を含んでいる場合に、特異的位置でのみ当該タンパク質を分割する。Ｎ末端からスタートして、アミノ酸アルギニンおよびリジンが互いに続く場合トリプシンは常にペプチド結合を分割する。したがって、アミノ酸配列のトリプシン消化後に生成されることになるペプチドをすべて理論的に決定することが可能である。理論的に決定されたペプチドをコードするアミノ酸についての知識から、理論的なトリプシン消化後に得られるペプチドの質量を決定することができる。したがって、理論的なトリプシン消化後のペプチドの質量に関する情報を含むデータベース（例えば、NCBInr http:// prospector. ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm; Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/ MassSearch.html）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得られた未知のタンパク質のペプチドの実際の質量と比較することができる。理論的および／または現実のトリプシン消化の後に同じペプチド質量を有するアミノ酸配列は、同一であると見なされる。当該データベースは、既にその機能が示されているタンパク質のペプチド質量、および配列決定計画により得られた核酸配列から出発したアミノ酸配列から導出された、今までのところ単に仮説的に存在するタンパク質のペプチド質量の両方を含む。そのような仮説タンパク質の実際の存在および機能が示されたことは希であり、また何らかの機能が存在するとしても、これは通常予測のみに基づいていて、実際の機能の実証には基づいていない。
【０１８９】
工程ａ）に従って得られたタンパク質を含むバンドをアクリルアミドゲルから切り出し；切り出されたアクリルアミド片を、約３０分間３７℃で、約１mlの６０％５０mMＮＨ４ＨＣＯ３４０％アセトニトリル中でインキュベーションすることにより、還元して脱色する。続いて脱色溶液を除き、残ったゲルを真空下（例えば Speedvac）で乾燥させる。乾燥後、トリプシン溶液を加えて、当該ゲル片に含まれるタンパク質を消化する。消化は、３７℃で一晩行う。消化の後、小量のアセトニトリルを加えて（アクリルアミドゲルが白く染まるまで）、調製物を真空下（例えばSpeedvac）で乾燥させる。乾燥が完了したとき、乾いた内容物を被うためにちょうど十分な５％ギ酸を加え、数分間３７℃でインキュベーションする。アセトニトリル処理とそれに続く乾燥をもう一度繰り返す。続いて、乾燥した内容物を０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、５μl〜１０μl）に吸収させ、担体上に約０．５μlずつ滴下する。等量のマトリックス（ε−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸）を担体に加える。マトリックスを結晶化させた後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳ（例えば Burker Reflex(商標) II, Bruker Daltonic, Bremen ）によってペプチドの質量を決定する。得られた質量についてデータベースを探索して、理論的トリプシン消化後に同じ質量を与えるアミノ酸配列を求める。このようにして、好んでリン酸化α−１，４−グルカンに結合する、および／または基質としてＰ−α−１，４−グルカンを必要とするタンパク質をコードするアミノ酸配列を同定することができる。
【０１９０】
１１．  タンパク質のデンプンリン酸化活性を実証する方法
【０１９１】
ａ）  タンパク質のＰ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンとのインキュベーション
タンパク質がデンプンリン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べるべきタンパク質をデンプンおよび放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションすることができる。これを行うために、約５mgのＰ−デンプンまたは約５mgの非リン酸化デンプンを、調べるタンパク質（用いるデンプン１mg当たり０．０１μg〜５.０μg）と５００μlリン酸化緩衝液中で１０分〜３０分間室温で攪拌下インキュベーションする。続いて反応を、ＳＤＳの２％（重量／体積）濃度までの添加によって止める。それぞれの反応混合物中のデンプン粒を遠心（１分間、１３,０００×ｇ）し、９００μlの２％ＳＤＳ溶液で１回および各々９００μlの２mMＡＴＰ溶液で４回洗浄する。各洗浄工程を、１５分間室温で撹拌下行なう。各洗浄工程の後、デンプン粒をそれぞれの洗浄緩衝液から遠心分離（１分間、１３,０００×ｇ）により分離する。
【０１９２】
さらに、タンパク質のデンプンリン酸化活性を実証する実験を実施するときは、タンパク質を含んでいないかまたは不活性化されたタンパク質を含むが、それ以外は記述した反応調製物と同じ方法で処理されるさらなる反応調製物を、いわゆる対照として処理するべきである。
【０１９３】
ｂ）  酵素活性によりＰ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに取り込まれたリン酸残基の量の決定。
工程ａ）に従って得られたデンプン粒を、放射性ラベルされたリン酸残基の存在について調べることができる。これを行うために、それぞれのデンプンを１００μlの水に再懸濁し、それぞれ３mlのシンチレーションカクテル（例えば Ready Safe（商標), BECKMANN Coulter）と混合し、次にシンチレーションカウンター(例えば、LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER(商標)）を用いて分析する。
【０１９４】
ｃ）  基質としてＰ−デンプンを好んで用いるタンパク質の同定
もしタンパク質をＰ−デンプンと共に一度、および非リン酸化デンプンと共に一度、別々の調製物中でａ）に記述した方法に従いインキュベーションするならば、工程ｂ）によって得られたデンプンリン酸の存在量を比較することよって、当該タンパク質が非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンにより多くのリン酸を取込んだかどうかを決定することができる。したがって、Ｐ−デンプンへリン酸を導入することができるが、非リン酸化デンプンへはできないタンパク質を同定することが出来る、即ちさらなるリン酸化反応用基質として既にリン酸化されているデンプンを要求するタンパク質を同定することができる。
【０１９５】
ｄ）  用いられる緩衝液の組成
リン酸化緩衝液：    ５０mM              ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ  ｐＨ７．５、
１mM                ＥＤＴＡ、
６mM                ＭｇＣｌ２、
０．０１〜０．５mM  ＡＴＰ、
１ml当たり０．２〜２ pCi の無作為化33Ｐ−ＡＴＰ（あるいは、γ位置に特異的にラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰを用いることもできる）。
【０１９６】
本発明に関連しては、用語「無作為化ＡＴＰ」とはγ位置およびβ位置の両方にラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰを意味すると理解するべきである（Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171）。無作為化ＡＴＰはまた科学文献にβ／γＡＴＰとして記述されている。無作為化ＡＴＰを作製する方法について下記に記述する。
【０１９７】
ｉ）  無作為化ＡＴＰの作製
ここで記述する、酵素触媒反応を用いる無作為化ＡＴＰの作製のための方法は、次の反応機構に基づく：
１．  反応工程１
γ33Ｐ−ＡＴＰ ＋ ＡＭＰ ＋ ミオキナーゼ  →  β33Ｐ−ＡＤＰ ＋ ＡＤＰ  
（アデノシン−Ｐ−Ｐ−33Ｐ ＋ アデノシン−Ｐ  →  
アデノシン−Ｐ−Ｐ ＋ アデノシン−Ｐ−33Ｐ）
２．  反応工程２
33Ｐ−ＡＤＰ ＋ ＡＤＰ ＋ ２ ＰＥＰ ＋ ピルビン酸キナーゼ  →
β33Ｐ−ＡＴＰ ＋ ＡＴＰ ＋ ２ ピルビン酸
（アデノシン−Ｐ−Ｐ ＋ アデノシン−Ｐ−33Ｐ ＋ ２ ＰＥＰ  →
アデノシン−Ｐ−Ｐ−Ｐ  ＋  アデノシン−Ｐ−33Ｐ−Ｐ ＋ ２ ピルビン酸）
反応平衡が生成物側に存在するにもかかわらず、この反応は、主としてβ33Ｐ−ＡＴＰおよびいくらかのγ33Ｐ−ＡＴＰからなる混合物を生成する。
【０１９８】
ii）  第１の反応工程の実施
33Ｐでラベルされたリン酸残基をγ位置に含むＡＴＰ(Hartmann Analytic,10μCi/μl)（１００μCi、３０００Ci/mmol）を、２μlミオキナーゼ（ウサギ筋肉のＡＭＰホスホトランスフェラーゼ；SIGMA, Prod. No.: M3003、３．８mg/ml、１，６２６単位/mg）と９０μlの無作為化緩衝液中１時間３７℃でインキュベーションする。１２分間９５℃でインキュベーションすることにより反応を停止し、その後、反応調製物をＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１０フィルタ（Amicon, Millipore Prod. No. 42407）を用い、１４，０００×ｇで少なくとも１０分間遠心濾過することにより精製した。
【０１９９】
iii）  第２の反応工程の実施
２μlのピルビン酸キナーゼ（適切な溶液を作製する方法については下を参照）および３μlの５０mMＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）を工程ii）で得られた濾液に加える。この反応混合物を４５分間３０℃でインキュベーションしてから、９５℃で１２分間インキュベーションすることにより反応を止める。続いて反応混合物を遠心する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機で２分間、１２，０００rpm）。遠心分離後に得られた無作為化ＡＴＰを含む上清を取り出して、小分けにし、−２０℃で貯蔵することができる。
【０２００】
ピルビン酸キナーゼ溶液の作製
１５μlピルビン酸キナーゼ（ウサギ筋肉由来、Roche, Prod. No.12815, １０mg/ml, ２００単位/mg，２５℃で) を遠心し、上清を捨て、またペレットを２７μlピルビン酸キナーゼ緩衝液に吸収した。
【０２０１】
iv）  用いられる緩衝液
ピルビン酸キナーゼ緩衝液：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、
１mM        ＥＤＴＡ
無作為化緩衝液：            １００mM    ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ  ｐＨ７．５、
１mM        ＥＤＴＡ、
１０％      グリセリン、
５mM        ＭｇＣｌ２、
５mM        ＫＣｌ、
０．１mM    ＡＴＰ、
０．３mM    ＡＭＰ
【０２０２】
１２．  タンパク質の自己リン酸化の実証
タンパク質が自己リン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べたいタンパク質を放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションすることができる。これを行うために、調べたいタンパク質（５０μg〜１００μg）を、２２０μlリン酸化緩衝液（上記の一般的方法、項目１２ｄ）を参照のこと）の中で３０分〜９０分間室温で撹拌下インキュベーションする。その後、反応を最終濃度０．１１MまでのＥＤＴＡを加えることによって止める。その後、約２μg〜４μgのタンパク質を、変性ポリアクリルアミド電気泳動（７．５％アクリルアミドゲル）を用いて分離する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法後に得られたゲルをオートラジオグラフィーに付す。オートラジオグラフィーで信号を示すタンパク質は放射性リン酸残基を保持している。
【０２０３】
１３．  デンプンリン酸化タンパク質によりリン酸残基を導入されるα−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−原子位置の同定
α−１，４−グルカンのグルコース分子のどのＣ−原子位置がタンパク質によりリン酸化されるかを、制御された様式で、適切なタンパク質を用いて得られたリン酸化グルカンのインビトロの加水分解、それに続く加水分解後に得られたグルコースモノマーの分離、およびそれに続く、適切なタンパク質によりグルコース分子の一定の分画に組み入れられたリン酸の測定、により実証することができる
【０２０４】
ａ）  α−１，４−グルカンの全加水分解
α−１，４−グルカンを含む水懸濁物を遠心し、続いて沈殿したペレットを０．７MのＨＣl（Baker、解析用）に再懸濁して、撹拌下２時間９５℃でインキュベーションする。インキュベーションの完了後、試料を短時間冷却し、遠心する（例えば２分間、１０，０００×g）。得られた上清を新しい反応容器に移し、２M ＮａＯＨ（Baker、解析用）を添加して中和する。ペレットが残っている場合は、それを１００μlの水に再懸濁し、そこに存在するラベルされたリン酸の量を対照として測定する。
【０２０５】
続いて中和した上清を１０kDaフィルターに載せて遠心する。得られた濾液の小分画を、例えば、シンチレーションカウンターを用いて測定して、濾液中のラベルされたリン酸の量を決定する。
【０２０６】
ｂ）  加水分解生成物の分別およびリン酸化されたＣ−原子位置の決定
工程ａ）によって得られた加水分解生成物の中和された濾液を、例えば高圧陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ）を用いて、分離することができる（約３０００cpmの放射性ラベルＡＴＰを用いる場合）。ＨＰＡＥに必要な体積を得るために中和された濾液をＨ２Ｏで薄めることができる。さらに、グルコース−６−リン酸（約０．１５mM）およびグルコース−３−リン酸（約０．３mM）を、適切な濾液に各々内部対照として加える。ＨＰＡＥによる分離を例えば、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ １００カラム（適切なプレカラムを備えた）およびパルスアンペロメトリック検出器（ＥＤ ５０）を用いるＤｉｏｎｅｘ ＤＸ ６００ ＢｉｏＬｃシステムを用いて、行なうことができる。そうする際に、試料を注入する前に、カラムをまず１０分間９９％溶出液Ｃおよび１％溶出液Ｄで濯ぐ。その後、６０μlの試料体積を注入する。試料の溶出は下記条件下で起こる：
流量：１ml／分
勾配：０分〜３０分まで直線的に増加する
溶出液Ｃ    溶出液Ｄ
０分    ９９％        １％
３０分      ０％    １００％
３５分      ０％    １００％
溶出終了。
【０２０７】
カラムから溶出した加水分解生成物を、各々１mlの分画毎に集める。毎回非ラベルグルコース−３−リン酸（Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171）および非ラベルグルコース−６−リン酸（Sigma, Prod. No.: G7879）を、注入された加水分解生成物の試料に内部基準として加えておくので、グルコース−３−リン酸またはグルコース−６−リン酸のいずれかを含む分画を、パルスアンペロメトリック検出により決定することができる。個々の分画中のラベルされたリン酸の量を測定し、続いてグルコース−３−リン酸またはグルコース−６−リン酸を含む分画と比較することにより、これをラベルされたグルコース−６−リン酸またはラベルされたグルコース−３−リン酸を含む分画を決定するために用いることができる。当該分画中のラベルされたリン酸の量を決定する。個々の加水分解生成物中でラベルされたリン酸について測定されたグルコース−３−リン酸のグルコース−６−リン酸に対する量比から、α−１，４−グルカンリン酸化酵素がどのＣ−原子位置を好んでリン酸化するかをここで決定することができる。
【０２０８】
ｃ）  用いる緩衝液
溶出液Ｃ：１００ mM  ＮａＯＨ
溶出液Ｄ：１００ mM  ＮａＯＨ、
５００ mM  酢酸ナトリウム
【０２０９】
１４．  Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いる配列決定用試料の調製
【０２１０】
ａ）  概論
ポリアクリルアミドゲルから切り出されたバンドの形で存在することもできる単離したタンパク質を、最初により小さな断片へ、トリプシン消化により分割する。形成されたペプチドを、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計が四重極質量分析計と結合されたハイブリッド質量分析計中へ導入する。測定の第１段階において、第１の質量分析計（四重極）の「スイッチを切り」、消化により形成されたペプチドの質量をＴＯＦ質量分析計中で決定することができる。第２段階では、選択されたペプチドが四極子中へ「濾過される」、即ちこのペプチドのみが四極子を通ることができ、他のものはすべて逸らされる。次に、ペプチドが「衝突セル」の荷電ガス分子と衝突することにより、破壊される。この場合、「破壊」は主としてペプチド結合で生じる。その結果、質量が異なる多かれ少なかれ統計的に分布したペプチド断片が形成される。その後、これらの断片を「ソートする」ことによりペプチドのアミノ酸配列を決定することができる。重複するペプチドが得られる場合は、このようにしてタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。同定と配列決定のための質量分析計の使用は、当業者に公知であり、専門家文献に十分に記述されている［例えば、P. Michael Conn（Ed.), 2003, Humana Press, New Jersey, ISBN: 1-58829-340-8]; J.R. Chapman（Ed.), 2000, Humana Press, SBN: 089603609X] 。
【０２１１】
ｂ）  タンパク質のシステイン残基の還元およびアルキル化
分析するタンパク質のアミノ酸配列を含むシステイン残基を、タンパク質の分離の前にゲル電気泳動によって還元／アルキル化することができる。この目的のために、ゲル電気泳動によって分離するべきタンパク質をＳＤＳ試料緩衝液（ＤＴＴまたはβメルカプトエタノールを少しも含んではならない）と混合する。その後、新たに調整したＤＴＴをこれらの試料に１０mMの最終濃度まで加え、そして試料を３分間９５℃でインキュベーションする。試料を室温へ冷却した後に、新たに調整したヨ−ドアセトアミドを２０mMの最終濃度まで加える。試料を２０分間室温暗黒下でインキュベーションする。その後、試料中に存在するタンパク質をアクリルアミドゲル電気泳動によって分離する。
【０２１２】
ｃ）  アクリルアミドゲルからのタンパク質の単離
配列決定するべきタンパク質を含むタンパク質のバンドを清潔なメスを用いてできるだけ「縁なし」の状態で切り出し（約１mm3 の立方体）、還元する。還元されたゲル片を、０．５mlまたは１．５mlの反応容器に入れ、短い遠心によって沈殿させる。
【０２１３】
ｄ）  切り出されたゲル片の脱色
銀イオンを用いて染色したゲルを用いた場合は、工程ｃ）によって得られたゲル片を、３０mMフェリシアン化カリウムおよび１００mMチオ硫酸ナトリウムを１：１の比率で含む溶液で完全に覆い、そして完全にゲル片が脱色されるまで攪拌する（Vortexで）。その後、脱色溶液を除去し、ゲル片を３回、各回高純度水（伝導性約１８MOhm）２００μlで洗浄する。
【０２１４】
もしクーマシーブルーで染色されたゲルを用いた場合は、工程ｃ）によって得られたゲル片を、高純度水およびアセトニトリル（純度の程度：少なくともＨＰＬＣ純度）を比率１：１で含む溶液で２回、各回撹拌下１５分間インキュベーションする。脱色溶液の体積はゲルの体積の約２倍に一致するべきである。洗浄溶液を各洗浄工程の後に除去する。
【０２１５】
脱色が完了した後、ゲル片をアセトニトリルの１体積（ゲル片に対して）と混合して、１５分間室温で撹拌下インキュベーションする。アセトニトリルを除去し、１体積の１００mM炭酸水素アンモニウムと混合したゲル片を混合して、５分間室温でインキュベーションする。その後、炭酸水素アンモニウムとアセトニトリルの相対量が１：１の比率を与えるようにアセトニトリルを加える。さらに１５分間室温でインキュベーションを実施し、その後溶液を除去し、残ったゲル片を真空下（例えば Speedvac）で乾燥させる。
【０２１６】
ｅ）  ゲル片中のタンパク質のトリプシン消化
トリプシン溶液（５０mM炭酸水素アンモニウムμl当たり１０ngのトリプシン）を１０μlずつ工程ｄ）によって得られた乾燥ゲル片に加える。トリプシン溶液の添加後、毎回１０分間氷上でインキュベーションを実施する。ゲル片がそれ以上膨張せず、トリプシン溶液によって完全に被われるまで、トリプシン溶液を小分けして加える。その後トリプシン溶液を除去し、ゲル片を一晩３７℃でインキュベーションする。
【０２１７】
ｆ）  アクリルアミドゲルからのペプチドの単離
工程ｅ）で得られた試料を、反応容器に含まれる液体を集めるために短時間遠心し、液体を取出して新しい反応容器へ移す。ゲル片を超音波で（超音波水浴で）２分間処理する。残ったゲル片を、次に、ゲル片の体積と同じ２５mM炭酸水素アンモニウム溶液と混合し、また２０分間撹拌下でインキュベーションする。その後アセトニトリルを加えて、アセトニトリルに対する重炭酸アンモニウムの比率を１：１に調節し、室温でさらに１５分間撹拌下インキュベーションを実施する。インキュベーションが完了した後、２分間超音波で試料を再び処理し、その後液体を取り出して、以前に取り出した液体と合わせる。残ったゲル片を、それらと同体積の５％ギ酸およびアセトニトリルを比率１：１で含む溶液と混合し、撹拌下１５分間室温でインキュベーションする。液体を取り出し、以前に取り出した液体と合わせる。ゲル片の５％ギ酸／アセトニトリル（比率１：１）中でのインキュベーションを繰り返し、得られた液体を同様に、以前に集めた液体に加える。合わせた上清が、配列決定するべきペプチドを含んでおり、６０℃で真空遠心（Speedvac）により約１５μlに濃縮する。このようにして得られたペプチドを、Ｑ−ＴＯＦを用いて分析するまで、２０℃で貯蔵することができる。質量分析によりタンパク質を配列決定する前に、それらを当業者に公知の方法を用いて脱塩することができる。
【０２１８】
１５．  イネ植物の形質転換
イネ植物を、Hiei et al.（1994, Plant Journal 6(2), 271-282）によって記述された方法に従って形質転換した。
【０２１９】
１６．  ジャガイモ植物の形質転換
ジャガイモ植物を、アグロバクテリウムを用いて、Rocha-Sosa et al.（EMBO J. 8,（1989), 23-29）によって記述されているように形質転換した。
【０２２０】
１７．  デンプンリン酸含量の決定
Ｃ−６リン酸含量の決定
デンプンにおいては、グルコース単位のＣ２、Ｃ３およびＣ６位置がリン酸化されることができる。デンプンのＣ６−Ｐ含量を決定するために、５０mgのデンプンを、５００μlの０．７ MのＨＣｌ中、４時間９５℃で加水分解した。その後、調製物を１０分間１５，５００ｇで遠心し、上清を取り出した。上清からの７μlを１９３μlのイミダゾール緩衝液（１００mMイミダゾール、ｐＨ７．４；５mMＭｇＣｌ２、１mMＥＤＴＡ、および０．４mMＮＡＤ）と混合した。光度計を用いて、３４０mmで測定を行った。基礎吸収を確立した後、２単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Leuconostoc mesenteroides, Boehringer Mannheim の）を加えることにより、酵素反応を開始した。吸収の変化は、デンプンのＧ−６−Ｐ含量の濃度に正比例する。
【０２２１】
ｂ）  全リン酸含量の決定
全リン酸含量を、エームズ法（Methods in Enzymology VIII,（1966), 115-118）を用いて決定した。約５０mgのデンプンをエタノール硝酸マグネシウム溶液３０μlと混合し、マッフル炉中３時間５００℃で灰化する。残渣を０．５M 塩酸３００μlと混合し、３０分間６０℃でインキュベーションする。次に、一部分を０．５M 塩酸３００μlとして、１００μlの１０％アスコルビン酸および６００μlの２M 硫酸中の０．４２％モリブデン酸アンモニウム混合物に加えて、２０分間４５℃でインキュベーションする。
【０２２２】
ｃ）  Ｃ−６リン酸およびＣ−３リン酸含量の決定
α−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−６位置およびＣ−３位置に結合したリン酸の含量を決定するために、当該グルカンを、一般的方法項目１３に指定された方法を用いて全加水分解後に、ＨＰＡＥを使用して分離することができる。グルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸の量を、ＨＰＥＡ分離の後、得られる個々のピーク面積の積分により決定することができる。調査する試料中のグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸の量を、未知の試料で得られたグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸に対するピーク面積を、既知量のグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸をＨＰＡＥを用いて分離した後に得られたピーク面積と比較することにより、決定することができる。
【実施例１】
【０２２３】
Arabidopsis thaliana からの非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増加した結合活性を有するタンパク質の単離
【０２２４】
ａ）  Arabidopsis thaliana からのタンパク質抽出物の作製
タンパク質抽出物を、Arabidopsis thaliana（Oekotyp Columbia, Col-O）の約７ｇの葉（生体重量）から、一般的方法項目１に記述された方法に従って作製した。
【０２２５】
ｂ）  Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉からのデンプン粒の単離
デンプン粒を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の約２０gの葉（生体重量）から、一般的方法項目２に記述された方法に従って単離した。
【０２２６】
ｃ）  Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体から単離されたデンプンの、精製されたＲ１タンパク質によるインビトロのリン酸化
Arabidopsis thaliana sexl-3突然変異体から単離された約３０mgの非リン酸化デンプンを、一般的方法項目７に記述された方法に従って、E. coli 中で組換え発現され精製されたＲ１タンパク質によってリン酸化した。Ritte et al.（2002, PNAS 99, 7166- 7171）に記述された方法を、E. coli 中のＲ１タンパク質の発現、およびそれに続く精製に用いた。
【０２２７】
ｄ）  Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の単離
工程ａ）に従って得られた Arabidopsis thaliana のタンパク質抽出物を、５０mgの工程ｃ）に従って作製されたインビトロでリン酸化されたデンプンと、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用いて、調製物Ａ中でインキュベーションし洗浄した。
【０２２８】
第２の調製物Ｂ中で、工程ａ）に従って得られた Arabidopsis thaliana のタンパク質抽出物を、工程ｂ）に従って作製された５０ mgの非リン酸化デンプンと、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用い、インキュベーションし洗浄した。
【０２２９】
続いて、調製物ＡのＰ−デンプンに、および調製物Ｂの非リン酸化デンプンに結合したタンパク質を、一般的方法項目８ｂ）に記述された方法に従って溶解した。
【０２３０】
第３の調製物Ｃ中で、工程ｃ）に従って作製された５０mgのインビトロでリン酸化されたデンプンを、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用いて、インキュベーションし洗浄した。しかし、調製物Ｃはタンパク質抽出物を含まなかった。
【０２３１】
ｅ）  工程ｄ）に従って得られたタンパク質のアクリルアミドゲル電気泳動による分離
工程ｄ）中で得られた調製物Ａ、Ｂ、およびＣのタンパク質を、一般的方法項目９に記述された方法を用いて、変性条件（ＳＤＳ）下の９％アクリルアミドゲルによって分離し、続いてクーマシーブルーで染色した。染色されたゲルを図１に示す。変性アクリルアミドゲル中で、タンパク質標準マーカー（トレースＭ）と照合して約１３０kDaの分子量を有するタンパク質が、非リン酸化デンプン（Ｋ）と比較して好んでリン酸化デンプン（トレースＰ）に結合することを、はっきり見ることができる。
【０２３２】
ｆ）  非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに好んで結合するタンパク質の同定
工程ｅ）で同定された約１３０kDa の分子量を有するタンパク質のバンドをゲルから切り出した。一般的方法１０ｂ）に記述したように、続いてタンパク質をアクリルアミドから放出させ、トリプシンで消化し、得られたペプチドの質量をＭＡＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳによって決定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得られたいわゆる「フィンガープリント」を、データベース（Mascot: http://www.matrixscience. com/search form_select.html; ProFound: http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe; PepSea:  http://195.41.108.38/PepSeaIntro.html）中の理論的に消化されたアミノ酸分子のフィンガープリントと比較した。このようなフィンガープリントはタンパク質に非常に特異的であるため、アミノ酸分子を同定することができた。このアミノ酸分子の配列を用いて、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を、Arabidopsis thaliana から特定することができた。この方法を用いて同定したタンパク質をＡ.ｔ.−ＯＫ１と名付けた。Arabidopsis thaliana からのアミノ酸配列を分析した後に、これがデータベース中に存在する配列（ＮＰ １９８００９、ＮＣＢＩ）と相違することが判明した。配列番号２に示されるアミノ酸配列が、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードする。配列番号２には、データベース中の配列（Ａｃｃ.：ＮＰ １９８００９.１，ＮＣＢＩ）と比較すると、差異が含まれる。配列番号２に含まれるアミノ酸５１９〜５２３（ＷＲＬＣＥ）および７６２〜７６６（ＶＲＡＲＱ）は、データベースに存在する配列（ＡＣＣ.: ＮＰ １９８００９．１）.ＮＰ  １９８００９．１）中にはない。データベース配列のバージョン２（Ａｃｃ.： ＮＰ １９８００９.２）と比較して、配列番号２中に示されるアミノ酸配列は追加のアミノ酸５１９〜５２３（ＷＲＬＣＥ）を含む。
【実施例２】
【０２３３】
同定されたＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
Ａ.ｔ.−ＯＫ１ｃＤＮＡを、Arabidopsis thaliana の葉から単離したｍＲＮＡを用い、逆ＰＣＲ法を使用して単離した。これを行うために、逆転写酵素（SuperScript(商標) First-Strand Synthesis System for RT PCR, Invitrogen Prod. No.: 11904-018）によってｃＤＮＡ鎖を合成し、その後ＤＮＡポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR Systems, Roche Prod. No.: 1732641）を用いてこれを増幅した。このＰＣＲ反応から得られて増幅された生成物を、ベクターｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ（Invitrogen Prod.No.: A3600）へクローニングした。得られたプラスミドをＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔと名付け、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を決定し、配列番号１（登録商標）に示す。
【０２３４】
配列番号１に示された配列は、データベースに含まれている配列と同じではない。これは既に、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に対して議論した。
【０２３５】
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの増幅に用いた条件
【０２３６】
第１鎖の合成：
メーカーによって指定された条件および緩衝液を用いた。さらに、第１鎖合成用の反応調製物は次の物質を含んでいた：
３μg        全ＲＮＡ、
５μM        ３'−プライマー（ＯＫ１逆方向１： ５'−ＧＡＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＣ）
０．８３μM    ｄＮＴＰ混合物。  
反応調製物を５分間７５℃でインキュベーションし、続いて室温に冷却した。その後第１鎖緩衝液、ＲＮａｓｅ阻害剤およびＤＴＴを加えて２分間４２℃でインキュベーションし、その後１μlの SuperScript ＲＴ ＤＮＡポリメラーゼを加え、反応調製物を５０分間４２℃でインキュベーションした。
【０２３７】
第１鎖のＰＣＲによる増幅の条件：
１μl          第１鎖合成の反応調製物
０．２５μM   ３’プライマー（ＯＫ１逆方向２： ５'−ＴＧＧＴＡＡＣＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＣＡＧＡ）
０．２５μM   ５’プライマー（ＯＫ１順方向２： ５'−ＡＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＡＡＴＧ）
【０２３８】
反応条件：
工程１  ９５℃    ２分間
工程２  ９４℃  ２０秒間
工程３  ６２℃  ３０秒間
工程４  ６８℃    ４分間
工程５  ９４℃  ２０秒間
工程６  ５６℃  ３０秒間
工程７  ６８℃    ４分間
工程８  ６８℃  １０分間
まず反応を工程１〜４に従って行なった。工程４と工程２の間で１０回の繰返し（サイクル）を実施し、工程３の温度を各サイクルの後に０．６７℃だけ低下させた。次に、これに続けて工程５〜８で指定された条件に従う反応を行った。工程７と工程５の間で２５回の繰返し（サイクル）を実施し、工程７の時間を各サイクルで５秒ずつ増加させた。反応完了後すぐに、反応物を４℃に冷却した。
【実施例３】
【０２３９】
ＯＫ１タンパク質のｃＤＮＡの組換え発現のためのベクターの作製
鋳型としてプラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ（登録商標）を用い、ゲートウェイ技術(Invitrogen)を用いるＰＣＲによる増幅に続いて、Arabidopsis thaliana のＯＫ１タンパク質をコードする配列を先ずベクターｐＤＯＮＯＲ（商標）２０１（Invitrogen Prod. No.: 11798-014）へクローニングした。続いて、得られたベクターのＯＫ１タンパク質のコード領域を、配列特異的組換えによって発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７（Invitrogen Prod. No.: 11803-014）中へクローニングした。得られた発現ベクターをＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１と名付ける。クローニングは、その結果として、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの、発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７中に存在するヌクレオチドとの翻訳的融合を引き起こした。ベクターｐＤＥＳＴ１７(商標)１７起源のヌクレオチドはＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡと翻訳的に融合され、２１個のアミノ酸をコードする。これらの２１個のアミノ酸は、とりわけ、開始コドン（ＡＴＧ）およびいわゆるＨｉｓタグ（直接連続する６個のヒスチジン残基）を含む。翻訳的に融合した配列の翻訳の後、これは、Ｎ末端にベクター起源のヌクレオチドによりコードされる追加の２１個のアミノ酸を有するＡ,ｔ.−ＯＫ１タンパク質をもたらす。したがって、このベクターに起因する組換えＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質は、そのＮ末端にベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７起源の２１個の追加のアミノ酸を含む。
【実施例４】
【０２４０】
E. coli 中のＯＫ１タンパク質の非相同発現
実施例３に従って得た発現ベクターＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７を、E.coli 菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ(商標)(ＤＥ３）（Invitrogen, Prod. No. C6010-03）中に形質転換した。この発現系の記述は既に上に与えた（一般的方法項目３を参照）。形質転換の結果得られたベクターＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７を含むバクテリアのクローンを、まず予備培養の作製に使用し、それを、続いて本培養（一般的方法項目３ｃ）を参照のこと）へ接種するために用いた。予備培養および本培養を各々３０℃で撹拌下（２５０rpm）インキュベーションした。本培養が約０．８のＯＤ600に達した時、組換えＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１mMに達するまで加えることにより誘導した。ＩＰＴＧの添加後、本培養を３０℃撹拌下（２５０rpm）でＯＤ600 が約１．８に達するまでインキュベーションした。本培養をその後３０分間氷上で冷却し、次に本培養の細胞を遠心分離（１０分間４，０００×ｇ、４℃）により培地から分離した。
【実施例５】
【０２４１】
組換え発現されたＯＫ１タンパク質の精製
実施例４に従って得られた細胞のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の精製および濃縮を、一般的方法項目４に記述された方法を用いて実施した。
【実施例６】
【０２４２】
ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性の実証
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性を、一般的方法項目１１に記述された方法に従って実証した。その際に、実施例５に従って作製された精製Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質５μgを各々調製物Ａでは実施例１ｂ）に従って Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体から単離された５mgのデンプンと、および調製物Ｂでは実施例１ｃ）に従って酵素的リン酸化によって得られた５ mgのデンプンと、それぞれ０．０５mM放射性（33Ｐ）ラベル無作為化ＡＴＰ（全体で１，１３０，００cpm、約０．５５μCi）を含むリン酸化緩衝液５００μl中で、３０分間室温で撹拌下インキュベーションした。調製物Ｂに対応し、ＯＫ１タンパク質を含んでいないがそれ以外は標品ＡおよびＢと同じ方法で処理された調製物Ｃを、対照として用いた。すべての調製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）について、各々互いに独立に２つのテストを行なった。
【０２４３】
シンチレーションカウンターを用い、調製物Ａ、ＢおよびＣから得られたデンプンを、放射性ラベルされたリン酸の存在について調べた（一般的方法項目１１ｂ）を参照）。結果を表１および図３に示す。
【０２４４】
【表１】
2007525986.tif 000002
【０２４５】
ＯＫ１タンパク質により非リン酸化デンプンに転移されたリン酸基の分量（cpmで測定した）は、調製物Ｃ（対照）における放射性ラベルリン酸基の分量を超えないので、得られた結果から、基質として非リン酸化デンプンが与えられた場合は、ＯＫ１タンパク質はＡＴＰからデンプンにリン酸基を転移しないことが分かる。他方で、基質としてＰ−デンプンが与えられた場合は、ＡＴＰからＰ−デンプンへ転移される放射性リン酸基の分量（cpmで測定した）が、有意に高い。このことから、ＯＫ１タンパク質は基質としてＰ−デンプンを要求すること、またＯＫ１タンパク質は非リン酸化デンプンを基質として受け入れないことがわかる。
【０２４６】
もし上記のテストが、33Ｐによりγ位置に特異的にラベルされたＡＴＰを用いて行われた場合は、放射性ラベルされたリン酸のデンプン中への取り込みは、まったく確立することができない。これにより、ＡＴＰのβリン酸残基がＯＫ１タンパク質からデンプンへ転移されることがわかる。そのようなテストの結果を図６に示す。
【実施例７】
【０２４７】
自己リン酸化の実証
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化が上記の方法により実証された（一般的方法項目１２を参照のこと）。ここで、５０μgの精製されたＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質を放射性ラベルされた無作為化ＡＴＰと、２２０μlのリン酸化緩衝液（上記一般的方法項目１２ｄ）を参照のこと）中で、室温６０分撹拌下でインキュベーションした。続いて、インキュベーション調製物から各々１００μlを取り出し、４つの新鮮な反応容器に移した。反応容器１では、４０μlの０．１１M ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。反応容器２を９５℃で５分間インキュベートした。反応容器３にＨＣｌを最終濃度０．５M まで加え、反応容器４にＮａＯＨを最終濃度０．５M まで加えた。反応容器３および４を各々２５分間３０℃でインキュベーションした。続いて、反応容器１、２、３および４から各々５０μlを取り出し、ＳＤＳテスト緩衝液と混合して、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％アクリルアミドゲル）によって分離した。この目的のために、反応容器からの試料を各々２つの同一のアクリルアミドゲルのそれぞれに添加した。電気泳動を完了して得られたゲルのうちの１つをオートラジオグラフィーに付し、もう１つのゲルをクーマシーブルーで染色した。
【０２４８】
クーマシーブルーで染色したゲル中で（図２Ａを参照のこと）、０．５M のＮａＯＨによる処理がＯＫ１タンパク質の分解をもたらすことがはっきり分かる。したがって、ＯＫ１タンパク質はＮａＯＨに対して不安定であると言わなければならない。３０℃、９５℃および０．５M ＨＣｌでのインキュベーションは、ＯＫ１タンパク質が述べたインキュベーション条件下で比較的安定していることを示す。これを、これらのインキュベーション条件下では、いずれもクーマシーブルー染色後の当該ゲル中でほぼ同じ量のＯＫ１タンパク質を実証することができるという事実から結論することができる。
【０２４９】
オートラジオグラフィー（図２Ｂを参照）において、３０℃でインキュベーションしたリン酸化ＯＫ１タンパク質と比較してリン酸化ＯＫ１タンパク質の９５℃でのインキュベーションが、ＯＫ１タンパク質に結合したリン酸の有意な減少をもたらすことがわかる。したがって、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合は熱に不安定であると言わなければならない。更に、ＯＫ１タンパク質に結合したリン酸のわずかな減少が、０．５M ＨＣｌおよび０．５M ＮａＯＨとのインキュベーションについて、３０℃でインキュベーションしたリン酸化ＯＫ１タンパク質と比較して見られる。ＯＫ１タンパク質のＮａＯＨに対する不安定性のために、オートラジオグラフィー中の、０．５M ＮａＯＨ処理後のＯＫ１タンパク質の量が、熱と酸で処理された試料より有意に少ないという事実を考慮に入れるならば、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合は、塩基に関しては比較的安定しているだろうと結論付けることができる。酸で処理された試料が、３０℃および９５℃でインキュベーションした試料とほぼ同じ量のタンパク質を含んでおり、しかし３０℃で処理された試料よりオートラジオグラフィー中で有意に低い信号を有するので、酸とのインキュベーション条件は、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合もある程度切断すると考えなければならない。したがって、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合の不安定性を、行なわれたテストにより確立することができた。同時に、酸に関する不安定性は熱に関する不安定性より有意に小さいと分類される。
【０２５０】
アミノ酸のヒスチジンおよびリン酸間の結合は、熱に不安定であり、酸に不安定であるが、しかし塩基に安定である（Rosenberg, 1996, Protein Analysis and Purification, Birkhaeuser, Boston, 242-244）。上述の結果は、したがってホスホヒスチジンがＯＫ１タンパク質の自己リン酸化によって生成されることを示す。
【０２５１】
組換え発現されたＯＫ１タンパク質を、上述のようにγ位置を33Ｐで特異的ラベルされたＡＴＰとインキュベーションする場合は、自己リン酸化を立証することはできない。図５Ａ）は、適切なインキュベーション工程の後にウエスタンブロット解析によりそれぞれの反応調製物中で検出されるタンパク質の量を示す。図５Ｂ）は、個々の反応調製物からのタンパク質のオートラジオグラフィーを示す。γ位置で特異的にラベルされたＡＴＰを用いる場合ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化を実証することができないが、しかし無作為化されたＡＴＰを用いる場合、自己リン酸化を実証することができる。これは、ＯＫ１タンパク質が自己リン酸化される場合、ＡＴＰのβ位置のリン酸残基が共有結合でＯＫ１タンパク質のアミノ酸へ結合することを意味する。
【実施例８】
【０２５２】
ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されるデンプンのグルコース分子のＣ−原子位置の実証
【０２５３】
ａ）  リン酸化されたデンプンの作製
リン酸化デンプンを一般的方法項目７に従って作製した。これを行うために、Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された５mgの非リン酸化デンプンを、調製物Ａ中で２５μgの精製されたＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質と共に用い、また別の調製物Ｂ中で、元はArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離され、インビトロでリン酸化されたデンプン５mgを５μgの精製されたＲ１タンパク質と共に用いた。各反応を、33ＰラベルＡＴＰ（約２．５×１０6cpm）を各々含む５００μlのリン酸化緩衝液中で、室温で１時間撹拌下インキュベーションすることにより、行なった。さらに、Arabidopsis thaliana sex1-3の突然変異体の葉から単離された５mgのデンプンおよび前記リン酸化緩衝液を含み、しかしタンパク質を含まない対照調製物を用いた。対照調製物を正確に調製物ＡおよびＢと同じ方法で処理した。個々の反応を、各々１２５μlの１０％ＳＤＳを加えることにより止め、２％ＳＤＳで１回、２mMＡＴＰで５回、およびＨ２Ｏで２回、各回に９００μlを用いて、洗浄を実施した。各洗浄工程の後に遠心分離（各回２分間Eppendorf 卓上遠心機で１３,０００rpm）を実施した。各調製物について、得られたデンプンペレットを１ml のＨ２Ｏに再懸濁し、１００μlの各調製物を３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer(商標), BECKMANN）を加えた後に混合し、続いて、シンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。
【０２５４】
測定は次の結果を与えた：
対照：                    ６３cpm／１００μl        ６３０cpm／１０００μl
調製物Ａ（ＯＫ１）：  １３５１cpm／１００μl    １３５１２cpm／１０００μl
調製物Ｂ（Ｒ１）：    ３８５３cpm／１００μl    ３８５２６cpm／１０００μl
【０２５５】
ｂ）  Ｐ−デンプンの全加水分解
工程ａ）に従って得られた調製物Ａ、Ｂ、およびＣの懸濁液を再び遠心（５分間Eppendorf 卓上遠心機で１３,０００rpm）して、得られたペレットを９０μlの０．７M ＨＣｌ（Baker、解析用）に再懸濁し、続いて２時間９５℃でインキュベーションした。調製物Ａ、Ｂ、およびＣを再び遠心（５分間Eppendorf 卓上遠心機で１３,０００rpm）して、上清を新しい反応容器に移した。調製物の沈殿残渣を各々１００mlのＨ２Ｏ中に再懸濁し、３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safe(商標), BECKMANN）を加えた後にシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。残渣の何れにも有意な量の放射活性は証明できなかったが、これは放射性リン酸でラベルされた加水分解生成物はすべて上清に存在することを意味する。
【０２５６】
これに続いて、加水分解生成物を含む個々の上清に、各々３０μlの２M ＮａＯＨを加えて中和した（中和に必要なＮａＯＨの量を予めブランクの試料でテストしておいた）。中和した加水分解生成物を、前もって２回、各回に２００μlのＨ２Ｏで濯いでおいた１０kDa Microconフィルタ上に置き、Eppendorf卓上遠心機で１２，０００rpm 約２５分間遠心した。得られた濾液（各約１２０μl）から１０μlを採取し、３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer(商標), BECKMANN）を加えた後にシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。個々の調製物中に存在する活性を決定して次の結果を得た：
調製物Ａ（ＯＫ１）：  ９３４cpm／１０μl    １１，２０８cpm／１２０μl、
９３cpm／μl
調製物Ｂ（Ｒ１）：  ２５１８cpm／１０μl    ３０，２１６cpm／１２０μl、
２５２cpm／μl
【０２５７】
ｃ）  加水分解生成物の分離
工程ｂ）に従って得られた加水分解生成物を、上述の条件下で（一般的方法項目１３ｃ）を参照のこと）Dionexシステムを用いてＨＰＡＥにより、分離した。工程ｂ）に従って得られた調製物ＡおよびＢのろ過された上清を分離するための試料は以下の構成であった：
調製物Ａ（ＯＫ１）： 工程ｂ）に従って得られた４３μlの調製物Ａの上清（約４，０００cpmに等価）、３２μlのＨ２０、２．５μlの２．５mMグルコース−６−リン酸および２．５μlの５mMグルコース−３−リン酸（合計体積＝８０μl）。
調製物Ｂ（Ｒ１）： 工程ｂ）に従って得られた調製物Ｂの上清１６μl（約４，０００cpm に等価）、５９μlのＨ２０、２．５μlの２．５mMグルコース−６−リン酸および２．５μlの５mMグルコース−３−リン酸（合計体積＝８０μl）。
【０２５８】
それぞれの場合に、６０μlの約３,０００cpmを含む対応する試料を、ＨＰＡＥを用いて分離するために注入した。ポイント２３ｃ）に指定された条件に従ってＨＰＡＥを実施した。ＨＰＡＥカラムを通した後、各々１mlの分画に溶出緩衝液を集めた。試料を注入して１０分後に分画の収集を開始した。用いたＰＡＤ検出器から受取った信号に基づいて、グルコース−６−リン酸の溶出を分画１５へ、およびグルコース−３−リン酸の溶出を分画１７へ割当てた。各々、個々の分画の５００μlを３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer(商標), BECKMANN）と混合し、続いてシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。個々の分画について次の測定が得られた：
【０２５９】
【表２】
2007525986.tif 000003
表４：ＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質によってリン酸化されたデンプンの加水分解によって得られた加水分解生成物の、個々の分画中の測定された放射活性量［cpm］。
結果を図５にグラフでも示す。
【０２６０】
Ｒ１タンパク質により触媒されたデンプンのリン酸化後、デンプンを加水分解した後に、分析した分画中の全測定放射性リン酸のうち約６６％の放射性ラベルされたリン酸が、標準としてグルコース−６−リン酸を含む分画と共に、また約２７％が標準としてグルコース−３−リン酸を含む分画と共に、溶出した。ＯＫ１タンパク質により触媒されたデンプンのリン酸化後、デンプンを加水分解した後に、分析した分画中の全測定放射性ラベルリン酸のうち、約６７％の放射性ラベルされたリン酸が標準としてグルコース−３−リン酸を含む分画と共に、また約８％が標準としてグルコース−６−リン酸を含む分画と共に、溶出された。これから、Ｒ１タンパク質のデンプンのグルコース分子は、Ｃ−６位置で好んでリン酸化され、一方ＯＫ１タンパク質からのデンプンのグルコース分子は、Ｃ−３位置で好んでリン酸化されると結論付けることができる。
【実施例９】
【０２６１】
イネの中のＯＫ１タンパク質の同定
一般的方法項目１〜１３に記述された方法を用いて、Oryza sativa（品種Ｍ２０２）から、ＡＴＰからＰ−デンプンへリン酸残基を転移するタンパク質を同定することができた。そのタンパク質をＯ.ｓ.−ＯＫ１と名付けた。非リン酸化デンプンは、基質としてＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質に使用されない、即ちＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質もまたＰ−デンプンを基質として必要とする。同定されたＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質を規定する核酸配列を配列番号３に示し、Ｏ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４に示すＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示すＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列と５７％の同一性を有する。配列番号３に示すＯ.ｓ.−ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に示すＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列と６１％の同一性を有する。
【０２６２】
Oryza sativa のＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＭＩ５０の作製
ベクターｐＭＩ５０はイネの品種Ｍ２０２の完全なＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む。イネからのＤＮＡの増幅を、５つの副工程により実施した。配列番号３に指定された配列の位置 −１１から位置２８８までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
【表３】
2007525986.tif 000004
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して、増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２３と名付けた。
【０２６３】
配列番号３に指定された配列の位置２５０から位置９４９までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
【表４】
2007525986.tif 000005
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２０と名付けた。
【０２６４】
配列番号３に指定された配列の位置８３９から位置１７６１までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
【表５】
2007525986.tif 000006
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２１と名付けた。
【０２６５】
配列番号３に指定された配列の位置１５７１から位置３２４１までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
【表６】
2007525986.tif 000007
を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いる、逆転写酵素およびポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１１９と名付けた。
【０２６６】
位置２７７７から位置３６２１までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチド
【表７】
2007525986.tif 000008
をイネのゲノムＤＮＡ上のプライマーとして用いる、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２２と名付けた。
【０２６７】
ＯＫ１の読取枠のサブパーツを一緒にクローニングすることを次のようにして実施した。ＯＫ１の読取枠の一部を含むｐＭＬ１２０の７００塩基対の長さのＡｐａＩ断片をｐＭＬ１２１のＡｐａＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭI４７と名付けた。
【０２６８】
ｐＭＬ１２０およびｐＭＬ１２３由来のベクターのＯＫ１をコードする領域を含む９６０塩基対の長さの断片を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。それを行うために、各々５０nM の濃度のプライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｆ４（上記参照）およびプライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｒ９（上記参照）、ならびに各々５００nMの濃度のＯｓ_ｏｋ１−Ｆ６およびＯｓ_ｏｋｌ−Ｒ６を用いた。増幅されたＤＮＡ断片を、ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４４と名付けた。
【０２６９】
停止コドンの後にＸｈｏＩ部位を導入するために、８４５塩基対の長さのｐＭＬ１２２の断片を、プライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｆ３（上を参照）および
【表８】
2007525986.tif 000009
によって再増幅し、ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４５と名付けた。
【０２７０】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１６７１塩基対の長さの断片を、ｐＭＬ１１９から制限酵素ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで消化することにより得た。断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Genbank Acc.: X52328）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４６と名付けた。
【０２７１】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１７０６塩基対の長さの断片を制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによりｐＭＩ４６から切り出し、同じ制限酵素で切っておいたベクターｐＭＩ４５へクローンニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４７と名付けた。
【０２７２】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１４６塩基対の長さの断片を制限酵素ＡｆｌII／ＮｏｔＩによりｐＭＩ４３から切り出し、同じ制限酵素で切っておいたベクターｐＭＩ４４へクローンニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４９と名付けた。
【０２７３】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１６５７塩基対の長さの断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＮａｒＩによりベクターｐＭＩ４９から切り出し、同じ制限酵素で切っておいたベクターｐＭＩ４７へクローンニングした。 得られたプラスミドはｐＭＩ５０と名付けられ、またイネで同定されたＯＫ１タンパク質の全コード領域を含む。
【実施例１０】
【０２７４】
様々な植物種のさらなるＯＫ１タンパク質の同定
一般的方法項目１〜１３に記述された方法を用いて、ＡＴＰからＰ−デンプンへリン酸残基を転移するタンパク質を、オオムギ（Hordeum vulgare）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、コムギ（Triticum aestivum）およびキビ（Sorghum bicolor）で同定した。これらのタンパク質は基質として非リン酸化デンプンを用いない、即ちこれらのタンパク質は基質としてＰ−デンプンを要求する。
【０２７５】
タンパク質を、一般的方法項目１４に記述された方法を用いて単離し、トリプシンで消化し、ゲルから溶解し、Ｑ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いて配列決定した。得られたペプチド配列を用いて、データベースとの比較（Ｂｌａｓｔ検索）により、オオムギ、ジャガイモ、コムギまたはキビの当該ＯＫ１タンパク質をコードするＥＳＴ核酸配列を決定することができた。
【０２７６】
配列番号９で示される核酸配列は、オオムギのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、データベース比較（Ｂｌａｓｔ検索）により、ＴＩＧＲ（http://tigrblast. tigr.org/tgi/）データベース中の「登録」番号：ＴＣ１１７６１０の下に見出された。オオムギから単離されたＯＫ１タンパク質をＱ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いて配列決定することにより得られ、配列番号９に示されたＥＳＴ核酸配列を同定するために用いられたペプチドが、配列番号６、配列番号７および配列番号８に特定されている。配列番号１０に示されるアミノ酸配列は、オオムギのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、配列番号１０に示される核酸配列から導出することができる。
【０２７７】
配列番号１５で示される核酸配列は、ジャガイモのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、ＴＩＧＲ（http://tigrblast. tigr.org/tgi/）データベース中の「登録」番号：ＢＦ０５４６３２の下に、データベース比較（Ｂｌａｓｔ検索）により見出された。ジャガイモから単離されたＯＫ１タンパク質をＱ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いて配列決定することにより得られ、配列番号１５に示されたＥＳＴ核酸配列を同定するために用いられたペプチドが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４に特定されている。配列番号１６に示されるアミノ酸配列は、ジャガイモのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、配列番号１５に示される核酸配列から導出することができる。
【０２７８】
配列番号２１で示される核酸配列は、キビのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、データベースとの比較（Ｂｌａｓｔ検索）により、ＴＩＧＲ（http://tigrblast. tigr.org/tgi/）データベース中の「登録」番号：ＴＣ７７２１９の下に見出された。キビから単離されたＯＫ１タンパク質をＱ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いて配列決定することにより得られ、配列番号２１に示されたＥＳＴ核酸配列を同定するために用いられたペプチドが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０に特定されている。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、キビのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、配列番号２１で示される核酸配列から導出することができる。
【０２７９】
配列番号２５で示される核酸配列は、コムギのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、データベースとの比較（Ｂｌａｓｔ検索）により、ＴＩＧＲ（http://tigrblast.tigr.org/tgi/）データベース中の「登録」番号：ＣＡ７４３１９の下に見出された。コムギから単離されたＯＫ１タンパク質をＱ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いて配列決定することにより得られ、配列番号２５に示されたＥＳＴ核酸配列を同定するために用いられたペプチドが、配列番号２３および配列番号２４に特定されている。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、コムギのＯＫ１タンパク質の一部をコードし、配列番号２５で示される核酸配列から導出することができる。
【０２８０】
データベース比較を行なうために次の設定を選択した：
Program：          tblastn
Matrix：          blosum62
Expect：               100
Echofilter：      disabled
Descriptions：          20
他のすべての設定は「default」を読んだ。
【実施例１１】
【０２８１】
特異的にＯＫ１タンパク質を認識する抗体の作製
抗原として、約１００μgの精製されたＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質を含むタンパク質バンドを切り取って、EUROGENTEC S.A.社（ベルギー)へ送り、同社が請負により抗体の作製を行なった。第１に、ウサギの未免疫血清を検査して、組換えＯＫ１で免疫化する前に既にＡ.ｔ.全抽出物から得たタンパク質を認識するかどうかを確かめた。２匹のウサギの未免疫血清が、１００〜１５０ kDa の範囲のタンパク質を認識しなかったので、免疫化のために選択した。各ウサギにタンパク質の１００μgを４回（０、１４、２８、５６日目）注射した。各ウサギから４つの血液サンプルを採取した：（３８日、６６日、８７日目、および最後の採血）。第１の採血後に得られた血漿は、既に特異的な反応をＯＫ１抗原に対してウエスタンブロットで示した。しかしながら、それ以上のすべてのテストでは、ウサギの最終採血を用いた。
【実施例１２】
【０２８２】
上昇または低下したＯＫ１タンパク質の活性を有する遺伝子組換えイネ植物の作製
【０２８３】
ａ）  プラスミドｐＧｌｏ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１の作製
イネの品種Ｍ２０２のゲノムＤＮＡに対してプライマー
【表９】
2007525986.tif 000010
ならびに高忠実度Ｔａｑポリメラーゼ（Invitrogen, catalogue number 11304-011）によるポリメラーゼ連鎖反応（３０ × ２０秒９４℃、２０秒６２℃、１分６８℃、４mMＭｇ２ＳＯ４）を用いて、イネ由来のグロブリン遺伝子プロモーターを増幅し、それをｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）中へクローニングすることにより、プラスミドｐＩＲ９４を得た。２つのオリゴヌクレオチド
【表１０】
2007525986.tif 000011
から成る合成ＤＮＡ片を、ＳｄａＩおよびＭｕｎＩで切ったベクターｐＧＳＶ７１へクローニングすることにより、プラスミドｐＩＲ１１５を得た。
【０２８４】
得られたプラスミドｐＩＲ１１５をＳｄａＩで切り、突出している３'末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、そしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより平滑化されまた Agrobacterium tumefaciens のオクトピン合成酵素遺伝子の終結シグナルを含むｐＢｉｎＡＲの１９７塩基対のＨｉｎｄIII／ＳｐｈI断片（Hoefgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）を挿入した。得られたプラスミドをｐIＲ９６と名付けた。
【０２８５】
イネ由来のグロブリン遺伝子のプロモーターを含むｐIＲ９４からの９８６塩基対の長さのＤＮＡ断片を、プラスミドｐIＲ９６へクローンニングすることにより、プラスミドｐIＲ１０３を得た。
【０２８６】
ｐＧＳＶ７１は、介在するベクターｐＧＳＶ１に由来するプラスミドｐＧＳＶ７の誘導体である。ｐＧＳＶ１は、コンストラクションについて Cornelissen および Vanderwiele（Nucleic Acid Research 17,(1989),19-25) によって記述されたｐＧＳＣ１７００の誘導体である。ｐＧＳＶ１はｐＧＳＣ１７００から、カルベニシリン抵抗性遺伝子の欠失、ならびにプラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡ領域のＴ−ＤＮＡ塩基配列の欠失により、得られた。
【０２８７】
ｐＧＳＶ７は、プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点（Bolivar et al., Gene 2,（1977), 95-113）、ならびに Pseudomonas プラスミドｐＶＳ１の複製開始点（Itoh et al., Plasmid 11,（1984), 206）を含む。ｐＧＳＶ７は、さらに Klebsiella pneumoniae のトランスポゾンＴｎ１３３１から由来する選択可能なマーカー遺伝子ａａｄＡを含み、それが抗生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する抵抗性を与える（Tolmasky, Plasmid 24（3),（1990), 218-226; Tolmasky and Crosa, Plasmid 29(1),（1993), 31-40）。
【０２８８】
プラスミドｐＧＳＶ７１を、ｐＧＳＶ７の境界領域間にキメラのｂａｒ遺伝子をクローニングすることにより得た。キメラのｂａｒ遺伝子は、カリフラワーモザイクウィルスの転写開始用プロモーター配列（Odell et al., Nature 313,（1985), 180）、Streptomyces hygroscopicus のｂａｒ遺伝子（Thompson et al., Embo J. 6,（1987), 2519-2523）およびｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡのノパリン合成酵素遺伝子の、転写終了およびポリアデニル化用の３'−非翻訳領域を含む。ｂａｒ遺伝子は、除草剤グルホシネートアンモニウムに対する耐性を与える。
【０２８９】
Arabidopsis のＯＫ１タンパク質の完全な読取枠を含むＤＮＡ断片を、ベクターＡ.ｔ.−ｏｋ１−ｐＧＥＭ−Ｔから切り出し、ベクターｐＩＲ１０３へクローニングした。この目的のために、プラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＧＥＭ−Ｔを制限酵素Ｂｓｐ１２０１によって切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、続いてＳａｌＩで切り取った。Arabidopsis thalianaのＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、Ｅｃｌ１３６IIおよびＸｈｏＩで切開したベクターｐIＲ１０３へクローニングした。得られたプラスミドをｐＧｌｏ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１と名付けた。
【０２９０】
ｂ）  ＲＮＡｉ技術による、イネのＯＫ１タンパク質を阻害するためのコンストラクトの作製
イネ植物の形質転換に用いたプラスミドｐＭＬ１２５を、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステム（Invitrogen）を用いたプラスミドｐＭＬ１２４およびｐIＲ１１５の特異的組換えにより得た。
【０２９１】
ｐＭＬ１２４を、イネのＯＫ１タンパク質をコードする読取枠の一部を含む３５９塩基対の長さのｐＭＬ１１９（上記［実施例９］参照）のＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩで切開したベクターｐＥＮＴＲ−１Ａ（Invitrogen, product number 11813- 011）へクローニングすることにより、得た。
【０２９２】
プラスミドｐIＲ８７を、プライマー
【表１１】
2007525986.tif 000012
をトウモロコシのゲノムＤＮＡに用いて、トウモロコシのアルコールヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のイントロン１を増幅することにより得た。ポリメラーゼ連鎖反応（３０ × ３０秒９４℃、３０秒５９℃、１分７２℃、２．５mMＭｇＣｌ２）の生成物を、制限酵素ＸｈｏＩで消化して、同じ酵素で切開しておいたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Genbank Acc.: X52328）へクローニングした。
【０２９３】
イネ由来のグロブリン遺伝子のプロモーターを含むｐＩＲ９４から得た９８６塩基対の長さのＤＮＡ断片を、ベクターｐＩＲ９６へクローニングした。得られたプラスミドをｐＩＲ１０３と名付けた。
【０２９４】
プラスミドｐｌＲ１０７を、「ＲｆＡカセット」（上記参照）を、制限酵素ＥｃｏＲＶで切開したプラスミドｐＩＲ１０３へクローニングすることにより得た。
【０２９５】
トウモロコシ由来のアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子のイントロン１を含む５４０塩基対の長さの断片を、プラスミドｐｌＲ８７から制限酵素Ｘｈｏｌにより切り取り、ＸｈｏＩで同様に切断したプラスミドｐＩＲ１０７へクローニングした。得られたプラスミドをｐＩＲ１１４と名付けた。プラスミドｐｌＲ１１５を、「ＲｆＡカセット」（上記参照）を、制限酵素Ｅｃｌ１３６IIで切開したプラスミドｐＩＲ１１４へクローニングすることにより得た。
【０２９６】
ｃ）  イネ植物の形質転換
イネ植物（品種Ｍ２０２）を、Agrobacterium（プラスミドｐＧｌｏ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１またはプラスミドｐＭＬ１２５のいずれかを含む）を用い、Hiei et al.(1994, Plant Journal 6(2), 271-282）に記述された方法を使用して、形質転換した。
【０２９７】
ｄ）  Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質を発現した遺伝子組換えイネ植物、およびこれらの植物によって合成されたデンプンの解析
プラスミドｐＧｌｏ−Ａ.ｔ.−ＯＫ１で形質転換されて非相同のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質発現を示した植物を、ノーザンブロット解析によって同定した。
【０２９８】
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを検出できる量だけ発現した植物を温室で栽培した。これらの植物の穀粒を収穫した。これらの穀粒のデンプンは、当該デンプンに共有結合で結合している高い含量のリン酸を示した。
【０２９９】
ｅ）  ＲＮＡｉ技術によって内因性ＯＫ１タンパク質の発現が抑制された遺伝子組換えイネ植物、およびこれらの植物から合成されたデンプンの解析
プラスミドｐＭＬ１２５で形質転換され、ＯＫ１タンパクをコードする内因性ｍＲＮＡの発現が低下したイネ植物をノーザンブロット解析によって同定した。
【実施例１３】
【０３００】
高いまたは低いＯＫ１タンパク質活性を有する遺伝子組換えジャガイモ植物の作製
【０３０１】
ａ）  プラスミドｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇの作製
プラスミドｐＢｉｎＢ３３からスタートして、Ｂ３３プロモーターを含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII断片、ポリリンカーの一部、およびｏｃｓ終止コドンを切り取り、対応して切開したたベクターｐＢＩＢ−Ｈｙｇ（Becker, 1990, Nucl. Acids Res. 18, 203）へライゲーションした。
【０３０２】
Solanum tuberosumのパタチン遺伝子Ｂ３３（Rocha-Sosa et al., 1989）のプロモーターをＤｒａＩ断片（ヌクレオチド-１５１２−＋１４）として、ＳｓｔＩで切り出し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて端部を平滑化されたベクターｐＵＣ１９へライゲーションすることにより、プラスミドｐＢｉｎＢ３３を得た。この結果、プラスミドｐＵＣ１９−Ｂ３３が得られた。Ｂ３３プロモーターをこのプラスミドからＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩにより切り取り、対応して切開したベクターｐＢｉｎＡＲ（Hoefgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）へライゲーションした。これにより植物発現ベクトルｐＢｉｎＢ３３が得られた。
【０３０３】
ｂ）  ベクターＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇの作製
Ａ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質のコード配列を制限酵素Ｂｓｐ１２０ＩおよびＳａｌＩでプラスミドＯＫ１−ｐＧＥＭから切り取り、ＳｍａＩおよびＳａｌＩで切開したベクターｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇにライゲーションした。得られたプラスミドをＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇと名付けた。
【０３０４】
ｃ）  ジャガイモ植物の形質転換
Agrobacterium tumefaciens（菌株 GV2260)をプラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇにより形質転換した。デジレ品種のジャガイモ植物を、次にプラスミドＡ.ｔ.−ＯＫ１−ｐＢｉｎＢ３３−Ｈｙｇを含む Agrobacterium を用い、Rocha-Sosa et al.（EMBO J. 8,（1989), 23-29) に記述された方法を使用して形質転換し、植物を再生させた。この形質転換事象から得られた植物を３８５ＪＨと名付けた。
【０３０５】
ｄ）  遺伝子組換えジャガイモ植物およびこれらによって合成されたデンプンの解析
非相同発現されたＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の高い活性を示した植物、および共抑制効果により内因性ＯＫ１タンパク質の活性が低下した植物を、ウエスタンブロット解析により同定した。ウエスタンブロット解析を、実施例１１に記述された抗体を用いて行なった。
【０３０６】
図７は、形質転換イベント３８５ＪＨから得られた単一の植物中のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質の、ウエスタンブロット解析による検出を典型的に示す。葉組織中におけるＢ３３プロモーターの誘導のために、形質転換イベント３８５ＪＨの単一の系統を、１００mMショ糖を含む固体 Musharige Skoog 培地上で、組織培養として２日間培養した。収穫後、タンパク質抽出物を一般的方法項目１ａ）に記述された方法により、これらの植物の葉組織から生成した。変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるタンパク質の分離後、各系統の４０μgのタンパク質抽出物を、実施例項目１０に記述した抗体を用いるウエスタンブロット解析により分析した。対照試料として、アラビドプシス植物およびジャガイモ野生型植物（cv Desiree）のタンパク質抽出物もまた分析した。
【０３０７】
対応する野生型植物と比較して高い量のＡ.ｔ.−ＯＫ１タンパク質を示した植物を温室で栽培した。これらの植物の塊茎から分離されたデンプンは、形質転換されていない野生型植物から単離されたデンプンと比較して、デンプンに共有結合で結合したリン酸の高い含量を示した。
【実施例１４】
【０３０８】
本発明によるタンパク質の低下した活性を示すArabidopsis thaliana 植物の解析
Arabidopsis thalianaのＴ−ＤＮＡ挿入突然変異体（Salk Institute Genomic Analysis Laboratory, 10010 N. Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, http://signal.salk.edu/ under ACC. No.: Salk_110814, Alias N610814 から入手可能）（ＯＫ１遺伝子中の挿入に関して同型接合体の）を、下記条件下で生育させた：
明期：１６時間、２０℃
暗期：  ８時間、１６℃
花の発生の少し前に、１２時間２０℃の明期および１２時間１７℃の暗期で植物を栽培した。
【０３０９】
得られた突然変異体系統植物（Salk 110814）は、最初の種子材料（Salk 110814-1, Salk 110814-2, Salk 110814-3）の３つの異なる種子から解析のために栽培した。
【０３１０】
暗期の終りに、６つの野生型植物（Oekotyp Columbia）から各々１０枚の葉を採取し、７０％エタノール中５０℃で脱色した。更に、突然変異体系統 Salk_110814-1、Salk_110814-2、または Salk_110814-3（各々ＯＫ１遺伝子中のＴ−ＤＮＡ挿入に関して同型接合体）の４つの異なる植物からそれぞれ６枚の葉を採取し、これらを７０％エタノール中５０℃で脱色した。その後、葉を１０分間ルゴール液中でインキュベーションし、続いて過剰のルゴール液を葉から水道水で濯ぎ落した。すべての野生型植物の葉は、ルゴール液による染色を示さなかった。他方、突然変異体系統 Salk_110814-1, Salk_110814-2 または Salk_110814-3 の葉は、すべて暗褐色または黒い彩色を示した（図７を参照）。したがって、突然変異体系統は野生型植物と比較して、デンプン過剰の表現型を示した。栽培中、生育に関する差異は突然変異体系統と野生型植物の間で確認することができなかった。
【０３１１】
３５Ｓプロモーター制御下のＯＫ１遺伝子コード領域の「逆方向反復」を含むＲＮＡｉコンストラクトで形質転換された遺伝的修飾Arabidopsis thaliana植物を、実施例１０に記述された抗体を用いて、ウエスタンブロット解析により分析した。野生型植物と比較してＯＫ１タンパク質の低下した量を示したいくつかの独立の系統を同定した。これらの系統を上に明記した培養条件の下で栽培した。個々の系統の各５枚の葉を、暗期（１７℃１２時間）の終わりに採取し、エタノール中で脱色し、ルゴール液で染色した。すべての植物が対応する野生型植物と比較して、デンプン過剰の表現型を示した。栽培中に、遺伝的に修飾された植物と野生型植物の間で生育に関する差異を確認することはできなかった。ＲＮＡｉ技術によって遺伝的修飾された植物は、このように突然変異体系統、Salk_110814-1, Salk_110814-2 または Salk_110814-3と同じ特性を示した。
【０３１２】
独立した形質転換イベントの結果、ＲＮＡｉ技術によってＯＫ１タンパク量が低下した、系統 Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−１、Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−２、Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−３、Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−４、Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−５の各４つの Arabidopsis thaliana 植物を、それらのデンプン含量について様々な時に調べた。それぞれの系統におけるＯＫ１タンパク質の量の低下を、エスタンブロット解析によって実証した（図８を参照）。個々の系統の葉のデンプン含量を、Boehringer Mannheimのデンプンキット（Product No.: 0207748) を用いて決定した。この目的のために、個々の系統の４つの植物の葉を各々すべて収穫し、葉を乳鉢を用いてホモジナイズした。４０mg〜６０mgのホモジナイズされた葉材料を各々８０％エタノールで２回洗浄し、上清を捨てた。エタノールに可溶でない残りの材料を、１mlの水で一度洗浄した後に凍結乾燥し、次に、０．５mlの０．２M ＫＯＨに１時間９５℃で溶解し、得られた溶液を８８μlの１M酢酸を用いてｐＨ７に調節した。得られたそれぞれの溶液の２５μlを、１単位のα−アミラーゼ（Bacillus amyloliquefaciens から, Boehringer, Prod-No. 161764）を加えておいた５０μlのアミログルコシダーゼ溶液（Starch-Kit from Boehringer Mannheim, Product No.: 0207748）と混合し、１時間５５℃でインキュベーションした。その後、アミログルコシダーゼおよびα−アミラーゼで処理された溶液２０μlを、酵素共役光学測定テスト（Boehringer Inmgelheim, Product No.: 0207748の、天然デンプン測定用の製品情報シートを参照のこと）を使用するグルコースの測定に用いた。遺伝子組換え系統と同時に、Arabidopsis thaliana 野生型植物（Ecotype Columbia）の葉の中のデンプン含量を測定した。野生型植物および遺伝子組換え植物を同じ条件下：明期１２時間それに続く暗期１２時間で栽培した。
【０３１３】
各遺伝子組換え植物系統および野生型植物の葉を、各々種子発芽約４.５週間後の暗期の終り、明期の終り、および明期のすぐ後に続く第２の暗期の終りに収穫した。各遺伝子組換え植物系統については、各々２つの独立した抽出物を生成し、それぞれについてデンプン含量を２回ずつ測定した。野生型植物については、各々について４つの抽出物を生成し、それぞれについてデンプン含量を２回ずつ測定した。葉のデンプン含量の測定により次の結果が得られた：
【０３１４】
【表１２】
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表４  ＲＮＡｉ技術を用いてＯＫ１タンパク質の量を低下させた Arabidopsis thaliana 植物の葉のデンプン量。
＊  次の一般式を用いる標準偏差：
平方根［（ｎΣｘ2 −（Σｘ)2)／ｎ(ｎ−１）］
【実施例１５】
【０３１５】
低下したＯＫ１タンパク質活性を示す植物から単離されたデンプンの解析
実施例１４に記述した植物の葉からデンプンを単離し、一般的方法項目１３に記述した方法を用いて加水分解し、次にＨＰＡＥ分析によって分離した。ＨＰＡＥ解析によって得た分離された信号のＣ−３リン酸およびＣ−６リン酸に対する面積を計算し（ソフトウェア： Chromelion 6.20 from Dionex, USA）、得られた値を、互いの間の比率として示した。野生型植物中のＣ−６リン酸のＣ−３リン酸に対する比率は２．１であった。一方実施例１４に記述された、ＯＫ１タンパク質活性がＲＮＡｉ技術によって低下した植物中においては、系統Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−１、Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−２、Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−３、Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−４、およびＡ.ｔ.−α−ＯＫ１−５から分離されたデンプンの分析により決定された、Ｃ−６リン酸のＣ−３リン酸に対する平均比率は２．５であった。系統Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−５からのデンプンの解析がＣ−６リン酸のＣ−３リン酸に対する最低の比率（比率２．２）を、系統Ａ.ｔ.−α−ＯＫ１−１からのデンプンが最高の比率（比率２．７）を、与えた。実施例１３に記述された低下したＯＫ１タンパク質活性を示す突然変異体の葉から単離されたデンプンは、当該デンプン中でＣ−６リン酸のＣ−３リン酸に対する比率の増加を示した。
【図面の簡単な説明】
【０３１６】
【図１】Arabidopsis thaliana 由来の、リン酸化デンプンと比較して非リン酸化デンプンに好んで結合するタンパク質を同定するための変性アクリルアミドゲル。標準タンパク質分子量マーカーを、トレース「Ｍ」に示す。実施例１ｄ)からの対照調製物Ｃのインキュベーション後に得られたタンパク質を、トレース「−」に示す。Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体（実施例１ｄ）の調製物Ｂ）の葉から単離された非リン酸化デンプンとのインキュベーション後に得られた、Arabidopsis thaliana のタンパク質抽出物を、トレース「Ｋ」に示す。予めインビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていたArabidopsis thaliana sex1-3 の葉から分離されたデンプンとインキュベーションした後に得られたArabidopsis thaliana のタンパク質抽出物（実施例１ｄ)の調製物Ａ）を、トレース「Ｐ」に示す。電気泳動の完了後、アクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色した。
【図２】ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化活性の実証。図２Ａ）は電気泳動完了後にクーマシーブルーで染色した変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルを示す。  図２Ｂ）は、変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。同じ量の同じ試料を２つの各ゲルに加えた。 Ｍ：標準タンパク質分子量マーカー；Ｒ１：実施例７による反応容器１からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後）；Ｒ２：実施例７による反応容器２からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を９５℃に熱した）；Ｒ３：実施例７による反応容器３からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を０．５ M ＨＣｌ中でインキュベーションした）；Ｒ４：実施例７による反応容器４からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を０．５ M のＮａＯＨ中でインキュベーションした）。
【図３】ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性の実証（実施例６を参照のこと）。ＯＫ１タンパク質を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離された非リン酸化デンプン（調製物Ａ）、および予めインビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていた、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプン（調製物Ｂ）とインキュベーションした。調製物Ｃは、ＯＫ１タンパク質なしでこの調製物Ｃをインキュベーションした以外は、調製物Ｂと同じである。２つの独立したテストを各調製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）について行なった（テスト１およびテスト２）。それぞれの量を、非リン酸化デンプン（調製物Ａ）およびリン酸化デンプン（調製物Ｂ）へ導入した33Ｐラベルリン酸のcpm（カウント／分）で測定して示す。
【図４】Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質によりそれぞれリン酸化されたデンプンのグルコース分子のＣ−原子位置の比較（実施例９を参照のこと）。ＯＫ１タンパク質（調製物Ａ）を 33ＰラベルＡＴＰ存在下でArabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から単離された、予めＲ１タンパク質によりインビトロでリン酸化されていたデンプンとインキュベーションした。Ｒ１タンパク質（調製物Ｂ）を、Arabidopsis thaliana sex1-3 突然変異体の葉から分離されたデンプンと、33ＰラベルＡＴＰ存在下で インキュベーションした。インキュベーションが完了した後、デンプンの全加水分解を実行し、得られた加水分解生成物を、ＨＰＡＥクロマトグラフィーを用いて分離した。標準として、加水分解生成物にグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸を分離の前に加えた。ＨＰＡＥクロマトグラフィーによって分離された加水分解生成物を個々の分画に集めた。加えたグルコース−６−リン酸が分画１５に、また加えたグルコース−３−リン酸が分画１７に溶出された。得られた分画を、続いて放射性ラベルされたリン酸の存在について調べた。個々の分画で測定されたcpm（カウント／分）で測った33Ｐラベルリン酸（それはＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質によってリン酸化デンプンの加水分解生成物へ導入されたリン酸である）の量をグラフに示す。
【図５】ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化の実証。図５Ａ）は、ウエスタンブロットを示す。図５Ｂ）は、変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーを示す。同じ量の同じ試料を２つのゲル各々に添加した。ＯＫ１タンパク質を、無作為化放射性ラベルＡＴＰと、または特異的にγ位置に放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションした。インキュベーションの完了後、タンパク質を３０℃または９５℃に熱するか、または０．５ M のＮａＯＨまたは０．５ M のＨＣｌ中でそれぞれインキュベーションした。
【図６】ＯＫ１タンパク質によって触媒された反応における、ＡＴＰのβリン酸残基のデンプンへの転移の実証。特異的に33Ｐでγ位置をラベルされたＡＴＰまたは無作為33Ｐ−ＡＴＰのいずれかを用いて、インビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていた、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプンを、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化した。「対照」として指定された実験のいずれにもＯＫ１タンパク質を加えなかった。調製物をそれぞれ２回、互いに独立にテストした。両方のテストの結果を示す。
【図７】Arabidopsis thaliana のＯＫ１タンパク質に対する抗体を用いた、植物からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット解析。次の植物の葉からのタンパク質抽出物を示す。Ａｒａ： Arabidopsis thaliana；５１、５４、５５、６７、７２、７３、７９、６２、６３、６４、６５、６９、６６、６８は、形質転換３８５ＪＨの独立な系統である。  Ｄ： 野生型 Solanum tuberosum cv Desiree。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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