(57)【要約】  本発明は、磁性ナノ粒子（１１）が表面に付着している間に磁界を加えるとともに磁性ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータを検出することによって、少なくとも一つの磁性ナノ粒子（１１）と他の物体の表面との間において特定結合を非特定の結合と区別する方法及び装置（１０）を提供する。方法及び装置（１０）を、生体内又は生体外生体分子診断に適用することができる。本発明によるセンサは、一つのセンサ（１０）において、磁性粒子又はラベル（１１）の検出と、他の物体の表面に結合した磁性粒子又はラベル（１１）の結合の性質及び特性の決定とを組み合わせる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの偏光可能な又は偏光されたナノ粒子ラベルと他の物体の表面との間で特定結合を非特定結合と区別するセンサ装置であって、
偏光され又は偏光可能なナノ粒子ラベルを含むサンプル流体に電界又は磁界を加える少なくとも一つの電界又は磁界発生手段と、
少なくとも一つの磁気センサ素子と、
前記ナノ粒子ラベルと前記他の物体の表面との間で特定結合を非特定結合と区別するために、前記ナノ粒子ラベルが前記表面に付着されている間、ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連したパラメータを検出する手段とを具えることを特徴とするセンサ装置。
【請求項２】
請求項１記載のセンサ装置において、
前記電界又は磁界発生手段が回転磁界を発生することを特徴とするセンサ装置。
【請求項３】
請求項１記載のセンサ装置において、
前記電界又は磁界発生手段が一方向磁界を発生することを特徴とするセンサ装置。
【請求項４】
請求項１記載のセンサ装置において、
前記電界又は磁界発生手段が前記センサ装置上に配置されたことを特徴とするセンサ装置。
【請求項５】
請求項１記載のセンサ装置において、
前記電界又は磁界発生手段を２次元ワイヤ構造としたことを特徴とするセンサ装置。
【請求項６】
請求項１記載のセンサ装置において、
前記磁気センサ素子をＡＭＲセンサ素子、ＧＭＲセンサ素子、ＴＭＲセンサ素子のうちの一つとしたことを特徴とするセンサ装置。
【請求項７】
請求項１記載のセンサ装置において、
一つの磁気センサ素子のそれぞれの側に配置した二つの電界又は磁界発生手段を具えることを特徴とするセンサ装置。
【請求項８】
請求項１記載のセンサ装置において、
二つの電流ラインの間に配置されたことを特徴とするセンサ装置。
【請求項９】
種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又はナノ粒子ラベルのクラスタを単一のナノ粒子ラベルから区別するセンサ装置であって、
偏光され又は偏光可能なナノ粒子ラベルを含むサンプル流体に電界又は磁界を加える少なくとも一つの電界又は磁界発生手段と、
少なくとも一つの磁気センサ素子と、
前記種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又は前記ナノ粒子ラベルのクラスタを前記単一のナノ粒子ラベルから区別するために、前記ナノ粒子ラベルが前記表面に付着されている間、ナノ粒子回転又は運動の自由度に関連したパラメータを検出する手段とを具えることを特徴とするセンサ装置。
【請求項１０】
少なくとも一つの偏光可能な又は偏光されたナノ粒子ラベルと他の物体の表面との間で特定結合を非特定結合と区別する方法であって、
少なくとも一つのナノ粒子ラベルを設け、
電界又は磁界を加え、
前記少なくとも一つのナノ粒子ラベルが前記表面に付着されている間、ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータを検出して、前記ナノ粒子ラベルと前記表面との間で特定結合を非特定結合と区別することを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、
前記少なくとも一つのナノ粒子ラベルを磁性ナノ粒子ラベルとすることを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、
前記少なくとも一つのナノ粒子ラベルが、少なくとも一つの強磁性ナノ粒子ラベルを具えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、
前記少なくとも一つの磁性ナノ粒子ラベルが、少なくとも一つの超磁性ナノ粒子ラベルを具えることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１０記載の方法において、
回転磁界を加えることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０記載の方法において、
一方向磁界を加えることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１１記載の方法において、
前記磁性ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータの検出を磁気的に行うことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０記載の方法において、
前記少なくとも一つのナノ粒子ラベルに、内部回転の自由度を有する結合部分を設けることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１０記載の方法において、
前記磁性ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータの検出を、信号緩和を時間の関数として測定することによって行うことを特徴とする方法。
【請求項１９】
種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又はナノ粒子ラベルのクラスタを単一のナノ粒子ラベルから区別する方法であって、
ナノ粒子ラベルを設け、
電界又は磁界を加え、
ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータを検出して、前記種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又は前記ナノ粒子ラベルのクラスタを単一のナノ粒子ラベルから区別することを特徴とする方法。
【請求項２０】
生体分子診断における請求項１０記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出又は診断、特に、生体内及び生体外アプリケーションの医療及び食物診断のような生体分子診断の分野に関する。更に詳しくは、本発明は、液体又は液体媒体のようなサンプル流体、すなわち、生体内及び生体外のターゲット分子を検出するとともに、磁気ナノ分子と他の物体の表面との間で特定結合(specific binding)を非特定結合(less specific binding)から区別する方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体検知の課題は、高濃度、例えば、ｍｍｏｌ／Ｌのバックグランド物質（例えば、アルブミンのような蛋白質）を有する複雑な混合物（例えば、血液、培養細胞、組織）中の低濃度の特定ターゲット分子（例えば、ｐｍｏｌ／Ｌ範囲又はそれ以下の腫瘍マーカ及び病原体誘導物質(pathogen-derived material)を検出することである。
【０００３】
バイオセンサは、一般に、検出を容易にするために特定の補足分子２，３及びラベル４を有する表面１を用いる。これを、第１の補足分子２が結合されたバイオセンサ表面１を表す図１に示す。溶液５において、ターゲット６と、第２の補足分子３が結合されたラベル４とが存在する。ターゲット６及びラベル４をバイオセンサ表面１に結合することができる。図２において、バイオセンサ表面１に対するラベル４のあり得る結合の幾何学的配置の一部の例を示す。例えば、タイプ１は、所望の特定結合であり、更に詳しくは、ターゲット分子６がバイオセンサ表面１上の第１の補足分子２とラベル４上に存在する第２の補足分子３との間に挟まれている構造である。さらに、ラベル４は、特定されない方法でバイオセンサの表面１に付着することもでき、すなわち、特定のターゲット分子６の介在なく表面１に結合することができる。図２のタイプ２は、［ラベル４及び／又はラベル４に結合した第２の補足分子３］と［バイオセンサ表面１及び／又はバイオセンサ表面１に結合した第１の補足分子２］との間の単一の非特定結合(non-specific bond)を表す。タイプ２ｂは、交差反応とも称される。通常、タイプ２の種類の結合は、表面１に弱く結合され、洗浄や磁気力のような厳密な手順によって除去しうる。図２のタイプ３は、［ラベル４及び／又はラベル４に結合した第２の補足分子３］と［バイオセンサ表面１及び／又はバイオセンサ表面１に結合した第１の補足分子２］との間の広い領域に亘る複数の非特定結合を表す。タイプ３の種類の結合は、タイプ１の結合に比べて表面に強固に結合される。図２のタイプ４は、タイプ１の変性形態を示し、この場合、ラベル４は、特定結合及び非特定結合によってバイオセンサ表面１に結合される。
【０００４】
図３は、表面７に嵌め込まれたターゲット６に結合したラベル４を有する生体検知を示す。ターゲット６３を、例えば、細胞膜上の受容体分子、蛋白質又は組織中の他の生物分子とすることができる。この状況は、例えば、専用の(dedicated)造影剤を用いた分子イメージングで発生し、この場合も、生物的な特定結合が要求される。ラベル４の存在又は濃度は、ターゲット分子６の存在、濃度又は活動度に関連する。イメージングを、従来知られている複数の方法、例えば、励起領域(excitation field)の走査、位置に依存する励起の使用、検知システムの走査、調査下の物体の走査、センサアレイの使用等によって行うことができる。
【０００５】
検出の制限及び補足に基づく生体検知の特定を向上するために、種々のラベル結合タイプの集団を区別することができる技術を開発することが重要である。非特定信号を減少する既知の解決は、厳格な手順を化学的（例えば、高塩分濃度の洗浄）又は物理的（例えば、温度、せん断流、磁気力）に適用することによるものである。厳格なステップは、特定結合（図２のタイプ１）が妨害されない状態である間に弱い結合ラベル（例えば、図２のタイプ２）を除去することである。このようにして、信号対バックグランド比を増大する。しかしながら、タイプ３及び４によるバイオセンサ表面１に結合したラベル４は、ラベル４がタイプ１による特定結合より強く表面１に結合されたときには表面１上に存在したままである。これは、非特定の相互作用に対して利用できる大きな表面領域を有するナノ粒子ラベル４には重要な事項である[‘High-fluorescence nano-particles’, Perrin et al., J. Immunological Methods 224,77 (1999)]。磁性ナノ粒子ラベル４の非特定結合(non-specific binding)は、ＧＭＲバイオセンサにおいて知られた問題でもある[Rife et al., Sens. Act. A107,209(2003)]。
【０００６】
生物分子及び分子結合の機械的な特性を調べる既知の研究方法は、いわゆる磁気ピンセット(magnetic tweezer)である[例えば、Harada et al., Nature vol.409, p.113(2001); Assi et al., J. Appl. Phys. Vol.92, p.5584(2002)]。器具は、磁性粒子に磁気力及び磁気回転を加えることに基づき、この場合、生物分子が粒子の一端に付着するとともに静止表面が粒子の他端に付着する。典型的には、磁性粒子は、１〜５μｍの径及び１０−１３Ａ．ｍ２のオーダの磁気モーメントを有する。磁界は、典型的には０．１〜１Ｔの領域の外部磁石及び１０３Ｔ／ｍまでの磁界勾配の機械的な制御によって加えられる。この場合、磁気ビーズ上の力Ｆは、
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に等しくなり、この場合、ｍを、ビーズすなわち磁性ナノ粒子の磁気モーメントとし、Ｂを磁界とする。右側の近似は、例えば磁気飽和によって生じた一定の粒子モーメントに適用する。磁気ピンセットの実験は、一般に、ｐＮ及びｎＮ範囲の力が加えられる単一分子を調べるのに用いられる。低周波数の分子の回転及び分子のねじれは、外部磁石を回転することによって調べられる。ビーズを光学的に検出することによって、ビーズの偏移を測定することができる。加えられる力を、ビーズの熱振動の光学的なイメージングによって決定することができる。
【０００７】
しかしながら、この方法は、以下の制約を有する。第１に、実際の用途に対して器具をコンパクト、小型化かつ使用が容易なバイオセンサアレイにするのが困難なことである。第２に、用いられるビーズは、十分大きい磁気モーメントを有するとともに光学的な検出を容易にするために大きくなる。しかしながら、バイオセンサにおいて、ビーズの寸法は、高速な拡散、低い沈降、高い表面対容量比及びセンサの小さい立体障害に対して、好適には１μｍより下、更に好適には５００ｎｍより下である。さらに、磁気ピンセット技術は、一般に、研究環境において単一の分子を調べるのに適用される。実用的なバイオセンサにおいて、多数のラベル、例えば、意味のある統計を有するために１００を超えるラベルが１００／ｍｍ２〜１０００／μｍ２の密度で存在する。更なる不都合は、現在の磁気ピンセットにおいて、回転の研究が低周波数、典型的には１Ｈｚに制約され、ビーズの回転状態を検出するのが非常に困難なことである。高周波測定は、比較的低速で不正確な光イメージングのために実行するのが困難である。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の目的は、高濃度のバックグランド物質を有する混合物のターゲット分子を、向上した信号対バックグランド比で検出する方法及び装置を提供することである。
【０００９】
上記目的は、本発明による方法及び装置によって達成される。
【００１０】
本発明の第１の態様は、少なくとも一つの偏光可能な又は偏光されたナノ粒子ラベルと他の物体の表面との間で特定結合を非特定結合と区別するセンサ装置を提供する。センサ装置は、
偏光され又は偏光可能な、例えば、ナノ粒子ラベルを含むサンプル流体に電界又は磁界を加える少なくとも一つの電界又は磁界発生手段と、
少なくとも一つの磁気センサ素子と、
前記ナノ粒子ラベルと前記他の物体の表面との間で特定結合を非特定結合と区別するために、前記ナノ粒子ラベルが前記表面に付着されている間、ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連したパラメータを検出する手段とを具えることを特徴とする
【００１１】
本発明の利点は、バイオセンサ表面のような他の物体の表面上の種々のタイプのラベル結合間又はビーズ、細胞、センサ表面、組織等の他の物体の表面上の種々のラベル結合集団間の区別を行えることである。
【００１２】
電界又は磁界発生手段は、回転磁界を発生することができる。他の例において、電界又は磁界発生手段は、一方向すなわち１次元磁界、例えば、パルス１方向磁界又は正弦変調磁界を発生することができる。この場合、運動の自由度を、流体、例えば、液体又は気体を通じて所定の方向の並進速度に関連させることができる。
【００１３】
電界又は磁界発生手段を、センサ装置に配置することができ、例えば、電流ワイヤ又は２次元ワイヤ構造とすることができる。磁気センサ素子を、ＡＭＲセンサ素子、ＧＭＲセンサ素子、ＴＭＲセンサ素子の一つとすることができる。
【００１４】
本発明の一例において、装置は、一つの磁気センサ素子のいずれかの側、すなわち、左右又は上下に配置された二つの電界又は磁界発生手段を具えることができる。
【００１５】
他の例において、センサ装置は、二つの電流ライン間に配置される。このようにして、磁気センサに対する磁気的なクロストークを最小にすることができる。電流ラインを、例えば、平行な電流シートとすることができる。本発明の本例による磁気センサの利点は、電流シートを流れる電流を部分的に又は完全に検知せずに磁性粒子の存在に起因する磁界のみ感知することである。この容量に磁界センサを配置することによって、センサが磁性粒子からの磁界を測定する間に電流が存在する場合のセンサのあり得る飽和を回避する。
【００１６】
本発明は、種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又はナノ粒子ラベルのクラスタを単一のナノ粒子ラベルから区別するセンサ装置であって、
偏光され又は偏光可能なナノ粒子ラベルを含むサンプル流体に電界又は磁界を加える少なくとも一つの電界又は磁界発生手段と、
少なくとも一つの磁気センサ素子と、
前記種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又は前記ナノ粒子ラベルのクラスタを前記単一のナノ粒子ラベルから区別するために、前記ナノ粒子ラベルが前記表面に付着されている間、ナノ粒子回転又は運動の自由度に関連したパラメータを検出する手段とを具えることを特徴とするセンサ装置も含む。
【００１７】
検出手段を、光学的、磁気的又は電気的にすることができる。方法及びセンサの利点は、物理的な分子ステップ又は例えば顕微鏡を通じた視覚的な観察に依存する必要なくビーズのような不所望なクラスタ又はナノ粒子を自動的に区別できることである。
【００１８】
本発明の他の態様において、少なくとも一つの偏光可能な又は偏光されたナノ粒子ラベルと他の物体の表面との間で特定結合を非特定結合と区別する方法を設ける。この方法は、
少なくとも一つのナノ粒子ラベルを設け、
電界又は磁界を加え、
前記少なくとも一つのナノ粒子ラベルが前記表面に付着されている間、ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータを検出して、前記ナノ粒子ラベルと前記表面との間で特定結合を非特定結合と区別することを特徴とする。
【００１９】
本発明の利点は、バイオセンサ表面のような他の物体の表面上の種々のタイプのラベル結合間又はビーズ、細胞、センサ表面、組織等の他の物体の表面上の種々のラベル結合集団間の区別を行えることである。
【００２０】
本発明の方法の他の利点は、特定結合を有する集団と非特定結合を有する集団との間及び／又は単一の特定結合を有する集団と複数の少ない特定結合を有する集団との間の区別を行うことである。
【００２１】
磁性ナノ粒子ラベルは強磁性ナノ粒子を具えることができる。磁気モーメントと磁性粒子物質との間に存在するトルクは、内部磁界を発生する磁性粒子の磁気異方性及び内部摩擦を生じる粒子の磁気の荒さに起因する。強磁性粒子は、熱エネルギーよりも大きな磁気異方性エネルギーを有し、したがって、ＫＶ＞ｋＢ．Ｔとなる。磁気異方性エネルギーは、加えられた磁界の磁気双極子エネルギーよりも大きく、すなわち、Ｋ．Ｖ＞ｍ．Ｂとなり、この場合、粒子の配向及びモーメントの配向が強固に結合される。
【００２２】
本発明の他の例において、強磁性ナノ粒子以外の磁性粒子、例えば、超磁性粒子のように関連のタイムスケール（例えば、磁界変調の周期）で粒子の配向と磁気モーメントの配向との間の角度が可変の粒子を用いることができる。
【００２３】
本発明によれば、加えられる電界又は磁界を、回転磁界とすることができる。ビーズの回転を、例えば、生化学アッセイの露出速度、すなわち、衝突及び粘着速度又は有効結合速度（ｋｏｎ）を最適化するのに用いることができる。ラベルを、他のボディ、例えば、バイオチップの表面又は細胞の表面に対して回転するとき、ラベルと他のボディとの間の相互作用を高めることができる。
【００２４】
他の例において、加えられる電界又は磁界を、パルス一方向磁界のような一方向すなわち一次元磁界とすることができる。この場合、運動の自由度を、液体や気体のような流体を通じた所定の方向の並進速度に関連させることができる。
【００２５】
本発明による、磁性ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータの検出を、好適には磁気的に行うことができる。光学的な検出を行うこともできるが、回転の光学的な検出は、磁気ナノ粒子内又はその付近に光学的なラベルを伴う必要があり、光学的なラベル又は光学的な励起がナノ粒子の磁気異方性軸に対して配向される。光学的な検出の場合、磁気力又は起電力によるラベルの機械的な励起は、表面に結合した生物の複合体(biological complex)中の光学的な素子からの信号を変調する。一例において、ラベルの回転は光信号を変化させる。その理由は、光学的な能動素子が偏光軸を有するからである。他の例において、光学素子の運動によって、光学的なエバネッセント場において変化率を有する内部結合(in-coupling)及び／又は光学的な外部結合(optical out-coupling)が生じる。更に別の例において、光学素子の運動によって、表面のように光学的に散乱する要素(optically perturbing element)、消失要素(quenching element)又はプラズマナノ粒子のような増強要素に対して種々の距離又は向きが生じる。光信号の変調の分析を、ＳＮＲを更に増大するのに用いることができる。その理由は、ラベルからの光学的な信号がラベルの動作に従って変調するからである。バックグランド信号を抑制することができる。その理由は、例えば、生物的な環境の自己発光がラベルの起動によって変調しないからである。光信号を化学発光又は電気化学発光によって発生することもでき、それに対して、光信号をラベルの起動によって変調することができる。検出を、例えば、酸化還元酵素を検出ラベルとして用いるときに電流又は電圧によって行うことができる。電気信号の変調をラベルの起動によって行うこともできる。さらに、光学的に活性の希土類錯体のような長寿命のラベルによる発光偏光(luminescence polarization)検出を用いることができる。カー回転や円二色性のような磁気光学効果を用いることもできる。さらに、磁性ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータの検出を、時間の関数としての信号緩和を測定することによって行う。
【００２６】
本発明による方法は、回転の自由度を増大するために内部回転の自由度を有する結合部を持つ磁性ナノ粒子ラベル、例えば、自由な炭素−炭素結合、オリゴ−アルカン鎖又はオリゴ−エチレングリコール鎖を有するリンカー分子を具えることもできる。リンカー分子の他の例は、”Polymer Chemistry”, by Hiemenz, P.C. Dekker, New York, 1984で見つけることができる。回転の自由度に起因して、タイプ１の結合状態の磁性粒子ラベルは自由に回転し、それに対して、タイプ３及び４のラベルの回転は強力に妨げられる。このようにして、特定結合と非特定結合との間の区別を向上することができる。
【００２７】
磁性粒子の回転動作又は回転の自由度は、局部粘性摩擦の強さ及び他の物体の表面に対する結合の存在に依存する。さらに、磁性粒子の回転動作又は回転の自由度は、結合の種類に依存する。本発明の方法を用いることによって、種々のターゲット分子及びターゲット分子を含む種々の錯体を同時に検出することができる。
【００２８】
本発明による方法を、生体分子診断、すなわち、生体内又は生体外の生体分子診断で用いることができる。
【００２９】
さらに、本発明による方法を、種々の特性、例えば、種々の磁気モーメント及び／又は回転摩擦特性を有する磁気粒子を区別するのに用いることができる。したがって、回転分光を、ビーズの多重化を行う、すなわち、種々の固有の特性を有するビーズすなわち磁性粒子を区別するのに用いることができる。
【００３０】
本発明による方法をバイオセンサのアレイ、いわゆるバイオチップ又は３次元解像度を有するイメージングに適用することができる。
【００３１】
本発明は、種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又はナノ粒子ラベルのクラスタを単一のナノ粒子ラベルから区別する方法であって、
ナノ粒子ラベルを設け、
電界又は磁界を加え、
ナノ粒子の回転又は運動の自由度に関連する物理的なパラメータを検出して、前記種々のタイプのナノ粒子ラベルを区別し又は前記ナノ粒子ラベルのクラスタを単一のナノ粒子ラベルから区別することを特徴とする方法も含む。検出手段を、光学的、磁気的又は電気的にすることができる。ナノ粒子の寸法を、１ｎｍ〜５μｍ、好適には５ｎｍ〜５００ｎｍとすることができる。
【００３２】
本発明のこれら及び他の特徴、形態及び利点を、本発明の原理を例示によって示す添付図面を参照しながら以下の詳細な説明から明らかにする。この説明は、例示のためにのみ与えられ、本発明の範囲を制限するものではない。以下で引用する参照図は添付図面を言及する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
図面中、同一参照番号は、同一又は同様の構成要素を表す。
本発明を、特定の実施の形態に対して所定の図面を参照して説明するが、本発明は、それに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。図示した図面は線形的なものであり、限定的なものではない。図面中、図示のために構成要素の一部の寸法を誇張しており、寸法通りではない。単数の名詞を参照する際に定義されていない又は定義された個数を用いる場合、特に言及しない場合には複数の個数を含む。
【００３４】
さらに、発明の詳細な説明及び特許請求の範囲の用語「第１」、「第２」、「第３」等は、同様な構成要素間の区別を行うために用いられ、順序又は時系列を表す必要はない。そのように用いられる用語は、適切な状況下で入れ替えることができ、ここで説明する本発明の実施の形態を、ここで説明し又は図示した順序以外の順序で実施することができる。
【００３５】
さらに、発明の詳細な説明及び特許請求の範囲の用語「上」、「下」等は、説明のために用いられ、相対的な位置を説明する必要はない。そのように用いられる用語は、適切な状況下で入れ替えることができ、ここで説明する本発明の実施の形態を、ここで説明し又は図示した向き以外の向きで実施することができる。
【００３６】
特許請求の範囲の用語「具える」は、以降に挙げる手段を限定するものと解釈すべきでなく、他の構成要素又はステップを除外するものではない。したがって、表現「手段Ａ及びＢを具える装置」の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるものではない。それは、本発明に対して装置の関連する構成要素がＡ及びＢのみであることを意味する。
【００３７】
本発明は、バイオセンサアレイのようなセンサ１０を提供し、この場合、ラベルは、例えば、導体（例えば、電流ワイヤ）を含む回転磁界発生手段又は電界発生手段とすることができる電界又は磁界発生手段によって発生する磁界によって影響が及ぼされるように配置され、センサ１０は、例えば、ＧＭＲ，ＴＭＲ又はＡＭＲセンサ素子とすることができる少なくとも一つの磁界センサ素子も具える。
【００３８】
本発明の一態様において、ラベルにトルクが発生するように電界又は磁界を加える。このようにして、ラベルは、磁界又は電界を用いることによって他のボディ（例えば、他のビーズ、チップ、細胞、組織）に対して回転するように配置される。ラベルは磁性材料を含む。ラベルは、例えば、磁気ビーズ、磁性粒子、磁気ロッド、一連の磁性粒子又は合成粒子、例えば、非磁性マトリックス内に磁気的又は光学的な活性材料又は磁性材料を含む粒子とすることができる。更なる説明において、ラベルを、ラベル、磁性ナノ粒子又はビーズ及びナノ粒子と称する。結合状態におけるナノ粒子の回転又は運動の自由度に関するパラメータは、センサ素子によって検出される。本発明による方法によって、高周波数の運動の自由度又は回転の自由度の測定が可能になる。結合の強さを、ラベルの他のオブジェクトからの離脱力を測定する方法によって見つけることができるとしても、そのような方法は、壊さない結合が特定の結合であるか他のタイプの結合であるかを決定する必要がない。本発明の方法は、結合ラベルの運動又は回転の自由度に関する他の情報を提供し、これによって、特定の結合を更に正確に確認することができる。したがって、本発明は、バイオセンサの信号対バックグランド比を向上し、従って、バイオセンサの特定を向上する。
【００３９】
本発明によるセンサ１０は、センサ１０において、他のビーズや、細胞や、センサ表面や、組織のような他の物体の表面に結合したナノ粒子又はラベルの検出と、センサ１０の周辺の３次元のｘｙｚ空間の磁性粒子又はラベル１１の結合の性質及び特性の決定とを組み合わる。回転自在のラベル１２と十分に固定されたラベル１３（図４）との間の区別を行うために、（ｘ軸、ｙ軸及び／又はｚ軸の周辺の）３次元回転ポテンシャルは、（後に説明するように）有用な方法である。
【００４０】
本発明の方法及び装置を、センサ表面に結合したラベル又はナノ粒子１１によって説明する。しかしながら、本発明はこれに限定されるものではない。既に説明したように、本発明の方法及び装置を、ラベル又はナノ粒子１１が組織や細胞のような他の物体の表面に結合するときにも適用することができる。さらに、本発明の方法を、生体内及び生体外の生体分子診断に適用することができる。
【００４１】
加えられる磁界を、粒子１１の磁気モーメントの配向を生じる程度に十分大きくする必要がある。要求される磁界は、粒子１１の寸法及びタイプ、例えば、超磁性、強磁性、球体又は非球体に依存する。例えば、１００ｎｍの径を有する超磁性粒子は、約１０−１６Ａ．ｍ２の飽和磁気モーメントｍを有することができ、それに対して、１μｍの径を有する超磁性粒子は、１０−１３Ａ．ｍ２の飽和磁気モーメントを有することができる。それに対して、１００ｎｍの径を有する高密度の磁性材料から構成された粒子は、１０−１５Ａ．ｍ２の飽和磁気モーメントを有することができる。
【００４２】
回転磁界を加えることによって磁気モーメントｍの磁性ナノ粒子又はビーズに加えられる磁気トルクτは、式２によって与えられる。[Reitz et al., ‘Foundations of electromagnetic theory’, chapter 8, Addison-Wesley, 3rd ed.(1979)参照]
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【００４３】
ビーズ又は磁性ナノ粒子の磁気モーメントのトルクは、ビーズ又は粒子のモーメントを、加えられた磁化に対して平行な向きに向ける。バイオセンサにおいて、加えられたトルクは、（ｉ）粒子それ自体に対する磁気モーメントの回転、（ii）粒子が存在する粘性環境に対する粒子の回転、及び（iii）バイオセンサの表面に結合する粒子からの力に起因するトルクによって逆にされる。
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【００４４】
液体中の小粒子１１に対して、慣性力を、一般に粘性力に対して無視することができる。これは、共振が減衰されるとともに粒子１１の質量が運動の式において重要でないことを意味する。例えば、トルクを加えた後に安定状態に到達する時間は、ρＲ２／３ηによってほぼ与えられ、この場合、ρを、粒子の密度とし、Ｒを粒子半径とし、ηを流体の粘性とする。密度１．５．１０３ｋｇ／ｍ３，Ｒ＝５０ｎｍ及びη＝１０−３Ｐａ．ｓの粒子に対して、約１ナノ秒の時間安定状態を達成することができ、これは、（後に説明するように）一般に粒子１１の回転周期より著しく短い。
【００４５】
本発明をガス液体(gaseous fluid)とともに用いる場合、粘性力に対して慣性力を無視するのは正確でなく、更に完璧なアッセイが必要となることがある。
【００４６】
磁界Ｂ及び粒子の磁気モーメントｍが同一平面、例えば、ｘｚ平面にあると仮定すると、磁界Ｂのベクトルは、基準軸、例えば、図３に示すようなｘ軸に対して角度φＢで整列してこの平面に配置され、ｍは、基準軸、例えば、図３に示すようなｘ軸に対して角度φｍで整列してこの平面に配置される。この場合、加えられるトルクは、
2007538252.tif 000006
となる。
【００４７】
磁気モーメントと磁性粒子材料との間に存在するトルクは、内部磁界を発生する磁性粒子の磁気異方性及び内部摩擦を発生する粒子の磁気的な荒れ(magnetic roughness)に起因する。簡単のために、磁性粒子が基準軸、例えば、ｘ軸に対して角度φｐを成す異方軸を有する１軸対称の楕円形状を有すると仮定する。
2007538252.tif 000007
この場合、Ｋを、磁気異方性（単位Ｊ／ｍ３）とし、Ｖを、粒子の磁気容量(magnetic volume)とし、γを、磁気的な摩擦係数とする。
【００４８】
粘性トルクは、環境の回転摩擦によって決定される。これが粘性ηの解によって支配される場合、粘性トルクは、
2007538252.tif 000008
にほぼ等しくなり、ｄを、粒子の流体力学的な径とする。バイオセンサの場合のような粒子に近接する表面の存在によって、式（６）から幾分逸脱することがある。ラベルの表面への結合に起因するトルクは、ラベル−表面結合の種類に応じて著しく変化する。
【００４９】
回転摩擦は、非常に小さい摩擦（例えば、後に説明するように回転可能なリンカーが存在するときに摩擦が溶媒中でなくなることができる図２のタイプ１）から非常に大きい摩擦又は完全に抑制された回転（例えば、図２のタイプ３ｂ）まで変化することができる。以下、１μｍの径で表面に強固に結合した（ほぼ共有結合(near-covalent bond)）比較的大きな粒子の結合エネルギーを見積もる。二つの材料が共有結合するとき、単位領域ごとの結合エネルギーは、１０−１８Ｊ／ｎｍ＝１Ｎ／ｍのオーダとなる。粒子１１が例えば０．１μｍ２の広い領域に亘って結合すると仮定した場合、結合エネルギーは、１Ｎ／ｍ×０．１μｍ２＝１０−１３Ｊとなる。加えることができる磁気トルクを計算することができる。例えば、１Ｔの磁界が、１０Ｔの磁界が１０−１３Ａ．ｍ２の磁気モーメントのμサイズの粒子に加えられると、加えられる磁気トルクが１０−１３Ｊに等しくなり、換言すれば、磁気回転によって、非常に強力な結合ラベルさえも動かすことができる。
【００５０】
本発明を主に磁界及び磁界発生器を参照して例示するとしても、本発明は、起電力による、例えば、電界発生器からの電界による回転及び配向粒子も含む。起電力に起因する粒子のトルクは、
2007538252.tif 000009
に等しくなる。この場合、ｐを、粒子の電気双極子モーメントとし、Ｅを、加えられた電界とする。磁気的な場合において、双極子モーメントを、永続的にも一時的にもすることができ、一様でない形状（例えば、ロッド状）の粒子、周辺の材料とは異なる電気的な分極率、用いられた材料の強誘電性、材料の（超）常誘電性等に起因することができる。
【００５１】
電気トルクが熱的な確率化(thermal randomization)に反して粒子を配向できるか否かを知るために、電気的なエネルギーを計算する。
2007538252.tif 000010
この場合、Φを、粒子の容量とし、εを、電気的な分極率とし、Ｅを、加えられる電界とする。例えば、１００ｎｍの径の粒子、１０−１１Ｆ／ｍのオーダの分極率及びＥ＝１０６〜１０８Ｖ／ｍの範囲の電界に対して、１０−２１〜１０−１７Ｊの静電エネルギーとなる。換言すれば、電気的な配向エネルギーは、室温の熱エネルギー（ｋＢＴ＝４．１０−２１Ｊ）より著しく大きいオーダとなる。
【００５２】
粒子を包囲する流体はしばしば、例えばイオン価、電気双極子、材料に導入された電気双極子等に起因して電気的に活性化する。この電気的な活性化は、加えられた電界から粒子を部分的に遮蔽することができる。さらに、加えられた電界によって、電気化学的な反応又は電気的な破壊が生じることがある。したがって、加えられた電界が時間変動する（ＡＣ）場合が好適である。
【００５３】
以下の説明において、本発明による方法を、種々の実施の形態によって説明する。しかしながら、本発明は、本発明の例示に過ぎない説明する実施の形態に限定されるものではない。
【００５４】
本発明の第１の実施の形態において、強磁性粒子１１を、生物的な流体材料、例えば、血液中の蛋白質や核酸のようなターゲット分子の検出の際にラベルとして用いられる。強磁性粒子１１に、図１を参照して既に説明した第１の補足分子を設けることができる。
【００５５】
強磁性粒子１１は、熱エネルギーに比べて大きな磁気異方性エネルギーを有し、したがって、Ｋ．Ｖ＞ｋＢ．Ｔとなる。磁気異方性エネルギーが、加えられた磁界の磁気双極子エネルギーより大きいとき、すなわち、Ｋ．Ｖ＞ｍ．Ｂのとき、粒子配向及びモーメント配向は強固に結合される。自由に回転できるとともに表面に対して強固でない又は部分的に結合した（τbinding＝０）強磁性粒子１１に対して、φｍ＝φｐであると仮定すると、運動の式は、
2007538252.tif 000011
となる（式（３）〜（６）参照）。
【００５６】
磁界が一定の大きさ及び変動する向きを有すると仮定すると、式（９）は、
2007538252.tif 000012
に簡単化される。
【００５７】
例えば、η＝１０−３Ｐａ．ｓ，ｄ＝１００ｎｍ及びｍ＝１０−１６Ａ．ｍ２である場合、α／Ｂは３１．８ＭＨｚ／Ｔに等しくなる。１０ｍＴの大きさの磁界が加えられると仮定すると、周波数αは、約３００ｋＨｚのオーダに到達する。熱振動は、粒子に影響を及ぼすとともに理論的な角度と実際の角度との間に約ｋＢＴ／ｍＢの誤差が生じることがある。この場合、ｋＢをボルツマン定数とし、Ｔを温度とする。Ｔ＝３００Ｋ，ｍ＝１０−１６Ａ．ｍ２及びＢ＝１０ｍＴにおいて、約０．２度の角度の誤差しか存在しない。
【００５８】
加えられる磁界が角周波数ωでｘｙ平面（図５参照）において回転すると仮定すると、磁性粒子１１は、
2007538252.tif 000013
に従って磁界と磁気モーメントとの間の種々の角遅延Δ＝φＢ−φｐの集団に分離する。
【００５９】
α＞ωの強磁性粒子１１は、一定の角遅延で磁界に従う。α＜ωの強磁性粒子１１は、磁界に従わず、最終的な向きが固定されない。
【００６０】
回転磁界を、例えば、（回転又は非回転）磁気材料及び／又は電流ワイヤ１４（図６及び７参照）のような導体とすることができる磁界発生手段によって強磁性粒子１１に加えることができる。本実施の形態において、回転磁界を、好適には電流ワイヤ１４ａ，ｂによって発生することができる。ナノ粒子回転の検出を、好適には磁気的に行う。光学的な検出を行うこともできるが、回転の光学的な検出は、光学的なラベルを磁気的なナノ粒子内又はその上に含むことを必要とし、光学的なラベル又は光学的な励起がナノ粒子１１の磁気的な異方性軸に対して配向される。光学的に活性の希土類錯体のような長寿命のラベルによるルミネッセンス偏光検出(luminescence polarization detection)を用いることができる。カー回転や円二色性のような磁気光学効果を検出の際に用いることもできる。
【００６１】
この第１の実施の形態において、磁気検出を、好適には集積磁気センサ１０を用いることによって行うことができる。ホールセンサや、磁気インピーダンスや、ＳＱＵＩＤや、他の任意の適切な磁気センサのような種々のタイプのセンサを用いることができる。図６及び７は、磁気センサ素子１５を具える集積磁性ナノ粒子センサ１０を示し、磁気センサ素子１５は、磁気抵抗素子、例えば、ＧＭＲ，ＴＭＲ又はＡＭＲセンサ素子を有する。回転磁界発生器が設けられる。これを、センサ１０の外側に配置し又はセンサ１０内に集積し、例えば、本実施の形態では磁気センサ素子１５の側にそれぞれ配置された電流ワイヤ１４ａ及びｂとすることができる二つの導体と、ワイヤ用の電流発生器とを有することができる。磁気センサ素子１５は、例えば、細長い（長くて狭い）ストリップの幾何学的配置を有する。回転磁界は、集積された電流ワイヤ１４ａ及びｂに流れる電流によって強磁性粒子又はラベル１１に加えられる。好適には、電流ワイヤ１４ａ及びｂを、強磁性粒子１１が存在する容量に磁界を発生するように配置することができる。図６に示すように電流Ｉｙ１及びＩｙ２を正のｙ方向で電流ワイヤ１４ａ，１４ｂにそれぞれ供給することによって、矢印１６によって示す結果的に得られた正のｘ方向の磁界を発生する。図７に示すように電流方向を反転することによって、結果的に得られる磁界は、図７に示すように矢印１７で示す負のｘ方向に反転する。磁界を発生した領域の容量が、ナノ粒子１１のラベルが存在する領域に良好に整合するとき、系は、最小のインダクタンスを有し、これは、高周波数かつ比較的大きい磁界の低電力動作に有用である。
【００６２】
図６及び７において、参照番号１８は、第１の電流ワイヤ１４ａによって発生した磁界を表す。第２の電流ワイヤ１４ｂによって発生した磁界を、参照番号１９によって表す。磁性ナノ粒子１１に影響を及ぼす全磁界は、集積電流ワイヤ１４ａ，１４ｂによってそれぞれ発生した磁界１８，１９と、あらゆる遠隔の磁界発生素子、例えば、コイル、磁石の磁界と、地磁気に起因する小磁界と、他の装置からの浮遊磁界との和となる。遠隔の磁界発生素子は、近接する磁界発生素子が不均一な磁界を発生する間に均一な磁界を発生することができる。
【００６３】
センサ装置１０は、ｘｙ平面に配置された場合に磁気センサ素子１５が所定の方向の磁界の成分、例えば、図６及び７において矢印２０で示すような磁界のｘ成分のみを検出するような検知方向を有することができる。換言すれば、ｘ方向はセンサ１５の検知方向である。したがって、導体１４ａ，１４ｂをそれぞれ流れる電流によって生じた磁界は、センサ１１の位置で主にｚ方向に向いているために磁性ナノ粒子１１が存在しないセンサ１５によってほとんど又は全く検出されない。
【００６４】
磁性粒子１１がセンサ１０の表面に存在する場合、磁性粒子１１はそれぞれ磁気モーメントｍを現す。磁気モーメントｍは、センサ１０の位置に面内磁界成分２１を有する双極子浮遊磁界を発生する（図６及び７）。
【００６５】
磁気センサ素子１５は、磁性粒子１１の磁気モーメントの配向によって生じた磁界を測定する。モーメントの配向は、粒子１１の物理的な配向に関連し、したがって、種々の回転動作又は種々の運動の自由度を有する粒子１１の集団を、磁気センサ１５によって区別することができる。
【００６６】
磁性粒子１１の回転動作又は運動の自由度は、局部粘性摩擦(local viscous friction)の強さ及びセンサ１０の表面、本実施の形態では他の物体の表面に対する結合の存在に依存する。さらに、磁性粒子１１の回転動作及び運動の自由度は、センサ表面又は他の物体の表面に生じる図２で一部を既に説明した結合の種類に依存する。したがって、種々の（生）化学環境を有する粒子の集団は、測定された回転スペクトルにおいて種々の形跡（例えば、Ｂ及びωの関数として測定した振幅及び位相）を有する。したがって、本発明の方法を用いることによって、種々のターゲット分子及びターゲット分子を含む種々の錯体を同時に検出することができる。
【００６７】
回転又は運動の自由度の磁気的な検出による結合識別及び集団識別方法は、好適には、物理的な回転と磁気的な回転との間又は物理的な運動の自由度と磁気的な自由度の運動の自由度との間に明確な関係を必要とする。これは、強磁性粒子１１に対して、好適には加えられた磁界が関心のある周波数範囲の粒子の抗電界より小さくすべきである。
【００６８】
さらに、回転励起を、互いに相違する回転軸に沿って加えることができる。測定されたスペクトルを、例えば、磁性ナノ粒子環境の異方性を決定するために比較することができる。例えば、ｚ軸の回り及びｘ軸の回りの回転の測定は、タイプ１及びタイプ３ａの集団を区別することができる。また、回転異方性は、粒子１１と表面との間の距離を明らかにすることができる。
【００６９】
上記実施の形態で説明したセンサ１０は、本発明を限定するものではない。他のセンサ形態も本発明とともに用いることができる。例えば、センサ１０は、２を超える磁界発生器１４ａ及びｂを具えることができ、１を超える磁気センサ素子１５を具えることができる。
【００７０】
第２の実施の形態において、第１の実施の形態の原理を、磁界発生手段として図８に示すような２次元ワイヤ構造を具えるセンサ１０に拡張する。２次元ワイヤ構造は、ｙ方向の電流ワイヤ１４ａ，ｂ及びｘ方向の電流ワイヤ２２ａ，ｂを具えることができ、更なる説明において、ｙワイヤ１４ａ，ｂ及びｘワイヤ２２ａ，ｂとそれぞれ称する。ｘワイヤ２２ａ，ｂ及びｙワイヤ１４ａ，ｂにおいて矢印２３ａ−ｄによって示した電流の方向に応じて、矢印２４ａ−ｄによって示される正味の磁界は、ｘｙ平面で回転し、これによって、磁性粒子又はビーズ１１を取り出す。このようにして、いわゆる４極「ビーズ」モータ(four-pole ‘bead’ motor)となる。しかしながら、この方法は、回転に限定されるものではない。粒子又はビーズ１１が回転できないとき、これらを所定の方向に曲げ又は引き出し、その後に検出することもできる。このようにして、結合特性を、結合の強固さを測定することによって測定することができる。これを、電流ワイヤ１４ａ，ｂ及び２２ａ，ｂによって誘導された磁気力に応答した所定の方向への動きを測定することによって行うことができる。簡単な例として、単一のオンチップ電流ワイヤの周辺に生じた磁界勾配は、
2007538252.tif 000014
に等しくなる。この場合、Ｉを、電流ワイヤ１４ａ，ｂを流れる電流とし、ｒを、電流ワイヤ１４ａ，ｂからの距離とする。例えば、５μｍの距離における１０ｍＡの電流は、８０Ｔ／ｍの磁界勾配を発生する。１ｍＰａ．ｓの粘性を有する環境において１００ｎｍの距離及び１０−１３Ａ．ｍ２の磁気モーメントを有するビーズ１１を仮定する。この場合、磁界勾配に起因する並進速度は、０．８ｍｍ／ｓに等しくなる。振動周期が１００μｓであるとき、ビーズの長手方向の偏移は約８０ｎｍであり、これを検出することができる。
【００７１】
さらに、回転粒子１１の存在は、その存在の情報を与え、したがって、粒子１１の検出も行うことができる。この第２の実施の形態による方法は、磁性粒子又はラベル１１の検出及び回転／移動の十分な３次元空間分解能を提供する。
【００７２】
本発明によるセンサ１０において、２次元ワイヤ構造は、種々の形態を有するとともに種々の方法で適用されることができる。これを図９〜１２に示す。図９において、ｘ電流ワイヤ２２ａ−ｄ及びｙ電流ワイヤ１４ａ，ｂを互いに分離し、互いに相違する二つの金属層から形成することができる。磁気センサ素子を、ｙ電流ワイヤ１４ａ，ｂ間に配置することができる。適切なｘ電流ワイヤを選択することによって、特定のｙ位置におけるナノ粒子１１を回転することができる。図９に示した形態は、単一の磁気センサ素子１５を用いた局所的な検出及び磁性粒子１１の回転を提供する。
【００７３】
他のあり得る形態を図１０及び１１に示す。この形態において、ｘ電流ワイヤ２２ａ−ｄ及びｙ電流ワイヤ１４ａ−ｄの両方を同一金属層から形成する。各磁気センサ素子１５ａ−ｄを、二つのｙ電流ワイヤ１４ａ−ｄ間に配置することができる。ｘ電流ワイヤ２２ａ−ｄ及びｙ電流ワイヤ１４ａ−ｄを流れる電流を個別に制御することができる。
【００７４】
図１２において、局所的なビーズ回転を行うことができる更に別の形態を示す。この形態において、２次元ワイヤ構造は、同一金属層から形成され、磁気センサ素子１５の上に配置される。しかしながら、他の形態において、２次元ワイヤ構造を、磁気センサ１５の下に配置することもできる。いずれの場合も、２次元ワイヤ構造及び磁気センサ素子１５を互いに分離する必要がある。
【００７５】
第２の実施の形態は、局所的なビーズ回転／移動を達成できるという利点を有する。局所的なビーズ回転／移動は、表面及び容積の結合特性に３次元空間分解能を提供する。また、局所的な励起を行うことによって、磁性ナノ粒子１１の３次元検出が行われる。さらに、第２の実施の形態は、局所的な励起に起因する低電力消費の利点も有する。
【００７６】
本発明による他の実施の形態において、本実施の形態では磁気センサ１０の上下の電流シート２５とすることができる電流ラインを設けることによって磁気センサ１０に対する磁気的なクロストークを最小にすることができ、これによって、図１３において矢印２６によって示すようにセンサ１０が配置された磁界のない容量を形成することができる。これを通じて、センサ１０を飽和することなく強電流の高トルクを磁性粒子１１に加えるのと同時に磁性粒子１１の磁界を測定することができるようになる。結果的に得られる磁界は、距離がシート２５のサイズに比べて小さい（図１３）という制約の下では電流シート２５までの距離に依存しない。Ｊを電流密度とする場合、磁界は、Ｂ＝μ０．Ｊ／２によって与えられる。図１３の場合のように二重の電流シートを用いる場合、電界のない容量２６はシート２５間に存在し、平行な電流シート２５の間に同一電流を流すので、磁界が存在しない。本発明の本実施の形態による磁気センサ１０が電流シート２５を流れる電流を全く検知せず、磁性粒子１１の存在に起因する磁界のみを感知するという利点がある。したがって、磁界センサ１０をこの容量に配置することによって、センサ１０が磁性粒子１１からの磁界を測定する間に電流が存在する場合にセンサ１０のあり得る飽和を回避する。
【００７７】
電流シート２５を、ｘ及びｙ方向の時間変動する電流を同時に供給することによってｘｙ平面の磁性粒子１１を回転するのに用いることができる。これを、図１３で与えた例に対して図１４に示す。Ｉｘ＝Ｊ０．ｙ．ｃｏｓωｔ及びＩｙ＝Ｊ０．ｘ．ｓｉｎωｔの場合に、一定の振幅の回転磁界が得られる
【００７８】
Ｊ０＝２Ｂ／μ０によって、所望の電流密度となる。シートの各々で均一な電流を維持するために、例えばｘ方向に流れる電流がｙ方向に電流を流すリードに広がるのを抑制する必要がある。これを、電流リードの各々にいわゆる電流コム(current comb)を供給することによって良好に行うことができる。電流コム２７を、電流の均一な流れしたがってセンサエリア２８全体に亘る磁界の均一な分布を保証するために用いられる。電流コム２７は、磁気センサ１０のエリアに並列であるが外側を流れる電流を減少する１組の並列抵抗として有効に動作する。
【００７９】
一連の例えば並列のワイヤに対する電流シート２５の利点は、非常に高いパッケージ密度であるとしても、電流がセンサエリア２８内で任意の方向に流れることができ、したがって、センサエリア２８内で磁界の回転を行えるようにするために、余分な層となる交差ワイヤを必要としないことである。また、個別の電流ワイヤは、磁界内が不均一となり、粒子１１とセンサ１０の両方に悪影響を及ぼしうる。電流シート２５を用いることによって、センサエリア２８の全体を均一にすることができる。
【００８０】
更に別の実施の形態において、(specific binding)特定結合の粒子１１（例えば、図２のタイプ１）と(less specific binding)非特定結合の粒子１１（例えば、図２のタイプ３ｂ）との間の回転又は運動の自由度の差、したがって、センサの特性を、回転の自由度を操作することによって向上することができる。これを、例えば、単一の特定結合に含まれるときに回転が自由である磁性粒子ラベル１１を用いるとともにラベルの回転の自由度を測定することによって行うことができる。
【００８１】
ラベル１１が所望の結合状態、例えば、図２のタイプ１にあるときにラベル１１に対する回転の自由度を操作する種々の方法がある。ある方法は、回転の自由度を有する表面上に補足分子を設けることによるものである。他の方法は、回転の自由度を有するナノ粒子１１上に補足分子を設けることによるものである。補足分子それ自体は、（例えば、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡストランドの場合において）回転の自由度を有し、又は専用のリンカーを用いることができる。回転の自由度を向上するために、回転の自由度を有するリンカー部、例えば、自由な炭素−炭素結合を有する結合子分子、オリゴ−アルカン鎖又はオリゴ−エチレングリコール鎖を用いることができる。リンカー分子の例を、”Polymer Chemistry”, by Hiemenz, P.C. Dekker, New York, 1984から見つけることができる。回転の自由度のために、タイプ１の結合飽和の磁性粒子ラベル１１は自由に回転し、それに対して、タイプ３及び４の結合のラベルの回転は強力に妨げられる。
【００８２】
ラベル１１の熱的な回転による緩和速度を、回転による拡散係数Ｄｒ（単位ｓ−１）から見積もることができる。
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この場合、ηを、粒子１１の付近の流体の有効粘性とし、Ｒを、粒子半径とする。例えば水の場合（η＝１ｍＰａ．ｓ）、回転による拡散係数は、種々の値のＲに対して表１に要約される。
2007538252.tif 000016
【００８３】
熱的な回転による緩和速度の測定を、種々のサイズのラベル１１間の区別を行うのに用いることができる。また、熱的な回転の緩和速度の測定は、種々のタイプの結合間の区別を行う方法でもある。結合プロセス及び結合解放プロセスがセンサ１０の表面で行われる間、互いに相違するタイプの結合間の区別を行うために磁性ナノ粒子ラベル１１の回転の自由度が測定される。その方法の一つは、図１５のグラフに示すように時間の関数として信号の緩和を測定することによるものである。光学的、電気的又は磁気的な励起パルスを印加することができ、信号を時間の関数として記録することができる。タイムスケールを、例えば、１ｎｓから１ｓまでの範囲とすることができる。次に、緩和時間の分布を導き出し（図１６参照）、これは、表面に対する種々のタイプの結合を表す。例えば、タイプ１の回転の自由度が高いために、タイプ１の結合は、タイプ３又はタイプ４の結合よりも短い緩和時間を有する。分布の幅を、ラベル１１の多分散性のような磁性ナノ粒子ラベル１１の特性によって決定される。
【００８４】
結合タイプの他の分離を、例えばタイプ１とタイプ３ａとの間の区別を行うために励起パルスを種々の方向に印加することによって確立することができる。
【００８５】
タイプ１の結合が所定の遅延によってタイプ４の結合に進むことができる。運動の緩和スペクトルを規則的に記録する必要がある場合、タイプ１の結合の総数を導くことができる。
【００８６】
回転の緩和を、種々の方法で、例えば、磁気的又は光学的に測定することができる。第１に、ラベルが、永続的又は導出可能な磁気モーメントを有するとき、回転の緩和を、磁界パルスを印加することによって測定することができる。ラベルは、好適には、長いニール緩和時間(Neel relaxation time)、すなわち、タイプ１の特定の結合の回転の緩和時間より長いニール緩和時間を有する。磁気ラベル１１の緩和信号を、例えば、磁気抵抗センサ２０、磁気誘導コイル又は超伝導磁束量子干渉計（ＳＱＵＩＤＳ）によって測定することができる[例えば、Chemla et al., PNA 97, 14268(2000)]。
【００８７】
第２に、ルミネッセンス偏光（例えば、蛍光又は燐光）を、ラベル回転の測定に用いることができる。粒子１１は磁気的であり、光学的な活性は、磁気的な配向軸に結合される。例えば、光学的なラベルを磁気的なナノ粒子１１内又はその上に含めることができ、光学的なラベルがナノ粒子１１の磁気異方性軸に対して配向されている。光学的に活性の希土類錯体のような長寿命のラベルによって、ルミネッセンス偏光検出を用いることができる。カー回転や円二色性のような磁気光学効果を検出の際に用いることもできる。互いに相違する二つの偏光軸による光学的な検出を用いることもでき、例えば、粒子１１を、一方の偏光軸で照明することができ、検出を他方の偏光軸で行うことができる。ルミネッセンス寿命（蛍光、燐光）がラベルの回転時間に匹敵し又はそれより大きくなる必要がある。ルミネッセンス偏光において、偏光によりラベルから発生したルミネッセンススペクトルは、ラベルの結合状態、特に、その回転の自由度に依存する。
【００８８】
本発明の第３の実施の形態において、回転の自由度は、強磁性粒子１１に加えられる１次元（１方向）磁界を用いて測定される。運動の自由度は、流体、例えば、液体又は気体を通じた所定の方向の並進速度に関連することができる。時間ｔにおいて、全ての粒子１１の磁気モーメントがφ＝０となり、磁界Ｂが角度θで加えられると仮定すると、粒子１１は、
2007538252.tif 000017
に従って回転する。
【００８９】
粒子は、種々のφｐ（ｔ）の集団に分離し、その結果、角度φの種々の到達時間を有し、互いに相違する角スペース(angular spacing)を有する。
【００９０】
好適には、周期的な信号、例えば、パルス列Ｂｘ＋，Ｂｘ−，Ｂｘ＋などを印加する。磁性粒子１１は、種々の速度及び種々の発振周波数の集団に分離する。低周波数発振からロー信号を取得するために、例えば、センサストリップの長手方向の軸線に沿って全ての磁気モーメントを予め整列するのが有利である。このために、集積電流ワイヤ又は外部（電）磁石によって、予め整列した磁界を加えることができる。
【００９１】
ｘ軸に沿った正弦磁界Ｂｘ＝Ｂ０ｓｉｎ（ωｔ）が加えられるとき、運動の式は、
2007538252.tif 000018
となる。集団は、磁気モーメント、流体力学的な径(hydrodynamic diameter)及び（例えば、粘性摩擦及び局所的な生化学結合に起因する）局所的な摩擦特性の関数としての種々の角度対時間依存性を取得する。
【００９２】
他の実施の形態において、応力をかけて生化学結合を行うとともに不所望な結合を破壊するために磁気トルクを用いることができる。非常に強力な結合の磁性粒子１１及び十分な回転の自由度を有する粒子１１のみが移動されない。
【００９３】
静的な状態において、加えられたトルクに対抗するのに必要な力は、力が作用する位置に依存する。径ｄを有する粒子に対して、磁気トルク（ｍ．Ｂ）に対抗するのに必要な最小の力は、
2007538252.tif 000019
によって与えられる。
【００９４】
ｍ＝１０−１６Ａ．ｍ２，Ｂ＝１０ｍＴ及びｄ＝１００ｎｍの特定例において、２０ｐＮ（ピコニュートン）の最小の力が要求される。この力は、非特定結合を破壊するのに十分大きい。このようにして、ｐＮの力を、小さいビーズ及び小さい磁界を用いることによって加えることができる。並進ピンセット(translational tweezer)において、ｐＮの力を得るために更に大きな磁界及び更に大きなビーズが要求される。
【００９５】
１方向の回転応力を加えることによって、すなわち、同一方向で回転を行うことによって、結合の回転の自由度を更に検査することができる。時間対結合破壊(time-to-bond-breaking)は、結合の強さの測定を与える。
【００９６】
例えばケミカルウォッシュステップから構成することができる従来の厳格な手順に対して、本発明による磁気的な方法の重要な利点は、それを結合プロセス中に実行できることであり、その結果、特定の信号を検査中に動的にモニタすることができる。これは、検査速度を向上するとともに、結果の信頼性を増大する。
【００９７】
加えられたトルクは、一回の、断続的な又は連続的な強制力(stringency)として作用する。それは、応力が課される（生）化学的な相互作用の有効分解速度（ｋｏｆｆ）を増大する物理的な方法として知られている。
【００９８】
それに対して、ラベル１１の回転を、生化学アッセイの露出速度、すなわち、衝突−停止速度(hit-and-stick rate)又は有効結合速度（ｋｏｎ）を最適化するのに用いることができる。これを二つの方法で適用することができる。第１に、ラベル１１が溶液中に存在するとき、これらラベル１１の回転は、溶液中の生化学物質とラベル１１との間の相互作用及び結合速度を増大する。これを、例えば、アッセイ中のフィッシングステップに適用し、この場合、ラベル１１は、サンプル溶液中の特定の生化学物質に結合し及び／又はこの物質を抽出するのに用いられる。第２に、ラベルを、他のボディ、例えば、バイオチップの表面又は細胞の表面に対して回転するとき、ラベルと他のボディとの間の相互作用及び結合速度を増大することができる。結合速度の増大は、ラベルの表面領域がラベル上の関連の分子結合領域（例えば、パラトープ、エピトープ又はハイブリダイゼーション整合領域）のサイズに比べて大きいときに特に重要である。これは、例えば、低濃度アッセイにおいてフィッシングステップが表面上に関心のある生化学物質がほとんどないラベルを生じる場合である。参照のために、生体分子動力学の配向及び回転の役割の一部の計算を、K.S. Schmitz and J.M. Schurr, ‘The role of orientation constraints and rotation diffusion in biomolecular solution kinetics’, J.Phys.Chem. vol. 76, p.534(1972)で見つけることができる。
【００９９】
理想的な回転速度は、所定のアッセイ時間で形成する必要がある生化学結合の許容できる結合解放速度(unbinding rate)（ｋｏｆｆ）における最適な結合速度（ｋｏｎ）によって与えられる。換言すれば、回転は、感度及び特性に対して最適化される。
【０１００】
本発明の他の実施の形態において、上記回転測定を、種々の特性、例えば、種々の磁気モーメント及び／又は回転摩擦特性を有する磁性ナノ粒子１１を区別するのに用いることができる。磁化寿命、磁化異方性又は磁化摩擦の差を用いることもできる。したがって、ビーズの多重化を行う、すなわち、種々の固有の特性を有するビーズを区別するために、回転分光を用いることができる。これを、ラベルを多重化したアッセイ、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーションに用いることができる。これを、非特定吸収に起因する信号を減少して信号対バックグランド比を更に増大するのに用いることができる。種々のサイズ又は種々の磁化を有する粒子又は粒子クラスタを区別することもできる。一例は、厳格な目的に対する種々の粒子の使用である。溶液中及び／又は表面上の粒子クラスタ又は粒子チェーンを検出するために回転測定を用いることもできる。これは、クラスタアッセイ又は凝固アッセイに有用となりうる。また、粒子の一部が、制御されない不所望な凝固又はチェーン形態を示す場合、本発明による方法を、凝固した粒子に起因する信号から単一粒子１１の信号を区別するのに用いることができ、これによって、生化学検査の定量化及び信頼性を増大する。
【０１０１】
これまで強磁性粒子を説明したが、他の磁性粒子１１、例えば、超磁性粒子のような粒子１１の向きと関連のタイムスケール（例えば、磁界変調の周期）上の磁気モーメントの向きとの間に可変の角度を有する粒子１１を用いることができる。本発明の他の実施の形態において、回転磁界又はパルス一方向磁界を超磁性粒子に加えることができる。超磁性粒子は、零の抗電界及び低い磁気異方性Ｋを有し、したがって、φｍ≠φｐとなる。粒子は、加えられた磁界においてのみ正味の磁気モーメントを取得する。この場合、式（３）に適用されるトルクは、τmagnとτviscousとの間で割り当てられる。これを２スリップ系（two-slip system）として観察することができる。その理由は、粒子に対する磁化スリップ及び環境に対する粒子スリップが存在するからである。したがって、角遅延φＢ−φｍは、粘性摩擦の強さ及び表面に対する結合の存在に依存する。磁化の回転周波数は、一般に、スリッピングドライブで起こるように粒子それ自体の回転周波数に等しくない。周波数スペクトルの測定は、種々の磁気特性及び種々の結合状態を有する粒子１１を区別することができる。一例を図１７に示す。図面中、種々の粒子１１並びに種々の環境及び種々の結合状態の粒子１１の大きい又は小さい集団に起因しうる種々の形態を区別することができる。例えば、ピーク１は、例えば、他の物体に結合されずに急速に移動又は回転することができる非クラスタ化粒子に対応する。ピーク２は、例えば、図２のタイプ１の結合を通じて緩やかに他の物体に結合した粒子１１によって発生する。他のピーク（例えば、ピーク３）は、他のビーズにクラスタ化した粒子１１によって発生する。ピーク４を、例えば図２のタイプ２に対応する他のタイプの環境の粒子１１によって発生する。形態５は、非常に強く妨害された運動の自由度の粒子１１、例えば、複数の相互作用を通じて表面に結合した粒子１１によって発生する。したがって、周波数スペクトルのピークの位置は、ビーズ１１と他の物体の表面との間の結合のタイプに依存する。図１７のスペクトルは、説明のためのみのものであり、本発明を制限するものではない。
【０１０２】
本発明の種々の実施の形態による方法は、バイオセンサ中の種々のビーズ集団を区別するために磁性ナノ粒子又はビーズの回転又は運動の自由度を用いる。本発明の方法を適用することによって、バイオセンサ表面上の種々のラベル結合集団間の区別を行い、単一の特定結合を有する集団と複数の非特定結合を有する集団との間の識別を行うことができる。本発明の方法を適用することによって、信号対バックグランド比及びバイオセンサの検出範囲を向上する。
【０１０３】
本発明の方法を、種々の装置アーキテクチャに適用することもできる。装置を、例えば、単一のセンサ、バイオセンサのアレイ又はいわゆるバイオチップとすることができる。方法を、使い捨て装置に適用することもできる。例えば、装置を、流体チャネル、容器、試薬等を含むカートリッジ又は実験装置(lab-in-a-device)とすることができる。方法を、使い捨てピペットキャップ内又はアフィニティカラム内で用いることもできる。方法を、単一のウェル又は複数のウェル、例えば、ウェルプレート又はマイクロプレートで用いることもできる。
【０１０４】
本発明による方法の利点は、結合プロセス又は結合解放プロセスが表面上で生じる間に、種々のタイプの結合を区別するようラベルの運動の自由度を測定することである。
【０１０５】
本明細書中で説明した方法を、分子アッセイ及び微生物群、細胞、細胞片、組織抽出物等の検出にも用いることができる。
【０１０６】
回転力に加えて、磁界勾配を適用することもできる。これらは、例えば、生化学結合を伸ばすために並進力を発生する。
【０１０７】
上記ラベル回転法を利用することができる複数のアッセイがある。一つは、ラベル１１が結合し又は結合を解放して回転特性を変更するアッセイであり、この場合、結合又は非結合は、サンプル中の特定の生体物質の存在に依存する。例示は、結合アッセイ、比較アッセイ、抑制アッセイ、置換アッセイ等である。
【０１０８】
他のタイプのアッセイは、磁性ピンセットと同様に作用し、この場合、磁性粒子１１は、生物リンカーによって他のボディ（例えば、固体表面）に結合される。一例として、リンカーを、磁気的に加えられた伸縮力によって機械的に応力が課され又は溶媒からの酵素（例えば、制限酵素又はＤＮＡ修復酵素）と相互作用する核酸分子とすることができる。従来の磁性ピンセット器具において、磁性粒子１１のｘｙｚ位置及び運動は、生物リンカーの状態及びそれがどのようにして周辺と相互作用するかを表す。本発明の方法によって、一つ以上の磁性粒子１１のｘｙｚ位置及び回転をオンチップ磁気センサによって検出する磁性ピンセットを形成することができる。アッセイ中、並進及び回転磁気力を３次元で加えることができる。これを、一つ以上の磁性粒子１１を磁気センサ１０に結合する生体部(biological moiety)との相互作用によって溶媒からの物質を分析するアッセイに対してコンパクトかつ万能の器具で行うことができる。ｚ力ピンセットに対する回転ピンセットの利点は、更に小さいビーズを用いることができるとともに更に高い周波数特性を測定できることである。
【０１０９】
粒子回転を用いることができるアッセイの他の分類は、最初に粒子の回転が妨げられるとともに他の物質の介在によって回転の自由度を増大するアッセイである。例えば、分子ビーコン（相補的核酸ストランドにハイブリダイズするときに開くヘアピン核酸）に接続した粒子１１は、ビーコンの閉状態で回転を妨げるとともにビーコンの開状態で回転の自由度を増大することができる。また、プローブ分子は、ターゲット分子の結合の際に形状を変化することができ、これによって、付着した又は隣接する磁性粒子の回転の自由度を変更することができる。また、酵素は、リンカー分子の一部を切り取ることができ、これによって、粒子の回転の自由度を増大する。
【０１１０】
アッセイの他の分類において、粒子１１の回転の自由度は、分子種との相互作用によって減少する。例えば、単一ストランドＤＮＡによってボディにリンクした粒子は、リンカーが相補ストランドのハイブリダイゼーションによって二重ストランドＤＮＡになるときに回転の自由度の一部を緩める。これは、二重ストランドＤＮＡの機械的な強固さに起因する。また、ターゲット分子の結合に起因して、分子は、周辺の更に大きなボディ（例えば、表面）までの距離を変更することができ、これによって、摩擦及び回転の自由度を変更する。
【０１１１】
アッセイの他の分類において、回転は生物的な動作によって行われ、酵素及び酵素基板によって分子又は細胞種を回転する。回転酵素の一例を、例えば、ヘリケースとする。粒子１１の回転を、磁気的に検査し及び検出することができる。
【０１１２】
アッセイの他の分類を利用する。磁性粒子１１は、細胞表面に結合し又は細胞内に入り込み、これによって、回転特性を変更する。又は、既に存在する粒子１１は、他の生物分子との相互作用に起因して回転特性を変更する。細胞をセンサ表面に取り付け、又は細胞が溶液中に存在することができる。
【０１１３】
上記方法を生体外診断及び生体内診断、例えば、細胞、組織、有機体及び生体の診断に適用することができる。例えば分子イメージングの形態で生体内診断に適用する場合、例えば、分子回転のための外部磁界及び回転を検出する光学系を用いることによって、又は、時間的に分離した起動及び検出（例えば、フィールド切替(switched-field)磁気共鳴）を用いることによって、磁気的な起動と磁気的な検出との間の干渉を回避するよう注意する必要がある。
【０１１４】
本発明による装置に対して、ここでは好適な実施の形態、特定の構造及び形態、並びに物質を説明したが、種々の変更又は変形を、本発明の範囲を逸脱することなく行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】ターゲット及びラベルを含む溶液中で第１の補足分子が結合されたバイオセンサ表面を示し、ラベルに第２の補足分子が結合されていることを示す。
【図２】ラベルをバイオセンサ表面に結合できる種々の方法を示す。
【図３】表面に組み込まれたターゲット、例えば、細胞膜上の受容体分子又は組織表面上のターゲット分子にラベルが結合できる方法を示す。
【図４】センサ表面上で回転自在かつ十分に固定されたナノ粒子間の差を示す。
【図５】磁界Ｂ及び粒子の磁気モーメントｍのベクトル表示を示す。
【図６】本発明の一実施の形態による磁界発生電流ワイヤ及び磁気抵抗検出器ストリップに近接する磁性粒子を示す。
【図７】本発明の一実施の形態による磁界発生電流ワイヤ及び磁気抵抗検出器ストリップに近接する磁性粒子を示す。
【図８】本発明の実施の形態によるセンサの磁界発生手段として適用することができる２次元ワイヤ構造を示す。
【図９】本発明の実施の形態による２次元ワイヤ構造を用いたあり得るセンサ形態を示す。
【図１０】本発明の実施の形態による２次元ワイヤ構造を用いたあり得るセンサ形態を示す。
【図１１】本発明の実施の形態による２次元ワイヤ構造を用いたあり得るセンサ形態を示す。
【図１２】本発明の実施の形態による２次元ワイヤ構造を用いたあり得るセンサ形態を示す。
【図１３】本発明の実施の形態によるセンサ形態の断面図を示す。
【図１４】図１２のセンサ形態の上面を示す。
【図１５】時間の関数としての信号緩和の概略図を示す。
【図１６】互いに相違する２タイプの結合の緩和時間分布の概略図を示す。
【図１７】周波数スペクトルを図示した例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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