(57)【要約】  本発明は、配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質；又は血管新生阻害活性を示すことで規定される前記タンパク質のフラグメント；又は血管新生阻害活性を示すことで規定される配列番号２の配列由来、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列；又は血管新生阻害活性を示すことで規定される配列番号２の配列、又は前記で定義されたフラグメントに相同的な任意の配列；を含むか又は構成されることを特徴とする、内皮増殖の阻害を必要とする病態、又は内皮の活性化の阻害を必要とする病態の治療用薬剤の製造のための、タンパク質の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮の増殖を阻害することを必要とする病態［特には、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、血管腫、血管肉腫の枠内の病態、特には、キャッスルマン病及びカポジ肉腫］；又は
内皮の活性化を阻害することを必要とする病態［特には同種移植拒絶及び異種移植拒絶、肢端チアノーゼ、強皮症の枠内の病態、又は回収と移植の間の移植片調整の枠内の病態］
の治療用薬剤の製造のための使用であって、
（Ａ）配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質、又は
前記タンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、タンパク質の使用、
（Ｂ）前記定義されたＮＯＶタンパク質、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質のフラグメント、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質由来の配列、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質の相同配列、
をコードするヌクレオチド配列であって、
前記ヌクレオチド配列が、特には、配列番号２をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号６をコードする配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、ヌクレオチド配列の使用、
（Ｃ）ＮＯＶタンパク質の抗イディオタイプ抗体の使用、
である治療用薬剤の製造のための使用。
【請求項２】
内皮の増殖を阻害することを必要とする病態［特には、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、血管腫、血管肉腫の枠内の病態、特には、キャッスルマン病及びカポジ肉腫］；又は
内皮の活性化を阻害することを必要とする病態［特には同種移植拒絶及び異種移植拒絶、肢端チアノーゼ、強皮症の枠内の病態、又は回収と移植の間の移植片調整の枠内の病態］
の治療用薬剤の製造のための使用であって、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質、又は
前記タンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の使用。
【請求項３】
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質を含むか、又は構成されることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質の使用。
【請求項４】
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、請求項２に記載のタンパク質の使用。
【請求項５】
癌の治療用薬剤の製造のための使用であって、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、癌の治療用薬剤の製造のためのタンパク質の使用。
【請求項６】
医薬用組成物であって、
（Ａ）配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とするタンパク質、
（Ｂ）前記定義されたＮＯＶタンパク質、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質のフラグメント、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質由来の配列、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質の相同配列、
をコードするヌクレオチド配列であって、
前記ヌクレオチド配列が、特には、配列番号２をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号６をコードする配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、ヌクレオチド配列、
（Ｃ）ＮＯＶタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
を医学的に許容可能なベクターと組み合わせ、有効成分として含むことを特徴とする、医薬用組成物。
【請求項７】
医薬用組成物であって、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とするタンパク質、
を医学的に許容可能なベクターと組み合わせ、有効成分として含むことを特徴とする、請求項６に記載の医薬用組成物。
【請求項８】
配列番号８の配列を有効成分として含むことを特徴とする、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の割合で投与される組成物の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の対象は、新規の抗血管新生剤、及びその使用、特には癌の治療における使用である。
【０００２】
血管新生は、既存の血管からの新しい毛細血管の成長工程である。特に、３つの特異な現象である内皮細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）(管形成：ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）がこの工程の中心を形成する。血管新生は、血管新生因子として知られる特定の成長因子、例えば、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  １）、又はＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ２）によって活性化される。
【０００３】
通常、血管新生は、本質的に女性生殖器系及び損傷の瘢痕形成に限定されている。しかしながら、血管新生はまた、多くの病態の症状、例えば、糖尿病性網膜症、乾癬、関節リウマチ、加齢性黄斑変性、及び癌に関連している。事実、後者において、特に腫瘍からの血管新生因子の分泌の結果、腫瘍内部に新しい血管新生が発生し、腫瘍状の成長が顕著に促進されることが示されてきている。
【０００４】
抗血管新生タンパク質の使用を基礎として、治療方法に関する多くの試みが進行している。これらの化合物のうち、最も期待されているものの１つがエンドスタチン（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）であり、現在フェーズIの臨床治験が行われている（Ｈｅｒｂｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのフラグメントに相当する２０ｋＤａのタンパク質であるが、エンドスタチンの活性メカニズムは、まだ明らかではない。
【０００５】
ある治療の試みは、公知の活性メカニズムの解明を基礎としている。増殖中の内皮細胞はインテグリンａｖｂ３を発現しているが、静止期の内皮細胞は、それを発現していない（Ｂｒｏｏｋｓ，１９９４）。この知見により、現在治験が行われているこの分子の阻害薬の開発が可能になったものである。
【０００６】
血管新生の活性化に関連しているすべての分子因子のうち、ＶＥＧＦのみが、血管新生活性測定のためのすべての実験モデルにおいて、実際にその効果を証明された（Ｏｒｔｅｇａ，１９９９）。更に、２００３年の春にジェネンテックは、抗ＶＥＧＦ抗体が大腸癌患者において抗腫瘍活性を示すという知見を公表した。そのため、ＶＥＧＦに結合し、そしてそれにより抗ＶＥＧＦ抗体の抗腫瘍活性と遜色ない抗腫瘍活性を示すことのできる分子を探索することが、最も重要となった。
【０００７】
最初にトリ腎芽細胞種（Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍａｒｔｉｎｅｒｉｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｂａｌ，１９９１）で同定されたｎｏｖ遺伝子は、ヒト（ｎｏｖＨ）（Ｍａｒｔｉｎｅｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４）、マウス（ｎｏｖＭ）（Ｓｎａｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、及びアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）（Ｙｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｉｎｇ，１９９６）においてクローニングされた。現在まで、前記ｎｏｖ遺伝子によってコードされているＮＯＶタンパク質の機能は明らかではないが、以下のタンパク質、ＣＹＲ６１（Ｌａｕ  ａｎｄ  Ｎａｔｈａｎｓ，１９８５）、ＣＴＧＦ（Ｂｒａｄｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、ＥＬＭ−１又はＷＩＳＰ−１（Ｐｅｎｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、Ｒ−ＣＯＰ又はＷＩＳＰ−２（Ｐｅｎｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋ，１９９９）及びＷＩＳＰ−３（Ｐｅｎｎｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）を含む、ＣＣＮファミリーにＮＯＶタンパク質は属している（Ｂｏｒｋ，１９９３）。これらのタンパク質はすべて４つの明確なドメイン、インシュリン様成長因子結合蛋白（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ＩＧＦＢＰ）、ウイレブランド因子タイプＣ繰り返しドメイン（Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｃ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）、トロンボスポンディン・タイプＩ繰り返しドメイン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）及びＣＯＯＨ末端ドメイン（ＣＯＯＨ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ）から構成されている。前記ＣＣＮファミリータンパク質は、増殖、接着、アポトーシス、及び走化性を含む、異なった正常細胞の過程を制御している。また、それらは着床、スケルトン形成、胚の発達及び異なる疾患、例えば、繊維症、瘢痕形成、及び癌とも関連している（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０００８】
前記ヒトＮＯＶタンパク質（ＮＯＶＨ）は、正常組織（腎臓、筋、軟骨組織、大脳、肺、卵巣、心臓及び副腎皮質）において異なるレベルで検出することができ（Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２；Ｍａｒｔｉｎｅｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋｏｃｉａｌｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｐｅｒｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、その発現は発生段階によって様々である。
【０００９】
現在、ＮＯＶタンパク質の行なっている機能について、明確には確立されていないが、ＮＯＶが特定のインテグリン（ａｖｂ３，ａ６ｂ１及びａ５ｂ１）に結合することができることから、最近、ＮＯＶは血管新生促進作用を示すであろうと提唱されてきている（Ｌｉｎ，２００３）。更に、その著者らはＮＯＶがウサギの角膜モデルにおいて血管新生促進作用を呈することを示した。しかしながら、この試験では、角膜で合成され蓄積している血管新生因子の放出によって擬陽性の結果が誘導されることが証明された（Ｐｌｏｕｅｔ，１９９７）。
【００１０】
本発明は、ＮＯＶのＶＥＧＦへの結合によるＮＯＶの抗血管新生活性の知見に基づくものである。
【００１１】
本発明の目的は、新規な作用機構を有する新規な抗血管新生剤を提供するものである。
【００１２】
本発明は、内皮の増殖を阻害することを必要とする病態［特には、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、血管腫、血管肉腫の枠内の病態、特には、キャッスルマン病及びカポジ肉腫］；又は
内皮の活性化を阻害することを必要とする病態［特には同種移植拒絶及び異種移植拒絶、肢端チアノーゼ、強皮症の枠内の病態、又は回収と移植の間の移植片調整の枠内の病態］
の治療用薬剤の製造のための使用であって、
（Ａ）配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質、又は
前記タンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、タンパク質の使用、
（Ｂ）前記定義されたＮＯＶタンパク質、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質のフラグメント、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質由来の配列、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質の相同配列、
をコードするヌクレオチド配列であって、
前記ヌクレオチド配列が、特には、配列番号２をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号６をコードする配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、ヌクレオチド配列の使用、
（Ｃ）ＮＯＶタンパク質の抗イディオタイプ抗体の使用、
である治療用薬剤の製造のための使用に関する。
【００１３】
本発明は、内皮の増殖を阻害することを必要とする病態［特には、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、血管腫、血管肉腫の枠内の病態、特には、キャッスルマン病及びカポジ肉腫］；又は
内皮の活性化を阻害することを必要とする病態［特には同種移植拒絶及び異種移植拒絶、肢端チアノーゼ、強皮症の枠内の病態、又は回収と移植の間の移植片調整の枠内の病態］
の治療用薬剤の製造のための使用であって、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質、又は
前記タンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質の使用に関する。
【００１４】
配列番号２の配列は、配列番号１のヌクレオチド配列によってコードされたヒトＮＯＶタンパク質を示す。
【００１５】
配列番号４の配列は、ヒトＮＯＶタンパク質のＩＧＦＢＰ（インシュリン様成長因子結合蛋白：ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）フラグメントを示し、前記フラグメントは配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされている。このフラグメントは、７２アミノ酸を含み、配列番号２の配列の３３残基〜１０４残基の範囲のＮＯＶタンパク質のフラグメントに相当する。
【００１６】
配列番号６の配列は、ヒトＮＯＶタンパク質のＶＷＣ（フォン・ウイレブランド因子タイプＣ繰り返しドメイン：ｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｃ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）フラグメントを示し、前記フラグメントは配列番号５のヌクレオチド配列によってコードされている。このフラグメントは、６７アミノ酸を含み、配列番号２の配列の１０８残基から１７４残基の範囲のＮＯＶタンパク質のフラグメントに相当する。
【００１７】
配列番号８の配列は、ヒトＮＯＶタンパク質のＴＳＰ−１（トロンボスポンディン・タイプＩ繰り返しドメイン：ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｐｅａｔ  ｄｏｍａｉｎ）フラグメントを示し、前記フラグメントは配列番号７のヌクレオチド配列によってコードされている。このフラグメントは、４５アミノ酸を含み、配列番号２の配列の２０６残基から２５０残基の範囲のＮＯＶタンパク質のフラグメントに相当する。
【００１８】
配列番号１０の配列は、ヒトＮＯＶタンパク質のＣＴ（ＣＯＯＨ末端ドメイン：ＣＯＯＨ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ）フラグメントを示し、前記フラグメントは配列番号９のヌクレオチド配列によってコードされている。このフラグメントは、７５アミノ酸を含み、配列番号２の配列の２６４残基から３３８残基の範囲のＮＯＶタンパク質のフラグメントに相当する。
【００１９】
配列番号１２の配列は、ヒトＮＯＶタンパク質のＣ末端フラグメント（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）を示し、前記フラグメントは配列番号１１のヌクレオチド配列によってコードされている。このフラグメントは、１７０アミノ酸を含み、配列番号２の配列の１８８残基から３５７残基の範囲のＮＯＶタンパク質のフラグメントに相当する。
【００２０】
血管新生阻害活性も、また抗血管新生活性と称する。この活性は、例えば、本発明のペプチド配列により、内皮細胞の増加、遊走、及び分化の阻害を、試験管内で証明することによって検出することが可能である。内皮細胞の増加阻害の測定は、その活性を評価するペプチド配列の存在下で、内皮細胞を培養することにより行なうことが可能である。内皮細胞の遊走阻止の測定は、内皮細胞のカーペットの上で、傷（ｗｏｕｎｄ）を作り、次に試験をするペプチドの存在下で細胞を培養にすることにより行なうことが可能である。続いて、傷の上に遊走してきた細胞の数を測定する。内皮細胞の分化（管形成）阻害の測定は、試験をするペプチドの存在下で内皮細胞をゲル上で培養し、形成される細管（ｔｕｂｌｅｓ）の長さを測定することにより行なうことが可能である。
【００２１】
標準の血管新生測定モデルのなかで、局所の輸送モデル、例えば、
発明（Ｉｎｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の化合物が浸透したマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ：Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の皮内注射、又は
発明（Ｃｅｌｅｒｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）の化合物を含んだ、移植片のトリ絨毛尿膜への適応、を挙げることが可能である。
【００２２】
前記発明の化合物は、全身性のルート（血管内、腹空内、皮下）で動物に投与されることができ、実験的血管新生疾患が発生する。また、前記発明の化合物は腫瘍内に直接投与することも可能である。あるいは、後述する本発明のＮＯＶタンパク質又はフラグメント又は抗イディオタイプ抗体は、局所又は全身性のルートで、タンパク質又はフラグメント又は抗イディオタイプ抗体の発現が可能な任意の方法（ＮＯＶ配列を含むウイルス又はプラスミド）を用いた遺伝子治療法により、輸送することが可能である。あるいは、本発明のＮＯＶタンパク質又はフラグメント又は抗イディオタイプ抗体は、癌細胞にトランスフェクトされるプラスミドに導入することができる。（ここで、測定はＮＯＶ又はフラグメント配列を含むか、又は含まないプラスミドによってトランスフェクトされた癌細胞から増えた腫瘍発生を測定することによる。）これらすべての測定方法は、特に、Ｊａｉｎら（１９９７）の論文に記載されている。
【００２３】
「抗腫瘍活性（ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」の用語は、腫瘍状の成長を阻害、及び／又は腫瘍の退行、又は消失さえも誘導することのできる活性を称するために用いる。例えば本発明のペプチド配列及び／又は本発明のペプチド配列を発現する核酸配列の投与下、又は非投与下において、腫瘍細胞の注入によって誘導され成長した腫瘍の大きさを測定することにより、前記活性を生体内で検出することが可能である。
【００２４】
「内皮増殖の阻害」の表現は、後述（実験部）の試験に従って内皮細胞の増殖を鈍化させることのできる任意の内容を示す。
【００２５】
「内皮の活性化」の表現は、病的でない状態と比較して、増加した濃度のＶＥＧＦにさらされた内皮細胞に伴う任意の病態を示すものである。
【００２６】
有利な実施態様によれば、本発明は、配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質を含むか、又は構成されることを特徴とする、前記で定義されたタンパク質の使用に関する
【００２７】
本発明による有利な使用は、内皮の増殖を阻害することを必要とする病態、［特には、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、血管腫、血管肉腫の枠内の病態、特には、キャッスルマン病及びカポジ肉腫］の治療用薬剤の製造のための、配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質を含むか、又は構成されることを特徴とする、前記で定義されたタンパク質の使用からなる。
【００２８】
本発明による有利な使用は、内皮の活性化を阻害することを必要とする病態、［特には同種移植拒絶及び異種移植拒絶、肢端チアノーゼ、強皮症の枠内の病態、又は回収と移植の間の移植片調整の枠内の病態］の治療用薬剤の製造のための、配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質を含むか、又は構成されることを特徴とする、前記で定義されたタンパク質の使用からなる。
【００２９】
有利な実施態様によれば、本発明は、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、前記で定義されたタンパク質の使用に関する。
【００３０】
本発明による有利な使用は、内皮の増殖を阻害することを必要とする病態、［特には、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、血管腫、血管肉腫の枠内の病態、特には、キャッスルマン病及びカポジ肉腫］の治療用薬剤の製造のための、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、前記定義されたタンパク質の使用である。
【００３１】
本発明による有利な使用は、内皮の活性化を阻害することを必要とする病態、［特には同種移植拒絶及び異種移植拒絶、肢端チアノーゼ、強皮症の枠内の病態、又は回収と移植の間の移植片調整の枠内の病態］の治療用薬剤の製造のための、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、前記定義されたタンパク質の使用である。
【００３２】
また、本発明は、癌の治療用薬剤の製造のための使用であって、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、癌の治療用薬剤の製造のためのタンパク質の使用に関する。
【００３３】
また、本発明は、内皮の増殖を阻害することを必要とする病態、［特には、癌、加齢性黄斑変性、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、血管腫、血管肉腫の枠内の病態、特には、キャッスルマン病及びカポジ肉腫］の治療用薬剤の製造のための使用であって、
（Ａ）配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質、又は
前記タンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、タンパク質の使用、
（Ｂ）前記定義されたＮＯＶタンパク質、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質のフラグメント、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質由来の配列、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質の相同配列、
をコードするヌクレオチド配列であって、
前記ヌクレオチド配列が、特には、配列番号２をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号６をコードする配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、ヌクレオチド配列の使用、
（Ｃ）ＮＯＶタンパク質の抗イディオタイプ抗体の使用、
である治療用薬剤の製造のための使用に関する。
【００３４】
また、本発明は、内皮の活性化を阻害することを必要とする病態、［特には同種移植拒絶及び異種移植拒絶、肢端チアノーゼ、強皮症の枠内の病態、又は回収と移植の間の移植片調整の枠内の病態］
の治療用薬剤の製造のための使用であって、
（Ａ）配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質、又は
前記タンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、タンパク質の使用、
（Ｂ）前記定義されたＮＯＶタンパク質、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質のフラグメント、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質由来の配列、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質の相同配列、
をコードするヌクレオチド配列であって、
前記ヌクレオチド配列が、特には、配列番号２をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号６をコードする配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、ヌクレオチド配列の使用、
（Ｃ）ＮＯＶタンパク質の抗イディオタイプ抗体の使用、
である治療用薬剤の製造のための使用に関する。
【００３５】
本発明は、医薬用組成物であって、
（Ａ）配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質、又は
前記タンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、タンパク質、
（Ｂ）前記定義されたＮＯＶタンパク質、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質のフラグメント、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質由来の配列、又は
前記定義されたＮＯＶタンパク質の相同配列、
をコードするヌクレオチド配列であって、
前記ヌクレオチド配列が、特には、配列番号２をコードする配列番号１のヌクレオチド配列、又は配列番号４をコードする配列番号３のヌクレオチド配列、又は配列番号６をコードする配列番号５のヌクレオチド配列、又は配列番号８をコードする配列番号７のヌクレオチド配列、又は配列番号１０をコードする配列番号９のヌクレオチド配列、又は配列番号１２をコードする配列番号１１のヌクレオチド配列に相当するヌクレオチド配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とする、ヌクレオチド配列、
（Ｃ）ＮＯＶタンパク質の抗イディオタイプ抗体、
を医学的に許容可能なベクターと組み合わせ、有効成分として含むことを特徴とする医薬用組成物に関する。
【００３６】
本発明は、医薬用組成物であって、
配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質のフラグメントであって、前記フラグメントは血管形成阻害活性を示すことで規定され、特には約４０〜約１８０のアミノ酸を含むか、及び特には以下の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２の配列の１つで表される前記フラグメント、又は
配列番号２の配列、又は前記定義されたフラグメント由来の任意の配列であって、特には、１又はそれ以上の置換、欠失又は付加によるものであり、血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、又は
配列番号２の配列又は前記で定義されたフラグメントの相同配列であって、配列番号２の配列の３３及び３３８の位置のアミノ酸間を含む領域において、好ましくは、少なくとも８０％、特には８５％の相同性を有しており、前記相同配列が血管形成阻害活性を示すことで規定される配列、
を含むか、又は構成されることを特徴とするタンパク質、
を医学的に許容可能なベクターと組み合わせ、有効成分として含むことを特徴とする医薬用組成物に関する。
【００３７】
本発明による有利な医薬用組成物は、活性成分として、前記フラグメントＴＳＰ−１（配列番号８）を含む。
【００３８】
本発明による有利な組成物は、増殖、遊走、分化試験により、血管新生阻害活性を測定されること、及びその阻害活性は、その媒介物単独の存在下で得られる血管新生の２０％〜１００％を含む阻害割合に相当することを特徴とする。
【００３９】
増殖、遊走又は分化の試験（試験管内血管新生）は以下の実験部に記載された。
【００４０】
また、本発明は、配列番号２で表されるＮＯＶタンパク質を活性成分として含むことを特徴とする前記定義された組成物に関する。
【００４１】
本発明の有利な実施態様によれば、前記定義された組成物は、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の割合で投与することができることを特徴としている。
【００４２】
また、本発明は、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の割合で投与される前記定義された組成物の製造のための、前記定義の使用に関する。
【００４３】
また、本発明は、タイプＴＳＰ−１（配列番号８）の配列を含む遺伝子、タンパク質又はペプチドの形態で投与されることを特徴とする前記定義組成物に関する。
【００４４】
本発明の有利な組成物は、特に好ましくは注射可能な形態で投与される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、ヨード化ＶＥＧＦ１６５のＮＯＶタンパク質への結合を示す。  ＮＯＶタンパク質（４μ／ｍＬ）は、実験部に記載された条件に従って、プラスチックに固定し、そして、非存在（ＰＢＳカラム）、又は２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ１６５の存在下、又は２μｇ／ｍＬのＮＯＶの存在下（ＮＯＶカラム）で、ヨード化ＶＥＧＦ１６５（１ｎｇ／ウエル）とインキュベートした。結果は、洗浄後のウェルあたりの結合したヨード化ＶＥＧＦ１６５のｃｐｍで表した。
【００４６】
【図２】図２は、ヨード化ＶＥＧＦ１６５のＮＯＶタンパク質への結合を示す。  ＮＯＶタンパク質（４μ／ｍＬ）は、実験部に記載された条件に従って、プラスチックに固定し、そして、非存在（ＰＢＳカラム）、又は２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ１６５の存在下、又は２μｇ／ｍＬのＮＯＶの存在下（ＮＯＶカラム）でヨード化ＶＥＧＦ１６５（１ｎｇ／ウエル）とインキュベートした。結果は、洗浄後のウェルあたりの結合したヨード化ＶＥＧＦ１６５のｃｐｍで表した。
【００４７】
【図３】図３は、細胞の遊走試験を示す。８視野の細胞をカウントし、平均をｙ軸に示した。ｘ軸はＮＯＶタンパク質の濃度をμｇ／ｍＬで示している。ダイヤモンド型で示したポイントはＶＥＧＦとインキュベートしていない細胞を示し、正方形で表されたポイントは予めＶＥＧＦで処理した細胞を示す。
【００４８】
【図４】図４は、細胞増殖試験を示す。ｘ軸はＮＯＶタンパク質をμｇ／ｍＬで示し、ｙ軸に、５９５ｎｍで測定した光学密度を示す。ダイヤモンド型で示したポイントは、ＶＥＧＦによって刺激していない細胞を示し、正方形で表されたポイントは、ＶＥＧＦで刺激した細胞を示している。
【００４９】
【図５】図５は、ＦＢＡＥ細胞接着試験を示す。ｘ軸は、ＮＯＶタンパク質をμｇ／ｍＬで示し、ｙ軸に５９５ｎｍで測定した光学密度を示す。ダイヤモンド型で示したポイントは、ＶＥＧＦとインキュベートしていない細胞を示し、正方形で表されたポイントは、予めＶＥＧＦで処理した細胞を示している。
【００５０】
【図６Ａ】及び
【図６Ｂ】図６Ａ及び６Ｂは、ＶＥＧＦ１６５で刺激したＨＵＡＥＣ細胞の遊走におけるＮＯＶ及びそのフラグメントの効果を示す。図６Ａは、ＶＥＧＦ１６５で刺激されていない対照試験を示し、図６Ｂは、ＶＥＧＦ１６５で刺激された試験を示している。カラムは視野あたりの細胞数を示している。白のカラムは、対照細胞（ＮＯＶ又はフラグメントの１つの添加なし）を示し、黒のカラムは、ＮＯＶの存在下で刺激された細胞を示し、縦線のカラムはＮＯＶのＮ末端のフラグメント（ＮＯＶの１〜１８７アミノ酸残基）の存在下で刺激された細胞を示し、横線のカラムはＮＯＶのＣ末端フラグメントの存在下で刺激された細胞を示す。
【００５１】
【図７Ａ】図７Ａは、ＶＥＧＦ１６５で刺激されたＨＵＡＥＣｓ（ヒト臍動脈内皮細胞：ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）の増殖における、ＮＯＶタンパク質又はＣ末端フラグメントの効果を示している。ｘ軸は、ＮＯＶタンパク質又はＣ末端フラグメント（配列番号１２）の濃度をμｇ／ｍＬで示し、ｙ軸に５９５ｎｍで測定した光学密度を示す。白の四角の実線の曲線は、ＮＯＶタンパク質を示し、黒の四角の破線の曲線は、配列番号１２のフラグメントを示している。
【００５２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｂＦＧＦで刺激されたＨＵＡＥＣｓの増殖における、ＮＯＶタンパク質又はＣ末端フラグメントの効果を示している。ｘ軸は、ＮＯＶタンパク質又はＣ末端フラグメント（配列番号１２）の濃度をμｇ／ｍＬで示し、ｙ軸に５９５ｎｍで測定した光学密度を示す。白の四角の実線の曲線は、ＮＯＶタンパク質を示し、黒の四角の破線の曲線は、配列番号１２のフラグメントを示している。
【００５３】
【図８Ａ】及び
【図８Ｂ】図８Ａ及び図８Ｂは、角膜の血管新生における、ＮＯＶタンパク質のＣ末端フラグメント（配列番号１２）の効果を示している。図８ＡはＬＰＳ単独の注射であり、図８Ｂは、ＬＰＳ及びＣ末端フラグメントの注射を示している。
【実験部】
【００５４】
《材料》
ＮＯＶ分子は、相当するｃＤＮＡ（配列番号１）を含む組換えバキュロウイルスによるＳＦ９昆虫細胞の感染によって生産される（Ｔｈｉｂｏｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【００５５】
１６５番及び１８９番のアミノ酸残基のＶＥＧＦのアイソフォームは、対応するｃＤＮＡ（Ｐｌｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）を含む組換えバキュロウイルスによるＳＦ９昆虫細胞の感染によって生産される
【００５６】
ヒト臍動脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ａｒｔｅｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ＨＵＡＥＣｓ）は、基底膜を消化するためにコラーゲン（Ｓｉｇｍａ）で還流した臍動脈から分離した。ＨＵＡＥＣ細胞は、熱で非動化した２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で維持した。この細胞株は、１日ごとにＶＥＧＦを１ｎｇ／ｍＬ添加し、培養した。
【００５７】
ウシ胎児大動脈内皮（ＦＢＡＥ）細胞は、地方の食肉処理場のウシ胎児大動脈から分離した。前記細胞は、熱で非動化したウシ新生仔血清（ＦＣＳ）１０％、ペニシリン１００μｇ／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加したＤＭＥＭ  Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３７℃、１０％ＣＯ２で維持し、２日おきにＶＥＧＦ１ｎｇ／ｍＬを添加した。
【００５８】
《ＶＥＧＦ及びＮＯＶの間の直接相互作用》
固定したＮＯＶタンパク質への結合のために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、ｐＨ９．６の０．０５Ｍ炭酸緩衝液で４μｇ／ｍＬとしたＮＯＶタンパク質で、４℃一昼夜覆った。非特異的結合部分を、ＢＳＡを炭酸緩衝液で５ｍｇ／ｍＬとし、ブロッキングした。ウェルをｐＨ７．４のＰＢＳで２回洗浄後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．５％ＢＳＡ、１ｍＭＭｇＣｌ２、及び１ｍＭＣａＣｌ２を含んだＰＢＳで希釈した２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦ１６５の存在下、又はＮＯＶの存在下、又は非存在下で、それぞれのウェルにヨード化ＶＥＧＦを１ｎｇを添加した。
【００５９】
ウェルをＰＢＳに、Ｔｗｅｅｎ２０を０．１％、ＢＳＡを０．１％加えた混合液で３回洗浄し、結合したタンパク質を０．２ＭのＮａＯＨで可溶化した。
【００６０】
これらの実験の結果を図１及び２に示す。
【００６１】
図１は、ヨード化ＶＥＧＦ１６５が特異的にＮＯＶに結合することを示しているが、それは、非放射性標識のＶＥＧＦ（ＶＥＧＦ）の添加がこの結合を阻害するからである。同様に、ＮＯＶも放射性標識したＶＥＧＦ１６５のＮＯＶへの結合を阻害する
【００６２】
《遊走試験》
ＦＢＡＥ細胞は、高密度（５０，０００細胞／ウェル）で４ｃｍ２のウェルに接種する。単層培養がコンフルエントになったとき、無血清のＤＭＥＭで一昼夜培養することによって、増殖を停止させる。次に、任意の細胞で自由に表面の境界を定めることのできるフォームスクレイパーを用いて単層状で傷（ｗｏｕｎｄ）を形成させる。次いで非付着細胞を除くために、単層培養は、ＤＭＥＭで３回洗浄する。そして、任意の細胞の遊走の前に、表面の境界を定めるために写真を撮影する。ウェルは、ＤＭＥＭ単独、又はＶＥＧＦ５０ｎｇ／ｍＬ存在下において、いくつかの濃度のＮＯＶ存在下で培養した。２４時間後、ウェルを３回洗浄し、メイ・グルンバルト・ギムザで染色し、撮影した。実験の前と後に撮った写真は遊走した細胞のカウントを行なうために重ね合わせた。
【００６３】
これらの試験の結果を図３に示す。
【００６４】
ＶＥＧＦの非存在下でのＮＯＶの添加は、細胞のベースの遊走に影響しない。一方、ＮＯＶはＶＥＧＦの活性を阻害し、５０％最大有効量は、５０−１００ｎｇ／ｍＬのＮＯＶ濃度で得られる。
【００６５】
《増殖試験》
９６ウェル培養プレートに５％ウシ新生仔血清を加えたＤＭＥＭでウェルあたり１０００ＦＢＡＥ細胞をシードした。細胞は、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５で刺激するか、又はＶＥＧＦ１６５で刺激しない状態において、各種の濃度のＮＯＶで刺激した。５日後、ウェルはＤＭＥＭで穏やかにリンスし、細胞を１％グルタルデヒド（ｇｌｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）、２０分常温で固定した。固定した細胞は、クリスタルバイオレットの取り込みで定量した（Ｋｕｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。細胞を０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で常温２０分間インキュベートした。取り込まれなかった染色液は大量の水でウェルを完全に洗浄することによって除き、取り込まれたクリスタルバイオレット染色液は、ウェルあたり１００μＬの１０％酢酸で溶解した。光学密度の測定は、５９５ｎｍで行なった。３回の個別の実験で、同様の結果が得られた（図４参照）。示した値は、６ウェルの光学密度の平均±ＳＤである。
【００６６】
単独で使用したＮＯＶタンパク質は、ベースの増殖（血清単独による）に対して有意な効果を示さなかった。一方、ＶＥＧＦによって誘導される増殖を、ＮＯＶタンパク質は容量依存的に阻害した。５０％最大有効量は、１００−２００ｎｇ／ｍＬのＮＯＶ濃度で得られる。
【００６７】
《細胞接着試験》
Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓら（２００３）の論文に記載されたプロトコールに従って、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ）を、０．０５Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ９．６で希釈したＶＥＧＦ１６５で４℃、一昼夜覆った。非特異的結合部分は、炭酸緩衝液で５ｍｇ／ｍＬとしたＢＳＡで３７℃、１時間ブロッキングし、実験の前にＤＭＥＭで２回洗浄した。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、そして非処理のプラスチックチューブ中で１０％ＦＣＳを含んだ５ｍＬのＤＭＥＭに再懸濁し、１０％ＣＯ２下で３７℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を遠心で回収し、０．２％ＢＳＡを含み、血清を含まないＤＭＥＭで再懸濁し、この細胞の懸濁液は、接着を調整するため、ＮＯＶタンパク質で２０分間（３７℃、１０％ＣＯ２）処理した。ウェルあたり４０，０００の細胞をウェルに１００μＬの０．２％ＢＳＡ添加ＤＭＥＭで分注した。細胞は、３７℃、１０％ＣＯ２下で、接着のため必要な時間静置した。ウェルは非接着細胞を除くため、ＤＭＥＭで穏やかに３回洗浄し、接着細胞は１％グルタールアルデヒドを用い、２０分間常温で固定した。固定した細胞は、クリスタルバイオレットの取り込みで定量した（Ｋｕｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。細胞を０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で常温２０分間インキュベートし、取り込まれなかった染色液は大量の水でウェルを完全に洗浄することによって除き、取り込まれたクリスタルバイオレット染色液は、ウェルあたり１００μＬの１０％酢酸で溶解した（図５参照）。
【００６８】
《試験管内血管新生》
大部分がタイプＩコラーゲンで構成されている白腱（ｗｈｉｔｅ  ｆａｓｃｉｃｕｌｉ）を回収するため、４匹のラットの尾の皮膚を取り除き、細かく裂いた。これらの繊維から、冷やした０．５Ｍ酢酸５０ｍＬ中にコラーゲンを抽出し、一昼夜撹拌する。次に、その液体を５０００ｇで４０分間遠心し、上清を回収する。２０ｍＬの酢酸で抽出を一度繰り返し、上清を混合し、１Ｌの０．２Ｍ酢酸に透析した。コラーゲンの濃度は、重量で３ｍｇ／ｍＬに調整する。試験管内血管新生用のゲルの調整は、液体状のコラーゲンを維持するため、氷上で行う。コラーゲン１ｍＬ（５ｍｇ／ｍＬ）を１０ＸＤＭＥＭ（１０Ｘ濃度の抗生物質とグルタミンを含む）５ｍＬ、滅菌水０．９ｍＬ及び１Ｍ重炭酸ナトリウム０．１ｍＬと混合する。ｐＨを７．４に調整し、等量のマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を加える。ゲルを培養ウェル（２ｍｍ厚）に注ぎ、凝固させるために３７℃でインキュベートした。細胞（１００，０００細胞／ｃｍ２）を１５分後にゲルの表面に加える。２時間後にいくつかの溶解性の因子を添加し、細胞を観察し、２４時間後に写真を撮影する。
【００６９】
《抗イディオタイプ抗体の産生》
最初に、ＮＯＶ中和抗体をフロイント完全アジュバント（ＮＯＶタンパク質の容量に対して１容量）と混合したＮＯＶタンパク質を動物、特にマウスに、注射することによって調整する。体重の１から２００μｇ／ｋｇの間に含まれるＮＯＶの量が、動物へ免疫するために選択される。完全アジュバントを不完全アジュバントに置き換えることを除いては、同じ操作を１５日及び３０日の間隔で行なう。４０日に採血を行ない、血清を分離し、任意の通常の分画方法、特には、硫酸アンモニウム沈殿、プロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィーによって免疫グロブリンを精製する。免疫グロブリン中和活性は前記の任意の試験（ヨード化ＶＥＧＦの結合、細胞増殖、遊走、接着）によって測定される。免疫グロブリンがＮＯＶとＶＥＦＧの相互作用を阻害する能力を有する免疫グロブリンのバッチを、中和と称する。
【００７０】
２番目に、前記のアジュバント、特にフロイント完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）１００μＬと組み合わせたＮＯＶ活性を中和する免疫グロブリンの調整物１〜１００μｇを皮下に注射することによって、ＮＯＶの抗イディオタイプ抗体を調整する。注射を１５日、３０日、及び４５日後に繰り返す。最初の注射から５５日後に、マウスは１０μｇの同じ抗体を腹空内のルートで注射される。最初の注射から５８日後に、マウスを安楽死させ、脾細胞を放出するために、脾臓を摘出し２つに裂く。脾細胞はマウスミエローマ細胞、特にＡＧ８Ｘ  ６３細胞（Ｋｅａｒｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９）と融合し、１００，０００細胞／ウェルの割合でインキュベートする。融合は３０秒ごとの間隔で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）５０μＬを２０回添加することにより行なう。次に、３７℃に暖めておいたイスコフ（ＩＳＣＯＶＥ‘ｓ）培地４ｍＬを加え、細胞懸濁液にドロップワイズで添加し、更に、３７℃で４分間のインキュベーション後に４ｍＬを添加する。次に、細胞懸濁液を遠心し、細胞ペレットを２０％ウシ胎児血清及び１ＸＨＡＴ（５０Ｘ：５ｍＭヒポキサンチン、２０μＭアミノプテリン、及び０．８ｍＭチミジン）を添加された１００ｍＬのイスコフ培地に入れ、マクロファージの入ったウェルに１００μLずつ分配する。５日後に、ＨＡＴ培地１００μＬを添加し、８〜１４日の間に、免疫原性を有している抗体、例えば、抗ＮＯＶ抗体に対する直接ＥＬＩＳＡ法による測定のために、それぞれのハイブリドーマのコンディションメディウムを回収する。そして、この抗イディオタイプ抗体の活性は、ＥＬＩＳＡ試験で測定する。
【００７１】
任意の標準的な方法、特にパパイン消化法で調整した抗ＮＯＶ免疫グロブリンのＦａｂフラグメントをマイクロタイトレーション・プレートに固定する（５０ｍＭ炭酸緩衝液，ｐＨ９．６で、０．１〜２０μｇ／ｍＬ）。同じ緩衝液でアルブミン血清を５ｍｇ／ｍＬに希釈し、非特異部分を飽和させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだＰＢＳ緩衝液で２倍に希釈したハイブリドーマの培養上清を加える。リンスの後、抗イディオタイプ抗体を、適当な濃度のペルオキシダーゼ結合抗マウスＦｃ抗体の添加により検出する。そして、固定された抗イディオタイプ抗体の量はペルオキシダーゼの発色によって測定され、発色反応の強度に比例する。
【００７２】
ハイブリドーマは、抗ＮＯＶ抗体に直接反応する抗体を分泌する能力によって選択され、例えば、細胞はウェルあたり０．１ｍＬの量の限界希釈の状態（５細胞／ｍＬ）下でシードされ、クローニングされる。培養液は、１０日後に交換される。１５日後に、特定のウェルには増殖巣が確認され、この細胞は最初にシードされた細胞から増加しているため、すべての細胞は同一であり、同じクローンに由来する。細胞によって覆われたウェル表面が、少なくともウェルの全体表面の半分以上になったときに、培養液を回収し、前記のように抗ＮＯＶ  ＦａｂのＥＬＩＳＡ試験によって解析する。この段階で、抗体産生クローンを選択することが可能であり、その特異性がわかる。
【００７３】
一旦、同定したクローンは、前記の限界希釈の条件下で、同じクローン由来の細胞を９６ウェルプレートにシードする標準操作を行い、そのモノクローナルの性質を固定する。そのため、前記抗体がモノクローナルであるためには、そのすべての分泌クローンが同じ特異性の抗体を分泌しなければならない。次に、クローンが確実にモノクローナルであると保証するため、３回目のクローニングを正確に同じ条件で行う。
【００７４】
抗イディオタイプ抗体は、バッテリー試験（ｂａｔｔｅｒｙ  ｔｅｓｔ）、特に、ＶＥＧＦ固定のＥＬＩＳＡによってスクリーニングされる。ＶＥＧＦは前記のように、炭酸緩衝液で固定（０．１〜１０μｇ／ｍＬ）され、このＥＬＩＳＡ試験のすべての段階は、抗ＮＯＶ  ＦａｂのＥＬＩＳＡ試験で記載したものと同一である。この試験は、すべての抗イディオタイプ抗体から、ＮＯＶタンパク質（配列番号２）又はタイプＴＳＰ−１フラグメント（配列番号８）の機能を模倣する抗体、例えば、ＶＥＧＦを認識する抗体をスクリーニングすることが可能である。
【００７５】
《ＮＯＶ変異体の構築》
ＮＯＶタンパク質の欠失変異体は、参考文献（Ｐｅｒｂａｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に従って構築し、バキュロウイルスの発現システムで産生した。
Ｎ−Ｔｅｒ（ＮＯＶの１−１８７アミノ酸を含む配列で表される）、及び
Ｃ−Ｔｅｒ、１８８〜３５７アミノ酸を含む［この配列はトロンボスポディン・タイプドメイン（配列番号８）及びシステインリッチＣ末端ドメイン（配列番号１０）を含む。］
【００７６】
《遊走試験》（図６）
ＨＵＡＥＣ細胞は、高密度（５０，０００細胞／ウェル）で４ｃｍ２のウェルに接種する。単層培養がコンフルエントになったとき、１％ＮＢＣＳのＳＦＭで一昼夜培養することによって、増殖を停止させる。次に、任意の細胞で自由に表面の境界を定めることのできるフォームスクレイパーを用いて単層上で傷を形成させる。次いで非付着細胞を除くために、単層培養は、ＳＦＭで３回洗浄する。そして、任意の細胞の遊走の前に、表面の境界を定めるために写真を撮影する。ウェルは、ＳＦＭ単独又はＶＥＧＦ５０ｎｇ／ｍＬ存在下において、様々な濃度のＮＯＶ又はＮ−Ｔｅｒ又はＣ−Ｔｅｒの存在下で培養した。２４時間後、ウェルを３回洗浄し、メイ・グルンバルト・ギムザで染色し、撮影した。実験の前と後に撮った写真は遊走した細胞のカウントを行なうために重ね合わせた。
【００７７】
これらの試験の結果を図６に示す。
【００７８】
ＶＥＧＦの非存在下でのＮＯＶ又は前記Ｎ−Ｔｅｒフラグメントの添加は、細胞のベースの遊走に影響しない。ＮＯＶはＶＥＧＦの活性を阻害し、５０％最大有効量は、５０−１００ｎｇ／ｍＬのＮＯＶ濃度で得られる。前期Ｎ−Ｔｅｒは阻害活性を示さない。一方、Ｃ−ＴｅｒはＨＵＡＥＣ細胞の遊走を阻止する。
【００７９】
これらの実験は、１８８〜３５７アミノ酸を含むＮＯＶ配列が、確かにＶＥＧＦによる血管新生の阻害活性に関与しており、それがＶＥＧＦの非存在下でも遊走阻止活性を誘導することを証明している。
【００８０】
《増殖試験》（図７）
９６ウェル培養プレートに１０％ＮＢＣＳ添加ＳＦＭ培養液でウェルあたり２０００のＨＵＡＥＣ細胞をシードした。細胞は、２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ１６５の刺激下か、又は刺激しない状態で、各種の濃度のＮＯＶの存在下又はＣ−Ｔｅｒフラグメントで刺激した。５日後、ウェルはＳＦＭ培養液で穏やかにリンスし、細胞を１％グルタルデヒド（ｇｌｕｔａｌｄｅｈｙｄｅ）、２０分常温で固定した。固定した細胞は、クリスタルバイオレットの取り込みで定量した。細胞を０．２Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ９．５で希釈した０．１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で常温２０分間インキュベートした。取り込まれなかった染色液は大量の水でウェルを完全に洗浄することによって除き、取り込まれたクリスタルバイオレット染色液は、ウェルあたり１００μＬの１０％酢酸で溶解した。光学密度の測定は、５９５ｎｍで行なった。３回の個別の実験で同様の結果が得られた（図７参照）。示した値は、６ウェルの光学密度の平均±ＳＤである。
【００８１】
ＮＯＶタンパク質は、容量依存性にＶＥＧＦ及びＦＧＦにより誘導される増殖を阻害する。５０％最大有効量はＶＥＧＦ及びＦＧＦに対して、２００ｎｇ／ｍＬのＮＯＶの５０％阻害濃度で得られた。同様に、前記Ｃ−Ｔｅｒフラグメントは、ＶＥＧＦ及びＦＧＦによって誘導される増殖を２００ｎｇ／ｍＬで阻害する。
【００８２】
これらの実験は、１８８〜３５７のアミノ酸を含むＮＯＶ配列が、確かに血管新生阻害活性を担っていることを示している。また、ＦＧＦの分裂促進活性も１８８〜３５７のＮＯＶフラグメントによって阻害されるという観察は、阻害活性が、ＶＥＧＦ因子単独の活性に対して、限定されるものではないことを示している。
【００８３】
《角膜血管新生》
ウイスターラットを麻酔する。角膜を切開し、フォームスパチュラを使用してストロマの厚さを２つに引き裂くことによって、角膜ポケットを得る。いくつかの血管新生因子に依存する血管新生反応のトリガーとなる炎症剤であるリポポリサッカライドを含むエルバックス移植片（Ｅｌｖａｘ  ｉｍｐｌａｎｔ：ＤｕＰｏｎｔ）を前記ポケットの底に挿入する。８日後、角膜輪部に血管新生反応が観察されるようになる。Ｃ−Ｔｅｒフラグメントを角膜ポケットに注入した場合（Ｄ４からＤ８の間に２日毎に５μｇ）、血管新生反応は完全に阻害される（図８）。
【００８４】
これらの実験はＮＯＶのＣ−Ｔｅｒが、いくつかの血管新生因子の活性化に依存している、主な抗血管新生活性を阻害することを示した。
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【図１】
2007501203.tif 000002
【図２】
2007501203.tif 000003
【図３】
2007501203.tif 000004
【図４】
2007501203.tif 000005
【図５】
2007501203.tif 000006
【図６Ａ】
2007501203.tif 000007
【図６Ｂ】
2007501203.tif 000008
【図７Ａ】
2007501203.tif 000009
【図７Ｂ】
2007501203.tif 000010
【図８Ａ】
2007501203.tif 000011
【図８Ｂ】
2007501203.tif 000012
【配列表】
2007501203000001.app
【国際調査報告】
2007501203.tif 000013
2007501203.tif 000014
2007501203.tif 000015
2007501203.tif 000016
2007501203.tif 000017
2007501203.tif 000018
2007501203.tif 000019
2007501203.tif 000020