(57)【要約】【解決手段】本願で提供されるのは、表面増感ラマン分光法（ＳＥＲＳ）を用いて分子結合を検出する複数の方法である。ＳＥＲＳ信号は、複数の結合相手の１つがＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合することによって生成される。２つの結合相手が互いに接触した後と、複数の結合相手が互いに接触する前とのＳＥＲＳ信号の変化を検出することにより、結合は検出される。方法は、複数の抗体の複数の抗原への結合、および複数の受容体の複数の配位子への結合のような複数の生物分子の結合の検出に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合を検出する方法であって、
ａ）第１の特定の結合ペア要素が表面増感ラマン散乱活性な粒子または基板と会合する段階と、
ｂ）前記表面増感ラマン散乱活性な粒子または基板と会合した前記第１の特定の結合ペア要素を第２の特定の結合ペア要素に接触させる段階と、
ｃ）前記第１の特定の結合ペア要素と前記第２の特定の結合ペア要素とが接触する前と、前記第１の特定の結合ペア要素と前記第２の特定の結合ペア要素とが接触した後との前記第１の特定の結合ペア要素の表面増感ラマン散乱信号の差を検出することによって、前記第２の特定の結合ペア要素の前記第１の特定結合ペア要素への結合を検出する段階であって、前記第１の特定の結合ペア要素の前記第２の特定の結合ペア要素への結合を検出する段階と
を備える方法。
【請求項２】
前記第１の特定の結合ペア要素と会合している前記表面増感ラマン散乱活性な粒子または基板が金属粒子である
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の特定の結合ペア要素が前記表面増感ラマン散乱表面に吸着することによって、前記第１の特定の結合ペア要素が前記金属粒子と会合する
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記金属粒子が、コロイド状の銀または金を含む
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の特定の結合ペア要素が、前記表面増感ラマン散乱活性な表面と会合する前に固定化基板上に固定化される
請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記表面増感ラマン散乱信号の前記差は、前記信号の減少である
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第２の特定の結合ペア要素の前記第１の特定の結合ペア要素への結合が、前記金属表面から前記第１の特定の結合ペア要素を解離する
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記表面増感ラマン散乱信号の前記差は、前記信号の増加である
請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２の特定の結合ペア要素が前記第１の特定の結合ペア要素と接触する前に、吸着が検出される
請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の特定の結合ペア要素が前記金属粒子と接触した後に前記第１の特定の結合ペア要素によって生成される表面増感ラマン散乱信号の増加を検出することにより、吸着が検出される
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の特定の結合ペア要素が、化学塩の存在下で前記金属粒子と会合する
請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記化学塩が、塩化リチウムである
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の特定の結合要素がタンパク質であり、および前記第２の特定の結合ペア要素がタンパク質である
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１または第２の特定の結合ペア要素が、抗体分子またはその断片である
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の特定の結合ペア要素が受容体であり、および前記第２の特定の結合ペア要素が配位子である
請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１または前記第２の特定の結合ペア要素が核酸分子であり、および前記第１または前記第２の特定の結合ペア要素のもう一方がタンパク質である
請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の特定の結合ペア要素が表面増感ラマン散乱の標識と結合している
請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面増感ラマン散乱の標識がデオキシアデノシン一リン酸である
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
表面増感コヒーレントアンチストークスラマン分光法が、前記第１の特定の結合ペア要素の検出に用いられる
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の特定の結合ペア要素が表面増感ラマン散乱活性な基板上に固定化されることにより、前記第１の特定の結合ペア要素が前記表面増感ラマン散乱活性な粒子または基板と会合する
請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記表面増感ラマン散乱活性な基板が、複数の金属が含浸したポーラスシリコン基板を含む
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗体、またはその断片の抗原への結合を検出する方法であって、
ａ）固定化基板上に抗体を固定化する段階と、
ｂ）前記固定化された抗体を金属粒子と接触させて、前記金属粒子上に前記固定化された抗体を吸着させる段階と、
ｃ）前記固定化された抗体と抗原とを接触させる段階と、
ｄ）前記抗体が前記抗原と接触する前と、前記抗体が前記抗原と接触した後の前記抗体によって生成された表面増感ラマン散乱信号の差を検出することによって、前記抗原の前記抗体、またはその断片への結合を検出する段階であって、前記抗体の前記抗原への結合を検出する段階と
を備える方法。
【請求項２３】
前記抗体、またはその断片が、完全な抗体分子である
請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体、またはその断片が、Ｆａｂ断片である
請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記金属粒子が、コロイド状の金または銀を含む
請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
生物学的試料中の検体を検出する方法であって、
ａ）第１の特定の結合ペア要素を表面上に固定化する段階であって、前記第１の特定の結合ペア要素が前記検体と結合する段階と、
ｂ）前記固定化された第１の特定の結合ペア要素と金属粒子とが、前記金属粒子上に前記固定化された第１の特定の結合ペア要素が吸着することにより接触する段階と、
ｃ）前記金属粒子上に吸着した前記固定化された第１の特定の結合ペア要素が前記生物学的試料と接触する段階と、
ｄ）前記固定化された第１の特定の結合ペア要素と前記第２の特定の結合ペア要素とが接触する前と、前記第１の特定の結合ペア要素と前記第２の特定の結合ペア要素とが接触した後の前記固定化された第１の特定の結合ペア要素によって生成された表面増感ラマン散乱信号を検出する段階であって、前記検出された複数の表面増感ラマン散乱信号の差が、前記生物学的試料中に前記検体が存在することを示す段階と
を備える方法。
【請求項２７】
前記第１の特定の結合ペア要素が、抗体またはその断片である。
請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記金属粒子が、コロイド状の金または銀を含む
請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の特定の結合ペア要素が、塩化リチウムの存在下で前記金属粒子上に吸着される
請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的試料が血清である
請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
抗体またはその断片を検出する方法であって、
ａ）前記抗体またはその断片を表面上に固定化する段階と、
ｂ）前記抗体またはその断片と金属粒子とが、前記金属粒子上に前記固定化された抗体が吸着することにより接触する段階と、
ｃ）前記固定化された抗体またはその断片の表面増感ラマン散乱信号を検出する段階であって、前記抗体またはその断片を検出する段階と
を備える方法。
【請求項３２】
前記抗体、またはその断片が、完全な抗体分子である
請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体、またはその断片が、Ｆａｂ断片である
請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記金属粒子が、コロイド状の金または銀である
請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に複数の生体分子の検出および分析に関し、特に複数の生体分子間の結合の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的検定のような複数の分子結合の検定は、医療および複数の診断目的のために、血清、血漿、尿、または他の体液試料中の複数の検体の検出にしばしば用いられる。複数の分子結合検定によって多量の検体が検出できる。しかしながら、多数の検体にとって、分析的および機能的な感度に対する要求が、ますます求められている。
【０００３】
従来、抗体または標的分子上の蛍光性または放射性の複数の標識を検出することにより、分子結合は観察されている。しかしながら、従来の複数の方法は、非限定的な結合による強いバックグラウンドの信号にしばしば影響され、複数の結合の事象についての人を誤らせる情報を生成したり、当該方法の機能的な感度を限定する。例えば、抗体または残りの色素の複数の分子からの汚染の非限定的な結合は、誤って高いバックグラウンドの信号を生成する。非限定的な結合は、従来の複数の検定方法に固有のもので、完全に避けることは困難である。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】本願明細書で提供する方法の間における信号レベルの変化を示す。
【０００５】
【図２】本願明細書で提供する典型的な方法の概要図である。
【０００６】
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、抗体分子のＳＥＲＳ信号（図３Ａ）、および抗体の欠如下において生成された負の制御信号（図３Ｂ）を示す図である。
【発明の開示】
【０００７】
本願明細書において開示した複数の方法は、第２の特定の結合ペア要素に結合した第１の特定の結合ペア要素によって生成された表面増感ラマン分光（ＳＥＲＳ）信号の変化を検出することにより、第１の特定の結合ペア要素と第２の特定の結合ペア要素の間の生体分子結合を検出することに有用である。本願明細書において開示した複数の方法は、第１の生体分子の第２の生体分子への結合を検出するために用いられる、複数の免疫学検定のような従来の蛍光分析の標識化工程を必要としない。複数の標識が用いられず、および／または、蛍光検出が実施されないので、検定のバックグラウンドの信号は大幅に減少する。さらに、生体分子の構造を難解にし、および／または活性を妨害する、生体分子への標識の結合のような生体分子の修飾は必要でない。それゆえに、ＳＥＲＳを用いることにより、結合の複数の事象が、複数の蛍光標識を使用せずに検出され、結果として、感度が向上し、正確性が向上する。
【０００８】
本願明細書で提供される複数の方法は、所定の複数の生体分子が強いＳＥＲＳの複数の信号を生成することが知られている事実に一部基づく。さらに、複数のＳＥＲＳ信号は、化学および環境の複数の変化に敏感である（Efrima S. and Bronk B. V., （1998）, Journal of Physical Chemistry B, 102, 5947；Lee N S, Hsieh Y Z, Paisley R. F．,and Morris M. D. (1988), Anal. Chem. 64, 442；Wood E, Sutton C, Beezer A E, Creighton J A, Davis A F and Mitchell J. C., （1997） International Journal of Pharmaceutics, 154, 115）。最後に、抗体および抗原のような、および複数の特定の結合ペアの多数の違いのような複数の特定の結合ペアの多数の異なる型の要素間における複数の結合の事象は知られている。
【０００９】
【００１０】
結果的に、一実施形態によれば、本願明細書で提供されているのは、第２の特定の結合ペア要素への第１の特定の結合ペアの要素の結合の検出のための方法である。当該方法は、第１の特定の結合ペア要素と表面増感ラマン散乱（ＳＥＲＳ）活性な粒子または基板とが会合する段階、ＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合している第１の特定の結合ペア要素が第２の特定の結合ペア要素へ接触する段階、および第２の特定の結合ペア要素の第１の特定の結合ペア要素への結合を検出する段階を含む。結合は、典型的には、第１の特定の結合ペア要素が第２の特定の結合ペア要素とが接触する前に、第１の特定の結合ペア要素によって生成されたＳＥＲＳ信号を、第１の特定の結合ペア要素が第２の特定の結合ペア要素に接触した後に生成されたＳＥＲＳ信号と比較して、相違を検出することにより決定される。第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合を検出することにより、本願明細書に開示した複数の方法は、第１の分子と第２の分子との間の分子の相互作用の検出を可能にする。本願明細書で述べる複数の方法は、ＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合したときに検出可能なＳＥＲＳ信号を生成する複数の分子の一から提供される、事実上いかなる複数の分子間の相互作用の検出に用いられ得、当該ＳＥＲＳ信号は、第１の分子の第２の分子への結合によって影響される。例えば、１つの側面において、第１の特定の結合ペア要素は抗体であり、第２の特定の結合ペア要素は、明確に抗体に制約される抗原である。他の側面においては、第１の特定の結合ペア要素はレセプターであり、第２の特定の結合ペア要素は配位子である。
【００１１】
本願明細書では、"１つの"は、項目の一つの１つ以上を意味し得る。
【００１２】
本願明細書では、"検体"という用語は、検出および／または同定のための、いかなる原子、化学物質、分子、化合物、組成物、あるいは興味のある物質の会合体を言及する。複数の検体の非限定的な例は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、糖、炭水化物、オリゴ糖、多糖類、脂肪酸、脂質、ホルモン、代謝産物、サイトカイン、ケモカイン、レセプター、神経伝達物質、抗原、アレルゲン、抗体、基板、代謝産物、共同因子、阻害物質、麻薬、調合薬、栄養物、プリオン、毒素、毒物、爆発物、殺虫剤、化学兵器、生体有害薬剤、放射性物質、ビタミン、複素環式芳香族化合物、発がん性物質、突然変異誘発物質、麻酔薬、アンフェタミン、バルビツール酸系催眠薬、幻覚剤、廃棄物、および／または汚染物質を含む。
【００１３】
"生物学的試料"は、例えば、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、排泄物、痰、脳脊髄液、涙、鼻汁、およびそのようなものを含む。ある複数の側面においては、生物学的試料は、哺乳類の対象、例えば、人間の被験者からの試料である。生物学的試料は、試料が第２の特定の結合ペア要素を含むかあるいは含み得る限り、事実上、いかなる生物学的試料であってよい。例えば、試料は、第１の特定の結合ペア要素として含まれる抗体によって見分けられるエピトープを有するタンパク質を含むことが疑われていてよい。生物学的試料は、例えば、１から１０，０００，０００個、１０００から１０，０００，０００個、または１，０００，０００から１０，０００，０００個の体細胞を含む、細胞組織の試料であってよい。試料は、本願明細書で提供される複数の方法のための十分な量の特定の結合ペア要素を含む限り、無傷細胞を含む必要はない。本願明細書で提供される複数の方法の複数の側面によれば、生物学的試料は哺乳類の対象からのものであり、生物学的あるいは細胞組織の試料は、いかなる細胞組織の試料であってよい。例えば、細胞組織は、手術、生体検査法、標本、検便用サンプル、あるいは他の収集方法によって得られる。他の複数の側面においては、生物学的試料は、例えばウイルス、バクテリアの病原体のような病原体を含むか、あるいは含むものと疑われるか、若しくは、含む危険がある。
【００１４】
本願明細書では、"ナノ結晶シリコン"という用語は、典型的には、１から１００ナノメータ（ｎｍ）の範囲の大きさのナノメータスケールの複数のシリコン結晶を有するシリコンを言及する。"ポーラスシリコン"は、エッチングされたか、または、ポーラス構造を形成すべく取り扱われたシリコンについて言及する。
【００１５】
本願明細書では、"操作可能に連結する"とは、装置および／またはシステムの２以上のユニット間で機能的な相互作用があることを意味する。例えば、ラマン検出器は、コンピュータが検出器によって検出された複数のラマン信号を取得、処理、格納、および／または転送する場合には、コンピュータと"操作可能に連結"してよい。
【００１６】
抗体を参照する場合に用いられる"明確に結合する"あるいは"特定の結合活性"という用語は、抗体と特定のエピトープとの相互作用において、解離定数が少なくともおよそ１×１０−６を有し、一般的には少なくともおよそ１×１０−７、通常は少なくともおよそ１×１０−８、そして特に少なくともおよそ１×１０−９または１×１０−１０かそれ以下を有することを意味する。
【００１７】
本願明細書では、"抗体"という用語は、複数の抗体の複数の断片を結合する抗原と同様に、複数のポリクロナールおよびモノクロナール抗体を含む最も広い意味で用いられる。本発明は、複数の抗体の全体およびそれらの機能的な複数の断片を含む。本発明において用いられる抗体という用語は、複数の無傷の分子、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２のようなそれらの複数の断片、エピトープのデターミナントに結合可能な複数のＦｖおよびＳＣＡ断片を含むことを意味する。
（１）Ｆａｂ断片は、酵素パパインによる抗体分子全体の分解により生成される抗体分子の一価の抗原−結合断片が主成分であり、無傷の軽鎖および重鎖の部分が主成分である断片が生じる。
（２）抗体分子のＦａｂ’断片は、抗体分子全体をペプシンと共に取り扱い、続いて還元させて、無傷の軽鎖および重鎖の部分を含む分子を生成することによって得られる。２つのＦａｂ’断片が、当該方法で取り扱われた１つの抗体分子ごとに得られる。
（３）抗体の１つの（Ｆａｂ’）２断片が、酵素ペプシンと共に抗体分子全体を取り扱うことによって、続いての還元なしで得られる。１つの（Ｆａｂ’）２断片は、２つのＦａｂ’断片の二量体であり、２つのジスルフィド結合によって互いに拘束される。
（４）１つのＦｖ断片は、２つの鎖として表現される軽鎖の様々な領域および重鎖の様々な領域を含む遺伝工学的断片として定義される。
（５）単一鎖の抗体（ＳＣＡ）は、適切な、柔軟性のあるポリペプチドリンカーによって結合された、軽鎖の様々な領域および重鎖の様々な領域を含む遺伝工学的な単一鎖分子である。
【００１８】
本願明細書で用いられる"抗体"という用語は、自然発生する複数の抗体、自然発生しない複数の抗体を含み、例えば、複数の単一鎖抗体、複数のキメラ、二元機能、およびヒト化抗体、それらの複数の抗原結合断片を含む。そのような自然発生しない複数の抗体は、固相ペプチド合成を用いて構成され得、組み換え的に合成され得、あるいは、例えば、様々な重鎖および様々な軽鎖を含む複数の組み合わせライブラリーのスクリーニングにより得られ得る（Huse et al., Science 246,1275-1281(1989)参照。）。例えば、キメラ、ヒト化、ヒト型（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）、単一鎖、および二元機能を有する複数の抗体を製造するこれらの、および他の複数の方法は当業者に周知である（Winter and Harris, Immunol. Today 14, 243-246, 1993; Ward et al., Nature 341, 544-546, 1989; Harlow and Lane, Antibodies: A laboratory manual（Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）; Hilyard et al., Protein Engineering: A practical approach（IRL Press 1992）; Borrabeck, Antibody Engineering, 2d ed.（Oxford University Press 1995））。
【００１９】
例えば、ウサギ、ヤギ、ねずみ、あるいは他の哺乳類の複数のポリクローナル抗体を調達する複数の方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", Immunochemical Protocols（Manson, ed., Humana Press 1992）, pages 1-5; Coligan et al., "Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters", Curr. Protocols Immunol.（1992）, section 2.4.1参照。）。さらに、複数のモノクローナル抗体は、当該技術分野において周知である、所定の複数の方法を用いて得られる（Harlow and Lane, supra, 1988）。
【００２０】
本発明において用いられるように、"エピトープ"という用語は、抗体のパラトープが結合する、抗原上の抗原性デターミナントを言及する。複数の抗原性デターミナントは、一般的に、複数のアミノ酸または複数の糖の側鎖のような、複数の分子の化学的に活性な表面の複数の配置を含み、固有の複数の電荷特性と同様に、固有の複数の３次元構造特性を有する。
【００２１】
本発明の複数の免疫学的検定の複数の型の複数の実施例は、直接または間接的フォーマットのいずれかの競合および非競合免疫測定法を含む。過度の実験をすることなしに他の複数の免疫学的検定の形式が合わされることが、当業者には周知であるか、または容易に理解するであろう。
【００２２】
本発明の方法の実施において、"複数の遮断薬"は培養培地内に含まれうる。"複数の遮断薬"は、複数の分子の表面および間に、非特異的な結合を最小化すべく添加される。
【００２３】
"核酸"は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、あるいは三本鎖、およびそれらのいかなる化学的な修飾を施したものを意味する。事実上、核酸のいかなる修飾をも意図される。"核酸"は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、７５０００、１０００００、１５００００、２０００００、５０００００、１００００００、１５０００００、２００００００、５００００００、あるいは長さにおいてより多くの複数の塩基から、染色体ＤＮＡ分子の全長までのほとんどいかなる長さであり得る。
【００２４】
"レセプター"という用語は、タンパク質、またはタンパク質の断片、若しくは、配位子と呼ばれる特定の物質に選択的に結合する複数のタンパク質に会合する基を意味する。その配位子の結合に際して、レセプターは、細胞内での特定の反応を引き起こす。
【００２５】
"ポリペプチド"という用語は、本願明細書では、ペプチド結合によって結合した２つ以上のアミノ酸を意味するものとして広く用いられる。"断片"あるいは"タンパク質分解の断片"という用語もまた、本願明細書では、ポリペプチドの分解反応によって生成され得る生成物、すなわち、ポリペプチド中のペプチド結合の開裂によって生成されるペプチドであることを言及する。本発明に係るポリペプチドは、少なくともおよそ６つのアミノ酸、通常はおよそ１０のアミノ酸を含み、および、１５以上のアミノ酸、特に２０以上のアミノ酸を含み得る。"ポリペプチド"という用語は、本願明細書においては、特定の大きさ、または分子を構成する複数のアミノ酸の数を示唆することに用いられず、本発明のペプチドは、いくつかのアミノ酸の残りまたはそれ以上を含み得ると理解すべきである。タンパク質は、リン酸基、炭水化物成分のような、複数のアミノ酸以外の他の複数の化学成分を含むポリペプチドである。
【００２６】
図１は、本願明細書で提供される複数の方法の様々な段階の間における予期されたＳＥＲＳ信号のレベルの変化を示す仮想的なグラフである。第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な基板または粒子と会合する前には、ほとんどあるいは全くＳＥＲＳ効果は観察されず、抗体のような第１の特定の結合ペア要素のラマン信号は、本発明のある側面においては弱い。第１の特定の結合ペア要素によって生成されるＳＥＲＳ信号は、第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な粒子または基板との会合、例えば、複数の金属粒子および任意に複数の化学塩１１０の導入の後に、第１の特定の結合ペア要素の金属粒子への吸着によって強められる。典型的には、本願明細書に開示した複数の方法のある側面において、ＳＥＲＳ信号の増加によって検出される会合の後に、時々本願明細書では標的分子と言及される第２の特定の結合ペア要素が導入され（１２０）、第１の特定の結合ペア要素と接触して結合する。第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合の結果として、ＳＥＲＳ信号が変化して、結合の検出が可能となる。例えば、信号の増加あるいは信号の減少は、結合が生じたこと（１４０）を示す。第１の特定の結合ペア要素が第２の特定の結合ペア要素に接触した後に、ＳＥＲＳ信号が変化しない場合は（１３０）結合が生じていないことを示しており、標的分子１３０の検出可能なレベルの欠如を示す。それゆえに、第１の特定の結合ペア要素が第２の特定の結合ペア要素と接触する前後のＳＥＲＳ信号を監視することにより、第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合を検出することができる。
【００２７】
第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素との接触前に対する接触後のＳＥＲＳ信号の差異は、第１の特定の結合ペア要素と第２の特定の結合ペア要素の分子結合の複数の事象によるＳＥＲＳ信号の生成の途絶または増加の結果である。特定の理論にとらわれる事は望ましくはないが、ある複数の実施例においては、第１の特定の結合ペア要素によって生成されたＳＥＲＳ信号は、第２の特定の結合ペア要素が第１の特定の結合ペア要素のＳＥＲＳ信号を抑制したときに減少すると考えられている。このＳＥＲＳ信号の抑制は、例えば、第１の特定の結合ペア要素の、第２の特定の結合ペア要素が第１の特定の結合ペア要素に結合しているＳＥＲＳ活性な基板からの解離の結果であり得る。言い換えると、第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合力は、第１の特定の結合ペア要素のＳＥＲＳ活性な金属粒子または表面との会合の力よりも強く、第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な粒子または基板から解離し得る。
【００２８】
図２は、本願明細書において開示した方法に係る、第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合の、検出方法の特定の実施例を示す図である。第１の特定の結合ペア要素２００が、固定化基（例えば、架橋試薬）２１０を用いて固体支持材２２０上に固定される。ＳＥＲＳ活性な粒子または基板、例えば、金属粒子２４０が、第１の特定の結合ペア要素２００と会合する。第１の特定の結合ペア要素２００の第２の特定の結合ペア要素２５０への結合により、第１の特定の結合ペア要素２００から金属粒子２４０が解離して、ＳＥＲＳ信号が減少する結果となる。
【００２９】
第１の特定の結合ペア要素２００は、第１の特定の結合ペア要素２００のＳＥＲＳ信号を強める標識２３０と会合し得る。他の複数の実施例において、第１の特定の結合ペア要素２００は、ＳＥＲＳ活性な粒子または表面の近傍に位置したときにその独自のＳＥＲＳ信号を生成し得る。本発明の他の側面においては、第１の特定の結合ペア要素２００の第２の特定の結合ペア要素２５０への結合の結果、ＳＥＲＳ信号が増加する。例えば、第２の特定の結合ペア要素２５０は、第１の特定の結合ペア要素２００をＳＥＲＳ活性な粒子または表面２２０の近接近に至らしめ、それゆえ、ＳＥＲＳ信号が増加する。その他の方法として、ＳＥＲＳ信号は、第２の特定の結合ペア要素２５０によって、または第１の特定の結合ペア要素２００および第２の特定の結合ペア要素２５０の双方によって生成される。
【００３０】
上記で指摘したように、本願明細書で開示した複数の方法において第１の特定の結合ペア要素によって生成されるＳＥＲＳ信号を増加させるために、第１の特定の結合ペア要素が、典型的には、金属粒子のようなＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合する。それゆえに、第１の特定の結合ペア要素の検出はＳＥＲＳを用いて達成される。典型的には、第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合した場合には、それはＳＥＲＳ活性な粒子または基板に近接して、ＳＥＲＳ活性な粒子または基板の１０ｎｍから５０ｎｍの範囲内に存在することとなる（Chang and Furtak, Surface-enhanced Raman scattering, Plenum Press（1982））。
【００３１】
本発明のある複数の実施形態は、第１の特定の結合ペア要素から得られるラマン信号を増感させるべく、複数のＳＥＲＳ活性粒子の使用を含む。例えば、複数の金属粒子が本願明細書の複数の方法で、複数の特定の結合ペア要素と会合する。複数の金属粒子は、典型的には、コロイド状の銀、金、銅、白金、あるいは特有の大きさおよび形の他の複数の金属粒子であり、強いプラズモン共鳴を生成する。
【００３２】
いくつかの側面において、複数の金属粒子は、銀または金の複数のナノ粒子のような、ＳＥＲＳ活性金属を含む複数のナノ粒子である。表面増感ラマン分光（ＳＲＥＳ）の信号の提供ができるいかなるナノ粒子も用いてよい。本発明の他の実施形態においては、複数のナノ粒子は複数のナノプリズムである（Jin et al., Science 294:1902-3（2001））。様々な複数の側面において、直径が１ｎｍと２マイクロメータ（μｍ）との間の複数のナノ粒子が用いられる。他の複数の側面においては、２ｎｍから１μｍの間、５ｎｍから５００ｎｍ、１０ｎｍから２００ｎｍ、２０ｎｍから１００ｎｍ、３０ｎｍから８０ｎｍ、４０ｎｍから７０ｎｍ、あるいは５０から６０ｎｍの間の直径の複数のナノ粒子が意図される。本発明のある複数の実施形態においては、５から２００ｎｍ、１０から５０ｎｍ、５０から１００ｎｍ、あるいはおよそ１００ｎｍの平均直径を有する複数のナノ粒子が意図される。複数のナノ粒子は、略球状、棒状、鋭い形状、面を持つ形状、または先のとがった形状であるが、複数のナノ粒子は、いかなる形状または不規則な形状が用いられてもよい。複数のナノ粒子を製造する複数の方法は知られている（例えば、米国特許第6054495号、6127120号、6149868号；Lee and Meisel, J. Phys. Chem. 86:3391-3395,1982; Jin et al., 2001参照）。また、複数のナノ粒子は商業的供給源から取得できる（例えば、Nanoprobes Inc., Yaphank, NY; Polysciences, Inc., Warrington, PA）。
【００３３】
複数のナノ粒子は単一の複数のナノ粒子、および／または複数のナノ粒子の複数の会合体である（例えば、コロイド状の複数のナノ粒子）。複数のナノ粒子は架橋して、複数の二量体、複数の三量体、複数の四量体、あるいは他の複数の会合体のような、複数のナノ粒子の複数の会合体を生成する。異なる大きさの複数の会合体の不均一な複数の混合物、または複数のナノ粒子の均質な複数の集団もまた用いられる。複数のナノ粒子（例えば、二量体、三量体等）の選択された数を含む複数の会合体は、スクロース溶液中での頂遠心分離のような、公知の複数の技術によって濃縮または精製される。大きさがおよそ１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００から１０００ｎｍまたはそれ以上のナノ粒子の複数の会合体が意図される。
【００３４】
複数のナノ粒子を架橋する複数の方法は公知である（例えば、Feldheim, "Assembly of metal nanoparticle arrays using molecular bridges" The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25）。例えば、末端にチオール基またはスルフヒドリル基を持つ二官能基性の複数のリンカー化合物を用いて、金の複数のナノ粒子が架橋される。金の複数のナノ粒子の反応において、リンカーは、リンカーの長さによって分離されるナノ粒子の複数の二量体を形成する。３つ、４つ、またはそれ以上のチオール基を有する複数のリンカーが、多重の複数のナノ粒子に同時に結合するべく用いられる（Feldheim, 2001）。複数のリンカー化合物に過剰のナノ粒子を用いると、多重の架橋およびナノ粒子の沈殿の形成を抑制する。当該技術分野において公知の複数の標準的な合成方法によって、銀の複数のナノ粒子の複数の会合体が形成される。
【００３５】
複数のナノ粒子は、複数のリンカー化合物に結合する前に、様々な複数の反応活性基を含むべく修飾される。Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Yaphank，NY）のＮａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子のような、修飾された複数のナノ粒子は商業的に入手可能である。複数のＮａｎｏｇｏｌｄ（登録商標）ナノ粒子は、１つのナノ粒子あたり単一のまたは多重のマレイミド、アミノあるいは他の複数の官能基のいずれかが結合した状態で入手できる。また、Ｎａｎａｏｇｏｌｄ（登録商標）は、正または負のいずれかに帯電した状態で利用できる。そのような修飾された複数のナノ粒子は、様々な公知の複数のリンカー化合物と結合して、二量体、三量体あるいは他の複数のナノ粒子の複数の会合体を生成する。
【００３６】
用いられるリンカー化合物の型は、溶液中で同時発生的に沈殿しない複数のナノ粒子の複数の小さな会合体の生成がされる限り限定されない。リンカーの官能基は、複数のフェニルアセチレンポリマーを含む（Feldheim, 2001）。他の例としては、リンカーの複数の官能基は、ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニルピロリドン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、あるいは他の公知の複数の高分子を含む。用いられる複数のリンカー化合物は複数の高分子に限られず、複数のシラン、複数のアルカン、誘導体化された複数のシラン、または誘導体化された複数のアルカンの他の複数の型もまた含む。
【００３７】
第１の特定の結合ペア要素は、ＳＥＲＳ活性表面と会合する前に、任意に固定化基板上に固定化される。この固定化は、本願明細書に開示された複数の方法の所定の複数の側面にしたがって、例えば、上に第２の結合ペア要素が結合している第１の結合ペア要素から、解離したＳＥＲＳ活性表面の分離をより簡単にすることによって、複数の方法を容易にする。本願明細書においてさらに詳述される、複数の特定の結合ペア要素として振舞う様々な分子を固定化する複数の方法は、当該技術分野において周知である。
【００３８】
本願明細書において提供される複数の方法は、事実上、いかなる特定の結合ペア要素の分子間相互作用（すなわち結合）の検出に用いられる。本願明細書において使用するように、"特定の結合ペア要素"という用語は、特定の結合ペアの他の要素と明確に結合する、または選択的に混成する、若しくは相互作用する分子について言及する。複数の特定の結合ペア要素は、例えば、レセプターおよび配位子、または、抗原および抗体を含む。複数の特定の結合ペア要素の１つである"検体"は、以下に限られないが、核酸、タンパク質、またはペプチド、脂質、若しくはポリサッカリドを含む。例えば、第１の特定の結合ペア要素は、抗体分子のようなタンパク質、またはその断片であり、第２の特定の結合ペア要素は、タンパク質のような生体分子であり、抗体によって認識されるエピトープを含む。一実施例によれば、第１の特定の結合ペア要素はレセプターであり、第２の特定の結合ペア要素は配位子である。
【００３９】
他の実施例によれば、第１または第２の特定の結合ペア要素は、第１または第２の特定の結合ペア要素と相互作用する核酸分子である。それゆえに、本実施形態は、複数のタンパク質と相互作用する複数の核酸分子、または複数の核酸分子と相互作用する複数のタンパク質の同定に用いられる。複数の核酸分子は比較的強いＳＥＲＳ信号を提供するので、第２の特定の結合ペア要素が核酸である所定の複数の側面においては、第１の特定の結合ペア要素のＳＥＲＳ信号の変化を検出することの代わりに、第１の特定の結合ペア要素に結合した核酸によって生成されたＳＥＲＳ信号の検出によって、第１の特定の結合ペア要素への核酸の結合が検出される。
【００４０】
第１および第２の特定の結合ペア要素が図示される。しかしながら、追加の複数の特定の結合ペア要素も存在する。例えば、第１の特定の結合ペア要素に結合する、第３の特定の結合ペア要素が含まれる。第２の特定の結合ペア要素の結合は、第３の特定の結合ペア要素と競合的に置き換わり、結果として、第１の特定の結合ペア要素によって生成されるＳＥＲＳ信号を変化させる。
【００４１】
抗体のような第１の特定の結合ペア要素は、一般的に、金属粒子のようなＳＥＲＳ活性表面と会合したときに、それ自身によって強いＳＥＲＳ信号を生成する。しかしながら、ある複数の側面においては、第１の特定の結合ペア要素によって生成されるＳＥＲＳ信号を増加させるべく、第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ標識と会合する。他の方法としては、第１の特定の結合ペア要素のＳＥＲＳ信号を増感させるべく、第１の特定の結合ペア要素の構造が修飾される。例えば、複数の修飾基が第１の特定の結合ペア要素に付加され、ＳＲＥＳ信号を増加させる。そのような修飾基は、例えば、複数のアミン基のような窒素を含む基、二重結合を含む複数の基、およびベンゼン環のような環状構造を含む複数の基が含まれる。
【００４２】
複数の抗体のような、多数の異なる生体分子に複数の標識を付加する複数の方法は周知である。ある複数の側面においては、標識はヌクレオチドであり、あるいは、本願明細書においてさらに詳細が開示される強いＳＥＲＳ信号を生成する他のいかなる分子であってもよい。例えば、ＳＥＲＳ標識は、デオキシアデノシンモノリン酸である。バックグラウンドの複数の信号が許容範囲のレベルのままであるように注意が必要ではあるが、色素もまた生体分子の標識化に用いられる。
【００４３】
例えば、第１の特定の結合ペア要素は、第１の特定の結合ペア要素の標準基板（例えば、ガラス又は金）上への固定化、およびＳＲＥＳ活性な複数の金属粒子の導入により、ＳＥＲＳ活性な粒子と会合する。他の実施形態においては、含侵した複数の金属を含むポーラスシリコン基板のようなＳＥＲＳ活性な基板上で第１の特定の結合ペア要素が固定化することにより、第１の特定の結合ペア要素はＳＥＲＳ活性な基板と会合する。本願明細書において記載したように、第１の特定の結合ペア要素またはその標識のＳＥＲＳ信号は、典型的には、第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合した後、レーザ励起下で生成される。さらに、ＳＥＲＳ信号の増感が、ＳＥＣＡＲＳのような非標準的なＳＥＲＳ検出方法を用いて取得できる。
【００４４】
他の実施形態においては、本発明は、固定化基板上に抗体を固定化する段階と、固定化された抗体を金属粒子上に吸着させて金属粒子と固定化された抗体とを接触させる段階と、固定化された抗体を抗原と接触させる段階と、および、抗体またはその断片への抗原の結合を検出する段階とを含む、抗体あるいは抗体の断片の抗原への結合を検出する方法を提供する。抗体が抗原と接触する前と後とを対比して、抗体によって生成されたＳＥＲＳ信号の差異を検出することにより結合は検出される。
【００４５】
他の実施形態によれば、本発明は、表面に第１の特定の結合ペア要素を固定化する段階と、固定化された第１の特定の結合ペア要素を金属粒子上に吸着させて金属粒子と第１の特定の結合ペア要素を接触させる段階と、金属粒子上に吸着された第１の特定の結合ペア要素を生物学的試料と接触させる段階と、および固定化された第１の特定の結合ペア要素が第２の特定の結合ペア要素と接触した前後の、固定化された第１の特定の結合ペア要素によって生成された表面増感ラマン散乱（ＳＥＲＳ）信号を検出する段階とを含む、生物学的試料中の検体を検出する方法を提供する。検出された複数のＳＥＲＳ信号の差異は、生物学的試料中に検体が存在することを暗示する。ある複数の側面においては、例えば、第１の特定の結合ペア要素は抗体、またはその断片である。例えば、第１の特定の結合ペア要素は、検体を結合する抗体である。
【００４６】
他の実施形態によれば、本発明は、抗体またはその断片を表面に固定化する段階と、抗体またはその断片を金属粒子上に固定化された抗体を吸着させて金属粒子と抗体またはその断片を接触させる段階と、および固定化された抗体またはその断片の表面増感ラマン散乱（ＳＥＲＳ）信号を検出する段階とを含み、それゆえに抗体またはその断片を検出する、抗体またはその断片を検出する方法を提供する。
【００４７】
ある複数の側面においては、第１の特定の結合ペア要素を複数の金属粒子と混合することにより、第１の特定の結合ペア要素はＳＥＲＳ活性な粒子と会合する。他の複数の側面においては、含侵した複数の金属を含むポーラスシリコン基板のようなＳＥＲＳ活性な基板上での第１の特定の結合ペア要素の固定化により、第１の特定の結合ペア要素はＳＥＲＳ活性な基板と会合する。
【００４８】
本願明細書において提供された複数の方法の様々な段階の反応時間は、複数の段階に含まれる複数の分子の接触を可能にするのに十分である。例えば、第１の特定の結合ペア要素とＳＥＲＳ活性な粒子または基板との会合の反応時間は、第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な粒子または基板への結合を可能にするのに十分である。様々な複数の反応剤が互いに結合する速度、および、それゆえに最小の培養時間は、多数の要因によって影響される。これらの複数の要因は、例えば、複数の反応剤の濃度、複数の反応材が反応容器を横切る速さ、および反応容器の大きさ並びに形状を含む。これらの複数の要因のいずれも、培養時間が、複数の反応剤が接触することを可能とするのに十分であることを確実にすべく変更され得る。本願明細書において提供される複数の方法の複数の反応時間は、典型的には１００ミリ秒から６０分の範囲であるが、１ミリ秒から１時間の範囲である。例えば、ある複数の側面において、培養時間は１００ミリ秒、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４５、あるいは６０秒、あるいは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０、２０、３０、４５、若しくは６０分である。
【００４９】
本願明細書において提供される複数の方法のいくつかの段階は、第１の特定の結合ペア要素の、ＳＥＲＳ活性な粒子または基板のような、または、固定化基板のような固体構造への会合を利用する。上述したように、本願明細書において開示した複数の方法の性能を促進すべく、第１の特定の結合ペア要素は固定化基板に固定化される。さらに、第１の特定の結合ペア要素は、表面増感ＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合する。ある複数の側面においては、ＳＥＲＳ活性な粒子または基板は、また、固定化基板である。複数の特定の結合ペア要素を複数の固体構造の表面に会合させる複数の方法が公知である。
【００５０】
ＳＥＲＳ活性な粒子と会合させるべく、第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な基板にひきつけられる。会合において、第１の特定の結合ペア要素は、内力、外力、または熱ドリフト（例えば、電荷による誘引力、磁場、光学的圧力、流体圧力、あるいは拡散）によってＳＥＲＳ活性な基板上または近傍に配置される。会合に共有またはイオン結合は不要である。第１の特定の結合ペア要素と会合すべく、ＳＥＲＳ活性基板が、第１の特定の結合ペア要素の近傍に、典型的には、第１の特定の結合ペア要素の少なくとも１００ｎｍ以内に配置される。例えば、第１の特定の結合ペア要素は、ＳＥＲＳ活性基板の表面上に吸着する。
【００５１】
第１の特定の結合ペア要素のＳＥＲＳ活性粒子または基板との会合に関して、金属ナノ粒子のようなＳＥＲＳ活性粒子、または基板への第１の特定の結合ペア要素の共有結合は、ＳＥＲＳ、ＳＥＲＲＳ、あるいはＣＡＲＳによるラマン信号の増感を生成するためには必要ではないことが理解されるであろう。例えば、ＳＥＲＳ活性粒子あるいは基板が金属粒子である場合に、第１の特定の結合ペア要素が金属粒子に吸着することにより、第１の特定の結合ペア要素が金属粒子と会合し得る。図２に図示したように、例えば、複数の金属粒子が、複数の自由電子の分布によって表面上で負に帯電しており、第１の特定の結合ペア要素、または第１の特定の結合ペア要素と会合している標識の正に帯電している部分へ吸着する。一般的には、複数の第１の特定の結合ペア要素を複数の金属粒子に吸着するために、複数の金属粒子は、複数の特定の結合ペア要素の存在下で混合される。
【００５２】
抗体を金属粒子へ吸着させる方法の説明に役立つ実施例において、銀コロイド溶液を、第１の特定の結合ペア要素と混合する。銀コロイド溶液は、公知の製法で製造される（P.C. Lee and D. Meisel, J. Phys. Chem. 86, 3391 (1992)）。複数の銀コロイド粒子と抗体との間の強力な結合を防止すべく、１００μＬのＰＥＧ−４００（ポリエチレングリコール−４００）が銀溶液に添加され、続いて、室温において１時間培養される。
【００５３】
非限定的な、本発明の方法の説明に役立つ実施例が、続くパラグラフにおいて述べられる。複数の抗体は、公知の複数の方法によって固定化される。例えば、Ｘｅｎｏｂｉｎｄ（登録商標）アルデヒドスライド（Polysciences, Inc., PA, USA）が、本願で開示した複数の方法において複数の基板として用いられる。使用前に、スライド上の複数の井戸が、１ｍｍ厚の硬化したＰＤＭＳの断片を被せることによって準備する。ＰＤＭＳは、直径５ｍｍの複数の穴を有する。抗体（９μｇ／ｍＬ）は、０．３３Ｘ  ＰＢＳ中で生成される。５０マイクロリットルの抗体がスライド上の井戸に添加され、スライドは、湿度室内において、３７℃、２時間培養される。抗体溶液を取り除いた後に、５０μＬの１０ｍＭグリシン溶液中の１％ＢＳＡを、複数のアルデヒド基をクエンチすべく、各井戸に添加する。そして、スライドはさらに１時間３７℃で培養され、５０μＬのＰＢＳＴ洗浄溶液（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０が添加された１ＸＰＢＳ）を用いて、複数の井戸は４回洗浄される。複数の銀粒子を複数の抗体と会合させるべく、銀コロイド溶液で処理された５０μＬのＰＥＧが、複数の井戸上に滴下される。溶液は、室温でさらに５分培養され、過剰な溶液は任意に取り除かれる。そして、複数の井戸は、標準的な複数の免疫学的検定と類似の複数の条件を用いた、タンパク質の結合に用いられ、ＳＥＲＳを用いた抗体−金属粒子複合体の検出が続く。標的のタンパク質を含むものと疑われる試料が、各井戸に加えられ、３７℃でさらに１時間、培養される。複数の井戸は、各回、５０μＬのバッファ溶液で４回洗浄され、続いて、５０μＬの脱イオン化水で１回洗浄される。最後に、固定化された複数の抗体のラマン信号の検出前に、３０μＬの脱イオン化水が各井戸に添加される。
【００５４】
吸着は比較的弱い化学結合である。それゆえに、吸着した複数の粒子は、化学的および物理的な状態が変化したとき、あるいは外力が加えられたときに解き放たれる。これは、ＳＥＲＳ信号の減少によって第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合を検出するために、本願において提供される複数の方法のある複数の側面において利用される。
【００５５】
ある複数の化学塩の導入によって、第１の特定の結合ペア要素の吸着は強められ、また、複数の金属粒子の会合を誘起し、典型的には、本願明細書で開示するようにより強いＳＥＲＳ信号へと導く。それゆえに、複数のある側面において、第１の特定の結合ペア要素は複数の化学塩の存在下で金属粒子と接触する。例えば、第１の特定の結合ペア要素は、塩化リチウムのようなアルカリ金属の塩化物塩、および、例えば複数の銀のナノ粒子の双方と接触する。例えば、約５０から約１５０マイクロモルの濃度で、塩化リチウムが用いられる。本願で提供される複数の方法において用いられる他の複数の化学塩は、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、およびヨウ化ナトリウムを含む。
【００５６】
本発明のある複数の側面において、金属の複数のナノ粒子は、複数の第１の特定の結合ペア要素に共有結合する。典型的には、第２の特定の結合ペア要素の第１の特定の結合ペア要素への結合は、ＳＥＲＳ信号の抑制よりもむしろ、ＳＥＲＳシグニチャが変化する結果となる。複数の特定の結合ペア要素は、複数のナノ粒子に直接的に結合するか、または、複数のナノ粒子に共有結合的、若しくは非共有結合的に結合する複数のリンカー化合物に結合する。２以上のナノ粒子を互いに架橋させるよりもむしろ、複数のリンカー化合物は、第１の特定の結合ペア要素をナノ粒子あるいはナノ粒子会合体に結合させるべく用いられる。複数のナノ粒子は、複数の誘導体化シランで覆われている。そのような修飾された複数のシランは、標準的な複数の方法を用いて複数の第１の特定の結合ペア要素に共有結合的に結合する。
【００５７】
以下で述べられる複数の表面に複数の特定の結合ペア要素を架橋させる様々な公知の複数の方法は、また、第１の特定の結合ペア要素を複数のナノ粒子に結合させるべく用いられる。第１の特定の結合ペア要素の結合に用いられる複数のリンカー化合物は、約１００ｎｍ以下のほとんどどのような長さであってもよいことが意図される。
【００５８】
上述したように、本発明のある複数の側面において、第１の特定の結合ペア要素は、固定化基板上に固定化される。特定の結合ペア要素の固定化に効果的である限り、第１の特定の結合ペア要素の固定化に用いられる基板の型は限られることはない一方で、第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素へのアクセスを提供し、第１の特定の結合ペア要素からのＳＥＲＳ放出を抑制しない。固定化表面は、磁性ビーズ、非磁性ビーズ、平面、とげのある表面、または、十分に耐久性があり、核酸のシークエンシング反応の発生に対して不活性な材料である限り、ほとんどいかなる材料をも含む固体表面のいかなる他の構造である。用いられる複数の表面の非限定的な複数の実施例は、ガラス、シリカ、シリケート、ＰＤＭＳ、ニトロセルロース、ナイロン、活性化した水晶、活性化したガラス、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリメチルメタクリレート、あるいはポリジメチルシロキサンのような他の高分子、および複数のナイトレン、複数のカルベン、および複数のケチルラジカルを含む複数の感光性高分子を含む。複数のある側面において、表面は銀または他の金属で覆われた複数の表面を含む。
【００５９】
複数の表面に複数の特定の結合ペア要素を結合する様々な方法は当該技術分野において公知であり、実施できる。例えば、複数の架橋試薬が用いられる。さらに、複数の修飾基が複数の架橋試薬に共有結合的に結合して、複数の特定の結合ペア要素間の結合の複数の相互作用が、立体障害なしに発生する。典型的な複数の架橋基は、複数のエチレングリコールオリゴマーおよび複数のジアミンを含む。結合は、共有結合あるいは非共通結合のいずれかである。複数の固定化基板への複数の特定の結合ペア要素の結合のための複数の架橋基は、複数の固定化基として本願では言及される。
【００６０】
他の特有の実施例としては、ストレプトアビジンあるいはアビジンで表面をコーティングして、ビオチニル化された抗体のような、ビオチニル化された第１の特定の結合ペア要素が続いて結合することにより固定化は達成される（複数の核酸を用いた方法である、Holmstrom et al., Anal. Biochem. 209:278-283, 1993を参照。）。固定化は、シリコン、ガラス、あるいは他の複数の表面を、ポリ−Ｌ−Ｌｙｓ（ｌｙｓｉｎｅ）でコーティングすることも含む。アミンの残渣が、架橋のためのアミノシランの使用を通して、表面上に導入される。
【００６１】
第１の特定の結合ペア要素は、始めにガラス表面をシラン化して、そして、カルボジイミドあるいはグルタルアルデヒドで活性化することにより、ガラスに結合される。他の複数の手順は、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰ）あるいはアミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＳ）のような複数の試薬を用いる。ある複数の特定の結合ペア要素は、複数の膜の表面に紫外線照射を用いて直接結合する。
【００６２】
二官能基を持つ複数の架橋試薬が、特定の結合ペア要素を表面に結合するために用いられる。二官能基性の複数の架橋試薬は、例えば、アミノ基、グアジニノ基、インドール基、あるいはカルボキシル基のような複数の官能基の選択性に応じて分類される。これらの中で、複数の自由なアミノ基向けの複数の試薬が、商業的に入手可能であり、合成が容易で、それらが用いられる条件下の穏やかな複数の反応条件のために人気がある。複数の分子を架橋する実験的な複数の方法が、米国特許第５６０３８７２号および第５４０１５１１号に開示されている。複数の架橋試薬は、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能基性オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）のような複数のカルボジイミドを含む。
【００６３】
本願で述べたように、本願で提供される複数の方法のある複数の側面において、第１の特定の結合ペア要素は、ＳＥＲＳ活性基板上で第１の特定の結合ペア要素が固定化することにより、ＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合する。これらの複数の実施形態において、固定化基番は、また、ＳＥＲＳ活性な基板である。ＳＥＲＳ活性な複数の基板の多数の異なる型が当該技術分野において公知である。例えば、ラマン活性金属を含む、上述した複数の固定化基板が用いられる。
【００６４】
本願で提供した複数の方法の当該側面のある複数の実施例において、第１の特定の結合ペア要素が会合し、典型的には固定化されているＳＥＲＳ活性な基板は、含侵された複数の金属を含むポーラスシリコン基板のような、ポーラス金属基板である。ラマン活性な複数の金属のような、１つ以上の金属の均一な層で複数のポーラス基板をコーティングする複数の方法は公知である。本発明の特定の複数の実施形態においては、本願で開示されている複数のポーラス基板は複数のポーラスシリコン基板であるが、それらの複数の実施形態に限られない。熱の適用に耐えうるいかなるポーラス基板も、開示した複数の方法、複数のシステム、および／または装置に用いられる。ある複数の実施形態によれば、薬３００℃、４００℃、５００℃、６００℃、７００℃、８００℃、９００℃、または１０００℃の熱の適用が意図されている。本発明のある複数の実施形態によれば、ポーラス基板は剛体である。ポーラスシリコンに限られず、ポーラスポリシリコン、複数のポーラス金属グリッド、およびポーラスアルミニウムを含む、さまざまな複数のポーラス基板が公知である。複数のポーラス基板の複数の実験的な製造方法が、さらに下記で開示される。
【００６５】
複数のポーラスシリコン基板は、公知の複数の技術で製造される（例えば、米国特許第６２４９０８０号および６４７８９７４号）。例えば、ポーラスポリシリコン層は、半導体基板上に、低圧化学気相蒸着法（ＬＰＣＶＤ）を用いて形成される。ＬＰＣＶＤの複数の条件は、例えば、約２０パスカルの圧力、約６４０℃の温度、および約６００ｓｃｃｍ（標準立方センチメートル）のシランガス流量を含む（米国特許第６２４９０８０号）。ポリシリコン層は、例えば、ＨＦ（フッ化水素酸）を用いた電気化学陽極酸化、または硝酸およびフッ化水素酸を用いた化学エッチングによりエッチングされ、多孔質となる（米国特許第６４７８９７４号）。典型的には、そのような複数の方法によって形成される複数のポーラスポリシリコン層は、厚さがおよそ１μｍ（マイクロメートル）以下に限られる。その一方で、典型的には約５００μｍの厚さを有するバルクのシリコン基板の厚さを通してポーラスシリコンはエッチングされる。
【００６６】
複数のポーラス基板は、ナノ結晶シリコンの１つ以上の層を含む。ナノ結晶シリコンを製造する様々な方法が公知である（例えば、Petrova-Koch et al.,"Rapid-thermal-oxidized porous silicon-the superior photoluminescent Si" Appl. Phys. Lett. 61:943, 1992; Edelberg, et al., "Visible luminescence from nanocrystalline silicon" Proc. 7th Int. Conf. on Modulated Semiconductor Structures, Madrid, pp. 605-608, 1995; Zhao, et al., "Nanocrystalline Si: a material constructed by Si quantum dots" 1st Int. Conf. on Low Dimensional Structures and Devices, Singapore, pp. 467-471, 1995; Lutzen et al., Structural characteristics of ultrathin nanocrystalline silicon films formed by annealing amorphous silicon, J. Vac. Sci. Technology B 16: 2802-05 1998; 米国特許第5770022号、5994164号、6268041号、6294442号、および6300193号）。本願で開示した複数の方法、複数のシステム、および装置は、複数のナノ結晶シリコン基板の製造方法に限られるものではなく、他の公知の手法を用いてもよい。
【００６７】
ＳＥＲＳ活性基板が金属でコーティングされたポーラス基板である、本発明のある側面においては、基板は純シリコンに限られず、チップ製造業において公知の窒化ケイ素、酸化ケイ素、二酸化ケイ素、ゲルマニウムおよび／または他の複数の材料を包含する。複数のドーパントのような他の微量の材料もまた存在する。ポーラスシリコン１１０、２１０は、７８３ｍ２／ｃｍ３までの大きな表面積を有しており、複数の表面増感ラマン分光技術のような複数の応用に対して非常に大きな表面積を提供する。
【００６８】
複数のポーラスシリコン基板に含浸している複数の金属は、典型的にはラマン活性な複数の金属である。実験的な複数のラマン活性な金属は、金、銀、白金に限られず、銅およびアルミニウムをも含む。金属コーティングの複数の公知の手法は、電気めっき法、カソードエレクトロマイグレーション法、複数の金属の蒸着法およびスパッタ法、複数の種結晶を用いた触媒プレーティング法（即ち、金をメッキすべく、銅／ニッケルの種を用いる方法）、イオンプランテーション、拡散法、あるいは複数のポーラス基板上に複数の金属薄膜をメッキするための公知の他のいかなる方法をも含む（Lopez and faucet, "Erbium emission from porous silicon one-dimensional photonic band gap structures" Appl. Phys. Lett. 77: 3704-6, 2000; 米国特許第5561304号、6171945号、および6359276号参照。）。他の非限定的な金属コーティングの例は、無電解めっきを含む（例えば、Gole et al., "Patterned metallization of porous silicon from electroless solution for direct electrical contact" J. Electrochem. Soc. 147: 3785, 2000）。組成、および／または金属層の厚さは、複数の金属コーティングされたポーラス基板の光学的および／または電気的な複数の特性を最適化すべく、制御される。
【００６９】
本願で提供された本発明の複数の所定の方法は、検出可能なラマンシグニチャを生成する能力を増感させるべく、複数の特定の結合ペア要素内に標識を組み込むことを含む。ラマン標識は、いかなる有機または無機分子、原子、錯体、あるいは検出可能なラマン信号を生成できる構造であってよく、以下のものに限られないが、複数の合成分子、複数の色素、フィコエリトリンのような複数の天然顔料、Ｃ６０、複数のバッキーボール、および複数のカーボンナノチューブあるいは複数のナノプリズムのような複数の有機ナノ構造、および複数の量子ドットのような複数のナノスケールの半導体を含む。複数のラマン標識の多数の実施例が以下で開示される。当業者ならば、そのような複数の実施例に限られず、および、公知のラマン分光法によって検出されるいかなる有機または無機の原子、分子、化合物、または構造を、ラマン標識が包含することを理解するであろう。
【００７０】
ラマン分光法に用いられる複数の標識の非限定的な複数の実施例は、ＴＲＩＴ（テトラメチルローダミンイソチオール）、ＮＢＤ（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１,３−ジアゾール）、テキサスレッド色素、フタル酸、テレフタル酸、イソフタル酸、クレシルバイオレット、クレシルブルーバイオレット、ブリリアントクレシルブルー、パラアミノ安息香酸、エリトロシン、ビオチン、ジゴキシゲニン、５−カルボキシ−４’、５’−ジクロロ−２’、７’−ジメトキシフルオレセイン、５−カルボキシ−２’、４’、５’、７’−テトラクロロフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシローダミン、６−カルボキシローダミン、複数の６−カルボキシテトラメチルアミノフタロシアニン、複数のアゾメチン、複数のシアニン、複数のキサンチン、複数のスクシニルフルオレセイン、およびアミノアクリジンを含む。当該技術分野において公知のように、一般的な複数の多環式芳香族化合物は複数のラマン標識として機能する。これら、および他の複数のラマン標識は商業的供給源から取得できる（例えば、Molecular Probes, Eugene, OR）。
【００７１】
用いられ得る他の複数の標識は、シアン化物、チオール、塩素、臭素、メチル、リン、および硫黄を含む。複数のカーボンナノチューブがまた、複数のラマン標識として用いることができる。ラマン分光法において複数の標識を用いることは公知である（例えば、米国特許第5306403号および6174677号参照。）。当業者ならば、複数のラマン標識がヌクレオチドの異なる複数の型に結合した場合に、区別可能なラマンスペクトルを生成することを理解するであろう。
【００７２】
複数の標識は、複数の特定の結合ペア要素に直接的に結合することができ、また、様々なリンカー化合物を介して結合することができる。他の複数の分子と共有結合的な反応をすべく設計された複数の反応活性な基を含む複数のラマン標識は、商業的に入手可能である（例えば、Molecular Probes, Eugene, OR）。
【００７３】
他の実施形態によれば、装置は、基板上に固定化され、ＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合した特定の結合ペア要素を含む反応チャンバと、反応チャンバと流体の伝達をするチャネルと、およびチャネルに操作可能に結合したラマン検出ユニットとを含んで提供される。装置は、本願で提供した複数の方法の実行に用いられ、そこでは、第１の特定の結合ペア要素の第２の特定の結合ペア要素への結合がラマン検出ユニットの使用によって検出される。
【００７４】
マイクロ流体工学およびナノ流体工学が、本願で開示された複数の方法の実行に用いられる。これらの複数の実施形態によれば、様々な段階の反応が実行される反応チャンバの複数の寸法は、少なくとも１つの寸法が、７ナノメータから１００ミリメータの範囲内である。一般的には、これらの複数の実施形態は、より大きな複数のチャンバを超えて、必要な培養時間を減少させる。ある複数の側面において、反応チャンバは、１００マイクロメータ以下であり、例えば、１００マイクロメータ、５０マイクロメータ、２５マイクロメータ、２０マイクロメータ、１５マイクロメータ、１０マイクロメータ、５マイクロメータ、１マイクロメータ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎｍ、５０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍ、１５ｎｍ、１０ｎｍ、９ｎｍ、８ｎｍ、あるいは７ｎｍの少なくとも１つの寸法を含む。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本願で開示した方法は、微小電気機械システム（ＭＥＭＳ）において実行される。ＭＥＭＳは、複数の機械的部品、複数のセンサ、複数のアクチュエータ、および複数の電子機器を含む統合された複数のシステムである。それらの複数の部品の全ては、シリコンベースまたは等価基板を含む一般的なチップ上のおける公知の複数の微細加工技術によって製造される（例えば、Voldman et al., Ann. Rev. Biomed. Eng. 1: 401-425, 1999）。ＭＥＭＳの複数のセンサ部品は、機械的、熱的、生物学的、化学的、光学的、および／または磁気的な現象の測定に用いられる。複数の電子機器は、複数のセンサからの情報を処理して、複数のポンプ、複数のバルブ、複数のヒータ、複数の冷却器、複数のフィルタ等のような複数のアクチュエータ部品を制御し、それによってＭＥＭＳの機能を制御する。
【００７６】
ＭＥＭＳの複数の電子部品は、集積回路（ＩＣ）の複数のプロセスを用いて製造される（例えば、ＣＭＯＳ、バイポーラ、あるいはＢＩＣＭＯＳプロセス）。それらは、フォトリソグラフ、およびコンピュータチップの製造において公知の複数のエッチング方法を用いてパターンが形成される。シリコンウエハの複数の部分を選択的にエッチングして取り除き、あるいは、複数の機械的および／または電気機械部品を形成する複数の新しい構造の層を加える、適合する複数の"マイクロマシン"プロセスを用いて、複数の微小機械部品は製造される。
【００７７】
ＭＥＭＳ加工における基本的な複数の手法は、基板上に材料の薄膜を蒸着する方法、フォトリソグラフィーイメージングあるいは他の公知の複数のリソグラフィーの手法によって複数の膜状にパターンマスクを適用する方法、および複数の膜を選択エッチングする手法を含む。薄膜は数ナノメータから１００マイクロメータの範囲内の厚さを有する。使用される複数の蒸着技術は、化学気相蒸着法（ＣＶＤ）、電気めっき、エピタキシー、および熱酸化のような複数の化学的手段、並びに物理気相蒸着法（ＰＶＤ）および鋳造のような複数の物理的手段を含む。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態において、ＳＥＲＳ活性な複数の粒子または複数の基板、および／または複数の固定化基板は、複数のマイクロ流体チャネル、複数のナノチャネル、および／または複数のマイクロチャネルのような様々な流体で満たされた複数の区画に取り付けられている。これら、および装置の他の複数の構成部品は、例えば、複数の半導体チップ、および／またはマイクロキャピラリー、または複数のマイクロ流体チップとして知られているチップの形態のような単一のユニットとして形成される。その他の方法として、金属でコーティングされたポーラスシリコン基板のような固定化基板は、シリコンウエハから取り除かれ、装置の他の複数の構成部品に取り付けられる。そのような複数のチップに用いられることが知られているいかなる複数の材料も、開示された装置において使用され、シリコン、二酸化シリコン、窒化ケイ素、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、プラスチック、ガラス、水晶を含む。
【００７９】
複数のチップのバッチ製造の複数の手法は、コンピュータチップ製造、および／またはマイクロキャピラリーチップ製造の分野において周知である。そのような複数のチップは、フォトリソグラフィーおよびエッチング、レーザアブレーション、射出成型、鋳造、分子ビームエピタキシー、ディップペンナノリソグラフィー、化学気相蒸着（ＣＶＤ）製造、電子ビームまたは集束イオンビーム技術、あるいはインプリンティング技術のような当該技術分野において公知のどのような手法によっても製造される。非限定的な複数の実施例は、プラスチックやガラスのような流動性を有し、光学的に透明な材料を用いた従来の成型方法、二酸化シリコンのフォトリソグラフィーおよびドライエッチング手法、二酸化シリコン１２０基板上のアルミニウムのマスクにパターンを形成すべく、ポリメチルメタクリレートのレジストを用いた電子ビームリソグラフィーをし、続いて、反応性イオンエッチングする手法を含む。本発明のある複数の実施形態において、複数のナノ電子機械システムの製造の複数の公知の手法が用いられる（例えば、Craighead, Science 290; 1532-36, 2000を参照。）。微細加工された複数のチップの様々な形態が、例えば、Caliper Technologies Inc. (Mountain View, CA)およびACLARA BioSciences Inc. (Mountain View, CA)から商業的に入手可能である。
【００８０】
本発明のある複数の実施形態において、ガラス、シリコン、水晶、あるいは他の光学的に透明ないかなる材料のように、装置の一部分あるいは全てが、ラマン分光法に用いられる励起および放出の複数の周波数での電磁波に対して透過であるように選択される。複数のタンパク質、複数のペプチド、複数の核酸、複数のヌクレオチドのような様々な生物分子にさらされる流体で満たされた複数の区画にとって、そのような複数の分子にさらされる複数の表面は、例えば、表面を疎水性から親水性の表面へ変換する、および／または表面への複数の分子の吸着を減少させるコーティングによって修飾される。ガラス、シリコン、水晶、および／またはＰＤＭＳのような一般的な複数のチップ材料の表面修飾は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第6263286号）。そのような複数の修飾は、以下のものに限定はされないが、商業的に入手可能な複数のキャピラリーコーティング剤（Supelco, Bellafonte, PA）、ポリエチレンオキサイドあるいはアクリルアミド、または当該技術分野において公知の他のコーティング剤のような様々な複数の官能基を有する複数のシランを用いたコーティングを含む。
【００８１】
第１の特定の結合ペア要素は、本願で提供されて複数の方法では、ラマン検出ユニットを使用したＳＥＲＳによって検出される。ラマン検出ユニットは、レーザ励起および波長選択検出器を含む。光源は典型的には、当該技術分野において公知のレーザ光で、より詳細が本願で述べられる。光源からの光は、第１の特定の結合ペア要素に向けて発射され、検出器によって検出される。
【００８２】
検出ユニットは、レーザのような励起源、およびラマン分光検出器を含む。励起源は、反応チャンバまたはチャネルを励起ビームで照射する。励起ビームは、第１の特定の結合ペア要素と相互作用して、複数の電子がより高いエネルギー状態に励起される結果となる。複数の電子が低いエネルギー状態に戻ると、ラマン検出器によって検出されるラマン放出信号を放射する。
【００８３】
スペクトロメータまたはモノクロメータアレイのような検出器からデータは集められ、情報処理制御システムへと提供される。情報処理制御システムは、バックグラウンドの複数の信号の除去のような、当該技術分野で公知の標準的な複数の手順を実行する。さらには、情報処理制御システムは、データを分析して、第１の特定の結合ペア要素が第２の特定の結合ペア要素に接触する前後で得られたＳＥＲＳスペクトルの間でＳＥＲＳ信号に変化が生じたか否かを決定する。例えば、情報処理制御システムは、標準の統計の複数の手法を用いる。
【００８４】
前述の通り、本願で提供した複数の方法の実行のための装置は、典型的には反応チャンバを含む。反応チャンバは、固定化基板、第１の特定の結合ペア要素、第２の特定の結合ペア要素、および／または、ラマン活性な粒子若しくは基板を水性環境中で保持するように設計される。反応チャンバは、例えば、複数のペルチェ部品の組み込み、または当該技術分野において公知のほかの複数の方法によって、温度が制御されるように設計される。拡散重合に用いられる低容積の液体の温度を制御する複数の方法は、当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第5038853号、5919622号、6054263号、および6180372号参照。）。
【００８５】
反応チャンバおよび関連するどのような複数の流体チャネルも、検出ユニット、廃棄ポート、挿入ポート、複数の金属粒子のソース、または特定の結合ペア要素への複数の接続を提供する。反応チャンバは、コンピュータチップの製造またはマイクロキャピラリーチップの製造分野において公知の、バッチ製造の複数の手法で製造される。
【００８６】
反応チャンバおよび装置の他の複数の部品は、単一の集積チップとして製造される。そのようなチップは、例えば、フォトリソグラフィーおよびエッチング、レーザアブレーション、射出成型、鋳造、分子ビームエピタキシー、ディップペンナノリソグラフィー、化学気相蒸着（ＣＶＤ）製造、電子ビームまたは集束イオンビーム技術、あるいはインプリンティング技術のような当該技術分野において公知の複数の手法によって製造される。非限定的な複数の実施例は、プラスチックやガラスのような流動性を有し、光学的に透明な材料を用いた従来の成型方法、二酸化シリコンのフォトリソグラフィーおよびドライエッチング手法、二酸化シリコン基板上のアルミニウムのマスクにパターンを形成すべく、ポリメチルメタクリレートのレジストを用いた電子ビームリソグラフィーをし、続いて、反応性イオンエッチングする手法を含む。複数のマイクロ流体チャネルは、Ａｎｄｅｒｓｏｎらによる手法によって、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の成型によって製造される（"Fabrication of topologically complex three-dimensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping", Anal. Chem. 72: 3158-3164, 2000）。複数のナノ電気機械システムの製造に用いられる複数の手法が用いられる（例えば、Craighead, Science 290: 1532-36, 2000を参照。）。複数の微細加工されたチップは、Caliper Technologies Inc.（Mountain View, CA）およびACLARA BioSciences Inc.（Mountain View, CA）のような複数の供給元から商業的に入手可能である。
【００８７】
複数の集積チップにおいて使用されることが公知のどのような複数の材料も、本願で提供した複数の手法を実行するための装置に用いられ、シリコン、二酸化シリコン、窒化ケイ素、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、プラスチック、ガラス、水晶等を含む。ガラス、シリコン、水晶、あるいは他の光学的に透明ないかなる材料のように、装置の一部分あるいは全てが、ラマン分光法に用いられる励起および放出の複数の周波数での電磁波に対して透過であるように選択される。複数の核酸、および／または複数のヌクレオチドにさらされる、反応チャンバ、マイクロ流体チャネル、ナノチャネル若しくはマイクロチャネルのような、流体が満たされた複数の区画にとって、そのような複数の分子にさらされる複数の表面は、例えば、表面を疎水性から親水性の表面へ変換する、および／または表面への複数の分子の吸着を減少させるコーティングによって修飾される。ガラス、シリコン、および／または水晶のような一般的な複数のチップ材料の表面修飾は当該技術分野において公知である（例えば、米国特許第6263286号）。そのような複数の修飾は、以下のものに限定はされないが、商業的に入手可能な複数のキャピラリーコーティング剤（Supelco, Bellafonte, PA）、ポリエチレンオキサイドあるいはアクリルアミド、または当該技術分野において公知の他のコーティング剤のような様々な複数の官能基を有する複数のシランを用いたコーティングを含む。
【００８８】
複数の特定の結合ペア要素は、マイクロ流体チャネル、ナノチャネル、またはマイクロチャネルを通って、反応チャンバおよび検出ユニットに向かって流れる。マイクロチャネルまたはナノチャネルは、約３ｎｍと約１μｍとの間の直径を有する。チャネルの直径は、励起レーザビームよりもわずかに小さい大きさとなるべく選択される。チャネルは、マイクロキャピラリー（例えば、ACLARA BioSciences Inc., Mountain View, CAから入手可能である）、または液体集積回路（例えば、Caliper Technologies Inc., Mountain View, CA）を含む。そのような複数のマイクロ流体プラットフォームは、ナノリットルの容量の試料を必要とするだけである。複数のヌクレオチドは、溶媒のバルクのフローによって、電気浸透によって、あるいは、当該技術分野において公知のほかの複数の手法によって、マイクロ流体チャネルを通って流れる。
【００８９】
マイクロキャピラリー電気泳動の複数のデバイスを含む、複数のマイクロ流体デバイスの微細加工が、例えば、Jacobsen et al. (Anal. Biochem, 209: 278-283, 1994); Effenhauser et al. （Anal. Chem. 66: 2949-2953, 1994）; Harrison et al. （Science 261: 895-897, 1993）および米国特許第5904824号公報に述べられている。典型的には、これらの複数の方法は、シリカ、シリコン、または他の複数の結晶性基板若しくは複数のチップ上でのミクロンスケールの複数のチャネルのフォトリソグラフィーエッチング手法を含み、開示した複数の方法および複数の装置の使用に容易に適用される。複数のナノチャネルのような、より小さな直径の複数のチャネルは、マイクロチャネルの内側をコーティングして狭い直径にするような技術、あるいはナノリソグラフィーを使用する技術、集束電子ビーム技術、集束イオンビーム技術あるいは集束原子レーザ技術などの、公知の複数の方法によって作成される。
【００９０】
検出ユニットは、複数の特定の結合ペア要素によって生成される複数のラマン信号を取得すべく設計される。これは典型的に、ＳＥＲＳ検出を含む。表面増感ラマン分光法（ＳＥＲＳ）または表面増感共鳴ラマン分光法（ＳＥＲＲＳ）の複数のバリエーションも使用される。ＳＥＲＳおよびＳＥＲＲＳにおいて、銀、金、白金、銅、またはアルミニウムの表面、若しくは複数のナノ構造の表面のような複数の金属粗面上に吸着、あるいは会合した複数の分子により、ラマン検出の感度は１０６以上の係数で増加する。
【００９１】
検出ユニットの非限定的な実施例は、米国特許第6002471号公報に開示されている。当該実施形態においては、励起ビームは、波長が５３２ｎｍの周波数二重Ｎｄ：ＹＡＧレーザ、または波長が３６５ｎｍの周波数二重チタン：サファイアレーザのいずれかによって生成される。しかしながら、励起波長は、本願で提供した複数の方法に限定されることなく、大幅に変化し得る。複数のパルスレーザビーム、または複数の連続レーザビームが用いられる。励起ビームは、共焦点光学素子および顕微鏡対物を通り、反応チャンバ上に集束される。複数の特定の結合ペア要素からのラマン放出光は、顕微鏡対物および共焦点光学素子によって集められ、スペクトル分離のためのモノクロメータに結合される。共焦点光学素子は、複数のダイクロイックフィルター、複数のバリアフィルター、複数の共焦点ピンホール、複数のレンズ、およびバックグラウンドの信号を減少させる複数のミラーを含む。標準の全分野に及ぶ光学素子は、共焦点光学素子と同様に用いられる。ラマン放出信号はラマン検出器によって検出される。検出器は、信号の計数およびデジタル処理をするコンピュータと連動するアバランシェフォトダイオードを含む。
【００９２】
複数の検出ユニットの他の複数の実施例が、例えば、米国特許第5306403号公報に開示されており、単一フォトン計数モードで操作されるガリウムヒ素の光電子増倍管（RCA Model C31034あるいはBurle Industries Model C3103402）が備えられたＳｐｅｘ  Ｍｏｄｅｌ  １４０３  二重グレーティング分光光度計を含む。励起源は、ＳｐｅｃｔｒａＰｈｙｓｉｃｓのアルゴンイオンレーザ、Ｍｏｄｅｌ  １６６の５１４．５ｎｍのライン、およびクリプトンイオンレーザ（Innova 70, Coherent）の６４７．１ｎｍのラインである。
【００９３】
他の複数の励起源は、波長３３７ｎｍの窒素レーザ（Laser Science Inc.）および波長３２５ｎｍのヘリウムカドミウムレーザ（Linconox）を含む（米国特許第6174677号公報）。励起ビームは、バンドパスフィルタ（Corion）によってスペクトル的に浄化され、６Ｘ対物レンズ（Newport, Model L6X）を用いて、反応チャンバ上に集束される。対物レンズは、励起ビームと放出されるラマン信号とが直角の幾何学的配置を形成するホログラフィックビームスプリッタ（Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18）を用いて、複数のヌクレオチドを励起すること、およびラマン信号を収集することの双方に使用される。ホログラフィックノッチフィルタ（Kaiser Optical Systems, Inc.）が、レイリー散乱放射を減少させるべく用いられる。他の複数のラマン検出器は、赤色増感強化型電荷結合素子（ＲＥ−ＩＣＣＤ）検出システム（Princeton Instruments）を備えたＩＳＡ  ＨＲ−３２０分光器を含む。複数の電荷注入デバイス、複数のフォトダイオードアレイ、または複数のフォトトランジスタアレイのような、他の型の複数の検出器も用いられる。
【００９４】
当該技術分野において公知のラマン分光法または関連する複数の技術のいかなる適切な形態または構成を、複数の特定の結合ペア要素の検出に用いることができ、以下のものに限られないが、標準ラマン散乱、共鳴ラマン散乱、表面増感ラマン散乱、表面増感共鳴ラマン散乱、コヒーレントアンチストークスラマン分光法（ＣＡＲＳ）、誘導ラマン散乱、逆ラマン分光法、誘導ゲインラマン分光法、ハイパーラマン散乱、分子光学レーザ検査（ＭＯＬＥ）、またはラマンマイクロプローブまたはラマン顕微鏡または共焦点ラマンマイクロ分光分析、３次元あるいは走査ラマン、ラマン飽和分光法、時間分解共鳴ラマン、ラマンデカップリング分光法、若しくはＵＶラマン顕微鏡を含む。
【００９５】
複数のある側面においては、本願で提供される複数の方法は、第１の特定の結合ペア要素をＣＡＲＳを用いて検出する方法を含む。第１の特定の結合ペア要素がＳＥＲＳ活性な粒子または基板と会合した後に、第１の特定の結合ペア要素は、ＳＥＣＡＲＳ検出を用いて検出される。周知のように、ＣＡＲＳは、自然発生のラマン散乱の非線形光学変換であるコヒーレントアンチストークスラマン散乱を検出する。当該手法において、特定のラマン遷移がいわゆる"ポンプレーザ"および"ストークスレーザ"の２つのレーザ領域によってコヒーレントに引き起こされ、アンチストークス信号領域を生成する（Muller et al., CARS microscopy with folded BoxCARS phasematching. J. Microsc. 197: 150-158, 2000）。プロセスのコヒーレントな性質は、特定の振動モードへの複数のレーザ領域の十分なカップリングを許容して、当該モードからの信号を大きなオーダーの大きさで増加させる。ＳＥＣＡＲＳはＳＥＲＳ基板と会合した分子のＣＡＲＳによる検出である。
【００９６】
上述したように、他の実施形態によれば、本願で提供されたのは、ＳＥＲＳ粒子または基板と同様に、抗体のような特定の結合ペアが組み込まれたキットである。複数のある側面においては、キットは、ＳＥＲＳ粒子または基板と会合した特定の結合ペア要素を含む。さらには、キットは、固定化基板を含む。ある複数の側面においては、第１の特定の結合ペア要素がキットに含まれ、固定化基板に結合されており、状況に応じてＳＥＲＳ粒子または基板と会合する。キットはまた、例えば、特定の結合ペア要素を識別する複数の試薬を含有する。
【００９７】
以下の複数の実施例は、本発明を限定することなく説明することが意図される。
【００９８】
（実施例１）（標識化されていない抗体のＳＥＲＳ検出）当該実施例は、ＳＥＲＳを用いた抗体の検出を説明する。複数の抗体分子は、Ｐｉｅｒｃｅ（Rockford, IL）によって開発され利用可能となった、ＥＤＣ（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）化学反応を用いて、金がコーティングされた基板上に固定化された。対照は、ＥＤＣ処理された抗体のないブランク基板であった。コロイド状の銀の混合物８０マイクロリットル（Lee and Meisel, J. Phys. Chem. 1982, 986, 3391-3396による製造法によって合成された）および塩化リチウム塩溶液が、スペクトル収集の前に試料および対照上に加えられた。
【００９９】
ラマン顕微鏡が、抗体試料および対照試料からの複数のスペクトルを収集すべく用いられた。ラマン顕微鏡は、アルゴンイオンレーザ（Coherent, Santa Clara, CA）、光学顕微鏡（Nikon）、複数の光学フィルター（Kaiser Optical, Ann Arbor, MI）、分光器（Acton Research, Acton, MA）、およびＣＣＤカメラ（Roper Scientific, Princeton, NJ）を含む。レーザは、焦点で１００ｍＷ以下の出力を提供し、各スペクトルは、１００ミリ秒間収集された。
【０１００】
図３Ａおよび図３Ｂにおいて図示したように、抗体試料は、対照試料においては出現しなかった、検出可能なＳＥＲＳスペクトルを生成した。これらの結果は、複数の抗体がＳＥＲＳ信号を生成したことを示す。
【０１０１】
本発明が上記実施例に関連して述べられたが、複数の変更および複数の変形が本発明の精神および範囲内に含まれることが、理解されるであろう。したがって、本発明は添付した特許請求の範囲の記載によって特定される。
【図１】
2007526488.tif 000002
【図２】
2007526488.tif 000003
【図３Ａ】
2007526488.tif 000004
【図３Ｂ】
2007526488.tif 000005
【国際調査報告】
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