(57)【要約】  脱ターゲット型及び再ターゲット型の組換えアデノウィルス・ウィルス粒子及びベクターが提供される。具体的には、コクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)にin vivoで結合するアデノウィルス由来の修飾型線維であって、線維軸部に修飾を含有する修飾型線維が提供される。このような線維を発現させるアデノウィルス(Ad)粒子は、CARとの結合の低減を示す。従って脱ターゲット型Ad粒子が提供され；また再ターゲット型粒子も提供される。
2007531507.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維タンパク質軸部に対する修飾を含む修飾型アデノウィルス線維であって、該修飾が：
最後の完全反復の修飾と、
3番目のβ-反復に対応するβ-反復の修飾及び最後の完全反復の修飾と；
最後の完全反復の修飾、及び3番目のβ-反復内のSEQ ID NO:44で示されたアミノ酸配列TTVT/Sに対応する隣接アミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸の修飾のうちの一方又は両方の修飾と、
から選択された修飾を含み、これにより、該線維又は該線維を含有するウィルス粒子と、コクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)との結合が、未修飾型線維と比較して低減される、
修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２】
線維タンパク質軸部に対する修飾を含み、これにより、該修飾された線維とコクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)との結合が、低減又は排除される修飾型アデノウィルス線維であって、
未修飾型線維がコクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)に結合し；そして、
該修飾が、該軸部の最後の完全β-反復、又は3番目のβ-反復及び最後の完全β-反復、又は最後の完全β-反復及びTTVT/Sモチーフ(SEQ ID NO:44)又は対応モチーフを含む3番目のβ-反復の一部のうちの一方又は両方、に対応する反復の修飾
を含む、
修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３】
該修飾型線維は、未修飾型線維の結合アフィニティの50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、1%未満でCARに結合する、請求項1又は2に記載の修飾型線維。
【請求項４】
該修飾型線維が、該未修飾型線維よりも剛性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項５】
該修飾が、該3番目の反復に対応する線維軸部反復内の1つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失、挿入、又は置換である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項６】
該未修飾型線維が、C血清型アデノウィルスの線維である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項７】
該C血清型アデノウィルスが、Ad2又はAd5である、請求項6に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項８】
該修飾型線維が、該未修飾型線維よりも剛性であり短い、請求項1〜7のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項９】
SEQ ID NO:42又は43で示されたアミノ酸配列に対応する隣接アミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸が修飾される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１０】
該3番目のβ-反復を、D血清型線維軸部反復配列に由来する対応反復と置換することにより、該3番目のβ-反復が修飾される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１１】
該D血清型アデノウィルスが、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p及びAd37から成る群から選択される、請求項10に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１２】
該3番目のβ-反復を、SEQ ID NO:58, 66, 67及び68から成る群から選択された対応反復と置換することにより、該3番目のβ-反復が修飾される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１３】
該修飾が、該最後の完全β-反復に対応する線維軸部β-反復内、及び/又は該3番目のβ-反復に対応する線維軸部β-反復内の1つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失、挿入、又は置換である、請求項1〜12のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１４】
該未修飾型線維が、C血清型アデノウィルス線維である、請求項13に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１５】
該C血清型アデノウィルスが、Ad2又はAd5である、請求項12に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１６】
該修飾が、SEQ ID NO:46又は47で示されたアミノ酸配列に対応する隣接アミノ酸配列内の1つ以上のアミノ酸の修飾である、請求項15に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１７】
該修飾が、該最後の完全β-反復を、D血清型アデノウィルス線維軸部に由来する対応反復配列と置換することを含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１８】
該D血清型アデノウィルスが、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p及びAd37から成る群から選択される、請求項17に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項１９】
該修飾が最後の完全反復内にあり；そして該最後の完全反復は、SEQ ID NO:49で示されるアミノ酸配列に対応する隣接アミノ酸における反復内の1つ以上のアミノ酸の変化を含む、請求項13〜18のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２０】
該修飾が最後の完全反復内にあり；そして該最後の完全反復は、SEQ ID NO:48, 59, 60及び61から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項13〜18のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２１】
該線維軸部の3番目の反復に対応する隣接アミノ酸配列が欠失されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２２】
該線維軸部の最後の完全反復に対応する隣接アミノ酸配列が欠失されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２３】
該3番目の反復に対応する隣接アミノ酸配列、及び該最後の完全反復に対応する隣接アミノ酸配列が修飾されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２４】
該修飾が、該3番目の反復及び/又は該最後の完全反復に対応する線維軸部反復内の1つ以上のアミノ酸の突然変異、欠失、挿入、又は置換である、請求項22又は23に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２５】
該未修飾型線維軸部が、C血清型アデノウィルスに由来する、請求項24に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２６】
該C血清型アデノウィルスが、Ad2又はAd5である、請求項25に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２７】
該3番目の反復及び該最後の完全反復に対応する、該修飾された反復が、D血清型アデノウィルスに由来する、請求項25に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２８】
該D血清型アデノウィルスが、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p及びAd37から成る群から選択される、請求項27に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項２９】
該3番目の反復が、SEQ ID NO:58, 66, 67及び68から成る群から選択された配列を含み、そして、該最後の完全反復が、SEQ ID NO:48, 59, 60及び61から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３０】
該3番目の反復の配列が、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p及びAd37に由来する線維タンパク質の対応反復配列から選択され；そして、該最後の完全反復が、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p及びAd37に由来する線維タンパク質の対応反復配列から選択される、請求項25に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３１】
該修飾型アデノウィルス線維がさらに、線維タンパク質内に1つ以上の付加的な修飾を含み、これにより、該修飾型線維はCAR以外の受容体に、該未修飾型線維が該受容体に結合するよりも大きなアフィニティで結合する、請求項1〜30のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３２】
該修飾型アデノウィルス線維がさらに、該線維タンパク質中に1つ以上の付加的な修飾を含み；そして、該修飾が、該修飾型線維とCARとの任意の結合をさらに低減又は排除する、線維節部の修飾である、請求項1〜30のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３３】
付加的な修飾が、該線維軸部内のヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン(HSP)結合部位の修飾である、請求項31に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３４】
付加的な修飾が、該線維節部の修飾である、請求項31又は32に記載の修飾型アデノウィルス。
【請求項３５】
該未修飾線維と比較して、該線維が短縮されているか、又はそのフレキシビリティが低減されている、請求項1〜34のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３６】
該線維節部が、CARと相互作用しないアデノウィルスに由来する線維節部と置換される、請求項34に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３７】
CARと相互作用しない該アデノウィルス線維節部が、Ad3線維節部、Ad41短線維節部、又はAd35線維節部である、請求項36に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３８】
線維節部突然変異が、ABループ又はCDループの突然変異である、請求項34に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項３９】
線維節部突然変異が、KO1及びKO12から選択されたABループ又はCDループの突然変異である、請求項38に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項４０】
線維タンパク質を含む修飾型アデノウィルス線維であって：
未修飾型線維がコクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)に結合し；
該線維タンパク質が、線維タンパク質軸部に対する修飾を含むことにより、該修飾型線維とCARとの結合が実質的に低減又は排除されるようになっており；
該修飾型線維が、3番目の反復及び最後の完全反復に対応する反復を含み；そして、
該線維軸部の1つ以上の反復が欠失されている、
修飾型アデノウィルス線維。
【請求項４１】
反復4-17に対応する反復が欠失されている、請求項40に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項４２】
該線維が、C血清型アデノウィルスに由来する、請求項40又は請求項41に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項４３】
該C血清型アデノウィルスが、Ad2又はAd5である、請求項42に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項４４】
位置95-316に対応する該アミノ酸が欠失されている、請求項43に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項４５】
該線維タンパク質が、A, B, C又はF血清型アデノウィルスから成っており；そしてSEQ ID NO:49で示されたコンセンサス反復配列に対応する1つ以上のアミノ酸が、該3番目の反復又は該最後の完全反復に対応する反復内で修飾されている、請求項1〜39のいずれか1項に記載の修飾型アデノウィルス線維。
【請求項４６】
核酸分子であって、請求項1〜45のいずれか1項に記載の修飾型線維をコードするヌクレオチドの配列を含む、核酸分子。
【請求項４７】
ベクターを含む、請求項46に記載の核酸分子。
【請求項４８】
遺伝子生成物をコードする異種核酸を含む、請求項46又は47に記載の核酸分子。
【請求項４９】
アデノウィルス・ベクターである、請求項46〜48のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項５０】
C血清型アデノウィルスに由来するアデノウィルス・ベクターである、請求項49に記載の核酸分子。
【請求項５１】
該異種核酸が治療用生成物をコードする、請求項49又は50に記載の核酸分子。
【請求項５２】
初期世代アデノウィルス・ベクター、ガットレス・アデノウィルス・ベクター、又は複製条件付きアデノウィルス・ベクターである、請求項46〜51のいずれか1項に記載の核酸。
【請求項５３】
該複製条件付きアデノウィルス・ベクターが、腫瘍溶解性アデノウィルス・ベクターである、請求項52に記載の核酸分子。
【請求項５４】
細胞であって、請求項46〜53のいずれか1項に記載の核酸を含む細胞。
【請求項５５】
真核細胞である、請求項54に記載の細胞。
【請求項５６】
原核細胞である、請求項54に記載の細胞。
【請求項５７】
パッケージング細胞系内にある、請求項54に記載の細胞。
【請求項５８】
アデノウィルス粒子であって、請求項1〜45のいずれか1項に記載の修飾型線維を含む、アデノウィルス粒子。
【請求項５９】
キャプシドがさらにペントン修飾を含む、請求項58に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６０】
該修飾型線維が、C血清型Adウィルスの線維に由来するN末端部分を含み、該N末端部分が、これが存在しない場合と比較して該粒子内への組込みを増大させるのに十分である、請求項58又は59に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６１】
修飾型C血清型ゲノムを含み、該修飾型線維のN末端部分が少なくとも、C血清型線維のN末端の15, 16又は17個のアミノ酸を含む、請求項58〜60のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６２】
該C血清型ウィルスがAd2又はAd5ウィルスである、請求項61に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６３】
さらに、該キャプシド内にターゲッティング・リガンドを含む、請求項58〜62のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６４】
さらに、そのゲノム内に異種核酸を含む、請求項58〜63のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６５】
該異種核酸が、治療上効果的な生成物をコードする、請求項64に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６６】
該キャプシドに対する修飾を含み、これにより、該ウィルス粒子とHSPとの結合が、未修飾型キャプシドを発現させる粒子と比較して変化させられる、請求項58〜65のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６７】
HSP結合を変化させる該キャプシド修飾が該線維中にある、請求項66に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６８】
該キャプシドのαvインテグリン結合領域内に突然変異を含み、これにより該インテグリンとの結合が排除又は低減される、請求項58〜67のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項６９】
該線維がさらに線維節部の修飾を含むことにより、さらに任意のCAR結合を低減する、請求項58〜68のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項７０】
該線維節部の修飾がABループ又はCDループ内にある、請求項69に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項７１】
該線維節部の修飾が、KO1及びKO12から成る群から選択される、請求項70に記載のアデノウィルス粒子。
【請求項７２】
患者に投与するために調製された組成物であって、請求項58〜71のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子を含む、組成物。
【請求項７３】
アデノウィルス・ベクターを脱ターゲットする方法であって、請求項1〜45のいずれか1項に記載の修飾型線維を発現させるアデノウィルス粒子を生成することによって、アデノウィルス粒子とCARとの結合を低減又は排除することを含む前記方法。
【請求項７４】
該修飾線維が、該未修飾線維と比較して特定細胞タイプとの結合を増大させる、請求項73に記載の方法。
【請求項７５】
該修飾型線維が2つ以上の修飾を含むことにより、選択された細胞タイプとの結合が、該未修飾線維と比較して増大させられる、請求項73に記載の方法。
【請求項７６】
該第2の修飾が、該アデノウィルス粒子のキャプシド内にターゲッティング・リガンドを付加することを含む、請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
該第2の修飾が、該線維節部又はその一部の置換を含む、請求項75に記載の方法。
【請求項７８】
請求項58〜71のいずれか1項に記載のアデノウィルス粒子を細胞内に導入し；そして該細胞を患者内に導入することを含む方法。
【請求項７９】
該細胞が免疫細胞又は線維芽細胞である、請求項78に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載された作業は、NIH助成金EY 11431、HL 54352及びAI 42929によって支援された。政府はこのような対象において或る一定の権利を有する。
【０００２】
関連出願
Glenn Nemerow, Eugene Wu及びPhoebe Stewartに対する2003年6月11日付けで出願された「MODIFIED FIBER PROTEINS FOR EFFICIENT RECEPTOR BIDING」と題する米国仮出願第60/478,008号明細書の優先権を主張する。認められる場合には、上記出願の開示内容及び対象の全体を参考のため引用する。
【０００３】
発明の分野
脱ターゲット型及び再ターゲット型の組換えアデノウィルス・ウィルス粒子及びベクターが提供される。具体的には、コクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)にin vivoで結合するアデノウィルス由来の修飾型線維であって、線維軸部に修飾を含有する修飾型線維が提供される。このような線維を発現させるアデノウィルス(Ad)粒子は、CARとの結合の低減を示す。従って脱ターゲット型Ad粒子が提供され；また再ターゲット型粒子も提供される。
【背景技術】
【０００４】
背景
全てではないにしてもほとんどのアデノウィルス・ベクター媒介型遺伝子治療法は、特定の組織、例えば腫瘍又は器官に形質導入することを目的とする。このようなターゲット型送達は、正常なウィルス親和性のアブレーション(脱ターゲット)及び典型的には、新しい特異性の付加(再ターゲット)を必要とする。アデノウィルス粒子と宿主細胞との多数の相互作用が、効率的な細胞侵入を促進するのに必要なので(Nemerow (2000) Virology 274:1-4)、脱ターゲット及び再ターゲットは複雑であるおそれがある。1つのアデノウィルス侵入経路は、2つの別個の細胞表面事象に関与すると考えられる。先ず、アデノウィルス線維と細胞受容体との高アフィニティ相互作用が、アデノウィルス粒子と細胞表面との付着を媒介する。続いて、キャプシドのペントン・タンパク質が、コレセプターとして作用する細胞表面インテグリンαvβ3及びαvβ5と会合することにより、ウィルス内部化を増強する。
【０００５】
種々の細胞タイプ上には、複数のアデノウィルス線維受容体が存在する。異なるアデノウィルス部分群の線維は、異なる受容体と相互作用する。このような1細胞受容体は、コクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)である。CARは、肺上皮細胞を含む多くのヒト組織内で発現される(例えば、Bergelson他(1997) Science 275:1320-1323)。部分群Bを除く全てのアデノウィルス部分群の線維は、CARに結合することが判っている(例えばBergelson他(1997) Science 275:1320-1323; Roelvink他(1998) J. Virol. 72:589-596)。しかし全てのアデノウィルス部分群がCARを一次細胞受容体として使用するわけではない(Arnberg(2000) J. Virol. 74:42-48; Roelvink他(1996) J. Virol. 70:7614-7621)。部分群Dの一員であるAd37は、結膜細胞上に見いだされる50 kDaタンパク質と相互作用する(Wu他、(2001) Virology 279:78-89)。
【０００６】
アデノウィルス線維と細胞表面受容体との会合は、複雑な三次元相互作用である。線維と受容体との間の認識は、いくつかの事例において、線維節部内の、大部分はタンパク質構造におけるβ鎖間のループ内の特異的アミノ酸残基に帰因して生じる(Roelvink他(1999) Science 286:1568-1571; Bewley他(1999) Science 286:1579-1583; Huang他(1999) J. Virol. 73:2798-2802)。in vitroでの認識とin vivoでの認識とは、常に同等であるとは限らない。例えば、Ad37線維は、in vitroでの研究ではその節部内にCAR結合部位を含有し、そしてCARと結合するにもかかわらず、宿主細胞を感染させるのに効率的にCARを使用することはできない(Arnberg(2000) J. Virol. 74;42-48; Wu他(2001) Virology 279:78-89)。
【０００７】
in vivoアデノウィルス・ベクターの再ターゲットが、遺伝子治療における最終目標であり、この目標を達成するための方法を開発することを焦点として、有意義な努力が為されている。多くの用途の場合、最も臨床的に有用なアデノウィルス・ベクターは、例えば末梢静脈内へ全身送達することができ、体内の所望の場所をターゲットとし、そして他の場所をターゲットとすることから生じる望ましくない副作用を有さないことになる。従って、ターゲット法が成功するならば、ベクター投与量全体は適切な部位に導かれ、そして、使用する毒性ベクターがより少量で済むことにより、ベクターの安全プロフィールが改善されることが見込まれ、また免疫原性を潜在的に少なくすることもできるはずである。アデノウィルスの脱ターゲット及び再ターゲットはまだ成功していない。
【０００８】
従って、基礎ベクターとして使用するためにin vivoで脱ターゲットされるアデノウィルスを開発し、そして例えば特異的治療用途のために再ターゲット型アデノウィルスを開発することが必要である。従って、本明細書における目的の中で、1つの目的は、脱ターゲット型アデノウィルス・ベクター、その製造方法及びその使用を提供することである。さらに本明細書における目的の中で、1つの目的は、治療のための再ターゲット型アデノウィルス・ベクター、その製造方法及びその使用を提供することである。
【発明の開示】
【０００９】
概要
脱ターゲット型及び再ターゲット型アデノウィルス粒子、このような粒子の生成源となるアデノウィルス・ベクター、ベクター及び粒子の製造方法、及びベクター及び粒子の使用が提供される。キャプシド修飾、特に線維軸部修飾、及びその結果として得られるタンパク質が、提供され記載される。これらのタンパク質は、アデノウィルス粒子上に発現されるとアデノウィルス・ベクターの脱ターゲットを可能にする。キャプシド修飾、例えば線維軸部修飾をその他の修飾、例えば線維節部及び/又はペントンの修飾と組合わせることにより、より完全に脱ターゲット及び再ターゲットが施されたアデノウィルス粒子を生成することができる。キャプシド・タンパク質、特に線維軸部領域の修飾によって天然親和性が低減(排除を含む)されたアデノウィルス・ベクター及びアデノウィルス粒子が提供される。
【００１０】
線維軸部修飾を含むキャプシド突然変異形が提供される。キャプシド突然変異形は、特定の受容体、具体的にはコクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)との結合を低減又は調節し、これにより、このような修飾を有するキャプシドを含有するアデノウィルス・ベクターの効率的な再ターゲットを可能にする。線維軸部修飾を含むキャプシド突然変異形を有するアデノウィルス粒子が提供される。キャプシド突然変異形は、特定の受容体との結合を低減し、これにより、このような修飾を有するキャプシドを含有するアデノウィルス・ベクターの効率的な再ターゲットを可能にする。
【００１１】
本明細書中に提供された特定の修飾は、線維内のβ鎖又はβターンの構造を変化させ、これにより、CARとの相互作用を変化させるように構成される。こうして、修飾型線維とCAR線維タンパク質軸部との結合が、未修飾軸部と比較して、実質的に低減される(少なくとも50%、40%、30%、10%、5%、又は1%以下の低減)か又は排除される(1%、0.5%、又は0.1%以下よりも少なくなる)ように、軸部修飾を含む修飾型アデノウィルス(Ad)線維タンパク質が提供される。修飾型線維は、アデノウィルス粒子、例えばAdのC血清型、例えばAd2及びAd5に由来し、これらの粒子において、線維は通常CARと結合する。線維は、修飾型線維の三次構造が未修飾型線維の構造と比較して変化させられて、修飾型線維が未修飾型線維よりも剛性であるようになっている線維を含む。
【００１２】
修飾は、任意の突然変異、例えば線維軸部内、具体的には線維軸部の反復内部の1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含み、これにより、その結果として生じる線維は、特にin vivoにおけるCARとの結合の低減を示すようになっている。反復内部の任意のアミノ酸は、例えばアミノ酸を非同類アミノ酸と置換することにより(例えば下記表1に示す同類アミノ酸置換を参照)、又はアミノ酸を排除することにより、修飾することができる。このような修飾は、反復内、具体的には3番目の反復及び/又は最後の完全反復に対応する反復内でアミノ酸を系統的に置換し、そしてその結果生じた線維を、in vitroでのCARとの結合に関して試験することにより、実験に基づいて見極めることができる。in vitroでの結合において2分の1以下、典型的には10分の1以下、100分の1以下、又はそれ未満への低減を示す任意の線維が選択される。3番目の反復において、修飾は、TTVT/S配列(SEQ ID NO:44)を含有する3番目の反復の部分に対応する1つ又は2つ以上のヌクレオチドを含む修飾を含む。
【００１３】
修飾型線維はまた、軸部の全て又は部分の代わりに、CARと結合する線維よりも剛性の反復を含む線維に由来する軸部、例えば線維軸部、具体的にはD血清型線維に由来する1つ又は2つ以上のβ反復、例えばAd37、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p軸部反復が置かれた線維を含む。CAR結合線維内の置換された反復は、軸部内の3番目の反復及び/又は最後の完全β反復であってよい。これらの修飾は、1つ又は2つ以上の反復、具体的には3番目の反復及び/又は最後の完全β反復の欠失を含むことができ、これにより、その結果生じる線維はCARと結合することはない。アデノウィルスD血清型に由来する3番目の反復の例は、SEQ ID NO:58, 66, 67及び68のいずれかで示された反復を含む。アデノウィルスD血清型に由来する修飾型の最後の完全反復の例は、SEQ ID NO:48, 59, 60及び61のいずれかで示された反復を含む。これらの反復のそれぞれの全て又は部分は、CARと結合するアデノウィルス、例えばC血清型ウィルスの線維内の対応反復の代わりに置くことができ、或いは、このような線維の修飾のための鋳型として役立つことができる。他の修飾は、CAR結合を低減又は排除する線維に応じて、中心反復、例えば1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13又は14個又はその他の数の中心反復のうちの1つ又は2つ以上の欠失を含む。
【００１４】
線維タンパク質は、線維内の1つ又は2つ以上の付加的な修飾を含むこともできる。このような修飾はさらに、CARとの結合をアブレート又は低減することができ、ヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン(ヘパリン・スルフェート・グリコサミノグリカン:HSPとも呼ばれる)との結合を低減する線維軸部の修飾、線維節部の修飾、具体的には、CARとの結合をさらに低減する修飾、及び他の受容体に線維を再ターゲットするためのリガンドを付加する修飾を含む。脱ターゲット型アデノウィルス粒子、このような粒子の生成源となるアデノウィルス・ベクター、ベクター及び粒子の製造方法、及びベクター及び粒子の使用が提供される。キャプシド修飾、特に線維軸部修飾、及びその結果として得られるタンパク質が、提供され記載される。これらのタンパク質は、アデノウィルス粒子上に発現されるとアデノウィルス・ベクターの脱ターゲットを可能にする。キャプシド修飾、例えば線維軸部修飾をその他の修飾、例えば線維節部及び/又はペントンの修飾と組合わせることにより、脱ターゲット型アデノウィルス粒子を生成することができる。特定の修飾は、線維軸部内のβ鎖又はβターンの構造を変化させる。こうして、キャプシド・タンパク質、特に線維軸部領域の修飾によって天然親和性がアブレート(低減又は排除)されたアデノウィルス・ベクター及びアデノウィルス粒子が提供される。
【００１５】
従って、線維軸部修飾を含むキャプシド突然変異形が提供される。キャプシド突然変異形は、特定の受容体、具体的にはコクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)との結合をアブレートし、これにより、このような修飾を有するキャプシドを含有するアデノウィルス・ベクターの効率的な脱ターゲット及び再ターゲットを可能にする。
【００１６】
修飾型線維とCAR線維タンパク質軸部との結合が、実質的に低減される(少なくとも50%、40%、30%、10%、5%、又は1%以上の低減)か又は排除される(1%、0.5%、又は0.1%以下を下回るようになる)ように、軸部修飾を含む修飾型アデノウィルス(Ad)線維タンパク質が提供される。修飾型線維は、アデノウィルス粒子、例えばAdのC血清型、例えばAd2及びAd5に由来し、これらの粒子において、線維は通常CARと結合する。線維は、修飾型線維の三次構造が未修飾型線維の構造と比較して変化させられて、修飾型線維が未修飾型線維よりも剛性であるようになっている線維を含む。未修飾型線維と比較して短縮された修飾型線維、又は低減されたフレキシビリティを示す修飾型線維が含まれる。
【００１７】
修飾は、任意の突然変異、例えば線維軸部内、具体的には線維軸部の反復内部の1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換を含む。修飾型線維は、軸部の全て又は部分の代わりに、CARと結合する線維よりも剛性である反復を含む線維に由来する軸部、例えば線維軸部、具体的にはD血清型線維に由来する1つ又は2つ以上のβ反復、例えばAd37、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p軸部反復が置かれた置換形を含むことができる。CAR結合線維内の置換された反復は、軸部内の3番目の反復及び/又は最後の完全β反復であってよい。これらの修飾は、1つ又は2つ以上の反復、具体的には3番目の反復及び/又は最後の完全β反復の欠失を含むことができ、これにより、その結果生じる線維はCARと結合することはない。修飾型の3番目の反復の例は、SEQ ID NO:58, 66, 67及び68のいずれかで示された反復を含み、修飾型の最後の完全反復の例は、SEQ ID NO:48, 59, 60及び61のいずれかで示された反復を含む。3番目の反復の修飾は、3番目のβ反復内のTTVT/Sに対応するヌクレオチド遺伝子座の修飾を含む。その他の修飾は、14個の中心反復の欠失を含む。
【００１８】
線維タンパク質は、線維内の1つ又は2つ以上の付加的な修飾を含むこともできる。このような修飾はさらに、CAR及び/又はヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン(ヘパリン・スルフェート・グリコサミノグリカン:HSPとも呼ばれる)との結合をアブレート又は低減することができる。他の修飾は、線維節部の修飾、具体的には、CARとの結合をさらに低減する修飾、及び他の受容体に線維を再ターゲットするためのリガンドを付加する修飾を含む。
【００１９】
線維タンパク質をコードする核酸、核酸を含有するベクター、及び、ベクター及び/又は核酸を含有する細胞も提供される。アデノウィルス粒子、具体的にはC血清型粒子の脱ターゲット及び再ターゲットのための線維の使用方法が、種々の用途においてin vivo、in vitro及びex vivoで細胞に形質導入するための粒子の使用方法と同様に提供される。特定の実施態様は、下記実施態様、及び本明細書中の開示内容全体にわたって記載され例示された実施態様を含む。
【００２０】
3番目のβ-反復又は最後の完全反復のうちの一方又は両方に対応する反復内に軸部修飾を有する修飾形アデノウィルス線維が提供され、これにより、線維又はこのような線維を含有するウィルス粒子と、コクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)との結合が、未修飾型線維と比較して低減又は排除される。未修飾線維はCARと結合し、結合はin vivoにおいて、2分の1以下、5分の1以下、10分の1以下、100分の1以下、200分の1以下、500分の1以下、1000分の1以下、又はそれ未満に低減される。具体的には、修飾型線維は、in vivoにおける未修飾型線維の結合アフィニティの50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満、1%未満でCARと結合し、また、in vitro法によって評価することができる。典型的には、修飾型線維は未修飾型線維よりも剛性である。
【００２１】
修飾の一例としては、3番目の反復及び/又は完全反復に対応する線維軸反復内の1つ以上のアミノ酸の消失、挿入又は置換(又はその他の修飾)、例えば3番目のβ反復及び/又は最後の完全反復を、D血清型線維軸部反復配列に由来する対応反復と置換することが挙げられ、これにより、その結果生じる線維は、未修飾型線維と比較して低減されたCARとの結合を示す。修飾の例は、SEQ ID NO:42, 43及び/又は44、及びSEQ ID NO:46及び47で示されたアミノ酸配列に対応する隣接アミノ酸配列内の線維中の1つ又は2つ以上のアミノ酸の1つ以上の置換又は欠失を含む。一般には、未修飾線維は、C血清型アデノウィルス、例えばAd2又はAd5に由来する。D血清型アデノウィルスの一例としては、Ad8、Ad9、Ad15、Ad19p及びAd3が挙げられる。置換する3番目の反復は、SEQ ID NO:58, 66, 67及び68のいずれかで示されたアミノ酸配列を含むことができ、置換する最後の完全反復は、コンセンサス配列であるSEQ ID NO:48, 59, 60, 61、及びSEQ ID NO:49のいずれかで示されたような任意のアミノ酸配列を含むことができる。結果として生じた修飾型線維がCARとの結合の低減(2分の1以下、典型的には10分の1以下、50分の1以下、100分の1以下又はそれ未満に低減)を示す限り、3番目及び/又は最後の反復に加えて、又はこれらの反復の代わりに、他の反復を置換することができる。
【００２２】
修飾アデノウィルス線維は、線維タンパク質中に1つ又は2つ以上の付加的な修飾を含むことができ、これにより、修飾型線維は、CAR以外の受容体に、未修飾型線維がこのような受容体に結合するよりも大きなアフィニティで結合し、或いは、修飾アデノウィルス線維は、線維タンパク質中に、CARとの結合をさらに低減するか、又は任意の他の所望の特性を加える1つ又は2つ以上の付加的な修飾を含むことができる。このような修飾は、線維軸部内のヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン(HSP)結合部位の修飾、及び線維節部、例えばCARと相互作用しないアデノウィルスに由来する線維節部の修飾を含む。このようなアデノウィルス節部は、Ad3線維節部、Ad41短線維節部、又はAd35線維節部に由来する節部を含む。節部の突然変異は、ABループ及び/又はCDループ、例えばKO1及びKO12の突然変異を含む。
【００２３】
上記修飾型アデノウィルス線維のいずれも、A, B, C又はF血清型アデノウィルスを含む任意の血清型アデノウィルス、具体的には、SEQ ID NO:45及び/又は49で示されたコンセンサス反復配列に対応する1つ以上のアミノ酸が、3番目の反復又は最後の完全反復に対応する反復において修飾(欠失又は置換又は配列内の置換)されるように修飾されたアデノウィルス線維に由来してよい。
【００２４】
他の修飾型線維、例えばAd2及びAd5を含むC血清型ウィルスに由来する修飾型線維は、未修飾型線維がコクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)に結合し、線維タンパク質が、線維タンパク質軸部に対する修飾を含むことにより、該修飾型線維とCARとの結合が実質的に低減又は排除されるようになっており、修飾型線維が、3番目の反復及び最後の完全反復に対応する反復を含み、そして、該線維軸部の1つ以上の反復が欠失されている、修飾型線維を含む。このような他の反復は例えば反復4-17を含む。欠失は、Ad5線維の位置95-316に対応する5又は6つ以上の隣接アミノ酸の欠失を含む。
【００２５】
修飾型線維をコードする核酸分子が提供される。核酸分子の中には、ベクター、具体的には例えばアデノウィルス・ベクターが含まれ、アデノウィルス・ベクターは、異種核酸を含むこともできる。異種核酸は例えば調節配列であってよく、又は遺伝子生成物、例えば治療用生成物をコードすることができる。アデノウィルス・ベクターの一例としては、初期世代アデノウィルス・ベクター、ガットレス・アデノウィルス・ベクター、及び複製条件付きアデノウィルス・ベクター、例えば腫瘍溶解性ベクターが挙げられる。核酸分子を含有する真核細胞及び原核細胞を含む細胞も提供される。これらの細胞の中には、パッケージング細胞系に由来する細胞が含まれる。これらの細胞、具体的には、アデノウィルス・ゲノムに由来する別個の構造として修飾型線維をコードする核酸を含有する細胞を有するパッケージング細胞系も提供される。
【００２６】
修飾型線維を発現させるアデノウィルス粒子も提供される。粒子はさらに、付加的なキャプシド修飾、例えばペントン修飾を含むことができる。粒子は、線維のN末端部分がゲノムと同じ血清型に由来することにより、キャプシド内への線維の組込みが容易になるように形成することができる。典型的には、修飾型線維のN末端部分は少なくとも、このような線維のN末端の15, 16又は17個のアミノ酸を含む。選択された細胞又は組織に粒子を再ターゲット又はターゲットするために、粒子は、キャプシド内、例えば線維内にターゲッティング・リガンドを含むこともできる。粒子は、粒子の付加的な結合特性又はターゲット特性を変化させるために、線維を含む、キャプシドの更なる修飾を含むことができる。例えば、粒子は、未修飾型キャプシドを発現させる粒子と比較して、HSPとの結合が変化させられるように修飾型線維を含むことができ、且つ/又は、キャプシドのαvインテグリン結合領域内に突然変異を含むことができ、これによりインテグリンとの結合が排除又は低減され、且つ/又は、節部修飾のような修飾、例えばABループ及び/又はCDループ内の修飾を含むことができ、これにより任意のCAR結合を低減又は排除する。
【００２７】
また、修飾型線維のいずれかを発現させるアデノウィルス粒子を生成することにより、アデノウィルス粒子とCARとの結合を低減又は排除することによって、アデノウィルス・ベクターを脱ターゲットする方法も提供される。
【００２８】
患者に投与するために調製された組成物が提供される。組成物はアデノウィルス粒子を含有する。
組成物を投与することによる治療方法が提供される。これらの組成物は、選択されたターゲット細胞への通行のために、アデノウィルス粒子を細胞内又は患者内に導入することにより、in vivo又はex vivoで投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
詳細な説明
A.  定義
B.  キャプシド修飾
1.  線維遺伝子及びタンパク質
2.  線維軸部
3.  線維軸部の修飾
C.  核酸、アデノウィルス・ベクター、及び核酸を含有する細胞、及びベクターを含有する細胞
1.  アデノウィルス・ベクター及び粒子
a.  ガットレス・ベクター
b.  腫瘍溶解性ベクター
c.  ヘルパー非依存性ウィルス
2.  パッケージング細胞系及び補完細胞系
D.  脱ターゲット
E.  再ターゲット
1.  ターゲッティング・リガンドの付加
2.  修飾型線維を介して達成される再ターゲット
F.  異種生成物の送達
1.  異種ポリペプチド
2.  遺伝子の発現及び調節
a.  異種ポリヌクレオチド
b.  遺伝子発現の調節
G.  動物及びヒトへの送達
H.  調製及び投与
【００３０】
A.  定義
特に断りのない限り、本明細書に使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載された開示内容全体にわたって言及される全ての特許明細書、特許出願明細書、特許出願公開明細書、GENBANK配列、ウェブサイト及び全ての発表済資料は、特に断りのない限り、全体を参考のため本明細書に引用する。本明細書に記載された用語に対して複数の定義がある場合には、この項の定義が優先される。URL又はその他のこのような識別子又はアドレスに言及される場合には、言うまでもなく、このような識別子が変わる場合があり、インターネット上の特定の情報は移り変わりが激しいが、同等の情報が知られており、例えばインターネット及び/又は適切なデータベースを検索することにより、容易にアクセスすることができる。これに言及することは、このような情報が利用可能であり、公に普及していることを証明する。
【００３１】
本明細書中に使用される「アデノウィルス」又は「アデノウィルス粒子」という用語は、全ての群、部分群、及び血清型を含む、ヒト又は動物に感染する任意のアデノウィルスを含む、アデノウィルスとして分類することができる任意の、そして全てのウィルスを含むために使用され、カプセル化核酸を含む粒子を意味する。核酸は、天然型アデノウィルス・ゲノム又は修飾型ゲノム、例えばアデノウィルス・ベクターであってよい。いくつかの部分群に分類されるアデノウィルス血清型は、51以上ある。例えば、部分群Aはアデノウィルス血清型12、18及び31を含む。部分群Cはアデノウィルス血清型1、2、5及び6を含む。部分群Dはアデノウィルス血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39及び42-49を含む。血清型19は変異体「a」及び「p」を有する。Ad19pはAd19の非病原性変異体である(Arnberg他(1998) Virology 227:239-244)のに対して、Ad19aは、Ad8及びAd37と一緒に、流行性角結膜炎(EKC)の腫瘍原因である。Ad19a及びAd37は、同一の線維タンパク質を有し(Arnberg他(1998) Virology 227:239-244)、in vivoにおいて同様の親和性を有する。部分群Eはアデノウィルス血清型4を含む。部分群Fはアデノウィルス血清型40及び41を含む。これらの後者の2つの血清型は長線維タンパク質及び短線維タンパク質を有する。従って、本明細書中に使用されるように、アデノウィルス又はアデノウィルス粒子は、パッケージングされたベクター又はゲノムである。
【００３２】
本明細書中に使用される「ウィルス」、「ウィルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウィルス・ベクター粒子」及び「ビリオン」は、例えばウィルス・ゲノムの全て及び一部を含有するベクターが、このような粒子の生成に適した細胞又は細胞系内に形質導入されるときに形成される感染性ウィルス粒子を意味するのに互いに置き換え可能に使用される。その結果生じたウィルス粒子は、例えばin vivo又はin vitroでの細胞内への核酸導入を含む種々の用途を有する。本明細書中の目的の場合、ウィルスは、アデノウィルス・ベクター、例えば本明細書中に提供された任意のアデノウィルス・ベクターがアデノウィルス・キャプシド内にカプセル化されたときに形成される組換え型アデノウィルスを含む、アデノウィルスである。このように、ウィルス粒子は、パッケージング型ウィルス・ゲノムである。アデノウィルス・ウィルス粒子は、ウィルスの最小の構造的又は機能的単位である。ウィルスは単一の粒子、粒子ストック又はウィルス・ゲノムを意味することができる。アデノウィルス(Ad)粒子は比較的複雑であり、種々の下部構造内に分割することができる。
【００３３】
アデノウィルス及びアデノウィルス粒子の中には、全ての群、部分群、及び血清型を含む、ヒト又は動物に感染する任意のアデノウィルスを含む、アデノウィルスとして分類することができる任意の、そして全てのウィルスが含まれる。このように、本明細書中に使用される「アデノウィルス」及び「アデノウィルス粒子」はウィルス自体及びこれらの誘導体を意味し、そして特に断りのある場合を除いて、全ての血清型及び亜型、並びに天然発生形及び組換え形を含む。アデノウィルス及びアデノウィルス性は、「Ad」として省略することができる。ヒト細胞に感染するアデノウィルスが含まれる。アデノウィルスは野生型であってよく、または当業者に知られた、又は本明細書中に開示された種々の方法で修飾することができる。このような修飾の一例としては、感染ウィルスを形成するために粒子内にパッケージングされたアデノウィルス・ゲノムの修飾が挙げられる。修飾の例は、当業者に知られた欠失、例えばE1a, E1b, E2a, E2b, E3又はE4をコードする領域のうちの1つ又は2つ以上の欠失を含む。修飾の他の例は、アデノウィルス・ゲノムのコード領域の全ての欠失を含む。このようなアデノウィルスは、「ガットレス」アデノウィルスとして知られている。この用語はまた、反復条件付きアデノウィルスを含む。反復条件付きアデノウィルスは、細胞又は組織の特定タイプ内で優先的に複製するが、しかし他のタイプではより低い程度で複製するか又は全く複製しないウィルスである。例えば本明細書中に提供されたアデノウィルス粒子の中には、異常に増殖する組織内で複製するアデノウィルス粒子、例えば充実性腫瘍及びその他の新生物である。これらは、米国特許第5,998,205号明細書及び同第5,801,029号明細書に開示されたウィルスを含む。このようなウィルスは、「細胞溶解性」又は「細胞変性」ウィルス(又はベクター)と呼ばれることがあり、そしてこれらが新生細胞に対するこのような効果を有する場合には、「腫瘍溶解性」ウィルス(又はベクター)と呼ばれる。本明細書中に使用される腫瘍溶解性アデノウィルスは、腫瘍細胞中で選択的に複製するアデノウィルスを意味する。
【００３４】
本明細書中に使用される「ベクター」、「ポリヌクレオチド・ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構造」、「核酸ベクター構造」及び「ベクター構造」という用語は、当業者には明らかなように、遺伝子導入のために使用することができる任意の核酸構造を意味するのに互いに置き換え可能に使用される。
【００３５】
本明細書中に使用される「ウィルス・ベクター」という用語は、当業者に認識された意味に従って使用される。この用語は、ウィルス起源の1つ以上の要素を含む核酸ベクター構造を意味し、ウィルス・ベクター粒子内にパッケージングすることができる。ウィルス・ベクター粒子は、DNA、RNA又はその他の核酸をin vivo又はin vitroで細胞中に導入する目的で使用することができる。ウィルス・ベクターの一例としては、レトロウィルス・ベクター、ワクシニア・ベクター、レンチウィルス・ベクター、ヘルペス・ウィルス・ベクター(例えばHSV)、バキュロウィルス・ベクター、サイトメガロウィルス(CMV)ベクター、パピローマウィルス・ベクター、シミアン・ウィルス(SV40)・ベクター、シンドビス・ベクター、セムリキ森林熱ウィルス・ベクター、ファージ・ベクター、アデノウィルス・ベクター、及びアデノ随伴ウィルス(AAV)ベクターが挙げられる。好適なウィルス・ベクターは、例えば米国特許第6,057,155号、同第5,543,328号、及び同第5,756,086号の各明細書に記載されている。本明細書に記載されたベクターは、アデノウィルス・ベクターである。
【００３６】
本明細書中に使用される「アデノウィルス・ベクター」、「アデノウィルス性ベクター」という用語は、アデノウィルス・ゲノムの全て又は一部を含有するポリヌクレオチドを意味するのに互いに置き換え可能に使用され、当業者によく知られている。アデノウィルス性ベクターは、全ゲノム又は修飾型ゲノムをコードする核酸を意味し、或いは細胞内への導入時、特に粒子としてのパッケージング時に異種核酸を導入するのに使用することができるベクターを意味する。アデノウィルス・ベクターは、いくつかの形態のいずれかを成している。これらの形態の一例としては、ネイクドDNA、アデノウィルス・キャプシド内にカプセル化されたDNA、別のウィルス形態又はウィルス様形態(例えば単純ヘルペス及びAAV)でパッケージングされたDNA、リポソーム中にカプセル化されたDNA、ポリリシンと複合されたDNA、合成ポリカチオン性分子と複合されたDNA、トランスフェリンと接合されたDNA、分子を免疫的に「マスキング」し、且つ/又は半減期を増大させるために、PEGのような化合物と複合されたDNA、又は非ウィルス性タンパク質に接合されたDNAが挙げられる。
【００３７】
本明細書中に使用されるように、種々異なる要件及び目的を有する種々のベクターが記載されている。例えば1つのベクターは、染色体への安定的な組入れの際に、パッケージング細胞系内に特定の核酸分子を送達するのに使用される。これらのタイプのベクターは、補完プラスミドとも呼ばれる。別のタイプのベクターは、ウィルス・ベクターを増殖させるために、細胞系(例えばパッケージング細胞系)内で又は細胞系中に、核酸分子を担持又は送達し、従ってこれらのベクターは本明細書中では、送達プラスミドと呼ぶこともできる。第3の「タイプ」のベクターは、ウィルス性核酸をカプセル化するウィルス粒子の形態を成し、そして本明細書中に提供されるように修飾されたキャプシドを含有するベクターである。このようなベクターは、特定のポリペプチド、例えば治療用ポリペプチド又は調節タンパク質又は調節配列をコードする異種核酸分子を含有することにより、治療を必要とする患者の特異的細胞又は細胞タイプをターゲットにすることもできる。
【００３８】
本明細書中に使用される「モチーフ」という用語は、或る特定の不変位置又は保存位置に隣接する、又はこれらの位置とアラインメントすることができるタンパク質の一次配列の部分を形成する任意のアミノ酸集合であって、特定の機能と連携するものを意味するのに使用される。モチーフは、一次配列によってだけではなく、三次元折畳みの結果としても生じることができる。例えば、モチーフGXGXXGは、ヌクレオチド結合部位と会合する。別の例の場合、線維は三量体であり、従って三量体構造は、モチーフの形成に関与することができる。或いは、モチーフは、分子下部構造の知識及び分子下部構造との関連なしに、機能に基づいて画定されたタンパク質分子の領域である、タンパク質のドメインとして考えることができ、例えば受容体と結合するタンパク質分子部分として考えることができる。例えば、モチーフ(KKTK)(SEQ ID NO:65)は、HSP(ヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン；ヘパリン・スルフェート・グリコサミノグリカンとも呼ばれる)との線維軸部の相互作用のためのコンセンサス配列を構成する。
【００３９】
本明細書中に使用される「結合する」又は「結合」という用語は、リガンド及びその受容体との結合、例えば10-2〜10-15モル/L、一般には、10-6〜10-15及び10-7〜10-15及び典型的には10-8〜10-15のKd(及び/又は105〜1012、107〜1012、108〜1012L/モルのKa)を伴うAd5軸部モチーフとHSP(ヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン)との結合を意味するのに使用される。
【００４０】
本明細書中に使用される特異的結合又は選択的結合は、特定のリガンドと1受容体との結合相互作用(Ka又はKeq)が、別の受容体の場合よりも2倍以上、一般には5倍、10倍、50倍、100倍又はそれ以上大きいことを意味する。特定ウィルス・ベクターが細胞又は組織をターゲットとするという記述は、宿主内又はin vitroのこのような細胞又は組織に対するそのアフィニティが、in vitro条件下で宿主内の他の細胞及び組織に対するよりも約2倍以上、一般には5倍、10倍、50倍、又は100倍以上大きいことを意味する。
【００４１】
本明細書中に使用される「アブレートする」又は「アブレートされる」という用語は、アデノウィルス、アデノウィルス・ベクター又はアデノウィルス粒子であって、対応する野生型アデノウィルスと比較して、特定の細胞受容体に結合する能力が低減又は排除され、一般には実質的に排除(10分の1、100分の1又はそれ未満に低減)されるものを意味するのに使用される。アブレーションを施されたアデノウィルス、アデノウィルス・ベクター又はアデノウィルス粒子(すなわち修飾型アデノウィルス、アデノウィルス・ベクター又はアデノウィルス粒子が野生型アデノウィルスの天然型親和性を有さない場合)は、脱ターゲット型とも言われる。対応する野生型線維タンパク質及び/又は野生型ペントン・タンパク質と比較した場合の、突然変異型アデノウィルス線維タンパク質及び/又は突然変異型アデノウィルス・ペントン・タンパク質が細胞受容体に結合する能力の低減又は排除を、測定又は評価することができる。このような測定又は比較は、突然変異型線維タンパク質及び/又は突然変異型ペントン・タンパク質を含有するアデノウィルス粒子が、細胞受容体を有する細胞内に形質導入される効率(遺伝子導入及びマーカー遺伝子の発現)を、野生型線維タンパク質及び/又は野生型ペントン・タンパク質を含有するアデノウィルス粒子と比較することによって行われる。
【００４２】
本明細書中に使用される、修飾型線維とCAR線維タンパク質軸部との結合は、in vivoでの未修飾軸部と比較して、結合が少なくとも50%、40%、30%、10%、5%、又は1%又はそれ未満だけ低減される場合に「低減された」と言われ、そして、結合が1%、0.5%、又は0.1%以下よりも少ない場合に「排除された」と言われる。結合は最初、in vitroアッセイで評価される。本明細書中に提供された特定の修飾に関しては、in vitroでのCARとの結合の低減が、in vivoの低減と相関することが観察される。
【００４３】
アデノウィルスと関連して本明細書中に使用される「親和性」は、キャプシド・タンパク質、例えば線維タンパク質及び/又はペントンによって、粒子に付与される選択的な感染力又は結合を意味する。
【００４４】
本明細書中に使用される「ペントン」又は「ペントン複合体」は、ペントン・ベース及び線維の複合体を意味するのに使用される。「ペントン」という用語はまた、ペントン・ベース並びにペントン複合体を示すのにも使用される。「ペントン」という用語単独の意味は、これが使用される文脈から明らかになるはずである。
【００４５】
形質導入効率に関して本明細書中に使用される「実質的に排除される」という用語は、野生型線維含有ウィルスの効率の約50%未満、典型的には約11%未満の形質導入効率を意味する。一般には、低減された形質導入効率は、野生型線維含有ウィルスの約9%未満、典型的には約8%未満である。細胞に対する形質導入効率は、当業者に知られた任意の方法によって測定することができる(例えば2001年6月30日付けで出願され、米国特許出願公開第20020137213号明細書として発行された米国特許出願第09/870,203号明細書、及び2001年6月1日付けで出願された国際PCT出願第PCT/EP01/06286号明細書の実施例1を参照)。手短に言えば、修飾型線維タンパク質を含有するアデノウィルス粒子を細胞に感染させることにより、CAR相互作用及びこれに続く遺伝子発現に対する線維アミノ酸突然変異の効果を評価する。12ウェル皿内の細胞単層に、例えば1細胞当たり1000個の粒子を、例えば2% FBSを含有するDMEM 0.35mlの総容積中で、2時間にわたって37℃で感染させる。次いで感染培地を単層から吸引し、そしてウェル1つ当たり、10% FBSを含有する完全DMEM 1mLを添加した。β-ガラクトシダーゼ発現を可能にするのに十分な時間にわたって、一般には約24時間にわたって細胞をインキュベートし、この発現を、化学ルミネセンス・リポーター・アッセイ及び発色基質を用いた組織化学的染色によって測定する。β-ガラクトシダーゼ活性の相対レベルを、好適な系、例えばGalacto-Light化学ルミネセンス・リポーター・アッセイ系(Tropix, Bedford, Mass)を用いて見極める。細胞単層をPBSで洗浄し、製造者のプロトコルに従って処理する。細胞ホモジェネートをマイクロ遠心管に移し、そして遠心分離することにより細胞残屑を除去する。例えばアッセイ標準としてウシ血清アルブミンを用いたビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイ(Pierce, Inc., Rockford, III)によって、総タンパク質濃度を見極める。次いで、各試料のアリコートをTropix β-ガラクトシダーゼ基質と一緒に、96ウェル・プレート内で45分間にわたってインキュベートする。照度計を使用して、1試料当たり発せられる相対光単位(RLU)を測定し、次いで各試料中の総タンパク質の量に対して基準化する(RLU/μg総タンパク質)。組織化学的染色処置の場合、細胞単層をPBS中の0.5%グルタルアルデヒドで固定し、次いでPBS 0.5ml中、1 ml当たり1 mgの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトシド(X-gal)、5mMのフェロシアン化カリウム、5mMのフェリシアン化カリウム、及び2mMのMgCl2の混合物と一緒にインキュベートする。単層をPBSで洗浄し、そして青い細胞を、Zeiss ID03光学顕微鏡を用いて光学顕微鏡法によって視覚化する。
【００４６】
本明細書中に使用される「低減する」又は「低減」は、野生型線維を含有することを除いて同じアデノウィルスと比較した場合の、突然変異型線維を含有するアデノウィルスによる形質導入効率の変化を意味する。典型的には、低減は野生型の約90%、80%、又は75%以下である。一般には、効率の変化は野生型の約65%以下のレベルである。典型的には、効率の変化は野生型の約55%以下である、この形質導入効率比較系は、ウィルス粒子との関連における所望の親和性に関して、修飾型線維タンパク質及び/又は修飾型ペントン・タンパク質を迅速に分析することができる。
【００４７】
本明細書中に使用される用語「突然変異させる」、「突然変異」、「修飾させる」、「修飾」は、当該タンパク質内の1つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換又は変化を意味する。アミノ酸は、アミノ酸を誘導体化する方法で置換又は修飾によって変化させることができる。こうして、アデノウィルス線維における配列KLGXGLXFD/N(SEQ ID NO:49)の1つ以上のアミノ酸(Xは任意のアミノ酸であってよい)を突然変異させることにより、CARとのウィルス相互作用をアブレートする。
【００４８】
例えば「キメラ・タンパク質」又は「キメラ線維」との関連において本明細書中に使用される「キメラ」という用語は、タンパク質の少なくとも一部、典型的には5つ又は6つよりも多い隣接アミノ酸を含有する部分が野生型タンパク質とは異なる、タンパク質又はポリペプチドを意味する。キメラ・タンパク質は、野生型タンパク質と第2タンパク質又はその一部又はペプチドとの融合体であってよい。キメラ・タンパク質は、別のタンパク質に由来する領域と置換されるタンパク質の1領域を有するタンパク質を含む。例えば、本明細書中に記載されているように、キメラ線維は、尾部に接合された1つのアデノウィルス線維に由来する節部領域と、別のAd線維に由来する軸部領域とを有するように構成される。また本明細書中には、異なるAd線維に由来する反復から形成された軸部領域を含有するキメラ線維が記載されている。キメラ線維タンパク質の例を図2に示す。
【００４９】
本明細書中に使用される「反復」という用語は、ポリペプチド内部で2回以上発生するアミノ酸の配列を意味する。いくつかの事例において、反復は、アミノ酸配列において互いに同一となる。他の事例において、反復は同一ではなく、タンパク質内部の反復のいくつか又は全てを比較することから導き出されるコンセンサス配列に似ていることが可能である。例えば、本明細書中に記載されているように、アデノウィルス線維軸部は、アミノ酸、約15アミノ酸長の反復を有する。各線維内部の反復の数は、アデノウィルス線維間で変化する。これらの反復のそれぞれは、コンセンサス配列abCdEfGhijKlMno(SEQ ID NO:45参照)に似ている。この配列において、大文字は疎水性アミノ酸を表し、そして下線を付けた残基(j)は、β鎖がβターンを形成するのを可能にする特別なプロリン又はグリシンを意味する。
【００５０】
本明細書中に使用される「〜に対応する位置で」は、別の基準核酸分子又はタンパク質内の位置に対する核酸分子又はタンパク質内の位置(すなわち塩基番号又は残基番号)を意味する。配列を比較してアラインメントすることにより対応位置を見極めることによって、マッチングするヌクレオチド又はアミノ酸残基の数を最大化し、例えば配列間の類似性が25%を上回り、典型的には40%を上回るようにすることができる。次いで当該位置には、基準核酸分子において割り当てられた番号が与えられる。例えば、本明細書中に示すように、Ad5の線維軸部における3番目の反復が、SEQ ID NO:35のアミノ酸76-95で生じる。別のアデノウィルス線維における対応反復を同定するために、配列をアラインメントし、次いでアミノ酸76-95と合致する位置を見極める。異なるアデノウィルス線維は異なる長さを有することができるので、アミノ酸76と指定された位置は、アミノ酸76でないかもしれないが、その代わりに、基準配列におけるその位置に「対応する」位置に存在する。同様に、Ad5における3番目の反復と指定された反復は、異なるアデノウィルス線維の3番目の反復ではないかもしれないが、しかしこれらのアミノ酸が3番目の反復のアミノ酸に「対応する」ような位置に存在する。異なるアデノウィルスに由来する線維タンパク質における3番目の反復及び最後の完全配列に対応する反復例を、図1A及び1Bに示す。
【００５１】
本明細書中に使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、核酸分子、例えばDNA又はRNAを意味する。分子は調節配列を含むことができ、そして一般にはDNAである。このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に含まれる教示内容との組合わせにおいて当業者に知られている技術によって調製されるか又は入手される。
【００５２】
本明細書中に使用される「タンパク質」及び「ポリペプチド」は互いに置き換え可能に使用される。
本明細書中に使用される「相同」は、約25%を上回る、例えば25%、40%、60%、70%、80%、90%又は95%の核酸配列同一性を意味する。必要な場合には、パーセンテージ相同性は特定されることになる。「相同性」及び「同一性」は、しばしば互いに置き換え可能に使用される。一般には、配列は、最上位マッチが得られるようにアラインメントされる(例えば：Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.編、Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W.編、Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M.及びGriffin H.G.編、Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987;及びSequence Analysis Primer, Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press, New York, 1991; Carillo他(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)。配列同一性によって、保存アミノ酸の数は、標準的なアラインメント・アルゴリズム・プログラムにより見極められ、これらのプログラムは、それぞれの供給元によって確立されたデフォルト・ギャップ・ペナルティと共に用いられる。実質的に相同の核酸分子は、典型的には中緊縮度又は高緊縮度で、核酸の全長に沿って、又は当該完全長核酸分子の少なくとも約70%、80%又は90%に沿ってハイブリッド形成することになる。また、ハイブリッド形成する核酸分子内のコドンの代わりに縮重コドンを含有する核酸分子も考えられる。
【００５３】
どの2つの核酸分子も、例えば最小80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%の「同一性」を有するヌクレオチド配列を含むかどうかは、例えばPearson他(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(その他のプログラムはGCGプログラム・パッケージを含む(Devereux, J.他、Nucleic Acids Research 12(I):387(1984))、BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F.他、J Molec Biol 215:403(1990);Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop編、Academic Press, San Diego, 1994、及びCarillo他(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)に記載されているようなデフォルト・パラメータを用いて、周知のコンピュータ・アルゴリズム、例えば「FAST A」プログラムによって見極めることができる。例えば、National Center for Biotechnology Information データベースのBLAST関数を用いて、同一性を見極めることができる。商業的又は公的に入手可能なその他のプログラムは、DNAStar 「MegAlign」プログラム(Madison, WI)及びUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)「Gap」プログラム(Madison, WI)を含む。タンパク質及び/又は核酸分子のパーセント相同性又は同一性は、例えばGPA コンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することにより、見極めることができる(例えばSmith 及びWaterman((1981) Adv. Appl. Math. 2:482)によって訂正された、Needleman 他(1970)J. Mol. Biol. 48:443)。手短に言えば、GAPプログラムは、類似のアラインメントされた符号(すなわちヌクレオチド又はアミノ酸)の数を、2つの配列のうちの短い方における符号の総数で割算したものとして類似性を定義する。GAPプログラムに対するデフォルト・パラメータは、下記のものを含むことができる：(1)Schwartz及びDayhoff編、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, 第353-358頁(1979)によって記載されたような、単項比較行列(同一性には1の値、そして非同一性には0の値を含む)及びGribskov編(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の重み付け比較マトリックス；(2)各ギャップに対して3.0のペナルティ、及び各ギャップにおける各符号に対して付加的な0.10のペナルティ；及び(3)エンド・ギャップにはペナルティなし。従って、本明細書中に使用される「同一性」という用語は、試験ポリペプチド又はポリヌクレオチドと、基準ポリペプチド又はポリヌクレオチドとの比較を表す。
【００５４】
本明細書中に使用される「アラインメント」は、試験ポリペプチド又はその部分と、その基準ポリペプチド又はその部分との比較、例えばAd5線維軸部に由来する反復と、別のアデノウィルス線維軸部に由来する線維部分領域、例えばAd37反復との比較を表す。このアラインメントは、本明細書中に定義された対応位置又は対応反復を決定する。
【００５５】
本明細書中に使用される「〜と90%以上同一」という用語は、基準ポリペプチド又はポリヌクレオチドとの90〜100%のパーセント同一性を意味する。90%以上のレベルの同一性は、例示のために100アミノ酸長の試験ポリペプチドと基準ポリペプチドとが比較されると想定すると、試験ポリペプチド内のアミノ酸の10%(すなわち100個のうち10個)以下が基準ポリペプチドのアミノ酸と異なるという事実を示す。同様の比較を試験ポリヌクレオチドと基準ポリヌクレオチドとの間で行うこともできる。このような差異は、アミノ酸配列の全長にわたってランダムに分配された点突然変異として表すことができ、或いは、可変長の1つ又は2つ以上の場所内に、許容し得る最大の差異、例えば100個のうちの10個のアミノ酸の差異(ほぼ90%同一性)までクラスター化することができる。差異は核酸又はアミノ酸の置換又は欠失として定義される。約85〜90%を上回る相同性又は同一性のレベルでは、結果はプログラム及びギャップ・パラメータの集合とは無関係であるべきである。このような高レベルの同一性は、しばしばソフトウェアに依存することなしに、容易に評価することができる。
【００５６】
パーセンテージ・ミスマッチを見極める上で本明細書中に使用されるハイブリダイゼーション緊縮度(ストリンジェンシー)は下記の通りである：
1)高緊縮度：0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃
2)中緊縮度：0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃
3)低緊縮度：1.0 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃
【００５７】
当業者には明らかなように、安定的なハイブリッドが得られるように洗浄工程が選択される(例えばSambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、第3巻、p. B.13参照、さらに、一般に用いられているラボラトリー解決手段を記載した数多くのカタログも参照)。SSPEは、pH 7.4のリン酸緩衝された0.18 MのNaClである。さらに、当業者に明らかなように、ハイブリッドの安定性はTmによって決定される｛Tmは、ナトリウム・イオン濃度及び温度の関数である(Tm = 81.5℃-16.6(log10[Na+]) + 0.41(%G + C)-600/l))｝ので、ハイブリッド安定性にとって重大な洗浄条件のパラメータは、SSPE(SSC)中のナトリウム・イオン濃度及び温度だけである。
【００５８】
言うまでもなく、別の緩衝液、塩及び温度を用いて同等の緊縮度を得ることができる。低緊縮度条件を用いた処置の一例としては、下記のものが挙げられる(Shilo及びWeinberg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6789-6792(1981)も参照)：35%ホルムアミド、5 x SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、5 mM EDTA、0.1% PVP、0.1% Ficoll、1% BSA、及び500 μg/mlの変性サケ精子DNA(10 x SSCは1.5 M塩化ナトリウム及び0.15 Mのクエン酸ナトリウム、pH 7に調節)を含有する溶液中で6時間にわたって40℃で、DNA含有フィルターを前処理する。
【００５９】
下記修飾を有する同じ溶液中でハイブリダイゼーションを実施する：0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.2% BSA、100 μg/mlのサケ精子DNA、10%(wt/vol)デキストランスルフェート、及び5-20 x 106 cpmの32P標識付きプローブを使用する。フィルターを40℃で18-20時間にわたってハイブリダイゼーション混合物中でインキュベートし、次いで2 x SSC、25 mM Tris-HCl(pH 7.4)、5 mM EDTA、及び0.1% SDSを含有する溶液中で、1.5時間にわたって55℃で洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液と交換し、さらに1.5時間にわたって60℃でインキュベートする。フィルターを乾燥状態でブロットし、そしてオートラジオグラフィのために露光する。必要な場合には、フィルターに3回目の洗浄を65-68℃で施し、これをフィルムに再び当てる。用いることができる他の低緊縮度条件が当業者によく知られている(例えば、異種間ハイブリダイゼーションのために採用される条件)。
【００６０】
中緊縮度条件を用いた処置の一例としては、下記のものが挙げられる： 6 x SSC、5 X デンハート溶液、0.5% SDS及び100 μg/mlの変性サケ精子DNAを含有する溶液中で6時間にわたって55℃で、DNA含有フィルターを前処理する。同じ溶液中でハイブリダイゼーションを実施し、5-20 x 106 cpmの32P標識付きプローブを使用する。フィルターを55℃で18-20時間にわたってハイブリダイゼーション混合物中でインキュベートする。2 x SSC、0.1% SDSを含有する溶液中で、1時間にわたって37℃でフィルターを洗浄し、次いで1 x SSC、0.1% SDSを含有する溶液中で、30分間にわたって60℃で2回洗浄する。フィルターを乾燥状態でブロットし、そしてオートラジオグラフィのために露光する。用いることができる他の中緊縮度条件が当業者によく知られている。
【００６１】
高緊縮度条件を用いた処置の一例としては、下記のものが挙げられる： 6 x SSC、50 mM Tris-HCl(pH 7.5)、1 mM EDTA、0.02% PVP、0.02% Ficoll、0.02% BSA、及び500 μg/mlの変性サケ精子DNAから成る緩衝液中で8時間から一晩にわたって65℃で、DNA含有フィルターの前ハイブリダイゼーションを実施する。100 μg/mlの変性サケ精子DNA及び5-20 x 106 cpmの32P標識付きプローブを含有する前ハイブリダイゼーション混合物中で、48時間にわたって65℃でフィルターをハイブリッド形成する。2 x SSC、0.01% PVP、0.01% Ficoll及び0.01% BSAを含有する溶液中で、1時間にわたって37℃で、フィルターを洗浄する。続いて、オートラジオグラフィの前に50℃で45分間にわたって、0.1 x SSC中で洗浄を行う。用いることができる他の高緊縮度条件が当業者によく知られている。
【００６２】
「実質的に同一」又は「実質的に相同」又はこれと同様の用語は、当業者に理解されるように文脈と共に変化し、一般には、最小60%又は70%、好ましくは最小80%、85%又はそれ以上、又はより好ましくは最小90%、及び最も好ましくは最小95%の同一性を意味する。
【００６３】
本明細書における目的上、同類アミノ酸置換及び非同類アミノ酸置換を形成し、次いで必要な場合には、結果として得られた線維を、in vitroのCAR結合活性に関して試験することにより、アミノ酸置換を形成することができる。活性(すなわちCAR結合)を排除するためのアミノ酸置換は、典型的には、非同類アミノ酸を使用して形成される。同類アミノ酸置換が当業者に知られており、これらの置換は、一般に、結果として得られた分子の生体活性、例えば酵素的活性を変化させることなしに形成することができる。当業者には明らかなように、一般には、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は、生体活性をほとんど変化させない(例えばWatson他、Molecular Biology of the Gene, 第4版, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., 第244頁参照)。本明細書中で考えられる置換は、必須領域内にあり、線維軸部内のβ-反復である。従って、任意のアミノ酸を別のアミノ酸の代わりにすることにより、CAR結合活性を低減することができる。同類(保存的)アミノ酸置換は、例えば下記表1に示されたものに従って形成される：
【００６４】
表1
元の残基 同類置換
Ala(A)                       Gly; Ser, Abu
Arg(R)                       Lys, orn
Asn(N)                       Gln; His
Cys(C)                       Ser
Gln(Q)                       Asn
Glu(E)                       Asp
Gly(G)                       Ala; Pro
His(H)                       Asn; Gln
Ile(I)                       Leu; Val; Met; Nle; Nva
Leu(L)                       Ile; Val; Met; Nle; Nv
Lys(K)                       Arg; Gln; Glu
Met(M)                       Leu; Tyr; Ile; Nle Val
オルニチン                   Lys; Arg
Phe(F)                       Met; Leu; Tyr
Ser(s)                       Thr
Thr(T)                       Ser
Trp(W)                       Tyr
Tyr(Y)                       Trp; Phe
Val(V)                       Ile; Leu; Met; Nle; Nv
【００６５】
実験により、又は周知の特性に従って置換を見極めることができ、且つ/又はin silicoで見極めることができる。
本明細書中に使用されるin silicoとは、コンピューターを使用して実施される研究及び試験を意味する。in silico法の一例としては、分子モデリング研究、生体分子ドッキング試験、及び分子構造及び/又はプロセス、例えば分子相互作用の仮想提示が挙げられる。
【００６６】
本明細書中に使用されるアデノウィルス・ゲノムは、修飾型線維タンパク質を含む任意のAdベクター又は核酸を含む、任意のアデノウィルス・ベクター又は任意の核酸分子を含むものとする。本明細書中のベクター及び方法に使用するものとしては、全てのアデノウィルス血清型が考えられる。
【００６７】
本明細書中に使用されるパッケージング細胞系は、アデノウィルス・ゲノム又は修飾型ゲノムをパッケージングすることにより、ウィルス粒子を生成することができる細胞系である。パッケージング細胞系は欠落遺伝子生成物又はその同等物を提供することができる。従って、パッケージング細胞は、アデノウィルス・ゲノムにおいて欠失された遺伝子に対する補完機能を提供することができ(例えば修飾型線維タンパク質をコードする核酸)、そしてアデノウィルス粒子内にアデノウィルス・ゲノムをパッケージングすることができる。このような粒子の生成は、ゲノムが複製されること、及び感染性ウィルスの集成に必要なタンパク質が生成されることを必要とする。粒子はまた、ウィルス粒子の成熟に必要な或る特定のタンパク質を必要とすることもある。このようなタンパク質は、ベクターによって、又はパッケージング細胞によって提供することができる。
【００６８】
本明細書中に使用される脱ターゲット型アデノウィルス粒子は、天然型粒子が相互作用する受容体との相互作用がアブレート(低減又は排除)されている。脱ターゲット型粒子は、2つ又は3つ以上の特異性が変化させられている。言うまでもなく、in vivoでは、任意の細胞と相互作用しないように粒子がアブレートされることはない。脱ターゲット型粒子は、天然型受容体との相互作用が低減され、典型的には実質的に低減又は排除されている。本明細書中の目的上、脱ターゲット型粒子は、CARとの結合が低減(2分の1、5分の1、10分の1、又は100分の1以下に低減)されているか、又は事実上結合が行われず；脱ターゲット型ベクター粒子はさらに他の細胞受容体、HSP及びインテグリンとの相互作用を排除するためのキャプシド修飾を含む。粒子は依然として細胞に結合するが、しかし細胞のタイプ及び相互作用は低減される。
【００６９】
本明細書中に使用される「シュードタイピング」とは、ベクター自体の血清型とは異なる血清型に由来する1つ又は2つ以上の修飾型キャプシド・タンパク質を有するアデノウィルス・ベクター粒子を生成することである。その一例はAd37及びAd35線維タンパク質を含有するアデノウィルス5ベクター粒子の生成である。このことは、例えば、種々異なる線維タンパク質を発現させるパッケージング細胞系内でアデノウィルス・ベクター粒子を生成することにより、達成することができる。本明細書中に提供されるように、線維軸部内部の反復配列のうちの1つ以上を置換、突然変異又は欠失させることにより、CARと結合するアデノウィルス5粒子又は他のC血清型群アデノウィルス又はその他のアデノウィルスを脱ターゲットしてCARとの結合を低減又は排除することができる。
【００７０】
本明細書中に使用される「受容体」は、その他の分子と特異的又は選択的に結合する生体活性分子を意味する。「受容体タンパク質」という用語を使用して、特異的受容体のタンパク質としての性質をより特異的に示すことができる。
【００７１】
本明細書中に使用される、線維-受容体相互作用との関連におけるような「相互作用する」及び「相互作用」は、分子間の会合を意味する。これらの分子は、分子間の直接的及び/又は間接的会合、結合及び/又は認識に関与することができる。
【００７２】
本明細書中に使用される「環状RGD」(又はcRGD)という用語は、細胞表面上でαvインテグリンと結合する任意のアミノ酸を意味し、そして配列RGD(Arg-Gly-Asp)を含有する。
本明細書中に使用される「異種ポリヌクレオチド」という用語は、アデノウィルス以外の生物源、又は異なる血清型のアデノウィルスに由来する生物源から導き出されるポリヌクレオチドを意味するか、或いは、野生型ウィルスに由来する異なる遺伝子座に位置するポリヌクレオチドであってよい。異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチド、例えば毒素又は治療用タンパク質をコードすることができる。異種ポリヌクレオチドは、調節領域、例えばプロモーター領域、例えば特異的細胞又は組織内で活性のプロモーター、腫瘍溶解性アデノウィルス内に見いだされるような腫瘍組織を含有することができる。或いは、異種ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、そしてさらに、コード領域に作用連関されたプロモーター領域を含有することもできる。
【００７３】
本明細書中に使用される、アデノウィルス・タンパク質内のアミノ酸、又はアデノウィルス・ゲノム内のヌクレオチドは、特に断りのない限り、Ad5に関連して言及される。他のアデノウィルス株及び/又は修飾型株等及びベクター内の対応するアミノ酸及びヌクレオチドは、当業者によって同定することができる。このように突然変異に言及するときには、対応遺伝子座を有する全てのアデノウィルス株を含むものとする。
【００７４】
本明細書中に使用される「KO突然変異」は、例えば米国特許出願第10/351,890号明細書及び同第60/459,000号明細書に例示されているような、CARとの結合をノックアウトする線維タンパク質の突然変異を意味する。例えば、KO1突然変異は、Ad5線維の突然変異及び他の線維タンパク質の対応突然変異を意味する。Ad5の場合、この突然変異の結果、線維アミノ酸408及び409を置換し、これらの線維アミノ酸をそれぞれセリンからグルタミン酸へ、そしてプロリンからアラニンへ変化させる。本明細書中に使用される「KO 12突然変異」は、Ad5線維の突然変異及び他の線維タンパク質の対応突然変異を意味する。Ad5の場合、この突然変異は、下記のようなSEQ ID NO:35の4アミノ酸置換である：R512S, A515G, E516G及びK517G。他のKO突然変異は、実験により同定することができ、或いは当業者に知られている。
【００７５】
本明細書中に使用される「PD突然変異」は、RGDトリペプチドを置換することによりαvインテグリンとの結合をアブレートするペントン遺伝子の突然変異を意味する。例えば、米国特許出願第60/459,000号明細書中に例示されたPD1突然変異は、結果として、Ad5ペントン・タンパク質のアミノ酸337から344までのHAIRGDTF(SEQ ID NO:61)を、アミノ酸SRGYPYDVPDYAGTS(SEQ ID NO:62)と置換し、これによりRGDトリペプチドと置換する。
【００７６】
本明細書中に使用される「治療」は、状態、障害又は疾患の症状を改善又は有益に変化させる任意の様式を意味する。
本明細書中に使用される「治療上効果的な生成物」は、異種DNAによってコードされる生成物であって、宿主内にDNAを導入すると、先天性又は後天性疾患の症状、徴候を効果的に改善又は排除するか、又は前記疾患を治癒する生成物が発現される。
【００７７】
本明細書中に使用される「患者」は動物、例えば哺乳動物、典型的には病人を含むヒトである。
本明細書中に使用される「遺伝子治療」は、このような治療が求められる疾患又は症状を有する哺乳動物、特にヒトの或る特定の細胞、ターゲット細胞に異種DNAを導入することに関与する。選択されたターゲット細胞中にDNAを導入することによって、異種DNAを発現させ、そしてこのDNAによりコードされた治療用生成物を生成する。或いは異種DNAは、何らかの形式で、治療用生成物をコードするDNAの発現を媒介することもでき、異種DNAは、治療用生成物の発現を直接的又は間接的に何らかの形式で媒介するペプチド又はRNAのような生成物をコードすることもできる。遺伝子治療を用いて、遺伝子生成物をコードする核酸を送達することにより、欠陥遺伝子を置換するか、又は核酸が導入された哺乳動物又は細胞によって生成された遺伝子生成物を補足することもできる。導入された核酸は、治療用化合物、例えば成長因子又はそのインヒビター、又は腫瘍壊死因子又はそのインヒビター、又はこれらのための受容体をコードすることができ、このような治療用化合物は、哺乳動物宿主内で通常は生成されず、又は治療上効果的な量又は治療上有用な時点で通常は生成されない。治療用生成物をコードする異種DNAを、罹患宿主の細胞内に導入する前に修飾することにより、生成物又はその発現を増強するか、又はその他の形式で変化させることができる。
【００７８】
本明細書中に使用される「治療核酸」は、治療用生成物をコードする核酸である。生成物は、核酸、例えば調節配列又は遺伝子であってよく、或いは、治療活性又は治療効果を有するタンパク質であってもよい。例えば、治療用核酸は、リボザイム、アンチセンス、二本鎖RNA、タンパク質をコードする核酸及びその他であってよい。
【００７９】
本明細書中に使用される「生成物と実質的に同一」は十分に類似していて、当該特性が、その生成物の代わりに実質的に同一の生成物を使用できるほど十分に不変であることを意味する。
【００８０】
本明細書中に使用される「実質的に純粋」は、標準的な分析法、例えば当業者によって使用される薄膜クロマトグラフィ(TLC)、ゲル電気泳動法及び/又は高性能液体クロマトグラフィ(HPLC)によって測定して、容易に検出可能な不純物がないように見えるほど十分に均質であるか、或いは、更なる精製が物質の物理的及び化学的な特性、例えば酵素活性及び生体活性を検出可能に変化させることがないほど十分に純粋であることを意味する。実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための化合物精製法は、当業者によく知られている。しかし実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体又は異性体の混合物であってもよい。このような事例において、さらに精製することにより、化合物の特異的活性を増大させることもできる。
【００８１】
これらの方法、及び本明細書中に提供される生成物の調製は、特に断りのない限り、当業者の技術範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養及びトランスジェニック生物学のコンベンショナルな技術を採用する(例えばManiatis他(1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook他(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel他(1992) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York; Glover(1985) DNA Cloning I and II, Oxford Press; Anand(1992) Techniques for the Analysis of Complex Genomes(Academic Press); Guthrie and Fink(1991) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press; Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY; Jakoby and Pastan編, (1979) Cell Culture. Methods in Enzymology 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jaovanovich, NY; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S. J. Higgins編, 1984)；Culture of Animal Cells(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cell And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal (1984), A Practical Guide to Moleuclar Cloning; Gene Transfer Vertors For Mammalian Cells(J. H. Miller及びM.P. Calos編, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods in Enzymology, 第154及び155巻(Wu他編); Immunochemical Method in Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker編), Academic Press, London, 1987); Handbook of Experimental Immunology, 第I-IV巻(D. M. Weir及びC. C. Blackwell編, 1986)；Hogan他(1986) Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY参照)。
【００８２】
B.  キャプシド修飾
アデノウィルスと天然型受容体との相互作用を低減、排除又はアブレートするウィルス・キャプシド修飾、そして任意には、ターゲットされた受容体との相互作用を加えた修飾が本明細書中に提供される。具体的には、これらの修飾は、アデノウィルスとCARとの特にin vivoでの相互作用を低減又はアブレートする線維修飾である。修飾された親和性を有するアデノウィルスは一般に、その天然形態においてCARと、特にin vivoで相互作用するアデノウィルスである。これらの線維修飾は、その他のキャプシド・タンパク質修飾、例えばその他の線維修飾及び/又はペントン及び/又はヘクソン修飾と組み合わせることにより、ウィルス粒子上に発現されたときに天然受容体とのウィルス相互作用をアブレートし、且つ/又は、ターゲットされた受容体との相互作用を導入することができる。修飾は、三量体形成又は核内への線維輸送を妨害するべきではない。
【００８３】
1.  線維遺伝子及びタンパク質
線維タンパク質は、キャプシドから延び、そして特異的細胞受容体と結合することにより、細胞表面とのウィルス結合を媒介する(Philipson他(1968) J. Virol. 2:1064-1075)。線維は、アデノウィルス・ペントン・ベースと相互作用するN末端尾部ドメイン、可変長の中央軸部ドメイン、及び細胞受容体結合部位を含有するC末端節部ドメインを含む三量体タンパク質である(Chroboczek他(1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199:163-200; Riurok他(1990) J. Mol. Biol. 215:589-596; Stevenson他(1995) J. Virol. 69:2850-2857)。アデノウィルス血清型2(Ad2), Ad5, Ad3, Ad35, Ad12, Ad40及びAd41を含む種々の血清型に由来する線維遺伝子の配列が知られている。21以上の種々異なる線維遺伝子がGENBANKにある。
【００８４】
上述のように、線維タンパク質は3つのドメインに分けることができる(例えばGreen他(1983)EMBO J. 2:1357-1365参照)。保存N末端は、ペントン・ベースと会合するのに関与する配列、並びに核局在化シグナルを含有する。可変長の棒状軸部は、典型的には約15アミノ酸β-構造の反復を含有し、反復数は約6〜23である(例えばAd3では6反復、Ad37では8反復、Ad4では12反復、Ad5及びAd41では22反復、及びAd12では23反復)。しばしば、最後の完全反復には不完全な反復が続く。例えば、Ad5では、最後の完全反復は線維軸部の21番目の反復であり、そしてこれには、線維節部との接合の前に、不完全な反復配列(22番目の反復)が続く。配列TLWT(例示されたようなSEQ ID NO:64)を含むアミノ酸の保存列は、軸部内のβ-構造の反復単位と、節部と呼ばれる球状頭部ドメインとの間に境界をマーキングする。C末端節部のサイズは、Ad41の短線維の157アミノ酸残基から、Ad11及びAd34の193残基までである。線維スパイクはホモ三量体であり、C末端は線維ホモ三量体の三量体化に関与する。典型的には、ペントン・ベース複合体と会合することによって付着されるスパイクは、1ビリオン当たり典型的には12個である。
【００８５】
アデノウィルス線維は、アデノウィルス親和性の主要な決定因子である。線維は細胞表面上の受容体と相互作用することにより、細胞表面とのウィルス結合を媒介する。ほとんどのヒト・アデノウィルスに対する一次受容体は、コクサッキー-アデノウィルス受容体(CAR)、免疫グロブリン上科の一員である46 kDaタンパク質である(Bergelson他(1997) Science 275: 1320-1323)。受容体は、in vivoで多くの細胞タイプ上に分配され、部分群Bを除くほとんどのAd血清型によって認識される(Bergelson他(1997) Science 275: 1320-1323; Roelvink他(1998) J. Virol. 72:589-596)。線維とCARとの間の認識は、線維節部とCARとの相互作用として生じる。線維節部、例えばβ鎖A及びB、又はC及びDに加わるループ(それぞれAB-ループ及びCD-ループ)の突然変異は、CAR結合を実質的に低減及び/又は排除することができる(Roelvink他(1999) Science 286: 1568-1571; Bewley他(1999) Science 286: 1579-1583; Huang他(1999)J. Virol. 73:2798-2802)。CARと相互作用する線維節部を有するアデノウィルスは、(a)部分群Aのアデノウィルス、例えばAd12、(b)部分群Cのアデノウィルス、例えばAd2及びAd5、(c)部分群Dのアデノウィルス、例えばAd8, 9, 10, 13, 15, 17, 19(Ad19a及びAd19pを含む)、20, 22-30, 32, 33, 36-39、及び42-49、及び(d)部分群Fのアデノウィルス、例えばAd40及びAd41、具体的には部分群Fの短線維を含む。
【００８６】
ほとんどの血清型に由来する線維の節部がCARを認識することはできるものの、これらの血清型のすべてが、一次細胞受容体としてCARを使用するわけではない。Arnberg他((2000) J. Virol. 74;42-48)が報告したところによれば、Ad37(部分群Dの血清型)は、肺上皮細胞上のその一次受容体として、シアリン酸を含有する糖タンパク質を使用する。Wu他((2001) Virology 279:78-89)が実証したところによれば、Ad37は、Ad37及び関連する部分群DウィルスAd19a及びAd8が異常な親和性を共有する細胞タイプである結膜細胞、及びその他の細胞の上に存在する別の受容体に結合する。Ad37線維の節部は、この相互作用において役割を演じる。この相互作用は、Ad37節部のCDループの突然変異により妨害することができる。
【００８７】
2.  線維軸部
線維軸部もまた細胞相互作用において役割を演じる。その一例は、アデノウィルスと肝細胞との相互作用である。肝細胞において、in vivoの侵入経路は、ヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン(HSP)結合を介した、線維軸部、例えばAd5軸部によって媒介されるメカニズムに関与する。この結合を排除すると、HSP結合を介した肝細胞への侵入が排除される。HSPとのウィルス相互作用をアブレートするこのようなアデノウィルス線維軸部修飾は、米国特許出願第60/459,000号明細書(参考のため本明細書中に引用する)に記載されているような修飾である。
【００８８】
特定の細胞タイプと相互作用するアデノウィルスの能力はまた、HSP結合を排除する修飾とは別に、線維軸部の修飾によっても影響される。細胞結合を修飾、低減且つ/又は排除するアデノウィルス線維軸部修飾が本明細書中に提供される。CARとの相互作用をアブレート又は低減するアデノウィルス線維軸部修飾が提供される。CAR結合を排除すると、細胞結合、及びCAR依存性細胞タイプ、例えば肺上皮細胞の感染が排除される。CAR結合を低減又は実質的に排除し、そして特定の細胞タイプ、例えば上皮細胞との相互作用をアブレートするAd線維軸部修飾が提供される。好適な修飾、例えば本明細書中に記載された修飾は、野生型ウィルスがCARと相互作用するような任意のアデノウィルスに関して形成することができる。
【００８９】
線維又はウィルスとCARとの相互作用、並びに細胞結合及び感染性は、当業者に知られた任意の方法によって測定することができる。1つのこのようなアッセイは、マーカータンパク質、例えばGFPを発現させるアデノウィルス粒子又はシュードタイプされたアデノウィルス粒子を使用して、細胞感染を測定することである。手短かに言えば、50,000個の付着細胞、例えばA549細胞を、20,000個のウィルス粒子と3時間にわたって37℃でインキュベートする。洗浄後、顕微鏡法又は蛍光支援細胞分別(FACS)によって細胞を分析して、GFPを発現させる感染細胞を区別する。
【００９０】
別のこのようなウィルス-細胞相互作用アッセイは、ウィルス付着アッセイである。手短かに言えば、培養細胞、例えばA549細胞を取り外し、そしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に、管1本当たり細胞1 x 106個の密度まで再懸濁する。細胞には1 x 109個のウィルス粒子を加え、そして4℃で揺らしながら管をインキュベートすることによりウィルス内部化を防止する。非特異的ウィルス結合を見極めるために、試料を、過剰のAd5節部タンパク質と共にインキュベートする。細胞をPBSで数回にわたって選択し、次いで当業者に知られた標準的な分子生物学的方法によってDNAを抽出する。ウィルスDNAの存在は、PCR、Taqman、サザン・ブロット法のような方法、又は当業者に知られた任意の他の方法によって見極められる。
【００９１】
線維又はウィルスとCARとの相互作用は、細胞に基づくアッセイ、例えばArnberg他(2000) J. Virology 74;42-48に記載されているようなアッセイで見極めることができる。手短かに言えば、3H標識付きウィルス粒子を、CAR発現細胞、例えばCHO-CAR細胞と共に、そして同等のCAR非発現細胞、例えばCHOアルファ2(ヒトα-2インテグリンを発現させる)と共にインキュベートする。上述のように、又はArnberg他(2000) J. Virology 74;42-48に記載されているように、ウィルス付着アッセイを実施する。シンチレーション・カウントにより、CAR発現試料及びCAR非発現試料内の細胞に付着されたウィルスの量を見極める。CARと相互作用するウィルス粒子は、CAR非発現細胞と比較して、CAR発現細胞との付着を増大させる。
【００９２】
線維とCARとの相互作用は、線維構造によって見極められ、そして細胞表面に対する線維及びアデノウィルス粒子の配向能力によって影響される。線維の長さ及びフレキシビリティは、細胞相互作用及び感染性における重要な決定因子である。本明細書に記載されているように、特定の線維軸部修飾は、線維軸部又は線維軸部部分の構造又は配向を変化させることによって、細胞相互作用及び感染性を低減する。これらの修飾はCARとの相互作用を変化させる。
【００９３】
当業者に知られた方法、例えば結晶構造分析及び低温電子顕微鏡法(cryo-EM)研究によって、線維構造及び配向を評価することができる(Xia他(1994) Structure 2:1259-1270; van Raaij他 I., (2000) Structure 8: 1147-1155; Stewart他(1997) EMBO J. 16:1189-1198)。例えば、本明細書中に記載されているように、cryo-EM研究によって、線維のフレキシビリティ又は剛性を実証することができる。分子モデリング・ソフトウェア及び構造モデリング・ソフトウェアを使用して、粒子配向及び受容体相互作用を含む、細胞表面におけるアデノウィルス相互作用の画像を構成することができる。本明細書中に記載されているように、線維軸部構造又は配向、及びアデノウィルスがCARと相互作用する能力は、Ad線維軸部の領域を置換、突然変異又は欠失させることにより修飾される。
【００９４】
3.  線維軸部の修飾
in vivoでCARと結合する血清型に由来する修飾型アデノウィルス線維が、ここに提供される。修飾型線維は、軸部の修飾、具体的にはβ-反復の修飾を有する線維を含む。
Ad線維軸部は、反復単位から形成される。反復単位は或いは、反復、β-反復、シュード反復又は反復モチーフ(それぞれの用語は互いに置き換え可能である)と呼ばれる。これらの反復はそれぞれ、(アラインメントに応じて)ほぼ13-20、一般には15アミノ酸長であり、そして線維軸部配列内部で連続して発生する。反復は、β-反復を線維軸部に与え、各反復は、βターンによって分離された2つのβ鎖を含有する。異なるアデノウィルスに由来する線維軸部は、異なる数の反復配列を有する。例えば、Ad2及びAd5はそれぞれ、線維軸部内に21個の完全な反復を有するのに対して、Ad37の線維軸部は8つの反復を有する。一般には線維がより長いアデノウィルスが、CARと相互作用し、線維がより短いアデノウィルスは、CARと相互作用しない。しかし、本明細書中に示すように、特に軸によって媒介される相互作用の場合、線維の長さだけではなく、線維のフレキシビリティも、CARとの相互作用を媒介する。本明細書中に示すように、CAR結合線維内の軸部反復の修飾は、in vivoでの相互作用を低減する。
【００９５】
本明細書中に示すように、1つ又は2つ以上の反復のβ鎖又はβターンのいずれかの修飾が、線維の構造を変化させ、そして細胞の感染性及びCARとの相互作用を実質的に低減又は排除する。従って、修飾型線維、具体的には、CARとの相互作用を変化させられた修飾型軸部を有する線維が提供される。相互作用は、これらの反復、具体的には、Ad2又はAd5の3番目のβ-反復及び/又は最後の完全反復に対応する反復のうちの一方又は両方を変化させることによって、相互作用を調節することができる。例えば、本明細書に示されたように、Ad2又はAd5の3番目のβ-反復及び/又は最後の完全反復に対応する反復のうちの一方又は両方を修飾することによって、CARとの結合が低減される。他の血清型及び他のタイプのアデノウィルスに由来する線維を同様に修飾することにより、in vivoでのCAR相互作用を調節することができる。このことは、反復を排除し、反復を挿入し、そして反復を修飾することにより実現することができる。具体的には、Ad2又はAd5の3番目の反復及び最後の完全反復に対応する反復を修飾することにより、in vivoでのCAR相互作用を調節することができる。これに加えて又はその代わりに、相互作用は、CARと結合する線維内の反復を欠失させ、ARと結合しない線維内に反復を挿入することにより調節することができる。
【００９６】
本明細書における目的上、線維軸部配列を比較してアラインメントすることにより、種々異なるタンパク質内部の対応反復位置を見極めることによって、アミノ酸残基の数、ひいてはアラインメントされた類似残基の数を最大化することができる。反復は比較的短いので、アラインメントはマニュアルで行うことができる。種々異なる線維軸部の反復のようなタンパク質をアラインメントする際には、線維軸部全体又はその一部(本明細書中では「領域」とも呼ばれる)をアラインメントにおいて使用することができる。アラインメントにおいて線維タンパク質配列全体を使用する必要はなく、また線維軸配列全体を使用する必要もない。例えば、図1A及び1Bは、種々異なるアデノウィルス線維タンパク質に対応する、それぞれ3番目の反復配列及び最後の完全反復配列のアラインメントを示す。加えて、線維タンパク質をアラインメントする際には、同一残基だけではなく、同類アミノ酸置換もアラインメントされる。ペプチド又はタンパク質の場合、好適な同類アミノ酸置換が当業者に知られている。同類置換の例を上記表1に示す。
【００９７】
線維シャフト領域内の同一アミノ酸及び保存アミノ酸のアラインメントは、標準的なアラインメント・アルゴリズム・プログラムにより見極められ、これらのプログラムは、それぞれの供給元によって確立されたデフォルト・ギャップ・ペナルティと共に用いられる。マニュアル・アラインメントを用いて、タンパク質間のアラインメントされた同類アミノ酸及び同一アミノ酸の数を最大化することもできる。3つ以上の線維軸部配列又は線維軸部領域、例えば反復のうちのいずれか2つがアラインメントするかどうかは、例えばPearson他(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444(その他のプログラムはGCGプログラム・パッケージを含む(Devereux, J.他、Nucleic Acids Research 12(I):387(1984))、BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul, S.F.他、J Molec Biol 215:403(1990);Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop編、Academic Press, San Diego, 1994、及びCarillo他(1988) SIAM J Applied Math 48:1073)に記載されているようなデフォルト・パラメータを用いて、周知のコンピュータ・アルゴリズム、例えば「FAST A」プログラムによって見極めることができる。例えば、National Center for Biotechnology Information データベースのBLAST関数を用いて、同一性を見極めることができる。商業的又は公的に入手可能なその他のプログラムは、DNAStar 「MegAlign」プログラム(Madison, WI)及びUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)「Gap」プログラム(Madison, WI)を含む。タンパク質及び/又は核酸分子のパーセント相同性又は同一性は、例えばGPA コンピュータ・プログラムを使用して配列情報を比較することにより、見極めることができる(例えばSmith 及びWaterman((1981) Adv. Appl. Math. 2:482)によって訂正された、Needleman 他(1970)J. Mol. Biol. 48:443)。手短に言えば、GAPプログラムは、類似のアラインメントされた符号(すなわちヌクレオチド又はアミノ酸)の数を、2つの配列のうちの短い方における符号の総数で割算したものとして類似性を定義する。GAPプログラムに対するデフォルト・パラメータは、下記のものを含むことができる：(1)Schwartz及びDayhoff編、ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, 第353-358頁(1979)によって記載されたような、単項比較行列(同一性には1の値、そして非同一性には0の値を含む)及びGribskov編(1986) Nucl. Acids Res. 14:6745の重み付け比較マトリックス；(2)各ギャップに対して3.0のペナルティ、及び各ギャップにおける各符号に対して付加的な0.10のペナルティ；及び(3)エンド・ギャップにはペナルティなし。上述のように、アラインメントされる線維内の領域が比較的短いことから、マニュアル・アラインメントで十分である。
【００９８】
同様に、本明細書中に記載され当業者に知られた技術を用いて、同じタンパク質内部の領域間を比較することにより、反復モチーフの同定が可能になる。例えばAd5線維軸部内部の領域をアラインメントすると、21個の反復が同定され、これらの反復のそれぞれは、コンセンサス配列(SEQ ID NO:45), abCdEfGhijKlMnoに似ている。この配列において、大文字は疎水性アミノ酸を表し、そして下線を付けた残基(j)は、β鎖がβターンを形成するのを可能にする特別なプロリン又はグリシンを意味する。
【００９９】
アデノウィルス線維タンパク質間又はアデノウィルス・タンパク質内部の対応反復を見極めることにより、任意の線維、その一部、又はキメラ線維タンパク質におけるこのような反復の修飾が可能になる。別の実施態様の場合、線維軸部領域内部及び線維軸部領域間の反復が同定され、これらの反復のうちの1つ又は2つ以上が、反復配列を突然変異、欠失又は置換させることにより修飾される。例えば軸部配列内部の反復のうちの1つの反復の1つ以上のアミノ酸を修飾して、CAR相互作用が実質的に低減又は排除されるようにする。
【０１００】
当業者に知られた任意の方法によって、修飾を形成することができる。例えばPCRを用いて、線維タンパク質をコードする核酸の特異的突然変異を導入することができる。或いは、化学的な突然変異原、紫外線波長、突然変異原性細菌株及び突然変異原性PCRプロトコルを用いて、線維タンパク質又はその一部をコードする核酸の1つ又は2つ以上の突然変異を導入することもできる。線維タンパク質をコードする核酸の突然変異は、1つ又は2つ以上のアミノ酸の挿入、1つ又は2つ以上のアミノ酸の欠失、又は線維軸部内部の反復のうちの1つ又は2つ以上のアミノ酸配列の変化、又はこれらの任意の組合わせを導入する。
【０１０１】
ウィルス付着、本明細書に記載された細胞感染性及びCAR結合アッセイ、及び当業者に知られた他のこのようなアッセイのようなアッセイを用いて、CAR結合及び細胞感染性に対する修飾の効果が評価される。本明細書中に記載された線維の修飾は、CARとのin vivoでの結合を修飾することになる。しかし、in vitroアッセイを用いて、β-反復、具体的にはAd2及びAd5の3番目の反復及び最後の完全反復に対応する反復に修飾が施されたときの、CARとの結合を評価することもできる。
【０１０２】
一般には、所望の修飾は、CAR結合を排除又は低減(2分の1以下、一般には10分の1以下、100分の1以下又はそれ未満に低減)するためのCAR結合線維の修飾である。本明細書中に示すように、このことは、β-反復を修飾し(選択された反復を、CAR非結合線維に由来する対応反復と置換し、反復内、具体的にはAd2又はAd5の3番目の反復及び最後の完全反復に対応する反復内の1つ又は2つ以上のアミノ酸を変化させる)、且つ/又は、反復、例えばこのようなCAR結合線維内の14個の中心反復のうちの1つから全部に至るまでの反復を排除することにより達成される。また言うまでもなく、反復を付加し、且つ/又は反復、具体的には3番目の反復及び最後の完全反復に対応する反復を、CAR結合線維に由来する反復と置換することにより、CARと結合するように、一般にはCARに結合しない線維、例えばAd37を修飾することができる。
【０１０３】
本明細書中に提供された修飾型線維の中には、修飾型線維の三次構造が未修飾型線維の構造と比較して変化させられることにより、修飾型線維が未修飾型線維よりも剛性となる線維がある。未修飾型線維と比較して、短縮されるか又は低減されたフレキシビリティを示す修飾型線維が含まれる。線維軸部は、反復のうちの1つ又は2つ以上が修飾されるように修飾される。本明細書中に記載されているように、Ad5線維配列(SEQ ID NO:35)が、基準配列として使用される。こうして例えば、「3番目の反復の修飾」は、Ad5の3番目の反復の修飾、又はAd5の3番目の反復に対応する反復に対する修飾を意味する。「対応する反復」は、別の線維、その部分又はキメラ内の反復の配列内では3番目の反復ではないかもしれない。例えば、線維軸部配列内部の3番目の反復に対応するアミノ酸配列が修飾される。例えば、部分群C線維、例えばAd2又はAd5の線維軸部を修飾することにより、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:42及び43)内の3番目の反復の配列内部のアミノ酸のうちの1つ以上を突然変異、置換、挿入、又は欠失させ、ひいてはCAR結合を実質的に低減又は排除する。例えば、当業者に知られた標準的な分子生物学法及び生化学法によって、3番目の反復内部のTTVT/S配列(SEQ ID NO:44)を欠失させ、置換し、又は1つ又は2つ以上のアミノ酸を挿入する。この遺伝子座(又は対応遺伝子座）における3番目の反復の修飾は、例えば本明細書に記載されているように、線維軸部の構造を妨害し、その結果、線維軸部の剛性が増大し、そしてそのフレキシビリティが減少した線維がもたらされる。
【０１０４】
別の例として、線維軸部内の最後の完全反復に対応するアミノ酸の配列を修飾する。例えば、ほとんどの血清型の線維軸部の最後の完全反復内に見いだされるKLGXGLXFD/Nモチーフ(SEQ ID NO:49)は、モチーフ内部の1つ以上のアミノ酸を突然変異、置換、挿入又は欠失させることにより、又はモチーフ内に1つ以上の付加的なアミノ酸を挿入することにより修飾され、ひいてはCAR結合が実質的に低減又は排除される。例えば、部分群C線維、例えばAd2又はAd5の線維軸部を修飾することにより、最後の反復のアミノ酸配列を突然変異、置換又は欠失させ、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:46及び47)の21番目の配列、例えばKLGXGLXFD/Nモチーフ(SEQ ID NO:49)を、当業者に知られた標準的な分子生物学法及び生化学法によって欠失又は突然変異させる。
【０１０５】
線維軸部内の最後の反復の修飾は、線維軸部の構造を変化させる。Ad2線維における節部と軸部との界面には、ヒンジ構造が存在する(van Raaij他, (200) Nature 401:935-938)。例えば、最後の反復に対する修飾は、線維軸部の構造を変化させ、そして線維軸部と節部との間のヒンジ構造を変化させることができる。このような修飾を有する線維が提供される。
【０１０６】
上述のように、本明細書中に提供される修飾型線維は、細胞軸部の反復領域ののうちの1つが、CARに結合しないか又はその一次受容体としてCARを使用しないAd線維に由来する反復配列と置換されているような線維を含む。このような領域は、部分群DのAd血清型、例えばAd8, 9, 10, 13, 15, 17, 19(Ad19a及びAd19pを含む)、20, 22-30, 32, 33, 36-39、及び42-49から導き出すことができる。例えば、部分群C、例えばAd2又はAd5のようなCAR結合線維の線維軸部を修飾することにより、反復のうちの1つを、部分群D、例えばAd37, Ad8, Ad9又はA19の対応反復配列と置換する。
【０１０７】
他の実施態様の場合、CARに結合する線維の線維軸部配列内部の3番目の反復に対応する領域のアミノ酸を、CARに結合しないか又はその一次受容体としてCARを使用しないAd線維に由来する線維軸部の3番目の反復と置換する。例えば、部分群C線維、例えばAd2又はAd5の線維軸部を修飾することにより、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:42及び43)内の3番目の反復のアミノ酸を、D血清型ウィルス線維軸部に由来する3番目の反復(又は3番目の反復に対応する反復)と置換する。このような置換は、CAR結合を低減又は排除する。例えば、当業者に知られた標準的な分子生物学法及び生化学法によって、Ad5線維軸部(SEQ ID NO:43)の3番目の反復を、Ad37線維軸部(SEQ ID NO:58)の3番目の反復と置換する。
【０１０８】
この実施態様の別の観点において、CARに結合する線維の線維軸部配列内部の3番目の反復に対応する反復は、3番目の反復の1つ又は2つ以上のアミノ酸を、CARに結合しない(又はin vivoでその一次受容体としてCARを使用しない)線維に由来する対応アミノ酸と置換することにより修飾される。当業者に知られた標準的な分子生物学法及び生化学法によって、部分群C線維、例えばAd2又はAd5のようなCAR結合線維に由来する線維軸部の3番目の反復を修飾することにより、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:42及び43)の3番目の反復内のアミノ酸のうちの1つ又は2つ以上から全部に至るまでのアミノ酸を、Ad37, Ad8, Ad9又はA15(SEQ ID NO:58、及び66-68)に由来するような線維軸部の3番目の反復の対応反復配列と置換し、ひいてはCARとの結合を実質的に低減又は排除する。
【０１０９】
この実施態様の別の観点の場合、CARに結合する線維の線維軸部配列内部の3番目の反復に対応する反復は、当業者に知られた標準的な分子生物学法及び生化学法によって、1つ又は2つ以上のアミノ酸を、非同類アミノ酸置換(同類アミノ酸置換は上記表1に示すような置換である)と置換することにより修飾され、ひいてはCARとの結合を実質的に低減又は排除する。例えば、TTVT/S配列(SEQ ID NO:44)のアミノ酸のうちの1又は2つ以上を突然変異させて非同類アミノ酸、例えばプロリンにし、そしてCAR結合が実質的に低減又は排除される。CAR結合を低減する軸部内の単一修飾を含む修飾型線維の場合、修飾は、本明細書中に例示されたTTVT/Sモチーフに対応する領域内の1つ以上のヌクレオチドの修飾を含み、これにより、CAR結合が低減又は排除される。
【０１１０】
この実施態様の別の観点の場合、線維軸部内の最後の完全反復に対応する領域を修飾する。例えば、ほとんどの血清型の線維軸部の最後の完全反復内に見いだされるKLGXGLXFD/Nモチーフ(SEQ ID NO:49)は、この反復を、このモチーフを有さない線維に由来する線維軸部の最後の完全反復と置換することにより修飾される。当業者に知られた標準的な分子生物学法及び生化学法によって、部分群C線維、例えばAd2又はAd5のようなCAR結合線維に由来する線維軸部の最後の完全反復を修飾することにより、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:46及び47)の21番目の反復を、このモチーフを含有しない線維軸部、例えばAd37, Ad8, Ad9又はA15(SEQ ID NO:48、及び59-61)に由来する線維軸部の対応する最後の完全反復と置換し、ひいてはCARとの結合を実質的に低減又は排除する。
【０１１１】
この実施態様の別の観点の場合、ほとんどの血清型の線維軸部の最後の完全反復内に見いだされるKLGXGLXFD/Nモチーフ(SEQ ID NO:49)に対応する領域は、1つ又は2つ以上のアミノ酸を、このモチーフを有さない線維に由来する対応アミノ酸と置換することにより修飾される。部分群C線維、例えばAd2又はAd5のようなCAR結合線維に由来する線維軸部の最後の完全反復を修飾することにより、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:46及び47)の21番目の反復におけるKLGXGLXFD/Nモチーフ(SEQ ID NO:49)のうちの1つ又は2つ以上から全部に至るまでのアミノ酸を、Ad37, Ad8, Ad9又はA15(SEQ ID NO:48、及び59-61)に由来するようなこのモチーフと置換し、これにより、CARとの結合を低減又は排除する。修飾は、当業者に知られた標準的な分子生物学法及び生化学法によって行うことができる。この実施態様の別の観点の場合、ほとんどの血清型の線維軸部の最後の完全反復内に生じる、KLGXGLXFD/Nモチーフ(SEQ ID NO:49)に対応する領域は、1つ又は2つ以上のアミノ酸を、非同類アミノ酸置換(同類アミノ酸置換は上記表1に示すような置換である)と置換することにより修飾される。
【０１１２】
別の実施態様の場合、具体的には2つ以上の反復内に、複数の修飾を有する線維軸部が提供される。例えば、軸部の3番目の反復及び軸部の最後の完全反復に対応する反復の修飾が提供される。例えば、3番目の反復は、反復の1つ以上のアミノ酸を突然変異、置換、挿入又は欠失させることにより修飾され、そして最後の完全反復も、反復内部の1つ以上のアミノ酸を突然変異、置換、挿入又は欠失させることにより修飾されるので、線維構造は変化させられ、CARとの線維相互作用は実質的に低減又は排除される。この実施態様の別の観点において、CARと相互作用する線維に由来する線維軸部の3番目の反復(又は3番目の反復に対応する反復)、及び最後の完全反復は、CARと相互作用しない線維に由来する線維軸部の対応反復と置換される。例えば、部分群C線維、例えばAd2又はAd5のような線維軸部を修飾することにより、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:42及び43)内の3番目の反復のアミノ酸配列を、部分群Dウィルス線維の対応反復配列と置換し、また線維軸部の最後の完全反復を修飾することにより、Ad2又はAd5(SEQ ID NO:46及び47)の21番目の反復を、このモチーフを含有しない線維軸部、例えばAd37, Ad8, Ad9又はA15(SEQ ID NO:48、及び59-61)に由来する線維軸部の最後の完全反復と置換する。このことは、線維の構造を変化させ、CAR結合を低減又は排除する。キメラ線維の例は、図2に概略的に示されたAd5s/Ad37s線維(SEQ ID NO:55)であり、この場合、Ad5線維の3番目及び21番目の反復が、Ad37の対応反復と置換されている。
【０１１３】
別の実施態様において、コンセンサス配列(SEQ ID NO:45), abCdEfGhijKlMnoに対応するアミノ酸の1つ又は2つ以上が修飾されて、線維構造が変化させられるように、1つ又は2つ以上の反復が修飾される。例えば、保存疎水性残基のうちの1つ又は2つ以上を欠失させ、又は当業者に知られているような非疎水性アミノ酸と置換することにより、線維構造を変化させ、CAR結合を低減又は排除する。本明細書中に記載されているか又は当業者に知られている方法のいずれかによって、線維構造を評価することができる。別の実施態様の場合、SEQ ID NO:45でjによって示された保存プロリン又はグリシンを欠失させるか、又は非同類アミノ酸変化と置換することにより、このアミノ酸によって形成されたβターンを妨害し、その結果として、CARとの修飾型線維相互作用は、実質的に低減又は排除される。
【０１１４】
別の実施態様の場合、1つ又は2つ以上の反復、又は1つ又は2つ以上の反復の一部を欠失させ、ひいては線維構造、及びそのCARとの相互作用を変化させる。例えばAd5線維軸部から反復を欠失させ、その結果、細胞感染性が低減される。このような線維の一例はAd5Δsであり、Ad5Δsは、14個の中心反復(SEQ ID NO:51)の欠失を有する。
【０１１５】
複数の修飾の組合わせ
本明細書中に提供された修飾は、他の線維修飾と、そしてウィルス粒子の場合には、その他のキャプシド修飾と組合わせることにより、キャプシド・タンパク質を発現させる、結果として生じる粒子をさらに脱ターゲット及び/又は再ターゲットすることができる。例えば、CARとの結合を低減する付加的な修飾を、本明細書中に提供された修飾と組合わせることにより、CAR結合をさらに低減又は排除することができる。他の受容体及びタンパク質との結合を低減するその他の修飾を導入することもできる。例えば、本明細書中に記載されたCAR相互作用を低減する線維軸部修飾を、HSP相互作用を低減する修飾と組合わせることができる。好適なアデノウィルス線維軸部修飾は、線維タンパク質のHSP結合モチーフの修飾を含んで、細胞表面、具体的には幹細胞、例えば米国特許出願第10/351,890号明細書に記載された細胞表面上のHSPともはや相互作用しないようになっている。例えば、アデノウィルス線維が部分群Cアデノウィルスに由来する場合には、線維軸部を突然変異させてHSP結合モチーフを修飾することにより、HSPとの結合を排除又は低減することができる。HSP結合モチーフは、例えばAd5線維(SEQ ID NO:35)内のアミノ酸残基91-94の間に配置されたKKTK配列(SEQ ID NO:65)である。HSPと相互作用する線維の能力は、野生型線維軸部を、HSPと相互作用しないアデノウィルスの線維軸部又はその部分と置換することにより修飾される。この部分は、HSPとの相互作用を低減又は排除するのに十分である。HSPと相互作用しない線維軸部を有するアデノウィルスの例は、(a)部分群Bのアデノウィルス、例えばAd3, Ad35, Ad7, Ad11, Ad16, Ad21, Ad34、(b)部分群Fのアデノウィルス、例えばAd40及びAd41、具体的には短線維、及び(c)部分群Dのアデノウィルス、例えばAd19a及びAd19pを含む。
【０１１６】
別の実施態様の場合、野生型線維節部を、CARと相互作用しないアデノウィルスの線維節部と置換することにより、上記CAR相互作用を低減する線維軸部修飾が、アデノウィルス線維修飾と組み合わされる。CARと相互作用しない線維節部を有するアデノウィルスの例は、(a)部分群Bのアデノウィルス、例えばAd3, Ad35, Ad7, Ad11, Ad16, Ad21, Ad34、(b)部分群Fのアデノウィルス、例えばAd40及びAd41、具体的には短線維を含む。CAR相互作用が変化させられた付加的な突然変異及び線維は、米国特許出願第10/351,890号明細書に記載されており、例えばKO1及びKO12突然変異体である。
【０１１７】
本明細書中に記載されたようなCARとのウィルス相互作用を低減する修飾を有する線維を発現させるウィルス粒子中のキャプシドを、αvインテグリンとのウィルス相互作用を低減するペントン修飾と組合わせることができる。好適なアデノウィルス・ペントン修飾は、当業者に知られているペントン修飾を含む(例えば米国特許第5,731,190号明細書を参照；Einfeld他(2001) J. Virology 75:11284-11291; 及びBai他(1993) J. Virology 67:5198-5205)。例えば、ペントン中のαv相互作用に必要とされるRGDトリペプチド・モチーフを、αvインテグリンと相互作用しない異なるトリペプチドと置換することにより、αvインテグリンとのペントン相互作用を低減することができ、或いは排除することもできる。αvインテグリン相互作用が低減されたペントン・タンパク質は、当業者に知られた化学的技術及び生物学的技術によって修飾される(例えば米国特許第6,731,190号明細書参照)。一般には、アデノウィルスは部分群B又はCのアデノウィルスである。
【０１１８】
アデノウィルスの親和性を変化させるその他の線維修飾も提供される。特異的細胞タイプに対して粒子を再ターゲットする修飾と組合わされて、ウィルス粒子を脱ターゲットするアデノウィルス線維修飾が形成される。例えば、光受容体細胞タイプ上の細胞表面受容体を認識する線維の一部、Ad37に由来する線維節部又はその一部(米国特許出願第09/562,934号明細書参照；米国特許出願公開第200020193327号明細書も参照)に加わるキメラ線維が提供され、残りの線維部分は、これらの細胞タイプと効率的には相互作用しない線維から提供される。これらの細胞に対して治療用生成物をターゲットするための組換えウィルス粒子を、これらのキメラ線維を有するように構成することにより、このような変性眼疾患、例えば網膜色素変性、スタルガルト病、糖尿病性網膜症、網膜脈管化、及び遺伝的根拠のあるその他の疾患を治療することができる。網膜の後ろの光受容体細胞内で発現される遺伝子は、これらの疾患に関係する。この実施態様の1観点において、例えば線維軸部内部の反復のうちの1つを突然変異、欠失又は置換させることにより、もはやCARと効率的に結合しないように、キメラ線維の線維軸部がさらに修飾される。
【０１１９】
樹状細胞(DC)をターゲットするキメラ線維が提供される。抗原特異的免疫応答におけるDSの役割は既に知られている。DCは、全て制御又は抑制されない免疫応答から生じる自己免疫、アレルギー及び移植拒絶反応に対するワクチン接種を助けるのに利用することができる(Hawiger他(2001) J. Exp. Med. 194:769-779; Steinman他(2003) Annual Rev. Immunol. 21:685-711)。DCに関与するワクチン法は、全身性紅斑性狼瘡、重症筋無力症、関節リウマチ、インスリン依存性糖尿病及びグレーブス病を含む臨床的に重要な種々の自己免疫及び関連疾患の治療に重要であり得る。部分群BウィルスAd16及びAd35に由来する線維タンパク質との組換えアデノウィルスは、ヒトDCに感染する能力を増大させることが判っている(Havenga他(2002) J. Virol. 76:4612-4620; Rea他(2001) J. Immunol. 166:5236-5244)。組換えアデノウィルス粒子は、樹状細胞をターゲットするアデノウィルスに由来する線維又はその一部を有するように構成され(米国特許仮出願第60/467,500号明細書を参照する)、そして線維は、例えば線維軸部内部の反復のうちの1つを突然変異、欠失又は置換させることにより、もはやCARと効率的に結合しないように、さらに修飾される。これらのアデノウィルス粒子の場合、アデノウィルス(Ad)粒子は線維を除いて、部分群Cアデノウィルスに由来し、そして線維は、樹状細胞上の受容体をターゲットするのに十分なアデノウィルス部分群D部分、例えばAd19p部分を含む。修飾型細胞を有するアデノウィルス粒子はまた、樹状細胞中、例えば腫瘍抗原中に発現されるように治療生成物を発現させるように構成される。アデノウィルス粒子は、提示のために、又は樹状細胞の活性を変化させるために、樹状細胞内に発現させるための生成物をコードする異種核酸を含むことができる。異種生成物例は、腫瘍抗原(下記Fの項の表参照)及びその他の免疫調節タンパク質を含む。
【０１２０】
C.  核酸、アデノウィルス・ベクター、及び核酸を含有する細胞、及びベクターを含有する細胞
1.  アデノウィルス・ベクター及び粒子
ウィルス粒子内にカプセル化され、外生的遺伝子を発現させるアデノウィルス・ベクター・ゲノムは、系の成分である。組換えアデノウィルス・ベクター・ゲノムの成分は、選択されたアデノウィルス構造遺伝子を発現させ、所望の外生的タンパク質を発現させ、そしてゲノムが遺伝子送達ベクター粒子内にパッケージングされるのに十分な複製シグナル及びパッケージ・シグナルを含有する能力を含む。複製シグナル例は、よく知られ本明細書に記載されているように、アデノウィルス複製起源を含有する逆方向末端反復である。
アデノウィルスは多くのタンパク質をコードするが、組換えアデノウィルス粒子の集成のために、全てのアデノウィルス・タンパク質が必要になるわけではない。組換えAdベクターから適切な遺伝子を欠失させることにより、より大きな「外来」DNAセグメントの収容が可能になる。
【０１２１】
ヒト治療用のものを含み、異種核酸をin vitro及びin vivoの細胞に送達するためのアデノウィルス粒子が知られている。本明細書中に提供されているように、このような周知のウィルスを修飾することにより、CARとの相互作用を低減又は排除することができ、任意には、選択された受容体をターゲットしてこのような受容体を発現させる細胞に対して再ターゲットすることができる。ウィルス粒子を生成するのに使用されるアデノウィルス・ベクターは、他の修飾を含むことができる。修飾は、アデノウィルス・ベクターを形成するために、粒子内にパッケージングされたアデノウィルス・ゲノムの修飾を含む。上述のように、種々の修飾を有するアデノウィルス・ベクター及び粒子が利用可能である。アデノウィルス・ベクターの修飾は、当業者に知られた欠失、例えばE1a, E2a, E2b, E3又はE4コード領域のうちの1つ又は2つ以上の領域内の欠失を含む。これらのアデノウィルスはしばしば初期発生アデノウィルスと呼ばれ、そして、アデノウィルス・ゲノム(下記「ガットレス」アデノウィルス)のコード領域の全ての欠失を有するアデノウィルスを含み、また、複製条件付きアデノウィルス、つまり、異種プロモーターの制御下で複製にとって必須のアデノウィルス遺伝子を配置する結果として、細胞又は組織の特定タイプ内で複製するがしかし他のタイプでは複製しないウィルスを含む(米国特許第5,998,205号明細書及び同第5,801,029号明細書；米国特許出願第60/348,670号明細書及び対応する国際公開第02/06786号パンフレットも参照)。これらのアデノウィルスは、腫瘍溶解性ウィルスを含む細胞溶解性、細胞変性ウィルス(又はベクター)を含む。
【０１２２】
或いは、ベクターは、E1b遺伝子内の突然変異又は欠失を含むこともできる。典型的にはE1b遺伝子内のこのような突然変異又は欠失は、E1b-19kDタンパク質が非機能的になるように形成される。E1b領域の修飾は、E3の全て又は一部が存在するベクターと組合わせることができる。
【０１２３】
腫瘍溶解性アデノウィルス・ベクターはさらに、1つ以上の異種コード配列、例えば治療用生成物をコードする配列を含むことができる。異種コード配列、例えば治療用遺伝子は一般的に、必ず必要というわけではないが、cDNAの形態を成し、そしてベクターの感染性又は複製に不都合な影響を与えることのない任意の遺伝子座に挿入することができる。例えば、治療用遺伝子は、E3タンパク質、例えば19kD又は14.7kD E3遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列のうちの1つ以上の代わりに、E3領域内に挿入することができる。
【０１２４】
a.ガットレス・ベクター
ガットレス・アデノウィルス・ベクターは、ほとんど又は全てのウィルス遺伝子が欠失させられているベクターである。これらのベクターは、「ヘルパー」ウィルスが細胞に同時感染することにより成長する(例えばE1欠失型Adベクターを使用)。「ヘルパー」ウィルスにおいて、パッケージング細胞はE1遺伝子生成物を発現させる。ヘルパー・ウィルスは、粒子の集成に必要とされるウィルス構造タンパク質の生成を含む、欠落したAD機能をトランス補完する。
【０１２５】
アデノウィルスDNAはまた、血清型に応じて、サイズ範囲約100〜150 bpの逆方向末端反復配列(ITR)を有する。逆方向反復はウィルスDNA一本鎖が、これらの末端配列の塩基対合により環化するのを可能にすることにより、ウィルスDNAの複製に必要とされる塩基対合「パンハンドル」構造を形成する。効率的なパッケージングのために、ITR及びパッケージング・シグナル(数百bp長)は、複製及びアデノウィルス粒子内へのゲノム核酸のパッケージングのための「最小要件」を含有する。全ての又はほとんどのウィルスORFを欠いてはいるが、しかしこれらの必須cis要素(ITR及び隣接パッケージング配列)を含む、ヘルパー依存性ベクターが構成されている。
【０１２６】
ガット型アデノウィルス・ベクター・キャプシド内にキャプシド修飾を組込むためには、本明細書中に記載されたようなヘルパー・ウィルスに、変化を加えなければならない。修飾型キャプシド・タンパク質を含む所要のAdタンパク質全ては、ヘルパー・ウィルス及び/又はパッケージング細胞によって提供され、そしてガット型アデノウィルス粒子は、宿主細胞内に発現されるような特定の修飾型キャプシドを備える。ウィルス複製及びパッケージングには、E1a, Eab, E2a, E2b及びE4が一般に必要とされる。これらの遺伝子が欠失されると、パッケージング細胞又はヘルパー・ウィルスは、これらの遺伝子又は機能等価物を提供しなければならない。
【０１２７】
ヘルパー・アデノウィルス・ベクター・ゲノム及びガットレス・アデノウィルス・ベクター・ゲノムが、パッケージング細胞に送達される。細胞は、標準的な細胞維持又は成長条件下で維持され、これによりヘルパー・ベクター・ゲノム及びパッケージング細胞は一緒に、アデノウィルス・ベクター粒子のパッケージングのために補完タンパク質を提供する。このようなガットレス・アデノウィルス・ベクター粒子は、標準的な技術によって回収される。ヘルパー・ベクター・ゲノムは、標準的なトランスフェクション技術によって、プラスミド又は同様の構造の形態で送達することができ、或いは、ゲノムを含有するウィルス粒子の感染によって送達することもできる。このようなウィルス粒子は、一般にはヘルパー・ウィルスと呼ばれる。同様に、ガットレス・アデノウィルス・ベクター・ゲノムは、トランスフェクション又はウィルス感染によって細胞に送達することもできる。
【０１２８】
ヘルパー・ウィルス・ゲノムは、本明細書に開示されているような修飾型アデノウィルス・ベクター・ゲノムであってよい。このようなゲノムは、これがアデノウィルスE1A及びE1Bタンパク質をコードする遺伝子を欠くように、調製又は設計することもできる。加えて、ゲノムはさらに、アデノウィルスE3タンパク質をコードするアデノウィルス遺伝子を欠くことができる。或いは、このようなタンパク質をコードする遺伝子は、存在はするがしかしこれらが機能的E1A、E1B及びE3タンパク質をコードしないように突然変異させることができる。さらに、このようなベクター・ゲノムは、他の機能的初期タンパク質、例えばE2A、E2B3及びE4タンパク質をコードすることはできない。或いは、このような他の初期タンパク質をコードする遺伝子は、存在はするがしかしこれらが機能的タンパク質をコードしないように突然変異させることができる。
【０１２９】
ガットレス・ベクターを生成する際には、ヘルパー・ウィルス・ゲノムがパッケージングされ、これにより、ヘルパー・ウィルスを生成する。生成されるヘルパー・ウィルスの量を最小化し、そして生成されるガットレス・ベクター粒子の量を最大化するために、ヘルパー・ウィルス・ゲノム内のパッケージング配列を欠失させるか、或いは、ヘルパー・ウィルス・ゲノムのパッケージングが防止又は制限されるように修飾することができる。ガットレス・ベクター・ゲノムは、未修飾型パッケージング配列を有することになるので、優先的にパッケージングされる。
【０１３０】
1方法は、配列を含むヌクレオチドの1つ又は2つ以上を欠失させるか、或いは、パッケージング機能を不活性化又は阻止するように配列を突然変異させることにより、パッケージング配列を突然変異させることである。1アプローチ例は、リコンビナーゼ・ターゲット部位がパッケージング配列を側方で挟むようにヘルパー・ゲノムを遺伝子工学的に作り出すこと、及びパッケージング細胞内のリコンビナーゼを提供することである。このような部位に対するリコンビナーゼの作用の結果、ヘルパー・ウィルス・ゲノムからパッケージング配列が除去される。リコンビナーゼは、リコンビナーゼをコードするパッケージング細胞内のヌクレオチド配列によって提供することができる。このような配列は、パッケージング細胞のゲノム内に安定的に組入れることができる。種々様々なリコンビナーゼが当業者によって知られており、その一例としては、上述のパッケージング配列のいずれかの側に遺伝子工学的に作り出されたいわゆるIox部位上で作業するCreリコンビナーゼが挙げられる(例えば米国特許第5,919,676号、同第6,080,569号、同第5,919,676号の各明細書参照；例えばMorsy及びCaskey, Molecular Medicine Today, Jan. 1999, 第18-24頁も参照)。
【０１３１】
ガットレス・ベクターの一例はpAdARSVDys(Haecker他(1996) Hum Gene Ther. 7:1907-1914)である。このプラスミドは、完全長ヒト・ジストロフィンcDNAを含有する。このcDNAは、RSVプロモーターによって駆動され、そしてAd逆方向末端反復及びパッケージング・シグナルによって側方から挟まれる。293細胞に第1世代Adを感染させる。第1世代Adはヘルパー・ウィルスとして役立ち、次いで精製されたpAdARSVDys DNAがこれにトランスフェクトされる。ヘルパーAdゲノム及びpAdARSVDys DNAは、Ad染色体として複製され、ヘルパー・ウィルスによって生成されたウィルスタンパク質を使用して、粒子内にパッケージングされる。粒子が分離され、pAdARSVDys含有粒子は、ゲノムサイズがより小さく、ひいてはCsCl勾配上の密度が異なることよって、ヘルパーから分離される。ガットレス・アデノウィルス・ベクターの他の例も知られている(例えばSandig他(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97(3):1002-7参照)。
【０１３２】
b.腫瘍溶解性ベクター
手短に言って、腫瘍細胞内で選択的に複製するウィルスである腫瘍溶解性ベクターは、腫瘍内のウィルス複製により、投入されたウィルス用量を増幅し、腫瘍塊全体にわたってウィルスが広がるように設計される。アデノウィルスのin situ複製は、細胞溶解につながる。このin situ複製は、比較的低い非毒性投与量が、腫瘍細胞を選択排除するのに極めて高い効果を発揮するのを可能にする。選択性を達成するための1つのアプローチは、非ターゲット細胞内での成長には必須であるがしかし腫瘍細胞内での成長には必須ではないウィルス遺伝子の機能損失突然変異を導入することである(例えば米国特許第5,801,029号明細書)。この方法は、E1b-55KD遺伝子内の欠失を有するAddl 1520を使用することによって例示される。正常細胞において、アデノウィルスE1b-55KDタンパク質は、アポトーシスを防止するためにp53に結合することを必要とされる。p53欠損腫瘍細胞内では、p53とのE1b-55KD結合は不要である。このように、E1b-55KDの欠失は、ベクター複製をp53欠損腫瘍細胞に限定するはずである。
【０１３３】
別のアプローチは、腫瘍選択的プロモーターを使用して、複製に必要な初期ウィルス遺伝子の発現を制御することである(例えば国際公開第96/17053号及び同第99/25860号の各パンフレット参照)。このアプローチの場合、複製に必須の遺伝子がプロモーター又は腫瘍選択的なその他の転写調節要素の制御下にある場合、アデノウィルスは腫瘍細胞を選択的に複製して溶解する。
【０１３４】
例えば、アデノウィルス複製に必須のアデノウィルス遺伝子に作用連関される癌選択的調節領域を含有する腫瘍溶解性アデノウィルス・ベクターが知られている(例えば米国特許第5,998,205号明細書参照)。複製に必須のアデノウィルス遺伝子の一例としては、E1a, E1b, E2a, E2b及びE4が挙げられる。癌選択的調節領域の例は、癌胎児性抗原(CEA)、DE3乳癌特異的配列、アルファ-フェトプロテイン、Erb-B2及びチロシナーゼに由来するプロモーター及び/又はエンハンサーを含む。例えば、腫瘍溶解性アデノウィルス・ベクターの例は、E1a遺伝子に作業連関された癌選択的調節領域を有する。他の実施態様の場合、腫瘍溶解性アデノウィルス・ベクターは、E1a遺伝子に作用連関された癌選択的調節領域、例えば上述のもののうちの1つ、及びE4遺伝子に作用連関された第2癌選択的調節領域を有する。ベクターは1つ以上の治療用トランス遺伝子、例えば腫瘍細胞に対する全身性免疫応答を刺激することができるGM-CSFのようなサイトカインをコードするポリヌクレオチドを含むこともできる。
【０１３５】
他の腫瘍溶解性アデノウィルス・ベクター例は、複製に必須のアデノウィルス遺伝子の発現が、腫瘍細胞内で選択的にトランス活性化されるE2F応答性プロモーターによって制御されるようなベクターを含む。このように、ベクターが含有するアデノウィルス核酸バックボーンは順番に：左ITR、アデノウィルス・パッケージング・シグナル、終止シグナル配列、組換えウィルス・ベクターの複製に必須の第1遺伝子、例えばE1aに作用連関されたE2F応答性プロモーター、及び右ITRを含有する(国際公開第02/06786号パンフレット、及び米国特許第5,998,205号明細書参照)。
【０１３６】
c.ヘルパー非依存性ウィルス
使用のために考えられるのは、ヘルパー非依存性無線維組換えアデノウィルス・ベクター・ゲノムであり、これらのアデノウィルス・ベクター・ゲノムは、(a)全ての又はほとんどのアデノウィルス構造遺伝子生成物を発現させ、(b)アデノウィルス・パッケージング・シグナルと、アデノウィルス複製起源を含有する逆方向末端反復とを含有し、そして(c)外生的タンパク質、例えば本明細書中に記載されたマーカー・タンパク質又は治療用タンパク質を発現させることができる遺伝子を含む。
【０１３７】
アデノウィルス・ベクターは、線維タンパク質又はその一部、又はキメラ線維タンパク質を発現させるように構成することができる。例えば、本明細書中に記載された修飾型線維がAd5線維遺伝子の代わりに置かれたウィルス・バックボーンが構成される。このような1発現系は、pAdEasyプラスミドに基づいている(米国特許第5,922,576号明細書、米国特許出願第60/459,000号明細書、及びHe他、(1998) Proc. Natl. Acad Sci. 2509-2514)。この系は、E1欠失とトランス遺伝子の挿入のためのポリリンカーとを伴う、Ad5ゲノムのほとんどを含有する大きいプラスミド(pAdEasy)と、ウィルス・ゲノムの左末端を有する、より小さなシャトル・プラスミドを含む。E.coliにおけるpAdEasyとシャトル・プラスミドとの組換えは、完全長感染性Adゲノムを再構成する。CMV駆動型EGFPリポーター遺伝子を含有するシャトル・プラスミドpAdTrackとの構成済ベクターの付加的な組換え(He他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:2509-2514(1998); 米国特許第5,922,576号明細書)によって、E1欠失部位のEGFPリポーター並びにウィルス染色体内の修飾型線維遺伝子を有するAdベクターがもたらされる。EGFPリポーターを使用することにより、本明細書中に記載されているように、また当業者に知られているその他の方法によって、ウィルス感染性、生体分布及び親和性をモニタリングすることができる。
【０１３８】
アデノウィルス・ベクター・ゲノムは、ゲノムを含有するrDNAプラスミドの形態で、ラボラトリーにおいて増殖され、そして適切な宿主内へ導入されると、ウィルス遺伝子要素は、プラスミドに基づく増殖ではなく、ウィルス・ゲノム複製及びパッケージングを可能にする。Ad-ベクター・ゲノムの調製方法例を実施例に記載する。
【０１３９】
本明細書中のベクターは、細胞内で自律的複製することができる核酸(典型的にはDNA)分子を含み、この分子にDNAセグメント、例えば遺伝子又はポリヌクレオチドを作用連関させて、付着されたセグメントの複製を行うことができる。本明細書中の目的上、ベクター配列に作用連関されるべきヌクレオチド・セグメントのうちの1つが、治療用核酸分子の少なくとも一部をコードすることができる。本明細書中に示したように、治療用核酸分子は、タンパク質をコードする分子を含み、そしてまた、ターゲットされた細胞内の遺伝子生成物を発現させるか、又はこの遺伝子生成物の発現を阻害又は変化させることができる調節因子をコードする分子を含む。
【０１４０】
Adベクターは、これがパッケージング細胞系、下記のようなパッケージング細胞系に由来するような線維遺伝子の相補性なしには、線維含有アデノウィルス粒子をパッケージングするためのアデノウィルス線維タンパク質を発現させないか、又は不十分にしか発現させないように、構成することもできる。
【０１４１】
2.  パッケージング細胞系及び補完細胞系
本明細書中に提供されたウィルス粒子は、当業者に知られた任意の方法によって形成することができる。一般に、ウィルス粒子は、標準的なアデノウィルス・パッケージング細胞内の修飾型線維タンパク質をコードする核酸を含有するアデノウィルス・ベクターを成長させることにより調製され、これにより、修飾型線維を発現させる粒子が生成される。或いは、ベクターは線維をコードすることはない。このようなベクターは、修飾型線維タンパク質を発現させる細胞内にパッケージングされることにより、粒子が生成される。
【０１４２】
上述のように、組換えアデノウィルス・ベクターは一般に、第1ウィルス初期遺伝子領域内の欠失を少なくとも有している。この領域は、E1と呼ばれ、E1a及びE1b領域を含む。ウィルスE1領域は、組換えアデノウィルスを、複製できないようにし、そして続いて感染されるターゲット細胞内に感染性ウィルス粒子を生成できないようにする。このように、E1欠失型アデノウィルス・ゲノム複製を発生させ、そしてウィルス粒子を生成するためには、欠損E1遺伝子生成物を提供する相補性の系が必要となる。E1相補性は、典型的には、E1を発現させる細胞系、例えばヒト胎児腎臓をパッケージングする細胞系、すなわち293と呼ばれる上皮細胞系によって提供される。細胞系293は、アデノウィルスのE1領域を含有し、E1領域は、E1遺伝子領域生成物を提供することにより、細胞系内のE1欠失型ウィルスの成長を支援する(例えばGraham他, J. Gen. virol. 36:59-71, 1977)。加えて、アデノウィルスE4領域の一部を有する欠陥アデノウィルスの生成に使用可能な細胞系を採用することもできる(例えば国際公開第96/22378号パンフレット参照)。多数の欠失アデノウィルス・ベクター及び補完細胞系も記載されている(国際公開第95/34671号パンフレット及び米国特許第5,994,106号明細書参照)。
【０１４３】
例えば、米国特許出願公開第20030157688号明細書として公開された同時係属中の米国特許出願第09/482,682号明細書(国際公開WO/0042208号パンフレットも参照)には、ウィルス・ゲノムの大部分が欠失されているウィルス・ベクターを、ヘルパー・ウィルスを必要とすることなしにサポートするパッケージング細胞系が提供され、そしてヘルパー依存性ベクターと一緒に使用するための細胞系及びヘルパー・ウィルスも提供される。パッケージング細胞系は、細胞ゲノムの染色体内に安定的に組入れられた異種DNAを有する。異種DNA配列は、1つ又は2つ以上のアデノウィルス調節的且つ/又は構造的ポリペプチドをコードする。これらのポリペプチドは、複製されパッケージングされるべきアデノウィルス・ベクター・ゲノム内で欠失又は突然変異させられた遺伝子を補完する。
【０１４４】
パッケージング細胞系は例えば、1つ又は2つ以上のアデノウィルス構造タンパク質、ポリペプチド、又はそのフラグメント、、例えばペントン・ベース、ヘクソン、線維、ポリペプチドIIIa、ポリペプチドV、ポリペプチドVI、ポリペプチドVII、ポリペプチドVIII、及びその生体活性フラグメントを発現させる。発現は構成的であるか又は調節可能なプロモーターの制御下にあってよい。これらの細胞系は、具体的には、治療用生成物の送達を目的として組換えアデノウィルスを発現させるように設計されている。本明細書中に使用するために、このようなパッケージ細胞系は、修飾型キャプシド・タンパク質、例えばCARとの結合が低減又は排除されるときには線維タンパク質、及び/又は修飾型ペントン及びヘキソン・タンパク質を発現させることができる。
【０１４５】
特定のパッケージング細胞系は、アデノウィルス構造タンパク質、調節ポリペプチドE1A及びE1B、及び/又は調節タンパク質又はポリペプチドE2A, E2B, E3, E4, L4又はそのフラグメントのうちの1つ又は2つ以上をコードするDNA配列の欠失又は突然変異を有するウィルス・ベクターを補完する。
【０１４６】
パッケージング細胞系は、各DNA分子を細胞内に導入し、次いで別個の補完プラスミドを介してゲノム内に導入することにより生成されるか、或いは、補完タンパク質をコードする複数のDNA分子を、単一の補完プラスミドを介して導入することができる。本明細書中で重要なのは、補完プラスミドが、線維タンパク質、キメラ線維、又はその修飾型変異体をコードするDNAを含むような変異形である。
【０１４７】
治療用途のような用途の場合、送達プラスミドはさらに、異種ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。送達プラスミドの一例としては、pDV44、pΔE1Bβ-gal及びpΔE1sp1Bが挙げられる(本明細書中に記載されたもの、及び米国特許出願第09/562,934号明細書参照；及び対応する米国特許出願公開第200020193327号明細書も参照)。同様に、治療用核酸、例えば治療用生成物をコードする核酸を導入することもできる。
【０１４８】
細胞はさらに、本明細書中で考えられるような線維をコードする補完プラスミドを含み、このプラスミド又はその一部は、細胞の細胞ゲノムの染色体内に組入れられる。
典型的には、パッケージング細胞系は、細胞ゲノム内の1つ又は2つ以上の染色体内に安定的に組入れられた線維タンパク質又は修飾型タンパク質をコードする核酸を含有することになる。パッケージング細胞系は、原核細胞系又は真核細胞系から導き出すことができる。哺乳動物細胞、具体的には上皮細胞系、例えば293, A549, 及びAE1-2a細胞系を例に挙げるが、種々様々な他の非上皮細胞系を種々の実施態様に使用することができる。このような使用に適したものであればどのような他の細胞系も、本明細書中で検討される。
【０１４９】
D.  脱ターゲット
本明細書中に提供された線維突然変異は、血清型、例えばC血清型ウィルスとCARとの相互作用を低減又は排除することにより、アデノウィルス粒子の脱ターゲットを可能にする。従って、軸部、具体的には本明細書中に記載されたβ-反復領域の変化を有する線維を発現させる粒子が、CAR相互作用の低減を示す。本明細書中に記載された線維修飾を他の修飾と組合わせることにより、CAR相互作用をさらに低減し、且つ/又は付加的な受容体から脱ターゲットすることができる。例えば、Ad粒子と肝細胞との相互作用を低減又は排除することにより、アデノウィルス媒介型治療において肝臓毒性を低減することができる。肝臓形質導入のアブレーションは、アデノウィルス粒子に対する修飾の組合わせを必要とすることができる(米国特許出願第10/351,890号、同第60/459,000号の各明細書参照)。アデノウィルス媒介型治療における肝臓毒性を低減する方法は、アデノウィルス・ベクターを修飾して、in vivoの肝細胞に対するネガティブな親和性をアブレートすることを含む。このようなベクターは患者に投与することができる。このような修飾は、本明細書中に記載された修飾を含む。
【０１５０】
このような脱ターゲット型Adベクターは、例えばHSP(ヘパリン・スルフェート・プロテオグリカン；ヘパリン・スルフェート・グリコサミノグリカンとも呼ばれる)との線維軸部相互作用が、本明細書に記載された線維軸部反復に対する修飾と相俟って、具体的にはin vivoでアブレート(低減又は実質的に排除)されたアデノウィルス・ベクターで構成することができる。米国特許出願第60/459,000号明細書に記載されているような突然変異を、線維内のHSP結合部位、例えばAd2及びAd5におけるKKTKコンセンサス配列(SEQ ID NO:65)に形成し、これらの突然変異を導入することにより、HSP相互作用を低減することができる。HSP結合部位に対する突然変異は、本明細書中に記載された線維軸部反復に対する突然変異と組合わされる。当業者に知られた技術、例えばオーバーラップPCR及びPCR SOEing又はその他の周知の技術、例えば相同組換え及び化学的突然変異生成を用いて、突然変異が生じる。次いで修飾型線維は、本明細書中に記載されたような方法によって発現され、アデノウィルス粒子内に組込まれる。線維軸部反復及びHSP結合部位の修飾の組合わせは、アデノウィルス粒子をさらに脱ターゲットするように役立つ。
【０１５１】
線維軸部内の修飾はまた、CARとのウィルス相互作用をアブレートする線維節部修飾と組合わせて提供される。線維節部突然変異は：(a)CARと相互作用する線維ループ、例えばAB又はCDループ突然変異内の個々のアミノ酸の突然変異；(b)CARと相互作用するCAR結合モチーフの能力を修飾する、線維ループ内の個々のアミノ酸の突然変異；及び(c)CARと相互作用しないアデノウィルス、例えばAd3線維節部、Ad41短線維節部、又はAd35線維節部を使用した線維節部の置換を含む。例えば、米国特許出願第10/351,890号明細書に記載されたKO1及びKO12のような突然変異が、PCR又は当業者に知られたその他の生化学技術によって、本明細書中に記載されているような線維軸部反復内の突然変異と組合わされる。線維節部修飾と線維軸部反復修飾との組合わせはさらに、CAR相互作用を低減し、脱ターゲット型アデノウィルス・ベクターを提供する。
【０１５２】
脱ターゲットの1測定法は、修飾型線維を含有するアデノウィルス・ベクターのin vivo生体分布、及び、アデノウィルス媒介型肝臓形質導入に対するアデノウィルス・ベクターの影響を評価することである。このようなアッセイの例は、米国特許出願第10/351,890号明細書に記載されている。5匹のC57BL/6マウスのコホートに、1kg当たり粒子1 x 1013個の投与量で尾静脈注射を介して各ベクターを与える。ベクター投与から約72時間後にこれらの動物を犠牲にし、組織試料、例えば肝臓、心臓、肺、脾臓、及び腎臓をそれぞれの動物から捕集する。
【０１５３】
組織の免疫組織化学法を用いて、ウィルスの組織分布を評価する。ウィルス・タンパク質又はマーカー遺伝子に対する抗体、例えばβ-ガラクトシダーゼ又はGFPで染色することにより、陽性細胞を視覚化する。加えて、ベクターから発現させられた遺伝子の酵素活性、蛍光又はその他の特性も、組織分布をモニタリングするのに有用である。例えばヘクソンDNAのPCR分析により、ウィルス・コピー数が種々異なる組織内で評価される。脱ターゲット型ウィルスは、未修飾型ウィルスを用いたアッセイと比較して、抗体アッセイにおいて染色された肝細胞、又はマーカー遺伝子活性を示す肝細胞の数及び/又は強度の低減を示す。肝臓以外の組織の脱ターゲットが、同様の方法及び当業者に知られたその他の方法によって評価される。
【０１５４】
E.  再ターゲット
結合特異性を加えることにより、例えばキャプシド内に受容体リガンドを含むことにより、選択された組織に対して、脱ターゲット型粒子を再ターゲットすることができる。
【０１５５】
1.  ターゲッティング・リガンドの付加
本明細書中に記載されているように脱ターゲットされたウィルス粒子は、キャプシド内に適切なターゲッティング・リガンドを含むことにより、選択された細胞及び/又は組織に対して再ターゲットすることができる。リガンドは、キャプシド・タンパク質、例えば線維、ヘクソン及びペントンのうちのいずれかに含むことができる。リガンドをコードする核酸を含むための遺伝子座は、種々のアデノウィルス血清型に関して、当業者に知られており、必要な場合には、適切な遺伝子座及びその他のパラメーターを実験により見極めることができる。
【０１５６】
リガンドは、キャプシド・タンパク質をコードする核酸内にコード配列を含むことにより、融合体として生成することができ、或いは、イオン相互作用、共有結合相互作用又はその他の相互作用を介して、キャプシドに化学的に接合するか、又はキャプシドに結合することができる(例えば、抗体がキャプシド・タンパク質に結合する場合には抗体-リガンド融合によって；又はジスルフィド結合、又はその他の架橋部分又は化学物質によって)。
【０１５７】
こうして、例えば、修飾型線維核酸は、ターゲッティング・リガンドをコードするヌクレオチドの配列を含むことにより、ターゲッティング・リガンドをキャプシド内に含むウィルス粒子を生成することもできる。ターゲッティング・リガンド、及びウィルス・キャプシド内にこのようなリガンドを含む方法がよく知られている。線維タンパク質内にターゲッティング・リガンドを含むことは、米国特許第5,543,328号及び同第5,756,086号、米国特許出願公開第20020137213号明細書として発行された米国特許出願第09/870,203号明細書、及び国際特許出願第PCT/EP01/06286号明細書に記載されている。アデノウィルス種々異なる血清型及び株に対して、ターゲッティング・リガンドを挿入するための遺伝子座を実験に基づいて見極めることができる。種々異なる血清型及び株に対して、このような遺伝子座は変わることがある。
【０１５８】
アデノウィルス線維は三量体構造を有しているので、リガンドは、三量体構造を有するように選択又は設計して、リガンドの最大3つの分子が各成熟線維に対して存在するようにすることができる。当業者に知られた方法を用いて、線維タンパク質内にリガンドを組込むことができる(例えば米国特許第5,756,086号明細書参照)。線維の代わりに、ペントン又はヘクソン・タンパク質内にターゲッティング・リガンドを含むことができる。ペントン内(例えば米国特許第5,731,190号明細書及び同第5,965,431号明細書参照)及びヘキソン・タンパク質内(例えば米国特許第5,965,541号明細書参照)にターゲッティング・リガンドを含むことが知られている。
【０１５９】
1実施態様の場合、リガンドは線維タンパク質内に含まれ、この線維タンパク質は、本明細書中に記載されているように突然変異された線維タンパク質である。本明細書中に示されるように、ターゲッティング・リガンドは、例えば線維タンパク質のHIループ内部に含むことができる。HIループ内に適合することができ、且つ機能性ウィルスをなおも提供する任意のリガンドがここで検討される。このようなリガンドは、80-100アミノ酸という長さ、又はそれを上回る長さであってよい(例えばBelousova他(2002) J. Virol. 76:8621-8631)。このようなリガンドは、当業者に知られた技術によって加えられる(例えば国際公開WO99/39734号パンフレット、及び米国特許出願公開第20030157688号明細書として公開された米国特許出願第09/482,682号明細書参照)。当業者に知られた技術によって、他のリガンドを発見することもできる。これらの技術のいくつかの例は、ファージ提示ライブラリー又はその他のタイプのライブラリーをスクリーニングすることを含む。
【０１６０】
ターゲッティング・リガンドは、所望の細胞タイプ及び/又は組織に対してアデノウィルス粒子を優先的に指向させる任意の化学部分を含む。このようなリガンドのカテゴリーの一例としては、ペプチド、ポリペプチド、単鎖抗体、及び多量体タンパク質が挙げられる。特異的リガンドは、リガンドの腫瘍壊死因子(TNF)超科、例えばTNFα及びTNFβ、リンホトキシン(LT)、例えばLT-α及びLT-β、Fas抗体に結合するFasリガンド；B-リンパ球のCD40受容体に結合するCD40リガンド；ホジキン・リンパ腫の新生細胞のCD30受容体に結合するCD30リガンド；CD27リガンド、NGFリガンド、及びOX-40リガンド；腫瘍細胞、活性化T-細胞、及び中性組織細胞上に配置されたトランスフェリン受容体に結合するトランスフェリン；肝細胞のLDL受容体に結合するApoB；肝細胞のLRP受容体に結合するアルファ-2-マクログロブリン；肝臓のアシアログリコプロテイン受容体に結合するアルファ-1酸性糖タンパク質；マクロファージのマンノース受容体に結合するマンノース含有ペプチド；活性化内皮細胞のELAM-I受容体に結合するシアリル-ルイス-X抗原含有ペプチド；造血前駆細胞のCD34受容体に結合するCD34リガンド；リンパ球のLFA-I(CD11b/CD18)受容体、又はマクロファージのMac-I(CD11a/CD18)受容体に結合するICAM-1；脾臓及び骨髄マクロファージのc-fms受容体に結合するM-CSF；肝臓細胞の肝臓熱帯マラリア原虫受容体に結合するスポロゾイド周囲タンパク質；活性化内皮細胞のVCAM-I受容体に結合するVLA-4；T-ヘルパー細胞のCD4受容体に結合するHIV gp120及びクラスII MHC抗原；アポリポE(ApoE)分子のLDL受容体結合領域；CSF受容体に結合するコロニー刺激因子、又はCSF；IGF-I及びIGF-II受容体にそれぞれ結合するインスリン様成長因子、例えばIGF-I及びIGF-II；インターロイキン1〜14受容体にそれぞれ結合するインターロイキン1〜14；免疫グロブリンのFv抗原結合ドメイン；ゲラチナーゼ(MMP)インヒビター；ボンベシン、ガストリン放出ペプチド；サブスタンスP；ソマトスタチン；黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)；血管活性ペプチド(VIP)；ガストリン；メラニン細胞刺激ホルモン(MSH)；サイクリックRGDペプチド、及び任意のリガンド又は細胞表面タンパク質に結合(又はこれをターゲット)する分子、又は選択された細胞又は組織のこのような修飾を有する粒子をターゲットする分子、を含む。
【０１６１】
2.  修飾型線維を介して達成される再ターゲット
Ad粒子は、特異的細胞タイプに対して再ターゲットされたベクターとして、遺伝子治療において有用である。1つのこのような例は、光受容体内で発現される遺伝子が関与する疾患を遺伝子治療するための組換えAdベクターの使用である。このような疾患の一例としては、変性眼疾患、例えば網膜色素変性及びスタルガルト病が挙げられる。Ad37の親和性は、その線維タンパク質の結合優先性に由来し、線維タンパク質は、Chang C、結膜上皮細胞系を含む細胞の表面上に配置された受容体に結合する(Huang他(1999) J. Virology 73:2798-2802)。Ad37線維の節部領域内のアミノ酸が、線維と眼細胞受容体との相互作用に関与している(Huang他(1999) J. Virology 73:2798-2802)。
【０１６２】
眼細胞、例えば光受容体細胞に対して再ターゲットされたベクターを構成することができる。眼細胞及び/又は受容体細胞結合に必要なAd37線維領域、例えばAd37線維節部を含有するキメラ線維タンパク質が、本明細書中に記載された線維軸部修飾と組合わされる。眼親和性を有するアデノウィルスに由来する他の線維領域、例えば他の血清型Dウィルス、例えばAd8、及びAd19pを含むAd19を使用することができる。非眼細胞に由来するAdベクターをさらに脱ターゲットするために、付加的な線維修飾、例えば本明細書に記載されたHSP結合部位の修飾を加えることができる。
【０１６３】
いくつかの方法によって、眼に対するターゲットを評価することができる。例えば、修飾型線維を発現させるAdベクターをChang C細胞に感染させる。これらのベクターはまた、マーカー遺伝子、例えばGFP(例えば実施例に記載されたGFP)を発現させるように構成される。細胞は、細胞1つ当たり10,000個の粒子で感染させ、インキュベーションから一晩後に、細胞を取り外して洗浄し、そしてGFP蛍光を測定する。アデノウィルス細胞結合を測定することができる(米国特許出願第09/562,934号明細書参照；対応する米国特許出願公開第200020193327号明細書も参照)。
【０１６４】
本明細書中に記載されたベクターを用いた、眼細胞、例えば光受容体細胞に対する再ターゲットはまた、このようなベクターを有するウィルス粒子を生成し、そして約1 x 109個の粒子/μlを含有する溶液を、マウスの眼のガラス体腔内に注射することによって評価される。注射から7日後に、眼を捕集し、パラホルムアルデヒドで固定し、そして極低温切片化する。切片を抗ロドプシン抗体で染色することにより、光受容体細胞を同定し、そしてDAPIで染色することにより、全ての細胞核を示す。GFP染色は、形質導入された細胞を示す(米国特許出願第09/562,934号明細書参照；対応する米国特許出願公開第200020193327号明細書も参照)。
【０１６５】
本明細書に記載された眼細胞に対して再ターゲットされたAdベクターは、網膜障害、例えば網膜芽細胞腫の治療にも有用である。これらの組換えアデノウィルス・ベクターによって治療薬をコードすることができ、これらの治療薬は、例えば栄養因子、例えばグリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)及び毛様体神経栄養因子(CNTF)、成長因子及び成長因子インヒビター、抗アポトーシス因子、例えばBcl-2(CNTF)、抗腫瘍薬、抗血管形成薬、及び欠陥遺伝子の遺伝子置換又は修復のための遺伝子又はその一部を含む。
【０１６６】
アデノウィルス・ベクターはまた、樹状細胞に対して再ターゲットされると、遺伝子治療において有用である。免疫系において種々の重要な生理学的特徴を有する樹状細胞は、免疫治療及びワクチン開発のターゲットとして役立つことができる。樹状細胞は抗原を取り上げ、身体組織からリンパ系組織へ移動する。その場所でこれらの細胞は、MHCタンパク質に結合された外来エピトープを表示することにより、リンパ器官内で抗原を提示し、そして体液性及び細胞性免疫応答をトリガーする。このような抗原提示細胞(APC)は、免疫応答メカニズムの一部である。特定の抗原、例えば腫瘍抗原を発現させる遺伝学的修飾型樹状細胞は、ワクチンとして使用することができる。多数の研究が示したところによれば、樹状細胞へのアデノウィルス(Ad)媒介型送達は、抗腫瘍応答をもたらすことができる。これらのベクターは、異種核酸を送達することにより、樹状細胞抗原提示、サイトカイン生成及びその他の樹状細胞機能を変化させることができる。
【０１６７】
CARを使用しない或る特定のAD血清型に由来する線維は、樹状細胞上の受容体に結合する。特に効果的なのは、Ad19p、Ad37又はAd16のような部分群Dに由来する線維又はこれらの部分である(例えば米国特許仮出願第60/467,500号明細書参照)。樹状細胞に対して再ターゲットされるADベクターは、本明細書中に記載された修飾型線維を使用して構成し、CAR結合を低減し、組換えベクターを樹状細胞に対して再指向させる線維部分、例えば仮出願明細書に記載された修飾と組み合わせ、例えば、D血清型Ad線維に由来する線維節部又はこれらの一部を含有する線維部分と組み合わせることができる。
【０１６８】
例えば雌Balb/Cマウスに由来する骨髄細胞の培養によって骨髄由来樹状細胞を発生させ、そして細胞表面マーカーを使用して、例えば確認のためにCD11c、CD80、及びCD86に対して指向された蛍光接合型抗体で染色することにより、樹状ターゲットをin vivoで評価することができる。一次樹状細胞培養に、修飾型線維でシュードタイプされたAd5.GFP.ΔF、100,000ウィルス粒子/細胞を感染させる。GFP発現を使用して、細胞感染性をモニタリングする。
【０１６９】
F.  異種生成物のデリバリー(送達)
アデノウィルス粒子を使用することにより、例えばターゲットされた細胞に遺伝子生成物を送達するために、異種核酸を発現させることができる。
【０１７０】
1.  異種ポリペプチド
パッケージングされたアデノウィルス・ゲノムは、当該生成物、例えば治療用タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを含有することもできる。異種ポリヌクレオチドを含有するアデノウィルス・ゲノムはよく知られている(例えば米国特許第5,998,205号、同第6,156,497号、同第5,935,935号及び同第5,801,029号の各明細書参照)。これらのアデノウィルス・ゲノムは、異種ポリヌクレオチド又は異種ポリヌクレオチドの生成物のin vitro、ex vivo及びin vivo送達のために使用することができる。
【０１７１】
このように、本明細書に提供されたアデノウィルス粒子を使用して、さもなければ発現させないか又は十分な量では発現させないタンパク質を発現させるように、細胞を遺伝子工学的に作り出すことができる。この遺伝子工学的な作成は、所望の異種ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するアデノウィルス粒子を、所望の細胞に感染させることにより達成される。次いで、異種ポリヌクレオチドが、遺伝子工学的に作り出された細胞内に発現される。本明細書における用途では、細胞は一般には、哺乳動物細胞であり、典型的には、ヒト細胞を含む霊長類細胞である。細胞は、動物の体内(in vivo)又は体外(in vitro)にあってよい。粒子内部のアデノウィルス・ゲノム内には異種ポリヌクレオチド(異種核酸配列とも呼ばれる)が含まれ、異種ポリヌクレオチドは、当業者によって知られる技術によってそのゲノムに加えられる。当該任意の異種ポリヌクレオチド、例えば米国特許第5,998,205号明細書(参考のため本明細書中に引用する)に開示された異種ポリヌクレオチドを付加することができる。
【０１７２】
Adゲノム又はベクター内に導入されたポリヌクレオチドは、当該タンパク質をコードする任意のもの、又は調節配列である任意のものであってよい。タンパク質の一例としては、治療用タンパク質、例えば免疫刺激性タンパク質、例えばインターロイキン、インターフェロン又はコロニー刺激因子、例えば顆粒球コロニー刺激因子(GM-CSF；例えば5,908,763参照。一般には、このようなGM-CSFはヒトGM-CSFを含む霊長類GM-CSFである。他の免疫刺激遺伝子の一例としては、サイトカインIL1, IL2, IL4, IL5, IFN, IFN, TNF, IL12, IL18及びfl3が挙げられる)、免疫細胞との相互作用を刺激するタンパク質(B7, CD28, MHCクラスI、MHCクラスII、TAP)、腫瘍関連抗原(MART-1、gp100(pmel-17)、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1、チロシナーゼ関連タンパク質2、メラニン細胞刺激ホルモン受容体、MAGE1、MAGE2、MAGE3、MAGE12、BAGE、GAGE、NY-ESO-1、-カテニン、MUM-1、CDK-4、カスパーゼ8、KIA 0205、HLA-A2R1701、α-フェトプロテイン、テロメラーゼ触媒タンパク質、G-250、MUC-1、癌胎児性タンパク質、p53、Her2/neu、トリオースリン酸イソメラーゼ、CDC-27、LDLR-FUT、テロメラーゼ逆転写酵素、及びPSMAに由来する免疫原性配列)、阻害シグナルをブロックする抗体(CTLA4ブロッケード)、ケモカイン(MIP1, MIP3, CCR7リガンド及びカルレチクリン)、及びその他のタンパク質のcDNAが挙げられる。
【０１７３】
当該治療用核酸を含む他のポリヌクレオチド、例えば治療用遺伝子の一例としては、抗血管形成遺伝子及び自殺遺伝子が挙げられる。抗血管形成遺伝子の一例としては、METH-1、METH-2、TrpRSフラグメント、プロリフェリン関連タンパク質、プロラクチン・フラグメント、PEDF、バソスタチン、細胞外マトリックス・タンパク質の種々のフラグメント及び成長因子/サイトカイン・インヒビターをコードする遺伝子が挙げられる。細胞外マトリックス・タンパク質の種々のフラグメントの一例としては、アンギオスタチン、エンドスタチン、キニノスタチン、フィブロノゲン-Eフラグメント、トロンボスポンジン、トゥムスタチン、カンスタチン及びレスチンが挙げられる。成長因子/サイトカイン・インヒビターの一例としては、VEGF/VEGFRアンタゴニスト、sFlt-1、sFlk、sNRP1、アンギオポエチン/tieアンタゴニスト、sTie-2、ケモカイン(IP-10、PF-4、Gro-beta、IFN-ガンマ(Mig)、IFN、FGF/FGFRアンタゴニスト(sFGFR)、エフリン/Ephアンタゴニスト(sEphB4及びセフリンB2)、PDGF、TGF及びIGF-1が挙げられる。
【０１７４】
ウィルス構造及びその結果生じる粒子内に含むことができる治療用トランス遺伝子の中には、「武装」ウィルスを生じさせる遺伝子がある。例えば、本明細書中に記載されたいくつかの実施態様におけるようにE3領域を欠失させるのではなく、E3領域の全て又は一部を保存するか、又は(上述の)腫瘍溶解性アデノウィルス・ベクター内に再挿入することができる。E3領域の全て又は一部の存在は、アデノウィルス・ベクターの免疫原性を減少させることができる。E3領域の全て又は一部の存在はまた、腫瘍細胞内で細胞変性効果を増大させ、正常細胞に対する毒性を減少させる。典型的には、このようなベクターは、E3タンパク質の半分よりも多くを発現させる。
【０１７５】
「自殺遺伝子」は、ジフテリア毒素Aの発現と共に細胞死を招くことができるタンパク質をコードし、或いは、このタンパク質の発現は、細胞を或る特定の薬物に対して選択的に感受性にし、例えば単純ヘルペス・チミジン・キナーゼ遺伝子(HSV-TK)の発現は、細胞を抗ウィルス化合物、例えばアシクロビル、ガンスクロビル及びFIAU(1-(2-デオキシ-2-フルオロ-1-ベータ-D-アラビノフラノシル)-5-ヨードウラシル)に対して感受性にする。他の自殺遺伝子の一例としては、カルボキシペプチダーゼG2(CPG2)、カルボキシルエステラーゼ(CA)、シトシン・デアミナーゼ(CD)、シトクロムP450(cyt-450)、デオキシシチジン・キナーゼ(dCK)、ニトロレダクターゼ(NR)、プリン・ヌクレオシド・ホスホリラーゼ(PNP)、チミジン・ホスホリラーゼ(TP)、水疱瘡ウィルス・チミジン・キナーゼ(VZV-TK)、及びキサンチン-グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ(XGPRT)が挙げられる。或いは、例えば、アンチセンス・メッセージ又はリボザイム、スプライシング又は3'プロセッシング(例えばポリアデニル化)に影響を与えるタンパク質、又は細胞内部の別の遺伝子の発現レベルに影響を与えるタンパク質をコードすることにより、例えばmRNA蓄積速度の変化、mRNA輸送の変化、及び/又は転写後調節の変化を媒介することにより、治療用核酸はRNAレベルにおいてその効果を発揮することができる。
【０１７６】
ウィルスに治療用核酸を加えることにより、ウィルスは付加的な抗腫瘍作用メカニズムを有することになる。このように、単一の存在物(すなわち治療用トランス遺伝子を担持するウィルス)が、複数の抗腫瘍メカニズムを含むことができる。コードされた他のタンパク質の一例としては、安全スイッチとして有用な単純ヘルペス・チミジン・キナーゼ遺伝子(HSV-TK) (国際公開第WO/9925860号パンフレットとして公開された、1997年11月19日付けで出願された米国特許出願第08/974,391号明細書参照)、Nos、FasL及びsFasR(可溶性Fas受容体)が挙げられる。
【０１７７】
樹状細胞を含む、免疫細胞のような細胞に送達するためのその他の生成物は、腫瘍抗原である。腫瘍抗原の一例としては、癌胎児性抗原、NY-BR1、NY-ESO-1、MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE、SCP-1、SSX-1、SSX-2、SSX-4、CT-7、Her2/Neu、NY-BR-62、NY-BR-85、及び腫瘍タンパク質D52が挙げられる(Scanlan及びJaeger(2001) Breast Cancer Res. 3:95-98；Yu及びRestifo(2002) J. Clin. Inverst. 110:289-94)。下記表では、腫瘍抗原及びこのような抗原を発現させる組織の例を挙げる。
【０１７８】
【表１】
2007531507.tif 000003
【０１７９】
【表２】
2007531507.tif 000004
【０１８０】
【表３】
2007531507.tif 000005
【０１８１】
【表４】
2007531507.tif 000006
【０１８２】
【表５】
2007531507.tif 000007
【０１８３】
【表６】
2007531507.tif 000008
【０１８４】
また、相乗的であり、相補的であり且つ/又はオーバーラップしない毒性及び作用方法を示すことができる2つ又は3つ以上の異種タンパク質の組合わせも検討される。その結果として得られるアデノウィルスは、ウィルス性腫瘍溶解性機能を維持することができ、そして例えば、付加的に、免疫及び抗血管形成応答及び望みに応じてその他の応答を誘発する能力に恵まれる。
【０１８５】
2.  遺伝子の発現及び調節
a.  異種ポリヌクレオチド
治療用ポリヌクレオチド及び異種ポリヌクレオチドはまた、RNA又はタンパク質のレベルにおいて効果を発揮するポリヌクレオチドを含む。これらは、アポトーシスを開始することができる因子、RNA、例えばRNAi及び他の二本鎖RNA、数ある能力の中で増殖に必須のタンパク質をコードするmRNAに向けることができるアンチセンス及びリボザイム、例えば構造タンパク質、転写因子、ポリメラーゼ、細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子、遺伝子工学により作り出された、ヌクレアーゼの細胞質変異体(例えばRnase A)、又はプロテアーゼの細胞質変異体(例えばトリプシン、パパイン、プロテイナーゼK及びカルボキシペプチダーゼ)をコードする遺伝子を含む。他のポリヌクレオチドは細胞又は組織に対して特異的なプロモーター、例えば腫瘍溶解性アデノウィルス内で使用されるプロモーター(例えば米国特許第5,998,205号明細書)を含む。
【０１８６】
b.  遺伝子発現の調節
上述のように、アデノウィルス・ベクターは、生成物、例えば治療用生成物をコード又は提供する異種核酸、又は遺伝子発現を変化させる異種核酸を含むこともできる。任意の治療用生成物が検討され、種々のものが一例として本明細書中に示される。異種核酸はポリペプチドをコードすることができ、又は調節配列、例えばプロモーター又はRNAを含むか又はコードすることができる。異種核酸は、遺伝子発現を変化させることができる小さなRNA、例えばRNAi、他の二本鎖RNA(dsRNA)、アンチセンスRNA及びリボザイムをコードすることができる。プロモーターは、例えば構成的且つ調節型のプロモーター、及び組織特異的プロモーター、例えば腫瘍特異的プロモーターを含む。プロモーターは、例えば複製に必須のアデノウィルスの遺伝子に作用連関することができる。
【０１８７】
ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドは、コード領域に作用連関されたプロモーターを含有することもできる。1つの例は、調節されたプロモーター及び転写因子の発現系、例えば発表済のテトラサイクリン調節型系、又はその他の調節可能な系(例えば国際公開第01/30843号パンフレット参照)であり、これにより、コードされたポリペプチドの調節された発現が可能になる。調節可能なプロモーター系の一例は、Tet-On及びTet-Off系(例えばClontech(Palo Alto, Ca)から入手可能)である。このプロモーター・システムは、テトラサイクリン又はテトラサイクリン誘導体、例えばドキシサイクリンによって制御されたトランス遺伝子の調節された発現を可能にする。この系を使用することにより、本明細書中に提供されたウィルス粒子及び核酸内のコードされたポリペプチドの発現を制御することができる。他の調節可能なプロモーター系も知られている(例えば米国特許出願公開第20020168714号明細書参照)。調節可能なプロモーターはまた、組織特異的プロモーターを含む。組織特異的プロモーターは遺伝子の発現を、これらが作用連関される特異的細胞タイプに指向させる。組織特異的プロモーターは、専らでないにしても主に、プロモーターがその内生的遺伝子を発現させた特異的細胞内に、その3'に位置する遺伝子を発現させる。典型的には、組織特異的プロモーターがその3'に位置する遺伝子を発現させるならば、この遺伝子は正しい細胞タイプ内に適切に発現されると考えられる(例えばPalmiter他(1986) Ann. Rev. Genet. 20: 465-499参照)。本明細書中に記載されたようなAdベクター内で有用な組織特異的プロモーターは、例えば腫瘍特異的プロモーター｛例えば腫瘍溶解性アデノウィルス(例えば米国特許第5,998,205号明細書参照)に使用される腫瘍特異的プロモーター｝、眼細胞特異的プロモーター、例えばロドプシン・プロモーター、及び樹状細胞特異的プロモーター、及び組織選択的プロモーター、例えば米国特許第5,998,205号明細書に記載されたプロモーターである。採用できるその他の好適なプロモーターの一例としては、アデノウィルス・プロモーター、例えばアデノウィルス主要後期プロモーター及び/又はE3プロモーター；又は異種プロモーター、例えばサイトメガロウィルス(CMV)プロモーター；ラウス肉腫ウィルス(RSV)プロモーター；誘発性プロモーター、例えばMMTプロモーター、メタロチオネイン・プロモーター；熱ショック・プロモーター；アルブミン・プロモーター；及びApoAlプロモーターが挙げられる。
【０１８８】
異種ポリヌクレオチドは、パッケージング細胞系内の発現に適したRNAプロセッシング・シグナル(例えばスプライス・ドナー部位又はスプライス・アクセプター部位)を含有するイントロンに作用連関されたアデノウィルス三部分リーダー(TPL)核酸配列(例えばSEQ ID NO:22)を含むこともできる。一般に、イントロンは、スプライス・ドナー部位とスプライス・アクセプター部位とを含有する。或いは、TPLヌクレオチド配列はイントロンを含有しない、イントロンは、パッケージング細胞系内でスプライシング・シグナルを含むRNAプロセッシング・シグナルを提供するように機能する任意のヌクレオチド配列を含む。イントロンは、多数の構造遺伝子から十分に特徴付けられており、そして例えば、アデノウィルスに由来する天然型イントロン1、例えばAd5のTPLイントロン1を含み、その他のイントロンは、SV40 VPイントロン、ウサギ・ベータ-グロビン・イントロン、及び合成イントロン構造を含む(例えばPetitclerc他(1995) J. Biothechnol., 40;169;及びChoi他(1991) Mol. Cell. Biol., 11:3070)。
【０１８９】
TPL、例えば少なくとも第1イントロンを有する天然TPLをコードする核酸分子は、例えば(a)第1及び第2のTPLエクソン、又は(b)第1、第2及び第3のTPLエクソン(配列内の各TPLエクソンは完全TPLエクソン1、部分TPLエクソン1、完全TPLエクソン2、及び完全TPLエクソン3の中から選択される)を含むことができる。完全エクソンは、野生型ウィルス・ゲノム内に見いだされる配置に基づく完全核酸配列を含有するエクソンである。TPLエクソンは典型的には、Ad2、Ad3、Ad5及びAd7に由来し；これらは、本明細書中に記載された任意のAd血清型から導き出すことができる。例えば、部分エクソン1を有するTPLを使用することができる(例えば国際公開第98/13499号パンフレット、及びUS20040002060として発行された米国特許出願第09/795,292号明細書参照)。
【０１９０】
G.  動物及びヒトへの送達
本明細書中に提供されたアデノウィルス・ベクターを使用することにより、in vitro又は種々の動物モデルにおける細胞形質導入及び遺伝子発現を研究することができる。後者の事例はex vivo技術を含み、これらの技術において、細胞がin vitroで形質導入され、次いで動物に投与される。本明細書中に提供されるAdベクターを使用することにより、ヒト又はその他の動物において遺伝子治療を行うことができる。このような遺伝子治療はex vivo又はin vivoであってよい。in vivo遺伝子治療の場合、製薬上許容可能なキャリヤ中のアデノウィルス粒子を、治療上有効な量でヒトに送達することにより、このようなヒトの細胞中に、治療用タンパク質をコードする異種遺伝子を導入することを介して、ヒトにおける疾患又はその他の医学的状態を予防、治療又は改善する。アデノウィルスは、体重1キログラム当たり約1つの粒子〜体重1キログラム当たり約1014個の粒子の投与量で送達される。一般に、アデノウィルスは、体重1キログラム当たり約106個の粒子〜体重1キログラム当たり約1013個の粒子の投与量で送達され、そして典型的には投与量は、体重1キログラム当たり約108個の粒子〜体重1キログラム当たり約1012個の粒子である。
【０１９１】
遺伝子治療法はin vivo及びex vivo法を含む。異種核酸を発現させることに関与する全ての方法において、核酸を含有するベクターが、1つ又は2つ以上の細胞内に形質導入される。これらの方法の場合、本明細書中に提供されたアデノウィルス・ベクターを細胞中に形質導入することにより、核酸及び/又はコードされた生成物を送達する。形質導入はin vivo又はin vitro又はex vivoで生じさせることができ、遺伝子発現及び遺伝子治療の研究を含む種々の目的で行うことができる。細胞は、原核細胞であってよいが、しかし典型的には真核細胞である。真核細胞は、例えばヒトを含む霊長類の細胞のような哺乳動物細胞を含む。細胞は、特異的タイプの細胞、例えば腫瘍細胞又は特定組織内の細胞であってよい。ベクターは、腫瘍細胞を死滅させるための腫瘍溶解性ベクターであってよい。
【０１９２】
増殖及びスケールアップ
線維及び/又はペントン・キャプシド・タンパク質中に突然変異を含有するアデノウィルス・ベクターを二重にアブレートする結果、細胞結合、及びCAR/αvインテグリン侵入経路を介した侵入を非効率的にすることができるので、スケールアップ技術がこのようなベクターの成長及び増殖を改善することにより、臨床用の高力価のアデノウィルス・ベクターを生成する。多数の方法を用いて、線維及び/又はペントンの修飾を介して脱ターゲットされたベクターをスケールアップすることができる。これらの方法は：(a)ベクター上で提示されるリガンドと結合する表面受容体を発現させるように遺伝子工学的に作り出されたシュード受容体細胞系を使用すること(例えば国際公開第98/54346号パンフレット参照)、及び(b)天然型線維を発現させるように遺伝子工学的に作り出され、そして天然型線維及びペントンを発現させるように遺伝子工学的に作り出すことができる細胞系を補完すること(例えば国際公開第00/42208号パンフレット参照)；(c)組織培地に添加されると、アデノウィルス粒子及びこれらの侵入をプロデューサー細胞内に指向させるポリカチオン及び/又は二官能性試薬を使用すること；及び(d)当業者に知られたその他の方法、を含む。この後者の方法(同時係属中の米国特許出願第10/351,890号明細書及び国際PCT出願PCT/US03/02295号明細書参照)の場合、試薬(培地添加剤とも呼ばれる)を、プロデューサー細胞を含有する組織培地内に含むことにより、これらの試薬に脱ターゲット型アデノウィルス・ベクターを感染させることができる。或いは、試薬はウィルスと予混合することができ、この混合物を次いで、組織プロデューサー細胞に加えることができる。この方法において有用な試薬は、アデノウィルス粒子侵入をプロデューサー細胞内に指向させることができる試薬である。このような試薬の一例としては、ポリカチオン及び二官能性試薬が挙げられる。好適な試薬の例は、米国特許出願第10/351,890号明細書及び国際PCT出願PCT/US03/02295号明細書に記載されているもの、例えばポリエチレンイミン、硫酸プロタミン、ポリ-L-リシン、臭化ヘキサジメトリン、及び二官能性試薬、例えば抗線維抗体リガンド融合体、抗線維-Fab-FGF接合体、抗ペントン抗体リガンド融合体、抗ヘクソン抗体リガンド融合体、及びポリリシン-ペプチド融合体である。
【０１９３】
H.  調製及び投与
治療上効果的な濃度の組換えアデノウィルス粒子を含有する組成物が提供される。粒子は任意の好適なビヒクル中で好適な濃度で、例えば混合によって調製され、希釈用の濃縮配合物及び単回投与用配合物を含む。投与は任意の手段によって行われる。これらの手段は治療に応じて、全身投与、例えば筋内、非経口、及び静脈内投与、又は局所投与を含む。組成物は、徐放性配合物、リポソーム及びその他の送達ビヒクル中で調製することができる。徐放性配合物を複数回投与のために調製して、選択された気管中、例えば1か月間又は最大約1年間にわたって、数回投与量が投与されるようにすることができる。このように、例えば、全体で約2回〜6回以上にわたって、単回投与量が単回投与で投与されるようにリポソームを調製することができる。
【０１９４】
組成物を調製するために、ウィルス粒子は、好適な許容可能なキャリヤ中に透析され、或いはウィルス粒子は例えば濃縮且つ/又はキャリヤと混合することができる。結果として生じた混合物は溶液、懸濁液又はエマルジョンであってよい。加えて、ウィルス粒子は、組成物中で唯1つの製薬上活性の成分として調製することができ、或いは、治療される特定の障害のための他の活性物質と組合わせることもできる。
【実施例】
【０１９５】
以下の実施例は説明のためだけに記載されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１９６】
実施例1
キメラ線維タンパク質の構成
Ad5及びAd37線維遺伝子フラグメントから、オーバーラップ伸長PCR(Horton他、(1990) J. Virol. 74:10274-10286)によって、遺伝子スプライシングを用いて、キメラ・アデノウィルス線維タンパク質を構成した。PCR及び突然変異原性プライマーを表2に挙げる。
【０１９７】
表2  PCR、オーバーラップ伸長PCR、及び突然変異原性プライマー
導入された制限部位を太字で示す。開始コドンをアスタリスク(*)で示す。突然変異原性塩基に下線を付ける。
【０１９８】
【表７】
2007531507.tif 000009
【０１９９】
【表８】
2007531507.tif 000010
【０２００】
AD37s/Ad5k:約108個の粒子の野生型Ad37(ATCC)を、PCRマスター・ミックス(1 x PhermoPol Buffer、それぞれ300μMのdATP、dTTP、dGTP、及びdCTP、及び2U Vent DNAポリメラーゼ、New England Biolabs, Beverly, MA)、200nMのプライマーL37(SEQ ID NO:1)及び37s5k-3(SEQ ID NO:2)と混合することにより、Ad37線維のアミノ酸1-184をコードするヌクレオチド配列を増幅した。突然変異をAd37線維尾部内に組込むことにより、この配列をAd5尾部とより緊密にマッチングさせた(Wu他 (2001) Virology 279:78-89)。これらの突然変異は、尾部の最初の7つのアミノ酸を変化させて、Ad37のMSKRLRV(SEQ ID NO:37)からAd5のMKRARPS(SEQ ID NO:35)にすることにより、Ad5ベクター・キャプシド内への線維組込みを容易にする。PCR反応混合物を5分間にわたって94℃に加熱し、そして1分間94℃、1.5分間45℃、及び2分間72℃を1サイクル、次いで1分間94℃、1.5分間50℃、及び2分間72℃を30サイクル施し、そして5分間72℃の最終伸長ステップを施した(プログラム1)。
【０２０１】
キメラのAd5部分を構成するために、pDV67(寄託番号PTA-1145でATCCから入手可能)を、開始材料として使用した。pDV67のヌクレオチド配列を、SEQ ID NO:21で示す。pDV67はTPLカセットを有し、そしてpCDNA3.1/Zeo(+)バックボーン内にAd5線維遺伝子を挿入する(米国特許出願第60/459,000号明細書；Von Seggern他(1998) J. Gen Virol., 79:1461-1468)。
【０２０２】
第2の反応において、pDV67をPCRマスター・ミックスと混合した。この反応物に、プライマー5k-5(SEQ ID NO:3)及び線維3(SEQ ID NO:4)を添加することにより、Ad5線維のアミノ酸400-581をコードするヌクレオチド配列を増幅した。このPCR反応混合物を5分間にわたって94℃に加熱し、そして1分間94℃、1分間55℃、及び2分間72℃を30サイクル施し、そして5分間72℃の最終伸長ステップを施した(プログラム2)。
【０２０３】
第1ステップPCR生成物を、1%低融点アガロース・ベル中で、100μl反応物のうちの10μlからゲル精製した。ゲル精製されたPCR生成物を溶融し、そしてそれぞれ10μlを1 x PCR緩衝液、付加的な3 mM MgCl2、それぞれ300μMのdNTP、0.8μMのL37 5'プライマー(SEQ ID NO:1)及び線維3 3'プライマー(SEQ ID NO:4)、及び5U Taq DNAポリメラーゼ(Gibco BRL; Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合させる。オーバーラップ伸長PCR反応のために上述のプログラム1を用いた。
【０２０４】
TOPO TA Cloning Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)を使用して、PCR生成物をpCR2.1クローニング・ベクター(SEQ ID NO:69)内にクローニングした。プラスミドをTOP10 E.coli細胞(Invitrogen)内に形質転換し、そしてQiagen Plasmid Mini Spin Kit(Qiagen, Vacencia, CA)を使用して、培養された細胞から精製した。pCR2.1からキメラ線維遺伝子を摘出し、pCDNA3.1/zeo(+)(Invitrogen)のBamHI及びNotI部位内に連結した。BamHI及びBglIIを使用してpDV55からAd5三部リーダー(TPL;SEQ ID NO:22)を摘出し、発現ベクター中のキメラ線維遺伝子の前方のBamHI部位内に挿入した｛プラスミドpDV55の構成は、米国特許出願公開第20030157688号明細書として公開された同時係属中の米国特許出願第09/482,682号明細書(国際PCR出願PCT/US00/00265号明細書も参照)；及び国際PCT出願第PCT/EP01/04863号明細書としても出願された、米国特許出願第09/562,934号明細書(対応する米国特許出願公開第200020193327号明細書も参照)(それぞれを参考のため本明細書中に引用する) に記載されている｝。Ad37s/Ad5kを含有するプラスミドをpLP13を称した。
【０２０５】
Ad5 TPLが先行するAd5s/Ad37k、Ad5Δs、及びAd5s/Ad37s遺伝子(それぞれpLP23、pLP32、及びpLP43と称される)を、表3に挙げたプライマー、鋳型及びPCRプログラムを用いて、Ad37s/Ad5kと同じように構成した。キメラ線維タンパク質Ad37s/Ad5k、Ad5s/Ad37k、Ad5Δs/Ad37sを図2に概略的に示す。
【０２０６】
Qiagen Plasmid Maxi Kitを使用して、500mlの培養から、4つの全てのプラスミドpLP13、pLP23、pLP32、及びpLP43を精製した。
【０２０７】
【表９】
2007531507.tif 000011
【０２０８】
pDV121の構築
Ad37線維の発現のためのプラスミドを構成するために、プライマーL36(SEQ ID NO:1)及び37fr(SEQ ID NO:10)のウィルス・ゲノムDNAから、オープン・リーディング・フレームをPCR増幅し、そしてpCR2.1 TOPO(Invitrogen, Carlsbad, CA;SEQ ID NO:70参照)内にクローニングすることにより、pDV117を形成した。正しい配列の確認後、PCRプライマー内に含有されたBamHI及びNotI部位を使用して、Ad37線維オープン・リーディング・フレームをpDV117から摘出し、そしてpCDNA3.1/zeo(+)(Invitrogen)のBamHI及びNotI部位内に挿入した。上述のように、BamHI-BglIIフラグメントをpDV55から切除し、そしてpDV120のBamHI部位内に挿入することにより、プラスミドpDV121を形成した。
【０２０９】
実施例2
線維を発現させるパッケージング細胞系の構築
細胞系
HEK-293T細胞(DuBridge他、(1987) Mol. Cell. Biol. 7:379-387)及びA549肺癌細胞(American Type Culture Collection, Manassas, VA)を、10%ウシ胎仔血清(FBS; Mediatech, Herndon, VA)を含有するDulbecco変性イーグル培地(Gibco BRL; Invitrogen, Carlsbad, CA)中に培養した。
【０２１０】
AE1-2a S8細胞は、プラスミドpGRE5-2.E1(GRE5-E1-SV40-Hygro構造とも呼ばれ、SEQ ID NO:23で示される)及びpMNeoE2a-3.1(MMTV-E2a-SV40-Neo構造とも呼ばれ、SEQ ID NO:24で示される)の染色体挿入体を有するA549肺癌系(ATCC no. CCL 185)の誘導体である。これらのプラスミドは、それぞれアデノウィルスE1及びE2a機能の補完を可能にする(van Raaij他(1999) Nature 401:935-938)。AE1-2a細胞をMichael Kadan(Genetic Therapy, Inc./Novartis, Summit, NJ)から獲得し、そして、10% FBS、200μg/ml ヒグロマイシンB(Calbiochem, San Diego, CA)及び200μg/ml 硫酸ネオマイシン(Calbiochem)を含有する改善された変性イーグル培地(IMEM; Mediatech, Herndon, VA)中で維持した。
【０２１１】
線維タンパク質を発現させるパッケージング細胞内の線維欠失型ウィルスの成長、並びにE1欠失の補完は、任意の所望の線維を有する粒子の発生を可能にする。
【０２１２】
パッケージング細胞系
当該線維のための発現構造(Von Steggern他、J. Virol. 74:354-362(2000))をA549誘導型E1-及びE2a-補完細胞系(Gorziglia他、J.Virol. 70:4173-4178(1996))内に安定的にトランスフェクトすることにより、パッケージング細胞系を発生させ、そして高いレベルで線維を発現させるクローンを選択した。
【０２１３】
Ad5又はAd37線維を発現させる細胞系
AE1-2a S8細胞を、以前に記載されたように(Von Steggern他(1998) J. Gen Virol. 79: 1461-1468)、pDV67(上述の通り；米国特許出願第60/459,000号明細書も参照)でエレクトロポレートし、そしてゼオシン(600 μg/ml)で、安定的な系を選択することによりAd5線維を発現させる細胞系を生成した。Ad5発現細胞を細胞系633と称した。同様に、AE1-2a細胞をプラスミドpDV121でエレクトロポレートすることにより、Ad37線維を発現させる細胞系を生成し、そしてゼオシン(800 μg/ml)で、安定的な系を選択した。Ad37線維を発現させる細胞系を、細胞系761, 762及び763と称した。
【０２１４】
Ad5(Von Steggern他(1999) J. Virol. 73: 1601-1608)線維タンパク質を発現させるAE1-2a誘導型細胞系633、及びAd37 (Wu他(2001) Virology 279:78-89) 線維タンパク質を発現させるAE1-2a誘導型細胞系761を、IMEM、10% FBS、200μg/mlのヒグロマイシンB、200μg/ml 硫酸ネオマイシン、及び200μg/ml ゼオシン(Invitrogen, Carlsbad, CA)中に維持した。
【０２１５】
キメラ線維を発現させる細胞系
Gene Pulser II(Bio-Rad, Richmond, CA)を0.3 kV及び500μFで使用して、IMEM、0.1 mM DTT中に懸濁された5 x 106個のAE1-2a細胞中に、7 μgの線維発現ベクターpLP13、23及び32を安定的にトランスフェクトした。600μg/mlのゼオシン、400μg/mlのヒグロマイシンB、及び400μg/mlの硫酸ネオマイシンを使用して、細胞を成長培地中に一晩にわたって平板培養して選択した。抗線維モノクローナル4D2抗体(NeoMarkers, Fremont, CA)及びAlexaFluor（登録商標）488ヤギ抗マウスIgG接合体(Molecular Probes, Eugene, OR)を使用して、選択されたコロニーを免疫蛍光によって分析した。製造者の指示書に記載されているように、SuperFectトランスフェクション試薬(Qiagen, Valencia, CA)を使用して、pLP43を293T細胞内に一時的にトランスフェクトした。
【０２１６】
実施例3
無線維Ad5粒子の構築
E1/線維消失型ウィルス・ベクターを構成するために、本明細書中に記載されたように、pDV44を調製する。プラスミドpDV44は、当業者に知られた方法によって、Bett他(1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:8802-8806によって記載され、国際公開第95/00655号パンフレットに記載されたように調製されたベクターであるpBHG10から誘導される。このプラスミドはまた、Microbix (Toronto, Canada)から商業的に利用可能である。このプラスミドは、欠失された左末端にパッケージング・シグナルを有するAd5ゲノムと、制限酵素PacIに対応する固有部位を有するリンカーによって置換されたE3領域(ヌクレオチド28133-30818)とを含有する。アデノウィルス・ゲノムの右末端を含有する11.9 kb BamHIフラグメントを、pBHG10から分離し、そしてpBS/SK(+)のBHGHI部位内にクローニングすることにより、約14,658 bpを有するプラスミドp11.3を形成する。次いで、p11.3プラスミドをPacI及びSalIで消化することにより、線維、E4、及び逆方向末端反復(ITR)配列を除去した。
【０２１７】
このフラグメントを、ITRセグメント及びE4遺伝子を含有する3.4 kbフラグメントと置換した。3.4 kbフラグメントは、下記オリゴヌクレオチド配列：5'TGTACACCG GATCCGGCGCACACC3'SEQ ID NO:25;及び5'CACAACGAGCTC AATTAATTAATTGCCACATCCTC3'SEQ ID NO:26を用いて、pBHG10からPCR増幅することによって発生させられた。これらのプライマーは、PACI及びBAMHIに対応する部位を内蔵した。p11.3バックボーンのPACI部位及び平滑末端SalI部位内にこのフラグメントをクローニングすることにより、ITR及びE4領域単独によって、pBHG10中に存在する、融合されたITR、E4領域及び線維遺伝子が置換される。結果として得られた、ITR及びE4領域を含有するp11.3プラスミド (プラスミドpDV43aと称される)を、次いでBamHIで消化した。次いでこのBamHIフラグメントを使用することにより、pBHG10内のBamHIフラグメントを置換し、これによりpBHG10バックボーン内にpDV44を形成した。
【０２１８】
別のアプローチにおいて、制限クローニング部位の組込みを容易にするための付加的なサブクローニング・ステップを用いて、pDV44を調製した。この別のクローニング手順は次のように実施された。線維遺伝子及び残留E3配列のいくつかをpBHG10(Microbix Biosystems)から除去することによって、上記pDV44を構成した。上記のように、操作を単純化するために、Ad5ゲノムの最も右側の部分を含む11.9 kb BamHIフラグメントをpBHG10から除去し、そしてpBS/SK内に挿入した。結果として得られたプラスミドをp11.3と称した。上記オリゴヌクレオチドを使用して、pBHG10から、アデノウィルス・タイプ5のE4領域及び両ITRに対応する3.4kb DNAフラグメントを増幅し、ベクターpCR2.1(Invitrogen)内にサブクローニングすることにより、pDV42を形成した。このステップは、SalI部位の組込みを容易にするための付加的なクローニング・ステップである。次いでPCRプライマーのうちの1プライマー内の固有部位で切断するPacIで、そして、pCR2.1ポリリンカー内の固有部位で切断するSalIで、pDV42を消化した。このフラグメントを使用して、p11.3の対応PacI/XhoIフラグメント(固有XhoI部位を含有するAd DNAフラグメントに隣接するpBSポリリンカー)を置換し、pDV43を形成する。
【０２１９】
AdEasy System(米国特許第5,922,576号明細書及びHe他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95:2509-2514参照；システムは、Johns Hopkins University の著者又はその他の提供元から公に利用することができる)の修飾を用いて、細菌中で組換えを行うことにより、Ad5.GFP.ΔFを構成した。第1に、pAdEasy-1から線維遺伝子を除去することにより、線維欠失型ゲノム・プラスミドを構成した。E1遺伝子を含むヌクレオチド1-3,533、及びE3を含むヌクレオチド28,130-30,820を除いて、プラスミドpAdEasy-1はAd5ゲノム全体を含有する。
【０２２０】
プラスミドpDV43をPac1で消化し、そしてE.coli DNAポリメラーゼの大きなフラグメント及びdNTPで処理することによって、末端を平滑化し、そして生成物を再連結してプラスミドpDV76を生成した。その結果得られたpDV76は、Pac1部位の損失を除いてpDV43と同一であり、そしてE3及び線維が欠失されたAd5ゲノムの右末端を含有する。オリゴヌクレオチド・プライマー(それぞれSEQ ID NO:27及び28)：5' CGC GCT GAC TCT TAA GGA CTA GTT TC 3'｛Ad5ゲノム内の固有Spe1部位(太字下線)を含む｝；及び5' GCG CTT AAT TAA CAT CAT CAA TAA TAT ACC TTA TTT T 3'｛右AD5 ITRに隣接する新しいPAC1部位(太字下線)を含む｝を使用して、PDV76の4.23 kbフラグメントを増幅した。その結果生じた、PCR増幅されたフラグメントは、ヌクレオチド28,133-32,743(E3及び線維遺伝子)が欠失された、Ad5ゲノムのヌクレオチド27,082-35,935を含有し、このフラグメントを使用して、pAdEasy 1の対応Spe1/Pac1フラグメントを置換する(例えば米国特許第5,922,576号明細書参照)ことにより、pDV77を形成した。
【０２２１】
pDV77とPme1-線状化型pAdTrackとの混合物で、第2のE.coli株BJ5183を、記載の通り(米国特許第5,922,576号明細書；He他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 95:2509-2514)にエレクトロポレートし、そしてカナマイシン耐性コロニーからDNAを分離した。結果として生じたプラスミドpDV83は、E1-、E3-及び線維欠失を伴う完全Ad5ゲノムを含有すると共に、E1欠失部位にはCMV駆動型GFPリポーター遺伝子が挿入されている。
Pac1消化によって完全長Ad染色体を分離し、これを、本明細書中に記載されたE1-及び線維補完633細胞内にトランスフェクトした(Von Seggern他(2000) J. Virol., 74:354-362も参照)。次いで、回収されたウィルスAd5.GFP.ΔFを、633細胞上で平板培養することによりプラーク精製し、そして細胞ぺレットを凍結-解凍することにより、ウィルス・ストックを調製した。
【０２２２】
実施例4
シュードタイプされたウィルスの構築
Ad5-シュードタイプ粒子作製
当該親和性を同定するために修飾型線維遺伝子を試験する系は、同時係属中の米国特許出願第09/482,682号明細書(米国特許出願公開第20030157688号明細書；国際PCR出願PCT/US00/00265号明細書も参照)に記載されている。in vitro系は、線維欠失型Adを有する組織培養細胞の感染、及び線維発現を指向させるプラスミドのトランスフェクションに関与する。この系は、ウィルス粒子上に発現される修飾型線維を生成してこれを評価するのを可能にする。この系を使用することにより、修飾型線維タンパク質を有する治療量のアデノウィルス・ベクターを生成することができる。
【０２２３】
それぞれ線維補完633及び761細胞内でAd5.GFP.ΔFを増殖することにより、Ad5.GFP.ΔF/5F及びAd5.GFP.ΔF/37FでシュードタイプされたAd5ベクターを生成した。種々の細胞系中で成長させることにより生成された粒子は、それらの線維タンパク質を除いて同一である。
【０２２４】
Ad5線維を有する粒子
野生型Ad5線維タンパク質を発現させる、633細胞内でのウィルス成長によって、Ad5シュードタイプ粒子(Ad5.GFP.ΔF/5F)を発生させた。ウィルス粒子を分離し、そして、予形成された15-40% CsCl勾配上で遠心分離することにより精製した(4℃で3時間にわたって111,000 x g；Von Seggern他(1999) J. Virol., 73:1601-16080)。
【０２２５】
Ad37線維を有する粒子
Ad37線維生成細胞系761に由来する細胞に、約1000個の粒子/細胞でAd5.GFP.ΔFを感染させた。上述のように、ウィルス粒子を分離し、そしてCsCl勾配上で精製した。バンドを捕集し、そして貯蔵緩衝液(10 mM Tris-pH 8.1, 0.9% NaCl、及び10% グリセロール)中に透析し、アリコートし、そして-70℃で貯蔵した。
【０２２６】
キメラ線維を有する粒子
上記Ad37s/Ad5k、Ad5s/Ad37k、Ad5Δs、又はAd5s/Ad37s線維を発現させる細胞に、1細胞当たり約2000個の粒子のAd5.GFP.ΔF/5Fを75-80%の密集度で感染させた。感染から約72時間後に細胞を取り外し、そして凍結及び解凍を繰り返すことにより溶解した。遠心分離により細胞残屑を除去し、そして解放されたウィルス粒子を、111,000 x gで3時間にわたって、16-40% CsCl勾配で精製した。精製済ウィルスを、TBS、10%グリセロール中に透析した。Bradfordタンパク質アッセイ(Bio-Rad)によって、タンパク質濃度を測定した。既知のAd2粒子分子量(1 μg = 4 x 109個の粒子)を用いて、タンパク質濃度からウィルス濃度を計算した。
【０２２７】
実施例5
線維発現アッセイ
Ad粒子の免疫ブロット分析を用いて、線維発現を分析した。2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)及び0.2M 2-メルカプトエタノール緩衝液中で5分間にわたって煮沸することにより、500ナノグラムのウィルスを変性した。8-16% トリス-グリシン・ゲル(Noves/Invitrogen)中でSDS-ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動(SDS-PAGE)によってウィルス・タンパク質を分離し、そしてこれをポリビニルジフルオリド(PCDF)膜に移した。膜をリン酸緩衝生理食塩水中5%(w/v)のミルク、及び0.02%(v/v)Tween-20(PBS-T)中でブロックし、PBS-T中のミルク中で1:1,000に希釈された4D2抗線維モノクローナル抗体(Neomarker, Fremont, CA)と一緒に、この膜を室温で1時間にわたってインキュベートした。膜を洗浄し、そして1:1000ヤギ抗マウス・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ接合型抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)と一緒に、室温で30分間にわたってインキュベートした。膜を再び洗浄した後、ブロットを、増強された化学ルミネッセンス試薬(Supersignal West Pico試薬；Pierce, Rockford, IL)でプローブし、そしてフィルム上で現像した。
【０２２８】
ウィルス試料の等しいローディングを保証するために、膜を剥ぎ取り、ペントン・ベースに関して再プローブした。膜を100 mM 2-メルカプトエタノール、2% SDS、62.5 mM Tris、pH 6.7と一緒に、42℃で1時間にわたってインキュベートした。洗浄後、膜をウサギ抗ペントン・ポリクローナル抗体(Wickham他(1993) Cell 73:309-319)の1:500希釈物で1時間にわたってプローブし、洗浄し、ヤギ抗ウサギHRP接合型抗体(Sigma-Aldrich)の1:5,000希釈物で30分間にわたってプローブし、そして再び洗浄した。ペントン・ブロットを上記のように現像した。
【０２２９】
キメラ又は切断型の線維シュードタイプAd粒子のそれぞれは、同様の量の、予期サイズの線維タンパク質を含有した。線維免疫ブロットとペントン・ベース・ブロットとを比較することにより、同様の量の各ウィルスが分析されることが判った。
【０２３０】
実施例6
線維構造：長さ及び剛性の評価
cryo-EM法及び単一粒子画像再構成法を用いて、Ad5シュードタイプ・ウィルス粒子内に組込まれたAd5s/Ad37s線維タンパク質を視覚化した。線維シュードタイプAd(Ad5s/Ad37s)の精製済ウィルス調製物(〜200μg/ml)の小液滴(3μl)を、グロー放電型有孔性炭素グリッドに塗布した。グリッドをブロットして、液体窒素によって冷却されたエタン・スラッシュ中でガラス化した(Adrian他(1984) Nature 308:32-36)。凍結されたグリッドを、液体窒素で予冷却されたGatan 626極低温転移ホルダーに1つずつ移すか、又は液体窒素下で保存した。LaB6フィラメント及びGetan低速走査CCDカメラ(YAGシンチレーター、1024 x 1024画素)を備えたFEI/Philips CM 120透過型電子顕微鏡上で、低線量条件を用いて、電子顕微鏡写真を記録した。公称倍率35,000xを用いて、分子スケールで5.2Åの画素サイズをもたらした。デフォーカス値-1.5、-1.0及び-0.7 μgで画像を収集することにより、位相差を発生させた。
【０２３１】
QVIEWソフトウェア・パッケージ(Shah他、(1998) J. Struct. Biol. 123:17-21)を使用して、360 x 360画素画像で極低温電子顕微鏡写真から粒子をデジタル式に選択し、そして、IMAGIC-5ソフトウェア・パッケージ(van Heel他(1996) J. Struct. Biol. 116:17-2440)を使用して、更なる画像処理を行った。Ad5の前の再構成を検索モデルとして用いて、初期粒子配向を得た(van Raaji他(1999) Nature 401;935-93842)。初期配向が得られると、その線維が有意な再構成線維密集を発生させるのに十分に真直ぐかどうかを見極めるために、各粒子を別々に再構成した。単一AD粒子に基づく再構成が、予測線維長の50%を上回る長さに沿って、バックグラウンド・ノイズ・レベルを上回る線維密度を示す場合、この再構成を、最も真直ぐな線維を有するAD粒子データ・セット内に含まれるものとして選択した。このように、線維-シュードタイプAd(Ad5s/AD37s)の1236個の粒子画像から成る全体集合から、85個の粒子画像を選択した。同じ基準を使用して、403個の野生型Ad5粒子画像から7つの画像を選択した。Chiu他(1999) J. Virol. 73:6759-6768に記載されているように、種々異なるデフォーカス値で収集された粒子画像を1つにする前に、電子顕微鏡のコントラスト伝達関数(CTF)に対してコンピュータ補正を行った。
【０２３２】
CTFの不完全な補正は、なぜ線維密集がペントン・ベースから結合解離しているように見えるかを説明すると考えられる。1°の角度の検索ステップ・サイズを用いて、選択された粒子画像集合で4ラウンドのアンカーセット精密化を実施した。このことは、37Åから29Åへ、再構成されたキャプシドの分解能を改善した。20面体キャプシド密度は改善されたが、再構成された線維密度は、精密化とともに改善することはなかった。この観察は、最も真直ぐな線維でさえも、20面体5重軸に沿って全てが完全にアラインメントされなければならないわけではないことを示唆した。選択された85個の粒子画像に基づく、精密化されていない再構成を選択した。
【０２３３】
0.5相関閾値基準を用いて、フーリエ・シェル相関法によって、各再構成の分解能を評価した。2つの半再構成に「ソフト」マスクを適用することにより、分解能評価において20面体キャプシドだけを考慮に入れた(Stewart他(2000)Microsc Res Tech 49:224-232)。画像処理及びグラフィックの全ては、Compaq/DECアルファ・ワークステーション上で行った。グラフィック表示は、AVS-5ソフトウェア・パッケージ(Advanced Visualization Systems, Inc., Waltham MA)で生成した。
【０２３４】
これらの発見の有意性を見極めるために、統計学的カイ二乗分析を実施した。この試験は、帰無仮説が真である確率、すなわち線維シュードタイプAd粒子と、野生型Ad5粒子とが等しくフレキシブルな線維を有する確率が0.0001と極めて低いことを示唆した。Ad5s/Ad37s線維を有する統計的に有意な数のシュードタイプAd粒子が、Ad5野生型粒子と比較してかなり「真直ぐ」な線維を有することが見いだされる。cryo-EM分析によれば、Ad5s/Ad37s線維は野生型Ad5線維よりもフレキシブルでなく、キメラ線維はおそらく野生型ほどは大きな角度を成して曲がることはできない。
【０２３５】
組合わされたこの再構成において、線維密集は、ペントン・ベースから359±18Åまで外に出ているように見え、これは無傷のペントンにおけるAd2線維に関して報告された331±5Åに近い(Ruigrok他(1990)J. Mol. Biol. 215:589-596)。長さ測定における5%の誤差範囲は、顕微鏡倍率値の誤差範囲に基づいている。測定された線維長は、完全長Ad5線維に対して予期された長さと概ね等価である。
【０２３６】
実施例7
感染アッセイ
GFPトランス遺伝子を担持するシュードタイプAdベクターを使用して、感染アッセイを実施した。手短かに言えば、50,000個の付着性A549細胞を、DMEM、10% FBS中で3時間にわたって37℃で、1細胞ベクター当たり20,000個の粒子と一緒にインキュベートした。細胞を食塩水で3回洗浄し、そして成長培地中で一晩培養した。細胞を取り外し、そしてFACScan血球計算器(Becton Dickenson, Franklin Lakes, NJ)内で蛍光支援細胞分別(FACS)によって分析した。未感染細胞の蛍光によって確立された閾値を用いて、GFPを発現させる感染細胞を区別した。
【０２３７】
試験結果が示すところによれば、Ad5野生型線維を備えたAd粒子は、Ad37線維を備えたウィルスよりも8倍高い感染を示した。Ad5節部に融合されたAd37軸部(Ad37s/Ad5k)、又は中心軸部ドメイン(Ad5Δs)内の14個の反復を欠くAd5線維を示す粒子は、感染力を有意に低減し、線維軸部ドメインが細胞感染において重要な役割を演じることを示した。Ad線維軸部上にAd37節部を配置することにより(Ad5s/Ad37k)、更なる証拠が観察された。この構造は、野生型Ad5線維レベル近くまでウィルス感染力を増大させた。過剰の抗CAR抗体を添加することにより、感染力の増強を止めることができる(データは示さず)。このように、これらの発見は、Ad5線維軸部における反復がAd粒子による細胞感染にとって重要であることを実証する。
【０２３８】
キメラAd5s/Ad37s線維を備えたAd5粒子を、Ad感染を支援する能力に関して試験した。その結果が示すところによれば、Ad5の3番目及び21番目のβ-反復を、より剛性のAd37軸部内の対応領域と置換することにより、細胞感染が止められる。切断型Ad5線維(Ad5Δs)も、感染力の低減を示す。これらの発見はさらに、細胞感染にとって、線維軸部の3番目及び21番目の反復が重要であることを実証する。
【０２３９】
実施例8
ウィルス付着アッセイ
ウィルス付着アッセイを実施して、線維軸部の修飾が細胞とのウィルスの付着をも変化させたかどうかを評価した。
5 mM EDTAを使用して5分間にわたって、培養されたA549細胞を取り外した。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に細胞を再懸濁させ、管1本当たり1.0 x 106個の細胞の密度にアリコートした。1.0 x 109個のウィルス粒子を管に加え、4℃で管を1時間にわたって揺らすことにより内部化を防止した。過剰の組換えAd5節部(100 μg/ml)を加えることにより、非特異的Ad結合を見極めた。細胞を遠心分離によりペレット化し、そしてPBS中に3回再び再懸濁した。細胞から総試料DNAを抽出し、QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)を使用して、製造者の指示書に従ってウィルスに結合した。
【０２４０】
1 x TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA)、300nM 5'プライマーEGFP553f(SEQ ID NO:29)及び3'プライマーEGFP810r(SEQ ID NO:30)、200 nMプローブEGFP734p(SEQ ID NO:31)及びVIC標識付きRNase P対照試薬(Applied Biosystems)を含有する45 μl反応混合物に、各200 μl DNA抽出物のうちの5 μlを添加した。EGFPプライマー及びプローブは、Ad5ベクター・ゲノムにおけるEGFPトランス遺伝子内の258 bp領域を検出するように設計される(Klein他(2000)Gene Therapy 7:458-468)一方、RNase P対照試薬は、宿主細胞ゲノムRNase P遺伝子のセグメントを増幅するように設計された。2分間にわたって50℃に、次いで10分間にわたって95℃に加熱することにより、AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼを最初に変性して活性化した後、15秒95℃及びこれに続いて1分間60℃を40サイクル行って、アンプリコンを増幅した。ABI Prism 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems)内で各サイクル中に、リポーター色素FAM及びVICの蛍光を測定した。既知量のpEGFP-N1プラスミド(Clontech, Palo Alto, CA)、EGFP発現プラスミド、及び精製済細胞DNAを標準として使用することにより、各試料中のAdゲノムのコピー数及び細胞数を測定した。
【０２４１】
シュードタイプ・ウィルス粒子によるウィルス付着アッセイの試験結果が示すところによれば、Ad5は、Ad37線維でシュードタイプされたウィルスよりも高い、A549細胞との結合を示す。切断型Ad5節部(Ad5Δs)、又はAd5節部に融合されたAd37軸部(Ad37s/Ad5k)を含有する粒子は、結合活性を低減し；これに対して、Ad37節部に融合されたAd5軸部(Ad5s/Ad37k)を備えた粒子は、細胞付着の実質的な増大を有する。Ad37に由来する3番目及び21番目の反復を有する「真直ぐにされた」Ad5線維軸部(Ad5s/Ad37s)を含有する粒子は、最小限の特異的細胞付着を示し、このことは、これら2つの反復が、細胞付着にとって、並びに細胞感染にとって重要であることを実証する。 (Ad5s/Ad37k)の細胞付着の増大はAd5節部に匹敵し、このことはA549細胞のAd5感染がCAR依存性であるため、CAR結合が修復されたことを示す(Wu他、(2001) Virology 279:78-89)。
【０２４２】
実施例9
インテグリン相互作用
無傷ウィルス粒子とのインテグリン結合を以下のように見極めた。精製済シュードタイプを、96ウェル・プレートのウェル (Immulon 4 HBX; Dynex Technologies, Chantilly, VA)に、室温で一晩にわたってコーティングした。ウェルをPBS(Pierce)中のSuperblockでブロックした。ウィルスをコーティングされたウェルを、可溶性αvβ5インテグリン(27)の量を変化させながら2時間にわたって先ずインキュベートした。洗浄後、ウィルスをコーティングされたウェルを、非機能ブロック性抗αvサブユニット・モノクローナル抗体(LM142)(D. Cheresh, TSRI, La Jolla, CA提供)10 μg/mlと一緒に1時間にわたってインキュベートした。付加的な洗浄ステップ後、ウェルを1:10,000ヤギ抗マウスHRP接合型抗体と一緒に1時間にわたってインキュベートした。ELISAをABTS基質で展開し、そして405nmの吸光度を測定することにより分析した。
結果が示したところによれば、種々異なるAd粒子のそれぞれが同様のαvβ5インテグリン結合レベルを示し、このことは、線維軸部修飾がこれらの二次受容体の会合を妨害しないことを示唆する。
【０２４３】
実施例10
受容体相互作用のモデリング
最近の構造分析は、アデノウィルス線維タンパク質及びレオウィルスのシグマ1タンパク質(Chappell他(2002)EMBO J. 21:1-117)、つまりレオウィルス受容体JAM-1(4)のための付着タンパク質の構造が際立って類似していることを明らかにした。CARとマウスJAM(mJAM)とは、膜遠位IgVドメイン及び二量体化界面において類似性を共有する。両者とも、2つのIg様の外部ドメインを有する免疫グロブリン超科の員であり、両方とも宿主細胞上の密な接合部に配置されている(Cohen他、(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98:15191-15196; Martin-Padura他(1998) J. Cell Biol. 142:117-127; Wickham(1993) Cell 73:309-319)。
【０２４４】
タンパク質トポロジカル比較プログラムであるTPO(Lu, G.(2000) J. Appl. Cryst. 33:176-183)を用いて、mJAM、CAR DI二量体、Ad12節部-CAR DI複合体(Bewley他(1999) Science 286:1579-15836)、及びAd2節部プラス軸部の4つのβ反復(Raaij他、(2000) Structure 8:1147-1155.41)の結晶構造を順次一緒にアラインメントした。CAR及びmJAMの膜遠位ドメインはIgVドメインであり23%同一性なので、これらのβ鎖及び二次構造を密にアラインメントすることができた。結果として生じたキメラCAR-JAM分子は、コクサッキーウィルスB3に結合されたヒトCARの曲げcryo-EM構造に酷似する(He他(2001) Nature Struc. Biol. 8:874-878)。最後に、ほとんど同一のβ-バレル第三構造を有する、41%同一性の部分群C Ad2節部及び軸部は、Ad12節部に容易にアラインメントされた。CAR D1二量体の2つの分子が平面的な細胞構造に対して等距離であることを想定して、線維-CAR-mJAM複合体全体を細胞表面に対してマニュアルで配向した。Ad37線維でシュードタイプされたAd5ベクターのcryo-EM画像再構成から得られた電子密度(Chiu他(2001) J. Virol. 75:5375-5380)を、Ad2節部及び軸部の結晶構造上に加え、複合モデル内に組込んだ。その結果得られるAd37-CAR-宿主細胞複合体モデルにおいて、線維軸部の三重対称軸と細胞表面との間の角度は約20°であり、そしてAd37節部のCAR結合表面をCARと接触するように位置決めするために、モデルは、概ね300Åのオーバーラップと共に、Ad37と宿主細胞膜との間に有意な立体衝突を示す。2つのCARドメインと2つのmJAMドメインとの間の曲げ角に中程度に大きな偏差(±30°)があるとしても、このことは、Ad37と宿主細胞膜との間に予測される立体衝突を完全には軽減しない。立体妨害を回避するためには、剛性Ad37線維が、線維軸部の三重対称軸と細胞表面との間の角度が60°以上になるように配合されなければならない。相同性モデル形成に基づいた、並びにX線結晶構造及びcryo-EM構造に基づいたAd37-CAR-宿主細胞複合体の分子モデルは、Ad37線維が、線維節部内にCAR結合配列を含有するにもかかわらず、なぜ細胞表面のCARを介したウィルス結合を支援することができないのかを説明する。従って、細胞表面及び受容体配向によって与えられた立体障害は、線維及びCAR分子のアラインメントにおいて有意な役割を演じる。
【図面の簡単な説明】
【０２４５】
【図１Ａ】Ad2、Ad5、Ad37、Ad8、Ad9及びAd15のアデノウィルス線維タンパク質に由来する3番目の反復配列及び最後の完全反復配列の反復アラインメントの例を示し；最後の完全反復のコンセンサス配列を図1Bに示す(SEQ ID NO:49参照)。
【図１Ｂ】Ad2、Ad5、Ad37、Ad8、Ad9及びAd15のアデノウィルス線維タンパク質に由来する3番目の反復配列及び最後の完全反復配列の反復アラインメントの例を示し；最後の完全反復のコンセンサス配列を図1Bに示す(SEQ ID NO:49参照)。
【図２】図2は、線維キメラ、並びにそれぞれの長さ特性及びフレキシビリティ特性を示し、Ad5領域は明るいグレーで、そしてAd37領域は黒色で示され；線維のフレキシビリティに関与する反復は、縞の楕円として示され；プラス及びマイナスは、線維又は線維キメラの相対的な長さ又はフレキシビリティを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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