(57)【要約】本発明は、糸状菌である担子菌類のシュタケ属の一核株を、所定の組換えタンパク質の調製方法を実施するために利用することに関するものであり、前記方法は、シュタケ属の前述の一核株においてこのタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現によって行われる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の組換えタンパク質の調製方法であり、前記方法が、糸状菌である担子菌類のシュタケ属の一核株において、この所定のタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることによって行われ、また、
−前述のシュタケ属の一核株を培養する過程であって、前記株が、所定の組換えタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が、構成的または誘導的な、前述の菌の内因性プロモーターに対応するプロモーターまたはそうでないプロモーター（外因性プロモーターとも呼ばれる）の制御下に置かれていることを特徴とする過程と、
−プロモーターが誘導的であるとき、場合によっては前述のプロモーターを誘導する過程と、
−培地で生成した所定の組換えタンパク質を回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいる方法。
【請求項２】
所定の組換えタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現に用いるシュタケ属の一核株が、元々は二核である株を３０℃で１５日間、暗所で培養した後、担子器と呼ばれる、菌糸が分化した子実体が形成されるまで、室温で２〜３週間日光にさらすことで得られ、該担子器の中で核融合が起こり、その後、性分化した四つの胞子、すなわち遺伝的に異なった半数体の担子胞子の形成を引き起こす減数分裂が起こり、それにより発芽後に一核菌糸体が生じることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いるシュタケ属の一核株がシュタケの株であることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
過剰発現した所定の組換えタンパク質が、シュタケ属の内因性タンパク質に対応するか、または、外因性タンパク質に、とりわけ、植物の生体内変換に関与する担子菌類の酵素のような、シュタケ属以外の担子菌類の内因性タンパク質に対応する外因性タンパク質、あるいは、前記組換えタンパク質の生成に用いるシュタケ属株とは異なるシュタケ属株の内因性タンパク質に対応する外因性タンパク質に対応することを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
所定の組換えタンパク質が、
−以下のシュタケ属の内因性タンパク質：
＊ラッカーゼまたはチロシナーゼのような金属酵素、
＊または、セロビオースデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、βグリコシダーゼ、インベルターゼもしくはαアミラーゼ、
−以下から選択される外因性タンパク質：
＊チロシナーゼの生成に用いるシュタケ属株がヒイロタケとは異なる場合のヒイロタケのチロシナーゼのような、前記組換えタンパク質の生成に用いるシュタケ属株とは異なるシュタケ属株のチロシナーゼ、
＊ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ  ｖｉｌｌｏｓａ（好塩性担子菌）のラッカーゼのような、シュタケ属以外の担子菌類のラッカーゼ、
＊クロコウジカビのシンナモイルエステラーゼＡおよびＢ、
に対応することを特徴とする、請求項１〜請求項４のいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
シュタケ属の内因性タンパク質に対応する所定の組換えタンパク質の調製方法であり、用いるシュタケ属の一核株が、所定の組換えタンパク質が対応する内因性タンパク質をコードする遺伝子を欠いていることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
シュタケ属の内因性タンパク質に対応する所定の組換えタンパク質の調製方法であり、用いるシュタケ属の一核株が、標識された、とりわけヒスチジンタグによって標識された所定の組換えタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換されることを特徴とする、請求項１〜請求項６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
シュタケ属の内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼの調製方法であり、
−シュタケ属の一核株を培養する過程であって、該株が、場合によってはシュタケ属の内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、場合によっては標識されているシュタケ属のラッカーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現がこのラッカーゼの内因性プロモーターに対応するプロモーターの制御下に置かれている過程と、
−前述のプロモーターを誘導する過程であり、とりわけ、エタノール、または、麦藁、トウモロコシの糠およびビートの果肉のようなリグノセルロースを含んだ農業副産物、あるいは、２，５−キシリジン、ベラトルム酸、グアヤコール、ベラトリルアルコール、シリンガルダジン、フェルラ酸、カフェー酸およびリグノスルホン酸塩のような芳香族化合物の添加によって誘導する過程と、
−培地で生成した前述のシュタケ属の内因性ラッカーゼに対応する、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表されるシュタケの内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼの調製方法であり、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が場合によってはシュタケの内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される、場合によっては標識されている組換えラッカーゼをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が前述のラッカーゼの内因性プロモーターに対応するｐＬａｃプロモーターの制御下に置かれ、前記ｐＬａｃプロモーターの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されることを特徴とする過程と、
−前述のｐＬａｃプロモーターをエタノールで誘導する過程と、
−培地で生成した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シュタケ属の内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼの調製方法であり、
−シュタケ属の一核株を培養する過程であり、該株が、場合によってはシュタケ属の内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、場合によっては標識されているシュタケ属のラッカーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が、
＊ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表される、スエヒロタケのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現プロモーターｇｐｄ、
＊または、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表される、スエヒロタケのハイドロフォビンをコードする遺伝子の発現プロモーターｓｃ３、
から選択される外因性プロモーターの制御下にある過程と、
−培地で生成した、前述のシュタケ属の内因性ラッカーゼに対応し、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴とする、請求項１〜請求項７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される、シュタケの内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼの調製方法であり、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が場合によってはシュタケ属の内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、場合によっては標識されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される組換えラッカーゼをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が外因性プロモーターｇｐｄまたはｓｃ３の制御下に置かれていることを特徴とする過程と、
−培地で生成した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表されるヒイロタケのチロシナーゼに対応する組換えチロシナーゼの調製方法であり、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表され場合によっては標識されている組換えチロシナーゼをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を有する発現ベクターによって形質転換されており、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５が、好適には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２における最初の２１個のアミノ酸によって画定されたシュタケのシグナルペプチドをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１２８位および１９０位のヌクレオチドによって画定されたヌクレオチド配列の後ろにあり、また、その発現がシュタケのラッカーゼの内因性プロモーターに対応するｐＬａｃプロモーターの制御下に置かれ、前記ｐＬａｃプロモーターの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されることを特徴とする過程と、
−前述のｐＬａｃプロモーターをエタノールによって誘導する過程と、
−培地において生成した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表され、場合によっては標識されている組換えチロシナーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１３】
図１２に示したｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ  ｖｉｌｌｏｓａのラッカーゼに対応する組換えラッカーゼ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）の調製方法であり、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が、場合によってはシュタケの内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表され、場合によっては標識されている組換えラッカーゼをコードする、図１２に示されたヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が、シュタケのラッカーゼの内因性プロモーターに対応するｐＬａｃプロモーターの制御下に置かれ、前記ｐＬａｃプロモーターの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されることを特徴とする過程と、
−前述のｐＬａｃプロモーターをエタノールによって誘導する過程と、
−培地において生成した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表され、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１４】
シュタケの内因性ラッカーゼのｐＬａｃプロモーターをコードし、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対応するヌクレオチド配列、または、一つまたは複数のヌクレオチドを置換、付加または削除することでこのプロモーターから誘導され、配列の発現プロモーターとしての特性を保持しているあらゆる配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載のｐＬａｃプロモーターの配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を有することを特徴とする発現ベクター。
【請求項１６】
所定の組換えタンパク質をコードし、発現が請求項１４に記載のｐＬａｃプロモーターの制御下に置かれた遺伝子を有することを特徴とする、請求項１５に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
所定の組換えタンパク質が、
−以下のシュタケ属の内因性タンパク質：
＊ラッカーゼもしくはチロシナーゼのような金属酵素、
＊または、セロビオースデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、βグリコシダーゼ、インベルターゼもしくはαアミラーゼ
−以下から選択される外因性タンパク質：
＊チロシナーゼの生成に用いるシュタケ属株がヒイロタケとは異なる場合のヒイロタケのチロシナーゼのような、前記組換えタンパク質の生成に用いるシュタケ属株とは異なるシュタケ属株のチロシナーゼ、
＊ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ  ｖｉｌｌｏｓａ（好塩性担子菌）のラッカーゼのような、シュタケ属以外の担子菌類のラッカーゼ、
＊クロコウジカビのシンナモイルエステラーゼＡおよびＢ、
に対応するタンパク質であることを特徴とする、請求項１５または請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１５〜請求項１７のいずれか一つに記載の発現ベクターによって形質転換される宿主細胞。
【請求項１９】
シュタケの株のようなシュタケ属株の一核の細胞に対応する、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１５〜請求項１７のいずれか一つに記載の発現ベクター、あるいは、請求項１８または請求項１９に記載の宿主細胞を利用して実施することを特徴とする、請求項１〜請求項１３のいずれか一つに記載の所定の組換えタンパク質を過剰生成させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の組換えタンパク質の調製方法を実施するために、糸状菌である担子菌類のシュタケ属（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）の一核株を利用することに関するものであり、前記方法は、シュタケ属の前述した一核株でこのタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることによって行われるものである。
【背景技術】
【０００２】
現状では、金属酵素のような植物の生体内変換に関与する酵素の生成の枠組みにおいて、主要な産業グループによって菌類の二つのモデルが好んで用いられている。それはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）とトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）であり、これらは不完全菌類に属している。しかし、これらのモデルによる生成効率、とりわけラッカーゼの生成における効率は１５０ｍｇ／ｌを超えることがない。
【特許文献１】Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ  Ｊ．Ｃ．，Ｈｅｒｐｏｅｌ  Ｉ．，  Ｆｒａｓｓｅ  Ｐ．，Ｍｏｕｋｈａ  Ｓ．，Ｌｅｓａｇｅ−Ｍｅｅｓｓｅｎ  Ｌ．，Ａｓｔｈｅｒ  Ｍ．，１９９９、「Ｌａｃｃａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎ  Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｉｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎ」、『Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ』１５、４８１−４８４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は、ラッカーゼをコードし、発現がシュタケのラッカーゼのｐＬＡＣ内因性プロモーターと同じプロモーターの制御下にある遺伝子を有するベクターによって、ラッカーゼ活性を欠いたシュタケの一核株を形質転換すると、ラッカーゼ活性を欠いていないシュタケの一核株にエタノールを作用させてこのラッカーゼの内因性プロモーターを誘導することでラッカーゼを過剰生成させる方法を実施したときと同等のラッカーゼが生成すること、つまり、生成するｇ／ｌが等しいことが本発明者らによって明らかになったことに基づいている。
【０００４】
本発明者らによって、前述したｐＬａｃプロモーターの代わりに、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅ）のｇｐｄプロモーターおよびｓｃ３プロモーターを用いて同様の結果が得られている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、所定の組換えタンパク質の調製方法を目的とするものであり、前記方法は、糸状菌である担子菌類のシュタケ属の一核株において、この所定のタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現させることによって実行されるものであり、また、該方法は、
−前述のシュタケ属の一核株を培養する過程であって、前記株が、所定の組換えタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が、構成的または誘導的な、前述の菌の内因性プロモーターに対応するプロモーターあるいはそうでないプロモーター（外因性プロモーターとも呼ばれる）の制御下に置かれていることを特徴とする過程と、
−誘導的プロモーターであれば、場合によっては前述のプロモーターを誘導する過程と、
−培地で生成した所定の組換えタンパク質を回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいる。
【０００６】
本発明は、より具体的には、上述した方法を目的とするものであり、所定の組換えタンパク質をコードする遺伝子の過剰発現に用いるシュタケ属の一核株が、元々は二核である株を暗所で１５日に渡って３０℃で培養した後、担子器と呼ばれる、菌糸が分化した子実体が形成されるまで、室温で２〜３週間日光にさらすことで得られ、該子実体の中で核融合（核の合体）が起こり、その後に、性分化した四つの胞子、すなわち、遺伝的に異なった半数体の担子胞子の形成を引き起こす減数分裂が起こり、それにより発芽後に一核菌糸体が生じることを特徴としている。
【０００７】
好適には、本発明の前述した方法で用いられるシュタケ属の一核株はシュタケの株である。
【０００８】
本発明による方法を実施する範囲における、過剰発現させる所定の組換えタンパク質は、シュタケ属の内因性タンパク質に対応しているか、あるいは、前記組換えタンパク質の生成に用いるシュタケ属株の内因性タンパク質とは異なる、外因性タンパク質に対応するものである。とりわけ、これらの外因性タンパク質は、植物の生体内変換に関与する担子菌類の酵素のような、シュタケ属以外の担子菌類の内因性タンパク質に対応するものであるか、あるいは、前記組換えタンパク質の生成に用いるシュタケ属株とは異なるシュタケ属株の内因性タンパク質に対応するものである。
【０００９】
本発明は、より具体的には、上述した方法を目的とするものであり、該方法は、所定の組換えタンパク質が、
−以下のシュタケ属の内因性タンパク質：
＊ラッカーゼあるいはチロシナーゼのような金属酵素、
＊または、セロビオースデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、βグリコシダーゼ、インベルターゼもしくはαアミラーゼ、
−以下から選択される外因性タンパク質：
＊チロシナーゼの生成に用いるシュタケ属株がヒイロタケとは異なっている場合のヒイロタケのチロシナーゼのような、前記組換えタンパク質の生成に用いるシュタケ属株とは異なるシュタケ属株のチロシナーゼ、
＊ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ  ｖｉｌｌｏｓａ（好塩性担子菌）のラッカーゼのような、シュタケ属以外の担子菌類のラッカーゼ、
＊クロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のシンナモイルエステラーゼＡ（番号ＥＭＢＬ  Ｙ０９３３０）およびＢ（番号ＥＭＢＬ  ＡＮＩ３０９８０７）、
に対応するものであることを特徴としている。
【００１０】
好適には、とりわけシュタケ属の内因性タンパク質に対応する所定の組換えタンパク質を調製する場合には、用いるシュタケ属の一核株が、所定の組換えタンパク質が対応する内因性タンパク質をコードする遺伝子を欠いており、前記組換えタンパク質の精製時に、所定の組換えタンパク質が対応する内因性タンパク質から該所定の組換えタンパク質を分離する必要がない。
【００１１】
変形例では、とりわけシュタケ属の内因性タンパク質に対応する所定の組換えタンパク質を調製する場合には、用いるシュタケ属の一核株は、所定の組換えタンパク質が対応する内因性タンパク質をコードする遺伝子を欠いていないこともあり、このとき、前記株は、精製過程の際に内因性タンパク質から区別するために標識された所定の組換えタンパク質をコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換される。たとえば、所定の組換えタンパク質はヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）によって標識することができる。
【００１２】
そのため、本発明は、より具体的には、シュタケ属の内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼの調製方法を目的としており、該方法は、
−シュタケ属の一核株を培養する過程であって、該株は、場合によってはシュタケ属の内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠いており、場合によっては標識されたシュタケ属のラッカーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が、このラッカーゼの内因性プロモーターに対応するプロモーターの制御下に置かれていることを特徴とする過程と、
−前述のプロモーターを誘導する過程であり、とりわけ、エタノールの添加によって、または、麦藁、トウモロコシの糠およびビートの果肉のようなリグノセルロースを含んだ農業副産物の添加によって、あるいは、２，５−キシリジン、ベラトルム酸、グアヤコール、ベラトリルアルコール、シリンガルダジン、フェルラ酸、カフェー酸およびリグノスルホン酸塩のような、芳香族化合物を添加することによって誘導する過程と、
−培地において生成した、とりわけ、Ｓｉｇｏｉｌｌｏｔ  Ｊ．Ｃ．，Ｈｅｒｐｏｅｌ  Ｉ．，  Ｆｒａｓｓｅ  Ｐ．，Ｍｏｕｋｈａ  Ｓ．，Ｌｅｓａｇｅ−Ｍｅｅｓｓｅｎ  Ｌ．，Ａｓｔｈｅｒ  Ｍ．，１９９９、「Ｌａｃｃａｓｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎ  Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｄｉｋａｒｙｏｔｉｃ  ｓｔｒａｉｎ」、『Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ』１５、４８１−４８４に記載されている方法によって生成した、前述のシュタケ属の内因性ラッカーゼに対応し、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいる。
【００１３】
本発明は、より具体的には、上記で定義した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される、シュタケの内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼの調製方法に関するものであり、該方法は、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が、場合によってはシュタケの内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠いており、場合によっては標識されている、とりわけＨｉｓ−ｔａｇというタグによって標識されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される組換えラッカーゼをコードするヌクレオチド配列（または核酸配列）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が、前述のラッカーゼの内因性プロモーターに対応するｐＬａｃプロモーターの制御下に置かれ、前記ｐＬａｃプロモーターの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されることを特徴とする過程と、
−前述のｐＬａｃプロモーターをエタノールによって誘導する過程と、
−培地において、とりわけ前述のＳｉｇｏｉｌｌｏｔ  Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）に記載された方法によって生成する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２によって表され、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴としている。
【００１４】
本発明は、より具体的には、シュタケ属の内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼの調製方法を目的とするものであり、該方法は、
−シュタケ属の一核株を培養する過程であって、該株が場合によってはシュタケ属の内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、シュタケ属のラッカーゼをコードする遺伝子を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が、
＊ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４で表される、スエヒロタケのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の発現プロモーターｇｐｄ、
＊または、ヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５で表される、スエヒロタケのハイドロフォビンをコードする遺伝子の発現プロモーターｓｃ３、
から選択される外因性プロモーターの制御下に置かれていることを特徴とする過程と、
−培地において、とりわけ前述のＳｉｇｏｉｌｌｏｔ  Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）に記載された方法によって生成する、前述のシュタケ属の内因性ラッカーゼに対応する組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴としている。
【００１５】
本発明は、より具体的には、上記で定義した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される、シュタケの内因性ラッカーゼに対応するラッカーゼの調製方法に関するものであり、該方法は、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が場合によってはシュタケの内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、場合によっては標識されている、とりわけＨｉｓ−ｔａｇというタグで標識されているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表される組換えラッカーゼをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現が外因性プロモーターｇｐｄまたはｓｃ３の制御下に置かれていることを特徴とする過程と、
−培地において、とりわけ前述のＳｉｇｏｉｌｌｏｔ  Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）に記載されている方法によって生成する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２で表され、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴としている。
【００１６】
本発明は、より具体的には、上記で定義した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６によって表される、ヒイロタケのチロシナーゼに対応する組換えチロシナーゼの調製方法を目的とするものであり、該方法は、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表され場合によっては標識されている組換えチロシナーゼをコードするヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５を有する発現ベクターによって形質転換されており、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５が、好適には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２における最初の２１個のアミノ酸によって画定されたシュタケのシグナルペプチドをコードする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の１２８位および１９０位のヌクレオチドによって画定されたヌクレオチド配列の後ろにあり、また、その発現が、シュタケのラッカーゼの内因性プロモーターに対応するｐＬａｃプロモーターの制御下に置かれ、前記ｐＬａｃプロモーターの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されることを特徴とする過程と、
−前述のｐＬａｃプロモーターをエタノールで誘導する過程と、
−培地で生成した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６で表され、場合によっては標識されている組換えチロシナーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含んでいることを特徴としている。
【００１７】
本発明は、より具体的には、上記で定義した、図１２に示したｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ  ｖｉｌｌｏｓａのラッカーゼに対応する組換えラッカーゼ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）の調製方法に関するものであり、該方法は、
−シュタケの一核株を培養する過程であって、該株が、場合によってはシュタケの内因性ラッカーゼをコードする遺伝子を欠き、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表され場合によっては標識されている組換えラッカーゼをコードする、図１２に示したヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）を有する発現ベクターによって形質転換されており、その発現がシュタケのラッカーゼの内因性プロモーターに対応するｐＬａｃプロモーターの制御下に置かれ、前記ｐＬａｃプロモーターの配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３で表されることを特徴とする過程と、
−前述のｐＬａｃプロモーターをエタノールによって誘導する過程と、
−培地において生成した、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８で表され、場合によっては標識されている組換えラッカーゼを回収し、場合によっては精製すること、
を含むことを特徴としている。
【００１８】
また、本発明は、シュタケの内因性ラッカーゼのｐＬａｃプロモーターをコードする、配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に対応するヌクレオチド配列、または、一つまたは複数のヌクレオチドを置換、付加、あるいは削除することでこのプロモーターから誘導され、配列の発現プロモーターとしての特性を保持しているあらゆる配列も目的とするものである。
【００１９】
また、本発明は、プラスミドｐＥＬＰのようなあらゆる発現ベクターにも関するものであり、該ベクターは、前述のｐＬａｃプロモーターの配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、または、上記で定義した誘導配列を有することを特徴としている。
【００２０】
本発明は、より具体的には、上記で定義したあらゆる発現ベクターを目的とするものであり、該発現ベクターは、所定の組換えタンパク質をコードする遺伝子を有し、その発現が前述のｐＬａｃプロモーターまたは上記で定義した誘導配列の制御下に置かれていることを特徴としている。
【００２１】
本発明は、より具体的には、上記で定義したあらゆる発現ベクターに関するものであり、該発現ベクターは、所定の組換えタンパク質が、
−以下のシュタケ属の内因性タンパク質：
＊ラッカーゼもしくはチロシナーゼのような金属酵素、
＊または、セロビオースデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、βグリコシダーゼ、インベルターゼもしくはαアミラーゼ、
−以下から選択される外因性タンパク質：
＊チロシナーゼの生成に用いるシュタケ属株がヒイロタケとは異なる場合のヒイロタケのチロシナーゼのような、前記組換えタンパク質の生成に用いるシュタケ属株とは異なるシュタケ属株のチロシナーゼ、
＊ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ  ｖｉｌｌｏｓａ（好塩性担子菌）のラッカーゼのような、シュタケ属以外の担子菌類のラッカーゼ、
＊クロコウジカビのシンナモイルエステラーゼＡおよびＢ、
に対応するタンパク質であることを特徴としている。
【００２２】
また、本発明は上記で定義した発現ベクターによって形質転換されたあらゆる宿主細胞にも関するものである。
【００２３】
本発明は、より具体的には、シュタケの株のようなシュタケ属株の一核の細胞に対応する、前述のあらゆる宿主細胞を目的とするものである。
【００２４】
また、本発明は、上記で定義した所定の組換えタンパク質を過剰生成させる方法を実施するために、上記で定義した発現ベクターまたは前述の宿主細胞を利用することも目的としている。
【００２５】
本発明は、ＳＥＰＣ：Ｓｙｓｔｅｍｅ  ｄ’Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ  ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ（シュタケの発現系）、すなわち、現状で欧州の主なグループによって用いられている産業モデル（アスペルギルスとトリコデルマ）を用いないことを可能にする、有効な菌類の発現モデルの開発についての以下の詳細な説明によってより良く説明されるものである。
【００２６】
要するに、本発明は、真核生物の発現系、より具体的には、糸状菌の担子菌類であるシュタケの発現系を対象とするものであり、該系は本発明者らが、産業的利益のあるタンパク質を過剰発現するように開発したものである。この作業は、ラッカーゼのような金属酵素の研究の枠組みで行われてきており、特に、該作業によって、それらの過剰発現に関与する遺伝子をクローニングすることと、発酵槽によって大量のラッカーゼを過剰生成することが可能になっており、これは、食用の産業的応用（パン製造、茶の色を調節するための飲料調製、果汁およびアルコール飲料の清澄の補助、農産物由来ポリマーの形成）および非食用の産業的応用（「ジーンズ」の処理、土壌中の芳香族の汚染物質の分解、製紙用パルプの分野におけるリグノセルロースの繊維のバイオブリーチング）において用いることを目的としている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
Ｉ）菌の形質転換および有益な遺伝子の過剰生成のための、シュタケの一核株の取得。
この過程は、有益な遺伝子を発現させるための宿主として用いる、糸状菌であるシュタケの性分化した胞子に由来する半数体の細胞株を単離し、選別することを目的としている。シュタケは野生の状態では二核の形態（細胞ごとに対になっていない二つの核）である自家不和合性の菌であり、該菌から、潜在的により安定で、したがって遺伝形質の転換に有用な、一核株（細胞ごとに一つの核）を選別する。この研究の枠組みにおいて、本発明者らは、ラッカーゼ活性のない（ｌａｃ-）一核株を選別するようにした。二核状態では、菌は無性生殖することができる（図１）。しかし、特殊な環境条件の影響下で、研究所では、子実体の形成を誘導することができる。担子器と呼ばれる分化した菌糸の中では核融合（核の合体）が起こり、その後、性分化した四つの胞子、すなわち遺伝的に異なる半数体の担子胞子の形成を引き起こす減数分裂が起こる。発芽後、各担子胞子は一核菌糸体を生成する。簡単な比色分析試験によって、ラッカーゼ活性のない株のみを選別することが可能になる。
【００２８】
１）一核株の分離
子実体の培地は２％（Ｐ／Ｖ）の麦芽エキスと寒天（１．６％Ｐ／Ｖ）で構成される。培養物をシャーレに接種し、暗所で１５日間、３０℃で維持した後、室温で２〜３週間日光にさらした。子実体はオレンジ〜赤色に見えた。そして単胞子を、滅菌水でシャーレのふたに採取した。懸濁液を希釈し、コロニーを単離するために、ＭＡ２培地（２％Ｐ／Ｖの麦芽および２％Ｐ／Ｖの寒天）を入れたシャーレで培養した。単離した純粋培養物をＭＡ２培地に釣菌し、３０℃で５日間維持し、４℃で保存した。
【００２９】
これらの条件で、ラッカーゼ活性を欠いた一核株を、ラッカーゼ遺伝子を過剰発現させるための発現ベクターによる形質転換のために選別した。サザンブロット法による分析を行い、それにより、この株がシュタケのラッカーゼをコードする遺伝子を欠いていることが証明された。
【００３０】
２）単胞子コロニーのラッカーゼ活性を検出する迅速試験
菌糸体を少量シャーレに置き、０．１％（Ｐ／Ｖ）のシリンガルダジンのエタノール溶液の液滴で覆った。１５分後、色の変化が観察された。また、ラッカーゼ活性を検出するための基質として２，２−アジノ−ビス−［３−エチルチアゾリン−６−スルホナート］（ＡＢＴＳ）を用いることもできる。
【００３１】
３）ラッカーゼを生成するための培養条件
前培養したものから接種菌を採取するのだが、該前培養したものは、２００ｍＬの合成培地を含むルー瓶において１０日間３０℃で生育させたもので、該合成培地は、１Ｌあたり、以下の組成を有している。マルトース（２０ｇ）、酒石酸ジアンモニウム（１．８４ｇ）、酒石酸ジナトリウム（２．３ｇ）、ＫＨ2ＰＯ4（１．３３ｇ）、ＣａＣｌ2・Ｈ2Ｏ（０．１ｇ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．５ｇ）、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０７ｇ）、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（０．０４６ｇ）、ＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ（０．０３５ｇ）、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（０．１ｇ）、酵母エキス（１ｇ）、Ｔａｔｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｎｔ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」『Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ』３７、３８−４６、１９５０）によるビタミン溶液（１ｍＬ／Ｌ）。二つの瓶の菌糸体を回収し、１００ｍＬの滅菌水と混合し、Ｕｌｔｒａｔｕｒａｘホモジナイザーで６０秒間ホモジナイズした。ラッカーゼを生成するために、合成培地に１ｍＬの菌糸体懸濁液を接種した。次に、培地（１００ｍＬ）を、２５０ｍＬのバッフル付き三角フラスコにおいて３０℃で撹拌しながら（１２０ｒｐｍ）インキュベートした。
【００３２】
ＩＩ）発現ベクターの構築を目的とする、シュタケのラッカーゼをコードする遺伝子とそのプロモーターのクローニング
所定の組換えタンパク質の過剰生成には、真核生物の発現系、より具体的には、糸状菌の担子菌類であるシュタケの発現系が問題となる。選択した研究モデルはシュタケのラッカーゼのモデルである。現状では、二つの菌類モデルが主要な産業グループによって好んで用いられている。それはアスペルギルスとトリコデルマであり、これらは不完全菌類に属している。したがって、この発現システムは完全に新規なものであり、産業界の要求（細胞外培地で分泌タンパク質を大量生産すること、および、発酵槽で生産者である菌類を培養することの可能性）を満たす担子菌類の発現系の開発に関する不備を埋めるものとなる。
【００３３】
１）シュタケのラッカーゼ遺伝子およびそのプロモーターのクローニング
第一の過程において、本発明者らは、ラッカーゼをコードする遺伝子の断片を、縮重ヌクレオチドプライマーを用いて増幅した（図２）。上流の縮重プライマーＦ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；ＣＡＹＴＧＧＣＡＹＧＧＲＴＴＣＴＴＣＣ）および下流の縮重プライマーＲ８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；ＧＡＧＲＴＧＧＡＡＧＴＣＲＡＴＧＴＧＲＣ）はそれぞれ、類似の菌のラッカーゼの銅ＩおよびＩＶへの結合領域から誘導し、シュタケＩ−９３７のゲノムＤＮＡを用いてのＰＣＲ反応（ポリメラーゼ連鎖反応）に用いた。１０μｌの反応混合物に、１００ｎｇのゲノムＤＮＡ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ、２５ｐｍｏｌの各ヌクレオチドプライマー、１０分の１の体積の１０×Ｐｆｕポリメラーゼバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、５００ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ８．３）、ならびに１ＵのＰｆｕポリメラーゼを添加した。混合物は５分間、９４℃で加熱し、その後、ポリメラーゼを加えた。反応条件は、９４℃で５分、５５℃で３０秒、そして７２℃で４分を５サイクル、次いで、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして７２℃で３分を２５サイクルである。反応を終えるため、７２℃で１０分間の過程を行う。ラッカーゼ遺伝子の中央部分に対応する１．６４ｋｂｐのバンドが得られた。この遺伝子部分をシーケンシングするために、ＤＮＡ配列をｐＧＥＭ−Ｔでクローニングした。
【００３４】
サザンブロット技術（図３）により、我々はラッカーゼ遺伝子の全体を含んでいる可能性のある最小のＤＮＡ断片を得るために、欠損した５’末端および３’末端を増幅することに役立つ可能性のある、適切な制限酵素認識部位を決定した。サザンブロット法を、酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＳａｃＩ、ＳｍａＩおよびＸｂａＩを用いてシュタケのゲノムＤＮＡで行い、該方法によって、ゲノムＤＮＡの消化によって３．５ｋｂｐのバンドを示すＰｓｔＩを選択することができた。遺伝子の欠損部分を増幅するために、インバースＰＣＲ技術を、先に単離した中央部分に特異的なヌクレオチドプライマーとシュタケのゲノムＤＮＡを有するＰＣＲ混合物に対して用いた。ＰＣＲ反応は、ＰｓｔＩによって切断し、セルフライゲーションによって再環状化した１５０ｎｇのＤＮＡと、ヌクレオチドプライマーＦｅｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；ＧＧＡＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧ）およびＲｅｘ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９；ＣＧＣＡＧＴＡＴＴＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧ）を用いて行った。反応条件は、９４℃で５分、５５℃で３０秒、および７２℃で５分を５サイクル、次いで、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で４分を２５サイクルであり、７２℃で１０分間の最終過程も含まれる。増幅したＤＮＡ断片は、ｐＧＥＭ−Ｔでクローニングし、シーケンシングした、２．７ｋｂｐのバンドに対応した。
【００３５】
次に、ラッカーゼをコードする遺伝子の全体を、中央部分と増幅した５’部分および３’部分を組み合わせて画定した。この配列を確認するために、遺伝子全体を、シュタケのゲノムＤＮＡから、ヌクレオチドプライマーＦｉｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０；ＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＣＧＣＣＴＧＴＣ）およびＲｉｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１；ＡＴＣＧＡＡＧＧＴＴＣＣＧＡＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＧＡＣ）を用いて増幅した（３３３１ｋｂｐ、図４）。また、この遺伝子はシュタケｓｓ３のゲノムＤＮＡからもクローニングされ、シュタケＩ−９３７で単離されたものと同一であることが明らかになった。
【００３６】
２）ラッカーゼ遺伝子のプロモーターを用いた発現ベクターの構築
ラッカーゼの遺伝子配列から、本発明者らは、先に遺伝子の単離に用いたものと同じ方法を用いて、つまり、制限酵素ＢｇｌＩＩによって今回は切断したゲノムＤＮＡ断片（３．５ｋｂｐ）に対するインバースＰＣＲ技術によって、この遺伝子のプロモーターをクローニングした（図５）。このようにして、ラッカーゼ遺伝子の前方の２５２７ｋｂｐをインバースＰＣＲでクローニングし、シーケンシングした。このプロモーターを、細菌におけるプロモーターのサブクローニングのためのアンピシリン耐性と、菌における選択マーカーとして用いるフレオマイシン耐性を有するベクターに組み込んだ。スエヒロタケのハイドロフォビンｓｃ３をコードする遺伝子のターミネーターを、転写過程を終わらせるために下流に置いた。ｐＥＬＰと呼ばれるこのベクターを、ラッカーゼの同種の発現に用いる（図６）。他の二つの異なったプロモーターをこの研究では用いた。それらは、スエヒロタケのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）をコードする遺伝子のプロモーターとハイドロフォビン（ｓｃ３）をコードする遺伝子のプロモーターであり（図６）、それぞれ、発現ベクターｐＥＧＴおよびｐＥＳＣを構成する。ベクターｐＥＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）、ｐＥＳＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）およびｐＥＬＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）のヌクレオチド配列の全体を、プロモーター、選択マーカーおよびターミネーターの位置とともに図７、図８および図９に示した。
【００３７】
ＩＩＩ）発現ベクターによる一核株の形質転換（研究モデル：シュタケのラッカーゼ）
１）プロトプラストを得るための菌糸体の調製
固形培地で培養した（１０日間）コロニーの四分の一を、５０ｍｌのＹＭ培地（１リットルあたり、１０ｇのグルコース、５ｇのペプトン、３ｇの酵母エキス、３ｇの麦芽エキス）において一分間、ホモジナイザー（Ｕｌｔｒａｔｕｒａｘタイプ、低速度）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを、５０ｍｌのＹＭ培地を入れた２５０ｍｌの滅菌した三角フラスコに移し、次に、３０℃で、撹拌しながら（２２５ｒｐｍ）２０時間にわたってインキュベートした。培養物を改めて１分間ホモジナイズし（低速度）、１００ｍｌのＹＭ培地を加えた。ホモジネートを５００ｍｌの三角フラスコに移し、３０℃で一晩培養した。
【００３８】
２）プロトプラストの調製
菌の培養物を振動型ローター（５０ｍｌのチューブ）において、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１６ｇ（湿重量）を、４０ｍｌの、０．５ＭのＭｇＳＯ4溶液または０．５Ｍのスクロース溶液で洗浄した。スクロースを用いる場合、細胞壁を消化するために用いる溶解酵素をスクロースで希釈する。次に、菌糸体を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを除去した。菌の細胞壁の溶解に関しては、５０ｍｌの培養物に由来する菌糸体に、０．５ＭのＭｇＳＯ4溶液で１ｍｇ／ｍｌに希釈した１０ｍｌの溶解酵素（Ｇｌｕｃａｎｅｘ、Ｓｉｇｍａ社）を加えた。消化は、５００ｍｌの三角フラスコにおいて、３〜４時間にわたる弱い撹拌のもと、３０℃で行った。このインキュベーションの間、プロトプラストの出現を顕微鏡で確認した。１０ｍｌの滅菌水を加え、穏やかに混合した。プロトプラストを１０分間、水と平衡する間放置した（プロトプラストは表面に浮かぶようになる）。次に該プロトプラストを、振動型ローターにおいて、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。プロトプラストを含む上澄みを慎重に５０ｍｌの新しい容器に移した。底に残った塊を０．５ＭのＭｇＳＯ4溶液２５ｍｌで再びインキュベートすることで、最大量のプロトプラストを回収することができる（このとき遠心分離過程を繰り返す）。プロトプラストの調製物の量に等しい量の１Ｍソルビトールを加えた。１０分間、液体中でプロトプラストを凝集させた。次に、この調製物を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、少量のソルビトールが残った。プロトプラストを新しいチューブに移した。前のチューブを１Ｍのソルビトール溶液ですすぎ、回収されたプロトプラストを新しいチューブに加えた。プロトプラストを計数し、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次に、プロトプラストを１Ｍのソルビトール溶液で、１ｍｌあたり２×１０7個のプロトプラストを含む濃度に希釈した。０．５ＭのＣａＣｌ2溶液（１／１０）をプロトプラストに加えた。
【００３９】
３）プロトプラストの形質転換
形質転換のために、滅菌した１０ｍｌのチューブにおいて、１００μｌのプロトプラストを５〜１０μｇのベクター（最大量で１０μｌ）で形質転換した。該プロトプラストを氷中で１０〜１５分間インキュベートした。一定量の４０％ＰＥＧ４０００溶液を加え、混合し、プロトプラストを室温で５分間インキュベートした。２．５ｍｌの再生培地（１００ｍｌあたり、２ｇのグルコース、１２．５ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．０４６ｇのＫＨ2ＰＯ4、０．１ｇのＫ2ＨＰＯ4、０．２ｇのバクト（ｂａｃｔｏ）ペプトン、０．２ｇの酵母エキス）をプロトプラストに加え、該プロトプラストを３０℃で一晩インキュベートした。選択用ケース（７μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含むＹＭ培地、四角のケース）を３７℃に予め加熱した。７．５ｍｌのトップアガーの混合物（７〜１０μｇ／ｍｌのフレオマイシンを含むＹＭ培地で希釈した１％低融点アガロース）を、プロトプラストを含む再生培地に加え、予め加熱した選択用ケースに入れた。トップアガー溶液が固化すると、ケースを３０℃で４日間インキュベートした。そうして、形質転換体を新しい選択用ケースに移した。
【００４０】
４）形質転換体のターゲティング
１６ｇの菌糸体から、一般的にはおよそ１〜２×１０7個のプロトプラストが得られる。再生のパーセンテージは１０％である。ベクターｐＥＳＣに関しては、一核を、シュタケのラッカーゼをコードするｃＤＮＡ（ＢＲＦＭ４７２、４７３および４７４）または遺伝子（ＢＲＦＭ４７０および４７１）を有するベクターで形質転換した（図１０）。同様に、その他の一核を、ラッカーゼをコードする遺伝子を含んだプロモーターｐＥＧＴ（ＧＰＤ１１、１２および１３）またはベクターｐＥＬＰ（１２．３、１２．７および１２．８）によって形質転換した（図１０）。結果を見ると、二つの形質転換体１２．７およびＧＰＤ１４は、同等の活性で他のものよりもぬきんでている。形質転換体ＧＰＤ１４および１２．７については、活性を時間の経過を追って調査した（図１１）。活性は３〜４日目から検出可能で、培地にエタノールを加えることで、１２日目まで上昇し、およそ１２００ｎｋａｔａｌ／ｍｌ、すなわち７２０００Ｕ／ｌに達した。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ラッカーゼ活性のない一核株の単離
【図２】シュタケのラッカーゼをコードする遺伝子の単離
【図３】シュタケのラッカーゼをコードする遺伝子のサザンブロット法による分析
【図４】シュタケのラッカーゼをコードする遺伝子の配列
【図５】シュタケのラッカーゼをコードする遺伝子のｐＬａｃプロモーター配列（ラッカーゼのメチオニンをコードするＡＴＧまで）
【図６】シュタケにおけるラッカーゼの生成に用いた三つの発現ベクターｐＥＧＴ、ｐＥＳＣ、ｐＥＬＰの物理的地図
【図７】ｇｐｄ遺伝子プロモーター（４４８０〜５１１２）、フレオマイシン耐性マーカー（５０７〜１８２２）およびｓｃ３遺伝子ターミネーター（７１〜５０７）を有するベクターｐＥＧＴのヌクレオチド配列
【図８】ｓｃ３遺伝子プロモーター（１〜１０３３）、フレオマイシン耐性マーカー（１５４０〜２８５５）およびｓｃ３遺伝子ターミネーター（１１０４〜１５４０）を有するベクターｐＥＳＣのヌクレオチド配列
【図９】ラッカーゼ遺伝子のプロモーター（４４５７〜６９８３）、フレオマイシン耐性マーカー（５０７〜１８２２）およびｓｃ３遺伝子ターミネーター（７１〜５０７）を有するベクターｐＥＬＰのヌクレオチド配列
【図１０】もっとも強い活性を示す形質転換体の生成結果。培養はエタノールを伴ってまたは伴わずに（対照）行った。
【図１１】エタノールを伴うまたは伴わない（対照）、時間経過に応じた形質転換体ＧＰＤ１４および１２．７のラッカーゼ活性の追跡調査
【図１２】ｈａｌｏｃｙｐｈｉｎａ  ｖｉｌｌｏｓａのラッカーゼをコードする遺伝子の配列
【図１】
2007518407.tif 000002
【図２】
2007518407.tif 000003
【図３】
2007518407.tif 000004
【図４】
2007518407.tif 000005
【図５】
2007518407.tif 000006
【図６】
2007518407.tif 000007
【図７】
2007518407.tif 000008
【図８】
2007518407.tif 000009
【図９ａ】
2007518407.tif 000010
【図９ｂ】
2007518407.tif 000011
【図１０】
2007518407.tif 000012
【図１１】
2007518407.tif 000013
【図１２】
2007518407.tif 000014
【配列表】
2007518407000001.xml
【国際調査報告】
2007518407.tif 000038
2007518407.tif 000039
2007518407.tif 000040
2007518407.tif 000041
2007518407.tif 000042
2007518407.tif 000043
2007518407.tif 000044
2007518407.tif 000045
2007518407.tif 000046
2007518407.tif 000047