(57)【要約】細胞を培養するための積重可能なフラスコが開示されている。細胞培養チャンバは、側壁（１８）および端壁（２０）により連結された実質的に矩形形状の剛性底部トレイ（１６）と上面プレートとにより画成され、フラスコの本体は、細胞培養チャンバと外部環境との間で自由に気体を流動させるガス透過性膜（２３）を備えている。フラスコ本体は、針またはカニューレにより細胞培養チャンバに到達できる密封隔膜（３８）も備えている。フラスコのサイズおよび随意的なネックとキャップ部分の位置により、標準的な自動化アッセイ設備によりフラスコを操作することができ、そのためこのフラスコが高速大量処理用途に理想的になっている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を増殖させるためのフラスコであって、
剛性の表面を持つ底部トレイおよび上面プレートにより画成された、細胞培養チャンバとして働くフラスコ本体であって、前記底部トレイおよび上面プレートが側壁および端壁により連結されているフラスコ本体、
前記細胞培養チャンバ内からのガスがそこを通って該細胞培養チャンバの外側のガスと連絡しているガス透過性開口部を画成する、前記フラスコ本体内に位置する少なくとも１つのガス透過性挿入物、および
漏れ止め隔膜を含有する、前記フラスコ本体内の少なくとも１つの開口部、
を有するフラスコ。
【請求項２】
前記開口部が、前記フラスコ本体から延在するネックであることを特徴とする請求項１記載のフラスコ。
【請求項３】
頂面に一体成形された通気口をさらに備え、それによって、前記通気口が、前記挿入物を支持することができ、該挿入物が、液体が前記通気口を通って前記細胞培養チャンバから逃げないように該通気口を覆うことを特徴とする請求項２記載のフラスコ。
【請求項４】
前記上面プレートの外面から上昇しているかまたは前記底部トレイの外面から低下している支えをさらに含むことを特徴とする請求項１記載のフラスコ。
【請求項５】
前記開口部が１つの壁に沿って位置しており、対向する壁の内部が、前記フラスコが該開口部が上向きとなるように置かれたときに、前記対向する壁の最も低い点が前記開口部と垂直に整合するように配置されるような様式で傾斜していることを特徴とする請求項１記載のフラスコ。
【請求項６】
細胞を増殖させるためのフラスコであって、
剛性の表面を持つ底部トレイおよび上面プレートにより画成された、細胞培養チャンバとして働くフラスコ本体であって、前記底部トレイおよび上面プレートが側壁および端壁により連結されており、実質的に矩形の設置面積を有するフラスコ本体、
前記フラスコ本体に連結され、そこから延在しているネックであって、前記細胞培養チャンバへのアクセスを提供する開口部を有するネック、
前記ネックの開口部を覆うためのキャップ、および
前記実質的に矩形の設置面積からの切欠き領域、
を有し、
それによって、前記ネックおよびキャップが前記実質的に矩形の設置面積内にあるように該ネックおよびキャップが前記切欠け領域内で前記フラスコから延在しているフラスコ。
【請求項７】
前記矩形の設置面積が、マイクロプレートのための業界基準の設置面積の寸法と実質的に同じ寸法を有することを特徴とする請求項６記載のフラスコ。
【請求項８】
前記フラスコが、前記底部トレイの最も外側の平面と前記上面プレートの最も外側の平面との間の距離により測定された高さを有し、前記キャップが、前記フラスコの高さを超えない直径を有することを特徴とする請求項６記載のフラスコ。
【請求項９】
前記ネックが１つの壁に沿って位置しており、対向する壁の内部が、前記フラスコが該ネックが上向きとなるように置かれたときに、前記対向する壁の最も低い点が前記ネックと垂直に整合するように配置されるような様式で傾斜していることを特徴とする請求項６記載のフラスコ。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、その内容をここに引用する、２００３年１２月３１日に出願された米国特許第１０／７５０４７４号の優先権の恩恵を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、広く、細胞生物学分野に関し、特に、細胞培養フラスコに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞を体外培養することにより、薬物学、生理学、および毒物学における研究に必要な物質が得られる。培養された細胞のために作り出される環境条件は、体内の細胞が経験する条件にできるだけ厳密に似ているべきである。細胞を培養するのに適した手段の一例は、ライマン(Lyman)への特許文献１に実証されたような一般的な研究所のフラスコである。細胞は、適切な栄養補給培地中に浸された状態で、フラスコの底壁に付着され、その上で増殖する。このフラスコは、これを適切な温度と雰囲気に維持するように培養器内に保持される。
【０００４】
ほとんどの細胞は６．８から７．８の水素イオン濃度（ｐＨ）範囲に耐えるが、ほ乳類の細胞が増殖するための最適ｐＨは７．２から７．４である。最適ｐＨを細胞培養中に維持するために、細胞培養培地は緩衝系を含有しなければならない。
【０００５】
約５から７体積パーセントの二酸化炭素の培養器の雰囲気と共に、培地に重炭酸塩緩衝系を使用することによりｐＨを維持することが多い。二酸化炭素は水と反応してカルボン酸を生成する。次に、カルボン酸は、培地中の重炭酸イオンと反応して、ｐＨを生理的レベルに維持する緩衝系を形成する。培養器から細胞培養フラスコ中への二酸化炭素の進入は、一般に、フラスコと培養器との間でガス交換のために小さな開口部が維持されるようにゆるく嵌められたまたは半密閉のキャップまたはカバーを用いて行われる。さらに、水蒸気、酸素および二酸化炭素に対して透過性の耐衝撃性ポリスチレン・プラスチックから製造されたフラスコが販売されている。しかしながら、ポリスチレンを通してのガス交換のみに依存することは、透過速度が非常に遅いために、一般に非効率的である。さらにまた、それ自体が非常に薄く（約０．００４インチ（０．１ｍｍ）厚）柔軟なガス透過性膜である細胞増殖表面を有するフラスコが製造されてきた。このタイプの構造によりガス交換が可能であるが、増殖表面の柔軟性および薄さは、均一な表面の増殖を難しくし、フラスコの耐久性に関連する問題の一因となる。
【０００６】
多くのフラスコを培養器内に互いに積み重ね、多数の培養物を同時に増殖させることが望ましい。増殖培地、温度および細胞の変動性におけるわずかな変動も、培養の進行に著しい影響を与える。その結果、細胞の増殖をモニタするために、繰り返し顕微鏡により目視検査を行う必要がある。それゆえ、細胞培養フラスコは一般に、そのような目視検査を可能にする光学的に透明な材料から構成される。
【０００７】
細胞を用いた高速大量処理用途の出現で、完全に自動化された細胞培養システムが重大な開発研究の主題となってきた（例えば、非特許文献１を参照のこと）。これらの自動化システムでは、従来の細胞培養容器（すなわち、一般的なフラスコ、ローラ・ボトル、および細胞培養皿）を用いている。これらのシステムには常に、操作者のように、フラスコの蓋を開け、それらを操作するための関節型アームが必要である。
【特許文献１】米国特許第４７７０８５４号明細書
【非特許文献１】A Review of Cell Culture Automation, M.E.Kempner, R.A.Felder, JALA Volume 7, No.2, April/May 2002, pp.56-62
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
必要なガス交換を提供する一方で、一般にロボット式操作を用いた高速大量処理アッセイ用途の実施に使用するのに適した、剛性構造を持つ細胞培養フラスコが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の例示の実施の形態によれば、細胞を効率的に培養するためのフラスコが開示される。この例示のフラスコは、側壁と端壁により連結された、細胞増殖区域を画成する底部トレイおよび上面プレートを含む単一体を備えている。フラスコ自体の本体は、その中に配置された少なくとも１つの通気性膜またはフイルムを有する。この膜またはフイルムは、フラスコ内部と外部環境との間で圧力差が生じるのを防ぐのに十分に透過性である。培地を追加したり除去したりするために、フラスコには、フラスコ自体の本体内に組み込まれているか、またはキャップの一部として、隔膜シール・アクセシブル開口部または穴が設けられている。さらに、本発明のフラスコは、扱いにくいロボット・アームの操作を必要とせずに、フラスコ内部にロボットがアクセスできるような形状と構成である。
【００１０】
本発明は、添付の図面と共に読んだときに、以下の詳細な説明からもっともよく理解される。様々な特徴構造は、必ずしも、一定の縮尺で描かれていないことを強調しておく。実際に、議論を明白にするために、寸法は任意に増加または減少しているであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下の詳細な説明において、本発明の完全な理解を与えるために、特定の詳細を開示した例示の実施の形態を述べる。しかしながら、本発明は、ここに開示した特定の詳細から逸脱する他の実施の形態で実施してもよいことが当業者には明らかであろう。他の例において、本発明の説明を曖昧にしないように、よく知られた装置や方法の詳細な説明は省かれている。
【００１２】
図１および２を見ると、本発明のフラスコ１０が示されている。フラスコ本体１２は、側壁１８と端壁２０により連結された細胞増殖表面を画成する底部トレイ１６および上面プレート１４を含む。フラスコの上面プレート内には、通気口２２が配置されている。この通気口は、上面プレート１４の表面からわずかに突出し、ガス透過性膜材料のディスク２３を受け入れるような形状をしている。この通気口は、外部環境とのガス連絡を与える、フラスコ本体を通る一連の開口部から形成されている。スクリュー式キャップ２４により被覆された首のある開口部であるネック２６は、フラスコ１０の切欠き角部２８に位置している。以下により詳しく論じるように、キャップの構成部は、キャップ２４がフラスコの矩形の、設置面積(footprint)から突出しないように配置されていることが好ましい。この矩形の設置面積は、フラスコが、図１に示すように底部トレイが表面に接触し、上面プレートが上向きになるように表面に置かれたときに、フラスコが占める概略の長さ×幅の寸法である。例えば、図３に示されているように、設置面積は、フラスコの周囲により決定される区域であり、その周囲は、切欠き角部２８の周りの点線区域により拡張されている。図５において、フラスコの設置面積は、中央ノッチ部５３の上で点線により拡張されたフラスコの周囲により画成される。
【００１３】
支えとして働く隆起した枠３０が、上面プレートの表面に配置されている。図７に移ると、支え枠３０は、フラスコ１０の頂部に積み重ねられる同じフラスコの底部トレイ１６と接触することが意図されている。一旦積み重ねられたら、支え枠によって、積み重ねられたフラスコの間に空気間隙３２が形成される。このことは、通気口を通してガス交換を行うために重要である。支えの他の代わるべき手段としては、隆起角部、支柱、突出部、または連続して積み重ねられたフラスコの間に間隙を形成できる任意の他の特徴構造が挙げられる。さらに、底面トレイには、積み重ねられたフラスコの横の安定性を確実にするように、直接隣接したフラスコからの支え枠３０と係合する、周囲に亘る枠３４が成形されていることが好ましい。
【００１４】
フラスコ１０は、当業者によく知られた多数の許容される製造方法のいずれによって製造してもよい。好ましい方法において、フラスコは、別々に射出成形された部品群から組み立てられる。成形に適しており、研究所での製造に一般に用いられる任意のポリマーを用いてよいが、ポリスチレンが好ましい。別々に成形された部品は、異なるポリマーから形成してもよいが、同じ材料であることが好ましい。底部トレイ１６は、安定性および剛性を与えるのに十分な厚さを持つ実質的に平らな剛性片である。ポリスチレンに関して、厚さは、０．５ｍｍより厚いことが好ましく、１ｍｍより厚いことがより好ましい。この厚さにより、フラスコの底部が完全に平らであることが確実により、これにより、使用中に、均一な細胞層を容易に付着させられる耐久性表面が提供される。要求されないが、光学的透明度のためには、厚さを２ｍｍ以下に維持することが有益である。
【００１５】
好ましくは、また細胞の付着と増殖を向上させるために、底部トレイの表面は、親水性であるように処理されている。処理は、プラズマ放電、コロナ放電、ガス・プラズマ放電、イオン衝撃、電離放射線、および高輝度紫外線を含む、当該技術分野に公知の多数の方法のいずれにより行ってもよい。細胞の付着は、一般に、１つの表面（底部トレイ）だけ標的にされるが、フラスコ内部の全表面で細胞が増殖できるように、フラスコの他の部分が処理されていてもよい。
【００１６】
底部トレイのように、上面プレートも射出成形されることが好ましい。上面プレートは、側壁１８、端壁２０、通気口２２、およびキャップ２４が嵌められるネジ付きネック２６が互いに一体に成形されるように成形されることが好ましい。また、図３Ｃに示されているように、通気口には、上面プレート１４の内面から延在し、通気口構造体の内側部分に膜ディスク２３を適切に収容する位置決めリング３６が成形されていることが好ましい。
【００１７】
膜材料のシートから打ち抜かれた膜ディスク２３は、位置決めリング３６内に位置している。膜ディスク２３は、通気口２２の全体を覆い、通気口２２を取り囲む上面プレート１４の部分にわずかに重複するように適切な寸法で作製されている。膜ディスク２３は、以下に限られないが、溶剤接着、超音波溶着、または熱溶着を含む多数の方法のいずれによって上面プレート１４に付着させてもよい。フラスコの内面の一体部となるように上面プレートの面に、その膜がぴったりと重なり、融着するように、膜領域の周りに気密シールを形成するためには、ディスク周囲の熱溶着が好ましい。膜は、疎水性（非湿潤性）である、または適切な処理方法によって疎水性にできる材料から製造されることがさらに好ましい。適切な材料の例としては、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）または相溶性フルオロポリマー、もしくはポリプロピレンが挙げられる。ＰＴＦＥが膜の好ましい材料である。この膜は、どのような厚さであってもよいが、約５０から２５０マイクロメートルの間であることが理想的である。さらに、膜は、細菌の入口や出口を封鎖することができるべきであり、したがって、０．２マイクロメートルから０．４５マイクロメートルの細孔を有することが好ましい。しかしながら、それより大きい細孔径も効果的であるかもしれない。膜と通気口との組合せによって、フラスコの内部と外部環境との間の自由かつ瞬時のガス交換が可能になり、それらは、どのようなサイズや形状をとってもよい。
【００１８】
一旦、膜が通気口区域に適切に固定されたら、上面プレートと底部プレートを連結してよい。これらの部品は、互いに保持され、継ぎ目に沿って接着剤で結合されるか、超音波溶着されるか、または走査溶着される。部分的にまたは完全に自動化されたアセンブリ・システムにおいて、走査溶着設備を使用することが好ましい。上面プレートおよびトレイは、接合部の外周に沿って走査溶着が行われている間、適切に位置合せされている。
【００１９】
最後に、キャップ２４が提供されるが、このキャップは、キャップの頂部と一体となった隔膜３８を有することが好ましい。これによって、カニューレ、チップまたは針が、キャップを外す必要なく、フラスコの内容物に到達することができる。隔膜３８は、一旦、針、チップまたはカニューレがフラスコから引き抜かれたら、何回も刺された後でさえも、漏れ止め、穿孔可能であり、再封止可能である。キャップとネックの配置は本発明にとって必要ではないことに留意すべきである。別の実施の形態において、図６に示すように、隔膜４３が、膜ディスクをフラスコの壁に貼り付けるための上述した方法のいずれかによって、フラスコの本体に一体に貼り付けられる。その場合、フラスコの内部へのアクセスは、隔膜４３によって、液体に対して不透過性に作製された開口部を通して、フラスコ本体により直接行ってよい。この実施の形態において、隔膜は、フラスコの外面とぴったりと重なることが好ましく、フラスコ本体のどの表面に位置していてもよい（側壁、端壁、上面プレートまたは底部トレイ）。開口部を覆う隔膜が多数あってもよく、したがって、多数のアクセス点が可能になる。フラスコを積み重ねることが要求される場合、または相当なロボット操作が行われる場合、キャップを外す必要がなくなるので、この実施の形態が好ましいであろう。隔膜自体は、鈍端針にとって有用なスリット構成を含む、国際公開第０９／０６６５９５号パンフレットに一般的に記載されるような当該技術分野により知られた任意の形態をとってもよい。この文献をここに引用する。隔膜を製造するのに使用してよい可能性のある材料としては、以下に限られないが、シリコーンゴム、フルオロカーボンゴム、ブチルゴム、ポリクロロプレンゴム、シリコーンエラストマー複合材料、熱可塑性エラストマー、医療等級のシリコーンゴム、ポリイソプレン、合成イソプレン、シリコーンとフルオロポリマーの積層品およびそれらの組合せを含む、天然と合成のエラストマー材料が挙げられる。好ましい実施の形態において、エラストマー材料は、培養細胞にとって実質的に非毒性である。
【００２０】
フラスコ本体の通気口を通してのガス交換のために、隔膜を通しての液体の除去や注入の間でさえも、外側の雰囲気とフラスコ内との間で圧力は等しくされる。それゆえ、通気口と適切な膜が存在することにより、圧力の蓄積による内容物の爆発的な流出が生じない。
【００２１】
本発明の別の好ましい要素は、フラスコが、ネック２６が上向きになる位置に配置されたときに、培地を完全に排出し除去するための、端壁に沿って傾斜した特徴構造４０である。そのような位置において、培地は、傾斜した端壁の底の最も低い部分４２に溜まる。この部分は、ネジ付きキャップのネックと垂直に位置決めされている。例えば、図３および４Ｂにおいて、端壁２０の内面の左部分が、同じ端壁の右側より上に持ち上げられている。その効果は、液体をフラスコから除去するときに、残りの培地が最も低い部分４２に溜まる。これによって、ネックから垂直に下方に延在し、対向する端壁に作用するカニューレにより全ての液体を完全に除去できる。
【００２２】
好ましい実施の形態においては、ネックはフラスコの角部に位置しているが、ネック領域は、フラスコの端部壁または側壁に沿ったどこに位置していてもよいことに留意されたい。例えば、図５に示したように、ネック５０は、フラスコの端壁５２の中央に位置していてもよい。そのような実施の形態において、対向する端壁５４の内部を構成する２つの対向する傾斜５１が、ネック部分５０と垂直に整合して位置した底の最も低い地点５６に収束する。
【００２３】
好ましい実施の形態において、本発明は、業界基準のマイクロプレート（５．０３０±０．０１０インチ×３．３６５±０．０１０インチ）（約１２．８±０．０２５ｃｍ×８．５５±０．０２５ｃｍ）に適合する設置面積を有する。この理由のために、ネック部分は、全体の矩形の設置面積内に凹んでいることが好ましい。フラスコをそのような設置面積にすることの利点は、マイクロプレートの操作のために特別に設計された自動化設備を、非常にわずかしか特化して改造せずに、このフラスコに使用できることである。同様に、高さ、または底部トレイの最も外側部分と上面プレートの外側部分との間の距離は、約０．６８５±０．０１０インチ（約１．７４±０．０２５ｃｍ）である。図３Ｂおよび図４Ａに示したように、ネック２６およびキャップ２４は、フラスコの設置面積を超えて延在しない。いずれにせよ、本発明は、上述した好ましい寸法によりどのようにも制限されることが意図されておらず、実際に任意の寸法で構成してよい。
【００２４】
使用の際に、本発明のフラスコは、許容される細胞増殖方法にしたがって用いられる。細胞は、ネジ付きネックを通して、または隔膜を通してフラスコに導入される。細胞が培地中に浸されるように培地が細胞と一緒に導入される。フラスコは、細胞含有培地が底部トレイの細胞増殖表面を覆うように配置される。膜と通気口の組合せを覆わないようにフラスコを完全には充填しないことが重要である。このことにより、フラスコ内部と外部環境との間の自由かつ迅速なガス交換が確実になる。次いで、フラスコは培養器内に配置される。このフラスコは、多数の細胞培養物が同時に増殖するように、類似のフラスコと一緒に積み重ねられてもよい。フラスコは、底部トレイが培地により完全に覆われる水平位置をとるように置かれる。細胞増殖は、底部トレイを通しての顕微鏡検査により時々監視される。細胞増殖プロセス中、使い果たされた培地を取り出し、新しい培地を注入する必要が生じるであろう。前述したように、培地の交換は、例えば、隔膜を通して、カニューレの挿入により行われるであろう。あるいは、培地は、このオプションを提示する実施の形態においては、キャップを取り外すことによって交換してもよい。一旦、細胞が採取の準備ができたら、トリプシンなどの化学剤を、隔膜を通してフラスコに加える。トリプシンには、フラスコの壁から細胞を開放する効果がある。次いで、細胞をフラスコから採取する。
【００２５】
本発明をこのように記載してきたが、この開示の恩恵を受けた当業者によって本発明を様々な様式で変更してもよいことが明らかであろう。そのような変更は、本発明の精神および範囲から逸脱したものと考えられず、当業者にとって明白なそのような改変は、添付の特許請求の範囲およびその法律上の同等物内に含まれることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明のフラスコの実施の形態の斜視図
【図２】本発明のフラスコの実施の形態の分解図
【図３Ａ】本発明の実施の形態の正面図
【図３Ｂ】図３Ａの切断線Ｂ−Ｂに沿った断面図
【図３Ｃ】図３Ａの切断線Ｃ−Ｃに沿った断面図
【図４Ａ】本発明の実施の形態の上端の側面図
【図４Ｂ】図４Ａの切断線Ａ−Ａに沿った断面図
【図５】本発明の別の実施の形態の正面図
【図６】本発明の他の実施の形態の正面図
【図７】２つの積み重ねられたフラスコの部分断面図
【符号の説明】
【００２７】
１０    フラスコ
１４    上面プレート
１６    底部トレイ
２２    通気口
２３，４３    隔膜
２４    キャップ
【図１】
2007516726.tif 000003
【図２】
2007516726.tif 000004
【図３Ａ】
2007516726.tif 000005
【図３Ｂ】
2007516726.tif 000006
【図３Ｃ】
2007516726.tif 000007
【図４Ａ】
2007516726.tif 000008
【図４Ｂ】
2007516726.tif 000009
【図５】
2007516726.tif 000010
【図６】
2007516726.tif 000011
【図７】
2007516726.tif 000012
【国際調査報告】
2007516726.tif 000013
2007516726.tif 000014
2007516726.tif 000015