(57)【要約】  本発明は、式Ｒ1−Ａ−Ｘ−ＣＨ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｌ1［式中、Ａは基質としてＡＧＴによって認識される基であり、Ｘは酸素または硫黄であり、Ｒ1は基−Ｒ2−Ｌ2または基Ｒ5であり、Ｒ2およびＲ4は互いに独立したリンカーであり、Ｒ3は芳香族基もしくは複素環式芳香族基；または場合により置換されている不飽和アルキル、シクロアルキル、もしくはＣＨ2に結合する二重結合を有するヘテロシクリル基であり、Ｒ5はアリールメチルもしくはヘテロアリールメチル、または場合により置換されているシクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはヘテロシクリル基であり、Ｌ1は１個の標識、複数の同じもしくは異なる標識、Ｒ4とＡを結合して環状基質を形成する結合、またはさらなる基−Ｒ3ＣＨ2−Ｘ−Ａ−Ｒ1であり、かつＬ2は、１個の標識、または複数の同じもしくは異なる標識である］のＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）基質に関する。本発明は、さらに、これらの基質からＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に標識を移動させる方法、およびＡＧＴ融合蛋白質に関する。
2007526282.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
2007526282.tif 000045
［式中、
Ａは、基質としてＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）によって認識される基であり；
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ1は、基−Ｒ2−Ｌ2または基Ｒ5であり；
Ｒ2およびＲ4は、互いに独立したリンカーであり；
Ｒ3は、芳香族基もしくは複素環式芳香族基、または場合により置換されている不飽和アルキル、シクロアルキル、もしくはＣＨ2に結合する二重結合を有するヘテロシクリル基であり；
Ｒ5は、アリールメチルもしくはヘテロアリールメチル、または場合により置換されているシクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはヘテロシクリル基であり；
Ｌ1は、１個の標識、複数の同じもしくは異なる標識、Ｒ4とＡを結合して環状基質を形成する結合、またはさらに基−Ｒ3−ＣＨ2−Ｘ−Ａ−Ｒ1であり；かつ
Ｌ2は、１個の標識、または複数の同じもしくは異なる標識である］
の化合物。
【請求項２】
請求項１に記載の式（１）の化合物であって、
Ａが、１〜５個の窒素原子を含む複素環式芳香族基であり、
Ｘが、酸素であり、
Ｒ1が、基−Ｒ2−Ｌ2または基Ｒ5であり、
Ｒ2およびＲ4が、互いに独立した、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキレン基であって、場合により
（ａ）一個以上の炭素原子が酸素によって、特に、全ての第３炭素原子が酸素によって置き換えられている、例えば、１〜１００個のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基である；
（ｂ）一個以上の炭素原子が、水素原子を有する窒素によって置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソによって置換されている、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を示す；
（ｃ）一個以上の炭素原子が酸素によって置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソによって置換されている、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を示す；
（ｄ）２個の隣接する炭素原子間の結合が二重または三重結合であり、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表す；
（ｅ）一個以上の炭素原子が、フェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、架橋ヘテロ芳香族、または架橋飽和もしくは不飽和ヘテロシクリル基によって置き換えられている；
（ｆ）２個の隣接する炭素原子が、ジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−によって置き換えられている；
または場合により置換基を含み、先の（ａ）〜（ｆ）下で定義したような２個以上、特に、２個もしくは３個のアルキレン基および／または修飾アルキレン基の組合せであり、
Ｒ3が、フェニル、０、１、２、３、もしくは４個の環窒素原子、０もしくは１個の酸素原子、および０もしくは１個の硫黄原子を含む、５環もしくは６環原子の非置換もしくは置換、単環式もしくは２環式ヘテロアリール基（但し、少なくとも１個の環炭素原子は、窒素、酸素、もしくは硫黄原子によって置き換えられている）、１−アルケニル、１−アルキニル、３〜７個の炭素原子を有する１−シクロヘキセニル、あるいは３〜１２個の原子と、窒素、酸素、硫黄から選択した１〜５個のヘテロ原子と、ヘテロシクリル基とメチレンＣＨ2を結合する位置にある二重結合を有する、場合により置換されている不飽和ヘテロシクリル基であり、
Ｒ5が、場合により置換されているフェニルメチルまたはナフチルメチル；場合により置換されているヘテロアリールメチル［ここで、ヘテロアリールは、０、１、２、３、もしくは４個の環窒素原子、０もしくは１個の酸素原子、および０もしくは１個の硫黄原子を含む単環式もしくは２環式ヘテロアリール基（但し、少なくとも１個の環炭素原子は、窒素、酸素、もしくは硫黄原子によって置き換えられている）であり、かつ５〜１２個の環原子を有する］；３〜７個の炭素原子を有する、場合により置換されているシクロアルキル；５〜７個の炭素原子を有する、場合により置換されているシクロアルケニル；３〜１２個の原子と、窒素、酸素、硫黄から選択した１〜５個のヘテロ原子とを有する、場合により置換されている飽和もしくは不飽和ヘテロシクリルであり、
Ｌ1が、分光プローブ、磁気プローブ、造影剤、パートナーに特異的に結合することができる特異的結合対の片方である分子、他の生体分子と相互に作用すると推測される分子、他の生体分子と相互に作用すると推測される分子ライブラリ、他の分子に架橋結合することができる分子、Ｈ2Ｏ2およびアスコルバートに曝露されるとヒドロキシルラジカルを発生することができる分子、光を照射すると反応性ラジカルを発生することができる分子、固体支持体に共有結合している分子、その相補鎖と塩基対を形成することができる核酸もしくはその誘導体、膜挿入特性を有する脂質もしくは他の疎水性分子、望ましい酵素的、化学的、もしくは物理的性を有する生体分子、Ｒ4とＡを結合して環状基質を形成する結合、およびさらに基−Ｒ3−ＣＨ2−Ｘ−Ａ−Ｒ1から選択される一つもしくは複数の同じもしくは異なる標識であり、かつ
Ｌ2が、分光プローブ、磁気プローブ、造影剤、パートナーに特異的に結合することができる特異的結合対の片方である分子、他の生体分子と相互に作用すると推測される分子、他の生体分子と相互に作用すると推測される分子ライブラリ、他の分子に架橋結合することができる分子、Ｈ2Ｏ2およびアスコルバートに曝露されるとヒドロキシルラジカルを発生することができる分子、光を照射すると反応性ラジカルを発生することができる分子、固体支持体に共有結合している分子、膜挿入特性を有する脂質もしくは他の疎水性分子、および望ましい酵素的、化学的、もしくは物理的性を有する生体分子から選択される一つもしくは複数の同じもしくは異なる標識である、
化合物。
【請求項３】
基Ｒ1−Ａが、式（２）
【化２】
2007526282.tif 000046
「式中、Ｒ6は、水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換アミノであり；Ｒ7およびＲ8の一方はＲ1であり他方は水素である］
のプリンラジカルである、請求項１に記載の式（１）の化合物。
【請求項４】
Ｘが酸素であり、Ｒ3がフェニルである、請求項３に記載の式（１）の化合物。
【請求項５】
Ｘが酸素であり、Ｒ3がチエニルである、請求項３に記載の式（１）の化合物。
【請求項６】
基Ｒ1−Ａが式（２）のプリンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ7がＲ1であり、Ｒ8が水素であり、Ｘが酸素である、請求項３に記載の式（１）の化合物。
【請求項７】
基Ｒ1−Ａが式（２）のプリンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ7が基−Ｒ2−Ｌ2であり、Ｒ8が水素であり、Ｘが酸素である、請求項３に記載の式（１）の化合物。
【請求項８】
Ｌ2が分光プローブである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｌ1およびＬ2が分光プローブである、請求項７に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｌ1およびＬ2が、蛍光ドナー／蛍光クエンチャー対を表す、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｌ1およびＬ2がＦＲＥＴ対を表す、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
基Ｒ1−Ａが式（２）のプリンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ7が基Ｒ5であり、Ｒ8が水素であり、Ｘが酸素である、請求項３に記載の式（１）の化合物。
【請求項１３】
Ｒ5がシクロペンチルである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
基Ｒ1−Ａが式（２）のプリンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ7が水素であり、Ｒ8がＲ1であり、Ｘが酸素である、請求項３に記載の式（１）の化合物。
【請求項１５】
基Ｒ1−Ａが式（２）のプリンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ7が水素であり、Ｒ8が基−Ｒ2−Ｌ2であり、Ｘが酸素である、請求項３に記載の式（１）の化合物。
【請求項１６】
Ｌ2が分光プローブである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｌ1およびＬ2が分光プローブである、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｌ1およびＬ2が、蛍光ドナー／蛍光クエンチャー対を表す、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｌ1およびＬ2がＦＲＥＴ対を表す、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｌ2が、特異的結合対の片方を表す分子である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２１】
Ｌ2が、固体支持体に共有結合している分子である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｌ2が、細胞膜輸送エンハンサ基である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項２３】
基Ｒ1−Ａが、式（３）
【化３】
2007526282.tif 000047
［式中、置換基Ｒ6は、水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換アミノである］
の８−アザプリンラジカルである、請求項１に記載の式（１）の化合物。
【請求項２４】
Ｘが酸素であり、Ｒ3がフェニルである、請求項２３に記載の式（１）の化合物。
【請求項２５】
基Ｒ1−Ａが、式（３）の８−アザプリンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ1が基−Ｒ2−Ｌ2であり、Ｘが酸素である、請求項２３に記載の式（１）の化合物。
【請求項２６】
Ｌ2が分光プローブである、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
Ｌ1およびＬ2が分光プローブである、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
Ｌ1およびＬ2が、蛍光ドナー／蛍光クエンチャー対を表す、請求項２７に記載の化合物。
【請求項２９】
Ｌ1およびＬ2がＦＲＥＴ対を表す、請求項２８に記載の化合物。
【請求項３０】
基Ｒ1−Ａが、式（４ａ）または（４ｂ）
【化４】
2007526282.tif 000048
［式中、Ｒ9は水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、またはアミノであり、かつＲ10は水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、アミノ、ニトロ、またはニトロソである］
のピリミジンラジカルである、請求項１に記載の式（１）の化合物。
【請求項３１】
Ｘが酸素であり、Ｒ3がフェニルである、請求項３０に記載の式（１）の化合物。
【請求項３２】
基Ｒ1−Ａが、式（４ａ）または（４ｂ）のピリミジンラジカルであり、Ｒ1が基−Ｒ2−Ｌ2であり、Ｘが酸素である、請求項３０に記載の式（１）の化合物。
【請求項３３】
Ｌ2が分光プローブである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｌ1およびＬ2が分光プローブである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｌ1およびＬ2が、蛍光ドナー／蛍光クエンチャー対を表す、請求項３４に記載の化合物。
【請求項３６】
Ｌ1およびＬ2がＦＲＥＴ対を表す、請求項３５に記載の化合物。
【請求項３７】
基Ｒ1−Ａが式（４ｃ）
【化５】
2007526282.tif 000049
［式中、Ｒ6は、非置換もしくは置換アミノであり、Ｒ7およびＲ8の一方はＲ1であり他方は水素である］
のプテリジンラジカルである、請求項１に記載の式（１）の化合物。
【請求項３８】
Ｘが酸素であり、Ｒ3がフェニルである、請求項３７に記載の式（１）の化合物。
【請求項３９】
基Ｒ1−Ａが式（４ｃ）のプテリジンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ7が水素であり、Ｒ8がＲ1であり、Ｒ1が基−Ｒ2−Ｌ2であり、Ｘが酸素である、請求項３７に記載の式（１）の化合物。
【請求項４０】
Ｌ2が分光プローブである、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
Ｌ1およびＬ2が分光プローブである、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４２】
Ｌ1およびＬ2が、蛍光ドナー／蛍光クエンチャー対を表す、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
Ｌ1およびＬ2がＦＲＥＴ対を表す、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
対象となる蛋白質を検出し、かつ／または操作する方法であって、対象となる蛋白質をＡＧＴ融合蛋白質中に組み込み、該ＡＧＴ融合蛋白質を、請求項１から３８のいずれか一項記載の式（１）の化合物に接触させ、標識を認識しかつ／または取り扱うために設計した系で標識Ｌ1を使用して該ＡＧＴ融合蛋白質を検出し、場合によりさらに操作する方法。
【請求項４５】
式（１）の化合物で、標識Ｌ2が固体支持体であり、かつ式（１）の化合物に接触させたＡＧＴ融合蛋白質を、ろ過、遠心分離、または磁気ビーズ分離によって式（１）の化合物から分離する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
式（１）の化合物で、２個の相互作用する分光プローブＬ1／Ｌ2の、標識Ｌ1が一構成要素であり、標識Ｌ2が他方の構成要素であり、ＡＧＴ融合蛋白質が蛍光によって検出される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
対象となる蛋白質を検出しかつ／または操作するための請求項４４に記載の方法であって、対象となる蛋白質を変異体ＡＧＴと融合し、変異体ＡＧＴ融合蛋白質を
（ａ）Ｒ1が基Ｒ5であり、変異体ＡＧＴによって認識されない式（１）の化合物、および
（ｂ）変異体ＡＧＴ融合蛋白質によって認識される式（１）の別の化合物、
の混合物に接触させ、そして標識を認識しかつ／または取り扱うために設計した系で標識を使用して、変異体ＡＧＴ融合蛋白質を検出し、場合によりさらに操作する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基質からＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に標識を移動させる方法、Ｏ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ融合蛋白質、およびそのような方法に適した新規な特異的基質に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレアなどの求電子試剤の変異原性および発癌性作用は、主としてＤＮＡのグアニンのＯ6−アルキル化によるものである。ＤＮＡアルキル化からそれ自体を守るために、哺乳動物および細菌は、これらの病変部を修復する蛋白質Ｏ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を保持している。ＡＧＴは、アルキル化したグアニンおよびグアニン誘導体のＯ6位からアルキル基を自身のシステインの一つであるメルカプト基に移動させ、不可逆的にアルキル化ＡＧＴを生じさせる。根底にある機序は、ＳＮ２型の求核反応であり、この反応によってメチル基のみならずベンジル基までも容易に移動する理由が説明される。腫瘍細胞でＡＧＴが過剰発現することは、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロマイド、ビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソウレアなどのアルキル化薬物に対する耐性の主たる理由であり、その結果、化学療法においてＡＧＴ阻害薬を感作物質として使用することが提案されきた（Peggら, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 51:167-223, 1995）。米国特許第５，６９１，３０７号は、ベンジル基に様々な置換基を有するＯ6−ベンジルグアニン、および腫瘍細胞でＡＧＴ濃度を枯渇させ、それによってアルキル化抗腫瘍薬物に対する応答性を増大するためのその使用について記載している。同様に、国際公開公報第９７／２０８４３号は、Ｏ6−ベンジル−およびＯ6−ヘテロアリールメチル−ピリミジン誘導体を表す、さらに別のＡＧＴ枯渇化合物を開示している。
【０００３】
ドイツ国特許第１９９０３８９５号は、ＡＧＴレベルを測定するためのアッセイを開示し、このアッセイはビオチン化されたＯ6−アルキルグアニン誘導体とＡＧＴの間の反応を頼りに、ＡＧＴをビオチン標識化する。これにより、順次、ストレプトアビジン被膜プレート上のＡＧＴを分離し、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイでＡＧＴを検出できるようにする。このアッセイは、腫瘍組織でＡＧＴ濃度をモニタリングすること、およびＡＧＴ阻害薬スクリーニングでの使用に向けて提案される。
【０００４】
国際公開公報第０１／８５２２１号は、ＡＧＴの検出に放射性標識したフルオロまたはヨード置換Ｏ6−ベンジルグアニンの使用およびＡＧＴレベルのモニタリングを提案している。
【０００５】
Damoiseaux ら, ChemBiochem. 4:285-287, 2001は、ＡＧＴ標識化の化学プローブとして使用し、再度、癌細胞におけるこの酵素のレベルの検出を容易にして研究および化学療法に役立てるために、オリゴデオキシリボヌクレオチドに組み込まれた改変Ｏ6−アルキル化グアニン誘導体を開示している。
【０００６】
国際公開公報第０２／０８３９３７号は、対象となる蛋白質を検出し、かつ／または操作する方法であって、蛋白質とＡＧＴを融合し、標識を有するＡＧＴ基質にＡＧＴ融合蛋白質を接触させ、そして標識を使用しＡＧＴ融合蛋白質を検出し、場合によりさらに操作する方法を開示した。使用する数種のＡＧＴ融合蛋白質、ＡＧＴ基質の一般構造原理、ならびに多種多様な標識、およびその方法で使用可能な標識を検出するための方法が記載されている。
【０００７】
ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８５９（国際公開公報第２００４／０３１４０４号）は、対象となる蛋白質を検出しかつ／または操作する上記の方法で使用される特定のＡＧＴ融合蛋白質、この方法によって得られる標識した融合蛋白質、および特定のＡＧＴ融合蛋白質の使用方法について記載している。
【０００８】
ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８８９（国際公開公報第２００４／０３１４０５号）は、対象となる蛋白質を検出しかつ／または操作する上記の方法に特に適した標識を有する追加のＡＧＴ基質、およびそのような特に標識した基質の適用を開示している。この特許出願はまた、これらの追加のＡＧＴ基質の製造方法について記載している。
【０００９】
発明の概要
本発明は、式（１）
【００１０】
【化６】
2007526282.tif 000003
【００１１】
［式中、Ａは基質としてＡＧＴによって認識される基であり；
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ1は、基−Ｒ2−Ｌ2または基Ｒ5であり；
Ｒ2およびＲ4は、互いに独立したリンカーであり；
Ｒ3は、芳香族基もしくは複素環式芳香族基；または場合により置換されている不飽和アルキル、シクロアルキル、もしくはＣＨ2に結合する二重結合を有するヘテロシクリル基であり；
Ｒ5は、アリールメチルもしくはヘテロアリールメチル、または場合により置換されているシクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはヘテロシクリル基であり；
Ｌ1は、１個の標識、複数の同じもしくは異なる標識、Ｒ4とＡを結合して環状基質を形成する結合、またはさらに基−Ｒ3−ＣＨ2−Ｘ−Ａ−Ｒ1であり；かつ
Ｌ2は、１個の標識、または複数の同じもしくは異なる標識である］
のＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）基質に関する。
【００１２】
本発明は、さらに、これらの基質からＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に標識を移動させる方法およびＡＧＴ融合蛋白質に関する。
【００１３】
本発明の詳細な説明
本発明の特定のＡＧＴ基質は、式（１）
【００１４】
【化７】
2007526282.tif 000004
【００１５】
［式中、
Ａは基質としてＡＧＴによって認識される基であり；
Ｘは、酸素または硫黄であり；
Ｒ1は、基−Ｒ2−Ｌ2または基Ｒ5であり；
Ｒ2およびＲ4は、互いに独立したリンカーであり；
Ｒ3は、芳香族基もしくは複素環式芳香族基；または場合により置換されている不飽和アルキル、シクロアルキル、もしくはＣＨ2に結合する二重結合も有するヘテロシクリル基であり；
Ｒ5は、アリールメチルもしくはヘテロアリールメチル、または場合により置換されているシクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはヘテロシクリル基であり；
Ｌ1は、１個の標識、複数の同じもしくは異なる標識、Ｒ4とＡを結合して環状基質を形成する結合、またはさらに基−Ｒ3−ＣＨ2−Ｘ−Ａ−Ｒ1であり；かつ
Ｌ2は、１個の標識、または複数の同じもしくは異なる標識である］
の化合物である。
【００１６】
基Ｒ1−Ａでは、残基Ａは、１〜５個の窒素原子を含み、基質としてＡＧＴによって認識される複素環式芳香族基であることが好ましい。
【００１７】
複素環式芳香族基Ａは、単環式もしくは２環式であり、５〜１２個の、好ましくは６個の、または９個もしくは１０個の環原子を有し；そしてこの基Ａは、置換基Ｒ1を有することに加えて、メチルなどの低級アルキル、メトキシやエトキシなどの低級アルコキシ、ヒドロキシ、オキソ、アミノ、低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、アシルアミノ、塩素や臭素などのハロゲン、トリフルオロメチルなどのハロゲン化した低級アルキル、カルボキシ、低級アルコキシカルボニル、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、または低級アルキルカルボニルからなる群から選択される一個以上の、特に１、２、もしくは３個のさらなる置換基によって置換されていなくても置換されていてもよい。
【００１８】
低級アルキルは、１〜７個の、好ましくは１〜４個のＣ原子を有するアルキルであり、直鎖もしくは分枝鎖であることが好ましく；低級アルキルはｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどのブチル、ｎ−プロピルやイソプロピルなどのプロピル、エチルまたはメチルが好ましい。低級アルキルはメチルが最も好ましい。
【００１９】
低級アルコキシでは、低級アルキル基は先に定義した通りである。低級アルコキシは、好ましくはｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、エトキシ、またはメトキシ、特にメトキシを示す。
【００２０】
好ましい単環式もしくは２環式複素環式芳香族基Ａは、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、インダゾリル、プリニル、８−アザプリニル、７−デアザプリニル、８−アザ−７−デアザプリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キノリニル、プテリジニル、インドリジニル、３Ｈ−インドリル、インドリル、イソインドリル、トリアゾリル、テトラゾリル、またはベンゾ［ｄ］ピラゾリルから選択される。より好ましくは、単環式もしくは２環式複素環式芳香族基Ａは、プリニル、８−アザプリニル、７−デアザプリニル、８−アザ−７−デアザプリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、およびトリアジニルからなる群から選択される。
【００２１】
例えば、基Ｒ1−Ａは、式（２）
【００２２】
【化８】
2007526282.tif 000005
【００２３】
「式中、Ｒ6は、水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換アミノであり、Ｒ7およびＲ8の一方はＲ1であり他方は水素である］のプリンラジカルでよい。
【００２４】
Ｒ6がヒドロキシである場合、プリンラジカルは主に互変異性体で存在し、ここで、それぞれ、Ｒ6を有する炭素原子に隣接する窒素は水素原子を有し、この窒素原子とＲ6を有する炭素原子の間の二重結合は単結合であり、そしてＲ6は二重結合酸素である。
【００２５】
置換されたアミノ基Ｒ6は、１〜４個の炭素原子の低級アルキルアミノまたはアシルアミノであり、ここで、アシル基は、１〜５個の炭素原子を有する低級アルキルカルボニル、例えばアセチル、プロピオニル、ｎ−もしくはｉｓｏ−プロピルカルボニル、またはｎ−、ｉｓｏ−、もしくはｔｅｒｔ−ブチルカルボニルもしくはアリ−ルカルボニルであり、例えばベンゾイルである。
【００２６】
Ｒ6が非置換もしくは置換アミノであり、プリンラジカルの結合に接続する残基Ｘが酸素である場合、式（２）の残基はグアニン誘導体である。
【００２７】
特に好ましいものは、基Ｒ1−Ａが式（２）のプリンラジカルであり、Ｒ6が非置換アミノであり、Ｒ7がＲ1であり、Ｒ8が水素であり、かつＸが酸素である化合物、すなわち、Ｎ9位にさらに置換基を有するグアニン誘導体である。
【００２８】
本発明の別の好ましい態様では、基Ｒ1−Ａが式（３）
【００２９】
【化９】
2007526282.tif 000006
【００３０】
［式中、置換基Ｒ6は、式（２）下でＲ6について定義した意味を有する］
の８−アザプリンラジカルである。
【００３１】
本発明のさらに好ましい態様では、基Ｒ1−Ａは、式（４ａ）または（４ｂ）
【００３２】
【化１０】
2007526282.tif 000007
【００３３】
［式中、Ｒ9は水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、またはアミノであり、アミノが好ましく、かつＲ10は水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、アミノ、ニトロ、またはニトロソである］のピリミジンラジカルである。ハロゲンＲ9またはＲ10は、例えばフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードである。
【００３４】
Ｘは、酸素であることが好ましい。
【００３５】
本発明のさらに好ましい態様では、基Ｒ1−Ａが式（４ｃ）
【００３６】
【化１１】
2007526282.tif 000008
【００３７】
［式中、Ｒ6は、非置換もしくは置換アミノであり、Ｒ7およびＲ8の一方はＲ1であり他方は水素である］
のプテリジンラジカルである。
【００３８】
リンカー基Ｒ2またはＲ4は、それぞれ、一個の標識Ｌ2またはＬ1、あるいは複数の同じもしくは異なる標識Ｌ2またはＬ1を基質に結合する柔軟なリンカーであることが好ましい。リンカー単位は、想定した適用と関連して、すなわち、ＡＧＴを含む融合蛋白質への基質の移動に際して選択される。リンカー単位はまた、適当な溶媒への基質溶解性も増大させる。使用するリンカーは、実際の適用条件下で化学的に安定している。リンカーは、ＡＧＴによる反応にも、標識Ｌ1および／またはＬ2の検出にも干渉しないが、例えば、式（１）の化合物とＡＧＴを含む融合蛋白質が反応した後のある時点で切断されるように構築しうる。
【００３９】
リンカーＲ2またはＲ4は、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキレン基であって、場合により
（ａ）一個以上の炭素原子が酸素によって、特に、全ての第３炭素原子が酸素によって置き換えられている、例えば、１〜１００個のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基である；
（ｂ）一個以上の炭素原子が、水素原子を有する窒素によって置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソによって置換されている、アミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−を示す；
（ｃ）一個以上の炭素原子が酸素によって置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソによって置換されている、エステル官能基−Ｏ−ＣＯ−を示す；
（ｄ）２個の隣接する炭素原子間の結合が二重または三重結合であり、官能基−ＣＨ＝ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表す；
（ｅ）一個以上の炭素原子が、フェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、架橋ヘテロ芳香族、または架橋飽和もしくは不飽和ヘテロシクリル基によって置き換えられている；
（ｆ）２個の隣接する炭素原子が、ジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−によって置き換えられている；
または場合により置換基を含み、先に（ａ）〜（ｆ）下で定義したような２個以上の、特に、２個もしくは３個のアルキレン基および／または修飾アルキレン基の組合せ
である。
【００４０】
考えられる置換基は、メチルなどの例えば低級アルキル、メトキシなどの低級アルコキシ、アセトキシなどの低級アシルオキシ、またはクロロなどのハロゲニルである。
【００４１】
考えられるさらなる置換基は、例えば、αアミノ酸、特に自然に存在するαアミノ酸がリンカーＲ2またはＲ4に組み込まれたときに得られる置換基であり、ここで、炭素原子は、（ｂ）下で定義したアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−によって置き換えられている。そのようなリンカーでは、アルキレン基Ｒ2またはＲ4の炭素鎖の一部が、基−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）ｎ−［式中、ｎは１〜１００であり、Ｒはαアミノ酸の様々な残基を表す］によって置き換えられている。
【００４２】
さらなる置換基は、光切断リンカーＲ2またはＲ4をもたらす置換基であり、例えばｏ−ニトロフェニル基である。特に、この置換基ｏ−ニトロフェニルは、アミド結合に隣接する炭素原子に位置し、例えば基−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−ＮＨ−ＣＯ−に位置し、またはポリエチレングリコール鎖中の、例えば、基−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−Ｏ−中の置換基として位置する。考えられる他の光切断リンカーは、例えば、フェナシル、アルコキシベンゾイン、ベンジルチオエーテル、ピバロイルグリコール誘導体である。
【００４３】
先に（ｅ）下で定義した炭素原子に置き換わるフェニレン基は、例えば、１，２−、１，３−、であり、１，４−フェニレンが好ましい。特定の態様では、フェニレン基はニトロ基によってさらに置換され、そして（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｆ）下で上記した他の置き換えと組み合わされて光切断基を表し、例えば−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2−４−ニトロ−１，３−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＯ−中の４−ニトロ−１，３−フェニレン、または例えば−ＣＨ2−Ｏ−２−メトキシ−５−ニトロ−１，４−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−中の２−メトキシ−５−ニトロ−１，４−フェニレンなどがある。光切断リンカーを表す他の特定の態様は、例えば、−１，４−フェニレン−ＣＯ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2−（フェナシル基）、−１，４−フェニレン−ＣＨ（ＯＲ）−ＣＯ−１，４−フェニレン−（アルコキシベンゾイン）、又は−３，５−ジメトキシ−１，４−フェニレン−ＣＨ2−Ｏ−（ジメトキシベンジル部分）である。先に（ｅ）下で定義した炭素原子に置き換わる飽和もしくは不飽和シクロアルキレン基は、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキルに由来し、シクロペンチルまたはシクロヘキシルに由来するのが好ましく、例えば、１，２−もしくは１，３−シクロペンチレン、１，２−、１，３−、好ましくは１，４−シクロヘキシレン、または例えば１位もしくは２位で不飽和である１，４−シクロヘキシレンがある。先に（ｅ）下で定義した炭素原子に置き換わる飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン基は、７もしくは８個の炭素原子を有するビシクロアルキルに由来し、例えば、ビシクロ［２．２．１］ヘプチレンやビシクロ［２．２．２］オクチレンであり、場合により、２位で不飽和であり、または２位と５位で二重に不飽和である１，４−ビシクロ［２．２．１］ヘプチレン、ならびに場合により、２位で不飽和であり、または２位と５位で二重に不飽和である１，４−ビシクロ［２．２．２］オクチレンが好ましい。先に（ｅ）下で定義した炭素原子に置き換わる架橋複素環式芳香族基は、例えばトリアゾリデン、好ましくは１，４−トリアゾリデン、またはイソオキサゾリデン、好ましくは３，５−イソオキサゾリデンである。先に（ｅ）下で定義した炭素原子に置き換わる架橋飽和もしくは不飽和ヘテロシクリル基は、例えば、先にＲ3下で定義した不飽和ヘテロシクリル基に由来し、例えばイソオキサゾリジネン、好ましくは３，５−イソオキサゾリジネン、または３〜１２個の原子を有し、その１〜３個が窒素、酸素、硫黄から選択したヘテロ原子である完全飽和ヘテロシクリル基、例えばピロリジンジイル、ピペリジンジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキサンジイル、モルホリンジイル、またはテトラヒドロチオフェンジイルであり、２，５−テトラヒドロフランジイル、または２，５−ジオキサンジイルが好ましい。考えられる特定のヘテロシクリル基は、糖類部分であり、例えばα−もしくはβ−フラノシル部分、またはα−もしくはβ−ピラノシル部分である。
【００４４】
リンカーＲ2またはＲ4の環状下部構造は、Ｒ2またはＲ4内で回転可能な結合数によって測定される分子柔軟性を減少させ、それによりインビボでの標識適用例全てにおいて重要である膜透過速度が上昇する。
【００４５】
リンカーＲ2またはＲ4は、それぞれ、−ＣＨ＝ＣＨ−基または−Ｃ≡Ｃ−基によって基ＡまたはＲ3に場合により結合している、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基、または４〜１００個のエチレンオキシ単位を有する直鎖ポリエチレングリコール基であることが好ましい。さらに好ましいものは、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基であり、ここで、炭素原子はアミド官能基−ＮＨ−ＣＯ−によって場合により置き換えられており、光切断サブユニット、例えば、ｏ−ニトロフェニルを有している。さらに好ましいものは、３〜６個のエチレングリコール単位であるポリエチレングリコール基と、炭素原子がアミド結合によって置き換えられているアルキレン基を含み、さらに置換されたアミノ官能基とヒドロキシ官能基を有する分枝リンカーである。他の好ましい分枝リンカーは、アミン、カルボキサミド、および／またはエーテル官能基がアルキレン基の炭素原子に置き換わっているデンドリティック（樹状）構造を有している。
【００４６】
特に好ましいリンカーＲ2またはＲ4は、１０〜４０個の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで、３〜１２個の炭素原子は酸素によって置き換えられ、１個もしくは２個の炭素原子は、それぞれ、１個もしくは２個の１，４−トリアゾリデン単位によって置き換えられ、かつ場合により１個の炭素原子は１，４−フェニレン単位によって置き換えられている。
【００４７】
別の特に好ましいリンカーＲ2またはＲ4は、オキソによって場合により置換されている、１０〜４０個の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで、３〜１２個の炭素原子は、酸素によって置き換えられ、１個もしくは２個の炭素原子は、窒素によって置き換えられている。
【００４８】
別の特に好ましいリンカーＲ2またはＲ4は、６〜４０個の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、ここで、２〜１２個の炭素原子は、酸素によって置き換えられ、２個の隣接する炭素原子間の１個もしくは２個の結合は官能基−ＣＨ＝ＣＨ−を表す二重結合である。
【００４９】
別の特に好ましいリンカーＲ2またはＲ4は、１〜１５個の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、Ｎ−メチルイソオキサゾリジン−３，５−ジメチル基である。
【００５０】
リンカーＲ2またはＲ4は、一個もしくは複数の同じもしくは異なる標識、例えば１〜１００個の同じもしくは異なる標識、特に１〜５個、好ましくは１、２、もしくは３個の、特に１個もしくは２個の同じもしくは異なる標識を有しうる。
【００５１】
芳香族基もしくは複素環式芳香族基としてＲ3、または場合により置換されている不飽和アルキル、シクロアルキル、もしくはヘテロシクリル基としてＲ3は、（その反応機序に従い）ＡＧＴによって立体的に、そして電子的に受け入れられる基であり、それによってＲ3−Ｒ4−Ｌ1単位は融合蛋白質に共有結合的に移動する。Ｒ3−Ｒ4−Ｌ1単位では、Ｒ4−Ｌ1は、複数の同じもしくは異なる標識Ｌ1を有する複数の同じもしくは異なるリンカーＲ4である意味を含みうる。
【００５２】
芳香族基としてＲ3は、フェニルまたはナフチル、特にフェニルが好ましく、例えばパラ位もしくはメタ位でＲ4によって置換されているフェニルである。
【００５３】
複素環式芳香族基Ｒ3は、０、１、２、３、もしくは４個の環窒素原子、０もしくは１個の酸素原子、および０もしくは１個の硫黄原子を含む単環式もしくは２環式ヘテロアリール基（但し、少なくとも１個の環炭素原子は、窒素、酸素、もしくは硫黄原子によって置き換えられている）であり、そして、５〜１２個の、好ましくは５または６個の環原子を有し；そして置換基Ｒ4を有することに加えて、置換されていなくても、あるいはメチルなどの低級アルキル、メトキシやエトキシなどの低級アルコキシ、例えば塩素、臭素、フッ素などのハロゲン、トリフルオロメチルなどのハロゲン化した低級アルキル、またはヒドロキシからなる群から選択される、一つ以上、特に一つの、さらなる置換基によって置換されていてもよい。
【００５４】
単環式もしくは２環式ヘテロアリール基Ｒ3は、２Ｈ−ピロリル、ピロリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ピラゾリル、インダゾリル、プリニル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、４Ｈ−キノリジニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリル、キナゾリニル、キノリニル、プテリジニル、インドリジニル、３Ｈ−インドリル、インドリル、イソインドリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、フラザニル、ベンゾ［ｄ］ピラゾリル、チエニル、およびフラニルから選択されることが好ましい。より好ましくは単環式もしくは２環式ヘテロアリール基は、ピロリル、１Ｈ−イミダゾール−１−イルなどのイミダゾリル、１−ベンゾイミダゾリルなどのベンゾイミダゾリル；インダゾリル、特に５−インダゾリル：例えば２−、３−、または４−ピリジルなどのピリジル；ピリミジニル、特に２−ピリミジニル；ピラジニル；イソキノリニル、特に３−イソキノリニル；キノリニル、特に４−、または８−キノリニル；インドリル、特に３−インドリル；チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ベンゾ［ｄ］ピラゾリル、チエニル、ならびにフラニルからなる群からを選択される。
【００５５】
特に好ましい本発明の態様では、ヘテロアリール基Ｒ3は、トリアゾリル、特に４位もしくは５位にさらに置換基Ｒ4を有する１−トリアゾリル；テトラゾリル、特に４位もしくは５位にさらに置換基Ｒ4を有する１−テトラゾリル、または５位にさらに置換基Ｒ4を有する２−テトラゾリル；イソオキサゾリル、特に５位にさらに置換基Ｒ4を有する３−イソオキサゾリル、または３位にさらに置換基Ｒ4を有する５−イソオキサゾリル；あるいはチエニル、特に３位、４位、もしくは５位、好ましくは４位にさらに置換基Ｒ4を有する２−チエニル、または４位にさらに置換基Ｒ4を有する３−チエニルである。
【００５６】
最も好ましいものは、４位もしくは５位に置換基Ｒ4を有するトリアゾリルとしてのヘテロアリール基Ｒ3であり、また４位もしくは５位に置換基Ｒ4を有する２−チエニルとしてのＲ3である。
【００５７】
場合により置換されている不飽和アルキル基Ｒ3は、１位もしくは２位に、好ましくは２位にさらに置換基Ｒ4を有する１−アルケニル；または１−アルキニルである。１−アルケニルで考慮される置換基は、例えば、メチルなどの低級アルキル、メトキシなどの低級アルコキシ、アセトキシなどの低級アシルオキシ、またはクロロなどのハロゲニルである。特に好ましい本発明の態様では、Ｒ3は１−アルキニルである。
【００５８】
場合により置換されている不飽和シクロアルキル基は、１位に不飽和で５〜７個の炭素原子を有するシクロアルケニル基であり、例えば任意の位置にさらに置換基Ｒ4を有する、１−シクロペンテニルまたは１−シクロヘキセニルである。考えられる置換基は、例えば、メチルなどの低級アルキル、メトキシなどの低級アルコキシ、アセトキシなどの低級アシルオキシ、またはクロロなどのハロゲニルである。
【００５９】
場合により置換されている不飽和ヘテロシクリル基は、３〜１２個の原子；窒素、酸素、硫黄から選択した１〜５個のヘテロ原子；およびヘテロシクリル基をメチレンＣＨ2に結合する位置にある二重結合を有する。考えられる置換基は、例えば、メチルなどの低級アルキル、メトキシなどの低級アルコキシ、アセトキシなどの低級アシルオキシ、またはクロロなどのハロゲニルである。
【００６０】
特に、場合により置換されている不飽和ヘテロシクリル基は、複素環式芳香族基Ｒ3について先に定義した部分的に飽和した複素環式芳香族基である。そのようなヘテロシクリル基の一例は、イソオキサゾリジニル、特に５位にさらに置換基を有する３−イソオキサゾリジニル、または３位にさらに置換基を有する５−イソオキサゾリジニルである。
【００６１】
アリールメチルを意味するＲ5では、アリールは、フェニルまたはナフチルであることが好ましく、特に、フェニルまたは置換されたフェニル、例えば、メチルやエチルなどの低級アルキル、メトキシなどの低級アルコキシ、フッ素や塩素などのハロゲン、アミノ、またはアシルアミノによってパラ位もしくはメタ位で置換されたフェニルである。
【００６２】
ヘテロアリールメチルを意味するＲ5では、ヘテロアリールは、０、１、２、３、もしくは４個の環窒素原子、０もしくは１個の酸素原子、および０もしくは１個の硫黄原子を含む単環式もしくは２環式ヘテロアリール基（但し、少なくとも１個の環炭素原子は、窒素、酸素、もしくは硫黄原子によって置き換えられている）であり、そして５〜１２個の、好ましくは５または６個の環原子を有し；そして置換されていなくても、あるいはメチルなどの低級アルキル、メトキシもしくはエトキシなどの低級アルコキシ、例えば塩素、臭素、フッ素などのハロゲン、トリフルオロメチルもしくはヒドロキシなどのハロゲン化した低級アルキルからなる群から選択される、一つもしくは複数の、特に一つの、さらなる置換基によって置換されていてもよい。ヘテロアリールメチルＲ5のヘテロアリールとして好ましいものは、ヘテロアリールＲ3下で好ましいものとして記載したヘテロアリール、例えばトリアゾリルや２−チエニルである。
【００６３】
場合により置換されているシクロアルキルとしてＲ5は、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル基であり、例えば、任意の位置に場合により置換基を有する、シクロプロピル、シクロペンチル、またはシクロヘキシルである。考えられる置換基は、例えば、メチルなどの低級アルキル、メトキシなどの低級アルコキシ、アセトキシなどの低級アシルオキシ、またはクロロなどのハロゲニルである。
【００６４】
場合により置換されているシクロアルケニルとしてＲ5は、任意の位置に、例えば１位に不飽和で５〜７個の炭素原子を有するシクロアルケニル基であり、例えば、任意の位置に場合により置換基を有する１−シクロペンテニルや１−シクロヘキセニルである。考えられる置換基は、シクロアルキルＲ5下で挙げた置換基である。
【００６５】
場合により置換されているヘテロシクリル基としてＲ5は、飽和もしくは不飽和であり、３〜１２個の原子、および窒素、酸素、硫黄から選択した１〜５個のヘテロ原子を有する。考えられる置換基は、例えば、メチルなどの低級アルキル、ビニルやアリルなどの低級アルケニル、アセチレニルなどのアルキニル、フェニルなどのアリール、トリフルオロメチルなどのハロ低級アルキル、ヒドロキシメチルなどのヒドロキシアルキル、ヒドロキシ、メトキシなどの低級アルコキシ、アセトキシなどの低級アシルオキシ、カルボキシ、カルバモイル、メトキシカルボニルなどの低級アルコキシカルボニル、アミノ、アセチルアミノなどのアシルアミノ、ニトロ、アジド、シアノ、低級アルキル−またはアミノ低級アルキル−スルフェニル、−スルフィニル、または−スルホニル、あるいはクロロなどのハロゲニルがある。好ましいヘテロシクリルは、例えば、２−テトラヒドロフラニルなどのテトラヒドロフラニルである。
【００６６】
先に定義したＲ5は、例えば、２−テトラヒドロフラニル中に１個以上のキラル中心を有し、野生型ｈＡＧＴによって唯一の鏡像異性体（またはジアステレオマー）を選択的に認識するかもしれない。
【００６７】
好ましいＲ5は、シクロペンチル、シクロヘキシル、ベンジル；ヒドロキシ置換したシクロペンチル、シクロヘキシル、もしくはベンジル；およびヒドロキシ、もしくはヒドロキシ低級アルキル置換したテトラヒドロフラニルである。
【００６８】
基質の標識Ｌ1およびＬ2は、融合蛋白質が意図される適用に依存して、当業者が選択することができる。標識は、例えば、標識Ｌ1を有する標識融合蛋白質を容易に検出し、または標識Ｌ1をその環境から分離するようなものであってよい。考えられる他の標識は、標識した融合蛋白質および／または基質環境において変化を感知し誘発することができる標識、あるいは基質の物理的および／または化学的特性によって融合蛋白質を操作することに役立つ標識で、融合蛋白質に特異的に導入されたものである。
【００６９】
標識Ｌ1およびＬ2の例には、フルオロフォアや発色団などの分光プローブ、磁気プローブ、造影剤；放射性に標識した分子；パートナーに特異的に結合することができる特異的結合対の片方である分子；他の生体分子と相互に作用すると推測される分子；他の生体分子と相互に作用すると推測される分子ライブラリ；他の分子に架橋結合ことができる分子；繋留した金属キレートなど、Ｈ2Ｏ2およびアスコルバートに曝露されるとヒドロキシルラジカルを発生することができる分子；マラカイトグリーンなど、光を照射すると反応性ラジカルを発生することができる分子；固体支持体に共有結合している分子であって、支持体がガラススライド、マイクロタイタープレート、または当業者に公知の任意のポリマーであってよい分子；その相補鎖と塩基対を形成することができる核酸もしくはその誘導体；膜挿入特性を有する脂質もしくは他の疎水性分子；望ましい酵素的、化学的、もしくは物理的性を有する生体分子；あるいは上で挙げた特性の任意の組合せを有する分子が含まれる。
【００７０】
さらに、標識Ｌ1およびＬ2は、結合させた分子が生細胞原形質膜を越えて移動するのを促進することが知られている正電荷の直鎖もしくは分枝鎖ポリマーである。これは、細胞膜透過性が低いか、そうでなければ実質的に生細胞の細胞膜不透過性である物質では特に重要である。細胞不透過性ＡＧＴ基質は、そのような基Ｌ1またはＬ2にコンジュゲートすることによって細胞膜透過性になる。そのような細胞膜輸送エンハンサ基Ｌ1およびＬ2には、例えば、６〜１５個のアルギニン残基を有するＤ−および／またはＬ−アルギニンの直鎖ポリ（アルギニン）、それぞれグアニジウム基を有する６〜１５個のサブ単位の直鎖ポリマー、その一部がグアニジウム基に結合する６〜５０サブユニットのオリゴマーもしくは短鎖ポリマー、および／またはＨＩＶ−ｔａｔ蛋白質配列、特にサブユニットＴａｔ４９−Ｔａｔ５７（一文字アミノ酸コードでＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）配列の一部が含まれる。ＡＧＴ基質は、先に定義したリンカーＲ2またはＲ4によってこのＬ1またはＬ2基に共有結合し、このリンカーは生細胞内側で不安定であるのが好ましく、例えば、細胞内エステル分解酵素によるエステル基Ｒ2もしくはＲ4の切断によって分解し、直接的に、またはエステル官能基の切断によって誘発されたさらに別の反応で、ＡＧＴ基質と、細胞膜透過性を亢進する単位Ｌ1およびＬ2を分離しうる。
【００７１】
好ましいものは、放射性標識分子を除く先に記載した標識Ｌ1およびＬ2である。本発明の範囲から除外されるものは、核酸を意味する標識Ｌ2である。標識Ｌ1として最も好ましいものは、分光プローブ、およびパートナーに特異的に結合することができる特異的結合対の片方である分子、いわゆる親和性標識である。標識Ｌ2として最も好ましいものは、パートナーに特異的に結合することができる特異的結合対の片方を表す分子、および固体支持体に共有結合している分子である。
【００７２】
標識Ｌ1またはＬ2が、フルオロフォア、発色団、磁気標識、放射性標識などである場合、検出は、その方法がインビトロもしくはインビボで使用されようが、標識に適合させた標準的手段によって行われる。Ｌ1がフルオロフォアである場合、その方法を緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の適用例と比較することができ、この緑色蛍光蛋白質は対象となる蛋白質に遺伝子的に融合され、生細胞において蛋白質研究を可能にするものである。標識Ｌ1およびＬ2の特定の例には、非線形光学特性を示すホウ素化合物もある。特に好ましいものは、２個の相互作用する分光プローブＬ1／Ｌ2の、Ｌ1が一構成要素であり、Ｌ2が他方の構成要素であって、ドナーとアクセプターが密接（１０nmの距離未満）している場合、動的または静的消光によって、エネルギーをドナーとアクセプター（クエンチャー）間で無放射に移動できるようにする標識である。そのような１対の標識Ｌ1／Ｌ2は、標識基質とＡＧＴ融合蛋白質の反応においてその分光学的特性を変化させる。そのような１対の標識Ｌ1／Ｌ2の一例は、以下にさらに詳細説明するＦＲＥＴ対である。
【００７３】
標識Ｌ1の特性に応じて、対象となる蛋白質とＡＧＴを含む融合蛋白質は、基質と反応すると固体支持体に結合しうる。ＡＧＴを含む融合蛋白質と反応する基質の標識Ｌ1は、予め固体支持体に結合させておいてよく、ＡＧＴと反応し始めたとき、あるいは続いて、すなわちＡＧＴに移動後、標識したＡＧＴ融合蛋白質を固体支持体に結合させるために使用しうる。あるいは、基質の標識Ｌ2は、固体支持体であっても、または固体支持体に結合してあっても、結合することもでき、この固体支持体によって、反応後に標識Ｌ1を有する標識融合蛋白質が基質残余部分から分離しＬ2を含むようになる。標識は、特異的結合対の一構成要素でよく、特異的結合対の他方の構成要素は、共有結合によって、または他の任意の手段によって固体支持体に結合し、または結合可能である。考えられる特異的結合対は、例えば、ビオチン、およびアビジンもしくはストレプトアビジンである。結合対のいずれかの構成要素は、基質の標識Ｌ1および／またはＬ2でよく、他方は固体支持体に結合されている。固体支持体へ好都合に結合できるようにする標識のさらに別の例には、例えば、マルトース結合蛋白質、糖蛋白、ＦＬＡＧタグ、あるいはそのような置換基と、固体支持体の表面上の相補的官能基の間の化学選択的反応を可能にする反応性置換基がある。反応性置換基および相補的官能基のそのような対の例には、例えば、アミド、アジドを形成するアミンおよび活性化したカルボキシ基；および１，３−双極子環化付加反応を起こすプロピオル酸誘導体；２個のアミド結合を生じる活性化したビスジカルボン酸誘導体型の付加されたニ官能基リンカー試薬と反応する、アミンおよび別のアミン官能基、あるいは当技術分野で公知の他の組合せがある。
【００７４】
好都合な固体支持体の例は、例えば、ガラススライドなどのガラス表面、マイクロタイタープレート、および適当なセンサー素子、特に機能性を付与したポリマー（例えばビーズ形）、化学的に改変した酸化物表面、例えば、二酸化ケイ素、タンタル五酸化物、もしくは二酸化チタン、または化学的に改変した金属表面、例えば金や銀表面などの貴金属表面である。次いで、不可逆的に結合させ、かつ／またはスポットしたＡＧＴ基質を使用してＡＧＴ融合蛋白質を空間的に離して、特に、固体支持体にスポットすることによって結合させ、蛋白質マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、または小分子のアレイを表してよい。
【００７５】
標識Ｌ1またはＬ2が、外部刺激への曝露によってヒドロキシルラジカルなどの反応性ラジカルを生成できる場合、生成したラジカルは次いでＡＧＴ融合蛋白質、およびＡＧＴ融合蛋白質に密接しているような蛋白質を不活化することができ、これらの蛋白質の役割を研究できるようになる。そのような標識の例には、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩に曝露されるとヒドロキシルラジカルを発生する繋留した金属キレート錯体、およびレーザー照射によってヒドロキシルラジカルを発生するマラカイトグリーンなどの発色団がある。ヒドロキシルラジカルを発生させるために、発色団およびレーザーを使用することもまた、クロモホア援助レーザー誘起不活化法（ＣＡＬＩ）として当技術分野で公知である。本発明では、標識Ｌ1としてマラカイトグリーンなどの発色団を有する基質でＡＧＴ融合蛋白質を標識し、続いてレーザー照射することによって、時間を制御し空間的に離して、標識したＡＧＴ融合蛋白質、およびＡＧＴ融合蛋白質と相互に作用するような蛋白質を失活させる。この方法は、インビボ、またはインビトロで適用することができる。さらに、ＡＧＴ融合蛋白質に密接する蛋白質は、特異的抗体による蛋白質フラグメントの検出、高解像度２Ｄ電気泳動ゲル上でそれらの蛋白質の消失、あるいは分離による切断した蛋白質フラグメントの同定、および質量分析やＮ末端分解による蛋白質配列決定などの配列決定技術によって同定することができる。
【００７６】
標識Ｌ1が、他の蛋白質、例えば、マレイミド、活性エステル、アジド、および当業者に公知の他のものなど、官能基を含む分子に架橋できる分子の場合、他の蛋白質と（インビボもしくはインビトロで）相互に作用するＡＧＴ融合蛋白質にそのような標識したＡＧＴ基質を接触させると、標識を介してＡＧＴ融合蛋白質とその相互作用する蛋白質の共有結合性架橋がもたらされる。これによりＡＧＴ融合蛋白質と相互に作用する蛋白質を同定できるようになる。光架橋用の標識Ｌ1（およびＬ2）は、例えば、ベンゾフェノンである。架橋の特殊な局面では、標識Ｌ1は、それ自体、ＡＧＴ融合蛋白質を二量体化するＡＧＴ基質の分子である。そのような二量体の化学構造は、対称（ホモ二量体）でも、非対称（ヘテロ二量体）でもよい。
【００７７】
考えられる他の標識Ｌ1は、例えば、フラーレン、中性子捕獲治療用ボラン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、例えば、自己アドレス指定（self-addressing）チップ用のもの、ペプチド核酸、および金属キレート、例えば、ＤＮＡに特異的に結合する白金キレートである。      
【００７８】
望ましい酵素的、化学的、もしくは物理的性を有する特定の生体分子はメトトレキサートである。メトトレキサートは、酵素、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）に強固に結合する阻害薬である。Ｌ1がメトトレキサートである式（１）の化合物は、いわゆる「二量体化化学誘導物質」（ＣＩＤ）の周知のクラスに属する。ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡを有する融合蛋白質ｈＡＧＴを使用し、Ｌ1がメトトレキサートである式（１）の化合物を有するｈＡＧＴ融合蛋白質のインビボ標識に転写活性化ドメインＢ４２を有するＤＨＦＲを加えることによって、ｈＡＧＴ−ＬｅｘＡ融合蛋白質とＤＨＦＲ−Ｂ４２融合蛋白質のカップリング（「二量体化」）が誘発され、ＬｅｘＡとＢ４２が空間的に近接し、続いて転写が刺激される。
【００７９】
基質が２個以上の標識を有する場合、これらの標識は、同一でもまたは異なってもよい。特定の好ましい組合せは、異なる２個の親和性標識、または１個の親和性標識と１個の発色団標識、特に、１個の親和性標識と１個のフルオロフォア標識、または１対の分光学的に相互作用する標識Ｌ1／Ｌ2、例えばＦＲＥＴ対である。
【００８０】
好ましいものは、Ｘが酸素である式（１）の化合物である。さらに好ましいものは、Ｘが酸素であり、Ｒ3がフェニルである化合物であり、特に、パラ置換フェニルもしくはチエニル、特に２，４−２置換チエニルである。
【００８１】
同様に好ましいものは、基Ｒ1−Ａが式（２）［式中、Ｒ6は、水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換アミノであり、非置換アミノが好ましく、Ｒ7およびＲ8の一方はＲ1であり他方は水素である］のプリンラジカルである式（１）の化合物である。Ｒ7がＲ1である場合、Ｒ1は基−Ｒ2−Ｌ2もしくは残基Ｒ5であってよい。特に好ましいものは、Ｒ8がＲ1であり、Ｒ1が基−Ｒ2−Ｌ2である化合物に対応する。Ｒ1が残基Ｒ5である場合、好ましいＲ5の意味はシクロペンチルである。
【００８２】
他の好ましい化合物は、基Ｒ1−Ａが
式（３）の８−アザプリンラジカル［式中、置換基Ｒ6は水素、ヒドロキシ、または非置換もしくは置換アミノであり、非置換アミノが好ましい］、
式（４ａ）または（４ｂ）のピリミジンラジカル［式中、Ｒ9は水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、またはアミノであり、かつＲ10は水素、ハロゲン、１〜４個の炭素原子を有する低級アルキル、アミノ、ニトロ、またはニトロソである］、および
式（４ｃ）プテリジンラジカル［式中、Ｒ6は、非置換もしくは置換アミノであり、非置換アミノが好ましく、かつＲ7およびＲ8の一方はＲ1であり他方は水素である。好ましくは、Ｒ7が水素であり、Ｒ8が基−Ｒ2−Ｌ2である］
である式（１）の化合物である。
【００８３】
好ましいものは、Ｌ2が分光プローブである化合物、特にＬ1およびＬ2が分光プローブである化合物、例えば、ＦＲＥＴ対を表す。同様に好ましいものは、Ｌ2が特異的結合対の片方を表す分子である化合物、Ｌ2が固体支持体に共有結合している分子である化合物、およびＬ2が細胞膜輸送エンハンサ基である化合物である。
【００８４】
最も好ましいものは、実施例の化合物である。
【００８５】
本発明は、さらに、対象となる蛋白質を検出し、かつ／または操作する方法であって、対象となる蛋白質をＡＧＴ融合蛋白質中に組み込み、該ＡＧＴ融合蛋白質を先に記載した標識を有する特定のＡＧＴ基質に接触させ、そして、標識を認識しかつ／または取り扱うために設計した系で標識を使用して、該ＡＧＴ融合蛋白質を検出し、場合によりさらに操作する方法に関する。
【００８６】
本発明の方法では、対象となる蛋白質またはペプチドをＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に融合する。対象となる蛋白質またはペプチドは、任意の長さでよく、どちらも二次、三次、または四次構造を有していても有していなくてもよく、かつ少なくとも１２アミノ酸〜２０００アミノ酸からなることが好ましい。そのような対象となる蛋白質またはペプチドの例には、例えば、酵素、ＤＮＡ結合蛋白質、転写調節蛋白質、膜蛋白質、核内受容体蛋白質、核移行シグナル蛋白質、蛋白質補因子、小モノマーＧＴＰ加水分解酵素、ＡＴＰ結合カセット蛋白質、細胞内構造蛋白質、特定の細胞区画に蛋白質を向かわせる配列を有する蛋白質、一般的に標識もしくは親和性タグとして使用される蛋白質、および前述の蛋白質ドメインもしくはサブドメインがある。対象となる蛋白質またはペプチドは、酵素によって、例えば、ＤＮＡ期に適当な制限酵素によって切断されうるリンカー、および／または蛋白質期に適当な酵素によって切断可能なリンカーを経てＡＧＴに融合されていることが好ましい。
【００８７】
Ｏ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）は、基質上に存在する標識をＡＧＴのシステイン残基の一つに移動し、融合蛋白質の一部を形成する特性を有する。好ましい態様では、ＡＧＴは、野生型ヒトＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、ｈＡＧＴ、またはその変異体、例えば、Juilleratら., Chem Biol 10:313-317, 2003もしくは後の実施例に記載されている変異体である。本発明で使用される変異体ＡＧＴは、一個以上のアミノ酸置換、欠失、または付加という点で野生型ｈＡＧＴと異なってよいが、依然として基質上に存在する標識を融合蛋白質のＡＧＴ部分に移動する特性を保持している。変異体ＡＧＴは、当業者に公知の蛋白質設計技術、例えば、飽和変異誘発、配列の任意の場所に変異を導入するためのエラープローン（error prone）ＰＣＲ、あるいは飽和変異誘発および／またはエラープローンＰＣＲ後に使用されるＤＮＡシャフリングを使用し生成されることが好ましいであろう。
【００８８】
対象となる蛋白質およびＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合蛋白質は、標識を有する特定の基質と接触させる。反応条件は、ＡＧＴが基質と反応し、基質の標識を移動させるように選択する。通常の条件は、ｐＨ７付近、室温、例えば、およそ２５℃の緩衝液である。しかし、ＡＧＴは様々な他の条件下でも反応し、ここに述べたような条件が本発明の範囲を制限することはないことは理解されよう。
【００８９】
反応速度は、基質の構造に非常に大きく依存する。本発明に記載した化合物は、反応性に違いがあり、これらの差は、異なるＯ6−アルキルグアニンＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）、例えば異なる種に由来する野生型ＡＧＴ、すなわち特に実施例で示す、野生型ＡＧＴの幾つかのアミノ酸が異なるアミノ酸によって置き換えられているＡＧＴ変異体と、本発明の化合物とを選択的に反応させるために使用しうる。
【００９０】
反応性の差は、例えば、式（１）｛式中、Ｘは酸素であり、Ｒ3はパラ置換フェニルであり、基Ｒ1−Ａは式（２）［式中、Ｒ6は非置換アミノであり、Ｒ7およびＲ8の一つは基−Ｒ2−Ｌ2であり、他方の一つは水素である］のプリンラジカルである｝の化合物に見られる。Ｒ7が水素であり、Ｒ8が基−Ｒ2−Ｌ2であるような化合物は、Ｒ7が基−Ｒ2−Ｌ2（例えば同じ基−Ｒ2−Ｌ2）でありＲ8が水素である、対応する化合物よりも少なくとも３倍迅速に反応し、さらにＲ7とＲ8が水素である化合物よりも迅速に反応する。
【００９１】
ＡＧＴは、その天然基質Ｏ6−アルキルグアニンＤＮＡからアルキル基をそのシステイン残基の一つへ不可逆的移動する。同様に、ＡＧＴは、本発明の基質が関連する位置にあるグアニン型Ｏ6置換基またはその対応する置換基をそのシステイン残基の一つに移動する。ＡＧＴのこの特性を本発明の方法に使用して、式（１）の化合物の残基ＣＨ2−Ｒ3−Ｒ4−に結合した標識Ｌ1をＡＧＴに移動する。
【００９２】
この基質の標識Ｌ1は、融合蛋白質を意図したその適用に依存して当業者が選択することができる。ＡＧＴを含む融合蛋白質を基質と接触させた後、標識Ｌ1を融合蛋白質に共有結合させる。次いで、移動した標識によって、標識したＡＧＴ融合蛋白質をさらに操作し、かつ／または検出する。標識Ｌ1は、複数の同じもしくは異なる標識からなってよい。基質が、一つを超える標識Ｌ1を含む場合、その対応する標識したＡＧＴ融合蛋白質は、標識した融合蛋白質をさらに操作し、かつ／または検出するための選択肢をさらに提供する標識を一つを超えてさらに含む。
【００９３】
特定の局面では、本発明は、標識Ｌ1をＡＧＴ融合蛋白質に移動させ、全ての未反応ＡＧＴ基質を除去するのに特に好都合な方法を提供する。Ｒ2を介して基質としてＡＧＴによって認識される複素環基Ａに結合された標識Ｌ2が、固体支持体を意味し、または固体支持体に結合可能な反応基、例えば、固体支持体に結合するパートナーに特異的に結合することができる特異的結合対の片方を意味する標識Ｌ2である場合、これは簡単に行われる。次いで、Ｌ1で標識されたＡＧＴ融合蛋白質を含む、固体支持体および蛋白質溶液は、例えば、ろ過によって、さらに別の操作をせずに容易に分離される。より具体的には、分子過剰な式（１）［式中、Ｒ1はＲ2−Ｌ2であり、Ｌ2は固体支持体または固体支持体に結合された基である］の基質をＡＧＴ融合蛋白質と反応させ、得られた標識Ｌ1を有する標識ＡＧＴ融合蛋白を固体支持体から分離するが、この固体支持体には反応した基質の残りの部分、すなわち残基Ｒ2−Ａが結合し、さらにこの固体支持体には式（１）の過剰な未反応基質が依然として結合している。他の点では、ＡＧＴ融合蛋白質は、基質と反応すると固体支持体から標識Ｌ1を離し、引き継ぎ、固体支持体に結合している全ての未反応標識Ｌ1はそのまま残される。
【００９４】
この特定の局面では、標識Ｌ1は、先に記載した任意の標識、例えば、分光プローブまたはフルオロフォアでよい。固体支持体すなわちＬ2、またはＬ2が結合する支持体は、任意の固体支持体、例えば、ビーズ（例えば磁気ビーズ）、ポリマー支持体、金属表面でよい。未反応基質から標識したＡＧＴ融合蛋白質を分離することは、固体支持体の特性に応じて、ろ過、遠心分離、または他の適当な方法によってよく、例えば、固体支持体が磁気ビーズの場合は磁場をかけてよい。
【００９５】
本発明の別の特定の局面では、ＡＧＴ融合蛋白質による反応において標識Ｌ1およびＬ2の空間的分離を利用する方法を提供する。本発明の特定の基質は、相互作用性分光学的標識として、例えば、一端（例えばＬ1）にドナー（レポーター）を、他端（Ｌ2）にアクセプター（クエンチャー）を共有結合標識し、逆も同様であるプロ蛍光プローブとして設計される。そのようなプローブでの消光は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、またはドナーアクセプター対が密接することによる静的消光により生じうることが一般的に知られている。ドナーとアクセプターは、そのスペクトルの重なりが最大になるように選択すべきである。蛍光エネルギー転移は、典型的には、２０〜１００Åまでの距離で生じる。
【００９６】
Ｌ1がドナー（レポーター）であり、Ｌ2がアクセプター（クエンチャー）であり、またはＬ1がクエンチャーであり、Ｌ2がレポーターである特定の本発明の方法では、ＡＧＴ融合蛋白質と基質の反応によって蛍光が変化する。二重に標識した基質内のリポーター−クエンチャー間距離が、ＡＧＴ融合蛋白質との反応によって変化し、レポーターとクエンチャーを空間的に分離し、それによって蛍光が出現する。それぞれ、標識Ｌ1またはＬ2として例えば赤外放射フルオロフォアを含む幅広い選択肢のレポーター基を使用してよく、唯一のフルオロフォア標識Ｌ1を有する基質と比較して、方法の感受性および特異性がかなり改善する。レポーターとクエンチャーを含む基質は、ＡＧＴ融合蛋白質と反応するまで暗いままであり、反応混合物が「点灯」されると、フルオロフォアの発光スイッチが入る。なぜならば、今度は、レポーター標識とクエンチャー標識が、空間的に分離されるからである。蛍光消光およびエネルギー転移は、２個の標識、消光した標識またはエネルギードナー標識の一つだけが発光することによって測定できる。エネルギー転移が生じ、エネルギー受容標識も蛍光である場合、アクセプター標識蛍光も測定することができる。これらの２個の相互作用性標識のドナー標識は、励起ランプの必要性を取り除き、アクセプターバックグラウンド蛍光を低減する化学発光ドナープローブから選択することができる。そのような二重標識した基質を使用する記載した特定の方法は、蛍光時間測定に基づく反応速度の定量に有用であり、インビボおよびインビトロで利用してよい。
【００９７】
インビトロでは、一般的に、ＡＧＴ融合蛋白質と本発明の基質の反応は、細胞抽出物中で、またはＡＧＴ融合蛋白質の精製体もしくは濃縮体を用いて実施することができる。
【００９８】
本発明の基質を用いる実験をインビボでまたは細胞抽出物中で行う場合、宿主の内在性ＡＧＴの反応が有利に考慮される。宿主の内在性ＡＧＴが、Ｏ6−アルキルグアニン誘導体、または基質として関連する化合物を受け入れない場合、（外来性）ＡＧＴ融合蛋白質の反応は特異的である。ヒト、マウス、ラット細胞などの哺乳動物細胞中で内在性ＡＧＴを用いた非特異的反応が可能である。内在性ＡＧＴと（外来性）ＡＧＴ融合蛋白質の同時反応に問題があるような実験では、公知のＡＧＴ欠乏細胞系を使用することができる。
【００９９】
記載した特定の本発明の態様では、レポーターとクエンチャーを有する二重に標識した基質によって、インビトロもしくはインビボでＡＧＴ融合蛋白質の濃度を定量できるようになる。インビボでの適用については、レポーターは、近赤外（ＮＩＲ）領域のエミッターであることが好ましい。この領域が生物蛍光に干渉しないからである。これらの要件に合致する公知のシアニンＮＩＲ色素を本発明の基質に組み込むことが好ましい。
【０１００】
適当なレポーターとクエンチャー対は、当業者が選択することができる。典型的には、レポーターとクエンチャーは、スペクトルが大きく重なる蛍光色素であり、例えば、レポーターとしてフルオレセイン、およびクエンチャーとしてローダミンである。他のクエンチャーは、金クラスタや金属クリプテートである。
【０１０１】
本発明で使用される第２クラスのクエンチャーは、「ダーククエンチャー」（Johnasson, M. K.ら, Chem. Eur. J. 9:3466-3471, 2003）であり、すなわち、天然蛍光を持たず、一般的なレポーター色素の発光スペクトルと重複し、最大のＦＲＥＴ消光をもたらす吸収スペクトルを有する色素である。一般的なレポーター色素の発光スペクトルと重複し最大のＦＲＥＴ消光をもたらす吸収スペクトルを有する天然蛍光を持たない色素である。ずさらに、基底状態の複合体内で共鳴双極子−双極子相互作用機序（静的消光）を促進するために、その吸収帯が重なるように色素対を選択することができる。
【０１０２】
考えられる特定のフルオロフォアおよびクエンチャーは以下のものである。Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、Ａｌｅｘａ６３５、Ａｌｅｘａ６４７を含むＡｌｅｘａ色素（PanchukVoloshina, N.ら, J. Histochem. & Cytochem. 47:1179-1188, 1999）、ジメチルアミノクマリン（７−ジメチルアミノクマリン−４−酢酸スクシンイミジルエステル、Moelcular Probes社製、商品名Ｄ３７４）、クエンチャーＱＳＹ３５、ＱＳＹ９、およびＱＳＹ２１（Molecular Probes社製、Eugene OR ９７４０２、米国）、シアニン−３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、およびシアニン５．５（Ｃｙ５．５）（Amersham - GE Healthcare, Solingen, Germany）；ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、およびＢＨＱ−３（Biosearch Technologies, Inc.のBlack Hole Quencher（商標）, Novato, CA 94949, USA）、フルオロフォアＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ６００、およびＡＴＴＯ６５５、およびクエンチャーＡＴＴＯ５４０Ｑ、およびＡＴＴＯ６１２Ｑ（Atto-Tec,  D57076 Siegen, Germany）、フルオロフォアＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、ＤＹ−６３２、およびＤＹ−６４７（Dyomics, Jena, Germany）、５／６−カルボキシフルオレセイン、テトラメチルローダミン、４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４'−スルホニル誘導体（Ｄａｂｃｙｌ）、および４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４'−カルボニル誘導体（Ｄａｂｃｙｌ）。これらは、以下の組合せで有利に併用される。
フルオロフォア                              クエンチャー
・Ａｌｅｘａ３５０、ジメチルアミノクマリン・Ｄａｂsｙｌ、Ｄａｂｃｙｌ
５／６−カルボキシ−フルオレセイン、        ＢＨＱ１、ＱＳＹ３５
Ａｌｅｘａ４８８、ＡＴＴＯ４８８、
ＤＹ−５０５
・５／６−カルボキシフルオレセイン、      ・ＢＨＱ２、ＱＳＹ９、
Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、      ＡＴＴＯ５４０Ｑ
Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５５５、
ＡＴＴＯ４８８、ＡＴＴＯ５３２、
テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、
ＤＹ−５０５、ＤＹ−５４７、
・Ａｌｅｘａ６３５、Ａｌｅｘａ６４７、    ・ＢＨＱ３、ＡＴＴＯ６１２Ｑ、
ＡＴＴＯ６００、ＡＴＴＯ６５５、          ＱＳＹ２１
ＤＹ−６３２、Ｃｙ５、ＤＹ−６４７
Ｃｙ５．５    
【０１０３】
特定の態様では、この方法には、Ｌ2が固体支持体であり、もしくはレポーター／クエンチャー対の一構成要素をさらに有する固体支持体に結合しており、またはＬ2が固体支持体とレポーター／クエンチャー対の一構成要素の組合せであり、かつＬ1がこの対の他方の構成要素である基質が関与する。このように、ＡＧＴ基質であるダーク固体支持体は、ＡＧＴ融合蛋白質と反応すると蛍光性になる。
【０１０４】
レポーター／クエンチャー対、例えば、ＦＲＥＴ対に基づく蛍光の定量が関与する記載の特定の方法は、相当の蛋白質調製物、および非特異的シグナルを除去するための条件操作を必要とする、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングなどに基づく濃度または反応速度を測定用の他の方法よりもはるかに好都合である。エネルギー移動法は、反応および未反応のＡＧＴ基質を分離する必要がない。従って、この方法は、化合物ライブラリの高処理スクリーニング、活性ＡＧＴ変異体の同定、またはＡＧＴ阻害薬の同定に特に好都合である。
【０１０５】
さらに別の特定の本発明の方法では、Ｒ1が、基Ｒ5、特に、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルメチル、アリールメチル、またはヘテロアリールメチル基である基質を使用する。好ましい基Ｒ5の例は、シクロペンチルおよびベンジルである。ＡＧＴ融合蛋白質では、変異体ＡＧＴは融合パートナーとして選択され、このパートナーは、Ｒ5が記載した特定の、または好ましい置換基の一つである基質に対して反応性が低い。そのような特定の対象となる蛋白質を検出しかつ／または操作する方法では、対象となる蛋白質は、変異体ＡＧＴと融合され、変異体ＡＧＴ融合蛋白質を（ａ）基質であって、Ｒ1は基Ｒ5であり、変異体ＡＧＴによって認識されない基質、および（ｂ）別のＡＧＴ基質であって、変異体ＡＧＴ融合蛋白質によって認識され、先に記載した標識を有する基質の混合物に接触させ、標識を認識しかつ／または取り扱うために設計した系で標識を使用し、変異体ＡＧＴ融合蛋白質を検出し、場合によりさらに操作する。そのような方法は、反応が内在性ＡＧＴを含む系においてインビボで実施され、または内在性ＡＧＴを含む細胞抽出物中で実施される場合の選択方法である。内在性ＡＧＴが飽和し、必要な場合は、Ｒ1が基Ｒ5である本発明の基質の標識Ｌ1を使用し分離する。並列反応では、変異体ＡＧＴ融合蛋白質は、先に記載した一つの標識もしくは複数の標識を有する別のＡＧＴ基質と反応し、適宜検出し、かつ／または操作する。
【０１０６】
製造方法
本発明の基質は、一般的に、当技術分野で公知の標準的方法によって調製される。特定の方法は、例えば、特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／１０８８９に説明される。式（２）の基質、すなわち、Ａがプリン物質である化合物の合成では、公知の方法を使用してＯ6、Ｃ8、およびＮ9の位置を改変することができる。本発明は、以下に記載する新規な方法、および使用し得られた新規な中間体にも関する。
【０１０７】
特に、複数の標識（例えばＬ1およびＬ2）を有するＡＧＴ基質の好ましい合成は、直交的に保護された官能基を利用する。保護基をそのように選択することによって、脱保護の分離が可能になり、その結果、各遊離された官能基を順次さらに化学的に操作して、標識をそれに結合させ、あるいはリンカーＲ2および／またはＲ4のそれ以上の伸展を導入することができる。想定される官能基に適した保護基は、当業者が選択することができ、例えば、T.W. GreeneおよびP.G.M. Wuts in "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York 1991に要約されている。
【０１０８】
グアニン誘導体の調製には、アンモニウム塩中間体を介した対応する６−クロログアニン誘導体と、三級アミン例えばメチルピロリジンとの反応に、基−ＣＨ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｌ1もしくはその前駆体を導入する。アルコラート−Ｏ−ＣＨ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｌ1もしくはその前駆体によりアンモニウム基を置き換えることによって、塩素を直接置き換えるのに比べて全体収量が多くなり、アンモニウム塩との反応を室温で実施することができる。
【０１０９】
式（２）のグアニンのＮ9位への基Ｒ1の導入は、ハロゲン誘導体Ｒ1−Ｈａｌを使用するＳＮ2反応による直接アルキル化によって実施しうる。しかし、位置選択性は、一般的に不十分であり、Ｎ7およびＮ9のアルキル化したグアニン生成混合物が得られる。アルキル化した生成物のＮ9／Ｎ7割合は、ＬｉＨで前処置し、またはＮ9置換に好都合な高温で得られた生成物を平衡化ことによってイミダゾール環を活性化すると高くなる。式（５）の好都合な中間体の調製をスキーム１に示す。
【０１１０】
【化１２】
2007526282.tif 000009
【０１１１】
式（５）の中間体は、Ｎ9のリンカーおよびＯ6位のベンジル官能基で直交的に保護されている。次いで、この中間体をさらに操作して残基−Ｒ4−Ｌ1をＯ6のベンジル官能基で、残基−Ｒ2−Ｌ2をＮ9位で完成させてよい。あるいはMitsunobuの条件（アルコール誘導体Ｒ1−ＯＨ、トリフェニルホスフィン、ジエチルアゾジカルボキシラート）を、Ｎ9位に置換基Ｒ1（すなわちＲ5、または−Ｒ2−Ｌ2）を導入するために使用してよい。
【０１１２】
中間体（５）に密接に関係するが、Ｎ9位にアジドプロピル基を有する化合物の合成を実施例８〜１０の実験パートに例示する。
【０１１３】
【化１３】
2007526282.tif 000010
【０１１４】
スキーム２は、Ｎ9位に置換基を位置選択的に導入する閉環反応を示す。式（６）の中間体は、既に、標識Ｌ1を含み、アジド官能基を手直しすることによって適当な標識Ｌ2を導入できるようになる。
【０１１５】
トリフェニルホスフィンによって式（６）の化合物のアジド官能基を還元し、ＱＳＹ−９−ＮＨＳ（Molecular Probes）によってアシル化すると、式（７）［式中、Ｌ1（カルボキシ−フルオレセイン）およびＬ2（ＱＳＹ−９）は、ＦＲＥＴ対（スキーム３）を表す］のプロ蛍光ＡＧＴ基質が得られる。
【０１１６】
【化１４】
2007526282.tif 000011
【０１１７】
標識Ｌ1およびＬ2を、それぞれ、Ｏ6位およびＮ9位に有し、ＦＲＥＴ対を表す、さらに別の（７）型化合物を以下の実施例１４、１５、および１９に記載する。
【０１１８】
Ｎ9の位置選択的アルキル化の別の方法は、スキーム４に示すパラジウム触媒アリル位アルキル化である。
【０１１９】
リンカー部分Ｒ2のレベルで構造を手直しするために、適当な官能性を持たせたホモ−Ｎ，Ｏ−ヌクレオシドの合成も同様にスキーム４に示すが、このヌクレオシドのグアノシンの糖部分はイソオキサゾリジン環によって置き換えられている（ＴＢＤＰＳ＝ｔｅｒｔ−ブチル−ジフェニル−シリル）。そのような手直しによって、一般的ヌクレオシドの比較的反応性アミン結合と比較して加水分解切断または酵素切断への耐性の増大、および高次構造の柔軟性の上昇が導入される。反応配列は可変であり、アリル二重結合に異なる適当な官能性を持たせたニトロンを結合できるようになる。
【０１２０】
あるいは、水素化ホウ素試薬９−ボラビシクロ［３．３．１］ノナン（９−ＢＢＮ）によって、Ｎ9のアリル基を一級ヒドロキシ官能基に転換し、次いで適当な基Ｒ5または−Ｒ2−Ｌ2を得るためにさらに操作するすることができる。
【０１２１】
【化１５】
2007526282.tif 000012
【０１２２】
【化１６】
2007526282.tif 000013
【０１２３】
Ｌ1がフルオロフォア（Ａｌｅｘａ５９４、Molecular Probes）であり、Ｌ2が固体支持体（例えばビーズＢ、またはアビジンもしくはストレプトアビジンを有するビーズに結合可能なビオチン残基Ｂ）である、式（９）の本発明の基質の合成をスキーム５に要約する。
【０１２４】
異なる２種の標識がプリン塩基のＯ6位およびＣ8位に結合している式（１）の化合物の合成に使用可能な中間体の合成をスキーム６および７に要約する。
【０１２５】
【化１７】
2007526282.tif 000014
【０１２６】
【化１８】
2007526282.tif 000015
【０１２７】
式（１１）の化合物の代替合成法を実施例２０〜２３に例示する。この代替合成法では、ｐ−（トリフルオロアセトアミドメチル）ベンジル置換基は初期に導入される。次いで、二重に保護された式（１１）の化合物は、標識Ｌ1およびＬ2を、それぞれ、Ｏ6位およびＣ8に有する化合物、例えば、実施例２４〜４２に記載されている化合物にさらに作り上げることができる。
【０１２８】
Ｒ1−Ａが式（４ａ）のピリミジン残基であり、Ｒ9がアミノであり、Ｒ10がニトロソである式（１）の化合物の調製については、スキーム８または９に示す反応順序を実施する。４−クロロ−２，６−ジアミノピリミジンを適当なナトリウムアルコキシドと反応させ、次いで亜硝酸ナトリウムの３０%酢酸溶液で処理してニトロソ官能基を導入する。Ｎ6−置換誘導体は、適当な無水物または塩化アシルで処理することによって調製される。
【０１２９】
【化１９】
2007526282.tif 000016
【０１３０】
化合物（１２）の直前の前駆体２，６−ジアミノ−５−ニトロソピリミジンをその対応する２，５，６−トリアミノピリミジンに還元する場合、式（４ｃ）のプテリジンはジヒドロキシアセトンによる縮合、および実施例４３〜４６に記載した側鎖をさらに作成することによって得られる。
【０１３１】
【化２０】
2007526282.tif 000017
【０１３２】
Ｎ6位へのアミノアルキル置換基の導入をスキーム９に示す。１１−アジド−３，６，９−トリオキサ−ウンデカ−アミンと２，４，６−トリクロロピリミジンの反応によって、クロマトグラフィーによって分離することができる２，６−二置換生成物と共に、６−置換クロロピリミジンが得られる。マスクをかけたアンモニア同等物として、２位をビス−ｐ−メトキシ−ベンジルアミン（ＰＭＢ）で置換することによって２置換ピリミジンが生じ、この２置換ピリミジンは、続いて、適当なアルコキシドとの反応によりＯ4誘導体へ転換される。６０℃でトリフルオロ酢酸により脱保護すると２−アミノピリミジンが遊離される。５−ニトロソ化合物は、酢酸に含まれる亜硝酸ナトリウムによって調製される。
【０１３３】
実施例
略語：
ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ＝ジチオトレイトール
ｅｑｕｉｖ．＝当量
ＭＰＬＣ＝中圧液体クロマトグラフィー
ｓａｔ．＝飽和
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィー
【実施例１】
【０１３４】
（４−ブロモチオフェン−２−イル）−メタノール（１４）
【０１３５】
ＮａＢＨ4（１．１１g、２９．３１mmol）を４−ブロモチオフェン−２−カルボアルデヒド（５g、２６．１７mmol）を含むイソプロパノール（７０mL）溶液に加える。反応混合物を室温で２時間攪拌する。ＮＨ4Ｃｌ（１５mL）の飽和水溶液を溶液に加える。懸濁液をろ過し、ろ液を減圧濃縮し、ＣＨ2Ｃｌ2（７０mL）に溶解し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、再度減圧濃縮する。残留物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル１：１０）により精製する。収量４．５５g（２３．５５mmol、９０%）。ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７５（酢酸エチル／石油エーテル１：１）。
【０１３６】
【表１】
2007526282.tif 000018
【実施例２】
【０１３７】
２−シクロペンテニルメチルカルボナート（１５）
【０１３８】
シクロペンタ−２−エン−１−オール（１．０g、１１．９mmol、J.-L. Luche, J. Am. Chem. Soc., 1978, 100:7, 2226-2227）を含むＣＨ2Ｃｌ2（３０mL）およびピリジン（１０mL）の０℃の攪拌溶液にクロロぎ酸メチル（２．９４mL、３８mmol）を３０分かけて滴下する。４時間後、ＴＬＣは完全反応を示し、反応混合物を飽和ＮＨ4Ｃｌ（５０mL）に注ぎ、Ｅｔ2Ｏ（３×５０mL）で抽出する。有機相を洗浄液が酸性になるまで１M  ＨＣｌで洗浄し、水洗（５０mL）し、塩水（５０mL）洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル１：１００）によって精製する。収量１．７７７g（１２．５mmol、５３%）。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．７０（酢酸エチル／石油エーテル１：１２）。
【０１３９】
【表２】
2007526282.tif 000019
【実施例３】
【０１４０】
Ｎ9−（シクロペンタ−２−エニル）−６−クロログアニン（１６）
【０１４１】
この反応は、無水条件下（アルゴン雰囲気下、かつ溶媒は分子篩にかける）で実施する。６−クロログアニン（５９６mg、３．５２mmol）を含むＤＭＳＯ（１０mL）溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ3）4（４０４mg、０．３５mmol）を加え、続いて２−シクロペンテニルメチルカルボナート（１３）（５００mg、３．５２mmol）を含むＴＨＦ（１０mL）溶液を加える。反応混合物を室温で１時間攪拌する。それをＨ2Ｏ（６０mL）に注ぎ、酢酸エチル（３×５０mL）で抽出する。混合有機層を塩水（６０mL）で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧濃縮する。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル６  ４）によって精製する。収量：３８１mg（１．６２mmol、６１%）。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３３（酢酸エチル／石油エーテル６：４）。
【０１４２】
【表３】
2007526282.tif 000020
【実施例４】
【０１４３】
Ｎ9−シクロペンチル−６−クロログアニン（１７）
【０１４４】
パラジウム担持活性炭（１００mg）をＮ9−（シクロペンタ−２−エニル）−６−クロログアニン（１６）（２００mg、０．８５mmol）を含むメタノール（３３mL）溶液に加える。水素ガスを３０分間溶液に通す。粗生成物をシリカ（５００mg）に吸着させ、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル１：４、３：７、および２：３）によって精製する。収量：１１１mg（０．４７mmol、５５%）。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．３４（酢酸エチル／石油エーテル１：１）。
【０１４５】
【表４】
2007526282.tif 000021
【０１４６】
または、臭化シクロペンチル（２００mg、１．３４mmol）を６−クロログアニンを含むジメチルアセトアミド懸濁液に加え、続いてＮａＯＭｅ（１４４mg、２．６７mmol）を加える。溶液を１００℃で終夜攪拌する。溶媒を減圧蒸発させる。残留物をシリカ（１g）に吸着させ、フラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル１：１）によって精製する。収量：１４０mg（０．５９mmol、４４%）。
【実施例５】
【０１４７】
Ｎ9−シクロペンチル−Ｏ6−（４−ブロモチオフェン−２−イル）−グアニン（ＣＰＴＧ、１８）
【０１４８】
Ｎ9−シクロペンチル−６−クロログアニン（１７、５０mg、０．２１mmol）を含むＤＭＦ（１．３mL）溶液に１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ、７１mg、０．６３mmol）を加える。反応混合物を室温で３時間攪拌する。ＴＬＣは、完全反応を示す。次いで、（４−ブロモチオフェン−２−イル）−メタノール（１４、４９mg、０．２５mmol）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）（９６mg、０．０９４mL、０．６３mmol）を含むＤＭＦ（０．７mL）溶液を反応混合物に加える。溶液を終夜室温で攪拌する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーによって精製する（酢酸エチル／石油エーテル１：９→３：７）。収量２５mg（０．０６３mmol、３０%）。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２３（酢酸エチル／石油エーテル１：１）。
【０１４９】
【表５】
2007526282.tif 000022
【実施例６】
【０１５０】
Ｎ9−ベンジル−６−クロログアニン（１９）
【０１５１】
フラスコに６−クロログアニン、ＰＰｈ3、およびベンジルアルコールを装入する。混合物を３時間減圧乾燥し、続いて活性化分子篩（４Å）を加えた無水ＴＨＦに溶解する。１５分間攪拌した後、ジイソプロピルアゾジカルボキシラート（ＤＩＡＤ）を加える。反応を終夜攪拌する。溶媒を減圧下で除去し、生成物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル３：１）によって精製する。
【０１５２】
【表６】
2007526282.tif 000023
【実施例７】
【０１５３】
Ｎ9−ベンジル−Ｏ6−（４−ブロモチオフェン−２−イル）−グアニン（２０）
【０１５４】
Ｎ9−ベンジル−６−クロログアニン（１９、５０mg、０．１９mmol）を含むＤＭＦ（１．５mL）溶液に、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（ＤＡＢＣＯ、６５mg、０．５７mmol）を加える。反応混合物を室温で３時間攪拌する。ＴＬＣは、完全反応を示す。次いで、（４−ブロモ−チオフェン−２−イル）−メタノール（１４，４４mg、０．２３mmol）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）（８８mg、０．０８６mL、０．５７mmol）を含むＤＭＦ（０．７mL）溶液を反応混合物に加える。溶液を終夜室温で攪拌する。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル１：４→３：７）によって精製する。収量２７mg（０．０６５mmol、３４%）。ＴＬＣ  Ｒｆ＝０．２０（酢酸エチル／石油エーテル１：１）。
【０１５５】
【表７】
2007526282.tif 000024
【実施例８】
【０１５６】
Ｎ9−（３−クロロプロピル）−２−アミノ−６−クロルプリン（２１）
【０１５７】
６−クロロプリン（５．０g、２９．４８mmol）、およびＫ2ＣＯ3（４．４８g、３２．４２mmol）を含む無水ＤＭＦの攪拌懸濁液に、１−ブロモ−３−クロロプロパン（１３．９２g、８８．４５mmol）を加える。反応混合物を５０℃で１分間加熱し、室温でさらに３時間攪拌する。反応混合物を１２０mLの水に注ぎ、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出する。混合有機相を水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧蒸発させる。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール５０：１〜１０：１）によって精製すると、２．６g（１０．６５mmol、３５%）の表題化合物が無色固体として得られる。
【０１５８】
【表８】
2007526282.tif 000025
【実施例９】
【０１５９】
Ｎ9−（３−アジドプロピル）−２−アミノ−６−クロルプリン（２２）
【０１６０】
Ｎ9−（３−クロロプロピル）−２−アミノ−６−クロルプリン（２１、２．５６g、１０．４０mmol）、およびアジ化ナトリウム（８１１mg、１２．４８mmol）を２５mLのＤＭＳＯに溶解し、８０℃で１６時間攪拌する。室温に冷却後、反応混合物を１５０mLの水に注ぎ、ＣＨ2Ｃｌ2で抽出する。混合有機相を水洗し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、減圧蒸発させる。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール５０：１〜１０：１）によって精製すると表題化合物が無色固体（６５０mg、２，５７mmol、２４%）として得られる。
【０１６１】
【表９】
2007526282.tif 000026
【実施例１０】
【０１６２】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−アジドプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（２３）
【０１６３】
【化２１】
2007526282.tif 000027
【０１６４】
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチル−ベンジル）−アセトアミド（１３８mg、０．５９mmol）をアルゴン雰囲気下で３mLの無水ジメチルアセトアミドに溶解し、ＮａＨ（３１mg、１．３１mmol）を加える。Ｎ9−（３−アジドプロピル）−２−アミノ−６−クロロプリン（２２、１００mg、０．３９mmol）を加え、溶液を９０℃で１６時間加熱する。室温に冷却後、混合物を８０mLの水に注ぎ、トリフルオロ酢酸でｐＨを６に調整する。水相をＣＨ2Ｃｌ2および酢酸エチルで抽出する。有機相を水と塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を蒸発させる。粗生成物をメタノールに溶解し、ＳｉＯ2（１５０mg）に吸着させ、ジクロロメタン：メタノール（９５：５）のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。収量：１５１mg（０．０３３６mmol、８５%）。
【０１６５】
【表１０】
2007526282.tif 000028
【実施例１１】
【０１６６】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−アミノプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（２４）
【０１６７】
アジド２３（実施例１０、１００mg、０．２３mmol）を０．９mLの１，４−ジオキサン／Ｈ2Ｏ（８：１）に溶解し、０．３mLのトリメチルホスピン溶液（ＴＨＦ中１Ｍ）を加える。反応を室温で３時間攪拌し、次いで全揮発性物質を減圧除去する。粗生成物をジクロロメタン／メタノール（９５：５〜１０：１）のフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。収量：８７mg（０．０２１mmol、９１%）。
【実施例１２】
【０１６８】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（２５）
【０１６９】
４−（［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ）−安息香酸スクシンイミジルエステル（１４．３mg、０．００３９mmol）およびトリフルオロアセタミド２４（実施例１１、１６．６mg、０．００３９mmol）をＴＥＡ１０μL含有ＤＭＦ０．８mLに溶解する。反応混合物を室温で終夜攪拌し、生成物を逆相ＭＰＬＣによって精製する。
【実施例１３】
【０１７０】
４−（２−アミノ−９−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジルアミン（２６）
【０１７１】
トリフルオロアセタミド２５（実施例１２、５０mg）を１mLのメタノールに溶解し、２mLのメチルアミン（エタノール中３３%）を加える。反応混合物を終夜室温で攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。生成物を次のステップでさらに精製することなく使用する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５７９．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例１４】
【０１７２】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＡＴＴＯ４８８−アミド（２７）
【０１７３】
【化２２】
2007526282.tif 000029
【０１７４】
アミン２６（実施例１３、２mg）、およびＡＴＴＯ４８８−スクシンイミジルエステル（２８、２mg、Atto-Tech, Siegen, Germany, Cat.-No. AD488-3）をＴＥＡ１μL含有ＤＭＦ１５０μLに溶解し、室温で２４時間放置する。生成物（２７）を逆相ＭＰＬＣによって精製する。
【実施例１５】
【０１７５】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド（２９）
【０１７６】
【化２３】
2007526282.tif 000030
【０１７７】
アミン２６（実施例１３、２mg、０．００３４mmol）および５（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（３０、２．０mg、０．００４２mmol）をＴＥＡ１μL含有ＤＭＦ１５０μLに溶解し、室温で２４時間放置する。生成物（２９）を逆相ＭＰＬＣによって精製する。
【実施例１６】
【０１７８】
４−（２−アミノ−９−（３−アジドプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジルアミン（３１）
【０１７９】
アジド２３（実施例１０、５０mg、０．１１mmol）を１mLのメタノールに溶解し、２mLのメチルアミン（エタノール中３３%）を加える。反応混合物を５０℃で終夜攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭeＯＨ１０：１）によって精製し３３．５mgを得た。
【０１８０】
【表１１】
2007526282.tif 000031
【実施例１７】
【０１８１】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−アジドプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−テトラメチル−ローダミン−５（６）−カルボキサミド（３２）
【０１８２】
アジド３１（実施例１６、１０mg、０．０８mmol）および５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（３３、７．４７mg、０．０１４mmol）をＴＥＡ２０μL含有ＤＭＦ８５０μLに溶解し、室温で２４時間放置する。生成物を逆相ＭＰＬＣによって精製し９．０mg（０．０１２mmol、７９%）を得た。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７６６．０［Ｍ］＋。
【０１８３】
【化２４】
2007526282.tif 000032
【実施例１８】
【０１８４】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−アミノプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド（３４）
【０１８５】
アジド３２（実施例１７、９．０mg、０．０１２mmol）を６００μLの１，４−ジオキサンおよび８０μLの水の混合物に溶解する。この貯蔵液の２００μLを１４μLのトリメチルホスフィン（ＴＨＦ中１Ｍ）溶液で３時間処理する。全揮発性物質を減圧除去し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製する。収量３．４７mg（０．００４７mmol，４０%）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７４０．１［Ｍ＋］。
【実施例１９】
【０１８６】
Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−ＱＳＹ９−アミノプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド（３５）
【０１８７】
【化２５】
2007526282.tif 000033
【０１８８】
アミン３４（実施例１８、１００μL、ＤＭＦ中４．７mM）溶液にＱＳＹ−９−スクシンイミジルエステル（３６、Molecular Probes、Eugene OR、ＵＳＡ、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｑ２０１３１）（０．８mg）および１μLのＴＥＡを加え、混合物をシェーカーに乗せ室温で終夜放置する。水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １５３９．９［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例２０】
【０１８９】
２，６−ジアミノ−４−［４−（２，２，２−トリフルオロ−アセトアミドメチル）−ベンジルオキシ］−ピリミジン３７
【０１９０】
Ｎ−（４−ヒドロキシメチル−ベンジル）−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（１２．０g、５２mmol）を８０mLの無水ＤＭＳＯに溶解し、ＮａＨ（４．０８g、１０２mmol、鉱油中６０%懸濁液）をアルゴン雰囲気下、３０分かけて少しずつ加える。室温で１時間攪拌後、２，６−ジアミノ−４−クロロピリミジン（７．５２g、５２mmol）を加え、反応混合物を６０℃まで終夜加熱する。室温に冷却後、混合物を１Lの１Ｎ  ＨＣｌに注ぎ、生成物を酢酸エチル（５００mL）で抽出する。混合有機相を水と塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を蒸発させる。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール１００：０〜８０：２０）によって精製すると、表題化合物が無色固体（４．７g、１３．７８mmol、２７%）として得られる。
【０１９１】
【表１２】
2007526282.tif 000034
【実施例２１】
【０１９２】
２，６−ジアミノ−５−ニトロソ−４−［４−（２，２，２−トリフルオロ−アセトアミドメチル）−ベンジルオキシ］ピリミジン（３８）
【０１９３】
ピリミジン３７（実施例２０、４．７２g、１３．７mmol）を６０mLの酢酸（３０%）に溶解し、７０℃に加熱する。５mLの水に溶解したＮａＮＯ2（１．４g、２０．０３mmol）をＫＪ澱粉紙が黒色に留まっているまで滴下する。氷浴で０℃に冷却後、紫色沈殿物をろ過によって収集し、アセトンから再結晶化すると、３．９g（１０．５４mmol、７７%）の紫色固体が得られる。
【０１９４】
【表１３】
2007526282.tif 000035
【実施例２２】
【０１９５】
２−アミノ−６−（４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−ブタノイルアミノ）−５−ニトロソ−４−［４−（２，２，２−トリフルオロ−アセトアミドメチル）−ベンジルオキシ］−ピリミジン（３９）
【０１９６】
アルゴン雰囲気下、４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−酪酸（１．５８g、８mmol）を２０mLの乾燥ＴＨＦに溶解し、０℃に冷却する。ジイソプロピルエチルアミン（１．１８g、９mmol）を加え、混合物を−２０℃に冷却し、クロロギ酸イソブチルエステル（１．１５g、８mmol）を加える。混合物をこの温度で５分間攪拌し、２０mLの乾燥ＴＨＦに溶解させたニトロソピリミジン３８（実施例２１、２．６４g、７mmol）を注射器によって加える。反応混合物を放置して室温まで暖め、５５℃まで加熱し、この温度で終夜攪拌する。室温に冷却後、混合物を１００mLの１Ｎ  ＨＣｌに注ぎ、生成物を酢酸エチル（３００mL）で抽出する。混合有機相を水と塩水で洗浄し、続いてＭｇＳＯ4で乾燥し、溶媒を蒸発させる。残留物をＳｉＯ2に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル１：２〜１：１０）によって精製すると、表題化合物が青色固体（１．９６g、３．５３mmol、５０．４%）として得られる。この粗製物質より、分析用試料を酢酸エチルから再結晶化する。
【実施例２３】
【０１９７】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（１１）
【化２６】
2007526282.tif 000036
【０１９８】
ニトロソ−ピリミジン３９（実施例２２、１．８４g、３．３mmol）およびトリフェニルホスフィン（１．８９g、７mmol）を含む２０mLのｏ−キシレンを１０時間加熱還流する。室温に冷却後、溶媒を減圧除去し、残存する残留物を酢酸エチルに再溶解する。残留物をＳｉＯ2に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／エタノール１：０〜１０：１）によって精製すると、表題化合物が無色固体（１．０４g、３．５３mmol、５０．４%）としてが得られる。
【０１９９】
【表１４】
2007526282.tif 000037
【実施例２４】
【０２００】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（４１）
【０２０１】
ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル誘導体１１（実施例２３、１００mg、０．１９mmol）を１０mLのジクロロメタンに懸濁し、２mLのトリフルオロ酢酸を加える。混合物を室温で３０分間攪拌し、７０mLのジエチルエーテルに注ぐ。沈殿物をろ過によって収集し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ５：１）によって精製すると、７４mg（０．１７mmol、９２%）の表題化合物が得られる。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ４２４．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例２５】
【０２０２】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（４２）
【０２０３】
アミン４１（実施例２４、２０mg、０．０４７mmol）および４−（［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ）安息香酸スクシンイミジルエステル（１７．３mg、０．０４７mmol）をＴＥＡ２０μL含有ＤＭＦ０．６mLに溶解する。反応混合物を終夜室温で攪拌し、溶媒を減圧除去する。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ９５：５〜１０：１）によって精製すると２３mg（０．０３５mmol、７５%）が得られる。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６７５．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例２６】
【０２０４】
４−（２−アミノ−８−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル−アミン（４３）
【０２０５】
トリフルオロアセタミド４２（実施例２５、２３mg、０．０３５mmol）を２mLのメタノールに溶解し、２mLのメチルアミン（エタノール中３３%）を加える。反応混合物を５０℃で終夜攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。生成物をさらに精製することなく使用する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ５７９．１［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例２７】
【０２０６】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド（４４）
【０２０７】
【化２７】
2007526282.tif 000038
【０２０８】
アミン４３（実施例２６、２．０mg、０．００３５mmol）および５−（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（１．６３mg、０．００３５mmol）をＴＥＡ５μL含有ＤＭＦ２００μLに溶解する。反応混合物を終夜室温で放置し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって粗生成物を精製する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ９３７．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例２８】
【０２０９】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（４−［４−ジメチルアミノ−フェニル］−アゾ−ベンゾイル）アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＡＴＴＯ４８８−アミド（４５）
【０２１０】
【化２８】
2007526282.tif 000039
【０２１１】
アミン４３（実施例２６、１．０mg、０．００１７mmol）およびＡＴＴＯ４８８−スクシンイミジルエステル（２８、１．０mg、０．００１５mmol）をＴＥＡ１μL含有ＤＭＦ１００μLに溶解する。反応混合物を終夜室温で放置し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって粗生成物を精製する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １１５０．０［Ｍ＋］。
【実施例２９】
【０２１２】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−ＱＳＹ９−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（４６）
【０２１３】
アミン４１（実施例２４、１．６mg、０．０３８mmol）およびＱＳＹ−９−スクシンイミジルエステル（３６、３．７mg、０．０３８mmol）をＴＥＡ２μL含有ＤＭＦ０．２５mLに溶解する。反応混合物を終夜室温で攪拌する。反応混合物を１mLの水／アセトニトリル（８０：２０）で希釈し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配を使用し逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製すると２．１mg（０．００１７mmol、４４%）の表題化合物が得られる。
【実施例３０】
【０２１４】
４−（２−アミノ−８−（３−ＱＳＹ９−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジルアミン（４７）
【０２１５】
トリフルオロアセタミド４６（実施例２９、２．１mg、１．７２μmol）を１mLのメタノールに溶解し、２mLのメチルアミン（エタノール中３３%）を加える。反応混合物を終夜室温で攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。生成物をさらに精製することなく使用する。
【実施例３１】
【０２１６】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−ＱＳＹ９−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド（４８）
【０２１７】
【化２９】
2007526282.tif 000040
【０２１８】
アミン４７（実施例３０、１mg、０．８８６μmol）、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンスクシンイミジルエステル（３３、０．５mg、０．８８６μmol）、および１μLのＴＥＡを１００μLのＤＭＦに溶解し、混合物をシェーカーに乗せ終夜室温で放置する。水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製する。
【実施例３２】
【０２１９】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（Ｎ−（＋）−ビオチニル−６−アミノカプロイル）−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−２，２，２−トリフルオロ−アセトアミド（４９）
【０２２０】
アミン４１（実施例２４、１０mg、０．０２３mmol）およびＮ−（＋）−ビオチニル−６−アミノカプロン酸スクシンイミジルエステル（５０、１０mg、０．０２３mmol）をＴＥＡ５μL含有ＤＭＦ６５０μLに溶解し、終夜室温で放置する。水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製すると、１５．１mg（０．０１９mmol、８６%）の表題化合物が得られる。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７６３．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０２２１】
【化３０】
2007526282.tif 000041
【実施例３３】
【０２２２】
４−（２−アミノ−８−（３−（Ｎ−（＋）−ビオチニル−６−アミノカプロイル）−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル−アミン（５１）
【０２２３】
トリフルオロアセタミド４９（実施例３２、１５．１mg、０．０１９mmol）を１mLのメタノールに溶解し、２mLのメチルアミン（エタノール中３３%）を加える。反応混合物室温で４８時間を攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。生成物をさらに精製することなく使用する。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６６７．５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例３４】
【０２２４】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（Ｎ−（＋）−ビオチニル−６−アミノカプロイル）−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド（５２）
【０２２５】
【化３１】
2007526282.tif 000042
【０２２６】
アミン５１（実施例３３、１０mg、０．０１５mmol）および５（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（３０、７．０mg、０．０１５mmol）をＴＥＡ１０μL含有ＤＭＦ  ５００μLに溶解する。反応を２４時間室温で放置し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製すると、８．２mg（０．００８mmol、５３%）の表題化合物が得られる。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  １０２５．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例３５】
【０２２７】
４−（２−アミノ−８−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル−アミン（５３）
【０２２８】
トリフルオロアセタミド１１（実施例２３、１００mg、０．１９mmol）を２mLのメタノールに溶解し、２mLのメチルアミン（エタノール中３３%）を加える。反応混合物を終夜５０℃で攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ９５：５〜１０：１）によって精製すると、７７mg（０．０１７mmol、９４%）の表題化合物が得られる。
【実施例３６】
【０２２９】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド（５４）
【０２３０】
アミン５３（実施例３５、１０mg、０．０２３mmol）および５（６）−カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（３０、１１．４mg、０．０２３mmol）をＴＥＡ１０μL含有ＤＭＦ  ５００μLに溶解し、終夜室温で攪拌し、続いて水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配を使用し逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製すると、１３．４mg（０．０１７mmol、７３%）の表題化合物が得られる。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ７６６．０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例３７】
【０２３１】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−アミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド（５５）
【０２３２】
ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミド５４（実施例３６、５mg、０．００６２mmol）を２mLのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、１mLのＴＦＡを加える。混合物を室温で４時間攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。粗生成物を０．５mLのＭｅＯＨに再溶解し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配を使用し逆相ＭＰＬＣによって精製すると、０．５mg（０．０００６mmol、１０%）の表題化合物が得られる。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ  ６８６．２［Ｍ＋Ｈ］＋。
【実施例３８】
【０２３３】
Ｏ6−フルオレセイン−Ｃ8−ビーズコンジュゲート（５６）
【０２３４】
【化３２】
2007526282.tif 000043
【０２３５】
ＮＨＳ活性化セファロース（商標）をポリプロピレンカラム（HiTrap（商標）、カラム容量１mL、Amersham Biosciences）に充填し、アミン５５（実施例３７、８mM）を含む０．５M  ＮａＣｌ溶液ｐＨ８．５と共に３０分間インキュベートする。カラムを最初に６mLの緩衝液Ａ（０．５M  エタノールアミン、０．５M  ＮａＣｌ、ｐＨ８．３）で、続いて６mLの緩衝液Ｂ（０．１M  酢酸、０．５M  ＮａＣｌ、ｐＨ４）で洗浄する。残存する全てのＮＨＳエステルをクエンチするために、続いてカラムを緩衝液Ａと共に３０分間インキュベートし、次いで再度６mLの緩衝液Ａで、続いて６mLの緩衝液Ｂで、次いで６mLの緩衝液Ａで再度洗浄する。式５６のビーズがｈＡＧＴ用基質として使用するために今準備される。
【実施例３９】
【０２３６】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＡＴＴＯ４８８−アミド（５７）
【０２３７】
アミン５３（実施例３５、２．５mg、０．０８mmol）およびＡＴＴＯ４８８−スクシンイミジルエステル（２８，４mg、０．０８mmol）をＴＥＡ１０μL含有ＤＭＦ  ５００μLに溶解し、終夜室温で攪拌し、続いて水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配を使用し逆相ＭＰＬＣによって生成物を精製すると、１３．４mg（０．０１７mmol、７３%）の表題化合物が得られる。
【実施例４０】
【０２３８】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−アミノ−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］ＡＴＴＯ４８８−アミド（５８）
【０２３９】
ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミド５７（実施例３９、２mg、０．００２mmol）を１mLのＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、０．１mLのＴＦＡを加える。混合物を室温で３０分間攪拌し、全揮発性物質を減圧除去する。粗生成物を０．５mLのＭｅＯＨに再溶解し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配を使用し逆相ＭＰＬＣによって精製する。
【実施例４１】
【０２４０】
Ｎ−［４−（２−アミノ−８−（３−（マレイミドアセチル−アミノ）−プロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＡＴＴＯ４８８−アミド（５９）
【０２４１】
アミン５８（実施例４０、１mg、０．００１１mmol）およびマレイミド酢酸スクシンイミジルエステル（１mg、０．００３９mmol）をＴＥＡ１μL含有ＤＭＦ１００μLに溶解し、終夜室温で放置する。水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配を使用し逆相ＭＰＬＣによって粗生成物を精製する。
【実施例４２】
【０２４２】
Ｏ6−ＡＴＴＯ４８８−Ｃ8−ＴｙｒＡｒｇ9Ｃｙｓコンジュゲート（６０）
【０２４３】
【化３３】
2007526282.tif 000044
【０２４４】
マレイミドフルオロフォア５９（実施例４１、４当量）を含む５０mLのアセトニトリルを、ＴｙｒＡｒｇ9Ｃｙｓを含む０．５mLの脱酸素化ＭｅＯＨに加え、次いでＮ2下、２〜４時間室温で振盪する。エチルエーテル（１０倍過剰な）を加えて生成物を沈殿させる。精製は、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配を使用し、その対応する波長で検出しながら、逆相ＭＰＬＣによって実施する。生成物は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって特徴付ける。
【実施例４３】
【０２４５】
２，５，６−トリアミノ−４−［４−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ−メチル）−ベンジルオキシ］ピリミジン（６１）
【０２４６】
２，６−ジアミノ−５−ニトロソ−４−［４−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ−メチル）−ベンジルオキシ］−ピリミジン（１．２２g、３．３mmol）およびトリフェニルホスフィン（１．８９g、７mmol）を含む２０mLのｏ−キシレンを１時間加熱還流する。室温に冷却後、溶媒を減圧除去し、残存する残留物をメタノールに再溶解する。残留物をＳｉＯ2に吸着させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／メタノール９５：５〜５：１）によって精製すると表題化合物が得られる。
【実施例４４】
【０２４７】
２−アミノ−６−ヒドロキシメチル−４−［４−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ−メチル）−ベンジルオキシ］−プテリジン（６２）
【０２４８】
ピリミジン６１（実施例４３、５．０g、１４．１mmol）をアスコルビン酸ナトリウム（２．８５g、１４．４mmol）と共にジメチルアセトアミド／水（１：１）に溶解する。ジヒドロキシアセトン二量体（２．５７g、１４．３mmol）を加え、エアを反応混合物に吹き入れながら反応混合物を４０℃に加熱する。４時間後、反応混合物を２５０mLのＨ2Ｏに注ぎ、形成した固体をろ過によって収集する。この固体をＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（３：１、５００mL）に再溶解し、ＭｇＳＯ4で乾燥する。粗生成物をＳｉＯ2に吸着し、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（２０：１）を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。
【実施例４５】
【０２４９】
２−アミノ−４−［４−（２，２，２−トリフルオロ−アセチルアミノ−メチル）−ベンジルオキシ］−プテリジン−６−カルボン酸（６３）
【０２５０】
ヒドロキシメチル化合物６２（実施例４４、０．３４２g、０．８４mmol）をアセトン／０．５M  リン酸緩衝液、ｐＨ７（１：１、２０mL）に懸濁し、過マンガン酸カリウム（０．３４g、２．１８mmol）を２時間かけて少しずつ加える。反応混合物を室温で３時間攪拌し、Ｈ2Ｏ（５０mL）で希釈し、過マンガン酸が消費するまで亜硫酸ナトリウムを加えると、黒褐色沈殿物が生じ、これをろ過除去する。ｐＨを２M  ＨＣｌを加えて２．５に調整すると黄色固体が生じ、これをろ過収集する。固体をＨ2Ｏ（５０mL）に溶解しｐＨが３０分間一定になるまで０．１M  ＮａＯＨを加えてｐＨを７．０に調整する。混合物をろ過し、再度酸性化し、水からアセトニトリル（０．０８%ＴＦＡ）までの直線勾配の使用による逆相ＭＰＬＣによって粗生成物を精製する。
【実施例４６】
【０２５１】
２−アミノ−６−（３−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−プロピル）−４−［４−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ−メチル）−ベンジルオキシ］−プテリジン（６４）
【０２５２】
カルボン酸６３（実施例４５、０．１０g、０．２４mmol）およびＰｙＢＯＰ（（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）−トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスファート、０．１２g、０．２４mmol）を１mLの無水ＤＭＦに溶解し、室温で３０分間攪拌する。ＴＥＡ（５０μL）およびｔｅｒｔ−ブチル２−アミノエチルカルバマート（４８mg、０．３mmol）を加える。反応混合物をさらに３時間攪拌し５０mLの水に注入する。生成物をＣＨ2Ｃｌ2で抽出し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ（２０：１）を使用するフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製する。
【実施例４７】
【０２５３】
Ｎ9−シクロペンチル−Ｏ6−（４−ブロモチオフェン−２−イル）−グアニン（１８、ＣＰＴＧ）を有するＡＧＴ変異体の反応速度
【０２５４】
最初にＡＧＴ変異体Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕを指向進化法によって調製する。ＰＧＥＧ−ｈＡＧＴ遺伝子の部分的に重複する２領域、変異Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕを含むＡＧＴ（Juillerat et al., Chem Biol 10:313-317, 2003）を別々の反応において適当なプライマーで増幅する。プライマーには、ｈＡＧＴ遺伝子のコドン１３１、１３２、１３４、１３５に対応する位置にヌクレオチド混合物ＮＮＫ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、もしくはＴ；Ｋ＝ＧもしくはＴ）が含まれる。その部分的相補性に関して、さらなるＰＣＲ反応でこれらの２つのＰＣＲフラグメントを合わせ、増幅してコドン１３１、１３２、１３４、１３５でランダム化された完全長遺伝子を得る。これらを、Ｓｆｉｌ制限部位によりベクターｐＡＫ１００の繊維状ファージのｇ３蛋白質に融合してクローン化する。得られた遺伝子ライブラリをファージディスプレイに使用する。
【０２５５】
このライブラリのファージは、大腸菌ＪＭ１０１細胞で産生される。指数関数的培養をヘルパーファージに重感染させ、終夜２４℃で増殖する。この培養上清を１μMジゴキシゲニン化Ｏ6−ベンジルグアニン（Juillerat et al., Chem Biol 10:313-317, 2003の物質２）と共に６分間インキュベートする。次の選択ラウンドでは、反応時間をそれぞれ９０秒および４５秒に減少し、基質濃度を１０nMに減少して選択圧力を増大させる。４%ＰＥＧ／３%ＮａＣｌで沈殿させることによって、この反応からファージを精製する。今回共有結合によりジゴキシゲニンで標識した変異体ＡＧＴを有するファージは、抗ジゴキシゲニン抗体（Roche Diagnostics）でコートした磁気ビーズと共にインキュベートすることによって単離し、細菌の再感染に使用される。
【０２５６】
選択したＡＧＴ変異体を増幅し、続いて発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Amersham）のＢａｍＨ１とＥｃｏＲ１間部位にクローン化する。これによりＧＳＴ蛋白質Ｃ末端融合体として挿入遺伝子の発現が可能になり、ベクターによってこの遺伝子を提供する。
【０２５７】
このベクターからの蛋白質発現は大腸菌株ＢＬ２１で行う。指数関数的に増殖する培養を０．５mM  ＩＰＴＧによって誘発し、２４℃で３．５時間発現させる。
【０２５８】
精製：１mM  ＰＭＳＦおよび２μｇ／mLアプロチニンを補充し、５０mMリン酸塩、０．５M  ＮａＣｌ、１mM  ＤＴＴを含む緩衝液に回収した細胞を再懸濁し、リゾチームおよび超音波処理により破壊する。細胞残屑は、４００００×ｇでの遠心分離によって分離する。抽出物を予め平衡化したグルタチオンセファロース（Amersham）にアプライし、次いでこれを２０ベッド容量（５０mMリン酸塩、０．５M  ＮａＣｌ、１mM  ＤＴＴ）で洗浄する。変異ＧＳＴ−ＡＧＴ融合蛋白質を、１０mM還元グルタチオンを含む５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．９で溶出する。精製した蛋白質を５０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１mM  ＤＴＴ、３０%グリセロールに対して透析し、次いで−８０℃で貯蔵する。
【０２５９】
変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１ｌｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、および１８２での切り詰めを含む第２のＡＧＴ変異体（「ＡＧＴＭ」）は上記ＡＧＴ変異体に由来するが、さらなる変異およびコドン１８２後の切り詰めを変異体ＡＧＴ遺伝子に続いて導入することによる。続くＰＣＲ増幅によって、第１の変異体について記載したｐＧＥＸ２Ｔ中にサブクローン化された、さらなる変異遺伝子が生じる。ＧＳＴ融合蛋白質が発現し同様に精製する。
【０２６０】
ＡＧＴＭに関係し、変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｇｌｎ１１５Ｓｅｒ、Ｇｌｎ１１６Ｈｉｓ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ａｓｎ、Ｓｅｒ１５１ｌｌｅ、Ｓｅｒ１５２Ａｓｎ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、および１８２での切り詰めを含む第３のＡＧＴ変異体（「ＡＧＴ２１」）を同じ方法によって調製する。
【０２６１】
ＡＧＴＭに関係し、変異Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ａｌａ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、１８２での切り詰めを含む第４のＡＧＴ変異体（「ＡＧＴ２６」）も同じ方法によって調製する。
【０２６２】
ＡＧＴＭ（１μM終濃度）をＮ9−シクロペンチル−Ｏ6−（４−ブロモチオフェン−２−イル）−グアニン（１８、ＣＰＴＧ）（１%ＤＭＳＯ中の終濃度１０μM）を含む反応緩衝液（５０mM  ＨＥＰＥＳ、１mM  ＤＴＴ、２００mg／mL  ＢＳＡ、ｐＨ７．３）と共に２４℃でインキュベートする。試料を所定の時間（５、１０、１５、２０、３０、４５、６０、９０、１２０分）に採取し、直接、ビオチン化Ｏ6−ベンジルグアニン（ＢＧＢＴ；Juillerat et al., Chem Biol 10:313−317, 2003の物質３ａ、１０μM終濃度）と共に４分間インキュベートする。ＳＤＳ−Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液を加えることによって反応をクエンチし９５℃で２分間加熱する。試料を１２%アクリルアミドゲル上で泳動させ、ウェスタンブロッティングによって分析する。結果を図２に示す。
【０２６３】
２次速度定数：ｋ2＝９２．５［Ｓ−1Ｍ−1］。この値は、ＢＧＢＴによるＡＧＴＭの活性と比較して非常に遅い（ｋ2＝〜３，０００［Ｓ−1Ｍ−1］）。２種類の基質ＢＧＢＴ／ＣＰＴＧの活性比は少なくとも２５である。
【実施例４８】
【０２６４】
Ｎ9−シクロペンチル−Ｏ6−（４−ブロモチオフェン−２−イル）グアニン（１８、ＣＰＴＧ）とビオチン化Ｏ6−ベンジルグアニン（ＢＧＢＴ）の間のインビトロでの競合
【０２６５】
変異体ＡＧＴ（ＡＧＴＭ）および野生型ヒトＡＧＴ（０．５μＭ終濃度）を、別々に、ＢＧＢＴ（０．５μM終濃度）および異なる濃度のＣＰＴＧ（終濃度０、０．５、１、５、１０μM）を含む反応緩衝液（５０mM  ＨＥＰＥＳ、１mM  ＤＴＴ、２００mg／mL  ＢＳＡ、ｐＨ７．３）と共に４５分間インキュベートする。反応を２×ＳＤＳ緩衝液を加えることによってクエンチし９５℃で２分間放置する。試料を１２%アクリルアミドゲル上で泳動させ、ウェスタンブロッティングによって分析する。
【０２６６】
ＡＧＴＭおよび野生型ｈＡＧＴは、化合物ＣＰＴＧおよびＢＧＢＴの存在下、ＣＰＴＧに対して著しく異なる反応性を示す。ＢＧＢＴの２０倍の濃度のＣＰＴＧでは、９５%の野生型ＡＧＴが４５分後にＣＰＴＧによってクエンチされるが、８７%の変異体ＡＧＴＭは依然として活性である。ＢＧＢＴを有する野生型ｈＡＧＴの反応速度定数は４００Ｓ−1Ｍ−1であることが知られているので、ＣＰＴＧを有する野生型ｈＡＧＴの速度定数は、立体的に匹敵する、３４０Ｓ−1Ｍ−1の値（Lodewijkら、欧州特許第７０４４４５号）を示すＮ9−デスオキシリボシル−Ｏ6−ベンジルグアニンを有するｈＡＧＴの既知の反応性に基づいて著しく影響を受けないとみなすことができる。
【０２６７】
ＡＧＴＭ−６×Ｈｉｓ融合蛋白質（０．２μM終濃度）および野生型ｈＡＧＴ−ＧＳＴ融合蛋白質（１．２μM終濃度）を含む反応緩衝液（５０mM  ＨＥＰＥＳ、１mM  ＤＴＴ、２００mg／mL  ＢＳＡ、ｐＨ７．３）溶液をＢＧＢＴ（５μM終濃度）および異なる濃度のＣＰＴＧ（０、５、１０μM終濃度）と共に３０分間インキュベートする。反応を２×ＳＤＳ緩衝液を加えることによってクエンチし９５℃で２分間放置する。試料を１２%アクリルアミドゲル上で泳動させ、ウェスタンブロッティングによって分析する。結果を図３に示す。
【０２６８】
ＡＧＴＭおよび野生型ｈＡＧＴの反応を比較すると、ＣＰＴＧのｈＡＧＴに対する高い特異性が観察される。同じ濃度（両基質、終濃度５μM）では、ＡＧＴＭのわずか５%に対して９５%の野生型ＡＧＴがＣＰＴＧと反応した。
【実施例４９】
【０２６９】
異なる２種の基質を有する一試料における、異なる２つのＡＧＴ変異体の細胞内競合
【０２７０】
変異体ＡＧＴＭ（実施例４７）を適当なプライマーによって増幅し、ベクターｐＥＧＦＰ−ＮｕｃのＮｈｅＩとＢｇｌＩＩ部位の間にクローン化する。酵母β−ガラクトシダーゼ遺伝子を同様に増幅し、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩによりこのベクター中にサブクローン化して、ＡＧＴ−β−Ｇａｌ融合遺伝子を有するベクターを得る。野生型ｈＡＧＴ遺伝子を増幅し、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩによってｐＥＧＦＰ−Ｎｕｃ中にクローン化して、変異Ｇｌｙ１６０ＴｒｐをコードするＡＧＴ−ＮＬＳ３融合遺伝子を得る。ＣＨＯ細胞中で並行して両ＡＧＴ変異体を一時的に発現させた後、細胞を１０分間５μM  ＣＰＴＧ（１８）と共にインキュベートし、続いてJuillerat et al., Chem Biol 10:313-317, 2003、（Ｏ6−（４−（ジアセチルフルオレセイン−カルボニルアミノメチル）−ベンジル）−グアニン（ＢＧ−ＡｃＦＬ）の物質４の５μM共に２０分間インキュベートする。細胞を洗浄し標準手順によって画像化する。
【０２７１】
ＣＨＯ細胞では、蛍光基質ＢＧ−ＡｃＦＬと反応させることによって、細胞質内に局在化するＡＧＴ−β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質を選択的に蛍光標識する。核内にはその他のＡＧＴ融合蛋白質の有意な標識は観察されない。ＡＧＴ（Ｇｌｙ１６０Ｔｒｐ）は、細胞内でＣＰＴＧ（１８）と効率よく反応し、従ってその後蛍光基質で標識されることは有り得ないと結論付けらる。変異体ＡＧＴＭは、細胞内でＣＰＴＧとのプレインキュベーション後も依然として蛍光基質に反応性であり、従って第１ステップでＣＰＴＧと反応しない。
【実施例５０】
【０２７２】
蛍光出現アッセイ
１００μLのｈＡＧＴ−ＧＳＴ融合蛋白質を含む反応緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ、１mM  ＤＴＴ、１mg／mL  ＢＳＡ、ｐＨ８．０、ｈＡＧＴ−ＧＳＴの終濃度：１μM）の２個のアリコットを黒色平底マイクロタイタープレートに入れる。一つのアリコットを対照として使用し、これを４０分間ベンジルグアニン（終濃度は１００μM）でクエンチする。化合物（７）を含むＤＭＳＯをｈＡＧＴ−ＧＳＴ（終濃度１０nM）の両試料に加え、２５℃で１時間インキュベートする。フルオレセイン−プロトコルを備えたＶｉｃｔｏｒ2Ｖプレートリーダー（Perkin-Elmer）で蛍光を読み取る。試料の蛍光読取り値は、対照の読取り値の少なくとも２倍である。
【０２７３】
さらに別のアッセイでは、蛋白質濃度１０μMのＡＧＴ変異体ＡＧＴＭおよびＡＧＴ２１（実施例４７）の精製蛋白質を、１００mM  ＮａＣｌ、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１%Ｔｗｅｅｎ、１mM  ＤＴＴを含む緩衝液に含まれた１００ｎM  Ｎ−［４−（２−アミノ−９−（３−ＱＳＹ９−アミノプロピル）−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−テトラメチルローダミン−５（６）−カルボキサミド（３５、Ｎ9−ＱＳＹ９−ＢＧ−ＴＭＲ、実施例１９）と共に室温でインキュベートする。蛍光強度（５３１nm励起／５９５nm発光）をＶｉｃｔｏｒ２マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用し追跡する。変異体ＡＧＴ２１は、Ｎ9−ＱＳＹ９−ＢＧ−ＴＭＲ（化合物３５）に対して有意な反応性を示し、２５℃で１時間にわたってテトラメチルローダミン蛍光を約８０%増大させる。それに反して、変異体ＡＧＴＭでは、Ｎ9−ＱＳＹ９−ＢＧ−ＴＭＲにより２５℃で１時間におよぶインキュベーションすることで５%未満のテトラメチルローダミンの蛍光が増大する。
【０２７４】
同様に、ＡＧＴＭおよびＡＧＴ２１をＮ−［４−（２−アミノ−８−（３−（４−［４−ジメチルアミノフェニル］−アゾ−ベンゾイル）−アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−ＡＴＴＯ４８８−アミド（４５、Ｃ8−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８、実施例２８）、およびＯ6−（４−（ＡＴＴ０４８８−アミドメチル）−ベンジル）グアニン（ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８、Atto-Tec Siegen, D, Prod Nr.: AD 488-2）と共にインキュベートし、蛍光強度を４９０nm（励起）および５３５nm（発光）で測定する。変異体ＡＧＴＭは、ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８と比較してＣ8−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８に対して３倍の反応性を示す。変異体ＡＧＴ２１は、ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８と比較してＣ8−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８に対して二倍の反応性を示す。
【０２７５】
さらなる反応比較により以下の結果が得られた。
ＡＧＴ２１は、化合物４８（Ｃ8−ＱＳＹ９−ＢＧ−ＴＭＲ、実施例３１）と、Ｃ8／Ｎ9非置換化合物（ＢＧ−ＴＭＲ、Molecular Probes製品Ｃ３００）との場合より２倍速く、化合物３５（Ｎ9−ＱＳＹ９−ＢＧ−ＴＭＲ、実施例１９）との場合より少なくとも４倍速く反応する。ＡＧＴ２１は、化合物４５（Ｃ8−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８、実施例２８）と、Ｃ8／Ｎ9非置換化合物（ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８、Atto-Tec Siegen, D, Prod. No. AD 488-2）との場合より２倍速く、化合物２７（Ｎ9−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８、実施例１４）との場合より少なくとも４倍速く反応する。
【０２７６】
ＡＧＴ２１は、化合物４４（Ｃ8−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−ＦＬ、実施例２７）と、Ｃ8／Ｎ9非置換化合物（ＢＧ−ＦＬ、Juillerat et al., Chem Biol 10:313-317, 2003の物質５）との場合より２倍速く、化合物２９（Ｎ9−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−ＦＬ、実施例１５）との場合より少なくとも４倍速く反応する。
【０２７７】
ＡＧＴＭは、化合物４８（Ｃ8−ＱＳＹ９−ＢＧ−ＴＭＲ、実施例３１）と、Ｃ8／Ｎ9非置換化合物（ＢＧ−ＴＭＲ）との場合より２倍速く、化合物３５（Ｎ9−ＱＳＹ９−ＢＧ−ＴＭＲ、実施例１９）との場合より少なくとも１０倍速く反応する。
【０２７８】
ＡＧＴＭは、化合物４５（Ｃ8−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８、実施例２８）と、Ｃ8／Ｎ9非置換化合物（ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８）との場合より３倍速く、化合物２７（Ｎ9−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−Ａｔｔｏ４８８、実施例１４）との場合より少なくとも１５倍速く反応する。
【０２７９】
ＡＧＴＭは、化合物４４（Ｃ8−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−ＦＬ、実施例２７）と、Ｃ8／Ｎ9非置換化合物（ＢＧ−ＦＬ）との場合より２倍速く、化合物２９（Ｎ9−Ｄａｂｃｙｌ−ＢＧ−ＦＬ、実施例１５）との場合より少なくとも１０倍速く反応する。
【実施例５１】
【０２８０】
ワンポット標識および分離アッセイ
５０μLのｈＡＧＴ−ＧＦＰ融合蛋白質を含む反応緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ、１mM  ＤＴＴ、１mg／mL  ＢＳＡ、ｐＨ７．３、ｈＡＧＴ−ＧＦＰの終濃度：５μＭ）を基質（９）（Ｂ＝ビオチン、終濃度１０μM）と共に１時間インキュベートする。１５０μLのストレプトアビジン被膜ビーズ（Dynabeads  Ｍ−２８０）を加え、インキュベーション時間および上清からの磁気分離を製造業者の使用説明書に従って行う。４８８nmでのＧＦＰ吸収を測定することによって、磁気ビーズによる処理前後の溶液中の融合蛋白質量を定量する。融合蛋白質の損失は３０%未満である。未反応基質を除去後、上清中のＡＬＥＸＡ色素の吸収を５９４nmで測定によって標識効率を定量する。標識効率は少なくとも２０%である。
【０２８１】
他の実験では、蛋白質濃度が５μMである精製ＡＧＴＭまたはＡＧＴ２１（実施例４７）を、１００mM  ＮａＣｌ、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１%Ｔｗｅｅｎ、１mM  ＤＴＴを含む緩衝液５０μｌに含まれる１０μMのＮ−［４−（２−アミノ−８−（３−（Ｎ−（＋）−ビオチニル−６−アミノカプロイル）アミノプロピル）−９Ｈ−プリン−６−イルオキシメチル）−ベンジル］−フルオレセイン−５（６）−カルボキサミド（５２、実施例３４）と共に室温でインキュベートする。１時間後、少なくとも１nmｏｌビオチンを結合する能力を有するストレプトアビジン被膜磁気ビーズ（Ｍａｇｎａｂｉｎｄストレプトアビジン、Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、インキュベーション時間、およびフルオレセイン標識蛋白質を含む上清からの磁気分離を製造業者の使用説明書に従って行う。磁気ビーズによる処理前後の溶液中の蛋白質量をBradfordアッセイによって決定する。蛋白質の損失は３０%未満である。未反応基質およびビーズへの結合および磁気分離によって遊離した生成物を除去後の上清中の蛍光強度を、４９０nm励起および５３５nm発光のＶｉｃｔｏｒ２マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）を使用して測定することによって標識効率を定量する。標識効率は少なくとも２０%である。
【０２８２】
基質が予め固定されるさらに別の実験では、１ｍｌ当たり２μｇのビオチンに結合する能力を有するストレプトアビジン被膜磁気ビーズ（Magnabindストレプトアビジン、Pierce）を、１００mM  ＮａＣｌ、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１%Ｔｗｅｅｎを含む緩衝液に含まれた２倍過剰の化合物５２（上のように）と共に室温でインキュベートして基質をビーズに固定する。インキュベーション時間、および上清からの磁気分離を製造業者の使用説明書に従って行う。未結合基質は、続く３回の洗浄ステップで緩衝液により除去する。蛋白質濃度が５０μMのＡＧＴＭを、１００mM  ＮａＣｌ、５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．１%Ｔｗｅｅｎ、１mM  ＤＴＴを含む緩衝液５０μｌに含まれたこれらの基質改変ビーズと共に室温でインキュベートする。２０時間後、フルオレセイン標識蛋白質を含む上清からビーズを分離する。磁気ビーズによる処理前後の溶液中の蛋白質量をBradfordアッセイによって決定する。蛋白質の損失は３０%未満である。上のように、蛍光強度を測定することによって標識効率を定量するが、少なくとも２０%である。
【実施例５２】
【０２８３】
標識ビーズ
機能付与したセファロースビーズ５６（実施例３８）を５mLの緩衝液Ｃ（１０mM  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．０５%Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄することによって平衡化する。この懸濁液に１００μLのｈＡＧＴ−ＧＦＰ（終濃度５０μＭ）を加え、２５℃で１時間インキュベートする。セファロースビーズを遠心分離によって除去し、４８８nmで上清中のフルオレセインの吸収を測定することによって標識効率を定量する。標識効率は少なくとも２０%である。４８８nmでのＧＦＰ吸収を測定することによって、改変セファロースビーズ処理前後の溶液中の融合蛋白質量を定量する。融合蛋白質の損失は３０%未満である。
【０２８４】
別の実験では、製造業者により提供された使用説明書に従って、化合物５６をセファロース４FastFlow（ＮＨＳ−エステルとして活性化させたカルボキシル基、Amersham Prod No. 17-0906-01）によって調製する。洗浄液中に蛍光が検出されなくなるまで樹脂物質を洗浄し、暗所において４℃で貯蔵する。以下の全ステップで使用する緩衝液は、１５０mM  ＮａＣｌと５０mM  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に１mM  ＤＴＴを加えたものである。各実験には、製造業者の使用説明書に従い、２００μLの改変樹脂をBio-Rad Micro Biospinスピンカラムに充填し、２分間１０００×ｇで遠心分離する。素通りは廃棄する。その後５０μM濃度の非標識ＡＧＴＭ１００μLを加え、２５℃の暗所で１時間放置する。
【０２８５】
対照実験として、１００μMのＯ6−ベンジルグアニンで予め３０分間ブロックした５０μM  ＡＧＴＭを１００μL使用する。その後、カラムを１０００×ｇで２分間遠心分離し、その度に２００μLの緩衝液を加えることによって４回洗浄する。最終容量を１mLに調整する。蛋白質含有量をＢＣＡアッセイ（Pierce BCA蛋白質アッセイキット−Prod. Nr. 23225, Perbio Science, Switzerland）によって決定する。見出された値は、予想された５μM濃度の少なくとも８０%である。ｐＨ９に調整した１００mM  Ｎａ2ＣＯ3緩衝液で１：５０に希釈した後、全溶液の蛍光を定量する。黒色９６ウェルプレート（Costar）には各試料の２００μLが備わる。試験試料のフルオレセイン範囲の蛍光をＶｉｃｔｏｒ２プレートリーダー（フルオレセインフィルタセット）によって読み取る。試験試料で見られた蛍光は、対照実験で見られた蛍光の少なくとも５倍である。
【実施例５３】
【０２８６】
コンジュゲートＯ6ＡＴＴＯ４８８−Ｃ8−ＴｙｒＡｒｇ9Ｃｙｓ（６０）の細胞透過性
ＡＧＴ２６およびＣａａＸ−ファルネシル化シグナル融合用ベクターを、内在性野生型ＡＧＴを持たないＣＨＯ細胞中に形質移入する。安定した形質移入体をジェネティシン（geneticine）処理下で選択する。その目的のために、ＡＧＴ２６遺伝子をｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔ（Stratagene）中にクローン化し、そのＣ末端にｐＥＣＰ−Ｆ（Clontech）中にコードされているＣａａＸ−ｂｏｘ配列を続けた。最終蛋白質配列（位置６９０〜１２７１）によって、１９４アミノ酸を有する単一ポリペプチドが得られる。安定した形質移入細胞系統では、このポリペプチドによって、細胞膜内面に局在化するＡＧＴ融合蛋白質がもたらされる。これらの細胞を５μM  Ｏ6−テトラメチルローダミン−ベンジルグアニン（ＢＧ−ＴＭＲ、ＴＭＲ−ＮＨＳ−エステルから合成、Molecular Probes製品Ｃ３００）で３０分間標識し、続いて培地を２回交換し、次に３０分間休止し、さらに培地を交換した場合、このＡＧＴ融合蛋白質は細胞膜に明白なシグナルをもたらす。テトラメチルローダミン用およびフルオレセイン用のフィルタセットを備えた逆位Zeiss蛍光顕微鏡Axiovert40CFLで全画像化を行う。同ステップ順序に続いて、５μM  Ｏ6−Ａｔｔｏ４８８−ベンジルグアニン（ＢＧ−ＡＴＴＯ４８８、Atto-Tec Siegen, D, Prod. No. AD 488-2）でインキュベーションしても、有意な細胞標識は観察されない。これは、ビス−スルホン化Ａｔｔｏ４８８誘導体が非常に低い細胞膜透過性しか有していないことを示している。コンジュゲートＯ6−ＡＴＴＯ４８８−Ｃ8−ＴｙｒＡｒｇ9Ｃｙｓ（６０、実施例４２）が同じ条件下、５μM濃度で使用される場合、細胞膜の主要標識によって有意な細胞内染色が観察される。これは、ベンジルグアニン誘導体が細胞透過性でない場合でも、ポリ−アルギニンリンカーの導入が透過性を増大させることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２８７】
【図１】対象となる蛋白質（Ｐ）およびＡＧＴを含む融合蛋白質と、式Ｒ1−Ａ−Ｘ−ＣＨ2−Ｒ3−Ｒ4−Ｌ1の基質との反応を示す模式図である。
【図２】ＡＧＴＭ−ＣＰＴＧの動力学的測定：発光ペルオキシダーゼ基質により検出したＡＧＴＭ−ＢＧＢＴ複合体の強度のウエスタンブロットを示す図である。実施例８を参照。変異体ＡＧＴＭ−６×Ｈｉｓのアリコットを、緩衝化した水溶液中で、１０倍過剰のＮ9−シクロペンチル−Ｏ6−（４−ブロモチオフェン−２−イル）−グアニン（ＣＰＴＧ）によりインキュベートする。所定の時間を経た後、ビオチン化Ｏ6−ベンジルグアニンによって反応が終了（ＢＧＢＴ、Juilleratら., Chem Biol 10: 313-317, 2003の基質３ａ）するが、これは蛋白質と非常に素早く反応し、それによって未反応ＡＧＴＭを捕獲すると考えられる。次いで、蛋白質をＳＤＳおよび熱で変性させる。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析にかける。対応するバンド強度は、化学発光染色によって検出する。
【図３】２種の蛋白質（〜２５kDaのＡＧＴＭ−６×Ｈｉｓ、０．２μM、および〜５０kDaの野生型ｈＡＧＴ−ＧＳＴ融合蛋白質、１．２μM）と、２種の基質Ｎ9−シクロペンチル−Ｏ6−（４−ブロモチオフェン−２−イル）−グアニン（ＣＰＴＧ、０、５、１０μM）、およびビオチン化Ｏ6−ベンジルグアニン（ＢＧＢＴ、５μM）の反応のウエスタンブロットを示す図である。実施例９参照。発光ペルオキシダーゼ基質によるＡＧＴＭ−ＢＧＢＴ複合体の検出は、図２に記載されている通りである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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