(57)【要約】  疎水性または脂質コーティングで被覆された、伝達因子および／またはハイブリッドグルカンのようなグルカンを含む組成物。組成物を、亜鉛、必須脂肪酸、乳酸産生菌等を含む栄養補助食品と併用することができる。また、これらの組成物を用いた動物疾患の予防および処置方法ならびにそれらの製造方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物に、疎水性または脂質コーティングにより封入された伝達因子を含む伝達因子製剤を投与することを含む方法。
【請求項２】
該疎水性コーティングが、必須脂肪および／または植物油を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該植物油が大豆油を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該製剤がさらにグルカンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該グルカンがハイブリッドグルカンである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該グルカンが、疎水性または脂質コーティングにより封入されている、請求項４記載の方法。
【請求項７】
該疎水性コーティングが、必須脂肪および／または植物油を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該植物油が大豆油を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該伝達因子が、標的伝達因子である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
該標的伝達因子が、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヘリコバクター・ピロリ、カンホバクター（Champhobactor）またはクラミジアである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該投与が予防を目的とする、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該投与が病的状態の処置を目的とする、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該病的状態が、心臓疾患、炎症疾患および血管疾患から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該投与が食物変換効率を高めるためである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
疎水性または脂質コーティングにより封入された伝達因子を含む組成物。
【請求項１６】
該疎水性コーティングが、必須脂肪または植物油を含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
該植物油が大豆油を含む、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
さらにグルカンを含む、請求項１５記載の組成物。
【請求項１９】
該グルカンがハイブリッドグルカンである、請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
該グルカンが、疎水性または脂質コーティングにより封入されている、請求項１８記載の組成物。
【請求項２１】
該疎水性コーティングが、必須脂肪および／または植物油を含む、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
該植物油が大豆油を含む、請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
該伝達因子が標的伝達因子である、請求項１５記載の組成物。
【請求項２４】
該標的伝達因子が、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヘリコバクター・ピロリ、カンホバクター（Champhobactor）またはクラミジアである、請求項２２記載の組成物。
【請求項２５】
動物に、疎水性または脂質コーティングにより封入されているグルカンを含む製剤を投与することを含む方法。
【請求項２６】
該グルカンがハイブリッドグルカンである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
該疎水性コーティングが、必須脂肪および／または植物油を含む、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
該植物油が大豆油を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該製剤がさらに伝達因子を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
該伝達因子が、疎水性または脂質コーティングにより封入されている、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該伝達因子の疎水性コーティングが、必須脂肪および／または植物油を含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
該伝達因子を封入する植物油が大豆油を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
疎水性または脂質コーティングにより封入されたグルカンを含む組成物。
【請求項３４】
該グルカンがハイブリッドグルカンである、請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
該疎水性コーティングが、必須脂肪または植物油を含む、請求項３３記載の組成物。
【請求項３６】
該植物油が大豆油を含む、請求項３５記載の組成物。
【請求項３７】
さらに伝達因子を含む、請求項３３記載の組成物。
【請求項３８】
該伝達因子が、疎水性または脂質コーティングにより封入されている、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
該伝達因子の疎水性コーティングが、必須脂肪または植物油を含む、請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
該植物油が大豆油を含む、請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
伝達因子およびハイブリッドグルカンを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（１）疎水性または脂質コーティングにより被覆された伝達因子および／または（２）疎水性または脂質コーティングで被覆された菌グルカンまたはハイブリッドグルカンのようなグルカンを含む封入組成物に関する。上記組成物は、病的状態の予防および処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
白血球およびリンパ球により生産される伝達因子は、細胞性免疫を刺激するかまたはある個体から別の個体および異なる種間でこれを伝達するが、アレルギー応答を生じることはない、約４４アミノ酸程度の小さな水溶性ポリペプチドである。伝達因子は抗体より小さいため、抗体仲介応答を伝達することも、抗体産生を誘導することもない。一伝達因子または複数伝達因子の特性、特徴および取得方法は、米国特許第４８１６５６３、５０８０８９５、５８４０７００、５８８３２２４および６４６８５３４号で開示されており、それらの内容は出典明示により本明細書中に援用される。
【０００３】
伝達因子は、単純ヘルペスウイルスの有効な治療法（Vizaら）、ざ瘡斑点の処置、米国特許第４４３５３８４号およびカンジダ・アルビカンス（C.albicans）に対する治療法（Khanら）として報告されている。伝達因子はまた、特異的伝達因子で処置された受容者において腸クリプトスポリジウム症を処置するのにも使用されている（McMeekingら）。Stillらはまた、鶏痘感染が、鶏痘を有するかまたは言い換えれば鶏痘(varicella)抗原に感作された個体からの伝達因子で処置された子供の前処置により阻止されることを示した。抗原特異的伝達因子については研究し尽くされており、経験済みの供与者の抗原認識能力を未経験の受容者に伝達できることが立証されている。伝達因子の供給源である個体または動物が興味の対象である抗原に感作されたと仮定され得る。本明細書において抗原なる語は、細胞性免疫応答を開始させるものであると定義される。しかしながら、動物（例、牛）のプールに由来する市販の牛初乳抽出物中に見出される伝達因子は、プールの全部からの後天的免疫性を含むことから、概括的な養子移入の一つのタイプを提供している。複数伝達因子または一伝達因子は、伝達因子を含む溶解細胞の透析可能抽出物または細胞外液の抽出物から入手され得る。伝達因子の一般的供給源は、初乳および卵子である。一般に実践されているところでは、伝達因子を含む調製物を活性成分の名称（すなわち、伝達因子またはＴＦ）により示している。本明細書では複数伝達因子を含む伝達因子抽出物についても伝達因子と称する。牛初乳抽出物由来の伝達因子は、公称１００００分子量フィルターを通過する脱脂水溶性物質として定義される。初乳由来の伝達因子は、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルスを含む様々な生物体に対する活性を伴うものとして製造されている。伝達因子の特異的効果の一つは、著しく高められたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性である。ナチュラルキラー細胞は、先天性免疫防御系の一部としてウイルスに対する防御作用を示す。
【０００４】
伝達因子はポリペプチドではあるが、驚くべきことに消化管中で安定であることが報告されている。例えば、Kirkpatrickは、臨床試験で伝達因子の経口対非経口投与を比較した。Kirkpatrick, Biotherapy, 9:13−16, 1996。彼は、消化管の酸性または酵素環境が伝達因子を用いる経口療法を阻むであろうという全ての主張を、これらの結果が論破するという結論に達した。
【０００５】
ＴＦの配列決定を試みたとき、伝達因子ペプチドのＮ末端が逐次エドマン分解に抵抗性であることが報告された。Kirkpatrick、Molecular Medicine、6(4):332−341(2000)。
【０００６】
伝達因子はまた、反芻動物を含む動物疾患および症候群を処置するための組成物において有効に使用されている。２００３年４月２４日公開の米国特許公開２００３／００７７２５４号参照。
【０００７】
従って、伝達因子は、消化管および第一胃では安定していると考えられた。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、伝達因子がかつて信じられていたほど安定しているわけではないという発見に基づいている。これは、反芻動物の場合に特に当てはまる。
【０００９】
本発明は、伝達因子および／またはグルカンが「封入」されている組成物を提供する。封入により、伝達因子および／またはグルカンは消化管での不活化から保護される。上記封入は、特に、第一胃内での消化に問題があることが見出された反芻動物の場合に重要である。伝達因子を封入し、反芻動物に投与したとき、高い生物学的利用能が立証された。好ましい態様において、伝達因子および／またはグルカンは、疎水性材料または脂質と混合して伝達因子および／またはグルカン周囲にコーティングを形成させることにより封入される。
【００１０】
封入伝達因子および／または封入グルカンを含む封入製剤は、鉱物、酸化防止剤、アミノ酸および他の栄養補助食品と合わせられ得る。本明細書で使用されている「封入製剤」は、封入伝達因子製剤および／または封入グルカン製剤をいう。従って、封入製剤は、封入伝達因子製剤、封入グルカン製剤、または封入伝達因子および封入グルカンの両方を含む封入製剤を包含し得る。
【００１１】
本発明の一局面は、予防を目的として動物に封入製剤を投与することである。
【００１２】
別の一局面は、病的状態、例えば心臓疾患、炎症および血管疾患の処置を目的として動物に封入製剤を投与することである。
【００１３】
別の一局面は、食物変換効率を高めるために封入製剤を動物に投与することである。
【００１４】
別の一局面は、伝達因子製剤、例えば１種またはそれ以上の標的伝達因子を含む封入製剤を提供することである。
【００１５】
本発明の別の一局面は、伝達因子が、例えば単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヘリコバクター・ピロリ、カンホバクター（Champhobactor）またはクラミジアを標的とする標的伝達因子を含む伝達因子製剤を提供することである。
【００１６】
本発明の別の一局面は、乳酸菌も含む封入製剤を提供することである。
【００１７】
本発明の別の一局面は、イノシトールヘキサホスフェート、オリーブ葉抽出物、アロエ抽出物粉末およびβ−シトステロールも含む封入製剤を提供することである。
【００１８】
本発明の別の一局面は、酵母抽出物も含む封入製剤を提供することである。
【００１９】
本発明の別の一局面は、アスコルビン酸も含む封入製剤を提供することである。
【００２０】
本発明の別の一局面は、リン酸二カリウムも含む封入製剤を提供することである。
【００２１】
本発明の別の一局面は、塩化カリウム、硫酸マグネシウムおよびパントテン酸カルシウムも含む封入製剤を提供することである。
【００２２】
本発明の別の一局面は、ビタミンＥも含む封入製剤を提供することである。
【００２３】
本発明の別の一局面は、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、およびビタミンＢ１２も含む封入製剤を提供することである。
【００２４】
本発明の別の一局面は、亜鉛、例えば亜鉛タンパク質化合物も含む封入製剤を提供することである。
【００２５】
本発明の別の一局面は、第一胃バイパスが、動物への伝達因子製剤の注射によって、例えば静脈内、筋肉内または皮下注射によって達成される、上記製剤を提供することである。
【００２６】
本発明の別の一局面は、第一胃バイパスが、動物への伝達因子製剤の膣内、鼻腔内、直腸内適用、粘膜への直接適用によるか、または食道溝の開口を誘導することにより達成される上記製剤を提供することである。
【００２７】
本発明の別の一局面は、様々な成分を合わせて製剤を作り出すことによる、本明細書記載の封入製剤の製造方法を提供することである。
【００２８】
別の一局面は、培養中の２種の異なる菌を、菌の細胞壁を分解する組成物、例えばヘビ毒と接触させることによるハイブリッドグルカンの製造方法を提供することである。これによって、２種の菌間で遺伝子交換が行われ、ハイブリッドグルカンおよび他のハイブリッド組成物を作り出すハイブリッド菌が形成され得る。
【００２９】
上記方法により製造されたハイブリッド菌並びに上記ハイブリッド菌で見出されるハイブリッドグルカンおよび他のハイブリッド分子もまた開示されている。
【００３０】
（図面の簡単な説明）
図１は、表７の封入伝達因子製剤を用いて得られた結果を示す。封入伝達因子で処置した動物を、伝達因子で処置しなかった対照と比較したとき、罹病率は１５.５％から３.１％に低下し、死亡率は５.５％から０％に減少した。さらに、対照の一日当たりの体重増加は、封入伝達因子製剤で処置した動物についての３.０５ ｌｂｓ／日に対して１.８５ ｌｂｓ／日であった。
【００３１】
図２は、高ストレス負荷牛を用いた異なるフィールドスタディーにおける表７の封入伝達因子製剤の使用を含む第２試験である。この試験において、動物の罹病率は、伝達因子を投与されていない対照と比較して封入伝達因子製剤で処置した動物では８３％から２.６％に低下し、死亡率は２４％から０％に減少した。さらに、対照集団は、封入伝達因子製剤で処置した動物についての３.１ ｌｂｓ／日と比較して０.９ ｌｂｓ／日の体重増加を示した。
【００３２】
（発明の詳細な記載）
本発明の封入製剤は、封入伝達因子および／またはハイブリッドグルカンを含む封入グルカンを含有する。伝達因子および／またはグルカンは、個々に封入されるか、または混合物として封入され得る。別法として、製剤全体が封入され得る。
【００３３】
様々な形態の伝達因子が本発明に従って使用され得る。それらは、伝達因子含有細胞、例えばリンパ球、白血球および卵子から放出され、細胞外液、例えば初乳および血液から集められた排出伝達因子を包含する。別の形態は、細胞内または細胞表面で見出される排出前伝達因子を包含する。また、白血球、初乳または卵子に由来し、１００００ダルトン未満の分子量および２１４ナノメートルでの吸光度単位当たり少なくとも５０００単位の比活性を有する実質的に精製された伝達因子も使用され得る。本発明の実施例で使用され、以下の表で示され、さらに詳細な記載の残りの部分で言及されている伝達因子は、泌乳中のウシの一般的プールから集められた初乳および卵子から抽出される。実施例、表および以下の記載で使用されている伝達因子は、公称１００００分子量フィルターを通過するウシ初乳からの脱脂水溶性物質として定義される。牛初乳由来伝達因子を用いることにより、本発明製剤は開発されたが、他の種類および供給源の伝達因子を用い得ることは当業者には周知である。
【００３４】
伝達因子の別の供給源には、トリ伝達因子、卵子伝達因子、およびウシ以外の動物、例えばヤギ、ブタ、ウマおよびヒトから集められた初乳から単離された伝達因子が包含されるが、それらに限定されない。さらに、かなり多数の供給源からの伝達因子の組合せも、本発明の製剤で使用され得る。伝達因子はまた、１種またはそれ以上の伝達因子を発現するように遺伝子操作される組換え細胞から、または白血球のクローン増殖により誘導され得る。
【００３５】
別の種類の伝達因子としては、標的伝達因子が包含されるが、それに限定されない。ターゲット伝達因子には、（１）１種またはそれ以上のウイルス性または他の感染性生物体、（２）免疫応答を生じさせる１種またはそれ以上の抗原、または（３）生物体および抗原の組合せに暴露された供給源から集められた伝達因子が含まれる。上記ウイルス性または他の感染性生物の例には、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ヘリコバクター・ピロリ、カンホバクターおよびクラミジア、ウシ鼻気管炎ウイルス、パラインフルエンザ、ＲＳウイルスワクチン、修飾生ウイルス、カンピロバクター・フィータス、レプトスピラ・カニコーラ（Leptospira Canicola）、グリッポチフォーサ、ハージョ（Hardjo）、レテロヘモラジエ（Leterohaemorrhagiae）、ポモナ（Pomona）・バクテリン、牛ロタ−コロナウイルス、大腸菌（Escherichia Coli）バクテリン、クロストリジウム・ショウベイ（Clostridium Chauvoei）、セプティクム（Septicum）、ヘモリティクム（Haemolyticum）、ノービ（Novy）、ソルデリー（Sordellii）、パーフリンゲンス（Perfringens）ＣおよびＤ型、バクテリン、トキソイド、ヘモフィルス・ソムヌス（Haemophilus Somnus）、パスツレラ・ヘモリティカ（Pasteurella Haemolytica）、ムルトシダ（Multocida）・バクテリンが含まれる。しかしながら、当業者であれば、広く多様な他のウイルスおよび他の感染性生物が本発明で使用され得ることは容易に認めるはずである。例としては、付表１および付表２に示されたものがある。
【００３６】
表１は、モンモリロナイトの典型的成分を示す。
【００３７】
表２〜６は、様々な動物および病状を処置するのに使用されてきた伝達因子製剤を示す。それぞれの場合において、伝達因子は、本明細書で示された要領では封入されていない。しかしながら、これらの製剤のそれぞれにおける伝達因子は、製剤の他の成分と混合する前に疎水性または脂質コーティングで容易に封入され得る。
【００３８】
表２は、クッシング症候群、クッシング病、腺腫、オンコセルカ症、甲状腺機能低下またはＥＰＭの処置を目的とする伝達因子栄養補助食品および担体の製剤の崩壊を示す。表２および他の表全てにおいて、「ｌｂ」（ポンド）とあるのは、体重のポンドを意味する。
【００３９】
表２〜６の２、３および４列目は、単一用量で動物に与えられる、体重１ポンド当たりの量で表した、処方成分のそれぞれ概算的な高用量、低用量、および好ましい量を示す。表３および４における製剤は、表２の製剤と酷似しているが、それらはイヌおよびネコにそれぞれ特化されている。表２に示されている製剤は、主として家畜用に設計されている。５列目に列挙した５オンスの処方は、１０００ポンドの動物に与えられるように設計されているが、これは変化するものであり、場合によっては５００ポンドの動物にも与えられ得る。平均的なウマは１０００ポンド前後である。表３における２８.３ｇ用量は、体重約１００〜２００ポンドのイヌについて算出されているが、その用量は１５ポンドのイヌにも投与され得る。表４における２.２ｇの処方は、体重１５ポンド前後のネコに関するものである。しかしながら、これらの製剤は、栄養補助食品および伝達因子を含んで構成されるため、当業者であれば、これらの範囲は確定的なものではなく、また逆症療法薬剤についての範囲ほど重要ではないことを認めるはずである。
【００４０】
さらに、表２〜４における製剤は、主に慢性疾患を処置すべく設計されており、表５における製剤は、主に急性疾患について設計されており、表６における製剤は、急性および慢性疾患の両方に関するものである。製剤は全て、急性応答を達成するべく大量投与され得る。
【００４１】
表７は、病状を処置するための封入伝達因子製剤を提供する。この伝達因子製剤は、少なくともウシおよびトリの両供給源に由来する封入伝達因子、および／または１種またはそれ以上のハイブリッドグルカンを含む。この製剤のグルカン部分もまた封入されるのが好ましい。他の成分には、亜鉛タンパク質化合物、標的トリ伝達因子、β−シトステロール、イノシトールヘキサホスフェート（ＩＰ６）、オリーブ葉抽出物、アロエ抽出物粉末、プロバイオティクス、バシラス・サブチリス（B.subtlis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・テルモフィリウム（B.thermophilium）、ラクトバシラス・アシドフィルス（L.acidophilus）、エンテロコッカス・フェシウム（E.faecium）、およびスタフィロコッカス・セレヴィシエ（S.cerevisia）が含まれる。好ましい態様では、前述のものは全てこの伝達因子製剤に含まれる。
【００４２】
好ましい封入態様において、伝達因子は、１０ｍｇ〜１２ｇ／ｏｚ、さらに好ましくは１００ｍｇ〜６ｇ／ｏｚおよび最も好ましくは１０ｍｇ〜３ｇ／ｏｚの量で製剤中に存在する。
【００４３】
伝達因子は、好ましくは伝達因子の２５％から１５０重量／％の間、約５０〜１５０重量／％および約７５〜１２５重量／％であり、最も好ましいのは等重量である疎水性または脂質コーティングにより封入されている。
【００４４】
好ましい態様において、本発明で使用されているハイブリッドグルカンは、コルジセプス（Cordyceps、冬虫夏草）、特にコルジセプス・シネンシス（Cordyceps sinensis）のハイブリッド株に存在するかまたは由来する。コルジセプスのハイブリダイゼーションを誘導する一技術としては、実施例１７および１８で詳細に記載されている要領に従ってガラガラヘビ毒液を接種しておいた単一寒天平板上で２種の異なる株または種を平板培養することが含まれる。その記載によると、ヘビ毒液にはコルジセプス株／種の細胞壁を弱める作用があり、それによって株／種を互いに近づけて培養したときに、それらの間で核物質の交換が行われ得る。好ましい態様において、本発明のハイブリッドグルカンを生産するハイブリッド株は、カリフォルニア、サンタクルス、パシフィック・マイコ・プロダクツから入手可能なコルジセプス・シネンシス・アロハエンシス（Cordyceps sinensis Alohaensis）である。
【００４５】
多くの異なるコルジセプス・シネンシス株が存在し、それらの変化に富む無性菌糸生長形態故に、それらは多くの分類学者により異なる種であるとみなされてきた。例えばペシロマイセス・ヘピアリ・チェン（Paecilomyces hepiali Chen）、セファルスポリム・シネンシス（Cephalsporim sinensis）、ペシロマイセス・シネンシス（Paecilomyces sinensis）Ｃｎ８０−２、シダリルム類（Scydalilum sp.）、ヒルスツテラ・シネンシス（Hirstutella sinenis）、モルチエレラ・ヘピアリ（Mortierella hepiali）チェン・ル（Chen Lu）、トピクラジウム・シネンシス（Topycladium sinensis）、シタリジウム・ヘピアリ（Scytalidium hepiali）G.L.Liといった株が挙げられるが、これで全て網羅したわけではない。本発明の好ましい態様では、これら種々の株の１種またはそれ以上のハイブリッドからのハイブリッドグルカンを利用しているが、本発明は、別法として非ハイブリッド株からのグルカンを優先的に含み得る。別の態様では、全ハイブリッドコルジセプス、例えばコルジセプス・シネンシス・アロハエンシスを使用する。ハイブリッドグルカンはまた、飼料供給源、例えばオート麦等を交雑することにより得られたものも包含する。
【００４６】
グルカンまたはハイブリッドグルカンを使用するとき、製剤は、好ましくは１０ｍｇ〜１８ｇの全生物体／ｏｚ、さらに好ましくは１００ｍｇ〜１０ｇの全生物体／ｏｚおよび最も好ましくは１００ｍｇ〜５ｇ全生物体／ｏｚを含む。
【００４７】
等量の精製または部分精製グルカンまたはハイブリッドグルカンおよびそれと関連したヌクレオシド（例、コルジセピン（３'デオキシアデノシン）、アデノシンおよびＮ６−（２ヒドロキシエチル）−アデノシン）もまた使用され得る。
【００４８】
封入伝達因子の場合と同様、疎水性または脂質コーティングの量は、ハイブリッドグルカンの約２５％から１５０重量／％の間、約５０〜１５０重量％、または約７５〜１２５重量／％であるのが好ましく、等重量が最も好ましい。
【００４９】
製剤の他の成分もまた封入され得る。例えば、ＩＰ６ β−シトステロール、オリーブ葉抽出物、アロエ抽出物および／またはビタミンＣは、個々に封入され得るかまたは封入前に１種またはそれ以上の成分と合わされ得る。好ましい態様において、ＩＰ６は、１０ｍｇから３ｇ／ｏｚの間、または好ましくは１００ｍｇから２ｇ／ｏｚの間、そして最も好ましくは１００ｍｇから１ｇ／ｏｚの間の量で存在する。β−シトステロールは、好ましくは１０ｍｇから３ｇ／ｏｚの間、または好ましくは１００ｍｇから２ｇ／ｏｚの間、そして最も好ましくは１００ｍｇから１ｇ／ｏｚの間の量である。オリーブ葉抽出物は、好ましくは２ｍｇ〜２ｇ／ｏｚ、さらに好ましくは５ｍｇから１ｇ／ｏｚの間、そして最も好ましくは５ｍｇから５００ｇ／ｏｚの間の量で存在する。アロエ抽出物は、好ましくは２ｍｇから１０００ｍｇの間、さらに好ましくは５から５００ｍｇ／ｏｚの間、そして最も好ましくは５から２５０ｍｇ／ｏｚの間の量で存在する。ビタミンＣは、１０ｍｇ／ｏｚから１０ｇ／ｏｚの間、または好ましくは１００ｍｇから８ｇ／ｏｚの間、そして最も好ましくは１００ｍｇから５ｇ／ｏｚ間の量で存在し得る。
【００５０】
製剤で使用される伝達因子および／またはグルカンの量または投与される製剤の量は、提示された臨床症状の重篤度により変化する。さらに、受容者に投与される伝達因子の量は、受容者の種と比べて伝達因子が由来する種の方に左右される。畜牛に投与されるウシ種由来の伝達因子は、別種、例えばトリ種由来の伝達因子よりも有効であることが観察された。従って、伝達因子の供給源と受容者が異なる種であるとき、伝達因子の量を増加させるのが好ましい。
【００５１】
亜鉛および少なくとも１種の必須脂肪酸との封入伝達因子の製剤の投与は、クッシング症候群、クッシング病、腺腫および他の良性腫瘍、オンコセルカ症、甲状腺機能低下またはＥＰＭの少なくとも部分的に有効な処置結果をもたらすことが予測される。この処置は、表２に列挙された他の栄養補助食品を加えるとさらに有効である。特記しない場合、用量は１ポンド当たりのミリグラム数で示されている。他の好ましい栄養補助食品を含む５オンス伝達因子製剤に存在する成分の量は、表２の５列目に示されている。
【００５２】
約０.４９ｍｇ／ｌｂの亜鉛および２０.５７ｍｇ／ｌｂのカノーラ油、ベニバナ油または亜麻油といった必須脂肪酸（すなわち、３、６、９オメガ脂肪酸）の供給源との組み合わせ中約０.７５ｍｇ／ｌｂ伝達因子の用量での封入伝達因子を、クッシング症候群、クッシング病、腺腫または他の良性腫瘍、オンコセルカ症、甲状腺機能低下またはウマ原虫性脊髄炎に罹患した動物に１日１回与えると、良性腫瘍の大きさおよび／またはこれら列挙された疾病の症状のほぼ３０％〜５０％縮小がもたらされるはずである。勿論、これらの成分は全て、当然それらを投与されている動物にとって医薬上許容されるものである。
【００５３】
上記で列挙した伝達因子および他の脂肪酸栄養補助食品との組合せにおいて約２.１６ｍｇ／ｌｂでのビタミンＣおよび２.２９ｍｇ／ｌｂの酵母を組み合わせることにより、良性腫瘍の大きさおよび／または上記で列挙された疾病の症状の約４０％〜５０％縮小がもたらされるはずである。
【００５４】
本発明の全製剤においては、動物に消化され易い形態であり、またタンパク質化合物形態はｐＨに対する安定性も高いことから、金属栄養補助食品はタンパク質化合物を形成していることが好ましい。表２〜７の製剤における栄養補助食品成分は、様々な上記疾病および症候群を処置するための有効成分である。製剤を動物の嗜好に合うものとし、混合物の保存性を高めるために、増量剤および担体を含ませる。これらの例には、二酸化珪素、マルトデキストリン、大豆および落花生粉、落花生油、デキストロース、乳漿、香辛料および香味料がある。混合トコフェロールおよびコリンクロリドは栄養補助食品であるが、本明細書に記載されている有効な結果は、製剤からこれら２成分を削除することにより達成され得る。
【００５５】
反芻動物、例えばウシにおける非封入伝達因子のこれまでの使用は、著しく有益な成果をもたらすものであった。例えば２００３年４月２４日公開の米国特許公開第２００３／００７７２５４号参照、これについては出典明示により本明細書に援用する。それに続いて、ウシのストレス負荷集団において経口投与した場合、伝達因子は安定していないことが発見された。伝達因子が第一胃液および叢の存在下ではインビトロで不活化されることが発見された後、反芻動物での伝達因子による以前の成果は食道溝の存在によるものであることが決定された。ストレスをかけていないとき、食道溝は第一胃の部分バイパスを形成する。しかしながら、ストレス負荷集団では、食道溝が閉じるため、伝達因子製剤が第一胃へそらされる。伝達因子および／またはグルカンを疎水性物質または脂質で封入して封入製剤を形成させることは、ストレスをかけた集団でさえ、第一胃の実質的なバイパス（例、８５％）を形成させるのに十分であることが発見された。
【００５６】
第一胃についての様々な他のバイパス形成方法も知られている。一態様では、封入または非封入製剤を直接（皮下、筋肉内または静脈内）注射することにより、第一胃だけでなく消化器系全体についてバイパスを形成させる。同様に、膣内投与、直腸内投与または粘膜、例えば眼の結膜下への他の直接投与により、消化器系および特に第一胃にバイパスが形成される。別法として、製剤は、直接皮膚吸収を可能にする様々な溶媒と混合され得る。さらに、様々な反芻動物において刺激を加えて食道溝の開口を促す方法は、当業界では周知であり、上記開口の結果、第一胃についてバイパスが形成されることにより、消化管への経口投与製剤の直接通過が可能となる。
【００５７】
特に好ましい態様では、封入伝達因子製剤の使用により第一胃バイパスが容易に形成される。
【００５８】
封入伝達因子および／または封入グルカン製剤は、様々な方法で製造され得る。好ましい態様では、製剤における伝達因子および／またはグルカンは各々、米国特許第５１９０７７５号、同第６０１３２８６号および米国特許出願第２００３／０１２９２９５号記載の要領で封入され、これについては出典明示により本明細書に援用する。簡単に述べると、上記で挙げた特許および特許出願記載の方法は、封入製剤の浮動を阻止することにより第一胃からさらに消化器系へと製剤を通過させ易くするための、追加の界面活性コーティングと組み合わせた、第一胃の分解性に対し防御機能を果たす疎水性または脂質コーティングの使用を中心としている。疎水性コーティングの好ましい例には、各々パーム油、パーム仁油、綿実油、大豆油、トウモロコシ油、落花生油、ババス油、ヒマワリ油またはベニバナ油およびそれらの混合物から誘導または製造された、植物油および硬化植物油が含まれるが、これらに限定されるわけではない。さらに、上記コーティングは、例えば限定されるわけではないが、蜜蝋、石油ワックス（wad）、米ぬかワックス、ひまし油ワックス、微晶性ワックス、およびそれらの混合物のようなワックスと混合され得る。界面活性剤の好ましい例には、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコール、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、脂肪酸のラクチルエステル、脂肪酸のポリグリセリンエステル、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００５９】
上記封入製剤は、第一胃バイパスにおけるそれらの役割に加えて様々な利点を有する。まず、封入により製剤が分解作用から保護され、著しく長い貯蔵寿命がもたらされる。上記封入製剤は、動物飼料用としてのペレット形成または人間の消費用としての加工処理を含む多くの製造加工処理に必要な華氏１３５度を越える温度への加熱に耐え得る。また封入により、製剤に通常存在する苦味および臭気が除かれるため、口当たりが大きく改善される。また、封入により製剤に可撓性がもたらされるため、脆弱な成分と刺激の強い鉱物、塩類または変化し易いｐＨとの相互作用が回避される。
【００６０】
貯蔵寿命、熱安定性、嗜好性および可撓性が高められるため、封入製剤、例えば封入伝達因子製剤は、人間および動物による消費に好適である。人間の消費に好ましい態様としては、加工食品、例えばシリアル、スナック、チップまたはバーにおける封入伝達因子製剤の組込みが含まれるが、これに限定されるわけではない。動物の消費に好ましい態様には、飼料ペレット、家畜用岩塩、糖蜜リックまたは他の加工飼料製品中に混合させた封入伝達因子製剤があるが、これらに限定されるわけではない。
【００６１】
封入伝達因子製剤は、食物変換効率を高めるのに使用される。食物変換効率は、生物体が食物を体重に変換させ得る割合であり、飼料変換効率としても畜牛業界では周知である。封入伝達因子製剤は、処置牛が罹患している状況でさえ、非処置牛と比べて高い割合で牛の体重を増加させるのに使用され、成果をあげてきた。従って、封入製剤は、病状の予防および処置に限定されるわけではなく、全体的な生物体の健康および発達の他の局面においても有用である。
【００６２】
本発明の封入伝達因子製剤は、投与に適切な医薬組成物を含む。好ましい態様では、医薬組成物は水溶性形態をしており、例えば医薬上許容される塩として存在するが、この塩とは、酸および塩基付加塩の両方を包含するものとする。「医薬上許容される酸付加塩」とは、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、燐酸など、並びに有機酸、例えば酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などにより形成された、遊離塩基の生物学的有効性を保持し、生物学的またはその他の点で有毒なものではない塩類をいう。「医薬上許容される塩基付加塩」には、無機塩基、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などから誘導されたものが含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩である。医薬上許容される有機非毒性塩基から誘導された塩類には、第１級、第２級および第３級アミン、天然に存する置換アミンを含む置換アミン、環状アミンおよび塩基性イオン交換樹脂、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンの塩類がある。
【００６３】
医薬組成物はまた、下記の１種またはそれ以上を含み得る：担体タンパク質、例えば血清アルブミン、緩衝液、例えば酢酸ナトリウム、増量剤、例えば微晶性セルロース、乳糖、コーンおよび他の澱粉、結合剤、甘味料および他の香味料、着色剤、およびポリエチレングリコール。添加物は当業界では周知であり、様々な製剤で使用されている。
【００６４】
さらなる態様において、医薬組成物はミセル製剤で加えられる。米国特許第５８３３９４８号参照、これについては出典明示により本明細書に援用する。
【００６５】
医薬組成物の組合せも投与され得る。さらに、組成物は、他の療法と組み合わせて投与され得る。
【００６６】
１４日間にわたる、表２、３または４の５列目における製剤のいずれかについて体重１ポンドにつき１４１ｍｇの一日用量は、ネコ肺炎、ネコ白血病、ネコ自己免疫機能不全、ネコノミ咬症皮膚炎、ネコ甲状腺機能亢進、ネコウイルス感染症、ネコ潰瘍、ネコ細菌感染症、イヌノミ咬症皮膚炎、イヌクッシング病、悪性腫瘍、イヌ自己免疫機能不全、イヌウイルスおよび細菌感染症の処置において成果をあげている。これらの治療により、大部分は完全治癒に至っている。これらの製剤における封入伝達因子の使用は、同じかまたはさらに良い結果をもたらすと予測される。
【００６７】
良性腫瘍のある動物に好ましい用量で表２の栄養補助食品を全て含む製剤を投与すると、良性腫瘍の大きさの約６０％縮小および上記で列挙した疾病および症候群に罹患している動物が呈する症状の約９０％縮小がもたらされた。これらの製剤における封入伝達因子の使用は、同じかまたはさらに良い結果をもたらすと予測される。
【００６８】
上記表の３列目における低用量で表２の栄養補助食品を全て投与すると、腫瘍の大きさの約７％〜１００％縮小および／または上記疾病または症候群に罹患している動物が呈する症状の３０％〜１００％縮小がもたらされた。これらの製剤における封入伝達因子の使用は、同じかまたはさらに良い結果をもたらすと予測される。
【００６９】
表５におけるストレス製剤はまた、多くの動物疾患および症候群そして前述した通り、主にそれらの急性段階を処置するのに使用される。また、この製剤は水溶性であるため、動物の飲用水で与えられ得る。約０.７５ｍｇ／ｌｂの伝達因子および約１.４２ｍｇ／ｌｂのラクトバシラス・アシドフィルス（lactobacillus acidophilus）１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）の混合物を１日２回与えると、腺疫、ダストによる咳、甲状腺機能不全およびリンパ球減少症から生じる臨床症状の少なくとも３０％縮小がもたらされる。同一用量を若年の牛に与えても、罹病率は約３０％減少する。１日２回の上記量の伝達因子および乳酸菌にほぼ表５の４列目の量でカルシウム、マグネシウム、ナトリウムおよびカリウムのイオン塩またはキレートを加えると、上述の疾病の臨床症状が４０％低減化する。上記製剤に約０.４８２ｍｇ／ｌｂのクエン酸を加えると、上述の疾病の症状が約４５％縮小される。さらにビタミンＡ、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、ＣおよびＥ、およびチアミンを加えると、これらの疾病の症状は５０％低減化する。表５の４列目に提示された用量で１日１回または２回ストレス製剤を与えると、自己免疫ダスト咳、ウイルス病因による下痢、腺疫での膿瘍、腺疫での鼻たれ、ブタにおける急性ウイルス血症、ウマにおける繋皹（グリース踵）、繋皹およびオンコセルカ症からの過敏症、ＰＵＲＲＳ、ＢＲＤ、子ウシの赤痢、大腸菌感染症、ロードコッカス（Rhodococcus）感染症、クロスチジウム（Clostidium）感染症、トリにおけるサーコウイルス、およびネコにおける肺炎の症状は、治癒に至るかまたは少なくとも治療および低減化される。伝達因子および乳酸菌の組合せまたはこの組合せをさらに表５に示された酵母と合わせたものも、これらの疾病を治療するが、範囲は限られている。封入伝達因子の使用は、同じかまたはさらに良い結果をもたらすと予測される。
【００７０】
また、１日１回または２回与えられる表５に示されているストレス製剤は、家畜の体重増加および飼料効率を高める。体重増加は少なくとも８％の率で高められる。伝達因子および乳酸菌の組合せまたはこの組合せをさらに表５に示された酵母と合わせたものも、体重増加を促すが、範囲は限られている。封入伝達因子の使用は、同じかまたはさらに良い結果をもたらすと予測される。好ましい態様では、１ｇのハイブリッドグルカンを含む２ｇの封入ハイブリッドグルカンを使用する。
【００７１】
表６は、多くの疾病、例えば関節炎、蹄葉炎、炎症および悪性腫瘍の治療および治癒を目的とする伝達因子および栄養補助食品の高効能製剤の分解を示す。これらの疾病はまた、伝達因子およびスーパーオキシドジスムターゼ；伝達因子およびグルコサミン塩；伝達因子、グルコサミン塩およびスーパーオキシドジスムターゼ；伝達因子、グルコサミン塩、スーパーオキシドジスムターゼおよびグリシン；伝達因子、グルコサミン塩、スーパーオキシドジスムターゼ、グリシンおよびメチルスルホニルメタン；伝達因子、グルコサミン塩、スーパーオキシドジスムターゼ、グリシン、メチルスルホニルメタンおよびオクトコソノールまたは伝達因子、グルコサミン塩、スーパーオキシドジスムターゼ、グリシン、メチルスルホニルメタン、オクトコソノールおよびモンモリロナイトの組合せで処置され得る。
【００７２】
表７は、伝達因子ならびにハイブリッドおよび非ハイブリッドの両グルカンを含む製剤を示す。
【００７３】
上述の製剤はいずれも封入製剤に組込まれ得る。
【００７４】
【表１】
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【表２】
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【００７５】
【表３】
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【表４】
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（＊）乳酸菌は、成分の３分の２であり、酵母は３分の１である。乳酸菌は５００００００００ＣＦＵ／ｇ、酵母（例、「サッカロマイシス」(Saccharamyces)）２５０００００００ＣＦＵ／ｇである。
【００７６】
【表５】
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【表６】
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（＊）乳酸菌は、成分の３分の２であり、酵母は３分の１である。乳酸菌は５００００００００ＣＦＵ／ｇ、酵母（例、「サッカロマイシス」(Saccharamyces)）２５０００００００ＣＦＵ／ｇである。
【００７７】
【表７】
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【表８】
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（＊）乳酸菌は、成分の３分の２であり、酵母は３分の１である。乳酸菌は５００００００００ＣＦＵ／ｇ、酵母（例、「サッカロマイシス」(Saccharamyces)）２５０００００００ＣＦＵ／ｇである。
【００７８】
【表９】
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(＊)１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇ
【００７９】
【表１０】
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＊これらの量は、体重約４５０〜１０００ポンドの家畜、体重約１５０ポンドのヤギ、並びに体重約８〜約１５ポンドのイヌおよびネコについて計算されている。
１伝達因子の量は種によって変わり得るが、他の成分の量は各種について同一のままである。
【００８０】
【表１１】
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＊これらの量は、体重約４５０〜１０００ポンドの家畜、体重約１５０ポンドのヤギ、並びに体重約８〜約１５ポンドのイヌおよびネコについて計算されている。
１安定化有効成分は、５０％大豆油および５０％有効成分の製剤に含有される。
【００８１】
以下、実施例により、本発明を用いる方法をさらに詳しく説明し、さらには本発明の様々な局面を実施するのに考えられる最善の方法を示す。これらの実施例は、決して本発明の真の範囲を限定するものではなく、単に説明目的で提供されているものとする。特許、特許出願、出版物およびそこに引用されている参考文献については全て、出典明示により本明細書に援用する。
【実施例】
【００８２】
実施例１
１群
２４０頭の交雑種の若年雌牛を、各々８０頭の牛から成る３群に無作為に分けた。それらを個々に秤量し、伝染性ウシ鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、死菌ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤ）、修飾生ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス（ＢＲＳＶ）および死菌パラインフルエンザ−３（ＰＩ３）ウイルスから成る組合せ修飾生ウイルスワクチン、７種のクロストリジウムに対する多価バクテリン−トキソイド、ドルメクチン駆虫薬（イボメック）、およびプロゲステロン移植片を与えた。処置の１０日後、最初に牛に与えたのと同じ修飾生ワクチンを含むブースターをそれらに与えた。平均体重４４０.１ポンドの牛８０頭から成る第１セットには、処置の時点で投薬シリンジを介して１オンスの水に溶かした形で、表５の５列目に示されたストレス製剤の１オンス用量を投与する。その後、飼料（総混合飼料−ＴＭＲ）に混ぜて１日１オンス用量のストレス製剤を、処置後４日間それらに与えた。平均体重４４０ポンドの牛８０頭から成る第２セットには、初回処置時点で１.５ｍｌ／ｃｗｔのチルミコシン（ミコチル）を与えた。平均体重４４９.９ポンドの牛８０頭から成る第３セットについては対照として扱った。処置後２６日間上記セットを観察した時点で、牛を各々再び秤量し、各群について集合的に飼料効率を計算した。
【００８３】
２群
２００頭の交雑種の若い繁殖用雌牛を、各々５０頭の牛から成る４群に無作為に分けた。１群における家畜と同様にそれらを処置した。平均４４１ポンドの牛５０頭から成る第１セットには、５日間それらのＴＭＲに混ぜた形で１日当たり表４、５列目に示したストレス製剤１オンスを与えた。平均４３３ポンドの牛５０頭から成る第２セットには、５日間それらのＴＭＲに混ぜた形で同ストレス製剤２分の１オンスを与えた。平均４４７ポンドの牛５０頭から成る第３セットには、初回処置時点で１ｃｗｔ当たり早期処置的(metaphylactic)１.５ｍｌのチルミコシンを与えた。平均４３２ポンドの牛５０頭から成る第４セットについては、対照として扱った。全４セットにおける各雌牛には、初回処置の１０日後ＩＢＲ、ＰＩ３、ＢＶＤおよびＢＳＶワクチンブースターの修飾生ウイルス組合せを与えた。それらの群を２６日間観察した時点で、牛を各々再び秤量し、各群について飼料効率を集合的に計算した。
【００８４】
重量増加の一元統計分散分析を行った。１型誤差率としてアルファ＝０.０５を用いてＦ検定およびＬＳＤ平均分離を行った。ソフトウェアはＳＡＳ（１９９９）、procedureＧＬＭであった。
【００８５】
使用したＢＲＤ罹病率の統計分析：有意であると解釈される０.０５またはそれ未満の確率でのフィッシャーの正確確率検定によるカイ２乗分析により、群間の罹病率の差異を解明する。
【００８６】
結果を下記表８および９に列挙する。
【００８７】
１群については、処置日に投薬シリンジを介した１オンスの水溶液中のストレス製剤１オンスおよび処置後４日間ＴＭＲに添加されたストレス製剤１日当たり１オンスで処置された若年雌牛８０頭からは病気で引抜かれた要治療牛（すなわち、治療を要する病気の雌牛）は無かった。対照群からはＢＲＤについて１７頭の病気で引抜かれた要治療牛および４頭の再度引抜かれた要治療牛があり、チルミコシンセットからは１２頭の病気で引抜かれた要治療牛および１頭の再度引抜かれた要治療牛があった。
【００８８】
１群ストレス製剤セットにおける若年雌牛は、２６日の試験期間中３.６３ポンドの平均一日体重増加を示しており、これは他の２セットと比較した場合統計的に有意である。チルミコシンおよび対照セットの平均一日体重増加（ＡＤＧ）は、それぞれ２.９６および３.０８ポンドであった。ストレス製剤、チルミコシンおよび対照セットについての飼料効率は、それぞれ６.７３、６.９４および６.６６であった。
【００８９】
２群の１オンスストレス製剤投薬セットにおける若年雌牛は、３.２ポンドの平均一日体重増加を示し、２分の１オンスストレス製剤投薬セットにおける若年雌牛は、３.０５ポンドの平均一日体重増加を示した。チルミコシンおよび対照セットは、それぞれ２.８８ポンドおよび２.９２ポンドの平均一日体重増加を示す。１オンスストレス製剤についての飼料効率は、５.３１であり、２分の１オンスストレス製剤、チルミコシンおよび対照セットについての値は、それぞれ６.０９、６.１０および５.９９である。
【００９０】
処置当日から始まり、５日間総混合飼料に添加された１日当たり１オンスのストレス製剤を受けた若年雌牛５０頭のセットでは、ＢＲＤ治療に関して１１頭の病気で引抜かれた要治療牛および再度引抜かれた要治療牛があり、５日間牛のＴＭＲ中に添加された２分の１オンスのＴＦを受けた群ではＢＲＤ治療に関して１３頭の病気で引抜かれた要治療牛および４頭の再度引抜かれた要治療牛があった。３０日の試験期間中、チルミコシンセットからは５頭の病気で引抜かれた要治療牛および２頭の再度引抜かれた要治療牛があった。若年雌牛の対照セットにおいては、１１頭のＢＲＤ罹病で引抜かれた要治療牛および２頭の再度引抜かれた要治療牛があった。
【００９１】
１群におけるセット間での病気で引抜かれた要治療牛の割合の差異を比較すると、ストレス製剤は、２６日の試験期間中ＢＲＤに対する顕著な防御効果を与えると思われた。ストレス製剤はまた、平均一日体重増加を著しく高めた。
【００９２】
２群では、両セットにおける若年雌牛は、他の２セットの若年雌牛よりも優れた体重増加を達成した。しかしながら、２群では、ＢＲＤからの防御効果は、チルミコシンの場合より劣ると思われる。１群および２群間でＢＲＤに対するＴＦの効果を比較したとき、２群の若年雌牛が処置中に投薬シリンジを介したストレス製剤の初回用量を受けなかったことが十分に理解されるまで、結果は矛盾していると思われた。この証拠は、どの対象も、全体的にＴＭＲを介したストレス製剤の投与に頼るのではなく、少なくとも完全な初回用量が投与されることを確実にするための投薬シリンジまたはカプセルによる初回用量の投与を強く主張するものである。２つのストレス製剤セットにおいて引抜かれた要治療の若年雌牛は、最初の重大なストレスに満ちた日にＴＭＲの全分量を食べなかった可能性があるため、免疫系を刺激するのに十分な量のストレス製剤を受け入れなかったことになる。
【００９３】
完全な１日１オンスのストレス製剤を与えられた若年雌牛を、１日に半オンスを与えられたセットと比較したとき、若年雌牛の能力に顕著な差異は無い。両投薬量が最初に投薬シリンジまたはカプセルを介して投与されても、差異は大したものではないという可能性は非常に高い。
【００９４】
ここで、２群における他のセットによる体重増加の値を大きく凌ぐストレス製剤セットによる体重増加の値は、ストレス製剤セットにおけるＢＲＤ治療の費用を補って余りあるものであったということに注目すべきである。
【００９５】
これらの試験における若年雌牛のような前もって条件付けしていない高危険度の牛では、ワクチン投与と一緒にストレス製剤により免疫系を直接刺激することにより、実際にＢＲＤに対する免疫レベルを高めると思われた。ストレス製剤は、抗生物質処置の必要性を低下させるか、および／または抗生物質療法の有効性を高めると思われた。
【００９６】
【表１２】
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【００９７】
【表１３】
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【００９８】
実施例２
カリフォルニア、フォート・ビドウェルの牛群は、死亡率が６３％および罹患率が９０％である子牛の赤痢についての慢性的な問題を抱えていた。この問題は７年間続いていた。改善を全くもたらさなかった処置には、抗生物質テトラサイクリン、ミコチル、硫黄およびペニシリンと他の従来処置、例えば液状製剤および抗下痢薬、例えばカオペクテートの併用が含まれた。カリフォルニア大学、Davisおよびワシントン大学は、解決策を提供できなかった。各々体重１００ポンド前後の４０頭の試験子牛を、２日間ゼラチンカプセルで送達される表５、５列目に示されたストレス製剤１日１オンスで処置し、６０頭の子牛については予防薬を何も投与しない対照として扱った。試験子牛では、薬物治療が手遅れであったため１頭は死亡したが、他の試験動物はいずれも病気の症状を全く呈しなかった。しかしながら、対照子牛は、前年度までと同様９０％の率で赤痢を有していた。子牛から赤痢が途絶え、子牛が治癒した直後にそれらをストレス製剤で処置した。群れの新たな子牛は、ゼラチンカプセル中の表５、５列目に示されたストレス製剤１オンスで処置されており、それらは、２日間１日１ゲルカプセルにより試験子牛と同じ結果を示した。ストレス処方プロトコールで処置された群れの残り２０頭の子牛は、牧草を食べていることが判明しており、試験子牛より７％重く、毛並も姿勢も優れている。同様の赤痢問題を抱えた子牛を飼っている近隣の牧場主もまた、ストレス処方プロトコールの試験を開始し、同様の成果をあげた。
【００９９】
実施例３
ペンシルベニアの農場は、自分の子牛を全て失っている卵子ドナーの雌牛４０頭を飼っており、雌成牛の中には病気であると思われる牛もいた。オハイオ大学は、雌牛および子牛をクロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium Perfrengens）Ａ型に罹患しているものとして診断した。雌牛および子牛を初めに幾つかの利用可能な抗生物質で処置したが、成果は無かった。子牛に関する罹病率は１００％であり、死亡率は８０％であった。生後７日間、表５、５列目に示されたストレス製剤１日１オンスで各々体重約８０〜１００ポンドの子牛を処置することからプロトコールが開始された。これらの子牛には抗生物質を全く与えなかった。このプロトコールの開始以来、約３０頭の子牛を処置したが、この群れでは赤痢は全く観察されず、死亡した子牛も無かった。
【０１００】
実施例４
ネブラスカ、コロンバスにおける１３０頭の雌牛および子牛の群れは、大腸菌起源の慢性赤痢に悩まされていた。子牛の約６０％は罹患していると思われた。抗生物質および液状製剤による処置はある程度の成果を上げたものの、死亡率は約１０％であった。各々体重約８０〜１００ポンドである赤痢に罹患している子牛１０頭を、３日間、表５、５列目に示されたストレス製剤１オンスで毎日処置した。プロトコールでの３日後、１０頭の子牛はもはや赤痢の徴候を呈しなかった。しかしながら、未処置の子牛は依然として赤痢の問題を抱えていた。
【０１０１】
実施例５
ネコ（表４、５列目に示されている２.２ｇ／日）、イヌ（表３、５列目に示されている２８.３７ｇ／日）およびウマおよびウシ（表２、５列目に示されている５ｏｚ／日）における５０症例を越える良性腫瘍を、プレミックス製剤で処置した。これらの腫瘍は、良性類肉腫から乳頭腫の範囲に及ぶ。一般に、腫瘍は４０％から８０％低減化され、場合によっては緩解することもあった。悪性腫瘍、例えば口腔扁平上皮癌は、表３の５列目に示されたプレミックス製剤２８.３７ｇ／日を投与されているイヌおよび表４の５列目に示されたプレミックス製剤２.２ｇ／日を投与されているネコでは低減化されていた。
【０１０２】
実施例６
ちょうど雌牛から離乳した体重４５０ポンドの１００頭のウシを、大牧場からトラックで２時間かけて飼養場に運んだ。予防接種した牛の５０頭を、常用の予防接種を行い、駆虫薬を与え、ミコチルを一回注射し、対照として扱う。他の５０頭の牛に予防接種し、駆虫薬を与え、各々表５で示されている１５００ｍｇの伝達因子および１４１８ｍｇの乳酸菌を含む溶液１オンスを投与する。この用量を、さらに４日間試験牛の各々に経口投与する。伝達因子および乳酸菌を与えて３０日後、試験牛は、ミコチル投与牛より各々１０ポンド重かった。
【０１０３】
実施例７
分娩中の雌牛１００頭が、所定の従来処置で子牛罹病率８０％および死亡率３０％という深刻なクロストリジウム・パーフリンゲンスＡ型の大発生を被っていた。各々体重約１１０ポンドの子牛に、連続２日間７５０ｍｇの伝達因子および１４１８ｍｇのラクトバシラス・アシドフィルス（１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇ）を与えたところ、クロストリジウム感染症の発病は、２０％に低下し、死亡率は５％に低下した。
【０１０４】
実施例８
各々体重約６００ポンドの若い食肉牛５００頭を、大牧場から６時間トレーラーで運んだ後、飼養場に入れ、即座に処置（すなわち、駆虫薬投与および予防接種）した。２５０頭または他の約半数の子牛に、表５に従って７５０ｍｇの伝達因子、２８３ｍｇの酵母、および２３６８ｍｇの乳酸菌を与える。残りの子牛に処置を施し、ミコチルを与えるか、またはリクアルナイシン（Liquarnycin）およびサルファ（sulfa）を与えることにより、推奨用量で種々の製品を試験する。４０日後、伝達因子、酵母、および乳酸菌を与えた子牛は、他の子牛より１２ポンド重くなっており、伝達因子などを与えた子牛では、他の子牛より罹病率が３０％少なかった。屠体収量データは、伝達因子を与えた牛について、リブロースが大きく、屠体廃棄量が少なく、収率が高いという主要な改善を示していた。
【０１０５】
実施例９
乳牛１００頭の小群では、その最初に生れた子牛がクロストリジウム・パーフリンゲンスＡ型慢性赤痢に罹患していた。子牛は慣用的処置により死にかけていた。残りの子牛を、生後５日間、表５に示されている１３００ｍｇの伝達因子および１４１８ｍｇの乳酸菌および２８３ｍｇの酵母を溶液中へ混合した製剤を用いて、各子牛へそれを投薬することにより処置する。罹病率は６０％低減化され、死亡率は８０％低減化された。
【０１０６】
実施例１０
この実施例では、ウシ伝達因子の経口投薬と子牛の早期処置的（metaphylactic）抗生物質（ミコチル）処置を、ストレス負荷畜牛の能力および健康に対するそれらの効果について比較する。
【０１０７】
約６００〜７００頭の畜牛（各々４００〜５００Ｉｂ）を大型畜舎中に入れ、処置前に無制限に飲用水および長い茎の干し草へ接近できるようにした。到着後２４時間以内に、体重および直腸温度を各動物について記録した。牛を無作為に処置施設へ通し、番号付けした耳タッグで一意的に識別した。各動物を内部および外部寄生生物について処置（フォネクチン(Phonectin)）し、共通のウイルス性（ボビシールド(Bovishield)４）およびクロストリジウムの（フォートレス(Fortress)−７）疾患に対して予防接種した。
【０１０８】
各負荷の子牛を各々２３〜２８頭の群へ４通りに選別した。他のほぼ半分の子牛には、表５に示された非封入ウシ伝達因子の１オンス経口用量を与え（経口液状水薬として投与）、そして残りの子牛には１.５ｍｌ／１００ｌｂ・ＢＷのミコチルを与えた。ウシ伝達因子群に割当てられた動物には、２、３、４および５日目に追加飼料として１日１頭当たり１オンスのウシ伝達因子を補充した。群を、無作為に連続通し番号を付けて家舎へ割当てた。初回処置後７日目、ウシに４種ウイルスワクチン（ボビシールド−４）を用いて再予防接種し、体温を記録した。
【０１０９】
実験食餌療法では、約４５％粗飼料および５５％濃厚飼料が提供された。各牛舎に提供された飼料の量を、毎朝７時頃に測定した。牛には、翌朝飼槽に未消費飼料が僅かしか残らない程度の量の飼料を与えた。各牛舎について全一日飼料を毎日８時頃に配給した。多すぎた場合、腐敗を防ぐために残留飼料を飼槽から除去した。除去された飼料を秤量し、次いで飼料消費を計算するために計上した。
【０１１０】
動物を呼吸器疾患の臨床徴候について毎日モニターした。抑うつ、嗜眠、食欲不振、咳、急迫呼吸、鼻汁および／または目やにを含む呼吸器疾患の臨床徴候を呈する牛を治療的処置用の候補として識別した。動物に１〜４の範囲の臨床スコアを割当てた。１の臨床スコアは、軽い呼吸器疾患を示すのに使用し、２の臨床スコアは中程度の疾患を示し、３のスコアは深刻な呼吸器疾患を示し、そして４の臨床スコアは瀕死の動物を示す。１またはそれより大きい臨床スコアが割当てられた動物は牛舎から連れ出され（引抜かれ）、体重および直腸温度測定のための処置区域へ連れ出された。１またはそれより大きい臨床スコアの動物には抗生物質療法を施した。
【０１１１】
処置される動物には全て、１０ｍｇ／ｋｇの用量でチルミコシン（ミコチル、登録商標）の皮下注射を含む、呼吸器疾患についての標準プロトコールを施した。直腸温度を記録し、処置後、牛をもとの牛舎へ戻した。必要な場合、４８時間後に処置を反復した。実験全体を通して罹病率、死亡率、体重増加率および飼料摂取量に関する情報を集めた。
【０１１２】
受容期の最後に、牛を個々に秤量し、１０ｍｌアリコートの血液を血漿採取用に保存した。受容牛舎を統合して、各処置からの牛を２つの牧草地の各々へ均等に分布させた。次いで、天然牧草地で牛を夏季放牧するため輸送した。放牧期完了時、牛を放牧地から集め、終了ため輸送した。牛を４つの飼養牛舎間に分配し、６牛舎からの牛を単一飼養牛舎に統合した（約１５０〜１８０頭）。
【０１１３】
この実験からの結果を表１０に示す。表から明らかな通り、伝達因子処置を受けているこれらの動物は、ミコチルで処置した動物と比べて抗生物質処置について引抜かれた牛が著しく高く、すなわち初回処置については７３％対４８％、２回目の処置については３２％対１４％および３回目の処置については１７％対５０％であった。
【０１１４】
これらの結果は、伝達因子が、牛のストレス集団の処置に使用されたときには、ミコチルほど十分には作用しなかったことを示す。
【０１１５】
【表１４】
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【０１１６】
実施例１１
インビトロタンパク質分解。第一胃液単独（対照）とカゼインまたはＴＦとのインビトロインキュベーションを実施した。無制限の消費のために提供された７６％蒸しコーンフレーク、１０％アルファルファ草、３％大豆粉餌、１.２％尿素、５％サトウキビ糖蜜および４.８％のミネラルビタミンプレミックス（ＤＭベース）を含む食餌を与えられた、カニューレを第一胃に挿入されたジャージー種の子牛２頭から第一胃内容物を得た。第一胃内容物全体を、２層のチーズクロスで濾過し、濾過した第一胃液の元の体積の合計と等しい合計体積を用いて調製したマクデューガル緩衝液でチーズクロス上に残っている固体残留物を４回洗浄することにより、粒子関連生物の除去を試みた。次いで、濾した第一胃液および緩衝液混合物を８層のチーズクロスにより濾過し、混合した。
【０１１７】
最終接種材料は、（１リットル当たり）濾した第一胃液４５０ｍＬ、洗浄固体からの緩衝液抽出物４５０ｍＬ、２３４ｍｇの２−メルカプトエタノール、１００ｍｇ／ｍＬマルトース含有マルトース溶液５０Ｌ、６０ｍＭのヒドラジンサルフェート溶液２５ｍＬおよび１.８０ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール含有クロラムフェニコール溶液２５ｍＬを含有していた。硫酸ヒドラジンおよびクロラムフェニコールを加えて、微生物取り込みおよびＮＨ３およびＡＡの代謝の阻止を試みた。
【０１１８】
カゼインまたはストレス製剤からの４０ｍｇのＮ（カゼインおよびストレス製剤のＮ濃度を、ケルダールＮ１６の分析に従って予め測定しておいた）を、５００ｍＬエルレンマイヤーフラスコへ秤量して入れ、１００ｍＬのマクデューガル緩衝液を加えた。次いで、緩衝液のみ（対照）、緩衝液＋カゼイン、または緩衝液＋ストレス製剤を含むフラスコを、温度制御室において３９℃で１時間インキュベーションした。合計１２フラスコを使用し、１処置につき４複製した。
【０１１９】
ＣＯ２でフラッシュしながら、各フラスコへ２００ｍＬの接種材料を加えることにより、インビトロインキュベーションを開始した。インキュベーションは持続して４時間であり、接種材料添加直後（０時）およびその後３０分毎に１ｍＬ試料を集めた。試料採取後、１ｍＬ試料を冷却した２５％ｗ／ｖトリクロロ酢酸０.２５ｍＬを含む使い捨て微小遠心分離管へ入れ、後の分析時まで−２０℃で貯蔵した。
【０１２０】
分析時、試料を室温で解凍し、次いで２１０００×ｇで１５分間遠心分離にかけ、得られた上清を、テクニコンIII オートアナライザーｆを用いて、BroderickおよびKang１７に従ってＮＨ３および全アミノ酸濃度について分析した。
【０１２１】
タンパク質分解率の計算。インビトロインキュベーションを４時間にわたって実施したが、ＮＨ３および全アミノ酸濃度は１.５時間までの期間のみ増加し、その後ＮＨ３および全ＡＡ濃度は減少し始めたことから、ＮＨ３および全アミノ酸は微生物に取込まれたと考えられた。従って、０時間と１.５時間の間の時点だけを、インビトロタンパク質分解率の計算に使用した。各時点でのインビトロタンパク質分解率を、次の公式を用いて計算した：分解されたタンパク質パーセント＝補正ブランク（［ＮＨ３−Ｎ］）＋（［全アミノ酸−Ｎ］）／フラスコに加えられたＮのｍｇ。各時点での非分解タンパク質パーセントを、次の公式を用いて計算した：１００−非分解タンパク質パーセント。
【０１２２】
統計分析。回帰分析を用いて時間に対する非分解タンパク質パーセントの自然対数を回帰推定することにより、タンパク質分解率を測定した。得られた勾配は、フラクション／時でのタンパク質分解率を表していた。ＡＮＯＶＡｇを用いることにより、タンパク質分解率を表す勾配を分析し、フラスコはタンパク質供給源から成る実験単位およびモデル効果としての役割を果たした。
【０１２３】
実施例１２
畜牛３８００頭を有する牛飼養場操業所が、表７で詳述した組成物を用いる試験に参加した。当業界の多くが実践しているのは、典型的には、大牧場または競売場から畜牛を購入し、次いで牛を飼養場へ輸送することである。到着時、動物は、典型的には体重３５０〜５５０ｌｂである。牛を処置し、飼料を与え、出荷用の目標体重に仕上げる。試験に参加している飼養場は、数年にわたって以下の処置プロトコールを採用している：ミコチル（登録商標）を１ｃｗｔにつき１.５ｃｃ投与；ＴＳＶ−２（鼻腔内ＩＢＲ−ＰＩ−３）；トライアングル４（ＩＢＲ−ＰＩ−３、ＢＶＤ、ＢＲＳＶ、パスツレラ・ヘモリティクム(Pasturella hemolyticum)およびヘモフィルス・ソミス(Haemophilus somis)）；イベルメクチン（注入）；微量無機塩を含む切り刻んだ混合牧草中、２１日間１日８０ｍｇの割合でのオーレオマイシン。試験の前年、上記プロトコールの結果は、死亡１５頭（３.９％）、罹病１１４０頭（３０％）、および慢性肺疾患（肺病罹患牛）２００頭（５.３％）であった。参加飼養場プロトコールの結果は、３８００頭の牛に関する自然平均と統計的に類似しているかまたはそれより良好であり、死亡率２４７頭（６.４％）および２５〜３５％の罹病率となる。
【０１２４】
この試験中、参加飼養場の標準プロトコールに表７で詳述した組成物を補足した。プロトコールの補足には、各々１日目に１ｏｚゲルカプセルの単一経口投与、次いで連続２日間追加製剤の投与を含む３日連続処置が含まれた。
【０１２５】
試験結果は、先のプロトコールに表７で詳述されている組成物を添加することによる、前年および自然平均を凌ぐ劇的で例外的な改善を反映している。特に、罹病率は１５頭（０.３９％）へと９０％低下し、罹病率は３４２頭（９％）へと６８％低下し、そして慢性肺疾患は３２頭（０.８４％）へと８４％低下した。
【０１２６】
死亡率および罹病率の改善結果に加えて、この試験はまた、先のプロトコールへ表７で詳述されている組成物を加えることにより、体重増加の顕著な増加がもたらされることを反映していた。先の処置プロトコール下では、平均体重増加は最初の３０日で４５ポンドであった。補足後プロトコール下では、平均体重増加は最初の３０日で８０ポンドであった。
【０１２７】
実施例１３
許容されるバルクタンク体細胞数（ＢＴＳＣＣ）を維持するための絶えず続いている戦いは、酪農業界への単独で最大の経済的負担の一つを占める。１雌牛処置にかかる個々の費用は、２５０ドルを越え得る。最近の研究によると、全乳牛の３４.５％が２０００００〜２２９０００の範囲のＳＳＣを有することが示されている。抗生物質の使用を制限する圧力の増大、耐性微生物株の出現、および国内ＢＴＳＣＣの最近の上昇傾向は、さらにこの問題の深刻な性質、および体細胞数を低下させ、それを維持する必要性の増大を立証している。品質プレミアム形態での経済的報酬は、ＳＣＣ制御にさらなる重要性を付加する。従って、表７で詳述した組成物を用いてＢＴＳＣＣを有効に低下させ得るか否かを測定する試験が実施された。
【０１２８】
試験には、高い体細胞数について選別された２６頭の雌牛が含まれた。対照群（１３雌牛）は、１８５４８１１の開始平均ＳＣＣを有していた。処置群（１３雌牛）は、２３７４０００の開始平均ＳＣＣを有していた。対照群の雌牛には、６０日の試験期間中標準プロトコールを施した。処置雌牛には、連続３日間毎日表７に詳述されている組成物１ｏｚを与え、次いで３日間は中止し、これを３周期実施した（合計９処置）。
【０１２９】
２６日後、対照および処置群のＳＣＣ試験は、対照群が２０４９６３６のＳＣＣを有し（１０.５％の増加）、処置群が９５７４５５のＳＣＣを有する（５９.７％の減少）ことを示した。従って、処置群は、対照群に対し７０.２％の改善を示した。さらに、９０日目の試験で計数されたＳＣＣ数は、ＳＣＣの２６％低減化を示したことから、組成物の残留効果が立証された。
【０１３０】
実施例１４
６４頭の高ストレス畜牛を購入し、３２頭（処置群）に、表７で詳述されている組成物を含む１ｏｚのゲルカプセル２杯を最初に投与し、残り３２頭（対照群）は未処置のまま放置した。また処置群には、さらに２日間組成物を１日１ｏｚ与えた。処置群も対照群も抗生物質処置は受けなかった。３週間後、処置群からは５頭の子牛が病気のための処置を必要とし、対照群からは１２頭の子牛が上記処置を必要とした（罹病率低下については６０％改善）。さらに、対照群では１頭の子牛が死亡したが、試験群で死亡した子牛は無かった。
【０１３１】
実施例１５
各々重度の伝染性角結膜炎、クラミジア、他の細菌感染症を有するかまたは盲目になりかけている７頭のヤギを使用した。７頭には全て３週間標準医薬を投与したが、改善はほとんどまたは全く見られなかった。次いで、病気のヤギ全てに、１４日間、表７に詳述された組成物を毎日１ｏｚ投与した。病気が緩解している２頭のヤギは、約４８時間で進行を止め、他のヤギは、眼の瘢痕も伴わず１０日で正常に戻り、感染ヤギからはいぼも落ちた。プロトコールでは、抗生物質を全く使用しなかった。
【０１３２】
実施例１６
コルジセプス(Cordyceps)菌の生長
コルジセプスの固体基質生長に理想的な培地は以下の通りである：１部の白キビ（皮付き）〜４部の白マイロ（皮付き）に０.８％ｗ／ｗの粉砕したカキ殻および１％ｗ／ｗ植物油（落花生油または大豆油）を添加。水を加えて滅菌基質中均等な５０％総水分にする。滅菌前４〜６時間、穀物混合物を予め加熱処理すると、コルジセプスからかなり速い生長応答が誘発される傾向を示す。この培地では、コルジセプスは長期間生長し得るため、基質がほぼ完全に菌糸体に変換され、コルジセプスからの二次代謝物が完全に発現され得る。この基質において培養された場合、コルジセプスは、約３〜４％残留粒状、または約９６〜９８％の純菌糸体である。この培養方法にとって真の利点は、全生長過程を通じて生産される細胞外代謝物の全量（compliment）が得られることである。ある種の生長誘発性化合物をこの混合物に加えると、昆虫材料が全く存在しなくても、コルジセプス・シネンシス(Cordyceps sinesis)が容易に誘導され、培養中で結実する。しかしながら、この培地での子実体の形成は、分析化学プロフィールに大した変化をもたらさない。
【０１３３】
上記基質を用いても、培養されたコルジセプスの完全な化学プロフィールは、非常に特異的な条件下で培養されなければ、採取された野生コルジセプスのそれに近づくことはない。コルジセプス・シネンシスは、大気圧酸素レベルおよび室温で培養されたとき、比較的大量の遊離アデノシンを生産する。また、それは大量のウリジンおよびグアノシンを生産する。しかし、コルジセピンが生産されたとしても非常に僅かであり、ヒドロキシルエチルアデノシンは事実上存在しない。生物がこれらの化合物を生産するためには、酸素の欠如、温度低下および光の全体的欠如による生長ストレスを負荷される必要がある。コルジセプスは、冷たい嫌気条件下で培養されたとき、非常に異なる化学プロフィールを有する酵母様アナモルフを形成するため、それを開始から上記条件下で生長させても生産性を示さない。まずそれを高温で迅速に生長させ、次いでだます形でその「夏時間」代謝物を標的医薬化合物へ変換させなければならない。これらの標的化合物を得るため、厳密な生長プロトコールに従った。粉砕／マイロ基質へ接種後、コルジセプスを、２８〜３０日間拡散光線中、海水面空中酸素および２０〜２２℃で生長させる。次いで、酸素が５０％空中酸素、すなわち約１０％酸素に低減化されている環境制御チャンバーへそれを移す。生長雰囲気の残りは、窒素、一酸化炭素および二酸化炭素により構成される。温度を３℃に低下させ、光を全て排除する。それを上記条件下で約１５〜２０週間保つ。この結果、アデノシンの多くがコルジセピン、ジデオキシ−アデノシンおよびヒドロキシエチル−アデノシンに変換される。多くの他の特有ヌクレオシドもまた生産され、最終化学プロフィールは野生型コルジセプスのそれと等しくマッチする。
【０１３４】
実施例１７
ハイブリッドグルカン製剤
基質および生長パラメーターを測定することにより標的化合物が最適化されると、種々のコルジセプス・シネンシス株からの化学プロフィール差異が測定された。非常に多くのコルジセプス株が存在し、各株はそれ自体の特有な化学プロフィールを有するため、得られた株を全て試験した。既知株はどれも、野生コルジセプスから見出される量の有効成分を生産しないことが示された。標的化合物生産を定量的に増加させるため、コルジセプス株のハイブリダイゼーション実験を実施して、標的化合物の生産を大きく増加させるためにそれらを交雑した。様々な実験を実施して種々の菌株を得ることにより、それら自体の核融合を遂行した。例えばニコチン酸は、ハイブリダイゼーションした菌糸体を作製するのに使用され得る。この化合物は使用しにくく、そこから得られる結果も信用できない。この融合を誘発するため幾つかの異なる化合物を試した後、ヘビ毒液が最もよく作用することが発見された。
【０１３５】
ハイブリダイゼーション実験用にウエスタン・ダイアモンドバック・ラトルスネーク（クロタルス・アトロクス(Crotalus atrox)）［シグマ・サイエンティフィック、セントルイス、ミズーリ、米国］から、ヘビ毒液を購入した。生長を改変させるが、問題の株に毒性を示すとは考えられない量で、ヘビ毒液を寒天培地に加える。ヘビ毒液のこの範囲は、寒天培地３００ｍｌにつき１０ｍｇ〜３０ｍｇである。毒液は熱安定性ではなく、培地の滅菌後に無菌状態で加えられなければならない。このハイブリダイゼーションに使用される寒天は、麦芽抽出物、活性炭、鉱物および腐植質−石炭燃焼工業過程からの高炭素灰残留物により構成される、Ｒ７アガーと命名されたハワイ、マウイのアロハ・メディシナル、インコーポレイテッドによる登録商標寒天である。正確な処方を表１１に示す。他の寒天も同様に使用され得る。
【０１３６】
【表１５】
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【０１３７】
このＲ７アガー培地のペトリ皿に、コルジセプス属の２種の異なる株からの菌糸体を接種する。我々はコルジセプス・シネンシスを他のコルジセプス種、例えばコルジセプス・ミリタリエス(C.militaries)、コルジセプス・ソボリフェラ(C.sobolifera)およびコルジセプス・オフィオグロソイデス(C.ophioglosoides)とも交雑したが、これらは通常コルジセプス・シネンシスの２種の変異型である。これらの異なる株を１枚のペトリ皿へ一緒に接種した場合、それらはほぼ接するところまで通常互いに向かって生長し、その時点で抑制域を形成するが、そこではどちらの株も生長し得ない。結局、一方の株が他方より強く、プレートにおいて他方より大きく生長することが判るが、それらは依然として遺伝的には異なるもので、２種の異なる培養物は同じペトリ皿に存在する。
【０１３８】
十分な量のヘビ毒液を寒天に加えると、２種の培養物は、それらが接触するまで互いに向かって生長し、そしてそれらの相互抑制域を形成する。しかしながら、この抑制期間は約２または３時間に過ぎず短命であり、コロニーは各々菌糸繊維を抑制域へ送り出し始める。これらの繊維は一緒に生長し、毒液で弱められたそれらの細胞壁を通して核物質を交換する。それらは、親株のいずれとも明確に異なる新たなハイブリッド株をこの相互接触点で形成する。最初の抑制域形成後の約４時間以内に、ハイブリダイゼーションは完了し、コロニーは互いに向かって急速な生長を再開する。それらは、最初の２株および新たなハイブリッド株といった３つのコロニーとなる。
【０１３９】
新たに形成されたハイブリッドの一部分を、コロニーが融合し始める正確な時点で最初の抑制域から注意深く除去する。それはコロニーの初回接触後３〜４時間の間である。ハイブリッドを、通常の（非ヘビ毒液）アガーを含む新しいペトリ皿に移す。ハイブリダイゼーションの一測定方法では、通常のアガーを含む新たな皿に、全３株、すなわち最初の２株および疑いのあるハイブリッドを接種する。ハイブリダイゼーションが実際に行なわれた場合、これらは３種の異なるコロニーであり、相互３方向の抑制域を形成する。ハイブリダイゼーションし得なかった場合、疑いのあるハイブリッドは容易に互いにまたは元のコロニーの他方と融合することから、疑いのあるハイブリッドは元のコロニーのいずれか一方と容易に融合することがわかり、疑いのあるハイブリッドは元の株と遺伝的に区別されないことがわかる。
【０１４０】
一旦ハイブリッドが確認されると、それを生長パラメーターについて試験する。それが基質での元気で丈夫な生長体であると思われる場合、それを大量の菌糸体から生長させ、採取し、有効成分について分析する。この要領で反復試験を通じて、潜在力が他のいずれの培養株よりも大きく、最高品質の野生型コルジセプスと潜在力が少なくとも同等である、固体基質培養で容易に培養されるハイブリッド株が生成される。この新しい株は、コルジセプス・シネンシス・アロハエンシス(C.sinensis Alohaenis)である。
【０１４１】
実施例１８
ストレス負荷牛の処置
表７に示された伝達因子製剤を用いて、ストレス下の家畜を試験した。この第一胃バイパス製剤を、４日間１日１頭につき１オンスの量で子牛に投与した。伝達因子製剤で処置したのは３１８頭の子牛であった。対照集団の子牛は１８０頭であった。全子牛に予防接種をし、暖めた。
【０１４２】
この実験からの結果を図１に示す。図から明らかな通り、対照集団における罹病率は約１５.５％であり、伝達因子処置集団における罹病率は３.１％であった。さらに、対照集団における死亡率は５.５％であり、伝達因子処置集団における死亡率は０％であった。対照についての体重増加は１日当たり１.８５ポンドであり、伝達因子処置集団での１日当たりの体重増加は約３.０５ポンドであった。
【０１４３】
実施例１９
別の試験では、５８５頭の子牛を、３日間毎日表７の伝達因子製剤１オンスおよび１２日目の再予防接種中に表７の製剤１オンスで処置した。２９頭の子牛の対照集団には、表７の製剤を与えなかった。試験における全子牛にワクチンおよび抗生物質（ミコチルまたはＡ−１Ａ）および駆虫薬（イボメック(Ibomec)）を与えた。子牛を４〜６日から４５日間条件付けし、必要ならば角切りし、全雄牛を去勢した。条件付けした囲いでの体重増減に基いて平均１日体重増加を計算した。
【０１４４】
図２から明らかな通り、対照群の罹病率は８３％に達し、伝達因子処置集団での罹病率は２.６％に過ぎなかった。同様に、対照集団における死亡率は２４.１％であり、それに対し伝達因子処置集団では０％であった。それぞれの場合において、対照集団での死亡は、ウシ呼吸疾患の結果であった。さらに、対照群における一日体重増加は、１日当たり１ポンド未満であり、伝達因子処置群では、増加は１日当たり約３.１ポンドであった。
【０１４５】
【表１６】
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【表１７】
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【０１４６】
【表１８】
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【表１９】
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【図面の簡単な説明】
【０１４７】
【図１】図１は、表７の封入伝達因子製剤を用いて得られた結果を示す。封入伝達因子で処置した動物を、伝達因子で処置しなかった対照と比較したとき、罹病率は１５.５％から３.１％に低下し、死亡率は５.５％から０％に減少した。さらに、対照の一日当たりの体重増加は、封入伝達因子製剤で処置した動物についての３.０５ ｌｂｓ／日に対して１.８５ ｌｂｓ／日であった。
【図２】図２は、高ストレス負荷牛を用いた異なるフィールドスタディーにおける表７の封入伝達因子製剤の使用を含む第２試験である。この試験において、動物の罹病率は、伝達因子を投与されていない対照と比較して封入伝達因子製剤で処置した動物では８３％から２.６％に低下し、死亡率は２４％から０％に減少した。さらに、対照集団は、封入伝達因子製剤で処置した動物についての３.１ ｌｂｓ／日と比較して０.９ ｌｂｓ／日の体重増加を示した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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