(57)【要約】  パッションフルーツ抽出物を製造する。該抽出物は哺乳動物における血圧及び血清中一酸化窒素濃度を低下させる効果を有する。該抽出物は哺乳動物における肝臓保護効果、並びに抗酸化及び抗炎症効果も提供する。新規化合物が抽出物中に確認され、エデュリル酸と命名された。
2007531734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッションフルーツ抽出物の製造法であって、
（ａ）パッションフルーツの果皮を水と接触させて水性抽出物と固体残渣とを得るステップと；
（ｂ）前記水性抽出物を高分子マトリックスと接触させて該水性抽出物から少なくとも一つの成分を吸着させるステップと；そして
（ｃ）前記成分を前記マトリックスから溶出するステップと
を含む方法。
【請求項２】
溶出ステップが有機溶媒を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
有機溶媒が、エタノール、イソプロピルアルコール、メタノール、１−プロパノール、及びアセトンからなる群から選ばれる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
高分子マトリックスが非イオン性高分子マトリックス樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
高分子マトリックスを、水性抽出物との接触後、溶出ステップの前に水で洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法に従って製造されたパッションフルーツの抽出物。
【請求項７】
哺乳動物における血圧の低下法であって、哺乳動物に有効量の請求項６の抽出物を投与することを含む方法。
【請求項８】
哺乳動物における血清中一酸化窒素濃度の低下法であって、哺乳動物に有効量の請求項６の抽出物を投与することを含む方法。
【請求項９】
哺乳動物における肝損傷の防止法であって、哺乳動物に有効量の請求項６の抽出物を投与することを含む方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
カテキン、シアニジン、エデュリル酸、エピカテキン、ルテオリン、フェニルピルビン酸、ケルセチン、及びそのような化合物のいずれかの配糖体からなる群の少なくとも一つの化合物を含む、請求項６に記載のパッションフルーツ果皮の抽出物。
【請求項１２】
構造：
【化１】
2007531734.tif 000005
を有する化合物及びそのシス異性体を含む、請求項６に記載のパッションフルーツの抽出物。
【請求項１３】
パッションフルーツの果皮のみが使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法に従って製造された抽出物。
【発明の詳細な説明】
【技術内容】
【０００１】
発明の背景
本発明は一般的に植物抽出物に関し、さらに詳しくはパッションフルーツ（トケイソウ科、Passiflora sp.）の抽出物、特にパッションフルーツの果皮の抽出物、並びに該抽出物の食品、栄養補助食品、及び医学用への使用に関する。
【０００２】
高血圧、すなわち１４０／９０ｍｍＨｇより高い血圧は、心臓血管及び脳血管疾患の発病及び死亡の最も一般的なリスク因子である。米国では高血圧による死亡は年間４０，０００例あるが、高血圧は脳卒中については最も修正可能なリスク因子である。高血圧は米国では成人４人に約１人、又は約５０００万人が罹患している。
【０００３】
フラミンガム研究(Framingham study)によれば、ヒトが３０歳から６５歳に年を取ると、彼らの血圧は収縮期で平均２０ｍｍＨｇ、拡張期で１０ｍｍＨｇ増加し、収縮期血圧は９０歳まで上昇し続けるということが示されている。
【０００４】
血圧が高いほど心臓血管イベントの可能性が増大するのに、高血圧はうまく管理されていないことが多く、適切に治療されている患者は極めて少ない。疫学研究の予測によれば、全身血圧を主要臨床試験で通常達成される量だけ低下させると、心臓血管イベントが４２％、心臓イベントが２４％削減できるということである。
【０００５】
高血圧は非特異的に治療されることが多いため、多数の軽微な副作用がもたらされ、非治療又は不適切治療の割合も比較的高い。従って、高血圧の新規治療法の模索は今も継続中である。
【０００６】
天然産物由来の療法はよく知られている。ある種のフラボノイドは高血圧に有益効果があることが確立されている。例えば、フランス海岸松(Pinus pinaster)の樹皮抽出物はフラボノイドの混合物を含有しており、軽度の高血圧患者が経口摂取すると収縮期血圧を下げる。
【０００７】
一酸化窒素は血圧の重要な分子レギュレータである。一酸化窒素は強力な血管拡張剤である。一酸化窒素は、血小板活性化を抑制し、白血球の血管内皮への接着を制限し、心筋収縮を調節する。一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）によって触媒される一酸化窒素の合成は血管内皮で起こるが、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）が関与する一酸化窒素の産生は免疫機能と関連している。しかしながら、別のＮＯＳ、血管内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）によって産生される少量の一酸化窒素は、細胞保護効果及び心臓血管系に対する血管拡張作用を有する。
【０００８】
ペルオキシナイトライトは一酸化窒素から形成される損傷性酸化剤である（ＮＯ＋Ｏ２  ＯＮＯＯ−）。ペルオキシナイトライトは、脂質過酸化、タンパク質のニトロ化、ＤＮＡ一本鎖切断、及びグアニジンのニトロ化を起こしうる。
【０００９】
フラボノイドのケルセチン及びケンフェロール(kaempferol)は、高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）の細胞におけるＮＯＬＡ依存性自然大動脈輪収縮をインビトロで阻害することが示されている。ＮＯＬＡは一酸化窒素合成酵素阻害剤である。大量のアセチルコリン誘導性血管収縮も、ケルセチン、ケンフェロール、ルチン、及びエスクレチンのような抗酸化性フラボノイドによって阻害できる。血管平滑筋収縮の阻害は血圧の低下をもたらすはずである。
【００１０】
また、フラボノイドの免疫機能に対する効果には議論がある。カテキンはリンパ球の増殖と抗体産生を増強するが、高濃度では阻害効果が働く。ある研究はフラボノイドのＮＫ細胞活性増強を示しているが、他の研究はフラボノイドに効果がないことを示している。ケルセチンは非特異的免疫応答を阻害するとみられ、抗炎症作用を発揮する。
【００１１】
パッションフルーツ(Passiflora edulis)は、２０フィートにも成長する旺盛なつる性の亜熱帯又は熱帯性植物である。紫色のパッションフルーツは南ブラジルからパラグアイを経て北アルゼンチンの原産である。その果実は、１．５〜３インチ幅のほぼ円形又は卵形で、堅くてなめらかなろう状の外皮を持つ。
【００１２】
パッションフルーツの生物活性成分を調査する中で、今回驚くべきことに、パッションフルーツ抽出物が高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）の収縮期血圧を下げ、またｉＮＯＳ由来の一酸化窒素産生を減少させ、よってＳＨＲにおける内皮機能不全を改良することを見出した。従って、パッションフルーツ抽出物は抗酸化特性を示すことも予想される。
【００１３】
そこで本発明の目的は、高血圧、及び高血圧に伴う疾患に対して治療効果を示し、肝臓保護効果も有するパッションフルーツ抽出物を提供すること、又は少なくとも有用な選択肢を提供することである。
発明の要旨
第一の側面において、本発明は、哺乳動物に有効量のパッションフルーツ抽出物を投与することを含む、哺乳動物における血圧の低下法を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、哺乳動物に有効量のパッションフルーツ抽出物を投与することを含む、血圧を下げることが望ましい哺乳動物の疾患又は障害の予防又は治療法を提供する。
【００１５】
また、哺乳動物に有効量のパッションフルーツ抽出物を投与することを含む、哺乳動物における血清中一酸化窒素濃度の低下法も提供する。
本発明はさらに、哺乳動物に有効量のパッションフルーツ抽出物を投与することを含む、哺乳動物における肝機能関連疾患又は障害の治療法も提供する。
【００１６】
従って、本発明は、高血圧並びに高血圧に伴ういずれかその他の疾患又は障害の治療法を提供する。本発明はさらに、哺乳動物における肝臓保護法、並びに肝機能関連の何らかの疾患又は障害の治療法も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、パッションフルーツ抽出物の抗酸化剤としての使用、すなわちフリーラジカルによる損傷を阻害し、血清中の脂質過酸化を削減し、そして健康な組織中抗酸化ビタミン濃度を維持する抗酸化剤としての使用も提供する。
【００１８】
本発明のパッションフルーツ抽出物は、ケルセチン、シアニジン配糖体、カテキン、エピカテキン、ルテオリン、フェニルピルビン酸、単離され本明細書中に記載されている新規なエデュリル酸(edulilic acid)、及びそれらのいずれかの配糖体から選ばれる一つ以上のグループを含む。
【００１９】
好ましくは、パッションフルーツ抽出物は、下記ステップを含む工程によって製造される。
（ｉ）好ましくは、パッションフルーツを小片に切り分けて表面積を増加させ；
（ii）パッションフルーツの小片を水と接触させて水性抽出物と固体残渣とを得；
（iii）水性抽出物を固体残渣から分離し；
（iv）水性抽出物を高分子マトリックスと接触させて抽出物の一つ以上の成分をマトリックスに吸着させ；
（ｖ）マトリックスを水で洗浄し；そして
（vi）有機溶媒又は有機溶媒の混合物を用いて一つ以上の成分をマトリックスから溶出する。
【００２０】
所望によりパッションフルーツの果皮を果肉から分離して抽出工程に使用してもよい。
有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、又はアセトンが好適である。
【００２１】
本発明はまた、パッションフルーツ抽出物を含有する組成物も提供する。
該組成物は食物又は食品でありうる。該組成物は、栄養補助食品又はその他の栄養組成物のようなサプリメントであってもよい。
【００２２】
あるいは、該組成物は、前述の抽出物を一つ以上の製薬学的に許容しうる賦形剤と混合して含む医薬組成物であってもよい。
更なる側面において、本発明は、サプリメントのような栄養補助食品として、又は医学的もしくは機能性食品及び飲料の製造における有効成分としてのパッションフルーツ果皮抽出物の使用を提供する。
詳細な説明
本明細書中に記載されている“パッションフルーツ”は、一般的に果皮及び食用果肉の両方を含む果実を意味する。“パッションフルーツ果皮”という用語は、内部の食用果肉を取り除いた後の残りの果実部分を意味するために使用される。ＨＰＬＣ分析によれば、本発明のパッションフルーツ抽出物は、ケルセチン、ケルセチンガラクトシド、ケルセチングルコシド、ルテオリン、ルテオリングルコシド、シアニジン−３−グルコシド、カテキン及びエピカテキンを含むいくつかのフラボノイドを含有することが示されている（図１）。
【００２３】
抽出物のフラボノイド及びシアニジン成分は、スーパーオキシドの形成及びｉＮＯＳによる一酸化窒素産生を阻害するので、内皮機能不全を改良し血圧を低下させる。ケルセチンは、ｉＮＯＳ  ｍＲＮＡと一酸化窒素産生を阻害することが示されている。
【００２４】
ヒト本態性高血圧は、酸化的ストレスによる内皮依存性血管拡張の障害によって特徴づけられる。本発明の抽出物は抗高血圧効果を有する。さらに、抽出物のフラボノイド成分は、血圧を低下させ、ＬＤＬの酸化を阻害し、血小板凝集を阻害することによって心臓血管保護作用を発揮する。抽出物の成分は、抗高血圧活性を有することで知られている化合物のケルセチンを含むが、抽出物に含有される量は約１〜５％未満で、抽出物の抗高血圧活性を実質的に説明するには十分でないことに注意する。実際、抽出物のこれまでに知られている成分のいずれも、観察された効果を単独で提供するに足る量で存在しているわけではない。
【００２５】
また、インビトロのデータに基づいて、抽出物は抗酸化特性を持つであろうことも予想される。
高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）を用いた研究で、出願人らは、５０ｍｇ／ｋｇの抽出物を補給した食餌はＳＨＲの血圧を下げ、加齢による正常の血圧上昇を遅らせることを見出した。収縮期血圧は、５０ｍｇ／ｋｇの抽出物を摂取したラットでは、対照群と比べて１２．３ｍｍＨｇ低かった（Ｐ＜０．０１）（図２）。
【００２６】
さらに、一酸化窒素濃度は、１０ｍｇ／ｋｇの抽出物を摂取したラットでは１８．８２μｍｏｌ／Ｌで、抽出物を摂取していないラットより４０％低かった。一酸化窒素濃度は、５０ｍｇ／ｋｇの抽出物を摂取したラットでは１１．０７μｍｏｌ／Ｌで、抽出物を摂取していないラットより６５％低かった（図３）。これによって、一酸化窒素の過産生と、それに続く心臓血管系に有害なペルオキシナイトライトの形成反応が予防されることになる。
【００２７】
出願人らはまた、ラット肝臓の研究で、パッションフルーツ抽出物が肝臓保護性であることも見出した。精密カットしたラット肝スライスを２０μｇ／ｍｌのパッションフルーツ抽出物とインキュベートした。９及び２４時間のインキュベーション時点で、生存の指標であるスライス中のカリウム濃度は対照スライスと著しく異なってはいなかった。
【００２８】
次に、肝毒物である１ｍＭのクロロホルムの存在下又は不在下で、抽出物を精密カットしたラット肝スライスとインキュベートした。６時間のインキュベーション及び９時間のインキュベーション時点で、パッションフルーツ抽出物はクロロホルム傷害に対して顕著な肝臓保護を示していた。この研究で抽出物の毒性は認められなかった。
【００２９】
インビトロ研究では、抽出物がヒト赤血球膜結合Ｎａ−Ｋ  ＡＴＰアーゼ及びＣａ  ＡＴＰアーゼ活性を増大することも示されている。ＲＢＣ膜結合Ｎａ−ＫポンプＡＴＰアーゼは、０．２５ｍｇ／ｍＬ（１０２％増）、１ｍｇ／ｍＬ（１０７％増）、又は２５ｍｇ／ｍＬ（１７０％増）のいずれかの抽出物と培養した場合に、対照群よりもかなり高い活性を有していた（図４）。１ｍｇ／ｍＬ及び２．５ｍｇ／ｍＬの濃度の抽出物は、膜結合Ｃａ  ＡＴＰアーゼ活性を平均で７８％及び４１％増大した。
【００３０】
出願人らはヒトの研究も実施した（図５）。図５は、プラセボ又はパッションフルーツ抽出物（２ｍｇ／ポンド／日、最大４００ｍｇ／日）を４週間投与された高血圧患者におけるＳＢＰ（収縮期血圧）及びＤＢＰ（拡張期血圧）の変化を示している。パッションフルーツ抽出物又はプラセボピルは、これらの患者に無作為化二重盲検並行群様式で投与された。彼らの平均収縮期血圧は１７６．６０±４．９０ｍｍＨｇ（平均±ＳＥＭ）であった。パッションフルーツによる治療で収縮期血圧は、プラセボ群と比べて１４５．６７±４．４４ｍｍＨｇ（平均±ＳＥＭ）に著しく低下した（ｐ＜０．００１）。データはまた、パッションフルーツ抽出物の補給で、平均拡張期血圧１０３．２７±２．３０ｍｍＨｇ（平均±ＳＥＭ）の高血圧患者の拡張期血圧を７８．６７±２．７８ｍｍＨｇ（平均±ＳＥＭ）に著しく低下させる（ｐ＜０．００１）ことも示した。研究に参加した患者で４週間の治療後に心電図の変化を示した者は一人もいなかった。
【００３１】
前述の活性のため、パッションフルーツ抽出物は、心臓病及び高血圧だけでなく、関節炎、喘息及びアレルギーといった炎症関連疾患を有する患者にも有益であることが期待される。その上、本願に記載の研究では抽出物の非常に大量の摂取又は量を使用したにもかかわらず、抽出物の毒性は、ヒト、ラット、マウス又は培養細胞に認められなかった。
【００３２】
当業者であれば、抽出物は患者に経口投与又は注射を含む様々な経路で投与できることは理解されるであろう。投与される抽出物の量は、患者及び治療される疾患の性質及び程度によって広く変動することになろう。典型的には、抽出物は静脈内投与又は経口摂取による投与ができる組成物として製剤化される。該組成物は、血圧の低下及び／又は免疫機能の増大に適切ないずれかの用量レベル及び投与頻度で摂取又は静脈内投与されうる。
【００３３】
本発明の組成物は栄養補助食品（これに限定されない）を含む食品であってもよい。
医薬組成物の場合、抽出物は、固体又は液体製剤、例えば錠剤、カプセル、散剤、溶液、懸濁液及び分散液に製剤化できる。液体形は、水及びエタノールのような担体を、製薬学的に許容しうる界面活性剤又は懸濁化剤のようなその他の薬剤と共に、又はそれらの薬剤なしで含む。
【００３４】
本発明を以下の実施例を参照しながらさらに説明する。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されないことは理解されるはずである。
実施例
実施例１：パッションフルーツ抽出物の製造
パッションフルーツ(Passiflora edulis)を半分にカットし、果汁の多い果肉を除去して中身のないパッションフルーツ果皮の殻を得た。この殻を切り刻んで長さ１０ｍｍ未満の小片にし、容器に入れた。熱水（６５〜７５℃）を容器に加え、刻んだ殻を完全に浸した。該混合物を最初の１時間は時々撹拌し、その後一晩浸漬放置した。該混合物をろ過し、ろ液を非イオン性高分子樹脂のカラムに通し、フェノール性及びその他の有機化合物を吸収させた。蒸留水をカラムに通し、糖及びその他の極性成分を洗い流した。次に吸収された化合物をメタノールを用いてカラムから溶出し、溶出液を減圧下で濃縮して暗色の濃縮物を得た。該濃縮液を凍結乾燥し、パッションフルーツ抽出物を暗赤色粉末として得た。メタノールを溶離剤として使用したが、エタノール、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、又はアセトンを使用することもできた。
実施例２：パッションフルーツ抽出物の成分の決定
抽出物の成分はＨＰＬＣによって決定した。実験は、ＤＡＤ検出器及び３０℃に保たれたＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ  １００ＲＰ−１８（ｕｍ）カラム（１２５×４）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １１００装置で実施した。溶媒プログラムは、溶媒Ａ（水中２％ＨＯＡｃ）中３．６％のＢ（アセトニトリル中２％ＨＯＡｃ）で開始し、２０分で１２％のＢ、３０分で２０％のＢ、そして４５分で５０％のＢまで上げていった。流速はｍＬ／分にセットし、化合物は、フェノール酸については２８０ｎｍ、フラボノイドについては３５０ｎｍ及びアントシアニンについては５２０ｎｍにセットされたＵＶ吸収によってモニタした。化合物の同定は、リテンションタイム及びＵＶ／可視スペクトルを標準材料と比較することによって確認した。
実施例３：赤血球膜の調製とＡＴＰアーゼアッセイ
赤血球膜は既報の通りに調製した（Ｆａｒｒａｎｃｅ，ＭＬ．，＆  Ｖｉｎｃｅｎｚｉ，ＦＦ．（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４７１：４９−５８）。手短に言えば、血液は健常人から採取した。赤血球を生理食塩水で洗浄し、ＥＧＴＡ（１００ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）及びＰＭＳＦ（１０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）入りの低張イミダゾール緩衝液（ｐＨ７．４、２０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）中で溶解した。膜を、ＥＧＴＡ及びＰＭＳＦ含有イミダゾール緩衝液（２０ｍＭ）、ＥＧＴＡ含有イミダゾール緩衝液、及びイミダゾール緩衝液のみで各１回ずつ順に洗浄した。最後の洗浄は４０ｍＭのヒスチジン−イミダゾール緩衝液（ｐＨ７．４）中で行い、膜を窒素下で冷蔵庫（４〜８℃）に保管した。アッセイに先立ち、ＲＢＣ膜（０．７５ｍｇ／ｍＬ）を３０分間３７℃で、０、０．２５、１、２．５ｍｇ／ｍＬのパッションフルーツ果皮抽出物及び最終体積１ｍＬを達成するに足る生理食塩水と共にインキュベートした。インキュベーション及び遠心分離の後、上清を除去し、膜を生理食塩水中に再懸濁させ１ｍＬとした。その後、膜ＡＴＰアーゼ活性をマルチウェルプレートで同時に測定した。典型的なアッセイ混合物は、ＲＢＣ膜（７５μｇ／ｍＬ）、１８ｍＭのヒスチジン−イミダゾール（ｐＨ７．１、Ｓｉｇｍａ）、３ｍＭのＭｇＣｌ２、８０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのＫＣｌ、０．２ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのウワバイン（Ｓｉｇｍａ）及び３０ｎＭのＣａＭ（ＣａＭ−活性化Ｃａ２＋ポンプについてのみ、Ｓｉｇｍａ）を含有していた。３７℃で１５分間の予備インキュベーション後、５％のＳＤＳ（Ｓｉｇｍａ）を対照群に加えた。酵素反応は３ｍＭのＡＴＰで開始した。３７℃で６０分間後、反応を５％ＳＤＳで停止し；放出された無機ホスフェートをモリブデン酸アンモニウム／アスコルビン酸混合物を用いて測定し、Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＥＬ３１  １．ＵＳＡ）によって吸収を波長８２０ｎｍで測定した。正確さを追加するために、ＢＣＡアッセイを実施して各アッセイ終了時における管内のタンパク質の最終濃度を決定した。上記実験の膜（２５μｌ）、２５μｌのｄｄＨ２Ｏ及び１ｍＬのカラー試薬を管に加え、次いで３０分間３７℃でインキュベートした。その間、異なる濃度の標準タンパク質（アルブミン、Ｓｉｇｍａ）をインキュベートした。インキュベーション後、各管を室温に冷却した。分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，ＤＵ６４０）によりＸ＝５６２ｎｍで吸光度を測定した。膜のタンパク質濃度を標準曲線から読み取った。
ＡＴＰアーゼの活性は下記式によって算出した。
【００３５】
ＡＴＰアーゼ活性＝Ｎ（Ｐ１）×０．２７７８×タンパク質濃度／初期タンパク質濃度（０．７５ｍｇ／ｍＬ）
実施例４：動物と食餌−ＳＨＲ研究
６週齢の高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ）は、実験中、２２〜２０℃及び湿度５０％に保った。２４匹のＳＨＲを各群８匹ずつの３群に分けた。動物には以下の食餌：すなわち、基本食、５０ｍｇ／ｋｇのパッションフルーツ抽出物を補給した基本食、又は１０ｍｇ／ｋｇのパッションフルーツ抽出物を補給した基本食を与えた（表１）。摂取した食餌の量、体重及び収縮期血圧を週１回記録した。収縮期血圧はテイルカフ(tail cuff)法（Ｓｏｆｔｒｏｎ，Ｃｏ．Ｌｔｄ，東京、日本）によって測定した。８週間の給餌後、全ラットをネンブタール(Nembutal)（０．１ｍｇ／１００ｇ体重、Ｗａｋｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，日本）での麻酔下で犠死させた。胸腺、脾臓、肝臓及び心臓を摘出し、重量測定した。毒性は観察されなかった。
実施例５：一酸化窒素測定
一酸化窒素の測定は既報通りに実施した（Ｒｏｃｋｅｔｔ，ＫＡ．，Ａｗｂｕｒｎ，ＭＭ．，Ｃｏｗｄｅｎ，ＷＢ．＆  Ｃｌａｒｋ，ＪＡ．（１９９１）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５９：３２８０−３）。一酸化窒素は容易に亜硝酸塩に転化する。一酸化窒素を求めるために硝酸塩を測定した。ＮａＮＯ２（ＢＤＨ；Ｗａｋｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，日本）と試験化合物の希釈液を蒸留水中、９６穴平底プレートに製造し、最終体積５０ｕｌとした。２０マイクロリットルのＮＨ４Ｃｌホウ酸緩衝液を一酸化窒素／亜硝酸塩の分析を必要とする全てのウェルに加えた。次に５０マイクロリットルのＧｒｉｅｓｓ試薬［２ＭのＨ２ＳＯ４中、１％のスルファニルアミド＋０．１％のＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンジヒドロクロリド（Ｗａｋｏ，Ｃｏ．Ｌｔｄ．，日本）］を一酸化窒素／亜硝酸塩について分析されるウェルに加えた。プレートを５４０ｎｍ（試験）で読み、一酸化窒素と亜硝酸塩濃度を亜硝酸塩標準曲線から直接読み取った。
実施例６：ヒトの研究
高血圧患者、すなわち５７．０±１４．４８歳（平均±ＳＤ）の男性１４人と５７．５６±１２．７５歳（平均±ＳＤ）の女性１６人を研究に含めた。患者は、高血圧の検出、評価、及び治療に関する米国合同委員会(Joint National Committee on Detection, Evaluation, and Treatment of High Blood Pressure)のガイドラインによればステージ１及び２の高血圧を有していた。反復血圧測定で、彼らの収縮期血圧（ＳＢＰ）は１４４〜２１０ｍｍＨｇ、拡張期血圧（ＤＢＰ）は８０〜１２０ｍｍＨｇであった。除外基準は、腎疾患又は心疾患保有者、経口避妊薬服用者、喫煙及び飲酒、又は１日１個のマルチビタミン錠剤以外の何らかのビタミン剤の服用者であった。研究に含めた被験者はいずれも、利尿薬、β遮断薬及びＡＣＥ阻害薬を含む抗高血圧薬併用療法を受けていた。１００人を上回る人をふるいにかけて３０人の参加者を選択した。この参加者のうち研究中の脱落者は一人もいなかった。
【００３６】
研究開始時には、パッションフルーツ群とプラセボ群の平均血圧（ＳＢＰ、１７６．６０±４．９０  ｖｓ．１７９．６７±３．７９ｍｍＨｇ、ＤＢＰ、１０３．２７±２．３０  ｖｓ．１０４．３３±２．０６ｍｍＨｇ）、年齢、性別、身長、体重、心拍数、及び高血圧に対する前処置投薬又はＥＣＧのパターンに違いはなかった。
【００３７】
研究はＭａｓｈｈａｄ大学のヒト被験者委員会の承認を受けた。インフォームドコンセントの提供と、それまでの何らかの抗高血圧薬治療（２人の被験者におけるトリアムテレン−Ｈを除く）の１週間の離脱の後、適格患者は４週間の二重盲検、プラセボ対照、並行群試験に入った。患者は試験期間中、副作用を評価する経過観察のために毎週受診するよう要請された。さらに、血圧と心拍数の測定も実施した。最初の受診時に完全な病歴と心電図を含む身体検査を実施した。血圧は被験者を座位で１０分間安静にした後、登録看護師が測定した。コロトコフ音のＩ及びＶをそれぞれ収縮期及び拡張期血圧とみなした。受診ごとに２分間隔で合計３回の座位測定の読みを繰り返し取った。所与の受診時における反復測定の平均を記録した。２回目の受診時に血圧及び心拍数を再評価して患者を無作為化し、１日２回投与の２ｍｇ／ポンド／日（最大４００ｍｇ／日）の統計式のパッションフルーツピル又は類似外観のプラセボを４週間投与した。第１週及び第０週のデータを合わせてベースライン値とした。最後の受診時、各患者に対してＥＣＧを実施し、試験薬を回収した。ベースライン及び経過観察受診時に、あらゆる併用投薬及び臨床有害事象における変化は、自発的に申し出たものであれ質問によって引き出されたものであれ、記録されたが、何の報告もなかった。
【００３８】
コンプライアンスは錠剤を数えることによって評価した。４週間の処置期間中、被験者は全員、盲検式に提供されたピルを１００％摂取していた。全ての試験はピルを最後に摂取後２〜４時間に行った。
実施例７：パッションフルーツ果皮抽出物からのエデュリル酸の単離
実施例１に従って製造されたパッションフルーツ果皮抽出物を５０％のエタノール水溶液に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０カラム上で処理し、５０％エタノール水溶液で溶離した。クロマトグラフィーのフラクションを２０ｍｌ管にフラクションコレクターの助けを借りて回収した。フラクションは、セルロースＴＬＣを用いる薄層クロマトグラフィー（６％酢酸水溶液で展開）によってモニタし、ＵＶ下で視覚化した。この条件下で新規化合物（Ｒｆ  ０．８）が有色アントシアニンフラクション（Ｒｆ  ０．４〜０．５）と共溶出した。このフラクションを回収し、濃縮して、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｌｔｄから購入したＭＣＩ  ＧＥＬ  ＣＨＰ  ２０Ｐのカラム上で再度クロマトグラフィーにかけた。１５％メタノール水溶液を溶離溶媒として用いた。フラクションを回収し、セルロースＴＬＣ（ターシャリーＢｕＯＨ−ＡｃＯＨ−Ｈ２Ｏ（３／１／１  ｖ／ｖ）で展開）によってモニタした。新規化合物（この溶媒でＲｆ  ０．９）含有フラクションを回収し、溶媒を蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。
【００３９】
エデュリル酸の高分解エレクトロスプレーイオン化質量分析をニュージーランド・ウェリントンのビクトリア大学のＭＡＲＩＮＥＲ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで陰イオンモードで運転して実施し、（Ｍ−Ｈ）−１のピークを３０１．０９６９１に得た。これはＣ１３Ｈ１８Ｏ８の分子式に一致した。様々なＮＭＲ試験（１Ｈ、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣ及びＮＯＳＥＹ）及び質量分析をエデュリル酸に対して実施した。表１にＮＭＲ試験のデータを示す。
【００４０】
【表１】
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【００４１】
これに基づくと、エデュリル酸の化学構造は以下に示すとおりである。アノマー性プロトンのＪ−カップリングマグニチュードが大きいため（Ｊ＝７．３Ｈｚ）、グルコース残基はベータ結合となっている。
【００４２】
【化１】
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【００４３】
分子の図は、ＡＣＤ／ＣｈｅｍＳｋｅｔｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて作成した。それによれば、（２Ｅ）−シクロペンタ−２−エン−１−イリデン（（３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イル）オキシ）酢酸のＩＵＰＡＣ名が与えられた。該化合物は、本明細書全体を通じて“エデュリル酸”として識別されており、元はパッションフルーツ(Passiflora edulis)の果実から発見されたものである。上図のエデュリル酸の構造はＥ又はトランス異性体である。エデュリル酸は、シス／トランスエノール化を受けてＺ又はシス形になり、また戻ると考えられる。電子シフトはＣ−２プロトンから酢酸部分を通り、又は酢酸部分から反対方向に移動して同じシス／トランスに帰結することができる。
【００４４】
Ｄ２Ｏ中のエデュリル酸のＮＯＥＳＹスペクトルは、糖のアノマー性プロトンとＣ−１（先に示した構造中に番号付けしてある）上のメチレンプロトンとに何らかの相互作用があることを示している（図６ａ及び６ｂ）。これは、カルボン酸部分がシクロペンテン環の二重結合側にある場合にのみ可能である。エデュリル酸のＤｒｅｉｄｉｎｇモデルを用いた更なる研究では、シクロペンテン環に対して最も少ない込み合いを提供する糖部分の配向によって、アノマー性プロトンは確かにＣ−１上のメチレンプロトンに密接して配置されていることを示している。
実施例８：パッションフルーツ果肉中のエデュリル酸の検出
パッションフルーツ果肉の水性抽出物を、果皮に関して実施例１に記載したのと同様に製造し、その化学的特徴をＨＰＬＣを用いて調べた。アセトニトリルの代わりにメタノールを用いる異なるＨＰＬＣ溶媒プログラムが、エデュリル酸とプルナシン(prunasin)のピークを分解するのにうまく使用できた。またＵＶ検出の代わりに、プルナシンのような弱ＵＶ吸収化合物をよりよく検出するために蒸発光散乱検出(Evaporative Light Scattering Detection)（ＥＬＳＤ）を使用した。図７ａ及びｂに、そのような条件下で得られた果皮及び果肉の抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムをそれぞれ示す。果皮及び果肉の抽出物は、それらのＨＰＬＣの特徴によって明らかに区別可能であったが、エデュリル酸及びプルナシンは両方とも、どちらの抽出物中にも存在していたことも明らかとなった。
【００４５】
上記説明及び図面は本発明の例示的態様を含む。本明細書中に記載の前述の態様及び方法は、当業者の能力、経験及び好みによって変動しうる。方法のステップをある順序でリストするだけでは、その方法のステップの順序に対して何らかの制限を構成することにはならない。前述の記載及び図面は単に本発明を説明及び図示するためのものであって、特許請求の範囲がそのように制限している場合を除いて、本発明はそれに制限されない。本開示を前にした当業者は、本発明の範囲から離れることなく、その中で変更及び変形を為すことが可能であろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１ａ−ｃ】本発明に従って製造されたパッションフルーツ抽出物のＨＰＬＣトレースを示す図である。
【図２】パッションフルーツ抽出物を投与された高血圧自然発症ラット群における血圧の低下を示すデータのダイヤグラム表示である。
【図３】パッションフルーツ抽出物を投与されたラット群における血清中一酸化窒素濃度の低下を示すデータのダイヤグラム表示である。
【図４ａ】パッションフルーツ抽出物によるインビボのＮａ−Ｋ  ＡＴＰアーゼ活性の増大を示すデータのダイヤグラム表示である。
【図４ｂ】パッションフルーツ抽出物によるインビボのＣａ  ＡＴＰアーゼ活性の増大を示すデータのダイヤグラム表示である。
【図５ａ】パッションフルーツ抽出物を投与されたヒト群における収縮期血圧の低下を示すデータのダイヤグラム表示である。
【図５ｂ】パッションフルーツ抽出物を投与されたヒト群における拡張期血圧の低下を示すデータのダイヤグラム表示である。
【図６ａ】Ｈ−１メチレンプロトンと、糖部分のＨ−１’及びＨ−２’との相互作用を示す図である。
【図６ｂ】Ｈ−１メチレンプロトンと、糖部分のＨ−１’及びＨ−２’との相互作用を示す図である。
【図７ａ】同一条件下で得られたパッションフルーツ果皮抽出物のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムを示す図である。
【図７ｂ】同一条件下で得られたパッションフルーツ果肉抽出物のＨＰＬＣ−ＥＬＳＤクロマトグラムを示す図である。
【図１ａ−ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【国際調査報告】
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