(57)【要約】  本発明は、ＦｃγＲ細胞外可溶性領域を含む分子、好ましくは可溶性（すなわち非膜結合型）ポリペプチド、最も好ましくは可溶性融合ポリペプチド、その誘導体およびアナログ、ならびにそれをコードする核酸に関する。本発明の分子は、自己免疫疾患の治療、管理、もしくは予防、または１つまたは複数の症状の改善、特に免疫性血小板減少性紫斑病に関連する血清中血小板欠乏の改善にとりわけ有用である。本発明は、本発明の分子を投与することにより自己免疫疾患のための標準的な現行療法または実験的療法の治療効果を増強するための方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つのポリペプチド鎖を含む二量体融合タンパク質であって、前記鎖のそれぞれが、ＦｃＲｎと結合する分子と連結した、Ｆｃ結合部位を含む活性化型ＦｃγＲ細胞外領域を含み、前記分子がいずれのＦｃγＲとも結合せず、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする二量体融合タンパク質。
【請求項２】
前記活性化型ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＡである、請求項１に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項３】
２つのポリペプチド鎖を含む二量体融合タンパク質であって、前記鎖のそれぞれが、ＦｃＲｎと結合する分子と連結した、Ｆｃ結合部位を含む抑制型ＦｃγＲ細胞外領域を含み、前記分子がいずれのＦｃγＲとも結合せず、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする二量体融合タンパク質。
【請求項４】
ＦｃＲｎと結合する前記分子がＩｇＧ分子のヒンジ−定常領域である、請求項１または３に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項５】
前記抑制型ＦｃγＲがＦｃγＲＩＩＢである、請求項４に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＩｇＧ分子がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から成る群から選択される、請求項４に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項７】
２つの同じポリペプチド鎖を含む二量体融合タンパク質であって、前記鎖のそれぞれが、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結した、Ｆｃ結合部位を含むＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を含み、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする二量体融合タンパク質。
【請求項８】
２つの同じポリペプチド鎖を含む二量体融合タンパク質であって、前記鎖のそれぞれが、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結した、Ｆｃ結合部位を含むＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域を含み、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする二量体融合タンパク質。
【請求項９】
自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法であって、それを必要とする被験者に治療上有効な量の請求項１または３に記載の二量体融合タンパク質またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む方法。
【請求項１０】
前記自己免疫障害が特発性血小板減少性紫斑病、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血、強皮症、自己抗体誘発じん麻疹、天疱瘡、血管炎症候群、グッドパスチャー症候群、多発性硬化症、シェーグレン症候群、川崎病、多発性筋炎、または皮膚筋炎である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験者に治療上有効な量の１つまたは複数の抗炎症剤を投与することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験者に治療上有効な量の１つまたは複数の免疫調節剤を投与することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの免疫調節剤が有機小分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記有機小分子がメトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル、マロニトロールアミド、ステロイド、またはコルチコステロイドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの抗炎症剤が非ステロイド系抗炎症薬である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記非ステロイド系抗炎症薬がアスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、ナブメトン、ナプロキセン、またはケトプロテンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
特発性血小板減少性紫斑病の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善する方法であって、それを必要とする被験者に標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法を投与することと組み合わせて、前記被験者に治療上有効な量の請求項１または３に記載の二量体融合タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項１８】
特発性血小板減少性紫斑病の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善する方法であって、それを必要とする被験者に治療上有効な量の請求項１または３に記載の二量体融合タンパク質を投与することを含み、前記被験者が標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法に抗療性である方法。
【請求項１９】
前記標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法が静脈内免疫グロブリン療法、コルチコステロイド療法、脾摘出、またはプラスマフェレーシスである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記被験者がヒトである、請求項９、１７、または１８に記載の方法
【請求項２１】
前記被験者が免疫無防備状態である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験者が癌を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療上有効な量の請求項１または３に記載の二量体融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項２４】
２つの同じポリペプチド鎖を含む二量体融合タンパク質であって、前記鎖のそれぞれが、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域がＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、それによってモノクローナル３Ｇ８抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記３Ｇ８モノクローナル抗体が前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする二量体融合タンパク質。
【請求項２５】
前記細胞外領域における前記少なくとも１つのアミノ酸改変がＦｃγＲＩＩＩＡの３Ｇ８結合部位の置換を含む、請求項２４に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項２６】
前記３Ｇ８結合部位がＦｃγＲＩＩＩＡのＢＣループである、請求項２５に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項２７】
前記３Ｇ８結合部位がＦｃγＲＩＩＩＡのＦＧループである、請求項２５に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項２８】
ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域における前記少なくとも１つのアミノ酸改変が位置１１２でのアスパラギン酸による置換、位置１１３でのリジンによる置換、および位置１１４でのプロリンによる置換を含む、請求項２４に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項２９】
ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域における前記少なくとも１つのアミノ酸改変が位置１６０でのフェニルアラニンによる置換を含む、請求項２４に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項３０】
ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域における前記少なくとも１つのアミノ酸改変が位置１５４でのアスパラギンによる置換、および位置１５５でのイソロイシンによる置換を含む、請求項２４に記載の二量体融合タンパク質。
【請求項３１】
２つの同じポリペプチド鎖を含む二量体融合タンパク質であって、前記鎖のそれぞれが、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域がＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、それによってＦｃγＲＩＩＩＡ抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記抗体が前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする二量体融合タンパク質。
【請求項３２】
自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法であって、それを必要とする被験者に治療上有効な量の請求項２４または３３に記載の二量体融合タンパク質、またはその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む方法。
【請求項３３】
自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法であって、それを必要とする被験者に、（ｉ）Ｆｃγ結合部位を含むＦｃγＲＩＩＩＡの野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の分子と、（ｉｉ）２つの同じポリペプチド鎖を有する治療上有効な量の二量体融合タンパク質とを投与することを含み、前記鎖のそれぞれがＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を含み、前記変異型細胞外領域は前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、それによって前記分子が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記分子が前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記分子が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗体がＣＬＢ−ＧＲＡＮ１、ＢＷ２−９／２、ＧＲＭ１、ＤＪ１３０ｃ、ＬＮＫ１６である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法であって、それを必要とする被験者に、（ｉ）治療上有効な量の請求項２４に記載の二量体融合タンパク質と、（ｉｉ）治療上有効な量の３Ｇ８モノクローナル抗体、または結合について３Ｇ８と競合する抗体、とを投与することを含む方法。
【請求項３７】
前記３Ｇ８モノクローナル抗体または３Ｇ８と結合を競合する抗体がヒト化抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法であって、それを必要とする被験者に、（ｉ）Ｆｃγ結合部位を含むＦｃγＲＩＩＢの野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の抗体と、（ｉｉ）２つの同じポリペプチド鎖を含む治療上有効な量の二量体融合タンパク質とを投与することを含み、前記鎖のそれぞれがＦｃγＲＩＩＢ変異型細胞外領域を含み、前記変異型細胞外領域が前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、それによって前記抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記抗体が前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする方法。
【請求項３９】
前記抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９１を有するクローン２Ｂ６により産生される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体がＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９２を有するクローン３Ｈ７により産生される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
特発性血小板減少性紫斑病の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善する方法であって、それを必要とする被験者に標準的な特発性血小板減少性紫斑病治療法を投与することと組み合わせて、前記被験者に治療上有効な量の請求項２４または３３に記載の二量体融合タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項４２】
前記標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法が静脈内免疫グロブリン療法、コルチコステロイド療法、脾摘出、またはプラスマフェレーシスである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
特発性血小板減少性紫斑病の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善する方法であって、それを必要とする被験者に治療上有効な量の３Ｇ８モノクローナル抗体または結合について３Ｇ８と競合する抗体と組み合わせて、治療上有効な量の請求項２４に記載の二量体融合タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項４４】
特発性血小板減少性紫斑病の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善する方法であって、それを必要とする被験者に治療上有効な量の３Ｇ８モノクローナル抗体と組み合わせて、治療上有効な量の請求項２４に記載の二量体融合タンパク質を投与することを含み、前記被験者が標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法に抗療性であることを特徴とする方法。
【請求項４５】
特発性血小板減少性紫斑病の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善する方法であって、それを必要とする被験者に治療上有効な量の３Ｇ８モノクローナル抗体と組み合わせて、治療上有効な量の請求項２４に記載の二量体融合タンパク質を投与することを含み、標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法の副作用をもたらさないことを特徴とする方法。
【請求項４６】
前記副作用が好中球減少症またはサイトカイン放出症候群である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記被験者に標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法を投与することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法が静脈内免疫グロブリン療法（ＩＶＩＧ）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
治療上有効な量の請求項１または３のいずれかに記載の二量体融合タンパク質と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。
【請求項５０】
（ｉ）Ｆｃγ結合部位を含むＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の分子と、（ｉｉ）２つの同じポリペプチド鎖を含む治療上有効な量の二量体融合タンパク質と、（ｉｉｉ）薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物であって、前記鎖のそれぞれがＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を含み、前記変異型細胞外領域が前記野生型細胞外領域と対して少なくとも１つのアミノ酸改変を含み、それによって前記分子が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記分子が前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質が免疫複合体と特異的に結合することを特徴とする医薬組成物。
【請求項５１】
請求項１または３に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項５２】
請求項５１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５３】
発現ベクターである、請求項５２に記載のベクター。
【請求項５４】
請求項５１に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項５５】
請求項１または３に記載のポリペプチドを組換え産生するための方法であって、（ｉ）前記ポリペプチドの発現に適した条件で前記ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞を培地中で培養すること、および（ｉｉ）前記培地から前記ポリペプチドを回収することを含む方法。
【請求項５６】
配列番号１〜４、３４、３６、３８、４０または４２のうちの１つのアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項５７】
請求項５８に記載のポリペプチドのいずれかの断片であって、免疫複合体と結合する断片。
【請求項５８】
配列番号１〜４、３４、３６、３８、４０、および４２のいずれかからのアミノ酸配列と少なくとも７５％相同であり、かつ免疫複合体と結合するがＦｃγＲと結合しないアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号１〜４、３４、３６、３８、４０および４２のいずれかからのアミノ酸配列を含むタンパク質をコードし、かつ免疫複合体と結合するがＦｃγＲと結合しないヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項６０】
二量体融合タンパク質をコードし、配列番号７、８、３５、３７、３９または４１のヌクレオチド配列と高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子。
【請求項６１】
前記ポリペプチド鎖が同じである、請求項１または３に記載の二量体融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体を参照により本明細書中に取り入れる、２００３年１月１３日に出願した米国仮出願第60/439,709号の優先権を主張するものである。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、Ｆｃγの細胞外可溶性領域を有する分子、好ましくは可溶性（すなわち膜結合ではない）ポリペプチド、最も好ましくは可溶性融合ポリペプチド、その誘導体およびアナログ、ならびにそれをコードする核酸に関する。本発明の分子は自己免疫疾患の治療、管理、もしくは予防、または自己免疫疾患の１つもしくは複数の症状の改善、特に免疫性血小板減少性紫斑病に関連する血清中血小板欠乏の改善にとりわけ有用である。本発明は、本発明の分子を投与することにより自己免疫疾患のための標準的な現行療法または実験的療法の治療効果を増強するための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
２．１  Ｆｃγ受容体および免疫系に果たすそれらの役割
抗体抗原複合体と免疫系の細胞との相互作用は、抗体依存性細胞傷害、マスト細胞脱顆粒反応、および食作用などのエフェクター機能からリンパ球の増殖および抗体分泌の制御などの免疫調節シグナルまで広い一連の応答をもたらす。これらの相互作用の全ては、抗体のＦｃγドメインまたは免疫複合体が造血細胞上の特定の細胞表面受容体と結合することによって開始する。抗体および免疫複合体により誘発された細胞応答の多様性は、Ｆｃγ受容体の構造の不均一性に起因する。Ｆｃγ受容体は、細胞内シグナル伝達をおそらく仲介している構造的に関係したリガンド結合ドメインを共有している。
【０００４】
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリータンパク質のメンバーであるＦｃγ受容体は、免疫グロブリン分子のＦｃγ部分と結合する表面糖タンパク質である。ファミリーの各メンバーはＦｃγ受容体の鎖上の認識ドメインを介して１つまたは複数のアイソタイプの免疫グロブリンを認識する。Ｆｃγ受容体は免疫グロブリンサブタイプに対する特異性により定義される。ＩｇＧに対するＦｃγ受容体をＦｃγＲ、ＩｇＥに対するものをＦｃεＲ、ＩｇＡに対するものをＦｃαＲと呼ぶ。異なるアクセサリー細胞が異なるアイソタイプの抗体に対するＦｃγ受容体を有し、どのアクセサリー細胞が所定の応答に携わるかを抗体のアイソタイプが決定している（Ravetch J.V.ら、1991、Annu. Rev. Immunol. 9: 457〜92頁；Gerber J.S.ら、2001 Microbes and Infection、3:131〜139頁；Billadeau D.D.ら、2002、The Journal of Clinical Investigation、2(109): 161〜1681頁；Ravetch J.V.ら、2000、Science、290:84〜89頁；Ravetch J.V.ら、2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275〜90頁；Ravetch J.V. 1994, Cell、78(4):553〜60頁に総説される。）。異なるＦｃγ受容体、それらを発現する細胞、およびそれらのアイソタイプ特異性を表１（Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 第4版、1999、Elsevier Science Ltd/Garland Publishing、ニューヨークから改作した。）にまとめる。
【０００５】
Ｆｃγ受容体
このファミリーの各メンバーは、Ｃ２セットの免疫グロブリン関係ドメインに関係する細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および多様な長さの細胞質ドメインを有する内在性膜糖タンパク質である。ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）と称する３つの公知のＦｃγＲが存在する。別個の遺伝子がこれら３つの受容体をコードするが、ファミリーの３つのメンバーの間の広い相同性は、それらがおそらく遺伝子重複により共通の前駆体から生じたことを示唆している。
【０００６】
ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）
ＦｃγＲＩＩタンパク質は、単量体Ｉｇ（１０６Ｍ−１）に対する親和性が低いことから、複合体となったＩｇＧとのみ結合する４０ＫＤａの内在性膜糖タンパク質である。この受容体は、単球、マクロファージ、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、好中球、マスト細胞および血小板を含めた全ての造血細胞に存在する最も広く発現するＦｃγＲである。ＦｃγＲＩＩは免疫グロブリン結合鎖に２つの免疫グロブリン様領域しか有していないことから、ＩｇＧに対してＦｃγＲＩよりもはるかに低い親和性を有する。３つのヒトＦｃγＲＩＩ遺伝子（ＦｃγＲＩＩ−Ａ、ＦｃγＲＩＩ−Ｂ、ＦｃγＲＩＩ−Ｃ）があり、それらの全ては凝集体または免疫複合体中のＩｇＧと結合する。
【０００７】
ＦｃγＲＩＩ−ＡおよびＦｃγＲＩＩ−Ｂの細胞質ドメイン内の独特な相違により、受容体連結に対して２つの機能的に異種の応答を生じる。基礎的な相違は、Ａアイソフォームは食作用および呼吸バーストなどの細胞活性化をもたらす細胞内シグナル伝達を開始するが、Ｂアイソフォームは例えばＢ細胞活性化の抑制などの抑制シグナルを開始することである。
【０００８】
ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）
このクラス内の不均一性が原因となって、マウスおよびヒトにおけるＦｃγＲＩＩＩの分子量は４０から８０ＫＤａの範囲である。２つのヒト遺伝子が２つの転写体、すなわち内在性膜糖タンパク質であるＦｃγＲＩＩＩＡおよびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合型のＦｃγＲＩＩＩＢをコードしている。１つのマウス遺伝子が膜貫通型ヒトＦｃγＲＩＩＩＡと相同のＦｃγＲＩＩＩをコードする。ＦｃγＲＩＩＩは残りの２つのＦｃγＲのそれぞれと共通の構造特性を有する。ＦｃγＲＩＩと同様に、ＦｃγＲＩＩＩは低親和性でＩｇＧと結合し、対応する２つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含む。ＦｃγＲＩＩＩＡはマクロファージ、マスト細胞に発現し、ＮＫ細胞における唯一のＦｃγＲである。ＧＰＩ結合ＦｃγＲＩＩＩＢが発現することが分かっているのは現在のところヒト好中球のみである。
【０００９】
ＦｃγＲを介したシグナル伝達
活性化シグナルと抑制シグナルの両方が連結後のＦｃγＲを介して伝達される。これらの正反対の機能は、異なる受容体アイソフォーム間の構造の相違に起因する。免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＡＭ）または免疫受容体主チロシン抑制モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｂａｓｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｏｔｉｆ）（ＩＴＩＭ）と呼ばれる、受容体の細胞質シグナル伝達ドメイン内の２つの別個のドメインが、異なる応答の原因となっている。これらの構造に異なる細胞質酵素が動員されると、ＦｃγＲ介在性細胞応答の結果が決まる。ＩＴＡＭ含有性ＦｃγＲ複合体にはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃＲＩＩＩＡがあり、ＩＴＩＭ含有性複合体にはＦｃγＲＩＩＢだけがある。
【００１０】
ヒト好中球はＦｃγＲＩＩＡ遺伝子を発現する。免疫複合体または特異的抗体架橋を介したＦｃγＲＩＩＡのクラスタリングは、ＩＴＡＭのリン酸化を促進する受容体関連キナーゼと一緒にＩＴＡＭを凝集させるように働く。ＩＴＡＭのリン酸化はＳｙｋキナーゼのためのドッキング部位として働き、Ｓｙｋキナーゼの活性化は下流の基質（例えばＰＩ３Ｋ）の活性化を招く。細胞の活性化は前炎症性伝達物質の放出をもたらす。
【００１１】
ＦｃγＲＩＩＢ遺伝子はＢリンパ球上に発現し、その細胞外ドメインはＦｃγＲＩＩＡと９６％同一で、区別できない様式でＩｇＧ複合体と結合する。ＦｃγＲＩＩＢの細胞質ドメインにＩＴＩＭが存在することは、この抑制サブクラスのＦｃγＲの顕著な特徴である。最近になってこの抑制の分子的基盤が確立された。活性化型ＦｃγＲと一緒に共連結する場合に、ＦｃγＲＩＩＢ中のＩＴＩＭはリン酸化され、イノシトールポリリン酸５’−ホスファターゼのＳＨ２ドメイン（ＳＨ２  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｏｓｉｔａｌ  ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ５’−ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＳＨＩＰ）を誘引し、その酵素はＩＴＡＭ含有ＦｃγＲが仲介するチロシンキナーゼ活性化の結果として放出されたホスホイノシトールメッセンジャーを加水分解し、結果として細胞内Ｃａ＋＋の流入を阻害する。このようにＦｃγＲＩＩＢの架橋は、ＦｃγＲ連結に対する活性化応答を鈍らせ細胞応答性を抑制する。このようにしてＢ細胞活性化、Ｂ細胞増殖および抗体分泌が中断する。
【表１】
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【００１２】
２．２関連疾患
２．２．１自己免疫疾患
自己免疫疾患は自己抗原に対して特定の適応免疫応答を備える場合に起こる。外来抗原に対する適応免疫応答の通常の結果は身体からの抗原の浄化である。例えばウイルスに感染した細胞は細胞傷害性Ｔ細胞により破壊され、一方、可溶性抗原は抗体と抗原との免疫複合体の形成により浄化され、マクロファージのような単核食細胞系の細胞により捕獲される。しかし、適応免疫応答が自己抗原に対して発生すると、免疫エフェクターメカニズムが抗原を完全に排除することが通常不可能であるため、持続性の応答が起こる。その結果、免疫のエフェクター経路が組織に慢性の炎症傷害を引き起こし、致死的となるおそれがある。自己免疫疾患における組織損傷のメカニズムは、防御免疫および過敏性疾患で作動するものと本質的に同一である。
【００１３】
自己免疫疾患の２つの主なパターン、すなわち自己免疫の発現が身体の特定の器官に限られる「器官特異性」自己免疫疾患として知られている疾患と、身体の多くの組織が冒される「全身性」自己免疫疾患とを識別することが有用である。器官特異性自己免疫疾患の例には、それぞれ主に甲状腺を冒す橋本甲状腺炎およびグレーヴズ病、ならびに膵島を冒すＩ型インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）がある。全身性自己免疫疾患の例には、皮膚、腎臓および脳に至る多様な組織の全てが冒されるおそれのある全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および原発性シェーグレン症候群がある。
【００１４】
自己抗原は身体の内因性構成要素であり、その結果として免疫系のエフェクターメカニズムが身体自体の組織に対するため、自己免疫疾患では組織傷害が生じる。また、適応免疫応答が身体から困りものの自己抗原を除去できないため、免疫応答は持続し、新たな自己抗原が常に供給され、それが応答を増幅する。
【００１５】
血液細胞表面に位置する抗原に対するＩｇＧまたはＩｇＭ応答は、これらの細胞の迅速な破壊をもたらす。この例には自己免疫性溶血性貧血があり、この疾患では赤血球上の自己抗原に対する抗体が細胞の破壊を誘発し、貧血をもたらす。これは２つの方法で起こり得る。ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体が結合した赤血球は、固定した単核食細胞系の細胞上のそれぞれＦｃγ受容体または補体受容体と相互作用することにより循環から速やかに浄化される。これは特に脾臓で起こる。代わりに、自己抗体で感作された赤血球は、補体の膜攻撃複合体の形成により溶解する。自己免疫性血小板減少性紫斑病において、血小板上のＧｐＩＩｂ：ＩＩＩａフィブリノーゲン受容体に主に対する自己抗体は、血小板減少症（血小板の枯渇）を引き起こす場合があり、これが次には出血を引き起こし得る。
【００１６】
免疫障害の現行の治療は、ほぼ全てが本来経験的で、多数の天然化合物および合成化合物をスクリーニングすることにより同定された免疫抑制薬を使用している。免疫系を抑制するために現在使用されている薬物を３つに分類することができる。１つ目は、プレドニゾンのようなコルチコステロイドファミリーの強力な抗炎症薬であり、２つ目は、アザチオプリンおよびシクロホスファミドのような細胞傷害薬であり、３つ目は、Ｔリンパ球内のシグナル伝達イベントを阻害するシクロスポリンＡ、ＦＫ５０６（タクロリムス）およびラパマイシン（シロリムス）のような真菌および細菌誘導体である。これらの薬物は全て作用が非常に広範囲で、免疫系の防御機能も有害な機能とともに阻害する。したがって、日和見感染は免疫抑制薬療法でよくみられる合併症である。このように、より安全で、より有効な自己免疫障害用の治療剤を開発することが依然として必要である。
【００１７】
Ｆｃγ受容体は自己免疫障害の病因に関係している。具体的には、活性化型Ｆｃγ受容体を欠損したマウスは、免疫グロブリン（ＩｇＧ）がコグネイト抗原と結合した場合に、炎症応答を開始することができなかった（Sylvestereら、1994、Science、265:1095〜8頁；Hazenbosら、1996、Immunity、5:181〜8頁；Clynesら、1995、Immunity、3:21〜26頁）。全く対照的に、補体成分を欠損した動物は、これらの実験的に誘導した細胞傷害性抗体およびＩｇＧ−抗原複合体に対して正常な炎症応答を有した（Sylvestreら、1996, J. Exp. Med, 184: 2385〜2392頁）。この発見は、ＦｃγＲは、結合した抗体によるエフェクター細胞応答の誘発を可能にする分子カップリングをもたらすことを実証した。この観察により、抗体が自己免疫疾患において病原性物質として炎症を誘発するメカニズムを基本的に見直すこととなった。
【００１８】
患者の免疫系が血小板を攻撃して破壊する疾患である特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）は、実験動物モデルが利用できることから、自己免疫障害の分子的基盤を理解するための重要な標的であった（Bussel、2000、Semin. Oncol. 27：91〜98頁）。ヒトにおいて血小板糖タンパク質に対する抗体はＩＴＰの病因と関係があるとされてきた（McMillanら、1981、N. Engl. J. Med.、304:1135〜1147頁）。ＦｃγＲノックアウトおよびトランスジェニックマウスの使用と組み合わせたこの疾患のマウスモデルの開発により、病原および治療のメカニズムをさらに深く洞察することが可能になった。（ＮＺＷ×ＢＸＳＢ）Ｆ１マウスは自己抗体の産生が原因で血小板減少症を自然発生する（Oyaizuら、1988、J. Exp. Med.、167: 2017〜22頁；Mizutaniら、1993、Blood、82:837〜844頁）。抗血小板モノクローナル抗体である６Ａ６がこれらのマウスから得られ、ＩＴＰのための受動モデルとして他のマウス系統に使用された。ＣｌｙｎｅｓおよびＲａｖｅｔｃｈは、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩＡの機能を欠損したＦｃγＲ−／−マウスにおいてモノクローナル抗体６Ａ６は血小板減少症を誘導しないことを示した（Clynesら、1995、Immunity、3:21〜26頁）。さらなる研究は、６Ａ６抗体がＦｃγＲＩＩＩを欠失した動物に血小板枯渇を誘導せず、ＦｃγＲＩを欠失した動物では誘導することを実証した。彼らはさらに、ＩＶＩＧ療法が野生型動物の血小板枯渇を防止できるが、ＦｃγＲＩＩＢを欠失した動物ではそうならないことを実証した。ＩＶＩＧで処理した野生型動物はＦｃγＲＩＩＢの発現増加を示した（Samuelssonら、2001、Science、291: 484〜486頁）。このように、これらの研究は、ＩＶＩＧは活性化受容体を遮断するという明らかなメカニズムによって必ずしも作用せず、むしろ抑制受容体ＦｃγＲＩＩＢを誘導することにより作用することを示した。
【００１９】
米国のおよそ１００,０００人がＩＴＰを有し、そのうち原発性ＩＴＰは１８,０００人、ＨＩＶ感染に二次的なＩＴＰは５０,０００人、他の状態に二次的なＩＴＰは３０,０００人である。成人の中で、男性のおよそ３倍の女性がＩＴＰに冒され、小児では男女比はおよそ同等である。この疾患は全ての年齢群を冒す。毎年新たに２０,０００症例が加わり、発生率の推定値は、おおまかに１００万人あたり約１０から１２５人である。ＩＴＰをコントロールするための現行の治療戦略には、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）もしくは抗Ｄ（ＩＶ輸液によらない方法でも送達できる抗Ｒｈグロブリン）の投与、免疫抑制剤（ステロイド、アザチオプリンまたはシクロスポリン）または脾摘出がある。しかし、現在のところＩＴＰのための治療方式は不完全であり、より安全で、より効き目のある治療法が必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
活性化型受容体ＦｃγＲ、例えば受容体ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６Ａ）は、自己抗体の病原作用を仲介する上で重大な役割を果たす。特定の理論と結びつけることを意図するわけではないが、自己免疫疾患で観察される病原性ＩｇＧは、これらの疾患の病因となる誘因であるか、疾患の進行に寄与するかのどちらかであり、細胞性Ｆｃγ受容体の不適当な活性化を介して疾患を仲介する。凝集した自己抗体および／または自己抗原と複合体を形成した自己抗体（すなわち免疫複合体：本明細書で使用する免疫複合体は、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つの異種Ｆｃ領域含有ポリペプチドとが互いに結合して、分子量の大きな複合体を形成する場合に形成する構造を指す。免疫複合体の例には、可溶性または粒子状（例えば細胞表面の抗原／抗体複合体）のどちらかであり得る抗原−抗体複合体があるり、活性化型ＦｃγＲ、例えば受容体ＦｃγＲＩＩＩＡと結合することによって多数の自己免疫疾患の病原作用を誘発する。任意の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、免疫グロブリン凝集物（すなわち免疫複合体）による活性化型受容体ＦｃγＲ、例えば受容体ＦｃγＲＩＩＩＡの活性化（すなわちシグナル伝達）を低減することは自己免疫疾患の治療および／または予防に有望な治療アプローチであろう。このように、ＦｃγＲ介在性経路をターゲッティングすることにより自己免疫疾患を治療および／または予防するための現行法の治療効果を増強すること、または代替治療方式を開発することのどちらかの必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、自己免疫疾患の治療および／または予防のための代替法および組成物を提供する。具体的には本発明は、免疫複合体が活性化型ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡと相互作用するのを予防するための、自己免疫疾患の治療および／または予防のための治療効果を有する分子および組成物を提供する。このように本発明は、自己免疫疾患のための現行の単剤療法または現行の組合せ治療方式よりも優れた治療プロフィルを提供する治療方式または治療プロトコルを包含する。好ましくは、本発明の分子および組成物は、単独または追加の治療剤との組み合わせのどちらかで、好ましくない作用または有害作用も軽減または防止する。ある実施形態において、本発明は組合せ療法を含み、その組合せ療法は、自己免疫疾患のための当技術分野で公知の現行療法と比べて改善された総合療法を提供するものである。
【００２２】
本発明の方法および組成物は、未治療の被験者だけでなく、自己免疫疾患のための現行の標準的療法および実験的療法に対して部分的または完全に抗療性の患者の治療にも有用である。好ましい実施形態において、本発明は、本発明の分子を投与することを含む療法以外の療法に対して抗療性または非応答性であることが示されたか、そのおそれがある自己免疫疾患の治療または予防のための治療法および予防法を提供する。本発明は、自己免疫疾患の治療および／または予防のために当技術分野で公知である１つまたは複数の他の治療剤および／または予防剤と組み合わせて本発明の分子を投与することをさらに包含する。
【００２３】
本発明は、ＦｃγＲの細胞外可溶性領域を有する分子、好ましくは可溶性（すなわち非膜結合型）ポリペプチド、最も好ましくは可溶性融合ポリペプチド、およびそれをコードする核酸に関する。本発明は、これらの分子のアナログ、誘導体および結合体、ならびにそれをコードする核酸を包含する。本発明は、詳細には可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡおよび可溶性ＦｃγＲＩＩＢポリペプチド、ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する融合タンパク質、ならびにそれをコードする核酸に関する。本発明は、可溶性ＦｃγＲＩＩＩＢおよび可溶性ＦｃγＲＩＩＡポリペプチド、ＦｃγＲＩＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡの細胞外領域を有する融合タンパク質、ならびにそれをコードする核酸にも関する。
【００２４】
本発明は、異種ポリペプチドと共有結合したＦｃγＲ細胞外領域を有する、単量体であり得るが好ましくは二量体である融合タンパク質を包含する。本発明の二量体融合タンパク質は１つまたは複数の特異性を有し得る。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は少なくとも２つの異なる結合部位を有し、例えば融合タンパク質はＦｃγＲと特異的に結合するＦｃγＲ細胞外領域と、例えばＩｇＧ分子のＦｃ領域などのＦｃＲｎ結合性分子とを含む。例として一実施形態においてこの異種ポリペプチドは、ＦｃγＲ細胞外領域のｉｎ  ｖｉｖｏ血漿中半減期を延長する。好ましい実施形態において、ＦｃγＲ細胞外領域は、免疫グロブリン定常領域、さらに好ましくはヒンジ−定常領域またはその一部と連結する。非常に好ましい実施形態においてヒンジ−定常領域は、可溶性受容体が投与された患者において循環する抗体に対する親和性よりも他の可溶性受容体融合タンパク質に対して低い親和性を有する。別の好ましい実施形態において、可溶性受容体融合タンパク質のヒンジ−定常領域は、可溶性受容体が投与された患者において循環する抗体に対する親和性よりも膜結合型天然ＦｃγＲに対して低い親和性を有する。好ましくは、本発明の融合タンパク質のＦｃ領域は、Ｆｃ領域と融合した可溶性ＦｃγＲと結合しないか、またはそれに対して低い親和性を有する。他の実施形態において本発明の融合タンパク質のＦｃ領域は、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＢのようなＦｃγＲの１つまたは組み合わせと結合しない。本発明は、当業者に公知である標準的な方法を用いた、またはその全体が参照により本明細書に組み入れられているそれぞれ２００３年１月９日および２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号および第60/456,041号、ならびに２００３年１０月２３日に出願した代理人整理番号011183-009-888の米国仮出願第60/514,549号および２００４年１月９日に出願した代理人整理番号011183-004-999の米国出願第＿号に開示されている方法のいずれかを用いて、可溶性ＦｃγＲに対する親和性を調節するために少なくとも１つのアミノ酸改変を含むように操作されたヒンジ−定常領域の変異体を包含する。非常に好ましい実施形態において、ＦｃγＲ細胞外領域はＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結される。
【００２５】
ある特定の実施形態において、本発明の二量体融合タンパク質は、ＦｃγＲの２つの可溶性細胞外領域を含むという点で少なくとも二価であり、各可溶性細胞外領域はＦｃ定常領域のための結合部位を含む。好ましくは可溶性細胞外領域は同一のＦｃγＲからのもので、さらに好ましくは同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、可溶性細胞外領域は異なるＦｃγＲからのもので、すなわち異なる特異性を有するため、二量体融合タンパク質は少なくとも二特異性である。本発明の二量体融合タンパク質は、ＦｃγＲの各可溶性細胞外領域と融合した分子をさらに含む可能性があり、その分子は二量体融合タンパク質の安定性（例えば血清中半減期）を増加させる。これらの分子は、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧの好ましくはＦｃドメインであり、さらに好ましくは免疫グロブリンＦｃのヒンジ−定常領域である。そのような分子は、１つまたは複数の追加の結合ドメイン、例えばＦｃＲｎに対する結合ドメインを含む可能性があり、好ましくはＦｃγＲと結合しない。このように、本発明のこのような分子は、少なくとも３つの結合部位を有する点で少なくとも三価であり得る。他の特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ定常領域に対する結合部位を含むＦｃγＲの可溶性細胞外領域を有する単量体融合タンパク質を含み、その可溶性細胞外領域は可溶性細胞外領域の安定性を増加させる分子と融合している。そのような単量体融合タンパク質は一価（すなわち１つの結合部位のみを有する）であり得るが、追加の結合部位を有する可能性もあり、例えば可溶性細胞外領域がＦｃ定常ドメインまたはヒンジ−定常ドメインと融合する場合、そのドメインは例えばＦｃＲｎに対する結合部位も有する可能性があることから、少なくとも二価である。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体（Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｎｅｏｎａｔｅ））と結合する任意の分子と共有結合したＦｃγＲ細胞外領域を有する二量体融合タンパク質を包含し、前記二量体融合タンパク質は好ましくはＦｃγＲと結合しない。ＦｃＲｎ結合性分子には、例えばＦｃ領域または（ヒンジ−定常領域を含めた）その一部を含むＩｇＧ分子またはその一部、例えばＩｇＧのＩｇＧ１サブクラスがあるが、所定の動物の他の任意のＩｇＧサブクラスでもあり得る。例えばヒトにおいて、ＩｇＧクラスにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４があり、マウスＩｇＧにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、およびＩｇＧ３がある。ＩｇＧ分子はＦｃγＲおよび／またはＦｃＲｎに対する結合親和性を改変する少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変を有し得る。ＩｇＧの結合親和性を改変するアミノ酸改変は当技術分野で公知であり本明細書に包含される。
【００２７】
特定の実施形態において、本発明は２つの同じポリペプチド鎖を有する二量体融合タンパク質を包含し、前記鎖のそれぞれは、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結した、Ｆｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。なお別の特定の実施形態において、本発明は２つの同じポリペプチド鎖を有する二量体融合タンパク質を包含し、前記鎖のそれぞれは、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結したＦｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域を有し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。
【００２８】
本発明は、そのような分子の治療上の使用、詳細には自己免疫疾患の治療および／または予防のための使用に関する。任意の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡポリペプチド、それを含む融合タンパク質、およびその誘導体はＦｃγＲＩＩＩＡと免疫複合体との相互作用を遮断することで、単剤療法としての治療有用性を有する。本発明は、自己免疫疾患の治療および／または予防のための単剤療法としての可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡポリペプチド、それを含む融合タンパク質、ならびにその誘導体の使用を包含する。本発明は、自己免疫疾患の治療および／または予防のための可溶性ＦｃγＲＩＩＢポリペプチド、それを含む融合タンパク質、およびその誘導体の使用も提供する。これは、ＦｃγＲＩＩＢは伝統的には免疫複合体の浄化に関係しないとされているものの、本明細書に開示したようにＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する融合タンパク質が自己免疫疾患のための動物モデルに治療有用性を有するという本発明者らによる驚くべき発見に部分的に基づいている。
【００２９】
本発明は、ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域から成る可溶性ＦｃγＲポリペプチドを提供する。本発明は、自己免疫障害（自己免疫障害の例を本明細書の５．４．１節に開示する）の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、その方法は、治療上有効な量の可溶性ＦｃγＲポリペプチドを、当業者に公知である自己免疫疾患の治療に使用される治療上有効な量の１つまたは複数の治療剤と組み合わせて投与することを含む。本発明の分子と組み合わせて使用できる治療剤を本明細書の５．４．３節に開示する。特定の一実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、その方法は治療上有効な量の可溶性ＦｃγＲポリペプチドを３Ｇ８モノクローナル抗体と組み合わせて投与することを含む。
【００３０】
本発明は、自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、その方法は治療上有効な量の融合タンパク質を投与することを含み、その融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ−定常領域（または安定性を強化するが、特別なＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢと結合しない他のポリペプチド）と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を含む。代わりの実施形態において、本発明は、自己免疫疾患の治療および／または予防のために、治療上有効な量の融合タンパク質を、当業者に公知の１つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む組合せ療法を包含し、その融合タンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する。ＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質は、特発性血小板減少性紫斑病の１つまたは複数の症状の治療、予防、または改善に特に有用である。一実施形態において本発明は、ＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する融合タンパク質を、標準的な特発性血小板減少性紫斑病療法、例えばＩＶＩＧと組み合わせて投与することにより、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善することを包含する。好ましい実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する融合タンパク質をＩＴＰの治療のために投与することは、標準的なＩＴＰ療法の有害副作用、例えば好中球減少症、サイトカイン放出症候群と比べて軽減された有害副作用を有する。非常に好ましい実施形態において、ＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質は、最小の副作用を招く一方で、自己免疫疾患に対して増強した臨床効果を有する。
【００３１】
本発明は、当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ法を用いて本発明の分子を操作することを包含する。特定の実施形態において、本発明はＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質を操作することを包含し、融合タンパク質は細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有し、そのアミノ酸改変は自己免疫疾患の治療および／または予防のための作用物質、例えばＦｃγＲ細胞外領域と特異的に結合する抗体に対する可溶性細胞体タンパク質の親和性を１００分の１以下に、好ましくは１０００分の１（例えばマイクロモル濃度範囲）に低下させるため、生じた修飾融合タンパク質をその作用物質と組み合わせて投与することができ、その作用物質と顕著に複合体を形成することがない。細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有する修飾融合タンパク質も免疫複合体と特異的に結合する。一実施形態において、細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有する修飾融合タンパク質は、野生型細胞外領域に比べて高い親和性で免疫複合体と特異的に結合する。
【００３２】
なお別の実施形態において、本発明はＦｃγＲ細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質を操作することを包含し、融合タンパク質は、作用物質に対する可溶性細胞外タンパク質の親和性を打ち消す少なくとも１つのアミノ酸改変を細胞外領域に有し、融合タンパク質はさらに野生型細胞外領域に比べて免疫複合体に対して増強した親和性を有する。
【００３３】
特定の一実施形態において、本発明は２つの同じポリペプチド鎖を有する二量体融合タンパク質を包含し、それぞれの鎖はＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域はＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、３Ｇ８モノクローナル抗体（または３Ｇ８抗体との結合を野生型ＦｃγＲＩＩＩＡと競合する他の任意の抗体）は、前記モノクローナル３Ｇ８抗体が野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記二量体融合タンパク質と結合し、その二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。一実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域における１つまたは複数のアミノ酸改変は、３Ｇ８結合部位での置換を含む。別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１１２でのアスパラギン酸による置換、位置１１３でのリジンによる置換、位置１１４でのプロリンによる置換を含む。なお別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１６０でのフェニルアラニンによる置換を有する。別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１５４でのアスパラギンによる置換、および位置１５５でのイソロイシンによる置換を有する。
【００３４】
本発明は、２つの同じポリペプチド鎖を有する二量体融合タンパク質も包含し、それぞれの鎖はＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ）の野生型細胞外領域を有する。
【００３５】
本発明は、本発明の操作された分子を用いた自己免疫疾患の治療および／または予防を包含する。一実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための組み合わせ方式を包含し、前記方式は、それを必要とする被験者に、Ｆｃ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の分子、好ましくは抗体、例えばＣＬＢ−ＧＲＡＮ１、ＢＷ２−９／２、ＧＲＭ１、ＤＪ１３０ｃ、ＬＮＫ１６（Tammら、1996、Journal of Immunology、157(4):1566〜81頁；Fleitら、1989、Leukocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens、159頁）と、２つの同じポリペプチド鎖を有し、前記鎖のそれぞれがＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する治療上有効な量の二量体融合タンパク質とを投与することを含み、前記変異型細胞外領域は、前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、前記分子が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記分子は前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。
【００３６】
特定の一実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、前記方法はそれを必要とする被験者に、２つの同じポリペプチド鎖を有する本発明の二量体融合タンパク質のような治療上有効な量のＣＤ１６Ａアンタゴニストを投与することによる組合せ療法を含み、このとき前記鎖のそれぞれは、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域はＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、モノクローナル３Ｇ８抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記３Ｇ８モノクローナル抗体は前記二量体融合タンパク質と結合し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。
【００３７】
別の特定の実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、前記方法は、それを必要とする被験者に、Ｆｃ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＢ野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の抗体、例えばＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９１（参照により本明細書に組み込まれているＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、マサチューセッツ州、ＶＡ  ０２２０９−２０１１に寄託）を有するクローン２Ｂ６から産生される抗体と、２つの同じポリペプチド鎖を有する治療上有効な量の二量体融合タンパク質とを投与することを含み、前記鎖のそれぞれはＦｃγＲＩＩＢの変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域は前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、前記抗体が野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記抗体は前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。
【００３８】
なお別の特定の実施形態において、本発明は、自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、前記方法は、それを必要とする被験者に、Ｆｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＢ野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の任意の抗体と、２つの同じポリペプチド鎖を有する治療上有効な量の二量体融合タンパク質とを投与することを含み、前記抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２００２年８月１４日に出願した米国仮出願第60/403,266号および２００３年８月１４日に出願した米国出願第10/643,857号に開示され、前記鎖のそれぞれはＦｃγＲＩＩＢの変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域は前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、前記抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記抗体は前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。
【００３９】
好ましくは、免疫グロブリン定常領域のヒンジ−定常領域は、免疫グロブリン定常領域のヒンジ部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインの境界に対応するアミノ酸として定義される。特定の実施形態において、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域は、参照により本明細書に組み込まれているKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Science、 NIH、ベセズダ、メリーランド州（１９９１）に収載されているようなＥＵインデックスに基づくと、アミノ酸６８０〜１３６６から成る。Ｋａｂａｔに収載されているような「ＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基付番を指す。特定の実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＦｃγＲ細胞外領域のＣ末端アミノ酸にヒンジ−定常領域のＮ末端アミノ酸を融合させることを含む。本発明は、ＦｃγＲ細胞外領域のＮ末端またはＣ末端アミノ酸にヒンジ−定常領域を融合させることを包含する。本発明は、ヒンジ−定常領域の一部を包含する。本明細書において使用する「ヒンジ−定常領域の一部」という用語は、ヒンジ−定常領域の断片を指す。断片５はアミノ酸からヒンジ−定常領域全体から１アミノ酸を減じたものまでサイズが変動し得る。好ましくはそのような一部は可溶性ＦｃγＲの安定性を増加させる。
【００４０】
本発明は、本発明の分子の生物学的に活性な断片も包含する。一実施形態において、本発明は、当業者に公知の標準的なアッセイにより決定されるような、Ｆｃγの結合を維持するＦｃγＲ細胞外領域の断片に関する。別の実施形態において、本発明は本明細書に記載されるように、天然二量体融合タンパク質の活性を保持する本発明の二量体融合タンパク質の生物学的に活性な断片を包含する。本発明は、本発明の分子のアミノ酸配列と十分に（例えば、少なくとも約４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、９９％）同一の、またはそのアミノ酸配列から得られたポリペプチドも包含する。
【００４１】
本発明は、免疫グロブリン定常領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域を有する本発明の分子をコードするポリヌクレオチド、例えば、本発明の二量体融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を包含する。本発明は、本発明の分子またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸分子を提供する。ある実施形態において、本発明は当業者に公知の、または本明細書に記載される標準的なアッセイにより決定されるように天然分子と比較すると生物学的活性を維持している本発明の分子の変異体をコードする核酸分子を提供する。ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含めるがそれらに限定されない任意の免疫グロブリンの定常領域に対応する核酸分子が本発明の範囲内である。本発明は免疫グロブリン定常領域の変異体をコードする核酸分子も包含する。好ましい実施形態において、本発明は、当業者に公知の標準的なアッセイにより決定されるように、ＦｃγＲＩＩＩＡに対して低い親和性を有する免疫グロブリン定常領域の変異体をコードする核酸分子を包含する。別の好ましい実施形態において、定常領域は、２００３年１月９日、２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号、第60/456,041号および２００３年１０月２３日に出願した米国仮出願第60/514,549号、ならびに２００４年１月９日に出願し整理番号011183-004-999の米国出願第＿号に開示された変異体と、そこに開示された方法により同定された特定の変異体とのうちの１つである。これら全ての出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００４２】
一実施形態において、本発明は好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列を提供する。一実施形態において、本発明はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ５２６４５であるｃＤＮＡがコードするｃＤＮＡ（ｃＤＮＡ＝ＧＩ：３１３２３）を包含する。代わりの実施形態において、本発明はＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｐ０８６３７がコードするタンパク質（タンパク質＝ＧＩ：１１９８７６）を提供する。好ましい実施形態において、本発明は本明細書において参照された対立遺伝子変異体、具体的には１５８Ｖ／Ｆを包含する。一実施形態において、本発明は好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＩＢの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列を提供する。別の実施形態において、本発明は好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列を提供する。本発明の融合タンパク質は、その全てが参照により本明細書に組み込まれている以下の寄託物：Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３１９３４（ＧＩ：１８２６００、ＦｃγＲＩＩＢ−２  ｃＤＮＡ）、ＡＡＡ３５８４２（ＦｃγＲＩＩＢ−２タンパク質＝ＧＩ：１８２６０１）、Ｍ３１９３５（ＦｃγＲＩＩＢ−１  ｃＤＮＡ＝ＧＩ：１８２６０２）、Ｍ３１９３３（ＦｃγＲＩＩＢ−３  ｃＤＮＡ＝ＧＩ：１８２５９８）の配列またはその一部がコードするタンパク質およびＤＮＡを包含する。本発明は、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＡの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列も包含する。本発明は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ３１９３２（ＧＩ：１８２４７３、ＦｃγＲＩＩＡ  ｃＤＮＡ）を包含する。一実施形態において、本発明はＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と融合した、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列を提供する。一実施形態において、本発明はＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と融合した、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＩＢの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列を提供する。別の実施形態において、本発明はＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と融合した、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列を提供する。なお別の実施形態において、本発明はＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と融合した、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＡの細胞外領域をコードする、単離された核酸配列を提供する。
【００４３】
本発明は前記核酸を有するベクターにも関する。特定の一実施形態において、前記ベクターは発現ベクターである。好ましい実施形態において、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と融合した、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、またはＦｃγＲＩＩＩＢの細胞外領域を有する可溶性融合タンパク質を発現するベクターを、当業者に公知の標準的なトランスフェクション法によりＨＥＫ−２９３細胞に安定トランスフェクトし、可溶性融合タンパク質を分泌させる。分泌した融合タンパク質を好ましくはプロテインＧクロマトグラフィー法で精製してから、ＩｇＧカラムでアフィニティクロマトグラフィーを行う。非常に好ましい実施形態において、融合タンパク質を９５％の均一性まで精製する。
【００４４】
本発明は、本発明の分子のベクターまたはその分子をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞をさらに提供する。本発明は、本発明の分子の産生のための方法をさらに提供する。本発明の分子をポリペプチド、具体的には融合ポリペプチドの産生のための当技術分野で公知の任意の方法、例えば化学合成または当技術分野で公知の組換え発現法により産生できる。
【００４５】
本発明は細胞に基づくアッセイおよび無細胞アッセイにおいて本発明の分子を特性決定するための方法を包含する。本発明は細胞外ＦｃγＲ領域を有するか、またはその領域から成る本発明の分子がリガンド、例えば免疫複合体と免疫特異的に結合する能力を決定するための方法を包含する。例えばＥＬＩＳＡに基づくアッセイ、放射免疫に基づくアッセイ、ＦＡＣＳ分析など（以下の５．２節参照）を含めた当業者に公知の任意の標準的なアッセイが、本発明の方法に考えられている。特定の一実施形態において、本発明の分子は、免疫に基づくアッセイ、例えばＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ分析で決定されるように１〜１０ｎＭの範囲のＫｄで免疫複合体と結合する。別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有する本発明の分子は、野生型細胞外領域を有する分子よりも高いアビディティで免疫複合体と結合する。本発明は、当業者に公知の免疫複合体遮断アッセイにより本発明の分子を特性決定することをさらに包含する。追加的に、本発明の分子の治療効果を動物モデルで決定できる。例示的なモデル系はＩＴＰのためのマウスモデル系である（Oyaizuら、1988、J. Exp. Med. 167: 2017〜22頁およびMizutaniら、1993、Blood、82: 837〜44頁参照、これら両方はその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。以下の実施例６参照のこと。
【００４６】
本発明は、本発明の分子を含む医薬組成物も包含する。一実施形態において、本発明は、治療上有効な量の二量体融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を包含し、その融合タンパク質は、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結した２つの同じポリペプチド鎖を有し、前記鎖のそれぞれがＦｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。別の実施形態において、本発明は、治療上有効な量の二量体融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を包含し、その融合タンパク質は、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結した２つの同じポリペプチド鎖を有し、前記鎖のそれぞれがＦｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域を有し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。
【００４７】
なお別の実施形態において、本発明は、ＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の分子と、２つの同じポリペプチド鎖を有する治療上有効な量の二量体融合タンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を包含し、前記鎖のそれぞれはＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域は前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、前記分子が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記分子は前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。
【００４８】
３．１定義
本明細書において使用する「免疫複合体と特異的に結合する」という用語および類似の用語は、免疫複合体と特異的に結合し別の分子と特異的に結合しない分子を指す。免疫複合体と特異的に結合する分子は、例えばイムノアッセイ、ＢｌＡｃｏｒｅ、または当技術分野で公知の他のアッセイで決定されるように、他のペプチドまたはポリペプチドと低い親和性で結合し得る。好ましくは、免疫複合体と特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。例えばイムノアッセイ、ＢｌＡｃｏｒｅ、または当業者に公知の他の方法により、免疫複合体と特異的に結合する分子を同定できる。
【００４９】
本明細書において使用する免疫複合体は、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つの異種Ｆｃγ領域含有ポリペプチドとが互いに結合して大きな分子量の複合体を形成する場合に形成する構造を指す。免疫複合体の例には、可溶性または粒子状（例えば細胞表面の抗原／抗体複合体）のどちらかであり得る抗原−抗体複合体がある。
【００５０】
本明細書において使用する「重鎖」、「軽鎖」、「可変領域」、「フレームワーク領域」、「定常ドメイン」などは、免疫分野における通常の意味を有し、天然免疫グロブリンにおけるドメインおよび合成（例えば組換え）結合タンパク質（例えばヒト化抗体、一本鎖抗体など）の対応するドメインを指す。天然免疫グロブリン（例えばＩｇＧ）の基本構造ユニットは、通常およそ１５００００ダルトンの糖タンパク質として発現される２本の軽鎖と２本の重鎖とを有する四量体である。各鎖のアミノ末端（「Ｎ」）部分は抗原認識を主に担う約１００から１１０以上のアミノ酸から成る可変領域を含む。各鎖のＣ末端（「Ｃ」）部分は定常領域を規定し、軽鎖は単一の定常ドメインを有し、重鎖は通常３つの定常ドメインと１つのヒンジ部とを有する。このように、ＩｇＧ分子の軽鎖の構造はｎ−ＶＬ−ＣＬ−ｃであり、ＩｇＧ重鎖の構造はｎ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｃ（Ｈはヒンジ領域）である。ＩｇＧ分子の可変領域は、抗原と接触している残基を含む相補性決定部（ＣＤＲ）とフレームワークセグメントと呼ばれる非ＣＤＲセグメントとから成り、そのセグメントは総じて構造を維持し、（若干のフレームワーク残基は抗原とも接触し得るが）ＣＤＲループの位置を決定している。このように、ＶＬおよびＶＨドメインはｎ−ＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３，ＦＲ４−ｃの構造を有する。
【００５１】
本明細書において使用する「ＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質」、「ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体」、および「抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体」という用語は、相互交換可能に使用され、多様な免疫グロブリン様または免疫グロブリン由来タンパク質を指す。「ＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質」は、ＶＬおよび／またはＶＨドメインとの相互作用を介して（Ｆｃγ介在性結合とは別個に）ＦｃγＲＩＩＩＡと結合する。ＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質の例には、（例えば重鎖２本と軽鎖２本とを有する）完全ヒト抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、その断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片）、二機能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）または多機能性抗体（ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（例えばLanzavecchiaら、1987、Eur. J. Immunol. 17:105頁参照）、一本鎖抗体（例えばBirdら、1988、Science 242:423〜26頁参照）、融合タンパク質（例えばファージディスプレイ融合タンパク質）、「ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」（例えば米国特許第5,837,821号参照）、ならびにＶＬおよび／もしくはＶＨドメインまたはその断片を有する他の抗原結合タンパク質がある。一態様においてＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質は、「四量体性抗体」、すなわち天然ＩｇＧの構造を総じて有し、可変および定常ドメイン、すなわちＶＬドメインと軽鎖定常ドメインとを含む２つの軽鎖およびＶＨドメインと重鎖ヒンジドメインと定常ドメインとを含む２つの重鎖を有する。
【００５２】
本明細書において使用する「ＣＤ１６アンタゴニスト」という用語は、ＦｃγＲＩＩＩＡの少なくとも１つの生物学的活性、例えばシグナル伝達の遮断（すなわち、ブロック）と拮抗する、低分子を含めたタンパク質および非タンパク質性物質を指す。例えば、本発明の分子はＦｃγＲＩＩＩＡに対するＩｇＧの結合を遮断することによりシグナル伝達を遮断する。
【００５３】
（本明細書において広く定義されるように）結合タンパク質または抗体を指す場合、各ドメインへのアミノ酸の割り当てはKabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest（国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド州、１９８７および１９９１年）の定義に従う。免疫グロブリンの成熟重鎖および軽鎖の可変領域からのアミノ酸は、鎖におけるアミノ酸の位置で呼ばれる。Ｋａｂａｔは抗体について多数のアミノ酸配列を記載し、各サブグループに対するアミノ酸コンセンサス配列を同定し、各アミノ酸に残基番号を割り当てた。Ｋａｂａｔの付番体系は、保存されたアミノ酸に関してＫａｂａｔにおけるコンセンサス配列の１つと問題の抗体とを整列させることによって、Ｋａｂａｔの概論に含まれない抗体にまで拡大できる。残基番号を割り当てるためのこの方法は本分野で標準となり、キメラまたはヒト化変異体を含めた異なる抗体で相当する位置にあるアミノ酸を容易に同定する。例えば、ヒト抗体軽鎖の位置５０のアミノ酸はマウス抗体軽鎖の位置５０のアミノ酸に相当する位置を占めている。
【００５４】
免疫グロブリンの「Ｆｃγ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。Ｆｃγ領域の境界は幾分変動し得るが、通常はＦｃγ領域は位置おおそ２２６〜２３０からポリペプチドのカルボキシ末端にまで伸びる（そしてＣＨ２およびＣＨ３ドメインを包含している）。「Ｆｃγ領域含有ポリペプチド」という用語は、Ｆｃγ領域を有する抗体のようなポリペプチドを指す。
【００５５】
ＩｇＧのＦｃγ領域は２つの定常ドメインであるＣＨ２およびＣＨ３を含む。ヒトＩｇＧのＦｃγ領域のＣＨ２ドメイン（「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる）は、通常はアミノ酸２３１〜３４０から伸長する。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対になっていない点で独特である。逆に、２つのＮ結合型分枝糖鎖が無傷天然ＩｇＧの２つのＣＨ２ドメインの間に挿入されている。
【００５６】
本明細書にわたって、ＩｇＧ重鎖における残基の付番は、参照により本明細書に明白に組み込まれているKabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、NHI、メリーランド州(1991)におけるようなＥＵインデックスの付番である。「ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の付番を指す。ＩｇＧ２ヒンジ部について全ての残基をＥｕ指数により付番するわけではない。他に詳記しない限り本明細書にわたって、ＦｃＲにおける残基の付番は、Sondermannら、2000、Nature、406:267〜273頁により開示された付番に基づき、その文献の全体が参照により本明細書に組み込まれている。位置１５８で共通に参照されたＦｃγＲＩＩＩＡの多型変異体の場合（例えば参照により本明細書に組み込まれているKoeneら、1997、Blood、90:1109〜14頁；Wuら、1997、J. Clin. Invest. 100参照）、Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎらに基づく付番よりもむしろ通常使用される付番が参照されている（すなわち位置１５８はＳｏｎｄｅｒｍａｎｎらにおける位置１５５および配列番号１における位置１５９を指す）。
【００５７】
本明細書において使用する「同じポリペプチド鎖」は、例えば１つまたは複数のアミノ酸の相違、好ましくは保存的アミノ酸置換を有する鎖を含むため２つのポリペプチド鎖の活性が有意には異ならない、ほぼ同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖も指す。
【００５８】
「ヒンジ部」は、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０への伸長として総じて定義される（Burton、Molec. Immunol.、22: 161〜206頁、1985）。重鎖間Ｓ−Ｓ結合を形成する第一および最終システイン残基を同位置に置くことによって、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ部をＩｇＧ１配列と整列させることができる。
【００５９】
本明細書において使用する「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、多特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ポリクローナル抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、細胞内発現抗体（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体および抗−抗Ｉｄ抗体を含めた）、ならびに前記のいずれかのエピトープ結合断片を指す。具体的には、抗体には免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち抗原結合部位を含む分子がある。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスであり得る。
【００６０】
本明細書において使用する「免疫複合体」は、少なくとも１つの標的分子と少なくとも１つの異種Ｆｃγ領域含有ポリペプチドとが互いに結合して大きな分子量の複合体を形成する場合に形成する構造を指す。免疫複合体の例には可溶性または粒子状（例えば細胞表面の抗原／抗体複合体）のどちらかであり得る抗原−抗体複合体がある。
【００６１】
本明細書において使用する「安定な融合タンパク質」は、当業者に公知である通常の生化学アッセイおよび機能アッセイを用いて評価されるような産生および／または貯蔵の間の分解レベルが最小ないし検出できず、生物学的活性、例えばＦｃγＲに対する結合の消失なしに長期間貯蔵できる融合タンパク質を指す。
【００６２】
ポリペプチドまたはタンパク質に関連して本明細書において使用する「誘導体」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失または付加の導入により改変されたアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書において使用する「誘導体」という用語は、修飾された、すなわちポリペプチドまたはタンパク質に対する任意のタイプの分子の共有結合により修飾されたポリペプチドまたはタンパク質も指す。例えば限定としてでは全くなく、例えばグリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、リン酸化、アミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連鎖などにより抗体を修飾できる。アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めるが特定の化学開裂に限定されない当業者に公知の方法を用いた化学修飾により、誘導ポリペプチドまたは誘導タンパク質を産生できる。さらに、誘導ポリペプチドまたはタンパク質誘導体は、それが由来するポリペプチドまたはタンパク質と類似するか、または同一の生物学的機能を少なくとも１つ保有する。
【００６３】
非タンパク質誘導体に関連して本明細書において使用する「誘導体」という用語は、第一有機または無機分子の構造に基づいて形成される第二有機または無機分子を指す。有機分子の誘導体には、例えば水酸基、メチル基、エチル基、カルボキシル基またはアミン基の付加または欠失により修飾された分子があるがそれらに限定されない。有機分子はエステル化、アルキル化および／またはリン酸化もされ得る。
【００６４】
本明細書において使用する「障害」および「疾患」という用語は、被験者における状態を指すために相互交換可能に使用される。具体的には、「自己免疫疾患」という用語は、被験者自身の細胞、組織および／または器官に対する被験者の免疫反応により引き起こされる細胞、組織および／または器官の傷害を特徴とする被験者における状態を指すために「自己免疫障害」という用語と相互交換可能に使用される。「炎症疾患」という用語は、炎症、好ましくは慢性炎症を特徴とする被験者における状態を指すために「炎症障害」という用語と相互交換可能に使用される。自己免疫障害は炎症を伴う場合もあるし、伴わない場合もある。さらに、炎症は自己免疫障害により引き起こされる場合もあるし、引き起こされない場合もある。このように、ある種の障害は自己免疫障害および炎症性障害の両方を特徴とし得る。
【００６５】
免疫調節剤を含めるがそれに限定されない、本明細書において使用する「免疫調節剤」という用語およびその変形は、宿主免疫系を調節する薬剤を指す。ある実施形態において免疫調節剤は免疫抑制剤である。他のある実施形態において、免疫調節剤は免疫刺激剤である。免疫調節剤には低分子、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、無機分子、模倣剤、および有機分子があるが、それらに限定されない。
【００６６】
本明細書において使用する「エピトープ」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性を有する分子断片を指す。免疫原性を有するエピトープは、動物に抗体応答を誘発するポリペプチド断片またはタンパク質断片である。抗原性を有するエピトープは、当業者に十分公知である任意の方法、例えばイムノアッセイにより決定されるように、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチド断片またはタンパク質断片である。抗原エピトープは必ずしも免疫原性ではない。
【００６７】
本明細書において使用する「断片」という用語は、別のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５つの隣接アミノ酸残基、少なくとも１０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも２０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも２５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも４０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも５０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも６０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも７０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも８０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも９０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１００個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１２５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１５０個の隣接隣接アミノ酸残基、少なくとも１７５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも２００個の隣接アミノ酸残基、または少なくとも２５０個の隣接アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ポリペプチドの断片は、ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する。
【００６８】
本明細書において使用する「核酸」および「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ＤＮＡ分子とＲＮＡ分子との組み合わせまたはハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ分子、およびＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子のアナログを含む。例えばイノシンまたはトリチル化塩基を含めるがそれに限定されないヌクレオチドアナログを使ってそのようなアナログを発生させることができる。そのようなアナログは、例えばヌクレアーゼ耐性または細胞膜を通過する能力の増加のような、分子に対して有益な特質を添える修飾されたバックボーンを有するＤＮＡまたはＲＮＡ分子も含み得る。核酸配列またはヌクレオチド配列は一本鎖、二本鎖の場合があり、一本鎖部分および二本鎖部分の両方を含む得るし、三本鎖部分も含み得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００６９】
本明細書において使用する「治療上有効な量」は、Ｆｃγ受容体シグナル伝達経路における制御の消失に関連する疾患または障害、例えば自己免疫疾患を治療または管理するために十分な、または他の療法、例えばＩＶＩＧ療法などの治療効果を増強するために十分な治療剤の量を指す。治療上有効な量は、疾患の開始を遅らせるか、または最小にするために十分な治療剤の量を指し得る。治療上有効な量は、疾患の治療または管理に治療上の有益性を提供する治療剤の量も指し得る。さらに、本発明の治療剤に関連して治療上有効な量は、単独の場合、または疾患の治療または管理に治療上の有益性を提供する他の療法と組み合わせた場合の治療剤の量、例えば疾患の治療または管理に十分なようにＩＶＩＧ療法の治療効果を増強するために十分な量を意味する。本発明の分子の量に関して使用される場合、本用語は全般的な療法を向上させ、望まれない作用を軽減または防止するか、または別の治療剤の治療効果を増強するか、もしくはその治療剤と相乗的に作用する量を包含し得る。
【００７０】
本明細書において使用する「予防剤」という用語は、障害の予防または障害の再発または蔓延の予防に使用できる任意の薬剤を指す。予防有効量は、疾患の予防に予防有益性を提供する予防剤の量も指す。さらに、本発明の予防剤に関連して予防有効量は、疾患の予防に予防有益性を提供する、単独の場合、または他の薬剤と組み合わせた場合の予防剤の量を意味する。本発明の分子の量に関して使用される場合、本用語は全般的な予防を向上する量、または治療抗体を例とするがそれに限定されない別の予防剤の予防効果を増強するか、その予防剤と相乗的に作用する量を包含し得る。
【００７１】
本明細書において使用する「予防する」、「予防すること」および「予防」という用語は、予防剤または治療剤の投与に起因する、被験者における障害の１つまたは複数の症状の再発または発症の予防を指す。
【００７２】
本明細書において使用する「組み合わせ」という用語は、１つを超える予防剤および／または治療剤の使用を指す。「組み合わせ」という用語の使用は、障害を有する被験者に予防剤および／または治療剤が投与される順序を制限しない。障害を有する被験者に第二予防剤または治療剤を投与する前（例えば５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、投与と同時、または投与後（例えば５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）に第一予防剤または治療剤を投与できる。
【００７３】
４．図面の簡単な説明
（後述の記載参照のこと。）
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
５．発明の詳細な説明
５．１可溶性ＦｃγＲタンパク質
本発明は可溶性ＦｃγＲタンパク質、例えばＦｃγ結合部位を有するＦｃγＲ細胞外領域を包含する。本発明は詳細には可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢタンパク質に関する。一実施形態において本発明の可溶性タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域であるＦｃγＲＩＩＩＡをコードするｃＤＮＡの位置１４０〜７１５に対応する。別の実施形態において、可溶性タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域であるＦｃγＲＩＩＢをコードするｃＤＮＡの位置１３７〜６７６に対応する。いくつかの実施形態において、本発明は可溶性ＦｃγＲＩＩＩＢおよびＦｃγＲＩＩＡタンパク質を包含する。
【００７５】
本発明は、当業者に公知の任意の対立遺伝子変異体を有する可溶性ＦｃγＲタンパク質も包含し、その例にはWarmerdamら、1991、Journal of Immunology、147:1338〜43頁；Kimら、2001、J. Mol. Evol. 53:1〜9頁；Fijenら、2000、Clin. Exp. Immunol. 120:338〜345頁；Fujiwaraら、1999 Vox Sang. 77:218〜222頁；Petraら、1990、J. Exp. Med. 172:19〜25頁；Nagarajanら、1995、J. Biol. Chem. 270(43):25762〜70頁；Teboら、2002、Clin. Exp. Immunol. 130:300〜6頁；Sorgeら、2003、Tissue Antigens、61:189〜202頁（これらの全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）に開示されたものがある。いくつかの実施形態において、本発明は、ＦｃγＲの多形変異体に対応する１つまたは複数の位置にアミノ酸置換を有する可溶性ＦｃγＲタンパク質を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、Ｖ１５８Ｆ、Ｄ１０５Ｅ、Ｇ１３ＯＤ、Ｆ１３４Ｓ、Ｙ１４１Ｈ、およびＴ１４２Ｉを含めるがそれらに限定されないＦｃγＲＩＩＩＡの任意の公知の多形変異体を包含する。他の実施形態において、本発明は、ＦｃγＲＩＩＡ−Ｒ１３１またはＦｃγＲＩＩＡ−Ｈ１３１のようなＦｃγＲＩＩＡの任意のアロタイプ変異体を包含する。本発明は改変された食作用を有し得るＮＡ１およびＮＡ２と称するＦｃγＲＩＩＩＢの対立遺伝子変異体も包含する。
【００７６】
本発明は、Ｆｃγ領域を有する分子、例えば免疫複合体に対する可溶性ＦｃγＲの親和性を調節するための、当業者に公知の組換えＤＮＡ法を用いた可溶性ＦｃγＲタンパク質の操作を包含する。本発明の可溶性ＦｃγＲタンパク質は、本明細書の５．２節で論じられ、当業者に公知の標準的なｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えばＥＬＩＳＡアッセイまたはＢｉａｃｏｒｅにより決定されるように、免疫複合体と特異的に結合する。
【００７７】
特定の一実施形態において、本発明の分子は、相互作用する分子の解離定数を測定および定量する免疫に基づくアッセイまたは当業者に公知である他の任意のアッセイ、例えばＢｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡにより決定されるように１〜１０ｎＭの範囲の解離定数またはＫｄ（Ｋｏｎ／Ｋｏｆｆ）で免疫複合体と結合する。いくつかの実施形態において、本発明の分子は１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×ｌ０−８Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−５Ｍ未満、５×１０−５Ｍ未満、１０−４Ｍ未満、５×１０−４Ｍ未満、１０−３Ｍ未満、５×１０−３Ｍ未満のＫｄで免疫複合体と結合する。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本発明はＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）と結合する任意の分子と共有結合したＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質を包含し、前記融合タンパク質は好ましくはＦｃγＲと結合しない。ＦｃＲｎ結合性分子には、例えばＩｇＧ分子または例えばＦｃ領域もしくはその一部を含むＩｇＧ分子の一部、例えばＩｇＧのＩｇＧ１サブクラスがあるが、所定の動物の他の任意のＩｇＧサブクラスでもあり得る。例えば、ヒトにおいてＩｇＧクラスにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４があり、マウスにおいてＩｇＧにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＧ３がある。ＩｇＧ分子は、ＦｃγＲおよび／またはＦｃＲｎに対する結合親和性を改変する少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変を有し得る。マウスＩｇＧのＦｃ領域における様々な部位特異的突然変異誘発実験により、本発明に包含されるＩｇＧとＦｃＲｎとの間の相互作用に関与する若干の重大なアミノ酸残基を同定するに至った（Kimら、Eur. J. ImmunoL, 240:2429〜2434頁、1994；Medesanら、Eur. J. Immunol.、26:2533頁、1996；Medesanら、J. Immuno.、158:2211〜2217頁、1997；および国際公開WO 02/60919、これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【００７９】
ある特定の実施形態において、本発明の二量体融合タンパク質はＦｃγＲの２つの可溶性細胞外領域を有し、各可溶性細胞外領域はＦｃ定常領域に対する結合部位を含むという点で少なくとも二価である。好ましくは、可溶性細胞外領域は同一のＦｃγＲからのもので、さらに好ましくは同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、可溶性細胞外領域は異なるＦｃγＲからのものであり、すなわち異なる特異性を有するため、二量体融合タンパク質は少なくとも二特異性である。本発明の二量体融合タンパク質は、ＦｃγＲの可溶性細胞外領域のそれぞれと融合した分子をさらに有する可能性があり、その分子は二量体融合タンパク質の安定性（例えば血清中半減期）を増加させる。これらの分子は、好ましくは免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧのＦｃドメイン、最も好ましくは免疫グロブリンＦｃのヒンジ−定常領域である。そのような分子は１つまたは複数の追加の結合ドメイン、例えばＦｃＲｎに対する結合ドメインを含む可能性があり、好ましくはＦｃγＲと結合しない。このように、本発明のこのような分子は少なくとも３つの結合部位を有するという点で少なくとも三価であり得る。他の特定の実施形態において、本発明はＦｃ定常領域に対する結合部位を含むＦｃγＲ可溶性細胞外領域を有し、可溶性細胞外領域の安定性を増加させる分子と融合した単量体融合タンパク質を含む。そのような単量体融合タンパク質は一価（すなわち結合部位１つのみを有する）であり得るが、追加の結合部位も有す可能性もある。例えば可溶性細胞外領域がＦｃ定常ドメインまたはヒンジ−定常ドメインと融合している場合、そのドメインは例えばＦｃＲｎに対する結合部位も有し得ることから、融合タンパク質は少なくとも二価になる。
【００８０】
一実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲタンパク質は、野生型ＦｃγＲが免疫複合体と結合するのと同じアビディティで免疫複合体と結合する。別の実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲタンパク質は当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ法を用いて操作され、細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、変異型ＦｃγＲは野生型ＦｃγＲ細胞外領域を有する分子に比べて高い親和性（又はアビディティ）で免疫複合体と結合する。いくつかの実施形態において、可溶性ＦｃγＲタンパク質は野生型ＦｃγＲ細胞外領域を有する分子に対して少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％高いアビディティで免疫複合体と結合する。本発明の可溶性ＦｃγＲタンパク質は、本明細書に論じられ当業者に公知の免疫複合体遮断アッセイにより決定されるように、免疫複合体に対するＦｃγＲの結合を遮断する。一実施形態において、本発明の可溶性ＦｃγＲタンパク質は本明細書に記載され当業者に公知の免疫複合体遮断アッセイにより決定されるように、ＦｃγＲに対する免疫複合体の結合をおよそ２５％、３５％、４５％、５０％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％または９９％低下または阻害する。
【００８１】
一実施形態において、標準的なタンパク質精製法を用いた適当な精製計画により細胞源または組織源からＦｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドを単離できる。別の実施形態において、本発明のＦｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドを組換えＤＮＡ法により産生する。組換え発現の代わりに、Ｆｃγ結合部位を有するポリペプチドを標準的なペプチド合成法を用いて化学的に合成できる。
【００８２】
本発明は、免疫グロブリンのＦｃ領域（例えばＦｃγＲＩＩＩＡのような活性化型ＦｃγＲまたはＦｃγＲＩＩＢのような抑制型ＦｃγＲの細胞外可溶性領域）と特異的に結合する、異種ポリペプチドと共有結合したポリペプチドを有する融合タンパク質を包含する。好ましい実施形態において、免疫グロブリンＦｃ領域と特異的に結合するポリペプチドは、Ｆｃ結合部位を有する受容体ＦｃγＲ細胞外領域である。別の好ましい実施形態において、ＦｃγＲ細胞外領域と融合した異種ポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域、さらに好ましくはヒンジ−定常領域であるため、生じた融合ポリペプチドは免疫複合体と特異的に結合する。アルブミン、リポタンパク質、アポリポタンパク質、およびトランスフェリンを含めるがそれらに限定されない、当技術分野で公知の任意の安定な血漿タンパク質にＦｃγＲ細胞外領域を融合させて二量体融合タンパク質を形成させることは、本発明の方法および組成物に考えられている。他の実施形態において、本発明は免疫グロブリンのＦｃγ領域（例えばＦｃγＲＩＩＩＡのような活性化型ＦｃγＲまたはＦｃγＲＩＩＢのような抑制型ＦｃγＲの細胞外可溶性領域）と特異的に結合するポリペプチドを有する融合タンパク質を包含し、そのポリペプチドは、ＦｃγＲ細胞外領域と二量体化できるためＦｃγＲ細胞外領域の完全性および構造が損なわれない異種分子と共有結合している。ある実施形態において、ＦｃγＲ細胞外領域と融合した異種分子は、ジスルフィド結合を形成できる残基、例えばシステインを有する。特定の実施形態において、ＦｃγＲ細胞外領域と融合した異種分子は、ジスルフィド結合を形成できるアミノ酸残基を有する少なくとも５つのアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、または少なくとも２００個のアミノ酸のペプチド有する。本発明は、システイン残基以外のジスルフィド結合を形成できる残基、またはＰｅｎ（ペニシラミン）、Ｍｐｒ（メルカプトプロピオニル）、またはＭｖｌ（メルカプトバレリル）を含めるがそれらに限定されない他の結合を形成できる残基を有するＦｃγＲ細胞外領域と融合した異種分子を包含する。
【００８３】
本発明は免疫グロブリンＦｃγ領域（例えばＦｃγＲＩＩＩＡのような活性化型ＦｃγＲまたはＦｃγＲＩＩＢのような抑制型ＦｃγＲの細胞外可溶性領域）と特異的に結合するポリペプチドを有する融合タンパク質を包含し、そのポリペプチドは異種ポリペプチドと共有結合している。当業者に公知の任意の標準的な組換え法を用いて本発明の変異体は発生する。特定の実施形態において、本発明は免疫グロブリン定常領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質の変異体を包含し、免疫グロブリン定常領域は可溶性ＦｃγＲタンパク質に対する免疫グロブリン定常領域の親和性を調節する少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。特定の実施形態において、本発明は、当技術分野で既知の標準的な方法を用いて、またはそれぞれ２００３年１月９日および２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号；第60/456,041号、ならびに２００３年１０月２３日に出願した米国仮出願第60/514,549号および２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第＿号に開示された方法のいずれかを用いて、可溶性ＦｃγＲに対する親和性を調節する少なくとも１つのアミノ酸改変を含むように操作された定常領域の変異体を包含する。これら出願の全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。特定の実施形態において、本発明はＦｃγＲＩＩＩＡに対する親和性を低下させるアミノ酸改変を有する定常領域の変異体、例えばそれぞれ２００３年１月９日および２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号；第60/456,041号、ならびに２００３年１０月２３日に出願した米国仮出願第60/514,549号および２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第＿号に開示された変異体を包含する。本発明はそれぞれ２００３年１月９日および２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号；第60/456,041号、ならびに２００３年１０月２３日に出願した整理番号011183-009-888を有する米国仮出願第60/514,549号および２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第＿号に開示された方法のいずれかを用いた免疫グロブリン定常領域の変異体を包含する。
【００８４】
ある特定の実施形態において、本発明は本発明の融合タンパク質変異体を包含し、その融合タンパク質ではＦｃγＲ細胞外領域と融合した免疫グロブリン定常領域は、免疫原性の改変または生じたポリペプチドの半減期の改変のような追加の性質または異なる性質を提供する少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変を有する。定常領域における変化は、１つまたは複数のアミノ酸残基から定常領域の完全な再設計まで変動し得る。本発明に考えられている変化には、例えば膜受容体との相互作用、補体の固定、循環中での持続性および他のエフェクター機能に影響する変化があり、そのような変化は当業者に十分公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第6,277,375号に記載されているように、ヒンジまたは他の領域を修飾できる。いくつかの実施形態において、Ｆｃγ領域のアミノ酸を欠失または改変することはしばしば有利である。例えば一実施形態において、（親の天然免疫グロブリン定常領域に対して）１つまたは複数のアミノ酸置換または欠失を有する本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質のＦｃγ領域とＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＩＩＩＡとの相互作用の低減（例えば好中球のターゲッティングの最小化）および／またはＦｃγＲＩＩＢに対するＦｃγ領域の結合の増加（例えばＦｃγＲＩＩＢが介在するエフェクター細胞活性化阻害の増強、その全体が参照により本明細書に組み込まれているBollandおよびRavetch、1999、Adv. in Immunol. 72:149頁参照）を生じる。例えば微生物、ウイルスまたは哺乳動物細胞の表面に発現した突然変異Ｆｃγライブラリーの表出を用いて選択し、望みの特性または性質を有する突然変異Ｆｃγ変異体を求めてそのようなライブラリーをスクリーニングすることによって、結合に望みの変化をもたらす特定の突然変異を同定できる。さらに、本発明はＦｃγ−ＦｃγＲ相互作用に関して入手できる構造および生化学データに基づいて本発明の融合タンパク質を操作することを包含する（Shieldsら、2001、J Biol.Chem. 276:6591〜6604頁；Sondermannら；Deisenhoferら、1981、Biochemistry、20(9):2361〜70頁；Burmeisterら、1994、Nature、342:379〜383頁；これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。いくつかの実施形態において、本発明はＦｃγＲに対するヒト抗体上の結合部位である残基２３３〜２３９にある任意のアミノ酸の突然変異を包含する（Canfieldら、1991、J Exp Med 173:1483〜91頁；Woofら、1986、Mol. Imm. 23:319〜30頁；Duncanら、1988、Nature 332:563頁;これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。Ｆｃγ領域の例示的な突然変異には、例えば全てのＦｃγＲに対して低い親和性を有することが示されたＬ２３５Ｅ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＤ２６５Ａがある（Clynesら、2000、Nat. Med. 6:443〜46頁；Alegreら、1992、J Immunol 148:3461〜68頁；Xuら、2000、Cell Immunol 200:16〜26頁；これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。ＦｃγＲの結合に影響するとされている追加のＦｃγ領域の修飾はWO 00/42072およびU.S. 6,194,551に記載され、これら両方はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００８５】
他の実施形態において、本発明は免疫グロブリン定常領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質の変異体を包含し、ＦｃγＲ細胞外領域は少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変を有し、その修飾はＦｃ含有ポリペプチドに対する細胞外領域の親和性を調節する。Ｆｃγ受容体と当技術分野で公知のＦｃ含有ポリペプチドとの間の相互作用に重大な細胞外領域におけるアミノ酸の細胞外領域の変異体を包含する。例えばHulettら、1993、Eur J. Immunol；Hulettら、1995、Journal of Biological Chem.、270(36) 21188〜94頁；Hulettら、1994、Journal of Biological Chem.、269(21):15287〜93頁；Warmerdamら、1991、J. Immunology、147:1338〜43頁；Warmerdamら、1990、Journal of Ex. Med. 172:1925頁)を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。本発明米国特許第5,985,599号に開示されたＦｃγＲ細胞外領域の変異体を包含し、その全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００８６】
他の実施形態において、本発明は免疫グロブリン定常領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質を包含し、ＦｃγＲ細胞外領域はキメラ細胞外領域を有するため、当業者に公知の方法および本明細書に開示された方法により評価されるようにキメラ細胞外領域は免疫複合体と結合する。キメラ細胞外領域は、当技術分野で公知の例えば遺伝子シャフリング法を用いてＦｃγＲからの１つまたは複数の領域を有する。特定の実施形態において、キメラ細胞外領域は、ＦｃγＲＩＩＡからの領域に対応する領域およびＦｃγＲＩＩＢからの領域に対応する領域を有する。別の特定の実施形態において、キメラ細胞外領域はＦｃγＲＩＩＩＡからの領域に対応する領域およびＦｃγＲＩＩＢからの領域に対応する領域を有する。
【００８７】
本発明は、詳細にはＩｇＧ２定常領域と融合した、ＦｃγＲ（例えばＦｃγＲＩＩＩＡのような活性化型ＦｃγＲまたはＦｃγＲＩＩＢのような抑制型ＦｃγＲ）の細胞外領域を有する融合タンパク質に関する。任意の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、ＩｇＧ２定常領域とＦｃγＲ細胞外領域との間に親和性はほとんどまたは全く存在しないことから、ＩｇＧ２定常領域が本発明に従う使用に好ましい定常領域である。さらに、融合タンパク質にヒンジ部を包含させることにより、２つの受容体の腕部の可動性および各単量体の共有ジスルフィド連鎖が可能になり、その融合タンパク質はＦｃγＲ細胞外領域およびＩｇＧ２ヒンジ−定常領域を有するし、すなわち二量体融合タンパク質が形成する。本発明にしたがい、ＩｇＧ２定常領域とのＦｃγＲ細胞外領域の融合は、本明細書においてＩｇＧ２のヒンジ部ならびにＩｇＧ２定常領域のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを包含する領域と定義される「ヒンジ−定常領域」のＮ末端に、ＦｃγＲ細胞外領域のＣ末端を融合させることを含む。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明はＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＩＡ可溶性細胞外領域に対応する配列番号１に示される融合タンパク質を包含する。別の実施形態において、本発明は配列番号１の変異体を包含し、ここでそのタンパク質は１つまたは複数のアミノ酸改変を有するため、融合タンパク質は配列番号１の融合タンパク質に比べて増強した安定性を有する。さらに特定の実施形態において、本発明は、好ましくは配列番号１の残基１８３および１８４内に残基の修飾を包含するため、タンパク質は増強した安定性を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した場合に検出可能な分解産物をもたらさない。特定の一実施形態において、本発明は配列番号３３、３５、３７または３９を有する変異体Ｖ１〜Ｖ４のいずれかを包含する。任意の特定の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、増強した安定性を有する本発明の融合タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＩＡドメインとＩｇＧ２のＦｃドメインとの間の任意の位置で開裂しない。本明細書において使用する「安定な融合タンパク質」は、当業者に公知である通常の生化学アッセイおよび機能アッセイを用いて評価されるような産生および／または保存の間に最小ないし検出できないレベルの分解を受け、生物学的活性、例えばＦｃγＲに対する結合の消失なしに長期間保存できる融合タンパク質を指す。改変した安定性を有する修飾融合タンパク質のＦｃγＲに対する結合を決定するために使用できるアッセイには、例えば免疫複合体結合アッセイ、ＥＬＩＳＡアッセイなど、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析がある。好ましくは、本発明の融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析もしくは高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）または当業者に公知の他の任意の方法により評価されるように、２０〜２５℃の温度範囲、好ましくは２５℃で、少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、さらに好ましくは少なくとも４か月間安定性を示す。いくつかの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析もしくは高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）または当業者に公知の他の任意の方法により評価されるように、２〜８℃の温度範囲、好ましくは４℃で少なくとも１か月間、少なくとも２か月間、さらに好ましくは少なくとも４か月間安定性を示す。好ましくは、本発明の融合タンパク質は上記のように長期間保存後に低いないし検出できないレベルの分解を示す。好ましくは、上記のように一定期間保存した後で低い、ないし検出できないレベルの分解を有する。好ましくは、上記のように一定期間保存した後でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはＨＰＳＥＣで測定されるように、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、および最も好ましくは０．５％以下のタンパク質が分解する。最も好ましい実施形態において、当技術分野で公知の標準的な方法で評価されるように本発明の融合タンパク質は、上に記載した条件で長期保存する間に生物学的活性がほぼ全く失われない。本発明の融合タンパク質は、上に規定された期間保存した後に、保存前の最初の生物学的活性の８０％を超える、８５％を超える、９０％を超える、９５％を超える、９８％を超える、９９％を超える、または９９．５％を超える���性を保持する。配列番号１を有する融合タンパク質に比べて増強した安定性を有するように修飾された本発明の若干の融合タンパク質は、当技術分野で公知で本明細書に例示される標準的なアッセイを用いて決定されるように配列番号１の融合タンパク質と類似した親和性でＦｃγＲＩＩＩと結合する（実施例６．４）。
【００８９】
本発明は、ＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＩＡ可溶性細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質を修飾して、野生型タンパク質に比べて増強した安定性を有するようにすることを包含する。修飾には、融合タンパク質の構造および機能が損なわないような、例えば本明細書において開示および例示された方法のようなＦｃ−ＦｃγＲ相互作用を監視するための当技術分野で公知の方法を用いて評価するときに類似または向上した親和性でＦｃγＲまたは免疫複合体と結合するような欠失、置換、および挿入があり、修飾はリンカーの導入も含み得る。本発明の構築物に使用できるリンカーは、好ましくは少なくとも１つのアミノ酸、少なくとも５つのアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、または少なくとも２０個のアミノ酸および好ましくは２０個以下のアミノ酸を有する。好ましくは、本発明の構築物に使用されるリンカーは、グリシン、アラニンのようなアミノ酸の多数の繰り返し、または融合タンパク質の機能または構造に影響しない任意の残基の繰り返しを有する。本発明のリンカーは、荷電、極性、および非極性アミノ酸を含めた任意のアミノ酸を有し得る。いくつかの実施形態において、挿入は活性化型ＦｃγＲおよび抑制型ＦｃγＲを含めた任意のＦｃγＲからの配列に対応する配列を含むため、本明細書において開示および例示された方法のような、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用を監視するための当技術分野で公知の方法を用いて評価されるように、融合タンパク質は類似または向上した親和性でＦｃγＲと結合する能力を保持する。ＦｃγＲＩＩＢが分解に感受性でないことから、いくつかの実施形態において挿入はＦｃγＲＩＩＢからの配列に対応する配列を含む。特定の実施形態において、挿入はＦｃγＲＩＩＢのアミノ酸１６９〜１８１に対応する配列を有する。
【００９０】
特定の一実施形態において、本発明はＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＩＡ可溶性細胞外領域を有する融合タンパク質（配列番号３３および３４）を包含し、ここでアミノ酸１７６〜１９２は可動リンカー配列ＧＧＧＧＳに置換されている。別の実施形態において、アミノ酸１７６から１９２は少なくとも１つのアミノ酸、長さが少なくとも５つのアミノ酸、少なくとも１０個、少なくとも１５個のアミノ酸または長さが少なくとも２０個のアミノ酸である当技術分野で公知の任意のリンカーに置換されている場合がある。別の特定の実施形態において、本発明はＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＩＡ可溶性細胞外領域を有する融合タンパク質（配列番号３５および３６）を包含し、ここでアミノ酸１７６〜１９２は可動リンカー配列ＧＧＧＧＳに置換され、ＦｃＲの残基１７０はＮからＱに換わっているため、融合タンパク質はグリコシル化されない。
【００９１】
特定の一実施形態において、本発明はＩｇＧ２定常領域と融合した、ＦｃγＲＩＩＩＡ可溶性細胞外領域を有する融合タンパク質（配列番号３７および３８）を包含し、ここでアミノ酸１７６〜１９２はＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２のアミノ酸１７２〜１８１に置換されている。別の特定の実施形態において、本発明はＩｇＧ２定常領域と融合した、ＦｃγＲＩＩＩＡ可溶性細胞外領域を有する融合タンパク質（配列番号３９および４０）を包含し、ここでアミノ酸１７０〜１９２はＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２のアミノ酸１６９〜１８１に置換されている。
【００９２】
別の実施形態において、本発明はＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＢ可溶性細胞外領域に対応する配列番号２に示す融合タンパク質を包含する。ある実施形態において、本発明はＦｃγＲの対立遺伝子変異体、詳細にはＦｃγＲ細胞外領域における対立遺伝子変異体を包含する。いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＢのヒンジ部における１つまたは複数のシステインが修飾されているため、融合タンパク質が野生型タンパク質に比べて増強した安定性を有する場合もある。本発明にしたがって修飾され得るヒンジ部のシステインは、例えばｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２（配列番号２）の１８５、１８６、１８９、および１９２である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２（配列番号１）の位置１９６、１９７、２００および２０３であるヒンジ部ＩｇＧ２  Ｆｃにおける４つのシステイン残基のうち１つ、さらに好ましくは２つ、最も好ましくは３つが修飾され、例えば欠失するか、またはＳｅｒのような別のアミノ酸に変換される。他の実施形態において、ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２（配列番号２）の位置および残基１８５、１８６、１８９および１９２にあるヒンジ部ＩｇＧ２  Ｆｃにおける４つのシステイン残基のうち１つ、さらに好ましくは２つ、最も好ましくは３つが修飾され、例えば欠失するか、またはＳｅｒのような別のアミノ酸に変換される。特定の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、ヒンジ部におけるシステイン残基の修飾は、形成する必要のあるジスルフィド結合数を減らすと考えられ、よって馴化培地に分泌される正しくフォールドされたタンパク質の率を高め得る。ジスルフィド結合数の減少はフォールディングの全般的な動態を改善し融合タンパク質の全般的な分泌レベルを高める見込みもある。
【００９４】
ある実施形態において、本発明はＦｃγＲＩＩＡ細胞外領域を有する融合タンパク質を包含する。なお他の実施形態において、本発明はその全体が参照により本明細書に組み込まれているWarmerdamら、1991、Journal of Immunology、147:1338〜43頁に記載されたようなＦｃγＲＩＩＡの対立遺伝子変異体、例えばヒスチジンまたはアルギニンへの置換のような位置１３１での変異体を包含する。特定の実施形態において、本発明は配列番号３に開示されるような、ＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＡ細胞外領域の対立遺伝子変異体を有する融合タンパク質を包含する。別の特定の実施形態において、本発明は配列番号４に開示されるような、ＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＡ細胞外領域の対立遺伝子変異体を有する融合タンパク質を包含する。本発明は、Warmerdamら、1991、Journal of Immunology、147:1338〜43頁；Kimら、2001、J. Mol. Evol. 53:1〜9頁；Fijenら、2000、Clin. Exp. Immunol. 120:338〜345頁；Fujiwaraら、1999 Vox Sang. 77:218〜222頁；Petraら、1990、J. Exp. Med. 172:19〜25頁；Nagarajanら、1995、J. Biol. Chem. 270(43):25762〜70頁；Teboら、2002、Clin. Exp. Immunol. 130:300〜6頁；Sorgeら、2003、Tissue Antigens、61:189〜202頁に開示されたような当技術分野で公知のＦｃγＲ対立遺伝子変異体の細胞外領域を有する融合タンパク質を包含し、これら文献全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００９５】
好ましい実施形態において、ＦｃγＲ細胞外領域および／またはＩｇＧ２定常領域はヒトからのものであり、例えばヒトＦｃγＲ細胞外領域のアミノ酸配列およびヒトＩｇＧ２定常領域のアミノ酸配列（例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｊ００２３０  Ｖ００５５４、生殖細胞系ＤＮＡ＝ＧＩ：１８４７５０、タンパク質寄託Ｐ０１８５９、これらは参照により組み込まれている）を有する。本発明はＩｇＧ２のアロタイプ変異体、詳細には位置２８２での変異体を包含する。代わりに、本発明の方法および組成物に使用されるＦｃγＲ細胞外領域およびＩｇＧ２定常領域は、鳥類および哺乳類（例えばヒト、非ヒト霊長類、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）を含めた任意の動物起源であり得る。
【００９６】
非常に好ましい実施形態において、本発明は２つの同じポリペプチド鎖を有するため、前記鎖のそれぞれがＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結した、Ｆｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有する二量体融合タンパク質を包含し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。他の実施形態において、前記二量体融合タンパク質は一価であり、すなわち単一の結合部位を有する。なお別の好ましい実施形態において、本発明は２つの同じポリペプチド鎖を有するため、前記鎖のそれぞれがＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結した、Ｆｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域を有する二量体融合タンパク質を包含し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。なお他の実施形態において、前記二量体融合タンパク質は一価であり、すなわち単一の結合部位を有する。
【００９７】
免疫グロブリン定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質は、当業者に公知のアッセイおよび本明細書の５．２節に論じられたアッセイにより決定されるように、免疫複合体と特異的に結合する。特定の実施形態において、免疫グロブリン定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質は、野生型ＦｃγＲに匹敵するアビディティで免疫複合体と結合する。別の特定の実施形態において、免疫グロブリン定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を有する本発明の可溶性融合タンパク質は、ＦｃγＲ細胞外領域が少なくとも１つのアミノ酸改変を有するように操作される結果、変異型ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質は、前記の少なくとも１つのアミノ酸改変を欠く野生型ＦｃγＲよりも高いアビディティで免疫複合体と結合する。
【００９８】
ＦｃγＲ細胞外領域を有する本発明の二量体融合タンパク質は、５．４節に論じるように自己免疫疾患の治療および／または予防のための単一治療剤としての治療有用性を有する。任意の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、免疫グロブリン定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を有する融合タンパク質の単一治療剤としての有用性は、本明細書に論じられ当業者に公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ免疫複合体遮断アッセイにより決定されるように、その融合タンパク質がＦｃγＲとの免疫複合体の相互作用を阻害または低減することである。具体的には、本発明の分子（例えば活性化型ＦｃγＲ細胞外領域、活性化型ＦｃγＲの可溶性細胞外領域を有する融合タンパク質）は、抗体介在性活性化および自己免疫疾患の誘発を調節する。特定の実施形態において、免疫グロブリン定常領域と連結した活性化型ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を有する融合タンパク質は、本明細書に論じられ当業者に公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ免疫複合体遮断アッセイにより決定されるように、ＦｃγＲに対する免疫複合体の結合をおよそ２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、または９９％低減または阻害する。
【００９９】
本発明は、当業者に公知の標準的な組換えＤＮＡ法を用いて本発明の分子を操作することを包含する。特定の実施形態において、本発明はＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質を操作することを包含し、融合タンパク質は細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有し、その修飾は作用物質、例えばＦｃγＲ細胞外領域と特異的に結合する自己免疫疾患の治療および／または予防のための抗体に対する可溶性細胞外タンパク質の親和性を少なくとも２５％、少なくとも３５％、少なくとも４５％、少なくとも５５％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％低下させるため、生じた修飾融合タンパク質をその作用物質と組み合わせて投与できる。別の特定の実施形態において、本発明はＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質を操作することを包含し、融合タンパク質は細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有し、その修飾は作用物質、例えばＦｃγＲ細胞外領域と特異的に結合する自己免疫疾患の治療および／または予防のための抗体に対する可溶性細胞外タンパク質の親和性を少なくとも１００分の１、好ましくは１０００分の１に低下させるため、生じた修飾融合タンパク質をその作用物質と組み合わせて投与できる。細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有する修飾融合タンパク質は、免疫複合体と特異的に結合する。一実施形態において、細胞外領域に少なくとも１つのアミノ酸改変を有する修飾融合タンパク質は野生型細胞外領域よりも高いアビディティで免疫複合体と特異的に結合する。
【０１００】
特定の実施形態において、本発明は自己免疫疾患の治療および／または予防のために、１つまたは複数のＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質と組み合わせた、活性化型ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質の使用を包含する（５．４．２節参照）。一実施形態において、活性化型ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質を、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域を除く１つまたは複数の他のＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質と組み合わせて使用する。このとき、融合タンパク質は当業者に公知の組換えＤＮＡ法を用いて操作され、１つまたは複数の他のＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質に対する融合タンパク質の親和性が低下している。本発明に包含されるＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質には、例えばＦｃγＲＩＩＩＡと特異的に結合する抗体がある（５．４．２節参照）。
【０１０１】
特定の一実施形態において、本発明は２つの同じポリペプチド鎖を有する二量体融合タンパク質を包含し、それぞれの鎖はＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域はＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、３Ｇ８モノクローナル抗体（例えばヒト化３Ｇ８モノクローナル抗体）またはＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域との結合について３Ｇ８抗体と競合する抗体は、前記モノクローナル３Ｇ８抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記二量体融合タンパク質と結合し、二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。一実施形態において、本発明はＦｃγＲＩＩＩＡの３Ｇ８結合部位に少なくとも１つのアミノ酸改変（例えば置換）を有するＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する二量体融合タンパク質を包含し、その修飾は変異型ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域に対する３Ｇ８抗体の親和性を低下させる。このＦｃγＲＩＩＩＡの３Ｇ８結合部位における１つまたは複数のアミノ酸改変は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する３Ｇ８抗体の結合部位における任意のアミノ酸の改変、例えば１０９〜１１４内の任意のアミノ酸残基および／またはアミノ酸１５０〜１６０内の任意のアミノ酸の改変であり得る。ＦｃγＲＩＩＩＡの３Ｇ８結合部位における１つまたは複数のアミノ酸改変には、ＦｃγＲＩＩＩと複合体を形成したＦｃγ断片の結晶学的構造により決定されるような「Ｂ」ｂシートと「Ｃ」βシートとの間のループであるＦｃγＲＩＩＩＡのＢＣループにおける（アミノ酸Ｔｒｐ１１０からＡｌａ１１４への）修飾（Sondennannら、２０００、Nature、406:267〜273頁）、ＦｃγＲＩＩＩＡのＦＧループにおける（アミノ酸Ｖａｌ１５５からＬｙｓ１５８への）修飾、ＦｃγＲＩＩＩＡのＣストランドにおける（アミノ酸Ｈｉｓ１１６からＴｈｒ１１９）修飾、およびＦｃγＲＩＩＩＡのＣ’ストランドにおける（アミノ酸Ａｓｐ１２６からＨｉｓ１３２）改変があるがそれらに限定されない。代わりに、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域における１つまたは複数のアミノ酸改変は、３Ｇ８結合部位を除く任意の領域にあり得る。特定の一実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１１２でのアスパラギン酸による置換、位置１１３でのリジンによる置換、位置１１４でのプロリンによる置換を有する。別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１６０でのフェニルアラニンによる置換を有する。なお別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１５４でのアスパラギンによる置換、および位置１５５でのイソロイシンによる置換を有する。好ましくは、３Ｇ８抗体は、例えば実施例６に述べる免疫複合体遮断アッセイにより決定されるように本発明の変異型融合タンパク質の結合を阻害しない。
【０１０２】
特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質は、位置１１２でのアスパラギン酸による置換、位置１１３でのリジンによる置換、位置１１４でのプロリンによる置換を有し、免疫に基づくアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにより決定されるように、ＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域を有するタンパク質よりも高いアビディティで免疫複合体、例えば実施例６に開示するようなｃｈ−４−４−４０／ＢＳＡ−ＦＩＴＣと特異的に結合する。別の実施形態において、３Ｇ８モノクローナル抗体はＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質と、免疫に基づくアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにより決定されるように、野生型ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有するタンパク質よりも低いアビディティで結合する。その融合タンパク質は、位置１１２でのアスパラギン酸による置換、位置１１３でのリジンによる置換、位置１１４でのプロリンによる置換を有する。なお別の実施形態において、３Ｇ８モノクローナル抗体は、免疫複合体とのＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質の結合を、免疫複合体遮断アッセイで決定されるように阻害しない。その変異型細胞外領域は、位置１１２でのアスパラギン酸による置換、位置１１３でのリジンによる置換、位置１１４でのプロリンによる置換を有する。
【０１０３】
別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質は位置１６０でのフェニルアラニンによる置換を有し、免疫に基づくアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにより決定されるように、ＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域を有するタンパク質に匹敵するアビディティで免疫複合体、例えば実施例６に開示するようなｃｈ−４−４−４０／ＢＳＡ−ＦＩＴＣと特異的に結合する。別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質は位置１６０でのフェニルアラニンによる置換を有し、免疫に基づくアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにより決定されるように、３Ｇ８モノクローナル抗体は野生型ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有するタンパク質に比べて低いアビディティでその融合タンパク質と結合する。なお別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質は位置１６０でのフェニルアラニンによる置換を有し、免疫複合体遮断アッセイで決定されるように、３Ｇ８モノクローナル抗体は免疫複合体に対するその融合タンパク質の結合を阻害しない。
【０１０４】
別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質は位置１５４のでアスパラギンによる置換、位置１５５でのイソロイシンによる置換を有し、免疫に基づくアッセイ、例えばＥＬＩＳＡにより決定されるように、ＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域を有するタンパク質に匹敵するアビディティで免疫複合体、例えば実施例６に開示するようなｃｈ−４−４−４０／ＢＳＡ−ＦＩＴＣと特異的に結合する。別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有する融合タンパク質は位置１５４でのアスパラギンによる置換、位置１５５でのイソロイシンによる置換を有し、免疫に基づくアッセイ例えばＥＬＩＳＡにより決定されるように、３Ｇ８モノクローナル抗体は野生型ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有するタンパク質に比べて低いアビディティでその融合タンパク質と結合する。なお別の実施形態において、融合タンパク質は位置１５４でのアスパラギンによる置換、位置１５５でのイソロイシンによる置換を有し、免疫複合体遮断アッセイで決定されるように３Ｇ８モノクローナル抗体は免疫複合体に対するその融合タンパク質の結合を阻害しない。
【０１０５】
特定の実施形態において、本発明は自己免疫疾患の治療および／または予防のための、他のＦｃγＲＩＩＢ結合タンパク質と組み合わせた抑制型ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質の使用を包含する（５．４．２節参照）。一実施形態において、抑制型ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質を、ＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域を除く１つまたは複数の他のＦｃγＲＩＩＢ結合タンパク質と組み合わせて使用し、当業者に公知の組換えＤＮＡ法を用いて融合タンパク質を操作して、１つまたは複数の他のＦｃγＲＩＩＢ結合タンパク質に対する融合タンパク質の親和性を低減する。本発明に包含されるＦｃγＲＩＩＢ結合タンパク質には、例えばＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する抗体がある（５．４．２節参照）。特定の好ましい実施形態において、ＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域を有する本発明の融合タンパク質と組み合わせて使用されるＦｃγＲＩＩＢ結合タンパク質は抗体、好ましくはＦｃγＲＩＩＢに特異的なモノクローナル抗体である。当業者に公知の任意のＦｃγＲＩＩＢ特異性抗体が本発明の方法および組成物に考えられている。詳細な実施形態において、本発明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２００２年８月１４日に出願した米国仮出願第60/403,266号および２００３年８月１４日に出願した整理番号011183-010-999を有する米国出願第10/643,857号に開示された抗体のような抗体、好ましくはモノクローナル抗体を包含し、それらの抗体は前記抗体がＦｃγＲＩＩＡと結合するよりも高い親和性でＦｃγＲＩＩＢと特異的に結合する。
【０１０６】
本発明は、改変されたオリゴ糖含量を有する分子も提供する。特定の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、改変されたオリゴ糖含量を有する分子は、ＦｃγＲＩＩＩＡに対する改変された親和性を有し、例えばＦｃγＲＩＩＩＡを活性化しない。本明細書において使用するオリゴ糖は、２つ以上の単糖を有する糖鎖を指し、本明細書において２つの用語を相互交換可能に使用できる。当技術分野で共通に使用される命名を参照して本発明の糖鎖部分を記載する。糖質化学の総説については例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているHubbardら、1981 Ann. Rev. Biochem.、50:555〜583頁を参照のこと。この命名には、例えばマンノースを表すＭａｎ、２−Ｎ−アセチルグルコサミンを表すＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースを表すＧａｌ、フコースを表すＦｕｃおよびグルコースを表すＧｌｃがある。シアル酸を、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸についてはＮｅｕＮＡｃで、５−グリコールノイラミン酸に対してはＮｅｕＮＧｃという短い表記で記載する。
【０１０７】
一般に、抗体は重鎖の定常領域の保存された位置に糖鎖部分を含み、ヒトＩｇＧの３０％までがグリコシル化されたＦａｂ領域を有する。ＩｇＧは、ＣＨ２ドメインに位置するＡｓｎ２９７に単一のＮ結合二分岐型糖鎖構造を有する（Jefferisら、1998、Immunol. Rev. 163:59〜76；Wrightら、1997、Trends Biotech 15:26〜32頁）。ヒトＩｇＧは概して以下の構造：ＧｌｃＮＡｃ（フコース）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（ＭａｎＧｌｃＮＡｃ）２の糖鎖を有する。しかし、Ｉ機能の改変をもたらすようなｇＧの間の糖質含量の変動は実際に起こる。例えばJassalら、2001 Bichem. Biophys. Res. Commun. 288:243〜9頁；Groeninkら、1996 J. Immunol. 26:1404〜7頁；Boydら、1995 Mol. Immunol. 32:1311〜8頁；Kumpelら、1994、Human Antibody Hybridomas、5:143〜51頁を参照のこと。本発明は、Ａｓｎ２９７に結合した糖鎖部分に変動を有する分子を包含する。一実施形態において、糖鎖部分は末端Ｇ１ｃＮＡｃの一方もしくは両方および／または３番目のＧｌｃＮａｃの腕部（分岐ＧｌｃＮＡｃ）にガラクトースおよび／またはガラクトース−シアル酸を有する。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、改変された糖鎖修飾は以下：分子の溶解度、細胞内輸送および分泌の促進、集合の助長、およびコンホメーションの完全性の１つまたは複数を調節する。本発明にしたがう糖鎖修飾の改変には、例えば抗体の糖質含量の増加または抗体の糖質含量の減少がある。糖質含量の改変法は当業者に公知であり、例えばWallickら、1988、Journal of Exp. Med. 168(3):1099〜1109頁；Taoら、1989 Journal of lmmunology、143(8):2595〜2601頁；Routledgeら、1995 Transplantation、60(8):847〜53頁；Elliottら、2003、Nature Biotechnology、21:414〜21頁；Shieldsら、2002 Journal of Biological Chemistry、277(30):26733〜40頁を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている
いくつかの実施形態において、本発明は１つまたは複数のグリコシル化部位を有するため、１つまたは複数の糖鎖部分が分子と共有結合している分子を包含する。他の実施形態において、本発明は１つまたは複数のグリコシル化部位およびＦｃ領域における１つまたは複数の修飾を有する分子を包含する。そのような分子の例は上に開示され、２００３年１月９日、２００３年３月１９日、および２００３年１０月２３日に出願した米国仮出願第60/439,498号、第60/456,041号、および第60/514,549号、ならびに２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第60/514,549号に開示され、これら出願の全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。好ましい実施形態において、Ｆｃ領域における１つまたは複数の修飾は、野生型Ｆｃ領域を有する抗体に比べて活性化型ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡに対する分子の親和性を増強する。
【０１０９】
本発明は、好ましくは分子の機能性、例えば結合活性を改変せずに、分子の１つまたは複数の部位に１つまたは複数のグリコシル化部位を導入することによって修飾された分子を包含する。本明細書において使用する「グリコシル化部位」は、オリゴ糖（すなわち共に連鎖した２つ以上の単糖を含む糖鎖）が特異的に共有結合する、本発明の分子における任意の特異的アミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖はＮ結合またはＯ結合のどちらかを介して抗体の主鎖と概して連鎖する。Ｎ結合型グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の結合を指す。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、例えばセリン、トレオニンへのオリゴ糖部分の結合を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、グリコシル化部位の付加または欠失による本発明の分子の糖質含量の変更法を包含する。抗体の糖質含量の変更法は当技術分野で十分公知であり、本発明に包含される。例えば米国特許第6,218,149号、EP 0,359,096 B1、米国出願US 2002/0028486、WO 03/035835、米国出願第2003/0115614号、米国特許第6,218,149号、米国特許第6,472,511号を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。他の実施形態において、本発明は分子の１つまたは複数の内因性糖鎖部分の欠失により本発明の分子の糖質含量を変更する方法を包含する。
【０１１０】
本発明は、例えばヒトＩｇＧ１から得られたＦｃ領域を有する分子を包含し、ここでＦｃ領域のＣＨ２ドメインの位置２９７に対応するアミノ酸は非グリコシル化型（ａｇｌｙｃｏｓｙｌ）である。Ｆｃ領域全体を指す場合、またはＦｃ領域における特定のアミノ酸残基を指す場合、「非グリコシル化型」または「非グリコシル化」という用語は、その特定の領域または残基に糖鎖残基が結合していないことを意味する。
【０１１１】
非グリコシル化されたヒトＩｇＧ抗体は、Ｆｃ受容体およびＣ１ｑのようなＦｃエフェクターリガンドに対して結合の減少を示す（例えばJefferisら、1995、Immunology Letters 44:111〜17頁；Tao、1989、J. of Immunology、143:2595〜2601頁；Friendら、1999、Transplantation 68:1632〜37頁；RadaevおよびSun、2001、J. of Biological Chemistry 276:16478〜83頁；Shieldsら、2001、J. of Biological Chemistry 276:6591〜6604頁、および米国特許第5,624,821号）。特定の機序と結びつけることを意図せずに、本明細書に記載された分子のＦｃドメインの位置２９７でのアミノ酸の非グリコシル化は、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび補体Ｃ１ｑ成分に対する結合の低減をもたらすと考えられている。そのような非グリコシル化抗体はエフェクター機能を欠いている。
【０１１２】
ヒトＩｇＧ１定常領域において、位置２９７の残基はアスパラギンである。本発明の一実施形態において、分子のＦｃ領域の位置２９７の残基またはそれに対応する残基はアスパラギン以外である。アスパラギンの場所に別のアミノ酸残基を置換すると位置２９７のＮグリコシル化部位がなくなる。哺乳動物細胞に分子を発現させる場合にグリコシル化を生じないような任意のアミノ酸残基の置換は本実施形態に適している。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、位置２９７のアミノ酸残基はグルタミンまたはアラニンである。いくつかの実施形態において、位置２９７のアミノ酸残基は任意選択でＰＥＧと結合したシステインである。
【０１１３】
本発明の他の実施形態において、位置２９７の残基はアスパラギンであってもなくてもよいが、グリコシル化されていない。これは多様な方法で達成できる。例えば位置２９７でアスパラギン以外のアミノ酸残基であることは、位置２９７でのＮ結合型グリコシル化に重要であることが知られており（JefferisおよびLund、1997、Chem. Immunol． 65:111〜28頁参照）、ＣＨ２ドメインの位置２９７以外の位置での残基の置換は、残基２９７で非グリコシル化された分子をもたらし得る。そのような位置の例には位置２９８および２９９がある。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、本発明の分子は１つまたは複数の選択された糖基、例えば１つまたは複数のシアル酸残基、１つまたは複数のガラクトース残基、１つまたは複数のフコース残基を実質的に有さない。当業者に公知の一般的な方法を用いて、１つまたは複数の選択された糖基を実質的に有さない分子を調製でき、その方法には例えば抗体の糖鎖部分への選択された糖基の付加が欠損している宿主細胞で、本発明の分子を組換え産生させて、組成物中の抗体の約９０〜１００％が糖鎖部分への選択された糖基の結合を欠くようにすることがある。そのような分子の代替調製法には、例えば１つもしくは複数の選択された糖基の付加を抑制もしくは低減する条件で細胞を培養すること、または１つまたは複数の選択された糖基の翻訳後除去がある。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているShinkawaら、2003、J. Biol. Chem. 278(5):3466〜73頁を参照のこと。
【０１１５】
５．１．１  ＦｃγＲ含有分子、その誘導体およびアナログ
本発明の一態様は、例えば免疫グロブリン定常領域のような異種ポリペプチドと共有結合したポリペプチドを有する融合タンパク質に関し、そのポリペプチドは、ＦｃγＲの、詳細にはＦｃγＲの細胞外可溶性領域の誘導体またはアナログであり、免疫グロブリンのＦｃγ領域と特異的に結合する。一実施形態において、本発明は、Ｆｃγ結合部位を有する単離されたポリペプチド、例えばＦｃγＲ細胞外領域または当業者に公知の標準的なアッセイで決定されるようなＦｃγ結合性を保持したその生物学的に活性な断片を包含する。一実施形態において、標準的なタンパク質精製法を用いた適当な精製計画により細胞または組織起源からＦｃγ結合部位を有するポリペプチドを単離できる。別の実施形態において、組換えＤＮＡ法によりＦｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドを産生させる。組換え発現の代わりに、標準的なペプチド合成法を用いてＦｃγ結合部位を有するポリペプチドを化学合成できる。
【０１１６】
「単離」または「精製」されたポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片は、細胞性物質またはそのタンパク質が得られた細胞または組織源から混入した他のタンパク質を実質的に有さないか、または化学合成した場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に有さない。「実質的に細胞性物質を有さない」という言葉は、タンパク質が単離または組換え産生される細胞の細胞性構成要素からタンパク質が分離されるタンパク質の調製物を含む。このように、細胞性物質を実質的に有さないタンパク質には、（本明細書において「混入タンパク質」とも呼ばれる）異種タンパク質を（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、または５％未満有するタンパク質の調製物がある。タンパク質またはその生物学的に活性な断片が組換え産生される場合、培地を実質的に有さないことも好ましく、すなわち培地はタンパク質調製物の体積の約２０％、１０％、または５％未満に相当する。タンパク質が化学合成により産生される場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に有さないことが好ましく、すなわちタンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質からそのタンパク質は分離される。したがって、タンパク質のそのような調製物は、目的のポリペプチド以外の化学前駆体または化合物の（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％未満を有する。
【０１１７】
Ｆｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片には、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢを含めるがそれらに限定されない任意のＦｃγＲ細胞外領域のアミノ酸配列（例えばＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５、Ｍ３１９３３、Ｍ３１９３２を有するｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列）と十分同一であるか、そのアミノ酸配列から得られるアミノ酸配列を有するポリペプチドがあり、そのポリペプチドはそれらが由来するタンパク質のアミノ酸数よりも少ないアミノ酸を含むが、本明細書に開示され当業者に公知の標準的なアッセイで決定されるような、対応する全長細胞外領域のＦｃγ結合活性を表す。Ｆｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片は、例えば長さが少なくともアミノ酸２５個以上のポリペプチドであり得る。本発明は少なくとも２５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも４０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも５０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも６０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも７０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも８０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも９０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１００個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１２５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１５０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１７５個の隣接アミノ酸残基、少なくとも２００個の隣接アミノ酸残基のアミノ酸配列を有する、本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片を包含する。好ましくは、Ｆｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドの生物学的に活性な断片は、少なくとも８０〜１００個のアミノ酸長である。ある実施形態において、本発明は配列番号２１〜２３に開示したような、ＦｃγＲ細胞外領域の膜隣接ドメインを包含する。
【０１１８】
Ｆｃγ結合部位を有する好ましいポリペプチドは配列番号２１〜２３のいずれかのアミノ酸配列を有する。本発明に包含される他の有用なポリペプチドはＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５、Ｍ３１９３３を有するｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列のいずれかと実質的に（例えば少なくとも約４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、または９９％）同一であり、対応する天然ポリペプチドのタンパク質の機能的活性、例えばＦｃγとの結合を保持するが、自然の対立遺伝子変異または突然変異が原因でアミノ酸配列が異なっている。
【０１１９】
本発明は、配列番号１〜４、３３、３５、３７、３９または４１のいずれかからのアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは上に挙げた配列番号のいずれかと少なくとも約７０％、少なくとも７５％、少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性を表すアミノ酸配列を有する。
【０１２０】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の同一性を決定するために、最適な比較を行う目的で配列の整列を行う（例えば第二アミノ酸配列または第二核酸配列と最適に整列させるために第一アミノ酸配列または第一核酸配列に例えばギャップを導入できる）。対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを次に比較する。第一配列における位置を、第二配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが占めている場合、両分子はその位置で同一である。２つの配列の同一性は、配列に占める同一の位置の数の関数である（％同一性＝同一の位置の数／位置の総数（例えば重複する位置）×１００）。一実施形態において、２つの配列は同じ長さである。
【０１２１】
数学的アルゴリズムを用いて２つの配列の間の同一性を決定できる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい限定することのない例は、KarlinおよびAltschul(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873〜5877頁のように修正されたKarlinおよびAltschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264〜2268頁のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはAltschulら、(1990)J. Mol. Biol. 215:403〜410頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長１２でＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチャーを実行できる。本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長３でＢＬＡＳＴプロテインサーチャーを実行できる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るために、Altschulら、(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389〜3402頁に記載されているようにギャップ付きＢＬＡＳＴを利用できる。代わりに、分子間の距離関係（Ｉｄ）を検出する反復検索を実行するためにＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用できる。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメータを使用できる。
【０１２２】
配列の比較に利用できる数学的アルゴリズムの別の好ましい限定することのない例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）である。そのようなアルゴリズムは、ＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０ウエイト・レズィデュ・テーブル、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用できる。配列分析のための追加のアルゴリズムは当技術分野で公知であり、そのアルゴリズムにはTorellisおよびRobotti(1994) Comput. Appl. Biosci.、10:3〜5頁に記載されたＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびにPearsonおよびLipman(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444〜8頁に記載されたＦＡＳＴＡがある。ＦＡＳＴＡでは、ｋｔｕｐは検索の感度と速度を調節する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２ならば、比較される２つの配列における類似した領域が整列後の残基の対に注目することにより発見され、ｋｔｕｐ＝１ならば、整列後の単一アミノ酸を調べる。タンパク質配列についてｋｔｕｐを２または１に、ＤＮＡ配列について１から６に合わせることができる。ｋｔｕｐが詳記されていないならば、デフォルトはタンパク質について２で、ＤＮＡについて６である。
【０１２３】
上に記載した方法と類似した方法を用いて、ギャップの許容のある状態またはない状態で２つの配列の間の同一性を決定できる。同一性の計算において、概して正確な適合を計数する。
【０１２４】
本発明は、免疫グロブリンのＦｃγ領域と特異的に結合するＦｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドの変異体にも関する。本発明のタンパク質の突然変異体、例えば部位特異的突然変異体、ランダム突然変異体、短縮突然変異体のコンビナトリアルライブラリーをＦｃγ結合活性についてスクリーニングすることにより、Ｆｃγの結合を保持するＦｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドの変異体を同定できる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示したアッセイまたは当業者に公知のアッセイに記載されたように、本発明のポリペプチドの変異体を、ＦｃγＲに対する結合の増大についてスクリーニングできる。本発明は、免疫グロブリン定常領域に融合したＦｃγ結合部位を有するＦｃγＲ細胞外領域を有する本発明のポリペプチドの変異体を、ＦｃγＲ細胞外領域に対する免疫グロブリン定常領域の親和性の低下についてスクリーニングすることも包含する。一実施形態において、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、多彩な変異体のライブラリーを発生させ、多彩な遺伝子ライブラリーがその変異体ライブラリーをコードする。例えば遺伝子配列に合成オリゴヌクレオチドの混合を酵素的に連結することによって潜在的なタンパク質配列の縮重セットが個別のポリペプチドとして、またはその代わりに（例えばファージディスプレイのための）さらに大きな融合タンパク質のセットとして発現することによって、多彩な変異体のライブラリーを産生できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から本発明のポリペプチドの潜在的な変異体のライブラリーを産生させるために使用できる方法は多様である。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は当技術分野で公知である（例えばNarang(1983)Tetrahedron 39:3頁；Itakuraら(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323頁；Itakuraら(1984)Science 198:1056頁；Ikeら(1983)Nucleic Acid Res.11:477頁を参照のこと）。
【０１２５】
さらに、変異体のスクリーニングおよびその後の選択のために多彩なポリペプチド集団を発生させるために、Ｆｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドをコードする配列断片のライブラリーを使用できる。例えば、ニッキングが１分子あたりおよそ１回だけ起こる条件で目的のコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理し二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを復元してニッキング後の種々の産物からのセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させ、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することにより再形成した二本鎖から一本鎖部分を除き、生じたフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって、コード配列断片のライブラリーを発生させることができる。この方法により、目的のタンパク質の様々なサイズのＮ末端断片および内部断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０１２６】
点突然変異またはトランケーションにより作られたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングに、および選択された性質を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにいくつかの方法が当技術分野で公知である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スループット分析に従う最も広く使われている方法は、概して複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローニングすること、生じたベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換すること、および望みの活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が促進される条件でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。帰納アンサンブル突然変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）、すなわちライブラリーにおける機能的突然変異体の頻度を増大させる方法を本発明のタンパク質の変異体を同定するためのスクリーニングアッセイと組み合わせて使用できる（ArkinおよびYourvan(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811〜7815頁；Delgraveら、(1993) Protein Engineering 6(3):327〜331頁）。
【０１２７】
高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマー分子を結合させることにより、融合タンパク質および可溶性ＦｃγＲタンパク質を含めた本発明の分子を修飾できる。特定の実施形態において、ＰＥＧで修飾された本発明の分子は増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期、例えば血清中半減期を有する。前記抗体もしくは抗体断片のＮまたはＣ末端にＰＥＧを部位特異的に結合させること、またはリジン残基に存在するε−アミノ基のどちらかを介して多官能リンカー存在下または非存在下でＰＥＧを前記分子に結合できる。生物学的活性の最小の損失を生じる直鎖あたは分岐ポリマーによる誘導体化が使用される。抗体にＰＥＧ分子が正しく結合していることを確認するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析により結合度を厳密に監視する。例えばサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーにより抗体−ＰＥＧ結合体から未反応のＰＥＧを分離できる。ＰＥＧでポリペプチドを修飾する方法は当業者に公知である。例えばLeongら、2001 Cytokine、16:106〜19頁；Koumenisら、2000,、Int. J. Pharm, 198:83,95頁；米国特許第6,025,158号を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み入れられている。本発明の分子の誘導体またはアナログは本発明の範囲内に含まれ、それらは翻訳中または翻訳後に例えばアミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解、抗体分子または他の細胞性リガンドとの連鎖などにより分別修飾される。多数の化学修飾のいずれかを、臭化シアンによる特異的化学開裂、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、またはアセチル化、ホルミル化、酸化もしくは還元、またはツニカマイシンの存在下での代謝合成などを含めるがそれらに限定されない公知の方法により実施できる。
【０１２８】
さらに、本発明の分子のアナログおよび誘導体を化学的に合成できる。例えば、本発明の組成物に使用するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏで望みの機能的活性（すなわちＦｃγとの結合）を仲介するＦｃγＲ細胞外領域に対応するペプチドをペプチド合成装置の使用により合成できる。さらに、望むならば１つまたは複数の非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログをＦｃγＲ配列への置換または付加として導入できる。非古典的アミノ酸には、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、およびアミノ酸アナログ一般があるがそれらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。Ｆｃγ結合部位を有する本発明のポリペプチドは、当業者に公知の任意の方法を用いて翻訳後修飾される可能性もある。翻訳後修飾にはグリコシル化（例えばＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化）、ミリスチル化、パルミチル化、フコシル化、アセチル化、リン酸化（例えばセリン／トレオニンまたはチロシン）があるが、それらに限定されない。
【０１２９】
本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける半減期（例えば血清中半減期）が１５日を超える、好ましくは２０日を超える、２５日を超える、３０日を超える、３５日を超える、４０日を超える、４５日を超える、２か月を超える、３か月を超える、４か月を超える、または５か月を超える本発明の分子の使用も包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおける本発明の分子または生物学的に活性なその断片の半減期の増加は、哺乳動物における前記分子の高い血清中力価を生じ、それにより前記分子の投与頻度を減少させ、かつ／または投与される前記分子の濃度を減らす。当業者に公知の方法によりｉｎ ｖｉｖｏ半減期の増加を有する本発明の分子を発生させることができる。
【０１３０】
ＦｃγＲ細胞外領域を免疫グロブリン定常領域に好ましくは連鎖させる。概して免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリン重鎖の定常領域にある機能的に作動する少なくとも１つのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する。本発明の融合タンパク質は、定常領域のＮ末端にあるヒンジ部を好ましくはさらに有し得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物に使用するための免疫グロブリン定常領域は、ヒンジ−ＣＨ１ドメインを有する。他の実施形態において、本発明の方法および組成物に使用するための免疫グロブリン定常領域は、ヒンジ−ＣＨ２ドメイン（例えばアミノ酸２１６〜３４０）を有する。なお他の実施形態において、本発明の方法および組成物に使用するための免疫グロブリン定常領域は、ヒンジ−ＣＨ３部（例えばアミノ酸２１６〜２３０およびアミノ酸３４１〜４４６）を有する。非常に好ましい実施形態において、免疫グロブリン定常領域は融合するＦｃγＲ細胞外領域に対して低減した親和性を有するか、または親和性を有さない。本発明はＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＡを含めるがそれらに限定されない任意の免疫グロブリンアイソタイプを包含する。追加的に、ＩｇＧのサブクラスであるＩｇＧ−１、−２、−３、−４およびＩｇＡのサブクラスであるＩｇＡ−１および−２は本発明に包含される。本発明は単離された免疫グロブリン定常領域およびその生物学的に活性な断片を包含する。本発明の方法および組成物に使用するための免疫グロブリン定常領域の生物学的に活性な断片は、抗体、好ましくはＩｇＧ分子にあるＦｃγドメインのアミノ酸配列のうち少なくとも７０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも８０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１２５個のアミノ酸残基、少なくとも１５０個の隣接アミノ酸残基、少なくとも１７５個のアミノ酸残基、少なくとも２００個の隣接アミノ酸残基、または少なくとも２５０個の隣接アミノ酸残基のアミノ酸配列を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは免疫グロブリン定常領域の生物学的に活性な断片は、少なくとも９０〜１００個のアミノ酸のアミノ酸配列を有する。Ｆｃγドメインの断片は、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、Ｆｃγヒンジ領域、またはその組み合わせを有し得る。
【０１３１】
本発明は、本発明の方法および組成物に使用するための免疫グロブリン定常領域の変異体、誘導体、またはアナログにも関する。本明細書に開示された方法または当業者に公知の方法のいずれかを用いて免疫グロブリン定常領域の変異体を産生させることができる。Ｆｃγ部の修飾は当技術分野で十分公知であり、免疫グロブリンＦｃγ領域に１つまたは複数のアミノ酸改変（例えば置換）が導入される（例えば全体が参照により本明細書に組み込まれているU.S. 6,194,551、WO 00/42072を参照のこと）。２００３年１月９日および２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号；第60/456,041号、ならびに２００３年１０月２３日に出願した米国仮出願第60/514,549号および２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第＿号に開示された任意の方法を用いて免疫グロブリン定常領域の変異体を代替産生できる。これら出願の全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３２】
上に記載した方法、または当業者に公知の方法のいずれかを用いて本発明の方法および組成物に使用するための免疫グロブリン定常領域を修飾できる。ある実施形態において、ポリエチレングリコールのようなポリマー分子を結合させることによって免疫グロブリン定常領域を修飾する。本発明は免疫グロブリン定常領域の翻訳後修飾も包含する。翻訳後修飾にはグリコシル化（例えばＮ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化）、ミリスチル化、パルミチル化、アセチル化、リン酸化（例えばセリン／トレオニンまたはチロシン）があるが、それらに限定されない。
【０１３３】
翻訳中または翻訳後に例えばアミド化、公知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、抗体分子または他の細胞性リガンドとの連鎖などにより、分別修飾された免疫グロブリン定常領域の誘導体またはアナログは、本発明の範囲内に含まれる。多数の化学修飾のうちいずれかを、臭化シアンによる特異的化学開裂、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、またはアセチル化、ホルミル化、酸化、もしくは還元、またはツニカマイシンの存在下での代謝合成などによる特定の化学開裂を含めるがそれらに限定されない公知の方法により実施できる。
【０１３４】
本発明に使用するための免疫グロブリン定常領域には、例えば以下のＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４  ＧＩ：１８４７５０、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：１８４７５１に対応するｃＤＮＡによりコードされる定常領域のアミノ酸配列と十分に同一の、またはその配列から得られるアミノ酸配列を有するポリペプチドがある。代わりに、免疫グロブリン定常領域は全長免疫グロブリン定常領域よりも少数のアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、免疫グロブリン定常領域はさらにヒンジ領域をさらに有する。本発明にしたがって使用できる免疫グロブリン定常領域の生物学的に活性な断片は、当業者に公知の標準的なアッセイにより決定されるように、ＦｃγＲに対する結合を保持する例えば８０〜１００個のアミノ酸長のポリペプチドであり得る。
【０１３５】
好ましい免疫グロブリン定常領域は、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４  ＧＩ：１８４７５０を有するｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有する。他の有用な免疫グロブリン定常領域は、以下のＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４  ＧＩ：１８４７５０、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：１８４７５１に対応するｃＤＮＡによりコードされる任意の配列と実質的に（例えば少なくとも約４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、または９９％）同一であり、ＦｃγＲとの結合性を保持するが、天然対立遺伝子変異または突然変異が原因となって、対応する天然免疫グロブリン定常領域とはアミノ酸配列が異なっている。同一性の決定については上に記載した。
【０１３６】
本発明は、免疫グロブリン定常領域の変異体も包含する。同定され、２００３年１月９日および２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号；第60/456,041号、ならびに２００３年１０月２３日に出願した整理番号011183-009-888を有する米国仮出願第60/514,549号および２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第＿号に開示された変異体のうち任意のものが本発明の範囲内に入り、これら全ての出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられている。追加的に、免疫グロブリン定常領域の任意の変異体が同定され、かつ２００３年１月９日および２００３年３月１９日に出願した米国仮出願第60/439,498号；第60/456,041号、ならびに２００３年１０月２３日に出願した整理番号011183-009-888を有する米国仮出願第60/514,549号および２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第＿号に開示された方法を用いて発生され、これら全ての出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１３７】
本発明は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５、Ｍ３１９３３、Ｍ３１９３２を有する任意のｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列と少なくとも２５％、好ましくは３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を有するＦｃγＲ細胞外領域であるＦｃγ結合部位を有するポリペプチドを包含し、そのタンパク質またはポリペプチドはＦｃγ結合活性を保持する。
【０１３８】
本発明は、免疫グロブリン定常領域が以下のＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４  ＧＩ：１８４７５０、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：１８４７５１に対応する任意のｃＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列と少なくとも２５％、好ましくは３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６５％、７５％、８５％、９５％または９８％同一であるアミノ酸配列を有する、免疫グロブリン定常領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域を有する融合ポリペプチドをさらに包含する。
【０１３９】
本発明は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５、Ｍ３１９３３、Ｍ３１９３２を有する任意の配列の核酸配列と少なくとも約３０％、好ましくは３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされるＦｃγＲ細胞外領域である、Ｆｃγ結合部位を有する単離されたポリペプチドまたはタンパク質、およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５、Ｍ３１９３３、Ｍ３１９３２を有する任意の配列またはその相補配列のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドまたはタンパク質も本発明内に入る。
【０１４０】
本発明は、免疫グロブリン定常領域がＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４  ＧＩ：１８４７５０、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：  １８４７５１を有する核酸配列と少なくとも約３０％、好ましくは３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７５％、８５％、９５％または９８％同一であるヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされている、免疫グロブリン定常領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域であるＦｃγ結合部位を有する単離されたポリペプチドまたはタンパク質、ならびにＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４  ＧＩ：１８４７５０、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：１８４７５１を有する任意の配列またはその相補配列のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドまたはタンパク質も本発明内に入る。
【０１４１】
本明細書において使用する、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも６０％（６５％、７０％、好ましくは７５％）同一であるヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズされることを概して維持するハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を記述することを意図する。そのようなストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク(1989)6.3.1〜6.3.6に見いだすことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の限定するものでない例には、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後、５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回洗浄することがある。
【０１４２】
５．１．２  可溶性ＦｃγＲ結合体
本発明のポリペプチド、例えば可溶性ＦｃγＲタンパク質、その融合タンパク質、およびそのアナログを、異種ポリペプチド（すなわち無関係のポリペプチド、またはその一部、好ましくは少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個または少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）と組換え融合または（共有結合および非共有結合の両方を含めた）化学的に複合させて雑種融合タンパク質を発生させることができる。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して起こり得る。いくつかの実施形態において、本発明は本明細書に開示された免疫グロブリン定常領域と融合し、さらに別の異種ポリペプチドと融合したＦｃγＲ細胞外領域を有する本発明の二量体融合タンパク質を包含する。
【０１４３】
本発明のポリペプチドをペプチドのようなマーカー配列と融合させて精製を容易にすることができる。好ましい実施形態において、マーカーアミノ酸配列は多くが商業的に入手できる中でとりわけｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、チャッツワース、カリフォルニア州、９１３１１）に提供されるタグのようなヘキサヒスチジンペプチドである。Gentzら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、86:821〜824頁、1989に例えば記載されているように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の精製に都合がよい。精製に有用な他のペプチドタグには、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から得られるエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Wilsonら、Cell、37:767 1984）および「 ｆｌａｇ」タグ（Knappikら、Biotechniques、17(4):754〜761頁、1994）があるが、それらに限定されない。
【０１４４】
本発明は、診断剤もしくは治療剤または血清中半減期が増加することが望まれる他の任意の分子と複合した本発明のポリペプチドも包含する。本発明のポリペプチド、例えば可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡまたは可溶性ＦｃγＲＩＩＢを、臨床検査法の一部として疾患、障害または感染の発生または進行を監視して、例えば所定の治療方式の効果を決定するために診断的に使用できる。活性化および抑制型Ｆｃγ受容体、例えばＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢはこれらの受容体の均衡した機能および正しい細胞性免疫応答に重大である。このように、検出可能な標識と融合した本発明のポリペプチドを、活性化および抑制受容体により達成される免疫応答の均衡喪失に関係した任意の疾患の進行を監視するために使用できる。検出可能な物質に抗体をカップリングさせることにより検出を容易にできる。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出金属、および非放射常磁性金属イオンがある。当技術分野で公知の方法を用いて、直接または（例えば当技術分野で公知のリンカーのような）中間物を介して間接的のどちらかで、検出可能な物質を抗体にカップリングまたは複合させることができる。本発明に従う診断としての使用のために抗体と複合させることができる金属イオンについては、例えば米国特許第4,741,900号を参照のこと。様々な酵素、ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含めるがそれらに限定されない酵素；例えばストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどであるがそれらに限定されない補欠分子団複合体；例えばウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ロダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンなどであるがそれらに限定されない蛍光物質；例えばルミノールなどであるがそれに限定されない発光物質；例えばルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどであるがそれらに限定されない生物発光物質；ビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタニウム（１４０Ｌａ）、ルテニウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（97Ｒｕ）、サマリウム（153Ｓｍ）、スカンジウム（47Ｓｃ）、セレン（75Ｓｅ）、ストロンチウム（85Ｓｒ）、イオウ（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、三重水素（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）；様々なポジトロンエミッショントモグラフィーを用いた陽電子放射金属、ならびに非放射性常磁性金属イオンを含めるがそれらに限定されない検出可能な物質を抗体にカップリングさせることによりそのような診断および検出を達成できる。
【０１４５】
細胞毒性剤（例えば細胞増殖抑制剤または細胞障害剤）、治療剤または放射性元素（例えばアルファ放射体、ガンマ放射体など）のような治療部分と本発明のポリペプチドを複合させることができる。細胞毒性剤または細胞傷害剤には細胞に有害な任意の薬剤がある。その例には、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミスラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシン、ならびにそのアナログまたはホモログがある。治療剤には、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブチル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前の名はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前の名はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗分裂剤（例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン）があるがそれらに限定されない。
【０１４６】
さらに、放射性物質または放射性金属イオンとの複合に有用な大環状キレート薬のような治療部分と本発明のポリペプチドを複合させることができる（放射性物質の例については上を参照）。ある実施形態において、大環状キレート薬は、リンカー分子を介して抗体に結合できる１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’”−四酢酸（ＤＯＴＡ）である。そのようなリンカー分子は、当技術分野で通常公知であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれているDenardoら、1998、Clin Cancer Res. 4:2483〜90頁；Petersonら、1999、Bioconjug. Chem. 10:553頁；およびZimmermanら、1999、Nucl. Med. Biol. 26:943〜50頁に記載されている。
【０１４７】
ポリペプチドにそのような治療部分を複合させる方法は公知であり、例えばArnonら、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeldら編、1985、243〜56頁、Alan R. Liss, Inc.)；Hellstromら、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery（第２版）、Robinsonら編、1987、623〜53頁、Marcel Dekker, Inc.）；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications、Pincheraら編、1985、475〜506頁）；「Analysis, Results, And Future Prospetive Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwinら編、1985、303〜16頁、Academic Press；およびThorpeら、Immunol. Rev.、62:119〜58頁、1982を参照のこと。
【０１４８】
５．２  可溶性ＦｃγＲタンパク質のキャラクタリゼーション
本発明は、本発明の可溶性ＦｃγＲタンパク質、それを有する融合タンパク質、ならびにその誘導体およびアナログを特性決定する方法も包含する。本発明は、細胞に基づくアッセイおよび／または無細胞アッセイで本発明の分子（例えば可溶性ＦｃγＲタンパク質、ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質）を特性決定することを包含する。具体的には、リガンド、例えば免疫複合体のようなＦｃγ領域を有する分子と免疫特異的に結合する能力について、ＦｃγＲ細胞外領域を有する本発明の分子をアッセイできる。本発明の分子の免疫特異的な結合を分析するために使用できるイムノアッセイには、少数を挙げるとＦＡＣＳ分析、ウエスタンブロットのような方法を用いた競合および非競合アッセイ系、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイがあるが、それらに限定されない。このようなアッセイは日常的であり、当技術分野で十分公知である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているAusubelら編、1994、Current Protocols in Molecular Biology、第１巻、John Wiley & Sons, Inc.、ニューヨークを参照）。
【０１４９】
免疫複合体に対する本発明の分子、例えば可溶性ＦｃγＲタンパク質、可溶性ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質の結合を決定する例示的な一アッセイは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイであり、以下（実施例６にこのアッセイをさらに例示する）を含む：（マウス抗フルオレセインモノクローナル抗体である）キメラ４−４−２０抗体と、ＦＩＴＣと複合したウシ血清アルブミンとを有する免疫複合体を形成させること；本発明の分子の濃度を上げながらタイトレーションすること；免疫複合体に対する本発明の分子の結合を検出および測定することを含む。陰性対照として、天然ＦｃγＲタンパク質または野生型ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質のどちらかの濃度を上げながらタイトレーションも行い、免疫複合体と相互作用させ、免疫複合体との結合を検出し測定する。免疫複合体に対する本発明の分子の結合を、免疫複合体に対する陰性対照の結合と比較すると、本発明の分子は陰性対照に匹敵する結合パラメータ（例えば５０％のみかけの結合を生じる分子濃度であるＫｄ）を有する。いくつかの実施形態において、本発明の分子はアッセイで測定された陰性対照よりも高い親和性を有する。当技術分野で公知の標準的な方法を用いて、他の免疫複合体を形成させることができる。
【０１５０】
表面プラズモン共鳴アッセイを用いて、リガンド、例えば免疫複合体、Ｆｃγ領域を有する分子に対する本発明の分子の結合も検出でき、それは結合パートナー、すなわち本発明の分子および免疫複合体の動態性質および平衡性質についての情報も提供する。
【０１５１】
リガンド、例えば免疫複合体、Ｆｃγ領域を有する分子に対する本発明の分子の速度パラメータをキャラクタリゼーションするために当技術分野で公知である任意の表面プラズモン共鳴アッセイを用いて本発明の分子をアッセイできる。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（ウプサラ、スウェーデン）から入手できるＢｌＡｃｏｒｅ計器、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｓｅｎｓｏｒｓ（フランクリン、マサチューセッツ州）から入手できるＩＡｓｙｓ計器、Ｗｉｎｄｓｏｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（バークシア、イギリス）から入手できるＩＢＩＳシステム、日本レーザ電子（北海道、日本）から入手できるＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡシステム、およびＴｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ダラス、テキサス州）から入手できるＳＰＲ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｐｒｅｅｔａを含めるがそれらに限定されない商業的に入手できる任意のＳＰＲ計器を本発明に使用できる。ＳＰＲに基づく方法の総説については、Mulletら、2000、Methods 22: 77〜91頁；Dongら、2002、Review in Mol. Biotech.、82:303〜23頁;；Fivashら、1998、Current Opinion in Biotechnology 9:97〜101頁；Richら、2000、Current Opinion in Biotechnology 11:54〜61頁を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。追加的に、米国特許第6,373,577号；6,289,286号；5,322,798号；5,341,215号；6,268,125号に記載されたタンパク質間相互作用を測定するための任意のＳＰＲ計器およびＳＰＲに基づく方法が本発明の方法に考えられており、これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５２】
簡単に説明すると、ＳＰＲに基づくアッセイは結合対の一方のメンバーを表面に固定化することおよび溶液中の結合部位のもう一方のメンバーとの相互作用をリアルタイムで関しすることを必要とする。ＳＰＲは複合体の形成または解離時に起こる表面近くの溶媒の屈折率の変化を測定することに基づく。固定化が起こる表面はセンサーチップであり、それはＳＰＲ法の心臓部である。センサーチップは金の薄層でコーティングされたガラス面から成り、その面への分子の結合を最適化するように設計された一連の特殊な面の基礎を築いている。多様なセンサーチップが商業的に、特に上に挙げた会社から入手でき、それら全てを本発明の方法に使用できる。センサーチップの例には、ＢｌＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｉｎｃ．から入手できる、例えばセンサーチップＣＭ５、ＳＡ、ＮＴＡ、およびＨＰＡがある。ＮＴＡチップとのアミノ基を介した直接共有カップリング、スルフヒドリル基を介した直接共有カップリング、アビジンコーティング面へのビオチンの結合、糖鎖基へのアルデヒドカップリング、およびヒスチジンタグを介した結合があるがそれらに限定されない任意の固定化法および当技術分野で公知の化学法を用いてセンサーチップの表面に本発明の分子を固定化できる。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、ＢｌＡｃｏｒｅ計器（例えばＢｌＡｃｏｒｅ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  １０００、ＢｌＡｃｏｒｅ  Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を用いて、リガンドに対する本発明の分子の結合速度パラメータを決定できる。
【０１５４】
いったんデータセット全体が集まると、生じた結合曲線に対してＳＰＲ計器の製造業者、例えばＢｌＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が供給するコンピュータアルゴリズムを用いて全体にわたって突合せを行う。これらのアルゴリズムはＫｏｎおよびＫｏｆｆの両方を計算し、そこから２つの速度定数の比（すなわちＫｏｆｆ／Ｋｏｎ）としてみかけの平衡結合定数Ｋｄを推定する。どのように個別の速度定数を得るかのさらに詳細な処理については、ＢｌＡｅｖａｌｕａｉｏｎソフトウェアハンドブック（ＢｌＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に見出すことができる。当技術分野で公知の任意の方法を用いて発生したデータの分析を行うことができる。発生した速度データを解釈する様々な方法の総説については、Myszka、1997、Current Opinion in Biotechnology 8:50〜7頁；Fisherら、1994、Current Opinion in Biotechnology 5:389〜95頁；O'Shannessy、1994、Current Opinion in Biotechnology、5:65〜71頁；Chaikenら、1992、Analytical Biochemistry、201:197〜210頁；Mortonら、1995、Analytical Biochemistry 227:176〜85頁；O'Shannessyら、1996、Analytical Biochemistry 236:275〜83頁を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５５】
本発明は、免疫複合体遮断アッセイにより本発明の分子を性状分析することをさらに包含し、その性状分析ではＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質、例えば３Ｇ８モノクローナル抗体のようなＦｃγＲＩＩＩＡと特異的に結合する抗体が、免疫複合体に対する本発明の分子の結合を遮断、すなわち阻害する能力を測定する（このアッセイを実施例６でさらに例示する）。これらの免疫複合体遮断アッセイは当技術分野で公知であり、無細胞アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ形式のアッセイ、または例えばラジオイムノアッセイまたはＦＡＣＳ分析を用いた細胞に基づくアッセイのどちらかにおいて行うことができる。
【０１５６】
免疫複合体に対する本発明の分子、例えば可溶性ＦｃγＲタンパク質、可溶性ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質の免疫複合体遮断活性を決定するための例示的な一アッセイは、ＥＬＩＳＡに基づくアッセイであり、以下（このアッセイを実施例６でさらに例示する）：（マウス抗フルオレセインモノクローナル抗体である）４−４−２０抗体と、ＦＩＴＣと複合したウシ血清アルブミンとを有する免疫複合体を形成させること；３Ｇ８モノクローナル抗体と本発明の分子とが相互作用可能な条件で、連続希釈した３Ｇ８モノクローナル抗体を本発明のビオチン化した分子と共に予備インキュベートすること；３Ｇ８モノクローナル抗体と結合した本発明の分子の濃度を上げながら滴定すること；免疫複合体に対する本発明の分子−３Ｇ８複合体の結合を検出し測定することを含む。陰性対照として、（１）これも３Ｇ８モノクローナル抗体と共に予備インキュベートした天然ＦｃγＲタンパク質または野生型ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質の一方の濃度を上げながら滴定を行い、免疫複合体と相互作用を可能にし、結合を測定するか；（２）本発明の分子を予備インキュベートしないか；または（３）ＦｃγＲＩＩＩＡに対して全く親和性を有さない無関係の免疫グロブリンと共に本発明の分子を予備インキュベートする。本発明の分子−３Ｇ８複合体の結合と、任意の陰性対照の結合とを比較し、本発明の分子に対する免疫複合体の結合を３Ｇ８モノクローナル抗体が遮断する能力を、検出したシグナルにおける減少率として測定する。
【０１５７】
本発明の分子の免疫複合体遮断活性を測定するための別の例示的なアッセイは、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いた細胞に基づくアッセイである。代わりに、ＦＡＣＳに基づく分析を使用できる。このアッセイでは、ＦｃγＲＩＩＩＡを有する細胞上に形成したＩｇＧ複合体に本発明の分子が結合するのを、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合タンパク質、例えば３Ｇ８モノクローナル抗体が遮断する能力を測定する。使用できる適当な細胞には、（１）正常なヒト末梢血リンパ球に由来するＮＫ細胞またはマクロファージ、（２）ｈｕＣＤ１６Ａトランスジェニックマウスから得られた細胞（Li、1996 J. Exp. Med. 183:1259〜63頁）、（３）ＲＩＩの膜貫通および細胞内ドメインまたは（ＣＤ８またはＬＦＡ−３のような）別の受容体と融合したＣＤ１６Ａの細胞外部分を発現する哺乳動物細胞系、（４）ＣＤ１６Ａ発現ベクターを一過的または安定的にトランスフェクトされた（そして任意選択で、最適な発現受容体の発現のためのガンマ鎖を同時発現する）哺乳動物細胞系（例えばＣＨＯ、ＨＥＫ−２９３、ＣＯＳマウス骨髄腫細胞（ＮＳＯ））があるが、それらに限定されない。例示的な細胞に基づくＲＩＡアッセイにおいて、免疫複合体に対する本発明の分子の結合を測定できる。本発明の分子を１２５Ｉ標識し、当業者に公知の標準的な方法で分子の比放射能を決定できる。本発明の標識分子と、ＩｇＧと共に予備培養して免疫複合体でコートされた細胞を形成している、ＦｃγＲＩＩＩＡを有する細胞とを数時間混合し、遠心分離により未結合の物質から細胞および結合した物質を分離し、両コンパートメント中の放射能を決定する。ＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩｇＧでコーティングされた細胞に対する本発明の分子のＫｄを決定するために直接結合形式を使用する。当業者により決定される結合データのスキャッチャード分析を用いて、本発明のヨウ化分子に対する結合部位数を決定できる。過剰のコールド（未標識）分子である競合体を含有する対照を入れ、特異的相互作用を反映する結果を確かめることができる。次に、競合形式アッセイである細胞に基づくＲＩＡアッセイを使用して、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合分子、例えば３Ｇ８モノクローナル抗体がＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩｇＧでコーティングされた細胞に対する本発明の分子の結合を阻害する能力を測定できる。
【０１５８】
本発明は、本発明の分子のＦｃγへの結合を測定するための他のアッセイを包含する。一実施形態において、本発明の分子がヒトＩｇＧを有する免疫吸着カラムにより溶液からＦｃγＲＩＩＩＡを好んで除去する能力を、当業者に公知の標準的な方法を用いて決定する。別の実施形態において、本発明は、ＩｇＧでコーティングされた赤血球と、ＦｃγＲＩＩＩＡを有することが知られている細胞との間のロゼット形成を測定することを包含する。ロゼットアッセイは当技術分野、例えばWinchesterら、第31章、Roseら編、Manual of Clinical Laboratory Immunology、第３版、American Society for Microbiology、ワシントンDC.、1986；Savelkoulら、1988、Journal of Immunological Methods、111:31〜37頁；Koflerら、1977、Journal of Immunological Methods、16:201〜209頁；Lopezら、1999、Immunology、98:450〜455頁に標準的であり、これら全ての文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１５９】
本発明は、マスト細胞の脱顆粒の際に放出されるｂ−ヘキサミニダーゼ量を監視することにより、本発明の分子、具体的にはＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域を含む分子がヒトマスト細胞の活性化を調節する能力を決定することも包含する。任意の特定の作用様式と結びつけることを意図せずに、放出されるｂ−ヘキサミニダーゼ量は受容体の活性化に比例する。マスト細胞の活性化を測定するための当技術分野で公知の他のアッセイ、例えばセロトニンの放出を測定するためのアッセイ、ヒスタミンの放出を測定するためのアッセイも本発明の範囲内である。
【０１６０】
本発明は、本発明の分子がＦｃγＲのエフェクター細胞介在性機能を遮断する能力を特性決定するための方法も包含する。本発明にしたがってアッセイできるエフェクター細胞の機能の例には、抗体依存性細胞性細胞傷害、食作用、オプソニン化、オプソニン食作用、Ｃ１ｑの結合、および補体依存性細胞性細胞傷害があるが、それらに限定されない。エフェクター細胞機能活性を決定するための当業者に公知の任意の細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイを使用できる（エフェクター細胞アッセイについてはPerussiaら、2000、Methods Mol. Biol. 121:179〜92頁；Baggioliniら、1998 Experientia、44(10):841〜8頁；Lehmannら、2000 J. Immunol. Methods、243(1〜2):229〜42頁；Brown EJ. 1994、Methods Cell Biol.、45:147〜64頁；Munnら、1990 J. Exp. Med.、172:231〜237頁、Abdul-Majidら、2002 Scand. J. Immunol. 55:70〜81頁；Dingら、1998、Immunity 8:403〜411頁を参照のこと。これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【０１６１】
５．３  可溶性ＦｃγＲタンパク質を組換え産生する方法
５．３．１  可溶性ＦｃγＲタンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明は、ＦｃγＲ細胞外領域から成るポリペプチド、ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質、その誘導体およびアナログ、ならびに本発明の方法により同定された他の任意の分子を含めた分子をコードするポリヌクレオチドも包含する。当技術分野で公知の任意の方法により、本発明の分子をコードするポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定できる。
【０１６２】
一実施形態において、本発明は好ましくはヒトの、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域をコードする単離された核酸配列を提供する。別の実施形態において、本発明は好ましくはヒトの、ＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域をコードする単離された核酸配列を提供する。一実施形態において、本発明は免疫グロブリン定常領域、例えばＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域をコードする単離された核酸配列を包含する。特定の好ましい実施形態において、本発明は、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と融合した、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域をコードする単離された核酸配列を提供する。別の好ましい実施形態において、本発明は、ＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と融合した、好ましくはヒトのＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域をコードする単離された核酸配列を提供する。
【０１６３】
ある実施形態において、本発明は配列番号５〜８の任意の核酸配列を包含する。他の実施形態において、本発明は配列番号１〜８、３３、３５、３７、３９もしくは４１またはその相補配列と高度にストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な配列を含む核酸配列を包含する。他の実施形態において、本発明はＮＢＬＡＳＴのような当業者に公知のアルゴリズムを用いて決定されたような配列番号３３、３５、３７、３９もしくは４１またはその相補配列と少なくとも７０％、８０％、または９０％相同の核酸配列を包含する。
【０１６４】
本発明の一態様は、本発明のポリペプチド、例えばＦｃγＲ可溶性細胞外領域、もしくは５．１節で開示されたような免疫グロブリン領域と融合したＦｃγＲ細胞外領域を有する融合タンパク質、またはその生物学的に活性な断片をコードする単離された核酸分子、ならびに核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用するのに十分な、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子および核酸分子の増幅または突然変異のためのＰＣＲプライマーとしての使用に適したそのような核酸分子の断片に関する。本明細書において使用する「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチドアナログを用いて発生したＤＮＡまたはＲＮＡのアナログを含めることを意図する。核酸分子一本鎖または二本鎖であり得るが好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１６５】
「単離された」核酸分子は、天然起源の核酸分子に存在する他の核酸分子から分離されるものである。好ましくは単離された核酸分子は、その核酸が得られた生物のゲノムＤＮＡ中の核酸と自然に隣接する配列（すなわち核酸の５’および３’末端に位置する配列）（好ましくはタンパク質をコードする配列）を有さない。例えば様々な実施形態において、単離された核酸分子は、その核酸が得られる細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に自然に隣接する約５ｋＢ、４ｋＢ、３ｋＢ、２ｋＢ、１ｋＢ、０．５ｋＢまたは０．１ｋＢ未満のヌクレオチド配列を含み得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え法で産生される場合に他の細胞性物質または培地を実質的に有さないか、または化学合成される場合に化学前駆体または他の化学物質を実質的に有さない可能性がある。本明細書において使用する「単離された」という用語は、核酸分子を呼ぶ場合に単離された染色体を含まない。
【０１６６】
本発明の核酸分子、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＡを含めるがそれらに限定されないＦｃγＲの任意の細胞外領域のヌクレオチド配列を有する核酸分子、および免疫グロブリン定常領域のヌクレオチド配列を有する核酸分子、例えばＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｊ００２３０  Ｖ００５５４を有する核酸分子またはその相補配列を、標準的な分子生物学的方法および本明細書において提供される配列情報を用いて単離できる。ＩｇＧ定常領域の核酸配列の全てまたは一部、例えばＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｊ００２３０  Ｖ００５５４を有する核酸の一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、本発明の核酸分子を（例えばSambrookら編、Molecular Cloning:A Laboratory  Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、 Cold Spring Harbor、ニューヨーク、1989に記載されているような）標準的なハイブリダイゼーションおよびクローニング法を用いて単離できる。
【０１６７】
テンプレートとしてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと、標準的なＰＣＲ増幅法にしたがった適当なオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて本発明の核酸分子を増幅できる。そのように増幅した核酸を適当なベクターにクローニングして、ＤＮＡ配列分析により特性決定できる。さらに、本発明の核酸分子の全てまたは一部に対応するオリゴヌクレオチドを標準的な合成法、例えば自動化ＤＮＡ合成装置を用いて調製できる。
【０１６８】
本発明は、遺伝暗号の縮重が原因で公知のＦｃγＲのヌクレオチド配列（例えばＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３２、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５を有する核酸配列）および公知の免疫グロブリン定常領域（例えばＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：１８４７５１を有する核酸配列）と異なりるが、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３２、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５、またはＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：１８４７５１を有する核酸配列がコードするのと同じタンパク質をコードする核酸分子をさらに包含する。
【０１６９】
そのうえ、本明細書に記載されるヒトタンパク質のヌクレオチド配列と異なるヌクレオチド配列を有する、ヒト以外の他の種からの本発明のタンパク質（ホモログ）をコードする核酸分子は、本発明の範囲内に入ることが意図される。標準的なハイブリダイゼーション法に従うストリンジェントなハイブリダイゼーション条件でのハイブリダイゼーションプローブとしてヒト配列またはその一部を用いて、本明細書に開示されるヒト核酸分子に対する同一性に基づいて、本発明の分子に使用されるＦｃγＲ配列およびＩｇＧ配列の天然対立遺伝子変異体およびホモログに対応する核酸分子を単離できる。
【０１７０】
集団中に存在し得る本発明の核酸分子配列の天然対立遺伝子変異体以外に、突然変異により変化を導入でき、それによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすことができるがそのタンパク質の生物学的活性を改変することはないことを当業者は認識しているであろう。例えば、ヌクレオチド置換を行って「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換をもたらすことができる。「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を改変せずに野生型配列から改変できる残基であり、「必須」アミノ酸残基は、生物学的活性に必要である。例えば様々な種のホモログ間で保存されていないか、または半保存されているだけのアミノ酸残基は、活性に非必須であるおそれがあるため、改変に適当なターゲットである。代わりに、様々な種（例えばマウスおよびヒト）のホモログ間で保存されているアミノ酸残基は活性に不可欠であるおそれがあるため、改変に適当なターゲットではなかろう。
【０１７１】
ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｘ５２６４５、Ｍ３１９３２、Ｍ３１９３４、Ｍ３１９３５、ＪＯＯ２３０  Ｖ００５５４、Ｊ００２２８  ＧＩ：１８４７３９、Ｊ００２３１  ＧＩ：１８５０４１、Ｋ０１３１６  ＧＩ：１８４７５１を有する核酸配列のヌクレオチド配列に１つまたは複数のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって変異型タンパク質をコードする単離された核酸分子を作製することができ、その結果コードされたタンパク質に１つまたは複数のアミノ酸置換、付加または欠失が導入される。部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ介在性突然変異誘発のような標準的な方法により突然変異を導入できる。好ましくは、１つまたは複数の予測される可欠アミノ酸残基で保存的アミノ酸置換が作られる。「保存的アミノ酸置換」は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基にアミノ酸残基を交換する置換である。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えばトレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸がある。代わりに、飽和突然変異誘発によるような、コード配列の全てまたは部分に沿ってランダムに突然変異を導入することができ、生じた突然変異体について生物学的活性をスクリーニングし、活性を保持している突然変異体を同定することができる。突然変異誘発の後に、コードされたタンパク質を組換え発現させることができ、タンパク質の活性を決定できる。
【０１７２】
本発明の方法により同定された本発明の分子または他の分子のヌクレオチド配列がいったん決定されると、当技術分野で十分公知の方法、例えば組換えＤＮＡ法、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（例えばSambrookら、2001、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第３版、Cold Spring larbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨーク；およびAusubelら編、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨークに記載されている方法を参照のこと。これら両方はその全体が参照により本明細書に組み込まれている）を用いてそのヌクレオチド配列を操作して、例えばアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を発生させることにより、例えば異なるアミノ酸配列を有する分子を発生させることができる。
【０１７３】
別の実施形態において、当技術分野で公知の標準的な方法により、当技術分野で入手できるヒトライブラリーまたは他の任意のライブラリーをスクリーニングして、本発明の分子をコードする核酸をクローニングできる。
【０１７４】
上の５．１節に論じたように、当業者に公知の方法を用いてＦｃγＲ細胞外領域を有する本発明の分子を操作できる。突然変異を導入するための例示的な方法は、実施例６に例示するような商業的に入手可能なキットであるＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱｕｉｃｋ  ｃｈａｎｇｅキットを用いることである。簡単に説明すると、この突然変異誘発の取り組みはメチル化ＤＮＡに対するＤｐｎＩエンドヌクレアーゼの選択性を利用している。メチル化ＤＮＡのみを分解するＤｐｎＩを用いて、突然変異誘発（例えばＰＣＲに基づく突然変異誘発）の反応産物を分解する。このように非突然変異メチル化親ＤＮＡを切断し、主な種として目的の突然変異を含む新たに合成された非メチル化産物を残す。当業者に公知である任意の突然変異誘発法により本発明の分子のアミノ酸配列変異体を得られることは、当業者に認識されている。これらの方法のいくつかを本明細書に簡潔に記載するが、代替法も等しい結果を生じ得ることが認識されている。好ましい実施形態において、ＦｃγＲの変異型細胞外領域を有する本発明の分子は、変異性ＰＣＲにより調製される（Leungら、1989、Technique、1:11参照）。
【０１７５】
修飾されるＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外領域の配列内に１つまたは複数の修飾を有するオリゴヌクレオチドを合成することを含めるがそれに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法にしたがって、突然変異誘発を実施できる。部位特異的突然変異誘発は、望みの突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、および十分な数の隣接ヌクレオチドを使用することにより突然変異体の産生を可能にし、十分なサイズおよび配列複雑度のプライマー配列を提供し、欠失接合部をまたぐ両側に安定な二重鎖を形成する。概して、配列の接合部の両側で約１０から約２５残基以上が改変された長さ約１７から約７５ヌクレオチド以上のプライマーが好ましい。１つまたは複数の位置で多様な異なる突然変異を導入するこのような多数のプライマーを、突然変異体のライブラリーを発生させるために使用できる。
【０１７６】
部位特異的突然変異誘発法は、種々の出版物で例示されるように、当技術分野で十分公知である（例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているKunkelら、Methods Enzymol.、154:367〜82頁、1987参照）。一般に、まず一本鎖ベクターを得ることにより、または配列内に望みのペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む二本鎖ベクターの二本の鎖を融解して別々にすることにより、部位特異的突然変異誘発を実施する。目的の突然変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーを総じて合成的に調製する。次にこのプライマーを一本鎖ベクターと共にアニーリングし、突然変異保有ストランドの合成を完了するためにＴ７  ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡ重合酵素を作用させる。このように、片方のストランドが本来の非突然変異配列をコードし、２番目のストランドが望みの突然変異を保有するヘテロ二本鎖を形成させる。次にこのヘテロ二本鎖ベクターを用いて大腸菌細胞のような適当な細胞を形質転換またはトランスフェクトし、突然変異配列の配置を保有する組換えベクターを含むクローンを選択する。認識されるように、本方法は概して一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを採用している。部位特異的突然変異誘発に有用な典型的なベクターにはＭ１３ファージのようなベクターがある。これらのファージは商業的に容易に入手でき、それらの使用は総じて当業者に十分公知である。プラスミドからファージへの目的遺伝子の移動ステップを排除した二本鎖プラスミドも、部位特異的突然変異誘発に日常的に採用される。
【０１７７】
代わりに、増幅したＤＮＡ断片に突然変異誘発オリゴヌクレオチドプライマーを導入して、次に適当なクローニングベクターまたは発現ベクターにクローニングできるようにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような商業的に入手できる熱安定酵素を用いたＰＣＲの使用を使用できる。例えばＰＣＲ（商標）介在性突然変異誘発法についてはTomicら、Nucleic Acids Res.、18(6):1656頁、1987およびUpenderら、Biotechniques、18(1):29〜30頁、32頁、1995を参照のこと。これらはその全体が本明細書に組み込まれている。熱安定性ポリメラーゼ以外に熱安定性リガーゼを採用しているＰＣＲ（商標）を使用して、増幅したＤＮＡ断片にリン酸化した突然変異誘発オリゴヌクレオチドを導入し、それを次に適当なクローニングベクターまたは発現ベクターにクリーニングすることもできる（その全体が参照により本明細書に組み込まれている例えばMichael、Biotechniques、16(3):410〜2頁、1994参照）。
【０１７８】
本発明に使用するための変異体の別の調製法は、Wellsら (1985、Gene、34:315頁)に記載された方法に基づくカセット突然変異誘発である。出発物質は突然変異させるタンパク質をコードする望みのＤＮＡを有するプラスミドである（例えばＦｃγ領域を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ）。突然変異させるＤＮＡ配列中のコドンを同定する。同定された突然変異部位の両側に独特の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。そのような制限部位が存在しないならば、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によりそれを発生させることができる。プラスミドに制限部位を導入してから、これらの部位でプラスミドを切断し線状にする。制限部位の間のＤＮＡ配列をコードしているが突然変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドを、当業者に公知の標準的な手順を用いて合成する。二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。このカセットは線状プラスミドの両端に適合可能な３’および５’末端を有するように設計されている結果、プラスミドと直接連結できる。
【０１７９】
本発明の分子の配列変異体を産生させるための当業者に公知の他の方法を使用できる。例えば、本発明の分子のアミノ酸配列をコードする組換えベクターを、ヒドロキシルアミンのような突然変異誘発剤で処理して配列変異体を得ることができる。
【０１８０】
変異型領域、例えば変異型細胞外領域を有する本発明の分子を直接配列決定するために、当技術分野で公知の多様な配列決定反応のうちいずれかを使用できる。配列決定反応の例には、MaximおよびGilbert（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、74:560頁、1977）またはSanger（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463頁、1977）により開発された方法に基づく反応がある。質量分析による配列決定（ＰＣＴ公報WO 94/16101；Cohenら、Adv. Chromatogr.、36:127〜162頁、1996；およびGriffinら、Appl. Biochem. Biotechnol.、38:147〜159頁、1993)を含めた多様な自動配列決定法のいずれかを利用できることも考えられる（Bio/Techniques、19:448頁、1995）。
【０１８１】
５．３．２  可溶性ＦｃγＲタンパク質の組換え発現
いったん本発明の分子（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有する融合タンパク質）をコードする核酸配列が得られたなら、分子を産生するためのベクターを当技術分野で公知の方法を用いた組換えＤＮＡ法により産生できる。本発明の分子のコード配列と、適当な転写および翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築するために、当業者に十分公知の方法を使用できる。これらの方法には、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ法、合成法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組み換えがある。（例えばSambrookら、1990、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、ニューヨークおよびAusubelら編、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク参照のこと）。
【０１８２】
本発明は、本発明の分子のコード領域が異種プロモーターに作動可能に連結した分子を含めた、組換え操作された核酸分子を含む。本発明は、当業者に公知の方法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発生した組換え操作された核酸分子を含む。例えば、本発明は細胞内に存在する核酸分子、例えばエピソームまたは細胞の１つまたは複数の染色体に組み込まれた分子を含む。いくつかの実施形態において、そのような核酸分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで発生させ細胞にトランスフェクトする。他の実施形態において、当技術分野で公知の遺伝子活性化法、例えば内因性コード領域と作動可能に連結した少なくとも１つの異種プロモーターを導入することにより、本発明の核酸分子を生成させる。
【０１８３】
本発明の分子、または本発明の方法により同定された他の任意の分子のヌクレオチド配列を有する発現ベクターを通常の方法（例えばエレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈殿）により宿主細胞に移入でき、トランスフェクトされた細胞を次に通常の方法で培養して本発明の分子を産生させる。特定の実施形態において、本発明の分子は構成性プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターにより制御される。
【０１８４】
本発明の分子、および本発明の方法により同定された他の分子を発現させるために使用される宿主細胞は、特に組換え免疫グロブリン分子全体の発現のための大腸菌のような細菌細胞、または好ましくは真核細胞のどちらかであり得る。具体的には、ヒトサイトメガロウイルスからの主要な即時型遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと併用したチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞は、免疫グロブリンのための効果的な発現系である（Foeckingら、1998、Gene 45:101頁；Cockettら、1990、Bio/Technology 8:2頁）。本発明の方法に使用するための他の細胞には、例えばＮＳＯ（マウス骨髄腫細胞）およびＰｅｒ．Ｃ６細胞（ヒト網膜細胞）がある。
【０１８５】
本発明の分子を発現させるために多様な宿主−発現ベクター系を利用できる。そのような宿主−発現系は、本発明の分子のコード配列を産生させ、その後精製できる媒介を表すが、適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはその配列をトランスフェクトした場合にｉｎ  ｓｉｔｕで本発明の分子を発現し得る細胞も表す。これらには、分子に対するコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば大腸菌および枯草菌）；本発明の分子をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属）；本発明の分子をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；本発明の分子をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に感染した植物細胞系または組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムから得られたプロモーター（例えばメタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスから得られたプロモーター（例えばアデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えばＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ（ｌｙｍｐｈｏｔｉｃ）細胞（U.S. 5,807,715参照）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌにより開発されたヒト網膜細胞）があるが、それらに限定されない。
【０１８６】
細菌系において、発現させようとする分子に対して意図した使用に応じて、多数の発現ベクターを好都合に選択できる。例えば、本発明の分子の医薬組成物を発生させるために、そのようなタンパク質を大量に産生させようとする場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指令するベクターが望ましい。そのようなベクターには、ベクターのｌａｃ  Ｚコード領域を有するフレーム内に抗体コード配列を個別に連結できることにより融合タンパク質が産生する大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Rutherら、1983、EMBO J. 2:1791頁）；ｐＩＮベクター（Inouye & Inouye、1985、Nucleic Acids Res. 13:3101〜3109頁；Van Heeke & Schuster、1989、J. Biol. Chem. 24:5503〜5509頁）などがあるが、それらに限定されない。外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として発現させるためにｐＧＥＸベクターも使用できる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、溶解した細胞からマトリックスグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合させた後に遊離グルタチオンの存在下で溶離させることにより容易に精製できる。トロンビンまたはＸａプロテアーゼ切断部位を含むようにｐＧＥＸベクターを設計しているため、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から離すことができる。本発明の方法における使用のための他の好ましいベクターは、それぞれ２００３年１月９日、２００３年３月１９日、および２００３年１０月２３に出願した米国仮出願第60/439,498号；第60/456,041号、および第60/514,549号、ならびに２００４年１月９日に出願した整理番号011183-004-999を有する米国出願第＿号に開示されているベクターである。これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１８７】
昆虫系において、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスはスポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔａｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞に生育する。抗体のコード配列をウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えばポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
【０１８８】
哺乳動物宿主細胞において、ウイルスに基づく多数の発現系を利用できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば遅延型プロモーターおよび３連リーダー配列に目的のコード配列を連結できる。このキメラ遺伝子を次にｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入できる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えばＥ１またはＥ３領域）への挿入は、感染した宿主中で生存し免疫グロブリン分子を発現できる組換えウイルスを生じる（例えばLogan & Shenk、1984、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:355〜359頁参照）。挿入された抗体コード配列が効率的に翻訳されるために特異的開始シグナルも必要であり得る。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列がある。さらに、開始コドンは、挿入部全体の翻訳を確実にするために望みのコード配列のリーディングフレームと同調しなければならない。これらの外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の多様な起源であり得る。適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含ませることにより発現効率を上げることができる（Bittnerら、1987、Methods in Enzymol. 153:51〜544頁参照）。
【０１８９】
さらに、挿入配列の発現を調節するか、または望みの特定のやり方で遺伝子産物を修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択できる。そのようなタンパク質産物の修飾（例えばグリコシル化）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能に重要であり得る。種々の宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的で特異的なメカニズムを有する。発現した外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために、適当な細胞系または宿主系を選択できる。この目的のために、一次転写体の適正なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化のための細胞装置を保有する真核宿主細胞を使用できる。そのような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０ならびにＨｓ５７８Ｂｓｔ、ＮＳＯ、Ｐｅｒ．Ｃ６があるがそれらに限定されない。
【０１９０】
組換えタンパク質を長期高収量産生させるためには安定発現が好ましい。例えば、本発明の分子を安定発現する細胞系を操作できる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりむしろ、適当な発現制御エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されるＤＮＡと選択可能なマーカーとで宿主細胞を形質転換できる。外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞を強化培地で１〜２日間増殖させてから選択培地に切り換える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、プラスミドを細胞の染色体に安定的に組み込みさせ、増殖させて細胞増殖巣を形成させ、その巣を今度はクローニングし細胞系に発達させることができる。本発明の抗体を発現する細胞系を操作するためにこの方法を好都合に使用できる。そのような操作された細胞系は、本発明の抗体と直接または間接的に相互作用する化合物をスクリーニングし評価するために特に有用であり得る。
【０１９１】
それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞に採用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wiglerら、1977、Cell 11: 223頁）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Szybalska & Szybalski、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowyら、1980、Cell 22: 817頁）を含めるがそれらに限定されない多数の選択系を使用できる。また、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wiglerら、1980、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:357頁；O'Hareら、1981、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527頁）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan & Berg、1981、Proc. Natl. Acaci Sci. USA 78:2072頁）、アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ Clinical Pharmacy 12:488〜505頁；WuおよびWu、1991、3:87〜95頁；Tolstoshev、1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573〜596頁；Mulligan、1993、Science 260:926〜932頁；ならびにMorganおよびAnderson、1993、Ann. Rev. Biochem. 62:191〜217頁；May、1993、TIB TECH 11(5):155〜215頁）のための選択基盤として代謝拮抗物質耐性を使用できる。組換えＤＮＡ法の分野で通常公知であり、使用できる方法は、Ausubelら編、1993、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク；Kriegler、1990、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、ニューヨーク；ならびに12および13章、Dracopoliら編、1994、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、ニューヨーク；Colberre-Garapinら、1981、J. Mol. Biol. 150:1頁に記載され、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏがある(Santerreら、1984、Gene 30:147頁)。
【０１９２】
ベクター増幅により、本発明の分子の発現レベルを増加できる（総説についてはBebbingtonおよびHentschel、The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning、第3巻(Academic Press、ニューヨーク、1987)を参照のこと。本発明の分子を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物中に存在する阻害物質レベルの増加はマーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域は分子のヌクレオチド配列と関連するため、分子の産生も増加する（Crouseら、1983、Mol. Cell. Biol. 3:257頁）。
【０１９３】
いったん本発明の分子が組換え発現されたならば、ポリペプチドの精製のための当技術分野で公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、詳細にはプロテインＡクロマトグラフィーの後に特異的抗原に対するアフィニティクロマトグラフィーにより、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはポリペプチドの精製のための他の任意の標準的な方法によりその分子を精製できる。
【０１９４】
本発明は、配列番号１〜４、３３、３５、３７、３９および４１のいずれかから選択されたアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態において、配列番号における位置４１８はセリンである。他の実施形態において、位置４１８はプロリンである。いくつかの実施形態において、配列番号２における位置４０７はセリンまたはプロリンである。特定の実施形態において、配列番号３における位置４１０はセリンまたはプロリンでありＮ末端の最初の３つのアミノ酸はＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａであるか、存在しないかのどちらかである。別の特定の実施形態において、配列番号４における位置４１０はセリンまたはプロリンであり、Ｎ末端の最初の３つのアミノ酸はＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａであるか、存在しないかのどちらかである。
【０１９５】
５．４  予防法および治療法
本発明は、動物、好ましくは哺乳動物、および最も好ましくはヒトに対して本発明の分子を投与することによる自己免疫障害または炎症障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、管理、または改善することを包含する。本発明の治療化合物および予防化合物には、可溶性ＦｃγＲポリペプチド、ＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する融合ポリペプチド、これらの分子のアナログ、誘導体およびそれをコードする核酸があるがそれらに限定されない。当技術分野で公知の、または本明細書に記載された薬学的に許容可能な組成物に本発明の分子を提供できる。
【０１９６】
５．４．１  自己免疫障害および炎症障害
本発明は、本発明の分子および組成物を用いて自己免疫障害または炎症障害を治療および／または予防することを包含する。任意の作用機序と結びつけることを意図するわけではないが、自己免疫障害で観察される病原ＩｇＧ抗体は疾患の病原誘発因子であり、かつ／または受容体ＦｃγＲの不適切な活性化による疾患の進行に寄与している。凝集した自己抗体および／または自己抗原と複合体を形成した自己抗体（免疫複合体）は、活性化型ＦｃγＲと結合し、自己免疫障害の発病を誘発する。任意の詳細なメカニズムに限定することを意図するわけではないが、本明細書に記載した本発明の分子は、自己免疫障害に治療有用性を有する。それは、それらの分子が自己抗体と受容体ＦｃγＲとの相互作用を妨害するからである。
【０１９７】
本発明は、アレルギー性喘息、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、自己免疫性溶血性貧血（ＡＨＡ）、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、強皮症、自己抗体誘発じん麻疹、天疱瘡、血管炎症候群、自己免疫血球減少症、、ギランバレー症候群、抗ＶＩＩＩ因子自己免疫疾患、ぶどう膜炎、皮膚筋炎を含めるがそれらに限定されない静脈内免疫グロブリン療法を用いた治療に感受性の疾患の治療および／または予防も包含する。
【０１９８】
本発明は、可溶性ＦｃγＲポリペプチド、それを有する融合タンパク質、およびその誘導体を単一治療剤として、または自己免疫疾患または炎症疾患の治療および／または予防のための他の治療剤と組み合わせて使用することを包含する。本発明は、可溶性ＦｃγＲポリペプチド、ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合ポリペプチド、ならびにそのアナログおよび誘導体を含めるが、それらに限定されない本発明の分子を、自己免疫疾患または炎症疾患の治療または予防のための治療上または予防上有効な用量を被験者に投与することを包含する。一実施形態において、少なくとも０．１μｇ／ｇ、少なくとも０．２μｇ／ｇ、少なくとも０．３μｇ／ｇ、少なくとも０．４μｇ／ｇ、少なくとも０．５μｇ／ｇ、少なくとも１μｇ／ｇ、または少なくとも５μｇ／ｇの用量で本発明の分子の１つまたは複数の用量を被験者に投与する。
【０１９９】
特定の実施形態において、本発明は自己免疫疾患または炎症疾患の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するするための方法を包含し、その方法はＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ細胞外領域を有する治療上または予防上有効な量の融合タンパク質を投与することを含む。一実施形態において、少なくとも０．１μｇ／ｇ、少なくとも０．２μｇ／ｇ、少なくとも０．３μｇ／ｇ、少なくとも０．４μｇ／ｇ、少なくとも０．５μｇ／ｇ、少なくとも１μｇ／ｇ、または少なくとも５μｇ／ｇの用量で本発明の融合タンパク質の１つまたは複数の用量を被験者に投与する。
【０２００】
本発明は、被験者における自己免疫障害または炎症障害に関連した１つまたは複数の症状を予防、治療、または管理する方法を提供し、その方法は治療上有効な量の本発明の分子を前記被験者に投与することを含む。本発明は、被験者における炎症障害に関連した１つまたは複数の症状を予防、治療、または管理する方法も提供し、その方法は治療上有効な量の１つまたは複数の抗炎症剤を前記被験者に投与することをさらに含む。本発明は、自己免疫疾患に関連した１つまたは複数の症状を予防、治療、または管理する方法も提供し、その方法は前記被験者に治療上有効な量の１つまたは複数の免疫調節剤を投与することをさらに含む。第５．４．３節に抗炎症剤および免疫調節剤の非限定例を提供する。
【０２０１】
当技術分野で公知の抗体を含めた任意の治療剤と組み合わせて、自己免疫疾患または炎症疾患の治療および／または予防のために本発明の分子を使用することもできる。炎症障害および／または自己免疫障害の治療または予防に使用される治療剤の限定することのない例には、５Ｇ１．１（Ａｌｅｘｉｏｎ  Ｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）、５Ｇ１．１−ＳＣ、ＡＢＸ−ＣＢＬ（Ａｂｇｅｎｉｘ  Ｉｎｃ．）、ＡＢＸ−ＩＬ８（Ａｂｇｅｎｉｃｓ  Ｉｎｃ．）、アンテグレン（Ａｔｈｅｎａ、Ｅｌａｎ）、抗ＣＤ１１ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、抗ＣＤ１８（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、抗ＬＦＡ１（Ｐａｓｔｅｕｒ−Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）、アントラ（Ａｎｔｏｒａ）（Ｂｉｏｇｅｎ）、ＢＴＩ−３２２（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＣＤＰ５７１（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、ＣＤＰ８５０（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）、Ｃｏｒｒｅｖｉｎ  Ｍ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、Ｄ２Ｅ７（ＣＡＴ／ＢＡＳＦ）、Ｈｕ２３Ｆ２Ｇ（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）、ＩＣ１４（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ  Ｉｎｃ．）、ＩＣＭ３（ＩＣＯＳ  Ｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．）、ＩＤＥＣ−１１４（ＩＤＥＣ）；ＩＤＥＣ１３１、ＩＤＥＣ−１５１、ＩＤＥ−１５２、インフリキシマブ（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、ＬＤＰ−０１（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、ＬＤＰ−０２（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）、ＭＤＸ−３３（Ｍｅｄａｒｅｘ）、ＭＤＸ−ＣＤ４、ＭＥＤＩ−５０７（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、ＯＫＴ４Ａ（Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｒｈｕＭａｂ−Ｅ２５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＳＢ−２４０５６３（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、５Ｂ−２４０６８３、ＳＣＨ５５７００（ＣｅｌｌＴｅｃｈ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）、ＳＭＡＲＴ  Ａ−ＣＤ３（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ）、ゼナパックス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂ／Ｈｏｆｆｍａｎ  ＬａＲｏｃｈｅ）、ＡＢＸ−ＲＢ２、５ｃ８（抗ＣＤ−４０）、ＳＭＡＲＴ抗ガンマインターフェロン抗体、ベルテポルチン（Ｖｅｒｔｅｐｏｒｔｉｎ）、エンブレル、抗ＣＤ２０抗体、例えばリツキシマブ（McCLaughlinら、1998、J. Clin. Oncol.16(8): 2825〜33頁）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、アレファセプト（Ａｍｅｖｉｖｅ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標）、ＩＬＥＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌ．Ｐ．）、バシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ．）、アブシキシマブ（Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ  Ｂ．Ｖ）、ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）、Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．）、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．）、イブリツマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、インターフェロンベータ−１ａ（Ａｖｏｎｅｘ（登録商標）、Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）、インターフェロンベータ−１ａ（Ｒｅｂｉｆ（登録商標）、Ｓｅｒｏｎｏ，Ｉｎｃ．）、���ンターフェロンベータ−１ｂ（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ（登録商標）、Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）、ムロモナブ−ＣＤ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３（登録商標）、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＬＰ）、オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）、リツキシマブ（リツキサン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）、トシツモマブおよびヨウ素I１３１トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐ．）、およびパリブリツマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．）がある。本発明の分子は、例えば上に挙げた治療抗体の治療効果を増強し得る。
【０２０２】
本発明の分子を投与することにより治療され得る自己免疫障害には、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫異常症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕状の類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状エリテマトーデス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴズ病、ギレンバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、全身性血管炎、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発性動脈炎、多発性軟骨炎、多内分泌腺機能低下症候群、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レーノー現象、ライター症候群、慢性関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、疱疹状皮膚炎血管炎のような血管炎、白斑、ならびにヴェーゲナー肉芽腫症があるが、それらに限定されない。炎症障害の例には、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節症、未分化型関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染または慢性細菌感染に起因する慢性炎症があるが、それらに限定されない。本明細書に記載するように、一部の自己免疫障害は炎症状態に関連する。このように、自己免疫障害および炎症障害とみなされるものの間には重複がある。したがって、一部の自己免疫障害は炎症障害とも特徴づけられる場合がある。本発明の方法にしたがって予防、治療または管理できる炎症障害の例には、喘息、脳炎、炎症性腸疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アレルギー障害、敗血症性ショック、肺線維症、未分化型脊椎関節症、未分化型関節症、関節炎、炎症性骨溶解、および慢性ウイルス感染または慢性細菌感染に起因する慢性炎症があるが、それらに限定されない。
【０２０３】
炎症障害を有する動物、詳細には哺乳動物に経験される炎症を軽減するためにも本発明の分子も使用できる。特定の実施形態において、本発明の分子は動物における炎症を、前記分子を投与されていない動物における炎症に比べて、少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％軽減する。本発明の分子は移植片の拒絶の予防にも使用できる。
【０２０４】
５．４．１．１  特発性血小板減少性紫斑病
本発明の方法および組成物は、被験者の免疫系が血小板を攻撃し破壊する血小板障害である特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するために特に有用である。ＩＴＰを有する被験者における血小板数は、特徴的に５０，０００／ｍｍ３未満である。標準的なＩＴＰ療法には、例えば静脈内免疫グロブリン療法（ＩＶＩＧ）、概して注射を介する抗Ｄ（抗Ｒｈグロブリン）療法、コルチコステロイド療法、脾摘出、ステロイド療法、免疫抑制剤（例えばステロイド、アザチオプリン、シクロスポリン）の投与、またはプラズマフェレーシスがある。
【０２０５】
本発明は、ＩＴＰの治療または予防のために可溶性ＦｃγＲポリペプチド、ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合ポリペプチド、ならびにそのアナログおよび誘導体を含めるがそれらに限定されない本発明の分子を、治療上または予防上有効な用量で被験者に投与することを包含する。一実施形態において、少なくとも０．１μｇ／ｇ、少なくとも０．２μｇ／ｇ、少なくとも０．３μｇ／ｇ、少なくとも０．４μｇ／ｇ、少なくとも０．５μｇ／ｇ、少なくとも１μｇ／ｇ、または少なくとも５μｇ／ｇの用量で１つまたは複数の用量の本発明の分子を被験者に投与する。
【０２０６】
特定の実施形態において、本発明はＩＴＰの１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、その方法は、ＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃｇＲ細胞外領域を有する治療上または予防上有効な量の融合タンパク質を投与することを含む。一実施形態において、少なくとも０．１μｇ／ｇ、少なくとも０．２μｇ／ｇ、少なくとも０．３μｇ／ｇ、少なくとも０．４μｇ／ｇ、少なくとも０．５μｇ／ｇ、少なくとも１μｇ／ｇ、または少なくとも５μｇ／ｇの用量で１つまたは複数の用量の本発明の融合タンパク質を被験者に投与する。
【０２０７】
一実施形態において、本発明の方法および組成物は標準的なＩＴＰ療法、例えばＩＶＩＧ療法よりも良好な治療プロフィルを提供する。本発明は、本発明の分子を標準的なＩＴＰ療法、例えばＩＶＩＧと組み合わせて投与することにより、ＩＴＰの１つまたは複数の症状を治療、予防または改善するための方法も包含する。標準的なＩＴＰ療法のためのプロトコルは当業者に公知であり、本発明の方法および組成物と組み合わせて考えられている。標準的なＩＴＰ治療方式については、例えばSoubraneら、1993、Blood、81(1):15〜19頁；Clarksonら、1986、New England Journal of Med.、314:1236〜1239頁；Olssonら、2002、Thrombosis Research、107:135〜9；Busselら、1983 Blood、62:480〜6頁；Imbachら、1981、Lancet、1:1228〜31頁を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。別の実施形態において、本発明はＦｃγＲＩＩＩＡと特異的に結合する分子、例えば３Ｇ８モノクローナル抗体を投与することをさらに包含する。本発明の方法および組成物は標準的ＩＴＰ療法に抗療性の被験者に特に有用である。
【０２０８】
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物は、当業者に公知の標準的なアッセイにより決定されるように、ＩＴＰを有する被験者における自己オプソニン化赤血球のクリアランス速度を高める。オプソニン化赤血球の浄化速度を決定するための例示的なアッセイは、例えばFrankら（1979、New England Journal of Med、300:518〜23頁、これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）により確立されている。簡潔には、被験者から血液を採取し、細胞を４℃、２０００ｒｐｍで５分間沈降させる。赤血球を生理食塩緩衝液で洗浄し、赤血球１ｍＬあたり１０μＣｉの５１Ｃｒを加え、３７℃で３０分間培養する。次に細胞適量にＩｇＧ抗Ｒｈ（Ｄ）を添加して感作させ、これらのＩｇＧに感作した５１Ｃ標識赤血球を前肘静脈から注射し、赤血球の生存を経時的な採血により決定する。細胞の５０％が循環により除去される時間である、細胞の半減期を決定することにより生存を計算する
本発明の方法および組成物は、当業者に公知の標準的なアッセイにより決定されるような血小板数が少なくとも５，０００／ｍｍ３、１０，０００／ｍｍ３、１５，０００／ｍｍ３、２００００／ｍｍ３である被験者に特に有用である。特定の実施形態において、本発明の方法および組成物は、少なくとも５０，０００／ｍｍ３、少なくとも１００，０００／ｍｍ３、少なくとも２００，０００／ｍｍ３、少なくとも４００，０００／ｍｍ３への血小板数の上昇をもたらす。特定の実施形態において、患者における血小板数は５日、６日、７日、８日、９日、１０日以内に上昇する。なお別の特定の実施形態において、患者における血小板数は少なくとも５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、３０日間、１年間、２年間維持される。
【０２０９】
一実施形態において、本発明の方法および組成物は、ＩＴＰに感受性の免疫無防備状態の患者、例えば癌患者またはＡＩＤＳ患者に使用される。
【０２１０】
一実施形態において、単一治療剤としての本発明の組成物は、ＩＴＰを有する患者において標準的なＩＴＰ療法に比べて増強した治療効果を有する。
【０２１１】
本発明の方法および組成物は、標準的なＩＶＩＧ療法に概して関連する望ましくない副作用を好ましくは全く生じない。標準的なＩＶＩＧ療法に関連する望ましくない副作用には、例えばＨＡＭＡ応答、．好中球減少症、サイトカイン放出症候群がある。
【０２１２】
本発明は、その全体が参照により本明細書に組み込まれているSongら、Blood、2002年12月27日、印刷に先行する電子版により開示された任意の抗体、例えば抗ＣＤ２４抗体、他の循環細胞型と反応する抗体と組み合わせて本発明の分子を用いて、ＩＴＰを治療および／または予防することをさらに包含する。好ましい実施形態において、Ｓｏｎｇらに開示された抗体と組み合わせた本発明の分子は、その抗体単独で達成される治療効果よりも、ＩＴＰの予防に増強した治療効果を有する。好ましい実施形態において、Ｓｏｎｇらに開示された抗体と組み合わせた本発明の分子は、標準的なＩＶＩＧ治療（２ｇ／Ｋｇ）に比べて１００分の１、１０００分の１の用量で血小板減少を有意に予防する。
【０２１３】
いくつかの実施形態において、本発明は抗Ｄ抗体またはＷｉｎＲｈｏ  ＳＤＦ（Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ボカロタン、フロリダ州）と組み合わせて本発明の分子を用いてＩＴＰを治療および／または予防することを包含する。抗Ｄ抗体は血小板数の一時的上昇および偶発的な長期上昇を達成するために使用される血液産物である。それは、Ｒｈ（Ｄ）に対する抗体を含有する凍結乾燥ガンマグロブリン画分である。静脈内輸液の数分以内にＷｉｎＲｈｏ  ＳＤＦはレシピエント（正常）赤血球に精製ＩｇＧをコーティングし、これは（異常型自己免疫）ＩＴＰ免疫グロブリンによる血小板のコーティングに類似している。Ｄ（Ｒｈ）陽性赤血球を抗Ｄでコーティングした後に、それらの赤血球はレシピエントのＩｇＧ（ＩＴＰ）コーティング血小板と、脾臓でのマクロファージによる食作用（破壊）を競合する。通常は、ＩｇＧ（ＷｉｎＲｈｏ）をコーティングされた赤血球はＩｇＧ（ＩＴＰ）をコーティングされた血小板の脾臓での破壊を遮断することに成功することで血小板数を増加させる。血小板数の有意な増加は輸液後１〜３日以内に起こり、数のピークは輸液後８日に観察される。この効果は約１か月持続する（例えばGeorge、2002、Blood Rev.16(1):37〜8頁；Freibergら、1998、Semin. Hematol. 35(1、付録1):23〜7頁参照、これら両者はその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【０２１４】
ＷｉｎＲｈｏと組み合わせて治療上有効な本発明の分子を投与することを含む本発明の組合せ治療は、しかしながらＷｉｎＲｈｏ単独の使用よりも有効な治療プロフィルを提供する。本発明の組合せ治療は、頭痛、悪寒、発熱、体の痛み、注射部位の疼痛および腫脹、血液産物に過敏性を有する患者についてのアナフィラキシー（ショック応答）のリスク、ならびに溶血（赤血球の破壊）により起こる貧血を含めるがそれらに限定されない、ＷｉｎＲｈｏ単独の使用で観察される有害副作用を全く生じない。
【０２１５】
５．４．２  組合せ治療
ある好ましい実施形態において、本発明の治療法は、自己免疫疾患または炎症障害の治療および／または予防のために、例えば５．４．３節に開示されたもう１つの追加的な治療剤を投与することによる自己免疫疾患または炎症障害に対する標準的な療法と組み合わせて、本発明の分子を送達させることを含む。
【０２１６】
本発明は、被験者における自己免疫障害または炎症障害を治療、予防、または管理するための方法を包含し、その方法は自己免疫障害または炎症障害の治療、予防、または管理に有用な１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて、本発明の分子を投与することを含む。いくつかの実施形態において、本発明は可溶性ＦｃγＲポリペプチド、ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合ポリペプチド、ならびにそのアナログおよび誘導体を含めるがそれらに限定されない本発明の分子を、本明細書に開示される他の治療用抗体と組み合わせて投与することを包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の可溶性ＦｃγＲポリペプチドを、ＦｃγＲＩＩＩＡまたはＦｃγＲＩＩＡに特異的な抗体と組み合わせて投与することを包含する。好ましくは、本発明の方法で使用される抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体および抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＡに特異的な多数のモノクローナル抗体が当技術分野で公知であり、本明細書に開示され、本発明の方法および組成物に包含される。本発明の方法に使用され得る抗ＦｃγＲ抗体の例にはＫＢ６１、ＡＴ１０、ＫＵ７９、ＦＬ１８．２、ＦＬ１８．２６、２Ｅ１、４１Ｈ１６、Ｋ２２−２Ｇ８、ＩＩ１Ａ５、ＩＩ８Ｄ２、ＩＶ．３、ＣＩＫＭ３およびＣＩＫＭ５がある。例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているZolaら、2000、J. Biol. Regul. Homeost Agents、14:311〜6頁を参照のこと。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、本発明は可溶性ＦｃγＲポリペプチド、ＦｃγＲ細胞外領域を有する融合ポリペプチド、ならびにそのアナログおよび誘導体を含めるがそれらに限定されない本発明の分子を、抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体、ＩＶＩＧ、免疫複合体、またはその全体が参照により本明細書に組み込まれているU.S.2003/061826に開示されたようなＦｃ領域を有する構築物のような、ＦｃγＲＩＩＢの抑制活性を活性化する分子または作用物質と組み合わせて投与することを包含する。ＦｃγＲとの相互作用に関して凝集ＩｇＧおよび免疫複合体の機能を模倣できる任意の作用物質を本発明の分子と組み合わせて使用できる。本発明の分子と組み合わせて使用できる抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は、当技術分野で公知であるか、または２００２年８月１４日に出願した米国仮出願第10/643,857号および２００３年８月１４日に出願した米国出願第10/643,857号に開示された任意の抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体である。両出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。好ましくは、本発明の分子と組み合わせて使用される抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体は受容体ＦｃγＲＩＩＢの抑制活性を活性化する。本発明の方法にしたがって使用できる抗ＦｃγＲＩＩＢ抗体の例は、（参照により本明細書に組み込まれているＡＴＣＣ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、マナッサス、バージニア州０２２０９−２０１１に寄託された）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９１を有する２Ｂ６モノクローナル抗体およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９２を有する３Ｈ７モノクローナル抗体である。
【０２１８】
ある特定の実施形態において、本発明の分子を、自己免疫障害または炎症障害の治療に有用な１つまたは複数の他の治療剤と同時に、哺乳動物、好ましくはヒトに投与する。「同時に」という用語は、正確に同時点に予防剤または治療剤を投与することに限らず、むしろ本発明の分子と他の作用物質とが共同して作用して別の方法で投与された場合よりも大きな利益をもたらすことができる順序および時間間隔で、本発明の分子および他の薬剤が哺乳動物に投与されることを意味する。例えば、各予防剤または治療剤（例えば免疫調節剤、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域を有する融合タンパク質を含めるがそれに限定されない本発明の分子）を同時、にまたは種々の時点で任意の順序で連続的に投与できるが、同時に投与しないならば、望みの治療効果または予防効果をもたらすように十分に近い時点でそれらを投与すべきである。各治療剤を任意の適当な形状で任意の適当な経路で別々に投与できる。様々な実施形態において、予防剤または治療剤を１時間未満の間隔で、約１時間の間隔で、約１時間から約２時間の間隔で、約２時間から約３時間の間隔で、約３時間から約４時間の間隔で、約４時間から約５時間の間隔で、約５時間から約６時間の間隔で、約６時間から約７時間の間隔で、約７時間から約８時間の間隔で、約８時間から約９時間の間隔で、約９時間から約１０時間の間隔で、約１０時間から約１１時間の間隔で、約１１時間から約１２時間の間隔で、２４時間を超えない間隔で、または４８時間を超えない間隔で投与する。好ましい実施形態において、１回の患者の来院で２つ以上の成分を投与する。他の実施形態において、予防剤または治療剤を約２から４日の間隔で、約４から６日の間隔で、約１週間の間隔で、約１から２週間の間隔で、または約２週間を超える間隔で投与する。好ましい実施形態において、予防剤または治療剤を両薬剤がまだ活性である時間枠内で投与する。当業者は、投与された薬剤の半減期を決定することによりそのような時間枠を決定できるであろう。
【０２１９】
ある実施形態において、本発明の予防剤または治療剤を被験者に循環的に投与する。循環療法は、第一薬剤をある期間投与してから第二薬剤および／または第三薬剤をある期間投与し、この連続投与を繰り返すことを伴う。循環療法は１つまたは複数の療法に対する耐性の発生を軽減し、１つの療法の副作用を回避または軽減し、かつ／または治療効果を改善することができる。
【０２２０】
ある実施形態において、予防剤または治療剤を約３週間未満、隔週約１回、１０日に約１回、または毎週約１回のサイクルで投与する。１サイクルは、各サイクルにつき約９０分、各サイクルにつき約１時間、各サイクルにつき約４５分間を超える輸液による治療剤または予防剤の投与を含み得る。各サイクルは少なくとも１週間の休薬、少なくとも２週間の休薬、少なくとも３週間の休薬を含み得る。投与を行うサイクル数は約１から約１２サイクル、さらに一般的には約２から約１０サイクル、さらに一般的には約２から約８サイクルである。
【０２２１】
なお他の実施形態において、本発明の治療剤および予防剤を、連続輸液または休薬期間を延長しない頻回投与のどちらかによる規則正しい投薬方式で投与する。そのような規則正しい投与は、休薬期間なしの一定間隔での投薬を伴い得る。概して治療剤、具体的には細胞傷害剤を低用量で使用する。そのような投薬方式は、比較的低用量を長期間慢性的に毎日投与することを包含する。好ましい実施形態において、低用量の使用は有毒副作用を最小にして休薬期間を排除することができる。ある実施形態において、治療剤および予防剤を、約２４時間から約２日間、約１週間まで、約２週間まで、約３週間まで約１か月まで約２か月まで、約３か月まで、約４か月まで、約５か月まで、約６か月までの範囲で慢性低用量または連続輸液により送達する。
【０２２２】
他の予防剤および／または治療剤と組み合わせて使用する場合、本発明の分子ならびに予防剤および／または治療剤は相加的に、またはさらに好ましくは相乗的に作用し得る。一実施形態において、本発明の分子を同一の医薬組成物中の１つまたは複数の治療剤と同時に投与する。別の実施形態において、本発明の分子を別々の医薬組成物中の１つまたは複数の治療剤と同時に投与する。さらに別の実施形態において、本発明の分子を別の予防剤または治療剤の投与の前または後に投与する。本発明は、同一または異なる投与経路、例えば経口および非経口投与により他の予防剤または治療剤と組み合わせて本発明の分子を投与することを考えている。ある実施形態において、毒性を含めるがそれに限定されない有害副作用を潜在的に産生する別の予防剤または治療剤と共に本発明の分子を同時投与する場合、有害副作用が誘発されるしきい値未満の用量で予防剤または治療剤を、好都合に投与できる。
【０２２３】
本明細書において提供される投薬量および投薬頻度は、治療上有効および予防上有効という用語に包含される。投薬量および頻度は、投与される特定の治療剤または予防剤、癌の重症度と種類、投与経路、ならびに年齢、体重、応答、および患者の過去の病歴に依存して、各患者に特異的な要因にしたがって概してさらに変動する。このような要因を考慮することにより、かつ例えば文献に報告されPhysician's Desk Reference（第56版、2002）に勧められた投薬にならうことにより、当業者は適当な方式を選択できる。
【０２２４】
特定の実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し（自己免疫障害の例は本明細書の５．４．１節に開示されている）、その方法は治療上有効な量の可溶性ＦｃγＲポリペプチド、例えば可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡ、可溶性ＦｃγＲＩＩＢを、自己免疫疾患の治療に使用される当業者に公知の治療上有効な量の１つまたは複数の治療剤と組み合わせて投与することを含む。本発明の分子と組み合わせて使用できる治療剤は本明細書の５．４．３節に開示されている。
【０２２５】
特定の一実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、その方法は治療上有効な量の可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡポリペプチドを、３Ｇ８抗体、好ましくは３Ｇ８モノクローナル抗体と組み合わせて投与することを含む。３Ｇ８抗体の任意の変異体、誘導体、またはアナログは本発明の方法および組成物に考えられている。具体的には、２００２年５月３０日に出願した米国仮出願第60/384,689号および２００３年５月３０日に出願した米国出願第＿号ならびに２００３年１２月１１日に公開された国際公開WO 03/101485に開示された３Ｇ８抗体の任意の変異体、誘導体、またはアナログは、本発明の方法および組成物に考えられている。これら全ての出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれている。別の実施形態において、本発明は治療上有効な量の可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡポリペプチドを任意ＦｃｒｙＲＩＩＩＡ結合タンパク質、例えば当技術分野で公知の抗体と共に投与することを包含する。別の特定の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患の治療および／または予防のためにＩｇＧ２ヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲ、例えばＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢの細胞外領域を有する治療上有効な量の融合タンパク質を、当業者に公知の１つまたは複数の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む組合せ治療を包含する。
【０２２６】
ある実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、前記方法はそれを必要とする被験者、好ましくはヒトに、ＦｃγＲ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域と特異的に結合する治療上有効な量の分子、好ましくは抗体と、治療上有効な量の二量体融合タンパク質とを投与することを含み、前記鎖のそれぞれはＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域は前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、前記分子は前記分子が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記分子は前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する。本発明に包含されるＦｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域と特異的に結合する分子には、ＦｃγＲＩＩＩＡと結合する当技術分野で公知の抗体、例えばＣＬＢ−ＧＲＡＮ１、ＢＷ２−９／２、ＧＲＭ１、ＣＬＢ−Ｇｒａｎ１、ＤＪ１３０ｃ、ＬＮＫ１６、ＭＥＭ−１５４、Ｂ８８−９、ＰＥＮ１、１Ｄ３、Ｂ７３．１、ＢＬ−ＬＧＬ／１、ＢＬ−ＬＧＬ／２、ＶＥＰ１３、ＹＦＣΓ１２０．５、ＭＧ３８（その全体が参照により本明細書に組み込まれているTammら、1996、Journal of Immunology、157(4):1566〜1581頁参照）があるが、それらに限定されない。
【０２２７】
ヒトＦｃγＲＩＩＩＡに特異的な多数のモノクローナル抗体が当技術分野で公知であり、自己免疫疾患の治療に使用されており、それらの全てを本発明の分子と組み合わせて使用できる（例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているTammおよびSchmidt、1996、J. Imm. 157:1576〜81頁参照）。一例は、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢのＦｃγ結合ドメインを認識するＩｇＧ１抗体であるマウスモノクローナル抗体ｍＡｂ３Ｇ８である（Fleitら、1982、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 79:3275〜79頁、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。３Ｇ８は受容体に対して１×１０９Ｍ−１のＫａを有し、単離されたヒトＮＫ細胞、単球および好中球、ならびにＦｃγＲＩＩＩＡをトランスフェクトした２９３細胞に対するヒトＩｇＧ１免疫複合体の結合を遮断する。他の抗体、例えばＦｃγＲＩＩＩＡに特異的なヒトまたはヒト化ポリクローナルまたはモノクローナル抗体（例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているTammおよびSchmidt、1996、J. Imm. 157:1576〜81頁；Fleitら、1989、159頁、Leukocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens、Kappら編、Oxford Univ. Press、オックスフォード参照）を、本発明の分子と組み合わせて本発明の治療法に使用できる。
【０２２８】
好ましくは、抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ＦｃγＲＩＩＩＡに対するヒト抗体を、ヒト免疫系のエレメントを有するトランスジェニック動物（例えば米国特許第5,569,825号および第5,545,806参照。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）を用いて、またはヒト末梢血細胞（その全体が参照により本明細書に組み込まれているCasaliら、1986、Science 234:476頁）を用いて産生できる。代わりの実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡに対するヒト抗体を、その全体が参照により本明細書に組み込まれているHuseら、1989、Science 246:1275頁に概説された一般的なプロトコルにしたがってヒトＢ細胞からのＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより産生できる。ＦｃγＲＩＩＩＡに結合する抗体は選択され、配列決定され、クローニングされる。代わりに、当業者に公知の抗体ヒト化法を用いてヒト化抗体を作ることができる。いくつかの実施形態において、３Ｇ８と同一のエピトープ特異性を有するヒト抗体またはヒト化抗体は競合結合実験もしくはエピトープマッピング、または他の方法により選択する。
【０２２９】
別の実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善するための方法を包含し、前記方法はそれを必要とする被験者に２つの同じポリペプチド鎖を有する治療上有効な量の二量体融合タンパク質を投与することを含み、すなわち本明細書において使用される等しいポリペプチド鎖は、ほぼ等しいアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖、例えば１つまたは複数のアミノ酸の相違、好ましくは保存的アミノ酸置換を含むため、２つのポリペプチド鎖の活性が有意には異ならないポリペプチド鎖も指し、前記鎖のそれぞれがＩｇＧ２のヒンジ−定常領域と連結したＦｃγＲＩＩＩＡ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域はＦｃγＲＩＩＩＡ野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変有するため、モノクローナル３Ｇ８抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で前記３Ｇ８モノクローナル抗体は前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質は免疫複合体および治療上有効な量の３Ｇ８モノクローナル抗体と特異的に結合する。非常に好ましい実施形態において、前記３Ｇ８モノクローナル抗体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２００２年５月３０日に出願した米国仮出願第60/384,689号に開示されるようなヒト化抗体である。一実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域における１つまたは複数のアミノ酸改変は３Ｇ８結合部位に置換を有する。特定の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１１２でアスパラギン酸への、位置１１３でリジンへの、かつ位置１１４でプロリンへの置換を有する。なお別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１６０でフェニルアラニンへの置換を有する。別の実施形態において、ＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外領域におけるアミノ酸改変は、位置１５４でアスパラギンへの、かつ位置１５５でイソロイシンへの置換を有する。
【０２３０】
別の実施形態において、本発明は自己免疫障害の１つまたは複数の症状を治療、予防、または改善する方法を包含し、前記方法は、それを必要とする被験者に、治療上有効な量の抗体および２つの同じポリペプチド鎖を有する治療上有効な量の二量体融合タンパク質を投与することを含む。前記抗体は、Ｆｃγ結合部位を有するＦｃγＲＩＩＢ野生型細胞外領域と特異的に結合し、例えばそれぞれＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−４５９１、ＰＴＳ−４５９２を有するクローン２Ｂ６またはクローン３Ｈ７から産生される抗体であり、前記鎖のそれぞれがＦｃγＲＩＩＢ変異型細胞外領域を有し、前記変異型細胞外領域は前記野生型細胞外領域に対して少なくとも１つのアミノ酸改変を有するため、前記抗体が前記野生型細胞外領域と結合するよりも低い親和性で、前記抗体は前記二量体融合タンパク質と結合し、前記二量体融合タンパク質は免疫複合体と特異的に結合する
５．４．３  免疫調節剤および抗炎症剤
本発明の方法は、本発明の分子を他の治療薬剤と共に投与することを含む、自己免疫疾患および炎症疾患の治療法を提供する。免疫調節剤の例には、メトトレキサート、ＥＮＢＲＥＬ、ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標）、レフルノミド、シクロホスファミド、シクロスポリンＡ、マクロライド系抗生物質（例えばＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド（例えばコルチゾル、コルチゾン、フルドロコルチゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン）、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナル（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ）、マロノニトリロアミンデス（ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｏａｍｉｎｄｅｓ）（例えばレフルナミド）、Ｔ細胞受容体調節剤、およびサイトカイン受容体調節剤があるが、それらに限定されない。
【０２３１】
本発明の方法および組成物に使用できるステロイドにはジプロピオン酸アルクロメタゾン、アムシノニド、ジプロピオン酸ベクロメタゾン、ベタメタゾン、安息香酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、リン酸ベタメタゾンナトリウム、吉草酸ベタメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、クロコルトロンピバレート、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン誘導体、デソニド、デスオキシメタゾン、デキサメタゾン、フルニソリド、フルコキシノリド（ｆｌｕｃｏｘｉｎｏｌｉｄｅ）、フルドロキシコルチド、ハルシノシド（ｈａｌｃｉｎｏｃｉｄｅ）、メドリゾン、メチルプレドニゾロン、酢酸メチプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、フランカルボン酸モメタゾン、酢酸パラメタゾン、プレドニゾロン、酢酸プレドニゾロン、リン酸プレドニゾロンナトリウム、プレドニゾロンテブアテート、プレドニゾン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンジアセテート、およびトリアムシノロンヘキサアセトニドがあるが、それらに限定されない。
【０２３２】
抗炎症剤は、炎症障害および自己免疫障害の治療に成功を示し、今やそのような障害の普通の標準的な治療である。当業者に公知の任意の抗炎症剤を本発明の方法に使用できる。抗炎症剤の限定することのない例には、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド系抗炎症薬、ベータ作動薬、抗コリン作動薬、およびメチルキサンチンがある。ＮＳＡＩＤの例には、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮ（商標））、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥ（商標））、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮ（商標））、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮ（商標））、ケトララク（ＴＯＲＡＤＯＬ（商標））、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯ（商標））、ナブメントン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標））、トルメンチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標））、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（商標））、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標））、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮ（商標））およびナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））があるが、それらに限定されない。これらのようなＮＳＡＩＤは酵素シクロオキシゲナーゼ（例えばＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）を阻害することにより機能する。ステロイド系抗炎症薬びの例には、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アザルフィジン、ならびにプロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエンのようなエイコサノイドがあるが、それらに限定されない。
【０２３３】
５．５  組成物および投与法
本発明は、方法および本発明の分子を有する医薬組成物を提供する。本発明は、治療上有効な量の本発明の分子、例えば可溶性ポリペプチド、可溶性融合ポリペプチド、これらの分子の誘導体およびアナログ、ならびにそれをコードする核酸、または本発明の分子を含む医薬組成物を被験者に投与することにより、疾患または障害に関連した１つまたは複数の症状の治療法、予防法、および改善法も提供する。好ましい態様において、本発明の分子は実質的に精製されている（すなわちその効果を制限するか、または望しくない副作用を産生する物質が実質的に存在しない）。特定の実施形態において、被験者は動物、好ましくは非霊長類（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（例えばカニクイザルのようなサルおよびヒト）のような哺乳動物である。好ましい実施形態において、被験者はヒトである。
【０２３４】
様々な送達系が公知であり、本発明の分子およびその薬学的に許容可能な塩を含む組成物を投与するために使用できる。送達系の例にはリポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへの封入、本発明の分子を発現できる組換え細胞、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。
【０２３５】
本発明の分子の投与法には、非経口投与（例えば皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、および粘膜（例えば鼻腔内および経口経路）があるが、それらに限定されない。特定の実施形態において、本発明の分子は筋肉内、静脈内または皮下に投与される。任意の都合のよい経路、例えば輸液または大量注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を介した吸収により本発明の組成物を投与でき、他の生物学的に活性な薬剤と共に投与できる。投与は全身または局所であり得る。さらに、インヘラーまたはネブライザーの使用、およびエーロゾル化剤を用いた製剤により肺投与も採用できる。例えば米国特許第6,019,968号、第5,985,320号、第5,985,309号、第5,934,272号、第5,874,064号、第5,855,913号、第5,290,540号、および第4,880,078号、ならびにPCT公報WO 92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、およびWO 99/66903を参照のこと。これらそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。非常に好ましい実施形態において、本発明の組成物を自己投与することで患者のコンプライアンスの向上をもたらす。
【０２３６】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれているWO 02/072636に開示されているような結晶懸濁物としてバッチプロセス法を用いて調製される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー等電点電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー−ＨＰＬＣ、動的光散乱、ＭＳ、ペプチドマッピングなどのような当業者に公知の標準的な方法を用いて調製物の純度と完全性が決定される。好ましくは、Yangら(2003、PNAS、100(12);6934〜9頁。その全体が参照により本明細書に組み込まれている)により記載された方法を用いて、本発明の結晶組成物を少量、高濃度でｓ．ｃ．投与する。本方法を用いた組成物の投与は、通常の投与モードに比べて薬物動態上で長時間の血清プロフィルおよび高いバイオアベイラビリティを生じる。
【０２３７】
本発明は、抗体の量を表示したアンプルまたは分包のような気密容器に本発明の分子をパッケージすることも提供する。一実施形態において、本発明の分子は気密容器に入った乾燥した滅菌凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給され、例えば水または生理食塩水で再構成して被験者に投与するために適当な濃度にすることができる。好ましくは、本発明の分子は少なくとも５ｍｇ、さらに好ましくは少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、少なくとも３５ｍｇ、少なくとも４５ｍｇ、少なくとも５０ｍｇ、または少なくとも７５ｍｇの単位投薬量で気密容器に入った乾燥した滅菌凍結乾燥粉末として供給される。本発明の凍結乾燥された分子は、本来の容器に入れて２から８℃の間で貯蔵すべきであり、分子を再構成してから１２時間以内、好ましくは６時間以内、５時間以内、３時間以内、または１時間以内に投与すべきである。代わりの実施形態において、本発明の分子は抗体、融合タンパク質または複合分子の量および濃度を表示した気密容器に入った液状で供給される。好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２００ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で、液状の分子は気密容器に入れて供給される。
【０２３８】
障害に関連する１つまたは複数の症状の治療、予防または改善に有効であろう本発明の組成物の量を標準的な臨床法で決定できる。製剤に採用される正確な用量は、投与経路および状態の重症度にも依存するため、医師の判断および各患者の事情に応じて決定すべきである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系または動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から有効用量を外挿することもできる。
【０２３９】
本発明に包含する分子について、患者に投与される投薬量は、概して患者の体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇから１００ｍｇである。好ましくは患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇと２０ｍｇの間、０．０００１ｍｇと１０ｍｇの間、０．０００１ｍｇと５ｍｇの間、０．０００１と２ｍｇの間、０．０００１と１ｍｇの間、０．０００１ｍｇと０．７５ｍｇの間、０．０００１ｍｇと０．５ｍｇの間、０．０００１ｍｇから０．２５ｍｇ、０．０００１から０．１５ｍｇ、０．０００１から０．１０ｍｇ、０．００１から０．５ｍｇ、０．０１から０．２５ｍｇ、または０．０１から０．１０ｍｇである。
【０２４０】
一実施形態において、患者に投与される本発明の分子の投薬量は、単剤療法として使用される場合に０．０１ｍｇから１０００ｍｇ／日である。別の実施形態において、本発明の分子は他の治療組成物と組み合わせて使用され、患者に投与される投薬量は前記分子が単剤療法として使用される場合よりも低い。
【０２４１】
特定の実施形態において、本発明の医薬組成物を治療の必要な領域に局所投与することが望ましい。これは、例えば制限の目的ではないが局所輸液により、注射により、または埋込みにより達成でき、前記埋込みはシアラスティック膜のような膜または繊維を含めた多孔質物質、無孔物質またはゼラチン様物質からできている。好ましくは、本発明の分子を投与する場合、その分子が吸収しないような物質を使用するように注意しなければならない。
【０２４２】
別の実施形態において、組成物を小胞、具体的にはリポソーム(Langer、Science 249:1527〜1533頁(1990)；Treatら、Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer、Lopez-BeresteinおよびFidler編、Liss、ニューヨーク、353〜365頁(1989)；Lopez-Berestein、同、317〜327頁参照。一般に同文献を参照。)に封入して送達できる。
【０２４３】
なお別の実施形態において、制御放出系または持続放出系で組成物を送達できる。当業者に公知の任意の方法を使用して、本発明の分子を有する持続放出製剤を製造できる。例えば米国特許第4,526,938号；PCT公報WO 91/05548；PCT公報WO 96/20698；Ningら、1996、「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel」、Radiotherapy & Oncology 39:179〜189頁；Songら、1995、「Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions」、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372〜397頁；Cleekら、1997、「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application」、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853〜854頁；およびLamら、1997、「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery」、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759〜760頁を参照のこと。これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４４】
一実施形態において、制御放出系にポンプを使用できる（Langer上記；Sefton、1987、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20頁；Buchwaldら、1980、Surgery 88:507頁；およびSaudekら、1989、N. Engl. J. Med. 321:574頁を参照）。別の実施形態において、本発明の分子の制御放出を達成するためにポリマー物質を使用できる（例えばMedical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise編、CRC Pres.、ボカラトン、フロリダ州(1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall編、Wiley、ニューヨーク(1984)；RangerおよびPeppas、1983、J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61頁参照。Levyら、1985、Science 228:190頁；Duringら、1989、Ann. Neurol. 25:351頁；Howardら、1989、J. Neurosurg. 71:105頁）；米国特許第5,679,377号；米国特許第5,916,597号；米国特許第5,912,015号；米国特許第5,989,463号；米国特許第5,128,326号；PCT公報WO 99/15154；およびPCT公報WO 99/20253も参照のこと）。持続放出製剤に使用されるポリマーの例には、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリル酸、エチレン−酢酸ビニル共重合体、ポリメタクリル酸、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ラクチド−グリコリド共重合体（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルがあるが、それらに限定されない。なお別の実施形態において、制御放出システムは治療標的（例えば肺）に近接して配置できることから、全身用量の一部分だけを必要とする（例えばGoodson、Medical Applications of Controlled Release、上記、第2巻、115〜138頁(1984)参照）。別の実施形態において、制御放出埋込み物として有用なポリマー組成物をＤｕｎｎら(U.S. 5,945,155参照)にしたがって使用する。この特定の方法は、ポリマーシステムからの生物活性物質のｉｎ  ｓｉｔｕ制御放出の治療効果に基づいている。埋込みは、治療処理を必要とする患者の体内の任意の場所で総じて起こり得る。別の実施形態において、非ポリマー性持続送達系が使用され、この場合、薬物送達システムとして被験者の体内の非ポリマー性埋込み物が使用される。体内に埋込む際に、埋込み物の有機溶媒が組成物から周辺の組織液に放散、分散、または浸出し、非ポリマー性物質は徐々に凝固または沈殿し固形の微孔性マトリックスを形成する（U.S. 5,888,533参照）。
【０２４５】
制御放出系はLanger（1990、Science 249:1527〜1533頁）による総説に論じられている。本発明の１つまたは複数の治療剤を含む持続放出製剤を製造するために当業者に公知の任意の方法を使用できる。例えば米国特許第4,526,938号；国際公開WO 91/05548およびWO 96/20698；Ningら、1996、Radiotherapy & Oncology 39:179〜189頁；Songら、1995、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372〜397頁；Cleekら、1997、Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853〜854頁；およびLamら、1997、Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759〜760頁を参照のこと。これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２４６】
本発明の組成物が本発明の分子をコードする核酸である特定の実施形態において、適当な核酸発現ベクターの一部としてその核酸を構築して、核酸が細胞内になるようにそれを投与することによって、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第4,980,286号参照）、直接注射により、またはマイクロパーティクルボンバードメント（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によって、または脂質、細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤をコーティングすることによって、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチド（例えばJoliotら、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864〜1868頁参照）と連鎖させて核酸を投与することなどによって、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏ投与して、その核酸がコードする分子の発現を促進できる。代わりに、相同組換えによる発現のために、核酸を細胞内に導入して宿主細胞ＤＮＡに組み込むことができる。
【０２４７】
本発明の分子またはその薬学的に許容可能な塩を含む組成物は、患者に対する妥当な投与の形態をもたらすために、適当な量の薬学的に許容可能なビヒクルを追加的に含み得る。
【０２４８】
特定の実施形態において、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物、哺乳動物、およびさらに詳細にはヒトにおける使用について米連邦政府または州政府の監督官庁により承認されたか、米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に収載されたことを意味する。「ビヒクル」という用語は、本発明の分子と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または担体を指す。そのような薬学用ビヒクルは、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などのような石油、動物、植物または合成起源のものを含めた水および油のような液体であり得る。薬学用ビヒクルは、生理食塩水、アラビアゴム、ゼラチン、デンプンのり、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素などであり得る。さらに、佐剤、安定化剤、粘稠化剤、滑沢剤および着色剤も使用できる。患者に投与する場合、薬学的に許容可能なビヒクルは好ましくは滅菌状態である。本発明の化合物を静脈内投与する場合に水は好ましいビヒクルである。生理食塩水およびブドウ糖水溶液ならびにグリセリン溶液も詳細には注射可能な溶液のための液体ビヒクルとして採用できる。適当な薬学用ビヒクルには、デンプン、ブドウ糖、乳糖、しょ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアリン酸、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールのような賦形剤もある。望むならば化合物組成物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含み得る。
【０２４９】
本発明の組成物は液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、液体含有カプセル剤、粉剤、持続放出製剤、坐剤、乳剤、エアゾール剤、噴霧剤、懸濁剤の剤形、または使用に適した他の任意の剤形をとり得る。一実施形態において、薬学的に許容可能なビヒクルはカプセル（例えば米国特許第5,698,155号参照）である。適当な薬学用ビヒクルの他の例は、Remington's Pharmaceutical Sciences、Alfonso R. Gennaro編、Mack Publishing Co.、イーストン、ペンシルベニア州、第19版、1995、1447〜1676頁に記載され、これは参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５０】
好ましい実施形態において、本発明の分子またはその薬学的に許容可能な塩を、ヒトへの経口投与に適合した医薬組成物として日常的な方法にしたがって製剤する。経口送達用の組成物は例えば錠剤、トローチ剤、、水性または油性懸濁剤、顆粒剤、粉剤、乳剤、カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤の剤形であり得る。経口投与される組成物に１つまたは複数の薬剤、例えば果糖、アスパルテームまたはサッカリンのような甘味料；ペパーミント、ウインターグリーン油、またはサクランボのような着香料；着色料；および保存料を含有させて薬学的に美味な調製物を提供できる。さらに、錠剤または丸剤の剤形では、組成物をコーティングして消化管での崩壊および吸収を遅らせることで長時間持続する作用をもたらすことができる。浸透圧的に駆動活性のある化合物を選択的に透過可能な膜で覆うことも経口投与された組成物に適している。これらの後者の基盤において、カプセルの周りの環境からの液体は駆動化合物に吸収され、駆動化合物は膨張して薬剤または薬剤組成物を開口部を通過させて移動させる。これらの送達基盤は、即時型放出製剤の急激に変化するプロフィルとは逆に、本質的にゼロ次送達プロフィルをもたらし得る。グリセロールモノステアリン酸またはグリセロールステアリン酸のような時間遅延物質も使用できる。経口組成物は、マンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的なビヒクルも含み得る。そのようなビヒクルは好ましくは医薬品等級である。概して、静脈内投与用組成物は滅菌等張水性緩衝液を含む。必要な場合は、組成物は溶解補助剤も含み得る。
【０２５１】
別の実施形態において、本発明の分子またはその薬学的に許容可能な塩を静脈内投与用に製剤できる。静脈内投与のための組成物は、注射部位の疼痛を減らすためのリグノカインのような局所麻酔剤を任意選択で含み得る。一般に、成分は単位投薬量形態で別々にまたは共に混合してのどちらかで、例えば有効薬剤の量を表示したアンプルまたは分包のような気密容器に入った乾燥した凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。化合物またはその薬学的に許容可能な塩を輸液により投与する場合、例えば医薬品等級の滅菌した水または生理食塩水を含む輸液ボトルを用いてそれを調剤することができる。化合物またはその薬学的に許容可能な塩を注射により投与する場合、投与前に成分を混合できるように注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルを提供できる。
【０２５２】
特定の疾患の治療に有効であろう本発明の分子またはその薬学的に許容可能な塩の量は、疾患の性質に依存すると考えられ、標準的な臨床法により決定できる。さらに、最適な投薬量範囲を同定することを援助するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを任意選択で採用できる。採用される正確な用量は、投与経路および疾患の重症度にも依存し、医師の判断および各患者の事情に応じて決定されるべきである。しかし、経口投与に適した投薬量範囲は、総じて１日あたり体重１ｋｇあたり化合物またはその薬学的に許容可能な塩約０．００１ミリグラムから約２００ミリグラムである。本発明の特定の好ましい実施形態において、経口用量は１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１ミリグラムから約１００ミリグラム、さらに好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１ミリグラムから約７５ミリグラム、さらに好ましくは１日あたり体重１ｋｇあたり約０．５ミリグラムから５ミリグラムである。本明細書に記載される投薬量は、投与される総量を指し、すなわち１つを超える化合物が投与されるならば、または１つの化合物が治療剤と共に投与されるならば、好ましい投薬量は投与される総量に対応する。経口組成物は好ましくは約１０重量％から約９５重量％の有効成分を含有する。
【０２５３】
静脈内（ｉ．ｖ．）投与に対する適当な投薬量範囲は、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１ミリグラムから約１００ミリグラム、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１ミリグラムから約３５ミリグラム、および１日あたり体重１ｋｇあたり約１ミリグラムから約１０ミリグラムである。鼻腔内投与に対する適当な投薬量範囲は、総じて１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１ｐｇから１日あたり体重１ｋｇあたり約１ｍｇである。坐剤は総じて１日あたり体重１ｋｇあたり約０．０１ミリグラムから約５０ミリグラムの本発明の化合物を含有し、約０．５重量％から約１０重量％の範囲の有効成分を含む。
【０２５４】
皮内、筋肉内、腹腔内、皮下、硬膜外、舌下、脳室内、膣内、経皮投与または吸入による投与に対する推奨投薬量は、１日あたり体重１ｋｇあたり約０．００１ミリグラムから約２００ミリグラムの範囲である。局所投与に適した用量は、投与部位に応じて約０．００１ミリグラムから約１ミリグラムの範囲である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系または動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から有効用量を外挿することもできる。そのような動物モデルおよび系は当技術分野で公知である。
【０２５５】
ヒトに使用する前に望まれる治療活性または予防活性について、本発明の分子およびその薬学的に許容可能な塩をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでアッセイすることが好ましい。例えば、その分子、その薬学的に許容可能な塩、および／または別の治療剤を投与することが好ましいかどうかを決定するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを使用できる。安全性および効果を実証するために動物モデル系を使用できる。
【０２５６】
５．６  治療有用性のキャラクタリゼーションおよび実証
ヒトに使用する前に、望まれる治療活性について、本発明の医薬組成物、予防剤または治療剤のいくつかの態様をｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養系およびげっ歯動物モデル系のような動物モデル生物で試験することが好ましい。例えば、特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを決定するために使用できるアッセイには細胞培養アッセイがあり、そのアッセイでは患者の組織試料を培養し、本発明の医薬組成物を曝露させるか、さもなければ接触させ、そのような組成物が組織試料に及ぼす効果を観察する。組織試料は患者の生検により入手できる。この試験により、各個別の患者について治療上最も有効な予防分子または治療分子を同定することが可能になる。種々の特定の実施形態において、自己免疫障害または炎症障害に関与する細胞型の代表的な細胞（例えばＴ細胞）を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に望みの効果を有するかを決定することができる。
【０２５７】
本発明の方法に使用するための好ましい動物モデルは、例えばマウスエフェクター細胞上にヒトＦｃγＲを発現するトランスジェニックマウスであり、例えば（その全体が参照により本明細書に組み込まれている）U.S.5,877,396に記載された任意のマウスモデルを本発明に使用できる。本発明の方法に使用するためのトランスジェニックマウスには、ヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス、ヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウス、ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＩＡを保有するマウス、ヒトＦｃγＲＩＩＢおよびヒトＦｃγＲＩＩＡを保有するマウスがあるが、それらに限定されない。
【０２５８】
本発明は、当業者に公知のループス（lupus）、ＡＨＡ、ＥＡＥ、糸球体腎炎のための任意の動物モデルを包含する。本発明は、Clynesら（1998、Science、279:1052〜4頁、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）により開発されたもののような糸球体腎炎のための動物モデルを包含する。簡単に説明すると、ニュージーランドブラック（ＮＺＢ）マウスは自己抗体および自己免疫性溶血性貧血を発生するが、ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）バックグラウンドマウスと交配してＮＺＢ／ＮＺＷ（Ｂ／Ｗ  Ｆ１）マウスを発生するまで糸球体疾患の徴候を示さない。Ｂ／Ｗ  Ｆ１に自己免疫性糸球体腎炎が出現するには最低で３つの遺伝子座、すなわちＮＺＢマウス由来の２つおよびＮＺＷマウス由来の１つが必要である（例えばTheofilopoulosおよびDixon、1985、Adv. Immunol. 37:269頁；Morelら、1994、Immunity、1:219頁；Vyseら、1996、Curr. Opin. Immunol. 8:843頁参照。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。このモデルの数々の特徴はヒトのループスと一致する。Ｃｌｙｎｅｓおよび共同研究者らは８代にわたりＮＺＢマウスおよびＮＺＷマウスをマウス系統γ−／−と戻し交配した。マウス系統γ−／−は、受容体ＦｃγＲのｇ鎖を欠失し、活性化受容体ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現しないが依然としてＦｃγＲＩＩＢを含む。ｇ鎖の破壊についてホモ接合性またはヘテロ接合性の動物を同定した。これらのマウスは免疫複合体を発生し沈着するが、重症腎炎から防御されていた。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、本発明はBolland ら(2002、J. Exp. Med. 195(9):1167〜1174頁、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれている)により開発されたもののような、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のための動物モデルを包含する。簡単に説明すると、Ｂ６．ＲＩＩＢ−／−およびＳｌｅ感受性遺伝子座の間、またはＳＬＥ調節因子ｙａａおよびｌｐｒの間の雑種を発生させた。
【０２６０】
本発明は、自己免疫疾患の動物モデルとして当技術分野で公知のＦｃγＲＩＩＢ欠失マウス、例えばＨ−２ｂハプロタイプのＦｃγＲＩＩＢ欠失マウスを提供し、そのマウスは、ヒトにおける慢性関節リウマチのモデルであるＩＩ型コラーゲン誘導性関節炎に感受性である。例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているYuasaら、1999、J. Exp. Med. 189:187〜194頁を参照のこと。追加的に、本発明はＩＶ型コラーゲンの免疫に応答してグッドパスチャー症候群（ＧＰＳ）を発生するＦｃγＲＩＩＢ欠失マウスモデルを包含する。例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているNakamuraら、2000、J. Exp. Med. 191(5):899〜905頁を参照のこと。ＧＰＳは病原性抗ＩＶ型コラーゲン抗体と肺胞または糸球体の基底膜との相互作用に起因する自己免疫疾患である。
【０２６１】
いくつかの実施形態において、本発明はＴ細胞とＢ細胞の両方に重大に依存する炎症性関節炎のモデルであるＫ／ＢｘＮ  Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウス（ＫＲＮマウス）を包含する。このマウスモデルは、Ｔ細胞により主に開始するが自己抗原グルコース６−リン酸イソメラーゼに対する抗体によりほぼ完全に維持されるヒト慢性関節リウマチの特徴の多くを表す。これらのＫＲＮトランスジェニックマウスで自然発生する関節炎は、強力であるが不完全なクローン欠失を招く、Ａｇ７  ＭＨＣ分子に対するトランスジェニックＴ細胞受容体の自己反応性を原因とする。ＫＲＮマウス法の総説については、例えばJiら、2001、J. Exp. Med. 194(3):321〜30頁；Schallerら、2001、Nat. Immunol. 2(8):746〜53頁；Wipkeら、2001、J. Immunol. 167(3):1601〜8頁；Korganowら、1999、Immunity, 10(4):451〜61頁；Basuら、2001、J. Immunol. 166(6):4005〜11頁；Kyburzら、2000、Arthritis Rheum. 43(11):2571〜7頁；de Bandtら、2000、Arthritis Rheum. 43(9):2056〜63頁；Basuら、2000、J. lmmunol. 164(11):5788〜96頁、Mangialaioら、1999、Arthritis Rheum. 42(12):2517〜23頁；Jiら、1999、Immunol. Rev. 169:139〜46頁；Jiら、2002、Immunity、16:157〜68頁；Basuら、2001、J. Immunol. 166:4005〜11頁を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２６２】
本発明に使用するための例示的なモデル系は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のためのマウスモデルである（Oyaizuら、1988、J Exp.Med. 167:2017〜22頁；Mizutaniら、1993、Blood 82:837〜44頁参照）。下記の実施例６を参照のこと。他の適当なモデルは当技術分野で公知である。他の動物モデルには、例えばCurrent Protocols in Immunologyに記載された炎症疾患のげっ歯動物モデルがある（一部のケースではヒトＦｃγＲＩＩＩＡ遺伝子を導入された動物を使用することに変更している）。
【０２６３】
本発明の分子の治療効果を試験するための別の例示的な動物モデルは、本発明の分子をマウスに投与した後に好中球減少を測定するためのマウスＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ヒトＦｃγＲＩＩＩＢトランスジェニックマウスである。好ましくは、本発明の分子はＦｃγＲＩＩＩＡと結合し、自己免疫疾患に対して防御効果を有する。追加的に、本発明の分子は好中球の表面でＦｃγＲＩＩＩＢと結合でき、好中球減少アッセイの基礎である好中球の枯渇（好中球減少）を仲介する。簡潔には、本発明の分子、または関連性のないヒトＩｇＧ１（陰性対照）またはマウスＲＢ６−８Ｃ５（陽性対照）のような対照をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶かして５ｍｇ／ｇの濃度でｍｕＦｃγＲＩＩＩ−／−，ｈｕＦｃγＲＩＩＩＢトランスジェニックマウスの群に投与する。投与される別の陰性対照はＰＢＳ単独であり得る。その２４時間後にマウスを安楽死させ血液、脾臓、および骨髄を回収する。好中球をＦＡＣＳで分析する。３％ＦＣΓＳを含有するＲＰＭＩで染色実験を実施する。ＦＩＴＣ結合３Ｇ８（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）およびＲ−ＰＥ結合ＲＢ６−８Ｃ５（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用いてマウス細胞を染色する。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたフローサイトメトリーで試料を分析する。このように好中球のシェディングを定量する。
【０２６４】
特定の医薬組成物の投与が望ましいかどうかを決定するために使用できる他のアッセイには、細胞培養アッセイがあり、そのアッセイでは患者の組織試料を培養し、本発明の医薬組成物を曝露するか、さもなければそれに接触させ、そのような組成物が組織試料に及ぼす効果を観察する。組織試料は患者の生検により入手できる。この試験により、各個別の患者について治療上最も有効な予防分子または治療分子を同定することが可能になる。種々の特定の実施形態において、自己免疫障害または炎症障害に関与する細胞型の代表的な細胞（例えばＴ細胞）でｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施して、本発明の医薬組成物がそのような細胞型に望みの効果を有するかを決定することができる。
【０２６５】
予防剤および／または治療剤の組み合わせをヒトに使用する前に、適当な動物モデル系で試験できる。そのような動物モデル系には、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギなどがあるが、それらに限定されない。当技術分野で十分に公知の任意の動物系を使用できる。本発明の特定の実施形態において、予防剤および／または治療剤の組み合わせをマウスモデル系で試験する。そのようなモデル系は広く使用され、当業者に十分に公知である。予防剤および／または治療剤を繰り返し投与できる。その方法の数々の態様は多様であり得る。前記態様には予防剤および／または治療剤の時間的な投与方式、ならびにそのような薬剤を別々にまたは混和として投与するかどうかがある。
【０２６６】
本発明の組合せ療法の抗炎症活性を、当技術分野で公知の、Crofford L.J.およびWilder R.L.、「Arthritis and Autoimmunity in Animals」、Arthritis and Allied Conditions:A Textbook of Rheumatology、McCartyら編、第30章(LeeおよびFebiger、1993)に記載されている炎症性関節炎の様々な実験動物モデルを用いることによって決定できる。炎症性関節炎および自己免疫リウマチ性疾患の実験動物モデルおよび自然発生動物モデルも本発明の組合せ療法の抗炎症活性を評価するために使用できる。以下に例として提供し、限定によるものではないいくつかのアッセイを示す。
【０２６７】
当技術分野で公知であり広く使用される関節炎または炎症疾患のための主要な動物モデルには、アジュバント誘導性関節炎ラットモデル、コラーゲン誘導性関節炎ラットおよびマウスモデル、ならびに抗原誘導性関節炎ラット、ウサギおよびハムスターモデルがあり、その全てはCrofford L.J.およびWilder R.L.、「Arthritis and Autoimmunity in Animals」、Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology、McCartyら編、第30章(LeeおよびFebiger、1993)に記載され、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２６８】
本発明の組合せ療法の抗炎症活性をカラギナン誘導性関節炎ラットモデルを用いて評価できる。カラギナン誘導性関節炎は、慢性関節炎または炎症の研究にウサギ、イヌおよびブタでも使用されている。定量的形態計量評価を治療効果を決定するために使用する。そのようなカラギナン誘導性関節炎モデルを使用するための方法は、Hansra P.ら、「Carrageenan-Induced Arthritis in the Rat」、Inflammation、24(2):141〜155頁、(2000)に記載されている。当技術分野で公知であり記載されているザイモサン誘導性炎症動物モデルも通常使用されている。
【０２６９】
本発明の組合せ療法の抗炎症活性を、Winter C. A.ら、「Carageenan-Induced Edema in Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs」Proc. Soc. Exp. Biol Med. 111、544〜547頁、(1962)に記載された方法を変更したものを用いて、ラットにおけるカラギナン誘導性足浮腫の阻害を測定することによっても評価できる。このアッセイは大抵のＮＳＡＩＤの抗炎症活性を一次ｉｎ  ｖｉｖｏスクリーニングするものとして使用されており、ヒトでの効果の予測とみなされている。試験予防剤または試験治療剤の抗炎症活性はビヒクルを投与した対照群に対する試験群の後肢重量の増加の阻害率として表現される。
【０２７０】
追加的に、炎症性腸疾患のための動物モデルも本発明の組合せ治療の効果を評価するためにも使用できる（Kimら、1992、Scand. J. Gastroentrol. 27:529〜537頁；Strober、1985、Dig. Dis. Sci. 30(付録12):3S〜10S）。潰瘍性大腸炎およびクローン病は動物に誘導できるヒト炎症性腸疾患である。アミロペクチン、カラギン、硫酸アミロペクチン、および硫酸デキストランを含めるがそれらに限定されない硫酸多糖、またはトリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）および酢酸を含めるがそれらに限定されない化学刺激物を動物に経口投与して炎症性腸疾患を誘導できる。
【０２７１】
自己免疫障害のための動物モデルも本発明の組合せ治療の効果を評価するために使用できる。１型糖尿病、甲状腺自己免疫、全身性エリテマトーデス、および糸球体腎炎のような自己免疫障害のための動物モデルが開発されている（Flandersら、1999、Autoimmunity 29:235〜246頁；Kroghら、1999、Biochimie 81:511〜515頁；Foster、1999、Sernin. Nephrol. 19:12〜24頁）。
【０２７２】
当業者に公知の任意のアッセイを、自己免疫疾患および／または炎症疾患のための本明細書に開示した治療法の予防有用性および／または治療有用性を評価するために使用できる。標準的なＩＴＰ療法、例えばＩＶＩＧと組み合わせた本発明の分子および組成物の治療有用性を、脾摘出を受けた被験者における血小板レベルを決定すること、マウス免疫グロブリンおよび抗マウス免疫グロブリンのレベルを決定すること、抗イディオタイプのレベルを決定すること、ナチュラルキラー細胞の機能を決定すること、免疫複合体の浄化を測定すること、オプソニン化赤血球の浄化を測定することを含めるがそれらに限定されない当業者に公知のアッセイを用いて評価できる（例えばHunter、1978、Handbook of Experimental Inununology、第3版、Oxford: Blackwell、14:01〜14.37；Shawlerら、1985、Journal of Immunology、135:1530〜5頁；Westら、1977 Journal of lmmunolgoy、355〜61頁；McDougalら、1979、Journal of Clinical Invest. 63:627〜36頁；Hoseaら、1981 N. England Journal of Med.、304:245〜50頁；Frankら、1979、N. England Journal of Med.、300:518〜23頁参照。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）。
【０２７３】
本発明の予防プロトコルおよび／または治療プロトコルの毒性および効果を細胞培養または実験動物での標準的な薬学法、例えばＬＤ５０（個体数の５０％を殺す用量）およびＥＤ５０（個体数の５０％に治療有効な用量）を決定するための方法により決定できる。毒性作用と治療効果の間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。大きな治療指数を示す予防剤および／または治療剤が好ましい。有毒副作用を示す予防剤および／または治療剤を使用できるが、未感染の細胞に対する潜在的な損傷を最小に抑え、それによって副作用を軽減するように、そのような薬剤を冒された組織部位に標的づける送達系を設計するように注意を払うべきである。
【０２７４】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトに使用するための一連の投薬量の予防剤および／または治療剤を製剤する際に使用できる。そのような薬剤の投薬量はほとんど毒性を有さないか全く有さないＥＤ５０を含む循環中濃度範囲に入ることが好ましい。投薬量は利用する投薬剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内を変動し得る。本発明の方法に使用される任意の薬剤について、初めに細胞培養アッセイから治療上有効な用量を推定できる。動物モデルにおいてある用量を製剤し、細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち症状の阻害の最大値の半分の阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成することができる。そのような情報を使用してヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定できる。例えば高速液体クロマトグラフィーにより血漿中レベルを測定できる。
【０２７５】
治療に使用するための本発明の分子を、ヒトに試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどを含めるがそれらに限定されない適当な動物モデル系、例えば上記の動物モデルで試験できる。次に、適当な臨床試験で化合物を使用できる。
【０２７６】
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを使用して炎症障害または自己免疫疾患の治療または予防のための、本明細書に開示した組合せ療法の予防および／または治療有用性を評価できる。
【実施例】
【０２７７】
６．実施例
６．１  可溶性ＦｃγＲ融合タンパク質の操作
ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢそれぞれの細胞外領域をＩｇＧ２の定常領域と融合させることにより可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ融合タンパク質を発生させた。ヒトＦｃγＲＩＩＩＡ細胞外ドメインをヒトＩｇＧの２ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域（すなわちヒンジ−定常領域）に融合させた（本構築物を「ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２」、配列番号６と呼ぶ）。ＩｇＧ２定常領域を選んだのは、ＦｃγＲがこの定常領域と結合しないからである。以下のプライマー：ＳＪ４５ｆ（ＣＴＣ  ＴＣＣ  ＡＣＡ  ＧＧＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＣＣＣ）およびＳＪ４８ｒ（ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＣ  ＡＧＧ  ＴＧＧを用いてテンプレートとして全長ｃＤＮＡクローン（Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｒａｖｅｔｃｈ博士、ロックフェラー大学からの贈与）を用いてＦｃγＲＩＩＩＡの細胞外ドメインを増幅した）。この増幅した断片を次に、重複ＰＣＲ法によりシグナル配列コードセグメント（シグナル配列の入手元：ＶＨシグナル配列およびイントロンをコードするマウスゲノムセグメントに基づきＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓで作られた合成構築物、ＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ１２８８０。プライマー：Ｈ００９（ＣＧＡ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＡ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＡＧＴ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＴＡＣ）、ＳＪ２７ｒ（ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＧＡＣ  ＡＣＣ  ＴＧＴ  ＧＧＡ  ＧＡＧ））およびＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（アミノ酸２１６〜４４６）セグメントと連結した。ＩｇＧ２定常領域の入手元はＰＭＧＸ１０１、すなわちＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓで作られたｃＤＮＡクローンであり、プライマーはＳＪ４７ｆ（ＣＣＴ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＡＡＡ  ＴＧＴ  ＴＧＴ  ＧＴＣ  ＧＡＧ  ＴＧＣ  ＣＣ）およびＳＪ２０ｒ（ＧＧＣ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＡＣＡ  ＧＧ）であった。生じた断片をＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで分解し哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏにクローニングした。ヒンジ部を含むことにより２つの受容体の腕部と各単量体のジスルフィド共有結合が可動性になる。
【０２７８】
可溶性ＦｃγＲＩＩＢもＩｇＧ２定常領域と融合させ「ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２」構築物、配列番号５を発生させる。ＦｃγＲＩＩＢ細胞外領域（アミノ酸１３７〜６７６）を、それ自体のシグナル配列（アミノ酸１１〜１３６）を含めてｃＤＮＡクローン（ＦｃγＲＩＩＢ  ｃＤＮＡの入手元：Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｒａｖｅｔｃｈ博士、ロックフェラー大学からの贈与から増幅させた。
【０２７９】
増幅用のプライマーはＳＪ８４ｆ（ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＴＣＴ  ＴＡＣ  Ｃ）およびＳＪ８２ｒ（ＣＡＴ  ＴＴＧ  ＣＧＣ  ＴＣＣ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＧＣ）であり、重複ＰＣＲによりヒトＩｇＧ２定常領域のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ｃＤＮＡと連結した。生じた断片をＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで分解し、哺乳動物発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏにクローニングした。
【０２８０】
６．２  ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２およびＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２可溶性受容体−ＩｇＧ融合タンパク質を分泌する安定トランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞の発生
細胞培養：２９３Ｈ細胞系をＧＩＢＣＯ（グランドアイランド、ニューヨーク州）から入手し、０．１ｍＭ可欠アミノ酸（ＮＥＡＡ）および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコＭＥＭ（Ｄ−ＭＥＭ、高グルコース（４５００ｍｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース）中で接着細胞として維持した。細胞培養物を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【０２８１】
トランスフェクション：トランスフェクションの前日に、ポリリジンをコーティングした６穴平板に、植え込み密度１×１０６個／穴となるように培地２ｍＬで２９３Ｈ細胞を植え込んだ。修飾された重鎖および軽鎖ならびにＧ４１８耐性カセットを発現するプラスミドＤＮＡ構築物（１穴あたり総ＤＮＡ５μｇ）を、リポフェクタミン２０００陽イオン性脂質試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、カリフォルニア州）１穴あたり１０ｍＬを用いて細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間の細胞を様々に希釈して１０ｃｍの皿に継代した。次の日、８００μｇ／ｍＬの活性Ｇ４１８を含有する選択培地に培地を交換した。安定で単一の孤立コロニーを集め、９６穴平板に移した。
【０２８２】
タンパク質の発現：ＥＬＩＳＡアッセイにより各穴の培養上清をスクリーニングしてＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２およびＦｃγＲＩＩＢＧ２可溶性融合タンパク質の発現を決定した。簡潔にはＮｕｎｃ  Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ平板に、炭酸緩衝液に溶かした２μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をコーティングし４℃で一晩放置した。ＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−０．５％ＢＳＡで平板をブロッキングし、ＲＴで３０’放置した。ヒトＩｇＧ２を参照標準として使用した。平板のブランクとしてＰＢＳ／Ｔ−ＢＳＡを加えた最低２つの穴を含めて標準および試料それぞれ５０ｍＬを平板の２か所の細胞に加え、ＲＴで１時間培養してからＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＨＲＰと結合したヤギ抗マウス抗体（１：１０００）を平板に加えて室温で１時間培養してから平板をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１００μＬ／穴のＴＭＢ試薬を加え、遮光下でＲＴで５分間培養して平板を可視化し、５０μＬ／穴の停止溶液（０．１８Ｍ硫酸）を加えて反応を停止させた。平板の吸光度を４５０ｎＭで測定した。
【０２８３】
各トランスフェクションから１つのクローンを選択し、その後のタンパク質発現のために増殖させた。クローンを増殖させ３００μｇ／ｍｌのＧ４１８を有する増殖培中で維持した。増殖したクローンでは発現レベルは少なくとも３か月間安定であった。培養９日後の可溶性受容体融合タンパク質の発現は、ＦｃγＲＩＩＢＧ２およびＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２についてそれぞれ１６．４ｍｇ／Ｌおよび１５．０ｍｇ／Ｌ以下であった。
【０２８４】
精製：プロテインＧクロマトグラフィーに続くヒトＩｇＧ−セファロースカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製を行い、約６０パーセントの回収率と約９５パーセントの純度を得た。ＯＤ２８０の測定により濃度を決定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を評価した（データは示さず）。融合タンパク質がＩｇＧカラムと結合する能力は、その融合タンパク質が正しくフォールドしＩｇＧとの結合を保持していることを示す。
【０２８５】
６．３  ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２融合タンパク質の突然変異体の生成
ＦｃγＲＩＩＩＡモノクローナル抗体である３Ｇ８モノクローナル抗体との結合を欠くがＦｃγとの結合能を保持しているｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２突然変異体：
ＦｃγＲＩＩＩＡモノクローナル抗体である３Ｇ８モノクローナル抗体との結合を欠くがＦｃγとの結合能を保持している可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡ融合タンパク質を生成させるために構築物ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２を突然変異させた。これらの突然変異融合タンパク質は、単独またはヒト化３Ｇ８モノクローナル抗体と組み合わせたどちらかで免疫複合体がｉｎ  ｖｉｖｏでＦｃγＲと結合するのを妨害することができた。したがって、免疫複合体の浄化が望まれる場合に治療上の有用性を有する。
【０２８６】
ヒト可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡをヒトＩｇＧ２のＦｃγ部分と融合させ上記のようにｓＦｃγＲＩＩＩＡＡ−Ｇ２と定義する。ヒトＩｇＧ１のＦｃγと相互作用するｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２のアミノ酸残基を、３Ｇ８との結合を欠くがＦｃγとの結合を維持している突然変異体を発生させるための突然変異誘発のために選択した。
【０２８７】
ＦｃγＲＩＩＩＡはヒトＦｃγ領域とＢ／Ｃループ（Ｔｒｐ１１０〜Ａｌａ１１４）、Ｆ／Ｇループ（Ｖａｌ１５５〜Ｌｙｓ１５８）、Ｃストランド（Ｈｉｓ１１６〜Ｔｈｒ１１９）、およびＣ’ストランド（Ａｓｐ１２６〜Ｈｉｓ１３２）で結合する。追加的に、Ａｒｇ１５２と、Ｎ末端ドメイン１およびドメイン２の間のコネクタ（Ｉｌｅ８５〜Ｔｒｐ８７）とが結合に関与している（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎら、Ｔａｍｍら）。以前の研究は、３Ｇ８モノクローナル抗体が残基１０９〜１１４および１５６〜１６０でＦｃγＲＩＩＩＡと結合することを示唆した。
【０２８８】
ＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとの間の配列アライメント、結晶解析から推定されたＦｃγ上のＦｃγＲＩＩＩＡ結合部位、およびＦｃγＲＩＩＩＡ上の３Ｇ８結合部位に関する入手可能なデータに基づき、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｈａｎｇｅ法によりＩｇＧ２定常領域と融合したＦｃγＲＩＩＩＡ可溶性領域を有する融合タンパク質に以下の突然変異体を発生させた。
【０２８９】
表２にＦｃγＲＩＩＩＡ−ＩｇＧ２融合タンパク質に導入された突然変異を列挙する。
【表２】
2007525149.tif 000003
【０２９０】
安定性の検討：
４℃で保存しＰＢＳ中で製剤した場合ｓＦｃγＲＩＩＩＡＧ２融合タンパク質は不安定であった。保存２か月以内に低分子量の分解産物の顕著な出現がＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で明らかであった。不安定の原因を特性決定するために、分解断片を機能的および生化学的に分析した。図１Ａに示すように４つの変異体が発生した。分解産物をプロテインＧまたはヒトＩｇＧマトリックスの一方を用いたクロマトグラフィーにかけて、結合画分および未結合画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットで分析した。ある分解断片（２８ｋｄ）はプロテインＧセファロースに結合し、もう１つの断片（３８ｋｄ）はＩｇＧセファロースに結合するという別個の結合パターンを観察した。このデータは、融合タンパク質がＦｃＲ３ＡとＩｇＧ２のＦｃドメインとの間で開裂したことを意味している。開裂部位を確認するために、ＩｇＧセファロースと結合するタンパク質断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単離してＮ末端配列決定にかけた。配列決定データは、切断部位が融合タンパク質の残基１８３および１８４周辺であること、およびタンパク質が実際にＦｃＲ３ＡとＦｃＧ２ドメインとの間で開裂することを強く示唆した。
【０２９１】
６．４  突然変異タンパク質材料および方法のキャラクタリゼーション
Ｉ．  ＢＳＡ−ＦＩＴＣ  ｃｈ−４−４−２０免疫複合体とのＦｃγＲＩＩＩの結合のアッセイ
Ａ．  ｃｈ−４−４−２０／ＢＳＡ−ＦＩＴＣ免疫複合体の生成およびキャラクタリゼーション
それぞれのＶＨおよびＶＬ部をヒトＩｇＧ１定常領域またはヒトＩｇｋ定常領域と組み合わせることでキメラ版のマウス抗フルオレセインモノクローナル抗体４−４−２０（ｃｈ−４−４−２０）を生成させた。生じた遺伝子を発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏにクローニングした。キメラ抗体を一過性発現させるために、生じたベクターを次にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、キメラ抗体は培地に概して約５ｍｇ／Ｌ蓄積した。ｃｈ−４−４−２０タンパク質をプロテインＧクロマトグラフィーの後にサイズ排除クロマトグラフィーを用いることで精製した。次に、このタンパク質を使用してＦＩＴＣ−ＢＳＡと免疫複合体を形成させた。
【０２９２】
ＦＩＴＣ−ＢＳＡに対するｃｈ−４−４−２０（またはＤ２６５Ａ突然変異を保有する突然変異体）の結合をＥＬＩＳＡ平板で実施した。同一の形式を使用してＦＩＴＣ−ＢＳＡに対するキメラモノクローナル抗体の結合を評価した。炭酸緩衝液に溶かしたＦＩＴＣ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／穴）をＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｂ平板にコーティングし室温で１６時間結合させた。ＢＳＡでブロッキングしてから、穴にｃｈ４−４−２０の希釈液を加えて、室温でさらに１時間結合させた。未結合のモノクローナル抗体を除き、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体を加えた。１時間後に、二次抗体を除き、平板を洗浄しＴＭＢ基質で可視化させた。酸性停止溶液を加えた後で、平板を４５０ｎｍで計測した。ｃｈ４−４−２０およびｃｈ−４−４−２０（Ｄ２６５Ａ）の両方が高親和性でＦＩＴＣ−ＢＳＡ免疫複合体と結合した（データは示さず）。
【０２９３】
Ｂ．  ｃｈ−４−４−２０／ＦＩＴＣ−ＢＳＡ免疫複合体に対する可溶性ＦｃγＲの結合のアッセイ
ＦＩＴＣ標識ＢＳＡをＭａｘｉＳｏｒｐ平板にコーティングした。コーティング済みの平板をｃｈ４−４−２０と共にインキュベートすることにより免疫複合体が形成する。ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体は免疫複合体のヒトＩｇＧ１のＦｃγ部分と結合する。結合したｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体をマウス抗ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体を用いて検出する。
【０２９４】
炭酸緩衝液に溶かした１０μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ−ＦＩＴＣをＮｕｎｃ  Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ平板にコーティングし４℃で一晩放置した。平板をＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−０．５％ＢＳＡでブロッキングしＲＴで３０’放置した。ＰＢＳ／ＢＳＡに溶かした１μｇ／ｍＬのｃｈ４−４−２０を平板に加えて室温で１ｈｒ放置し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体を図２に表示する濃度で加え、室温で２時間放置し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。抗ｈｕＩｇＧ２−ビオチン（１：１０００）を加え室温で１時間放置し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡに溶かした１：５０００ストレプトアビジン−ＨＲＰを５０μＬ／穴で各平板に加えて室温で３０分間放置し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１００μＬ／穴のＴＭＢ試薬を加えることにより平板を可視化し、遮光下でＲＴで５分間放置した。５０μＬ／穴の停止溶液（０．１８Ｍ硫酸）を加えて反応を停止させた。平板を４５０ｎＭで計測した。このアッセイを図１に概略的に示し、野生型ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２についてのデータを提供する。
【０２９５】
ＩＩ．  ３Ｇ８による免疫複合体／ＦｃγＲＩＩＩＡの結合抑制についてのアッセイ
ＭａｘｉＳｏｒｐ平板にＦＩＴＣ標識ＢＳＡをコーティングした。コーティング済みの平板をｃｈ４−４−２０と共に放置することで免疫複合体が形成させた。３Ｇ８モノクローナル抗体をｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその当然変異体と混合し、混合物を平板に加えた。３Ｇ８はｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体が免疫複合体におけるヒトＩｇＧ１のＦｃγ領域と結合するのを遮断する。残りの結合型ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体をマウス抗ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体により検出する。このアッセイを上記のように行い、図３に例示する。
【０２９６】
ＩＩＩ．  ３Ｇ８とＦｃγＲＩＩＩＡ融合タンパク質との結合のアッセイ
ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＭａｘｉＳｏｒｐ平板にコーティングした。ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２または突然変異体をそれらのＩｇＧ２  Ｆｃγ部分を介して捕捉した。捕捉されたｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体を３Ｇ８モノクローナル抗体と共にインキュベートした。結合した３Ｇ８の量を、ＨＲＰと結合したヤギ抗マウス抗体により検出した。
【０２９７】
炭酸緩衝液に溶かした２μｇ／ｍＬヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＮｕｎｃ  Ｆ９６  ＭａｘｉＳｏｒｐ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ平板にコーティングし、４℃で一晩放置した。平板をＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ−０．５％ＢＳＡでブロッキングしＲＴで３０’放置した。ＰＢＳ／ＢＳＡで希釈した馴化培地に溶かしたＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体を平板に加えて室温で１時間放置し、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。図４に示すように表示された濃度で３Ｇ８モノクローナル抗体を平板に加え、室温で１時間放置してから、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。ＨＲＰと結合したヤギ抗マウス抗体（１：１０００）を平板に加えて室温で１時間放置してから平板をＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。１００μＬ／穴のＴＭＢ試薬を加えることにより平板を可視化し、遮光下でＲＴで５分間放置した。５０μＬ／穴の停止溶液（０．１８Ｍ硫酸）を加えて反応を停止させた。平板を４５０ｎＭで計測した。
【０２９８】
結果
Ｂ／Ｃループ（Ｔｒｐ１１０〜Ａｌａ１１４）：
文献に基づくと、潜在的３Ｇ８結合部位の１つは、ＦｃγＲＩＩＩＡのＢＣループ（１０９〜１１４）（Ｔａｍｍら）である。突然変異１１２ＮＴＡ１１４→ＤＫＰ（ｐＭＧＸ３３０）は図５Ａに示すように免疫複合体の結合を保持していたが、図５Ｂおよび５Ｃに示すようにこの突然変異体は３Ｇ８の結合が劇的に減少していた。しかし、各個別のアミノ酸変化を有するＦｃγＲＩＩＩＡ突然変異体（Ｎ１１２Ｄ、Ｔ１１３Ｋ、Ａ１１４Ｐ）は、３Ｇ８モノクローナル抗体およびＦｃγＲＩＩＩＡ野生型と結合できた（図５、６、および７）。これらの結果は、Ｂ／Ｃループ（Ｔｒｐ１１０〜Ａｌａ１１４）が３Ｇ８接触部位ではないおそれがあるがこのループは全体としてＦｃγＲＩＩＩＡに対する３Ｇ８の結合に貢献していることを示唆している。
【０２９９】
Ｃストランド
突然変異Ｈ１１６Ｖは免疫複合体との結合を失い、３Ｇ８との結合を保持した（データは示さず）。この結果はＣストランドはＦｃγとＦｃγＲＩＩＩの間の接触部位の１つであるという点で文献と一致している。
【０３００】
Ｆ／Ｇループ
この領域の数個の突然変異体：１５６ＧＳＫＮＶ１６０→ＧＹＴＬＦ、Ｖ１６０Ｆ、および１５４ＬＶ１５５→ＮＩが構築された。
【０３０１】
図５、６、および７に示すように、１５６ＧＳＫＮＶ１６０→ＧＹＴＬＦ突然変異体は免疫複合体との結合および３Ｇ８との結合の両方を失った。Ｖ１６０Ｆおよび１５４ＬＶ１５５→ＮＩは免疫複合体との結合を保持したが３Ｇ８との結合を失った。ほとんど３Ｇ８と結合しないことから、動物研究用の望みの候補の１つとしてＶ１６０Ｆを選択した。
【０３０２】
ＦｃγＲＩＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＢ変異体
Ｖ１５５Ｆ突然変異体では、ＩＣとの結合および３Ｇ８との結合が劇的に減少した（図５Ｃ、７Ｂ、および７Ｃ）。
【０３０３】
Ｙ１３７Ｈは、野生型と類似したプロフィルを有する。突然変異Ｇ１２６Ｄは受容体の機能および３Ｇ８との結合を消失した。まとめると、位置１２６でＦｃγＲＩＩＩＡ  Ｇ１２６−Ｙ１３７−Ｖ／Ｆ１５５のパターンが破壊されるとＦｃγＲＩＩＩの機能性が失われる。
【０３０４】
まとめると、３Ｇ８との結合を欠くがＦｃγ結合能を保持する２つのｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２突然変異体（Ｖ１６０Ｆおよび１１２ＮＴＡ１１４→ＤＫＰ）が生成した。それらをさらに動物実験のために研究した。免疫複合体との結合および３Ｇ８との結合の両方を欠く突然変異体１５６ＳＫＮＶ１６０→ＹＴＬＦも陰性対照としてアッセイの開発に使用するために発現させた。
【０３０５】
表３に免疫複合体との結合および３Ｇ８との結合を特性決定した突然変異体をまとめる。
【表３】
2007525149.tif 000004
【０３０６】
安定性結果
安定性が増強した可溶性ＦｃγＲＩＩＩＡ融合タンパク質を発生させるために構築物ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２に突然変異誘発させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により評価すると野生型ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２は限られた安定性しか有さなかった。ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２融合タンパク質の安定性を向上させるために４つの変異体を発生させた（図１Ａ）。分析結果は、不安定性のもとがアミノ酸Ｓ１８３〜Ｓ１８４に対応するＦｃγＲとＦｃセグメントの結合部またはその付近でのタンパク質分解であることを示唆した。ヒトにおいて、細胞外ドメインのＣ末端近くの残基Ｖ１９６〜Ｓ１９７でのタンパク質分解（Galonら、1998、Eur. J. Immunol. 28:2101〜7頁；付番は配列番号１に従う）により、細胞から可溶形態への天然受容体の放出を生じることが実証された。例えばGalonら、1998、Eur. J Immunol. 28:2101〜7頁；Fleitら、1992、Blood、79:2721〜8頁；Masudaら、2003、J. Rhematol. 30(9):1911〜7頁；Masudaら、2003、Clin. Exp. Immunol. 132(3):477〜84頁を参照のこと。これら全てはその全体が参照により本明細書に組み込まれている。しかし、細胞結合型ＦｃγＲＩＩＢはｉｎ  ｖｉｖｏでそのような天然タンパク質分解に合わない。ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２の２つの変異型であるＶ１およびＶ２において、細胞外ドメインのＣ末端ＬＡＶＳＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶはフレキシブルなＧＧＧＧＳリンカー配列と置き換わっていた。他の２つの変異体Ｖ３およびＶ４において、ＦｃγＲＩＩＩＡのＣ末端残基ＩＴＱＧＬＡＶＳＴＩＳＳＦＦＰＰＧＹＱＶはＦｃγＲＩＩＢの対応するセグメントＶＱＡＰＳＳＳＰＭＥと置き換わっていた。この領域におけるＦｃγＲＩＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢとの追加的な相違はＦｃγＲＩＩＩＡにＮ結合グリコシル化部位が存在し、ＦｃγＲＩＩＢには存在しないことである。このように、Ｖ１およびＶ３においてこの位置でのＦｃγＲＩＩＩＡ配列は保持されているが、Ｖ２およびＶ４では非グリコシル化ＦｃγＲＩＩＢ配列が利用された。これらの分子を重複ＰＣＲ法で構築し、ＨＥＫ−２９３細胞に一過性に発現させた。
【０３０７】
変異型融合タンパク質および本来の「Ｗｔ」ＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２分子の安定性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。試料を２５℃で２か月間インキュベートし、ゼロ時間、１か月および２か月の時点で還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図１Ｂ）。Ｗｔ分子は１か月で有意な分解を示し、２か月では全長融合タンパク質がほとんど存在しなかった。対照的に、４つの変異体は全て２５℃で２か月後に低度の分解しか示さず、ＲＩＩＩＡとＲＩＩＢとの間のキメラ受容体であるＶ３およびＶ４は最も少ない分解を示した。
【０３０８】
ゼロ時間では、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてタンパク質が免疫複合体に対する標識単量体ＦｃγＲＩＩＩＡの結合を阻害する能力を試験した（図１Ｃ）。このアッセイにおいて、これらの変異体のそれぞれは、本来の「Ｗｔ」構築物に比べて効果の増加を示した。キメラ受容体Ｖ３およびＶ４はこのアッセイで最も強力な分子であり、すなわち本来の「Ｗｔ」構築物に比べて単量体受容体の結合阻害が顕著に良好であった。どのタンパク質もこの時点であまり分解していなかったため、この結果は予想外であった。
【０３０９】
６．５  ＢＡＬＢ／Ｃマウスにおける単量体ｓＦＣｙＲＩＩＢおよび二量体ｓＦＣｙＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑの薬物動態
ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑ（ロットＰＯ  ５４−０６９）、またはｓＦｃγＲＩＩＢ（ロットＰＯ  ５４−０３４）を１群５匹のマウスにそれぞれ１ｍｇ／ｋｇ（２０μｇ／マウス）の用量でＩＶ注射により投与した。２、７、２４、４８、および７２時間後の時点で動物から採血し、得られた血清中の可溶性受容体レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで決定した。表４および図８に示した結果は、二量体性Ｆｃ融合タンパク質が単量体の可溶性ＦｃγＲＩＩＢよりも顕著に長時間ずっと高い濃度で血清中に存在することを表している。
【表４】
2007525149.tif 000005
【０３１０】
６．６  ＩＴＰ実験
材料と方法
第０日にマウスから採血し、血小板レベルを決定した。次に、第１日にマウス抗ＦｃγＲＩＩＩＡモノクローナル抗体３Ｇ８（０．５ｍｇ／ｋｇ）または可溶性受容体分子（０．５ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇ）の一方を動物に静脈内注射した。マウス１匹には化合物を全く投与しなかった。１時間後に各動物にキメラ６Ａ６（ｃｈ６Ａ６）を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与（０．１μｇ／ｇ）することによりＩＴＰを誘導した。ｃｈ６Ａ６の投与後２時間、５時間、２４時間および４８時間に動物から採血し、７０μｍのアパーチャーを備える粒子計数サイズ分析装置Ｚ２（Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて血漿中血小板数を決定した。血小板に対応する大きさ１．５と４μｍとの間のサイズの粒子を計数した。それぞれの濃度について相対血小板レベル（実際の血小板数を時間ゼロでの血小板数で割ったもの）を時間に対してプロットすることによりデータを分析した。
【０３１１】
結果
本実験で測定した血小板レベルを図９に示す。図９に示すように、可溶性ＦｃγＲＩＩＢ−ＩｇＧ２定常領域融合タンパク質（ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２）で処理された全ての動物はＣｈ６Ａ６介在性の血小板枯渇を予防した。驚くことには、ｓＦｃγＲＩＩｂ−ＩｇＧ２で処理された動物４匹中３匹がｃｈ６Ａ６の投与後２時間に血小板レベルの顕著な増加を表し、血小板枯渇の徴候を示さなかった。ＦｃγＲＩＩｂ−ＩｇＧ２で処理された４番目の動物は小幅の枯渇を表し、それは２４時間では正常に戻った。ＦｃγＲＩＩＩａ−ＩｇＧ２で処理された２匹の動物のうち１匹も６Ａ６の投与による影響を受けなかったが、高用量の可溶性受容体を投与された方の動物は、２時間および５時間で血小板数の減少を実際に有したが２４時間には正常（ｄ０）レベルに戻った。実際に、二量体性可溶性ＦｃγＲ−Ｇ２分子の一方で処理された全ての動物は、２４時間の時点で正常な血小板レベルを有した。抗ＦｃγＲＩＩＩ  Ｍａｂ  ３Ｇ８で処理された動物の血小板レベルも抗血小板Ｍａｂの注射後２４時間でほぼ正常レベルに戻った。
【０３１２】
ＩＴＰ  ＦｃγＲＩＩＩノックアウトヒトＦｃγＲＩＩＩＡトランスジェニックモデルにおけるｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２の用量
トランスジェニックマウス（ＦｃγＲＩＩＩノックアウトヒトＦｃγＲＩＩＩＡトランスジェニック）の群をｃｈ６Ａ６で処理してＩＴＰを誘導した。次に、種々の用量のｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２融合タンパク質の投与に起因する血小板枯渇の低減を測定し、図１０に示すように予防効果を図から定量した。図１０に示すように、０．７５ｍｇ／ｇおよび０．５μｇ／ｇでｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２は最も大きい予防効果をもたらたことから、０．５μｇ／ｇの最適用量を選ぶ。
【０３１３】
ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−  ｈＣＤ３２Ａ＋マウスにおけるＩＴＰ予防へのｓＦγｃＲＩＩＩＡ−Ｇ２の使用
シングルトランスジェニック（ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋またはｍＦｃＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ３２Ａ＋）またはダブルトランスジェニック（ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ａ＋）マウスの群に０．５μｇ／ｇのｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２を第０日にｉ．ｖ．注射した。１時間後に、ｃｈ６Ａ６（０．１μｇ／ｇ）のｉｐ投与によりＩＴＰを誘導した。血小板数を第０日（免疫前）、ならびにｃｈ６Ａ６注射の２、５、２４および４８時間後に決定した。図１１に示すように、データはシングルおよびダブルトランスジェニックマウスの両方がｃｈ６Ａ６誘導性ＩＴＰに感受性であることを表している。３匹全てのマウスにおいて０．５μｇ／ｇのｓＦｃＲｙＩＩＩＡ−Ｇ２の予備注射はＩＴＰの発症を予防する。
【０３１４】
ＩＴＰに対する療法へのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑの使用
ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスに０時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６をｉ．ｐ．注射することによりＩＴＰを誘導した。２時間後に、血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。ｃｈ６Ａ６のｉ．ｐ注射の３時間後に、種々の濃度のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑをマウスにｉ．ｖ．注射した（矢印）。図１２に示すように、データはｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑの注射後に血小板数が速やかに正常に戻るが、未処理マウスでは血小板数は低いままであることを表している。このようにｃｈ６Ａ６の３時間後に０．３μｇ／ｇのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑを注射した場合にＩＴＰの治療が達成された。データはトランスジェニックマウスにおいてＩＴＰを治癒するためにｓＦγｃＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑを使用できることを表している。
【０３１５】
ｓＦγｃＲＩＩＡ−Ｇ２−Ｎ２９７ＱはｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスをＩＴＰから治癒しない
ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスにゼロ時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６をｉ．ｐ．注射することによりＩＴＰを誘導した。２時間後に、血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。ｃｈ６Ａ６のｉ．ｐ．注射の３時間後に、種々の濃度のｓＦｃγＩＩＡ１３１Ｈ−Ｇ２−Ｎ２９７ＱまたはｓＦｃγＲＩＩＡ１３１Ｒ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑをマウスにｉ．ｖ．注射した（矢印）。データはｓＦｃγＲＩＩＡ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑの注射後に未処理マウスと同様に血小板数が低い値を維持したことを示している。図１３に示すように、データはトランスジェニックマウスにおいてＩＴＰを治癒するために、試験を行った実験条件でｓＦｃγＲＩＩＡ−Ｇ２−Ｎ２９７ＱをＩＴＰの治癒に使用できないことを示している。
【０３１６】
ＩＴＰに対する治療法へのｓＦγｃＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑと抗ｈＦｃγＲＩＩＩＡ抗体との組み合わせの使用
ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスに０時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６をｉ．ｐ．注射することによりＩＴＰを誘導した。２時間後に、血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。ｃｈ６Ａ６のｉ．ｐ．注射の３時間後に、種々の濃度のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑまたは抗ｈＦｃγＲＩＩＩＡ５．１  Ｎ２９７Ｑおよび２２．１  Ｎ２９７Ｑ抗体をマウスにｉ．ｖ．注射した（矢印）。これらの実験条件では「低」濃度はＩＴＰを治癒しないが、「高」濃度は治癒する。
【０３１７】
同じ実験において、追加のマウスにｃｈ６Ａ６の３時間後に低濃度のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑと、５．１  Ｎ２９７Ｑまたは２２．１  Ｎ２９７Ｑの一方との組み合わせを注射した。データは低濃度（０．２μｇ／ｇ）のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７ＱがｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスをＩＴＰから治癒しないが、低濃度（０．２μｇ／ｇ）のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑと低濃度（０．１２５μｇ／ｇ）の抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体との組み合わせがマウスをＩＴＰから治癒することを表している。データは、ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑと、５．１  Ｎ２９７Ｑまたは２２．１  Ｎ２９７ＱとをＩＴＰの組合せ療法に使用できることを示している（図１４Ａ〜Ｃ）。
【０３１８】
ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ３２Ａ＋マウスにおけるＩＴＰ予防へのｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２の使用
シングルトランスジェニック（ｍＦｃγＲＩｌＩＡ−／−ｈＣＤ３２Ａ＋、図１５）マウスまたはダブルトランスジェニック（ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ａ＋、図１４）マウスの群にゼロ時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６をｉ．ｐ．注射することによりＩＴＰを誘導した。２時間後に、血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。３時間後に、マウスに０．５μｇ／ｇのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑをｉ．ｖ．投与した（矢印）。データは０．５μｇ／ｇのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７ＱがヒトＣＤ３２Ａ導入遺伝子を発現するマウスを治癒することを示している。
【０３１９】
６．７  自己免疫性溶血性貧血（ＡＨＡ）
ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑを用いたｍｕＦｃγＲＩＩＩ−／−，ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡトランスジェニックマウスにおけるＡＨＡの予防
ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋トランスジェニックマウスに第０日に５μｇ／ｇまたは７．６μｇ／ｇのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑをｉ．ｖ．注射した。３時間後に病原性抗マウス赤血球（ＲＢＣ）抗体（３４−３Ｃ、例えばPottierら、1996、Clin. Exp. Immunol. 106(1):103〜7頁参照。これはその全体が参照により本明細書に組み込まれている）をｉｐ（５０μｇ／マウス）投与することによりＡＨＡを誘導した。ＲＢＣ数を第０日（免疫前）、ならびに３４−３Ｃ注射の１、２、３、４、および７日後に決定した。図１６に示すように、データはｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋トランスジェニックマウスが３４−３Ｃ誘導性ＡＨＡに感受性であることを表している。データはｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑを注射されたマウスではＲＢＣ数が一定であるが、無処理マウスではＲＢＣ数が低下することも表している。このモデルにおいて、第７日に全てのマウスにおいてＲＢＣ数は正常値に戻る。繰り返し採血がＲＢＣ数に及ぼす効果を決定するために、対照マウスから毎日採血するが、注射は行わない。ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑの予備注射は、ｍｕＦｃγＲＩＩＩ−／−，ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡトランスジェニックマウスにおけるＡＨＡの発症を予防する。
【図面の簡単な説明】
【０３２０】
【図１】安定性の増強を有するｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２変異体を示す図である。（Ａ．）構築物ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２を突然変異させて、Ａパネルに示す変異体Ｖ１〜Ｖ４を発生させた。（Ｂ．）還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってタンパク質を監視することにより、２５℃でゼロ時間、１か月、および２か月における変異体Ｖ１〜４の安定性を野生型と比較した。野生型分子は１か月に有意な分解を示し、２か月では全長タンパク質はほとんど存在しなかった。４つの変異体全ては２５℃で２か月後に低度の分解を示した。（Ｃ．）ＥＬＩＳＡアッセイにおいて変異体が免疫複合体に対する標識化単量体ＦｃγＲＩＩＩＡの結合を阻害する能力を試験した。各変異体は野生型よりも高い効果を示した。
【図２】ＦｃγＲＩＩＩとＢＳＡ−ＦＩＴＣ  ｃｈ４−４−２０免疫複合体との結合を示す図である。右のパネルに免疫複合体（ＢＳＡ−ＦＩＴＣ／４−４−２０）とのＦｃγＲの結合を測定するために使用したアッセイを概略的に示す。簡単に説明すると、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡをＭａｘｉＳｏｒｐ平板にコーティングする。コーティング済みの平板にｃｈ  ４−４−２０を入れてインキュベートすることにより免疫複合体を形成させる。ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体は、免疫複合体のヒトＩｇＧ１のＦｃγ部分と結合する。結合したｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体をマウス抗ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体で検出する。左のパネルは種々の濃度のｃｈ−４−４−２０である２μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、および８μｇ／ｍＬでのＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２に対する免疫複合体の結合を示す。
【図３】３Ｇ８による免疫複合体／ＦｃγＲＩＩＩＡの結合阻害のアッセイを示す図である。右のパネルに３Ｇ８による免疫複合体／ＦｃγＲＩＩＩＡの結合阻害のアッセイを概略的に示す。左のパネルに種々の抗体によるＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２に対する免疫複合体ＢＳＡ−ＦＩＴＣ／ｃｈ−４−４−２０の結合阻害を測定する。黒四角は３Ｇ８による阻害を表し、黒三角はｃｈ３Ｇ８による阻害を表し、◆はヒトＩｇＧ１による阻害を表し、黒逆三角はＬＮＫ１６による阻害を表す。
【図４】３Ｇ８およびＦｃγＲＩＩＩＡ融合タンパク質の結合のアッセイを示す図である。右のパネルに３Ｇ８とＦｃγＲＩＩＩＡ融合タンパク質との結合のアッセイを概略的に示す。簡単に説明すると、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体をＭａｘｉＳｏｒｐ平板にコーティングした。ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体を、それらのＩｇＧ２  Ｆｃγ部分を介して捕捉した。捕捉されたｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２またはその突然変異体を３Ｇ８モノクローナル抗体と共にインキュベートした。結合した３Ｇ８の量を、ＨＲＰと複合したヤギ抗マウス抗体で検出した。左側のパネルに、ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２および種々の突然変異体に対する３Ｇ８の結合を野生型細胞外領域（ｐＭＧＸ１１９）の結合と比較する。□および黒四角は野生型細胞外領域を表し、黒三角はｐＭＧＸ３２７（１５６ＧＳＫＮＶ１６０→ＧＹＴＬＦ）、黒逆三角はｐＭＧＸ−３２８（Ｖ１６０Ｆ）、黒四角はｐＭＧＸ−３２９（１５４ＬＶ１５５→ＮＩ）である。
【図５】免疫複合体結合アッセイを示す図である。図５Ａ〜５ＣにおいてｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２およびその突然変異体との免疫複合体の結合を野生型タンパク質との免疫複合体の結合を比較する。（Ａ．）ｐＭＧＸ３３０（黒三角）との免疫複合体の結合を野生型（黒四角）と比較する。（Ｂ．）ｐＭＧＸ３２７（黒三角）、ｐＭＧＸ３２８（黒逆三角）、ｐＭＧＸ３２９（◆）との免疫複合体の結合を野生型（黒四角）と比較する。（Ｃ．）ｐＭＧＸ３３５．１（黒三角）、ｐＭＧＸ３３６．１（黒逆三角）、ｐＭＧＸ３３７．１（◆）、ｐＭＧＸ３３７．２（●）、ｐＭＧＸ３３９．１（□）との免疫複合体の結合を野生型（黒四角）と比較する。
【図６】３Ｇ８またはキメラ３−Ｇ８による免疫複合体／ＦｃγＲＩＩＩＡの結合の阻害アッセイを示す図である。（Ａ．）ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２突然変異体を用いたｃｈ３Ｇ８との阻害アッセイ。（Ｂ．）ｐＭＧＸ３２７（黒三角）、ｐＭＧＸ３２８（黒逆三角）、ｐＭＧＸ３２９（◆）の３Ｇ８遮断活性を野生型（黒四角）と比較する。（Ｃ．）ｐＭＧＸ３３５．１（黒三角）、ｐＭＧＸ３３６．１（黒逆三角）、ｐＭＧＸ３３７．１（◆）の３Ｇ８遮断活性を野生型と比較する。（Ｄ．）ｐＭＧＸ３３８．１（黒三角）、ｐＭＧＸ３３９．１（黒逆三角）、ｐＭＧＸ３４０．１（◆）の３Ｇ８遮断活性を野生型と比較する。
【図７】３Ｇ８結合アッセイを示す図である。（Ａ．）ｐＭＧＸ３２７（黒三角）、ｐＭＧＸ３２８（黒逆三角）、ｐＭＧＸ３２７（黒三角）、ｐＭＧＸ３２９（◆）、精製３３０（●）との３Ｇ８の結合をｐＭＧＸ１１９（黒四角）および精製１１９（□野生型）と比較する。（Ｂ．）ｐＭＧＸ３３５．１（黒三角）、ｐＭＧＸ３３６．１（逆黒三角）、ｐＭＧＸ３３７．１（◆）、ｐＭＧＸ３３８．１（●）、ｐＭＧＸ３３９．１（□）との３Ｇ８の結合をｐＭＧＸ１１９（黒四角）（野生型）と比較する。（Ｃ．）ｐＭＧＸ３４０．１（黒三角）、ｐＭＧＸ３３５．２（黒逆三角）、ｐＭＧＸ３３６．２（◆）、ｐＭＧＸ３３８．２（●）、ｐＭＧＸ３３９．２（□）との３Ｇ８の結合をｐＭＧＸ１１９（野生型）と比較する。
【図８】ＢＡＬＢ／ＣマウスにおけるｓＦｃγＲＩＩＢ分子の薬物動態を示す図である。ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７ＱまたはｓＦｃγＲＩＩＢを１ｍｇ／Ｋｇの用量で１群４〜５匹のマウスにＩＶ注射により投与した。その２、７、２４、４８、および７２時間後に動物から採血し、得られた血清中の可溶性受容体レベルをサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。
【図９】血小板枯渇アッセイを示す図である。ｓＦｃγＲＩＩＩ−Ｇ２（３ｍｇ／ｋｇ）（□）、ｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｆｃγ（０．５ｍｇ・ｋｇ）（○）、ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２（０．５ｍｇ／ｋｇ）（黒四角）、ｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２（３ｍｇ／ｋｇ）（＊）を投与後に血漿中血小板数を決定した。
【図１０】用量曲線を示す図である。ＩＴＰを有するように誘導したマウスを表示した濃度範囲でｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２で処理した。
【図１１】ＩＴＰの予防におけるＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２の使用を示す図である。ＩＴＰを有するように誘導したｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ３２Ａ＋マウス、ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋およびｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ３２Ａ＋マウス、ならびにｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋マウスを表示した濃度範囲でｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２で処理した。全てのマウスにおいて０．５μｇ／ｇの予備注射はＩＴＰの発症を予防する。
【図１２】ＩＴＰに対する療法へのＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑの使用を示す図である。ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスに０時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６をｉ．ｐ．注射することによりＩＴＰを誘導した。その２時間後に血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。ｃｈ６Ａ６のｉ．ｐ．注射の３時間後に、マウスに種々の濃度のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑをｉ．ｖ．注射した（矢印）。
【図１３】ＩＴＰに対する療法へのＦｃγＲＩＩＡ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑの使用を示す図である。ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスに０時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６をｉ．ｐ．注射することによりＩＴＰを誘導した。その２時間後に血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。ｃｈ６Ａ６のｉ．ｐ．注射の３時間後に、マウスに種々の濃度のｓＦｃγＲＩＩＡ１３１Ｈ−Ｇ２−Ｎ２９７ＱまたはｓＦｃγＲＩＩＡ１３１Ｒ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑをｉ．ｖ．注射した（矢印）。
【図１４】ＩＴＰに対する療法へのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑおよび抗ｈＦｃγＲＩＩＩＡ抗体の組み合わせの使用を示す図である。（Ａ．）組合せ療法なしの対照処理。（Ｂ．）ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスに０時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６をｉ．ｐ．注射することによりＩＴＰを誘導した。その２時間後に血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。ｃｈ６Ａ６のｉ．ｐ．注射の３時間後に、マウスに種々の濃度のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑまたは抗ｈＦｃγＲＩＩＩＡ  ５．１  Ｎ２９７Ｑおよび２２．１  Ｎ２９７Ｑ抗体をｉ．ｖ．注射した（矢印）。「低」濃度はこれらの実験条件でＩＴＰを治癒しないが、「高」濃度は治癒する。（Ｃ．）ｃｈ６Ａ６の３時間後に追加のマウスに低濃度のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑと、５．１  Ｎ２９７Ｑまたは２２．１  Ｎ２９７Ｑの一方との組み合わせを注射した。データは、低濃度（０．２μｇ／ｇ）のｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７ＱがｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−，ｈＣＤ１６Ａ＋マウスのＩＴＰを治癒しないことを示している。低用量（０．２μｇ／ｇ）のＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑと低用量（０．１２５μｇ／ｇ）の抗ＦｃγＲＩＩＩＡ抗体との組み合わせはマウスのＩＴＰを治癒する。データは、ｓＦｃＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑと、５．１  Ｎ２９７Ｑまたは２２．１  Ｎ２９７ＱとがＩＴＰの組合せ療法に使用できることを表している。
【図１５】ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ３２Ａ＋マウスにおけるＩＴＰの予防へのｓＦｃγＲＩＩＩＡ−Ｇ２の使用を示す図である。シングルトランスジェニック（ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ３２Ａ＋、図３）マウスまたはダブルトランスジェニック（ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋ｈＣＤ３２Ａ＋、図１４）マウスの群に０時間に０．１μｇ／ｇのｃｈ６Ａ６のｉ．ｐ．注射によりＩＴＰを誘導した。その２時間後に血漿中の血小板数を決定してＩＴＰの存在を確認した。３時間後に、０．５μｇ／ｇのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２  Ｎ２９７Ｑをマウスにｉ．ｖ．注射した（矢印）。
【図１６】ｓＦｃＲγＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑを用いたｍｕＦｃγＲＩＩＩ−／−，ｈｕＦｃγＲＩＩＩＡトランスジェニックマウスにおけるＡＨＡの予防を示す図である。ｍＦｃγＲＩＩＩＡ−／−ｈＣＤ１６Ａ＋トランスジェニックマウスに第０日に５μｇ／ｇまたは７．６μｇ／ｇのｓＦｃγＲＩＩＢ−Ｇ２−Ｎ２９７Ｑをｉｖ注射した。３時間後に病原性抗マウス赤血球（ＲＢＣ）抗体（３４−３Ｃ）をｉｐ（５０μｇ／マウス）投与することによりＡＨＡを誘導した。ＲＢＣ数を第０日（免疫前）および３４−３Ｃの注射の１、２、３、４、および７日後にＲＢＣ数を決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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