(57)【要約】  本発明は、二環ヌクレオシド、およびこうしたヌクレオシドを少なくとも１つ含むオリゴマー化合物に関する。これらのオリゴマー化合物は、典型的には、非修飾オリゴマー化合物に比較して、増進した結合親和性およびヌクレアーゼ抵抗特性を有する。該オリゴマー化合物は、例えば研究目的および療法目的に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
Ｔ１−（Ｎｕ１−Ｌ１）ｎ１−（Ｎｕ２−Ｌ２）ｎ２−（Ｎｕ３−Ｌ３）ｎ３−Ｔ２
式中：
各Ｎｕ１およびＮｕ３は、独立に、高親和性修飾ヌクレオシドであり、ここで、Ｎｕ１およびＮｕ３の少なくとも一方が、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋または４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋を含む、二環糖修飾ヌクレオシドである；
各Ｎｕ２は２’−デオキシヌクレオシドであり；
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、ヌクレオシド間連結基であり；
各Ｔ１およびＴ２は、独立に、Ｈ、ヒドロキシ保護基、場合によって連結されるコンジュゲート基、または固体支持体への共有結合であり；
ｎ１は１〜約６であり；
ｎ２は１１〜約１８であり；そして
ｎ３は２〜約６である
を含むオリゴマー化合物。
【請求項２】
高親和性修飾ヌクレオシドの各々が、独立に、二環糖修飾ヌクレオシド、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオシド、２’−Ｆ修飾ヌクレオシド、または２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１Ｒ２修飾ヌクレオシドである、ここで各Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、窒素保護基、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルである、ここで置換は、ＯＲ３、ＳＲ３、ＮＨ３＋、ＮＲ３Ｒ４、グアニジノまたはアシルである、ここでアシルは酸アミドまたはエステルであるか、あるいはＲ１およびＲ２が一緒に窒素保護基であるか、またはＮおよびＯから選択されるさらなるヘテロ原子を場合によって含む環構造において、Ｒ１およびＲ２が連結されている、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３】
二環糖修飾ヌクレオシドの各々が、独立に、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋または４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋を有する、請求項２のオリゴマー化合物。
【請求項４】
各Ｒ１およびＲ２が、独立に、Ｈ、窒素保護基、またはＣ１−Ｃ１０アルキルである、請求項２のオリゴマー化合物。
【請求項５】
Ｔ１がＨまたはヒドロキシル保護基である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項６】
Ｔ２がＨまたはヒドロキシル保護基である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項７】
ヒドロキシル保護基の各々が、独立に、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、メシル、トシル、４，４’，４”−トリス−（ベンジルオキシ）トリチル、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル、４，４’，４”−トリス（レブリニルオキシ）トリチル、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、９−（４−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボニル、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル、４−（メチルチオメトキシ）ブチリル、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル、２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルオキシメチル）ベンゾイル、またはレブリニル基である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項８】
Ｔ１およびＴ２の一方が、支持体への共有結合である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項９】
支持体が、調節孔ガラス、オキサリル調節孔ガラス、シリカ含有粒子、ポリスチレンのポリマー、ポリスチレンのコポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー、ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンのコポリマー、可溶性支持体、またはＰＥＰＳである、請求項８のオリゴマー化合物。
【請求項１０】
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が、独立に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、またはボラノホスフェートである、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項１１】
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が、独立に、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結基である、請求項１０のオリゴマー化合物。
【請求項１２】
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項１０のオリゴマー化合物。
【請求項１３】
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が、独立に、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、またはアミドである、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項１４】
ヌクレオシド間連結基が、独立に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、または−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−である、請求項１３のオリゴマー化合物。
【請求項１５】
各ヌクレオシドが、独立に、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、または３−デアザアデニンである複素環塩基部分を含む、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項１６】
ｎ１が１〜約５である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項１７】
ｎ１が１〜約３である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項１８】
ｎ１が２〜約３である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項１９】
ｎ３が２〜約５である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２０】
ｎ３が２〜約３である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２１】
ｎ２が１２〜約１８である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２２】
ｎ２が１２〜約１６である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２３】
ｎ２が１４〜約１６である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２４】
ｎ１、ｎ２およびｎ３の合計が１４〜約３０である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２５】
ｎ１、ｎ２およびｎ３の合計が１４〜２４である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２６】
ｎ１、ｎ２およびｎ３の合計が１４〜２１である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２７】
ｎ１、ｎ２およびｎ３の合計が１６〜２１である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２８】
ｎ１が１〜約３であり、ｎ２が１２または１３であり、そしてｎ３が２または３である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項２９】
ｎ１が３であり、ｎ２が１２であり、そしてｎ３が３である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３０】
ｎ１が１〜約３であり、ｎ２が１４または１５であり、そしてｎ３が２または３である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３１】
ｎ１が２であり、ｎ２が１４であり、そしてｎ３が２である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３２】
ｎ１が１〜約３であり、ｎ２が１６または１７であり、そしてｎ３が２または３である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３３】
ｎ１が２であり、ｎ２が１６であり、そしてｎ３が２である、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３４】
少なくとも１つのＮｕ１ヌクレオシドおよび少なくとも１つのＮｕ３ヌクレオシドがＬＮＡまたはＥＮＡである、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３５】
最も５’末端または最も３’末端の親和性修飾ヌクレオシドの少なくとも一方がＬＮＡまたはＥＮＡである、請求項１のオリゴマー化合物。
【請求項３６】
遺伝子発現を阻害する方法であって、１以上の細胞、組織、または動物と、請求項１のオリゴマー化合物を接触させることを含む、前記方法。
【請求項３７】
構造：
【化１】
2007505138.tif 000021
式中：
各Ｂｘは複素環塩基部分であり；
各Ｘは、独立に、ＯまたはＳであり；
Ｔ１およびＴ２は、各々、独立に、Ｈ、ヒドロキシ保護基、場合によって連結されるコンジュゲート基、または固体支持体への共有結合であり；
各ｍは、独立に、１または２であり；
ｎａは１〜約６であり；
ｎｂは１１〜約１８であり；そして
ｎｃは２〜約６である
を含むオリゴマー化合物。
【請求項３８】
各ｍが１である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項３９】
各ｍが２である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項４０】
Ｔ１およびＴ２の少なくとも一方が、Ｈまたはヒドロキシル保護基である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項４１】
ヒドロキシル保護基の各々が、独立に、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、メシル、トシル、４，４’，４”−トリス−（ベンジルオキシ）トリチル、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル、４，４’，４”−トリス（レブリニルオキシ）トリチル、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、９−（４−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボニル、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル、４−（メチルチオメトキシ）ブチリル、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル、２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルオキシメチル）ベンゾイル、またはレブリニル基である、請求項４０のオリゴマー化合物。
【請求項４２】
Ｔ１およびＴ２の一方が、支持体への共有結合である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項４３】
支持体が、調節孔ガラス、オキサリル調節孔ガラス、シリカ含有粒子、ポリスチレンのポリマー、ポリスチレンのコポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー、ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンのコポリマー、可溶性支持体、またはＰＥＰＳである、請求項４２のオリゴマー化合物。
【請求項４４】
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が、独立に、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結基である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項４５】
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３が、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である、請求項４４のオリゴマー化合物。
【請求項４６】
各Ｂｘが、独立に、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、または３−デアザアデニンである、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項４７】
ｎａが１〜約５である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項４８】
ｎａが１〜約３である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項４９】
ｎａが２〜約３である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５０】
ｎｃが２〜約５である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５１】
ｎｃが２〜約３である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５２】
ｎｂが１２〜約１８である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５３】
ｎｂが１２〜約１６である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５４】
ｎｂが１４〜約１６である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５５】
ｎａ、ｎｂおよびｎｃの合計が１４〜約３０である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５６】
ｎａ、ｎｂおよびｎｃの合計が１４〜２４である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５７】
ｎａ、ｎｂおよびｎｃの合計が１４〜２１である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５８】
ｎａ、ｎｂおよびｎｃの合計が１６〜２１である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項５９】
ｎａが１〜約３であり、ｎｂが１２または１３であり、そしてｎｃが２または３である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項６０】
ｎａが３であり、ｎｂが１２であり、そしてｎｃが３である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項６１】
ｎａが１〜約３であり、ｎｂが１４または１５であり、そしてｎｃが２または３である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項６２】
ｎａが２であり、ｎｂが１４であり、そしてｎｃが２である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項６３】
ｎａが１〜約３であり、ｎｂが１６または１７であり、そしてｎｃが２または３である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項６４】
ｎａが２であり、ｎｂが１６であり、そしてｎｃが２である、請求項３７のオリゴマー化合物。
【請求項６５】
遺伝子発現を阻害する方法であって、１以上の細胞、組織、または動物と、請求項３７のオリゴマー化合物を接触させることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規二環糖部分を含むヌクレオシド組成物、およびこうしたヌクレオシドを少なくとも１つ含むオリゴマー化合物に関する。本発明のオリゴマー化合物は、典型的には、非修飾オリゴマー化合物に比較して、増進した結合親和性を有するであろう。該オリゴマー化合物は、例えば研究目的および療法目的に有用である。
【０００２】
発明の背景
多細胞生物における疾患状態のほぼすべてに、タンパク質の作用が関与する。古典的な療法アプローチは、タンパク質の疾患誘引活性または疾患増強活性を抑える試みの中で、タンパク質と他の分子の相互作用に重点を置いてきた。より最近の療法アプローチでは、タンパク質産生の調節が追求されてきている。現在の療法アプローチのいくつかの一般的な目的は、遺伝子発現に干渉するか、または別の方式で遺伝子発現を調節することである。
【０００３】
特定の遺伝子の発現を阻害する１つの方法は、オリゴヌクレオチド、特に特定の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列に相補的なオリゴヌクレオチドの使用を伴う。近年、前途有望な研究結果が得られているため、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、現在、療法および診断法に優れた見込みを持つ療法剤として認められている。
【０００４】
オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、特定の特性を有するように設計することも可能である。オリゴマー化合物には、療法剤としての有用性を増す、いくつかの化学的修飾が導入されてきている。こうした修飾には、標的鎖への結合親和性を増加させ、細胞浸透を増加させ、オリゴヌクレオチドの構造または活性を分解するかまたはそれに干渉するヌクレアーゼおよび他の酵素に対して安定化させ、オリゴヌクレオチドがひとたび標的に結合したならば、分解の様式（終結事象）を提供し、そしてオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善するように設計されたものが含まれる。
【０００５】
コンホメーション的にロックされた、二環糖部分を有する二環ヌクレオシド化合物の１つの群は、ロック化核酸またはＬＮＡである（Ｋｏｓｈｋｉｎら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９８，  ５４，  ３６０７−３６３０；米国特許第６，２６８，４９０号および第６，６７０，４６１号）。これらの化合物はまた、文献中で、二環ヌクレオチド類似体（国際特許出願ＷＯ  ９８／３９３５２）とも称されるが、この用語はまた、ＬＮＡに加えて他の類似体を含む化合物属にも適用可能である。ＬＮＡは、リボヌクレオシド模倣体（ｍｉｍｉｃｓ）が望まれる、多くの研究で用いられてきている。こうした修飾ヌクレオシドは、天然リボヌクレオシドの３’−エンド糖コンホメーションを模倣し、結合親和性が増進し、そしてヌクレアーゼに対する耐性が増加する利点がある。ＬＮＡは、以下により徹底的に論じられる。
【０００６】
１つのグループが、ＬＮＡの２’，４’架橋基に、さらなるメチレン基を付加している（例えば４’−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−２’（ＥＮＡ）、Ｋａｎｅｋｏら、米国特許出願第Ｕ．Ｓ．２００２／０１４７３３２号、日本特許出願ＨＥＩ−１１−３３８６３、１９９９年２月１２日；米国特許出願公報第２００３／０２０７８４１号および第２００２／０１４７３３２号もまた参照されたい）。
【０００７】
別の公報は、多様な立体配置および化学的組成を有する二環糖を生成する多様な架橋を伴う多様な二環糖部分を有する、ヌクレオシドの大きな属を報告する（米国特許出願公報第ＵＳ２００２／００６８７０８号）。
【０００８】
これらの進歩にもかかわらず、当該技術分野には、オリゴマー化合物の結合親和性およびヌクレアーゼ耐性特性を改善する手段の開発に対する必要性が存在する。
発明の簡単な概要
本発明は、構造Ｔ１−（Ｎｕ１−Ｌ１）ｎ１−（Ｎｕ２−Ｌ２）ｎ２−（Ｎｕ３−Ｌ３）ｎ３−Ｔ２、式中、各Ｎｕ１およびＮｕ３は、独立に、高親和性修飾ヌクレオシドであり、ここで、Ｎｕ１の少なくとも１つのヌクレオシドおよび／またはＮｕ３の少なくとも１つのヌクレオシドが、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋または４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋を含む、二環糖修飾ヌクレオシドである、を含むオリゴマー化合物を提供する。各Ｎｕ２は２’−デオキシヌクレオシドであり、そして各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、ヌクレオシド間連結基である。各Ｔ１およびＴ２は、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、場合によって連結されるコンジュゲート基、または固体支持体への共有結合である。ｎ１は１〜約６であり、ｎ２は１１〜約１８であり、そしてｎ３は２〜約６である。
【０００９】
いくつかの態様において、高親和性修飾ヌクレオシドの各々は、独立に、二環糖修飾ヌクレオシド、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオシド、２’−Ｆ修飾ヌクレオシド、または２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１Ｒ２修飾ヌクレオシドである、ここで各Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、窒素保護基、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルである、ここで置換は、ＯＲ３、ＳＲ３、ＮＨ３＋、ＮＲ３Ｒ４、グアニジノまたはアシルである、ここでアシルは酸アミドまたはエステルであるか、あるいはＲ１およびＲ２が一緒に窒素保護基であるか、またはＮおよびＯから選択されるさらなるヘテロ原子を場合によって含む環構造において、Ｒ１およびＲ２が連結されている。
【００１０】
いくつかの態様において、ヒドロキシル保護基の各々は、独立に、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、メシル、トシル、４，４’，４”−トリス−（ベンジルオキシ）トリチル、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル、４，４’，４”−トリス（レブリニルオキシ）トリチル、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、９−（４−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボニル、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル、４−（メチルチオメトキシ）ブチリル、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル、２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルオキシメチル）ベンゾイル、またはレブリニル基である。
【００１１】
いくつかの態様において、支持体は、調節孔ガラス、オキサリル調節孔ガラス、シリカ含有粒子、ポリスチレンのポリマー、ポリスチレンのコポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー、ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンのコポリマー、可溶性支持体、またはＰＥＰＳである。
【００１２】
いくつかの態様において、各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、ボラノホスフェート、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、またはアミドである。いくつかの態様において、ヌクレオシド間連結基の各々は、独立に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、または−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００１３】
いくつかの態様において、各ヌクレオシドは、独立に、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、または３−デアザアデニンである複素環塩基部分を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、ｎ１は、１〜約５、または１〜約３、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎ３は、２〜約５、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎ２は、１２〜約１８、または１２〜約１６、または１４〜約１６である。いくつかの態様において、ｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１４〜約３０、または１４〜２４、または１４〜２１、または１６〜２１である。いくつかの態様において、ｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１２または１３であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は３であり、ｎ２は１２であり、そしてｎ３は３であるか；あるいはｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１４または１５であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は２であり、ｎ２は１４であり、そしてｎ３は２であるか；あるいはｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１６または１７であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は２であり、ｎ２は１６であり、そしてｎ３は２である。
【００１５】
いくつかの態様において、少なくとも１つのＮｕ１ヌクレオシドおよび少なくとも１つのＮｕ３ヌクレオシドは、ＬＮＡまたはＥＮＡである。いくつかの態様において、最も５’末端または最も３’末端の親和性修飾ヌクレオシドの少なくとも一方は、ＬＮＡまたはＥＮＡである。
【００１６】
本発明はまた、構造：
【００１７】
【化１】
2007505138.tif 000002
【００１８】
式中、各Ｂｘは複素環塩基部分であり；各Ｘは、独立に、ＯまたはＳであり；Ｔ１およびＴ２は、各々、独立に、Ｈ、ヒドロキシ保護基、場合によって連結されるコンジュゲート基、または固体支持体(support medium)への共有結合であり；各ｍは、独立に、１または２であり；ｎａは１〜約６であり；ｎｂは１１〜約１８であり；そしてｎｃは２〜約６である
を含むオリゴマー化合物も提供する。
【００１９】
いくつかの態様において、各ｍは１または２である。いくつかの態様において、Ｔ１およびＴ２の少なくとも一方は、Ｈまたはヒドロキシル保護基、例えば、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、メシル、トシル、４，４’，４”−トリス−（ベンジルオキシ）トリチル、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル、４，４’，４”−トリス（レブリニルオキシ）トリチル、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、９−（４−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボニル、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル、４−（メチルチオメトキシ）ブチリル、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル、２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルオキシメチル）ベンゾイル、またはレブリニル基である。
【００２０】
いくつかの態様において、支持体は、調節孔ガラス、オキサリル調節孔ガラス、シリカ含有粒子、ポリスチレンのポリマー、ポリスチレンのコポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー、ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンのコポリマー、可溶性支持体、またはＰＥＰＳである。
【００２１】
いくつかの態様において、各Ｂｘは、独立に、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、または３−デアザアデニンである。
【００２２】
いくつかの態様において、ｎａは、１〜約５、または１〜約３、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎｃは、２〜約５、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎｂは、１２〜約１８、または１２〜約１６、または１４〜約１６である。いくつかの態様において、ｎａ、ｎｂおよびｎｃの合計は、１４〜約３０、または１４〜２４、または１４〜２１、または１６〜２１である。いくつかの態様において、ｎａは１〜約３であり、ｎｂは１２または１３であり、そしてｎｃは２または３であるか；あるいはｎａは３であり、ｎｂは１２であり、そしてｎｃは３であるか；あるいはｎａは１〜約３であり、ｎｂは１４または１５であり、そしてｎｃは２または３であるか；あるいはｎａは２であり、ｎｂは１４であり、そしてｎｃは２であるか；あるいはｎａは１〜約３であり、ｎｂは１６または１７であり、そしてｎｃは２または３であるか；あるいはｎａは２であり、ｎｂは１６であり、そしてｎｃは２である。
【００２３】
本発明はまた、遺伝子発現を阻害する方法であって、１以上の細胞、組織、または動物と、本明細書記載のオリゴマー化合物いずれかを接触させることを含む、前記方法も提供する。
【００２４】
発明の詳細な説明
本発明は、二環ヌクレオシド類似体、およびこれらの二環ヌクレオシド類似体を少なくとも１つ有するオリゴマー化合物を提供する。二環ヌクレオシド類似体の各々は、リボフラノース糖部分の２’位および４’位間に架橋を有する。これらの二環ヌクレオシド類似体を少なくとも１つ有するオリゴマー化合物は、遺伝子発現の調節に有用であろう。より具体的には、本発明のオリゴマー化合物は、核酸標的にハイブリダイズして、標的核酸の正常な機能の損失を生じることによって、遺伝子発現を調節するであろう。
【００２５】
本発明は、デオキシヌクレオシドをギャップ中に有し、そして非修飾ヌクレオシドに比較して増進した親和性を有するように修飾されたヌクレオシドをウィング中に有するギャップ化オリゴヌクレオシドを提供する。適切な連結には、ホスホロチオエート、ホスホジエステル、並びにホスホロチオエートおよびホスホジエステルの組み合わせが含まれる。増進した親和性を有するヌクレオシド（高親和性修飾ヌクレオシド）の少なくとも１つは、二環糖部分を含む。
【００２６】
二環糖部分を有する適切なヌクレオシドには、リボシル糖環の２’−ヒドロキシル基が、糖環の４’炭素原子に連結して、それによって２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン連結を形成して、二環糖部分を連結する、「ロック化核酸」（ＬＮＡ）が含まれる（Ｅｌａｙａｄｉら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｎｓ．  Ｄｒｕｇｓ，  ２００１，  ２，  ５５８−５６１；Ｂｒａａｓｃｈら，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００１，  ８  １−７；およびＯｒｕｍら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ２００１，  ３，  ２３９−２４３に概説される；米国特許６，２６８，４９０および６，６７０，４６１もまた参照されたい）。用語、ロック化核酸はまた、文献中で、糖コンホメーションをロックするいかなる二環構造も含むように、より広い意味でも用いられてきており、例えば、１つの配向において、糖を３’−エンド・コンホメーションにロックする、前述の２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン連結も含まれる。
【００２７】
二環糖部分を有する適切なヌクレオシドにはまた、ＥＮＡＴＭも含まれ、この場合、過剰なメチレン基が架橋に付加されてＥＮＡＴＭが生じる（２’−Ｏ、４’−エチレン架橋核酸、４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’；Ｓｉｎｇｈら，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １９９８，  ４，  ４５５−４５６；ＥＮＡ：Ｍｏｒｉｔａら，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００３，  １１，  ２２１１−２２６６）。架橋を有するものを含む二環糖部分、例えば４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’、式中、ｎは１または２である、は、相補的ＤＮＡおよびＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０Ｃ）、３’−エキソ核酸分解に対する安定性、および優れた可溶性を示す。ＬＮＡは、ＰｒｏＬｉｇｏ（フランス・パリおよび米国コロラド州ボールダー）から商業的に入手可能であり、そしてＥＮＡＴＭは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｊａｐａｎから商業的に入手可能である。
【００２８】
二環系を示すＬＮＡの基本的な構造を以下に示す：
【００２９】
【化２】
2007505138.tif 000003
【００３０】
式中、ｎは多様であることも可能であるが、日常的に調製されるのは１〜約４０であり、各Ｔ１およびＴ２は、独立に、水素、ヒドロキシル保護基、連結されたヌクレオシドまたは連結されたオリゴマー化合物であり、Ｂｘは複素環塩基部分であり、そして各Ｚ１は、独立に、例えばホスホジエステルまたはホスホロチオエートなどの、ヌクレオシド間連結基である。
【００３１】
２Ｄ  ＮＭＲ分光法によって決定されるＬＮＡのコンホメーションは、ＬＮＡヌクレオチドのロックされた配向によって、一本鎖ＬＮＡおよび二重鎖の両方において、Ｎ型コンホメーションがより高い割合で導入されるような方式で、リン酸主鎖が拘束されることを示している（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，  ２０００，  １３，  ４４−５３）。これらのコンホメーションは、核酸塩基スタッキングの改善と関連付けられている（Ｗｅｎｇｅｌら，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９９，  １８，  １３６５−１３７０）。
【００３２】
ＬＮＡは、非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖を形成することが示されてきている（Ｋｏｓｈｋｉｎら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９８，  １２０，  １３２５２−１３２５３）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、熱的に最も安定な核酸型二重鎖系であることが示され、そしてＬＮＡのＲＮＡ模倣特性が、二重鎖レベルで確立された。３つのＬＮＡ単量体（ＴまたはＡ）を導入すると、ＤＮＡ相補体に対する融点が有意に増加した（Ｔｍ＝＋１５／＋１１）。非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖が形成されることから、ＬＮＡが仲介するハイブリダイゼーションが普遍的であることが強調されてきている。ＬＮＡのＲＮＡ模倣は、単量体のＮ型コンホメーション拘束に関して、そしてＬＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の二次構造に関して、反映された。
【００３３】
ＬＮＡはまた、高い熱親和性で、相補的なＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡとの二重鎖を形成する。円二色（ＣＤ）スペクトルは、完全に修飾されたＬＮＡを含む二重鎖（特にＬＮＡ：ＲＮＡ）が、Ａ型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に構造的に似ていることを示す。ＬＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の核磁気共鳴（ＮＭＲ）検査によって、ＬＮＡ単量体が３’−エンド・コンホメーションであることが確認された。二本鎖ＤＮＡを認識することもまた立証され、ＬＮＡが鎖に侵入することが示唆されている。ミスマッチ配列の研究によって、ＬＮＡがワトソン−クリック塩基対形成規則にしがたい、一般的に、対応する非修飾参照鎖に比較して、改善された選択性を持つことが示される。ＤＮＡ：ＬＮＡキメラは、ルシフェラーゼｍＲＮＡ内の多様な領域（５’非翻訳領域、開始コドン領域またはコード領域）を標的とした際、効率的に遺伝子発現を阻害することが示されてきている（Ｂｒａａｓｃｈら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００２，  ３０，  ５１６０−５１６７）。
【００３４】
新規種類のＬＮＡ−オリゴマー化合物とともにＬＮＡは、広い範囲の診断適用および療法適用に有用である。これらの中には、アンチセンス適用、ＰＣＲ適用、鎖置換オリゴマー、核酸ポリメラーゼの基質、および一般的に、ヌクレオチドに基づく薬剤がある。
【００３５】
ＬＮＡを含有する、強力で、そして非毒性のアンチセンス・オリゴヌクレオチドが記載されてきている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ２０００，  ９７，  ５６３３−５６３８）。著者らは、ＬＮＡが、アンチセンス化合物にいくつかの望ましい特性を与えることを立証した。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、血清および細胞抽出物中で、容易には分解しなかった。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、生存ラット脳におけるＧタンパク質共役型受容体シグナル伝達、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるレポーター遺伝子の検出のように、共通点のないアッセイ系において、強力なアンチセンス活性を示した。リポフェクチンが仲介する、ＬＮＡの生存ヒト乳癌細胞への効率的な搬送もまた、達成されてきている。ＬＮＡを伴うさらなるｉｎ  ｖｉｖｏ研究によって、毒性なしに、ラット・デルタ・オピオイド受容体のノックダウンが成功することが示され（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ２０００，  ９７，  ５６３３−５６３８）、そして別の研究において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットの翻訳が遮断されることが示された（Ｆｌｕｉｔｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２００３，  ３１，  ９５３−９６２）。
【００３６】
ＬＮＡ単量体、アデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルの合成および調製とともに、そのオリゴマー化、並びに核酸認識特性が記載されてきている（Ｋｏｓｈｋｉｎら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９８，  ５４，  ３６０７−３６３０）。ＬＮＡおよびその調製はまた、ＷＯ  ９８／３９３５２およびＷＯ  ９９／１４２２６にも記載されている。
【００３７】
やはり研究されているＬＮＡの異性体は、３’−エキソヌクレアーゼに対して、優れた安定性を有することが示されている、∀−Ｌ−ＬＮＡである（Ｆｒｉｅｄｅｎら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ２００３，  ２１，  ６３６５−６３７２）。∀−Ｌ−ＬＮＡは、アンチセンス・ギャップマーおよびキメラに取り込まれ、これらは強力なアンチセンス活性を示した。∀−Ｌ−ＬＮＡの構造を以下に示す：
【００３８】
【化３】
2007505138.tif 000004
【００３９】
調製されそして研究されてきた別の類似の二環糖部分は、糖環の４’炭素原子への、単一のメチレン基を介した、３’−ヒドロキシル基からの架橋を有し、それによって、３’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン連結を形成する（米国特許６，０４３，０６０を参照されたい）。
【００４０】
ＬＮＡの第一の類似体、ホスホロチオエート−ＬＮＡおよび２’−チオ−ＬＮＡもまた、調製されている（Ｋｕｍａｒら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９８，  ８，  ２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼの基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含有するロック化ヌクレオシド類似体の調製もまた、記載されてきている（Ｗｅｎｇｅｌら、ＰＣＴ国際出願ＷＯ  ９８−ＤＫ３９３  １９９８０９１４）。さらに、ハンドルを含む、新規のコンホメーション制限された高親和性オリゴヌクレオチド類似体、２’−アミノ−ＬＮＡの合成が当該技術分野において記載されてきている（Ｓｉｎｇｈら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９８，  ６３，  １００３５−１００３９）。さらに、２’−アミノ−ＬＮＡおよび２’―メチルアミノ−ＬＮＡが調製され、そして相補ＲＮＡ鎖および相補ＤＮＡ鎖との二重鎖の熱安定性が先に報告されている。
【００４１】
ＥＮＡＴＭは、ＬＮＡ（４’−（ＣＨ２）−Ｏ−２’）に類似の特性を有する。ＥＮＡＴＭは、ＤＮＡ／ＲＮＡに対して、増進した親和性を有し、ヌクレアーゼ分解に非常に耐性であり、そしてアンチセンス核酸として、研究されてきている（Ｍｏｒｉｔａら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００２，  １２，  ７３−７６；Ｍｏｒｉｔａら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ２００３，  １１，  ２２１１−２２２６；Ｍｏｒｉｔａら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｕｐｐｌ．，  ２００２，  Ｓｕｐｐｌ．  ２，  ９９−１００；Ｍｏｒｉｔａら，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．，  ２００３，  ２２，  １６１９−１６２１；およびＴａｋａｇｉら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２００３，  Ｓｕｐｐ．  ３，  ８３−８４を参照されたい）。
【００４２】
本明細書において、用語「標的核酸」および「核酸標的」は、便宜的に、標的とされることが可能ないかなる核酸も含むように用いられ、限定なしに、ＤＮＡ、こうしたＤＮＡから転写されるＲＮＡ（プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡまたはその一部を含む）、およびまたこうしたＲＮＡに由来するｃＤＮＡが含まれる。本発明のいくつかの態様において、標的核酸は、ＲＮアーゼＨなどのヌクレアーゼを伴う機構によって分解される、メッセンジャーＲＮＡである。標的核酸と本発明のオリゴマー化合物のハイブリダイゼーションは、一般的に「アンチセンス」と称される。その結果、本発明のいくつかの態様の実施に含まれると考えられる１つの機構は、本明細書において、「アンチセンス阻害」と称される。こうしたアンチセンス阻害は、典型的には、少なくとも１つの鎖またはセグメントが切断され、分解され、または別の方式で機能不能になるように、オリゴヌクレオチド鎖またはセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションに基づく。これに関連して、現在、こうしたアンチセンス阻害のため、特定の核酸分子およびその機能を標的とすることが、適切である。
【００４３】
干渉されるべきＤＮＡの機能には、限定されるわけではないが、複製および転写が含まれる。複製および転写は、例えば、内因性細胞テンプレート、ベクター、プラスミド構築物またはその他のものからであることも可能である。干渉されるべきＲＮＡの機能には、限定されるわけではないが、タンパク質翻訳部位へのＲＮＡの転位置、ＲＮＡ合成部位から離れた細胞内の部位へのＲＮＡの転位置、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１以上のＲＮＡ種を生じるＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡによって作用されうるまたはＲＮＡによって促進される、ＲＮＡが関係する触媒活性または複合体形成などの機能が含まれる。
【００４４】
本発明の関連において、「調節」および「発現の調節」は、遺伝子をコードする核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡの量またはレベルの増加（刺激）または減少（阻害）いずれかを意味する。阻害は、しばしば、発現調節の好ましい型であり、そしてｍＲＮＡは、しばしば、適切な標的核酸である。
【００４５】
本発明の化合物
本発明の関連において、用語「オリゴマー化合物」は、核酸分子の領域にハイブリダイズ可能なポリマー構造を指す。この用語には、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド擬似体（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）およびこれらの組み合わせが含まれる。オリゴマー化合物は、日常的には、直鎖で調製されるが、連結することも可能であるし、または環状であるように調製することも可能であり、そしてまた分枝を含むことも可能である。オリゴマー化合物は、ハイブリダイズして二本鎖化合物を形成することも可能であり、こうした二本鎖化合物は、平滑末端であることも可能であるし、また突出部（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことも可能である。一般的に、オリゴマー化合物は、連結単量体サブユニットの主鎖を含み、ここで各連結単量体サブユニットは、直接または間接的に複素環塩基部分に付着する。単量体サブユニット、糖部分または代用物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅｓ）および複素環塩基部分をつなぐ連結を、独立に修飾して、複数のモチーフを生じさせ、その結果、ヘミマー、ギャップマー、およびキメラを含む、オリゴマー化合物を生じることも可能である。
【００４６】
当該技術分野に知られるように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基部分である。こうした複素環塩基の２つの最も一般的な種類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合するリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は、該糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれに連結することも可能である。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、互いに、隣接するヌクレオシドと共有結合して、直鎖ポリマー化合物を形成する。ハイブリダイゼーションによって、または共有結合の形成によって、この直鎖ポリマー構造のそれぞれの端をつないで、環状構造を形成することも可能であるが、開いた直鎖構造が、一般的に適切である。オリゴヌクレオチド構造内で、リン酸基は、一般的に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結を形成すると称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの通常のヌクレオシド間連結は、３’−５’ホスホジエステル連結である。
【００４７】
本発明の関連において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖および共有ヌクレオシド間連結で構成されるオリゴヌクレオチドが含まれる。用語「オリゴヌクレオチド類似体」は、オリゴヌクレオチドに類似の方式で機能する、１以上の非天然存在部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。こうした非天然存在オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込み増進、核酸標的に対する増進した親和性、およびヌクレアーゼの存在下での増加した安定性などの望ましい特性のため、しばしば、天然存在型より望ましい。
【００４８】
本発明の関連において、用語「オリゴヌクレオシド」は、リン原子を持たないヌクレオシド間連結によってつながれるヌクレオシドを指す。この種のヌクレオシド間連結には、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合ヘテロ原子シクロアルキル、１以上の短鎖ヘテロ原子および１以上の短鎖複素環が含まれる。これらのヌクレオシド間連結には、限定されるわけではないが、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファメート；メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、アミド、並びに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
【００４９】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；５，７９２，６０８；５，６４６，２６９および５，６７７，４３９が含まれる。
【００５０】
本発明にさらに含まれるのは、アンチセンス・オリゴマー化合物、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする他のオリゴマー化合物などのオリゴマー化合物である。こうしたものとして、これらのオリゴマー化合物は、一本鎖、二本鎖、環状またはヘアピン・オリゴマー化合物の形で導入されることも可能であり、そして内部または末端のバルジまたはループなどの構造要素を含有することも可能である。系にひとたび導入されたら、本発明のオリゴマー化合物は、１以上の酵素または構造タンパク質の作用を誘発して、標的核酸の修飾を達成することも可能である。
【００５１】
こうした酵素の１つの限定されない例は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼ、ＲＮアーゼＨである。当該技術分野には、「ＤＮＡ様」の一本鎖アンチセンス・オリゴマー化合物が、ＲＮアーゼＨを誘発することが知られる。したがって、ＲＮアーゼＨの活性化は、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それによって、オリゴヌクレオチドが仲介する遺伝子発現阻害の効率が非常に増進する。ＲＮアーゼＩＩＩおよびリボヌクレアーゼＬ酵素ファミリー中のものなどの他のリボヌクレアーゼに関して、類似の役割が推論されてきている。
【００５２】
アンチセンス・オリゴマー化合物の１つの型は、一本鎖アンチセンス・オリゴヌクレオチドであるが、多くの種では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子などの二本鎖構造を導入すると、アンチセンスが仲介する、遺伝子またはその関連遺伝子産物の機能の、強力で、そして特異的な減少が誘導されることが示されてきている。この現象は、植物および動物の両方で起こり、そしてウイルス防御およびトランスポゾン・サイレンシングに進化的な連関を有すると考えられる。
【００５３】
上述の修飾に加えて、多様な他の修飾が、単独で、または他のヌクレオシドと組み合わせて、上述の望ましい特性の１以上を増進する限り、本発明のオリゴマー化合物のヌクレオシドは、これらの他の修飾を有することも可能である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドに取り込まれたヌクレオチドに関しては、これらのヌクレオチドは、天然存在の糖または修飾された糖に対応する糖部分を有することも可能である。代表的な修飾された糖には、炭素環または非環糖、２’位、３’位または４’位の１以上に置換基を有する糖、および糖の１以上の水素原子の代わりに置換基を有する糖が含まれる。改変された塩基部分およびまたは改変された糖部分を有する、本発明に受け入れられるさらなるヌクレオシドが、米国特許３，６８７，８０８およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０２３２３に開示される。
【００５４】
改変された塩基部分または改変された糖部分にはまた、本発明の要旨と一致した他の修飾も含まれる。こうしたオリゴヌクレオチドは、最適には、天然存在または合成の野生型オリゴヌクレオチドと、構造的に区別可能であるが、それでもなお機能的に交換可能なものとして説明される。こうしたオリゴヌクレオチドはすべて、これらが望ましいＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖の構造を模倣するように、有効に機能する限り、本発明に含まれる。代表的な塩基修飾の種類には、「Ｇクランプ」と称される三環シトシン類似体が含まれる（Ｌｉｎら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９８，  １２０，  ８５３１）。この類似体は、標的とされるグアニン（Ｇ）のワトソン−クリック面およびフーグスティーン面を同時に認識することによって、らせん内の相補Ｇに対して、４つの水素結合を作る。このＧクランプ修飾がホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドに取り込まれると、細胞培養において、アンチセンス有効性が劇的に増進する。本発明のオリゴヌクレオチドにはまた、Ｆｌａｎａｇａｎら，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９９，  １７，  ４８−５２に開示される型のフェノキサジン置換塩基が含まれることも可能である。
【００５５】
本発明は、構造：
Ｔ１−（Ｎｕ１−Ｌ１）ｎ１−（Ｎｕ２−Ｌ２）ｎ２−（Ｎｕ３−Ｌ３）ｎ３−Ｔ２
式中：
各Ｎｕ１およびＮｕ３は、独立に、高親和性修飾ヌクレオシドであり、ここで、Ｎｕ１およびＮｕ３の少なくとも一方が、４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋または４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’架橋を含む、二環糖修飾ヌクレオシドである；
各Ｎｕ２は２’−デオキシヌクレオシドであり；
各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、ヌクレオシド間連結基であり；
各Ｔ１およびＴ２は、独立に、Ｈ、ヒドロキシ保護基、場合によって連結されるコンジュゲート基、または固体支持体への共有結合であり；
ｎ１は１〜約６であり；
ｎ２は１１〜約１８であり；そして
ｎ３は２〜約６である
を含むオリゴマー化合物を提供する。
【００５６】
いくつかの態様において、高親和性修飾ヌクレオシドの各々は、独立に、二環糖修飾ヌクレオシド、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオシド、２’−Ｆ修飾ヌクレオシド、または２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＲ１Ｒ２修飾ヌクレオシドである、ここで各Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、窒素保護基、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニルである、ここで置換は、ＯＲ３、ＳＲ３、ＮＨ３＋、ＮＲ３Ｒ４、グアニジノまたはアシルである、ここでアシルは酸アミドまたはエステルであるか、あるいはＲ１およびＲ２が一緒に窒素保護基であるか、またはＮおよびＯから選択されるさらなるヘテロ原子を場合によって含む環構造において、Ｒ１およびＲ２が連結されている。いくつかの態様において、各Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｈ、窒素保護基、またはＣ１−Ｃ１０アルキルである。いくつかの態様において、Ｔ１はＨまたはヒドロキシル保護基である。いくつかの態様において、Ｔ２はＨまたはヒドロキシル保護基である。
【００５７】
いくつかの態様において、ヒドロキシル保護基の各々は、独立に、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、メシル、トシル、４，４’，４”−トリス−（ベンジルオキシ）トリチル、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル、４，４’，４”−トリス（レブリニルオキシ）トリチル、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、９−（４−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボニル、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル、４−（メチルチオメトキシ）ブチリル、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル、２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルオキシメチル）ベンゾイル、またはレブリニル基である。
【００５８】
いくつかの態様において、Ｔ１およびＴ２の一方は、支持体、例えば、調節孔ガラス、オキサリル調節孔ガラス、シリカ含有粒子、ポリスチレンのポリマー、ポリスチレンのコポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー、ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンのコポリマー、可溶性支持体、またはＰＥＰＳへの共有結合である。
【００５９】
いくつかの態様において、各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、５’−アルキレンホスホネート、キラル・ホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、３’−アミノホスホロアミデート、アミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、またはボラノホスフェートである。いくつかの態様において、各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結基である。いくつかの態様において、各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である。いくつかの態様において、各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、スルファメート、メチレンイミノ、メチレンヒドラジノ、スルホネート、スルホンアミド、またはアミドである。いくつかの態様において、ヌクレオシド間連結基の各々は、独立に、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−または−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、または−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−である。
【００６０】
いくつかの態様において、各ヌクレオシドは、独立に、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、または３−デアザアデニンである複素環塩基部分を含む。
【００６１】
いくつかの態様において、ｎ１は、１〜約５、または１〜約３、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎ３は、２〜約５、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎ２は、１２〜約１８、または１２〜約１６、または１４〜約１６である。いくつかの態様において、ｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１４〜約３０であり；またはｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１４〜２４であり；またはｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１４〜２１であり；またはｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１６〜２１である。いくつかの態様において、ｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１２または１３であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は３であり、ｎ２は１２であり、そしてｎ３は３であるか；あるいはｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１４または１５であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は２であり、ｎ２は１４であり、そしてｎ３は２であるか；あるいはｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１６または１７であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は２であり、ｎ２は１６であり、そしてｎ３は２である。
【００６２】
いくつかの態様において、少なくとも１つのＮｕ１ヌクレオシドおよび少なくとも１つのＮｕ３ヌクレオシドは、ＬＮＡまたはＥＮＡである。いくつかの態様において、最も５’末端または最も３’末端の親和性修飾ヌクレオシドの少なくとも一方は、ＬＮＡまたはＥＮＡである。したがって最も末端の５’および／または３’ヌクレオシドは、独立に、ＬＮＡまたはＥＮＡのいずれかであることも可能である。
【００６３】
本発明はまた、構造：
【００６４】
【化４】
2007505138.tif 000005
【００６５】
式中：
各Ｂｘは複素環塩基部分であり；
各Ｘは、独立に、ＯまたはＳであり；
Ｔ１およびＴ２は、各々、独立に、Ｈ、ヒドロキシ保護基、場合によって連結されるコンジュゲート基、または固体支持体への共有結合であり；
各ｍは、独立に、１または２であり；
ｎａは１〜約６であり；
ｎｂは１１〜約１８であり；そして
ｎｃは２〜約６である
を含むオリゴマー化合物も提供する。
【００６６】
いくつかの態様において、各ｍは１または２である。いくつかの態様において、Ｔ１およびＴ２の少なくとも一方は、Ｈまたはヒドロキシル保護基である。いくつかの態様において、ヒドロキシル保護基の各々は、独立に、４，４’−ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセチル、クロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ピバロイル、ベンゾイル、ｐ−フェニルベンゾイル、メシル、トシル、４，４’，４”−トリス−（ベンジルオキシ）トリチル、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル、４，４’，４”−トリス（レブリニルオキシ）トリチル、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル、４−デシルオキシトリチル、４−ヘキサデシルオキシトリチル、９−（４−オクタデシルオキシフェニル）キサンテン−９−イル、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル、ｐ−フェニルアゾフェニルオキシカルボニル、９−フルオレニル−メトキシカルボニル、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル、４−（メチルチオメトキシ）ブチリル、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル、２−（イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル、２−（２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルオキシメチル）ベンゾイル、またはレブリニル基である。
【００６７】
いくつかの態様において、Ｔ１およびＴ２の一方は、支持体、例えば、調節孔ガラス、オキサリル調節孔ガラス、シリカ含有粒子、ポリスチレンのポリマー、ポリスチレンのコポリマー、スチレンおよびジビニルベンゼンのコポリマー、ジメチルアクリルアミドおよびＮ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンのコポリマー、可溶性支持体、またはＰＥＰＳへの共有結合である。
【００６８】
いくつかの態様において、各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、独立に、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結基である。いくつかの態様において、各Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、ホスホジエステル・ヌクレオシド間連結基である。
【００６９】
いくつかの態様において、各Ｂｘは、独立に、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、５−ハロシトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−置換アデニン類およびグアニン類、５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニン、７−メチルアデニン、８−アザグアニン、８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、または３−デアザアデニンである。
【００７０】
いくつかの態様において、ｎ１は、１〜約５（例えば１、２、３、４、５）、または１〜約３（例えば１、２、３）、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎ３は、２〜約５（例えば２、３、４、５）、または２〜約３である。いくつかの態様において、ｎ２は、１２〜約１８（例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）、または１２〜約１６（例えば１２、１３、１４、１５、１６）、または１４〜約１６（例えば１４、１５、１６）である。いくつかの態様において、ｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１４〜約３０（例えば１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）であるか；またはｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１４〜２４（例えば１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４）であるか；またはｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１４〜２１（例えば１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１）であるか；またはｎ１、ｎ２およびｎ３の合計は、１６〜２１（例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１）である。いくつかの態様において、ｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１２または１３であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は３であり、ｎ２は１２であり、そしてｎ３は３であるか；あるいはｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１４または１５であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は２であり、ｎ２は１４であり、そしてｎ３は２であるか；あるいはｎ１は１〜約３であり、ｎ２は１６または１７であり、そしてｎ３は２または３であるか；あるいはｎ１は２であり、ｎ２は１６であり、そしてｎ３は２である。
【００７１】
オリゴマー合成
適切なように、ＤＮＡ合成（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，  Ａｇｒａｗａｌ監修（１９９３），  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）および／またはＲＮＡ合成（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），  ２３，  ２０６−２１７．  Ｇａｉｔら，  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  Ｓｍｉｔｈ監修（１９９８），  １−３６．  Ｇａｌｌｏら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），  ５７，  ５７０７−５７１３）のための文献の方法にしたがって、修飾および非修飾ヌクレオシドのオリゴマー化を行う。さらに、本発明のオリゴマー化合物の合成のための特定のプロトコルを、以下の実施例に例示する。
【００７２】
本発明にしたがって用いるオリゴマー化合物を、便宜的に、そして日常的に、周知の固相合成技術にしたがって作成することも可能である。例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）を含む、いくつかの業者によって、こうした合成のための装置が販売されている。当該技術分野に知られる、こうした合成の他の手段いずれかを、さらに、または別に、使用することも可能である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製する類似の技術の使用が周知である。
【００７３】
本発明はまた、少なくとも１つの２’−Ｏ保護されたヌクレオシドを取り込んだ、オリゴマー化合物の調製にも有用である。取り込まれ、そして適切に脱保護された後、２’−Ｏ保護ヌクレオシドは、取り込まれた位置で、リボヌクレオシドに変換されるであろう。最終オリゴマー化合物中の２−リボヌクレオシド単位の数および位置は、いずれかの部位の１つから多様であることも可能であるし、また完全な２’−ＯＨ修飾オリゴマー化合物になるまで調製する戦略を用いることも可能である。オリゴマー化合物の合成に受け入れられるすべての２’−Ｏ保護基が、本発明に含まれる。一般的に、例えばスクシネート・リンカーによって、保護されたヌクレオシドを固体支持体に付着させる。次いで、５’末端ヒドロキシル基を脱保護し、さらなるヌクレオシド単位をカップリングし、キャップ処理し、そして酸化する（あるいは硫化する）周期を反復することによって、オリゴヌクレオチドを伸長する。より頻繁に用いられる合成法において、アンモニア溶液で処理することによって、リン酸保護基および環外アミノ保護基を除去することで、完成したオリゴヌクレオチドを固体支持体から切断する。次いで、２’−ヒドロキシル基の保護に用いる、より特殊化された保護基には、通常、さらなる脱保護工程が必要であり、これによって、完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドが得られるであろう。
【００７４】
オリゴリボヌクレオチドの合成には、多数の２’−Ｏ保護基が用いられてきているが、年を追って、より有効な基が発見されてきている。有効な２’−Ｏ保護基に重要なのは、２’−Ｏ位に選択的に導入可能であり、そして合成後、望ましくない副産物の形成を伴わずに、容易に取り除きうることである。保護基はまた、オリゴリボヌクレオチド合成に必要な、一般的な脱保護工程、カップリング工程、およびキャッピング工程に対して、不活性であることも必要である。オリゴリボヌクレオチド合成に最初に用いられた保護基のいくつかには、テトラヒドロピラン−１−イルおよび４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イルが含まれた。これらの２つの基は、５’−Ｏ保護基のすべてとは適合せず、したがって、５’−ＤＭＴ基とともに、１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）などの修飾型が用いられた。Ｒｅｅｓｅは、オリゴリボヌクレオチド合成に有用ないくつかのピペリジン誘導体（Ｆｐｍｐに類似）を同定しており、これらには１−（（クロロ−４−メチル）−フェニル）−４’−メトキシピペリジン−４−イルが含まれる（Ｒｅｅｓｅら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９８６，  ２７，  ２２９１）。別のアプローチは、標準的な５’−ＤＭＴ（ジメトキシトリチル）基を、レブリニルおよび９−フルオレニルメトキシカルボニルなどの、非酸性条件下で除去される保護基で置き換えることであった。こうした基は、オリゴリボヌクレオチド合成のために、酸不安定性２’保護基の使用を可能にする。オリゴリボヌクレオチドの合成のために、より広く最初に用いられた別の保護基は、ｔ−ブチルジメチルシリル基であった（Ｏｇｉｌｖｉｅら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９７４，  ２８６１；Ｈａｋｉｍｅｌａｈｉら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９８１，  （２２），  ２５４３；およびＪｏｎｅｓら，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ．，  ２７６２）。２’−Ｏ保護基は、取り除くために特殊な試薬を必要とする可能性もあり、例えばｔ−ブチルジメチルシリル基は、通常、他の切断工程／脱保護工程がすべて終了した後、オリゴマー化合物をテトラブチルアンモニウムフロリド（ＴＢＡＦ）で処理することによって、取り除かれる。
【００７５】
研究者の１グループは、いくつかの２’−Ｏ保護基を調べた（Ｐｉｔｓｃｈ，  Ｃｈｉｍｉａ，  ２００１，  （５５），  ３２０−３２４）。このグループは、中程度の条件を用いて取り除かれる、フッ化物不安定性保護基および光不安定性保護基を調べた。調べた１つの光不安定性基は、（２−（ニトロベンジル）オキシ）メチル（ｎｂｍ）保護基であった（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９２，  ２，  １０１９）。調べた他の基には、いくつかの構造的に関連するホルムアルデヒドアセタール由来の２’−Ｏ保護基が含まれた。やはり調製されたのは、２’−Ｏ−アルキル化ヌクレオシド・ホスホロアミダイトを調製するための、いくつかの関連する保護基であり、２’−Ｏ−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）３、ＴＯＭ）が含まれた。ＴＯＭ基に直交して用いるために調製された１つの２’−Ｏ保護基は、２’−Ｏ−（（Ｒ）−１−（２−ニトロフェニル）エチルオキシ）メチル）（（Ｒ）−ｍｎｂｍ）であった。
【００７６】
フッ化物不安定性５’−Ｏ保護基（非酸不安定性）および酸不安定性２’−Ｏ保護基を用いる別の戦略が報告されてきている（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２００１，  ２３，  ２０６−２１７）。５’−Ｏ保護に関して、いくつかの可能なシリルエーテルが調べられ、そして２’−Ｏ保護に関して、いくつかのアセタールおよびオルトエステルが調べられた。最適な結果を生じる保護スキームは、５’−Ｏ−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）であった。このアプローチは、修飾ホスホロアミダイト合成アプローチを用い、このアプローチでは、ＲＮＡ／ＤＮＡ合成に日常的には用いられない、いくつかの異なる試薬が必要である。
【００７７】
多くの研究がオリゴリボヌクレオチド合成に重点を置いてきているが、現在、商業的に用いられている主なＲＮＡ合成戦略には、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル）（ＦＰＭＰ）、２’−Ｏ−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）３（ＴＯＭ）、および５’−Ｏ−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル（ＡＣＥ）が含まれる。現在、ＲＮＡ製品を提供する、主な企業のいくつかの現在のリストには、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．が含まれる。１つの企業、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓは、ＲＮＡ合成活性化因子を市販し、特にＴＯＭおよびＴＢＤＭＳ化学反応でカップリング時間を減少させると広告している。こうした活性化因子もまた、本発明に受け入れられるであろう。
【００７８】
商業的ＲＮＡ合成に用いられている主な基は：
ＴＢＤＭＳ＝５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル；
ＴＯＭ＝２’−Ｏ−（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル；
ＤＯＤ／ＡＣＥ＝（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキシ）メチル
ＦＰＭＰ＝５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル）
である。
【００７９】
前述のＲＮＡ合成戦略はすべて、本発明に受け入れられる。例えば１つの戦略からの５’保護基と別の戦略からの２’−Ｏ保護基を用いる、上記のハイブリッドである戦略もまた、本発明に受け入れられる。
【００８０】
リボヌクレオチド、および少なくとも１つのリボヌクレオシドを取り込んだオリゴマー化合物、並びにこれらの２つの両端の間に属する可能な立体配置すべての調製が、本発明に含まれる。対応するオリゴマー化合物は、相補性領域を有するオリゴリボヌクレオチドを含む、さらなるオリゴマー化合物とハイブリダイズして、二本鎖（二重鎖）オリゴマー化合物を形成することも可能である。当該技術分野において、こうした二本鎖オリゴヌクレオチド部分は、アンチセンス機構を介して、標的発現を調節し、そして翻訳とともにＲＮＡプロセシングを制御することが示されてきている。さらに、二本鎖部分は、化学的修飾の対象となることも可能である（Ｆｉｒｅら，  Ｎａｔｕｒｅ，  １９９８，  ３９１，  ８０６−８１１；ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅ，  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，  ３９５，  ８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓら，  Ｇｅｎｅ，  ２００１，  ２６３，  １０３−１１２；Ｔａｂａｒａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９８，  ２８２，  ４３０−４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９８，  ９５，  １５５０２−１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ，  １９９９，  １３，  ３１９１−３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００１，  ４１１，  ４９４−４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒら，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００１，  １５，  １８８−２００）。例えば、こうした二本鎖部分は、二重鎖のアンチセンス鎖が標的に古典的にハイブリダイズし、それによって標的の酵素的分解を誘発することによって、標的を阻害することが示されてきている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００２，  ２９５，  ６９４−６９７）。
【００８１】
本発明のオリゴマー化合物を調製する方法を、薬剤発見および標的検証の分野に適用することもまた可能である。本発明は、薬剤を発見する試みの中で、本明細書で同定するオリゴマー化合物および適切な標的を使用して、タンパク質、および疾患状態、表現型または状態の間に存在する関係を解明することを含む。これらの方法には、標的ペプチドを検出するか、または調節する方法であって、試料、組織、細胞、または生物と、本発明のオリゴマー化合物を接触させて、標的の核酸レベルまたはタンパク質レベル、並びに／あるいは関連する表現型または化学的終点を、処理後のある時点で測定し、そして場合によって、測定した値を非処理試料または本発明のさらなるオリゴマー化合物で処理した試料と比較することを含む、前記方法が含まれる。これらの方法を、他の実験と平行して、または他の実験と組み合わせて行って、標的検証のプロセスのため、未知の遺伝子の機能を決定するか、あるいは特定の疾患、状態、または表現型の治療または予防の標的として、特定の遺伝子産物の妥当性を決定することもまた可能である。
【００８２】
存在する文献にしたがって、ＲＮＡｉ活性に対するヌクレオシド修飾の影響を評価する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，  Ｎａｔｕｒｅ（２００１），  ４１１，  ４９４−４９８；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａら，  Ｃｅｌｌ（２００１），  １０７，  ４１５−４１６；およびＢａｓｓら，  Ｃｅｌｌ（２０００），  １０１，  ２３５−２３８）。
【００８３】
いくつかの化学的官能基が、ブロッキングされた型で本発明の化合物に導入され、そして続いて脱ブロッキングされて、最終的な望ましい化合物を形成することも可能である。複素環塩基に直接または間接的に付着する基、ヌクレオシド間連結、並びに２’位、３’位および５’位での糖置換基などである。反復オリゴヌクレオチド合成中、成長しつつあるオリゴマー化合物中に位置する官能基をブロッキングするように保護基を選択することも可能であり、一方、必要に応じて、他の位を選択的に脱ブロッキングすることも可能である。一般的に、ブロッキング基は、より大きい分子の化学的官能性を、特定の反応条件に対して不活性であるようにし、そして後で、分子の残りに実質的に損傷を与えずに、こうした官能性から取り除かれることも可能である（ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  第３版，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク，  １９９９）。例えば、アミノ基の窒素原子は、フタルイミド基として、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基として、そしてトリフェニルメチルスルフェニル、ｔ−ＢＯＣまたはベンジル基で、ブロッキング可能である。カルボキシル基は、アセチル基としてブロッキング可能である。代表的なヒドロキシル保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，  ４８，  ２２２３に記載される。適切なヒドロキシル保護基は、酸不安定性であり、例えばトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）および９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）である。
【００８４】
化学的官能基を前駆体型の中に含むことによって「ブロッキング」することもまた可能である。したがって、アジド基は容易にアミンに変換されるため、アジド基をアミンの「ブロッキング」型とみなして用いることも可能である。オリゴヌクレオチド合成に利用される、さらなる代表的な保護基が、Ａｇｒａｗａｌら，  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，  監修，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ニュージャージー州，  １９９４；Ｖｏｌ．２６  ｐｐ．１  ７２に論じられる。
【００８５】
ヒドロキシル保護基の例には、限定されるわけではないが、ｔ−ブチル、ｔ−ブトキシメチル、メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、１−エトキシエチル、１−（２−クロロエトキシ）エチル、２−トリメチルシリルエチル、ｐ−クロロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ベンジル、２，６−ジクロロベンジル、ジフェニルメチル、ｐ，＝−ジニトロベンズヒドリル、ｐ−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリフェニルシリル、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、ピバロエート、ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、９−フルオレニルメチルカーボネート、メシレートおよびトシレートが含まれる。
【００８６】
酸処理に安定であるアミノ保護基は、塩基処理で選択的に取り除かれ、そして置換に選択的に利用可能な反応性アミノ基を作成するのに用いられる。こうした基の例はＦｍｏｃ（Ｅ．  ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ．  Ｓｈｅｐｐａｒｄ，  Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ中，  Ｓ．  Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ，  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  オーランド，  １９８７，  第９巻，  ｐ．１）、およびＮｓｃ基に例示される多様な置換スルホニルエチルカルバメート（Ｓａｍｕｋｏｖら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，  １９９４，  ３５：７８２１；ＶｅｒｈａｒｔおよびＴｅｓｓｅｒ，  Ｒｅｃ．  Ｔｒａｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ｐａｙｓ−Ｂａｓ，  １９８７，  １０７，  ６２１）である。
【００８７】
さらなるアミノ保護基には、限定されるわけではないが、カルバメート保護基、例えば２−トリメチルシリルエトキシカルボニル（Ｔｅｏｃ）、１−メチル−１−（４−ビフェニリル）エトキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）；アミド保護基、例えばホルミル、アセチル、トリハロアセチル、ベンゾイル、およびニトロフェニルアセチル；スルホンアミド保護基、例えば２−ニトロベンゼンスルホニル；およびイミンおよび環状イミド保護基、例えばフタルイミドおよびジチアスクシノイルが含まれる。
【００８８】
オリゴマー化合物調製のため、現在選択される方法は、支持体を利用する。支持体は、第一のヌクレオシドまたは他のシントンの付着に用いられ、これが次いで反復して伸長されて、最終オリゴマー化合物または他のポリマー、例えばポリペプチドを生じる。不溶性であるように、または異なる溶媒中で多様な可溶性を有するように、支持体を選択して、望ましいように、支持体に結合した、成長するポリマーが、溶液内または溶液外いずれかにあるのを可能にすることも可能である。固体支持体などの伝統的な支持体は、大部分、不溶性であり、そして日常的に反応容器中に入れられ、一方、最終ポリマー化合物が切断されるまで、試薬および溶媒が、成長する鎖と反応し、そしてまたは鎖を洗浄する。より最近のアプローチは、可溶性ポリマー支持体を含む可溶性支持体を導入して、合成の望ましい点で、反復して合成される産物の沈殿および溶解を可能にしている（Ｇｒａｖｅｒｔら，  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．，  １９９７，  ９７，  ４８９−５１０）。
【００８９】
用語、支持体は、オリゴマー化合物および関連化合物、例えばペプチドの合成のため、当該技術分野に知られる支持体のすべての型を含むよう意図される。本発明の方法に受け入れられる、いくつかの代表的な支持体には、限定されるわけではないが、以下：調節孔ガラス（ＣＰＧ）；オキサリル調節孔ガラス（例えばＡｌｕｌら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９１，  １９，  １５２７を参照されたい）；シリカ含有粒子、例えば多孔性ガラスビーズ、並びにトリクロロ−（３−（４−クロロメチル）フェニル）プロピルシランおよび多孔性ガラスビーズの反応によって形成されるものなどのシリカゲル（ＰａｒｒおよびＧｒｏｈｍａｎｎ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｅｒｎａｌ．  Ｅｄ．  １９７２，  １１，  ３１４を参照されたい、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、米国マサチューセッツ州フラミンガムによって、登録商標「ＰＯＲＡＳＩＬ  Ｅ」として販売される）；１，４−ジヒドロキシメチルベンゼンおよびシリカのモノエステル（ＢａｙｅｒおよびＪｕｎｇ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９７０，  ４５０３を参照されたい、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓによって、登録商標「ＢＩＯＰＡＫ」として販売される）；ＴＥＮＴＡＧＥＬ（例えばＷｒｉｇｈｔら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９３，  ３４，  ３３７３を参照されたい）；架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマー・ビーズ化マトリックスまたはＰＯＲＯＳ、ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマー（Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）；可溶性支持体、ポリエチレングリコールＰＥＧ（Ｂｏｎｏｒａら，  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２０００，  ４，  ２２５−２３１）が含まれる。
【００９０】
本発明に受け入れられる、さらなる支持体には、限定なしに、ペンダント長鎖ポリスチレン（ＰＳ）グラフトを有するポリエチレン（ＰＥ）フィルムであるＰＥＰＳ支持体（分子量、約１０６（Ｂｅｒｇら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９８９，  １１１，  ８０２４および国際特許出願ＷＯ  ９０／０２７４９を参照されたい）が含まれる。フィルムの装填能は、ビーズ化マトリックスのものと同程度に高く、多数の合成に同時に対処しうる、さらなる柔軟性を持つ。ＰＥＰＳフィルムは、各々が個々の区画として働く、別個の標識されたシートの形で構築されることも可能である。合成周期のすべての同一の工程の間、シートは単一の反応容器中にともに維持されて、慣用的な方法による単一ペプチドの合成に近い速さで、多数のペプチドの同時調製を可能にする。また、例えば不織フェルト、編んだネット、スティックまたはマイクロウェルプレートなどのＰＥＰＳポリマーの他の形状での実験も、合成の有効性にいかなる限界も示していない。
【００９１】
本発明に受け入れられる、さらなる支持体には、限定なしに、既知の量のＮ−ｔｅｒｔブトキシカルボニル−ベータ−アラニル−Ｎ’−アクリロイルヘキサメチレンジアミンを含む、Ｎ，Ｎ’−ビスアクリロイルエチレンジアミンと架橋したジメチルアクリルアミドのコポリマーに基づく粒子が含まれる。典型的には、ベータ・アラニル基を介して、いくつかのスペーサー分子が付加され、その後、アミノ酸残基サブユニットが続く。また、重合中に、ベータ・アラニル含有単量体の代わりにアクリロイル・サフコシン（ｓａｆｃｏｓｉｎｅ）単量体を用いて、樹脂ビーズを形成することも可能である。重合に続いて、エチレンジアミンとビーズを反応させて、共有結合した官能性として一級アミンを含有する樹脂粒子を形成する。ポリアクリルアミドに基づく支持体は、ポリスチレンに基づく支持体より、比較的親水性であり、そして通常、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン等を含む、極性非プロトン性溶媒とともに用いられる（Ａｔｈｅｒｔｏｎら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９７５，  ９７，  ６５８４，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  １９７９，  ８，  ３５１、およびＪ．Ｃ．Ｓ．  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｉ  ５３８（１９８１）を参照されたい）。
【００９２】
本発明に受け入れられる、さらなる支持体には、限定なしに、使用する有機合成反応条件に対して実質的に不活性である、樹脂および別の材料の合成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ）が含まれる。１つの典型的な合成物（Ｓｃｏｔｔら，  Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．  Ｓｃｉ．，  １９７１，  ９，  ５７７）は、反応性クロロメチル基を含有する、疎水性架橋スチレンポリマーでコーティングされたガラス粒子を利用し、そしてこれは、米国コネティカット州ハムデンのＮｏｒｔｈｇａｔｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．に供給される。別の典型的な合成物は、フッ素化エチレンポリマーのコアを含有し、この上にポリスチレンがグラフトされている（ＫｅｎｔおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｉｓｒａｅｌ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  １９７８，  １７，  ２４３およびｖａｎ  Ｒｉｅｔｓｃｈｏｔｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ中  １９７４，  Ｙ．  Ｗｏｌｍａｎ監修，  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク，  １９７５，  ｐｐ．１１３−１１６を参照されたい）。ＰＥＰＳ以外の連続的固体支持体、例えばコットンシート（ＬｅｂｌおよびＥｉｃｈｌｅｒ，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓ．  １９８９，  ２，  ２３２）およびヒドロキシプロピルアクリレートでコーティングしたポリプロピレン膜（Ｄａｎｉｅｌｓら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９８９，  ４３４５）。成長するペプチド鎖を固定し、そして区画化合成を行う、アクリル酸グラフトポリエチレン・ロッドおよび９６マイクロタイターウェル（Ｇｅｙｓｅｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８４，  ８１，  ３９９８）。伝統的に用いられるポリマービーズを含有する「ティーバッグ」（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８５，  ８２，  ５１３１）。異なる密度を持つ２つの異なる支持体の同時使用（Ｔｒｅｇｅａｒ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  Ｊ．  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ監修，  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｓｃｉ．  Ｐｕｂ．，  アナーバー，  １９７２  ｐｐ．１７５−１７８）。マニホールドを介した反応容器の組み合わせ（Ｇｏｒｍａｎ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９８４，  １３６，  ３９７）。マルチカラム固相合成（例えばＫｒｃｈｎａｋら，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．，  １９８９，  ３３，  ２０９）、並びにＨｏｌｍおよびＭｅｌｄａｌ，  “Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２０ｔｈ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ”中，  Ｇ．  ＪｕｎｇおよびＥ．  Ｂａｙｅｒ監修，  Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ  ＆  Ｃｏ．，  ベルリン，  １９８９  ｐｐ．２０８−２１０）。セルロース・ペーパー（Ｅｉｃｈｌｅｒら，  Ｃｏｌｌｅｃｔ．  Ｃｚｅｃｈ．  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  １９８９，  ５４，  １７４６）。ペプチドの支持体媒介合成もまた報告されてきている（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，  Ｇｒｅｇｏｒｙ  Ａ．  Ｇｒａｎｔ監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２；ＵＳ−Ａ−４，４１５，７３２；４，４５８，０６６；４，５００，７０７；４，６６８，���７７；４，９７３，６７９；５，１３２，４１８；４，７２５，６７７およびＲｅ−３４，０６９を参照されたい）。
【００９３】
支持体に結合したオリゴヌクレオチド合成は、成長する鎖の一端へのヌクレオチドの連続付加に基づく。典型的には、第一のヌクレオシド（存在する環外アミン官能性いずれにも保護基を有する）を適切なガラスビーズ支持体に付着させて、そして活性化ホスファイト化合物（典型的には、やはり適切な保護基を有するヌクレオチド・ホスホロアミダイト）を段階的に付加して、成長するオリゴヌクレオチドを伸長させる。固相合成のさらなる方法が、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、米国特許第４，４１５，７３２号；第４，４５８，０６６号；第４，５００，７０７号；第４，６６８，７７７号；第４，９７３，６７９号；および第５，１３２，４１８号；並びにＫｏｓｔｅｒ、米国特許第４，７２５，６７７号およびＲｅ．３４，０６９に見出されうる。
【００９４】
オリゴマー化合物および関連化合物の支持体に基づく合成に日常的に用いられる、商業的に入手可能な装置が、いくつかの業者によって販売されており、これらの業者には、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）が含まれる。当該技術分野に知られる、こうした合成の他の手段いずれも、さらに、または別に、使用可能である。自動化合成技術を含む、適切な固相技術が、Ｆ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（監修），  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク（１９９１）に記載される。
【００９５】
オリゴマーおよび単量体修飾
当該技術分野に知られるように、ヌクレオシドは塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。こうした複素環塩基の２つの最も一般的な種類は、プリン類およびピリミジン類である。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合するリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は、該糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部分のいずれに連結することも可能である。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は、互いに、隣接するヌクレオシドと共有結合し、直鎖ポリマー化合物を形成する。次に、この直鎖ポリマー化合物のそれぞれの端をつないで、さらに環状化合物を形成することも可能であるが、直鎖化合物が、一般的に好ましい。さらに、直鎖化合物は、内部核酸塩基相補性を有することも可能であり、そしてしたがって、完全にまたは部分的に二本鎖である化合物を産生する方式でフォールディングすることも可能である。オリゴヌクレオチド内で、リン酸基は、一般的に、ヌクレオシド間連結を形成するか、または糖環と組み合わせて、オリゴヌクレオチドの主鎖を形成すると称される。ＲＮＡおよびＤＮＡの主鎖を構成する通常のヌクレオシド間連結は、３’−５’ホスホジエステル連結である。
【００９６】
修飾ヌクレオシド間連結
本発明に有用な、適切なオリゴマー化合物の特定の例には、修飾連結、例えば非天然存在ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書に定義するように、修飾ヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドには、リン原子を保持するヌクレオシド間連結、およびリン原子を持たないヌクレオシド間連結が含まれる。本明細書の目的のための、そして当該技術分野に時に引用されるような、ヌクレオシド間主鎖にリン原子を持たない修飾オリゴヌクレオチドもまた、オリゴヌクレオシドとみなすことも可能である。
【００９７】
線虫（Ｃ．  ｅｌｅｇａｎｓ）系において、ヌクレオチド間連結の修飾（ホスホロチオエート）は、ＲＮＡｉ活性に有意には干渉しなかった。この観察に基づいて、本発明の特定のオリゴマー化合物もまた、１以上の修飾ヌクレオシド間連結を有することも可能であることが示唆される。適切なリン含有修飾ヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結である。
【００９８】
リン原子を含有する、適切な修飾オリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート類、キラル・ホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類、３’−アルキレンホスホネート類、５’−アルキレンホスホネート類、およびキラル・ホスホネート類を含む、メチルおよび他のアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、３’−アミノホスホロアミデート類およびアミノアルキルホスホロアミデート類を含む、ホスホロアミデート類、チオノホスホロアミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、セレノホスフェート類、並びにボラノホスフェート類であって、通常の３’−５’連結を有する前記修飾オリゴヌクレオチド、これらの２’−５’連結類似体、並びに１以上のヌクレオチド間連結が３’−３’、５’−５’または２’−２’連結である、逆転した極性を有するものが含まれる。逆転した極性を有する、適切なオリゴヌクレオチドは、最も３’のヌクレオチド間連結で、単一の３’−３’連結、すなわち無塩基性である（核酸塩基が失われているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）ことも可能な単一の逆転したヌクレオシド残基を含む。多様な塩、混合塩および遊離酸型もまた、含まれる。
【００９９】
上記のリン含有連結の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１；５，０２３，２４３；５，１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６，０１９；５，２７８，３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５，４６６，６７７；５，４７６，９２５；５，５１９，１２６；５，５３６，８２１；５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；５，１９４，５９９；５，５６５，５５５；５，５２７，８９９；５，７２１，２１８；５，６７２，６９７および５，６２５，０５０が含まれる。
【０１００】
本発明のいくつかの態様において、オリゴマー化合物は、１以上のホスホロチオエートおよび／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（天然ホスホジエステル・ヌクレオチド間連結は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として示される）を有する。ＭＭＩ型ヌクレオシド間連結が、上に引用する米国特許５，４８９，６７７に開示される。適切なアミド・ヌクレオシド間連結が、上に引用する米国特許５，６０２，２４０に開示される。
【０１０１】
リン原子を含まない適切な修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキル・ヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル・ヌクレオシド間連結、あるいは１以上の短鎖ヘテロ原子または複素環ヌクレオシド間連結によって形成される主鎖を有する。これらには、モルホリノ連結を有するもの（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；リボアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖を有するもの；並びに混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
【０１０２】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３５，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，６１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；５，７９２，６０８；５，６４６，２６９および５，６７７，４３９が含まれる。
【０１０３】
いくつかの態様において、オリゴマー化合物のヌクレオシド構成要素は、場合によって保護されるホスホロチオエート・ヌクレオシド間連結によって、互いに連結される。ホスファイト連結、ホスホジエステル連結およびホスホロチオエート連結などのリン含有ヌクレオシド間連結の代表的な保護基には、β−シアノエチル、ジフェニルシリルエチル、δ−シアノブテニル、シアノｐ−キシリル（ＣＰＸ）、Ｎ−メチル−Ｎ−トリフルオロアセチルエチル（ＭＥＴＡ）、アセトキシフェノキシエチル（ＡＰＥ）およびブテン−４−イル基が含まれる。例えば米国特許第４，７２５，６７７号およびＲｅ．３４，０６９（β−シアノエチル）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ４９  Ｎｏ．１０，  ｐｐ．１９２５−１９６３（１９９３）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ４９  Ｎｏ．４６，  ｐｐ．１０４４１−１０４４８（１９９３）；Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｓ．Ｌ．およびＩｙｅｒ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ４８  Ｎｏ．１２，  ｐｐ．２２２３−２３１１（１９９２）を参照されたい。
【０１０４】
オリゴマー擬似体（オリゴヌクレオチド模倣体）
本発明に受け入れられるオリゴマー化合物の別の適切な群には、オリゴヌクレオチド擬似体が含まれる。用語、擬似体は、オリゴヌクレオチドに適用された場合、フラノース環のみ、またはフラノース環およびヌクレオチド間連結の両方が、新規基で置換されているオリゴマー化合物を含むよう意図され、フラノース環のみの置換はまた、当該技術分野において、糖代用物とも称される。複素環塩基部分または修飾複素環塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのため、維持される。こうしたオリゴマー化合物の１つは、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されてきているオリゴヌクレオチド擬似体であって、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡオリゴマー化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖は、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖と置き換えられる。核酸塩基は保持され、そして主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と、直接または間接的に結合される。ＰＮＡオリゴマー化合物の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；および５，７１９，２６２が含まれる。ＰＮＡオリゴマー化合物のさらなる解説を、Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９１，  ２５４，  １４９７−１５００に見出すことも可能である。
【０１０５】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されてきている１つのオリゴヌクレオチド擬似体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物の主鎖は、２以上の連結されたアミノエチルグリシン単位であり、これがＰＮＡにアミド含有主鎖を与える。複素環塩基部分は、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と、直接または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：５，５３９，０８２；５，７１４，３３１；および５，７１９，２６２が含まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる解説を、Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９１，  ２５４，  １４９７−１５００に見出すことも可能である。
【０１０６】
ＰＮＡは、基本的なＰＮＡ構造が最初に調製されて以来、修飾されて、多くの修飾を取り込んできている。基本的な構造を以下に示す：
【０１０７】
【化５】
2007505138.tif 000006
【０１０８】
式中：
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ４は、水素、アミノ保護基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基、レポーター基、コンジュゲート基、α−カルボキシル基を介して、または場合によって、アミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるとき、ω−カルボキシル基を通じて連結されているＤまたはＬ  α−アミノ酸、あるいはカルボキシル基を通じて連結されているＤ、Ｌまたは混合ＤおよびＬアミノ酸由来のペプチドであり、ここで置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから選択される；
Ｔ５は、−ＯＨ、−Ｎ（Ｚ１）Ｚ２、Ｒ５、α−アミノ基を介して、または場合によって、アミノ酸がリジンもしくはオルニチンであるとき、ω−アミノ基を通じて連結されているＤまたはＬ  α−アミノ酸、あるいはアミノ基を通じて連結されているＤ、Ｌまたは混合ＤおよびＬアミノ酸由来のペプチド、化学官能基、レポーター基、あるいはコンジュゲート基であり；
Ｚ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはアミノ保護基であり；
Ｚ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アミノ保護基、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｊ−Ｚ３、α−カルボキシル基を介して、または場合によって、アミノ酸がアスパラギン酸もしくはグルタミン酸であるとき、ω−カルボキシル基を通じて連結されているＤまたはＬ  α−アミノ酸、あるいはカルボキシル基を通じて連結されているＤ、Ｌまたは混合ＤおよびＬアミノ酸由来のペプチドであり；
Ｚ３は、水素、アミノ保護基、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３、ベンジル、ベンゾイル、または−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｈ）Ｚ１であり；
各Ｊは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｒ５はカルボニル保護基であり；そして
ｎは２〜約５０である。
【０１０９】
研究されてきている別の種類のオリゴヌクレオチド模倣体は、モルホリノ環に付着した複素環塩基を有する、連結モルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づく。モルホリノ核酸において、モルホリノ単量体単位を連結する、いくつかの連結基が報告されてきている。１つの種類の連結基は、非イオン性オリゴマー化合物を生じるように選択されてきている。非イオン性のモルホリノに基づくオリゴマー化合物は、細胞性タンパク質と望ましくない相互作用を有する可能性がより低い。モルホリノに基づくオリゴマー化合物は、細胞性タンパク質と望ましくない相互作用を形成する可能性がより低い、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．  ＢｒａａｓｃｈおよびＤａｖｉｄ  Ｒ．  Ｃｏｒｅｙ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２００２，  ４１（１４），  ４５０３−４５１０）。モルホリノに基づくオリゴマー化合物が、米国特許５，０３４，５０６、１９９１年７月２３日発行に開示される。単量体サブユニットをつなぐ、多様な異なる連結基を有する、モルホリノ種のオリゴマー化合物が調製されてきている。
【０１１０】
単量体サブユニットをつなぐ、多様な異なる連結基（Ｌ２）を有する、モルホリノ核酸が調製されてきている。基本的な式を以下に示す：
【０１１１】
【化６】
2007505138.tif 000007
【０１１２】
式中：
Ｔ１は、ヒドロキシルまたは保護されたヒドロキシルであり；
Ｔ５は、水素またはホスフェートまたはホスフェート誘導体であり；
Ｌ２は連結基であり；そして
ｎは２〜約５０である。
【０１１３】
オリゴヌクレオチド擬似体のさらなる種類は、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子に通常存在するフラノース環が、シクロヘニル（ｃｙｃｌｏｈｅｎｙｌ）環で置換される。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホロアミダイト単量体が調製されており、そして古典的なホスホロアミダイト化学反応にしたがって、オリゴマー化合物合成に用いられてきている。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物、およびＣｅＮＡで修飾された特定の位を有するオリゴヌクレオチドが調製され、そして研究されてきている（Ｗａｎｇら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ２０００，  １２２，  ８５９５−８６０２を参照されたい）。一般に、ＤＮＡ鎖にＣｅＮＡ単量体を取り込むと、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性が増加する。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然複合体と類似の安定性で、ＲＮＡ相補体およびＤＮＡ相補体と複合体を形成した。天然核酸構造へのＣｅＮＡ構造の取り込みを研究すると、ＮＭＲおよび円二色法によって、簡単なコンホメーション適応を伴って進行することが示された。さらに、ＲＮＡを標的とする配列にＣｅＮＡを取り込むと、血清に対して安定であり、そして大腸菌ＲＮアーゼを活性化して、標的ＲＮＡ鎖の切断を生じることが可能であった。
【０１１４】
ＣｅＮＡの一般式を以下に示す：
【０１１５】
【化７】
2007505138.tif 000008
【０１１６】
式中：
各Ｂｘは複素環塩基部分であり；
Ｔ１は、ヒドロキシルまたは保護されたヒドロキシルであり；そして
Ｔ２は、ヒドロキシルまたは保護されたヒドロキシルである。
【０１１７】
１以上のアンヒドロヘキシトール・ヌクレオシドから、別の種類のオリゴヌクレオチド擬似体（アンヒドロヘキシトール核酸）を調製することも可能であり（ＷｏｕｔｅｒｓおよびＨｅｒｄｅｗｉｊｎ，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．，  １９９９，  ９，  １５６３−１５６６）、そしてこの擬似体は、一般式：
【０１１８】
【化８】
2007505138.tif 000009
【０１１９】
を有する。
式（アミダイト単量体を示す）：
【０１２０】
【化９】
2007505138.tif 000010
【０１２１】
を有する二環および三環ヌクレオシド類似体を含むように、さらなるオリゴヌクレオチド擬似体が調製されてきている（Ｓｔｅｆｆｅｎｓら，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９９７，  ８０，  ２４２６−２４３９；Ｓｔｅｆｆｅｎｓら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９９，  １２１，  ３２４９−３２５５；およびＲｅｎｎｅｂｅｒｇら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ２００２，  １２４，  ５９９３−６００２を参照されたい）。ホスホロアミダイト・アプローチを用いて、これらの修飾ヌクレオシド類似体がオリゴマー化されてきており、そして三環ヌクレオシド類似体を含有する、生じたオリゴマー化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれ自体にハイブリダイズした際、増加した熱安定性（Ｔｍ）を示してきている。二環ヌクレオシド類似体を含有するオリゴマー化合物は、ＤＮＡ二重鎖のものに近い熱安定性を示してきている。
【０１２２】
別の種類のオリゴヌクレオチド擬似体は、ホスホノモノエステル核酸と称され、主鎖にリン基を取り込む。この種のオリゴヌクレオチド擬似体は、遺伝子発現阻害の分野（アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、センス・オリゴヌクレオチドおよび三重鎖形成オリゴヌクレオチド）で、核酸検出のプローブとして、そして分子生物学で使用する補助剤として、有用な物理的および生物学的および薬理学的特性を有すると報告されている。
【０１２３】
一般式（マーカッシュ変動の定義に関しては：米国特許５，８７４，５５３および６，１２７，３４６を参照されたい）を以下に示す。
【０１２４】
【化１０】
2007505138.tif 000011
【０１２５】
フラノシル環がシクロブチル部分で置換されている、別のオリゴヌクレオチド擬似体が報告されてきている。
修飾糖
本発明のオリゴマー化合物はまた、１以上の置換糖部分を含有することも可能である。適切なオリゴマー化合物は：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；あるいはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであって、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルが、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはＣ２−Ｃ１２アルケニルおよびアルキニルで置換されていることもまたは非置換であることも可能であるもの、から選択される糖置換基を含む。特に適切であるのは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であって、ｎおよびｍが１〜約１０であるものである。他の適切なオリゴヌクレオチドは：Ｃ１−Ｃ１２の低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基、から選択される糖置換基を含む。１つの修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎら，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９９５，  ７８，  ４８６−５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基が含まれる。別の修飾には、以下の実施例に記載するような、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野において、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
【０１２６】
他の糖置換基には、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）およびフルオロ（Ｆ）が含まれる。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であることも可能である。１つの２’−アラビノ修飾は、２’−Ｆである。同様の修飾はまた、オリゴマー化合物上の他の位、特に３’末端ヌクレオシド上のまたは２’−５’連結オリゴヌクレオチド内の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位で行うことも可能である。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖擬似体を有することも可能である。こうした修飾糖構造の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：４，９８１，９５７；５，１１８，８００；５，３１９，０８０；５，３５９，０４４；５，３９３，８７８；５，４４６，１３７；５，４６６，７８６；５，５１４，７８５；５，５１９，１３４；５，５６７，８１１；５，５７６，４２７；５，５９１，７２２；５，５９７，９０９；５，６１０，３００；５，６２７，０５３；５，６３９，８７３；５，６４６，２６５；５，６５８，８７３；５，６７０，６３３；５，７９２，７４７；および５，７００，９２０が含まれ、前記特許のあるものは、本出願と同一所有である。
【０１２７】
さらなる代表的な糖置換基には、式ＩａまたはＩＩａ：
【０１２８】
【化１１】
2007505138.tif 000012
【０１２９】
式中：
Ｒｂは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｒｄは、単結合、Ｏ、ＳまたはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｒｅは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）であるか、または式ＩＩＩａ
【０１３０】
【化１２】
2007505138.tif 000013
【０１３１】
を有し；
ＲｐおよびＲｑは、各々、独立に、水素またはＣ１−Ｃ１２アルキルであり；
Ｒｒは−Ｒｘ−Ｒｙであり；
各Ｒｓ、Ｒｔ、Ｒｕ、およびＲｖは、独立に、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基またはコンジュゲート基であり、ここで置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルから選択される；
あるいは場合によって、ＲｕおよびＲｖは、一緒に、これらが付着する窒素原子を伴って、フタルイミド部分を形成し；
各Ｒｗは、独立に、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニルまたはアリールであり；
Ｒｋは、水素、窒素保護基または−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｐは、水素、窒素保護基または−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｘは、結合または連結部分であり；
Ｒｙは、化学官能基、コンジュゲート基または固体支持体であり；
各ＲｍおよびＲｎは、独立に、Ｈ、窒素保護基、置換または非置換Ｃ１−Ｃ１２アルキル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルケニル、置換または非置換Ｃ２−Ｃ１２アルキニルであり、ここで置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル；ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノおよびアシル、ここで前記アシルは酸アミドまたはエステルである、から選択される；
あるいはＲｍおよびＲｎは、一緒に、窒素保護基であるか、場合によってＮおよびＯから選択されるさらなるヘテロ原子を含む環構造に連結されるか、または化学官能基であり；
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、またはＮ（Ｒｚ）２であり；
各Ｒｚは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）ＲｕまたはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり；
Ｒｆ、ＲｇおよびＲｈは、約４〜約７の炭素原子を有するか、または約３〜約６の炭素原子および１もしくは２のヘテロ原子を有する環系を含み、ここで前記ヘテロ原子は、酸素、窒素、およびイオウから選択され、そして前記環系は、脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、または飽和もしくは不飽和複素環である；
Ｒｊは、１〜約１０の炭素原子を有するアルキルまたはハロアルキル、２〜約１０の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋまたはＣＮであり；
ｍａは１〜約１０であり；
各ｍｂは、独立に、０または１であり；
ｍｃは、０または１〜１０の整数であり；
ｍｄは１〜１０の整数であり；
ｍｅは、０、１、または２であり；そして
但しｍｃが０の場合、ｍｄは１より大きい。
の基が含まれる。
【０１３２】
式Ｉの代表的な置換基が、米国特許出願第０９／１３０，９７３号、１９９８年８月７日出願、標題「キャップ化２’−オキシエトキシ・オリゴヌクレオチド」に開示される。
式ＩＩの代表的な環状置換基が、米国特許出願第０９／１２３，１０８号、１９９８年７月２７日出願、標題「コンホメーション的にあらかじめ編成された、ＲＮＡ標的化２’−オリゴマー化合物」に開示される。
【０１３３】
特に適切な糖置換基には、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３））２、式中、ｎおよびｍは１〜約１０である、が含まれる。
【０１３４】
式ＩＩＩおよびＩＶに示す代表的なグアニジノ置換基は、共有される米国特許出願０９／３４９，０４０、表題「官能化オリゴマー」、１９９９年７月７日出願に開示される。
代表的なアセトアミド置換基が、米国特許６，１４７，２００に開示される。
【０１３５】
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基が、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５、表題「２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル−オリゴマー化合物」、１９９９年８月６日出願に開示される。
【０１３６】
修飾核酸塩基／天然存在核酸塩基
オリゴマー化合物にはまた、核酸塩基（当該技術分野において、しばしば単に「塩基」または「複素環塩基部分」と称される）修飾または置換も含むことも可能である。本明細書において、「非修飾」または「天然」核酸塩基には、プリン塩基、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。本明細書においてまた複素環塩基部分とも称される修飾核酸塩基には、他の合成および天然核酸塩基が含まれ、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン類およびグアニン類、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、並びに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンがある。
【０１３７】
複素環塩基部分にはまた、プリン塩基またはピリミジン塩基が、他の複素環、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンで置換されたものが含まれることも可能である。さらなる核酸塩基には、米国特許３，６８７，８０８に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ８５８−８５９ページ，  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．Ｉ．監修，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら，  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９１，  ３０，  ６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．Ｓ．，  第１５章，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ２８９−３０２ページ，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，  Ｂ．監修，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３に開示されるものが含まれる。これらの核酸塩基の特定のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに特に有用である。これらには、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類、並びにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン類が含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を、０．６〜１．２℃増加させることが示されてきており（Ｓａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．Ｓ．，  Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．Ｔ．およびＬｅｂｌｅｕ，  Ｂ．監修，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  ボカラトン，  １９９３，  ｐｐ．２７６−２７８）、そして現在、適切な塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合、さらにより適している。
【０１３８】
本発明の１つの側面において、１以上の複素環塩基部分の代わりに、多環複素環化合物を有するオリゴマー化合物が調製される。いくつかの三環複素環化合物が、先に報告されている。これらの化合物は、標的鎖への修飾された鎖の結合特性を増加させるため、アンチセンス適用で日常的に用いられる。最も研究されている修飾は、グアノシンを標的とし、したがって、これらはＧ−クランプまたはシチジン類似体と称されている。これらの多環複素環化合物の多くは、一般式：
【０１３９】
【化１３】
2007505138.tif 000014
【０１４０】
を有する。
第二の鎖のグアノシンと３つの水素結合を作成する、代表的なシトシン類似体には、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）（Ｋｕｒｃｈａｖｏｖら，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９７，  １６，  １８３７−１８４６）、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｓ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）（Ｌｉｎ，  Ｋ．−Ｙ．；Ｊｏｎｅｓ，  Ｒ．Ｊ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，  Ｍ．Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９５，  １１７，  ３８７３−３８７４）および６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｆ）（Ｗａｎｇ，  Ｊ．；Ｌｉｎ，  Ｋ．−Ｙ．  Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，  Ｍ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  １９９８，  ３９，  ８３８５−８３８８）が含まれる。オリゴヌクレオチドに取り込まれると、これらの塩基修飾は、相補グアニンとハイブリダイズすることが示され、そして後者はまた、アデニンとハイブリダイズし、そして延長されたスタッキング相互作用によって、らせん熱安定性を増進することも示された（米国特許出願、表題「修飾ペプチド核酸」、２００２年５月２４日出願、第１０／１５５，９２０号；および米国特許出願、表題「ヌクレアーゼ耐性キメラ・オリゴヌクレオチド」、２００２年５月２４日出願、第１０／０１３，２９５号も参照されたい）。
【０１４１】
シトシン類似体／置換が、強固な１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン骨格に付着する、アミノエトキシ部分を有する場合（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１＝−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｒ１２−１４＝Ｈ）、さらなるらせん安定化特性が観察されてきている（Ｌｉｎ，  Ｋ．−Ｙ．；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，  Ｍ．Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １９９８，  １２０，  ８５３１−８５３２）。結合研究によって、単一の取り込みが、その相補標的ＤＮＡまたはＲＮＡへのモデルオリゴヌクレオチドの結合親和性を増進しうることが立証され、これは５−メチルシトシン（ｄＣ５ｍｅ）に比較して、最高１８°のΔＴｍを持ち、これまでに知られる単一修飾の親和性増進の最高である。一方、らせん安定性が増大しても、オリゴヌクレオチドの特異性は損なわれない。Ｔｍデータによって、ｄＣ５ｍｅに比較して、完全マッチ配列およびミスマッチ配列間のより大きな区別が示される。束縛されたアミノ基が、相補グアニンのフーグスティーン面、すなわちＯ６と相互作用する、さらなる水素結合ドナーとして働き、それによって、４つの水素結合を形成することが示唆された。これは、Ｇ−クランプの親和性増加が、延長された塩基スタッキングおよびさらなる特異的水素結合の組み合わせによって仲介されることを意味する。
【０１４２】
本発明に受け入れられる、さらなる三環複素環化合物およびこれらを用いる方法が、米国特許第６，０２８，１８３号、２０００年５月２２日発行、および米国特許第６，００７，９９２号、１９９９年１２月２８日発行に開示される。
【０１４３】
フェノキサジン誘導体の結合親和性が増進されるともに、その配列特異性が損なわれないことから、こうした誘導体は、より強力なアンチセンスに基づく薬剤の開発のため、価値ある核酸塩基類似体となる。実際、フェノキサジン置換を含有する７ヌクレオチドが、ＲＮアーゼＨを活性化し、細胞取り込みを増進し、そして増加したアンチセンス活性を示すことが可能であることを立証する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から、見込みのあるデータが得られている（Ｌｉｎら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９８，  １２０，  ８５３１−８５３２）。活性増進は、Ｇ−クランプの場合、さらにより顕著であり、これは単一置換が、２０量体２’−デオキシホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を有意に改善することが示されたためである（Ｆｌａｎａｇａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９９９，  ９６，  ３５１３−３５１８）。にもかかわらず、オリゴヌクレオチド設計を最適にし、そして生物学的活性に対するこれらの複素環修飾の影響をよりよく理解するため、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性に対する影響を評価することが重要である。
【０１４４】
複素環塩基として有用なさらなる修飾多環複素環化合物が、限定されるわけではないが、上記のＵ．Ｓ．３，６８７，８０８とともに、Ｕ．Ｓ．：４，８４５，２０５；５，１３０，３０２；５，１３４，０６６；５，１７５，２７３；５，３６７，０６６；５，４３２，２７２；５，４３４，２５７；５，４５７，１８７；５，４５９，２５５；５，４８４，９０８；５，５０２，１７７；５，５２５，７１１；５，５５２，５４０；５，５８７，４６９；５，５９４，１２１；５，５９６，０９１；５，６１４，６１７；５，６４５，９８５；５，６４６，２６９；５，７５０，６９２；５，８３０，６５３；５，７６３，５８８；６，００５，０９６；および５，６８１，９４１；並びに米国特許出願第０９／９９６，２９２号、２００１年１１月２８日出願に開示される。
【０１４５】
コンジュゲート
本発明のオリゴマー化合物に付加することも可能な別の置換は、生じるオリゴマー化合物の活性、細胞分布、または細胞取り込みを増進する、１以上の部分またはコンジュゲートの連結を伴う。１つの態様において、こうした修飾オリゴマー化合物は、ヒドロキシル基またはアミノ基などの官能基に、コンジュゲート基を共有結合させることによって調製される。本発明のコンジュゲート基には、挿入剤、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を増進する基、およびオリゴマーの薬物動態特性を増進する基が含まれる。典型的なコンジュゲート基には、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が含まれる。薬力学特性を増進する基には、本発明の関連において、オリゴマー取り込みを改善する基、分解に対するオリゴマー耐性を増進する基、および／またはＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が含まれる。薬物動態特性を増進する基には、本発明の関連において、オリゴマー取り込み、分布、代謝または排出を改善する基が含まれる。代表的なコンジュゲート基は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６、１９９２年１０月２３日出願に開示される。
【０１４６】
コンジュゲート部分には、限定されるわけではないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １９８９，  ８６，  ６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  １９９４，  ４，  １０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １９９２，  ６６０，  ３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔ．，  １９９３，  ３，  ２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９２，  ２０，  ５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １９９１，  １０，  １１１１−１１１８；Ｋａｂａｎｏｖら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  １９９０，  ２５９，  ３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋら，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，  １９９３，  ７５，  ４９−５４）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム  １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６，  ３６５１−３６５４；Ｓｈｅａら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９０，  １８，  ３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９５，  １４，  ９６９−９７３）、あるいはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９５，  ３６，  ３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａら，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １９９５，  １２６４，  ２２９−２３７）、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅら，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．，  １９９６，  ２７７，  ９２３−９３７）が含まれる。
【０１４７】
本発明のオリゴマー化合物を、活性薬剤物質、例えばアスピリン、ワーファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルザルコシン、２，３，５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、フォリン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病剤、抗細菌剤または抗生物質にコンジュゲート化することもまた可能である。オリゴヌクレオチド−薬剤コンジュゲートおよびその調製が、米国特許出願０９／３３４，１３０（１９９９年６月１５日出願）に記載される。
【０１４８】
こうしたオリゴヌクレオチド・コンジュゲートの調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：４，８２８，９７９；４，９４８，８８２；５，２１８，１０５；５，５２５，４６５；５，５４１，３１３；５，５４５，７３０；５，５５２，５３８；５，５７８，７１７；５，５８０，７３１；５，５８０，７３１；５，５９１，５８４；５，１０９，１２４；５，１１８，８０２；５，１３８，０４５；５，４１４，０７７；５，４８６，６０３；５，５１２，４３９；５，５７８，７１８；５，６０８，０４６；４，５８７，０４４；４，６０５，７３５；４，６６７，０２５；４，７６２，７７９；４，７８９，７３７；４，８２４，９４１；４，８３５，２６３；４，８７６，３３５；４，９０４，５８２；４，９５８，０１３；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，０８２，８３０；５，１１２，９６３；５，２１４，１３６；５，２４５，０２２；５，２５４，４６９；５，２５８，５０６；５，２６２，５３６；５，２７２，２５０；５，２９２，８７３；５，３１７，０９８；５，３７１，２４１；５，３９１，７２３；５，４１６，２０３；５，４５１，４６３；５，５１０，４７５；５，５１２，６６７；５，５１４，７８５；５，５６５，５５２；５，５６７，８１０；５，５７４，１４２；５，５８５，４８１；５，５８７，３７１；５，５９５，７２６；５，５９７，６９６；５，５９９，９２３；５，５９９，９２８および５，６８８，９４１が含まれる。
【０１４９】
キメラ・オリゴマー化合物
オリゴマー化合物のすべての位が均質に修飾されていることは必要ではなく、そして実際、上述の修飾の１より多くが、単一のオリゴマー化合物に、またはオリゴマー化合物内のヌクレオシドなどの単一の単量体サブユニットに取り込まれていることさえ可能である。本発明はまた、キメラ・オリゴマー化合物であるオリゴマー化合物も含む。本発明の関連において、「キメラ」オリゴマー化合物または「キメラ」は、各々少なくとも１つの単量体単位、すなわち核酸に基づくオリゴマーの場合、ヌクレオチドで構成される、２以上の化学的に異なる領域を含有する、オリゴマー化合物である。
【０１５０】
キメラ・オリゴマー化合物は、典型的には、ヌクレアーゼ分解に対する増加した耐性、増加した細胞取り込み、および／または標的核酸に対する増加した結合親和性を与えるように修飾されている、少なくとも１つの領域を含有する。オリゴマー化合物のさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することが可能な酵素の基質として働くことも可能である。例として、ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。ＲＮアーゼＨの活性化は、したがって、ＲＮＡ標的の切断を生じ、それによって、遺伝子発現の阻害効率を非常に増進させる。その結果、キメラを用いた場合、例えば同じ標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエート・デオキシオリゴヌクレオチドに比較して、より短いオリゴマー化合物で、匹敵する結果を得ることも、しばしば可能である。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動、および必要な場合、当該技術分野に知られる関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、日常的に検出可能である。
【０１５１】
本発明のキメラ・オリゴマー化合物は、２以上の上述のようなオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド、および／またはオリゴヌクレオチド擬似体の混成構造として形成されることも可能である。こうしたオリゴマー化合物はまた、当該技術分野に、ハイブリッド、ヘミマー、ギャップマーまたは反転ギャップマーと称されてきている。こうしたハイブリッド構造の調製を解説する、代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：５，０１３，８３０；５，１４９，７９７；５，２２０，００７；５，２５６，７７５；５，３６６，８７８；５，４０３，７１１；５，４９１，１３３；５，５６５，３５０；５，６２３，０６５；５，６５２，３５５；５，６５２，３５６；および５，７００，９２２が含まれる。
【０１５２】
３’−エンド修飾
本発明の１つの側面において、オリゴマー化合物には、３’−エンド糖コンホメーションを誘導するように合成的に修飾されたヌクレオシドが含まれる。ヌクレオシドは、複素環塩基、糖部分または両方に、望ましい３’−エンド糖コンホメーションを誘導する、合成修飾を取り込むことも可能である。これらの修飾ヌクレオシドを用いて、ＲＮＡ様ヌクレオシドを模倣して、オリゴマー化合物の特定の特性が増進されうるようにする一方、望ましい３’−エンド・コンホメーション形状が維持されるようにする。ＲＮＡ干渉の必要条件（例えばトリガー）として、ＲＮＡ型二重鎖（Ａ型らせん、主に３’−エンド）への見かけの優先性があり、これは、２’−デオキシ−２’−Ｆ−ヌクレオシドで構成される二重鎖が、線虫系において、ＲＮＡｉ反応を誘発するのに効率的であるようであるという事実によって、部分的に支持される。より安定な３’−エンド・ヌクレオシドを用いることによって増進される特性には、限定されるわけではないが、タンパク質結合、タンパク質解離速度、吸収およびクリアランスの修飾を通じた、薬物動態特性の調節；ヌクレアーゼ安定性とともに化学的安定性の調節；結合親和性およびオリゴマー特異性の調節（酵素とともに相補配列に対する親和性および特異性）；並びにＲＮＡ切断有効性の増加が含まれる。本発明は、Ｃ３’−エンド型コンホメーションを支持するような方式で修飾された１以上のヌクレオシドを有するＲＮＡｉのオリゴマー・トリガーを提供する。
【０１５３】
【化１４】
2007505138.tif 000015
【０１５４】
ヌクレオシド・コンホメーションは、ペントフラノシル糖の２’位、３’位または４’位での置換を含む多様な要因によって影響を受ける。電気陰性置換基は、一般的に、アキシアル位を好み、一方、立体的に制約のある置換基は、一般的に、エクアトリアル位を好む（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｓａｎｇｅｒ，  １９８４，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。以下の図２に例示するように、認識要素として、２’−ＯＨを維持しつつ、３’−エンド・コンホメーションを支持する２’位の修飾が達成可能である（Ｇａｌｌｏら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１），  ５７，  ５７０７−５７１３．  Ｈａｒｒｙ−Ｏ’ｋｕｒｕら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．，  （１９９７），  ６２（６），  １７５４−１７５９およびＴａｎｇら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．（１９９９），  ６４，  ７４７−７５４）。あるいは、３’−エンド・コンホメーション配置を採用して、電気陰性フッ素原子をアキシアル位に配置する、２’デオキシ−２’Ｆ−ヌクレオシド（Ｋａｗａｓａｋｉら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  （１９９３），  ３６，  ８３１−８４１）に例示されるように、２’−ＯＨの欠失によって、３’−エンド・コンホメーションの優先性を達成することも可能である。リボース環の他の修飾、例えば４’−Ｆ修飾ヌクレオシドを生じる４’位での置換（Ｇｕｉｌｌｅｒｍら，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５），  ５，  １４５５−１４６０およびＯｗｅｎら，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．（１９７６），  ４１，  ３０１０−３０１７）、または例えばメタノカルバ（ｍｅｔｈａｎｏｃａｒｂａ）ヌクレオシド類似体を生じる修飾（Ｊａｃｏｂｓｏｎら，  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．（２０００），  ４３，  ２１９６−２２０３およびＬｅｅら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００１），  １１，  １３３３−１３３７）もまた、３’−エンド・コンホメーションに対する優先性を誘導する。類似の方式で、ＲＮＡｉ反応のオリゴマー・トリガーは、コンホメーションがＣ３’−エンド型コンホメーションにロックされた方式で修飾された１以上のヌクレオシド、すなわちロック化核酸（ＬＮＡ、Ｓｉｎｇｈら，  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  （１９９８），  ４，  ４５５−４５６）、およびエチレン架橋核酸（ＥＮＡ、Ｍｏｒｉｔａら，  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２），  １２，  ７３−７６）で構成されることも可能である。本発明に受け入れられる修飾ヌクレオシドの例を以下の表Ｉに示す。これらの実施例は、代表であって、そして包括的ではないことが意味される。
【０１５５】
表Ｉ
【０１５６】
【表１】
2007505138.tif 000016
【０１５７】
分子力学計算、核磁気共鳴分光およびＣＤ測定などの多様な方法によって、修飾ヌクレオシドおよびそのオリゴマーの１つのコンホメーションを概算することも可能である。したがって、ＲＮＡ様コンホメーション、オリゴマーの背景におけるＡ型二重鎖形状を誘導すると予測される修飾が、本発明の修飾オリゴヌクレオチドで使用するために選択される。本発明に受け入れられる、多くの修飾されたヌクレオシドの合成が、当該技術分野に知られる（例えばＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌ  １−３，  Ｌｅｒｏｙ  Ｂ．  Ｔｏｗｎｓｅｎｄ監修，  １９８８，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、および以下の実施例セクションを参照されたい）。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの阻害剤／基質であることが知られるヌクレオシド（例えばＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ）。
【０１５８】
１つの側面において、本発明は、核酸標的に対して、天然ＲＮＡに比較して増進された特性を有するように調製されたオリゴヌクレオチドに関する。標的を同定し、そして標的配列の部分に相補的な、有効な長さおよび配列を有するオリゴヌクレオチドを選択する。選択される配列の各ヌクレオシドは、可能な増進修飾に関して精査される。別の修飾は、３’−エンド・コンホメーション形状を有するヌクレオシドでの、１以上のＲＮＡヌクレオシドの置換であろう。こうした修飾は、天然ＲＮＡに比較して、化学的安定性およびヌクレアーゼ安定性を増進させうる一方、同時に、合成し、そして／またはオリゴヌクレオチドに取り込むのがより安価で、そしてより容易である。選択される配列は、さらに、領域に分割可能であり、そしてキメラ立体配置の結果であることも可能な増進修飾に関して、各領域のヌクレオシドを評価することも可能である。末端ヌクレオシドの１以上に作成することも可能な、好適な修飾がしばしばあるため、５’末端および３’末端にもまた考慮を払う。本発明のオリゴマー化合物には、単一鎖上に、あるいは単数または複数の二本鎖配列の少なくとも１つの５’位上に、少なくとも１つの５’修飾リン酸基を含む。ヌクレオシド間連結、コンジュゲート基、置換糖または塩基、１以上のヌクレオシドのヌクレオシド擬似体での置換、および意図される標的に対して、選択される配列を増進可能な他の修飾いずれかなどのさらなる修飾もまた考慮される。
【０１５９】
ホモ二重鎖核酸のコンホメーション形状を記載するのに用いられる用語は、ＲＮＡに関しては「Ａ型」、そしてＤＮＡに関しては「Ｂ型」である。ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ二重鎖のそれぞれのコンホメーション形状は、核酸繊維のＸ線回折分析から決定された（ＡｒｎｏｔｔおよびＨｕｋｉｎｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．，  １９７０，  ４７，  １５０４）。一般的に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖よりも、より安定であり、そしてより高い融点（Ｔｍ）を有する（Ｓａｎｇｅｒら，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １９８４，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；ニューヨーク州ニューヨーク；Ｌｅｓｎｉｋら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９５，  ３４，  １０８０７−１０８１５；Ｃｏｎｔｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ２５，  ２６２７−２６３４）。ＲＮＡの安定性増加は、いくつかの構造特徴に起因すると考えられているが、最も顕著なのは、Ａ型形状から生じる、改善された塩基スタッキング相互作用である（Ｓｅａｒｌｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９３，  ２１，  ２０５１−２０５６）。ＲＮＡ中に２’ヒドロキシルが存在すると、糖がＣ３’エンド・パッカー（ｐｕｃｋｅｒ）、すなわちノーザン・パッカーとも称されるゆがみに偏向し、これによって二重鎖がＡ型形状を支持するようになる。さらに、ＲＮＡの２’ヒドロキシル基が、水が仲介する水素結合のネットワークを形成して、ＲＮＡ二重鎖を安定化させるのを補助することも可能である（Ｅｇｌｉら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９６，  ３５，  ８４８９−８４９４）。一方、デオキシ核酸は、Ｃ２’エンド糖パッカー、すなわちサザン・パッカーとも称される、を選択し、これは、より安定でないＢ型形状を与えると考えられる（Ｓａｎｇｅｒ，  Ｗ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  ニューヨーク州ニューヨーク）。本明細書において、Ｂ型形状は、Ｃ２’−エンド・パッカーおよびＯ４’−エンド・パッカー両方を包含する。これは、Ｂ型二重鎖を生じるフラノース・コンホメーションを考慮する際は、Ｏ４’−エンド・パッカーの貢献もまた考慮すべきであることを指摘する、Ｂｅｒｇｅｒら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９８，  ２６，  ２４７３−２４８０と一致する。
【０１６０】
しかし、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重鎖は、通常、純粋なＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖よりも安定でなく、そして配列に応じて、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖より安定であることも、また安定でないこともありうる（Ｓｅａｒｌｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，  １９９３，  ２１，  ２０５１−２０５６）。ハイブリッド二重鎖の構造は、Ａ型およびＢ型形状の中間であり、劣ったスタッキング相互作用を生じうる（Ｌａｎｅら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １９９３，  ２１５，  ２９７−３０６；Ｆｅｄｏｒｏｆｆら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９３，  ２３３，  ５０９−５２３；Ｇｏｎｚａｌｅｚら，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９５，  ３４，  ４９６９−４９８２；Ｈｏｒｔｏｎら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９６，  ２６４，  ５２１−５３３）。標的ＲＮＡおよび合成配列間に形成される二重鎖安定性は、限定されるわけではないが、アンチセンスおよびＲＮＡ干渉などの療法の中核となり、これはこれらの機構が、ＲＮＡ標的鎖への合成オリゴヌクレオチド鎖の結合を必要とするためである。アンチセンスの場合、ｍＲＮＡの有効な阻害には、アンチセンスＤＮＡがｍＲＮＡと非常に高い結合親和性を有することが必要である。そうでなければ、合成オリゴヌクレオチド鎖および標的ｍＲＮＡ鎖の間の望ましい相互作用が、まれにしか起こらず、有効性が減少するであろう。
【０１６１】
１つの日常的に用いられる糖パッカリングの修飾法は、糖形状に影響を及ぼす置換基での、糖の２’位の置換である。環コンホメーションに対する影響は、２’位の置換基の性質に依存する。糖パッカリング効果を決定するため、いくつかの異なる置換基が研究されてきている。例えば、２’−ハロゲンが研究されてきており、２’−フルオロ誘導体がＣ３’−エンド型の最大集団（６５％）を示し、そして２’−ヨードが最低集団（７％）を示すことが示されている。アデノシン（２’−ＯＨ）対デオキシアデノシン（２’−Ｈ）の集団は、それぞれ３６％および１９％である。さらに、アデノシン二量体の２’−フルオロ基（２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン−２’−デオキシ−２’−フルオロ−アデノシン）の影響は、スタッキングされるコンホメーションの安定化とさらに相関する。
【０１６２】
予期されるように、２’−ＯＨ基を２’−Ｆ基で置換することによって、相対的二重鎖安定性を増進して、それによってＣ３’−エンド集団を増加させることも可能である。２’−Ｆ結合が非常に極性の性質であり、そしてＣ３’−エンド・パッカリングを非常に優先することから、スタッキングされるコンホメーションが、Ａ型二重鎖に安定化されうると推測される。ＵＶ淡色効果、円二色法、および１Ｈ  ＮＭＲのデータもまた、ハロ置換基の電気陰性度が減少するにつれて、スタッキングの度合いが減少することを示す。さらに、糖部分の２’位の立体バルクは、Ｂ型二重鎖よりもＡ型二重鎖によりよく適合する。したがって、二ヌクレオシド一リン酸の３’末端上の２’置換基は、スタッキング・コンホメーションにいくつかの影響を発揮すると考えられる：立体反発作用、フラノース・パッカリング優先性、静電反発作用、疎水性誘引、および水素結合能。これらの置換基の影響は、置換基の分子の大きさ、電気陰性度、および疎水性によって決定されると考えられる。相補鎖の融点もまた、２’置換アデノシン二リン酸で増加する。コンホメーションの３’−エンド優先性または置換基の存在が、結合増加に関与するかどうかは明らかでない。しかし、隣接する塩基の重複（スタッキング）の増大は、３’−エンド・コンホメーションを用いて達成可能である。
【０１６３】
ヌクレアーゼ耐性を増加させ、そしてヌクレオチドへの非常に高い結合親和性を生じさせる、１つの合成２’修飾は、２−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）側鎖である（Ｂａｋｅｒら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９７，  ２７２，  １１９４４−１２０００）。２’−ＭＯＥ置換が直ちに生じる利点の１つは、結合親和性の改善であり、これは、多くの類似の２’修飾、例えばＯ−メチル、Ｏ−プロピル、およびＯ−アミノプロピルよりも大きい。２’−Ｏ−メトキシエチル置換基を有するオリゴヌクレオチドもまた、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることが示されてきており、これはｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に見込みがある特徴を伴う（Ｍａｒｔｉｎ，  Ｐ．，  Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ，  １９９５，  ７８，  ４８６−５０４；Ａｌｔｍａｎｎら，  Ｃｈｉｍｉａ，  １９９６，  ５０，  １６８−１７６；Ａｌｔｍａｎｎら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．，  １９９６，  ２４，  ６３０−６３７；およびＡｌｔｍａｎｎら，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９７，  １６，  ９１７−９２６）。ＤＮＡに比較して、２’−ＭＯＥ修飾を有するオリゴヌクレオチドは、改善されたＲＮＡ親和性およびより高いヌクレアーゼ耐性を示す。ウィング・ヌクレオシドに２’−ＭＯＥ置換基を、そしてデオキシ−ホスホロチオエート・ヌクレオチドの内部領域を有するキメラ・オリゴヌクレオチド（ギャップ化オリゴヌクレオチドまたはギャップマーとも称される）は、低用量で、動物モデルにおける腫瘍増殖の有効な減少を示した。２’−ＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドはまた、いくつかの疾患状態において、アンチセンス剤として、顕著な見込みを示している。１つのこうしたＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドが、現在、ＣＭＶ網膜炎治療の臨床試験において、研究されている。
【０１６４】
化学的性質の定義
本明細書において、別に定義しない限り、アルキルは、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ８、またはＣ１−Ｃ６の直鎖または（可能な場合）分枝鎖脂肪族ヒドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ）を意味する。
【０１６５】
本明細書において、別に定義しない限り、ヘテロアルキルは、鎖の末端部分を含めて、鎖中に少なくとも１つまたは約１〜約３のヘテロ原子を含有する、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ８、またはＣ１−Ｃ６の直鎖または（可能な場合）分枝鎖脂肪族ヒドロカルビルを意味する。適切なヘテロ原子には、Ｎ、ＯおよびＳが含まれる。
【０１６６】
本明細書において、別に定義しない限り、シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１２、Ｃ３−Ｃ８、またはＣ３−Ｃ６の脂肪族ヒドロカルビル環を意味する。
本明細書において、別に定義しない限り、アルケニルは、直鎖または（可能な場合）分枝鎖ヒドロカルビル部分であることも可能であり、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有する、Ｃ２−Ｃ１２、Ｃ２−Ｃ８、またはＣ２−Ｃ６のアルケニルを意味する。
【０１６７】
本明細書において、別に定義しない限り、アルキニルは、直鎖または（可能な場合）分枝鎖ヒドロカルビル部分であることも可能であり、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有する、Ｃ２−Ｃ１２、Ｃ２−Ｃ８、またはＣ２−Ｃ６のアルキニルを意味する。
【０１６８】
本明細書において、別に定義しない限り、ヘテロシクロアルキルは、少なくとも３つの環員を含有し、そのうちの少なくとも１つが炭素であり、そしてそのうちの１、２または３つの環員が炭素以外である、環部分を意味する。炭素原子の数は、１〜約１２、または１〜約６の間で多様であることも可能であり、そして環員の総数は、３〜約１５、または約３〜約８の間で多様であることも可能である。適切な環ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳである。適切なヘテロシクロアルキル基には、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、ホモモルホリノ、ホモチオモルホリノ、ピロロジニル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイミダゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソキサゾリル、テトラヒドロピラゾリル、フラニル、ピラニル、およびテトラヒドロイソチアゾリルが含まれる。
【０１６９】
本明細書において、別に定義しない限り、アリールは、少なくとも１つのアリール環を含有する炭化水素環構造いずれも意味する。適切なアリール環は、約６〜約２０の環炭素を有する。適切なアリール環には、フェニル、ナフチル、アントラセニル、およびフェナントレニルが含まれる。
【０１７０】
本明細書において、別に定義しない限り、ヘタリールは、少なくとも１つの完全に不飽和である環であって、炭素および非炭素原子からなる前記環を含有する環部分を意味する。環系は、約１〜約４の環を含有することも可能である。炭素原子の数は、１〜約１２、または１〜約６の間で多様であることも可能であり、そして環員の総数は、３〜約１５、または約３〜約８の間で多様であることも可能である。適切な環ヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳである。適切なヘタリール部分には、限定されるわけではないが、ピラゾリル、チオフェニル、ピリジル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジニル、プリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾチオフェニル等が含まれる。
【０１７１】
本明細書において、別に定義しない限り、部分が、化合物部分、例えばヘタリールアルキル（ヘタリールおよびアルキル）、アラルキル（アリールおよびアルキル）等として定義される場合、下位部分の各々は、本明細書に定義するとおりである。
【０１７２】
本明細書において、別に定義しない限り、電子求引基は、付着している炭素から電荷を求引する基、例えばシアノ基またはイソシアナート基である。注目すべき他の電子求引基には、その電気陰性度が、炭素のものを超える、例えばハロゲン、ニトロ、あるいは１以上のシアノ基、イソチオシアナート基、ニトロ基またはハロ基でオルト位またはパラ位が置換されたフェニルが含まれる。
【０１７３】
本明細書において、別に定義しない限り、用語、ハロゲンおよびハロは、通常の意味を有する。適切なハロ（ハロゲン）置換基は、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩである。
前述の場合による置換基は、本明細書において、別に定義しない限り、望ましい特性に応じて適切な置換基である。含まれるのは、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アルキル、アルケニル、およびアルキニル部分、ＮＯ２、ＮＨ３（置換および非置換）、酸部分（例えば−ＣＯ２Ｈ、−ＯＳＯ３Ｈ２など）、ヘテロシクロアルキル部分、ヘタリール部分、アリール部分等である。先行する式のすべてにおいて、波線（〜）は、５’−ホスフェートの酸素またはイオウへの結合を示す。
【０１７４】
ホスフェート保護基には、ＵＳ特許、ＵＳ  ５，７６０，２０９、ＵＳ  ５，６１４，６２１、ＵＳ  ６，０５１，６９９、ＵＳ  ６，０２０，４７５、ＵＳ  ６，３２６，４７８、ＵＳ  ６，１６９，１７７、ＵＳ  ６，１２１，４３７、ＵＳ  ６，４６５，６２８に記載されるものが含まれる。
【０１７５】
本発明は、二環糖部分を含む新規ヌクレオシド、およびこうしたヌクレオシドを少なくとも１つ含むオリゴマー化合物を開示する。二環糖部分は、天然ＲＮＡヌクレオシドと関連する望ましくない特性のいくつかを伴わず、ＲＮＡ様の、Ａ型を有するヌクレオシドを提供する、ロック化３’−エンド糖コンホメーションを有する。直ちに生じる利点の１つは、ロック化、例えば二環糖ヌクレオシドでＲＮＡヌクレオシドを置換することによって得られる、ヌクレアーゼ安定性である。二環糖修飾ヌクレオシドはまた、ＬＮＡに関して先に報告されている結合親和性の増進を有するとも期待される（修飾あたり３〜８℃）。
【０１７６】
本発明のヌクレオシドは、２’位から４’位に架橋を有し、これは、以下の構造Ｉに示すような−Ｑ１−Ｑ２−Ｑ３−によって定義される。
【０１７７】
【化１５】
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【０１７８】
式中：
Ｂｘは複素環塩基部分であり；
各ＴａおよびＴｂは、独立に、Ｈ、ヒドロキシル保護基、活性化リン部分、コンジュゲート基または支持体への共有結合であり；
−Ｑ１−Ｑ２−Ｑ３−は、−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ１）−ＣＨ２−、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ１）−またはＮ（Ｒ１）−Ｏ−ＣＨ２−であり；そして
Ｒ１は、Ｃ１−Ｃ１２アルキルまたはアミノ保護基である。
【０１７９】
本発明はまた、構造Ｉの二環糖部分を有する少なくとも１つのヌクレオシドを有するオリゴマー化合物も提供する。構造Ｉのヌクレオシドを用いて、オリゴマー化合物の特性を修飾することも可能である。こうしたヌクレオシドを、単一の位または複数の位で、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドに入れて、ヘミマー、ブロックマー、ギャップマー、またはさらなる複雑な交互のオリゴマー化合物またはキメラ・オリゴマー化合物を生成することも可能である。構造Ｉを有するヌクレオシドを用いて、さらなる複雑な化学特性を含む、オリゴマー化合物の特性を修飾して、本質的にオリゴヌクレオチド模倣体であるオリゴマー化合物、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸、ロック化核酸（ＬＮＡおよびＥＮＡ）、二環および三環核酸、ホスホノモノエステル核酸およびシクロブチル核酸を調製することも可能である。
【０１８０】
本発明の組成は、カップリング反応において、活性化リン組成物（例えば活性化リン含有置換基を有する化合物）の使用を例示する。本明細書において、用語「活性化リン組成物」には、別の単量体またはオリゴマー化合物のヒドロキシル基と反応性である、活性化リン含有置換基を有し、リン含有ヌクレオチド間連結を形成する、単量体およびオリゴマー化合物が含まれる。こうした活性化リン基は、ＰＩＩＩ原子価状態の活性化リン原子を含有し、そして当該技術分野に知られ、そして限定されるわけではないが、ホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスフェートトリエステルおよびキラル補助基が含まれる。１つの合成固相合成は、活性化ホスフェートとしてホスホロアミダイトを利用する。ホスホロアミダイトは、ＰＩＩＩの化学的性質を利用する。続いて、既知の方法を用いて、中間体ホスファイト化合物をＰＶ状態に酸化して、いくつかの態様において、ホスホジエステルまたはホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を得る。さらなる活性化ホスフェートおよびホスファイトが、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｒｅｐｏｒｔ第３０９号（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＩｙｅｒ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９９２，  ４８，  ２２２３−２３１１）に開示される。
【０１８１】
活性化リン基は、限定されるわけではないが、オリゴヌクレオシドおよびオリゴヌクレオチドとともに、塩基または糖あるいは両方が他の基で修飾されたかまたは他の基とコンジュゲート化したオリゴヌクレオチドを含む、広い範囲のオリゴマー化合物の調製に有用である。やはり含まれるのは、限定されるわけではないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ核酸、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）、アンヒドロヘキシトール核酸、ロック化核酸（ＬＮＡおよびＥＮＡ）、二環および三環核酸、ホスホノモノエステル核酸、およびシクロブチル核酸を含むオリゴヌクレオチド擬似体である。活性化リン基と反応性ヒドロキシル基のカップリングを利用する、１つの種類のオリゴマー合成の代表的な例は、広く用いられるホスホロアミダイト・アプローチである。適切な条件下で、ホスホロアミダイト・シントンを反応性ヒドロキシル基と反応させて、ホスファイト連結を形成し、これをさらに、ホスホジエステル連結またはホスホロチオエート連結に酸化する。このアプローチは、一般的に、式：
【０１８２】
【化１６】
2007505138.tif 000018
【０１８３】
式中：
Ｂｘ’は、場合によって保護された複素環塩基部分であり；
Ｒ１’は、独立に、Ｈまたは場合によって保護された糖置換基であり；
Ｔ３’は、Ｈ、ヒドロキシル保護基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、またはオリゴヌクレオチドであり；
Ｌ１はＮ（Ｒ１）Ｒ２であり；
Ｒ１およびＲ２は、独立に、Ｃ１−Ｃ１２直鎖または分枝鎖アルキルであり；
あるいはＲ１およびＲ２は、一緒に連結されて、Ｒ１およびＲ２が付着する窒素原子を含む、４〜７員複素環系を形成し、ここで環系は、場合によって、Ｏ、ＮおよびＳから選択される、少なくとも１つのさらなるヘテロ原子を含む；
Ｌ２は、Ｐｇ−Ｏ−、Ｐｇ−Ｓ−、Ｃ１−Ｃ１２直鎖または分枝鎖アルキル、ＣＨ３（ＣＨ２）０−１０−Ｏ−または−ＮＲ５Ｒ６であり；
Ｐｇは、保護／ブロッキング基であり；そして
Ｒ５およびＲ６は、独立に、水素、Ｃ１−Ｃ１２直鎖または分枝鎖アルキル、シクロアルキルまたはアリールであるか；
あるいは場合によって、Ｒ５およびＲ６は、これらが付着する窒素原子と一緒に、Ｏ、ＳおよびＮから選択される、さらなるヘテロ原子を含むことも可能な環状部分を形成し；あるいは
Ｌ１およびＬ２は、Ｌ１およびＬ２が付着するリン原子と一緒に、キラル補助基を形成する
のヌクレオシド・ホスホロアミダイトを利用する。
【０１８４】
酸化の前および後にヌクレオチド間連結のリン原子に付着する基（Ｌ１およびＬ２）は、モルホリンなどの、窒素含有環状部分を含むことも可能である。こうした酸化ヌクレオシド間連結には、ホスホロモルホリドチオエート連結が含まれる（Ｗｉｌｋら，  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，  １９９１，  １０，３１９−３２２）。本発明に受け入れられる、さらなる環状部分には、オキソ、アシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アミノ、アミド、アジド、アリール、ヘテロアリール、カルボン酸、シアノ、グアニジノ、ハロ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、ヒドラジノ、ＯＤＭＴ、アルキルスルホニル、ニトロ、スルフィド、スルホン、スルホンアミド、チオールおよびチオアルコキシなどの基で置換されていることも可能な、単環、二環または三環部分が含まれる。窒素を含む適切な二環構造は、フタルイミドである。
【０１８５】
ハイブリダイゼーション
本発明の関連において、「ハイブリダイゼーション」は、オリゴマー化合物の相補鎖の対形成を意味する。本発明において、対形成の１つの機構は、オリゴマー化合物の鎖の相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基（核酸塩基）間の、ワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン水素結合であることも可能な水素結合を伴う。例えば、アデニンおよびチミンは、水素結合の形成を通じて対形成する、相補的核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、多様な環境下で起こることも可能である。
【０１８６】
アンチセンス・オリゴマー化合物は、該化合物の標的核酸への結合が、標的核酸の正常な機能に干渉して、活性損失を生じ、そして特異的結合が望ましい条件下、すなわちｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは療法処置の場合は生理学的条件下、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合は、アッセイが行われる条件下で、非標的核酸配列へのアンチセンス・オリゴマー化合物の非特異的結合を回避するために十分な度合いで相補性であるならば、特異的にハイブリダイズ可能である。
【０１８７】
本発明において、句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」は、本発明のオリゴマー化合物が、標的配列にハイブリダイズするが、最も少数の他の配列にしかハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる環境で多様であろうし、そして本発明の関連において、オリゴマー化合物が標的配列にハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、オリゴマー化合物の性質および組成、並びに該化合物を調べるアッセイによって、決定される。
【０１８８】
「相補的」は、本明細書において、２つの核酸塩基がどこに位置するかにかかわらず、２つの核酸塩基の正確な対形成の能力を指す。例えば、オリゴマー化合物の特定の位の核酸塩基が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子である標的核酸の特定の位の核酸塩基と水素結合することが可能である場合、該オリゴヌクレオチドおよび該標的核酸間の水素結合の位は、相補的な位であるとみなされる。各分子において、十分な数の相補的な位が、互いに水素結合することが可能な核酸塩基で占められている場合、オリゴマー化合物およびさらなるＤＮＡ、ＲＮＡ、またはオリゴヌクレオチド分子は互いに相補的である。したがって、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、安定で、そして特異的な結合が、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸間で起こるような、十分な数の核酸塩基に渡る、十分な度合いの正確な対形成または相補性を示すのに用いられる用語である。
【０１８９】
アンチセンス・オリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸と１００％相補的である必要はないことが、当該技術分野に理解されている。さらに、オリゴヌクレオチドは、間にあるセグメントまたは隣接するセグメントがハイブリダイゼーション事象に関与しないように、１以上のセグメントに渡ってハイブリダイズすることも可能である（例えばループ構造またはヘアピン構造）。本発明のオリゴマー化合物は、標的とする標的核酸配列内の標的領域に、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の配列相補性を含むことも可能である。例えば、アンチセンス・オリゴマー化合物の２０核酸塩基のうち１８が標的領域に相補的であり、そしてしたがって特異的にハイブリダイズする、アンチセンス・オリゴマー化合物は、９０％の相補性に相当するであろう。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、クラスター化されていることも、または相補核酸塩基の中に散在していることも可能であり、そして互いにまたは相補的核酸塩基に対して隣接している必要はない。こうしたものとして、標的核酸と完全な相補性を持つ２つの領域が隣接する、４つの非相補核酸塩基を有する、長さ１８の核酸塩基であるアンチセンス・オリゴマー化合物は、標的核酸と、全体で７７．８％の相補性を有し、そしてしたがって、本発明の範囲に属するであろう。当該技術分野に知られるＢＬＡＳＴプログラム（基本的局所並列検索ツール）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９９０，  ２１５，  ４０３−４１０；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，  １９９７，  ７，  ６４９−６５６）を用いて、アンチセンス・オリゴマー化合物と、標的核酸の領域の相補性パーセントを日常的に決定することも可能である。
【０１９０】
本発明の標的
本発明の関連において、特定の核酸分子へのアンチセンス・オリゴマー化合物の「標的化」は、多段階プロセスであることも可能である。該プロセスは、通常、その機能を調節すべき核酸配列の同定で始まる。この標的核酸は、例えば、その発現が特定の障害または疾患状態と関連する細胞性遺伝子（または該遺伝子から転写されるｍＲＮＡ）、あるいは感染性病原体由来の核酸分子であることも可能である。
【０１９１】
標的化プロセスは、通常、望ましい効果、例えばタンパク質調節が生じるであろうように、アンチセンス相互作用が起こるための、標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、セグメント、または部位の決定もまた含む。本発明の関連内で、用語「領域」は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能、または特性を有する標的核酸の部分と定義される。標的核酸の領域内にセグメントがある。「セグメント」は、標的核酸内のより小さい部分または領域の下位部分と定義される。「部位」は、本発明において、標的核酸内の位置と定義される。用語、領域、セグメント、および部位はまた、本発明のオリゴマー化合物、例えば３つの別個のセグメントを有するギャップ化オリゴマー化合物を記載するのにも使用可能である。
【０１９２】
当該技術分野に知られるように、翻訳開始コドンは、典型的には、５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子において；対応するＤＮＡ分子では５’−ＡＴＧ）であるため、翻訳開始コドンはまた、「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」または「ＡＵＧ開始コドン」とも称される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列、５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧまたは５’−ＣＵＧを有する翻訳開始コドンを有し、そして５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧおよび５’−ＣＵＧがｉｎ  ｖｉｖｏで機能することが示されてきている。したがって、用語「翻訳開始コドン」および「開始コドン」は、各例のイニシエーターアミノ酸が、典型的にはメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）であっても、多くのコドン配列を含むことも可能である。真核遺伝子および原核遺伝子が、２以上の代替開始コドンを有する可能性もあり、そのいずれか１つが、特定の細胞種または組織において、あるいは一組の特定の条件下で、翻訳開始に優先的に利用される可能性もあることもまた当該技術分野に知られる。本発明の関連において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、こうしたコドンの配列（単数または複数）に関わらず、核酸標的をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳を開始するのに、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いられる、単数または複数のコドンを指す。遺伝子の翻訳終結コドン（または「終止コドン」）は、３つの配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、それぞれ、５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡである）の１つを有することも可能であることもまた、当該技術分野に知られる。
【０１９３】
用語「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからどちらかの方向（すなわち５’または３’）の約２５〜約５０の隣接するヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を指す。同様に、用語「終止コドン領域」および「翻訳終結コドン領域」は、翻訳終結コドンからどちらかの方向（すなわち５’または３’）の約２５〜約５０の隣接するヌクレオチドを含むｍＲＮＡまたは遺伝子の部分を指す。その結果、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「終止コドン領域」（または「翻訳終結コドン領域」）は、本発明のオリゴマー化合物で有効に標的化可能な、すべての領域である。
【０１９４】
翻訳開始コドンおよび翻訳終結コドンの間の領域を指すことが当該技術分野に知られるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コード領域」もまた、有効に標的化可能な領域である。本発明の関連内で、適切な領域は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始コドンまたは終結コドンを含む、遺伝子内領域である。
【０１９５】
他の標的領域には、翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野に知られ、そしてしたがってｍＲＮＡの５’キャップ部位および翻訳開始コドンの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、並びに翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡの部分を指すことが当該技術分野に知られ、そしてしたがってｍＲＮＡの翻訳終結コドンおよび３’端の間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応するヌクレオチド）を含む、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）が含まれる。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−５’三リン酸連結を介して、ｍＲＮＡの最も５’の残基に連結している、Ｎ７−メチル化グアノシン残基を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体とともに、キャップ部位に隣接する最初の５０ヌクレオチドを含むとみなされる。５’キャップ領域もまた、標的とするのに適切である。
【０１９６】
直接翻訳される真核ｍＲＮＡ転写物もあるが、多くは、翻訳される前に転写物から切除される「イントロン」として知られる、１以上の領域を含有する。残った（そしてしたがって翻訳される）領域は、「エクソン」として知られ、そして一緒にスプライシングされ、連続するｍＲＮＡ配列を形成する。スプライシング部位、すなわちイントロン−エクソン接合部またはエクソン−イントロン接合部の標的化もまた、異常なスプライシングが疾患に関連付けられている状況、または特定のスプライシング産物の過剰発現が疾患に関連付けられている状況で、特に有用でありうる。再編成または欠失による異常な融合接合部もまた適切な標的部位である。異なる遺伝子供給源から、２つ（以上）のｍＲＮＡのスプライシングのプロセスを介して産生されるｍＲＮＡ転写物が、「融合転写物」として知られる。例えばＤＮＡまたはプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンス・オリゴマー化合物を用いて、イントロンを有効に標的化可能であることもまた知られる。
【０１９７】
当該技術分野において、代替ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡの同一ゲノム領域から産生可能であることもまた知られる。これらの代替転写物は、一般的に、「変異体」として知られる。より具体的には、「プレｍＲＮＡ変異体」は、同一ゲノムＤＮＡから産生される転写物であって、同一ゲノムＤＮＡから産生される他の転写物と、開始位置または停止位置のいずれかが異なり、そしてイントロン配列およびエクソン配列両方を含有する、前記転写物である。
【０１９８】
スプライシング中の１以上のエクソン領域またはイントロン領域、あるいはその一部の切除に際して、プレｍＲＮＡ変異体は、より小さい「ｍＲＮＡ変異体」を産生する。その結果、ｍＲＮＡ変異体は、プロセシングされたプレｍＲＮＡであり、そしてユニークな各プレｍＲＮＡ変異体は、常に、スプライシングの結果、ユニークなｍＲＮＡ変異体を産生するはずである。これらのｍＲＮＡ変異体はまた、「選択的スプライシング変異体」としても知られる。プレｍＲＮＡ変異体のスプライシングがまったく起こらないのであれば、プレｍＲＮＡ変異体は、ｍＲＮＡ変異体と同一である。
【０１９９】
当該技術分野において、変異体が、転写を開始するかまたは停止する代替シグナルの使用を通じて、産生可能であり、そしてプレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡが、１より多い開始コドンまたは停止コドンを有しうることもまた、当該技術分野に知られる。代替開始コドンを用いて、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡから生じる変異体は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替開始変異体」として知られる。代替停止コドンを用いる転写物は、そのプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「代替停止変異体」として知られる。１つの特別な種類の代替停止変異体は、「ポリＡ変異体」であり、ここでは、産生される多数の転写物が、転写機構による「ポリＡ停止シグナル」の１つの代替選択から生じ、それによって、ユニークなポリＡ部位で終結する転写物を産生する。本発明の関連内で、本明細書に記載する種類の変異体もまた、適切な標的核酸である。
【０２００】
オリゴマー化合物がハイブリダイズする標的核酸上の位置は、本明細書において、以下、「適切な標的セグメント」と称される。本明細書において、用語「適切な標的セグメント」は、活性オリゴマー化合物が標的とする標的領域の少なくとも８核酸塩基部分と定義される。理論に束縛されることは望ましくないが、これらの標的セグメントは、現在、ハイブリダイゼーションのため接近可能な標的核酸部分に相当すると考えられる。
【０２０１】
典型的で適切なオリゴマー化合物には、標的核酸、例えば細胞性遺伝子または該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの５’末端から少なくとも８つの隣接核酸塩基を含むオリゴマー化合物が含まれる（残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能な化合物の５’末端のすぐ上流から始まって、そしてオリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続ストレッチである）。さらなる適切なオリゴマー化合物は、例示化合物の１つの３’末端から少なくとも８つの隣接核酸塩基を含むオリゴヌクレオチド配列に代表される（残りの核酸塩基は、標的核酸に特異的にハイブリダイズ可能な化合物の３’末端のすぐ下流から始まって、そしてオリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含有するまで続く、同じオリゴヌクレオチドの連続ストレッチである）。本明細書に例示する適切な化合物を手にした当業者は、過度な実験を伴わずに、さらなるオリゴマー化合物を同定可能であろう。
【０２０２】
ひとたび１以上の標的領域、セグメントまたは部位が同定されてきたら、標的に十分に相補的な、すなわち十分によく、そして十分な特異性でハイブリダイズし、望ましい効果を与える、オリゴマー化合物を選択する。
【０２０３】
本発明の１つの態様にしたがって、本発明のオリゴマー化合物およびその相補体を含む、一連の核酸二重鎖を、単数または複数の特定の標的のため、設計することも可能である。１以上の天然または修飾核酸塩基を付加することによって、鎖の末端を修飾して、突出部を形成することも可能である。次いで、アンチセンス鎖の相補体として、二重鎖のセンス鎖を設計し、そして合成し、そしてまたセンス鎖は、いずれの末端にも、修飾または付加を含有することも可能である。例えば、１つの態様において、二重鎖の両方の鎖は、中央部の核酸塩基に渡って相補的であり、各々、一方または両方の末端に突出部を有する。
【０２０４】
例えば、配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列番号１）を有し、そしてデオキシチミジン（ｄＴ）の２核酸塩基突出部を有する、アンチセンス・オリゴマー化合物を含む二重鎖は、以下の構造：
【０２０５】
【化１７】
2007505138.tif 000019
【０２０６】
を有するであろう。
本明細書に開示する方法によって、二重鎖のＲＮＡ鎖を合成することも可能であるし、または例えばＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（コロラド州ラファイエット）などの多様なＲＮＡ合成企業から購入することも可能である（以下のＲＮＡ合成に関するセクションも参照されたい）。ひとたび合成したら、相補鎖をアニーリングする。一本鎖をアリコットし、そして５０μＭの濃度に希釈する。ひとたび希釈したら、３０μｌの各鎖を１５μｌのアニーリング緩衝液の５ｘ溶液と合わせる。緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、および２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終量は７５μｌである。この溶液を９０℃で１分間インキュベーションし、そして次いで１５秒間遠心分離する。試験管を３７℃で１時間静置し、この時点で、ｄｓＲＮＡ二重鎖を実験に用いる。ｄｓＲＮＡ化合物の最終濃度は２０μＭである。この溶液を凍結して（−２０℃）保存するか、または最大５回まで凍結融解する。
【０２０７】
ひとたび調製したら、標的発現を調節する能力に関して、望ましい合成二重鎖を評価する。細胞が８０％集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達したら、本発明の少なくとも１つのオリゴマー化合物を含む合成二重鎖で、これらを処理する。９６ウェルプレートで増殖させた細胞に関しては、ウェルを２００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１血清減少培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で１回洗浄し、そして次いで、１２μｇ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および最終濃度２００ｎＭの望ましいｄｓＲＮＡ化合物を含有する１３０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理する。５時間処理した後、培地を新鮮な培地と交換する。処理１６時間後、細胞を採取し、この時点でＲＮＡを単離し、そしてＲＴ−ＰＣＲによって標的減少を測定する。
【０２０８】
別の態様において、本明細書に同定される「適切な標的セグメント」を、標的発現を調節するさらなるオリゴマー化合物のスクリーニングに使用することも可能である。「調節剤」は、標的をコードする核酸分子の発現を減少させるかまたは増加させ、そして適切な標的セグメントに相補的な、少なくとも８つの核酸塩基部分を含む、オリゴマー化合物である。スクリーニング法は、標的をコードする核酸分子の適切な標的セグメントと、１以上の候補調節剤を接触させ、そして標的をコードする核酸分子の発現を減少させるかまたは増加させる１以上の候補調節剤に関して選択する工程を含む。ひとたび、単数または複数の候補調節剤が、標的をコードする核酸分子の発現を調節可能である（例えば減少させるかまたは増加させるかいずれか）ことが示されたら、標的の機能の研究に、あるいは、本発明にしたがって研究剤、診断剤、または療法剤としての使用のため、該調節剤を使用することも可能である。
【０２０９】
本発明に適した標的セグメントを、本発明のそれぞれの相補的アンチセンス・オリゴマー化合物と合わせて、安定化された二本鎖（二重鎖）オリゴヌクレオチドを形成することも可能である。
【０２１０】
スクリーニングおよび標的検証
さらなる態様において、選択されるタンパク質の発現を調節する、さらなるオリゴマー化合物に関するスクリーニングにおいて、「適切な標的セグメント」を使用することも可能である。「調節剤」は、タンパク質をコードする核酸分子の発現を減少させるかまたは増加させ、そして適切な標的セグメントに相補的な、少なくとも８核酸塩基部分を含む、オリゴマー化合物である。スクリーニング法は、タンパク質をコードする核酸分子の適切な標的セグメントと、１以上の候補調節剤を接触させ、そしてタンパク質をコードする核酸分子の発現を減少させるかまたは増加させる１以上の候補調節剤に関して選択する工程を含む。ひとたび、単数または複数の候補調節剤が、ペプチドをコードする核酸分子の発現を調節可能である（例えば減少させるかまたは増加させるかいずれか）ことが示されたら、ペプチド機能のさらなる研究に、あるいは、本発明にしたがって研究剤、診断剤、または療法剤としての使用のため、該調節剤を使用することも可能である。
【０２１１】
本発明のオリゴマー化合物を、薬剤発見および標的検証の分野に適用することもまた可能である。本発明は、薬剤を発見する試みの中で、本明細書で同定するオリゴマー化合物および適切な標的を使用して、タンパク質および疾患状態、表現型、または状態の間に存在する関係を解明することを含む。これらの方法には、標的ペプチドを検出するかまたは調節する方法であって、試料、組織、細胞、または生物と、本発明のオリゴマー化合物を接触させ、標的の核酸レベルまたはタンパク質レベル、並びに／あるいは関連する表現型終点または化学的終点を、処理後のある時点で測定し、そして場合によって、測定した値を非処理試料の測定値または本発明のさらなるオリゴマー化合物で処理した試料の測定値に比較することを含む、前記方法が含まれる。これらの方法を、他の実験と平行して、または組み合わせて行って、標的検証プロセスのため、未知の遺伝子の機能を決定するか、あるいは特定の疾患、状態、または表現型の治療または防止の標的として、特定の遺伝子産物の妥当性を決定することもまた可能である。
【０２１２】
存在する文献にしたがって、ＲＮＡｉ活性に対するヌクレオシド修飾の効果を評価する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら，  Ｎａｔｕｒｅ（２００１），  ４１１，  ４９４−４９８；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａら，  Ｃｅｌｌ（２００１），  １０７，  ４１５−４１６；およびＢａｓｓら，  Ｃｅｌｌ（２０００），  １０１，  ２３５−２３８）。
【０２１３】
キット、研究試薬、および療法剤
本発明のオリゴマー化合物を、診断剤、療法剤、予防剤に、そして研究試薬およびキットとして利用することも可能である。さらに、特定の遺伝子の機能を解明するか、または生物学的経路の多様なメンバーの機能間を区別するため、一般の当業者は、しばしば、非常に強い特異性で遺伝子発現を阻害することが可能なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いる。
【０２１４】
キットおよび診断剤において用いるため、本発明のオリゴマー化合物を、単独で、または他のオリゴマー化合物または療法剤と組み合わせて、示差分析および／またはコンビナトリアル分析におけるツールとして用いて、細胞および組織内で発現される遺伝子の一部または完全な相補体の発現パターンを解明することも可能である。
【０２１５】
限定されない例の１つとして、１以上のアンチセンス・オリゴマー化合物で処理した細胞または組織内の発現パターンを、アンチセンス・オリゴマー化合物で処理していない対照細胞または組織に比較して、そして例えば、調べた遺伝子の疾患関連、シグナル伝達経路、細胞局在、発現レベル、サイズ、構造または機能に関連するような、遺伝子発現の示差レベルに関して、生じたパターンを分析する。これらの分析を、刺激細胞または非刺激細胞に対して、そして発現パターンに影響を及ぼす他の化合物およびまたはオリゴマー化合物の存在下または非存在下で、行うことも可能である。
【０２１６】
当該技術分野に知られる遺伝子発現分析の方法の例には、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（ＢｒａｚｍａおよびＶｉｌｏ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２０００，  ４８０，  １７−２４；Ｃｅｌｉｓら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２０００，  ４８０，  ２−１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）（Ｍａｄｄｅｎら，  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ，  ２０００，  ５，  ４１５−４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化したｃＤＮＡの制限酵素増幅）（ＰｒａｓｈａｒおよびＷｅｉｓｓｍａｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １９９９，  ３０３，  ２５８−７２）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現分析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ２０００，  ９７，  １９７６−８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２０００，  ４８０，  ２−１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔら，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  １９９９，  ２０，  ２１００−１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）配列決定（Ｃｅｌｉｓら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ２０００，  ４８０，  ２−１６；Ｌａｒｓｓｏｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０００，  ８０，  １４３−５７）、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＦ）（Ｆｕｃｈｓら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２０００，  ２８６，  ９１−９８；Ｌａｒｓｏｎら，  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，  ２０００，  ４１，  ２０３−２０８）、サブトラクティブクローニング、示差ディスプレイ（ＤＤ）（ＪｕｒｅｃｉｃおよびＢｅｌｍｏｎｔ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２０００，  ３，  ３１６−２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉら，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｕｐｐｌ．，  １９９８，  ３１，  ２８６−９６）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術（ＧｏｉｎｇおよびＧｕｓｔｅｒｓｏｎ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  １９９９，  ３５，  １８９５−９０４）および質量分析法（Ｔｏ，  Ｃｏｍｂ．  Ｃｈｅｍ．  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，  ２０００，  ３，  ２３５−４１）が含まれる。
【０２１７】
本発明のオリゴマー化合物は、タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズするため、研究および診断に有用である。例えば、有効なタンパク質阻害剤であるように、本明細書に開示する有効性で、そして条件下で、ハイブリダイズすることが示されたオリゴヌクレオチドはまた、遺伝子増幅または検出を支持する条件下で、それぞれ、有効なプライマーまたはプローブであろう。これらのプライマーおよびプローブは、タンパク質をコードする核酸分子の特異的検出を必要とする方法において、そして検出のため、またはさらなる研究で使用するための核酸分子の増幅において、有用である。当該技術分野に知られる手段によって、本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド、特にプライマーおよびプローブと、核酸とのハイブリダイゼーションを検出することも可能である。こうした手段には、オリゴヌクレオチドへの酵素のコンジュゲート化、オリゴヌクレオチドの放射標識または他の適切な検出手段いずれかが含まれることも可能である。試料において、選択されたタンパク質のレベルの検出のため、こうした検出手段を用いるキットもまた、用意することも可能である。
【０２１８】
アンチセンスの特異性および感度はまた、療法的使用のため、当業者によって利用されている。アンチセンス・オリゴマー化合物は、ヒトを含む動物における疾患状態の治療において、療法部分として使用されてきている。リボザイムを含むアンチセンス・オリゴヌクレオチド薬剤は、ヒトに安全にそして有効に投与されてきており、そして多くの臨床試験が現在行われている。したがって、アンチセンス・オリゴマー化合物は、有用な療法様式であることも可能であり、該化合物を、細胞、組織および動物、特にヒトの治療用の治療措置において、有用に設定することも可能である。
【０２１９】
療法のため、選択されるタンパク質の発現を調節することによって処置可能な疾患または障害を有すると推測されるヒトなどの動物を、本発明記載のアンチセンス・オリゴマー化合物を投与することによって、処置する。例えば、１つの限定されない態様において、該方法は、処置の必要がある動物に、療法的に有効な量のタンパク質阻害剤を投与する工程を含む。本発明のタンパク質阻害剤は、タンパク質の活性を有効に阻害するか、またはタンパク質の発現を阻害する。いくつかの態様において、動物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるタンパク質の活性または発現は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％、阻害される。
【０２２０】
例えば、タンパク質発現の減少を、動物の血清、脂肪組織、肝臓または他の体液、組織または臓器において、測定することも可能である。分析する体液、組織または臓器内に含有される細胞が、タンパク質をコードする核酸分子および／またはタンパク質自体を含有することも可能である。
【０２２１】
有効量のオリゴマー化合物を、適切な薬学的に許容しうる希釈剤またはキャリアーに添加することによって、本発明のオリゴマー化合物を薬剤組成物において利用することも可能である。本発明のオリゴマー化合物および方法の使用はまた、予防的に有用であることも可能である。
【０２２２】
配合物
本発明のオリゴマー化合物はまた、例えばリポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の配合物のように、取り込み、分布および／または吸収を補助するため、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合し、これらに被包し、これらとコンジュゲート化し、または別の方法で関連させることも可能である。こうした取り込み、分布および／または吸収補助配合物の調製を解説する代表的な米国特許には、限定されるわけではないが、Ｕ．Ｓ．：５，１０８，９２１；５，３５４，８４４；５，４１６，０１６；５，４５９，１２７；５，５２１，２９１；５，５４３，１５８；５，５４７，９３２；５，５８３，０２０；５，５９１，７２１；４，４２６，３３０；４，５３４，８９９；５，０１３，５５６；５，１０８，９２１；５，２１３，８０４；５，２２７，１７０；５，２６４，２２１；５，３５６，６３３；５，３９５，６１９；５，４１６，０１６；５，４１７，９７８；５，４６２，８５４；５，４６９，８５４；５，５１２，２９５；５，５２７，５２８；５，５３４，２５９；５，５４３，１５２；５，５５６，９４８；５，５８０，５７５；および５，５９５，７５６が含まれる。
【０２２３】
本発明のアンチセンス・オリゴマー化合物は、いかなる薬学的に許容しうる塩、エステル、またはこうしたエステルの塩も、あるいはヒトを含む動物に投与した際、生物学的に活性がある代謝産物またはその残基を（直接または間接的に）提供することが可能な、いかなる他の化合物も含む。したがって、例えば、本開示はまた、本発明のオリゴマー化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容しうる塩、こうしたプロドラッグの薬学的に許容しうる塩、並びに他の生物学的等価物にも関する。
【０２２４】
用語「プロドラッグ」は、内因性酵素または他の化学薬品および／または状態の作用によって、体内または体の細胞内で活性型（すなわち薬剤）に変換される、不活性型で調製されている療法剤を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグ型は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎらに対するＷＯ  ９３／２４５１０、１９９３年１２月９日公開、またはＩｍｂａｃｈらに対するＷＯ  ９４／２６７６４およびＵ．Ｓ．５，７７０，７１３に開示される方法にしたがったＳＡＴＥ（（Ｓ−アセチル−２−チオエチル）ホスフェート）誘導体として調製される。
【０２２５】
用語「薬学的に許容しうる塩」は、本発明のオリゴマー化合物の生理学的および薬学的に許容しうる塩：すなわち親化合物の望ましい生物学的活性を保持し、そしてその望ましくない毒性効果を与えない塩を指す。オリゴヌクレオチドに関しては、薬学的に許容しうる塩およびその使用の例が、米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。
【０２２６】
本発明はまた、本発明のアンチセンス・オリゴマー化合物を含む、薬剤組成物および配合物も含む。局所または全身処置が望ましいかどうかに応じて、そして治療しようとする領域に応じて、本発明の薬剤組成物をいくつかの方式で投与することも可能である。投与は、局所（眼、並びに膣および直腸搬送を含む粘膜に対するものを含む）、例えば、噴霧器によるものを含む、粉末またはエアロゾルの吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ、ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による、肺；気管内、鼻内、上皮、皮内および経皮、経口または非経口であることも可能である。非経口投与には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋内注射または注入；あるいは頭蓋内、例えば鞘内または脳室内、投与が含まれる。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を持つオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると考えられる。局所投与のための薬剤組成物および配合物は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体および粉末を含むことも可能である。慣用的な薬学的キャリアー、水性、粉末または油性基剤、粘稠化剤等が必要であるか、または望ましい可能性もある。コーティング・コンドーム、手袋等もまた、有用である可能性もある。
【０２２７】
本発明の薬剤配合物は、便宜的に単位投薬型で提示されることも可能であり、こうした薬剤配合物を、薬剤産業に周知の慣用的技術にしたがって、調製することも可能である。こうした技術には、活性成分と薬剤キャリアー（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）を会合させる工程が含まれる。一般的に、均一にそして緊密に、活性成分と液体キャリアーまたは細かく分割された固体キャリアーまたは両方を会合させ、そして次いで、必要に応じて産物を成型することによって、配合物を調製する。
【０２２８】
本発明の組成物を、限定されるわけではないが、錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座薬、および浣腸剤などの多くの可能な投薬型のいずれかに配合することも可能である。また、本発明の組成物を、水性、非水性、または混合媒体中の懸濁物として配合することも可能である。水性懸濁物は、例えばカルボキシメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁物の粘性を増加させる物質をさらに含有することも可能である。懸濁物はまた、安定化剤も含有することも可能である。
【０２２９】
本発明の薬剤組成物には、限定されるわけではないが、溶液、エマルジョン、泡およびリポソーム含有配合物が含まれる。本発明の薬剤組成物および配合物は、１以上の浸透増進剤、キャリアー、賦形剤、または他の活性もしくは不活性成分を含むことも可能である。
【０２３０】
エマルジョンは、典型的には、通常、直径０．１μｍを超える小滴の形で、別の液体中に分散した１つの液体の不均一系である。エマルジョンは、分散相に加えて、さらなる構成要素および活性薬剤を含有することも可能であり、活性薬剤は、水性相、油相、または分離相としてのそれ自体のいずれかの中に、溶液として存在することも可能である。本発明の態様として、マイクロエマルジョンが含まれる。エマルジョンおよびその使用は、当該技術分野に周知であり、そして米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。
【０２３１】
本発明の配合物には、リポソーム配合物が含まれる。本発明において、用語「リポソーム」は、単数または複数の球状二層に配置された両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性成分、および搬送しようとする組成物を含有する水性の内部から形成される、膜を有する単層または多層小胞である。陽イオン性リポソームは、陽性に荷電するリポソームであり、陰性に荷電するＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成すると考えられる。ｐＨ感受性または陰性荷電であるリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するよりも、ＤＮＡを捕捉すると考えられる。陽イオン性および非陽イオン性リポソームの両方が、ＤＮＡを細胞に搬送するのに用いられてきている。
【０２３２】
リポソームにはまた、「立体的に安定化された」リポソームも含まれ、この用語は、本明細書において、１以上の特殊化脂質であって、リポソームに取り込まれた際に、こうした特殊化脂質を欠くリポソームに比較して、増進した循環寿命を生じる、前記特殊化脂質を含む、リポソームを指す。立体的に安定したリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、１以上の糖脂質を含むか、または１以上の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されているものである。リポソームおよびその使用は、米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。
【０２３３】
本発明の薬剤配合物および組成物は、界面活性剤を含むこともまた可能である。薬剤製品、配合物、およびエマルジョン中の界面活性剤の使用は、当該技術分野に周知である。界面活性剤およびその使用は、米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。
【０２３４】
１つの態様において、本発明は、核酸、特にオリゴヌクレオチドの効率的な搬送を達成するため、多様な浸透増進剤を使用する。非親油性薬剤の細胞膜を渡る拡散を補助するのに加えて、浸透増進剤はまた、親油性薬剤の浸透性も増進する。浸透増進剤は、５つの広いカテゴリー、すなわち界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の１つに属すると分類可能である。浸透増進剤およびその使用は、米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。
【０２３５】
当業者は、配合物が、その意図される使用、すなわち投与経路にしたがって、日常的に設計されることを認識するであろう。
局所投与に適した配合物には、本発明のオリゴヌクレオチドが、局所搬送剤、例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤と混合されているものが含まれる。適切な脂質およびリポソームには、中性（例えばジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、陰性（例えばジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）および陽イオン性（例えばジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）のものが含まれる。
【０２３６】
局所または他の投与のため、本発明のオリゴヌクレオチドをリポソーム内に被包するか、またはリポソームと、特に陽イオン性リポソームと複合体を形成させることも可能である。あるいは、オリゴヌクレオチドを脂質、特に陽イオン性脂質と複合体形成させることも可能である。適切な脂肪酸およびエステル、薬学的に許容しうるその塩、およびその使用は、米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。局所配合物は、米国特許出願０９／３１５，２９８、１９９９年５月２０日出願に詳細に記載されている。
【０２３７】
経口投与のための組成物および配合物には、粉末または顆粒、マイクロ粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁物または溶液、カプセル、ゲルカプセル、サシェー剤（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。粘稠化剤、フレーバー剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、希釈剤、乳化剤、分散補助または結合剤が望ましい可能性もある。適切な経口配合物は、本発明のオリゴヌクレオチドが、１以上の浸透増進剤、界面活性剤およびキレート剤と組み合わせて投与されるものである。適切な界面活性剤には、脂肪酸および／またはそのエステルまたは塩、胆汁酸および／またはその塩が含まれる。適切な胆汁酸／塩および脂肪酸、並びにその使用は、米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。やはり適切なのは、浸透増進剤の組み合わせ、例えば胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩である。適切な組み合わせはラウリン酸、カプリン酸およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透増進剤には、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが含まれる。本発明のオリゴヌクレオチドを、スプレー乾燥させた粒子を含む顆粒型で経口搬送することも可能であるし、または複合体化させて、マイクロ粒子またはナノ粒子を形成することも可能である。オリゴヌクレオチド複合体化剤およびその使用が、米国特許６，２８７，８６０にさらに記載される。オリゴヌクレオチドのための経口配合物およびその調製は、米国特許出願０９／１０８，６７３（１９９８年７月１日出願）、０９／３１５，２１８（１９９９年５月２０日出願）および１０／０７１，８２２、２００２年１２月８出願に詳細に記載される。
【０２３８】
非経口、鞘内または脳室内投与のための組成物および配合物は、緩衝剤、希釈剤および他の適切な添加物、例えば限定されるわけではないが、浸透増進剤、キャリアー化合物および他の薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤もまた含有することも可能な、無菌水性溶液を含むことも可能である。
【０２３９】
本発明の特定の態様は、１以上のオリゴマー化合物、および非アンチセンス機構によって機能する１以上の他の化学療法剤を含有する薬剤組成物を提供する。こうした化学療法剤の例には、限定されるわけではないが、癌化学療法薬剤、例えばダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン、ブレオマイシン、マホスファミド、イホスファミド、シトシン・アラビノシド、ビス−クロロエチルニトロソ尿素、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロソ尿素、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスファミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペルオキシシクロホスホロアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキセート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキセート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチンおよびジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）が含まれる。本発明のオリゴマー化合物とともに用いた場合、こうした化学療法剤を、個々に（例えば５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド）、連続して（例えば、ある期間、５−ＦＵおよびオリゴヌクレオチド、その後、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド）、または１以上の他のこうした化学療法剤と組み合わせて（例えば５−ＦＵ、ＭＴＸおよびオリゴヌクレオチド、または５−ＦＵ、放射療法およびオリゴヌクレオチド）、用いることも可能である。限定されるわけではないが、非ステロイド性抗炎症薬剤およびコルチコステロイドを含む抗炎症薬剤、並びに限定されるわけではないが、リビビリン、ビダラビン、アシクロビルおよびガンシクロビルを含む抗ウイルス薬剤もまた、本発明の組成物と組み合わせ可能である。アンチセンス・オリゴマー化合物および他の非アンチセンス薬剤の組み合わせもまた、本発明の範囲内である。２つのオリゴマー化合物、またはさらなる化合物と組み合わせた１つのオリゴマー化合物などの、２以上の組み合わせた化合物を、ともに、または連続して、用いることも可能である。
【０２４０】
別の関連する態様において、本発明の組成物は、第一の核酸を標的とする、１以上のアンチセンス・オリゴマー化合物、特にオリゴヌクレオチド、および第二の核酸標的を標的とする、１以上のさらなるアンチセンス・オリゴマー化合物を含有することも可能である。あるいは、本発明の組成物は、同じ核酸標的の異なる領域を標的とする、２以上のアンチセンス・オリゴマー化合物を含有することも可能である。アンチセンス・オリゴマー化合物の多くの例が当該技術分野に知られる。２以上の組み合わせた化合物を、一緒に、または連続して用いることも可能である。
【０２４１】
投薬
療法組成物の配合およびそれに続く投与（投薬）は、当業者の技術範囲内であると考えられる。投薬は、治療しようとする疾患状態の重症度および反応性次第であり、治療過程は数日〜数ヶ月、あるいは治癒が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで持続する。最適投薬計画は、患者の体内の薬剤蓄積の測定値から計算可能である。一般の当業者は、容易に、最適投薬、投薬方法論および反復率を決定することも可能である。最適投薬は、個々のオリゴヌクレオチドの相対効力に応じて多様である可能性もあり、そして一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルで有効であることが見出されたＥＣ５０に基づいて、概算可能である。一般的に、投薬は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇ、体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜１０ｇ、体重１ｋｇあたり１μｇ〜１ｇ、体重１ｋｇあたり１０μｇ〜１００ｍｇ、体重１ｋｇあたり１００μｇ〜１０ｍｇ、または体重１ｋｇあたり１００μｇ〜１ｍｇであり、そして毎日、毎週、毎月または毎年１回以上、あるいは２〜２０年ごとに１回投与されることも可能である。一般の当業者は、体液または組織における薬剤の測定された滞在時間および濃度に基づいて、投薬反復率を容易に概算することも可能である。治療成功に続いて、患者に、疾患状態の再発を防止する維持療法を施すことが望ましい可能性もあり、この場合、体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１００ｇの範囲で、毎日１回以上から２０年ごとに１回、オリゴヌクレオチドを維持用量で投与する。
【０２４２】
本発明は、特定の態様にしたがって、特異性を持って記載されてきたが、以下の実施例は、本発明の例示のみとして働き、そして本発明を限定することを意図しない。
（実施例１）
キメラＬＮＡ／ＥＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成
キメラＬＮＡ／ＥＮＡ  ２’−デオキシ・オリゴヌクレオチドには、連結しているＬＮＡ／ＥＮＡヌクレオチドの５’および３’「ウィング」セグメントの間に置かれる、連結している２’−デオキシヌクレオチドの「ギャップ」セグメントが含まれる。この種のオリゴヌクレオチドは、「ギャップマー」またはギャップ化オリゴヌクレオチドとして当該技術分野に知られる。
【０２４３】
（ＬＮＡ）−−（２’−デオキシ）−−（ＬＮＡ）キメラ・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
以下に記載するように、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ自動化ＤＮＡ合成装置ＡＫＴＡ１０（１０のホスホロアミダイト・ポートを用いて、いかなる既定の配列の組み立ても可能にする）を用いて、ＬＮＡホスホロチオエートおよび２’−デオキシ・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド・セグメントを有するキメラ・オリゴヌクレオチドを合成することも可能である。
【０２４４】
自動化合成装置、並びにＤＮＡ部分のための２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト、並びに５’および３’ウィングのための５’−ジメトキシトリチル−ＬＮＡ−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトを用いて、オリゴヌクレオチドを合成することも可能である（ＬＮＡアミダイトは、Ｇｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＥｘｉｑｏｎから入手可能である）。用いたＬＮＡホスホロアミダイトを以下に列挙する：
−５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−アデノシン，  ３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
−５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイル−５−メチル−（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−シチジン，  ３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
−５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ジメチルホルムアミジン−（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−グアノシン，  ３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
−５’−ジメトキシトリチル−５−メチル−（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−ウリジン，  ３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
記載する合成で使用する固体支持体は、ポリマー性キャリアー（ＰＲＩＭＥＲ、Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥから入手可能）およびＡｎｄｒｅｉ  Ｇｕｚａｙｅｖ（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２５（９），  ２３８０−２３８１，  ２００３）に記載される普遍的リンカー（ＵＮＩＬＩＮＫＥＲの修飾型）からなった。Ａｃｈａｒｙａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手可能なフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を用いて、ホスホロチオエート連結を生成した。
【０２４５】
５’−ジメトキシトリチル−ＬＮＡ−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト（５’−ジメトキシトリチル−ＥＮＡ−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト）を取り込むため、カップリング反応時間が増加したカップリング工程を取り込むことによって、標準的合成周期を修飾することも可能である。次いで、２−シアノエチル基を取り除く（そしてＣＮＥＴ形成を排除する）ため、トリエチルアミン／アセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）の混合物で、完全に保護されたオリゴヌクレオチド（固体支持体に付着）を洗浄することも可能である。続いて、部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチド産物を支持体から切断し、そして濃アンモニア（ＮＨ４ＯＨ）中、５５℃で１２〜１６時間、脱保護する。キャピラリー電気泳動および質量分析によって、収量および純度に関して、脱保護されたオリゴを分光光度的に分析する。
【０２４６】
合成周期
トルエン中の１０％ＤＣＡの溶液を用いて、４０μｍｏｌカラム（１．２ｍｌ）に入れた、普遍的固体支持体を脱トリチル化した（４９８ｎｍでのＵＶシグナルに基づいて、脱トリチル化）。
【０２４７】
続いて、３．５当量の対応する３’−Ｏ−ホスホロアミダイト（無水アセトニトリル中、０．２Ｍ溶液）および１０．５当量のアセトニトリル中の１Ｈ−テトラゾール溶液で、固体支持体を処理した。カップリング時間は、２’−デオキシ・ホスホロアミダイトに関しては、等しく３分間（単一カップリング、リサイクリング）、そしてＬＮＡおよびＥＮＡホスホロアミダイトに関しては、１５分間（単一カップリング、リサイクリング）に等しかった。カップリング反応後、アセトニトリル洗浄（５カラム容積）を行った。
【０２４８】
ピコリンおよびアセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）の混合物中のフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）の０．３Ｍ溶液を用いて、硫化を５分間行った。反応後、アセトニトリル洗浄（２カラム容積）を行った。
【０２４９】
キャッピング溶液Ａ（無水酢酸／ピリジン／ＴＨＦ、０．４／０．４／３．２、ｖ／ｖ／ｖ）およびキャッピング溶液Ｂ（Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ、０．４／３．６、ｖ／ｖ）の等量混合物を用いて、キャッピングを１分間行った。反応後、アセトニトリル洗浄（２カラム容積）を行った。
【０２５０】
２−シアノエチル基の除去
支持体に付着したオリゴヌクレオチド産物を、トリエチルアミン／アセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）の混合物で洗浄した。
【０２５１】
最終切断および脱保護
部分的に脱保護されたオリゴヌクレオチド産物を支持体から切断し、そして濃アンモニア（ＮＨ４ＯＨ）中、５５℃で１２〜１６時間、完全に脱保護した。
【０２５２】
（ＥＮＡ）−−（２’−デオキシ）−−（ＥＮＡ）キメラ・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
ＬＮＡキメラ・オリゴヌクレオチドに関して上述する方法にしたがって、５’−ジメトキシトリチル−ＬＮＡ−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトの代わりに５’−ジメトキシトリチル−ＥＮＡ−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトを用いて、キメラ・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを調製した。
【０２５３】
オリゴヌクレオチド単離
固体支持体から切断し、そして濃水酸化アンモニウム中、５５℃で１２〜１６時間脱ブロッキングした後、イオン交換カラムに直接装填する（ＮＨ４ＯＨ除去を伴わない）ことによって、オリゴヌクレオチド産物を精製した。
【０２５４】
ＥＸＰＬＯＲＥＲ  ＨＰＬＣ系（ＡＭＥＲＳＨＡＭ）を用いて、イオン交換ＨＰＬＣを達成した。ＵＮＩＣＯＲＮソフトウェア・パッケージによって、ＨＰＬＣ系の構成要素を管理した。ＳＯＵＲＣＥ  Ｑ  ３０、２５０ｘ２５ｍｍカラム、および一定濃度のＮａＯＨ（５０ｍＭ）で、３０分間の２．５Ｍ  ＮａＣｌの０％〜６０％の直線勾配を用いて、合成オリゴマーを精製した。流速は１２ｍｌ／分であった。９０％より高い純度の産物を含有する分画を合わせて、そしてＲＰ−ＨＰＬＣを用いて脱塩した。エレクトロスプレー質量分析（分子量決定）によって、そしてキャピラリーゲル電気泳動によって、精製オリゴヌクレオチドを分析し、そして少なくとも９２〜９５％が全長成分であると判断した。
【０２５５】
（実施例２）
マウスＴＲＡＤＤを標的とするＬＮＡギャップマー：ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
６週齢のオスＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州バーハーバー）に、ＴＲＡＤＤを標的とする化合物を注射した。各処置群は、４匹の動物からなった。３週間に渡って、週２回、腹腔内注射を介して動物に投薬した。ＬＮＡギャップマー、ＩＳＩＳ  ３３５３８５、ＩＳＩＳ  ３５３８７８、およびＩＳＩＳ  ３５３８７９を４０、１２、または４ｍｇ／ｋｇ（それぞれ４．５、１．５、または０．５μｍｏｌ／ｋｇ）の用量で評価した。２’−ＭＯＥギャップマー、ＩＳＩＳ  ３２５５８５、ＩＳＩＳ  ３２５５８７、およびＩＳＩＳ  ３２５５８８を同様に投与した。生理食塩水を注射した動物、および対照２’−ＭＯＥギャップマー、ＩＳＩＳ  １４１９２３を注射した動物が、対照群として働いた。最後の用量のオリゴヌクレオチドを投与した後、動物を屠殺し、そして肝臓、腎臓、および脂肪組織を採取した。
【０２５６】
リアルタイムＰＣＲを用いて、研究終了時、肝臓中の標的減少を測定した。記載するような化合物４０ｍｇ／ｋｇ（４．５μｍｏｌ／ｋｇ）で処置した動物に関して、結果を表２に提示する。データを生理食塩水で処置した対照に標準化して、そして対照のパーセントとして表し、ここで１００未満のパーセンテージは、標的ｍＲＮＡ減少の指標となる。
【０２５７】
表２
マウス肝臓におけるＴＲＡＤＤを標的とするＬＮＡ化合物による標的減少
【０２５８】
【表２】
2007505138.tif 000020
【０２５９】
ＭＯＥまたはＬＮＡウィングおよびデオキシギャップを持つ完全ホスホロチオエート
表２に示すように、ＴＲＡＤＤを標的とする化合物はすべて、マウス肝臓中のｍＲＮＡレベルを減少させるのに有効であり、一方、対照オリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ  １４１９２３は、実質的な標的減少を引き起こさなかった。３’端および５’端の両方に３つのＬＮＡが隣接した１０の２’−デオキシヌクレオチドギャップで構成されるオリゴマー化合物であるＩＳＩＳ  ３３５３８５は、３’端および５’端両方に３つの２’−ＭＯＥヌクレオチドが隣接した１０の２’−デオキシヌクレオチドギャップで構成されるオリゴマー化合物であるＩＳＩＳ  ３２５５８５に比較した際、ＴＲＡＤＤ  ｍＲＮＡレベルを実質的に減少させた。３’端および５’端両方に３つのＬＮＡが隣接した１２の２’−デオキシヌクレオチドギャップで構成されるオリゴマー化合物であるＩＳＩＳ  ３５３８７８は、３’端および５’端両方に３つの２’−ＭＯＥヌクレオチドが隣接した１２の２’−デオキシヌクレオチドギャップで構成されるオリゴマー化合物であるＩＳＩＳ  ３２５５８８に産生されるものに匹敵する、ＴＲＡＤＤ  ｍＲＮＡレベルの減少を引き起こした。
【０２６０】
（実施例３）
ヌクレオシド・ホスホロアミダイトの合成
アミダイトおよびその中間体を含む、以下の化合物を、米国特許６，４２６，２２０および公開ＰＣＴ  ＷＯ  ０２／３６７４３に記載されるように調製した；５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン中間体、５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−５−メチルシチジン中間体、５−メチルｄＣアミダイトのための５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン、最後から２番目の中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（５−メチルｄＣアミダイト）、２’−フルオロデオキシアデノシン、２’−フルオロデオキシグアノシン、２’−フルオロウリジン、２’−フルオロデオキシシチジン、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）修飾アミダイト、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン中間体、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン、最後から２番目の中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  Ｔアミダイト）、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−５−メチルシチジン中間体、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチル−シチジン、最後から二番目の中間体、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−ベンゾイル−５−メチルシチジン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  ５−Ｍｅ−Ｃアミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ６−ベンゾイルアデノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  Ａアミダイト）、（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）−Ｎ４−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−イル）−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト（ＭＯＥ  Ｇアミダイト）、２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトおよび２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシ−エチル）ヌクレオシドアミダイト、２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（（２−フタルイミドオキシ）エチル）−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（（２−ホルマドクスイミノオキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（Ｎ，Ｎジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチル−ウリジン、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、２’−（アミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト、Ｎ２−イソブチリル−６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−２’−Ｏ−（２−エチルアセチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシン−３’−（（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオシドアミダイト、２’−Ｏ−（２−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）エチル）−５−メチルウリジン、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル））−５−メチルウリジンおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−（２（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）−エチル））−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−（シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト。
【０２６１】
（実施例４）
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成
本発明にしたがって用いるアンチセンス・オリゴマー化合物を、便宜的に、そして日常的に、周知の固相合成技術にしたがって作成することも可能である。例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティー）を含む、いくつかの業者によって、こうした合成のための装置が販売されている。当該技術分野に知られる、こうした合成の他の手段いずれかを、さらに、または別に、使用することも可能である。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調製する類似の技術を用いることが周知である。
【０２６２】
オリゴヌクレオチド：ヨウ素による酸化を伴う標準的ホスホロアミダイト化学反応を用いて、自動化ＤＮＡ合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４）上で、非置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドを合成する。
【０２６３】
以下の例外を伴って、ホスホジエステル・オリゴヌクレオチドと同様に、ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）を合成する：ホスファイト連結の酸化のため、アセトニトリル中の３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシドの１０％ｗ／ｖ溶液を利用することによって、チオ化を達成した。チオ化反応工程時間を１８０秒に増やし、そして続いて通常のキャッピング工程を行った。ＣＰＧカラムから切断し、そして、濃水酸化アンモニウム中、５５℃で脱ブロッキングした（１２〜１６時間）後、１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ溶液から＞３倍量のエタノールで沈殿させることによって、オリゴヌクレオチドを回収した。ホスフィネート・オリゴヌクレオチドを、米国特許５，５０８，２７０に記載されるように調製する。
【０２６４】
アルキルホスホネート・オリゴヌクレオチドを、米国特許４，４６９，８６３に記載されるように調製する。
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネート・オリゴヌクレオチドを、米国特許５，６１０，２８９または５，６２５，０５０に記載されるように調製する。
【０２６５】
ホスホロアミダイト・オリゴヌクレオチドを、米国特許５，２５６，７７５または米国特許５，３６６，８７８に記載されるように調製する。
アルキルホスホノチオエート・オリゴヌクレオチドを、公開ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６（それぞれＷＯ  ９４／１７０９３およびＷＯ  ９４／０２４９９として公開）に記載されるように調製する。
【０２６６】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホロアミダイト・オリゴヌクレオチドを、米国特許５，４７６，９２５に記載されるように調製する。
ホスホトリエステル・オリゴヌクレオチドを、米国特許５，０２３，２４３に記載されるように調製する。
【０２６７】
ボラノホスフェート・オリゴヌクレオチドを、米国特許５，１３０，３０２および５，１７７，１９８に記載されるように調製する。
オリゴヌクレオシド：メチレンメチルイミノ連結オリゴヌクレオシドは、ＭＭＩ連結オリゴヌクレオシド、メチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴヌクレオシドとも同定され、またＭＤＨ連結オリゴヌクレオシド、およびメチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシドとも同定され、またアミド−３連結オリゴヌクレオシド、およびメチレンアミノカルボニル連結オリゴヌクレオシドとも同定され、またアミド−４連結オリゴヌクレオシドとも同定されるが、該オリゴヌクレオシド並びに、例えば交互にＭＭＩおよびＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ連結を有する混合主鎖オリゴマー化合物を、米国特許５，３７８，８２５、５，３８６，０２３、５，４８９，６７７、５，６０２，２４０および５，６１０，２８９に記載されるように調製する。
【０２６８】
ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結オリゴヌクレオシドを、米国特許５，２６４，５６２および５，２６４，５６４に記載されるように調製する。
エチレンオキシド連結オリゴヌクレオシドを、米国特許５，２２３，６１８に記載されるように調製する。
【０２６９】
（実施例５）
ＲＮＡ合成
一般的に、ＲＮＡ合成化学反応は、戦略的な中間反応で、多様な保護基を選択的に取り込むことに基づく。一般の当業者は、有機合成における保護基の使用を理解するであろうが、保護基の有用な種類には、シリルエーテルが含まれる。特に、２’−ヒドロキシル上の酸不安定性オルトエステル保護基と組み合わせ、大きいシリルエーテルを用いて、５’−ヒドロキシルを保護する。次いで、標準的固相合成技術で、この保護基セットを用いる。他の合成工程すべての後で、酸不安定性オルトエステル保護基を最後に取り除くことが重要である。さらに、合成中にシリル保護基を早期に使用することで、望ましい場合には、望ましくない２’ヒドロキシルの脱保護を伴わずに、容易に除去することが可能になる。
【０２７０】
異なって取り除かれ、そして異なって化学的に不安定である保護基によって、２’−ヒドロキシルの保護と組み合わせた５’−ヒドロキシルの連続した保護のためのこの方法にしたがって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。
【０２７１】
段階的な方式で、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成する。各ヌクレオチドを連続して（３’から５’方向に）固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドに付加する。鎖の３’端の第一のヌクレオシドを固体支持体に共有結合する。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシド・ホスホロアミダイト、および活性化剤を添加し、第一のヌクレオシドの５’端に第二の塩基をカップリングする。支持体を洗浄し、そして未反応の５’−ヒドロキシル基を無水酢酸でキャッピングして、５’−アセチル部分を生じる。次いで、連結を酸化して、より安定で、そして最終的に望ましいＰ（Ｖ）連結にする。ヌクレオチド付加周期の最後に、フッ化物を用いて、５’−シリル基を切断する。続くヌクレオチドの各々で、この周期を反復する。
【０２７２】
合成後、ＤＭＦ中の１Ｍ  二ナトリウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１，１−ジチオレート三水和物（Ｓ２Ｎａ２）を利用して、ホスフェート上のメチル保護基を３０分間切断する。水を用いて、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドから脱保護溶液を洗浄する。次いで、支持体を水中の４０％メチルアミンで、５５℃で１０分間処理する。これによって、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが溶液中に放出され、環外アミンが脱保護され、そして２’−基が修飾される。この段階で、陰イオン交換ＨＰＬＣによって、オリゴヌクレオチドを分析することも可能である。
【０２７３】
２’−オルトエステル基が取り除かれる最後の保護基である。Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．（コロラド州ラファイエット）によって開発されたエチレングリコール・モノアセテート・オルトエステル保護基は、以下の重要な特性を有する、有用なオルトエステル保護基の一例である。該保護基は、ヌクレオシド・ホスホロアミダイト合成およびオリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定である。しかし、オリゴヌクレオチド合成後、オリゴヌクレオチドをメチルアミンで処理し、これは固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断するだけでなく、オルトエステルからアセチル基を取り除く。オルトエステル上に生じる２−エチル−ヒドロキシル置換基は、アセチル化前駆体より、電子求引性が低い。その結果、修飾オルトエステルは、酸が触媒する加水分解により不安定になる。特に、切断速度は、アセチル基が除去された後は、およそ１０倍速い。したがって、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合するための十分な安定性を有し、そしてなお、続いて修飾されると、最終ＲＮＡオリゴヌクレオチド産物と適合する、比較的穏やかな水性条件下で、脱保護を実行することを可能にする。
【０２７４】
さらに、ＲＮＡ合成法は当該技術分野に周知である（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，  Ｓ．Ａ．  Ｐｈ．Ｄ．  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ，  １９９６；Ｓｃａｒｉｎｇｅ，  Ｓ．Ａ．ら，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９９８，  １２０，  １１８２０−１１８２１；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，  Ｍ．Ｄ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｍ．Ｈ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １９８１，  １０３，  ３１８５−３１９１；Ｂｅａｕｃａｇｅ，  Ｓ．Ｌ．およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｍ．Ｈ．  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９８１，  ２２，  １８５９−１８６２；Ｄａｈｌ，  Ｂ．Ｊ．ら，  Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．  Ｓｃａｎｄ，．  １９９０，  ４４，  ６３９−６４１；Ｒｅｄｄｙ，  Ｍ．Ｐ．ら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  １９９４，  ２５，  ４３１１−４３１４；Ｗｉｎｃｏｔｔ，  Ｆ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９９５，  ２３，  ２６７７−２６８４；Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｂ．Ｅ．ら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９６７，  ２３，  ２３０１−２３１３；Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｂ．Ｅ．ら，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  １９６７，  ２３，  ２３１５−２３３１）。
【０２７５】
本明細書の方法によって、本発明のＲＮＡアンチセンス・オリゴマー化合物（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）を合成することも可能であるし、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ（コロラド州ラファイエット）から購入することも可能である。ひとたび合成したら、次いで、当該技術分野に知られる方法によって、相補的ＲＮＡアンチセンス・オリゴマー化合物をアニーリングして、二本鎖（二重鎖）アンチセンス・オリゴマー化合物を形成することも可能である。例えば、各３０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチドの各相補鎖（５０μＭ  ＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）および１５μｌの５ｘアニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）を合わせ、その後、９０℃で１分間、次に３７℃で１時間加熱することによって、二重鎖を形成することも可能である。生じた二重鎖アンチセンス・オリゴマー化合物を、キット、アッセイ、スクリーニング、または他の方法で用いて、標的核酸の役割を調べることも可能である。
【０２７６】
（実施例６）
キメラ・オリゴヌクレオチドの合成
本発明のキメラ・オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドまたは混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、いくつかの異なるタイプのものであることも可能である。これらには、連結しているヌクレオシドの「ギャップ」セグメントが、連結しているヌクレオシドの５’および３’「ウィング」セグメントの間に置かれる第一のタイプ、並びに「ギャップ」セグメントがオリゴマー化合物の３’末端または５’末端のいずれかに位置する第二の「オープン端」タイプが含まれる。第一のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野に「ギャップマー」またはギャップ化オリゴヌクレオチドとしても知られる。第二のタイプのオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野に「ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）」または「ウィングマー」としても知られる。
【０２７７】
（２’−Ｏ−Ｍｅ）−−（２’−デオキシ）−−（２’−Ｏ−Ｍｅ）キメラ・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−アルキルホスホロチオエートおよび２’−デオキシホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド・セグメントを有するキメラ・オリゴヌクレオチドを、上述のように、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動化ＤＮＡ合成装置、モデル３９４を用いて合成する。オリゴヌクレオチドは、自動化合成装置、並びにＤＮＡ部分のための２’−デオキシ−５’−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト、並びに５’および３’ウィングのための５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトを用いて合成する。５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−ホスホロアミダイトの反応時間を増加させたカップリング工程を取り込むことによって、標準的合成周期を修飾する。完全に脱保護されたオリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして濃アンモニア（ＮＨ４ＯＨ）中、５５℃で１２〜１６時間脱保護する。次いで、脱保護されたオリゴを適切な方法（沈殿、カラムクロマトグラフィー）によって回収し、真空で容積を減少させ、そしてキャピラリー電気泳動によって、そして質量分析によって、収量および純度に関して、分光光度的に分析する。
【０２７８】
（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））−−（２’−デオキシ）−−（２’−Ｏ−（メトキシエチル））キメラ・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−メチル・キメラ・オリゴヌクレオチドに関する上記の方法にしたがい、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを用いて、（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル））−−（２’−デオキシ）−−（−２’−Ｏ−（メトキシエチル））キメラ・ホスホロチオエート・オリゴヌクレオチドを調製した。
【０２７９】
（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル）−−（２’−デオキシホスホロチオエート）−−（２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ホスホジエステル）キメラ・オリゴヌクレオチド
２’−Ｏ−メチル・キメラ・オリゴヌクレオチドに関する上述の方法にしたがい、２’−Ｏ−メチルアミダイトの代わりに、２’−Ｏ−（メトキシエチル）アミダイトを用い、ヨウ素で酸化し、キメラ構造のウィング部分内にホスホジエステル・ヌクレオチド間連結を生成し、そして３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用して硫化し、中央ギャップにホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を生成して、（２’−Ｏ−（２−メトキシエチルホスホジエステル）−−（２’−デオキシホスホロチオエート）−−（２’−Ｏ−（メトキシエチル）ホスホジエステル）キメラ・オリゴヌクレオチドを調製する。
【０２８０】
他のキメラ・オリゴヌクレオチド、キメラ・オリゴヌクレオシドおよび混合キメラ・オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドを、米国特許５，６２３，０６５にしたがって、合成する。
【０２８１】
（実施例７）
オリゴヌクレオチド単離
調節孔ガラス固体支持体から切断し、そして濃水酸化アンモニウム中、５５℃で１２〜１６時間脱ブロッキングした後、＞３倍量のエタノールを用い、１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃからの沈殿によって、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドを回収する。エレクトロスプレー質量分析（分子量測定）によって、そしてキャピラリーゲル電気泳動によって、合成されたオリゴヌクレオチドを分析し、そして全長成分が少なくとも７０％であると判断した。−１６原子質量単位（＋／−３２＋／−４８）に比較した、正しい分子量の比によって、合成で得られるホスホロチオエートおよびホスホジエステル連結の相対量を決定した。いくつかの研究では、オリゴヌクレオチドを、Ｃｈｉａｎｇら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １９９１，  ２６６，  １８１６２−１８１７１に記載されるように、ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ精製成分で得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製成分で得られたものと同様であった。
【０２８２】
（実施例８）
オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレート形式
９６ウェル形式で、同時に９６の配列を組み立てることが可能な自動化合成装置上で、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミダイト化学反応を介して、オリゴヌクレオチドを合成した。水性ヨウ素での酸化によって、ホスホジエステル・ヌクレオチド間連結を得た。無水アセトニトリル中の３，Ｈ−１，２  ベンゾジチオール−３−オン  １，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用した硫化によって、ホスホロチオエート・ヌクレオチド間連結を生成した。標準的塩基保護ベータ−シアノエチル−ジイソ−プロピル・ホスホロアミダイトを、商業的業者（例えばＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー、またはＰｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）から購入した。非標準的ヌクレオシドを、標準法または特許の方法にしたがって合成する。これらを、塩基保護ベータ−シアノエチルジイソプロピル・ホスホロアミダイトとして利用する。
【０２８３】
オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、そして濃ＮＨ４ＯＨを用いて、上昇させた温度（５５〜６０℃）で１２〜１６時間、脱保護し、そして次いで、遊離した産物を真空で乾燥させた。次いで、乾燥産物を無菌水に再懸濁し、マスタープレートを得て、ここからその後、ロボットピペッターを利用し、すべての分析および試験プレート試料を希釈した。
【０２８４】
（実施例９）
オリゴヌクレオチド分析−９６ウェルプレート形式
各ウェル中のオリゴヌクレオチド濃度を、試料の希釈およびＵＶ吸収分光によって評価した。個々の産物の全長完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を、９６ウェル形式（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭ  ＭＤＱ）で、または個々に調製された試料に関しては商業的ＣＥ装置（例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥＴＭ  ５０００、ＡＢＩ  ２７０）上で、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）によって評価した。エレクトロスプレー質量分析を利用したオリゴマー化合物の質量分析によって、塩基および主鎖組成を確認した。単一および多チャンネルロボットピペッターを用い、すべてのアッセイ試験プレートをマスタープレートから希釈した。プレート上の少なくとも８５％のオリゴマー化合物が全長の少なくとも８５％である場合、プレートは許容しうると判断した。
【０２８５】
（実施例１０）
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
標的核酸が測定可能なレベルで存在する限り、オリゴマー化合物の標的核酸発現に対する影響を、いかなる多様な細胞種において試験することも可能である。例えばＰＣＲまたはノーザンブロット分析を用い、日常的にこれを測定することも可能である。以下の細胞種を、例示目的のため提供するが、選択した細胞種において標的が発現されている限り、他の細胞種も日常的に用いることも可能である。これは、当該技術分野において日常的な方法、例えばノーザンブロット分析、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、またはＲＴ−ＰＣＲによって、容易に測定可能である。
【０２８６】
Ｔ−２４細胞：
ヒト移行上皮膀胱癌細胞株Ｔ−２４を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得た。Ｔ−２４細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ペニシリン１００単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を補った、完全ＭｃＣｏｙの５Ａ基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）中で日常的に培養した。細胞が９０％集密に達したとき、トリプシン処理および希釈によって日常的に細胞を継代した。ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用するには、細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２）に７０００細胞／ウェルの密度で蒔いた。
【０２８７】
ノーザンブロッティングまたは他の分析には、細胞を、１００ｍｍまたは他の標準的な組織培養プレートに蒔き、そして適切な量の培地およびオリゴヌクレオチドを用い、同様に処理することも可能である。
【０２８８】
Ａ５４９細胞：
ヒト肺癌細胞株Ａ５４９を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得た。Ａ５４９細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）、ペニシリン１００単位／ｍｌ、およびストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を補った、ＤＭＥＭ基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）中で日常的に培養した。細胞が９０％集密に達したとき、トリプシン処理および希釈によって日常的に細胞を継代した。
【０２８９】
ＮＨＤＦ細胞：
ヒト新生皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。ＮＨＤＦを、供給者により推奨されるように補った、線維芽細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル）中で日常的に維持した。細胞を、供給者によって推奨されるように、１０継代まで維持した。
【０２９０】
ＨＥＫ細胞：
ヒト胚性角化細胞（ＨＥＫ）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（メリーランド州ウォーカーズビル）から得た。ＨＥＫを、供給者により推奨されるように配合した、角化細胞増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル）中で日常的に維持した。細胞を、供給者によって推奨されるように、１０継代まで日常的に維持した。
【０２９１】
ＭＣＦ−７細胞
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナサス）から得る。これらの細胞は、野生型ｐ５３遺伝子を含有する。ＭＣＦ−７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を補ったＤＭＥＭ低グルコース（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）中で日常的に培養する。細胞が９０％集密に達したとき、トリプシン処理および希釈によって日常的に細胞を継代する。本発明のオリゴマー化合物で処理するため、細胞を、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３８７２）に７０００細胞／ウェルの密度で蒔く。
【０２９２】
ＨｅｐＢ３細胞
ヒト肝腫瘍細胞株ＨｅｐＢ３（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ−ＡＴＣＣカタログ＃ＨＢ−８０６４）（バージニア州マナサス）から得る。この細胞株は、元来、８歳の黒人男性の肝細胞癌に由来した。この細胞は、形態的には上皮であり、そしてヌードマウスにおいて、腫瘍形成性である。アールの平衡化塩溶液、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＡＴＣＣ  ＃２０−２００３、バージニア州マナサス）、および熱不活性化した１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガイザーズバーグ）を補った最小必須培地（ＭＥＭ）中で、ＨｅｐＢ３細胞を日常的に培養する。細胞が９０％集密に達したとき、トリプシン処理および希釈によって日常的に細胞を継代する。
【０２９３】
初代マウス肝細胞
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓから購入したＣＤ−１マウスから、初代マウス肝細胞を調製する。初代マウス肝細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）、２５０ｎＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミズーリ州セントルイス）、１０ｎＭウシ・インスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミズーリ州セントルイス）を補った肝細胞付着培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州カールスバッド）中で、日常的に培養する。本発明のオリゴマー化合物で処理するため、４０００〜６０００細胞／ウェルの密度で、９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ  ＃３５３８７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州ベッドフォード）に細胞を蒔く。
【０２９４】
オリゴマー化合物での処理：
細胞が６５〜７５％集密に達したとき、オリゴヌクレオチドで処理する。９６ウェルプレートで増殖させた細胞に関しては、ウェルを１００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１血清減少培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）で１回洗浄し、そして次いで、３．７５μｇ／ｍｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）および望ましい濃度のオリゴヌクレオチドを含有する、１３０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭＴＭ−１で処理した。３つ組で細胞を処理し、そしてデータを得る。３７℃での処理の４〜７時間後、培地を新鮮な培地で置き換えた。オリゴヌクレオチド処理１６〜２４時間後に細胞を採取した。
【０２９５】
用いるオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株間で多様である。特定の細胞株に関して最適なオリゴヌクレオチド濃度を決定するため、ある範囲の濃度の陽性対照オリゴヌクレオチドで細胞を処理する。ヒト細胞では、陽性対照オリゴヌクレオチドを、ヒトＨ−ｒａｓを標的とするＩＳＩＳ  １３９２０（ＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧ、配列番号１０）、またはヒトＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ−２（ＪＮＫ２）を標的とするＩＳＩＳ  １８０７８（ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＴＣ、配列番号１１）いずれかから選択する。両方の対照は、ホスホロチオエート主鎖を持つ、２’−Ｏ−メトキシエチル・ギャップマーである（２’−Ｏ−メトキシエチルを太字で示す）。マウスまたはラット細胞では、陽性対照オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖を持つ、２’−Ｏ−メトキシエチル・ギャップマー（２’−Ｏ−メトキシエチルを太字で示す）、ＩＳＩＳ  １５７７０、ＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡＡＧＧＡ、配列番号１２であり、これはマウスおよびラット両方のｃ−ｒａｆを標的とする。次いで、ｃ−Ｈ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ  １３９２０に関して）、ＪＮＫ２（ＩＳＩＳ  １８０７８に関して）またはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ  １５７７０に関して）ｍＲＮＡの８０％阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの濃度を、その細胞株に対する、続く実験における新規オリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。８０％阻害が達成されない場合、ｃ−Ｈ−ｒａｓ、ＪＮＫ２またはｃ−ｒａｆ  ｍＲＮＡの６０％阻害を生じる陽性対照オリゴヌクレオチドの最低濃度を、その細胞株に対する、続く実験における新規オリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として利用する。６０％阻害が達成されない場合、その特定の細胞株は、オリゴヌクレオチド・トランスフェクション実験には適していないとみなされる。本明細書において、用いたアンチセンス・オリゴヌクレオチドの濃度は、５０ｎＭ〜３００ｎＭである。
【０２９６】
（実施例１１）
標的発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析
標的発現のアンチセンス調節を、当該技術分野に知られる多様な方法でアッセイすることも可能である。例えば標的ｍＲＮＡレベルを、例えばノーザンブロット分析、競合ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、定量化することも可能である。リアルタイム定量的ＰＣＲが、現在、適切である。総細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡに対して、ＲＮＡ分析を行うことも可能である。本発明のＲＮＡ分析の１つの方法は、本明細書の他の実施例に記載するような総細胞性ＲＮＡの使用である。ＲＮＡ単離の方法が当該技術分野に周知である。ノーザンブロット分析もまた、当該技術分野において日常的である。ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティーから入手可能である、商業的に入手可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ７６００、７７００、または７９００配列検出系を、製造者の指示にしたがって用いて、リアルタイム定量的（ＰＣＲ）を便宜的に達成することも可能である。
【０２９７】
標的タンパク質レベルを、当該技術分野に周知の多様な方法、例えば免疫沈降、ウェスタンブロット分析（イムノブロッティング）、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）で定量化することも可能である。標的に対して向けられる抗体を、多様な供給源、例えばＭＳＲＳ抗体カタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ミシガン州バーミンガム）から同定し、そして得ることも可能であるし、あるいは慣用的なモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体生成法を介して調製することも可能である。
【０２９８】
（実施例１２）
標的阻害剤を使用するための表現型アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究の設計
表現型アッセイ
本明細書に開示する方法によって、標的阻害剤が同定されたら、各々、特定の疾患状態または状態の治療における有効性を予測する、測定可能な終点を有する、１以上の表現型アッセイにおいて、オリゴマー化合物をさらに調べる。
【０２９９】
表現型アッセイ、その使用のためのキットおよび試薬が当業者に周知であり、そして本明細書において、健康および疾患における標的の役割および／または関連を調べるためにこれらを用いる。いくつかの商業的業者のいずれの１つからも購入可能な代表的な表現型アッセイには、細胞生存度、細胞傷害性、増殖または細胞生存を測定するもの（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ボストン）、酵素アッセイを含むタンパク質に基づくアッセイ（Ｐａｎｖｅｒａ，  ＬＬＣ、ウィスコンシン州マディソン；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州フランクリンレークス；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）、細胞制御、シグナル伝達、炎症、酸化プロセスおよびアポトーシス（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｉｎｃ．、ミシガン州アナーバー）、トリグリセリド集積（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、血管形成アッセイ、管形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイ並びに代謝アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州テメキュラ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。
【０３００】
１つの限定されない例において、特定の表現型アッセイに適していることが決定されている細胞（すなわち乳癌研究のために選択されるＭＣＦ−７細胞；肥満研究のための脂肪細胞）を、上述の方法によって決定される最適濃度で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究で同定された標的阻害剤並びに、対照化合物で処理する。アッセイに特異的な１以上の方法によって、処理期間の終了時、処理細胞および未処理細胞を分析して、表現型結果および終点を決定する。表現型終点には、ある期間または処理用量に渡る細胞形態の変化とともに、タンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖または金属などの細胞構成要素のレベルの変化が含まれる。ｐＨ、細胞周期の段階、細胞による生物学的指標の取り込みまたは排出を含む細胞状態の測定もまた、重要な終点である。
【０３０１】
処理後の細胞の遺伝子型の分析（細胞の１以上の遺伝子の発現測定）もまた、標的阻害剤の有効性または強度の指標として用いられる。ホールマーク遺伝子、または特定の疾患状態、状態、または表現型と関連すると推測される遺伝子を、処理細胞および未処理細胞両方で測定する。
【０３０２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
本明細書に記載するｉｎ  ｖｉｖｏ研究の個々の被験者は、ヒトを含む温血脊椎動物である。
【０３０３】
臨床試験を厳しい規制に供して、個体が不必要にリスクを与えられないようにし、そして被験者に、研究における被験者の役割を完全に知らせる。
処置を受ける際の精神的影響を考慮するため、志願者にランダムにプラセボまたは標的阻害剤を提供する。さらに、医師が処置中に偏見をもつのを防ぐため、投与中の薬剤が標的阻害剤またはプラセボのいずれであるか、医師には知らせない。このランダム化アプローチを用いると、各志願者は、新規治療またはプラセボのいずれかを投与される、同一の見込みを有する。
【０３０４】
志願者らは、標的阻害剤またはプラセボのいずれかを８週間投与され、示される疾患状態または状態と関連する生物学的パラメーターを、研究期間中、開始時（いかなる処理よりも前のベースライン測定値）、終了時（最終処置の後）、および定期的な間隔で測定する。こうした測定には、処置前レベルと比較した、体液、組織または臓器における、標的をコードする核酸分子のレベルまたは標的タンパク質レベルが含まれる。他の測定には、限定されるわけではないが、治療中の疾患状態または状態、体重、血圧、疾患または毒性の薬理学的指標の血清力価の指標並びにＡＤＭＥ（吸収、分布、代謝および排出）測定が含まれる。
【０３０５】
各患者に関して記録される情報には、年齢（歳）、性別、身長（ｃｍ）、疾患状態または状態の家族歴（あり／なし）、意欲評点（ある程度／中程度／非常に）、並びに表示される疾患または状態の先の治療措置の数および種類が含まれる。
【０３０６】
この研究に参加した志願者は、健康な成人（１８〜６５歳）であり、そしてこの研究に参加したのは、おおよそ同数の男性および女性である。特定の特性を持つ志願者が、プラセボおよび標的阻害剤治療に同等に分布する。一般的に、プラセボで処置した志願者は、処置にほとんどまたはまったく反応せず、一方、標的阻害剤で処置した志願者は、研究終了時に、疾患状態または状態指標において、陽性の傾向を示す。
【０３０７】
（実施例１３）
ＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡ単離
Ｍｉｕｒａら（Ｃｌｉｎ．  Ｃｈｅｍ．，  １９９６，  ４２，  １７５８−１７６４）にしたがって、ポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡを単離した。ポリ（Ａ）＋  ｍＲＮＡ単離のための他の方法が当該技術分野において日常的である。簡潔には、９６ウェルプレート上で増殖させた細胞に関しては、増殖培地を細胞から除去し、そして各ウェルを２００μｌの冷ＰＢＳで洗浄した。６０μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、２０ｍＭバナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、プレートを穏やかに攪拌し、そして次いで、室温で５分間インキュベーションした。５５μｌの溶解物をオリゴｄ（Ｔ）コーティング９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アービン）に移した。プレートを室温で６０分間インキュベーションし、２００μｌの洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ７．６、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄後、プレートの水分を紙タオル上で吸い取り、過剰な洗浄緩衝液を除去し、そして次いで５分間空気乾燥した。あらかじめ７０℃に加熱した６０μｌの溶出緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６）を、各ウェルに添加し、プレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベーションし、そして次いで溶出物を新鮮な９６ウェルプレートに移した。
【０３０８】
すべての溶液を適切な量で用いて、１００ｍｍまたは他の標準的プレート上で増殖させた細胞を、同様に処理することも可能である。
総ＲＮＡ単離
製造者の推奨する方法にしたがって、Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州バレンシア）から購入したＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭキットおよび緩衝液を用い、総ＲＮＡを単離した。簡潔には、９６ウェルプレート上で増殖させた細胞に関しては、増殖培地を細胞から除去し、そして各ウェルを２００μｌの冷ＰＢＳで洗浄した。１５０μｌの緩衝液ＲＬＴを各ウェルに添加し、そしてプレートを２０秒間、激しく攪拌した。次いで、１  μｌの７０％エタノールを各ウェルに添加し、そして上下に３回ピペッティングすることによって、内容物を混合した。次いで、廃水収集トレーを取り付けそして真空供給源につないだＱＩＡＶＡＣマニホールドにつないだＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭウェルプレートに試料を移した。真空を１分間適用した。５００μｌの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして１５分間インキュベーションし、そして再び真空を１分間適用した。さらに５００μｌの緩衝液ＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして真空を２分間適用した。次いで、１ｍｌの緩衝液ＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ  ９６ＴＭプレートの各ウェルに添加し、そして真空を９０秒間適用した。次いで、緩衝液ＲＰＥ洗浄を繰り返し、そして真空をさらに３分間適用した。次いで、プレートをＱＩＡＶＡＣＴＭマニホールドから取り除き、そして紙タオルで水分を吸い取った。次いで、プレートを再び、１．２ｍｌの収集試験管を含有する収集試験管ラックを取り付けたＱＩＡＶＡＣＴＭマニホールドにつないだ。次いで、１４０μｌのＲＮＡ不含水を各ウェルにピペッティングし、１分間インキュベーションし、そして次いで、真空を３分間適用することによって、ＲＮＡを溶出した。
【０３０９】
ＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ  ９６０４（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて、反復ピペッティング工程および溶出工程を自動化することも可能である。本質的には、培養プレート上の細胞を溶解した後、プレートをロボット・デッキに移し、ここでピペッティング、ＤＮアーゼ処理および溶出工程が行われる。
【０３１０】
（実施例１４）
標的ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量的ＰＣＲ分析
製造者の指示にしたがい、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ  ７６００、７７００、または７９００配列検出系（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー）を用い、リアルタイム定量的ＰＣＲによって、標的ｍＲＮＡレベルの定量化を達成した。これは、閉管のゲルに基づかない蛍光検出系であり、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の高処理定量化を可能にする。増幅産物がＰＣＲの完了後に定量化される、標準的ＰＣＲと対照的に、リアルタイム定量的ＰＣＲの産物は、集積しながら定量化される。これは、ＰＣＲ反応において、順方向および逆方向ＰＣＲプライマーの間に特異的にアニーリングし、そして２つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含むことによって、達成される。レポーター色素（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダまたはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビルのいずれかから得られる、ＦＡＭまたはＪＯＥ）をプローブの５’端に付着させ、そして消光色素（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティー、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州アラメダ、またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビルのいずれかから得られる、ＴＡＭＲＡ）をプローブの３’端に付着させる。プローブおよび色素が損なわれていない場合、レポーター色素発光は、３’消光色素が近接することによって、消光される。増幅中、プローブが標的配列にアニーリングすることによって、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断することが可能な基質が生成される。ＰＣＲ増幅周期の伸長期中、Ｔａｑポリメラーゼがプローブを切断することで、残りのプローブから（そしてしたがって消光剤部分から）レポーター色素が遊離し、そして配列特異的蛍光シグナルが生成される。各周期で、さらなるレポーター色素分子がそれぞれのプローブから切断され、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭＴＭ配列検出系に取り付けられたレーザー・オプティクスにより、規則正しい間隔で蛍光強度が監視される。各アッセイにおいて、未処理対照試料由来のｍＲＮＡの連続希釈を含有する一連の平行反応は、試験試料のアンチセンス・オリゴヌクレオチド処理後、阻害パーセントを定量化するのに用いられる標準曲線を生成する。
【０３１１】
定量的ＰＣＲ分析の前に、ＧＡＰＤＨ増幅反応と「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）」する能力に関して、測定する標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブ・セットを評価する。多重化では、標的遺伝子および内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨ両方を、単一試料中で同時に増幅する。この分析において、未処理細胞から単離したｍＲＮＡを連続希釈する。各希釈物を、ＧＡＰＤＨのみ、標的遺伝子のみ（「単一化（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｌｅｘｉｎｇ）」）、または両方（多重化）に特異的なプライマー−プローブ・セットの存在下で増幅する。ＰＣＲ増幅後、単一化および多重化両方の試料から、希釈の関数としてのＧＡＰＤＨおよび標的のｍＲＮＡシグナルの標準曲線を生成する。多重化試料から生成されるＧＡＰＤＨおよび標的のシグナルの傾斜および相関係数両方が、単一化試料から生成される対応する値の１０％以内に属する場合、その標的に特異的なプライマー−プローブ・セットは多重化可能とみなされる。ＰＣＲの他の方法もまた、当該技術分野に知られる。
【０３１２】
ＰＣＲ試薬を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（カリフォルニア州カールスバッド）から得た。２０μｌのＰＣＲカクテル（ＭｇＣｌ２を除いた２．５ｘＰＣＲ緩衝液、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各３７５μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、各３７５ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、１２５ｎＭのプローブ、４単位のＲＮアーゼ阻害剤、１．２５単位のＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５単位のＭｕＬＶ逆転写酵素、並びに２．５ｘＲＯＸ色素）を、３０μｌの総ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）を含有する９６ウェルプレートに添加することによって、ＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。４８℃で３０分間インキュベーションすることによって、ＲＴ反応を行った。９５℃で１０分間インキュベーションし、ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化した後、４０周期の２段階ＰＣＲプロトコルを行った：９５℃で１５秒間（変性）の後、６０℃で１．５分間（アニーリング／伸長）。
【０３１３】
発現が一定である遺伝子、ＧＡＰＤＨの発現レベルを用いるか、またはＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）を用いて総ＲＮＡを定量化するか、いずれかによって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって得られる遺伝子標的量を標準化する。多重化するか、または別個に、標的と同時に実行することによって、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＧＡＰＤＨ発現を定量化する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ  ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．オレゴン州ユージーン）を用いて、総ＲＮＡを定量化する。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭによるＲＮＡ定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ，  Ｌ．Ｊ．ら（Ａｎａｌｙｔｉａｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １９９８，  ２６５，  ３６８−３７４）に解説される。
【０３１４】
このアッセイにおいて、１７０μｌのＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭワーキング試薬（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中で１：３５０に希釈されたＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ試薬）を、３０μｌの精製細胞性ＲＮＡを含有する９６ウェルプレートにピペッティングする。４８５ｎｍ励起および５３０ｎｍ発光で、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中でプレートを読み取る。
【０３１５】
公開される配列情報を用いて、ヒト標的配列にハイブリダイズするように、プローブを設計する。
（実施例１５）
標的ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析
アンチセンス処理の１８時間後、細胞単層を冷ＰＢＳで２回洗浄し、そして１ｍｌ  ＲＮＡＺＯＬＴＭ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ  “Ｂ”  Ｉｎｃ．、テキサス州フレンズウッド）中で溶解した。製造者が推奨するプロトコルにしたがって総ＲＮＡを調製した。ＭＯＰＳ緩衝系（ＡＭＲＥＳＣＯ，  Ｉｎｃ．、オハイオ州ソロン）を用いて１．１％ホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲルを通じた電気泳動によって、２０マイクログラムの総ＲＮＡを分画した。ノーザン／サザン・トランスファー緩衝系（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ  “Ｂ”  Ｉｎｃ．、テキサス州フレンズウッド）を用いて、一晩、キャピラリー・トランスファーすることによって、ＲＮＡをゲルからＨＹＢＯＮＤＴＭ−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）に移した。ＲＮＡトランスファーをＵＶ視覚化によって確認した。ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲＴＭ  ＵＶクロスリンカー２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて、ＵＶ架橋することによって膜を固定し、そして次いで、ストリンジェントな条件に関する製造者の推奨を用い、ＱＵＩＣＫＨＹＢＴＭハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホヤ）を用いて探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。
【０３１６】
ヒト標的を検出するため、ＰＣＲによってヒト標的特異的プライマー・セットを調製する。装填およびトランスファー効率の変動を標準化するため、膜をストリップし、そしてヒト・グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州パロアルト）に関して探査した。
【０３１７】
ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭおよびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴＴＭソフトウェアＶ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて、ハイブリダイズした膜を視覚化し、そして定量化した。未処置対照のＧＡＰＤＨレベルにデータを標準化した。
【０３１８】
（実施例１６）
オリゴヌクレオチドによるヒト標的発現のアンチセンス阻害
本発明にしたがって、ヒト標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするように、一連のオリゴマー化合物を設計する。本明細書の他の実施例に記載するように、定量的リアルタイムＰＣＲによって、ヒト標的ｍＲＮＡレベルに対するその影響に関して、オリゴマー化合物を分析する。データは３つの実験由来の平均である。これらの適切な配列が相補的である標的領域は、本明細書において、「適切な標的セグメント」と称され、そしてしたがって、本発明のオリゴマー化合物が標的とするのに適している。該配列は、適切なアンチセンス・オリゴマー化合物の逆相補体に相当する。
【０３１９】
これらの「適切な標的セグメント」は、本発明のアンチセンス・オリゴマー化合物とのハイブリダイゼーションに対してオープンであり、そして接近可能であることが、実験によって見出されているため、当業者は、日常的な実験以上のものを用いずに、これらの適切な標的セグメントに特異的にハイブリダイズし、そしてその結果、標的の発現を阻害する他のオリゴマー化合物を含む、本発明のさらなる態様を認識するか、または確かめることが可能であろう。
【０３２０】
本発明にしたがって、アンチセンス・オリゴマー化合物には、アンチセンス・オリゴマー化合物、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、選択的スプライサー、プライマー、プローブ、および標的核酸の少なくとも一部にハイブリダイズする、他の短いオリゴマー化合物が含まれる。
【０３２１】
（実施例１７）
標的タンパク質レベルのウェスタンブロット分析
標準法を用いて、ウェスタンブロット分析（イムノブロット分析）を行う。オリゴヌクレオチド処理の１６〜２０時間後、細胞を採取し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（１００μｌ／ウェル）に懸濁し、５分間煮沸し、そして１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に装填した。ゲルを１５０Ｖで１．５時間泳動し、そしてウェスタンブロッティングのため、膜に移した。標的に向けられる適切な一次抗体を、一次抗体種に対して向けられる放射標識または蛍光標識二次抗体とともに用いる。ＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて、バンドを視覚化する。
【０３２２】
当業者には、前述の説明から、本明細書記載のものに加えて、本発明の多様な修飾が明らかであろう。こうした修飾はまた、付随する請求項の範囲内に属することも意図される。本出願に引用される、各参考文献（限定されるわけではないが、論文、米国特許および非米国の特許、特許出願刊行物、国際特許出願刊行物、遺伝子バンク寄託番号等）が、本明細書に完全に援用される。米国出願第１０／８７２，１０６号、２００４年６月１８日出願、米国仮出願第６０／５０１，７１９号、２００３年９月９日出願、米国仮出願第６０／５６８，０３９号、２００４年５月３日出願、および米国仮出願第６０／５６８，４８９号、２００４年５月６日出願が、各々、本明細書に完全に援用される。
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年10月6日(2006.10.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】
【化１７】
2007505138.tif 000025
【国際調査報告】
2007505138.tif 000026