(57)【要約】本発明は保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。ある実施形態において、本発明は、凍結乾燥固体組成物または凍結液体組成物として保存安定性のあるウイルス組成物をもたらす１つ以上の処方物と製造工程に関する。本発明の１実施形態において、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはそれらの組合せを含む、保存安定性のあるウイルス組成物を製造するための方法であって、（ａ）ウイルス組成物をそのガラス転移温度未満に約６０分以下の時間凍結する工程；および（ｂ）該ウイルス組成物を凍結乾燥する工程を包含し、凍結乾燥された該ウイルス組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間安定である方法が、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはそれらの組合せを含む、保存安定性のあるウイルス組成物を製造するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ウイルス組成物をそのガラス転移温度未満に６０分以下の時間凍結する工程；および
（ｂ）該ウイルス組成物を凍結乾燥する工程
を包含し、ここで、凍結乾燥された該ウイルス組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間安定である、方法。
【請求項２】
前記ガラス転移温度が約−４０℃〜約−５０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ガラス転移温度が約−３０℃〜約−４０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
約−３５℃のガラス転移温度に４０分以下の時間で達する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
約−３５℃のガラス転移温度に２０分以下の時間で達する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液に処方される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液に処方される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸またはＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはＬ（＋）−グルタミン酸／Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩の混合物、およびヒトアルブミン（ＨＡ）をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＡがネイティブまたは組換えである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ダイズペプトンをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれら混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡが約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／ＬのＨＡ、および約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記保存温度が５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルス組成物が、約１℃〜約１０℃での１年間の保存後に約１．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ウイルス組成物が、約１℃〜約１０℃での１年間の保存後に０．２ｍＬあたり少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｂ）におけるウイルス組成物を凍結乾燥する工程が、適切な容器手段中に約０．２ｍＬ〜約１．０ｍＬのウイルス組成物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
容器手段がさらにバイアル、チューブまたは鼻スプレー装置と定義される。請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記ウイルス組成物を凍結乾燥する工程が：
（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬの該ウイルス組成物をバイアルに入れて、約５℃の温度まで冷却する工程；
（ｂ）該バイアルを凍結乾燥たなに置き、たな温度を５℃から−５０℃まで１分間あたり約−１．０℃〜１分間あたり約−２．０℃の速度で低下させる工程；
（ｃ）該たな温度を約−５０℃に約６０分間保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、該たな温度を約−５０℃に３０〜６０分間保持しする工程；
（ｅ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約１．０℃〜約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上昇させて、該たな温度を約０℃で約５４０分間〜約７２０分間保持する工程；
（ｆ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上げて、該たな温度を約１５℃に約６００分間〜約７２０分間保持する工程；および
（ｇ）該バイアルに窒素ガスを充填し、該バイアルを密閉する工程、
としてさらに定義される、方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の方法であって、ここで前記ウイルス組成物を凍結乾燥する工程が：
（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬの該ウイルス組成物をバイアルに入れて、約５℃の温度まで冷却する工程；
（ｂ）凍結乾燥たなを約−７０℃の温度に冷凍する工程；
（ｃ）該バイアルを該凍結乾燥たなに置き、温度を約−７０℃に約６０分間保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに低下させ、たな温度を−７０℃から−５０℃まで１分あたり約１．０℃の速度で上昇させる工程；
（ｅ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約１．０℃〜１分間あたり約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上昇させて、該たな温度を約０℃で約５４０分間〜約７２０分間保持する工程；
（ｆ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上昇させて、該たな温度を約１５℃に約６００分間〜約７２０分間保持する工程；および
（ｇ）バイアルに窒素ガスを充填し、バイアルを密閉する工程、
としてさらに定義される、方法。
【請求項２４】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、またはそれらの組合せを含む、凍結乾燥保存性のあるバルク体積のウイルス組成物を製造するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも５０ｍＬの体積を有する液体ウイルス組成物を凍結乾燥トレイに置く工程；
（ｂ）該ウイルス組成物を液体窒素浴中で少なくとも約２０分間そのガラス転移温度未満で凍結する工程；および
（ｃ）該ウイルス組成物を凍結乾燥する工程
を包含し、ここで、該凍結乾燥ウイルス組成物は、凍結乾燥前のウイルス組成物に対して約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する、方法。
【請求項２５】
前記ガラス転移温度が約−４５℃である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ガラス転移温度が約−３５℃である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記凍結乾燥トレイがＬｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ウイルス組成物の体積が少なくとも５００ｍＬである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルス組成物の体積が少なくとも１０００ｍＬである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、１０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸またはＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩、およびヒトアルブミン（ＨＡ）をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＡがネイティブまたは組換えである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ダイズペプトンをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡが約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／ＬのＨＡ、および約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２４に記載の方法であって、ここで前記バルク体積のウイルス組成物を凍結乾燥する工程が、以下：
（ａ）約−５０℃の温度で凍結ウイルス組成物を備える凍結乾燥トレイを約−５０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、その温度を約６０分間保持する工程；
（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．２３℃の速度で該たな温度を−５０℃から−２３℃に上昇させる工程；
（ｃ）該たな温度を約−２３℃に約８０時間〜約１００時間保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに低下させ、１分間あたり約０．２３℃の速度で該たな温度を−２３℃から１５℃に上昇させる工程；
（ｅ）約３０時間〜約４０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、該たな温度を約１５℃に保持し；
（ｆ）０．０２Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．１７℃の速度で該たな温度を１５℃から２５℃まで上昇させる工程；
（ｇ）約１０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、該たな温度を約２５℃に保持する工程；および
（ｈ）該チャンバーを窒素ガスで満たし、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下に該トレイを密閉する工程
としてさらに定義される、方法。
【請求項４２】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記バルク体積のウイルス組成物の凍結乾燥が：
（ａ）約−７０℃の温度の凍結ウイルス組成物を備える凍結乾燥トレイを約−７０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、該温度を約６０分間保持する工程；
（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに低下させ、１分間あたり約０．２３℃の速度で該たな温度を−７０℃から−２３℃に上昇させる工程；
（ｃ）約０．１０Ｔｏｒｒで該たな温度を約−２３℃に約８０時間〜約１００時間保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに低下させて、１分間あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−２３℃から１５℃に上昇させる工程；
（ｅ）約３０時間〜約４０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、該たな温度を約１５℃に保持する工程；
（ｆ）０．０２Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．１７℃の速度で該たな温度を１５℃から２５℃まで上昇させる工程；
（ｇ）約１０時間、該温度を約２５℃に保持する工程；および
（ｈ）該チャンバーを窒素ガスで満たし、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下にトレイを密閉する工程、
としてさらに定義される、方法。
【請求項４３】
ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、またはそれらの組合せを含む、保存安定性のある液体ウイルス組成物を製造するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）金属プレートを液体窒素浴中で平衡化させる工程；
（ｂ）該液体ウイルス組成物を鼻スプレー装置に置く工程；
（ｃ）工程（ｂ）の該鼻スプレー装置を金属ホルダーに挿入する工程；
（ｄ）該金属ホルダーを工程（ａ）の該平衡化金属プレート上に約１０分間置く工程；
（ｅ）該鼻スプレー装置を該金属ホルダーから取り出す工程；および
（ｆ）該鼻スプレー装置を約−２０℃〜約−７０℃の温度で保存する工程
を包含し、ここで、工程（ａ）〜（ｆ）後のウイルス組成物は６ヶ月間の保存後に約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する、方法。
【請求項４４】
前記金属ホルダーがアルミニウムである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記金属ホルダーがステンレス鋼である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ウイルス組成物が、工程（ａ）〜（ｆ）後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ウイルス組成物が、−２０℃の温度で６ヶ月の保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ウイルス組成物が、−７０℃の温度で６ヶ月の保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記液体ウイルス組成物が、タンパク質安定剤の非存在下で処方される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、１０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
スクロース、ならびにＬ（＋）−グルタミン酸、Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはＬ（＋）−グルタミン酸およびＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩の混合物をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
約７５ｇ／Ｌスクロース、および約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物をさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
請求項１の方法により作られた、保存安定性のある、ウイルス組成物。
【請求項５８】
請求項２４の方法により作られた、凍結乾燥安定性のある、バルク体積のウイルス組成物。
【請求項５９】
請求項４３の方法により作られた、保存安定性のある、凍結させた液体ウイルス組成物。
【請求項６０】
薬学的に受容可能なキャリアに溶解された、請求項１の方法により作られたウイルス組成物を含む、免疫原性組成物。
【請求項６１】
薬学的に受容可能なキャリアに溶解された、請求項２４の方法により作られたウイルス組成物を含む、免疫原性組成物。
【請求項６２】
請求項４３の方法により作られた鼻スプレーウイルス組成物を含む、免疫原性組成物。
【請求項６３】
保存安定性のあるウイルス組成物を製造するための方法であって、該ウイルス組成物は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パピローマウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）からなる群から選択されるウイルスを含み、該方法は、以下：
（ａ）該ウイルス組成物をそのガラス転移温度未満に約６０分以下の時間凍結する工程；および
（ｂ）該ウイルス組成物を凍結乾燥する工程
を包含し、ここで該凍結乾燥ウイルス組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間安定である、方法。
【請求項６４】
前記ガラス転移温度が約−４０℃〜約−５０℃である請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ガラス転移温度が約−３０℃〜約−４０℃である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
約−３５℃のガラス転移温度に４０分以下の時間で達する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
約−３５℃のガラス転移温度に２０分以下の時間で達する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液に処方される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸またはＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはＬ（＋）−グルタミン酸／Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩の混合物、およびヒトアルブミン（ＨＡ）をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ＨＡがネイティブまたは組換えである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ダイズペプトンをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡをさらに含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡが約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／ＬのＨＡ、および約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７９】
前記保存温度が５℃である、請求項６３に記載の方法。
【請求項８０】
前記ウイルス組成物が、約１℃〜約１０℃で１年間の保存後に約１．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項８１】
前記ウイルス組成物が、約１℃〜約１０℃で１年間の保存後に０．２ｍＬあたり少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵである、請求項６３に記載の方法。
【請求項８２】
工程（ｂ）における前記ウイルス組成物を凍結乾燥する工程が、適切な容器手段中の約０．２ｍＬ〜約１．０ｍＬのウイルス組成物を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項８３】
容器手段がバイアル、チューブまたは鼻スプレー装置とさらに定義される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
請求項６３に記載の方法であって、前記ウイルス組成物を凍結乾燥する工程が、以下：
（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬの該ウイルス組成物をバイアルに入れて、約５℃の温度に冷却する工程；
（ｂ）該バイアルを凍結乾燥たなに置き、たな温度を５℃から−５０℃まで１分間あたり約−１．０℃〜１分間あたり約−２．０℃の速度で低下させる工程；
（ｃ）該たな温度を約−５０℃に約６０分間保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに低下させて、該たな温度を約−５０℃に３０〜６０分間保持する工程；
（ｅ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約１．０℃〜約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上昇させて、該たな温度を約５４０分間〜約７２０分間約０℃に保持する工程；
（ｆ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上昇させて、該たな温度を約６００分間〜約７２０分間約１５℃で保持する工程；および
（ｇ）該バイアルに窒素ガスを充填して、該バイアルを密閉する工程、
としてさらに定義される、方法。
【請求項８５】
請求項６３に記載の方法であって、ここで前記ウイルス組成物を凍結乾燥する工程が、以下：
（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬの該ウイルス組成物をバイアルに入れて、約５℃の温度まで冷却する工程；
（ｂ）凍結乾燥たなを約−７０℃の温度まで冷凍する工程；
（ｃ）該バイアルを該凍結乾燥たなに置き、温度を約−７０℃に約６０分間保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに低下させて、該たな温度を−７０℃から−５０℃まで１分間あたり約１．０℃の速度で上昇させる工程；
（ｅ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約１．０℃〜１分間あたり約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上昇させて、該たな温度を約５４０分間〜約７２０分間約０℃に保持する工程；
（ｆ）該たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上昇させて、該たな温度を約６００分間〜約７２０分間約１５℃に保持する工程；および
（ｇ）該バイアルに窒素ガスを充填して、該バイアルを密閉する工程、
としてさらに定義される、方法。
【請求項８６】
凍結乾燥に安定なバルク体積ウイルス組成物を製造するための方法であって、該バルク体積ウイルス組成物は、ＨＳＶ、ＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パピローマウイルス、ＨＰＶ、ポリオーマウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、ＶＳＶおよびＶＥＥからなる群から選択されるウイルスを含み、該方法は、以下：
（ａ）少なくとも５０ｍＬの体積を有する液体ウイルス組成物を凍結乾燥トレイに置く工程；
（ｂ）該ウイルス組成物をそのガラス転移温度未満で液体窒素浴中、少なくとも約２０分間凍結する工程；および
（ｃ）該ウイルス組成物を凍結乾燥する工程
を包含し、ここで、該凍結乾燥ウイルス組成物は、凍結乾燥前のウイルス組成物に対して約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する、方法。
【請求項８７】
前記ガラス転移温度が約−４５℃である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ガラス転移温度が約−３５℃の温度である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記凍結乾燥トレイがＬｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイである、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記ウイルス組成物の体積が少なくとも５００ｍＬである、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記ウイルス組成物の体積が少なくとも１０００ｍＬである、請求項８６に記載の方法。
【請求項９２】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、１０ｍＭリン酸緩衝溶液に処方される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸またはＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩、およびヒトアルブミン（ＨＡ）をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
ＨＡがネイティブまたは組換えである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
ダイズペプトンをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡが約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／ＬのＨＡ、および約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
請求項８６に記載の方法であって、ここで、前記バルク体積のウイルス組成物を凍結乾燥する工程が、以下：
（ａ）約−５０℃の温度の凍結ウイルス組成物を有するトレイを約−５０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、該温度を約６０分間保持する工程；
（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、約０．１０Ｔｏｒｒで１分間あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−５０℃から−２３℃に上昇させる工程；
（ｃ）該たな温度を約８０時間〜約１００時間約−２３℃に保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに低下させて、該たな温度を１分あたり約０．２３℃の速度で−２３℃から１５℃に上昇させる工程；
（ｅ）該たな温度を約３０時間〜約４０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで約１５℃に保持する工程；
（ｆ）該たな温度を０．０２Ｔｏｒｒで１分あたり約０．１７℃の速度で１５℃から２５℃まで上昇させる工程；
（ｈ）該たな温度を約１０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、約２５℃に保持する工程；および
（ｉ）該チャンバーを窒素ガスで満たし、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下で該トレイを密閉する工程、
としてさらに定義される、方法。
【請求項１０４】
請求項８６に記載の方法であって、ここで、前記バルク体積のウイルス組成物を凍結乾燥する工程が、以下：
（ａ）約−７０℃の温度の凍結ウイルス組成物を有するトレイを約−７０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、該温度を約６０分間保持する工程；
（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに低下させて、１分間あたり約０．２３℃の速度で該たな温度を−７０℃から−２３℃に上昇させる工程；
（ｃ）該たな温度を約０．１０Ｔｏｒｒで約８０〜１００時間約−２３℃に保持する工程；
（ｄ）チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに低下させて、該たな温度を１分間あたり約０．２３℃の速度で−２３℃から１５℃に上昇させる工程；
（ｅ）該温度を約３０〜４０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで約１５℃に保持する工程；
（ｆ）該たな温度を０．０２Ｔｏｒｒで１分あたり約０．１７℃の速度で１５℃から２５℃まで上昇させる工程；
（ｇ）該温度を約１０時間、約２５℃に保持する工程；および
（ｈ）該チャンバーを窒素ガスで満たして、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下で該トレイを密閉する工程、
としてさらに定義される、方法。
【請求項１０５】
保存安定性のある液体ウイルス組成物を製造するための方法であって、該液体ウイルス組成物は、ＨＳＶ、ＣＭＶ、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パピローマウイルス、ＨＰＶ、ポリオーマウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、ＶＳＶおよびＶＥＥからなる群から選択されるウイルスを含み、該方法は、以下：
（ａ）金属プレートを液体窒素浴中で平衡化させる工程；
（ｂ）液体ウイルス組成物を鼻スプレー装置に入れる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の該鼻スプレー装置を該金属ホルダーに挿入する工程；
（ｄ）該金属ホルダーを工程（ａ）の該平衡化金属プレート上に約１０分間置く工程；
（ｅ）該鼻スプレー装置を該金属ホルダーから取り出す工程；および
（ｆ）該鼻スプレー装置を約−２０℃〜約−７０℃の温度で保存する工程
を包含し、ここで、工程（ａ）〜（ｆ）後の該ウイルス組成物が６ヶ月間の保存後に約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する、方法。
【請求項１０６】
前記金属ホルダーがアルミニウムである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記金属ホルダーがステンレス鋼である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ウイルス組成物が、工程（ａ）〜（ｆ）後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ウイルス組成物が、−２０℃の温度で６ヶ月間の保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
ウイルス組成物が、−７０℃の温度で６ヶ月間の保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
前記液体ウイルス組成物が、タンパク質安定剤の非存在下で処方される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１２】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１３】
前記ウイルス組成物が、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩を含み、かつ約６．５〜約７．８のｐＨを有する、１０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１４】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムをさらに含む、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１７】
スクロース、およびＬ（＋）−グルタミン酸、Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはＬ（＋）−グルタミン酸とＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩との混合物をさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
約７５ｇ／Ｌスクロース、および約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物をさらに含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
請求項６３の方法により作られた、保存安定性のあるウイルス組成物。
【請求項１２０】
請求項８６の方法により作られた、凍結乾燥に安定なバルク体積ウイルス組成物。
【請求項１２１】
請求項１０５の方法により作られた、保存安定性のある凍結させた液体ウイルス組成物。
【請求項１２２】
薬学的に受容可能なキャリアに溶解させた、請求項６３の方法により作られたウイルス組成物を含む、免疫原性組成物。
【請求項１２３】
薬学的に受容可能なキャリアに溶解させた、請求項８６の方法により作られたウイルス組成物を含む、免疫原性組成物。
【請求項１２４】
請求項１０５の方法により作られた鼻スプレーウイルス組成物を含む、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般にウイルス学の分野、ウイルス処方物およびプロセス開発に関する。より具体的には、本発明は、凍結乾燥固体組成物または凍結液体組成物として保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
パラミクソウイルスファミリーのメンバーであるヒトＲＳウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）は幼児および幼い子供たちの重篤な呼吸器疾患の原因となる主要な病原体である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。グループＡ（ＲＳＶ−Ａ）とグループＢ（ＲＳＶ−Ｂ）のＲＳＶの２グループは毎年冬の流行期間中に同時に広がるが、通常、グループＡ感染の優勢が指摘される（非特許文献４；非特許文献５）。ＰＩＶタイプ３（ＰＩＶ−３）は気管支炎、肺炎およびクループの共通する原因である。ＲＳＶとＰＩＶ−３はともに呼吸器管疾患のために幼児と幼い子供たちのすべての入院の３０％までを占める（非特許文献６）。ＰＩＶタイプ１と２（ＰＩＶ−１およびＰＩＶ−２）はクループの共通する原因でもある。ＲＳＶは免疫が損なわれた個人と年配者に顕著な病的状態を引き起こすことも報告されている。６千５百万のＲＳＶ感染が毎年世界的で起こり、１６０，０００の死をもたらす（非特許文献７）。米国のみにおいても、１００，０００人の子供がＲＳＶ感染に由来する肺炎と気管支炎の重篤な症例で入院している（非特許文献８；非特許文献９）。米国におけるＲＳＶ感染を有する子供に対する入院と通院のケアは１９９２年において毎年３億４０００万ドルを超える費用と予想された（非特許文献１０）。世界保健機関（ＷＨＯ）（非特許文献６）および国立アレルギー・感染症研究所（ＮＩＡＩＤ）ワクチン諮問委員会はワクチン開発に関してＲＳＶをＨＩＶに次いで、唯一、二番目にランク付ける一方で、有効なＰＩＶ（例えば、ＰＩＶタイプ３）ワクチンの調製物はワクチン開発に関して優先事項と考えられる上から１０位以内のワクチンにランクされている。
【０００３】
よって、幼児、幼い子供たち、年配者および免疫が損なわれた個人において深刻な呼吸器疾患を予防することのできる安全で効果的なＲＳＶおよび／またはＰＩＶワクチンを工学的に作り出せることに対する緊急の必要性が存在する。呼吸器疾患を調節するための生きた弱毒ＲＳＶおよび／またはＰＩＶの使用はさらに見込みのあるアプローチの１つである。多くの生きた弱毒ＲＳＶ株が開発され、過去２０年間、ＲＳＶ血清陰性の子供たちにおいて調べられてきた。ＲＳＶの生きた弱毒化の最も追求されたアプローチは、低温継代（ｃｐ）ＲＳＶ、温度感受性（ｔｓ）ＲＳＶ変異体および低温継代温度感受性（ｃｐｔｓ）ＲＳＶ変異体である（非特許文献１１）。ｃｐｔｓ−２４８、ｃｐｔｓ−２４８／４０４、ｃｐｔｓ−５３０等のＲＳＶ変異体およびＰＩＶ−３変異体ｃｐ−４５は研究室および臨床的試験で現在評価されつつある。
【０００４】
効果的な生きた弱毒ＲＳＶ、ＰＩＶ、またはＲＳＶ／ＰＩＶ組合せの免疫原性組成物の同定と開発に対する必要性に加えて、保存安定性のあるＲＳＶおよび／またはＰＩＶ組成物およびその免疫原性組成物の製造方法に対する必要性が現在存在する。例えば、ＲＳＶは、−６５℃〜−８６℃の保存中に３ヶ月以内に不活性化する易熱性ウイルスである（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。したがって、保存安定性のあるＲＳＶ、ＰＩＶまたはＲＳＶ／ＰＩＶ免疫原性組成物の製造方法を同定することは非常に望ましい。
【０００５】
さらに、他のウイルス免疫原性組成物の保存安定性を増強させることが、世界的な健康に対するワクチンの影響力を向上させるために重要な目標として長い間認識されてきた（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。したがって、ウイルス処方物および製造方法開発の技術において、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、水泡性口内炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス等の保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に対する必要性が存在する。
【非特許文献１】Ｇｌｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．（１９８１）９８：７０８−７１５
【非特許文献２】Ｃｈａｎｏｃｋｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ（１９９２）９０：１３７−１４２
【非特許文献３】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｎｃｅｔ（１９７８）１０３５−１０３８
【非特許文献４】ＭｃＣｏｎｎｏｃｈｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｂｔｙｐｅ」，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．（１９９０）１１７：５２−６２
【非特許文献５】Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｈｏｓｐｉｔａｌｉｚｅｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｉｎ  Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，  Ｏｈｉｏ  ｆｒｏｍ  １９８５  ｔｏ１９８８，」Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．（１９９１）１１：９８−１０２
【非特許文献６】Ｃｒｏｗｅ，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  （ＲＳＶ）  ａｎｄＰａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓ（ＰＩＶ）：Ａ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｒｅｐｏｒｔ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＷＨＯ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：４１５−４２１
【非特許文献７】Ｒｏｂｂｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓｃｉ．Ａｍ．（１９８８）２５９：１２６−１３３
【非特許文献８】Ｇｌｅｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ．（１９８６）１４０，１４３−１４６
【非特許文献９】Ｋａｔｚ，「Ｎｅｗ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｐｒｉｏｒｉｔｉｅｓ」，Ｖｏｌ．１，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．（１９８５）ｐｐ．３９７−４０９
【非特許文献１０】Ｗｅｒｔｚ  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｅｎｄｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈ（１９９２）２０：１５１−１７６
【非特許文献１１】Ｋｎｅｙｂｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｐｅｎ，「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ｏｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｆｏｒ  Ｉｎｆａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ」Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．２００２（）２１：６８５−６９６
【非特許文献１２】Ｈａｍｂｌｉｎｇ，「Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＳＶ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｕｎｄｅｒ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ」，Ｂｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９６４）４５：６４７−６５５
【非特許文献１３】Ｗｕｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，「ＲＳＶ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｔｒａｉｎｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ  ｉｎ  ｍｏｎｋｅｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９６４）１１５：４５８−４６２
【非特許文献１４】Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＳＶ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ  ｃｙｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＲＳＶ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ」，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１４１７−１４２０
【非特許文献１５】Ｍｅｌｎｉｃｋ  ａｎｄ  Ｗａｌｌｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．（１９６３）１１２：８９４−８９７
【非特許文献１６】Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄ（１９７３）１２６：４６５−４６９
【非特許文献１７】Ａｙｒａ，Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：５９５−５９７
【非特許文献１８】Ｈｉｌｌｅｍａｎ，Ｒｅｖ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．（１９８９）１１（補追３）：Ｓ６１３−６１６，
【非特許文献１９】Ｌｅｍｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｓｓｅｓｓ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ（１９９４）１０：１７７−１８４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、広く、保存安定性のあるウイルス組成物とその免疫原性組成物の製造方法に関する。ある実施形態において、本発明は、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはそれらの組合せからなる保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。さらに具体的には、ある実施形態において、本発明は、保存安定性のあるウイルス組成物をもたらす１つ以上の処方物と製造工程に関し、該ウイルス組成物は凍結乾燥固体組成物または凍結液体組成物として保存安定性がある。特定の実施形態において、発明は、保存安定性のあるＲＳＶ、ＰＩＶまたはＲＳＶ／ＰＩＶ組成物をもたらす１つ以上の処方物と製造工程に関し、該ＲＳＶ、ＰＩＶまたはＲＳＶ／ＰＩＶ組成物は凍結乾燥固体組成物または凍結液体組成物として保存安定性がある。
【０００７】
よって、ある実施形態において、本発明は、小体積の保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。１つの特定の実施形態において、本発明は、（ａ）ウイルス組成物をそのガラス転移温度以下に約６０分以下の時間凍結し、そして（ｂ）ウイルス組成物を凍結乾燥することからなり、凍結乾燥ウイルス組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間安定である、ＲＳＶ、ＰＩＶまたはそれらの組合せからなる少体積の保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。一実施形態において、ガラス転移温度が約−４５℃の温度であり、約６０分以下の時間で達する。別の実施形態において、ガラス転移温度は約−３５℃の温度であり、約４０分以下の時間で達する。さらに別の実施形態において、ガラス転移温度は約−３５℃の温度であり、約２０分以下の時間で達する。一実施形態において、ウイルス組成物の体積は約０．２ｍＬ〜約１．０ｍＬである。ある実施形態において、ウイルス組成物は適切な容器手段に含まれ、容器手段は、さらに、ウイルス、チューブまたは鼻スプレー装置と定義される。一実施形態において、ＲＳＶは、さらに、グループＡ  ＲＳＶ（ＲＳＶ−Ａ）、グループＢ  ＲＳＶ（ＲＳＶ−Ｂ）、またはグループＡおよびＢのそれぞれの１つ以上の抗原を含むキメラ組換えＲＳＶ（ＲＳＶ−ＡＢ）と定義され、ＰＩＶは、さらに、ＰＩＶタイプ１（ＰＩＶ−１）、ＰＩＶタイプ２（ＰＩＶ−２）またはＰＩＶタイプ３（ＰＩＶ−３）と定義される。
【０００８】
ある実施形態において、小体積の保存安定性のあるウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。別の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を含む。他の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液が、さらに、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【０００９】
ある実施形態において、小体積の保存安定性のあるウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。他の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。他の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００１０】
一実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）は、さらに、スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸、Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩、Ｌ（＋）−グルタミン酸とＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩との混合物、ヒトアルブミン（ＨＡ）および／またはダイズペプトンを含む。他の実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡを含む。別の実施形態において、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡは約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される。さらに別の実施形態において、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウム、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウム、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡおよび約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む。
【００１１】
一実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡを含む。別の実施形態において、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡは約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される。さらに別の実施形態において、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、約０．２５ｍＭ〜約１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化マグネシウム、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化カルシウム、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡおよび約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む。
【００１２】
一実施形態において、小体積の保存安定性のあるウイルス組成物の保存温度は約５℃である。他の実施形態において、ウイルス組成物は、約１℃〜約１０℃での１年間の保存後に、約１．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。さらに別の実施形態において、ウイルス組成物は、約１℃〜約１０℃での１年間の保存後に、０．２ｍＬあたり少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵである。
【００１３】
一実施形態において、ウイルス組成物の凍結乾燥が、さらに、（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬのウイルス組成物をバイアルに置き、約５℃の温度まで冷却し；（ｂ）バイアルを凍結乾燥たなに置き、たな温度を５℃から−５０℃まで１分あたり約−１．０℃〜１分あたり約−２．０℃の速度で減少させ；（ｃ）たな温度を約−５０℃に約６０分間保持し；（ｄ）凍結乾燥チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、約−５０℃のたな温度を３０〜６０分間保持し；（ｅ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約１．０℃〜約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上げて、たな温度を約０℃で約５４０分間〜約７２０分間保持し；（ｆ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上げて、たな温度を約１５℃で約６００分間〜約７２０分間保持し；そして（ｇ）バイアルに窒素ガスを充填し、バイアルを密閉すると定義される。
【００１４】
別の実施形態において、ウイルス組成物の凍結乾燥が、さらに、（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬのウイルス組成物をバイアルに置き、約５℃の温度まで冷却し；（ｂ）凍結乾燥たなを約−７０℃の温度まで冷凍し；（ｃ）バイアルを凍結乾燥たなに置き、温度を約−７０℃に約６０分間保持し；（ｄ）凍結乾燥チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、たな温度を−７０℃から−５０℃まで１分あたり約１．０℃の速度で増加させ；（ｅ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約１．０℃〜１分あたり約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上げて、たな温度を約０℃で約５４０分間〜約７２０分間保持し；（ｆ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上げて、たな温度を約１５℃で約６００分間〜約７２０分間保持し；そして（ｇ）バイアルに窒素ガスを充填し、バイアルを密閉すると定義される。
【００１５】
さらに別の実施形態において、本発明は、バルク（または大）体積の凍結乾燥安定性ウイルス組成物の製造方法に関する。１つの特定の実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも５０ｍＬの体積を有する液体ウイルス組成物を凍結乾燥トレイに置き；（ｂ）ウイルス組成物を液体窒素浴中で少なくとも約２０分間凍結し、そして（ｃ）ウイルス組成物を凍結乾燥することからなり、該凍結乾燥ウイルス組成物は、凍結乾燥前のウイルス組成物に対して約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する、ＲＳＶ、ＰＩＶまたはそれらの組合せからなるバルク（または大）体積の凍結乾燥保存性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。さらに別の実施形態において、バルク体積のウイルス組成物は、凍結乾燥後に一投与量あたり少なくとも５．０  ｌｏｇ  ＰＦＵである。一実施形態において、ガラス転移温度が約−３５℃の温度である。別の実施形態において、ガラス転移温度が約−３０℃〜約−４０℃の温度である。さらに別の実施形態において、凍結乾燥トレイがＬｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイ（Ｗ．Ｌ．Ｇｏｒｅ  ａｎｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）である。一実施形態において、ウイルス組成物のバルク体積は１凍結乾燥トレイあたり少なくとも５００ｍＬである。別の実施形態において、ウイルス組成物のバルク体積は１凍結乾燥トレイあたり少なくとも１０００ｍＬである。一実施形態において、ＲＳＶは、さらに、ＲＳＶ−Ａ、ＲＳＶ−Ｂ、またはグループＡおよびＢのぞれぞれの１つ以上の抗原を含むキメラ組換えＲＳＶ（ＲＳＶ−ＡＢ）と定義され、ＰＩＶは、さらに、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２またはＰＩＶ−３と定義される。
【００１６】
一実施形態において、バルク体積のウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。別の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。他の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液が、さらに、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００１７】
ある実施形態において、バルク体積のウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。他の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。他の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００１８】
一実施形態において、約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸、Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩、Ｌ（＋）−グルタミン酸とＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩との混合物、ヒトアルブミン（ＨＡ）および／またはダイズペプトンを含む。他の実施形態において、約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡを含む。一実施形態において、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡは約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される。別の実施形態において、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウム、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウム、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡおよび約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む。
【００１９】
さらに別の実施形態において、約２．５ｍＭ〜約１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡを含む。さらに別の実施形態において、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡは約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される。さらに別の実施形態において、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、約２．５ｍＭ〜約１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化マグネシウム、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化カルシウム、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡおよび約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む。
【００２０】
別の実施形態において、バルク体積のウイルス組成物の凍結乾燥が、さらに、（ａ）約−５０℃の温度の凍結ウイルス組成物を有する凍結乾燥トレイを約−５０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、その温度を約６０分間保持し；（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−５０℃から−２３℃に上げ；（ｃ）たな温度を約−２３℃に約８０時間〜約１００時間保持し；（ｄ）凍結乾燥チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに減少させ、１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−２３℃から１５℃に上げ；（ｅ）約３０時間〜約４０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、たな温度を約１５℃に保持し；（ｆ）０．０２Ｔｏｒｒで１分あたり約０．１７℃の速度でたな温度を１５℃から２５℃まで上げ；（ｇ）約１０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、たな温度を約２５℃に保持し、そして（ｈ）チャンバーを窒素ガスで満たし、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下にトレイを密閉すると定義される。
【００２１】
他の実施形態において、バルク体積のウイルス組成物の凍結乾燥が、さらに、（ａ）約−７０℃の温度の凍結ウイルス組成物を有するトレイを約−７０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、その温度を約６０分間保持し；（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−７０℃から−２３℃に上げ；（ｃ）約０．１０Ｔｏｒｒでたな温度を約−２３℃に約８０時間〜約１００時間保持し；（ｄ）チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに減少させ、１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−２３℃から１５℃に上げ；（ｅ）約３０時間〜４０時間、０．０２Ｔｏｒｒで、温度を約１５℃に保持し；（ｆ）０．０２Ｔｏｒｒで１分あたり約０．１７℃の速度でたな温度を１５℃から２５℃まで上げ；（ｇ）約１０時間、温度を約２５℃に保持し、そして（ｈ）チャンバーを窒素ガスで満たし、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下にトレイを密閉すると定義される。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は保存安定性のある凍結液体ウイルス組成物の製造方法に関する。特定の一実施形態において、本発明は、ＲＳＶ、ＰＩＶ、またはそれらの組合せからなる保存安定性のある凍結液体ウイルス組成物の製造方法に関し、本製造方法は、（ａ）金属プレートを液体窒素浴中で平衡化させ；（ｂ）液体ウイルス組成物を適切な容器手段に置き；（ｃ）工程（ｂ）の容器を金属ホルダーに挿入し；（ｄ）金属ホルダーを工程（ａ）の平衡化金属プレートに約１０分間置き；（ｅ）容器を金属ホルダーから取り出し、そして（ｆ）容器を約−２０℃〜約−７０℃の温度で保存することからなり、工程（ａ）〜（ｆ）後のウイルス組成物は、６ヶ月の保存後に０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。ある実施形態において、容器手段は鼻スプレー装置である。一実施形態において、鼻スプレー装置は、ＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）鼻スプレー装置（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）である。別の実施形態において、金属ホルダーはアルミニウムである。さらに別の実施形態において、金属ホルダーはステンレス鋼である。別の実施形態において、ウイルス組成物は、工程（ａ）〜（ｆ）後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである。さらに別の実施形態において、ウイルス組成物は、−２０℃の温度で６ヶ月間の保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである。別の実施形態において、ウイルス組成物は、−７０℃の温度で６ヶ月保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２  ｍＬである。ある実施形態において、液体ウイルス組成物はタンパク質安定剤の存在なしに処方される。一実施形態において、ＲＳＶは、さらに、ＲＳＶ−Ａ、ＲＳＶ−Ｂ、またはグループＡおよびＢのぞれぞれの１つ以上の抗原を含むキメラ組換えＲＳＶ（ＲＳＶ−ＡＢ）と定義され、ＰＩＶは、さらに、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２またはＰＩＶ−３と定義される。
【００２３】
ある実施形態において、液体ウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。他の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。ある別の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００２４】
ある実施形態において、液体ウイルス組成物はナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。別の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。他のある実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００２５】
一実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、スクロースおよびＬ（＋）−グルタミン酸、Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物を含む。他の実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約７５ｇ／Ｌスクロースおよび約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはＬ（＋）−グルタミン酸とＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩との約４．９ｍＭの混合物を含む。
【００２６】
さらに他の実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約７５ｇ／Ｌスクロースおよび約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはＬ（＋）−グルタミン酸とＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩との約４．９ｍＭの混合物を含む。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、ウイルス組成物をそのガラス転移温度以下に約６０分以下の時間凍結し、そしてウイルス組成物を凍結乾燥することからなる製造方法にしたがって作られる小体積の凍結乾燥ウイルス組成物に関し、該凍結乾燥ウイルス組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間安定である。
【００２８】
さらに別の実施形態において、本発明は、少なくとも５０ｍＬの体積を有する液体ウイルス組成物を凍結乾燥トレイに置き；ウイルス組成物を液体窒素浴中で少なくとも約２０分間そのガラス転移温度以下で凍結し、そしてウイルス組成物を凍結乾燥することからなる製造方法にしたがって作られるバルク体積の凍結乾燥ウイルス組成物に関し、該凍結乾燥ウイルス組成物は、凍結乾燥前のウイルス組成物に対して０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。
【００２９】
さらに別の実施形態において、本発明は、（ａ）金属プレートを液体窒素浴中で平衡化させ；（ｂ）液体ウイルス組成物を適切な容器手段に置き；（ｃ）工程（ｂ）の容器を金属ホルダーに挿入し；（ｄ）金属ホルダーを工程（ａ）の平衡化金属プレートに約１０分間置き；（ｅ）容器を金属ホルダーから取り出し、そして（ｆ）容器を約−２０℃〜約−７０℃の温度で保存することからなる製造方法にしたがって作られた保存安定性のある凍結液体ウイルス組成物に関し、工程（ａ）〜（ｆ）後のウイルス組成物は、６ヶ月の保存後に０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。
【００３０】
さらに別の実施形態において、本発明は、ウイルスが薬学的に受容可能なキャリアに溶解、希釈または懸濁される、本発明の凍結乾燥製造方法にしたがって作られたウイルス組成物からなる免疫原性組成物に関する。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の製造方法にしたがって作られた凍結液体ウイルス組成物からなる免疫原性組成物に関する。
【００３２】
本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明、その好ましい実施形態および請求の範囲から明らかとなるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
（発明の詳細な説明）
以下に説明する本発明は、保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に対する必要性に向けられる。ある実施形態において、本発明は、幼児、幼い子供たち、年配者および免疫が損なわれた人において呼吸器疾患を予防または改善する免疫原性組成物に使用される、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）またはそれらの組合せからなる保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法の必要性に向けられる。
【００３４】
他の実施形態において、本発明は、下記ウイルスの１つ以上により引き起こされる病気を予防または改善する免疫原性組成物に使用される単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、水泡性口内炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス等からなる保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に対する必要性に向けられる。
【００３５】
よって、ある実施形態において、本発明は、小体積の凍結乾燥ウイルス組成物の製造方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、小体積の凍結乾燥ウイルス組成物の製造方法に関し、該凍結乾燥組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間保存安定性がある。他の実施形態において、本発明は、大（またはバルク）体積の凍結乾燥ウイルス組成物の製造方法に関する。特定の実施形態において、本発明は、大（またはバルク）体積の凍結乾燥ウイルス組成物の製造方法に関し、該凍結乾燥組成物は、凍結乾燥前の組成物に対して約０．５  ｌｏｇプラーク形成単位（ＰＦＵ）未満の損失を有する。別の実施形態において、本発明は、凍結液体ウイルス組成物の製造方法に関する。ある実施形態において、本発明は、凍結液体ウイルス組成物の製造方法に関し、該組成物は６ヶ月の保存後に約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。他の実施形態において、本発明は発明の方法にしたがって作られた保存安定性のあるウイルス組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は発明の方法にしたがって作られた免疫原性組成物を提供する。
【００３６】
（Ａ．ウイルス組成物）
ＲＳＶはパラミクソウイルス科内に分類されるニューモウイルス属に属する。ウイルス粒子は、１０種類のウイルスタンパク質をコードする１５，２２２塩基対の一本鎖陰性センスＲＮＡを含む。これらの１０種類のタンパク質は、Ｇ、ＦおよびＳＨと呼ばれる３種類のエンベロープ会合糖タンパク質、２種類のマトリックスタンパク質ＭおよびＭ２，３種類のヌクレオキャプシドタンパク質Ｌ、ＮおよびＰ、および非構造タンパク質１Ｂおよび１Ｃからなる。
【００３７】
ＲＳＶの２グループであるグループＡとグループＢはＧタンパク質の抗原差異およびそれよりも低い程度のＦタンパク質の抗原差異に基づいて同定される。抗原差異は前記の２グループ内に見ることができる。Ｇタンパク質は、ＲＳＶのグループＡとグループＢと間の５３％だけのアミノ酸同一性を有する高い変動度およびＲＳＶのグループＡ内のＧタンパク質配列の２０％までの差異を示す。以下、「ＲＳＶのグループＡ」を「ＲＳＶ−Ａ」と表わし、「ＲＳＶのグループＢ」を「ＲＳＶ−Ｂ」と表わす。
【００３８】
本発明の方法の１つにしたがって作られた保存安定性のあるＲＳＶ組成物（またはＲＳＶ／ＰＩＶ組合せ）は、低温継代ＲＳＶ変異体（ｃｐＲＳＶ）、温度感受性ＲＳＶ変異体（ｔｓＲＳＶ）、低温継代温度感受性ＲＳＶ変異体（ｃｐｔｓＲＳＶ）、低温適応ＲＳＶ変異体（ｃａＲＳＶ）、小プラークＲＳＶ変異体（ｓｐＲＳＶ）等の、しかし、これらに限定されない弱毒ＲＳＶ（例えば、弱毒ＲＳＶ−Ａおよび弱毒ＲＳＶ−Ｂである。例えば、米国特許第５，８８２，６５１号、同第５，９３２，２２２号、同第５，９９３，８２４号、同第６，０７７，５１４号および同第６，２８４，２５４号（それぞれが文献の援用によりその全文がここに編入される）は多様な弱毒ＲＳＶ表現型の製造方法を記載する。好ましい実施形態において、本発明の弱毒ＲＳＶは、ＬＲＳＶ−４０４としても知られるｃｐｔｓＲＳＶ  ２４８／４０４（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５２）およびこの株から作られたすべての組換え改変体（組換えＲＳＶ−ＡＢ株を含む）である。本発明の他の例示的なＲＳＶ株として、（ａ）ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＳＨ（ＬＲＳＶ−ｒＡ３６としても知られる）；（ｂ）ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０ΔＳＨ（ＬＲＳＶ−ｒＡ３８としても知られる）；（ｃ）ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４／１０３０（ＬＲＳＶ−ｒＡ３９としても知られる）；（ｄ）ｒＡ２ｃｐ２４８／４０４ΔＮＳ２（ＬＲＳＶ−ｒＡ４１としても知られる）；（ｅ）ｒＡＢｃｐ２４８／４０４／１０３０（ＬＲＳＶ−ｒＡＢ１としても知られる）；（ｆ）ｒＡＢｃｐ２４８／４０４ΔＳＨ（ＬＲＳＶ−ｒＡＢ２としても知られる）；（ｇ）ｒＡＢｃｐ２４８／４０４ΔＮＳ２（ＬＲＳＶ−ｒＡＢ４としても知られる）；（ｈ）ｃｐｔｓＲＳＶ  ５３０／１００９（ＡＴＣＣ  ＶＲ２４５１）およびこの株から作られる、ｒＡ２ｃｐ５３０／１００９ΔＮＳ２（ＬＲＳＶ−ｒＡ４２としても知られる）；ｒＡ２ｃｐ５３０／１００９／４０４（ＬＲＳＶ−ｒＡ４３としても知られる）；ｒＡＢｃｐ５３０／１００９ΔＮＳ２（ＬＲＳＶ−ｒＡＢ３としても知られる）およびｒＡＢｃｐ５３０／１００９／４０４（ＬＲＳＶ−ｒＡＢ６としても知られる）等の組換えＲＳＶ−ＡＢ株を含むすべての組換え改変体が挙げられる。
【００３９】
ヒトパラインフルエンザウイルスタイプ３（ＰＩＶ−３）は、パラミクソウイルス科の最近命名されたレスピロウイルス属の１メンバーである。そのゲノムは長さが１５，４６２ヌクレオチドの一本鎖の陰性センスＲＮＡである。ヌクレオキャプシドタンパク質ＮＰ、ホスホプロテインＰ、非構造タンパク質Ｃ、Ｄタンパク質、マトリックスタンパク質Ｍ、融合糖タンパク質Ｆ、赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質ＮＨおよび大きなポリメラーゼタンパク質Ｌの少なくとも８種類のタンパク質がＰＩＶ−３によりコードされている。ＮＨタンパク質とＦタンパク質が、主要な中性および保護抗原であるエンベロープ会合表面糖タンパク質である。ＰＩＶタイプ（例えば、タイプ１、２および３）間の類似ＰＩＶ  ＨＮまたはＦタンパク質間の顕著な配列の逸脱は保護免疫のタイプ特異性の基礎であると思われる。
【００４０】
ヒトパラインフルエンザウイルスタイプ１（ＰＩＶ−１）は、パラミクソウイルス科のレスピロウイルス属のもう１つのメンバーである。そのゲノムは、長さがおよそ１５，６００ヌクレオチドの一本鎖の陰性センスＲＮＡである。ＰＩＶ−１によりコードされた遺伝子産物の順列は、ヌクレオキャプシドタンパク質ＮＰ、ホスホプロテインＰ（およびＰの読み枠によりコードされた多様な他の遺伝子産物）、マトリックスタンパク質Ｍ、融合糖タンパク質Ｆ、赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質ＮＨおよび大きなポリメラーゼタンパク質Ｌを含む。
【００４１】
ヒトパラインフルエンザウイルスタイプ２（ＰＩＶ−２）は、パラミクソウイルス科のルブラウイルス属の１メンバーである。そのゲノムは、長さがおよそ１５，６５４ヌクレオチドの一本鎖の陰性センスＲＮＡである。ＰＩＶ−２によりコードされた遺伝子産物の順列は、ヌクレオキャプシドタンパク質ＮＰ、ホスホプロテインＰ、Ｖタンパク質、マトリックスタンパク質Ｍ、融合糖タンパク質Ｆ、赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質ＮＨおよび大きなポリメラーゼタンパク質Ｌを含む。
【００４２】
本発明の方法の１つにしたがって作られた保存安定性のあるＰＩＶ組成物（またはＲＳＶ／ＰＩＶ組合せ）は、低温継代ＰＩＶ変異体（ｃｐＰＩＶ）、温度感受性ＰＩＶ変異体（ｔｓＰＩＶ）、低温継代温度感受性ＰＩＶ変異体（ｃｐｔｓＰＩＶ）、低温適応ＰＩＶ変異体（ｃａＰＩＶ）、小プラークＰＩＶ変異体（ｓｐＰＩＶ）等の、しかし、これらに限定されないいずれかの弱毒ＰＩＶである。好ましい実施形態において、本発明の弱毒ＰＩＶはｃｐ−４５（またはＪＳ  ｃｐ４５）と命名されたＪＳ野生型株の低温継代ＰＩＶ−３変異体である。他の好ましい実施形態において、ＰＩＶ−３  ｃｐ−４５変異体は、米国特許第６，４１０，０２３号と同第５，８６９，０３６号（それぞれ参照により本文に編入される）に記載のＰＩＶ−３変異体を弱毒化する「メニュー」を用いてさらに弱毒化される。
【００４３】
他の実施形態において、本発明の方法の１つにしたがって作られた保存安定性のあるウイルス組成物として、表１に記載の１つ以上のウイルスまたはそれらのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
【表１−１】
2007514450.tif 000002
【００４５】
【表１−２】
2007514450.tif 000003
。
【００４６】
（Ｂ．小体積の保存安定性のあるウイルス）
ある実施形態において、本発明は小体積の保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。一実施形態において、本発明は、ＲＳＶ、ＰＩＶ、またはそれらの組合せからなる小体積の保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。該製造方法は、ウイルス組成物をそのガラス転移温度（Ｔｇ）以下に約６０分以下の時間凍結し、そしてウイルス組成物を凍結乾燥することからなる。固体粉末またはケーキである凍結乾燥ウイルス組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間安定である。小体積の保存安定性のある凍結乾燥ウイルス組成物は、単一または多投与量の免疫原性組成物として特定の有用性があり、凍結乾燥粉末が所与の時間保存される。
【００４７】
ウイルス組成物の「小体積」は約１００μＬ〜約５ｍＬである。ある実施形態において、小体積のウイルス組成物は約２００μＬ〜約１ｍＬである。一実施形態において、ウイルス組成物の体積は５００μＬである。
【００４８】
よって、ある実施形態において、小体積のウイルス組成物は適切な容器手段内で凍結され、凍結乾燥される。典型的には、適切な容器手段は、小体積のウイルス組成物に関して、凍結および凍結乾燥温度および真空圧に耐えうる容器である。例えば、小体積の保存安定性のある組成物製造のために適切な容器手段は、バイアル、チューブ、シリンジ、二段階シリンジまたは鼻スプレー装置である。例えば、米国特許第５，４８９，２６６号、同第５，７３２，８３７号および同第４，０８４，３３０号（それぞれが文献の援用によりその全体が本文に編入される）を参照されたい。凍結乾燥のさらなる容器手段は公知であり、当業者に容易に利用可能である。
【００４９】
（１．小体積のウイルス処方物）
以下に定義される「ＲＳＶ組成物」、「ＰＩＶ組成物」または「ＲＳＶ／ＰＩＶ組成物」はウイルス（すなわち、ＲＳＶ、ＰＩＶまたはＲＳＶ／ＰＩＶ）からなり、典型的には１ｍＬあたり約１０３〜１０７ＰＦＵの弱毒ウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアからなる。薬学的に受容可能なキャリアとして、緩衝液、塩溶液、水、注射用の水（ＷＦＩ）、タンパク質安定剤、糖、アミノ酸、凍結保護材等が挙げられる。
【００５０】
小体積のウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。ある処方物において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００５１】
ある処方物において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウム、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）中に処方された小体積のウイルス組成物は、さらに、スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸、Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、ヒトアルブミン（ＨＡ）および／またはダイズペプトンを含む。他のある処方物において、約０．２５ｍＭ〜約１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）は、さらに、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約５０ｇ／Ｌスクロースおよび約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡを含む。他のある処方物において、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡは約５０ｇ／Ｌのダイズペプトン（Ｈｙ−Ｓｏｙ（登録商標）としても知られる；Ｑｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）で置換される。別の処方物において、安定的な小体積のウイルス組成物は、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウム、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウム、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡおよび約５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）中に処方される。
【００５２】
（２．小体積ウイルスの凍結速度と凍結乾燥）
上記のように、小体積の保存安定性のあるウイルス組成物の製造方法は、（ａ）ウイルス組成物をそのガラス転移温度（Ｔｇ）以下に６０分以下の時間凍結し、そして（ｂ）ウイルス組成物を凍結乾燥することからなり、該凍結乾燥ウイルス組成物は約１℃〜約１０℃の保存温度で少なくとも１年間安定である。
【００５３】
ウイルス組成物のＴｇは典型的には約−３５℃である。ウイルス組成物のＴｇは、塩化ナトリウム等の「残留」塩の存在下に約−３５℃よりも低い（例えば、約−４２℃）。例えば、塩化ナトリウムはウイルス成長培地の成分であるが、小体積処方物の成分ではない。よって、あるウイルス処方物は残留量（すなわち「キャリーオーバー（残留物）」）の塩化ナトリウムを含むだろうが、それ自体として、Ｔｇは約−３５℃よりも低くてもよいが、典型的には約−５０℃よりも低くはない。
【００５４】
「ガラス転移温度」または「Ｔｇ」との用語は、液体状態からガラス状態への転移が起こる温度範囲のおおよその中点値をいう。ウイルス組成物がそのＴｇに達する速度は、凍結乾燥中のウイルス安定性にとって重要であり（例えば、実施例２を参照）また長期のウイルス保存安定性にとって重要である（例えば、実施例３を参照）。別の言い方をすれば、さらに急速凍結速度はさらに安定なウイルス組成物をもたらすことにより、ウイルス組成物の力価損失がより低いものとなる。
【００５５】
「凍結速度」との用語は、ウイルス組成物がそのＴｇに達する速度をいう。凍結速度は、凍結中の温度低下のおおよその速度として計算することができる。例えば、ウイルス組成物の初期温度が５℃であり、それが４０分間の時間で−３５℃のそのＴｇまでに凍結した場合、その「凍結速度」は−１℃／分であったであろう。類似の条件で、凍結の速度論は個々の容器間で変動し、バルク体積の場合では、異なる時点で偏差を示しうる。よって、凍結速度は、容器内で観察されたか、またはトレイに置かれた物質の異なる位置で測定された平均凍結速度である。
【００５６】
小体積のウイルス組成物の凍結速度は、約−０．５℃／分〜約−２．５℃／分である。一実施形態において、６０分以下の時間でＴｇに達する。別の実施形態において、４０分以下の時間でＴｇに達する。さらに別の実施形態において、２０分以下の時間でＴｇに達する。ウイルス組成物のＴｇは、過度な実験なしに、例えば示差走査熱量法（ＤＳＣ）等の熱力学的測定を用いて当業者によって容易に決定される（Ｈａｔｌｅｙ，１９９２；Ｆｒａｎｋｓ，１９９２；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，２００２）。
【００５７】
一実施形態において、小体積のウイルス組成物を含む凍結乾燥バイアルは約５℃の温度まで前冷却される。次に、前冷却されたウイルス組成物を含むバイアルを凍結乾燥たなに置いて、約−１℃／分〜約−２℃／分の速度で、少なくとも−５０℃の温度まで凍結する。他の実施形態において、前冷却されたウイルス組成物を含むバイアルを、−７０℃の温度に前冷凍させた凍結乾燥たなに直接置く。
【００５８】
凍結乾燥（またはフリーズドライ）は、試料溶液（例えば、ＲＳＶ／ＰＩＶ組成物）が凍結され、溶媒（例えば、水または緩衝液）が高真空の適用による昇華により除去される脱水技術である。凍結乾燥の技術は当業者によく知られている（Ｒｅｙ  ａｎｄ  Ｍａｙ，１９９９）。
【００５９】
一実施形態において、凍結乾燥させた小体積のウイルス組成物は下記のように調製される：（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬのウイルス組成物をバイアルに置き、約５℃の温度まで冷却し；（ｂ）バイアルを凍結乾燥たなに置き、たな温度を５℃から−５０℃まで１分あたり約−１．０℃〜１分あたり約−２．０℃の速度で減少させ；（ｃ）たな温度を約−５０℃に約６０分間保持し；（ｄ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、たな温度を約−５０℃に３０〜６０分間保持し；（ｅ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約１．０℃〜約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上げて、そしてたな温度を約０℃に約５４０分間〜約７２０分間保持し；（ｆ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上げて、そしてたな温度を約１５℃で約６００分間〜約７２０分間保持し；そして（ｇ）バイアルに窒素ガスを充填し、バイアルを密閉する。
【００６０】
別の実施形態において、ウイルス組成物の凍結乾燥が下記のように調製される：（ａ）約０．５ｍＬ〜０．６ｍＬのウイルス組成物をバイアルに置き、約５℃の温度まで冷却し；（ｂ）凍結乾燥たなを約−７０℃の温度まで冷凍し；（ｃ）バイアルを凍結乾燥たなに置き、温度を約−７０℃に約６０分間保持し；（ｄ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、たな温度を−７０℃から−５０℃まで１分あたり約１．０℃の速度で増加させ；（ｅ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約１．０℃〜１分あたり約２．０℃の速度で−５０℃から０℃まで上げて、そしてたな温度を約０℃で約５４０分間〜約７２０分間保持し；（ｆ）たな温度を、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約０．５℃の速度で０℃から１５℃まで上げて、そしてたな温度を約１５℃に約６００分間〜約７２０分間保持し；そして（ｇ）バイアルに窒素ガスを充填し、バイアルを密閉する。
【００６１】
凍結乾燥させた小体積のウイルス組成物（すなわち、凍結乾燥ケーキ）は、凍結乾燥から生じる約１．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有し、約１℃〜約１０℃での１年間の保存後に約１．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する（例えば、実施例２、実施例３および表２と表４〜７を参照）。さらに別の実施形態において、凍結乾燥させた小体積のウイルス組成物は、約１℃〜約１０℃での１年間の保存後に０．２ｍＬあたり少なくとも約４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵである。
【００６２】
（Ｃ．バルク体積の凍結乾燥安定性のあるウイルス組成物）
別の実施形態において、本発明はバルク（または大）体積の凍結乾燥安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。一実施形態において、本発明は、ＲＳＶ、ＰＩＶ、またはそれらの組合せからなるバルク（または大）体積の凍結乾燥安定性のあるウイルス組成物の製造方法に関する。本製造方法は、（ａ）少なくとも５０ｍＬの体積を有する液体ウイルス組成物を凍結乾燥トレイに置き、（ｂ）ウイルス組成物を、液体窒素浴中で少なくとも約２０分間そのＴｇ以下で凍結し、そして（ｃ）ウイルス組成物を凍結乾燥することからなる。凍結乾燥ウイルス組成物は、凍結乾燥プロセス前のウイルス組成物に対して０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。バルク体積の凍結乾燥安定性のあるウイルス組成物の製造方法は、ウイルス組成物の大規模生産／製造中に特定の有用性を有する。
【００６３】
以下に定義される「バルク」体積または「大」体積のウイルス組成物は１凍結乾燥トレイあたり約５０ｍＬ〜約２Ｌである。ある実施形態において、バルク体積は１凍結乾燥トレイあたり約２５０ｍＬ〜約１ｍＬである。特定の一実施形態において、バルク体積のウイルス組成物は１凍結乾燥トレイあたり１Ｌである。
【００６４】
（１．バルク体積のウイルス処方物）
バルク体積のウイルス組成物は、緩衝液、塩溶液、水、注射用の水（ＷＦＩ）、タンパク質安定剤、糖、アミノ酸、凍結保護材等を含む薬学的に受容可能なキャリア中に処方される。
【００６５】
一実施形態において、バルク体積のウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなるリン酸緩衝溶液中に処方される。リン酸緩衝液の濃度は約５．０ｍＭ〜約２０ｍＭで、約６．５〜約７．８のｐＨを有する。
【００６６】
別の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約２．５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。他のある実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００６７】
ある実施形態において、バルク体積のウイルス組成物は１０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）中に処方され、さらに約２．５ｍＭ〜約１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。他の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００６８】
一実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５〜７．８、２．５〜２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１〜１．０ｍＭ塩化マグネシウム、０．１〜１．０ｍＭ塩化カルシウム）は、さらに、スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸、Ｌ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、ヒトアルブミン（ＨＡ）および／またはダイズペプトンを含む。別の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ６．５〜７．８、２．５〜１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１〜０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１〜０．５ｍＭ塩化カルシウム）は、さらに、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、および約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡを含む。一実施形態において、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡは約５０ｇ／Ｌのダイズペプトンで置換される。さらに別の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）は、約２．５ｍＭ〜約１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化マグネシウム、約０．１ｍＭ〜約０．５ｍＭ塩化カルシウム、約５０ｇ／Ｌスクロース、約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約０．０４９ｍＭ〜約２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、約１．０ｇ／Ｌ〜約１０．０ｇ／ＬのＨＡおよび約５０ｇ／ｍＬダイズペプトンを含む。
【００６９】
（２．バルク体積ウイルスの凍結速度および凍結乾燥）
バルク体積の凍結乾燥保存性のあるウイルス組成物の製造方法は、（ａ）少なくとも５０ｍＬの体積を有する液体ウイルス組成物を凍結乾燥トレイに置き；（ｂ）ウイルス組成物を、液体窒素浴中で少なくとも約２０分間そのＴｇ以下で凍結し；そして（ｃ）ウイルス組成物を凍結乾燥することからなり、凍結乾燥ウイルス組成物は、凍結乾燥前のウイルス組成物に対して約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。
【００７０】
第Ｂ．２章に記載されているように、小体積のウイルス組成物がそのＴｇに達する速度はウイルス保存安定性にとって重要である。同様に、バルク体積のウイルス組成物がそのＴｇに達する速度はウイルス保存安定性にとって重要である。よって、バルク体積のウイルスを調製するために重要な工程は、ウイルス組成物を、液体窒素浴中で少なくとも約２０分間そのガラス転移温度以下で凍結することである。バルク体積の急速凍結速度を達成するためのもう１つの重要なパラメーターは、凍結乾燥トレイの熱転移性、組成および形状である。例えば、大きな表面領域を有する凍結乾燥トレイは、バルク体積のウイルス組成物がそのＴｇに達するのにかかる時間を減少させる。凍結乾燥トレイはよく知られており、ステンレス鋼トレイ、ガラストレイ、アルミニウムトレイ、プラスチックトレイおよびＬｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）トレイを含む。一実施形態において、凍結乾燥トレイはＬｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイである。トレイは、良好な熱転移性を有するバルク凍結乾燥用に特に設計される。トレイは、水蒸気の良好な物質移動を可能としながら、固体粒子が凍結乾燥サイクル中にトレイから「飛び散る」ことを妨げるように設計された微細孔膜からなる。
【００７１】
ウイルス組成物のＴｇは約−３５℃の温度である。前述のように、ウイルス増殖培地に由来する残存量（すなわち「キャリーオーバー（残留物）」）の塩化ナトリウムはＴｇをさらに減少させうるが、−５０℃以下には減少させない。
【００７２】
他の実施形態において、ウイルス組成物の凍結乾燥が、さらに、（ａ）約−５０℃の温度の凍結ウイルス組成物を有するトレイを約−５０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、その温度を約６０分間保持し；（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、約０．１０Ｔｏｒｒで１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−５０℃から−２３℃に上げ；（ｃ）たな温度を約−２３℃に約８０時間〜約１００時間保持し；（ｄ）チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに減少させ、１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−２３℃から１５℃に上げ；（ｅ）約３０時間〜約４０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、たな温度を約１５℃に保持し；（ｆ）０．０２Ｔｏｒｒで１分あたり約０．１７℃の速度でたな温度を１５℃から２５℃まで上げ；（ｇ）約１０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、たな温度を約２５℃に保持し、そして（ｈ）チャンバーを窒素ガスで満たし、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下にトレイを密閉すると定義される。
【００７３】
別の実施形態において、バルク体積のウイルス組成物の凍結乾燥が、さらに、（ａ）約−７０℃の温度の凍結ウイルス組成物を有するトレイを約−７０℃の温度に前冷却された凍結乾燥たなに置いて、その温度を約６０分間保持し；（ｂ）チャンバー圧力を０．１０Ｔｏｒｒに減少させ、１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−７０℃から−２３℃に上げ；（ｃ）約０．１０Ｔｏｒｒでたな温度を約−２３℃に約８０時間〜約１００時間保持し；（ｄ）チャンバー圧力を０．０２Ｔｏｒｒに減少させ、１分あたり約０．２３℃の速度でたな温度を−２３℃から１５℃に上げ；（ｅ）約３０時間〜約４０時間、約０．０２Ｔｏｒｒで、温度を約１５℃に保持し；（ｆ）０．０２Ｔｏｒｒで１分あたり約０．１７℃の速度でたな温度を１５℃から２５℃まで上げ；（ｇ）約１０時間、その温度を約２５℃に保持し、そして（ｈ）チャンバーを窒素ガスで満たし、アルミニウムポーチ内で窒素ガス下にトレイを密閉すると定義される。
【００７４】
凍結乾燥させたバルク体積のウイルス組成物（すなわち、凍結乾燥ケーキ）は、凍結乾燥から生じる約１．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有し、約１℃〜約１０℃での１年間の保存後に約１．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する（例えば、実施例４を参照）。
【００７５】
（Ｄ．液体ウイルス組成物）
別の実施形態において、本発明は保存安定性のある液体ウイルス組成物の製造方法に関する。一実施形態において、本発明は、ＲＳＶ、ＰＩＶ、またはそれらの組合せからなる保存安定性のある液体ウイルス組成物の製造方法に関する。本製造方法は、（ａ）金属プレートを液体窒素浴中で平衡化させ；（ｂ）液体ウイルス組成物を適切な容器手段に置き；（ｃ）工程（ｂ）の容器を金属容器ホルダーに挿入し；（ｄ）金属容器ホルダーを工程（ａ）の平衡化金属プレートに約１０分間置き；（ｅ）容器を金属容器ホルダーから取り出し；そして（ｆ）容器を約−２０℃〜約−７０℃の温度で保存することからなる。
【００７６】
（１．液体ウイルスの凍結と解凍）
工程（ｆ）で示されたように、凍結ウイルス組成物を含む容器は約−２０℃〜約−７０℃で保存する。ウイルス組成物を室温で解凍することはウイルス組成物を液体状態に戻すことであり、解凍させた液体ウイルス組成物は６ヶ月保存後に約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する。一実施形態において、解凍液体ウイルス組成物は、−２０℃の温度で６ヶ月間の保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２ｍＬである。別の実施形態において、解凍液体ウイルス組成物は、−２０℃の温度で６ヶ月保存後に少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵ／０．２  ｍＬである。
【００７７】
典型的には、適切な容器手段は、液体ウイルス組成物に関して、約−２０℃〜約−７０℃の範囲の温度に耐える容器である。例えば、保存安定性のある液体組成物の生産の適切な容器手段はバイアル、チューブ、シリンジまたは鼻スプレー装置である。ある実施形態において、容器は鼻スプレー装置である。一実施形態において、鼻スプレー装置は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から利用可能なＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）鼻スプレー装置または類似の鼻スプレー装置である。
【００７８】
液体ウイルス組成物が凍結する速度はウイルス保存安定性にとって重要である（例えば、実施例５を参照）。液体窒素浴を用いてウイルス組成物を迅速に凍結する。工程（ａ）の金属プレートは、熱を液体窒素浴に十分に移して工程（ｃ）の金属容器ホルダーから熱を除去するどのような金属でもよい。同様に、工程（ｃ）の金属容器ホルダーは熱を金属プレートに移してウイルスを含む容器から熱を除去するどのような金属でもよい。一実施形態において、金属容器ホルダーはアルミニウムである。別の実施形態において、金属容器ホルダーはステンレス鋼である。
【００７９】
（２．液体ウイルス処方物）
液体ウイルス組成物は、緩衝液、塩溶液、水、注射用の水（ＷＦＩ）、糖、アミノ酸、凍結保護材等を含む薬学的に受容可能なキャリア中に処方される。
【００８０】
上記の液体ウイルス組成物は、ナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。一実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。別の実施形態において、５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００８１】
ある実施形態において、液体ウイルス組成物はナトリウムおよび／またはカリウムの一塩基性塩および二塩基性塩からなり、約６．５〜約７．８のｐＨを有する１０ｍＭリン酸緩衝溶液中に処方される。他の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含む。別の実施形態において、１０ｍＭリン酸緩衝溶液は、さらに、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む。
【００８２】
一実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）は、さらに、スクロース、Ｌ（＋）−グルタミン酸またはＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物、およびヒトアルブミン（ＨＡ）を含む。他の実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む５．０ｍＭ〜約２０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）は、さらに、約７５ｇ／Ｌスクロースおよび約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物を含む。
【００８３】
さらに他の実施形態において、約０．２５ｍＭ〜約２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化マグネシウムおよび約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭ塩化カルシウムを含む１０ｍＭリン酸緩衝溶液（約６．５〜約７．８のｐＨ）は、さらに、約７５ｇ／Ｌスクロースおよび約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸または約４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩またはそれらの混合物を含む。
【００８４】
液体凍結ウイルス組成物（すなわち、スプレー装置またはバイアルに凍結）は、「速い」凍結後に約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有し、約−２０℃〜約−７０℃で６ヶ月の保存後に約０．５  ｌｏｇ  ＰＦＵ未満の損失を有する（例えば、実施例５と表９〜１２を参照）。さらに別の実施形態において、液体凍結ウイルス組成物は約−２０℃〜約−７０℃で６ヶ月間の保存後に、０．２ｍＬあたり少なくとも４．０  ｌｏｇ  ＰＦＵである。
【００８５】
（Ｅ．免疫原性ウイルス組成物）
ある実施形態において、本発明は、本発明の方法により作られた、ＲＳＶ、ＰＩＶ、またはそれらの組合せからなる保存安定性のある（凍結）液体ウイルス組成物からなる免疫原組成物を提供する。他の実施形態において、本発明は、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、アデノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、トガウイルス、アルファウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、パピローマウイルス、ポリオーマウイルス、メタニューモウイルス、コロナウイルス、水泡性口内炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス等を含む保存安定性のある（凍結）液体ウイルス組成物からなる免疫原性組成物を提供する。
【００８６】
ある実施形態において、凍結させた液体免疫原性組成物は鼻スプレー装置に含まれる。典型的には、本発明の保存安定性のある（凍結）液体ウイルス組成物は、本発明の液体処方物と製造方法を用いる哺乳類対象への投与のために処方され、加工され（例えば、第Ｄ章、実施例１および実施例５を参照）、凍結させた液体として保存され、そして哺乳類対象に投与する前に解凍される。
【００８７】
ある実施形態において、本発明の保存安定性のあるウイルス組成物は凍結乾燥固体（または凍結乾燥ケーキ）組成物である。特定の実施形態において、保存安定性のある凍結乾燥ウイルス組成物は薬学的に受容可能なキャリアに溶解、希釈または懸濁され、哺乳類対象（例えば、ヒト）への投与に適する免疫原性組成物として提供される。よって、そのような凍結乾燥組成物は典型的には「免疫原性」組成物（例えば、弱毒ＲＳＶおよび／または弱毒ＰＩＶウイルス）および「薬学的に受容可能なキャリア」からなる。以下に用いられる「薬学的に受容可能なキャリア」との用語は、薬学的投与に適合性のあることが知られているすべての溶媒を含むものとする。薬学活性のある物質に対するそのような媒体および物質の使用はよく知られている。慣用の媒体または物質が有効化合物（例えば、ＲＳＶまたはＰＩＶ）に非適合である以外、そのような媒体が本発明の組成物に用いられる。
【００８８】
よって、本発明の免疫原性組成物は、意図する投与経路に適合性のあるように処方される。投与経路の例として、非経口（例えば、静脈内、皮内、皮下、筋内、腹腔内）、粘膜（例えば、経口、直腸、鼻内、頬、膣、呼吸）および経皮（局所）が挙げられる。例えば、鼻内スプレーとして投与される保存安定性のある凍結乾燥ウイルス免疫原性組成物は、注射用の水等の滅菌希釈剤、塩溶液、緩衝液（例えば、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩）および塩化ナトリウムまたはデキシトロース等の張度を調節するための物質等の１つ以上の成分を含む。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基により調節される。免疫原性組成物は、スプレー装置、アンプル、使い捨てのシリンジ、またはガラスかプラスチック製の単一／複数投与量バイアルに封入する。
【００８９】
非経口組成物を、投与の容易さと投与量の均一性のために投与単位形に処方することが特に有利である。以下に用いられる投与単位形は、処置される対象に対して単位投与量として適する物理的に分離した単位をいい、各単位は、必要とされる薬学的キャリアと組合されて所望の治療効果を生むように計算された一定量の有効化合物を含有する。本発明の投与単位形の詳細は有効化合物の独自の特徴と達成すべき特定の治療効果、および個人の治療のために有効化合物の処方技術に内在する制限により示され、かつそれらに直接に依存する。
【００９０】
薬学的に受容可能なベヒクルは、副作用を起こさず、かつ例えば有効化合物の投与を容易とし、生体内でその寿命および／または有効性を高め、溶液中のその溶解度を高め、もしくはその保存性を高めることを可能とする薬学的または免疫原性組成物に入る化合物または化合物の組合せを示すものと理解される。これらの薬学的に受容可能なベヒクルはよく知られており、選択された有効化合物の性質と投与態様にしたがって当業者により適合させられるだろう。
【００９１】
ここで挙げられたすべての特許および公刊物は文献の援用によりここに編入する。
【実施例】
【００９２】
（Ｆ．実施例）
特にことわらない限り、下記の実施例は、当業者によく知られ、慣用である標準的な技術を用いて実施される。下記の実施例は説明の目的のために示されるものであって、本発明の範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【００９３】
（実施例１）
（ＲＳＶおよびＰＩＶ処方成分）
ここに記載されるＲＳＶおよび／またはＰＩＶ試料は、下記のように「処方物Ａ１」〜「処方物Ｅ２」と称される下記のリン酸緩衝液処方の１つに処方する：
処方物Ａ１：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１．０ｇ／ＬのＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。ＨＡはＧｒｉｆｏｌｓ（登録商標）２０％（ｗ／ｖ）ヒトアルブミン（Ｇｒｉｆｏｌｓ  ＵＳＡ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ；カタログ番号６１９５３−０００１−１）である。
処方物Ａ２：１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１．０ｇ／ＬのＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ａ３：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１．０ｇ／Ｌ組換えＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。組換えＨＡは酵母細胞に発現する２０％（ｗ／ｖ）ヒトアルブミンであり、Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標）（Ｄｅｌｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）の商品名で販売されている。
処方物Ａ４：１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１．０ｇ／Ｌ組換えＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｂ１：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１０ｇ／ＬのＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｂ２：１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１０ｇ／ＬのＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｂ３：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１０ｇ／Ｌ組換えＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｂ４：１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１０ｇ／Ｌ組換えＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｃ１：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロース、５０ｇ／Ｌダイズペプトン（ＨｙＳｏｙ（登録商標））および１．０ｇ／ＬのＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｃ２：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロース、５０ｇ／Ｌダイズペプトンおよび約１．０ｇ／Ｌの組換えＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｃ３：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロース、５０ｇ／Ｌダイズペプトンおよび約１．０ｇ／Ｌ組換えＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｃ４：１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロース、５０ｇ／Ｌダイズペプトンおよび約１．０ｇ／ＬのＨＡを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｄ１：２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
処方物Ｄ２：１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび５０ｇ／Ｌダイズペプトンを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）。
【００９４】
（実施例２）
（凍結乾燥中の小体積のＲＳＶ処方物および／またはＰＩＶ処方物の力価に対する凍結速度の効果）
この実施例において、小体積のＲＳＶ処方物および／またはＰＩＶ処方物の凍結速度を研究してウイルス力価の損失を最小化するために必要とされる最適凍結条件を決定した。
【００９５】
最初に、ＬＲＳＶ−４０４、ＰＩＶ３−ｃｐ４５およびＬＲＳＶ−４０４／ＰＩＶ３−ｃｐ４５の組み合わせを含む３試料を調べた（表２）。これらの処方物に用いられたウイルスバルクは、フェーズ１とフェーズ２のヒト臨床試験の臨床材料として調製した。各ウイルス試料は、実施例１に示された「処方物Ａ１」を用いて処方した。試料は２ｍＬバイアル（１バイアルあたり０．６ｍＬ）に充填し、約５℃の温度まで前冷却し、次に凍結乾燥器の前冷却（−５０℃）たなに置いた。約４０分間（約−１．０℃／分の凍結速度に対応）でウイルス組成物（約−３５℃±５℃）のガラス転移温度（Ｔｇ）に達した。凍結後、０℃での一次乾燥とそれに続く１５℃での二次乾燥を含む凍結乾燥サイクルを適用した。
【００９６】
【表２】
2007514450.tif 000004
（ａ）＊＝−１℃／分で凍結させた場合の試料
（ｂ）ＬＲＳＶ−４０４１：組合せられたＬＲＳＶ−４０４／ＰＩＶ−ｃｐ４５処方物から決定したＬＲＳＶ−４０４１の力価。
（ｃ）ＰＩＶ−ｃｐ４５１：組合せられたＬＲＳＶ−４０４／ＰＩＶ−ｃｐ４５処方物から決定したＰＩＶ−ｃｐ４５１の力価。
【００９７】
初期ウイルスバルク、凍結工程後のバイアル中のウイルス材料、および凍結乾燥試料（凍結乾燥直後のもの）のウイルス力価試験を実施した。ＲＳＶは、プラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイおよびＶｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣカタログＮｏ．ＣＣＬ−１８）を用いて調べた。アッセイは、（ａ）２４ウエルプレートでの細胞単層の調製、（ｂ）リファレンスと試験試料の１０倍希釈物の調製、（ｃ）細胞の感染、（ｄ）３２℃、５％ＣＯ２での約５日間のプレートのインキュベーションおよび（ｅ）細胞の固定とプラークを可視化するための免疫染色を含んだ。ＰＩＶは、（ａ）２４ウエルプレートでの細胞単層の調製、（ｂ）リファレンスと試験試料の１０倍希釈物の調製、（ｃ）細胞の感染、（ｄ）３２℃、５％ＣＯ２での約４日間のプレートのインキュベーションおよび（ｅ）細胞の固定とプラークを可視化するための免疫染色を含むプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイおよびＬＣＣ−ＭＫ２細胞を用いて調べた。両方のアッセイに関する力価試験の結果は、アッセイから決定されたリファレンス試料の力価が登録値の±０．５ｌｏｇ  ＰＦＵにある場合に受諾しうるとみなした。
【００９８】
ＲＳＶ、ＰＩＶおよびＲＳＶ／ＰＩＶ処方物に対して実施された力価試験の結果を表２に示す。これらのデータは、約−１．０℃／分の速度で凍結させた処方物の最少の力価損失を示す。この実験の結果から、ＲＳＶとＰＩＶは、組合わされた処方物中において適合性があることも確認した。
【００９９】
さらに速い（−２℃／分；表６）および遅い（−０．３℃／分；表３）凍結速度および異なる濃度の組換えＨＡ（ｒＨＡ）、ＨＡ、ダイズペプトンおよびそれらの組合せを用いてＲＳＶおよび／またはＰＩＶの安定性をさらに調べた。ウイルス試料は、フェーズ１およびフェーズ２のヒト臨床試験のために調製されたＬＲＳＶ−４０４、ＬＲＳＶ−ｒＡ３８、ＬＲＳＶ−ｒＡ４２またはＰＩＶ３−ｃｐ４５液体ウイルスバルクを含んだ。各ウイルス試料は、表３〜６の第二欄に示された処方物を用いて調製した。ウイルス試料を２ｍＬバイアル（１バイアルあたり０．５ｍＬ）に充填し、約５℃の温度まで前冷却し、次に凍結乾燥器のたなに置いた。凍結試料を、０℃での一次乾燥とそれに続く１５℃での二次乾燥を含むサイクルを用いて凍結乾燥した。
【０１００】
初期ウイルスバルク、凍結後のバイアル中の材料、および凍結乾燥試料（凍結乾燥直後のもの）の力価試験を実施した。力価試験結果は、約−０．３℃／分（表３）で凍結させた試料中のＲＳＶまたはＰＩＶ力価の顕著な減少および−１℃／分（表４および表５）および−２℃／分（表６）での速い速度で凍結させた処方物中のＲＳＶまたはＰＩＶの高い安定性を示した。
【０１０１】
【表３】
2007514450.tif 000005
【０１０２】
【表４】
2007514450.tif 000006
【０１０３】
【表５】
2007514450.tif 000007
【０１０４】
【表６】
2007514450.tif 000008
（実施例３）
（ＲＳＶまたはＰＩＶを含む小体積処方物の保存安定性）
実施例２に記載の処方物の保存安定性は、５℃での３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月および１２ヶ月保存を含む異なる時間点での力価試験により評価した。安定性データを下記の表７に要約するが、これらのデータは５℃での１年間までのウイルス組成物の最少の力価損失を示している。表７の処方物の欄は実施例１に示された処方物を表す。
【０１０５】
【表７】
2007514450.tif 000009
。
【０１０６】
（実施例４）
（凍結乾燥中のバルク体積のＲＳＶ処方物および／またはＰＩＶ処方物の力価に対する凍結速度の効果）
ＲＳＶ、ＰＩＶまたはそれらの組合せを含む免疫原性組成物の大規模生産の凍結乾燥法を最適化するために、バルク（大）体積のＲＳＶ処方物またはＰＩＶ処方物に関して異なる凍結速度を調べた。
【０１０７】
１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０（２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．４９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸一ナトリウム塩、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１ｇ／ＬのＨＡ）を含むバルクＲＳＶ−４０４処方物を調製して、１ＬのＬｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイ内で凍結乾燥した。材料の凍結は、凍結乾燥器のたな上で、４５分間でたな温度を５℃から−４５℃まで低下させることによって行った。凍結乾燥トレイはたな（−４５℃）上でさらに５時間保持して、処方物をガラス転移温度以下で凍結させた。ガラス転移温度（約−３５℃）に達する実際の時間は約２時間であり、これは１分あたり約−０．３℃の凍結速度に対応した。引き続いて、０℃での一次乾燥とそれに続く１５℃での二次乾燥を含む９０時間の凍結乾燥サイクルを適用した。最初の処方されたバルクと凍結乾燥材料の力価をＰＦＵアッセイにより調べた。
【０１０８】
別の実験において、ＬＲＳＶ−ｒＡ３９を用いた処方物を同じ処方物を用いて調製したが、材料は、５０ｍＬ容量を有する小さいサイズのアルミニウムトレイを用いて凍結乾燥した。材料は、凍結乾燥器のたな上で６０分間で温度を５℃から−４０℃に低下させることによって凍結した。材料のガラス転移温度（約−３５℃）に達する実際の時間は約１．５時間であり、これは１分あたり約−０．４℃の凍結速度に対応した。引き続いて、０℃での一次乾燥とそれに続く１５℃での二次乾燥を含む２４時間の凍結乾燥サイクルを適用した。最初の処方されたバルクと凍結乾燥材料の力価をＰＦＵアッセイにより調べた。
【０１０９】
もしくは、１ＬのＬｙｏｇｕａｒｄ（登録商標）凍結乾燥トレイでのバルク凍結乾燥を用いて２つの他のＲＳＶ処方物を調製した。１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．５ｍＭ塩化カルシウム、２．４５ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸、５０ｇ／Ｌスクロースおよび１０ｇ／ＬのＨＡを含む１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．０）を用いて、ＬＲＳＶ−ｒＡ３８とＬＲＳＶ−４０４（無血清培地で生育させたもの）を別々に処方した。ウイルス組成物は、トレイを液体窒素浴に少なくとも２０分間浸すことにより凍結した。凍結乾燥トレイを次に前冷却（−５０℃）凍結乾燥たなに置き、（ａ）０．１０Ｔｏｒｒに設定した真空下の一次乾燥の開始；（ｂ）−２３℃のたな温度までの温度傾斜（０．２３℃／分）；（ｃ）−２３℃の温度に８０〜１００時間保持し；（ｄ）０．０２Ｔｏｒｒに設定した真空下に二次乾燥の開始；（ｅ）１５℃のたな温度までの温度傾斜（０．１３℃／分）；（ｆ）温度を１５℃に３０〜４０時間保持し；（ｇ）温度を２５℃のたな温度まで傾斜（０．１７℃／分）させ、そして（ｈ）温度を２５℃に１０時間保持することを含む１２０時間サイクルを用いて凍結乾燥した。
【０１１０】
処方されたウイルスバルクおよび凍結乾燥材料の試料の力価をＰＦＵアッセイで調べた。凍結速度は凍結乾燥サイクル中のウイルス力価の保存に重要であることを確認させるデータを下記の表８に挙げる。凍結乾燥たな上のトレイの凍結（「遅い凍結」）は、力価損失が無視できる（表８、第３欄）である液体窒素によるトレイの凍結（「急速凍結」）に比べて凍結乾燥材料の顕著な力価の損失をもたらした（表８、第２欄）。
【０１１１】
【表８】
2007514450.tif 000010
。
【０１１２】
（実施例５）
（鼻スプレー装置に充填された液体ＲＳＶ処方物の急速凍結）
（無血清培地で生育させた）ＬＲＳＶ−ｒＡ３８の液体処方物を、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．０ｍＭ塩化マグネシウム、１．０ｍＭ塩化カルシウム、７５ｇ／Ｌスクロースおよび４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸からなる１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）中に調製した。処方物をＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）鼻スプレー装置（１装置あたり０．２３ｍＬ）に充填し、各鼻スプレー装置を、本出願人により設計され、作られたアルミニウム鼻スプレーホルダー（例えば、図１を参照）のウエルに挿入した。鼻スプレーホルダーは、ウエルの直径が鼻スプレー装置の直径よりも０．５ｍｍ大きい９６ウエルを有するアルミニウムブロックから作られた。ウエルは、各鼻スプレー装置内のウイルス試料がホルダーの上面下に存在させるのに十分な深さがある。
【０１１３】
鼻スプレー装置の充填時に、（０．３ｍ×０．２ｍ×０．０２ｍの大きさを有する）ステンレス鋼プレートを、液体窒素を充填した冷凍容器に置き、該プレートを液体窒素中で平衡化（すなわち、液体窒素が沸騰を停止するまで）させる。平衡化後、冷凍容器中の液体窒素の体積を、金属プレートに接触させるには十分であるが、鼻スプレーホルダーには接触させない体積が存在するように調節する。充填させた鼻スプレー装置を含む鼻スプレーホルダーを、冷凍容器の内部の「凍結」プレートの上部に置き、少なくとも１０分間、「速く凍結」させる。続いて、鼻スプレー装置を、鼻スプレー装置の半分が−７０℃に設定されたフリーザーに保存し、鼻スプレー装置の他の半分を−２０℃に設定されたフリーザーに保存した鼻スプレーホルダーから取りだした。
【０１１４】
さらに、（無血清培地で生育させた）ＬＲＳＶ−４０４の液体処方物を、２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．１ｍＭ塩化マグネシウム、０．１ｍＭ塩化カルシウム、７５ｇ／Ｌスクロースおよび４．９ｍＭのＬ（＋）−グルタミン酸からなる１０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に調製した。処方物を、上記に記載のように、ＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）鼻スプレー装置（１装置あたり０．２３ｍＬ）に充填し、「速く」凍結し、保存した。
【０１１５】
もしくは、液体ＬＲＳＶ−ｒＡ３８と液体ＬＲＳＶ−４０４試料を処方し、上記のように鼻スプレー装置に充填したが、凍結は、−７０℃に冷却された普通のフリーザーのたなに鼻スプレーホルダーを置くことにより実施され、２４時間凍結させた（「遅い」凍結）。図２のデータは「速い」凍結（図２、黒四角）および「遅い」凍結（図２、白四角）の速度論を示す。続いて、鼻スプレー装置の半分を、−７０℃に設定されたフリーザーに保存し、鼻スプレー装置の他の半分を−２０℃に設定されたフリーザーに保存した。
【０１１６】
試料の保存安定性を、０ヶ月、１ヶ月、３ヶ月、４ヶ月および６ヶ月の期間での力価試験により評価した。鼻スプレー装置（各時間点あたり３装置）を室温で約１時間解凍した。各鼻スプレー装置の内容物をチューブ中に放出させて、次にＰＦＵアッセイを用いて力価を調べた。
【０１１７】
表９〜１２に示すデータは、液体ＲＳＶ処方物の安定性に対する急速凍結速度の効果を要約する。
【０１１８】
【表９】
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【０１１９】
【表１０】
2007514450.tif 000012
【０１２０】
【表１１】
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【０１２１】
【表１２】
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これらのデータから、液体窒素により凍結させたＲＳＶ処方物（「速い」凍結）は、両保存温度（−２０℃と−７０℃）で安定であることが観察された（表９および表１１）。−７０℃のフリーザーのたな上で凍結させたＲＳＶ処方物（「遅い」凍結）は、力価の減少および異なる時間点での力価のかなりの変動性を示した（表１０および表１２）。
【０１２２】
スプレー性能に対する凍結の影響は、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＳｐｒａｙＴｅｃ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒを用いる小滴径分布の測定により評価した。上記の液体ＬＲＳＶ−ｒＡ３８処方物を充填したスプレー装置について分析を行った。下記のスプレー装置（１試験あたり１０装置）の小滴径分布が測定された：（ａ）ＲＳＶが充填されているが、凍結されていない鼻スプレー装置、（ｂ）ＲＳＶが充填され、液体窒素で凍結され、−７０℃で３ヶ月間保存された鼻スプレー装置、（ｃ）ＲＳＶが充填され、液体窒素で凍結され、−２０℃で３ヶ月間保存された鼻スプレー装置、（ｄ）ＲＳＶが充填され、−７０℃フリーザーで凍結され、−７０℃で３ヶ月間保存された鼻スプレー装置、および（ｅ）ＲＳＶが充填され、−７０℃フリーザーで凍結され、−２０℃で３ヶ月間保存された鼻スプレー装置。
【０１２３】
ＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）鼻スプレー装置は鼻内ワクチン接種を（各鼻孔に対して別々の）二連続スプレーにより実施するように設計されているために、各スプレーを分析した。１０μｍ未満の粒子径を有する小滴（％）の画分の値を基準（１０μｍ未満の粒子を有する画分の質量の増加は承諾できない）として用いた。分析の結果を表１３に要約する。凍結スプレー装置の凍結および３ヶ月間の保存はスプレーの性能に影響を与えなかった。１０μｍ未満の直径を有する小滴の全質量の観察された増加は存在しなかった。
【０１２４】
【表１３】
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【０１２５】
【表１４−１】
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【０１２６】
【表１４−２】
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１】図１は、処方物を凍結するために用いられた９６ウエルアルミニウムホルダー中のＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）装置の配置の概略図を示し、下記のように示される：（１）アルミニウムまたはスチールホルダー、（２）装置に充填された処方物、（３）ＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ装置、（４）ストッパーおよび（５）空のウエル。
【図２】図２は、−７０℃フリーザーでの処方物の凍結ｖｓ液体窒素による同一処方物の凍結の速度論を示す。液体処方物はＢＤ  Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）装置に加えられ、その凍結は、液体窒素により冷却された金属表面にアルミニウムホルダーを置くか、または−７０℃フリーザーのたなにアルミニウムホルダーを置くことにより実施した。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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