(57)【要約】変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットおよびこのような変異体をコードする核酸配列を記載する。更に、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする核酸配列を特徴付けるための方法、Ｎａν１．７ハプロタイプを決定するための方法、対象のナトリウムチャンネル変異に関連する神経学的障害の素因を決定するための方法、および、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをモジュレートする化合物を同定する方法を記載する。変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルに関する他の物質、組成物、物品、装置および方法もまた本明細書に記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする核酸配列を特徴付ける方法であって、細胞内Ｎ末端領域、ドメインＩ内の細胞外ループ、ドメインＩとＩＩとの間の細胞内ループ、ドメインＩＩとＩＩＩとの間の細胞内ループ、ドメインＩＩの膜内領域またはこれらの何れかの組み合わせをコードする核酸配列の領域における部位１つ以上における変異を同定する工程を含み、このようにして同定されたヌクレオチドが核酸配列の特徴を示すものである、上記方法。
【請求項２】
変異がサブユニットの細胞内Ｎ末端をコードする核酸領域中に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
変異がアミノ酸残基６２をコードする、請求項２記載の方法。
【請求項４】
コードされるアミノ酸残基がバリンである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
変異がサブユニットのドメインＩの細胞外ループをコードする核酸領域に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項６】
変異がアミノ酸残基１４９をコードする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
コードされるアミノ酸残基がグルタミンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
変異がサブユニットのドメインＩとＩＩとの間の細胞内ループをコードする核酸領域に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
変異がアミノ酸残基６４１をコードする、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
コードされるアミノ酸残基がチロシンである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
変異がアミノ酸残基６５５をコードする、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
コードされるアミノ酸残基がアルギニンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
変異がサブユニットのドメインＩＩとＩＩＩとの間の細胞内ループをコードする核酸領域に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
変異がアミノ酸残基１１２３をコードする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
コードされるアミノ酸残基がフェニルアラニンである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
変異がサブユニットのドメインＩＩの膜内領域をコードする核酸領域に存在する、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
変異がアミノ酸残基７３９をコードする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
コードされるアミノ酸残基がバリンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
変異を同定する工程が核酸配列を野生型核酸配列と比較する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
野生型核酸配列が配列番号３８のアミノ酸配列をコードする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
同定工程が生物学的試料を得る工程、および、試料を試験してそこに含有される核酸の変異部位におけるヌクレオチドを同定する工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
核酸を配列決定またはプロービングする工程により試料を試験する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
試験工程が試料中に含有される核酸を増幅する工程を含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
試験工程が増幅された核酸を配列決定する工程をさらに含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
増幅工程がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
増幅工程が配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１の配列の１つ以上を含むプライマーに核酸を接触させる工程を含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
アミノ酸残基６２、１４９、６４１、６５５、７３９、１１２３または何れかのこれらの組み合わせをコードするヌクレオチド１つ以上を同定する工程を含む、ヒト対象におけるＮａν１．７ハプロタイプを決定するための方法であって、ヌクレオチドがハプロタイプを示す上記方法。
【請求項２８】
対象のナトリウムチャンネル変異に関連する神経学的障害の素因を決定するための方法であって、対象のＮａν１．７ハプロタイプを神経学的障害に相関する参照ハプロタイプ１つ以上と比較する工程を含み、ここで、参照ハプロタイプと比較した場合の対象のＮａν１．７ハプロタイプにおける同様のハプロタイプは神経学的障害に対する素因を示すものである上記方法。
【請求項２９】
神経学的障害が発作障害である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
発作障害が熱性発作障害である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
参照ハプロタイプが、コードされるＮａν１．７のアミノ酸配列の残基６２、残基１４９、残基６４１、残基６５５、残基７３９または残基１１２３における変異１つ以上をコードするヌクレオチドを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをモジュレートする化合物を同定する方法であって、下記工程：
ａ）残基６２、残基１４９、残基６４１、残基６５５、残基７３９または残基１１２３における変異１つ以上を含む変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをコードする変異体Ｎａν１．７核酸を含有する細胞を試験化合物に接触させる工程；
ｂ）Ｎａν１．７ナトリウムチャンネル活性を検出する工程；
ｃ）接触させた細胞におけるＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性を対照細胞におけるＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性の量と比較する工程、ここで対照細胞は試験化合物とは接触させず、対照細胞と比較した場合の試験細胞における増大または低減したＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性は変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをモジュレートする化合物を示すものである工程；
を含む上記方法。
【請求項３３】
配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項３４】
請求項３３記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む、単離された核酸。
【請求項３５】
発現制御配列に作動可能に連結している請求項３３記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３６】
請求項３５記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項３７】
核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項３６記載の細胞を培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法あって、該ポリペプチドが変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを含む上記方法。
【請求項３８】
配列番号２のアミノ酸配列の残基少なくとも５つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、該アミノ酸残基の１つが配列番号２の６２位に相当する位置にバリンを含む上記核酸。
【請求項３９】
配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項４０】
請求項３９記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む、単離された核酸。
【請求項４１】
発現制御配列に作動可能に連結している請求項３９記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４１記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項４３】
核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項４２記載の細胞を培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法あって、該ポリペプチドが変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを含む上記方法。
【請求項４４】
配列番号３のアミノ酸配列の残基少なくとも５つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸あって、該アミノ酸残基の１つが配列番号３の１４９位に相当する位置にグルタミンを含む上記核酸。
【請求項４５】
配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項４６】
請求項４５記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む、単離された核酸。
【請求項４７】
発現制御配列に作動可能に連結している請求項４５記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項４８】
請求項４７記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項４９】
核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項４８記載の細胞を培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法あって、該ポリペプチドが変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを含む上記方法。
【請求項５０】
配列番号４のアミノ酸配列の残基少なくとも５つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸あって、該アミノ酸残基の１つが配列番号４の６４１位に相当する位置にチロシンを含む上記核酸。
【請求項５１】
配列番号５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項５２】
請求項５１記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む、単離された核酸。
【請求項５３】
発現制御配列に作動可能に連結している請求項５１記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項５４】
請求項５３記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項５５】
核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項５４記載の細胞を培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法あって、該ポリペプチドが変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを含む上記方法。
【請求項５６】
配列番号５のアミノ酸配列の残基少なくとも５つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸あって、該アミノ酸残基の１つが配列番号５の６５５位に相当する位置にアルギニンを含む上記核酸。
【請求項５７】
配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項５８】
請求項５７記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む、単離された核酸。
【請求項５９】
発現制御配列に作動可能に連結している請求項５７記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６０】
請求項５９記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項６１】
核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項６０記載の細胞を培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法あって、該ポリペプチドが変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを含む上記方法。
【請求項６２】
配列番号６のアミノ酸配列の残基少なくとも５つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸あって、該アミノ酸残基の１つが配列番号６の７３９位に相当する位置にバリンを含む上記核酸。
【請求項６３】
配列番号７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
【請求項６４】
請求項６３記載の核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む、単離された核酸。
【請求項６５】
発現制御配列に作動可能に連結している請求項６３記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項６６】
請求項６５記載のベクターを含む培養細胞。
【請求項６７】
核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で請求項６６記載の細胞を培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法あって、該ポリペプチドが変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを含む上記方法。
【請求項６８】
配列番号７のアミノ酸配列の残基少なくとも５つをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸あって、該アミノ酸残基の１つが配列番号７の１１２３位に相当する位置にフェニルアラニンを含む上記核酸。
【請求項６９】
変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする細胞を含むトランスジェニックマウスであって、マウスが野生型マウスと比較して増大した発作活性を示す上記マウス。
【請求項７０】
配列番号２を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号３２を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７２】
配列番号３を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号３３を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７４】
配列番号４を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
配列番号３４を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７６】
配列番号５を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７７】
配列番号３５を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７８】
配列番号６を含む単離されたポリペプチド。
【請求項７９】
配列番号３６を含む単離されたポリペプチド。
【請求項８０】
配列番号７を含む単離されたポリペプチド。
【請求項８１】
配列番号３７を含む単離されたポリペプチド。
【請求項８２】
変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する精製された抗体。
【請求項８３】
変異体がＩ６２Ｖ変異体である、請求項８２記載の抗体。
【請求項８４】
変異体がＰ１４９Ｑ変異体である、請求項８２記載の抗体。
【請求項８５】
変異体がＮ６４１Ｙ変異体である、請求項８２記載の抗体。
【請求項８６】
変異体がＫ６５５Ｒ変異体である、請求項８２記載の抗体。
【請求項８７】
変異体がＩ７３９Ｖ変異体である、請求項８２記載の抗体。
【請求項８８】
変異体がＬ１１２３Ｆ変異体である、請求項８２記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は２００４年、１月２１日出願の米国仮出願６０／５３８，１４９の優先権の利益を請求する。米国仮出願６０／５３８，１４９は参考として全体が本明細書に援用される。
（謝辞）
本発明は米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与されている連邦認可Ｒ０１−ＮＳ−３２６６６の下の政府支援により作製された。政府は本発明に特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
電圧ゲート性ナトリウムチャンネルは、ニューロンおよび筋肉のような興奮性細胞における活動電位の初期脱分極の原因となる再生性内向電流を媒介する膜貫通タンパク質である。ナトリウムチャンネルは、典型的には、種々のサブユニットの複合体であり、原則的なものはアルファサブユニットである。アルファサブユニットは、孔形成サブユニットであり、それ単独ですべての既知ナトリウムチャンネル機能のために十分である。しかしながら、特定のナトリウムチャンネルにおいては、ベータサブユニットと称されるより小型の副次的なサブユニットがより大型のアルファサブユニットと会合していることが知られており、アルファサブユニットの機能の一部をモジュレートしていると考えられている。（Ｋｒａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０：６３４１−６３４７（非特許文献１）；Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５８：７５１９−７５２６（非特許文献２）；Ｈａｒｔｓｈｏｒｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：１６６７−１６７５（非特許文献３）；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７２：Ｓ１４−Ｓ４８（非特許文献４）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７２：Ｓ８９−Ｓ１５８（非特許文献５）参照）。ナトリウムチャンネルに関する考察はＣａｔｔｅｒａｌｌ，（１９９５）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６４：４９３−５３１（非特許文献６）に記載されている。
【０００３】
種々の組織（脳、末梢神経、骨格筋および心筋）および生物（クラゲ、イカ、ウナギ、ラット、ヒト）に由来するナトリウムチャンネルアルファサブユニットの一次構造が明らかにされており、そしてそのアミノ酸配列は長期の進化の期間に亘り保存されている個々の領域を示している（Ａｌｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ”５３４−５３５，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）（非特許文献７）参照）。これらの研究から、ナトリウムチャンネルのアルファサブユニットは細胞内ループにより連結されている４つの相同ドメイン（図１においてＩ〜ＩＶと標記）を含有する大型の糖タンパク質であることがわかっている。アルファサブユニットのＮ末端はドメインＩ（即ちＤＩ）において細胞内に伸展し、そしてアルファサブユニットのＣ末端はドメインＩＶ（即ちＤＩＶ）において細胞内に伸展している。原形質膜において、４つのドメインは、それ自体の構造の成分がナトリウムチャンネルの選択性および導伝性の特性を決定する中央孔部が形成されるような態様で配向している。
【０００４】
ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの各ドメインは、膜貫通アルファヘリックスまたはセグメント６個を含有する（図１において１〜６と標記）。これらの膜貫通セグメントのうち５個は疎水性であり、１個のセグメントは数個のリジンおよびアルギニン残基により正荷電している。この高度に荷電されたセグメントは各ドメインにおける第４の膜貫通セグメントである。細胞外ループはセグメント１（即ちＳ１）をセグメント２（即ちＳ２）に、そして、セグメント３（即ちＳ３）をセグメント４（即ちＳ４）に連結する。細胞内ループはＳ２をＳ３に、そしてＳ４をセグメント５（即ちＳ５）に連結する。細胞外の再進入ループはＳ５をセグメント６（即ちＳ６）に連結する。（Ａｇｎｅｗ，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５：２６０６−２６１０（非特許文献８）；Ａｇｎｅｗ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ９２：８６０−８６６（非特許文９）；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（１９８６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５５：９５３−９８５（非特許文献１０）；Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７２：Ｓ１４−Ｓ４８（非特許文献１１）参照）。
【０００５】
電圧ゲート性ナトリウムチャンネルは、Ｇｏｌｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２８：３６５−３６８（非特許文献１２）に概説されている命名法の標準的な形式に従って、命名することができる。この系によれば、電圧ゲート性ナトリウムチャンネルは、９種の哺乳類アイソフォームが同定され発現されている１つのファミリーに分類される。これらの９種のアイソフォームは、Ｎａν１．１〜Ｎａν１．９と命名されている。更にまた、種々のアイソフォームのスプライス変異体も数字に後続する小文字の使用により識別される（例えば、”Ｎａν１．１ａ”）。
【０００６】
ニューロンおよび筋肉のような興奮性細胞における活動電位の伝達においてナトリウムチャンネルが果たしている重要な役割のため、ナトリウムチャンネルは多くの感覚、運動および神経学的障害において関連が示唆されている。したがって、ナトリウムチャンネルは多くの科学的研究の対象となっている。しかしながら、ナトリウムチャンネルに関して多くの事柄が学習されたものの、ナトリウムチャンネルの機能を更に理解すること、および、ナトリウムチャンネルの変異および異常に起因する疾患、障害および状態を診断、予測、予防および治療するための手段がなお必要とされている。本明細書に記載した物質、組成物、物品、装置および方法のこれらおよび他の目的および利点、ならびに、それ以上の本発明の特徴は以下の開示から明らかにされる。
【非特許文献１】Ｋｒａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０：６３４１−６３４７
【非特許文献２】Ｔａｎａｋａ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５８：７５１９−７５２６
【非特許文献３】Ｈａｒｔｓｈｏｒｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５９：１６６７−１６７５
【非特許文献４】Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７２：Ｓ１４−Ｓ４８
【非特許文献５】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７２：Ｓ８９−Ｓ１５８
【非特許文献６】Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（１９９５）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６４：４９３−５３１
【非特許文献７】Ａｌｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ”５３４−５３５，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）
【非特許文献８】Ａｇｎｅｗ，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７５：２６０６−２６１０
【非特許文献９】Ａｇｎｅｗ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ９２：８６０−８６６
【非特許文献１０】Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（１９８６）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５５：９５３−９８５
【非特許文献１１】Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（１９９２）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７２：Ｓ１４−Ｓ４８
【非特許文献１２】Ｇｏｌｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２８：３６５−３６８
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
本明細書において実施形態を示し、広範に説明されるように、開示した物質、組成物、物品、装置および方法の目的によれば、開示された要件は、１つの局面において、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする核酸配列を特徴付ける方法に関し、該方法は、細胞内Ｎ末端領域、ドメインＩ内の細胞外ループ、ドメインＩとＩＩとの間の細胞内ループ、ドメインＩＩとＩＩＩとの間の細胞内ループ、ドメインＩＩの膜内領域またはこれらの何れかの組み合わせをコードする核酸配列の領域における部位１つ以上における変異を同定する工程を含み、このようにして同定されたヌクレオチドは核酸配列の特徴を示す。
【０００８】
別の局面において、開示された要件は、アミノ酸残基６２、１４９、６４１、６５５、７３９、１１２３または何れかのこれらの組み合わせをコードするヌクレオチド１つ以上を同定することを含むヒト対象におけるＮａν１．７ハプロタイプを決定するための方法に関し、ここでヌクレオチドはハプロタイプを示す。
【０００９】
更に別の局面において、開示された要件は、対象のナトリウムチャンネル変異に関連する神経学的障害の素因を決定するための方法であって、対象のＮａν１．７ハプロタイプを神経学的障害に相関する参照ハプロタイプ１つ以上と比較することを含み、ここで、参照ハプロタイプと比較した場合の対象のＮａν１．７ハプロタイプにおける同様のハプロタイプは神経学的障害に対する素因を示すものである上記方法に関する。
【００１０】
更に別の局面において、本発明に記載するものは、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをモジュレートする化合物を同定する方法であり、該方法は、残基６２、残基１４９、残基６４１、残基６５５、残基７３９または残基１１２３における変異１つ以上を含む変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをコードする変異体Ｎａν１．７核酸を含有する細胞を試験化合物に接触させること、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネル活性を検出すること、接触させた細胞におけるＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性を対照細胞におけるＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性の量と比較すること、ここで対照細胞は試験化合物とは接触させず、対照細胞と比較した場合の試験細胞における増大または低減したＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性は変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをモジュレートする化合物を示すものであること、を含む。
【００１１】
更にまた、本明細書に記載されるものは、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸、このような核酸から作製された発現ベクター、このようなベクターを含む培養細胞、および、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下でこのような細胞を培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法であり、ここでポリペプチドは変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを含む。更にまた、本明細書に記載されるものは、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを含む単離されたポリペプチドおよびそのフラグメント、ならびにこのような変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに結合する精製された抗体である。
【００１２】
別の利点については、一部は後述する説明において記載され、そして一部は説明から自明であるものであり、あるいは、後述する特徴の実施により学習されるものである。当然のことながら、後述する利点は添付する特許請求の範囲において特に指摘する要素と組み合わせを用いることにより実現および獲得される。上記した一般的説明および後述する詳細な説明は例示および説明に過ぎず、限定的なものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（詳細な説明）
本明細書に記載した物質、組成物、物品、装置および方法は、開示された要件およびそこに包含される方法および実施例の後述する詳細な説明、および、その前後に示す図面を参照することにより、より容易に理解される。
【００１４】
本発明の物質、組成物、物品、装置および方法を開示して説明する前に、以下に記載した局面は、それ自体が当然ながら変動してよい特定の合成方法または特定の試薬に限定されないことが理解される。更にまた、本明細書に記載した用語は、特定の特徴の説明のみを目的としており、限定することを意図していないことが理解される。
【００１５】
本明細書に記載するものは、開示した方法および組成物のために使用できるか、それとともに使用できるか、その製造において使用できるか、または、その生成物であることができる物質、組成物および成分である。これらおよび他の物質を本明細書に開示し、そしてこれらの物質の組み合わせ、部分集合、相互作用、基等が開示される場合は、これらの化合物の各々の種々の個々および集合的な組み合わせおよび順列の特定の言及が明確に開示されていない場合も、各々が本明細書において特に意図され記載されているものとみなす。例えば、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルが開示され、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルに関連するものを含むアミノ酸残基またはヌクレオチドの多くのものに対して行うことができる多くの修飾が考察されている場合、可能である如何なる各々の組み合わせおよび順列も特段の反対の記載が無い限り、特に意図されるものとする。即ち、置換基Ａ、ＢおよびＣのあるクラスならびに置換基Ｄ、ＥおよびＦのあるクラス、および、組み合わせ分子の例、Ａ−Ｄが開示されている場合、各々が個別に説明されていない場合であっても、各々が個々に、そして集合的に意図されているものとする。即ち、この例においては、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆの各々が特に意図されており、そしてＡ、ＢおよびＣ；Ｄ、ＥおよびＦ；および例示される組み合わせＡ−Ｄの開示から、開示されているものと見なさねばならない。同様に、これらのいずれかの部分集合または組み合わせもまた特に意図され、開示される。即ち、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループが特に意図され、そしてＡ、ＢおよびＤ；Ｄ、ＥおよびＦ；および例示される組み合わせＡ−Ｄの開示から開示されたものと見なすものとする。この概念は、本開示の全ての特徴、例えば、開示された組成物の製造および使用の方法における工程に適用されるものとする。即ち、実施できる別の工程が種々存在する場合、これらの別の工程の各々は開示された方法の何れかの特定の実施形態または実施形態の組み合わせとともに実施することができ、そして、そのような組み合わせの各々が特に意図され、開示されたものと見なすべきであるとする。
【００１６】
本明細書全体を通じて、種々の刊行物を参照する。これらの刊行物の開示は、その全体において、それが関係する技術水準をより十分に説明するために、参考として本明細書に援用される。開示された参考文献はまた、参考文献の根拠となる文章において論じられるその内容について、個々に、そして詳細に参考として本明細書に援用される。
【００１７】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において、多くの用語に言及するが、これらは以下の意味を有するものとして定義される。
【００１８】
本明細書および添付の請求項においては、特段の記載が無い限り、単数形態「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は複数形態を含む。即ち、例えば、「ヌクレオチド」という標記はそのようなヌクレオチド２つ以上の混合物を含み、「アミノ酸」という標記はそのようなアミノ酸２つ以上の混合物を含み、「ナトリウムチャンネル」という標記はそのようなナトリウムチャンネル２つ以上の混合物を含む等々とする。
【００１９】
「任意の」または「場合により」とは、後続して記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、そして説明文は、事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。例えば、「アレイは第２の・・位置において最も一般的に見出される対立遺伝子を場合により含むことができる」という表現は、第２の位置における最も一般的に見出される対立遺伝子がアレイ内に存在してもしなくてもよく、そして、説明文は第２の位置に最も一般的に見出される対立遺伝子を有さないアレイおよび第２の位置に最も一般的に見出される対立遺伝子が存在するアレイの両方を含むことを意味する。
【００２０】
範囲は本明細書においては、「約」ある特定の数値から、および／または、「約」別の特定の数値までと表示してよい。このような範囲を表示する場合、別の局面は、ある特定の数値および／または別の特定の数値を含む。同様に先行表記「約」を用いて数値を概数表示で表示する場合、特定の数値は別の局面を形成するものと見なす。更にまた範囲の各々の終点は他の終点との関連および他の終点との独立の双方において有意とする。
【００２１】
「対象」とは、本明細書においては個体を意味する。１つの局面において、対象は霊長類のような哺乳類であり、そして別の局面においては、対象はヒトである。「対象」という用語はまた、家畜動物（例えば、ネコ、イヌ等）、牧畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）および実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット等）を含む。
【００２２】
「Ｎａν１．７」という用語は、本明細書においては、ＮａＳ、ｈＮＥ−ＮａおよびＰＮ１のような名称により当該分野において知られているナトリウムチャンネルのアイソフォームをさす。Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルに関する伝統的な遺伝子の符号はＳＣＮ９Ａであり、従って、Ｎａν１．７という用語は本明細書においては、ＳＣＮ９Ａという用語と同義語とする。以下のＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００２９７７（ヒト）、Ｕ３５２３８（ウサギ）、Ｘ８２８３５（ヒト）、Ｕ７９５６８（ラット）およびＡＦ０００３６８（ラット）を有するＮａν１．７に関連する種々の配列が存在し、これらの核酸配列、それによりコードされるポリペプチドおよび他の核酸およびポリペプチドの配列はそこに含有される個々の配列と同様に参考として全体が本明細書に援用される。
【００２３】
アミノ酸系（例えば、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのような）種々の組成物を、本明細書において開示する。即ち、本明細書においては、「アミノ酸」とはポリペプチドを構成する典型的に遭遇する２０アミノ酸を意味する。更に、それほど典型的ではない成分（天然に存在する典型的にみられるアミノ酸のアナログ（例えば、限定ではないが、ホルミルメチオニンおよびセレノシステイン）、ならびにアミノ酸またはアミノ酸官能性の模倣物の双方とも）も含まれる。これらおよび他の分子の非限定的な例は本明細書に記載する通りである。
【００２４】
本明細書においては、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は化学的に結合しているアミノ酸の化合物のクラスを指す。これらおよび他の分子の非限定的な例は、本明細書に記載する通りである。一般的に、アミノ酸はアミド結合（ＣＯＮＨ）を介して化学的に相互結合するが、アミノ酸は当該分野でよく知られている他の化学結合により相互結合してよい。例えば、アミノ酸はアミン結合により結合してよい。本明細書において使用するペプチドには、アミノ酸のオリゴマーならびに小型および大型のペプチド、例えば、ポリペプチドおよびタンパク質が挙げられる。
【００２５】
核酸系（例えば、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする核酸）である種々の組成物を本明細書に開示する。即ち、本明細書においては、「核酸」とは、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物で構成された分子を意味する。これらおよび他の分子の非限定的な例は、本明細書に記載する通りである。核酸は２本鎖または１本鎖であることができる。例えば、ベクターが細胞内で発現される場合、発現されたｍＲＮＡは典型的にはＡ、Ｃ、ＧおよびＵより構成されるものとする。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば、外因性送達を介して細胞または細胞環境に導入される場合、アンチセンス分子は、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチドアナログから構成されることが好都合であることが理解される。
【００２６】
本明細書においては、「ヌクレオチド」とは塩基部分、糖部分およびホスフェート部分を含有する分子である。ヌクレオチドはそのホスフェート部分および糖部分を介して相互連結することができ、これによりヌクレオシド内結合を創生する。ヌクレオチドの塩基部分はアデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であることができる。ヌクレオチドの糖部分はリボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのホスフェート部分は５価のホスフェートである。ヌクレオチドの非限定的な例は３’−ＡＭＰ（３’−アデノシンモノホスフェート）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシンモノホスフェート）である。
【００２７】
「ヌクレオチドアナログ」とは、本明細書においては、塩基、糖またはホスフェート部分のいずれかに対する修飾の任意の型を含有するヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は当該分野でよく知られており、そして例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノアデニンならびに糖またはホスフェート部分における修飾が挙げられる。
【００２８】
「ヌクレオチド代替物」とは、本明細書においては、ヌクレオチドと同様の機能的特性を有するがホスフェート部分を含有しない分子、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ヌクレオチド代替物は、ワトソンクリックまたはフーグスティーンの態様において核酸を認識するが、ホスフェート部分以外の部分を介して相互連結している分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用する場合に二重螺旋型構造に配座することが可能である。
【００２９】
例えば、細胞取り込みを増強するために、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに他の型の分子（コンジュゲート）を連結することも可能である。コンジュゲートはヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結できる。このようなコンジュゲートは、例えば、コレステロール部分のような脂質部分を含む（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８６：６５５３−６５５６）。
【００３０】
「ワトソンクリック相互作用」とは、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のワトソンクリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のワトソンクリック面は、プリン系のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１およびＣ６位、およびピリミジン系のヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、Ｃ４位を含む。
【００３１】
「フーグスティーン相互作用」とは、２本鎖ＤＮＡの大溝内に露出されているヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのフーグスティーン面において起こる相互作用である。フーグスティーン面は、Ｎ７位およびプリンヌクレオチドのＣ６位における反応性の基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【００３２】
「欠失」とは本明細書においては、それぞれアミノ酸またはヌクレオチドの残基１つ以上が参照配列との相対比較において非存在であるアミノ酸またはヌクレオチド配列における変化を指す。
【００３３】
「挿入」または「付加」とは、本明細書においては、参照配列との相対比較においてそれぞれアミノ酸またはヌクレオチドの残基１つ以上の付加をもたらすアミノ酸またはヌクレオチド配列の変化を指す。
【００３４】
「置換」とは、本明細書においては、参照配列におけるそれぞれ異なるアミノ酸またはヌクレオチド１つ以上によるアミノ酸またはヌクレオチド１つ以上の置き換えを指す。
【００３５】
「単離された」とは、本明細書においては、（１）それ自体が天然に存在する環境において観察されるものと同様に、それ自体と通常会合しているか相互作用している成分を、実質的または本質的に含まない核酸またはポリペプチドのような物質を指す。単離された物質は、場合により、それ自体の天然の環境における物質とともに観察されない物質を含む場合もあるが；または、（２）物質がその天然の環境にある場合は、物質は、意図的な人的介入により合成的に（非天然に）組成物に改変されるか、および／または、その環境において観察される物質にとってネイティブではない細胞内の遺伝子座（例えば、ゲノムまたは細胞下位小器官）に配置されている。合成物質をもたらす改変は、その天然の状態内にあるか、それより取り出された物質に対して実施できる。
【００３６】
変異体Ｎａν１．７核酸配列の特徴付け
特定の神経学的障害においては、Ｎａν１．７遺伝子の特定の部位が変異し、即ち特定の位置におけるヌクレオチドが最も一般的に存在するＮａν１．７遺伝子配列において観察されるものとは異なっていることが分かっている。従って、本明細書に記載するものは、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする変異体核酸配列を特徴付ける方法、および、疾患状態および神経学的障害（例えば、発作）を診断して治療するためのこのような核酸の使用である。
【００３７】
１つの局面において、本明細書に開示されるものは、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの種々の領域をコードする核酸配列の領域内の部位１つ以上における変異を同定する工程を含む、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする核酸配列を特徴付ける方法である。変異はＮａν１．７核酸配列の何れの領域に存在することもできるが、変異が同定され得る核酸配列の特定の領域は、例えば、細胞内Ｎ末端領域、ドメインＩ内の細胞外ループ、ドメインＩとＩＩとの間の細胞内ループ、ドメインＩＩとＩＩＩとの間の細胞内ループ、ドメインＩＩの膜内領域またはこれらの何れかの組み合わせをコードする領域を含む。このようにして同定されたヌクレオチドは核酸配列の特性を示すことが出来る。
【００３８】
「変異」および「変異体」という用語は、本明細書においては、核酸またはアミノ酸配列の特定の位置１つ以上において最も一般的に見出されるヌクレオチドまたはアミノ酸とは異なるヌクレオチドまたはアミノ酸が同定されることを意味する。変異は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における欠失、付加、挿入および置換を含む。例えば、本明細書に開示する１つの特定の変異体Ｎａν１．７核酸配列においては核酸配列の１８４位が置換を含有する。即ち、Ｎａν１．７遺伝子の１８４位において最も一般的に見出されるヌクレオチドはＡであるが、変異体Ｎａν１．７核酸配列においては１８４位、即ち変異部位に存在するヌクレオチドはＧである。当業者は１８４位を分析して２つのアミノ酸（ＡまたはＧ）のどちらが存在するかを調べることができる。別の例としては、本明細書に開示する１つの特定の変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットにおいて、アミノ酸配列の６２位は置換を含有する。即ち、Ｎａν１．７アミノ酸配列の６２位における最も一般的に存在するアミノ酸はイソロイシンであるが、変異体Ｎａν１．７アミノ酸配列においては６２位、即ち変異部位に存在するアミノ酸はバリンである。更にまた、当業者はアミノ酸配列の６２位を分析して２つのアミノ酸（イソロイシンまたはバリン）のどちらが存在するかを調べることができる。更にまた、本明細書においては、「変異体」とはＮａν１．７核酸またはアミノ酸配列の１つより多くの位置における変異の組み合わせを含む。変異は、コードされたポリペプチドの変化、ｍＲＮＡの安定性の変化、ＤＮＡまたはＲＮＡへの転写翻訳因子の結合等を介して、遺伝子配列における機能的な相違をもたらしてよい。変異はまたナトリウムチャンネルの活性のおよび発現の表現型の変動に対する遺伝子的な関連性を検出するための１ヌクレオチドまたは１アミノ酸変異として使用できる。
【００３９】
本明細書においては、Ｎａν１．７核酸配列の「特性」とはＮａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのハプロタイプを構成している変異部位に存在するヌクレオチドの組み合わせ、ならびに、特定の変異または変異の組み合わせに関連する生物学的活性であることができる。
【００４０】
１つの特定の局面において、変異は、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの細胞内Ｎ末端領域をコードする核酸領域に存在することができる。例えば、このような変異はアミノ酸残基６２をコードする部位に存在できる。変異部位はＮａν１．７核酸配列の１８４位に存在できる。１つの特定の局面においては、変異はアミノ酸残基６２においてバリンをコードすることができる。
【００４１】
別の局面において、変異はＮａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのドメインＩの細胞外ループをコードする核酸領域に存在することができる。例えば、このような変異はアミノ酸残基１４９をコードする部位にあることができる。変異部位はＮａν１．７核酸配列の４４６位にあることができる。１つの特定の局面において、変異はアミノ酸残基１４９においてグルタミンをコードすることができる。
【００４２】
更に別の局面において、変異は、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのドメインＩとＩＩの間の細胞内ループをコードする核酸領域に存在することができる。例えば、このような変異は、アミノ酸残基６４１および／またはアミノ酸残基６５５をコードする部位にあることができる。変異部位は、Ｎａν１．７核酸配列の１９２１および／または１９６４位にあることができる。１つの特定の局面において、変異はアミノ酸残基６４１においてチロシンをコードすることができる。別の局面において、変異はアミノ酸残基６５５においてアルギニンをコードすることができる。
【００４３】
更に別の局面において、変異は、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのドメインＩＩの膜内領域をコードする核酸領域に存在することができる。例えば、このような変異はアミノ酸残基７３９をコードする部位にあることができる。変異部位はＮａν１．７核酸配列の２２１５位にあることができる。１つの特定の局面において、変異はアミノ酸残基７３９においてバリンをコードすることができる。
【００４４】
更に別の局面において、変異は、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのドメインＩＩとＩＩＩの間の細胞内ループをコードする核酸領域に存在することができる。例えば、このような変異はアミノ酸残基１１２３をコードする部位にあることができる。変異部位はＮａν１．７核酸配列の３３６９位にあることができる。１つの特定の局面において、変異はアミノ酸残基１１２３においてフェニルアラニンをコードすることができる。
【００４５】
変異はまた、細胞内Ｎ末端領域およびドメインＩの細胞外ループ；細胞内Ｎ末端領域およびドメインＩとＩＩの間の細胞内ループ；細胞内Ｎ末端領域およびドメインＩＩとＩＩＩの間の細胞内ループ；細胞内Ｎ末端領域およびドメインＩＩの膜内領域；ドメインＩの細胞外ループおよびドメインＩとＩＩの間の細胞内ループ；ドメインＩの細胞外ループおよびドメインＩＩとＩＩＩの間の細胞内ループ；ドメインＩの細胞外ループおよびドメインＩＩの膜内領域；ドメインＩとＩＩの間の細胞内ループおよびドメインＩＩとＩＩＩの間の細胞内ループ；ドメインＩとＩＩの間の細胞内ループおよびドメインＩＩの膜内領域；およびドメインＩＩとＩＩＩの間の細胞内ループおよびドメインＩＩの膜内領域をコードする領域のように、核酸配列の１つより多い領域に存在することができる。
【００４６】
本明細書に記載した方法により同定することができる変異の一部は、例えば、Ｎａν１．７核酸配列の１８４、４４６、１９２１、１９６４、２２１５、３３６９位またはこれらの何れかの組み合わせにおける変異を含む。何れかの個々の変異は、これらの位置の何れかにおいて分析することができるか、あるいは、１つより多い位置における変異体の組み合わせを本明細書に記載した方法により同定して分析することができる。
【００４７】
多くの方法を用いて特定の配列の存在について核酸を分析することができる。本明細書に記載した方法の全てについて、ゲノムＤＮＡを試料から抽出でき、そしてこの試料は何れかの生物に由来するものであることができ、そして、例えば、限定ではないが、末梢血、骨髄標本、原発腫瘍、包埋組織切片、凍結組織切片、細胞プレパレーション、細胞学的プレパレーション、脱落試料（例えば、痰）、微細針吸引物、羊膜細胞、新鮮組織、乾燥組織および培養された細胞または組織であり得る。このような試料は対象から直接得るか、市販品を入手するか、または、他の手段を介して得ることができる。即ち、本明細書に記載した方法を利用することによりゲノムＤＮＡ、増幅ＤＮＡ（例えば、ＰＣＲ産物）、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、制限フラグメントまたは他の何れかの所望の核酸試料を含む核酸試料を分析することができる。ゲノムＤＮＡに対して本明細書に記載した方法の１つを実施する場合、典型的にはゲノムＤＮＡは、ＤＮＡの粘度を低減し、そしてゲノムＤＮＡの標的領域とのプライマーまたはプローブの接触をより良好にするための手段で処理される。このような粘度の低減は当業者の知る何れかの所望の方法、例えば、ＤＮａｓｅ処理またはゲノムＤＮＡの好ましくは穏やかな剪断処理により達成できる。
【００４８】
十分なＤＮＡが得られれば、ゲノムＤＮＡは直接使用できる。あるいは、目的の領域を適当なベクターにクローニングし、そして分析のために十分な量まで生育させる。核酸は従来の手法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅して分析に十分な量を得てよい。種々のＰＣＲ法は当該分野でよく知られている。ＰＣＲ法の検討のためには、「ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）と題された刊行物を参照でき、これは増幅方法に関して参考として全体が本明細書に援用される。これらのＰＣＲ操作法の各々において、増幅すべき核酸配列の何れかの側に対するＰＣＲプライマーをｄＮＴＰおよび熱安定性ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＰｆｕポリメラーゼまたはＶｅｎｔポリメラーゼとともに適宜調製した核酸試料に添加する。試料中の核酸を変性し、ＰＣＲプライマーを試料中の相補核酸配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたプライマーを伸長させる。その後、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを更に行う。サイクルを複数回反復することによりプライマー部位の間の核酸配列を含有する増幅されたフラグメントを製造する。ＰＣＲは、更に米国特許４，６８３，１９５、米国特許４，６８３，２０２および、米国特許４，９６５，１８８を含むいくつかの特許に記載されている。これらの刊行物の各々は、ＰＣＲ法に関して参考として全体が本明細書に援用される。本明細書に記載した核酸配列の何れかにフランキングするプライマーをどのようにして設計して合成するかは当業者の知るとおりである。
【００４９】
例えば、開示された方法はプライマー
【００５０】
【化１】
2007518422.tif 000002
および
【００５１】
【化２】
2007518422.tif 000003
を与えるものであり、これらを利用してヌクレオチド１８４位を含むＮａν１．７核酸配列の領域を増幅することによりこの部位における変異を同定することができる。開示された方法はまたプライマー
【００５２】
【化３】
2007518422.tif 000004
および
【００５３】
【化４】
2007518422.tif 000005
を与えるものであり、これらを利用してヌクレオチド４４６位を含むＮａν１．７核酸配列の領域を増幅することによりこの部位における変異を同定することができる。更にまた開示された方法はプライマー
【００５４】
【化５】
2007518422.tif 000006
および
【００５５】
【化６】
2007518422.tif 000007
を与えるものであり、これらを利用してヌクレオチド１９２１位を含むＮａν１．７核酸配列の領域を増幅することによりこの部位における変異を同定することができる。更にまた開示された方法はプライマー
【００５６】
【化７】
2007518422.tif 000008
および
【００５７】
【化８】
2007518422.tif 000009
を与えるものであり、これらを利用してヌクレオチド１９６４位を含むＮａν１．７核酸配列の領域を増幅することによりこの部位における変異を同定することができる。更にまた開示された方法はプライマー
【００５８】
【化９】
2007518422.tif 000010
および
【００５９】
【化１０】
2007518422.tif 000011
を与えるものであり、これらを利用してヌクレオチド２２１５位を含むＮａν１．７核酸配列の領域を増幅することによりこの部位における変異を同定することができる。例えば、開示された方法はプライマー
【００６０】
【化１１】
2007518422.tif 000012
および
【００６１】
【化１２】
2007518422.tif 000013
を与えるものであり、これらを利用してヌクレオチド３３６９位を含むＮａν１．７核酸配列の領域を増幅することによりこの部位における変異を同定することができる。Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニット配列全体にわたって、何れかのヌクレオチド位における変異を同定する目的のために、Ｎａν１．７核酸配列の何れかの領域を増幅するためにどのようにして適宜プライマーを設計するかは、当業者の知る通りである。増幅はまた変異に特異的なプライマーを用いることにより変異が存在するかどうかを調べるために使用してよい。
【００６２】
変異を検出する手段としてオリゴヌクレオチドライゲーションを利用する種々の方法が当該分野で知られており、例えば、Ｒｉｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １８：２８８７−２８９０；およびＤｅｌａｈｕｎｔｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５８：１２３９−１２４６を参照でき、これらは変異を検出する方法に関して参考として全体が本明細書に援用される。このような方法には、１塩基鎖伸長（ＳＢＣＥ）、オリゴヌクレオチドライゲーション試験（ＯＬＡ）およびクレバーゼ反応／シグナル放出（Ｉｎｖａｄｅｒ法、Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。
【００６３】
ＬＣＲおよびＧａｐＬＣＲは指数的増幅の手法である。両方ともＤＮＡ分子にアニーリングした隣接するプライマーに結合するためにＤＮＡリガーゼに依存している。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）においては、２つの一次（第１および第２）および２つの二次（第３および第４）のプローブを含むプローブ対を用い、これらは全て標的に対してモル過剰で使用される。第１のプローブは標的鎖の第１のセグメントにハイブリダイズし、そして第２のプローブは標的鎖の第２のセグメントにハイブリダイズし、第１および第２のセグメントが隣接することにより一次プローブが５’−ホスフェート−３’−ヒドロキシル環系において相互に接近し、そしてリガーゼは２つのプローブを共有結合的に融合またはライゲーションして融合産物とすることができる。更にまた、第３（二次）のプローブは第１のプローブの部分にハイブリダイズでき、そして第４（二次）のプローブは同様の接近態様において第２のプローブの部分にハイブリダイズすることができる。当然ながら、標的が初期において２本鎖である場合は、二次プローブもまた初回に標的相補体にハイブリダイズする。一次プローブのライゲーション鎖が標的鎖から分離すれば、これは第３および第４のプローブにハイブリダイズし、これがライゲーションして相補二次ライゲーション産物を形成することができる。ライゲーション産物は標的またはその相補体の何れかと機能的に等価であることを確認することが重要である。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルにより、標的配列の増幅が達成される。多重ＬＣＲの方法もまた記載されている（ＷＯ９３２０２２７、そこに記載されている方法に関して参考として全体が本明細書に援用される）。ギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）は、プローブが隣接せず２〜３塩基により分断されているＬＣＲの型である。
【００６４】
ＤＮＡにおける１ヌクレオチド変異をタイピングするための方法である標識遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）は、Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２２：４１６７−４１７５に記載されている。この方法においては、変異部位を含有するゲノムＤＮＡの特定のフラグメントをまず１つの通常型および１つのホスホロチオエート修飾型のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。２本鎖ＰＣＲ産物は酵素Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理することにより１本鎖となり、そして固定化されたオリゴヌクレオチドプライマーへのハイブリダイゼーションにより９６穴のポリスチレンプレートの個々のウェルに捕獲する。このプライマーは目的の変異部位から直ぐに隣接した１本鎖標的ＤＮＡにハイブリダイズするように設計されている。Ｅ，ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩまたは修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ）のクレノウフラグメントを用いながら、捕獲オリゴヌクレオチドの３’末端を、１つのビオチン標識、１つのフルオレセイン標識および２つの未標識のジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの混合物を用いながら１塩基分だけ伸長する。次にアルカリホスファターゼおよびセイヨウワサビパーオキシダーゼの抗体コンジュゲートを用いてＥＬＩＳＡフォーマットにおいて伸長された塩基の性質を決定する。更にまた、ＰＣＲ産物における変異の検出のために固定化されたプライマーによるミニ配列決定が利用されている（Ｐａｓｔｉｎｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７：６０６−６１４参照）。
【００６５】
ＧＢＡの向上のために、５’→３’の２本鎖特異的Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼの加水分解活性へのホスホロチオエート結合の作用を使用する。１本鎖ＰＣＲ産物の製造および固相ハイブリダイゼーションによるその検出のためのホスホロチオエートプライマーおよびエキソヌクレアーゼ加水分解の使用を行うことができる（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ３：２８５−２９１参照）。５’末端に１つのホスホロチオエート残基を含有する２本鎖ＤＮＡ基質は、未修飾のものと同様に効率的にこの酵素により加水分解されることがわかった。しかしながら酵素活性は４つのホスホロチオエートの存在により完全に阻害された。これらの結果に基づいて、２本鎖ＰＣＲ産物の完全長１本鎖ＤＮＡフラグメントへの変換のための方法が開発された。この方法においては、ＰＣＲプライマーの一方はその５’末端に４つのホスホロチオエートを含有し、そして対向する鎖のプライマーは未修飾である。増幅の後、２本鎖産物をＴ７遺伝子６エキソヌクレアーゼで処理する。ホスホロチオエート化された鎖はこの酵素の作用から保護されるが、対向する鎖は加水分解される。ホスホロチオエート化ＰＣＲプライマーが５’ビオチニル化されると、１本鎖ＰＣＲ産物は、マイクロプレート上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズした後には比色分析により容易に検出することができる。塩の存在下で親水性表面を有するマイクロプレートへの比較的短いオリゴヌクレオチドの固定化のために、単純で効率的な方法が使用できる。
【００６６】
表面結合オリゴヌクレオチドのアレイへの鋳型ハイブリダイゼーション（またはハイブリダイゼーション＋酵素プロセシング）に基づくＤＮＡ分析は、高密度パラレル低コストおよび自動化可能なプロセシングのために極めて適している（Ｉｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ  ＳＰＩＥ−Ｉｎｔ  Ｓｏｃ  Ｏｐｔ  Ｅｎｇ  ２６８０（Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）２５８−２６９）。標識されたＤＮＡの直接蛍光検出は合理的なコストにおいて直線性、大きいダイナミックレンジ、複数分析対象検出、プロセシングの単純さおよび安全な取り扱いという利点をもたらす。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｏｏｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、９６穴プレートおよび顕微鏡スライドガラスにおけるＤＮＡプロセシングに、独占の固相遺伝子タイピングの酵素的方法を適用している。蛍光標識ＧＢＡジデオキシヌクレオチドを検出するには約１００モル／μｍ２の検出限界を必要とする。市販品のプレートリーダーは約１０００モル／μｍ２を検出し、そしてアルゴンレーザーおよび熱電気的冷却ＣＣＤを用いた実験セットアップが約１桁小さいシグナルを検出することができる。現時点での限界はガラス蛍光に起因している。フルオレセイン、エオシン、テトラメチルローダミン、リサミンおよびテキサスレッドで標識されたジデオキシヌクレオチドが特徴付けられており、そして光漂白、クエンチングおよび蛍光発生性の基質による間接的検出が検討されている。
【００６７】
本発明の内容において使用できる別の増幅法には、例えば、欧州特許出願４５４４６１０に記載されているＱベータ増幅、ＥＰ６８４３１５Ａに記載されている鎖置換増幅、および、ＰＣＴ公開ＷＯ９３２２４６１に記載されている標的媒介増幅が挙げられ、これらの開示内容はそこに記載されている方法に関して参考として全体が本明細書に援用される。
【００６８】
対立遺伝子特異的増幅もまた、２対立遺伝子マーカーのために利用できる。２対立遺伝子マーカーの２つの対立遺伝子の間の識別もまた対立遺伝子特異的増幅、選択的手法により達成することができ、これにより他方の対立遺伝子を増幅することなく対立遺伝子の一方が増幅される。対立遺伝子特異的増幅については、プライマーの対の少なくとも１つのメンバーがそれ自体とハイブリダイズする本発明の２対立遺伝子マーカーの多形塩基を有する参照配列（即ちＮａν１．７）の領域と十分相補である。このようなプライマーは２対立遺伝子マーカーの２つの対立遺伝子の間の判別が可能である。これは増幅プライマーの一方の３’末端に変異した塩基を置くことにより達成できる。このような対立遺伝子特異的プライマーは、２対立遺伝子マーカーに存在する２つの対立遺伝子の一方を含有する核酸試料とともにそれらが使用される限り増幅または配列決定反応を選択的にプライミングする傾向を示すが、その理由は、伸長はプライマーの３’末端から起こり、この位置における、またはその近傍のミスマッチは増幅に対して抑制作用を有するためである。従って、適切な増幅条件下ではこれらのプライマーはその相補対立遺伝子に対する増幅を指向するのみである。ミスマッチの厳密な位置を決定することおよび相当する試験条件は、当該分野でよく知られている。
【００６９】
増幅反応には検出可能な標識を使用してよい。適当な標識としては、蛍光色素、例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ等が挙げられる。標識は２段階の系であってよく、その場合増幅されたＤＮＡは高親和性の結合相手、例えば、アビジン、特異的抗体等を有するビオチン、ハプテンなどにコンジュゲートし、ここで結合相手は検出可能な標識にコンジュゲートさせる。標識はプライマーの一方または両方にコンジュゲートしてよい。あるいは、増幅産物に標識が導入されるように増幅に使用するヌクレオチドのプールを標識する。
【００７０】
試料核酸、例えば、増幅またはクローニングされたフラグメントは、当該分野に公知の多くの方法の１つにより分析することができる。核酸はジデオキシまたは他の方法で配列決定できる。変異体配列とのハイブリダイゼーションもまたサザンブロット、ドットブロット等によりその存在の決定のために使用できる。方法に関して参考として全体が本明細書に援用される米国特許５，４４５，９３４およびＷＯ９５／３５５０５に記載されている固体支持体上に固定化されたオリゴヌクレオチドプローブのアレイへの対照（参照）および変異体の配列のハイブリダイゼーションパターンを変異体配列の存在を検出する手段として使用してもよい。１本鎖コンホーメーション多形（ＳＳＣＰ）分析、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ミスマッチ切断検出およびゲルマトリックス中のヘテロ二重らせん分析を用いることにより電気泳動の運動性の変化としてＤＮＡ配列変異により生じたコンホーメーションの変化を検出する。あるいは、変異が制限エンドヌクレアーゼに対する認識部位を創生または破壊する場合（制限フラグメント長多形、ＲＦＬＰ）、試料をそのエンドヌクレアーゼで消化し、そして産物の大きさを分画してフラグメントが消化されたかどうか調べる。分画はゲルまたはキャピラリー電気泳動、特にアルリルアミドまたはアガロースゲルにより行う。
【００７１】
開示した物質、組成物および方法はまた、変異を分析するための移動相の固体支持体を用いた方法における本明細書に記載した核酸配列の使用を提供する。例えば、ＷＯ０１／４８２４４を参照でき、これはそこに記載されている方法に関して参考として全体が本明細書に援用される。
【００７２】
ルミネックスフローメトリクス系のＳＮＰ分析を実施する方法では、２種の異なった色を有するＦＡＣＳ分析可能なビーズへのＰＣＲ産物の示差的ハイブリダイゼーションを行う。フローメトリクスのシステムは現在では２種の染料（橙色および赤色）の８濃度において染色された均一な大きさを有する５ミクロンのポリスチレン−ジビニルベンゼンビーズよりなる。８濃度の２種の染料のマトリックスは、ルミネックスＰＣコンピューターボードにより適宜修飾された、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒにより各々示差できる６４種の異なる色のビーズをもたらす。ルミネックスＳＮＰ分析においては、ビーズに共有結合しているものは短い（約１８〜２０塩基）の「標的」オリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）である。標的オリゴの中心に位置するヌクレオチドは多形塩基をコードしている。一対のビーズを合成し、対の各々のビーズは多形オリゴヌクレオチドの一方をそれ自体に結合して保有している。分析すべきＳＮＰを包囲するＤＮＡの領域のＰＣＲを実施して、ＰＣＲ産物を生成する。厳密な相補体がコードされているビーズへの優先的なＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションを可能にするような条件を確立する。１つのフォーマット（「競合物質非存在下」）において、ＰＣＲ産物自体がフルオレセイン染料を取り込み、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ試行中に測定されるようにビーズ上の蛍光染色は増大する。この蛍光染色の増大は、ハイブリダイゼーションを示す。第２のフォーマット（「競合物質存在下」）においては、ビーズは競合物質とともにＰＣＲ産物にハイブリダイズする。この場合は競合物質自体がフルオレセインで標識される。そして未標識ＰＣＲ産物により置き換えられることによるフルオレセインの損失は、良好なハイブリダイゼーションを示す。
【００７３】
単離されたＮａν１．７核酸配列
本明細書に記載した核酸配列は当該分野で知られ、そして本明細書に記載する方法により単離することができる。１つの局面において、本明細書に開示されるものは変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸である。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるものは配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列である。別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列である。別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列である。また更に別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列である。１つの局面において、本明細書に開示されるものは配列番号７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸配列である。
【００７４】
更にまた、本明細書に開示されるものはＮａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの少なくとも５連続した残基をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸である。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるものは配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも５連続した残基をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であり、ここでアミノ酸残基の１つは配列番号２の６２位に相当する位置にバリンを含む。別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号３のアミノ酸配列の少なくとも５連続した残基をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であり、ここでアミノ酸残基の１つは配列番号３の１４９位に相当する位置にグルタミンを含む。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号４のアミノ酸配列の少なくとも５連続した残基をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であり、ここでアミノ酸残基の１つは配列番号４の６４１位に相当する位置にチロシンを含む。別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号５のアミノ酸配列の少なくとも５連続した残基をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であり、ここでアミノ酸残基の１つは配列番号５の６５５位に相当する位置にアルギニンを含む。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも５連続した残基をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であり、ここでアミノ酸残基の１つは配列番号６の７３９位に相当する位置にバリンを含む。１つの局面において、本明細書に開示されるものは配列番号７のアミノ酸配列の少なくとも５連続した残基をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であり、ここでアミノ酸残基の１つは配列番号７の１１２３位に相当する位置にフェニルアラニンを含む。
【００７５】
参照核酸配列
最も一般的に見出される対立遺伝子を含むＮａν１．７遺伝子の参照配列を、本明細書に提示する。本明細書においては、「参照配列」とは、Ｎａν１．７核酸配列の特定の位置において特定のヌクレオチドを含む、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットまたはそのフラグメントをコードする核酸配列をさす。場合により、参照配列は特定の位置に最も一般的に見出されるヌクレオチドまたは対立遺伝子を含む。この参照配列は完全長Ｎａν１．７核酸配列またはそのフラグメントであり得る。完全長ヒトＮａν１．７核酸配列の例は、配列番号１として本明細書に示される。
【００７６】
「野生型」という用語は、最も一般的に見出される対立遺伝子を含む参照配列をさすために使用される。当業者は、「野生型」という表記は単に一般的な対立遺伝子に対する好都合な標記であり、その形態の配列に如何なる特定の性質を割り付けるものと見なすべきではないことを理解するであろう。
【００７７】
あるいは、当業者は、Ｎａν１．７核酸配列の特定のヌクレオチド位置に最も一般的に見出されるヌクレオチドでも対立遺伝子でもないヌクレオチドまたは対立遺伝子を含む参照配列またはそのフラグメントを利用することができるか、あるいは、特定の位置に代替のヌクレオチドを含む参照配列を利用することができる。このような代替ヌクレオチドを１８４位に含む完全長Ｎａν１．７核酸配列の例は、配列番号８として本明細書に示される。従って、参照配列またはそのフラグメントを利用する場合、１８４位のヌクレオチドはＡまたはＧである。４４６、１９２１、１９６４、２２１５および３３６９位にこのような代替ヌクレオチドを含む完全長Ｎａν１．７参照配列の他の例は、それぞれ配列番号９、１０、１１、１２および１３として本明細書に呈示する。従って、これらの参照配列またはそのフラグメントを利用する場合は、それぞれ、４４６位のヌクレオチドはＣまたはＡであり、１９２１位のヌクレオチドはＡまたはＴであり、１９６４位のヌクレオチドはＡまたはＧであり、２２１５位のヌクレオチドはＡまたはＴであり、そして３３６９位のヌクレオチドはＧまたはＴであることができる。
【００７８】
１つの局面において参照配列は、Ｎａν１．７核酸配列のフラグメントを含むことができる。例えば、本明細書に開示されるものは、Ｎａν１．７遺伝子配列のヌクレオチド１７７〜１９１に相当するヌクレオチド配列
【００７９】
【化１３】
2007518422.tif 000014
を含む参照配列である。この参照配列は１８４位に「Ａ」を有し、これはこの位置において最も一般的に見出されるヌクレオチドである。従って、当業者はこの参照配列を試験配列と比較し、試験配列の１８４位に最も一般的に見出されるヌクレオチド（Ａ）が存在するか、または、試験配列の１８４位に他のヌクレオチド（Ｇ）が存在するかを決定することができる。同様に提供されるものは、１８４位にＡを含む配列番号１４の何れかのフラグメントに相当するヌクレオチド配列、または、１８４位にＧを含む相当する配列である。
【００８０】
別の例においては、本明細書に開示されるものは、Ｎａν１．７遺伝子配列のヌクレオチド４３９〜４５３に相当するヌクレオチド配列
【００８１】
【化１４】
2007518422.tif 000015
を含む参照配列である。この参照配列は４４６位に「Ｃ」を有し、これはこの位置において最も一般的に見出されるヌクレオチドである。従って、当業者はこの参照配列を試験配列と比較し、試験配列の４４６位に最も一般的に見出されるヌクレオチド（Ｃ）が存在するか、または、試験配列の４４６位に他のヌクレオチド（Ａ）が存在するかを決定することができる。同様に提供されるものは、４４６位にＣを含む配列番号１５の何れかのフラグメントに相当するヌクレオチド配列、または、４４６位にＡを含む相当する配列である。
【００８２】
更にまた、本明細書に開示されるものは、Ｎａν１．７遺伝子配列のヌクレオチド１９１４〜１９２８に相当するヌクレオチド配列
【００８３】
【化１５】
2007518422.tif 000016
を含む参照配列である。この参照配列は１９２１位に「Ａ」を有し、これはこの位置において最も一般的に見出されるヌクレオチドである。従って、当業者はこの参照配列を試験配列と比較し、試験配列の１９２１位に最も一般的に見出されるヌクレオチド（Ａ）が存在するか、または、試験配列の１９２１位に他のヌクレオチド（Ｇ）が存在するかを決定することができる。同様に提供されるものは、１９２１位にＡを含む配列番号１６の何れかのフラグメントに相当するヌクレオチド配列、または、１９２１位にＧを含む相当する配列である。
【００８４】
更に、本明細書に開示されるものは、Ｎａν１．７遺伝子配列のヌクレオチド１９５６〜１９７１に相当するヌクレオチド配列
【００８５】
【化１６】
2007518422.tif 000017
を含む参照配列である。この参照配列は１９６４位に「Ａ」を有し、これはこの位置において最も一般的に見出されるヌクレオチドである。従って、当業者はこの参照配列を試験配列と比較し、試験配列の１９６４位に最も一般的に見出されるヌクレオチド（Ａ）が存在するか、または、試験配列の１９６４位に他のヌクレオチド（Ｇ）が存在するかを決定することができる。同様に提供されるものは、１９６４位にＡを含む配列番号１７の何れかのフラグメントに相当するヌクレオチド配列、または、１９６４位にＧを含む相当する配列である。
【００８６】
更に別の例において、本明細書に開示されるものは、Ｎａν１．７遺伝子配列のヌクレオチド２２０８〜２２２２に相当するヌクレオチド配列
【００８７】
【化１７】
2007518422.tif 000018
を含む参照配列である。この参照配列は２２１５位に「Ａ」を有し、これはこの位置において最も一般的に見出されるヌクレオチドである。従って、当業者はこの参照配列を試験配列と比較し、試験配列の２２１５位に最も一般的に見出されるヌクレオチド（Ａ）が存在するか、または、試験配列の２２１５位に他のヌクレオチド（Ｇ）が存在するかを決定することができる。同様に提供されるものは、２２１５位にＡを含む配列番号１８の何れかのフラグメントに相当するヌクレオチド配列、または、２２１５位にＧを含む相当する配列である。
【００８８】
また更に別の例において、本明細書に開示されるものは、Ｎａν１．７遺伝子配列のヌクレオチド３３６２〜３３７６に相当するヌクレオチド配列
【００８９】
【化１８】
2007518422.tif 000019
を含む参照配列である。この参照配列は３３６９位に「Ｇ」を有し、これはこの位置において最も一般的に見出されるヌクレオチドである。従って、当業者はこの参照配列を試験配列と比較し、試験配列の３３６９位に最も一般的に見出されるヌクレオチド（Ｇ）が存在するか、または、試験配列の３３６９位に他のヌクレオチド（Ｔ）が存在するかを決定することができる。同様に提供されるものは、３３６９位にＧを含む配列番号１９の何れかのフラグメントに相当するヌクレオチド配列、または、３３６９位にＴを含む相当する配列である。
【００９０】
プローブおよびプライマー
本明細書に記載した変異を含む目的の核酸は、プローブまたはプライマーとして利用することができる。本明細書に開示されるＮａν１．７核酸配列の相補配列もまた提供される。大部分において、核酸フラグメントは少なくとも約１５ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、頻繁には少なくとも約５０ヌクレオチドである。このようなフラグメントはＰＣＲ、ハイブリダイゼーションスクリーニング等のためのプライマーとして有用である。より大型の核酸フラグメント、例えば、約１００ヌクレオチドより大型のものはプロモーターフラグメント、モチーフ等の作製のために有用である。増幅反応、例えば、ＰＣＲにおいて使用する場合は、一対のプライマーを使用する。プライマー配列の厳密な組成は本発明にとっては重要ではないが、大部分の用途に対しては、プライマーは当該分野で知られるとおりストリンジェントな条件下において対象配列にハイブリダイズする。
【００９１】
「プローブ」とは本明細書においては、例えば、ハイブリダイゼーションを介して、典型的には配列特異的な態様において、標的核酸と相互作用することができる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは当該分野でよく理解されており、そして本明細書で考察する通りである。典型的には、プローブは、当該分野で使用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチドの誘導体もしくはアナログの何れかの組み合わせから作製できる。
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」または「高度にストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」とは、ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分、典型的には少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０または５０ヌクレオチド）を含むものが、提供されたヌクレオチド配列の全体または部分に対しストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることを意味する。「ハイブリダイゼーション」という用語は、典型的には少なくとも２つの核酸分子（例えば、プライマーまたはプローブと遺伝子）の間の配列駆動性相互作用を意味する。配列駆動性相互作用とは、ヌクレオチド特異的態様において２つのヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド誘導体の間に起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、または、Ｔと相互作用するＡは配列駆動性相互作用である。典型的な配列駆動性相互作用は、ヌクレオチドのワトソンクリック面またはフーグスティーン面上で起こる。２核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の条件およびパラメーターの多くにより影響を受ける。例えば、反応の塩濃度、ｐＨおよび温度は全て２核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。一般的に、ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、本発明のＮａν１．７核酸の配列またはその部分またはその相補体に対し、少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、９５％または９８％同一である。本発明のハイブリダイズ核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー（例えば、ＰＣＲ用）、診断用プローブまたはアンチセンスプローブとして使用できる。核酸試料へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、典型的にはストリンジェントな条件下で実施される。核酸２重鎖またはハイブリッドの安定性は、標的ＤＮＡからプローブが解離する温度である融点（即ちＴｍ）として表示される。この融点を用いて必要なストリンジェンシー条件を定義する。プローブに対して同一というよりはむしろ関連性があり実質的に同一である配列を同定すべき場合は、特定濃度の塩（例えば、ＳＳＣまたはＳＳＰＥ）において相同ハイブリダイゼーションのみが起こるような最低の温度をまず確立することが有用である。１％のミスマッチがＴｍの１°Ｃ低下をもたらすと仮定すれば、ハイブリダイゼーション反応における最終洗浄の温度は相応に低下する（例えば、プローブと＞９５％同一性を有する配列を検索する場合は、最終洗浄温度は５°Ｃ低下する）。特に、Ｔｍの変化は１％ミスマッチにつき０．５°Ｃ〜１．５°Ｃである。ストリンジェントな条件では、５ｘＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液／１．０％ＳＤＳ中６８°Ｃでハイブリダイズし、そして、室温で０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄する。中等度のストリンジェントな条件は、４２°Ｃで３ｘＳＳＣ中の洗浄を含む。塩濃度および温度のパラメーターは、プローブと標的核酸との間の同一性の最適水準を達成するために変動させることができる。このような条件に関する別の指針は当該分野でよく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ��ａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｕｎｉｔ  ２．１０（１９９５）に記載されている。
【００９２】
核酸の合成アナログは試験条件下における優れた安定性のため、プローブとして使用することが好ましい。ネイティブの構造の修飾、例えば、骨格、糖または複素環塩基の改変は、細胞内安定性および結合親和性を向上させることがわかっている。骨格の化学的特徴の有用な変化は、ホスホロチオエート、非結合酸素の両方がイオウで置換されているホスホロジチオエート、ホスホロアミダイト、アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェートである。アキラルなホスフェート誘導体は、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネートおよび３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミデートを含む。ペプチド核酸は、ペプチド結合で全リボースホスホジエステル骨格を置き換える。
【００９３】
糖修飾もまた安定性および親和性を増強するために使用される。デオキシリボースのアルファ−アノマーを使用してよく、この場合、塩基は天然のベータ−アノマーと比較して反転している。リボース糖の２’−ＯＨを改変して２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリルの糖としてよく、これにより親和性を犠牲にすることなく分解に対する抵抗性を得ることができる。
【００９４】
複素環塩基の修飾は適切な塩基対形成が維持できなければならない。いくつかの有用な置換には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、デオキシシチジンに対する５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンが挙げられる。５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピニル−２’−デオキシシチジンは、それぞれデオキシチミジンおよびデオキシシチジンに対して置換される場合に、親和性および生物活性を増大させることがわかっている。
【００９５】
１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、野生型Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのアミノ酸配列をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。１つの局面においては、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。
【００９６】
別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、変異体Ｎａν１．７核酸配列またはそのフラグメントにハイブリダイズするが、野生型Ｎａν１．７核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号８の核酸配列またはそのフラグメント、例えば、配列番号１４にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号９の核酸配列またはそのフラグメント、例えば、配列番号１５にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１０またはそのフラグメント、例えば、配列番号１６の核酸配列にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１１またはそのフラグメント、例えば、配列番号１７の核酸配列にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１２またはそのフラグメント、例えば、配列番号１８の核酸配列にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１３またはそのフラグメント、例えば、配列番号１９の核酸配列にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。
【００９７】
更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む変異体Ｎａν１．７核酸にハイブリダイズするが、野生型Ｎａν１．７核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをコードする単離された核酸である。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。別の局面においては、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸にハイブリダイズするが、配列番号１の核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。
【００９８】
更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、変異体Ｎａν１．７核酸配列またはそのフラグメントにハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号８またはそのフラグメント、例えば、配列番号１４の核酸配列にはハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号９またはそのフラグメント、例えば、配列番号１５の核酸配列にはハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１０またはそのフラグメント、例えば、配列番号１６の核酸配列にはハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１１またはそのフラグメント、例えば、配列番号１７の核酸配列にはハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。更に別の局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１２またはそのフラグメント、例えば、配列番号１８の核酸配列にはハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。１つの局面において、本明細書に開示されるものは、ストリンジェントな条件下で、配列番号１３またはそのフラグメント、例えば、配列番号１９の核酸配列にはハイブリダイズするが、配列番号３８をコードする核酸配列にはハイブリダイズしない配列を含む単離された核酸である。
【００９９】
アレイ
開示された物質、化合物および方法はまた、アレイ上の個々の位置が、与えられた変異配列の１つ以上と相補である変異の同定のためのオリゴヌクレオチド、例えば、少なくとも１２ヌクレオチド、頻繁には１５ヌクレオチド、２０ヌクレオチド以上のオリゴヌクレオチド、そして、変異位置にフランキングする配列を含むオリゴヌクレオチドのアレイを提供する。このようなアレイは一連のオリゴヌクレオチドを含んでよく、その各々は開示した組成物の異なる変異に対して特異的にハイブリダイズすることができる。アレイは配列番号８、９、１０、１１、１２および／または１３を有する核酸配列またはその少なくとも１５連続したヌクレオチドの何れかのフラグメント、例えば、配列番号１４、１５、１６、１７、１８および／または１９の全てまたは部分集合を含んでよい。通常はこのようなアレイは、少なくとも２つの変異した配列、即ち遺伝子座内の独特の位置に存在する変異を含み、そして与えられた変異の全てを含んでよい。従って、アレイは最も一般的に見出される対立遺伝子を含む野生型配列を含むことができる。アレイは、場合により、第１、第２、第３、第４、第５またはそれ以上の位置にある最も一般的に見出される対立遺伝子ならびにこれらの位置の各々にある他のヌクレオチドを含むことができる。アレイ上の各オリゴヌクレオチド配列は、通常は少なくとも約１２ヌクレオチド長（即ち１０〜１５ヌクレオチド）であるか、与えられた変異下配列の長さであるか、または、フランキング領域に向けて伸長させて１００〜２００ヌクレオチド長のフラグメントを形成してもよい。アレイの例としては、Ｒａｍｓａｙ，（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １６：４０４４；Ｈａｃｉａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４４１−４４７；Ｌｏｃｋｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １４：１６７５−１６８０；およびＤｅＲｉｓｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４：４５７−４６０を参照でき、これらはアレイの作製および使用の方法について参考として全体が本明細書に援用される。
【０１００】
ハプロタイピング
別の局面において、開示された物質、組成物、物品、装置および方法はまた、ヒト対象におけるＮａν１．７ハプロタイプを決定するための方法に関し、ここで方法はアミノ酸残基６２、１４９、６４１、６５５、７３９、１１２３または何れかのこれらの組み合わせをコードするヌクレオチド１つ以上を同定することを含み、そしてここで、ヌクレオチドはハプロタイプを示すものである。開示された要件はまた、対象のゲノム核酸内に含有されるＮａν１．７遺伝子の一方または両方のコピーにおける部位１８４、４４６、１９２１、１９６４、２２１５、３３６９の１つ以上において存在するヌクレオチド１つ以上を同定することを含む、ヒト対象におけるＮａν１．７ハプロタイプを決定するための方法を提供し、ここで変異部位に存在するヌクレオチドはＮａν１．７ハプロタイプを示す。多くのハプロタイプが可能であることは、当業者により理解される。
【０１０１】
例えば、当業者は、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニット配列内のアミノ酸６２をコードする対象のゲノム核酸内に含有される、Ｎａν１．７遺伝子の一方または両方のコピーに存在するヌクレオチドを同定することができる。この特定の分析のためのハプロタイプはＩ６２Ｖ、Ｐ１４９Ｑ、Ｎ６４１Ｙ、Ｋ６５５Ｒ、Ｉ７３９Ｖ、Ｌ１１２３Ｆまたはこれらの組み合わせであることができ、ここで数はＮａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニット内の位置を示し、最初の文字はその位置に存在する最も共通するアミノ酸を示し、そして最後の文字はハプロタイプに存在するアミノ酸を示す。同様に、当業者は、部位１８４、４４６、１９２１、１９６４、２２１５および／または３３６９におけるＮａν１．７核酸配列内のヌクレオチドを同定し、Ｎａν１．７ハプロタイプを調べることができる。従って、核酸配列内の部位１８４、４４６、１９２１、１９６４、２２１５および／または３３６９またはコードされるアミノ酸配列内の位置６２、１４９、６４１、６５５、７３９および／または１１２３の何れかを個別に、または組み合わせて分析することにより、開示された要件のハプロタイプを得ることができる。
【０１０２】
素因の決定
本明細書に開示されるものは、対象のＮａν１．７ハプロタイプを、ナトリウムチャンネル変異に関連する神経学的障害に相関する参照ハプロタイプ１つ以上と比較することを含む、対象の神経学的障害の素因を決定するための方法であって、ここで、参照ハプロタイプと比較した場合の対象のＮａν１．７ハプロタイプにおける同様のハプロタイプは、神経学的障害に対する素因を示すものである。
【０１０３】
本明細書において「ナトリウムチャンネル変異に関連する神経学的障害」とは、例えば、発作性の障害（例えば、熱性発作、非熱性発作および癲癇性発作）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において「癲癇性発作」とは、例えば、部分（例えば、単純または複合的）および全身性（例えば、欠神発作、ミオクローヌス発作および強直・間代発作）の発作、側頭葉癲癇、および、幼児の重度のミオクローヌス癲癇が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
各ハプロタイプは、当業者が参照ハプロタイプに対象のハプロタイプを比較することができ、対象が神経学的障害の危険を有するかどうかを決定できるように、特定の神経学的障害またはそのような障害の重症度と相関付けて参照ハプロタイプのデータベースを作製することができる。
【０１０５】
参照ハプロタイプは、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットにおける変異１つ以上をコードするヌクレオチドを含むことができる。例えば、参照ハプロタイプは、Ｎａν１．７のコードされたアミノ酸配列の残基６２、残基１４９、残基６４１、残基６５５、残基７３９または残基１１２３において変異１つ以上をコードするヌクレオチドを含むことができる。
【０１０６】
集団に関するより多くの情報が収集されるに従い対象は多くのパラメーター（例えば、人種、年齢、体重、治療歴等）に応じて変動するので、対象が神経学的障害を発症する危険性を、対象の人口統計学的プロファイルにより緊密に関連する情報に基づいて当業者が評価できるように、データベースは人種、年齢、体重、治療歴等により分類されるハプロタイプ情報を含有することができる。人種的背景または他のパラメーターにより変異に示差的な分布が存在すれば、薬剤投与のための指針は一般的に特定のグループ専用に作製することができる。
【０１０７】
本明細書に開示した核酸ならびに対象から同定される核酸およびアミノ酸の配列はコンピューターにより読み取られアクセスできる何れかの媒体上に保存、記録および操作することができることを当業者は理解する。本明細書において使用される場合、「記録される」および「保存される」という表現は、コンピューター媒体上に情報を保存するための過程を指す。当業者は、本発明の核酸１つ以上を含む配列のリストを作製するために、コンピューター読み取り可能な媒体上に情報を記録するための現在知られている方法の何れかを、容易に適用することができる。本発明の別の局面は、本発明または対象から同定される核酸配列の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００または５０００の核酸をそれ自体に記録して保有するコンピューター読み取り可能な媒体である。
【０１０８】
コンピューター読み取り可能な媒体としては、磁気的に読み取り可能な媒体、光学的に読み取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体および磁気／光学的媒体が挙げられる。例えば、コンピューター読み取り可能な媒体は、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ＲＡＭまたはＲＯＭならびに他の型の当業者に公知の他の媒体であってよい。
【０１０９】
本発明の実施形態は、本明細書に記載した配列の情報を含有するシステム、特にコンピューターシステムを含む。本明細書において使用される場合、「コンピューターシステム」とは、本発明のヌクレオチド配列または他の配列を、保存および／または分析するために使用されるハードウエア要素、ソフトウエア要素、およびデータ保存要素を指す。コンピューターシステムは、好ましくは、上記したコンピューター読み取り可能な媒体および配列のデータにアクセスして操作するためのプロセッサーを含む。
【０１１０】
好ましくは、コンピューターは、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、データを保存するためのデータ保存要素１つ以上、および、データ保存要素上に保存されたデータを検索するためのデータ検索装置１つ以上を含む一般目的のシステムである。現在使用可能なコンピューターシステムの何れが適当であるかを、当業者は容易に理解し得る。
【０１１１】
１つの特定の局面において、コンピューターシステムは、好ましくは、ＲＡＭとして組み込まれたメインメモリに接続されたバスに接続されたプロセッサー、およびデータ保存装置（例えば、ハードドライブおよび／またはそれ自体に記録されたデータを有する他のコンピューター読み取り可能な媒体）の１つ以上を含む。一部の実施形態において、コンピューターシステムは、更にデータ保存要素上に保存されたデータを読み取るためのデータ検索装置１つ以上を含む。データ検索装置は、例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ、ハードディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤドライブ等であってよい。一部の実施形態において、データ保存要素は、それ自体に記録されたコントロールロジックおよび／またはデータを含むリムーバブルなコンピューター読み取り可能な媒体（例えば、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、磁気テープ等）である。コンピューターシステムは、好都合には、一旦データ検索装置に挿入されたデータ保存要素からコントロールロジックおよび／またはデータを読みだすための適切なソフトウエアを含むか、またはそれによりプログラムされてよい。本発明の核酸のヌクレオチド配列にアクセスして処理するためのソフトウエア（例えば、検索ツール、比較ツール、モデリングツール等）は、実行中にメインメモリ中に存在してよい。
【０１１２】
一部の局面において、コンピューターシステムは、更にコンピューター読み取り可能な媒体上に保存されている核酸配列を、コンピューター読み取り可能な媒体上に保存されている別の試験配列と比較するための配列コンペアラーを含んでよい。「配列コンペアラー」とは、ヌクレオチド配列を他のヌクレオチド配列と比較するためにコンピューターシステム上に設けられたプログラム１つ以上を指す。
【０１１３】
従って、本発明の１つの局面は、プロセッサー、本発明の核酸をそれ自体に保存して保有するデータ保存装置、試験配列または試料配列と比較すべき参照ヌクレオチド配列をそれ自体に保存して検索可能に保有しているデータ保存装置、および比較を実施するための配列コンペアラーを含むコンピューターシステムである。配列コンペアラーは、比較された配列の間の相同性のレベルを示すか、または、２配列間の差を同定するものであってよい。例えば、配列番号８またはその何れかのフラグメント、例えば、配列番号１４を含む参照配列を対象由来の試験配列と比較することにより、試験配列が参照配列と同様であるか、例えば、１８４位においてＡまたは異なるヌクレオチド（Ｇ）を含有するかを調べることができる。
【０１１４】
あるいは、コンピュータープログラムは、対象または複数の対象に由来する試験ヌクレオチド配列を参照ヌクレオチド配列と比較することにより、試験ヌクレオチド配列が１つ以上の位置において参照核酸配列と異なるか、または同様であるかどうかを調べるコンピュータープログラムであり得る。場合により、このようなプログラムは、参照ポリヌクレオチドまたは試験ヌクレオチド配列の何れかの配列に関して挿入、欠失または置換されたヌクレオチドの長さおよび名称を記録する。１つの実施形態において、コンピュータープログラムは、試験ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列に関して１ヌクレオチド変異１つ以上を含有するかどうかを調べるプログラムであり得る。これらの１ヌクレオチド変異は各々１塩基置換、挿入または欠失を含んでよい。
【０１１５】
従って、本明細書に開示した物質、化合物、物品、装置および方法の別の局面は、試験ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列とヌクレオチド１つ以上において異なるかどうかを調べるための方法であって、この方法は、核酸配列間の差を同定するコンピュータープログラムの使用を介して試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列を読み取る工程、および、コンピュータープログラムにより試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間の差を同定する工程を含む。コンピュータープログラムは、１ヌクレオチド多形を同定するプログラムであってよい。この方法は、上記したコンピューターシステムにより実施され得る。方法はまた、コンピュータープログラムの使用を介して少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、５０、１００以上の試験ヌクレオチド配列および参照ヌクレオチド配列を読み取ること、および、コンピュータープログラムにより試験ヌクレオチド配列と参照ヌクレオチド配列の間の差を同定することにより実施され得る。本明細書に開示した要件はまた、Ｎａν１．７遺伝子配列における１ヌクレオチド変異を同定し、そして対象のハプロタイプを決定するコンピュータープログラムを意図している。本明細書に開示した要件はまた、対象が熱性発作、非熱性発作または癲癇性発作のような神経学的障害を発症する危険性を当業者が評価できるように、Ｎａν１．７のレベルにハプロタイプを相関付けるコンピュータープログラムも提供する。このコンピュータープログラムは、場合により発作の増大した危険性に関連するハプロタイプを有する対象に対する治療の選択肢または薬剤の適応症を含むことができる。
【０１１６】
本発明の核酸（試験核酸配列および参照核酸配列の両方）は、種々のフォーマットの種々のデータ処理プログラムにおいて保存および操作され得る。例えば、ワープロファイル、例えば、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷＯＲＤまたはＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴ中のテキストとして、または、ＤＢ２、ＳＹＢＡＳＥまたはＯＲＡＣＬＥのような当業者のよく知る種々のデータベースプログラムにおけるＡＳＣＩＩファイルとして保存してよい。更に、多くのコンピュータープログラムおよびデータベースを、配列のコンペアラー、識別子または参照核酸配列のソースとして使用してよい。以下のリストは本発明の核酸配列とともに使用できるプログラムおよびデータベースのガイダンスとして示すものであり、本発明を限定するものではない。使用してよいプログラムおよびデータベースには、例えば、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＢａｓｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＧｅｎｅＭｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｌｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＭａｃＬｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２（ＮＣＢＩ）、ＢＬＡＳＴＹＮおよびＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３：４０３−４１０）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ）、（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８）、ＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｃｏｍｐｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  ６：２３７−２４５）、Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｃｅｒｉｕｓ．ｓｕｐ．２．ＤＢＡｃｃｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＨｙｐｏＧｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、  ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＣＨＡＲＭｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｆｅｌｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＱｕａｎｔｅＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＩＳＩＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｑｕａｎｔａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＷｅｂＬａｂ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌ��ｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ＳｅｑＦｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）、ｔｈｅＥＭＢＬ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｅｉｎ  データベース、ｔｈｅＭＤＬ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙデータベース、ＭＤＬ  Ｄｒｕｇ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｒｔデータベース、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙデータベース、Ｄｅｒｗｅｎｔｓ’ｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｄｅｘデータベース、ＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅデータベース、ＧｅｎｂａｎｋデータベースおよびＧｅｎｓｅｑｎデータベースが挙げられるがこれらに限定されない。多くの他のプログラムおよびデータベースも著明となる。
【０１１７】
Ｎａν１．７核酸配列の送達
場合により、本明細書に記載した核酸は種々の発現系に送達される。インビトロまたはインビボのいずれかにおいて、細胞に核酸を送達するために使用できる多くの組成物および方法が存在する。これらの方法および組成物は、大部分が２つの種類、即ちウイルス系の送達系および非ウイルス系の送達系に分類できる。例えば、核酸は多くの直接の送達系（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド）を介して、あるいは細胞またはカチオンリポソームのような担体中での遺伝子物質の転移を介して送達することができる。トランスフェクションの適切な手段（例えば、ウイルスベクター、化学トランスフェクタントまたは物理的機械的方法（例えば、エレクトロポレーションおよびＤＮＡ直接拡散）は、例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８；およびＷｏｌｆｆ，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：８１５−８１８に記載されている。このような方法は当該分野で周知であり、そして本明細書に記載した組成物および方法とともに使用するのに容易に適用可能である。特定の場合において、この方法は、大型のＤＮＡ分子で特に機能するように変更される。
【０１１８】
核酸系の送達系：ベクター
１つの局面において、本明細書に開示されるベクターは、変異したＮａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターであり、ここでヌクレオチド配列は発現制御配列に作動可能に連結している。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結した配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターである。別の局面において、本明細書に開示されるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結した配列番号３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターである。更に別の局面において、本明細書に開示されるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結した配列番号４のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターである。別の局面において、本明細書に開示されるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結した配列番号５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターである。更に別の局面において、本明細書に開示されるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結した配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターである。１つの局面において、本明細書に開示されるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結した配列番号７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現ベクターである。
【０１１９】
配列番号２〜７をコードする核酸の何れかのフラグメントを含む発現ベクターであるが更に提供される。このようなフラグメントは、配列番号２〜７の少なくとも５連続したアミノ酸配列を好ましくはコードする。
【０１２０】
発現または転移ベクターは、細胞に遺伝子を送達するために使用される任意のヌクレオチド構築物（例えば、プラスミド）であるか、または、遺伝子を送達するための一般的手法の一部分（例えば、組換えレトロウイルスまたはアデノウイルスの一部分）であり得る（Ｒａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ５３：８３−８８）。
【０１２１】
本明細書において、プラスミドまたはウイルスベクターは、分解を伴うことなく、細胞内に配列番号８、９、１０、１１、１２および／または１３のような開示した核酸を輸送する物質であり、そしてそれらが送達される細胞内の遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含む。ウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロン栄養性ウイルス、シンドビスまたは他のＲＮＡウイルス（例えば、ＨＩＶ骨格を有するウイルス）である。更にまた好ましいものは、ベクターとして使用するのに適するウイルス特性を共有した任意のウイルスファミリーである。レトロウイルスは、ネズミマロニー白血病ウイルスＭＭＬＶおよびベクターとしてＭＭＬＶの所望の特性を発現するレトロウイルスを含む。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大型の遺伝子負荷、即ちトランスジーンまたはマーカー遺伝子を保持することができ、そしてこの理由から、一般的に使用されているベクターである。しかしながら、それらは非増殖性細胞においては同様に有用ではない。アデノウイルスベクターは比較的安定であり、作業が容易であり、高い力価を有し、エアロゾル製剤において送達することができ、そして非分裂細胞をトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大型であり、遺伝子を挿入するための幾つかの部位を有し、熱安定性であり、そして室温で保存できる。１つの特定の局面は、ウイルス抗原により誘発された宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されているウイルスベクターである。この型のベクターは、インターロイキン８またはインターロイキン１０のコーディング領域を保持する。
【０１２２】
ウイルスベクターは、細胞に遺伝子を導入する化学的または物理的な方法よりも高いトランスアクション（遺伝子を導入する能力）の能力を有することができる。典型的には、ウイルスベクターは、非構造早期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびカプシド化のために必要な反転末端リピート、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するためのプロモーターを含有する。ベクターとして操作された場合、ウイルスは、典型的には除去された早期遺伝子１つ以上を有しており、そして遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットが除去されたウイルスＤＮＡの変わりに、ウイルスゲノムに挿入される。この型の構築物は、外来性の遺伝子物質を約８ｋｂまでを保持できる。除去された早期の遺伝子の必要な機能は、典型的にはトランスにおける早期遺伝子の遺伝子産物を発現するように操作されている細胞系統により供給される。
【０１２３】
レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、任意の型、サブファミリー、属または親和性を含むレトロウイルス科のウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的にレトロウイルスベクターおよびその作製方法に関して、参考として全体が本明細書に援用されるＶｅｒｍａ，Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２２９−２３２，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，（１９８５）に記載されている。遺伝子療法のためにレトロウイルスベクターを使用するための方法の例は、米国特許４．８６８，１１６および４，９８０，２８６；ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０６およびＷＯ８９／０７１３６；およびＭｕｌｌｉｇａｎ，（Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０：９２６−９３２（１９９３））に記載されており、これらの内容はレトロウイルスベクターおよびその使用方法について参考として本明細書に援用される。
【０１２４】
レトロウイルスは、本質的にはそれ自体に充填された核酸負荷物を有するパッケージである。核酸負荷物は、パッケージングシグナルをそれ自体に保持しており、これにより、複製された娘分子は確実にパッケージ被膜内部に効率的にパッケージされる。パッケージシグナルのほか、複製および複製されたウイルスのパッケージングのためにｉｎ  ｃｉｓで必要となる多くの分子が存在する。典型的には、レトロウイルスゲノムはタンパク質被膜の作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有している。標的細胞に転移されるべきものは、外来性のＤＮＡにより典型的に置き換えられるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは、典型的には、パッケージ被膜内に取り込まれるためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始をシグナルする配列、逆転写に必要なエレメント（例えば、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するためのプライマー結合部位）、ＤＮＡ合成の間にＲＮＡ鎖のスイッチをガイドする末端リピート配列、ＤＮＡ合成の第２の鎖の合成のためのプライミング部位として機能する３’ＬＴＲに対して５’側のプリンリッチの配列、および、レトロウイルスのＤＮＡ状態の挿入を可能にして宿主ゲノム内に挿入させるＬＴＲの末端近傍の特定の配列を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の除去により、約８ｋｂの外来性配列がウイルスゲノム内に挿入され、逆転写され、そして複製時には新しいレトロウイルス粒子内へのパッケージが可能となる。この量の核酸は各転写物のサイズに応じて多くの遺伝子の１つを送達するために十分である。インサート中に他の遺伝子とともに正または負の選択マーカーのいずれかを含ませることが好ましい。
【０１２５】
大部分のレトロウイルスベクターにおいて、複製の機構およびパッケージングタンパク質は除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）、ベクターは、典型的にはパッケージング細胞系統内へのその導入により形成される。パッケージング細胞系統は、複製およびパッケージングの機構を含有するが、何れのパッケージングシグナルも欠いているレトロウイルスでトランスフェクトまたは形質転換されている細胞系統である。選択されたＤＮＡを担体しているベクターがこれらの細胞系統内にトランスフェクトされる場合、目的の遺伝子を含有するベクターは複製され、ヘルパー細胞によりｉｎ  ｃｉｓで与えられる機構により新しいレトロウイルス粒子内にパッケージングされる。機構のためのゲノムは、それらが必要なシグナルを欠いているため、パッケージングされない。
【０１２６】
アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築が報告されている（Ｂｅｒｋｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ（１９８７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０；Ｍａｓｓｉｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６：２８７２−２８８３；Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４；Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９；Ｚｈａｎｇ，（１９９３）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２）。ベクターとしてこれらのウイルスを使用する利点は、これらのウイルスは初期感染細胞内では複製できるが、新しい感染性ウイルス粒子を形成することができないので、他の細胞型に拡張する程度が限定されている点である。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質および多くの他の組織部位への直接的なインビボ送達後に、高度に効率的な遺伝子転移を達成することが示される（Ｍｏｒｓｙ，１９９３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：１５８０−１５８６；Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，（１９９３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：３８１−３８７；Ｒｏｅｓｓｌｅｒ，（１９９３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２：１０８５−１０９２；Ｍｏｕｌｌｉｅｒ，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９；Ｌａ  Ｓａｌｌｅ，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９；９８８−９９０；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ，（１９９２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７：２５１２９−２５１３４；Ｒｉｃｈ，（１９９３）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６；Ｚａｂｎｅｒ，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３；Ｇｕｚｍａｎ，（１９９３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ  ７３：１２０１−１２０７；Ｂｏｕｔ，（１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０；Ｚａｂｎｅｒ，（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６；Ｃａｉｌｌａｕｄ，（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１；Ｒａｇｏｔ，（１９９３）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７）。組換えアデノウイルスは、特定の細胞の表面の受容体への結合により遺伝子導入を達成し、その後、野生型または複製欠損性のアデノウイルスと同様の態様で受容体媒介エンドサイトーシスによりウイルスを内在化する（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９７０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−３９６；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ５１：６５０−６５５；Ｓｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ４：１５２８−１５３３；Ｖａｒｇａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０；Ｗｉｃｋｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９）。
【０１２７】
ウイルスベクターは、除去されたＥ１遺伝子を有していたアデノウイルスに基づくものであることができ、そしてこれらのウイルスは、ヒト２９３細胞系統のような細胞系統内で発生される。別の局面においては、Ｅ１およびＥ３遺伝子の両方をアデノウイルスゲノムから除去する。
【０１２８】
アデノ関連ウイルスベクター
ウイルスベクターの別の型は、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）に基づく。この欠損性のパルボウイルスは、それが多くの細胞型を感染でき、そしてヒトに対しては非病原性であるので好ましい。ＡＡＶ型のベクターは、約４〜５ｋｂを輸送することができ、そして野生型ＡＡＶは、第１９染色体に安定に挿入されることが知られている。この部位特異的組み込み特性を含むベクターが好ましい。この型のベクターの特に好ましい実施形態は、Ａｖｉｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡにより製造されたＰ４．１Ｃベクターであり、これは単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ｔｋおよび／またはマーカー遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質ＧＦＰをコードする遺伝子）を含有する。
【０１２９】
別の型のＡＡＶウイルスにおいては、ＡＡＶは、非相同遺伝子に作動可能に連結した細胞特異的発現を指向するプロモーターを含む、少なくとも１つのカセットにフランキングした反転末端リピート（ＩＴＲ）の対を含有する。この内容において、非相同とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウイルスに由来しない任意のヌクレオチド配列または遺伝子を指す。
【０１３０】
典型的には、ＡＡＶコーディング領域およびＢ１９コーディング領域は欠失しており、これにより安全で非細胞毒性のベクターが得られる。ＡＡＶ  ＩＴＲまたはその修飾物は、感染性および部位特異的組み込みを与えるが細胞毒性を与えず、そしてプロモーターは細胞特異的発現を指向する。ＡＡＶベクターに関する物質についての米国特許６，２６１，８３４は、参考として全体が本明細書に援用される。
【０１３１】
即ち、全体を通じて記載される開示されたベクターは、実質的な毒性を伴うことなく、哺乳類の染色体への組み込みが可能な核酸を提供する。ベクターはまた、卵母細胞（例えば、Ｋｅｎｏｐｕｓ卵母細胞）中で発現させることができる核酸を提供する。
【０１３２】
ウイルスおよびレトロウイルス中で挿入された遺伝子は、通常は、プロモーターおよび／またはエンハンサーを含有し、これにより所望の遺伝子産物の発現を制御することができる。プロモーターは、一般的に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置に存在する場合に機能する核酸配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用のために必要なコアエレメントを含有し、そして上流のエレメントおよび応答エレメントを含有してよい。
【０１３３】
大負荷のウイルスベクター
大型のヒトヘルペスウイルスを用いた分子遺伝子的実験は、大型の非相同ＤＮＡフラグメントを、ヘルペスウイルスによる感染が可能な細胞中にクローニング、増殖および確立することができる手段を提供している（Ｓｕｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１；Ｃｏｔｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４）。これらの大型のＤＮＡウイルス（単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））は、特異的な細胞に＞１５０ｋｂのヒト非相同ＤＮＡのフラグメントを送達する能力を有する。ＥＢＶ組換え体は、エピソームＤＮＡとして感染Ｂ細胞内にＤＮＡ大型片を維持することができる。個々のクローンは、見かけ上遺伝子的に安定な３３０ｋｂまでのヒトゲノムインサートを保持していた。これらのエピソームの維持は、ＥＢＶによる感染の間に構成的に発現される特異的なＥＢＶ核タンパク質であるＥＢＮＡ１を必要とする。更にまた、これらのベクターは、大量のタンパク質をインビトロで一過性に発生できるトランスフェクションのために使用できる。ヘルペスウイルスアンプリコン系もまた、＞２２０ｋｂのＤＮＡ片をパッケージするため、および、エピソームとして安定にＤＮＡを維持できる細胞に感染するために使用される。
【０１３４】
他の有用な系としては、例えば、複製および宿主制限非複製のワクシニアウイルスベクターが挙げられる。
【０１３５】
非核酸系
開示された組成物はまた、核酸系の方法以外の種々の方法で標的細胞内に送達することができる。例えば、組成物はエレクトロポレーションを介して、または、リポフェクションを介して、またはリン酸カルシウム沈殿を介して送達できる。選択される送達の機序は、部分的には、ターゲティングされる細胞の型に応じて、そして、送達を、例えば、インビボまたはインビトロのどちらで行うかによって決定される。
【０１３６】
即ち、組成物は、開示した変異体Ｎａν１．７核酸配列またはベクターのほかに、例えば、リポソームのような脂質（例えば、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣコレステロール）またはアニオン性リポソーム）を含むことができる。リポソームは更に、所望により特定の細胞のターゲティングを促進するタンパク質を含む。化合物およびカチオン性リポソームを含む組成物の投与は、標的臓器に流入する血液中に行われるか、または、呼吸管内に吸収させて呼吸管の細胞をターゲティングすることができる。リポソームに関しては、例えば、Ｂｒｉｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １：９５−１００；Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７；米国特許４，８９７，３５５を参照できる。更に、化合物は、マクロファージのような特定の細胞型にターゲティングすることができるか、あるいはマイクロカプセルからの化合物の拡散または化合物の送達が特定の速度または用量のについて設計されている、マイクロカプセルの成分として投与することができる。
【０１３７】
対象の細胞内への外因性ＤＮＡの投与または取り込みを含む上記方法（即ち、遺伝子導入またはトランスフェクション）において、細胞への組成物の送達は、種々の機序を介して行うことができる。一例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ならびに当該分野の標準的操作法に従って開発された他のリポソームのような市販のリポソーム調製品を用いて、リポソームを介して行うことができる。更に、開示した核酸またはベクターは、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から利用可能な手法であるエレクトロポレーションならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ機（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を用いることにより、インビボで送達することができる。
【０１３８】
物質は、溶液、懸濁液（例えば、マイクロカプセル、リポソームまたは細胞内に取り込まれたもの）であってよい。これらは、抗体、受容体または受容体リガンドを介して、特定の細胞型にターゲティングされ得る。以下の参考文献は、この手法を用いて腫瘍組織に特異的なタンパク質をターゲティングする例である（Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：４４７−４５１；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６０：２７５−２８１；Ｂａｇｓｈａｗｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５８：７００−７０３；Ｓｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  ４：３−９；Ｂａｔｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３５：４２１−４２５；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ  Ｒｅｖ  １２９：５７−８０；Ｒｏｆｆｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ４２：２０６２−２０６５）。これらの手法は、種々の他の特定の細胞型に対しても使用できる。「ステルス」などのビヒクルおよび他の抗体コンジュゲートリポソーム（例えば、結腸癌への脂質媒介薬剤ターゲティング）、特定のリガンドを介したＤＮＡの受容体媒介ターゲティング、リンパ球指向腫瘍ターゲティングおよびインビボのネズミグリオーマ細胞に高度に特異的な治療用レトロウイルスターゲティングが挙げられる。以下の参考文献は、この手法を用いて、腫瘍組織に特異的なタンパク質をターゲティングした例である（Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４９：６２１４−６２２０；Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １１０４：１７９−１８７）。一般的に、受容体は、構成的またはリガンド誘導性の任意のエンドサイトーシス経路に関与している。これらの受容体は、クラスリンコーティングピット内でクラスター化し、クラスリンコーティング小胞を介して細胞内に進入し、受容体が分類される酸性化エンドソームを通過し、そして次に細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に保存されるか、または利疎ソーム内で分解される。内在化経路は種々の機能、例えば、栄養の取り込み、活性化タンパク質の除去、マクロ分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的進入、リガンドの解離および分解、および、受容体量の調節等を行う。多くの受容体が、細胞型、受容体濃度、リガンド型、リガンド価およびリガンド濃度に応じて１つより多くの細胞内経路に依存する。受容体媒介エンドサイトーシスの分子および細胞機序が検討されている（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：３９９−４０９）。
【０１３９】
宿主細胞ゲノムに組み込まれるべき細胞に送達される核酸は、典型的には、組み込み配列を含有する。これらの配列は、特にウイルス系を使用する場合、ウイルス関連配列である場合が多い。これらのウイルス組み込み系はまた、非核酸系の送達（例えば、リポソーム）を用いて送達されるべき核酸内に組み込むことができ、これにより、送達系に含有される核酸は、宿主ゲノム内に組み込まれることができる。
【０１４０】
宿主ゲノム内への組み込みのための他の一般的方法には、例えば、宿主ゲノムとの相同組換えを促進するように設計された系が挙げられる。これらの系は、典型的には、送達された核酸が宿主ゲノムに組み込まれるために十分な宿主細胞ゲノム内の標的配列との相同性を有する、発現されるべき核酸にフランキングした配列に依存し、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えを起こす。相同組換えを誘発するために必要なこれらの系および方法は、当該分野で公知である。
【０１４１】
発現
細胞に送達される核酸は、典型的には、発現制御系を含む。例えば、ウイルスおよびレトロウイルスの系の挿入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現の制御を容易にするために、発現制御配列、即ちプロモーターおよび／またはエンハンサーを含む。プロモーターは、一般的には、転写開始部位に対して相対的に固定された位置にある場合に機能するＤＮＡの配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、そして上流のエレメントおよび応答エレメントを含んでもよい。
【０１４２】
ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳類宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の原料、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはサイトメガロウイルス）のゲノムから、または、非相同の哺乳類プロモーター（例えば、ベータアクチンプロモーター）から得られ得る。ＳＶ４０ウイルスの早期および後期プロモーターは、複製のＳＶ４０ウイルス起点も含有するＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得られる（Ｆｉｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３）。ヒトサイトメガロウイルスの極早期プロモーターは、好都合には、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限フラグメントとして得られる（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０参照）。当然ながら、宿主細胞または関連の種に由来するプロモーターも、本発明において有用である。
【０１４３】
エンハンサーは、一般的には、転写開始部位から固定されない距離において機能し、そして転写単位に対して５’（Ｌａｉｍｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ７８：９９３）または３’（Ｌｕｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ３：１１０８）のいずれかであるＤＮＡの配列を指す。更にまた、エンハンサーはイントロン内（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９）ならびにコーディング配列自体内（Ｏｓｂｏｒｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ  ４：１２９３）に存在し得る。これらは、通常は、１０〜３００ｂｐ長であり、ｉｎ  ｃｉｓで機能することができる。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大させる機能を有する。エンハンサーは、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有する場合が多い。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答エレメントを含有することができる。エンハンサーは、遺伝子の発現の調節を決定する場合が多い。哺乳類遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン）由来のエンハンサー配列の多くが現在知られているが、典型的には、一般的な発現のためには、真核細胞のウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期の側（ｂｐ１００〜２７０）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期の側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１４４】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、その機能をトリガーする光または特定の化学的事象のいずれかにより特異的に活性化される。系はテトラサイクリンおよびデキサメタゾンのような試薬により調節できる。放射線への曝露（例えば、ガンマ線照射）またはアルキル化剤の化学療法により、ウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もある。
【０１４５】
特定の実施形態においては、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、構成的なプロモーターおよび／またはエンハンサーとして機能することにより、転写すべき転写単位の領域の発現を最大限にすることができる。特定の構築物において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定の時点において細胞の特定の型においてのみそれが発現されるとしても、全ての真核細胞型において活性である。この型の好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（完全長プロモーター）およびレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０１４６】
全ての特定の調節エレメントを、クローニングし、そして、黒色腫細胞のような特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターの構築に使用できることが示されている。例えば、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア起源の細胞において遺伝子を選択的に発現するために使用されている。
【０１４７】
真核細胞宿主細胞（コウボ、カビ、昆虫、植物、動物、ヒトまたは核化細胞）において使用される発現ベクターはまた、ｍＲＮＡ発現に影響し得る、転写終止に必要な配列を含有してよい。これらの領域は、ｍＲＮＡコード組織因子タンパク質の未翻訳部分におけるポリアデニル化セグメントとして転写される。３’未翻訳領域はまた、転写終止部位も含む。転写単位はポリアデニル化領域も含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写単位がｍＲＮＡのようにプロセシングされて輸送される可能性を増大させることである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分確立されている。相同ポリアデニル化シグナルをトランスジーンの構築物において使用することが好ましい。特定の転写単位においては、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０早期ポリアデニル化シグナルから誘導され、そして約４００塩基よりなる。転写単位に、他の標準的な配列を単独および上記した配列と組み合わせて含有させることにより、構築物からの発現または安定性を向上させることも好ましい。
【０１４８】
マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達され、そして送達された後に発現されたかどうかを調べるために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、Ｅ．Ｃｏｌｉ  ｌａｃＺ遺伝子であり、これはベータガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしている。
【０１４９】
マーカー産物は、本明細書においては「レポータータンパク質」と同義である。本明細書において使用される場合、「レポータータンパク質」とは、発現された場合に特に検出することができる任意のタンパク質である。レポータータンパク質は、発現配列からの発現を検出または定量するために有用である。多くのレポータータンパク質が当該分野で公知である。これらには、例えば、特定の検出可能な産物を生成するベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられるがこれらに限定されない。蛍光レポータータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色リーフコーラル蛍光タンパク質（Ｇ−ＲＣＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）もまた使用できる。
【０１５０】
一部の実施形態においては、マーカーまたはレポータータンパク質は、選択可能なマーカーであってよい。哺乳類細胞のための適当な選択可能なマーカーの例は、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ヒドロマイシンおよびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳類宿主細胞に良好に転移されれば、形質転換された哺乳類宿主細胞は選択圧力下に置かれた場合に生存することができる。選択様式には、２種類の広範に使用される異なる分類が存在する。第１の分類は、細胞の代謝および添加補給された培地に依存せずに生育する能力を欠いた変異体細胞系統の使用に基づいている。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞およびマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養の添加がない場合は生育する能力を欠く。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路のために必要な特定の遺伝子を欠いているため、欠如したヌクレオチドが補給培地中に提供されなければ生存することができない。培地へ補給する代わりに、該当する遺伝子を欠いた細胞内に未損傷のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を導入すること、即ち、その生育要件を改変することができる。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子で形質転換されていない個々の細胞は、非補給培地中では生存することができない。
【０１５１】
第２の分類は、任意の細胞型において使用される選択スキームを指し、そして変異体の細胞系統の使用を必要としない優性選択（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）である。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の生育を停止させる薬剤を使用する。新しい遺伝子を有するこれらの細胞は、薬剤耐性を温存しているタンパク質を発現し、選択条件下で生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｊ  Ｍｏｌｅｃ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ  １：３２７）、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２）またはハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ５：４１０−４１３）を使用する。３つの例は、適切な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ゲネチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）あるいはハイグロマイシンのそれぞれに対する耐性を付与するために、真核生物制御下の細菌遺伝子を使用する。他の例としては、ネオマイシンアナログＧ４１８およびピューラマイシンが挙げられる。
【０１５２】
培養細胞
１つの局面において、本明細書に開示した物質、組成物、物品、装置および方法は、変異体Ｎａν１．７核酸を含むベクターを含む細胞を、核酸によりコードされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程を含む、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットを作製する方法に関し、ここでポリペプチドは変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを含む。
【０１５３】
トランスジェニック動物
１つの局面において、本明細書に開示されるものは、本明細書に記載する変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルの１つ以上を発現するトランスジェニック動物である。例えば、本明細書に開示されるものは、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットをコードする細胞を含むトランスジェニックマウスであり、ここでマウスは野生型動物と比較して増大した発作を示す。
【０１５４】
「トランスジェニック動物」とは、本明細書においては、トランスジーンを含む動物を意味する。「トランスジーン」とは、細胞内に人為的に挿入され、その細胞および子孫のゲノムの部分となる核酸配列を意味する。このようなトランスジーンは（必須ではないが）、細胞に対して部分的または完全に非相同（例えば、異なる種から誘導されたもの）であってよい。トランスジェニック動物は、任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ヒツジ、ブタ、ヤギ等）であることができる。トランスジェニック動物は、当該分野で周知の手法により製造できる。例えば、トランスジェニック動物は、米国特許４，７３６，８６６において使用されている方法により製造できる。
【０１５５】
変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニット
１つの局面において、本明細書に開示されるものは、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットおよび疾患状態（例えば、ナトリウムチャンネル変異に関連する神経学的障害）を診断および治療するための、このような変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルの使用である。Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの特定の部位が変異すること、即ち、特定の位置のアミノ酸が最も一般的に存在するＮａν１．７ナトリウムチャンネルで観察されるものとは異なることがわかった。
【０１５６】
本明細書は種々のアミノ酸配列を考察するため、これらのアミノ酸配列をコードする核酸もまた開示されることが理解される。これは、特定のアミノ酸配列に関連する全ての縮重した配列、即ち１つの特定のアミノ酸配列をコードする配列を有する全ての核酸、ならびに、アミノ酸配列の開示された変異体および誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸を含む。即ち、各々の特定の核酸配列を本明細書に記述しない場合があるが、各々全ての配列は実際には開示されたアミノ酸配列を介して本明細書に開示および記載されるものと見なす。例えば、配列番号２のアミノ酸配列をコードすることができる多くの核酸配列の１つを配列番号８に示す。配列番号３のアミノ酸配列をコードする別の核酸配列を配列番号９に示す。配列番号４のアミノ酸配列をコードする別の核酸配列を配列番号１０に示す。配列番号５のアミノ酸配列をコードする別の核酸配列を配列番号１１に示す。配列番号６のアミノ酸配列をコードする別の核酸配列を配列番号１２に示す。配列番号７のアミノ酸配列をコードする別の核酸配列を配列番号１３に示す。どの特定のＤＮＡ配列が生物内でそのタンパク質をコードするかを何れのアミノ酸配列も示していないが、開示したタンパク質の特定の変異体が本明細書に開示されていれば、そのアミノ酸配列の発生源である特定の変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニット内でそのアミノ酸配列をコードする既知の核酸配列はまた公知であり、そして本明細書に開示および記載されていることもまた理解される。
【０１５７】
１つの局面において、本明細書に記載した変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットは、変異部位１つ以上を有する。例えば、１つの局面において、本明細書に開示されるものは、６２位のアミノ酸が６２位に一般的に存在するようにイソロイシン（Ｉ）ではなく、バリン（Ｖ）となっている変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットである（配列番号２）。別の局面においては、本明細書に開示されるものは、１４９位のアミノ酸が１４９位に一般的に存在するようにプロリン（Ｐ）ではなく、グルタミン（Ｑ）となっている変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットである（配列番号３）。別の局面においては、本明細書に開示されるものは、６４１位のアミノ酸が６４１位に一般的に存在するようにアスパラギン（Ｎ）ではなく、チロシン（Ｙ）となっている変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットである（配列番号４）。更に別の局面においては、本明細書に開示されるものは、６５５位のアミノ酸が６５５位に一般的に存在するようにリジン（Ｋ）ではなく、アルギニン（Ｒ）となっている変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットである（配列番号５）。別の局面においては、本明細書に開示されるものは、７３９位のアミノ酸が７３９位に一般的に存在するようにイソロイシン（Ｉ）ではなく、バリン（Ｖ）となっている変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットである（配列番号６）。更に別の局面においては、本明細書に開示されるものは、１１２３位のアミノ酸が１１２３位に一般的に存在するようにロイシン（Ｌ）ではなく、フェニルアラニン（Ｆ）となっている変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットである（配列番号７）。
【０１５８】
同様に意図されるものは、開示した変異体Ｎａν１．７アミノ酸配列の変異体および誘導体である。本明細書に開示したタンパク質の変異体および誘導体を定義する１つの方法は、特定の既知配列に対する相同性／同一性の観点から変異体および誘導体を定義することによることが理解される。例えば、配列番号２は変異体Ｉ６２Ｖ変異ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの特定の配列を示し、配列番号３は変異体Ｐ１４９Ｑ  Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの特定の配列を示し、配列番号４は変異体Ｎ６４１Ｙ  Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの特定の配列を示し、配列番号５は変異体Ｋ６５５Ｒ  Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの特定の配列を示し、配列番号６は変異体Ｉ７３９Ｖ  Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの特定の配列を示し、配列番号７は変異体Ｌ１１２３Ｆ  Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの特定の配列を示す。特に開示されるものは、記載した配列に対して少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％の相同性を有する、これらの変異体および本明細書に開示した別のタンパク質である。更にまた、配列が保存的アミノ酸置換１つ以上を含む配列番号２、３、４、５、６および７の配列またはそのフラグメントを含むアミノ酸配列も提供される。好ましくは、保存的アミノ酸置換を有するアミノ酸配列は、ナトリウムチャンネル機能を温存している。保存的アミノ酸置換の例は表１に示すとおりである。２タンパク質の相同性をどのように決定するかは当業者に容易に理解される。例えば、相同性は、相同性がその最高レベルとなるように２配列をアライニングした後に計算することができる。
【０１５９】
【表１】
2007518422.tif 000020
2007518422.tif 000021
相同性を計算する別の方法は、公開されているアルゴリズムにより実施できる。比較のための配列の最適アライメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ  Ａｐｐｌ  Ｍａｔｈ  ２：４８２のローカル相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４８：４４３の相同性アライメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８５：２４４４の同様性法のための検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター処理（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により、または、精査により実施してよい。
【０１６０】
更にまた、本明細書に開示されるものは、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドおよびポリペプチドのフラグメントである。例えば、本明細書に開示されるものは、配列番号２、３、４、５、６および７のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。別の局面においては、本明細書に開示されるものは、このような配列のフラグメントである。例えば、本明細書に開示されるものは、配列番号３２、３３、３４、３５、３６および３７のアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチドである。
【０１６１】
更にまた、配列番号２、３、４、５、６および７に相当する少なくとも５連続したアミノ酸配列のフラグメントも提供される。これらのフラグメントに含まれるものは、ＰＦＶＹＧ（配列番号３２）、ＮＰＱＤＷ（配列番号３３）、ＬＰＹＧＱ（配列番号３４）、ＩＨＲＫＲ（配列番号３５）、ＬＡＶＴＩ（配列番号３６）およびＮＰＦＰＧ（配列番号３７）を含むものである。
【０１６２】
ポリペプチド合成方法
本明細書に開示するペプチド、ポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントはＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）またはＢｏｃ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）化学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の何れかを用いて現在使用できる実験室機材を用いて化学合成することができる。本明細書に開示したナトリウムチャンネルに相当するペプチドまたはポリペプチドは、例えば、標準的な化学反応により合成できることは当業者に容易に理解され得る。例えば、あるペプチドまたはポリペプチドフラグメントは、合成し、そして、その合成樹脂から脱離させなくてもよく、一方、別のペプチドまたはポリペプチドフラグメントは合成し、その後、樹脂から脱離させることにより他のフラグメント上で機能的にブロックされる末端基を曝露させることができる。ペプチド縮合反応により、これらの２フラグメントは、それぞれそのカルボキシおよびアミノ末端におけるペプチド結合を介して共有結合することによりナトリウムチャンネルまたはそのフラグメントを形成することができる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  Ｍ  ａｎｄ  Ｔｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９３）参照）。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドを上記した通りインビボで独立して合成する。
【０１６３】
例えば、クローニングされた、または合成されたペプチドセグメントの酵素的ライゲーションにより、比較的短いペプチドフラグメントを結合させてより大きいペプチドフラグメント、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインとすることができる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：４１５１）。あるいは、合成ペプチドのネイティブの化学的ライゲーションを利用して、より短いペプチドフラグメントから大型のペプチドまたはポリペプチドを合成的に構築することができる。この方法は、２工程の化学反応よりなる（Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。第１の工程は、未保護の合成ペプチド−アルファ−チオエステルとアミノ末端Ｃｙｓ残基を含有する別の未保護のペプチドセグメントの化学選択的反応により初期共有結合産物としてのチオエステル連結中間体を形成することである。この中間体は、反応条件を変化させることなく、自発的で急速な分子内反応を起こし、ライゲーション部位においてネイティブのペプチド結合を形成する。このネイティブの化学ライゲーション法をタンパク質分子の全合成に適用することは、ヒトインターロイキン８（ＩＬ−８）の製造により説明される（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：１６０７５；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：３１２８；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３−３０）。
【０１６４】
あるいは、未保護のペプチドセグメントを、化学ライゲーションの結果としてペプチドセグメント間に形成された結合が非天然（非ペプチド）結合となるように化学的に連結する（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１）。この方法は、タンパク質ドメインのアナログならびに完全な生物活性を有する比較的純粋な大量のタンパク質を合成するために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７−２６７（１９９２））。
【０１６５】
変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルの抗体
本明細書に開示された物質、組成物、物品、装置および方法は、１つの局面において、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する精製された抗体に関する。１つの局面において、精製された抗体は、Ｉ６２Ｖ変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する。別の局面において、精製された抗体は、Ｐ１４９Ｑ変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する。更に別の局面において、精製された抗体は、Ｎ６４１Ｙ変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する。別の局面において、精製された抗体は、Ｋ６５５Ｒ変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する。更に別の局面において、精製された抗体は、Ｉ７３９Ｖ変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する。１つの局面において、精製された抗体は、Ｌ１１２３Ｆ変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープに選択的に結合する。
【０１６６】
「選択的に結合する」とは、抗体が非変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルに感知できるほど（ａｐｐｒｅｃｉａｂｌｙ）結合することなく変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルに結合することを意味する。「結合する」とは、結合を示すシグナルが非結合対照のシグナルの少なくとも約１．５倍であることを意味する。即ち、「感知できるほど結合することなく」とは、非結合対照のバックグラウンドの１．５倍以下を意味する。
【０１６７】
「抗体」という用語は、本明細書においては、広範な意味において使用され、そして、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方ならびにヒト化、完全ヒト、および非ヒトの抗体を含む。更にまた、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのエピトープにフラグメントが選択的に結合するこれらの抗体のフラグメントも提供される。抗体は本明細書に記載したインビトロの試験を用いて、または、類似の方法により所望の結合活性について試験することができる。場合により、抗体は直接または間接的に標識し、そして変異体Ｎａν１．７の発現を検出するための画像化手法とともに使用することができる。
【０１６８】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書においては、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体を指し、即ち、抗体分子の小部分集合に存在してよい可能な天然に存在する変異を除き、集団内の個々の抗体が同一であることを指す。モノクローナル抗体は本明細書においては特に、重鎖および／または軽鎖の部分が特定の種から誘導された、または、特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一または相同であるが鎖の残余は別の種から誘導された、または別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一または相同であるような、「キメラ」抗体、ならびに、所望の拮抗活性を示す限りそれらの抗体のフラグメントも含む（米国特許４，８１６，５６７およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５参照）。
【０１６９】
開示されるモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を製造する任意の操作法を用いて作製できる。例えば、開示されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５）に記載のものを用いて製造できる。ハイブリドーマ法においては、マウスまたは他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤で免疫化することにより、免疫化剤に特異的に結合する抗体を製造するかまたは製造可能なリンパ球を生じさせる。あるいは、リンパ球を、例えば、本明細書に記載されている変異体Ｎａν１．７チャンネルを用いてインビトロで免疫化してよい。
【０１７０】
モノクローナル抗体はまた、米国特許４，８１６，５６７に記載されるような組換えＤＮＡ法により作製してよい。開示されたモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法（例えば、ネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによる）を用いて容易に単離または配列決定することができる。抗体または活性抗体フラグメントのライブラリを作製し、例えば、米国特許５，８０４，４４０および６，０９６，４４１に記載の通り、ファージディスプレイ手法を用いてスクリーニングすることもできる。
【０１７１】
インビトロの方法はまた、１価の抗体、例えば、ｓｃｆｖ抗体の製造に適している。抗体を消化してそのフラグメント、特にＦａｂフラグメントを作製することは、当該分野にて知られている通常の手法を用いて行うことができる。例えば、消化はパパインを用いて行うことができる。パパイン消化の例は、ＷＯ９４／２９３４８および米国特許４，３４２，５６６に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には各々が単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および、残余のＦｃフラグメントを生成する。ペプシン処理は２つの抗原複合化部位を有し、なお抗原に交差結合できるフラグメントをもたらす。
【０１７２】
他の配列に結合しているか否かにかかわらず、フラグメントは、抗体または抗体フラグメントの活性が、非修飾の抗体または抗体フラグメントと比較して大きく改変または損なわれていない限り、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または他の選択された修飾も含み得る。このような修飾は、一部の付加的な特性、例えば、ジスルフィド結合可能なアミノ酸の除去／付加、生命持続の延長、分泌特性の改変等をもたらすことができる。いずれの場合においても、抗体または抗体フラグメントは、その同族抗原に対する特異的結合のような生物活性特性を保有していなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能的または活性な領域は、タンパク質の特異的領域の変異誘発、その後の発現および発現されたポリペプチドの試験により同定してよい。このような方法は、当業者に容易に理解され、抗体または抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる（Ｚｏｌｌｅｒ，（１９９２）Ｊ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３：３４８−３５４参照）。
【０１７３】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体も指すことができる。多くの非ヒト抗体（例えば、マウス、ラットまたはウサギから誘導されたもの）がヒトにおいて天然に抗原性であり、即ち、ヒトに投与されれば望ましくない免疫応答を誘発する場合がある。従って、方法におけるヒトまたはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を惹起する可能性を低減する働きを有する。
【０１７４】
ヒト抗体
開示されたヒト抗体は、任意の手法を用いて製造できる。ヒトモノクローナル抗体製造の技術の例には、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７，１９８５）により、そして、Ｂｏｅｒｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７：８６−９５により記載されたものが挙げられる。ヒト抗体（およびそのフラグメント）はまた、ファージディスプレイライブラリを用いて製造することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１参照）。
【０１７５】
開示されたヒト抗体はまた、トランスジェニック動物から得ることもできる。例えば、免疫化に応答してヒト抗体の全レパートリーを生産することができるトランスジェニック変異体マウスが記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３参照）。具体的には、これらのキメラおよび生殖細胞系統の変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体生産の完全な抑制をもたらす。そしてこのような生殖細胞系統の変異体マウスへの、ヒト生殖細胞系統抗体遺伝子アレイの良好な転移は、抗原攻撃の際にヒト抗体の生産をもたらす。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載する変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルを用いて選択される。
【０１７６】
ヒト化抗体
抗体ヒト化技術では、一般的に抗体分子のポリペプチド領域１つ以上をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡ技術を使用する。従って、非ヒト抗体（またはそのフラグメント）のヒト化形態は、キメラ抗体または抗体鎖（またはそのフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’または抗体の他の抗原結合部分）であり、これはヒト（レシピエント）抗体のフレームワーク内に組み込まれる非ヒト（ドナー）抗体に由来する抗原結合部位の部分を含有する。
【０１７７】
ヒト化抗体を形成するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の相補性決定領域（ＣＤＲ）１つ以上に由来する残基を、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対する特異性または親和性の特定のレベル）を有することがわかっているドナー（非ヒト）抗体分子のＣＤＲ１つ以上に由来する残基と置き換える。一部の場合においては、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基を相当する非ヒト残基と置き換える。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体や移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列の何れにも存在しない残基を含有してよい。一般的に、ヒト化抗体は非ヒトである原料からそれに導入されたアミノ酸残基１つ以上を有する。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基により置換されているヒト化抗体である。ヒト化抗体は一般的に、典型的にはヒト抗体のものである抗体定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分を含有する（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｐｒｅｓｔａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２：５９３−５９６参照）。
【０１７８】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該分野で周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒ等の方法（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６）に従って、げっ歯類ＣＤＲまたはヒト抗体の相当する配列に関するＣＤＲ配列を置換することにより形成することができる。ヒト化抗体を製造するために使用できる方法は更に、米国特許４，８１６，５６７、米国特許５，５６５，３３２、米国特許５，７２１，３６７、米国特許５，８３７，２４３、米国特許５，９３９，５９８、米国特許６，１３０，３６４および米国特許６，１８０，３７７に記載されている。
【０１７９】
１つの局面において、治療の形態として、抗体は変異体タンパク質の機能を不活性化するために使用できる。
【０１８０】
薬剤スクリーニングおよび送達の方法
本明細書に開示した物質、組成物、物品、装置および方法は、１つの局面において、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをモジュレートする化合物を同定する方法に関し、この方法は、チャンネルの残基６２、残基１４９、残基６４１、残基６５５、残基７３９または残基１１２３における変異１つ以上を含む変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをコードする変異体Ｎａν１．７核酸を含有する細胞を試験化合物に接触させること；Ｎａν１．７ナトリウムチャンネル活性を検出すること；および、接触させた細胞におけるＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性を対照細胞におけるＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性の量と比較する工程を含み、ここで対照細胞は試験化合物とは接触させず、対照細胞と比較した場合の試験細胞における増大または低減したＮａν１．７ナトリウムチャンネル活性は、変異体Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルをモジュレートする化合物を示すものである。ナトリウムチャンネル活性の検出は当該分野でよく知られている方法により行うことができる。例えば、ナトリウムチャンネル活性を検出するための適当なプロトコルは、Ｋａｕｓａｌｉａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．  １０．１１５２／ｊｎ．００６７６．２００３に記載されている。
【０１８１】
細胞は、変異体チャンネルを天然に発現するか、そのように遺伝子的に修飾される。場合により、細胞は、変異体ナトリウムチャンネルを発現した卵母細胞である。変異体ナトリウムチャンネルは、Ｉ６２Ｖ、Ｐ１４９Ｑ、Ｎ６４１Ｙ、Ｋ６５５Ｒ、Ｉ７３９ＶまたはＬ１１２３Ｆ変異体であることができる。場合により、変異体チャンネルは部位変異１つ以上を含むことができる。
【０１８２】
場合により、チャンネル活性は、ナトリウムイオン流出に関連する膜電位における変化を評価するために細胞内または細胞外の記録を用いて試験する。あるいは、画像化技術を用いて、標識されたイオン流出を観察することができる。発現は、アフリカツメガエル卵母細胞またはＣＨＯ、ＨＥＫおよびｔｓａ２０１のような哺乳類細胞において評価できる。変異は、タンパク質の輸送およびタンパク質の相互作用の誤りをもたらす。これにより、変異体チャンネルは、野生型チャンネルに対する標識された抗体を使用することによってか、または、チャンネルに共通のエピトープを結合し、そのエピトープに対する特定の抗体を使用することによって、小胞体内に保持されているのではなく細胞膜内の機能的チャンネルを形成するその能力について評価できる。細胞内タンパク質（例えば、タンパク質キナーゼＡ、タンパク質キナーゼＣもしくはカルモジュリンキナーゼ、またはナトリウムチャンネルベータサブユニット）との相互作用を改変する変異は、コウボ２−ハイブリッド試験、同時免疫沈降実験、または、電子生理学的実験を介して同定することができる。
【０１８３】
更にまた、本明細書に開示する物質、組成物、物品、装置および方法は、１つの局面において、変異体Ｎａν１．７のレベルをモジュレートする組成物で神経学的障害の危険性を有する対象を治療することによる、熱性発作、非熱性発作または癲癇のような神経学的障害の作用を予防または低減する方法に関する。即ち、Ｎａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットにおける変異を有する対象は、神経学的障害または神経学的障害の増大した危険性と合致して、本明細書に記載した方法を用いて同定または製造される変異体Ｎａν１．７モジュレーターを含む組成物で治療することができる。
【０１８４】
本明細書に開示される物質および組成物は、製薬上許容しうる担体中でインビボで投与できる。「製薬上許容しうる担体」とは、生物学的、または、他の面において不適切ではない物質を意味し、即ち、その物質は、本明細書に記載した方法により同定または作製されたＮａν１．７ナトリウムチャンネル機能のモジュレーターとともに対象に投与してよく、その際、不適切な生物学的作用およびそれが含有されている医薬組成物の他の成分の何れかとの有害な態様における相互作用のいずれも誘発しないものである。当業者に周知の通り、担体は自然に活性成分の分解を最低限にするため、そして、対象における副反応を最小限にするために選択される。
【０１８５】
組成物は、経口、非経腸（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所等で投与してよいが、典型的には局所鼻内投与または吸入による投与が好ましい。本明細書においては、「局所鼻内投与」とは、鼻道の片方または両方を経由する鼻腔内への組成物の送達を意味し、そして噴霧機序または滴下機序によるか、組成物のエアロゾル化を介した送達が挙げられる。後者は、大量の動物を同時に治療すべき場合に有効である。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または滴下機序による送達を介して鼻または口を経由して行うことができる。送達はまた、挿管を介して呼吸系の何れかの領域（例えば、肺）に直接行うことができる。必要な組成物の厳密な量は、試験対象の種、年齢、体重および全身状態、治療すべき障害の重症度、使用する特定の核酸またはモジュレーター、投与様式等により対象毎に異なる。従って、各組成物の厳密な量を特定することは不可能である。しかしながら、適切な量は、本明細書に記載した通常の実験のみを用いて当業者が決定することができる。
【０１８６】
組成物の非経腸投与を行う場合は、それは一般的に注射を特徴とする。注射製剤は、液体または懸濁液の従来の形態、注射前に液体中の懸濁液の溶解に適する固体形態または乳液として製造できる。非経腸投与のためにより最近再検討された方法では、一定の用量が維持されるように、緩徐放出または持続放出の系を使用する。例えば、参考として本明細書に援用される米国特許３，６１０，７９５を参照のこと。
【０１８７】
物質は、溶液、懸濁液であってよい（例えば、微粒子、リポソームまたは細胞内に取り込まれたもの）。これらは、抗体、受容体または受容体リガンドを介して特定の細胞にターゲティングしてよい。
【０１８８】
リポソームは、水相をカプセル化する同心円状に層をなす脂質二層１つ以上よりなる小胞である。これらは、通常は溢出性ではないが、膜に穴部または細孔が形成されるか、膜が溶解または分解するか、または、膜の温度が相転移温度まで上昇すれば、溢出性となる。リポソームを介した薬剤送達の現在の方法は、リポソーム担体が最終的には透過性となり、標的部位においてカプセル化された薬剤を放出することを必要とする。これは、例えば、リポソーム二層が身体内の種々の物質の作用を介して経時的に分解されるという受動的態様において行うことができる。何れのリポソーム組成物も、循環系中または身体内の他の部位において特徴的な半減期を有しており、従って、リポソーム組成物の半減期を制御することにより、二層が分解する速度をある程度調節することができる。
【０１８９】
受動的薬剤放出とは対照的に、能動的薬剤放出は、リポソーム小胞中の透過性の変化を誘導する物質を使用する。リポソーム膜は、リポソーム膜近傍の環境が酸性となった場合に脱安定化されるように構築することができる（例えば、リポソームの構築および投与の記載に関し、参考として全体が本明細書に援用される（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：７８５１；（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８：９０８を参照できる）。リポソームが標的細胞によりエンドサイトーシスされると、例えば、リポソームを脱安定化させ薬剤を放出させる酸性エンドソームに導くことができる。
【０１９０】
あるいは、リポソームを緩徐に脱安定化させる膜上のコーティングとして酵素が添加されるように、リポソーム膜を化学修飾することができる。薬剤放出の制御は、膜内に最初に添加された酵素の濃度に依存しているため、「オンデマンド」の薬剤送達を達成するために薬剤放出をモジュレートまたは改変する真に効率的な方法はない。同じ問題は、リポソーム小胞が標的細胞と接触すると直ぐに取り込まれ、ｐＨの低下が薬剤放出をもたらすというｐＨ感受性リポソームに関しても存在している。このリポソーム送達系はまた、Ｂ細胞特異的受容体に対する親和性を有するリガンドをリポソーム構造内に取り込むことによりＢ細胞をターゲティングするように作製することもできる。
【０１９１】
製薬上許容しうる担体内にリポソームを含んでいる組成物もまた意図される。
【０１９２】
ソノフォレシスと組み合わせて脂質系組成物（即ちパッチの形態）を用いることにより、低分子量のタンパク質を送達するために、経皮送達装置が使用されている。しかしながら、開示されている方法に関して、参考として全体が本明細書に援用される米国特許６，０４１，２５３に報告されている通り、経皮送達は電場を適用することにより（例えば、イオノホレシスまたはエレクトロポレーションにより）、更に増強できる。角質層の脂質層のキャビテーションを誘導する低周波超音波を使用することにより、より高度な経皮流出、急速な経皮流出制御、および、より低値の超音波強度における薬剤放出が達成できる。電場および超音波に化学的増強剤および／または磁場を組み合わせることで、更に増強することが可能である。
【０１９３】
インプラントまたは注射によるタンパク質のデポ組成物もまた使用することができ、組成物の長期間の送達を可能にする。例えば、タンパク質デポ組成物および使用に関して、参考として全体が本明細書に援用される米国特許６，３３１，３１１は、生体適合性重合体、重合体を溶解して粘稠なゲルを形成する溶媒、および粘稠なゲル中の分散した液滴の相の形態の乳化剤を含む注射可能なデポゲル組成物を報告している。注射により、このようなゲル組成物は、比較的連続した速度で送達されるべき薬剤を分散させ、これにより送達されるべき薬剤の初期の爆発的放出を回避することができる。
【０１９４】
本明細書に記載した試験化合物およびモジュレーターは、例えば、抗体、化学物質、小分子、修飾されたアンチセンスＲＮＡ、イオン、ｓｉＲＮＡ、受容体リガンド、薬剤および分泌タンパク質であることができるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１９５】
以下の実施例は、特許請求の範囲に記載した抗体、ポリペプチド、核酸、組成物および／または方法をどのようにして作製して評価するかについて、完全な開示および説明を当業者に提示するために記載するものであり、本発明の純粋な例示を意図しており、そして、本発明者らが本発明の範囲と見なしているものを制限する意図はない。数値（例えば、量、温度等）に関しては正確を期したが、誤差および偏差は不可避である。
【０１９６】
実施例１
熱性発作（ｆｅｂｒｉｌｅ  ｓｅｉｚｕｒｅ）は、幼児期の最も一般的な発作性障害であり、欧州および北米の小児の２〜５％で発生し、日本人では９％の高値となっている。一親等血縁者における熱性発作の発生率は、３１％（Ａｉｃａｒｄｉ，Ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９４））であり、熱性発作の強力な遺伝的因果関係を裏付けている。熱性発作を経験した個体が後発の非熱性発作を発症する確立が２〜７％であることから、熱性発作の影響は多大である（Ａｎｎｅｇｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３１６：４９３−４９８）。これらの後発の癲癇性の現象は、種々の全身性の発作性ならびに単純および複合的な部分的発作の症例を含む。
【０１９７】
熱性発作同属（ｋｉｎｄｒｅｄ）Ｋ４４２５の連鎖分析によれば、ナトリウムチャンネルアルファサブユニット遺伝子５を含有する染色体２ｑ２４（ＦＥＢ３，ＯＭＩＭ  ６０４４０３）上の組換えが無い１０ｃＭの領域が同定されている（Ｐｅｉｆｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４６：６７１−６７８参照）。この厳密な領域内のナトリウムチャンネル遺伝子３つ、即ちＮａν１．１、Ｎａν１．２およびＮａν１．３は８５％の同一性を共有しており、そして脳において高度に発現される（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２６：１３−２５参照）。この厳密な遺伝子区間内にやはり存在するＮａν１．７は、Ｎａν１．１、Ｎａν１．２およびＮａν１．３と約７０〜８０％の相同性を共有しており（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２６：１３−２５；Ｓａｎｇａｍｅｓｗａｒａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１４８０５−１４８０９参照）、脊髄神経節のニューロンにおいて主に発現され、そして、脳における発現は最小限または皆無である（Ｆｅｌｔｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ４５：７１−８２；Ｔｏｌｅｄｏ−Ａｒａｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：１５２７−１５３２）。その結果、Ｎａν１．７は末梢神経系チャンネルとして分類されている（Ｃａｔｔｅｒａｌｌ，（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ  ２６：１３−２５；Ｇｏｌｄｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６３：８７１−８９４）。
【０１９８】
最近、疾患誘発変異が、全身癲癇性熱性発作プラス（ＧＥＦＳ＋）、即ち同族Ｋ４４２５で記載されている表現型とはわずかに異なる熱性発作障害について、Ｎａν１．１およびＮａν１．２において同定された（Ｓｉｎｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４５：７５−８１；Ｓｕｇａｗａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：６３８４−６３８９；  Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６８：８５９−８６５；Ｅｓｃａｙｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２４：３４３−３４５参照）。Ｋ４４２５における罹患個体の配列分析では、これらの２遺伝子のいずれにおいても、そして、緊密に関連したＮａν１．３遺伝子においても如何なる疾患誘発変異体は生じなかった。ドメインＩとＩＩとの間のＮａν１．７の大型細胞内ループの配列分析によれば、２３６対照染色体には存在しなかったＫ４４２５の全罹患個体におけるミスセンス変化（Ｎ６４１Ｙ）が判明した（図２参照）。
【０１９９】
次に熱性疾患の状況において生じる発作を有する散発性および家族性の３２症例のパネルにおいてＮａν１．７を配列決定し、そして、１８０の民族的にマッチした対照染色体に存在しなかったＮａν１．７の５種の変異体が更に同定された（表２）。これらの変異体は、細胞内Ｎ末端（Ｉ６２Ｖ）、ＤＩ  Ｓ１−Ｓ２細胞外ループ（Ｐ１４９Ｑ）、ＤＩ−ＤＩＩ細胞内ループ（Ｋ６５５Ｒ）、ＤＩＩ  Ｓ１膜貫通ドメイン（Ｉ７３９Ｖ）およびＤＩＩ−ＤＩＩＩ細胞内ループ（Ｌ１１２３Ｆ）において同定されている（図３参照）。
（表２Ｎａν１．７変異に関連するアミノ酸の保存および臨床所見）
【０２００】
【表２】
2007518422.tif 000022
種：マウス、ラットおよびウサギのＮａν１．７の相当するアミノ酸；遺伝子ファミリー：Ｎａν１．１、Ｎａν１．２およびＮａν１．３の相当するアミノ酸；O、アミノ酸はヒトＮａν１．７と同一である。家族歴；−、陰性；＋、陽性。ＦＳ、熱性発作；ＧＴＣ、全身性緊張性間代性；ＰＣ、部分複合型；ＳＰ、単純部分的；ＧＴ、全身性緊張性；ＧＡ、全身性非緊張性；ＩＧＥ、特発性全身性癲癇；＊図２に記載されているファミリー。
【０２０１】
全ての変異体は、プロリン１４９を除き、マウス、ラットおよびウサギのＮａν１．７遺伝子において保存されている。プロリン１４９はマウスおよびラットにおいて保存されており、ウサギにおいてはアラニンで置換されている（表２）。変異体Ｎａν１．７残基のより低値の保存が、Ｎａν１．１、Ｎａν１．２およびＮａν１．３遺伝子で観察されている。
【０２０２】
広範な種類の神経学的顕在性がＮａν１．７における変異を有する患者で観察されており、広範な臨床的連続性を示唆している。軽度側の末端を説明するものは、６歳以前に頻繁ではない熱性発作を示すのみであった２つの発端者である（表２：Ｉ６２Ｖ、Ｐ１４９Ｑ）。別のこのような２患者は、後に稀な全身性発作性エピソード（ＥＥＧにおける全身性癲癇様放電を伴う）を発症しており、これは８歳までに緩解している（表２：Ｋ６５５Ｒ、Ｉ７３９Ｖ）。Ｋ４４２５の罹患個体２１例は全て、６歳までに熱性発作を経験している（表２：Ｎ６４１Ｙ）。これらの個体のうち８例は後に非熱性発作を有しており、これは６個体においては１６歳までに退行している（Ｐｅｉｆｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  ４６：６７１−６７８）。最終的に緩解した非熱性発作を有していたこれらの患者は中間的表現型を示唆している。最後に、本発明者らの研究の１発端者は、多発性の全身性間代性発作を経験しており、これは主に非熱性であり、５ヶ月に始まっている。発作の家族歴を有さないこの患者は、１６ヶ月時まで癲癇重積持続状態および長時間持続する複合的部分的発作の頻繁なエピソードを有するまで進行し、そして５歳の時点では、思い切った治療介入にも関わらず持続して混合型の発作（おそらくはミオクローヌス失立発作を含む）を有していた。この最後の症例は、臨床スペクトルの重度側の末端を示し、ＳＭＥＩと同様のものとして特徴付けられる（表２：Ｌ１１２３Ｆ）。現在では、Ｎａν１．１における変異を有する患者における癲癇の表現型の範囲の拡大を示す大量の証拠が存在する（Ｎａｂｂｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６０：１９６１−１９６７；Ｆｕｊｉｗａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｒａｉｎ  １２６：５３１−５４６参照）。これらの独特のＮａν１．７変異の電気生理学的特徴付けは、この患者グループにおいて観察される発作の顕在性の変動を解明する材料となり得る。
【０２０３】
今日まで、Ｎａν１．１およびＮａνβ１．１は熱性発作の表現型における最も一般的に変異した遺伝子である。しかしながら３６未関連ＧＥＦＳ＋試料のオーストラリアコホートにおいては、Ｎａν１．１およびＮａνβ１．１における変異は症例のわずか１７％に相当するのみである（Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６８：８５９−８６５参照）。３２症例の未関連熱性発作の本発明者らのパネルにおいては、わずか一例のＮａν１．１変異、Ｒ９４６Ｈが同定された。Ｎａν１．１はＳＭＥＩまたはＤｒａｖｅｔ症候群の主因と考えられている（Ｎａｂｂｏｕｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ６０：１９６１−１９６７；Ｆｕｊｉｗａｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｒａｉｎ  １２６：５３１−５４６；Ｃｌａｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２１：６１５−６２１参照）。ＧＥＦＳ＋およびおそらくはＳＭＥＩは、遺伝子的な不均質性を示すため、両方の障害のコホート内にはＮａν１．７変異が蔓延していると考えられる。
【０２０４】
実施例２
Ｌｏｓｓｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ２３（３６）：１１２８９−１１２９５に記載の通り実験を実施した。結果を図４に示す。完全長野生型ＳＣＮ９Ａおよび変異体ＳＣＮ９Ａ（Ｋ６５５ＲおよびＮ６４１Ｙ）構築物を、ｔｓＡ２０１細胞に一過性にトランスフェクトした。５ｍＶ漸増で、−６０ｍＶから＋４０ｍＶまで試験パルスにより電流を発生させた。負の電位においては、Ｋ６５５Ｒは野生型よりも高値の電流密度を示した。正の電位においては、Ｎ６４１Ｙは野生型と比較してｐ＜０．０５で低減した電流密度を示した。
【０２０５】
本出願を通じて、種々の刊行物を参照した。これらの刊行物の開示は、本発明が関連する技術の水準をより詳細に説明するために、参考として全体が本明細書に援用される。
【０２０６】
当業者の知る通り、本発明の範囲および精神から外れることなく、本発明の種々の変形および変更が可能である。本発明の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書に記載した本発明の実施から、当業者には明らかになるものである。本明細書および実施例は例示に過ぎず、本発明の真の範囲および精神は後述する請求項に示されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０２０７】
添付する図面は本明細書に組み込まれ、その部分を構成するものであり、後述するいくつかの特徴を説明している。
【図１】図１はナトリウムチャンネルアルファサブユニットの二次構造のダイアグラムである。４ドメインの各々における孔部領域は図示されないが、膜貫通領域５と６の間の内向ループよりなる。
【図２】図２はＮ６４１Ｙ変異の隔離および同族４４２５の表現型所見を示すダイアグラムである。ダイアグラム中は以下の略記法が用いられる。即ち「ｆｓ」は発熱性の発作：「ａｆｓ」は非発熱性の発作；「＋」は野生型；そして「ｍ」は変異体を示す。
【図３】図３は種々の変異の位置が同定されるＮａν１．７ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの二次構造のダイアグラムである。
【図４】図４は全細胞電流の電流電圧関係を示すグラフである。完全長野生型ＳＣＮ９Ａおよび変異体ＳＣＮ９Ａ（Ｋ６５５ＲおよびＮ６４１Ｙ）構築物を、ｔｓＡ２０１細胞に一過性にトランスフェクトした。電流は５ｍＶ漸増の−６０ｍＶから＋４０ｍＶまでの試験パルスにより発生させた。負の電位において、Ｋ６５５Ｒは野生型より高値の電流密度を示した。正の電位において、Ｎ６４１Ｙは野生型と比較して低減された電流密度を示した。ｐ＜０．０５。
【図１】
2007518422.tif 000023
【図２】
2007518422.tif 000024
【図３】
2007518422.tif 000025
【図４】
2007518422.tif 000026
【配列表】
2007518422000001.app
【国際調査報告】
2007518422.tif 000027
2007518422.tif 000028
2007518422.tif 000029