(57)【要約】  本発明は、レナラーゼとしても知られる哺乳類モノアミンオキシダーゼＣ（ＭＡＯ−Ｃ）の同定、単離及び使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも約１５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号：２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸残基１７〜３４２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがＮ末端にシグナルペプチドを含まない、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＦＡＤ結合部位を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが活性レナラーゼタンパク質である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが哺乳類レナラーゼタンパク質である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドがヒトレナラーゼタンパク質である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドがさらに補因子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記補因子がフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）又はその類似体である、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記補因子がフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である、請求項９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤若しくはビヒクルを含む、又は基本的にそれらから構成されている組成物。
【請求項１３】
経口又は注射投与向けに処方されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が即放性又は徐放性剤形である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが微晶質形態である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリペプチドがナノ粒子中に封入されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
ポリペプチド及び薬学的に許容可能な担体、希釈剤若しくはビヒクルを含む、又は基本的にそれらで構成されている組成物であって、ポリペプチドが配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：２の残基１７〜３４２のアミノ酸配列を有する組成物。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドとフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を結合させる工程を含む、活性レナラーゼポリペプチドの生産方法。
【請求項１９】
前記補因子がフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）又はその類似体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵素補因子がフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの体液からタンパク質を単離することにより、レナラーゼタンパク質を得る工程を含むレナラーゼタンパク質の獲得方法。
【請求項２２】
前記体液が血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、全血、髄液組織培地及び細胞抽出物からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
イオン交換クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、リガンド結合アフィニティクロマトグラフィ、ゲル透過クロマトグラフィ又はそれらの任意の組合せを使用することにより、得られた前記レナラーゼタンパク質をさらに精製する工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
レナラーゼタンパク質を産生する細胞、細胞培養、組織、組織培養、器官又は器官培養から該タンパク質を単離することにより、前記レナラーゼタンパク質を得る工程を含むレナラーゼタンパク質の獲得方法。
【請求項２５】
レナラーゼタンパク質を産生するように培地中で細胞を培養し、前記細胞及び／又は培地からタンパク質を単離することによってレナラーゼタンパク質を得る工程を含む、レナラーゼタンパク質の獲得方法。
【請求項２６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項２７】
哺乳類のレナラーゼタンパク質又はそのフラグメントと特異的に結合する抗体。
【請求項２８】
前記抗体がポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び合成抗体からなる群から選択される、請求項２６又は２７に記載の抗体。
【請求項２９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドの治療上有効な量を哺乳類に投与する工程を含む、哺乳類におけるレナラーゼ媒介型身体状態、障害又は疾病を予防、治療又は改善する方法。
【請求項３０】
前記身体状態、障害又は疾病が、腎臓の状態、障害又は疾病；心臓血管の状態、障害又は疾病；心臓の状態、障害又は疾病；中枢神経系（ＣＮＳ）の状態、障害又は疾病；及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記心臓血管の身体状態、障害又は疾病が、高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、心調律障害、卒中、アテローム性動脈硬化及びこれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記高血圧が、慢性高血圧、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、肺高血圧、急性重症高血圧及びそれらのあらゆる組合せからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記腎臓の状態、障害又は疾病が、末期腎不全（ＥＳＲＤ）、慢性腎不全及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
レナラーゼ療法を必要とする哺乳類に対しレナラーゼ療法を提供するための方法であって、前記哺乳類に対し請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドの治療上有効な量を投与する工程を含む方法。
【請求項３５】
ＥＳＲＤを予防、治療又は改善する方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドの治療上有効な量を、ＥＳＲＤの予防、治療又は改善を必要とする哺乳類に対し投与する工程を含む方法。
【請求項３６】
ＣＮＳの状態、障害又は疾病を予防、治療又は改善する方法であって、治療上有効な量のレナラーゼ阻害物質を、ＣＮＳの状態、障害又は疾病の予防、治療又は改善を必要とする哺乳類に対し投与する工程を含む方法。
【請求項３７】
ＣＮＳの状態、障害又は疾病が、うつ病、不安症、躁病、統合失調症及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記レナラーゼ阻害物質が、低分子阻害物質、抗体、リボザイム、干渉ＲＮＡ及びアンチセンス核酸分子及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類がヒトである、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
レナラーゼ媒介型の身体状態、障害又は疾病の予防、治療又は改善を必要としている哺乳類において、レナラーゼ媒介型の身体状態、障害又は疾病を予防、治療又は改善するための遺伝子治療の方法であって、前記哺乳類に対し配列番号：１の核酸配列を含む又は配列番号：１の残基２４〜１０４９の核酸配列を含む単離された核酸分子を投与する工程を含む方法。
【請求項４１】
単離された核酸が、さらに、配列番号：１の核酸配列又は配列番号：１の残基２４〜１０４９の核酸配列に対し操作可能に連結されたプロモータを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
単離された核酸がウイルスベクターを用いて投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
レナラーゼ媒介型の身体状態、障害又は疾病の予防、治療又は改善を必要とする哺乳類において、レナラーゼ媒介型の身体状態、障害又は疾病を予防、治療又は改善するための遺伝子治療の方法であって、（ａ）前記哺乳類由来の細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで配列番号：１の核酸配列で又は配列番号：１の残基２４〜１０４９の核酸配列で工学的に処理する工程；及び（ｂ）前記工学的に処理した細胞を前記哺乳類に戻す工程を含む方法。
【請求項４４】
高血圧の予防、治療又は改善を必要とする哺乳類において高血圧を予防、治療又は改善するための方法であって、前記哺乳類に対し治療上有効な量のレナラーゼアゴニストを投与し、それによりレナラーゼの発現を増大させ、哺乳類における高血圧を予防、治療又は改善する工程を含む方法。
【請求項４５】
ＥＳＲＤの予防、治療又は改善を必要とする哺乳類においてＥＳＲＤを予防、治療又は改善するための方法であって、前記哺乳類に対し治療上有効な量のレナラーゼアゴニストを投与し、それによりレナラーゼの発現を増大させ哺乳類におけるＥＳＲＤを予防、治療又は改善する工程を含む方法。
【請求項４６】
哺乳類の身体状態、障害又は疾病の診断若しくは診断の補助をする方法、又は哺乳類の身体状態、障害又は疾病に対する感受性の診断若しくは診断の補助をする方法であって、前記身体状態、障害又は疾病が前記哺乳類において改変されたレナラーゼの発現に関連するものであり、前記方法が、前記哺乳類のレナラーゼ発現レベルを検出する工程と、前記哺乳類の前記レナラーゼ発現レベルを、前記身体状態、障害又は疾病を罹患していない哺乳類の前記レナラーゼ発現レベルと比較し、それにより、前記身体状態、障害又は疾病を罹患している、又は前記身体状態、障害若しくは疾病に対する感受性をもつ哺乳類の診断又は診断の補助をする工程と、を含む方法。
【請求項４７】
前記身体状態、障害又は疾病がＥＳＲＤ、高血圧、ＡＮＴ、心臓血管疾患及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記身体状態、障害又は疾病がＣＮＳの身体状態、障害又は疾病である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
細胞内のレナラーゼの発現を増大させる化合物を同定する方法であって、
内部でレナラーゼが発現している細胞と１つの化合物を接触させ、該化合物と接触させられた前記細胞内のレナラーゼの発現レベルを、前記化合物と接触させられていない点を除いて同一である細胞内のレナラーゼの発現レベルと比較する工程を含み、
前記化合物と接触させられていない点を除いて同一である細胞内のレナラーゼ発現レベルと比較して、前記化合物と接触させられた前記細胞のレナラーゼ発現レベルがより高いものであることを、前記化合物が前記細胞内でのレナラーゼの発現を増大させたことの指標とする方法。
【請求項５０】
細胞内のレナラーゼの発現を減少させる化合物を同定する方法であって、
内部でレナラーゼが発現している細胞を化合物と接触させ、該化合物と接触させられた前記細胞内のレナラーゼの発現レベルを、前記化合物と接触させられていない点を除いて同一である細胞内のレナラーゼの発現レベルと比較する工程を含み、
前記化合物と接触させられていない点を除いて同一である細胞内のレナラーゼ発現レベルと比較して、前記化合物と接触させられた前記細胞のレナラーゼ発現レベルがより低いものであることを、前記化合物が前記細胞内でのレナラーゼの発現を減少させたことの指標とする方法。
【請求項５１】
請求項４９又は５０に記載の方法により同定された化合物。
【請求項５２】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチドに対する結合パートナーを同定するための方法であって、（ａ）潜在的結合パートナーと前記単離されたポリペプチドを接触させる工程及び（ｂ）前記結合パートナーが前記ポリペプチドの活性に影響を及ぼすか否かを判定し、それにより結合パートナーを同定する工程を含む方法。
【請求項５３】
プロモータ／調節配列を含む核酸に対し操作可能に連結された配列番号：１の核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項５４】
プロモータ／調節配列を含む核酸に対し操作可能に連結された配列番号：１の核酸配列の残基２４〜１０４９を含む単離された核酸分子。
【請求項５５】
プロモータ／調節配列をコードする核酸配列に対し操作可能に連結された配列番号：１の核酸配列と少なくとも約４０％の同一性を有する核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項５６】
共有結合で連結されたタグポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項５５に記載の単離された核酸分子。
【請求項５７】
請求項５５又は５６に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５８】
請求項５５に記載の核酸分子、請求項５６に記載の核酸分子又は請求項５７に記載のベクターを含む組換え細胞。
【請求項５９】
レナラーゼポリペプチドの生産方法であって、前記レナラーゼポリペプチドを発現する能力をもつ組換え細胞を培養する工程を含み、前記レナラーゼポリペプチドは、配列番号：１の核酸配列と少なくとも約４０％の同一性を有する核酸配列を有する核酸分子によってコードされている、方法。
【請求項６０】
請求項５９に記載の方法によって生産される単離されたレナラーゼポリペプチド。
【請求項６１】
前記核酸分子が、アミノ酸配列が配列番号：２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるレナラーゼタンパク質をコードする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法により生産される単離されたレナラーゼタンパク質。
【請求項６３】
レナラーゼポリペプチドを生産する方法であって、（ａ）請求項５３に記載の単離された核酸分子を含む組換え細胞を、該核酸分子の発現を可能にする条件下で培養する工程、及び（ｂ）前記細胞により産生された前記レナラーゼタンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載の方法によって生産される単離されたレナラーゼポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号：１の核酸配列と少なくとも約４０％の同一性を有する核酸配列に相補的である単離された核酸分子であって、該相補的核酸分子がアンチセンス配向にある、核酸分子。
【請求項６６】
操作可能に連結されたプロモータ／調節領域をさらに含む、請求項６５に記載の単離された核酸分子。
【請求項６７】
レナラーゼポリペプチドの生産方法であって、前記レナラーゼポリペプチドをコードする核酸を発現する能力をもつ組換え細胞を培養する工程を含み、前記レナラーゼポリペプチドが、配列番号：１の核酸配列と少なくとも約４０％の同一性を有する核酸配列を有する核酸分子によってコードされ、前記相補的核酸がアンチセンス配向にある方法。
【請求項６８】
前記核酸配列がさらに、操作可能に連結されたプロモータ／調節領域をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項６７又は６８に記載の方法によって生産された単離されたレナラーゼポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、共にその全体が本明細書に参照により援用されている２００４年３月１９日付けで提出された米国仮特許出願第６０／５５４，５５２号及び２００４年１０月１日付けで提出された米国仮特許出願第６０／６１５，４５２号に基づき、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）に従う優先権資格を有するものである。
【０００２】
連邦が後援する研究又は開発に関する記述
本発明は、米国政府から得た資金により一部支援され（国立衛生研究所認可番号Ｋ０８ＤＫ０２９１７０２号）、従って米国政府は本発明について一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
体液及び電解質代謝の調節は、腎臓の主要な機能である。血液は糸球体を通って腎臓の中に入り、これが細胞及びタンパク質をろ過し、糸球体ろ過と呼ばれるプロセスを通して血漿と同一のイオン組成をもつ流体を生成する。糸球体ろ過液はこのとき、その体積及びイオン組成を漸進的に修正する全く異なる一連の管状セグメントを通って走行する。物理的な力、局所的なあるいは循環するホルモンを含めた数多くの因子が糸球体ろ過を調節するものとして知られている（ブレナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら、１９７６年）。同様にして、腎尿細管再吸収及び分泌はかなり複雑な調節プロセスによって修正される。
【０００４】
腎臓は、赤血球始原細胞及び前駆細胞の増幅及び終端分化に必要とされる赤血球質量の主要な決定因子であるエリスロポエチンの主たる供給源であることから、内分泌器官としても役立つ（ライン（Ｌｉｎｅ）ら、１９８５年；ジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）ら、１９８５年）。さらに、腎臓はレニン放出にとって最も重要な部位であると思われる。血流量の低下、交感神経刺激の増大又は遠位細管へのナトリウム送達の減少が、アンギオテンシノゲンをアンギオテンシンＩへと分割する酵素であるレニンの放出を刺激することができる。レニン−アンギオテンシン系は、流体及び電解質代謝、血圧及び心臓機能の主要な調節因子である。
【０００５】
腎臓が果たすこれらの数多くの機能の中でも、腎臓内分泌機能を理解することの重要性は、エリスロポエチンの発見によって強調されている。腎臓がレニン及びエリスロポエチンの分泌を超えた複雑な内分泌機能を有することを示唆する証拠が存在する。腎臓によって分泌されるこれまで知られていないタンパク質／ホルモンの同定は、腎臓生理学のより完全な理解を提供するだけでなく、末期腎不全（ＥＳＲＤ）を患う患者を治療する方法を著しく改善することもできる。
【０００６】
末期腎不全を発生させる患者は、腹膜又は血液透析などの腎代償療法で治療されるか又は腎移植を受けるかのいずれかである。末期腎不全患者のための血液透析などの現行の腎代償療法は、これまでのところ唯一の成功した長期のｅｘ  ｖｉｖｏ臓器代用療法であった。延命における透析の成功にも関わらず、望ましくないことにこの療法に付随する罹患率及び死亡率は高く、大部分の患者は低いクオリティ・オブ・ライフに悩んでいる（ヒュームズ（Ｈｕｍｅｓ）ら、１９９５年；ウォルフ（Ｗｏｌｆｅ）ら、１９９９年）。例えば、これらの患者は、彼らの間で最も一般的な死亡原因を提供する高血圧、心臓血管疾患例えば無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全及びアテローム性動脈硬化の有病率を増大させてきた。この理由は完全に明らかではないが、該処置では天然の臓器の重要な機能を再現できないためと一般に考えられている。該処置は、血液からの余剰の水分及び可溶性廃棄物を除去するのに体外「人工腎臓」を使用するが、天然の臓器の重要な吸収、代謝、内分泌及び免疫機能は再現しない。
【０００７】
ＥＳＲＤを患う患者は、酸化的ストレス（オバージュ（Ｏｂｅｒｇｅ）ら、２００４年）の増大及び交感神経緊張の高まり（クーマンス（Ｋｏｏｍａｎｓ）ら、２００４年；ジョレス（Ｊｏｌｅｓ）ら、２００４年）と相関関係をもつと思われるリスクである、心臓血管疾患を発生させる危険性が著しく高いということが充分に立証されている。ＥＳＲＤにはさまざまなタンパク質／ホルモンが関与しているという事実にも関わらず、ＥＳＲＤに関与する因子はきわめてわずかしか同定及び特徴づけされていない。それでも、かかる因子の同定は、腎臓により分泌されるタンパク質／ホルモン又は、関連する血管疾患とＥＳＲＤの治療のための診断学及び治療学の発展において極めて重要である。かくしてＥＳＲＤに関連する因子の同定及び特徴づけに対する切実なニーズが長い間存在している。
【０００８】
モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）は、生体アミンをその対応するアルデヒドに転換させるフラビン−アデノシン−ジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有酵素である。ＭＡＯは、別々の遺伝子産物である２つのアイソフォーム（ＭＡＯ−Ａ（配列番号：１１）及びＭＡＯ−Ｂ（配列番号：１３））として存在し、両者は７０％を超える配列同一性を示し、ドーパミン、セロトニン及びノルエピネフリンなどの神経伝達物質の異化作用においては、互いに異なるものの重複する基質特異性を示す（２、３）。ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂは両方共、多数の神経疾患に関与しパーキンソン疾患及びうつに対する薬物にとっての標的である（４）。哺乳類ＭＡＯは外部ミトコンドリア膜に結合し、システイン残基への８α−チオエーテル連結を介してタンパク質に共有結合したＦＡＤ分子を有する（５）。これらは、組織依存的及び年令依存的の両方の形で発現され、広範な臨床及び薬学研究の主題となってきた。
【０００９】
ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂは、カルボキシ末端を介して外部ミトコンドリア膜に定着している（ビンダ（Ｂｉｎｄａ）ら、２００２年）。これらは、重複する基質特異性を有し、エピネフリン、ノルエピネフリン、セロトニン及びドーパミンなどの神経伝達物質を異化し、パルギリン及びクロルギリンによって特異的に阻害される。もう１つの既知のＦＡＤ含有オキシダーゼであるポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯ）は、スペルミン及びスペルミジンを代謝し細胞成長を調節する細胞内オキシダーゼである（ジャルカネン（Ｊａｌｋａｎｅｎ）ら、２００１年）。ヒトＭＡＯ−Ｂの結晶構造は、３．０Ａの解像度で解き明かされており、システイン側鎖（Ｃｙｓ−３９２）に共有結合したＦＡＤ補因子を伴う２量体であることが明らかにされている（ビンダら、２００２年）。ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂは、７０％超の配列同一性、及び神経伝達物質の異化において、異なるものの重複する基質特異性を示し、Ｘ染色体上で隣接するものの分離している遺伝子によってコードされる。
【００１０】
ＭＡＯ−ＡとＭＡＯ−Ｂは、組織分布、構造及び基質特異性が異なる。ＭＡＯ−Ａは、セロトニン、オクトパミン、アドレナリン及びノルアドレナリンに対するより高い親和性を有し、一方ＭＡＯ−Ｂについての天然の基質は、フェニルエチルアミン及びチラミンである。ドーパミンは、両方のアイソフォームによって酸化されるものと考えられている。ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂは、脳を含む複数の臓器内で広く分布している（Ａ．Ｍ．セスラ（Ｃｅｓｕｒａ）及びＡ．プレッチャー（Ｐｌｅｔｓｃｈｅｒ）、Ｐｒｏｇ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２年、第３８号、１７１〜２９７頁）。脳ＭＡＯ−Ｂ活性は、年令と共に増大するように考えられる。この増大は、加齢に付随するグリオーシスのせいであるとされてきた（Ｃ．Ｊ．ファウラ（Ｆｏｗｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｔｒａｎｓｍ、１９８０年、第４９号、１〜２０頁）。さらに、ＭＡＯ−Ｂ活性は、アルツハイマー病患者の脳内で著しく高くなり（Ｐ．ドスタート（Ｄｏｓｔｅｒｔ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、１９８９年、第３８号、５５５〜５６１頁）、老人斑のまわりの星状細胞の中で発現が高いことが発見されてきた（サウラ（Ｓａｕｒａ）ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４年、第７０号、７５５〜７７４頁）。これに関連して、ＭＡＯによる第１級モノアミンの酸化的脱アミノ反応は、立証済みの又は潜在的な毒性をもつ作用物質であるＮＨ３、アルデヒド及びＨ２Ｏ２を産生することから、痴呆及びパーキンソン病の治療のための選択的ＭＡＯ−Ｂ阻害物質の使用に対する理論的根拠が存在することが示唆されている。ＭＡＯ−Ｂの阻害は、ドーパミンの酵素不活性化の低減ひいてはドーパミン作動性ニューロン内の神経伝達物質の利用可能性の延長をひき起こす。年令及びアルツハイマー病及びパーキンソン病に関連する変性プロセスも同様に、ＭＡＯ活性の増大及びその結果としてのＭＡＯ−ＢによるＨ２Ｏ２形成の増加に起因する酸化的ストレスのせいであり得る。従って、ＭＡＯ−Ｂ阻害物質は、酸素ラジカルの形成の低減及び脳内モノアミンレベルの上昇の両方によって作用し得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の神経疾患にはＭＡＯ−Ｂが関与していると考えると、この酵素活性全体を制御できるようにすると思われる強力でかつ選択的な阻害物質を得ることがきわめて有利である。一部の既知のＭＡＯ−Ｂ阻害物質の薬理学は、例えばＣＮＳ  Ｄｒｕｇｓ、１９９６年、６、２１７〜２３６頁でＤ．ベンチュ・フェラー（Ｂｅｎｔｕｅ−Ｆｅｒｒｅｒ）ら、により論述されている。不可逆的で非選択的なＭＡＯ阻害物質活性の主要な制限として、食事性チラミンを摂取した時点で高血圧クリーゼが誘発される危険性ならびにその他の薬物治療との相互作用の潜在的可能性に起因する食事上の予防措置を遵守する必要性があるものの（Ｄ．Ｍ．ガードナー（Ｇａｒｄｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９６年、第５７号、９９〜１０４頁）、これらの不利な事象は、可逆的及び選択的ＭＡＯ阻害物質特にＭＡＯ−Ｂの場合さほど心配ではない。
【００１２】
ＭＡＯ活性を阻害することによりＭＡＯ阻害物質は、異なる脳領域内及び体内のモノアミン及びその神経伝達物質放出レベル（ドーパミン、ノルエピネフリン及びセロトニン）を調節することができる。かくして、ＭＡＯ阻害物質は、神経内分泌機能、呼吸、気嫌、運動制御及び機能、集中及び注意、集中力、記憶及び認識力及び物質乱用の機序の変調に影響を及ぼすことができる。ＭＡＯの阻害物質は、注意、認識力、食欲、物質乱用、記憶、心臓血管機能、錐体外路系機能、疼痛及び胃腸の運動性及び機能に対し効果を及ぼすことが実証されてきた。ＭＡＯは脳内で広く分布しており、基底核、大脳皮質、辺縁系及び中脳及び後脳核を含む。末梢組織内では、該分布は筋肉、胃腸管、心臓血管系、自律神経節、肝臓、及び内分泌系を含む。
【００１３】
その他の阻害物質によるＭＡＯ阻害は、脳及び体内のモノアミン含有量を増大させることが示されてきた。体内のモノアミンレベルの調節は、うつ、不安症、ストレス障害、記憶機能に付随する疾病、神経内分泌の疾患、心臓機能不全、胃腸障害、食餌障害、高血圧、パーキンソン病、記憶障害及び禁断症状を含めた数多くの疾病状態において有効であることが示されてきた。
【００１４】
タバコの煙はモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）に対して不可逆的な阻害効果を有し得ることが示唆されてきた。ボールトン（Ｂｏｕｌｔｏｎ）ら、「Ｂｉｏｇｅｎｉｃ  Ａｍｉｎｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ、Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｏｋｉｎｇ」、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、第１（８５７７）号、１１４〜１５５頁（１９８８年１月１６日）は、タバコの煙のＭＡＯ阻害特性が喫煙によるパーキンソン病への防御作用を説明する一助となり得ることを報告し、又精神障害をもつヘビースモーカの患者は、喫煙に誘発される障害に異常な頻度で悩まされることはないという所見を示した。ＭＡＯ阻害因子としての喫煙はパーキンソン病を導くドーパミン作動性神経毒性に対する防御を行なう可能性があること、そして、喫煙のＭＡＯ阻害特性が精神疾患患者における抗うつ効果を結果としてもたらしうることが示唆された。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
本発明以前は、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂのみが、ヒトの体内で同定された２つのモノアミンオキシダーゼである。ヒトゲノミクスデータベースを用いてヒトにおける新規の分泌タンパク質を同定し特徴づすることを試みる間に、本発明者らは、新しいモノアミンオキシダーゼを同定した。本発明は、ノルエピネフリン、ドーパミン及びエピネフリンなどの生体アミンを代謝するモノアミンオキシダーゼの分泌形態の同定及び特徴づけについて開示している。新たに同定されたモノアミンオキシダーゼは、ヒトにおいてモノアミンを代謝する同定された第３の酵素であることから、本発明者らはそれを「ＭＡＯ−Ｃ」と名付けた。それは腎臓により分泌されたタンパク質であることから、代替的に「レナラーゼ」とも呼ばれる。ＭＡＯ−Ｃ即ちレナラーゼは、モノアミンオキシダーゼファミリーの新しい成員であることから、該酵素は同様に、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂと同様に脳内で重要な役割を果たすものと予想されている。
【００１６】
本発明は、カテコールアミンを調節するのに関与する新規のタンパク質である、レナラーゼと呼ばれる新規の哺乳類モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）をコードする核酸（配列番号：２）に関する。ヒトレナラーゼの核酸配列は、ヒトＭＡＯ−Ａのもの（配列番号：１０）と２７．７％の相同性を、又ＭＡＯ−Ｂのもの（配列番号：１２）と３８．２％の相同性を有する。レナラーゼは、それぞれＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂに対しアミノ酸レベルで１３％及び１２％の同一性を有する。それは同様に、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂと異なる基質特異性及び阻害物質プロファイルを有し、それがＦＡＤ含有モノアミンオキシダーゼのユニークでまったく新しいクラスを代表していることを示している。
【００１７】
ヒトレナラーゼ遺伝子は染色体１０の上にあり、９個のエクソンを含有し、約３００Ｋｂにわたる。ヒトレナラーゼ遺伝子は、アミノ末端シグナル配列とそれに続くフラビン−アデノシン−ジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有ドメインとアミノオキシダーゼドメインを含む３４２アミノ酸のタンパク質をコードする。組織ノーザンブロッティング研究によれば、腎臓でのレナラーゼの活発な発現と、分析されたその他全ての組織におけるはるかに低いレベルの発現が実証された。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによれば、近位及び遠位小管内でレナラーゼの高い発現レベルが実証された。
【００１８】
レナラーゼは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び翻訳実験において高い発現を示した。ヒトレナラーゼｃＤＮＡは、約３８−ｋＤａの分子質量をもつタンパク質を産生するように翻訳され、これは予測されているタンパク質サイズと一致している。トランスフェクションを受けたＨＥＫ２９３細胞の馴化培地を用いたウエスタンブロット研究は、レナラーゼが分泌されたタンパク質であることを示している。レナラーゼは、健康な個体の血漿中に５〜１０ｍｇ／ｌの濃度で存在する。
【００１９】
末期腎不全（ＥＳＲＤ）は、高いカテコールアミンレベルに結びつけられ、このレベルはそれ自体例えば無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全及びアテローム性動脈硬化を含めた無数の身体状態、疾病及び障害を導く。これらの身体状態、疾病及び障害は、ＥＳＲＤ患者の中の一般的な死因である。
【００２０】
レナラーゼは以下の順でカテコールアミンを代謝する：ドーパミン＞エピネフリン＞ノルエピネフリン。レナラーゼはＥＳＲＤ患者において事実上検出不能である。かくして、ＥＳＲＤ患者におけるレナラーゼの損失又はレベル低下は少なくとも部分的に、血漿カテコールアミンレベルの上昇の原因となり、これはＥＳＲＤ患者間で一般的な死因である。
【００２１】
さらに、レナラーゼレベルと腎機能の間の相関関係のため、レナラーゼは、腎臓疾患、特に、集中治療室の環境内で一般に発生する急性腎細管壊死のための診断マーカーの理想的候補となっている。レナラーゼの生物学的な意味及びその潜在的な臨床適切度については本明細書でさらに論述される。
【００２２】
本発明は、腎臓により血液中に分泌される新規のＦＡＤ依存性アミンオキシダーゼを提供する。それは循環カテコールアミンを代謝し、とりわけ血圧及び心拍数の強力な調節因子である。さらに、ＥＳＲＤ患者の血漿中ではその存在が低くなっていることから、交感神経の高い緊張及びこの患者集団内で充分に実証されている心臓血管リスクの増大に対する因果関係が示唆される。レナラーゼの同定は、心臓血管生理学のより詳しい理解を発展させる上で重要なステップであるばかりでなく、腎臓疾患及び／又は心臓疾患及びそれに関連する合併症をもつ患者のための最適な治療を提供するための探求における重要なステップでもある。
【００２３】
本発明は、配列番号：１の核酸配列と約４０％以上の配列同一性を共有する、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。
【００２４】
本発明は、配列番号：１の核酸残基２４〜１０４９の核酸配列と約４０％以上の配列同一性を有する、ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含んでいる。
【００２５】
１つの態様においては、該核酸はさらに、それに共有結合で連結されたタグポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００２６】
もう１つの態様では、該核酸はさらに、それに操作可能に連結されているプロモータ／調節配列を特定する核酸を含む。
【００２７】
さらにもう１つの態様では、本発明は、ポリペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターにおいて、核酸が配列番号：１と約４０％以上の同一性を有するベクターを含む。
【００２８】
さらなる態様では、本発明はポリペプチドをコードする単離された核酸を含む組換え細胞において、該核酸が配列番号：１と約４０％以上の同一性を有する組換え細胞を含む。
【００２９】
本発明は、１つのポリペプチドをコードする単離された核酸に相補的な単離された核酸又はそのフラグメントを含み、該相補的な核酸はアンチセンス配向にある。
【００３０】
１態様においては、本発明の核酸は、ヒトレナラーゼの配列をもつ（配列番号：１）核酸と相補的な核酸と約４０％以上の同一性を有する。
【００３１】
本発明は、単離された哺乳類のレナラーゼペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を含む。
【００３２】
本発明は、単離された哺乳類のポリペプチドにおいて、配列番号：２のアミノ酸配列をもつポリペプチドと約１５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００３３】
本発明は、配列番号：２のアミノ酸残基２４〜３４２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと約１５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。
【００３４】
本発明は、哺乳類のレナラーゼと特異的に結合する抗体又はそのフラグメントを含む。該抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は合成抗体であり得る。
【００３５】
本発明は、配列番号：１と約４０％以上の同一性を共有し、ポリペプチドをコードする単離された核酸、及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を含む。
【００３６】
本発明は、単離された哺乳類レナラーゼポリペプチド及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を含む。
【００３７】
本発明は、細胞内のヒトレナラーゼの発現を減少させるか又は阻害する化合物を同定する方法を含む。該方法は、内部でレナラーゼが発現している細胞を化合物と接触させる工程及びその他の点では同一の細胞内のヒトＲＮＧの発現レベルと該化合物と接触させられた細胞内のヒトＲＮＧの発現レベルを比較する工程を含み、ここで該化合物と接触させられていない点を除いて同一である細胞内のヒトレナラーゼ発現レベルと比較して、該化合物と接触させられた該細胞内のヒトレナラーゼ発現レベルがより低いものであることは、該化合物が該細胞内でのヒトレナラーゼの発現を阻害したことの標示である。１つの態様では、本発明はこの方法によって同定され、ヒトレナラーゼのアンタゴニストである化合物を含んでいる。
【００３８】
本発明は、細胞内のヒトレナラーゼの発現を増強させるか又は増大させる化合物を同定する方法を含む。該方法は、内部でレナラーゼが発現される細胞を化合物と接触させる工程及びその他の点では同一の細胞内のヒトＲＮＧの発現レベルと該化合物と接触させられた細胞内のヒトＲＮＧの発現レベルを比較する工程を含み、ここで該化合物と接触させられていない点を除いて同一である細胞内のヒトレナラーゼ発現レベルと比較して該化合物と接触させられた該細胞内のヒトレナラーゼ発現レベルがより高いものであることは、該化合物が該細胞内でのヒトレナラーゼの発現を増強又は増大させたことの標示である。１つの態様では、本発明はこの方法によって同定され、ヒトレナラーゼのアゴニストである化合物を含んでいる。
【００３９】
本発明は、ヒトレナラーゼの発現により媒介される身体状態、障害又は疾病の治療方法を含む。該方法は、ヒトレナラーゼの発現により媒介される身体状態、障害又は疾病に悩まされているヒトの患者に対して、ヒトレナラーゼの発現を阻害する量又はヒトレナラーゼの発現を減少させる量のレナラーゼ阻害物質を投与し、かくしてヒトレナラーゼの発現により媒介される身体状態、障害又は疾病を治療する工程を含む。
【００４０】
本発明の組成物及び方法は、ヒトを含む生体の血管、心臓、腎臓、神経及び／又は内分泌系に結びつけられるあらゆる身体状態、障害又は疾病を治療するために使用可能である。一態様においては、該身体状態、障害又は疾病は、ＥＳＲＤ、慢性腎疾患、高血圧、心臓血管疾患例えば無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心調律障害及びアテローム性動脈硬化からなる群から選択される。
【００４１】
さらにもう１つの態様においては、レナラーゼ阻害物質には、ヒトレナラーゼをコードする単離された核酸に対し相補的である単離された核酸が含まれ、該相補的核酸はアンチセンス配向にある。
【００４２】
該発明は、レナラーゼを投与しかくして哺乳類における高血圧を治療する工程を含む、哺乳類における高血圧の治療方法を含む。
【００４３】
同じく考慮されているのは、制限的な意味なく痴呆、アルツハイマー病、統合失調症、精神疾患、うつ病、頭痛、片頭痛又は緊張性頭痛及びてんかんを含む中枢神経系（ＣＮＳ）の身体状態、障害又は疾病の治療、及び精神疾患の特徴、緊張病性の特徴、うつ病の特徴、非定型特徴又は産後発症を伴う又は伴わない、双極性うつ病、単極性うつ病、単発又は再発性大うつ病発作を含めた大うつ病性障害といったＣＮＳ障害の治療及び／又は予防、不安症の治療及びパニック障害の治療方法である。大うつ病性障害という用語の中に包含されるその他の気分障害としては、非定型特徴を伴う又は伴なわない又は早期又は晩期発症の気分変調性障害、神経症性うつ病、外傷後ストレス障害及び対人恐怖；早期又は晩期発症のアルツハイマー型の痴呆、アルコール、アンフェタミン、コカイン、幻覚剤、吸入抗原、オピオイド、フェンシクリジン、鎮静剤、睡眠薬、抗不安薬及びその他の物質によって誘発される障害が含まれる。
【００４４】
本発明はさらに、レナラーゼの発現の改変に結びつけられた疾病、障害又は身体状態に悩まされているヒトの患者を識別する方法をも含んでいる。該方法はヒトの体内でのレナラーゼ発現レベルを検出する工程及び、該ヒトの体内のレナラーゼの発現レベルをレナラーゼの発現改変に付随する疾病、障害又は身体状態を罹患していない正常なヒトにおけるレナラーゼの発現レベルと比較し、かくしてレナラーゼの発現改変に付随する疾病、障害又は身体状態に悩まされているヒトの患者を検出する工程を含む。
【００４５】
前述の要約ならびに以下の発明の詳細な説明は添付図面と併せて読まれた時点でさらに良く理解されることであろう。本発明を例示する目的で、図面には、現在好まれている実施形態が示されている。ただし、本発明は、図示されている通りの配置及び手段に制限されるわけではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
発明の詳細な説明
本書中の全ての刊行物及び特許出願は、各々個々の刊行物又は特許出願が参照により特定的にかつ個別に参照により援用されるべく指示された場合と同じ程度で参照により援用される。
【００４７】
以下の記述には、本発明を理解する上で有用であり得る情報が含まれている。ただし、本書に提供されている情報のいずれかが先行技術であるか又は現在請求されている発明に関連していること又は特定的に又は暗示的に参照指示されているあらゆる刊行物が先行技術であることを是認するものではない。
【００４８】
別途定義する場合を除き、本書に使用されている全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者の一人により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本書に記述されているものと類似の又は同等のあらゆる方法及び材料が本発明の実践又は試験において使用可能であるが、好ましい方法及び材料が記述される。
【００４９】
本書で開示されているデータは受容体相互作用を除外せず、とりわけ、腎臓、心臓及び血管の機能のための重要な媒介物質であるノルエピネフリン、ドーパミン及びエピネフリンなどの循環カテコールアミンを分解する上でレナラーゼが重要な役割を果たすことを実証している。従って、本書の他の場所でさらに完全に記述する通り、レナラーゼは、その他の組織及び／又は器官の機能を調節するという点でホルモンとしての役割も果たす。これには同様に、その機能が一部分カテコールアミンによっても媒介されていることから、神経系も含まれ得る。こうしてレナラーゼは、例えば充分な量のレナラーゼを産生しない患者に対して提供され得る。レナラーゼの同定は、なかでも、高血圧、心臓血管疾患例えば無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全及びアテローム性動脈硬化を治療／防止する目的で末期腎不全（ＥＳＲＤ）についての治療学及び診断学の発達において重要な関わりを有している。
【００５０】
貧血症患者を治療するために広く用いられる組換え型タンパク質であるエリスロポエチン（ＥＰＯ）と同様に、レナラーゼは分泌されたタンパク質であり、腎臓内で発現される。レナラーゼのもう１つの顕著な特長は、ＥＰＯと同様、それがＥＳＲＤ患者において事実上検出不可能である一方で、健康な個体の血液中では約５〜１０ｍｇ／Ｌの濃度で発現されるという点にある。
【００５１】
本書で開示されているデータは、カテコールアミンを代謝する新規の酵素の存在を実証している。ＭＡＯのパラダイムを拡張することに加えて、この新しい発見事実は、例えばＥＳＲＤ患者にとって多大な臨床的意味合いをもつ。レナラーゼ基質（すなわちカテコールアミン）の過剰なレベルに対抗するべくレナラーゼレベルを補充する戦略は、ＥＳＲＤで患者を治療するための論理的アプローチである。さらに、カテコールアミンの過剰なレベルによってひき起こされるその他のあらゆる疾病が、腎臓機能の状態の如何に関わらず、補足量又は補充量のいずれかのレナラーゼを添加することを通して治療可能であると思われる。
【００５２】
代替的には、交感神経の緊張が低下している患者において循環カテコールアミンレベルを上昇させることによって或る種の心臓血管合併症の結果を改善するための薬物標的として、レナラーゼを使用することが可能である。現行のＭＡＯ阻害物質も、認識されずにレナラーゼを標的にしている可能性があり、それによって好ましくない副作用を結果としてもたらし得ることから、レナラーゼはＭＡＯ−Ａ又はＭＡＯ−Ｂに特異的な医薬品の設計も同様に可能にすることができる。
【００５３】
レナラーゼの同定及び特徴づけは、慢性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、心調律障害などの心臓血管疾患が交感神経刺激を増大させる突然の情動ストレスによって促進され得るということを理由にして、レナラーゼ及びこれらの疾患の病態生理におけるその役割のさらなる研究のための枠組を提供する（ウィットスタイン（Ｗｉｔｔｓｔｅｉｎ）ら、（２００５年）、「Ｎｅｕｒｏｈｕｍｏｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｓｕｄｄｅｎ  ｅｍｏｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｅｓｓ」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３５２号、５３９−５４８頁）。恐らくより重要なことに、ＭＡＯ−Ａ及び−Ｂと同様、レナラーゼは、ヒトにおける交感神経活性を変調させるための潜在的に有用な標的を提供し得る。
【００５４】
その潜在的な治療上の役割に加えて、レナラーゼは、急性腎不全（すなわち腎尿細管壊死又はＡＴＮ、腎臓内の虚血性条件）の診断マーカーとしても使用可能である。上述のように、適正に機能する腎臓をもたない患者は、レナラーゼのレベルがより低い。
【００５５】
同様に本発明中に含まれるのは、レナラーゼの遺伝子発現及び酵素活性の測定に基づいて、心臓血管、心臓、腎臓及び精神関連の身体状態、障害又は疾病に対する感受性を診断する方法である。例えば、高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全、心筋梗塞、心調律障害及びアテローム性動脈硬化などの心臓血管の身体状態、障害又は疾病；うつ病及び不安症などの精神的な身体状態、障害又は疾病；及び肺高血圧症などの心臓の身体状態、障害又は疾病が全て、レナラーゼ遺伝子発現レベル、レナラーゼタンパク質レベル及び／又はレナラーゼ酵素活性を決定することにより診断、評価及び監視され得る。例えば、レナラーゼ遺伝子の発現の低下は、交感神経出力の増加に付随する障害の診断マーカーになると思われる。
【００５６】
本発明の組成物及び方法を、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病性高血圧を含めた高血圧を治療、防止、低減又は改善するために使用することができる。その上、より稀な高血圧障害、肺高血圧についても同じ利点が予測される。肺高血圧は、肺動脈（心臓から肺まで導く血管）中の圧力が正常なレベルよりも上昇し生命を脅すことになり得る肺の稀な血管障害である。糖尿病性高血圧及び孤立性収縮期高血圧における全身血圧の増加に伴う肺床内の高い血圧の発生の類似性は、類似の機序が関与していることを示唆している。
【００５７】
定義
本書で使用されているように、以下の用語の各々は、本節においてそれに結びつけた意味を有する。
【００５８】
「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は本書では、その冠詞の文法上の目的語のうちの１つ又は２つ以上のもの（すなわち少なくとも１つ）を意味する。一例を挙げると、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
【００５９】
本書で使用されるように、「隣接する」という用語は、介入するヌクレオチドを全くもたない互いに直接付着されたヌクレオチド配列を意味するために使用される。一例を挙げると、ペンタヌクレオチド：５’−ＡＡＡＡＡ−３’は、２つがつながって５’−ＡＡＡＡＡＴＴＴ−３’又は５’−ＴＴＴＡＡＡＡＡ−３’である場合トリヌクレオチド５’−ＴＴＴ−３’に隣接し、２つがつながって５’−ＡＡＡＡＡＣＴＴＴ−３’である場合は隣接していない。
【００６０】
本書で使用するアミノ酸は、下表に記されているように、そのフルネーム、それに対応する３つの文字コード又はそれに対応する１文字コードによって表わされる：
【００６１】
【表１】
2007531518.tif 000002
【００６２】
本書で用いられている疾病、障害又は身体状態を「緩和する」という用語は、該疾病、障害又は身体状態の１つ以上の症候の重症度を軽減することを意味する。これは、細胞又は組織（例えば平滑筋細胞、肺組織、動脈）内で発現されるレナラーゼのレベルを増大させること、治療方法に先立つ又は治療方法が無い場合の患者の体内のレナラーゼレベルと比べて患者の体内のレナラーゼレベルを減少又は増大させることが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００６３】
「アンチセンス」は特に、タンパク質をコードする２本鎖ＤＮＡ分子の非コーディングストランドの核酸配列、又は実質的に非コーディングストランドに対して相同なものである配列を意味する。本書で定義されるように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする２本鎖ＤＮＡ分子の配列に対し相補的である。アンチセンス配列が単にＤＮＡ分子のコーディングストランドのコーディング部分に対してのみ相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディングストランド上で特定され、コーディング配列の発現を制御する調節配列に対して相補的であり得る。
【００６４】
本書中で用いられている「アプリケータ」という用語は、皮下注射器、ピペット、気管支鏡、噴霧器などを含む（ただしこれに制限されるわけではない）、該発明のレナラーゼ、タンパク質及び／又は組成物を哺乳類に投与するためのあらゆる装置を意味する。
【００６５】
本書で使用されている「生物試料」という用語は、レナラーゼの発現レベル、存在するレナラーゼタンパク質のレベル又はその両方を評価するのに使用可能な動物から得た試料を意味する。かかる試料は、血管（例えば頚動脈、大動脈など）試料、肺組織試料、及びＳＭＣ試料を含むがこれに制限されるわけではない。
【００６６】
「レナラーゼをコードする核酸の一部又は全てと相補的な」という用語は、レナラーゼタンパク質をコードしない核酸の配列を意味する。むしろ、細胞内で発現されつつある配列はレナラーゼタンパク質をコードする核酸の非コーディングストランドと同一であり、かくしてレナラーゼタンパク質をコードしない。
【００６７】
本書で使用されている「相補的」及び「アンチセンス」という用語は、完全に同義語ではない。「アンチセンス」というのは、タンパク質をコードする２本鎖ＤＮＡ分子の非コーディングストランドの核酸配列、又は非コーディングストランドと実質的に相同である配列を意味する。
【００６８】
本書で使用されている「相補的」というのは、例えば２つのＤＮＡ分子といった２つの核酸の間のサブユニット配列相補的の広い概念を意味する。分子の両方におけるヌクレオチド位置が通常互いに塩基対合する能力をもつヌクレオチドにより占有されている場合には、該核酸はこの位置で互いに相補的であるものとみなされる。かくして、２つの核酸は、分子の各々の中の実質的数（少なくとも５０％）の対応する位置が通常互いに塩基対合するヌクレオチド（例えばＡ：Ｔ及びＧ：Ｃのヌクレオチド対）により占有されている場合に、互いに対して相補的である。本書で定義されているように、アンチセンス配列は、タンパク質をコードする２本鎖ＤＮＡ分子の配列と相補的である。アンチセンス配列が単にＤＮＡ分子のコーディングストランドのコーディング部分に対してのみ相補的である必要はない。アンチセンス配列は、タンパク質をコードするＤＮＡ分子のコーディングストランド上で特定され、コーディング配列の発現を制御する調節配列に対して相補的であり得る。
【００６９】
１つの遺伝子の「コーディング領域」は、それぞれに、該遺伝子の転写により産生されたｍＲＮＡ分子のコーディング領域と相同性をもつか又はそれに対して相補的である該遺伝子のコーディングストランドのヌクレオチド残基及び該遺伝子の非コーディングストランドのヌクレオチドからなる。
【００７０】
ｍＲＮＡ分子の「コーディング領域」は同様に、ｍＲＮＡ分子の翻訳中に転移ＲＮＡ分子のアンチコドン領域と整合された又は停止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。コーディング領域はかくして、ｍＲＮＡ分子によってコードされた成熟タンパク質の中に存在しないアミノ酸残基（例えばタンパク質移行シグナル配列内のアミノ酸残基）に対応するヌクレオチド残基を含み得る。
【００７１】
「コーディング（コードする）」というのは、定義されたヌクレオチド配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義されたアミノ酸配列のいずれかをもつ生物学的プロセスの中でその他の重合体及び巨大分子の合成のための鋳型として役立つための遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列の固有の特性、及びその結果としての生物学的特性を意味する。かくして、１つの遺伝子はそれに対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又はその他の生物系内で１つのタンパク質を産生する場合に、そのタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一でありかつ通常配列リスト内に提供されているコーディングストランド及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コーディングストランドの両方を、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又はその他の産物をコードするものとして言及することができる。
【００７２】
別途定義する場合を除き、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮退バージョンであり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。
【００７３】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列に対し操作可能に連結された発現制御配列を含む組換え型ポリヌクレオチドを含むベクターを意味する。発現ベクターは、発現のための充分なシス作用要素を含む。発現のためのその他の要素は、宿主細胞によってか、そうでなければｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系の中で供給され得る。発現ベクターには、組換え型ポリヌクレオチドを取込むコスミド、プラスミド（例えばリポソーム内に含まれているか又は裸の）及びウイルス（例えばレトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）などの当該技術分野において既知のもの全てが含まれる。
【００７４】
該発明のウイルス遺伝子治療ベクターとの関係において本書で使用されている「複製不良の」という用語は、そのウイルスベクターが独立してさらにそのゲノムを複製しパッケージングすることができないことを意味する。例えば、対象の細胞がｒＡＡＶビリオンの感染を受けた場合、それでも感染細胞にＡＡＶｒｅｐ及びキャップ遺伝子及び付属機能遺伝子が欠如しているという事実に起因して、ｒＡＡＶは複製できない。
【００７５】
本書で使用されているように、「レトロウイルス転移ベクター」というのは、トランス遺伝子をコードし、ベクターのパッケージングに必要なヌクレオチド配列をさらに含むヌクレオチド配列を含む発現ベクターを意味する。好ましくは、レトロウイルス転移ベクターは同様に、細胞内のトランス遺伝子を発現するために必要な配列をも含む。
【００７６】
本書で使用されている「パッケージング系」というのは、組換え型ウイルスをパッケージングすることに関与するウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む１組のウイルス構成体を意味する。標準的には、パッケージング系の構成体は究極的にパッケージング細胞内に取り込まれることになる。
【００７７】
本書で使用される通り、「第２世代」レンチウイルスベクター系というのは、付属遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆがそこから欠失されているか又は不活性化されているものなどの機能的付属遺伝子が欠如したレンチウイルスパッケージング系を意味する。例えば、ジュフェレ（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ）ら、１９９７年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第１５号、８７１〜８７５頁を参照のこと。
【００７８】
本書で使用されている「第３世代」レンチウイルスベクター系というのは、第２世代のベクター系の特徴をもち、さらにｔａｔ遺伝子がそこから欠失又は不活性化されたものなどの機能的ｔａｔ遺伝子が欠如しているレンチウイルスパッケージング系を意味する。標準的には、遺伝子コーディングｒｅｖは、別の発現構成体上に提供されている。例えばダル（Ｄｕｌｌ）ら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、第７２（１１）号、８４６３〜８４７１頁を参照のこと。
【００７９】
本書で使用されている「シュードタイプの」というのは、非相同の又は機能的に修飾された外皮タンパク質での未変性外被タンパク質の置換を意味している。
【００８０】
本書で使用されている「ｅｘ  ｖｉｖｏ投与」という用語は、一次細胞が対象から取出され、形質導入、感染又はトランスフェクションを受けた組換え細胞を産生するべく細胞に対してベクターが投与され、組換え細胞が同じ又は異なる対象に対し再度投与されるプロセスを意味する。
【００８１】
２つの領域が互いに隣接する場合又は２つの領域が約１０００個以下のヌクレオチド残基、好ましくは約１００個以下のヌクレオチド残基により分離されている場合に、オリゴヌクレオチドの第１の領域はオリゴヌクレオチドの第２の領域を「フランキングする」。
【００８２】
本書で使用されている核酸配列又は核酸分子に適用される「フラグメント」という用語は、基準の全長核酸配列又は分子のセグメント又は部分を意味し、ここで該フラグメントは基準核酸配列又は分子の全長より短かい。フラグメント核酸配列又は分子の一例としては、それぞれ全長レナラーゼｃＤＮＡ配列又は分子のセグメント又は一部分がある。フラグメント核酸配列又は分子のもう１つの例は、それぞれに全長ゲノミックレナラーゼＤＮＡ配列又は分子の１セグメント又は一部分である。フラグメントは、天然の又は未変性のｃＤＮＡ又は遺伝子の全長よりも短いあらゆる長さであってよい。フラグメントの例としては、長さが少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５０〜約１００ヌクレオチド、少なくとも約１００〜約２００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド〜約３００ヌクレオチド、少なくとも約３００〜約３５０ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、少なくとも約５００〜約６００、少なくとも約６００ヌクレオチド〜約６５０ヌクレオチド、少なくとも約６５０〜約８００ヌクレオチド又は少なくとも８００〜約１０００ヌクレオチドの長さの核酸が含まれる。
【００８３】
本書で使用されている、アミノ酸配列又はアミノ酸分子に適用される「フラグメント」という用語は、基準の全長アミノ酸配列又は分子のセグメント又は部分を意味し、ここで該フラグメントは基準アミノ酸配列又は分子の全長より短かい。フラグメントアミノ酸配列又は分子の一例としては、それぞれ全長レナラーゼｃＤＮＡ配列又は分子によりコードされたポリペプチドのセグメント又は一部分がある。フラグメントアミノ酸配列又は分子のもう１つの例は、それぞれに全長ゲノミックレナラーゼＤＮＡ配列又は分子によりコードされたポリペプチドの１セグメント又は一部分である。フラグメントは、天然の又は未変性のｃＤＮＡ又は遺伝子によりコードされた全長ポリペプチドよりも短いポリペプチドのあらゆる長さであってよい。フラグメントの例としては、長さが少なくとも約２０アミノ酸又は少なくとも約３０アミノ酸又は少なくとも約４０、又は少なくとも約５０アミノ酸、又は少なくとも約６０、又は少なくとも約７０、又は少なくとも約８０、又は少なくとも約９０、又は少なくとも約１００、又は少なくとも約１１０、又は少なくとも約１２０、又は少なくとも約１３０、又は少なくとも約１３０、又は少なくとも約１４０、又は少なくとも約１５０、又は少なくとも約１６０、又は少なくとも約１７０、又は少なくとも約１８０、又は少なくとも約１９０、又は少なくとも約２００、又は少なくとも約２１０、又は少なくとも約２２０、又は少なくとも約２３０、又は少なくとも約２４０、又は少なくとも約２５０、又は少なくとも約２６０、又は少なくとも約２７０、又は少なくとも約２８０、又は少なくとも約２９０、又は少なくとも約３００、又は少なくとも約３１０、又は少なくとも約３２０、又は少なくとも約３３０、又は少なくとも約３４０アミノ酸であるアミノ酸が含まれる。
【００８４】
「ゲノムＤＮＡ」というのは、１つの遺伝子と相同なヌクレオチド配列をもつＤＮＡストランドである。一例を挙げると、哺乳類のｍＲＮＡの逆転写により誘導されたＤＮＡ及び染色体のフラグメントは両方共ゲノムＤＮＡである。
【００８５】
本書で使用されている「相同性」という用語は、２つの重合体分子の間、例えば２つの核酸分子の間、例えば２つのＤＮＡ分子の間又は２つのＲＮＡ分子の間又は２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列類似性を意味する。２つの分子の両方におけるサブユニット位置が同じ単量体サブユニットにより占有されている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の中の位置がアデニンにより占有されている場合には、それらはその位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、整合位置又は相同位置の数と正比例する。例えば、２つの化合物配列内の位置の半分（例えば長さが重合体１０サブユニット内の５つの位置）が相同である場合には、その２つの配列は５０％相同であり、９０％の位置すなわち１０中９が整合しているか又は相同である場合には、２つの配列は９０％の相同性を共有する。一例を挙げると、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’及び３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
【００８６】
本書で使用されている「相同性」という用語は、「同一性」と同義で用いられている。さらに、「相同性」又は「同一性」という用語が本書で核酸及びタンパク質に言及するために使用される場合、それは核酸及びアミノ酸の両方の配列レベルでの相同性又は同一性に適用されるものとみなされるべきである。少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約６５％、さらに一層好ましくは少なくとも約７０％、さらに一層好ましくは少なくとも約８０％そして好ましくは少なくとも約９０％又はより好ましくは少なくとも約９５％相補的であるオリゴヌクレオチドのみを互いにアニールさせる条件下で２つのオリゴヌクレオチドがアニールする場合、第１のオリゴヌクレオチドは第２のオリゴヌクレオチドと「高いストリンジェンシー」で又は「高いストリンジェンシー条件下で」アニールする。２つのオリゴヌクレオチドをアニールさせるために使用される条件のストリンジェンシーは、その他の因子のうちでも、既知の場合には温度、アニーリング媒質のイオン強度、インキュベーション期間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含有量及び２つのオリゴヌクレオチドの間の予測非相同性度の関数である。アニーリング条件のストリンジェンシーを調整する方法は既知である（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、中を参照のこと）。
【００８７】
２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の同一性百分率の判定は、数学アルゴリズムを用いて達成可能である。例えば、２つの配列を比較するために有用な数学アルゴリズムは、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）及びアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０号、５８７３〜５８７７頁）中の通りに修正されたカーリン及びアルトシュル（１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８７号、２２６４〜２２６８頁）のアルゴリズムである。このアルゴリズムはアルトシュルら、（１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１５号、４０３〜４１０頁）のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム内に取込まれており例えばＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）にあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＮＬＭ）のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ワールドワイドウェブサイトのＢＬＡＳＴサイトでアクセス可能である。ＢＬＡＳＴヌクレオチド探索は、（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と呼称されている）ＮＢＬＡＳＴプログラムで次のパラメータを用いて実施できる：本書に記述されている核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることを目的としてギャップペナルティ＝５；ギャップ拡張ペナルティ＝２；ミスマッチペナルティ＝３；整合報酬＝１；期待値１０．０；及びワードサイズ＝１１。ＢＬＡＳＴタンパク質探索は、（ＮＣＢＩウェブサイトで「ｂｌａｓｔｎ」と呼称される）ＸＢＬＡＳＴプログラム又はＮＣＢＩ「ｂｌａｓｔｐ」プログラムで以下のパラメータを用いて実施可能である：本書に記述されたタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることを目的として、期待値１０．０、ＢＬＯＳＵＭ６２評定マトリクス。
【００８８】
比較することを目的としてギャップのあるアライメントを得るためには、アルトシュルら、（１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２５号、３３８９〜３４０２頁）の中で記述されているようなＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。代替的には、分子間の遠位関係（同文献）及び共通のパターンを共有する分子間の関係を検出する反復探索を実施するために、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ又はＰＨＩ−Ｂｌａｓｔを使用することができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔ及びＰＨＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈにあるＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイト上で利用可能であるようなそれぞれのプログラム（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【００８９】
２つの配列間の同一性百分率は、ギャップを許容して又は許容することなく、上述のものに類似した技術を用いて判定可能である。同一性百分率を計算するにあたっては、標準的に正確な整合が計算される。
【００９０】
本書で使用される「遺伝子」及び「組換え型遺伝子」という用語は、該発明のポリペプチドをコードする読取り枠を含む核酸分子を意味する。このような天然の対立遺伝子変動は標準的に、一定の与えられた遺伝子のヌクレオチド配列の１〜５％のばらつきを結果としてもたらし得る。一定数の異なる個体内で問題の遺伝子を配列決定することによって代替的な対立遺伝子を同定することができる。これは、さまざまな個体内の同じ遺伝子座を同定するためにハイブリダイゼーションプローブを使用することにより直ちに実施可能である。このようなヌクレオチド変形形態及び天然対立遺伝子変異の結果であり機能的活性を改変しない結果としてのアミノ酸多型性又は変異の全てが、該発明の範囲内に入るように意図されている。
【００９１】
その上、本書で記述されているマウスのタンパク質のものと異なるヌクレオチド配列を有するその他の種（相同体）からの該発明のタンパク質をコードする核酸分子が、該発明の範囲内に入る。該発明のｃＤＮＡの天然対立遺伝子変異体及び相同体に対応する核酸分子を、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で標準的なハイブリダイゼーション技術に従ってハイブリダイゼーションプローブとしてマウスｃＤＮＡ又はその一部分を用いてマウス核酸分子に対するその同一性に基づいて単離することができる。例えば、該発明のラットレナラーゼタンパク質をコードする核酸の相同体を、高ストリンジェンシー条件下でラット及び／又はヒトレナラーゼの全て又は一部分をコードする核酸分子とのそのハイブリダイゼーションに基づいて単離することが可能である。
【００９２】
「単離された核酸」というのは、天然に発生する状態でそれにフランキングする配列から分離された核酸セグメント又はフラグメント、例えば通常そのフラグメントに隣接する配列例えばその中でそれが天然に発生するゲノムの中でそのフラグメントに隣接する配列から除去されたＤＮＡフラグメント、を意味する。この用語は同様に、天然に核酸に随伴するその他の構成要素例えばＲＮＡ又はＤＮＡ又はタンパク質から実質的に精製された核酸にもあてはまる。従ってこの用語は、例えば、ベクター内、自律的に複製するプラスミド又はウイルス内又は原核動物又は真核動物のゲノムＤＮＡ内に取込まれる組換え型ＤＮＡ、又はその他の配列とは無関係に別の分子として（例えばＰＣＲ又は制限酵素消化によって産生されたｃＤＮＡ又はゲノミック又はｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換え型ＤＮＡを含む。この用語は又、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え型ＤＮＡをも含む。
【００９３】
本発明に関連して、一般に発生する核酸塩基についての以下の略号が使用される。すなわち、「Ａ」はアデノシン、「Ｃ」はシチジン、「Ｇ」はグアノシン、「Ｔ」はチミジンそして「Ｕ」はウリジンを意味する。
【００９４】
「操作可能に連結された」ものとして２つのポリヌクレオチドを記述することにより、１本鎖又は２本鎖核酸部分には、２つのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つがもう一方に比較してそれを特徴づける生理学的効果を及ぼすことができるような形で該核酸部分内に配置された２つのポリヌクレオチドが含まれていることが意味される。一例を挙げると、１つの遺伝子のコーディング領域に操作可能に連結されたプロモータは、該コーディング領域の転写を促進することができる。好ましくは、所望のタンパク質をコードする核酸がさらにプロモータ／調節配列を含む場合、該プロモータ／調節は、それが細胞内の所望のタンパク質の発現を駆動するように所望のタンパク質コーディング配列の５’末端に位置づけされる。所望のタンパク質をコードする核酸及びそのプロモータ／調節配列は一緒になって「トランス遺伝子」を構成する。２つのポリペプチドは、操作可能に連結されるために必ずしも互いに隣接している必要はない。
【００９５】
本書で使用する「プロモータ／調節配列」という用語は、該プロモータ／調節配列に対し操作可能に連結されている遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。一部の例においては、この配列はコアプロモータ配列であり得、又その他の例においては、この配列は同様に、エンハンサ配列及び遺伝子産物の発現に必要とされるその他の調節要素をも内含し得る。プロモータ／調節配列は例えば組織特異的に遺伝子産物を発現するものであり得る。
【００９６】
「構成的」プロモータは、遺伝子産物をコードするか又は特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結された場合に細胞の大部分の又は全ての生理学的条件下で生きたヒト細胞の中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００９７】
「誘導的」プロモータは、遺伝子産物をコード又は特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結された場合に、実質的に該プロモータに対応する誘発物質が細胞内に存在した時点でのみ生きたヒト細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００９８】
「組織特異的」プロモータは、遺伝子産物をコード又は特定するポリヌクレオチドと操作可能に連結された場合に、細胞が実質的に該プロモータに対応する組織型の細胞である場合にのみ生きたヒト細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００９９】
「ポリアデニル化配列」は、転写された伝令ＲＮＡ配列上でポリＡ尾部の付加を導くポリヌクレオチド配列である。「ポリヌクレオチド」というのは、核酸の１本鎖又は平行及び逆平行ストランドを意味する。かくして、ポリヌクレオチドは１本鎖又は２本鎖核酸のいずれかであり得る。
【０１００】
「核酸」という用語は標準的に大きいポリヌクレオチドを意味する。
【０１０１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は標準的に短かく、一般的には約５０ヌクレオチド以下のポリヌクレオチドを意味する。ヌクレオチド配列がＤＮＡ配列（すなわちＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）によって表わされている場合、これには同様に、「Ｕ」が「Ｔ」に置き換ったＲＮＡ配列（すなわちＡ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）も含まれる。
【０１０２】
本書では、ポリヌクレオチド配列を記述するために、従来の表記法が使用されている。すなわち、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、２本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５’−方向と呼ばれる。
【０１０３】
未完成ＲＮＡ写しに対するヌクレオチドの５’→３’への付加方向は転写方向と呼ばれる。ｍＲＮＡと同じ配列をもつＤＮＡストランドは「コーディングストランド」と呼ばれる。ＤＮＡ上の基準点に対し５’のところに位置設定されているＤＮＡストランド上の配列は「上流側配列」と呼ばれる。ＤＮＡ上の基準点に対し３’のところにあるＤＮＡストランド上の配列は、「下流側配列」と呼ばれる。
【０１０４】
本書で使用されている「治療上有効な量」という用語は、身体状態、障害又は疾病を治療する上で有効である作用物質の量を意味する。
【０１０５】
ポリヌクレオチドの１「部分」というのはポリヌクレオチドの少なくとも約２０の逐次的ヌクレオチド残基を意味する。ポリヌクレオチドの一部分はポリヌクレオチドの全てのヌクレオチド残基を内含し得るというふうに理解されている。
【０１０６】
「プライマ」というのは、指定されたポリヌクレオチド鋳型に対して特異的にハイブリッド形成し相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点を提供する能力をもつポリヌクレオチドを意味している。かかる合成は、合成が誘発される条件下すなわちヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチド鋳型そしてＤＮＡポリメラーゼなどの重合用作用物質の存在下にポリヌクレオチドプライマを置いた場合に発生する。プライマは標準的に１本鎖であるが、２本鎖であってもよい。プライマは標準的にはデオキシリボ核酸であるが、さまざまな合成及び天然に発生するプライマが数多くの利用分野にとって有用である。プライマは、合成の開始のための一部位として役立つようにそれにハイブリッド形成するべく設計されている鋳型に相補的であるが、鋳型の正確な配列を反映している必要はない。このような場合、鋳型に対する該プライマの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによって左右される。プライマは、例えば色原性、放射性又は螢光性部分で標識され、検出可能な部分として使用可能である。
【０１０７】
「プローブ」というのは、もう１つのポリヌクレオチドの指定された配列に特異的にハイブリッド形成する能力をもつポリヌクレオチドを意味する。プローブは、標的相補的ポリヌクレオチドに対しハイブリッド形成するが、鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。このような場合、標的に対する該プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーによって左右される。プローブは、例えば色原性、放射性又は螢光性部分で標識され、検出可能な部分として使用可能である。
【０１０８】
「レナラーゼ阻害物質」というのは、化合物が無い状態にあるそれ以外の点では同一である細胞又は組織の中のレナラーゼレベルに比べ、１つの細胞又は組織内のレナラーゼレベルを検出可能な形で阻害する化合物を意味する。レナラーゼレベルには、その分子をコードする核酸の発現レベル、検出可能なレナラーゼのレベル及び／又はレナラーゼ活性レベルが含まれるがこれに制限されるわけではない。レナラーゼ阻害物質には、化学的化合物、補因子、抗体、リボザイム、アンチセンス分子、核酸などが含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０１０９】
「組換え型ポリヌクレオチド」というのは、天然に接合されない配列をもつポリヌクレオチドを意味する。増幅された又は集合した組換え型ポリヌクレオチドが適切なベクター内に含まれていてよく、適切な宿主細胞を形質転換するためにベクターを使用することができる。組換え型ポリヌクレオチドは、非コーディング機能（例えばプロモータ、複製起点、リボソーム結合部位など）にも役立ち得る。
【０１１０】
「組換え型ポリペプチド」は、組換え型ポリヌクレオチドの発現時点で産生されるものである。
【０１１１】
「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に発生する構造的変異体及びペプチド結合を介して連結された合成で非天然発生のその類似体、関連する天然に発生する構造的変異体及びその合成で天然に発生する類似体からなる重合体を意味する。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチド合成装置を用いて合成可能である。
【０１１２】
「タンパク質」という用語は、標準的に大型ポリペプチドを意味する。
【０１１３】
「ペプチド」という用語は、標準的に短かいポリペプチドを意味する。本書ではポリペプチド配列を描写するために従来の表記法が使用される。ポリペプチド配列の左側末端はアミノ末端であり、ポリペプチド配列の右側末端はカルボキシル末端である。
【０１１４】
本書で使用されるように、「レナラーゼ」という用語は、ドーパミン、ノルエピネフリン及びエピネフリンなどの生体モノアミンを代謝する腎臓によって分泌される新規のモノアミンオキシダーゼを意味する。本書で開示されているレナラーゼ分子は、本書で開示されているその他のポリペプチドと高い及び／又は有意な配列同一性を有するものを含む分子の１種類である。より特定的には、推定上のレナラーゼは、配列番号：１を有する核酸と少なくとも約４０％の配列同一性を共有することになる。より好ましくは、レナラーゼをコードする核酸は、本書に開示されている配列番号：１と少なくとも約４５％の同一性、少なくとも約５０％の同一性、又は少なくとも約５５％の同一性、又は少なくとも約６０％の同一性、又は少なくとも約６５％の同一性、又は少なくとも約７０％の同一性、又は少なくとも約７５％の同一性、又は少なくとも約８０％の同一性、又は少なくとも約８５％の同一性、又は少なくとも約９０％の同一性、又は少なくとも約９５％の同一性、又は少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。さらに一層好ましくは、核酸は配列番号：１である。
【０１１５】
「レナラーゼ」という用語は同様にレナラーゼアイソフォームをも内含する。レナラーゼ遺伝子は、ヒトゲノムの染色体１０の中で３１０１８８ｂｐにまたがる９個のエクソンを含有する。本書で開示されているレナラーゼクローン（配列番号：１、ジェンバンク（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ）登録番号：ＢＣ００５３６４号）は、エクソン１、２、３、４、５、６、８を含有する遺伝子である。ヒトゲノムデータベース内に示されているように少なくとも２つの付加的な選択的にスプライシングされた形態のレナラーゼタンパク質が存在する。１つの選択的にスプライシングされた形態には、ジェンバンク登録番号ＡＫ００２０８０（配列番号：３）及びＮＭ＿０１８３６３（配列番号：４）としてヒトゲノムデータベース内でクローンにより同定されるエクソン１、２、３、４、５、６、９が含まれる。もう１つの選択的にスプライシングされた形態は、ジェンバンク登録番号ＢＸ６４８１５４（配列番号：５）としてヒトゲノムデータベース内でクローンにより同定されるエクソン５、６、７、８を含有する。
【０１１６】
別途指示される場合を除き、「レナラーゼ」は、全ての既知のレナラーゼ（例えばラットレナラーゼ及びヒトレナラーゼ）、及び本書で開示されているレナラーゼの特徴及び／又は物理的特長を有するマウスレナラーゼ及びチンパンジーレナラーゼを含む（ただしこれに制限されるわけではない）今後発見されるレナラーゼを包含する。
【０１１７】
「制限部位」というのは、制限エンドヌクレアーゼにより認識される２本鎖核酸の一部分である。２本鎖核酸の一部分は、核酸及びエンドヌクレアーゼが接触させられた時点でエンドヌクレアーゼが該部分において該核酸の両方のストランドを分割する能力をもつ場合に、制限エンドヌクレアーゼによって「認識される」。
【０１１８】
本書で使用する「特異的に結合する」という用語は、特定の分子を認識し結合するものの試料中のその他の分子を実質的に認識又は結合しない例えばタンパク質、核酸、抗体などといった化合物を意味する。
【０１１９】
少なくとも約７０％、又は少なくとも約７３％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらに一層好ましくは少なくとも約８０％、さらに一層好ましくは少なくとも約８５％さらに一層好ましくは少なくとも約９０％そして最も好ましくは少なくとも約９５％相補的であるオリゴヌクレオチドのみを互いにアニールさせる条件下で２つのオリゴヌクレオチドがアニールする場合、第１のオリゴヌクレオチドは第２のオリゴヌクレオチドと「高いストリンジェンシー」でアニールする。２つのオリゴヌクレオチドをアニールさせるために使用される条件のストリンジェンシーは、その他の因子のうち、既知の場合には、温度、アニーリング媒質のイオン強度、インキュベーション期間、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドのＧ−Ｃ含有量及び２つのオリゴヌクレオチドの間の予測非相同性度の関数である。アニーリング条件のストリンジェンシーを調整する方法は既知である（例えば、サンブルックら、１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、中を参照のこと）。
【０１２０】
本書で使用される「トランス遺伝子」という用語は、トランスジェニック細胞又は哺乳類によってコードされる外因性核酸である外因性核酸配列を意味する。
【０１２１】
「組換え細胞」は、トランス遺伝子を含む細胞である。かかる細胞は真核細胞又は原核細胞であり得る。同様に、トランスジェニック細胞は、トランス遺伝子を含む胚幹細胞、トランス遺伝子を含むトランスジェニックＥＳ細胞に由来するキメラ哺乳類から得られた細胞、トランスジェニック動物又はその胎生組織又は胎盤組織から得られた細胞、及びトランス遺伝子を含む原核細胞を包含するが、これに制限されるわけではない。
【０１２２】
「外因性核酸」という用語は、１つの細胞又は動物内への核酸の導入を容易にする目的で開発された技術を用いて細胞又は動物内に核酸が導入されたことを意味する。「タグ」ポリペプチドというのは、ペプチド結合により連結された時点でタンパク質を局在化させ、それを細胞抽出物から精製し、結合アッセイ内で使用するためにそれを固定化し、そうでなければその生物学的特性及び／又は機能をその他の形で研究するために使用可能であるあらゆるタンパク質を意味する。
【０１２３】
本書に使用されているように、「トランスジェニック哺乳類」という用語は、その細胞が外因性核酸を含む哺乳類を意味する。外因性核酸は、哺乳類のゲノム内に組込まれていてもいなくてもよい。
【０１２４】
本書で使用されている「治療する」というのは、患者がＥＳＲＤ、高血圧、心臓血管疾患、精神障害などの症候を経験する頻度、範囲、重症度及び／又は持続時間を低減させることを意味する。
【０１２５】
本書で使用する「ベクター」という用語は、外因性核酸をコードするあらゆるプラスミド又はウイルスを意味する。この用語は同様に、例えばポリリシン化合物などなどのビリオン又は細胞内への核酸の転移を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を内含するものとみなされるべきである。ベクターは、患者に対し哺乳類レナラーゼをコードする核酸又はレナラーゼタンパク質を送達するための送達ビヒクルとして適しているウイルスベクターであってもよいし、或いは又、同じ目的に適した非ウイルスベクターであってもよい。
【０１２６】
細胞及び組織に対するＤＮＡの送達のためのウイルス及び非ウイルスベクターの例は、当該技術分野において周知であり、例えばマー（Ｍａ）ら、（１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第９４号、１２７４４〜１２７４６頁）中で記述されている。ウイルスベクターの例としては、組換え型ワクシニアウイルス、組換え型アデノウイルス、組換え型レトロウイルス、組換え型アデノ関連ウイルス、組換え型鶏痘ウイルスなどが含まれるがこれに制限されるわけではない（クラナージ（Ｃｒａｎａｇｅ）ら、１９８６年、ＥＭＢＯ  Ｊ．第５号、３０５７〜３０６３頁；１９９４年８月１８日公開の国際特許出願第ＷＯ９４／１７８１０号パンフレット；１９９４年１０月２７日公開の国際特許出願第ＷＯ９４／２３７４４号パンフレット）。非ウイルスベクターの例としては、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０１２７】
本書で使用される「ノックアウトターゲティングベクター」という用語は、もう１つの核酸配列により置換されかつ／又は欠失されるべき問題の標的にフランキングする核酸領域に各々が相補的である２つの核酸配列を含むベクターを意味する。従って、該２つの核酸配列は、相同な組換えプロセスによって除去されるべき標的配列にフランキングする。
【０１２８】
本書で使用されるように、「慢性腎臓病」というのは、糸球体ろ過量（ＧＦＲ）の減少を伴うか又は伴わない構造的又は機能的異常により定義づけられる３カ月間の腎臓損傷、又は腎臓の損傷を伴う又は伴わない６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２以下のＧＦＲを意味する。ＧＦＲは連続的な尺度で表現できる、血液をろ過する腎臓の能力の単位である。ＧＦＲは、血清クレアチニン、体重及び年令を使用することにより推定可能である。
【０１２９】
本書で使用する「末期腎不全（ＥＳＲＤ）」という用語は、腎臓が廃棄物を排せつし、尿を濃縮しかつ電解質を調節するように機能することが完全に又はほぼ完全にできなくなることを意味する。末期腎不全（ＥＳＲＤ）は、腎臓が恒久的にその能力の１０％未満で機能する点に至るまで慢性腎不全が進んだ時点で起こる。この時点で腎機能は非常に低くそのため透析又は腎臓移植を行なわなければ合併症は多重かつ重篤であり、体内の流体及び廃棄物の蓄積から死が訪れる。
【０１３０】
記述
Ｉ．  単離された核酸
Ａ．  センス核酸
本発明は、哺乳類の腎臓の発現された分子、レナラーゼ又はそのフラグメントをコードする単離された核酸において、（配列番号：１）の配列を有する少なくとも１つの核酸と少なくとも約４０％の同一性を共有する核酸を含んでいる。代替的には、核酸は、本書で開示されている配列番号：１に対し少なくとも約４５％の相同性又は少なくとも約５０％の相同性、又は少なくとも約５５％の相同性又は少なくとも約６０％の相同性、又は少なくとも約６５％の相同性又は少なくとも約７０％の相同性、又は少なくとも約７５％の相同性又は少なくとも約８０％の相同性、又は少なくとも約８５％の相同性又は少なくとも約９０％の相同性、又は少なくとも約９５％の相同性又は少なくとも約９８％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有している。１実施形態においては、該核酸配列又は分子は配列番号：１の配列により提供される。
【０１３１】
もう１つの実施形態においては、本発明は、哺乳類のレナラーゼ又はそのフラグメントをコードする単離された核酸において、該核酸によりコードされるタンパク質が配列番号：２のアミノ酸配列と約１５％超の相同性を共有する単離された核酸を含んでいる。整列研究により、レナラーゼがモノアミンオキシダーゼＡと１３．２％のアミノ酸同一性を有することが明らかになっている。
【０１３２】
好ましくは、レナラーゼをコードする単離された核酸によりコードされるタンパク質は、配列番号：２に対する少なくとも約１５％の相同性、又は少なくとも約２０％の相同性、又は少なくとも約２５％の相同性、又は少なくとも約３０％の相同性、又は少なくとも約３５％の相同性、又は少なくとも約４０％の相同性、又は少なくとも約４５％の相同性、又は少なくとも約５０％の相同性、又は少なくとも約５５％の相同性、又は少なくとも約６０％の相同性、又は少なくとも約６５％の相同性、又は少なくとも約７０％の相同性、又は少なくとも約７５％の相同性、又は少なくとも約８０％の相同性、又は少なくとも約８５％の相同性、又は少なくとも約９０％の相同性、又は少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９８％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。１実施形態においては、レナラーゼポリペプチドは配列番号：２中に提供された核酸によってコードされる。本書で開示されているように、配列番号：１の核酸を、３７．８ｋＤａの計算上の分子質量をもつ３４２個のアミノ酸を含むヒトレナラーゼタンパク質を産生するように翻訳することができる。
【０１３３】
本発明は本書で開示されている核酸及びアミノ酸配列にのみ制限されるものとみなされるべきではない。ひとたび本発明を備えたならば、当業者にとっては、その他の哺乳類種（例えば、サル、テナガザル、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、マウスなど）の中に存在するものなどのレナラーゼポリペプチドをコードするその他の核酸も、本書で開示されているようなレナラーゼポリペプチドをコードするラット及びヒトのレナラーゼ核酸の単離のための実験の詳細の節で本書に記述されている手順（例えばゲノミック又はｃＤＮＡライブラリのスクリーニング）、及び当該技術分野において周知の（例えばｍＲＮＡ試料を用いた逆転写ＰＣＲ）又は今後開発されるべき手順に従うことによって得ることができるということが直ちに明らかとなる。
【０１３４】
さらに、例えばサンブルックら、（１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及びアウスベル（Ａｕｓｂｅｌ）ら、（１９９７年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記述されているものなどの当該技術分野において周知の組換え型ＤＮＡ方法を用いてレナラーゼの突然変異体、誘導体又は変異体形態を生成するために、任意の数の手順を使用することができる。
【０１３５】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を改変することによるタンパク質又はポリペプチドのアミノ酸変化の導入のための手順は、当該技術分野において周知であり、サンブルックら、（１９８９年、上掲書)；アウスベルら、(１９９７、上掲書)の中でも記述されている。
【０１３６】
該発明はさらに、タグポリペプチドをコードする核酸がそれに共有結合により連結されている、哺乳類のレナラーゼをコードする核酸を含んでいる。すなわち、該発明は、少なくとも１つのヒトレナラーゼをコードする核酸に、タグポリペプチドをコードする核酸配列が共有結合によって連結されているキメラ核酸を包含している。かかるタグポリペプチドは当該技術分野において周知であり、例えば、緑色螢光タンパク質（ＧＦＰ）、インフルエンザウイルスヘマグルチニンタグポリペプチド、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＦＬＡＧタグポリペプチド、ＨＡタグポリペプチド、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグポリペプチドを内含する。しかしながら、該発明はいかなる形であれ、上述のタグポリペプチドをコードする核酸に制限されるべきではない。むしろ、これらのタグポリペプチドと実質的に類似する要領で機能し得るポリペプチドをコードするあらゆる核酸配列が本発明の中に含まれると考えられるべきである。タグポリペプチドをコードする核酸を含む核酸を、細胞、組織（例えば血管、骨など）及び／又は全生体（例えば両生類及び／又は哺乳類の胎児など）の内部でレナラーゼの位置を特定するため、細胞から分泌された場合にレナラーゼを検出するため、そして細胞内のレナラーゼの役割を研究するために使用することが可能である。さらに、タグポリペプチドの添加は、該発明のタンパク質を容易に産生し精製できるような形で「タグ付けされた」タンパク質の単離及び精製を促進する。
【０１３７】
Ｂ．  アンチセンス核酸
或る種の状況においては、レナラーゼの発現を阻害することが望ましい可能性があり、従って該発明は、レナラーゼ発現の阻害にとって有用な組成物が含まれる。かくして、該発明は、転写との関係においてアンチセンス配向にある、哺乳類のレナラーゼをコードする核酸の一部分又は全長に対し相補的である単離された核酸に関するものである。該アンチセンス核酸は、配列番号：１と少なくとも約４０％の相同性をもつ核酸又はそのフラグメントと相補的である。その他の実施形態においては該アンチセンス核酸は、転写との関係においてアンチセンス配向にある、配列番号：１の配列をもつ哺乳類レナラーゼをコードする核酸の一部分又は全長又はそのフラグメントに対し相補的である核酸に対し少なくとも約４５％の相同性、又は少なくとも約５０％の相同性、又は少なくとも約５５％の相同性、又は少なくとも約６０％の相同性、又は少なくとも約６５％の相同性、又は少なくとも約７０％の相同性、又は少なくとも約７５％の相同性、又は少なくとも約８０％の相同性、又は少なくとも約８５％の相同性、又は少なくとも約９０％の相同性、又は少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。最も好ましくは、該核酸は、配列番号：１である核酸の一部分又は全長又はそのフラグメントに対して相補的である。かかるアンチセンス核酸は、腎臓発現された（レナラーゼ）分子の発現、機能又はその両方を阻害するのに役立つ。
【０１３８】
さらに、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを用いて（ただしこれに制限されるわけではない）細胞、組織及び／又は生体内のレナラーゼｍＲＮＡの発現を検出するために、レナラーゼをコードする核酸の全部又は一部分に相補的なアンチセンス核酸を使用することができる。かくして当業者は、本書で提供されている開示に基づいて、レナラーゼ発現を査定するためのプローブとして使用可能であるアンチセンス核酸を該発明が内含することを理解することだろう。
【０１３９】
該発明のアンチセンス分子は合成的に作りその後細胞に提供することができる。容易に合成され標的細胞内に導入されることから、約１０〜約３０個の間、そしてより好ましくは約１５個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましい。該発明により考慮されている合成アンチセンス分子には、未修飾オリゴヌクレオチドに比べて改善された生物活性をもつ当該技術分野において既知のオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる（その全体が本発明に参照により援用されているコーエン（Ｃｏｈｅｎ）、上掲書；タリス（Ｔｕｌｌｉｓ）、１９９１年、米国特許第５，０２３，２４３号明細書を参照のこと）。
【０１４０】
ＩＩ．  単離されたポリペプチド
Ａ．  ポリペプチド、その類似体及び修飾
本発明は同様に、哺乳類レナラーゼを含む単離されたポリペプチドを内含している。１実施形態においては、哺乳類レナラーゼを含む単離されたポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸配列をもつポリペプチドに対する少なくとも約１５％の相同性をもつ。変形実施形態においては、哺乳類レナラーゼを含む単離されたポリペプチドは、ラットレナラーゼに対する少なくとも約２０％の相同性、又は少なくとも約２５％の相同性、又は少なくとも約３０％の相同性、又は少なくとも約３５％の相同性、又は少なくとも約４０％の相同性、又は少なくとも約４５％の相同性、又は少なくとも約５０％の相同性、又は少なくとも約５５％の相同性、又は少なくとも約６０％の相同性、又は少なくとも約６５％の相同性、又は少なくとも約７０％の相同性、又は少なくとも約７５％の相同性、又は少なくとも約８０％の相同性、又は少なくとも約８５％の相同性、又は少なくとも約９０％の相同性、又は少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９８％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。１実施形態においては、哺乳類レナラーゼを含む単離されたポリペプチドは、ラットレナラーゼのものである。もう１つの実施形態においては、哺乳類レナラーゼ分子を含む単離されたポリペプチドは配列番号：２である。
【０１４１】
本発明は同様に、本書で開示されている通りのレナラーゼを含むタンパク質又はペプチドの類似体をも提供する。類似体は、保存的アミノ酸配列差異又は配列に影響を及ぼさない修飾又はその両方により、天然に発生するタンパク質又はペプチドと異なるものであり得る。例えば、タンパク質又はペプチドの一次配列を改変するものの通常その機能を改変しない保存的アミノ酸変更を行なうことができる。保存的アミノ酸置換は標準的に以下の群の内部での置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リシン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン
【０１４２】
（通常一次配列を改変しない）修飾には、ポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学的誘導体化、例えばアセチル化又はカルボキシル化が含まれる。同じく含まれるのは、グリコシル化の修飾、例えばその合成及びプロセシング中又はさらなるプロセシング工程においてポリペプチドのグリコシル化パターンを修正することによって；例えばグリコシル化に影響を及ぼす酵素例えば哺乳類グリコシル化又は脱グリコシル化酵素に対しポリペプチドを曝露することによって行なわれる修飾である。同様に包含されているのは、例えばホスホチロシン、ホスホセリン又はホスホトレオニンといったようにホスホリル化されたアミノ酸残基を有する配列である。
【０１４３】
同様に内含されているのは、タンパク質分解劣化に対するその耐性を改善するか又は溶解度特性を最適化するか又はそれらを治療薬としてより適切なものにするために通常の分子生物学的技術を用いて修飾されたポリペプチドである。かかるポリペプチドの類似体には、天然に発生するＬ−アミノ酸以外の残基例えばＤ−アミノ酸又は非天然発生の合成アミノ酸が含まれる。該発明のペプチドは、本書に列挙されている特定のプロセス例のいずれかの製品に制限されるわけではない。
【０１４４】
本発明は同様に、結果としてのペプチド（又はＤＮＡ）が本書に記されている配列と同一でないものの、ペプチドが本発明のレナラーゼペプチドの生物学的／生化学的特性を有するという点で本書に開示されたペプチドと同じ生物学的特性を有するような形で１つ以上のアミノ酸で改変されている（又はそれをコードするヌクレオチド配列に関する場合には１つ以上の塩基対において改変されている）レナラーゼペプチドである、該発明のペプチド（又はそれをコードするＤＮＡ）の「突然変異体」「誘導体」及び「変異体」を包含するものとみなされるべきである。
【０１４５】
さらに、該発明は、レナラーゼアイソフォーム及びレナラーゼ配列の天然に発生する変異体又は組換えにより誘導された突然変異体を含むものとしてみなされるべきであり、かかる変異体又は突然変異体は、該発明の全長クローンに比べ高い、低い又はちょうど同程度の生物学的活性を、このようにコードされたタンパク質に付与する。
【０１４６】
Ｂ．  細胞からのポリペプチドの生産及び単離
本書の他の箇所で実証されているように、本発明は同様に、レナラーゼを産生する細胞からのレナラーゼポリペプチドの生産及び単離のための方法にも関する。該発明は同様に、かかる細胞が成長させられる培地からのレナラーゼの生産及び単離の方法をも考慮している。
【０１４７】
このような方法において使用可能な細胞には、レナラーゼを天然に産生するあらゆる細胞及びレナラーゼを生産するべく突然変異、改変又は処理を受けた細胞が含まれる。かかる細胞には、そのようなタイプの細胞に標準的なレナラーゼの量を産生する細胞及びレナラーゼを過剰産生する細胞が含まれる。レナラーゼを天然に産生しない又はレナラーゼを少量しか産生しない細胞は、かかる細胞及びそれが成長させられた培地からのその単離のために物理的及び／又は経済的に実用的な量でレナラーゼを産生するような形で突然変異、改変又は処理を受けることができる。
【０１４８】
ひとたび細胞によって産生された時点で、レナラーゼを、タンパク質単離の当業者にとって周知のタンパク質単離技術を用いて細胞及び／又はそれらの成長培地から単離することができる。望ましい又は必要である場合には、単離されたレナラーゼを、タンパク質精製の当業者にとって周知の精製技術を用いてさらに精製することができる。
【０１４９】
Ｃ．  体液からのポリペプチドの精製
本発明は同様に、動物特に哺乳類の体液からのレナラーゼポリペプチドの精製方法にも関する。レナラーゼを産生するあらゆる動物を、その体液からのレナラーゼの精製のために使用することができる。適切な動物の例としては、マウス、ラット、ウマ、ブタ、イヌ、サル、ウシ及びヒトが含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０１５０】
フラグメント、相同性ポリペプチド、ムテイン、類似体、誘導体及び融合タンパク質を含めたポリペプチドの精製は周知であり、当業者の技能範囲内に入る。例えば、例えば、スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」第２版（１９８７年）を参照のこと。化学的に合成されたペプチドの精製は、例えばＨＰＬＣにより容易にもたらされ得る。従って、本発明は少なくとも１つの体液からレナラーゼポリペプチドを精製する方法を提供する。体液には、血液、血清、血漿、唾液、尿、リンパ液、全血、髄液組織培地及び細胞抽出物が含まれるが、これに制限されるわけではない。体液からのレナラーゼの精製は、単独で又は組合わせた形でイオン交換クロマトグラフィ、吸着クロマトグラフィ、リガンド結合アフィニティクロマトグラフィ及びゲル透過クロマトグラフィの手順を含む（ただしこれに制限されるわけではない）当該技術分野において既知のあらゆるタンパク質精製により行なうことができる。
【０１５１】
安定剤の存在又は不在下で純粋な又は実質的に純粋な形態で本発明の単離したタンパク質を純粋な又は実質的に純粋な形で提供することが本発明の１態様である。安定剤としては、タンパク質様又は非タンパク質様の両方の材料が含まれ、これらは当該技術分野において周知である。アルブミン及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの安定剤は既知であり市販されている。
【０１５２】
本発明の単離されたタンパク質がワクチン中などの治療薬として、及び代償療法として使用される場合に高レベルの純度が好まれるが、本発明の単離されたタンパク質はさらに低い純度でも有用である。例えば、実験動物の体内の抗体を上昇させるために本発明の部分的に精製されたタンパク質を免疫原として使用することができる。
【０１５３】
Ｄ．  ポリペプチドの活性
本発明はさらに、酵素活性のために補因子を含む薬学組成物を提供する。本書の他の場所でより詳細に開示されているように、レナラーゼは、その官能性のために補因子ＦＡＤを必要とするフラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有酵素である。本発明をひとたび備えたならば、当業者にとって、実質的にＦＡＤと類似の要領で機能し得るもの及び当該技術分野において周知のものといったその他の酵素補因子を、レナラーゼ活性の活性化又は非活性化のために利用することができる、ということは直ちに明らかになる。これらの補因子にはＦＡＤ類似体、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、チアミンピロリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ピリドクサルリン酸、補酵素Ａ、テトラヒドロ葉酸、アデノシン三リン酸、グアノシン三リン酸及びＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）、金属イオン、金属ポルフィリン、例えば、ヘム基、ビオチン、α２ミクログロブリン、チアミンピロリン酸、補酵素Ａ、ピリドクサルリン酸、補酵素Ｂ１２、ビオサイチン、テトラヒドロ葉酸、及びリポ酸が含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０１５４】
レナラーゼ活性は同様に、ホモ多量体又はヘテロ多量体の形成によっても調節され得る。ホモ多量体は、３つ以上の同一のサブユニットからなるポリペプチドであってよい。一方では、多量体ポリペプチドはヘテロ２量体すなわち２つの異なるサブユニットからなるポリペプチド又はこれらのサブユニットのうちの少なくとも２つが異なっている３つ以上のサブユニットからなるヘテロ多量体であり得る。例えば多量体ポリペプチドは、「単一の」多量体ポリペプチドを形成する複数のサブユニット又はそれ自体単量体及び／又は多量体ポリペプチドであり得る複数の機能的に関連したポリペプチドの複合体で構成されている。
【０１５５】
ホモ２量体又はホモ多量体は、複数の同一のポリペプチドサブユニットの自然発生的な会合によって形成され得る。ヘテロ２量体又はヘテロ多量体は、複数の異なるポリペプチドサブユニットの自然発生的会合により形成され得る。レナラーゼが２量体又は多量体複合体を形成するという証拠が存在する（図６Ｃ）。レナラーゼの２量体化又は多量体化が酵素活性にプラス又はマイナスの影響を与え得ると考えられている。従って、レナラーゼの２量体又は多量体複合体の分断又は安定化はさまざまな治療目的にとって特に有用であると予想されている。
【０１５６】
Ｅ．ポリペプチドの使用
核酸及びそれによりコードされたペプチドは、細胞内のレナラーゼ分子の機能を解明するための有用な手段である。さらに、哺乳類レナラーゼ分子を含む核酸及びアミノ酸は、例えばレナラーゼ発現などに影響を及ぼし、高血圧、腎臓疾患、心臓疾患などのための潜在的な治療薬候補である化合物を同定するのに使用可能である有用な標的である。該核酸、それによりコードされるタンパク質又はその両方は、哺乳類内のレナラーゼの発現又は活性を増大又は減少させるために哺乳類に投与可能である。これは、哺乳類内のレナラーゼの過小又は過剰発現が健康な哺乳類におけるレナラーゼの正常な発現に比較して改変されたレナラーゼ発現と結びつけられる疾病又は条件を媒介するような状況において、哺乳類にとって有益であり得る。レナラーゼ発現又は活性を変調させかくして治療上の利益を提供することにより影響され得るこのような身体状態としては、高血圧、腎臓疾患、心臓病などが含まれるがこれに制限されるわけではない。これは、本書の他の箇所でより詳しく開示されているように、ラットにおけるレナラーゼの輸液が血圧及び心拍数を低下させることが示されてきたからである。
【０１５７】
さらに、該発明の核酸及びアミノ酸は、なかでもレナラーゼの作用の研究のため、新規の診断及び治療法の同定のためそしてレナラーゼの細胞の役割を解明するための有用な手段である組換え細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳類を生産するために使用可能である。例えば、腎臓及び血管疾患に関係する身体状態を研究するために、トランスジェニック動物を用いることができる。
【０１５８】
さらに、該発明の核酸及びアミノ酸は、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓病、腎臓病、心臓血管病などの重症度及び予後を査定するために、遺伝子発現レベル又はタンパク質発現レベルのいずれかを査定することによって診断的に使用可能である。該発明の核酸、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は同様に、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓血管疾患などを予防するための治療の効能を査定するためのアッセイの開発においても有用である。すなわち、該発明の核酸、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、レナラーゼの発現に対するさまざまな療法の効果を検出しかくして、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓疾患、腎臓疾患及び心臓血管疾患のための治療の効能の査定といったように（ただしこれに制限されるわけではない）療法の有効性を確認するためにも使用することができる。
【０１５９】
Ｆ．ポリペプチドの小分子阻害物質
本書で開示されているような抗体、リボザイム、干渉性ＲＮＡ（すなわちＲＮＡｉ）及びアンチセンス核酸分子に加えて、本発明はさらにレナラーゼ活性を変調させるために小分子を用いる方法をも提供する。本書で使用する「潜在的小分子阻害物質」という用語は、選択されたタンパク質に対し結合するものの酵素の生物活性を阻害する（例えば酵素の触媒速度を低減させる）能力がまた試験されていない小分子を意味する。かかる阻害特性の確認の後、該小分子を、「小分子阻害物質」又はより一般的に「阻害物質」と呼ぶことができる。
【０１６０】
「小分子」という用語は、約５０００ダルトン（５ｋＤ）以下、又は約３ｋＤ未満又は約２ｋＤ未満又は約１ｋＤ未満の分子質量をもつ化合物に関する。一部のケースでは、小分子が約７００Ｄａ以下の分子質量を有することが好ましい。
【０１６１】
実施例において提供されているように、配列番号：２のアミノ酸をもつタンパク質などの該発明のタンパク質及び核酸は、カテコールアミン代謝に関与している。タンパク質又は該タンパク質の少なくとも１つの活性のアゴニスト又はアンタゴニストなどの作用物質の発現を変調又はダウンレギュレートする小分子を使用して、タンパク質の機能及び活性と結びつけられる生物学的及び病理学的プロセスを変調させることができる。
【０１６２】
病理学的プロセスは、悪影響を生み出す生物学的プロセスの１カテゴリを意味する。例えば、該発明のタンパク質の発現の欠如又はそのダウンレギュレーションを、ＥＳＲＤなどの或る種の疾病に結びつけることができる。本書で使用する小分子阻害物質は、該作用物質が該プロセスの程度又は重症度を低減させるとき、病理学的プロセスを変調させると言われる。例えば、該発明のタンパク質の発現又は少なくとも１つの活性を何らかの形で低減又は変調させる作用物質の投与により、疾病を予防したり又は疾病の進行を変調させることができる。
【０１６３】
本発明の小分子阻害物質は、単独で提供することもできるし、又は特定の病理学的プロセスを変調させるその他の作用物質と組合せて提供することもできる。本書で使用されている２つの小分子は、２つの小分子が同時に投与されるか又は作用物質が同時に作用するような形で独立して投与された場合に、組合せた形で投与されると言われる。
【０１６４】
本発明の小分子阻害物質は、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、経皮又は経口腔的に投与可能である。代替的に又は同時に、投与を経口投与することもできる。投与される投薬量は、レシピエントの年令、健康状態及び体重、該当する場合は同時治療の種類、治療の頻度及び望まれる効果の性質によって左右される。
【０１６５】
ＩＩＩ．  ベクター
Ａ．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のためのベクター
その他の関連する態様においては、該発明は、核酸が好ましくは該核酸によってコードされるタンパク質の発現を導く能力を有するような形でプロモータ／調節配列を含む核酸に操作可能に連結された哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含む。かくして、該発明は、例えばサンブルックら、（１９８９年、上掲書）、及びアウスベル（１９９７年、上掲書）の中で記述されているもののような細胞の中での外因性ＤＮＡの同時発現を伴う細胞内への外因性ＤＮＡの導入のための発現ベクター及び方法を包含する。
【０１６６】
通常レナラーゼを発現しないか又はタグポリペプチドと融合されたレナラーゼを発現しない細胞内での単独での又は検出可能なタグポリペプチドに融合されたレナラーゼの発現は、ベクターが内部に導入される細胞においてタグを伴って又は伴わずにタンパク質の発現を駆動するために役立つプロモータ／調節配列に対し操作可能に連結された所望の核酸を含むプラスミド、ウイルス又はその他のタイプのベクターを生成することによって達成することができる。当該技術分野においては遺伝子の構成性発現を駆動するのに有用な数多くのプロモータ／調節配列が利用可能であり、これには例えば、共に本書に開示される実験の中で使用されているサイトメガロウイルス前初期プロモータエンハンサ配列、ＳＶ４０初期プロモータ、ならびにラウス肉腫ウイルスプロモータが含まれるがこれに制限されるわけではない。その上、レナラーゼをコードする核酸の誘発性及び組織特異的発現は、誘発性又は組織特異的プロモータ／調節配列の制御下にタグを伴って又は伴なわずに核酸コーディングレナラーゼを置くことにより達成可能である。その目的にとって有用である組織特異的又は誘導的プロモータ／調節配列の例としては、ＭＭＴＶＬＴＲ誘導的プロモータ及びＳＶ４０後期エンハンサ／プロモータが含まれるがこれに制限されるわけではない。さらに、金属、グルココルチコイドなどの誘発剤に応えて誘発される当該技術分野において周知のプロモータも、該発明において考慮されている。かくして、該発明が既知の又は未知のいずれかでありかつ操作可能に連結された所望のタンパク質の発現を駆動する能力をもつあらゆるプロモータ／調節配列の使用を含む、ということがわかるだろう。
【０１６７】
ベクターを使用してレナラーゼを発現させることにより、組換えによって産生されるタンパク質を大量に単離することが可能になる。さらに、レナラーゼ発現の欠如又はレベル低下がかかる発現に関連する疾病、障害又は身体状態をひき起こす場合、プロモータ／調節配列によって駆動されるレナラーゼの発現は、レナラーゼを提供する遺伝子治療を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）有用な療法を提供することができる。レナラーゼを提供する遺伝子治療を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）レナラーゼの投与が有用な療法でありうる、発現レベル、タンパク質レベルの上昇又はタンパク質の活性の低下に関連する疾病、障害又は身体状態。従って、レナラーゼの発現及び／又は活性の減少及び増加の両方が有効な療法を提供する上で有用であり得ることから、該発明はレナラーゼの発現、翻訳及び／又は活動を阻害する方法を含んでいるだけではなく、レナラーゼの発現、タンパク質レベル及び／又は活性を増大させることに関する方法をも含んでいる。
【０１６８】
任意の特定のプラスミドベクター又はその他のＤＮＡベクターの選択は本発明における制限的因子ではなく、当該技術分野においてはさまざまなベクターが周知である。さらに、特定のプロモータ／調節配列を選択しこれらのプロモータ／調節配列を所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に操作可能に連結することは、当業者の技能範囲内に充分入ることである。このような技術は当該技術分野において周知であり、例えばサンブルック、上掲書、及びアウスベル、上掲書の中で記述されている。
【０１６９】
かくして該発明は、哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含むベクターを含む。ベクター内への所望の核酸の取込み及びベクターの選択は、例えばサンブルックら、上掲書、及びアウスベルら、上掲書の中で記述されているように当該技術分野において周知である。
【０１７０】
該発明は同様に、かかるベクターを含有する細胞、ウイルス、プロウイルスなどをも内含する。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は当該技術分野において周知である。例えばサンブルックら、上掲書、及びアウスベルら、上掲書を参照のこと。
【０１７１】
レナラーゼをコードする核酸はさまざまなプラスミドベクター内にクローニングすることができる。しかしながら、本発明は、プラスミド又は任意の特定のベクターに制限されるものとみなされるべきものではない。それどころか、本発明は、当該技術分野において容易に入手可能でありかつ／又は周知である広範なベクターを包含するものとみなされるべきである。
【０１７２】
Ｂ．  ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏ発現のためのベクター
レナラーゼポリペプチドは同様に、往々にして「遺伝子治療」と呼ばれるｉｎ  ｖｉｖｏでのこのようなポリペプチドの発現によっても本発明に従って利用され得る。
【０１７３】
かくして、例えば患者由来の細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）で工学処理し、工学処理した細胞を次に該ポリペプチドで治療すべき患者に提供することができる。このような方法は当該技術分野において周知であり、本書の教示から明らかである。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを使用することにより細胞を工学処理することができる。
【０１７４】
同様にして、例えば当該技術分野において既知の処置によりｉｎ  ｖｉｖｏでのポリペプチドの発現のためにｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を工学処理することができる。例えば、パッケージング細胞が問題の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するような形で、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターをパッケージング細胞に形質導入させる。これらの産生細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を工学処理しｉｎ  ｖｉｖｏでポリペプチドを発現させるために、患者に投与することができる。このような方法により本発明のポリペプチドを投与するためのこれらの及びその他の方法は、本発明の教示から当業者には明らかとなるはずである。
【０１７５】
本発明は、２つ以上のポリペプチド又はタンパク質のためのコーディング配列及び自己プロセッシング分割配列を含む構成体を細胞内に導入してタンパク質の発現がその結果としてもたらされるようにさまざまなベクターのうちのいずれかを使用することを考慮している。当該技術分野においては発現ベクターの数多くの例が知られており、これらはウイルス又は非ウイルス由来であり得る。該発明の実践において利用可能な非ウイルス遺伝子送達方法にはプラスミド、リポゾーム、核酸／リポゾーム複合体、カチオン脂質などが含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０１７６】
ウイルスベクターは、細胞に効率良く形質導入し、それ自体のＤＮＡを宿主細胞に導入することができる。組換え型ウイルスベクターを生成するにあたっては、問題のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子で、可欠遺伝子を置換する。ベクターの例としては、ウイルス及び非ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）、その複製コンピーテント、複製欠損及びガットレス形態を含めたアデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシ乳頭腫ベクター、エプスタイン−パールベクター、ヘルペスベクター、ワクチニアベクター、モロニーマウス白血病ベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター及び非ウイルスプラスミドが含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０１７７】
ベクターは標準的には、複製起点を含み、さらにそのベクターを同定し選択することのできる「マーカー」又は「選択性マーカー」機能を含んでいてもいなくてもよい。いかなる選択性マーカーでも使用可能であるが、組換え型ベクター内で使用するための選択性マーカーは一般に当該技術分野において既知であり、適切な選択性マーカーの選択は、宿主細胞により左右されることになる。抗生物質又はその他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択性マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、メトトレキサート、テトラサイクリン、ネオマイシン（サザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ら、Ｊ．，Ｊ  ＭｏＩ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９８２年、第１（４）号、３２７〜４１頁（１９８２年））、マイコフェノール酸（ムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２０９号、１４２２〜７頁（１９８０年）、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（サグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．第５（２）号、４１０〜３頁（１９８５年））及びＧ４１８が含まれるが、これに制限されるわけではない。当業者であれば理解する通り、発現対象のコーディング配列に適切であるように、発現ベクターは標準的に複製起点、発現すべきコーディング配列に操作可能に連結されたプロモータならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を含んでいる。
【０１７８】
「組換え型」としてベクター又はその他のＤＮＡ配列に言及している場合それは単に、自然から単離された又は自然の中で発見される通りの標準的に操作可能に連結されていないＤＮＡ配列の操作可能な形での連結を認めているにすぎない。調節（発現及び／又は制御）配列は、発現及び／又は制御配列が核酸配列の転写そして該当する場合にはその翻訳を調節する場合に、核酸コーディング配列に操作可能に連結されている。かくして、発現及び／又は制御配列は、プロモータ、エンハンサ、転写ターミネータ、コーディング配列に対し５’のところにある開始コドン（すなわちＡＴＧ）、イントロンのためのスプライシングシグナル及び停止コドンを内含することができる。
【０１７９】
アデノウイルス遺伝子治療ベクターは、強い過渡的発現、優れた力価そしてｉｎ  ｖｉｖｏで分割及び非分割細胞を形質導入する能力を示すものとして知られている（ヒット（Ｈｉｔｔ）ら、Ａｄｖ  ｉｎ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ、第５５号、４７９〜５０５頁、２０００年）。本発明の組換え型Ａｄベクターは、（１）複製欠損Ａｄビリオンの中にベクターを取込むことができるようにするパッケージング部位；（２）問題の２つ以上のタンパク質又はポリペプチドのためのコーディング配列、及び（３）単独の又は付加的なタンパク質分解分割部位と組合せた形での自己プロセシング分割部位をコードする配列を含む。感染性ビリオン内に取込むために必要な又は有用なその他の要素には、５’及び３’ＡｄＩＴＲ、Ｅ２遺伝子、Ｅ４遺伝子の一部分そして任意にはＥ３遺伝子が含まれる。
【０１８０】
本発明の組換え型Ａｄベクターを封入する複製欠損Ａｄビリオンは、Ａｄパッケージング細胞及びパッケージング技術を用いて当該技術分野において既知の標準的技術により作製される。これらの方法の例は、例えば米国特許第５，８７２，００５号明細書の中に見られる。問題の２つ以上のポリペプチド又はタンパク質のためのコーディング配列は一般にウイルスゲノムの欠失したＥ３領域内でアデノウイルス内に挿入される。該発明を実践する上で使用するための好ましいアデノウイルスベクターは、１つ以上の野生型Ａｄ遺伝子産物、例えばＥ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４を発現しない。好ましい実施形態は、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４の機能そして任意にはＥ３遺伝子領域の機能を補完するパッケージング細胞系統と合わせて用いられるビリオンである。例えば、米国特許第５，８７２，００５号明細書、第５，９９４，１０６号明細書、第６，１３３，０２８号明細書及び６，１２７，１７５号明細書を参照のこと。かくして本書で使用されているように、「アデノウイルス」及び「アデノウイルス粒子」は、ウイルス自体又はその誘導体を意味し、相反する指示のないかぎり、全ての血清型及び亜型そして天然に発生するもの及び組換え型のものの両方の形態を網羅する。かかるアデノウイルスは、野生型であり得、そうでなければ当該技術分野において既知の又は本書で開示されている通りのさまざまな形で修飾され得る。かかる修飾には、感染性ウイルスを作製するべく粒子内にパッケージングされるアデノウイルスゲノムに対する修飾が含まれる。かかる修飾には、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３又はＥ４コーディング領域のうちの１つ以上のものの欠失などの当該技術分野において既知の欠失が含まれる。パッケージング及び産生細胞の例は２９３、Ａ５４９又はＨｅＬａ細胞から誘導される。アデノウイルスベクターは、当該技術分野において既知の標準的技術を用いて精製され処方される。
【０１８１】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、染色体組込みにより潜在的に細胞を感染させることのできるヘルパー依存性ヒトパルボウイルスである。染色体的に組込むことのできるその能力及びその非病原性のため、ＡＡＶは、ヒト遺伝子治療ベクターとしての多大な潜在性を有する。本発明を実践する上で使用するためには、当業者にとっては既知である標準的な方法を用いてｒＡＡＶビリオンを産生し、転写方向で転写開始及び終結配列を含む制御配列を含むような形でこれらを構築する。より特定的には、本発明の組換え型ＡＡＶベクターは；（１）複製欠損ＡＡＶビリオンの中にベクターを取込むことができるようにするパッケージング部位；（２）問題の２つ以上のタンパク質又はポリペプチドのためのコーディング配列；（３）単独の又は付加的なタンパク質分解分割部位と組合せた形での自己プロセシング分割部位をコードする配列を含む。該発明を実践する上で使用するためのＡＡＶベクターは、転写方向の操作可能に連結された構成要素として転写開始及び終結配列を含む制御配列をも含むような形で構築される。これらの構成要素は、機能的ＡＡＶＩＴＲ配列により５’及び３’末端上でフランキングされる。「機能的ＡＡＶＩＴＲ配列」というのは、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングのために意図されたように機能することを意味する。
【０１８２】
組換え型ＡＡＶベクターは、それらが標的細胞内の問題の選択された組換え型タンパク質又はポリペプチドの発現及び産生を導く能力をもつことをも特徴としている。かくして、組換え型ベクターは、少なくとも包膜のために不可欠なＡＡＶの配列の全て及び組換え型ＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの感染のための物理的構造を含む。従って、該発明のベクターにおいて使用するためのＡＡＶＩＴＲは、（例えばコチン（Ｋｏｔｉｎ）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第５号、７９３〜８０１頁、１９９４年に記されている通り）野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、ヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって改変され得、そうでなければ複数のＡＡＶ血清型のいずれかからＡＡＶＩＴＲを誘導することができる。一般に、制限的意味なくＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８などを含むアデノ関連ウイルス血清型から誘導されたベクターである。好ましいｒＡＡＶ発現ベクターは、全体的に又は部分的に欠失された野生型ＲＥＰ及びＣＡＰ遺伝子を有するが、機能的フランキングＩＴＲ配列を保持する。
【０１８３】
標準的には、ＡＡＶ発現ベクターが産生細胞内に導入されその後ＡＡＶヘルパー構成体が導入され、ここで該ヘルパー構成体は、産生細胞内で発現される能力を有しかつＡＡＶ発現ベクター内には不在であるＡＡＶヘルパー機能を補完するＡＡＶコーディング領域を内含している。本書で使用する「ＡＡＶヘルパー機能」という用語は、ｒＡＡＶベクターから欠如しているＡＡＶウイルス機能を補完するべく宿主細胞内で発現される能力をもつＡＡＶコーディング領域を意味する。標準的には、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶｒｅｐコーディング領域及びＡＡＶｃａｐコーディング領域を含む。ヘルパー構成体は、米国特許第６，５４８，２８６号で記述されているように、標準的にはＡＴＧからＡＣＧまでのｐ５に後続する開始コドンを突然変異させることによって、大Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８）の発現をダウンレギュレートするように設計され得る。
【０１８４】
産生細胞内へのＡＡＶ発現ベクターの導入には標準的に、産生細胞内へのヘルパーウイルス及び／又は付加的なベクターの導入が後続し、ここでヘルパーウイルス及び／又は付加的なベクターは効率の良いｒＡＡＶウイルス産生を支援できる付属的機能を提供する。
【０１８５】
「付属的機能」というのは、複製のためにＡＡＶが必要とするもののＡＡＶビリオン自体によって提供されない機能を意味している。かくして、これらの付属的機能及び因子は、宿主細胞、ウイルス（例えばアデノウイルス、単純ヘルペスウイルス又はワクチニアウイルス）、又は同じ細胞内で同時発現される発現ベクターによって提供されなくてはならない。一般に、アデノウイルスのＥ１Ａ及びＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡコーディング領域は、ＡＡＶ複製及びパッケージングのために要求される必要な付属的機能を供給するために用いられる（松下ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、第５号、９３８頁［１９９８年］）。
【０１８６】
産生細胞はこのとき、ｒＡＡＶを産生するために培養される。これらの工程は標準的な方法を用いて実施される。本発明の組換え型ＡＡＶベクターを封入する複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞及びパッケージング技術を用いて当該技術分野において既知の標準的技術によって作製される。これらの方法の例は、米国特許第５，４３６，１４６号明細書；５，７５３，５００号明細書；６，０４０，１８３号明細書；６，０９３，５７０号明細書及び６，５４８，２８６号明細書の中に見い出すことができる。パッケージングのためのさらなる組成物及び方法は、ワング（Ｗａｎｇ）ら（米国特許第２００２／０１６８３４２号明細書）の中で記述されており、当業者の知識範囲内に入る技術を含む。ＡＡＶベクター及びＡＡＶヘルパー構成体の両方を、１つ以上の任意の選択可能なマーカー遺伝子を含有するべく構築することが可能である。適切な選択培地に対し抗生物質耐性又は感応性を付与する選択性マーカー遺伝子が当該技術分野において一般に知られている。
【０１８７】
「ＡＡＶビリオン」という用語は（ＡＡＶカプシドタンパク膜と結びつけられた線形１本鎖ＡＡＶ核酸ゲノムを含む）「野生型」（ｗｔ）ＡＡＶウイルス粒子などの完全なウイルス粒子を意味する。これとは対照的に、「組換え型ＡＡＶビリオン」及び「ｒＡＡＶビリオン」は、ＡＡＶＩＴＲにより内側がフランキングされた問題の非相同ＤＮＡ配列を含有する感染性ウイルス粒子を意味する。
【０１８８】
該発明を実践する上で、ｒＡＡＶビリオンを産生するための宿主細胞には、哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物及び酵母が含まれる。宿主細胞は同様に、ＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子が宿主細胞内で安定した形で維持されているパッケージング細胞、又はＡＡＶベクターゲノムが安定した形で維持されパッケージングされている産生細胞でもあり得る。パッケージング及び産生細胞の例は、２９３，Ａ５４９又はＨｅＬａ細胞から誘導される。ＡＡＶベクターは、当該技術分野において既知の標準的な技術を用いて精製され処方される。
【０１８９】
レトロウイルスベクターは同様に、遺伝子送達のための一般的手段でもある（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ、第３５７号、４５５〜４６０頁、１９９２年）。レトロウイルスベクターそしてより特定的にはレンチウイルスベクターを、本発明の実践において使用することができる。従って、本書で使用される、「レトロウイルス」又は「レトロウイルスベクター」という用語は、「レンチウイルス」及び「レンチウイルスベクター」をそれぞれ含むように意図されている。レトロウイルスベクターをテストし、広範囲の標的細胞のゲノム内に問題の遺伝子を安定した形で導入するための適切な送達ビヒクルであることがわかった。再配置されていない単一のコピートランス遺伝子を細胞内に送達するレトロウイルスベクターの能力は、レトロウイルスベクターを細胞内に遺伝子を移送するために充分適したものにしている。さらに、レトロウイルスは、宿主細胞上の特異的細胞表面受容体に対してレトロウイルス外皮糖タンパク質を結合させることによって宿主細胞内に入る。その結果、コード化された未変性外皮タンパク質がこのタンパク質とは異なる細胞特異性をもつ（例えば未変性外皮タンパク質に比べ異なる細胞表面受容体に結合する）非相同性外皮タンパク質により置換されているシュードタイプのレトロウイルスベクターも同様に、本発明を実践するにあたり有用であり得る。特異的な標的細胞に対する１つ以上の標的タンパク質コーディング配列をコードするレトロウイルスベクターの送達を導く能力は、本発明の実践において望ましいものである。
【０１９０】
本発明は、例えば１つ以上のトランス遺伝子配列を含むレトロウイルス転移ベクター及び１つ以上のパッケージング要素を含むレトロウイルスパッケージングベクターを含むレトロウイルスベクターを提供している。特に、本発明は、シュードタイプのレトロウイルスを産生するための非相同な又は機能的に修飾された外皮タンパク質をコードするシュードタイプのレトロウイルスベクターを提供する。
【０１９１】
本発明のレトロウイルスベクターのコア配列は、例えばＢ、Ｃ、及びＤ型レトロウイルスを含む多様なレトロウイルスならびにスプマウイルス及びレンチウイルスから容易に誘導可能である（「ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５年）。本発明の組成物及び方法において使用するのに適したレトロウイルスの例としては、レンチウイルスが含まれるが、これに制限されるわけではない。本発明の組成物及び方法において使用するのに適したその他のレトロウイルスには、トリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞病巣誘発ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細菌内皮症ウイルス及びラウス肉腫ウイルスが含まれるがこれに制限されるわけではない。好ましいマウス白血病ウイルスには４０７０Ａ及び１５０４Ａ（ハーレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）及びロー（Ｒｏｗｅ）、「Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．」第１９号、１９−２５頁、１９７６年）、アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）（ＡＴＣＣ第ＶＲ−９９９号）、フレンド（Ｆｒｉｅｎｄ）（ＡＴＣＣ第ＶＲ−２４５号）、グラフィ（Ｇｒａｆｆｉ）、グロス（Ｇｒｏｓｓ）（ＡＴＣＣ第ＶＲ−５９０号）、キルステン（Ｋｉｒｓｔｅｎ）、「Ｈａｒｖｅｙ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ」及びラウシャー（Ｒａｕｓｃｈｅｒ）（ＡＴＣＣ第ＶＲ−９９８号）、及びモロネー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）「Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ」（ＡＴＣＣ第ＶＲ−１９０号）が含まれる。かかるレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州）などの寄託機関又は収集機関から容易に得ることができ、そうでなければ一般に利用可能な技術を用いて既知の供給源から単離することができる。
【０１９２】
好ましくは、本発明のレトロウイルスベクター配列はレンチウイルスから誘導される。好ましいレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス例えば１型又は２型（すなわちＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２、なおＨＩＶ−１は以前リンパ節症関連ウイルス３（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ）及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）関連ウイルス（ＡＲＶ）と呼ばれていた）、又は同定されエイズ又はエイズ様疾患と結びつけられたＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２に関連するもう１つのウイルスである。その他のレンチウイルスには、ヒツジビスナ／マエディウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシレンチウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、及びヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が含まれる。
【０１９３】
該組成物及び方法で使用するのに適したレトロウイルスのさまざまな属及び菌株が当該技術分野において周知である（例えば、「Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、第３版、Ｂ．Ｎ．フィールド（Ｆｉｅｌｄｓ）ら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９６年）、例えば、第５８章、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、１７６８〜１７７１頁を参照のこと）。
【０１９４】
本発明のパッケージング系には、少なくとも２つのパッケージングベクターすなわち、ｇａｇ、ｐｏｌ又はｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列を含む第１のパッケージングベクター、及び非相同性又は機能的に修飾された外被タンパク質を含む第２のヌクレオチド配列を含む第２のパッケージングベクターが含まれる。好ましい実施形態においては、レトロウイルス要素はＨＩＶなどのレンチウイルスから誘導される。好ましくは、ベクターには、機能的ｔａｔ遺伝子及び／又は機能的付属遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｎｅｆ）が欠如している。さらなる好ましい実施形態においては、該系はさらにｒｅｖ遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む第３のパッケージングベクターを含む。該パッケージング系は、第１、第２及び任意には第３のヌクレオチド配列を含有するパッケージング細胞の形で提供することができる。
【０１９５】
該発明は、さまざまな系に適用可能であり、当業者であればレトロウイルスの異なる群全体にわたり共有されている共通の要素を認識することであろう。本書の記述では、代表的実施例としてレンチウイルス系が使用されている。ただし全てのレトロウイルスは、線形プラス−センス１本鎖ＲＮＡの１つの分子、２量体からなるゲノム及び共有タンパク質ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを含有し表面突起を伴う被包されたビリオンの特長を共有する。
【０１９６】
レンチウイルスは、ｅｎｖ遺伝子によりコードされる外皮糖タンパク質ＳＵ（ｇｐ１２０）及びＴＭ（ｇｐ４１）；ｇａｇ遺伝子によりコードされるＣＡ（ｐ２４）、ＭＡ（ｐ１７）及びＮＣ（ｐ７−１１）、及びｐｏｌ遺伝子によりコードされるＲＴ、ＰＲ及びＩＮを含めた複数の構造ビリオンタンパク質を共有する。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２は、付属タンパク質及びウイルスＲＮＡの合成及びプロセシング及びその他の複製機能の調節に関与するその他のタンパク質を含有する。ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ／ｖｐｘ及びｎｅｆ遺伝子によりコードされる付属タンパク質は、組換え型系から削除する（又は不活性化する）ことができる。さらに、ｔａｔ及びｒｅｖを、例えば突然変異又は欠失により削除又は不活性化することもできる。
【０１９７】
第１世代のレンチウイルスベクターパッケージング系は、ｇａｇ／ｐｏｌ及びｅｎｖのための別々のパッケージング構成体を提供し、標準的に安全性の理由から非相同性又は機能的に修飾された外皮タンパク質を利用する。第２世代のレンチウイルスベクター系においては、付属遺伝子ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆが欠失又は不活性化される。第３世代のレンチウイルスベクター系は、本発明を実践するのに使用するために好まれ、ｔａｔ遺伝子を欠失させた又はその他の形（例えば突然変異を介して）で不活性化させたものを含む。
【０１９８】
通常ｔａｔにより提供される転写調節のための補償は、例えばヒトサイトメガロウイルス前初期（ＨＣＭＶ−ＩＥ）エンハンサ／プロモータなどの強い構成的プロモータの使用により提供可能である。その他のプロモータ／エンハンサは、構成的プロモータ活性の強度、標的組織に対する特異性（例えば肝臓特異的プロモータ）又は当該技術分野において理解されているように、発現に対する所望の制御に関するその他の因子に基づいて選択可能である。例えば、一部の実施形態においては、制御された発現を達成するためにｔｅｔなどの誘導的プロモータを利用することが望ましい。遺伝子コーディングｒｅｖは好ましくは別々の発現構成体上に提供され、かくして標準的な第３世代のレンチウイルスベクター系には４つのプラスミドすなわちｇａｇｐｏｌ、ｒｅｖ、外皮及び転移ベクターについて各々１つずつのプラスミドが関与するようになっている。利用されるパッケージング系の世代の如何に関わらず、ｇａｇ及びｐｏｌは単一の構成体又は別々の構成体上に提供され得る。
【０１９９】
標準的には、パッケージングベクターは、パッケージング細胞内に含まれ、トランスフェクション、形質導入又は感染を介して細胞内に導入される。トランスフェクション、形質導入又は感染の方法は、当業者にとって周知のものである。本発明のレトロウイルス／レンチウイルス転移ベクターをトランスフェクション、形質導入又は感染を介してパッケージング細胞系統内に導入して産生細胞又は細胞系統を生成することができる。
【０２００】
本発明のパッケージングベクターは、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクション又は電気穿孔法を含む標準的方法によりヒト細胞又は細胞系統内に導入することができる。一部の実施形態においては、パッケージングベクターはｎｅｏ、ＤＨＦＲ、Ｇｉｎシンセターゼ又はＡＤＡなどの優性選択性マーカーと共に細胞内に導入され、その後適切な薬物の存在下で選択されクローンが単離される。選択性マーカー遺伝子を、パッケージングベクターによりコーディングする遺伝子に対し物理的に連結させることが可能である。
【０２０１】
パッケージング機能が適切なパッケージング細胞により発現されるように構成されている安定した細胞系統がすでに知られている。例えばパッケージング細胞について記述する米国特許第５，６８６，２７９号明細書；及びオーリ（Ｏｒｙ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６年）第９３号、１１４００〜１１４０６頁、を参照のこと。安定した細胞系統の産生についてのさらなる記述は、ダルら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７２（１１）号、８４６３〜８４７１頁；及びジュフェレら、１９９８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７２（１２）号、９８７３〜９８８０頁中に見い出すことができる。
【０２０２】
ジュフレら、１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１５号、８７１〜８７５頁は、ＨＩＶ−１外皮遺伝子を含むｐｏｌの配列３’が欠失しているレンチウイルスパッケージングプラスミドについて教示している。該構成体はｔａｔ及びｒｅｖ配列を含有し、３’ＬＴＲは、ｐｏｌｙＡ配列で置換されている。５’ＬＴＲ及びｐｓｉ配列は、誘発可能なプロモータなどのもう１つのプロモータによって置換される。例えば、ＣＭＶプロモータ又はその誘導体を使用することができる。
【０２０３】
好ましいパッケージングベクターは、レンチウイルスタンパク質発現を高め安全性を高めるべくパッケージング機能に対する付加的な変化を含む可能性がある。例えば、ｇａｇの上流側のＨＩＶ配列の全てを除去することができる。同様に外皮の下流側の配列を除去することができる。その上、ＲＮＡのスプライシング及び翻訳を増強するためにベクターを修飾する処置を取ることができる。
【０２０４】
任意には、ダルら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７２（１１）号、８４６３〜８４７１頁、１９９８年により記述されているもののような条件付きパッケージング系が使用される。同様に好ましいのは、例えばジュフレら、１９９８年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７２（１２）号、９８７３〜９８８０頁により記述されているような、ＨＩＶ−１長末端反復（ＬＴＲ）の欠失によりベクターの生物安全性を改善する自己不活性化ベクター（ＳＩＮ）の使用である。誘発性ベクターも、例えばｔｅｔ誘発性ＬＴＲを通して使用可能である。
【０２０５】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、神経細胞に対するその向性に起因して神経系を治療する上で大きな関心を生み出したが、このベクターは、その広い宿主範囲から見てその他の組織のために利用することも可能である。ＨＳＶを魅力的なベクターにしているもう１つの要因は、ゲノムのサイズ及び組織にある。ＨＳＶはサイズが大きいことから、多数の遺伝子又は発現カセットの取込みがその他のより小さなウイルス系ほど問題にならない。さらに、さまざまな性能（時間的、強度など）を有する異なるウイルス制御配列を利用することができるために、発現をその他の系よりも高度に制御することが可能である。ウイルスが比較的わずかにしかスプライシングされていないメッセージを有し、かくして遺伝子操作を容易にしているということも又利点である。
【０２０６】
ＨＳＶは同様に比較的操作が簡単であり、これを高力価まで成長させることが可能である。かくして、送達には、充分なＭＯＩを達成するために必要とされる体積に関してと同様、反復投薬の必要性の減少に関しても、問題が少ない。遺伝子治療ベクターとしてのＨＳＶの再考については、グロリオーソ（Ｇｌｏｒｉｏｓｏ）ら、（１９９５年）を参照のこと。当業者であれば、ベクターとしてのＨＳＶの使用のための周知の技術に慣れ親しんでいることだろう。
【０２０７】
ワクチニアウイルスベクターは、その構築の容易さ、得られる比較的高い発現レベル、広い宿主範囲及びＤＮＡを担持する大きな容量のため広く使用されてきた。ワクチニアは、著しい「Ａ−Ｔ」選好性を示す約１８６ｋｂの線形２本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。約１０．５ｋｂの逆方向末端反復が該ゲノムにフランキングしている。不可欠遺伝子の大部分は、ポックスウイルスの中で最も高度に保存されている中央領域の中でマッピングするように思われる。ワクチニアウイルス内の推定された読取り枠の数は１５０〜２００である。両方のストランド共にコーディングしているが、読取り枠の広範な重複は一般的ではない。
【０２０８】
本発明内の構成体としてはその他のウイルスベクターを利用することができる。例えば、ポックスウイルスなどのウイルスから誘導されたベクターを利用することができる。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）ウイルスの分子クローニングされた菌株が、非相同性ウイルスタンパク質の発現のための複製コンピテントワクチンベクターとして遺伝子的に精製されてきた（デイビス（Ｄａｖｉｓ）ら、１９９６年）。研究により、ＶＥＥ感染が強いＣＴＬ応答を刺激することが実証され、ＶＥＥが免疫化のために極めて有用なベクターであり得ることが示唆されてきた（カレイ（Ｃａｌｅｙ）ら、１９９７年）。本発明においては、ＶＥＥウイルスが樹状細胞をターゲティングする上で有用であり得るということが考慮されている。
【０２０９】
特異的結合リガンドを発現するために工学処理されてきたウイルスベクターの中に、ポリヌクレオチドを収納することができる。かくして、ウイルス粒子は標的細胞の同族受容体に対し特異的に結合し細胞に対し中味を送達することになる。レトロウイルスベクターの特異的ターゲティングを可能にするように設計された新規のアプローチが、ウイルス外皮に対するラクトース残基の化学的添加によりレトロウイルスの化学的修飾に基づいて開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能にし得る。
【０２１０】
レトロウイルス外皮タンパク質に対する及び特異的細胞受容体に対するビオチニル化抗体を使用した組換え型レトロウイルスのターゲティングに対するもう１つのアプローチが設計された。抗体はストレプトアビジンを用いてビオチン構成要素を介してカップリングされた（ルー（Ｒｏｕｘ）ら、１９８９年）。主要組織適合複合体クラスＩ及びクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでエコトロピックウイルスでのこれらの表面抗原を担持したさまざまなヒトの細胞の感染が実証された（ルーら、１９８９年）。
【０２１１】
該発明を実践する上で使用するためのあらゆるベクターが非相同性制御配列、例えば構成的プロモータ例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモータ、ＲＳＶＬＴＲ、ＭｏＭＬＶＬＴＲ及びＰＧＫプロモータ、ｍＴＴＲ、ＴＫ、ＨＢＶ、ｈＡＡＴ、調節可能な又は誘発性のプロモータ、エンハンサなどを含めた組織又は細胞特異的プロモータを含むことになる。好ましいプロモータとしては、ＬＳＰプロモータ（ＩＩＩら、「Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８Ｓ２」、２３〜３０頁、１９９７年）、ＥＦｌ−アルファプロモータ（キム（Ｋｉｍ）ら、Ｇｅｎｅ、第９１（２）号、２１７〜２３頁、１９９０年）及びグオ（Ｇｕｏ）ら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第３（９）号、８０２〜１０頁、１９９６年））が含まれる。最も好ましいプロモータとしては、伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ）プロモータ、ホスホグリセラートキナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモータ、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモータ、キメラ肝臓特異的プロモータ（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサ／ニワトリベーターアクチン（ＣＡＧ）プロモータ、テトラサイクリン応答性プロモータ（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモータ（ＴＴＲ）、シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータ及びＣＫ６プロモータが含まれる。これらの及び数多くの付加的なプロモータの配列が当該技術分野において知られている。関連する配列は、公共データベースから容易に得ることができ、本発明を実践する上で使用するためにベクター内に取込まれる。
【０２１２】
本発明は同様に、問題の２つ以上のポリペプチド又はタンパク質のためのコーディング配列の制御された発現を目的とする遺伝子調節系の内含についても考慮している。遺伝子調節系は、特定の遺伝子の変調された発現において有用である。１つのアプローチ例では、遺伝子調節系又はスイッチには、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイン及びＤＮＡ結合ドメインを有するキメラ転写因子が含まれている。該ドメインは、事実上あらゆる供給源から得ることができ、新規のタンパク質を得るための数多くの方法のうちのいずれかの中で組合せることができる。調節可能な遺伝子系は同様に、キメラ転写因子と相互作用するＤＮＡ応答要素をも内含する。この要素は、調節されるべき遺伝子に隣接して位置設定される。
【０２１３】
本発明を実践する上で利用することのできる遺伝子調節系の例としては、ショウジョウバエ・エクジソン系（ヤオ（Ｙａｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９３号、３３４６頁（１９９６年））、カイコ・エクジソン系（サー（Ｓｕｈｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９５号、７９９９頁（１９９８年））、バレンチス遺伝子スイッチＲＴＭ。誘導因子としてＲＵ４８６を用いる合成プロゲステロン受容体系（オスターワルダー（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、第９８（２２）号、１２５９６〜６０１頁（２００１年））；標的の転写調節（オン又はオフ切換）のためにテトラサイクリン（Ｔｃ）又は類似体、例えばドキシサイクリンといった小分子を利用するＴｅｔ．ＴＭ．及びＲｅｖＴｅｔ．ＴＭ．系（ＢＤバイオサイエンシズ・クローンテック（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））、（ノット（Ｋｎｏｔｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３２（４）号、７９６、７９８、８００頁（２００２年））；各々転写活性化因子又はＤＮＡ結合タンパク質のいずれかに連結されている２つの細胞内分子を一緒にするべく小分子の使用に基づいているアリアド（ＡＲＩＡＤ）調節技術が含まれる。これらの構成要素が一緒になった時点で、問題の遺伝子の転写が活性化される。アリアドは、２つの主要な系すなわち、ホモダイマー化に基づく系とヘテロダイマー化に基づく系を有し（リベラ（Ｒｉｖｅｒａ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ、第２（９）号、１０２８〜１０３２頁（１９９６年）；イー（Ｙｅ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２８３号、８８〜９１頁（２０００年））、そのいずれでも本発明のベクター内に取込むことができる。
【０２１４】
本発明を実践する上で使用するための好ましい遺伝子調節系は、ＡＲＩＡＤ調節技術及びＴｅｔ．ＴＭ．＆ＲｅｖＴｅｔ．ＴＭ.系である。
【０２１５】
Ｃ．  非ウイルスベクター
細胞内への発現ベクターの転移のための複数の非ウイルス方法も本発明により考慮されている。これらには、リン酸カルシウム沈殿（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）及びファンデルエブ（Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ）、１９７３年；チェン（Ｃｈｅｎ）及び岡山、１９８７年；リップ（Ｒｉｐｐｅ）ら、１９９０年）ＤＥＡＥ−デキストラン（ゴパル（Ｇｏｐａｌ）、１９８５年）、電気穿孔法（タル・カスパ（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ）ら、１９８６年；ポッター（Ｐｏｔｔｅｒ）ら、１９８４年）、直接マイクロインジェクション（ハーランド（Ｈａｒｌａｎｄ）及びワイントラーブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）、１９８５年）、ＤＮＡをロードされたリポソーム（ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）及びシーン（Ｓｅｎｅ）、１９８２年；フレリー（Ｆｒａｌｅｙ）ら、１９７９年）及びリオフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（フェチハイマー（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ）ら、１９８７年）、高速マイクロプロジェクタイルを用いた遺伝子ボンバードメント（ヤン（Ｙａｎｇ）ら、１９９０年）、ポリカチオン（ブッシフ（Ｂｏｕｓｓｉｆ）ら、１９９５年）及び受容体媒介トランスフェクション（ウー（Ｗｕ）及びウー（Ｗｕ）、１９８７年；ウー及びウー、１９８８年）が含まれる。これらの技術の一部は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏでの使用にうまく適合させることができる。当業者であれば、非ウイルスベクターの使用に関係する技術に慣れ親しんでおり、本書で開示されているもの以外のタイプの非ウイルスベクターが本発明により考慮されていることを理解することと思われる。
【０２１６】
該発明のさらなる１実施形態においては、発現カセットを、リポソーム又は脂質処方物の中に捕捉することができる。リポソームは、リン脂質２層膜及び内部水性媒質によって特徴づけされた多孔質構造である。多重膜リポソームは水性媒質により分離された多数の脂質層を有する。これらは余剰の水溶液中でリン脂質が懸濁されている場合に自然発生的に形成する。脂質構成要素は閉鎖構造の形成の前に自己転位を受け、水及び溶解した溶質を脂質２層間に捕捉させる（ゴーシュ（Ｇｈｏｓｈ）及びバチャワット（Ｂａｃｈｈａｗａｔ）、１９９１年））。同様に考慮されているのは、リポフェクタミンと複合体形成された遺伝子構造体である（ジブコＢＲＬ）。当業者であれば、リポソーム及び脂質処方物を利用する技術に慣れ親しんでいると思われる。
【０２１７】
脂質ベースの非ウイルス処方物は、アデノウイルス遺伝子治療に対する代替案を提供する。数多くの細胞培養研究が脂質ベースの非ウイルス遺伝子転移について立証しているが、脂質ベースの処方物を介した全身的遺伝子送達は制限されてきた。非ウイルスベースの遺伝子送達の主要な制限は、非ウイルス送達ビヒクルを含むカチオン脂質の毒性にある。リポソームのｉｎ  ｖｉｖｏ毒性がｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子転移結果間の不一致を一部説明している。この矛盾したデータに寄与するもう１つの要因は、血清タンパク質の存在下及び不在下でのリポソームの安定性の差である。リポソームと血清タンパク質の間の相互作用はリポソームの安定性特性に対して劇的な影響を及ぼす（ヤン（Ｙａｎｇ）及びファン（Ｈｕａｎｇ）、１９９７年）。カチオンリポソームは負に帯電した血清タンパク質をひきつけ結合させる。血清タンパク質によりコーディングされたリポソームは、マクロファージにより取上げられる。溶解させられて、それらは循環から除去されることになる。現行のｉｎ  ｖｉｖｏリポソーム送達方法は、循環中のカチオン脂質と結びつけられる毒性及び安定性の問題を回避するために、皮下、皮内又は頭蓋内の注射を用いる。リポソーム及び血漿タンパク質の相互作用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（フェルナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、１９８７年）及びｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子転移（ズー（Ｚｈｕ）ら、１９９３年；ソロジン（Ｓｏｌｏｄｉｎ）ら、１９９５年；ティエリー（Ｔｈｉｅｒｒｙ）ら、１９９５年;塚本ら、１９９５年; アクセンティエビッキ（Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈ）ら、１９９６年）の効率間の不均等の原因である。
【０２１８】
脂質処方物の産生は往々にして、（Ｉ）逆相蒸発（ＩＩ）脱水−再水和（ＩＩＩ）洗浄剤透析及び（ＩＶ）薄膜水和の後のリポソーム混合物の音波処理又は連続押出しによって達成される。ひとたび製造されると、脂質構造は、循環状態にあるとき毒性（化学療法薬）又は不安定（核酸）である化合物を封入するために使用可能である。リポソーム封入の結果として、このような化合物の毒性は低くなりその血清半減期は長くなる（ギャビゾン（Ｇａｂｉｚｏｎ）ら、１９９０年）。数多くの疾病治療に、従来の療法を強化するため又は新規療法特に超増殖性疾患を治療するための療法を確立する目的で遺伝子転移戦略が用いられている。
【０２１９】
Ｄ．  細胞に対するタンパク質又はポリペプチドコーディング配列を含む核酸構成体の送達
非相同タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸配列及び単独の又は付加的なタンパク質分解分割部位をコードする配列と組合わせた形の自己プロセッシング分割部位を含む該発明により利用され得るベクター構成体を、ｉｎ  ｖｉｖｏで例えば体細胞といった細胞による非相同コーディング配列の発現のため、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのベクター形質導入された細胞による組換え型ポリペプチドの産生のため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで細胞内に導入することができる。
【０２２０】
該発明のベクター構成体は、当該技術分野において既知の標準的方法を用いてｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで細胞内に導入され得る。かかる技術としては、リン酸カルシウムを用いたトランスフェクション、培養した細胞内へのマイクロインジェクション（カペッキ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、Ｃｅｌｌ、第２２号、４７９〜４８８頁（１９８０年））、電気穿孔（シゲカワ（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎ．、第６号、７４２〜７５１頁（１９８８年））、リポソーム媒介遺伝子転位（マニノ（Ｍａｎｎｉｎｏ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎ．、第６号、６８２〜６９０頁（１９８８年））、リポ媒介形質導入（フエルナーら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８４号、７４１３〜７４１７頁（１９８７年））、及び高速マイクロプロジェクタイルを用いた核酸送達（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３２７号、７０〜７３頁（１９８７年）））が含まれる。
【０２２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ発現のためには、機能タンパク質を発現するのに有効なあらゆる細胞を利用することができる。タンパク質発現のために使用される細胞及び細胞系統の数多くの例が当該技術分野において既知である。例えば、発現のために原核細胞及び昆虫を使用することも可能である。さらに、酵母などの真核微生物も使用可能である。原核、昆虫及び酵母系における組換え型タンパク質の発現は一般に当該技術分野において既知であり、本発明の組成物及び方法を用いてタンパク質又はポリペプチドの発現のために適合させることができる。
【０２２２】
発現のために有利な宿主細胞の例としては、線維芽細胞、非ヒト哺乳類からの細胞例えばヒツジ、ブタ、マウス及びウシ細胞、などの哺乳類細胞、昆虫細胞などがさらに含まれる。哺乳類細胞の特定的な例としてはＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、３Ｔ３繊維芽細胞、Ｗｌ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞及びＭＤＣＫ細胞が含まれる。
【０２２３】
宿主細胞は、プロモータを誘発するため、形質転換体を選択するため又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜修正された従来の栄養培地内で培養される。哺乳類宿主細胞はさまざまな培地の中で培養可能である。ハム（Ｈａｍ）のＦｌ０（シグマ（Ｓｉｇｍａ））、最小必須培地（ＭＥＭ）、シグマ）、ＲＰＭＩ１６４０（シグマ）、及びダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ、シグマ）いったような市販の培地が標準的に宿主細胞の培養に適している。既定の培地は一般に必要に応じてホルモン及び／又はその他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン又は上皮細胞増殖因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン及びチミジン）、抗生物質、微量元素及びグルコース又は同等のエネルギー源で補足される。当業者にとっては既知であると思われるその他の必要な補足物も適切な濃度で内含させることができる。温度、ｐＨなどなどの特定の細胞系統のための適切な培養条件が一般に当該技術分野において知られており、例えば「ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＡｌｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｃｆｍ」にてオンラインで入手可能なＡＴＣＣカタログなどの中で数多くの細胞系統の培養についての培養条件が示唆されている。
【０２２４】
該発明のベクターは、動物モデル又はヒトの対象において２つ以上のタンパク質又はポリペプチドを発現するための自己プロセッシング分割配列を介してつながれた多重遺伝子を送達するべくさまざまな経路（例えば皮内、静脈内、腫瘍内、脳内、門脈内、腹腔内、筋内、膀胱内など）を介してｉｎ  ｖｉｖｏで投与され得る。投与経路に応じて、治療用タンパク質はその効果を局所的に（例えば脳内又は膀胱内）又は全身的に（その他の投与経路）惹起する。本発明のベクター中のタンパク質又はポリペプチドのための読取り枠に対して５’のところにある組織特異的プロモータの使用は、ベクターによりコードされた２つ以上のタンパク質又はポリペプチドの組織特異的発現をもたらすために用いることができる。
【０２２５】
トランス遺伝子を担持する組換え型ベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏ、エクスビトロ又はｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞内に導入するさまざまな方法がこれまでに記述されてきており、当該技術分野において周知である。本発明は、該発明の組換え型ベクターで標的細胞を形質導入することによる治療的方法、ワクチン及び癌療法を提供している。
【０２２６】
例えば、該発明の組換え型ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ送達は、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺及び皮膚を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）多様な臓器タイプにターゲティングすることができる。
【０２２７】
ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子転移の場合、標的細胞は、宿主からとり出され、本発明の組換え型ベクター及び当該技術分野において周知の方法を用いて実験室内で遺伝子的に修飾される。
【０２２８】
該発明の組換え型ベクターは、上述の様式を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）従来の投与様式を用いて投与可能である。該発明の組換え型ベクターは、液体溶液及び懸濁液、小胞、リポソーム、及び注射可能な又は不溶融性の溶液などのさまざまな処方物のいずれかの形で提供可能である。好ましい形態は、投与様式及び治療的利用分野に応じて左右される。送達経路に適した形態を、関係する技術の当業者が一般に利用できる知識を用いて容易に決定することができる。
【０２２９】
組換え型タンパク質及びポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ産生における該発明の発明力ある組換え型ベクター構成体を用いることで実現されるはずの数多くの利点としては、患者の体内で２つ以上の組換え型タンパク質又はポリペプチドＯＲＦを長時間持続的に発現させるための単一ベクターの投与；生物活性をもつ２つ以上の組換え型タンパク質又はポリペプチドＯＲＦのｉｎ  ｖｉｖｏ発現；及びヒトの細胞内で生成された組換え型タンパク質又はポリペプチドの天然の翻訳後修飾、が含まれる。
【０２３０】
１つの好ましい態様は、組換え型タンパク質及びポリペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生のための本発明の組換え型ベクター構成体の使用である。組換え型タンパク質産生のための方法は当該技術分野において周知であり、本発明の自己プロセシング分割部位含有ベクター構成体は、かかる標準的方法を用いて組換え型タンパク質及びポリペプチドを発現するために利用可能である。
【０２３１】
該発明の一実施例においては、細胞に対するベクターの導入又は投与（トランスフェクション）の後に以下の工程のうちの１つ以上のものが続く：
（１）  組換え型タンパク質又はポリペプチドを発現する細胞を選択するような条件下でトランスフェクションを受けた細胞を培養する工程；
（２）  組換え型タンパク質又はポリペプチドの発現を評価する工程；
及び
（３）  組換え型タンパク質又はポリペプチドを収集する工程。
【０２３２】
以上で言及されたレトロウイルスプラスミドベクターを誘導しうるレトロウイルスとしては、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス及び乳房腫瘍ウイルスが含まれるがこれに制限されるわけではない。１実施形態においては、レトロウイルスプラスミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから誘導される。
【０２３３】
ベクターには１つ以上のプロモータが含まれる。利用可能な適切なプロモータとしては、レトロウイルスＬＴＲ；ＳＶ４０プロモータ；及びミラーら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第７巻、第９号、９８０−９９０頁（１９８９年)に記述されたヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、又はその他のあらゆるプロモータ（例えばヒストン、ｐｏｌＩＩＩ、及び．ベータ．−アクチンプロモータを含む（ただしこれに制限されるわけではない）真核細胞プロモータなどの細胞プロモータ）が含まれるが、これに制限されるわけではない。利用可能なその他のウイルスプロモータには、アデノウイルスプロモータ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ、及びＢ１９パルボウイルスプロモータが含まれるが、これらに制限されるわけではない。適切なプロモータの選択は、本書に含まれている教示から当業者には明らかとなるであろう。
【０２３４】
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は適切なプロモータの制御下にある。利用可能な適切なプロモータとしては、アデノウイルスプロモータ例えば、アデノウイルス主要後期プロモータ；又は非相同プロモータ例えばサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモータ；誘導的プロモータ例えばＭＭＴプロモータ、メタロチオネイシプロモータ；熱ショックプロモータ；アルブミンプロモータ；ＡｐｏＡＩプロモータ；ヒトグロビンプロモータ；ウイルスチミジンキナーゼプロモータ、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ；レトロウイルスＬＴＲ（上述の修飾型レトロウイルスＬＴＲを含む）；β−アクチンプロモータ；及びヒト成長ホルモンプロモータが含まれるが、これに制限されるわけではない。プロモータは同様に、ポリペプチドをコードする遺伝子を制御する未変性プロモータでもあり得る。
【０２３５】
レトロウイルスプラスミドベクターは、産生細胞系統を形成するべくパッケージング細胞系統を形質導入するために利用される。トランスフェクションを受け得るパッケージング細胞の例としては本発明に参照により援用されているミラー、「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、第１巻、５−１４頁（１９９０年）中に記述された通りのＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍｌ２及びＤＡＮ細胞系統が含まれるがこれに制限されるわけではない。ベクターは、当該技術分野において既知のあらゆる手段を通してパッケージング細胞を形質導入し得る。かかる手段には、電気穿孔法、リポソームの使用及びＣａＰＯ４沈殿が含まれるがこれに制限されるわけではない。１つの変形形態においては、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム内に封入するか又は脂質にカップリングし、次に宿主に投与することができる。
【０２３６】
産生細胞系統は、ポリペプチドをコードする核酸配列を内含する感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベクター粒子は、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで真核細胞を形質導入するために利用可能である。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列を発現することになる。形質導入されうる真核細胞としては、胚幹細胞、胚性癌腫細胞、ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞及び気管支上皮細胞が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０２３７】
ＩＶ．  体外から供給されたコーディング核酸分子を含有する宿主細胞
本発明はさらに、レナラーゼタンパク質をコードする核酸分子で形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は原核細胞又は真核細胞のいずれでもあり得る。該発明のタンパク質の発現のために有用である真核細胞は、その細胞系統が細胞培養方法と相容性がありかつ発現ベクターの伝搬及び遺伝子産物の発現と相容性があるかぎり、制限されない。好ましい真核宿主細胞には、マウス、ラット、サル又はヒト細胞系統及びその他の不死化された細胞系統由来のものといった好ましくは脊椎動物細胞である哺乳類細胞及び酵素、昆虫細胞が含まれるがこれに制限されるわけではない。好ましい真核宿主細胞には、ＣＣＬ６１としてＡＴＣＣから入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＲＬ１６５８としてＡＴＣＣから入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞Ｎ阻害物質／３Ｔ３、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）及び類似の真核組織培養細胞系統及びその他の不死化された細胞系統が含まれる。
【０２３８】
該発明のタンパク質をコードするｒＤＮＡ分子を発現するためにあらゆる原核宿主を使用することができる。好ましい原核宿主はＥ．ｃｏｌｉである。
【０２３９】
本発明のｒＤＮＡ分子での適切な細胞宿主の形質転換は、標準的に使用されるベクターのタイプ及び利用される宿主系によって左右される周知の方法によって達成される。原核宿主細胞の形質転換に関しては、電気穿孔法及び塩処理方法が標準的に利用される。例えばコーエンら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第６９号、２１１０頁、１９７２年；及びマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｍｍａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８２年）を参照のこと。ｒＤＮＡを含有するベクターでの脊椎動物の細胞の形質転換に関しては、電気穿孔法、カチオン脂質又は塩処理方法が標準的に利用される。例えばグラハムら、Ｖｉｒｏｌ．、第５２号、４５６頁、１９７３年；ウィグラー（Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第７６号、１３７３〜７６頁、１９７９年を参照のこと。
【０２４０】
首尾よく形質転換された細胞すなわち本発明のｒＤＮＡ分子を含有する細胞は、選択性マーカーについての選択を含む周知の技術により同定可能である。例えば、本発明のｒＤＮＡの導入の結果得られた細胞をクローニングして単一のコロニーを産生することができる。これらのコロニーからの細胞を収獲し、溶解させ、サザーン、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第９８号、５０３頁、１９７５年、又はベレント（Ｂｅｒｅｎｔ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．第３号、２０８頁、１９８５年により記述されているもののような方法又は免疫学的方法を介してアッセイされた細胞から産生されたタンパク質を用いてｒＤＮＡの存在についてそのＤＮＡ含有量を検査した。
【０２４１】
Ｖ．  アンチセンス分子、リボザイム及び干渉性ＲＮＡ
さらに、該発明は、細胞プロセスにおけるレナラーゼの役割を解明するための有用なモデルである、アンチセンス核酸を含む組換え細胞を内含する。すなわち、バルーンにより損傷された脈管内そしてより特定的に言うとその外膜内でのレナラーゼの発現の増加は、レナラーゼが負のリモデリング及び動脈再狭窄に結びつけられる細胞増殖に関与することを示している。従って、レナラーゼに相補的であるもののアンチセンス配向にあるアンチセンス核酸を含むトランスジェニック細胞が、レナラーゼ作用機序の研究及び細胞内でのその役割の研究のための有用な手段である。
【０２４２】
当業者であれば、本書で提供されている開示に基づいて、レナラーゼをコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を、細胞のトランスフェクションのために使用することができ、かつレナラーゼの機能を研究し有用な療法及び診断を識別する目的でレナラーゼの改変された発現の効果を判定するためにその細胞を研究できるということを認識できる。
【０２４３】
さらに、細胞内のレナラーゼ発現及び／又は活性を減少させる方法は、レナラーゼ発現の増大、細胞又はそれからの分泌内のレナラーゼタンパク質のレベル増大及び／又はレナラーゼ活性の増大により媒介される又はそれに付随する疾病、障害又は身体状態のための有用な診断法及び／又は療法を提供することができる。
【０２４４】
当業者であれば、細胞内のレナラーゼｍＲＮＡ及び／又はタンパク質のレベルを減少させるための１つの方法は、タンパク質をコードする核酸の発現を阻害することである、ということがわかるだろう。例えばアンチセンス分子を使用して、さらには同様に例えばウィアニー（Ｗｉａｎｎｙ）及びケルニッカ・ゲーツ（Ｋｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚ）（２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、第２号、７０〜７５頁）で記述されているようにリボザイム又は２本鎖ＲＮＡを用いることにより、レナラーゼの発現を阻害することができる。
【０２４５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮｉ）は、さまざまな範囲の生体及び細胞型の中への２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入が相補的ｍＲＮＡの分解をひき起こす１つの現象である。細胞内で、長いｄｓＲＮＡは、短かい２１〜２５ヌクレオチドの小さい干渉性ＲＮＡつまりｓｉＲＮＡへと、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）として知られるリボヌクレアーゼにより分割される。ｓｉＲＮＡはその後タンパク質構成要素と集合して、プロセス中で巻戻されるＲＮＡ誘発型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）となる。活性化されたＲＩＳＣはこのとき、ｓｉＲＮＡアンチセンスストランドとｍＲＮＡの間の塩基対合相互作用により相補的写しに結合する。結合したｍＲＮＡは分割させられ、ｍＲＮＡの配列特異的分解が遺伝子サイレンシングを結果としてもたらす。例えば、米国特許第６，５０６，５５９号明細書；ファイアー（Ｆｉｒｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９９８年）、第３９１（１９）号、３０６〜３１１頁；ティモンズ（Ｔｉｍｍｏｎｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、（１９９８年）、第３９５号、８５４頁；モンゴメリー（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ）ら、「ＴＩＧ」（１９９８年）第１４（７）号、２５５−２５８頁；デービッド（Ｄａｖｉｄ）Ｒ．エンゲルケ（Ｅｎｇｅｌｋｅ）編、「ＲＮＡ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ）Ｎｕｔｓ  ＆  Ｂｏｌｔｓ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ＤＮＡ  Ｐｒｅｓｓ（２００３）；及びグレゴリー（Ｇｒｅｇｏｒｙ）Ｊ．ハモン（Ｈａｎｎｏｎ）編、「ＲＮＡｉ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００３年）を参照のこと。従って、本発明は同様に、ＲＮＡｉ技術を用いることによりレナラーゼをコードする遺伝子をサイレンシングする方法をも内含する。
【０２４６】
アンチセンス分子及び遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用は、当該技術分野において周知である（例えばコーエン、１９８９年、「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ中を参照のこと）。アンチセンス核酸は、本書の他の場所でこの用語が定義づけされている通り、特定的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子である（ワイントラーブ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ、第２６２号、４０頁）。細胞内、アンチセンス核酸は、対応するｍＲＮＡにハイブリッド形成し、２本鎖分子を形成して遺伝子の翻訳を阻害する。
【０２４７】
遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス方法の使用は、当該技術分野において既知であり、例えばマーカス・サクラ（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ）（１９８８年、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１７２号、２８９頁）中で記述されている。かかるアンチセンス分子は、井上（１９９３年、米国特許第５，１９０，９３１号）によって教示されているようにアンチセンス分子をコードするＤＮＡを用いて遺伝子発現を介して細胞に選択され得る。
【０２４８】
代替的には、該発明のアンチセンス分子を合成的に作り、その後細胞に提供することが可能である。約１０〜約３０の間、より好ましくは約１５のヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーは、容易に合成され標的細胞内に導入されることから好まれる。該発明によって考慮されている合成アンチセンス分子には、未修飾のオリゴヌクレオチドに比べ改良された生物活性をもつ当該技術分野において既知のオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる。（その全体が本発明に参照により援用されているコーエン、上掲書；タリス、１９９１年、米国特許第５，０２３，２４３号を参照のこと）。
【０２４９】
リボザイム及び遺伝子発現を阻害するためのその使用も、当該技術分野において周知である（例えばその全体が本発明に参照により援用されているチェック（Ｃｅｃｈ）ら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６７号、１７４７９〜１７４８２頁；ハンペル（Ｈａｍｐｅｌ）ら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２８号、４９２９〜４９３３頁；エクスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）ら、国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号パンフレット；アルトマン（Ａｌｔｍａｎ）ら、米国特許第５，１６８，０５３号明細書を参照のこと）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似の要領で、その他の１本鎖ＲＮＡを特異的に分割する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を通して、ＲＮＡ分子内の特定のヌクレオチド配列を認識しそれを分割するように分子を工学処理することができる（チェック、１９８８年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ、第２６０号、３０３０頁）。このアプローチの主要な利点は、配列特異的であることを理由として、特定の配列をもつｍＲＮＡのみが不活性化されるという点にある。
【０２５０】
リボザイムには２つの基本タイプ、すなわちテトラヒメナタイプ（ハッセルホフ（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ）、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、第３３４号、５８５頁）とハンマーヘッドタイプが存在する。テトラヒメナタイプのリボザイムは、長さが４塩基の配列を認識し、一方ハンマーヘッドタイプのリボザイムは長さが１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。配列が長くなればなるほど、標的ｍＲＮＡ種内で排他的に配列が発生する確率は高くなる。その結果、特定のｍＲＮＡ種を不活性化するためには、テトラヒメナタイプのリボザイムよりもハンマーヘッドタイプのリボザイムが好ましく、さまざまな無関係のｍＲＮＡ分子内で無作為に発生し得るより短い認識配列よりも１８塩基の認識配列の方が好ましい。
【０２５１】
レナラーゼの発現を阻害するのに有用なリボザイムは、配列番号：１に対し少なくとも約３３％の相同性を有するか又はレナラーゼによりコードされたレナラーゼのｍＲＮＡ配列に相補的である標的配列を基本的リボザイム構造内に取込むことによって設計可能である。好ましくは、該配列は、配列番号：１に対して少なくとも約３５％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約４０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約４５％の相同性、さらに一層好ましくは少なくとも約５０％の相同性、より好ましくは少なくとも約５５％の相同性、より好ましくは少なくとも約６０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約６５％の相同性、さらに一層好ましくは少なくとも約７０％の相同性、より好ましくは少なくとも約７５％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約８０％の相同性、さらに一層好ましくは少なくとも約８５％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性、さらに好ましくは少なくとも約９５％の相同性、そして最も好ましくは少なくとも約９９％の相同性を有する。レナラーゼをターゲティングするリボザイムは、市販の試薬（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を用いて合成可能であるか又はそれらをコードするＤＮＡから遺伝子的に発現され得る。
【０２５２】
Ｖ．  組換え細胞及びトランスジェニック非ヒト哺乳類
該発明には、なかんずくレナラーゼをコードする単離された核酸、それに相補的なアンチセンス核酸、レナラーゼを特異的に結合させる抗体をコードする核酸などを含む組換え細胞が含まれる。１つの態様においては、組換え細胞は、レナラーゼをコードする核酸の一部分をコードするベクター（例えばプラスミド、など）で過渡的にトランスフェクションを受ける可能性がある。該核酸は、細胞ゲノム内に組込まれる必要も、又細胞内で発現される必要もない。その上、該細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得、該発明は、いずれかの特別な細胞系統または細胞型に制限されるものとみなされるべきではない。かかる細胞には、線維芽細胞、マウス幹細胞、両生類卵母細胞、骨芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞などが含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０２５３】
１態様においては、トランスジェニック非ヒト哺乳類を産生するために哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含む組換え細胞が使用される。すなわち、該発明の外因性核酸、又は本書で同様に用いられている用語である「トランス遺伝子」は、細胞内に導入され、次に該細胞を用いて非ヒトトランスジェニック哺乳類が生成される。トランス遺伝子が導入される細胞は好ましくは胚幹（ＥＳ）細胞である。しかしながら、該発明は、該発明のトランス遺伝子を含むＥＳ細胞のみ又はトランスジェニック動物を生産するのに用いられる細胞のみに制限されるとみなされるべきではない。むしろ、該発明のトランスジェニック細胞には、トランス遺伝子を含むトランスジェニック動物から誘導されるあらゆる細胞、トランスジェニックＥＳ細胞から誘導されたキメラ動物から誘導されたトランス遺伝子を含む細胞、そして非ヒトトランスジェニック動物を生成するために使用できる又はできないトランス遺伝子を含むその他のあらゆる細胞が含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０２５４】
さらに、トランス遺伝子を含むすなわち組換え細胞の目的がトランスジェニック動物の生成に制限されるものとみなされるべきでないということを指摘しておくことが重要である。むしろ、該発明は、制限的な意味なく哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含む原核細胞及び真核細胞を含め、哺乳類レナラーゼをコードする核酸が中に導入されるあらゆる細胞型を含むものとみなされるべきである。
【０２５５】
細胞が真核細胞である場合、該細胞は、該発明のトランス遺伝子が中に導入され、所望の遺伝子によりコードされたタンパク質がもはやそれから発現されなくなった時点で利点が得られるようなあらゆる真核細胞であり得る。このような利点には、所望の遺伝子の発現の欠如が実験室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで或いはその細胞が常在する哺乳類の体内で研究され得る系、研究、診断及び治療用手段として、該導入された遺伝子欠失を含む細胞を使用できる系、そして、例えばＥＳＲＤ及び高血圧を含む哺乳類体内の選択された疾病状態のための新しい診断及び治療用手段の開発にとって有用である動物モデルが生成される系が提供されてきたという事実が含まれ得る。
【０２５６】
代替的には、該発明は、そのトランス遺伝子が中に導入されかつ予め細胞内に存在するか発現されていなかった場合又はトランス遺伝子が導入される前のものと異なるレベルで又は異なる状況下で現在発現されている場合には所望の遺伝子によりコードされたタンパク質がそこから発現された時点で、利点が得られるような真核細胞を含む。このような利点には、所望の遺伝子の発現が実験室内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで或いはその細胞が常在する哺乳類の体内で研究され得る系、研究、診断及び治療用手段として、該導入された遺伝子を含む細胞を使用できる系、そして、哺乳類体内の選択された疾病状態のための新しい診断及び治療用手段の開発にとって有用である動物モデルが生成される系が提供されてきたという事実が含まれ得る。
【０２５７】
レナラーゼをコーディングする単離された核酸を発現するこのような細胞を用いて、低レベルのレナラーゼ発現及び／又は活性に付随する疾病、障害又は身体状態を治療又は緩和するのにより高いレナラーゼレベルが有用であり得る細胞、組織又は動物全体に対しレナラーゼを提供することができる。かかる疾病、障害又は身体状態としてはＥＳＲＤ、高血圧、心臓血管疾患が含まれるがこれに制限されるわけではない。かくして、レナラーゼのさらなる発現がより低い血圧を導く可能性がある。従って、該発明は、レナラーゼ発現、タンパク質レベル、及び／又は活性を増大させることが疾病、障害又は身体状態を治療又は緩和するのに有用であり得る場合に、レナラーゼ発現、翻訳及び／又は活性を増大又は誘発するためのレナラーゼを発現する細胞を含んでいる。
【０２５８】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づき、該発明の「ノックイン」又は「ノックアウト」ベクターが、それぞれ置換又は欠失されるべき核酸の２つの部分と相同な少なくとも２つの配列を含むことを認識するだろう。該２つの配列は、遺伝子をフランキングする配列と相同である。すなわち、１つの配列は、レナラーゼをコードする核酸のコーディング配列の５’部分にあるか又はその近くの領域と相同であり、もう一方の配列は最初のものからさらに下流にある。当業者であれば、本書で提供されている開示に基づいて、本発明がいずれかの特定的なフランキング核酸配列に制限されないということを認識することだろう。その代り、ターゲティングベクターは、それぞれ哺乳類ゲノムから又はその中にレナラーゼをコーディングする核酸又はそのフラグメントの一部又は全てを除去する（すなわち「ノックアウト」ベクター）又はそれらを挿入する（すなわち「ノックイン」ベクター）２つの配列を含むことができる。ターゲティングベクターの重大な特長は、レナラーゼをコードする核酸の全て又は一部分が哺乳類染色体上の１つの場所から欠失されるか又はその中に挿入されるような形で相同性組換えによる欠失／挿入が発生できるようにするため、「ノックアウト」ベクターの場合にはレナラーゼ読取り枠（ＯＲＦ）の反対側のすなわち５’及び３’の末端に向かって位置設定された２つの配列の充分な部分を含むという点にある。
【０２５９】
トランス遺伝子及びノックイン及びノックアウトターゲティングベクターの設計は、当該技術分野において周知であり、サンブルックら、（１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びアウスベルら、（１９９７年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中などといった標準的学術論文の中で記述されている。ターゲティングベクター内で使用されるべきレナラーゼコーディング領域をフランキングするか又はその内部にある上流側及び下流側部分は、既知の方法に基づいて、かつラット及びヒトの両方のレナラーゼの核酸及びアミノ酸配列を含めた本書に提供された開示に基づいて本書に開示されている教示に従って、容易に選択可能である。これらの配列を具備した状態で、当業者であれば同様に本発明のトランス遺伝子及びノックアウトベクターを構築することもできるだろう。
【０２６０】
該発明はさらに、例えばｎｅｏＲ遺伝子をコードする核酸などの選択性マーカーをコードし、かくしてレナラーゼをコードする核酸又はその一部分が欠失しＧ４１８の存在下で成長する細胞の能力によりネオマイシン耐性遺伝子と置換された場合のトランスジェニック細胞の選択を可能にする核酸などの選択性マーカーをコードする核酸を含むノックアウトターゲティングベクターをも含んでいる。しかしながら本発明は、選択性マーカーとしてネオマイシン耐性に制限されるものとみなされるべきではない。むしろ、レナラーゼ遺伝子が欠失されかつ／又は不活性化されしかも選択された選択性マーカーをコードする核酸によって置換された場合に組換え細胞の選択を可能にするべく、ノックダウンターゲティングベクター内で、当該技術分野において周知のその他の選択性マーカーを使用することが可能である。選択性マーカーを選択しベクター内に取込む方法は当該技術分野において周知であり、例えばサンブルックら、（１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びアウスベルら、（１９９７年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）の中で記述されている。
【０２６１】
本書で指摘されているように、該発明は、そのゲノム内の所望の部位の中に挿入されかくして所望の内因性標的遺伝子のコーディング領域を欠失させる外因性核酸を含む非ヒトトランスジェニック哺乳類すなわちノックアウトトランスジェニック哺乳類を含む。さらに、該発明は、レナラーゼをコードする外因性核酸がゲノム内の一部位内に挿入されているトランスジェニック非ヒト哺乳類すなわち「ノックイン」トランスジェニック哺乳類をも含んでいる。挿入された該ノックイントランス遺伝子は、通常細胞内に存在しないか又は標準的にレナラーゼに操作可能に連結されていないレナラーゼをコードする核酸に操作可能に連結されているプロモータ／調節領域であるタグポリペプチドなどをコードするさまざまな核酸を含み得る。
【０２６２】
該発明の非ヒトトランスジェニック哺乳類の生成は好ましくは、ここで記述する方法を用いて達成される。しかしながら、該発明は、その他の方法を用いて所望のノックアウト哺乳類を生成することができるという点で、この方法の使用のみに制限されるものとみなされるべきでは全くない。非ヒトトランスジェニック哺乳類を生成する好ましい方法においては、該発明のトランス遺伝子を含むＥＳ細胞が生成され、次にこの細胞は、基本的にナギー（Ｎａｇｙ）及びロサント（Ｒｏｓｓａｎｔ）（１９９３年、「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、１４６−１７９頁、Ｊｏｙｎｅｒ  ｅｄ．、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）中に記述されている通りにノックアウト動物を生成するために使用される。ＥＳ細胞は、宿主胚盤胞又は会合体の中に分割球期の胚を注射することにより胚環境に戻された場合に、正常な胚細胞として挙動する。このように戻された時点で、細胞は胚の全ての系統に沿って発達するのに充分な潜在性を有する。かくして、ＥＳ細胞を得、所望のＤＮＡをその中に導入し、次に、所望のＤＮＡが発現され得る成熟した哺乳類細胞へと発達するための胚環境にその細胞を戻すことが可能である。
【０２６３】
トランスジェニックマウスの生成のための精確なプロトコルはナギー及びロサント（１９９３年、「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｊｏｙｎｅｒ  ｅｄ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１４６〜１７９頁）中で開示されており、従って本書ではくり返さない。中に所望のＤＮＡを導入するためのＥＳ細胞のトランスフェクション又は形質導入は、例えばサンブルックら、（１９８９年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、及びアウスベルら、（１９９７年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中に記述されているもののような標準的プロトコルを用いて達成される。好ましくは、該発明のトランス遺伝子内に含まれている所望のＤＮＡはＥＳ細胞内に電気穿孔され、細胞はソリアーノ（Ｓｏｒｉａｎｏ）ら、（１９９１年、「Ｃｅｌｌ」第６４号、６９３〜７０２頁）中で記述されている通りに伝搬させられる。
【０２６４】
哺乳類の受精卵内への単離された核酸の導入は、トランスジェニック技術における任意の数の標準的技術によって達成される（ホーガン（Ｈｏｇａｎ）ら、１９８６年、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）。最も一般的には、マイクロインジェクションを用いて胚の中に核酸が導入される。
【０２６５】
核酸が卵の中にひとたび導入されると、この卵は短時間インキュベートされ、その後、例えばホーガンら、（１９８６年、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹに記述されているように卵が得られたのと同じ種の偽妊娠した哺乳類の中に転移させられる。標準的には、実験１回につき数多くの卵が注入され、卵のうち約３分の２がこの処置に生き延びる。その後約２０の生存可能な卵が偽妊娠動物内に転移され、通常こうして転移された生存可能な卵のうち４個〜１０個が生きた子供へと発達する。
【０２６６】
その哺乳類レナラーゼ遺伝子の全て又は一部分の欠失を含むトランス遺伝子を宿すトランスジェニック細胞又はトランスジェニック哺乳類を生産するために、本書に記述されている方法においてあらゆる哺乳類レナラーゼ遺伝子を使用することができる。
【０２６７】
該発明のトランスジェニック哺乳類は、あらゆる哺乳類種であり得る。かくして該発明は、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ及び畜牛を含めたキメラ核酸をコードするトランスジェニック哺乳類の生成を内含するものとみなされるべきである。トランスジェニックマウスの生成のために本書に記述されている方法は、任意の哺乳類種を用いて類似の形で応用することができる。好ましくは該発明のトランスジェニック哺乳類はゲッ歯類であり、さらに一層好ましくは、該発明のトランスジェニック哺乳類はマウスである。一例を挙げると、ルカリネン（Ｌｕｋｋａｒｉｎｅｎ）ら、（１９９７年、「Ｓｔｒｏｋｅ」第２８号、６３９−６４５頁）は、トランスジェニックマウスの生成を可能にする遺伝子構成体が、ラットを含めたその他のトランスジェニックゲッ歯類の生成をも可能にする、ということを教示している。同様にして、１つの種の動物の遺伝子座の中のヌル接合体突然変異を、第１の種との高い相同性をもつ遺伝子座をもつもう１つの種の動物の中で複製させることができる。
【０２６８】
該発明のトランスジェニック哺乳類を同定するためには、サザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ及び／又はＲＴ−ＰＣＲなどの標準的な技術を用いて単離された核酸の存在について子供を検査する。哺乳類の細胞及び組織内の核酸の発現も同様に、本書で記述されている通常の技術を用いて査定される。さらにトランスジェニック動物の循環血中のレナラーゼの有無は、タンパク質が分泌されている場合、例えばウエスタンブロット分析を用いて又は当該技術分野において周知であるタンパク質検出のための標準的方法を用いて判定可能である。
【０２６９】
本書にその用語が使用されている通り、同じく「トランスジェニック細胞」とみなされる該発明のトランスジェニック哺乳類から得た細胞は、本書の他の場所で記述されているレナラーゼ（＋／−）及び（−／−）トランスジェニック非ヒト哺乳類から得られるもののような細胞を包含し、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓血管疾患などのレナラーゼ発現の改変されたレベルと結びつけられると考えられている哺乳類の疾病及び症候及びレナラーゼ発現の改変されたレベルに結びつけられるその他のあらゆる疾病、障害又は身体状態をモデリングするための有用な系である。
【０２７０】
特に適しているのは、レナラーゼ遺伝子を含むトランス遺伝子が発現されるか又はさまざまな組織内のレナラーゼの発現を阻害する、本書に記述された非ヒトノックアウト又はノックイントランスジェニック哺乳類の組織から誘導された細胞である。一例としては、かかる細胞が誘導される細胞型としては、線維芽細胞及び（１）レナラーゼ（＋／＋）、（＋／−）及び（−／−）非ヒトトランスジェニック生産哺乳類、（２）レナラーゼ（＋／＋）、（−／−）又は（＋／−）胎児動物、及び（３）レナラーゼ（＋／＋）、（−／−）及び（＋／−）胎児及び生産哺乳類の類似の細胞が含まれる。
【０２７１】
当業者であれば、この開示に基づいて低レベルのレナラーゼタンパク質、低レベルのレナラーゼ活性又はその両方を含む細胞にはレナラーゼ発現の阻害物質（例えばアンチセンス又はリボザイム分子）を発現する細胞が含まれるがこれに制限されるわけではないことを認識するであろう。
【０２７２】
哺乳類細胞が本書で記述するトランスジェニックマウスなどのマウスから得られた細胞を含む（ただしこれに制限されるわけではない）哺乳類から得られる、培養中の哺乳類細胞を維持するために有用な方法及び組成物が、当該技術分野において周知である。
【０２７３】
代替的には、組換え細胞を投与することで細胞、組織及び／又は動物にタンパク質が投与されることになる場合、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ療法の内部でレナラーゼを発現する組換え細胞を投与することができる。付加的には、組換え細胞は、レナラーゼリガンド及びレナラーゼシグナリング経路の発見のために有用である。
【０２７４】
レナラーゼが細胞移動、外膜線維症、動脈再狭窄、負のリモデリングなどにおいて１つの役割を果たすという仮説が立てられてきたため、細胞のホメオステシス及び細胞増殖及び／又は移動に対するレナラーゼレベルの上昇及び降下の効果を研究するために、該発明の組換え細胞を使用することができる。
【０２７５】
細胞がレナラーゼを発現しないか又は生物活性の欠如した減少した又は改変されたレナラーゼを発現する該発明の組換え細胞は、同様に、動物自身の細胞（例えば線維芽細胞など）か又は同系適合したドナーの細胞のいずれかが（例えば、レナラーゼ発現及び／又はタンパク質のレベルが組換え細胞内で低減させるような形でアンチセンス核酸又はノックアウトベクターを挿入することにより）本書の他の場所で記述されている通りに組換えにより工学処理され、組換え細胞がレシピエント動物に投与される場合、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの細胞療法においても使用することができる。このようにして、それ自身の細胞が高レベルのレナラーゼを発現しかくして本書の他の場所で開示されている通り増大したレナラーゼ発現と結びつけられる又はそれにより媒介される疾病、障害又は身体状態を治療又は緩和する動物に対し、低レベルでレナラーゼを発現する組換え細胞を投与することができる。
【０２７６】
例えばレナラーゼノックアウトマウスなどの外膜線維症、動脈再狭窄などに対する感受性を付与された該発明のトランスジェニック哺乳類は、これらの疾病の病原論及びその中でのレナラーゼの潜在的役割を研究するために使用することができる。
【０２７７】
さらに、該発明のトランスジェニック哺乳類及び／又は細胞を用いてさらにレナラーゼの細胞内局在化を研究することが可能である。同様に、該発明のトランスジェニック哺乳類（＋／−及び−／−生産児及び胎児の両方）を用いて、レナラーゼ作用の標的ならびにレナラーゼと結合して細胞内でのその効果を媒介するあらゆる受容体及び／又はリガンドを解明するべくカテコールアミン循環におけるレナラーゼの役割を研究することができる。
【０２７８】
ＶＩ．  抗体
該発明は同様に、特異的にレナラーゼを結合させる抗体又はそのフラグメントをも含んでいる。当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、レナラーゼを特異的に結合させる抗体がヒトレナラーゼ又はその免疫原性部分などの（ただしこれに制限されるわけではない）該発明のタンパク質と結合することが理解できることと思われる。１実施形態においては、該抗体は配列番号：２のアミノ酸配列を含むラットのレナラーゼに向けられている。
【０２７９】
当該技術分野において周知の標準的な免疫学的技術に従ってウサギを免疫化することによって、ポリクローナル抗体が生成される（例えばハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら、１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ中を参照のこと）。このような技術には、マルトース結合タンパク質又はグルタチオン（ＧＳＨ）タグポリペプチド部分といったもう１つのタンパク質の一部分、及び／又はレナラーゼ部分を免疫原性にするような部分（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と接合されたレナラーゼ）、及びそれぞれのゲッ歯類及び／又はヒトのレナラーゼアミノ酸残基を含む部分を含むキメラタンパク質で動物を免疫化する作業が含まれる。キメラタンパク質は、ｐＭＡＬ−２又はｐＣＭＸといった（ただしこれに制限されるわけではない）ようなこの目的に適したプラスミドベクター内にレナラーゼをコーディングする適切な核酸（例えば配列番号：１）をクローニングすることによって産生される。
【０２８０】
しかしながら、該発明は、これらの抗体又はタンパク質抗原のこれらの部分のみに制限されるものとみなされるべきではない。むしろ該発明は、その用語が本書の他の場所で定義されているように、ラット及びヒトのレナラーゼ又はその一部分に対するその他の抗体を包含するものとみなされるべきである。さらに本発明は、なかでもレナラーゼと結合する抗体を包含するものとみなされるべきであり、これらは、ウエスタンブロット上に存在するレナラーゼを結合させ、又は組織の免疫組織化学染色においてレナラーゼを結合させて組織内のレナラーゼを位置特定し、又少なくともレナラーゼの一部分をコードする核酸で過渡的なトランスフェクションを受けた細胞の免疫螢光顕微鏡検査法においてレナラーゼを結合させることができる。
【０２８１】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、該抗体が該タンパク質の任意の部分と特異的に結合でき、全長タンパク質を用いてそれに特異的な抗体を生成することができるということを認識するであろう。しかしながら、本発明は、免疫原として全長タンパク質を使用することに制限されるものではない。むしろ、本発明は、哺乳類レナラーゼと特異的に結合する抗体を産生するためにタンパク質の免疫原性部分を使用することを含んでいる。すなわち、該発明は、レナラーゼタンパク質の免疫原性部分又は抗原決定基を用いて動物に免疫付与する工程を含む。抗体は、該発明のタンパク質又はその一部分でウサギ又はマウスといった（ただしこれに制限されるわけではない）動物に免疫付与することによって、又は、レナラーゼの少なくとも一部分を含むタンパク質、又は例えば適切なレナラーゼアミノ酸残基を含む部分と共有結合により連結されたマルトース結合タンパク質タグポリペプチド部分を含むタグポリペプチド部分を含む融合タンパク質を用いて動物に免疫付与することによって産生可能である。当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、これらのタンパク質のより小さなフラグメントを用いてレナラーゼに特異的に結合する抗体を産生することができるということを認識するだろう。
【０２８２】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、単離されたレナラーゼポリペプチドのさまざまな部分を用いて、レナラーゼの極めて保存度の高い領域又はポリペプチドの保存されていない領域のいずれかに対する抗体を生成することができるということを認識すると思われる。本書のその他の場所で開示されている通り、レナラーゼは、Ｎ末端からの推定上のシグナルペプチド、ＦＡＤ結合ドメイン（約４〜３５のアミノ酸残基）；アミンオキシダーゼドメイン（約７５〜３３９のアミノ酸残基）を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）さまざまな保存されたドメインを含む。
【０２８３】
レナラーゼの配列及び該タンパク質のさまざまな保存された及びされていないドメインを位置特定する詳細な分析をひとたび具備したならば、当業者は、本書に提供されている開示に基づいて、当該技術分野において周知の方法又は今後開発すべき方法ならびに本書で開示されている方法を用いて哺乳類レナラーゼポリペプチドのさまざまな部分に特異的な抗体をいかにして得るかを理解するものと思われる。
【０２８４】
さらに、当業者は、本書に提供されている開示に基づいて、問題のタンパク質の非保存領域が、さまざまな生体の間で保存されている保存度の高い領域よりもさらに高い免疫原性を有し得ることがわかるであろう。さらに、非保存免疫原性部分を用いた免疫付与により非保存領域に特異的な抗体を産生しかくして１つ以上の保存部分を共有し得るその他のタンパク質と相互作用しない抗体を産生することが可能となる。かくして、当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、各々のレナラーゼ分子の非保存領域を用いて、そのレナラーゼについてのみ特異的であってその他のレナラーゼ又はその他のタンパク質と特異的に交差反応しない抗体を産生することができる、ということを認識するものと思われる。
【０２８５】
代替的には、当業者は同様に、本書に提供されている開示に基づいて、１つ以上のレナラーゼ分子の間で保存されている領域を用いて開発された抗体を用いて、１つ以上のレナラーゼ分子と特異的に反応する抗体を産生することができるということをも理解すると思われる。そうでなければタンパク質のその他の部分よりも免疫原性が低いものであり得る保存されたタンパク質ドメインと特異的に結合する抗体を産生するための方法は、当該技術分野において周知であり、分子（例えばキーホールリンペットヘモシアニンなど）に対し問題のタンパク質フラグメントを接合させ、かくしてタンパク質ドメインに免疫原性を与えること、又はアシュバント（例えばフロイント完全及び／又は不完全アシュバントなど）の使用によるもの、又はその両方を含むがこれに制限されるわけではない。かくして、該発明は、全てのレナラーゼと特異的に結合する抗体を含めて、２つ以上のレナラーゼと特異的に結合する抗体及び少なくとも１つのレナラーゼを認識する抗体を包含している。
【０２８６】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、レナラーゼのどの部分が、保存されたドメインを共有するその他のタンパク質と比較的低い相同性を有するかを認識することであろう。しかしながら、本発明は、特定のいずれかのドメインに制限されるわけではない。それどころか、当業者であれば、該発明のレナラーゼタンパク質のその他の非保存領域を使用して本書に開示されている通りの該発明の抗体を産生することができるということを理解することだろう。
【０２８７】
従って、当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、本発明が、（例えば必要なレナラーゼ受容体／リガンド相互作用を阻害することにより）レナラーゼ活性を中和及び／又は阻害し、ヒトレナラーゼならびにさまざまな種に由来するレナラーゼ（例えばマウスレナラーゼ）を含む（ただしこれに制限されるわけではない）１つ以上のレナラーゼを認識することのできる抗体を包含しているということを認識することと思われる。
【０２８８】
該発明は、本書で開示されている抗体又は該発明のタンパク質の任意の特定の免疫原性部分のみに制限されるものとしてみなされるべきではない。むしろ、該発明は、その用語が本書のその他の場所で開示されている通り、レナラーゼ又はその一部分に対する、又は配列番号：２のアミノ酸配列をもつポリペプチドと少なくとも約１５％の相同性を共有するタンパク質に対するその他の抗体をも含むものとみなされるべきである。その他の実施形態においては、ポリペプチドは、ヒトレナラーゼに対して少なくとも約２０％の相同性、又は少なくとも約２５％の相同性、又は少なくとも約３０％の相同性、又は少なくとも約３５％の相同性、又は少なくとも約４０％の相同性、又は少なくとも約４５％の相同性、又は少なくとも約５０％の相同性、又は少なくとも約５５％の相同性、又は少なくとも約６０％の相同性、又は少なくとも約６５％の相同性、又は少なくとも約７０％の相同性、又は少なくとも約７５％の相同性、又は少なくとも約８０％の相同性、又は少なくとも約８５％の相同性、又は少なくとも約９０％の相同性、又は少なくとも約９５％の相同性、又は少なくとも約９９％の相同性を有する。もう１つの実施形態においては、哺乳類レナラーゼに特異的な抗体と特異的に結合するポリペプチドはヒトレナラーゼである。
【０２８９】
該発明は、ポリクローナル、モノクローナル、合成抗体などを包含する。当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、該発明の抗体の不可欠な特長は、該抗体がレナラーゼと特異的に結合するという点にあるということを理解することだろう。すなわち、該発明の抗体は、当該技術分野において周知の標準的方法を用いるウエスタンブロット上、細胞の免疫染色及び／又はレナラーゼの免疫沈降においてレナラーゼを結合する抗体により実証される通り、レナラーゼ又はそのフラグメント（例えば免疫原性部分又はその抗原決定基）を認識する。
【０２９０】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、細胞内の関連するタンパク質を位置特定しこうして細胞プロセス内で認識された抗原の役割を研究するために該抗体を使用できるということを認識すると思われる。その上、該抗体を用いて、ウエスタンブロット法及び酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）といった（ただしこれに制限されるわけではない）周知の方法を利用して生物試料中に存在するタンパク質の量を検出しかつ／又は測定することが可能である。さらに、該抗体を用いて、当該技術分野において周知の方法によりその同族抗原を免疫沈降させかつ／又は免疫親和力精製することができる。
【０２９１】
さらに、細胞内のレナラーゼレベルを減少させて細胞内のレナラーゼの効果を阻害させるために該抗体を使用することもできる。かくして、動物の細胞又は組織に又は動物自体に該抗体を投与することにより、必要とされるレナラーゼ受容体／リガンド相互作用は阻害されることになり、かくしてレナラーゼが媒介するシグナリング効果も同様に阻害されることになる。当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、抗レナラーゼ抗体を用いたレナラーゼリガンド／受容体の相互作用の阻害に対する検出可能な効果には、細胞増殖の減少、細胞移動の減少、負のリモデリングの減少、外膜線維症の減少、動脈再狭窄の減少、いずれかの器官又は組織における線維症の減少、骨化又は骨形成の減少などが含まれ得る（ただしこれに制限されるわけではない）ことを理解するものと思われる。
【０２９２】
ポリクローナル抗体の生成は、抗原を所望の動物に接種し、例えばハーロウら、（１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）中に記述されているものなどの標準的な抗体産生方法を用いてそれに由来する抗原を特異的に結合させる抗体を単離することによって達成される。
【０２９３】
タンパク質又はペプチドの全長又はペプチドフラグメントに対して導かれたモノクローナル抗体は、例えばハーロウら、（１９８８年、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）中及びチュジンスキー（Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉ）ら、（１９８８年、「Ｂｌｏｏｄ」、第７２号、１０９〜１１５頁）中で記述されているもののような周知のあらゆるモノクローナル抗体調製手順を用いて調製可能である。所望のペプチドは同様に化学的合成技術を用いて大量に合成することもできる。代替的には、所望のペプチドをコードするＤＮＡをクローニングし大量のペプチドの生成に適した細胞の中で適切なプロモータ配列から発現させることもできる。該ペプチドに向けられたモノクローナル抗体は、本書で参照指示されているような標準的手順を用いてペプチドで免疫付与されたマウスから生成される。
【０２９４】
本書に記述されている手順を用いて得られるモノクローナル抗体をコードする核酸は、当該技術分野において利用可能でありかつ例えばライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、（１９９２年、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、第１２号、１２５〜１６８頁）及びその中で引用されている参考の中で記述されている技術を用いてクローニングされ、配列決定される。
【０２９５】
さらに、該発明の抗体は、例えばライトら、（上掲書）、の中で引用されている参考文献中、そしてグー（Ｇｕ）ら、（１９９７年、「Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈｅｍａｔｏｃｙｓｔ」、第７７号、７５５〜７５９頁）中で記述されている技術及び当該技術分野において周知であるか又は今後開発されるべきその他の抗体ヒト化方法を用いて「ヒト化」され得る。
【０２９６】
ファージ抗体ライブラリを生成するためには、例えば所望の抗体といったファージ表面上で発現されるべき所望のタンパク質を発現する例えばハイブリドーマといった細胞から単離されるｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリがまず最初に得られる。逆転写酵素を用いてｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーが産生される。ＰＣＲにより免疫グロブリンフラグメントを特定するｃＤＮＡが得られ、結果としてのＤＮＡは、免疫グロブリン遺伝子を特定するＤＮＡを含むバクテリオファージＤＮＡライブラリを生成するため、適切なバクテリオファージベクター内にクローニングされる。非相同性ＤＮＡを含むバクテリオファージライブラリを作るための手順は、当該技術分野において周知であり、例えばサンブルックら、上掲書の中で記述されている。
【０２９７】
対応するその結合タンパク質例えば該抗体が向けられている抗原に結合するために利用できるような形でタンパク質がその表面上に表示されるような形で、所望の抗体をコードするバクテリオファージを工学処理することができる。かくして、特異的抗体を発現するバクテリオファージが対応する抗原を発現する細胞の存在下でインキュベートされた時点で、バクテリオファージは細胞に結合することになる。抗体を発現しないバクテリオファージは細胞に結合しない。かかるパニング技術は当該技術分野において周知であり、例えばライトら、（上掲書）の中で記述されている。
【０２９８】
上述の通りのプロセスは、Ｍ１３バクテリオファージ表示を用いてヒト抗体の産生のために開発されてきた（バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）ら、１９９４年、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第５７号、１９１−２８０頁）。基本的に、ｃＤＮＡライブラリが、抗体産生細胞の集団から得られたｍＲＮＡから生成される。ｍＲＮＡは、再配置された免疫グロブリン遺伝子をコードし、かくしてｃＤＮＡもこれをコードする。増幅されたｃＤＮＡはＭ１３発現ベクター内にクローニングされ、その表面上でヒトＦａｂフラグメントを発現するファージライブラリを作り上げる。問題の抗体を表示するファージは、抗原結合によって選択され、細菌内を伝播して可溶性ヒトＦａｂ免疫グロブリンを産生する。かくして、従来のモノクローナル抗体合成とは対照的に、この手順は、ヒト免疫グロブリンを発現する細胞ではなくむしろヒト免疫グロブリンをコードするＤＮＡを不死化する。
【０２９９】
以上で提示した手順は、抗体分子のＦａｂ部分をコードするファージの生成を記述している。しかしながら、該発明は、Ｆａｂ抗体をコードするファージの生成のみに制限されるものとみなされるべきではない。むしろ、１本鎖抗体をコードするファージ（ｓｃＦｖ／ファージ抗体ライブラリ）も同様に該発明に含まれている。Ｆａｂ分子はＩｇ軽鎖を含む。すなわち、これらは軽鎖の可変領域と定常領域の両方を含むが、重鎖については可変領域と第１の定常領域（ＣＨ１）しか含まない。１本鎖抗体分子は、ＩｇＦｖフラグメントを含むタンパク質の１本鎖を含む。ＩｇＦｖフラグメントは、いかなる定常領域も中に含んでおらず、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域のみを含む。ｓｃＦｖＤＮＡを含むファージライブラリは、マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、（１９９１年、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第２２２号、５８１−５９７頁）中に記述された手順に従って生成され得る。このようにして所望の抗体の単離のために生成されたファージのパニングは、ＦａｂＤＮＡを含むファージライブラリについて記述されたものと類似の要領で行なわれる。
【０３００】
該発明は同様に、重鎖及び軽鎖可変領域をそれらが考えられるほぼ全ての特異性を含むような形で合成できるような合成ファージ表示ライブラリを含むものとみなされるべきであるバルバス（Ｂａｒｂａｓ）、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第１号、８３７〜８３９頁；デクリーフ（ｄｅ  Ｋｒｕｉｆ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２４８号、９７〜１０５頁。
【０３０１】
ＶＩＩ．  組成物
該発明は、転写に関してアンチセンス配向にある哺乳類レナラーゼをコードする核酸又はその一部分に相補的な単離された核酸を含む組成物を含む。好ましくは、組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。
【０３０２】
該発明は、本書に記述されているような単離された哺乳類レナラーゼポリペプチドを含む組成物を含む。好ましくは該組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。
【０３０３】
該発明は、レナラーゼを特異的に結合する抗体を含む組成物をも含む。好ましくは組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。
【０３０４】
該発明はさらに、哺乳類レナラーゼをコードする単離された核酸を含む組成物を含む。好ましくは組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。
【０３０５】
組成物は、細胞、組織又は動物に対しレナラーゼを投与するため又は細胞、組織又は動物の中でのレナラーゼの発現を阻害するために使用可能である。組成物は、細胞、組織又は動物の中のタンパク質のレベル又はレナラーゼ発現の減少又は増加が動物にとって有益となるような形でレナラーゼの発現の改変により媒介される疾病、障害又は身体状態を治療するために有用である。すなわち、１匹の動物の体内の疾病、障害又は身体状態がレナラーゼ発現のレベル又はタンパク質レベルの改変により媒介されるか又はそれに結びつけられる場合、該組成物をレナラーゼのこのような発現又はタンパク質レベルを変調させるために使用することができる。
【０３０６】
哺乳類に対し投与するためには、ポリペプチド又はそれをコードする核酸、及び／又はその全て又は一部分に相補的なアンチセンス核酸を、例えば約７．８というｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水といったあらゆる薬学的に許容可能な担体の中で懸濁させることができる。
【０３０７】
有用であるその他の薬学的に許容可能な担体としては、グリセロール、水、生理食塩水、エタノール及びその他の薬学的に許容可能な塩溶液例えばリン酸塩及び有機酸の塩が含まれるが、これに制限されるわけではない。当業者にとって既知のこれらの及びその他の薬学的に許容可能な担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９１年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏ．、ニュージャージー州）の中で記述されている。
【０３０８】
該薬学組成物は、無菌注射剤水性又は油性懸濁液又は溶液の形で調製、包装又は販売可能である。この懸濁液又は溶液は、既知の技術に従って処方され得、活性成分に加えて、本書に記述されている分散剤、湿潤剤又は懸濁剤などの付加的成分を含み得る。このような無菌注射剤処方物は、例えば水又は１，３−ブタンジオールといった無毒で非経口で許容可能な希釈剤又は溶媒を用いて調製され得る。その他の許容可能な希釈剤及び溶媒としては、リンガー溶液、等張塩化ナトリウム溶液及び固定油例えば合成モノ又はジーグリセリドが含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０３０９】
該発明の方法において有用である薬学組成物は、経口、直腸、経膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、口腔、眼球又はその他の投与経路に適した処方物の形で投与、調製、包装及び／又は販売され得る。その他の考慮対象の処方物としては、計画されているナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する、再シールした赤血球及び免疫学ベースの処方物が含まれる。
【０３１０】
本書で使用される「ナノ粒子」という用語は、任意のサイズ、形状又は形態を有する１〜１０００ナノメートルの直径をもつ粒子として定義されている。ナノ粒子は、１つ以上の導電性シェル層によりとり囲まれた個別的な誘電性又は半導性コア区分を有するナノ粒子である「ナノシェル」でさえあり得る。「ナノシェル」は、個別的なコア／シェル構造を特徴とするナノ粒子の亜種である。ナノシェルもナノ粒子も、例えばＤＮＡ、ＲＮＡなどといった負に帯電した分子に結合するためのドーパントを含有し得る。一般的に使用される正に帯電したドーパントの例としてはＰｒ３、Ｅｒ３及びＮｄ３が含まれる。本書で使用されている「シェル」というのは、一般に１つのコアの少なくとも一部分をとり囲むことになる１つ以上のシェルを意味する。複数のコアを大きなナノシェル内に取込むことが可能である。１つの実施形態では、ナノ粒子は標準的な方法を用いて動物に投与される。
【０３１１】
本書で使用されている通り、ナノ粒子を「送達する」という用語は、標的の場所で細胞に接触できることになる粒子の数を最大限にするために例えば静脈内で標的の場所に付着された、又はそれに隣接した又はそれに充分近いところでのナノ粒子の配置を描写するために使用される。
【０３１２】
本発明の組成物は、ナノ粒子の中に、ナノ粒子に対し、又はナノ粒子のまわりに結合された核酸配列及びその使用方法を含む。結合されたナノ粒子は、内皮細胞などのさまざまな生物学的標的に対する核酸配列の送達のために使用可能である。１実施形態においては、核酸例えば遺伝子発現のためのプロモータの制御下にある核酸遺伝子は、正にドープされたナノコアに付着させられ、このときこのナノコアは、例えば問題の細胞上のリガンド標的に特異的なターゲティングリガンドを内含するシェルによりとり囲まれる。
【０３１３】
該発明の１つの実施形態は、ナノ粒子の中又はナノ粒子に対して結合された核酸配列に関する。ナノ粒子は、「ナノ粒子前駆体」の集合によって調製される。核酸配列は一般に、生物学的標的内への送達のために選択されたあらゆる核酸配列であり得る。核酸配列はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ又はその他の合成又は修飾済み核酸配列であり得る。１つの実施形態においては、核酸配列は、ヒトレナラーゼをコードするＤＮＡ配列である（ジェンバンク登録番号ＢＣ００５３６４）。ＤＮＡ配列は天然に発生する配列、天然に発生する配列の修飾済みバージョン又は合成配列であり得る。１実施形態においては、核酸は標的宿主のコドン使用百分率を最大限にするように修飾される。天然に発生する配列は、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、クマ、ウサギ、ムース、魚、ヒツジ又はその他の動物の配列であり得る。特定の配列を添加し欠失するようにこの配列を修飾することができる。例えば、制限部位を除去する、共通の分割又は突然変異部位を削除する、ナノコアに対する結合を最大限にするべくＤＮＡ配列を修飾することができる。さらに、タンパク質分割部位の削除、転写、翻訳、位置特定、分割及び／又はプロセシング部位の付加及びグリコシル化部位の付加又は除去を補助する付加的な配列を含むように配列を修飾することもできる。
【０３１４】
１実施形態においては、ナノ粒子前駆体は、ナノ粒子重合体に結合された核酸配列を含む。ナノ粒子前駆体と核酸の間の結合は、非共有結合又は共有結合であってよい。ナノ粒子重合体は、ナノ粒子の形に集合できるあらゆる重合体であり得る。例えば、核酸配列は第１の重合体に非共有結合され得る。この第１の重合体はポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）などのＤＮＡ結合カチオン重合体であり得る。第１の重合体は第２の重合体に共有結合し得る。第２の重合体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性重合体であり得る。例えば、第２の重合体を、ＰＥＩの一次アミンの画分に接合させることができる。
【０３１５】
親水性重合体を、抗体などのリガンドに結合させることが可能である。該抗体は、ポリクローナル抗体か又はモノクローナル抗体であり得るが、現在はモノクローナル抗体が好まれている。抗体は、生物学的受容体又はその他の細胞発現されたタンパク質に特異的であり得る。例えば、抗体は、レクチン様酸化低比重リポタンパク（ＬＤＬ）受容体−１、Ｌｏｘ−１を結合させることができる。抗体は魅力的な結合能力を提供するが比較的高い立体バルクを有する。該発明のさまざまな実施形態においてリガンドとしてより小さな抗体フラグメント又はその他の結合ペプチド又は分子を用いることができる。
【０３１６】
ナノ粒子前駆体が自己集合する場合、核酸分子は、形成されたナノ粒子内に封入され、抗体又はリガンドはナノ粒子の表面上に提示される。封入された核酸分子は、環境、酵素、加水分解又はその他の分解力による分解から部分的又は完全に防御されている。
【０３１７】
集合したナノ粒子は一般に約１〜約１０００ｎｍの平均直径を有することができる。より狭い直径範囲には、約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ及び約４０ｎｍ〜約１００ｎｍが含まれる。
【０３１８】
該発明の付加的な実施形態は、集合したナノ粒子に関する。集合したナノ粒子は、溶解状態で集合したナノ粒子前駆体を含む。集合したナノ粒子は好ましくは、ナノ粒子の内部体積内の核酸配列、及びナノ粒子の外部面上に提示された抗体又はその他の結合ペプチドを含有する。ナノ粒子は一般にいかなる形状をしていてもよいが、およそ球形が現在好まれている。抗体は好ましくはその天然の立体構造を維持し、その天然の標的への結合を可能にする。
【０３１９】
集合したナノ粒子は、溶解状態、乾燥状態、リポソーム中などを含むさまざまな処方物で存在し得る。処方物の特定的例としては、フラーレンナノ粒子、亜鉛を安定剤として反対に帯電した重合体ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及び硫酸デキストラン（ＤＳ）で構成された水性ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、ハイドロー又はフルオロカーボン尾部のいずれかを担持するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから誘導されたエンドキャップされたオリゴマ；共役ポリ（アミノポリ（エチレングリコール）シアノアクリラート−コ−ヘキサデシルシアノアクリラート（ポリ（Ｈ（２）ＮＰＥＧＣＡ−コ−ＨＤＣＡ）ナノ粒子、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）から処方された生物分解性ナノ粒子、及び水溶性、生物分解性ポリホスホエステル、ポリ（２−アミノエチルプロピレンリン酸）（ＰＰＥ−ＥＡ）ナノ粒子が含まれる。
【０３２０】
該発明の態様は同様に、集合したナノ粒子を調製する方法にも関する。該方法は、重合体接合体の形成及び重合体接合体を核酸と接触させてナノ粒子を形成させる工程を含み得る。重合体接合体は第１の重合体、第２の重合体及びリガンドを含む。第１の重合体は好ましくは、非共有結合的に核酸に結合する。現在好まれている第１の重合体はポリエチレンイミン（「ＰＥＩ」）といったＤＮＡ結合カチオン重合体である。第２の重合体は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などの親水性重合体であり得る。該リガンドは、現在抗体であることが好まれている。
【０３２１】
重合体接合体の一部分が共有結合により結びつけられていることが現在好まれている。重合体接合体の集合の特定の順序は変動し得る。例えば第１の重合体及び第２の重合体を結びつけることができ、次にリガンドを結びつけることができる。代替的には第２の重合体及びリガンドを結びつけ、その後第１の重合体を結びつけることができる。該方法はさらに、接触工程の後に実施すべき単離又は精製工程を含むことができる。記述された集合したナノ粒子はさまざまな利用分野で使用可能である。ナノ粒子はｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏの利用分野で使用可能である。
【０３２２】
本発明は同様に、微晶質形態でレナラーゼの薬学組成物を提供する。自由界面拡散方法（サレンメ（Ｓａｌｅｍｍｅ）、Ｆ．Ｒ．（１９７２年）、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、第１５１号、５３３〜５３９頁）、懸滴又は静滴内蒸気拡散法（マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、Ａ．（１９８２年）、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、８２〜１２７頁）及び液体透析（ベイレー（Ｂａｉｌｅｙ）、Ｋ．（１９４０年）、Ｎａｔｕｒｅ、第１４５号、９３４〜９３５頁）を含めた、タンパク質結晶を得るためのさまざまな方法が開発されてきた。非結晶質タンパク質と比べて、結晶質タンパク質は、タンパク質の濃度及び安定性における著しい改善を提供し、このことが、タンパク質の経口及び非経口送達の機会をもたらすことになる。一部のケースでは、分子の特定の結晶形態は、より高い生物活性をもち、より迅速に溶解し、分解しにくく、かつ精製がさらに容易である。
【０３２３】
ヒト及び動物への生物学的送達のために組成物内にタンパク質、糖タンパク質、酵素、抗体、ホルモン及びペプチド結晶又は結晶処方物を封入することができる。タンパク質を結晶化し、薬学成物又は賦形剤を用いて安定化された処方物を調製し、かつ任意には組成物を生産するべく重合体担体内にそれらを封入し、このようなタンパク質結晶処方物及び組成物を治療用タンパク質及びワクチンの送達を含めた生物医学的利用分野のために使用するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば米国特許第６，５４１，６０６号明細書は、タンパク質結晶又は結晶処方物が１つの組成物を形成するべく重合体担体を含むマトリクス内に封入されることを開示している。該処方物及び組成物は、タンパク質の未変性生物活性三次構造の保存を増強し、必要な場所及び時点で活性タンパク質をゆっくりと放出することのできるタンクを作り上げる。このような重合体担体は、生体適合性及び生物分解性重合体を含んでいる。生物活性あるタンパク質はその後、使用される特定の技術、重合体処方物、結晶幾何形状、結晶溶解度、結晶架橋及び処方条件により判定されるように、一定の時間にわたり制御された形で放出される。
【０３２４】
該発明の組成物は、経口、直腸、経膣、非経口、局所、肺、鼻腔、口腔又は眼内投与経路を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）さまざまな経路を介して投与され得る。投与経路は当業者にとって容易に明らかとなり、治療対象の疾病のタイプ及び重症度、動物又はヒトの患者のタイプ及び年令などにより左右される。
【０３２５】
該発明の方法において有用である薬学組成物は、経口固体処方物、眼内、座薬、エアロゾル、局所又はその他の類似の処方物で全身投与することができる。硫酸ヘパラン又はその生物学的等価物などの化合物に加えて、このような薬学組成物は薬学的に許容可能な担体及び薬物投与を増強し容易にするものとして知られているその他の成分を含有し得る。該発明の方法に従ったレナラーゼ及び／又はそれをコードする核酸を投与するために、ナノ粒子、リポソーム、再シールされた赤血球、及び免疫学ベースの系といった考えられるその他の処方物も使用することができる。
【０３２６】
本書に記述されている方法のいずれかを用いて同定される化合物を処方し、動脈再狭窄、外膜線維症、いずれかの臓器又は組織内の線維症、負のリモデリング、過剰骨形成、過剰骨化などの治療のために哺乳類に投与することができる。
【０３２７】
該発明は、動脈再狭窄、外膜線維症、負のリモデリングなどの治療のために有用な化合物を活性成分として含んでいる薬学組成物の調製及び使用を包含する。このような薬学組成物は、対象に投与するのに適した形状で活性成分単独で構成されていてもよいし、或いは又、該活性成分及び１つ以上の薬学的に許容可能な担体、１つ以上の付加的な成分又はこれらの何らかの組合せを含んでいてもよい。該活性成分は、当該技術分野において周知の通り、生理学的に許容可能なカチオン又はアニオンと組合わせた状態などの生理学的に許容可能なエステル又は塩の形で薬学組成物中に存在していてもよい。
【０３２８】
本書で用いられる「薬学的に許容可能な担体」という用語は、活性成分と組合せることができ、組合せの後対象に対し活性成分を投与するために使用可能である化学組成物を意味する。本書で使用される「生理学的に許容可能な」エステル又は塩という用語は、組成物が投与される予定の対象にとって有害でない薬学組成物のその他のあらゆる成分と相容性がある活性成分のエステル又は塩形態を意味する。
【０３２９】
本書で記述されている薬学組成物の処方物は、薬理学技術分野において既知の又は今後開発される何らかの方法により調製され得る。一般にこのような調製方法は、活性成分を担体又は１つ以上のその他の付属成分と会合させ、次に必要とあらば又は望ましいならば生成物を所望の一回の又は複数回用量単位に整形又は包装する工程を含んでいる。
【０３３０】
本書で提供されている薬学組成物の記述は主としてヒトに対する倫理的投与に適した薬学組成物に向けられているが、当業者であれば、かかる組成物が一般にあらゆる種類の動物への投与にも適しているということを理解することだろう。さまざまな動物への投与に適したものにするための、ヒトに対する投与に適した薬学組成物の修正は、充分に理解されており、獣医薬理学の当業者であれば、実験を要するとしてもごく普通の実験だけで、このような修正を設計し実施することができる。該発明の薬学組成物の投与が考慮されている対象としてはヒト及びその他の霊長類、畜牛、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ及びイヌなどの商業的に適切な哺乳類を含めた哺乳類が含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０３３１】
該発明の方法において有用である薬学組成物は、経口、直腸、経膣、非経口、局所、肺、鼻腔、口腔、眼内髄腔内その他の投与経路に適した処方物で、調製、包装又は販売され得る。考慮されているその他の処方物としては、計画されたナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再シール赤血球及び免疫学ベースの処方物が含まれる。
【０３３２】
該発明の薬学組成物は、一回単位用量としてか又は複数の一回単位用量として調製、包装又はバルク販売され得る。本書で使用する「単位用量」というのは、活性成分を予め定められた量だけ含む個別的量の薬学組成物のことである。該活性成分の量は一般に、対象に投与されることになる活性成分の投薬量又は、例えばこのような投薬量の２分の１又は３分の１などのその便利な画分に等しい。
【０３３３】
該発明の薬学組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な担体及び任意の付加的な成分の相対的量は、治療対象のアイデンティティー、サイズ及び身体状態に応じて、そしてさらに組成物の投与経路に応じて変動することになる。一例を挙げると、該組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０３３４】
活性成分に加えて、該発明の薬学組成物はさらに、１つ以上の付加的な薬学的に活性な作用物質を含み得る。特に考慮されている付加的な作用物質としては、抗嘔吐剤及びシアン化物及びシアン酸塩スカベンジャといったスカベンジャが含まれる。
【０３３５】
該発明の薬学組成物の徐放性又は持続放出性処方物を、従来の技術を用いて作製することができる。経口投与に適した該発明の薬学組成物の処方物を、各々予め定められた量の活性成分の入った錠剤、ハード又はソフトカプセル、カシェ剤、トローチ又はロゼンジを含めた（ただしこれに制限されるわけではない）個別の固形用量単位の形で調製、包装又は販売することができる。経口投与に適したその他の処方物には、粉末又は顆粒状処方物、水性又は油性懸濁液、水性又は油性溶液又はエマルジョンが含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０３３６】
本書で使用する「油性」液体というのは、含炭素液体分子を含みかつ水よりも極性の低い液体である。
【０３３７】
活性成分を含む錠剤は例えば、任意には１つ以上の付加的成分と共に活性成分を圧縮又は成形することによって作ることができる。圧縮錠は、任意には結合剤、潤滑剤、賦形剤、表面活性剤及び分散剤のうちの１つ以上のものと混合した状態で、粉末又は顆粒状調製物といった自由流動形状の活性成分を適切な装置の中で圧縮することによって、調製可能である。成形錠は、活性成分、薬学的に許容可能な担体及び少なくとも混合物を潤すのに充分な液体の混合物を適切な装置の中で成形することにより作ることができる。錠剤の製造において使用される薬学的に許容可能な賦形剤には、不活性希釈剤、造粒及び崩壊剤、結合剤及び潤滑剤が含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の分散剤には、ジャガイモでんぷん及びでんぷんグリコール酸ナトリウムが含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の表面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウムが含まれるがこれに制限されるわけではない。既知の希釈剤には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、微晶質セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム及びリン酸ナトリウムが含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の造粒及び崩壊剤には、コーンスターチ及びアルギン酸が含まれるがこれに制限されるわけではない。既知の結合剤には、ゼラチン、アカシア、ゼラチン化前のトウモロコシでんぷん、ポリビニルピロリドン及びヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の潤滑剤には、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカ、及びタルクが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０３３８】
錠剤は、コーティングされていなくてもよく、そうでなければ、対象の胃腸管内での崩壊を遅延させかくして活性成分の持続放出又は吸収を提供するために、既知の方法を用いてこれをコーティングすることもできる。一例を挙げると、錠剤をコーティングするためにモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの材料を使用することができる。さらに、一例として、浸透徐放性錠剤を形成するべく米国特許第４，２５６，１０８号明細書、４，１６０，４５２号及び４，２６５，８７４号明細書の中で記述されている方法を用いて錠剤をコーティングすることもできる。さらに錠剤は、薬学的に洗練され口当たりのよい調製物を提供するべく甘味剤、着香剤、着色剤、防腐剤又はこれらの何らかの組合せを含むことができる。
【０３３９】
活性成分を含むハードカプセルをゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物を用いて作ることができる。このようなハードカプセルは、活性成分を含み、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンなどの不活性固体希釈剤を含めた付加的な成分を含むことができる。活性成分を含むソフトゼラチンカプセルは、ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物を用いて作ることができる。このようなソフトカプセルは水又はピーナツ油、液体パラフィン又はオリーブ油といった油性媒質と混合可能である活性成分を含む。
【０３４０】
経口投与に適した該発明の薬学組成物の液体処方物は、液体形状又は使用に先立ち水又はもう１つの適切なビヒクルで戻すよう意図された乾燥製品の形のいずれかで、調製、包装及び販売することができる。
【０３４１】
液体懸濁液は、水性又は油性ビヒクル中で活性成分の懸濁を達成するための従来の方法を用いて調製可能である。水性ビヒクルとしては例えば水及び等張生理食塩水が含まれる。油性ビヒクルには例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油例えばラッカセイ油、オリーブ、ゴマ又はココナツ油、分留植物油及び鉱油例えば液体パラフィンが含まれる。液体懸濁液にはさらに、懸濁剤、分散剤又は湿潤剤、乳化剤、粘滑薬、防腐剤、緩衝液、塩、着香剤、着色剤及び甘味剤が含まれるがこれに制限されるわけではない。油性懸濁液はさらに増粘剤を含むことができる。既知の懸濁剤には、ソルビトールシロップ、硬化食用脂、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アカシアゴム及びセルロース誘導体例えばナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の分散剤又は潤滑剤には、天然に発生するホスファチド例えばレシチン、脂肪酸、長鎖脂肪族アルコール、脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステル又は脂肪酸とヘキシトール無水物から誘導された部分エステルと酸化アルキレンとの縮合生成物（それぞれ、たとえばステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレアート、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の乳化剤としてはレシチン及びアカシアが含まれるがこれに制限されるわけではない。既知の防腐剤にはメチル、エチル又はｎ−プロピル−パラヒドロキシベンゾアート、アスコルビン酸及びソルビン酸が含まれるが、これに制限されるわけではない。既知の甘味剤には、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロース及びサッカリン。油性懸濁液用の既知の増粘剤としては例えば、ハチロウ、硬質パラフィン及びセチルアルコールなどが含まれる。
【０３４２】
水性及び油性溶媒中の活性成分の液体溶液は、液体懸濁液と実質的に同じ要領で調製され得るが、主要な差異は、活性成分が溶媒中に懸濁されるのではなくむしろ溶解させられるという点にある。該発明の薬学組成物の液体溶液は、液体懸濁液に関して記述された構成要素の各々を含み得るが、当然のこととして懸濁剤は必ずしも溶媒中の活性成分の溶解を助けるわけではない。水性溶媒としては例えば水及び等張生理食塩水が含まれる。油性溶媒には例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール、植物油例えばラッカセイ油、オリーブ、ゴマ又はココナツ油、分留植物油及び鉱油例えば液体パラフィンが含まれる。
【０３４３】
該発明の薬学調製物の粉末及び顆粒状処方物は既知の方法を用いて調製可能である。このような処方物は、例えば錠剤を形成するため、カプセルを充填するため又は水性又は油性ビヒクルをそれに加えることによって水性又は油性懸濁液又は溶液を調製するために用いられて、対象に直接投与され得る。これらの処方物の各々はさらに分散剤又は湿潤剤、懸濁剤及び防腐剤のうちの１つ以上のものを含むことができる。充填剤及び甘味剤、着香剤又は着色剤などの付加的な賦形剤もこれらの処方物中に含み入れることができる。
【０３４４】
該発明の薬学組成物は同様に、水中油形エマルジョン又は油中水形エマルジョンの形で調製、包装又は販売され得る。油性相はオリーブ油又はラッカセイ油などの植物油、液体パラフィンといった鉱油、又はそれらの組合せであり得る。かかる組成物はさらに、１つ以上の乳化剤例えばアカシアゴム又はトラガカントゴムといった天然に発生するゴム、ダイズ又はレシチンホスファチドといった天然に発生するホスファチド、ソルビタンモノオレアートといったヘキシトール無水物と脂肪酸の組合せから誘導されたエステル又は部分エステル及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレアートといった酸化エチレンとこのような部分エステルの縮合生成物を含み得る。これらのエマルジョンは同様に、例えば甘味剤又は着香剤を含めた付加的な成分をも含有し得る。
【０３４５】
該発明の薬学組成物は、直腸投与に適した処方の形で調製、包装又は販売され得る。かかる組成物は、例えば座薬、保留浣腸剤調製物、及び直腸又は結腸洗浄浣腸の形をしていてよい。
【０３４６】
座薬処方物は、通常の室温（すなわち約２０℃）で固体であり、対象の直腸体温（すなわち健康なヒト体内における約３７℃）で液体である無刺激性の薬学的に許容可能な賦形剤と活性成分を組合せることによって作ることができる。適切な薬学的に許容可能な賦形剤としては、ココアバター、ポリエチレングリコール及びさまざまなグリセリドが含まれるがこれに制限されるわけではない。座薬処方は、酸化防止剤及び防腐剤を含めた（ただしこれに制限されるわけではない）さまざまな付加的成分をさらに含むことができる。
【０３４７】
直腸又は結腸洗浄のための保留浣腸剤調製物又は溶液は、活性成分と薬学的に許容可能な液体担体を組合せることによって作ることができる。当該技術分野において周知であるように、浣腸剤調製物は、対象の直腸生体構造に適合させた送達装置を用いて投与され得又かかる装置の中に包装され得る。浣腸剤調製物はさらに、酸化防止剤及び防腐剤を含む（ただしこれに制限されるわけではない）さまざまな付加的成分を含むことができる。
【０３４８】
該発明の薬学組成物は、経膣投与に適した処方物で調製、包装又は販売可能である。かかる組成物は例えば座薬、含浸又はコーティングされた膣内挿入材料例えばタンポン、圧注調製物又は膣洗浄用のゲル又はクリーム又は溶液の形をとることができる。
【０３４９】
化学組成物で材料を含浸又はコーティングするための方法には、当該技術分野において既知であり、表面上に化学組成物を被着又は結合させる方法、（例えば生理学的に分解可能な材料を用いて）材料の合成中に材料の構造の中に化学組成物を取込む方法、及びその後の乾燥を伴う又は伴わない、呼吸性材料内に水性又は油性溶液又は懸濁液を吸収させる方法が含まれる。
【０３５０】
膣洗浄用の圧注調製物又は溶液は、薬学的に許容可能な液体担体と活性成分を組合わせることにより作ることができる。当該技術分野において周知の通り、圧注調製物は、対象の膣生体構造に適合させた送達装置を用いて投与され得又かかる装置の中に包装され得る。圧注調製物はさらに、酸化防止剤、抗生物質、抗真菌剤及び防腐剤を含む（ただしこれに制限されるわけではない）さまざまな付加的成分を含むことができる。
【０３５１】
本書で使用される薬学組成物の「非経口投与」には、対象の組織の物理的裂け目を特徴とする投与及び組織内の裂け目を通した薬学組成物の投与のあらゆる経路が含まれる。かくして、非経口投与には、組成物の注射、外科的切開を通した組成物の適用、組織を貫入する非外科的創傷を通した組成物の適用などによる薬学組成物の投与が含まれるがこれに制限されるわけではない。特に非経口投与は、皮下、腹腔内、筋内、胸骨内注射及び腎臓透析輸液技術を含む（ただしこれに制限されるわけではない）ものとして考慮される。
【０３５２】
非経口投与に適した薬学組成物の処方物は、薬学的に許容可能な担体例えば無菌水又は無菌等張生理食塩水と組合わせた活性成分を含む。かかる処方物は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で調製、包装又は販売され得る。注射用処方物は、防腐剤の入ったアンプル又は複数回用量容器といった単位剤形で調製、包装又は販売され得る。非経口投与用の処方物には、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト及び移植可能な持続放出又は生物分解性処方物が含まれるがこれに制限されるわけではない。かかる処方はさらに、懸濁剤、安定剤又は分散剤を含む（ただしこれに制限されるわけではない）１つ以上の付加的な成分を含むことができる。非経口投与のための処方物の１実施形態においては、活性成分は、戻した組成物の投与に先立ち適切なビヒクル（例えば無菌の発熱物質を含まない水）で戻すように乾燥（すなわち粉末又は顆粒）形態で提供されている。
【０３５３】
薬学組成物は、無菌の注射用水性又は油性懸濁液又は溶液の形で調製、包装又は販売可能である。この懸濁液又は溶液は既知の技術に従って処方可能であり、活性成分に加え本書に記述されている分散剤、湿潤剤又は懸濁剤といった付加的な成分を含み得る。このような無菌の注射用処方物は、例えば水又は１，３−ブタンジオールなどの無毒性の非経口で許容可能な希釈剤又は溶媒を用いて調製され得る。その他の許容可能な希釈剤及び溶媒には、リンガー液、等張塩化ナトリウム溶液及び固定油例えば合成モノー又はジーグリセリドが含まれるが、これに制限されるわけではない。有用なその他の非経口投与可能な処方物には、微晶質形態で、リポソーム調製物中で、又は生物分解性重合体系の１構成要素として活性成分を含むものが含まれる。持続放出又は移植のための組成物は、薬学的に許容可能な重合体又は疎水性材料例えばエマルジョン、イオン交換樹脂、やや溶けにくい重合体、又はやや溶けにくい塩を含み得る。
【０３５４】
局所投与に適した処方物には、液体又は半液体調製物例えば塗布薬、ローション、水中油又は油中水エマルジョン例えばクリーム、軟こう又はペースト、及び溶液又は懸濁液が含まれるが、これに制限されるわけではない。局所的に投与可能な処方物は例えば約１％〜約１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むが、活性成分の濃度は溶媒中の活性成分の溶解度限界と同じ位高いものであり得る。局所的投与のための処方物はさらに、本書に記述されている付加的な成分のうちの１つ以上のものを含み得る。
【０３５５】
該発明の薬学組成物は、口腔を介して肺投与に適した処方物で調製、包装又は販売され得る。かかる処方物は、活性成分を含み約０．５〜約７ナノメートルの範囲内そして好ましくは約１〜約６ナノメートルの範囲内の直径を有する乾燥粒子を含み得る。かかる組成物は、都合のよいことに、粉末を分散するように噴射剤の流れをそれに向けることのできる乾燥粉末タンクを含む装置を用いた、又は密封された容器内で低沸点噴射剤の中に溶解又は懸濁させられた活性成分を含む装置などの自己噴射型溶媒／粉末送出し容器を用いた投与のための乾燥粉末の形をしている。好ましくは、このような粉末には、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートル超の直径を有し、粒子の少なくとも９５数％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子が含まれる。より好ましくは、粒子の少なくとも９５重量％が１ナノメートル超の直径を有し、粒子の少なくとも９０数％が６ナノメートル未満の直径を有する。乾燥粉末組成物は好ましくは、糖などの固形細粉末希釈剤を内含し、都合のよいことに単位剤形で提供される。
【０３５６】
低沸点噴射剤は一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般に噴射剤は、組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成することができ、活性成分は組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成しうる。噴射剤はさらに、液体非イオン又は固体アニオン表面活性剤又は固体希釈剤（好ましくは活性成分を含む粒子と同じ位の粒度をもつもの）などの付加的成分を含み得る。
【０３５７】
肺送達用に処方された該発明の薬学組成物は同様に、溶液又は懸濁液の液滴の形で活性成分を提供し得る。このような処方物は、活性成分を含む、任意には無菌の水性又は低濃度のアルコール溶液又は懸濁液として調製、包装又は販売され得、何らかの噴霧又は微粒化装置を用いて都合良く投与され得る。このような処方物はさらに、着香剤例えばサッカリンナトリウム、揮発油、緩衝剤、表面活性剤又は防腐剤例えばメチルヒドロキシベンゾアートを含めた（ただしこれに制限されるわけではない）１つ以上の付加的成分を含み得る。この投与経路によって提供される液滴は、好ましくは、約０．１〜約２００ナノメートルの範囲内の平均直径を有する。
【０３５８】
肺送達のために有用であるものとして本書に記述された処方物は、該発明の薬学組成物の鼻腔内送達のためにも有用である。
【０３５９】
鼻腔内投与に適したもう１つの処方物は、約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有し活性成分を含む粗粉末である。このような処方物は、においが取込まれる要領で、すなわち鼻孔近くに保持された粉末の容器から鼻道を通る急速な吸入によって投与される。
【０３６０】
鼻腔内投与に適した処方物は、例えば最小約０．１％（ｗ／ｗ）、最大約１００％（ｗ／ｗ）もの活性成分を含むことができ、さらに本書で記述されている付加的な成分のうちの１つ以上のものを含み得る。
【０３６１】
該発明の薬学組成物は、口腔投与に適した処方物の形で調製、包装又は販売され得る。かかる処方物は例えば、従来の方法を用いて作られる錠剤又はロゼンジの形をしていてよく、例えば０．１〜２０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み、残りは、経口可溶又は分解性組成物、そして任意には本書で記述された付加的な成分のうちの１つ以上のものを含む。代替的には、口腔投与に適した処方物は、活性成分を含む粉末又はエアロゾル化又は微粒化された溶液又は懸濁液を含み得る。このような粉末化、エアロゾル化又は微粒化された処方物は、分散された時点で好ましくは約０．１〜約２００ナノメートルの範囲内の平均粒子又は液滴サイズを有し、さらに本書で記述された付加的な成分のうちの１つ以上のものを含み得る。
【０３６２】
該発明の薬学組成物は、眼内投与に適した処方物で調製、包装又は販売可能である。かかる処方物は例えば、水性又は油性の液体担体中の活性成分の０．１〜１．０％（ｗ／ｗ）溶液又は懸濁液を含む点眼液の形をしていてよい。かかる点眼液はさらに、緩衝剤、塩又は本書で記述されている付加的な成分のうちの１つ以上のその他のものを含み得る。有用であるその他の眼内投与可能な処方物としては、微晶質形態で又はリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれる。
【０３６３】
本書で使用される「付加的成分」というのは、以下のもののうちの１つ以上のものを含むがこれに制限されるわけではない；賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味剤；着香剤；着色剤；防腐剤；生理学的分解性組成物例えばゼラチン；水性ビヒクル及び溶媒；油性ビヒクル及び溶媒；懸濁剤；分散又は湿潤剤；乳化剤；粘滑剤；緩衝剤；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；酸化防止剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；及び薬学的に許容可能重合体又は疎水材料。該発明の薬学組成物の中に含み入れることのできるその他の「付加的成分」が当該技術分野において既知であり、例えば本発明に参照により援用されているジェナロ（Ｇｅｎａｒｏ）、編（１９８５年、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ペンシルバニア州）、の中で記述されている。
【０３６４】
標準的には、動物好ましくはヒトに投与できる該発明の化合物の投薬量は、動物のタイプ及び治療対象の疾病状態のタイプ、動物の年令及び投与経路を含む（ただしこれに制限されるわけではない）任意の数の因子に応じて変動することになる。
【０３６５】
化合物は、一日数回といった頻度で動物に投与され得、そうでなければ、さらに少ない頻度で、例えば一日一回、一週間に一回、２週間に一回、１ヵ月に一回又はより一層少ない頻度例えば数カ月に一度さらには一年に一度以下の頻度で投与することも可能である。用量の頻度は当業者には容易に明らかであり、治療対象の疾病のタイプ及び重症度、動物のタイプ及び年令などといった（ただしこれに制限されるわけではない）任意の数の因子に左右されることになる。
【０３６６】
ＶＩＩＩ．  方法
Ａ．  レナラーゼ発現に結びつけられる又はそれによって媒介される疾病、障害又は身体状態を治療又は緩和する方法。
本発明の一態様においては、哺乳類レナラーゼと結びつけられる又はそれにより媒介される疾病、障害又は身体状態を治療するための方法が提供されている。かかる疾病、障害又は身体状態には、ＥＳＲＤ、慢性高血圧、収縮期高血圧、孤立性収縮期高血圧、糖尿病性高血圧、肺高血圧、急性重症高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全（ＣＨＦ）、心筋梗塞（ＭＩ）、心調律障害、卒中、アテローム性動脈硬化、うつ病、不安症、躁病及び統合失調症などが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【０３６７】
本書で開示されているデータは、レナラーゼの過剰発現、レナラーゼの過小発現、過活性レナラーゼ及び不活性レナラーゼが、レナラーゼレベルの減少、レナラーゼレベルの増加、レナラーゼ活性の減少及びレナラーゼ活性の増加の方法により潜在的に利益が得られるようなさまざまな疾病、障害又は身体状態に結びつけられるものであり、ここで、選択される方法は考慮対象の特定の障害、身体状態及び／又は疾病によって左右されることを示唆している。従って、治療前の細胞内のレナラーゼレベルと比べて又は、改変されたレナラーゼレベルと結びつけられるか又はそれにより媒介される疾病、障害又は身体状態を罹患していないことがわかっている哺乳類から得たその他の点では同一である細胞内のレナラーゼレベルと比べて、レナラーゼレベルが減少又は増大している広範な疾病、障害又は身体状態を治療／緩和するためにレナラーゼレベルに影響を与える方法がここで開示されている。
【０３６８】
レナラーゼの発現、ポリペプチドのレベル又はその活性が増大するか減少するかに関わらず、当業者であればこの開示に基づいて、レナラーゼを減少させるか又は誘発する方法が、レナラーゼを発現するか又はその発現が欠如している天然に発生する又は天然に発生するものでないレナラーゼ、レナラーゼ阻害物質又は組換え細胞を投与する工程を包含するものであることを認識すると思われる。かくして、当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、本発明が哺乳類におけるレナラーゼの発現又は活性のレベルの検出可能な増大又は減少のいずれかをもたらすための当該技術分野において既知の治療の方法を包含するということを認識するものと思われる。
【０３６９】
本発明の組成物は、細胞、組織又は動物に対しレナラーゼを投与するため又は細胞、組織又は動物におけるレナラーゼの発現を促進するために使用可能である。該組成物は、細胞、組織又は動物におけるタンパク質のレベル又はレナラーゼ発現を減少又は増大させることがその動物にとって有益であるような形でレナラーゼの発現の改変により媒介される疾病、障害又は身体状態を治療するために有用である。すなわち、１つの動物における疾病、障害又は身体状態がレナラーゼ発現レベル又はタンパク質レベルの改変により媒介されるか又はそれと結びつけられる場合、該組成物は、レナラーゼのこのような発現又はタンパク質レベルを変調させるために使用可能である。
【０３７０】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、１つの細胞内でレナラーゼのレベル又は活性を増大させることが有利であり得る、ということを理解すると思われる。すなわち、レナラーゼ発現と高血圧の間の結びつきを実証する本書で開示されているデータは、レナラーゼ活性の増大又は過剰発現が血圧を低下させ得るということを示している。このことは、天然に発生する又は天然に発生するものでないレナラーゼを投与することにより、その疾病、障害又は身体状態を患らっていないその他の点では同一の細胞、組織又は動物におけるレナラーゼの発現、レベル又は活性と比較したときに、レナラーゼの発現、レベル又は活性の低下に結びつけられるか又はそれにより媒介される疾病、障害又は身体状態（例えば高血圧）を治療又は緩和するために有用であり得る。かかる疾病、障害又は身体状態としては、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓血管障害、又は精神障害が含まれるがこれに制限されるわけではない。
【０３７１】
本書で開示されているデータは、レナラーゼが全身的血圧を調節できることを実証している。かくして、当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、カテコールアミンを代謝することにより心臓血管疾患を治療するためにレナラーゼを使用できるということを認識すると思われる。従って、本発明は、循環中のレナラーゼの活性又は細胞内のレナラーゼの発現を増大させる工程を含むカテコールアミン代謝を増大させる方法を包含している。例えば、ＥＳＲＤは、哺乳類に対し有効量のレナラーゼを投与することによって治療可能である。これは、本書で開示されているデータがレナラーゼはＥＳＲＤと結びつけられるということを実証しているからである。すなわち、該データは、レナラーゼの発現の欠如がＥＳＲＤと結びつけられるということを実証している。さらに、本書で開示されているデータは、ラット体内への組換え型レナラーゼの輸注が結果としてラットの血圧の低下をもたらし、このことがＥＳＲＤ誘発型高血圧及びその他の心臓血管疾患を治療するためにレナラーゼを使用することができるということを示唆している、ということを実証している。
【０３７２】
さらにもう１つの実施形態においては、該発明は、レナラーゼの発現及び／又は活性を阻害する阻害物質を哺乳類に投与することによってレナラーゼの発現又は活性の改変により媒介される疾病、障害又は身体状態を緩和する方法を含んでいる。ＭＡＯ阻害物質と全く同じように、レナラーゼ阻害物質は、気分障害といったＣＮＳ障害の治療において有用である判明する可能性がある。従って、例えばレナラーゼを阻害する化合物、ペプチドミメティック、小分子、リボザイム、アンチセンス核酸、抗体及びイントラボディでレナラーゼの発現を減少させるか又はレナラーゼの活性を減少させることにより、脳内のモノアミン含有量は増大し、これらの障害の症候は緩和されることになる。かくして、当業者であれば、本書のその他の場所でより完全に記されているようにさまざまな方法によって達成できるレナラーゼの阻害が、ＣＮＳ障害特に気分障害のための有用な治療であることを理解するものと思われる。
【０３７３】
ＣＮＳ障害には、痴呆、アルツハイマー病、統合失調症、精神病、うつ病、頭痛及び片頭痛が含まれるがこれに制限されるわけではない。本書で使用される「うつ病」という用語は、抑うつ障害例えば単エピソード又は周期性大うつ病性障害及び気分変調性障害、抑うつ神経症、及び神経症性うつ病；拒食症、体重減少、不眠症及び早朝覚醒及び精神運動遅延を含む憂うつ性うつ病；食欲増加、睡眠過剰、精神運動興奮及び興奮性不安及び恐怖症を含む非定形うつ病（又は反応性うつ病）；季節性情動障害；又は例えば双極性Ｉ障害、双極性ＩＩ障害及び循環病障害といった双極性障害又は躁うつ病を含んでいる。
【０３７４】
「うつ病」という用語の中に包含されるその他の気分障害には、早期又は晩期発症型で非定型特長を伴う又は伴わない気分変調性障害；早期又は晩期発症型でうつ気分を伴うアルツハイマタイプの痴呆；うつ気分を伴う血管性痴呆；アルコール、アンフェタミン、コカイン、幻覚剤、吸入抗原、オピオイド、フェンシクリジン、鎮痛剤、睡眠薬、抗不安薬及びその他の物質により誘発される気分障害；うつ型の統合失調性感情障害；及びうつ気分を伴う適応障害が含まれる。
【０３７５】
本発明の組成物は、不安症の治療に有用である。本書で使用する「不安症」には、不安障害例えば広場恐怖症を伴う又は伴わないパニック障害、パニック障害の病歴の無い広場恐怖症、特定恐怖症、特定動物恐怖症、対人恐怖、強迫神経症、外傷後ストレス障害及び急性ストレス障害を含むストレス障害、及び全般性不安障害が含まれる。
【０３７６】
「全般性不安症」は標準的に、その期間の大部分の日において症候を伴う長期にわたる（例えば少なくとも６カ月）過度の不安又は心配として定義づけされる。不安及び心配は制御が困難であり、情動不安、疲れ易さ、集中力欠如、興奮性、筋肉緊張及び睡眠障害が伴う可能性がある。
【０３７７】
「パニック障害」は、再発性パニック発作とその後に続く少なくとも１カ月にわたる又パニック発作があるのではないかというしつような懸念の存在として定義される。「パニック発作」は強い不安、恐怖又は非常な恐ろしさの突然の発症が存在する離散的期間である。パニック発作の間、その個体は、動悸、発汗、ふるえ、息切れ、胸痛、吐気及び目まいを含めたさまざまな症候を体験し得る。パニック障害は、広場恐怖症を伴って又は伴わずに起こり得る。
【０３７８】
「恐怖症」には、広場恐怖症、特定恐怖症及び対人恐怖病が含まれる。「広場恐怖症」は、そこからの脱出が困難であるか又は厄介でありうるか又はその中でパニック発作が起こった場合に助けが得られない可能性のある場所又は状況にあることに関する不安を特徴とする。広場恐怖症は、パニック発作の病歴無しでも起こり得る。「特定恐怖症」は、特定の心配した物体又は状況にさらされることによって誘発される臨床的に有意な不安を特徴とする特定恐怖症には、以下の亜型が含まれる。すなわち、動物又は昆虫をきっかけとする動物型；自然環境内の物体例えば荒天、高所又は水をきっかけとする自然環境型；血液又は負傷を見たこと又は注射又はその他の浸襲性医療措置を見たこと又は受けたことをきっかけとする血液−注射−負傷型；公共輸送機関、トンネル、橋、エレベータ、飛行、ドライブ又は閉所といった特定の状況をきっかけとする状況型；及びその他の刺激を恐怖のきっかけとするその他の型。特定恐怖症は、同様に単純恐怖症とも呼ぶことができる。「対人恐怖症」は、或る種のタイプの社会的又は業損的境遇にさらされたことにより誘発される臨床的に有意な不安を特徴とする。対人恐怖症は社会不安障害とも呼ばれる。
【０３７９】
「不安症」という用語の中に包含されるその他の不安障害には、アルコール、アンフェタミン、カフェイン、大麻、コカイン、幻覚剤、吸入抗原、フェンシクリジン、鎮痛剤、睡眠薬、抗不安薬及びその他の物質によって誘発される不安障害、及び不安症を伴うか又は不安症とうつ病の混合を伴う適応障害が含まれる。
【０３８０】
不安症は、不安症と抑うつ障害の混合においてうつ病などのその他の障害を伴って又は伴わずに存在し得る。従って、本発明の組成物は、随伴するうつ病を伴う又は伴わない不安症の治療において有用である。
【０３８１】
該発明は、その他の点では同一であるが正常な組織すなわち治療又は緩和対象の疾病、障害又は身体状態に結びつけられる何らかの検出可能な臨床的パラメータを示さない組織におけるレナラーゼ発現のレベルに比較して増大したレナラーゼ発現により媒介される疾病、障害又は身体状態に悩まされている患者に対しレナラーゼをコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を投与することによりレナラーゼの発現の改変により媒介される疾病、障害又は身体状態を緩和する方法を提供する。これはそれ自体、レナラーゼ発現の減少を媒介し、かくしてレナラーゼの異常な発現により媒介される疾病、障害又は身体状態を緩和する。
【０３８２】
レナラーゼの阻害はアンチセンスを細胞に投与しかくして細胞内のレナラーゼの発現を阻害することによって例示されているが、当業者であれば、細胞内の活性及び／又はタンパク質発現を阻害するための多数の方法が存在するということを認識することだろう。かかる方法には、リボザイムを用いたレナラーゼの発現を阻害すること、及び例えば細胞内で抗体が発現されかくして抗体を細胞の細胞質ゾルまで抗体を送達するような形で細胞に対し該抗体をコードする核酸を投与することなどにより細胞に対し抗体を投与して細胞内のタンパク質の活性を阻害すること、が含まれるが、これらに制限されるわけではない。タンパク質の細胞内活性を阻害するためのこれらの「イントラボディ」の使用は、当該技術分野において周知である。例えば、ベルマ（Ｖｅｒｍａ）ら、（１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ、第３８９号、２３９〜２４２頁；ベンハー（Ｂｅｎｈａｒ）及びパスタン（Ｐａｓｔａｎ）、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７０号、２３３７３〜２３３８０頁；ウィルダ（Ｗｉｌｌｕｄａ）ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第５９号、５７５８〜５７６７頁；及び、ウォーン（Ｗｏｒｎ）ら、２０００年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７５号、２７９５〜２８０３頁）を参照のこと。従って、本発明は、当該技術分野において既知の方法又は今後開発されるべき方法を用いて細胞内の問題のタンパク質の活性を阻害するあらゆる方法を包含する。
【０３８３】
該発明のもう１つの実施形態においては、レナラーゼ発現と結びつけられるか又はそれにより媒介される疾病、障害又は身体状態を患う個体は、レナラーゼ発現が欠如した細胞で欠陥細胞を補足、増加及び／又は置換することによって治療され得る。細胞は、正常な同系の適合したドナーから得た細胞か又は治療を受ける予定の個体から得た細胞に由来し得る。レナラーゼ発現を阻害するために細胞を遺伝子組換えすることができる。代替的には、当該技術分野において周知の組換え型方法を用いてレナラーゼ発現を増大させるべく修飾することができる。同様に、該発明は、必要としている哺乳類に投与できる改変されたレナラーゼ発現に結びつけられた何らかの疾病又は障害を患っていないその他の点では同一であるドナーから得た正常な細胞を使用することを包含している。
【０３８４】
付加的には、該発明は、細胞が哺乳類から得られ、増大又は減少したレナラーゼレベルを発現するように修飾され、哺乳類内に再導入される場合のｅｘ  ｖｉｖｏ技術を含んでいる。その上、改変されたレナラーゼ発現と結びつけられる何らかの身体状態を患っていない同様の哺乳類から得たその他の点では同一である細胞の中で発現されるレナラーゼレベルと比べてレナラーゼの正常なレベルを発現する哺乳類に由来する細胞を、成長及び拡張させることができ、該細胞を有効数だけ該哺乳類に再導入させることができる。かかる方法には、当該技術分野において周知の方法である骨髄間質細胞の使用に関する細胞及び遺伝子治療技術が含まれる。かくして当業者であれば、細胞がｉｎ  ｖｉｖｏで投与される、検出可能なレナラーゼ発現を有する又はそれが欠如している細胞に関する細胞療法及び遺伝子治療が本発明の中に包含されるということを認識すると思われる。
【０３８５】
同系の免疫学的に適合したドナーからの修復済み細胞又は正常な細胞で不良な細胞を置換することに加えて、該発明の方法は同様に、１つの動物の体内で分泌された時点で有益な効果をもつ所望のタンパク質の発現を容易にするためにも使用可能である。すなわち、細胞を単離し、レナラーゼをコードする遺伝子を供給し、ドナー又は同系の適合したレシピエントの体内に導入することができ、ここで外因性レナラーゼの発現が治療効果を及ぼす。
【０３８６】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、１つの細胞からのレナラーゼの分泌が本発明において考慮されているということを理解することだろう。すなわち、日常的作業者にとっては、本書に提供されている開示に基づいて、１つの細胞からのレナラーゼの分泌が有用な治療方法であり得ることそして本発明が１つの細胞からのレナラーゼの分泌を含むことを認識することであろう。細胞からのレナラーゼの分泌は、当該技術分野において周知の標準的な方法及び将来開発されるべき方法に従ってもたらされ得る。かかる方法としては、単離された核酸コーディングレナラーゼの５’末端に対して分泌済み分子のシグナルペプチドをコードする核酸を共有結合的に連続させることが含まれるが、これに制限されるわけではない。細胞からのタンパク質の分泌を媒介するために使用可能な広範なシグナル配列が入手可能で当該技術分野においては周知であり、該発明はこれらならびに細胞からのタンパク質の分泌を駆動するため将来開発されるべき配列を含んでいる。
【０３８７】
該発明のこの態様は、治療量のレナラーゼが個体に投与される遺伝子治療に関連する。すなわち、本発明の一部の態様に従うと、該発明のレナラーゼをコードする核酸、アンチセンス核酸又はノックアウトターゲティングベクターのいずれかでのトランスフェクションを受けた組換え細胞を、レナラーゼの発現欠如を含めたレナラーゼの改変された発現を特徴とする疾病、障害又は身体状態を治療するために使用することができる。
【０３８８】
特に、レナラーゼをコードする非相同遺伝子を含む遺伝子構成体が細胞内に導入される。これらの組換え細胞は、動物に投与された単離済みレナラーゼを精製するために使用される。当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、単離されたレナラーゼポリペプチドを投与する代りに、組換え細胞自体を哺乳類に投与することによってそれを必要とする哺乳類にレナラーゼを投与できる、ということを理解することだろう。これは、レシピエントの系の中に組換え細胞によりタンパク質が発現され分泌された時点で、レシピエントである個体にとって有益なものとなる。
【０３８９】
本発明に従うと、該発明のヌクレオチド配列を含む遺伝子構成体は細胞内に導入される。すなわち、ここで「組換え細胞」と呼ばれる細胞は、レナラーゼをコードする核酸又は、組換え細胞内でのレナラーゼの発現及び／又はそれによる分泌を阻害する核酸（例えばアンチセンスレナラーゼ核酸、抗レナラーゼ抗体をコードする核酸など）を導入しかくして該組換え細胞が投与されるレシピエントに対し有益な効果を媒介するために遺伝子的に改変されている。該発明の一部の態様に従うと、治療すべき個体自身又はもう１つの個体又は非ヒト動物から得られた細胞を改変させて、不良なレナラーゼ遺伝子を置換すること及び／又は該個体に対しその発現が有益な効果をもつレナラーゼ遺伝子を導入すること又は該個体に対する有益な効果をもち得るレナラーゼ発現を阻害することができる。
【０３９０】
該発明の一部の態様においては、レナラーゼをコードする核酸の正常で機能するコピーを含む遺伝子構成体を含有する単離された組換え細胞を提供することによって、レナラーゼをコードする不良な又は欠損した核酸を補足、増加及び／又は置換させることで疾病、障害又は身体状態を患う個体を治療することができる。該発明のこの態様は、存在及び／又は機能的に欠損しているレナラーゼをコードする核酸を個体に提供する遺伝子治療に関するものである。細胞により提供されるレナラーゼをコードする単離された核酸は、該核酸が個体内で発現された時点で個体内の疾病、障害又は身体状態を緩和するか又はその他の形で治療するのに役立つタンパク質が産生されることから、該個体のレナラーゼ発現不良を補償する。このような核酸は好ましくは組換え細胞から分泌されるレナラーゼポリペプチドをコードする。
【０３９１】
レナラーゼをコードする遺伝子構成体が細胞内にトランスフェクトされる全てのケースにおいて、核酸は、組換え細胞内で核酸の発現を達成するために必要とされる適切なプロモータ／調節配列に操作可能に連結される。このようなプロモータ／調節配列は、構成性及び誘発性及び／又は組織特異的及び分化特異的プロモータを含み、本書の他の場所で論述されている。構成的プロモータには、サイトメガロウイルス前初期プロモータ及びラウス肉腫ウイルスプロモータが含まれるがこれに制限されるわけではない。さらに、ハウスキーピング遺伝子の発現を調節するものなどのハウスキーピングプロモータも同様に使用することができる。その他のプロモータには、グリフ線維性酸性タンパク質をコードする遺伝子のためのプロモータといった（ただしこれに制限されるわけではない）中枢神経系の細胞内で優先的に発現されるものが含まれる。さらに、プロモータ／調節要素を、遺伝子発現が誘発可能となるように選択することができる。例えば、テトラサイクリン誘導的プロモータを使用することができる（フライントリッチ（Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈ）ら、１９９７年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、第２８３号、１５９〜１７３頁）。
【０３９２】
遺伝子構成体は好ましくは、ベクターが細胞内にトランスフェクトされた時点でコーディング配列が細胞により発現されるような形で、不可欠なプロモータ／調節配列に対し操作可能に連結された該発明の哺乳類レナラーゼのコーディング配列を含む発現ベクターとして提供される。コーディング配列は、細胞内での配列の発現に必要なプロモータ／調節要素に対し操作可能に連結される。タンパク質をコードするヌクレオチド配列はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はそのハイブリッド又はｍＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。プロモータ／調節要素に対し操作可能に連結されたレナラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構成体は、機能するエピソーム分子として細胞内に存在した状態にとどまる可能性があり、そうでなければそれは細胞の染色体ＤＮＡ内に組込まれ得る。細胞内に遺伝子材料を導入することができ、ここでこの遺伝子材料はプラスミドの形をした別の遺伝子材料としてとどまる。代替的には、宿主細胞染色体に組込まれうる線形ＤＮＡを細胞内に導入することができる。細胞内にＤＮＡを導入する場合、染色体内へのＤＮＡの組込みを促進する試薬を添加することができる。組込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列も同様にＤＮＡ分子内に含み入れることができる。代替的には、ＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【０３９３】
発現ベクター内の遺伝子材料を発現させるためには、プロモータ／調節要素を、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結しなくてはならない。タンパク質産生を最大限にするためには、所望の細胞内の遺伝子発現を充分適したプロモータ／調節配列を選択することができる。さらに、細胞内に最も効率よく転写されるコドンを選択することができる。当業者であれば、所望の細胞内で機能的である発現ベクターとして組換え型遺伝子材料を生産することができる。
【０３９４】
タンパク質の組織特異的発現を容易にするように、プロモータ／調節要素を選択できるということも同様に考慮されている。かくして例えば、組換え細胞が移植される場合組織内で非相同遺伝子のみが発現されるような形で、特異的プロモータ／調節配列を提供することができる。さらに、当業者であれば本書に提供されている開示に基づいて、レナラーゼプロモータを問題の核酸に操作可能に連結しかくしてその組織又は器官の部位で核酸の発現を導くことができるということを認識すると思われる。同様にして、高いカテコールアミン循環が問題ある場合にかかる発現が有益である場合には、レナラーゼプロモータは、問題の核酸の発現を駆動することができる。
【０３９５】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、レナラーゼの発現又は発現欠如がターゲティングされなくてはならない場合の好ましい組織として、皮膚の潰瘍形成、骨折などが含まれるもののこれに制限されるわけではないということを理解することだろう。さらに、プロモータ／調節要素は、遺伝子発現を誘発できるような形で選択可能である。例えば、テトラサイクリン誘発可能なプロモータを使用することができる（フライントリッチら、１９９７年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ、第２８３号、１５９〜１７３頁）。
【０３９６】
特定の何らかの理論にも束縛されることを望むわけではないが、レナラーゼをコードする核酸は好ましくは、組換え細胞内で単離された核酸によりコードされたレナラーゼの輸送及び分泌を導き得る本書のその他の場所で開示されている通り推定上のシグナル配列（例えばヒトレナラーゼのＮ末端にあるアミノ酸）を含む。該シグナル配列は、該細胞からの成熟したレナラーゼタンパク質の分泌時点でプロセッシングされ除去される確率が大きい。代替的には、特定の何らかの理論により束縛されることを望むわけではないが、推定シグナル配列は分割されなくてもよく、反対に膜内外ドメインであり得る。
【０３９７】
細胞内の遺伝的欠陥を矯正する、そうでなければ遺伝子材料が個体内の遺伝的欠陥を矯正するような形で充分な数量及び／又は機能的条件で存在しないタンパク質をコードする、かつ／又はそれに結びつけられる特定の疾病、障害又は身体状態の治療又は予防において有用であるタンパク質をコードしかつ細胞内でのレナラーゼの発現を阻害する（例えばノックアウトターゲティングベクター、アンチセンス核酸など）組換え型遺伝子材料を細胞に提供することに加えて、かかる細胞を選択的に終結させることが万一望ましくなかった場合にその終結を行なうための手段を提供するべく本発明の中で用いられる組換え細胞の中に遺伝子材料を導入することも可能である。破壊のために組換え細胞をターゲティングするためのかかる手段は、組換え細胞内に導入され得る。
【０３９８】
該発明に従うと、組換え細胞に対し、それらを特異的に破壊されやすいものにする遺伝子材料を供給することができる。例えば、細胞毒性作用物質で特異的にターゲティングされ得る受容体をコードする遺伝子を組換え細胞に提供することができる。選択的細胞死を誘発するために使用され得る遺伝子の発現可能な形態を、組換え細胞内に導入することができる。このような系においては、該遺伝子によりコードされるタンパク質を発現する細胞は、特定の条件下又は特定の作用物質の存在下又は不在下でターゲティングされた形で死滅させられる可能性が高い。例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ヘルペスｔｋ）遺伝子の発現可能な形態を組換え細胞内に導入し選択的細胞死を誘発するために使用することができる。ヘルペスｔｋ遺伝子を内含する導入された遺伝子材料が個体の中に導入された時点で、ヘルペスｔｋが産生されることになる。移植された組換え細胞を死滅させることが望ましい又は必要である場合には、ヘルペスｔｋを産生する任意の細胞の選択的な死滅をひき起こすことになる薬物ガングシクロヴィアを個体に投与することができる。かくして、移植された組換え細胞の選択的破壊を可能にする系を提供することができる。
【０３９９】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、本発明が、哺乳類の体内でレナラーゼを提供するか又はレナラーゼ発現を阻害するための組換え細胞の産生をも包含することを理解するであろう。すなわち、動物に対しレナラーゼを投与するため又は分子（例えばノックアウトターゲティングベクター、アンチセンス核酸、リボザイム及び特異的にレナラーゼと結合する抗体など）を送達するために、細胞を使用することが可能である。
【０４００】
動物に対するレナラーゼの投与は、レナラーゼの作用機序を研究するためのモデル系としてか又はレナラーゼ発現と結びつけられる疾病、障害又は身体状態のための診断法及び／又は治療法の開発にとって有用なモデル系を開発するために用いることができる。
【０４０１】
さらに、レナラーゼを発現及び分泌する組換え細胞の投与により媒介される動物に対するレナラーゼの送達は同様に、レナラーゼのレベルの増加が治療効果を媒介する場合の疾病、障害又は身体状態の治療又は緩和のために使用することも可能である。より特定的には、レナラーゼをコードする核酸を発現する組換え細胞を投与することによる動物に対するレナラーゼの投与は、なかでもＥＳＲＤ、高血圧、心臓血管疾患の治療のために有用であり得る。
【０４０２】
代替的には、その発現が１つの細胞からのレナラーゼの発現、活性及び／又は分泌を阻害又は低減する核酸を含む組換え細胞の投与を、レナラーゼ発現、活性及び／又は分泌と結びつけられるか又はそれにより媒介される疾病、障害又は身体状態にとって有用な診断法及び／又は治療法の開発のためのモデルとして使用することができる。本発明は、組換え細胞がレナラーゼ発現を阻害する分子を産生しかくしてかかる分子を動物に提供できることを包含している。特定の何らかの理論によって束縛されることを望むわけではないが、代替的には、レナラーゼを発現することができないという点を除いてそうでなければ機能的な細胞である組換え細胞自体は、レナラーゼシグナリング経路の対象となることなく、その他の点では同一であるものの非組換え型である細胞の機能を果たすことができる。
【０４０３】
動物から及び市販の又は今後開発されるべき立証済みの細胞系統から又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された一次細胞から得た細胞は両方共、当業者にとって容易に利用可能な周知の技術を用いてトランスフェクションを受けることができる。かくして本発明は、ドナー動物から又は患者である動物自身から細胞を得ることに制限されない。むしろ、該発明は、組換え細胞がレナラーゼを発現する（工学処理を受ける前にそれがレナラーゼを発現しなかった場合又は細胞内への核酸の導入に先立ち異なるレベルで細胞がレナラーゼを産生した場合）か又は組換え細胞がレナラーゼを発現しないか又はより低いレベルでしか発現しない（細胞内への核酸の導入の前にそれがレナラーゼを発現したか又はかかる導入に先立ち異なるレベルでレナラーゼを発現した場合）ような形で該発明の核酸を用いて工学処理され得るあらゆる細胞を使用することを含んでいる。
【０４０４】
遺伝子によりコードされたタンパク質を発現するか又はレナラーゼ発現を阻害する分子を発現する細胞内に遺伝子構成体を導入するために利用される標準的方法を用いて細胞内に核酸を導入することが可能である。一部の実施形態においては、リン酸カルシウム沈殿トランスフェクション、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、リポソーム媒介転移、化学物質媒介転移、リガンド媒介転移又は組換え型ウイルスベクター転移によって細胞がトランスフェクトされる。
【０４０５】
一部の実施形態においては、所望の配列をもつＤＮＡを細胞内に導入するために組換え型アデノウイルスベクターが用いられる。一部の実施形態では、細胞内に所望の配列を有するＤＮＡを導入するために組換え型レトロウイルスベクターが使用される。一部の実施形態においては、分裂する細胞内に所望のＤＮＡを取込むために、標準的なリン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン又は脂質担体媒介トランスフェクション技術が利用される。トランスフェクションを受けた細胞を同定し選択するために標準的抗生物質耐性選択技術を使用することができる。一部の実施形態では、マイクロインジェクションにより細胞内に直接ＤＮＡが導入される。同様にして、細胞内の外来性ＤＮＡを導入するためには、周知の電気穿孔法又は粒子ボンバード技術を使用することができる。第２の遺伝子は通常、レナラーゼをコードする核酸又はノックアウトターゲティングベクター又はそれに対するアンチセンス分子との同時トランスフェクションを受けかつ／又はそれに対し共有結合により連結される。第２の遺伝子は、選択性抗生物質耐性遺伝子であることが多い。トランスフェクションを受けた組換え細胞は、選択性遺伝子を取り上げない細胞を死滅させる抗生物質中で細胞を成長させることによって選択可能である。２つの遺伝子が連結されておらず、同じトランスフェクションを受けていない大部分のケースにおいて、抗生物質処置を生き延びた細胞は両方の遺伝子を含有し、それを発現する。
【０４０６】
レナラーゼのレベルを査定するための方法（例えばウエスタンブロット法又はＥＬＩＳＡなどのその他の免疫ベースの分析において抗レナラーゼ抗体を使用するもの）及び／又は細胞及び／又は組織内のレナラーゼ発現レベルを評価するための方法（例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ分析、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどを用いるもの）は本書で開示されているか又は当業者にとって周知である。かかるアッセイは、レナラーゼのレベルを望ましいレベルまで低減又は増大させるために動物に対し投与すべき「有効量」のレナラーゼを判定するために（単離された核酸、抗体、アンチセンス核酸、リボザイム、組換え細胞などのいずれを使用したかに関わらず）使用可能である。
【０４０７】
Ｂ．  有用な化合物を同定する方法
本発明はさらに、細胞内のレナラーゼの発明及び／又は活性に影響を及ぼす化合物を同定する方法を含む。該方法は、テスト化合物と細胞を接触させ、このように接触させられた細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性のレベルを、該化合物と接触しておらずその他の点では同一である細胞内でのレナラーゼの発現及び／又は活性と比較する工程を含む。レナラーゼの発現及び／又は活性のレベルが、テスト化合物と接触していないその他の点では同一である細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性のレベルと比べて、テスト化合物と接触した細胞内では高い又は低い場合、これは、そのテスト化合物が細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性に影響を与えることを表わしている。
【０４０８】
同様にして、本発明は、１つの細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性を低減させる化合物を同定する方法を含む。該方法は、テスト化合物と細胞を接触させ、該化合物と接触させられた細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性のレベルを、該化合物と接触しておらずその他の点では同一である細胞内でのレナラーゼの発現及び／又は活性と比較する工程を含む。レナラーゼの発現及び／又は活性のレベルが、該化合物と接触させられなかった細胞内のレベルと比べて、化合物と接触した細胞内では低い場合、これは、そのテスト化合物が細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性を低減させることを表わしている。
【０４０９】
当業者であれば、本書で提供されている開示に基づいてレナラーゼをコードするｍＲＮＡの発現及び／又は活性のレベルを判定することによって細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性のレベルを測定できるということを認識すると思われる。代替的には、該発明の抗レナラーゼ抗体を用いるウエスタンブロット分析を用いて本書で記述されているようなｍＲＮＡからのレナラーゼ産生を査定するため免疫学的方法を用いることによりレナラーゼをコードするｍＲＮＡの発現及び／又は活性のレベルを判定することができる。さらに、ノーザンブロット及びＰＣＲアッセイなどなどの核酸ベースの検出方法も同様に使用することができる。さらに、例えば腎臓、心臓、骨格筋及び小腸などの中のレナラーゼ発現及び／又は活性のレベルといったレナラーゼ活性による影響を受け得るさまざまなパラメータのレベルを判定することにより、細胞内のレナラーゼ活性レベルを査定することも可能である。代替的には、アミンオキシダーゼアッセイの内部でレナラーゼ活性のレベルを査定することができる。かくして、当業者であれば、本書に提供されている広範な開示及び実施化に基づいて、本書で開示されている方法、当該技術分野において周知の方法及び将来開発されるべき方法を含め、細胞内のレナラーゼの発現及び／又は活性のレベルを査定するために使用され得る多数の方法が存在するということを認識するものと思われる。
【０４１０】
さらに、当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、以下の実施例で開示されている通り、内因性レナラーゼ発現及び／又は活性が欠如している細胞を、細胞内でレナラーゼの発現及び／又は活性がもたらされるようにするレナラーゼをコードする単離された核酸を含むベクターでトランスフェクトすることができるということを認識すると思われる。トランスフェクションを受けた細胞は次にテスト化合物と接触させられ、かくして、該化合物がレナラーゼの発現及び／又は活性に影響を及ぼすか否かの判定を可能にする。従って、本発明を備えた当業者であれば、レナラーゼ発現ベクターを用いて検出可能なレベルのレナラーゼが欠如している細胞を選択的にトランスフェクトすることによって、レナラーゼの発現及び／又は活性に選択的に影響を及ぼす化合物を同定することができると思われる。
【０４１１】
当業者であればさらに、本書に提供されている開示に基づいて、検出可能なレナラーゼが細胞により産生されるような形で内因性の検出可能なレベルのレナラーゼの発現及び／又は活性が欠如した細胞に対しレナラーゼをコードする単離された核酸が投与される場合、単離された核酸は、例えばそれに共有結合により連結された状態でタグポリペプチドをコードする付加的な核酸を含み得る。こうしてタグポリペプチドの発現及び／又は活性を検出することによりレナラーゼの発現及び／又は活性を検出することが可能となる。かくして、本発明は、レナラーゼと同時発現されるもう１つの分子の発現及び／又は活性を検出することによりレナラーゼの発現及び／又は活性を検出する方法を包含する。
【０４１２】
該発明は、レナラーゼと特異的に結合するタンパク質を同定する方法を内含する。レナラーゼは少なくとも１つのもう一方のタンパク質と結合し、これによりその他のタンパク質とのかかる相互作用がレナラーゼの生物学的機能に影響が及ぼされる可能性がある。かくして、該発明は、レナラーゼと特異的に結合しかつ／又はそれと会合するタンパク質を同定するための、当該技術分野において周知の又は今後開発されるべき方法を包含する。かかる方法としては、標的タンパク質すなわちレナラーゼが適切な支持体上で固定化され、レナラーゼ関連タンパク質とのレナラーゼ結合を可能にする条件下でインキュベートされるタンパク質結合アッセイが含まれるが、これに制限されるわけではない。レナラーゼは、それぞれ融合タンパク質が次にグルタチオン−セファロースビーズ、マルトースカラム又はニッケルキレート化樹脂（例えばＨｉｓ−Ｂｉｎｄ樹脂、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウイスコンシン州）に結合される場合にグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、又はＨｉｓ６−タグを含むレナラーゼの産生といった（ただしこれに制限されるわけではない）標準的方法を用いて支持体上に固定化され得る。固体支持体は、それに非特異的に結合され得るタンパク質を除去するべく洗浄され、このときマトリクスからあらゆるレナラーゼ関連タンパク質を解離させ、かくしてレナラーゼ関連タンパク質を同定することができる。
【０４１３】
さらに、例えば酵母２ハイブリッドアッセイを用いて、例えば受容体、リガンド及び／又はその他のレナラーゼ関連タンパク質といったレナラーゼと特異的に結合するタンパク質を同定することができる。酵母２ハイブリッドアッセイは、当該技術分野において周知であり、標準的な方法に従って市販のキット（例えば、マッチメーカー（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ）（商標）システム、クローンテックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、カリフォルニア州、及びその他のかかるキット）を用いて実施可能である。従って、例えば「ベイト」タンパク質、レナラーゼの全アミノ酸及び核酸配列といった本書に提供されている教示をひとたび備えたならば、当業者は、レナラーゼ受容体タンパク質、レナラーゼリガンドなどといった（ただしこれに制限されるわけではない）レナラーゼと特異的に結合するタンパク質を容易に同定することができる。
【０４１４】
当業者であれば、本書に提供されている開示に基づいて、該発明が本書のその他の場所で論述されている方法を用いて同定されたあらゆる分子を包含する、ということを理解すると思われる。すなわち、レナラーゼ受容体タンパク質、レナラーゼリガンドタンパク質又はその両方といった（ただしこれに制限されるわけではない）レナラーゼと会合する分子を用いて、ＥＳＲＤ、高血圧、心臓血管疾患などといったレナラーゼ関連タンパク質とのレナラーゼ相互作用によって媒介される疾病、障害又は身体状態のための治療法及び診断法を開発することが可能である。すなわち、当業者であれば、レナラーゼと特異的に結合する抗体について論述するにあたり本書の他の場所でより詳述に記されている通り、レナラーゼ活性のために必要とされる必要なレナラーゼ受容体／リガンド相互作用及びその他のレナラーゼ結合相互作用を阻害することによって１つの細胞内のレナラーゼ活性を阻害する治療法を開発するためにレナラーゼ関連タンパク質を使用することができるということを認識するものと思われる。
【０４１５】
以上で開示されている方法により同定されたレナラーゼ関連タンパク質は、レナラーゼ関連タンパク質又はその一部分と細胞を接触させることによりレナラーゼ相互作用を阻害するために直接使用することができ、そうでなければレナラーゼとのレナラーゼ関連相互作用を阻害しかくしてレナラーゼの機能及び活性を阻害することのできる抗体及び／又はペプチドミメティックスを開発するために使用することもできる。かくしてレナラーゼ受容体／リガンドタンパク質を含むレナラーゼ関連タンパク質が有用であり、該発明により包含される。
【０４１６】
Ｃ．  診断及び療法査定の方法
本発明は、ＥＳＲＤ、慢性腎疾患、高血圧、心臓血管疾患例えば無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全及びアテローム性動脈硬化といった（ただしこれに制限されるわけではない）或る種の疾病、障害又は身体状態の診断方法を含む。レナラーゼは同様に、急性腎不全（すなわち、急性腎尿細管壊死又はＡＴＮ）などのための診断マーカーとしても使用可能である。
【０４１７】
該発明は、哺乳類から生物試料を得、試料内のレナラーゼのレベル（発現、量、活性）を腎疾患を罹患していない人からの試料の中のレナラーゼのレベルと比較する工程を含む。ＥＳＲＤ、ＡＮＴ、又は高血圧を罹患していない人から得た試料中のレナラーゼレベルと比較して患者からの試料中のレナラーゼのレベルが低い場合、それはその患者がＥＳＲＤ、ＡＮＴ又は高血圧に悩まされていることの標示である。
【０４１８】
該発明は、哺乳類におけるＥＳＲＤの治療の有効性を査定する方法を含む。該方法は、ＥＳＲＤがレナラーゼ発現の減少と結びつけられることから、特定されたＥＳＲＤ治療単位の前、途中及び後のレナラーゼの発現、量及び／又は活性のレベルの査定を含む。これは、以前に他の場所で述べたとおり、又本書で開示されているデータが実証しているように、レナラーゼの発現、量及び／又は活性が或る種の疾病状態（例えばＥＳＲＤ及び高血圧）の特長であるカテコールアミン循環と結びつけられるか又はそれを増大させたからである。かくして、レナラーゼの発現／量／活性に対する１治療単位の効果を評価すると、レナラーゼの発現、量又は活性のレベル上昇が該治療方法の成功を表わすような形で治療の効能が示されることになる。
【０４１９】
さらに記述することなく、当業者であれば、以上の記述及び以下の実施例を用いて、本発明の化合物を作り利用し、請求対象の方法を実践することができる。従って以下の作業実施例は、本発明の好ましい実施形態を特定的に指摘するものであり、いかなる形であれ制限的意味をもつものとみなすべきものではない。
【実施例】
【０４２０】
概要
この実施例で提示されている実験は、以下のように要約することができる。まず第１に、レナラーゼが同定される。この新規の腎臓分泌タンパク質を単離するために、既存の公共データベース、特定的には哺乳類遺伝子収集プロジェクト（ＭＧＣ）が利用された。新規分泌タンパク質をコードする合計１１４の候補遺伝子が以下の基準に基づいて同定された：（ｉ）候補遺伝子が、データベース内の既存のタンパク質に対する２０％未満の類似性／同一性で新規タンパク質をコードする；（ｉｉ）シグナルペプチド配列を予測する２つの異なる方法を用いて）、推定タンパク質がシグナルペプチド配列を有しているものと予測されている；（ｉｉｉ）（Ｉ型膜タンパク質などの一部の膜タンパク質も同様にシグナルペプチド配列を宿していることから）推定タンパク質が膜内外ドメインを含有しない。
【０４２１】
この戦略は、次のようないくつかの全く異なる利点を提供する。すなわち、分析は新規の遺伝子のみに制限される；それは厄介なクローニングプロセスを迂回し、興味深い遺伝子の探求を数カ月さらには数年分切り落す；それは、組織内の遺伝子発現及び生化学的及び機能的研究を即刻に確認できるようにする。実際、このアルゴリズムを用いて、１つのクローンＭＧＣ１２４７４が腎臓内で高レベルで発現されることが発見された（以下参照）。かくしてこのクローンはさらなる研究のために選択された。
【０４２２】
ＭＧＣ１２４７４はモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）活性をもつタンパク質をコードする。ＭＡＯは、生体モノアミンをその対応するアルデヒドに転換させるフラビン−アデノシン−ジヌクレオチド（ＦＡＤ）含有酵素である。酵素反応（マッシー（Ｍａｓｓｅｙ）ら、２０００年）は、フラビン補因子の同時還元を伴ってイミソ産物を形成するべく基質のα−ＣＨ結合の酸化的分割を介してモノアミンの酸化の触媒として作用する。イミン産物は次に対応するアルデヒド及びアンモニアまで加水分解される。還元されたフラビン補酵素は酸素と反応して過酸化水素とフラビンの酸化形態を形成して触媒サイクルを完了する。
【０４２３】
ヒトとマウスの間で同一であるアミノ酸位置２２６〜２３８から誘導された合成ペプチドを用いて、ウサギ抗レナラーゼポリクローナル抗体も発生させられた。ウエスタンブロット研究は、この抗体が同じ３７Ｋｄのレナラーゼ−ＨＡ融合タンパク質を抗ＨＡ抗体として認識することを示した。
【０４２４】
その上、レナラーゼは、ヒトの体内の血液に対し分泌されることが発見され（詳細については以下参照）、さらにレナラーゼの分泌タンパク質としての性質を実証した。
【０４２５】
タンパク質産物の検出を容易にするために、レナラーゼのＣ末端にあるＨＡタグが工学処理された。抗−ＨＡと抗−レナラーゼ抗体の両方を用いたウエスタンブロット法は、腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞の培地中の３７Ｋｄのタンパク質を明らかにし、レナラーゼが機能的Ｎ末端シグナル配列を有し、これらの研究で使用された細胞培養モデル内で分泌されることを示した。
【０４２６】
さらに、ヒトの血液をレナラーゼ特異的ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法で検査した。図３ｂは、レナラーゼが血液中で容易に検出可能であることを示している。腎臓が循環するレナラーゼの主要な供給源であるか否かを判定するために、我々は、重症の腎臓病患者において血中濃度が削減され腎機能を低下させるか否かをテストした。図３ｂに示されているように、レナラーゼは、血液透析を受けているＥＳＲＤ患者の血液中で事実上検出不可能であった。
【０４２７】
実験について以下でさらに詳述する。
【０４２８】
実施例１：レナラーゼをコードする遺伝子の同定と解析
材料と方法
ＭＧＣデータベースのバイオインフォマティックス解析
この実験の日付現在で哺乳類遺伝子収集物プロジェクトＭＧＣから入手可能な１２５６３個の全く異なるヒト完全ＯＲＦｃＤＮＡｓの全てを３ラウンドの逐次的スクリーニングに付した。ＭＧＣの初期解析は２００１年１２月２４日に実施した。まず第１に、ジェンバンク定義の無い遺伝子をさらに詳細な解析のために選択した。第２にラウンド１内で選択された遺伝子によりコードされた予測されたアミノ酸配列をＢＬＡＳＴ(ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ)を用いて解析し、既知のタンパク質と２０％未満の同一性しかないタンパク質をコードするものを選択した。第３に、Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ  Ｖ２．０（ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／Ｓｉｇｎａｌ  Ｐ−２．０１／）及びＳＯＳＵＩシグナルＢｅｔａ＿Ｖｅｒｓｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｓｕｉ．ｐｒｏｔｅｏｍｅ．ｂｉｏ．ｔｕａｔ．ａｃ．ｊｐ）を用いて推定上のシグナル配列の存在を査定した。その後、両方の方法により予測されたシグナルペプチド配列をもつ新規のタンパク質を、Ｐｆａｍを用いてドメイン探索に付した。問題のｃＤＮＡクローンコーディングクローンをＡＴＣＣから購入し、両方のストランド上で配列決定し（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＢＬＡＳＴを用いて解析した。
【０４２９】
ＭＧＣ
ＭＧＣプロジェクトは、ヒト遺伝子の機能的研究を容易にするべく全長ｃＤＮＡリソースを生成するためのＮ阻害物質による新たな研究活動である。このプロジェクトは、世界中の研究共同体に対し公けにアクセス可能なリソースを提供する。ＭＧＣプロジェクトは、ライブラリの製作、配列決定及びデータベース及び所蔵所の開発ならびにヒト及びその他の哺乳類の全長（読取り枠）配列及び発現済み遺伝子の完全なセットを得ることを目的としたライブラリ構築、配列決定及び解析技術のサポートを伴う（ロザンスキー（Ｒｏｚａｎｓｋｉ）ら、１９９９年；テンデラ（Ｔｅｎｄｅｒａ）ら、２００１年）。最も重要なことに、ＭＧＣは、選択されたクローンが潜在的に完全な配列を確実にコードするようにするため頑強な情報科学ツールを確立した。ＭＧＣはこの実験の日付現在で１２５６３の全く異なるヒト完全ＯＲＦｃＤＮＡを製作しており、その約２０％が新規の遺伝子である（新規遺伝子は、既知のタンパク質と２０％未満の類似性／同一性として定義づけされる）。
【０４３０】
ＤＮＡ配列
レナラーゼをコードするＭＧＣ１２４７４ｃＤＮＡクローンをＡＴＣＣから購入し、両方のストランド上で配列決定し（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）でＢＬＡＳＴＮを用いて公開済みの配列に対するＤＮＡ配列の同一性／類似性について解析した。
【０４３１】
ノーザンブロット分析
クローンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）からヒト多組織ノーザンブロットを得、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識されたレナラーゼｃＤＮＡとハイブリッド形成させた。１〜２時間又は一晩、６２〜６８℃で標識済みプローブ（約２×１０６ｃｐｍ／ｍｌ）を含有するＲａｐｉｄ−ｈｙｂ緩衝液中でハイブリダイゼーションを実施した。ストリンジェントな条件下でブロットを洗浄し、コダック（Ｋｏｄａｋ）ＸＡＲフィルムに曝露した。等しいＲＮＡ負荷についての内部対照のためのプローブとしてグリセルアルデヒド−３−ホスファートデヒドロゲナーゼｃＤＮＡを使用した。
【０４３２】
統計的分析
標準的な対応のあるスチューデントｔ−アッセイを２つのグループ間の比較に使用した。同等の周期でグループ比較のため標準的な対応のないスチューデントｔアッセイを使用した。全てのデータは平均±ＳＥであり、Ｐ＜０．０５が統計的に有意な差として受入れられた。
【０４３３】
結果
インポートの生物学的な役割をもつ新規のタンパク質を単離するために、既存の公共データベース、特定的には哺乳類遺伝子収集物プロジェクト（ＭＧＣ）（ストラウスバーグ（Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ）ら、１９９９年）を、腎臓により分泌される可能性の高い新しいタンパク質を選択するように設計されたアルゴリズムを用いてスクリーニングした。ＭＧＣプロジェクトは、遺伝子産物の機能的研究を容易にするためにヒト及びマウスにおける全長ｃＤＮＡリソースを生成するためのＮＩＨによる新たな研究活動である（ストラウスバーグら、１９９９年：ｈｔｔｐ：／／ｍｇｃ．ｎｃｉ，ｎｉｈ．ｇｏｖ）。分泌されたタンパク質をコードする候補遺伝子を選択するために、ＭＧＣが公表したクローン全てを研究した。ＭＧＣは、これらの実験の日付現在で１２，５６３の全く異なるヒト完全ＯＲＦｃＤＮＡを製作しており、その約２０％が新規の遺伝子である（新規遺伝子は、既知のタンパク質と２０％未満の類似性／同一性として定義づけされる）。ＭＧＣデータ解析が２００３年８月１日に完成した時点までに、合計で新規分泌タンパク質をコードする１１４の候補遺伝子が以下の基準に基づいて同定された。すなわち、（ｉ）候補遺伝子は、データベース内の既存のタンパク質に対する２０％未満の類似性／同一性で新規タンパク質をコードする；（ｉｉ）推定上のタンパク質が（シグナルペプチド配列を予測する２つの異なる方法を用いて）シグナルペプチド配列を収容している；（ｉｉｉ）推定上のタンパク質は（Ｉ型膜タンパク質などの膜タンパク質の一部分が同様にシグナルペプチド配列を宿していることから）膜内外タンパク質を含有していない。各々の候補遺伝子の組織発現をノーザンブロット分析により査定し、これは、ヒトの腎臓内でのこれらのクローンの１つの頑強かつ優先的な発現（ＭＧＣ１２４７４、ジェンバンク登録番号ＢＣ００５３６４）を明らかにした（図１Ａ）。ＭＧＣ１２４７４は１４７４個のヌクレオチドを有し、その最長の読取り枠（ヌクレオチド２２−１０４７）は、３７．８ｋＤａという計算上の分子質量の３４２個のアミノ酸を伴う新規のタンパク質をコードする（図２Ａ）。レナラーゼと命名されるヒト遺伝子は、およそ３１１，０００ｂｐにわたる７個のエクソンを有し、ｑ２３．３３にて染色体１０上に存在する（図２Ｂ）。ＭｏｔｉｆＳｃａｎを用いた分析により、Ｎ末端にあるシグナルペプチド、ＦＡＤ結合部位（アミノ酸４〜３５）及びアミノ酸１１〜３３９にあるアミンオキシダーゼドメインが明らかになった（図１Ｂ）。レナラーゼはモノアミンオキシダーゼＡ（ＭＡＯ−Ａ）と１３．２％のアミノ酸同一性をもち（図１Ｃ）、ＭＡＯ−Ｂと弱い類似性を有している（図２Ｃ）。
【０４３４】
実施例２：レナラーゼは腎臓により分泌される。
遺伝子発現カセットの構築（ＴＡＰフラグメント）
２つの逐次的ＰＣＲ反応の後、５’−ＣＭＶプロモータ及び３’−ＳＶ４０ｐＡがそれぞれに各候補クローンの５’及び３’末端に添加されるＰＣＲベースのアプローチを使用した。詳細な方法については、リアン（Ｌｉａｎｇ）らにより記述されている。簡単に言うと、この方法は、２つの逐次的ＰＣＲ工程で構成されている。第１の工程は、万能ＴＡＰ末端及び標的遺伝子に特異的な配列を含むプライマ（各々０．４μｇ）を用いて実施される。５’万能ＴＡＰ末端配列は、ＣＭＶ前初期遺伝子プロモータを含むＤＮＡフラグメントに相補的であり、増幅された遺伝子にＣＭＶプロモータを付着させるために第２のＰＣＲ工程の中で用いられる。３’万能末端は、ＳＶ４０前初期遺伝子転写ターミネータを含むＤＮＡフラグメントと重複し、同じく増幅された遺伝子に転写ターミネータ配列を付着させるために第２工程のＰＣＲにおいて用いられる。レナラーゼを含有するＴＡＰフラグメントを生成するために、第１工程のＰＣＲに用いられる５’−及び３’プライマは以下の通りである；５’−オリゴ＝５’−ＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＧＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＣＡａｔｇｃｇａｃｃｃｃａｇｇｇｃｃｃｃｇｃｃｇ（配列番号：６、大文字は第２工程のＰＣＲのためのアンカーとして用いられる５’−ＴＡＰ万能配列であり、小文字はＡＴＧ開始部位で始まるクローン＃２特異的配列である）；３’−オリゴ＝５’−ＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＣＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴｔｔｔｔｇｇｔａｇｔｔｃｔｔｃａａｔａａｇ（配列番号：７、最初の２５の塩基は、第２工程のＰＣＲのためのアンカーとして用いられる３’−ＴＡＰ万能配列であり、下線の付いた配列は、ＨＡとそれに続く停止コドンＴＧＡをコードし、小文字は３’末端で始まるクローンレナラーゼ特異的配列マイナス停止コドンである）。第２工程のＰＣＲのために用いられる５’及び３’プライマはメーカー（ジーンセラピーシステム（ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）によって提供される。
【０４３５】
遺伝子の送達及び発現
Ｇｅｎｅ  ＰＯＲＴＥＲ（ジーンセラピーシステム、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を用い、メーカーが推奨する手順に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションを実施した。対照として緑色螢光タンパク質ＴＡＰフラグメントを用いて査定される通り、一貫して４０〜６０％のトランスフェクション効率が得られた。
【０４３６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳
インサートの５’末端の前にＴ７を含むｐＤＮＲ−ＬＩＢ内へとレナラーゼｃＤＮＡをクローニングした。レナラーゼｍＲＮＡを転写し、その後シングルチューブプロテイン(登録商標)システム３（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、カリフォルニア州）を用いて翻訳した。正の対照としてルシフェラーゼＴ７ｃＤＮＡを使用した。５０μＣｉの［３５Ｓ］メチオニンで補足された５０μｌの反応混合物中の１μｇのプラスミドＤＮＡ（アマーシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ニュージャージー州）を用いてメーカーの指示事項に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−翻訳を実施した。
【０４３７】
遺伝子の送達及び発現
ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ（ジーンセラピーシステム）を用いメーカーが推奨する手順に従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションを実施した。対照として緑色螢光タンパク質ＴＡＰフラグメントを用いて一貫して４０〜６０％のトランスフェクション効率が得られた。レナラーゼが分泌タンパク質であるか否かをテストするためには、ｉｎ  ｖｉｖｏ発現実験において直接使用される転写活性のあるＰＣＲ（ＴＡＰ）フラグメントを生成するためのＰＣＲベースのアプローチを利用した（リアンら、２００２年）。
【０４３８】
レナラーゼ抗体の生成
ウサギ抗レナラーゼポリクローナル抗体は、抗原として組換え型ＧＳＴ−レナラーゼ融合タンパク質を用いてプロテインテックグループ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ）（Ｃｈｉｃａｇｏ）により生成された。１０週間後、ウサギはＧＳＴ−レナラーゼタンパク質でのブースタ投与を受けた。第２の抗原注入から６〜８週間後に、ウサギを出血させ、抗レナラーゼ抗体を親和力精製した。
【０４３９】
ウエスタンブロット分析
１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのＬグルタミン及び抗生物質で補足されたダルベッコ修正イングル培地の中でＨＥＫ２３９細胞を成長させた。細胞は６０〜８０％の集密性に至るまで６ウェルの平板内で成長させ、Ｇｅｎｅｐｏｒｔｅｒを用いメーカーの指示事項に従ってレナラーゼ−ＨＡ融合タンパク質を含有するＴＡＰフラグメントでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８〜７２時間後に、細胞溶解物からのタンパク質を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離しニトロセルロース膜上に移し、抗ＨＡモノクローナル抗体（ロシュケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））で免疫ブロッティングした。
【０４４０】
免疫複合体をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）に接合された二次抗体で検出し、スーパーシグナルウエストピコルミノール（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｌｕｍｉｎｏｌ）／エンハンサ溶液（ピアース）で視覚化した。候補遺伝子によってコードされたタンパク質の分泌特性を検査するべく、培地を細胞溶解物と並行してウエスタンブロット分析に付した。ヒト血漿レナラーゼを検査するべく、レナラーゼ特異的抗体を用いたウエスタンブロットにより１０マイクロリットルの血漿を分析した。
【０４４１】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、前述の通りに実施した。簡単に言うと、ＭＧＣクローン＃１２４７４由来の４２６ｂｐのＤＮＡフラグメントを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩ消化により単離した。その後それをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  ＫＳ（＋）ベクターへとサブクローニングさせ、ＤＩＧ標識キット（ロッシュバイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）でＤＩＧ標識されたＲＮＡプローブ内にｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写した。センスストランドを対照として使用する一方、レナラーゼを検出するためにアンチセンスを使用した。パラフィン内に包埋された心臓及び腎臓の組織から切断された切片とハイブリット形成するためにこれらのプローブを使用した。成人の心臓及び腎臓組織は、家族の同意及び大学臨床研究倫理委員会の承認を得て、剖検のケースから入手した。組織をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％のパラホルムアルデヒドで一晩定着させた。死後遅延は約７時間であった。組織をグレードエタノールを通して脱水し、キシレンで一掃し、パラフィンで包埋させ、厚み５μｍの切片を調製した。
【０４４２】
脱ろう及び水和の後、切片を１０分間３７℃でプロティナーゼＫ（２０μｇ／ｍｌ）で消化させた。これらを次に１０分間ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドで後定着させた。４×ＳＳＣ、１０％の硫酸デキストラン、１×デンハルト溶液、５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＣＨＡＰＳ、５０％の脱イオンホルムアミド、２００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ、及び２００ｎｇ／ｍｌのＤＩＧ標識されたプローブを含有するハイブリダイゼーション緩衝液の中で５０℃でハイブリダイゼーションを行なった。スライドを、２×ＳＳＣ中で１５分ずつ４回洗浄し、次に５０℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で各１５分ずつ２回洗浄した。アルカリホスファターゼに接合された抗ＤＩＧ抗体を用いて比色検出を実施し、その後続いてジゴキシゲニン−核酸検出キット（ロッシュ、ドイツ）を用いてＮＢＴ／ＢＣＩＰカラー基質でインキュベートした。ヒトレナラーゼについては、ＮＢＴ／ＢＣＩＰカラー基質溶液中での顕色に約５分が必要であった。
【０４４３】
結果
レナラーゼｍＲＮＡの組織分布を決定するために、ヒト組織パネル上でノーザンブロッティングを実施した。図１Ａに描かれた結果は、レナラーゼｍＲＮＡが腎臓内で高レベルで発現され、複数のその他の組織型の中ではより低いレベルで発現されるということを示している。さまざまなヒト組織の中でのレナラーゼｍＲＮＡの空間的分布を判定するために、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した（図３）。腎糸球体、近位細管（図３Ａ、左パネル）及び心臓ミオサイト（図３Ｂ、左パネル）の中に特異的シグナルが検出された。この分布は、腎糸球体、近位細管（図３Ｃ、左パネル）及び心筋細胞（図３Ｄ、左パネル）の中のレナラーゼタンパク質の検出によって明らかにされる通り、免疫細胞化学実験によって確認された。これらの結果は、高レベルのレナラーゼｍＲＮＡ発現が組織特異的であることを表わし、それが腎臓、骨格筋、心臓及び肝臓の中に見られる細胞に特異的な機能を有しうるということを示唆している。
【０４４４】
候補遺伝子が分泌されたタンパク質をコードするか否かをテストするために、直接ｉｎ  ｖｉｖｏ発現実験で使用されている転写活性のあるＰＣＲ（ＴＡＰ）フラグメントを生成するべく、ＰＣＲベースのアプローチを利用した（６）。タンパク質産物の検出を容易にするため、レナラーゼのＣ末端でＨＡタグも工学処理した（シグナルペプチドの無欠性を保つためＮ末端を回避した）。図４ａで示されているようにレナラーゼ−ＨＡに対し５’−ＣＭＶプロモータ及び３’−ＳＶ４０ｐＡを融合させ、ＨＥＫ２９３細胞内にＴＡＰフラグメントをトランスフェクトした。抗ＨＡ抗体でのウエスタンブロッティングは、推定上のＮ末端シグナル配列の存在と一貫した、培地中で予想された３７Ｋｄの発現済みタンパク質産物を明らかにした（図４ｂ）。
【０４４５】
細胞内区画に限定されているか又は膜結合されているＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ及びＰＡＯとは異なり、レナラーゼは血液中に分泌され、ここでそれはウエスタンブロッティングによって検出可能である。ヒト血漿中でアミンオキシダーゼが測定され、これは平滑筋、含脂肪細胞及び内皮細胞により分泌される銅含有セミカルビジド感応性アミンオキシダーゼである血管接着タンパク質１（ＶＡＰ−１）によって媒介されるものと考えられている（サルミ（Ｓａｌｍｉ）ら、２００１年）。ＶＡＰ−１の基質特異性及び阻害物質プロファイルは、レナラーゼとはかなり異なるものである。それはベンシルアミン及びメチルアミンを代謝し、セミカルビジド及びヒドロキシルアミンにより阻害される。従って、レナラーゼは、循環中に分泌され循環カテコールアミンを代謝する唯一の既知のアミンオキシダーゼである。
【０４４６】
レナラーゼ発現は、腎臓、心臓、骨格筋及び小腸に制限されると思われる。腎臓は、最高の発現レベルを示し、循環する大量のレナラーゼの原因であると思われる。実際、透析を受けている末期腎不全（ＥＳＲＤ）患者の体内では劇的に減少する。重症の腎不全に結びつけられる代謝異常が心臓及び骨格筋によるレナラーゼ分泌を減少させ得るという可能性も排除できない。それでも、循環するレナラーゼプールに腎臓が大きく寄与している確率は高い。
【０４４７】
興味深いことに、最近の研究は、血漿ドーパミン及びノエルピネフリンレベル及び交感神経系の緊張がＥＳＲＤ患者において一貫して増大していることを示した（ジョレスら、２００４年；ゾッカーリら、２００２年；ハウスバーグら、２００２年）。最近の研究は同様に突然の情動ストレスが交感神経性刺激を増大させ気絶心筋を導き得るということも発見した（ウィットスタインら、（２００５年）「Ｎｅｕｒｏｈｕｍｏｒａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｔｕｎｎｉｎｇ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｓｕｄｄｅｎ  ｅｍｏｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｅｓｓ」、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、第３５２号、５３９〜５４８頁）。高まった交感神経系の緊張は、高血圧、左心室肥大及び機能障害などの心臓血管合併症の病因に寄与し得る。これらの障害は、ＥＳＲＤ患者に見られる高死亡率に寄与する確率が高い。かくして低いレナラーゼ血中レベルがＥＳＲＤ患者に見られる交感神経系の緊張の高まりを導き、レナラーゼを投与することで心臓血管合併症の発生率が減少し生存率が上昇しうるということが可能である。
【０４４８】
実施例３：レナラーゼがｉｎ  ｖｉｔｒｏでカテコールアミンを分解し、ｉｎ  ｖｉｖｏで心臓機能及び全身血圧を調整する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳
インサートの５’末端の前にＴ７を含有するｐＤＮＲ−ＬＩＢ内にＭＧＣ１２４７４クローンをクローニングさせた。レナラーゼｍＲＮＡを転写させ、その後シングルチューブプロテイン（登録商標）システム３（ノバジェン、カタログ番号７０１９２）を用いて翻訳した。正の対照としてルシフェラーゼＴ７ｃＤＮＡを使用した。メーカーの指示事項に従って５０μＣｉの［３５Ｓ］メチオニン（アマーシャムファルマシアバイオテク）で補足された５０μｌの反応混合物の中の１μｇのプラスミドＤＮＡを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−翻訳を実施した。１０μｌの生成物を１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その後オートラジオグラフィ及びウエスタンブロッティングを行なった。
【０４４９】
ＧＳＴレナラーゼ組換え型タンパク質の生成
センスプライマ５’−ＴＴＴＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＡＧ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＴＣ  ＧＴＧ（配列番号：８）及びアンチセンス３’−ＴＴＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＣＴＡ  ＡＡＴ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＡ  ＡＧＣ（配列番号：９）を用いてレナラーゼコーディング領域（ｎｔ２４−１０５２）を増幅させる。Ｂａｍ  ＨＩ及びＥｃｏ  ＲＩで消化した後のＰＣＲフラグメントを、Ｎ末端でＧＳＴタグ（２６ｋＤａ）と同一枠内でｐＧＥＸ−４Ｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））内にクローニングさせた。ＤＮＡ配列決定による適正なクローニングを確認した後、組換え型ＧＳＴ−レナラーゼプラスミドを、組換え体融合産生のためにＥ．Ｃｏｌｉ  ＢＬ２１内に形質転換させた。形質転換の後、６リットルの細菌培養を、最後の３．５時間の培養中にＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を添加して１６時間２２０ｒｐｍ３７℃で成長させた。ＩＰＴＧ誘導の時点で１０μＭのＦＡＤを同様に添加した。レナラーゼの存在を、全細菌溶解物の４０μｇのタンパク質でウエスタンブロッティングにより確認した。
【０４５０】
ＧＳＴｒａｐカラムを用いて１工程方法で、細菌溶解物から直接レナラーゼタンパク質を精製することができる。結合緩衝液はｐＨ７．０のＰＢＳ（１４０ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、及びｐＨ７．０の１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含有する。溶出緩衝液：５０ｍＭトリス（商標）ＨＣｌ及び１０ｍＭ還元グルタチオン、ｐＨ８．０。試料調製のためには、１０ｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）試料を遠心分離し、氷上で結合緩衝液中で再懸濁させた。試料を音波処理してＧＳＴ−レナラーゼ融合タンパク質を放出させた。カラム精製の手順は以下の通りである：
１）  ５カラム体積の結合緩衝液でカラムを平衡させる、
２）  ０．２ｍｌ／分の流速を用いて試料を塗布する。
３）  ５〜１０カラム体積の結合緩衝液で洗浄するか又は排液中にいかなる材料も現われなくなるまで洗浄する。
４）  ５〜１０カラム体積の溶出緩衝液で溶出する。
【０４５１】
ＧＳＴ融合タンパク質又はその他のグルタチオン結合タンパク質のＧＳＴｒａｐに対する結合に影響を及ぼす最も重要なパラメータの１つは、流速である。ＧＳＴとグルタチオンの間の相対的に緩慢な結合反応速度に起因して、最大の結合能力を得るためには試料塗布中に流速を低く保つことが重要である。溶出に使用される体積及び時間は、異なるバッチのタンパク質間で変動し得る。より高い濃度のグルタチオンで付加的な溶出が必要となる可能性がある。必要とあらばウエスタンブロットと組合せた形でＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＧＳＴ融合タンパク質について、流入、洗浄及び溶出済み材料を監視すべきである。
【０４５２】
ＧＳＴ−レナラーゼ変性
尿素によるＲＺタンパク質の変性が、熱心な研究及び論争の的となってきた。レナラーゼ変性の研究は、以下のように実施される；
１．  およそ１ｍｇ／ｍｌの最終タンパク質濃度で５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）を含有する５０μｌの試料緩衝液の中で比較すべき２つのタンパク質試料の各々を調製する。
２．  ６Ｍという最終尿素濃度を得るため１８ｍｇの固体尿素に５０μｌの試料（工程１からのもの）を添加することにより、タンパク質を変性させる。
３．  ５μｌの調製したばかりの１００ｍＭのＤＴＴ（Ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ  Ｈ２Ｏ中で調製されたもの）を添加することによりタンパク質を還元し、ボルテックスにより混合する。１時間室温で溶液をインキュベートする。
【０４５３】
ＧＳＴ−レナラーゼの再生
産生され均質になるまで精製された変性レナラーゼの効率の良い再生プロセスを、中性ｐＨで８Ｍの尿素で変性させ、さまざまな緩衝液を用いて急速に希釈させた。中性ｐＨの緩衝液での急速な希釈は、低いタンパク質回収を生み出した。再生溶液中のタンパク質濃度の減少がタンパク質の回収を改善することはなかった。アルカリ性緩衝液での急速な希釈も、低いタンパク質回収を生み出した。しかしながら、弱酸性の緩衝液は、部分的な酵素活性を伴う量的タンパク質回収を示し、これは回収されたタンパク質がなおも部分再生状態で引き止められていることを表わしていた。従って我々は、低温（４℃）で酸性緩衝液内で形成される部分的に再生されたレナラーゼの効率の良い再生手順をさらに調査した。レナラーゼ酵素活性はｐＨ４で恒常にとどまった。１２時間より短かいインキュベーションを伴う同じｐＨ滴定は、より低い酵素活性を生み出した。室温で実施された再生試行は、凝集を導き、活性収量のほぼ半分が４℃で得られた。低温で酸性ｐＨ下の尿変性レナラーゼの急速な希釈が特定の立体構造を結果としてもたらし、それを次に生理的ｐＨまでの滴定により未変性状態に転換させることができる、という結論が導き出される。該プロセスは、次のように実施される：
１．  封入体としてレナラーゼタンパク質を精製し、中性に緩衝された８Ｍの尿素中で可溶化させる。タンパク質により必要とされる通りに、ＤＴＴで緩衝液を補足する。
２．  タンパク質濃度を０．１ｍｇ／ｍｌに調整する。
３．  順番に示すように透析緩衝液に対し各タンパク質を１０００μｌずつ透析した。
４．  溶液を穏やかに混合しながら、各透析管に１０００μｌのタンパク質溶液をゆっくりと添加する。
５．  緩衝液配列に従って１２時間４℃で透析。
６．  ５分間マイクロフュージによりレナラーゼを収集する。
７．  清浄な管内に液体をピペットで入念に取る。これは、再生された可溶性タンパク質を含有しているはずである。
８．  以下の通り再生の成功を査定する：
すなわち、何らかの活性タンパク質が存在する場合か否かを判定するため機能的アッセイを実施するのが最良である。異常な折り畳みの又は凝集したタンパク質は、正しく折畳みされたタンパク質とは異なる活性読取り値を有することになる。再生の成功は、投入されたタンパク質又は活性の３０％超が可溶性画分中で回収された場合に達成される。
実験で用いられる緩衝液は以下のものを含む：
緩衝液１：５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２  ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．７５ＭグアニジンＨＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＦＡＤ
緩衝液２：５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５、１０ｍＭＮａＣｌ、０．４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５Ｍアルギニン、０．０５％ポリエチレングリコール３、５５０、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．１ｍＭ  ＧＳＳＨ
緩衝液３：５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４Ｍスクロース、０．７５ＭグアニジンＨＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００、０．０５％ポリエチレングリコール３，５５０、１ｍＭ  ＤＴＴ
緩衝液４：５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５Ｍアルギニン、０．５％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．１ｍＭ  ＧＳＳＨ
緩衝液５：５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．４Ｍスクロース、０．７５ＭグアニジンＨＣ、１ｍＭ  ＤＴＴ
緩衝液６：５０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．５、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍアルギニン、０．４Ｍスクロース、０．５％トリトンＸ−１００、０．０５％ポリエチレングリコール３，５５０、１ｍＭ  ＧＳＨ、０．１ｍＭ  ＧＳＳＨ
【０４５４】
アミンオキシダーゼアッセイ
螢光マイクロプレート読取り装置を用いたアミンオキシダーゼ活性の連続的測定のための１工程螢光方法を提供するアンプレックスレッドモノアミンオキシダーゼアッセイキット（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄ  Ｍｏｎｏａｍｉｎｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ）、（モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、カタログ番号Ａ−１２２１４）を用いて、レナラーゼの酵素アッセイを実施した。該アッセイは、Ｈ２Ｏ２のための感応性の高い安定したプローブである１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシ−フェノキサジン、（アンプレックスレッド試薬）を用いたホースラディッシュペルオキシダーゼ対合反応におけるＨ２Ｏ２の検出に基づくものである。２ｍＭという最終的基質濃度でメーカーの指示事項に従って実験を実施した。
【０４５５】
結果
構造分析は、レナラーゼが、アミノオキシダーゼドメインを含んでいることを明らかにし、このことはレナラーゼがアミン酸化において１つの役割を果たし得ることを示唆していた。従って我々は、基質として一連のアミンを用いてそれがオキシダーゼ活性を有するか否かをテストした。大腸菌内のレナラーゼ融合タンパク質は、ＧＳＴ遺伝子融合素を用いてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）含有ｐＧＥＸ発現ベクター内にレナラーゼｃＤＮＡをクローニングすることによって生成された。図４ａに示されているように、レナラーゼは、ドーパミン＞エピネフリン＞ノルエピネフリンといった等級順の効能でカテコールアミンを特異的に代謝させる。その酵素活性は、ＦＡＤ含有アミンオキシダーゼの阻害物質、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂによる影響を受けなかった（図４ｂ）。
【０４５６】
ＧＳＴ−レナラーゼ融合タンパク質を、グルタチオンセファロースカラムを用いて均質になるまで精製した（図５ａ）。精製された融合タンパク質は、ＧＳＴタグのＭＷ（２６ＫＤ）に予測されたレナラーゼのＭＷ（３７．８ＫＤ）を加えたものと一致して約６４ＫＤのＭＷを有する。レナラーゼは腎臓において発現度が高く分泌タンパク質であることから、レナラーゼは循環中に存在することそしてＥＳＲＤを患う個体がはるかに低いレナラーゼレベルを有することは想像できる。血漿試料をウエスタンブロットによってレナラーゼ特異的抗体で分析した時点で（図５Ｂ）、我々は、血液透析上でＥＳＲＤ患者におけるレナラーゼレベルが事実上検出不可能である一方、正常な個体は約７ｍｇ／ｌの循環レナラーゼ濃度を有するということを発見した。
【０４５７】
我々はその後、基質として一連のアミンを用いてレナラーゼがオキシダーゼ活性を有するか否かをテストした。図６に示されているように、ＧＳＴ−レナラーゼ融合タンパク質は、基質としてドーパミン、ノルエピネフリン及びエピネフリン（２ｍＭ）が使用された場合に有意なオキシダーゼ活性を有する。かくして、レナラーゼはドーパミン、ノルエピネフリン及びエピネフリンを代謝する新規のタンパク質であるという結論を下すことができる。
【０４５８】
実施例４：レナラーゼは全身血圧を調節する。
血行動態測定
イナクチン（１００ｍｇ／ｋｇ）でスプレーグ・ドーリーラット（１５０〜２５０ｇ）を麻酔した。カテーテル（ＰＥ−２４０）を気道保護のため気管内に設置し、一時間あたり体重１００ｇにつき１．５ｍｌの割合で６．２５％のウシアルブミンを伴う標準生理食塩水からなる維持流体溶液を静脈下輸液するために左頸静脈（ＰＥ−５０）内に設置した。直腸体温計を通してコア温度を監視し、加熱パッドを用いて３７℃で体温を維持した。左頸静脈の中に挿入され圧力変換器に接続されたＰＥ−５０カテーテルを通して動脈圧及び心拍数を連続的に監視した（ＡＤインストルメンツ（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、コロラド州、ＵＳＡ）。血行動態記録を、ＰｏｗｅｒＬａｂ／８ＳＰデータ収集システム（ＡＤインストルメンツ）を用いてデジタル化し記憶し分析した。外科手術の完了からの回復時間として一時間がラットに許容され、その後の３０分は対照期間として使われた。その後、実験グループは０．５ｍｌのＰＢＳ中の０．５ｍｇの組換え型レナラーゼのボーラス静脈内注射を受けた。対照グループには、０．５ｍｌのＰＢＳ中の０．５ｍｇのＢＳＡ又は０．５ｍｇの組換え型グルタチオントランスフェラーゼのいずれかを注射した。血圧と心拍数を連続的に測定し記録した。
【０４５９】
血圧は、心拍出量及び末梢血管抵抗の関数であり、交感神経系により調整される。循環カテコールアミンが心拍数、心筋収縮能及び抵抗血管の緊張を制御する。レナラーゼは血管中を循環しカテコールアミンを分解することから、我々は、血行動態パラメータに対するそのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を検査した。組換え型レナラーゼの単一のホーラス静脈内注射から３０秒以内で、収縮期、拡張期及び平均動脈圧は、それぞれ２３．５±１．３、３２．６±２．９及び２８．９±２．７％だけ減少した（ｎ＝４、ｐ＜０．００１）。図７Ａ（上パネル）に示されているように、血圧は２分以内で回復し、その後は漸進的に減少して、基線（ｎ＝４、ｐ＜０．０１）より低い１６．５±１．５、１４．３±１．２及び１４．８±１．１％という収縮期、拡張期及び平均動脈圧で天底（６０〜９０分の間）に達した（図７Ａ、下パネル）。心拍数は当初不変のままであり、６０分までにわずかに（６．４％）減少した（図７Ａ、下パネル）。対照研究では、アルブミン又はＧＳＴ輸液のいずれによっても血圧及び心拍数が影響を受けることはなかった（図７Ｂ）。これらのデータは、レナラーゼの低血圧作用が加速されたカテコールアミン分解の結果である確率が最も高く、これが、（低血圧に応答した）脈拍数の予測された上昇を妨げ心筋収縮性を減少させ血管抵抗性を低下させることになる、ということを表わしている。代替的には、レナラーゼは同族受容体に結合し、心筋収縮性及び血管抵抗性を直接変調させることができる。
【０４６０】
【表２】
2007531518.tif 000003
【０４６１】
実施例５：動物モデル
ラット残存腎臓モデル（ＲＲＫＭ）
記述されている通りに（和田（Ｗａｄａ）、Ｍら；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９７年１２月１５日；第１００（１２）号：２９７７〜８３頁）、ラット部分（５／６）腎摘出術又はラット残存腎臓モデルを使用することができる。雄のラット（生後２〜３ヵ月、体重１５０〜２００ｇ）をまず最初に片側腎摘出術（左腎又は右腎）に付す。２．０ｃｍの皮膚切開を腹側正中で行ない、その尾側１．０ｃｍの頭蓋末端をジフォイド（Ｘｙｐｈｏｉｄ）プロセスに付す。中線に沿って２．０ｃｍの筋肉切開を行なう。右腎を単離し、周囲の脂肪及び結合組織を除去して、腎動脈及び腎静脈そして腎門に入ったときには尿管が明確に見えるようにする。副腎の妨害を最小限におさえるべく注意を払う。腎動脈、静脈及び尿管のまわりに結紮糸（３／０絹糸）を設置する。これらの管を次に腎臓の近くで切断し、腎臓をとり出し、このとき副腎を妨害しないように注意を払う。外科手術の第２工程には、第１工程から７〜１０日に残った腎臓の３分の２を取出すことが関与する。血漿クレアチニン（Ｃｒ）及びＢＵＮのレベルは、腎臓質量及び機能の損失に起因して劇的に上昇する。次の数週間にわたり、生存する動物の血漿Ｃｒ及びＢＵＮレベルは幾分か正常値に向かって下降するが高いままにとどまる。このとき、腎機能は可変的な長さの期間比較的一定又は安定した状態にとどまるように思われる。この時点の後、動物は、死に至るまでの腎機能の基本的に線形の下降が存在する慢性腎不全の期間に入る。
【０４６２】
外科的対照として、生後日数、体重を整合させたラットを、腎臓に被膜剥離術に施さず腎組織を全く取り出さない「擬似」手術に付す。
【０４６３】
慢性腎不全の介入モデル
このモデルにおいては、腎摘出を施したラットと擬似手術を受けたラットの両方を手術後およそ５〜６カ月の間維持する。この時点で、腎摘出した動物は慢性腎不全期に入ることになる。
【０４６４】
ラットを、各グループに１５匹ずつの８グループに分割する。対照として、２グループの腎摘出を施したラットを用い（Ｎ×対照）、そのうち１グループはいかなる処置も受けておらず、一方もう一つのグループはビヒクル緩衝液のみの注射を受けたものである。さらに、擬似手術を受けたラットの２グループを対照（擬似対照）として使用し、一方のグループはビヒクル緩衝液のみを受け、もう一方のグループは、体重１ｋｇあたり１００マイクログラムで可溶性レナラーゼを受けた。腎摘出を受けたラットの４つの実験グループも利用され、ＳＱ注射により体重１ｋｇあたり１０、１００、５００マイクログラムでレナラーゼを受ける。レナラーゼで処置されたラット及びビヒクルのみのラットは、４〜８週間一日に２回の注射を受ける。
【０４６５】
全てのグループにおいて、レナラーゼ治療の前及びその間、血漿ＢＵＮ、Ｃｒが検査されることになる。レナラーゼはＮｘラットに対し治療の利益を提供することになる（慢性腎不全の進行を遅くする）。糸球体硬化、尿細管虚脱、間質性硬化及び微細動脈瘤の発生を検査するためレナラーゼ治療の終わりに組織学的研究も実施されることになる。
【０４６６】
慢性腎不全の予防的モデル
慢性腎不全の開始を予防、阻害又は遅延するためのレナラーゼ（腎臓治療薬）をテストする目的で、ラットを上述の通りに腎摘出術又は擬似手術に付す。手術の第２工程から約２週間後でレナラーゼ療法の開始前にラットを回復させる。この時点で、生存している動物は急性腎不全期を過ぎ、また慢性腎不全に入ってはいない。ラットを１２匹からなる２グループに分割する。１グループはビヒクル緩衝液（Ｎ×対照）のみを受け、一方もう１つのグループは一日ＳＱで２回ずつ体重１ｋｇあたり１００マイクログラムの割合でレナラーゼ治療を受ける。レナラーゼ又はビヒクルの投与は、およそ８〜９週間にわたり続いた。
【０４６７】
全てのグループにおいて、レナラーゼ注射の前及び途中で血漿ＢＵＮ、Ｃｒが検査されることになる。レナラーゼは慢性腎不全の開始を予防、阻害又は遅延することになると予想されている。糸球体硬化、尿細管虚脱、間質性硬化及び微細動脈瘤の発生を検査するためレナラーゼ治療の終わりに組織学的研究も実施されることになる。
【０４６８】
高血圧モデル
本態性高血圧症の研究及び心臓血管研究のためには一般に、自然発症高血圧の非近交ラット（ＳＨＲ）を使用する。生後１２週間以上の雄は、信頼性ある形で、２００ｍｍＨｇ超の平均収縮期血圧を示す。レナラーゼの高血圧防止効果は、ＳＨＲにおいてテストできる。
【０４６９】
ＳＨＲラットを１２匹からなる２つのグループに分割する。１グループはビヒクル緩衝液のみを受け、一方もう１つのグループは一日ＳＱで２回ずつ体重１ｋｇあたり１００マイクログラムの割合でレナラーゼ治療を受ける。レナラーゼ又はビヒクルの投与は、およそ２〜６週間にわたり続いた。ラット血圧は、埋込み型遠隔計測装置により毎日検査されることになる。
【０４７０】
うっ血性心不全モデル
うっ血性心不全（ＣＨＦ）モデルは、大型及び小型の動物を含め文献中で充分に記述されている。これらのモデルは、レナラーゼの予防的及び治療的効果をテストするために使用可能である。例えば、ディールハンティー（Ｄｅｌｅｈａｎｔｙ）ら、（ディールハンティー、ＪＭら、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９４年３月、第２６６号（３Ｐｔ２）：Ｈ９３０−５）により記述されているように、イヌ科の動物（すなわちイヌ）においてＣＨＦを誘発するために急速心室ペーシングモデルを使用することができる。８週間毎分心拍数２２５回でのペーシングに付されたイヌは、８週間毎分心拍数１００回でペーシングされたイヌと比べ高い左心房圧、時間との関係における左心室内圧の一次導関数の低下及び心拍出量の低下によって証明されるように、心不全を発生させた。高速ペーシングを受けたイヌは同様に、血漿ＮＥの上昇及び心筋ＮＥ含有量を示した。
【０４７１】
その他のＣＨＦ動物モデルも同様に使用可能である。例えば、心筋梗塞を誘発するために以前に記述された通り（グリーネン（Ｇｒｅｅｎｅｎ）Ｄ．Ｌ．ら、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、第６３号、９２〜９６頁（１９８７年）；バトリック（Ｂｕｔｔｒｉｃｋ）Ｐ．ら、Ａｍ．J．Ｐｈｙｓｉｏｌ．第２６０号、１１４７３〜１１４７９頁（１９９１年））に左冠動脈結紮に雄スプレーグードーリ（ＳＤ）ラットを付す。このラットをペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で麻酔し、気管切開術を介して挿管し、人工呼吸器により換気する。左側開胸術の後、左冠動脈を７〜０絹結紮糸でその根元から約２ｍｍのところで結紮する。擬似動物は、縫合が冠動脈の下に通され次に除去されるという点を除き、同じ手順を受ける。結紮から４〜６週間以内に、心筋梗塞がラットの心不全を発生させる。臨床患者においては、心筋梗塞又は冠動脈疾患が、心不全の最も一般的な原因である。このモデルにおけるうっ血性心不全は、大部分のヒトの患者におけるうっ血性心不全を適度に模倣している。
【０４７２】
卒中（脳血管障害）モデル
「卒中」は、脳に対する血液供給の異常によりひき起こされる突然の機能喪失である。卒中は、「一過性脳虚血発作」又は「ＴＩＡ（永続的な障害無し）から「部分的非進行性卒中」、「完全な卒中」（永続的で悲惨な神経学的欠損）に至るまでの異なる重症度レベルを示す。
【０４７３】
卒中モデルには、一般的に、卒中傾向をもつ高血圧自然発生（ＳＨＲ−ＳＰ）ラットが使用される。この実験は、卒中予防／治療において可能な有益な効果についてテストするのに用いることができる。雄の生後８週目のＳＨＲ−ＳＰラットが２つのグループに無作為の順序で分割される。対照ラットは、普通食及び飲用溶液としての１％のＮａＣｌを含む水で維持される。治療グループは、４〜８週間レナラーゼ注射ＳＱ（一日２回、１００マイクログラム／ｋｇ）を受ける。意識のある動物において、テイルカフ法により、収縮期血圧が測定され、拍出速度は、これら２つのグループにおいて磁気共鳴画像形成（ＭＲＩ）、組織病理学及び神経行動学的試験を用いて検査されることになる。
【０４７４】
関節硬化症モデル
カテコールアミンが血管損傷をひき起こし、高脂血症の存在下でアテローム性動脈硬化の加速及び悪化をひき起こすことがわかっている（ククレジャ（Ｋｕｋｒｅｊａ）ＲＳら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．（１９８１年）第４０（３−４）号、２９１〜８頁）。従って、レナラーゼはアテローム性動脈硬化を予防／治療する可能性がある。ククレジャら（ククレジャＲＳら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９８１年１１月−１２月、第４０（３−４）号、２９１〜８頁）によって記述されているように、次の２つの手順を用いてアカゲザルにおいて進行性大動脈及び冠動脈アテローム性動脈硬化を発生させることができる：（ａ）７ヵ月にわたる高脂肪及び高コレステロール給餌及び（ｂ）この食餌療法と組合せた毎日の静脈内アドレナリン注射（体重１ｋｇあたり５０マイクログラム）。手順（ｂ）に付されたサルは、大動脈及び冠動脈内の線維性硬斑の形で著しく進行したアテローム性動脈硬化を発生させることになり、一方その他のグループではこれらの病巣ははるかに頻度が低いものと予想されている。アテローム発生性の食餌療法とアドレナリン注射の両方を受けたサルにおいて、合計血清コレステロール対遊離血清コレステロールの比は、著しく増大することになり、大動脈コレステロール含有量はきわめて高いものとなる。これらのモデルは、アテローム性動脈硬化の予防及び治療に対するレナラーゼの効果をテストするために使用可能である。
【０４７５】
レナラーゼをテストするための第２のモデルには、ａｐｏＥノックアウトマウスが関与する（ザング（Ｚｈａｎｇ）ＳＨ、レディック（Ｒｅｄｄｉｃｋ）ＲＬ、ピエドラヒタ（Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ）ＪＡ、前田（Ｍａｅｄａ）Ｎ．、（１９９２年）「Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ  ａｎｄ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｌａｃｋｉｎｇ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２５８号、４６８〜４７１頁）。ａｐｏＥノックアウトマウスは、ａｐｏＥ遺伝子を分断するための胚幹細胞内での遺伝子ターゲティングにより生み出された。糖タンパク質であるＡｐｏＥは肝臓により合成される超低比重リポタンパク質（ＶＬＤＬ）及び腸内合成キロミクロンの１つの構造的構成要素である。これは同様に、細胞間でのコレステロール輸送活性に関与する高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）のサブクラスの１成分でもある。ａｐｏＥの最も重要な役割は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体に対するａｐｏＥを含有するＶＬＤＬ粒子及びキロミクロンの高親和性結合を仲介することにある。これにより、コレステロール富有残留物の血漿中の蓄積を防止する輸送のために必要な肝臓によるこれらの粒子の特異的摂取が可能となる。ａｐｏＥ遺伝子の同型接合的不活性化は、その血清中にａｐｏＥを持っていない動物を結果としてもたらす。マウスは正常に発達するように見えるものの、正常血清血漿コレステロールの５倍及び自然発生アテローム性動脈硬化病巣を示す。これは、ＬＤＬ受容体への結合が不良であるａｐｏＥ遺伝子の変異体形態を有しかつアテローム性動脈硬化の早期発生及び血漿トリグリセリド及びコレステロールレベルの上昇のリスクがある人における疾病に類似している。ａｐｏＥノックアウトマウスは、アテローム発生プロセスを修正する介入療法を調査するためにアテローム性動脈硬化モデルとして広く用いられており、ここではレナラーゼを用いたかかる療法の効果をテストするために使用可能である。
【０４７６】
実施例６：将来の研究
上述の実施例に加えて、当該発明者により研究が計画されてきており、又実施中である。１つの研究には、約３００人の対象における腎臓の機能とレナラーゼレベルの相関関係の臨床的査定が関与する。これまでに７０名の人が登録されてきた。予備結果は、約６〜７週間以内に入手可能となる予定である。もう１つの研究では、発明者らは、慢性腎不全のラットモデルにおける慢性腎臓疾患の進行及び心臓血管合併症の発生に対する皮下注射による慢性レナラーゼ投与の効果を評価する予定である。又さらにもう１つの研究においては、発明者らは、ラットモデルにおけるＣＭＶ−レナラーゼベクターの筋内注射の効能を評価する予定である。
【０４７７】
論述
本書で同定されているレナラーゼは、機能的ゲノムデータベースを用いたヒトにおける第３のモノアミンオキシダーゼである。ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂと同様に、レナラーゼは、ドーパミン（ＤＡ）、ノルエピネフリン（ＮＡ）及びエピネフリン（ＥＰ）などのカテコールアミンを代謝させる。レナラーゼは、それをＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂと区別するいくつかの重要な独特の特長を有している。第１に、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂに比べ、レナラーゼは腎臓の中で卓越して発現され、このことはレナラーゼが末梢におけるカテコールアミン代謝で独特の役割をもつことを示唆している。循環性モノアミンの代謝は、ＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）及びスルホトランスフェラーゼを含めた多数の細胞内酵素（アイセンホッファー（Ｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ）ら、２００１年）によって実施されると考えられている。これらの酵素は細胞内の場所を有することから、循環性カテコールアミンの寿命を制限する主要な機序は、酵素による代謝ではなく細胞内への活発な輸送による摂取である。これは、ＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂの主要な役割がアミンの代謝及び神経伝達物質レベル及び細胞内アミン貯蔵の調節にあるという概念と一貫性をもつものである。
【０４７８】
第２に、ミトコンドリアの外部膜にあるＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂとは異なり、レナラーゼは、分泌タンパク質であり、これは、カテコールアミンのクリアランスが細胞外空間内で起こり得ることを示唆しており、カテコールアミンを異化させるには細胞によりこれを取り上げなくてはならないという従来の考え方に挑むものである。それは血液中を循環し、ここでレナラーゼは血清カテコールアミンを異化する。レナラーゼが分刻みで血漿カテコールアミンレベルを「微調整」することも可能である。
【０４７９】
第３に、レナラーゼは腎臓内で高レベルで発現され、これは、腎臓がレナラーゼ触媒経路を介してカテコールアミンの分解に関与していることを示唆している。本書で提供されているデータは、レナラーゼが全身レベルと同様局所的腎臓レベルでもカテコールアミンを調節するという仮説と一貫性をもつものである。レナラーゼが、細胞内アミンを異化するＭＡＯ−Ａ及びＭＡＯ−Ｂと併せてオキシダーゼ細胞外カテコールアミンにとって重要な酵素でありかくして交感神経系の緊張の調節に寄与するということは考えられる。
【０４８０】
レナラーゼは近位細管内で最も豊富であり、正常な個人の循環の中に姿を現わし、これは近位細管内のレナラーゼタンパク質が側低膜を介し、それがその基質を異化した循環内に分泌され得、かくして全身レベルでカテコールアミンホモオスタシスを調節することを示唆している。
【０４８１】
レナラーゼはネフロンの管腔まで容易にろ過され得る小タンパク質であることから、それが腎再尿管の管腔においてもその生物学的機能を及ぼすことは可能である。さらに、レナラーゼは近位細管により頂端膜を介して直接分泌され得、そこでそれは、糸球体を通ってろ過し新たにドーパミンなどの腎細尿管細胞により生成したその基質を代謝させる（ワングら、２００１年）。管腔内でのカテコールアミン代謝におけるレナラーゼの意義は、管腔内カテコールアミンレベルを調節しかくして塩及び水の再吸収を調節することにある。
【０４８２】
最近の研究から、血漿ドーパミン（クッシュ（Ｃｕｃｈｅら、１９８６年；プランソー（Ｐｒｉｎｓｅａｕ）ら、１９８６年）及びノルエピネフリン（ゾッカーリら、２００２年）がＥＳＲＤ患者において一貫して高いことがわかっている。カテコールアミンレベルのこれらの変化は、無症候性左心室機能障害（ベネディクトら、１９９６年、慢性うっ血性心不全（ルロー（Ｒｏｕｌｅａｕ）ら、１９９４年）及びアテローム性動脈硬化（ロザンスキーら、１９９９年）といった心臓血管疾患の病因論に大きく寄与するものである。心臓血管合併症における高い交感神経系の緊張の重要性は同様に介入研究により裏づけされている（テンデラ（Ｔｅｎｄｅｒａ）ら、２００１年）。ＥＳＲＤ患者では、循環カテコールアミンの増大は、尿毒性患者を左心室肥大から不整脈に至るまでの一連の心臓血管合併症にかかりやすくしかねない（ゾッカーリら、２００２年）。ＥＳＲＤ患者における高いカテコールアミンの機序は、未だほとんど理解されていない。（カテコールアミンを異化し腎臓内で高レベルで発現されている）レナラーゼについての我々の発見は、（ＥＳＲＤ患者におけるエリトロポエチン分泌の減少と同様に）腎臓質量を喪失するという理由でこれらの患者におけるカテコールアミン異常の病因を説明し得る。
【０４８３】
レナラーゼは、ＥＳＲＤ患者がその機能を失なってしまっている臓器である腎臓の中で最も多く発現されることから、ＥＳＲＤ患者においてレナラーゼが劇的に減少することは驚くべきことではない。レナラーゼがカテコールアミンを異化するという事実は、ＥＳＲＤ患者における高いカテコールアミンレベルと併さって、レナラーゼがカテコールアミンホメオスタシスを維持する上できわめて重要なタンパク質であり、ＭＡＯ−Ｃが高血圧、無症候性左心室機能障害、慢性うっ血性心不全及びアテローム性動脈硬化といった心臓血管疾患を導くカテコールアミン異常に寄与する不足因子である、ということを強く示唆している。
【０４８４】
以上の詳細な説明は、理解を明瞭にするためのみに示されており、当業者にとっては修正が明白であることから、ここからいかなる不必要な制限も理解するべきではない。
【０４８５】
該発明はその特定の実施形態に関連して記述されてきたが、それをさらに修正することが可能であり、本出願が、一般に該発明の原則に従いかつ該発明が関連する技術分野の範囲内での既知の又は慣習的な実践の範囲内に入るような又添付の特許請求の範囲内で以下又は以上で記された不可欠な特長に対し適用され得るような本開示からの逸脱を含めて、該発明のあらゆる変形形態、用途又は適合化を網羅するべく意図されたものあることを理解すべきである。
【０４８６】
参考文献
ここで引用され、以下に挙げられた参考文献を含むがそれらに限定されない特許、特許出願のそれぞれは、その全体がここに参照として援用される。
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【図面の簡単な説明】
【０４８７】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】プローブとしてＭＧＣ１２４７４クローンを用いたヒト組織のノーザンブロット分析である。
【図１Ｂ】レナラーゼ内で検出される推定上の構造モチーフを描いている。ＦＡＤ：フラビン・アデニン・ジヌクレオチド、ＳＰ：シグナルペプチド
【図１Ｃ】ＭＡＯ−Ａと比較したヒトレナラーゼの演繹的アミノ配列である。
【図１Ｄ】レナラーゼポリクローナル抗体を用いたラット組織のウエスタンブロット分析である。
【図２Ａ】ヒトレナラーゼのｃＤＮＡと演繹的アミノ酸配列を示す。囲みに入ったアミノ酸残基１〜１６はシグナルペプチドをコードすると考えられている。
【図２Ｂ】レナラーゼのゲノム構造を描いている。
【図２Ｃ】ヒトＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ及びＭＡＯ−Ｃ間のアライメントである。
【図３Ａ−３Ｄ】ヒトの腎臓及び心臓の中のレナラーゼの細胞内局在決定を示す。
【図３Ａ】ヒトの腎臓のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析である；左パネル：アンチセンスプローブ、倍率：２００倍、白色矢印は糸球体を標識し、黒色矢印は近位細管を現わす；右パネル：センスプローブ対照、倍率：１００倍。
【図３Ｂ】ヒトの心臓のｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析である；左パネル：アンチセンスプローブ、倍率：２００倍、白色矢印は血管を標識し、黒色矢印は心室ミオサイトを表わす。右パネル：センスプローブ対照。
【図３Ｃ】ヒトの腎臓内の免疫学的局在決定画像である。左パネル：抗レナラーゼ抗体、倍率：６３０倍、黒色矢印は近位細管を表わす。右パネル：免疫前血清。
【図３Ｄ】ヒトの心臓内の免疫学的局在決定画像である。左パネル：抗レナラーゼ抗体、倍率：６３０倍、白色矢印は血管を標識し、黒色矢印は心室ミオサイトを表わす。右パネル：免疫前血清。
【図４Ａ−４Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞内のラットレナラーゼ−ＨＡ−タグ付き融合タンパク質の発現を示す。
【図４Ａ】レナラーゼの発現ＴＡＰフラグメントの構成を描いている。
【図４Ｂ】ＧＳＴ−レナラーゼ融合タンパク質の生成及び精製を描いた図である。未精製細菌溶解物からのタンパク質（１００μｇ）及び精製ＧＳＴレナラーゼ（１０μｇ）は１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離され、クーマシーブルーで染色された。レーンＡ：未精製細菌溶解物；レーンＢ：精製済みレナラーゼタンパク質。
【図４Ｃ】レナラーゼ活性の判定を示す。各アッセイに精製済みＧＳＴ−レナラーゼ融合タンパク質（各反応について１０μｇ）を使用した。ドーパミン又はノルエピネフリン（２ｍＭの最終濃度）との３０分間のインキュベーションの後のタンパク質１０μｇあたりの任意螢光単位でアミノオキシダーゼ活性が表現されている。カラム１：ドーパミン及びノルエピネフリンと対照タンパク質（ＧＳＴ）；カラム２：ノルエピネフリンとＧＳＴ−レナラーゼ；カラム３：ドーパミンとＧＳＴ−レナラーゼ
【図５Ａ−５Ｂ】レナラーゼが分泌タンパク質であることを示す。
【図５Ａ】レナラーゼｃＤＮＡでのトランスフェクションを過渡的に受けたＨＥＫ２９３細胞の培地内のレナラーゼの検出を表わす画像である。
【図５Ｂ】抗レナラーゼ抗体を用いたヒト血漿のウエスタンブロット分析を示す画像であり、「正常」は正常な腎機能を有する個体を意味し、「対照」は組換え型レナラーゼであり、ＥＳＲＤは血液透析を受けている末期腎不全患者を表わす。
【図６Ａ−６Ｃ】レナラーゼの酵素活性及び機能を示す。
【図６Ａ】各アッセイについて１０μｇのＧＳＴレナラーゼ融合タンパク質が使用された；タンパク質１０μｇあたりの任意螢光単位でアミンオキシダーゼ活性が表現されている。基質（２ｍＭ）は３０分インキュベートされる。
【図６Ｂ】図６Ａと同様、１μＭのクロルギリン及び１μＭのパルギリンが使用された。
【図６Ｃ】親和性精製されたヒトレナラーゼの画像である。抗レナラーゼ抗体を用いてヒトの尿からタンパク質が単離された；レーン１：ヒトの尿、レーン２：２次抗体単独での対照。
【図７Ａ−７Ｇ】レナラーゼの血行動態効果を描いている；矢印はレナラーゼ注射のタイミングを表わし、タイムスケールは分単位であり、心拍数は毎分心拍数（ｂｐｍ）で測定され、収縮期及び拡張期動脈血圧は水銀柱ミリメートル（ｍｍＨｇ）で表現されている。
【図７Ａ】体重１ｇあたり４μｇのＩＶ（静脈内）ボーラス注射の前後の心臓応答を示す；矢印はレナラーゼ注射のタイミングを表わす；Ｖｐ＝左心室圧；ＨＲ＝心拍数；ｄＰ／ｄｔ＝左心室圧の変化速度、心臓収縮性の尺度。
【図７Ｂ】レナラーゼ注射の前後の圧力−体積曲線
【図７Ｃ】図７Ａの一部分の拡大図である（矢印を参照のこと）。ＨＲ：心拍数、Ｖｐ：左心室圧。
【図７Ｄ】心臓収縮性に対するレナラーゼ用量−応答曲線である。
【図７Ｅ】平均動脈圧に対するレナラーゼ用量−応答曲線である。
【図７Ｆ】血漿エピネフリンに対するレナラーゼ活性の経時変化である。
【図７Ｇ】血漿ノルエピネフリンに対するレナラーゼ活性の経時変化である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【配列表】
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